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泌尿器科癌へのIFN-γ遺伝子導入による遺伝子治療の開発

【目的】インターフェロン-γ(IFN-γ)は免疫担当細胞への作用や組織適合性抗原MHCの発現の増強等,抗腫瘍免疫において重要な役割を担っている.今回,IFN-γ遺伝子をマウス膀胱腫瘍細胞株(MBT2)に導入し,遺伝子治療の可能性を検討した.【方法】ψ2細胞をウイルスパッケージング細胞として,レトロウイルスベクターによりマウス膀胱癌株(MBT2)にin vitroでIFN-γ遺伝子を導入した.G418選択を行い,IFN-γ産生膀胱癌株(MBT-2/Kγ)を樹立した.また,腫瘍内へのIFN-γ遺伝子の直接導入を試み抗腫瘍効果を検討した.7週齢のC3H/He雄マウスにday0に1.5x105個のMBT2をマウスの背部に皮下注した.マウスを対照群(8匹),Kγ群(7匹),Muγ群(7匹)の3群に分け,day1,2,3に生食,IFN-γの遺伝子を含むウイルス培養上清ψ2(Kγ),ψ2(Muγ)を各々0.1mlずつ,MBT2を移植した部位へ皮下注した.腫瘍はその後経時的に計測した.【結果】MBT-2/Kγは14U/ml/106cellのIFN-γを産生している事をbioassayにより確かめた.FACS解析により,MBT-2/KγのクラスIMHC抗原の発現はMBT2に比較して増強していることが示された.MBT-2/Kγをマウスに皮下注しても腫瘍形成は認められず,このマウスは親株MBT2を拒絶し,MBT-2/Kγは抗腫瘍ワクチンの作用のあることが示された.しかもこの免疫は特異的であり,CD8(+)T細胞が免疫応答に関与していることが示唆された.腫瘍内へのIFN-γ遺伝子の直接導入実験では,腫瘍形成率は対照群:8/8(100%),Kγ群:4/7(57%),Mu群:3/7(43%)でありMuγ群では対照群に比較し,有意に腫瘍形成率は減少した.腫瘍形成の時期もKγ群,Muγ群では対照群に比較して優位に遅延した.実測生存期間もKγ群,Muγ群ともに生存期間の延長が認められ,特にMuγ群では有意に生存期間が延長した.【結論】IFN-γ遺伝子を腫瘍細胞に導入し,特異的免疫反応を引き起こすことにより遺伝子治療が可能であると考えられた.【目的】インターフェロン-γ(IFN-γ)は免疫担当細胞への作用や組織適合性抗原MHCの発現の増強等,抗腫瘍免疫において重要な役割を担っている.今回,IFN-γ遺伝子をマウス膀胱腫瘍細胞株(MBT2)に導入し,遺伝子治療の可能性を検討した.【方法】ψ2細胞をウイルスパッケージング細胞として,レトロウイルスベクターによりマウス膀胱癌株(MBT2)にin vitroでIFN-γ遺伝子を導入した.G418選択を行い,IFN-γ産生膀胱癌株(MBT-2/Kγ)を樹立した.また,腫瘍内へのIFN-γ遺伝子の直接導入を試み抗腫瘍効果を検討した.7週齢のC3H/He雄マウスにday0に1.5x105個のMBT2をマウスの背部に皮下注した.マウスを対照群(8匹),Kγ群(7匹),Muγ群(7匹)の3群に分け,day1,2,3に生食,IFN-γの遺伝子を含むウイルス培養上清ψ2(Kγ),ψ2(Muγ)を各々0.1mlずつ,MBT2を移植した部位へ皮下注した.腫瘍はその後経時的に計測した.【結果】MBT-2/Kγは14U/ml/106cellのIFN-γを産生している事をbioassayにより確かめた.FACS解析により,MBT-2/KγのクラスIMHC抗原の発現はMBT2に比較して増強していることが示された.MBT-2/Kγをマウスに皮下注しても腫瘍形成は認められず,このマウスは親株MBT2を拒絶し,MBT-2/Kγは抗腫瘍ワクチンの作用のあることが示された.しかもこの免疫は特異的であり,CD8(+)T細胞が免疫応答に関与していることが示唆された.腫瘍内へのIFN-γ遺伝子の直接導入実験では,腫瘍形成率は対照群:8/8(100%),Kγ群:4/7(57%),Mu群:3/7(43%)でありMuγ群では対照群に比較し,有意に腫瘍形成率は減少した.腫瘍形成の時期もKγ群,Muγ群では対照群に比較して優位に遅延した.実測生存期間もKγ群,Muγ群ともに生存期間の延長が認められ,特にMuγ群では有意に生存期間が延長した.【結論】IFN-γ遺伝子を腫瘍細胞に導入し,特異的免疫反応を引き起こすことにより遺伝子治療が可能であると考えられた.レトロウイルスベクターによりマウス膀胱癌株(MBT2)にin vitroでIFN-γ遺伝子を導入し,IFN-γ産生膀胱癌株(MBT-2/γ)を樹立した.MBT-2/γをマウスに皮下注しても腫瘍形成は認められず,またこのマウスは親株MBT2を拒絶し,抗腫瘍ワクチンの作用を有していた.今年度は,この免疫が特異的であることを示しMBT-2/γクラスI MHC発現の増強を確認した.1)IFN-γ遺伝子導入

マウス膀胱癌細胞(MBT-2/γ)のクラスI MHC発現の程度コントロールとしてMBT2,MBT-2/Neo(MBT2にNeomycin耐性の遺伝子を導入したもの)を用い,FAC SCANにてクラスI MHCの発現を調べた.MBT-2/γではMBT2,MBT-2/Neoに比較してクラスI MHC発現が増強していた.2)免疫応答の特異性を調べるために、MBT-2/γで免疫したマウスの脾細胞とMBT2を混合して正常マウスに皮下注すると腫瘍は形成されなかった。しかし抗CD8,抗Thyl抗体を入れると腫瘍は形成された。抗CD4抗体では腫瘍は形成されなかった。以上より、CD8陽性T細胞が、今回の抗腫瘍免疫反応に主要な役割を果たしていることが解明された。本年度はリポゾームを用いて、in vitro、in vivoでIFN-γ遺伝子をヒト膀胱癌に導入してIFN-γの産生を確認した。In vivoでは、ヌードマウスにKK47を移植して腫瘍を形成したのちに、腫瘍内に高周波電流を流した。その後にDNA/LF=5/25ugを腫瘍内に5回注射した。腫瘍を摘出してin vitroで培養してIFN-γの産生を確認した。今回の研究でヒト膀胱癌細胞にもin vitro,in vivoでIFN-γの遺伝子導入が可能なことが示された。
DNAバイオセンサの診断応用に関する基礎研究

本研究では、DNAバイオセンサの診断応用に関する基礎研究を目的とした。DNAを電極上に簡便かつ効率的に固定化し、これに生体膜に学ぶ独自の電気化学的検出原理を適用することにより、種々のDNA結合性化学物質を計測する手法の確立を目指した。まず遺伝子DNAの計測を目的としてセンサシステムの構築を試みた。検出糸としては、金電極に固定化したオリゴヌクレオチドと末端に酸化還元活性種であるフエロセンを導入したオリゴヌクレオチドの2つを用い、この両者と相補的なターゲットDNAとからなるサンドイッチ複合体形成反応を利用した。その結果、相補鎖と非相補鎖の間で還元電流値に明らかな差異がみられ、このセンサが選択的にターゲットDNAを検出していることを証明した。次いで、診断応用の視点から、DNA固定化電極をバイオアフィニティー反応の解析へ応用した。発ガン性や変異原性を有する化学物質とDNAとの相互作用について系統的な評価を行ったところ、いくつかの結合定数が明らかな物質について電極応答との間に有意な相関関係があることが明らかとなった。ラングミュイア式を仮定し電極応答と化合物濃度との関係式を導き、芳香族化合物のDNA結合能を推定することに成功した。また、全身性エリテマトーデスに関わりが深いとされる抗DNA抗体を計測対象とし、その電気化学計測にむけて基礎的な検討を行った。電極上のDNAへの抗体タンパク質の結合に伴い、電極表面の物性に変化が生じ、これを「イオンチャンネル型センサ」原理に基づく電気化学手法によって検知することにより、IgM抗体の濃度決定が可能であることを明らかにすることができた。分子生物学や遺伝子工学の急速な発展にともない、DNAの科学が社会生活の中にも随所で見られるようになった。遺伝子診断・遺伝子治療も臨床段階まできており、世間の注目を集めている。そこで筆者らは遺伝子DNAを識別素子とする分離・計測化学の研究を続けてきた。本研究では、DNAバイオセンサの診断応用に関する基礎研究を目的とする。DNAを電極上に簡便かつ効率的に固定化する手法を確立し、遺伝子DNAのみならず、変異原物質、発ガン物質などの計測が可能となることを実証する。本年度はまず、新しいDNA固定化法の開発を試みた。その一つとして、5'末端付近をホスホロチオエステル化したオリゴヌクレオチドを合成し、金と硫黄の化学吸着を利用することで、オリゴヌクレオチドの金電極への固定化を試みたところ、その電気化学応答性からこれが再現性に優れたDNA固定法であることを確認した。次いでこれを遺伝子センサとして用いるための基礎検討を行った。検出系としては、金電極に固定化したオリゴヌクレオチドと末端に酸化還元活性種であるフェロセンを導入したオリゴヌクレオチドの2つを用い、この両者と相補的なターゲットDNAとからなるサンドイッチ複合体形成反応を利用することとした。系中に存在する相補的な塩基配列を持つターゲットDNAとハイブリッドを形成した時のみフェロセンユニットが電極表面上に濃縮されると考えられる。実際にターゲット遺伝子が系に存在する場合にはフェノセンに基づく電気化学的特性を確認することができた。一方、電極に固定したDNAと相補的な配列を持たない比較サンプルにおいてはフェロセン由来のピークはわずかであり、相補鎖と非相補鎖の間で還元電流値に明らかな差異がみられた。このことはこのセンサが選択的にターゲットDNAを検出していることを証明している。8年度は特に遺伝子DNAの計測に焦点を絞り、これが可能であることを実証し報告した。本年度(9年度)は診断応用の視点から、このDNA固定化電極をバイオアフィニティー反応の解析へ応用した。

すなわち多環芳香族化合物の多くは発ガン性や変異原性を有しており、DNAとの相互作用を介して生体に害を及ぼすと考えられている。そこで本研究で得たDNA固定化電極を用い、これら化学物質とDNAとの相互作用について系統的な評価を行ったところ、いくつかの結合定数が明かな物質について電極応答との間に有意な相関関係があることが明らかとなった。ラングミュイア式を仮定し電極応答と化合物濃度との関係式を導き、芳香族化合物のDNA結合能を推定することに成功した。また、全身性エリテマトーデスに関わりが深いとされる抗DNA抗体を計測対象とし、その電気化学計測にむけて基礎的な検討を行った。電極上のDNAへの抗体タンパク質の結合に伴い、電極表面の物性に変化が生じ、これを「イオンチャンネル型センサ」原理に基づく電気化学手法によって検知することにより、IgM抗体の濃度決定が可能であることを明らかにすることができた。
ＣＣＬ２を抑制する間葉系幹細胞を用いた周産期脳障害に対する新規治療法の開発

周産期低酸素性虚血性脳症に対する新規治療法の開発は急務である。本研究では、炎症誘発性のCCケモカインのひとつであるCCL2を抑える間葉系幹細胞(7ND-MSC)を用いた周産期脳障害に対する新規治療法開発へ向けての基礎的データを得た。まず、マウスでのモデルを確立させた。次に、臨床応用を見据え、静注後の動態評価を行い、骨髄由来MSCが安全に投与できることを確認した。また、免疫組織学的検討では、7ND-MSCを投与すると、急性期のアポトーシスを抑制することがわかった。今年度は、確立されたマウスモデルで7ND-MSC投与の治療効果を検討した。10日齢(P10)の新生仔マウス(C57BL/6)の左総頸動脈を2重結紮、切離し、その後低酸素インキュベーターを用い、8%酸素負荷を40分行った。この低酸素負荷により片側の海馬を中心とした受傷が起こることは昨年度に確認している。細胞は、DMEM培養液(+10%FBS)にて培養増殖させ、投与前に1×10^7個/mlの濃度に調製した。低酸素負荷4時間後、および24時間後に7ND-MSCを1×10^6個(100ul)腹腔内投与し、その24時間後に潅流固定し、組織切片を作製した。投与後24時間の間に死亡したマウスはVehicle群、7ND-MSC投与群ともにいなかった。抗active caspase 3抗体を用い、免疫組織学的に海馬におけるアポトーシス細胞をカウントしたところ、負荷4時間後投与群では、Vehicle群と7ND-MSC投与群で差を認めなかったが、24時間後投与では、陽性細胞数が76%減少、陽性細胞密度が75%減少した。この結果より7ND-MSCの低酸素負荷24時間後の腹腔内投与は、急性期のアポトーシスを抑制することが示唆された。本研究課題の最終目標は、ミクログリアの活性化や増殖を調節しているChemokine (C-C motif) ligand 2 (CCL2)を阻害する間葉系幹細胞(MSC)を用い、周産期HIEに対する新規治療法開発を行うことである。今年度は細胞投与後の動態の確認およびマウスモデルの確立を行った。細胞投与経路は様々な方法が考えられる。新生児での臨床応用を考えた時、静脈内投与が最も容易であるが、この場合、局所投与に比べより全身での評価が必要となる。特にMSCの静脈投与では、成人症例で肺塞栓の事例もあり注意が必要である。そこでIVIS Imaging Systemを用い、細胞静脈内投与後の動態の検討を行った。骨髄由来間葉系細胞(BM-MSC)、あるいは骨髄単核球(BM-MC)を細胞膜のみに染色される蛍光色素(DiR)でラベルし、低酸素虚血負荷した生後7日齢のラットの外頸静脈から1×105個投与した。その後の体内動態を4週間後まで経時的にIVIS Imaging Systemにて評価したところ、両細胞とも投与後2日をピークに肝臓を中心に多臓器において検出され、その後徐々に減少した。BM-MSCでは肺への集積も多く認められた。両細胞とも脳内では検出できなかった。観察期間において死亡したラットはいなかった。また、作製したMSCはマウス骨髄由来の細胞のため、マウスによるモデル確立を行った。すでに我々の研究室でもラットにおいて確立しているRice-Vannuciモデルを用いマウスにて作製を試みた。生後7日齢(P7)あるいは10日齢(P10)の新生仔マウスの左総頸動脈を2重結紮、切離し、その後低酸素インキュベーターを用い8%酸素負荷をかけた。様々な低酸素負荷時間で確認したところ、P7マウスでは35分、P10マウスでは40分の低酸素負荷で適度な梗塞が作製できることがわかった。26年度は、ラット新生児低酸素性虚血性脳症(HIE)モデルにおいて、骨髄単核球(BM-MNC)を投与した際の行動評価、部位別脳体積、および、骨髄単核球(BM-MNC)、骨髄由来間葉系幹細胞(BM-MSC)を投与したときの血中サイトカインの変化を検討した。生後7日齢ラットを用いHIEモデルを作製し、受傷24時間後にBM-MNC 1×10^5個を外頸静脈から投与し、3週齢から行動学的評価を行った。歩行解析において、対照群では患側後肢の接地面積が健側に対して17%大きくなっていたが、BM-MNC投与群では健側と差を認めなかった。脳体積は、患側の線条体および淡蒼球が対照群と比してBM-MNC投与群で大きく、線条体で2.4倍、淡蒼球では1.8倍であった。

同様にHIEモデルを作製し、受傷24時間後にBM-MNCまたは、BM-MSCを1×10^5個投与し、その24時間後にLuminex xMAP technologyを用い、27種類の血中サイトカイン、ケモカインを評価した。BM-MNC投与では変化を及ばさなかったが、BM-MSC投与では、抗炎症性サイトカインの上昇と、貪食細胞走化因子の抑制を認めた。新生児学昨年度のモデルの確立の遅れをまだ取り戻せていないため。モデルの確立に当初の予定より時間がかかってしまった。ラットに比べ吸入麻酔による呼吸抑制が強く、至適な麻酔条件、方法を見出すことにも時間を要してしまった。行動学的評価として、能動的回避反応による学習能力、footprints試験、回転棒試験、シリンダー試験による運動能力やオープンフィールドでの基本行動の解析を行う。より効果的な治療を開発するために、以下に述べる研究系を用いて、作用機序を解析する。酸化ストレス(nitrotyrosine、4HNE)、シトクロムC、calpain、オートファジーを生化学的、免疫組織学的に評価する。負荷後BrdUを投与し、神経特異的なマーカー(NeuN)と抗BrdU抗体を使い免疫組織学的に幹細胞移植による神経新生の変化を調べる。抗炎症の評価としては、Luminex xMAP technologyを用いて27種類のサイトカイン/ケモカインを同時測定する。また、神経病理学的検討として、神経特異的なmicrotubule-associated protein 2(MAP2)に対する抗体で免疫組織染色を行い、梗塞体積、組織欠損率を求め評価、比較検討する。次年度以降で、確立できたモデルを用い、細胞投与による治療効果を検討し、新規治療の開発を目指す。移植細胞の生着、分化の評価として、GFPでプレラベルした後移植し、移植細胞の脳内生着数、分布を免疫組織学的に評価する。また、分化もそれぞれに特異的な抗体を用いて調べる。神経病理学的検討として、それぞれの神経特異的なmicrotubule-associated protein 2(MAP2)に対する抗体で免疫組織染色を行い、梗塞体積、組織欠損率を求め評価、比較検討する。行動学的評価として、受動的回避反応、慣れを用いた記憶保持試験、水迷路学習を用いた空間記憶実験法による学習能力、footprints試験、回転棒試験、シリンダー試験による運動能力やcontact placing responseによる反射、オープンフィールドでの基本行動の解析を行う。各種炎症マーカーの脳内レベルをELISA法で、(活性化)マイクログリア数を免疫組織学的に評価する。細胞死抑制については各種caspases活性、apoptosis induce factor(AIF)、酸化ストレス(nitrotyrosine、4HNE)、シトクロムC、calpain、オートファジーを生化学的、免疫組織学的に評価する。また、細胞移植後の血管新生への影響も調べる。Luminex xMAP technologyを用いてサイトカイン/ケモカインを測定するためにはキットを購入する必要がある。今年度の予算の一部を次年度に充て、他の必要消耗品などの購入に支障を来さないようにした。当初の予定の通り、実験動物、抗体などの免疫関連試薬、細胞培養に使用する薬品などに用いる。
新規多点制御型有機分子触媒の創製を基盤とするドミノ型反応の開発

Rauhut-Currier(RC)反応は、ルイス塩基を触媒とするα,β-不飽和カルボニル化合物のカップリング反応である。本反応は、多段階であり律速段階に炭素-炭素結合のステップとその次のプロトン移動のステップが関わっているため不斉反応への展開は困難であった。平成23年度は、環状ジエノンにアクリル酸エステル部位を導入した対称な反応基質の有機分子触媒によるエナンチオ選択的RC反応を検討した。二重活性化型有機分子触媒による本RC反応を確立するために、基質に対して、先ずは、アキラルな酸および塩基化合物による触媒スクーリンニングを行った。その結果、ルイス塩基触媒としてトリフェニルホスフィン、ブレンステッド酸触媒にフェノールを用いると目的物が収率81%で得られることを見出した。なお、キラルなブレンステッド酸触媒として(S)-BINOLを添加してもラセミ体が得られることを確認している。ホスフィン系キラル触媒を中心に検討した結果、バリンから誘導される触媒を用いると効率良く反応が進行し、光学活性な生成物が得られることを見出した。触媒の窒素置換基を精査したところ、トシル基を導入した酸-塩基型触媒を用いた場合に、目的環化体を単離収率99%、光学収率98%eeで得ることに成功した(Angew. Chem. Int. Ed. in press)。スピロ骨格を有する二重活性化型有機分子触媒を創製し、aza-Morita-Baylis-HiIlman反応に極めて有効であることを報告した。さらに、これまでに報告例のないイミンを反応基質とするaza-MBH反応についてもブルゴーニュ大学のJuge教授らと共同で検討し、Juge教授らの開発したキラルなホスフィン誘導体により目的物を高収率・高エナンチオ選択的に得ることができた(投稿準備中)。キラルな二重活性化型有機触媒を用いるエナンチオ選択的アザ-森田-ベイリースーヒルマン(aza-MBH)反応の展開として、二種類のドミ反応を検討した。トシルイミンとアクロレインのaza-MBK反応において、反応中間体と、もう一分子のアクロレインとのドミノ反応を検討したところ、溶媒としてジクロロエタンを用い、0°Cで反応を行った後に25°Cまで昇温することで、高収率かつ高エナンチオ選択的にテトラヒドロピリジン誘導体を得ることに成功した。この反応では、マイケル反応/マンニッヒ反応/アザ-マイケル反応/分子内アルドール反応/脱水反応が連続的に進行している。トシルイミンに対して、アクロレインとメチルビニルケトンの二種類を同時に反応基質として用いた場合にはドミノ反応に展開できないものの、最初に生じたaza-MBH付加体をDBU存在下メチルビニルケトンと処理することで目的の三成分連結体を得ることができた。また、トシルイミンの分子内にマイケルアクセプターとして働くα,β-不飽和エステルを導入した反応基質を用いて、メチルビニルケトンとの反応を行ったところ、マイケル反応/マンニッヒ反応/分子内アザーマイケル反応/逆マイケル反応が連続的に進行し、他の方法では合成の困難なイソインドリン誘導体を最高93%eeで収率よく得ることができた。得られたイソインドリン誘導体は、種々の反応により高い光学純度を保ったまま様々な誘導体に変換可能であった。今後、医薬品の合成中間体としての利用が期待できる。
乳がん術後未再発日本人女性患者の心理的実存的課題の解明と効果的な介入方法の研究

乳がん術後未再発女性患者を対象とし、患者の苦悩が成長の機会となるという観点から心理的課題(抑うつ・不安・心の健康度)・実存的課題(生きることの意味・スピリチュアリティ)について質問紙調査・面接調査を実施した。結果として、患者群の心理的健康度が健常群と同等あるいはより高いこと、乳がん罹患が人間関係を確認し、自らの弱さを受容するきっかけとなって、実存的な転換が生じている可能性が示唆された。がん罹患の積極的側面についての研究は、患者・家族にとって有意味であり今後も継続されるべきである。平成22年度においては、愛知医科大学医学部付属病院において、女性乳がん患者を対象とした質問紙調査を開始すべく、実施する質問紙の選定を実施、研究代表者が一般人を対象として調査を実施した際に用いたSMiLE・PIL・自己超越尺度に加えて、SDS・STAI・SUBI・GHQ-30も使用することとした。また質問紙調査および面接調査の時期および対象患者を決定し、研究のプロトコールを確定した。同時に患者への説明文書・同意書などを作成して、愛知医科大学医学部倫理委員会に提出し、平成22年度第2回医学部倫理委員会第二臨床試験専門委員会(平成22年6月17日開催)にて審査を受けた。結果として、説明文書への記載不備を数箇所、訂正するように指示を受けた程度で、質問紙調査・面接調査の実施については、承認手続きに入る段階となった。しかし研究分担者(当時)の愛知医科大学医学部福富教授から研究代表者に対して、研究成果にかんする論文の執筆者について強い要請が行われ、その条件が満たされない限りは研究協力はできない旨の申し出があり、それに伴い、倫理委員会の審査結果も保留となった。申請時の研究計画の大幅な変更を要するような、研究実施計画の変更が愛知医科大学側から提案されたため、それを巡っての話し合いが試みられたが、合意に至らなかった。平成23年2月に研究分担者から削除の申し出があり、研究代表者も受諾した。新たな研究組織編成のため、平成23年3月から九州がんセンターおよび滋賀県立成人病センターに研究実施を依頼し、平成23年度における研究計画の実施の準備を行った。平成23年度はまず、研究分担者及び滋賀県立成人病センター乳腺外科の担当医師と協議し、本研究のプロトコールを確定した。その過程において、九州がんセンター緩和ケア科の担当医師とも連絡を取り、九州がんセンターにおいても実施可能なプロトコールになるように努めた。九州がんセンターにおいて、死を直接的に意識させる文言が含まれる質問紙の使用は差し控えるべきだとの指摘を受けたことを踏まえ、予備調査で使用した質問紙とは異なり、うつ・不安・神経症の尺度(SDS・STAI・GHQ)、心の健康度の尺度(WHO SUBI)及び、がんや慢性疾患罹患時の適応度やスピリチュアリティを測定する尺度の乳がん患者版(FACT-B及びFACIT-Sp)を、「生きることの意義評価票」(Schedule for Meaning in LifeEvaluation,SMiLE)と共に実施することに決定した。対象者は滋賀県立成人病センター乳腺外科外来受診中の、30-70歳で術後3年以内の未再発日本人女性乳がん患者とし、データの管理方法・患者への説明方法などを確定した。このプロトコールを滋賀県立成人病センターの倫理委員会に提出して研究申請し、実施の承認を得た(平成23年11月)。それと並行して九州がんセンターの倫理委員会にも質問紙調査実施を申請し、12月に承認を得た。平成24年に入ってからは、九州がんセンターにて60例、滋賀県立成人病センターにて6例の質問紙データを得たので、患者群と人口統計学的に適合した対照群についての質問紙調査を実施すべく、社団法人新情報センターに調査の開始を依頼した。患者群に実施した質問紙のうち、がんに直接的に関係した質問項目は省いて、健常群にも適用可能なものを用いて調査し、統計的分析を行うこととした。また、面接調査への協力を承諾してくれた患者に対する調査も開始した。平成24年度においては、最終年度として研究の完成を目指した。まず23年度中に収集した患者群データに基いて対照群を設定し、人口統計学的に合致している健常女性200名を対象としたデータを入手した。また九州がんセンター・滋賀県立成人病センターにおいて、面接調査に応じても良いと回答した患者との面接調査を実施した。さらに患者データを集めるため、その後一宮市立市民病院乳腺外科での調査実施を依頼した。質問紙調査のみならば迅速審査が可能ということで、50名に対する質問紙調査を実施した。これらのデータを集積した結果と健常女性群とを比較し、特にその個別性を含んだデータを中心にまとめた結果を、オランダ・ロッテルダムにおいて平成25年11月に開催予定のInternational Psychooncology Society第15回大会において発表予定である。

介入プログラムの開発については、滋賀県立成人病センターにおける症例数が少なく、また研究協力者であった天野心理士が平成25年3月に退職されたため、実施には至らなかった。研究の申請時には、研究分担者(当時)が所属する愛知医科大学医学部付属病院において、平成22年度に女性乳がん患者を対象とした質問紙調査を開始する予定であった。そのため22年4月より質問紙の選定を実施、研究のプロトコールを確定し、同時に患者への説明文書・同意書などを作成して、愛知医科大学医学部倫理委員会に提出した。この計画は平成22年度第2回医学部倫理委員会第二臨床試験専門委員会(平成22年6月17日開催)にて審査を受け、説明文書への記載不備を数箇所、訂正するように指示を受けた程度で、質問紙調査・面接調査実施の承認手続きに入る段階となった。しかし研究分担者の愛知医科大学医学部福富教授から研究代表者に対して、研究成果論文の執筆者代表者を愛知医科大学側に確定するという条件が満たされない限りは研究協力はできない旨の申し出があり、それに伴い、倫理委員会の審査結果も保留となった。同時に、申請時の研究計画の大幅な変更が愛知医科大学側から提案されたため、それを巡っての話し合いが試みられたが、合意に至らず、平成23年2月に研究分担者から削除の申し出があり、研究代表者も受諾した。こういった経緯の後に、新たな研究組織編成のため、平成23年3月から九州がんセンターおよび滋賀県立成人病センターに研究実施を依頼し、倫理委員会での承認を受けるための研究計画を準備したが、両施設における質問紙調査及び面接調査実施の承認を得られたのが23年11月以降となった結果、患者群に対する質問紙調査の症例数が、当初計画の予定数まで到達しなかった。また2施設のみではデータ量が不足しているため、他施設の倫理委員会にも研究申請中だが、まだ承認されていない。患者群の人口統計学的特徴が確定しなかったため、健常群のデータ収集も遅れ、24年4月にようやく200例のデータを得たため、データ分析も実施できなかった。24年度が最終年度であるため、記入しない。本年度は本研究課題の最終年度でもあり、当初の計画を達成すべく、以下の点を重点的に対応する。(1)質問紙データの更なる収集。医療機関は多忙であるため、質問紙を患者に依頼する余裕がないことが多いが、説明と依頼をする人を別に付けてでも、十分な症例数が確保されるように努力する。(2)面接調査の継続。質問紙に回答いただいた患者さんのうちの半数程度は、面接調査への協力を承諾いただいた。個別の事例研究は、質問紙では得られない質的データを提供してくれるため、質問紙のデータ量の不足を補う意味でも、積極的に面接調査を進める。(3)データ分析。健常群データを分析し、患者群との比較を行う。また患者群については、全体を一括して分析するだけではなく、様々な指標によって下位群を作成し、心理的・実存的課題の実際を詳細に検討する。(4)介入プログラムの策定。診断および手術・治療の経過の中でのcritical pointsを見つけ、そこに重点的に介入するプログラムを策定し、可能であれば医療機関においてパイロットスタディを実施する。
果樹におけるABAの生理作用に関する分子生物学的研究

本年度は、果実発育および成熟時の内生ABA量とその代謝産物であるファゼイン酸(PA)およびジヒドロファゼイン酸(DPA)の定量を行い、ABA生合成遺伝子である9-cis-epoxycarotenoid dioxygenase(NCED)遺伝子、PpNCED1とPpNCED2について、その果実と樹体における発現特性について詳細に検討し、果実発育、成熟時のABAの機能について解析した。その結果、前年度も確認された内生ABA量の果実成熟時における増加とそれに続く減少は、ABAの代謝、すなわちABA→PA→DPAという速やかな変化により制御され、それによりABAの一過的な上昇が認められることが強く示唆された。また、PAは果実発育の初期に多く、その後減少することが示された。さらに、定量PCRによりNCED遺伝子の発現解析を行った結果、ABAの上昇はPpNCED1遺伝子の発現上昇を伴って起こることが示された。その上昇は、エチレン生合成酵素遺伝子の前に認められ、果実の成熟開始の初期にPpNCED1遺伝子が関わる可能性が示された。また、PpNCED1遺伝子の樹体における発現量を比較したところ、PpNCED2は茎で発現量が高いのに対して、PpNCED1遺伝子は茎頂や葉での発現に比較して成熟果実における発現が著しく高いことが明らかになった。ABAの生合成は乾燥ストレスにより誘導されることが知られているため、葉に乾燥ストレスを与えた際のPpNCED1遺伝子の発現量を調べた結果、約50倍の著しい発現上昇が認められ、本遺伝子が乾燥ストレス誘導性の遺伝子であることが明らかになった。また、プロモーター領域をクローニングした結果、複数の重要なシス因子の存在が示された。これらの研究により、果実におけるABAの生合成の制御様式について遺伝子レベルの制御機構が存在することが示され、成熟シグナルとの関与が示唆されたと考えられた。果樹におけるABA生合成の制御機構を明らかにするために、ABA生合成の鍵酵素であるとされる9-cis-epoxycarotenoid dioxygenase(NCED)遺伝子の単離を行った。始めに、既に他の植物で報告されている本酵素のアミノ酸の保存配列より作製したプライマーを合成し、モモ果実、および日本ナシ花芽由来のcDNAを用いてRT-PCR法により本遺伝子を増幅した。増幅された遺伝子断片についてクローニングし、遺伝子配列を決定したところ、他の植物のNCED遺伝子と高い相同性があることが明らかになった。また、モモと日本ナシでは非常に高い相同性があることが示された。これらの遺伝子断片を用いて、樹体と果実での発現を時間的、空間的に調べるため、RNAブロットハイブリダイゼーションにより、解析を行った。その結果、モモ果実では果実成熟の後期において特異的に本遺伝子が発現していることが示された。このことは、モモの果実成熟に伴って増加するとされる果実内のABA蓄積にNCED遺伝子が機能している可能性を示唆するものと考えられた。一方、モモと日本ナシの花芽における発現を解析したところ、休眠前期で比較的強く発現していることが示唆された。現在、これらの遺伝子のモモ、および日本ナシゲノムでの存在様式を、DNAブロットハイブリダイゼーションで解析中であり、また、水ストレスのNCED遺伝子発現への影響についても検討中である。本年度は、ABA生合成遺伝子の一つである9-cis-epoxycarotenoid dioxygenase (NCED)遣伝子について、モモゲノム中における存在様式を解析し、その果実成熟における機能について検討した。まず、NCEDの保存アミノ酸配列の情報を基に作成したディジェネレートプライマーを用いて増幅した断片について調べたところ、NCED遣伝子と相同性の高い2つの遺伝子(NCED1,NCED2)がクローン化された。それらについてサザンハイブリダイゼーションを行った結果、他の植物で報告されているのと同様に、それぞれ数コピーからなるファミリーを形成していることが明らかになった。さらに、果実成熟やABA生合成に関与しているかどうかを検討するため、モモ果実の発育段階における内生ABA量等について測定した。その結果、果実成熟が開始する満開後90日後よりABA量は急激に増加し始め、その後95日後にピークを迎え、成熟後期で再び下がった。NCED1遺伝子の発現はABA量の増加に先だってみられたことから、本遣伝子が果実成熟後期のABA生合成を制御していることが示唆された。さらに、NCED1遣伝子の発現が増加した時期は、糖度などの上昇など果実成熟が開始する時期と一致することから、NCED1遣伝子が果実成熟と関連する可能性が考えられる。一方、NCED2遣伝子は果実発育初期で最も高く、その後低く推移しており、NCED1遣伝子とは異なる機能をもつことが示唆された。以上のことから、モモ果実において、NCED1遺伝子の成熟時期特異的発現が明らかにされた。今後、果実成熟におけるNCED1遺伝子の機能を解明してゆくことで,果実成熟の制御機構を明らかにしてゆけるものと考えられる。

その結果、前年度も確認された内生ABA量の果実成熟時における増加とそれに続く減少は、ABAの代謝、すなわちABA→PA→DPAという速やかな変化により制御され、それによりABAの一過的な上昇が認められることが強く示唆された。また、PAは果実発育の初期に多く、その後減少することが示された。さらに、定量PCRによりNCED遺伝子の発現解析を行った結果、ABAの上昇はPpNCED1遺伝子の発現上昇を伴って起こることが示された。その上昇は、エチレン生合成酵素遺伝子の前に認められ、果実の成熟開始の初期にPpNCED1遺伝子が関わる可能性が示された。また、PpNCED1遺伝子の樹体における発現量を比較したところ、PpNCED2は茎で発現量が高いのに対して、PpNCED1遺伝子は茎頂や葉での発現に比較して成熟果実における発現が著しく高いことが明らかになった。ABAの生合成は乾燥ストレスにより誘導されることが知られているため、葉に乾燥ストレスを与えた際のPpNCED1遺伝子の発現量を調べた結果、約50倍の著しい発現上昇が認められ、本遺伝子が乾燥ストレス誘導性の遺伝子であることが明らかになった。また、プロモーター領域をクローニングした結果、複数の重要なシス因子の存在が示された。これらの研究により、果実におけるABAの生合成の制御様式について遺伝子レベルの制御機構が存在することが示され、成熟シグナルとの関与が示唆されたと考えられた。
無声映画期の欧米諸国におけるアジア映画の上映およびアジア映画人の活動に関する研究

無声映画期は、欧米で最新技術をもって作られた映像が、もっぱらアジアへ輸出される時期だと考えられてきた。映像技師をはじめとする映画人の移動も、欧米からアジアへという一方的な流ればかり注目されてきた。しかし無声映画期の欧米諸国におけるアジア映画の上映と受容の実態に関する研究は決して充分とはいえない。本研究は従来の国別の映画史研究では看過されてきた無声映画期の史実を、地域横断的な視点で論じようとする。さらに、異民族に向けて自らの「正しい」表象を構築しようとするアジア映画人の努力、そしてアジアからの文化的発信は欧米諸国にいかに受容されたかを解明しようとする。
レーザスペックルを用いた金属材料の疲労損傷評価法の開発

本研究ではレーザを用いた光学的な方法により,金属材料の疲労損傷を非接触で評価し,余寿命を推定する方法を開発するための基礎的な研究を行った。主な研究項目は以下のとおりである。(1)鋼材試験片に一定応力振幅の繰返し荷重を加え,疲労過程中の材料表面のあらさ変化を観測した。表面状態の変化を表わす特性パラメータとして、算術平均あらさRa、そしてあらさ曲線の周波数分布の特性を表わすパラメータS_f、さらにあらさ曲線を図形として見たときの複雑さを表わすパラメータであるフラクタル次元kを考えた。これらのパラメータと応力繰返し数との関係を調べたところ、データのばらつきがかなり見られたが、応力繰返し数の増加につれてこれらのパラメータの値は増加することがわかった。これらの結果から疲労損傷と表面状態との対応関係が有ることが確認できた。(2)疲労過程中の試験片表面にHe-Neレーザを照射し,反射光の干渉により生じるスペックルパターンの解析を行った。スペックルパターンの特徴を表わすパラメータB_sを用いて、疲労損傷との関係を調べた。このパラメータと上記の表面特性のパラメータとの間に相関性があることがわかった。特に周波数特性を表わすパラメータS_fとの相関が高く、スペックルパターンが表面の3次元的な周波数特性と関係していることがわかった.また、B_sと応力繰返し数との関係については、表面特性との関係に比べて非常にばらつきが少なく、応力繰返し数に対して一意的な関係が有ることがわかった。したがって、疲労損傷を評価するためのパラメータとしてB_sが適していることが明らかになった。(3)油圧サーボ式の疲労試験機に鋼材試験片を装着し,試験機を作動させたままレーザスペックルを「その場」観測するための光学系を構築した。(4)各種の応力振幅の下で応力繰返し数とスペックルパターンとの関係を調べた。応力振幅と疲労寿命との関係を調べ,さらにこれとスペックルパターンの変化の割合との関係を調べた。同一材料についてこれらの各種の関係を求め,データベースとしてコンピュータに蓄積する。これらのデータに基づいてスペックルパターンの変化を観測することにより疲労寿命を推定するための一つの方法を考案した。寿命評価を行った結果、ある程度の精度で推定が可能であることがわかった。本年度は次の項目について研究を行った。(1)鋼材試験片に疲労荷重を加えた場合について材料の表面性状の変化の観測、(2)表面特性の評価法および表面性状と疲労損傷との関係、(3)表面特性のパラメータとスペックルパターンの特徴パラメータとの関係、(4)スペックルパターンと疲労損傷との関係の定量化および疲労寿命の推定、以上の項目について検討した。(1)鋼材試験片に一定応力振幅の繰返し荷重を加え,今年度予算において購入した表面あらさ計を用いて疲労過程中の材料表面のあらさ変化を観測した。(2)疲労による表面状態の変化を表わす特性パラメータとして、算術平均あらさRa、そしてあらさ曲線の周波数分布の特性を表わすパラメータとしてパワースペクトルの面積A_f、さらにあらさ曲線を図形として見たときの複雑さを表わすパラメータであるフラクタル次元kを考えた。

これらのパラメータと応力繰返し数との関係を調べたところ、データのばらつきがかなり見られたが、応力繰返し数の増加につれてこれらのパラメータの値は増加し、また応力振幅が大きいほど値も大きくなることがわかった。それらの結果から疲労損傷と表面状態との対応関係が有ることが確認できた。(3)疲労過程中の試験片表面にHe-Neレーザを照射し,反射光の干渉により生じるスペックルパターンの解析を行った。スペックルパターンの特徴を表わすパラメータB_Sを用いて、疲労損傷との関係を調べた。このパラメータと上記の表面特性のパラメータとの間に相関性があることがわかった。特に周波数特性を表わすパラメータS_fとの相関が高く、スペックルパターンが表面の3次元的な周波数特性と関係していることがわかった。また、B_sと応力繰返し数との関係については、表面特性と応力繰返し数との関係に比べて非常にばらつきが少なく、応力繰返し数に対して一意的な関係が有ることがわかった。したがって、疲労損傷を評価するためのパラメータとしてB_sが適していることが明らかになった。(4)各種の応力振幅のもとで,スペックルパターンと繰返し数との関係を調べ,その間の関係式を導いた。その関係式を用いて、測定対象の余寿命を評価する一つの方法を考案し、寿命評価を行った結果、ばらつきがあったが、ある程度の精度で推定が可能であることがわかった。本研究ではレーザを用いた光学的な方法により,金属材料の疲労損傷を非接触で評価し,余寿命を推定する方法を開発するための基礎的な研究を行った。本年度は以下の項目について研究を行った。(1)油圧サーボ式の疲労試験機に鋼材試験片を装着し,試験機を作動させたままレーザスペックルを「その場」観測するための光学系を構築した。(2)疲労試験中の鋼材試験片の表面性状の変化とスペックルパターンを観測した。スペックルパターンはCCDカメラを通して高解像度のディジタル画像としてコンピュータに入力し,画像処理によって評価パラメータを求めた。表面性状については接触式の表面あらさ計で測定を行い,算術平均あらさについては測定機から直接読み,あらさ曲線についてはコンピュータにデータ入力をし,自作の解析プログラムにより解析を行った。(3)あらさ曲線の特性については,FFT解析を行ない,そのパワースペクトル分布を求めた.またあらさ曲線のフラクタル解析を行い,これらのパラメータとレーザスペックルパターンとの比較を行ない,表面性状とスペックルパターンとの対応を検討した。(4)各種の応力振幅の下で応力繰返し数とスペックルパターンとの関係を調べた。応力振幅と疲労寿命との関係を調べ,さらにこれとスペックルパターンの変化の割合との関係を調べた。同一材料についてこれらの各種の関係を求め,データベースとしてコンピュータに蓄積する。これらのデータに基づいてスペックルパターンの変化を観測することにより疲労寿命を推定するための一つの方法を考案した。
東アジア山岳宗教研究の基盤形成―日本・中国・韓国の国際比較研究から―

本研究課題は、日本・中国・韓国の代表的な山岳霊山(英彦山・泰山・智異山)について、自然と山岳宗教・心意と山岳宗教・社会と山岳宗教という3つのアプローチから比較検討を行い、東アジア山岳宗教の比較研究の基盤を築くことを目的としている。研究2年目となる2018年度は、主として宗教的実践(祭礼・法会・巫俗儀礼など)の比較研究を行った。具体的には、近代以降の英彦山における神道・仏教・教派神道・民俗宗教、泰山における道教・仏教・風水思想、智異山における儒教・仏教・巫俗・風水思想、などを対象に、宗教実践と諸宗教の習合の諸相について考察を行った。特に、日本英彦山と韓国智異山については現地調査によってその具体的様相を捉えることができた。近代英彦山の信仰を知るうえで重要な役割を果たした教派神道神理教については、教団文書の分析から英彦山との関係を詳細に考察することができた。また、韓国智異山においては、山神祭(10月)・天王祭(11月)の現地調査を実施し、巫俗と儒教とが習合した現代韓国の宗教実践の様相を調査することができた。また、10月と3月には学会発表を行い、本研究課題の成果を公表するとともに、3月には学術論文をまとめ、公表した。さらに年間を通して東アジア山岳宗教に関する文献の収集分析に取り組んだ。以上のように、2018年度は、近代の英彦山信仰に大きな影響を与えた神理教を新たなフィールドとして開拓するとともに、昨年度に構築した国際連携関係を活用して韓国の山岳宗教実践を詳らかに調査するなど、研究実績に大きな弾みをつけることができた。2018年度は日本の英彦山、韓国の智異山に関する研究について大きな進展が見られた。英彦山については、近代の講社組織化、官幣社昇格運動といった各場面において教派神道神理教の介在があったことが神理教所蔵資料の調査を通して初めて確認することができた。英彦山における修験崩壊後の山岳宗教の教理・組織化・宗教実践についてこれまでにない視角からの研究が可能となった。また、韓国智異山においては、山神祭(10月)・天王祭(11月)の現地調査を行い、現代韓国における巫俗と儒教との併存祭祀の実践を実見するとともに、菩薩(女性巫者)・法師(男性巫者)・儒者への聞き取り調査を行った。また、2018年に「韓国の山寺」が世界遺産に登録されたことは、本研究とも関連がある出来事であった。たとえば、智異山にも近い松廣寺では、境内の伽藍と山川といった自然環境、および山内に点在する庵・塔・窟などの存在が確認できる。韓国の山寺研究の視点を取り込むことは本研究の進展にも益すると考えられる。なお、研究成果については、口頭発表2件、学術論文1本をそれぞれ発表している。以上の進捗状況を踏まえると、本研究課題はおおむね順調に進展しているということができる。2019年度は、日中韓の山岳宗教について、主として宗教制度(社会と山岳宗教)に着目しつつ調査・研究を進めたいと考える。その際には、日中韓の山岳聖地観・山岳宗教実践にみられる共通性と差異の大きな要因であり、各国の山岳宗教の特性を規定したとみられる近世(江戸時代・宋代・朝鮮時代)以降の山岳宗教に関する諸制度を調査し、比較検討を進めたい。具体的には、日本英彦山については、別格本山成立から修験廃止までの変遷を、中国泰山については、国家祭祀から民間祭祀への変遷を、韓国智異山については、朝鮮時代の儒教国教化と廃仏政策を、それぞれ文献調査と現地調査を併用する形で分析していきたい。また、年間を通して東アジア山岳宗教の文献収集・分析を行う。なお、本年度は韓国および智異山の宗教制度史を重点課題に据え、資料収集に努めたい。また、2019年度より研究の後半に入るため、国内外における研究成果の発信をさらに積極的に進めたい。本研究課題は、日本・中国・韓国の代表的山岳霊山(英彦山・泰山・智異山)について、自然と山岳宗教・心意と山岳宗教・社会と山岳宗教という3つのアプローチから比較検討を行い、東アジア山岳宗教の比較研究の基盤を築くことを目的としている。上記の課題を達成するため、初年度となる本年度は、主として山岳聖地観の比較研究(自然と山岳宗教)を実施するとともに、現地協力機関および研究者との情報交換を行った。また、日本および英彦山の宗教制度史に関する資料分析を行った。具体的には、日中韓の山岳宗教に関する図書や資料を入手するとともに、研究遂行に必要な機材を整備した。また、中国の泰山学院、韓国の国立慶尚大学校・国立順天大学校と、そこに所属する研究者との間に、研究期間中の研究協力・情報交換が可能な関係を築いた。これを承けて、10月には中国泰山において山内聖地(特に洞窟聖地)、山麓の寺廟、および廟会と香社についての現地調査を実施し、23月には韓国智異山において儒・仏・巫と山岳聖地との関係、および巫俗祭祀の現地調査を実施した。また8月には口頭発表、9月には学会出張を実施し、研究成果の発表および研究情報交換を行った。以上のように、本年度は主として中国・韓国の山岳宗教についての現地調査・研究を行うとともに、現地協力機関・協力者との連携関係を構築した。これにより、次年度以降、山岳宗教の比較研究を推進するうえでの基礎を築くことができた。

研究の初年度となる本年度は、中国の泰山および韓国の智異山における現地調査、および現地研究機関との連携関係の構築を中心に研究課題を推進した。中国においては、泰山学院泰山研究院の協力のもとに、山内聖地(霊応宮・火神廟・王母池・呂祖洞・王母池など)、泰山内の洞窟聖地(白雲洞・青雲洞・桃花洞・仰天洞・朝陽洞など)、泰山麓の寺廟(総司廟・祝陽泰山行宮・三官廟・七聖堂・霊巌寺・元君廟・元君行宮・蒿里山など)の踏査、及び聞き取り調査を行った。また、廟会(廟の祭礼)調査と香社の人びとへの聞き取り調査も実施した。韓国においては、国立慶尚大学校慶南文化研究院・国立順天大学校の協力のもとに、智異山麓の寺廟(四聖庵・徳川書院・山天齋・龍巌寺址など)の踏査と聞き書き調査を実施した。また、旧暦1月15日には智異山北麓の龍遊潭で行われたクッ(巫俗祭祀)の実地調査と宗教者への聞き取り調査を行った。上記の中国・韓国における現地調査は、現地機関と研究者の全面的な協力のもとに遂行することができた。また、泰山・智異山に関する多くの中国書籍・韓国書籍の寄贈を受け、資料的基盤を整えることもできたことも考え併せると、本年度は当初の計画以上の成果を収めることができたと言える。ただし、日本の英彦山における主要な調査候補地であった朝倉地区が、同年7月の九州北部豪雨により、被災したことは当初予期していなかったことであった。よって同地区の調査については次年度以降に延期することになった。以上のことを総合すると、本年度の進捗状況の評価は「おおむね順調に進展している」とするのが妥当であると判断する。本研究課題は、日本・中国・韓国の代表的な山岳霊山(英彦山・泰山・智異山)について、自然と山岳宗教・心意と山岳宗教・社会と山岳宗教という3つのアプローチから比較検討を行い、東アジア山岳宗教の比較研究の基盤を築くことを目的としている。研究2年目となる2018年度は、主として宗教的実践(祭礼・法会・巫俗儀礼など)の比較研究を行った。具体的には、近代以降の英彦山における神道・仏教・教派神道・民俗宗教、泰山における道教・仏教・風水思想、智異山における儒教・仏教・巫俗・風水思想、などを対象に、宗教実践と諸宗教の習合の諸相について考察を行った。特に、日本英彦山と韓国智異山については現地調査によってその具体的様相を捉えることができた。近代英彦山の信仰を知るうえで重要な役割を果たした教派神道神理教については、教団文書の分析から英彦山との関係を詳細に考察することができた。また、韓国智異山においては、山神祭(10月)・天王祭(11月)の現地調査を実施し、巫俗と儒教とが習合した現代韓国の宗教実践の様相を調査することができた。また、10月と3月には学会発表を行い、本研究課題の成果を公表するとともに、3月には学術論文をまとめ、公表した。さらに年間を通して東アジア山岳宗教に関する文献の収集分析に取り組んだ。以上のように、2018年度は、近代の英彦山信仰に大きな影響を与えた神理教を新たなフィールドとして開拓するとともに、昨年度に構築した国際連携関係を活用して韓国の山岳宗教実践を詳らかに調査するなど、研究実績に大きな弾みをつけることができた。2018年度は日本の英彦山、韓国の智異山に関する研究について大きな進展が見られた。英彦山については、近代の講社組織化、官幣社昇格運動といった各場面において教派神道神理教の介在があったことが神理教所蔵資料の調査を通して初めて確認することができた。英彦山における修験崩壊後の山岳宗教の教理・組織化・宗教実践についてこれまでにない視角からの研究が可能となった。
新規間葉系幹細胞を移植する機能回復を目指した骨格筋再生治療への挑戦

申請者は未分化なマウスES細胞を脂肪細胞へと分化誘導する過程で、新規間葉系幹細胞(MSCs)を大量に作成し、収集する技術を確立した。このMSCsの高い骨格筋分化能を利用して、筋の運動機能回復を目指した損傷骨格筋への移植法の確立と筋の再生機構解明を目的に研究を行った。その結果、(1)マウスの前頚骨筋を挫滅損傷させるモデルを作成し、損傷24時間後に直接MSCsを患部移植することで効果的な筋再生を実現できた。(2)移植MSCsは骨格筋や血管に分化すると共に、支配神経の再生を促進し、結果的に筋組織の再生を促進した。(3) MSCsの移植により、前頚骨筋の機能回復が促進され、1週間早く治癒した。新規間葉系幹細胞をマウスES細胞から安定して大量に作成する技術を確立した。それにより、マウスの損傷骨格筋に細胞移植が可能となった。本成果を国際特許(米国)と日本国内特許として申請し、共に取得した。マウスの前頚骨筋を座滅損傷させる損傷骨格筋モデルを作成し、これに間葉系幹細胞を移植する実験を行った。その結果、細胞移植により骨格筋および運動神経の再生が促進され、機能の回復が約1週間早くなった。この研究成果は英文の原著論文として発表した。しかし本間葉系幹細胞を損傷していない正常な骨格筋に移植しても細胞は生着できない。そこで細胞生着の足場形成に必要な物質を探索した結果、間葉系幹細胞が産生するTNF stimulated gene 6 (TSG6)が必須であることを見出した。現在その結果を論文にまとめている。本研究のメインはマウスES細胞(多能性幹細胞)から組織幹細胞(間葉系幹細胞)を作成する事であるが、逆に間葉系幹細胞からiPS細胞(多能性幹細胞)を作成することを試みた。その結果、作成効率を上げてマウスに比べて作成の難しい、ラットのiPS細胞を樹立することができた。具体的には所属研究機関で解析しているヒトメタボのモデル(肥満)ラットおよびそのコントロール正常ラットの脂肪組織より間葉系幹細胞を採取し、それらからiPS細胞を樹立した。本研究の成果を特許出願し、また論文を作成して現在投稿中である。申請者はマウスES細胞から、間葉系幹細胞を効率よく分化誘導し、採集する方法を確立して報告した(Differentiation 2011)一般に、間葉系幹細胞は脂肪、骨、軟骨には容易に分化するが、骨格筋には分化誘導が難しいとされている。しかし、新規間葉系幹細胞は生体外で骨格筋への高い分化能を示した。従って骨格筋再生に向けての移植用細胞資源として有用であると考えた。本研究の目的は、申請者の開発した新規間葉系幹細胞を用いて、生体内における分化効率を検証し、その移植効果を組織学的に解析すると共に、骨格筋の機能回復を歩行時の機能的解析から明らかにすることを目的としている。これまでの報告の多くは、移植による生着率、分化率による評価が多く、実際に移植細胞がどの程度機能回復に資するかについて詳細に解析したものは極めて少ない。本研究はリハビリテーション(理学療法)の観点から移植効果の有効性を検証することが大きな研究テーマになっている。昨年度は、前脛骨筋に物理的な損傷を加えた筋損傷モデルマウスを作成した。これは一定の圧力で一定時間鉗子を用いて筋を挟み込み画一的な損傷を与える方法である。手技は簡単で安定しているため、移植効果の解析にバラツキが少なくなった。このモデルマウスへの移植方法は、大きく二通りある。一つは血管を介する移植で、尾静脈より間葉系幹細胞を注入する方法である。これは患部に一定数の細胞を集積させるには大量の移植細胞が必要であった。そこで直接患部への移植を試みたところ、血管を介する移植法に比べて約1/10量の細胞で効果が見られた。従って患部への直接移植法を採用した。また、移植の時期についても検討したところ、筋損傷24-48時間で炎症がピークに達し、この時に移植することで移植細胞の生着率を向上させることができた。今後は本方法により移植の効果の解析を進める。平成24年度は予定した実験を遂行し、筋損傷モデルマウスの作成、移植方法の確立、移植時期の決定を行うことができた。また組織学的な筋再生過程のデーターも収集できた。次年度は「機能の回復」を実際の歩行運動を解析することで検討する。前脛骨筋の座滅損傷はマウスの全身的な機能を損なうものではない。体重の減少、食欲の低下等は認められず、約5週間で組織学的に筋の損傷は回復した。