hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
貝紫の染色性に関する研究

平成8年度は,有明海産アカニシから採取した貝紫色素の染色性を検討し,以下の成果を得た。1.還元染色における貝紫濃度は3050%(対繊維濃度)で中色濃色が得られた。2.水酸化ナトリウム濃度は1015g/l,ハイドロ濃度は2030g/lが適量であった。3.建化と染色の温度は60°Cが適温であった。4.染色時間は1020分が適当であった。5.染浴は3回まで利用できたが,3回目の色素残存量は極めてわずかであった。6.毎回新たな染浴で反復染色を行うと濃色が得られたが,3回目でほぼ平衡に達した。7.生貝を用いた直接染色では日光によって発色が進行したが,還元染色で日光を受けるとムラ染めが生じた。これは,紫外線によって貝紫の臭素結合が切断されることによる。8.直接染色では赤みの紫に,還元染色では青みの紫に発色したが,ソ-ピングや仕上げによって赤みが増した。これは,淡色ほど,また,アセテートとビニロンで明瞭に認められた。9.直接染色ではナイロン,毛,絹が良好な染色性を示し,還元染色でのポリエステルとアクリルに対する染色性は低かった。10.吉野ヶ里遺跡出土の貝紫データと比較すると,本研究の直接染色の捺染が近似した結果を示した。平成9年度は,有明海産アカニシから採取した貝紫の染色性の検討と,長崎県および沖縄県産のアクキガイ科の種々の貝類の色素成分を分析し,以下の成果を得た。1.貝紫色素の抽出溶媒にはエーテルのほか貝の分泌液や海水も良好であった。2.還元染色で染料溶解剤を用いると均染性は向上したが,染着性は低下した。3.発色は空気酸化よりも水中酸化が効果的であった。4.貝15種類について高速液体クロマトグラフイ-で色素成分の分析を行った結果,それぞれ固有の比率で種々の色素を含有していた。5.色素は貝紫であるジブロムインジゴのほか、モノブロムインジゴ,インジゴおよびインジルビンが検出されたが,およそ7割の貝がジブロモインジゴを主成分としていた。6.同種の貝でも棲息場所で色素成分や比率が異なっていた。本年度は有明海産アカニシから採取した貝紫色素の染色性を検討し,以下の成果を得た。1.貝紫濃度は,50%(対繊維重量)で濃色が得られたが,30%との色相差は小さかった。2.アルカリ剤と還元剤濃度は,濃色には15g/1(NaOH),30g/1(ハイドロ)が,中色には10g/1(NaOH),20g/1(ハイドロ)がそれぞれ効果的であった。3.建化と染色温度は,10分間の染色では60°Cが適温であった。4.染色時間は,一回の染色では10分から20分でほぼ平衡に達した。5.染浴は3回まで利用できたが,3回目の色素残存量は極めて少なかった。

6.毎回新たな染浴で反復染色を行うと濃色が得られたが,3回目でほぼ平衡に達した。7.生貝を用いた直接染色では日光によって発色が進行したが,日光下で還元染色を行うと,紫外線によって貝紫(ジブロムインジゴ)の臭素結合が切れるためにムラ染めが生じた。8.直接染色では赤みの紫に,還元染色では青みの紫に発色したが,染色後のソ-ピングや熱処理によっていずれも青みが減り,赤みを帯びた。これは淡色ほど,また,アセテートとビニロンで明瞭に認められた。9.同一の染浴で染色しても各種繊維はそれぞれ固有の染色性を持ち,これは直接染色よりも還元染色において顕著であった。直接染めではナイロン,毛,絹が良好な染色性を示し,還元染色でのポリエステルとアクリルに対する染色性は低かった。10.吉野ケ里遺跡出土の貝紫データと比較すると,本研究の直接染色の捺染(摺り染め)が比較的近似した結果を示した。本年度は,有明海産のアカニシから採取した貝紫の染色性の検討と,長崎県と沖縄県産のアクキガイ科の種々の貝類の色素成分を分析し,以下の成果を得た。1.アカニシ由来の貝紫の染色性(1)生貝を用いた直接染色において,色素の抽出溶媒の種類を種々変化させた結果,貝の分泌液を用いた方法が発色性と均染性に優れていた。次いで海水,水,尿の順となり,10%NaOHと10%H_2SO_4では染色性が悪かった。無溶媒の場合は濃色であったが均染性に劣っていた。前年度に行ったエーテルやエタノールを用いた方法と比較すると,発色性はほぼ同等で均染性はエーテルが優れていた。この結果,貝紫の抽出溶媒としてはエーテルが良好であることが分かり,古式手法も染色性に加えて安全性や簡便性に着目するとこれに劣らないことが確認できた。(2)発色済の貝紫を用いた還元染色(建て染め)において,染料溶解剤(アニノール)を用いると均染性は向上したが染着性はやや低下した。これは,色素の溶解性が高まると同時に脱着性も増すことによると考えられる。(3)建て染めにおける酸化の方法としては空気酸化よりも水中酸化の場合が発色性と均染性に優れていた。(4)建て染めにおいて後処理(仕上げ)のソ-ピングと酸通しを行うことにより被染物は赤みを増した。2.アクキガイ科の貝類の色素成分15種類の貝の鰓下腺(パ-プル腺)に含まれる色素を液クロ分析した結果,貝はそれぞれ固有の比率で種々の色素を含有しており,貝紫であるジブロムインジゴのほかモノブロムインジゴやインジゴおよびインジルビンが検出された。同種の貝でも生息場所によって成分や比率が異なったがおよそ7割が貝紫を主成分としていた。
選択的タンパク質分解を介したブレインサイズ決定機構の解明

本研究により,研究代表者のグループが独自に発見したユビキチンリガーゼZNRF1が酸化・還元環境の変化に応答して活性化し,神経細胞の細胞内反応を調節することによって,大脳皮質形成を制御する可能性が示唆された.今後,選択的タンパク質分解制御の観点からこの可能性をさらに詳細に検討することにより,大脳皮質形成過程のさらなる理解に繋がる新しい知見が得られることが期待される.研究代表者のグループは末梢神経傷害後に神経繊維を構成する軸索の持ち主である神経節において発現が上昇する遺伝子のスクリーニングを行い,RINGフィンガー領域にE3ユビキチンリガーゼ活性を持つ新規タンパク質zincand ring finger 1 (ZNRF1)を同定した.その後の解析から,ZNRF1は軸索変性過程においてセリン・スレオニンキナーゼAKTをUPS依存的に分解し,AKTおよびその下流シグナルを軸索から失わせることによって軸索変性の進行を促進することが明らかとなった(Wakatsuki S. et al. Nat Cell Biol 2011).ZNRF1は神経細胞全般に発現を認めるが,詳細な組織学的解析により,脳室帯など発生過程初期の神経細胞,ならびに神経前駆細胞に強く発現することから,神経前駆細胞の分裂,移動,分化など神経発生への寄与が示唆されていた.Cre/loxPシステムにより野生型ZNRF1を過剰発現できるTgマウスを作出し,Nestin-Cre Tgマウスとの掛け合わせによりZNRF1を神経細胞全般に発現させたところ,顕著な大脳皮質形成異常が認められた.これらのことから,ZNRF1を起点としたシグナルカスケードが大脳皮質形成の制御に関与する可能性が強く示唆された.本研究計画では,この可能性に関して実験的検証を与えることにより,タンパク質分解制御の観点から大脳皮質形成過程のさらなる理解に貢献する新たな知見を得ることを目的として開始された.本研究により,研究代表者のグループが独自に発見したユビキチンリガーゼZNRF1が酸化・還元環境の変化に応答して活性化し,神経細胞の細胞内反応を調節することによって,大脳皮質形成を制御する可能性が示唆された.今後,選択的タンパク質分解制御の観点からこの可能性をさらに詳細に検討することにより,大脳皮質形成過程のさらなる理解に繋がる新しい知見が得られることが期待される.研究代表者のグループは末梢神経傷害後に神経繊維を構成する軸索の持ち主である神経節において発現が上昇する遺伝子のスクリーニングを行い,RINGフィンガー領域にE3ユビキチンリガーゼ活性を持つ新規タンパク質zincand ring finger 1 (ZNRF1)を同定した.その後の解析から,ZNRF1は軸索変性過程においてセリン・スレオニンキナーゼAKTをUPS依存的に分解し,AKTおよびその下流シグナルを軸索から失わせることによって軸索変性の進行を促進することが明らかとなった(Wakatsuki S. et al. Nat Cell Biol 2011).ZNRF1は神経細胞全般に発現を認めるが,詳細な組織学的解析により,脳室帯など発生過程初期の神経細胞,ならびに神経前駆細胞に強く発現することから,神経前駆細胞の分裂,移動,分化など神経発生への寄与が示唆されていた.Cre/loxPシステムにより野生型ZNRF1を過剰発現できるTgマウスを作出し,Nestin-Cre Tgマウスとの掛け合わせによりZNRF1を神経細胞全般に発現させたところ,顕著な大脳皮質形成異常が認められた.これらのことから,ZNRF1を起点としたシグナルカスケードが大脳皮質形成の制御に関与する可能性が強く示唆された.本研究計画では,この可能性に関して実験的検証を与えることにより,タンパク質分解制御の観点から大脳皮質形成過程のさらなる理解に貢献する新たな知見を得ることを目的として開始された.研究代表者は末梢神経傷害後に神経繊維を構成する軸索の持ち主である神経節において発現が上昇する遺伝子のスクリーニングにより,ユビキチンリガーゼ活性を持つ新規タンパク質ZNRF1を同定した.その後の解析から,ZNRF1は軸索変性過程においてAKTをUPS依存的に分解し,AKTおよびその下流シグナルを軸索から失わせることによって,軸索変性の進行を促進すること分かった(Wakatsuki S. et al. Nat Cell Biol).ZNRF1は神経細胞全般に発現を認めるが,特に脳室帯などの発生過程初期の神経細胞並びに神経前駆細胞に強く発現することから,神経前駆細胞の分裂,移動,分化など神経発生への寄与が示唆された.興味深いことに,神経細胞特異的に野生型ZNRF1を過剰発現させたTgマウスでは大脳皮質形成異常が認められた.これらのことから,ZNRF1を起点としたシグナルカスケードが大脳皮質形成の制御に関与する可能性が強く示唆された.本研究計画では,この可能性に関して実験的検証を与えることにより,タンパク質分解制御の観点から大脳皮質形成過程のさらなる理解に貢献する新たな知見を得ることを目的として開始された.本研究により,1)酸化ストレスを与えて細胞内を酸化条件にすることにより,ZNRF1自身が繊維芽細胞増殖因子受容体を介してチロシンリン酸化され,そのユビキチンリガーゼ活性が亢進すること,2)主に子宮内エレクトロポーレーション法を用いた検討から,ZNRF1のユビキチンリガーゼ活性が大脳皮質形成に必要であること,などが明らかとなった.神経科学計画を進めていく上で,これまでに次に示すような研究結果を得ている.

動物個体を用いた解析により明らかとなったこととして,1マウス胚大脳皮質の神経前駆細胞に対してZNRF1遺伝子を過剰発現させることにより,大脳皮質形成,特に神経細胞が構築する層構造の形成が異常になった.ZNRF1の分子生化学的解析により明らかとなったこととして,2AKTがプロてテアソーム依存的に分解されることにより, Glycogen synthase kinase 3Bが活性化した.3酸化ストレスを与えて細胞内を酸化条件にすることにより,チロシンリン酸化されたZNRF1の存在量が相対的に増加するとともに,ユビキチンリガーゼ活性が亢進した.ZNRF1は細胞内ROS産生を介して活性化する,上皮細胞増殖因子受容体などのチロシンキナーゼによって直接リン酸化された.4発生段階の神経細胞にZNRF1を過剰発現させたトランスジェニックマウスは小頭症の症例とよく似た所見を示した.小頭症の原因遺伝子に関する報告例は有糸分裂に直接関連する8種のみであり,有糸分裂の異常が細胞数の減少を来たし,結果として小頭症の症状に繋がるとされる.ZNRF1の過剰発現は培養細レベルでは細胞増殖には影響を与えないことから,野生型ZNRF1 Tgマウス系統の表現型は有糸分裂の異常とは別の分子メカニズムによって生じていると考えられた.計画を進めていく上で,これまでに次に示すような研究結果を得ている.動物個体を用いた解析により明らかとなったこととして,1マウス胚大脳皮質の神経前駆細胞に対してZNRF1遺伝子を過剰発現させることにより,大脳皮質形成,特に神経細胞が構築する層構造の形成が異常になった.ZNRF1の分子生化学的解析により明らかとなったこととして,2AKTがプロテアソーム依存的に分解されることにより, Glycogen synthase kinase 3Bが活性化した.3酸化ストレスを与えて細胞内を酸化条件にすることにより,チロシンリン酸化されたZNRF1の存在量が相対的増加するとともに,ユビキチンリガーゼ活性が亢進した.4発生段階の神経細胞にZNRF1を過剰発現させたトランスジェニックマウスは小頭症の症例とよく似た所見を示した.小頭症の原因遺伝子に関する報告例は有糸分裂に直接関連する8種のみであり,有糸分裂の異常が細胞数の減少を来たし,結果として小頭症の症状に繋がるとされる.ZNRF1の過剰発現は培養細レベルでは細胞増殖には影響を与えないことから,野生型ZNRF1 Tgマウス系統の表現型は有糸分裂の異常とは別の分子メカニズムによって生じていると考えられた.これまでの研究成果をもとに,本年度はZNRF1を起点としたUPS依存的なタンパク質分解機構が大脳皮質形成においてどのような生理的役割を担うのかを明確にするため以下の実験を行う.培養細胞を用いた実験として,1ZNRF1のリン酸化に関わるチロシンキナーゼの活性制御には細胞内ROS産生が関与する.細胞内ROSの産生源としてはミトコンドリア電子伝達系とNADPHオキシダーゼが挙げられるので,それぞれの遺伝子の過剰発現やRNA干渉により発現抑制させた場合のZNRF1のチロシンリン酸化,AKTのユビキチン化を調べ,細胞内ROS産生に関わる酵素を明らかにする.動物個体を用いた実験として,2子宮内エレクトロポーレーション法を用いて, ZNRF1を起点としたシグナルカスケードのそれぞれの分子を過剰発現,あるいはRNA干渉によって発現抑制することにより,大脳皮質形成に生じる影響を,遺伝子導入した細胞を追跡することで明らかにする.
19世紀における技術者への熱学の普及と蒸気機関への応用について

最新の蒸気機関の実験場であった英国コーンウォール地方の技術者・科学者コミュニティの中心人物であったデービス・ギルバートに特に着目した.ギルバートは,熱物質説を支持していた可能性が高いこと,デービー,ランフォード伯,ヘラパスの熱運動説は,当時最新の蒸気機関の開発に影響を及ぼしていないと考えられること,科学・技術のパトロンとしてのギルバートだけではなく,技術者からギルバートへの科学・技術情報の提供があったこと,「蒸気機関の理論」の修正に際し,実際の高圧蒸気機関とその性能を測定するインジケーターがその基礎となったことなどを明らかにした.最新の蒸気機関の実験場であった英国コーンウォール地方の技術者・科学者コミュニティの中心人物であったデービス・ギルバートに特に着目した.ギルバートは,熱物質説を支持していた可能性が高いこと,デービー,ランフォード伯,ヘラパスの熱運動説は,当時最新の蒸気機関の開発に影響を及ぼしていないと考えられること,科学・技術のパトロンとしてのギルバートだけではなく,技術者からギルバートへの科学・技術情報の提供があったこと,「蒸気機関の理論」の修正に際し,実際の高圧蒸気機関とその性能を測定するインジケーターがその基礎となったことなどを明らかにした.2009年度の研究成果としては,まず18世紀末から19世紀初頭にかけての,熱と水蒸気および蒸気機関の理論を熱素説との関係において研究した成果を,2009年5月に日本科学史学会(九州大学)および2009年7月28日8月2日の会期で開催された国際科学史技術史会議(ハンガリー,ブダペスト)にて発表を行ったことがあげられる.19世紀後半の舶用蒸気ボイラの発達を,ボイラ形式の変化と鋼の大量生産技術の確立との関係から検討した研究成果を,雑誌『科学史研究』に論文を投稿し,掲載が決定した.また,当該研究の加速度的進捗を図るため,英国を2度訪問し,資料収集および現地の機械などの視察を行った.研究の進展にともなって,デービス・ギルバート(1767-1839)が蒸気機関の理論形成に果たした役割に特に着目するようになった.Royal Institution of Cornwallの図書館には,トレビシックやホーンプロワーら技術者がギルバートとかわした書簡が,またCornwall Record Officeには,ギルバートの日記を含む彼に関する膨大な資料があり,その一部を複写した.そもそもコーンウォール地方は石炭を産出しない金属鉱山地帯であったため,蒸気機関の熱効率を改善する大きな動機があったことはよく言われてきたが,このような背景だけでは,熱に関する科学と蒸気機関との関係を論じるには不十分であると考える.実際に科学と技術を具体的に橋渡しする人物や人的ルートが存在していたのであり,その中心的人物がギルバートであったと考えている.この人的ルートを通じて彼らは技術情報や自然科学的知識を共有しており,こういった人的関係が当時の蒸気機関の理論形成に影響を与えたものと考えている.2010年度は,さらに研究を進めた成果を学会等で発表予定である.平成22年度は,昨年度に固まった研究の方向性をより深化させた.まず平成22年5月30日に,日本科学史学会第57回年会シンポジウム「18世紀科学史に見る理論と実践の相互作用」にて,「デービス・ギルバートとコーンウォールの技術者たち-動力技術開発における技術者と科学者との交流」と題した発表を行った.この発表を通じて,19世紀初頭,コーンウォール地方における最新蒸気機関の開発を促した要因として,地理的要因の他に,デービー,ホーンブロワー,トレビシック,ウルフといったコーンウォール出身同士の交流や協業を促進する仲介者としてのデービス・ギルバートの役割を指摘した.また,これまでギルバートはデービーや技術者のパトロンとして描かれてきたが,ウルフがギルバートに宛てた手紙には,断熱膨張に関する実地のデータがあったことを指摘し,技術者からギルバートへの逆の知的交流があったことを指摘した.平成22年度も英国各地を訪問して,資料収集および現地の機械などの視察を行った.Royal Institution of Cornwallに収蔵されているホーンブロワー,トレビシックらの書簡類は本年度も特に重視し,資料の閲覧と収集を行った.さらに,ウィリアム・ポール(William Pole, 1814-1900)の熱学に関する研究および著作に着目した.ポールは,デービス・ギルバートの義理の息子John Samuel Enysとも関係があったと思われ,また英国の多くの技術者とも交流を持っていたと考えている.彼が関係した英国の技術者間のネットワークについては,平成23年度も継続して研究する予定である.平成23年度は,昨年度開催した日本科学史学会第57回年会シンポジウム発表の報告書「デービス・ギルバートとコーンウォールの技術者たち-動力技術開発における技術者と科学者との交流」『科学史研究』第50巻258号(2011年),122-125頁を執筆した.2011年5月に東京大学で開催された日本科学史学会第58回年会シンポジウム「物質・技術文化からみた近代数理諸科学の展開(1660-1840)」(代表者:野澤聡)にて「19世紀中葉までの「蒸気機関の理論」の物質的基礎」を発表した.さらにその発表時の間違いを直して大きく書き加えた報告書を雑誌『科学史研究』第50巻259号(2011年)165-169頁に発表した.

この報告書で,コーンウォール機関やその他の蒸気機関に関する情報を技術者らが交換する窓口として,The Institution of Civil Engineersがある一定の役割を果たした可能性があること,19世紀中葉までの「蒸気機関の理論」は,現代から見れば間違った学説である熱物質説または熱素説をベースとしていたが,高圧蒸気の使用によって熱効率を上げたコーンウォール機関およびインジケーターの普及によって,間違った理論を実測によって補正することができたにちがいないであろうことを指摘した.前述したように,「蒸気機関の理論」は熱物質説または熱素説を前提としていたが,18世紀後半,ランフォード伯やハンフリー・デービーによって熱運動説が提唱されている.この時期の熱運動説がコーンウォールで活躍した技術者たちの蒸気機関の改良や彼らの熱理論にどのような影響を与えたかについての研究成果は,平成24年度に学会で発表予定である.平成24年度は,ランフォード伯やハンフリー・デービーらが唱えた熱運動説が蒸気機関開発にどのような影響を与えたかを検討した.その研究成果の一部は,日本科学史学会第59回年会一般講演(三重大学生物資源学部校舎)にて「コーンウォールの技術者たちの熱理論と熱運動説」として発表した.本研究課題の成果は,2013年2月に出版された拙著『19世紀における高圧蒸気原動機に関する研究』(「平成24年度科学研究費助成事業(科学研究費補助金(研究成果公開促進費))学術図書」の援助を受けた出版)にできる限り掲載するように努めた.また,蒸気機関技術史研究のこれまでの経緯と現状および今後の課題について私見をまとめたものを「蒸気機関技術史概論」として執筆し,『科学史研究』(2013年第52巻1-4頁)に発表した.これまでの研究では,イギリスにおけるワット以外の蒸気機関の開発に際し,デービス・ギルバートと技術者・科学者のコネクションに着目していたが,そこからさらに進んで,デービス・ギルバートがどのような熱理論を持っていたかについてより深く検討している.ギルバートが書いた書簡を読む限り,1790年代,ギルバートは,水蒸気の弾性力について熱運動説を基礎に検討していたように思われる.一方,18世紀末にランフォード伯やデービーら熱運動説を唱え,その情報はギルバートに伝えられてはいた.さらに平成24年度はジョン・ヘラパス(John Herapath, 1790-1868)の熱運動説にも着目したが,その当時の熱運動説はどれも蒸気機関の開発にほとんど影響も与えなかったように思われる.英国Cornwall地方にあるRoyal Institution of CornwallおよびCornwall Record Officeの資料によって,加速度的に研究が進捗しているためである.特に熱力学成立前の時代については,当初,期待した以上の成果をあげつつある.一方,当初計画していた19世紀初頭の水力機関および特に活力(vis-viva)の理論と熱力学成立前の蒸気機関の理論との関係,熱力学成立後の技術者への熱力学の普及およびそれら理論が各時代にどのようにして実際の蒸気機関の設計・製造・使用に応用されたかについては,研究の進展にともなって,研究対象を熱力学成立前の蒸気機関の理論に特に着目しているため,進捗としてはやや遅れているのかもしれないが,それ以上に,最初に述べた研究課題が大きな成果をあげつつあるので,その他の遅れを埋めるのに申し分ないものである.全体としては,「当初の計画以上に進展している」と判断している.24年度が最終年度であるため、記入しない。
動物個体内で遺伝子の機能を光制御する新手法の開発

モデル生物の個体内で,任意の遺伝子の機能発現を光制御する新手法の開発を目的に研究を行った。ケージドDNAおよびRNAを合成する要素技術として,修飾位置特異的ケージドDNAを化学合成するためのケージドヌクレオシドを合成した。また,モジュール型ケージドヌクレオチドを設計・合成し,塩基配列選択的ヌクレオチドケージング試剤の開発に応用した。さらに,最も長波長光で光活性化できる新規光分解性保護基の開発にも成功したモデル生物の個体内で,任意の遺伝子の機能発現を光制御する新手法の開発を目的に研究を行った。さらに,最も長波長光で光活性化できる新規光分解性保護基の開発にも成功したケージド化合物を用いる光制御を,厚みのある組織切片や哺乳動物個体に適用するためには,可視から近赤外光を用いることが望ましい。赤色から近赤外領域に吸収極大を持つ新しい光分解性保護基の開発を目指して研究を行った。1光子励起条件下で,500nmより長波長光によって高い効率で活性化できて,様々な官能基を保護できる光分解性保護基は報告されていない。そこで,キサンテン系色素を基本骨格に持つ新規光分解性保護基(X)を合成した。X基は516nmに吸収極大を持つこと,その塩化物(X-C1)は516nm光の照射で分解することを確認した。このときの光反応効率(量子収率とモル吸光係数の積)は5,000/(M cm)以上であった。さらに,X-C1とBhcmoc-Glu(吸収極大波長は370nm)の混合物に516nm光を照射するとX-Clを,370nm光を照射するとBhcmoc-Gluをそれぞれ選択的に活性化できることも明らかにした。ケージング試薬であるBhc-diazoによりケージドdsDNAの合成が可能である。しかし,プラスミドDNAのケージングに適用すると,ケージング反応がランダムに起こるため,ケージングされたプラスミドと未修飾プラスミドの混合物が生成する問題点があった。そこで,ビオチンタグを持つ新規ケージング試薬Bio-Bhc-diazoを合成し,ストレプトアビジンで修飾した磁気ビーズを利用したアフィニティー精製によって,未修飾DNAとの混合物からケージドDNAを分離精製できることを明らかにした。分離精製したケージドdsDNAをHeLa細胞にトランスフェクトしたところ,ケージングしていないdsDNAと比較して,目的遺伝子の発現が20%に低下し,UV照射によって80%まで発現が回復することを確認した。1.ケージドプライマーの開発(1)光分解性保護基で修飾したホスホロアミダイトモノマーを開発することが出来れば,PCRによりケージドプラスミドDNAを容易に合成することが可能となる。そこでまず,核酸塩基への光分解性保護基の導入法を最適化した。その結果,デオキシグアノシン(dG)の環外のアミノ基にNVOC基を導入できること,高い光反応性を持つと考えられるBmcmoc基をdCの環外のアミノ基に導入できることを明らかにした。(2)合成したケージドヌクレオシドは,350nmの紫外光照射によって,元のデオキシヌクレオシドを生成することを確認した。(3)光分解性保護基で修飾したプライマーを用いて,ケージドプラスミドDNAを調製する実験系を構築した。2.塩基配列選択的ケージング試剤の開発DNAやRNAのケージド化合物を合成するために,塩基配列を認識して狙った位置を修飾できるケージング試剤の開発を目指した。(1)DNAの塩基配列を認識するための6-mer PNA,および,DNAのリン酸結合と共有結合を作るためのジアゾメチル基を持つ新しいケージング試薬,PNA-Bhc-diazoの合成に成功した。(2)合成したPNA-Bhc-diazoを用いて,PNA結合配列を含む80-merのssDNAをケージングできること,PNA-Bhc基がPNA結合配列近傍に結合すること,さらに350nm光照射でアンケージングされることを,機器分析と酵素反応を利用して確認した。(3)PNA結合配列を挿入したプラスミドDNAを用いて,哺乳動物細胞内で発現するルシフェラーゼの定量でケージング反応の有無を確認する実験系を構築した。1.可視光で光活性化できる新規光分解性保護基ケージド化合物に使われている既存の保護基の中で、最も高い効率で活性化できるのはBhc基)である。しかし、375 nmに吸収極大を持つため、厚みのある組織切片や生物個体で利用するには、より長波長の可視光で活性化できる保護基が望ましい。そこで、本研究では可視光で活性化できる光分解性保護基を開発することを目的とした。キサンテンを基本骨格として、500 nmより長波長に吸収極大をもつ保護基Xanの合成を考えた。クロロ酢酸から出発して、3段階でXan-Clの合成に成功した。合成したXan-ClはpH7の緩衝液中で516 nmに吸収極大を持つこと、さらに516 nmの光照射によって光分解し、Xan-OHを生成することを明らかにした。このときの光反応効率は5278であった。

さらに、Xan-ClとBhcmoc-Gluの混合物に516 nmの光を照射するとXan-Clだけを、350 nmの光照射ではBhcmoc-Gluをそれぞれ選択的に光活性化できることも明らかにした。Xan-Clはこれまでに報告されたケージド化合物のどれよりも、長波長光で活性化可能である。2.モジュール型ケージドヌクレオチドの開発遺伝子の機能発現を光制御することを可能にするため,ケージドDNAの開発を進めてきた。これまでに報告されているケージドプラスミドDNA合成の問題点を明らかにし,ケージド化合物をモジュール化することでその解決を図った。モジュール型ケージド化合物のプラットフォーム分子を2種類開発した。そのうちの一つを用いて,アフィニティ精製用のタグ付きケージドDNAを合成し,哺乳動物培養細胞内でルシフェラーゼの発現を光照射で活性化できることを確認した。また,ペプチド核酸を導入したケージング試薬によって,塩基配列を認識して2本鎖DNAをケージングできることも明らかにした。当初計画に設定した研究項目は,ケージドプライマーの開発と塩基配列選択的ケージング試剤の開発である。ケージドプライマーを合成するためのケージドモノマー合成と,ケージドプラスミドDNAを調製するための実験系の構築に成功した。また,2本鎖DNAを塩基配列選択的にケージングする試薬を開発することができた。しかし,哺乳動物個体内で働くことを確かめるまでには至らなかった。24年度が最終年度であるため、記入しない。ケージドプライマーを用いる方法と,塩基配列選択的ケージング試薬を用いる方法で,モデル生物個体内で用いることができるケージドDNAの開発を推進する。運動する個体で光制御する場合,狙った場所を精度よく光刺激することは困難である。よって,個体での光制御を実現するためには,ケージド化合物を狙った細胞にターゲッティングする手法開発が必須である。そこで,低分子量機能性分子のケージド化合物とタグープローブシステムを組み合わせて,ターゲッティング可能か検討する。
機能カメラの協調動作による遠隔講義・講義支援システム

画像認識技術を遠隔講義システムに利用するという立場から研究を行った。遠隔講義システムには、画像認識技術だけでなく、通信技術、マルチメディア技術が必要で、それ以上に大切なのが教育的側面である。このことを理解した上で、講義室で行われる講義を固定位置に設置された複数台の首振りカメラを用いて如何に映像化するか、という点を中心に研究を進めた。得られた研究成果は以下の3点である。1.利用できるカメラを観測用カメラと撮影用カメラに分けると、観測と撮影が独立に考えられるという利点がある。この結果、カメラ間の協調問題が観測するカメラ群の協調と撮影カメラ群の協調、観測カメラ群と撮影カメラ群のコミュニケーションに分離でき、システムの設計が容易になった。カメラの配置に関しても、観測カメラ群は講義室がすべて観測できるような配置、撮影カメラ群はいい映像が取得できるような配置を考えるだけでよい。2.観測カメラ群と撮影カメラ群のコミュニケーションは動的状況を介して行うようにした。すなわち、観測カメラからの情報を動的状況に写像し、動的状況に基づいて撮影カメラを制御する。これにより、動的状況を明確に定義すれば、動的状況に写像できるという条件で、観測はカメラだけでなくさまざまなセンサーを併用できる。また、撮影カメラも動的状況に依存して制御する規則を書くことで観測と独立に制御できる。3.撮影カメラの制御規則を受講者が書くことによって、遠隔地の受講者がカメラを制御することが可能になった。この問題は、基本的には、資源割り当て問題になり、多数決の原理を適用するのが有効であることが判明した。遠隔講義における画像認識理解技術の適用研究を行った。講義室を人間が活動する一つの空間として捉え、この空間で起こる様々な状況を遠隔にいる人間に伝送するための基本的機能を明らかにした。講義は実空間で起こる活動であり、その活動をカメラで撮影するには、講義そのものの状況(これをコンテキストと呼ぶ)を定義する必要がある。コンテキストは、「カメラをどう制御するか」に対応している必要があり、講義の内容とは無関係である。コンテキストを記述するためには、講義を構成する人物(講師が最も重要)の位置、方向、動作を把握する必要がある。講義室に配置した複数台のカメラを用いて、講師の位置、方向、動作を計測する基礎実験を行った。講義室では、講師の動きが最も大きいので、単純な差分処理で講師の位置計測が可能なことが実証できた。講師の位置をもとにコンテキストを定義した。講師が黒板の近くにいるかどうか、を一つのコンテキストとし、黒板の近くにいる場合は、板書している可能性が高いので、黒板を撮影する。それ以外は講師を撮影する。これを、一台のカメラで行うのではなく、講師を撮影するカメラ、黒板を撮影するカメラ、生徒を撮影するカメラなど複数の機能カメラを実現し、これらのカメラの協調動作として講義室の状況を撮影する。簡単な実験システムを構築することにより、この方式の実現可能性を実証した。一台のカメラで様々な対象を撮影する方式に比べて、カメラの制御が容易であるだけでなく、講師の位置計測に失敗したときでもそれなりの映像が撮影できるなど、様々な利点があることが確認できた。講義室において、さまざまな撮影機能を実現する自律エージェントとしてのカメラシステムのプロトタイプを構築した。システム構築を進めながら実際の講義に適用して問題点を洗い出し、システムの改良を行った。技術的には、講義室を対象として映像を取得する枠組みは完成した。その基本は、講義室の動的状況の定義であり、これを2つの記述方式で記述する点に特徴がある。一つ目は、カメラ制御を行うための動的状況であり、どのような時にカメラを切り替えるのかを映像取得の観点から定義するものである。記述のレベルはシンボルであり、カメラワークを定義する表現方式として利用する。

二つ目は、センサーから取得した信号から区別できる動的状況であり、信号処理でどのような状況が区別できるかの観点からの定義である。具体的な記述のレベルは特徴レベルであり、センサーからの信号を処理してどのような特徴が得られるかをもとに、動的状況を定義する。この2種類の記述形式が同じ動的状況を定義するかどうかは別問題として、これが同じであると仮定してシステムを作成した。二つの動的状況を1対1に対応づける枠組みにより、センサーから抽出された特徴に基づき動的状況が変化し、これに基づいて3次元世界を映像化できる。講義室において簡単な動的状況を定義し、このメカニズムの有効性を確認した。このシステムを実際の講義に適用するときに、どのような映像を遠隔の参加者が求めているかという要求を明確化し、センサーからの特徴抽出機能の制約のもとに適切な動的状況を定義する必要がある。このような観点から定義した動的状況の実用性を評価すると同時に、動的状況を学習できる枠組みについて最終年度は研究を進める。複数台の首振りカメラを計算機制御する自動カメラシステムを中心に遠隔講義システムを構築した。このシステムは、映像伝送システム、プレゼンテーションシステム、音声システムを含む総合的なシステムである。実利用できるシステムを作成するために、動的状況の定義をかなり単純化した。すなわち、観測カメラから得られる講師の位置情報を空間的ゾーンに分割し、各ゾーンに対して一つの動的状況を割り当てた。これにより、観測カメラでの講師の位置検出誤差やエラーに対処できるロバストなシステムが構築できた。撮影用カメラの制御は、ゾーンに対してある程度固定し、必要なとき以外は講師を追跡しないようにした。また、想定外のイベントが発生したときのために、人間が撮影カメラを手動で操作できるインターフェースを作成し、手動モードと自動モードの切り替えが簡単に行えるようにした。構築した遠隔講義スステムをアメリカカリフォルニア大学ロサンジェルス校と京都大学に設置し、これらを利用して、半年間、連続して国際遠隔講義を実施した。実験よりも講義を優先しなければならないので、必要以上にオペレータがカメラ操作に介入した感があるが、大部分は自動モードでカメラ制御および映像撮影を行った。講義をした講師、受講した学生にアンケート調査を行った結果、カメラ制御と映像取得に関してある程度良好な評価を得たが、同時に、カメラが動きすぎるという問題点も明らかになった。ソフトウエア会社と共同で自動カメラシステムを製品化するための研究を始める計画が進行中で、うまく進めば研究成果が実用化されていくと思われる。
抗菌性ペプタイドによる真菌感染症の制御に向けての生物学的検討

抗菌ペプタイドの抗真菌作用について、以下の点を明らかにした。1.α-defensin-1、β-defensin-2に比べ、我々の作成したラクトフェリンペプタイド(Peptide2)はカンジダ菌、アスペルギルスの双方に対し、強い抗菌作用を示した。2.Peptide 2およびHistatin 5は、抗真菌剤のアムホテリシンBとは相加的に、イトラコナゾールとは相乗的に抗カンジダ菌作用を示した。3.Peptide 2、Histatin 5あるいはα-defensin-1と抗真菌剤を併用すると、抗真菌剤単独に比べ、菌内の抗真菌剤濃度は上昇した。4.各抗菌ペプタイドはカンジダ菌の細胞壁成分(キチン、マンナン、グルカン)およびDNA合成を弱いながら阻害したが、チトクロムP450に対する阻害作用は認められなかった。各抗菌ペプタイドは、細胞膜の透過性を亢進することなく真菌内のATPを排出させた。5.抗菌ペプタイド、特にPeptide 2は抗真菌剤と協調し、マウスのカンジダ菌およびアスペルギルス菌感染症を制御した。6.抗真菌剤のアムホテリシンBおよびイトラコナゾールはカンジダ菌の多剤耐性遺伝子(MDR1)の発現を亢進せしめたのに対し、Peptide 2およびHistatin 5はMDR1の発現に影響せず、アムホテリシンB耐性カンジダ菌に対しても感受性菌と同等に作用した。7.調べたペプタイドの中で、Peptide 2のみが好中球の殺菌能/活性酸素生成能を亢進せしめた。8.Peptide 2で処理したヒト好中球では、活性酸素生成に関わる細胞膜G蛋白→PI3K→PKCシグナル活性、p47^<phox>およびp67^<phox>の発現が増強し、さらに貧食能と関係のあるRac2/Cdc2の発現増強、PAK1およびERK1/2の活性化が認められた。以上の結果より、真菌感染症におけるPeptide 2の臨床応用の有用性が示唆された。1.α-defensin-1、β-defensin-2に比べ、我々の検討したラクトフェリンペプタイド(Peptide 2)はカンジダ菌、アスペルギルス菌の双方に対し、強い抗菌作用を示した。2.各々の抗菌ペプタイドは双方の真菌の細胞壁成分(キチン、マンナン、グルカン)の合成を弱いながらも阻害したが、チトクロームP450に対する阻害作用は認められなかった。3.各々のペプタイドは、特にPeptide 2は細胞膜の透過性を亢進することなく、細胞内のATPを細胞外に排出し、各真菌の細胞内ATPレベルを低下させた。4.各々のペプタイドは、DNA合成あるいは蛋白合成に対する阻害作用は非常に弱く、Peptide 2のDNA結合能は認められなかった。5.調べたペプタイドの中で、Peptide 2のみが好中球の殺菌能/活性酸素生成能を亢進せしめた。6.各々のペプタイド、特にPeptide 2は抗真菌剤と協調し、マウスのカンジダ菌及びアスペルギルス菌感染症を制御した。7.Peptide 2をはじめ、各defensinは抗真菌剤とは異なり、真菌の薬剤耐性遺伝子の発現に影響を与えず、さらには多剤耐性菌に対しても感受性菌とほぼ同等に作用した。以上のことより、抗菌性ペプタイドは、抗真菌剤とは異なる次元で抗菌性を示すこと、抗菌性ペプタイド、特にPeptide2と抗真菌剤との併用が真菌感染症に有用であることを示唆している。今後、多剤耐性遺伝子に及ぼす影響、及び好中球活性化作用の解析を行う予定である。

ラクトフェリンより作成した抗菌ペプタイド(Peptide2)と抗真菌剤を併用した際のカンジダ菌およびアスペルギルス菌に対する増殖抑制作用を検討するとともに、Peptide2のヒト好中球の活性酸素産生能および貪食能に及ぼす影響を検討した。1.Peptide2あるいはHistatin5と抗真菌剤アムホテリシンBは相加的な抗カンジダ菌作用しか示さなかったが、イトラコナゾールとは相乗的に作用した。2.α-defensin 1とアムホテリシンBとは相乗的に、α-defensin 1とイトラコナゾールとは相加的に作用した。4.ヒト好中球をPeptide2で処理すると、活性酸素生成能および貪食能が亢進した。5.Peptide2で処理したヒト好中球では、活性酸素生成に関わる細胞膜G蛋白→PI3K→PKCシグナル活性、p47^<phox>およびp67^<phox>の発現が増強し、さらには、貪食能と関係のあるRac2/Cdc2の発現増強、PAK1およびERK1/2の活性化が認められた。以上の結果より、Peptide2は抗真菌剤と相乗的・相加的に真菌増殖を抑制するとともに、好中球の活性酸素産生能および貪食能を亢進させることが明らかとなり、Peptide2の臨床応用の有用性が示唆された。
スタック上の点の安定性の研究

22年度中春は、正標数のアルチン代数スタックの局所構造について再考した。安定性の研究を半安定性に進めるには局所構造が技術的な格である。いくつかの(幾分高尚な)アプローチによって新しい方策を模索したが、明るい結果は得られなかったものの、KeelとMoriによるある補題を使うと大雑把ではあるが商構造としてかけることが分かり短い論文にしてまとめた。また、いくつかの研究集会やセミナーで講演を行った。その後多くの時間を導来淡中淡中双対性の構想について多くの時間を割いた。モチーフなどの具体的な応用先を念頭にいくつかのモデルケースにおいて淡中型の定理を証明した。そこにおいてはToen-VezzosiやLurieにより発展させられたderived algebraic geometryが必要でそこにおける群スキームの類似が重要であることが分かりそれを用いて定式化証明をした。それにおいては、導来森田理論などの高次圏において証明された最新の結果が使えることが分かった。また技術的に必要な高次圏の結果をいくつか示した。またベックの定理を用いてアプローチしてみて、ある有限性を仮定するとかなり使えることがわかったが、そうでない場合はいくつかの技術的障害があり、本質的に応用に十分なレベルまで応用可能かわからなかったのでそれは今後の課題として残っている。2009年度はスキームやスタック上の連接複体のなす導来圏に対して淡中双対性の類似を追求し、それらに対する淡中双対を確立することに成功した。代数多様体(より一般にスキームやスタック・オービフォルド)の研究において導来圏は代数多様体のよい不変量であり逆にどの程度代数多様体の情報を反映するか?関係はどうあるか?という基本的な問がある。そこには、Fourier-MukaiパートナーやThomason-Balmerの復元定理などが知られていた.私はThomason-Balmerの結果に触発され、導来圏に対する淡中双対性が成り立つだろうと考えた.考えたところ旧来考えられていた導来圏では成立しないことがわかった。その困難は高次圏を用いることで解消されること、そこのおける森田理論やKan extensionが使えることが発見された.これらを用いて私は,スキームやDeligne-Mumfordスタックに対して淡中双対性を導来圏レベル(正確には安定∞-圏レベル)で証明した。この結果の重要な帰結は次の二点である。(1)テンソル構造付き導来圏からスキームやスタックを復元できる.これはThomason-Balmerの結果の別証明かつ拡張になっておりまたスタックの場合はThomason-Balmerの方法は使えないのでより強い方法になっている。(2)二番目は(1)よりより大切なことである。スキームやスタックの射は導来関手を生むが、逆に抽象的に関手をあらえたときいつ幾何から来るか?という自然な問題が生まれる。これは,導来圏の自己同型と代数多様体の自己同型との関係はどうなっているか?という基本的な問題をふくむ.これに対して淡中双対性は、関手がいつ幾何からくるか純粋に圏論的な特徴づけをあたえる.これはスキームに対してもこれまでなかった結果で導来圏の幾何とスキーム理論的な幾何の幾何を明瞭にあたえる.なお上記の研究は一部福山ひろし氏と行った.そのほかスタックで粗モジュライが完備のときリーマンロッホ研究した.22年度中春は、正標数のアルチン代数スタックの局所構造について再考した。
静電応力駆動型単分子スイッチの創製

エレクトロマイグレーション自己破断接合法による分子サイズギャップ電極作製技術を開発し、同技術を応用して面内型ゲーティングナノポアを作製した。このデバイスを用いて、電極間に発生させた静電場の影響により、電極間を移動する単一分子の移動速度が大きく低下することを明らかにした。以上の結果は、電極間に架橋した分子の配向・形状を静電場で制御するタイプの静電応力駆動型単分子スイッチを設計する上での指針となる。バックゲート組込み型ナノブリッジ電極の作製に向けた、分子サイズ(サブナノメートルスケール)電極ギャップの形成手法を開発した。まず、シリコン基板上に電子線描画法を用いてマイクロ接合をパターニングした。その後、RFスパッタによる金属蒸着及びリフトオフプロセスにより、幅100ナノメートルの狭窄部を有する金マイクロ接合を作製した。電極ギャップ作製のために、まず、室温・真空中で金マイクロ接合に通電し、狭窄部にエレクトロマイグレーションを誘起させた。その際、試料に印加する電圧は、接合抵抗値を指標としたフィードバック制御を行った。この手法を用いて、接合抵抗値が1000Ω以上になるまで接合を狭窄させた。こうして形成される金原子サイズ接合を室温・一定電圧下で自発的に破断させた。この自己破断プロセス過程では、接合コンダクタンスがステップ状に低下する現象が観察された。以上のプロセスを用いることで、1-0.5ナノメートルサイズの金電極ギャップが25%以上の歩留まりで作製することに成功した。上記の手法により作製したサブナノギャップ電極を用いて、直径約0,8ナノメートルのフラーレン分子を対象に、電極間の電流計測による単分子検出を行った。その結果、金電極間に単一フラーレン分子が架橋したことを示唆するシグナルが観測され、このことから、今回開発した電極ギャップ作製手法が、単分子接合の作製に応用できるものであることを確認した。前年度開発した、エレクトロマイグレーション自己破断接合法による1ナノメートルサイズの電極ギャップ作製技術を応用し、面内型ゲーティングナノポアを作製した。この新規ナノ構造は、ナノメートルスケールの流路と、その中に組み込まれた電極ギャップで構成される。面内ゲーティングナノポアを用いたナノ電極間の電流計測により、生体分子の単一分子識別を実証した。一方、面内型ゲーティングナノポア構造を応用し、電極組込み型ナノ流路デバイスを作製した。このデバイスを用いて、流路を泳動する単二分子を、埋め込み電極間に印加する電圧により生じる静電場で制御することを試みた。その結果、ナノ流路を1方向に泳動する負に帯電した分子は、埋め込み電極間の静電場の影響により、カソード電極表面に引き寄せられ、泳動速度が大きく低下することを明らかにした。更に今年度は、ナノヒータ組込み型ナノ加工機械的破断接合を開発し、通電時に生じるAu単原子接点における散逸熱を評価した。その結果、準バリスティックにAu単原子接点を伝導するホットエレクトロンによるエネルギー散逸のため、電流の下流側においてホットスポットが生じることを明らかにした。本技術は、静電駆動型単一分子スイッチにおける最適なスイッチング性能をもたらす外部温度環境を検証する上での有用な実験基盤となることで、今後の単分子コンフィギュレーションスイッチの研究開発に活用されることが期待される。
雄性配偶子の細胞膜分子構造が制御する重複受精機構の解明

本研究は、被子植物に特有の重複受精における配偶子間相互作用を分子細胞生物学的に解析することを目的としており、特に雄性配偶子で同定された膜タンパク質の分子機能解明を目標としてきた。テッポウユリの雄性配偶子細胞(雄原細胞)で発現する遺伝子を網羅的に解析したRNAseqデータベースを基に、同細胞の膜タンパク質プロテオーム解析をおこなったところ、新規の膜タンパク質分子LGM1の同定に成功した。LGM1は4つの膜貫通ドメインを持つ低分子タンパク質であり、被子植物のみならず藻類、コケ植物、小葉類にも保存されていることが分かった。分子細胞生物学的解析の結果、LGM1は雄性配偶子特異的な発現を示した。被子植物を中心とする陸上植物は、食糧となる農作物から森林資源に至るまで我々人類の生活を支える重要な植物資源となっている。遺伝的多様性に富んだ植物資源を維持するためには、それを保証する有性生殖の仕組みの理解が重要な鍵と考えられる。本研究では、被子植物の受精(重複受精)において、雌雄の配偶子(精細胞・卵細胞)を融合へと導くタンパク質分子群を明らかにし、被子植物の繁殖を根底から支える重複受精の分子メカニズム解明を目指している。平成25年度は、近年新規に発見した雄性配偶子側受精制御因子GEX2の分子レベルでの機能解析を試みた。遺伝学的手法によって新たに見いだされた同因子はシロイヌナズナ精細胞の表面で特異的に発現する膜タンパク質であり、GEX2を正常に発現できない変異株は不完全な重複受精を見せることが分かった。そこで、GEX2が配偶子融合のどのような局面で機能するかを検証するために、GEX2変異株精細胞を受け入れた胚珠内の様子を詳細に観察した。胚珠内に存在する胚のう組織は細胞同士が密着しているため、雌雄配偶子の相互作用を観察するのは困難である。そこで新たな手法として、胚珠組織を細胞壁分解酵素で処理し、胚のう組織を細胞ごとに分散させる実験法を開発した。この手法によって、GEX2変異精細胞は卵細胞や中央細胞と安定した接着できないことが新たに分かり、GEX2は配偶子融合を安定化させる接着因子であると結論した。本研究成果を論文としてまとめ、米科学誌「Current Biology」(2014, 24(2):170-175)に発表した。論文は世界的にも注目されており、同雑誌の“Dispatch"(2014, 24(4):R164-R166)で紹介された。平成24年度は、近年新規に発見した雄性配偶子側受精制御因子の機能解析を試みた。遺伝学的手法によって新たに見いだされた同因子はシロイヌナズナ精細胞の表面で特異的に発現する膜タンパク質であり、同因子を正常に発現できない変異株は不完全な重複受精を見せることが分かった。現在、同因子は配偶子融合に先立つ配偶子接着・認識などの段階で働くものと予想している。また、植物受精の瞬間における配偶子膜の動態解析を行った。シロイヌナズナの配偶子特異的遺伝子を駆使し、雌雄配偶子の膜を特異的に標識した株について受精の様子を観察したところ、生きた組織内での配偶子膜融合の様子を観察することに成功した。一方、雌性配偶子側の受精因子は全く分かっておらず、イネの単離卵細胞を用いた雌性配偶子受精因子の探索を開始した。イネ卵細胞のサンプルは微量であるため、そこから抽出したmRNAを標的としたPCR法を適用した。その結果、卵細胞に特異的な遺伝子と思われるDNA断片を多数見いだすことに成功した。平成26年度は、テッポウユリ雄性配偶子細胞(雄原細胞)の膜タンパク質プロテオーム解析によって新規膜タンパク質LGM1の同定に成功した。花粉発生過程および各種組織間での半定量的RT-PCR解析によって、LGM1は花粉発生過程では雄原細胞形成期以降に発現し、雌性配偶子や体細胞組織には一切発現がないこと(花粉のみで発現すること)が分かった。花粉in situ hybridization解析の結果、LGM1は雄原細胞のみに発現することが分かった。また、研究代表者の発見である植物配偶子膜融合因子GCS1について、雌性配偶子側で発現することが予想されるGCS1パートナー分子探索のストラテジーを考案した。

GCS1は膜貫通ドメインを1つ持つI型膜貫通タンパク質であるため、膜貫通ドメインをGFPに置換したGCS1分子(GAH)は細胞外に分泌されるものと予想できる。このGAHを卵細胞特異的プロモーターの下流に連結し、卵細胞が特異的にGAHを放出するシロイヌナズナ株の作成に成功した。精細胞核をRFP標識した花粉で受粉を行った結果、同株では野生型に比べて、配偶子融合が滞る表現型があった。このことは、分泌型GCS1が卵側の受精因子をトラップしている可能性を示唆している。また、分泌型GCS1にはGFPタグが融合されているため、GFPをターゲットにしたpull-down法によってGCS1パートナーを単離できる可能性が期待されている。植物生理学これまで全く謎であった配偶子接着機構に、GEX2分子が関与していたことを世界で初めて明らかにした成果は想定以上に大きいと考えられる。また、次世代シーケンサーを用いて得られたテッポウユリの花粉生殖細胞の全遺伝子カタログをベースに、新規雄性配偶子膜タンパク質の網羅解析も進行中であり、新たな植物雄性配偶子膜タンパク質LGM1の単離にも成功した。以上の理由から、表記の評価としたい。新規植物雄性配偶子受精因子の解析をメインテーマとして進行しているが、ほぼ予定通りの進展を得ている。テッポウユリの花粉生殖細胞の全遺伝子カタログを用いた新規雄性配偶子膜タンパク質の網羅解析も進行中であり、新たな植物雄性配偶子受精因子の単離が期待される。また、新たに開始した雌性配偶子受精因子の探索法も昨年度内に確立されたため、今後の展開が期待できる。平成25年度のうちに新たな受精因子が同定できれば翌年度内にその発現・機能解析を完了することができる見通しである。平成26年度は、新たに単離した、LGM1タンパク質分子の発現局在・機能解析を試みる。興味深いことに、LGM1は被子植物のみならず緑藻・コケ植物・シダ植物にもオーソログが見いだされており、緑色植物進化の中で保存されてきた機能が期待できる。また、雌性配偶子(卵細胞・中央細胞)側で発現すると予想される受精因子(上記GEX2のパートナー分子など)を単離する計画も現在進行中であり、世界で初めてとなる被子植物雌性配偶子側受精因子の同定につなげたい。平成25年度以降は、昨年度から解析を行っている新規雄性配偶子受精因子の機能解析を進行すると同時に、テッポウユリ花粉生殖細胞膜タンパク質の網羅解析から新たな受精因子の探索を試みる。昨年度のうちに同細胞の膜画分の精製に成功しており、質量分析の準備は完了しているため、解析結果から同細胞で顕著な候補を絞り、発現解析を開始する。モデル植物シロイヌナズナでホモログが同定できるものは逆遺伝学的手法による機能解析を行う。また、イネ卵細胞を用いた特異的遺伝子スクリーニングの実験系も確立したため、雌性配偶子受精因子の同定にも注力する。上記の通り、今年度に新たな受精因子の同定・発現解析を行う予定であるが、シロイヌナズナの栽培環境拡大の必要が予想される。新たな栽培装置(人工気象器)の購入を検討しているが、実験スペースなどの問題が生じる場合は他機関へ共同研究等の申請も検討している。該当なし