hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
成体内神経幹細胞におけるエピジェネティックス制御の解明

DNAのメチル化は哺乳類ゲノムに見られる唯一の化学修飾で、ヒストン修飾と共にクロマチン構造を制御するエピジェネティック機構の中心となる。体を構成するすべての細胞のゲノムにはDNAメチル化領域が存在する。各領域で細胞や組織の種類に特有のメチル化状態が形成され、これらが集合して各々の細胞や組織に固有のDNAメチル化プロファイルが構築される。細胞、組織間でDNAメチル化プロファイルを比較すると、メチル化状態が異なる領域が多数見出されることになり、こうした領域は、組織特異的DNAメチル化可変領域(Tissue-dependent and Differentially Methylated Regions,T-DMR)と定義される。本研究では、成体内神経幹細胞特異的なDNAメチル化状態を解析する基盤として、様々な組織、細胞のDNAメチル化プロファイルの解析を行った。まず、Real Time PCRを用いたDNAメチル化感受性定量的PCR法により、18種類のマウス組織、細胞間で221か所のNot I認識部位のメチル化率の定量と階層的クラスタリングを行った。さらに、当研究室で開発されたD-REAM(T-DMR profiling with restrictiontag-mediated amplification)法により、マウス肝臓、腎臓、成体脳、筋芽細胞、筋、ES細胞、胎生11.5日、14.5日の胎仔脳に由来するニューロスフィア間でDNAメチル化プロファイルを解析、比較した。申請者が神経幹細胞の増殖抑制能を明らかにしたPSP遺伝子に着目すると、本遺伝子プロモーター領域(転写開始点上流6kbから下流2.5kb)に複数のT-DMRが検出された。また、ES細胞に比べ、これらのT-DMRの中にはPSP遺伝子の発現が認められている肝臓、腎臓で共通した低メチル化領域が認められた。一方、ニューロスフィアでは、これらのT-DMRでは低メチル化傾向と高メチル化傾向を示す領域が共に検出され、他組織とは異なる特有のパターンが検出された。今後PSP遺伝子のみならず、ゲノムワイドなDNAメチル化プロファイルの比較から神経幹細胞に特異的な複数のT-DMRの検出し、成体内神経幹細胞におけるDNAメチル化状態の解析に応用できると考えられる。本研究室ではこれまで、Restriction Landmark Genomic Scanning(RLGS)法を用いたゲノムワイドなDNAメチル化解析によって、組織、細胞特異的なDNAのメチル化プロファイルが構築されていた。このRLGSによる結果とゲノムデータベースを基にしたコンピューター上の模擬的RLGS(ViRLGS)の組み合わせにより遺伝子領域の決定が迅速に行えるようになり、各々の遺伝子領域についてReal Time PCRを用いたDNAメチル化感受性定量的PCRによるDNAメチル化率の定量が可能となった。平成18年度はこのDNAメチル化感受性定量的PCRを用いたゲノムワイドなDNAメチル化の解析方法を習得し、遺伝子領域を中心としたNot I座位221箇所について、DNAメチル化率の定量を行った。また、同様に得られた18種の組織、細胞間(脳、肝臓、腎臓、脾臓、骨格筋、精巣、精子、白色脂肪細胞、褐色脂肪細胞、下垂体、胎盤、胚性幹細胞(ES細胞)、胚性生殖細胞(EG細胞)でのDNAメチル化率を比較し、階層的クラスタリングによる組織、細胞間での系統分けを行った。その結果、221箇所のNot I座位において各組織、細胞特異的なDNAメチル化率のパターンが新たに示され、さらに階層的クラスタリングによって18種の組織、細胞間においてどの組織、細胞がDNAのメチル化率が近似し、いかなる細胞系譜に由来するかが示唆された。以上の研究結果はDNAのメチル化という新たな観点による組織、細胞の系統分類に寄与し、今後DNAメチル化プロファイルによる未知の細胞系においても応用可能な研究成果であったといえる。近年、ゲノム上には細胞・組織特異的にメチル化/脱メチル化される領域(T-DMR)が存在し、各々の組織や細胞特異的なパターンを形成していることが明らかになった。申請者らは平成18年度に引き続き、Real Time PCRを用いたDNAメチル化感受性定量的PCR法を使用し、遺伝子領域を中心としたNotI座位221箇所について、18種のマウス組織、細胞間でのDNAメチル化率の定量を行った。その結果221箇所のNotI座位において各組織、細胞特異的なT-DMRが新たに示され、加えて階層的クラスタリングにより組織、細胞間でのDNAのメチル化率の近似性および各々の組織、細胞がいかなる細胞系譜に由来するかが示唆された。(これらの結果は論文として発表した。(下記研究発表欄))さらに平成19年度にはマイクロアレイとDNAメチル化感受性酵素を用いたDNAメチル化解析法D-REAM(T-DMR profiling with restriction tag mediated-amplification method)が申請者の所属する研究室で開発され、約3万もの遺伝子領域でのT-DMRの検出が可能となり、申請者もデータベースの構築に貢献した。肝臓、成体脳、胎生11.5日および14.5日の胎仔脳より作製したニューロスフィアのゲノムから、D-REAMによる解析を行い、申請者がこれまで神経幹細胞での増殖抑制機能を持つことを明らかにしていたPSP(Hrsp12)について解析した。その結果、PSP遺伝子プロモーターのおよそ5kb下流でT-DMRが存在することが示された。しかし、プロモーター上流域ではメチル化感受性酵素切断間のフラグメントが長い等の問題から、T-DMRを本解析方法では抽出することができなかった。現在プロモーター上流域および周辺のDNAメチル化状態を解析中である。

DNAのメチル化は哺乳類ゲノムに見られる唯一の化学修飾で、ヒストン修飾と共にクロマチン構造を制御するエピジェネティック機構の中心となる。体を構成するすべての細胞のゲノムにはDNAメチル化領域が存在する。各領域で細胞や組織の種類に特有のメチル化状態が形成され、これらが集合して各々の細胞や組織に固有のDNAメチル化プロファイルが構築される。細胞、組織間でDNAメチル化プロファイルを比較すると、メチル化状態が異なる領域が多数見出されることになり、こうした領域は、組織特異的DNAメチル化可変領域(Tissue-dependent and Differentially Methylated Regions,T-DMR)と定義される。本研究では、成体内神経幹細胞特異的なDNAメチル化状態を解析する基盤として、様々な組織、細胞のDNAメチル化プロファイルの解析を行った。まず、Real Time PCRを用いたDNAメチル化感受性定量的PCR法により、18種類のマウス組織、細胞間で221か所のNot I認識部位のメチル化率の定量と階層的クラスタリングを行った。さらに、当研究室で開発されたD-REAM(T-DMR profiling with restrictiontag-mediated amplification)法により、マウス肝臓、腎臓、成体脳、筋芽細胞、筋、ES細胞、胎生11.5日、14.5日の胎仔脳に由来するニューロスフィア間でDNAメチル化プロファイルを解析、比較した。申請者が神経幹細胞の増殖抑制能を明らかにしたPSP遺伝子に着目すると、本遺伝子プロモーター領域(転写開始点上流6kbから下流2.5kb)に複数のT-DMRが検出された。また、ES細胞に比べ、これらのT-DMRの中にはPSP遺伝子の発現が認められている肝臓、腎臓で共通した低メチル化領域が認められた。一方、ニューロスフィアでは、これらのT-DMRでは低メチル化傾向と高メチル化傾向を示す領域が共に検出され、他組織とは異なる特有のパターンが検出された。今後PSP遺伝子のみならず、ゲノムワイドなDNAメチル化プロファイルの比較から神経幹細胞に特異的な複数のT-DMRの検出し、成体内神経幹細胞におけるDNAメチル化状態の解析に応用できると考えられる。
ＤＳＢ誘導実験系を用いたジーンターゲッティング効率向上因子のスクリーニング

ゲノム中の特定の部位に任意のタイミングでDNA二重鎖切断を導入する為、誘導型I-SceI発現カセットならびに、I-SceI認識配列を内部に有するLuciferase遺伝子を形質転換したシロイヌナズナを作出し、標的遺伝子切断がジーンターゲッティング効率に及ぼす影響を評価した。その結果、相同組換えの鋳型を形質転換する際、同時に標的遺伝子切断を行うことでジーンターゲッティング効率が5-10倍上昇することが明らかとなった。またプロトプラストにおけるタンパク質の一過的発現系とDNA二重鎖切断誘導を組み合わせ、ChIP法によって発現タンパク質とDNA二重鎖切断部位との結合を評価する系を構築した。H25年度は、b-estradiol処理によって、外来遺伝子であるluciferase(Luc)遺伝子中のI-SceI siteに誘導的にDNA二重鎖切断を導入できるシロイヌナズナを材料に、アグロバクテリウム由来のVirD2を一過的に発現させ、DNA二重鎖切断部位への結合の有無をChIP assayによって解析した。切断誘導あり/なしの条件においてVirD2を発現させ、VirD2と共沈してくるDNAについて解析したところ、切断誘導がある場合、I-SceI site近傍のDNAが共沈しやすい傾向にあり、VirD2が植物ゲノム中のDNA二重鎖切断部位に直接または他のタンパク質を介して結合している可能性も示唆された。しかし、確証は得られていないので、、追試および検出系の改良を予定している。また、b-estradiol処理によって誘導的にLuc内にDNA二重鎖切断を導入できる本材料を利用し、ジーンターゲッティング効率評価系も構築した。I-SceI siteを有するLuc遺伝子の上流にはプロモーターが存在しないため、材料となるシロイヌナズナはLucの発現を示さない。相同組換えによってLuc遺伝子上流にプロモーター配列を導入するジーンターゲッティングベクターを作成し、アグバクテリウム経由で形質転換したところ、I-SceIの発現を誘導し、標的遺伝子であるLucを切断することでジーンターゲッティング効率が510倍程度上昇することが確認された。さらに、両端にI-SceI siteを有するジーンターゲッティングベクターを一旦ゲノム内に挿入しておき、I-SceIの発現により、標的遺伝子の切断およびジーンターゲッティングベクターの切り出しを同時に行うことで、さらに10倍程度ジーンターゲッティング効率が向上することが示された。アグロバクテリウムを介して植物ゲノム中に外来遺伝子を導入する場合、DNA二重鎖切断部位に挿入されやすいことが報告されているが、その分子機構については明らかになっていない。そこで、植物核内へ運ばれる、DNA-タンパク複合体(T-complex)のなかで、植物ゲノム中のDNA二重鎖切断部位に結合する因子が存在するか否かをChIP assayにより明らかにするために、まずは実験材料となる植物体を作成した。特定の配列を任意のタイミングで切断できるよう、メガヌクレエースであるI-SceIの認識配列および、誘導的I-SceI発現カセットを形質転換したシロイヌナズナを作出し、b-estradiol処理によるI-SceIの発現誘導で効率的にI-SceI認識配列が切断される系統を選抜した。この植物体からプロトプラストを調製し、T-complexに含まれるVirD2と、YFPのN末端のキメラタンパク質の発現コンストラクトをPEG法によって導入した後、b-estradiol処理することでVirD2発現とI-SceI siteにおけるDNA二重鎖切断誘導のタイミングを合わせることができることを確認した。YFP N末を認識する抗体を用いたクロマチン免疫沈降に着手した。また、DNA二重鎖切断における相同組換えの促進はジーンターゲッティング(GT)の効率化に必須であるが、その効果的な策は見つかっていない。そこで、迅速かつ正確にGT効率を評価できる系を構築し、GT効率が高い変異体または、薬剤処理を見出すことを試みる。前述したシロイヌナズナでは、I-SceI認識配がプロモーターを有さないLuc遺伝子内に配してある。そこでGTによりLuc遺伝子上流にプロモーターを付与できるようなGTベクターを構築し、GTベクター形質転換時にI-SceI発現誘導をかけることで、GT細胞が検出できることを確認した。ChIP assay, GT実験共に、材料となる植物体において、DNA二重鎖切断誘導のON, OFFがきちんと行えることが成功の鍵となる。上記の条件を満たす植物体の選抜に時間を費やしたが、約100個体の独立した形質転換体の中から、I-SceI認識配列を含むLuc遺伝子および、誘導型I-SceI発現カセットを1コピー有し、且つb-estradiol処理によってのみ、I-SceI認識配列の切断が生じる系統を2系統選抜することができた。

これら2系統では、b-estradiol処理によるGT効率の向上も再現性があり、また、植物体全体、根、プロトプラストのいずれにおいても二重鎖切断の誘導がかかることも確かめられた。ChIP assayに関しては、プロトプラストを用いてPEG法によりVirD2-nYFPを発現させる際の形質転換効率や、少ない細胞からのDNA-タンパク複合体の免疫沈降など、課題もあるが、各ステップの条件検討を行うなど、概ね順調に進展している。ChIP assayと同じ植物材料を用いてGT効率評価系を構築する課題においては、Lucの発現を指標にGT細胞を検出できること、I-SceIの発現誘導によりGT効率が向上することを確認している。GT効率の向上が期待される、DNA損傷修復関連因子変異体との交配を進めており、進捗は概ね順調である。ChIP assayに関しては、T-complexに含まれ、DNAと共に植物核内に移行すると考えらる、アグロバクテリウム由来のタンパク質であるVirD2およびVirE2がDNA二重鎖切断部位に結合するか否かを検証する。ChPI assayに用いる材料として、VirD2またはVirE2を発現するプロトプラストを大量に獲得する必要があるので、PEG法によるVirD2, VirE2発現コンストラクトの形質転換の条件についても検討する。ジーンターゲッティング効率評価系の構築ならびに、ジーンターゲッティング効率が高い変異体、薬剤処理の検出については、染色体内相同組換え効率が高い変異体を複数入手しているので、それらの変異体と評価系植物の交配を行い、root transformationにより、根にGTベクターを含むアグロバクテリウムを感染させる際にb-estradiolを処理することで、標的遺伝子切断を伴うGT実験を行う。また近年、ジーンターゲッティングベクターをアグロバクテリウム経由で個々の細胞に送り込むのではなく、最初に植物ゲノム中に挿入しておき、標的遺伝子を切断するのと同時に、GTベクターを切り出すGT法(in planta GT)が発表され、難形質転換植物にも有効なジーンターゲッティング法として注目されている。そこで、H24年度に構築したGTベクターを改変し、標的遺伝子との相同配列の隣接部位にI-SceI認識配列を付加したGTベクターを構築する。GTのアクセプターサイトならびに、誘導型I-SceI発現カセットを有するシロイヌナズナに、改良GTベクターをfloral dip法で形質転換した後、b-estradiol処理を行うことで、GTベクターの切り出しならびにGTが生じる効率を評価する。ジーンターゲッティング(GT)が生じた細胞の検出はルシフェラーゼ(Luc)の発光検出により行うため、基質となるルシフェリンを購入する。また、Lucの発光が検出された細胞でGTが生じていることを遺伝子レベルで解析するため、DNA抽出やPCR, Southern blot,シークエンス解析などの実験を行う予定であり、これらの実験に必要な試薬や消耗品を購入する。
後期アンリ言語論の統合的解釈モデルの構築

前年度は、後期アンリ言語論の理論的原型を求めて、『マルクス』(1976)の「生の潜勢態の現勢化」の分析を行ったが、2018年度はさらに、『受肉』(2000)及び『キリストの言葉』(2002)の記述を踏まえ、言語論と「生の疎外としての経済」と題された『マルクス』第7章との比較考察を行った。後期アンリ言語論は、生の言葉と世界の言葉の対立を軸に展開される。アンリはこの言葉(ロゴス)を一貫して「現出」や「開示」として捉える。その意味では、後期アンリ言語論もまた、前期以来の超越と内在という二つの現出様態に基づく二元論、すなわち「現出の二元論」を踏襲する。ただ、後期アンリの特徴は、前期における極端な二元論を修正し、言語によって二つの現出様態を積極的に架橋しようと試みる点にある。この困難な作業は一方で、「生の言葉」を通じて内在領域内部の豊かさを表現し、それを「生」と「生けるもの」との相互内在的関係として定式化することによって遂行される。ところが他方でこの作業は、この同じ「生の言葉」がいかに内在から超越への転換の契機を含むかという問いへ応答することをも要求する。この課題は、『キリストの言葉』では限定的にしか論じられていない。ただ、それはアンリがこの問いを放置したことを意味しない。というのも、『マルクス』第7章が当該の問いへの暫定的解答とみなしうるからである。事実、アンリは「生の潜勢態の現勢化」を、生の豊かさを表現する運動として捉える一方で、この運動のなかに生が変質する契機を見出している。アンリはそこで「感情」を産出する主観的行為としての「欲求」が、その直接的満足を離れ、いかに貨幣を介した満足、「商品」の際限なき生産を指向する運動へと変質するかを描き出すのである。この変質は「生の目的論の逆転」と呼ばれる。この決定的な過程の分析を通じて、後期アンリ言語論の新たな側面を明らかにすることを試みた。2018年度は、『受肉』及び『精神分析の系譜』(1985)の分析を進めた後、『キリストの言葉』の読解にも着手したが、その結果、言語論の中心的発想が『マルクス』へと遡行することが明らかとなった。そのため、『マルクス』の分析によって補完する形で、後期アンリ言語論の研究を遂行した。この研究に関連して、アンリが参照した戦前のフランス哲学文献調査のため、フランス国会図書館で文献調査を行った。以上の成果は、今後、同志社哲学会のSPD叢書の論文として発表される予定である。なお、それと平行して、アンリと同時代のデリダの著作も参照し、特に「特有語」と「翻訳」をめぐるデリダの思考を手がかりに、アンリ言語論との比較対照を試みた。この一連のデリダの思考は、連作「ゲシュレヒト」(Geschlecht)として断続的に展開されたものだが、それは、アンリと同様、(『言葉への途上』におけるトラークル解釈を中心とした)ハイデガーの言語論を批判的参照軸としながら、初期エクリチュール論の新たな展開を試みたものである。デリダの「ゲシュレヒト」論を読み解くことで、1980年代から1990年代にかけてフランス現象学内部で展開された言語論の一側面が明らかになった。それと同時に、こうした読解は、アンリ言語論の射程と限界を照らす一助となった。その成果は、2019年に同志社大学で行われた国際コロック、「ジャック・デリダと現象学」で発表された。2020年度は本研究課題最終年度にあたるため、これまでの研究成果を踏まえ、後期アンリ言語論の総括に着手する。総括にあたり、「生の言葉」と「世界の言葉」との錯綜した関係に焦点を当て、統合的な解釈モデルを構築する。その際、「生の言葉」が後期アンリにおいて「神のロゴス」として思惟される以上、後期アンリのキリスト教への接近がどのような意味をもつかを明らかにする必要がある。そのために、『キリストの言葉』の分析を改めて整理し、後期アンリ言語論において聖書読解が果たす役割、さらに「キリスト」という(生と諸々の生けるものとの)媒介的存在のもつ重要性について、さらなる考察を進める予定である。その際、次の二つの資料を重視する。第一に、『キリストの言葉』成立過程を窺い知ることのできる、ルーヴァン・カトリック大学アンリ・アルシーヴ発行の『キリストの言葉』準備草稿である。第二に、J.-L.クレティアンによるアンリ言語論に関する論考である。これら二つの資料を踏まえ、『キリストの言葉』における聖書の(言葉(parole)と同語源の)「たとえ話」(parabole)をめぐる記述を精査し、アウグスティヌス言語論に淵源するこの記述が、どのような点で後期アンリ言語論の中核的記述でありうるかを論究する。こうした作業を通じて、『我は真理なり』(1996)、『受肉』、『キリストの言葉』というキリスト教三部作において展開された後期アンリ言語論の全容を解明する。その成果は、『人文学』(同志社大学人文学会)において公表される予定である。アンリにおける生の現象学の言語論の諸前提を明らかにするため、『我は真理なり』(1996)における「生の自己触発」概念を分析した。この書においてアンリは、生を、単に静態的な同一性として捉えるのではなく、むしろ固有の時間構造を備えた動態的な「出来事」として理解する。

さらに、生に「自己産出」の機能を与え、「生けるもの」の生成を理論化するに至る。この生の自己触発概念を起点として、アンリは、言語論に着手する。そこで、本研究は、言語論の前提となる生概念についてより詳細な理解を得るため、生の自己触発の原型となった諸概念の研究に着手した。それが『マルクス』(1976)の「生ける労働の時間」論、及び「諸観念の生成」論である。第一に、アンリは、いかに生が、表象や反省のもつ動態性とは異なる動態性を備えているかを明らかにする。前者は「客観的時間」、後者が「主観的時間」と呼ばれる。客観的時間が、質的に異なる様々な労働を、定量化し、同一の時間地平へと回収する時間であるのに対して、主観的時間は、質的に異なる労働を、「生の潜勢態の現勢化」の過程へと統一する。客観的時間の統一が抽象的で観念的な同一性であるのに対し、主観的時間の統一は、生の現実化の運動そのものとして、具体的な実質を備えている。この生の現実化の運動こそ、生ける労働の時間である。第二に、この時間概念から、アンリは、「生の潜勢態の現勢化」こそ、生の動態性であること、さらにこの動態的過程のただ中で、様々な表象や観念、概念もまた、生成することを明らかにする。したがって、『マルクス』は、単に生を、自己触発の直接的同一性に限定せず、表象や概念といった媒介的な事態をも支える、より豊かな出来事として、探究している。以上の分析から、本研究は、『マルクス』が、『我は真理なり』の生概念、及びそれに支えられた言語論にとって決定的に重要な役割を果たすことを明らかにした。当初、平成29年度は、『我は真理なり』で前提される記号理解の研究を予定していた。しかし、『我は真理なり』の詳細な読解を進めていくなかで、予定を一部修正し、『我は真理なり』以前の著作に遡行する必要性を感じた。理由は次の通りである。第一に、アンリが『我は真理なり』で用いている諸概念が、聖書の記述に依拠しながら規定され、十分な哲学的規定を与えられていないことが挙げられる。いかに自身の生概念が、聖書の読解において有効に機能するかを暗に示そうとする論述は、アンリにとってすでに生概念の核となる部分がすでに完成していることを示唆するものである。第二に、生の動態的構造についてはすでに規定済みであるかのような扱いを受けている。実際、『顕現の本質』を参照させる箇所もあり、『我は真理なり』の段階では、より詳細な規定が与えられていない可能性が感じられた。そのため、生の動態的構造や生けるものの生成といった、記号的構造のヒントとなる諸概念を、当初『我は真理なり』に依拠して分析しようと予定していた本研究は、『我は真理なり』以前の『マルクス』まで遡って、生概念についてのより詳細な哲学的規定を探し求める作業に着手した。その結果、『我は真理なり』の論述からは得られない、具体的な分析を見出し、当初の予定と変わらぬ、言語論に関する、有益な結果を得ることができた。なお、ルーヴァン大学への滞在が予定されていたが、Edition Hermann、及びFondation Meyerの招聘により、国際コロック登壇、及び1週間パリ滞在の機会を得たため、予定を変更した。この期間中、『マルクス』の研究成果を発表しただけでなく、Emmanuel Cattin、Alexender Schnellら、コロック参加の研究者らとの意見交換を行い、研究進展の一助とした。
子どもの交通事故と防犯対策を考慮した通学路の計画・空間設計手法の検討

登下校時の通学路上で発生する交通事故や路上犯罪・不審行為は、子どもの日常生活の安全を脅かす重大な要因である。そこで本研究は、通学路のネットワーク・空間の設計や交通規制などの交通計画的手法による交通安全・防犯対策の検討のため、子どもの存在状況や道路空間の物理的要因が交通事故および路上犯罪・不審行為の発生に与える影響を定量化するモデルを作成した。モデルを福岡市内の中学校区で生徒が被害者となる交通事故や路上犯罪・不審行為事例に適用したところ、学校からの距離とそれらの発生の関係を再現することができた。さらに、物理的要因が事故や犯罪に与える影響度を定量化することができた。登下校時の通学路上で発生する交通事故や路上犯罪・不審者出没は,子どもの日常生活の安全を脅かす大きな要因である.これらの発生には通学路周辺の子どもの存在状況と道路空間に関する物理的要因が影響しており,影響要因の制御によって抑制が可能であると考えられる.そこで本研究は,通学路のネットワーク・空間設計や交通規制などの交通計画的手法による交通安全・防犯対策の効果を検討することを目的とし,子どもの存在状況や道路空間の物的要因が交通事故および路上犯罪・不審者出没に与える影響の定量化を試みる.当該年度においては,予定していたもののうち,路上犯罪・不審者出没と児童の存在状況および通学路の物的要因の関係の分析と定量化を行った.今回は中学生が被害者となる通学路上の犯罪・不審者出没を対象に,中学生の登下校行動と通学路の物的要因が与える影響を定量化する数学モデルの作成を行った.モデルは校区内の任意の地点の路上犯罪・不審者出没を目的変数,中学生の登下校行動および通学路空間の物的要因に関する物理量を説明変数とした.各要因には犯罪発生・不審者出没に対する影響度を表すパラメータを導入した.このモデルに実際の校区から得たデータを適用し,各要因のパラメータを変動させながら,モデルの再現性を検討し,その上でパラメータの考察を行った.路上犯罪・不審者発生状況と中学生の登下校行動については,福岡市内の中学校1校を対象にアンケート調査を行い,データを収集した.調査項目は,登下校時刻・所要時間やルート,犯罪・不審者との遭遇地点・時刻・内容などである.道路の物的要因については,現地調査を行った.調査項目は,交通量・沿道施設の状況・街灯の有無などである.モデルを実際の校区の事例に適用した結果,学校から任意の距離での犯罪・不審者出没分布を良好に再現し,各要因の影響度を定量的に表現し,用印鑑の影響度の比較ができた.登下校時の通学路上で発生する交通事故や路上犯罪・不審者出没は,子どもの日常生活の安全を脅かす大きな要因である.これらの発生には通学路周辺の子どもの存在状況と道路空間に関する物理的要因が影響しており,影響要因の制御によって制御が可能であると考える.そこで本研究は,中学生を対象に,通学路のネットワーク・空間設計や交通規制などの交通計画的手法による交通安全・防犯対策の効果を検討することを目的とし,中学生の存在状況や道路空間の物的要因が交通事故および路上犯罪・不審者出没に与える影響の定量化を試みる.当該年度においては,当初前年度に実施予定であった交通事故と中学生の登下校行動および通学路の物的要因との関係の定量化を目的とした数学モデルの作成を行った.モデルは校区内の任意の地点の交通事故の発生指標を目的変数,中学生の登下校行動と通学路空間の物的要因に関する物理量を説明変数とした.各要因には交通事故に対する影響度を表すパラメータを導入した.特に,中学生はこれまで研究代表者らが対象としてきた小学生と比べて下校時刻が遅いため,通学路の明るさに関する物的要因を新たにモデルに追加した.このモデルに実際の校区から得たデータを適用し,各要因のパラメータを変動させながらモデルの再現性を検討し,その上でパラメータの考察を行った.交通事故と中学生の登下校行動については,福岡市内の中学校1校を対象にアンケート調査によりデータを収集した.調査項目は,登下校時刻・所要時間やルート,交通事故およびその可能性のあった地点・時刻・内容などである.道路の物的要因については,現地調査によりデータを収集した.調査項目は,交通量・路上と沿道の施設の状況・照度などである.モデルを実際の校区の事例に適用した結果,学校から任意の距離での交通事故分布を良好に再現し,各要因の影響度を定量的に表現し,要因間の影響度の比較ができた.登下校時の通学路上で発生する交通事故や路上犯罪・不審者出没は,子どもの日常生活の安全を脅かす大きな要因である.これらの発生には通学路周辺の子供の存在状況と道路空間に関する物理的要因が影響しており,影響要因の操作によって制御が可能であると考える.そこで本研究は,中学生を対象に,通学路のネットワーク・空間設計や交通規制などの交通計画的手法による交通安全・防犯対策の効果を検討することを目的とし,中学生の存在状況や道路空間の物的要因が交通事故および路上犯罪・不審者出没に与える影響の定量化を試みる.申請当初は当該年度の前年に当たる平成26年を最終年度としていたが,平成26年12月から平成28年1月まで産前・産後および育児休業による中断をしていたことより,期間延長申請を行い,受理されたことで平成28年度が最終年度となった.当該年度(平成27年度)においては,活動期間が3か月と短期であったため,主にこれまでの研究成果の公表を行った.

まずは,研究代表者が会員として所属する公益社団法人土木学会の土木学会論文集D3(土木計画学)に「中学生との遭遇機会と通学路の物理的環境要因が不審者出没に与える影響に関する研究」と題した論文を投稿し,査読の結果登載された.次に,同学会の第52回土木計画学研究発表会にて「通学路周辺の物理的環境が中学生の交通事故危険性に与える影響に関する研究」と題した講演を行った.さらに,同学会の土木計画学研究委員会内の「少子高齢社会における子育てしやすいまちづくり研究小委員会」に委員として参加し,本研究に関する情報収集・交換を行った.当初は平成26年度が最終年度であったが,同年12月より平成28年1月まで産前・産後および育児休業による中断をしていたため,遅れている.これについては,中断申請と合わせて期間延長申請を行い,平成28年度までの延長が認められている.登下校時の通学路上で発生する交通事故や路上犯罪・不審者出没は,子どもの日常生活の安全を脅かす大きな要因である.これらの発生には通学路周辺の子どもの存在状況と,道路空間に関する物理的要因が影響しており,影響要因の操作によって制御が可能であると考える.そこで,本研究では中学生を対象に,通学路のネットワーク・空間設計や交通規制などの交通計画的手法による交通安全・防犯対策の効果を検討することを目的とし,中学生の存在状況や道路空間の物的要因が交通事故および路上犯罪・不審者出没に与える影響の定量化を試みた.特に,これまで研究代表者が実施してきた小学生対象の同様の研究に比べ,下校時刻が夕刻から夜間になる中学生では物的要因に新たに明るさに関する要因の影響を考慮した.具体的には,犯行企図者の視認距離と照度の関係を定量化しモデルに導入した上で,物的要因として新たに現場周辺の照度を追加した.作成したモデルは実際の中学校区で発生する交通事故および犯罪・不審者発生の学校からの距離分布を再現する結果となった.登下校時の通学路上で発生する交通事故や路上犯罪・不審行為は、子どもの日常生活の安全を脅かす重大な要因である。そこで本研究は、通学路のネットワーク・空間の設計や交通規制などの交通計画的手法による交通安全・防犯対策の検討のため、子どもの存在状況や道路空間の物理的要因が交通事故および路上犯罪・不審行為の発生に与える影響を定量化するモデルを作成した。モデルを福岡市内の中学校区で生徒が被害者となる交通事故や路上犯罪・不審行為事例に適用したところ、学校からの距離とそれらの発生の関係を再現することができた。さらに、物理的要因が事故や犯罪に与える影響度を定量化することができた。まずは前年度予定であった交通事故に関する分析やモデル化を実施したこと,さらに産前・産後および育児休業による中断をしたことから,今年度の実施予定の道路計画・空間設計手法の検討を行うことができなかった.平成27年度終了時点で,予定していた実施計画内容のほとんどが完了しており,最終年度である平成28年度内で本研究課題を終了することが可能であると考えている.最終年度に予定している,これまでの結果を用いた道路計画・空間設計手法の検討については,交通事故と防犯に関するモデルで取り扱った要因が若干異なることからシミュレーションなどの定量的分析は難しいと考えている.
屋内空間の記憶と道順学習の神経機構

私達は,環境の空間的な配置を脳内に再現することによって自分の位置を認知し,また種々の日常生活行動を営んでいる。このしくみを認知地図(cognitive map)という。この認知地図に関係した神経機構を調べるために,人工現実感(バーチャル・リアリティ;virtual reality)で仮想空間内をジョイステックを操作して,最終目標の部屋までの道順を覚える探索行動課題を成熟したニホンザル2頭に学習させた。1.行動学的特徴:訓練はまず,出発地点から3方向(左,右,直進)を選択する課題を学習させた(第1の訓練)。それが成功すると,さらに2番目の出発地点からの探索行動課題の訓練(第2の訓練)を行った。その結果,第2の訓練時間は最初の訓練時間よりも短時間であることが示された。さらに,新しい出発地点から次の地点に行く方向を見つけるのに要する時間は,第2の訓練終了後の方が第1の訓練終了後よりも短いことが明らかになった。2.ニューロン活動の特徴:上頭頂小葉内側領域(7m)から364個のニューロンが記録できた。記録されたニューロンには,仮想空間内のある特定の場所やゴールの部屋のドアの前に来ると発火頻度の増加する場所細胞(place cell)と呼ばれる種類のニューロンがあった。記録されたニューロンのうち,150個(41%)のニューロンは3つの動き(左,右,直進)のうちの少なくとも1つに反応し,56個(15%)は運動選択性を示し,その活動は運動のタイプによって変化した。運動選択性ニューロン(movement-selective neurons)のうち,42個(75%)は位置に対して選択性があり,人工現実感での仮想環境内の位置によって運動による反応性は変化した。これらのニューロンは,サルがある特別な位置で,特定の運動を行った時に活動し始めることから,目的地への経路に伴う重要な情報を表わしていると思われる。成熟したニホンザルを用いて,人工現実感(バーチャル・リアリティ;VR)で仮想空間内をジョイステックを操作して,最終目標の部屋までの道順を覚える学習課題を行った。人工現実感は2階建ての建物内で,1階に8部屋,2階に7部屋の合計15部屋があり,それぞれの室内にはテーブル,椅子,キャビネット,本棚,コンピュータ,動物用ケージなどを備え,各部屋に特徴を持たせた。また,上下階の移動はエレベーターで行えるように設定した。本年度は,1階の4部屋と2階の1部屋の含わせて5部屋の建物内での配置を覚え,最終目標の部屋に到達すると,報酬としてジュースがもらえる課題を学習させた。訓練の第1段階は,パイロットの動きに合わせて,サルがジョイステックを操作し,その後を追従する課題(視覚誘導課題)を学習させた。第2段階は,サルはジョイステックを操作しない状態で,まずスタート地点から最終目標の部屋までの道順を自動的に移動して,その道順を記憶させた後,実際にサルにジョイステックを操作させて,先程記憶した部屋に行く課題(視覚記憶課題)を学習させた。現在は,第3段階として,目標の部屋の内部の場面を呈示し,サルがその呈示された部屋の場所を記憶し,パイロット(視覚誘導)なしでジョイスティックを操作して,目標の部屋に行く課題(記憶誘導課題)を学習させ,現在ではほぼ完全にこの課題を遂行できるようになった。以上のように,本年度はサルでの認知地図の学習過程の行動学的な検索を行った。

次年度は,この道順課題を学習したサルを用いて,空間内の環境を基にした脳内表現に関連した海馬と,道順の経路上にある障害物の相対的な位置の情報処理に関係した頭頂連合野からニューロン活動を記録し,道順課題遂行中のニューロン活動の性質について解析を行いたい。成熟したニホンザルを用いて,人工現実感(バーチャル・リアリティ;VR)で仮想空間内をジョイステック(JS)を操作して,最終目標の部屋までの道順を覚える学習課題を行った。人工現実感は2階建ての建物内で,1階に8部屋,2階に7部屋の合計15部屋があり,それぞれの室内にはテーブル,椅子,キャビネット,本棚,コンピュータ,動物用ケージなどを備え,各部屋に特徴を持たせた。また,上下階の移動はエレベーターで行えるように設定した。昨年度は,1階の4部屋と2階の1部屋の合わせて5部屋の建物内での配置を覚え,最終目標の部屋に到達すると,報酬としてジュースがもらえる課題を学習させた。訓練には3つの段階があり,第1段階はパイロットの動きに合わせて,サルがJSを操作し,その後を追従する視覚誘導課題,第2段階はまず初め,サルはJSを操作しないで,スタート地点から最終目標の部屋までの道順を自動的に移動し,その道順を記憶させた後,実際にサルがJSを操作して,先程記憶した道順を思い出して部屋に到達する視覚記憶課題,第3段階は目標の部屋の内部の場面を呈示し,サルがその呈示された部屋の場所を記憶し,パイロット(視覚誘導)なしでJSを操作し,目標の部屋に到達する記憶課題である。昨年度は第3段階の記憶課題をほぼ完全に遂行できるようなレベルに達した。今年度は,この道順課題を学習したサルの上頭頂小葉内側面(7m)領域から記憶課題遂行中のニューロン活動の記録を行った。記録されたニューロンの中にはある特定の場所に来ると反応する場所細胞(place cell)と呼ばれるものがあり,これは目的の部屋までの道順のある特定な場所を記憶していると考えられる。次年度はさらに記録実験を行い,道順課題遂行中のニューロン活動の性質についてさらに詳細な解析を行いたい。私達は環境の空間的な配置を脳内に再現(representation)することによって自分の位置を認知し,また種々の日常生活行動を行っている。これを認知地図(cognitive map)という。この認知地図に関係した神経機構を調べるために成熟したニホンザル2頭を用いて,人工現実感(virtual reality)による仮想空間内をジョイステック(JS)を操作して,最終目標の部屋までの道順を覚える探索行動課題(navigation task)を訓練し,上頭頂小葉内側領域(PGM野およびその付近)からニューロン活動を記録した。人工現実感は2階建ての建物内で,1階に8部屋,2階に7部屋の合計15部屋があり,すべての部屋は廊下またはエレベーターで連絡している。探索行動の開始の合図として,各タスクの最初に最終目標の部屋の内部のイメージが呈示された。訓練はまず,スタート地点(starting-point ; SP)から3方向(左,右,直進)を選択する課題(タスク)を学習させた。それが成功すると,さらに2番目のSPからの探索行動課題の訓練を行った。サルは15の部屋のうち,5つの部屋へ行く経路を学習した。行動学的なデータでは,第2の訓練時間は最初の訓練時間よりも短時間であることが示された。さらに,新しいSPから次に行く方向を見つけるのに要する時間は第2の訓練後の方が短かった。
内因性神経活性物質の研究(総括班)

1.特定研究「内因性神経活性物質の研究」の総括班として昨年度に引続き本年度もこの領域の研究を飛躍的に発展させるため、総括班々会議を開催して論議し、総括班シンポジウムを企画、開催した。又、13号にわたってニュースを発行した。年度末には本年度研究報告集を発行、配布した。2.総括班主催の公用シンポジウムは昭和61年12月4日、大阪商工会議所で開催した。そのプログラムは下記の通りである。1)グルタメイトレセプターに対するジョロウグモ毒素の作用(都立神経研川合述史)2)ジョロウグモ毒素の単離と構造決定(東大・薬中嶋暉躬)3)セロトニンニューロン系の免疫組織化学(京府医大佐野豊)4)モノアミン神経伝達物質の生合成の調節(名大・医永津俊治)5)シナプス形成に関与する生体因子(金沢大・がん研三木直正)6)発生過程における神経特異蛋白質の発現(群馬大・医小幡邦彦)7)神経伝達物質受容体と神経ペプチドの相関に関するin vitro実験的研究8)神経系におけるプロティンキナーゼCの局在と役割について(神戸大・医田中千賀子)3.本年度のニュースには総括班々会議の記録、本年度の班構成、各班会議の記録、種々の報告事項の外、ミニレビューとして次の諸文を掲載した。1)新活性物質の急激な増加を見つめて京都大・薬高木博司2)黒質におけるtachykinin物語-その主役争いのミステリ--筑波大臨床医学系金沢一郎3)シナプス形成に関与する神経栄養因子金沢大・がん研三木直正4.本年度の研究報告集に見られるように本年度の研究はかなり大きな進歩があったと思われる。その1、2をあげるとglutamate receptorに働くジョロウグモ毒素の単離、構造決定、ムスカリン様アセチルコリン受容体の【M_1】、【M_2】の構造決定などが明らかになった。
水系での固相合成-Green Chemistryを指向したペプチド合成の開発

ペプチドの合成法には液相法と固相法があり、現在では固相法がその主流となっている。固相法は簡便で合成時間も短く自動化しやすいなどの利点があるが、有機溶媒の使用量が多く、使用後の溶媒は最終的には燃焼処理されている。地球温暖化、ダイオキシン等の有害物質の発生など環境保全という面から有機溶媒の使用は少ない事が望ましい。将来的には毒性の少ない試薬を用い、水中での合成反応が望まれる。この環境保全面を考えた化学合成(Green Chemistryを指向した化学合成)を検討するため、まず水を溶媒とする固相ペプチド合成法を検討し、水系での固相化学合成法を開拓した。まず戦略として水中で反応するために水溶性のアミノ保護基を開発した。まずアミノ保護基として2-[phenyl(methyl)sulfonio]ethoxycarbonyl基を開発し、この保護基をつけたアミノ酸が水溶性であること、緩和な塩基で除去可能な事、簡単なペプチドであれが水溶液中で固相合成可能であることをロイシンエンケファリンを合成して証明した。また同じくアミノ保護基としてethanesulfonylethoxycarbonyl(Esc)基を開発し、この基が付いたアミノ酸を用いて、水溶液中と有機溶媒中でロイシンエンケファリンを合成し、水中でも有機溶媒中でも使える保護基であることを報告した。Pms基はやや不安定、Esc基は水溶性がやや低いこともあり、更に安定で、且つ水溶性の高いアミノ保護基として2-(4-sulfophenylsulfonyl)ethoxycarbony(Sps)基を開発した。Sps-アミノ酸は安定で、且つ高い水溶性を示し、水溶液中でのロイシンエンケファリンの固相法合成を行い、その有用性を証明した。Sps基は水溶性で且つ緩和な塩基条件で除去できる有望な保護基で、ペプチド合成以外にも種々の応用が考えられる。水溶液中でペプチド合成を行う場合、保護アミノ酸が水溶性でないと反応が進まない。水溶性保護基として2-[phenyl(methyl)sulfonio]eyhoxycarbonyl(Pms)基の開発に成功した。phenylthioethanolをphenylthioethylchloroformateに変換した後、これをアミノ酸に導入しphenylthioethoxycarbonyl-アミノ酸とし、次いでヨードメチルで処理してPms-アミノ酸を得ることができた。しかしながらこの方法ではMetやCysは分子内のSがオニウム塩となってしまう為、Pms誘導体を合成する事ができなかった。そこでPmsの活性エステルを作り、これをMetやCysに導入する方法を検討した。まずphenylthioethanolをヨードメチルでオニウム塩とし、これにp-nitrophenyl chloroformateを作用させ、目的とする2-[phenyl(methyl)sulfonio]ethyl-4-nitrophenylcarbonate(Pms-ONp)を得た。本試薬は結晶として得られ、取り扱いに便利である。別途にphenylthioethanolを2-[phenyl(methyl)sulfonio]ethanolとし、ついでホスゲンを作用させて2-[phenyl(methyl)sulfonio]ethoxycarbonyl chloride(Pms-Cl)とし、これをアミノ酸に導入させてPms-アミノ酸を合成する方法を検討した。しかしながらこの方法では、2-[phenyl(methyl)-sulfonio]ethanolが有機溶媒に溶けにくいこと、ホスゲンならびにPms-Clが水に不安定なことからPms-アミノ酸を合成することができなかった。Pms-ONpをもちいて合成したPms-Met-OH, Pms-Gly-OH, Pms-Tyr-OH, Pms-Phe-OHを用いてメチオニンエンケファリンアミドを水溶液中、固相法で合成を試みた。

樹脂として水で膨潤するCLEAR樹脂を用い、縮合剤として水溶性カルボジイミド、反応促進剤としてN-hydroxy-5-norbornene-2,3-dicaboximideを添加した。合成したTyr-Gly-Gly-Phe-Me-CLEARをtrifluoroacetic acidで処理してペプチドを樹脂から切り離し、HPLCで精製して目的とするメチオニンエンケファリンアミドを合成する事ができた。水溶液中でペプチドの固相合成を行うために水溶性のアミノ保護基、2-[phenyl(methyl)sulfonio]-ethoxycarbonyl基(Pms基)を考案し、その導入試薬として2-[phenyl(methy1)sulfonio]ethyl-4-nitrophenylcarbonate (Pms-ONp)を開発したが、Pms-ONpとアミノ酸を反応させてPms-アミノ酸を合成する際に遊離する4-nitrophenolは環境問題からは好ましくない試薬である。そこで4-nitrophenolより毒性の少ないN-hydroxysuccimide (HOSu)とN-hydroxy-5-norbornene-endo-2,3-dicarboximide (HONb)に注目し、Pms-OSuとPms-ONbを合成した。Phenylthioethoxycarbonylchloride (Pte-Cl)とHOSu(またはHONb)を反応させPte-OSu(またはPte-ONb)を合成し、次いでmethyl iodideとsilver tetrafluoroborateを反応させPms-OSu(またはPms-ONb)を得た。Pte-OSu, Pte-ONbともに水溶性の高い、そして反応性の高い試薬であったが、安定性があまり良くなく、精製を繰り返すと逆に分解するなどの欠点があったが、これら試薬を使って種々の側鎖を持つ側鎖保護Pms-アミノ酸を合成することができた。水溶液中のみならず、場合に応じて有機溶媒中でも反応できる保護アミノ酸としてethanesulfonyl-ethoxycarbonyl基(Esc基)を考案した。2-ethanesulfonylethanolを2-ethanesulfonylethyl chloro-formate (Esc-Cl)に変換後アミに酸と反応させ、Esc-アミノ酸をえた。しかしながらEsc-Clは不安定で分解しやすいため、より安定なEsc基導入試薬を検討した。2-ethanesulfonylethanolに4-nitro-Phenyl chloroformateを反応させ、ethanesulfonylethyl-4-nitrophenyl carbonate (Esc-ONp)とした後、これとアミノ酸を反応させEsc-アミノ酸を得ることができた。
メタボロミクスを用いた向精神薬多剤併用による突然死の病態解析と法医診断への応用

向精神薬多剤併用による突然死の法医診断マーカーおよびメカニズムの解明を目的に、GC-MS/MSを用いたメタボロミクス解析法で、単剤投与および多剤併用動物モデルの血漿中の代謝物の変化を経時的に検討した。多剤併用モデルにおいて93種類の代謝物が検出され、特に投与12時間後において解糖系、TCA回路、脂質代謝といったエネルギー産生に関係した代謝物に特徴的な変動を認めた。本研究は、代表的な向精神薬を投与した小動物モデルを用いて、質量分析法を用いたメタボロミクス技術によって生体内の代謝物の変動を網羅的に解析し、突然死にいたる病態メカニズムの解析および法医診断に有用なマルチバイオマーカーの探索を目的とするものである。平成27年度は当初の計画に沿って、分析にあたっての各種臓器の試料前処理および分析条件の検討を行った。順次、急性中毒モデル実験を施行する予定である。急性中毒モデル作成にあたっての薬物用量設定や、試料採取時期等の詳細な条件設定の検討が遅れているため。多剤併用モデルを検討するにあたり、単剤での血清中代謝物の変化を確認することが必要であると考えられ、Chlorpromazine(CPZ), Clomipramine(CPM), Paroxetine (PAR), Flunitrazepam(FLU)の投与量について、ラットを用いて検討を行った。その結果、CPZ(10mg/kg), CPM(10mg/kg), PAR(10mg/kg), FLU(3mg/kg)を投与することに決定した。また、同様に、試料採取時間の検討を行い、投与前、投与3, 6, 12, 24, 48時間後の6点で採取することとした。結果、本試験として、SD系雄性ラット(16週齢)にそれぞれの薬物を上記投与量で腹腔内投与し、投与前、投与3, 6, 12, 24, 48時間後に採血し、速やかに血清を分離した。血清からクロロホルムーメタノール溶液(2:5, v/v)で抽出を行い、メトキシアミンとMSTFAで誘導体化後、GCMS-TQ8030で分析を行った。代謝物データはSIMCA-P+ (Umetrics, ver.13)で多変量解析を行った。同時に、体温変化、症状の記録を行い、薬物血中濃度も測定した。さらに、多剤併用モデル作成にあたり、それぞれの薬物の投与用量設定を行った。単剤投与実験が終了し、分析結果が得られたため。急性中毒モデル作成にあたっての薬物用量設定や、試料採取時間などの詳細な条件設定の検討が遅れているが、順次解決していく。メタボローム解析に用いるデータベースについては、市販のデータベース等も活用していく。多剤併用モデルにおける実験を行い、単剤時との比較、さらに、組み合わせにおける特徴的な代謝物変動の有無について検索し、特異的バイオマーカーの可能性および突然死にいたるメカニズムとの関係について検討する。法医学動物実験の施行の予定がやや遅れているために、次年度使用額が生じた。ラットの使用数をできるだけ削減したことや、使用する薬物の種類数を減らしたことなどで、次年度使用額が生じた。動物実験の条件設定の課題が解決され次第、順次実験を施行し、使用していく予定である。多剤併用モデルの実験およびメタボロミクス解析にあたっての消耗品、分析機器のメンテナンス、解析用コンピューターの購入が必要になる可能性があり、それらに使用する予定である。
HGFアンタゴニストを用いた膵・胆道癌の浸潤・転移,腹膜播種に対する新しい治療

申請者らは膵癌の浸潤・転移には膵癌組織中の豊富が線維芽細胞から放出されるHGFが重要な役割を果たしていることを見出した。さらにHGFの分子内断片であるNK4はHGFの作用を拮抗的に阻害するのみならず、血管新生をも阻害することに着目し、新しい膵癌治療法を確立することを研究の目的としてきた。これまでにHGFが膵癌細胞の浸潤を強く促進し、NK4の添加によりin vitro系で細胞の浸潤が強く抑制され、ヌードマウスを使った実験でも膵癌細胞の浸潤・転移が抑制されることを明らかにした。今年度はアデノウイルスヴェクターを用い、NK4遺伝子を膵癌細胞あるいは癌周囲組織中の細胞に導入することによりNK4を長期的に高濃度で癌細胞に作用させ、浸潤・増殖を強く抑制させることに成功した。つまり、in vitro系においてNK4遺伝子を導入された癌細胞はNK4蛋白を高濃度に産生し、HGFによって促進されるはずの浸潤能が強く抑制された。また膵癌細胞株をヌードマウスの皮下に移植すると細胞は増殖し腫瘍を形成するが、NK4を導入された腫瘍細胞の増殖は有意に抑制された。組織学的には腫瘍周囲の血管数が少なく、これは免疫組織学的にも確認でき、NK4による血管新生抑制作用による腫瘍増殖抑制効果と考えられた。更に一度生着したヌードマウスの皮下腫瘍の周囲にAdv-NK4を局所投与することにより、腫瘍の増殖が有意に抑制されることが明らかとなった。NK4蛋白は高価であり、反復投与が必要であるが、アデノウイルスを用いることにより比較的長期にわたり高濃度のNK4を局所に作用させることができ、新しい膵癌の治療法としてNK4遺伝子治療は益々期待されうるものと考えられた。今後は臨床応用に向け更なる研究を進める予定である。申請者らは膵癌の浸潤、転移を癌細胞が産生するHGF誘導因子ならびに間質由来のHGFをメディエーターとする癌-間質相互作用による癌悪性化機構を中心に解明し、それに基づきHGFアンタゴニストを用いた膵癌治療の基礎を確立することを目的として研究を進めてきた。In vitro培養系において、HGFはほとんどの膵癌細胞に対し、in vitroにおける遊走、基底膜浸潤を強く促進した。HGFは一部の膵癌細胞に対して増殖促進作用も認めた。ほとんどの膵癌細胞はc-Metレセプターを発現したHGFのターゲットであることを確認した。そしてc-Metの発現の強度はin vitro培養系における膵癌細胞の遊走、浸潤に対するHGFの促進作用と相関していた。また、膵癌細胞培養上清を間質線維芽細胞培養系に添加すると、線維芽細胞のHGF産生量が増加した。一方、膵癌細胞自体は有意なHGF産生を認めなかった。膵癌細胞と線維芽細胞をco-cultureすると膵癌細胞単独培養群に比して膵癌細胞の遊走が著明に促進された。申請者らは膵癌細胞の浸潤、転移は癌-間質相互作用によって大きく影響されていることをin vitro培養系にて見いだした。HGFアンタゴニスト(NK4)はin vitro培養系でHGFによって促進された膵癌細胞の遊走、基底膜浸潤をほぼ完全に阻害した。また、HGFによる膵癌細胞の増殖促進はNK4の添加で阻止された。NK4がin vivoにおいて種々の癌の浸潤、転移を抑制し、さらに血管新生阻害因子として腫瘍血管新生を抑制することは最近明らかにされており、今後、in vivoの膵癌モデルにてNK4の浸潤、転移、腫瘍血管新生に対する抑制効果について解析していく予定である。そして、in vivo実験動物レベルでのHGFアンタゴニスト遺伝子治療法を確立する予定である。