hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
新しいT細胞由来好酸球遊走因子の精製とアレルギー疾患における意義について

本研究において、我々が樹立したT細胞株(STO-2)はPI5,6,7,8および9の5つの異なる好酸球遊走因子を産生しているが、各遊走因子はそれぞれ異なる生物作用を示す事を明らかにした。また、これらの因子の多く(PI6,7,8および9)は現在発見されているエオタキシンやランテスなどのケモカインをはじめとする好酸球遊走因子と全く異なる因子と予想されていた。臨床的な応用においても、これまで好酸球が関与するヒト疾患患者の好酸球を用いて上記のSTO-2由来好酸球遊走因子に対する遊走能を検討を進め、以下の事実が明らかになった。1木村氏病患者の好酸球の遊走は皮膚症状の有無により異なる。2アトピー性皮膚炎患者の好酸球の反応性は合併症の有無や重症度によって異なる。3気管支喘息患者の好酸球の遊走能は、重症度によって異なり、とくにステロイド使用の必要性の有無を知ることができる。4好酸球性肺炎患者の場合には再発しない急性好酸球性肺炎患者と再発を繰り返しやすい慢性好酸球性肺炎患者の鑑別や治療効果の判定に利用される、等が明らかにされた。さらに我々は、STO-2由来の好酸球遊走因子のうち喘息患者のT細胞が抗原刺激によって産生遊離するECF-PI7について精製を進め、高度精製された因子に対するポリクローナル抗体を用いてcDNAクローニングの作製を試み、新しい好酸球遊走因子のcDNAを得た。この因子は分子量約3.6kDのガレクチンファミリーに属する好酸球特異的な遊走因子で、Ecalectinと名付け、現在リコンビナントEcalectinの作製、さらにはEcalectinに対するモノクローナル抗体やRT-PCR法に用いるプライマーを作製し、Ecalectinの生物学的作用をより明らかにするとともに、喘息をはじめとするアレルギー疾患患者の肺胞洗浄液などを用いてこの遊走因子の臨床における意義について検討を進めている。我々が樹立したT細胞株(STO-2)はPI5,6,7,8および9の5つの異なる好酸球遊走因子を産生するが、各遊走因子はそれぞれ異なる生物作用を示した。また、これらの因子の多く(PI6,7,8および9)は現在発見されている好酸球遊走因子と異なる因子と予想されていた。これまで好酸球が関与するヒト疾患患者の好酸球を用いて5つのSTO-2由来ECLに対する遊走能を検討したが、過好酸球症候群や木村氏病患者の好酸球はPI5ないしPI6の分画のみ遊走する事を明らかにした。このことから患者好酸球はすでに末梢血の段階で正常と異なることが示唆され、疾患の診断や予後との関係が予想された。本年の研究では、STO-2由来の5つの遊走因子の精製を進め、そのうちECF-PI7についてはアミノ酸の一次構造の一部が明らかにされ、現在遺伝子工学的手法を用いて、DNAのクローニングを展開中である。またECF-PI5およびECF-PI9についても高度の精製が目前でアミノ酸一次構造決定の準備中である。臨床応用に関してはアトピー性皮膚炎患者の好酸球の上記好酸球遊走因子に対する反応性を検討した結果、合併症の有無や重症度によって好酸球の反応が異なることを明らかにした。さらに、気管支喘息患者の好酸球を用いて我々の遊走因子や既知の因子に対する遊走能を検討すると、重症度、とくにステロイド使用の必要性の有無を知ることができると思われた。

好酸球性肺炎患者の場合には再発しない単純性ないし急性好酸球性肺炎患者と再発を繰り返しやすい慢性好酸球性肺炎患者の鑑別が上記の方法で可能であることや、治療効果の判定にも利用される可能性が示唆された。今後好酸球のフェノタイプ等を検討し、さらに好酸球遊走因子の高度精製品やリコンビナント製品を作製し、好酸球のヘテロジェナイティと疾患の病態や予後の判定との関与を明らかにしていきたい。本研究において、我々が樹立したT細胞株(STO-2)はPI5,6,7,8および9の5つの異なる好酸球遊走因子を産生しているが、各遊走因子はそれぞれ異なる生物作用を示す事を明らかにした。また、これらの因子の多く(PI6,7,8および9)は現在発見されているエオタキシンやランテスなどのケモカインをはじめとする好酸球遊走因子と全く異なる因子と予想されていた。臨床的な応用においても、これまで好酸球が関与するヒト疾患患者の好酸球を用いて上記のSTO-2由来好酸球遊走因子に対する遊走能を検討を進め、以下の事実が明らかになった。1木村氏病患者の好酸球の遊走は皮膚症状の有無により異なる。2アトピー性皮膚炎患者の好酸球の反応性は合併症の有無や重症度によって異なる。3気管支喘息患者の好酸球の遊走能は、重症度によって異なり、とくにステロイド使用の必要性の有無を知ることができる。4好酸球性肺炎患者の場合には再発しない急性好酸球性肺炎患者と再発を繰り返しやすい慢性好酸球性肺炎患者の鑑別や治療効果の判定に利用される、等が明らかにされた。さらに我々は、STO-2由来の好酸球遊走因子のうち喘息患者のT細胞が抗原刺激によって産生遊離するECF-PI7について精製を進め、高度精製された因子に対するポリクローナル抗体を用いてcDNAクローニングの作製を試み、新しい好酸球遊走因子のcDNAを得た。この因子は分子量約3.6kDのガレクチンファミリーに属する好酸球特異的な遊走因子で、Ecalectinと名付け、現在リコンビナントEcalectinの作製、さらにはEcalectinに対するモノクローナル抗体やRT-PCR法に用いるプライマーを作製し、Ecalectinの生物学的作用をより明らかにするとともに、喘息をはじめとするアレルギー疾患患者の肺胞洗浄液などを用いてこの遊走因子の臨床における意義について検討を進めている。
ヒト気道-肺胞上皮系における幹細胞の免疫組織学的同定と分離培養

ヒト気道-肺胞上皮系における幹細胞は"niche cell"として広く理解されつつある。下気道系の深部粘膜の上皮には前癌病変とされる扁平上皮化生が起こりにくく、同じ下気道でも気管支領域では扁平上皮化生と扁平上皮癌が発生しやすいとの事実がある。肺癌のcommitted precursor cellを探すことは、健常な上皮へのprecursor cellをさがすことでもあるとの仮定を設けた。すなわち、niche cellがbasal cell, goblet cell, ciliated cellへ分化しうるstem cellと考えたわけである。生体の気道上皮がapoptosisによりregenerationを発揮することは生理学的現象である。癌化を促す外来性ないし内因性刺激がかなりの期間にわたって継続することでbasal cell様上皮となり、ciliogenesisへと向かわずにsquamous metaplasiaに転向し、その刺激が継続されることで発癌にむかうことになると推測した。今年度の特異的成果は、protease activated receptor(PAR)1,PAR2の機能に関して新たな成果が望めるものとなった。PARの活性化により細胞増生、サイトカイン放出、運動性亢進が明らかとなった。PAR2が気道に見出された事実と、気道上皮が皮膚としての潜在能を具備することからこの推測は妥当性が高いと信じられる。好中球浸潤の豊富な慢性気道病変の形成において上皮の剥離と再生が繰り返される。その際新生を促す幹細胞について注目すべき基礎的情報が得られ、剥離と再生を繰り返す中で発生してくる上皮細胞が幹細胞由来であるとみなしたいが、今後ともこの領域での検索を継続したい。癌の発生は多段階におよぶ遺伝子の傷害にもとづくことで知られる。癌細胞は、その発生する組織細胞に形態学的な類似性を示すことでよく知られている。この形態学的特徴は分化を示す癌細胞ほど明瞭である。すなわち正常細胞の持つ免疫組織学的特異性を維持していることが多い。今回われわれは、肺癌のcommitted precursor cellを探す目的で最も高度に分化した原発性肺腺癌を対象とした。これらの癌の中でも、気道や肺胞上皮に起源(クララ細胞、II型肺胞上皮細胞、終末気道立方上皮細胞)をもつ細気管支肺胞上皮癌(粘液産生細胞を除く)10例の免疫組織学的分析を試みた。ホルマリン固定-パラフィン標本ないし未固定凍結標本にて、次のような抗体を用いて免疫組織化学法を実施した。そのタンパク質の存在が意味するところを記載すると、Cytokeratin(K)17:気道肺胞上皮細胞、K14:上位の基底細胞の形質、CC10:クララ細胞、SP-A:II型肺胞上皮の産生アポプロテイン、ABCA3:サーファクタント封入体膜タンパク)、TypeIV collagen:上皮の汎基底膜、Type VII collagen:気道上皮特異的基底膜などである。その結果、癌細胞はII型肺胞上皮の性格と、クララ細胞の性格を発現することが明らかになった。それは、気道上皮と肺胞上皮両者の特徴を発現することであり、気道肺胞系上皮細胞に共通する成人幹細胞の存在を想定しても矛盾しないものと思われた。今年度はこの内容に関する血管系の関与について検索した結果、肺癌の進展に伴い肺胞壁の血管が気道系毛細血管に特異性を示す形態に転換したことを明らかにした。以上より肺癌は肺胞上皮と気道上皮の両者に分化する幹細胞ないし同等のcommitted precursor cellに由来すると考えた。テーマの基礎は"癌の発生は多段階におよぶ傷害にもとづく"ことにある。下気道系の粘膜上皮細胞は扁平上皮細胞を欠如する。しかし、前癌病変に扁平上皮化生があり扁平上皮癌が発生する事実は良く知られている。その肺癌のcommitted precursor cellを探すことは重要である。私たちは、この細胞の表皮への分化も視野に入れることで気道系が潜在性皮膚であることを示唆してきた。本年度は気道特異タンパク分解酵素として発見されたhuman airway trypsin-like protease(HAT)が皮膚病変形成に影響を与えるか、あるいは全く関係ないかを知る目的でHATと膜受容体であるprotease activated receptor(PAR)1, PAR2の関連を検索した。PARの活性化は細胞に増生能、サイトカイン放出能、運動性などをもたらすことで知られる。そしてPARはセリンプロテアーゼにより限定分解されて活性化されるが、HATがその代役を果たすと推測した。そこで、好中球浸潤の多い尋常性乾癬組織を用いてホルマリン固定-パラフィン標本ないし未固定凍結標本を作成し分子病理学的検索をした。その結果、病変ケラチノサイトのPAR2がHATにより活性化されそれによってinterleukin(IL)8が放出される事実を見出した。このサイトカインが好中球浸潤による病変形成に重要な役割を果たす可能性を示唆出来た。HATとPAR2が気道に見出されることから、好中球浸潤の豊富な慢性気道病変の形成において上皮の剥離と再生が繰り返される。その際新生を促す幹細胞について注目すべき基礎的情報が得られた。今後剥離と再生を繰り返す中で発生してくる上皮細胞が幹細胞由来であるとみなし、検索を継続する予定である。

下気道系の深部粘膜の上皮には前癌病変とされる扁平上皮化生が起こりにくく、同じ下気道でも気管支領域では扁平上皮化生と扁平上皮癌が発生しやすいとの事実がある。肺癌のcommitted precursor cellを探すことは、健常な上皮へのprecursor cellをさがすことでもあるとの仮定を設けた。すなわち、niche cellがbasal cell, goblet cell, ciliated cellへ分化しうるstem cellと考えたわけである。生体の気道上皮がapoptosisによりregenerationを発揮することは生理学的現象である。癌化を促す外来性ないし内因性刺激がかなりの期間にわたって継続することでbasal cell様上皮となり、ciliogenesisへと向かわずにsquamous metaplasiaに転向し、その刺激が継続されることで発癌にむかうことになると推測した。今年度の特異的成果は、protease activated receptor(PAR)1,PAR2の機能に関して新たな成果が望めるものとなった。PARの活性化により細胞増生、サイトカイン放出、運動性亢進が明らかとなった。PAR2が気道に見出された事実と、気道上皮が皮膚としての潜在能を具備することからこの推測は妥当性が高いと信じられる。好中球浸潤の豊富な慢性気道病変の形成において上皮の剥離と再生が繰り返される。その際新生を促す幹細胞について注目すべき基礎的情報が得られ、剥離と再生を繰り返す中で発生してくる上皮細胞が幹細胞由来であるとみなしたいが、今後ともこの領域での検索を継続したい。
DNAを文化人類学的視点から読み解く研究

1.物質文化に関する比較研究今年度は、メソアメリカ南東部からメキシコ湾岸やメキシコ中央部における太鼓腹の石彫を対象として、メキシコ中央部において資料を収集した。動きやすい遺物を研究するために、蛍光X線分析に関する基本データを得るために、エルサルバドル遺産局の許可を得て、エルサルバドル国内から出土した緑色の石(ヒスイ、トルコ石、蛇紋岩他)から作られた遺物の写真を撮影し、エルサルバドル国内の緑色の石製品のデータベースを作成するための資料を得ることができた。2.DNA分析によるヒトの集団遺伝学的研究現代のエルサルバドル人のDNA試料(頬粘膜試料)をJuan Carlos Monterrosa(エルサルバドル最高裁DNA研究所)氏の協力を得て、また、先住民(ピピル族)であると自己申告した試料提供可能な人物から3つの集落でのDNA分析用試料(頬粘膜試料)を文化人類学者Jorge Lemus(ドン・ボスコ大学)氏の協力を得て、インフォームド・コンセントをとり、採取した。それらの全ての試料について、採取地、性別、年齢以外の個人情報を除き、非連結匿名化した試料を搬送し、DNAを抽出後、法科学分野で一般的に個人識別用使用される常染色体上の15座位のSTRs (short tandem repeats)を解析し、エルサルバドルにおけるデータベースを作成した。また、公表されている世界中のデータベースのデータと併せて集団遺伝学的解析を行った。その結果、先住民ピピルは、メキシコ南部の同じナワ語系先住民と遺伝的に近縁であることが示唆された。そのため、地理的に両者の間に分布するグァテマラ共和国の先住民との関係を知る必要性が生じたので、グァテマラ共和国の法医学研究所と連絡を取り、DNA分析用試料の提供を打診した。また、同研究所が行ったDNA分析結果に関する情報提供についての意見交換を行った。1.物質文化に関する比較研究動きにくい遺物である石彫の調査を継続した。ベラクルス大学で、太鼓腹の石彫の写真を撮ると共に必要な情報も収集した。また、携行型蛍光X線分析器による分析を円滑に進めるために、エルサルバドル国立人類学博物館で緑色の石の石製品の分析を始めた。年度ごとの当初の計画は少し異なるが、3年計画内の調査と研究は順調に進んでいる。2.DNA分析によるヒトの集団遺伝学的研究先住民ピピルなどのSTR解析から、その遺伝的な出自に関する新たな結果が得られたので、メキシコ南部とエルサルバドルを繋ぐDNA分析試料若しくはデータを得るために、グァテマラの法医学研究所との連携を考慮した。このために、グァテマラにおいて同研究所との協力を模索した。その結果、将来的な協力が得られる可能性が見いだされたので、今後、有効に時間を使って当初の計画に支障をきたさないように、グァテマラでの先住民を対象とした研究への発展も考慮している。以上の理由で、当初計画とは少し異なるが、おおむね順調に計画は進んでいる。1.エル・トラピチェ地区出土石彫とエルサルバドル出土石彫を、より北のメソアメリカ諸地方や南の中間地域の諸文化でみられる石彫と比較する。このため、今までメキシコ、グァテマラなどで収集した基本資料から、石彫にみられる特徴を分析する。一方、蛍光X線分析により産地同定を実施し、持ち運びやすい遺物の交易ルートを解明する。そして、主に運びやすい石製品にみられる短期の文化の変化と記念碑的な石彫にみられる長期の文化の変化を分析し、メソアメリカ辺境部における文化交流の実体を解明する。最後に、物質文化の移動史を再構築する。2.エルサルバドルの先住民ピピル族の集落で、インフォームド・コンセントをとり、男性のDNA試料(頬粘膜試料)を現地研究協力者により追加採取する。これらを非連結匿名化した後、抽出DNA試料として、また、既収集DNA試料のうち男性のDNA試料について、また、法科学分野で使用されるY染色体上の17座位のSTRsを解析し、エルサルバドルにおけるデータベースを作成する。また、公表されている世界中のデータベースのデータと併せて集団遺伝学的解析を行う。そして、エルサルバドル周辺諸国、特に、メキシコ南部とをつなぐ、グァテマラ共和国における先住民のDNA試料採取あるいは既存データの取得を模索し、法科学分野での常染色体上の15座位のSTRs及び17座位のY-STRsによる集団遺伝学的解析を行う。最終的に、DNA分析の成果を基にして、先住民の遺伝的な特質を明らかにする。3.メソアメリカ辺境部における交差点の役割を解明する研究物質文化に関する比較研究を基にして、DNA分析による人類の遺伝学的特質をその起源ごとに分けて分布図を作成する。さらに、物質文化の歴史的な起源を明らかにして、DNA分析による遺伝形質の起源分布図を、時期毎に分けて、歴史的な物もしくは人の移動を明らかにする。1.物質文化に関する比較研究本研究ではエルサルバドルで中心となった遺跡であるチャルチュアパ遺跡から出土した移動しにくい遺物である石彫から研究を進めた。また、動きやすい遺物を研究するために、蛍光X線分析に関する基本データを得るために、グァテマラにおいてヒスイのサンプルを収集した。チャルチュアパ遺跡タスマル地区で出土した王権に関する資料(ヒスイ・トルコ石製品など)を分析し、メソアメリカ文明における王権に関連する遺物と比較研究する基礎資料を整理するために、エルサルバドル遺産局の許可申請を行った。

2.DNA分析による人類の遺伝学的研究現代のエルサルバドル人のDNA試料(頬粘膜試料)をJuan Carlos Monterrosa(エルサルバドル最高裁DNA研究所)氏の協力を得て、また、先住民(ピピル族)であると申告した試料提供可能な人物から3つの集落でのDNA試料(頬粘膜試料)を文化人類学者Jorge Lemus(ドン・ボスコ大学)氏の協力を得て、インフォームド・コンセントをとり、採取した。それらの全ての試料について、採取地、性別、年齢以外の個人情報を除き、非連結匿名化した試料を搬送し、DNAを抽出後、法科学分野で一般的に使用される常染色体上の15座位のSTRs (short tandem repeats)を解析し、エルサルバドルにおけるデータベースを作成した。また、公表されている世界中のデータベースのデータと併せて集団遺伝学的解析を行った。一方、グァテマラ共和国では、法医学研究所と連絡を取り、DNA分析用試料の提供を打診した。また、同研究所が行ったDNA分析結果に関する情報提供についての意見交換を行った。1.物質文化に関する比較研究動きやすい小さな遺物を最初に扱う予定であったが、計画を開始する時期が遅かったために、当局などの許可を得ることができなかった。このため、次年度以降に予定していた動きにくい遺物である石彫から調査研究を始めることとした。また、自然科学的な分析も加えるために携行型蛍光X線分析器を借りることとし、その準備を29年度にした。また、標準となる試料を得るためにグァテマラでヒスイの標本を収集した。年度ごとの当初の計画は少し異なるが、3年計画内の調査と研究は順調に進んでいる。2.DNA分析による人類の遺伝学的研究メキシコ南部とエルサルバドルを繋ぐDNA分析試料若しくはデータを得るために、グァテマラの法医学研究所との連携を考慮した。このために、グァテマラにおいて同研究所との協力を模索した。結果として、今後の協力が得られそうである。このために、グァテマラでの調査研究も視野に入れている。このために、グァテマラでの調査研究に割く時間が必要となるが、今後、有効に時間を使って当初の計画に支障をきたさないようにする。以上の理由で、当初計画とは少し異なるが、おおむね順調に計画は進んでいる。1.物質文化に関する比較研究今年度は、メソアメリカ南東部からメキシコ湾岸やメキシコ中央部における太鼓腹の石彫を対象として、メキシコ中央部において資料を収集した。動きやすい遺物を研究するために、蛍光X線分析に関する基本データを得るために、エルサルバドル遺産局の許可を得て、エルサルバドル国内から出土した緑色の石(ヒスイ、トルコ石、蛇紋岩他)から作られた遺物の写真を撮影し、エルサルバドル国内の緑色の石製品のデータベースを作成するための資料を得ることができた。2.DNA分析によるヒトの集団遺伝学的研究現代のエルサルバドル人のDNA試料(頬粘膜試料)をJuan Carlos Monterrosa(エルサルバドル最高裁DNA研究所)氏の協力を得て、また、先住民(ピピル族)であると自己申告した試料提供可能な人物から3つの集落でのDNA分析用試料(頬粘膜試料)を文化人類学者Jorge Lemus(ドン・ボスコ大学)氏の協力を得て、インフォームド・コンセントをとり、採取した。
推進エンジン搭載型有機ナノ粒子の作製と組織浸透性評価

眼には様々なバリア機能が発達しているため、点眼液の眼内移行性は低いとされている。眼組織の奥まで薬剤を浸透させる目的でナノ粒子点眼液使用したとしてもその浸透性はまだまだ十分でない。これはナノ粒子の浸透エネルギーが濃度勾配による受動拡散だからである。ナノ粒子一個に推進力を生むエンジンを搭載させた、自動推進型ナノ粒子の作製を試み、ナノ粒子の生体組織浸透性を高める検証実験を行い、薬剤ナノ粒子の組織浸透性を格段に高める挑戦的研究に取り組んだ。エンジン搭載自動推進型ナノ粒子の作製を試みた。種々の測定装置を用い、作製したナノ粒子の構造物性解析を行った。通常の薬剤粒子において約100nm近傍の薬剤ナノ粒子を作製することに成功した。またH26年度に向けた予備検討として、推進エンジンを搭載しないナノ粒子点眼液を作製し、実験動物の眼に点眼したところ、ナノ粒子のナノサイズ効果により薬剤の眼内移行性が高まることが明らかとなった。H25年度の研究実施により、H26年度に実施予定のエンジン搭載自動推進型ナノ粒子点眼液の開発と薬物の眼内移行性評価につながる有効な成果を得ることに成功した。またナノ粒子の眼内移行性評価において有効なツールと成り得る蛍光性ナノ粒子の作製にも成功した。エンジン搭載自動推進型のナノ粒子の作製を試みた(特許性のため詳細技術は未記載)。推進エンジンナノ粒子点眼液の原型となる薬剤ナノ粒子点眼液を作製し、実験動物の眼に点眼したところ、ナノ粒子のナノサイズ効果により薬剤の眼内移行性が高めることに成功した。エンジン搭載自動推進型ナノ粒子点眼液のプロトタイプとして使用できると考える。いくつかの国際学会(招待講演等)で成果発表を行った。本成果は学術誌(査読有)に発表予定である。将来的に、引き続き研究遂行を発展させ、組織移行性を高めた推進エンジンナノ粒子点眼液の研究開発を実施したい。有機ナノ材料化学H25年度の目標達成、すなわち1エンジン搭載自動推進型ナノ粒子の作製と2物性評価(粒子サイズ、分散安定性等)について一定の成果を得ることに成功し、またH26年度の研究実施計画に繋がる予備的実験データの取得にも成功したため、研究はおおむね順調に進展していると考える。平成26年度の目標である、作製したエンジン搭載自動推進型ナノ粒子が、実際に高い眼組織浸透性を有するか実験動物を用いた点眼実験により明らかにする。具体的には、1、2を中心的に実施。1エンジン搭載自動推進型ナノ粒子点眼液の動物への点眼:作製したエンジン搭載自動推進型ナノ粒子点眼液を実験動物であるマウスやウサギに投与する。2眼内移行性評価:高速液体クロマトグラフィー(HPLC)を用い点眼液の眼内移行性を評価する。本年度において、推進エンジン搭載型有機ナノ粒子の作製と組織浸透性評価により得られた有効性をまとめあげ、本研究課題の意義を実証する予定。研究計画はおおむね予定通りに進行中である。申請当初の予算額より少ない予算での実験遂行となったため、次年度に継続的に研究遂行ができるよう、本年度はできる限り必要最小限の予算執行へ計画を変更し研究を遂行した。また成果発表に向け、特に学会への旅費等をH26年度に使用したいこともあり、次年度使用額が生じた。H26年の研究遂行に向け、必要な試薬・実験動物等の消耗品、学会発表のための旅費、論文成果発表のための謝金・その他の予算を執行予定である。
P2×7レセプター選択的阻害剤BBGを用いたアポトーシス抑制による網膜神経保護

網膜においてもP2X7レセプター依存的に視細胞がアポトーシスを起こしていた。細胞死刺激により細胞内へのCaイオン流入は細胞死のかなり早い時期に既におこり始め、この過程で細胞膜の透過性亢進、Caspaseやcytochrome c、AIF等アポトーシス関連シグナル伝達分子の挙動を確認した。P2X7レセプターknockoutマウスを用いて検討し、P2X7レセプターの選択性の裏付けを進めた。これら細胞死や細胞内シグナル伝達は選択的阻害剤BBGで抑制された。<P2X7レセプター選択的阻害剤BBGを用いたアポトーシス抑制による網膜神経保護>我々は様々な網膜疾患で、神経細胞がアポトーシスを起こし、ミトコンドリアに局在するアポトーシス促進因子の核内移行が重要な役割を果たすことを報告したが、この実行過程を効果的に抑制することは困難である。臨床研究において近年BBGにはP2X7受容体の非生理的阻害作用があることが解ってきた。今回、神経細胞のアポトーシスのより初期の過程である細胞表面チャンネル抑制による染色剤BBGの神経保護効果について検討をすすめた。<網膜由来神経細胞初代培養系を用いたin vitroの実験>細胞死の刺激としては神経培養液中の神経栄養因子B27supplementを除去した低栄養刺激と腹腔より誘導したマクロファージを添加する細胞傷害刺激を用意し、P2X7レセプターを介してCaイオンの流入により細胞死が誘導されることを確かめた。細胞内へのCaイオン流入は細胞死のかなり早い時期に既におこり始めることを発見した。この過程で細胞膜の透過性亢進、Caspaseやcytochrome c、AIF等アポトーシス関連シグナル伝達分子の挙動を確認した。同様の実験をP2X7 knockoutマウスを用いて検討し、P2X7レセプターの選択性を裏付けを進めている。mまた阻害剤BBGを用いることでP2X7受容体を阻害し、細胞内へのCaイオン流入、caspase 8の活性化、DNA断片化、いずれも減少させることを証明できた。網膜初代培養系は無事確立することができ、順調にすすんでいる。昨年度は培養細胞系において細胞死のメカニズムについて明らかにすることができた。本年度はこのメカニズムについてこの分子の関与を明らかにするとともに、当初の計画に基づいて動物実験において同様の作用機序を確かめる。またこれらの仮説の裏付けを得るために、同様の細胞培養、動物実験をP2X7受容体ノックアウト動物を用いて確認する予定である。当初の計画に基づき、研究試料、論文投稿費、学会旅費等に使用予定である。
大規模環境リスク評価のための統計解析法の実証的研究

Bangladeshに2010.10.5から11.20まで世良教授とShafiqul氏(長崎大学博士課程院生)とが出張し、バングラデシュ農業大学Jevu准教授の案内のもと、Comilla地区におけるヒ素汚染レベルの高い村の住民890名(全村民の60%)を抽出し、曝露量推定に必要な情報(使用井戸の汚染レベル、使用期間)と健康情報(性、年齢、身長、体重、血圧、疾病の有無)を調査し、さらに毛髪を数本採取した。毛髪を日本に持ち帰り、PIXE分析により、砒素を含む20種類以上のミネラル量を測定した。その後、毛髪ヒ素量を目的変数、曝露情報(性別、年齢、井戸の汚染レベル、使用期間)を共変量とする重回帰分析を行ったが、重相関係数が0.1と著しく低いため、曝露情報から毛髪ヒ素量を推定することを断念した。原因は、飲用している井戸の汚染レベルと毛髪ヒ素量との関連が予想に反して弱いことにある。井戸水以外のヒ素摂取要因として、小売されている食品と自家栽培している野菜がヒ素に汚染されていることを予想した。そこで、2010.12.20月から1.20に再びComilla地区を訪れ、米、魚、野菜・果物(小売と自家栽培)など日常食されている食品150点余を乾燥し日本に持ち帰り、PIXE分析により砒素を含むミネラル量を測定した。その結果(次ページ記載サイトにて参照可能)、143食品中のヒ素量は平均0.9、SD 0.7,最大4(単位ppm)であった。平均値が日本における食品の砒素の規制値1ppmに近いという、信じがたい汚染食品であることが判明した。毛髪砒素量は常用している井戸水からの砒素摂取量よりも、日常的に食している食品からの砒素摂取量の方が数倍多いことが見込まれる。本研究の目的を達成するためには、食品中の砒素量及び家族毎の食品別食品摂取量の推定値が必要なことが結論された。このため、世良岩手医大教授の科研費Bの分担者として、23年度中に、再度Comilla地区を訪問し、住民の食習慣調査を実施することで、研究目的達成を計画している。Bangladeshに2009年10月5日から11月20日まで世良教授とShafiqul氏(長崎大学博士課程院生)とが出張し、バングラデシュ農業大学Jevu准教授の案内のもと、Comilla地区における2つの特に砒素汚染レベルの高い村の住民2441名(全村民の60%)を抽出し、個人ごとにアンケート並びに健康調査を実施した。調査項目は、曝露量推定に必要な情報(使用井戸の汚染レベル、使用期間)、健康情報(性、年齢、身長、体重、血圧、疾病の有無)、さらに890名を抽出し毛髪を数本採取した。毛髪を日本に持ち帰り、PIXE分析をおこない、砒素を含む20種類以上のミネラル量を測定した。また回収されたアンケートを全てパソコン入力した。現在は信頼度が低いと判断された検体の再測定の準備をしているが、この業務は3月中には終了し、890名の精度の高いミネラル推定量を確定する予定である。その後、PIXE測定により得られた毛髪ミネラル量の値を目的変数、(性別、年齢、井戸の汚染レベル、使用期間)を共変量とする重回帰分析を行うことにより、ミネラル量を推定するための重回帰式を構成する。その式を用いて、2441名全ての対象者についてミネラル量の不偏推定値を求める。その推定値の精度を正確に求めておくことが、次年度のリスク推定において要求されるので、平成1819年度科研費(メタボリックシンドローム症候群診断基準の疫学的意義を明確にするための統計解析理論の開発)で開発された「移設可能性」の条件を満たすように、適切な前処理を施す。平均値が日本における食品の砒素の規制値

1ppmに近いという、信じがたい汚染食品であることが判明した。毛髪砒素量は常用している井戸水からの砒素摂取量よりも、日常的に食している食品からの砒素摂取量の方が数倍多いことが見込まれる。本研究の目的を達成するためには、食品中の砒素量及び家族毎の食品別食品摂取量の推定値が必要なことが結論された。このため、世良岩手医大教授の科研費Bの分担者として、23年度中に、再度Comilla地区を訪問し、住民の食習慣調査を実施することで、研究目的達成を計画している。
希ガスを用いたハロゲン元素の宇宙化学的研究

我々はこれまでに、Yamato-74191隕石やAllende(CV3)隕石中のCAI(Ca-Al-rich inclusion)に極めて高濃度のハロゲン(Cl, Br, I)を希ガス分析に基づいて予見していた。原始太陽系星雲中で固体粒子が凝縮するときにハロゲンは揮発性元素として振る舞うと一般に考えられおり、CAI中に観測されるこの高濃度のハロゲンを生成するメカニズムを説明することは難しい。これは、ハロゲンの宇宙化学的振る舞いに付いて我々の知識が欠落していることも要因である。本研究では、.主としてAllende隕石中のCAIからマトリックスにかけて、レーザーを使った希ガス抽出法を併用して空間分解能150ミクロン程度で希ガス同位体分布を測定した。測定された^<129>Xe濃度の分布は、EPMAにより測定された塩素濃度分布と良い相関を示した。^<80>Kr/^<84>Krと^<128>Xe/^<132>Xe比も^<129>Xe/^<132>Xe比が高い測定点で高い値を示している。^<80>Krと^<128>Xeは宇宙空間で^<79>Brと^<127>Iによる中性子捕獲反応で生成されたものである。本研究で得られた結果は、CAI中のハロゲンが水質変成でソーダライトが形成される過程に伴って外部から入ってきたものであることを示している。また、このようなハロゲン由来の希ガス同位体がCAIと接触しているマトリックス物質中に全く検出されないことから、CAI中の高濃度ハロゲン含有物質は太陽系星雲中で形成されたものであり、CAIがマトリックス物質に埋め込まれて母天体を作った後の産物で無いことが明らかになってきた。更に、高濃度の^<129>Xeがソーダライトに含まれていることは、水質変成は消滅核種^<129>Iがまだ多量に生き残っているような太陽系形成の極めて初期に起こったことを示している。本研究では、隕石中の希ガス同位体組成をレーザー・プローブ脱ガス法を用いて測定することにより、ハロゲン含有量が高い隕石やAllende隕石のコンドルールやCAI中のハロゲン元素の分布を調べる。この特色は、分析困難な微量ハロゲンの隕石中における分布を、宇宙空間における天然の中性子照射による核反応^<35>Cl(n,β)^<36>Ar,^<79>Br(n,β)^<80>Kr,^<127>I(n,β)^<128>Xeなどとレーザ・プローブによる超高感度希ガス局所分析を適用することにより解明することである。二年計画の初年度は、以下のような研究を行った。1)Y-74191の薄片(厚さ約300ミクロン)を切り出して表面の組成を顕微鏡観察した後、パルスYAGレーザー(プローブ径は約50ミクロン)を用いた希ガス抽出と希ガス同位体組成の測定を行なった。分析ポイント数はまだ十分でないが、マトリックスに比べてコンドルール内部の^<80>kr,^<129>Xe,含有量と同位体比^<80>Kr/^<84>Kr,^<129>Xe/^<132>Xeがともに高いのに対して、捕獲成分である^<84>Kr,^<132>Xe含有量に顕著な違いは見られなかった。

この結果は、コンドルールが星雲中で変成を受けてハロゲンを獲得した可能性を示している。今後、コンドルール内部のハロゲン分布を測定することにより、変成のメカニズムを明らかにする。2)上で用いたパルスレーザーでは、加熱のための出力を精密にコントロールする事が困難であったため、既存の連続YAGレーザーにQスイッチを用いたパワーコントロールを増設した。これにより、従来より精度の高い加熱脱ガスが可能となった。本研究では、隕石中の希ガス同位体組成をレーザー・プローブ脱ガス法を用いて測定することにより、ハロゲン含有量が高い隕石やAllende隕石のコンドルールやCAI中のハロゲン元素の分布を調べる。この特色は、分析困難な微量ハロゲンの隕石中における分布を、宇宙空間における天然の中性子照射による核反応^<35>Cl(n,β)^<36>Ar,^<79>Br(n,β)^<80>Kr,^<127>I(n,β)^<128>Xeなどと、レーザー・プローブによる超高感度希ガス局所分析を適用することにより解明することであり、世界的にも最初の試みである。二年計画の二年度は、以下のような研究を行った。1)Allendeの薄片(厚さ約300ミクロン)を切り出して表面研磨した後、光学顕微鏡と国立極地研究所(NIPR)の走査型電子顕微鏡を用いて鉱物組成を詳細に調べた。この結果をもとに、NIPRのEPMAを用いて白色包有物(CAI)を重点的に調べて塩素・カリウムのマッピングをおこなった。塩素、カリウムはCAIの周辺に濃集しており、外部からの変成に伴ってこれら元素が難揮発性元素からなるCAIに侵入したことを示す。2)Nd-YAGパルスレーザー(プローブ径:約50ミクロン)を用いて、塩素濃度の高い領域と検出限界以下の領域の希ガス同位体組成を系統的に測定した。3)この結果、CAIを囲むマトリックスやCAIの低塩素領域に比べて、CAI中の塩素・カリウム濃集領域において、明瞭に^<129>Xe含有量と同位体比^<80>Kr/^<84>Kr,^<129>Xe/^<132>Xeがともに高いことが分かった。この結果は、CAIが母天体に捕獲される以前に、原始太陽系星雲中で変成を受けてハロゲンを獲得したことを強く示唆している。この結果は、本研究で初めて明らかにされたものであり、惑星形成過程の解明に重要な制約条件を与えるものであり、本年5月にアメリカで開催されるGoldschmidt Conferenceで発表する。
脊椎動物共通DOP-PCRプライマーを用いた大規模遺伝子発現解析法の開発

マイクロアレイ法はあらかじめ明確なトランスクリプトームを必要とするため、環境中の多様な動物種には必ずしも適当でない。本研究では魚類から高等哺乳類までの7種の動物に共通した8mer程度の反復倒置配列がトランスクリプトームの約30%に存在することを明らかにした。Degenerate oligonucleotide-primed PCR(DOP-PCR)法に基づき、誤増幅率を考慮すれば40-70%を増幅する可能性がある275種の共通プライマーを選定した。このシステムを用いて、ダイオキシン感受性遺伝子をニワトリの他、遺伝的背景に乏しいカワウ胚の肝臓でも見いだすことが出来た。Unigeneが公開されている8種(カニクイザル、イヌ、ウシ、マウス、ニワトリ、ニシツメガエル、トラフグ、ゼブラフィッシュ)において8merの場合11, 143の共通反復倒置配列が存在した。この中から8merにおいて各動物毎の標的遺伝子数が50500、GC含有数が5または6という条件から275種を選定し、特異配列としたモノプライマーを設計した。このプライマーセットは各動物種で全トランスクリプトームのうち約2043%を標的としている。これら275種の脊椎動物共通DOPモノプライマーを用いてdifferential display (DD)法を実施した結果、2, 3, 7, 8-tetrachlorodibenzo-p-dioxin (TCDD)暴露によりゼブラフィッシュ全身およびニワトリ胚の肝臓で発現量を著変させる既知および未知の遺伝子群を検出することができた。また、前述の8種以外であり遺伝的背景が知られていない野生動物であるカワウ胚の肝臓に対して本法を実施したところ、同様に対照群と比べてTCDD暴露群において発現量が変化したバンドが得られた。従って、本脊椎動物共通DOP-PCRモノプライマーを用いたDD法は遺伝子情報が明らかでない多様な動物種を対象とした新しい半網羅的な遺伝子発現解析法として有用であることが示唆された。昨年度までに確立した、半網羅的遺伝子発現解析法(脊椎動物共通DOP-PCRプライマーを用いた大規模ファレンシャルディスプレイ(DD)法)の有効性を確かめるため、カワウなど汚染野生動物試料を入手してダイオキシン応答遺伝子を探索した。また比較のためニワトリについても検討した。1)琵琶湖に生息するカワウのダイオキシンレベルとその応答遺伝子:我々の既報のとおり、琵琶湖に生息するカワウ成鳥由来の肝臓は非常に高いダイオキシンレベルを示した。しかし、個体ごとのばらつきが大きく、大規模DD法で常に発現変化が確認できたのは我々が既報したCYP1A4と1A5だけであった。そこで、琵琶湖沿岸で採取したカワウ胚を実験室へ持ち帰り、in ovoでダイオキシン(TCDD)を注入し、肝臓試料の大規模DD法を実施したところ、CYP2AF1と未知ncRNAを検出できた。CYP2AF1は成鳥の肝臓ではダイオキシン濃度と全く相関しないことから、その応答性は胚特異的であると考えられた。2)ニワトリ胚肝臓におけるダイオキシン応答遺伝子:カワウ胚と比較するため、ニワトリ受精卵にTCDDを投与し、肝臓について大規模DD法を実施したところ、既報のCYP1A4や1A5の他、これまでダイオキシンとの関係を報告されていない9種の遺伝子と1種の未知遺伝子の発現変化が認められた。水銀汚染が報告されている奄美大島や沖縄のマングースについては、高度汚染個体が捕獲されなかったので検討していない。共同研究者がマングース肝由来の樹立細胞に取り組んでいるが、まだ途中段階である。A培養細胞系を用いたダイオキシン応答遺伝子の探索:計画していたニジマス血管内皮培養細胞を作出することができなかったため、ゼブラフィッシュ、ティラピアについても検討したが安定した培養細胞系を確立することができなかった。B探索遺伝子の機能解析:1)新しいダイオキシン毒性影響の定量法の開発:ゼブラフィッシュを含めた稚魚はダイオキシン毒性のモデルとして確固たる地位を得ているが、その最も特徴的といえる心臓周囲の浮腫の発生機序はいまも不明である。我々が以前確立した心臓周囲腔の画像解析による定量法は心臓が占める割合が高いために、浮腫が起きても変化率が高いことが問題であった。そのため、心臓と胸腔前部の間にできる浮腫の小腔について高速度カメラを用いて心臓の最大拡張期の画像を取得することで定量化し、検出感度を30倍程度改善した。2)ダイオキシン毒性における新たな標的:1)の実験系を用いて、遺伝子ノックダウンと特異的阻害薬を用いることで、2型シクロオキシゲナーゼ(COX2)-トロンボキサン(TBX)経路が浮腫でも関与すること、中脳血流遅延と非常によく似た応答性を示すことを確認した(全米毒性学会2012)。また、トロンボキサンの放出源を検討するため、栓球増殖に必要な遺伝子をノックダウンしたところ、ダイオキシン浮腫が回復することを見いだした。
不純物多価イオンの磁気双極子禁制線を利用したプラズマ分光計測の新展開と可能性

大型ヘリカル装置を用いて不純物多価イオンから放出される磁気双極子禁制線が可視域で強く発光していることを発見した.従来では真空紫外領域でしかできなかったプラズマコア部での不純物計測を可視域に拡張することに成功し,これを用いて不純物の定量化,空間分布,イオン温度計測及び磁気面計測等幅広いプラズマ診断応用に道を開いた.大型ヘリカル装置を用いて不純物多価イオンから放出される磁気双極子禁制線が可視域で強く発光していることを発見した.従来では真空紫外領域でしかできなかったプラズマコア部での不純物計測を可視域に拡張することに成功し,これを用いて不純物の定量化,空間分布,イオン温度計測及び磁気面計測等幅広いプラズマ診断応用に道を開いた.平成17年10月より開始されたLHD実験において,アルゴンパフ及び不純物ペレット入射を行うことにより,磁気双極子禁制線に関する詳しい観測と同定を行った.これらのスペクトル観測にあたっては可視及び真空紫外の2つの領域で研究を進めた.また,可視域アルゴン多価イオン禁制線の2次元画像を観測するために,CCDカメラに干渉フィルターを取り付け,計測を開始した.具体的な研究実績は下記の通りである.1.LHDのアルゴン放電を用いて首尾よく多くのアルゴン多価イオン磁気双極子禁制線を可視及び真空紫外の両領域で観測・同定することに成功した.禁制線の放出メカニズムを解明するためにArX可視禁制線(5533Å)と共鳴線(165.53Å)との強度比を測定した.強度比の明瞭な密度依存性が明らかとなり,その結果,禁制線を放出する基底状態上準位の占有密度は密度の上昇と共に飽和し,輻射遷移から電子及びイオン衝突脱励起が支配的となっている事が実験的に初めて明らかとなった.同様な観測をTiやFeに関しても行った(Physical Review誌に投稿予定).2.TiやFeの禁制線に関しては高エネルギーイオン衝突による励起が期待され,現在,NBI高速イオン励起を含めた禁制線放射強度計算とデータ解析を進めている(Letterとして投稿予定).3.可視域磁気双極子禁制線の偏光分光を開始し,通常の電気双極子遷移とは偏光方向が全く逆であることが明らかとなった.また,得られたデータのσ及びπ成分の強度比から,NBI高速イオン励起から結論付けられるスペクトル線の偏光成分を解析し始めている.4.CCDカメラによる画像計測により,ArXの2次元像を取得することに成功した.Hα光による画像とは明らかに異なっており,現在,3次元磁気面構造との比較を行っている(速報として投稿予定).平成18年度はこれまでのアルゴンに加えてより高Z原子からの磁気双極子禁制線を観測するために高Z不純物ペレット入射の準備を行った.通常の固体不純物ペレットの手法ではMoやWを入射した場合にはプラズマが放射崩壊を起こすので不純物ペレットの構造に特別な工夫を要する.また,真空紫外領域の分光計測系を更に充実させるため,3m直入射分光器を用いた空間分布計測の性能向上にも力を注いだ.具体的な研究実績は下記の通りである.1.昨年度に引き続き,磁気双極子禁制線と共鳴線の強度比に関する密度依存性についての研究を行った.このために可視及びEUV分光器の絶対較正を行った,その結果,簡単なモデルを仮定した準位占有密度解析結果との比較が可能となった.実験で求めた強度比の密度依存性は解析結果とおおむね良い一致を示した.この結果から磁気双極子禁制線の発光機構を実験的に証明することができた.結果をJournal of Quantitative Spectroscopy and Radiative Transfer誌に投稿した.2.3m直入射真空紫外分光器の光学調整,光軸調整,ミラー光学系の最適化及び分光器の結像調整等を行った.その結果壁からの反射光を除去することに成功し,空間分布計測の信頼性が向上した.また,スペクトル分解能も向上し,ほぼ全てのスペクトル線についてイオン温度算出することが可能となった.一部の結果をRev.Sci.Instrum.に公表した.3.高Z不純物ペレットを改良するために2種類の方法を考案した.一つはカーボンペレットに高Z元素をコーティングした2層ペレットであり,他方はカーボンペレット軸中心に高Z元素細線を内蔵した同軸型ペレットである.Fe,Mo及びWについて試作したペレットをLHDに入射した結果,プラズマを放射崩壊させることなく高Z元素からのスペクトルを観測することに成功した.結果をJpn.J.Appl.Phys.誌に投稿した.平成19年度はLHDにおける高Zペレットや高Z放電を利用して,多価に電離された高ZイオンからのEUV領域を含む真空紫外及び可視スペクトルを観測した.それを解析することにより多数の磁気双極子禁制線(M1)を発見及び同定した.特にMoやW等の高Z材料は将来の燃焼プラズマ(例えばITER)においてプラズマ対抗材料として使用することが見込まれており,それら多価イオンの振舞いを可視領域で観測するための貴重なデータを取得した.また,燃焼プラズマで重要な役割を担うα粒子計測のためにM1遷移を利用することを提案し,その基礎実験を行った.具体的な研究実績は下記の通りである.1.主にArを例にとりM1遷移発光に関する物理機構(温度・密度依存性,高エネルギーイオン衝突影響等)を明らかにした.

その結果,簡単なモデルを用いてそのスペクトル強度を計算することが可能となった.2.磁気双極子禁制線の観測に必要な高Zペレットの溶発プラズマのパラメータや溶発位置を実験的に明らかにした.また,水素ペレット溶発プラズマとの比較を行った.3.高Z多価M1遷移イオンのプラズマ中での振舞いを調べるために径方向不純物輸送に関する解析を行った.4.M1遷移スペクトルを同定するために様々な元素のVUV及び可視スペクトル構造の解析を行った.5.MoやWのEUV領域でのスペクトルを観測し,ITER等での計測の基礎データを算出した.6.M1遷移の偏光スペクトルを観測し解析した.その結果,偏光を用いることにより高エネルギーイオン衝突成分を選択に観測できることを示し,そのイオンの密度やイオンの磁力線に対するピッチ角を計測できることを示した.7.高閉じ込めプラズマでの(M1遷移を発光する)多価イオンの振舞いを調べるために,Hモード様プラズマを研究した.高閉じ込めプラズマでは高Zイオンは中心に集まる傾向があり,M1遷移を用いたプラズマ計測には有利に働くことが判った.平成20年度はLHDにおける高ZペレットやArパフ通常放電を利用して,多価に電離された高ZイオンからのEUVスペクトルを観測した.同時に昨年度に引き続き,可視域及びVUV域でも観測を継続した.特にMoやW等の高Z材料は将来の燃焼プラズマ(例えばITER)においてプラズマ対抗材料の一部としてその候補に挙げられており,各波長領域でそれら多価イオンのスペクトル構造を研究した.また,Ml遷移を利用した燃焼プラズマで重要な役割を担うα粒子計測の可能性を追求するために,実験データを下に計算を行った.その他,具体的な研究実績は下記の通りである.1. Ar禁制線の2次元画像をCCDカメラと干渉フィルターの組み合わせで観測した.結果をHα光等の他の2次元像と比較した結果,Ar禁制線は明らかに磁気面構造を有していることが分かった.2.可視域磁気双極子禁制線を利用して多価イオンの不純物量の解析を試みた.正確な励起係数が把握できれば高精度でその定量化が可能であること示した.D-T燃焼プラズマではトリチウムや中性子の影響から真空紫外分光がやりにくくなることが予想され,可視域での不純物分光が可能になればその意義は非常に大きい.3.可視禁制線と真空紫外許容線の強度比を利用して,真空紫外分光器の絶対較正の精度向上を目指し実験を行った.4.可視域磁気双極子禁制線を用いたα粒子計測の可能性はα粒子密度に大きく依存することが判った.生成されるα粒子にモジュレーションを与えることができれば実現可能性は大きくなる.一方,NBI等の高エネルギー粒子の計測は偏光分光を利用することで実現可能性が高いことを示した.
アルコ-ル脱水素酵素は酢酸発酵中にアポ化する

1.アルコ-ル脱水素酵素(ADH)のアポ化の機構に関して(1)Gluconobacter属酢酸菌はその成育後期にADHが一部その補酵素であるPQQを遊離してアポ化する。種々の培養条件でこの現象を検討したところ、培地中のpHの低下にともなってアポ型ADHが形成されることが示された。(2)菌体およびその細胞膜をpH4以下のBufferでインキュベ-トすることによって時間とともにADHのアポ化が進行することが示された。(3)アポ型ADHのPQQによるホロ化にはカルシウムイオンの存在が必須であり、、pH6付近で最も効率良くホロ化が起こることが示された。この時のPQQの結合のKm値は122nMであることも明らかとなった。(4)アポ型ADHはホロ型ADHと異なり、細胞膜からトリトンで可溶化されずコ-ル酸によって良く可溶化されることから、その構造がPQQの脱落によって大きく変化することが示唆された。2.ADHの構造と機能に関して(1)ADHはαβγのサブユニット構造を有し、そのαサブユニットにはPQQとヘムc各1分子が結合しており、βサブユニットには2分子のヘムcが結合していることが既に知られている。この構造と機能との関係を調べる目的で、αβγ構造の解体再構成を試みた。(2)ADHをpH5条件でイオン交換クロマトグラフィ-を行うことによって、αγ成分とβ成分とに解離することができた。(3)このαγ成分は著しくADH活性を低下させており、β成分は全くその活性を欠いていたが、両者を等量で再構成することによって本来の活性を回復することが示された。
真珠腫性中耳炎に対するDNAメチル基転移酵素を標的としたエピゲノム創薬の有効性

これまで研究者の所属機関にて採取されたヒト真珠腫組織検体および同様の組織像を呈する表皮嚢胞の手術検体について検鏡を行ったが、充分な量の角化扁平上皮細胞の基底層の細胞が採取されておらず、評価対象とするに不適切であった。2018年度新たに採取した真珠腫検体については、周囲粘膜層を含めて検体採取するように採取方法を改めることで、真珠腫matrixを含んだ評価が可能となった。なお、研究者が産休・育休を取得し、2018年4月より復職したものの、児の養育のため研究業務への専念が困難であり、研究に大幅な遅れを生じている。2017年10月より産休、育休を取得した。2018年4月より臨床業務を再開し、当初研究についても同時に再開予定であったが、児の養育のため研究業務の継続が困難となり、2019年4月よりの再開となったため、大幅な遅延を生じた。前年度手術にて採取した真珠腫組織について、正常ヒト皮膚・鼓膜をコントロールとし、DNAメチル化酵素(Dnmt3a,Dnmt3b)のmRNA及びタンパク質レベルでの発現確認を行う。また、研究者はこれまでにマウス耳介角化扁平上皮細胞においてdnmt3a阻害剤である3,3'-二没食子酸テアフラビン投与による遺伝子発現への影響をマイクロアレイにより解析しており、そのデータを用いてヒトにおける角化扁平上皮細胞の過剰増殖に関与する遺伝子の推定を行う。当該標的遺伝子の発現をヒト真珠腫組織およびコントロール組織においてmRNAレベルおよびタンパク質レベルで確認し、前述のDNAメチル化酵素発現との相関性を検証する予定である。これまで所属機関にて採取されたヒト真珠腫組織検体および同様の組織像を呈する表皮嚢胞について検鏡を行ったが、充分な量の角化扁平上皮細胞の基底層の細胞が採取されておらず、今回の評価対象とするにて不適であったことから、新規の検体採取が必要となった。ヒト真珠腫性中耳炎の新規臨床組織検体採取にあたり、所属機関での検体の採取方法及び保管方法の取り決めを行ない、新たに採取する真珠腫検体の管理のため、データベースの作成を行なった。現在、検体の使用については倫理委員会での承認準備中である。研究者が産休・育休を取得したために、研究に大幅な遅れを生じている。なお、2018年4月より復職し、再開している。これまで所属機関で採取された真珠腫組織検体について検鏡を行なったが、十分な上皮組織が採取された検体が非常に少なく、研究での使用は不可能と判断した。新規に採取する組織検体については、院内での取り扱い方法の取り決めに時間を要し、倫理委員会への承認申請が遅れた。また、研究者が10月より産休・育休に入ったため研究を中断しており、大幅な遅れが生じた。院内倫理委員会において承認を受け次第、ヒト真珠腫検体採取を開始する。採取した真珠腫組織について、正常ヒト皮膚・鼓膜及び表皮嚢胞組織をコントロールとし、DNAメチル化酵素(Dnmt3a,Dnmt3b)のmRNA及びタンパク質レベルでの発現確認を行う。mRNAレベルの解析については、採取した真珠腫検体をmatrix層とperimatrix層に分離することに困難が予想されることから、組織切片をlaser micro dissectionを用いて角化上皮細胞層を単離し、リアルタイム定量PCRにてRNAの定量的解析を行う予定である。また、研究者はこれまでにマウス耳介角化扁平上皮細胞において、dnmt3a阻害剤である3,3'-二没食子酸テアフラビン投与による遺伝子発現への影響をマイクロアレイにより解析しており、そのデータを用いて角化扁平上皮細胞の過剰増殖に関与する遺伝子の推定を行う。当該標的遺伝子の発現をヒト真珠腫組織およびコントロール組織においてmRNAレベルおよびタンパク質レベルで確認し、前述のDNAメチル化酵素発現との相関性を検証する。