hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
イネホウ素過剰耐性遺伝子の単離と育種への応用

ホウ素は高等植物の必須元素である。しかしながら、作物の生育に適した土壌のホウ素濃度の範囲は狭く、ホウ素過剰による作物の生育障害も発生しやすい。本研究では、イネのホウ素過剰耐性を増強することを目的とし、イネ品種間のホウ素過剰耐性の違いの原因となる遺伝子BET1を同定した。さらに、交配によって、ホウ素過剰耐性イネ品種のBET1遺伝子をホウ素感受性品種に導入し、そのホウ素過剰耐性を強化した。本研究は、イネの高濃度のホウ素に対する耐性を支配する遺伝子を同定し、この遺伝子を利用して感受性品種のホウ素過剰耐性を強化することを目的とする。ホウ素は土壌中に普遍的に存在する元素だが、乾燥気候下ではしばしば高濃度に存在するため、作物がホウ素過剰による障害をうける。イネはホウ素過剰に対して感受性であり、とくにインディカ種はジャポニカ種に比べて障害をうけやすい。ジャポニカ種にホウ素過剰耐性を与える遺伝子を利用して、インディカ品種のホウ素過剰耐性を強化する。これまでに、ジャポニカ種の熱研1号とインディカ種のIR36のRIL83系統を利用したホウ素過剰耐性のQTL解析からホウ素過剰耐性に関与する遺伝子の座乗部位を4番染色体上の約100kbの領域に絞り込んだ。平成21年度は、40品種のイネを用いて、この領域のDNA配列の比較を行い、感受性品種に共通する多型部位から、ホウ素過剰耐性を与える遺伝子としてBET1を同定した。この遺伝子は、NACドメインをもつ転写因子をコードしており、ホウ素過剰に感受性のインディカ品種が機能型の配列をもつ一方、耐性のジャポニカ品種では機能欠損していると推定された。つまり、ホウ素過剰耐性は、この遺伝子の機能が損なわれることによって発現すると推察した。今後さらにこの仮説の検証を行う。並行して、マーカー育種手法によるIR36,IR64のホウ素過剰耐性の強化をすすめている。IR36,IR64は東南アジアで人気があり、広く栽培される品種であるがホウ素過剰に感受性が高い。これらの品種に耐性品種コシヒカリの遺伝子を導入する。平成21年度はこれまでに得られていた交配種子のジェノタイピングと選抜を行い、さらに1回の戻し交配を行って世代をすすめた。イネのホウ素過剰耐性品種間差には4番染色体上のQTL遺伝子BET1が関与している。本研究課題では、BET1遺伝子をマップベースドクローニングの手法を用いて単離すること、及び、ホウ素感受性インディカ優良品種IR64にホウ素過剰耐性ジャポニカ品種コシヒカリのBET1をマーカー育種の手法で導入しホウ素過剰耐性の系統を作出することを目的としている。平成22年度は以下の検討を行った。ホウ素過剰感受性系統SL18を用いてBET1候補遺伝子であるOs049047730の発現を抑制したRNAi形質転換体を作出し、そのホウ素過剰耐性を評価したところ、発現抑制株では野生株(SL18)に比べてホウ素過剰に耐性になったことから、この遺伝子がBET1であると結論した。BET1の機能についての解明をすすめている。また、コシヒカリとIR64の交雑後代のIR64への戻し交配をさらに一世代すすめ、QTL領域以外がほぼIR64由来となった数系統を得た。幼苗を用いたホウ素過剰耐性の検定試験によって、これらの系統はIR64に比べてホウ素過剰に耐性であることが確認された。今後、登熟までの栽培試験を行い、ホウ素過剰耐性程度を評価する予定である。これまでにIR64を遺伝的背景としてホウ素過剰耐性遺伝子BET1近傍のみがコシヒカリに由来する系統を得た。今年はこの自殖種子の中からもっとも短い、BET1を含むコシヒカリ断片をもつ系統(IR64-コシヒカリBET1)を選抜し、栽培試験を行った。栽培試験は土壌を用いた。すなわち北白川水田土壌4kgを1/5000アールポットに充填し、窒素-リン-カリウムを慣行栽培量、添加した。ポットには下部に水抜き用の穴をあけ、土壌を含むポットごとホウ素溶液(0、10、20ppm)に浸漬した。水は下穴から上昇し土壌を湛水状態とした。ホウ素の一部は土壌に吸着されるが、ホウ素溶液に浸漬し続けると二週間後には田面水のホウ素濃度も外液と同じ濃度に達した。乾燥地帯で見られるホウ素過剰水田のホウ素濃度は130ppmと報告されており、現地の状況をよく反映した栽培システムが構成できた。ここにコシヒカリ、IR64、IR64-コシヒカリBET1を直接播種し生育を追跡した。0ppm対照区、10ppmホウ素区では、すべてのイネが順調に発芽した。しかし10ppm区の生育は対照区に比べ遅かった。20ppmホウ素区ではコシヒカリ、IR64-コシヒカリBET1にくらべIR64の発芽が大幅に遅れた。このため播種1ヶ月後にはIR64とIR64-コシヒカリBET1の生育には大きな差がついた。

しかし栄養生長期にはいると生育の差はなくなった。分ゲツ期には両者にやや差が見られ、IR64-コシヒカリBET1がIR64に優った。しかし、開花期、登熟期には両者の差はふたたび少なくなった。栽培期間を通しての観察によると、BET1遺伝子によるホウ素過剰耐性は、発芽期、分ゲツ期に顕著に発揮され、これが収量の増加をもたらした。これはホウ素過剰によるイネの生育障害が、発芽の遅れ、分ゲツ数の低下に起因するとするこれまでの知見とよく一致した。
皮膚バリアー制御メカニズムの分子薬理学的研究

我々の皮膚は、外来物質の体内透過や内部水分の蒸散を防止するバリアー機能を有し、その破綻はアトピー等の疾患を惹起する。この機能は、角化細胞が産生するケラチンや様々なバリアー蛋白質、脂質等によって担われている。一方、角化細胞は外的刺激により活性化され炎症惹起にも働く。これまで、各々のバリアー物質の生成や機能は調べられて来たが、これらが全体としてどう調節されているかは不明なままである。本研究では、ヒトの角化細胞であるNHEK細胞でのバリアー蛋白質発現を指標としてこれに働く化合物を同定、その作用をゲノムワイドに解析することにより角化細胞でのバリアー機能制御メカニズムを明らかにする。また、その個体での作用をマウスで実証、ヒトへの外挿を図ることを目的とする。本年度は、1TH2サイトカインであるIL-4存在下で、NHEK細胞で濃度依存性、時間依存性にバリアー蛋白質であるフィラグリン(FLG)遺伝子の発現を誘導する新規化合物X (知財のため構造を秘す)を見出した。2化合物Xの遺伝子発現プロフィールをmicroarrayで解析し、これが角化細胞分化、keratinizationに関係する遺伝子を系統的に発現誘導していることを見出した。3更に、RNAiとantagonistsを用い、この作用がAryl Hydrocarbon receptor(AHR)を経由していることを見出した。4ついで、この化合物の誘導体を20種類有機合成しその構造活性相関を解析し、化合物Xより数十倍活性の強い2種の化合物を得た。5これらの化合物のFLG発現とAHRの典型的な発現誘導遺伝子であるCyp1A1の発現誘導を比較し、FLG発現とCyp1A1発現誘導がdissociateすることを見出した。本研究は、ヒト角化細胞を用いて、そのバリアー機能を亢進する化合物を見出し、その作用を解析することで、バリアー機能制御メカニズムを解明することを目的としているが、本年度見出され化合物Xは阻害薬やRNAi実験から、核内受容体Aryl Hydrocarbon Receptor (AHR)に働いてFLG誘導・角化細胞分化を促進することが示唆されている。しかし、この化合物は、一方で、古典的なAHRアゴニストとは異なった遺伝子発現パタンを示し、AHRを含む独自の転写複合体に働いていると考えられる。AHRは、バリアーに関係すると言われている一方で皮膚での炎症惹起にも関係すると報告されており、この2つの機能の関係が不明である。化合物Xの作用機構を明らかにすることで、本研究の当初目的である角化細胞でのバリアー機能制御と炎症惹起のスイッチングメカニズムに迫ることが出来る。本年度は、上記仮説を基に以下の実験を行い、化合物Xの作用機構を明らかにし個体での活性を検証する。1. Xの誘導体合成による標的同定プローブの作成と構造活性相関解明;これまでのXの誘導体化により、FLG誘導活性は100倍以上増加したが、親和性はμM以上に留まっている。誘導体化を進めて構造活性相関を明らかにし、高親和性誘導体を得て標的の同定を行う。2.化合物Xの作用機構解明a.化合物Xの作用time windowの同定;XによるFLG誘導は、添加後7296時間後に最大となる。このことは、XによるAHR活性化がいくつかの段階を経てFLG誘導に至って居る可能性を示唆する。そこで、AHR antagonists, AHR RNAiを組み合わせ、XがAHRに働くtime windowを同定する。b. AHR co-factorsの同定;上記time windowでの転写因子・co-factorsの発現を同定、これらを網羅的にRNAiして、AHRと協力してXの作用を介達している転写因子の同定を図る。c. Xによる角化細胞分化機構の解明;上述の結果から、X(+)で培養下のNHEK細胞には、様々な分化段階の集団が混在して時間とともに最終分化へ収束しっていっているものと想定される。そこで、X(+)培養下のNHEK細胞を対象にsingle cell RNAseqを実施、得られたclustersをpseudotime analysisに供することにより、Xによる角化細胞分化過程を推定する。推定された各段階のclusterの遺伝子発現より、各分化過程で重要な転写因子を抽出し、その役割をRNAiで検証する。3. Xの生理作用の検討;高活性のX誘導体を用い個体の皮膚バリアーへの作用を検証する。また、AHRの働きが想定されている免疫系などでの作用を検討する。我々の皮膚は、外来物質の侵入や内部水分の蒸散を防止するバリアー機能を有し、その破綻はアトピー性皮膚炎等の疾患を惹起する。皮膚のバリアー機能は、皮膚の構成細胞である角化細胞が産生するケラチンやフィラグリン(FLG)などのバリアー蛋白質や脂質等によって担われている。これまで、各々のバリアー物質の生成経路や機能は調べられて来たが、これらが全体としてどう調節されているかは不明である。本研究では、培養ヒト表皮角化細胞(NHEK)に発現する受容体を系統的に同定、バリアー蛋白質, FLG,発現を指標としてこれらに働く薬物や新規化合物を探索し、その作用をゲノムワイドに解析し、NHEK細胞でのバリアー機能制御機構を解明、これをマウス個体で実証、ヒトへの外挿を図ることを目的とする。研究第1年度である平成29年度は、NHEK細胞で発現されているG蛋白質連関受容体(GPCR)を系統的に同定し、その中から発現が高く細胞内情報伝達を異にする受容体3種を選択し、それぞれのアゴニストを用いて、アトピー状態を模したIL-

4添加下でのNHEK細胞でのFLG誘導活性を検討した。その結果、NHEKでリゾフォスファチジン酸(LPA)がその受容体LPAR1とLPAR5に働き、Gα12/13-Rho-ROCK-SRF経路を介してFLGのみならず、様々なバリアー蛋白質を誘導して角化細胞の分化に働くことを見いだした。この作用は、ヒト皮膚の3次元培養系でも見られ現在アトピー性皮膚炎治療薬として使用されているJAK阻害薬より遥かに強力であった。また、LPAを塗布することにより、正常マウス皮膚で角化細胞分化の促進とdry skinモデルでのバリアー機能亢進を認めた。以上の結果をまとめ、論文を投稿した。上述したように、本研究は、培養ヒト表皮角化細胞(NHEK)を用い、バリアー蛋白質であるフィラグリンの誘導物質を系統的に探索・同定し、それらの誘導メカニズムを解析して皮膚バリアーの生理的調節メカニズムを解明、アトピー性皮膚炎など皮膚バリアー破綻治療の分子基盤を形成することを目的としている。そのため、以下の順序で研究を推進する。1NHEK細胞の受容体発現プロフィールの同定と被験化合物の選定、2被験化合物のFLG誘導活性物質の検討、3前記検討で見いだされたFLG誘導物質のNHEKでのゲノムワイドな発現シグネチャーの同定, 4誘導物質の遺伝子発現に至るシグナル伝達経路の同定、5誘導物質/誘導系の角化細胞のcell autonomousな分化への関与の検討と内因性分化物質の探索と同定、6ヒト皮膚3次元培養系での検討、7上記誘導物質の生体マウス皮膚のバリアー機能、アトピー性病態モデルでの有効性の検討。出発点であるNHEKの受容体発現プロフィールの同定は、膜受容体であるGPCRと核内受容体の2つのカテゴリーの受容体を対象に系統的に探索することにしており、平成29年度は、GPCRについて探索、この結果、LPA-LPAR1/5経路が角化細胞分化を促進することを見いだし、この経路について上記1から4、6と7の一部の解析を終えた。平成30年度は、残った5この経路が内因性の角化細胞分化、バリアー誘導・保持機構として働いているかについて検討することにしており、これをもって、本研究の2本柱の一つ皮膚バリアー機能に関するGPCRの研究は目的を達成することができる。また、もう一つの核内受容体についても、9.に記するように、出発物質を既に見いだし、その解析を開始している。このことから、本研究は順調に進展していると判断した。我々の皮膚は、外来物質の体内透過や内部水分の蒸散を防止するバリアー機能を有し、その破綻はアトピー等の疾患を惹起する。この機能は、角化細胞が産生するケラチンや様々なバリアー蛋白質、脂質等によって担われている。一方、角化細胞は外的刺激により活性化され炎症惹起にも働く。これまで、各々のバリアー物質の生成や機能は調べられて来たが、これらが全体としてどう調節されているかは不明なままである。本研究では、ヒトの角化細胞であるNHEK細胞でのバリアー蛋白質発現を指標としてこれに働く化合物を同定、その作用をゲノムワイドに解析することにより角化細胞でのバリアー機能制御メカニズムを明らかにする。また、その個体での作用をマウスで実証、ヒトへの外挿を図ることを目的とする。
細胞膜を介するシグナル転換

本研究は、各種生体細胞の生理反応の活性化に際して、外来刺激がどの様に細胞膜に受容され細胞内信号伝達系に伝わるか、その経細胞膜的信号変換系の性質と、それによる細胞生理反応の解析を主眼とする。1.初年度(昭和64年度)は筋肉組織における信号伝達系の解析をおこなった。(1)平滑筋における収縮制御機構へのライオトニンの関与を調べた(陳、江橋節郎)。(2)筋細胞におけるカルシウム反応へのイノシト-ル代謝の関与を、それに対するLiの効果から明らかにした。LiはK脱分極による拘縮を抑制し、ミオイノシト-ルはこれを回復させることが分かった(朱)。(3)骨格筋細胞における信号伝達系を調べるため蛍光性Caイオン指示薬であるFura2ーAMの細胞内ロ-ドを試みた。ウシガエル骨格筋細胞を使用して、これまで難しかったFuraー2ーAMによる細胞内染色に成功し、カルシウム濃度による蛍光信号を経時的、画像的に捉えた。カフェインによる細胞内カルシウムの遊離のいき値が1ー2mMであること、細胞の疲労によってカルシウムの再吸収能が低下すること、カルシウムによる、カルシウムの放出が含まれることなどがわかった(朱、寺川、古家)。2.第2年度(平成2年度)は外分泌腺の研究と向チャネル薬の研究を行った。(1)大腸の杯細胞の分泌反応をエキソサイト-シス数を直接数えて、また、Furaー2によってCa反応を測定して調べた。オカダ酸を投与した標本でムスカリニック刺激をすると、通常見られる持続性の応答が消失した。オカダ酸処理した標本では、細胞内カルシウム濃度の上昇も短かかった。これらから、レセプタ-の燐酸化が細胞反応の脱感作のメカニズムを担っていることが示唆された。また、cAMPが修飾性のセカンドメセンジャ-であることがわかった(寺川、朱、古家、山岸)。(2)ツパイ(下等霊長類)の唾液腺の構造と生理反応を調べた。導管構造が腺房末梢まで続いていることが分かり、顕微鏡観察に非常に適していた。このため蛋白の分泌反応を超高倍率の微分干渉顕微鏡にて直接捉えるのに成功した。また、水の分泌も導管の満ち引き運動として世界で初めて捉えることができた。舌下腺の粘液物質の分泌刺激としては、ムスカリニックなアゴニストが有効でありβ刺激は無効であることが分かった。また、ATPも有効な刺激となった。(寺川、徐)。(3)漢方薬の一成分である川棟素(Toosendainine)の細胞膜上Caチャネルに対する効果を分化型NG108細胞にて調べ、川棟素がCaチャネルをかなり選択的に抑制することがわかった(施、古家)。(4)サソリから取れる神経毒の精製とその構造決定を試み、昆虫のNaチャンネルに特異的に作用する神経毒素の精製に成功した(吉、徐、寺川)。3.第3年度(平成3年度)は最終年度としてツパイ唾液腺の刺激分泌連関における信号伝達系の研究を進め、さらに網膜水平細胞のグルタメ-ト応答の修飾に関する研究を行った。(1)ツパイの舌下腺を微分干渉顕微鏡下に観察しエキソサイト-シス数を数えて分泌の定量を行った。舌下腺はムスカリニック刺激に反応しβ刺激には反応しなかった。プロテインキナ-ゼC活性化剤は効果を持たなかった。Kー脱分局刺激は直接作用を持たなかった。以上のことから、舌下腺腺房細胞の粘液分泌反応はAキナ-ゼ系、Cキナ-ゼ系のいずれとも違うメッセンジャ-系の活性化によることが明らかとなった(寺川、村上、徐)。(2)コイの網膜の水平細胞を単離し、カイニン酸応答を電気的に測定した。カイニン酸は50μMでほぼ矩形波状の内向き電流を発生させた。このようなカイニン酸応答は、ドパミンによって濃度依存性に大きく抑制または促進された。ハロペリド-ルはこのドパミンの修飾効果を消失させた。このようなアゴニスト間の抑制、修飾効果はcGMPメッセンジャ-系の変化によるものと考えられる(楊、楊、大塚、金子)。

(1)大腸の杯細胞の分泌反応をエキソサイト-シス数を直接数えて、また、Furaー2によってCa反応を測定して調べた。オカダ酸を投与した標本でムスカリニック刺激をすると、通常見られる持続性の応答が消失した。オカダ酸処理した標本では、細胞内カルシウム濃度の上昇も短かかった。これらから、レセプタ-の燐酸化が細胞反応の脱感作のメカニズムを担っていることが示唆された。また、cAMPが修飾性のセカンドメセンジャ-であることがわかった(寺川、朱、古家、山岸)。(2)ツパイ(下等霊長類)の唾液腺の構造と生理反応を調べた。導管構造が腺房末梢まで続いていることが分かり、顕微鏡観察に非常に適していた。このため蛋白の分泌反応を超高倍率の微分干渉顕微鏡にて直接捉えるのに成功した。また、水の分泌も導管の満ち引き運動として世界で初めて捉えることができた。舌下腺の粘液物質の分泌刺激としては、ムスカリニックなアゴニストが有効でありβ刺激は無効であることが分かった。また、ATPも有効な刺激となった。(寺川、徐)。(3)漢方薬の一成分である川棟素(Toosendainine)の細胞膜上Caチャネルに対する効果を分化型NG108細胞にて調べ、川棟素がCaチャネルをかなり選択的に抑制することがわかった(施、古家)。(4)サソリから取れる神経毒の精製とその構造決定を試み、昆虫のNaチャンネルに特異的に作用する神経毒素の精製に成功した(吉、徐、寺川)。3.第3年度(平成3年度)は最終年度としてツパイ唾液腺の刺激分泌連関における信号伝達系の研究を進め、さらに網膜水平細胞のグルタメ-ト応答の修飾に関する研究を行った。(1)ツパイの舌下腺を微分干渉顕微鏡下に観察しエキソサイト-シス数を数えて分泌の定量を行った。舌下腺はムスカリニック刺激に反応しβ刺激には反応しなかった。プロテインキナ-ゼC活性化剤は効果を持たなかった。Kー脱分局刺激は直接作用を持たなかった。以上のことから、舌下腺腺房細胞の粘液分泌反応はAキナ-ゼ系、Cキナ-ゼ系のいずれとも違うメッセンジャ-系の活性化によることが明らかとなった(寺川、村上、徐)。(2)コイの網膜の水平細胞を単離し、カイニン酸応答を電気的に測定した。カイニン酸は50μMでほぼ矩形波状の内向き電流を発生させた。このようなカイニン酸応答は、ドパミンによって濃度依存性に大きく抑制または促進された。ハロペリド-ルはこのドパミンの修飾効果を消失させた。このようなアゴニスト間の抑制、修飾効果はcGMPメッセンジャ-系の変化によるものと考えられる(楊、楊、大塚、金子)。本研究の目的は、細胞膜上のレセプタ-とチャンネルの活性化がどのように細胞内の信号に置き代わり、様々な細胞反応を引き起こすのかを解明するものである。このために研究材料として、大腸の杯細胞における分泌反応がウサギなどでは簡単に観察できるので同様の組織を中国産の下等霊長類に求めることを計画していたが、きわめて発達が悪く、分泌反応も観察できないことがわかった。そこで、代替となる組織を探査したところ、同じ動物の唾液腺は導管が腺房末端まで連続するというユニ-クな構造を持ち、かつ開口分泌の活動性が高く、長持ちするという、我々の目的に大変よい標本であることがわかった。そこで主としてこの組織のアゴニストを検定した。
磁気プローブ、及びナノアレイを用いた多サンプル同時検出型イムノアッセイ法の開発

生体分子間反応の検出を可能とする磁気バイオ計測技術の開発を目的として、その基礎検討となるナノ磁気微粒子と有機シラン単分子膜被覆基板を用いたビオチン-ストレプトアビジン反応の検出について検討を行った。疎水性単分子膜修飾シリコン基板に対しUVフォトリソグラフィーを用いて5-200μmサイズのドットパターンを作製した。表面にアミノ基を配する単分子膜をドット内に修飾した後、化学架橋反応によりビオチン分子の修飾を行った。一方、粒径200nmのマグネタイト(Fe_3O_4)から成る磁気微粒子表面をアミノ基により被覆した後、ビオチンを修飾し、さらにストレプトアビジンを反応させ、ストレプトアビジン固定化磁気微粒子を作製した。ストレプトアビジン固定化磁気微粒子をビオチン固定化基板上に滴下し、反応を行ったところ、ビオチン-ストレプトアビジン間の特異的反応に由来すると考えられる粒子の固定化が確認された。一方で、ネガティブコントロールとなるアミノ基修飾基板においては、粒子の固定化は確認されなかった。次に、より応用性の高い抗体の磁気微粒子表面への固定化方法について検討を行った。アミノ基、及びチオール基修飾磁気微粒子を調整し、化学架橋反応を利用した抗体の固定化について検討を行った。アミノ基、及びチオール基修飾の確認はFT-IRを用いて行い、それぞれに特異的なピークを観測した。アミノ基修飾磁気微粒子には架橋剤BS3を反応後、抗体を固定化した。チオール基修飾磁気微粒子に対しては架橋剤GMBSを反応後、抗体を固定化した。各種bufferを用いて洗浄後、表面に固定化された抗体量を測定した結果、チオール基修飾磁気粒子に対してGMBSを用いた反応系の方が、アミノ基修飾磁気微粒子に対しBS3を用いた反応と比較し、約2倍量の抗体を固定化することが可能であった。同様に基板上への抗体固定化法についても検討を進めている。
ドッキングと分子シミュレーションの連帯によるタンパク質複合体の高精度構造予測

本申請研究はタンパク質ー基質複合体の構造予測の精度向上を目的に,ドッキングシミュレーションと分子動力学(MD)シミュレーションを連帯させた新しい計算手法を提案し,これを用い,結合ポケット内における基質の最安定配向の探索手法の開発を行い,計算プログラムの開発とテスト計算を行なう.さらに結合自由エネルギー解析からタンパク質結合サイトの同定と結合構造の同定を行なう.本研究ではリガンドータンパク質モデルとしてEstrogen receptor (ER, PDB ID: 1WGR)を用いた。分子ドッキング計算はMD計算によって生成されたレセプターのアンサンブル構造に対して行う。本研究ではレセプターの分子誘導適合をモデルするために、ドッキングにより示された結合ポーズの構造最適化を行う。その後、最適化された結合構造に対しMM-GBSA法を用いてリガンドーレセプターの結合自由エネルギー(スコア値)を評価する。最後に、作成したリガンド分子配座に対して、結晶の基質座標をreferenceにした根平均自乗変位(RMSD)計算を行い、結果の正当性を評価する。本研究では1500個のレセプター構造に対して誘導適合分子ドッキング計算を行い、それらの結合ポーズに対するスコア値とRMSD計算を行った。ドッキングによって予測された全ての基質配座のスコア値(結合自由エネルギー)をRMSD値に対してプロットした結果、RMSDの値が小さくなるに従って結合エネルギーが低くなる結果が得られ、開発した手法の有効性が示された。最も結合エネルギーが低かった時のリガンド分子の結合構造のRMSD値は0.9オングストローム程度であり、結晶で解かれた基質配座とほぼ一致する結果を示した。27年度が最終年度であるため、記入しない。本申請研究はタンパク質ー基質複合体の構造予測の精度向上を目的に,ドッキングシミュレーションと分子動力学(MD)シミュレーションを連帯させた新しい計算手法を提案し,これを用い,結合ポケット内における基質の最安定配向の探索手法の開発を行い,計算プログラムの開発とテスト計算を行なう.さらに結合自由エネルギー解析からタンパク質結合サイトの同定と結合構造の同定を行なう.平成26年度ではMDシミュレーションを用いてapoタンパク質の結合ポケットの構造サンプリングを効率的に行った.得られたポケット構造に対してdrugable解析(ポケットの表面・体積・hydrophobicity解析)を実行し,リガンド分子に対する最適ポケット構造のスクリーニングを行った.これらMD計算によって得られたアンサンブル構造に対してドッキングシミュレーションを行ったところ,実験で得られるholoタンパク質構造と良い精度で一致するリガンド複合体構造が示され,開発した手法の有効性が示された.研究結果は幾つかの国内外の学会・シンポジウムにて発表し,研究論文として国際雑誌に投稿中である.今後は開発した研究手法を実際の標的タンパク質に対する薬剤スクリーニングに適用し,最適薬剤の候補選定の研究を行なう.オリジナルのドッキングプログラムの開発も行った.現状では,他の計算プログラム(DOCK6.6)と同程度の計算精度を持つプログラムとなっている.本申請研究はタンパク質ー基質複合体の構造予測の精度向上を目的に,ドッキングシミュレーションと分子動力学(MD)シミュレーションを連帯させた新しい計算手法を提案し,これを用い,結合ポケット内における基質の最安定配向の探索手法の開発を行い,計算プログラムの開発とテスト計算を行なう.さらに結合自由エネルギー解析からタンパク質結合サイトの同定と結合構造の同定を行なう.本研究ではリガンドータンパク質モデルとしてEstrogen receptor (ER, PDB ID: 1WGR)を用いた。ベースとなる計算手法は作成し,テスト計算から手法の有効性が示されたが,手法の汎用性の検証が不十分でありこれを行なう必要がある.またより高精度の結合構造予測のためにはリガンドーレセプターの結合自由エネルギー計算の導入が必須である.27年度が最終年度であるため、記入しない。開発した手法の汎用性の検証のために,様々な標的タンパク質を対象にした計算を実行する.手法の精度を構造させるために計算パラメータの最適化を行なう.開発した研究手法を実際の標的タンパク質に対する薬剤スクリーニングに適用し,最適薬剤の候補選定の研究を行なう.自由エネルギー計算の導入によりより高精度のリガンドーレセプターの結合構造予測を行なう.27年度が最終年度であるため、記入しない。
細胞の可塑性とロバストネスの状態論

理論と実験が密に連携することにより、生命システムの定量的法則を抽出して、マクロ状態論を構築する研究を進めた。理論、実験ともに進化や適応をとおしての細胞状態が少数変数で記述する結果が得られた。より具体的な成果は以下のとおりである。(1)複製、適応、進化の普遍的状態論:進化シミュレーションの結果、少数の遅いモードが分離することを見出し低次元拘束の理論を検証した。また、統計力学を用いた理論の普遍性も確認した。さらに、複製細胞の必ず満たすべき性質として情報を担う分子と触媒を担う分子への分化が対称性の自発的破れにより生じることを示し、分子生物学の基本のセントラルードグマを導出した。さらに自発的適応の理論、多種共生系の理論も進めた。(2)進化の低次元拘束:これまでに進化実験で得られた様々なストレス耐性大腸菌について、取得した表現型ー遺伝子型データを解析したところ、発現プロファイルと耐性能プロファイルの関係が、比較的少数の特徴量によって関連付けられることが見出された。また、それら特徴量がストレス応答や増殖活性などの細胞機能と対応することが見出された。(3)大腸菌の適応と増殖:抗生物質アンピシリンに対する大腸菌の応答を解析した。アンピシリン投与に対して生き残る細胞は10の-4乗程度と低頻度なため、これまで生存細胞の検出が困難であった。この問題に対し、微細流体デバイスの設計等を工夫し、3分間隔のタイムラプス計測で、一度に10の5乗以上の細胞の薬剤応答を直接可視化できる計測系を立ち上げた。その結果従来仮説を覆し、成長とバルジ形成を繰り返す細胞が生き残ることを明らかにした。また細胞内のリボソームの大サブユニット、小サブユニットの量を同時にモニターできる大腸菌株を構築した。生物の普遍的性質の由来、そしてその性質を特徴づける研究を理論、実験で着実に進めた。(1)適応と進化の状態論および複製細胞の普遍的性質:進化により表現型変化が低次元の状態空間に拘束される結果をまとめて出版、またこれらをまとめた総説をAnnualReview of Biophys.,物理学会誌などに発表した。これにより細胞のマクロ状態論を広く発信した。また、スピン系の統計力学モデルで外場および相互作用行列への変異に対して低次元のスピン応答が有限温度で生じることは理論の普遍性の確認、今後の統計物理理論の構築上で重要な一歩である。一方で、原始的な複製細胞でも必ず満たすべき性質として(i)指数関数増殖の起源(ii)成分のやりとり(水平的遺伝子伝播)による複製の安定化を見出しており、これは生命の起源を考える上でも基本的な知見である。また鋳型情報と触媒への分化は、分子生物学の基本のセントラルドグマが物理の基本概念である対称性の自発的破れとして一般に導出されるという点で重要な成果と考えられる。(2)進化の低次元拘束:進化実験では広範なストレスに対してその耐性大腸菌での表現型-遺伝子型データが多量に得られており、そのデータ解析も着実に進んでいる。その中から大腸菌の進化ダイナミクスにおいて、取り得る表現型が比較的少数の特徴量によって記述され得ることが示されており、この結果は適応進化のマクロ状態論の構築に向けた基盤となる。(3)大腸菌の適応と増殖:成長とバルジ形成を繰り返す細胞の生存は従来仮説を覆した重要な成果である。さらにリボソームの大サブユニット、小サブユニットの量を同時にモニターできる大腸菌株の構築は今後、活性や成長と関連する細胞状態の計測につながるステップである。課題1大腸菌1細胞計測系を用いた表現型揺らぎに基づく環境適応ダイナミクスの解析:引き続き、大腸菌が抗生物質に対して表現型レベルの耐性を獲得し適応する現象の一般性および背景機構の理解を目指す。これまでに、特定のタンパク質の発現の有無が適応度を決めるローカルな適応応答がまず起こり、その後にグローバルな適応応答へと、時間スケールをまたいだ可塑的変化が生じることが見えてきている。この適応応答の一般性を、これまで構築してきた1細胞計測技術、ラマン分光技術を駆使して検証するとともに、理論モデルから背景原理の理解を目指す。課題2様々な環境下での大腸菌の進化実験を用いた表現型・遺伝子型の網羅的定量:昨年度までに、ストレス耐性株の表現型ー遺伝子型の解析そして進化実験で同定された変異株の表現型の解析を完了している。今年度は、それらのデータに基づいて、大腸菌がとり得る表現型がどのような分布を持ち、その変化がどのように少数のマクロ状態量によって記述され得るかを解析する。それらの結果に基づいて、環境摂動や遺伝子摂動に対して進化ダイナミクスがどのような影響を受けるかを予測する手法を構築し、大腸菌進化実験を用いて検証する。課題3細胞シミュレーションと理論解析を用いた細胞状態理論の構築:遺伝子制御ネットワークおよび統計力学のスピングラスモデルの進化シミュレーションにより、大自由度状態空間からの少数モード形成を確認して一般性を議論し、マクロポテンシャルでの理論記述を行う。これらと課題1,2の実験結果、またタンパクの実験データと結びつける。第2に細胞複製系の持つ成分の多様化、また細胞間相互作用による安定化、揺らぎと階層間整合性による細胞適応の理論を進める。課題4各成果および統合した細胞の状態論の公表を目指す。一環として、普遍生物学の成書の出版を今年度はまず日本語で行い、その英文化も進める。生命システムを考える上で、可塑性と頑健性は欠かせない概念である。細胞は環境変動に対して、その内部状態を変化させて適応する。

その状態は様々なノイズやゲノム変異に対しても、ある程度の頑健性を持つ。本研究では、理論と実験が密に連携することにより、この可塑性と頑強性(ロバストネス)の定量的法則を抽出する。実験側では、環境変化への適応・進化の過程において、細胞の内部状態(遺伝子発現量・ゲノム配列など)の動態と揺らぎを定量し、そこから細胞の可塑性とロバストネスを表現するマクロ量を抽出する。一方で、力学系・確率過程の理論を基盤とした細胞の適応と進化のシミュレーションを行い、増殖する細胞システムにおける普遍的性質を抽出する。その結果、適応・進化といった異なる時間スケールでの細胞状態変化において、遺伝子発現の変化、ゆらぎがみたす一般法則を理論化し、それにより可塑性とロバストネスを記述する、系の詳細に依らないマクロ状態論を構築する。平成27年度の主要な結果は以下のとおりである。(1)ラボオートメーションを用いた、多環境・多系列の大腸菌進化実験を可能とする系を構築した。酸・アルカリ・抗生物質など、100種類以上のストレス因子を選択し、それらを用いた進化実験が進行中である。(2)大腸菌の1細胞計測系を用いて、表現型の揺らぎが集団としての増殖速度にどのような影響を与えるかを定式化することに成功した。(3)抗生物質投与下での大腸菌の長期1細胞計測をおこない、表現型レベルで薬剤に順応する細胞系列が生じることを明らかにした。(4)細胞シミュレーションを用い、高次元のダイナミクスを持つ表現型が、進化過程を経ることにより低次元の状態空間に拘束されることを見出し、実験データとの対応を解析した。また、少数自由度で進化をあらわす現象論、細胞成長ー休眠ー死の状態変化をとらえるモデルの構築を進めた。多環境での進化実験、1細胞計測系での揺らぎ計測、細胞シミュレーションとそれぞれ成果が得られており、今後の展開のための大きな基盤ができたと考えている。これは1年目としては計画を上回るものであり、すでに実験結果を含む論文も複数、出版されている。また理論では、進化が少数自由度で記述されるとした場合の現象論、構築に成功し、今後の基盤を与えた。さらに、細胞における熱力学的効率の関係を求めるために、酵素量の振動による効率上昇を示した。さらに細胞の成長、休眠、死の状態転移をおこすモデルを構築し、その仕組みをあきらかにしつつある。これは相転移を含む細胞の状態論への第一歩である。また、細胞レベルだけでなく、分子ー細胞ー多細胞生物の階層にまたがるモデルを調べ、階層進化系のもつ普遍的性質の理論研究を進めた。具体的には(i)要素の進化と集団の進化に相反的性質がある場合の振動進化現象の発見とその解明(ii)細胞分化、役割分業による集団成長の発見とそのメカニズムの解明、そしてそれに基づく多細胞生物システムの普遍的性質への示唆(iii)シミュレーションによる進化と発生の対応関係の発見とその機構の解明、である。これらは、計画以上の結果である。課題1大腸菌1細胞計測系を用いた表現型揺らぎに基づく環境適応ダイナミクスの解析
インフラ点検のための熟練診断技能の抽出によるマルチモーダル自動診断システムの構築

社会インフラの老朽化は深刻な課題であり,従来の点検現場では,主に熟練検査員による打音検査が行われてきた.現在,熟練点検員による打音検査を代替する信頼性の高い自動診断技術が緊急に求められている.本研究では,高い効率性と診断の精度,および検査対象や環境の違いに対する頑健性を実現するために,マルチモーダル信号を用いた自動診断システムの構築を目的とする.以下の2つのアプローチで取り組み,それぞれシステム構築および実験による検証を行った.1熟練点検員の点検・診断技能を用いた検査対象や環境の違いに対する頑健性の向上.2視覚センサと聴覚センサのマルチモーダル情報を用いたコンクリートひび割れ侵入方向の検出.本研究では,老朽化が深刻な問題となっている社会インフラに対して高精度な自動点検を実現するために,多種センサを用いたマルチモーダルな自動検査システムの構築を目的とする.本研究では,熟練点検員の作業データから正しく診断を行うための特徴量を抽出するために,距離画像センサ,音響センサ,加速度センサなどの異種センサの出力それぞれについて健状・変状のモデルを生成する.その上で,各センサから得られる特徴量を統合することで高精度な診断を自動化するアプローチで検討を進めている.特に今年度は,実際の現場において重要視されている斜めひび割れの侵入方向の推定アルゴリズムの構築に注力した.距離画像センサと音響センサを組み合わせて用いることで,従来は困難であったコンクリート表層に対し斜め方向に侵入したひび割れの侵入方向を推定するアルゴリズムを構築し,新規に製作したコンクリート供試体を用いて手法の有効性を検証した.その成果は,国内学会において2件の口頭発表を行い,および国際学会1件に採択済みである.その他,インフラ点検を行う現場ごとに異なる環境音に対するキャリブレーションについて,時間周波数領域における自動校正法を提案し,コンクリート供試体および実寸大の模擬的なトンネルで実験を行い,その有効性を検証した.また,次年度に予定している打叩時における手応えの違いを利用した診断のための準備を行い,特に反力センサの選定を行った.2016年度は,多種センサからの特徴量抽出アルゴリズムの構築を行った.特に,以下の項目2.および3.について実験のための供試体およびロボットの試作を行っている間,項目1.の研究について注力し,順調な成果を上げた.1.斜めひび割れ侵入方向の推定:画像センサによるひび割れ検出と,音響センサによる打音診断法を組み合わせ,ひび割れの侵入方向を推定する手法を構築した.具体的には,レーザ光と画像センサを用いた光切断法により構造物表面の三次元形状を測定し,得られた三次元的なエッジ情報から構造物表層におけるひび割れの分布を推定する.さらに,あらかじめ機械学習により生成した打音による自動変状検出器を用いて,ひび割れ近傍を診断することで,構造物の内部に存在するひび割れによる浮き部の分布を推定する.診断の際には,表層と内部の双方のひび割れの分布情報を組み合わせることでひび割れの侵入方向の推定が可能である.新規に設計・製作したコンクリート供試体を用いた実験により,提案手法の有効性を確認した.本成果は,国内学会で口頭発表し,国際会議に採択が決定(2017年6月発表予定)した.2.雑音分離:音響診断を阻害する環境雑音,ロボット本体や自動打叩装置の駆動振動などによる影響を分離する手法を検討した.実施者らの独自の手法を時間・周波数方向に拡張することで,コンクリート診断に適した自動校正法を構築した.本研究成果は次年度に実験による検証を実施し,学会等で発表予定である.3.打叩時の手応えの特徴量化:本研究では,ハンマを振り下げる手元に返る反力の時系列変化の違いを利用して,音響診断だけでは変状の検出が困難な場合にも有効な特徴量の獲得を目的としている.2016年度は,方式検討に用いるコンクリート供試体を製作し,本研究に利用するセンサ類の選定を行った.以上,本課題はおおむね順調に進展している.本研究では,老朽化が深刻な問題となっている社会インフラに対して高精度な自動点検を実現するために,多種センサを用いたマルチモーダルな自動検査システムの構築を目的とする.最終年度である本年度は,教師あり学習に基づく診断アルゴリズムの高精度化に取り組むとともに,複数の異なる現場に検査システムを適用させる上で課題となる現場ごとに行うシステムの調整(キャリブレーション)について,キャリブレーションが不要な教師なしの診断法を構築した.教師ありのアプローチでは,熟練点検員の作業データから正しく診断を行うための特徴量を抽出するために,距離画像センサを用いてひび割れの位置を検出し,音響センサの出力を用いて識別した変状のひび割れに対する分布から,従来の打音検査では困難であったひび割れの侵入方向を推定する手法を構築し,高精度化をする検討を行った.教師なしのアプローチでは,打音のメル周波数ケプストラム成分を用いたクラスタリングを行うことで,変状と健状を高精度に分類し,それらの分布に関する事前知識を用いた識別を行うことで,教師信号を用いずに変状位置を推定する手法を構築した.それぞれ,新規に製作したコンクリート供試体および実寸大のトンネルを用いた検証を行い,その有効性を示した.それらの成果は,国内学会において1件の口頭発表,IEEEを含む国際学会に2件採択され,欧文誌Robotics and AutomationLettersの投稿論文1篇が採択された.さらに,本研究成果に関連する日本機械学会誌の論文について,日本機械学会賞(論文)を受賞し,船井学術奨励賞に内定(2018年4月21日受賞予定)するなど,学術的にも高い評価を受けた.社会インフラの老朽化は深刻な課題であり,従来の点検現場では,主に熟練検査員による打音検査が行われてきた.

現在,熟練点検員による打音検査を代替する信頼性の高い自動診断技術が緊急に求められている.本研究では,高い効率性と診断の精度,および検査対象や環境の違いに対する頑健性を実現するために,マルチモーダル信号を用いた自動診断システムの構築を目的とする.以下の2つのアプローチで取り組み,それぞれシステム構築および実験による検証を行った.1熟練点検員の点検・診断技能を用いた検査対象や環境の違いに対する頑健性の向上.2視覚センサと聴覚センサのマルチモーダル情報を用いたコンクリートひび割れ侵入方向の検出.2017年度は,2016年度から引き続き「多種センサによる特徴量抽出法」の構築を行うとともに,抽出した特徴量を用いた「構造物の自動診断アルゴリズム」の構築に取り組む.また,その診断手法のシステム実装を行う.具体的には以下の通りである.1.距離画像センサを用いたひび割れ特徴量,および注視点検出に基づく要点検箇所の提示:2017年度は,ひび割れの検出結果と打音診断結果を統合し,ひび割れの侵入方向を推定することで,より詳細な検査が必要な箇所の候補を提示する手法を構築する.特に,構造物内部におけるひび割れの分布を2次元画像上でマッピングし,閉合状態になる可能性がある部分を要点検箇所として幾何的に検出する.2.複数マイクロフォンを用いた環境雑音分離:2017年度は,実現場への適用を見据え,ロボットに搭載した際の振動や自己雑音などに頑健な手法の構築を行う.具体的には,点検時の打診動作による振動やロボットのモータ音などの自己雑音や,トンネル側面の湾曲形状に起因する叩き損じや二度叩きなどによる不良打音への対策をソフト面およびハード面の双方から講じる.ソフト面では,周波数フィルタの設計やマイクロフォンアレイを用いた独立成分分析などを検討する.また,ハード面では,ロボットを用いた検討を行い,特に昨年度に共同研究先により製作された自動打音診断装置を搭載するための自走式ガイドフレームのプロトタイプを用いる.3.加速度センサを用いた打叩時の手応えの特徴量化:2017年度は,昨年度選定した力・加速度センサを用いてハンマを振り下げる手元に返る反力の時系列変化の違いを利用して,環境雑音の程度が大きく音響診断だけでは変状の検出が困難な場合にも有効な特徴量を求める.昨年度から継続して,センサ出力の時系列に対し確率過程を用いたモデル化を行い,異常箇所に対する打音の検出を行う.29年度が最終年度であるため、記入しない。音響など多種センサ信号と機械学習を用いた社会インフラの自動診断,およびコンピュータビジョン29年度が最終年度であるため、記入しない。
破骨細胞のカルシニューリンシグナルをターゲットとした骨吸収性疾患の治療

骨吸収性疾患の治療において破骨細胞分化を調節する小分子化合物は非常に有望な創薬候補として期待される。破骨細胞分化を調節するあらたな小分子化合物を見出すためcell-basedのスクリーニングシステムを開発し、harmineという非常に興味深い小分子化合物を発見した。harmineは破骨細胞分化に対し正負に働くシグナル(カルシニューリン-NFATおよびid2)を同時に活性化させるという興味深い性質をもつことが明らかになった。カルシニューリンをターゲットとして破骨細胞にアポトーシスを起こすためには破骨細胞におけるカルシニューリン-NFATシグナルのより詳細な解明が必要である。そのため、破骨細胞におけるカルシニューリン-NFATシグナルを簡便に測定する目的でNFATのルシフェラーゼベクターを安定発現するRAW264細胞株を樹立した。この系を用いればアポトーシスに向かうシグナルを活性化する様々な薬物を見つけ出すことが容易になる。これまでの破骨細胞からRNAを抽出しRT-PCRにより遺伝子変化を見る方法に比べて格段に迅速なアッセイ方法である。われわれはこの方法でオーファンリガンドライブラリーより、いくつかの薬物を見出した。また、カルシニューリンを創薬のターゲットとして考えた場合、その多彩な生理作用を考えると、カルシニューリン自体を抑制することは強い副作用をもたらすと考えられる。われわれは破骨細胞特異的に働く分子を同定し、その分子を創薬のターゲットとすることで、副作用なく骨吸収をコントロールできる可能性があると考えている。このため、ツーハイブリッドを行い、候補遺伝子としてPICKIを同定した。本研究において、Calcineurin BとPICK1が結合することを見出した。さらに、破骨細胞分化とともにPICK1の発現が増加していることからPICK1とCalcineurinの複合体も増加すると推測される。この複合体はPICK1により作用部位へ輸送、局在化され、基質であるNFATc1を選択的に脱リン酸化し、最終的に破骨細胞分化を促進する働きを有すると推測される。本研究により、破骨細胞分化過程におけるCalcineurinの役割と、Calcineurinと結合するタンパク質としてPICK1が破骨細胞に発現することが明らかとなった。今後は、破骨細胞分化機構におけるPICK1分子の機能的役割を解明することにより、PICK1分子あるいはこれに関与する分子をターゲットとした破骨細胞形成を選択的に阻害する薬剤の開発にっなげたいと考えている.破骨細胞分化を制御するマスター遺伝子NFATの発見によりNFATおよびその上流の脱リン酸化酵素であるカルシニューリンが創薬のターゲットとして注目されている。われわれは、カルシニューリンシグナルをターゲットとした骨吸収性疾患の治療を目指し、これまでにカルシニューリンの新規結合タンパク質PICK1の同定などを行ってきたが、本年度は特にカルシニューリンシグナルに影響を与える小分子化合物の探索に焦点を当てて研究を進めてきた。この研究は直接創薬に結びつくのみならず、カルシニューリンシグナルに影響を与える新しい小分子化合物の発見は、分子プローブとして、カルシニューリンシグナルのさらなる解析につながる可能性のあるものである。そのため、カルシニューリンの下流の分子である転写因子NFATを簡便に測定する破骨前駆細胞株を作製し、この細胞株を川いた小分子化合物のスクリーニングを行うことを構想した。具体的には、RANKLに応答してカルシニューリン-NFATシグナルが活性化する破骨前駆細胞RAW264細胞を用いてこの細胞でNFATのルシフェラーゼベクターを恒常的に発現する細胞株を樹立した。スクリーニングの結果、オーファンリガンドライブラリーの中から小分子化合物harmineを見出した。harmineは破骨前駆細胞株RAW264細胞においてその分化誘導を著明に抑制したことから、この分子が骨吸収性疾患の治療に応用し得る可能性が示唆された。またharmineはリン酸化酵素であるDyrklaの特異的阻害剤として近年注目されており、Dyrklaが破骨細胞分化に及ぼず影響について研究を進めている。前年度からの継続で、カルシニューリン-NFATを簡便に測定するルシフェラーゼベクターを導入した破骨細胞前駆細胞RAW264株を用いた小分子化合物のスクリーニングをさらに進めた結果、あらたな創薬候補小分子化合物を多数発見した。またカルシニューリン-NFATを活性化させる化合物がかならずしも破骨細胞の分化を促進しないことを見出した。したがってスクリーニングにおいて新たな評価系を導入することが有用であることが考えられたことから、破骨細胞の分化において重要であることが報告されているNF-kB活性を簡便に測定できるルシフェラーゼベクターを導入した破骨細胞前駆細胞RAW264株を新たに樹立した。一方、これまでのスクリーニングで見出した小分子化合物のうち、harmineについてさらなる解析をすすめた。すなわち、harmineはカルシニューリン-NFAT活性を著明に活性化させるのみならず、id2の発現を上昇させることを見出した。Id2はこれまでに破骨細胞前駆細胞の分化に対し抑制的に働くことが報告されていることから、id2ノックアウトマウスを用いて破骨細胞分化に対するharmineの影響を検討したところ、予想通り破骨細胞分化が促進された。

したがってharmineは破骨細胞分化に対し正負に働くシグナル(カルシニューリン-NFATおよびid2)を同時に活性化させるという興味深い性質をもつことが明らかになった。
特定の温度域での膜変性を考慮した青果物の鮮度保持法に関する基礎研究

貯蔵中の膜機能の変化をとらえるために、H14年度は低温障害を呈する青果物の一つであるキュウリを用いて、貯蔵実験を行った。その結果、15°Cの対照区と比較して2°Cの低温区において、pHの顕著な増加、イオン漏出速度の上昇及びプロトン緩和時間T_1の増加が認められ、低温障害による膜の透過性の変化が明らかになった。一方、低温感受性果だけでなく、一般に高温条件に曝すことによる膜機能の変化と鮮度保持への効果を検討するために、H15年度はリンゴ果実を対象にヒートトリートメントの効果的な温度と処理時間について検討した。リンゴ果実が速やかに劣化する20°Cで貯蔵した結果、42°C-2時間処理を施したリンゴ果実の呼吸速度は、対照区の果実よりも低減され、プロトン緩和時間T_1も処理区において短い値が観測された。ここで観察されたT_1は、果実組織の水の平均のT_1を示すもので細胞内外の水を区別するものではない。このような平均のT_1は、低温障害果と同様に、通常の鮮度低下過程においても時間と共に長くなることが示されている。これに対して、本実験のようにT_1が短い値に維持されたことは、通常予測される膜の水透過性の増大が、ヒートトリートメントにより抑制されたものと推察される。一方、果肉の糖度、酸度、果実硬度などの品質評価項目には明確な違いが認められなかった。したがって、T_1は膜機能の変化を品質評価項目に先立って検知できる可能性が示され、最適な処理温度を更に詳細に検討するための指標になると考えられる。貯蔵中の膜機能の変化をとらえるために、低温障害を呈する青果物の一つであるキュウリを用いて、貯蔵実験を行った。栽培農家で朝どりしたキュウリ(cv.アンコール10)を用いた。常温輸送で収穫日の翌日に入手し、2°Cの低温区と15°Cの対照区にそれぞれ16果実を9日間貯蔵し、3日ごとに各区から4果実を採取して実験に供した。測定項目は、pH、イオン漏出速度および縦緩和時間T_1とした。ピッティングは低温区において貯蔵5日後に観察された。貯蔵9日後の目減りは、対照区で2.8%、低温区で2.2%であった。対照区においてpHの変化が僅少であったのに対し、低温区ではpHの顕著な増加が見られた。これは、低温貯蔵による酸の減少が原因と考えられる。平均のイオン漏出速度については、低温区で3日目に上昇が認められ、膜の透過性の変化が示唆されたが、対照区での変化の程度は抑制された。縦緩和時間T_1については、低温区では果肉部、胎座部とも3日目にT_1が急増したが、対照区では漸増の傾向はあるものの顕著な変化は認められなかった。T_1の変化はpHやイオン漏出速度の変化と対応しており、低温障害を特徴づける現象であると考えられる。以上のように、低温に置くことによりT_1が増加することが確認された。これは膜機能の低下に伴う水の漏出に起因すると考えられ、膜機能の低下や回復を早期に検知し、品質保持法を検討する上で有用な情報であることが示された。