hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
副甲状腺ホルモンによる破骨細胞・骨芽細胞カップリングの変化及びメカニズムの解明

副甲状腺ホルモン(PTH)は骨芽・骨細胞の副甲状腺ホルモン受容体を介して作用し、骨芽細胞分化や骨形成を促進する。活性化された骨芽・骨細胞は破骨細胞前駆細胞に発現する受容体のReceptor Activator of Nuclear Factor Kappa-B (RANK)と結合するRANK ligand (RANKL)発現が増加し、破骨細胞形成および骨吸収を促進する。PTHと双方向性の破骨細胞/骨芽細胞カップリング因子のEphrinB2/EphB4への作用は明らかではない。我々の検討において、PTH持続投与マウス骨組織・抽出液で破骨細胞EphrinB2及び骨芽細胞EphB4発現はWTマウスと比較し増加した。in vitroでは破骨細胞前駆細胞から成熟破骨細胞への分化に伴いEphrinB2発現は増加した。PTH添加で破骨細胞EphrinB2発現は変化なかったが、破骨細胞/骨芽細胞共培養でPTH添加は破骨細胞形成及びEphrinB2発現を増加させ、抗RANKL抗体でそれらは抑制された。PTH添加し培養した骨芽細胞の培養上清で破骨細胞形成は増加し、EphB4-Fc添加で低下した。骨芽細胞へのEphrinB2-Fc添加でALP及びアリザリンレッド染色は増加し、PTH同時添加で更に増加した。抗RANKL抗体を投与したWTマウス骨形態計測でOc.S/BS、N.Oc/BS、ES/BSは有意に低下し、同マウス骨抽出液のEphrinB2発現も有意に低下した。WTマウスへのRANKL投与では骨組織EphrinB2増加を認めた。以上の結果より、破骨細胞由来EphrinB2発現は骨代謝と並行して増減することが示された。PTHによって骨芽細胞のRANKL発現が上昇することで増加した破骨細胞のEphrinB2は、PTHと協調して骨芽細胞分化や石灰化を促進させることが明らかとなった。副甲状腺ホルモン(PTH)は骨・腎臓に作用し、血中カルシウムの恒常性を維持している。また、骨芽・骨細胞においては副甲状腺ホルモン受容体に作用し、骨芽細胞分化や骨形成を促進する。活性化された骨芽・骨細胞はReceptor Activator of Nuclear Factor Kappa-B ligand (RANKL)発現が増加し、破骨細胞前駆細胞に発現する受容体のReceptor Activator of Nuclear Factor Kappa-B (RANK)と結合することで、破骨細胞形成および骨吸収を促進する。原発性副甲状腺機能亢進症では副甲状腺腺腫や癌、過形成等によりPTHが過剰に分泌され、骨代謝の亢進が認められる。骨リモデリングは、前述の破骨細胞による骨吸収の後に、骨芽細胞によって新たな骨が再度形成されるという、破骨細胞/骨芽細胞カップリングの平衡状態が保持されている。近年様々な破骨細胞/骨芽細胞カップリング因子が発見されているが、病態モデルにおけるそれらの動態は未だ明らかではない。ephrinB2/EphB4は双方向性カップリング因子のひとつであり、それらを介し破骨細胞は骨芽細胞分化と石灰化を促進する一方、骨芽細胞は破骨細胞分化や骨吸収を抑制する。本研究では、原発性副甲状腺機能亢進症における過剰なPTHによって、破骨細胞/骨芽細胞のephrinB2/EphB4カップリング発現が変化し、その変化したephrinB2/EphB4によって、骨吸収・骨形成能がどのように調節されるかを研究課題とする。これらの現象や機序を検討することで、原発性副甲状腺機能亢進症に伴う骨粗鬆症のメカニズムの一旦やPTHによる破骨細胞/骨芽細胞カップリング因子調整を解明する。原発性副甲状腺機能亢進症(PHPT)モデルマウスでは既報通り、高カルシウム血症および低リン血症を呈した。PHPTマウスの骨組織において、WTと比較して免疫組織学的検討で破骨細胞ephrinB2発現および骨芽細胞EphB4発現は増加を認めた。また上記マウスの骨検体で、マイクロCTによる骨構造解析を行った結果、PHPTマウスで海綿骨・皮質骨の有意な減少を認めた。in vitroにおいて、PHPTマウス由来の破骨細胞はWTマウス由来のものと比較し、ephrinB2発現の増加を確認した。WTマウス由来の骨髄単球より破骨細胞を発生させる過程でPTHを添加して培養したが、ephrinB2は増加しなかった。このことは破骨細胞にPTH受容体なく、PTHの直接作用はないことと一致する。WTマウスの破骨細胞/骨芽細胞共培養において、PTHの添加によってephrinB2は増加し、抗RANKL抗体によって低下した。これは骨芽細胞からのRANKL刺激によって破骨細胞を成熟し、ephrinB2が増加したと考えられた。また、初代培養の骨芽細胞はPTHおよびephrinB2-FcによってALP染色およびアリザリンレッド染色が増大し、同時添加によって相加的に増加した。このことはephrinB2/EphB4を介した破骨細胞から骨芽細胞への刺激とPTHが相加的に骨芽細胞分化および石灰化を促進することを意味している。以上の検討において、過剰なPTH分泌によって活性化された骨芽細胞がRANKL発現を増加し、破骨細胞を分化させEphrinB2発現を増加することが示唆された。さらに破骨細胞EphrinB2はPTHと協調して骨芽細胞分化を促進させることが明らかとなった。

副甲状腺ホルモン(PTH)は骨芽・骨細胞の副甲状腺ホルモン受容体を介して作用し、骨芽細胞分化や骨形成を促進する。活性化された骨芽・骨細胞は破骨細胞前駆細胞に発現する受容体のReceptor Activator of Nuclear Factor Kappa-B (RANK)と結合するRANK ligand (RANKL)発現が増加し、破骨細胞形成および骨吸収を促進する。PTHと双方向性の破骨細胞/骨芽細胞カップリング因子のEphrinB2/EphB4への作用は明らかではない。我々の検討において、PTH持続投与マウス骨組織・抽出液で破骨細胞EphrinB2及び骨芽細胞EphB4発現はWTマウスと比較し増加した。in vitroでは破骨細胞前駆細胞から成熟破骨細胞への分化に伴いEphrinB2発現は増加した。PTH添加で破骨細胞EphrinB2発現は変化なかったが、破骨細胞/骨芽細胞共培養でPTH添加は破骨細胞形成及びEphrinB2発現を増加させ、抗RANKL抗体でそれらは抑制された。PTH添加し培養した骨芽細胞の培養上清で破骨細胞形成は増加し、EphB4-Fc添加で低下した。骨芽細胞へのEphrinB2-Fc添加でALP及びアリザリンレッド染色は増加し、PTH同時添加で更に増加した。抗RANKL抗体を投与したWTマウス骨形態計測でOc.S/BS、N.Oc/BS、ES/BSは有意に低下し、同マウス骨抽出液のEphrinB2発現も有意に低下した。WTマウスへのRANKL投与では骨組織EphrinB2増加を認めた。以上の結果より、破骨細胞由来EphrinB2発現は骨代謝と並行して増減することが示された。PTHによって骨芽細胞のRANKL発現が上昇することで増加した破骨細胞のEphrinB2は、PTHと協調して骨芽細胞分化や石灰化を促進させることが明らかとなった。In vitroにおいてはPTHによって活性化された骨芽細胞に発現増加するRANKLにより破骨細胞分化が促進され、ephrinB2発現が増加することが示された。これらのことをin vivoでも証明するため、WTマウスにPTHを単回投与もしくは持続投与し、時間依存的/容量依存的にephrinB2/EphB4が変化するか検討する。同時に血中の骨形成/骨吸収マーカーを測定し、骨代謝状態との関係を比較する。また、WTマウスにRANKLを24時間おきに腹腔内投与し、48時間で作製される高回転型骨粗鬆症モデルマウスにおいて、破骨細胞活性化による骨吸収亢進で、骨組織におけるephrinB2発現が増加するかをタンパク質での解析や免疫組織学的に検証する。反対に、WTマウスにマウス抗RANKL抗体を投与し、破骨細胞形成を低下させ骨吸収を阻害することで、骨組織におけるephrinB2が低下するかを同様の方法にて検討する。本年度に行った細胞を使用したin vitro実験によって、PTHによる破骨細胞/骨芽細胞カップリング因子ephrinB2/EphB4の増加が認められた。これらの実験において、当研究室にある共通物品等を使用したため、次年度使用額が生じたと考えられた。
統合失調症における認知機能障害を標的とした急性期リハビリテーションに関する研究

精神科リハビリは専ら慢性期ないしは維持期に施行されるが、身体科領域においては急性期リハビリの重要性が強調されている。本研究の目的は、急性期における認知機能リハビリテーションの実行可能性とその効果を検討することである。50歳以下の統合失調症入院患者を介入研究の対象とした。認知リハビリテーションとして、ワークブック形式の8週間のプログラムを作成した。精神症状の影響を受け明確な機能低下がみられるような急性期においても、半数近くの症例においてプログラムの導入が可能であり、その継続も良好であった。また、比較的単純な訓練プログラムに比べて、高次で包括的な訓練内容を含んだプログラムの優れた効果が示唆された。平成25年度の研究実績の概要は、1急性期統合失調症患者に適したワークブック形式の認知リハビリテーションプログラムおよびコントロールプログラム(リハビリ期間は8週間)を作成したこと、2プログラムの開始が可能な急性期症例を4群に割り付けたランダム化比較試験(RCT)を実施したことである。プログラムの作成においては、認知リハビリテーションについては、発散的思考課題、収束的思考課題、社会認知課題などから構成される訓練課題を独自に作成した。コントロールについては書写などを中心とした課題からなるものを作成した。RCTにおける4群とは、1前半4週間認知リハ課題+後半4週間コントロール課題(早期リハ群)、2前半4週間コントロール課題+後半4週間認知リハ課題(後期リハ群)、38週間認知リハ課題(長期リハ群)、48週間コントロール課題(対照群)、の4群である。対象は、東邦大学医療センター大森病院精神神経科に入院した患者の中で、統合失調症圏の15歳から50歳の患者のうち、入院から2週間以内に研究への参加について同意が得られプログラムを開始できる者とした。現在までに9例が研究参加の登録を行い、プログラムを開始した。9例は男性5名、女性4名、平均年齢30.2歳であった。全例ともリハビリプログラムを完了もしくは継続し、評価も継続中である。プログラムの開始に先立ち、認知機能、精神症状、社会機能などに関する評価を行い、その後も継続的なアセスメントを行った。また、光トポグラフィー検査を用いた脳機能評価も継続的に実施している。具体的なプログラムの実施については、対象者は担当者からワークブックが手渡され、そこで訓練課題についての実施方法と内容の理解の確認が行われた。定期的にプログラム実施の確認や継続の動機づけが行われ、対象患者の訓練態度、負担、病状の変化に細心の注意を払いながらプログラムが継続された。平成26年度の研究実績の概要は、急性期統合失調症患者に適したワークブック形式の認知リハビリテーションプログラムおよびコントロールプログラム(リハビリ期間は8週間)を用いて、プログラムの開始が可能な急性期症例を4群に割り付けたランダム化比較試験(RCT)を実施したことである。プログラムについて、認知リハビリテーションについては、発散的思考課題、収束的思考課題、社会認知課題などから構成される訓練課題を、コントロールについては書写などを中心とした課題を用いている。対象は、東邦大学医療センター大森病院精神神経科に入院した患者の中で、統合失調症圏の15歳から50歳の入院患者のうち、入院から2週間以内に研究への参加について同意が得られプログラムを開始できる者とした。現在までに24例が研究参加の登録を行い、プログラムを実施した。プログラムの開始に先立ち、認知機能、精神症状、社会機能などに関する評価を行い、その後も継続的なアセスメントを行っている。また、光トポグラフィーを用いた脳機能評価も継続的に実施している。平成27年度の研究実績の概要は、急性期統合失調症患者に適したワークブック形式の認知リハビリテーションプログラムおよびコントロールプログラム(リハビリ期間は8週間)を用いて、急性期症例を4群に割り付けたランダム化比較試験(RCT)を継続したことである。RCTにおける4群は、1前半4週間認知リハ課題+後半4週間コントロール課題(早期リハ群)、2前半4週間コントロール課題+後半4週間認知リハ課題(後期リハ群)、38週間認知リハ課題(長期リハ群)、48週間コントロール課題(対照群)、の4群である。対象は、東邦大学医療センター大森病院精神神経科に入院した患者の中で、統合失調症圏の15歳から50歳の入院患者のうち、入院から2週間以内に研究への参加について同意が得られプログラムを開始できる者である。現在までに33例が研究参加の登録を行い、プログラムを実施した。

具体的なプログラムの実施については、対象者は担当者からワークブックが手渡され、そこで訓練課題についての実施方法と内容の理解の確認が行われた。定期的にプログラム実施の確認や継続の動機づけが行われ、対象患者の訓練態度、負担、病状の変化に細心の注意を払いながらプログラムが継続された。進捗状況はやや遅れているが、除外基準などにより適応対象となるような入院患者の数が少なかったことが理由にあげられる。平成28年度の研究実績の概要は、急性期統合失調症患者に適したワークブック形式を用いて、認知リハビリテーションプログラムおよびコントロールリハビリテーションプログラム(リハビリ期間は8週間)を用いて、プログラムの開始が可能な急性期症例を4群に割り付けたランダム化比較試験(RCT)を継続して実施したことである。プログラムについて、認知リハビリテーションについては、発散的思考課題、収束的思考課題、社会認知課題などから構成される訓練課題を、コントロールリハビリテーションについては書写などを中心とした課題を用いている。RCTにおける4群とは、1前半4週間認知リハ課題+後半4週間コントロール課題(早期リハ群)、2前半4週間コントロール課題+後半4週間認知リハ課題(後期リハ群)、38週間認知リハ課題(長期リハ群)、48週間コントロール課題(対照群)、の4群である。対象は、東邦大学医療センター大森病院精神神経科に入院した患者の中で、統合失調症圏の15歳から50歳の入院患者のうち、入院から2週間以内に、研究への参加について同意が得られプログラムを開始できる者とした。合計40例(男性15例、女性25例、平均年齢31.6歳、平均教育年数13.0年)が研究参加の登録を行い、プログラムを実施した。入院からプログラム導入までの間隔は、平均9.8日であった。プログラムの開始に先立ち、認知機能、精神症状、社会機能、QOLなどに関する評価を行い、その後も継続的なアセスメントを行った。認知リハビリテーションを行った群とコントロール群を訓練前後で比較したところ、社会機能の変化において、認知リハビリテーション群の効果を示す傾向が認められた。急性期においても認知機能への働きかけを意図したリハビリテーションプログラムの実施は可能であることが示唆され、またその後の社会機能の改善に寄与する可能性が示された。精神科リハビリは専ら慢性期ないしは維持期に施行されるが、身体科領域においては急性期リハビリの重要性が強調されている。本研究の目的は、急性期における認知機能リハビリテーションの実行可能性とその効果を検討することである。50歳以下の統合失調症入院患者を介入研究の対象とした。認知リハビリテーションとして、ワークブック形式の8週間のプログラムを作成した。精神症状の影響を受け明確な機能低下がみられるような急性期においても、半数近くの症例においてプログラムの導入が可能であり、その継続も良好であった。また、比較的単純な訓練プログラムに比べて、高次で包括的な訓練内容を含んだプログラムの優れた効果が示唆された。
英語リーディング及び音読用CALL教材の提示法の違いによる認知効果の検証

CALL教材における英語リーディング活動で、チャンクごとのテキストと音声の提示方法で、4ヶ月を周期とする授業での処遇実験を行った。音読処遇と速読処遇で実験群を構成して、一定の処遇によるこの提示方法の効果を確認したが、両方に有意な差を見いだせなかった。しかし、必ずしも音読は読解を阻害するとは言えないという結果も得た。また脳血流測定でもチャンク提示による読みに効果がある可能性が確認できた。CALL(Computer Assisted Language Learning)環境を利用して特定ソフトウェアにより、英語リーディング教材の提示法の違いが下位レベルの学習者の読解速度と理解度に及ぼす影響について、実際の英語授業クラスにおいて実験群と統制群を組んで、速読及び音読訓練の処遇を実施して測定する計画であった。しかしながら、実施したCALL教室の不具合や機械的なトラブルによって有効なデータを得ることができなかった。しかしながら、以前からの準備研究で行なってきた脳科学的な検証結果については、新たに解析・分析を継続して研究発表に至り、一定の評価を得た。具体的にはソフトウェアによって画面上で、チャンクを順次表示させて読んでいく訓練を行い、毎回の脳血流の状態を「光トポグラフィー」(ETG-4000、日立メディコ)を用いて記録した。その結果、トレーニングの初期では、ブローカ野とウェルニッケ野の血流量がテキストの難易度に応じて同時に増減を示す傾向にあったが、トレーニングが進むにつれ、2つの領域が選択的に活性化されるように変化した。このことから、初級者でもチャンク読みの方略を繰り返すことによって、脳部位を選択的に活性化し、速読のために脳を最適化できる可能性が示された(湯舟、田淵、神田、2009)今後はさらに被験者数を増やし、実験方法を検討していくべきであろう。他方、長年の懸案であった速読提示法研究を活かした英語CALL教材の作成については、成果が見られた(湯舟他、2010)。イラストを用いて「文法をイメージする」ことと、「英文をチャンクで理解する」という方法を組み合わせた新しい学習法により、センテンス単位に拘らず、意味の塊ごとに直読直解させる教材であり、読解スピードと意味理解の向上が期待される。今後は音読効果研究の成果を盛り込んだ教材作成が課題である。本年度の研究目的はCALL環境における英語リーディング教材の提示法が、習熟レベルの学習者の読解速度と理解度に及ぼす影響を分析して、どのような提示方法が学習者の認知的負担を軽減し、理解と記憶を増進するかを明らかにすることであった。それを受け、昨年度からの発展として、実験群として同教材の音読訓練を処遇とするクラスを設定し、黙読による速読を処遇とするクラスと対比することで、プレ・ポストテストの定量的データと内省アンケートによって効果測定を行った。前期においては、この音読と速読の処遇において双方にプレポストで成績の伸びを確認できたが、両者で全ての点で有意な差異を見出すことができなかった。そこで後期も継続して同様の処遇を行おうとしたが、研究者の人事的問題や、CALL環境の問題等で中止せざるを得なくなった。そこで今後のこうした事態を回避するために、複数の大学で、より多くの研究者による処遇を実施する検討を始め、準備を進めている。これとは別に、以下の研究成果で示すように、過去の速読処遇の成果をベースに、CALL教材の開発と図書出版行った。これはチャンク区切りによる提示方法による速読ドリルを、利用していたCALLソフトウェアをカスタマイズしたものを使って行うものである。それだけでなくこの図書には、理論としてチャンク切りによる速読が、なぜ必要で、効果的であるかを、これまで研究成果を基に、脳科学、認知論、音声学等の知見を背景に、啓蒙的な解説も加えた。これにより本研究者グループの処遇している以外のクラスでも活用でき、広く一般にも研究成果を公開することとなる。本年度の研究目的はCALL環境における英語リーディング教材の提示法が、下位レベルの学習者の読解速度と理解度に及ぼす影響を分析して、チャンクによるどのような提示方法が学習者の認知的負担を軽減し、理解と記憶を増進するかを明らかにすることであった。また音声を発することが、果たして読解を阻害するかということも懸念として検証することとなった。それを受け、昨年度からの発展として、実験群として同教材の音声訓練を処遇とするクラスを設定し、黙読による速読を処遇とするクラスと対比することで、プレ・ポストテストの定量的データと内省アンケートによって効果測定を行った。具体的な音声訓練としては、短い英文の一節を、提示ソフトウェアにて一斉・個別に音読、リピーティング、シャドーイングなどを行わせるものである。前期・後期の各学期において、この音読と速読の処遇において双方にプレ・ポストテストで成績の伸びを確認できたが、両者で読解効率やWPMで目立った有意な差異を見出すことができなかった。

そこで、質的な分析として、被験者を当初WPMが低い者、読解スコアが低い者、及びその両方の者に、グルーピングして、その者達が処遇を経てどのようにWPMやスコアを推移させたかを検討した。その結果、音声処遇で一斉に発生する実験群では、それらの被験者は大きくWPM,スコアを上げた者が多かった。これにより、一定の音声・文字提示で声を出すことが、認知の負担とならず、読解を阻害するとは必ずしも言えないことが確認された。しかしながら、所期の目的の一つである、読解から聴解への転移効果は確認できていないので、さらにチャンクによる読解、音声に関する処遇の問題点を洗い出す必要が課題となった。
ウェットホワイト床皮からのコラーゲン生化学材料の調整

ウエットホワイトの脱アルミニウム条件について代表的な製革副産物である牛皮と豚皮のウエットホワイト床皮を、最終pH3以下になるように再ピックル処理(0.1Mギ酸/1M塩化ナトリウム溶液浸漬)することにより、皮中のアルミニウムを殆ど完全に(95%以上)除去することができた。再ピックルの前に水酸化ナトリウム溶液等によるアルカリ処理を施すとアルミニウムの除去は更に容易になる。2.ウエットホワイト中の合成鞣剤の除去についてウエットホワイトの調整の際に芳香族系合成鞣剤を使用した場合は、その床皮にこれが含まれることになる。合成鞣剤は上記の再ピックルでは20-25%除去され、アルカリ処理と再ピックルを組合せた場合には除去率は40%程度に上昇した。しかし完全に除去することは困難であることが認められた。従って脱アルミニウム後の高度利用の用途によっては、ウエットホワイト床皮の選別が必要になる。3.脱アルミニウム処理床皮の性状について上記の脱アルミニウム処理で得られた床皮の示差熱分析の結果、アルミニウム結合コラーゲンよりも1020°C低い6070°Cの領域にネーチブコラーゲン線維の変性を示す明瞭な吸熱ピークが得られた。これはウエットホワイト床皮から適当な脱アルミニウム処理により、未変性コラーゲン材料が得られることを証明してる。4.床皮からの線維分散体の性状について以上のように精製した床皮をホモジナイザーで中性の媒体中で破砕することにより、粒度分布測定装置で広い範囲に粒度分布をなす線維ないし細線維の分散液が得られた。酸性媒体中ではほぼ透明で粘性の強いコラーゲン溶液が得られ。ペプシンで90%以上の可溶化率が得られた。アミノ酸分析、電気泳動などでIコラーゲンの特長が確認された。
３次元１分子追跡のためのイメージングと画像解析技術の開発

MAPKシグナル伝達において、細胞外の刺激がリン酸化によりERKに伝わりERKそのものが核膜孔を通過することで遺伝子発現誘導を開始する。このプロセスの制御は運命決定に影響すると考えられる。実際に我々は運命決定における確率性の存在は、ERK核移行におけるアナログ・デジタル変換機構に由来する可能性を見出している。これまでに共焦点顕微鏡の画像解析技術を新規開発することで、ERKの核膜孔通過はシグナル伝達の律速段階であることが明らかとなっている。本年度は以下の研究を行った。1共焦点顕微鏡による高速スキャンと画像取得条件の最適化や解析法開発を行い、細胞内でERKの絶対濃度と核移行速度の定量化をすることで、ERK核移行の濃度依存性を検証した。2細胞内小器官や蛍光タンパク質が通過に及ぼす種々の影響を排するため、蛍光色素標識したERKの精製を行い、細胞膜可溶化による核の抽出を行うことでin vitroでERK核移行を計測可能な実験系の構築を行った。3ERK変異体の構築を行い、細胞刺激前後での変異体ERKの局在変化を調べることで、細胞質・核質のERKの濃度比や移行速度が著しく変化する変異部位を明らかにした。これと並行して、今後はin vitroでの1分子計測系を構築することで、協同性の帰結として予想される、個別の核膜孔にERK通過の履歴が生じる可能性などを検証し、変異体を用いた移行のメカニズム解明にも着手する。本研究においては細胞内分子濃度や拡散係数の定量が不可欠である。これまでそれらの計測には高価な装置が必要なFCSや、汎用の共焦点顕微鏡画像を用いたRICS(Raster image correlation spectroscopy)が用いられてきた。しかし、RICSでは細胞内の定量化が困難であったため我々は、FCSおよびRICSの長所を活かし、共焦点顕微鏡による高速スキャンと画像取得条件の最適化や解析法開発で、濃度や拡散係数の正確な推定に成功した。これを用いて細胞内ERKの絶対濃度推定と、FRAPによるERK核移行速度の定量を行うことで、濃度依存的な移行速度の関係を明らかにしている。さらに、細胞内の種々反応の影響やERKに融合した蛍光タンパク質の影響を排すため、精製したERKに蛍光色素の標識を行った。この精製ERKを、細胞膜を可溶化した核に加え、濃度依存的な通過速度の定量のin vitro実験系を構築している。これまでに細胞内でのERK核移行の協同性が示唆されてきたが、細胞質でERKは種々タンパク質と相互作用する。さらに細胞内では蛍光タンパク質の存在でERK核移行の通過速度が影響を受けることがわかったため、ERKそのものの通過キネティクスを明らかにすべく、精製したERKに直接蛍光標識を行い、in vitroでの実験を行う。この精製ERKを、細胞膜を可溶化した核のみの細胞に様々な濃度で滴下することで、核膜孔がERKを通過させる酵素反応速度を定量的に明らかにする。複数のERK変異体の解析により、リン酸化刺激前からERKの核移行が抑制される部位や、リン酸化後に細胞質から核質への流入を抑制する部位が明らかとなっており、これらを用いて通過の分子メカニズムを明らかにする。これまで細胞内で行ってきた1分子計測法では通過と解離イベントの区別ができなかったため、2焦点光学系で3次元1分子計測法の開発を続ける。これによりこれまで分離困難であった核膜孔が単一ERK分子を通過させる1分子酵素反応素過程の可視化を目指す。これと並行して、in vitroでの1分子計測系を構築することで、協同性の帰結として予想される、個別の核膜孔にERK通過の履歴が生じる可能性を検証する。

しかし、RICSでは細胞内の定量化が困難であったため我々は、FCSおよびRICSの長所を活かし、共焦点顕微鏡による高速スキャンと画像取得条件の最適化や解析法開発で、濃度や拡散係数の正確な推定に成功した。これを用いて細胞内ERKの絶対濃度推定と、FRAPによるERK核移行速度の定量を行うことで、濃度依存的な移行速度の関係を明らかにしている。さらに、細胞内の種々反応の影響やERKに融合した蛍光タンパク質の影響を排すため、精製したERKに蛍光色素の標識を行った。この精製ERKを、細胞膜を可溶化した核に加え、濃度依存的な通過速度の定量のin vitro実験系を構築している。これまでに細胞内でのERK核移行の協同性が示唆されてきたが、細胞質でERKは種々タンパク質と相互作用する。さらに細胞内では蛍光タンパク質の存在でERK核移行の通過速度が影響を受けることがわかったため、ERKそのものの通過キネティクスを明らかにすべく、精製したERKに直接蛍光標識を行い、in vitroでの実験を行う。この精製ERKを、細胞膜を可溶化した核のみの細胞に様々な濃度で滴下することで、核膜孔がERKを通過させる酵素反応速度を定量的に明らかにする。複数のERK変異体の解析により、リン酸化刺激前からERKの核移行が抑制される部位や、リン酸化後に細胞質から核質への流入を抑制する部位が明らかとなっており、これらを用いて通過の分子メカニズムを明らかにする。これまで細胞内で行ってきた1分子計測法では通過と解離イベントの区別ができなかったため、2焦点光学系で3次元1分子計測法の開発を続ける。これによりこれまで分離困難であった核膜孔が単一ERK分子を通過させる1分子酵素反応素過程の可視化を目指す。これと並行して、in vitroでの1分子計測系を構築することで、協同性の帰結として予想される、個別の核膜孔にERK通過の履歴が生じる可能性を検証する。
新しい酸素投与装置の開発

本研究の目的は、これまでになかった酸素投与装置を開発することである。出願した特許を元に、基礎研究から前臨床研究を進めることを目的とした。結果として、被搬送気体を通常のマスクよりも単純な筒から放出する方法(噴流法)の方が、長距離搬送に優れ、さらには、二重の筒の内側から被搬送気体を放出し外側の筒から被搬送気体を逃がさないための気流を放出するエアカーテン法が、被搬送気体を長距離、安定して搬送できることを見出した。非接触型酸素投与装置を作成する上で、「気体搬送法」を用いて、被搬送気体を放出し、目標部位に到達させるが、平成25年度は、噴流法と、渦輪搬送法の二つの気体搬送法での搬送能力の比較検討を行った。無風の実験室内で、酸素に見立てた「煙」を使用した。1リットル/分で放出した煙は、噴流法、すなわり、円柱状の放出部からそのまま放出すると、放出後、5 cmの距離で拡散することが、肉眼的に確認できた。一方、渦輪搬送法で放出すると、放出後、75 cmの距離を、煙の塊が拡散することなく搬送されることが確認できた。「研究の目的」本研究の目的は、これまでになかった酸素投与装置を開発することである。出願した特許を元に、基礎研究から前臨床試験を進めることを目的とした。結果として、被搬送気体を、通常のマスクよりも単純な筒から放出する(噴流法)方法の方が、長距離搬送に優れ、さらには、二重の筒の内側から被搬送気体を放出し外側の筒から被搬送気体を逃がさないための気流を放出するエアカーテン法が、被搬送気体を長距離、安定して搬送できることを見出した。「研究実施計画」では、当初、平成25年度に無風環境下で、種々の投与方法で、酸素を投与し、搬送距離毎に濃度を測定する予定だった。しかし、実施過程で高濃度酸素による火災の危険性が問題となったので、酸素の代わりに煙を用いて気流を可視化した実験に変更した。被搬送気体を単純な筒から放出する噴流法と、被搬送気体を渦輪状にし、飛ばして搬送する渦輪法とで、気体搬送距離の違いを見出した。1 L/分の放出では、噴流法では放出後5 cm程度の搬送距離で、煙は急速に拡散した。一方、渦輪法では75 cmの距離を煙が崩れず移動したので気体搬送方法の違いを非接触型酸素投与法として、利用できる可能性を見出したので、平成25年11月の臨床麻酔学会で発表した。計画の変更は平成25年度の実施状況報告書に反映させ、平成25年度後半と、平成26年度は、上述のエアカーテン法での被搬送気体の検討を行った。煙を用いた目視化による検討ののち、火災の対策のために、酸素でなく、二酸化炭素を用いて、搬送距離毎の二酸化炭素の濃度測定を行った。2, 4, 8, 10 L/分の種々の投与量のいずれにおいても、マスクよりも単純な筒、単純な筒よりも二重筒を使用したエアカーテン法の方が、CO2濃度を維持できる距離が長かった。渦輪法は、長距離輸送に優れていたが、空間移動中は濃度の濃淡が大きかったので評価対象外とした。麻酔元々の研究実施計画では、直接、酸素濃度を計測することとしており、具体的に実施を計画した。しかし、火災事故の危険性を、完全に否定することが出来なかった。空調実験室で、大量に酸素を使った実験を行い、もし、火災が発生した場合、人命に直結することから、酸素の代わりに、煙で可視化した研究に変更した。噴流法、渦輪搬送法だけでなく、エアカーテン法も用いた検討を行う。煙で可視化した研究だけでなく、酸素の代わりに二酸化炭素を用いた疑似的な濃度実験と粉塵内に清浄気体を放出して、清浄度の維持を検討する清浄度の実験といった酸素の代用を用いた実験を進める。それらのデータに基づき、酸素搬送能力を検討するために、火災実験が出来る施設との共同研究も検討する。2013年度は、渦輪搬送法の実験に留まり、エアカーテン法での実験を2014年度に持ち越したことが理由である。渦輪搬送法の試作機の改良機の作成と、エアカーテン法のための試作機、改良機の作成を行うので、予定通りの額が、必要になる見込みである。
HBSのレイヤ3における適合性試験法に関する研究

本研究テーマの目的は、HBS(ホームバスシステム)情報ネットワークに関する以下の内容である。1.HBSの3層に関する適合性試験法を改善し、経済的でかつ汎用性のある試験法を提案する。2.近い将来に出現するHA機器(HBC、NT、その他端末類)が、適合性試験を実施するために具備しなければならない標準的機能を明確にするとともに標準的被テスト装置を試作し、実証実験を行う。3.リアルタイムの遠隔適合性試験法について研究する。4.また、平成5年度の具体的な研究計画は、以下であった。1.ワークステーション上での試験方法を改善し、新試験システムを提案する。2.HBS制御用LSIの試作と標準的被テスト装置を開発する。3.これらの研究は、大阪産大(村田)、姫路独協大(滑川)と協調しながら進める。上記の計画にそって3層を中心にして目的1の終了及び目的2の5割程度を達成し、以下の成果を得た。1編の学会講演発表、1編の論文(テレビジョン学会、平成6年3月号掲載予定)及び1編のIEEE国際会議(平成6年6月浜辺発表決定、於米国シカゴ)に発表し、現在、IEEE Transactionへの投稿論文を執筆中である。今後の予定としては、平成6年度に7層を中心に研究を進め、3層と7層に関連するHBS端末(インタフェース)を試作してその適合性試験法を開発する。また、平成7年度は、目的3の遠隔適合性試験法についてISDNとのネットワーク接続に関する問題点の抽出とその解決法について研究する予定である。
尋常性乾癬表皮の細胞膜プロテオグリカンに関する研究

尋常性乾癬表皮とプロテオグリカンの関係について以下の実験を行った。A)乾癬患者皮膚を抗CD44抗体で免疫染色し、その発現を正常人皮膚と比較した。正常人表皮ではCD44は角層を除く表皮全層にわたり一様に表皮細胞膜上に発現がみられた。これに対し乾癬表皮では角層内にCD44陽性物質の沈着が見られ、有棘細胞層で細胞膜上CD44発現の強い部分と弱い部分が混在して認められた。角層内にCD44が陽性である所見が乾癬表皮に特異的かどうか他の錯角化を生じる疾患で見られるかどうか現在検討中である。B)乾癬表皮のGlycosaminoglycan(GAG)の発現をPoly-L-Lysine-gold複合体で染色し、組織化学的に検討した。乾癬表皮では正常表皮と比較して表皮細胞膜上でのGAGの発現の増強が観察された。コンドロイチナーゼ及びヒアルロニダーゼの前処理により細胞膜上での染色が消失することよりこのGAGは主として、コンドロイチン硫酸とヒアルロン酸であると考えられた。この現象に関しては現在症例数を増やして検討中である。C)乾癬患者血漿及び正常人血漿よりエタノール、アセトンで血漿中よりglycosaminoglycan(GAG)を抽出し、アセテート膜電気泳動でその量的及び質的な相違を検討した。血漿中のGAGは乾癬患者と正常人との間に有意な差は見られなかった。現在、GAGの抽出方法をカフムを用いた方法に変えて検討中である。また今後、乾癬患者表皮と正常人表皮よりGAGを抽出し、表皮細胞におけるGAG発現を生化学的に検索していく予定である。
窒素循環型システムのための中低温作動型窒素還元およびアンモニア酸化触媒の開発

低温・常圧下における電気化学的窒素還元触媒として窒素ドープしたTiO2ナノ粒子にAuを担持することにより新たな触媒を調製し,電気化学的窒素還元能の評価を行った.その結果,pH3で調製した触媒では,0.6 V vs. RHEで電解した場合,窒素ドープした触媒のほうが,アンモニア生成速度が高いことが分かった.また,pH2以下で調製した触媒では,-0.4 V vs. RHEで電解した場合,窒素ドープした触媒のほうが,ファラデー効率とエネルギー変換効率が高いことが明らかとなった.中低温(300°C)・常圧下でアンモニアの電解合成も試みた.本研究ではCHP-PO4電解質を用いて,Au/TiO2触媒(以後TRAT触媒),Mo窒素炭素触媒(Mo/N/KB)をカソード触媒とし,中温域においてアンモニアの電解合成を行った.TRAT触媒においてアンモニアの生成速度は200°Cにおいて高く,逆にファラデー変換効率とエネルギー変換効率は175°Cにおいて高いことが明らかとなった.Mo/N/KBを用いた場合,アンモニア生成速度および各種効率がTRATより低い値を示すことが明らかとなった.また,更なる高活性なアンモニア酸化触媒の開発を目指し,立方体形のIr-core/Pt-shellナノ粒子担持アンモニア酸化触媒の開発を目指して,立方体形Irナノ粒子担持カーボンの調製ならびに上記立方体形Irナノ粒子へのPtシェル形成,電気化学的AO活性評価について研究を行った.その結果,TEM像から,立方体に近いIrナノ粒子が生成したことが示された.また,形状制御していないPt@Ir/MWCNTと比較して過電圧が10 mV低下し,アンモニア酸化電流値が増加した.金属錯体をベースにしたMo窒素炭素触媒を用いて,アンモニアの電解合成を行ったが,高い窒素還元活性は得られなかった.触媒調整法を工夫するなどの対策が必要であると考えられる.最近Nature誌にMO錯体を用いて高活性な窒素還元触媒の報告があったため,計画が遅れることにはなるが,2018年度の研究を延長してMo系触媒について調製法を工夫するなどして,粘り強く検討していきたいと考えている.Aサイトに種々の希土類元素(M=La, Nd, Sm, Eu, Gd, Yb)を持つペロブスカイト型酸化物(MFe0.7Mn0.3O3,以後MFMOと称す)を調製し,アンモニア酸化能を三相界面を有しNafion膜で隔てた2室式セルを用いて低温(100°C)下で評価した.なお,生成物はガスクロマトグラフィと陽イオンクロマトグラフィで定量した.合成した触媒の表面形状を電子顕微鏡にて観察したところ,LaとDyに置換した触媒では,表面に空孔を持つ触媒が合成され,Sm,Eu,Gdに置換した触媒については,1次粒子が焼結することによってできた2次粒子を持つ触媒が合成されたことが明らかとなった.この中でも,表面に空孔を持つLaFMOとDyFMO触媒に関しては表面積が1.5 m2/g以上と他の触媒と比較して大きいことが明らかとなった.また各触媒において表面上の原子が均一に触媒上に存在しているため,表面形状によらず各触媒ともMFeO3にMnが固溶されていることが明らかとなった.合成したMFMOにおいて75°Cでの電解では,原子番号が大きくなるにつれてアンモニアの生成速度が向上していることが確認され,この事から,アンモニアの生成速度には格子定数が影響していることが示唆された.特に合成した触媒中で活性が良かったDyFMO触媒の75°Cと25°Cでのー1.0 V vs. RHEの活性を比較すると25°Cのほうがアンモニアの生成速度が速く,水素の生成が少なかった.このことから,過電圧が大きい条件では低温のほうが競争反応である水素の生成速度が抑制され,アンモニアの生成速度が増加することが示唆された.当初,研究計画では,溶液系で触媒をスクリーニングすることとしていたが,その後の検討で,三相界面を用いた方が,電流値が大きく,生成物の定量性がよくなるという判断から,三相界面を用いた2室式セルを設計し,電気化学システムを構築したことから,研究計画よりは遅れて進行している.しかしながら,課題はほぼ解決されつつあり,次年度はスムーズに研究を遂行できると考えている.低温・常圧下における電気化学的窒素還元触媒として窒素ドープしたTiO2ナノ粒子にAuを担持することにより新たな触媒を調製し,電気化学的窒素還元能の評価を行った.その結果,pH3で調製した触媒では,0.6 V vs. RHEで電解した場合,窒素ドープした触媒のほうが,アンモニア生成速度が高いことが分かった.また,pH2以下で調製した触媒では,-0.4 V vs. RHEで電解した場合,窒素ドープした触媒のほうが,ファラデー効率とエネルギー変換効率が高いことが明らかとなった.中低温(300°C)・常圧下でアンモニアの電解合成も試みた.本研究ではCHP-PO4電解質を用いて,Au/TiO2触媒(以後TRAT触媒),Mo窒素炭素触媒(Mo/N/KB)をカソード触媒とし,中温域においてアンモニアの電解合成を行った.TRAT触媒においてアンモニアの生成速度は200°Cにおいて高く,逆にファラデー変換効率とエネルギー変換効率は175°Cにおいて高いことが明らかとなった.Mo/N/KBを用いた場合,アンモニア生成速度および各種効率がTRATより低い値を示すことが明らかとなった.

また,更なる高活性なアンモニア酸化触媒の開発を目指し,立方体形のIr-core/Pt-shellナノ粒子担持アンモニア酸化触媒の開発を目指して,立方体形Irナノ粒子担持カーボンの調製ならびに上記立方体形Irナノ粒子へのPtシェル形成,電気化学的AO活性評価について研究を行った.その結果,TEM像から,立方体に近いIrナノ粒子が生成したことが示された.また,形状制御していないPt@Ir/MWCNTと比較して過電圧が10 mV低下し,アンモニア酸化電流値が増加した.金属錯体をベースにしたMo窒素炭素触媒を用いて,アンモニアの電解合成を行ったが,高い窒素還元活性は得られなかった.触媒調整法を工夫するなどの対策が必要であると考えられる.次年度は,当初計画していた,金属有機構造体等の錯体やペロブスカイト型の酸化物に加えて,WOx/RuOy等の複合酸化物による窒素還元能についても検討を行っていく予定である.また,アンモニアの酸化メカニズムの研究においては,現在はノーマルパルスボルタモグラム等の電気化学的手法により行っているが,今年度購入予定だった北斗電工のHQ-101Dが製造中止となり購入できなくなってしまったため,分光学的手法によってそれを補っていく予定である.また,形状制御シェルコアナノ触媒の調製とアンモニア酸化反応メカニズムの研究においては,シェルをPtに固定し,コア金属を原子番号順に変えていき,アンモニア酸化能とコア金属の種類との相関を検討する.また,コア金属をIr等の貴金属に変えたものについても検討を行っていく予定である.最近Nature誌にMO錯体を用いて高活性な窒素還元触媒の報告があったため,計画が遅れることにはなるが,2018年度の研究を延長してMo系触媒について調製法を工夫するなどして,粘り強く検討していきたいと考えている.624円分については,非常に少額であったため,無理に使うことができなかった.次年度分と合わせ,消耗品代として有効に活用したいと考えている.残額は431円であり,原資が税金であるので,無理に消費する必要はないと考えた.次年度,ガラス器具購入に使用したいと考えている.
ILO基準監視機構の司法的能

ILO監視機構の国際組織法上の位置づけを明確にしたうえで、条約勧告適用専門家委員会の意見(observation)を中心とする監視機構の判断の積み重ねを精査し、50年を超える同じ判断の継続は、総会基準適用委員会との協働を経て事実としての判例法集積があることを示した。その事実としての力の上に国際労働法の実体法が形成されていることを提示し、プロセスに権威がある場合、実体法である国際労働基準も結果として充実することを結論付けたILO監視機構の国際組織法上の位置づけを明確にしたうえで、条約勧告適用専門家委員会の意見(observation)を中心とする監視機構の判断の積み重ねを精査し、50年を超える同じ判断の継続は、総会基準適用委員会との協働を経て事実としての判例法集積があることを示した。その事実としての力の上に国際労働法の実体法が形成されていることを提示し、プロセスに権威がある場合、実体法である国際労働基準も結果として充実することを結論付けた代表者および分担者の間で何度か研究打合せを行い、初期の研究実施計画を参照しつつ、各人の分担部分について、主として文献収集、基礎資料整理、情報収集に努めた。とりわけ研究代表者は、ILOアジア太平洋地域総局(バンコク)におけるILO国際労働基準上級専門官の聞き取り調査を中心に、国際労働基準のアジア地域における適用とその監視についての最新情報を入手するとともに、ILO駐日代表事務所(東京)および厚生労働省国際課に幾度か赴いて各種情報.資料を収集した・また・21年度に主として活動した労働政策研究・研修機構の研究プロジェクトに参加したことを通じて、ILO基準の根幹である三者構成主義について、多くの職場における安全衛生基準との関連で研究し、基準実施の監視が、いかに安全衛生に関す労働基準基準がILOの監視機構によって担保されるようになったかを並行して研究した。また、国際労働基準の最終的な名宛人であるところの労働者、労働組合がどのようにILO監視機構の活動を見ていて、さらには逆に機構のほうに影響を与えているかをみるため、通報、提訴などを行っていたり準備したりしている団体と連絡を取って、勉強会に参加してILOによる監視ということの実質的な効果を調べた。予算の多くが文献費であるところからわかるように、初年度の研究は主として先行研究の追跡と資料収集であった。中間まとめとして、代表者はいくつかの論文を発表し、研究会等で意見交換を行った。ILO監視機構、とりわけ条約勧告適用専門家委員会による意見および直接請求をいわば「判例」として検証していく過程で、その判例性を裏付ける仕組み自体への信頼性が重要であることは、あらかじめある程度分かっていることではあったが、判例研究を進める過程で、また現地調査を含めての監視システムの現況を確認する作業の中で、ますますその重要性が高まってきた。12月に行ったジュネーブ本部における聞き取り調査において、従来型の監視システムにある程度の変容が生じていることが確認された。それ自体としては研究全体の方向性を変えていくほどのものではないが、せまい意味での「判例分析」だけでは全体像がつかめないことが分かった。したがって、これまでに行ってきた個別条約に係る監視機構の判断の変遷(それ自体にも意味があり、特に強制労働条約の解釈領域が格段に広げられている部分と、逆に狭まってきている部分があることが明らかになっただけでなく、報告手続上の細かい規則改定も不断になされていることも確認できた)だけにとどまらず、国際人権法の実施というもっと広い枠組みの中にILOの監視システムを位置づけ、さらには2010年11月発行のISO26000のような新種の国際基準のようなものが登場したことによる、ILO監視機構の相対化も含めて、本研究の最終的目的を達成すべく判断枠組みを調整しながら展開していくことの必要性が明らかになった。その際にはたとえば国際法学会、世界法学会(2010年アジア国際法学会研究大会(東京2010年11月)や他の研究資金を利用して参加した学会等(たとえば2011年2月のカリフォルニア大学サンタバーバラ校主催の国際会議)において得られたコンストラクティヴィスムの手法による分析視角が有用であることが確認された。本研究はILOの根本的な活動である国際労働基準の設定とその監視について、とりわけその監視機構の法的判断を総合的・体系的に分析することにより、どのような条件が整った場合に、監視機構による一連の判断が説得力を持つようになるのか、逆にどのようなときにそれは実体国際労働法としての価値が乏しくなるのか、実質的な判例法の形成がILO基準全体の拡充にとって(さらに広く国際人権法の拡充にとって)どのような意味を持つのかを解明しようとするものであった。ILO条約勧告適用専門家委員会の意見(observation)を中心とする監視機構の判断の積み重ねを精査した結果、一定の問題については一貫した判断基準が示され、また、年を経るにつれて基準の指標の取り方も変わっていくことが検証された。また、50年を超える同じ判断の継続は、総会基準適用委員会との協働を経て一種の判例法を形成するに至っていることも確定できた,。それらが成立する条件としては、ILOという三者構成の国際機構が持つ特殊性と、90年を超える実行の蓄積、及び手続の完備が大きく影響していることが分かった。すなわちプロセスの拡充が実体法である国際労働基準も結果として拡充することを意味する。最終的に本研究が目指したのは、プロセス重視の国際法定立理論であったが、プロセスに正当性があり、説得力がある場合には、法源性、実定法性に脆弱性がある場合にも、十分に法として機能することを明らかになった。
Ｔ細胞のリンパ節間質高速遊走における細胞内動態と組織微小環境

免疫系細胞は全身を循環しながら感染部位や病変組織へと素早く移行する必要性から、活発に移動すること自体が重要な機能のひとつであるといえる。本研究では二光子励起レーザー顕微鏡を用いた組織内生体イメージングにより、リンパ節間質を高速移動するT細胞の動態観察および隣接する組織細胞の同時可視化を試み、3次元的組織微小環境内における遊走機構の解明を目指した。二光子励起レーザー顕微鏡を用いたマウスのリンパ節イメージングの方法として、個体を用いたIntravital法やリンパ節Explant法に加え、組織Slice法を用いたT細胞遊走観察系を確立した。特に組織Slice法は抗体や薬剤を用いた阻害実験が容易で、遊走メカニズムの詳細な検討に非常に有効である。T細胞はリンパ節組織中で概ね10μm/min以上の速度で活発に移動した。また、CAG-ECFPマウス、CD11c-Venusマウスやそれらの骨髄キメラマウスを用いて、ストローマ細胞および樹状細胞のネットワーク構造を可視化し、遊走中のT細胞との関係を詳細に観察したところ、T細胞は両ネットワーク細胞に頻繁に接触しながら組織中を移動した。インテグリンLFA-1およびそのリガンドであるICAM-1の阻害はT細胞遊走を部分的に抑制し、野生型およびICAM-1欠損マウス骨髄キメラ由来のリンパ節を用いた解析から、樹状細胞が発現するICAM-1がLFA-1依存的な高速遊走に必要であることが明らかになった。また、ストローマ細胞が産生するAutotaxinとそれにより産生されるリゾフォスファチジン酸(LPA)がT細胞遊走に部分的に関与していることが示唆され、LFA-1非依存的な遊走活性に寄与していると推測される。以上のことから、リンパ節内のT細胞高速遊走は複数の組織細胞に支持された、いくつかの分子機構の協調作用により制御されていると考えられる。24年度が最終年度であるため、記入しない。免疫系細胞は全身を監視するために血液中を循環しながら必要に応じて組織に移行し、活発な遊走能を発揮して感染部位や病変組織へと急行する。すなわち素早く移動すること自体が免疫細胞の重要な機能のひとつであるといえる。本研究では二光子励起レーザー顕微鏡を用いた組織内ライブイメージングにより、リンパ節間質を高速移動するT細胞の内部構造と細胞極性の動態観察および隣接する組織細胞の同時可視化を試み、3次元的組織微小環境内におけるT細胞の遊走原理を究明することを目的としている。4チャンネル同時取得可能な二光子励起レーザー顕微鏡システムを用いたマウスのリンパ節生体イメージングの方法として、個体を用いたIntravital法、リンパ節Explant法、組織Slice法をそれぞれ確立しており、状況に応じて方法を選択、比較が可能な状態となっている。また、タイムラプス観察の画像データを三次元的に再構築し、詳細に解析する一連の作業工程も確立している。予備検討として、試験管内において活性化したT細胞をマウスに移入することで、リンパ節に移行させることが可能であることが判明し、遺伝子発現系を導入し、目的タンパク質の可視化を進めている。CAG-ECFPマウス、CD11c-Venusマウスをそれぞれ用いた観察系や骨髄キメラマウスの作成等の手技的な基盤は整ったことから、今後これらを組み合わせ、ストローマ細胞と樹状細胞のネットワーク構造を同時可視化たうえで、T細胞動態の観察を試みる。生体イメージングの実験系はほぼ確立し、興味深い知見が得られつつある。

一方、T細胞に遺伝子を導入し発現させたうえで、細胞動態を観察する実験系は手技上の困難がともない、予定よりやや遅れている現状である。24年度が最終年度であるため、記入しない。引き続き、リンパ球において細胞内構造の可視化するための発現システム構築を進めるとともに、動物個体において融合蛍光タンパク質を発現する遺伝子改変マウス系統を作成あるいは入手を試みる。