hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
急速眼球運動におけるサル大脳半球間競合を担う神経経路の同定：光遺伝学的fMRI

マカクザル大脳皮質弓状溝前壁の神経活動抑制が行動変化を引き起こす過程で、大脳領野間の多数の長距離相互連絡からなる機能的ネットワークにどのようなメカニズムが存在するのかはいまだ解明されていない。本研究は、機能的核磁気共鳴画像法(fMRI)実験中のマカクザルに対して弓状溝前壁の可逆的な不活性化を施し、大脳皮質広域にまたがる脳領野間機能的結合強度に皮質局所活動変化が及ぼす大域的影響を検出した。とくに、微小注入領域から遠く離れた2脳領野間の機能的結合においても、その強度変化が、微小注入領域と遠隔領野との間の平常時の機能的結合と定量的関係をもっていることを見出した。本研究の目的は、マカクサル前頭眼野を局所不活性化することで眼球運動課題において引き起こされることが知られている行動変化が、不活性化により影響を受ける多数の神経経路のうちどの経路の変化に起因しているのかを同定することである。大脳局所不活化時には、操作を施した部位の神経活動が抑制されるだけでなく、神経軸索投射を通じてその影響が多くの脳領野に及ぶと予想される。平成二十五年度は、弓状溝前壁の局所不活化の全脳への影響について、functional MRI(fMRI)実験およびfunctional connectivity(機能的結合性)解析を用いて基本的な知見を得ることを目的とした。そのために、麻酔下のマカクサルにおいてMRI装置内で弓状溝前壁にGABAA作動薬ムシモルによる可逆的不活性化を施し、それによる脳領野間機能的結合の変化をfMRIにより計測する実験を行った。その結果、施した不活性化は局所的なものであるにもかかわらず、機能的結合性の変化は、不活化領域がもつ解剖学的結合に対応する箇所にとどまらず、大脳の広域にわたる領野間において同定された。しかもこれらの変化は不活化領域と各脳領野との平常時の機能的結合と関係することが分かった。また与えた操作はGABAA作動薬による神経活動の抑制であるにもかかわらず、同定された機能的結合性の変化は増強・抑制の両方向の変化が確認された。この結果により弓状溝前壁の抑制から行動変化へとつながる中間過程としての脳領野間結合変化について知見を得ることができた。今後この結果についてさらに詳細な解析の上、対外発表を行う予定である。本研究は、大脳眼球運動関連領野の神経活動抑制に伴う一側消去現象が、抑制領域がもつ多数の長距離神経投射のうちいずれの欠落に起因しているのか特定することを目的としている。前年度より、弓状溝前壁をGABAA作動薬微小注入により可逆的に不活性化した麻酔下マカクサルにおいて機能的核磁気共鳴画像法(fMRI)実験を行い、大脳皮質の局所抑制が長距離神経投射を通じて全大脳脳領野間機能的結合に及ぼす影響を調べている。今年度は実験および解析を継続し、まず前年度に見出された現象、とくに局所不活性化による脳領野間機能的結合の変化と、微小注入領域と脳領野との間の平常時の機能的結合との関係の再現性を確認した。さらに、機能的結合性で定義される大脳領野間ネットワークの機能的モジュール構成が、局所的な皮質の抑制により大規模に変化していることが分かった。この結果は、大脳皮質領野の局所活動変化が脳領野間ネットワークに大域的な因果的影響を引き起こしていることを示している。マカクザル大脳眼球運動関連領野とくに弓状溝前壁の神経活動抑制に伴って、大脳領野間の多数の長距離相互連絡にどのような大域的変化が引き起こされるのかを調べることを目的としている。これまでに、弓状溝前壁をGABAA作動薬(ムシモル)の微小注入により可逆的に不活性化した麻酔下マカクザルにおいて機能的核磁気共鳴画像法(fMRI)実験を行い、大脳皮質広域にわたる脳領野間機能的結合強度に皮質局所不活性化が及ぼす影響を調べてきた。とくに、微小注入領域から遠く離れた2脳領野間の機能的結合においても、その強度変化が、平常時の微小注入領域と遠隔領野との間の機能的結合と定量的関係をもっていることが示されたが、本年度はこれまでに見出してきた大域的現象が、不活性化脳部位に依るものであるかどうかを検証するために、他の大脳皮質領野(一次体性感覚野)においてもGABA作動薬微小注入による活動抑制中のfMRI実験を遂行し、弓状溝前壁不活化実験で検討された定量的関係について同様の解析・検討を行った。本研究の結果は、微小な皮質領域の神経活動変化を局所の信号処理だけでなく広域の皮質ネットワークにわたる大域的な協調活動の一端としてとらえる視点に関連して局所活動から大域ネットワークへの因果的・定量的な影響に関する知見を提供するものであり、また今後の展開として皮質脳波法を用いた実験を通じて電気生理学的な局所活動変化と広域領野間相互作用ネットワーク動態との間の関係を検証する予定である。

とくに、微小注入領域から遠く離れた2脳領野間の機能的結合においても、その強度変化が、微小注入領域と遠隔領野との間の平常時の機能的結合と定量的関係をもっていることを見出した。大脳皮質の局所的不活性化によって引き起こされる全脳領野間機能的ネットワークの変化について、前年度までに得られた結果を発展させた知見を得ることができた。fMRIで計測された機能的結合ネットワークから定義される大脳皮質のモジュール構造は、個体行動に含まれる認知的要素と対応していることが以前より指摘されている。本年度に局所神経活動変化とモジュール構造の変化の因果的関係について知見が得られたことは、本研究の目的である行動変化に因果的にかかわる神経経路を探索するうえで本質的であり、研究は順調に進行している。認知神経科学弓状溝前壁のGABA作動薬による局所不活化に伴う全脳の領野間機能的ネットワーク変化について、対外発表としてまとめる。本研究のこれまでの研究結果により、局所的な神経活動の変化によって大脳領野間ネットワークが全脳領域にわたって影響を受けることが分かったが、その中で行動変化に因果的に影響を与えているネットワークレベルの現象を探索していきたい。今後さらに、脳の広い範囲にわたって時間的に詳細なダイナミクスを明らかにすることが可能な皮質脳波(ECoG)も導入して、薬理学的神経活動操作・電気刺激・光遺伝学的手法といった方法論の併用実験を通じて大脳ネットワーク変化が個体行動へとつながる因果関係の解明を目指す。本研究は、大脳眼球運動関連領野の不活性化に伴い行動に引き起こされる変化が、どの領野間神経経路の欠落に起因するのかを特定することを目指すものであるが、その第一段階として本年度に計画されていたのは、弓状溝前壁の局所的不活化によって全脳にわたる脳領野間機能的結合がどのように変化するかについて基本的な知見を得ることであった。大脳において神経投射が非常に複雑なネットワークを形成していることや、機能的結合が単に解剖学的結合とは一致するわけではないという過去の研究から、局所的な不活性化が全脳領域の間の機能的結合に与える影響は予想・推定が非常に困難であるため、不活性化から行動変化が引き起こされる中間段階としての脳領野間機能的結合性の変化に関する知見を得るうえで、また本研究において今後行動変化に因果的にかかわる神経経路を探索するうえで、この第一段階の研究は非常に重要であると考えている。本年度はこの第一段階のデータの収集と解析の結果基本的な知見を得ることができ、本研究は順調に進行している。年度末現在さらに詳細な解析を加え、この研究成果について対外発表を行う準備を進行中である。動物(ニホンザル)の購入を次年度以降に行うこととした。機材・試薬については所属研究室で購入していたものを使用するなど研究を効率的に推進した。また次年度以降に予定される外部発表の機会に必要な費用を配分することとした。平成二十五年度に引き続き、GABA作動薬による弓状溝前壁の局所不活化に伴う全脳の領野間機能的結合性の変化についてさらに詳細な解析を行い、対外発表としてまとめる。今後光遺伝学的手法のマカクサル大脳の関心領域における有効性を検証する予備実験ならびにサルの行動課題訓練を進行して以上の方法論の併用実験を目指す。本研究のこれまでの結果により、弓状溝前壁の局所不活化によって大脳の領野間機能結合は全脳の広範囲にわたって影響を受けることが分かったが、その中で行動変化に因果的に影響を与えている現象を探索していきたい。実験に使用する動物(ニホンザル)を、次年度以降に購入する計画にしている。
半導体-金属原子界面層の電界放射・イオン顕微鏡による評価

当研究は、個々の原子のトンネル物性の立場から下地金属表面上に真空蒸着されたSi単原子層レベルでの吸着構造、電子状態、Si-金属原子界面の原子配列構造およびSi-金属界面反応について電界放射・イオン顕微鏡法(FEM・FIM)により調べられた。Si原子の下地原子層内への拡散効果を調べるため、まず低温でSi蒸着後、最表面層から下地Wの第5原子層まで一原子層毎を電界蒸発法により剥ぎ取り、その都度仕事関数の変化が調べられた。結果は下地Wの第3原子層で初めてW固有の仕事関数の値になる。つまり、下地Wの第2原子層迄Siの存在を示唆さる。しかし、FIM法によるSi-W界面での界面反応では低温の下での蒸着に於いては、Si-W間の界面反応は識別されない。しかし、600Kの加熱処理の下では局所的には両原子間の界面反応が認められる。今後は、電界放射エネルギー分析器(FEES)による高分解能の電子状態の解明が求められる。
1987年直撃台風で生じた対馬・龍良山原生林の林冠ギャップの復元初期相の研究

龍良山の照葉樹林は海抜120mから山頂(海抜560m)に及び、面積は約100haである。海抜350m以下はスダジイ/イスノキ林、上方はアカガシ林である。調査項目は次の通り。1)スダジイ/イスノキ林に面積4haの永久方形区を設定し、胸高直径5cm以上の木本の生育位置、種別、胸高直径の測定、2)頂上に達する全長940m、幅10mのベルトトランセクトを設定し上記と同様の測定、3)低地から山頂まで、林冠木から林床までの林冠ギャップを除いた群落組成の調査、4)林冠ギャップ部位の群落組成の調査、5)林冠ギャップ部位のコケ植物の調査、6)ギャップ部位における樹木実生の生長の測定。下記の結果を得た。1)林冠ギャップは低地のスダジイ/イスノキ林に集中し、ギャップの大きさは520mで、5m四方のメッシュ総数1600個のうちギャップは274個で森林面積の17.1%に達した。2)胸高直径分布では、二山型(スダジイ)、逆J型(イスノキ、サカキ、ヤブツバキ等)、正規型(ウラジロガシ)があり、全生存木では逆J型であった。3)低地山頂の植生傾度において、高木、低木、草本個体直群すべてにおいて海抜350ー400mで急激な組成の交替があり、種類密度は不変化、種多様度は低下した。4)ギャップ部位と非ギャップ部位の林床植生の比較により、次のギャップ指標植物(木本)が明らかとなった(出現頻度の高い順に)。イイギリ、アカメガシワ、サルナシ、カラスザンショウ、ハゼノキ、カジノキ、オオクマヤナギ。またギャップ部位で実生密度が高くなる照葉樹林要素はスダジイとカクレミノである。5)ギャップ指標のコケ植物の上位5種は、ホソバオキナゴケ、カタシロゴケ、トサヒラゴケ、エダウロコゴケモドキ、ツクシナギモドキ。6)ギャップ部位における実生の直径と高さの相対生長関係では、生長係数が高い上位5種は次の通り。ウラギンツルグミ、オガタマノキ、カラスザンションウ、カジノキ、クロキ。調査項目は次の通り。下記の結果を得た。対馬・龍良山のスダジイ・イスノキ林において、4ha(1辺200m)の方形区の調査から下記の結果を得た。1)5m四方のメッシュ総数1600個のうちギャップは274個で、2)その個々のギヤップの大きさは520mであった。3)ギヤップ部位は5mメッシュの単位で地図化した。4)その結果、森林面積に対するギャップ面積の比は17.1%であることが判明した。5)4ha方形区内の胸高直径5cm以上のすべての樹木について(シイ・カシ類については樹高1.3m以上、胸高直径5cm以下含む)、樹種名・胸高直径・位置・生死を測定記録、胸高直径5cm以上の総個体数4754本(枯死木284本含む)のうちイスノキが36.8%を占めた。また相対胸高断面積ではスダジイ39.7%、イスノキ32.5%であった。

類似度は海抜高度に従って93%から28%に低下し、多様度は緩やかに低下した。6)胸高直径分布では、スダジイは二山型、イスノキ、ヤブツナキ、サカキは逆J字型、ウラジロガシは正規型を示した。また空間分布においては、スダジイ、ウラジロガシ、タブノキでは、方形区サイズの増加に伴い集中分布からランダム分布に近付き、イスノキ、ヤブツバキではすべての枠サイズでランダ分布に近い集中分布であった。7)ギヤップを指標種としては、木本:アカメガシワ、イイギリ、カジノキ、カラスザンショウ、サルナシ、こけ植物:ハイゴケ、ヒロハツヤゴケが明らかとなった。7)4ha永久方形区においては、枠内の胸高直径5cm以上の総ての生立木、枯死立木の位置、種名、胸高直径を記録し、生立木については個々の樹木の生長、枯死が追跡できるよう、将来の調査に備えた。龍良山の低地(約120m)から山頂(海抜560m)まで、幅10mのベルトトランセクトを設定した。ベルトの総延長は940mとなった。胸高直径5cm以上の樹木について、種別、生死の判定、胸高直径の測定とナンバリング、ならびに林冠ギャップの調査を行った。ベルトトランセクトの全長を50mごとに区切ると、0.05ha(最上部は0.04ha)のベルト19個(Bー1Bー19)となる。次の結果を得た。1)Bー1からBー12まではイスノキ、スダジイ、ウラジロガシが優占しているが、Bー13から上方Bー19まではアカガシ優占林となった。その変化は急激である。2)各ベルトの最大木はイスノキ、スダジイ林で大きく(最大個体は115cm)、アカガシ林で小さい(最小は45cm、最大でも85cm)であった。3)Bー1Bー19のいずれにおいても、全生存木の胸高直径分布は逆J型であった。林冠ギャップは低地のイスノキ、スダジイ林に集中しているこかが明らかとなった。この原因はまだ明らかでない。ギャップ部位と非ギャップの林麻植生の比較により、ギャップ部位の植生の特色が明らかとなった。1)ギャップ指標植物(大本)は次の通り(出現頻度の高い順に)。イイギリ、アカメガシワ、サルナシ、カラスザンション、ハゼノキ、カジノキ、オオクマヤナギ。2)ジャップ部位で実生密度が高くなる照葉樹林要素はスダジイとカクレミノである。3)これらの植物の実生における直径と高さの相対生長関係は、将来、発生時不明のギャップの履歴の推定に寄与するので、以下の植物の生長関係を測定した。生長係数が高い上位5種は次の通り。ウラギンツルグミ、オガタマノキ、カラスザンション、カジノキ、クロキ。4)ギャップ指標のコケ植物の上位5種は次の通り。ホソバオキナゴケ、カタシロゴケ、トサヒラゴケ、エダウロコゴケモドキ、ツクシナギモドキ。
らせん状両極性有機半導体の創製と高耐久な有機薄膜太陽電池の開発

本課題では、有機薄膜太陽電池に半永久的な安定性を賦与するため、正孔と電子の両方のキャリアを輸送可能な新材料“らせん状両極性半導体"の開発を目指して研究を行った。本研究により、らせん状ポリマーの主鎖骨格に沿って、半導体ユニットを規則配列させる手法を確立した。さらに、半導体ユニットがサブマイクロメートルオーダーに渡って“超高密集積化"することも明らかとなった。平成26年度は、「電子ドナー性のオリゴチオフェンOT」と「電子アクセプター性のナフタレンジイミドNDI」が共有結合で連結したD/A連結ユニットを側鎖に規則配列したらせん状ポリペプチドを合成し、その光学的特性について検討を行った。アミノエチル基含有ビチオフェン(1a)またはターチオフェンユニット(1b)を合成し、ナフタレン-1,4,5,8-テトラカルボン酸二無水物及びL-リジン誘導体とのイミド化反応、続く環化反応を行うことにより側鎖にD/A連結ユニットを導入したN-カルボキシ-α-アミノ酸無水物(2a及び2b)の合成を行った。得られたモノマーの開環重合を行うことにより、ポリペプチド誘導体(poly-2a及びpoly-2b)を得た。得られたポリマーの円二色性(CD)及び吸収スペクトルをTHF溶液中で測定した結果、いずれのポリマーにおいても明確なコットン効果が観測されることが分かった。ポリマー主鎖の吸収領域には、ポリペプチドが高次構造を形成していることを示唆する特徴的なCD吸収が観測され、側鎖に導入したD/A連結ユニットの吸収領域にも明確なコットン効果が観測されることが分かった。ビチオフェンユニットを有するpoly-2aと比べてターチオフェンユニットを導入したpoly-2bの方がD/A連結ユニットに由来するCD強度が増大しており、これは構成チオフェン環数が増えたことにより、側鎖間のπ-πスタッキングが効率的に作用したためだと推察される。Poly-2bのIRスペクトルを測定したところ、1630 cm-1付近に、ポリペプチド骨格がβシート構造を形成していることを示唆するピークが観測され、CDスペクトルの結果とも一致した。以上の結果から、本ポリマーはポリペプチドに特有の高次構造を形成しており、主鎖に沿って側鎖のD/A連結ユニットが不斉な環境で配列していることが明らかとなった。平成27年度は、“主鎖を構成する全ての原子上に望みの機能性側鎖を高密に導入可能なポリイソシアノペプチド"に着目し、“導入するアルキル基の種類や構成チオフェン環数が異なるオリゴチオフェンユニット"を側鎖に導入したポリイソシアノペプチド誘導体を系統的に合成し、側鎖構造が高次構造形成に与える影響について詳細に検討を行った。また、当該イソシアニドモノマーの鏡像体過剰率が、重合挙動や生成ポリマーの高次構造形成能に及ぼす影響についても検討を行った。その結果、側鎖オリゴチオフェンユニットを精緻に構造設計することで、ポリマー主鎖がらせんコンホメーションを取り得ることを見いだし、そのらせん構造に沿ってオリゴチオフェンユニットを高密度規則配列させることに成功した。具体的には、五つのチオフェン環が連結したキンクチオフェンユニットに直鎖アルキル基を導入したポリマー(poly-1)が、主鎖の吸収領域にらせん構造形成に由来する特徴的な円二色性(CD)吸収を発現するとともに、オリゴチオフェンユニットの吸収領域に励起子カップリングに由来する分裂型のコットン効果(長波長側から負-正の符号)を示すことを明らかにした。当該イソシアニドモノマーは対応する吸収領域に明確なCD吸収を示さないことも確認している。これらの結果は、主鎖らせん構造に沿ってオリゴチオフェンユニットが反時計回りにずれながらスタッキングしていることを示唆している。また、poly-1を合成する際、当該モノマーの鏡像体過剰率が、重合挙動や生成ポリマーのらせん構造形成能に非常に敏感に影響を及ぼすことも見出している。これは、「生長末端近傍と挿入されるモノマー間」あるいは「側鎖ユニット間」に作用する水素結合やπーπスタッキング相互作用さらには立体障害等の絶妙なバランスにより、「著しい重合速度の加速」及び「らせん構造の安定化」が生じたものと推察している。交付申請時には、平成26年度の研究計画として、「1D/A連結側鎖を高密導入したポリペプチドの合成法の確立」、「2電極基板上へのらせん状ポリペプチドの垂直固定化及びその半導体特性の評価」の課題を挙げていた。研究実績の概要に記載の通り、平成26年度内に1つ目の課題である目的のポリペプチドの合成に成功したが、残りの課題については未だ検討段階である。そのため「やや遅れている」と判断した。高分子化学昨年度から引き続き、「電極基板上へのらせん状ポリペプチドの垂直固定化及び両極性半導体特性の評価」を行うと共に、下記に挙げる二つの課題についても検討を行っていく。「モルフォロジー制御から脱却した有機太陽電池開発」→昨年度開発した“ポリペプチド型両極性半導体"を太陽電池素子に応用する。すなわち、“単一材料のみからなる発電層薄膜"を作製し、高耐久な太陽電池素子の開発に挑戦する。

本素子に太陽擬似光を照射することで、太陽電池性能を評価する。さらに、素子性能の安定性について、発電効率の時間依存性を様々な温度条件で評価することで定量する。「らせん状両極性半導体材料の普遍化及び高性能化」→“らせん高分子の構造的特徴を活かした両極性有機半導体開発"の新概念を普遍化するために、“p型ユニット"及び“n型ユニット"の組み合わせの異なる種々の高分子を設計し、これまでの課題と同様の研究項目について検討を行う。
周期植物の種間比較による周期遺伝子の探索

周期植物とは、それぞれの種に特異的な1年を越える周期で一斉に開花・枯死を繰り返す植物である。本研究で材料としたキツネノマゴ科コダチスズムシソウは、沖縄本島において6年周期で一斉開花する周期植物である。コダチスズムシソウの各個体は発芽から6年目に開花し、枯死することから、発芽から開花までの6年間を測る生物時計を持つと考えられる。そこで、近縁の周期を持たない種類と比較することで、6年間を測る周期遺伝子を探索するとともに、栽培環境をコントロールした栽培実験を行い、時間を測る環境シグナルとして、気温が重要であることを明らかとした。本研究は、6年周期で一斉開花・枯死するコダチスズムシソウを材料に、近縁種との比較と次世代シークエンサーを用いた解析を組み合わせることで、6年を測る時計遺伝子を探索し、周期的一斉開花の進化を探ることを目的とする。まず、サンプル採集および生活史調査のための野外調査を行った。沖縄本島および八重山諸島での野外調査は7月、1月、3月の3回、台湾での野外調査は4月、11月の2回、それぞれ行った。野外調査では、生活史の観察、遺伝的解析用サンプルの採集を行った。生活史の観察の結果、コダチスズムシソウは沖縄本島では6年周期で一斉開花・枯死する一方で、八重山諸島では一斉開花が起きず、開花後にほとんどの個体は枯死したが、少数の個体は生存し翌年も再び開花していた。一方、台湾では一斉開花が起きず、開花後も多くの個体が生存し、翌年も再び開花することが明らかとなった。発芽から6年目の開花までの遺伝子発現変動を明らかとし、6年を測る分子メカニズムの関連遺伝子を探索するため、温室において発芽からの経過時間の異なる個体について経時的にサンプリングを行った。現在、RNA-seqを行っている最中である。QTL解析を行い、6年を測る時計遺伝子領域の数や染色体上での位置を特定するため、コダチスズムシソウと近縁で毎年開花し複数回繁殖するオキナワスズムシソウのF2雑種を作成した。現在RAD-seqによるジェノタイピングと、フェノタイピングを進めている。さらに、6年を測る生理メカニズムの解明のため、温度や光環境を制御した栽培実験を行っている。どのような条件で開花が早まるのかあるいは遅くなるのか調べることで、どのように6年を測っているのか明らかにして行く予定である。周期生物とは2年以上の決まった周期で集団が一斉に繁殖を行ない、死んでしまう生物である。周期生物はそれぞれの個体が2年以上の長期間を厳密に測ることで同調的に開花していることから、長期間を正確に測る生物時計システムを持つと考えられる。そこで本研究課題では、6年周期で一斉開花・枯死するコダチスズムシソウを材料に、6年を測る周期遺伝子(時計遺伝子)を探索することを目的とする。どのような環境シグナルを用いて正確に長期間を測っているのかを明らかとするため、日長と気温を制御した栽培実験を行った。その結果、日長の違いは開花までの時間に影響を与えない一方で、気温が開花までの期間を認識するのに重要である可能性が示唆された。発芽から開花までの期間の遺伝子発現変動を追うため、発芽からの経過年数が異なる栽培個体を用いてサンプリングを行い、RNA-seqによるトランスクリプトーム解析を行う。これまでに、代表個体を用いたRNA-seqデータから、多くの開花関連遺伝子を検出することに成功した。6年目に開花する形質および1回繁殖性の形質について、コダチスズムシソウと、毎年開花する複数回繁殖型の近縁種オキナワスズムシソウの交配により得られたF2雑種集団を用いて、QTL解析を行う。これまでにRAD-seqを用いてF2雑種個体のジェノタイピングを進めた。また、開花個体および枯死個体を記録することによりフェノタイピングを行った。栽培実験、遺伝子発現解析、QTL解析のいずれも、順調に進展した。特に、栽培実験では、開花までの期間を正確に測るための環境シグナルとして気温が重要であることが明らかとなり、今後の研究の展開において、きわめて重要な知見が得られたと考えられる。また、RNA-seqデータから、多くの開花関連遺伝子が検出できたことから、発芽から開花までの遺伝子発現変動解析に向けて順調に研究が進んだ。周期植物とは2年以上の決まった周期で集団が一斉に開花し、枯死してしまう植物である。周期植物はそれぞれの個体が2年以上の長期間を厳密に測ることで同調的に開花していることから、長期間を正確に測る生物時計システムを持つと考えられる。そこで本研究課題では、6年周期で一斉開花・枯死するコダチスズムシソウ(キツネノマゴ科イセハナビ属)を材料に、6年を測る時計遺伝子(周期遺伝子)を探索することを目的とした。どのような環境シグナルを用いて正確に長期間を測っているのかを明らかとするため、日長(短日、長日、短日と長日の交互)と気温(低温、高温、低温と高温の交互)を制御した栽培実験を行った。その結果、日長の違いは開花までの時間に影響を与えない一方で、気温が開花までの期間を認識するために重要である可能性が示唆された。この結果は、周期植物において、長期間を測るために重要な環境シグナルを初めて明らかにしたものである。6年目に開花する形質および1回繁殖性の形質についてQTL解析を行うため、コダチスズムシソウと、毎年開花する複数回繁殖型の近縁種オキナワスズムシソウの交配により得られたF2雑種集団を作成した。

これらF2雑種個体のジェノタイピングをRAD-seqを用いて行った。また、6年目より早く開花した個体および枯死個体を記録することによりフェノタイピングを進めた。発芽から開花までの期間の遺伝子発現変動を追うことにより、周期遺伝子の探索を行った。発芽からの経過年数が異なる栽培個体を用いてサンプリングを行い、RNA-seqによるトランスクリプトーム解析を行った。これまでに、代表個体を用いたRNA-seqデータから、多くの開花関連遺伝子のホモログを検出することに成功した。これらの遺伝子について、開花までの発現変動から、周期遺伝子あるいは周期遺伝子の下流に存在する遺伝子の探索を進めている。周期植物とは、それぞれの種に特異的な1年を越える周期で一斉に開花・枯死を繰り返す植物である。本研究で材料としたキツネノマゴ科コダチスズムシソウは、沖縄本島において6年周期で一斉開花する周期植物である。コダチスズムシソウの各個体は発芽から6年目に開花し、枯死することから、発芽から開花までの6年間を測る生物時計を持つと考えられる。そこで、近縁の周期を持たない種類と比較することで、6年間を測る周期遺伝子を探索するとともに、栽培環境をコントロールした栽培実験を行い、時間を測る環境シグナルとして、気温が重要であることを明らかとした。野外調査、遺伝子発現解析、QTL解析、栽培実験、いずれにおいても順調に研究が進行している。野外調査では、予定通りコダチスズムシソウの分布する全地域から網羅的にサンプリングが完了した。遺伝子発現解析では、経時的なサンプリングから得られた試料について、RNA-seqにより現在解析を行っている。QTL解析については、RAD-seqを行い、得られたデータのバイオインフォマティクス的な解析を新たに開始した。栽培実験では、これまでの温度による影響の検証に加え、日長の影響の検証を開始した。このように、創意工夫により、研究を押し進めた。栽培実験、遺伝子発現解析、QTL解析を継続して行う。栽培実験では、気温の違いに対する反応性を検討するため、複数の気温条件で栽培し、比較を行っていく。遺伝子発現解析では、RNA-seqデータを用いて、開花関連遺伝子の発芽から開花までの発現変動を検証していく。QTL解析では、ジェノタイピング結果を用いて、連鎖地図を作成するとともに、F2雑種集団のフェノタイピングを進める。進化生物学サンプル採集および生活史調査のための野外調査を継続して行う。特にコダチスズムシソウの近縁種で台湾に分布するStrobilanthes rankanensisやS. lanyuensisの生活史を調べ、6年を測る時計遺伝子の探索において、コダチスズムシソウとの比較に有効であるかどうか検討する。発芽からの経過時間の異なる個体について経時的に採取したサンプルのRNA-seqのデータを解析し、発芽から6年目の開花までの遺伝子発現変動を明らかとする。QTL解析については、RAD-seqのデータをもとにジェノタイピングを進める。温度や光環境を制御した栽培実験では、今年度中に開花が生じる予定であるため、どのような条件で開花が早まるのかあるいは遅くなるのか検討する。
癌幹細胞をターゲットとした卵巣癌の白金製剤耐性機構の解明とその制御

白金製剤耐性の再発卵巣癌では、癌細胞の集塊として作られる腫瘍の中に抗癌剤に耐性を示し、増殖能が強い細胞の存在が示唆されることからcancer stem cells(CSCs)と呼ばれる癌幹細胞が注目されている。我々はシスプラチンが卵巣癌細胞株に対し上皮間葉形質転換(EMT)化を引き起こし、一方トポテカンはそれらを抑制することを明らかにした。さらに、近年上皮性卵巣癌の予後不良因子として報告されている膜型のエストロゲン受容体であるGPR30に着目したところ、EMT特異的表現型や増殖能の亢進、抗癌剤耐性化に強く関与していることが分かった。また、病理組織標本を用い免疫染色で検討すると、GPR30発現とEGFR発現を組み合わせることにより有意に予後不良因子となることが判明したため現在論文作成中である。種々の癌種で報告が相次いでいる癌幹細胞が、抗癌剤多剤耐性能を有している可能性があることに着目し、上皮性卵巣癌における癌幹細胞の同定と白金製剤耐性化機構の解明にむけ研究をしている。近年、膜型のエストロゲン受容体であるGPR30の発現が、上皮性卵巣癌の予後不良因子になるという報告がなされ(Gynecol. Oncol, 2009 ; 114, 465-)、この分子に着目した。我々は抗GPR30抗体で標識した卵巣癌細胞(A2780)をフローサイトメトリーで分離したところ、GPR30陽性細胞は全体の1%程度を占めていた。また、GPR30発現ベクターを作成し同細胞株に遺伝子導入したところ足場を失い上皮から間質の性格を呈する、つまり上皮間葉形質転換(EMT)を起こしている可能性が示唆された。また、TGF-β刺激によりGPR30の発現量は増加し、同時にE-cadherinの発現減少と転写因子であるsnailの核内移行も確認されたことより、GPR30陽性細胞はEMT現象をおこしている可能性が示唆された。よって、GPR30と、癌幹細胞またはEMT現象との関連をそれら両方面から現在検討中である。一方、臨床で得られた病理組織標本を用い、免疫染色を行ない抗癌剤耐性と予後に対する関与について検討している。EGFR発現は上皮性卵巣癌の予後不良因子の一つとして考えられているがGPR30発現とEGFR発現を組み合わせることにより、有意に予後不良因子となることが判明した。近年、膜型のエストロゲン受容体であるGPR30の発現が、上皮性卵巣癌の予後不良因子になるという報告がなされ(Gynecol Oncol, 2009 : 114, 465-)、この分子に着目している。GPR30発現ベクターを作成し卵巣癌細胞株(A2780)に遺伝子導入したところ、足場を失い上皮から間葉系の性格を呈する、上皮間葉形質転換(EMT)を起こしている可能性が示唆された。また、GPR30のアゴニストであるG1を同細胞株に添加したところ、EGFRのリン酸化に引き続きAkt経路の活性化、ひいては細胞増殖能の増加が認められた。よって現在、GPR30のEMT現象と癌幹細胞との関連を基礎的に検討中である。また、臨床で得られた病理組織標本を用い、免疫染色を行ない抗癌剤耐性と予後に関する関与について検討している。EGFR発現は上皮性卵巣癌の予後不良因子の一つとして考えられているが、GPR30発現とEGFR発現を組み合わせることにより、有意に予後不良因子となることが判明した。近年、膜型のエストロゲン受容体であるGPR30の発現が、上皮性卵巣癌の予後不良因子になるという報告がなされ(Gynecol Oncol,2009:114,465-)、この分子に着目し、GPR30発現ベクターを作成し卵巣癌細胞株(A2780)に遺伝子導入したところ、足場を失い上皮間葉形質転換(EMT)を起こしている可能性が示唆された。またGPR30のアゴニストであるG1を同細胞株に添加したところ、EGFRのリン酸化に引き続きAkt経路の活性化、ひいては細胞増殖能の増加が認められた。

また、臨床で得られた病理組織標本を用い、免疫染色を行ない抗癌剤耐性と予後に関する関与について検討している。GPR30発現とEGFR発現を組み合わせることにより有意に予後不良因子(無病生存期間の短縮と生存率の低下)となることが判明した。以上の事を現在論文作成中である。さらに、EMTの表面マーカーとして乳癌、膵臓癌で注目されているCD24に着目している。CD24陽性細胞は幹細胞と間葉系細胞の性質を合わせもち、腫瘍形成能にすぐれていることが報告されている(Oncogene28:209, 2009, Stem Celis 27:498, 2009)。また卵巣癌を用いた我々のpreliminaryな検討により、CD24陽性細胞はEMT特異的表現型(E-cadherinの減少、Snail,Slugの増加)を示しており、cisplatin耐性であった。さらにTGFβや1%02低酸素下での培養でSnail発現を増強させるとE-cadherin発現の減弱と、CD24発現の増加と共に基質への浸潤能増加及び間葉系への形態転換を認めた。以上より、CD24は卵巣癌における浸潤・転移に関するEMTマーカーとして利用できる可能性があると考えており、次のプロジェクトの土台を築くことができた。
超耐久性コンクリート構造物の構築手法の開発

メンテナンスフリーで500年程度の大深度地下施設や海峡長大橋および一般の各種海洋構造物等、また設計耐用期間が数万年という放射性廃棄物埋設処分施設といった各種の超耐久性を保持する社会基盤施設について、大気中だけでなく、海中や地中の各環境条件下において、コンクリート構造物の劣化の誘因となる、溶脱、塩害、凍害の現象について、これまでの研究成果をとりまとめた。そして、500年程度の長期間と数万年という超長期間に分けてこれらの劣化現象を定量的に評価する手法を調査し、今後解決すべき課題を抽出した。この場合に、各種の劣化因子がコンクリート中に侵入する挙動を解明することとなる。この際に、構築されたコンクリート構造物に大きな影響を及ぼす施工性の定量的な評価だけでなく、マスコンクリートの温度ひび割れおよび自己収縮と炭酸化収縮に起因するコンクリート構造物のひび割れの発生が避け得ない場合には、これらのひび割れやコンクリート構造物の施工欠陥のような初期欠陥が存在するコンクリート構造物全体の耐久性や安全性の評価手法を調査することが肝要である。また、古代ローマコンクリートなどを調査してナチュラルアナログの手法を採り入れることも、超長期間の劣化現象を定量的に評価するためには不可欠である。このようなこれまでに世界の研究者や技術者が採り上げなかった研究課題について調査研究して、超耐久性コンクリート構造物の構築手法の枠組みを提案した。
LA-PCR法を用いた効率的なリコンビナントGTaseの発現系の開発

Streptococcus mutans MT8148由来のGTase遺伝子gtfBとgtfCをもつ組換えプラスミドpSK6とpSK14をテンプレートとして用い,LA-PCR法によって約5kbの各gtf遺伝子の増幅を行った.この際,次のクローニングのために開始コドン部に制限酵素NcoIの切断部位を,カルポキシ末端部にはBglIIの切断部位が組み込まれるようにプライマーを設計した.ついでバクテリオファージT7のRNAポリメラーゼのプロモーターシステムをベースに,強力なプロモーターの制御機構を備えたpET-lldベクターに増幅したGTase遺伝子を組込み,gtfBを持つ組換えプラスミドpMT03及びgtfCを持つpMT01を作成した.これらを発現用の宿主大腸菌に形質転換後,IPTGを用いて誘導をかけ,リコンビナントタンパクを発現させた.このリコンビナントタンパクがGTaseであることを抗GTase抗体を用いてウエスタンブロットによって確認した.各種の発現用の宿主大腸菌を用いてGTase発現を検討したところHMS174(DE3)pLysE株が最も安定であった.さらに発現条件を検討したところIPTG濃度0.4mM,培養温度25°Cが至適であった.また発現されたリコンビナントGTaseにグルカン合成能があるかを^<14>C-スクロースをもちいて調べたところ,有意の活性は認められるが,その活性は低コピーベクターpMW119にgtf遺伝子が組み込まれたpSK6やpSK14と比較して増加していなかった.これは発現されたリコンビナントタンパクが不溶化しているものと考えられるので尿素や界面活性剤を用いて可溶化を現在試みている.Streptococcus mutans MT8148由来のGTase遺伝子gtfBとgtfCをもつ組換えプラスミドpSK6とpSK14をテンプレートとして用い,LA-PCR法によって約5kbの各gtf遺伝子の増幅を行った.この際,次のクローニングのために開始コドン部に制限酵素NcoIの切断部位を,カルポキシ末端部にはBglIIの切断部位が組み込まれるようにプライマーを設計した.ついでバクテリオファージT7のRNAポリメラーゼのプロモーターシステムをベースに,強力なプロモーターの制御機構を備えたpET-lldベクターに増幅したGTase遺伝子を組込み,gtfBを持つ組換えプラスミドpMT03及びgtfCを持つpMT01を作成した.これらを発現用の宿主大腸菌に形質転換後,IPTGを用いて誘導をかけ,リコンビナントタンパクを発現させた.このリコンビナントタンパクがGTaseであることを抗GTase抗体を用いてウエスタンブロットによって確認した.各種の発現用の宿主大腸菌を用いてGTase発現を検討したところHMS174(DE3)pLysE株が最も安定であった.さらに発現条件を検討したところIPTG濃度0.4mM,培養温度25°Cが至適であった.また発現されたリコンビナントGTaseにグルカン合成能があるかを^<14>C-スクロースをもちいて調べたところ,有意の活性は認められるが,その活性は低コピーベクターpMW119にgtf遺伝子が組み込まれたpSK6やpSK14と比較して増加していなかった.これは発現されたリコンビナントタンパクが不溶化しているものと考えられるので尿素や界面活性剤を用いて可溶化を現在試みている.
大規模社会システムにおけるファジィデータ解析に関する研究

社会システムに現われる人間の主観的あいまいさを含むデータの解析として,多変量解析的な観点から,相関分析や回帰分析および仮説検定等の手法を,解析の精度あるいは予測の精度が分かるような統計的データ解析の背景のもとで,ファジィデータを利用できるようにするための方法について検討した。特に,本年度は,主成分分析や仮説検定について研究を実施した。主成分分析については,基本的には分散・共分散の推定が必要となる。ここでは,ファジィデータの代表値としての通常の数値を統計処理するために推定値にバイアスがかかる。そこで,このバイアスを補正するための補正量を導き,この補正公式にもとづき分散・共分散の推定を行う。この結果,ファジィデータを用いた場合でも,正確な観測値を用いる場合とほぼ同程度の結果が得られることを,シミュレーションを用いて実験的に確認した。また,仮説検定についても,同様の補正公式を求め,ファジィ観測データを用いて検定する方法について検討した。特に,本年度は,ベイズ論的な仮説検定にも応用できないかどうかについて検討したが,シミュレーションによってかなり良好な結果が得られた。
金コア－硫化物シェルハーフカット形プラズモニック光触媒によるソーラー物質変換

本研究の主要な研究成果を以下の通りである。(1) Au/TiO2上にCdS光析出を行うことによりHC-Au@CdSナノエッグ粒子の合成に成功した。(2) CdS光析出温度を25°Cから50°Cに上げることにより、Au-CdS界面にエピタキシャル接合が形成されることを高分解能TEMによる解析で明らかにした。(3)最適条件下において、水分解に対する外部量子収率0.24%を達成した。これは、赤色光照射下(波長= 640 nm)における効率としては世界最高の値である。Auコアー硫化カドミウムシェルハーフカットナノエッグ粒子(Au@CdS-HCNE)の合成に成功し、ソーラーシュミレーターを光源とした可視光照射下で水から水素が生成することを確認した。1.析出沈殿法を用いてZnO担体上にAuナノ粒子を担持したのち、光析出法を用いてAuナノ粒子表面に選択的にCdSシェル層を形成させた。その後、ZnO担体を完全に溶解させることにより、Au@CdS-HCNE粒子が生成することを透過型電子顕微鏡で直接確認した。2.Au@CdS-HCNE粒子を純水に分散後、可視光を照射することにより水素が生成することをガスクロマトグラフィーで確認した。3.AuコアーとCdSシェルの間に、電子フィルターとしてZnS層を挟むことにより、水分解に対する可視光活性が顕著に増大することを見出した。4.光電気化学セルを用いたモデル系を用いて、Auナノ粒子からCdSへの可視光誘導電子移動が起こることを明らかにした。その結果、Au@CdS-HCNE粒子がプラズモニック光触媒として働くことが実証された。以上の結果を学会で口頭発表した。5.CdSe量子ドット担持TiO2のモデル系に対する密度汎関数理論計算を行い、CdSe価電子帯からTiO2伝導帯への直接電子遷移が起こることを明らかにした。この結果は、量子ドット増感光電気化学セルの光アノードを設計する上で極めて重要であると考えられる。本研究結果を学術雑誌に公表した。前述の通り、AuコアーとCdSシェルの間に、電子フィルターとしてZnS層を挟むことにより、水分解に対する可視光活性が顕著に増大することを見出した。これは、予想外の発見であり、Au@CdS-HCNEプラズモニック光触媒の活性を向上させる上で非常に重要な知見になると考えられる。Auコアー金属硫化物(MS)シェル(Au@MS)-HCNEプラズモニック光触媒の水分解に対する活性向上を目的として研究を実施した結果、次の成果が得られた。1.Au/ZnOのAu上への選択的CdS光析出反応において、溶液を50°Cに加熱することによりCdSシェル層の結晶性が向上することを見出した(ホット光析出法の確立)。2.ホット光析出法により合成したAu@CdS-HCNE粒子のAu/CdS界面において、ヘテロエピタキシャル接合が形成されていることを高分解能TEMを用いて確認した。3.各種方法でAu-CdS複合ナノ粒子を合成し、可視光照射下における水分解に対する活性を調べてところ、ホット光析出法で合成したAu@CdS-HCNE粒子が他のサンプルに比較して著しく高い活性を示すことを実証した。4.昨年度、Auナノ粒子とCdSとの間にZnS絶縁層膜を挟むことにより、可視光活性が劇的に増大することを見出したが、今年度は、光電気化学的手法を用いてその原因を明らかにし、その成果を学術雑誌に公表した(J. Phys. Chem. Lett. DOI:10.1021/acs.jpclett.6b0264)。Auとカルコゲナイド半導体との界面にヘテロエピタキシャル接合を形成するためには、通常、200°C以上の温度が必要とされている。今年度、当初の予定にはなかった、"ホット光析出法"を開発し、50°Cという低温でヘテロエピタキシャル接合を有するAu@CdS-HCNE粒子を合成することに成功した。さらに、原子レベルで整合した界面接合の形成が、ヘテロナノ構造型光触媒の活性を向上させるための要因であることを明らかにした。昨年度に引き続き、金コアー硫化カドミウムシェルハーフカットナノエッグ(HC-Au@CdS NE)プラズモニック微粒子の合成と水の完全分解への応用を目的として研究を実施した結果、次の成果を得た。1.50°Cにおける独自の光析出法を用いて、HC-Au@CdS NE粒子を合成し、高分解能TEM解析により、AuコアーCdSシェル界面にCdS{0001}/Au{111}配向を有するヘテロエピタキシャル接合が形成されることを明らかにした。2.HC-Au@CdS NGの光触媒活性が、CdSシェル厚およびAuコアサイズに強く依存することを明らかにした。3.最適条件下において、世界最高の外部量子収率0.24%(照射光波長640 nm)を達成した。4.水分解が、水素:酸素= 2 :1で化学量論的に分解されることを明らかにした。5.繰り返し反応実験を行った結果、光触媒は低下することなくHC-Au@CdS NEが安定に作動することを確認した。

6.HC-Au@CdS NEによる水分解が、AuコアからCdSシェルへのホット電子移動により誘起されることを明らかにすると共に、このスキームに基づいて、HC-Au@CdS NEの光触媒活性のCdSシェル厚依存性を合理的に説明することに成功した。7.HC-Au@CdS NEの高い光触媒活性がAu-CdS間のヘテロエピタキシャル接合を経由したスムーズな電子移動に起因することを明らかにした。本研究の主要な研究成果を以下の通りである。(1) Au/TiO2上にCdS光析出を行うことによりHC-Au@CdSナノエッグ粒子の合成に成功した。(2) CdS光析出温度を25°Cから50°Cに上げることにより、Au-CdS界面にエピタキシャル接合が形成されることを高分解能TEMによる解析で明らかにした。(3)最適条件下において、水分解に対する外部量子収率0.24%を達成した。これは、赤色光照射下(波長= 640 nm)における効率としては世界最高の値である。Auコアー金属硫化物(MS)シェル(Au@MS)-HCNEプラズモニック光触媒の水分解の活性向上、および二酸化炭素の高効率還元固定化を主目的として、合理的な材料デザインと合成を行い、疑似太陽光照射下における光触媒活性を評価する。1.Au@MS-HCNEプラズモニック光触媒:1水分解活性の向上2二酸化炭素還元多電子還元電極触媒の探索3Au@MS-HCNEプラズモニック光触媒のデザイン、合成および特徴づけ2.二酸化炭素還元に対する可視光活性評価3.DFT計算による反応解析来年度は、本研究の最終年度にあたることから、今年度開発したホット光析出法を発展させるとともに、これまでの研究成果をまとめる。1.各種Au@MS-HCNE粒子を合成する、2.高分解能TEMを用いて界面に重点をおいたキャラクタリゼーションを行う、3.可視光照射下における水分解に対する活性評価を行う、4.界面接合と光触媒活性の相関を明らかにする、5.これまでの研究成果を論文にまとめて公表する。光電気化学現在、文部科学省私立大学戦略的研究基盤形成支援事業に近畿大学の「太陽光利用促進のためのエネルギーベストミックス研究拠点の形成」が採択されており、本代表者もプロジェクトメンバーの一員になっている。消耗品費の支出が当初予定よりも少なくて済んだ。光触媒反応実験では光強度を測定することが必要不可欠である。現在使用している光量計が故障したため、来年度予算で新品(約50万円)を購入したい。そのため、今年度予算を多めに残した。来年度の実施内容に記載した通り、研究が予想以上に発展しているために、材料費が当初計画を超えることが予想される。従って、来年度は、今年度余った額も含めて有効に使用する予定である。光量計の購入および材料費に有効に使用する予定である。
Belle実験におけるCP非保存角phi3の測定

クォークにおけるCPの破れの角φ_3は、他の角φ_1、φ_2に比べて測定精度が悪く、精度向上が望まれている。角φ_3の測定は、ツリーダイヤグラムが支配的な過程を用いて行われ、CPの破れを用いた新物理探索において基盤的な役割を担う。本研究では、Belle実験で収集された7.7億のB中間子対を川い、B^-→DK^-崩壊の解析を行った。ここで、DはD^0中間子またはその反中間子を表す。D中間子の崩壊としてD→K^+π^-を用いる事で、D^0中間子を介する過程とその反中間子を介する過程の干渉の効果が信号事象数に大きく現れ、角φ_3の有用な情報を抽出できる。この過程は非常に強く抑制されているため、背景事象の詳細な研究が必要となる。最も重大な背景事象は、e^+e^-→qq(q=u, d, s, c)過程に起因するものであり、Belle実験におけるこれまでの標準的な分離方法は、終状態の粒子の飛行方向を主に用いるものであった。本研究では、新たに、信号事象において対として生成されるべきB中間子の情報などをニューラルネットワーク法を用いて加える事で、分離効率の飛躍的改善に成功した。結果として、世界初となる信号の証拠を4.1σの有意度で得、崩壊分岐比を世界最高精度で測定した。得られた崩壊分岐比を用い、すでに測られているB^-→D_<CP>K^-崩壊に関する観測量やD→K^+π^-崩壊の強い相互作用位相も合わせる事で、φ_3=89°^<+13°>_<-16°>を得た。本研究により、φ_3測定の新しい可能性が示され、小林・益川模型がより詳細に検証された。Belle実験で集められた約8億個のB中間子対を用い、CP非保存角phi3の測定に向けて解析を行った。角phi3の測定には、B中間子のD中間子・K中間子ペアへの崩壊を用いる方法が最も有効と考えられており、本研究では、続いて起こるD中間子崩壊の終状態としてKpiやCP固有状態を用いる。この反応は、極めて稀にしか起こらないため、バックグラウンドの除去が不可欠である。本年度は、最も寄与が大きいと考えられるe+e-→qq(q=u,d,s,c)反応に起因するバックグラウンドの、新たな除去方法の考察を行った。B中間子崩壊の再構成に用いない粒子の情報を用い、K中間子の電荷といった新たな複数のパラメータを導入することで、これまでの方法を大幅に改善する可能性を示した。特に、D中間子と適当に取ってきたpi中間子の質量がD*中間子の質量である事象を除くと、信号をほとんど失う事なく、e+e-→qqバックグラウンドの約15%を除去できることを発見した。また、実験グループが推進している、新しい粒子検出法の効率の評価を、モンテカルロシミュレーションと実データを用いて行った。この手法は、粒子飛跡構成や光子検出の効率を上げるもので、崩壊によって検出効率が数%から30%程度増加する事を確認した。崩壊確率が比較的大きなB中間子のD中間子とpi中間子への崩壊について、崩壊確率の測定を行い、新しい粒子検出法によってより精度良く崩壊確率を測れることが示された。値は、世界平均と矛盾しないものだった。本年度の解析によって、バックグラウンド除去と粒子検出の効率上昇を元に、より精度の良いphi3測定に向けての基盤が整ったと言える。
接着性細胞の膜面と関連細胞骨格に関する超音波細胞剥離による超微構造解析

分離破骨細胞を骨片、ガラス、人工アパタイトの上で培養し、細胞とそれぞれの基質間に形成される細胞接着装置の構造について検索を行った。破骨細胞の接着側細胞膜面の細胞質側を露出させるために、適度な超音波処理によって背側細胞膜と細胞質構造を除去し広範囲な接着細胞膜面の内面を露出させ、急速凍結固定、白金とカーボンによる回転蒸着レプリカを作製し電子顕微鏡によるステレオ写真を作成し三次元観察した。基質面への初期接着時に破骨細胞はF-アクチンからなる接着構造としてのポドゾームを形成するがそれらが出現する以前に多数のクラスリンシートが観察された。ポドゾーム出現以後もそれらは共存した。生体内でも同様なメカニズムが働いているのか現在検索中であるが、クラスリンシートは骨片、人工アパタイト、ガラスのいずれの基質に対しても破骨細胞膜面に形成された。これらの所見は破骨細胞の接着構造について初めての報告である。クラスリンシートがなぜクラスリン被覆小胞に移行しないfrustrated endocytosisのままであるのか不明であるがクラスリンとダイナミンI、IIとの関係はI型は同様に局在するがII型は欠如していることが細胞化学的手法で明らかとなった。細胞骨格からなるポドゾームの構成要素であるアクチンの重合端はポドゾーム中心にありクラスリンより強固な接着構造であると考えられる。本研究補助金によって破骨細胞の接着構造としての膜面上のクラスリンと細胞骨格のポドゾームの三次元超微構造を明らかにすることができた。接着性細胞としてウサギ長管骨骨髄から破骨細胞を分離培養したものを用いた。破骨細胞をガラス面上で培養すると加伽と同様な典型的な接着構造としてのポドゾームが出現する。ポドゾームはアクチンが主体となった細胞骨格構造が三次元的に配列するフォーカルコンタクの一種であり動的に変化する構造である。そのような破骨細胞に超音波処理して非接着側細胞膜を剥離して細胞質構造を適度に除去すると接着側細胞膜と接着構造としてのポドゾームが残存した。目的とする構造を残すための最適条件は超音波の出力と作動時間、チップ先端と試料との距離に依存し検討の結果30W,15秒、23cmであった。そのような条件下で処理し細胞骨格関連蛋白抗体を用いレーザー顕微鏡で蛍光免疫染色した試料からは未処理の場合と同一の局在パターンを示すことが判明し超音波剥離は蛋白局在について峠影響が無いことが明らかとなった。超微構造レペル観察では接着側細胞膜内面が露出し膜面上の粒子構造とアクチン細胞骨格力漣結していた。ポドゾーム構造は他の細胞骨格構造に比べ明らかに強固に膜面と連結していた。ポドゾーム周辺には大小不定形のクラスリンシートが出現しポドゾームと共存していた。次年度はコロイド化学を用いて超微構造レベルでの細胞骨格関連蛋白局在を明らかにすると共にミオシンサブフラグメントをアクチンに修飾させてアクチン線維の極性を決定し得られた所見からパーソナルコンピューターで三次元可視化してポドゾームの機能と構造を解析する予定である。白色ウサギの長管骨から破骨細胞を分離しガラスまたは人工ハイドロオキシアパタイト上で培養したものを研究対象とした。すでに培養した破骨細胞には特異な接着構造としてのポドゾームが出現しそれらは主にアクチン線維と関連蛋白質からなることが報告されているが、今回の研究で用いた超音波処理により背側細胞膜と大部分の細胞質とオルガネラを剥離し接着側細胞膜と関連細胞骨格を露出させたあと急速凍結固定、凍結乾燥、回転蒸着レプリカ法を行うとより詳細な細胞膜と細胞骨格構造の超微構造解析が可能となった。細胞剥離に超音波処理を用いることで従来の塩化亜鉛液を用いた手法に比べ短時間で物理的に細胞構造を除去することができより人工産物の少ない試料作製が可能となった。

用いる超音波の出力、作動時間によって種々の状態の細胞剥離が再現されホーン型の超音波チップから2cm離した距離に試料を置き30W出力、0.5秒間欠照射で15秒間細胞剥離を行った場合大部分の接着に直接関与しないと思われる細胞骨格が除去されポドゾーム構造だけを残存させることができた。そのようなレプリカ観察からポドゾームは短いアクチン線維束から成っており隣接する細胞骨格に連結していた。ミオシンサブフラグメント(S-1)を作用させるとアクチン線維は特有の矢尻構造を構築しアクチン線維極性を超微構造から可視化できる。その結果辺緑細胞質、特にlamellipodia,でのアクチン線維極性が種々の方向に向いているのに比べポドゾームでは矢尻方向がその中心に向いた単一の極性を示しアクチン線維の構造的極性がポドゾームの機能的極性を反映していると考えられた。一般的に短いアクチン線維はS-1を反応させると典型的な矢尻構造を形成しにくいことが判明したが、ポドゾームのアクチン線維の極性は急速に重合するbarbed endをポドゾームの中心に向けた線維を収束する場で、その中心はtriton処理に抵抗する物質から成っていた。こららの観察結果はポドゾームは細胞運動と連動した動的細胞骨格であることを示す新知見を提供している。