hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
酸化ストレスタンパク質MSP23の構造と機能

この1-2年間に20以上のMSP23構造類似タンパクがクローニングされ、種を超えたタンパクファミリーの存在が明らかになり、過酸化物を還元するパーオキシターゼ活性からperoxiredoxinという呼称が提案されている。高等動物においても数種類のMSP23のアイソフォームがクローニングされている。MSP23の構造と機能に関して、本年度は次のような知見を得た。(1)ラット肝より、抗MSP23ウサギ血清を指標として、ラット胆MSP23タンパクを効率良く精製する方法を確立した。本タンパク質は、胆ホモジェネートの可溶性画分の総タンパク質の0.4%にあたると推定した。本精製タンパク質は、イ-スト、脳において報告されているチオール特異的抗酸化タンパク質(TSA: MSP23と約75%構造類似)と同様に、ジチオスレイトールの自動酸化により産生する活性酸素から、タンパク質(グルタミン合成酵素)を保護する作用があることを確認した。(投稿準備中)(2)MSP23の抗血清を用いて、MSP23タンパクがほとんどの組織に発現している事を明らかにした。さらに、本抗血清がMSP23アイソフォームと交差することを明らかにした。ミトコンドリア型のMER5と赤血球に発現しているNKEFタンパク質をSDS-PAGE上で同定し、両タンパク質の組織特異的発現を明らかにした。(投稿準備中)(3)血管構成細胞におけるMSP23の発現調節を抗血清を用いて調べた(ロンドン大キングスカレッジDr.Mannとの共同研究)。ヒト臍帯動脈の平滑筋細胞において、ジエチルマレイン酸と過酸化水素によってMSP23様タンパク質の誘導を確認した。ヒトには、本タンパク質と95.5%共通のPAGタンパク質と93.5%共通のNKEF Aタンパク質が存在しており、本抗体と交差すると考えられる。また、ラット大動脈平滑筋細胞では、カドミウムがMSP23タンパクを強く誘導した。以上のように、血管平滑筋細胞においてもMSP23様タンパク質が発現し、抗酸化的役割を果していると考えられる。(英国生理学会発表;投稿準備中)この1-2年間に20以上のMSP23構造類似タンパクがクローニングされ、種を超えたタンパクファミリーの存在が明らかになり、過酸化物を還元するパーオキシターゼ活性からperoxiredoxinという呼称が提案されている。(英国生理学会発表;投稿準備中)
一日一定時間に限った運動負荷による体温日内変動の修飾

本研究は、一日の内一定時間のみ限定した運動の繰り返しにより、ラットの自発行動および深部体温の日内変動パターンがいかに変化するかを検討することを第一の目的とした。次いで、運動鍛練がラットの体温調節機能をいかに修飾するか検討した。ラットにストレスを与えないよう、運動負荷として自発輪回し運動を利用し、以下の成果を得た。1.輪付きケージでラットを飼育し、自由に輪回し行動を行わせた後、ラットの自発輪回し運動を暗期の前半または後半の3時間あるいは6時間のみに制限した。12日間の運動制限期間後、ラットを再度自由に輪回し運動ができる条件下におくと、ラットの輪回し運動はかつて輪回し行動ができた時間帯で増加した。2.腹腔内に深部体温測定用のテレメトリー送信機を植え込んだラットに暗期の後半の6時間のみ輪回し行動を許した。3週間の運動期間後、ラットを輪回し運動が出来ない条件下においた。ラットの深部体温は暗期の後半に上昇したが、自発行動量は有意に変化しなかった。3.ラットを輪付きケージで12週間以上飼育すると、安静時運動群の深部体温が上昇し、体温調節反応発現いき値が高くなる傾向にあった。また、腹腔内からの温熱負荷に対し、深部体温の上昇は抑えられ、非蒸散生熱放散量の増加程度が大きくなった。かくのごとく、ラットの輪回し行動を一日の内一定時間帯に限定し、これに馴らすと、運動時間帯に対する記憶が形成され、かつての運動時間帯に一致して深部体温が上昇することが確認された。また、自発輪回し行動による運動鍛練によりラットの体温のセットポイントは上昇し、体内からの温熱負荷に対する体温調節反応は促進されることが示唆された。本年度は、一日の内一定時間のみ限定した運動負荷の繰り返しにより、ラットの自発行動および深部体温の日内変動パターンがいかに変化するか検討した。ハンドリングやケージの移動によるストレスを避けるため運動負荷としてラットの自発輪回し行動を利用した。1.輪付きケージでラットを飼育し、自由に輪回し行動を行わせた後、ラットを以下の群に分けた。(1)暗期の前半の3時間あるいは6時間、または、暗期後半の3時間あるいは6時間のみ輪回し行動ができる運動制限群、(2)自由に運動できる自由運動群、(3)運動できない非運動群。12日間の運動制限期間後、ラットを再度自由に輪回し運動ができる条件下においた。運動制限群では、かつての輪回し行動ができた時間帯の活動量が運動制限期間前に比し有意に増加したが、他群の輪回し行動量には運動制限期間前後で差はなかった。2.ラットの腹腔内に深部体温測定用のテレメトリー送信機を植え込み、深部体温の日内変動が安定した後、ラット以下の3群に分けた。(1)暗期の後半6時間のみ輪回し行動ができる運動制限群、(2)自由運動群、(3)非運動群。3週間の運動期間後、運動制限群では暗期後半の深部体温が運動期間前に比し有意に上昇した。他の2群には同様の差異は観察されなかった。かくのごとく、ラットの輪回し行動を一日の内一定時間帯に限定し、これに馴らすと、輪回し行動および深部体温の日内変動パターンがおよび変化し、かっての運動時間帯に一致して自発行動量が増加し深部体温が上昇することが確認された。以上から、ラットでは一定時間帯に限定った運動負荷の繰り返しにより、運動時間帯に対する記憶が形成される可能性が示唆された。本年度は、自発輪回し行動による運動鍛練がラット体温調節反応をいかに修飾するか検討し、以下の成果を得た。

1.ウイスター系雌ラットを環境温24°C、明暗周期12:12時間、自由摂食摂水下、輪付きケージで12週間以上飼育した。この間、運動群には自発運動を許し、対照群は輪回し行動を行わせなかった。これら2群につき、静脈内に慢性的に植え込んだ水灌流型サーモードにより、深部体温を上昇あるいは下降させ、皮膚血管拡張反応発現時および熱産生上昇時の閾値体温を決定した。安静時、運動群の深部体温は対照群に比し有意に高かった。体温調節反応発現閾値は運動群で高い傾向にあった。2.上述実験と同様な方法で、ラットを運動群と対照群に分けた。ラットを直接熱量計内に入れ、腹腔内に慢性的に植え込んだ電熱器により加温、あるいは、熱量計内温を徐々に上昇させた。腹腔内加温中、運動群の深部体温の上昇程度は対照群比し有意に小さく、非蒸散性熱放散量の増加程度は有意に大きかった。しかし、環境温の上昇時、運動群の深部体温の上昇程度は対照群比し有意に大きかった。3.以上から、自発輪回し行動による運動鍛練によりラットの体温のセットポイントが上昇することが示唆された。また、運動鍛練動物では体内からの温熱負荷に対する体温調節反応は促進されるが、環境温上昇に対する体温調節反応は抑制されると推察された。本方法で運動鍛練したラットは手術侵襲に対し極めて脆弱で、術後半数近くが死亡した。このため、当該年度中に予定していた輪回し行動を一日の内一定時間帯に限る様式で運動鍛練したラットの体温調節反応は検討できなかった。今後、運動鍛練方法の見直しや術式の改善を行い、運動鍛練が体温調節機能に及ぼす効果につき更になる検討を望んでいる。
拡張係数の測定法の開発

本研究では、ある液体が他の液体の表面上に形成するレンズの厚さを測定し、それより拡張係数を算出することを意図している。この目的のために代表者らはレーザー光の干渉を利用した3種の異なる厚さ測定法を考案し、それぞれについてその実現性を検討した。1.レンズ表面へのレーザービームの入射角を連続的に変化させ、レンズ上下面での反射光の干渉に伴う総反射強度の変動を検知するという方法については、レーザーとフォトセルをパンタグラフ機構上に設置した装置を試作し、ガラス薄板及び水面上のデカンのレンズを対象として厚さの測定を行なった。ガラス薄板については極めて高精度の測定が可能であったが、デカンのレンズについては、その表面の微小な振動のために測定な困難となる場合があった。本測定法では瞬時の測定が不可能なため、振動を伴うことの多い液体レンズの厚さ測定への適用性はかなり限定されることが判明した。2.ビームエキスパンダを介してレーザービームを一旦広げ、更に凸レンズにより液膜表面に焦点を結ぶように入射させ、反射光によって作られる干渉縞よりレンズ厚さを測定するという方法についても、上と同様の検討を行なった。固体薄板,液体レンズのいずれについても十分な適用性があることを確認した。3.ピンホールを通してレンズ表面に垂直にタングステンランプの光を入射させ、その反射光を分光して得られる干渉縞よりレンズの厚さを算出するという方法については、固体薄板を対象に検討を行ない、本測定法が可能であることを確認したが、現在のところその精度は上記2方法に及ばない。以上の検討の結果、液体レンズの厚さ測定のためには第2の方法が最も優れているとの結論に達した。
細菌のカチオン輸送系の構造と機能の研究

Vibrioのゲノムに書き込まれた数多くの機能未知の膜タンパク質の役割はなんであるのか。Vibrioの細胞内pH調節を行っているK+/H+antiporterをコードする遺伝子はなんなのか。Vibrioの細胞内Ca^<2+>濃度は低く保たれているのか。低く保たれているならば、その仕組みはなんなのか。VibrioのPhaシステム、NhaP2、Fku、Trk、Ktrはどのような機能と役割をVibrioの中で担っているのか。このような疑問に対して答えを探し、その一端が明らかとなった。細菌のK+輸送系を主に、その構造と機能を明らかにする。本年度は、腸炎ビブリオのK^+H^+antiporterであるKhaV(NhaP2)についての解析、および大腸菌のcation/H^+antiporterであるChaAついての解析を進めた。KhaVに関しては、まず生理的役割を解析するため、野生型(AQ3334株)のKhaV遺伝子の機能欠失変異株を作製し、中性もしくはアルカリpH(7.3もしくは8.7)、および高濃度のKC1もしくはショ糖存在化での生育を比較した。その結果、アルカリ条件下(pH8.7)において、200mM以上のKC1存在化では変異株の生育が野生型と比較して顕著に阻害される事が明らかとなった。一方、400mMのショ糖存在化では生育の差は見られなかった事から、腸炎ビブリオにおいてKhaVは浸透圧ストレスへの適応には関与せず、むしろK^+排出に重要な役割を持つ事が示唆された。一方、ChaAに関しては、構造上の知見を得るためトポロジー解析に着手した。Hydrophilicityplotで予測されたChaAの11個の疎水性領域(TM)をC-末端側から一つずつ削ったクローンを作製し、これらにアルカリファスファターゼ(PhoA)もしくはGFPをコードする遺伝子をin frameで融合させたconstructを作製した。また、TMに挟まれた親水性領域が比較的長い場合は複数箇所でリポーター遺伝子と融合するようなものも作製し、合計19個のconstructを作製し、大腸菌に導入した。今後はPhoA活性を指標にペリプラズム側を向いているTMを、またGFPの蛍光強度を指標に細胞質側を向いているTMを検出し、それぞれの疎水性領域の膜トポロジーを解析していく予定である。光合成細菌であるシアノバクラリアの中でも好塩性が強い細菌であるAphanothece halophyticaには、Na^+/H^+交換輸送活性あるNapA1-1,NapA1-2,NhaP1などの膜タンパク質の存在を報告してきた。この細菌のゲノムを調べると、窒素固定細菌のPhaシスラムと相同性があるクラスター遺伝子(Ap-mrpCD1D2EFGAB)が見つかる。PhaシステムはK^+排出活性がある膜タンパク質をコードする遺伝子群として報告されたが、Phaシスラムと相同性がある窒素固定細菌以外の活性は主にNa^+排出活性があることが報告されている。今回、好塩性シアノバクテリアA.halophyticaの上記遺伝子をクローニングして、その活性を、3種類の交換輸送系を欠損させ、Na^+、Li^+、K^+の排出活性が弱い変異株TO114に遺伝子導入し、そのイオン輸送活性を測定した。反転膜小胞の結果、この遺伝子群はNa^+/H^+あるいはK^+/H^+交換活性があるが、K^+/H^+交換活性が無いことが示され、この結果から導かれるように、TO114のNa^+あるいはLi^+感受性を部分的に補い、NaClやLiClを加えた培地でTO114を生育できるようにさせた。好塩性が弱い、通常のシアノバクテリア(Synechococcus sp.PCC7942)にもA.halophyticaと同様にmrpCDEFGABが見つかる。この株のmrpAをノックアウトしたところ、野生株と比較して生育に対してNa^+感受性が増し、さらに、光合成を行う能力に対するNa^+の阻害効果が増大した。以上の結果から、シアノバクテリアのmrp遺伝子群はNa^+排出活性を担っている膜タンパク質をコードしていることが示された。今後は、NapA1-1,NapA1-2,NhaP1などはたった一つの膜タンパク質でNa^+排出活性があるのに対して、MrpCD1D2EFGABは何故8種類もの数多くの膜タンパク質が存在する必要があるのか検討する。大腸菌のChaAは細胞内からNa^+ばかりではなくK^+をもH^+と交換でそれぞれのイオンの濃度勾配に逆らって排出するアンチポーターである(Na^+, K^+/H^+ antiporter)。今回、ChaAのイオン輸送活性に重要な役割を担うと推定される、膜貫通領域に存在する酸性アミノ酸に部位特異的変異を導入してその役割を検討した。ChaAの第3膜貫通領域にはGlu-85が、第10膜貫通領域にはGlu-325が存在すると推定できる。

部位特異的変異導入実験の結果、85番目のグルタミン酸は機能に重要であるが、325番目のグルタミン酸は重要では無いことがわかった。今後は、85番目のグルタミン酸はNa^+やK^+を輸送する部位を構成しているのか、それともH^+と共役する部位なのか明らかにしたい。Na^+/H^+ antiporterNhaAの3次元構造解析がpH4で決定されたが、依然として、NhaAの何処をNa^+とH^+は輸送されるのか明確な答えは得られていない。本研究は、NhaAよりもChaAは基質特異性が広いので、膜貫通領域の酸性アミノ酸の変異が基質特異性の変化を起こすのか、それともH^+とのカップリングに影響するのか検討することにより、カチオンアンチポーターのイオン輸送ルートがNa^+(K^+)とH^+で別に2ルートあるのか、それとも同じ場所を共有しているのかという、まだ答えが得られていない疑問に対して答えることができると考えている。もし別にあるならば、それが何処であるのか調べる必要がある。細菌は一般的に言って、カチオン輸送系に相同性があるタンパク質は、糖やアミノ酸の輸送系よりも数が多い。しかしながら、カチオン輸送系に相同性があるタンパク質の大多数に関して、細胞内での機能の解明は今後の研究に残されている。ヒトの細胞内pHはどのように調節されているのか、その仕組みはわかっていない。Na^+/HCO_3^+共輸送系は細胞内pH調節に働いているし、Na^+/H^+交換輸送系NHEは調節済みの細胞内pHを外部刺激によってアルカリ化することができる。このように、ヒトの細胞内のpHは都合の良い値に調節されているが、どのように調節されているのかその仕組みは明確とは言えない。ヒトの細胞の生存には、厳密な外部pHの調整が要求されるので、外部pHを変動させて内部pHがどうなるのかという実験することは困難である。大腸菌やVibrioのような細菌は、外部pHが6から9まで生育することができる。そのような利点が細菌にはあるが、細菌の細胞内pHがどのように調節されているのか、依然として明確にはなっていない。大腸菌においてはNa^+/H^+交換輸送系NhaAが細胞内pHを酸性化して調節しているという考えもあるが、NhaAは誘導系タンパク質であり、nhaAを欠損させた変異株でも細胞内pHは調節されるので、その考えは間違っている。それでは何が中性付近で生育する細菌の細胞内pHを調節しているのかと言えば、我々は(1)最初に、電子伝達系が細胞内pHをアルカリ化している。(2)細胞内pHが7.5よりもアルカリ化すると細胞内からK^+が漏れ、K^+と1:1の交換比率でH^+が取り込まれ酸性に戻され、細胞内pHは調節されている。このように考えると良いという報告はしているが、残念ながらこれまでK^+/H^+交換輸送を行う膜タンパク質をコードする遺伝子は見つかっていなかった。数年前、我々はNhaP2というK^+の濃度勾配に逆らって排出する起電的なK^+/H^+交換輸送を見つけた。本年度は、(i)NhaP2は細胞内pHの調節系ではないこと。(ii)細胞内pHを調節するK^+/H^+交換輸送を見つけたいとして実験を進めた。
オキシトシン受容体の脳神経科学的エビデンスに基づく新規アゴニストの探索

オキシトシンーオキシトシン受容体(OXT-OXTR)は向社会行動に深くかかわり自閉症スペクトラム、不安障害、うつ病、健忘症、肥満症、糖尿病等の予防、改善などの効果が報告されている。特に精神疾患を抱える患者の数は近年大幅に増加しており、OXT-OXTRが精神・神経疾患の発症メカニズムあるいは治療、予防にどのようにかかわるかを明らかにすることが極めて重要である。オキシトシンは、1)類縁体のバソプレシンと相反する作用をもっており、かつそれぞれの受容体とのクロストークがある2)体内半減期が短い3)血液脳関門の透過効率が低いといった、問題点がある。そこで本研究では食品や植物など天然化合物または化合物ライブラリーからOXTRを活性化するOXTを超えるOXTRアゴニストをスクリーニング、同定することを着想した。まずは、既存のTGFαshedding assyを応用してOXTRアゴニストスクリーニングアッセイを構築する。次に天然物、あるいは化合物ライブラリーをスクリーニングしOXTRアゴニスト候補物を得る。得られた候補化合物を自閉症モデルマウスに投与し向社会行動テストを行いその効果を明らかにする。一方で神経活動依存的に蛍光発色するアデノ随伴ウイルスAAV-eSARE-Tdtomato、さらに得られた候補化合物を自閉症モデルマウスに投与し向社会行動テストを行いその効果を明らかにする。OXTR発現神経細胞が活性化すると蛍光発色するアデノ随伴ウイルスAAV- eSARE- FLEX-Tdtomatoを構築し向社会性行動刺激によって活性化するOXTR発現神経細胞の神経回路を明らかにし、得られた候補化合物が明らかにした神経回路を活性化するか否かを検証する。東北大学所有の化合物ライブラリー6000種、東京大学創薬機構所有のin silicoでGPCRと結合することが予想される化合物ライブラリー5400種、キリン株式会社から提供された果汁抽出物30種、岩手大学農学部所有の天然物ライブラリー770種について3次スクリーニングまで行った。その結果東京大学創薬機構由来の2種の候補化合物を得た。外側中核の向社会行動刺激特異的に活性化するOXTR発現神経細胞の存在を明らかにし、かつその投射先が海馬CA1であること、GABA作動性であることを明らかにした。代表的な向社会行動である母マウスによる養育行動が行われる際にも外側中核のOXTR発現神経細胞の活性化がおこることを明らかにした。またその細胞はGABA作動性であることを明らかにした。候補化合物について詳細に解析する。濃度依存性をshedding assayで確認後、OXTRへ結合活性を、luciferase assay,カルシウムアッセイ、バインディングアッセイで確認するまた、OXTRアンタゴニストに対する反応性、OXTRへの結合バソプレシン受容体V1aR, V1bRに対する結合性についてもshedding assayで確認を行う。自閉症モデルマウスであるVPA投与マウスにオキシトシンを投与すると社会性の改善が見らえる。そこで、候補化合物をVPA投与マウスに投与し、社会行動を測定する行動テストである3 chambertest, open field test, marble barry testを行いその改善効果を検討する。ヒトの研究においてオキシトシンーオキシトシン受容体(OXT-OXTR)は向社会行動に深くかかわり、自閉症スペクトラム、不安障害、うつ病、健忘症、肥満症、糖尿病等の予防、改善などの効果が報告されている。特に精神疾患をかかえる患者の数は近年大幅に増加しておりOXT-OXTRが精神・神経疾患の発症のメカニズムあるいは治療,予防にどのように関わるかを明らかにすることが極めて重要である。本研究では、まず、第一に食品や植物など天然化合物または化合物ライブラリーからOXTRを活性化するOXTを超える安全なOXTアゴニストをスクリーニング、同定することを着想し、OXTRアゴニストスクリーニングアッセイを構築した。東北大学所有の化合物ライブラリー6000種、東京大学所有の化合物ライブラリー2000種、キリン株式会社から果汁抽出物30種、岩手大学農学部・木村賢一教授所有の天然物ライブラリー770種についての1次スクリーニングをおこなった。次に自閉症モデルマウスに対するOXT-OXTRの作用機序を明らかにし、得られた新規アゴニストの作用をin vivoで評価する系を作成することを目指した。さらに神経活動依存遺伝子Arcのエンハンサー領域と最小プロモーター領域を融合させた人工プロモーターと蛍光タンパク質Tdtomatoを組み込んだウイルスベクター(pAAV-eSARE-Tdtomato)を構築しOXTR発現を可視化できる遺伝子改変マウス(OXTR-Venus)に感染させ社会行動の刺激を与えた際にどのOXTR神経回路が活性化するかを脳の3Dマッピングにより明らかにすることをめざした。OXTアゴニストスクリーニングの結果、東北大学所有の化合物ライブラリー6000種、キリン株式会社ら果汁抽出物30種、岩手大学農学部・木村賢一教授所有の天然物ライブラリー770種、東京大学所有の化合物ライブラリー5040種を1次スクリーニングした結果、化合物ライブラリーから29種の候補化合物を得た。今後これらについて再現性をとるとともに特異性、濃度依存性を解析する。自閉症モデルマウスは妊娠14.5日の母親マウスにバルプロ酸を腹腔内投与し、生まれたマウスをモデルマウスとした。新生児の鳴き声(Ultrasonic vocalization:USV)測定,向社会行動を反映する3chamber試験を行い作成したマウスが自閉症様行動を示すことを明らかにした。このマウスの脳内のOXTR発現細胞のみに人工受容体DREADDを発現させた。薬剤CNOを腹腔内投与することでOXTR発現細胞を活性化しその自閉症様行動を改善することを明らかにした。

改善効果は扁桃体、外側中隔のOXTRが重要であることも明らかにした。pAAV-eSARE-Tdtomatoベクターを構築し、ウイルス化し、OXTR発現を可視化できる遺伝子改変マウス(OXTR-Venus)に感染させ社会行動の刺激を与えた際にどのOXTR神経回路が活性化するかを脳の3Dマッピングにより明らかにすることをめざした。現在、共同研究者のペンシルバニア州立大学Yongsoo Kim博士にサンプルを送り3Dマッピング解析を依頼中である。オキシトシンーオキシトシン受容体(OXT-OXTR)は向社会行動に深くかかわり自閉症スペクトラム、不安障害、うつ病、健忘症、肥満症、糖尿病等の予防、改善などの効果が報告されている。特に精神疾患を抱える患者の数は近年大幅に増加しており、OXT-OXTRが精神・神経疾患の発症メカニズムあるいは治療、予防にどのようにかかわるかを明らかにすることが極めて重要である。オキシトシンは、1)類縁体のバソプレシンと相反する作用をもっており、かつそれぞれの受容体とのクロストークがある2)体内半減期が短い3)血液脳関門の透過効率が低いといった、問題点がある。そこで本研究では食品や植物など天然化合物または化合物ライブラリーからOXTRを活性化するOXTを超えるOXTRアゴニストをスクリーニング、同定することを着想した。まずは、既存のTGFαshedding assyを応用してOXTRアゴニストスクリーニングアッセイを構築する。次に天然物、あるいは化合物ライブラリーをスクリーニングしOXTRアゴニスト候補物を得る。得られた候補化合物を自閉症モデルマウスに投与し向社会行動テストを行いその効果を明らかにする。一方で神経活動依存的に蛍光発色するアデノ随伴ウイルスAAV-eSARE-Tdtomato、さらに得られた候補化合物を自閉症モデルマウスに投与し向社会行動テストを行いその効果を明らかにする。OXTR発現神経細胞が活性化すると蛍光発色するアデノ随伴ウイルスAAV- eSARE- FLEX-Tdtomatoを構築し向社会性行動刺激によって活性化するOXTR発現神経細胞の神経回路を明らかにし、得られた候補化合物が明らかにした神経回路を活性化するか否かを検証する。東北大学所有の化合物ライブラリー6000種、東京大学創薬機構所有のin silicoでGPCRと結合することが予想される化合物ライブラリー5400種、キリン株式会社から提供された果汁抽出物30種、岩手大学農学部所有の天然物ライブラリー770種について3次スクリーニングまで行った。その結果東京大学創薬機構由来の2種の候補化合物を得た。外側中核の向社会行動刺激特異的に活性化するOXTR
各種疾患において出現する破骨細胞様多核細胞の形質と形成機構の解明

色素性絨毛結節性滑膜炎における多核巨細胞に免疫組織化学的にCD51(ヴィトロネクチンリセプター)、c-src、TRAP(Tartrate-Resistant Acidic Phosphatase)、MMP-9(Matrix Metalloproteinase 9)が陽性であった。これらの蛋白質は、正常の破骨細胞に比較的特異的に発現する形質であり、今回の研究結果より色素性絨毛結節性滑膜炎における多核巨細胞は正常の破骨細胞と同一の形質を発現しており、その破骨細胞様の性質が明らかとなった。また、破骨細胞の分化に必須と考えられる因子であるRANKL(Receptor activator of NF-kappaB ligand)が免疫組織化学的に多核巨細胞の周囲の細胞に弱陽性で、多核巨細胞には陰性であったことより、色素性絨毛結節性滑膜炎の多核巨細胞の分化・成熟に正常の破骨細胞の分化・成熟と同様のRANK-RANKLsystemが存在することが示唆された。また、多核巨細胞の周囲の細胞には、c-fos及びPCNA蛋白質が陽性であったことから、これらの細胞のその増殖性と増殖因子の関連が示唆された。これらの蛋白質の発現を免疫組織化学的に証明したのは我々の研究が始めてだと思われます。今回の研究によって、色素性絨毛結節性滑膜炎における多核巨細胞は、正常の破骨細胞の分化と同様にRANKLによって分化することが示唆され正常の破骨細胞と同様の形質を有することが示されました。
黄砂の変質による吸湿特性の変化と、その光散乱・雲生成への影響についての研究

2008年から2009年の春季に、石川県宝達山、福岡などにて黄砂粒子を採取し電子顕微鏡(TEM,SEM)を用いて分析した。内部混合した黄砂粒子の割合は、約23-93%であり黄砂イベント毎に大きな変化がみられた。変質の主因は大気汚染物質であることが示唆された。変質した黄砂粒子は、高湿度において、液滴に変化することがわかった。人工粒子を用いた化学反応実験から、鉱物中の炭酸カルシウムは二酸化イオウとは反応しにくく、主に気体硝酸との化学反応により水溶性成分が生成されることが示唆された。光散乱式パーティクルカウンター(OPC)とライダーによる測定から、黄砂の散乱光強度は非球形性に大きく影響されること、黄砂の偏光解消度は、粒径に依存することが示唆された。1.サンプルの採取10月に石川県宝達山にて、試験的なサンプル採取を行った。2月に自動インパクター、OPC,SO2計、フィルターサンプラーなどの機材を山麓に設置し、連続サンプリングを行うと同時に、粒径分布などの関連データの連続測定を行った。3月に道路の除雪が終わるのを待って、機材を山頂に移設しサンプル採取及び関連データの測定を開始した(5月まで続けた)。2.電子顕微鏡を用いた分析宝達山、つくばで採取した大気エアロゾルや人工降雨実験用のマイクロパウダーなどを用いて、形態観察、EDX分析及び水透析を行った。これらの分析方法についての技術は確立された。3.等圧法による分析文献調査を行ない、NaCl水溶液を用いることなどを決めた。また、既存の顕微鏡のレンズ深度が浅いため、これに合わせて湿度調整チャンバーを設計、製作した。4.人工黄砂による実験実験システムの整備を行った。サンプル粒子を酸性気体と反応させるためのチャンバーを製作した。パイレックスガラス製で容積は約15リットルの球形チャンバーである。人工黄砂粒子の発生方法については、フィルターの下から空気を噴出すことによって舞い上がらせる方法を検討し、実験を行った。雲活性の特性を調べるための熱拡散チャンバーについては、既存の装置を修理し、必要な部品の製作を行った。サンプル空気の湿度調整については、バブリングと流量調製による方法では、高い湿度に調整することが難しいことがわかったので、来年度加湿チューブを整備することとした。平成20年2月末から石川県宝達山麓の石川県立大学付属農場において、エアロゾル粒径分布などの関連項目の試験観測を開始、同3月末からは宝達山頂にて黄砂粒子サンプル採取と関連項目の測定を開始し、5月中旬まで続けた。期間中大きな黄砂イベントはなく、弱い黄砂が観測されたのみであった。このため、平成20年の春季は、道路除雪を待たずにサンプル採取を開始した。また、積雪前(11月)に物置部品を山頂に保管しておいて、雪解け前の2月中旬に機材を人力で運び上げて、再びサンプル採取を開始した。3月中旬に比較的強い黄砂イベントがあり、サンプルが得られた。今後、平成21年6月まで続けてから撤収する予定である。採取したサンプルを用いて、水透析前後の形態観察とEDXによる元素組成分析を行った。黄砂粒子の約半数が水溶性成分を含んでいた。水溶性物質の体積混合率と含有元素組成の間に関係が見られ、最も混合率が高い水溶性成分は硫酸塩または硫酸であると示唆された。また、黄砂の濃度が高いときは、相対的に水溶性成分が少なくなるため、内部混合粒子の比率が低くなることが示唆された。また、降水の成分分析から、黄砂粒子やフライアッシュなど、大陸域が発生源と思われる不溶性成分が宝達山頂における降水に取り込まれていることが示された。等圧法で湿度による膨張特性を測定することを試みたところ、電子顕微鏡による分析結果と相反して、吸湿膨張は全く見られなかった。現在の機器での気密レベルでは、検出することは難しく、今後、完全な気密性を確保するため装置を改良する。平成21年3月及び4月に、つくば、福岡、石川県宝達山において黄砂サンプルを採取した。電子顕微鏡で分析した結果、黄砂粒子には、珪素、アルミニウム等を主成分とする粒子とカルシウムを主成分とする粒子が存在した。このうち珪素を主成分とするものは、従来から考えられているような不規則形状が多かったが、カルシウムを主成分とするものの多くは、球形、または結晶形を示し、液滴として空気中に存在したことが示唆された。宝達山頂で採取した降水試料を化学分析、および不溶性粒子(濾過残渣)の観察を行った。

その結果、降水には鉱物由来の粒子に加えて、生物由来の粒子(花粉と思われる)、燃焼過程を経て生成した粒子が共存していたことが推測された。人工発生させたカルシウム粒子、及び標準黄砂粒子を実験的に変質させることを試みた。高濃度の二酸化硫黄に曝露した結果、変質はほとんど見られなかったが、高濃度の硝酸ガスに曝露した場合は、電子顕微鏡観察で形態変化が認められ、さらに高湿度環境下では液滴に変化した。この結果から黄砂の変質(水溶性化)は、黄砂中のカルシウムと硝酸の化学反応によって起こる可能性が示唆された。偏光ライダーで測定される偏光解消度を定量的に解釈するため、実験室で黄砂等エーロゾルをチャンバー内に発生させて、ライダーで偏光解消度を測定した。黄砂の偏光解消度は、1μm以上の粒子数が多い場合28±3%(平均±標準偏差)、1μm以下が多い場合12±2%であった。サハラダストの値は、それぞれのサイズ分布について28±3%、15±2%であった。サイズが大きいダストの測定値は、過去に報告されている自由対流圏ダスト層観測値(2126%)と対応することが分かった。
ベイズ法を用いた経済サーベイ・データの解析手法の開発とその応用

近年,経済サーベイ・データは経済実証分析において盛んに用いられるようになってきた。本研究は,ベイズ統計学の立場から,このサーベイ・データを解析するための手法を開発することを目的とした。また,計量経済学の手法は,実際のデータ解析に使用されてこそ,その有用性が明らかになるとの考えから,所得等の経済サーベイ・データに本研究で開発された手法を適用した実証分析を行った。具体的には,以下の通りである。まず,ディリクレ過程事前分布を用いたベイジアン・ノンパラメトリック法をローレンツ曲線やジニ係数の推定に適用した。その際,サーベイ・データに見られる測定誤差の問題を推定と同時に考慮できるモデルを開発した。経済サーベイ・データの個票データが公表されておらず,その集計データのみが利用できる場合がよくある。そこで,本研究では,ベイジアン混合モデルを用いて集計データから個票データの所得分布を推定する方法を提案し,推定された所得分布からローレンツ曲線やジニ係数を計測した。更に,Ravallionの研究で指摘された2種類の貧困,即ち,慢性的貧困と一時的貧困をベイジアン混合モデルを用いて推計した。Ravallion等の既存の研究では,得られた貧困度は記述的なものであるが,本研究では,統計的推測が可能となる。以上の研究を論文の形にまとめ,専門誌に投稿あるいは投稿準備中である。既にそのうちの1本の論文はJournal of Econometrics誌に掲載されている。また,本研究の成果である論文をオーストラリア及びインドで開催された国際コンファレンスにて発表した。本研究は,近年,経済実証分析において盛んに用いられるようになってきている経済サーベイ・データをベイズ統計学の立場から解析するための統計手法の開発を目的としている。本年度は,本研究を進めるにあたり必要と思われる文献,データの収集を行うとともに,実際のサーベイ・データを用いてベイジアン・ノンパラメトリック法によるローレンツ曲線の推定を行った。この研究成果に基づき,以下の論文を作成または作成中である。この論文は,1.の論文で用いた手法を集計データを用いたローレンツ曲線の推定に拡張したものである。論文完成の後,専門誌に投稿する予定である。また,現在,経済サーベイ・データを用いたStochastic Dominanceのベイズ推定法の開発を行っており,開発された手法を不平等度及び貧困度の推定に応用していく予定である。本研究は、近年,経済の実証分析において盛んに用いられるようになってきている経済サーベイ・データをベイズ統計学の立場から解析するための統計手法の開発を目的としている。本年度は,本研究を進めるにあたり必要と思われる文献,データの収集を行うとともに,実際のサーベイ・データを用いてベイズ法によるローレンツ曲線の推定及び貧困度の推定を行った。この論文は,ベイズ法を集計データに適用してローレンツ曲線及びジニ係数を推定したものであり,現在,専門誌に投稿中である。また,2002年12月にインドのアラハバード大学で開催されたStatistics, Combinatorics and Related Area(SCRA)の第9回国際コンファレンスでこの論文の発表を行った。この論文は,日本福祉大学の上田和宏助教授との共著で,ベイズ法を用いて慢性的貧困及び一時的貧困を計測したものである。現在,専門誌への投稿の準備を進めている。また,本論文は,上田助教授により上記のSCRA第9回国際コンファレンスで発表された。本研究は,近年,経済の実証分析において盛んに用いられるようになってきている経済サーベイ・データをベイズ統計学の立場から解析するための統計手法の開発を目的としている。本年度は,過年度に引続き,本研究を進めるにあたり必要と思われる文献,データの収集を行うとともに,香港のセンサス・データを用いてベイズ法による不平等度の推定を行った。具体的な研究概要は下記の通りである。3.香港城市大学のAlan Wan

準教授と共同で香港のセンサス・データを用いて不平等度の1つの指標である一般化エントロピー尺度をベイズ法に基づき計測した。また,同データを用いて,香港の労働市場における香港生まれの労働者と中国大陸からの移民労働者の所得稼得の差異に関して混合分布モデルを使ったベイズ法で分析した。これらの分析結果は,幾つかの論文として纏められ,専門誌に投稿する予定である。
補体第4成分(C4)、凝固第13因子遺伝子領域の塩基置換の解析

遺伝的多型を示すタンパク質の遺伝子レベルでの変異を、補体第4成分(C4)及び凝固第13因子Aサブユニット(F13A)の遺伝子について検討した。F13Aについては、報告されている遺伝子構造から14個のコーディングエクソンすべてを遺伝子増幅法によって複製増幅できる14組のオリゴヌクレオチドを合成した。これらのプライマーを用いて、4つの対立遺伝子のホモ接合体をそれぞれのエクソンごとに増幅し、塩基配列の解析を行った。その結果、第12エクソンと第14エクソンに4つの対立遺伝子を特徴づける塩基置換のあることを明らかにした。すなわちエクソン12のアミノ酸残基564に対応するコドンにCTG/CCGの置換、エクソン14のアミノ酸650と651に対応するコドンにGTT-GAG/ATT/CAGの置換である。4つの対立遺伝子F13A*1A、*1B、*2A、*2Bのうち1A及び2Aと1B及び2Bの違い、すなわちAとBの違いはコドン564によって、1A及び1Bと2A及び2Bの違い、すなわち1と2の違いはコドン650と651によって規定されていることをはじめて明らかにした。さらに別のプライマーを合成してこれら2つのエクソンにおける塩基置換をPCR-RFLP法で検出する方法を確立し、DNAレベルでのF13Aタイピングも可能にした(以上、Am.J.Hum.Genetに投稿中)。塩基置換の部位と数から、4つの対立遺伝子のうち3つはそれぞれのエクソンの塩基置換によって生成したこと、残りの1つは他の3つのうちの2つの遺伝子内交叉によって生じたことが強く示唆され、現在遺伝子内交叉が生じた証拠を明らかにする実験を進めているところである。C4についてはPCR-RFLP法を用いた雑種アロタイプの検出方法を検討し、スクリーニング法として使用できる条件を確立したところである。
ハイブリッド型ベイズアプローチによる単一事例実験のための標本サイズ決定法

本研究は,個人を対象とした事例研究で行われる実験計画において分析に必要となる時点数等をあらかじめ定める方法を提案することを目的としたものである。従来の方法では,時点数等を定めるためにそもそも研究の対象となっている効果の大きさを仮定しなくてはいけないという非現実的な制約があった。本研究では,ハイブリッド型ベイズアプローチと呼ばれる手法を適用して,こうした未知の効果の大きさを一定の値に仮定しなくともすむように改良を加えるものである。
病院ベースの患者対照研究により閉経後の卵巣の意義を探る

年齢や肥満度が高いほど、同年齢でも卵巣機能が低下しているほど、上腕-足首間の脈波伝播速度(PWV)が高く、血管壁の弾力性が低下していた。PWVや腰椎骨密度の年齢調整平均値は自然閉経後と両側卵巣摘出後の女性で差を認めなかった。また、血中のエストラジオール濃度やFSH・LH濃度も両群間で差を認めなかった。PWV値で評価した際、日本人女性の中心性肥満の基準として腹囲80cmが妥当であり、さらには身長に応じた基準の設定が望ましいと考えられた。課題研究の遂行にあたり、おおまかな傾向を知るために、これまでに徳島大学病院産科婦人科外来を受診し、種々の治療開始前のデータ(閉経年齢、閉経の種類、BMI、血中脂質濃度、血圧など)が入手可能な45歳以上70歳未満の自然閉経後および両側卵巣摘出後の女性を対象にレトロスペクティブに検討した。その際、悪性腫瘍患者や高脂血症、高血圧、糖尿病で治療中およびホルモン療法施行中の女性は対象外とした。閉経後1年未満の女性も対象外とした。年齢とBMIで調整した血中脂質濃度、血圧について自然閉経群(N群)と両側卵巣摘出群(S群)で差があるかどうかを、閉経後3年未満、3年以上10年未満、10年以上の3群に分けて層別に解析した。血中脂質濃度は、閉経後年数にかかわらず、閉経の種類で差を認めなかった。収縮期および拡張期血圧は、閉経後早期では差を認めなかったが、閉経後10年以上では、S群がN群より有意に高値であった。早期のエストロゲンの急激な低下やその後の両側卵巣の消失が血管の性状に負の影響を及ぼす可能性が示唆された。現在、血管脈派速度など血管の性状の評価や血中炎症性サイトカイン/ケモカイン、高感度CRP、糖代謝や骨密度・骨代謝を中心に検討をすすめるために、研究協力者数を増やしているところである。徳島大学病院産科婦人科外来を受診および通院中の自然閉経後ならびに両側卵巣摘出後女性のうち同意の得られた女性を対象として、診療における定期検査時(空腹時)に研究用に余分に採血し、遠心分離後に分注し冷凍保管するとともに、既往歴、生殖歴、食事・運動習慣、喫煙・飲酒習慣などに関する質問票調査を実施している。さらに、血管脈波速度(pulse wave velocity ; PWV)等の血管機能の指標についても同時に測定している。それらのデータは匿名化してデータ管理ソフトに入力して保管している。50歳代、60歳代、70歳代の各年齢層において、自然閉経群50例ならびに両側卵巣摘出群50例での検討を予定しているが、両側卵巣摘出群の登録がまだ少なく、引き続き登録数の増加を目指す。全身の血管の硬度(arterial stiffness)を示すPWV値は、平成21年度までに測定した結果をみると、閉経後女性では比較的個人差が認められる。PWV値については、初回検査から3ヵ月後、6ヵ月後、1年後にも測定し縦断的なデータの取得も行っており、各年代層での血管の硬度の経時的変化についての情報も得られることを期待している。両側卵巣摘出群の症例数をさらに増やして、定期検査から得られる健康指標(血中脂質濃度、血糖値や骨密度など)やPWV値と生活習慣要因との関連を詳細に検討するとともに、閉経の種類(自然閉経と両側卵巣摘出)により、血中性ホルモン値や炎症性サイトカイン濃度あるいはPWV値などに差があるかどうかを検討する。徳島大学病院産婦人科外来を受診した同意の得られた自然閉経後ならびに両側卵巣摘出後女性に対して、一般診療に加えて、既往歴、生殖歴や生活習慣などに関する自記式質問票調査や腹囲測定を行うとともに、動脈硬化初期における血管壁の弾力性の低下を捉える指標である血管脈波伝播速度(Pulse Wave Velocity ; PWV)を測定した。質問票調査で循環器疾患の既往ありと答えた婦人は解析から除外した。PWV値は年齢および閉経後年数と有意な強い正の相関を示した。BMI、腹囲とも有意な正の相関を示し、腹囲との相関係数の方が高かった。身長とは有意な負の相関を示した。年齢で調整しても同様の傾向であった。PWVの年齢調整平均値は両側卵巣摘出後女性の方が自然閉経後女性より高値であったが、有意差は認めなかった。次に、BMI 25kg/m^2・腹囲90cm・腹囲80cmという3つの基準を用いて2群に分けた際のPWV値の年齢調整平均値は、腹囲80cmで分けた際にのみ2群間で有意差を認めた。さらに、腹囲に身長の要因を加味するために腹囲/身長や腹囲/身長2という指標を作成して、年齢で補正した偏相関分析を行うと、PWV値は両指標と有意な正の相関を示し、腹囲単独よりも相関係数が高かった。

PWV値を指標とした際には、腹囲のカットオフ値はメタボリック症候群の日本人女性の基準とされている腹囲90cmより、NECP ATPIII(2005年版)のアジア人向けの基準である腹囲80cmで区切るのが妥当であり、さらに、腹囲に身長の要因を加味することの有用性が示唆された。また、PWV値は加齢や閉経後年数の経過とともに上昇し、両側卵巣摘出により早期に閉経した女性は、自然閉経後の女性よりも、同年齢でも血管壁の弾力性の低下が大きい可能性が示唆された。
腎微小循環血流動態の直接計測による急性腎不全病態解析システムの構築

LPSの投与により糸球体毛細管での血流速度の濃度依存性の低下が認められ、DICが誘発された。LPSにヘパリンを前投与した群では、ヘパリンにより血流速度を指標とした評価からすればDICの進行を軽度であるが抑制することができた。LPSにCV3988を前投与した群では、CV3988によってさらに血流速度の低下を妨げ、ほぼDICへの進展を阻止出来ることが分かった。LPSにヘパリンとCV3988を前投与した群では、双方の効果により血流速度の低下は認められず、DICへの進展は全く抑制されることが分かった。ヘパリンとCV3988をそれぞれ単独投与した場合、血流速度はほとんど変化しなかった。DICにおける血流障害にはヘパリンよりCV3988が有効であり、さらにヘパリンを加えることでより効果が増強され、血流速度を保ちDICへの進展を妨げることが分かった。このことから、DICにおけるヘパリンとPAF阻害剤を併用した治療法の新たな可能性が期待される。本研究の目的は、急性腎不全時の腎皮質における微小循環を糸球体をも含めた毛細管レベルで可視化し、血流動態の急性変化および細動脈の血管径および血流速度を測定し、腎循環調節メカニズム破綻を微小循環レベルで解析することである。平成14年度の(1)(3)の計画は、当初の予定通り全うすることが出来た。(1)高解像度のペンシルレンズ型のCCD生体顕微鏡システムの改良顕微鏡システムの光学系の基本はGRIN.(Gradient-index)レンズとし、通常型の微小レンズを組み合わせ,以前の800倍よりさらに高い1000倍の倍率を実現した。これにより、血球の描出が鮮明になり、速度評価が可能となった。この計測・解析のため、高倍率改良型のCCDカメラ,画像収集解析システムを購入した。顕微鏡システムの光学系の基本はGRIN(Gradient-index)レンズとし、通常型の微小レンズを組み合わせ,以前の800倍よりさらに高い1000倍の倍率を実現した。この計測・解析のため、高倍率改良型のCCDカメラ、画像収集解析システムを購入した。(2)システムの測定精度の評価既知のマイクロスケール(2μm、5μm)とUSAFターゲット1957を計測し、空間分解能を評価した。像の歪みは、正方形のグリッドである血算板を観察して検討したところ、実用上問題がないことが分かった。被写界深度は約50μmであった。ラット腎糸球体および輸入・輸出細動脈のイメージングを行い,安定性を検討したところ開腹後5時間に及ぶ実験を行なっても生理的な影響はほとんど認められなかった。このシステムは、その高倍率性によって血管内を血流にのって流れる血球の動画を捉えて血流速度評価を可能にする画期的なものであることが確認された。さらに次年度の計画の予備実験を行ない、急性腎不全をエンドトキシンによって誘発することに成功し、その際の糸球体における血流速度を計測出来ることを確認した。この時、ラットは播種性血管内凝固を生じるので、血球が凝集に由来する血流速度の低下が観察された。この成果は、来る3月の日本循環器学会にて報告することが決定している。本研究の目的は、エンドトキシンであるLPS(lipopolysaccharide)にを投与することによって引き起こした急性腎不全時の腎皮質における微小循環障害(播種性血管内凝固症候群disseminated intravascular coagulation, DICの状態)を糸球体レベルで可視化し、血流動態の急性変化を測定し、腎循環調節メカニズム(PAF阻害薬CV3988とヘパリンの効果)を微小循環レベルで解析することである。血小板活性化因子「Platelet Activating Factor, PAF」の阻害剤は、PAFを抑制するので、血小板が活性化されず、その凝集を阻止し微小血管循環が閉塞するのを防ぐ働きがある。平成14年度の計画を予定通り全うし、平成15年度の計画(1)生体腎を用いた血流速度計測の評価2)誘発した急性腎不全の観察)も、予定通り遂行することが出来た。本年度の新たな結果は以下の通りである。

CCD生体顕微鏡を用いて腎微小循環をLPSを投与し(5mg/kg,10mg/kg)、生じた微小循環障害を生理条件下にin-vivoにおいて血流速度測定で調べた。LPSの投与により糸球体毛細管での血流速度の濃度依存性の低下が認められ、濃度依存性にDICが誘発された。ヘパリンを前投与したLPS群では、DICの進行を軽度であるが抑制した。CV3988を前投与したLPS群では、CV3988が血流速度の低下を妨げ、ほぼDICへの進展を阻止した。ヘパリンとCV3988を前投与したLPS群では、血流速度の低下は全く認められなかった。DICにおける血流障害にはヘパリンよりCV3988が有効であり、さらにヘパリンを加えることでより効果が増強され、血流速度を保ちDICへの進展を妨げることが分かった。このことから、DICにおけるヘパリンとPAF阻害剤を併用した治療法の新たな可能性が期待される。
学校教育におけるインターネット利用の問題と課題の解明を目的とする質的観察研究

本研究では、総合的な学習の研究指定校や日本と米国のフリースクールで継続的に観察・面接を行い、また米国のホームスクーラーの調査も行って、以下のような知見を得た.1.インターネットを含むテクノロジーの教育利用の全体的な問題状況についての知見(1)従来からの教室文化、教授・学習文化とコンフリクトを起こしていること(2)これらの文化は、総じて日本のカリキュラムの構造のもたらすものであること(3)この文化的伝統は非常に強く、このコンフリクトにより、インターネット利用に対する文化的変容または文化的同化(acculturation)がなされて、本来の特性とは異なる使い方がされる場合があること(4)同様なacculturationの例は、教育におけるテクノロジー利用ではこれまでもしばしば起きていたのに看過され、そのためにテクノロジー利用は普及しなかったこと(5)インターネットの利用法だけをいくら工夫しても、学校で広く有効に活用されると考えられない.(文化変容を起こして一斉授業の枠組みのなかに組み込まれてしまう可能性あり.)(6)したがって、インターネットも、このような学校文化を変える要因とはなりえないこと2.この問題の解決のための知見(1)このような教授・学習文化の潜在的な諸特性を顕在化させる必要があること(2)それらの一部を、教師を含む幅広い合意のもとに意図的・計画的に解体し、組み替えて、新たな教授・学習文化を創造していく必要があること3.明らかになった今後の研究課題インターネットだけでなく、近代的な教育システムをささえる校舎・教室のような建造物、カリキュラム・学習指導要領・教科・教科書・時間割・学習指導案のようなとしてのソフトテクノロジー、従来の教材・教具を含めて、包括的な観点から教育におけるテクノロジーと学校文化との間のコンフリクトと相互作用を研究し、解明する必要があること本研究では、総合的な学習の研究指定校や日本と米国のフリースクールで継続的に観察・面接を行い、また米国のホームスクーラーの調査も行って、以下のような知見を得た.1.インターネットを含むテクノロジーの教育利用の全体的な問題状況についての知見(1)従来からの教室文化、教授・学習文化とコンフリクトを起こしていること(2)これらの文化は、総じて日本のカリキュラムの構造のもたらすものであること(3)この文化的伝統は非常に強く、このコンフリクトにより、インターネット利用に対する文化的変容または文化的同化(acculturation)がなされて、本来の特性とは異なる使い方がされる場合があること(4)同様なacculturationの例は、教育におけるテクノロジー利用ではこれまでもしばしば起きていたのに看過され、そのためにテクノロジー利用は普及しなかったこと(5)インターネットの利用法だけをいくら工夫しても、学校で広く有効に活用されると考えられない.(文化変容を起こして一斉授業の枠組みのなかに組み込まれてしまう可能性あり.)(6)したがって、インターネットも、このような学校文化を変える要因とはなりえないこと2.この問題の解決のための知見(1)このような教授・学習文化の潜在的な諸特性を顕在化させる必要があること(2)それらの一部を、教師を含む幅広い合意のもとに意図的・計画的に解体し、組み替えて、新たな教授・学習文化を創造していく必要があること3.明らかになった今後の研究課題インターネットだけでなく、近代的な教育システムをささえる校舎・教室のような建造物、カリキュラム・学習指導要領・教科・教科書・時間割・学習指導案のようなとしてのソフトテクノロジー、従来の教材・教具を含めて、包括的な観点から教育におけるテクノロジーと学校文化との間のコンフリクトと相互作用を研究し、解明する必要があること1.日本の公立学校とフリースクールでのコンピュータとインターネットの利用に関する観察・調査これまでの公立校とフリースクールでの観察を継続するとともに、コンピュータの教育利用に実績を有し、かつ市内で2校だけ新たなシステムを導入した0市のA小学校での観察を開始し、継統した。これらはすべてフィ一ルドノートに記録され、コンピュータ上に蓄積され、分析された。2.教育実践研究の枠組みについての研究教育実践研究の枠組みについて、質的研究の立場から検討した。とくに現在きわめて一般的である「研究仮説」の設定について、聞き取り調査、文献調査等にもとづき、批判的に検討した。3.米国のフリースクールと公立学校での観察・調査米国の有名なフリースクールであるマサチューセッツ州のサドベリー・バレー・スクールとその近隣のフラミンガム市のプリスクール、プライマリースクール、ミドルスクール、ハイスクールを訪問し、コンピュータとインターネットの教育利用に関する観察・調査を行い両者を比較・分析した。4.ピッツバーグ大学とカーネギー・メロン大学での調査等コンピュータとインターネットの教室利用について質的研究を長期的に行っているピッツバーグ大学のJannet Ward Schofield教授を訪問し、研究対象、研究手法等について、広範な意見交換を行った。また、大谷の研究について同大学で発表を行い、多くの研究者と討論を行った。さらに、カーネギー・メロン大学を訪問し、コンピュータの教育利用の研究者らと研究交流を行った。1.日本の公立学校とフリースクールでのコンピュータとインターネットの利用に関する観察・面接、記録の作成、分析、理論化初年度の観察、分析、理論化を継続してさらに発展させた.観察はN市のNスクール、O市のF小学校等で継続した.その際、質的研究ソフトなどの多様なツールを用いて分析を行った.