hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
ＤＪ－１結合化合物による神経変性疾患根本的治療薬の開発

DJ-1結合化合物の改変:現在までにリード化合物として得ているDJ-1結合化合物B,化合物23の基本骨格を保持して側鎖部の改変を試みた。in silicoスクリーニングで用いた富士通バイオサーバーを用いてin silico改変し合成し、薬理活性について、ヒトドパミン神経細胞SH-SY5Y、DJ-1ノックアウトマウス由来神経細胞を用い、酸化ストレス付加時の細胞死抑制能をMTTアッセイ、レドックス関連遺伝子のマスター転写因子であるNrf2活性をルシフェラーゼを使ったレポーターアッセイで検討した。DJ-1特異的結合化合物はいずれもDJ-1の106位システインの過剰酸化を防ぎ、PTENを介したシグナル伝達経路におけるDJ-1制御作用を酸化ストレス下でも保持することで酸化ストレス応答遺伝子群のNrf転写制御系に作用することを見出した。また、酸化ストレスから神経細胞を保護する機能を持つタンパク質の一つであり、パーキンソン病患者では発現が報告されている小胞モノアミン輸送体2(VMAT2)とDJ-1が直接結合することを見出した(Ishikawa et al. BBRC, 2012)。VMAT2との結合がDJ-1酸化度依存的であるか、C106結合化合物の影響を含めて検討中である。またDJ-1結合化合物の定量的アッセイ系として、スクリーニング用に、精製DJ-1を96穴プレートに敷き、14C標識化合物B反応後、対象化合物を添加して競合的に遊離する14C標識化合物Bを測定する系の構築を目指し、様々な条件を検討中である。DJ-1結合化合物の改変、培養細胞における薬理活性検証に係る研究は概ね計画通りに進行し目的を達成しているが、結合化合物のDJ-1に対する結合活性を、従来の水晶発振バランスを用いた系に加え、Biacore等の表面プラズマを用いた機器、結合による発生エネルギーを測るカロリーメーターで測定する作業は、実験に用いるDJ-1の酸化度をコントロールすることが難しく、思うようにはかどらなかった。また、DJ-1結合化合物とDJ-1との共X線結晶構造解析も、化合物の析出、DJ-1のダイマー形成保持、およびDJ-1の酸化度コントロール等の点で計画通りには進行しなかった。何より、平成25年度以降の本研究課題助成金による研究継続を辞退させていただく状況に陥り、モチベーションが大きく損なわれたが、別途研究費を得る努力をして高齢化社会のQOL向上のために役立つ研究となるよう展開を図っていきたい。平成25年度以降の本
チトクローム酸化酵素におけるプロトンポンプ機構の電子レベルでの解明

17年度は、(1)チトクローム酸化酵素(CCO)中のプロトン移動径路の電子レベルでの解明、及び(2)CCO中のヘムaの電子状態の酸化・還元による変化の第一原理量子論による検討、の2つのテーマを中心に研究を行った。以下に各テーマの成果概要を箇条書きで述べる。月原らによって提案されているCCO中のH径路におけるプロトン移動機構を第一原理計算によって考察した。特に焦点を絞ったのは、H径路の終点であるAsp51直前に位置するターン構造を持つペプチド結合を通したプロトン移動の可能性である。その結果、ケト形のペプチド結合のC=0二重結合にプロトンが添加されるとその反対側のN-H結合からプロトンがAsp51に渡されること、さらにその後C=0二重結合に添加されたプロトンは直接Asp51付近のN原子に移動するより、隣接するペプチド結合中のN原子を経由して移動する方がエネルギー的に23kcal/mol程度活性化障壁が低下することを明らかにした。この結果は、ターン構造をもつペプチド結合は周囲の環境によってはプロトン移動の径路になることを示している。本成果は、従来の水素結合を通したプロトン移動とは全く別の機構のプロトン移動径路の存在の可能性を明らかにしたことでその意義は大きい。H径路付近に存在するヘムaの酸化・還元による電子状態変化を電子レベルで解明した。その結果、ヘムaを還元して電子を添加すると、添加された電子は基本的にポルフィリン環のπ軌道に収容されることを明らかにした。これは鉄イオン上における極めて強いクーロン反発力のため、鉄のd軌道が還元時に大きく上昇することがその起源であることも解明した。その結果として鉄イオンから遠く離れたホルミル基の0の周辺にまで電子移動は起こり、ホルミル基近傍に存在するArg38の影響でホルミル基周辺の電子増加量は非常に大きくなることを明らかにした。
植物の組織によって異なる概日時計の環境応答性の分子基盤

植物の概日時計の機能を組織レベルで解析した結果、(1)植物の概日時計の機能には動物と同様、組織特異性があること、(2)日長刺激は維管束の概日時計によって処理され花成制御に関わること、(3)維管束の概日時計は葉肉よりも上位に位置づけられること、(4)温度刺激は表皮の概日時計によって処理され、細胞伸長制御にかかわることを明らかにした。これらの結果から、植物の概日時計システムは動物とは異なり、組織ごとに外部環境刺激を処理していることを示した。初年度の研究計画通り、表皮およびその他組織を効率良く単離するための手法を開発を行った。表皮の単離法については、維管束の単離ですでに実績のある超音波処理と酵素処理の併用に加えて剥離法を検討した。その結果、超音波処理と酵素処理を併用した方法で効率よく表皮が単離できることがわかった。この方法で単離された表皮における遺伝子発現を調べたところ、他の組織と同様、明確な概日リズムが観察されたことからこの表皮単利方が今後の研究に利用可能であることを確認した。さらに、葉全体・単離葉肉・単離維管束を用いてマイクロアレイ解析を行った。さまざまな解析の結果組織特異的なリズム形成に関わっていると考えられる新しいcis配列を2つ同定した。概日時計は多くの生物種で共通して見られる仕組みである。動物では脳に存在する主要時計が末梢臓器に存在する末梢時計を制御することで個体としての概日リズム制御が行われている。しかし、植物には脳のような明確な中枢は存在せず、組織特異的な解析のための研究手段も充分ではなかったため、植物における概日時計の組織特異的な役割はほとんど明らかにされてこなかった。今回、概日時計の役割を組織レベルで明らかにするために、これまでの方法より時空間分解能にすぐれた組織単離方法と、組織レベルでの時計遺伝子のプロモーター活性を非侵襲的に測定する方法を新たに開発した。シロイヌナズナの葉を構成する主要な組織のうち、葉肉細胞と維管束を単離し、マイクロアレイ解析を行うことで概日時計の組織特異的な役割を解析した。その結果、維管束の概日時計は遺伝子発現量および振動遺伝子の位相という点で葉肉細胞や葉全体の概日時計とは大きく異なっているものであった。さらに、維管束の概日リズムは連続明条件でも持続することや維管束の概日時計機能の阻害効果が葉肉細胞や個体全体でも見られることも明らかとなった。こうしたことから、我々は維管束が動物と同様階層構造を持った概日時計システムを持っていることを明らかにし、植物の概日時計研究における組織・細胞レベルでの解析の重要性を示した。これまで、植物の個々の細胞が独自に時間を測っており、どの組織の体内時計も同じ機能を持っていると漠然と考えられていた。本研究で私たちは、各組織の体内時計がどのように環境刺激を処理しているか明らかにするため、組織ごとに体内時計機能を阻害した系統を作出した。体内時計はほぼ全ての細胞・組織で見られるため、変異体の解析や単純な過剰発現体の解析では、観察された表現型がどの組織の体内時計の機能に由来しているのかを推定するのは困難であった。今回、組織特異的な発現を持つプロモーターを用いて組織特異的に時計遺伝子を過剰に発現させることで、特定の組織における体内時計の機能を阻害した形質転換植物を多数作出した。これにより、観察される表現型と組織の機能の関係がはっきりとし、初めて定量的に各組織の体内時計の機能を解析することが可能になった。この系統を用いて、花を誘導する日長条件および花を誘導しない日長条件での、花芽形成速度を測定したところ、維管束の特に篩部伴細胞で時計機能を阻害した系統のみが日長依存的な遅咲きを示すことが明らかとなった。次に、他の生理応答でもこうした維管束・篩部伴細胞の時計が同様に重要であるかを調べるために、代表的な体内時計制御の生理応答である胚軸伸長制御について調べた。維管束・篩部伴細胞の時計は全く表現型が見られない一方で、表皮の時計機能を阻害した系統では顕著な胚軸伸長が観察された。また、表皮の時計は胚軸以外にも子葉や葉柄の伸展・伸長に関わっていたことから、表皮の時計は細胞伸長制御全般を司っていることが示され、花芽形成の場合と異なり、表皮の時計は常温刺激を処理し、細胞伸長制御に関わっていることが明らかとなった。これらの成果はNatureおよびNature Plants誌に発表した。当初の予定を越えて進行し、研究成果をNature誌に発表することができた。植物生理学時間生物学花成については組織特異的な概日時計の役割が概ね理解できたと考えているが、細胞伸長制御については維管束の概日時計では説明できないため、他の組織における概日時計が重要であると考えられる。引き続き、こちらについても解析を行う。

研究の大部分は既に終了し、現在論文のリバイス中である。論文出版を通じて広く研究成果を普及させることを目標とする。さらに、新たな実験系の導入を含め、概日時計の組織特異的な役割を明らかにするために引き続き概日リズムを組織レベルで解析していく。大型機器を購入する予定であったが、設置場所の確保ができなかったため繰越になった。引き続き大型機器の設置場所の確保に務める。
酸化ストレスによるBACE1発現変化とアミロイドβ蛋白との相関に関する解析

[目的]培養細胞に酸化ストレスを加えることによりBACE1の発現変化の機序を検討した。[方法]BACE1を過剰発現させたSH-SY5Y細胞(BA3細胞)に酸化ストレス物質であるEthacrynic acid(EA)や4-hydroxynonenal(HNE)を負荷し、抗BACE1抗体を用いたWestern blotで検討した。BA3細胞にEA負荷を行った後、蔗糖密度勾配法により分画し,各分画のWestern blot解析を行った。分画前の試料と,脂質ラフト画分やそれ以外の画分をそれぞれ対照とEA負荷とで比較検討した。BACE1のリン酸化が起こらない変異であるS498A変異のBACE1を過剰発現させたSH-SY5Y細胞(SH-BACE1-SA細胞)でも蔗糖密度勾配法を用いて同様な検討を行った。初代培養神経細胞やSH-SY5Y細胞をそれぞれ蔗糖密度勾配法で分画し、内在性BACE1の分布も検討した。[結果および考察]BA3細胞における酸化ストレス負荷では、APP,calnexinレベルの軽度増加傾向.HO-1レベルの増加が認められた。また、EA20mM,HNE5mMでは細胞死はほとんど認められないが,EA30mMでは少数の細胞死が認められた。BA3細胞のEA20mM負荷時に脂質ラフト分画やそれ以外の分画でHO-1レベルの上昇がみられた。BACE1レベルは脂質ラフト分画で軽度増加傾向がみられた。BA3細胞とSH-BACE1-SA細胞にとおけるBACE1の分布では、BACE1の分布パターンに著変は認められなかった。初代培養神経細胞とSH-SY5Y細胞におけるBACE1の検討では、内因性BACE1の脂質ラフト局在が確認された。SH-SY5Y細胞では脂質ラフトにmatureBACE1が多く,非ラフトではimmatureBACE1が多かった。[結論]BACE1過剰発現SH-SY5Y細胞において,弱い酸化ストレス負荷によりBACE1全体量は変化しないが,脂質ラフトではBACE1レベルが増加する傾向が認められた。S498A変異BACE1も野生型BACE1と同様の脂質ラフト局在を示した。[目的]アルツハイマー病(AD)脳の病理学的特徴の一つはアミロイドβ蛋白(Aβ)の広範な沈着であり、AβのN末端を切断するBeta-site APP-cleaving enzyme 1 (BACE1)がAβの産生に関与している。また、BACE1はin vitroでAβ1-40やAβ1-42からAβ1-34を産生することが報告されている。本研究では抗ヒトBACE1抗体を作成し、その反応性、特異性を調べるとともにヒト脳においてBACE1を解析し、脳内細胞における発現局在を調べ、対照脳及びおよびAD脳においてその発現量を比較した。また、ADの病態に酸化ストレスが関与していることが推察されているため、培養細胞系に酸化ストレスを加えることによりBACE1の産生量が変化するか否かを検討した。更に、BACE1によって生成されるAβの断片Aβ34の存在様式をAD脳において検討した。[方法]ヒトBACE1の合成ペプチドをウサギに免疫し、ポリクローナル抗体を作成した。ヒトBACE1を一過性に発現させたHela細胞の膜画分をポジティブコントロールとして、抗体の特異性や感度をウェスタンブロット法にて調べた。また、ヒト対照脳およびAD脳を抽出し、抗BACE1抗体と抗MAP2抗体にてWestern blottingを行い、densitometerで濃度を測定し、各蛋白を定量した。抗BACE1抗体と抗MAP2抗体、抗GFAP抗体で免疫二重染色を行ない、ヒト脳内のBACE1の分布を解析した。また、HTB-148/H4細胞に20μMのH_2O_2を加え、3および6時間処理したものと未処理のものを溶解バッファーにてホモジェナイズした後、各サンプルの蛋白量を一定にした。作成した抗BACE1抗体を用いてWestern blotting後、得られたバンドの蛋白量をdensitometerにて測定比較した。ラット初代培養神経細胞を用いて同様な実験を行った。Aβ34の存在様式の検討のため、AD患者の凍結剖検脳をリン酸緩衝液、SDS、ギ酸にて連続的に抽出し、免疫沈降、ウエスタンブロット、質量分析及びアミノ酸シークエンスを組み合わせて各画分に含まれるAβ分子種を解析した。[結果および考察]抗BACE1抗体にてヒト脳に約70kDaの全長型BACE1を同定した。AD脳の免疫二重染色でBACE1は神経細胞に発現しており、グリア細胞には認めなかった。対照群と比較してAD群ではBACE1の発現量の低下が認められたが、AD脳では神経細胞当たりのBACE1量を反映するBACE1/MAP2値は対照群より有意に上昇していた。HTB-148/H4細胞での解析では、BACE1の蛋白量は未処理のものと比較して3時間で1.25倍、6時間で1.37倍となっており、酸化ストレスによりBACE1発現の増加傾向がみられた。ラット初代培養神経細胞では、hemeoxygenase-1の増加が生じる条件でもBACE1の変化は認められなかった。また、BACE1が生成するAβ34はPBS可溶性画分に存在し、不溶性画分には認められなかった。[結論]ヒト脳において全長型BACE1の存在が示された。

ヒト脳ではBACE1は神経細胞に発現しており、AD脳では神経細胞あたりのBACE1が増加していることが示唆された。また、酸化ストレスとBACE1発現との関係は今後更に検討する必要がある。BACE1により生成されるAβ34は可溶性を獲得しており、BACE1がAβの重合性や神経毒性の軽減にも作用する可能性が考えられた。BACE1のAβ産生能がReticulonにより抑制されるという報告もあり、今後BACE1活性の調節因子やBACE1発現時のAβ40、Aβ42、Aβ34の動態に関して、更に解析する必要がある。[目的]培養細胞に酸化ストレスを加えることによりBACE1の発現変化の機序を検討した。[方法]BACE1を過剰発現させたSH-SY5Y細胞(BA3細胞)に酸化ストレス物質であるEthacrynic acid(EA)や4-hydroxynonenal(HNE)を負荷し、抗BACE1抗体を用いたWestern blotで検討した。BA3細胞にEA負荷を行った後、蔗糖密度勾配法により分画し,各分画のWestern blot解析を行った。分画前の試料と,脂質ラフト画分やそれ以外の画分をそれぞれ対照とEA負荷とで比較検討した。BACE1のリン酸化が起こらない変異であるS498A変異のBACE1を過剰発現させたSH-SY5Y細胞(SH-BACE1-SA細胞)でも蔗糖密度勾配法を用いて同様な検討を行った。初代培養神経細胞やSH-SY5Y細胞をそれぞれ蔗糖密度勾配法で分画し、内在性BACE1の分布も検討した。[結果および考察]BA3細胞における酸化ストレス負荷では、APP,calnexinレベルの軽度増加傾向.HO-1レベルの増加が認められた。また、EA20mM,HNE5mMでは細胞死はほとんど認められないが,EA30mMでは少数の細胞死が認められた。BA3細胞のEA20mM負荷時に脂質ラフト分画やそれ以外の分画でHO-1レベルの上昇がみられた。BACE1レベルは脂質ラフト分画で軽度増加傾向がみられた。BA3細胞とSH-BACE1-SA細胞にとおけるBACE1の分布では、BACE1の分布パターンに著変は認められなかった。初代培養神経細胞とSH-SY5Y細胞におけるBACE1の検討では、内因性BACE1の脂質ラフト局在が確認された。SH-SY5Y細胞では脂質ラフトにmatureBACE1が多く,非ラフトではimmatureBACE1が多かった。[結論]BACE1過剰発現SH-SY5Y細胞において,弱い酸化ストレス負荷によりBACE1全体量は変化しないが,脂質ラフトではBACE1レベルが増加する傾向が認められた。S498A変異BACE1も野生型BACE1と同様の脂質ラフト局在を示した。
民俗宗教としての社寺参詣習俗の実証的調査研究

今年度は前年度に続き、国立国会図書館、東京都中央図書館、国立歴史民俗博物館等の所蔵資料によって文献調査を行ったほか、現地調査と資料収集の対象とした地域は次のようであった。(1)東京都北区、同八王子市、(2)長野県長野市、同戸隠山、同木曾御嶽山、同阿南町、および長野県全域(3)秋田県秋田市および秋田県全域,(4)宮崎県椎葉村、(5)新潟県上越地方。ただし文献調査の対象は上記にとどまらず、青森県津軽地方、岩手県北上地方や愛知県一円など広範にわたったのはこれも前年度同様である。1.今年度の調査内容は基本的には前年度と同様であるが、それに加えて各地の参詣供養塔の種類と所在の把握に力を注いだ。その結果、道中記や公用文書には記録されない、各地域におけるより詳細や参詣行動が明らかになってきた。全体像については現在デ-タベ-ス化による集計作業を進めているところである。2.また一般庶民の旅行にまで視点を広げるならば、湯治、すなわち長期間温泉地を訪れる遊山的行動も、無視できないほど大きな比重を持っていたことも明らかになった。今後この方面の実態を究明することも重要な作業になると思われる。3.上記(5)の調査は偶然のことであったが、そうした遊山と信仰との興味ある結合事例として、調査の視野に入ってきたものである。毎年秋になると有縁講と称して、新潟県頸城地方から長野県北部地方の真宗寺院と門徒による大規模な宗教集会が営まれている。平成3年で33回目をむかえ120の寺院と4500名をこえる一般信徒が参加するまでになった。11月ほぼ1か月をかけて、交互にある温泉を訪ねては法話を聞き、一晩温泉を楽しむというものである。いわゆる寺社参詣の範疇にははいらないものの、今後これについても調査を深めていきたい。調査の開始に先だって国立国会図書館、東京都中央図書館等の所蔵資料によって文献調査を行った後、7月より今年度の現地調査を開始した。実施した調査地は、(1)和歌山県田辺市および新宮市とその周辺地域、(2)石川県能登地方を中心とする石川県地方、(3)山形県鶴岡市および羽黒山、(4)京都市、(5)岩手県宮古市およびその周辺地域、(6)愛知県名古屋市、三重県四日市市、(7)徳島県徳島市およびその周辺地域、である。ただし文献調査の対象は上記にとどまらず、青森県津軽地方や愛知県一円など広範にわたった。これらの調査からつぎのような傾向が判明してきた。なお現在これらの調査と並行して、各地の道中記の所在および公用文書等にみられる参詣記事のデ-タベ-ス化作業を進めているところである。1.当然のことであるが、地域によって固有の大小参詣地がそれぞれに存在する。たとえば山形県鶴岡地方の羽黒山、愛知県一円の木曾御岳山、徳島県徳島地方の四国霊場、青森県津軽地方の岩木山、などがその一例である。しかしすべての地域に卓越した近隣の参詣地があるとはかぎらない。社会的文化的に中心になる都市の有無や、歴史的な経緯をふまえてそのような差が生じたと考えられるが、詳細な検討は次年度に送りたい。2.一方、伊勢参詣は遠近を問わず、普遍的に行われた。ただし、遠隔地からの参詣者はしばしば詳細な道中記等の記録を残し、帰村のあとも参詣供養塔を建立することが希でない。また一体に大規模な集団になりがちである。地方、近接地からのそれは恒常的な伊勢講を基盤にしており、比較的小人数で、しかも記録を残すことがほとんどない。

11月ほぼ1か月をかけて、交互にある温泉を訪ねては法話を聞き、一晩温泉を楽しむというものである。いわゆる寺社参詣の範疇にははいらないものの、今後これについても調査を深めていきたい。
誘導型・磁気抵抗効果型複合磁気ヘッドによる記録再生過程シミュレーション

1有限要素法による3次元磁界解析のための自動分割プログラム磁気ヘッドから発生する磁界を解析するために有限要素法を用いるが、3次元物体のデータを自動的に作成するためのソフトウエアを開発した。ここでは、Delaunay法とOctree法を併用したプログラムにより自動データ作成を実現した。従来、物体の輪郭が失われることがあったが、この点を理論的に明らかにし、新しいアルゴリズムを開発することにより、この問題点を解決した。これにより有限要素法による3次元磁界解析を容易に行なえるようになった。2薄膜磁性体のマイクロ磁化過程シミュレーション外部磁界の有る場合、無い場合に対してランダウ・リフシッツ・ギルバ-ト方程式を解き、軟磁性薄膜、薄膜磁性媒体の磁区構造を動的に求め、可視化する手法を開発した(口頭発表:高野、金井、「薄膜磁性体のマイクロ磁化分布シミュレーション」、第5回電気学会東京支部新潟支所研究発表会、B-23、93-94(1995))。3今後の展望静的な状態に理想化した条件で、磁気力顕微鏡(MFM)による磁化状態の観測を試みたが、探針を磁性体に近づけると磁化状態が変化するという問題点が明らかになった。この点を解決するために、磁気力顕微鏡により得た像から元の像を数値的に逆推定する、という新しい課題につながった。また、前述の自動分割プログラムおよびマイクロ磁化過程シミュレーションは、アルゴリズム改良により更なる高速化、省メモリー化を図ることが重要である。
植物プロテアーゼの細胞内輸送及び翻訳語プロセシングの分子機構

1.免疫電子顕微鏡法により、SH-EPは小胞体からゴルジ体を経て液胞に輸送されることが示された。またこの際、超薄切片の作製が困難とされるデンプン性種子の固定・脱水・包理法を確立した。2.SH-EPのC末端プロペプチド中に存在するKDEL配列の機能を解析するために、KDEL配列をもつSH-EP(KDEL+SH-EP)とそれを欠失させたSH-EP(KDEL-SH-EP)を、バキュロウイルスを介してカイコ由来の昆虫培養細胞(Sf9)でそれぞれ発現させた。感染後のKDEL+SH-EPとKDEL-SH-EPの発現を経時的に調べた結果、KDEL+SH-EPとKDEL-SH-EPはともにSf9細胞中においてケツルアズキ子葉中で見られるプロセシングと類似したプロセシングをうけたが、KDEL+SH-EPのプロセシングはKDEL-SH-EPのそれよりも遅れて観察された。また、KDEL配列を特異的に認識する抗体を用いた解析およびショ糖密度勾配遠心法により、KDEL配列を含むC末端プロペプチドは小胞体内で切除され、その結果、SH-EPが小胞体から液胞へと輸送され始めることが示唆された。さらに、活性中心のCysをGlyに置換したSH-EPを同様に解析した結果、C末端プロペプチドの切除が観察されたことから、小胞体内腔におけるC末端プロセシングは自己切断反応によるものではないことが示された。また、免疫組織化学法により、Sf9細胞においてSH-EPはKDEL配列の有無にかかわらず主にリソソームに局在することが明らかになった。これらの結果より、SH-EPのC末端KDEL配列はSH-EPを小胞体内腔に「一時的な前駆体(中間体)」として保持する機能を持ち、その配列は小胞体に局在するプロテアーゼにより切除されることが推定された。標記の課題につき生化学及び細胞生物学両面からの研究を行い、次の結果を得た。1)ケツルアズキ発芽子葉から単離したシステインエンドペプチダーゼ(SH-EP)前駆体cDNAを、バキュロウイルス発現ベクターを用いて昆虫培養細胞sf-9に入れこみ、その発現を調べた。タンパク質免疫プロット法による解析の果、小胞体残留シグナルとされるC末端KDEL配列を含むSH-EP前駆体を導入した場合、SH-EPの大部分は細胞内に見出され、一部が細胞外へ分泌された。しかしKDELを欠失させたcDNAでは、逆にSH-EPの大部分は細胞外に分泌された。また、ダイズから得られたシステインプロテアーゼ類似タンパク質P34(C末端KDEL配列を欠く)についても同様の実験を行ったところ、やはり細胞内に大部分を見出され、一部分が培養液中に分泌された。以上の結果は、植物由来のKEDL配列が昆虫培養細胞中でも小胞体残留シグナルとして正しく受容体によって認識され、機能していることを示唆している。2)SH-EPを発現しているsf-9細胞を用いて、細胞内分画及び免疫組織化学分析を行い、これによっても、KDEL配列をもつSH-EPは、それを人為的に除いたSH-EPと比べて、小胞体に残留する割合が非常に高いことが示された。1)の結果と考えあわせると、SH-EPのC末端KDEL配列は、SH-EP分子の外側に露出しており、sf-9細胞中のKDEL受容体によって認識されて小胞体に輸送されることが推定される。

また、SH-EP(KDEL_+)を発現させたSf-9細胞中には、SH-EPを含む封入体様の構造が確認された。これは、小胞体に残留するSH-EPが多すぎたため、その結果として、小胞体中で封入体様の小胞に蓄積した可能性を示すものと考えられる。なお、P34を発現しているsf-9細胞をツニカマイシンで処理した結果、P34はsf-9細胞内で糖類の付加を受けることが確認された。標記の課題につき生化学・分子生物学および細胞生物学的な研究を行い、次の結果を得た。1.免疫電子顕微鏡法により、SH-EPは小胞体からゴルジ体を経て液胞に輸送されることが示された。またこの際、超薄切片の作製が困難とされるデンプン性種子の固定・脱水・包埋法を確立した。2.SH-EPのC末端プロペプチド中に存在するKDEL配列の機能を解析するために、KDEL配列をもつSH-EP(KDEL+SH-EP)とそれを欠失させたSH-EP(KDEL-SH-EP)を、バキュロウイルスを介してカイコ由来の昆虫培養細胞(Sf9)でそれぞれ発現させた。感染後のKDEL+SH-EPとKDEL-SH-EPの発現を経時的に調べた結果、KDEL+SH-EPとKDEL-SH-EPはともにSf9細胞中においてケツルアズキ子葉中で見られるプロセシングと類似したプロセシングをうけたが、KDEL+SH-EPのプロセシングはKDEL-SH-EPのそれよりも遅れて観察された。また、KDEL配列を特異的に認識する抗体を用いた解析およびショ糖密度勾配遠心法により、KDEL配列を含むC末端プロペプチドは小胞体内で切除され、その結果、SH-EPが小胞体から液胞へと輸送され始めることが示唆された。さらに、活性中心のCysをGlyに置換したSH-EPを同様に解析した結果、C末端プロペプチドの切除が観察されたことから、小胞体内腔におけるC末端プロセシングは自己切断反応によるものではないことが示された。また、免疫組織化学法により、Sf9細胞においてSH-EPはKDEL配列の有無にかかわらず主にリソソームに局在することが明らかになった。これらの結果より、SH-EPのC末端KDEL配列はSH-EPを小胞体内腔に「一時的な前駆体(中間体)」として保持する機能を持ち、その配列は小胞体に局在するプロテアーゼにより切除されることが推定された。
雪片の融解分裂による粒径分布の変化の解明

雪片を灯油中で融かすことにより、個々の雪片が融解する際に、どのような粒径分布の水滴を形成するかを測定した。その結果、平均的には、雪片の質量が増大するにつれて、ほぼ直線的に生成される水滴の個数が増大することが明らかとなった。これは、本研究によって世界で初めて明らかとなった事実である。雪片の質量の増加によって、急激に分裂する水滴の個数がふえるため、生成される水滴の平均粒径は、雪片の質量が増えるにつれて逆に減少することも明らかとなった。また、生成される水滴の粒径分布を調べると、質量の大きな雪片ほど相対的に小さい粒径の水滴を作りやすいことが示された。雪片の最大粒径、雪片の断面積、雪片の凹凸度、雪片のモーメントと生成された水滴の個数との関係をしらべると、数多くの水滴を生成する雪片は、最大粒径、断面積、凹凸度及び質量が大きいが、しかし、これらの値が大きいからといって必ずしも数多くの水滴が生成されるとは限らない(必要ではあるが十分条件ではない)ことが明らかとなった。各特徴量との間の相関を調べると、凹凸度と断面積、及びモーメントと質量との間にはほとんど相関が無いことが分かる。即ち、雪片がどの程度複雑な形をとり得るかは、雪片の大きさによらないということが分かる。言い換えれば、雪片が大きかろうと小さかろうと、その形は等しく複雑であると言える。また、重い雪片(あるいは大きな雪片)であるからと言って、中心部に質量が集中しているとは限らず、逆に、軽に雪片(あるいは小さな雪片)であるからと言って質量が一様に分散しているとは限らないことを意味している。モーメントも凹凸度も、何れも空中での雪粒子の併合様式に関係した値である。従って、雪粒子の併合様式は、その大きさや重さによらないランダムな現象であることが示唆された。本年度は、雪片融解装置、融解水滴撮影装置、ビデオ画像収録及び画像解析装置とその解析プログラムを作成した。雪片融解装置は、アクリル板で作成した容器内に軽油を満たし、その温度を0+5°Cに保ちながら、大気中を落下してくる雪片を軽油中で融解させるものである。融解水滴撮影装置は、雪片が融解する際にできる数多くの粒径の異なった微小水滴を撮影するものである。これらの微小水滴を数10ミクロンの分解能で撮影するため、高性能のビデオカメラを用い、かつ焦点から外れないように、ポンプを用いて水滴をロートの中に集めて落下させる方法を採用した。ビデオ画像はひとこまずつ解析装置に送って、微小水滴の大きさと数を計測した。融解前の雪片の重量は、これらの微小水滴の重さの和として求めた。完成した装置は、金沢大学工学部の屋上に初め設置し、その後は北海道大学低温科学研究所の屋上に設置して測定を行った。雪片は予想通り数多くの微小水滴に分裂し、一方あられのように密度の高い雪粒子はほとんど分裂せずにひとつの水滴に変化した。これらの融解過程は、高精度のビデオカメラによって鮮明にとらえられた。本研究は数多くのデータを取得するほど融解によって生ずる水滴の確率分布関数が正確に得られる。それには今年度のみの観測例数では不足である。そのため、来年度は12月初めから北海道で観測を開始し、大量のデータを取得する予定である。

また、今の装置で短時間に複数の雪片が連続して融解したときには、互いの水滴を分離することができない。現在は、プログラム上でこれらを分離する方法と、雪片をひとつひとつ分離して融解させる装置作りの両方で、この装置の欠点を修正しているところである。本年度は、昨年度の撮影した、ケロシン中を落下する雪片の融解・分裂の様子を示しているビデオテープ画像の処理を行なった。即ち、録画テープを再生し、画像処理装置を用いて雪片映像をコンピューターに取り込んだ。画像処理装置は、1画面当たり512x512画素、濃淡256諧調の分解能で画像を取り込むことができる。従って、撮影空間との対応から1画素当たりの長さは、0.08mmであった。通常、直径0.1mm以上のものを雨滴と定義しているので、ここで得られた値は分解能として十分である。雪片映像からは、粒径、断面積、凹凸度、モーメントを計算し、融解後の水滴画像からは、融解水滴の粒径分布と、それらの総和である融解前の雪片の質量を求めた。これらの解析の結果以下のことが明らかとなった。(1)大きい雪片ほど分裂する個数のばらつきが大きい。このことは、大きい雪片であるからといって必ずしも大きい雨滴になるとは限らないことを意味している。逆に、小さい雪片ほど一つの雨滴にまとまり易く、結果として大きい雨滴を形成しうることを意味している。(2)モーメントの小さい雪片ほど、融解後に大きな雨滴を作りやすい。モーメントが大きいという事は、一つの雪片の中で質量の濃淡が多いことを意味している。従って、ここで得られた結果は、雪結晶の併合の仕方にむらがあるほど小さい雨滴が形成され易く、ほぼ中心に固まって併合している場合には融解後も一つの大きな水滴を形成することを意味している。(1)の結果から、ある大きさの雪片が融解後に形成する雨滴の粒径分布を、確率的に計算することが可能になった。また、(2)の結果から、確率的に融解する理由についての物理的解釈が可能になった。
精神科救急・急性期ケアと多職種アウトリーチサービスとの連携モデルの開発

本研究は、精神科救急・急性期治療におけるケアとアウトリーチ(訪問支援)機関の緊密で有効な連携モデルの開発を試みた。先駆的にアウトリーチサービスを実施している施設にインタビューを実施し、協働関係の現状を把握し、情報共有の有効性について把握した。精神障害者の地域生活を支える連携のあり方として、双方向性、連続性、集中性、即応性の4点をキーワードとした情報共有や地域特性を踏まえた支援体制を整備していく必要性があると考えられた。多職種多機関での支援体制では、官民が協同して地域特性を超えた方法論と支援体制が整備されることが必要である。今年度は地域でアウトリーチを行っている施設3か所、医療機関内にアウトリーチチームを置き支援を行っている施設2か所にインタビューを行った。医療機関の場合と同じく対象者の選定については、行政機関等も含めて協議していたが、地域ごとに支援対象者や選定の基準方法が異なっていた。また、医療機関内にチームを作っている場合は情報共有が双方向に顔のみえる関係でおこなえていたが、地域で支援を行う場合は、支援機関以外との情報共有には齟齬が見られる場合があり、タイムリーなサービスに直結していない事例が報告された。しかしながら、各地域サービス施設の取り組みとしては、電話やメールを使用した連絡体制を整えたり、積極的に関係機関に出向くなどして支援に支障がきたさないよう配慮されていた。専任を配置することにより、地域で生活している対象者にじっくり関わりの糸口をみつけながら時間をかけて対象者とかかわりその人らしい生活の支援につながっているのではないかと考えられた。強制入院等行政介入も時に要するが、医療体制が必要な場合においてもあらかじめ支援方法を話し合い、入院に至る場合についてもチームでのフォロー体制を検討しておくことで短期間での入院で済んでいると考えられた。実際、地域で行っているアウトリーチチームの中には入院中も積極的に医療機関に出向き、医療スタッフと役割分担を行い支援の継続をしている事例もあり、退院後に向けた継続的な支援がおこなえているのではないかと考えられた。そのためには、アウトリーチに限らず、医療機関と地域サービスの相互理解があってこそ連携がとれると考えられたが、実際は医療機関との地域サービスとの垣根が支援の継続に支障をきたしていることも課題として挙げられた。先駆的にアウトリーチサービスを実施している施設にインタビューを実施し、精神科救急・急性期ケアと多職種アウトリーチサービス機関との協働関係の現状を把握し、医療機関における情報共有の有効性について検討した。その結果、病院関係機関や地域における保健所や相談支援事業所、福祉事業所等多機関が双方向性、連続性、集中性をキーワードとした情報共有を意識した連携をとりながら、支援をおこなっていた。アウトリーチサービスによって、多職種がそれぞれの専門性と個を活かした、支援を行うことで既存のサービスでは行き届かなかった支援がおこなえていることが明らかになった。今後の課題として、患者の地域生活を維持する個別支援に向けた取り組みを組織的に強化することや医療機関や福祉サービスにおける切れ目ないアウトリーチサービスが行われるようなシステムについて検討していく必要があると考えられる。地域ごとにサービスの内容や支援方法が異なるという現状から、官民が協同してそれぞれの地域特性を共有する機会を設けるなど医療福祉サービス全体で専門性を活かした相互教育を行っていく必要性があると考えられる。平成23年度より厚生労働省は、未治療の者や治療中断している者等に対して多職種専門職チームによる精神障害者アウトリーチ推進事業を開始した。本事業により病院や施設による保健・医療・福祉サービス提供だけではなく、在宅生活の継続を行いながらの包括支援が可能になると期待されている。本研究は、精神科救急・急性期ケアと訪問看護事業を含む多職種アウトリーチサービス機関との協働関係の現状を把握するとともに、有機的な連携モデルを開発することを目的とした。平成23年度は、精神科救急・急性期治療を行っている医療関係機関3か所に勤務する多職種の院内外の連携状況をフォーカスグループインタビューによって調査した。インタビューでは主として医療関係機関からアウトリーチサービス機関への情報提供の効果的な方法の現状を把握した。地域によって精神科救急システムや連携する在宅サービス機関数等は異なるが、(1)院内、関連機関に携わるスタッフで掲示板システムを利用した複数個所からの同時参加型カンファレンスによって在宅医療、生活支援を行っている(2)在宅生活支援スタッフとの退院支援事業の共同運営を院内多職種チームが実施(3)退院患者だけでなく、治療中断や医療につながっていない人を含め夜間休日等電話相談を受け医師への情報提供や多職種で情報共有を行うことで早期介入につなげていることが分かった。また、症状が悪化しても外来や地域で支えることで入院に頼らない、アウトリーチサービスの目的に合致した取り組みを施設ごとの特徴を織り交ぜながら行われていることが明らかになった。

平成24年度は、医療関係機関をどのような方法とタイミングで活用することが有効なのかをアウトリーチサービス機関の視点で調査を行う。それを踏まえて、わが国では未発達な相互情報管理システム、ケアプラン共同作成を重視した連携モデルを検討したい。今年度は地域サービス3か所でのインタビューを予定していた。地域でアウトリーチを行っている施設が少ないが、引き続き調査協力を依頼していく。また、病院でのアウトリーチ活動についても引き続き追加調査を行っていく予定である。今年度行う予定であった3つの医療機関にインタビューを実施し、現在分析を行っている。今年度実施するアウトリーチ機関へのインタビュー項目の見直しも順調に行っている。医療機関および地域サービスでのアウトリーチの取り組みから、精神障がい者が地域で生活するために多くの専門職や人的資源の投入が行われることによりその人らしい生活に近づけることがわかった。いずれにしろ、多職種が協働で話し合うための時間や場所の確保は簡単ではなく、タイムリーに行うということが必ずしもできない。そのために、専任の支援者を配置することで調整的役割を担うこと、情報ネットワークの構築等を整えることにより多くのニーズに応えらえるのではないかと考えられる。また、既存のサービスや今まで築いてきた地域でのネットワーク、地域の理解があってこそ支援サービスが行われるということ、よって地域住民への理解がえら得るよう同時に情報発信を進めていく必要があると考えられる。これらの現状を踏まえて、平成26年度は精神科救急・急性期ケアとアウトリーチ機関との連携モデルを考案する。また、連携モデルを洗練するためのインタビューを行う予定にしている。研究開始当初はアウトリーチサービス実施機関が少なかったが、昨年度末より徐々に増えている。よって、どのようなサービスが行われているのか、医療機関とどのような連携ができるのか検討を行う。インタビューを実施するための旅費、謝金、およびテープ起こし代金、報告書作成に使用する。新たな書籍や文献複写などにも使用する。また、アウトリーチに関する研修会を予定しておりその際にかかる諸経費ついても使用する予定である。3つのアウトリーチサービス機関にインタビュー調査を実施する。そのため、旅費、謝金、テープ起こし、郵送費を使用する。また、そのための会合費、学会発表に使用する。
個別化放射線治療に向けたリキッドバイオプシーの応用

「個別化放射線治療」を実現させるために、「リキッドバイオプシー」という手法を用い、リンパ球および血漿中に存在する腫瘍由来のエクソソームの核酸・タンパクなどを調べ、癌の放射線感受性予測に応用する。2018年度は、腹部骨盤部に放射線治療を施行した子宮頸癌、直腸癌、肛門癌、膵癌など、約50名の患者より血液を採取し、血漿およびリンパ球などの試料を分離採取した。またリンパ球のDNAーPK活性測定、放射線誘発ガンマH2AXフォーカス測定、血漿からエクソソーム内包マイクロRNA発現解析に必要なサンプルの分離調整を行った。また、子宮頸癌に疾患を絞っての治療効果予測研究のベースとして、20102015年にかけて当院で根治的放射線治療を行った子宮頸癌患者の治療成績の遡及的調査と、治療時に撮影したCTベースでの腔内照射の線量分布解析を行い、ステージ・腫瘍径・照射線量(特にHRーCTVのD90のEQD2)といった臨床的パラメータを用いた治療効果予測モデルの検討を行ない、この研究成果の概要を2018年10月に行われた第31回日本放射線腫瘍学会学術大会で発表した。また2019年4月の第78回日本医学放射線学会総会においても発表する準備を進めている。臨床的パラメーターでの治療効果予測に、リキッドバイオプシーから得られたバイオマーカーを加える事で更なる治療効果予測精度の向上が得られるかどうかを引き続き検討していく予定である。腹部骨盤部に放射線治療を施行した子宮頸癌、直腸癌、肛門癌、膵癌など、約50名の患者より血液を採取し、血漿およびリンパ球などの試料を分離採取した。エクソソーム内包miRNA発現解析に関しては、血漿から分離採取できるエクソソームの量が少ないため、具体的には血漿5001000μLから分離できるマイクロRNAが10100pg程度のごく微量しか回収できず、収量を増やす工夫および微量でRNA解析を行うため、RNA-seqという次世代シーケンサーを用いた解析の導入を検討中である。引き続き、目標の200名を目指して血液採取を継続する。同時に分離した血漿およびリンパ球サンプルのRNA発現解析と、DNA-PK活性測定、放射線誘発ガンマH2AXフォーカス測定を行っていく。血漿エクソソーム内包マイクロRNA解析は代表的なサンプルを選んでRNA-seqを用いた次世代シーケンサーでの解析で、RNAの定性および定量が可能かどうか検討を進める。サンプルが得られた患者群の臨床情報を収集し、局所再発や遠隔転移の有無といった放射線治療効果の予測因子に関連する生物学的因子の同定を進める。(理由)サンプル収集を優先させており、研究計画に差支えないことを前提に、一部の試薬や測定キットの購入を次年度に見合わせたためである。(使用計画)前年度に購入しなかった試薬を購入し、その他は概ね計画通りに使用する。
電子嗅覚装置を用いた老人性口臭の検討

近年、女性高齢者の喫煙率の増加が指摘されているため、におい識別装置で喫煙による口臭の特性を検討したところ、喫煙者の口臭には、硫化水素、硫黄系、芳香族系の成分が強く関与していることがわかった。また、高齢になるほど歯周病の進行と関連するメチルメルカプタンの濃度が高くなる傾向が示され、高齢者ほど口腔清掃が重要であることが示唆された。さらに、口臭に関する質問調査では、高齢者の口臭は身近な人とのコミュニケーションを阻害する大きな要因となっている可能性が示唆された。高齢者における動脈硬化は「血管の老化現象」と称され、食生活や高血圧との関連が指摘されるほか、喫煙も大きな影響を与えることが知られている。それは、タバコの煙に含まれるタール,ニコチン,および一酸化炭素が悪玉コレステロールを増加させて血管を細くし心臓に負担をかけるためであるとされている。よって、喫煙者の口臭は他人に不快感を与えるだけでなく、喫煙者本人の健康に対する為害性を表すバロメーターになる可能性があると考えられる。ガスクロマトグラフィーを用いた研究から、揮発性硫黄化合物(volatile sulfur compounds: VSC)が生理的口臭や病的口臭の主原因物質であることが明らかになっているが、タバコの煙には通常の口臭成分であるVSCガスだけでなく、様々な臭気成分を含有していることを考えると、喫煙による口臭の測定は従来法では不十分と考えられる。そこで、ヒト嗅覚同様に臭気を定性・定量できるエレクトロニック・ノーズ技術を用いて、喫煙による口臭の特性を包括的に明らかにすることを目的とし、健常者を非喫煙群と喫煙群に分け、におい識別装置(FF-2A)を用いた口臭検査を行い、喫煙による口臭の特性を検討したところ、喫煙者の口臭には硫化水素、硫黄系、芳香族系の成分が強く関与しているという結果が得られた。タバコを燃焼させ収集した主流煙の硫化水素、硫黄系、芳香族系の臭気指数を喫煙者および非喫煙者の呼気と比較すると、喫煙者の臭気指数は非喫煙者の呼気とタバコの主流煙の中間の値を示した。硫化水素は喫煙以外のプラークや舌苔などの生理的な口臭成分としても検出される物質であるが、非喫煙者の呼気中での検出は微少であった。しかしながら、硫化水素はタバコの主流煙に多量に含まれることから、喫煙により口腔に残留するため非喫煙者と異なる様相を呈したことが示唆された。近年、女性高齢者の喫煙率の増加が指摘されている。高齢者の喫煙は口臭を憎悪させるほか、動脈硬化に影響を与えることが知られており、高齢者の口臭は他人に不快感を与えるだけでなく、喫煙者本人の健康に対する為害性を表すバロメーターになる可能性があると考えられる。そこで、喫煙による口臭の特性を包括的に明らかにすることを目的とし、健常者を非喫煙群と喫煙群に分け、におい識別装置を用いた口臭検査を行い、喫煙による口臭の特性を検討したところ、喫煙者の口臭には硫化水素、硫黄系、芳香族系の成分が強く関与しているという結果が得られた。さらに、口臭を主訴として来院した患者を対象にして検討を行ったところ、口臭の指標となる揮発性硫黄化合物に関しては、高齢になるほどメチルメルカプタンの濃度が高くなる傾向が示された。メチルメルカプタンは歯周病の進行に伴い濃度が高くなることが知られており、高齢になるほど口腔清掃が重要であることが示された。これらの患者に生活習慣について調査をおこなったところ、口臭で悩む高齢者は、他の年齢層に比較して昼食後のブラッシングを行うことが少なく、補助的にデンタルフロスを使用することがないことが示された。また、口臭に関する質問調査では、高齢者ほど病悩期間が長く、口臭を意識したきっかけも家族からの指摘が多く、複数の医療機関を受診した経験者が多く、他人の口臭も気にしがちである傾向が示された。これらのことから、高齢者の口臭は身近な人とのコミュニケーションを阻害する大きな要因となっている可能性が示唆された。歯周病は、その罹患率が年齢を重ねるごとに高くなっており、糖尿病、循環器疾患など全身へ影響を及ぼすことが懸念されている。歯周病に罹患した患者では口臭を有することが多く、口臭検査で歯周病の早期発見ができれば全身の健康状態の維持にもつながると考えられる。よって、本研究では口臭検査において、におい成分を定性・定量できるヒト嗅覚システムを模倣した電子嗅覚装置が有用であるかどうかを検討する。実験の対象は、口臭を主訴として受診した患者群と健常者群とした。

口臭の評価は電子嗅覚装置(FF-2A、島津)より測定された臭気指数、官能試験値および口臭測定器(Oral Chroma、アビリット)による揮発性硫化物(VSC)濃度を用いた。被検者の口腔保健状態の評価は、歯周病の指標として4mm以上の歯周ポケットを有する歯周病有病歯率を、舌苔の付着状態の指標として舌苔スコア(TCS)を、歯垢の付着状態の指標としてプラーク・インデックス(PI)を用いた。患者群と健常者群の電子嗅覚装置で測定された9種類のガス群の臭気指数を比較したところ、患者群では硫化水素、有機酸、アミン、アルデヒド、エステルおよび芳香族系のにおい成分で高い値を示した。また、臭気指数、官能試験値および口臭測定器より得られたVSC濃度をそれぞれ目的変数とし、口腔保健状態を説明変数とした重回帰分析をおこなったところ、臭気指数は歯周病有病歯率との間に有意に高い関連性を認め、TSCと弱い関連性を認めたが、この関係は有意ではなかった。官能検査値は歯周病有病歯率とTSCとの間に高い関連性を示したが、VSC濃度はどの臨床評価値とも有意の関連性を示さなかった。以上のことから、本実験で使用した電子嗅覚装置は、口臭検査による歯周病のスクリーニングにおいて有用であることが示唆された。口臭の評価に用いている電子嗅覚装置(FF-2A、島津)が実験途中にて不調となり、修理・調整のために長期間使用できなかったことに合わせて、新たに追加した標準ガス(ジメチルサルファイド)の調整に時間がかかってしまったため、実験が滞ってしまった。口臭の評価に電子嗅覚装置(FF-2A、島津)を用いているが、実験途中にて装置が不調となり、修理・調整のため長期間使用ができなかったため、実験が滞ってしまった。当初、予定していた「口臭症の国際分類に基づき、生理的口臭と判定され、全身疾患を有しない者」という被験者の選択基準は、高齢になるほど厳しくなり、多数の被験者を集めることが困難である。これまでの検討で、本研究で使用している電子嗅覚装置(FFー2A、島津)は、歯周疾患患者のスクリーニングで有用であること、喫煙者の口臭には硫化水素,硫黄系,芳香族系の成分が強く関与していることを明らかにすることができている。そのため、口臭症の国際分類に基づき、病的口臭症と判定された高齢者について、歯周病の有無、喫煙の有無などによってグルーピングし、口腔内のにおい発生源と考えられる唾液、舌苔、使用中の義歯、それぞれの揮発ガスをサンプリングバッグに集め、におい識別装置を用いて臭気を測定し、臭気指数を算出し、検討を行う。また、口臭に関する高齢者の意識を確認するため、1いつから感じているか2いつ強く感じるか3どのような時に意識するか4どんなことが困るか5どんな対処をしているか6これまでどんな診察を受けたか7相談できる人が身近にいるか、などについて質問票を作成し、他の年齢群と比較することも並行してすすめていく予定である。口臭の主原因は、VSC(硫化水素、メチルメルカプタン、ジメチルサルファイド)と考えられているが、今回の実験で使用した電子嗅覚装置FFー2Aは、硫化水素とメチルメルカプタンを基準ガスとして有しているものの、ジメチルサルファイドは基準ガスとして組み込まれていない。よって、ジメチルサルファイドを組み込んで口臭検査の検討ができるよう、予備実験を重ねた後に、歯周病を有する患者の口臭について、年齢別特徴などを検討する本実験に入る予定である。
染色体特異的DNAプローブを用いた大腸の腺腫細胞・腺腫内癌細胞の染色体分析

初期癌といえる腺腫内癌(cancer in adenoma)細胞の染色体分析は、従来の方法では、不可能である。腺腫内癌は、生検やポリベクトミ-で診断されるため、培養は不可能だからである。また、腺腫内癌の診断、特にその断端については、患者の治療方針を左右するため、一部と言えども研究用に用いるのは倫理的にも問題がある。従って、腺腫内癌細胞の染色体異常の有無について検討するためには、診断に用いた病理組織標本で出来なければならない。この点、我々が開発してきた方法はこれを満たすものである。今回、申請した研究の目的は、従来不可能であった大腸の腺腫内癌細胞の染色体数的異常について検討することである。材料は、ポリペクトミ-により得られた腺腫内癌5例で、方法はすでに我々が報告してきた方法に従った。用いたプローブはビオチン化された7番・11番・17番染色体特異的プローブを用いた。その結果、正常上皮および浸潤炎症細胞核では核一個あたりシグナルは最大2個までであり、各プローブに特異的なシグナルであると思われた。核一個あたり3個以上のシグナルを有する数的異常細胞の割合は、17番染色体では、腺腫細胞は6.38%、腺腫内癌細胞は7.71%と差はあまり認めないが、場所によっては11.86%と高値を示した。7番染色体では、腺腫細胞は12.50%、腺腫内癌細胞は16.83%であった。11番染色体は他のプローブよりもシグナルが出にくく検討できた症例が2例と少なかったが、腺腫細胞は9.50%、腺腫内癌細胞は5.35%であった。17番染色体に関して、腺腫細胞と腺腫内癌細胞とでは数的異常細胞の割合に有意差は認めないが、マッピングにより、腺腫内癌では部分的に数的異常細胞の多い領域があり、プログレッションを反映しているものと思われた。7番染色体では、腺腫細胞でも数的異常細胞の割合が多く、すでにトリソミ-を呈していると思われた。11番染色体では今回症例が少なく結果の解釈には注意が必要と思われた。腺腫内癌の腺腫細胞でもすでに腺腫内癌細胞と同等の染色体数的異常を呈していると思われた。以上の結果は、第85回日本病理学会総会(東京)にて発表予定である。