hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
１型糖尿病におけるＴＲＰＡ１，ＴＲＰＭ２チャネル関与の検討

マウス単離唾液腺房細胞の培養系において、TRPV4とANO1が複合体を形成していることを共免疫沈降実験で確認した。マウス単離唾液腺房細胞でカルシウムイメージング法を用いて、TRPV4刺激剤による細胞内カルシウム濃度の上昇とそれにともなう細胞容積の縮小を観察した。このTRPV4刺激剤による細胞内カルシウム濃度の上昇と細胞容積の縮小は細胞外カルシウム依存的であり、TRPV4欠損マウスから調整した単離唾液腺房細胞では観察されなかったことから、TRPV4を介して流入したカルシウムによってANO1が活性化してクロライドイオン流出が水の流出(細胞容積縮小)を惹起しているものと考えられた。加えて、細胞内140mM CsCl、細胞外140 mMNaClの条件下で全細胞型パッチクランプ法によって外向き整流性を示す電流の活性化が観察された。この電流は、TRPV4阻害剤で完全に抑制されたことから、TRPV4の活性化を介して起こっていると考えられた。また、細胞内外140 mMNMDG条件下では、TRPV4刺激剤で外向き整流性を示すクロライド電流の活性化が観察された。こうした実験から、TRPV4活性化によって流入したカルシウムによってANO1が活性化したものと結論した。マウス唾液線からのアセチルコリン刺激による唾液分泌がTRPV4阻害剤で抑制された。マウス単離涙腺房細胞培養系も確立し、アセチルコリンのみならずTRPV4刺激剤で細胞内カルシウム濃度の上昇が観察された。マウス眼からの涙分泌量を測定し、アセチルコリンによる涙分泌がTRPV4阻害剤で抑制された。よって、TRPV4/ANO1機能連関によって涙腺房細胞から水分(涙)の流出が起こっているものと推定した。このように、唾液腺、涙腺での唾液、涙分泌にTRPV4/ANO1機能連関が関わっていることが明らかになった。27年度が最終年度であるため、記入しない。TRPチャネルの1型糖尿病発症への関与の検討を主課題としている。来日してから数ヶ月であり、研究内容はそれほど大きく進んでない。mRNAレベルと蛋白質レベルでTRPM8とTRPA1の発現を、単離培養したマウス膵臓β細胞、マウス由来のMIN6細胞、ラットインスリノーマ由来のINS-1細胞、ラットランゲルハンス島腫瘍由来のRIN-5F細胞で確認した。また、TRPM8とTRPA1のそれらの細胞における機能的発現を、カルシウムイメージング法およびパッチクランプ法で確認しつつあるところである。カルシウムイメージング法では、TRPM8に関しては、刺激物質メントールと誘導体WS-12投与での細胞外カルシウム依存的な細胞内カルシウム濃度上昇を、TRPA1に関しては、共有結合修飾による活性化をおこす刺激物質AITCと共有結合修飾を介さない活性化物質carvacrolによる細胞外カルシウム依存的な細胞内カルシウム濃度上昇を観察した。パッチクランプ法では、全細胞記録法での上記化合物による応答電流の観察を始めたところである。TRPチャネルのI型糖尿病発症への関与の検討を主課題としていたが、進行が思わしくなく、「唾液線および涙腺でのTRPV4/anoctamin 1 (ANO1)機能連関を介した唾液、涙分泌」にテーマを変更して実験を進めた。マウス単離唾液腺房細胞の培養系を確立し、TRPV4およびANO1の蛋白質レベルでの発現をWestern Blotting法、免疫染色法で確認した。また、マウス単離唾液腺房細胞でカルシウムイメージング法を用いて、TRPV4刺激剤による細胞内カルシウム濃度の上昇とそれにともなう細胞容積の縮小を観察した。マウス眼からの涙分泌量を測定し、アセチルコリンのみならずTRPV4刺激剤で涙分泌の増大が観察された。よってTRPV4/ANO1機能連関によって涙腺房細胞から水分(涙)の流出が起こっているものと推定した。このTRPV4刺激剤による細胞内カルシウム濃度の上昇と細胞容積の縮小は細胞外カルシウム依存的であり、TRPV

4欠損マウスから調整した単離唾液腺房細胞では観察されなかったことから、TRPV4を介して流入したカルシウムによってANO1が活性化してクロライドイオン流出が水の流出(細胞容積縮小)を惹起しているものと考えられた。加えて、細胞内140mM CsCl、細胞外140 mMNaClの条件下で全細胞型パッチクランプ法によって外向き整流性を示す電流の活性化が観察された。この電流は、TRPV4阻害剤で完全に抑制されたことから、TRPV4の活性化を介して起こっていると考えられた。また、細胞内外140 mMNMDG条件下では、TRPV4刺激剤で外向き整流性を示すクロライド電流の活性化が観察された。こうした実験から、TRPV4活性化によって流入したカルシウムによってANO1が活性化したものと結論した。マウス唾液線からのアセチルコリン刺激による唾液分泌がTRPV4阻害剤で抑制された。マウス単離涙腺房細胞培養系も確立し、アセチルコリンのみならずTRPV4刺激剤で細胞内カルシウム濃度の上昇が観察された。マウス眼からの涙分泌量を測定し、アセチルコリンによる涙分泌がTRPV4阻害剤で抑制された。よって、TRPV4/ANO1機能連関によって涙腺房細胞から水分(涙)の流出が起こっているものと推定した。このように、唾液腺、涙腺での唾液、涙分泌にTRPV4/ANO1機能連関が関わっていることが明らかになった。マウス単離唾液腺房細胞および涙腺房細胞の培養系の確立に成功し、TRPV4/ANO1機能連関をある程度確認できたと考えている。唾液腺からの唾液放出にANO1が関わることは明らかになっていることから、そのANO1活性化がTRPV4活性化によるカルシウム流出によってもたらされていることを示すデータが得られた。涙腺からの涙分布にTRPV4, ANO1が関わるのは全くあたらし発見であり、それを詰める実験が必要である。また、涙腺からの涙分布にTRPV4活性化が関わることはin vivoで示せたが、唾液分泌にTRPV4/ANO1機能連関が深く関わっていることは、まだ十分には証明できていないので、その検証も必要である。このプロジェクトを始めて約6ヶ月であり、著しい研究進展があったと言ってよい。細胞レベルでの検討は大きく進んでおり、組織レベル、個体レベルでの解析を進めることが望まれる。27年度が最終年度であるため、記入しない。これまでの成果を踏まえ、次のことを進めたい。1TRPV4/ANO1機能連関があることをマウス単離唾液腺房細胞および涙腺房細胞にパッチクランプ法を適用してANO1阻害剤を用いて検証する。2単離唾液腺房細胞および涙腺房細胞での細胞内カルシウム濃度上昇と細胞容積縮小の時間的・量的連関を詳細に解析する。3マウス唾液腺記からのTRPV4ならびにANO1活性依存的な唾液分泌をex vivo実験系を確立して検証する。4TRPV4依存的な唾液分泌が生理的に重要であることを、in vivoで刺激依存的な唾液分泌の差異を野生型マウスとTRPV4欠損マウスで比較検討する。ANO1阻害剤の効果も検討する。
バーチャル空間におけるストレス負荷時の咀嚼筋筋活動状態とそのセルフコントロール

視覚刺激と重心動揺に対する姿勢制御との間におけるフィードバックループの研究がなされている.しかし,咬筋の収縮が姿勢制御におよぼす影響についてはあまり知られていない.本研究では,重心動揺に影響を与える3D動画を用い,軽度の咬みしめと下顎安静位という下顎位の違いが重心動揺に及ぼす影響について検討した.被験者は顎関節症のない5名の男性とし,左右の咬筋,前脛骨筋,腓腹筋に電極を貼付し,バーチャル空間内の重心動揺計に立たせた.そして,被験者には軽度の咬みしめとして,最大咬合力の10%MVCを維持する練習をさせた.下顎安静位は上下の歯の無接触状態を指示した,その後ジェットコースターの3D動画を80秒間観賞させ,明らかに姿勢が変化した時間帯の筋電図と重心動揺のデータを分析対象区間とした.その結果,右側の腓腹筋以外は筋電値は下顎安静位よりも軽度の咬みしめ時の方が有意に高く,下顎安静位よりも軽度の咬みしめ時の方が,重心動揺は有意に安定することが確認できた.以上により,上下の歯の接触は姿勢の安定化に影響を与えると考えられた.視覚刺激と重心動揺に対する姿勢制御との間におけるフィードバックループの研究がなされている.しかし,咬筋の収縮が姿勢制御におよぼす影響についてはあまり知られていない.本研究では,重心動揺に影響を与える3D動画を用い,軽度の咬みしめと下顎安静位という下顎位の違いが重心動揺に及ぼす影響について検討した.被験者は顎関節症のない5名の男性とし,左右の咬筋,前脛骨筋,腓腹筋に電極を貼付し,バーチャル空間内の重心動揺計に立たせた.そして,被験者には軽度の咬みしめとして,最大咬合力の10%MVCを維持する練習をさせた.下顎安静位は上下の歯の無接触状態を指示した,その後ジェットコースターの3D動画を80秒間観賞させ,明らかに姿勢が変化した時間帯の筋電図と重心動揺のデータを分析対象区間とした.その結果,右側の腓腹筋以外は筋電値は下顎安静位よりも軽度の咬みしめ時の方が有意に高く,下顎安静位よりも軽度の咬みしめ時の方が,重心動揺は有意に安定することが確認できた.以上により,上下の歯の接触は姿勢の安定化に影響を与えると考えられた.視覚により姿勢の制御がなされるフィードバックループの存在が知られており,重心動揺に影響をもたらす因子であることが確認されている.しかし,視覚による姿勢制御を行う際に,咀嚼筋の担う役割については未だに不明な点も多い.そこで,バーチャル空間システムで重心動揺に影響を与える3D動画画像を用い,下顎位の違いが,視覚刺激による重心動揺に対する前脛骨筋とヒラメ筋の筋活動に及ぼす影響を検証した.本学男子学生5名を被験者とし,右の咬筋,前脛骨筋,ヒラメ筋にアクティブ電極を貼付し筋電図を双極導出した。実験開始に先立ち,最大咬合力の10%の咬合力(以下,軽度の咬みしめ)を維持する練習をさせた.バーチャル空間システム内で重心動揺計上に立たせ,ジェットコースターに乗車している3D動画を鑑賞させた。下顎位を下顎安静位とした場合と,軽度の咬みしめとした場合の2条件で,バーチャル空間内で重心動揺ならびに筋電図計測を行い,以下の結果を得た.1.すべての被験者で,ジェットコースターの動きが早く激しくなる部分(回転・急上昇・急降下など)や隕石群への突入などのダイナミックな視覚刺激に対し,ヒラメ筋や前脛骨筋の筋活動量が大きくなった.2.下顎安静位よりも軽度の咬みしめ時の方が前脛骨筋とヒラメ筋の筋活動量が増加し,右側のヒラメ筋以外は有意差を認めた.3.下顎安静位よりも軽度の咬みしめ時の方が,視覚刺激の強い時間帯での重心動揺は安定していた.以上の結果から軽度の咬みしめは,前脛骨筋とヒラメ筋の筋活動を賦活化させ,視賞刺激による重心動揺時の姿勢制御に影響を及ぼすと考えられた.バーチャル空間においてジェットコースターに乗っている3D画像を見ることによって重心動揺が生じ、その姿勢制御のために下腿の筋活動が生じること、その際に心拍数に変動を生じることから、ストレス負荷がなされていることを確認し、第118回日本補綴歯科学会学術大会において発表した。また、クレンチングを自覚し咀嚼筋痛を訴える成人20名を対象に日中の生活環境下でバイオフィードバック訓練を行った。実施前(1日目)に比較しフィードバック実験中(2日目、3日目)に有意に筋活動が抑制され、さらにその効果は持続し、フィードバック信号を遮断した状態(4日目)でも実施前に比べ有意に筋活動が減少していた。このことから、試作したバイオフィードバックシステムは、短期間での効果が認められるものと結論できる。その内容をJ Prosthodont Resに投稿し、平成22年度に掲載予定である。以上のことから、バーチャル空間での視覚刺激がストレス負荷を及ぼし、バイオフィードバックシステムが筋弛緩訓練に有効であるとことが明らかとなった。最終年度となる次年度は、ストレス負荷時のセルフコントロールについて検証する予定である。

バーチャル空間においてジェットコースターに乗っている3D画像を見ることによって重心動揺が生じ、その姿勢制御のために下腿の筋活動が生じること、その際に心拍数に変動を生じることから、ストレス負荷がなされていることを確認し、明海歯科医学雑誌40巻(2011)にその成果を発表した。また、クレンチングを自覚し咀嚼筋痛を訴える成人20名を対象に日中の生活環境下でバイオフィードバック訓練を行い、昨年その短期間の効果を報告したが、本年度はその内容をJournal of Prosthodontic Research (2011)に誌上発表した。さらに、これらの被験者のなかで1か月後のデータ採取に参加可能であった3名を対象に長期におよぶ効果を分析した。その結果、咀嚼筋筋電図の聴覚バイオフィードバックの日中クレンチング抑制効果に及ぼす影響が持続することがわかった。これらの結果から、ストレスマネージメントの手段として、長期的な効果が期待でき、歯科の臨床に対し大きな意義を持つ認知行動療法として発展させることの意義を第45回日本顎口腔機能学会(川越)において口頭発表を行った。以上のことから、バーチャル空間での視覚刺激がストレス負荷を及ぼし、バイオフィードバックシステムが筋弛緩訓練に有効であるとことが明らかとなった。日中のクレンチングは顎関節症をはじめ、頭頸部の筋疲労、歯周組織への外傷的な荷重、歯および修復物の破壊などの影響があり、今後の歯科臨床の適応範囲を拡大するうえでその対応が不可欠なパラファンクションである。将来的には、多くの患者を対象として多施設による臨床研究を行うことで、具体的な臨床応用の可能性が高まるものと考える。
カーボンナノチューブの生成に及ぼす金属の効果

前年度に引き続いて,金属を含まない原料グラファイト棒を直流アーク放電で蒸発したときのカーボンナノチューブの生成条件を詳しく調べた.雰囲気ガスの種類をHe,ArあるいはCH_4とし,圧力を10-400Torrと変えたときのナノチューブの生成の仕方の違いや,電極の極性を反転させた場合の効果などについても調べた.(Y.Ando : Fullerene Sci.& Tech.2(1994)pp.173-180,安藤:日本結晶学会誌36(1994)pp.259-263)作製したカーボンナノチューブを10^<-4>Torr程度あるいはそれ以下の真空度の真空炉の中でタングステンヒーターを使って熱処理すると,わづか10分の熱処理でもその太さが2倍以上になることが明らかになった.名大でエネルギー分散型のX線分析装置のついたSEMを借用して分析した結果,タングステンが酸化して蒸発し,それがナノチューブに付着して太くなっていることが解った.その論文はFullerene Sci.& Tech.に投稿して印刷中である.また,ナノチューブの生成条件によっては,生成直後のナノチューブの表面に一面に粒子が付着して,熱処理した場合とよく似たモルフォロジーで太っている場合もあることが解った.それに関しては現在どのような場合にそのような成長が生じるのかを究明中である.原料のグラファイト棒に金属を混入した効果については,前年度にSeを混入させた場合にナノチューブの成長が著しく促進されることを明らかにした.それ意外にもLaやYなどの金属を混入させた場合にも,同様のナノチューブの著しい成長の促進が認められることが解った.これに関しては,現在投稿用の原稿を準備中である.前年度に引き続いて,金属を含まない原料グラファイト棒を直流アーク放電で蒸発したときのカーボンナノチューブの生成条件を詳しく調べた.雰囲気ガスの種類をHe,ArあるいはCH_4とし,圧力を10-400Torrと変えたときのナノチューブの生成の仕方の違いや,電極の極性を反転させた場合の効果などについても調べた.(Y.Ando : Fullerene Sci.& Tech.2(1994)pp.173-180,安藤:日本結晶学会誌36(1994)pp.259-263)作製したカーボンナノチューブを10^<-4>Torr程度あるいはそれ以下の真空度の真空炉の中でタングステンヒーターを使って熱処理すると,わづか10分の熱処理でもその太さが2倍以上になることが明らかになった.名大でエネルギー分散型のX線分析装置のついたSEMを借用して分析した結果,タングステンが酸化して蒸発し,それがナノチューブに付着して太くなっていることが解った.その論文はFullerene Sci.& Tech.に投稿して印刷中である.また,ナノチューブの生成条件によっては,生成直後のナノチューブの表面に一面に粒子が付着して,熱処理した場合とよく似たモルフォロジーで太っている場合もあることが解った.それに関しては現在どのような場合にそのような成長が生じるのかを究明中である.原料のグラファイト棒に金属を混入した効果については,前年度にSeを混入させた場合にナノチューブの成長が著しく促進されることを明らかにした.それ意外にもLaやYなどの金属を混入させた場合にも,同様のナノチューブの著しい成長の促進が認められることが解った.これに関しては,現在投稿用の原稿を準備中である.
インドレアミン・ジオキシゲナーゼ阻害を介した結核に対する新規細胞ワクチンの開発

免疫応答を抑制し,免疫寛容を誘導するindoleamine2, 3-dioxygenase(IDO)を阻害することによって、結核感染症などの細胞内寄生菌に対する樹状細胞(DC)ワクチンのワクチン効果の増強を試み,さらにヒトの感染症におけるIDO活性の臨床的意義を検討した. DCワクチンを1-methyl-L-tryptophan(1MT)で処理することによって, IDO活性が抑制され, IL-10などの抑制性サイトカインの産生が低下し, DCワクチンの抗原提示能が増強することが明らかとなった.また,市中肺炎や肺結核症において,血清IDO活性が予後因子となることを証明した.免疫応答を抑制し,免疫寛容を誘導するindoleamine2, 3-dioxygenase(IDO)を阻害することによって、結核感染症などの細胞内寄生菌に対する樹状細胞(DC)ワクチンのワクチン効果の増強を試み,さらにヒトの感染症におけるIDO活性の臨床的意義を検討した. DCワクチンを1-methyl-L-tryptophan(1MT)で処理することによって, IDO活性が抑制され, IL-10などの抑制性サイトカインの産生が低下し, DCワクチンの抗原提示能が増強することが明らかとなった.また,市中肺炎や肺結核症において,血清IDO活性が予後因子となることを証明した.●マウス骨髄由来の樹状細胞(BM-DC)を,IL-4とGM-CSFを用いて分化誘導させ,磁気分離装置を用いて,CD11c陽性DCをpurifyした.さらに,このBM-DCを,各種Toll-like receprotのリガンド,CpG DNA,LPS,fragelinなどで刺激し,インドレアミン・ジオキシゲナーゼ(IDO)のmRNAおよびタンパクの発現が誘導,増強されることを,real-time PCRとWestern blottingで確認した.●さらに,これらのToll-like receptorのリガンドで刺激したBM-DCの培養液に,tryptophan(Trp)を加え,liquid chromoatography-mass spectrometry(LC-Mass)を用いて,Trpの代謝産物であるkynurenine(Kyn)を測定することによって,IDOの酵素活性を評価することに成功した.●Toll-like receptorのリガンドで刺激し,IDOを誘導したBM-DCに,IDOの選択的阻害剤である1-methyl-L-tryptophan(1-MT)を作用させることによって,in vitroでBM-DCのIDO活性が阻害されることを確認した.●IDOのsiRNSを作成し,mRNAレベルで,IDOの遺伝子発現が減弱することにも成功した.●マウス骨髄由来の樹状細胞(BM-DC)を,IL-4とGM-CSFを用いて分化誘導させ,磁気分離装置を用いて,CD11c陽性DCをpurifyした.さらに,このBM-DCを,各種Toll-like receprotのリガンドで刺激し,インドレアミン・ジオキシゲナーゼ(IDO)のmRNAおよびタンパクの発現が誘導,増強され,さらにその酵素活性をもっていることliquid chromoatography-mass spectrometry (LC-Mass)を用いてTrpの代謝産物であるkynurenine (Kyn)を測定することによって確認した.●次に,Toll-like receptorのリガンドで刺激し,IDOを誘導したBM-DCに,IDOの選択的阻害剤である1-methyl-L-tryptophan(1-MT)を作用させることによって,in vitroでBM-DCのIDO活性が阻害されることを確認した.●TLRリガンドで刺激したBM-DCに,細胞内寄生菌のdominant cytotoxic Tcell (CTL)epitope(リステリア菌のLL091-99など)を添加し,細胞ワクチンとしてBALB/cマウスに接種し,CTL epitope特異的なCTL活性が誘導されることを,LL091-99のtetramerやLLO91-99刺激によるCD8陽性T細胞からのIFNγの誘導能などで解析した.このとき,IDO活性を1-MTで阻害したBM-DC(1-MT BM-DC)と,阻害しないBM-DC(Non-treated BM-DC)とで,dominant CTLepitope特異的免疫誘導能を比較した.予想していたとおり,1-MTでIDO活性を阻害した1-MT BM-DCの方が,Non-treated BM-DCに比較し,より強い特異的免疫を誘導した.(2)各種TLRリガンドで刺激したBM-DCが抑制性サイトカインであるIL-10を産生することを確認した後に,IDOの選択的阻害薬1-methyl-L-tryptophan (1MT)がIL-10産生に及ぼす影響を検討した.さらに,異種リンパ球混合試験(mixed lymphochyte proliferation assay, MLR)によって,1-MT処理がBM-DCの抗原提示能に及ぼす効果を明らかにした.たBM-DCにおいては,IL-10産生が増加したが,1-MT添加によってこのIL-10産生が著明に抑制された.さらに,MLRにおいては,1-MT添加によってBM-DCの抗原提示能が有意に増強することを明らかにした.以上より,通常DCワクチンの成熟刺激として用いる各種TLRリガンドは同時にIDO発現と抑制性サイトカインIL-10産生を誘導するが,1-MT処理によって選択的にIDO活性を阻害すると,この抑制が解除され,DCワクチンの抗原提示能が高まる可能性が示唆された.(3)ヒトの結核感染症や市中肺炎において,血清中のTrpとKynの濃度をLC-Massで測定し,計算したIDO活性と予後との関連を検討し,血清IDO活性が独立した予後規定因子であることを明らかにした.
気候変動への適応力のある社会システム構築に向けた法政策の理論分析

本研究課題は、公正かつ効果的な気候変動適応策を策定・実施できる社会システムの構築をめざし、分配的正義論・責任論・民主制論の先端的知見を活用しつつ原理的考察を行った上で、環境法学・政策分析と接続して法政策を構想することを目的としている。この目的を効果的に達成するため、研究代表者・研究分担者・海外共同研究者により構成される原理班・思考班・構想班に分かれて活動しつつ、全体会合を通じて統合化を推進した。平成30年度には、(1)先端的研究の捕捉の継続、(2)理論構築、(3)共同討議を通じた理論彫琢、(4)中間成果の発表を予定していた。これらの作業はいずれも順調に実施することができた。(2)・(3)については、各班および研究組織全体での研究活動を通じて、現在・過去の温室効果ガス排出への責任と適応策費用の分配原理、長期的問題としての気候危機と民主制の理念、パリ協定後の気候変動政策の構造、気候変動下の流域管理法制の課題などについて、理論の構築と彫琢を重ねた。(4)としては、宇佐美による温室効果ガス排出権の分配と過去の排出への歴史的責任に関する諸論文や、熟議民主制の解明・検討を行った国際会議報告、足立による民主制と長期的問題に関する英語論文や国際会議報告、瀧川が気候変動下の動物の考慮を分析した論文、那須によるナッジに関する論文、松本による水法改革・漁業制度・森林管理関係法等に関する多数の国際会議・国内学会での報告などが挙げられる。平成30年度に予定していた4つの作業、すなわち先端的研究の捕捉の継続、理論構築、共同討議を通じた理論彫琢、中間成果の発表をいずれも順調に実施することができた。平成31年度には、当初予定の通り、理論彫琢を継続し、研究成果の個別的発表を引き続き重ねつつ、最終成果の組織的発表である論文集公刊に向けて準備を加速させる予定である。この目的を効果的に達成するため、原理班・思考班・構想班に分かれて活動しつつ、全体会合を通じて統合化を推進した。平成29年度には、(1)学問的蓄積の共有化、(2)現在の研究状況の把握、(3)主要論点の析出、(4)先端的研究の捕捉を予定していた。(3)としては、気候正義論における温室効果ガス排出権の各分配原理の構造・特徴、民主制における長期的射程をもった政策をめぐる理論的・実践的困難、気候変動下における水法をめぐる現況と課題など、原理的レベルから法政策レベルにおよぶ諸論点が抽出された。(4)の実施を兼ねて宇佐美・足立が参加した第3回公共政策国際会議(ICPP3)の折には、海外共同研究者であるフランク・フィッシャー名誉教授(ラトガーズ大学)およびラウル・レジャノ准教授(ニューヨーク大学)と、最終成果物の公刊を含む今後の研究計画について集中的協議を行った。さらに、(5)中間的成果の発表を多数行うことができた。主要な成果として、宇佐美によるICPP3での気候政策と民主制に関する研究報告や、気候政策における発展の権利を検討した国際会議報告、足立がICPP3で公共政策を考察した招待講演や、わが国の政策分析への評価を行った論文、高村による国際環境法、パリ協定、日本の気候政策その他に関する多数の論文および国際会議招待講演、那須が多元的法理論を論じた英語論文、瀧川が国境の法哲学的考察を行った論文および国際会議招待講演、そして松本による土地所有権の人口論的考察の著書や、富の共有に関する著書などが挙げられる。平成29年度に予定していた4つの作業、すなわち(1)学問的蓄積の共有化、(2)現在の研究状況の把握、(3)主要論点の析出、(4)先端的研究の捕捉について、いずれも順調に実施することができた。それにとどまらず、当初は平成30年度に予定していた(5)中間的成果の発表を、「研究実績の概要」欄に記載の通り、多くの件数行うことができた。

(4)としては、宇佐美による温室効果ガス排出権の分配と過去の排出への歴史的責任に関する諸論文や、熟議民主制の解明・検討を行った国際会議報告、足立による民主制と長期的問題に関する英語論文や国際会議報告、瀧川が気候変動下の動物の考慮を分析した論文、那須によるナッジに関する論文、松本による水法改革・漁業制度・森林管理関係法等に関する多数の国際会議・国内学会での報告などが挙げられる。平成30年度に予定していた4つの作業、すなわち先端的研究の捕捉の継続、理論構築、共同討議を通じた理論彫琢、中間成果の発表をいずれも順調に実施することができた。平成30年度には、当初予定の通り、先端的研究の捕捉を継続しつつ、理論構築を推進し、共同討議を通じて理論彫琢を行った上で、中間成果の発表を実施してゆく。平成31年度には、当初予定の通り、理論彫琢を継続し、研究成果の個別的発表を引き続き重ねつつ、最終成果の組織的発表である論文集公刊に向けて準備を加速させる予定である。
生殖腺体細胞との共培養によるメダカ始原生殖細胞の体外培養

申請者はこれまでに魚類始原生殖細胞(PGC)が凍結保存できることを明らかにしたが、本研究ではPGCを体外にて増殖、配偶子へ分化誘導することを目標に、PGCが赤色蛍光を発するolvas-DsRedトランスジェニックメダカを用いて以下の実験を行った。1、既存マウス由来株化細胞のフィーダー細胞化マウス由来のTM4とSL10という2種類の株化細胞を用い、「温度:28°C、培地:L-15+コイ血清5%」の培養条件下にてPGCとの共培養を行ったところ、両細胞株どちらにおいても増殖とコロニー化は確認されず、マウス由来細胞ではマッチしない可能性が示唆された。2、メダカ由来フィーダー細胞の樹立有用因子を分泌していると考えられるメダカ生殖腺体細胞と、サイトカイン分泌細胞である脾臓細胞をフィーダー細胞として用いるべく、培養法の検討を行った。生殖腺体細胞は培地中に胚抽出液を添加する事で維持・増殖が可能であった。現在、発現因子をmRNAレベルで解析を行っている。脾臓細胞は高濃度での播種及びPWMを培地中に添加することで活発な増殖・維持が可能であることが分かったため、今後はフィーダー細胞としてPGCと共培養を行う予定である。3、因子の漆加培地中へ有用因子の直接添加を行なう事によって、増殖性や生存性に変化があるか検討した。PGCは移動期である受精後3日(3dpf)と定着期である6日(6dpf)胚由来を用いた。その結果、SCF、FGF2、BMP4、TSAを加えた試験区は3dpfと6dpf由来のどちらにおいても、PGCの増殖とコロニー化が確認され、また以前の結果と比較して、PGC数とコロニー形成率の増加傾向が確認された。特に3dpf由来PGCでは、増殖率とコロニー形成率共に他の試験区と比較して有意に上昇した。この結果から、移動期のPGCを用いることが重要であることが示唆された。
神経細胞膜プロゲステロン受容体のラット脳における発現部位と分子機構の解明

近年、ステロイドホルモンであるプロゲステロンの細胞膜受容体と思われるタンパク質(PMBP)がブタの肝臓から同定された。研究代表者はPMBPのラットホモログであるRPMBPの全長cDNAを小脳、卵巣からクローニングし、その塩基配列(約2kbp)を決定した。小脳および卵巣から単離されたcDNAは同一であり、RPMBPの塩基配列はブタPMBPのそれと高い相同性を示した。さらに、ラットの卵巣、小脳、大脳、視床および視床下部、その他の脳組織、からそれぞれRNAを抽出し、RPMBPの発現をノーザンブロット解析した結果、すべての部位においてRPMBPの発現が確認された。これまでに、肝臓、筋肉、腎臓などで発現が確認されているほか、小脳での発現も確認されている。しかしながら、小脳以外の部位での発現に関しては報告されていない。この分子を介して神経細胞の活動が変化しうるかどうか、非常に興味深い。PMBPはその予想される機能から他のホルモンによって発現の調節を受けている可能性が高い。そこで、研究代表者はRPMBP遺伝子の上流域を解析し、他のホルモンによる発現調節に関する情報を得ることを試みた。ラットのゲノムライブラリーからRPMBPをコードするゲノムDNAを単離した結果、3つのポジティブクローンが得られた。これらの塩基配列を決定したところ、これらクローンはすべて同一の塩基配列であった。このゲノムDNAとcDNAの塩基配列を比較したところ、ゲノムDNAにイントロン構造は含まれておらず、さらに十数残基の欠損が確認された。この欠損によりフレームシフトが起こり、クローン化されたゲノムDNAから正常なタンパク質の発現は不可能である。これらのことから今回クローン化されたゲノムDNAはpseudogeneであると推測される。本研究の目的は、ブタの肝臓からプロゲステロンの細胞膜受容体として発見されたタンパク質のラットホモログcDNAをクローニングしそのラット脳内の発現部位を同定すること、およびこの分子の生理的意義、分子的作用機序を明らかにすることである。本研究は2年計画で実施され、本年はその一年目にあたる。本年度の研究により、ラット脳のtotalRNAからRT-PCR法によってラットホモログ全長cDNAのクローニングに成功し、このクローンの全長DNA配列を明らかにした。さらに、ノザン解析の結果、ラット脳のほぼ全域に発現していることが示唆された。また、ゲノム構造を明らかにすること、その上流域の情報を得ることを目的として、ラットゲノムライブラリーをスクリーニングした結果、このタンパク質をコードしていると思われるゲノムクローンの単離に成功している。来年度に継続して行われる予定の実験は、前述ゲノムクローンの制限酵素地図の作成、およびDNA配列の決定である。来年度には、さらに、in situ Hybridization法による詳細な脳内発現部位の同定を目指して実験を行う予定である。また、これと平行してリコンビナントタンパク質を作製する。このリコンビナントタンパク質に対する抗体を得ることは、免疫組織学的研究によるタンパク質レベルでの脳内発現部位の同定を可能にするばかりでなく、免疫沈降法を用いてこのタンパク質の関連分子を同定し、生理的意義を検討することが可能である。これらの研究を来年度も引き続き実施することによって、この分子の生理的役割が明らかになると考えている。
非凍結結晶を用いたタイムラプスX線回折測定による酵素反応の解析

本研究は,近年開発されたHAG法(湿度調整と水溶性ポリマーのコーティングを用いたタンパク質結晶マウント法)をさらに発展させ,温度やpHが正確に制御された環境下での結晶内での酵素反応を直接観察することを目的としている.具体的には土壌細菌由来銅含有アミン酸化酵素(AGAO)を材料とし,酸化的脱アミノ反応におけるpH・温度に依存したコンフォメーション変化と,TPQ生合成過程における前駆体Tyr残基から補酵素TPQへの構造変化の2つに焦点を当てる.本年度は酸化的脱アミノ反応中に観察されるコンフォメーション変化機構のメカニズムを明らかにした.AGAOは,活性中心に補酵素トパキノン(TPQ)および二価銅イオンを含み,第一級アミン類の酸化的脱アミノ反応を触媒する.TPQは前駆体Tyr残基から銅イオン存在下で自己触媒的に生成する.補酵素TPQは銅イオンに配位したOn-Cu型と配位しない構造Off-Cu型の2つの構造をとることが知られており,溶液実験では,On-Cu/Off-Cuの2つのコンフォメーションの割合が温度およびpHに依存することが知られている.このため本年度は, HAG法を用いて,温度およびpHを厳密に制御した環境下でのAGAO反応中間体のX線結晶構造解析を行った.各温度での平衡状態をプロットすることにより,コンフォメーション変化の熱力学的パラメーターを導出することに成功した.さらに,同一温度条件で各pHでの構造を比較することより,構造変化についての重要な知見が得られ,我々がこれまでに提案した反応スキームをさらに拡張できた.また,二つ目のテーマであるTPQ生合成機構についても,試薬,結晶のサイズなどについての予備的検討を開始している.本年度は研究2年目であり,前年度確立した測定条件に基づき本測定を行った.十分な条件検討と予備測定が行われていたため,比較的早い段階で本測定に成功し,年度後半は論文化に注力し,2018年11月に無事論文がアクセプトされた.また,二つ目のテーマであるTPQ生合成機構についても,測定を開始している.予備実験の段階であるが良好なデータが得られ始めており,条件が確立次第本測定を開始する.平成30年度で主要テーマのうちの前半部分を完了できたので,二つ目のテーマに本格的に取り掛かる.本年度中に条件検討を完了させ,本測定のための試料を準備する.本研究は,近年開発されたHAG法(湿度調整と水溶性ポリマーのコーティングを用いたタンパク質結晶マウント法)をさらに発展させ,非凍結結晶を用いて広pHおよび広温度領域でX線結晶構造解析を行い,プロトン化状態および温度変化よって引き起こされるコンフォメーション変化の制御機構を解明することを目指している.本年度は土壌細菌由来銅含有アミン酸化酵素(AGAO)を材料とし,触媒機構中に観察されるコンフォメーション変化機構のメカニズムを明らかにした.AGAOは,活性中心に補酵素トパキノン(TPQ)および二価銅イオンを含み,第一級アミン類の酸化的脱アミノ反応を触媒する.TPQは前駆体Tyr残基から銅イオン存在下で自己触媒的に生成する.補酵素TPQは銅イオンに配位したOn-Cu型と配位しない構造Off-Cu型の2つの構造をとることが知られている.溶液実験では,On-Cu/Off-Cuの2つのコンフォメーションの割合が温度およびpHにより変動することから,コンフォメーション変化が微小なエネルギー状態の差,および複数の解離基のプロトン化状態に制御されているのではないかと考えられていた.このため本年度は, HAG法を用いて,温度およびpHを厳密に制御した環境下でのAGAO反応中間体のX線結晶構造解析を行った.各pHでの構造を比較することより,我々がこれまでに提案した反応スキームをさらに拡張できる見込みである.また,各温度での構造変化をプロットすることにより,これらの構造変化の熱力学的パラメーターを導出することに成功した(in crystallo thermodynamic analysis).本年度は研究初年度であり,測定条件を決定することと,得られた条件を用いて予備的測定を行うことが目標であった.本研究を行う上では同程度の大きさの結晶を大量に必要とするため,結晶化条件の見直しをおこなったほか,HAG法に必要な水溶性ポリマーおよび可塑化剤の選定などを行った.これらは比較的早い時点で成功したため,本年度後半は予備的な測定を行った.得られた結果は予備的なものであるが,構造解析によりpHおよび温度により構造が大きく変化することを確認できた.またこれらの変化は同時に行った結晶顕微分光によっても観察できた.本研究は,近年開発されたHAG法(湿度調整と水溶性ポリマーのコーティングを用いたタンパク質結晶マウント法)をさらに発展させ,温度やpHが正確に制御された環境下での結晶内での酵素反応を直接観察することを目的としている.具体的には土壌細菌由来銅含有アミン酸化酵素(AGAO)を材料とし,酸化的脱アミノ反応におけるpH・温度に依存したコンフォメーション変化と,TPQ生合成過程における前駆体Tyr残基から補酵素TPQへの構造変化の2つに焦点を当てる.本年度は酸化的脱アミノ反応中に観察されるコンフォメーション変化機構のメカニズムを明らかにした.AGAOは,活性中心に補酵素トパキノン(TPQ)および二価銅イオンを含み,第一級アミン類の酸化的脱アミノ反応を触媒する.TPQは前駆体

Tyr残基から銅イオン存在下で自己触媒的に生成する.補酵素TPQは銅イオンに配位したOn-Cu型と配位しない構造Off-Cu型の2つの構造をとることが知られており,溶液実験では,On-Cu/Off-Cuの2つのコンフォメーションの割合が温度およびpHに依存することが知られている.このため本年度は, HAG法を用いて,温度およびpHを厳密に制御した環境下でのAGAO反応中間体のX線結晶構造解析を行った.各温度での平衡状態をプロットすることにより,コンフォメーション変化の熱力学的パラメーターを導出することに成功した.さらに,同一温度条件で各pHでの構造を比較することより,構造変化についての重要な知見が得られ,我々がこれまでに提案した反応スキームをさらに拡張できた.また,二つ目のテーマであるTPQ生合成機構についても,試薬,結晶のサイズなどについての予備的検討を開始している.本年度は研究2年目であり,前年度確立した測定条件に基づき本測定を行った.十分な条件検討と予備測定が行われていたため,比較的早い段階で本測定に成功し,年度後半は論文化に注力し,2018年11月に無事論文がアクセプトされた.また,二つ目のテーマであるTPQ生合成機構についても,測定を開始している.予備実験の段階であるが良好なデータが得られ始めており,条件が確立次第本測定を開始する.平成29年度で測定条件をほぼ固めることができたので,平成30年度では本測定を行う.実験条件をより細かく振ることにより,より詳細な構造データを得る.各pHにおける構造データを比較することにより,複数の解離基のプロトン化状態に制御された触媒機構の解明,および,各温度における構造データのvan't hoffプロットを行うことによる熱力学的パラメータの導出を行う.平成30年度で主要テーマのうちの前半部分を完了できたので,二つ目のテーマに本格的に取り掛かる.本年度中に条件検討を完了させ,本測定のための試料を準備する.平成29年度は研究費の節約に努めた結果,18万円程度次年度に繰り越せた.これらは主に結晶調製用の試薬および測定施設(SPring-8)までの旅費に使用する予定である.平成30年度は研究費の節約に努めた結果,30万円程度次年度に繰り越せた.これらは主に結晶調製用の試薬および測定施設(SPring-8)までの旅費に使用する予定である.
非平衡統計力学への運動論的アプローチ

非平衡系の統計力学を運動論的方程式から解析し、特にモード結合理論をせん断粉体系に適用して時間相関関数のロングタイムテールがどのように変化するのか、同時刻長距離相関がどうなるかを明らかにした。更に揺動散逸関係式を充たす場の理論を液体系に適用し、モード結合理論の基礎付けを行った。またせん断粉体系のジャミング転移の臨界指数を明らかにした。またナノクラスターの衝突では熱揺らぎの重要性を明らかにし、その結果反発係数が1を超えることがあることを明示した。本年度は主として粉体、弾性体の衝突と接触、非対称単純排他過程(ASEP)の統計力学の研究に成果を挙げた。また教科書として「非平衡統計力学」をサイエンス社から出版し、放送大学の講義を3回分行い、その教科書を執筆したことが一般向けの業績である。研究の詳細を紹介してみよう。粉体においては微小重力実験に即した粉体ガスのシミュレーションと理論解析を進めている。実際に実験を行った振動後の冷却に関してはやや研究が滞っているが、同じく重力の影響がない状態での剪断流の解析では大いに意味のある結果を得た。我々は2次元の剪断流の粒子シミュレーションを行い、運動論によって導かれた流体力学の結果と定量的に比較することで両者が良好な一致を示すことを明らかにした。この研究は粉体のレオロジーを明らかにする重要な一歩になっていると思われる。またこの剪断系ではBagnold則が成り立たず熱伝導が重要であることを明らかにした。現在、粉体ガスにおける時間相関関数のロングタイムテールについての成果も得て論文執筆中であり、粉体ガスの研究は19年度に引き継がれることになっている。また無散逸の弾性体の接触と衝突を調べることで従来の弾性理論で仮定される平衡状態へどのように緩和するのかを明らかにした。現在、3次元モデルの正面衝突ではねかえり係数が1を超えるメカニズムとゆらぎの定理の関係をまとめつつある。またASEPに関しては系の途中で出入りのある系では、その出入りのあるサイトが渋滞と非渋滞を隔てる界面(キンク)を引きつけることを示し、それがどのようなポテンシャルで記述できるかを明らかにした。本年度は2件の印刷された論文の他に、3篇のプレプリントを投稿している。更に国際会議の会議録として4篇のある程度まとまった論文(うち一つは招待論文)を投稿している。論文として出版したテーマは自由冷却粉体ガスのロングタイムテールと、せん断濃厚粉体へのモード結合理論の適用である。前者は粉体ガスの速度相関やストレスの相関のロングタイムテールを初めて理論的に論じると共にエネルギー流の相関では指数関数減衰になることを示したものである。後者はガラス転移等に用いられるモード結合理論をせん断粉体系に適用した注目すべき論文であった。その他、投稿した論文はせん断ガス系のカレントの相関関数のロングタイムテールとその輸送係数への影響を統一的に論じたもの、ガラス転移へ揺動散逸定理を充たす場の理論の適用によってモード結合理論の位置づけを明らかにした論文、それからナノクラスターの衝突で反発係数が1を超えることを示した論文である。最後の論文に関連して、更に衝突への弱い引力の効果を調べた論文を7月のロシアの国際会議での招待論文として発表する予定である。これらの論文は何れもオーソドックスな運動論に基づき非平衡統計力学に新しい観点をもたらしたことで注目される。またロングタイムテールの論文は主として稀薄粒子系を念頭においていたが、モード結合理論のようにガラス転移に適用できるような非常に濃厚な系に対する理論まで統一的に論じ得る機運が出てきたのは当初の計画にもない思いがけない進展である。当該年度は研究計画の最終年度ということでそれなりの研究成果が出たと思う。論文リストを見ても10篇もの論文が報告されている。これらの論文は大雑把に4つに分類できる。そのうちの一つはガラス転移に関するもので、揺動散逸関係式を充たした摂動論を完成し、密度と運動量のみの保存則によるモデルでは、少なくとも1次摂動の範囲内ではエルゴード性が回復できないことを示した。この内容は京都での国際会議の招待講演で話した。次のカテゴリーの論文はジャミング転移に関するもので、せん断粉体系の大規模シミュレーションと平均場近似による理論が良好な一致を示すことでジャミング転移の臨界的性質の全容を明らかにした。この内容で大槻氏は物理学会シンポジウム講演を行っている。またせん断粉体系と液体系の長距離相関の詳細を明らかにした論文も発表し、ドイツの国際会議での招待講演でも発表している。最後に、ナノクラスターの衝突に関連した研究では平均量は弾性論によって記述できるものの、サンプルによっては反発係数が1を超える異常反発があることと、その出現確率の見積もりをした論文等では、ロシアの国際会議でplenary talkをし、Physical Review Focus,Science News,東京(中日)新聞等のマスメディアでも取り上げられる等大いに注目を集めた。研究計画の最終年度にこのように大きな成果を次々と発表できたことに勝る喜びはない。
ジェンダー(心理社会的性)とセックス(生物学的性)の交互作用に関する研究

本研究では、妊娠期・産褥期うつ病および産後うつ病の発生におけるジェンダーとセックスの影響とその交互作用の検討を行うべく、妊産婦を対象に、心理社会的調査と遺伝子調査のデータ収集を行った。本研究において、妊娠期・産褥期うつ病および産後うつ病の発生にワーク・ファミリー・コンフリクトという、現在社会における女性の仕事と子育てとの両立の問題が少なからず影響を及ぼしていること(研究I)、マタニティ・ブルーズ尺度で産後5日間に一日でも8点以上の得点(抑うつ状態)を示したものが約35%いたこと(研究II)、妊娠初期・中期のEPDS得点とTCIの損害回避(HA)得点との間に正の有意な相関が見られること(研究III)などが明らかとなった。しかし、遺伝子解析(研究IV)では、サンプル数の少なさから、有意な結果を得ることはできなかった。このサンプル数の少なさについては、既に問題で述べたように、折からの少子化問題による妊産婦の減少があり、サンプル収集には非常に苦労しているところである。しかし、本研究の最終的な目的である、ジェンダーとセックスの影響とその交互作用の検討を行うためには、さらにサンプルの収集を必要としている。より有益な知見に到達するため、今後、サンプル収集にさらに努力したいと考えている。本研究は、男女共同参画社会の実現に資する資料を提供することを目的として、妊娠期・産褥期うつ病および産後うつ病の発生におけるジェンダーとセックスの影響とその交互作用を検討する。よく知られているように、うつ病の発生は女性が男性の約2倍であり、従来より「女の病」として取り上げられることが多い。今回ターゲットとした女性に特有な妊娠期、産褥期、産後の経過におけるうつ病の発生率は約1015%と報告されており、うつの発生の性差に生理学的な理由のあることは明らかである。しかし、女性の社会進出に伴う仕事と子育てとの葛藤や期待される母役割の認知などの心理社会的要因や、他に個人の遺伝的素因の影響も無視できない。このため、妊娠期から産後までを縦断的に対象とし、生理学的調査、心理社会的調査および遺伝子解析調査を行い統計的に解析することにより、これらの要因間の関係性の解明を目指す。本年度は、名古屋市内の病院の産婦人科に妊娠・出産のために受診している妊産婦のうち、調査内容を理解し、調査協力の同意書に署名した被験者を、心理社会的調査173名、遺伝子解析調査81名、生理学的調査62名を獲得した。これは当初計画よりも、少ない獲得数となったが、妊娠期におけるこういった調査の難しさを示すものと考えられる。また、収集できた資料の範囲で、パイロット的に心理社会的調査、遺伝子解析調査、生理学的調査それぞれの分析を行い、一定の知見を得た。来年度の目標は、まず、さらにデータを蓄積することである。また、データ数がある程度確保出来た段階で、3つの調査を統合する知見の算出に努める予定である。本年度は本研究の2年次であり、昨年度に引き続き、名古屋市内の病院の産婦人科に妊娠・出産のために受診している妊産婦を対象として、調査協力の同意書に署名した被験者の獲得と調査の実施を行った。結果昨年度までと合わせて、心理社会的調査394名、遺伝子解析調査217名(生理学的調査は昨年度で終了)を獲得した。

妊娠末期、産褥早期、産褥1ヶ月に採取した血液60人分(180検体)を分析中であり、血液中の抑うつ状態関連物質、ストレス関連物質、神経細胞増生因子、代謝関連ホルモンなどの測定を終了しつつある。次年度は、これらと周産期の気分状態との関連性を分析してゆく。心理社会的要因との関連についても、分析を進める。また、遺伝子解析用のDNA検体収集は217検体に達し、十分な数とはいえないが、来年度から本格的に解析に入る。最終的には、この3つの知見の統合的分析を進める。本研究では、妊娠期・産褥期うつ病および産後うつ病の発生におけるジェンダーとセックスの影響とその交互作用の検討を行うべく、妊産婦を対象に、心理社会的調査と遺伝子調査のデータ収集を行った。本研究において、妊娠期・産褥期うつ病および産後うつ病の発生にワーク・ファミリー・コンフリクトという、現在社会における女性の仕事と子育てとの両立の問題が少なからず影響を及ぼしていること(研究I)、マタニティ・ブルーズ尺度で産後5日間に一日でも8点以上の得点(抑うつ状態)を示したものが約35%いたこと(研究II)、妊娠初期・中期のEPDS得点とTCIの損害回避(HA)得点との間に正の有意な相関が見られること(研究III)などが明らかとなった。しかし、遺伝子解析(研究IV)では、サンプル数の少なさから、有意な結果を得ることはできなかった。このサンプル数の少なさについては、既に問題で述べたように、折からの少子化問題による妊産婦の減少があり、サンプル収集には非常に苦労しているところである。しかし、本研究の最終的な目的である、ジェンダーとセックスの影響とその交互作用の検討を行うためには、さらにサンプルの収集を必要としている。より有益な知見に到達するため、今後、サンプル収集にさらに努力したいと考えている。
新規疾病治療法の確立を指向したトランスポーターの細胞膜上発現量制御機構の解析

肝細胞の細胞膜に発現する輸送タンパク質であるBilesalt export pump(BSEP)の細胞膜発現量の低下は、肝内胆汁うっ滞を惹起する。BSEPの細胞膜発現量制御の分子機構が不明であるため、当該疾患に対しては有効な治療薬は存在せず、その開発が切望されている。本研究では、(1)Ub化という翻訳後修飾がBSEPの内在化シグナルとなること、(2)AP2というアダプタータンパク質がBSEPの細胞膜からの内在化に働くことを見出し、上記の分子機構の一端を明らかにすることに成功した。平成21年度は、4PBAを投与したラット肝臓から調製したRNAを用いて実施したマイクロアレイ解析において、発現変動が認められた200遺伝子のうち、細胞膜タンパク質の細胞膜からの分解過程への関与が報告、あるいは想定される遺伝子に着目してパスウェイ解析を遂行するとともに、BSEP発現培養細胞を用いて、パスウェイ解析から同定された遺伝子の機能解析を進めた。その結果、細胞膜近傍でBSEPと相互作用し、BSEPの細胞膜からの内在化促進に働くことで、BSEPの細胞膜発現量を負に制御するタンパク質をコードする遺伝子の同定に成功した。今後は、当該遺伝子のin vivoにおけるBSEPに対する作用について検討を進めるとともに、4PBAの作用が当該遺伝子を介して生じる可能性についても、BSEP発現培養細胞、実験動物を用いて解析を進める予定である。Bile salt exporpump(BSEP),Multidrug resistance-associated protein 2 (MRP2)は肝毛細胆管側膜に発現し、胆汁中へと胆汁酸、抱合型ビリルビンを排泄する役割を担っているABCトランスポーター(TP)であり、その細胞膜発現量低下に起因する機能不全はそれぞれ肝内胆汁うっ滞、黄疸を惹起する。両TPの細胞膜発現量の低下には、内在化促進の関与が示唆されているが、その分子機構が不明であるため、これら疾患に対してはtarget-basedな治療薬は存在せず、肝移植が唯一の根治療法である。本研究では、両TPの細胞膜からの内在化及び分解機構に着目し、分子機構の解析を進めた。膜タンパク質の細胞膜からの内在化/分解シグナルの1つとして、ユビキチン(Ub)化が知られている。Ub化されたタンパク質は、細胞膜から内在化し、初期エンドソームにおいてリソソーム分解経路へと選別を受ける。平成22年度は、BSEP,MRP2の細胞膜からの内在化/分解プロセスに対するUb化の関与を検討した。Ubのドミナントネガティブ体を発現させた培養細胞において、biotinylation法を用いて細胞膜上BSEP,MRP2の分解速度を測定したところ、有意な減少が観察された。一方、内在化速度は、BSEPでのみ低下し、MRP2では変化は認められなかった。また、内在化後のBSEP,MRP2の分解速度は、MRP2においてのみ低下が観察された。以上の結果から、Ub化は細胞膜上に発現している両TPの分解促進に働くが、その機序は異なり、BSEPに対しては、内在化を促進することで、MRP2に対しては、内在化後の分解シグナルとしての働きを介して作用することが示唆された。また、BSEPに関しては、これまでの報告からclathrinを介した内在化が推測されたこと、clathrin-mediated endocytosisのアダプタータンパク質であるAP2 adaptor complex(AP2)の認識配列が細胞内ドメインに存在することから、BSEPの内在化に対するAP2の寄与についても、RNAi法など種々の分子生物学的手法を用いて解析を進め、その関与を明らかにした。今後は、細胞膜上BSEPの内在化/分解機構の全貌の解明に向け、Ub化を介した機構、AP2を介した機構の関連性について更なる検討を加える予定である。