hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
高分子担持型不斉触媒を用いるフローシステムの構築

不溶性の架橋高分子担体に不斉触媒を結合することによって、貴重な不斉源の分離、定量的な回収、再使用が可能になる。また、触媒的不斉反応では、高分子触媒をカラムに充填することができるため、反応基質、試薬の溶液を連続的に流しながら反応を行うフローシステムが可能である。そこで、本研究では、高分子不斉触媒を開発するために、高分子化された不斉源の合成法の確立と、これを用いた不斉反応について検討し、不斉触媒の高分子化が立体選択性に及ぼす影響について詳しく検討すると共に、フローシステムの可能性を調査した。1.光学活性化合物(不斉源)を高分子化する方法は、反応性基を有する架橋高分子に光学活性化合物を結合させる方法と光学活性モノマーを架橋剤とともに共重合する方法とを検討し、N-スルホニルアミノ酸、アミノアルコール、ジオール型の架橋高分子についてそれぞれの合成法を確立した。2.高分子担持型不斉源とボランからなる錯体をキラルなルイス酸触媒として不斉Diels-Alder反応を行った。光学活性アミノアルコール型、ジオール型の高分子では高い選択性は得られなかった、N-スルホニルアミノ酸型高分子では、シクロペンタジエンとメタクロレインの反応で、65%eeを得た。3.不斉選択性に及ぼす高分子の効果について種々検討し、特に架橋構造が重要であることを見いだした。架橋剤にジビニルベンゼンの替わりにオリゴオキシエチレン鎖を用いると最高95%eeまで選択性が向上し、対応する低分子触媒を上回る選択性を示した。4.高分子不斉触媒をカラムに充填し、基質の混合溶液を流すとにより、カラム内で、不斉反応と分離が同時に行われ、連続的に光学活性生成物のみを取り出すことに成功した。
海水準変動が河川の堆積プロセスに及ぼす影響に関する研究

本研究では,河川の堆積プロセスと海水準変動との関係を検討するために,長崎県北松浦郡小佐々町田平町の海岸線において,前期前中期中新世(1,800万1,500万年前)の地層である野島層群の中下部層(大屋層と深月層)の地質調査を行い,大屋層と深月層の堆積環境の解釈と磁気層序による年代決定を行った.[1]大屋-深月層の40地点で泥岩の有機炭素・硫黄含有量を測定し,その炭素硫黄比を検討したところ,大屋層・深月層はそのすべてにおいて淡水成堆積物であることが確認された.[2]深月層の12地点から岩石試料を採取し磁気測定を行ったところ,深月層中部の1地点で正磁極,深月層上部の8地点で逆磁極が得られた.昨年度のデータと合わせると,大屋層深月層下部が正磁極帯,深月層上部が逆磁極帯である.深月層基底の凝灰岩層の放射年代(18.5±2.3百万年前)を参考にすると(誤差を考慮),大屋-深月層は(1)クロンC6An1n-C6r,(2)クロンC6n-C5Er,(3)クロンC5En-C5Dr,(4)クロンC5Dn-C5Crのいづれかに対比されるが,いづれに当たるかについてはより精度の高い放射年代データが必要である.また,大屋-深月層は大きく見積もっても135万年間より短い期間で堆積したことがわかった.[3]昨年度の研究から,大屋層と深月層は主に砂岩泥岩互層と厚い砂岩層からなり,砂岩泥岩互層は湖底堆積物,厚い砂岩層は湖に流れ込む河川河口三角州の堆積物と解釈された.大屋-深月層(層厚約2,000m)の垂直方向(=時系列方向)において,(1)湖底堆積物と(2)河川河口三角州の堆積物の出現頻度に著しい変化は認められなかった.これは,大屋-深月層について,その堆積環境の変遷と海水準変動(数百万年のオーダーの変動)との関係を検討するには,その堆積期間(<135万年)があまりにも短かすぎるためかもしれない.本研究では,長崎県北松浦郡小佐々町鹿町町の海岸線において,前期前中期中新世(1,800万から1,500万年前)の地層である,野島層群の中下部層(大屋層と深月層)の地質調査を行い,大屋層と深月層の堆積環境の解釈と磁気層序による年代決定のための磁気測定を行った.1.大屋層と深月層の堆積環境:大屋層と深月層は主に砂岩泥岩互層と厚い砂岩層からなり,砂岩泥岩互層は湖底堆積物,厚い砂岩層は湖に流れ込む河川河口三角州の堆積物と解釈することができた.大屋層の下部は湖底相の砂岩泥岩互層が優勢で,上部は河川河口三角州の砂岩層が優勢である。深月層は全体を通して湖底相と河川河口三角州の繰り返しからなる.これまで,野島層群は河川の堆積物からなるとされていたが,大屋層と深月層においては典型的な河川流路堆積物は少なく,湖底と湖に流れ込む河口三角州の堆積物が優勢であることが明らかになった.2.大屋層と深月層の磁気層序:大屋層からの8地点,深月層からの17地点からの岩石試料を採取し,それらの磁気測定を行った.得られた測定データを解析した結果,大屋層の全ての地点と深月層下部の14地点で正磁極,深月層中部の3地点で逆磁極が得られた.3.次年度の研究計画:次年度は大屋層と深月層における河川河口三角州の頻度を詳しく解析するとともに,本年度に行えなかった深月層上部について磁気測定を行い,大屋層と深月層の年代を磁気層序により決定する.その上で,河川流路の移動に伴う河口三角州の堆積時期と前期前中期中新世の海水準変動との関係を明らかにする.本研究では,河川の堆積プロセスと海水準変動との関係を検討するために,長崎県北松浦郡小佐々町田平町の海岸線において,前期前中期中新世(1,800万1,500万年前)の地層である野島層群の中下部層(大屋層と深月層)の地質調査を行い,大屋層と深月層の堆積環境の解釈と磁気層序による年代決定を行った.[1]大屋-深月層の40地点で泥岩の有機炭素・硫黄含有量を測定し,その炭素硫黄比を検討したところ,大屋層・深月層はそのすべてにおいて淡水成堆積物であることが確認された.[2]深月層の12地点から岩石試料を採取し磁気測定を行ったところ,深月層中部の1地点で正磁極,深月層上部の8地点で逆磁極が得られた.昨年度のデータと合わせると,大屋層深月層下部が正磁極帯,深月層上部が逆磁極帯である.深月層基底の凝灰岩層の放射年代(18.5±2.3百万年前)を参考にすると(誤差を考慮),大屋-深月層は(1)クロンC6An1n-C6r,(2)クロンC

6n-C5Er,(3)クロンC5En-C5Dr,(4)クロンC5Dn-C5Crのいづれかに対比されるが,いづれに当たるかについてはより精度の高い放射年代データが必要である.また,大屋-深月層は大きく見積もっても135万年間より短い期間で堆積したことがわかった.[3]昨年度の研究から,大屋層と深月層は主に砂岩泥岩互層と厚い砂岩層からなり,砂岩泥岩互層は湖底堆積物,厚い砂岩層は湖に流れ込む河川河口三角州の堆積物と解釈された.大屋-深月層(層厚約2,000m)の垂直方向(=時系列方向)において,(1)湖底堆積物と(2)河川河口三角州の堆積物の出現頻度に著しい変化は認められなかった.これは,大屋-深月層について,その堆積環境の変遷と海水準変動(数百万年のオーダーの変動)との関係を検討するには,その堆積期間(<135万年)があまりにも短かすぎるためかもしれない.
皮膚イオニクス医工学の開拓

神経・筋肉系で確立を遂げた電気的な計測・制御の技術体系を皮膚に展開し、角質バリアを中心とする皮膚機能を,表皮層のイオン構造(イオン局在)に対応付けて理解するために、表皮電位を刺激応答の現場(in-situ)で計測するための技術開発を進めた。先ず、皮下注射用の無痛微小針に伝導性ゲルを充填した表皮下用電極を作製し、これと皮膚表面用電極を一つに束ねたプローブ型表皮電位計測デバイスを世界で初めて開発した。ブタ皮膚を用いた実験によって、低侵襲かつ定量的な表皮電位の測定に成功し、デバイスによる局所表皮電位の簡易測定が可能であることを実証した。次に、アセトンによる脱脂で角質バリアを破壊したブタ皮膚切片に対して、バリア破壊領域において表皮電位の低下が確認できた。別途測定した水分蒸散量データとの比較検討によって、表皮電位によって角質バリア能が評価できることが確かめられた。この表皮電位計測技術を活かして、機械刺激と光刺激の影響を定量評価することが出来た。皮膚サンプル(ブタ皮膚切片)の伸展刺激中の表皮電位変化をモニタした結果、表皮電位が一過的に減少するという機械刺激に対する表皮電位応答の観察に成功した。電位変化は表皮で局所的に発生していることが確認でき、表皮の刺激検知メカニズムなどとの関連が示唆された。光刺激の効果についてもLED照射中の表皮電位計測によって検討を進めた。赤色の照射が皮膚バリア機能の治癒を促進するとの報告があり、美容器具に応用されてきたが、今回の実験により、赤色光刺激による表皮電位変化を初めて観察し、刺激条件による治癒効果の違いなどを定量化し、治療デバイス開発に寄与する新たな知見を得ることが出来た。表皮電位の計測デバイスの創出に成功し、機械刺激および光刺激に対する皮膚応答を定量的に評価できており順調と言える。治療法開発に直結する電気刺激によるバリア回復の研究も進めているがこれについては未だ検討中である。電気刺激によるバリア回復の研究を集中的に進める。本年度は、研究動向調査と情報収集に経費の仕様が偏ったが、その甲斐あって研究計画が具体的に固まったので、翌年度は材料を取り揃えて(物品費)、電気刺激の効果検証を進める。
植物水チャネルの分子多様性と機能特性の解明

酵母異種発現系とストップトフロー光散乱法を用いたダイコン水チャネル各分子種の水輸送活性測定により、ダイコン細胞膜水チャネル(RsPIP)の6分子種は機能的に異なる2つのグループに分かれることが示唆された。そこで植物水チャネルの生理機能を解明するために、今年度は(1)輸送基質特性の検定、(2)部位特異的変異導入による機能解析を行った。まず、輸送基質特性についてグリセロール取り込み活性測定を実施した。RsPIP1タイプとRsPIP2タイプのいずれの分子種についてもグリセロール輸送能を持たないことが示された。次にダイコン細胞膜水チャネルの活性が異なる要因を明らかにすることを目的に、高い活性を持つRsPIP2タイプと、活性がないあるいは低いRsPIP1タイプからそれぞれ1分子を対象とし、部位特異的にそれぞれ5つのアミノ酸を置換した。アミノ酸置換部位はNPAモチーフが存在するloopE、そしてN末またはC末の推定リン酸化部位とした。代表例を1つ説明する。すなわち、RsPIP2-2のloop Eに存在する235番目のバリンをRsPIP1タイプで保存されているイソロイシンに置換したものは活性が著しく減少した。これに対してRsPIP1-3の244番目のイソロイシンをバリンに置換したものでは水透過性が若干上昇した。これらの結果はloop Eに存在するバリン残基は水チャネル活性に必要であることを示唆している。植物の水の流れとその制御における水チャネルの細胞生物学的意義を明らかにすることを目的としている。今年度は水チャネル分子種の生理的機能を解明する目的で、ダイコンの細胞膜水チャネル(RsPIP1-1,1-2,1-3,2-1,2-2,2-3)と液胞膜水チャネル(RsTIP1-1,2-1)各分子種の水透過機能の測定を行った。液胞のプロテアーゼ活性のない酵母BJ5459株に各分子種を発現させ、膜を調製しストップトフロー光散乱法によって活性測定を行った。また、用いた酵母には2つの水チャネル遺伝子が存在することを確認した。1つは機能を持たないと報告されているタイプであり、もう1つは11塩基対の欠損によりフレームシフトが起こり終止コドンが生じていたことから、どちらも水チャネル活性がないと考えられた。RsPIP2タイプとRsTIPタイプはともにベクターのみを発現させたコントロールよりも早いシグナル減少が見られ、また、水チャネル活性阻害剤である水銀剤処理によりこれらの活性は抑制された。このことはRsPIP2タイプとRsTIPタイプが水チャネル活性を持つことを示している。これに対しRsPIP1タイプはイムノブロット解析よりタンパク質の蓄積を確認したが、活性は検出できなかった。つまり、RsPIP1-1、1-2、1-3は水チャネル活性を持たない、あるいは低いことを示唆している。これらのことから、RsPIP1グループは水透過以外の役割をもつ可能性が考えられ、RsPIP1タイプとRsPIP2タイプでは植物体内で異なる機能を担っていることが示唆された。
ケラチン１７は口腔扁平上皮癌細胞を活性化させる：１４－３－３σの挙動との対比解析

口腔粘膜悪性境界病変において14-3-3sigmaとケラチン17(K17)の免疫組織化学を行ったところ、正常上皮と異型上皮では両者の発現を認めなかったが、扁平上皮癌と上皮内癌で同時に発現していた。また、口腔癌細胞株ZK-1を用いてK17をノックダウンさせたところ、細胞質内に存在していた14-3-3sigmaの核移行することが確認でき、その細胞増殖能と細胞遊走能が抑制されることが分かった。以上の結果から、口腔癌においてK17は14-3-3sigmaを介して癌細胞の細胞増殖能と遊走能に重要な役割を担っていることが証明できた。(3)siRNAによるK17ノックダウン細胞株の樹立:K17に対するsiRNAをZK1にトランスフェクションさせ、K17遺伝子をノックダウンさせた細胞株(ZK1_K17-siRNA)を作成した。Stealth RNAi Negative Control DuplexesをトランスフェクションさせたZK1を対照とし、RNAi効果の測定はRNAレベルで行った。(4)K17ノックダウン細胞株における14-3-3σ細胞内配置変化の認識:ZK1_K17-siRNAに対し抗14-3-3σ抗体および抗K17抗体を用いて蛍光抗体法を行い、蛍光顕微鏡にて両タンパク発現を確認した。14-3-3σの細胞内配置を観察したところ、control cellsでは14-3-3σは細胞質内に分布していたのに対し、ZK1_K17-siRNAでは核内に限局して分布していた。(5)K17ノックダウン細胞株の細胞増殖能および遊走能の変化の検討:ZK1_K17-siRNAを用い、その細胞増殖能および遊走能を対照と比較検討した。細胞増殖能の検討にはMTT法を用いた。細胞培養プレートに各細胞株を播種後7日までを各日計測したところ、実験群では有意に増殖能の低下を認めた。細胞遊走能の検討にはscratch assayにて行った。実験群は対象に比較して細胞遊走能の低下を認めた。(6)研究総括:以上の実験結果から、K17と14-3-3σの分子動態の関連性が明らかとなり、口腔癌においてK17は14-3-3σを介して癌細胞の細胞増殖能と遊走能に重要な役割を担っていることが証明できた。(1)外科切除組織標本における14-3-3σとK17の発現パターンの認識新潟大学医歯学総合病院口腔外科において切除をおこない、同病院歯科病理検査室でシークエンス癌の所見が認められた68症例を抽出した。外科切除材料のパラフィンブロックから連続切片を作製し、抗14-3-3σ抗体および抗K17抗体を用いて免疫組織化学をおこない、その発現率を正常上皮、異型上皮、上皮内癌および浸潤癌ごとに集計するとともに相互の発現パターンを比較検討した。その結果、正常上皮では14-3-3σ、CK17ともに陽性はなく、異型上皮でも同様の傾向であり、上皮内癌と浸潤癌では14-3-3σ、CK17ともに陽性で、分化した癌細胞で強調されることが判明した。14-3-3σとCK17の陽性域は一致し、(63/68症例、93%)口腔粘膜扁平上皮細胞の悪性化にともない、14-3-3σとCK17の共発現が強調されることも判明した。(2)ヒト口腔扁平上皮癌細胞株における14-3-3σとK17の発現パターンの認識細胞実験にはヒト口腔扁平上皮癌細胞株ZK1をもちいた。14-3-3σおよびK17のプライマーを使用してRT-PCRを行い、ZK1における両遺伝子発現について解析したところ、両タンパクの遺伝子発現が確認された。また、抗14-3-3σ抗体および抗K17抗体を用いて蛍光抗体法を行い、蛍光顕微鏡にてZK1の両タンパク発現についても確認できた。応募申請の内容のH23年度に記載した事項を順調に達成できている。応募申請の内容にしたがい、今後の研究を推進する。H24年度に購入予定のものがH25年度に変更となったが、それ以外はおおむね応募申請の内容に著変なく使用する予定である。
テフロン相分離器を利用する同時正逆抽出分離法の開発

平成5年度は装置及び相分離器の改良を行い,ピリジルアゾナフトール(PAN)を抽出剤とすることにより鉄,ニッケル,コバルトの3成分分離の可能性を明らかにした.平成6年度はこれら3成分の最適分離条件の詳細を検討し,本法の特長である低抽出率化合物の回収条件を明らかにした.特に本法は平衡定数の差を利用するとともに錯形成速度の差を利用するところに他の抽出分離法には見られない利点を有している.この利点を最大限に発揮するためにテフロン相分離器を利用する連続抽出装置を開発した.これは高速撹拌下でおこなうもので,実験室内で利用できる完全回収を目的とした連続抽出装置としては最初のものである.この装置を使用し,アセチルアセトンを抽出剤とし,抽出性の低いバナジウム(V)の抽出を行い短時間でほぼ100%回収できることを明らかにした.平成5年度は装置及び相分離器の改良を行い,ピリジルアゾナフトール(PAN)を抽出剤とすることにより鉄,ニッケル,コバルトの3成分分離の可能性を明らかにした.平成6年度はこれら3成分の最適分離条件の詳細を検討し,本法の特長である低抽出率化合物の回収条件を明らかにした.特に本法は平衡定数の差を利用するとともに錯形成速度の差を利用するところに他の抽出分離法には見られない利点を有している.この利点を最大限に発揮するためにテフロン相分離器を利用する連続抽出装置を開発した.これは高速撹拌下でおこなうもので,実験室内で利用できる完全回収を目的とした連続抽出装置としては最初のものである.この装置を使用し,アセチルアセトンを抽出剤とし,抽出性の低いバナジウム(V)の抽出を行い短時間でほぼ100%回収できることを明らかにした.本研究は抽出側と逆抽出側にそれぞれテフロン相分離器を備え,分離された有機相をポンプで相互に送液し,その送液途中で紫外可視検出器で検出しながら,分離状況を確認するシステムを利用している.抽出側と逆抽出側の水相の条件をコントロールすることにより,抽出されない成分と抽出される成分,更に逆抽出される成分とされない成分,従って3成分の分離が可能となる.このような分離法の応用例を示すために,比較的分離の困難な鉄,ニッケル,コバルトの分離を試み,ピリジルアゾナフトールをリガンドとし詳細に実験条件を検討した.その結果,抽出速度の遅いニッケルは抽出側水相に残り、鉄は逆抽出側水相に,コバルトは有機相にそれぞれ完全に分離された.有機溶媒はクロロホルムが使用され,逆抽出溶液は6N硝酸溶液が使用された.従来法によるニッケルの抽出率は数%から数10%であったが,過剰試薬が同時に逆抽出されるため,抽出速度の遅いニッケルは全く抽出されない結果が得られた.平衡条件と反応速度の条件を有効に利用できた結果である.このような条件での分離を考察するために,“みかけの分配比"の概念が検討された.また本法は抽出率の悪い成分に対しても,100%の回収率を得ることができる.その条件は逆抽出側の分配比が著しく小さい場合であり,その詳細な条件が明らかにされた.更に抽出率の悪い試料溶液に適用できることから,強アルカリ溶液中の微量不純物の除去法を検討した.その結果鉄,バナジウム,ガリウムは分離できなかったがコバルト,ニッケル,マンガン,銅は1NのNaOH溶液から分離できた.コバルトは有機相に残り,他はpH1以下の水相に逆抽出された.逆抽出時間や効率はリガンドの種類と濃度が大きく影響した.本研究は同時正逆抽出法を確立すること,更にその応用例を示すことが目的である。抽出側のフラスコでの選択性と逆抽出側での選択性を組み合わせることにより,多様な分離法が可能となる。そのためには選択的抽出剤と優れた逆抽出剤の選定が重要になる。本研究ではピリジルアゾナフトール(PAN)を抽出剤に硝酸を逆抽出剤とすることにより鉄,コバルト,ニッケルの相互分離が可能となった。また低抽出性化合物の移送,例えばアルカリ溶液中からのガリウムの回収に重要な役割を担う逆抽出の速度定数を求め,最適逆抽出剤を明らかにした。本法の特長は平衡定数の差のみを利用するのではなく,錯体生成速度の差を利用することにある。更に速度差を有効利用するためにテフロン相分離器を利用する連続抽出装置の開発を試み,低抽出率のバナジウムを高回収率で回収することに成功した。
動脈硬化発生に関与するLDLの修飾過程の解明とその予防並びに治療法の開発

我々は粥状動脈硬化の中心病巣をなす泡沫細胞の形成過程についてin vitroで解析を行ってきた。すでに生体内に存在する可能性の高いと考えられてきた内皮細胞による修飾を受けたLDL、酸化LDL、およびタバコ煙抽出物修飾LDLについて、泡沫細胞の起源とされるマクロファ-ジ(Mф)への取り込み機序について今回検討したところ、いずれもMфに受容体を介して取り込まれ、泡沫化することを明らかにした。従来より、MфにはアセチルLDLをとくいて来に認識し、取り込むアセチルLDL受容体が存在することが知られているが、上記変性LDLは一部はアセチルLDL受容体を介するが、残り50%は今回明らかになった酸化LDL受容体を介して行われることが判明した。タバコ煙抽出物修飾LDLはその産生様式が不明であったが、この反応には活性酵素(O_2)が関与していることが明らかになり、他の2つの変性LDLと同じく酸化LDLの一群に入ることが明らかとなった。従って、いずれもS.O.D.でその反応が阻害される。ここで酸化を抑制しうる薬剤を種々検討し、LDLの変性阻害効果を調べた。Probucol、VitaminE、VitaminC誘導体などである。いずれもin vitroにおいては酸化反応を阻害することが明らかになってきたが、in vivoにおいてこれら薬剤をまず家兎に摂取させ、その後LDLを採取しその酸化反応を検討したところ、probucolにおいてのみ効果が得られた。詳細を検討したところ、probucolのみ大量にLDL粒子内に含まれていたことから、抗酸化剤がLDL粒子に含まれていることが必須であることが判明した。次にin vivoにおいてprobucolの抗酸化反応に起因した抗動脈硬化作用について検討したところ、短期、長期に有効であり、しかも退縮にも効果があることがわかった。この過程で、probucolには抗酸化作用のみならず、血管内膜下へのマクロファ-ジの侵入についても抑制的に作用するという新たな知見を得た。今後、この方面を含めて研究を進めたい。虚血性心疾患の根本病因と考えられる粥状動脈硬化症の発症に血中低比重リポ蛋白(LDL)が重要な役割を果たしていることは周知の事実である。また粥腫形成の初期においてはマクロファージ(Mφ)を起源とした泡沫細胞の集簇が特徴的所見としてみられる。従来よりinvivoにおけるatherogenicなリポ蛋白が何であるのか、invitroの系を用いて研究されてきたが、最近LDLを修飾するとMφで泡沫化することが明らかになり、生体内での修飾LDLの存在の可能性が問題となってきた。現在、アセチルLDL、酸化LDL、タバコ煙修飾LDL(CS-LDL)等の修飾LDLがMφを泡沫化させることが明らかになっているが、今回の研究において我々は、まずそれらの修飾LDLが如何なる機構でMφを泡沫化するかにつき検討した。次にタバコ煙によるLDLの修飾に関与する物質の同定およびLDLの修飾を防止する物質の発見を試みた。(結果)従来よりMφには、アセチルLDLを特異的に認識する受容体の存在が明らかになっている。今回さらに酸化LDL、CS-LDLについてもMφへの取り込みを検討したところ、MφにはアセチルLDLを特異的に認識する受容体に加えて、酸化LDL、アセチルLDL両者を共に認識する受容体、及び酸化LDLを特異的に認識する受容体がそれぞれ存在することが判明した。

CS-LDLのMφへの取り込み機構は、competition studyの結果酸化LDLと類似の機序によると考えられた。酸化LDLの形成に関しては、ラジカルスキャベンジャーであるBHT、ビタミンE、およびプロブコールがLDLの酸化を有効に防止することが判明した。従って上記物質により修飾を防止することによりMφの泡沫化は抑制されると考えられる。また、CS-LDLの形成にはスーパーオキサイドが重要な役割を果たしており、SODによりLDLのタバコ煙による修飾は抑制されるが、その抑制は約50%であることが明らかとなった。残りの50%がどの様な修飾によるのか検討中である。我々は粥状動脈硬化の中心病巣をなす泡洙細胞の形成過程についてin vitroで解析を行ってきた。すでに生体内に存在する可能性の高いと考えられてきた内皮細胞による修飾を受けたLDL、酸化LDL、およびタバコ煙抽出物修飾LDLについて、泡洙細胞の起源とされるマクロファ-ジ(Mφ)への取り込み機序について今回検討したところ、いずれもMφに受容体を介して取り込まれ、泡洙化することを明らかにした。従来より、MφにはアセチルLDLをとくいて来に認識し、取り込むアセチLDL受容体が存在することが知られているが、上記変性LDLは一部はアセチルLDL受容体を介するが、残り50%は今回明らかになった酸化LDL受容体を介して行われることが判明した。タバコ煙抽出物修飾LDLはその産生様式が不明であったが、この反応には活性酵素(O_2)が関与していることが明らかになり、他の2つの変性LDLと同じく酸化LDLの一群に入ることが明らかとなった。従って、いずれもS.O.D.でその反応が阻害される。ここで酸化を抑制しうる薬剤を種々検討し、LDLの変性阻害効果を調べた。Probucol、VitaminE、VitaminC誘導体などである。いずれもin Vitroにおいては酸化反応を阻害することが明らかとなってきたが、in vivoにおいてこれら薬剤をまず家兎に摂取させ、その後LDLを採取しその酸化反応を検討したところ、probucolにおいてのみ効果が得られた。詳細を検討したところ、probucolのみ大量にLDL粒子内に含まれていたことから、抗酸化剤がLDL粒子に含まれていることが必須であることが判明した。次にin vivoにおいてprobucolの抗酸化反応に起因した抗動脈硬化作用について検討したところ、短期、長期に有効であり、しかも退縮にも効果があることがわかった。この過程で、probucolには抗酸化作用のみならず、血管内膜下へのマクロファ-ジの侵入についても抑制的に作用するという新たな知見を得た。今後、この方面を含めて研究を進めたい。
三次元高周波超音波顕微鏡装置の関節軟骨評価への応用

東北大学医工学研究科・医用イメージング研究分野で開発された「三次元高周波超音波顕微鏡装置」は、非接触、非侵襲的に10ミクロンの高解像度で組織の評価が可能である。本研究では、関節軟骨評価に最適な中心周波数120MHz、焦点距離3.2mmのトランスデューサーを開発したまた、正常関節軟骨を表層、中間層、深層に分け、超音波顕微鏡像と三次元高周波超音波顕微鏡装置の画像比較を行うと、表層、中間層で強い相関関係を示した。平成21年度の計画に基づき、正常ラットの膝関節を展開し、骨・軟骨柱を安定して採取する方法を確立した。大腿骨と脛骨からそれぞれサンプルを採取し、三次元高周波超音波顕微鏡装置で安定して計測が可能か検討した。骨・軟骨柱をしっかりと支持し、なおかつ水に対して安定した材料を検討した。トランスデューサーと関節軟骨表面が平行になるようサンプルを保持し、安定して関節軟骨および軟骨下骨の評価が可能となった。関節軟骨の表面形状から、脛骨の関節軟骨がより平行に近く、今回の計測には適していることが判明した。関節軟骨の評価に最適な周波数として120MHzを選択した。計測の結果として、関節軟骨表面と軟骨下骨周囲の輝度の高い領域、およびその間の輝度の低い領域に分けられることが判明した。市販されている中心周波数14MHzの超音波診断装置でヒトの膝関節軟骨を計測してみたが、三次元高周波超音波顕微鏡装置の方が、より鮮明に微細な構造を反映しているものと考えられた。計測に使用したサンプルをPFAで固定し、パラフィン包埋後、5マイクロメートルの切片を作製し、従来の超音波顕微鏡で計測した。関節軟骨表面および軟骨下骨では音速が高く計測された。その間の領域は三次元高周波超音波顕微鏡装置と異なり、比較的均一な音速を示した。この従来の超音波顕微鏡と三次元高周波超音波顕微鏡装置との比較により、関節軟骨の各層の組織学的特長が明らかとなり、今後行う予定の変形性関節症モデルのための基礎的データを得ることが可能であった。また、ソフトを用いて3次元の合成画像を作成が可能であった。東北大学医工学研究科・医用イメージング研究分野で開発され,非接触、非侵襲的に10ミクロンの高解像度で組織の評価が可能な三次元高周波超音波顕微鏡装置を用いて,関節軟骨の評価を行うことを目的とした研究である。皮膚の観察用に開発されたトランスデューサーを改良し、中心周波数120MHz,焦点距離3.2mmの条件がラット膝関節軟骨には最適であることを確認し,実験を行った。16週齢のオス,S-Dラットの脛骨側から直径3mmの骨軟骨柱を採取し、トランスデューサーから放出された超音波が関節軟骨表面に垂直に当たるようにセットし、三次元高周波超音波顕微鏡装置で観察を行った。その後骨軟骨柱を4%PFA液に一晩浸漬固定し,脱灰後にパラフィン包埋し,5mmの切片を作製した。切片を脱パラフィンした後,組織の粘弾性と関連する「音速」を計測可能な中心周波数80MHzの超音波顕微鏡で関節軟骨の計測を行った。関節軟骨表層は三次元高周波超音波顕微鏡装置で高輝度,超音波顕微鏡では高い音速を示し,表層以下から軟骨下骨までの関節軟骨は低輝度および不均一は音速をそれぞれ示した。両者の画像を比較し,エコー輝度と音速のピアソンの相関関係を算出した。関節軟骨表層では0.704,表層以下では0.731の高い相関係数を示した。変形性関節軟骨の初期変化は一般的に関節軟骨表面の軟化を特徴としているが,臨床的にはプローブなどで触知して診断している。本実験から三次元高周波超音波顕微鏡装置で高輝度を示した領域は音速が高い,つまり粘弾性が高いことが世界で初めて証明された。トランスデューサーを小型化することによって,術中に病変部位をマイクロレベルで特定できる可能性が高く,本実験から得られた基礎的データは臨床応用へ向けた大変意義深い研究であった。
医原性馬尾神経根癒着の成立要因と機能生理学的変調および予防対策の樹立

1.知覚機能評価においてL5-6椎弓切除後異物付加群では術後4週において、熱刺激に対する逃避反応の潜時が延長し始め、術後9週でほぼプラトーに達した。L5-6椎弓切除群では術後4週から6週において一過性に潜時が短縮したが、術後7週以降、わずかな潜時の延長を認めた。shamoperation群では潜時の術前測定値との差は1秒以内であった。また各群間を比較すると、L5-6椎弓切除後異物付加群ではsham operation群、L5-6椎弓切除群と比べ術後4週以降、明らかに潜時が延長した。組織学的評価では癒着した馬尾における神経変性が術後3週から認められており、知覚機能の低下と馬尾癒着後の神経変性との関連が考察された。運動機能・膀胱機能評価においては各群間に差はなく、経時的にも大きな変化は認められなかった。2.馬尾集合癒着について術後24時間の時点で対照群と2つの予防処置群の比較を行うと、インドメタシン(IND)投与群、メチルプレドニゾロン(MP)投与群ともに馬尾接着に対する抑制効果が明らかであった。術後3週の結果でも同様に両群で有意な抑制が認められた。術後6週においては馬尾癒着の程度は対照群と有意差はないものの、MP投与群では軽度となる傾向があった。馬尾癒着によって起こる神経変性所見は術後24時間の1例を除き全てが術後3週および6週に認められた。各群の神経変性の発生頻度を見ると、対照群では15匹中5匹33%であるのに対し、IND投与群では2匹13%、MP投与群では全く認められず、コントロールに比べ神経変性の抑制が明らかであった。馬尾血管透過性の変化について検討すると、術後24時間において2つの予防処置群共に対照群と比べEBA漏出の抑制が明らかであった。その他の時間での有意差は、認められなかった。以上のように、抗炎症薬はラット椎弓切除術後24時間の馬尾の血管透過性亢進と馬尾接着を明らかに抑制し、引き続き起こる馬尾癒着と神経変性を軽減させた。本研究の結果から術後早期の抗炎症薬の投与は馬尾癒着および癒着性くも膜炎初期病態を抑制する可能性があると判断された。3.椎弓切除後カオリン付加群では線溶系機能の低下するものが一部に認められた。組織学的な検討では、対照および2つの治療群の間に馬尾癒着の程度に有意差は見られなかったが、線溶系抑制物質投与群では高度の馬尾癒着を来たすものがあり今後、個体数を増やして検討する予定である。1.知覚機能評価においてL5-6椎弓切除後異物付加群(カオリン)では術後4週において、熱刺激に対する逃避反応の潜時が延長し始めた。

術後4週以降、潜時は延長し続け、術後9週でほぼプラトーに達した。術後9週以降、熱刺激に対する逃避反応の潜時は術前測定値と比較し、最大5秒の延長を認めた。L5-6椎弓切除群では術後4週から6週において一過性に潜時が短縮したが、術後7週以降、わずかな潜時の延長を認めた。shamoperation群では経時的変化に乏しく、潜時の術前測定値との差は1秒以内であった。また各群間を比較すると、L5-6椎弓切除後異物付加群(カオリン)ではsham operation群、L5-6椎弓切除群と比べ術後4週以降、明らかに潜時が延長した。組織学的評価では相互に癒着した馬尾における神経変性が術後3週から認められており、知覚機能の低下と馬尾癒着後の神経変性との関連が考察された。inclined planesystemおよびトレッドミルによる運動機能評価においては各群間には差はなく、経時的においても大きな変化はみとめられなかった。膀胱機能においても同様であった。2.組織学的検討では椎弓切除後、硬膜外異物付加を行ったラット馬尾において背側に位置する知覚線維束や集合した馬尾の中心部で、特に神経変性が高度であった。3.椎弓切除後カオリン付加群では線溶系機能の低下するものが一部に認められたが、現在、線溶系機能の血液学的評価と他の評価との比較検討をさらに進めている。1.馬尾集合癒着について術後24時間の時点で対照群と2つの予防処置群の比較を行うと、インドメタシン(IND)投与群、メチルプレドニゾロン(MP)投与群ともに馬尾接着に対する抑制効果が明らかであった。術後3週の結果でも同様に両群で有意な抑制が認められた。術後6週においては馬尾癒着の程度は対照群と有意差はないものの、MP投与群では軽度となる傾向があった。馬尾癒着によって起こる神経変性所見は術後24時間の1例を除き全てが術後3週および6週に認められた。各群の神経変性の発生頻度を見ると、対照群では15匹中5匹33%であるのに対し、IND投与群では2匹13%、MP投与群では全く認められず、コントロールに比べ神経変性の抑制が明らかであった。馬尾血管透過性の変化について検討すると、術後24時間において2つの予防処置群共に対照群と比べEBA漏出の抑制が明らかであった。その他の時間での有意差は、認められなかった。以上のように、抗炎症薬はラット椎弓切除術後24時間の馬尾の血管透過性亢進と馬尾接着を明らかに抑制し、引き続き起こる馬尾癒着と神経変性を軽減させた。本研究の結果から腰椎後方手術という外科的創傷にまつわる局所炎症過程に対しての術後早期の抗炎症薬の投与は馬尾癒着および癒着性くも膜炎初期病態を抑制する手段として成立する可能性があると判断される。2.線溶系増強物質投与群、線溶系抑制物質投与群の両群でU-globulin timeの測定値にばらつきが見られた。その原因として固体差や薬剤の投与方法に問第があると考えられた。組織学的な検討では、対照および2つの処置群の間に馬尾癒着の程度に有意差は見られなかったが、線溶系抑制物質投与群では高度の馬尾癒着を来たすものがあり今後、個体数を増やして検討する予定である。また上記の問題点につき現在さらに検討を加えている。
組換えDNAの発現と生体機能

今年は最終年度にあたり、1つの総括班と、それぞれに今までの公募研究の中からもっとも適当と思われる課題を12件加えた9つの計画研究班を組織して、3年間の研究をまとめた。これらの総合的な研究活動によって得られた成果のうち特に重大と思われるものは次のごとくである。1.本特定研究がスタートした当時、非常に遅れていた植物細胞のベクター系は、病原ウイルス,ウイロイド,葉緑体,Ti,Ri,プラスミドのそれぞれにおいて開発が著しく進展し、中には形質転換個体で正常に開花結実して後代への伝達が検討されて、有用作物の育種への利用の基礎を固めた。2.ヒトX染色体の遺伝子ライブラリーを作成しそれについて適切なRestriction Fragment Length Polymorphismマーカーを求める研究がすすんだ。3.遺伝病の解析で、健常細胞から抽出したDNAを異常細胞に導入してその性質を正常型に形質転換させ、このような形質転換活性を指標にして、遺伝子の産物が不明の場合でも目的とする遺伝子をクローン化出来ることを原理として、遺伝病患者に欠損している機能に関する遺伝子を分離する方法を確立した。これは今後、遺伝病の本熊を解析する上に有用な手段となるものと考えられる。4.常染色体優性遺伝をする家族性アミロイドニューロパティーの本熊と考えられるプレアルブミン遺伝子の一塩基遺換を明らかにし、それにもとづく簡単な発症前診断法を得た。5.カイコ多角体ウイルスのベクターとしての利用をみとめた。本総括班はこれらの研究間の交流を密にするため、2回の班会議開催、3回のサーキュラーおよび班員名簿の発行、公開シンポジウムの開催、DNA構造に関するデータベースgENESの整備、「染色体レベルにおける形質発現の調節」に関する小集会1回を開催した。またこれらの研究のため高速液体クロマトグラフシステム1式、および超低温槽1台その他を購入して、班員の便に供した。
2次元半導体レーザと光ファイバの光結合系の設計・製作

2次元半導体レーザは、従来のストライプ構造の半導体レーザに比べて多彩な発振モードを示す。本研究では、2次元半導体レーザから出力される複数のビームをそれぞれ光ファイバに結合させるための光結合系を設計した。最適な光学部品を用いることにより、マルチモード光ファイバで21.6%、シングルモード光ファバで9.6%の結合効率が得られることを数値計算により明らかにした。さらに、市販の光学部品を用いて光結合系の試作を行った。本研究は、2次元半導体レーザから出力される複数のレーザビームを光ファイバに結合させる光結合系を設計・製作することを目的とする。平成19年度は、光結合系の設計ならびに光結合に関する基礎的な実験を行った。まず、光学系の設計については、拡張Fox-Liモード計算法と光線追跡法を組み合わせたマルチモード光ファイバ系に対する結合効率の計算方法を提案するとともに9本の光ファイバに光を分岐させる光結合系を設計した。SLS(Selfoc Lens Standard)タイプ、直径2.0mmの屈折率分布型レンズとNA0.2、コア径80μmのステップインデックスファイバを用いて光結合系を設計したところ、9本の光ファイバに結合する光の割合は21.6%と見積もられた。レンズピッチやレンズの配置角度に対する結合効率の変化を計算したところ、トレランスが比較的大きく、厳密なアライメントを必要としないことを示した。光結合の実験については、まず、擬似スタジアム型半導体レーザをヒートシンクにマウントして、レーザの発振特性を評価した。その結果、30mWの光出力まで安定な最低次モード発振が得られることを確認した。次に、市販のファイバコリメータ(日本板ガラス:C-OPCL-5G-010/PCFC)を用いて結合効率の評価を行った。その結果、レンズの配置角度に対する結合効率の変化は、計算結果とほぼ同じ傾向を示した。しかしながら、市販のファイバコリメータでは、レンズと光ファイバのパラメータが最適化されていないことなどから、結合効率が約1桁小さい値になった。また、(株)国際電気通信基礎技術研究所と協力して、2次元半導体レーザの構造に対しても検討を行った。具体的には、共振器の内部にエアギャップを設けてレーザビームの出射方向を制御する新しい方法を検討した。本研究は、2次元半導体レーザから出力される複数のビームをそれぞれ光ファイバに結合させるための光結合系を設計・製作することを目的とする。平成20年度は、レンズタイプや光ファイバの種類が異なる光結合系に対して結合効率ならびにトレランスを解析した。まず、解析については、コア径80μmのステップインデックス型マルチモード光ファイバを用いた光結合系に対して、レンズタイプの違いによる結合効率の変化を解析した。その結果、標準的な開口数を持つSLSタイプのレンズを用いる方が開口数の大きいSLWタイプのレンズを用いるより、結合効率が高くなることを明らかにした。更に、シングルモード光ファイバを用いた光結合系の結合効率を解析したところ、マルチモード光ファイバを用いる場合に比べて、結合効率が大幅に低下するとともに、レンズピッチに対するトレランスが極端に小さくなることが明らかになった。これらの計算結果を踏まえて、試作にはコア径80μmのステップインデックス型マルチモード光ファイバを使用した。まず、2次元半導体レーザをA1Nサブマウントに取り付け、サブマウントを銅のステムに融着した。次に、レンズ付の光ファイバを9本用意して出力ビームの向きに沿ってV溝加工を施した治具に光ファイバを接着した。更に、半導体レーザと光ファイバアレイを微動ステージに取り付けて光ファイバに結合する光パワが最大になるように調整を行った。今回の試作では、4本の光ファイバで故障が起こり、5本の光ファイバで光の結合が確認できた。結合効率は、最も高いチャンネルで0.56%となり、全体的に低い値を示した。これは、半導体レーザの構造が十分に最適化されていないことが主な原因である。素子構造を最適化して結合効率を高めることと光結合系の組立て方法を改善することが今後の課題である。
男性不妊の新マウスモデルを用いての、不妊症の免疫調節療法の開発

我々は同系精巣細胞(TC)の2,3回の皮下注射のみで、アジュバントその他の免疫増強操作なしに、マウスに実験的自己免疫性精巣炎をほぼ100%の頻度で発症させることをみいだした。(Clin.Exp.Immunol.1991;Autoimmunity 1991)。この実験系を免疫制御の検定系として、男性不妊症の免疫調節療法の開発に努力してきた。1.昨年度、この新EAOモデルをその前臨床期(preclinical phase)において抑制する能力をもつCD4^+T細胞株(C.Tsと命名)を、TC10回反復感作マウスから確立した(Clin.Exp.Immunol.,in press)。現在、千葉大学医学部附属高次機能制御研究センタ-免疫機能分野・谷口克教授との共同研究の下にC.Ts細胞のT細胞レセプタ-に関する研究が進行中で、Vα5鎖の使用が明らかとなった。2.マウスの部分精製精子抗原の可溶性画分(deーmTA)を寛容原としてC3H/Heマウスに投与することによる特異的免疫寛容の誘導と精巣炎の発症阻止のモデルが完成した。この疾患制御モデルにおいて働く調節細胞はCD8^+のT細胞で、細胞障害活性をもたない真のサプレッサ-T細胞であることが証明された(Clin.Immunol.Immunopathol.1992)。4.本年度に企画したその他の研究に関しても、現在実験が進行中である。
南米全域のモンゴロイド系先住民族における遺伝的差異の比較解析

南米全土の純粋な先住民族2,500個体より採取した末梢血単核球検体について、Epstein-Barrウイルスを用いて550個体分のB細胞株(EBV-B細胞)を樹立し、南米各部族の遺伝的特徴の解明と部族間類縁関係の解析を実施した。人類遺伝学的解析に先立ち、アレイCGH解析を行いEBV-B細胞の樹立過程および長期培養時のゲノム安定性を確認できた。人類遺伝学的解析として、性による影響を排除するために常染色体マイクロサテライト8領域を用いて地理的な位置関係に基づいて南米全土を5グループに分類し、各グループ間で遺伝的特徴に差異があることを明らかにできた。本課題研究に先立ち、報告者は、南米全土におよぶ純粋なモンゴロイド系少数民族の血液検体よりB細胞株500個体分を樹立した。血液検体は有限の研究材料であり、そのまま使用すればすぐに尽きてしまうリソースである。報告者が樹立した南米検体にはすでに滅亡し収集しなおすことのできない部族等も含まれており、B細胞株の樹立は、尽きることのない遺伝資源を確保するために非常に重要である。B細胞株は長期間培養後でも正常な染色体核型を保持することが知られており、ゲノム構造を安定に保つと考えられてきた。しかし、B細胞株のゲノム安定性に関して高解像度で網羅的なゲノム解析はこれまでにほとんど行われておらず本研究課題のような遺伝学的解析にB細胞株を使用することを不安視する研究者も多い。そこで報告者は本年度の研究として、まず、マイクロアレイを用いてB細胞株の網羅的なゲノム安定性解析を行った。その結果、B細胞株樹立過程で発生したと考えられるリアレンジメントはほとんど検出されず、B細胞株の遺伝資源としての有用性を示すことができた(この成果は、報告書提出時点で論文雑誌に投稿中である)。マイクロアレイ解析によりB細胞株のゲノム安定性が確認できたことを受け、本年度は部族間比較解析のための準備に着手した。解析対象のゲノム領域としてマイクロサテライト多型を用いることを計画しており、本年度は法医学的マーカーについてデータの取得を進めている。本報告書提出時点で、全てのB細胞株について、個体識別に使用される法医学的マーカーおよびY染色体上の法医学的マーカーのデータ取得が完了している。次年度は、マーカーの種類を増やすとともにこれらのデータを用いて南米各部族の類縁関係の解析を進め、解析に適したマーカーの絞り込みを行う予定である。しかし、B細胞株のゲノム安定性に関して高解像度で網羅的なゲノム解析はこれまでにほとんど行われておらず本研究課題のような遺伝学的解析にB細胞株を使用することを不安視する研究者も多いことから、昨年度はマイクロアレイを用いてB細胞株の網羅的なゲノム安定性解析を行い、B細胞株樹立過程で発生したと考えられるリアレンジメントはほとんど検出されずB細胞株の遺伝資源としての有用性を示した(Danjoh et al.,2011)。この結果を受けて昨年度から今年度にかけて、法医学的マイクロサテライトマーカーおよびY染色体上の法医学的マーカーのデータ取得を行い人類遺伝学的類縁関係の解析を開始した。この解析の過程でモンゴロイドではこれまでに報告されていない多型パタロンが検出された。これらの多型領域に関してはゲノムDNA塩基配列レベルでも解析を進める必要があると考えている。EBVで不死化したB細胞株(B細胞)は正常なゲノム構造を安定に保つと考えられているが、高解像度で網羅的なゲノム解析は行われていなかったことから、まずアレイCGH解析によりゲノム安定性を確認した。南米先住民族の類縁解析においては、性によるバイアスを極力排除するために常染色体上のマイクロサテライト(MS)多型を解析に用いた。1)B細胞株樹立および培養過程におけるゲノム安定性継代数15程度の10検体についてアレイCGH解析を行った結果、全てのB細胞において免疫グロブリン遺伝子クラスター(Ig)領域の欠失が認められた。Ig領域はBリンパ球の分化過程で欠失する領域であることから、B細胞で検出されたこの領域の欠失はBリンパ球由来であると考えられた。末梢血単核球からBリンパ球を分画し同様にアレイCGH解析を行ったところ、B細胞と同様の欠失パターンが認められた。

B細胞の樹立過程で生じたと考えられる増幅・欠失は4カ所検出され、樹立初期におけるゲノム構造は安定していることが示された。30継代程度培養したB細胞株おいては、解析した3株中1株において4番染色体トリソミーが確認された。この細胞集団では4番染色体以外の領域での増幅・欠失は認められなかった。継代数の少ない細胞集団と継代数を経た細胞集団について細胞クローンの解析を行った結果、両者は異なるBリンパ球由来であることが示された。2)部族間の類縁関係MS8領域とベネズエラ46個体、コロンビア26、エクアドル40、ボリビア24、チリ42を用いてMSの総アリル数を算出したところ、南米全検体は54で日本人(152検体)と大きな差異は無かった。地域ごとの集計では地域間で遺伝的特徴の異なることが示唆された。また地域ごとに各アリルの出現頻度が異なっており、南米先住民族は地域ごとに特徴的な遺伝的背景を保持することが示された。南米先住民族のマイクロサテライトデータの取得が順調に進み、人類遺伝学的解析も開始している。解析の過程で新規の発見もあり、今後の展開に期待が持てる。24年度が最終年度であるため、記入しない。交付申請書に記載したとおり、マイクロサテライトデータを用いて人類遺伝学的解析を進める。マイクロサテライトの繰り返しパターンで興味深い領域が検出されていることから、当初の計画には含まれていなかったが、このような領域についてはゲノムDNAの塩基配列レベルでの解析も行う予定である。
腸内細菌による代謝活性化：クロシン糖部の機能解析

糖鎖を有す植物成分、配糖体は天然に広く分布し、生薬や天然薬物の代表的有効成分としてよく知られている。ところが配糖体を経口摂取した場合、配糖体糖鎖が腸内細菌により代謝分解され、非糖部のみ腸管から吸収される。そのため、従来、真の有効成分として、糖鎖部は不要と考えられてきた。一方、サフランの有効成分配糖体crocinは神経細胞保護作用の研究において、非糖部(crocetin)のみでは全く活性を示さず、糖鎖部分も重要な役割を果たすことが動物実験において明らかとなり、パラダイムシフト的知見が得られた。そこで、このような糖鎖の持つ生体内現象を分子レベルで解明するためcrocin糖部の腸内細菌による代謝および化学的変換位基づく代謝の変化、さらには糖鎖と神経保護作用の関連に着目し、本研究を行なっている。腸内細菌の代謝については、まず被験物質であるcrocinと代謝生成物と予想されるcrocetinを植物エキスより単離した。単離したcrocinを用いて代謝実験を行なったところ、いくつかの中間代謝物を経てcrocetinが生成したことが確認できた。また、その他の未知生成物の検討も行なっている。合成糖鎖については、crocin様化合物の合成を試みたが、最終生成物が単離・精製できなかった。そこで、合成経路の再検討を行い、収率の向上を検討する。また、crocetin部分の変換が可能かを検討する予定である。この研究により、crocinの腸内細菌の代謝経路やその後の動態などを明らかになれば、配糖体糖鎖の必要性を確認でき、大きな意義があると考える。また、crocinにおいては神経保護作用が動物実験で明らかとなっているので、配糖体の神経細胞への関与も明らかになれば新しい創薬のターゲットになると考える。1)腸内細菌による代謝の影響の解明について腸内細菌の代謝については、まず被験物質であるcrocinと代謝生成物と予想されるcrocetinを植物エキスより単離した。昨年度確立した方法を用いて、単離したcrocinの代謝実験を行なったところ、いくつかの中間代謝物を経てcrocetinが生成したことが確認できた。2)化学的変換に基づく合成糖鎖配糖体の調製crocetinとのカップリングを行なったが、最終生成物の反応段階の収率が悪く、単離・精製がうまくいっていない。そこで、糖鎖保護基の検討を行なっていく。腸内細菌株による代謝の影響を確認する。理化学研究所微生物系保存施設(JCM)より購入した計29種類を用いる。代謝条件としては、GAM培地を用い、37°C、嫌気状態(N2 80%、CO2 10%、H2 10%)で行う。それらの代謝培養液よりOASIS HLBで代謝物を固相抽出し、HPLCを用いて分析を行う。まず、crocinの代謝を行い、配糖体の加水分解だけでなく、未知活性物質誕生の可能性を慎重に探る。続いて、合成糖鎖配糖体の代謝も合わせて行なう予定である。一方、合成糖鎖の収率改善のために、保護基の再検討として、エステル保護基でなくエーテル系・シリル系などの保護基の検討も行う。また、crocetin部分も簡略化できないかを検討する。腸内細菌の代謝については、代謝実験の条件等も確立し、被験物質であるcrocinの単離・精製を行なった。また、代謝生成物であると予想されるcrocetinの単離・精製も行い、これらより、代謝生成物同定や未知生成物の探索につながると考える。また、合成糖鎖については、crocin様化合物の合成を試みたが、最終生成物が単離・精製できなかった。そこで、収率改善のために反応条件の検討や、合成経路の再検討を行う。1)腸内細菌による代謝の影響の解明について被験物質であるcrocinの単離精製を行なった。まず、サンシシ果実を水で抽出し、その後Diaion HP-20、ODS、Silica gel等各種クロマトグラフィーを用いて精製を行なった。単離した化合物についてはNMR・MSのスペクトルデータよりcrocinであると同定した。また、純度・量ともに代謝実験に耐えうるcrocinを確保した。

一方、代謝のための予試験を行い、本試験時の条件検討の知見とした。2)化学的変換に基づく合成糖鎖配糖体の調製a)Gentiobiose誘導体の合成を試みた。糖供与体は、glucoseをアセチル化し、続いてチオクレゾール・3-フッ化ホウ素エーテル錯体存在下、チオグリコシドの合成を行なった。一方、糖受容体はglucoseのベンジル化を行い、その後、塩化亜鉛を触媒とし、6位の選択的アセチル化、続いて脱アセチル化を行い6位以外を選択的に保護した糖受容体として合成した。次に先ほど調製した糖受容体と糖供与体をNISを用いて塩化メチレン中反応させ、gentiobiose様のジサッカライドを合成した。この後、各種保護基を脱着し、gentiobioseの1位のみがOH基で残りがアセチル基で保護したgentiobiose誘導体を合成した。b) crocetinとのカップリングを行なったが、crocetinの反応溶媒への溶解性が低く、収率がとても低い。そのため、温度や反応溶媒などの反応条件の再検討が必要である。糖鎖を有す植物成分、配糖体は天然に広く分布し、生薬や天然薬物の代表的有効成分としてよく知られている。ところが配糖体を経口摂取した場合、配糖体糖鎖が腸内細菌により代謝分解され、非糖部のみ腸管から吸収される。そのため、従来、真の有効成分として、糖鎖部は不要と考えられてきた。一方、サフランの有効成分配糖体crocinは神経細胞保護作用の研究において、非糖部(crocetin)のみでは全く活性を示さず、糖鎖部分も重要な役割を果たすことが動物実験において明らかとなり、パラダイムシフト的知見が得られた。そこで、このような糖鎖の持つ生体内現象を分子レベルで解明するためcrocin糖部の腸内細菌による代謝および化学的変換位基づく代謝の変化、さらには糖鎖と神経保護作用の関連に着目し、本研究を行なっている。腸内細菌の代謝については、まず被験物質であるcrocinと代謝生成物と予想されるcrocetinを植物エキスより単離した。単離したcrocinを用いて代謝実験を行なったところ、いくつかの中間代謝物を経てcrocetinが生成したことが確認できた。また、その他の未知生成物の検討も行なっている。合成糖鎖については、crocin様化合物の合成を試みたが、最終生成物が単離・精製できなかった。そこで、合成経路の再検討を行い、収率の向上を検討する。また、crocetin部分の変換が可能かを検討する予定である。この研究により、crocinの腸内細菌の代謝経路やその後の動態などを明らかになれば、配糖体糖鎖の必要性を確認でき、大きな意義があると考える。また、crocinにおいては神経保護作用が動物実験で明らかとなっているので、配糖体の神経細胞への関与も明らかになれば新しい創薬のターゲットになると考える。1)腸内細菌による代謝の影響の解明について腸内細菌の代謝については、まず被験物質であるcrocinと代謝生成物と予想されるcrocetinを植物エキスより単離した。昨年度確立した方法を用いて、単離したcrocinの代謝実験を行なったところ、いくつかの中間代謝物を経てcrocetinが生成したことが確認できた。