hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
マルチオミクス解析によるクマムシ乾眠機構の全体像の解明

クマムシが乾燥シグナルを感知するカスケードを明らかにするために、昨年度までにリン酸化プロテオミクスによってあきらかとなったAMPK経路をさらにAMPK阻害剤・促進剤を用いて検証したところ、AMPK阻害によって乾眠成功率が有意に現象することが明らかとなり、本経路が乾燥センシングに必須であることを見出した。さらに、脱リン酸化反応阻害後のリン酸化プロテオミクスにより、AMPKの上流及び下流の因子の候補を複数見出すことができた。これにより、Hypsibius exemplarisにおける乾眠プレコンディショニングに必須なセンシング経路の概要像を得られたと考えている。交叉耐性については、紫外線や放射線照射後のDNA損傷・酸化ストレスダメージについて、ストレス処理後一定時間経過後にクマムシを乾眠させ、その復帰率や復帰時間からダメージ度合いを定量化する手法を新規に確立させた。これにより、紫外線照射後6-9時間経過後まではダメージの蓄積が有意に残ることが確認され、樽形成による防御だけでなく、乾眠・ストレス後の修復過程もクマムシの極限環境耐性に重要であることが示された。実際に、乾眠導入時と異なり乾眠復帰時には数百以上の遺伝子が大規模な発現変動をしており、その中にはDNA損傷修復や参加ストレス応答の経路が含まれている。この時に大きく発現変動する新規クマムシ遺伝子ファミリーも新規にトランスクリプトーム解析から見出しており、今後どのようにクマムシにおける修復が働いているかを掘り下げて調査していく。当初の目的通り、クマムシが乾燥シグナルを感知するシグナル伝達経路を明らかにするため、トランスクリプトーム解析・リン酸化プロテオーム解析・ATAC-Seq解析などを行い、初期のシグナル伝達・発現誘導応答について全体像を観察できた。ダメージの定量方法については限られた個体数のクマムシを殺さずに計測するため、方針を一部変更し、新規に連続乾眠や乾眠後の復帰時間を定量化することで計測する新たな実験系を構築したが、これにより乾燥を含むストレス後のダメージの存在を確認できた。クマムシ乾眠復帰時のダメージが具体的にどこに入っているのか、それをどう修復しているのか、を明らかにするため、これまでにトランスクリプトーム解析で見出した新規遺伝子ファミリーの機能解析や、生体組織の観察を並行して進める。クマムシが乾燥シグナルを感知するカスケードを明らかにするため、事前に24時間程度のプレコンディショニングを必要とするHypsibius dujardiniにおいて重点的に解析を行った。まず、乾眠前後のトランスクリプトームにより、乾眠関連遺伝子がこのプレコンディショニング時に強く誘導され、最終的に常時これら遺伝子を発現しているヨコヅナクマムシなどと同等なレベルの発現となることを確認した。これは、同じヤマクマムシ科に属する2種のクマムシが、ほとんど共通する遺伝子コンポーネントを利用しながらも、その発現誘導のみによって乾燥応答の時間を変化させていることを意味し、その誘導過程が重要であることを強く示唆する。次に、プレコンディショニング初期(3h)の挙動を観察するため、この時点でのトランスクリプトーム解析とATAC-Seqによるオープンクロマチン領域の探索を行った。発現変動としてはこの時点ではまだ限定的であったが、その後の発現に繋がると考えられるオープンクロマチン領域も予想に反して特に増えた様子はなく、遺伝子発現誘導がプレコンディショニングの後期で起きている可能性が示唆された。さらに、乾眠誘導後0分、15分、60分、180分のリン酸化プロテオミクス測定により、AMPKシグナル経路の活性化が見られた。これは既に明らかとなっているHypsibius dujardiniプレコンディショニング時に必須であるPP2A脱リン酸化作用に強く関連していることが他の生物で示されており、乾燥シグナリングに重要な経路であることが示唆される。よって、乾燥初期にHypsibius dujardiniはある程度時間をかけて乾燥シグナルを核に伝え、その後大規模な発現誘導に繋げていることが考えられる。一方で、発現誘導が想定していたタイミングよりもより後期で起きていることが確認され、この点については次年度以降観測する時間スケールを広げて再解析する必要がある。一方、本年度想定外にチョウメイムシ科のクマムシの新種を発見し、これの飼育系の確立に成功したことから、これまでヤマクマムシ科に限定されていたクマムシの解析を打破できる。やや遠い系統の乾眠能力を持つクマムシが実験対象となることにより、その共通機構を調べることがより容易となった。次年度以降の解析ではこの新種のチョウメイムシの解析を加えることで、クマムシ乾眠のコアコンポーネントの同定を進めていく。

これにより、紫外線照射後6-9時間経過後まではダメージの蓄積が有意に残ることが確認され、樽形成による防御だけでなく、乾眠・ストレス後の修復過程もクマムシの極限環境耐性に重要であることが示された。実際に、乾眠導入時と異なり乾眠復帰時には数百以上の遺伝子が大規模な発現変動をしており、その中にはDNA損傷修復や参加ストレス応答の経路が含まれている。この時に大きく発現変動する新規クマムシ遺伝子ファミリーも新規にトランスクリプトーム解析から見出しており、今後どのようにクマムシにおける修復が働いているかを掘り下げて調査していく。当初の目的通り、クマムシが乾燥シグナルを感知するシグナル伝達経路を明らかにするため、トランスクリプトーム解析・リン酸化プロテオーム解析・ATAC-Seq解析などを行い、初期のシグナル伝達・発現誘導応答について全体像を観察できた。ダメージの定量方法については限られた個体数のクマムシを殺さずに計測するため、方針を一部変更し、新規に連続乾眠や乾眠後の復帰時間を定量化することで計測する新たな実験系を構築したが、これにより乾燥を含むストレス後のダメージの存在を確認できた。上に述べたように、時間スケールを変えたマルチオミクス解析の継続に加え、申請者らがこれまでに見つけてきた乾眠関連遺伝子の詳細な細胞防御機構を明らかにする。これまでの発現実験から、CAHS・SAHS・MAHSなどの新規クマムシ特有のタンパクは、細胞内外のさまざまなコンパートメントへの移行シグナルを持ち、特異的な局在パターンを示すことが明らかとなっている。超高発現でありかつ遍在するこれら遺伝子は、膜及びタンパクの防御に何らかの形で関わっている可能性が高い。この詳細なメカニズムを解明するため、3つのin vitroアッセイを行う。(1)Liposome bindingassay:各種脂質の組み合わせで、ミトコンドリア内膜・外膜・細胞膜などを模したリポソームを作製し、発現・精製したクマムシ特有タンパクを混ぜ、リポソームとの共沈をin vitroで調べることにより結合する膜の種類を明らかにする(2)Liposome protectionassay:同様にリポソームを作製する際に、蛍光物質(carboxyfluorescein)を内包させ、発現・精製したクマムシ特有タンパクと混ぜた後に乾燥させ吸水させることでリポソームの破裂度合いを蛍光測定により定量する(3)Nucleaseprotectionassay:各種制限酵素と発現・精製したクマムシ特有タンパクを混ぜた後に乾燥させ吸水させることで、制限酵素の失活度合いを定量し、制限酵素の保護度合いを明らかにする。クマムシ乾眠復帰時のダメージが具体的にどこに入っているのか、それをどう修復しているのか、を明らかにするため、これまでにトランスクリプトーム解析で見出した新規遺伝子ファミリーの機能解析や、生体組織の観察を並行して進める。
マウス蝸牛ラセン神経節の有毛細胞前駆細胞

意義:マウス蝸牛ラセン神経節の有毛細胞前駆細胞、あるいは内耳幹細胞の存在を明らかにし、今後の蝸牛有毛細胞再生研究の手がかりとする。研究内容:1. Nes-CreERT2およびWnt1-creと蛍光レポーター発現の2重遺伝子改変マウスを用いたマウス蝸牛ラセン神経節標識細胞の細胞系譜追跡と分離培養・分化誘導法の確立;標識細胞が有毛細胞前駆細胞、あるいは内耳幹細胞であるかどうかを明らかにする。2.マウス蝸牛ラセン神経節の有毛細胞前駆細胞において有毛細胞への分化を制御する因子の探索;前駆細胞を有毛細胞に誘導するための方法を探索する。研究成果:1.Wnt1-Creと蛍光レポーター発現の2重遺伝子改変マウスを用いたマウス蝸牛ラセン神経節標識細胞の細胞系譜追跡を行った。これまで内耳感覚上皮は耳プラコード由来の細胞により形成されると考えられていたが、本研究のなかでWht1-Creと蛍光レポーター発現の2重遺伝子改変マウスにおいて標識された神経堤細胞由来細胞がラセン神経節を経由して内耳感覚上皮に入り込むことが観察された。内耳感覚上皮において由来の異なる細胞が混在していること、および標識細胞が多様な運命を示しうることから内耳幹細胞である可能性があることが、本研究による新しい知見と考えられた。しかしながら、同様の結果を含む論文が海外の別グループによって昨年Development誌に掲載されたため、研究内容2.に注力することとなった。2.ヘッジホッグシグナル伝達が生体内の蝸牛感覚上皮予定領域において、Fgf20を介して有毛細胞および支持細胞への分化を抑制することが明らかになった。また、蝸牛感覚上皮においてヘッジホッグシグナルが抑制されているマウスは生後、中程度の先天性難聴に加え加齢とともに進行性難聴を呈することが明らかとなり、ヘッジホッグシグナルの欠落により有毛細胞の脆弱性が生じることが推測された。これらの研究結果につき論文投稿準備中である上記研究課題については、得られた結果の一部と同様の結果を含む論文が海外の別グループによって昨年Development誌に掲載され、論文作成にあたっては方針転換を余儀なくされているものの、この研究課題より派生した研究として、マウス蝸牛感覚上皮発生におけるヘッジホッグシグナル伝達の役割についての研究では成果が得られ、昨年9月の日本神経科学会および今年2月のThe Association for Research in Otolaryngology 35rd MidWinterMeetingで発表した。昨年度中に実験は終了し、現在論文作成中である。総じて、研究は期待通りの進展があったと考えられる。(該当しない)(平成21年度の研究結果)Nes-CreERT2を用いた標識細胞は、ラセン神経節においてはSox10(神経堤由来シュワン細胞マーカー)が陽性のものが多く、主に神経堤由来細胞であると考えられた。それを踏まえて、Wnt1-Cre; CAG-EGFPマウス(神経堤由来細胞を標識することが可能)のサンプルの譲渡を受け、予備実験を行なった。その結果、Wnt1-Creによる標識細胞は、ラセン神経節においてNes-CreERT2を用いた標識と同様の発現パターンであり、Nes-CreERT2よりも高率に認められた。また、前庭感覚上皮内にも少数ながらGFP陽性細胞が認められ、標識細胞は有毛細胞前駆細胞あるいは複数の細胞種に分化しうる内耳幹細胞を含んでおり、内耳幹細胞は神経堤由来である可能性が高いと考えられた。(平成21年度の研究課題の達成状況)Nes-CreERT2を用いたマウス蝸牛ラセン神経節標識細胞の細胞系譜追跡と分離培養・分化誘導法の確立を行なう予定であったが、標識が非特異的組み換えによるものである可能性を除外するため、細胞系譜追跡はNes-CreERT2とWnt1-Creの両方でおこない、結果が一致するかどうか確認することにした。また、分離培養はより効率の高い標識が可能なWnt1-Creで行なうべきと考えられた。現在Wnt1-Creマウスの譲渡を受けて、当方のマウス飼育施設に導入しているところである。(副次的研究の進展)副次的に行なっていたマウス蝸牛感覚上皮に関する二つの研究(マウス蝸牛感覚上皮におけるHes遺伝子群の役割、および、マウス蝸牛感覚上皮におけるヘッジホッグシグナル伝達の役割)が進展し、いずれにおいても聴覚器の発生に関する重要な知見が得られている。研究内容:1.Nes-CreERT2およびWnt1-creと蛍光レポーター発現の2重遺伝子改変マウスを用いたマウス蝸牛ラセン神経節標識細胞の細胞系譜追跡と分離培養・分化誘導法の確立;標識細胞が有毛細胞前駆細胞、あるいは内耳幹細胞であるかどうかを明らかにする。研究成果:1.Nes-CreERT2を用いた細胞標識の場合、蝸牛感覚上皮内に有毛細胞マーカー陽性の標識細胞が低頻度ながらも観察され、標識細胞が有毛細胞前駆細胞である可能性が示唆された。

また、標識細胞が蝸牛感覚上皮に出現するのは胎生16.5日から胎生17.5日の間であることも明らかとなった。一方、Wnt1-creを用いた細胞標識の場合、有毛細胞内に標識細胞は観察されず、サンプリング数を増やして実験を継続する必要があると考えられた。2.ヘッジホッグシグナル伝達が生体内において、蝸牛感覚上皮前駆細胞の有毛細胞への分化を抑制することが明らかになった。また、前駆細胞の未分化状態を維持するのに必要な因子につき、ヘッジホッグシグナル伝達の鍵となる膜タンパクSmoothenedのコンディショナルノックアウト蝸牛およびSmoothened持続発現蝸牛の組織を用いたDNAマイクロアレイが施行され、候補が絞り込まれた。意義:マウス蝸牛ラセン神経節の有毛細胞前駆細胞、あるいは内耳幹細胞の存在を明らかにし、今後の蝸牛有毛細胞再生研究の手がかりとする。研究内容:1. Nes-CreERT2およびWnt1-creと蛍光レポーター発現の2重遺伝子改変マウスを用いたマウス蝸牛ラセン神経節標識細胞の細胞系譜追跡と分離培養・分化誘導法の確立;標識細胞が有毛細胞前駆細胞、あるいは内耳幹細胞であるかどうかを明らかにする。2.マウス蝸牛ラセン神経節の有毛細胞前駆細胞において有毛細胞への分化を制御する因子の探索;前駆細胞を有毛細胞に誘導するための方法を探索する。研究成果:1.Wnt1-Creと蛍光レポーター発現の2重遺伝子改変マウスを用いたマウス蝸牛ラセン神経節標識細胞の細胞系譜追跡を行った。これまで内耳感覚上皮は耳プラコード由来の細胞により形成されると考えられていたが、本研究のなかでWht1-Creと蛍光レポーター発現の2重遺伝子改変マウスにおいて標識された神経堤細胞由来細胞がラセン神経節を経由して内耳感覚上皮に入り込むことが観察された。内耳感覚上皮において由来の異なる細胞が混在していること、および標識細胞が多様な運命を示しうることから内耳幹細胞である可能性があることが、本研究による新しい知見と考えられた。しかしながら、同様の結果を含む論文が海外の別グループによって昨年Development誌に掲載されたため、研究内容2.に注力することとなった。2.ヘッジホッグシグナル伝達が生体内の蝸牛感覚上皮予定領域において、Fgf20を介して有毛細胞および支持細胞への分化を抑制することが明らかになった。また、蝸牛感覚上皮においてヘッジホッグシグナルが抑制されているマウスは生後、中程度の先天性難聴に加え加齢とともに進行性難聴を呈することが明らかとなり、ヘッジホッグシグナルの欠落により有毛細胞の脆弱性が生じることが推測された。これらの研究結果につき論文投稿準備中である上記研究課題については、得られた結果の一部と同様の結果を含む論文が海外の別グループによって昨年Development誌に掲載され、論文作成にあたっては方針転換を余儀なくされているものの、この研究課題より派生した研究として、マウス蝸牛感覚上皮発生におけるヘッジホッグシグナル伝達の役割についての研究では成果が得られ、昨年9月の日本神経科学会および今年2月のThe Association for Research in Otolaryngology 35rd MidWinterMeetingで発表した。昨年度中に実験は終了し、現在論文作成中である。総じて、研究は期待通りの進展があったと考えられる。
ポリカルコゲニドが架橋した多核白金錯体の合成

通常,金属硫化物イオンは,それ自身が縮合して二核あるいは三核錯体を形成する際に,溶媒中の微量の水や溶存酸素により酸化されて,末端のS原子がO原子に置き換わったりS-S結合を生成したりする以外はMS_4の構造を保ったまま錯体中に存在する傾向にある.我々は,金属間結合を持つランタン型錯体と金属硫化物イオンとの反応に興味を持ち研究を進めているが,ピリジンチオール類が架橋したランタン型二核白金錯体,[Pt^<III>_2Cl_2(R-pyt)](R=H,5-methyl)と金属硫化物イオン(WS_4^<2->)との反応をクロロホルム中で行なったところ,直鎖状のS_4^<2->イオンが2つのランタン型ユニットを架橋した4核錯体,[(Cl-Pt_2(R-pyt)_4)-S_4-(Pt_2(R-pyt)_4Cl)](2a)が生成することを見出した.【S_4架橋錯体の生成反応と構造の特徴】2はクロロホルム中で[Pt_2X_2(R-pyt)_4](X=Cl,Br)とWS_4^<2->とを反応させる以外にも,クロロホルム中で[Pt_2X_2(R-pyt)_4]とNa_2S_2とを反応させても生成する.しかし,アセトニトリル中では同様の反応は進行せず,[Pt_2X_2(R-pyt)_4]が還元されて[Pt_2(R-pyt)_4]が得られる.クロロホルム中での[Pt_2X_2(R-pyt)_4]とWS_4^<2->との反応(数分以内)はS_2^<2->との反応(数時間)に比べて速く,前者では中間にS_2^<2->を経ない反応経路が示唆される.S_2^<2->との反応では,一旦青色の沈殿を生じ,その懸濁液を撹拌していると徐々に赤色の溶液に変化して行くことより,S_2^<2->により部分的に還元されたPt_2(R-pyt)_4骨格が溶媒のクロロホルムにより再酸化され,最終生成物として2を与えているものと考えられる.また、2のクロロホルム溶液は光に対して極めて不安定で、蛍光灯程度の光でも速やかに[Pt_2Cl_2(R-pyt)_4]を与える.2aに過剰の臭化物イオンを作用させると,末端軸配位子の塩化物イオンのみが臭化物イオンに置換され,架橋S_4配位子は置換されない.このことは,塩化物イオンに比べてS_4の方が{Pt_2(R-pyt)_4}ユニットに強く配位していることを示している.通常,金属硫化物イオンは,それ自身が縮合して二核あるいは三核錯体を形成する際に,溶媒中の微量の水や溶存酸素により酸化されて,末端のS原子がO原子に置き換わったりS-S結合を生成したりする以外はMS_4の構造を保ったまま錯体中に存在する傾向にある.我々は,金属間結合を持つランタン型錯体と金属硫化物イオンとの反応に興味を持ち研究を進めているが,ピリジンチオール類が架橋したランタン型二核白金錯体,[Pt^<III>_2Cl_2(R-pyt)](R=H,5-methyl)と金属硫化物イオン(WS_4^<2->)との反応をクロロホルム中で行なったところ,直鎖状のS_4^<2->イオンが2つのランタン型ユニットを架橋した4核錯体,[(Cl-Pt_2(R-pyt)_4)-S_4-(Pt_2(R-pyt)_4Cl)](2a)が生成することを見出した.【S_4架橋錯体の生成反応と構造の特徴】2はクロロホルム中で[Pt_2X_2(R-pyt)_4](X=Cl,Br)とWS_4^<2->とを反応させる以外にも,クロロホルム中で[Pt_2X_2(R-pyt)_4]とNa_2S_2とを反応させても生成する.しかし,アセトニトリル中では同様の反応は進行せず,[Pt_2X_2(R-pyt)_4]が還元されて[Pt_2(R-pyt)_4]が得られる.クロロホルム中での[Pt_2X_2(R-pyt)_4]とWS_4^<2->との反応(数分以内)はS_2^<2->との反応(数時間)に比べて速く,前者では中間にS_2^<2->を経ない反応経路が示唆される.S_2^<2->との反応では,一旦青色の沈殿を生じ,その懸濁液を撹拌していると徐々に赤色の溶液に変化して行くことより,S_2^<2->により部分的に還元されたPt_2(R-pyt)_4骨格が溶媒のクロロホルムにより再酸化され,最終生成物として2を与えているものと考えられる.また、2のクロロホルム溶液は光に対して極めて不安定で、蛍光灯程度の光でも速やかに[Pt_2Cl_2(R-pyt)_4]を与える.2aに過剰の臭化物イオンを作用させると,末端軸配位子の塩化物イオンのみが臭化物イオンに置換され,架橋S_4配位子は置換されない.このことは,塩化物イオンに比べてS_4の方が{Pt_2(R-pyt)_4}ユニットに強く配位していることを示している.
心筋細胞内SERCA2aレベル改善を目的としたunloading時の細胞移植治療

LVAD長期装着例で左心室負荷軽減により心機能が改善しLVADから離脱できる症例を経験することがあることから、重症心不全に対する細胞移植治療の可能性を検討する基礎実験を計画した。Unload心として特徴的なOno-Lindseyモデルをラットを使っておこなった。また重症心不全の治療に対する体外循環・補助循環についても調査・研究し、成果を拡大することが可能になった。心臓の収縮弛緩は心筋細胞内のCa^<2+>により制御される。Ca^<2+>汲み出し機構には、心筋小胞体Ca^<2+>-ATPase (SERCA2a),Na^+/Ca^<2+> exchanger,形質膜Ca^<2+>-ATPase,ミトコンドリアのCa^<2+>uniportなどがあり、この4つの内、SERCA2aを介した心筋小胞体への取り込みが機能的に最も大きな役割を果たしている。しかも、SERCA2aによるCa^<2+>汲み上げは病態で変化し、心機能を規定する要因になっている。重症心不全の治療に、本邦では左心補助人工心臓(LVAD)を含むmechanical assist deviceを発展させ、長期間のLVAD使用を可能にした。LVAD長期装着例で左心室負荷軽減により心機能が改善しLVADから離脱できる症例を経験した。この事実は、LVAD駆動中に適切な治療を行うことにより心不全患者の心機能を正常近くまで回復させうる可能性を示唆していると考えた。1960年代から心臓移植に用いられた異所移植モデルを見直し、近年開発された2種類のトランスジェニックラットを応用することとした。ヌードラットをrecipientに用いてOno-Lindseyモデルを作成した。コンダクタンスカテーテルを用いての心機能計測の手順をunloading時の心不全心においてPV-Loopを描くことにより確認した。これを用いて、急性及び慢性心筋梗塞時のPV-Loopを描いた。さらにGFP-ratの新生児の心筋細胞分離を行うため妊娠したGFP-ratを購入し、新生児心筋を単一細胞レベルに分離でき、蛍光顕微鏡にてGFPを同定し、発光程度を確認できた。心筋細胞内のCa^<2+>により心臓の収縮弛緩は制御される。Ca^<2+>汲み出し機構には、心筋小胞体Ca^<2+>-ATPase(SERCA2a),Na^+/Ca^<2+>exchanger,形質膜Ca^<2+>-ATPase,ミトコンドリアのCa^<2+>uniportなどがあり、この4つの内、SERCA2aを介した心筋小胞体への取り込みが機能的に最も大きな役割を果たしている。心臓移植数が限られている本邦では、重症心不全の治療に左心補助人工心臓(LVAD)を含むmechanical assist deviceが発展した。LVAD長期装着例で左心室負荷軽減により心機能が改善しLVADから離脱できる症例が経験されている。この事実は、LVAD駆動中に適切な治療を行うことにより心不全患者の心機能を正常近くまで回復させうる可能性を示唆している。ヌードラットをrecipientに用いてOno-Lindseyモデルを作成し、コンダクタンスカテーテルを用いての心機能計測の手順をunloading時の心不全心においてPV-Loopを描くことにより確認している。今年度は心不全に対するunloading、医療における重症心不全の治療などの検討もおこなった。最近、分子生物学的に解明されてきた心不全の機序、中でもSERCA2aとの関わりに注目し、内科学的治療に抵抗性の心不全に対し、移植に変わる治療法としての細胞を用いた治療法がいわれている。本研究では心不全の中でもLVAD使用によるunloading時と言った条件を設定し、未熟な細胞neonatecardiomyocytesおよびbone marrow stromal cellsを使い、細胞治療の利点および特徴をいかした基礎的研究、および臨床研究として、心不全、補助循環使用時の条件の検討などを行うことを計画した。臨床研究の研究実績としては、人工心肺、補助循環、人工心臓関係の患者に関しては、本研究を遂行中に事故が多発しており医療安全調査委員会の設立を含め、構造改革が求められていることが明らかになった。体外循環の医療安全にはチーム医療が重要であり、外科治療におけるチーム医療推進・裁量権拡大に関するアンケートを体外循環技士に行い、臨床現場での状況を調査した。胸部外科での修練医の処遇改善には就労環境の改善と教育システムの整備が必須であることが医療分業化に関する調査から示唆された。米国のNP・PAシステムの日本への導入の可能性が提案されている,PCI施設や心臓外科施設の集約化、専門医削減を目的とすると、チーム医療推進が不可欠であり、外科診療における診療報酬の現状からは課題が多数残されている。また診療報酬を決める根拠、診療報酬とコスト、人件費以外のコストとの関係、間接経費などについて適正化が求められていることが明らかになった。

内科的治療に抵抗する心不全患者、人工心肺を用いて開心術を行った患者の術後の心臓リハビリテーション効果の報告があり、今後日本においてもQOLの改善という面から提案したい。
個体存在とモイラ運命の形而上学-アリストテレス研究-

人間は、自らが何ものであって、宇宙進化の先端に立つことの意味は何であるか、に関心をもつところの生き物である。こうして人間は、一方では原初受動性に制限され(誰も生まれようと思って生まれたわけではない)、世界の偶然性に翻弄される。他方では個人として自らの活動でその存在を維持拡張しようとする。その個人と個人を超える宇宙脈絡の力のせめぎ合いがモイラ運命であることを明らかにし、「汝自らを知れ」という抽象の極みとも見える掟が具現遂行される現場がモイラ運命であったことを示した。そしてこれに基づいて具体例としてオイディプスの悲劇を解明した。生物進化はその進比自体の関心を持つ生き物を生み出したが、そのように人間は自らの存在に関心を持つ動物である。その存在様式を人間が言葉を持つことから考察した。言葉を使うことではじめて可能になる多様な生き方をする人間は、その生き方をまた言葉で浮き彫りにしようとする存在なのである。しかし言葉を同時に人間の限界を与えることになる。人間は言葉の外には出られないのである。世界も人生も意味がないことさえ、言葉でしか押さえることができない。われわれ人間が言葉で、「がない、とする」以外ではないのである。こうした言葉の根本の働きから言葉が人間化機構を担っていることを分析した。言葉について最も強い関心を持った哲学者、ヘラクレイトスの「同じ川に二度入れない」という、所謂万物流転説が、同じ川、違う川、といった同異の意味分析から川(そしてもの一般)の存在、非存在の意味機構を分析するものであることを見出した。つまり存在、「ある」とは、われわれ人間が「ある、とする」人間化機構を負ったものであった。そこからさまざまな反対対立についても同様であり、例えばわれわれの現実に飢餓があり、満腹があり、戦争があり、平和があるのも、われわれ人間がこれを「ある、とする」ことに根があった。そして飢餓と満腹、戦争と平和はそれぞれ反対対立して決して両立しないが、われわれの現実に出現するその反対のどちらか一方というモイラ運命の中で、その反対対立を貫く全体を問わせているものが古来から神と呼ばれる全体そのものだったのである。こうした考察をギリシア哲学セミナーで発表した。アリストテレスは人間を政治動物とした。人間は言葉をもつことで、各自それぞれがあらゆる方向に自分用の関心と可能性を開き、同時に他人に見せかけ欺すことも可能な生き物である。つまり人間は、言葉をもつことで個体化するのである。そして偶然の混乱と衝突の可能性に直面しながら、共生の意義をその都度言葉で発掘する課題を負ったのが政治動物である。自分のこころの願いを目的とし、これを自分の能力で達成しようとする昨今の自己実現は、その成功と失敗が声高に言われるが、自分のこころの思い描く可能性の延長ですべてを測る視野狭窄の弊がある。人間は、その存在の理由を自己の掌中に掴む自己原因では決してなく、原初受動性に縛られている。人を時に襲う偶然が、自分が世界の中心でも人生の主人でもない現実を突きつけるのである。世界はむしろ、ヘラクレイトスの言ったように「がらくたの山」である。そして世界のいかなるものも自分のこころの願いの実現焦点(神)としないことにおいて初めて、偶然にぶちまけられたがらくたの山である世界を無条件に受け入れる運命脈絡が開けることになる。それは言葉をもって個体化を遂行する人間の今一つの現実である。原初受動性は、人が自分の出生の秘密を知らないことにある。人はなぜ自分が生まれてきて、何のために生きているかを掴んでないからである(ソクラテスはそれを「最大のことの無知」と表現した)。そのもっとも鮮烈な悲劇はオイディプスの運命の逆転にあった。オイディプスが人生を無条件に受け止めようとしたのは、自死した愛するイオカステに悲惨な人間の共苦同悲を見たからであった。
肢体不自由特別支援学校の寄宿舎の実態と生活支援・発達支援の実証的研究

子どもの発達にとって「生活問題」は大きな課題であり、学校教育においても重要な観点である。とりわけ障害児の場合は、その発達を保障するにふさわしい生活を享受することが困難である。そのような障害児や家族に対して、特別支援学校に設置されている寄宿舎は、生活を通してその発達を支え、家族支援を行ってきたが、特別支援教育制度への移行のなかで統廃合の対象となっている。あらためて障害児とその家族が有する困難・ニーズの実態を把握し、そうした困難・ニーズに対応できる寄宿舎教育のあり方を明らかにすることは重要である。それゆえに本研究では、全国の肢体不自由特別支援学校寄宿舎に在籍する児童・生徒とその家族への生活実態調査を通して、寄宿舎における障害児への生活発達支援の役割と課題を考察した。全国の特別支援学校(肢体不自由)63校の寄宿舎に在籍する保護者を対象に、郵送による質問紙法調査を実施した。保護者398人からの回答があり回収率32.8%であった。障害児の生活は、8割近くが母親・家族と過ごし、ほとんど家の中でテレビやビデオを観て過ごしている。半数近くの保護者は「体力の低下・身体の変形の心配」「興味・関心が広がらない」「社会的経験が乏しい」と感じており。このような生活は発達に大きな影響を及ぼしていることが伺える。家族の生活では。ひとり親家庭・両親不在が21.1%を占め、保護者の就労状況、経済状況も深刻な状況が浮き彫りとなった。保護者の健康では、9割の保護者が恒常的に身体的・精神的疲労を感じており、3割の保護者が「自分が病気にかかっても通院治療もできない」と回答した。また3割の保護者が「将来のことが心配で絶望的になり、死を考えたことがある」と回答し、深刻な精神状態にあることも分かった。親子関係では、3人に1人が子離れ、親離れができていないと回答し、親子の精神的自立が大きな課題となっている。寄宿舎の入舎希望理由で最も高かったのが「自立のため」44.3%、ついで「家庭事情」であった。入舎後の子どもの変化では、多くの保護者は子どもの生活上の困難、親子関係に改善が見られたと回答した。寄宿舎は単なる「通学困難のため」という狭い役割ではなく、教育的な役割が求められている。また家庭事情による入舎が多いことも今日の社会情勢を反映している。調査結果の検討から、今日の特別支援学校(肢体不自由)寄宿舎は、障害児の生活支援・発達支援のみならず、障害児家族の支援においても重要な役割を担っていることが明らかとなった。家族の生活では。
細胞核ダイナミクスにおける遺伝子の機能的収納機構の解明

T20(負の超らせんを擬態した180bpの人工ベントDNA)はクロマチン内での転写を活性化できる。平成18年度は、ゲノムにT20を保有するマウスのES細胞株を用いて、T20が細胞の分化に及ぼす影響について調べた。この細胞株は分化誘導の第1段階(中・内胚葉系細胞への分化誘導)では特に異常を示さなかったが、分化誘導の第2段階(肝細胞への分化誘導)に移行させる際に、条件によっては細胞増殖が停止してしまうことが明らかになった。なお、T20をもたない対照株では、問題なく肝細胞に分化した。この結果は、T20が細胞の分化機構にも関与しうることを示唆しており、興味深い発見と思われる。また、T20をもつ細胞株は、対照株にくらべて増殖速度が約1.5倍速いことが明らかになり、T20はDNA複製にも影響を及ぼす構造であることが示唆された。この他、平成18年度は、DNAの柔軟・剛直特性をゲノムワイドに解析できるコンピュータプログラムの開発を試みた。その結果、300MbのDNAの機械的特性をわずか1時間程度で解析できるプログラムを作成することに成功した。このプログラムを用いた解析は緒についたばかりであるが、興味深い知見が得られ始めている。たとえば、酵母第3染色体を用いた解析では、遺伝子間領域(プロモーターを含む)は、ORF (open reading frame)よりも硬いDNAでできていることが判明した。さらに当該年度は、二本鎖DNAに自己集合の能力があることと、DNAの自己集合は、生理的濃度のマグネシウムイオンの存在下で顕著に起こり、電気泳動でも分離しないほど安定であることを論文で発表した。本研究では、負の超らせんを擬態したベントDNA構造(以下、超らせん擬態構造と略記する)のクロマチン制御能が細胞の分化や、動物個体の発生段階または組織の違いに依存して変化するか、あるいはこれらの影響を受けない普遍的な機能なのかを明らかにすることを目的として、二カ年で以下の解析を実施する計画を立てた。(i)マウスES細胞を用いて、未分化細胞・胚様体細胞・終末分化細胞(例えば、骨格筋細胞や神経細胞)の細胞核における超らせん擬態構造のクロマチン制御能を解析する。(ii)ES細胞からトランスジェニックマウスを作製して、超らせん擬態構造の機能が発生時期や組織に依存するかどうかを解析する。初年度である本年度の研究は順調に進んだ。具体的には、まず、ニワトリのβ-アクチン遺伝子のプロモーターの上流に180塩基対からなる超らせん擬態構造(T20)を配置し、下流にGFP遺伝子を配置したレポーターを作製した。遺伝子導入細胞株の樹立に先だって一過的遺伝子発現解析系でT20の機能評価を行ったところ、興味深いことにマウスES細胞内では、T20はCMVエンハンサーよりもプロモーターを活性化する力が強いことが判明した。次にこのレポーターを持ったマウスES細胞のステーブルトランスフォーマントを数株樹立した。また、この内の一株を用いて、レポーター部位からT20を取り除いた細胞の作製にも成功した。これらの細胞を用いた解析で、T20はマウスES細胞のゲノム上でもプロモーターを活性化して遺伝子を安定に発現させる力を持っていることが判明した。
球脊髄性筋萎縮症におけるイオンチャネルを標的とした病態解明と革新的治療法の開発

球脊髄性筋萎縮症(spinal and bulbar muscular atrophy, SBMA)患者で高頻度にみられる寒冷暴露による運動麻痺の悪化が、本疾患の病態の鍵を握ると考え、骨格筋細胞膜に豊富に存在するイオンチャンネルに着目した病態解明と治療開発を並行して進めるものである。細胞・マウス・患者検体を用いた病態研究を行うとともに、イオンチャンネルの機能異常を是正するメキシレチン塩酸塩の有効性及び安全性を多施設共同ランダム化二重盲検クロスオーバー比較試験により評価する。
機能閉鎖空間における人間の適応性と環境因子に関する研究

分担課題別の研究成果は次の通りである。(1)機能閉鎖空間における人間の適応性と環境因子に関する検討(横山、落藤)では、在室者密度の下限値と環境因子の関係を生体機能計測および主観評価から一人あたり1.92.2m^2であることを示した。空気質、香り、音、照度、疑似窓、間仕切の有無の環境因子の緩和効果がある程度見られることが判明した。(2)疲労・ストレス指標への影響の実験(溝口)の結果、尿中検査も含めて有意の差は見られなかった。(3)一人用閉鎖作業空間の実験(永田)では、天井高さ2.1m、平面2.1×2.1mの立方体が大きさの限界であることを明らかにした。また鏡の存在は、広さ感を増大させることがわかった。(4)閉鎖環境の心理的効果の実験(宮田)では、心理的大きさとしての面積感・容積感と空間の物理的大きさとの関係を求め、視覚的刺激量(視野の明暗の複雑度)の効果とエッジの個数とに相関があることを明らかにした。ブラインド、間仕切、植物、壁面、家具が視覚的刺激の形成に一定の効果を持つことがわかった。(5)地下商店街における緑の効果の調査(佐々木)からも緑の必要性が指摘された。(6)気流による自然(の具体化)環境と適応性の研究(窪田)では、雰囲気温感と額面の放熱量の関係、気流の快適性と強弱感の関係を定式化し、パルス的短発気流が風の息としての疑似自然風になることを明らかにした。(7)閉鎖空間の温熱環境の評価方法と快適条件(堀越)では、比較的狭い空間内での対流熱伝導率、ふく射環境、床暖房の実験と理論解析を行い、新しい指標と算定式を示した。(8)暑さの定常限界近傍における生体の温熱特性(持田)では、着衣状態、運動条件を組合せた数多くの実験結果から、ぬれ面積率の特性を明らかにし、新しい評価指標に基づく温感線図を完成させ、閉鎖環境下での温熱設計の基礎を与えた。(9)地下空間の熱移動の解析(長野、落藤)では、土壌温度と熱水分移動の特性を明らかにした。完全に密閉された閉鎖空間における人間の生理的,心理的反応と環境因子との関係を明らかにするために必要な基本的研究と実験および調査を行った。その内容と成果は次のとおりである。(1)空気質環境と適応性;実験室を改修してクリ-ンル-ムを製作し、在室者密度に関する実験を行った。混雑強度,認容性不快度などの5項目からなる主観評価と顔面皮膚温度,心拍数などの生理的評価を行った結果、在室者密度の生体機能の評価指標としては、顔面皮膚温度の初期値低下度や心拍間隔の分散値が有効であること,生理的評価と主観評価の両面から、相互既知の青年男子の椅座位での精神作業空間としては在室者密度が一人当たり1.9m^2程度を下限と考えられることが分かった。炭酸ガスなどの空気質の濃度と認容性との間には相関が見られなかった。(落藤,横山,溝口)(2)温熱環境と適応性;快適性に関する実験は、裸体と着衣の両条件下で、温度,湿度,気流の3要素を組合わせて行い、新しい快適線図を作成した。

また、生理反応と心理反応が異なることを示した。(堀越)暑熱環境に関する実験では、等皮膚温度が湿り空気線図上で上に凸の曲線となり、従来のET^*とは異なり、より実際の人体反応に近い評価尺度が得られた。(持田)(3)自然(の具象化)環境と適応性;気流刺激に関する基礎実験を行い、気流の強弱感,明瞭感,温冷感の相関を明らかにした。特に快適感を流速と額からの放熱量との関数で表された。(窪田)また、緑や植栽の効果について広範な調査を行い、隔絶感や開放感,安らぎに対し効果的であることを示した。(佐々木)(4)視環境と適応性;視覚心理的にみた必要最小限の容積とその閉鎖感緩和要因の定量的解明について第一段階の実験を行った。(永田)また、閉鎖空間の心理的大きさ,視覚空間の視覚的刺激量の概念モデルを新しく構築した。(宮田)(5)熱物質収支と制御;大深度地下空間の環境を予測するための地盤の熱収支プログラムを開発した。(長野)1.空気質環境等と適応性:本年度は環境試験室を仕切って小空間を作り、椅坐位作業空間の下限値と在室者密度、空気質および擬似窓との関係について生理的、心理的な実験を行なった。その結果、青年男子の一人あたりの所要面積は、広い空間よりも小空間の方が大きく、おおよそ2.2m^2であることを明らかにした。一般にその下限値は1500ppm以下の範囲においてCO^2濃度に左右されないが、擬似窓や香りによる緩和効果が見られた。適応性の指標には、疲労・神経反応および尿反応よりは顔面皮膚温の変化および心摶間隔分散値が良いことを明らかにした。2.温熱環境と適応性;密室空関内の暑熱環境下での代謝量増加に伴う皮膚表面の温度、舌下温度、心摶数、体重減少量および温熱感を実験的に求めた。その結果、無効発汗量は50%前後に達すること、その値は気温と負、相対湿度と正の相関があることおよびぬれ面積率は環境条件によって変化することを示し、新しい温感指標を確立した。さらに快適域の実験に関しては、電気床暖房について行ない、伝導修正温度なる概念を提案した。3.自然の気流環境と適応性;気流の快適感の実験については、快適感は「強さ感」と「冷たさ感」の関数であり、流速と額からの放熱量の関数として数式化することが出来た。またパルス状の「ひと息」の快適感の実験から、最も好ましい継続時間は額の放熱量が一定になるように決まり、流速の-0.7乗に比例することを明らかにした。また、気流刺激の意味を分類整理した。4.視環境と適応性;可動模型室を用いて面積感と不快性の実験を行ない、一辺が2.2の正方形が基準になること、また、正方形よりも長方形の床が広く感じることを明らかにした。さらに、明度および開口率が大きな要因であることを定量的に示した。継続研究の内容と成果は下記のとおりである。(1)光・音環境因子と生理・心理反応(横山・落藤)閉鎖空間における在室密度の限界値に関する36例の実験を行った。主観評価に加えて仕事能率、顔面皮膚温度、心拍数、脳電位の計測を行い、生理、心理負担の軽減は、在室者密度が高いほど大きくなる傾向にあることがわかった。(2)疲労・ストレス指標の計測(溝口)在室者密度と疲労症状、フリッカー値および尿内総ケトステロイドの関係について実験を行い、明確な傾向が出現しないという結果を得た。(3)一人用閉鎖作業空間の受容可能大きさ(永田)無窓の可動空間における実験の結果、天井高2.1m、平面2.1×2.1mが最小限の大きさであることを明らかにした。また、鏡による緩和効果の実験を行い、広さ感は常に増大することを見出した。(4)閉鎖視環境の心理的効果(宮田)閉鎖空間の視
先端液体クロマトグラフィ-固相抽出法-NMR技術を用いた薬理活性化合物の探索

高速液体クロマトグラフィー/固相抽出法/核磁気共鳴分析(HPLC/SPE/NMR)装置は微量の天然有機化合物を自動的に迅速に構造解析できる。また高速液体クロマトグラフィー/フリエー変換エレクトロスプレー質量分析(HPLC/FT/ICR/MS)装置も微量水溶性化合物やアルカロイドなどの塩基性化合物の迅速分析には欠かせない。Dr. C. Paetzは上記2種の先端分析装置をフル回転して日本産薬用非食菌類、コケ類、シダ類、タデ科、カバノキ科、冬虫夏草培養液、タヒチ産キョウチクトウ科植物などの薬理活性化合物の迅速分析に従事した。1)タヒチ産キョウチクトウ科Rauvolfia sachetiaeから4種の新規アルカロイドisonorsandwicine-N_b-oxide, norsandwicine-N_b-oxide, isonorsandwicine, norsanwicineおよび既知sandowicine-N_6-oxide, isosandwicineおよびsandwicineを単離構造決定した(Phytochemical Analysisに投稿中)2)Erythrina crista-galliの花からcrystamidine, 8-oxoerythraline, erythrinan-ll-ol, erythralineが得られた。3)ペニシリウム属の一種(TBUYN3)から大多量に得られる赤色代謝物はアザフィロン誘導体であることを明らかにし構造決定するともに、本色素は防犯スプレー色素に応用できる可能性を示した。4)ゼニゴケ葉状体に含まれる筋肉弛緩ビスビベンジル類は光、クロロフォルム、メタノールなどの溶媒中でメチル化されたり多量体に変化していることを突き止めた。メトキシマルチャンチンEはマルチャンチンAから容易に変化することが明らかになった。5)昨年に引き続き、冬虫夏草培養液の酸素活性化の研究を行い。大量のアデノシン、デオキシアデノシン、5,6-ジヒドロ-4-メチル-2-ピラン-2-オンなどをえ、培養液抽出物の酸素活性化はアデノシンであると結論付けた。6)アルゼンチン産ブナ科植物Nothofagusの強い芳香について再調査し、本芳香は香料原料として重要なセスキテルペン,アガロフランであることを証明し、本植物が香料原料木として使用できることを証明した。7)タデ科ヤナギタデにはビタミンEが存在し、本植物の辛味成分であるポリゴジアールの抗酸化作用に関係していると推定した。8)カバノキ科オオバヤシャブシの強烈なシンナモン臭は桂皮酸-β-フェニルエチルであることを証明した。高速液体クロマトグラフと固相抽出カートリッジを直結したNMR(HPLC/SPE/NMR)を用いて本研究を実施した。また700MHzNMRを用いた化学構造分析も同時に行った。冬虫夏草(Cordycepssinensis)に含まれる含窒素化合物、cordycepinは疲労回復、免疫増強物質として知られシグマ社より576.36$/mgで市販され、極めて高価な薬物である。虫体からでなく、その培養液からcordycepinやより高活性名薬物を得る目的で培養液20リトルを酢酸エチル、ブタノール、水抽出物に分離した。3抽出物にはアデノシンが含まれ、これがミトコンドリアを活性化させ疲労回復などに役立っていると推定された。また酢酸エチル部の主成分としてキノコ臭を呈する5,6-dihydor-4-methyl-2H-pyran-2-oneが単離されたがcordycepin類は全く得られなかった。抗酸化活性を示す高等植物Erythrina crista-galliおよびタヒチ産Rauwolfia属植物および子宮収縮活性を有するボイセンベリーの活性物質探索を行い、E.crista-galliからcrystamidine,8-oxoerythraline, erythrinan-11-ol, Rauwolfiaからajimalin類が得られた。ボイセンベリーはフラボン配糖体が多種含有する。苔類の大環状ビスビベンジルは核内受容体拮抗薬として有望され、各国でそれらの合成が活発に行われている。ビスビベンジルのひとつmarchantin Aは筋肉弛緩、抗がん活性などさまざまな活性を示す。本物質を化学変換してより活性の強いmarchantin類や、核内受容体拮抗薬創生を目的に本物質を三酢酸マンガンで反応させ、marchantin Aの二量体、三量体などの生成について検討した。HPLC/SPE/NMR分析から生成物は極めて複雑な混合物からなり、現在LC/MSも併用して化学構造を確認している。またクロロフォルム中で1ヶ月放置すると、marchantin Aは速やかに多量体に変化することがわかり、その生成物組成も合わせて上記装置で探索している。これまで当研究室では苔類の生理活性成分の研究を30年間行い、400報以上の論文を発表しているが、そのほとんどは脂溶性成分に関するものである。最近蘇類のスギゴケ類、オオカサゴケなどの水溶性物質に抗腹水癌、抗アルツハイマー、強心活性があることが明らかになった。これらの含水メタノール抽出物はイワシなどに含まれる高度不飽和脂肪酸を多量に含むことから、これらが活性の本体であると推定しているが各成分組成は上記装置で分析中である。今回得られた成果について、論文を執筆中である。

また高速液体クロマトグラフィー/フリエー変換エレクトロスプレー質量分析(HPLC/FT/ICR/MS)装置も微量水溶性化合物やアルカロイドなどの塩基性化合物の迅速分析には欠かせない。Dr. C. Paetzは上記2種の先端分析装置をフル回転して日本産薬用非食菌類、コケ類、シダ類、タデ科、カバノキ科、冬虫夏草培養液、タヒチ産キョウチクトウ科植物などの薬理活性化合物の迅速分析に従事した。1)タヒチ産キョウチクトウ科Rauvolfia sachetiaeから4種の新規アルカロイドisonorsandwicine-N_b-oxide, norsandwicine-N_b-oxide, isonorsandwicine, norsanwicineおよび既知sandowicine-N_6-oxide, isosandwicineおよびsandwicineを単離構造決定した(Phytochemical Analysisに投稿中)2)Erythrina crista-galliの花からcrystamidine, 8-oxoerythraline, erythrinan-ll-ol, erythralineが得られた。3)ペニシリウム属の一種(TBUYN3)から大多量に得られる赤色代謝物はアザフィロン誘導体であることを明らかにし構造決定するともに、本色素は防犯スプレー色素に応用できる可能性を示した。4)ゼニゴケ葉状体に含まれる筋肉弛緩ビスビベンジル類は光、クロロフォルム、メタノールなどの溶媒中でメチル化されたり多量体に変化していることを突き止めた。メトキシマルチャンチンEはマルチャンチンAから容易に変化することが明らかになった。5)昨年に引き続き、冬虫夏草培養液の酸素活性化の研究を行い。大量のアデノシン、デオキシアデノシン、5,6-ジヒドロ-4-メチル-2-ピラン-2-オンなどをえ、培養液抽出物の酸素活性化はアデノシンであると結論付けた。6)アルゼンチン産ブナ科植物Nothofagusの強い芳香について再調査し、本芳香は香料原料として重要なセスキテルペン,アガロフランであることを証明し、本植物が香料原料木として使用できることを証明した。7)タデ科ヤナギタデにはビタミンEが存在し、本植物の辛味成分であるポリゴジアールの抗酸化作用に関係していると推定した。8)カバノキ科オオバヤシャブシの強烈なシンナモン臭は桂皮酸-β-フェニルエチルであることを証明した。
S抗原由来promiscuousペプチドの核の同定と治療への応用

目的:我々は、ヒトS抗原の一部分のアミノ酸配列(TLTLLPLLANNRERRGIALD,Fragment#29)はMHCクラスIIの多型性に関係せずT細胞応答を誘導するpromiscuous peptideであることを明らかとした。本年度の研究では、#29に感作されたT細胞が認識する#29の構成ペプチドをラット系統間で検討し、その認識に差があるかどうかを検討することを目的とした。方法:#29の構成アミノ酸配列で15アミノ酸長を持ち、1アミノ酸づつ重複するペプチドを合成した。#29ならびに15アミノ酸長ペプチドに感作されたルイスラット所属リンパ節細胞のペプチドに対する増殖反応およびぶどう膜炎惹起能を検討した。また、これらのペプチドがMHCの異なる4系統のラットにおいて、#29に感作されたリンパ節細胞に細胞増殖反応を誘導できるか否かを検討した。結果:ルイスラットにおいてはTLTLLPLLANNRERR,LTLLPLLANNRERRG,TLLPLLANNRERRGI,LLPLLANNRERRGIAに#29感作リンパ球に対する抗原性を認めたが、その内TLTLLPLLANNRERRのみにぶどう膜炎惹起能が認められた。基本的に#29は、いずれの系統においても免疫応答ならびにぶどう膜炎を誘導することができたが、#29に感作されたリンパ節細胞が認識する15アミノ酸長ペプチドは系統間で異なっていた。結論:ぶどう膜炎惹起能、免疫応答の観点からすると、ルイスラットにおいては、#29のコアペプチドはTLTLLPLLANNRERRであることが明らかとなった。また、#29は多くの系統のラットに認識されるものの、MHC接触部位あるいはT細胞認識部位は系統により異なる可能性が示唆された。我々はすでに、ヒトS抗原の一部分のアミノ酸配列#29(TLTLLPLLANNRERRGIALD)が種を越え(ヒト、サル、ラット)、また同一種間のMHCの差異に関わらず(ヒト、ラット)、リンパ球を刺激する能力のあることを証明した(Int.Immunol.9;169-177)。ところで#29は、MHCクラスIIに結合する最小限必要なアミノ酸長に比べて長く、免疫応答の誘導に不必要な部分を含んでいるものと思われる。本研究では、実験的自己免疫性ぶどう膜炎を発症させやすい系統であるルイスラットを用い、#29のどのアミノ酸配列がリンパ球刺激能を持ち、またぶどう膜炎を発症させるために必要かを検討した。#29のN末端より15アミノ酸長で、1アミノ酸ずつ重複するオーバーラッピングペプチドを作成した。各々のペプチドを免疫し、その3週間後、免疫原性、ぶどう膜炎惹起能を検討した結果、N末端より始まる15アミノ酸配列(15-1:TLTLLPLLANNRERR)にのみその両者を認めた。また、この15アミノ酸配列の両端を削除したペプチド(LTLLPLLANNRER)を作成し同様な検討を加えたところこの13アミノ酸長のペプチドには免疫原性、ぶどう膜炎惹起能とも認められなかった。以上の結果より15-1がぶどう膜炎惹起、免疫能の誘導に必須であることが明らかとなった。
マウスの血液交叉潅流実験 遺伝子導入治療後の不全心に対する心機能評価

力学的機能評価のみならず、容量-圧曲線及び心筋酸素消費を計測することにより、マウスにおける左室心筋の力学的エネルギー学的心機能評価を行うことを目的としマウスにおける交叉灌流実験を確立し、マウスにおける正常心での力学的エネルギー的検討を行うことを目標に実験を行なってきた。本実験系である血液交叉灌流マウス摘出心モデルでは、1匹のマウスから心臓を摘出し、ラットを代謝サポーターとし、その頚動・静脈と摘出心臓をつなぎ血液交叉灌流を行い、摘出心臓の冠循環を行なう。この際、摘出心標本に虚血を体験させないように心拍動下にカニューレを大動脈、右心室に挿入を試みているが、理想的なカニューレが存在せず、工夫しながら手作りのものを使用している。しかし、交叉灌流系が成立するものの、摘出心臓は交叉灌流の際には不全心となっており、実験系確立のためには摘出標本作成のスキルの上達、理想的なカニューレの開発が必要である。スキル上達を目的に、ラット血液交叉灌流実験を行った。心筋保護液に水溶性カルパイン阻害剤・NCX阻害剤を混合し、再灌流後更にカルパイン阻害剤・NCX阻害剤を冠状動脈注入することにより、その有効性について検討した。(1)心筋保護液を用いても再灌流障害として、機械的仕事は減少し、興奮収縮連関での心筋酸素消費量も減少した。しかし化学的エネルギーの機械的エネルギーへの変換効率は変化しなかった。(2)カルパイン阻害剤・NCX阻害剤を用いることによって虚血再灌流障害不全心の形成が抑制された。心臓手術における再還流障害において、カルパイン阻害剤は有効性をもつ可能性が示唆された。また、マウスは非常に小さく手技的にはかなり困難で、今のところ実験系確立の目途は立っていない。マウスにおける心機能評価法として、コンダクタンス・カテーテルを用いた機能評価を開始し、現在データの蓄積を行っているところである。力学的機能評価のみならず、容量-圧曲線及び心筋酸素消費を計測することにより、マウスにおける左室心筋の力学的エネルギー学的心機能評価を行うことを目的とし、平成16年度内にマウスにおける交叉灌流実験を確立し、マウスにおける正常心での力学的エネルギー的検討を行うことを目標に実験を行なってきた。まず予備実験として、サポートとしてラットを用いるため、ラット血液とマウス血液を混合し、異常な凝集反応を生じないことを確認した。次に、マウスにラット血液を輸血することによっても心機能に異常が生じないことを確認した。スキル上達を目的に、ラット血液交叉灌流実験を行い、虚血再灌流障害に対するカルパイン阻害剤の有効性について検討した。(1)虚血再灌流障害不全心では、Ca^<2+>過負荷状態により活性化されたカルパインによりα-フォドリンが分解され、興奮収縮連関でのCa^<2+>