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歯周靭帯幹細胞の多分化能力を応用した 靭帯・腱の再生治療法の確立

我々はこれまでに、歯根膜組織中に再生医療に応用可能な多分化能力を有した歯根膜幹細胞が存在し、この幹細胞が3次元的な構造を有した血管を構築する能力や創傷治癒にとって必要不可欠な筋線維芽細胞への分化能力を有していることを報告してきた。今回の研究課題において、この歯根膜幹細胞を筋線維芽細胞へ分化させた際に生じる物理的な組織収縮力を利用することで、三次元的な靭帯様構造を作成することに成功した。作成した靭帯様構造は組織学的な靭帯構造と類似した、並行して整列したコラーゲン線維束を形成し、物理的な強度を有していた。本研究の成果により、将来的に歯根膜幹細胞が靭帯再生治療に応用できる可能性が示唆された。3年計画の1年目となる今年度(平成27年度)におけるテーマは、1.『靭帯への分化に適した歯周靭帯幹細胞画分の抽出・濃縮方法の確立』であり、これは申請書の段階より『平成2728年度』の2か年計画で行う予定としているものである。まず、最初の検討として、歯根膜組織採取直後からの様々な刺激を行うことで良質な幹細胞画分を採取できる可能性があるかの検討を行った。その結果、過去の論文の大部分で用いられている従来通りの歯根膜細胞採取方法(従来法)と比較してある刺激を加えて培養すること(改変法)で複数の幹細胞マーカーにおいてその遺伝子発現が優位に上昇し、細胞の形態もより立体的となり、さらに増殖能力も高くなることを確認した。検討段階で良好な結果が示されたために、更なる培養条件の検討を行うことした。検討条件として、添加するサイトカインの種類の追加とともに、培養環境として、18%O2の通常培養条件に加え、5%O2の低酸素条件の追加を行い、合計24通りの条件での培養を試みた。その結果、コロニーフォーメーションアッセイにおいて従来法に比べて、条件によってはクリスタルバイオレットの平均吸光度において10倍を超えるコロニー形成能を有する培養条件が明らかとなった。歯周靭帯幹細胞を用いたin vitroにおける3次元的な靭帯構造の解析についても、その組織学的な検討を行うためにパラフィン切片を作成し、詳細な観察を試みた。結果として、ヘマトキシリン・エオジン染色において、細胞の塊で形成された均一な棒状構造ではなく、外周を一層細胞でコートされ、内面は極性を有した長軸方向に平行に複数の微細な線上の構造が走るのが確認された。その線上構造は、膠原線維を染色するアザン染色によって強陽性を有する膠原繊維であることが判明した。この組織構造は、正常なヒトの靭帯の組織切片像と比較し、形態・性状ともに非常に酷似していた。1.『靭帯への分化に適した歯周靭帯幹細胞画分の抽出・濃縮方法の確立』において、前段階的な検討により、cell sorting(細胞分取)を行うことなく、組織採取直後からの培養条件を工夫することにより、より幹細胞性の高い画分を選択的に増殖させることが出来る可能性を示すことが出来た。この結果をもとに更なる条件検討を行ったところ、前段階試験よりもより歯根膜幹細胞選別に適した培養条件を見出すことに成功した。加えて、非常に数が少なく貴重である初代培養の細胞を非常に有効に利用でき且つ、幹細胞が増殖するのに有利でさらに一度に複数の培養条件を検討できる方法の確立と、その結果を簡易的かつ定量的に数値化できる評価方法の確立にも成功した。これらの方法の確立は、今後の2年間の研究の進展にとって非常に重要なものとなることは間違いない。歯周靭帯幹細胞を用いたin vitroにおける3次元的な靭帯構造の解析についても、パラフィン切片をもちいた詳細な組織的構造解析により、三次元培養により作成した靭帯様構造は正常なヒトの靭帯組織像と比較して、形態・性状ともに非常に酷似していることが判明した。さらに、手動の引っ張り試験において当初予想していた以上の強靭な構造が形成されていることも判明している。これらの成果により、初年度の成果としてはおおむね順調に進展しているといえる。3年計画の本研究は、1靭帯への分化に適した歯周靭帯幹細胞画分の抽出・濃縮方法の確立(平成2728年度)2濃縮した歯周靭帯幹細胞画分を用いてin vitroで成熟靭帯構造の誘導法を確立(平成28年度)3作成した靭帯構造に対しマウス移植モデルを用いてその機能を評価(平成29年度)で実験計画を立案した。本年度はその最終年度であった。前年度までに引き続き、2をメインに実験を行った。しかし、前年度に引き続き3次元培養系によって作成した靭帯様組織の物理的な強度を測定するための引張試験が設備的な問題から思うように計測できなかったために、機能的な評価を判定できなかった。これにより、1の成果としても前年度以上の解析は進められなかった。また、3にも着手したが靭帯移植モデルは手技的に非常に困難で思うような結果を得ることができなかった。一方で、基礎研究としては、三次元培養による靭帯構造作成にとって必須因子であるTGF-βがどのようなシグナルを介して靭帯作成に必須なECM収縮能力を発現するかの解析を進める事には成功し、その成果に関して本年度、学会発表をおこなった。また、近日中にその成果について学術論文として発表する予定となった。今後の予定として、靭帯構造の機能的な評価法の確立を急ぐとともに、動物実験手技に関しても成熟化させることで、歯根膜幹細胞を利用した靭帯再生治療の実現を目指す。本研究支援による3年間の成果によって、そのための確実な足掛かりを得ることに成功した。

3年計画の2年目となる今年度(平成28年度)におけるテーマは、前年度に引き続き、1.『靭帯への分化に適した歯周靭帯幹細胞画分の抽出・濃縮方法の確立』であり、これは申請書の段階より『平成2728年度』の2か年計画で行う予定としているものである。2年目の成果として、cell sorting(細胞分取)を行うことなく、組織採取直後からの培養条件を工夫することにより、より幹細胞性の高い画分を選択的に増殖させることが出来る可能性を示すことが出来た。この結果をもとに更なる条件検討を行ったところ、前段階試験よりもより歯根膜幹細胞選別に適した培養条件を見出すことに成功した。加えて、非常に数が少なく貴重である初代培養の細胞を非常に有効に利用でき且つ、幹細胞が増殖するのに有利でさらに一度に複数の培養条件を検討できる方法の確立と、その結果を簡易的かつ定量的に数値化できる評価方法の確立にも成功した。これらの成果により、良質な歯周靭帯幹細胞の抽出方法が明らかとなったため、最適化した条件で抽出した幹細胞を用いて、in vitroにおける3次元的な靭帯構造の作成を試みた。結果として、前年度に用いた細胞と同様にヘマトキシリン・エオジン染色において、細胞の塊で形成された均一な棒状構造ではなく、外周を一層細胞でコートされ、内面は極性を有した長軸方向に平行に複数の微細な線上の構造が走るのが確認された。その線上構造は、膠原線維を染色するアザン染色によって強陽性を有する膠原繊維であることが判明した。この組織構造は、正常なヒトの靭帯の組織切片像と比較し、形態・性状ともに非常に酷似していた。1.『靭帯への分化に適した歯周靭帯幹細胞画分の抽出・濃縮方法の確立』において、良質な歯根膜幹細胞の抽出方法を確立した。また、歯周靭帯幹細胞を用いたin vitroにおける3次元的な靭帯構造の解析については、パラフィン切片をもちいた詳細な組織的構造解析により、新たに抽出した良質な歯根膜幹細胞より三次元培養により作成した靭帯様構造は正常なヒトの靭帯組織像と比較して、従来の幹細胞を用いるよりもより、形態・性状ともに非常に酷似していることが判明した。手動の引っ張り試験においても強靭な構造が形成されていることも判明した。しかし、定量性を持たせるために引っ張り試験用の機器を利用した引張り試験を行う予定だったが、設備の関係でまだ行うことができておらず、機能的な靭帯としての質を判定することができていない。我々はこれまでに、歯根膜組織中に再生医療に応用可能な多分化能力を有した歯根膜幹細胞が存在し、この幹細胞が3次元的な構造を有した血管を構築する能力や創傷治癒にとって必要不可欠な筋線維芽細胞への分化能力を有していることを報告してきた。今回の研究課題において、この歯根膜幹細胞を筋線維芽細胞へ分化させた際に生じる物理的な組織収縮力を利用することで、三次元的な靭帯様構造を作成することに成功した。作成した靭帯様構造は組織学的な靭帯構造と類似した、並行して整列したコラーゲン線維束を形成し、物理的な強度を有していた。本研究の成果により、将来的に歯根膜幹細胞が靭帯再生治療に応用できる可能性が示唆された。
DNA 修復遺伝子発現制御機構の解明:新規因子 CXXC5 に着目した制御複合体の解析

CXXC5タンパクはDNAに直接結合しDNA修復遺伝子MLH1の転写を正に制御する因子であることが明らかとなった.また,CXXC5は他のタンパク性因子SYF2やHNRNPH1と相互作用し,協同してMLH1の転写制御に関与することも示唆された.低酸素下ではこれら3因子のタンパク量はいずれも低下するが,強制的な発現によりこれら因子の低下を補完すると低酸素性MLH1発現抑制が緩和された.従って,これら3因子が介在するMLH1の低酸素性低下の新たな経路が明らかとなった.CXXC5タンパクはDNAに直接結合しDNA修復遺伝子MLH1の転写を正に制御する因子であることが明らかとなった.また,CXXC5は他のタンパク性因子SYF2やHNRNPH1と相互作用し,協同してMLH1の転写制御に関与することも示唆された.低酸素下ではこれら3因子のタンパク量はいずれも低下するが,強制的な発現によりこれら因子の低下を補完すると低酸素性MLH1発現抑制が緩和された.従って,これら3因子が介在するMLH1の低酸素性低下の新たな経路が明らかとなった.CXXC5タンパクはMLH1遺伝子のプロモーター領域に結合し,MLH1転写制御に関与する因子として我々がごく最近見いだしたタンパク性因子である.本研究は,CXXC5を中心に,DNA修復遺伝子の1つMLH1の生理条件での転写制御機構を分子レベルで解明することで,大腸癌をはじめとした病態でのMLH1発現抑制の仕組みを理解することを目的とする.さらに,得られた知見をもとに制御因子異常を指標とした病理診断や病態予測への応用研究の基盤を築くことも目指す.本年度はCXXC5を含む転写制御複合体の同定を行った.CXXC5を含む転写制御複合体を同定するために,免疫沈降法,電気泳動,ならびにnanoLC/MS/MS解析を用いて,CXXC5と相互作用するタンパクの同定を行った.次いで,同定されたタンパクについて,RNAi法を用いてMLH1転写制御活性の有無を調べた.その結果,CXXC5と複合体を形成し,MLH1転写を制御する新たな因子としてhnRPH1が同定された.一方,我々はすでに,DNAには結合しないもののMLH1転写量を正に制御する因子としてSYF2を見いだしている.CXXC5と同じ解析手法を用いて,SYF2と相互作用する因子についても検索したところ,やはりhnRPH1が見いだされた,これら因子が1つの複合体を形成するのか,あるいは,それぞれの複合体を形成し独立的もしくは協同的に働くのかなどの制御様式については現在検討中である.また,今後は低酸素状態などMLH1発現が抑制される条件でのこれら因子の発現や機能の異常についても検討を行う.本年度に実施した研究により,複数の,かつ,互いに相互作用する転写制御因子を見いだした.本成果は,生理条件でのMLH1転写制御機構の解明のみならず,大腸癌をはじめとする病態でのMLH1発現異常の仕組みを理解する上でも極めて有用である.CXXC5は,DNA修復遺伝子の1つであるMLH1遺伝子のプロモーター領域に結合し転写を正に制御するタンパクとして,我々がごく最近見いだした転写制御因子である.本研究では,CXXC5によるMLH1転写制御を分子レベルで明らかにすることで,生理学的条件下でのMLH1転写制御機構を解明する.次いで,大腸癌をはじめとした病態でのMLH1発現抑制の仕組みを理解する.さらに,制御因子異常を指標とした病理診断や病態予測への応用研究の基盤を築くことも目指す.前年度は,CXXC5と相互作用しMLH1の転写制御に関わる因子を検索し,候補因子としてSYF2およびhnRPH1を見いだした.本年度は,CXXC5によるMLH1転写制御のより詳細な解析と,新規に見いだした2つの因子の役割の検討を行った.3)これら因子は協調してhMLH1の転写を正に制御する.これらの結果から,CXXC5を含む複合体による転写制御はSYF2とhnRPH1によって正にコントロールされていると考えられた.また,MLH1発現抑制の要因の1つとして知られる低酸素でのこれら因子の発現を調べたところ,いずれもタンパクレベルで発現が低下することが明らかとなった.今後はMLH1発現低下に対するこれら因子の役割について検討を行う.DNA修復遺伝子の発現異常はゲノム不安定性を引き起こし,癌をはじめとした種々の加齢性疾患の原因となる.散発性大腸癌でも遺伝子変異やエピジェネティック変異,腫瘍微小環境低酸素を要因とした種々の修復遺伝子の発現低下が認められる.しかしながら,これら遺伝子の発現制御機構については必ずしも明らかとなっていない.本研究では,散発性大腸癌で高頻度に発現抑制が認められる修復遺伝子MLH1に着目し,新規因子CXXC5による発現制御を分子レベルで解明し,大腸癌など病態での発現抑制の仕組みを理解することを目的とした.また,制御因子異常を指標とした病理診断や病態予測への応用研究の基盤を築くことも目指した.CXXC5はMLH1の転写を正に制御する因子として見いだしたタンパクで,特徴的なZnフィンガードメインを有する.同様のドメインをもつ他のタンパクにはメチル化DNA結合因子やクロマチン修飾因子が知られているが,CXXC5についてはDNAやタンパクとの直接の結合は報告されていなかった.本研究で,昨年度までに,CXXC5が単独でMLH1上流のシスエレメントに特異的に結合することやmRNAプロセシング関連タンパクSYF2やHNRNPH1と協調してMLH

1転写を正に制御することを見いだしてきた.本年度は,MLH1発現抑制の一要因として知られる低酸素でのこれら因子の役割を検討した.その結果,CXXC5とHNRNPH1は転写レベルでの発現低下により,SYF2はプロテオソームによるタンパク分解により,それぞれ低酸素下でタンパク量が低下することを見いだした.さらに,MLH1の低酸素性発現抑制はこれら3因子の共発現によって回復することも見いだした.これらの結果は,腫瘍塊で生じる低酸素下でのMLH1発現抑制の責任分子がCXXC5やSYF2,HNRNPH1であることを示唆すると考えられた.本研究では次の4項目を具体目標として計画した.1)CXXC5を含む転写制御複合体の同定,2)複合体各因子のMLH1発現抑制に対する影響の検討,3)複合体の病態への関与の検証,4)転写制御複合体の新規ターゲットの網羅的検索.本年度までに3項目を達成しており,概ね順調に進展しているといえる.24年度が最終年度であるため、記入しない。本年度までの進捗状況から判断して,本研究計画の大幅な見直しは必要ないと考えられる.従って,次年度も申請時の計画に則って研究を遂行する.24年度が最終年度であるため、記入しない。
小笠原諸島における十脚目甲殻類のインベントリ作成および保全に関する基礎的研究

海洋島の小笠原諸島に生息するオガサワラヌマエビは絶滅が危惧されているが、保全に必要な生活史は未解明であった。また、サンゴ礁生態系は危機的な状況にあるが調査は不十分であった。本研究では、小笠原諸島のサンゴ礁海域で調査を行い、十脚目甲殻類のインベントリを作成し、併せて絶滅危惧種の初期生活史を解明し、今後の保全施策に資することを目的としていた。小笠原諸島の母島地先のサンゴ礁海域で十脚目甲殻類の分布調査を行って、撮影を行い、約130種のリストを作成した。また、オガサワラヌマエビについては安定して飼育することが可能になり、生活史の初期に採餌しないこと、塩分濃度が低いと直ちに着底するが、塩分濃度が高くなるにつれ浮遊生活を行う幼生の比率が高くなることなどが確認された。海洋島の小笠原諸島には独自の進化を遂げた固有種が分布することがさまざまな分類群で報告されている。ところが、十脚目甲殻類についてはこれまでに調査が行き届いておらず、新種や新記録となる種が発見される可能性がある。また、かつては本州や南西諸島に分布する種と暫定的に同一種とされてきた種についても分類学的な再検討を行うことにより、それぞれが別種とされるなどの例も想定される。もし新たな種が記録され、その種が小笠原諸島の固有種であったり、生息数・生息地点の少ない地域個体群などであったりするような場合には、例えば国立公園で保全する対象種として扱うなどすべきであると考えられる。そこで、父島・母島の陸水域と海域を調査地域とし、十脚目甲殻類を主要な対象とした水生生物の分布調査を行った。特にサンゴ礁海域は近年の白化現象により危機的な状況に陥る可能性が想定されたので、研究協力者より提供を得たGIS情報を参考にして造礁サンゴの被度が高い海域に重点をおいて調査を行った。海域ではD-フレームネットや篩いを用いた採集と併せて、潜水による調査を行い、得られた標本について可能な限り新鮮な状態でデジタルカメラを用いた撮影を行った。このようにして得られた標本や画像を用いて連携研究者がそれぞれ専門とする分類群について研究を行っているが、これまでにサンゴガニや共生エビが複数種見られており、共生エビはサンゴの他に、シャコ、ウミシダ、カイメンなどから得られたが、全体としての種数は南西諸島のサンゴ礁と比較すると少ないと考えられた。海洋島の小笠原諸島では陸水域や海域から十脚目甲殻類などの固有種が相次いで発見されており、これらの種は絶滅のおそれがある種としてレッドリストに掲載され、保全すべき対象種として扱われるようになったが、保全に必要な生活史や分布についての情報はまだ不足している。また、小笠原諸島地先の海域では造礁サンゴの白化現象により、共生エビやサンゴガニ類など造礁サンゴとの関わりが深い十脚目甲殻類が危機的な状況に晒される可能性があるが、この海域に生息する十脚目甲殻類の研究は不十分であり、種のリストさえ整っていない。そこで、本研究では、小笠原諸島の陸水域やサンゴ礁海域で十脚目甲殻類の調査を行い、固有種や絶滅危惧種など十脚目甲殻類のインベントリを作成するとともに、必要に応じてこれらの種の初期生活史や分布情報などを明らかして、今後の保全施策に資することを目的としている。本研究では前年度に引き続き小笠原諸島母島地先のサンゴ礁海域において潜水調査を行い、十脚目甲殻類の採集を行った。その結果、サンゴガニ類やキモガニ類をはじめとする造礁サンゴに関わりの深い十脚目甲殻類を採集するとともに、生息時の色彩を可能な限り残して撮影を行うことができた。これらの標本については、持ち帰って精査し、分類学的な検討を行っているところである。また、小笠原諸島父島の河川においてオガサワラヌマエビの分布調査を行い、父島の西側の海岸に流入している一河川では本種は源流域には分布せず、流量の安定している中流から上流域に分布していることが確認された。海洋島の小笠原諸島では近年その陸水域において十脚目甲殻類などの分類群で固有種が相次いで発見されている。そのうちオガサワラヌマエビやオガサワラモクズガニは絶滅のおそれがある生物種としてレッドリストに掲載されたが、これらの種を保全するうえで重要な初期生活史がまだ未解明であった。また、サンゴ礁海域は世界各地で白化現象により危機的な状況にあると考えられたが、小笠原諸島のサンゴ礁海域における十脚目甲殻類の調査は不十分な状況であった。

そこで、本研究では、小笠原諸島の陸水域やサンゴ礁海域などで十脚目甲殻類を対象とした調査を行い、固有種の発見に努め、絶滅危惧種や隔離分布種などを含めた十脚目甲殻類のインベントリを作成し、併せて絶滅危惧種の初期生活史を解明し、今後の保全施策に資することを目的としていた。小笠原諸島の海域では、平成22年度に引き続き母島地先のサンゴ礁海域において十脚目甲殻類の分布調査を行った。その結果、サンゴガニ類やカクレエビ類などの十脚目甲殻類を採集するとともに、生息時の色彩を可能な限り残して撮影を行うことができた。これらの標本については、持ち帰って精査し、分類学的な検討を行い種のリストを作成したが、一部の種で原記載と形態が合わないことが判明しているので再検討を行っている。また、小笠原諸島陸水域より持ち帰った固有種オガサワラヌマエビについては安定して飼育することが可能になり、生活史の初期において全く採餌しないこと、塩分濃度が低いと直ちに着底するが塩分濃度が高くなるにつれ浮遊生活を行う幼生の比率が高くなることなどが確認された。
運動による肝脂肪減少に骨格筋の代謝産物は寄与するのか

β-アミノイソ酪酸(BAIBA)はバリンの代謝産物として骨格筋から産生される物質であり、肝臓の脂質代謝を高める作用が報告されている。本研究では運動による肝臓脂肪の減少にBAIBAが関与するかを調査した。3か月の運動介入の結果、BAIBAと肝臓脂肪量の変化量、並びに大腿筋断面積の変化量に正の相関を認めた。介入前の肝臓脂肪量が高値と低値の群に分けたところ、高値群の肝臓脂肪量とBAIBAの変化量は正の相関、低値群では負の相関が認められた。本研究は運動による血中BAIBA濃度の変化と肝臓脂肪量の変化に関連がある可能性を示し、また介入前の肝臓脂肪量によってその関連性が異なる可能性を示した。様々な臓器が情報伝達物質や代謝産物などを放出して機能や代謝を調節する臓器間クロストークについて研究が進んでいる。我々は運動トレーニングによって肝臓の脂肪が減少するメカニズムを調査するために、骨格筋から血液中へ放出されるβアミノイソ酪酸(BAIBA)に注目をして研究を進めている。本年度はBAIBAの分析の立ち上げと、BAIBAの採血後の安定性について検証を行った。これは採血後どのタイミングで血液処理をすべきかを決めるための基礎情報を得るために実施したものである。試料は静脈血として、凝固促進フィルムを含むプレイン管とEDTA-2Na管を用いて血清と血漿を得た。これらの試料を分注して室温、4°C、-30°C、-80°Cの4条件で保存した。保存期間は、採血後12時間、24時間、3日、7日、14日、28日で、採血直後の血液を基準として比較をした。BAIBAの分析にはLC/MS/MSを用いた。血液試料は分析直前に内部標準であるL-フェニルアラニン-d8とL-バリン-d8を含むメタノールで処理された。分離は親水性相互作用クロマトグラフィー(HILIC)モードで行い、分子量86のフラグメントイオンのピークからBAIBAの濃度を求めた。室温と4°C保存では血清、血漿とも採血直後12時と採血直後のデータでは有意差を認めなかったが、以降はBAIBAのの濃度が増加した。-30°Cでは3日以降にBAIBAの濃度が増加し、L-フェニルアラニン-d8補正とL-バリン-d8補正それぞれで平均83.5%と25.2%の高値となったが、-80°Cではそれぞれ平均8.1%と0.22%の高値であった。本年度の実績として、BAIBAの分析を適切に行うためには採血後12時間以内に分離をして-80°Cで保存することが望ましいとの結果を得た。本年度は計画通りβアミノイソ酪酸の分析を立ち上げることができた。肝臓に過度に脂肪が蓄積することは糖代謝を悪化させたり、肝硬変や肝臓ガンへと発展するリスクにもなるが、これまでの研究から、運動トレーニングや食事制限によって肝臓の脂肪が減少することが報告されている。運動によって骨格筋から血液中への放出が高まる物質(マイオカインや代謝産物)が全身の代謝に影響することも知られており、中でもβアミノイソ酪酸(BAIBA)は肝臓の脂質代謝を向上させる可能性が報告されている。本研究では運動や食事制限による肝脂肪の減少にBAIBAが関与するとの仮説を検証することを目的とし、本年度は運動トレーニングや食事制限によって血中のBAIBA濃度が増加するかを調査した。対象者はメタボリックシンドロームの判定基準を1つでも有する者であり、無作為に運動群、食事制限群と観察群に分けられた。運動群は乳酸閾値強度の運動を週あたり300分、食事制限群はBMI22に相当する理想体重に25kcal/日を掛け合わせたエネルギーになるような食事を行い、介入期間は3ヶ月間とした。介入前後に空腹状態で得られた血液から、親水性相互作用クロマトグラフィー(HILIC)を用いたLC-MS/MSにて血中のBAIBAの濃度を分析した。介入前後の変化を群内で比較したところ、運動群、食事制限群と観察群に有意差を認めなかった。また群間の比較においても有意差を認めなかった。BAIBAの変化量と栄養摂取状況の関係について、運動群では炭水化物と正の相関関係、レチノールと負の相関関係を認めた。本年度は計画通り、介入研究の血液分析を実施することができた。本研究はメタボリックシンドロームまたはその予備群を対象に低強度運動の介入を3か月間行い、肝臓のβ酸化系を活性化させる因子として報告されているβ-アミノイソ酪酸(BAIBA)の血中濃度の変化と、CTによって評価した肝臓脂肪量(L/S比で評価)並びに大腿部の筋断面積、身体組成、糖代謝・脂質代謝に関連する血中物質と栄養摂取状況の変化との関連を調査した。その結果、血中BAIBAの変化量と、大腰筋面積、摂取エネルギー量、炭水化物摂取量、ビタミンB1摂取量、水溶性食物繊維摂取量の変化量との間に正の相関を認めた。またL/S比、血中レプチン濃度、安静時血小板数の変化量との間に負の相関を認めた。介入前のL/S比の低値群(1.14±0.22)と高値群(1.46±0.14)に分けて解析を行ったところ、低値群では負の相関、高値群では正の相関を認めた。

また本年度は対象者1名ではあるが、乳酸閾値強度で30分の運動による血中BAIBA濃度の変化と骨格筋でのBAIBA産生に関連する酵素であるAGXT2のタンパク発現を調査した。採血と外側広筋での筋生検を運動前、運動終了直後、1時間後、2時間後、3時間後に行った。同様の実験を4回繰り返して比較したところ、血中BAIBA濃度の経時間変化では有意差が認められなかったものの、4回すべてで運動前に比べて運動直後で高い値を示し、その後の時間経過とともに低下していくという結果を得た。また運動前と直後の血中BAIBA濃度のみの比較では有意な増加を示すという結果を得た。本研究は、運動トレーニングによる血中BAIBAの変化は、肝臓脂肪量など対象者の特性によって異なる可能性があること、また一過性の運動で血中BAIBA濃度が増加する可能性がある可能性を示した。β-アミノイソ酪酸(BAIBA)はバリンの代謝産物として骨格筋から産生される物質であり、肝臓の脂質代謝を高める作用が報告されている。本研究では運動による肝臓脂肪の減少にBAIBAが関与するかを調査した。3か月の運動介入の結果、BAIBAと肝臓脂肪量の変化量、並びに大腿筋断面積の変化量に正の相関を認めた。介入前の肝臓脂肪量が高値と低値の群に分けたところ、高値群の肝臓脂肪量とBAIBAの変化量は正の相関、低値群では負の相関が認められた。本研究は運動による血中BAIBA濃度の変化と肝臓脂肪量の変化に関連がある可能性を示し、また介入前の肝臓脂肪量によってその関連性が異なる可能性を示した。我々はメタボリックシンドロームのリスクを保有している者を対象に、運動トレーニングと食事制限の介入研究を実施している。本年度立ち上げた分析法を用いて、その研究で得た血液試料を分析してBAIBA濃度の変化を調査する。CTによって得られた肝臓の画像から、肝脂肪を定量してその変化とBAIBAの変化を比較する。運動生理学次年度の分析で使用する試薬の購入に当てるため。
実世界で動作するDNAナノマシン構築手法の確立

本研究課題では、所望の性能を示すナノマシンを定量的に設計して構築する手法の確立を目的として、複数の安定状態を考慮したモデルを用いて設計を行い、実際にナノマシンを構築して動作を検証する。DNAの結合を競合させるという独自の着想にもとづいて、これまで検証されてこなかった「最安定ではない構造をどのように取り扱うべきか?」という問いに取り組む。三年間の研究期間において複数のDNAナノマシンを設計し、各ナノマシンが設計通りの動作特性を示すかを実験で検証して、構築手法の有効性を実証する。
素材材質に対応した冷間鍛造用環境対応型潤滑剤の設計指針の構築

1.研究目的アルミ冷間鍛造品の需要が増えているが、材料費が高いため低コスト化が求められている。特に鍛造用潤滑剤のコストと環境負荷が問題とされ、安価な環境対応型潤滑剤が要望されている。住鉱潤滑剤(株)では下地膜と上塗膜の2層の固体皮膜を形成する環境対応型潤滑剤を開発したが、最適な皮膜条件が不明確であった。そこで硬さの異なるアルミ合金で摩擦試験を行い、材質が潤滑性能に与える影響を検証し、材質によるアルミ用環境対応型潤滑剤の設計や皮膜条件の指針を検討した。2.研究方法スプライン押出しを模擬した摩擦試験法を用い、得られた摩擦係数と焼付きの程度から潤滑剤性能を評価した。試験片には軟らかい順にアルミ合金A6061-0(焼鈍し材)、A7075-0、A6061-T6(焼入れ材)を採用した。従来の潤滑剤であるフッ化アルミ皮膜と環境対応型で材質の影響を比較検証し、環境対応型で皮膜前素材の表面処理、潤滑膜成分、膜厚、金型温度の影響を調査した。3.研究成果潤滑剤に関わらず、硬い材料ほど摩擦は増大した。環境対応型の方が増加量は大きく、性能が劣っていた。表面処理としてウェットブラスト処理を施した。潤滑剤に関わらず、軟らかい材料では効果がないが、硬い材料では最大で3割摩擦係数が低減した。硬い材料ほど素材表面処理が有効である。環境対応型の上塗膜成分は摩擦に影響しなかった。下地膜成分である高分子樹脂とバインダーの配合を変えたところ、高分子樹脂には摩擦低減効果がなく、逆に多過ぎると摩擦が増大した。上塗膜厚は過小では摩擦増大、過大では皮膜が脱落するため3μmが最適と判断された。下地膜厚は軟らかい材料では薄い方が低摩擦だが、硬い材料では鍛造の厳しさによって最適な膜厚があると推定された。金型を60100°Cに加熱すると環境対応型の摩擦はフッ化アルミと同等まで低下した。皮膜条件以上に金型温度が摩擦低減に有効であった。L'1.研究目的アルミ冷間鍛造品の需要が増えているが、材料費が高いため低コスト化が求められている。L'
天然生理活性物質トウトマイセチンを用いたPP1阻害による細胞内情報伝達の網羅解析

本研究では従来の生化学的手法に加え、1型プロテインホスファターゼ(PP1)の初めての特異的阻害剤トウトマイセチン(TC)、および質量分析装置等の新技術を組み合わせて使用し、特に細胞膜直下のリン酸化タンパク質の網羅的な解析を行う。そして、その成果によって癌、糖尿病および免疫系をはじめとする生命科学分野に新たな展開をもたらし、さらにTCの臨床薬剤としての応用も目指す。明らかになったこと:(1)様々な抗リン酸化抗体による実験結果から、2A型ホスファターゼ(PP2A)が、細胞内のほとんど全てのリン酸化セリン・スレオニンを基質とするのに対して、PP1は基質特異性が大きい。(2)トウトマイセチンで処理した細胞ではサイトカインTNFによる転写因子NF-κBの活性化が抑制される。この事実は、トウトマイセチンがNF-κBの上流であるキナーゼIKKの活性化を抑制する事を示している。またIKKとPP1は恒常的に結合しており、TNF刺激後はIKKの活性の減少と同様な時間経過での受容体へのPP1の結合と解離が観察された。このことからPP1はTNF/NF-κB経路の受容体付近に基質タンパク質をもっており、PP1はTNF/NF-κB経路を正に制御していると示唆される。(3)様々なシグナル伝達系路を調べた結果、PP1はDNA修復および細胞周期制御に重要なATMの基質を脱リン酸化することが示唆された。ATMの基質で有名な分子はp53であるが、本研究では異なった分子が見出され、リン酸化の部位も推定された。そこで、本年度はこれまでの成果、特に上記(3)で得られたPP1がTNF/NF-κBを正に制御しているという報告者は実験結果を論文として纏め、投稿中である。PP1のさらなる基質を探索すると共に、上記(4)で得られたATMの基質に関して、がんとの関連が推測されるので今後の研究課題として重要であると思われる。実績1;様々な増殖因子やサイトカインのうちTCが影響を及ぼすシグナル伝達経路はどれかを、下流の分子の活性化や発現を検出しながら網羅的に探索した。検出はルシフェラーゼ測定にて下流の転写因子の活性化、リン酸化抗体で下流分子の活性化を調べた。その結果、TCがTNFおよびEGF刺激を抑制することが明らかとなった。一方、同様な刺激であるLPSおよびIL-6などのサイトカインへの影響は示さなかった。実績2;市販の抗リン酸化抗体等の抗体でイムノブロット、またキナーゼおよびGタンパク質(Rasなど)の活性をIn vitroで測定し、シグナル伝達のどの段階にTCが作用しているか調べた。その結果、TNFにおいてはIKKキナーゼより上流で受容体よりも下流にTCの標的があることが示唆された。実績3;TCを用いて処理を行った細胞の抽出液を2次元電気泳動法において分離したところ、処理を行わなかった細胞抽出液に比べ幾つかのタンパク質が酸性側に移動しているのが示唆された。現在はリン酸化タンパク質親和性クロマトグラフィーを用いて、精製を試みている。実績2;市販の抗リン酸化抗体等の抗体でイムノブロット、またキナーゼおよびGタンパク質(Rasなど)の活性を功In vitroで測定し、シグナル伝達のどの段階にTCが作用しているか調べた。明らかになったこと:(1)様々な抗リン酸化

抗体による実験結果から、2A型ホスファターゼ(PP2A)が、細胞内のほとんど全てのリン酸化セリン・スレオニンを基質とするのに対して、PP1は基質特異性が大きい。(2)トウトマイセチンで処理した細胞ではサイトカインTNFによる転写因子NF-κBの活性化が抑制される。この事実は、トウトマイセチンがNF-κBの上流であるキナーゼIKKの活性化を抑制する事を示している。またIKKとPP1は恒常的に結合しており、TNF刺激後はIKKの活性の減少と同様な時間経過での受容体へのPP1の結合と解離が観察された。このことからPP1はTNF/NF-κB経路の受容体付近に基質タンパク質をもっており、PP1はTNF/NF-κB経路を正に制御していると示唆される。(3)様々なシグナル伝達系路を調べた結果、PP1はDNA修復および細胞周期制御に重要なATMの基質を脱リン酸化することが示唆された。ATMの基質で有名な分子はp53であるが、本研究では異なった分子が見出され、リン酸化の部位も推定された。そこで、本年度はこれまでの成果、特に上記(3)で得られたPP1がTNF/NF-κBを正に制御しているという報告者は実験結果を論文として纏め、投稿中である。PP1のさらなる基質を探索すると共に、上記(4)で得られたATMの基質に関して、がんとの関連が推測されるので今後の研究課題として重要であると思われる。
呼吸と睡眠時義歯装着/非装着との関連

今年度は前年度に引き続き,就寝時に義歯を装着,の酸素飽和度(SpO_2)を測定した被験者としては,全身疾患の少ない高齢者を対象とした口腔内状態としては,総義歯に準じる義歯を装着している被験者を対象とし本年度は8名を対象としたカニューレの使用も試行したが1名から許可があったくらいで他の被験者は無理であった睡眠時無呼吸の自覚症状のない被験者を主として集めたためにこのような結果となったのかもしれない被験者によりデータにばらつきがあるが,義歯の装着/非装着で,大きな変化は認められなかった.また,中には,軽度の睡眠時無呼吸が疑われる被験者もいたが,やはり大きな差は認められなかったさらに,BMIも測定し,BMIとの関臨検討したが,SpO_2との関わりは認められなかった.日常的な就寝時の義歯取扱いの影響も否定できないが,いずれの状態でも大きな差は認められなかった.結果では明らかにできなかりたが,高齢者では,他の疾患(高血圧糖尿病など)を有している被験者も多く,それらの疾患も考慮する必要があるであろう.認知症高齢者では,器機を装着することを試みたが,不可能であったので観察研究とした認知症高齢者93人を対象者とした(GH63人老健30人).睡眠導入剤の服用も認められた(GH23人老健8人).それぞれの施設のスタッフに聞いた被験者(入所者)の睡眠状態では全体で85名の被験者(914%)が良眠されているとの結果であったまた睡眠状態が不良の入所者は,夜間の排尿の影響が強い傾向であった.睡眠状態が不良の被験者8人のうち,6名は上下に義歯を装着し少なくともいずれかの義歯は総義歯であり,就寝時には外すことが多い傾向であったが睡眠状態と義歯の装着/非装着との間に明確な関連は認められなかった高齢者の健康には,睡眠が大きく影響することが考えられる.超高齢社会になり,義歯装着者は多くなることが予想されるが,義歯装着者の睡眠に注目した研究はほとんど見当たらない.中でも就寝時の義歯の装着/非装着の影響については未だ明らかではないことが多い.本研究では,就寝時の動脈血の酸素飽和度(SpO2)に注目した.パルスオキシメーターを用いて,睡眠中のSpO2を測定して,義歯の装着/非装着の影響を検討することとした.SpO2低下指数(ODI Oxygen Desaturation Index,1時間あたりの酸素低下指数)と1時間あたりの無呼吸低呼吸指数(AHI : Apnea Hypopunea Index)との相関を調べた結果では,ODI-3%とAHIとの間に有意な強い相関(r = 0.89)がみられている(中野博ほか,1998).したがって,SpO2脈拍を指標に総義歯の装着/非装着と呼吸との関係を検討することで,呼吸と義歯装着との相関の根拠を得ることができると考え本研究を計画した.現在,3名の義歯装着者を被験者として,測定機器を貸し出して,データを測定したところである.この収集したデータは,分析して種々検討している.また,現在(4月5日現在),測定に協力してもらえる2人に測定機器を貸し出しているところである.今のところ,測定は指先に測定装置を装着するのみでの測定であり,カニューレは使用できていないが,カニューレ使用を受け入れることができる対象者がいれば,併せて測定することを考えている.さらに,認知症高齢者の睡眠状態についてもデータを収集している(沼隈病院の関連施設など).認知症高齢者では,測定機器を指に着けることの困難さを考えて,睡眠時間および睡眠状態を観察研究によりデータ収集している.現在,約90名の認知症高齢者のデータを収集しているところである.今年度は前年度に引き続き,就寝時に義歯を装着,の酸素飽和度(SpO_2)を測定した被験者としては,全身疾患の少ない高齢者を対象とした口腔内状態としては,総義歯に準じる義歯を装着している被験者を対象とし本年度は8名を対象としたカニューレの使用も試行したが1名から許可があったくらいで他の被験者は無理であった睡眠時無呼吸の自覚症状のない被験者を主として集めたためにこのような結果となったのかもしれない被験者によりデータにばらつきがあるが,義歯の装着/非装着で,大きな変化は認められなかった.また,中には,軽度の睡眠時無呼吸が疑われる被験者もいたが,やはり大きな差は認められなかったさらに,BMIも測定し,BMIとの関臨検討したが,SpO_2との関わりは認められなかった.日常的な就寝時の義歯取扱いの影響も否定できないが,いずれの状態でも大きな差は認められなかった.結果では明らかにできなかりたが,高齢者では,他の疾患(高血圧糖尿病など)を有している被験者も多く,それらの疾患も考慮する必要があるであろう.認知症高齢者では,器機を装着することを試みたが,不可能であったので観察研究とした認知症高齢者93人を対象者とした(GH63人老健30人).睡眠導入剤の服用も認められた(GH23人老健8人).それぞれの施設のスタッフに聞いた被験者(入所者)の睡眠状態では全体で85名の被験者(914%)が良眠されているとの結果であったまた睡眠状態が不良の入所者は,夜間の排尿の影響が強い傾向であった.睡眠状態が不良の被験者

8人のうち,6名は上下に義歯を装着し少なくともいずれかの義歯は総義歯であり,就寝時には外すことが多い傾向であったが睡眠状態と義歯の装着/非装着との間に明確な関連は認められなかった総合的にみれば,研究は比較的順調に進んでいると考えているが,達成度としては,2030%くらいと考えられる.原因の1つは,測定の対象者の問題と考えられる.計画では,総義歯を装着して問題なく使用している高齢者を,当初は測定の対象者としていた.しかしながら,大学病院を受診される患者では,総義歯装着者の割合が減少しているようであり,研究計画を立案した当初の条件の患者数が少ない.また,高齢の対象者であれば,全身の健康状態が不調な方も多く,測定をお願いできないこともままあった.被験者とするための条件を少し変更し,対象者数を増やすことも考えている.他の原因としては,測定機器の電源の問題があった.本測定器では電源として電池を使用する.単三の電池1個で,8時間を測定1回として,3回の測定ができるようにしている.測定回数としては最大の条件である.検討した結果,測定がかなりの回数になるため,充電式の電池を購入して使用することとした.しかしながら,当初購入した充電式の電池は,1回の測定に使用したところで切れてしまい,予想と大きく異なっていた.測定機器の業者とも相談したがその原因がわからず,かなりの期間データ収集に支障をきたした.いろいろと検討した結果,充電式の電池の種類によることが判明し,種類を変えることにより,当初の想定したとおりの測定ができるようになった.また,現在は測定装置を3式使用しているが,測定のために貸し出した場合,距離が遠いところに住んでいらっしゃる方では,それぞれの都合で機器の回収までに時間がかかることもあり,データ収集が遅れている原因の1つであろう.しかしながら,測定のための条件が整ってきたので,時間の経過とともに着実に結果が出るものと考えている.被験者については,総義歯装着者のみならず,部分床義歯を装着している高齢者に対象を広げる予定である.部分床義歯装着者については,義歯を装着しなければ咬合高径を維持できない義歯装着者を目標として,被験者を選定する.また,現在は指先に測定装置を固定しているが,被験者の了解が得られれば,鼻孔にカニューレを装着しての測定の方がより精確であるが,協力して頂ける被験者には限りがあることが予想されるので,ベースとしての測定は指先での測定が重要であろう.現在まで得られたデータから,BMIのみならず上気道の形態も関係していると考えられる.そこで,視診により,被験者を軟口蓋の状態から3型に分類(正常型,境界型,軟口蓋低位型)して,軟口蓋との関係も検討する予定である.さらに,開口状態で写真を撮り,客観性をより高めることを考えている.さらに当初の設定では,被験者の条件をできるだけ同じようにするために,BMIが18.525の調査対象者を想定していたが,その範囲外の被験者も検討することを考えている.データ整理の時に検討したいと思っている.現在の日本の大きな問題となっている認知症高齢者に対して,本研究で用いている測定機器を装着する予定であるが,認知症高齢者の中には装置の装着ができないことも予想される.そのため,認知症高齢者の睡眠については,観察研究もあわせて行っている.さらに当初の設定では,BMIが18.525の調査対象者を想定していたが,その範囲外の被験者も検討することを考えている.データ整理の時に検討したいと思っている.現在の日本の大きな問題となっている認知症高齢者に対する対応も考えている.本研究で用いている測定機器を装着する予定であるが,認知症高齢者の中には装置の装着ができないことも予想される.そのため,認知症高齢者の睡眠については,観察研究もあわせて行っている.
伝統発酵食品中の微生物を用いた食品アレルゲン低減化の検討

東南アジアの発酵食品からプロテアーゼ産生微生物を分離し、米アレルゲンタンパク質分解能について検討を行った。米抽出タンパク質を基質とした時、強いプロテアーゼ活性を示した菌株はBacillus subtilis, Bacillus Megaterium, Bacillus cereus, Bacillusflexusであった。また、分離微生物から産生されたプロテアーゼは、米アレルゲンタンパク質に対し強い分解能を有することが示唆された。本研究は、東南アジアの伝統発酵食品から穀類(米、小麦、蕎麦)由来のアレルゲンタンパク質を特異的に分解する微生物を検索し、その分離微生物を用いた食品工業への応用を検討することを目的とした。平成19年度は、タイ、ベトナム、カンボジアの発酵食品を対象に、プロテアーゼ産生微生物のスクリーニングを行った。供試菌株は、各食品から分離した計86株とし、これらの菌株をNA、LB液体培地及びコラゲナーゼ誘導培地で培養(37°C、48時間)した培養上清を粗酵素溶液として用いた。また、米、小麦、蕎麦から抽出したタンパク質に、粗酵素溶液を作用させた時の分子量の変化を、SDS-PAGEにより観察することで、供試菌株の穀類タンパク質分解能を検討した。米抽出タンパク質に粗酵素溶液を作用させた時、分子量に変化がみられたのは35株であった。そのうち21株では26kDa付近のバンドが消失し、14株では26kDaに加え14-16kDa付近のバンドの減少が見られた。分子量の変化が認められたいずれのタンパク質も、6.5kDa以下に新たなバンドの出現が確認され、米タンパク質を分解する35株を特定することができた。しかし、小麦、蕎麦抽出タンパク質においては、いずれの粗酵素溶液を作用させた時も分子量に変化がみられず、粗酵素溶液の調製方法、培養条件を含めて、今後、検討する必要がある。次年度は、供試菌株の系統解析を行うと共にアレルゲンタンパク質分解能を明らかにしていきたい。東南アジアの発酵食品からプロテアーゼ産生微生物を分離し、穀類アレルゲンタンパク質分解能について検討を行った。申請者は、前年度までに、タイ、ベトナム、カンボジアの発酵食品から計86株のプロテアーゼ産生微生物を分離し、分離微生物の中から米の塩可溶性タンパク質を分解する35株を特定した。今年度は、昨年度分離した菌株について、16srRNA塩基配列およびAPI細菌同定検査キット(BIOMERIEUX)よる同定試験を行った。また、分離微生物産生プロテアーゼの米アレルゲンタンパク質分解能についても検討行った。米抽出タンパク質を基質とした時、強いプロテアーゼ活性を示した菌株は、Bacillus subtilis, Bacillusmegaterium, Bacillus cereus, Bacillus flexusであった。Bacillus subtilis, Bacillus Megaterium, Bacillus cereusにおいては、表現型の異なる複数の菌株が同定された。また、分離微生物から産生されたプロテアーゼを米抽出タンパク質に作用させた後、残存アレルゲン量を測定したところ、作用前のアレルゲンタンパク質量に比して5-20%の低減化が見られた。このことから、本実験で分離したBacillus属の産生プロテーゼは、米アレルゲンタンパク質に対し強い分解能を有することが示唆された。
新規トランスジェニック細胞樹立の基盤技術確立と合成生物学への応用

Synthetic Biology(合成生物学)の分野では,細胞を部品の集合であると考え,それらの部品を人工的なものに置き換えてみる,もしくは完全な人工物で集合体(細胞・広い意味での生物)を組み上げる(再構成する)研究が進んでおり,細胞ベースの優れた技術を生み出す領域としての役割も担う。細胞の構成要素としてのゲノムは,普遍的遺伝情報を格納する場としてその他の生体高分子の成り立ちにも大きく影響をもつ。従って,ゲノムを自在に操作および制御する技術が,合成生物学研究,特に哺乳類細胞における研究の発展に大きく貢献すると期待される。ゲノムに対する人為的な制御を可能とするためには30億塩基対から構成されるヒトゲノム配列に対して標的となるDNA配列に対して高い特異性で結合するタンパク質が必要となる。これを用いてエフェクタードメインを融合させ,酵素機能を有する機能分子を創製することができ,かつタンパク質発現系を利用して細胞内で作用させることができる。DNA切断反応を用いたゲノム編集技術によって内因性遺伝子に自在にトランス遺伝子や変異を導入できる。本研究では,ジンクフィンガーヌクレアーゼ(ZFN)を用いたトランスジェニック(ノックアウト)細胞樹立を行い,テロメア伸長酵素であるhTERT遺伝子のプロモーター領域を標的としたゲノム編集に成功した。他の標的としてこれまでノックアウトマウスの作製が困難であったASH1遺伝子(耐性致死)のエクソン配列を標的とし,それぞれZFNによる配列特異的なDNA切断による変異導入で標的箇所をゲノム編集した細胞を得ることに成功した。また,標的遺伝子部分を特異的に組み換えるDNA組換え酵素(ZFR)を用いた研究では目的とする欠損配列を生成させることに成功した。以上の結果は哺乳類細胞での内因性遺伝子に対するエンジニアリング技術基盤の確立につながると考えられる。25年度が最終年度であるため、記入しない。本研究では遺伝子回路研究を初めとする合成生物学研究に有用になる哺乳類細胞での内因性遺伝子に対するエンジニアリング技術基盤を確立することを目的とした。配列特異的にgenetic engineeringが行えるジンクフィンガー融合酵素を用いて(1)化合物によるコンディショナルな遺伝子ノックダウンを行えるシステムの構築(ジンクフィンガーヌクレアーゼ:Zinc Finger Nuclease(ZFN)を用いる)、(2)耐性致死遺伝子研究用細胞株の樹立とその解析(ジンクフィンガーリコンビナーゼ:Zinc Finger Recombinase (ZFR)を用いる)、(3)核内動態の観察と解析手法の確立、に取り組むことを当初の計画として立てた。平成24年度末までの研究目標として(1)有機小分子化合物で切断を誘導できるZFN遺伝子の構築、(2) in vitro翻訳系による各タンパク質の発現確認とラパマイシンによるDNA切断誘導実験、(3)胎生致死遺伝子欠損細胞の構築準備(ジンクフィンガーリコンビナーゼの構築)を具体的な取り組みとして掲げていた。化合物を用いたコンディショナルな遺伝子ノックダウンを行える系については必要なタンパク質は構築を終え、現在DNA切断条件の最適化に関して検討を行っている。ノックアウト細胞の創出に関する研究においては標的遺伝子としてhTERT(テロメア逆転写酵素)、ASH1、ATF3などを選定し、それぞれ標的とする遺伝子配列に対して特異的に結合するジンクフィンガードメインを構築することができた。特に優れたDNA結合活性を持つもので10 (nM)に匹敵する解離定数を有するドメインを見出すことができた。ヌクレアーゼに関してはin vitro翻訳系において構築したジンクフィンガードメインとヌクレアーゼドメインの融合酵素を構築しDNA切断を確認した。ZFNを用いたノックアウト細胞の作製に関して標的遺伝子配列に対するジンクフィンガードメインの選択方法、ヌクレアーゼによる変異導入の検出実験の手法に関してどのような遺伝子に対しても行える基礎的知見を得ることができた。このため、初年度の目標として十分に達成できたと考えられる。標的遺伝子としては、1) AAVS1、2)hTERT(ヒトテロメラーゼ)、3)ASH1、4)ATF3に対するヌクレアーゼを構築し、in vitroでの切断、ゲノム遺伝子での変異導入をAAVS

1に対するZFNをポジティブコントロールとして確認し、成果が出始めている。また、更に効率的にノックアウト細胞を得る手段の一つとして、ZFNによる切断箇所にドナー遺伝子を導入し、薬剤耐性マーカーによるセレクション方法に関しても手法を確立した。ジンクフィンガーリコンビナーゼに関しては反応効率の向上に関する基礎的知見を得ている。初年度の取り組みとして、2年間の研究において必要となる研究資材である人工タンパク質群をすべて構築することができたことは次年度の研究の発展に大きく貢献する成果である。また、遺伝子ノックアウトの研究系としてAAVS1遺伝子に対するコントロールZFNを用いて構築できたことはZFNの活性評価を加速させると考えられる。ZFRに関してはトランスフェクションによる細胞内導入で発現させたタンパク質の細胞内局在を蛍光を用いた免疫染色によって確認することができた。従って、同様の系を用いた場合、用いたZFRは細胞内での発現によって細胞核内にすべて送達されることが示された。以上のように、初年度の研究目標においていた事項に関してはすべて取り組むことができ、良好な結果を得ることができている。従って、次年度の研究も加速的に推進できるものと考えられる。平成25年度の研究計画として(1)化合物誘導型DNA二重鎖切断に関して、構築したタンパク質ドメインをin vitroで解析すると同時に細胞内導入についても検討し、細胞核内でのゲノム切断に関する知見を得る。(2)平成24年度に得られたZFNで標的としている遺伝子のノックアウトに関して細胞の表現型への影響を詳細に解析する。(3)ZFNに関してドナー遺伝子を多様に設計し、細胞内においてトランスジェニックな遺伝子の発現制御へと活用する方法を確立する。(4)ジンクフィンガーリコンビナーゼについて細胞内発現の最適化による反応効率向上を解析し、標的遺伝子のノックアウト反応へと利用する。という4点を挙げていた。具体的にはin vitroで標的DNA切断が確認されたZFNに関して核画分を用いたウェスタンブロッティングや蛍光免疫染色法によって核内への局在を確認し、さらにDNA切断による変異導入効率などを定量的に測定する。細胞の表現型への影響に関しては、樹立した培養細胞のみならず、プライマリー細胞を用いることで正常な染色体状態の細胞におけるノックアウト効果に関する知見を得ることにする。ノックアウトされた遺伝子の下流に存在するタンパク質の発現状態などを詳細に解析する。
内臓痛研究のための摘出標本の開発と侵害反射電位の発生に関与するタキキニン受容体

大内臓神経は胃,小腸,膵臓,肝臓,腎臓など腹部内臓からの痛み情報を中枢に伝える神経として知られている。今年度は幼若ラットを用い,脊髄に前根,後根,後根神経節,交感神経幹さらに大内臓神経をつなげた標本を作製し,内臓痛の研究をin vitroで行なうことを試みた。大内臓神経にテタヌス刺激(20HZ,1.53秒,40V)を加えると胸髄節前根(T911)から約40秒間持続する脱分極性の反射電位が記録された。この反射電位の生理および薬理学的性質を明らかにするため反射電位を抑制あるいは増大する薬物の作用を検討した。モルヒネ(0.13μM),メチオニン・エンケファリン(0.013μM),ガラニン(0.13μM),スコポラミン(0.010.3μM)およびGR71251(0.310μM),CP96345(0.310μM)などのタキキニンNK-1受容体拮抗薬は反射電位を用量依存的に抑制した。メチオニン・エンケファリン(3μM)およびモルヒネ(2μM)適用により反射電位は著しく抑制(92±0.33%)され,その抑制はナロキソン(0.5μM)の適用により消失した。GR71251およびCP96345も反射電位を用量・依存的に抑制し,10μMにおけるそれぞれの抑制率は51I3.59%,81.5±4.55%であった。ガラニンおよびスコポラミンも一過性に反射電位を抑制したのに対し,カルチトニン遺伝子関連ペプチドおよびエドロフォニウムは反射電位を有意に増大した。以上の成績から大内臓神経誘発反射電位は侵害反射電位の一つで内臓痛のモデルに見做すことが出来ると思われる。また,反射電位の発生にサブスタンスPおよびニューロキニンAなどタキキニンの他にアセチルコリン,ガラニン,エンケファリンなどの関与も示唆された。一方,GR71251,CP96345などの実験成績から電位発生にはNK-1受容体が関与していることが明らかとなった。