hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
地域高齢者見守りに対する住民意識向上のための教育啓発プログラムの効果評価

本研究では、地域高齢者への見守りに対する住民意識の向上を図る教育啓発プログラムを開発し、その効果について評価を行った。プログラムは、「認知症高齢者への見守り活動」や「高齢者の地域見守りの必要性と意義」をテーマとしたグループワーク・セッションであり、独自に作成した視聴覚教材を用いた。延べ94名の住民に開発したプログラムを試行した結果、住民の理解度は高く、地域高齢者の孤立を防ぐために社会資源の活用や専門機関との連携などの必要性に関する意見を住民から引き出すことができた。今後は本プログラムの効果について住民の地域高齢者見守り行動の向上や虐待・孤独死等の発生状況に着眼して評価を行う必要がある。地域住民のコミュニティ意識を向上させ、「適当な世話焼き」が可能な人間関係づくりは地域高齢者見守り支援には重要である。また、地域住民に対して、高齢者見守りを促進するための意識を啓発する教育プログラムを行うことは必要であり、住民研修が各地域で展開されているが、学術的なエビデンスは十分に蓄積されてはいない。本研究の目的は地域高齢者見守りへの住民意識の向上を図ることをねらった参加型教育啓発プログラムを作成し、その効果を評価することである。また、そのことによって地域住民が高齢者見守りの必要性を主体的に考え、地域見守り活動の活性化につながると考える。平成24年度は、平成23年度に作成した地域見守りの考え方を知ることを目的とした視聴覚教材「ご近所が気づく認知症のサイン」を使ったプログラムを地域民生委員39名に試みた。その結果、「登場人物の会話内容はわかりやすかった」「近隣で実際に起こりそうな内容だと思った」かという質問については「とてもそう思う」者は66.7%、「ややそう思う」者は30.8%であった。また、「認知症高齢者への地域見守り支援について理解できた」かという質問については「とてもそう思う」者は61.5%、「ややそう思う」者は33.3%であった。以上より、作成した教材については参加者にとって理解しやすく一定の効果があることが示された。地域住民のコミュニティ意識を向上させ、住民間において適当な「世話焼き」は可能な人間関係を形成することは、超高齢社会であるわが国では大変重要である。地域住民に対して、高齢者見守りを促進するための意識を啓発する教育プログラムを行うことが必要なため、地域見守りを促進する住民に対する研修が各地域で展開されているが、学術的なエビデンスは十分に蓄積されているとはいえない。本研究の目的は、地域高齢者見守りへの住民意識の向上を図ることをねらった住民参加型教育啓発教材とプログラムを作成し、その効果を評価することである。また、そのことによって、地域住民が高齢者見守りの必要性を主体的に考え、地域見守り活動の活性化に資することができると考える。本研究では、住民が行う地域見守り支援について1認知症初期症状を示す高齢者への対応(映像教材)、2セルフネグレクト状態にある高齢者への対応(シナリオ教材)、3閉じこもり高齢者への対応(映像教材)に関するプログラムを作成し、見守り支援に興味を持つ地域住民55名を対象者として、プログラムを試験的に提供した。参加者への発言等を定質的に分析した結果、1近隣のつながりが低下する中、地域で起きていることを発見するために社会資源を活用する必要性、2困難な問題には地域包括支援センターや医療機関、行政などが連携し、専門職は介入できるように住民からつなげる必要性などが示された。以上より、本研究で作成したプログラムは一定の効果が示されたと考える。地域住民のコミュニティ意識の活性化と「適度な世話焼き」が可能な人間関係づくりは地域高齢者見守り支援には重要である。また、地域住民への高齢者見守りのための意識を啓発する教育プログラムの必要性はあり住民研修が地域で展開されているが、学術的なエビデンスは十分に蓄積されてはいない。本研究の目的は、地域高齢者見守りへの住民意識の向上を図る参加型教育啓発プログラムを作成し、その効果を評価することである。そのことは、地域住民が高齢者見守りの必要性を主体的に考え、地域見守り活動の活性化につながると考える。平成23年度は、地域住民における高齢者見守り意識向上のための教育啓発プログラムの枠組みを作成した。本プログラムはその内容は「(1)地域見守り支援の必要性と意義を知る」、「(2)地域見守りの考え方を知る」、「(3)地域見守り訪問の実際を知る」、の3回から構成される。また、プログラム第2回目の「(2)地域見守りの考え方を知る」で活用する視聴覚教材を作成した。この視聴覚教材は、地域包括支援センターなどで高齢者見守り支援を行っている保健福祉専門職等からコンサルテーションを受けながら作成したものである。

その内容は、認知症の初期症状として、徘徊や物盗られる妄想を呈した高齢者の変化に近隣住民が気づくというシナリオを作成し、媒体化を図った。なお、教材の長さは約10分であり、タイトルは「ご近所が気づく認知症のサイン」というものである。今後は作成したプログラム枠組みにしたがって、教材の追加を行うことを計画している。さらには、地域住民の研修に教材等を用いて、プログラムの理解度などの面から効果を評価する予定である。平成24年度は、平成23年度に作成した教材について効果評価を行うことはできたが、追加教材の作成を行うことができなかった。平成25年度は効果評価結果をふまえて、さらなる教材を作成することを予定している。以上の経過から、上記区分どおり達成度を評価する。平成23年度中にすべての視聴覚教材を完成させ、平成24年度に効果評価を行う予定であったが、プログラム「(3)地域見守り訪問の実際を知る」で活用する予定の視聴覚教材の作成が残っている。教材の大まかな素案は、保健福祉専門職のコンサルテーションを受けながら作成できているが、平成24年度前半にて、教材を完成させ、平成24年度後半においてプログラム評価を行う予定である。以上の経過から、上記区分どおり、達成度を評価する。進捗状況はやや遅れているが進行は十分に取り戻せることは可能である。今後新たな教材について、平成24年度に実施した効果評価分析結果に基づいて作成することを予定している。進捗状況について、やや遅れているが、進行は十分取り戻せることは可能である。教材作成を着実に進めているとともに、研究フィールドとなる地域と良好なコミュニケーションを図りながら、プログラム評価を行う準備を進めることが重要である。既に、数年前より、大阪府下のいくつかの地域で見守りに関する住民研修や住民組織づくりなどに関わっており、研究遂行の見通しは明確にたっていると予測する。次年度も今年度と引き続き、教材作成等に研究費を使用する。また、効果評価分析に関する結果について、成果発表や追加分析などを行うことを予定しており、これらの活動に研究費を使用する予定である。次年度も今年度と引き続き、教材作成に研究費を使用する。また、作成したプログラム試案について、実際に地域住民を対象に展開するため、効果を評価するために、展開状況について、録音などを用いて記録する予定である。それらの逐語化にあたってのテープ起こしや資料整理などに研究費を使用することを計画している。
血管内皮前駆細胞の増幅・分化ニッチを構築する血液細胞の同定とその分子機構の解明

ヒト末梢血のCD34+血管幹細胞の血管内皮前駆細胞への分化・増幅においてCD34-細胞との直接的細胞間クロストークが重要であること、さらに、CD34-細胞分画中の単球(CD14+細胞)及びTリンパ球(CD3+細胞)の当該事象における役割について、CD3+細胞よりもCD14+細胞に発現するNotchリガンド及びCD34+細胞に発現するNotchリセプターの細胞間クロストークが重要であることを突き止めた。この結果は、単球とCD34+血管幹細胞のNotchリセプター・リガンド系による血管再生機能を担うニッチの形成という新規な血管生物学的分子機構を世界で初めて解明したことになる。末梢血単核球中の未分化血管内皮前駆細胞(Endothelial Progenitor Cell = EPC)の増幅・分化培養による評価系開発に成功した(特願第2012ー218206号)。本培養系を用いて、末梢血単核球中CD34+細胞分画の未分化EPCの分化、増幅に対するCD34-細胞分画の細胞間クロストークにおいてNotchシグナルの関与を探索した。成果として、1)幹・前駆細胞の分化・増幅に関係するNotchシグナル抑制剤のγsecretase inhibitor添加した末梢血単核球の本培養においてEPC分化増幅能の抑制が認められ、Notchシグナル系が重要であることが判明した。2)次に、Jagged-1(Jag-1)またはDelta like-4(DLL4)の中和抗体を添加し末梢血単核球のQQ培養を実施した。Jag-1抗体はEPCの増幅よりも分化を抑制し、DLL4抗体は分化よりも増幅をそれぞれ抑制した。3)CD34-細胞分画の中で単球(CD14+細胞)、リンパ球(CD3+細胞)、その他の細胞(CD34-/CD3-/CD14-細胞)の各細胞群とCD34陽性細胞の共培養を行い、EPC分化、増幅における責任細胞群を同定した。結果、CD14+細胞との共培養系においてCD34+細胞の機能性EPCコロニーが著増した。この結果は、EPCの分化・増幅能においてCD34細胞とCD14細胞との細胞間クロストークが存在することを意味する。以上の結果から、CD34+細胞のEPC増幅、分化において単球系の貢献が重要であり、その機構としてCD34+細胞のNotchリセプター及び単球系のJag-1やDLL4リガンドの発現が想定される。次年度以降は、CD34+細胞のEPC増幅・分化におけるCD34+細胞と単球系のNotchシグナルの重要性を検証する。考察;単球及び未分化EPCにはNotch ligand及びreceptorが発現しており、各Notch ligand単独での効果について、Jagged-1については、発現細胞も少なく不明であったが、DLL-4は未分化EPCの分化抑制的に増幅促進し、DLL-1は未分化EPCの分化は抑制せずに増幅を促進することが示唆された。方法と結果;ヒト末梢血単核球由来EPC増幅・分化促進培養細胞のflow cytometryによる解析の結果、7日間培養期間中のNotch ligandの発現について、全単球中のJAG1、DLL1、DLL4を発現する単球の割合は、いずれも3日目が最高となったが、JAG1、DLL4の0.5%、3.4%に対して、DLL1が35.2%と著しい高値を示した。また、CD34+未分化EPCと各LigandのRNA干渉を目的としたshRNAレンチウイルスを導入したCD14+細胞を各々共培養し、培養細胞のEPCコロニーアッセイを実施した。JAG1及びDLL4のshRNA導入群では、対照群に比較して相違は認めなかった。DLL1のshRNA導入群では、対照群に比較して、EPCの分化が12.5%に、EPCの増幅が44.6%まで抑制された。CD34+細胞は、Notch-1 (29.4%)とNotch-2 (27.1%)を発現しており(前年度の結果)、CD34+細胞からのEPCへの分化・増幅において、単球に発現するNotchligand (DLL1)とCD34+細胞のreceptorのNotch ligand/receptor系による細胞間クロストークが重要であることが判明した。考察及び展望;本研究は、血液細胞間クロストークによるヒトEPCの分化・増幅機構を世界で初めて解明した点、当該のNotchシグナル活性化によるヒトEPCの分化・増幅促進効果による血管再生療法の開発に繋がる点において意義深い。1)ヒト末梢血に含まれる単球の未分化EPCの増幅・分化に及ぼす細胞間分子機構において、単球に発現するNotch ligand及び未分化EPC(CD34+細胞)に発現するリセプターを同定した点。2)各Notch ligandの未分化EPCの増幅・分化活性に果たす役割を検出できた点。

以上の成果により、最終年度の実験計画が下記のように明確になった点において、最終年度は予定通り研究を遂行できると考えられる。血管再生2)EPCの分化、増幅が抑制されたNotch ligandについて、同様にQQ培養を実施し、ヌードマウスの下肢虚血モデルに移植する。レーザードップラーによる血流改善評価を実施し、さらに、組織学的に血管再生の定量的評価を実施する。以上により、特にCD14+細胞のNotch ligand-receptorシステムを介した単球のEPCの分化、増幅に貢献する機能を解明する。EPC (CD34+細胞)の分化・増幅におけるCD34-細胞中の単球(CD14+細胞)の促進効果を見い出した点、EPC (CD34+細胞)の分化・増幅における細胞間機能性分子としてNotchシグナルの重要性を見い出した点、以上は、今後の研究計画遂行における基盤研究成果であり、次年度以降の円滑な研究計画の実施に繋がると考えられる。1)平成26年度は、EPC増幅・分化における責任細胞の単球(CD14細胞)と未分化EPCのCD34+細胞間のNotchシグナルを探索する。末梢血単核球より分画採取したCD14細胞におけるNotchリガンド(Jag-1、DLL4及びDLL1)、CD34+細胞におけるNotchリセプターの発現を定量的PCRやFlow Cytometryにより確認する。Jag-1、DLL4またはDLL1のsiRNAを導入したCD14細胞とCD34+細胞の共培養、あるいはこれらのNotchリガンドの各中和抗を添加したCD14細胞とCD34+細胞の共培養を実施し、CD34+細胞のEPC増幅・分化能抑制効果を検討する。2)平成27年度は、Jag-1、DLL4またはDLL1のsiRNAを導入したCD14+細胞とCD34+細胞の混合細胞群、または共培養細胞群をBalb/cヌードマウスの下肢虚血モデルを作成し、虚血下肢に移植することにより、その血管再生能を生理学的、組織学的に対象細胞移植群と比較する。3)以上の研究により、EPC増幅・分化に寄与する責任細胞分画の単球とCD34+細胞のNotchリガンド・リセプターシグナルによる細胞間クロストークの重要性が証明され、本研究課題の目的達成が可能となる。
インスリン非依存性の糖取り込み能に及ぼす運動の急性及び慢性効果

1.実験動物のインスリン非依存性の糖取り込み能は、一過性の持久的運動(分速15m、90分間、トレッドミル走行)後に変化しなかったが、5週間の持久的トレーニング(1日60分、週4日、分速15-25m)で有意に高まった(Glucose infusion rate;コントロール群:6.5±0.8ml/kg/min、トレーニング群:8.5±1.5ml/kg/min,P<0.01)。2.一般健常者を対象として、一過性の軽運動(乳酸閾値強度、60分間)終了25分後に静脈糖負荷試験を行った結果、Insulin sensitivity(S_1:インスリン依存性の糖取り込み能の指標)は変化しなかったが、Glucose effectiveness(S_G:インスリン非依存性の糖取り込み能の指標)が有意に増加した(Control0.016±0.002,Exercise0.025±0.002,min^<-1>,P<0.05)。この結果は、一過性の軽運動が耐糖能の改善にかなり有益である可能性を示唆するものである。3.健常男性8名(18-25歳)を対象として6週間の自転車エルゴメータートレーニング(乳酸閾値強度,60分/回,5回/週)を行った結果、S_Gが有意に高まった(トレーニング前:0.018±0.001,トレーニング後:0.023±0.001,min^<-1>,P<0.05)。同様にS_1もトレーニング後に有意に増加した。本研究の結果から、インスリン作用を介する糖取り込み能だけでなくインスリン作用を介さない糖取り込み能も改善させる乳酸閾値強度の運動トレーニングが,2型糖尿病の予防に有効だと考えられた。4.臨床現場で簡易に、精度良く糖尿病患者の体力を評価出来る運動負荷テスト(ステップ台を用いたテストと小型歩数計を用いたテスト)を考案し、これらの運動テストで9割以上の糖尿病患者の乳酸閾値の判定が可能であることが分かった。これらの運動負荷テストは、糖尿病患者の有酸素性体力の評価、運動処方の作成に有用であると考えられた。インスリン作用を介さない糖の取り込み能に及ぼす運動の急性及び慢性効果をラットを用いて検討した。インスリン作用を介さない糖の取り込み能は、ソマトスタチンの持続投与下でグルコースクランプを施行し、単位体重あたりのグルコース注入速度(Glucose infusion rate:GIR,ml/kg/min)で評価した。その結果、GIRは1回の持久的運動後、変化しなかったが、5週間の持久的トレーニング(週4回、分速1525m/min、1日60分間)後、有意に増加した(コントロール群,n=8:6.5±0.8mg/kg/min,トレーニング群,n=7:8.5±1.5mg/kg/min,P<0.01)。さらに、一般健常人(n=3)を対象に、インスリン作用を介さない糖の取り込み能に及ぼす運動の急性効果を検討するために、乳酸閾値強度で60分間の自転車運動を行った直後に静脈糖負荷試験を実施した。インスリン作用を介さない糖の取り込み能は、ミニマルモデル解析で得られるGlucose effectiveness(SG)を用いた。その結果、SGは1回の持久的運動後、3名ともに増加した(運動前の平均値:0.0122min-1,運動後の平均値:0.023min-1)。この急性効果は、我々が以前報告した持久的鍛練者のSGに匹敵するものであり、耐糖能低下者に対してもこのような運動の急性効果が認めれるなら、運動と食事のタイミングを考慮した運動処方せんの作成に有用な情報となるものと思われる。

本研究の結果から、インスリン作用を介する糖取り込み能だけでなくインスリン作用を介さない糖取り込み能も改善させる乳酸閾値強度の運動トレーニングが,2型糖尿病の予防に有効だと考えられた。4.臨床現場で簡易に、精度良く糖尿病患者の体力を評価出来る運動負荷テスト(ステップ台を用いたテストと小型歩数計を用いたテスト)を考案し、これらの運動テストで9割以上の糖尿病患者の乳酸閾値の判定が可能であることが分かった。これらの運動負荷テストは、糖尿病患者の有酸素性体力の評価、運動処方の作成に有用であると考えられた。また、1例ではあるが高血圧患者(男性,38歳)を対象に同様のプロトコールで行った結果、S^Gは変化しなかったが、S^Iは21%増加した(S^I,:Control9.5,Eexercise 11.5×10^<-5>・min^<-1>・pM^<-1>;S^G:Control0.013,Eexercise0.013min^<-1>)。これらの結果は、一過性の持久的軽運動が耐糖能の改善に有益である可能性を示唆するものであり、S^I,S^Gの両面を考慮した、有効な運動処方を作成するために有用な情報になるであろうと思われる。軽強度の有酸素性トレーニングが、インスリン作用を介する糖取り込み能とインスリン作用を介さない糖取り込み能に及ぼす影響について検討した。若年健常男性8名(18-25歳)を対象として,6週間の自転車エルゴメータートレーニング(LT強度,60分/回,5回/週)を行った結果、最大酸素摂取量が有意に増加した(トレーニング前:41.6±1.2,トレーニング後:43.9±1.2,ml/kg/min,P<0.05)。一方、体重,体脂肪率は変化しなかった。トレーニング終了16時間後に静注糖負荷検査を実施した結果、インスリン作用を介さない糖取り込み能の指標であるS_Gが有意に増加した(トレーニング前:0.018±0.001,トレーニング16時間後:0.023±0.001,mm^<-1>,P<0.05)。その際、S_Gの初期値と変化率の間に有意な負の相関関係が認められた(r=0.85)。トレーニング終了1週間後でもS_Gの増加を維持する傾向があった(0.023±0.02,P<0.1)。また、インスリン作用を介する糖取り込み能の指標であるS_1も、トレーニング後に有意に増加した(トレーニング前:13.9±2.2,トレーニング16時間後:18.3±2.4,トレーニング1週間後:18.6±2.2)。本研究の結果から、LT強度の自転車エルゴメータートレーニングによって,若年健常者のS_GとS_Iの両方が増加する可能性が示唆された。インスリン作用を介する糖取り込み能だけでなくインスリン作用を介さない糖取り込み能も改善させるLT強度のトレーニングは,2型糖尿病の予防に有効だと考えられる。外来2型糖尿病患者を対象として、臨床現場で応用出来る簡易運動負荷テストを開発し、それに基づいた運動処方が日常身体活動量に及ぼす影響を検討した。2型糖尿病患者37名と健常者288名を対象としてステップ台を用いた漸増運動負荷テストを行なった結果、安静時血中乳酸値+0.5mM/Lに相当する仕事率を求めることで、糖尿病患者でも健常者と同様に有酸素性作業能が評価出来ることが分かった。次に、運動負荷テストの結果に基づいて運動処方し、3ヶ月間の介入前後で多メモリー加速度計付歩数計による身体活動量の測定、歩行多段階運動負荷テストとステップ台を用いた多段階運動負荷テストを実施した。運動負荷テストでは4分間の各負荷終了時に心拍数、血中乳酸値、主観的尺度を測定した。介入後、体重,BMIは変化しなかったが、ステップテストにおける安静時血中乳酸値+0.5mMに相当する仕事率が、有意に上昇した(介入前:3.52±0.90Mets,介入後:3.85±0.95Mets,P<0.05)。
脳細胞傷害時のグリア活性化におけるToll-like受容体系モーダルシフトの役割

通常は細胞内に存在する核タンパク質HMGB1や核酸RNAが、細胞傷害時に細胞外に遊離・漏出して細胞間情報伝達分子として働き、一方で、本来は細菌等由来の外来性分子に対するセルセンサーであるToll-like receptor (TLR)がHMGB1やRNAなどの内在性分子に対するセルセンサーとして機能するという「セルセンサーとその適刺激(リガンド)のデュアルモーダルシフト」が、脳細胞傷害によるグリア細胞活性化に関与する可能性について検討した。ラット大脳皮質線条体領域から作製したスライス培養系を用い、アストロサイトの活性化をケモカインMCP-1の産生を指標として評価した検討から、傷害を受けた神経細胞に由来するHMGB1がアストロサイトでのMCP-1産生亢進を引き起こす細胞間情報伝達分子の1つとして機能している可能性を示唆するデータを昨年度の研究で得ている。今年度は、細胞外に漏出するRNAに着目して検討を行った。脳スライス培養系において、NMDAによる神経細胞傷害により、細胞外RNA濃度は著しく上昇した。NMDA誘発神経細胞傷害によって誘導されるアストロサイトでのMCP-1産生は、RNaseAを培地中に加えることによって部分的ながら有意に抑制された。また、細胞外RNAの受容体として機能すると考えられているTLR3のアゴニストpoly I:CによってもアストロサイトでのMCP-1の発現亢進が認められた。TLR3は通常エンドソームに発現していることから、エンドソーム酸性化阻害薬クロロキンの効果を検討したが、クロロキンはNMDAによるMCP-1産生を抑制しなかった。アストロサイトにおいては、TLR3はエンドソームに加えて細胞膜表面にも局在すると報告されていることから、細胞外に漏出したRNAは、細胞膜表面のTLR3を介してMCP-1産生を誘導している可能性が考えられた。HMGB1はDNAの安定化や転写調節等に関わるDNA結合タンパクであるが、細胞が傷害されると細胞外に遊離・漏出されサイトカイン様に働くことから、様々な病態時の細胞間情報伝達の担い手として注目されている。そこで、通常は細胞内に存在するHMGB1が細胞間情報伝達分子として働き、本来は細菌等の外来性分子に対するセルセンサーであるTLRが内在性分子HMGB1に対するセルセンサーとして機能するという「セルセンサーとその適刺激のデュアルモーダルシフト」が、脳細胞傷害によるグリア細胞活性化に関与する可能性について、脳スライス培養系を用いて検討した。NMDAによる神経細胞傷害時に神経細胞でのHMGB1免疫活性が消失し、培地中HMGB1量が増加することを明らかにした。また、NMDA処置による神経細胞傷害が、グリア細胞におけるMAPキナーゼ活性化を介してMCP-1をはじめとする諸種のサイトカイン/ケモカインの発現を亢進させることを明らかにしている。そこで、これらNMDAによるサイトカイン/ケモカイン発現亢進に対するHMGB1阻害薬グリチルリチンの効果を、ケモカインMCP-1産生誘導に着目して検討した。その結果、グリチルリチンはNMDA処置によるアストロサイトでのMCP-1産生を、mRNAレベル、タンパクレベルの両方において部分的ではあるが有意に抑制した。一方、LPSやIL-1βによるMCP-1産生に対しては、グリチルリチンは抑制効果を示さなかった。これらのことから、NMDAによるMCP-1産生に対するグリチルリチンの抑制効果は、MCP-1を産生するアストロサイトへの直接的な作用ではなく、傷害を受けた神経細胞から細胞外に漏出したHMGB1を細胞外でトラップすることによってその作用を発揮している可能性が示唆された。
LAMP法を用いた歯髄・歯石DNAからの血液型判定

Loop-Mediated Isothermal Amplification法(以下、LAMP法とする)は、等温条件下で鎖置換反応を利用して目的の部位を増幅し、その際に生じる大量の副産物(ピロリン酸マグネシウム)が反応液を白く濁らせる状況を、目視あるいはリアルタイム濁度検出装置によって判定を可能とする検査法である。そこで、LAMP法によるMN式血液型判定について検討した。その結果、判定までの時間が約50分55分で可能となり、また、Loopプライマーを添加すれば30分で判定可能とした。さらに、リアルタイムPCR法を用いてABO式およびMN式遺伝子型の同時検出を試み、約40分で同時検出を可能とした。LAMP(Loop-Mediated Isothermal Amplification)法は等温条件下で連続的にDNAを増幅し、その際に生じる大量のピロリン酸マグネシウムが反応液を白く濁らせることで肉眼的にも判定することができる手法である。今回は、この手法を用いて、歯髄DNAを試料としてMN式血液遺伝子型判定への応用を試みた。アニーリング温度の濁度検出への影響について検討したところ、アニーリング温度が62°Cの場合、M型プライマーではN型とMN型の試料において42分前後で白濁を認めた。一方、N型プライマーではM型に比べ若干時間が遅く、50分前後で認められた。しかし、M型試料の中で65分以上経過するとN型プライマーに非特異的に反応するサンプルが認められた。つぎにアニーリング温度を63°Cの場合、M型プライマーではM型とMN型の試料において50分前後で白濁を認めた。一方、N型プライマーでは62°Cと同様にM型に比べ時間が遅く、56分前後に認められた。しかし、62°Cの場合と同様にM型試料の中でN型プライマーに非特異的に反応する試料が65分以降に認められた。そこで、アニーリング温度を63.5°Cで検討したところ、65分以上で認められた非特異的反応は消失した。以上のことから、歯髄DNAを試料として型検査を行う場合のアニーリング温度を63.5°Cに設定したところ、M型プライマーでは平均53分、N型プライマーでは平均60分の増幅時間でそれぞれ白濁し、型判定は可能であった。M型、N型およびMN型試料において反応時間を比較すると、M型試料が短時間で検出される傾向が認められた。つぎに、検査時間の短縮を目的に、M型およびN型プライマーにLoopプライマーを設計して検討したところ、いずれも30分以内で型判定することを可能にした。【結果】SMAP法におけるアリール特異的なXおよびYプライマー5種類(OP1(Outer Primer1)、FP (Folding Primer)、TPA (Turn-Back Primer Region A)、BP (Boost Primer)およびOP2(Outer Primer2) )を作製した(LAMP法では4種類)。X特異的プライマーを用いた場合には全試料において男女ともDNA増幅され,またY特異的プライマーを用いた場合は男性試料のみでDNA増幅が認められ、性別判定は可能であった。検出時間はXおよびYアリールともに3035分であった(LAMP法では約50分)。この検出時間の差については, LAMP法ではSMAP法におけるFPプライマーが存在しないことによるものと考えられた。つぎに、XおよびY特異的プライマーを用い,男性歯髄DNAを試料として鋳型DNA量について検討したところ、X特異的プライマーでは鋳型DNA量が10,5および1ngで,35分でDNA増幅は可能であった。また,Y特異的プライマーでは,鋳型DNA量が10および5ngの場合に30分で増幅は可能であったが,1ngではその増幅量は少ない傾向が認められた。以上のことから, LAMP法と同様の手法であるSMAP法による性別判定は,簡便かつ迅速に行えることが判明した。
インデノピラゾール骨格を基軸とした新しい創薬化学とケミカルバイオロジーの展開

正常組織では血管網が発達しているため栄養や酸素が十分に供給されているが、がん組織ではがん細胞の増殖が血管網の発達よりも速いために血管の発達が未熟となる。その結果、酸素ががん組織に十分に送達されなくなるため、がん組織には低酸素環境が存在している。この環境下で働く低酸素誘導因子(HIF)-1は病的血管新生などを誘導し、がんの悪性化に関与するため、がん治療の分子標的として注目されている。本申請者は、インデノピラゾール化合物に着目したHIF-1阻害剤の開発を行い、GN44028の開発に成功している。このHIF-1阻害剤の開発における構造活性相関研究においてHIF阻害活性を示さなかったインデノピラゾール化合物が非常に強力な細胞増殖抑制作用を示すことが明らかとなった。このことから、更なる細胞増殖抑制活性の向上と活性を示す構造を特定するための構造活性相関研究を行い、その作用機序の詳細な解析を目的とした研究を行うこととした。インデノピラゾール化合物誘導体を合成し、MTTアッセイにより細胞増殖抑制活性を測定した結果、GN39482が最も強い活性を示した。次にGN39482の作用機序解明のためMorphobase profilingとChemProteoBase profilingによる解析を行った結果、微小管に作用することが示唆された。そのため、tubulin重合に対する影響を解析した結果、インデノピラゾール化合物がtubulin重合を阻害し、細胞の微小管形成を阻害していることが確認された。これらの結果から、インデノピラゾール化合物はtubulinの重合を阻害することで細胞増殖抑制作用を示していることが明らかとなった。以上の結果からインデノピラゾール骨格は置換基の種類と導入する位置を変換することで様々な生物活性を誘導することのできる非常に有用な骨格であり、更なる構造活性相関研究によって、新たな生物活性を示す可能性が十分にあると考えられる。26年度が最終年度であるため、記入しない。
超高倍率光学顕微鏡による神経終末情報伝達の分子機構解析

神経終末部における生理活動は、生体制御や知的機能の基礎をなしている。従って、この部位の反応機構の解析は高度な生体機能の理解にもっとも重要である。本研究では、この神経終末の活動を高速画像処理によって強化した光学(DIC)顕微鏡によって直接捉え、動的な特性を調べ、その分子機構の解明を目指すものである。これまでの観察で次のようなことが分かった。初代培養クロマフィン細胞に形成される神経突起の先端は隣の細胞に接着しシナプス様の特別な形態を作った。このような部位で節前線維を刺激すると終末内の分泌顆粒が多数弾けるような急激な変化をするのが見られた。この反応は外液中カルシウムイオン依存性で、カドミウムやランタンにより抑えられた。反応した顆粒の大きさは、最小0.1umであった。反応は隣接細胞との接触面において特に高い頻度で起こった。繰り返し刺激をすると促通現象が見られた。また、多数り繰り返し刺激をすると疲労現象が観察された。このとき、終末内の顆粒数は減少するのが見られた。このような性質から、微小な顆粒の弾けるような反応はエキソサイトーシスであることが分かった、CaイメージングとDICイメージングを同時に超高倍率で行う装置を開発しシナプス様の接合部を観察すると、節前部のエキソサイトーシスに伴って節前Ca信号が節後細胞に伝達するのがわかった。これによってシナプス伝達におけるエキソサイトーシスの可視化が初めて証明された。シナプス伝達のエキソサイトーシスメカニズムとして、これまで広く信じられてきた2つの仮説、すなわち、顆粒の膨潤仮説と顆粒の細胞膜への衝突仮説はいずれも誤りであることが分かった。顆粒同士の融合は起こらないので顆粒と細胞膜の融合は細胞膜側の分子が鍵となると思われる。神経終末には電気刺激による急速なフィロポディアの発芽反応があることも見出した。これはシナプスの可塑性と強い関係にあると考えられる。本研究では、神経終末のエキソサイト-シス反応やフィロポディア急速発芽反応等の活動を、高速画像処理によって強化した光学顕微鏡によって直接捉え、その動的な特性を調べることによって分子機構の解明を目指すものである。人工膜系で膜融合を捉進することが分かっているヘモアグルチンニンペプチドの効果を、単離した分泌顆粒を顕微鏡下に直視して調べたところ、顆粒同士の融合は引き起こさないことがわかった。細胞質内の可溶性蛋白の中に膜融合促進酵素が含まれている可能性があるので、単離顆粒についてCaイオンとMgーATP存在下に細胞抽出液の効果を調べたが、顆粒同士の融合は起きなかった。これらの結果は細胞膜側に融合を引き起こす酵素が存在することを示唆する。神経終末の情報伝達に関する反応はいずれもCaイオンに依存したものであるが、細胞内Caイオン濃度の上昇がどの様に分子機構に転換され上記の反応を引き起こすのかを調べるため、微分干渉像と蛍光像の同時リアルタイム観察法を開発した。ダイクロイックミラ-とイメ-ジインテンシファイア-付きのCCDカメラ(ICCD)の使用によって、短波長での蛍光像と長波長での微分干渉像が同時に超高倍率で観察可能となった。微分干渉像の観察からエキソサイト-シスをした顆粒の位置、大きさ、数とその分布、及びフィロポディア形成の有無等がわかる。同時に蛍光像の観察から、エンドサイト-シスの有無やフィロポディア内のアクチン線維の有無が決定できる。

さらに、蛍光性Ca指示薬を併用して細胞内Ca信号とエキソサイト-シス、また、Ca信号とフィロポディア形成の間の定量的な関係を調べる目度がたった。装置の到着が遅れ、現在実験結果を十分に出すに至っていないが、完全な微分干渉像と蛍光像の分離ができビデオによる同時記録が可能となったので、第2年度計画が半ば達成されたといえる。本研究は、神経終末の活動を高速画像処理によって強化した光学顕微鏡によって直接捉え、その動的な特性を調べ、さらに、分子機構を解明することを目的とする。すでに、神経終末の電気活動に伴う生理反応として伝達物質放出のためのエキソサイトーシスと急速フィロポディア発芽の現象をとらえているので、これらのメカニズムを調べた。細胞内におけるCaイオン濃度との関連を調べる目的で、Fura2によるCaイメージングと高分解能DIC観察を同一標本で同時に行う装置を開発した。クロマフィン細胞の突起とその終末部においてCa波は刺激部位から末梢方向に伝播した。これに続いて細胞間接着部において沢山のエキソサイトーシス反応が見られた。この反応の現れた部位のCa濃度変化は刺激部位よりも小さなものであった。標本の厚みや顆粒分布等に特別な偏りが無かったので、エキソサイトーシスの頻度は細胞内Caイオン濃度だけでなく細胞膜の膜融合特性によっても制御されていることが分かる。さらに、このCaイメージングとビデオによるエキソサイトーシスの同時観察によって、プレ側の信号がポスト側の細胞に実際に信号として伝達していくのが観察された。これによって、クロマフィン細胞の突起終末と隣接細胞間に形成される接着構造が実際にシナプス同様に働くことが示された。従って、シナプス類似構造におけるエキソサイトーシスの可視化が初めて成功したことが証明された。さらに、顆粒の膜融合の分子機構を知るために、単離クロマフィン顆粒において、インフルエンザビールスの接着蛋白の効果を調べた。溶液のpHの低下では顆粒に対する効果が現われず、1μMのCaイオン存在下で強い接着効果が見られた。しかし、顆粒同志の膜融合を示す画像イメージは得られず、強い接着だけでは膜融合に至らないことと、顆粒と細胞膜間に特別な膜融合機構があることが示唆された。
細胞異型形成の分子学的機序からみた尿路上皮癌前駆病変の病理学的特徴と遺伝子異常

本研究の目的は、尿路上皮癌の周囲粘膜における“癌とは判断できない程度の軽度異型を示す平坦状尿路上皮"、すなわち異型尿路上皮、過形成あるいは異形成等を解析の対象とし、我々が過去の研究で明らかにしてきた悪性腫瘍における構造異型や細胞異型の形成に関わるMTOC (microtubule organizing center)を中心とした分子病理学的機構を基に、膀胱尿路上皮癌の初期発生における遺伝子異常や細胞異型の形成の分子機構を解析しする。さらに分子病理学的機構や遺伝子異常を元に、尿路上皮癌の初期病変の病理組織学的診断基準を定義し、臨床病理学的特徴を明らかにする。
培養細胞における「多様化誘導型」抗体ディスプレイシステムの開発

抗体は今や最も注目されるモダリティ(治療手段)と言えるが、一方で標的抗原の枯渇など課題も多く、従来法では取得困難な、新規な活性や機能を持つ抗体を獲得する技術の開発が待ち望まれている。本研究では、表現型スクリーニングが困難という抗体創薬のボトルネックを解消するため、一千万一億の多様な特異性をもつ抗体分子を発現する培養細胞ライブラリ構築、およびそれを用いた表現型スクリーニングによる機能抗体取得からなるプラットフォーム技術の開発に取り組む。
大腸癌におけるｍｉＲ－１４５のＷｎｔ／β－ｃａｔｅｎｉｎシグナル制御機構の解明

本研究は大腸癌で恒常的に活性化しているWnt/β-cateninシグナルにおけるmiR-145の役割を解明すること、およびmiRNA補充療法に適したmiR-145の化学修飾の確立を目的としている。これまでの研究でmiR-145が大腸癌で顕著に発現低下しており、miR-145を大腸癌細胞に導入するとδ-cateninを直接の標的遺伝子とし、δ-catenin/PAK4の相互作用を介してβ-cateninの核内移行を制御していることが明らかとなった。miR-145の大腸上皮細胞における発現低下がWnt/β-cateninシグナルの恒常的活性化、adenoma-carcinoma sequenceの進行に深く関与している可能性を示した。平成26年度、および平成27年度はmiR-145の臨床応用に向けて、ヌクレース耐性の付加および抗腫瘍効果の増強を行うため、miR-145の各種化学修飾を行いその効果を検証した。平成26年度に行った化学修飾ではヌクレース耐性を付加することができなかったため、新たな化学修飾方法として平成27年度はLNA修飾を採用した(miR-145/L1 miR-145/L3)。新規合成miR-145/L1の大腸癌細胞増殖抑制効果はAmbion社製miR-145と比較して同等以上、一部の標的遺伝子のタンパク(Fascin-1)発現抑制効果はAmbion社製miR-145と比較して同等であることがわかった。ヌクレース耐性はmiR-145/L3に弱いながらも付加されていることがわかった。しかし、総合的な抗腫瘍効果としてはAmbion社製のmiR-145が優れていると判断し、結果、今回のmiR-145/L1 miR-145/L3ではin vivoにおける抗腫瘍効果の検討実験に進めなかった。27年度が最終年度であるため、記入しない。これまでの研究でmiR-145が大腸癌で顕著に発現低下しており、miR-145を大腸癌細胞に導入するとβ-cateninの核内移行が阻害され、細胞増殖を抑制することを明らかにした。このmiR-145によるβ-cateninの核内移行抑制メカニズムをδ-cateninという分子に着目してさらに解明することを中心に研究計画を遂行した。具体的には1)Wnt/β-cateninシグナルにおけるmiR-145/δ-cateninの機能解析、2)δ-cateninがmiR-145の標的遺伝子であることの証明、3)δ-cateninの機能解析、4)AntagomiR-145を用いたrescue実験による1)-3)のデータ検証を行った。結果、miR-145はδ-cateninを直接の標的遺伝子とし、δ-catenin/PAK4の相互作用を介してβ-cateninの核内移行を制御していることが明らかとなった。miR-145の大腸上皮細胞における発現低下がWnt/β-cateninシグナルの恒常的活性化、adenoma-carcinoma sequenceの進行に深く関与している可能性が示された。次にmiR-145の臨床応用に向けて、化学修飾を施した合成miR-145の作成とその機能解析およびヌクレース耐性獲得の有無を検証した。結果、Ambion社製のmiR-145と比較すると、大腸癌細胞増殖抑制能、標的遺伝子発現抑制能はやや減弱したものであることがわかった。また今回作成した合成miR-145はヌクレース耐性能を有しないことがわかった。このmiR-145によるβ-cateninの核内移行抑制メカニズムをδ-cateninという分子に着目してさらに研究を進めた。次にmiR-145の臨床応用に向けて、化学修飾を施した合成miR-145の作成とその機能解析およびヌクレース耐性獲得の有無を検証した(25年度)。また25年度に作成した合成miR-145はヌクレース耐性能を有しないことがわかった。そこで26年度は化学修飾の方法を再検討し、LNA修飾による合成miR-145の作成に着手した。本研究は大腸癌で恒常的に活性化しているWnt/β-

cateninシグナルにおけるmiR-145の役割を解明すること、およびmiRNA補充療法に適したmiR-145の化学修飾の確立を目的としている。これまでの研究でmiR-145が大腸癌で顕著に発現低下しており、miR-145を大腸癌細胞に導入するとδ-cateninを直接の標的遺伝子とし、δ-catenin/PAK4の相互作用を介してβ-cateninの核内移行を制御していることが明らかとなった。miR-145の大腸上皮細胞における発現低下がWnt/β-cateninシグナルの恒常的活性化、adenoma-carcinoma sequenceの進行に深く関与している可能性を示した。平成26年度、および平成27年度はmiR-145の臨床応用に向けて、ヌクレース耐性の付加および抗腫瘍効果の増強を行うため、miR-145の各種化学修飾を行いその効果を検証した。平成26年度に行った化学修飾ではヌクレース耐性を付加することができなかったため、新たな化学修飾方法として平成27年度はLNA修飾を採用した(miR-145/L1 miR-145/L3)。新規合成miR-145/L1の大腸癌細胞増殖抑制効果はAmbion社製miR-145と比較して同等以上、一部の標的遺伝子のタンパク(Fascin-1)発現抑制効果はAmbion社製miR-145と比較して同等であることがわかった。ヌクレース耐性はmiR-145/L3に弱いながらも付加されていることがわかった。しかし、総合的な抗腫瘍効果としてはAmbion社製のmiR-145が優れていると判断し、結果、今回のmiR-145/L1 miR-145/L3ではin vivoにおける抗腫瘍効果の検討実験に進めなかった。本年度研究計画が順調に進展しているため2とした。化学修飾の方法をLNAにしたことで、Ambion社製のmiR-145と同等の標的遺伝子制御能を持つことがwestern blottingにより確認された。現在はどのオリゴヌクレオチドにLNA修飾を施すことが最適であるか、複数のLNA修飾miR-145を作成し、標的遺伝子の制御能をもとに比較検証中である。27年度が最終年度であるため、記入しない。LNA修飾によってmiR-145にヌクレース耐性をどの程度付加することができるのか検証する。最適なLNA修飾miR-145を完成させ、in vivoにおけるWnt/β-cateninシグナルを標的としたmiR-145の有用性の検討へ進む。本年度研究計画の約2/3を達成しているため2とした。計画後半の化学修飾を施した合成miR-145の作成とその機能解析に関しては、作成した6種の合成miR-145に期待するヌクレース耐性能が付与されなかったため、化学修飾および核酸の構造改変の方法を再検討中である。標的遺伝子制御能を失わずかつヌクレース耐性能を獲得させた合成miR-145を完成させ、in vitroにおけるWnt/6-cateninシグナルを標的としたmiR-145の有用性の検討へとすすむ。miR-145にヌクレース耐性を付加するために新たにLNA修飾を行うこととする。また、このLNA修飾mR-145の機能解析(in vitro)を行い、修飾によって性質・機能が損なわれていないことを確認する。
アンジオテンシン代謝分解よりみた妊娠中毒症発症に関する研究

1.胎盤のアンジオテンシン代謝分解酵素アンジオテンシンの代謝分解を行うヒト胎盤の酵素を明確にし、妊婦血中に著増するいわゆる"アンジオテンシナーゼ"の本態を明確にした。胎盤にはアンジオテンシンI(A-I)をII(A-II)に変換し、同時にブラディキニンのC端のジペプチドを水解するアンジオテンシン変換酵素(ACE),A-IIのN端のAspを特異的に水解しアンジオテンシンIII(A-III)にするAminopeptidase A、A-IIIのN端から順次アミノ酸を水解するAminopeptidaseM、A-IIのC端のpheを特異的に水解するpost-proline cleaving enzymeが存在し、胎盤でA-IIはこれら酵素によりすみやかにジペプチド(His-Pro)にまで分解される。一方妊婦血中にはA-IIをA-IIIにするAminopeptidase AとA-IIIのN端から順次アミノ酸を水解するP-LAPが著増する。従って妊婦血中のアンジオテンシナーゼとはこれら2つの酵素である。2.アンジオテンシナーゼの生理的意義A-IIは強力な昇圧物質であり、A-II投与によって非妊時と妊娠中毒症では血圧が著明に上昇するのに、正常妊娠時にはA-II不応性となって血圧が上昇しない。このA-II不応性の機序は妊娠中毒症発症解明の鍵と考えられる。本研究によるこのA-II不応性には胎盤アンジオテンシナーゼによるA-II分解の関与が示された。3.アンジオテンシナーゼの臨床応用正常妊婦と妊娠中毒症の血中A-Iとアンジオテンシン代謝分解酵素を測定比較した。A-IとACEのレベルは両者には著変がなかった。Aminopeptidase AとP-LAPは重症妊娠中毒症では正常妊婦と比べ著明に低下した。4.妊娠中毒症の治療エストロゲン(E)とプロゲステロン(P)が胎盤のアンジオテンシナーゼ産生や血中への遊出を増加させることをin vivo(ラット)で明確にした。そこで重症妊娠中毒症にEとPの大量漸増投与を行ったところ病態の改善傾向が認められた。5.研究の展開現在A-IIレセプターとアンジオテンシナーゼの関係につき検討している。1.アンジオテンシンの代謝分解に関与すると考えられる以下のアミノペプチダーゼを胎盤より精製し以下の知見,成果を得た。(1)アンジオテンシン変換酵素:本酵素の特異的阻害剤であるカプトリルを用いたアフィニティークロマトグラフィーにより6297倍に精製に成功し、胎盤における存在を初めて証明した。分子量は30万であった。(2)アミノペプチダーゼAおよび膜型ロイシンアミノペプチダーゼ:ゲルろ過,イオン交換,両酵素の阻害剤であるベスタチンのアフィニティークロマトグラフィーにてそれぞれ3946倍,3882倍に精製し、分子量はおのおの28万と22万であった。(3)ジペプチジルペプチダーゼIVおよびポストプロリンエンドペプチダーゼ:ゲルろ過,イオン交換およびphenyl-Sepharose4B

カラムによりそれぞれ1840倍,3390倍に精製し、分子量はおのおの35万と14万であった。(4)妊婦血中に著増する胎盤性LAP(血中P-LAP)ベスタチンアフィニティークロマトグラフィーおよび高速液体クロマトグラフィーにて1775倍に精製した。分子量は28万であった。2.アンジオテンシンの分解,上記精製酵素とアンジオテンシンをin vitroでインキュベートし、水解遊離するアミノ酸を高速液体クロマトグラフィーにより定量し、以下の事実を得た。アミノペプチダーゼAはN端のASpをよく遊離したあとのA-IVのArg-【Val_7】Tgrをよく遊離させ、これらはアンジオテンシナーゼとして働くことが証明された。3.臨床研究:アミノペプチダーゼAは妊娠中後期において妊娠高血圧例では正常に比較し有意に低下がみられ、また血中P-LAPは妊娠高血圧軽症例では低値を示し、重症例では病態の悪化とともに減少をみた。上記の事実をふまえ今後in vitroでの酵素による降圧作用を検討し性ホルモンの酵素活性に与える影響を調べる。(1)レニン及びアンギオテンシンをラットに投与することによって高血圧状態を作り,酵素(膜PLAP及びAAP)を投与し,血圧降下を観察した.同様の実験をSHR(Spontaneous hypertensive Rat)に対しても行ない, Ratに対する作用との差異を検討した.(2)妊娠中毒症に対するプロゲスチロン及びPLAP投与による治療の予備実験として,ラットにエストロゲン及びプロジエステロンを投与して,胎盤の種々のアミノペプチダーゼとその血中への遊離酵素を測定し,エストロジエンとプロジエステロンの酵素への影響を観察した.
近世社寺参詣道中日記にみる渡船・航路の利用

本研究は、近世の伊勢参宮・西国巡礼道中日記を資料として、その経路上に現れる渡船・航路の利用の実態解明を目的にした。まず全国各地域の社寺参詣道中日記を収集し、参宮・巡礼に分類、該当地域からそれぞれの目的地へ向かう代表的な経路を抽出し、そこに見られる渡船や航路の利用地点を確定した。そして渡船・航路のうち、多数の参宮者・巡礼者が利用する、瀬戸内航路・伊勢湾をめぐる渡船・竹生島の渡船に対象を限定して利用の実態を検討・考察した。参宮者・巡礼者の利用した瀬戸内航路は二つに分類でき、一は備後以西の地域の者が陸路の代用手段として大坂や室津などまで利用したもの、二には主に東日本の者が金毘羅参詣に利用した金毘羅船である。前者は利用者が船問屋などに直接交渉して出船する臨時便的な性格をもつが、後者は大坂・高砂の船宿・旅籠が自ら出船するかまたは仲介する規格化・様式化された定期便である。伊勢湾をめぐる渡船は東日本の者が利用し、いくつか経路がある中で大部分が佐屋・津島の渡しを利用した。佐屋・津島の渡しでは船番所が設置され、船賃も規定されていたが、船頭が規定船賃以外に様々な手段で金銭を要求し、場合によっては船頭のみならず船宿がこれに荷担する場合もあった。西国巡礼者が必ず利用する竹生島の渡船は、巡礼者が船宿と渡航地を契約して乗船したが、欠航や湖上での事故が少なからず記録に残る危険なものであった。それゆえ近世末の大部分の巡礼者は竹生島から長命寺へ向かう距離の長い渡船を避け、「石山から逆打」経路を選択して距離が短い長浜までの渡船を利用した。平成6年度には、8月末に11日間の九州地方への資料収集調査を行い、伊勢参宮・西国巡礼道中日記の原資料17点、抄録や要約、存在のみ確認できたものなどを含めると合計63点が収集できた。また2月末には7日間の中国地方への調査を行い、原資料9点、抄録や要約、存在のみ確認できたものなどを含めると合計24点が収集できた。収集した資料について、記録者・道中日記の名称・時期・参詣目的社寺・経路等を指標として、地域別道中日記一覧を作成した。一方、各々の道中日記については、内容の解読、郷里から伊勢参宮・西国巡礼への経路を地形図で判読し、渡船・航路の利用区間の把握を進めている。以上の作業を進める中で、収集した道中日記の予察的な分析を行ったところ、次の諸点について検討・考察することが必要であると考えられた。1)社寺参詣者が利用した瀬戸内航路の船の便数・目的地と寄港地、2)社寺参詣者の出身地と瀬戸内航路の利用区間、3)瀬戸内航路での宮島・金比羅山参詣について、4)西国巡礼札所竹生島への琵琶湖航路について、5)紀伊長島等における陸路と短距離航路の選択、6)社寺参詣者に見られる伊勢参宮と西国巡礼との関わり、7)伊勢参宮をする者の大坂から伊勢までの往復経路、8)航路・渡船に関する東国の伊勢参宮・西国巡礼者との経路比較来年度は、上記の点を機軸として道中日記の分析を行うと同時に、所在確認や要約しか入手できなかった道中日記について、極力全文を得るようにし、より客観的な結論に至る努力をしていきたい。本研究は、近世の伊勢参宮・西国巡礼道中日記を試料として、その経路上に現れる渡船・航路の利用の実態解明を目的にした。

まず全国各地域の社寺参詣道中日記を収集し、参宮・巡礼に分類、該当地域からそれぞれの目的地へ向かう代表的な経路を抽出し、そこに見られる渡船や航路の利用地点を確定した。そして渡船・航路のうち、多数の参宮者・巡礼者が利用する、瀬戸内航路・伊勢湾をめぐる渡船・竹生島の渡船に対象を限定して利用の実態を検討・考察した。参宮者・巡礼者の利用した瀬戸内航路は二つに分類でき、一は備後以西の地域の者が陸路の代用手段として大坂や室津などまで利用したもの、二には主に東日本の者が金毘羅参詣に利用した金比羅船である。前者は利用者が船問屋などに直接交渉して出船する臨時便的な性格をもつが、後者は大阪・高砂の船宿・旅籠が自ら出船するかまたは仲介する規格化・様式化された定期便である。伊勢湾をめぐる渡船は東日本の者が利用し、いくつか経路がある中で大部分が佐屋・津島の渡しを利用した。佐屋・津島の渡しでは船番所が設置され、船賃も規定されていたが、船頭が規定船賃以外に様々な手段で金銭を要求し、場合によっては船頭のみならず船宿がこれに荷担する場合もあった。西国巡礼者が必ず利用する竹生島の渡船は、巡礼者が船宿と渡航地を契約して乗船したが、欠航や湖上での事故が少なからず記録に残る危険なものであった。それゆえ近世末の大部分の巡礼者は竹生島から長寿寺へ向かう距離の長い渡船を避け、「石山から逆打」経路を選択して距離が短い長浜までの渡船を利用した。