hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
表面原子反応におけるアモルファス氷の触媒効果

・昨年度の設備備品費で購入した波長可変色素レーザーおよび今年度の消耗品費で自作した飛行時間型質量分析計を用いて,アモルファス氷表面から脱離する分子を選択的にイオン化して質量分析を行うシステムを作製した,これによって,表面で生成された分子の振動・回転励起伏態,運動エネルギー,オルト/パラ比(核スピン温度)などの測定が可能になった.・酸素分子に水素原子を照射して水分子が生成される過程を実験的に解明した.O_2+2H→H_2O_2,H_2O_2+H→H_2O+OH,OH+H→H_2O.なお,この過程はこれまで明らかにしてきたCO+H反応より2桁も反応速度が大きいことがわかり,分子雲では水分子は短時間で生成されることが明らかになった.分子雲に存在するアモルファス氷星間塵上における分子進化の研究は,太陽系の起源を研究する上でも極めて重要である.アモルファス氷星間塵は10K程度の極低温であるため,熱的な化学反応は極めて起こりにくく,そこでの分子進化プロセスには不明な点が多い.私たちは分子進化プロセスとして極低温特有のトンネル反応に着目し, (1)始原的有機分子であるホルムアルデヒド(H2CO)やメタノール(CH3OH)は極低温アモルファス氷表面におけるCO分子と水素原子のトンネル反応により効率よく生成されること,(2)アモルファス氷表面は触媒的な働きを持つことを明らかにした.本研究計画では, CO分子-水素原子トンネル表面反応における反応速度定数を測定することにより,アモルファスH2O氷の触媒効果を定量的に評価する.4年目である平成20年度は,以下の研究を行った.・昨年度までに立ち上げたパルス原子源,および原子脱離用レーザー-波長可変色素レーザーイオン化-飛行時間型質量分析システムを用いて,水素原子のアモルファス氷表面への吸着量の温度依存性の測定を行った.その結果,アモルファス氷表面への水素原子の吸着量は, 8Kで最大で,温度上昇とともに急激に減少することが示された.また,一定温度での吸着量の時間変化も観測された.現在,実験データの解析中であり,水素原子の付着率およびその温度依存性,水素原子の表面拡散に関する情報が得られることが期待される.・酸素分子に水素原子を照射して水分子が生成される過程(O2+2H→H2O2, H2O2+H→H2O+OH, OH+H→H2O)を,より分子雲に近い条件で実験的に再現した.その結果,生成される氷の構造はアモルファスであることが明らかになり,観測とよい一致を示した.また,この反応においても,アモルファス氷が触媒的な役割を果たしていることが明らかになった.星間分子雲にはアモルファス氷星間塵が存在し,アモルファス氷中には,ホルムアルデヒド(H_2CO),メタノール(CH_3OH)などが含まれている.これらの分子は,より大きな有機分子に進化しうる重要な先駆体である.私たちは,これらの分子が,低温(10K)でのCO分子(固体)への水素原子逐次付加反応:で生成されたことを実験的に明らかにした.さらに,反応(1)の温度依存性,ならびに氷組成依存性(純粋なCO,H_2O-CO混合物)に関する実験を行った.その結果,アモルファスH_2O氷に触媒効果があることを見出した.そこで,本研究計画では,アモルファスH_2Oがある場合とない場合について,反応(1)の各ステップの反応速度定数を測定することにより,アモルファスH_2O氷の触媒効果を議論することが目的である.平成21年度には,これまでに開発した実験装置を用いて,水素原子の表面への付着係数を測定することに成功した.具体的には,純粋なCOとアモルファスH_2O氷表面への水素原子の付着率の温度依存性を測定した.この結果およびこれまでに測定された実効的反応速度定数を用いて真の反応速度定数を求めることができた.
第三の酸化還元補酵素を利用する新規酵素の同定と機能解析

ピロロキノリンキノン(PQQ)は、ニコチンアミド(NADなど)およびフラビン(FADなど)に次ぐ第三の酸化還元補酵素としてバクテリアにおいて見つかったが、その後、多くの食物にPQQが含まれていることが判明した。また、PQQを含まない餌を与えたマウスは発達不良をはじめとする多くの異常を示したことから、PQQは哺乳類にとって重要な栄養素のひとつではないかと考えられた。しかし、生体内の役割については謎に包まれていた。我々は、PQQ結合モチーフを持ったタンパク質をコードする新規遺伝子を哺乳類から見出した。マウスのこのタンパク質はリジン代謝に関わる酵素であるアミノアジピン酸マミアルデヒド(AAS)脱水素酵素であろうと推測された。昨年度までに、ノザンブロット解析などの基本的なデータを取得した。その後、マウスの摂餌状態によってこの遺伝子の発現が変化することや、PQQを含まない餌を与えたマウスにおいて末梢血液中におけるリジンの代謝産物の量に変化が起きていることを確認した。これらの結果から、PQQは新規の酸化還元補酵素であると考えられた。そして、この我々の成果と、すでに報告されていた栄養学的なデータを併せて考慮すると、PQQは哺乳類(少なくともマウス)にとって新規のビタミンであることが強く示唆された。今年度はさらに、バキュロウィルス-昆虫細胞系を用い、AAS脱水素酵素を発現させ、その機能を解析した。これまでに、ATP依存的に基質と結合することを見出した。また、この研究の過程で、AAS脱水素酵素が極めて珍しい翻訳後修飾(4'-ホスホパンテテイン化)を受けることが判明した。そこで、その翻訳後修飾を担う酵素のクローニングした。この酵素を発現・精製し、試験管内において、リコンビナントAAS脱水素酵素4'-ホスホパンテテイン化させることにも成功した。ピロロキノリンキノン(PQQ)は、ニコチンアミド(NAD, NADH)およびフラビン(FAD, FMN)に次ぐ第三の酸化還元補酵素としてバクテリアにおいて見つかったが、その後、多くの食物にPQQが含まれていることが判明した。また、PQQを含まない餌を与えたマウスは発達不良をはじめとする多くの異常を示したことから、PQQは哺乳類にとってビタミンのひとつではないかと考えられていたが、生体内の役割については謎に包まれていた。我々は、PQQ依存的なバクテリアの脱水素酵素の間でよく保存されている配列(PQQ結合モチーフ)を持ったタンパク質をコードする新規遺伝子を哺乳類から見出した。我々がマウスから単離した遺伝子は、1,100アミノ酸残基のタンパク質をコードしていた。ノザンブロット解析を行ったところ、この遺伝子は全身の組織において発現しているが、とくに心臓および肝臓において強い発現が見られた。PQQ結合モチーフ以外の配列の相同性から、リジン代謝経路の一酵素であるアミノアジピン酸セミアルデヒド脱水素酵素(AASDH)をコードしているであろうと推測された。そこで、リジンを多量に含む食餌をマウスに与えたところ、リジン代謝に関わる他の遺伝子とともに、心臓・肝臓においてその新規遺伝子の発現も増強され、リジン代謝に関わっていることが示唆された。この新規酵素の生化学的な特性を調べるため、タンパク質を発現させることを試みた。当初は大腸菌を用いて可溶性を高めるための種々の検討を行ったが(GSTやMBPとの融合タンパク質としての発現、温度、IPTG濃度、分子シャペロンの共発現など)、可溶化させることはできなかった。そこで、バキュロウイルス-昆虫細胞系を用いて発現させたところ、可溶性タンパク質として精製できることがわかった。
慢性腎臓病の血管石灰化発症機序における転写調節因子の役割の解明と治療への応用

慢性腎臓病患者にみられる動脈石灰化のメカニズム解明のために、本研究では、培養細胞およびモデル動物を用いて、動脈石灰化に関わる転写調節因子の役割を検討した。高リン血症による血管平滑筋細胞の骨様細胞への形質変換に転写因子KLF4が関与することを、in vivo、in vtiroで同定した。また、同様の系で高血糖が血管石灰化の増悪因子として有意では無いことを示し、さらに血管平滑筋細胞特異的にNF- κB活性を抑制するマウスでは血管傷害による内膜肥厚性動脈硬化形成が抑制されることを示した。現在、腎不全病態におけるNF- κBの血管石灰化への役割をこれらマウスで用いて検討中である。慢性腎臓病の進展とともに動脈石灰化の形成・進行が認められる。石灰化病変は心血管系疾患を生じ、慢性腎臓病患者の予後を左右する最も重要な因子の一つであり、その発症機構解明は治療戦略をたてるうえで非常に重要である。本研究では、培養細胞および遺伝子改変動物を用いて、動脈石灰化に関わる転写因子の役割を検討している。培養血管平滑筋細胞を用いた検討では、リン負荷による血管平滑筋細胞の骨様細胞への形質変換に転写因子Klf4が関与することを同定し報告した(Yoshida et al., J Biol Chem, 2012)。すなわち、リン負荷が、平滑筋分化マーカーであるSM alpha-actin、SM22alphaの発現を低下させ、骨細胞の分化マーカーであるosteopontin、alkaline phosphatase、Runx2の発現を亢進させ、これらの変化にKlf4が関与することを発見した。Klf4は、高リン血症をきたすアデニン負荷慢性腎不全モデル動物においても動脈石灰化部位に発現が認められ、慢性腎不全に伴う高リン血症が石灰化病変を形成するにあたって、重要な役割を果たしている可能性が示唆された。現在遺伝子改変マウスでの検討を加えている。一方、炎症反応に重要なNFkB系の血管石灰化への影響を検討するため、血管平滑筋細胞特異的にNFkBを抑制するマウスの樹立を進めた。C57/BL6系マウスは血管石灰化に比較的抵抗性であることから、SM22alpha-Creマウス、dominant negative IkB floxedマウスを血管石灰化に感受性のあるCBA/2マウスに交配し、系統の変更を行った。現在、CBA/2系の血管平滑筋特異的NFkB抑制マウスの樹立が完成し、それらに5/6腎摘を行って血管石灰化の形成を検討している。慢性腎臓病の進展とともに動脈石灰化が認められ、心血管死の要因となり、慢性腎臓病患者の予後を左右する最も重要な因子の一つである。そこで、本研究では、培養細胞およびモデル動物を用いて、動脈石灰化に関わる転写因子の役割を検討した。まず、培養血管平滑筋細胞を用いた検討において、リン負荷による血管平滑筋細胞の骨様細胞への形質変換に転写因子KLF4が関与することを同定し報告した(J Biol Chem, 2012)。すなわち、リン負荷は平滑筋分化マーカーの発現を低下させ、骨分化マーカーの発現を亢進させるのであるが、これらの変化にKLF4が関与することを発見した。KLF4は、高リン血症をきたすアデニン負荷腎不全ラットにおいても動脈石灰化部位に発現が誘導されており、高リン血症が石灰化病変を形成するにあたって重要な役割を果たしている可能性が示唆された。また、ノックアウトマウスを用いた検討では、内皮細胞におけるKLF4が内膜肥厚型動脈硬化に抑制的に働くことを発見し、報告した(J Am Heart Assoc, 2014)。次に、炎症反応に重要なNF-kBの血管病変形成への影響を検討するため、血管平滑筋細胞特異的にNF-kBを抑制するマウスを樹立した。このマウスに血管傷害を起こしても、内膜肥厚性動脈硬化の形成は有意に抑制されることから、血管平滑筋におけるNF-kBの重要性が生体内で明らかとなった(J Am Heart Assoc, 2013)。現在、腎不全病態におけるNF-kBの血管石灰化への役割をこれらのマウスを用いて検討中である。さらには、慢性腎不全ラットに高血糖を誘導し、糖濃度・リン濃度と血管石灰化との関係を解析した(J Vasc Res, 2013)。以上のように、本研究では血管石灰化といった血管病変の形成における転写調節メカニズムについて新知見を得ることができた。慢性腎臓病患者にみられる動脈硬化症は、血管の中膜石灰化として知られ、そのメカニズムの解明は治療戦略をたてるうえでたいへん重要である。

近年の研究では、慢性腎不全にみられる高リン血症が血管平滑筋細胞を骨軟骨様細胞に形質変換させ、血管石灰化に寄与する可能性が示唆されている。本年度の研究では、その形質変換の分子メカニズムに焦点をあてた。培養血管平滑筋細胞を用いた検討では、高リン負荷により、平滑筋分化マーカーであるSM alpha-actin、SM22alphaの発現低下と骨軟骨細胞の分化マーカーであるosteopontin、alkaline phosphatase、Runx2の発現亢進が認められた。これらの変化に加えて、転写因子Klf4の発現亢進も認められた。興味あることに、Klf4の発現をsiRNAを用いて抑制した場合、高リン負荷による血管平滑筋細胞から骨軟骨様細胞への形質変換は有意に抑えられた。さらに、高リン血症をきたすアデニン負荷慢性腎不全モデルにおいて動脈石灰化部位を検討したところ、平滑筋分化マーカーの発現低下、骨軟骨細胞の分化マーカーの発現亢進、Klf4の発現亢進が認められた。これらの結果はKlf4がリン負荷による血管平滑筋細胞の骨軟骨様細胞への形質変換に重要な役割をしていることを示唆しており、現在遺伝子改変マウスでの検討を加えている。一方、炎症反応に重要なNFkB系の血管石灰化への影響を検討するため、血管平滑筋細胞特異的にNFkB系を抑制するマウスの樹立を進めている。C57/BL6系マウスは血管石灰化に比較的抵抗性であることから、SM22alpha-Creマウス、dominant negative IkB floxedマウスを血管石灰化に感受性のあるCBA/2マウスに交配し、系統の変更を行っている。1年間の交配により5世代の交配が進み、来年度の検討が可能となった。高リン負荷による血管平滑筋細胞の骨様細胞への形質変換に関与する転写因子を同定し、また、動脈石灰化感受性のCBA/2系遺伝子改変マウスを樹立できたという点で、平成24年度の計画は順調に進行したといえる。高リン負荷による血管平滑筋細胞の骨軟骨様細胞への形質変換をきたす培養細胞系の確立、動脈石灰化を伴う慢性腎不全モデルラットの確立ができたという点で、平成23年度の計画は順調に進行したといえる。また、SM22alpha-Creマウスなどの遺伝子バックグラウンドの変更も順調に進行した。Klf4の役割を生体内で明らかにするため、遺伝子欠損マウスをCBA/2系マウスとして樹立し、血管石灰化への影響を検討する。また、炎症反応に重要なNFkB経路の血管石灰化に対する役割を生体内で明らかにするため、血管平滑筋特異的NFkB抑制マウスの表現型を詳細に検討する。さらに、NFkB抑制薬を用いた動脈石灰化への影響の検討も並行して行う。また、炎症反応に重要なNFkB経路およびNFAT経路の血管石灰化に対する役割も検討する。培養血管平滑筋細胞を用いて、LPS刺激による炎症反応の活性化が、高リン負荷による血管石灰化をどのように修飾するか検討する。また、血管平滑筋特異的NFkB経路抑制マウスをCBA/2系マウスとして早期に樹立し、NFkB経路の血管石灰化への影響を検討する。さらに、NFkB抑制薬、NFAT抑制薬を用いた検討も並行して行う。研究費の多くは、細胞培養実験試薬代、分子生物学実験試薬代、免疫組織化学実験試薬代、動物飼育代に使われる。また、研究補助者への謝金にも使用する予定である。
"磯焼け"現象の解明:紅藻サンゴモ類のアレロケミカルスに関する研究

磯焼けの持続要因として無節サンゴモによる他感作用物質(アレロケミカルス)の関与を想定し、磯焼け現象を化学物質の視点で明らかにすべく研究を行った。そこで、磯焼け地帯における紅藻サンゴモ類、付着珪藻類、コンブなどの大型海藻類およびキタムラサキウニなどの捕食者間の相互作用を制御しているアレロケミカルスを探索した。その結果、サンゴモが微量化学物質を巧みに操って磯焼けの持続を仕組んでいるらしいことが分かってきた。すなわち、サンゴモは、コンブ配偶体の初期発生を抑制する物質を分泌して、高海水温の年にはサンゴモ上へのホソメコンブの入植を阻害する。さらに、サンゴモは、ウニ幼生を誘引し、且つ着底・変態を誘起する物質(グリセロ糖脂質)を分泌し、また、この物質は、ウニ稚仔や成体の摂食刺激物質でもあるためにウニを磯焼け地帯に棲息させ続け、その強い摂食圧(オーバーグレージング)によって磯焼け状態を持続させていると考えられる。なお、今のところ詳細は不明であるが、無節サンゴモ上の付着珪藻類もまた磯焼けの海底でサンゴモと同様にアレロケミカルスによって、キタムラサキウニ幼生の着底・変態を誘導し、また、コンブ配偶体の初期発生を抑制していることが明らかとなった。磯焼け地帯は、「海の砂漢」でも「不毛地帯」でもない。磯焼けの海底でもそこに棲息する生物種間における関係が"食う-食われる"の食物連鎖ばかりではなく、種々の生物活性を発現する化学物質を介して多くの生物が多様な生態系を構成している。1.磯焼け海域の優占種である無節サンゴモのエゾイシゴロモ(Lithophyllum yessoense F.)上から3種の付着珪藻を単離して、走査型電子顕微鏡によってそれぞれCylindortheca sp.、Navicula sp.およびNitzschia sp.と同定した。2.二藻培養の結果、これら3種の付着珪藻は高温でホソメコンブ(Laminaria religiosa M.)配偶体の成熟および胞子体形成を抑制した。(論文投稿準備中)3.磯焼け海域で採集した有節サンゴモのピリヒバ(Corallina pilulifera P.et R.)も、高温でホソメコンブ配偶体の成熟および胞子体形成を抑制した。5.ピリヒバは、ウニ幼生の着底・変態を誘起するだけではなく、ウニ幼生を誘引することも明らかにした。6.生物試験を指標としてピリヒバからの着底・変態誘起物質の探索を行った。その結果、数種の糖脂質を分離した。現在までに構造が明らかとなったのは、スルホキノボシルモノアシルグリセロール、スルホキノボシルジアシルグリセロール、モノガラクトシルジアシルグリセロールなどのグリセロ糖脂質である。これらの糖脂質はウニ成体の摂餌刺激物質としても知られている。(論文投稿準備中)7.以上、ピリヒバや付着珪藻のアレロケミカルスは、磯焼け現象に深く関わっていることが示唆された。2.磯焼け海域の優占種である無節サンゴモのエゾイシゴロモ(Lithophyllum yessoense F.)の抽出物からもこれらのグリセロ糖脂質を同定した3.上記の糖脂質の内、SQMG、MGMG、MGDG、DGMGは、ウニ浮遊幼生を誘引することも判明した。4.昨年度からの研究において、磯焼け海域において紅藻サンゴモ、ホソメコンブおよび捕食者であるウニの三者間の相互作用がアレロケミカルスを媒介として成り立っていることを明らかにした。

すなわち、紅藻サンゴモは、コンブ配偶体の初期発生を抑制する物質を放出して磯焼け地帯へのコンブの入植を阻害するだけでなく、ウニ幼生を誘引し、着底・変態を誘起する物質(グリセロ糖脂質)を分泌し、さらにこの物質はウニ稚仔や成体の摂食刺激物質でもあるためにウニをサンゴモの群落に蝟集させ、その摂食圧によって食害を引き起こして磯焼け状態を持続させていると考えられる(論文投稿中)。5.海の砂漠とも呼ばれている磯焼けの海底でも、そこに棲息する生物種間における関係が「食うー食われる」の食物連鎖ばかりではなく、種々の生物活性を発現する化学物質を介して成り立っていることが明らかとなった。昨年度までの研究において、磯焼け海域の優占種である無節サンゴモやサンゴモ上の付着珪藻類由来のアレロケミカルスが磯焼けの持続に深く関わっていることを明らかにした。今年度の研究では、いくつかの新しい知見が得られたが、磯焼けの海底でのグロセロ糖脂質の機能については宿題として残った。1.生物活性を発現したグリセロ糖脂質のグリセロール部のC-2位の絶対配置をキラルカラムを用いるHPLC法によって決定した。すなわち、サンゴモ由来のモノアシルグリセロ糖脂質(MGMGs、DGMGs、SQMGs)およびジアシルグリセロ糖脂質(MGDGs、DGDGs、SQDGs)のグリセロール部のC-2位の絶対配置はすべてR-配置であった(論文投稿中)。2.付着珪藻由来のウニ幼生に対する着底・変態誘起物質およびコンブ配偶体に対する成長抑制物質の探索は継続中である。3.生物活性を発現した付着珪藻は、継代培養によって徐々に活性が弱くなっていく傾向を示した。他生物が存在するか存在しないかで珪藻の代謝産物が異なることが示唆された。4.サンゴモの培養液や磯焼けの海底で採集した海水からのグリセロ糖脂質の分離および同定は、今のところ不成功で現在さらに続行中である。5.今後は、海水中に存在している微量生物活性物質(グリセロ糖脂質など)の検出および同定のための簡便な分析法を確立する。
接着斑キナーゼの抗アポトーシス作用とその機序の解析

細胞の増殖・分化と細胞死の制御はがん細胞生物学における重要なテーマであり,近年この経路に関与する多くのシグナル伝達分子の役割が明らかになりつつある.ヒトグリオーマ細胞株は通常,酸化ストレスや抗がん剤に耐性であり,その機序の解析はがん治療上大変重要である.私どもは,酸化ストレスやエトポシドによるアポートシス抵抗性に,接着斑キナーゼFAKが重要な役割を持つことを報告してきた(Sonodaら,1999).今年度は,FAKの抗アポトーシス作用のおける詳細な役割解析のため以下の検討を行った.1.FAK遺伝子高発現系クローンの樹立:一般にHL-60のような白血病細胞への遺伝子導入効率は低く,一過性導入の評価が検定しにくいため,恒常的に発現するクローンを樹立した.一方,グリオーマ細胞株では,アデノウイルスベクター(AxCA)を用いて,一過性であるが高発現の遺伝子導入し,アポトーシス耐性を検討した.2.FAK遺伝子導入HL-60とグリオーマ細胞株でのアポトーシス耐性の検討:FAK遺伝子を導入した細胞では酸化ストレス,エトポシドならびに放射線に対する耐性が見られた.この耐性にはFAKからPI3-キナーゼ,Akt/PKBを介するNF-kB活性化とアポトーシス阻止因子(IAP)の誘導経路が関与していることを明らかにした.3.SH2結合部位変異体であるY397F変異体を導入した場合は,アポトーシス耐性を失い,さらにアポトーシス刺激に対しても感受性を示した.4.免疫抑制剤として開発中のFTYは,1-10μMの濃度でヒトグリオーマ細胞株に対してアポトーシスを誘導した.この機序として,FTYは内在性のFAKの脱リン酸化を引こ起こし,FAK-PI3キナーゼ系のサバイバル経路を遮断することがわかった.また,FTYによるアポトーシスの実行分子として,カスパーゼ-6を確認した.細胞の増殖・分化と細胞死の制御はがん細胞生物学における重要なテーマであり,近年この経路に関与する多くのシグナル伝達分子の役割が明らかになりつつある.ヒトグリオーマ細胞株は通常,酸化ストレスや抗がん剤に耐性であり,その機序の解析はがん治療上大変重要である.私どもは,酸化ストレスやエトポシドによるアポートシス抵抗性に,接着斑キナーゼFAKが重要な役割を持つことを報告してきた(Sonodaら,1999).今年度は,FAKの抗アポトーシス作用のおける詳細な役割解析のため以下の検討を行った.1.FAK遺伝子高発現系クローンの樹立:一般にHL-60のような白血病細胞への遺伝子導入効率は低く,一過性導入の評価が検定しにくいため,恒常的に発現するクローンを樹立した.一方,グリオーマ細胞株では,アデノウイルスベクター(AxCA)を用いて,一過性であるが高発現の遺伝子導入し,アポトーシス耐性を検討した.2.FAK遺伝子導入HL-60とグリオーマ細胞株でのアポトーシス耐性の検討:FAK遺伝子を導入した細胞では酸化ストレス,エトポシドならびに放射線に対する耐性が見られた.この耐性にはFAKからPI3-キナーゼ,Akt/PKBを介するNF-kB活性化とアポトーシス阻止因子(IAP)の誘導経路が関与していることを明らかにした.3.SH2結合部位変異体であるY397F変異体を導入した場合は,アポトーシス耐性を失い,さらにアポトーシス刺激に対しても感受性を示した.4.免疫抑制剤として開発中のFTYは,1-10μMの濃度でヒトグリオーマ細胞株に対してアポトーシスを誘導した.この機序として,FTYは内在性のFAKの脱リン酸化を引こ起こし,FAK-PI3キナーゼ系のサバイバル経路を遮断することがわかった.また,FTYによるアポトーシスの実行分子として,カスパーゼ-6を確認した.
長波長蛍光プローブによる体内深部におけるがん細胞蛍光イメージング

より組織深部に存在するがんの検出を念頭に、昨年度までに開発・発表を行った非対称ローダミン骨格に基づいたプローブ群に比べ、さらに長波長で機能するプローブ群の開発を行った。具体的には、昨年度までのローダミン誘導体に関する知見をシリルローダミンにも適用することで、より長波長の蛍光を発し、かつプロテアーゼプローブの母核となり得る蛍光団の開発を試みた。まず、HMRGのシリルローダミンアナログであるHMSiR600を合成・評価した。この分子は想定通り長波長化したが、ローダミン誘導体より閉環構造を取りやすいことがわかった。そこで、pKcyclを適切な値に調節するため、非対称の分子内スピロ環化シリルローダミン群を合成・評価したところ、最も長波長の吸収・蛍光を示した誘導体が最適なpKcyclを示した。本骨格にペプチドを結合することにより、HMRG骨格に基づいた蛍光プローブ群よりも150 nm以上長波長化し近赤外蛍光を発する、新たなGGT活性検出蛍光プローブを開発し、がん特異的な蛍光検出が可能であることを実証した。また、HMRGベースのプローブとの併用で、異なるプロテアーゼ活性を同時に多色イメージングできることを示した。この成果は特許出願済であり、投稿論文準備中である。昨年度までに開発した論理的プロテアーゼプローブ群開発法に基づき、蛍光では原理的に観察が難しい深部組織を観察し得る手法として注目を浴びている、光音響イメージング用プロテアーゼプローブの開発も行った。過去の知見から、開発した非対称ローダミン誘導体の中からHMDiMeRを選択した。本骨格にペプチドを結合することによりGGTプローブを合成し、細胞イメージング、皮下腫瘍モデルマウスを用いたin vivoイメージングでの検討から、がん特異的な光音響波検出が可能であることを実証した。この成果は共著者として論文発表を行った。28年度が最終年度であるため、記入しない。1.本年度の年次計画に従い、目的の機能を持つ分子骨格の設計と合成に取り組んだ。術中における微小がんの選択的可視化には、がん選択的にactivatableな蛍光プローブの開発が必要である。本研究グループではこれまでに、分子内スピロ環化平衡を示す蛍光色素HMRG (hydroxymethyl rhodamine green)を基本骨格として、500 nm程度の波長で機能するactivatableなプロテアーゼ活性検出蛍光プローブ群を開発してきた。HMRGはpHに応じて吸収・蛍光を示す開環体と無色・無蛍光の閉環体からなるスピロ環化平衡を示すため、tumor-to-background ratioの高いがんイメージングに必要なactivatable蛍光プローブの母核に適している。そこで、まずこのHMRG骨格を出発点とし、キサンテン環部位に修飾を加えたローダミン誘導体群を合成することで、分子構造と波長やスピロ環化平衡の平衡定数(pKcycl)の関係性を評価した。これにより、アルキル鎖伸長により吸収・蛍光極大波長が長波長化すること、電子求引基の導入によりpKcyclが酸性側にシフトすることなどを見出した。これらの結果は、キサンテン環の修飾により蛍光団の波長をコントロールし、目的に適したpHでactivatableなプローブを論理的に設計・開発できることを示唆している。2.合成したプローブの評価に用いるセンチネルリンパ節イメージングの系として、スイス・ローザンヌ・スイス連邦工科大学ローザンヌ校のMelody SwartzおよびJeffrey Hubbell両教授の研究室にて、リンパ節転移を起こすがんマウスモデルの作成技術を習得した。これを用いることで合成したプローブのin vivoでの評価を再現性よく、また定量的に行うことができると期待される。昨年度までの成果の論文発表を行った。これまで本研究グループでは、分子内スピロ環化平衡を示す蛍光色素HMRGを基本骨格として、500 nm程度の波長で機能するactivatableなプロテアーゼ活性検出蛍光プローブ群を開発してきた。そのひとつであるgGlu-HMRGは、既存のプローブに比べ高感度にGGTの活性を検出することで、GGTを高発現するがん種は直径1 mm以下の微小がんであっても迅速に可視化できる。このHMRG骨格を出発点とし、キサンテン環の片方のアミノ基からアルキル鎖を伸長することで、吸収・蛍光極大波長を長波長化した一連の非対称ローダミン誘導体を合成した。さらにキサンテン環の2位にハロゲン修飾を施すことで、適切なpKcycl (50 %の分子がスピロ環化体となるpH)を有する新規ローダミン骨格HMJCRを合成した。本骨格にペプチドを結合することにより、HMRG骨格に基づいた蛍光プローブ群よりも50 nm程度長波長化した新たなGGT活性検出蛍光プローブgGlu-HMJCRを開発し、種々のイメージングでの検討から、がん特異的な蛍光検出が可能であることを実証した。また、HMRGベースのプローブとの併用で、異なるプロテアーゼ活性を持つ複数のがん種を多色イメージングによって弁別することに成功した。また、本年度の年次計画に従い、昨年度までのローダミンでの知見を、シリルローダミンを初めとする他の長波長色素骨格に適用し、目的の機能を持つ分子骨格の設計と合成に取り組んだ。

褪色に強く明るい蛍光骨格を修飾し、π共役系の拡張によって励起・蛍光極大波長を長波長化し、使用環境下に適したpKaを持つ新たな非対称骨格を作成した。mmオーダーの微小ながんの可視化・診断技術を臨床応用するにあたって、高いS/N比を持つactivatableな有機蛍光小分子を論理的に設計・合成することは極めて重要である。私は、昨年度までに見出した分子構造と波長やスピロ環化平衡の平衡定数の関係性を基に、ローダミン骨格の特性を微細に調整することで多色化を実現し、in vivoで複数のプロテアーゼ活性を同時に可視化・弁別することに成功し、論文発表を行った。現在ではこれらの知見を他の長波長色素骨格に適用し、深部のイメージングが可能な蛍光プローブを作成している。これらはリンパ節転移のイメージングを達成する上で非常に重要な知見と成り得るため、期待以上の研究の進展があったと言える。より組織深部に存在するがんの検出を念頭に、昨年度までに開発・発表を行った非対称ローダミン骨格に基づいたプローブ群に比べ、さらに長波長で機能するプローブ群の開発を行った。具体的には、昨年度までのローダミン誘導体に関する知見をシリルローダミンにも適用することで、より長波長の蛍光を発し、かつプロテアーゼプローブの母核となり得る蛍光団の開発を試みた。まず、HMRGのシリルローダミンアナログであるHMSiR600を合成・評価した。この分子は想定通り長波長化したが、ローダミン誘導体より閉環構造を取りやすいことがわかった。そこで、pKcyclを適切な値に調節するため、非対称の分子内スピロ環化シリルローダミン群を合成・評価したところ、最も長波長の吸収・蛍光を示した誘導体が最適なpKcyclを示した。本骨格にペプチドを結合することにより、HMRG骨格に基づいた蛍光プローブ群よりも150 nm以上長波長化し近赤外蛍光を発する、新たなGGT活性検出蛍光プローブを開発し、がん特異的な蛍光検出が可能であることを実証した。また、HMRGベースのプローブとの併用で、異なるプロテアーゼ活性を同時に多色イメージングできることを示した。この成果は特許出願済であり、投稿論文準備中である。昨年度までに開発した論理的プロテアーゼプローブ群開発法に基づき、蛍光では原理的に観察が難しい深部組織を観察し得る手法として注目を浴びている、光音響イメージング用プロテアーゼプローブの開発も行った。過去の知見から、開発した非対称ローダミン誘導体の中からHMDiMeRを選択した。本骨格にペプチドを結合することによりGGTプローブを合成し、細胞イメージング、皮下腫瘍モデルマウスを用いたin vivoイメージングでの検討から、がん特異的な光音響波検出が可能であることを実証した。この成果は共著者として論文発表を行った。mmオーダーの微小ながんの可視化技術を臨床応用するためには、高いtumor-to-background ratioを持つactivatableな小分子蛍光プローブを論理的に設計・合成し、適応症例を増やしていくことが極めて重要である。私はそのようなニーズに応えるべく、ローダミン誘導体の分子構造と波長やスピロ環化平衡の平衡定数の関係性を見出した。
転写制御の異常と増殖制御の破綻

ポリコーム遺伝子群の遺伝子産物はPRC-1,PRC-2/3/4蛋白質複合体を形成しエピピジェネティックな遺伝子発現制御などを介して細胞機能を制御している。複合体の酵素活性としてPRC-1はヒストンH2A-monoUbiqitination, SUMO E3-ligase活性、PRC-2にはヒストンH3-K9/27メチル化活性があることが分かっている。PRC-1複合体のサブユニットであるMel-18とBmi-1は構造が良く似ているが、「ガン抑制遺伝子」と「ガン遺伝子」と、発ガンに関しては性質が全く反対である事が分かっている。そこで、それぞれの蛋白質複合体を単離したところ、1種類と思われていたPRC-1複合体が実は2種類の異なる複合体であることが判明した。精製したそれぞれの複合体の細胞増殖に及ぼす影響、を調べるために細胞内にmicro-injectionをした所、(1)細胞増殖への影響が全く反対であること、(2)複合体でなく、Mel-18/Bmi-1蛋白質モノマーでは、細胞増殖への影響が見られないこと、などが明らかとなって、ポリコーム蛋白質複合体の細胞増殖への作用は「蛋白質複合体を介した制御」であることが明らかになった。さらに個体レベルで,mel-18が、ガン抑制遺伝子として機能し、「Haplo-insufficiency」によってガン化が起きる事が分かった。つまり、何らかの理由により、核内の2種類のポリコーム蛋白質複合体PRC-1のバランス制御機構が破綻・継続すると、細胞のがん化を引き起こすことが考えられる。この複合体の不安定化による転写抑制機構の破綻が、癌化の原因の一つと考えられる。1;ポリコーム遺伝子群;Haplo-insufficiencyによる発がん(特に乳がん・腺がん)機構として巨大な核内蛋白質複合体の安定的形成の破綻が原因であることが分かった。さらにこの蛋白質複合体を精製にも成功しつつあり、現在構成蛋白質の同定を試みている。CpGメチル化DNA結合蛋白質や、ヒストンの脱アセチル化酵素などが共存していることが分かってきた。DNAメチル化依存性の転写抑制機構の破綻が、癌化の原因の一つと考えられる。2;p53遺伝子群;(1)キメラ遺伝子を用いた解析-アデノウイルス組み換え体を作製し、遺伝子治療への可能性を示した。(2)p51、p73のゲノム解析-両ゲノム配列のほぼ全長を決定し、プロモーター領域の解析を行った。(3)新規アイソフォームΔNp73の解析-、(4)p51、p73蛋白質の制御機構解析-TAp51は顕著なユビキチン化による制御を受けてること、(5)_Np51の機能-_Np51BはIKKによりリン酸化、分解を受け角化細胞の分化を制御していることを見いだした。ポリコーム遺伝子群(mel-18)が、ガン抑制遺伝子として機能し、「two-hit」ではなく、「Haplo-insufficiency」による発がん機構であった。核内の巨大なポリコーム蛋白質複合体の破綻が原因であることが分かった。さらに遺伝子増幅でも同じようにポリコーム蛋白質複合体の破綻をきたし、がん化することが分かった。つまり、原因はなんであれ、核内のポリコーム蛋白質複合体の不安定化・破綻が継続すると、細胞のがん化を引き起こすことが分かった。現在、この蛋白質複合体の精製にほぼ成功した。この蛋白質複合体は約6MDaと巨大であり、少なくとも数種類のポリコーム遺伝子群産物、ヒストンの脱アセチル化酵素、基本転写因子のTFIIs、アクチン、などが共存していることが分かってきた。現在、このポリコーム蛋白質複合体の精製にも成功しつつあり、現在構成蛋白質の同定を試みている。ショウジョウバエでもポリコーム蛋白質複合体の精製がKingstonの研究室から最近報告された。蛋白質複合体の構成成分は、哺乳類とハエで共通のものも有るが、哺乳類特有のものもいくつか存在していることが分かってきた。DNA結合蛋白質や、ヒストンの脱アセチル化酵素、基本転写因子TFIIs、などが構成成分として存在していることが分かってきた。転写抑制機構の破綻が、癌化の原因の一つと考えられる。さらに、ガン細胞の細胞周期および細胞死のどちらの(または両方)パラメーターが異常になっているのかを検討するために、DNATipを用い、標的遺伝子の発現スクリーニングを始めたところ、いくつか興味深いがん遺伝子群、がん抑制遺伝子群が同定できた。これらの両方の遺伝子群を同時に制御していることが、細胞のがん化を制御していると考えられた。今後これらの制御機構を詳細に詰めていきたい。mel-18の+/-マウスを長期観察していたところ、腺癌・乳癌が多発することが最近確認された。このことは我々が以前mel-18は「がん抑制遺伝子活性」があると報告したことを、個体レベルで始めて証明した事になる。現在その詳細を解析中であり、ヒト腺癌・乳癌の新しい癌抑制遺伝子の発見につながるものと考えている。この発がん機構の説明として「2-ヒット理論」と、「haplo-insufficiency」の2つの作業仮説を考えた。さらに核内の巨大なポリコーム蛋白質複合体の精製に成功した。

このクラスIIポリコーム蛋白質複合体のバランス制御機構の破綻が、がん化の原因であることが分かった。つまり、核内のポリコーム蛋白質複合体の不安定化・制御機構破綻が継続すると、細胞のがん化を引き起こすことが分かった。この複合体の不安定化による転写抑制機構の破綻が、癌化の原因の一つと考えられる。現在、ポリコーム蛋白質複合体の構成蛋白質の解析を行っている。蛋白質複合体の構成成分は、哺乳類とハエで共通のものも有るが、哺乳類特有のものもいくつか存在していることが分かってきた。転写抑制機構の破綻が、癌化の原因の一つと考えられる。さらに、ガン細胞の細胞周期および細胞死のどちらの(または両方)パラメーターが異常になっているのかを検討するために、DNATipを用い、標的遺伝子の発現スクリーニングを始めたところ、いくつか興味深いがん遺伝子群、がん抑制遺伝子群が同定できた。これらの両方の遺伝子群を同時に制御していることが、細胞のがん化を制御していると考えられた。今後これらの制御機構を詳細に詰めていきたい。ポリコーム遺伝子群の遺伝子産物はPRC-1,PRC-2蛋白質複合体を形成しエピピジェネティックな遺伝子発現制御などを介して細胞機能を制御している。PRC-1複合体のサブユニットであるMel-18とBmi-1は構造が良く似ているが、「ガン抑制遺伝子」と「ガン遺伝子」と、発ガンに関しては性質が全く反対である事が分かっている。そこで、それぞれの蛋白質複合体を単離したところ、1種類と思われていたPRC-1複合体が実は2種類の異なる複合体であることが判明した。それぞれの複合体の細胞増殖に及ぼす影響、細胞内蛋白質濃度による影響が全く反対であることなどが明らかとなってきた。さらに個体レベルでのmel-18が、ガン抑制遺伝子として機能し、「Haplo-insufficiency」による発がん機構である事が分かった。つまり、核内の2種類のポリコーム蛋白質複合体PRC-1の・バランス制御機構破綻が継続すると、細胞のがん化を引き起こすことが分かった。この複合体の不安定化による転写抑制機構の破綻が、癌化の原因の一つと考えられるポリコーム遺伝子群の遺伝子産物はPRC-1,PRC-2/3/4蛋白質複合体を形成しエピピジェネティックな遺伝子発現制御などを介して細胞機能を制御している。複合体の酵素活性としてPRC-1はヒストンH2A-monoUbiqitination, SUMO E3-ligase活性、PRC-2にはヒストンH3-K9/27メチル化活性があることが分かっている。精製したそれぞれの複合体の細胞増殖に及ぼす影響、を調べるために細胞内にmicro-injectionをした所、(1)細胞増殖への影響が全く反対であること、(2)複合体でなく、Mel-18/Bmi-
広い波長域での温度無依存発振波長半導体レーザに関する研究

波長1.3μm-1.5μm領域で温度安定な発振波長の半導体レーザの実現が期待される新しいIII-V族混晶半導体TlInGaAsに関する研究を進めた。この混晶半導体は半金属TlAsと半導体InGaAsとの混晶であることから、ある組成域で温度無依存のバンドギャップを示す可能性があり、更に、屈折率の温度安定性も期待される半導体として提案したものである。したがって、この半導体を活性層に用いることにより、温度安定な発振波長をもつ半導体レーザの実現が期待される。これまでに、TlInGaAs/InPヘテロ構造においてフォトルミネセンス(PL)発光およびエレクトロルミネセンス(EL)発光のピークエネルギーの温度変化が予測どおり小さい値を持つことを示してきた。本年度は、InP基板上に成長したTlInGaAsに対してエリプソメトリーおよび光反射測定により、屈折率の温度依存性を調べ、T1の添加および増加によりTlInGaAsの屈折率の温度依存性が小さくなることを観測した。更に、光吸収測定によりバンドギャップエネルギーの温度依存性も測定し、同様に温度変化が小さくなることが確認された。これに基づき1.5-1.6μmで発振するTlInGaAs/InP LDを試作し、発振スペクトルの縦モード波長の温度依存性として0.06nm/Kと小さな値を得た。しかし、広い温度範囲では縦モードの飛びが見られ、0.3nm/Kであった。さらに、1.2-1.3μm帯に対応するGaAs基板上に成長したTlInGaAs/GaAs量子井戸構造を作製し、この波長域でもPL発光波長の温度依存性が小さくなることを確認した。このことにより温度安定な発振波長の半導体レーザの実現の可能性を示した。InP基板に格子整合する新しいIII-V族混晶半導体TlInGaAsによる1.5μm領域での温度安定な発振波長の半導体レーザの実現を狙いとした研究を進めた。この半導体は、適当な混晶組成域において周囲温度に依存しないバンドギャップを示すと予測しているものである。本研究に先だって、TlInGaAs/InPヘテロ構造においてフォトルミネセンス(PL)発光およびエレクトロルミネセンス(EL)発光のピークエネルギーの温度変化が予測どおり小さい値を持つことを示してきた。今回、ガスソースMBE法によりTlInGaAs/InPダブルヘテロ(DH)のレーザ構造を成長し、電極ストライプレーザダイオード(LD)を試作し、77-310Kでの電流注入パルス発振を達成した。室温での発振しきい値電流密度は5-7kA/cm2で、その温度特性は約90Kであり、比較的良好な特性であった。ペルチエ素子によりLDの温度を精密に制御して、発振スペクトルの温度依存性を調べた結果、狭い温度領域でのピーク波長の温度依存性は0.06nm/Kと、InGaAsP/InP DFB LDの0.1nm/Kよりも小さな値であることを確認した。活性層にTlを添加することにより、屈折率の温度依存性がInGaAsPよりも小さくなり、LD発振波長の温度特性が改善されたものと考えられる。屈折率の温度依存性の改善は、バンドギャップエネルギーの温度安定性から期待されるものである。温度安定な発振波長の半導体レーザの実現の可能性を示した。
スポーツ競技者の視空間知覚‐認知処理機構の解明

本研究では反応時間と脳波(事象関連脳電位)を用い,スポーツ競技者の視空間知覚-認知処理機構について検討した.その結果,1スポーツ競技者は非競技者に比べ,視空間知覚-認知課題のパフォーマンスに優れており,特に視空間認知処理に関わる神経活動が異なること,2オープンスキル競技者とクローズドスキル競技者では,特に反応抑制に関わる神経活動で差異が認められることが明らかとなった。本研究の成果は,長期間の身体運動がヒトの脳機能にポジティブな効果をもたらすことを裏付けるとともに,スポーツ競技者間においても,その競技種目の特性によって視空間知覚-認知処理機構への影響が異なることを示唆するものである.スポーツ競技者,特に球技系に代表されるオープンスキル種目では目的とする運動の準備・遂行のみならず,刻々と変化する周囲の状況を知覚,認知し,最適な状況判断,意思決定を行うことが要求される.したがって,視覚情報の知覚-認知処理能力は,オープンスキル競技者の優れた競技パフォーマンスを支える要因の一つと考えられる.そこで,本研究は行動指標(反応時間,正反応率)と事象関連脳電位を用いて,スポーツ競技者の視空間知覚-認知処理機構について検討した.平成24年度は,非競技者,バレーボール競技者,陸上跳躍競技者を対象に視空間認知課題を行い,課題遂行時の行動指標と事象関連電位のGo P3およびNoGo P3成分を比較した.その結果,1スポーツ競技者は非競技者に比べ,視空間認知課題のパフォーマンスに優れており,視空間認知処理に関わる神経活動も異なること,2高いオープンスキルが要求されるバレーボール競技者と,その要求度の低い陸上跳躍競技者では,反応抑制に関わる神経活動で差異が認められることが明らかとなった.平成25年度は,非競技者,バレーボール競技者,陸上短距離競技者,陸上中長距離競技者,陸上跳躍競技者を対象に,陸上短距離走のスタート場面に模したGo/NoGo反応時間課題(陸上)を行った.その結果,1陸上短距離競技者は特に聴覚刺激に対する認知パフォーマンスに優れており,それに関わる神経活動においても差異が認められること,2バレーボール競技者は非競技者に比べ,刺激モダリティーに関わらず認知パフォーマンスが高く,その処理に関わる神経活動も異なることが明らかとなった.これらの研究成果は,長期間の身体運動がヒトの知覚-認知処理機構にポジティブな効果をもたらすことを裏付けるとともに,スポーツ競技者間においても,競技種目の特性によって視空間知覚-認知処理機構への影響が異なることを示唆するものである.本研究では反応時間と脳波(事象関連脳電位)を用い,スポーツ競技者の視空間知覚-認知処理機構について検討した.その結果,1スポーツ競技者は非競技者に比べ,視空間知覚-認知課題のパフォーマンスに優れており,特に視空間認知処理に関わる神経活動が異なること,2オープンスキル競技者とクローズドスキル競技者では,特に反応抑制に関わる神経活動で差異が認められることが明らかとなった。本研究の成果は,長期間の身体運動がヒトの脳機能にポジティブな効果をもたらすことを裏付けるとともに,スポーツ競技者間においても,その競技種目の特性によって視空間知覚-認知処理機構への影響が異なることを示唆するものである.スポーツ競技者は長年にわたる運動トレーニングの結果,骨格筋や呼吸循環器が構造的,機能的に非競技者と大きく異なることは周知の事実である.さらに近年では,運動トレーニングは脳神経系に可塑的変化をもたらすことが報告され,スポーツ競技者の脳機能に関しても注目されている.しかし,スポーツ競技者の脳機能に関する研究は端緒についたばかりである.そこで本研究課題では,特にオープンスキル種目においてパフォーマンスを左右する一要因となる視空間知覚-認知処理機構に注目し,スポーツ競技者特有の視空間知覚-認知処理機構の解明を目的とした.平成24年度は,非競技者,バレーボール競技者,陸上跳躍競技者を対象に視空間認知課題を行い,課題遂行時の行動指標(反応時間,正反応率)と事象関連電位のGo P3およびNoGo P3成分を比較した.その結果,両スポーツ競技者の反応時間は非競技者よりも有意に短く,Go P3およびNoGo P3も高振幅を示した.また,バレーボール競技者のNoGo P3振幅は陸上跳躍競技者に比べ有意に大きかった.以上の結果から,1スポーツ競技者は非競技者に比べ,視空間認知課題のパフォーマンスに優れており,視空間認知処理に関わる神経活動も異なること,2高いオープンスキルが要求されるバレーボール競技者と,その要求度の低い陸上跳躍競技者では,反応抑制に関わる神経活動で差異が認められることが明らかとなった。本年度の研究成果は,長期間の身体運動はヒトの脳機能にポジティブな効果をもたらすことを裏付けるとともに,スポーツ競技者間においても,その競技種目の特性によって視空間認知処理機構への影響が異なることを示唆する重要なものである.スポーツ競技者特有の視空間知覚-認知処理機構の解明を目的として,平成24年度は,非競技者,バレーボール競技者,陸上跳躍競技者を対象に視空間認知課題を行い,課題遂行時の行動指標(反応時間,正反応率)と事象関連電位のGo P3およびNoGo P3成分を比較した.その結果,おおむね当初の仮説を支持する結果が得られた(1スポーツ競技者は非競技者に比べ,視空間認知課題のパフォーマンスに優れており,視空間認知処理に関わる神経活動が異なっていた,2高いオープンスキルが要求されるバレーボール競技者と,その要求度の低い陸上跳躍競技者では,反応抑制に関わる神経活動で差異が認められた)ことから,現在のところおおむね順調に研究が進展していると評価する.平成24年度の研究成果の中で注目すべきところは,バレーボール競技者と陸上跳躍競技者でNoGo P3(反応抑制に関わる神経活動)に差異が認められた点である。

したがって,平成25年度はこの点を突き詰めるため,対象のスポーツ種目を拡大するとともに,NoGo P3を誘発するのにより適した認知課題を用いて詳細に検討する予定である.平成25年度も研究が滞りなく遂行できるよう,実験器具および消耗品の購入のため物品費30万円,実験補助員に対する実験補助費と国際誌への投稿論文の添削・校閲のため謝金等を60万円計上する予定である.また,研究資料収集及び研究成果の学会発表を行うため,旅費30万円も計上する予定である.その他として,平成25年度は本研究課題の完結年度であるため,社会,国民への成果報告のためのパンフレット作成費8万円を計上する予定である.
橋梁のグローバル挙動逆算定に基づく省力形重量車両検出システムの開発

本研究は加速度応答計測に基づく橋梁車両重量計測手法を構築した.コンクリート床版の活荷重応答は局所的な応答であるがゆえ,主構造と比較して応答周波数領域が高い.そのため,一般的な加速度計を用いても比較的精度良く記録できる周波数領域を対象として使用できる.加速度記録は2回の積分処理を経て変位応答記録へと変換される.このとき,数値のドリフトを避けるため,カルマンフィルタを適用した.カルマンフィルタをコントロールする3つのパラメータは,変位計を用いた床版のたわみ計測記録と最も近い結果となるパターンを用いた.加速度BWIMの結果,車両速度が比較的速くない状況において良好な重量算出が可能となった.加速度計測に用いる携帯端末向けの3軸加速度記録アプリケーションを開発した。アプリケーションは実装先の携帯端末画面上で計測開始および停止の操作が可能となっている。本研究で選定した携帯端末による計測では100Hz以上のサンプリングレートでの計測が可能であり、橋梁の動的応答の計測には十分な計測間隔である。さらに30秒おきに携帯回線を通じてSNTPサーバーへのアクセスに基づく時刻修正機能も組み込んでいる。油圧サーボ型材料試験機を用いて、このアプリケーションを実装した携帯端末を複数同時に動的載荷した結果、時刻修正機能が有効であり、端末間での時刻記録が同期状態となっていることを確認した。さらに一定の周期による定常振動実験の結果、低周波数帯を除いて有線の加速度計と同等の応答振動数の把握が可能であることを確認した。このアプリケーションの開発により、複数の携帯端末を用いた同時に多点での無線加速度計測が可能となり、これまで有線計測を主として行われきた車両重量算定に対する配線や設置労力の低減、さらには外部電源を必要としないなどのメリットが生じる。実橋梁において、軸重が既知の重量車両を用いた走行試験を実施した。計測には開発したアプリケーションを実装した携帯端末を8台用い、橋梁の活荷重加速度応答をサンプリングレート100Hzで計測した。計測に際して携帯端末の設置には1名で20分程度と非常に低労力の設置作業であり、また計測終了後の機器回収も同様に省力的な作業で終えることが出来た。走行試験後は、同橋梁においておよそ8時間の実供用下の連続計測を行った。今後得られた加速度データの処理方法について詳細に検討し、橋梁上を走行する大型車両の総重量を計算するための手法を構築する。加速度計測用の携帯端末に実装するアプリケーションの開発は、搭載機種の多いアンドロイドOSを想定し、Javaを用いた。計測に使用した携帯端末はNexus5であり、OSはAndoroid4.4である。携帯端末の操作画面がアクティブ状態からスリープモード、またその逆の状態変化時おいて使用電力に大きな差が生じ、その瞬間に記録する時間間隔がずれることが判明した。そのため、スリープモードを解除した状態を保持するアプリケーションとした。携帯端末を用いたBWIMの実現上、複数の携帯端末を用いて、多点で同時にかつ動的に計測することを想定しているため、端末間の時刻記録情報に差が生じることを防ぐ必要があり、SNTPサーバーに30秒おきにアクセスし、携帯デバイス自身の時刻を常時修正するアプリケーションとした。時刻修正機能に基づく携帯端末間の時間記録の差を把握するため、油圧サーボ型材料試験機を用いて4機の携帯端末を同時に加振する連続載荷実験を行った。載荷継続時間は最大で60分とした。携帯端末同士の加速度記録時間差を、相互相関関数を利用して把握したところ、最大の時間差でも0.03秒と良好な結果が得られた。開発したアプリケーションを実装した携帯端末8台を用い実橋梁で計測を行った。設置作業は外壁用両面テープを用いたもので、2名で20分程度の作業と目標とする作業時間を達成できている。軸重が既知の車両を用いて計測し、コンクリート床版の局部応答および、桁中央部のグローバル応答を記録した。記録データに混入するノイズの影響は小さく、また局部応答ではBWIM処理に必要な車両時刻の把握が生データからも可能であることが示唆された。以上の進捗は当初の研究進行予定に沿っており、おおむね順調に進展していると判断した。実橋梁において軸重が既知の試験車両を走行させ、橋梁部材の加速度応答および変位応答を計測した。得られた計測データについて、(1)ウェーブレット変換の適用による車軸情報の捕捉、(2)加速度記録データからの変位データへの変換、(3)変位影響線の作成を実施した。まず(1)については、複素型の連続ウェーブレット変換に着目し、オリジナルのマザーウェーブレットを定義することで、加速度計測データからの車軸通過情報の抽出精度改善を図った。オリジナルマザーウェーブレットの設計には実波形から窓関数処理を施すことになるが、時間分解能と周波数分解能の両面に優れるHanning窓関数を採用することとした。その後、ノルムの正規化、ヒルベルト変換等の処理に基づいて、複素型のオリジナルマザーウェーブレットを作成した。オリジナルマザーウェーブレットを用いて波形分解処理を施したところ、軸通過情報が比較的良好に得られた。ただし、全軸を完全に捕捉できないケースがあり、この点は改善が必要である。次に(2)について、加速度からの変位への積分計算の途上にカルマンフィルタを導入し、誤差相当量を補正することで、積分過程に生じる数値のドリフトを抑えることとした。カルマンフィルタの設計上、カルマンゲインおよび状態方程式におけるノイズの分散、観測方程式におけるノイズの分散がコントロールパラメータとなる。これらパラメータを独立に変動させ、積分計算結果が、最も実計測の変位応答に近いものを決定した。