hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
次世代シーケンサーを用いた心臓突然死症例の網羅的遺伝子解析

私たちのグループは,原因不明の突然死(SUDS)症例の死因究明及び病態解明を目指して研究を行っている。これまでのSUDS症例の遺伝子解析は,主にチャネル遺伝子をターゲットとして行われていた。私たちは連続剖検例についてSUDS症例を抽出し,病理組織学的検索及び遺伝子解析を行った。その成果の一つとして,従来から言われていたチャネル関連遺伝子に加えて心筋症関連遺伝子の関与について示し,心臓の病理学的評価と心疾患関連遺伝子の網羅的解析の両方を行う必要性を示した。私たちの取り組みは,死因究明のみならず,突然死の予防に繋がると考えている。心臓突然死(SCD)の病因は、冠状動脈の虚血性心疾患が大部分を占めているが、原因不明のSCDの病因は多様で必ずしも心臓血管系に限定されない。法医剖検例のなかには、病理検査においても致死的な病変が認められず原因不明のSCD疑いとされる(sudden unexplained death syndrome; SUDS)症例も少なくない。近年、遺伝子解析による診断の可能性が報告されている。対象は2007年8月から2014年12月までに行った法医剖検例1265例のうち年齢1850歳のSUDS症例を抽出したところ25例が該当した。全てのケースについて、次世代シーケンサー(NGS)を用いて遺伝性心疾患に関連する73遺伝子について解析を行った。検出された変異体については、未知/既知についてデータベース検索にて確認し、pathogenicityについてはin silico解析法を用いて評価した。また、心臓の詳細な病理組織学的検索を行った。すでに報告されている5つの変異体及び15の傷害性が予測される変異体、25例中14例に検出された。不整脈の病歴をもつ2症例を含む5例に、6つのチャネル異常症関連遺伝子変異体を認めた。11例には、心筋症関連遺伝子あるいは心臓特異的転写因子変異体を検出した。デスモゾームや心筋症に関連する遺伝子変異体を持つ3例には病理組織学的変化を伴っていた。RYR2あるいはTBX5遺伝子変異体をもつ3例は心臓の刺激伝導系に傷害性の可能性をもつ線維化を示した。SUDS症例で検出された12の変異体は、コントロール頻度と比較したところ有意に高いことが示され傷害性が示唆された。チャネル異常症に加えて他の遺伝性心疾患も、臨床や病理組織学的にそれほど進んでいない場合でもSUDS症例の原因になる可能性が示唆された。また、NGS解析を用いた遺伝子解析及び詳細な病理組織学的検索は、SUDS症例の診断に有用である可能性が示唆された。本研究の目的は心臓突然死(SCD)の法医剖検例において、SCDの分子基盤を解明することである。これまで報告されているチャネル異常症のみならず他の遺伝性心疾患関連遺伝子の関与について解明することができた。また、この成果について学会発表および論文作製することができたことからおおむね順調に進展していると考えている。乳幼児や青壮年者の剖検例においては,解剖所見及び病理組織学的検索,薬物スクリーニング,生前の病歴,死亡時の状況調査の結果などを包括的に考慮しても死因が特定されず原因不明の突然死sudden unexplained death syndrome (SUDS)と診断せざるを得ない症例が少なからず存在する.近年,欧米を中心にSUDS剖検例に対して,死因究明を目的とした遺伝性心疾患関連遺伝子の遺伝子解析,すなわちmolecular autopsyが試みられるようになった.富山大学法医学教室では左右心室,刺激伝導系及び冠状動脈の標本作製を行った上で,1)包括的な検査結果の検証を経て,SUDSと診断された症例を抽出し,2)遺伝性心疾患に関わる73遺伝子について次世代シーケンサーを用いた遺伝子解析を実施,3)得られた変異体の遺伝子頻度,コンピュータ解析,機能解析,家族解析を基にした病原性の予測を行って,SUDSなどの突然死例の遺伝的背景を検索している.本研究は富山大学倫理委員会の承認を得ている.H28年度は,これまで当教室で経験したてんかん関連急死剖検症例sudden unexpected death in epilepsy (SUDEP) 12例を抽出し,遺伝子解析及び病理組織学的再検討を行った.SUDEP12例を対象とした検索結果では,チャネル及び心筋症関連遺伝子変異を8症例に認め,3症例には軽微な病理組織学的所見を認め,病理所見と遺伝子型の一致が示唆された.SUDEPの一部に心臓由来の不整脈器質を有する症例が一定の割合で存在し,てんかん発作を契機に急死する可能性が示唆された.本研究から,慎重な心臓の病理学的検索と心疾患関連遺伝子の網羅的解析を併せて行うことが突然死の診断に有用であることを示した.てんかん関連急死剖検症例sudden unexpected death in epilepsy (SUDEP)の一部に心臓由来の不整脈器質を有する症例が一定の割合で存在し,てんかん発作を契機に急死する可能性を示すことができた.また,この成果について学会発表及び論文作成することができたことからおおむね順調に進展していると考えている.本邦では年間約5万人が心臓突然死していると推定されているが,実際の剖検においては心臓性突然死であることが強く疑われるものの,詳細な病理学的検索をもってしても器質的疾患が特定されず,原因不明の突然死(Sudden Unexplained Death; SUD)と分類せざるを得ない症例が,若青年者を中心に一定割合で存在する。

近年,欧米ではSUD剖検例に対して,死因究明を目的とした遺伝性心疾患関連遺伝子の解析,すなわちmolecular autopsyが施行されるようになり,器質的疾患を欠く突然死症例の一部でイオンチャネル遺伝子(KCNQ1,KCNH2,SCN5A,RYR2など)に遺伝子変異を有し,心臓突然死と診断し得ることが報告された。その後も青壮年や小児のSUD症例,1才未満の乳児の原因不明の突然死(SIDS)のいずれにおいてもチャネル遺伝子異常の関与が報告されているが,その検出率は最も高い報告でも20%程度と必ずしも高くない。研究期間全体を通じて、申請者の研究グループは主に青壮年の心臓突然死の病理学的検索,病態究明にとりくみ,次世代シーケンサー(NGS)を用いた遺伝子診断に着手し,病理組織学的検索をベースとしたチャネル遺伝子以外の心筋症関連遺伝子検索の有用性を学術論文等で報告した。最終年度に実施した研究成果として、第63回日本不整脈心電学会学術大会ではFeatured Session,第81回日本循環器学会学術集会及び第101次日本法医学会学術全国集会ではシンポジウムで学会発表を行った。これまでの研究過程から,遺伝子診断の精度向上やコスト管理,特に形態学的に有意な病理所見が検出されないてんかんや代謝異常症を背景に有する心臓性以外の突然死に対する診断能力の向上させていく必要性も明らかとなった。私たちのグループは,原因不明の突然死(SUDS)症例の死因究明及び病態解明を目指して研究を行っている。これまでのSUDS症例の遺伝子解析は,主にチャネル遺伝子をターゲットとして行われていた。私たちは連続剖検例についてSUDS症例を抽出し,病理組織学的検索及び遺伝子解析を行った。その成果の一つとして,従来から言われていたチャネル関連遺伝子に加えて心筋症関連遺伝子の関与について示し,心臓の病理学的評価と心疾患関連遺伝子の網羅的解析の両方を行う必要性を示した。私たちの取り組みは,死因究明のみならず,突然死の予防に繋がると考えている。前年度同様、法医剖検例のなかで心臓突然死の疑いのあった症例について、薬物解析、病歴及び家族歴について検討を行う。抽出された症例について、NGSを用いた遺伝子解析及び詳細な病理組織検索を行う予定である。前年度同様,法医剖検例から心臓突然死の疑いのあった症例について,次世代シーケンサーを用いて遺伝子解析及び詳細な病理組織検索を行い,genotype-phenotypeの関連について検討する.また,今年度は最終年度であることから、これまでの成果をまとめた学会発表を行う予定である.法医学必要消耗品の購入に満たない額となってしまったため。必要消耗品の購入に満たない額となったため。残額と併せて翌年度分の請求助成金と併せて遺伝子解析及び細胞培養などの消耗品を購入する予定である。残額と併せて翌年度分の請求助成金と併せて使用する予定である。
ひずみゲージを用いた磁気弾性応力拡大係数の解析方法

本研究は、強磁場利用機器の設計・安全性評価に資することを目的に、ひずみゲージを用いた磁気弾性応力拡大係数の解析方法を提案し、応力拡大係数に及ぼす磁場の影響解明に関する理論的・実験的研究を行ったものである。昨年度の検討結果を踏まえて得られた成果を要約すると以下の通りである。1.磁場内における最適変位・ひずみ計測法を、検討した上で、フェライト系ステンレス鋼SUS430平板の曲げ試験を行い、磁気弾性相互干渉に及ぼす試験片長さ、厚さ及び幅の影響を明らかにした。また、軟磁性はり板の磁気弾性曲げ解析を行い、理論解析結果と実験結果を比較して理論の妥当性を検証した。2.磁場内におけるき裂を有する両端固定平板が試験片中央部に線状荷重を受ける場合の曲げ試験を行い、き裂先端近傍のひずみ分布計測法を、検討した。ひずみゲージは、磁気弾性応力拡大係数評価のため最適である単軸5連式ゲージを用いた。また、ゲージ設置位置は、き裂面に対して垂直方向に2mm間隔とし、この場合が最適であった。3. SUS430(比透磁率122.9)及びオーステナイト系ステンレス鋼SUS316電子ビーム溶接材(フェライト含有量2.58%、比透磁率3.906)を対象に、平板表面に垂直な一様磁場内における貫通き裂(片側・両側縁き裂、中央き裂)を有する両端固定平板が試験片中央部に線状荷重を受ける場合の曲げ試験を行った。また、計測したき裂先端近傍のひずみ分布より、外挿法を用いて磁気弾性応力拡大係数を算出した。SUS430の場合、応力拡大係数は、磁場の増大に伴い増大し、き裂長さと試験片厚さの比及び試験片長さと厚さの比が大きいほど顕著な磁場の影響を受ける。また、理論解析と実験では負荷条件等に違いがあるものの、応力拡大係数に及ぼす磁場の影響は、同一の傾向を示した。SUS316電子ビーム溶接材の場合についても同様な検討を行ったが、応力拡大係数に及ぼす磁場の影響は、ほとんど認められなかった。本研究は、強磁場利用機器の設計・安全性評価に資することを目的に、構造材料の破壊強度を示すパラメ-夕として有効な応力拡大係数に注目し、ひずみゲージを用いた磁気弾性応力拡大係数の解析方法を提案する他、応力拡大係数に及ぼす磁場の影響解明に関する実験的研究を行ったものである。得られた成果を要約すると以下の通りである。1.磁場内における非磁性平板の曲げ試験を行い、超音波・レーザー変位計およびひずみゲージを用いた変位・ひずみ計測結果に及ぼす磁場の影響を明らかにした。特に、ひずみ計測に及ぼす磁場の影響に関しては、ひずみゲージ、コーティング剤およびリ-ド線の種類を変えて検討を行い、磁場内における最適ひずみ計測方法を詳細に検討した。また、磁場内における軟磁性平板の曲げ試験を行い、変位およびひずみを計測し、変形挙動に及ぼす磁場の影響を解明した。2.貫通き裂を有する軟磁性平板の磁気弾性解析を行い、有効な試験結果を得るための試験片形状を決定した。3.平板表面に垂直な一様磁場内における貫通き裂(片側・両側縁き裂、中央き裂)を有する両端固定のフェライト系ステンレス鋼SUS430平板が試験片中央部に線状荷重を受ける場合について曲げ試験を行い、試験片中央部の変位およびき裂先端近傍のひずみ分布を計測した。ひずみ計測に関しては、ひずみゲージの枚数および設置位置を変化させて試験を行い、最適なひずみゲージ設置条件について検討した。4.計測したひずみ分布より、外挿法を用いて曲げモーメント拡大係数を算出し、磁場の影響を明らかにした。曲げモーメント拡大係数は磁場の増大に伴い増大し、き裂長さと試験片板厚の比が大きい程磁気弾性相互干渉は顕著になる。

SUS430の場合、応力拡大係数は、磁場の増大に伴い増大し、き裂長さと試験片厚さの比及び試験片長さと厚さの比が大きいほど顕著な磁場の影響を受ける。また、理論解析と実験では負荷条件等に違いがあるものの、応力拡大係数に及ぼす磁場の影響は、同一の傾向を示した。SUS316電子ビーム溶接材の場合についても同様な検討を行ったが、応力拡大係数に及ぼす磁場の影響は、ほとんど認められなかった。
ｉＰＳ細胞化技術を用いた白血病幹細胞の病態解明

ヒト白血病症例由来の腫瘍細胞より、iPS細胞を作製するため、レトロウイルス、sendai virus、episomal vectorを用いてOct3/4、Sox2、c-Myc、Klf4を同時に白血病細胞に導入し、iPS細胞へのリプログラミングを行った。この方法により、慢性骨髄性白血病(CML)、骨髄線維症(MF)などの骨髄増殖性疾患においてiPS細胞化に成功した。ストローマ細胞株との共培養法を用いて、ヒトiPS細胞から多能性の血液前駆細胞を誘導した。得られた血液細胞は元の腫瘍細胞の特性を有しており、原病のモデルとしての適格性を持つと考えられた。レトロウイルスを用いたiPS細胞の樹立では外来遺伝子がゲノムに挿入されてしまい、それにより腫瘍細胞の特性が変化してしまう可能性があるため、ゲノムに挿入されずにiPS細胞の樹立が可能であるepisomal vecterの系を用いてCML患者細胞由来iPS細胞(以下CML-iPS細胞と表記)に加え、骨髄線維症(MF)や本態性血小板血症(ET)などの骨髄増殖性疾患及び慢性骨髄単球性白血病(CMMoL)においてiPS細胞化に成功した。他の造血器腫瘍においても同様な方法によりiPS細胞の樹立を試みたが、現状では急性白血病症例においてはiPS細胞化に成功していない。造血器腫瘍細胞由来の場合は、さまざまなエピゲノムの変化により正常体細胞と比較してiPS細胞の樹立が困難である可能性があると考えられ、iPS細胞の樹立を促進することが知られている小分子化合物(バルプロ酸や酪酸など)の添加やshRNAによるp53経路の阻害を試みたが、依然として樹立には至っていない。さらにリプログラミングを促進する遺伝子としてLIN28, Glis1などの遺伝子群の追加導入によりiPS細胞の樹立を試みたが、不完全にリプログラミングされたコロニーを得るに留まった。そこで来年度は白血病の原因となる遺伝子異常そのものが、iPS細胞化を妨げる可能性もあるので、既知の遺伝子異常を持つものに関しては、それらをレンチウィルスによる誘導的なshRNAを用いて一過性に抑制することによりiPS細胞化を試みる。このようにして、病型に応じた最適なリプログラミング法を確立することを目指す。その他遺伝性の血液疾患であるRunx1遺伝子異常による家族性血小板異常症の患者の皮膚細胞からiPS細胞の樹立に成功した。レトロウイルスを用いたiPS細胞の樹立では外来遺伝子がゲノムに挿入されてしまい、それにより腫瘍細胞の特性が変化してしまう可能性があるため、ゲノムに挿入されずにiPS細胞の樹立が可能であるepisomal vecterの系を用いてCML患者細胞由来iPS細胞(以下CML- iPS細胞と表記)に加え、骨髄線維症(MF)や本態性血小板血症(ET)などの骨髄増殖性疾患及び慢性骨髄単球性白血病(CMMoL)においてiPS細胞化に成功した。さらにリプログラミングを促進する遺伝子としてLIN2 8, Glis1などの遺伝子群の追加導入によりiPS細胞の樹立を試みたが、不完全にリプログラミングされたコロニーを得るに留まった。その他遺伝性の血液疾患であるRunx1遺伝子異常による家族性血小板異常症(FPD)の患者の皮膚細胞からiPS細胞の樹立に成功した。FPD由来のiPS細胞から血小板の分化は著明に傷害されていたが、transcription activator-like effector nucleases (TALENs)を用いたRunx1の遺伝子変異の修正により、巨核球の産生は回復した。最初にヒト白血病・MDS症例由来の腫瘍細胞(以下、白血病細胞と表記)より、iPS細胞を作製するため、レトロウイルスを用いてOct3/4、Sox2、c-Myc、Klf4を同時に白血病細胞に導入し、3日後にMEFフィーダー上に継代、6日後からヒトES細胞培地で培養し、リプログラミングを行う。

この方法により、われわれは昨年度に樹立に成功したCML患者細胞由来iPS細胞(以下CML-iPS細胞と表記)に加え、骨髄線維症(MF)や本態性血小板血症(ET)などの骨髄増殖性疾患においてiPS細胞化に成功した。またレトロウイルスを用いたiPS細胞の樹立では外来遺伝子がゲノムに挿入されてしまい、それにより腫瘍細胞の特性が変化してしまう可能性があるため、ゲノムに挿入されずにiPS細胞の樹立が可能であるsendai virusの系を用いてCML患者検体よりiPS細胞の樹立に成功した。白血病iPS細胞からの造血細胞への誘導には、ES細胞で用いられている造血細胞への分化誘導方法を利用した。OP9細胞や10T1/2細胞などの間葉系細胞株との共培養法を用いて、ヒトiPS細胞から多能性の血液前駆細胞を濃縮する嚢状の構造物(iPS cell-derived sac)を誘導し、さらに内部の血液前駆細胞を解析する方法を用いた。得られた細胞は血液細胞のマーカーであるCD45と未分化マーカーであるCD34を発現していた。これらの細胞は造血コロニー形成能が認められ、bcr-ablの発現が確認されimatinibに対する感受性があり、原病のCMLのモデルとしての適格性を持つと考えられた。しかしながら誘導された血液細胞の中でCD34+CD38-CD90+の未分化な細胞集団はimatinibに対して抵抗性を示しCML幹細胞の特性を示した。今後このimatinib抵抗性の分子機構について検討する予定である。樹立したiPS細胞から白血病幹細胞が含まれると思われるCD34+CD38-CD90+の分画を分化誘導後にFACSにてソートした。慢性骨髄性白血病細胞由来のiPS細胞由来の上記細胞分画はimatinibに対して抵抗性を示しCML幹細胞の特性を示した。一方分化した細胞集団はimatinibに対して反応性が認められた。このようにiPS細胞から白血病幹細胞の性質を持つ細胞集団の誘導に成功している。CML由来iPS細胞からimatinib耐性という白血病幹細胞と同様な表現型を持つ細胞を誘導することができた。今後はその耐性機構の分子メカニズムついて検討予定である。慢性骨髄性白血病以外のiPS細胞からも白血病幹細胞の性質を持つ細胞集団の誘導を行い、白血病幹細胞の分子メカニズムについての検討を行う。また誘導した血液細胞はNOD/SCIDなどの免疫不全マウスへの移植実験を行い、造血細胞の再構築、特に白血病の再現が可能か検証を行う。現在のところ骨髄増殖性疾患以外の急性白血病症例においてはiPS細胞化に成功していない。造血器腫瘍細胞由来の場合は、さまざまなエピゲノムの変化により正常体細胞と比較してiPS細胞の樹立が困難である可能性があると考えられ、iPS細胞の樹立を促進することが知られている小分子化合物(バルプロ酸や酪酸など)の添加やshRNAによるp53経路の阻害を試みたが、依然として樹立には至っていない。さらにリプログラミングを促進する遺伝子としてLIN28, Glis1などの遺伝子群の追加導入によりiPS細胞の樹立を試みたが、不完全にリプログラミングされたコロニーを得るに留まった。
高圧凍結技法と相関アレイトモグラフィーで植物細胞内膜系の３次元超微形態を捉える

通常の化学固定で良好な光電子相関顕微鏡(CLEM)解析の結果を得ているERボディGFP及びペルオキシソームGFP発現株、エンドメンブレン系分子のSCAMP2-YFPやSYP41-YFP形質転換体シロイヌナズナの芽生え(発芽7-10日の根、葉)を用いて、高圧凍結固定・凍結置換を行った。アクリル系樹脂包埋のあとに、ダイヤモンドナイフを用いてウルトラミクロトームにより500nmまたは1000nmの準超薄切片を作製し、カバーガラスに貼付け、共焦点レーザー顕微鏡を用いて蛍光撮影を行った。いくつかのGFP退色防止剤等を含め、最も自家蛍光が少なく、蛍光色素の蛍光強度が強い処理条件を検討したが良好な結果を得られなかった。そこで、低pHに強い緑色蛍光タンパク質または赤色蛍光タンパク質RFPで標識したゴルジ体やエンドソームなどのエンドソーム系のコンストラクト作製および形質転換体の作製を進めた。RFP結合SCAMP2形質転換タバコ培養細胞を用いて、分泌に関与する小胞塊のCLEM解析を進めた。日立ハイテク社とともに、光顕で撮影した部位と同一箇所をFE-SEMで撮影し、正確かつ容易に画像が重ね合わせることができるCLEM解析システムMirrorCLEMの改良を進め、ソフトウェアのグラフィックユーザーインターフェイスを改良し、利便性を向上させた。これらの成果はオーストラリアで開催された国際顕微鏡会議(IMC19)や日本顕微鏡学会などで発表を行った。また、退色防止剤を用いた蛍光復帰によりCLEM法を国際誌に投稿した。一部の蛍光タンパク質を結合させた細胞内輸送系の形質転換体作製が遅れているが概ね順調に進展している。新しい高圧凍結装置を導入し、その技術検討が加わり時間を要しが、概ね順調に進展している。今までより3倍凍結面積が大きい試料を凍結固定できる新しい高圧凍結装置を用いて、シロイヌナズナなどの植物個体の凍結技術の検討を行う。Z軸方向の相関を取るのが難しいため、準超薄切片の蛍光撮影とFE-SEM観察での相関法を検討する。アライメントマークをつけたカバーガラス等用い、最新の共焦点レーザー顕微鏡で広域かつZ方向に撮影するとともに、FE-SEMでも連続切片を撮影するなど工夫する。100nmなど可能な限り薄い切片を作製し、最新の高感度共焦点レーザー顕微鏡により微弱な蛍光を検出かつ自家蛍光を取り除き、さらにFE-SEMで連続切片撮影することで細胞内膜系の3次元超微形態を明らかにする。通常の化学固定で良好な光電子相関顕微鏡(CLEM)解析の結果を得ているERボディGFP及びペルオキシソームGFP発現株、エンドメンブレン系分子のSCAMP2-YFPやSYP41-YFP形質転換体シロイヌナズナの芽生え(発芽7ー10日の根、葉)を用いて、高圧凍結固定・凍結置換を行った。いくつかのGFP退色防止剤等を含め、最も自家蛍光が少なく、蛍光色素の蛍光強度が強い処理条件を検討した。しかしながら、消失した蛍光はアルカリ処理や退色防止剤で復帰しなかった。そこで、低pHに強い赤色蛍光タンパク質RFPで標識したゴルジ体やエンドソームなどのエンドソーム系も用いて検討を進めるとともに、RFP結合SCAMP2形質転換体作製し、分泌に関与する小胞塊の可視化を進めている。日立ハイテク社とともに、光顕で撮影した部位と同一箇所をFE-SEMで撮影し、正確かつ容易に画像が重ね合わせることができるCLEM解析システムMirrorCLEMの改良を進め、ソフトウェアの改良や新しい治具を追加し、利便性を向上させた。切片が厚いほど蛍光強度は強くなるが、FE-SEM像は加速電圧にもよるが厚い切片ではZ軸方向に像が重なってぼやけた像として検出されるため相関が取りにくいことがある。そこで、100-200nmなど可能な限り薄い切片を作製し、高感度の最新の共焦点レーザー顕微鏡により蛍光を検出することで微弱な蛍光を検出でき、かつ自家蛍光を取り除くことができた。これらの成果はアメリカ顕微鏡学会や日本顕微鏡学会などで発表を行った。RFPなど蛍光タンパク質を結合させた細胞内輸送系の形質転換体作製を行えるよう分子生物実験系を立ち上げた。年度の途中に高圧凍結装置が故障し、新しいものに買い換えるトラブルがあったが、概ね順調に進展している。

日立ハイテク社とともに、光顕で撮影した部位と同一箇所をFE-SEMで撮影し、正確かつ容易に画像が重ね合わせることができるCLEM解析システムMirrorCLEMの改良を進め、ソフトウェアのグラフィックユーザーインターフェイスを改良し、利便性を向上させた。これらの成果はオーストラリアで開催された国際顕微鏡会議(IMC19)や日本顕微鏡学会などで発表を行った。また、退色防止剤を用いた蛍光復帰によりCLEM法を国際誌に投稿した。一部の蛍光タンパク質を結合させた細胞内輸送系の形質転換体作製が遅れているが概ね順調に進展している。新しい高圧凍結装置を導入し、その技術検討が加わり時間を要しが、概ね順調に進展している。新しい高圧凍結装置は今までより3倍凍結面積が大きいため、大きい試料を凍結固定することができる。これらの凍結技術の検討を行うとともに、準超薄切片の蛍光撮影とFE-SEM観察で相関が取りやすい方法を検討する。Z軸方向の相関を取るのが難しいため、共焦点レーザー顕微鏡で広域かつZ方向に撮影するとともに、FE-SEMでも連続切片を撮影するなど工夫する。光電子相関顕微鏡解析ソフトMirrorCLEMの改良をさらに進め、GUIの向上や位置合わせが容易にできるよう改良を進める。今までより3倍凍結面積が大きい試料を凍結固定できる新しい高圧凍結装置を用いて、シロイヌナズナなどの植物個体の凍結技術の検討を行う。Z軸方向の相関を取るのが難しいため、準超薄切片の蛍光撮影とFE-SEM観察での相関法を検討する。アライメントマークをつけたカバーガラス等用い、最新の共焦点レーザー顕微鏡で広域かつZ方向に撮影するとともに、FE-SEMでも連続切片を撮影するなど工夫する。100nmなど可能な限り薄い切片を作製し、最新の高感度共焦点レーザー顕微鏡により微弱な蛍光を検出かつ自家蛍光を取り除き、さらにFE-SEMで連続切片撮影することで細胞内膜系の3次元超微形態を明らかにする。
多様な話者性の制御を可能とする高品質なテキスト音声合成の研究

ある話者の音声を他の話者の音声へと変換する声質変換技術を用いることで、合成音声の特徴を容易に操作できる柔軟性の高い音声合成システムが実現できると見込まれる。声質変換では、少量の音声データから統計的に抽出された変換関数を用いることで任意の音声データに対するパラメータ変換が行われるが、既存手法の性能は不十分であり、得られる変換音声の品質劣化は大きい。この原因として、1)パラメータの時間変化に関する情報を使用していない、2)統計処理によりパラメータの過剰な平滑化が生じる、といった事が挙げられる。そこで,問題1)を解決するために、パラメータの静的特徴のみでなく動的特徴にも着目した変換法を提案した。さらに、問題2)を緩和するために、系列内変動という新たな特徴量を導入した変換法を提案した。従来法では統計処理として適切とは言い難いパラメータ変換処理が行われるが、提案法では尤度最大化基準に基づく変換処理が行われるため、数学的に取り扱いやすく、今後さらなる発展も十分に期待できる。実験的評価結果から、提案法は従来法と比較し、変換音声の音質、話者性を大きく改善できることを示した。また、本手法を実装したプログラムを、米国カーネギーメロン大学からフリーで公開されており世界中で広く使用されている音声合成用データベース作成ツールFestvoxに導入した。次期リリースにて本プログラムは公開される予定である。提案する統計的特徴量変換法を、調音特徴量からの音声合成、音声からの調音運動逆推定、非可聴つぶやきから通常音声への変換に対しても適用した。実験的評価により提案法の有効性を明らかにした。また、提案法を統計量ベーステキスト音声合成法における確率分布からのパラメータ生成に対しても適用した。実験的評価結果から、スペクトル・音源パラメータ生成においても提案法は有効であることを示した。ある話者の音声を合成する際には、得られる音声コーパスのサイズに適した音声合成法を用いることが重要である。極めて少量の音声データしか得られない場合には、他の話者の音声を所望の話者の音声へと変換する声質変換技術が有効であるが、その品質は不十分である。品質劣化をもたらす一つの要因として、特徴量パラメータ変換時に時間方向の相関を考慮していないことが挙げられる。この問題を解決するために、HMM音声合成にて用いられている動的特徴量を用いたパラメータ生成法を、混合正規分布モデルによるパラメータ変換法へ適用した。実験的評価により、提案法は従来法と比べパラメータ変換精度を改善できることを明らかにした。なお、本手法は声質変換のみならず、調音パラメータからの音声合成や音声からの調音パラメータ推定等にも用いることができる。そこで、これらの問題に対しても本手法の有効性を示した。一方、数百文以上の音声データが得られる状況では、素片選択を用いた波形合成法が有効である。その際に信号処理による韻律変形を施す必要性については、これまで十分な議論がなされていない。そこで、韻律変形の有効性についてコーパスサイズという観点から評価を行った。知覚実験結果から、コーパスサイズが2時間程度以下の際には韻律変形が有効であることを示した。さらに、物理尺度から知覚スコアを推定する実験式を用いることで、聴覚実験を行うことなく韻律変形の必要性を判断する枠組みを提案した。また、素片選択用コスト関数について知覚特性に基づく最適化を行うことで、合成音声のさらなる品質改善に成功した。変換スペクトルを用いた音声合成におけるさらなる品質改善を行うため、残差波形を統計的かつ定量的に抽出するアルゴリズムを考案した。今後、実験的評価を行う予定である。
ICAIにおける対象世界モデルとそれに基づく概念形成・知識獲得支援に関する研究

本年度は,自然科学・語学教育などを対象として,教材知識における対象世界モデルの表現の問題,ならびに対象世界モデルを用いた問題解決について検討し,以下に挙げる成果を得た.(1)高校化学において扱われる概念・知識の分類整理:市販の高校化学参考書・問題集などをもとに,化学系における物質・構造・作用・変化等を表す様々な概念と,それらの関係を表す知識について,どの様な観点から構成されているかに着目して事例研究を行った.その結果高校化学では,空間的・時間的なスケ-ルにより,一つの対象に複数の概念が対応することが確かめられた(例えば物質と,それを構成する原子・分子など).(2)高校化学の対象世界モデル表現とその利用:(1)に述べた事から,対象を様々なスケ-ルで捉えうる対象世界モデルの表現法を提案し,モデル上でのシミュレ-ション及び計算問題の求解への利用方法を示した.(3)英作文演習知的CAIにおける英文法モデル:英作文教育において学生との柔軟な対話,学生の理解状態のモデル化等に必須な英文法モデルの表現法を提案した.これは一種の対象世界モデルであると考えられるが,上記の自然科学系教科におけるモデルとは異なり,実世界を対象としないため,概念形成・知識獲得支援における対象世界モデルの役割についての一般的な知見を得る上で,極めて興味深い成果である.(4)システムの試作:以上の成果に基づいて,高校化学の問題演習システム,並びに英作文演習システムを設備備品費により購入したEWS上に試作した.本年度は,自然科学・語学教育などを対象として,教材知識における対象世界モデルの表現の問題,ならびに対象世界モデルを用いた問題解決について検討し,以下に挙げる成果を得た.(1)高校化学において扱われる概念・知識の分類整理:市販の高校化学参考書・問題集などをもとに,化学系における物質・構造・作用・変化等を表す様々な概念と,それらの関係を表す知識について,どの様な観点から構成されているかに着目して事例研究を行った.その結果高校化学では,空間的・時間的なスケ-ルにより,一つの対象に複数の概念が対応することが確かめられた(例えば物質と,それを構成する原子・分子など).(2)高校化学の対象世界モデル表現とその利用:(1)に述べた事から,対象を様々なスケ-ルで捉えうる対象世界モデルの表現法を提案し,モデル上でのシミュレ-ション及び計算問題の求解への利用方法を示した.(3)英作文演習知的CAIにおける英文法モデル:英作文教育において学生との柔軟な対話,学生の理解状態のモデル化等に必須な英文法モデルの表現法を提案した.これは一種の対象世界モデルであると考えられるが,上記の自然科学系教科におけるモデルとは異なり,実世界を対象としないため,概念形成・知識獲得支援における対象世界モデルの役割についての一般的な知見を得る上で,極めて興味深い成果である.(4)システムの試作:以上の成果に基づいて,高校化学の問題演習システム,並びに英作文演習システムを設備備品費により購入したEWS上に試作した.
除草剤分解液がマウス胎児及びメダカ卵に及ぼす影響

農薬の製剤についての安全試験は十分に行われているが、散布後に生成される分解生成物や残存の農薬原体などの複合毒性についてはほとんど知られていない。そこで我々はそのような混合物の対生物影響を知る目的で以下の実験を行い、興味ある結果を得た。試験薬剤としては広島県下で最も多く使用されている除草剤の一つであるジフェニルエ-テル系のクロルニトロフェン乳剤(CNP乳剤:市販品)を用いた。(1)マウス胎児に対する影響:CNP乳剤の約90%が分解するまで太陽光に暴露して得られた分解液及びCNP乳剤未分解液の0.05ml/10g Body Weightを妊娠マウスに妊娠第6日から第15日まで1日1回背皮下に投与した。1回のCNP投与量は1g/kgBWであった。妊娠第18日に開腹して着床数、胎児の数及び体重、外部及び骨格の形態を観察した。また自然出産した産児の体重を5週間にわたって観察した。得られた結果は以下の通りである。未分解液及び分解液区の平均胎児体重は対照に比較して有意に小さかった。分解液区では骨格異常の発生率が対照に比較して高かった。また産児の成長は分解液区及び未分解液区ともに対照区に比較して遅いことが認められた。(2)メダカに対する影響:CNP乳剤の未分解液、それに含有されるCNPの約50%が分解するまで太陽光に暴露して得られた分解液、あるいはCNP標準品液を桑実期のメダカ卵に5日間暴露し、孵化仔魚の数及び形態を観察した。更に成魚に対してそれらの試験液を24あるいは48時間暴露して、その生残数を観察した。また各々の試験液中のCNP濃度を暴露後3,6,12および24時間に定量し、その変化も併せて観察した。8ppmのCNPを含有する未分解液区、分解液区及び標準品液区ではメダカ卵の孵化率が対照区に比較して有意に低かった。異常孵化仔魚の発生率は8ppmのCNPを含有する未分解液区では顕著に高かった。また成魚に対する急性毒性は未分解液区で最も高かった。分解液区では試験液に残存するCNP濃度が急速に低下するためそれの毒性が正しく評価できなかった。以上の結果から、安全性が高いと言われて多用されているCNP乳剤の対メダカ毒性には無視できないものがあり、更にその分解液の対マウス胎児毒性にも無視できない毒性があることが指摘された。広島県下で最も多く使用されている除草剤の1つであるCNP乳剤について、メダカ及びマウスに対する影響を検討した。材料及び方法を以下13に示す。1.メダカ卵暴露実験:市販のヒメダガ成魚を室内飼育し産卵させた。

得られた卵を210、50、100ppmのCNPを含む乳剤液に各々受精後5日間暴露した後、脱素水道水でふ化するまで飼育し、ふ化率及びふ化、仔魚の形態を観察した。2.メダカ成魚暴露実験:市販のヒメダカを室内水槽で10日間馴致した後、20尾ずつ無作為に取り出し、5、10、20、40、80ppmCNPの乳剤液に48時間暴露し、生残率を求めた。3.妊娠マウス授与実験:CNP1g/kgあるいはオリーブ油(対照)1g/kgを妊娠マウスの背部皮下に妊娠第6日目から第15日目まで連続投与し、妊娠第18日目に開腹して胎仔を観察した。また自然出産した産児(対照区52尾CNP投与群65尾)についてそれらの体重を5週間にわたって観察した。これらの実験の結果、メダカ卵に対しては2ppmCNPの乳化剤液でもふ化率の低下及び異常仔実率の増加が認められた。成魚の急性毒性実験では40ppmCNP乳剤液でしその生残率が顕著に低下した。妊娠マウス投与実験では対照群の胎児体重に比較し、CNP投与群のそれは有意に小さかった。CNP投与群では対照区に比較して妊娠率は低く、死胚率及び骨格異常率は高かった。しかし、母獣の死亡、母獣当たりの生胎仔数、外形異常についてはその両者間に大きな相違は認められなかった。産児の成長観察実験では対照群に比較し、CNP投与群の体重は生下時では有意に大きかったが、第2週及び第5週では有意に小さかった。CNP投与群の産児体重が生下時で大きかったのは妊娠期間がその群で対照区で1日長かったことによるものと考えられる。本研究はCNP乳剤の分解液の毒性を検討するための基礎的知見を得るために行われたものである。今後CNP乳剤分解液を用いて同様な実験を行いそれらの結果を比較検討したい。市販のCNP乳剤(ジフェニルエ-テル系除草剤)の未分解液、その有効成分の約50%が分解するまで太陽光に暴露して得られた分解液、あるいはCNP標準品液を桑実期のメダカ卵に5日間暴露し、孵化仔魚の数及び形態を観察した。更に成魚に対してそれらの試験液を24あるいは48時間暴露して、その生残数を観察した。また各々の試験液中のCNP濃度を暴露後3,6,12および24時間に定量し、その変化も併せて観察した。得られた結果は以下のとうりである。(1)メダカ卵の孵化に及ぼす影響:孵化率は対照区(87%)に比較して8ppmのCNPを含有する未分解液区(31%)、分解液区(57%)では有意に低かった。(p<0.01)。また未分解液区及び標準品液区の孵化率はほぼ等しかったが、分解液区の孵化率はそれらに比較して有意に高かった(p<0.01)。(2)孵化仔魚に及ぼす影響:異常孵化仔魚の発生率は対照区では0%であったが、8ppmのCNPを含む未分解液区では65%と著しく高く、ついで標準品液区の13%、分解液区の4.7%であった。未分解液区のその発生率は他の二実験区のそれに比較して有意に高かった(p<0.01)。(3)成魚に対する急性毒性:4ppmのCNPを含む未分解液区及び標準品液では24時間後の生残率は各々60,47%であった。一方分解液区では24及び48時間後の生残率は各々100%で前二者に比較して高かった。(4)試験液中のCNP濃度の変化:未分解液及び標準品液では24時間後の試験液中のCNP残存率は60-70%であった。分解液のそれは10%以下であったが、減少分のCNPは試験容器壁に残存したことが認められた。以上の結果から、CNP標準品はメダカ卵及び成魚に対して未分解CNP乳剤とほぼ同等の毒性を示すことが明らかになった。
非病原性トリパノソーマの寄生戦略から探る病原性進化のダイナミズム

鹿児島県下で採取されたマタニ(Haemaphysalis hystricis)から検出されたトリパノソーマ原虫(KG1株)についてその生物学的、遺伝学的性状を検討した。本原虫は、HEK293T細胞をフィーダーとしてL929培地で培養が可能であったが、フィーダー細胞無しでは培養は不可能であった。また培養した原虫をダニ(Ornithodoros moubata)の体腔に注入し、一定時間後に臓器、ヘモリンフを回収し、塗抹染色標本を作製し、原虫を検索したところトリポマスティゴートあるいはエピマスティゴート様形態を示す虫体が検出できた。このことからツェツェバエで媒介されるトリパノソーマ種と同様のライフサイクルをダニ体内で保有していることが推察された。18および28sリボソームRMA遺伝子領域ならびにITS領域を解析し、他のトリパノソーマ、その他類縁種との系統解析を行った結果、病原性の高いトリパノソーマ種(T.brucei, T.simiae and T.congolense)とは系統発生的に離れており、Bodo, Crithidiaなど低無病原性のキネトプラスト目原虫と類縁であることが明らかにできた。KG1株をマウス、ウサギ、ヒツジに接種したが血液中での増殖は認められなかった。またT.evansiを抗原としてラマを免疫し、一本鎖抗体を含む抗血清を作製し、表面抗原(VSG)型が明らかに異なるT.bruceiライセートに対してウエスタンブロット解析を実施したが、VSG間の交差反応性は明瞭ではなかった。鹿児島県下でマダニ(Haemaphysalis hystrics)から分離されたトリパノソーマ原虫(KG-1株)の分類学的位置づけならびに哺乳動物に対する病原性を検討するため以下の実験を行った。本原虫は培養された原虫を実験動物(マウス、ラット、ウサギ)ならびに中動物(ヒツジ)の静脈内、腹腔内に接種し、病原性を調べた。接種後1-2ヶ月にわたり末梢血液中原虫ならびに血液からの原虫DNAのPCR増幅で感染性を検討したが、これらの哺乳動物種に対する感染性は確認できなかった。さらにマダニによるトリパノソーマ原虫の媒介性(機械的、生物学的)を検討するため、マダニ(Ornithodoros moubata)に血流型Trypanosoma congolenseを接種し、ヘモリンフを定期的に採取し、その中の原虫を形態学的に観察しところ、一定期間原虫が確認でき、昆虫型(epimastigote)に形態が変化していた。KG-1株の分類学的位置づけはsmall subunit ribosomal RNA遺伝子ならびにITS部位をPCRで増幅し、それら塩基配列を決定することで検討した。その結果、非病原性トリパノソーマの一種であるT.lewis(ラット由来)などと近縁であるが新種である可能性が高いと推定できた。今後本原虫の哺乳動物の自然宿主を明らかにするため、前記動物種以外に接種して感染性を明らかにする必要がある。特に犬あるいはいのししが本マダニの好適宿主であることから、これらを中心に検討を進める。
わが国における生鮮果実・果実加工品の海外販路拡大に関する計量的・実証的分析

本研究課題では、わが国における生鮮果実・果実加工品の海外販路拡大に関して、計量的かつ実証的に分析した。分析の結果、下記の諸点が明らかにされた。第1章では、栃木産にっこりととちおとめが、香港やバンコクの如何なる購買層に評価されるのか、プロビットモデルを推計し、考察した。まず、香港・バンコクにおける国産ナシ品種と国産イチゴ品種の認知度は非常に低かった。今後、栃木産にっこりととちおとめ輸田する際は、輸田専用パッケージ等による品種のイメージアップを図る必要があるだろう。そして、とちおとめは香港では大きさが、バンコクでは香りが評価された。そして、にっこりは中高年層に、とちおとめは女性に評価が高かった。最後に、香港でのにっこりの価格は中国産ナシの4倍、バンコクでのとちおとめの価格はタイ産イチゴの7倍の価格差があった。そして、香港ではにっこりは8割弱が、とちおとめも7割弱が、調査当日の小売価格または若干高くても購入するという回答が得られた。ただし、バンコクでは8割弱が、調査当日の店頭小売価格ならば購入しないという結果となった。そして、プロビットモデルの推計結果から判断するならば、今後の香港でのとちおとめ輸田は、中高年層をターゲットとし、食味評価の高い女性を如何に購買層に取り入れるかが輸出拡大のカギとなるだろう。第2章では、伊勢丹スコッツ店における栃木産巨峰の輸出動向とその来客の消費意識について考察した。同店において、日本産ブドウの評価自体は非常に高いが、栃木産巨峰の低価格性が求められた。ただし、日本人客の多い同店のようなケースでは、高価な日本産巨峰は安価なオーストラリア産と棲み分けられていた。シンガポール人の味覚や安全性の拘りも日本人とは異なっているのだが、シンガポール人による日本産巨峰の評価は非常に高い。そのため、今後の輸出は、早急に価格改定するというよりは、脱粒(巨峰の粒が茎から落ちること)・茎枯れ(鮮度が落ちて茎が枯れる)しないといった鮮度の向上や種なし巨峰販売といった手法で、ターゲットとする販売層(消費者層)を明確に意識したマーケティング活動が不可欠となるだろう。そして、同店の栃木産巨峰の販売拡大のカギとなるのは、日本人以外の巨峰購入のリピーターを如何にして拡大するかにかかっている。同店は、日本人客も比較的に多いのであるが、実際に購入回数が多い客は日本人が圧倒的に多く、大多数のシンガポール人に認識されるには至っていない。今後は、低価格性や甘味、そして鮮度を意識した栃木産巨峰のイベント等によって、シンガポール人に選好される巨峰販売を実施する必要があるだろう。第3章では,青森産混濁リンゴジュースの海外輸出拡大を目的とし,海外消費者の嗜好性を考察した。そして青森産が如何なる購買層に評価されるのか,その要因を分析した。まず,海外消費者は必ずしも国産品や品種に拘りはないが,無添加を求める者が7割と多かった,青森産は5割に評価された。次に,消費嗜好を属性別に検定した結果,国産品は高所得国の人に,単品種は若い人に好まれたが,単品種や混濁ジュースは高所得国以外の人に拘りはなかった。また,品種問の評価が最も高かったのはふじであり,高所得国以外の若い人に評価された。他方,シナノゴールドは年齢の高い人に,むつは食料の知識が豊富なバイヤーに評価された。更に,個別評価項目と総合評価との関連性を考察した結果,色が最も評価され,糖度と同様に,香りも評価された。ただし,青森産の購入意思を調査した結果,購入意思がない人が3割弱を,購入意思はあるが価格プレミアムを感じない人が6割を占めた。他方,ふじ等とシナノゴールド等の価格差が妥当である人は3割弱に過ぎず,評価の高いシナノゴールドでも価格差が妥当でない人が4割弱を占めた。加えて,購入意思と個人属性の関係を考察した結果,年齢が高く,大卒でアジア諸国の人ほど価格プレミアムを感じていなかったが,特に大卒やアジア諸国の人はその傾向が強かった。アジア諸国に輸田する際は十分な価格調査と適切な販売チャネルの選択が必要となるだろう。第4章ではとちおとめの香港輸田と消費者意識について考察した。一田YATAでは,日本産の購入経験は8割弱と多かった。そして日本産の購入経験者は日本産を他国産より高く評価した。他方,購入未経験者の方が日本産を評価するため,今後は購入未経験者にも購入してもらえる日本産を提供する必要がある。他方,香港人の日本産に対する階級イメージは大粒だが,必ずしも大粒を好むわけではなかった。あまおう等の大粒日本産と棲み分ける中・小粒の検討も必要だろう。そして,同店でのとちおとめ販売では,世帯員の少ない家庭では鮮度が,年配者には安全性が,中・高所得層には安全性と有機栽培が求められた。日本産の主たる購買層である中・高所得層に安全・安心が求められた。とちおとめ輸出には不可欠な改善要望指標といえる。今後は香港人富裕層の要望に応えた輸出対応を目標に,他の国内外産の購買層と棲み分けができるような長期的な輸出計画が必要となるだろう。第5章では,青森産リンゴのヘルシンキ輸出の可能性を購買選択行動から検討した。

まず,北欧の経済状況とリンゴの需給動向を総合的に考察した結果,人口は小規模ながら,国民所得や平均年収,購買力平価も高かった。そして,1人当たりのリンゴ供給量も極めて多いため,リンゴの輸出先国としては期待が持てる結果となった。続いて,ヘルシンキ市内の消費者の購買選択基準を考察した。その結果,回答者は糖度や鮮度,果汁,低価格性,有機栽培を評価した。特に回答者は日本産を高く評価した。青森産の小売価格を日本国内の価格水準に近づけることができれば輸出は期待できる。他方,大玉リンゴは参加者から評価されたが,一般参加者と学生参加者とではその選好に違いが見られた。一般的に価格提示後も同じ品種を選択する確率は高いのだが,高価なときから安価なふじへ品種選択する参加者も多く,輸田には高価格がネックになる可能性が高い。大玉リンゴの購買層は富裕層であるが,富裕層に選択されるのはときのみであった。高級品種は富裕層に,大衆品種は一般消費者といったように品種に応じた販売チャネルの再考が必要だろう。最後に,ヘルシンキへの輸田リンゴの大きさを再考した。コンジョイント分析の推計結果をみても,回答者は1果75mm以下のリンゴを望んでいる。今後は,大玉を好む北欧の富裕層,小玉を好む一般消費者といったように,大きさにも応じた輸出チャネルの再考も必要だろう。本研究課題では、わが国における生鮮果実・果実加工品の海外販路拡大に関して、計量的かつ実証的に分析した。分析の結果、下記の諸点が明らかにされた。第1章では、栃木産にっこりととちおとめが、香港やバンコクの如何なる購買層に評価されるのか、プロビットモデルを推計し、考察した。まず、香港・バンコクにおける国産ナシ品種と国産イチゴ品種の認知度は非常に低かった。今後、栃木産にっこりととちおとめ輸田する際は、輸田専用パッケージ等による品種のイメージアップを図る必要があるだろう。そして、とちおとめは香港では大きさが、バンコクでは香りが評価された。そして、にっこりは中高年層に、とちおとめは女性に評価が高かった。最後に、香港でのにっこりの価格は中国産ナシの4倍、バンコクでのとちおとめの価格はタイ産イチゴの7倍の価格差があった。そして、香港ではにっこりは8割弱が、とちおとめも7割弱が、調査当日の小売価格または若干高くても購入するという回答が得られた。ただし、バンコクでは8割弱が、調査当日の店頭小売価格ならば購入しないという結果となった。そして、プロビットモデルの推計結果から判断するならば、今後の香港でのとちおとめ輸田は、中高年層をターゲットとし、食味評価の高い女性を如何に購買層に取り入れるかが輸出拡大のカギとなるだろう。第2章では、伊勢丹スコッツ店における栃木産巨峰の輸出動向とその来客の消費意識について考察した。同店において、日本産ブドウの評価自体は非常に高いが、栃木産巨峰の低価格性が求められた。ただし、日本人客の多い同店のようなケースでは、高価な日本産巨峰は安価なオーストラリア産と棲み分けられていた。シンガポール人の味覚や安全性の拘りも日本人とは異なっているのだが、シンガポール人による日本産巨峰の評価は非常に高い。そのため、今後の輸出は、早急に価格改定するというよりは、脱粒(巨峰の粒が茎から落ちること)・茎枯れ(鮮度が落ちて茎が枯れる)しないといった鮮度の向上や種なし巨峰販売といった手法で、ターゲットとする販売層(消費者層)を明確に意識したマーケティング活動が不可欠となるだろう。
上眼瞼ミュラー筋の構造的特徴と刺激伝達機能に関する組織化学的研究

ミュラー筋は眼瞼縁に存在する平滑筋組織である。同筋は交感神経刺激により収縮する。同筋は上眼瞼を挙上する筋であるとともに、骨格筋で動眼神経支配である上眼瞼挙筋を収縮させる機械刺激受容器官としても働いている。本研究では、眼瞼ミュラー筋は血管や膀胱と同じ中胚葉由来平滑筋細胞で構成されること、その平滑筋の間にはギャップ結合が存在すること、およびその平滑筋組織内には、β2を除いて、β1、α2、α1の順でアドレナリン受容体が強く発現していることを組織学的に証明した。【目的】眼瞼ミュラー筋組織内に発現する機械刺激受容チャネル、ギャップ結合やカハール介在細胞などの刺激伝達機構、神経刺激の受容体、平滑筋細胞の細胞骨格、神経線維に関して組織化学的手法を用いた同定を行う。【方法】解剖学実習用検体10体の上眼瞼標本。機械刺激受容チャネル(TRPV1, TRPV2, TRPV4, TRPV6)、ギャップ結合(Cx32, Cx36, Cx43, Cx45)、カハール介在細胞(cKit)、アドレナリン受容体AR(α1, α2, β1, β2)、細胞骨格(ビメンチン、サイトケラチン、平滑筋アクチン)、神経線維(S100, TH: tyrosine hydroxylase)に対する抗体を一次抗体とした免疫組織化学染色を行った。【結果】ミュラー筋平滑筋細胞に発現していたものは、TRPV2、TRPV4、TRPV6、Cx32、Cx36、Cx43、ARα1、ARα2、ARβ1、ビメンチン、平滑筋アクチン。ミュラー筋組織内に、cKit陽性細胞、多くのS100陽性神経線維、疎らなTH陽性神経線維を認めた。TRPV1、Cx45、ARβ2、サイトケラチンは陰性であった。【考察】眼瞼ミュラー筋は血管や膀胱と同じ中胚葉由来平滑筋細胞で構成される。その平滑筋同士はギャップ結合で刺激が伝達される。ミュラー筋内には有髄神経が多く分布する一方、交感神経節後線維はわずかである。平滑筋細胞の間隙には他の内臓平滑筋同様にカハール介在細胞が存在し神経末端と平滑筋細胞の間の刺激伝達に寄与している。ミュラー筋平滑筋にはアドレナリンα1他の受容体が分布する。ミュラー筋平滑筋には機械刺激受容チャネルが存在する。眼瞼に加えられた進展や温度などの機械刺激はミュラー筋平滑筋細胞膜上のチャネルを開き、細胞内カルシウムイオン濃度を上昇させ、ミュラー筋を収縮させると考える。ミュラー筋はこれらの構造を介して物理刺激を受容伝達している。【目的】眼瞼ミュラー筋平滑筋には機械刺激受容チャネルが存在し、眼瞼に加えられた機械刺激を受容する。その刺激は、ギャップ結合やカハール介在細胞などの刺激伝達機構を介して涙腺神経内の感覚神経に伝達される。さらに、ミュラー筋を収縮させる交感神経アドレナリン受容体が各種存在している。ミュラー筋内の各種交感神経受容体の発現を同定すると共に涙腺神経の各部においてそれらの受容体がどのように存在するか、組織学的に検索した。【方法】5個の正常上眼瞼組織(年齢76-92歳(82.6±6.2)、男3、女2)を緩衝ホルマリン固定、パラフィン包埋の後、水平軸位断で連続切片を作成した。アドレナリン受容体AR(α1, α2, β1, β2の各サブタイプ)、平滑筋アクチンSMA、有髄神経線維S100に対する抗体を一次抗体とした免疫組織化学染色を行った。【結果】ミュラー筋平滑筋組織内には、β1とα2の受容体が強く発現していた。α1はそれらに次いで発現していた。β2の発現は見られなかった。涙腺組織内にある太い涙腺神経束には、β1, α2, α1の順で神経線維が密に存在した。ミュラー筋組織内の神経束では、β1, α2は涙腺内同等に存在したが、α1はいくらか疎らとなっていた。【考察】眼瞼組織において、アドレナリン受容体は、涙腺組織、ミュラー筋、結膜組織、血管壁などいたるところに、それぞれのサブタイプが部位によって異なる組成で存在している。涙腺神経からの神経束も末梢に行き、その終末組織に近づくにつれて、線維の組成も変化するものと思われた。平成26年度に、ミュラー筋内のギャップ結合関連コネクシン、上皮系マーカーであるサイトケラチン、中胚葉マーカーであるビメンチンの存在について検索できたのに引き続き、平成27年度には、ミュラー筋内のアドレナリンレセプター各種の存在の度合いを明らかにすることができた。本成果を日本形成外科学会基礎学術集会で発表できた。また、本研究と関連した内容がPLoSOne誌上に掲載された。【目的】眼瞼ミュラー筋には機械刺激受容チャネルが存在し、眼瞼に加えられた機械刺激を受容する。