hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
麻薬依存における脳内プロスタノイド受容体の役割に関する分子薬理学的研究

モルヒネペレットを慢性的に皮下に埋め込むことによりモルヒネに対する依存を形成したマウスにおけるナロキソン誘発禁断症状の1つである跳躍行動が、プロスタグランジンE2受容体のEP3サブタイプアゴニストM&B28,767やsulprostoneの脳室内投与により抑制されることを明らかにした。プロスタグランジン受容体のEP1/IPアゴニストiloprost、EP2アゴニストbutaprost、EPアゴニストprostaglandinF2aの脳室内投与は跳躍行動抑制効果を示さなかった。EP3アゴニストの脳室内投与は跳躍行動以外にも、paw shakeや体重減少などの禁断症状を抑制した。また、マウスに比べて多数の項目を観察することが容易であるラットを用いた実験においても、プロスタグランジンEP3受容体アゴニスト脳室内投与により、跳躍行動やpaw shakeなどの禁断症状が抑制されることを明らかにした。さらに、ラット脳において、麻薬依存形成に深く関与していることが知られている青斑核などの脳部位で、モルヒネの作用部位であるμオピオイド受容体のmRNAとEP3受容体mRNAの両方が発現していることをin situ hybridization法を用いて明らかにした。各受容体をコードするcDNAをin situhybridization法に用いるプローブ作製に適したベクターにサブクローニングする際の各種酵素反応のため本研究費で購入した恒温槽(ク-ルニットバスEL-8F)を用いた。
元禄期の江戸における浮世草子及び俳諧ネットワークの研究―出版文化を基盤として―

近世江戸において活動した出版書肆の活動調査を行い、上方書肆との関係について考察した。その中で、特に貞享・元禄期には上方出来の浮世草子を独占的に取扱った万屋清兵衛を中心に調査を行った結果、元禄末年頃に売れ筋の作品確保のため、積極的に上方出版界に働きかけていたことを確認した。また、近世小説に登場する「伊勢参宮」の描かれ方が変容することに着目し、人々の興味や嗜好のありように、出版活動が敏感に反応していたことを指摘した。上方の浮世草子が江戸板浮世草子に与えた影響の具体像について考察するため、調査を継続して行ない、現在までに得られた成果を研究論文として発表した(「近世前期文芸における大神宮と伊勢参宮」『神宮と日本文化』)。さらに、西鶴浮世草子のうち、伊勢参宮(ぬけ参り)を重要な要素として取り入れた貞享三年刊『好色五人女』巻二「情を入し樽屋物がたり」を取り上げ、本話において「ぬけ参り」が話の展開に与える効果とこれをめぐる登場人物の位置づけについて考察を進めた。その結果、主人公おせんが腰元、おせんをぬけ参りに連れ出す重要人物こさんが子おろしと設定されているが、それらの生業に対する当時の社会的な認識を基底に置いた上で「ぬけ参り」が終盤の事件を導くための大きな効果を挙げているとの知見を得た。今後この知見を論文化して公表する予定である。加えて、このような実際の事件に基づくと見られる内容の浮世草子が貞享四年から江戸でも複数出版されていることから、江戸板浮世草子の内容分析を継続し、西鶴をはじめとする上方板浮世草子との具体的な影響関係について考察する予定である。同時に、上方において浮世草子出版に従事していた書肆と、江戸書肆との交流がより活発化する元禄期後半から宝永正徳期にかけての出版文化の実態を究明すべく、書誌調査を継続して行なった。具体的には、上方と活発な交流が確認できる万屋清兵衛・須原屋茂兵衛・小川彦九郎他の出版物を、国文学研究資料館・国立国会図書館・東京都立中央図書館・京都大学附属図書館・京都府立総合資料館・法政大学図書館・中京大学附属図書館で調査を行なった。これにより、江戸書肆の活動をより明確に把握するとともに、上記の書肆が元禄十五年から刊行し出す前句附俳諧書についても調査を進めた。前年度に引き続き、近世前期に江戸において活動した出版書肆の活動調査を、書肆調査を中心に、継続して行うとともに、それらが手掛けた出版物の内容、及び時期・地域による特徴とその変遷について検討した。具体的には、万屋清兵衛の出版物調査を行う中で、同書肆の活動傾向が大きく転換する元禄15年前後の出版物を重点的に整理した。万屋清兵衛は、西鶴没後(元禄6年以後)、江戸・上方を問わず様々な方面から新たな取引先を模索し、各年につき、最低でも1点あたりの浮世草子出版に関わっているが、元禄15年からは江戸前句附俳諧書出版に携わり、活動傾向を変容させてゆく。江戸前句附俳書出版は、和泉屋三郎兵衛をその嚆矢とするが、その出版書を、間をおかず万屋清兵衛が求板していたことを再確認し、同時期における万屋にとっての前句附俳書出版の重要性について考察を加えた。これに関わる俳人と、万屋との交流の実態についてまでは調査を及ぼすことが、今後の課題である。同時期、万屋清兵衛と八文字屋との取引が確認されているが、この八文字屋と万屋清兵衛との取引の端緒となる出版の実態についても調査を加えた。これは、同時期の浮世草子出版における江戸出版書肆と上方書肆との関係性に関わる問題でもあり、これにより得られた知見は、論文として公表する予定である。また、江戸板浮世草子のうち、特に石川流宣作浮世草子並びに松月堂不角作浮世草子について、天和・貞享期浮世草子に見られる特徴について考察した。近世前期における三都出版界のネットワークを把捉するため、特に元禄期後半に刊行された浮世草子に係わる出版書肆の活動調査を継続して行った。調査対象とした書肆は、万屋清兵衛、須原屋茂兵衛、菊屋七郎兵衛、雁金屋庄兵衛等である。得られた調査結果は、既に公表したものの充実化も含めて個々に年表として纏め、これに基く各書肆の関係性の広がりについて明らかにしてゆく予定である。浮世草子の上方から江戸への伝播について、特に江戸板浮世草子の内容において上方からの影響を考察するにあたり、当時の作品中に広く見られる要素「伊勢参り」に着目し、諸作品から同要素の利用例を収集・分析し、研究論文を作成した(「近世前期文芸における大神宮と伊勢参宮」)。

さらに、西鶴浮世草子における伊勢参宮を趣向として取り入れた『好色五人女』巻二を取り上げ、研究発表を行た(「『好色五人女』巻二「情を入し樽屋物かたり」における「ぬけ参り」」西鶴研究会、平成23年8月12日)。元禄8ー10年板桃林堂作浮世草子について考察する前段階として、貞享・元禄初期に江戸で出版された浮世草子(松月堂不角作浮世草子等)について把握する必要が生じたため、その内容分析を優先したが、上方と江戸との交流の実態を考察するにあたっての調査は、概ね予定通り進行している。貞享・元禄初期に江戸で浮世草子を成した作者は、不角をはじめ江戸で活躍した俳諧師が多数を占めており、俳諧文化の中で醸成された言語感覚及びそこで得られた情報を活用して浮世草子を執筆していたと考えられる。そこで、浮世草子及び俳諧ネットワークの実態を究明するにあたり、同時期における出版状況と上方との影響関係について調査を進めている。また、今年度行なった元禄期後半から宝永・正徳期における江戸出版書肆の活動調査を継続して行い、出版ネットワークの上に成り立つ要素の強い前句附俳諧書の出版状況および作者と書肆との関係についての考察を進められる状態にある。出版書肆の活動調査については、概ね順調に進行している。特に、江戸・上方双方の書肆を調査することにより、これらの地域において相互関連性が格段に深まったのは、やはり浮世草子出版を通した関係の密接化によるものであることが裏付けられつつある。さらに、西鶴をはじめとする上方浮世草子を内容分析を進め、元禄時代後半に刊行された江戸板浮世草子への影響を具体的に論じる準備を整えることが出来た。これにより、予定通り江戸板浮世草子、特に桃林堂蝶麿作浮世草子の再評価を行ってゆく。前年度から継続して出版書肆の調査を行なう。また、貞享・元禄期に出版された江戸板浮世草子(特に不角作浮世草子、桃林堂作浮世草子)における上方からの影響とその独自性とを考察し、当時の出版文化を基盤とした作品創作の状況を明らかにしてゆく。さらに上記と併せ江戸前句附俳諧書の分析を進めて行く。具体的には、万屋清兵衛板俳書の収録句作者の俳諧活動をそれぞれ調査し、当時の江戸俳壇における位置づけを明確にした上で、書肆との関係について考察する。桃林堂を中心とした江戸板浮世草子における上方浮世草子摂取の状況、ならびに江戸板浮世草子の独自性について論じてゆく。平成24年度は、上記と併せ江戸前句附俳諧の句作りについての調査を行う。また、書肆の活動調査についても、継続して進めてゆく。研究課題に取り組むにあたり、必要となる諸学会・研究会出席のための旅費ならびに資料調査に係る旅費として使用する。加えて、必要と認められる書籍購入費としても使用する予定である。研究課題を進めるにあたり必要と思われる諸学会・研究会出席のための旅費並びに資料調査に係る旅費として使用する。加えて、必要と思われる書籍購入費としても使用を予定している。
旧積雪地方農村経済調査所による戦前期農家経済調査の体系的保存と有効活用の基盤確立

本研究の目的は、戦前期に旧農林水産省積雪地方農村経済調査所(以下、旧雪調)が実施した各種の「農家調査」の体系的保存とその有効活用方法について、その基盤確立を図ることである。具体的には、(1)メタデータの作成、(2)デジタルアーカイブ化、(3)両大戦期の農家経済行動や農家所得分布の計量分析、として本研究は実施され、コンピュータ技術の最先端の成果を取り入れつつ、研究上の参入障壁を出来るだけ取り除き、多くの研究者にとって利便性の高いデジタルアーカイブを構築し、これらのデータを用いた実証分析の基盤を形成することを目的とするものである。本研究を契機として京都大学と新庄市教育委員会は、平成22年11月に教育研究交流に関する協力協定を締結し、デジタルアーカイブを効率的に進めるための体制を構築した。本研究の遂行により、雪の里情報館に保管されている個票の保存状態が把握され、同館所蔵資料のデジタルアーカイブ構築の基盤を確立することができた。今年度の研究成果の概要は以下の通りである。(1)雪の里情報館に保管されている個票の保存状態を把握し、本研究の対象とする資料の絞り込みを行った。その結果、旧雪調が実施した農家調査の調査票の原票が保管されていることが判明し、デジタル化の優先順位を決めた。(2)上記(1)の調査に基づき、「現金に関する農家経済調査」の昭和9年、10年分、「庄内地方米作調査」、「農家負債に関する調査」のデジタル化を行った。(3)公開に向けたデジタルアーカイブシステムの構築を行った。(4)戦前期の農家経済調査にかかわるセミナーを研究グループ以外の学外者も招聘し、定期的に開催した。22年度には雪の里情報館に保管されている個票の保存状態を把握し、本研究の対象とする資料の絞り込みを行った。(1)初年度に決定したデジタル化の方針に基づき、「現金に関する農家経済調査」の北海道から宮城までの4道県および、「庄内地方米作調査」、「農家負債に関する調査」のデジタル化を行った。(2)デジタル化を実施した各調査票のデータ入力を行い、データベースとしての復元を行った。(3)昭和9年の現金に関する農家経済調査のデータを用い、現金収入および現金支出にかんする実証分析を行った。(4)公開に向けたデジタルアーカイブシステムの構築を行った。(5)戦前期の農家経済調査にかかわるセミナーを研究グループ以外の学外者も招聰し、定期的に開催した。
Notchリガンド・受容体システムによる腸管粘膜維持再生機構の解析

マウス正常腸管及び炎症腸管におけるNotchリガンド分子の発現解析を行い、正常・炎症の両腸管でDLL1,DLL4及びJAG1のmRNA発現を認め、更にDLL1及びDLL4はいずれも腸管上皮に発現していた。腸管上皮幹細胞特異的にDLL1及びDLL4を欠損したマウス腸上皮に於いて、分泌型細胞への明らかな分化偏位を認め、腸管においてDLL1及びDLL4が機能的な役割を担っている事を示す重要な知見を得た。(1)正常腸管及び炎症腸管粘膜におけるNotchリガンド分子の発現解析1)マウス正常腸管組織におけるNotchリガンド分子のmRNA発現をRTーPCR法で解析した結果、小腸及び大腸に於いてDLL1,DLL4,JAG1の発現を認めた。免疫染色による発現解析の結果、DLL1及びDLL4はいずれも腸管上皮に発現し、絨毛・陰窩軸に沿って異なる分布を呈していた。更にこれらDLL1及びDLL4陽性細胞は、i)一部の分画はKi67陽性であり、ii)杯細胞マーカーMUC2、内分泌細胞マーカーCgA、タフト細胞マーカーDCAMKL1と共局在する細胞分画を認め、分泌型細胞形質を獲得しているものと考えられた。2)DSS腸炎モデルの炎症粘膜に於けるDLL1及びDLL4陽性細胞の動態を解析した結果、炎症・再生過程の粘膜でDLL陽性上皮細胞数が著増している事が明らかとなった。(2)Notchリガンド発現の腸管上皮幹細胞選択的リガンド破綻による生体表現型の解析腸管上皮幹細胞特異的遺伝子LGR5のコード領域をCreリコンビナーゼに置換したノックインマウスを用い、腸管上皮幹細胞特異的にリガンド分子を欠損させた際の生体表現型の解析から、以下の結果を得た。1)腸管上皮幹細胞特異的にDLL1及びDLL4を欠損したマウスは、タモキシフェンによる遺伝子組み換え誘導開始から10日目には幹細胞ニッチの構成に変化を認めなかった。2)一方、腸管上皮幹細胞特異的にDLL1及びDLL4及を欠損したマウスは、タモキシフェンによる遺伝子組み換え誘導開始から10日目には杯細胞・内分泌細胞・タフト細胞の3系統の細胞の著しい増加を認め、分泌型細胞への明らかな偏位を認めた。上記の各成果は、腸管上皮幹細胞からの分化制御及び炎症粘膜における再生応答に於いて、DLL及びDLL4が機能的な役割を担っている事を示す重要な知見と考えている。(1)正常腸管及び炎症腸管粘膜におけるNotchリガンド分子の発現解析:マウス腸管におけるNotchリガンド分子の発現を解析し、以下の成果を得た。1)マウス正常腸管組織におけるNotchリガンド分子のmRNA発現をRTーPCR法で解析した結果、DLL1,DLL4,JAG1の発現を認めた。免疫染色による発現の解析を行った結果、DLL1、DLL4はいずれも腸管上皮に発現している事が確認された。さらにDLL1及びDLL4陽性腸管上皮細胞につき、増殖・分化マーカーの共発現を二重染色により解析した結果、i)いずれも幹細胞マーカーLgr5との共発現は確認されなかった。ii)一部の分画はKi67陽性であった。iii)杯細胞マーカーMUC2と共局在する細胞分画を認め、杯細胞形質を獲得しているものと考えられた。2)DSS腸炎モデルを作製し、炎症粘膜に於けるDLL1及びDLL4陽性細胞の動態を解析した結果、炎症・再生過程の粘膜でDLL陽性上皮細胞数が著増している事が明らかとなった。(2)Notchリガンド発現の臓器選択的・単一リガンド破綻による生体表現型の解析:腸管上皮特異的プロモーターT3bの制御下に遺伝子欠損を誘導可能なマウス系統を樹立し、腸管上皮特異的に各リガンド分子を欠損させた際の生体表現型の解析を行い、以下の結果を得た。1)腸管上皮特異的にDLL4及びJAG1を欠損したマウスは正常の発達・成長を示し、腸管上皮の細胞構成に於いても明らかな表現型を認めなかった。2)腸管上皮特異的にDLL1を欠損したマウスでは、十二指腸上部空腸にかけ、野生型と比較し約50%の杯細胞数増加を認めた。上記の各成果は、腸管上皮の恒常性維持のみならず、炎症粘膜における再生応答に於いてもDLLリガンド分子群がNotch活性化を通して機能的役割を担っている可能性を示す重要な知見であると考えている。本年度の成果として、マウス腸管上皮に於いて機能を発揮し得るNotchリガンドとしてDLL1及びDLL4を同定した。これは研究代表者らがヒト腸管組織の解析により得られた知見と一致するだけでなく、本研究計画に於いてマウス腸管をモデルとして解析を進める際の基盤を成す知見として重要な成果であると考えている。

また、DSS腸炎モデルの解析においては、再生応答時にDLL陽性腸管上皮細胞の著しい増加が誘導されるという画期的知見を得ており、上皮再生におけるNotch活性化機構の一端を明らかにしている。腸管上皮特異的なNotchリガンド欠損マウスの解析に於いては、DLL1の欠損により杯細胞の増加が誘導される一方、DLL4では同様の現象が誘導されない事から、DLL1とDLL4が単に機能的Redundancyを保ちつつ発現しているのではなく、一定の機能的棲み分けを保ち共に腸管上皮に発現していることを示唆する知見を得ている。本研究を通して得られたこれらの知見は、腸管上皮におけるリガンド依存的Notch活性化に新たな視点をもたらすものであり、次年度以降の解析により腸管上皮の恒常性維持と再生応答におけるNotchシグナルの機能的役割の解明に更なる画期的成果が大いに期待できる。今後、細胞系譜特異的な機能の解析やヒト疾患における成果の検証といった課題は残るものの、一部は当初計画を超える成果を得ており、概ね順調に進行していると評価することが妥当と考えている。本年度までの成果により、腸管上皮に於ける機能的NotchリガンドとしてDLL1とDLL4の重要性を確認した。したがって、次年度以降はDLL1及びDLL4発現細胞の性状解析、動態及び生体に於ける機能的棲み分けとredundancyに焦点を当て、解析を進めたい。具体的には、1)正常腸管におけるDLL1及びDLL4発現細胞の細胞集団を増殖・分化マーカー毎に分類し、定量的評価を進める。2) DLL1及びDLL4発現細胞が幹細胞形質を有する知見は得られなかったものの、Ki67陽性である中間前駆細胞の形質を有し得る知見を得ている事から、Hes1及びMath1といった前駆細胞マーカーとの共局在も解析対象とする。3)前記の性状解析をDSS腸炎モデルにおける炎症粘膜において経時的に解析を行い、DLL1及びDLL4発現細胞の動態を、性状面からも解析を加える。4)さらにクリプト単位におけるDLL1及びDLL4発現細胞の局在の差異についても更なる解析を加える。これらの解析に基づき、腸管上皮特異的なDLL1及びDLL4欠損マウスについても更なる検討を進めるため、5)DLL1/DLL4ダブルノックアウトマウスの表現型解析をT3bプロモーターのみならず、LGR5プロモーターや細胞系譜特異的プロモーターによりCreリコンビナーゼを発現する系を用いて更なる解析を加える。6)前記により作出されるノックアウトマウスにつき、DSS腸炎モデルにおける臨床的表現型や再生応答について解析を加える次年度以降は当初計画に則り、以下の課題を追求する予定である。1)Notchリガンド発現の臓器選択的・複数リガンド破綻による生体表現型の解析:前年度までに作出した各Notchリガンド分子における腸管組織特異的欠損マウス用い、様々な組み合わせのNotchリガンド欠損マウスの作製を進める。作出したマウスにつき組織学的な解析を加え、単一リガンド欠損による各々の表現型と比較検討する事により、リガンド分子相互のヒエラルキー及びRedundancyについても解析を加える。さらに各リガンド分子における腸上皮幹細胞特異的欠損マウス(Lgr5-CreERT2マウス)についても様々な組み合わせのNotchリガンド欠損マウスの作製を進める。
RNA干渉および多重発光マクロアレイを併用したダイズ脂質生合成遺伝子の網羅的解析

本年度は、昨年作成したダイズ(農林2号)未熟種子由来の完全長cDNAライブラリーから得られた、重複を省いた389クローンを選抜しマクロアレイを作成した。続いてこのマクロアレイシステムのテストを行うため、異なるステージのダイズ未熟種子(<5mm,57mm,79mm及び≧10mm)、葉、花、根からmRNAを抽出し、アンカーを介したRT-PCR法によりジゴキシゲニン(DIG)標識のcDNAプローブを作成し、ハイブリダイゼーションに用いた。この画像データをFAS-1000によりコンピュータ上に取り込み、画像解析ソフトImageQuantを用いて定量した結果、本方法はRIを用いた方法と同等の検出感度を持つことが明らかになった。また、発現量に変化が認められたもののうち56クローンを抽出してノーザンブロット分析により妥当性を検証したところ、5倍以上のシグナル強度の差を示したクローンについては、約85%のもので両方法での解析結果が一致した。そこで、主要な貯蔵タンパク質である7S及び11Sグロブリンが欠失した系統の解析を行った結果、リポキシゲナーゼ、オレオシン、FAD3といった脂質代謝関連遺伝子の一部について発現が有意に上昇してことが明らかとなった。また、昨年から引き続き行っているDGATおよびFAD3遺伝子のRNAi誘導個体は、それぞれ数系統のハイグロマイシン耐性個体が得れたが、稔性が低く、殆ど種子が得られておらず、解析には至っていない。これらの解析を進めるためには、今後、ダイズの形質転換法の更なる改良が必要であると考えられた。本年度は、植物においてRNA干渉(RNAi)を誘導するためのベクターシステムの開発とマクロアレイの作成に用いるcDNAクローンの収集を行った。先ず、細胞中に導入した場合に最も高い効率でRNAiを誘導すると言われるヘアピン型の2本鎖RNAを生成し、かつ、大腸菌中での安定した複製を可能とするため、パリンドローム構造を持つ標的遺伝子断片のクローニングサイトの間にダイズGmFAD3-2遺伝子の第三イントロンを挿入したRNAi用のベクターを作成した。続いて、このベクターの有効性を確認するために、遺伝子導入が比較的容易なイネを用いて小胞体型ω-6脂肪酸不飽和化酵素遺伝子に対する効果について検討を行った。その結果、本ベクターが効果的にRNAiを誘導し、ほぼ完全に目的遺伝子の転写産物を消失させることが確認された。そこで、現在、本ベクターにダイズのジアシルグリセロールアシルトランスフェラーゼおよび小胞体型ω-3脂肪酸不飽和化酵素をコードするGmDGAT1およびGmFAD3-2遺伝子を組み込み、ダイズ不定胚に対し、パーティクルガンを用いて遺伝子導入を進めている。また、ダイズ種子中の遺伝子発現パターンを網羅的に解析するための材料を得ることを目的として、二つの異なる登熟ステージ(直径5mm以下および直径79mm)の種子からSMART法を用いてcDNAライブラリーを作成し、約1500クローンについて5'側から塩基配列の決定を行い、データベース中の塩基配列との相同性を検索することで重複するクローンを整理した。その結果、合計280個の独立したcDNAを含むクローンが何らかの既知遺伝子と相同性を示し、約300個の既知の遺伝子とは相同性を示さないcDNAを含むクローンも得られた。そこで、現在、このうち既知遺伝子と相同性が認められた280クローンについて、ナイロンメンブレン上にスポットし、マクロアレイの作成を進めている。
民法秩序における信託法理の拡張可能性について

日本における信託制度は、合意によって設定される明示信託が念頭に導入されている。しかし、信託法理の根幹は、合意のないところでも課されうる「責任」にこそある。そこで、本申請研究では、日本の民法典の体系に沿った、所有権を主とする物権を根拠とする責任、合意に基づく責任と過失に基づく責任に加え、信託法理による説明原理を一般化することを目指す。信託法理による保護に対立あるいは併存しうる理念として、動的安定性に着目した経済的利益と予測可能な法的安定性がある。各理念により達成される利益の優先による正当化により、明確な線引きを達成する具体的な基準を導くことは困難である。しかし、各理念を踏まえた上での政策決定として有るべき法秩序の評価についてのバランスを取った制度設計を模索するべく、境界事例における意見や価値判断の対立について具体的事案を対象推して考察する必要がある。平成30年度は、要保護性の高い利益保護の具体例とともに、財産移転に関する利害対立を中心に、幅広く情報収集と資料収集を行った。申請書のうち、最新資料についての資料収集(v)および、その分析と整理(iii)を広く実施できた。具体的には、要保護性の高い利益に関する信託法理による保護に対立あるいは併存しうる理念として、動的安定性の背景にある経済的利益と予測可能な法的安定性に着目した分析を行った。中でも関連した事項のうち、特に動的安定性に関わる概念についての整理、検討を行い、平成31年度においては再度それらの検証を行った上で、最終年度としての総合考察を行う予定である。本年度については、福岡市にて比較法国際アカデミーが開催され、例年に続きさらに多くの国内の学会、研究会に出席することができ、本研究課題に資する情報収集および人脈の広がりによるさらなる情報収集の連鎖が続き、多くの予想を上回る示唆および資料を得ることができた。平成31年度においては、最終年度として、入手可能な最新の情報による検証を行いながらの総合考察を行う予定である。日本における信託制度は、合意によって設定される明示信託が念頭に置かれ導入されている。そこで、本申請研究では、日本の民法典の体系に沿った、所有権を主とする物権を根拠とする責任、合意に基づく責任と過失に基づく責任に加えて、信託法理による説明原理を一般化することを目指す。そこでは、合意によって設定される「明示信託」にも留意しつつ、法により信託的な責任の課される「擬制信託」を中心にして「信託法理」全体を捉え、従来の義務の説明根拠や体系の枠のみによっては説明しきれなかった事案における、公平性や妥当性を再検討する糸口を提供し、より良い民事法秩序を模索し打ち立てることが目的となる。そのような信託法理の重要な機能としては、優先的取り戻しの機能に並び、損失にとどまらない利得の吐き出し機能がある。既に、損失にとどまらない利得の吐き出しについては、日本において様々な研究がある。そのメインとしては、準事務管理の理論とそれを取り巻く議論状況がある。そこで、本年度においては、信託法理の検証の1つとして、日本における準事務管理を中心として発達した議論状況について考察を行った。結論として、準事務管理を取り巻く議論には代償理論が混在している。少なくとも、事務管理と準事務管理両方を包摂する一般法理として、価値の反映ないし転化である代償物理論の明記を行い、故意や義務違反による制裁理論との区分を明瞭化させることが望まれる。平成28年度においては、このような代償理論と信託法理の関連についての考察を推し進め、さらに、物権秩序との関係で信託法理の可能性についても研究を進める予定である。本年度についてはアメリカ法の議論を形にすることはできなかったが、28年度以降に予定されていた日本法の分析を先に行うことができた。そのことにより、初年度に予定されていたアメリカ法の重要な定義の再検証に関連して必要な重要な事柄と、民法秩序における全体の骨格について必要な事柄についての具体的な視点と確信を得ることができた。そのために、平成28年度については、(i)日本語文献に照らし合わせた分析として、道垣内弘人『信託法理と私法体系』(1996)と申請者の論文、「代位物に対する優先権の付与」(私法76号148頁(2014))を中心とした検討を行い、検証に必要な新たな文献と情報の収集も並行して行った(v.アメリカ法(学説・裁判例)と日本法(学説・裁判例))。本年度の経過において、信託法理により保護する利益に対立する利益の要保護性についての検討を行った。具体的には、従前想定していた担保権者と一般債権者をさらに細分化し、特に慎重な検討が必要と思われる労働債権と人身損害を理由とする不法行為債権についての検討を行った。また、物権的救済の重要性とともに、導入の意義の正当化理論、具体的事案の検討についての情報収集を行うことができた。平成29年度においては、正当化理論と対立する理念についての検討をより進める予定である。

本年度については、対立する権利との利益衡量という制度設計の本質部分についての最も困難な検討を行うことができ、一定の方向性についての確証を得ることができた。日本における信託制度は、合意によって設定される明示信託が念頭に導入されている。しかし、信託法理の根幹は、合意のないところでも課されうる「責任」にこそある。そこで、本申請研究では、日本の民法典の体系に沿った、所有権を主とする物権を根拠とする責任、合意に基づく責任と過失に基づく責任に加え、信託法理による説明原理を一般化することを目指す。平成29年度は、正当化理論と対立する理念についての検討をより進める計画で、幅広く情報収集と資料収集を行った。申請書のうち、中間報告についての公表準備を行い成果に反映させる作業(ii)。最新の資料があれば収集し分析する(v)といった計画を進めることができた。具体的には、信託法理による保護に対立あるいは併存しうる理念として、動的安定性に着目した経済的利益と予測可能な法的安定性などがある。各理念により達成される利益の優先による正当化により、明確な線引きを達成する具体的な基準を導くことは困難であり、各理念を踏まえた上での政策決定として有るべき法秩序の評価についてのバランスを取った制度設計は、境界事例においては多くの意見や価値判断の対立があるため、着地点を模索するのは困難で有る。とはいえ、中でも誰が情報不足の負担を負うべきかについて、学説や実務からの見解において対立の少ない一定の事案類型においてさえ、その視点からの解決が事実上なされていない傾向が見られることがわかった。このことから、価値判断がより分かれうる事案以外において、保護されるべきとの評価が高くなされている利益が守られえない処理方法が裁判において残存しており、信託法理による保護が機能するべき場面であると考えられるという方向性が考えられることとなった。従前重点を置いてきた財産隠匿の観点に加え、以上のような要保護性の強い利益保護の観点の双方より、平成30年度も引き続いて課題研究を進める予定である。本年度前期は、学務上の理由と他の研究企画の実施のために、予定していた資料収集等の一部を予定通りに実施することができなかった。後半においてより多くの情報を得る機会に恵まれたが、申請書のうち、中間報告についての公表準備を成果に反映させる(ii)作業に遅れが出ている。(なお、口頭報告については前年の平成28年度の年度末に実施している(実施状況報告書(平成28年度)3頁にて報告済み)。信託法理による保護に対立あるいは併存しうる理念として、動的安定性に着目した経済的利益と予測可能な法的安定性がある。各理念により達成される利益の優先による正当化により、明確な線引きを達成する具体的な基準を導くことは困難である。
敗血症腎傷害への治療戦略：糖質コルチコイドを標的とするβ２アドレナリン受容体療法

β2アドレナリン受容体(β2-AR)とグルココルチコイド(GC)の組み合わせによる抗炎症効果の相加・相乗作用が、敗血症による急性腎傷害(AKI)の防止に有用かどうか検討した。その結果、β2-AR過剰発現の腎臓にGCを投与すると、敗血症による腎機能低下・炎症反応が、cAMP-PKA, CB-1,CD14-TLR4-TNF-α伝達経路を介して回復できた。さらに循環中のNOとANG II、腎臓ヒストン酵素を調節しTNF-α遺伝子発現転写を抑制することで、生存率が回復した。以上から、β2-ARとGCの組み合わせる療法は、TNF-α細胞内伝達経路を通じて敗血症AKIからの防御効果を示すことを証明した。本研究の目的は、腎臓のβ2アドレナリン(β2AR)を活性化させグルココルチコイド(GC)を投与する治療方法が敗血症腎傷害に伴うGC抵抗性の病態改善に有効かどうかを細胞内と生体内から検証することである。本年度は、検体の採取と、その検体からGC抵抗性の病態の一つであるヒストンアセチル化現象への本治療方法の効果を調べる実験を実施した。1.検体の採取(1)細胞内分子レベルでの評価:ラット腎臓由来のマクロファージと尿細管上皮細胞の培養細胞を用い、アデノウイルスをベクターとしたβ2AR遺伝子を培養細胞に導入しβ2ARを活性化状態にした。この細胞にLPSあるいはグルココルチコイド(GC)を投与し、それぞれ細胞および上清サンプルを採取した。(2)生体内反応レベルでの評価:腹膜炎敗血症モデルラット(盲腸結紮1回穿刺法)に、アデノウイルスをベクターとしたβ2AR遺伝子を腎臓に直接導入することで腎組織内のβ2ARを活性化した。このβ2AR活性化状態にしたラット、あるいは活性化させないラットにグルココルチコイド(GC)を投与し、それぞれ検体を採取した。2.ヒストンアセチル化への効果敗血症のGC抵抗性ではヒストン脱アセチル化酵素HDACは低下すると考えられており、そのため炎症関連遺伝子発現の転写は亢進する。一方、β2AR情報伝達系とGC代謝機構はともにHDACを調節することでヒストンアセチル化を制御し、炎症関連遺伝子発現の転写を抑制する。この仮説を証明する目的でヒストンアセチル化に関わるHAT, HDAC, Ac-Histoneの変化を測定した。以上の結果に基づき、β2AR活性化がGC細胞内代謝機構のひとつであるヒストンアセチル化現象に作用し、敗血症により示されるGC抵抗性をどのように調節していくのかを、エピジェネテイクスの技術を用い解明している。本研究の目的は、腎臓のβ2アドレナリン(β2AR)を活性化させた状態でグルココルチコイド(GC)を投与する方法を敗血症ショックに伴う腎傷害の治療に適用し、その有効性を培養細胞を用いた細胞内分子レベルからの解析と、実験動物を用いた生体内反応レベルからの分析により明らかにすることである。1.細胞内分子レベルの反応からの検討: LPSとデキサメサゾン(GC)を添加したラット腎臓由来のマクロファージ培養細胞を利用し、GC細胞内代謝諸因子に対するβ2AR活性化がもたらす効果を、リガンド(11βHSD1&2)、グルココルチコイド受容体(GR)、シャペロン(Hsp90、FKBP5)、MAPK (MEK-1、ERK1/2、p38、JNK)、ヒストンアセチル化、転写因子、炎症関連サイトカイン遺伝子発現の各々GC代謝段階にわけて調べた。β2AR活性化はアデノウイルスをベクターとしたβ2AR遺伝子を導入することで作成した。その結果、β2AR活性化は、11βHSD1とGRα蛋白と遺伝子発現を増強し、ヒストン脱アセチル化酵素HDAC活性の上昇も加わることでNFーκBを抑制し、その作用で炎症性サイトカインであるTNFーα遺伝子発現の転写活性を減弱させた。これにより、β2AR活性化がGC細胞内代謝機構の各段階をどのように制御し、どのように炎症反応の抑制に寄与するかを確認できた。2.生体内反応レベルから検討:β2AR活性化した腹膜炎敗血症モデルラット(CLPモデル)にデキサメサゾン(GC)を濃度別に投与し、β2AR活性化とGCを組み合わせた治療法が敗血症AKIの病態に与える効果を、腎機能測定と組織の状態から評価した。その結果、敗血症による腎機能低下(主に糸球体機能)と組織障害(糸球体肥大)は、β2ARの活性化とGCを投与したモデルラットにのみ改善が認められ、この治療法の敗血症への有用性を確認できた。以下本年度の研究実績である。1.細胞内分子レベルの反応からの検討:腎臓のβ2アドレナリン(β2AR)細胞内伝達系のどの構成因子がグルココルチコイド(GC)細胞内代謝機構のどの分子に作用し、敗血症により抵抗性を示すGC細胞内代謝機構をどのように調節するのか、またエピジェネテイクスがどのように関わりその結果、炎症に関連するTNFーα遺伝子の発現をどのように制御するかを各代謝段階の阻害薬を用いて検討した。その結果、cAMP-PKAの情報伝達系が、11βHSD1とGRαと、ヒストン脱アセチル化酵素HDACを調節することでヒストンアセチル化を制御し、TNF-α遺伝子発現転写活性を抑制することを明らかにできた。2.生体内レベルでの検討:CLPによる敗血症モデル動物におけるβ2AR活性化とGCの腎傷害防止効果を、

エピジェネティック制御機構、特にどのヒストン修飾因子がTNF-α遺伝子発現に関わるかを解明するために以下の実験をおこなった。(1)ヒストン修飾の定量的解析では、アセチル化ではH3K9Acのみが敗血症では有意な増加を示し、これはβ2AR刺激薬とGCを投与することで抑制された。一方脱アセチル化に関わるH3K9me2, H3K27me3, H4K20meは変動を示さなかった。敗血症によって亢進するTNFーα転写活性をβ2AR活性とステロイドが抑制する場合には、ヒストン修飾因子としてH3K9アセチル化因子が強く関与することが明らかになった。(2)ヒストンアセチル化の酵素化学反応の解析では、敗血症によって亢進するHDAC, HAT活性の調節機序にβ2AR活性とステロイドが関与することが判明した。(3)Chip法を利用したTNFーα遺伝子プロモーターへのヒストン修飾因子の特異的解析では、H3K9AcとH3K27Acがβ2AR刺激薬とGCを投与により低下し、これらの相加効果も認められた。現在までの実験結果から、腎臓のβ2アドレナリン(β2AR)を活性化させグルココルチコイド(GC)を投与する治療方法が、敗血症に伴う腎傷害の細胞内と生体内の病態改善に有効であることを、以下の細胞内レベルと生体内レベルから確認できた。1.細胞内レベルでの解析:敗血症病態下で腎障害に関連する血液細胞、マクロファージ、腎尿細管上皮細胞を使用した。生化学的解析では、β2ARからの情報伝達系が、敗血症により減弱したGC細胞内代謝機構の諸分子(11βHSD1とGRα)を回復させ、ヒストンアセチル転換酵素HATを抑えヒストン脱アセチル化酵素HDAC活性を調節することで、NF-κB(p50,p65)活性を抑制し、それらの結果として炎症関連遺伝子あるTNF-α遺伝子発現を減弱させることを確認できた。また、Chip法を利用したTNFーα遺伝子プロモーターへのヒストン修飾の特異的解析では、H3K9AcとH3K27Acがβ2AR刺激薬とステロイド薬の投与により増加し、これらの相加効果でプロモーター活性が抑制されることを認めた。一方メチル化でも、β2AR活性化状態でH3K4me3はプロモーター活性を抑制し、H3K27me3はプロモーター活性を促進させたが、、NF-κBとの関連性は明らかにできていない。2.生体内反応レベルから検討:腎組織内のβ2ARを過剰発現させた敗血症AKIモデル動物(CLP)にデキサメサゾンを濃度別に投与した結果、腎機能の改善、組織所見の改善、TNF-αの組織内分布および遺伝子発現の低下が認められた。一方、CLPによる敗血症モデル動物におけるβ2AR活性化とGCの腎傷害防止効果を、エピジェネティック制御機構の面からも解析し、細胞内レベル実験と同様の結果を得た。以上よりこれらの成果は本年度までに達成する目標であったため、“おおみね順調"に実験は進んでいると判断した。敗血症は、全身に急激な炎症反応を認める病態であるが、時に多臓器不全を引き起こす。治療法としては循環・呼吸管理や抗菌薬投与などの対症療法が主流であるが、敗血症におけるステロイド療法の評価は定まっていない。一方、β2アドレナリン受容体(β2AR)活性化には炎症調節効果を用いた敗血症治療法(β2AR受容体療法)が紹介されている。我々はβ2交感神経受容体(β2AR)が副腎ステロイドの抗炎症効果を増強することに注目し、これらを併用することで敗血症による腎障害の軽減効果を期待できると考え、生体内および細胞内反応レベルからその機序解明を試みた。
撥水および親水性固体壁を有するマイクロチャンネル内の流動・伝熱特性の解明

マイクロチャンネル内の表面を改質することにより固体壁面に機能性を付加し,その固液界面現象の流動・伝熱特性に与える影響を明らかにすることを目的として,撥水性および親水性マイクロチャンネルに注目し,その流動特性について解明することを試みた.表面張力効果が顕著に現れてくると予想される直径数ミリ程度のガラス円管に,シリコン表面改質剤を塗布して撥水性流路を製作した.さらにガラス管内壁に酸化チタンコーティングを行い,親水性流路も製作した.恒温循環装置から温度一様の脱気水を流し,さらに窒素流路系を試験部に接続し,気液二相流実験を行った.その際,マイクロスコープおよび高速度ビデオカメラを用いて気液流動様式を観察し,流動特性のマッピングを行った.撥水性壁面を有する場合には,液相の見かけ流速の小さいところで,脈動する様子が確認された.流速の大きな場合は気液交互に流れるスラグ流となり,減速するにつれ管壁の液膜が破断し,管壁に液膜の存在しないセグメント状に気液が完全に分離する流れとなる.さらに加速下においては壁面で液膜が取り残される形となり,後方からの液柱と合体することによりスラグ流に転ずる.セグメント状の流れの際には,スラグ流に比べて大きな圧力損失が生じていた.これは,液膜の存在しないセグメント状流れでは,液柱後端部での固体壁からの液相のはがれと液柱前端部での付着および界面流動による流動抵抗の存在の影響があると考えられる.さらに,撥水性壁面とは異なり,気液二相流における液膜の破断といったことは起こりにくいことが予想され,圧力損失の低減の可能性が期待される親水性壁面について同様の検討を行った.しかし,コーティング剤や微粉末など様々な光触媒酸化チタンのガラス面へのコーティングを試みたが,流動によりすぐにその膜面が剥がれてしまうなど,残念ながら実験に耐えうる酸化チタン膜を形成することができなかった.マイクロチャンネル内の表面を改質することにより固体壁面に機能性を付加し,その固液界面現象の流動・伝熱特性に与える影響を明らかにすることを目的として,撥水性および親水性マイクロチャンネルに注目し,その流動特性について解明することを試みた.表面張力効果が顕著に現れてくると予想される直径数ミリ程度のガラス円管に,シリコン表面改質剤を塗布して撥水性流路を製作した.さらにガラス管内壁に酸化チタンコーティングを行い,親水性流路も製作した.恒温循環装置から温度一様の脱気水を流し,さらに窒素流路系を試験部に接続し,気液二相流実験を行った.その際,マイクロスコープおよび高速度ビデオカメラを用いて気液流動様式を観察し,流動特性のマッピングを行った.撥水性壁面を有する場合には,液相の見かけ流速の小さいところで,脈動する様子が確認された.流速の大きな場合は気液交互に流れるスラグ流となり,減速するにつれ管壁の液膜が破断し,管壁に液膜の存在しないセグメント状に気液が完全に分離する流れとなる.さらに加速下においては壁面で液膜が取り残される形となり,後方からの液柱と合体することによりスラグ流に転ずる.セグメント状の流れの際には,スラグ流に比べて大きな圧力損失が生じていた.これは,液膜の存在しないセグメント状流れでは,液柱後端部での固体壁からの液相のはがれと液柱前端部での付着および界面流動による流動抵抗の存在の影響があると考えられる.さらに,撥水性壁面とは異なり,気液二相流における液膜の破断といったことは起こりにくいことが予想され,圧力損失の低減の可能性が期待される親水性壁面について同様の検討を行った.しかし,コーティング剤や微粉末など様々な光触媒酸化チタンのガラス面へのコーティングを試みたが,流動によりすぐにその膜面が剥がれてしまうなど,残念ながら実験に耐えうる酸化チタン膜を形成することができなかった.マイクロチャンネル内の表面を改質することにより固体壁面に機能性を付加し,その固液界面現象の流動・伝熱特性に与える影響を明らかにすることにより,超小型熱交換器等の開発へ向けての機能性固体壁の適用性について検討することを目的として,撥水性マイクロチャンネルに注目し,その流動特性についての解明を行った.表面張力効果が顕著に現れてくると予想される直径数ミリ程度のガラス円管に,無色透明かつ平滑な表面構造を有するシリコン表面改質剤(水との公称接触角110度程度)を塗布して撥水性流路を製作した.恒温循環装置から温度一様の水道水および脱気水を流し,さらに窒素流路系を試験部に接続し,気液二相流実験を行った.その際,照明内蔵型深被写界深度のズームレンズおよびデジタルカメラ,デジタルビデオ,および高速度ビデオカメラを用いて,これまで困難であった顕微鏡クラスの倍率映像での深い被写界深度の画像および動画を計測することを試みた.これまで観察されていた,管壁における気体スラグ周囲液膜の破断の様子,さらに気液二相流実験の際に大きな圧力損失の原因と予想される液相前後の壁画との付着・はがれの様子をより詳細に捉えることを検討した.現在のところ新たな知見を得るまでには至っていないが,今後光学系および実験条件の見直し等を行うことにより,破断速度,流路内平均速度等の流動特性の温度依存性などについて,これまで得られている結果よりも詳細なものが得られる可能性を見出すことができた.

ガラス円管に撥水特性を有する無色透明かつ平滑な表面構造を有するシリコン表面改質剤を塗布して試験部とし,さらに窒素流路系を試験部に接続し,水-窒素の気液二相流実験を行い,管路中の発生する圧力損失を測定した.さらに,その周囲からマイクロスコープおよび高速度ビデオカメラにより気液流動様式を観察し,流動特性のマッピングを行った.液相の見かけ流速の小さいところで,脈動する様子が確認された.流速の大きな場合は気液交互に流れるスラグ流となり,減速するにつれ管壁の液膜が破断し,管壁に液膜の存在しないセグメント状に気液が完全に分離する流れとなる.さらに加速下においては壁面で液膜が取り残される形となり,後方からの液柱と合体することによりスラグ流に転ずる.セグメント状の流れの際には,スラグ流に比べて大きな圧力損失が生じていた.これは,液膜の存在しないセグメント状流れでは,固体壁からの液相のはがれ(液柱後端部)と付着(液柱前端部)および界面流動による流動抵抗の存在の影響があると考えられる.さらに,酸化チタンコーティングのマイクロチャンネルを製作し,親水性壁面による流動特性について検討し,撥水性壁面との比較を行うことを試みた.親水性壁面を用いることにより,撥水性壁面とは異なり,気液二相流における液膜の破断といったことは起こりにくいことが予想され,相変化を伴うマイクロチャンネル熱交換器等への応用としては,相変化による圧力損失の低減の可能性が期待される.しかしながら,コーティング剤や微粉末など様々な酸化チタンのガラス面へのコーティングを試みたが,残念ながら満足のいく酸化チタン膜を形成することができなかった.一見うまくいっているようなものについても,流動によりすぐにその膜面が剥がれてしまう結果となってしまった.今後とも継続して問題の解決を行う予定である.
細胞骨格制御によるミトコンドリア品質維持機構の解明

本研究では、微小管形成を担うγ-tubulinがミトコンドリアの機能維持において果たす役割を明らかにし、神経疾患の病態理解や治療戦略の基盤につなげることを目指す。神経特異的に発現するTubg2遺伝子を欠損したマウスの解析から、TUBG2タンパク質は普遍的に発現機能しているTUBG1タンパク質と同様の微小管形成能に加えて、ミトコンドリア品質管理に積極的に関与することが明らかとなった。さらにパーキンソニズムを伴う疾患の病理解析においてγ-tubulinレベルの低下が認められ、TUBG2タンパク質の機能低下がミトコンドリア機能低下を通して、病態の増悪に寄与している可能性が考えられた。ミトコンドリアの機能維持においてγ-tubulinが果たす役割を明らかにする目的で神経系に特異的に発現しているTUBG2遺伝子の機能解析を進めた。TUBG2KOマウスに見られるミトコンドリア異常を詳細に評価するため、電子顕微鏡による神経細胞の観察を行なったところ、ミトコンドリアの形態異常と微小管の減少を認めた。また初代培養神経においてATP産生能の低下も認めた。よってTUBG2KO神経におけるミトコンドリアは形態だけではなく機能的にも異常であると考えられる。免疫沈降-質量分析による予備検討においてミトコンドリアの分裂・融合に関わるタンパク質をTUBG2結合分子として同定していたため、培養細胞に両者を共発現させたが、タンパク質同士の相互作用ならびに細胞内共局在は認められなかった。よって予備検討の結果は、おそらく抗体の非特異的結合によるものと思われた。そこでTUBG1との分子的性質の違いをより明らかにするために、TUBG1、TUBG2をそれぞれ培養細胞に発現させて結合タンパク質をLC-MSで網羅的に探索、比較した。その結果TUBG2特異的に結合するタンパク質としてミトコンドリアに関連した複数の分子を新たに同定し、そのうちミトコンドリアの機能維持への関与が報告されている分子について上記再構成系でも結合を確認した。ブレインバンクから提供されたパーキンソン病と多系統萎縮症におけるγ-tubulinの発現量を解析した。パーキンソン病患者ではγ-tubulinの異常を認めなかったが、多系統萎縮症では顕著な減少を認めた。よって多系統萎縮証におけるパーキンソニズムにγ-tubulinの異常が関与する可能性が示された。予備検討で得られていた結果をもとにTUBG2KOマウスの細胞生物学的解析を進め、神経細胞における細胞骨格とミトコンドリアの異常を確認した。さらに生化学的な実験手法により、上記の異常と関係性が疑われるTUBG2結合タンパク質を同定した。これらの結果から神経系におけるTUBG2遺伝子の役割が細胞および分子レベルで明らかになりつつある。またヒトの疾患サンプルにおいて発現量に異常が見られたことから、疾患の発症メカニズムにTUBG2遺伝子が寄与する可能性が示唆された。以上のことから細胞骨格分子とミトコンドリア機能との新たな機能的関係性が認められ、プロジェクトは順調に進んでいると判断した。ミトコンドリアの機能維持においてγ-tubulinが果たす役割を明らかにする目的で、神経系に特異的に発現しているTUBG2遺伝子の機能解析を進めた。マウス初代培養神経を用いた実験により、Tubg2-KO細胞が示すミトコンドリアの形態異常、ATP産生の低下、抑制性神経の電気生理的異常については、異所性にTUBG2を発現させると回復すること、この回復はTUBG1では起こらずTUBG2特異的な機能であることを確認した。昨年度、免疫沈降-質量分析のプロテオミクス解析により同定したTUBG2に親和性を示すミトコンドリア関連タンパク質について、結合性や細胞内共局在性、ミトコンドリアへの影響を検証した。既報の通り当該タンパク質を細胞に発現させるとミトコンドリアの形態に変化が生じた。そこで培養細胞にTUBG2と共に発現させたところ、質量分析の結果に一致して生化学的実験では結合性を認めたものの、共焦点イメージングで細胞内の局在性を検討しても、TUBG2との積極的な関係性を認めなかった。質量分析の結果から、他の結合分子候補として微小管以外の細胞骨格分子を疑ったが、こちらも積極的な関連性は見られなかった。昨年度の結果から多系統萎縮症(MSA)との関係性が疑われたので、Tubg2-KOマウスの脳にMSAの特徴が見られるか検証したが、MSAの最大の特徴であるグリア細胞質内封入体(GCI)は認めなかった。このことから、MSAにおけるTUBG2の異常は当該疾患の根本的な原因ではなく、疾患の病変の中で2次的に起こる異常だと考えられる。TUBG2の損失は単独でミトコンドリア異常につながるため、MSAの病態において悪性度に影響するものと思われる。昨年度に引き続きTubg2-KOマウスの細胞生物学的解析を進め、TUBG1とは異なるTUBG2タンパク質特異的な機能を確認した。またTubg2-KOマウスとヒト神経変性疾患の病態を比較した。一方で昨年度に同定したTUBG2結合タンパク質が、TUBG2特異的機能に貢献しているか検証したが、分子メカニズム解明に至る結果が得られなかった。以上のことから、全体に研究は進んでいるものの、メカニズム解明部分が期待通りに進まなかったため、やや遅れていると判断した。神経特異的に発現するTubg

2遺伝子を欠損したマウスの解析から、TUBG2タンパク質は普遍的に発現機能しているTUBG1タンパク質と同様の微小管形成能に加えて、ミトコンドリア品質管理に積極的に関与することが明らかとなった。さらにパーキンソニズムを伴う疾患の病理解析においてγ-tubulinレベルの低下が認められ、TUBG2タンパク質の機能低下がミトコンドリア機能低下を通して、病態の増悪に寄与している可能性が考えられた。今後は再構成実験により分子メカニズムの解明を進める。特に新たに同定したTUBG2結合分子が、TUBG2遺伝子の欠損によりどのような影響を受けるかを確認し、認められた異常を補正することでミトコンドリア機能が回復するかを検証する。予備検討の結果から当初はミトコンドリアの分裂・融合制御とマイトファジーへの関連を疑い研究計画を立てていたが、その後の実験結果からは少し違う分子メカニズムが想定される。適宜計画を修正して実験を行ない、論文作成を進める。遅れている分子メカニズム解明部分については、生化学的結合分子の視点とは別に、超解像イメージング等を用いた細胞生物学的視点で解析を進める。特にTUBG1タンパク質とTUBG2タンパク質がそれぞれ形成する微小管の性状や分布の違いに着目する。TUBG2が神経特異的に発現すること、且つTUBG1欠損は細胞生存に著しく影響することから、培養細胞において適切に両者を比較することが難しかったが、現在構築しているCRISPR/Cas9システムを応用したコンディショナルノックアウト系を利用して、TUBG1-cKO細胞上でTUBG1またはTUBG2を再構成することを検討している。またH29年度は研究計画の最終年度であるため、適宜論文等で発表する準備を進める。細胞生物学平成27年度交付された直接経費900,000円のうち28,358円を次年度使用とした。理由は研究の遂行上、新年度に入ってすぐ必要な試薬類が生じる場合が考えられ、平成28年度分の交付前であっても対応できるようにするためである。平成28年度交付された直接経費900,000万円のうち128,909円を次年度使用とした。理由は研究の遂行上、新年度に入ってすぐ必要な試薬類が生じる場合が考えられ、平成29年度分の交付前であっても対応できるようにするためである。特に推進方策として前述したとおり解析手法を変える予定であるので、新年度早々に試薬の調達が必要である。平成28年度初頭に実験上必要な試薬類の購入に当てる。DNAオリゴ合成サービスや細胞培養関連試薬の購入が主な用途なる予定である。平成29年度初頭に実験上必要な試薬類の購入に当てる。