hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
時空間的異種情報の統合・連携予測による災害時変動下の道路交通情報解析

本研究は、大規模災害時における広域道路交通情報の収集方法を考案し、救助活動に必要となる情報の生成に役立てることを目的とするものである。そのため、上空から収集された広域情報とプローブカーにより道路上から収集された動的情報をもとに、大規模災害時の変動下における道路周辺の詳細情報を収集する新たな手法を考案し、ソフトウェアを実装し試作システムを構築した。また、実画像や地図を用いた実験も行い、手法の有効性を示した。まず、提案手法の詳細検討と、試作システム全体の検討を行った。地元消防局などの意見を参考に、活用する計算機環境と、入力できる情報、出力すべき情報、および解析に費やせる時間などを検討した。次に、平常時において撮影された上空画像とデジタル地図、および、プローブカー情報を統合する手法を検討した。ここでは、上空画像として、ヘリコプターに搭載されたビデオカメラにより撮影された画像を活用することとした。そして、ヘリコプターの位置情報と画像内の情報変化に基づき、自動的に画像と地図を位置合わせする手法を考案した。一方、プローブカー情報は、既存のソフトウェアを用いて地図と位置合わせすることとした。実画像と地図を用いた基礎実験において、作成したソフトウェアにより、データ間の位置あわせがおおむね正しく行われていることを目視にて確認した。まず、前年度から実施していた上空画像と地図の位置合わせに関する評価を実際に撮影された上空画像(ヘリコプター画像)とデジタル地図との間の位置ずれの長さを計測することにより行った。また、大規模災害により生じた地上における局所的な変化情報と、広域にわたる被災状況や道路状況などの変化情報を、その領域を撮影したヘリコプター画像や衛星画像などの上空画像の解像度に適合した画像処理手法により、画像から認識し解析する手法を考案した。また、車両が保持しているプローブカー情報により、道路区間ごとの局所的な車両の混雑度を算定する手法も考案した。なお、従来のカラー可視画像を利用する手法では、災害発生時の雲量等の天候の状況により、データの撮影可能性が左右されたり、データの入手時間がかかるという問題店があった。そのため本研究では、雲量等の天候に左右されず広域の地上解析が可能なSAR(合成開口レーダー)による衛星画像を用いることで、即時性や汎用性をより高める手法も検討した。またSAR画像を用いることで、可視画像の活用では困難であった津波や豪雨等による浸水地域の判別がより確実に容易になった。さらに、サンプリング間隔の粗いプローブカーデータを用いることで、短時間での解析の実現と、提供される個々の車両の匿名性を維持しつつ、検出精度の向上を目指した。そのため、連続しているが一定距離離れているプローブカーデータのサンプリング地点間を結んだ線分を中心とする楕円領域を作成し、その領域の重なり具合により車両の混雑度の概算を求める手法を考案した。この手法により、プローブカーの詳細な経路が識別できなくても、一定領域内の車両の混雑具合が判定できることとなった。当初の課題である、上空画像と地図の位置合わせに関する評価、上空画像とプローブカー情報を用いた局所的な変動情報抽出、および広域における被災状況や道路状況の情報抽出手法の検討を実施した。また、それぞれの情報抽出手法について、計算機上で処理する手法を考案し実装した。これまでに検討した手法と試作したソフトウェアシステムを用いて、総合実験を行った。上空映像として、東日本大震災時に6箇所で撮影された5km×5kmの範囲の低解像度の衛星画像(SAR画像、筋赤外線画像、RGB画像)を用い、プローブカーデータと統合して、道路区間ごとの通行可否の判定を行った。実際の処理においては、色補正やノイズ除去等の前処理、水領域と植生領域の抽出、エッジ抽出、抽出されたエッジの長さや角度の解析等の多くの画像処理手法を適用した。目視により求められた各道路区間の通行可否情報と比較した結果、検出率は約81%、誤検出率は約19%となった。また、1つの画像の処理にかかる時間は約45秒であった。同様な衛星画像を用いた既存研究では、処理時間が分単位を超え、また検出精度も7080%であり、本研究の手法の方が、より短い処理時間でより高い検出精度が実現できることがわかった。次に、これまでの検討と試作を踏まえ、実社会で応用可能なシステム作成の方向性を検討した。実験で活用した衛星画像は、衛星の軌道や天候により撮影日時が限定され、災害直後に容易に入手できるものではない。そのため、実際の災害時直後に情報を入手し災害救助活動等に活用することは難しいことが推測された。以上を踏まえ、衛星画像に代わる上空画像として、より撮影時の機動性が高いヘリコプターや航空機から撮影された画像を活用し、次年度に実験を行うことを検討した。当初の目標である大規模災害時に撮影された上空画像(衛星画像)を用いた実験を実施し、システムの社会応用の検討も行った。検討の結果、実利用が難しい衛星画像ではなく、ヘリコプター等から撮影された上空画像を活用した実験を今後行うこととした。昨年度に引き続き、検討した画像解析手法に基づいてコンピュータ上に実装したソフトウェアシステムを用いた実験を行った。昨年度は衛星画像を用いて実験を行い、概ね道路の通行可否情報を得ることが可能であったが、衛星画像は衛星の軌道や天候により撮影日時が限定され、災害直後に入手できない可能性があったため、今年度の実験では、航空機により300mほど上空から撮影された1m程度の解像度の画像を用いた。なお、衛星画像とは異なり、航空画像は、撮影高度が低いため、画像内に写されている地形や建物の影響が大きい。

そのため、道路上で遮蔽されて解析できない領域が多くなり、さらに画像と地図の位置合わせのずれも増えた。その結果、遮蔽のない道路区間では衛星画像を活用したときとほぼ同じ検出率であったが、遮蔽により通行可否がまったく判断できない道路区間が多くなった。この結果から、建物や地形等で高低差が多く存在する領域を低空から撮影した画像を活用する場合は、同じ場所を多方向から撮影する必要があることが判明した。なお、多方向からの撮影手法やデータ統合手法についての検討は、今後の検討課題である。さらに、全体の成果を踏まえ、実社会で活用可能なシステムの具体的な要求仕様を検討した。また、消防防災組織や道路交通管理組織から意見を伺ったところ、汎用のパソコン上で、専門家でなくても簡単に操作や更新ができ、特別な機材を必要としないシステムが望ましいとのことであった。なお、以上の研究成果について研究期間中に国内外の学会で発表したが、さらに今後は、国際論文誌に投稿するとともに、消防防災や道路交通管理にかかわる組織等を通じ、研究成果をより広く社会に発信する予定である。本研究は、大規模災害時における広域道路交通情報の収集方法を考案し、救助活動に必要となる情報の生成に役立てることを目的とするものである。そのため、上空から収集された広域情報とプローブカーにより道路上から収集された動的情報をもとに、大規模災害時の変動下における道路周辺の詳細情報を収集する新たな手法を考案し、ソフトウェアを実装し試作システムを構築した。また、実画像や地図を用いた実験も行い、手法の有効性を示した。当初計画していた、解析手法の検討と試作システムの設計、平常時異種情報自動統合処理の検討、および、平常時異種情報自動統合処理基礎実験・評価の各内容について、おおむね計画通り実施した。ここで本研究では、上空画像として、実際に災害時に消防機関などに広く活用されている、ヘリコプターに搭載されたビデオカメラによって撮影された画像を用いることとした。なお、基礎実験において、作成した上空画像と地図の位置合わせを行うソフトウェアにより、位置合わせがおおむね正しく行われていることを目視にて確認したが、定量的な評価は次年度以後に行うこととした。これまでの検討を踏まえて、地震災害等により甚大な被害を受けた地域において実際に撮影された上空画像を用いた実験を行い、認識率等の評価を行う。また、実験結果を踏まえて、実社会で活用可能なシステムの具体的な要求仕様を検討する。撮影時の機動性が高いヘリコプター等から撮影された画像を上空画像として活用し、各道路区間の通行可否を判断する実験を行う。また、実験結果を踏まえて、実社会で有効でかつ使いやすいシステムの具体的な要求仕様を検討する。社会システム工学・安全システムまず、平常時における上空画像と地図の位置合わせに関する定量的な評価を行う。つづいて、時系列の経過情報と平常時の基盤情報の双方を活用して比較することで、地域の局所的な変動情報を自動抽出する処理を検討する。さらに、局所的な変動情報から、より広域における被災状況や道路状況などの情報変化を予測する手法も考案する計画である。
放射光を利用したマントル鉱物の高温高圧下での弾性波速度その場測定

本年度は愛媛大学地球深部ダイナミクス研究センター設置のマルチアンビル型高圧発生装置と超音波速度測定装置を組み合わせた高圧下での弾性波速度測定システムの開発をおこなった。また、地球科学的に非常に重要なマントル遷移層の地震波速度構造を解釈するため、マントル鉱物の一つであるringwooditeの弾性波速度測定を上記システムを用いておこなった。特に鉄の影響に着目し、ringwooditeの弾性における鉄の影響について明らかにした。超音波法を用いて実験を行った結果、体積弾性率は鉄の含有量が増加すると大きくなり(K=184.8+11.1XFe GPa)、体積弾性率の圧力微分は変化しなかった(∂Ks/∂P=4.5)。剛性率は鉄の含有量が増加すると小さくなり(G=127.1-50.7XFe GPa)、剛性率の圧力微分は変化しないか、やや小さくなる傾向となった(∂G/∂P=1.4-1.0)。こうした実験結果をもとにマントル遷移層の520km、660km地震波速度不連続面の速度ジャンプとマントル遷移層の地震波速度勾配について考察をおこなった。その結果、520km地震波速度不連続面の汎地球的な地震波速度やインピーダンスコントラストはwadsleyite→ringwoodite相転移にともなう速度変化では十分に解釈できず、地域的なこれらの値の変化は鉄の効果に較べて非常に大きいことがわかった。この不一致の原因として、ringwoodite以外のgarnetなどの鉱物の相転移や、マントル中の水などの揮発性成分の影響が考えられる。今後、これらの鉱物の様々な組成における弾性波速度の測定が重要である。本年度は約4ヶ月間ニューヨーク州立大学との共同研究に基づき、マントル鉱物であるRingwooditeおよびMajeriteの弾性波速度測定および、マルチアンビル型高圧発生装置を用いた超音波速度測定法の習得をおこなった。RingwooditeおよびMajeriteはマントル遷移層の構成鉱物のほとんどを占めるもっとも主要な鉱物であると考えられている。これら、マントル鉱物の高圧条件下での相転移や弾性定数の変化を知ることはマントル遷移層を考える上で非常に重要なことであり、本研究では鉄を含むRingwoodite (Mg_2SiO_4、(Mg_<0.8>,Fe_<0.2>)_2SiO_4)およびMajerite(Mg_<0.9>,Fe_<0.1>)SiO_3、(Mg_<0.8>,Fe_<0.1>)SiO_3の弾性波速度を高圧条件下での超音波法を用いて測定した。実験の結果、弾性波速度はRingwoodite単成分では過去の低圧での実験(Rigden et al., 1992)とほぼ良い一致をしめした(Vp:9.810.7km/s, Vs:5.96.1km/s)、いっぽう鉄を含む系では単成分に較べ弾性波速度はかなり遅くなった(Vp:9.310.2km/s, Vs:5.45.7km/s)。しかし、体積弾性率はほとんど変化なく、剛性率は若干小さい値をとることがわかった。以上の結果はサンフランシスコで行われた米国地球物理連合秋季大会(AGU)で発表したほか、現在雑誌論文への投稿準備中である。
光‐分子‐電気二重層場の複合強結合系としての電極/金属ナノ粒子界面の分光応答

1.球形金ナノ粒子を金電極に修飾した有機超薄膜上に固定化した系について、様々な濃度の電解質溶液中をモデル設定して電気二重層電場分布を物理計算しだ結果、ナノ粒子近傍での特徴的な電位分布プロフィルが明らかになった。粒子表面から溶液沖合に向けての電位の距離依存性が平面より遥かに急峻であること、電極とナノ粒子のギャップに存在する中性分子は、基板電極から同じ距離にありながら粒子から離れた位置とは異なった二重層電場を感じることなどが新たに示された。2.従来法を大幅に改善した方法で、フリースタンディングな金ナノリングを水相合成することに成功した。銀ナノコインを経由し、金との酸化還元置換反応を用いる方法で、外径20nm、内径12nm程度のものが高効率に得られた。3.金ナノ構造体を、有機分子組織膜の電位駆動ダイナミクスと共役させて動かし、動的挙動中の粒子とプラズモン励起光との強いカップリングの出現の検出を試みた。しかし、中性界面活性剤のオクタデカノール、アニオン性のドデシル硫酸ナトリウムとも、十分な振幅の金ナノ構造体の動きを誘導しないことが明らかになった。一方、電位駆動が充放電を鋭くスイッチングをする挙動が見出され、プラズモン励起による光応答が電位でON-OFFできる可能性を指摘した。4.金ナノ粒子と電極表面との間に酸化還元活性なビオロゲンチオールSAMがある時、粒子の充放電が起こる系では、ビオロゲンの酸化還元応答が金ナノ粒子がない状態とは異なった。この現象と特徴的な二重層電場分布との関係を解析した。5.金ナノリングを、有機単分子層を介してITO電極上に固定化した系で、電位に依存したプラズモン吸収スペクトル変化を把握した。更に、金ナノリング表面に色素を吸着させたところ、分子配向の変化にも依存した非ファラデー反射スペクトル応答が得られ、増強シュタルク応答と解釈ができるかどうか検討した。
光化学治療により誘導されるアポトーシス発現に対するHSP70の影響

1癌細胞にHSP70を過剰発現させ、その発現をウェスタンブロット解析にて確認し、HSP70発現株を作成。HSP70が単独に発現するように構築したプラスミドをリポフェクション法にて細胞にトランスフェクションさせ、ウェスタンブロットにてHSP70が発現していることを確認できた。2親株とHSP70発現株において、PDTに対する感受性を比較。またアポトーシス誘導率についても検討。NPe6(レザフィリン)を用いたPDTを親株とHSP70発現株に施した後、生存率を比較した。親株の生存率に比べると、HSP70発現株は生存率が高かった。アポトーシスの検出はヘキスト染色、フローサイトメトリーを用いて行った。両株ともアポトーシスの検出はできたが、親株のほうがアポトーシス誘導率は高かった。3親株とHSP70発現株において、抗癌剤によって誘導されたアポトーシスの検出およびCaspaseの活性測定を行うCaspaseの活性測定は蛍光基質法を用いて行った。ここで、実際にHSP70が高発現している細胞においては、アポトーシス耐性機構が確立されていることを確認した。現在、HSP70発現株において、HSP70と結合しているタンパクをGST pull down assayにて分離し、HSP70と関連しているシグナル経路の同定を行っているところである。1:当科で樹立したヒト舌扁平上皮癌由来のNT-1細胞で、感光色素フォトフリンによる光化学治療をIC90^95で7回繰り返し光化学治療に対する耐性を獲得させ、マイクロアレイにて遺伝子発現の違いを検討した。2:当科で樹立したヒト舌扁平上皮癌由来のNT-1細胞とヒト頬粘膜扁扁平上皮癌由来のNB-1細胞をもとにシスプラチンに対する耐性を獲得させたNT-1CR, NB-1CR細胞とタキソールに対して耐性を獲得させたNT-1TR細胞での遺伝子発現の違いを検討した。今後の研究予定1で得たPDT耐性細胞と2で検討中のNT-1CR, NB-1CR, NT-1TRにおいて、レザフィリンを使ったPDTによりアポトーシスを誘導させ、HSPの発現について検討する。
非拡散性因子に由来する細胞内シグナル伝達の時間分解分析法の開発

通常は液性因子としてふるまう生体分子を材料に固定化するとその活性が顕著に変化することが知られている。本研究ではこの作用の時間分解分析を行うための研究ツールとしてマイクロパターン化基板と反応性ナノ粒子を開発した。女性ホルモンエストラジオールと上皮成長因子をこれら材料に固定化することで,細胞応答の時間空間動態を捉えることができるようになった。本手法は新たなバイオマテリアルや薬剤の開発に重要な情報を与えうる。通常は液性因子として作用する成長因子などを材料に固定化すると活性や効能が顕著に変化するが,そのメカニズムについては不明な点が多い。本研究では,これら非拡散性因子を細胞に暴露する「タイミング」と「量」の自在に制御する方法を開発することで,当該因子由来の細胞応答の時間分解分析を実現することを目的としている。本年度は,通常は核内受容体に作用するエストラジオール(E2,女性ホルモン)の細胞膜での作用(非ゲノム作用)に注目し,細胞に暴露するE2の「量」を制御する方法の開発に取り組んだ。具体的な戦略としては,ガラス基板上にum/nmサイズの金領域をアレイ状に形成し,当該非拡散性因子を修飾することで,金領域のサイズや間隔に応じて細胞に暴露する非拡散性因子の「量」をコントロールする。まず,フォトリソグラフィーにより,金領域(φ=2 μm)の間隔を変化させた基板を作製し,それらを走査型顕微鏡で確認した。次に,マイクロパターン基板と同じ方法で,別途用意した全面金基板にE2を修飾し,QCM-DおよびSPRによりその修飾過程とE2の生理活性の精確な評価を行った。最後にマイクロパターン化基板のガラス領域に細胞接着性リガンド(cRGD)を,金領域にE2を修飾した基板を作製し,そこに付着させたMCF-7細胞の応答を解析した。E2を修飾していないコントロールの基板では,ERKの活性化は細胞接着時の一時的なものであったが,E2固定化基板では,その活性化が持続した。さらに,E2固定化した基板は,通常の遊離状態のE2とは異なり,細胞増殖を更新しないことも確認した。これらより,本手法が材料に固定化したE2の作用の解析に有用であることが示された。以上の結果を論文に投稿し,採択された。本研究の2大目標であるところの,細胞に暴露する非拡散性因子の「量」と「時間」の制御のうち,その一方を完遂し,論文にも掲載されたため。エストロゲンシグナル伝達の非ゲノム作用の解析方法としての生物学的な意義があることも特筆に値する。本年度は,液性因子である上皮成長因子(EGF)を金ナノ粒子に固定化することで,通常の遊離状態のEGFとの作用の違いに注目しその解析を行った。活性エステルおよびPEG(Mw = 5000)を末端に有する2種類のジスルフィドを適当比で混合し,金ナノ粒子(粒径: 20 nm)表面を修飾した後,EGFを反応させた。動的光散乱法および溶液中のEGFの減少量から,このナノ粒子は約50 nmで,1粒子当たり50分子程度のEGFが固定化されていることが分かった。このEGF-GNPはHeLa細胞のアポトーシスを誘導し,その際,AKTについては一過性の活性化を示すのに対し,ERKの活性は長時間維持させることが分かった。つづいてEGF-GNPのHeLa細胞における作用点を暗視野顕微鏡による観察およびスクロース濃度勾配法による生化学分析で調べた。その結果,通常の溶存状態のEGFの場合は脂質ラフトに作用後にそこから脱出するのに対して,EGF-GNPは脂質ラフト内にとどまることが明らかになった。そこで,脂質ラフトの役割を調べるために,脂質ラフトの形成を阻害するβ-CDで予め処理した細胞にEGF-GNPsを添加したところ,アポトーシス誘導活性がほぼ失われることが分かった。この結果より、通常は細胞増殖・分化を促進するEGFを金ナノ粒子に固定化することで,逆に細胞死を誘導するメカニズムにおいて,脂質ラフトが重要な役割を果たしていることが示唆された。現在,本研究の内容について論文を作製しているところである。初年度に確立した系に,新たに「時間」制御の要素を組み込み,非拡散性因子の時間分解分析法として完成させる。生体分析化学ポスドクの雇用を翌年度に見送ったため。H29年度に本研究を遂行するポスドクを雇用する。
造影剤併用3次元磁気共鳴血管撮像法による頭蓋内血管の血行動態の評価に関する研究:正常人および脳血管性病変患者による検討

3)今年度の研究は、TR-MRAを頭蓋内動静脈シャントを有する疾患に対して施行し、頭蓋内の異常な血行動態の評価が可能であるかについて検討した。4)対象は、X線血管造影検査にて頭蓋内動静脈シャントが確認された頭蓋内硬膜動静脈奇形12例および脳動静脈奇形3例である。5)TR-MRAは、動静脈シャントを脳静脈構造の早期描出所見として描出し、全例にて頭蓋内硬膜動静脈奇形あるいは脳動静脈奇形との診断が可能であった。6)TR-MRAは、(前年度のコントロール群における検討結果から)動静脈シャントを有しない病変では動脈相と静脈相は分離して描出され、動静脈シャントを有する病変では脳静脈構造の早期描出所見を呈することから、頭蓋内病変の血行動態的な診断が可能であると考えられた。7)しかしながら、X線血管造影検査と比較すると、TR-MRAの時間分解能および空間分解能はいずれも十分とはいえず、今後の検討課題と考えられる。2)血管の信号強度が最も強くなるflip angleを決定するため、FLASH法の理論式を用いてコンピュータにてシュミレーションを施行した。ガドリニウム造影剤のボーラス静注による血管のT1緩和時間を50msecと仮定し、シュミレーションを施行したところ、flip angleが25°の際に最も強い信号が得られることが示された。4)TR-MRAを、血管造影検査にて明らかな動静脈シャントがないことを確認された患者21人に対して施行し、頭蓋内血管の血行動態に関する評価が可能であるか検討した。5)造影剤を用いたTR-MRAは、動脈相と静脈相を分離して描出できることから、頭蓋内の血行動態の評価がある程度可能であると考えられた。6)今後は、頭蓋内の動静脈シャント有する患者にて検討を進める予定である。
郵送調査法の特徴に関する総合的研究

本研究は,近年の社会調査環境で重要度を増している郵送調査法の特徴を総合的に研究した。特に回答者の匿名性を担保するための実施方式と,必ずしも担保されない方式の間の回収率や回答内容の差の比較を主に検討した。全国規模のランダム・サンプリングに基づく郵送調査を実施し,面接調査法等,他の調査法による調査結果とも比較した。郵送調査法内の実施方式間の結果の差は,他の調査法との差に比べれば小さかった。本研究は,郵送調査法の特徴を検討するために,面接調査法とウェブ調査とを比較対象として検討する。結果の差をもたらす要因として次の3つの観点から検討し,社会調査の企画・設計に資する具体的な経験則を得ることを目的とする。(1)面接調査法と比較した場合の回収層・非回収層の人口統計的属性の違い。(2)自記式である郵送調査法・ウェブ調査法と,調査員が回答を聴取する面接法とで回答結果の違いを生み出す原因。(3)郵送調査法の実施条件として,調査協力に際し対象者の匿名性を維持する方法と維持しない方法との間の結果の差。この目的のために,平成20年度中に郵送調査,平成21年度中にはウェブ調査を同じ調査項目について実施し,これらの調査と,他の機会に取得した面接法,留置法等による同じ調査項目による調査結果を比較,検討する。また(3)の目的のため,平成20年度の郵送調査は二つの条件を設けて実施する。条件間,調査方法間の比較を考察することによって郵送調査法の特徴を総合的に検討する。本研究では,郵送調査法の特徴を考察するために,面接調査法やウェブ調査を比較対象とし,結果の差をもたらす要因として次の3つの観点についての検討を行い,調査法上の特徴に関する経験則を得ることを目的とする。1.面接調査法と比較した場合の回収が容易な/回収が困難な対象層の人口統計的属性の違いを検討する。2.自記式である郵送調査法・ウェブ調査法と,調査員が回答を聴取する面接法とで,どのような調査項目で差が生じやすいかを検討する。3.郵送調査法の実施条件として,調査協力に際し対象者の匿名性を維持する方法と維持しない方法との間の結果の差を検討する。平成20年度は,データの取得を最大の目的とし,実際の郵送調査を行った。具体的には統計数理研究所が実施した2つの面接法による調査「日本人の国民性第12次全国調査」(平成20年秋)や,「国民性に関する意識動向(2008年度調査)」(平成21年1月2月)と同様の項目による郵送調査を,後者の時期に合わせて実施した。母集団を16歳79歳の日本全国の男女個人とし,層化多段無作為抽出法により抽出した計3200名を対象とした。特に研究目的(3)に関連させて,サンプルを折半し,匿名性の高い参加条件と匿名性の低い参加条件という二条件で実施した。調査項目の中には国民性に関する意識の他に,調査そのものに対する態度の項目を含めた。この調査について平成20年度中に、データクリーニングと基礎集計を完了した。回収率は全体で約51%,二つの参加条件下での回収率に大差は生じなかった。両条件間での回答傾向の差,面接調査法との比較など,詳細な分析は平成21年度中に実施する。報告書としての公表は平成21年度中に行う。平成20年度中のその他の成果として,自記式調査法に関する方法上の検討,調査項目の準備面で関連する調査研究に関する報告書等がある。平成21年度の研究は、大別して1.平成20年度中に実施した郵送調査(以下調査A)の結果分析、2.郵送調査の比較対象としてのウェブ調査等の実施およびその解析、の2点であった。1.平成20年度中に実施した郵送調査の結果分析調査Aの比較対象として、同時期に本科研とは別途実施した、面接調査(調査B)、面接方式による「日本人の国民性第12次全国調査」(調査C)を用いる。調査Aとの項目分布の比較は調査Bについて行い,調査Cは回収層の属性比較のために調査Cと共に比較検討資料とした。調査不能の分析を通じ,面接調査と郵送調査の間で,性・年齢の効果(若年男性が回収困難)は共通,しかし郵送調査では都市規模の要因が有意になりにくかった。本研究の目的の一つである郵送調査Aのうち匿名性維持条件(A1)と非維持条件(A2)で実施した場合の間の比較については,有意な差が見られる項目もあったが,A1A2間の差は,調査方式が異なる調査Bと調査A全体との差に比べれば小さいものであった。A1,A2間で生じた差の原因を今後の分析課題とする。2.郵送調査の比較対象としてのウェブ調査の実施およびその解析郵送調査と同様の自記式方式調査であるウェブ調査(調査D)を,調査会社の保持するモニター登録者集団を対象とし,平成22年2月に実施した。

調査項目は上記調査Cとほぼ同様とした(対象者:総計画標本2384名、有効回収標本1382,回収率58%。)この調査実施に合わせ,同時期に少数の項目について回答分布を比較する目的で留置自記式の調査として実施した(調査E)。調査DEと調査ABC間の比較などが次年度以降の分析課題とする。平成22年度の研究は,大別して(1)平成20年度中に実施した郵送調査の分析の継続,(2)郵送調査の比較対象として平成21年度中に実施したウェブ調査および関連して一部項目について取得した留置法・郵送法の調査データの基礎集計と解析,の2点であったが,平成20年度以前の実施分も含め,比較対象となる調査の種類が増えたため,今年度は分布の比較という基礎検討を中心に行った。1.平成20年度中に実施した郵送調査の継続分析:次の分析を行った。(1)郵送調査のうち匿名性維持条件と非維持条件で実施した場合の間の比較結果に大きな差はなく,条件間の差異は,対象者の回答の構えに影響を与えるほど大きな違いになっていない可能性が示唆された。(2)郵送調査Aと同時期に別途実施した面接調査B,面接調査Cとの結果の比較面接調査同士BCの間の差に比べると,郵送調査AとBC間の回答分布の差が大きい。(1)(2)とも相関構造の差の検討を,多母集団解析の活用により行うことが課題として残された。2.平成21年度中に実施したウェブ調査,および関連する各種条件よる調査データの解析まとめると,本科研費による平成20年度実施郵送調査(調査A)と21年度ウェブ調査(調査D)の比較対象として,平成20年度中に実施した面接調査2件(調査B:Aと同時期、および調査C:A,Bとは異なる時期),平成21年度取得の留置法による調査E(調査Dと同時期),登録者集団に対する郵送調査F(調査D,Eと同時期)が利用可能であり,これらの分析を総合的におこなう必要がある。22年度は分布の比較という基礎検討を行い,平成23年度(最終年度)の継続検討に備えた。平成23年度は本研究の最終年度であり,平成22年度までの分析結果を補強し,成果のとりまとめを行った。具体的な分析事項は大別して(1)平成20年度中に実施した郵送調査の分析の継続,(2)郵送調査の比較対象として実施したウェブ調査等,利用可能な調査結果との比較解析,(3)新たな視点を入れた分析,である。(2)については本科研費による平成20年度実施郵送調査(調査A)と21年度ウェブ調査(調査D)の比較対象として,平成20年度中に実施した面接調査(調査B,C),平成21年度取得の留置法による調査E,郵送法による調査Fの間の比較分析を予定したが,特にD調査と他の調査の比較は充分に行えなかった。事項(1)は本科研費の主眼である匿名性を確保した実施方式の効果を検討するという課題の検討が中心であるが,結論的に言えば回収率の点でも,また回答分布の点でも,回答通知ハガキ別送条件と呼ぶ匿名性確保条件の明確な効果は認められないという結論に至った。実施条件として匿名性を充分に強調する効果があったか不明である。事項(3)については,郵送調査に付随する情報(返信封筒の記載情報と回答者の教育水準との関連,返信時期と協力者の協力動機の分析)を行い,それぞれ弱い効果を認めた。また研究分担者のうち1名は,所属大学での実習機会を利用して郵送調査を自治体との共同で市民を対象とする無作為抽出による調査を行い,郵送調査法の実施結果(回収層の偏りなど)に関して得られている従来の知見との比較考察を行っている。
myc遺伝子産物による上皮細胞の形質転換とそれに伴う核骨格、細胞骨格の変化の解析

放射線により試験管内形質転換したヒトセンイ芽細胞(CT-1)では、c-mycの発現が顕著に上昇していた。この細胞のc-myc遺伝子をクローン化し、構造を調べたが正常c-mycと同じであった。CT-1細胞c-myc遺伝子のSmqIEcoRI断片をSV40またはマウスメタロチオネイン遺伝子の転写プロモーターに結合して発現可能なmyc組換体を作製した(pSV2CT-myc,pMKCTmyc)。-ネオマイシン耐性遺伝子と共に種々の培養細胞に導入し、細胞形質の変化を検討した。まずBalb/3T3細胞では、V-hasのみで低い頻度の形質転換が誘起されるが、pSV2CTmycを同時に導入すると形質転換の頻度が約5倍上昇し、形質転換細胞の形態がV-hasだけの場合とくらべ著しく紡錘形となった。しかし、mycだけでは形質転換しなかった。従ってc-mycの高発現はhasの機能と共役して細胞に作用し、恐らく細胞骨格のなかの微小管構造を変化させると考えられた。次に、マウス上皮細胞JB6,ラット上皮様細胞208Fおよびヒトセンイ芽細胞にpSV2CTmycを導入し、myc発現によるこれらの細胞の形質発現を検討した。JB6 KMST-6では導入したmycの発現は見られたが、細胞形態は対照と全く差が認められなかった。しかし、208Fに導入した場合、mycの発現が高いクローンでは細胞形態の変化(上皮様から紡錘形)が見られた。抗アクチン抗体を用いた蛍光抗体法により、mycの発現は細胞骨格のミクロフィラメントの重合を変化させることが示された。さらに、208F細胞は上皮細胞増殖因子(EGF)により軟寒天内コロニーが形成されるがmycを導入したクローンではこのEGFに対する反応性が消失していた。この消失の機構は不明だが、少なくとも受容体の変化ではなく、刺激伝達系の変化と思われる。以上の変化とmyc発現との相関を直接的に証明するには発現量を調節するベクターを用いる必要がある。メタロチオネインプロモーターは効果が弱いことが判明した。
微小管結合タンパクOrbitによる細胞分裂および細胞分化の制御

微小管結合タンパクをコードするorbit遺伝子が欠損した突然変異体において、雄の減数分裂細胞を観察したところ細胞質分裂の欠損をみいだした。正常では、細胞質分裂の開始前に微小管モーターPavがセントラルスピンドルの上を移動して細胞中央部に集積するが、変異体細胞ではセントラルスピンドルの形成がなくPavの集積も阻害されていた。さらに収縮環形成に先立ち細胞中央部の細胞膜裏打ち構造に集まるAnillinも正しく集合できていなかった。これらの異常がorbit突然変異体において収縮環形成の欠損につながると推測される。Orbitは、卵巣の生殖幹細胞およびシストサイトの分裂期から間期にかけて、中心体、スピンドル微小管、生殖細胞系列に特異的な細胞骨格であるfusome、ring canalへとダイナミックに局在を変化させた。生殖幹細胞の分裂では、2極性スピンドルの一方の中心体だけがfusomeに結合するため非対称な分裂がおこなわれ、シスト内の極性も確立される。同様にシストサイトの分裂方向も規定される。mutantでは2極性スピンドルの形成とともにそれとfusomeとの結合も損なわれていた。このため生殖幹細胞のリニューアルも阻害される。また正常では、分裂溝の収縮が途中で停止し、細胞膜の裏打ち構造が形成されて安定したring canal構造ができるが、mutantでは裏打ち構造(内壁)ができないため架橋がっまっていた。この結果は、Orbitが細胞膜の裏打ち構造をつくるアクチン系細胞骨格の重合にも関与することを示唆する。卵母細胞の分化に必須なタンパクは周囲の哺育細胞で合成されring canalを通って卵母細胞へ運搬されるので、この架橋構造が異常なorbitmutantでは卵母細胞の分化が阻害されていた。ショウジョウバエから同定された微小管結合タンパクOrbitは、GTPの加水分解に依存して微小管に直接結合し、M期微小管構造の形成に必要なタンパクである。orbit遺伝子の突然変異体では、多倍体細胞が頻度高く観察される。この多倍体化の原因を探るため、(1)染色体分配ならびにそれを制御するM期微小管構造の形成過程をライブ観察するシステムを確立させた。変異体では染色体の赤道面への整列と染色分体の極への移動が阻害されていること、分裂極の中央部で重なり合う極微小管構造の安定化と分裂極間を伸長させる極微小管間のスライドが阻害されていることがわかった。変異体では2極性M期微小管構造の形成、維持、分裂極の伸長が阻害され、このため染色体分配が欠損すると考えられる。一方(2)orbit変異体では細胞質分裂も欠損することを見い出した。分裂後期以降に作られるcentral spindle構造の形成が阻害される。細胞質分裂の開始に必須な微小管+端モーターPavarottiはその上を移動して細胞中央部に集積するが、変異体細胞ではこの移動が認められない。さらにアクチンリング形成に先立ち細胞中央部のcortexに集まるアクチン結合タンパク(Anillin)も変異体では正しく集積されないことがわかった。これらの異常が収縮環形成の欠損につながると推測される。微小管結合タンパクOrbitはM期微小管形成のみならず、微小管とアクチン系細胞骨格との相互作用にも関与し、細胞質分裂の開始を制御している可能性が示唆された。このほか(3)orbitは、雌の生殖細胞系列の細胞分裂ならびに卵母細胞の分化にも必須であることがわかった。卵母細胞の分化には卵母細胞と哺育細胞を繋ぐ間期微小管構造が必要である。orbitは、M期微小管構造のみならずこの極性をもった間期微小管構造の形成にも必須であることが分かった。
ウシにおける肝細胞因子(HGF)の役割:炎症時での発現とその機能

肝細胞増殖因子(HGF)は種々の組織の修復・再生、血管の新生など管腔の形成や乳腺の発達に関わることが知られる。反芻動物におけるHGF/c-Metシステムの病態生理学的意義は不明な点が多く、ここでは炎症におけるHGFの役割を明らかにすることを目的とした。ウシ好中球やTリンパ球機能を脂肪細胞由来サイトカイン、レプチンは機能を修飾するのに対し、HGFは全く作用を示さなかった。一方、ウシ血管内皮細胞はc-Metを発現し、HGFで刺激すると腫瘍壊死因子TNF-αによる細胞接着因子の発現を抑制した。この機構には一酸化窒素(NO)合成酵素eNOSの活性化によるNO産生が関与した。HGFによるeNOSの活性化にはCa^<2+>シグナルとAktによるリン酸化がより重要であるが、これまで関与が示唆されていたheat shock protein 90 (HSP90)については、その関与が否定された。またHSP90の数種の特異的阻害剤の比較から、geldanamycinにはHGFのシグナル増強作用が見いだされた。次に、HGFの生体内での機能を調べるためadenovirusベクターにHGF遺伝子を組み込んだコンストラクトを作成した。これをマウスに投与すると、機能的なHGFを産生した。現在、腎臓の虚血障害モデルマウスを作成し、HGFの有無によって腎機能が維持されているのか、この系にeNOS/NO系が関与するかNOS阻害剤を用いて検討を続けている。肝細胞増殖因子(HGF)は肝細胞の他、多様な細胞の増殖・分散因子として組織器官の形成や再生に重要な役割を担うことが知られる。我々はウシHGFとその受容体cMetの構造を明らかにしたが、本研究ではウシの炎症時におけるHGFの発現や機能に焦点を当て、HGFの役割を解明することを目的とした。ホルスタイン牛3頭の左前乳房に乳房炎牛より分離、培養した大腸菌(5x10^5cells)を乳頭口より注入し、経時的に乳汁および血液を採取した。大腸菌接種後1週間目に病理解剖を行ない、組織の採材を行なった。感染乳腺組織においてHGF及びcMet遺伝子の発現は非感染対照乳腺組織に比べ増加していた。さらに分離ウシ乳腺上皮細胞にはcMet mRNAやタンパクが発現することを確認した。この細胞を三次元培養条件下で培養し、HGFで刺激すると腺房や導管の形成が促進されたので、乳房炎の感染乳腺におけるHGFとcMetの発現増大は組織の修復に関わる応答と考えられた。一方、血液中の白血球分画において様々なサイトカイン遺伝子が発現することを見いだした。すなわち、大腸菌注入3時間後にはまず腫瘍壊死因子(TNF-α)mRNAの発現が増大し、それに遅れ24ないし48時間目からHGFやインターロイキン(IL)-1β遺伝子が誘導された。次に白血球画分におけるHGF発現部位とその機構を明らかにするため、まずウシ好中球を分離し、in vitroでTNF-αやIL-1β、ストレス因子であるグルココルチコイドで4時間刺激して発現を調べた。しかしHGFの発現に変化は見られなかった。現在、好中球の長時間刺激や他の白血球細胞での発現について詳細に検討を重ねており、炎症時におけるHGFの役割(機能)を明らかにしたい。肝細胞増殖因子(HGF)は種々の組織の修復・再生、血管の新生など管腔の形成や乳腺の発達に関わることが知られるが、反芻動物におけるHGF/c-Met(HGF受容体)システムの機能は未だ不明な点が多い。そこでウシ乳腺におけるHGF/c-Metの役割を調べたところ、c-Metは乳腺の発達段階に関わらず上皮細胞に限局して発現することが判った。次いで乳腺上皮細胞を分離、コラーゲンゲル三次元培養法にてHGFの形態形成に関する作用を調べたところ、HGFにより上皮細胞は集合し導管あるいは腺房様の構造物の形成を促進した。組織化学的にはHGFの乳腺における局在は検出されなかったが、分離した間質脂肪細胞において、その細胞の脂肪分化に伴ってHGFの発現が誘導されることを見いだした。つまり間質から分泌されたHGFが上皮に作用しその分化を調節していることが示された。乳房炎罹患牛においては感染乳房でのHGFの発現が増加しており、現在in vitroの培養系でそのメカニズムをさらに検討中である。一方、ウシ血管内皮細胞を用いてHGF/c-Metの役割を調べたところ、HGFは腫瘍壊死因子TNF-aによる細胞接着因子の発現を抑制した。また、その機構には一酸化窒素合成酵素eNOSの活性化が関与することを示した。これまでeNOSの活性化にはheat shock protein 90(HSP90)が重要と言われてきた。しかし、今回、種々の検討よりウシの血管内皮細胞におけるeNOS活性化にはHSP90の繋留タンパクとしての関与は小さく、CaシグナルやAktによるリン酸化がより重要であることが示された。

一方、ウシ血管内皮細胞はc-Metを発現し、HGFで刺激すると腫瘍壊死因子TNF-αによる細胞接着因子の発現を抑制した。この機構には一酸化窒素(NO)合成酵素eNOSの活性化によるNO産生が関与した。HGFによるeNOSの活性化にはCa^<2+>シグナルとAktによるリン酸化がより重要であるが、これまで関与が示唆されていたheat shock protein 90 (HSP90)については、その関与が否定された。またHSP90の数種の特異的阻害剤の比較から、geldanamycinにはHGFのシグナル増強作用が見いだされた。次に、HGFの生体内での機能を調べるためadenovirusベクターにHGF遺伝子を組み込んだコンストラクトを作成した。これをマウスに投与すると、機能的なHGFを産生した。現在、腎臓の虚血障害モデルマウスを作成し、HGFの有無によって腎機能が維持されているのか、この系にeNOS/NO系が関与するかNOS阻害剤を用いて検討を続けている。
星間塵上の化学反応シミュレーション

物質の進化が活発に行なわれている暗黒星雲に多く存在するアンモニア分子の生成機構に関して、星間塵が反応場となる可能性を検討した。実験法としては、極低温冷凍機のコールドヘッドに窒素プラズマによって生成した活性窒素を蒸着する。これを、水素原子を含む活性窒素と反応させる。もし水素原子が固体内を拡散し、窒素原子を遂次反応で水素化すれば、固相内でアンモニア分子が生成する筈である。1030Kで活性窒素を低温基板上に真空蒸着したところ、強い緑色の発光が観測された。このルミネッセンスを分光計測した処、発光が励起窒素原子の禁制遷移^2D→^4Sに対応することが分った。従って、プラズマスプレーにより活性窒素を冷却した基板に蒸着することにより、窒素原子を窒素分子マトリックス中に低温捕捉することができることが分る。約20000分子層の活性窒素薄膜を水素プラズマスプレーで10時間処理し、反応生成物の昇温脱離マススペクトルを測定した。アンモニアの生成に由来するm/z=17のピークが窒素マトリックスの脱離する3540Kにおいて観測された。これは、活性窒素薄膜の表面近傍で、窒素原子の水素化が進行して、アンモニア分子が合成されたことを示す。次に、水素原子の膜内への拡散距離に関する情報を得るために、200分子層の活性窒素薄膜の水素プラズマ処理の繰り返し実験を100回行い、生成物を積算した。この試料では、アンモニア分子に由来するm/z=17のシグナルが、凍結したアンモニアが脱離する温度(130K)において観測された。しかし、マトリックスの窒素分子が脱離する温度ではシグナルは観測されない。このことにより水素原子は少なくとも窒素薄膜中を200分子層拡散移動し、窒素原子を水素化し、生成したアンモニア分子が膜中で水素結合して網目構造を形成したことが分る。この結果から、星間塵は、アンモニアなどの星間分子の生成に重要な寄与を果していると予想される。
アクアポリン2を用いた低出生体重児の尿細管機能障害と慢性腎障害の病態解明

【研究の目的】近年、DOHaD理論により早産・低出生体重児の腎機能についての研究が進んでおり、我々の研究グループでも、子宮内発育遅延モデルラットにおいて腎機能障害に先駆けて尿中アンギオテンシノーゲンが上昇すること(Murano Y, at al.Pediatr Res. 2015)を報告してきた。しかし現時点では「糸球体障害」にこれらの研究の主眼が置かれている。腎発生において、糸球体だけでなく尿細管・間質にも何らかの影響を受けていることは予測される事であり、その詳細な検討を行うことや、成長後に及ぼす影響をAQP2を用い解明することが本研究の目的である。【研究の実績】子宮内発育遅延(IUGR)モデルラットを用い、尿細管機能を評価するため検討を行った。出生体重はIGUR群:5.64±1.29g対照群10.32±1.13g(P<0.01)と有意差を認めた。尿浸透圧(mOsm/kg 8週)IUGR群:1257.6±273.9対照群:1148.6±367.0(P=0.4)、血清cre(mg/dl 8週)IUGR群:0.253対照群:0.257 (P=0.45)有意差を認めなかった。免疫染色では対照群に比べIUGR群のAQP2の発現が低下していた。しかしAQP2の発現をWestern Blottingにおいて確認をしたところ、IUGR群:0.94±0.37対照群1±0.36(P=0.36)と、これらの発現に有意差が認められなかった。これらの解離に関して現在調査検討中である。これまでの結果よりAQP2の発現に障害が起こっている可能性が示唆され、これらの成果は今後の早産・低出生体重児の尿細管機能研究において重要な知見と考えられる。より有意な成果を得られるために、遠隔期(32週等)へ実験期間を延長することも検討している。これらの成果が揃い次第、論文化する計画である。近年のめざましい新生児医療の進歩に伴い、早産・低出生体重児として出生する新生児が先進国を中心に増加している。近年これらの早産・低出生体重児の腎機能についての研究が進んでおり、我々の研究グループでも、極低出生体重児の慢性腎障害のマーカーとして尿中アンギオテンシノーゲンが有用であること(Nishizaki N,at al. Clin Exp Nephrol. 2014)や、子宮内発育遅延モデルラットにおいて腎機能障害に先駆けて尿中アンギオテンシノーゲンが上昇すること(Murano Y, at al.Pediatr Res. 2015)を報告してきた。しかし我々含め、現時点では「糸球体障害」にこれらの研究の主眼が置かれている。早産・低出生体重児が尿細管機能の発生において、糸球体だけでなく尿細管・間質にも何らかの影響を受けていることは予測される事であり、その詳細な検討を行うことや、成長後に及ぼす影響を解明することが本研究の目的である。本研究では臨床像や尿細管機能を反映するバイオマーカーとしてAQP2を用いる。現在までに、動物実験にて子宮内発育遅延モデルラットの尿細管機能および慢性腎障害との関係を明らかにするべく検討を重ねている。今年度は学会・研究会等で専門家の意見収集し研究計画の推敲を行った。また予備実験にて子宮内発育遅延モデルラットの作成および、尿濃縮力障害およびAQPの発現の低下に一定の相関があることが明らかとなった。しかし統計学的有意差がでるには検体数が不十分であること、また遠隔期の慢性腎障害との関連に関しては未だ未解明である。予備実験の段階で子宮内発育遅延モデルラットの作成に時間を要した。しかし予備実験にて一定の相関が明らかとなったため、今後本実験を進め検体採取・保存・組織の免疫染色・AQP2の定量解析を行っていく。昨年度の予備実験にて子宮内発育遅延モデルラットの作成および、尿濃縮力障害およびAQP2・AQP3の発現の低下に一定の相関があることが明らかとなった。しかし個体毎にばらつきが認められ統計学的有意差がでるには検体数が不十分である。

またAQP4の発現が不規則な結果を示しており、これらの解釈に対して推敲を重ねる必要がある。また遠隔期の慢性腎障害との関連に関しては未だ結果が得られていない。当初の計画以上に子宮内発育遅延モデルラットの安定的な作成に時間を要している。またAQPの結果が個体毎にばらつきが認められたため、検体数を増やしている。しかし結果に関し、一定の傾向は認められているため今後さらに実験を進め検体採取・保存・組織の免疫染色・AQP・copeptinの定量解析を行っていく。【研究の目的】近年、DOHaD理論により早産・低出生体重児の腎機能についての研究が進んでおり、我々の研究グループでも、子宮内発育遅延モデルラットにおいて腎機能障害に先駆けて尿中アンギオテンシノーゲンが上昇すること(Murano Y, at al.Pediatr Res. 2015)を報告してきた。しかし現時点では「糸球体障害」にこれらの研究の主眼が置かれている。腎発生において、糸球体だけでなく尿細管・間質にも何らかの影響を受けていることは予測される事であり、その詳細な検討を行うことや、成長後に及ぼす影響をAQP2を用い解明することが本研究の目的である。【研究の実績】子宮内発育遅延(IUGR)モデルラットを用い、尿細管機能を評価するため検討を行った。出生体重はIGUR群:5.64±1.29g対照群10.32±1.13g(P<0.01)と有意差を認めた。尿浸透圧(mOsm/kg 8週)IUGR群:1257.6±273.9対照群:1148.6±367.0(P=0.4)、血清cre(mg/dl 8週)IUGR群:0.253対照群:0.257 (P=0.45)有意差を認めなかった。免疫染色では対照群に比べIUGR群のAQP2の発現が低下していた。しかしAQP2の発現をWestern Blottingにおいて確認をしたところ、IUGR群:0.94±0.37対照群1±0.36(P=0.36)と、これらの発現に有意差が認められなかった。これらの解離に関して現在調査検討中である。これまでの結果よりAQP2の発現に障害が起こっている可能性が示唆され、これらの成果は今後の早産・低出生体重児の尿細管機能研究において重要な知見と考えられる。より有意な成果を得られるために、遠隔期(32週等)へ実験期間を延長することも検討している。これらの成果が揃い次第、論文化する計画である。予備実験にて子宮内発育遅延モデルラットの作成に時間を要したが、現在は安定した作成に成功している。今後それらのモデルラットを用い本実験を進めていく計画である。検体採取・保存・組織の免疫染色・AQP2の定量解析を行っていく。またcopeptin等の計測に時間を要し計画の遅延が懸念される時には、外部委託を利用する計画である。子宮内発育遅延モデルラットの安定的作成に当初の計画以上に時間を要し、またAQPの結果が個体毎にばらつきが認められたため計画が遅延したが、現在は徐々に安定した作成に成功しつつある。今後それらのモデルラットを用い検体数を増やしていく計画である。検体採取・保存・組織の免疫染色・AQPの定量解析を行っていく。今年度は研究計画の推敲(学会・研究会等で専門家の意見収集)および予備実験の遂行に時間を要した。
植物細胞の運命を決める位置情報伝達経路の解明

研究代表者は本研究課題で、シロイヌナズナの位置依存的な遺伝子発現を決める転写因子を同定する新しい手法の開発を目指した。1.昨年度までに転写因子クローンのみを含むone-hybrid用ライブラリーを開発し、ATML1の表皮特異的な発現に十分なシス配列に結合する転写因子をスクリーニングした。結合が予測されていた転写因子が多数得られたことから、この手法が有効であることが示された。今年度は共同研究者との共著で論文を公表した。また、新しく単離された転写因子のうち、コンセンサス結合配列がATML1プロモーターに見つかったものについては、そのシス配列に変異を導入する実験をおこなった。これらの変異による発現パターンの顕著な変化は観察されなかったが、これはATML1の発現が多くの転写因子によって独立に制御されていることが一因と考えている。今後はChIP解析によって植物内での相互作用を確認していく予定である。2.ATML1のシス配列に存在する転写因子複合体を生化学的に精製するための実験も進めた。ATML1のシス配列とレポーター遺伝子(GFP)を含むレプリコンベクターを、Rep遺伝子を持つ系統に形質転換し、GFPの発現が見られるものを選抜した。しかしながら、エタノール誘導系によるRepの誘導は発現制御が難しいことが分かったため、エストラジール誘導性の発現ベクターを利用して再度形質転換体を選抜中である。引き続き系の改良とタンパク精製の予備実験を進めて行く予定である。3.組織特異的な転写活性化能を持つ転写因子をスクリーニングする系の開発も進めた。今年度は二成分による発現制御システムを改良し、形質転換体を得た。現在のところ、GFPとRFPの二種類のレポーターを使うことで、転写因子の発現する場所と機能する場所を同時に可視化できることが確認できた。今後は多くの転写因子を用いて網羅的なスクリーニングを進めていきたい。耕究代表有は、シロイヌナズナのホメオボックス遺伝子であるATML1の位置依存的な発現に必要充分なシス配列に作用する全転写因子を同定するための新しい手法を開発している。1.平成20年度は、約1000の転写因子クローンを入手し、one-hybrid用ライブラリーを作成した。このライブラリーは、ヒストンなどの非特異的なDNA結合因子を含まないので、1μgのライブラリーを形質転換するだけで、ATML1のシス配列に作用する転写因子を同定することができた。また、各クローンの存在量を均一にすることで、植物で転写量が低いと思われる転写因子も選抜することができた。2.また、ATML1のシス配列を含むクロマチン領域の免疫沈降と質量分析を組み合わせて、植物細胞内で転写制御領域に実際に存在している転写因子複合体を生化学的に明らかにする実験も進めている。平成20年度は、(1)レプリコンを持つコンストラクト、(2)レプリコンの複製に必要なRep遺伝子を発現誘導するためのコンストラクト、(3)構成的プロモーターの制御下でタグ付きのGal4とLexA発現するためのコンストラクトをホモ接合体として持つ形質転換体を作製した。3.さらに、シロイヌナズナの全転写因子の中で、特定の細胞・組織でのみ転写活性化能を持つ転写因子を半網羅的にスクリーニングすることで、位置情報を伝達する転写因子の候補を探している。平成20年度は、転写因子とGal4のDNA結合部位の融合タンパク質を、構成的なプロモーターを用いて植物全体で発現させるためのGateway対応ベクターを作製した。また、転写活性を検出するためのレポーター系統の作製、ホモライン化をおこなった。Gal4にVP16転写活性化部位を融合させたものをこれらの系統で発現させたところ、レポーター遺伝子の発現を確認することができた。研究代表者は、シロイヌナズナのホメオボックス遺伝子であるATML1の位置依存的な発現に必要充分なシス配列に作用する全転写因子を同定するための新しい手法を開発している。1.平成20年度に既に開発した転写因子クローンのみを含むone-hybrid用ライブラリーを用いて、ATML1のシス配列に結合する転写因子をスクリーニングした。候補の転写因子を植物で過剰発現し、また推定される結合配列に変異を導入して、ATML1の発現パターンに与える影響を観察した。2.ATML1のシス配列を含むクロマチン領域の免疫沈降と質量分析を組み合わせて、植物細胞内で転写制御領域に実際に存在している転写因子複合体を生化学的に明らかにする実験について、平成21年度は、レプリコンの複製に必要なRep遺伝子の発現を誘導できる形質転換植物を選抜し、ホモ系統を確立した。また、レプリコンベクターの改良もおこない、少ない形質転換回数で解析に必要な系統が得られるように工夫した。3.シロイヌナズナの全転写因子の中で、特定の細胞・組織でのみ転写活性化能を持つ転写因子を半網羅的にスクリーニングすることで、位置情報を伝達する転写因子の候補を探す実験では、発現系の改良をおこなった。多くの転写因子は過剰発現すると植物体が致死になる可能性が高いため、二成分による発現制御システムを活用し、胚発生において転写因子の活性を可視化できるコンストラクトの作製と、植物への形質転換をおこなった。