hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
棘皮動物の幼生骨片形成に関わる初期発生メカニズムの進化

昨年度までに、原始的ウニのノコギリウニからPmar1を同定し、ウニ以外の棘皮動物からはPmar1は見つからなかったものの、Pmar1に近縁なホメオボックス遺伝子を複数同定し、phb遺伝子とした。本年度は、Pmar1とPhbの機能がどのように進化したかを明らかにするため、ノコギリウニとイトマキヒトデを用いて機能解析を行なった。一般的なウニではPmar1を過剰発現すると、全ての細胞が骨形成細胞へと発生する。しかし、ノコギリウニを用いてPmar1の過剰発現実験を行なった結果、中胚葉性細胞は増加するが、骨形成細胞は増加しなかった。また、過剰発現胚では一般的なウニと同様にEts1やAlx1が活性化されたものの、HesCも全体で活性化された。以上の結果から、ノコギリウニにおいてもPmar1は中胚葉性細胞の特異化に関わっているが、HesCを介さずにAlx1やEts1を活性化していることが示唆された。一方、イトマキヒトデを用いてPhbのノックダウン実験を行なったところ、原腸形成と間充織細胞形成の阻害とEts1、HesCの発現抑制が観察された。また、Engrailed repressor domainもしくはVP16 activation domainとPhbの融合タンパクの過剰発現実験から、ヒトデのPhbも転写抑制因子であることが示された。従って、ヒトデにおいてもPhbは未知の転写抑制因子を抑制することで、Ets1とHesCを活性化していることが示唆された。今回得られた結果は、(1)Pmar1遺伝子がウニの共通祖先でPhbの重複によって獲得されたこと、(2)Pmar1の祖先遺伝子はヒトデとウニの共通祖先で既に中胚葉への機能をもっていたこと、(3)原始的ウニと一般的なウニの祖先が分かれた後、一般的なウニの祖先で、Pmar1の下流にHesCが挿入されたこと、を示唆した。翌年度、交付申請を辞退するため、記入しない。本研究では、棘皮動物の幼生骨片形成をモデルとして、発生メカニズムは改変されるが結果として生じる形態は変化しない現象「Developmental system drift」が起こるプロセスの理解を目指している。幼生骨片をもつウニ、ナマコ、クモヒトデでは、Alx1、Ets1などの転写因子が共通して幼生骨片の形成に重要なはたらきをしている。これらの骨形成転写因子は、一般的なウニでは、2つの転写抑制因子Pmar1、HesCの二重抑制によって活性化されている。しかし、pmar1が一般的なウニ以外からは単離されないことと、HesCの空間的発現パターンが劇的に変化していることから、この仕組みは原始的ウニや他の棘皮動物には存在しないことが示唆されている。では、一般的なウニ以外ではどのような仕組みによってAlx1などの骨形成転写因子が活性化されているのか?今年度はその問題を解決するために、Alx1の調節遺伝子の候補を選定するべく、スナクモヒトデと原始的ウニのノコギリウニを対象として、経時的トランスクリプトーム解析を行った。その後、その結果を基に、Alx1が発現開始する時期までに発現が上昇する遺伝子を抽出した。抽出された候補遺伝子は、スナクモヒトデでは19個、ノコギリウニでは42個であった。その中から、予期せずノコギリウニのpmar1遺伝子を同定した。スナクモヒトデでも似た配列の遺伝子が5つ同定された。発現解析の結果、いずれも一般的なウニのpmar1とよく似た発現パターンを示した。今後は、他の棘皮動物でのpmar1類似遺伝子を探索するとともに、ノコギリウニにおけるpmar1の機能を解析する予定である。並行して、pmar1以外の遺伝子がAlx1などの骨形成転写因子を活性化している可能性も考慮し、他の候補遺伝子についても発現解析を行っていく。当初の計画では、母性beta-cateninを抑制する処理をした胚を用いてトランスクリプトーム解析を行う予定であったが、ノコギリウニの良い胚が得られないという問題からそれを遂行することができなかった。しかし、以前抽出したRNAサンプルを利用して、経時的トランスクリプトームを行うことによって、別の方法でAlx1を調節する候補遺伝子を抽出することができた。候補遺伝子にはpmar1が含まれ、それをきっかけにスナクモヒトデを含む他の棘皮動物からも複数のpmar1類似遺伝子を同定するに至った。Pmar1が棘皮動物全体で共有されているという予期しない結果が得られたものの、遺伝子ネットワークの変化の全体像が明らかになる期待が高まっている。本研究では、棘皮動物の幼生骨片をモデルとして、発生メカニズムは改変されるが結果として生じる形態は変化しない現象「Developmental system drift」が起こるプロセスの理解を目指している。棘皮動物の一部の系統群(ウニ、ナマコ、クモヒトデ)は幼生独自の骨を持っている。この幼生の骨の形成には、Alx1やEtsなどの共通の転写因子が重要な役割をすることが知られているが、それらの転写因子群の調節システムは動物群によって異なると考えられている。一般的なウニでは、2つの転写抑制因子、Pmar1とHesCによってAlx1とEtsが活性化される。一方、原始的ウニやナマコとクモヒトデではPmar1が見つかっておらず、HesCの発現様式も異なっている。そこで、本研究ではまず一般的ウニ以外でのAlx1とEtsの調節機構を明らかにすることを目標としている。

昨年度は、原始的ウニとクモヒトデにおいてAlx1とEtsを調節する可能性がある転写因子のスクリーニングを行い、予期せず、Pmar1様遺伝子を単離することに成功した。そこで本年度(4ー6月)はヒトデとナマコからのpmar1様遺伝子の単離と発現解析を行うとともに、原始的ウニとヒトデにおいて機能解析を試みた。イトマキヒトデとマナマコから、それぞれ2つ、1つのpmar1様遺伝子を単離した。いずれの遺伝子も発生の早い段階から植物極側で発現しており、ヒトデの1遺伝子についてはウニのPmar1と同様に、胞胚期までの非常に短い期間しか発現しないという特徴があった。原始的ウニの機能解析は成功していないものの、イトマキヒトデではモルフォリノアンチセンスオリゴと合成RNAを用いた機能抑制実験と過剰発現実験を行うことができた。これまでの結果から、ヒトデのPmar1様遺伝子は内中胚葉形成に関わることが示唆された。原始的ウニでのpmar1の機能解析については、数回試みたものの、良い受精卵が得られず、成功していない。しかし、それ以外の解析については順調に結果が得られている。ヒトデとナマコのpmar1様遺伝子については、発生を通した発現解析を終えることができた。ヒトデを用いた機能解析についても、追加実験は必要であるが、おおよその見通しがたっている。昨年度までに、原始的ウニのノコギリウニからPmar1を同定し、ウニ以外の棘皮動物からはPmar1は見つからなかったものの、Pmar1に近縁なホメオボックス遺伝子を複数同定し、phb遺伝子とした。本年度は、Pmar1とPhbの機能がどのように進化したかを明らかにするため、ノコギリウニとイトマキヒトデを用いて機能解析を行なった。一般的なウニではPmar1を過剰発現すると、全ての細胞が骨形成細胞へと発生する。しかし、ノコギリウニを用いてPmar1の過剰発現実験を行なった結果、中胚葉性細胞は増加するが、骨形成細胞は増加しなかった。また、過剰発現胚では一般的なウニと同様にEts1やAlx1が活性化されたものの、HesCも全体で活性化された。以上の結果から、ノコギリウニにおいてもPmar1は中胚葉性細胞の特異化に関わっているが、HesCを介さずにAlx1やEts1を活性化していることが示唆された。一方、イトマキヒトデを用いてPhbのノックダウン実験を行なったところ、原腸形成と間充織細胞形成の阻害とEts1、HesCの発現抑制が観察された。また、Engrailed repressor domainもしくはVP16 activation domainとPhbの融合タンパクの過剰発現実験から、ヒトデのPhbも転写抑制因子であることが示された。従って、ヒトデにおいてもPhbは未知の転写抑制因子を抑制することで、Ets1とHesCを活性化していることが示唆された。今回得られた結果は、(1)Pmar1遺伝子がウニの共通祖先でPhbの重複によって獲得されたこと、(2)Pmar1の祖先遺伝子はヒトデとウニの共通祖先で既に中胚葉への機能をもっていたこと、(3)原始的ウニと一般的なウニの祖先が分かれた後、一般的なウニの祖先で、Pmar1の下流にHesCが挿入されたこと、を示唆した。今後は、主に以下の2つの計画で実験をすすめる予定である。
微細構造からみた骨粗鬆症患者の骨質・骨強度評価

骨粗鬆症において骨強度に寄与する要因のひとつとして骨微細構造が挙げられる。従来実験動物をマイクロCTで解析してきたが、臨床用CTを用いてin Vivoで脊椎の臨床的評価を行った。脊椎の経時的変化を明らかにするSubtraction法を開発し、初回評価時から骨形成や骨吸収がどのように生じるかを明らかにした。骨粗鬆症治療を行わなかった場合短期間に多くの骨が失われ、また治療により骨が維持される状態が可視化できた。平面分解能は世界最高レベルの臨床用CT(ヘリカルCT:XVigour Real、マルチスライスCT:Aquillion、東芝メディカル)を用いて、骨粗鬆症による骨脆弱性により圧迫骨折が危惧される患者の第3腰椎全体を撮像、DICOMデータを蓄積中である。対象疾患としては、原発性骨粗鬆症、ステロイド性骨粗鬆症、関節リウマチとしている。DXAによるBMD計測、各種血清学的マーカー、すなわち血清オステオカルシン濃度、骨型ALP濃度、および血中NTX濃度、ucOC等の評価を行っている。また内服薬や閉経時年齢等、修飾因子についても調査している。また、Superimposition法の改良、検証作業を行っている。本法はオリジナルな手法で、経時的に撮像した二つの再構築画像を三次元的にsuperimposeし、その差分データを作製、これに識別の為の色を付け、元のデータ上にoverlay表示させる。これにより、新たに添加された骨の量及び局在、消失した骨の量および局在が可視化可能となる。白色の椎体画像に添加された骨を青、消失した骨を赤などと着色して表示することを検討している。本手法についてのアルゴリズムの原案は既に完成しており、本研究においては、in vivoで撮像した腰椎CTデータに特化した手法を検討中である。実際の症例においては、個々のCTデータは撮像時の体位などにより必ずしも同じ配置とはなっていない。これを三次元的にregistrationする必要があるが、三次元空間座標系の中で一つの椎体を固定、もう一つの椎体を6自由度移動させることによって、精度良くマッチングさせることを考えている。再現性の検討として、ヒト脊椎を含むファントムを用意し、繰り返し撮像を行い、現在解析中である。平面分解能は世界最高レベルの臨床用CT(ヘリカルCT : X Vigour Real、マルチスライスCT : Aquillion、東芝メディカル)を用いて、骨粗鬆症による骨脆弱性により圧迫骨折が危惧される患者の第3腰椎全体を撮像、DICOMデータを蓄積中である。DXAによるBMD計測、各種血清学的マーカー、すなわち血清オウステオカルシン濃度、骨型ALP濃度、および血中NTX濃度、ucOC等の評価を行っている。蓄積されたデータを疾患(原発性骨粗鬆症、ステロイド性骨粗鬆症、関節リウマチ)や治療薬物により分類し、解析を進めている。subtraction法はオリジナルな手法で、経時的に撮像した二つの再構築画像を三次元的にsuperimposeし、その差分データを作製、これに識別の為の色を付け、元のデータ上にoverlay表示させる。実際の症例においては、個々のCTデータは撮像時の体位などにより必ずしも同じ配置とはなっていないため、昨年度に引き続きSubtraction法の改良、検証作業を行っている。現在三次元空間座標系の中で経時的に撮像した同一症例のデータを6自由度動かしてregistrationを行っているが、さらに精度を向上させるための方法を模索している。現在の方法で再現性の検討として、ヒト脊椎を含むファントムを用意し、撮影のセットアップを変えて、繰り返し撮像を行った。このデータからsuperimposition、subtractionの精度に問題が無いことを確認した。倫理委員会の承認を得て、平面分解能は世界最高レベルの臨床用マルチスライスCT(Aquillion、東芝メディカル)を用い、骨粗鬆症による骨脆弱性により圧迫骨折が危惧される患者100症例の第3腰椎全体を経時的に撮像、DICOMデータを収集した。DXAによる腰椎前後BMD計測、各種血清学的マーカーについてもデータを蓄積した。原発性骨粗鬆症と、ステロイド投与、関節リウマチに伴う続発性骨粗鬆症患者が含まれる。昨年度まで三次元空間座標系の中で経時的に撮像した同一症例のデータを6自由度動かしてregistrationするSubtraction法の手法の確立と精度検証を行ってきた。経時的に撮像した二つの3次元再構築画像を3次元的にsuperimposeし、差分データを作製、これに識別色を付け、元のデータ上にoverlay表示させる。この際、明瞭に識別色を表示させるためには、増加分はbaselineの画像に、減少分は再検時の画像にoverlayする必要があることがわかった。Subtraction法により経時的に撮像した第3腰椎の変化を検討したが、骨粗鬆症治療を行われていない症例では、経時的な骨減少とその局在が明らかとなった。特に海綿骨領域の減少が顕著であった。

ビスフォスフォネート剤投与症例では、その減少が抑制されており、症例によっては皮質骨シェル部分の骨増加が明らかであった。また1年間の経過で大動脈石灰化の著明な進行が認められる症例を認めた。
生活習慣要因と大腸前がん病変に関する疫学的研究

自衛官の定年退職前健康診断で得られる詳細な医学検査データと喫煙、飲酒、運動、食事などの生活習慣要因に関するデータを結合させたデータベースを継続的に構築した。対象者はほとんどが50歳代前半の男性自衛官である。以下の研究成果が得られた。1.糖尿病がS状結腸線腫リスクの高まりと関連していることを以前に報告していたが、全大腸内視鏡検査が導入されたので耐糖能と大腸線腫との関連性を部位別及び大きさ別に検討した。独立した2つの研究対象において、糖尿病と関連した右側結腸線腫リスクの高まりを観察した。左側結腸あるいは遠位部大腸線腫については糖尿病との関連は見られなかった。2.脂質代謝と関連するアポ蛋白E、発がん物質の解毒酵素及び葉酸代謝酵素の遺伝子多型と大腸線腫との関連を検討した。統計的に有意な関連は見られなかったが、アポ蛋白ε4アレルが右側結腸線腫に予防的であり、葉酸代謝酵素遺伝子多型と血漿葉酸値の相互作用が示唆された。3.大腸発がんにおける血漿インスリン様増殖因子IGF-1と結合蛋白IGFBP-3の関与が注目されている。IGF-I高値の者で大腸線腫リスクの軽度の高まりが観察され、この高まりはIGFBP-3及び負荷後2時間血糖値の調整後より顕著であった。また、肥満がIGF-I及びIGFBP-3と強く関連しており、肥満度とIGF-IあるいはIGFBP-3との関連性が集団によって異なる可能性が示唆された。4.大腸がんと胆石症は一部共通の原因に起因している可能性があり、胆石形成の関連要因を明確にすることは大腸発がん要因を考える上で重要である。喫煙と胆石との間に明らかな関連は見られなかったが、飲酒が胆石に予防的であることが観察された。また、コーヒーあるいはカフェインが胆石に予防的であるとする仮説に対して否定的な結果を得た。また、耐糖能障害と糖尿病が肝機能障害と強く関連していることを観察した。本研究は大腸前がん病変である大腸腺腫と関連する生活習慣要因を明らかにするための断面的疫学研究である。本研究の特色は、ほぼ全員が全大腸内視鏡検査を受ける職域集団を研究対象としていることである。自衛隊福岡病院および熊本病院において定年退職前健康診断を受診した男性自衛官者を対象にして、喫煙、飲酒、運動および食物摂取などの生活習慣要因に関する調査をおこない、大腸内視鏡検査をはじめとする医学的検査結果を系統的に収集整理した。また、ほとんどの調査対象者から採血し、血漿と白血球成分を凍結保存している。平成12年4月から平成13年1月までの期間に631名の調査を終えた。平成12年度の調査例数は約700例と見込まれる。以前から収集整理していた全大腸内視鏡検査受診者約1000名の調査データを用いて、喫煙、飲酒及び血清脂質との関連性を検討した。喫煙は大腸腺腫リスクの高まりと強く関連していたが、飲酒との関連性は明確でなかった。前者の関連は、多環芳香族炭化水素の代謝酵素の遺伝子型の違いに関係なく認められた。飲酒との関連が明らかでなかったことは、例数が少なかったことにもよるが、飲酒と関連する腺腫リスクは小さいと考えられる。また、血清中性脂肪と左側大腸腺腫との間に正の関連が見られたが、S状結腸腺腫についての報告していた知見を補強する結果である。

脂質代謝と密接に関連するアポ蛋白Eの遺伝子多型との関連性も検討したが、E4と右側腺腫との間に弱い予防的関連が観察された。本研究は大腸前がん病変である大腸腺腫と関連する生活習慣要因を明らかにするための断面的疫学研究である。本研究の特色は、ほぼ全員が全大腸内視鏡検査を受ける職域集団を研究対象としていることである。自衛隊福岡病院および熊本病院において定年退職前健康診断を受診した男性自衛官者を対象にして、喫煙、飲酒、運動および食物摂取などの生活習慣要因に関する調査をおこない、大腸内視鏡検査をはじめとする医学的検査結果を系統的に収集整理した。また、ほとんどの調査対象者から採血し、血漿と白血球成分を凍結保存している。平成13年4月から平成14年1月までの期間に785名の調査を終えた。平成12年度からの累積の調査例数は合計で1555例に達した。食物・栄養要因に注目して解析を進めている。一方、以前から収集保管している血漿を用いて、大腸腺腫例157例と全大腸内視鏡検査で異常なしの対照174例についてインスリン様成長因子(IGF)と大腸腺腫との関連性を検討した。IGF-I及びIGF結合蛋白(IGFBP3)のいずれに関しても、大腸腺腫との明らかな関連はみられなかったが、多重腺腫や悪性度の高い組織型を示すいわゆる高危険度腺腫ではIGFBP3高値の者でリスク高まりの傾向が見られた(補正オッズ比1.6、95%信頼区間0.6-4.6)。IGFの大腸発がんにおける影響は日本人と欧米人では異なるのではないかと推測される結果である。平成12年度からの累積の調査例数は合計で2300例余りに達した。以前からのデータを含め約2500名を対象として、糖尿病と大腸線腫の関係を部位別に検討し、糖尿病が右側大腸線腫リスクの高まりと関連していることを明確にした。また、616名について、血漿インスリン様増殖因子IGF-Iと結合蛋白IGFBP-3を測定し、IGF-Iが大腸線腫と関連していることを観察した。さらに、肥満度がIGF-IおよびIGFBP-3と強く関連しており、欧米での報告と異なる結果が得られた。また、この研究で用いている食物摂取調査票の妥当性を1年間28日食事記録にもとづく推定摂取量を用いて検討した。脂肪摂取量を除き、ほとんどの食物・栄養素について良好な妥当性を確認した。食物・栄養要因と大腸線腫については詳細な解析を進めている。
インプラント埋入による顎堤保存に対する分子生物学的アプローチ

インプラント埋入による顎堤の吸収に対するメカニズムを解明することを目的とした本研究において、まず、インプラントが骨との結合を獲得するまでの骨動態を詳細に検討した。その結果、骨へと埋入されたインプラント体は術後経過にしたがって骨との結合強度が認められた。また、その過程において、骨形成マーカー増加のみならず、骨吸収マーカーの減少が認められた。このことから、インプラントの骨結合獲得過程において骨形成が促進されるのみならず、骨吸収が抑制されると考えられた。本研究は、インプラントの埋入が骨吸収を抑制するとの報告から、意図的に作製した骨吸収モデルに対し、インプラント埋入を行うことで、骨吸収抑制の分子生物学的なメカニズムを解明し、顎骨の保存を目的とした臨床への応用を目指したものである。本研究では、今年度、意図的骨吸収モデルの確立を目指している。4週齢Wistar系雄性ラット頭蓋骨に対し、直径3mmのトレフィンバーを用いて骨欠損を作製した上で、同径のシリコンチューブにて垂直方向に隔壁を作製した。垂直方向に拡大した骨欠損内部にアテロコラーゲンゲルを填入し、術後2週、4週、8週にて組織切片を作製し、その内部の骨形成状態を確認した。その結果、垂直方向への拡大は3mmが限度であり、術後8週で内部はほぼ骨に置換されることがわかった。さらに、新生骨の形成状態の免疫組織学的な検討もあわせて行った。その結果、コラーゲンゲル内部には血管侵入に伴う細胞侵入が起こり、骨芽細胞の分化マーカーであるRunx2陽性細胞が認められた。また、コラーゲン内部には、骨基質タンパク質であるオステオカルシンやオステオポンチン、DMP1の分布が見られた。さらに、形成された新生骨は、コラーゲンのテロペプチドに対する抗体に陽性反応を示した。これらのことから、ラット頭蓋骨に作製した骨欠損に新しく形成された骨は、填入したアテロコラーゲンの石灰化物ではなく、正常な骨形成過程により形成されたラット由来の骨であると考えられた。つまり、アテロコラーゲンゲルにて意図的に作製した過剰骨は、ラットの骨と考えられ、今後の骨吸収の検討においても正常な過程の観察が可能であると考えられる。また、この結果から、2mm×2mmのチタン製インプラントを作製した。今後、新生骨へのインプラント埋入を行っていくと供に、骨吸収時のインプラント周囲骨の分子生物学的な検討を行っていく予定である。本研究は、インプラントの埋入が骨吸収を抑制するとの報告から、インプラント埋入を行うことで、骨吸収抑制の分子生物学的なメカニズムを解明し、顎骨の保存を目的とした臨床への応用を目指したものである。当該年度においては、インプラント埋入による周囲骨の骨動態の評価を行った。チタン製インプラント(2mm×2mm)をラット頚骨に埋入し、術後1から12週における除去トルクを経時的に計測した。また、血清中の骨形成マーカーである骨型アルカリフォスファターゼ(BAP)、骨吸収マーカーであるI型コラーゲン架橋N-テロペプチド(NTx)もあわせて計測し、骨動態の評価を行った。さらに、インプラント周囲の組織形態学評価も行った。インプラント埋入後、術後経過にしたがって除去トルクの増加が認められ、12週でプラトーに達した。また、BAP、NTxともにインプラント埋入を行っていないコントロールと比較して8週までに有意な差を認めた。12週ではコントロールと比較して差は認められなかった。これらのことから、インプラント埋入により、骨形成が促進されるのみならず、骨吸収が抑制されることがあきらかとなった。また、BAPやNTxのようなバイオマーカーとインプラントのオッセオインテグレーションの指標である除去トルクは、同様の傾向を持って変化しており、これらのことからこうしたバイオマーカーを用いることでインプラント周囲の骨の状態やインプラントそのものの状態を診断できる可能性が考えられた。
心筋細胞機能障害と心作動物質

1.心筋収縮・弛緩制御と心作動物質:Ca指示薬による細胞内Ca動態計測や二連イオン選択性電極によるK^+Na^+イオン動態計測を,単離心筋細胞や乳頭筋標本について行なうことにより研究が進められつつある.NaD^+K^Tポンプ阻害時に細胞内Ca^<++>が増加し,収縮機能が亢進すること, β受容体刺激時に細胞内Ca^<++>トランジェントが変化して収縮力が増強することが知られた.また, CAMPホスホジエステラーゼやK^+チャネル阻害物質,トロポニンのCa^<++>結合能に影響する物質などが新しい強心作動物質として見出され,その機序が検討されている.2.心筋電気活動の制御と心作動物質:細胞内Na^+, K^+, Ca^<++>活性やNa^+チャネルに対する結合・解離反応の測定,単一心筋細胞におけるパッチクランプ法の応用により,各種心作動物質の作用機序を究明しつつある. Na^+チャネル抑制物質と一括されていた一群の抗不整脈薬の中に, Na^+チャネルに対する結合・解離動態の異なる二種類のものの存在することが示された.アセチルコリン,アデノシンについては膜受容体と心筋K^+チャネルを共役するGタンパクとMg^<++>の重要性が知られ,また,キニジンとジソピラミドの抗コリン作用がそれぞれK^+チャネル,アセチルコリン受容体に直接作用することによることが示された.3.新しい内因性心作動性物質と心筋細胞機能制御:内因性ジギタリス様物質は,現在,ヒト尿から分離・精製が試みられている.同時にこの粗精製物質による生物作用の検討もすすめられている.心房性ナトリウム利尿ペプチドの血管拡張・利尿作用についも研究が展開中である.脂肪酸結合タンパクの定量ならびにその脂肪酸結合能測定が病態モデルに適用され,これが細胞内脂肪酸増加に抑制的に働くことが推定されている.以上,心筋細胞の生理的・病的状態における外因性・内因性心作動物質の作用機転を解明するという方向での研究が進行中である.1.心筋収縮・弛緩制御と心作動物質:Ca指示薬による細胞内Ca動態計測や二連イオン選択性電極によるK^+Na^+イオン動態計測を,単離心筋細胞や乳頭筋標本について行なうことにより研究が進められつつある.NaD^+K^Tポンプ阻害時に細胞内Ca^<++>が増加し,収縮機能が亢進すること, β受容体刺激時に細胞内Ca^<++>トランジェントが変化して収縮力が増強することが知られた.また, CAMPホスホジエステラーゼやK^+チャネル阻害物質,トロポニンのCa^<++>結合能に影響する物質などが新しい強心作動物質として見出され,その機序が検討されている.2.心筋電気活動の制御と心作動物質:細胞内Na^+, K^+, Ca^<++>活性やNa^+チャネルに対する結合・解離反応の測定,単一心筋細胞におけるパッチクランプ法の応用により,各種心作動物質の作用機序を究明しつつある. Na^+チャネル抑制物質と一括されていた一群の抗不整脈薬の中に, Na^+チャネルに対する結合・解離動態の異なる二種類のものの存在することが示された.アセチルコリン,アデノシンについては膜受容体と心筋K^+チャネルを共役するGタンパクとMg^<++>の重要性が知られ,また,キニジンとジソピラミドの抗コリン作用がそれぞれK^+チャネル,アセチルコリン受容体に直接作用することによることが示された.3.新しい内因性心作動性物質と心筋細胞機能制御:内因性ジギタリス様物質は,現在,ヒト尿から分離・精製が試みられている.同時にこの粗精製物質による生物作用の検討もすすめられている.心房性ナトリウム利尿ペプチドの血管拡張・利尿作用についも研究が展開中である.脂肪酸結合タンパクの定量ならびにその脂肪酸結合能測定が病態モデルに適用され,これが細胞内脂肪酸増加に抑制的に働くことが推定されている.以上,心筋細胞の生理的・病的状態における外因性・内因性心作動物質の作用機転を解明するという方向での研究が進行中である.
脳酸素動態と認知課題成績からみた高次脳機能の修飾刺激応答の個体差とその影響要因

低、中/高レベル騒音が認知課題成績、脳酸素動態、および心臓血管系反応に及ぼす影響の個体差は心理・性格特性で一部説明可能であることが明らかになったことから、認知課題成績等において認められた比較的大きな個体差の少なくとも一部は、心理・性格特性における多型性がその原因であると考えるべきであることが示された。また、騒音反応と心理・性格特性との関係性は、騒音レベルに依存して変化することが明らかになった。本研究では、環境中の刺激因子として騒音を取り上げ、騒音が存在する場合の高次脳機能に及ぼす影響を、騒音の強さレベルに依存してどのように変化するのかに注目し、新規に開発した認知課題成績高感度・高精度計測システム(特開2006-218065)と非侵襲・非拘束の近赤外分光法方式脳酸素動態計測システムを用い、特に心理・性格特性の関わりに注目して、個体レベルで明らかにしようとするものであり、認知課題成績、脳酸素動態、および心臓血管系反応を、相互に関連づけることによって個体差の原因解明と、高次脳機能に及ぼす影響の全体像を明らかにすることを目的としている。本年度においては、まずバックグラウンドとして、特に騒音が負荷されていない条件に重点をおいて、18名の健常若年者を対象として、認知課題成績2回連続遂行値の変化量を求め、これを脳酸素動態(酸素化ヘモグロビン濃度、脱酸素化ヘモグロビン濃度総ヘモグロビン濃度)と心臓血管系反応(血圧および心拍数)の変化量との関係性を明らかにした。さらに、個体差を生じさせる背景因子としての心理・性格特性を、モーズレイ性格検査等の4検査指標を用いて評価した。心理・性格特性は若年者として概ね偏りのない特性値を示した。また、食習慣を含む生活習慣についても、極端な偏りを持つ対象者はいなかった。結果として、反応時間約-0.09秒、正答率約+0.01、脱酸素化ヘモグロビン濃度(相対値)約+0.01、心拍数約-2(拍/分)の各変化量を得た。また、各変化量間の相関係数では、収縮期血圧:誤答数、外向性-内向性尺度:解答数において、それぞれ約-0.65、0.49などの有意な値の他、プライミング効果(前試行の影響)項目との間に多くの相関関係を認めた。一方で、脳酸素動態と心臓血管系反応の間に相関関係が認められなかった。以上、本年度の当初計画に沿った成果を得た。本研究は、環境中の刺激因子として騒音を取り上げ、騒音が存在する場合の高次脳機能に及ぼす影響を、騒音の強さレベルに依存してどのように変化するのかに注目し、新規に開発した認知課題成績高感度・高精度計測システム(特許第4765059号)と非侵襲・非拘束の近赤外分光法方式脳酸素動態計測システムを用い、特に心理・性格特性の関わりに注目して、個体レベルで明らかにしようとするものであり、認知課題成績、脳酸素動態、および心臓血管系反応を、相互に関連づけることによって個体差の原因解明と、高次脳機能に及ぼす影響の全体像を明らかにすることを目的としている。本年度においては、85dB(A)の騒音が負荷されている条件のもとで、18名の健常若年者を対象として、認知課題2回連続遂行(2回目のみ騒音負荷)において、認知課題成績、脳酸素動態(酸素化ヘモグロビン濃度、脱酸素化ヘモグロビン濃度、総ヘモグロビン濃度)、および心臓血管系反応(血圧および心拍数)の1回目の結果を基準とした2回目の変化量を求め、これを騒音無負荷の変化量と比較することにより増加変化量を得た。また、個体差を生じさせる背景因子としての心理・性格特性を、モーズレイ性格検査(MPI)等の4検査指標を用いて評価した。結果として、騒音による反応時間の有意な延長、解答数および正答率等の有意な低下など、課題成績の悪化が認められた。また、検査値相互の関係性を重回帰分析により分析した結果、反応時間の増加変化量は性格特性(MPI-Nなど)によって約37%説明できることが明らかになった。一方で、脳酸素動態と心臓血管系反応からの課題成績への関与は少ないことがわかった。以上、本年度の当初計画等に沿った成果を得た。本研究は、環境中の刺激因子として主として騒音を取り上げ、騒音が存在する場合の高次脳機能に及ぼす影響が騒音の強さレベルに依存してどのように変化するのかに注目し、特に心理・性格特性の関わりに着目して明らかにしようとするものであり、個体差の原因解明と、高次脳機能に及ぼす影響の全体像を明らかにすることを目的としている。

本年度においては、65dB(A)の騒音が負荷されている条件のもとで、認知課題2回連続遂行(2回目のみ騒音負荷)において、認知課題成績、脳酸素動態(酸素化ヘモグロビン濃度、脱酸素化ヘモグロビン濃度、総ヘモグロビン濃度)、および心臓血管系反応(血圧および心拍数)について、1回目の結果を基準とした2回目の変化量を求め、これを騒音無負荷の変化量と比較することにより増加変化量を得て、個体差を生じさせる背景因子としての心理・性格特性との関係性に重点を置いて解析した。結果として、前額部のdeoxy-Hbが騒音の影響で減少する者では解答数、正答率等の課題成績が向上し、逆に増加する者では、成績が低下することが明らかとなった。また、平均反応時間および平均動作時間は、それぞれ特性不安尺度(STAI-P)およびモーズレイ性格検査神経症的傾向尺度得点が高得点の者ほど騒音により延長することが明らかとなった。更に、deoxy-Hbの“増加変化"は、心拍数および収縮期血圧の“増加変化"とストレス自己評価尺度得点によって説明可能であり、また、顕在性不安検査得点とSTAI-Pはそれぞれ心拍数と収縮期血圧の“増加変化"の一部を説明できることが明らかになった。これらのことから課題成績への65dB(A)騒音の影響としては、背景として個人毎の性格特性によって騒音の影響が異なり、反応時間等においてはそれが直接表出し、また、正答率等においては脳酸素動態さらには心臓血管系反応を介して表出することが示唆された。特段、研究計画を妨げる事態が生じなかった。これにより、昨年度と同様に本年度もほほ研究計画に沿って順調に成果が得られたため。24年度が最終年度であるため、記入しない。過年度の経過から、特段、研究計画を妨げる要因は生じないと考えられる。従って、研究計画に沿って研究を進めることにより所定の成果が得られると期待できる。
マウス骨髄移植モデルにおける間葉系幹細胞のGVHD制御効果の検討

マウス骨髄移植モデルでは、間葉系幹細胞によるGVHDの治療効果は確認できなかった。但し、マウス由来間葉系幹細胞はin vitroにおいてはヒトと同様の免疫抑制効果を示しており、何らかの生物学的特性に違いがある可能性が示された。間葉系幹細胞の免疫抑制効果と細胞外マトリックスとの相互関係には非常に興味深いデータが得られたが、エンドトキシンの混入がヒアルロン酸の免疫修飾効果の評価に影響していることが示唆された。一定の重症度のGVHDを再現性よく発症させるマウス骨髄移植モテルを確立した。GVHD発症後に間葉系幹細胞(MSC)を投与し、その治療効果を検討した。研究実施計画に従い、細胞数、投与回数、及び投与のタイミングなどを比較したが、in vivoでの明らかなGVHD治療効果は確認できなかった。バイオイメージングでMSCの体内動態を追跡するなどの工夫を行うも検証は困難であった。MSCは恒常的に免疫抑制効果を示すわけではなく、何らかのサイトカインによってはじめて誘導されることが知られている。そこでMSCのGVHD制御効果を効率よく誘導、また制御するメカニズムを明らかにすべく、基礎的検討を行った。これまでの知見をもとに、MSCに発現する接着因子であるCD44、及びそのリガンドであるヒアルロン酸との相互関係に着目した。はじめにMSCがヒアルロン酸合成酵素のひとつであるHAS-2を発現しており、恒常的にヒアルロン酸を産生していることを明らかにした。一方でT細胞は活性化するとヒアルロニダーゼ活性を示すことが報告されているが、活性化T細胞にはヒアルロン酸分解酵素であるHya1-2の発現が誘導されることをRT-PCR法で確認した。ヒアルロン酸の分子量別で比較すると、低分子ヒアルロン酸は単独でMSCから免疫抑制因子であるPGE2の産生を.またIFN-γとの組み合わせでNOの産生が誘導されたが、高分子ヒアルロン酸ではいずれの免疫抑制因子の産生も認められなかった。更にMSCの細胞内シグナルのインヒビターを用いた実験では、ヒアルロン酸によるPGE2、NOの産生機序はそれぞれ異なるシグナル伝達,(MAPK,PI3K/AKT)によって制御されていることが示唆された。ヒトではMSCによる高いGVHD抑制効果が報告されており、本研究でMSCの免疫抑制のメカニズムを明らかにすることで、より高い安全性と治療効果の向上が期待できる。研究実施計画に従い、マウス骨髄移植モデルにおいて間葉系幹細胞(MSC)の細胞数、投与回数、及び投与時期などに工夫を加えてGVHDの抑制効果を検討したが、一定の治療効果は得照れなかった。一方で、IMSCの治療効果が同様の実験系で確認できたことがRenらによって報告された(Cell Stem Cell,2008)。われわれはMSCの免疫抑制メカニズムにnitric oxide(NO)が関与していることを報告したが(Blood,2007)、同グループよりin vivoにおいてもNOがGVHDの制御に中心的な役割を担うことが示された。従って本研究で期待された結果がほぼ報告されたため、更なる実験は追加していない。ほぼ同の実験系でわれわれが同様の結果を得られなかった原因は明らかではない。そこで平成19年度以降、あらたにMSCと細胞外マトリックスとの相互関係について着目して実験をすすめた。はじめにMSCが恒常的にヒアルロン酸を産生しており、活性化T細胞の存在下で低分子化されることを確認した。興味深いことに低分子ヒアルロン酸はMSCから免疫抑制物質のひとつであるPGE2の産生を誘導し、またIFN-γとの組み合わせでNOが産生されることを確認することで、炎症局所でMSCが免疫抑制効果を担うあらたな機序を示した。しかしながら用いるヒアルロン酸によっては低分子であっても必ずしもPGE2やNOの産生を誘導しないことが明らかとなり、試薬を再度検証したところ、一部にエンドトキシンの混入が確認された。すでにわれわれのグループはTLR4を介してエンドトキシンがMSCからPGE2やNOの産生を誘導することを報告しており、あらたな知見とはいえない。これまでヒアルロン酸がマクロファージなどの活性化に関与することが数多く報告されているが、いずれもエンドトキシンの混入が誤ったデータの解釈をもたらしている可能性がある。
アルキン化合物を合成素子とする複素環化合物の触媒的合成法の開発

本研究は、以下の反応を基盤とする連続的な結合形成反応を利用した複素環合成法に関する検討結果である。1)クライゼン転位反応を経由する連続反応として、金触媒を用いる多置換ピロール及びフラン合成法を開発した。2)環化異性化反応を経由する連続反応として、パラジウム触媒を用いる環化-アリル化反応並びに金属触媒を用いない酸化的環化反応を見出し、側鎖修飾型のオキサゾール及びフラン合成法を開発した。3)ヘテロエン-インメタセシス反応を経由する連続反応として、アンチモン-アルコール混合触媒によるジヒドロキノリン合成法並びに3成分縮合型のイミノキノリン合成法を明らかにした。アルキン化合物はへテロ原子などの求核試薬との付加反応が可能であり、その分子内反応は種々の複素環化合物の合成法として有用である。また、アルキン化合物を用いるメタセシス反応ではジエンやエノンなどの官能性分子への変換ができ、新規かつ効率的な触媒系の開発によりアルキン類の新たな反応性や有用性の高い合成法が見出されている。申請者はこのようなアルキン化合物の反応に注目し、遷移金属触媒を用いた複素環化合物の新規かつ効率的な合成法の開発を行なってきている。その一環として、N-プロパルギルアニリン誘導体の芳香族amino-Claisen転位反応を経由する触媒的インドール合成法の開発を行なった。また、アルキン-カルボニルメタセシス反応による共役エノン合成法を利用し、フェニルアルキン誘導体とアルデヒド類からの触媒的な1段階インダノン合成法を見出した。本年度は、これらの知見に基づき、種々の複素環合成について検討し、カチオン性金錯体を触媒とするN-プロパルギルエナミンノン誘導体からの多置換ピロール合成法や、パラジウム触媒を用いるN-プロパルギルアミド誘導体の環化/アリル化反応によるオキサゾール合成法を開発した。さらに、後者の反応の検討中に、超原子価ヨウ素試薬を用いた新規オキサゾール合成法を見出した。また、アルキンーカルボニルメタセシス反応を経由する合成法について検討した結果、SbF5のアルコール錯体を用いることにより、0-アルキニルアニリン誘導体とアルデヒド化合物から1段階で2,3-ジヒドロキノリン-4(1H)-オンが得られることが明らかとした。以上、本研究は、アルキン化合物の分子内反応を基盤とする新規複素環合成であり、有機合成化学上、興味深い知見を与えたものと考えている。申請者は昨年度に続き、アルキン化合物の環化反応やヘテロ-エンインメタセシス反応などに注目して、触媒的な複素環化合物の合成法について検討してきた。昨年度は、N-プロパルギルアミド誘導体からのオキサゾール合成法として、パラジウム触媒を用いる環化/アリル化反応や超原子価ヨウ素試薬を用いた酸化的な環化反応を見出した。また、アルキン-カルボニルメタセシス反応による共役エノン合成法を利用し、o-アルキニルアニリン誘導体とアルデヒド化合物から1段階で2,3-ジヒドロキノリン-4(1H)-オンが得られることを明らかにした。これらの知見に基に、本年度は、パラジウムを触媒とする2-プロパルギル-1,3-ジケトン誘導体の環化/アリル化反応を見出し、側鎖に不飽和結合部位を有するフランが得られることを明らかにした。また、後者の反応の展開として、o-アルキニルアニリン誘導体とアルデヒド、アミンの3成分混合型のアルキン-イミンメタセシス反応について検討し、溶媒にヘキサフルオロイソプロパノールを用いることにより、触媒を用いることなく2,3-ジヒドロ-4-イミノキノリンが1段階で得られることが明らかとした。以上、本検討結果は、アルキン化合物の分子内反応を基盤とする新規複素環合成であり、有機合成化学上、興味深い知見を与えたものと考えている。オキサゾールやフランに代表される複素環骨格は生理活性物質などに見られる重要な基本骨格であることから、新規かつ効率的な合成法の開発は重要な課題である。本研究期間中、アルキン化合物の分子内反応を基盤とした複素環化合物の効率的な合成法を行ってきており、その一環として「プロパルギルアミド誘導体の環化/アリル化反応および酸化的環化反応を利用する側鎖修飾型オキサゾール合成法」を明らかにした。これらの知見を基に、今年度は下記に示したフラン合成法へと展開した。(1)環化/アリル化反応による側鎖修飾型フラン合成法:昨年度、パラジウム触媒を用いた2-プロパルギル-1,3-ジカルボニル化合物とアリル炭酸エステルとの環化/アリル化反応が進行することを見出しおり、今年度は基質一般性の拡大を狙って、種々の置換基様式を有する4-アルキノン誘導体についても検討した。その結果、同条件下で4-アルキノン誘導体の環化反応によるフラン形成と共に側鎖へのアリル化反応が進行し、ホモアリルフラン誘導体が得られることを明らかにした。

(2)酸化的環化反応によるフルフリルアルコールおよびフルフラール誘導体の選択的合成法:三価ヨウ素試薬の使用によって、金属触媒を用いることなく2-プロパルギル-1,3-ジカルボニル化合物の酸化的環化反応が効率的に進行し、後処理後にフルフリルアルコール誘導体として得られることを見出した。また、三価ヨウ素試薬を二当量以上用いることにより、2-プロパルギル-1,3-ジカルボニル化合物のから直接的にフルフラール誘導体へと変換可能であることを明らかにした。以上、本検討結果は、アルキン化合物の環化反応を基盤とする連続的な結合形成反応を利用したフラン合成法であり、有機合成化学上、興味深い知見を与えたものと考えている。
悪性腫瘍の分化度と概日リズム形成不全の関係

がん細胞の分化度とその体内時計形成度の関係を明確にするために、ヒト癌細胞株において、正常な概日リズムを刻むかを解析した結果、明瞭な概日リズムを観察できなかった。次に、これらの細胞を用いて、遺伝子発現を網羅的に調べた結果、時計遺伝子群において、明確な発現量の差は示されなかった。そこで、当初の計画を変更し、Myc過剰発現マウス胚性幹細胞株を作製し、それらをin vitroで分化させ、概日リズム形成破綻モデル系を形成した。その結果、Mycの過剰発現をして、分化させると、概日リズム振動が顕著に阻害された。RNA-seqによる網羅的遺伝子発現解析の結果、時計形成を阻害する遺伝子ネットワークを同定した。がん細胞の分化度とその体内時計形成度の相関関係を明確にするために、いくつかのヒトNeuroblastoma細胞株において、正常な概日リズムを刻むかを詳細に解析した。はじめに、時計遺伝子Bmal1のプロモーター下流にルシフェラーゼ発光レポーターを組み込んだものを用いて、発光強度の長時間観察を行い、その細胞の概日リズムを観察した。安定にレポーターを細胞のゲノムに組み込むために、メダカのトランスポゾンベースのベクターを用いて、安定発現株を樹立した。PMTを用いた多細胞レベルの測定において、正常な概日リズムを刻むヒト細胞(広く概日リズム研究で使用されているU2OS細胞)に比べ、明確な概日リズムを観察することは出来なかった。次に、一つ一つの細胞は、リズムを刻んでいるが、細胞間の同期が出来ていない可能性を考え、EMCCDカメラを用いた1細胞レベルで発光強度の長時間観察を行った。これらのFFT周波数解析の結果、当初の予想通り、明確な概日リズムを観察することは出来なかった。次に、これらの細胞株を用いて、遺伝子発現を網羅的に調べた。その結果、驚くべきことに、これまでに報告のある多くの時計遺伝子群において、明確な発現量の差は示されず、概日リズム形成には、時計遺伝子群の発現レベルは、それほど重要でないことがわかった。これらのことから、新規時計遺伝子の存在や、時計遺伝子群の翻訳後修飾の変化などを詳細に検討する必要が考えられる。がん細胞分化度とその体内時計形成の破綻の関係を明らかにするために、概日リズム形成破綻モデル系として、ドキシサイクリン誘導性Myc過剰発現マウス胚性幹細胞株(ES細胞)を作製し、それらをin vitroで分化させ、体内時計を形成させることにした。そのために、まず、in vitro分化誘導による体内時計形成の方法を確立することにした。その結果、非常に、再現性良く安定して、体内時計の振動を形成させることができることがわかった。次に、Mycの過剰発現をしながら、in vitroで分化誘導をすると、概日リズムの振動が顕著に阻害されるということがわかった。これは、細胞を分化させた後に、Mycの過剰発現を誘導しても、概日リズムの振動は、阻害されなかったことと、大きく異なっていた。また、この時計形成の破綻は、Mycの過剰発現を停止すると、徐々に時計が形成されるということもわかった。Mycの直接的な影響によって、時計形成が阻害されるわけではないことが示唆された。これらの現象を詳細に調べるために、定量PCR法によって、時計遺伝子群の発現量を定量的に解析した結果、発現量に大きな差は観察されなかった。そこで、さらに、時計タンパク質の状態を調べるために、免疫染色とウェスターンブロットを行った。抗体は、時計遺伝子ノックアウトマウスから樹立した線維芽細胞株を用いて、時計タンパク質を特異的に認識することを確認したものを用いた。その結果、時計形成が破綻している細胞では、時計タンパク質が、細胞を分化させる前のES細胞のときの状態と非常に類似していることがわかった。今後、これらの詳細な分子機構を解析していくことを考えている。そのために、まず、in vitro分化誘導による体内時計形成の方法を確立した。次に、この方法を用いて、Mycの過剰発現をしながら、in vitroで分化誘導をすると、概日リズムの振動が顕著に阻害されるということがわかった。さらに、解析した結果、Myc以外の遺伝子によっても起こりえることがわかった。これらのモデル系を用いて、RNA-seqによる網羅的な遺伝子発現解析も行った。その結果、体内時計が破綻している細胞全てにおいて、時計遺伝子は発現しており、発現量に差がないことがわかった。さらに、遺伝子発現解析した結果、時計形成の破綻を誘発する数百の遺伝子ネットワークを同定した。

次に、これらの細胞を用いて、遺伝子発現を網羅的に調べた結果、時計遺伝子群において、明確な発現量の差は示されなかった。そこで、当初の計画を変更し、Myc過剰発現マウス胚性幹細胞株を作製し、それらをin vitroで分化させ、概日リズム形成破綻モデル系を形成した。その結果、Mycの過剰発現をして、分化させると、概日リズム振動が顕著に阻害された。RNA-seqによる網羅的遺伝子発現解析の結果、時計形成を阻害する遺伝子ネットワークを同定した。幾つかの異なる細胞で観察された現象が、共通の分子機構によって説明できる可能性が得られ、研究の重要性が増したためである。すなわち、概日リズムの振動が検出できない未分化なES細胞と、概日リズムの破綻しているガン細胞とで、時計タンパク質の状態が類似していることがわかり、これにより、全く異なる細胞においても、概日リズム破綻の分子メカニズムが同じである可能性が示唆されたためである。これは、細胞分化というものを、体内時計を通じて、再定義することにつながるかもしれず、生物学分野に幅広い影響を与えうるものと考えられる。体内時計本研究で構築したモデル細胞を用いて、次世代シークエンサーによる網羅的な遺伝子発現解析を行う。そして、体内時計形成の破綻を生み出すキー分子の同定をすることを目標にする。安定に発光レポーターを発現させることすら、難しい細胞も存在したため、概日リズムを測定出来ないものも存在したが、一部の細胞株において、それらを克服し、観察することができた。そのため、いくつかの結果を得ることができ、今後の研究を推進することが出来ると考えられたため。概日リズム破綻のモデル系として、ドキシサイクリン誘導性のMyc過剰発現細胞株を作製する。これは、Mycの発現量で、その悪性度をある程度評価できることが知られている概日リズム形成度と時計遺伝子群の発現、翻訳後修飾などを詳細に調べていく予定である。
縮退四波混合分光法による分子の前期解離ダイナミクスの研究

二光子共パラメトリック四波混合過程とレーザー誘起自然放射増幅過程を一酸化窒素を非線形媒質とするバルクの系において確認した。[1]二光子でC^2Π状態を励起した際、C^2Π-A^2Σ^+遷移に対応する近赤外光とA^2Σ^+-X^2Π遷移に対応する紫外光がレーザー同軸方向に伝搬することを確認した。両波はいずれもほぼ100%の偏光度を示し、その偏光面はレーザーと平行である。また両波の時間プロファイルがレーザーパルスとのそれとほぼ同じであること、また紫外光がFranck-Condon的な振る舞いを見せないことから、紫外光は赤外ASEがレーザーの二光子コヒーレンスとカップルした結果発生するものと断定された。紫外及び近赤外光に対する励起スペクトルはレーザー分解能内で一致しており、またピーク形状波ほぼレーザー線幅で制限されておりなんらの非対称性も見られないことから、新規なレーザー分光法として発展する可能性がある。[2]自然放射増幅光(ASE)を利用するレーザー分光法を開発した。具体的には、レーザー二重共鳴法によって状態を中間状態とし高リュードベリ状態の単一振動回転準位を励起する。このとき、励起準位と他の低いリュードベリ状態の間に反転分布を形成することから、近赤外領域においてそのエネルギー差に対応するASEを発生することを見いだした。LIASE分光法を、蛍光量子収率の低い前期解離状態の検出に応用したところK^2Π、S^2Σ^+状態などこれまで蛍光が報告されていない状態を信号対雑音比1000以上で検出することに成功した。このことはASE発振が弱い前期解離過程と競合していることを示すもので、ASEを蛍光、りん光に次ぐ第3の放射緩和過程として考慮する必要があることを提案した。原子系(Kr)および分子系(NO)において、二光子共鳴パラメトリック四波混合過程を確認した。Kr:5p二光子共鳴準位を励起した際に5p-5s遷移に帰属される800nm付近の近赤外光とKr共鳴線として知られている123.6nmの真空紫外光を同時に観測した。いずれもレーザー伝搬方向と同じ方向に狭い立体角を持って射出している。両波の発生機構については、一つの仮説として、まず反転分布を形成している5p-5s間において自然放射増幅光が発生し、それがレーザー場とカップルしパラメトリック四波混合過程を形成し真空紫外コヒーレント光を発生する。この仮説は、真空紫外光および近赤外光に対する励起スペクトルが一致することと矛盾しない。NO:二光子でC状態を励起した際、C-A遷移に対応する近赤外光と,A-X遷移に対応する紫外光がレーザー同軸方向に発生することを確認した。それぞれの偏光方向を調べたところ、いずれもほぼ100%の偏光性を示し、レーザーの偏光面と平行であった。このことから両波がコヒーレントな光学過程によって発生していることがわかった。紫外光の時間プロファイルがレーザーパルスのそれとほぼ同じであることも、紫外光が螢光ではないことを支持する。Krの場合と同様に、二光子共鳴パラメトリック四波混合過程が発生機構ではないかと思われる。紫外および近赤外光に対する励起スペクトルはレーザー分解能内で一致しており、またピーク形状はほぼレーザー線幅で制限されていてなんらの非対称性も見られないことから、新規なレーザー分子分光法として発展する可能性がある。一酸化窒素のリュードベリ状態に、レーザー誘起自然放射増幅分光法(LIASE)を適用した。

特に、波長3μm以上に存在するASEスペクトルの回転構造を完全に分離観測することにより、前期解離状態からのASE発振機構を明らかにした。K^2Π状態:弱い前期解離性を有することが知られており、これまでいかなる周波数領域においても蛍光は観測されていない。本研究ではK^2Π(v=0)状態の単一回転準位をレーザー二重共鳴法により選択励起した際、2.9μm付近にK^2Π-E^2Σ^+遷移に対応する、また4.5μm付近にK^2Π-F^2Δ遷移に対応するASEを確認した。特徴的なのは、後者が低いJ(J=1.5,F2準位とJ=0.5,F1準位の2準位)からのみ観測できることである。M^2Σ^+状態:M^2Σ^+(v=0)は前期解離性状態ではなく、2.6μmにあるM^2Σ^+-E^2Σ^+遷移に対する蛍光が報告されている。本研究ではこの遷移のほかに5.2μm付近にM^2Σ^+-H'^2Πに相当する強いASEを初めて見いだした。M^2Σ^+-H^2Σ^+遷移は観測されなかった。S^2Σ^+状態:弱い前期解離性を有することが知られており、これまでいかなる周波数領域においても蛍光は観測されていない。本研究では,4.0μmにS^2Σ^+-M^2Σ^+遷移を初めて検出することに成功した。S^2Σ^+-K^2Π遷移は全く検出にかからなかった。以上のように、これまで蛍光では発見できなかったリュードベリ状態間電子遷移をASEを信号源とすることによりきわめて高感度に検出することができた。LIASEは誘導放射を利用した新しい分光法であり、その強度は必ずしも状態間の遷移モーメントに一致しない。従って実験結果を理解するためには理論計算が必要である。