hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
医療被曝大幅低減撮影手法ー同位相グリッドレスおよびグリッド撮影法(GLG)-

〔背景〕これまで、医療被曝を大幅に低減できる撮影法(GLG法)を提案し、従来法の1/3まで線量を低減して撮影しても「全体に見やすく、従来法で撮影した画像と比較しても極端な画質の劣化はない。末梢の血管の走行も十分に観察でき、特に問題はない」との放射線科医の評価を得て、GLG法の有用性を示してきた。〔目的〕今回、さらなる線量の低減と画質の改善を目指し、(1)GLG法に用いる散乱線除去用グリッド(以下グリッド)(2)撮影条件(3)線量の3点について検討した。〔結果〕(1)GLG法の特徴を最大限いかすには、市販のグリッドでは不十分で、高密度、低グリッド比(厚さが薄く低露出倍数)のGLG用グリッドを特別に制作を依頼し入手した。このグリッドの最大の特徴は、同程度の散乱線除去効果を有する市販のグリッドに比較して厚さが約17%薄いことである。これにより後面像の拡大を押さえることができ鮮鋭度が向上した。(2)GLG像は撮影電圧に非常に影響を受け、コントラストが変化する。このグリッドを使用する場合、撮影電圧は100kV程度で撮影した場合、全体および細部において、従来法に匹敵するコントラストを有することがわかった。(3)これらの条件で撮影した場合、画像の粒状を中心に評価した場合、従来法の1/5程度まで線量を低減しても、従来法で撮影された画像と同程度の粒状であることがわかった。〔課題〕GLG法は線量を大幅に低減してもコントラスト、粒状については画質の低下は認められないが、鮮鋭度にわずかな劣化が認められる。現在、臨床応用に向け、この部分の改良を行っている。最近多くの施設に導入されているCR装置と、これまでの研究成果を利用し、一度散乱X線を含む画像を形成してから、後処理で散乱X線成分だけを取り除く手法を考えた。この医療被曝を大幅に低減できる撮影法(GLG法)で胸部ファントムを撮影し、実際に処理を行った。得られたGLG像について、視覚評価および模擬血管を使った画素値分布による物理評価を行った。その結果、縦隔部等の散乱X線が多く発生すると考えられる部分では、視覚評価および物理評価とも良い結果が得られ、期待通りの散乱X除去効果があることがわかった。しかし一方、肺野部分の末梢血管の描出は、従来法で撮影した画像に比べやや劣っていた。また、線量が少なくなると、全体に粒状性が悪くなる等の問題点もわかった。各画像のヒストグラム解析および各部位の画素値解析の結果、これらの問題点は、散乱X線が多く発生する縦隔部を中心に、各係数を設定したためとわかった。そこで、肺野部の末梢血管の描出および粒状性の改善に重点を置き、各係数の調整を繰り返した。その結果、線量を少なくしても、極端な画質の劣化はなく、肺野の末梢血管の描出、および画像全体の粒状性が改善できた。放射線科医も「全体に見やすく、従来法で撮影した画像と比較しても極端な画質の劣化はない。末梢の血管の走行も十分に観察でき、特に問題はない」と評価した。現在、実用化に向け腫瘍や間質性肺炎等の淡い陰影の描出等について、模擬結節などを用いて検討中である。
光応答性DNAを活用した光駆動型分子マシンの開発

本研究では、アゾベンゼンを導入した光応答性DNAを用いた光駆動型分子マシンの開発を目指した。まずDNA二重鎖の形成と解離の高効率な光制御を可能にする修飾アゾベンゼンの分子設計を行った。その結果、主鎖から遠い側にあるベンゼン環の2つのオルト位の化学修飾が、光制御効率の向上とcis体の熱安定性の向上に有効であることを見出した。また二重鎖中でアゾベンゼンと塩基対が交互に並ぶように光応答性DNAの配列を設計すると、アゾベンゼンの光異性化で二重鎖の形成と解離の完全な光制御が可能なことも見出した。これらの技術を利用し、1) RNAを可逆的に切断する光駆動型DNA分子マシン、2)光崩壊型DNAナノカプセル、3)可視光応答型アゾベンゼンとの組み合わせによるシーソー型ナノマシンの構築に成功した。本年度は、効率的な開閉が可能な光駆動型分子ピンセットおよび細胞への応用が可能な分子マシンの構築に向けて、1)2',6'-ジメチルアゾベンゼンを導入した光応答性DNA、2)可視光応答する新規光応答性DNAの開発を行った。まず、2',6'-ジメチルアゾベンゼンを導入した光応答性DNAでは、従来型の未修飾のアゾベンゼンと比較して期待通り幅広い温度範囲で光制御効率の大幅な向上が見られた。またNMRおよびコンピューターモデリングより、2'位と6'位へのメチル基導入に伴う光制御効率向上機構を明らかにした。更にそのcis体の熱異性化抑制機構も、モデル化合物との比較から明らかにした。可視光応答性DNAの開発では、アゾベンゼンのアルキルチオ基の導入による極大吸収波長の長波長化を検討した。その結果、極大吸収波長が390nm以上に長波長化するためには、1)パラ位にアルキルチオ基の導入、2)S上のアルキル基は1級および2級が必要条件であることを明らかにした。この条件を満たす4'-iPr-thioazobenzeneを合成し、DNA中に導入したところ、期待通り400nm以上の可視光照射で、可逆的にかつ効率的に二重鎖形成と解離を光制御できることを明らかにした。以上のように、当初目的とした2つの課題を達成することに成功した。本年度は効率的な開閉が可能な光駆動型分子ピンセットおよび細胞への応用が可能な分子マシンの構築に向けて、一分子型(単分子型)分子マシンの構築(第二世代型分子マシン)の構築を目指した。当初の計画に従い、Yurkeらの構築した分子ピンセットのアームの両末端に、アゾベンゼン導入DNAを直接装着した光開閉型分子マシンを設計・合成した。この分子マシンはいわば"光駆動型エンジン"一体型分子マシンであり、エンジンとピンセット本体が分離していた前年度の分子マシンとは異なり、1分子でも作動可能である。また一体型分子マシンの設計はDNA自身を燃料として使用する従来型の分子マシンでは不可能であり、我々が開発した光応答性DNAを用いることで初めて可能になる。得られた一体型分子マシンは濃度に依存せずに特定波長の光照射のみで可逆的に開閉可能であり、当初の設計通りの高い性能を示すことが明らかとなった。またUV光照射でtrans-体からcis-体に異性化すると二重鎖形成する光応答性DNAを組み込んだ逆応答型分子マシンも合成したところ、順応答型(trans-体からcis-体に異性化すると二重鎖が解離する光スイッチ)を凌駕する可逆性を示すことも明らかとなった。本研究者はアゾベンゼンを導入した光応答性DNAを利用することで、廃棄物を全く生成しない光駆動型DNA分子マシンの構築に成功している。本年度は、前年度の成果に基づき、二重鎖形成と解離の完全制御を可能にするInterstrand-wedgemotif(アゾベンゼン残基と塩基対が交互に並ぶモチーフ)を組み込んだDNAエンザイム(RNase)を設計・合成し、RNA切断の光スイッチングを可能にする実用的なDNA分子マシンの構築を目指した。ここでは、Joyceらが開発した10-23型DNAエンザイムを使用し、慢性骨髄性白血病遺伝子に関連するBCR-ABLをターゲットとした。DNAエンザイムに光応答性を付与するため、まずはDNAエンザイムの両末端に相補的なオーバーハングを導入したヘアピン型DNAエンザイムを設計し、そのオーバーハング部位にアゾベンゼンを多数導入した。この場合、trans体(可視光照射下)ではオーバーハング部位が二重鎖を形成するため活性構造を維持することが出来ずRNA切断活性はoffになると予想される。

一方cis体(UV光照射下)ではオーバーハング部位が解離してDNAエンザイムが再び活性構造をとることで、RNA切断活性の回復が期待できる。この設計に基づいて実際にヘアピン型光応答性DNAエンザイムを合成したところ、設計通りtrans体で活性がoff、cis体で活性がonとなった。On状態とoff状態での速度定数の比は40倍に達し、光照射によりRNA切断をほぼ完全に光制御することに成功した。さらにUV光と可視光を交互に照射することで、RNA切断のon-off交互スイッチングも実現した。また細胞応用を見据え、可視光照射のみで可逆的にtrans-cis異性化が可能な新規アゾベンゼンの合成にも成功した。従来型の紫外光応答型アゾベンゼンでは、光異性化に360nmの紫外光を照射する必要があり、酵素が損傷するので遺伝子発現の光制御は困難であった。そこで本年度は生体系で機能する光駆動型分子マシンの構築をめざし、酵素への損傷がほとんど無い400 nm以上の可視光照射のみで可逆的にon-offスイッチング可能な光駆動型DNAエンザイムを設計・合成し、ターゲット遺伝子に緑色蛍光性タンパク質(GFP)を用いて、無細胞タンパク質合成系で遺伝子発現の光制御を行った。光駆動型DNAエンザイムは、catalytic loop部位に相補的なオーバーハングに多数の可視光応答型アゾベンゼンを導入し、これをDNAエンザイムの5'端へ導入することで設計した。こうすることで、アゾベンゼンがtrans体の場合(450 nmの光照射)にはオーバーハングがcatalytic loopに結合するためRNA切断活性がoffになるが、cis体(400 nmの光照射)ではオーバーハングが解離するのでonになる。まずはモデル系でRNA切断を調べたところ、設計通り450 nmの光照射で活性がoff、400 nmでonになることを確認した。そこで実際に無細胞タンパク質合成系で可視光駆動型DNAエンザイムによるGFP発現の光制御を試みた。その結果、450 nmの光照射により光駆動型DNAエンザイムの活性がoffになり、GFPに基づく強い緑色蛍光が観察された。一方400nmの光を照射したところ、光駆動型DNAエンザイムの活性がonになりGFP発現が抑制され、弱い緑色蛍光しか観察されなかった。また可視光応答型アゾベンゼンを導入した光応答性T7プロモーターを用いた場合でも、GFP発現の可視光制御に成功した。このように我々が開発した可視光応答型アゾベンゼンを用いることで、遺伝子発現の光制御が実現できた。申請時に目的とした、1)二重鎖形成と解離の完全光制御、2)遺伝子発現の光制御が可能な光応答性DNAエンザイムの構築、3)可視光応答型アゾベンゼンの合成全てに成功した。24年度が最終年度であるため、記入しない。申請時の目的をほぼ達成したので、細胞応用が可能な実用的な光駆動型分子マシンの設計に向け、基礎的な知見を得る。
高血圧におけるエストロゲン・テストステロンおよびRhoキナーゼの役割に関する研究

【目的】5-6週齢(幼若期)および10-11週齢(成熟期)の高血圧自然発症ラット(SHR)と同週齢のWistar-Kyotoラット(WKY)の抵抗血管intact fiberとα-toxin処理skinned fiberにおいて、Rhdキナーゼ阻害薬であるY-27632を用い、Rhoキナーゼの細胞内Ca-収縮蛋白系への影響をWistar ratの基礎検討の後にSHRとWKYで比較検討した。【結果】(1)生筋において、高K,CafおよびNE収縮反応は幼若期ではSHRとWKYで有意差はなく、成熟期ではSHRはWKYに比べ大であった。Y-27632は高K,CafおよびNE収縮反応をそれぞれ減弱したが、それらの変化の程度は幼若期・成熟期ともにSHRはWKYに比し有意に大であった。(2)α-toxin処理skinnedfiberでは、Ca収縮は幼若期ではSHRとWKYで有意差はなく、成熟期ではSHRはWKYに比べ大であった。またY-27632によるCa収縮反応の減弱の程度は幼若期・成熟期ともにSHRはWKYに比べ有意に大であった。【結果】(1)生筋において高K、Caf、NEの収縮反応は、10μM E2により弛緩、1μM TSにより増強した。5μM tamoxifenはそのE2による収縮減弱作用を有意に阻害した。(2)α-toxin処理skinnedfiberでは、Ca収縮反応はE2により減弱、TSにより増大した。tamoxifenはそのE2の収縮減弱作用を有意に抑制した。【総括】生筋において高K、Caf、NEによる異なった機序での細胞内Ca上昇に伴う血管収縮反応はE2により弛緩、TSにより増強し、tamoxifenはE2刺激による収縮減弱作用を阻害したことは、estrogenおよびtestosteroneの細胞内Ca-収縮蛋白系への関与が考えられ、さらにα-toxin処理skinned fiberにおいても、Ca収縮反応はE2により減弱、TSにより増大し、tamoxifenはE2刺激時の収縮減弱作用を有意に抑制したことより、ラット抵抗血管における収縮蛋白のCa感受性はestrogenにより減弱し、一方testosteroneにより増大する可能性が示された。
咀嚼の全身の健康における役割を食行動時の脳内神経伝達物質の動態から解明する研究

口腔保健と全身的な健康状態の関係について、関心が急速に高まってきている。口腔保健の重要性を考えるにあたり、噛むことの生理的意義、特に全身機能とのかかわりに関する新しい解釈と科学的基盤の解明が求められている。本研究は、咀嚼の全身の健康における役割を解明するために、咀嚼システムに関した総合的研究を試みた。すなわち、口腔感覚入力の食行動およびエネルギー代謝調節における役割を、基礎的分野の研究によって解明するとともに、顎運動を中枢からの運動出力としてとらえ、臨床的分野で、歯列・歯・咬合小面形態を3次元的に精密に測定し、歯列および顎関節顆頭部の動態を解析するシステムを確立することによって、成長発育に伴った変化や、咬合異常を有する場合の特徴を解析した。基礎的研究では、脳内ヒスタミン神経系が食行動時に三叉神経中脳路核を介した咀嚼機能によって賦活化され、視床下部腹内側核における満腹感形成に寄与していること、また、食事に伴う熱産生が低硬度飼料摂取群において低下していることから、低硬度飼料長期飼育群にみられた脂肪の蓄積は、食事中に口腔内感覚によって駆動される生理的エネルギー代謝活動の低下に関連したものであることが明らかにした。臨床的研究では、小児および成人について咀嚼時の被験食品の性状変化に伴う下顎運動変化の三次元的解析を行い、顎関節、咬合、咀嚼筋、下顎骨などが形態的に発達過程にある小児では、被験食品の違いが咀嚼運動に与える影響が大きいことを明らかにした。また、咀嚼運動時の上下の歯の接触滑走範囲に関する顎機能診査方法や、3次元レーザー形状測定装置と下顎運動測定システムを組み合わせた高精度な咬合接触解析システムを開発することによって、形態と咀嚼機能の関連性を求める方法論を確立した。さらに、骨格性要因を含む反対咬合者の下顎運動の動態について正常咬合者の場合との比較を行い、特徴を明らかにした。近年、咀嚼と全身の健康について関係がクローズアップされてきており、科学的な関係解明が急務となっている。食欲を調節する物質に関する研究から、食事は、食欲を満足させるとともに、脳を賦活化することが明らかになってきた。本研究は、咀嚼と全身の健康との関わりを明らかにするために、咀嚼時の感覚入力の変化が、日内リズム、体温調節にいかなる影響を及ぼすか、動物の食行動および体温などをリアルタイムで記録解析する行動実験を行い、それと平行して細胞外液中の物質を透析膜を介して潅流液中に回収する方法であるマイクロダイアリシスを用いて、神経伝達物質の放出量の変化を調べることにより、そのメカニズムを解明することを目的とした。まず、行動実験として、麻酔下で、WKA成熟雄ラットの腹腔内に送信器を埋め込み、術後の回復を確認後、無麻酔無拘束下で、固形飼料と液体飼料、すなわち、咀嚼を伴う飼料と咀嚼を伴わない飼料を与えた場合、の生理的な行動を明暗周期12時間のサーカディアン測定箱内で観察記録し、体温および心拍数について、1回の食事前後で比較検討を行った。その結果、固形飼料群では、摂食行動開始後30分で、体温が有意に上昇してくることがわかった。一方、液体飼料摂取群では、摂食行動開始後15分間は、体温が有意に低下し、摂食駆動開始後30分では、体温の有意な上昇が認められた。

心拍数は、固形飼料摂取群および液体飼料摂取群いずれの群においても、摂食開始後15分間に、増加してくることがわかった。以上のことから、性状の異なる固形飼料と液体飼料は、咀嚼時に異なる口腔内感覚を生じさせ、消化過程や代謝に異なる影響を与える可能性が示唆された。さらに、マイクロダイアリシス法により、サンプリングした脳内神経伝達物質を定量するための測定系の確立を行っている。口腔保健の重要性を考えるに当たり、噛むことの生理学的意義、特に全身機能との係わりに関する新しい解釈と科学的基盤が求められている。本研究は、咀嚼と全身の健康の係わりを明らかにするために、動物実験では、ラットを用いて、咀嚼時の感覚入力の変化が、食事誘導性熱産生や体温の日内リズムにいかなる影響を及ぼすか、サーカディアン測定箱内でリアルタイムで記録解析するとともに、食行動に伴う脳内のドーパミン、セロトニンなどの神経伝達物質の動態変化を、マイクロダイアリシス法を用いて測定解析し、そのメカニズムの解明を試みることにある。さらに、臨床的研究においては、成人と小児に、口腔内感覚入力を変化させる目的で、被験食品として硬度の異なるグミや、ガムを与え、運動出力としての咀嚼時の顎運動がどのように変化するか、顎運動解析装置を用いて比較検討した。動物実験では、固形飼料と粉末飼料は、同一成分にもかかわらず、食事に伴う産熱反応と体温の日内変動に異なった影響を及ぼすことがわかった。食行動にともなう視床下部における神経伝達物質の動態は、現在解析中である。また、臨床的研究に3いては、グミ咀嚼時の切歯点の咀嚼運動範囲および咀嚼周期について、成人と小児で解析を行ったところ、成人と小児の両者において、硬い食品のほうが、軟らかい食品よりも咀嚼経路は大きい傾向を示したが、咀嚼周期については、成人群では食品の硬さによる咀嚼周期の違いは認められず、一方、小児では咀嚼開始直後において、硬い食品の咀嚼周期が軟らかい食品と比較して、長い傾向を示した。以上より、性状の違いによる咀嚼時の口腔内感覚の違いが、消化過程やその後の全身のエネルギー代謝に異なる影響を及ぼす可能性が示唆された。さらに、臨床的研究より、成長に伴い、食品の性状の違いに対応した、効率のよい咀嚼機能を獲得していくことが示唆された。近年、咀嚼と全身の健康に関する話題がクローズアップされてきており、科学的な根拠の実証が急務となっている。本研究は、食行動中に咀嚼による感覚入力が、中枢を介して恒常性維持のためのエネルギー代謝調節等の全身の諸機能にどのように関与しているか検証し、そのメカニズムの解明を試みることが目的である。摂食時の口腔内感覚を変化させる目的で、固形飼料または粉末飼料、通常の固形飼料または低硬度飼料、あるいは、液体飼料など様々な飼料を、離乳食後より正常ラットに与え、飼育した。体重成長曲線を比較すると、成長のスパートを過ぎた頃から、粉末飼料群の体重が固形飼料より小さくなった。内臓脂肪量は、成長期には両群間で有意な差は認められず、体重差が有意になった頃より、粉末飼料群が有意に小さくなった。成長期のラットについて血糖値、肝臓重量/体重百分率を比較すると粉末飼料群が固形飼料群より小さいことがわかった。体重差が有意になった頃には、両群間で血糖値には有意差はなく、粉末飼料群の血中遊離脂肪酸量が小さかった。各飼料で飼育した成長期のラットの体温変化を、摂食、飲水、運動測定装置内で、無麻酔無拘束下で、腹腔内に慢性的に埋入した体温測定用テレメトリーセンサーを用いて測定した。その結果、1日の体温変動について比較すると、明期と暗期の体温変動幅が、粉末飼料飼育群のほうが大きいことがわかった。また、24時間の絶食負荷を与えた場合、暗期の体温減少量が粉末飼料群で大きいことがわかった。
底層性サメ類の成長,繁殖,食性に関する研究

フトツノザメは成長,繁殖,食性を検討した。成長については銚子産,小笠原産,ハンコック海山産に違いがみられた。どの海域も雄の方が雌よりも成長が悪かった。性成熟の大きさも海域間で異なり、雌雄とも銚子産,小笠原産,ハンコック海山産の順となった。成熟年齢も同様に雌雄ともにこの順となった。交尾器長も精巣重量は性成熟の開始と共に急激に増大した。1腹あたりの胎仔数と大型卵巣卵数は親の大きさと共に増加した。成熟の大きさが異なるため、胎仔数と卵数は海域間で異なるが、種としての統一性は保持されているものと推測された。平均大型卵数は胎仔数よりも少なかった。食性についてみると、どの海域でも魚類の出現が高く、次いで頭足類,甲殻類の順となった。しかし、出現種が海域間で異なるため選択性は小さかった。小型ツノザメ類は銚子産の繁殖と食性を調べた。性成熟の大きさや最大体長は雌の方がかなり大きく、性差が著しかった。みかけの胎仔数よりも大型卵巣卵の方が実際の胎仔数を正確に反映していると判断された。胎仔の体長組成,卵径組成から判断して特定の繁殖周期はないものと推測された。食性については3種とも空胃率が著しく高いのが特徴であった。また、胃内容物重量の体重に対する割合はほとんどの場合3%以下であった。3種ともにイカ類と魚類の出現率が高かった。トラザメとニホンヤモリザメは銚子産の繁殖と食性を調べた。成熟の大きさと最大全長は雌雄でほとんど差がみられなかった。トラザメは周年卵殻をもつ雌が存在することから特定の繁殖周期はないものと推測された。2種とも空胃率はきわめて低かった。餌生物に大きな分類単位では重なりは認められるが、組成比が大きく異なること、また下位の分類単位で出現する餌生物が異なるので、両種は食い分けをしているものと推察された。
間葉系幹細胞の破骨細胞分化調節に対するビスフォスフォネートの影響に関する研究

本研究課題では、TNFα刺激による破骨細胞形成に対するヒト骨髄間葉系幹細胞(hMSC)の抑制機構を解明することを目的とした。また、これに対する骨粗鬆症治療薬ビスホスフォネートの影響についても解析した。私たちの結果は、hMSCは破骨細胞形成を抑制することを示し、ビスホスフォネートは、このhMSCの作用を阻害することを示した。以上より、炎症時においてビスフォスフォネートが、hMSCに対して通常の骨粗鬆症治療効果とは異なる作用を持つ可能性を示した。BP関連性顎骨壊死における骨吸収のメカニズムは明らかではない。そこで、BPが、間葉系幹細胞の免疫抑制能を低下させ、細菌感染による過剰な炎症が抑制できない為、炎症誘導性破骨細胞による骨吸収が誘導されているという仮説を検証する。本研究ではヒト骨髄間葉系幹細胞株を用いて、ビスフォスフォネート(BP)関連性顎骨壊死における破骨細胞分化に、骨髄間葉系幹細胞の機能低下が関与しているかどうか検討する。BPが、骨髄間葉系幹細胞の免疫抑制能の低下を介して、炎症性の破骨細胞分化を促進するか明らかにする事を目的とした。破骨細胞に分化する単球系の細胞として、マウス由来RAW264Dを用いた。これをRANKL、TNF-αで分化させ、TRAP染色を行った。また、ヒト骨髄由来間葉系幹細胞(hMSC)と共培養させ、同様にTRAP染色を行った。TRAP陽性かつ多核の細胞を破骨細胞として定量化し、評価した。また遺伝子発現はRT-PCRで解析した。RAW264D細胞は、RANKL及びTNFαの濃度に依存して、破骨細胞へ分化することをTRAP染色により確認した。このRANKL-TNFαによる破骨細胞分化を、hMSCは細胞濃度に依存して抑制した。hMSCによる破骨細胞の分化制御を調べる為に、オステオプロテゲリンやTGFβの発現を調べた結果、TNFα処理によりこれらの遺伝子発現は一過的に誘導された。これらの結果は、炎症性破骨細胞分化に対して、hMSCがOPGなどの発現を介して、調節していることを示唆した。また、ビスフォスフォネートの一種のrisedronateはTNFα-RANKLによる破骨細胞分化を顕著に抑制した。これらの結果は、炎症性サイトカインによる破骨細胞形成をhMSCが制御しうることを示した点で意義が有る。昨年度までに、炎症性破骨細胞分化に対して、間葉系幹細胞がOPGなどの発現を介して、調節している可能性を示した。また、BPの一種のrisedronateはTNFα-RANKLによる破骨細胞分化を顕著に抑制することを示した。当該年度は、以下の結果を得た。BP処理した間葉系細胞は、増殖に影響を受けないが、破骨細胞分化抑制作用を阻害された。さらに、ハイコンテントスクリーニングに使用されるArrayScanを用いて、破骨細胞分化関連転写因子であるNFkappaBやNFATc1が、それぞれ分化刺激15分と2日目で核内へシフトする事を確認した。これに対して間葉系幹細胞は、顕著な抑制作用を示さず、BP処理間葉系幹細胞でも影響は無かった。以上の結果は、BPが間葉系幹細胞の破骨細胞形成抑制作用を阻害する可能性を示した。
気象擾乱による土砂災害から身を守るための現況掌握方法に関する調査・研究

一般市民の立場からどのような情報をどのようにして得られるかを調査した結果,(1)携帯電話向けの気象情報サービスを活用し,最新情報を取得できる態勢をつくる.(2)レーダ雨量で降雨範囲を確認する.(3)アメダス等の地上雨量計で現況と累加雨量を確認する.とくに10分間雨量は,局地的な大雨を掌握する有効な情報となり得る.自治体によっては,ホームページで雨量情報を公開している.ただしこれらの情報を得るには携帯電話やパソコン等により,携帯電話回線やインターネットを利用する必要がある.(4)警報や土砂災害警戒情報,自治体からの避難勧告等を就寝中に知るには,自治体や予報業務許可事業者が提供する携帯電話用のメールサービスが便利.以上のような流れで情報を取得することにより現況を掌握することができた.自治体から発表される避難勧告に対し,実際に避難された人の割合は非常に低い値となっている.被害にあった人の多くは屋外での遭難等によるものであることから,避難経路に小さな河川や水路がある場合には特に注意が必要である.そのため居住地域の状況をよく考えた上で,避難のタイミングを計ることが重要である.浸水被害のみが想定されるのであれば,上層階に避難することも選択肢のひとつと考えられる.局地的大雨や集中豪雨などは夜間に発生することが多いため,住居近隣の浸水状況を掌握するには目視するほかない.現在,浸水状況を知ることができるシステムの設置場所は,岡崎市など一部の地域に限られている.岡崎市では,サイレンの鳴る間隔により浸水の程度がわかるようにしているため,その情報を取得するために住民が環境整備する必要はない.様々な機関で防災に関する情報提供がなされているが,携帯電話回線やインターネット経由により,最新で質の高い気象情報が提供されていること,浸水警報装置が設置されてサイレンにより浸水規模を知らせるということ等,それらを確実に周知することが重要である,今後も行政や自治体等からの周知のみではなく,本校で行っているような防災教育等の多角的なソフト対策が必要である.一般市民の立場からどのような情報をどのようにして得られるかを調査した結果,(1)携帯電話向けの気象情報サービスを活用し,最新情報を取得できる態勢をつくる.(2)レーダ雨量で降雨範囲を確認する.(3)アメダス等の地上雨量計で現況と累加雨量を確認する.とくに10分間雨量は,局地的な大雨を掌握する有効な情報となり得る.自治体によっては,ホームページで雨量情報を公開している.ただしこれらの情報を得るには携帯電話やパソコン等により,携帯電話回線やインターネットを利用する必要がある.(4)警報や土砂災害警戒情報,自治体からの避難勧告等を就寝中に知るには,自治体や予報業務許可事業者が提供する携帯電話用のメールサービスが便利.以上のような流れで情報を取得することにより現況を掌握することができた.自治体から発表される避難勧告に対し,実際に避難された人の割合は非常に低い値となっている.被害にあった人の多くは屋外での遭難等によるものであることから,避難経路に小さな河川や水路がある場合には特に注意が必要である.そのため居住地域の状況をよく考えた上で,避難のタイミングを計ることが重要である.浸水被害のみが想定されるのであれば,上層階に避難することも選択肢のひとつと考えられる.局地的大雨や集中豪雨などは夜間に発生することが多いため,住居近隣の浸水状況を掌握するには目視するほかない.現在,浸水状況を知ることができるシステムの設置場所は,岡崎市など一部の地域に限られている.岡崎市では,サイレンの鳴る間隔により浸水の程度がわかるようにしているため,その情報を取得するために住民が環境整備する必要はない.様々な機関で防災に関する情報提供がなされているが,携帯電話回線やインターネット経由により,最新で質の高い気象情報が提供されていること,浸水警報装置が設置されてサイレンにより浸水規模を知らせるということ等,それらを確実に周知することが重要である,今後も行政や自治体等からの周知のみではなく,本校で行っているような防災教育等の多角的なソフト対策が必要である.
エレクトロインジェクションによる植物細胞への遺伝子導入に関する研究

植物細胞の形質転換法としてはアグロバクテリュウムを用いる方法があるが、本法では本土壌細菌の宿主特異性のためその対象となる植物は主に双子葉植物に限られている。また、プロトプラストを用いた所謂エレクトロポーレーション法があるが、それらでは植物細胞のプロトプラスト化による分化全能性の欠失あるいは長期培養による核・オルガネラゲノムの遺伝的不安定性の増大などの問題がある。このため、どの植物種にも適用できる、プロトプラストを用いない遺伝子導入・形質転換法の開発は植物分子生物学・遺伝子工学上の必須の課題となっている。本研究代表者らはすでにエレクトロインジェクション法(細胞壁を有する植物細胞に電気パルスにより、DNA、RNAを導入・遺伝子発現させる方法)により、酵母生細胞、タバコ葉肉遊離細胞においてそれぞれトランスフォーメーションおよびトランスフェクションに成功している。この結果は細胞壁が必ずしも細胞の遺伝子取り込みの絶対的な障害になるのではなく少なくとも一定状態にある細胞壁はDNA(RNA)分子を通過させることを示している。そこで、本研究ではこのエレクトロインジェクション法による高等植物細胞・組織の形質転換の可能性、また、植物細胞の外来遺伝子取り込みにおける細胞壁の阻害効を定量的に調査し、細胞壁を有する細胞への直接的な遺伝子の導入法開発の基礎の確立を目指した。その結果、培養細胞あるいは植物組織細胞へのプラスミドDNA、ウィルスRNAの電気パルスによる導入・遺伝子発現についてはいままでのところ成功するに至っていないが、プロトプラストを培養して培養初期に形成される細胞壁は細胞の遺伝子取り込みを完全には阻害しないことが見いだされた。本研究の結果から、酵素的または機械的に細胞壁構造を修飾してその多孔性を増大させることにより細胞への遺伝子導入が可能であることが明かとなった。本研究代表者らはすでにエレクトロインジェクション法(細胞壁を有する植物細胞に電気パルスにより, DNA,RNAを導入し,細胞を形質転換する方法)により酵母生細胞および葉肉遊離細胞においてそれぞれトランスフォーメーションおよびトランスフェクションに成功している.周知のように,植物プロトプラストを用いる種々の形質転換法があるが,それらでは植物細胞のプロトプラスト化による分化全能性の欠失あるいは長期培養による遺伝的安定性の欠失などの本質的な問題があり,プロトプラストを用いない形質転換法の開発が強く望まれている.本年度はまず本法による高等植物培養細胞のトランスフェクションおよびトランスフォーメーションについて研究した.トランスフェクションの研究:タバコ,ムラサキハナナ培養細胞およびこれら細胞より単離したプロトプラストを培養して細胞壁形成,細胞分裂させた細胞(プロトプラスト由来細胞)へのタバコモザイクウィルス(TMV)粒子および同RNA,カリフラワーモザイクウィルスDNAなどののエレクトロインジェクションについて研究した.その結果,培養生細胞ではいまのところ成功例はえられていないが,培養3日のプロトプラスト由来細胞ではTMVにおいてプロトプラストと同程度の効率で,トランスフェクションが観察された.トランスフォーメーションの研究:タバコ培養細胞およびプロトプラスト由来細胞を用いて,プラスミドpCaMVCAT(35S-CAT-NOS)によるトランスフォーメーションについて研究した.処理後24時間培養して, CAT(クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ)活性を測定した.その結果,培養2日のプロトプラスト由来細胞ではプロトプラストの約15%のCTA活性が認められたが,培養12日細胞ではCAT活性はほとんどは認められなかった.また,培養生細胞ではこれまでのところ成功例はえられていない.まず、植物組織細胞への遺伝子導入を研究した。ハイブリッドポプラの葉脈切片あるいはヒラナス下胚軸切片(いずれも厚さ300ー500um)は培養2日で茎葉を分化し始め2ー3月で完全な個体を再生することが予備実験により明らかとなっている。そこで、これらの組織片への電気パルスによる遺伝子導入について調べた。

遺伝子としてはカナマイシン抵抗性遺伝子(pKR612b1)あるいはルシフェラーゼ遺伝子(pDO432)を用いた。これらプラスミドDNA存在下で組織片懸濁液に種々の条件の電気パルスを印加した。pKR612b1の導入を試みたハイブリッドポプラについては10ー50ug/mlのカナマイシン存在下で再生個体を得た。それら数個体についてはNPTII活性を調べたが、いずれもマイナスであった。また、pDO432の導入を試みたヒラナス下胚軸切片においてもルシフェラーゼ遺伝子のtransientな発現はいまのところ得られていない。次に、タバコ培養細胞のプロトプラストを培養して、細胞壁を再生させた細胞(プロトプラスト由来細胞)を用いて遺伝子導入における細胞壁の阻害効果について調べた。遺伝子としてはCAT遺伝子をもつプラスミド(pUC8CaMVCAT)を用いた。まず、蛍光顕微鏡観察および走査型電子顕微鏡観察により本タバコプロトプラストは2日以上培養すると細胞壁を形成することまた培養12日では細胞壁の構造がより発達することが分かった。ドットおよびサザンハイブリダイゼーションによりプラスミドDNAの細胞内への取り込みを調べた結果、電気パルスによるその細胞内への"取り込み"は細胞壁の形成が進むと共に増加するとの結果が得られた。他方、CAT活性はプロトプラスト、培養2ー5日、および培養12日プロトプラスト由来細胞でそれぞれ100、10ー15および>3%であった。この結果からハイブリ実験により検出されたプラスミドDNAはおそらく細胞壁マトリックスに吸着されたものと推定された。
がん細胞表面マーカーの探索とバイオナノ粒子による生体内分子標的

独自に開発している細胞表面マーカーDNAマイクロアレイを用いてマウス神経系腫瘍細胞株、ヒトグリオーマ細胞株、ヒト乳がん細胞株の遺伝子発現プロフィールを作成し、球面自己組織化マップを応用して遺伝子のクラスタリング解析を行った結果、それぞれの腫瘍に特異的なマーカー遺伝子の抽出に効率よく成功した。また、乳がん等で高発現が認められるErbB2に対して高親和性を示すペプチドを用いてin vitroおよびin vivoにおいて分子標的能力を示すことができた。がん細胞の表面マーカーを探索する目的で収集した細胞は、マウスの神経芽細胞腫あるいは脳腫瘍に由来する5種類、ヒトグリオーマ(脳腫瘍)に由来する10種類、ヒト乳がんに由来する9種類である。これらの細胞からをtotal RNA抽出するとともに、正常組織のコントロールtotal RNAとしては、市販のマウス正常脳、ヒト胎児および成人正常脳、ヒト成人女性正常乳房に由来するものを利用した。これらのRNAを用いて細胞表面マーカーDNAマイクロアレイに対するハイブリダイゼーションを行い、遺伝子発現プロフィールの作製を試みている。先行しているマウス腫瘍の解析において、球面自己組織化マップを応用して遺伝子発現プロフィールを比較した。その結果、マウス脳腫瘍に特異的なマーカーとして複数の候補を挙げることができた。これらの中には、神経系の細胞増殖に関与しているものが多く含まれているので、今後これらを絞り込み、腫瘍標的の分子マーカーとしていくために、定量的PCRや免疫化学的検証を行っていく。一方で、乳がんなどで過剰発現していることがあるErbB2に対する分子標的をデザインしている。ErbBファミリーのリガンドとしてはEGFファミリーがすでに良く知られているが、ErbB2のリガンドは特定されていない。そこでファージディスプレイにより報告されている12アミノ酸から成るペプチドを用いて、バイオナノ粒子の細胞親和性部分をデザインして、再標的化の検討を始めている。基本的には、バイオナノ粒子の構成単位であるB型肝炎ウイルス表面抗原Lタンパク質の肝細胞親和性領域を、このペプチド配列へ置き換える際に必要なスペーサーとなるペプチドの長さを検討している。現在、最適化されたデザインとして必要な長さのスペーサーをスクリーニングしている。この最適化は、今後得られる標的分子の情報に応用できると考えられる。マウスの神経芽細胞腫あるいは脳腫瘍に由来する5種類、ヒトグリオーマ(脳腫瘍)に由来する10種類、ヒト乳がんに由来する9種類を用いて、これらの細胞から腫瘍マーカーを抽出するためにtotal RNAからcDNAを合成して、細胞表面マーカーDNAマイクロアレイに対するハイブリダイゼーションを行い、遺伝子発現プロフィールの作製を試みた。マイクロアレイから得られた遺伝子発現プロフィールに対して球面自己組織化マップによりクラスタリング解析を行った結果、正常組織のコントロール(マウス正常脳、ヒト胎児および成人正常脳、ヒト成人女性正常乳房)と比較して、それぞれの腫瘍種に共通なマーカーを絞り込む事ができた。これらの結果は定量的PCRや免疫化学的に検証を行っているところであるが、現状ではマイクロアレイの結果を支持できる傾向を示しており、細胞表面マーカーDNAマイクロアレイの有用性と球面自己組織化マップによるクラスタリング解析の妥当性を示す事ができたと考えている。一方で、乳がんなどの既知のマーカーであるErbB2に対する分子標的を行うデザインとしてErbB2に親和性を持つ12アミノ酸のペプチドをバイオナノ粒子の表面に提示して、再標的化の検討を行った。このペプチドは単独では細胞内に取り込まれないが、抗体を提示できるようにデザインされたバイオナノ粒子の表面に抗体定常領域に融合したErbB2親和性ペプチドを提示すると細胞内へ移行する事が観察された。これによりバイオナノ粒子は細胞表面マーカーに対する抗体分子以外のリガンドを提示して分子標的を行うことが可能な有効な担体である事を示すことができた。さらにこれを発展させて、マイクロアレイで特定されたマーカー分子を利用した分子標的への応用を展開していく事が可能になったと考えられる。ヒトグリオーマ(脳腫瘍)に由来する10種類の細胞およびヒト乳がんに由来する9種類を用いて、細胞表面マーカーDNAマイクロアレイに対するハイブリダイゼーションを行い、遺伝子発現プロフィールを作成した。このプロフィールに対して球面自己組織化マップによりクラスタリング解析を行った結果、正常組織のコントロール(マウス正常脳、ヒト胎児および成人正常脳、ヒト成人女性正常乳房)と比較して、それぞれの腫瘍種に共通なマーカーを絞り込み、新しい腫瘍マーカーとして機能する可能性のある候補としてグリオーマではCD44、乳がんではTH9SF2を抽出した。これらの結果は定量的PCRや免疫化学的に検証を行った結果、腫瘍に共通して発現し正常組織では発現が低いことが明らかとなった。これらの分子標的を行うためのリガンドの調製を検討しているが、CD44に関しては、ヒアルロン酸への親和性が高いことから、すでに腫瘍中の新生血管を標的することに成功しているシアル酸と置き換えた方法論により脳腫瘍の分子標的システムを構築している。一方で、既知の腫瘍マーカーであるErbB2に対する分子標的を行うデザインとしてErbB2に親和性を持つ12アミノ酸のペプチドリガンドをバイオナノ粒子の表面に提示して、分子標的を行うために、担癌マウスにおける標的効果を確認した。

ErbB2の発現量が異なる2種類の細胞を移植したマウスへ尾静脈から、ルシフェラーゼと融合したリガンドを注射して、経時的に腫瘍中へ基質を注射すると1時間経過後から腫瘍部位に発光が検出された。発光の強さは細胞の表面に存在するErbB2の量に相関しており、分子標的がin vivoでも可能である事が示された。
光学ポリマー成形の光導波路型局在表面プラズモン共鳴バイオセンサーの研究開発

タンパク質相互作用の高感度な測定法として表面プラズモン共鳴センサーが広く用いられている.しかしこのセンサーは高価(数千万円)で複雑な光学系が必要であり,研究室レベルで特異の技術を持った専門技術者によって初めて検出可能であった.そこで,光学機能の集積化が可能な導波路型表面プラズモン共鳴(WSPR)が最近注目を浴びている.また,我々は微細凹凸を高精度に大量安価に作製することができるインプリント技術を開発している.本研究ではインプリント技術を応用したポリマーによるWSPRセンサーの研究開発を行った.このインプリント技術を用いることで,これまでの複雑な光学系を光集積回路に置き換えて平板上に集積化することにより,小型で簡便な構成を可能にした.この集積回路をインプリント技術によって,ガラス基板上に転写する手法を開発し,光集積回路を安価に製造できる可能性を示すことができた.さらに,センサーチップにターゲットの生体分子を捕捉するための機能膜の開発を行い,機能膜の高密度化によるターゲット分子の捕捉の絶対量の向上と,機能膜の構造を改良することで特定の生体分子のみを捕捉する率の向上を実現した.また,バイオセンサとしての有用性を実証するために,センサーチップの構造の最適設計を行い,インプリント技術を応用して作製し,モデルタンパク質の吸着反応の検出を行った.その際の屈折率分解能は,8.9×10-5[RIU(refractive index unit)]であった.タンパク質相互作用の高感度な測定法として表面プラズモン共鳴センサーが広く用いられている.しかしこのセンサーは高価(数千万円)で複雑な光学系が必要であり,研究室レベルで特異の技術を持った専門技術者によって初めて検出可能であった.そこで,光学機能の集積化が可能な導波路型表面プラズモン共鳴(WSPR)が最近注目を浴びている.また,我々は微細凹凸を高精度に大量安価に作製することができるインプリント技術を開発している.本研究ではインプリント技術を応用したポリマーによるWSPRセンサーの研究開発を行った.このインプリント技術を用いることで,これまでの複雑な光学系を光集積回路に置き換えて平板上に集積化することにより,小型で簡便な構成を可能にした.この集積回路をインプリント技術によって,ガラス基板上に転写する手法を開発し,光集積回路を安価に製造できる可能性を示すことができた.さらに,センサーチップにターゲットの生体分子を捕捉するための機能膜の開発を行い,機能膜の高密度化によるターゲット分子の捕捉の絶対量の向上と,機能膜の構造を改良することで特定の生体分子のみを捕捉する率の向上を実現した.また,バイオセンサとしての有用性を実証するために,センサーチップの構造の最適設計を行い,インプリント技術を応用して作製し,モデルタンパク質の吸着反応の検出を行った.その際の屈折率分解能は,8.9×10-5[RIU(refractive index unit)]であった.生体分子間相互作用の高感度な測定法として表面プラズモン共鳴センサーが広く用いられている.しかし,従来の表面プラズモン共鳴技術では,計測システムに精巧で複雑な光学系などが必要であったり,センサーチップの製作に高いコストが掛かるなどの問題点があった.そこで,これらの問題点を克服するために,光導波路技術や局在表面プラズモン共鳴を取り入れたセンシング技術の開発を行っている.光導波路型表面プラズモン共鳴センサーとして,ポリマーを用いたセンサーチップの製作に成功した.ポリマーのクラッド層に光導波のためのコア形状(3μm×3μm×15mm)の金型を圧着することによって,コア形状の溝を持つクラッド基板を形成した.この溝に屈折率の高いポリマーを封入して,光導波路を組み込んだ.さらに,導波路の上に金薄膜を蒸着することにより,光導波路型表面プラズモンセンサーチップを製作した.このセンサーチップを使うことによって,溶媒の屈折率変化(Δn10^<-2>)を検出することに成功した.また,生体分子間相互作用計測への応用を狙い,局在表面プラズモンの共鳴条件を数値解析によって検討した.光学ガラス(SF-10)表面に銀ナノ粒子を周其目的に配置したモデル系において条件を検討した.その結果,直径60nmの銀ナノ粒子を120nm間隔で配置した場合が適当であるという結果を得た.この場合,純水に接している銀ナノ粒子固定化表面に入射角55°で光を入射すると,500nm付近に共鳴点があった.さらに,銀ナノ粒子固定化表面に厚さ70nm,屈折率1.45の誘電体層を置くと,数10%程度の反射率変化が出力として得られることが分かった.今後,このようなシミュレーションや局在表面プラズモン共鳴センサーの試作を通して,局在表面プラズモン共鳴による生体分子間相互作用センシングの技術開発を進めたい.生体分子間相互作用センサーの表面には,アナライト分子の非特異的吸着性が低いこと,そして受容体分子を失活させずに特異的に固定化するという2つの性質が要請されている.ガラスは,可視域における高い透明性と化学的な安定性から,表面プラズモン共鳴や水晶発振マイクロバランスなどのバイオセンサー表面や,光学顕微鏡の試料支持体として非常に広く使われている材質である.したがって,ガラス表面におけるタンパク質の非特異的吸着の防止,そしてレセプタータンパク質の特異的そして安定な固定化は,これらのバイオセンサー開発にとっては重要な課題である.本研究においては,ガラス表面に対してそれらの2つの性質を付加するための技術開発を行った.3-アミノプロピルジメチルエトキシシラン処理でガラス表面をアミノプロピル化した.

次いで,このガラス表面に導入したアミノ基に直接ポリエチレングリコールを結合するのではなく,そのアミノ基に対してポリアクリル酸を縮合した.このようにしてガラス表面に高密度に導入したカルボキシル基と,アミノ化ポリエチレングリコールを縮合することによって,ガラス表面にポリエチレングリコールを高密度で修飾することに成功した.本研究で調製したガラス表面は,タンパク質の非特異的吸着に対して高い耐性を示すことがわかった.また,ガラス表面を修飾するために,ポリエチレングリコールとビオチン化ポリエチレングリコールを共縮合させることにより,ストレプトアビジンやニュートラアビジンをガラス表面に特異的に固定化することが可能になった.さらにビオチン-アビジン-ビオチン結合を利用することによって,安定に特異的に標的ビオチン化タンパク質をガラス表面に固定化することに成功した.様々なバイオセンサー表面の構築において,本研究で開発した方法は有用である.生体分子間相互作用や媒質の屈折率などを解析する手法として,導波路型表面プラズモン共鳴センサが,光学機能の集積化による小型化が可能であることから注目されている.しかし,主にガラスを材料として用いるため,このセンサチップの作製プロセスは複雑でスループットが低く,高価であり,さらに設計自由度が低いため感度領域の調整を行うことが困難であった,本研究では,今年度,ポリマー材料のセンサチップを用いることで,作製のハイスループット化の達成と感度領域が調整可能であることの実証を行った.詳細を下記に示す.センサチップは次の工程で作製した.(1)露光装置等を用いてパターンを描画し原盤を作製,(2)電鋳技術を用いて原盤と反転パターンを有する金属金型を作製,(3)金型を用いてポリマー樹脂に転写しクラッド構造を作製,(4)クラッド上にコアとなる屈折率が異なるポリマー樹脂を塗布した後,硬化させてコア層を形成,(5)樹脂やガラスなどで基板を封止,(6)最後にセンサ部分を研磨してコア層を剥きだしにする.転写工程では1枚のセンサチップが複数配置されたウェハを数分で作製することができる.スループットは,装置能力やチップの取り数によって変動するが、10K/M以上のハイスループット化が可能となる.さらに,我々は,導波路のコアとクラッドの屈折率を変化させた2種のチップを作製した.このチップによるシミュレーションと実験結果のセンサ出力特性はよく一致している.そして,屈折率分解能は約5.0×10^-33.2×10^-4[RIU(refractive index unit)]で,noise fluctuationは平均約6.0%であった.また,試料の屈折率に応じてポリマー材料を選択することによって,感度領域が容易に調整可能であることも実証している.さらに,我々はこのチップを用いて,溶液中の生体分子(Fibrinogen)の検出にも成功している.
民俗フットボールにおける伝統存続と近代化の受容からみるスポーツの意味変容について

英国に残存する民俗フットボールの存続要因、一方で消滅の危機に直面しているゲームの詳細が明らかになった。そして、残存する民俗フットボールは、近代化を受け入れ、一定変容し存続しながらも、ルールによって制度化された近代スポーツでは味わえない固有の楽しみをもつこと、さらに、担い手は住民であることを再認識させてくれる。スポーツが近代化する中で、ルールや環境などの変化を強いられるが、スポーツそのものの楽しみは変わらない。その楽しみを守り続ける住民の姿は、私たちが現代スポーツの担い手として自覚をもって何をすべきかを考え、そして、スポーツは何のためにするのか自問自答するためのヒントを与えてくれている。まず、ハクシーHaxey(イングランド、リンコリン州Lincolnshire)への調査は2014年1月2日から9日まで現地に出かけ、1月4日に開催されたゲームの観戦・調査にあたった。このゲームは、フードHoodという牛革でできた筒状のものをボールに見立て、ハクシーという町とウェスウッドトサイドWestwoodsideという二つの町が、それぞれの町にあるパブにフードを持ち込むというゲームであった。球状ではないボールを用いるということに加え、ハクシーのゴールは町にある3つのパブがゴールとなっており、片方のチームのゴールが3つあるということが注目すべき特徴であった。ハクシーのプレイヤーたちにとって、自分たちの町にボールを持ち込むことだけではなく、どのパブにゴールをするかが次の争点となり、意味を持つ。それは、日頃どのパブに通い、飲食しているかが重要であり、そのパブ店主との関係の深さで決まるそうである。ゲームのスタート地点から近いパブがこれまで多くのゴール回数を得ていないということがそれを証明している。その他には、委員会組織を持たない、審判がいない、コートや時間の制限もないなど、他の残存する民俗フットボールが有する特徴を持っていることが確認できた。ゲーム開催日近くから酒の消費は驚く量で、ゲーム後も夜明けまでパブ内外で飲み明かしていた。パブがゲームのパトロンであったという歴史を示す一例として貴重なゲームである。次に、著書の出版であるが、2014年1月8日に創文企画から『フットボールの原点』という著書を日本福祉大学の出版助成を受けて出版した。20年近く取り組んできた民俗フットボール研究の中間的まとめとしてサッカーとラグビーの起源と言われるゲームの実態を示し、そして民俗フットボールを通して現在のスポーツを批判的に分析し、これからのスポーツの在り方を検討するということを目的に作業に取り組み、著書にした。当初、未だ訪問せず観戦していないゲームの調査に出かける予定であったが、残存する民俗フットボールの中でも知名度の高い二つのゲームの委員会から、ゲームの情報提供の申し出を受け、また来賓扱いで貴重なセレモニーへの招待を受けたことから、今年度の計画を次年度に回し、その二つのゲームの観戦に出かけることにした。2012年12月に、まずカークウォールに出かけ、Ba'と呼ばれる民俗フットボールを観戦(1月1日に開催)し、ゲームの委員会のチェアマンのBobby Leslie氏にインタビューを行い、貴重な議事録も入手した。その後、エジンバラ大学のスコットランド研究所および付属図書館に出かけ文献探索をした。ロンドンでは、ウェンブリー・スタジアム内のフットボールミュージアムを訪れ、サッカーの歴史がどのように残されているか確認した。さらにハロー校にも訪問し、校内のゲーム開催場所に案内してもらい、ゲームの解説も聞くことができた。次に、2013年2月にアッシュボーンを訪問し、そこに残存するRyalShrovetide Footballのゲーム前に実施され、ゲームを支える一大イベントである昼餐会(約600名が参加)に招待客として出席した。そこでは、ゲームの委員会の広報担当のMaichel Betteridge氏の手配により、委員会のチェアマンほか、町の著名人、カウシルのメンバー、ボールを投入する人物、ボールのペインターなどの人物、そして地元の歴史家のLindsey Petter氏とも面会することができ、ゲームについての情報を入手することができた。ゲームの記録はもとより、招待客として地元の人たちからの心遣いにより、これまで知り得なかったゲームの姿や情報得、記録に残すことができた。この二か所への訪問は、それまでの研究の中で、不明であったことや疑問であったことが解明され、貴重な調査となった。今年度は残されたハラトンとコーフキャッスルの2か所に加え、確認のためにセント・コラム・メジャーに出かけ、調査を行った。まず、レスター州に位置するハラトンのゲームは、ボトル・キッキングと呼ばれ、小さなビア樽をボール代わりにして行われるユニークなゲームである。毎年イースター・マンデーにゲームは開催され、ゲームの前にパレードが行われ、その最後に観客にウサギの肉で作れたパイが投げ与えられる。ゲーム後勝者はビア樽の栓を開け、中のビールをチームのメンバーに振る舞う。他のゲームと同じくスクラムを組んで激しくビア樽を奪い合いながらゴールへと徐々に進んでいく。ハラトン村と隣村のメドボーンの間で異なる3つのビア樽が用意され