hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
弱い力による「誘発」に着目した動作教示手法の提案と一般手法に対する多次元的比較

前年度,人の運動学習の枠組みを「応答:装置×FB」の形式により, 1示唆(Indicate):V/T×No,2誘発(Induce):FH/ RH×On,3共動(Cooperation):FH/ RH×Off,4強制のように整理した.今年度は,それらに関し,動作学習・再現実験の結果,以下の特性を明らかにした.1示唆:アクティブホィールマウスを用いた触覚を介しての線画提示戦略として,After-Recognition Go StrategyとWhile-Perceiving Go Strategyを提案し,前者が優れていることを示した.視覚による動作教示に関して,手動作応答特性を調べたところ,片手動作では前方/側方/後方視野の間でさほど違いはなかったのに対し,注視できない両手動作においては後方視野が著しく優れていることを見出した.4強制:動作途中,速度が躍度最小軌道または等加速度で変化するときの速度知覚の丁度可知差異(JND)を調査した.指触覚への滑りの提示による示唆については,線画提示戦略について査読論文が掲載された.ハプティクスと視覚に関しては,モータのバネ剛性を変えた時の筋活動や軌道などの応答特性について査読論文が掲載された.その他,国際会議論文が7報,国内会議論文が1報掲載された.1.外骨格型3リンク肘・肩関節屈曲アクチュエータを用いた実験:肘・肩関節の屈曲を複合した手先の動作,特に肢の運動における速度に注目して動作の教示について検討を進める.すなわち,1受動的な運動学習:「受動的な運動の知覚→教示された動作の認知→教示された動作の再現」,2能動的な運動の遂行:「既学習の動作の想起(動作軌跡のメンタルイメージ生成)→想起した動作の計画(動作に伴う筋活動のメンタルイメージ生成)→計画された動作の表現」において,再現あるいは表現された運動の性能(正確さと精密さ)を比較する.さらにはこれらの性能を,3速度変化の知覚に関する精密さ,すなわちJust Noticeable Difference (JND)と比較することで,運動学習に関わる知覚精度(求心性)と動作精度(遠心性)に関する知見を得る.2.指触覚インタフェース,Finger-Tactile Interface (FTI): FTIにより滑りを提示し,提示された滑りを指触覚で知覚し,これを手先の運動として再現することいついて,FTIの最適な使い方を開発する.昨年度は,右利者を前提として,左手で知覚し,右手でストローク表現することが最適であることを見出した.今年度はこれをさらに進め,滑り知覚とストローク表現の実行順序の最適化について検討する.3.書道独学練習システム:これまで手首の左右側面に圧覚を提示することで,左右方向への運筆を教示する方式を開発してきた.さらなる性能の向上を目指して,システムを改善する.4.視覚による動作教示:引き続き,動作認識・再現特性にかかる最適化の対象である制御因子(1)対象観測方向因子:前方/前方/鏡像/側方/後方視野について,(2)対象注視視野因子:中心視/周辺視,および(3)対象個数因子:片手/両手動作の観点で比較検討する.装置として外骨格型2リンク肘関節屈曲アクチュエータ,およびアクティブホィールマウス(指先滑り覚を介した滑り速度提示デバイス)を用い,肘関節屈曲動作を対象として,4つの動作教示手法に関する基本的な知覚特性,および応答特性を調査した.1示唆(Indicate):視覚による示唆,アクティブホィールマウスによる触覚による運動の示唆については,ホィールの形状として凸点付ドラムを選定した.2誘発(Induce) :受動的運動条件の下で,知覚の手がかりとなる刺激種類(すなわち,運動覚,圧覚および力覚)の変容に注意して,外力による速度変化の知覚に関する閾値などを調査した.3共動(Cooperation):等速で移動する参照点からの偏差に比例する外力を受けて,随意運動を行う条件に注目して,共動が実現できることを確認した.4強制(Enforce):同じく,等速で移動する参照点からの偏差に比例する外力を発揮して,受動的運動を行わせる強制動作を実装し,確認した.前年度に引き続き,肘関節屈曲動作,および運筆動作を対象として,4つの動作教示手法に関する基本的な知覚特性,および教示特性を調査した.すなわち,装置は,外骨格型2リンク肘関節屈曲アクチュエータ,およびアクティブホィールマウス(指先滑り覚を介した滑り速度提示デバイス)を用いた.また,知覚の手がかりとなる刺激種類(すなわち,運動覚,圧覚および力覚)の変容に注意した.1示唆(Indicate):アクティブホィールマウスによる触覚による運動の示唆については7画までの多画線画が概ね知覚できることを確認した.また,HMDを用いた視覚によるポーズの教示については,視点設定法に関する3水準,すなわち「頭部連携/マウス連携/キー切替」,視野起点に関する2水準,すなわち「前方視野起点/後方視野起点」の知覚特性を検討するための予備実験を行った.2誘発(Induce),共動(Cooperation):これらにはバックドライバビリティーが求められることから,低減速比ギアボックスを利用する必要がある.その場合,コギングトルクの影響が大きくなる.そこで,モータの電機子と永久磁石との位置関係に基づいたコギングトルク抑制制御法を考案し,実装した.3強制(Enforce):受動的運動条件の下で,外力による速度変化の知覚に関する閾値などを調査した.その結果,時々刻々の速度変化ではなく,トータルとしての速度変化が重要であることを見出した.

触覚による示唆(Indicate)については,多画線画の知覚に成功した.視覚による示唆については,重要な因子を見出し,予備実験を行った.強制(Enforce)については,速度変化知覚の基本的な要因が明らかになってきた.さらに,誘発(Induce),共動(Cooperation)については,コギングトルクの問題に直面したが,その抑制制御法を実装することができた.人の運動学習の枠組みについて,これまでのI.刺激への応答に加え,新たな視点,II.目標運動の提示装置,およびIII.動作の誤差のフィードバックを加え,人の運動学習の枠組みを以下のように再編した.さらに,動作学習・再現実験を実施し,それらに関する基本的な特性を調査した.I.刺激への応答: 1示唆(Indicate):装置動力0%・筋活性あり・運動主体感あり.2誘発(Induce):装置動力あり・筋活性あり(時系列的変動,大.負値あり)・運動主体感小.3共動(Cooperation):装置動力あり・筋活性あり(時系列的変動,大.負値あり)・運動主体感あり.4強制(Enforce):装置動力100%・筋活性なし(ありも可)・運動主体感なしII.目標運動の提示装置: (FH)Flexiblehaptic:バックドライバビリティーのある低剛性な(比較的低出力の)サーボモータによる運動覚・力覚情報の提示.動作教示には,通常,利用されていない方式.(RH)Rigidhaptic:バックドライバビリティーのない高剛性な(十分に大出力な)サーボモータによる運動覚・力覚情報の提示.動作教示に,通常,利用されている方式.(V/T)Vision/Tactile:視覚/触覚情報の提示.III.動作の誤差のフィードバック:(No)No FB(運動主体感あり).(On) On-line FB(動作中の時々刻々で誤差を認識しすると同時に誤差を修正する.運動主体感なし).(Off)Off-line FB(動作全体を通して誤差を認識し,次の動作でFBされた誤差を修正する.運動主体感あり)なお,装置は,従来のアクティブホィールマウスの他,外骨格型3リンク肘・肩関節屈曲アクチュエータを新たに製作し,前年度の肘関節屈曲動作から肘・肩関節の屈曲を複合した手先の動作へと拡張した.指触覚への滑りの提示による示唆については,装置の最適化について査読論文が掲載された.書道独学練習システムについては,手首の左右への圧覚を提示することで,左右方向への運筆を教示する方式を開発し,予備的な実験を行い,可能性を見出した.ハプティクスと視覚に関しては,研究実績の概要に述べた通り,制御因子として,これまでの教示モード因子のほかに,装置因子,誤差フィードバック因子,筋活性因子,運動主体感因子を新たに見出し,基礎的な実験を行った.前年度,人の運動学習の枠組みを「応答:装置×FB」の形式により, 1示唆(Indicate):V/T×No,2誘発(Induce):FH/ RH×On,3共動(Cooperation):FH/ RH×Off,4強制のように整理した.今年度は,それらに関し,動作学習・再現実験の結果,以下の特性を明らかにした.
風疹予防接種方式の転換施策に対するコンピュータ予測計画に基づく医療経済学的研究

風疹予防接種が先天性風疹症候群発症によって発生する医療費の抑制に与える影響について検討した。評価された予防接種方式は、「中学2年女子に実施する現行法」、「未接種世代を免疫強化する米子保健所事業」、「平成元年より導入されているMMR接種」及び「それらの混合方式」である。評価は、予防接種実施により発症を防御した先天性風疹症候群(今回は心臓の先天異常に限定)にかかる総医療費を「効果」とし、それぞれの接種対象集団へのワクチン接種を「費用」とし、費用効果について検討した。その結果、中学2年女子に接種する現行法に比較して、その他の接種方式を組み合わせることによって総医療費は約60%から10%程度まで節減されると試算された。米子保健所において実施された免疫強化事業は、先天性風疹症候群発症予防における費用効果の観点から有効であることが示唆された。
雲物理モデルの改良と長大立坑に出現する人工雲の制御方法に関する研究

鉱山内の立坑を用い,雲及び降雨形成に関する微物理過程の解明を目的とした実スケール雲物理実験を行った.この実験は,立坑坑頂に設置した大型ファンにより空気塊を吸い上げ,坑内に上昇流を人工的に発生させ雲を生成させる.また,坑底で溶液噴霧を行うことにより,立坑内に流入するエアロゾル(大気浮遊粒子)の化学組成,溶質濃度,数濃度を制御することができる.この実験により得られた気象因子の高度変化,水蒸気から雲粒子へ相変化時の大気条件の変化等の基礎データ及び結果を,新しく開発している大気中のエアロゾルの効果を取り入れた降雨シミュレーションモデルの結果と比較を行った.以下に,研究期間内より得られた結果を示す.1,立坑内への流入大気の条件(エアロゾル数濃度,上昇風速)を制御した実験により,(1)エアロゾル数濃度の鉛直分布を計測し,雲底付近の急激な数濃度の増加及び立坑内を上昇するのに従い雲粒子へ成長していく様子を観測した.(2)坑内に溶液を噴霧することにより,坑頂において小粒径のエアロゾル数濃度が増加し大粒径の粒子の減少が見られた.(3)噴霧エアロゾル数濃度を高くするにつれて,生成される雲水量も増加するが,高濃度となると生成される雲水量は一定値となっていくことが観測された.(4)生成される雲水量は上昇風速が大きいほど多く,その関係は,ほぼ線形関係にあることがわかった.2,立坑内の気温の鉛直分布は,雲発生前後で異なることを観測した.さらに,雲発生時における雲底以上の高度において,立坑内の気温減率が,湿潤断熱減率よりも小さい値であった.この結果は,既存のモデルでは再現されなかったが,新しく開発しているエアロゾルの影響を取り入れた降雨シミュレーションモデルによって再現された.鉱山内の立坑を用い,雲及び降雨形成に関する微物理過程の解明を目的とした実スケール雲物理実験を行った.この実験は,立坑坑頂に設置した大型ファンにより空気塊を吸い上げ,坑内に上昇流を人工的に発生させ雲を生成させる.また,坑底で溶液噴霧を行うことにより,立坑内に流入するエアロゾル(大気浮遊粒子)の化学組成,溶質濃度,数濃度を制御することができる.この実験により得られた気象因子の高度変化,水蒸気から雲粒子へ相変化時の大気条件の変化等の基礎データ及び結果を,新しく開発している大気中のエアロゾルの効果を取り入れた降雨シミュレーションモデルの結果と比較を行った.以下に,研究期間内より得られた結果を示す.1,立坑内への流入大気の条件(エアロゾル数濃度,上昇風速)を制御した実験により,(1)エアロゾル数濃度の鉛直分布を計測し,雲底付近の急激な数濃度の増加及び立坑内を上昇するのに従い雲粒子へ成長していく様子を観測した.(2)坑内に溶液を噴霧することにより,坑頂において小粒径のエアロゾル数濃度が増加し大粒径の粒子の減少が見られた.(3)噴霧エアロゾル数濃度を高くするにつれて,生成される雲水量も増加するが,高濃度となると生成される雲水量は一定値となっていくことが観測された.(4)生成される雲水量は上昇風速が大きいほど多く,その関係は,ほぼ線形関係にあることがわかった.2,立坑内の気温の鉛直分布は,雲発生前後で異なることを観測した.さらに,雲発生時における雲底以上の高度において,立坑内の気温減率が,湿潤断熱減率よりも小さい値であった.この結果は,既存のモデルでは再現されなかったが,新しく開発しているエアロゾルの影響を取り入れた降雨シミュレーションモデルによって再現された.長大立坑(高さ425m)を利用した実スケール雲物理実験をおこなった。これは、人工的に上昇風速を発生させるとともに、大気中へ雲粒の核となるエアロゾルを噴霧し、より雲が生成しやすい条件を作ることで、立坑内に人工雲が発生させるものである。この実験により得られた基礎データ及び結果を、新しく開発をしている大気中のエアロゾルの効果を考慮した降雨シミュレーションモデルの結果と比較を行なった。以下に本年度の研究により得られた知見を示す。1,実験施設内への流入大気の気象条件を(上昇風速,エアロゾル数濃度)を制御したことにより、(1)上昇風速を大きくするに伴い、発生する雲粒の量が増加した。これは上昇風速の増加により、より多くのエアロゾルが凝結高度に達していると考えられ、雲生成過程に上昇風速の大きさも影響を与えている。(2)散布するエアロゾル数濃度を増加させると、発生する雲粒の量が増加した。このとき、散布したエアロゾルは各粒径とも定量的に増加させたにも関わらず、立坑上端で観測された粒径分布は粒径の大きい粒子ほど増加していた。(3)今回の観測においては、エアロゾルを溶液として噴霧させただけでなく、エアロゾルの溶液を乾燥させ、エアロゾルのみを噴霧した。これにより、エアロゾルの凝結成長を、より詳しく解明することができた。2,立坑内の気温の鉛直分布は、雲発生前と後では異なっていることが確認できた。さらに、雲発生時における雲底以上の高度において立坑内の気温の減率が、湿潤断熱減率よりも小さな値であった。このことは、新しく開発している降雨シミュレーションモデルによっても同様の結果が確認された。この結果より、降雨発生にはエアロゾルが大きく関与しており、降雨の再現計算を行なう際にはエアロゾルを考慮する必要がある。鉱山内の立坑を利用し,雲及び降雨形成に関する微物理過程の解明を目的とした実スケール雲物理実験を行っている.

この実験は立坑坑底の横穴から流入した空気を立坑坑頂に設置した大型ファンにより吸い上げ,立坑内の上昇流内で雲水を生成させる実験である.この雲物理実験施設には坑頂に2基のファンが設置してあり立坑内の上昇流速を3段階に制御することができる.また,坑底で溶液噴霧装置を使用することにより立坑内に流入するエアロゾルの化学組成,溶質濃度,数濃度を制御し立坑内へ供給することができる.坑頂では気温,湿度,雲水量,エアロゾル数濃度,坑底では気温,湿度,エアロゾル数濃度の観測を行っている.以下に本年度の研究より得られた結果を示す.エアロゾル粒子計測器を坑底,坑頂及び坑底から18m,32m,53m,74mの坑内の計6地点に設置しエアロゾル数濃度の鉛直分布,各粒径のエアロゾル数濃度の鉛直分布の計測を行った.高度が高くなるに従い数濃度の増加が見られ,大粒径の数濃度が増加し小粒径の濃度が減少し,エアロゾル粒子が雲粒子へと成長していく過程を捉えることができた.エアロゾル数濃度は高度2060mで急激に増加し,過去の実験,再現計算より凝結成長が激しく行われている高度とほぼ一致している.また,上昇風速を増加させることにより,立坑の各高度でエアロゾル数濃度の増加する様子を捉えたが,特に坑底から2060mの範囲の凝結成長が急激に行われている高度でエアロゾル粒子の増加量が多いことがわかった.坑底から100m地点までの各高度で溶液噴霧時に気温上昇を確認した.高度が低いほど凝結による潜熱の開放が盛んに行われ溶液噴霧時の気温上昇が大きく,高度の上昇とともに溶液噴霧による気温上昇は小さい.坑底から100m以上ではエアロゾル粒子の多くが雲水へとかわっているため,雲水による水蒸気の捕捉成長や雲水どうしの併合成長の効果が卓越するため潜熱開放による気温上昇が見られなかったと考えられる.鉱山内の立坑(全長425m)を用い,雲及び降雨形成に関する微物理過程の解明を目的とした実スケール雲物理実験を行っている.この実験は,立坑坑頂に設置した大型ファンにより空気塊を吸い上げ,坑内に上昇流を人工的に発生させ雲を生成させる.この雲物理実験施設は,坑頂に設置された2基のファンにより上昇流速を発生させ3段階に変化させることができる.坑底で溶液噴霧を行うことにより,立坑内に流入するエアロゾル(大気浮遊粒子)の化学組成,溶質濃度,数濃度を制御することが可能である.坑内の各高度に観測機材を設置することにより,気象因子の高度変化及び水蒸気から雲粒子への相変化の様子を詳細に計測している.以下に,本年度の研究より得られた結果を示す.坑内に硫酸アンモニウムのエアロゾル粒子を噴霧し,数濃度を12004800[count/cm^3]と昨年と比較して高濃度の条件で変化させるともに,各噴霧濃度のイベントで上昇風速を変化させ,数濃度及び上昇風速の影響を明らかにさせることを目的とした実験を行った.エアロゾル粒子計測を各高度10地点に設置し,0.35μm間の各粒径のエアロゾル数濃度を計測した.また,坑頂には10100μm間の粒径の計測を行ない大きく成長した雲粒子の数濃度を観測した.エアロゾル数濃度の鉛直分布から,高度2040mで急激な増加が見られ,雲底付近の数濃度の変化の様子を捉えた.
顎関節症における関節円板のコラーゲン発現機構の解明

本研究では、顎関節内障の発症の機序を明らかにするため、ラット咬合改変モデルを用いた実験を行う。この実験モデルでは、臼歯が離開(disocclusion)した切歯咬合(incisal power stroke)を恒常的に誘導し、顎関節に圧縮力を主とする関節負荷を加える。試料の解析では、まずReal-time PCRによる関節円板のmRNA発現の網羅的検討を行い、関節負荷に対して発現変化のみられるコラーゲンと弾性系線維を明らかにする。次にその結果を踏まえ、免疫組織化学による細胞外マトリックスの局在、マイクロダイセクション法により抽出した各領域別でのmRNA発現を検討する。
脳内 AMPK の睡眠ホメオスタシスおよび体温調節における役割と そのメカニズム

細胞内エネルギーセンサーであるAMPKは、6時間の断眠によってリン酸化される。また、AMPK活性化薬AICARの脳室内投与は睡眠期脳波徐波成分を増大させ、一方、AMPK阻害薬Compound Cは徐波成分を減弱させる。以上から、AMPKは睡眠ホメオスタシスに関与していることが考えられたが、絶食によってAMPKが活性化されても脳波徐波成分に変化はなく、また、PPARαノックアウトマウスでは上記薬物の効果がない。したがって、AMPKの睡眠ホメオスタシスに関する効果はPPARαを介することが示唆された。本課題では、22年度の実施計画として、(1)AMPKの免疫組織学的検討、(2)AMPK作動薬の脳内局所投与、(3)非薬物的AMPK活性化の効果、を挙げていた。(1)に関しては、AMPK-αサブユニットに対する抗体を用いた免疫染色をトライしているが、未だ明瞭な染色が得られていない。抗体の検討、染色条件の改良など、継続的に試行している。(2)に関しては、AMPK作動薬が人工髄液などに全く溶けず、局所投与は難しい。そこで、ウイルスを用いた遺伝子レベルでの発現抑制を計画し、現在セットアップ中である。(3)に関して、AMPKの活性化を引き起こすことが知られている絶食について観察を行った。24時間の絶食は、マウスにおいて体温の低下を引き起こすが、その際、視床下部では、NPYの発現増加やAMPKの活性化が引き起こされる。我々も確認した。睡眠は、この24時間の絶食中には、覚醒の増加傾向、ノンレム・レム睡眠の減少傾向が見られるが、睡眠ホメオスタシスの指標であるデルタ波のパワーには影響を与えなかった。一方、絶食後の再摂餌を起点として、デルタ波パワーの大きな増強が観察された。この現象は、6時間の断眠、AMPK活性化薬(AICAR)の脳室内投与に伴う睡眠の変化に類似しており、それらに共通するのは、やはり、AMPKの活性化である。現在、この絶食に関する結果を英文論文にまとめ、投稿中(revise version)である。また、PPARαノックアウトマウスにおいて、AICARの脳室内投与がデルタ波パワーを増強させないことを見いだしている。AMPKの睡眠ホメオスタシスに対する働きにはPPARαが仲介していることが示唆され、23年度の研究計画に加えている。本課題は、睡眠のホメオスタシス機構において、脳内AMPKがどのように関わるかを明らかにすることが目的である。睡眠不足が糖尿病など、生活習慣病に関わる可能性が示唆されており、エネルギー代謝に重要な役割を担っているAMPKの作用メカニズムを明らかにすることは、生活習慣病の予防に重要なテーマと考える。23年度に向けて交付申請書には、実施計画として、AMPK遺伝子操作やオブとジェネティック手法による慢性睡眠不足モデルマウスの作成などを挙げた。しかし、AMPKの睡眠作用がPPARαを介する可能性が、22年度末から23年度初頭に明らかとなったことから、まず、PPARαの下流に存在する、睡眠ホメオスタシスにおけるキー物質を明らかにしたいと考えた。その結果、下記の項目が明らかとなった。1.アンチセンス・オリゴヌクレオチドの脳室内投与によるPPARαの機能抑制は、ノンレム睡眠中のデルタ波を減弱させた。2.一方、PPARαノックアウトマウスでは、ノンレム睡眠中のデルタ波が増強していた。3.1.のマウスではケトン体比(アセト酢酸/βヒドロキシ酪酸)が低下していたが、2.のマウスでは逆に上昇していた。4.ノンレム睡眠中のデルタ波を増強する断眠では、ケトン体比は上昇した。5.脳室内にケトン体のひとつアセト酢酸を投与するとノンレム睡眠中のデルタ波が増強した。以上などから、脳内のケトン体、とくにアセト酢酸、あるいはケトン体比が睡眠ホメオスタシスに深く関わっていることが明らかとなってきた。ケトン体は脂質代謝の最終的産物であり、また、神経細胞がエネルギー源として利用できる物質である。AMPK、PPARαに関して、両者ともその活性化はケトン体産生に働く。したがって、AMPKの睡眠に関わる働きは、ケトン体を介する可能性が高い。まず、断眠に対するAMPKの応答を免疫組織学的手法により解析しようと試み、AMPKおよびリン酸化AMPKの抗体を入手しトライした。ウエスタンブロット法を用いた定量には成功したが、組織学的に染色することは未だできていない。抗体を変更するなど、継続して検討中である。また、核内受容体であるPPARalphaのノックアウトマウスにおいて、AMPKのエンハンサーAICARや阻害薬であるcompound_Cの効果が見られなかったことから、以前我々が報告したこれら薬物の睡眠期デルタ波への効果は、PPARalphaを介する、あるいは、必要とするものであることが分かった。AMPKおよびPPARは絶食時に活性化することが知られていることから、我々は、妊娠マウスに摂餌制限を負荷し、低出生体重モデルマウスを作製した。

そして、成長した後にその仔マウスの睡眠ホメオスタシスを観察した。仔マウスでは睡眠期のデルタ波が24時間にわたり増強していた。一方、仔マウスの脳視床下部においてPPARalpha mRNA発現が増加していたが、AMPKの活性化は見られなかった。これらの結果から、AMPKは脳内において摂食行動など重要な役割を担っており、断眠においてそのリン酸化が亢進するものの、睡眠のホメオスタシス(デルタ波)に関しては、少なくとも直接的な関与が存在するとはいえないことが明らかとなった。今後、PPARalphaなど、AMPKと関連性を持つ他の因子について解析を進める。交付申請書の研究実施計画からは大きくずれてしまったが、本来の目的は、方向性を変えながらも達成しつつある。AMPKは睡眠ホメオスタシスに直接関わっている訳ではなく、下流に存在するケトン体が重要であることが分かってきた。24年度が最終年度であるため、記入しない。ケトン体がキー物質であることが明らかになったので、脳内のAMPKがケトン体産生にどのように関わるか、また、そのメカニズム、さらにケトン体がどのように睡眠中のデルタ波に関わるか、そして、そのメカニズムについてを本研究課題の新たなターゲットとする。
ネオスポラ症における垂直感染阻止経口投与型ワクチンに関する研究

ネオスポラ症に対するワクチンの作出を、抗原を発現させた藻類クラミドモナスを経口投与することによって行った。クラミドモナスに腸管粘膜付着因子LT-BとNeospora caninumの表面抗原NcSAG1もしくはNcBAG1を共発現させた。蛋白発現クラミドモナスは加熱不活化後、約5×10^6/mLに調整した。ワクチンはマウスに0.5mLを週2回のペースで経口投与を行い、尾静脈からの採血を毎週行ない、血清抗体価を測定した。その結果、抗体は初回投与から3週目に認められ、継続して抗体産生を行った。このことから藻類クラミドモナスの経口は有用なワクチン候補であることが示唆された。ネオスポラ症は細胞内寄生原虫Neospora caninumの感染に起因する届出伝染病である。本症に対するワクチンは、1水平感染に対しては細胞性免疫のTh1型免疫が、2垂直感染に対しては液性免疫のTh2型が有効である。本研究の目的は、この相反する連続した事象に対するワクチンおよびワクチンプログラムの開発、特に2の問題について、経口投与型のワクチンの可能性を提示することである。以下に平成25年度の研究の概要を記する。(1)ワクチンプログラムの作出:平成27年度までの3年間で完結させる。(2) Th1/Th2免疫の有効性のマウスにおける再確認:水平感染で[抗原(NcSRS2)+ゴーヤ由来β-グルカン+オイルアジュバント]にてTh1型免疫が、さらに垂直伝播マウスモデルでTh2型免疫が、有用な防御活性を有することを再確認した。(3)マウス腸管粘膜接着因子としてのscFv型抗体の作出:マウス、ヒト正常脾臓細胞由来scFv抗体の作製を行い、マウス腸管粘膜細胞CMT/86/93細胞に対するヒト型scFv抗体のみが作製できた。(4) scFvと原虫由来抗原との融合蛋白の作出:ヒト型scFv抗体遺伝子と原虫由来NcSAG1抗原遺伝子との融合遺伝子の作製を行った。さらに蛍光蛋白tdTomatoとの融合蛋白を作製し、マウス腸管粘膜細胞との付着性を蛍光顕微鏡下で確認した。(5)植物β-グルカンのDMSO処理化:β-グルカンを用いる検討で、キノコ由来のグルカンよりもゴーヤ由来のグルカンの方がTh1誘導性が高いことが分かった。(6)ミドリムシにおける発現系の作出:光合成に関与する酵素蛋白Enolase遺伝子について5'UTR領域の1,814bpと3'UTRの912bpの解読を行い、蛍光蛋白であるtdTomato遺伝子を用いたミドリムシベクターの構築を行った。本症に対するワクチンは、1水平感染に対してはTh1型免疫が、2垂直感染に対してはTh2型が有効である。本研究の目的は、この相反する連続した事象に対するワクチンおよびワクチンプログラムの開発、特に2の問題について、経口投与型のワクチンの可能性を提示し、平成26年度の研究の概要を記する。(2) Th1/Th2免疫の有効性のマウスにおける再確認:垂直伝播モデル作製のために必要な正常な実験動物脳内におけるシスト形成は未だ報告がない。最終年度に向けて、その可能性を検証した。Nc-Liv株タキゾイトをSCIDマウスの腹腔内に約1×106を接種し、5週間後に剖検し、脳乳剤を作製した。その脳乳剤をスナネズミ腹腔内に接種(約7×106)し、05週間後に剖検し、脳内シスト形成能について検証した。その結果、感染後5週目の全てのスナネズミからPCRによって原虫DNAが検出された。しかし肉眼的鏡検によっては一部のスナネズミのみから検出され、その形成は安定しなかった。平成26年度に計画の一部修正を行った。25年度に作製したミドリムシベクターを構築したが、シベクターをミドリムシに安定的に形質転換することができず、さらにミドリムシには細胞壁が存在せず、経口投与後に胃を通過できないことが判明し、発現母体を細胞壁を有するクラミドモナスに変更した。そのため、(3)腸管粘膜接着因子を毒素原性大腸菌の易熱性毒素(LT)のBサブユニットにすることにし、クラミドモナスベクター内へ挿入した。さらに粘膜への接着確認用にGFP遺伝子も挿入を行い、接着ベクター作製を行った。構築ベクターをクラミドモナスに形質転換を行い、粘膜上皮細胞HT29に対する接着試験を行い、蛍光顕微鏡下でその接着能を確認した。本研究の目的は、この相反する連続した事象に対するワクチンおよびワクチンプログラムの開発、特に2の問題について、経口投与型のワクチンの可能性を提示し、平成27年度の研究の概要を報告する。最終年度である平成27年度では以下の事について研究を行った。(1)平成26年度で接着因子であるLT-Bおよび緑色蛍光蛋白GFPの発現をクラミドモナスにて確認していたが、さらに高度な発現を期待し、LT-B、GFP、さらに赤色蛍光蛋白tdTomato遺伝子のコドンの最適化を行った。その結果LT-BならびにGFP蛋白の発現量が上昇した。しかしtdTomato蛋白の発現は確認されなかった。

(2)LT-BおよびGFP蛋白発現クラミドモナスのマウスでの経口投与試験を行った。投与は週2回のペースでゾンデを用いた胃内投与法でおこない、最初の投与から3週間後には対照と比べて優位に高いGFP蛋白に対する血中抗体が検出され、経口投与ワクチンとしての有用性が確認された。(3)N. caninumのタキゾイト由来NcSAG1およびブラディゾイト由来NcBAG1蛋白についてもクラミドモナスへのコドンの最適化を行い、人工遺伝子を作製後、クラミドモナスベクターへの組換えを行い、クラミドモナスでの発現を確認することができた。(4)経口投与型ワクチンとしてのクラミドモナス不活化試験を行い、56°C、15分の加熱で不活化することが判明した。今後、各種蛋白発現クラミドモナスは56°C、15分以上加熱した不活化虫体を使用することでより安全な経口投与型ワクチンが生産できることが確認された。以上のことからより、クラミドモナスを用いて血中抗体を上昇させることが可能で安全な経口投与型ワクチンを作製できることが判明した。ネオスポラ症に対するワクチンの作出を、抗原を発現させた藻類クラミドモナスを経口投与することによって行った。クラミドモナスに腸管粘膜付着因子LT-BとNeospora caninumの表面抗原NcSAG1もしくはNcBAG1を共発現させた。蛋白発現クラミドモナスは加熱不活化後、約5×10^6/mLに調整した。ワクチンはマウスに0.5mLを週2回のペースで経口投与を行い、尾静脈からの採血を毎週行ない、血清抗体価を測定した。その結果、抗体は初回投与から3週目に認められ、継続して抗体産生を行った。このことから藻類クラミドモナスの経口は有用なワクチン候補であることが示唆された。平成26年度実績から、当初の計画から以下の点で若干の遅延を来している。これはワクチンの材型をミドリムシからクラミドモナスに変更し、その基礎試験ならびに性状検査を行ったためである。経口投与型ワクチンであるクラミドモナスを用いた経口投与ワクチン試験を平成26年度に行えなかった。しかし一方で、クラミドモナスではすでに発現用ベクター構築がなされ、26年度には発現ベクターとして蛋白発現ベクターの構築が完了し、さらにクラミドモナスにおける蛋白発現を確認が終了している。蛋白発現は接着因子である大腸菌LT-Bサブユニットと経口蛋白であるGFPであり、さらに27年度早々にはNeospora caninum由来のワクチン候補抗原を発現させる予定である。従って、平成27年度には経口投与型ワクチンとしての効力試験を行うことで、若干遅延気味にある進行予定は十分にカバーできるものである。獣医寄生虫学今後の研究の推進方策は以下の様にして行う。本研究の目的はワクチン効果として、1妊娠初期にはTh1型免疫を、2妊娠後期にはTh2型免疫を誘導する、ためのワクチン接種方法の確立にある。1については以前の研究ならびに平成25年度の研究でTh1型免疫賦活物質をアジュバントに添加することですでに解決済みである。2については1でのワクチン接種後、連続的に免疫状態をTh2型に変換していく必要がある。
COX阻害剤によるPAF産生亢進機序とその薬理学的意義の解明に関する研究

[4]培養液中にPGE2あるいはPAFを添加してSK&F 98625によるPAF及びPGE2産生抑制作用を打ち消しても、低下したTNF-α産生は回復しなかった。[5]刺激によるTNF-α産生亢進およびCOX阻害薬添加によるTNF-α産生増強は、PAF受容体拮抗薬であるE6123、L-652,731あるいはCV-6209によって部分的に抑制された。これらの拮抗薬は細胞内に入り込み細胞内のPAFの作用に拮抗し、それによってTNF-αの産生を抑制していることが示唆された。[6]刺激によりIkBの分解が亢進し、NF-kBの活性化が起こることによりTNF-α産生亢進が誘導されることが示唆された。また、PAF受容体拮抗薬は刺激によるIkBの分解亢進を抑制した。以上の知見から、COX阻害剤はPGE2産生を抑制することによりPAF産生を亢進し、産生されたPAFは細胞内に留まり、NF-kBの活性化を介してTNF-α産生誘導に関与していることが強く示唆された。ラット腹腔マクロファージをthapsigarginで刺激すると、PAF産生もPGE_2産生も同時に亢進し、またTNF-α産生も亢進した。この時、CoA-independent transacylase阻害薬であるSK&F98625を共存させると、細胞内PAFレベルも培養中のPGE_2レベルも、また培養液中のTNF-αレベルもSK&F98625の濃度に依存して低下した。この時、培養液中にPGE_2を添加してSK&F98625によるPGE_2産生抑制作用を打ち消しても、低下したTNF-α産生は回復しなかった。また、培養液中にPAFを添加しても、SK&F98625によるTNF-α産生抑制作用は打ち消されなかった。すなわち、細胞外に存在するPAFにはTNF-αの産生亢進を引き起こさないことが示された。一方、trapsigarginによるTNF-α産生亢進には、PAF受容体拮抗薬であるE6123、L-652,731あるいはCV-6209によって部分的に抑制された。これらの結果から、これらの拮抗薬は細胞内に入り込み、細胞内のPAFの作用に対して拮抗し、それによってTNF-αの産生を抑制していることが推定された。以上の知見から、刺激により産生されるPAFは細胞内に留まり、TNF-α産生誘導に関与している可能性があることが示唆された。なお、本研究の一部はLife Sciences(1998)に受理されている。[1]CoA-independent transacylase阻害薬であるSK&F98625を共存させると、刺激により上昇する細胞内PAFレベルも培養液中のPGE_2レベルも、また培養液中のTNF-αレベルもSK&F98625の濃度に依存して低下した。[2]培養液中にPGE_2あるいはPAFを添加してSK&F98625によるPAF及びPGE_2産生抑制作用を打ち消しても、低下したTNF-α産生は回復しなかった。(Life Sciences,62(1998)297-302)[2]刺激によるTNF-α産生亢進は、PAF受容体拮抗薬であるE6123、L-652,731あるいはCV-6209によって部分的に抑制され、これらの拮抗薬は細胞内に入り込み、細胞内のPAFの作用に対して拮抗し、それによってTNF-αの産生を抑制していることが推定された。(Eur.J.Pharmacol.投稿中、1999)[3]刺激によりIκBの分解が亢進し、NFκBの活性化がおこることによりTNF-α産生亢進が誘導されることが明らかになったが、これらのPAF受容体拮抗薬は刺激によるIκBの分解亢進を抑制することが明らかになった。
遺伝子導入による精子形成におけるNotchシグナルの機能解析と不妊症治療への応用

本研究では、ラット精子形成におけるNumbおよびNumb-like(Notchシグナル伝達系の抑制因子)の機能について、in vivo遺伝子導入技術を用いて解析した。NumbとNumb-likeは精母細胞以降の精細胞に発現があり、分化が進むにつれ、Numb発現は減少していた。In vivoでsiRNAを発現するベクターを導入し、NumbとNumb-likeをノックダウンすると、精母細胞から精子細胞への分化が阻害された。以上より、NumbおよびNumb-likeがNotchシグナルを抑制することで、精子細胞の分化を調節しており、それぞれ拮抗的に作用していることがわかった。1.ラット精巣へのsiRNA発現ベクターの導入とその効果1正常ラット精巣におけるNumbおよびNumb-likeの発現局在の解析を蛍光抗体を用いた免疫組織化学にておこなった。その結果、NumbおよびNumb-likeは精祖細胞から精子細胞までの精細胞に発現しており、Numbは精子細胞ではNumb-likeに比較して発現量が相対的に減少することがわかった。また週齢ごとによるNumbおよびNumb-likeの発現量の推移を、412週齢の正常ラットを用いて定量PCR法にて解析した。その結果、Numbは週齢を経るにつれて減少する一方、Numb-likeは精子形成が始まる6週齢でピークとなることがわかった。2次に、NumbおよびNumb-likeに対するsiRNA発現ベクターをデザイン、構築した。NumbおよびNumb-likeに対するsiRNAの配列をソフトウェアを用いて、それぞれ3種類ずつ作成した。このsiRNAを発現するDNAを、ベクタープラスミド(pcDNA TM6.2-GW/EmGFP-miR)にインサートし、siRNA発現ベクターを作成した。NumbおよびNumb-likeそれぞれに対してもっとも発現抑制効率の高いベクターを選定するため、NRK-52E細胞にベクターを遺伝子導入し、NumbおよびNumb-likeの発現変化を調べた。3以上で構築したベクタープラスミドをTOP10をcompitent cellとして、LB培地にて大量に培養・増幅をおこなった。増幅したベクタープラスミドは、ベクター抽出キットを用いてin vivo遺伝子導入に向けて調整した。4増幅したベクタープラスミドを、トリパンブルーで着色したPBSに溶解し、ラット精巣にin vivo導入を開始し、現在継続中である。前年度では、今回NumbおよびNumb-likeの精子形成における機能の解析をするにあたり、正常精巣での発現を検討した。さらに、in vivoにおいて機能をノックダウンするために、NumbおよびNumb-likeに対するsiRNAを発現する遺伝子を組み込んだベクタープラスミドを構築した。本年度は、構築したベクタープラスミドを大腸菌を用いて大量に増幅し、それをラット精巣に導入することに着手した。1.増幅したベクタープラスミドをラット精巣に、電気刺激法(エレクトロポレーション法)により導入した。遺伝子導入の至適条件を検討するために、電気刺激における、電圧、刺激回数、ベクタープラスミドの濃度を変えて検討をした。その結果150μgのベクタープラスミドを注入し、100V、18回の電気刺激で最も導入効率が高くなることが明らかとなった。これ以降の遺伝子導入の条件をこのように決定した。ベクタープラスミドにはレポーター遺伝子としてEmGFPを組み込んであるため、ベクタープラスミドが導入された細胞と、導入した遺伝子の発現を蛍光顕微鏡で確認することが可能である。導入後2・4・6・8週で組織を観察したが、4週間まで、導入遺伝子の発現が確認できた。また、電気刺激による精巣への組織障害は、導入後1週以降では形態学的にほとんど認められないことが明らかとなった。2.次にNumbおよびNumb-likeの遺伝子機能の解析を開始した。NumbおよびNumb-likeをそれぞれ単独でノックダウンした場合(Group AおよびB)と両者をノックダウンした場合(Group C)、さらにネガティブコントロール群(Group D)の4群で、遺伝子のノックダウンによる精子形成の変化を検討することとした。現在も引き続き、遺伝子導入により研究継続中である。本研究は、精子形成におけるNumbおよびNumb-likeの機能を解析することを目的とした。まず正常精巣におけるNumbおよびNumb-likeの発現を検討したところ、精母細胞以降の精細胞に発現しており、減数分裂後ではNumb-likeの発現量が相対的に増加していることが明らかとなった。次にIn vivoにおいてNumbおよびNumb-likeの機能をノックダウンするため、NumbまたはNumb-likeに対するsiRNAを発現するベクタープラスミドを構築した。構築したプラスミドを増幅ののち、精巣に注入し、100V 18回の矩形波電気刺激(エレクトロポレーション法)を与え精巣実質に導入した。遺伝子導入後、1・2・4・8週で組織を評価した。導入遺伝子は導入後4週間までの間、その発現を維持していることが明らかとなった。またエレクトロポレーションによる組織障害は、導入1週以降ではほとんど認められないことがわかった。次にNumbおよびNumb-likeの精細胞分化における役割を検討するため、オスSDラットをA群:Numbノックダウン群、B群:Numb-likeノックダウン群、C群:NumbおよびNumb-likeノックダウン群、D群:コントロール群の4群にわけて、それぞれ遺伝子導入した。4群の間で、遺伝子導入された精細胞(精祖細胞、精母細胞、円形精子細胞、伸長精子細胞)の割合を算出し、NumbおよびNumb-likeのノックダウンが精細胞分化のどの段階に影響を及ぼすかを検討した。その結果、A群では円形・伸長精子細胞が減少しており、B群およびC群では伸長精子細胞の数が減少していた。

本研究の結果により、NumbおよびNumb-likeは減数分裂以後の精細胞の分化に関わっており、NumbとNumb-likeはそれぞれ拮抗的に作用していることが示唆された。NumbおよびNumb-likeは哺乳類ではよく保存されている遺伝子であり、ヒト精子形成機構の解明、精子形成障害の治療法開発へつながるものと考えられた。本研究では、ラット精子形成におけるNumbおよびNumb-like(Notchシグナル伝達系の抑制因子)の機能について、in vivo遺伝子導入技術を用いて解析した。NumbとNumb-likeは精母細胞以降の精細胞に発現があり、分化が進むにつれ、Numb発現は減少していた。In vivoでsiRNAを発現するベクターを導入し、NumbとNumb-likeをノックダウンすると、精母細胞から精子細胞への分化が阻害された。以上より、NumbおよびNumb-likeがNotchシグナルを抑制することで、精子細胞の分化を調節しており、それぞれ拮抗的に作用していることがわかった。今年度は実際にsiRNAを発現するベクタープラスミドをin vivoで導入することを開始した。ラット精巣へのin vivoでの遺伝子導入には大量のベクタープラスミドが必要であり、また至適条件の設定に難渋したところはあったが、今年度中に至適条件の設定と、電気刺激(エレクトロポレーション)の影響を評価できたため、おおむね順調に進んでいるとした。泌尿器科学今後は、前に記載した4群において、NumbおよびNumb-likeをノックダウンした精巣での精細胞の分化を組織学的に検討することを継続して進める予定である。また、組織学的評価のみではなく、NumbおよびNumb-likeを取り巻く遺伝子群(ことにNotchシグナル伝達系の遺伝子群)の発現変化を定量RT-PCRや免疫染色により評価していく予定である。今年度は、遺伝子機能の解析に先立ち、正常ラット精巣における発現の局在と週齢における変化を検討した。また、in vivoで機能抑制実験に用いるためのベクタープラスミドを構築し、増幅しながら現在順次ラット精巣に導入を開始している。現在、導入効率に関して、その条件設定に課題を残す形とはなったが、機能解析の対象となる遺伝子の発現パターンの解析と、ベクタープラスミドの構築を行い、in vivo遺伝子導入を開始することができたため、おおむね順調に進んでいるとした。本年度は謝金の出費がなかったため、少額ではあるものの金額に余剰が生じた。今後は、平成25年度に構築したベクタープラスミドの増幅を繰り返しながら、ラット精巣にin vivo導入をさらに進めていく予定である。
職場の人間から褒められる効果の科学的検証：近赤外線分光法による脳機能評価

労働者が強いストレスを感じている事柄で「対人関係」の問題は大きな割合を占めており、対策が求められている。職場で褒めて・褒められることは対人関係を円滑にするのみならず、モチベーション維持やパフォーマンス向上にも繋がる。脳機能イメージング技術によって、社会的報酬によって脳機能が活性化する機序が明らかにされつつあるが、多くの研究はシミュレーション環境で実施されている。本研究では職場の実際の対人関係の中で、褒められることによる脳機能の変化を、近赤外線分光法による計測で定量化する。そして、より良好なコミュニケーションや職場環境の形成に寄与したい。本研究では、褒められたり認められたりするといった社会的報酬を、職場の関係性の中での脳活動計測データにより定量化する。最終的には、職場でのコミュニケーションや良好な職場環境の形成に寄与することが本研究の目的である。初年度である平成30年度は、褒められたり認められたりすることによる脳認知機能の定量的評価法の開発を目指すため、以下の実験計画を策定した。健康で右利きの筑波大学職員で、職場が同じあるいは近しい二名一組を対象として被験者を募集する。手順は、二名一組が向かい合って座り、褒める役と褒められる役を交互に担当する。褒められる役に測定機器である近赤外線分光法(fNIRS)を装着し、前頭極や背外側前頭前野の活動変化を酸素化ヘモグロビン濃度および脱酸素化ヘモグロビン濃度によって推定する。特に関係のない言葉を投げかられた際と、褒め言葉を投げかけられた際の測定結果の差異を観察する。また、得られた脳血流データと、気分プロフィール検査(POMS2)による主観的指標との相関を評価する。さらに、褒め言葉の特徴(努力の過程を評価しているか、共感できているか、さらなる期待を込めているか)との相互的影響を検討する。本研究の実施に関して、筑波大学医学医療系医の倫理委員会の承認を得た。平成31年度に被験者の募集と実験を開始する予定である。倫理委員会承認に時間を要したが、無事に承認された。実験を開始するための機器や調査票などの準備を整えた。平成30年度に予定していた被験者の募集は翌年度にずれ込んだ。しかし、実験は予定通り平成31年度に開始することができる見込みである。2019年4月から6月にかけて、筑波大学の職員を対象に研究協力者の募集を行い、被験者の確保を目指す。並行して5月以降に実験を実施する。7月以降に結果を分析し報告としてまとめ、国内外の関連学会にて発表する。

平成30年度に予定していた被験者の募集は翌年度にずれ込んだ。しかし、実験は予定通り平成31年度に開始することができる見込みである。2019年4月から6月にかけて、筑波大学の職員を対象に研究協力者の募集を行い、被験者の確保を目指す。並行して5月以降に実験を実施する。7月以降に結果を分析し報告としてまとめ、国内外の関連学会にて発表する。
からだ/運動を通して生命と脳を理解する教育プログラムの開発

東京大学教養学部では新入生を対象に必修科目のスポーツ・身体運動を行っている。その科目の一つとして、自分自身の身体を用いて運動を行いながら、運動時の身体変化を科学的に理解することを目的とした「スポーツサイエンスコース」を開講している。約30人の受講生を対象として、生命科学を基本とし、自分自身のからだを通して、また実際に運動することを通して、生命と脳を理解するための、以下の4つの教育プログラムの開発を行っている。1)フィールドにおける呼吸数による至適運動強度の推定を行い、運動に苦手意識を持つ学生にも自分自身のからだの機能を理解させる効果が得られた。2)運動後の脳の活性化を測定するためのプログラムを開発した。パソコンを用いた数分で修了する試験により、脳の活性状態を数値化し、比較検討することを可能としている。3)自分自身のからだを、構成単位である細胞から理解するために、ラットの解剖を行っており、現在、映像コンテンツを作成中である。4)自分自身の身体の動きを理解するために、ゆっくりとした動きを制御する太極拳を実習科目に取り入れ、太極拳について科学的な視点を持って身体の理解につなげる研究を行っている。伝統武術太極拳の脳機能への効果を、近赤外分光法(NIRS : Near Infrared Spectroscopy)を用いて検討した結果、太極拳実施中のOxyHbは対照課題実施時と異なる変化を示すことが明らかになった。2つの側面から研究を行った。ひとつは運動の脳の活性に及ぼす影響、他は自分のからだに対する生命科学からの認識に対して心筋細胞などの直接観察及び映像の観察の影響を調査した。1)呼吸数からの換気性閾値VET(乳酸性閾値LT)の推定方法の確立:マウスを用いた研究からマイルドな負荷強度である乳酸性閾値(=換気性閾値)は、脳の活性をあげる可能性が示唆された。LTを授業などで簡易に測定するために呼吸数での評価を試みた。体育館あるいはグランドに100mの周回走路を設置し、ランプ法にて6・8段階に走速度を増加させ、100mごとの呼吸数の変化を走速度あるいは酸素摂取量に対してプロットして変曲点を求めたところ、換気量と呼吸数の変曲点はほとんど一致をみた。この方法でのLTの推定が可能である。2)心筋細胞の自律性の理解には、拍動中の心筋細胞の顕微鏡観察が必要である。しかしながら、顕微鏡操作に習熟する技術者がいない場合や観察環境が不適切な場合には、細胞を観察することが困難になる。そこで自律拍動中の心筋細胞の顕微鏡観察像をCCDカメラで撮影し、編集/画像処理を施した。もう一方では、心筋細胞などの直接観察を行うことにより、自分の体に対する認識を深める映像作成を行っている。この映像観察に対する学生の印象は大変良好であった。
癌遺伝子産物による糖蛋白質特異的な糖転移酵素群の活性発現制御機構の解析

ヒトIL5をモデル糖蛋白質として、V-src、V-sis、V-erbB、V-K-rasの糖蛋白質特異的な糖転移酵素群の活性発現制御機構の解析を試みるべく実験を行った。JCRBより入手したヒトIL5遺伝子を鋳型に、そのN末部分は翻訳効率上昇のためKozak配列を導入する一方、C末はmRNAの安定性向上のため3′非翻訳領域を欠失させるようにPCRを行った。得られたDNA断片をCAGプロモーターを持つpCAGGSに導入した(pCAG-2)後、さらにプラストサイジンS耐性遺伝子を導入して、ヒトIL5安定発現用プラスミドpCAG5-2BSDを得た。pCAG5-2BSDを正常株NIH3T3及びその癌遺伝子導入株V-src-NIH3T3、V-sis-NIH3T3、V-erbB-NIH3T3、V-K-ras-NIH3T3に導入し、薬剤耐性コロニーを得た。これらの株をMEM+10%仔牛血清の培地を用いて培養したところNIH3T3では1ng/ml、癌遺伝子導入株では10-20ng/mlのヒトIL5を産生していることがELISA法により明らかになった。ヒトIL5を産生するNIH3T3株を用いて培地からのヒトIL5の精製を考慮し、血清成分の低減化が可能なopti-MEMを基本培地に血清成分の低減化を試みたところ、1%及び2%仔牛血清存在下では形態変化を引き起こしたため、生産には不向きであると考えられる一方、4%仔牛血清存在下では形態変化を引き起こさず、生産量もMEM+10%仔牛血清と同等であった。以上により、この培地組成によりNIH3T3及びその癌遺伝子導入株でのヒトIL5の生産が可能であると考えられる。
現存生物に内在する自律分散制御則から切り拓く古生物の運動様式の革新的再現手法

太古の地球を生きた古生物は,どのように動き回っていたのだろうか?古生物の運動様式は長く議論されてきたが,未だ多くの謎に満ちている.この現状を打破するため本研究では,「いかなる時代の生物も,環境や身体に呼応した合理的な運動様式を発現する」という作業仮説に基づき,適応的な運動パターンを生み出す自律分散制御を突破口とした革新的な再現手法を構築する.その第一歩として,現存する四脚動物の運動様式を再現した四肢の間の協調制御メカニズムを起点とし,四肢が大きなヒレという現生動物には存在しない,特異な形態を持つ首長竜の遊泳様式の再現を試みる.そして,古生物の在りし日の姿を復元する新たな道を切り拓く.太古の地球を生きた古生物は,どのように動き回っていたのだろうか?古生物の運動様式は長く議論されてきたが,未だ多くの謎に満ちている.この現状を打破するため本研究では,「いかなる時代の生物も,環境や身体に呼応した合理的な運動様式を発現する」という作業仮説に基づき,適応的な運動パターンを生み出す自律分散制御を突破口とした革新的な再現手法を構築する.その第一歩として,現存する四脚動物の運動様式を再現した四肢の間の協調制御メカニズムを起点とし,四肢が大きなヒレという現生動物には存在しない,特異な形態を持つ首長竜の遊泳様式の再現を試みる.そして,古生物の在りし日の姿を復元する新たな道を切り拓く.
気管支肺アスペルギルス症における病原性因子の研究

気管支肺アスペルギルス症の発症・進展に気管支肺局所の感染防御能とりわけ気道粘液線毛クリアランス機構の障害が密接に関与していることが強く示唆される。当該年度においては、アスペルギルス由来の未知の気道線毛上皮傷害性因子の分離同定を行なうとともに、既に病原性因子としての可能性が指摘されている諸物質の病原性因子としての意義を検討し、以下の成績を得た。1)低分子領域の気道線毛上皮傷害性物質の分離同定。Aspergillus fumigatusの当科臨床分離株(YN株)の培養濾液を用いて、クロロホルム処理後、カラムの種類・溶出条件を変えてHPLCを繰り返し、分離精製を進めながら、各段階でヒトの気道線毛上皮に対する傷害活性を比較検討し、最終的に著しい気道線毛上皮傷害活性を有する低分子物質を得た。HPLC上の溶出位置、紫外線吸収パターン、Mass Spectrometryによる分子量の解析等によって、強力な気道線毛上皮傷害物質はgliotoxinおよびそのmetabolitesであることが確認された。この成績は英文論文にまとめ既に投稿中である。2)高分子領域の気道線毛上皮傷害性物質の分離同定。上記の培養濾液を用いてゲル濾過を行ない高分子領域にも気道線毛上皮傷害活性が存在することを確認し、≧35kDaと≒25kDaの蛋白成分であるところまでは明らかになったが、現在さらにその高分子物質の精製と同定の作業を継続中である。遺伝子操作で作成されたA.fumigatusの変異株(alkaline proteaseまたはrestrictocinの単独欠損株)およびその親株(野生株)を当科で開発したマウス慢性気管支肺アスペルギルス症モデルに用いて、生存率や病変の広がりを比較検討したが、これらの諸物質の単独欠損ではマウスの生存率や病変の広がりの程度に差を認めず、単独では病原性を決定する因子にはならないことが示唆された。