hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
アリル炭化水素受容体を介した精子産生機能障害のin vivo機構解析

In vivoでマウス精子産生機能を障害する環境汚染物質の作用機構の解明を目的とし、本研究を行った。その結果、高いアリル炭化水素受容体(AhR)アゴニスト活性を示したbenzo[a] pyrene(BaP)は弱いながらも精子産生機能を阻害した。また、このBaPによる精子産生機能障害はAhRアンタゴニストによって減弱した。以上の結果から、BaPによる精子産生機能障害にAhRが関与していることが示唆された。従来から環境化学物質がヒトや野生動物の精子産生機能に及ぼす影響が注目されており、その機構を分子レベルで解明することがますます重要になっている。そこで、本研究では精子産生機能を障害する作用が認められた化合物の作用機構、特にアリル炭化水素受容体(AhR)の役割を明らかにすることを目的とし、雄性ddYマウスを用いて研究を行った。雄性ddYマウスの精細管内に化合物を直接投与し、3、4又は5週間後に顕微鏡を用いて精子細胞とセルトリ細胞を観察し、精子数を計測した。まず、AhRアゴニストとして多環芳香族炭化水素であるベンゾ[a]ピレン(BaP)又はクリセン(Chr)をマウスに投与し、精子産生機能障害を評価した。その結果、BaP及びChrを投与したマウスでは、対照群のマウスに比べ、弱いながらも精子産生機能の障害が観察された。また、得られた組織切片において、精細管内のセルトリ細胞と精子細胞中のCYP1A1タンパク質発現に対する各化合物の効果を免疫染色法により検討したところ、BaPまたはChrを投与したマウスでは、弱いながらもCYP1A1タンパク質発現の誘導が観察された。以上の結果から、本研究ではAhRアゴニストであるBaPやChrがAhRを介し、精子産生機能を阻害する可能性が示唆された。近年、精子の質の低下が提唱されているなど、環境中に普遍的に存在するAhRアゴニストなどの環境汚染物質による精子産生機能障害の影響が懸念されていることから、実験条件の最適化により、BaPやChrの精子産生機能に対する阻害効果がさらに強く発揮される可能性が考えられる。さらなる実験条件の再検討が必要である。従来から環境化学物質がヒトや野生動物の雄性生殖機能に及ぼす影響が注目されており、その機構を分子レベルで解明することはますます重要になっている。本研究の目的は、in vivoで精子産生機能を障害する化合物の作用機構を明らかにすることである。平成21年度までの研究から、アリル炭化水素受容体アゴニストであるベンゾ[a]ピレン(BaP)やクリセンが雄性マウスに対し精子産生機能障害及びCYP1A1タンパク質発現誘導を示すことが明らかになったが、その作用は非常に弱いものであった。本年度は、さらに強い効果を観察するため、化合物を投与する際に用いる溶媒の組成を検討した。その結果、5%エタノール及び5%クロモフォールを含むリン酸緩衝生理食塩液を溶媒とした場合、高速液体クロマトグラフィーの結果からBaPが高い溶解度を示すことが明らかになった。そこで、この溶媒を用いてBaPをマウスに投与したところ、マウスは著しい精子産生機能障害を示したが、投与後屠殺する前に死亡した。α-fodrinまたは活性型caspase-3に対する抗体を用いウエスタンブロットを行った結果、死亡したマウスの精巣で細胞死が起きていることが示唆された。以上の結果から、BaPをこの溶媒に溶解し使用した場合は致死性の強い毒性を示すため、この溶媒は今後の実験の使用に適さないと考えられた。また、マウス精巣由来TM4細胞でBaPの処置により発現が増強または減弱する遺伝子を特定することにした.BaPで処置した細胞からtotal RNAを抽出しcDNAを作製した後、Fluorescent differential display kitを用いてPCRを行い、ポリアクリルアミド電気泳動を行った.その結果、対照に比べ、発現が増強または減弱するバンドがいくつか観察された。平成23年度はクローニングを行い、これら遺伝子を同定する予定である。本研究の目的は、in vivoで精子産生機能を障害する化合物の作用機構、特にアリル炭化水素受容体(AhR)の役割を明らかにすることである。平成22年度までの研究で、benzo[a]pyrene(BaP)がマウスの精子産生機能を障害することを明らかにした。そこで、本年度はddYマウスにBaPとAhRアゴニストであるα-ナフトフラボン(α-NF)を併用投与し、精子数を計数した。その結果、BaPを単独投与したマウスに比べ、α-NFを併用投与したマウスでは精子数が増大し、α-NFがBaPの精子産生機能障害を減弱することが示唆された。BaPの精子産生機能障害にAhRが関与していることが考えられる。

また平成22年の研究では、BaPの処置により発現が増強または減弱する遺伝子を特定することを目的に、BaPで処置したマウス精巣セルトリ細胞由来のTM4細胞からtotal RNAを抽出してcDNAを作製した後、differential display kitを用いてPCRを行い、ポリアクリルアミド電気泳動を行った。その結果、対照に比べ発現が増強または減弱するバンドがいくつか観察された。そこで本年度は、BaPを投与したddYマウスから精巣を摘出し、total RNAを抽出した後cDNAを調製し、differential display kitを用いてPCRを行った。PCRはTM4細胞と同様のプライマーを使用した。その結果、対照に比べ発現が増強または減弱するバンドがいくつか観察されたが、そのパターンはTM4細胞を用いた結果とは異なっていた。以上の結果から、BaPによって発現が増強または減弱する遺伝子が、TM4細胞とddYマウスの精巣では一致しないことが示唆された。他のプライマーを用いて、再度differential display法を行う必要が考えられる。
神経細胞のinvitro観察・制御用光電融合バイオインターフェイスデバイスの開発

前年度までに0.35umルール標準CMOSプロセスを用いて試作した小型イメージセンサにより、マウス脳海馬のin vivo蛍光イメージングを行っい、マウス脳海馬におけるセリンプロテアーゼの活性発現のイメージングに成功し、マウス脳内において生じるLTP(Long Term Potentiation)に対応するとみられる酵素発現のイメージングに成功した。LTP発現等の高度な脳神経イメージング実験においては、これまで開発したin vivoイメージングモジュールに加え、励起光導入用光ファイバ、刺激電極、計測電極などを実験対象の脳に埋め込む必要がある。本研究では、イメージングの高機能化への対応として、イメージセンサに裏面からチップ面を通して励起光や薬物を導入するための貫通穴を形成することを試みた。また同時に、イメージセンサ上に刺激・計測電極の集積化を行った。これらの新機能を実証するイメージセンサデバイスを試作し、実装した上で、高機能化の実証(励起光導入.電気刺激機能)に成功した。0.35umルール標準CMOSプロセスを用いて、小型イメージセンサを設計試作し、in vitro蛍光イメージングに向けたチップ実装を行った。チップサイズは2mm×2.5mm,画素数はQCIF(176×144画素),画素サイズは7.5μm□である。チップに対し、防水保護するための樹脂包埋を施した後、励起光がチップに直接入射するのを避けるためのフィルタ層スピンコートした。このセンサを用いて、以下の結果を得た。マウス海馬スライスをDAPIによって染色し、UV励起光によって海馬の構造の蛍光観察に成功した。センサフィルタとしてはブルーレジストを用いた。マウスの脳皮質スライスおよび海馬スライスをDiAによって染色し、染色剤の伝播プロファイルの計測に成功した。センサフィルタとしてレッドレジストを用い、励起光にはAr+イオンレーザ(488nm)を使用した。現在、これらの結果の再現性を含め詳細なデータ取りを行うとともに、電気的に細胞システムを刺激する機能を持つ新規センサを設計している。前年度に0.35μmルール標準CMOSプロセスを用いて試作した、小型イメージセンサにより、マウス脳海馬のin vivo蛍光イメージングを行った。センサチップをin vivo蛍光イメージングに適用するには、デバイスを小型薄型に実装し、低侵襲イメージングを実現する必要がある。実装には150μm厚のCMOSセンサチップをフレキシブル基板に貼り付け、エポキシ樹脂で包埋した。励起光除去フィルターとしてカラーレジストをデバイスの上にスピンコートした。レジストの厚さ3μmで励起光抑圧-44dB以上を得た。一方、蛍光色素AMCからの蛍光の透過率80%以上を達成した。実装したデバイスの厚は350μmであり、小動物の脳を観察する時与える組織へのダメージを最小限にできる。このデバイスを用いての脳機能イメージングとして、マウス脳海馬におけるセリンプロテアーゼの活性発現のイメージングを試みた。実験には非蛍光化した基質(VPR-MCA、PGR-MCA)を用いた。カイニン酸(Kainic acid)を導入することで、プロテアーゼを分泌させ、基質を変化してAMCを生じる。蛍光イメージングにより脳のセリンプロテアーゼの活動を観察が可能である。その結果、プロテアーゼの時間経過及び反応開始を同定することに成功した。
性分化を制御する遺伝子ネットワークの解明

我々は遺伝子の機能解析を通じて生殖腺の性分化機構を研究し,これまでに性分化を制御する多数の遺伝子(素因子)の機能解析を行った。同時に,これらの素因子による遺伝子カスケードの解明を発展的研究対象と位置づけ,生殖腺の性分化に異常をきたす各種遺伝子破壊マウスやトランスジェニックマウスの作製を行ってきた。本研究はこれらのマウスを用いた遺伝学的解析によって,素因子間の関係を遺伝学的に体系化すること,そしてその実体を生化学的に同定することで,性分化を制御する遺伝的基盤の理解をめざし、(1)遺伝子改変動物を用いた遺伝学的解析と(2)転写因子を取り巻く複合体の精製とその解析を行った。(1)遺伝子改変動物を用いた遺伝学的解析-本年度はAd4BP/SF-1遺伝子とM33遺伝子の間の関連を解析した。二つの遺伝子はともに生殖腺の発生に不可欠であること、また遺伝学的にはM33がAd4BP/SF-1遺伝子の発現制御を行っていることが明らかになった。そこで、M33抗体を作製し、Ad4BP/SF-1遺伝子座全体を対象としたクロマチン抗体沈降法による解析を行ったところ、Ad4BP/SF-1遺伝子の5'側と3'側にM33の結合が認められた。特に5'側領域は遺伝子の境界を作っていることを示唆する結果を得ていた領域と一致し、この領域の形成にM33を含むポリコーム複合体の関与が示された。(2)転写因子を取り巻く複合体の精製とその解析-生殖腺の分化に不可欠なAd4BP/SF-1やSox9は翻訳後にSUMO化による修飾を受け、その転写活性が制御されることを明らかにしてきた。このSUMO化修飾されたAd4BP/SF-1を認識する因子を精製したところ、クロマチンリモデリング因子様の構造をもつ因子が単離された。この因子の機能解析を通じ、SUMO化による転写活性の制御機構の解析を行っている。
Al-Pd-Mn準結晶の熱膨張率の精密測定によるフェイゾンの観測

正二十面体相準結晶の散漫散乱分布の異方性や温度依存性を詳細に広い温度範囲で実験的に研究し,それによりフェイゾンの形や種類の解明することである。準結晶の熱膨張率の測定の1つである格子定数の精密な温度依存性は実験されていない上,格子定数の温度依存性に異常が観測される兆候もあり,格子定数の精密な温度依存性を調べた。測定方法としてはX線単結晶を用いた複数個の反射する結晶角を測定するボンド法を採用した。しかし,線膨張率が一定の温度範囲が以上に広く,格子定数の精密な温度依存性からはフェイゾン等の存在の明らかな徴候は得られなかった。散漫散乱分布の温度依存性を実験し,Huang散乱の準結晶への適用と体積非保存不純物による散漫散乱分布の計算を実行し比較した。Al-Pd-MnやAl-Cu-Fe等の正二十面体相の散漫散乱分布を実験した結果,(1)反射点によらずほぼ同じ形であること,(2)室温以下ではあまり温度依存性のしないこと,(3)その散漫散乱の概形はほぼ対称的で,L方向に短く,T方向にのびた菱形状であること,(4)その散漫散乱のq依存性はほぼq2に比例すること,等の特長がある。これらの散漫散乱分布の性質が,欠陥のまわりに生じる歪み場を弾性近似してえられるHuang散乱によく似ていることから,いくつかの欠陥を仮定し,このHuang散乱を正二十面体対称性を持つとして計算を実行した。この結果,正二十同体相中のHuang散乱には立方晶中において観測されるHuang散乱と同じで3種類の独立なものがあり,現実の欠陥による散漫散乱はこの3種のHuang散乱各々では説明できないことがわかった。特にランダムフェイゾンもこの置換型欠陥の一種と考えられるので,ランダムフェイゾンのような欠陥が数多くAl-Pd-MnやAl-Cu-Fe等の正二十面体相に入っているものと思われる。格子定数を精密に決定するためにボンド法と呼ばれる方法で格子定数aを決定する。主として反射対はCahnの指数の(4/8,8/12,0/0)(0/0,4/8,0/0)をもちいた。格子定数a_<6d>の結果は以下の様になります。測定した温度は約180Kから370Kの範囲だったが、直線的な格子定数の変化しかみられず,格子定数の温度依存性の直線はT°Cで,a_<6d>=0.000206T+12.62Åとなり,0°Cでの線膨張率は,16.3×10^<-6>で,その成分の加重平均した値よりも多少小さいという結果が得られました。室温におけるA1の線膨張率は,23.1×10^<-6>,Cuの線膨張率は16.5×10^<-6>,Feの線膨張率は11.8×10^<-6>です。この結論は準結晶の成分の加重平均に極めて近いが,少し小さな値を持っている。その値から考えると,当然の結果であるかもしれないが,ある意味で異常である。準結晶はAlとかCuのような最密構造ではなく,準結晶構造を持つためにはアモルファスに近いかボンド結合的な構造であるため,当然準結晶は通常の金属や合金の熱膨張率と違った値を持つと考えられるからである。

熱膨張率が構造敏感であることは、水晶と溶融石英の線膨張率の十数倍の違いがあること,また真鍮は銅と亜鉛の線膨張率の平均というより銅の値に近いことから明らかである。しかし今回の結果の線膨張率に関しては、金属合金結合の構造に近いものだと思われる。今後の展開としては、さらに高温での依存性を測定する必要がある。というのは高温になるにつれて格子欠陥が温度変化する。格子欠陥数の温度依存性は,その成因モデルに依存するため,線膨張率の温度依存性を測定することで,モデルを決定したい。正二十面体相準結晶の散漫散乱分布の異方性や温度依存性を詳細に広い温度範囲で実験的に研究し,それによりフェイゾンの形や種類の解明することである。準結晶の熱膨張率の測定の1つである格子定数の精密な温度依存性は実験されていない上,格子定数の温度依存性に異常が観測される兆候もあり,格子定数の精密な温度依存性を調べた。測定方法としてはX線単結晶を用いた複数個の反射する結晶角を測定するボンド法を採用した。しかし,線膨張率が一定の温度範囲が以上に広く,格子定数の精密な温度依存性からはフェイゾン等の存在の明らかな徴候は得られなかった。散漫散乱分布の温度依存性を実験し,Huang散乱の準結晶への適用と体積非保存不純物による散漫散乱分布の計算を実行し比較した。Al-Pd-MnやAl-Cu-Fe等の正二十面体相の散漫散乱分布を実験した結果,(1)反射点によらずほぼ同じ形であること,(2)室温以下ではあまり温度依存性のしないこと,(3)その散漫散乱の概形はほぼ対称的で,L方向に短く,T方向にのびた菱形状であること,(4)その散漫散乱のq依存性はほぼq2に比例すること,等の特長がある。これらの散漫散乱分布の性質が,欠陥のまわりに生じる歪み場を弾性近似してえられるHuang散乱によく似ていることから,いくつかの欠陥を仮定し,このHuang散乱を正二十面体対称性を持つとして計算を実行した。この結果,正二十面体相中のHuang散乱には立方晶中において観測されるHuang散乱と同じで3種類の独立なものがあり,現実の欠陥による散漫散乱はこの3種のHuang散乱各々では説明できないことがわかった。特にランダムフェイゾンもこの置換型欠陥の一種と考えられるので,ランダムフェイゾンのような欠陥が数多くAl-Pd-MnやAl-Cu-Fe等の正二十面体相に入っているものと思われる。
分子算盤:分子ネックレス内シクロデキストリンのSTM探針による操作

昨年度の結果より、分子ネックレス内のCyD分子の配列構造を制御するためには、まずCyD分子間の相互作用を評価し、制御することが重要であることがわかった。そのため、本年度はCyD分子間相互作用、およびCyDとゲスト分子との間の相互作用を、原子間力顕微鏡(AFM)を用いてフォースカーブを測定することにより評価することを試みた。まず始めに、HOPG上にCyD自己組織化膜を作成し、AFMを用いて大気中でフォースカーブを測定し、凝着力に注目することで、CyD分子間相互作用の評価を試みた。その結果、ホスト分子種の違いにより、凝着力に変化が見られた。さらに、ゲスト分子を加えた場合にも凝着力に変化が見られた。これらの結果は、ホスト分子種およびこれらにゲストを加えることによる分子間相互作用の変化が、凝着力の変化となって表れたものと考えられる。以上の結果から、AFMを用い、分子間の相互作用を評価できる可能性が示唆された。続いて、CyD分子-ゲスト分子間の相互作用をより詳細に調べるために、溶液中におけるフォースカーブ測定を行った。その結果、観察される凝着力の成分を、水分子特有の氷角構造に起因する相互作用、溶媒和に起因する相互作用、CyD分子-ゲスト分子間のイントリンジックな相互作用とに分解して、詳細に検討することが可能になった。以上の結果は、分子ネックレス内のCyD分子の配列構造を制御する際の礎となると期待され、今後は、求める分子操作に対応した配列構造の作成が可能になると期待される。α-シクロデキストリン(α-CyD)分子とSTM観察の際に基板として用いたMoS2との間の高い格子整合性を利用した分子ネックレス内でのCyD分子の配列構造の解析した結果、CyD分子の配列構造は80%がhead-to-headであるが、20%のhead-to-tailの配列も含まれていることが明らかになった。これまでは、CyD分子間の水素結合の強さにより、分子ネックレス中のCyD分子はhead-to-headの配列構造をとるとされてきた。しかしながら上記解析結果は、分子ネックレスの形成過程において、これまで無視されていた力の弱い水素結合も考慮する必要があることを示唆している。そこでCyD分子間の水素結合の強さにより、取込み時の配列構造に揺らぎが生じることを考慮した新たなモデルを提案することにより、実験結果の再現に成功した。本結果から、超分子を構成する分子間の相互作用が、その形成過程に影響していることが明らかになった。従って、例えば溶媒効果などを利用し、CyD分子間相互作用を制御することにより、分子ネックレス内のCyDの配列構造を制御できる可能性が開けた。上記結果より、分子ネックレス内のCyD分子の配列構造を制御するためには、まずCyD分子間の相互作用を評価し、制御することが重要であることがわかる。そこでCyD分子間相互作用を、原子間力顕微鏡(AFM)を用いてフォーカスカーブを測定することにより評価することを試みた。その結果、ゲスト分子によるCyD分子間相互作用の変化を直接評価できることを示し、今後、分子間相互作用を分子レベルで解析・制御するための手がかりを得た。
含水微惑星の衝突年代から読み解く惑星への水の供給ダイナミクス

2018年度は年代測定をする試料の準備を行った。標準試料に関しては、地球産のカルサイト、ドロマイトを複数購入し、樹脂に埋めて研磨試料を作製した。その試料はEPMAを用いて微量元素、主要元素を定量し、均質性を確かめた。樹脂に埋めた標準試料は、高崎の応用量子研究所においてクロムとマンガンのイオンを注入した。イオン注入は200 kV程度の加速電圧にて行い、ドーズ量は深さ方向プロファイルのピーク濃度において0.1重量パーセント程度になるように設定した。同時に、クロムとマンガンの濃度が既知のガラス試料にも同イオンを注入した。このガラス試料は次年度のSIMS分析の際に、イオン注入したクロムとマンガンの存在量のキャリブレーションに用いる。隕石試料に関しては、水質変成の影響が顕著なCRコンドライトとCMコンドライトを準備した。CRコンドライトはAsuka 881595という隕石で、サイズは小さいながらもカルサイト粒子が複数発見された。また、CMコンドライトは水質変成およびその後の熱変成を受けたJbilet Winselwanという隕石で、年代測定が十分可能なサイズのカルサイト粒子が複数発見された。熱変成の要因が天体衝突による加熱であるとすると、その年代は衝突の年代を記録しているのかもしれない。これら二つの隕石は、それぞれコンドルール内および周囲のフィロケイ酸塩の存在量と産状などから水質変成の程度を評価した。また、フィロケイ酸塩の化学組成を定量分析し、先行研究と比較して試料の均質性を確認した。初年度に隕石試料、標準試料ともに準備ができた。作製した標準試料を用いて、次年度は隕石試料に含まれる炭酸塩鉱物の高精度マンガン・クロム年代測定に予定通り着手できる。今後はSIMSを用いて隕石試料に含まれる炭酸塩鉱物のマンガン・クロム年代測定を行う。まず、マンガンとクロムの濃度が既知のガラス試料を用いて、炭酸塩鉱物の標準試料にイオン注入したマンガンとクロムのSIMSにおける感度を評価する。また、深さ方向のマンガン・クロム濃度プロファイルを測定し、濃度プロファイルの理論モデルと一致するかを確認する。深さ方向の濃度プロファイルは、SIMSの分析痕の深さをレーザー顕微鏡によって測定し、深さのキャリブレーションを行って求める。次に、未知試料である隕石中の炭酸塩鉱物のマンガン・クロム年代測定を行う。酸素の一次イオンを5ミクロン程度に絞って試料表面に照射し、叩き出されたマンガンおよびクロムの二次イオンを検出する。横軸にマンガンとクロムの比、縦軸にクロムの同位体比をとったアイソクロンダイアグラムにデータをプロットし、データ点の回帰直線の傾きから放射性マンガンの存在量および対応する年代値を求める。横軸のマンガンとクロムの比を求める際に、標準試料で決定したSIMSにおけるマンガンとクロムの感度を用いてキャリブレーションを行う。最後に、得られた年代値を典型的なCMコンドライト中の炭酸塩鉱物の年代と比較する。今回測定するコンドライト中の炭酸塩鉱物の年代値が他天体の衝突年代を記録しているのか、それとも放射性核種の壊変熱に誘起された水質変成の年代なのか議論する。

次に、未知試料である隕石中の炭酸塩鉱物のマンガン・クロム年代測定を行う。酸素の一次イオンを5ミクロン程度に絞って試料表面に照射し、叩き出されたマンガンおよびクロムの二次イオンを検出する。横軸にマンガンとクロムの比、縦軸にクロムの同位体比をとったアイソクロンダイアグラムにデータをプロットし、データ点の回帰直線の傾きから放射性マンガンの存在量および対応する年代値を求める。横軸のマンガンとクロムの比を求める際に、標準試料で決定したSIMSにおけるマンガンとクロムの感度を用いてキャリブレーションを行う。最後に、得られた年代値を典型的なCMコンドライト中の炭酸塩鉱物の年代と比較する。今回測定するコンドライト中の炭酸塩鉱物の年代値が他天体の衝突年代を記録しているのか、それとも放射性核種の壊変熱に誘起された水質変成の年代なのか議論する。
再興・布教から霊場化へ―増吽関連の寺院経蔵調査を中心に―

主となる覚城院では、これまでの写本調査に加えて、版本の調査ペースを上げる為、院生等の増員を計った。また、美術系の調査も開始すべく、過去の目録と現物の突合作業を終え、新たに情報の追加と撮影を行う準備が整っている。さらに文書関係の調査も本格的に開始し、その目録化を開始している。如上の調査を行う為に、年度中に6人の研究者が新たに調査メンバーとして加わり、研究組織の拡充にも繋がっている。その他の寺院として、西福寺・高幡不動尊金剛寺では、蔵書全体の目録作成を進めており、主たる研究テーマである神道玉水流聖教以外の典籍も整理を行っている。地蔵寺では蓮體自筆を含む写本群の調査を開始した。未だ数箱の虫払い、および番号付け作業に留まるが、今後の調査方針と研究方向がある程度定まったことにより、順次作業に入る準備が整った。安住院では長年の懸案であった別置版本の整理を行った。納屋より全典籍の運び出しと箱の詰め替えを行い、蔵へと移管した。と同時に書目の入力も行った。木山寺は今年度は組織調査は行えなかったが、少人数によって、蔵内の配置換えを行い、今後の作業効率を高める処置を施した。本年度は新たに正楽寺(備前市)の予備調査を開始した。蔵内の現存典籍の概数・状態などを確認すると共に、住職を中心に僧侶の方々に、目録化の作業指導を行い、典籍番号の付加と外題入力の基礎作業を行っていただいている。国分寺(備中)では、院生をはじめとする若手研究者への調査講習を行い、奥書を含めた目録作成の実践指導を行いつつ、蔵書目録の作成につなげている。以上の活動を通して、11月には「第2回覚城院聖教調査進捗報告会」を開催し5名による研究発表を行った。また、次年度より刊行予定の「寺院文献資料学の新展開」の企画会議や執筆を一年を通して行った。平成30年度が最終年度であるため、記入しない。木山寺で資料展示及び、講演会を開催した。展示資料は木山寺・木山神社所蔵の彫像・棟札・絵画・典籍・版木、計120点余り。その大半が調査で発見された資料群であり、初公開である。同時に木山寺客殿にて、関連講座を開催した。これらは本研究での学術資料調査が起点となり、所蔵者である寺社、及びその関係住民、更に地元教育委員会や博物館の協力を得て行った。学術面のみならず、学術資料調査が果たす地域貢献として大きな成功例と成り得た。更に、関係書籍の出版計画へと発展し、28年秋刊行に向けた調査・執筆にも取りかかっている。木山寺経蔵の悉皆的調査を通して、木山寺経蔵の全体像が把握されるに随い、近隣寺院や高野山との繋がり、善覚稲荷信仰の起源と広がり、神仏習合の木山宮内での諸相、神仏分離の混乱期の様相、など多義に亘る研究の進展に期待が高まっている。覚城院の蔵書調査は、その状態改善と点数の把握を主目的として行った。本堂内収蔵の典籍群を現在は29函に振り分け、内15函までに目を通すと同時に、塵払い・頁開き・配列整理などを行い、典籍番号の付加を行った。状態改善が優先の為、蔵書全体の特徴などは未だ不詳なるも、中世写本率が高い事、塔頭の金光寺や伊予実報寺からの流入本が多い事などが指摘できる。増吽関係資料の収集として、明石市の密蔵院を訪問、増吽に関係する寺伝を聴聞した。また岡山県の長福寺所蔵の伝増吽筆十二天絵像、及び同時代筆の両界曼荼羅のデジタル撮影を行った。更に、徳島県の蓮光寺でも、増吽筆との裏書が残る不動明王絵像と両界曼荼羅の実査を行った。以上のことは、第1回日本語の歴史的典籍国際研究集会「可能性としての日本古典籍」にて、「増吽年譜雑考ー安住院・覚城院蔵書調査を通してー」と題した発表や、日本学術研究支援協会ーJARSA( http://jarsa.jp/kiyama2015/ )に掲載するなど一部報告を行った。木山寺での資料展示は開創1200年の記念事業として行うものであった為、科研費の採択決定から半年で行わねばならなかった。その為、集中的に木山寺・木山神社の調査を行った。展示に資する典籍を選定する為、調書作成や撮影などは後回しにし、典籍を中心に一通り目を通す事を優先的に行った。同時に、地元の教育委員会や博物館に協力を要請した。更に分担・連携研究者以外にも、適任と思われる研究者に調査への参加を促し、短期間で出来うる限りの準備を行った。当初は既知の文化財に多少追加した程度の展示も止む無しと考えていたが、殆どが初公開となる貴重な資料展示となり、新聞掲載やケーブルテレビでの特別番組作成に至るまで企画が拡大した。加えて、その成果の出版計画も進行する事になり、事業規模・成果ともに当初の想定を上回るものとなった。木山寺での調査や成果公開の方法は、他の寺院にも応用可能であり、次年度以降の覚城院をはじめとする調査に活きる経験を積むことができた事は非常に有意義であった。

覚城院をはじめとする増吽関連寺院の調査も研究実績の概要に記した如く、概ね順調に推移している。今後木山寺で行った活動をモデルとして、覚城院宝物と増吽関係資料の展示報告の開催を目指して、資料調査・収集と環境整備を進めている。昨年度11月に行った木山寺での資料展示以降、それをベースにした出版企画が進行し、28年度前半はその実現に向けた調査、及び執筆・編集作業を中心に行った。10月に刊行した『神と仏に祈る山美作の古刹木山寺社史料のひらく世界』は、図録編・研究編・史料編の三部構成で、図版122点とその解説、関連論文8稿とコラム7稿、史料翻刻と解説6稿から成る、木山に関する初の本格的な資料公開と研究である。本書は研究成果物という学術的意義のみならず、地域の理解と連携に依って実現した産物であり、地方寺院での悉皆的史料調査がもたらす地域の活性化に実に大きなインパクトを与えたことは、本研究の大きな成果として捉えている。年度後半は、本研究の中心的課題である覚城院の調査を本格的に始動させた。本堂内典籍の調査に加えて、蔵内収蔵品にも調査範囲を広げるため、大がかりな蔵内整理を行った。その過程で新たに「増吽自筆書状」や室町初期「神道灌頂印信」、寂雲自筆聖教、新安流僧の行状記など、資料価値の高い典籍の発見が相次いでいる。これらは年度内最終調査の際に、研究会報告を行い、その一部は既に学会発表や出版物によって明らかにしていく事が具体的に進行している。また、Excelをベースとした覚城院用の調書作成フォームも作成し、実用段階に入っている。更には、今後の目録や画像の公開を見据え、先ずは研究メンバー間でデータの共有が出来るシステムの開発にも着手している。これらは今後の調査→研究→公開を円滑に進める鍵を握るものであり、試行錯誤を繰り返しながらも着実に実用化に向けて進んでいる。その他、安住院・西福寺・国分寺などの調査も研究計画に沿って進めており、それぞれの蔵書目録作成に向けた調査を継続して行った。木山での調査成果を市販書として出版する予定は当初無かったが、寺社側との折衝により、予定を大きく上回る内容の書籍として出版することになった。これにより、新出資料紹介や新知見に満ちた研究論文を提示することが出来たことは、想定を大きく上回る成果を得たと言える。一方、この出版作業により、研究の重点を覚城院の調査・研究にシフトする時期が半年以上遅れた。しかし、その覚城院に於いても、調書入力フォームの作成をはじめ、調査前の準備に万全を期すことで、現地での活動の効率化を高めた結果、本堂内収蔵の典籍のみならず、土蔵内の典籍の整理と調査への道筋を通すところまで行えた。加えて、当初の予想以上に覚城院所蔵典籍が学術的にも文化財的にも貴重であることが判明してきており、今後の展開が楽しみでもある。資料の貴重さと多様さを考慮し、次年度以降は新たに適任と考える研究者にもプロジェクトチームに加わっていただくべく、研究体制の強化も図った。年度末には、現状での課題や今後の展開を共有すべく、研究会と会議を開催し、調査チーム内の意識統一も形成しており、次年度以降に向けた準備にも最善を尽くした。木山寺・覚城院に関する事案に労力を割く一方で、安住院・西福寺・国分寺の調査も定期的に継続している。これによって多寺院間での資料的繋がりがより明確になっきており、新たな研究視点の発見や調査寺院の広がりへと発展している。昨年度後半から本格始動させた覚城院の調査であるが、調査が進むにつれて新たな発見があり、多義に亘る史料の宝庫として、その実態把握を加速させている。字数制限上、覚城院に関する主たる成果のみ以下に記す。
シークエンスレベルでのヒトゲノム構造多様性の解明

今日のヒトゲノム研究の進展に伴い、特定の形質の原因変異・感受性多型同定法が確立しつつある。特に疾患を対象としたゲノムワイド関連解析研究では、さまざまな疾患関連多型が同定されている。云うまでもなく最多の多型はSNPであるため、現在までに報告されたこれらの疾患関連多型もその多くはSNPである。しかしながら、ゲノム中にはSNP以外にもCNVをはじめとして多種の多型・変異が存在する。本研究では、ヒトゲノム中に存在する均衡型構造多型・変異のうち特に逆位と染色体内・染色体外転座を同定する手法を確立することを目指した。本研究では、ヒトゲノム中に存在する均衡型構造多型・変異のうち特に逆位と染色体内・染色体外転座を同定する手法を確立することを目指す。複数検体をメイトペアシークエンス法で次世代シークエンサーにより同時にリードすることで費用低減を図りつつ、新規開発する専用プログラムで高速に均衡型構造多型・変異の候補領域を網羅的に検出する。これと平行し逆位領域の切断点同定のため、PCR法、LAMP法、MIP法その他により最も簡便かつ高速に検出できる方法を検討する。検出された候補領域に対して切断点を同定可能か検討し、可能であれば複数領域に対して実施することで均衡型構造多型・変異地図を作成する。更に、申請者らが研究を行っている変形性関節症に関してこの多型の関連解析を行い、変形性関節症感受性逆位の同定を目指す。これと平行し逆位領域の切断点同定のため、PC R法、LAMP法、MIP法その他により最も簡便かつ高速に検出できる方法を検討する。ヒトゲノムプロジェクト、HapMapプロジェクトにより、ヒトゲノムに存在するSNPが数多く同定され、また、ヒトゲノム構造多型コンソーシアムをはじめとした多くの国際共同研究により、CNV(コピー数多型)が同定されてきた。しかしながら、その多くはゲノム上の大まかな領域の検出にとどまり、CNVの存在の実験レベルの確認や具体的な切断点の情報に欠く等の問題がある。また、均衡型構造変化である逆位は、DNAチップによる検出が困難でありまたその詳細な地図は存在していないのが現状である。本研究では、特に逆位、染色体内・染色体外転座等の均衡型構造多型・変異が生じている部分の網羅的検出とその切断点の同定を目指して、その方法論を確立すること、及び日本人検体を用いてその均衡型構造多型・変異地図を作成することが本研究の目的である。このため、複数検体を長鎖インサートのメイトペアライブラリを作成、次世代シークエンス法でリードすることで、網羅的な均衡型構造多型・変異を同定する。具体的には、ゲノムDNAをPicoGreeenで濃度調整後、ウオーターシェアーを2種類の長さ(3 kb、8 kb)で均等に切断、DNA Blunting Kitにより切断片を平滑化、3'端がCAGCAGで一部にビオチン標識されたインターナルアダプターをT4 DNA Ligaseでライゲーションした後、DNAを環状化した。この環状DNAをEcoP15Iで切断すると中央にアダプターが、両端にペアとなった25-27塩基のターゲット部位を含むDNA断片が得られる。この後、ビオチンタグによりDNAを濃縮し、アダプターを付加し、次世代シークエンス法による塩基配列の決定を行う。当研究室には昨年末に次世代型シークエンサが導入されたばかりであり、現在操作等の試行中である。

このため当該年度は、試料の作成にとどまった。平成23年度より当研究室では次世代シークエンサーIon torrentを導入し整備に努めて来た。本研究では、均衡型構造多型の同定・検出を目的とするため、リード長の大きいシステムが望まれる。初期のIon torrentではリード長が100 bpであり構造多型の同定・検出には多少困難であったが、200 bpまでリード可能なチップが販売され当初これを用いて実験を行うこととしたが、直後400 bpのリード可能なチップが平成24年末までに販売開始されるというアナウンスがあり、予定を変更してこの販売を待っていた(Applied Biosystems社のホームページ参照)。しかしながら平成25年2月まで販売されていない。同社への問い合わせでは4、5ヶ月程度遅れるが販売は行うとの話があり、技術面、金銭面からり構造多型の同定・検出ではこれを待ち研究を行う予定に変更した。本年度は本研究室への次世代型シークエンサの導入が若干遅れ、また実験等に習熟しているスタッフの不足により、本研究の中核である、均衡型構造多型・変異検出のための多検体同時解析システムの構築に遅れが生じている。昨年末に、次世代シークエンサを導入、現在機器の調整を行っている段階であるが、早急に環境を整備して研究を遂行する予定である。複数検体を長鎖インサートのメイトペアライブラリを作成、次世代シークエンス法でリードすることで、網羅的な均衡型構造多型・変異を同定する。具体的には、ゲノムDNAをPicoGreeenで濃度調整後、ウオーターシェアーを2種類の長さ(3 kb、8 kb)で均等に切断、DNA Blunting Kitにより切断片を平滑化する。3'端がCAGCAGで一部にビオチン標識されたインターナルアダプターをT4 DNA Ligaseでライゲーションした後、DNAを環状化する。この環状DNAをEcoP15Iで切断(もしくは別の方法で)すると中央にアダプターが、両端にペアとなった25-27塩基のターゲット部位を含むDNA断片が得られる。申請書では次世代シークエンサとして、Life Technologies/SOLiDTM4と記載したが、当研究室が導入した機器は、同社のI ON Torrentであった。これは、シークエンス精度は同程度に高いが解析速度で劣る。ビオチンタグによりDNAを濃縮し、アダプターを付加し、次世代シークエンス法による塩基配列の決定を行う。データ解析は、均衡型構造多型・変異検出専用プログラムで実施する。まず、タグ配列等を除去し、リピートマスカーによりターゲット部位(1、2とする)のリピートをマスク、ターゲット部位1をリファレンスゲノムへマッピングさせる。マッピング可能な場合、その周囲配列(3 kb断片では片側5 kb、8 kb断片では片側10 kb)を優先しマッピングするが、マッピング不可の場合、更に外側に、最終的には全ゲノムに対してマッピングさせる。ターゲット部位の方向、サイズなどから、挿入、欠失、逆位、染色体内転座、染色体外転座を判断、得られた情報を検体毎に物理的位置に応じてスコア化して解析する。
海洋生物由来コラーゲン分解酵素のスクリーニング及び同酵素による食肉軟化作用の検証

老廃牛肉や廃鶏肉などの硬い肉を、肉特有のテクスチャーを損なうことなく軟化させる技術が求められている。本研究では、肉の硬さの原因であるコラーゲン線維を分解できる酵素(CDE)を海洋生物から探し出し、その酵素が肉を軟化できるか検討した。魚介類(ハマチと帆立貝)の内臓と魚類体表に付着した細菌89菌株にCDEを見出した。最も強い活性を示したのはPseudomonas属菌SF10株(ババガレイ体表に付着)とShewanella属菌JS51株(スズキ体表に付着)由来の酵素であった。SF10由来酵素を大量生産し、牛肉塊に添加し4°Cで5日間保存したところ、肉は柔らかくなった。平成24年度には、高塩濃度下でも高いコラーゲン分解活性を有する二つの菌株(JS51,SF10)を見出した。平成25年度は、両菌株についてコラーゲン分解酵素(COLase)の生産に適した培養条件および酵素の分離精製法の検討を行った。16S rRNA遺伝子の配列決定により、JS51菌株はShewanella属、SF10菌株はPseudomonas属の細菌であることが分かった。両菌株の栄養要求性を調べたところ、JS51はアルギニン(Arg)、グルタミン酸(Glu)、リジン(Lys)を必要としたが、SF10には必須アミノ酸がないことが分かった。酵素生産に適した合成培地の検討を行ったところ、両菌株とも合成培地では十分なCOLaseの生産が行われなかった。合成培地に7種類のアミノ酸(Arg,Glu,Lys,Leu,Ser,Val,Ile) 20mMとゼラチンペプトン2mg/mlを添加した半合成培地を使うことで、高いコラーゲン分解活性を有するCOLaseを得ることができた。上述の半合成培地でJS51、SF10両菌を培養し、培養上清からCOLaseの分離精製を試みた。酵素の分離精製は、疎水性相互作用クロマトグラフィー(疎水クロマト)、分取用等電点クロマトグラフィー(等電点クロマト)、イオン交換クロマトグラフィー(IEクロマト)により行った。疎水クロマトには、JS51由来COLase、SF10由来COLaseとも樹脂に吸着した。また、樹脂からのCOLaseの溶出はJS51酵素が硫安を含まない溶液で溶出されたのに対し、SF10酵素は硫安濃度0.25Mを含む溶液で溶出された。等電点クロマトでは、JS51、SF10ともコラーゲン分解活性はpH8.0からpH9.0の間に溶出された。IEクロマト(SF10のみ実施)では、DEAEセルロファイン(移動相のpH8.6)には吸着し、0.1M NaClを含む溶液によって溶出されたが、CMセルロファイン(移動相のpH7.5)には吸着しなかった。平成24年度は、魚貝類の消化管および魚類の体表に付着している微生物から水溶性の酵素を回収し、それら酵素溶液にコラーゲン分解酵素が存在するかを調べた。魚貝類の消化管:ハマチの幽門垂およびホタテの中腸腺から酵素を抽出し、硫酸アンモニウム(硫安)による塩析で分画を行った。各画分のコラーゲン分解活性(基質コラーゲンのβ鎖の分解度をSDS-PAGEにより数値化して求めた)を調べたところ、ハマチ幽門垂では30-60%飽和硫安画分に、ホタテ中腸腺では40-60%飽和硫安画分に強いコラーゲン分解活性があった。魚類体表付着微生物:10魚種(ブリ、カンパチ、スズキ、サバ、サンマ等)の体表から1323菌株を単離した。これらの菌のコラーゲン分解活性を調べたところ、89菌株にコラーゲン分解活性があった。陽性であった89菌株の培養上清について、8.8%(1.5M)NaClという高い塩濃度でもコラーゲン分解活性を示すか調べた。その結果、8.8% NaCl存在下で0.04ユニット/(10μL)以上の高い酵素活性値を示したのは、BP3(チヌ由来)、JS51(スズキ由来)、YT3(ブリ由来)、SF912(ババガレイ由来)の7菌株であった。以上のことより、魚貝類の消化管および魚類体表に付着している細菌ともにコラーゲン分解酵素を有していること、また7菌株は高塩濃度下でも強いコラーゲン分解活性を示す酵素を分泌することがわかった。平成25年度はJS51とSF10という二つの菌株からコラーゲン分解酵素(COLase)を精製した。平成26年度はCOLaseの生化学的諸性質、基質特異性を調べた。

また、SF10から部分精製した酵素(以後、SF10-COLaseとする)をローストビーフ用牛肉に添加し、軟化作用の評価を行った。加工肉は出荷される前に最低でも6070°Cで加熱処理される必要がある。そこで酵素の熱安定性を調べた。60°C30分間の加熱によってSF10-COLaseは約90%、JS51-COLaseは約70%失活した。70°C30分加熱では両酵素とも完全に失活していた。60°C加熱でSF10-COLaseはほぼ失活していたことから、SF10-COLaseは加熱制御しやすい酵素であることがわかった。耐塩性については両酵素とも塩濃度が上がるにつれて徐々に酵素活性が低下していったが、加工肉に用いる塩漬け液中の塩濃度に相当する1.5M NaCl存在下では十分な酵素活性を保持していたことから、SF10-COLase、JS51-COLase共に塩漬け工程でも働くことが示唆された。酵素の基質特異性について調べたところ、両酵素ともコラーゲンとミオシンを同程度分解した。パパインなど従来の食肉軟化酵素は、コラーゲンよりもミオシンを強く分解することから、SF10-COLaseとJS51-COLaseは従来の食肉軟化酵素と比べて、コラーゲンへの親和性が高いプロテアーゼであることが示唆された。SF10-COLaseの酵素液(0.1%、186U/mL)を牛肉塊(アウトサイドフラット)約300gに60mLインジェクションし、4°Cで5日間インキュベートし、その後せん断強度測定を行った。試験区と対照区の肉は破断応力がほぼ等しい値であったが、破断点の歪率は対照区が70.8%であったのに対し、試験区は76.2%であり、SF10-COLase処理によって肉が柔らかくなることが示された。農芸科学・食品科学平成25年度は、JS51,SF10両菌株のコラーゲン分解酵素の生産に適した培養条件の検討と各種クロマトグラフィーによる酵素の精製法の検討を行った。当初の計画どおり、酵素生産に適した細菌の培養条件が見つかったこと、培養上清から疎水性クロマトグラフィーや陰イオン交換クロマトグラフィー(DEAEセルロファイン)でコラーゲン分解酵素が分離できたことより、計画はほぼ達成されたといえる。平成24年度は、魚貝類の消化管および魚に共生する微生物から酵素を回収し、コラーゲン分解酵素のスクリーニングを行った。当初の計画どおり、魚貝類の消化管および魚体表に付着した細菌にコラーゲン分解酵素が認められたこと、また、細菌由来の酵素については耐塩性が認められたことより、計画はほぼ達成されたといえる。今後は、大量に酵素精製が可能な簡易な酵素精製の分離方法を確立し、分離した酵素の基質特異性を調べるとともに、酵素を硬い牛肉に作用させ、肉の軟化作用を評価する予定である。今後は高塩濃度下でも高いコラーゲン分解能をもっていた細菌(例えば、JS51、SF10)の酵素にしぼって研究を進める。まず、細菌(JS51あるいはSF10)がコラーゲン分解酵素を大量に生産するのに適した培養条件(すなわち最適培養条件)を検討したのち、イオン交換クロマトグラフィーや疎水性相互作用クロマトグラフィーにより酵素の分離精製を行う。その後、精製した酵素を使って酵素の至適温度や至適pHなどの生化学的性質を調べる。酵素の生産方法、生化学的性質の解析が終わったら、その酵素を使って食肉軟化試験を行う。物品調達の効率化により残額が生じた次年度は消費税が5%から8%になることから、予想よりも消耗品の金額が増えることが予想される。その増加部分の補填に使用する。平成24年度は研究が順調に進んだことから、次年度も当初計画通りに研究費を使用し、研究の推進を図る。
癌転移に関わる新規血小板凝集誘導因子Aggrusの血小板凝集誘導機構の解析

新規血小板凝集因子Aggrus/Podoplaninは、がん転移促進に働く膜タンパク質として同定した分子である。実際にがん細胞における発現量がその細胞の転移能に相関していること、さらにaggrusを遺伝子導入したCHO細胞が肺転移を起こすようになることからも、Aggrusががん転移促進に関わる分子である事が明らかとなっている。昨年度までにヒトAggrusを発現しているがんの種類を同定するためにCancer ProfilingArrayを用いた解析を行ない、大腸癌や精巣腫瘍の中のセミノーマ特異的にAggrus高発現が認められることを明らかにしてきた。本年度も継続して検討を行なった結果、Cancer Profiling Arrayにスポットされている肺扁平上皮癌15症例中の10症例(66.7%)でaggrus遺伝子発現が亢進している事を見いだした。そこで肺癌21症例の組織切片を用い、作製した抗Aggrusポリクローナル抗体で免疫染色を行なった。8症例分含まれていた肺扁平上皮癌の組織切片中7症例(87.5%)で強い染色像が得られたのに対し、残りの13症例分含まれていた肺腺癌の中で強染色像が得られたのは2症例(15.4%)にとどまっていた。さらに、正常肺組織で強い染色像が得られたものはなかった。さらに培養細胞株におけるAggrus発現を検討した結果、肺扁平上皮癌由来のNCI-H226細胞株ではAggrus発現が認められたが、肺腺癌由来であるNCI-H23、NCI-H522、A549細胞株では発現が認められなかった。実際にNCI-H226細胞は血小板凝集誘導活性を持っている事が確認された。以上の結果より、Aggrusは肺扁平上皮癌の腫瘍マーカーとなりうる事が示唆された。さらにAggrus発現を減少させるsiRNA配列を決定し、このsiRNA処理によりNCI-H226細胞のAggrus発現を減少させる事に成功した。このsiRNA処理により、NCI-H226細胞の血小板凝集誘導活性が減弱したことから、このsiRNAは、Aggrus高発現癌細胞の転移抑制剤として使用できる可能性が示唆された。新規血小板凝集因子Aggrus/T1α/Podoplanin/OTS-8は、がん細胞における発現量がその細胞の転移能に相関していること、さらにAggrusを遺伝子導入したCHO細胞が肺転移を起こすようになることから、がん転移促進に働く膜タンパク質であることが示唆されていた。そこで、マウスAggrus依存的な血小板凝集を阻害する8F11抗体の認識部位を中心に多数の変異体を作製し、その血小板凝集誘導活性の変化を検討した。その結果、糖鎖が結合していると予想される34番目のスレオニン残基をアラニンに置換した変異体が血小板凝集誘導活性を失っていることを見いだした。ヒトとマウスのAggrusは、全体のホモロジーは低いにも関わらず、この部位は保存されていた。そこで、ヒトAggrusの相同部位に変異を入れた変異体(T34A)を作製したところ、予想通り血小板凝集誘導活性の喪失が確認された。そこで、このT34A-ヒトAggrusを恒常的に発現しているCHO細胞を作成し、ヌードマウスにおける実験的転移能を検討した結果、血小板凝集誘導活性の喪失に相関して転移能の減弱が確認された。よって、Aggrus依存的な血小板凝集誘導活性・転移促進活性には、34番目のスレオニン残基に結合する糖鎖が関与することが示唆された。この結果は、糖鎖合成不全のCHO亜株にAggrusを発現させても血小板凝集誘導活性を示さないことからも確認されている。ヒトAggrusを発現しているがんの種類を同定するために、Tissue Arrayを用いて免疫染色した結果、Aggrusは精巣腫瘍のうちセミノーマ特異的に発現していることを見いだした。精巣腫瘍は大きくセミノーマと非セミノーマ型胚細胞腫瘍に分けられるが、非セミノーマ型胚細胞腫瘍ではAggrus発現は認められず、Aggrusはセミノーマ特異的抗原であることが明らかとなった。

さらに培養細胞株におけるAggrus発現を検討した結果、肺扁平上皮癌由来のNCI-H226細胞株ではAggrus発現が認められたが、肺腺癌由来であるNCI-H23、NCI-H522、A549細胞株では発現が認められなかった。実際にNCI-H226細胞は血小板凝集誘導活性を持っている事が確認された。以上の結果より、Aggrusは肺扁平上皮癌の腫瘍マーカーとなりうる事が示唆された。さらにAggrus発現を減少させるsiRNA配列を決定し、このsiRNA処理によりNCI-H226細胞のAggrus発現を減少させる事に成功した。このsiRNA処理により、NCI-H226細胞の血小板凝集誘導活性が減弱したことから、このsiRNAは、Aggrus高発現癌細胞の転移抑制剤として使用できる可能性が示唆された。
エクソソームATP応答を基軸とした超初期石灰化の臓器向性研究

生体内の骨組織や軟組織の石灰化の初期段階では、その素材となるカルシウムイオンやリン酸イオンが細胞から放出される小胞に取り込まれ内部で著しく濃度が高まることで、難溶性のリン酸カルシウム化合物を生成する。本研究では、石灰化超初期の小胞内カルシウム流入の仕組みを明らかにすることを目的とした。平成29年度は、マウス骨芽細胞の培養上清に放出される細胞外小胞にはATP駆動型のカルシウムポンプが局在することを確認した。そこで、平成30年度は、細胞外小胞のうちエクソソームに焦点をあて、エクソソームにおけるATP代謝分子の発現を細胞の分化段階ごとに調べ、石灰化出現時のエクソソームにおけるATP代謝の関与を検討した。石灰化細胞として、マウス骨芽細胞や石灰化病変をきたす皮膚弾性線維細胞を培養し、石灰化段階に応じて放出されるエクソソームを経時的に回収した。対照としてエクソソームを放出する骨格筋細胞や正常皮膚弾性繊維細胞を培養し、石灰化細胞と同様の培養条件でエクソソームを回収した。エクソソームにおけるATP代謝分子群の発現変化をウェスタンブロット法により評価したところ、ATPの輸送分子が石灰化段階により大きく変化することが確認され、非石灰化細胞では未分化分化初期に強く発現するが分化段階に応じて減弱するのに対して、石灰化細胞では分化後も発現量が維持されることを見出した。これらの結果から、局所で石灰化が出現する段階に応じてエクソソーム周囲のATP環境が変化すると考えられ、エクソソームを含む細胞外小胞内にATP駆動型カルシウムポンプによりカルシウムが流入する機構が存在する可能性が示唆される。本研究では、石灰化超初期の小胞内カルシウム流入と、硬組織の石灰化や異所性石灰化が特定の組織に限定される局所化の仕組みを明らかにする。平成29年度は石灰化超初期の小胞活動を推し進める条件を明らかにするために、1濃度勾配に逆らい小胞内にカルシウムを流入させる候補分子の小胞局在を評価し、2細胞外小胞へのカルシウム流入の検出を試みた。1マウスの骨芽細胞を培養し、その培養上清から遠心分離法とアフィニティ生成法により細胞外小胞を回収した。また、異所性石灰化を生じる軟組織細胞試料として、石灰化病変が確認された弾性繊維細胞を培養し、培養情勢から細胞外小胞を回収した。ATP駆動型のカルシウムポンプの局在をウェスタンブロット法により確認した。カルシウム流入候補分子としては、ATP駆動型カルシウムポンプの局在を確認した。また、ATP代謝分子の局在は検出されなかったことから、小胞自身は外液のATP量を変化しないことが示唆された。21で使用した培養上清から遠心分離法および、アフィニティ精製法により細胞外小胞を回収し、Fura-2カルシウムプローブを導入して小胞内カルシウム流入の検出を試みた。遠心分離法にて回収した小胞でごくわずかなカルシウム流入がATP作用依存的に確認された。しかしながら、石灰化を開始する濃度のカルシウム流入は観察されなかった。細胞外小胞へのカルシウム流入を評価するための十分な検出感度が得られていない。そのため、小胞内へのカルシウム蓄積量の把握が困難である。細胞外小胞の膜構造を維持し、カルシウムを補足するキレート剤を使用しない方法を検討する必要がある。平成29年度に遂行予定であったATP依存的な小胞カルシウム流入については、引き続き条件を改良して検討を行う。さらに、平成30年度は石灰化細胞外小胞の臓器特異的分布能を検討する。試験試料として、石灰化モデルであるENPP1機能不全マウス

由来の細胞を用いる。このマウスの様々な組織から細胞外小胞を単離する。カルシウム流入因子が局在し、カルシウム流入が促進した小胞のインテグリンパターンをウェスタンブロット及びプロテオミクス解析により検討する。インテグリンは臓器向性の決定要素であるため、小胞のインテグリンパターンはそれを単離した組織(細胞)に親和性があるか、あるいは、遠隔組織に特異性があるかを調べる。細胞外小胞内へのカルシウム流入試験が予定よりも遅れたため、使用する消耗品の購入が少なくなり未使用額が発生した。平成30年度に実施予定である。