hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
学齢期中途脳障害による重障児の残存認知機能評価法と指導プログラム開発の試み

学齢期の交通事故によって重度脳障害を受けたふたりの事例(A;受傷7歳,現在24歳。B;受傷8歳,現在14歳)を対象にして,養育記録,治療、訓練、指導記録,家族からの聞き取り資料などをもとに,事故後から今日に至る意識障害の状態の推移にともなう行動反応変化の遡及的分析を試みた。その結果,ふたりの事例の間に,脳挫傷の範囲や軽重という生物学的要因に規定される障害像に大きな差異がみられたが,それとともに,心理機能の回復を促すうえで有効であったと推定される働きかけに関する共通点が明らかになった。その第一は,医学的に意識回復、症状固定と診断された時期に先行して,家族などによる言葉がけ等の働きかけに対する安定した反応(眼球の動き,瞬目,口の開閉)が観察されたこと,そして,そのような反応を観察することができたきっかけが栄養の経管摂取から経口摂取への転換であったこと,第二に,受傷前の経験に根ざす働きかけ(例えば,かつての級友の声や好きだった歌の呈示)が表示変化などを引き起こすうえで効果があったこと,である。そして,現時点での反応性を生理心理学的方法によって検討したところ,そのような受傷前の経験や好悪にもとづいて家族が継続してきた働きかけや刺激が,定位的反応や持続的注意を誘発するうえでより大きな効果を持つていることが明らかになった。本年度(第一年度)は、学齢期の交通事故によって脳障害を受けた二事例(A, B)を対象にして、事故後の意識障害の状態の推移にともなう行動反応の変化を、遡及的に整理、分析した.事例Aは、7歳11月時の事故によって脳挫傷を負い、3ケ月深昏睡状態が続いた.受傷後3ケ月から2年5ケ月間は意識遷延状態を呈し、その後症状固定期へ移行し、24歳となった現在いわゆる「超重症児」の状態にある.一方、事例Bは、8歳8月時の事故によって脳挫傷を負って昏睡状態に陥ったが、受傷後9ケ月で急性期外科医療が終了し、その後姿勢に3年8ケ月間入所し、現在14歳で養護学校中学部に在籍し、自宅から通学している.痙性四肢麻痺、言語障害の重複障害を有する.養育記録、治療・訓練・指導記録、そして家族からの聞き取り資料などをもとに、事例Aに関しては16年間の、事例Bに関しては5年余りにわたる遡及的分析を試みた.その結果、脳挫傷の範圍や軽重という生物学的要因に規定される障害像に大きな差異がみられたが、それとともに、心理機能の回復を促す働きかけに関する共通点が明らかになった。その第一は、医学的に意識回復・症状固定と診断された時期に先行して、家族などによる言葉がけ等の働きかけに対する安定した反応(眼球の動き、瞬目、口の開閉)が観察されたこと、そして、そのような反応を観察することができたきっかけが栄養の経管摂取から経口摂取への転換であった.第二に、受傷前の経験に根ざすはたらきかけ(例えばかつての級友の声や歌の呈示)がそのような反応誘発に効果があった.今後、周性期脳障害による重症児の発達過程との比較や非侵襲性脳機能測定を加えることによって、残存認知機能の明確化とそれを活用した指導法を開発することができる.学齢期の交通事故によって重度脳障害を受けたふたりの事例(A;受傷7歳,現在24歳。
中山間地の統合型・分散型水道システム最適組合せによる地震防災対策に関する研究

本研究では,中山間地域における水道システムの統合化を背景に,水道事業施設の耐震性や冗長性,復旧機能性に関する評価手法を提案することを目的としている.とくに近年では,甚大な被害をもたらす地震が多発する中,水道事業体においても事業規模を問わず甚大な被害に見舞われている.各事業体では,管路更新および耐震化などの事前対策と,被災後の初動体制や連絡網の強化さらには地震時緊急対応マニュアルの整備などの事後対策の両面から地震防災対策が実施されている.しかし,事前対策を実施するためには,水道事業体の現状把握が必要不可欠となってくる.まず,管路耐震化状況を定量的に評価する手法を提案するとともに事業規模による耐震化低減効果について明らかにした,給水人口規模が小さくなるほど地震に対して脆弱になることが分かった.また,給水人口2万人以上の事業体では,今後10年間の更新方法によって危険度を大幅に低減できることが明らかになった.それ以下の事業体では,管路の耐震化だけでなく,震後の緊急対応の充実化を図るなど事後対策と併せて対策すべきであると考えられる.また,昨年度から分析している中山間地の道路閉塞評価と将来的にリンクさせてシステムとしての評価方法につなげることが課題である.一方で,事業体の緊急対応マニュアルを収集し,事業規模におけるマニュアル整備状況と緊急対応時の組織状況について分析した.災害時の指令系統を計画している事業体が多かったが,事業規模が小さくなるにつれて職員数が減り,災害担当部署に数名しか配置できなくなることが明らかになった.本研究では、中山間地域における簡易水道システムの統合化を背景に、分散型システムと統合型システムの冗長性、復旧機能性に関する評価手法を提案することを目的としている。本年度は、まず、中小都市や中山間地域との管路システムの特性と管路被害、復旧過程について調査を行い、施設条件の違いとそれによる被害・復旧における影響を分析した。幾つかの水道システムの資料収集から、中山間地域では給水人口が少ないため、管路口径も小さく、経年管路が多く埋設されていることが明らかになった。また、都市域と比べて耐震継手のある管路を採用している水道システムも少ないこともわかった。これらの水道ネットワークについてはGISのデータベース化を試みている。さらに、中山間地の水道システムの特徴として、傾斜勾配の大きい道路上に管路が敷設されることが多い。本研究では、GISに道路ネットワークと標高データを組み込んで、管路が敷設されている道路周辺の傾斜角度を算出・図化した。現地調査から、本研究で用いた傾斜角度は妥当であることは確認している。さらに新潟県中越地震で被災した道路情報や地震動、地質と合わせることで中山間地域の道路閉塞率について定量分析を行い、地震時の道路閉塞率を推定する手法を提案した。新潟県中越地震の道路被害には斜面地域における路面の陥没、盛土の崩壊などが多く、地中管路にも影響を与える。斜面地域の地盤変位量についてさらに分析が進めば、中山間地域の地中管路脆弱性評価はさらに高精度なものとなると期待できる。本研究では,中山間地域における水道システムの統合化を背景に,水道事業施設の耐震性や冗長性,復旧機能性に関する評価手法を提案することを目的としている.とくに近年では,甚大な被害をもたらす地震が多発する中,水道事業体においても事業規模を問わず甚大な被害に見舞われている.各事業体では,管路更新および耐震化などの事前対策と,被災後の初動体制や連絡網の強化さらには地震時緊急対応マニュアルの整備などの事後対策の両面から地震防災対策が実施されている.しかし,事前対策を実施するためには,水道事業体の現状把握が必要不可欠となってくる.まず,管路耐震化状況を定量的に評価する手法を提案するとともに事業規模による耐震化低減効果について明らかにした,給水人口規模が小さくなるほど地震に対して脆弱になることが分かった.また,給水人口2万人以上の事業体では,今後10年間の更新方法によって危険度を大幅に低減できることが明らかになった.それ以下の事業体では,管路の耐震化だけでなく,震後の緊急対応の充実化を図るなど事後対策と併せて対策すべきであると考えられる.また,昨年度から分析している中山間地の道路閉塞評価と将来的にリンクさせてシステムとしての評価方法につなげることが課題である.一方で,事業体の緊急対応マニュアルを収集し,事業規模におけるマニュアル整備状況と緊急対応時の組織状況について分析した.災害時の指令系統を計画している事業体が多かったが,事業規模が小さくなるにつれて職員数が減り,災害担当部署に数名しか配置できなくなることが明らかになった.
「移民政策」の形成過程分析と政策評価-シンガポールの事例分析と比較考察-

アジアにおいて活発化する人の越境を、各国はどのように認識し、いかに規制しようとするのか。本研究では、上の問いを軸とし、シンガポールの事例、および比較対象として主に日本の事例を中心に扱い、「移民政策」の形成過程やその実態的影響の分析を試みた。現代社会における国際移住者の規模と形態は、労働力や技術への経済社会的需要に相応に規定されている一方で、ホスト国政府による国際人口移動と国益の結びつけ方に多大な影響を受けている。本研究は、シンガポールを中心とするアジア各国における移民政策の展開を比較分析し、評価することを試みている。本研究の初年度は、文献収集および分析概念の検討・フィードバックを主な作業とした。基本資料の収集としては、調査事例であるシンガポールの移民問題やエスニック問題等を中心に、全体の7割程度の資料を集めることができた。また、新型インフルエンザの影響などで現地での予備調査の延期を余儀なくされたが、現地の専門家(シンガポール国立大学アジア研究所の研究者ほか多数)と、国内外の学会やシンポジウムにおいて、意見・情報交換や研究打ち合わせの機会をもつことができた。また、シンガポールの市民社会組織や公官庁への連絡を随時行っており、今後の研究の遂行準備を行っている。また当該年度は、分析概念の精緻化を進めた。移民(migrants)といった基礎的な用語の使い方や認識などについて、国内外の状況を整理した。概念や用語法に関する共通土台を構築することは、他の専門家の研究協力や助言を必要とする本調査を継続するうえで、不可欠な作業であった。上の点についての討論やフィードバックは、以下の二つの論文と一つの学会報告を通じて行った。明石純一(2009)「『入管行政』から『移民政策』への転換」『日本比較政治学会年報』第11号。同(2010)「入国管理の『再編』とグローバルガバナンス」『国際日本研究』第2号。同,Discovery of Immigrants,香港社会学会、2009年12月5日。論文発表や学会報告では、各国研究者から多くの有意義なコメントを得ており、次年度の研究調査へと繋がる発展的作業となった。本研究の2年目は、引き続きの文献収集と現地調査を主な作業とした。基本資料の収集としては、調査事例であるシンガポールの移民問題やエスニック問題等を中心に、昨年度から累積して全体の9割程度の資料を集めることができた。また当該年度は、現地調査を実施し、新たな研究資料の収集も行ったほか、現地の専門家と打ち合わせを重ね、研究調査の内容と方向性について点検を実施した。さらに現時点までの調査成果にもとづき、以下の論文・共著((1)(4))を発表したほか、学会(移民政策学会・日本国際政治学会・日本社会学会)や国際シンポジウム(スカラブリニ移民センターとILOアジア太平洋地域事務所共催)などに参加し、当該テーマに関する意見交換に努めた。(1)「外国人『高度』人材の誘致をめぐる期待と現実」五十嵐泰正編『労働再審-越境する労働と<移民>』大月書店、2010年11月、(2)「インド人ITワーカーの越境」首藤もと子編『グローバル・ディアスポラ-東南アジア・南アジア』明石書店、2010年12月、(3)Japanese ImmigrationPolicy in a Transition, Asian Review Vol.24, Institute of Asian Studies, Chulalongkorn University, February, 2011,(4)「シンガポールの移民『マネジメント』」安里和晃編著『鎖国国家日本の衰退-人口減少社会の担い手はだれか』ダイヤモンド社、2011年3月。現地調査、論文発表、学会等の参加を通じて、各国研究者から有意義なコメントを多数得ており、次年度の研究調査と成果報告へと繋がる発展的作業となった。本研究の3年目は最終年度であり、これまでに収集した資料や予備的分析の結果をまとめながらの研究成果報告を主な活動とした。それとともに、今後とも研究を拡充、進展させていくための現地の専門家と打ち合わせや、研究へのフィードバックをおこなった。具体的には、アジア研究学会において日本およびアジア諸国の移民政策の形成メカニズムを論じ、当該テーマに関する意見交換に努めた。同様に、国際会議「アジアにおける移住労働に関するラウンドテーブル」(アジア開発銀行研究所/OECD共催)において、シンガポールを含むアジア各国の移民政策がもたらす越境労働への影響について報告をおこなった。後者の報告では、主に、2008年に発生した経済危機以降における国際人口移動の動向が各国の移民政策や経済社会的文脈によりいかに規定されているかを明らかにした。上に述べた学会および国際会議における研究報告と専門家からのフィードバックも参考にしながら、本年度は、以下の研究成果をまとめた。

「移住労働と世界的経済危機」明石純一編『移住労働と世界的経済危機』(明石書店、2011年9月)、および、「現代日本における入国管理政策の課題と展望」吉原和男編『現代における人の国際移動』(慶応義塾出版会、2012年4月刊行予定)。上述の通り、現地での研究打ち合わせ、論文発表、学会等の参加を通じて、各国研究者から有意義なコメントを多数得ることで、本研究事業にて焦点を当てたシンガポールの事例のみならず、移民政策の国際比較研究を深めていくための分析軸の整理、検討をおこなうことができた。また、当初から予定していた日本の事例との比較分析を試みた成果を発表するなど、今後の研究調査へと繋がる発展的作業となった。
慢性期脳血管障害患者の寝たきりを防ぐ背面開放座位ケアプログラムの開発

慢性期脳血管障害患者の寝たきり防止として、背面開放座位ケアプログラムを開発した。背面開放座位とは、足を床に付け背中を開放し首を自力保持する姿勢で、プログラムには、この座位を取るために必要な関節可動域運動や筋力訓練等を含めた。本プログラムを臨床活用できるよう、ホームページや簡単にケア出来るための保持具や冊子作成を行い、患者への効果検証も行った。離床時間の延長、家族の介護意欲の向上等の効果が得られた。本年度は、プログラム開発に必要な2つの視点から研究を行った。1つは、背面を開放して座ることの検証的研究であり、背面開放座位が体内刺激として有効か否かを自律神経活動の観点から研究した。対象は健常者16名、研究デザインは実験研究、研究方法は、フラクレットWTソフトウェアVer. 4.0を用いて周波数解析を行い、高周波成分HFを副交感神経活動、低周波成分1高周波成分LF/HFを交感神経活動の指標とした。分析方法は、統計学的手法を用いてWilcoxon順位検定もしくは符号付検定を行った。結果、(1)背面開放座位は安静仰臥位と足底を床に接地した頚部を自力保持した背面密着座位よりもHFが低下、LF/HFが賦活化した。(2)足底を床に接地し頚部自力保持した背面密着型座位は、安静仰臥位よりもHFが低下、LF/HFが賦活化した。本研究により、純粋に背面を開放するという行為が自律神経活動の賦活化を促進する要素になっている可能性が示唆でき、先行研究と合わせると、背面開放座位の姿勢は、背面を開放すること、両下肢を下げて足底を床に接地すること、頸部を自力保持することが体内刺激としての要素になると分かった。2つ目の研究は、背面開放座位の技術に関する現状調査である。背面開放座位導入の判断基準、座位前・中・後の患者に対する観察点や留意点、手順等をアンケートにて現状を調査し、プログラムとなる内容を抽出した。アンケートの配布対象は、背面開放座位を導入している医療施設の看護師及び在宅介護者であり、配布数は、569部で、回収部数は225部だった(回収率39.5%)結果はプログラム内容に不可欠と思われる内容が多数抽出され、本結果を次年度作成予定であるプログラム内容に含めていく予定である。本年度は、プログラム開発を行い、それの試用を行った。プログラム開発においては、昨年の現状調査と自律神経活動を指標とした背面開放座位の実験結果をもとに作成し、プログラム名を"起きる"看護ケアプログラムと命名した。看護師が臨床現場で手軽に持ち運びでき、いつでも見ることができるように小冊子を作成し、さらに小冊子だけでは説明できないプログラムの理論や考え方、プログラム開発に至った研究のプロセス等を雑誌図書の特集に掲載し製本とした(ナーシングトゥディ10月号特集)。また、プログラム内に含まれている背面開放座位の看護技術を安全で手軽に提供できるよう背面開放座位保持具を考案し[Sittan]と命名し、特許を申請した(申請中)。上記の内容を含んだ"起きる"看護ケアプログラムを東海地方の1総合病院の脳神経外科病棟で試用した。試用の結果、プログラム内容には修正がなく、対象患者である慢性期脳血管障害患者に表情の変化、頸部自力保持などの僅かな効果が見られた。また患者の家族にも良い影響を及ぼし、起きることの重要性を家族が認識し、介護意欲を高める結果となった。一方で、臨床看護師にプログラムを指導、教育する際の方法に何点か修正を認めた。修正内容は、臨床看護師への指導を定期的に数回に分けて行うこと、教育はプログラムの手技だけではなく、プログラムの重要性を含んだ理論や哲学等も説明すること、随時、質問に答えられる体制を取ることであった。プログラム導入には、臨床看護師への教育方法も詳細に検討していく必要があることが分かり、それらを踏まえて、プログラム導入の計画を立てていく必要がある。次年度は複数施設でプログラムを計画的に導入し、対象を患者、家族、臨床看護師の視点から検証していく予定である。過去2年間で作成した背面開放座位ケアプログラム(通称"起きる"看護ケアプログラム)を製本した冊子と書籍となった説明本、および背面開放座位保持具(Sittan[○!R])を使って、2医療施設の脳神経外科病棟2病棟で効果検証を行った。検証の結果、対象患者である慢性期脳血管障害患者計10名において表情の変化、頸部自力保持などの僅かな効果が見られたと同時に、離床時間の延長、家族との面会時間の延長の結果が得られた。また、患者の家族は、本プログラムを受け入れ、本プログラムを通じて、患者の身体的状況を理解し、家族自身が出来ることは何か模索する態度に繋がった。最終的には、起きることの重要性を家族が認識し、本プログラム提供メンバーとして参与することで介護意欲を高める結果となった。本プログラムの効果としては、計10例の患者データの結果となったことから、効果として価値づけるにはデータ数の少なさがあると考えられる。

加えて、家族にも良い影響があったことが付随の効果として認められたことから、今後は、家族への効果も測定し、データ数を増やしていく必要があると考えられた。上記の結果の一方で、"起きる"看護ケアプログラムを導入した医療施設の中で、幾つかの施設が導入を中断しており、効果が検証されているにも関わらず、同プログラムの普及には未だ課題が多いことが分かった。今後は、本プログラムの効果検証のデータを増やすと共に、医療施設への普及対策を考える研究に取り組むことが課題と考える。
ビリルビン測定法の再評価(ジアゾ法の問題点と新しい酵素的測定法の開発)

血清ビリルビン値は肝・胆疾患や新生児黄疸の診断や病態解析に不可欠であり、ジアゾ法によって直接型および間接型ビリルビンとして測定されているが、ビリルビン溶液の不安定性,血清中での存在様式の多様性,標準物質の欠除などの理由でビリルビン測定法を含めて、ビリルビンそのものを再評価することが強く望まれてきた。研究成果の要約を以下に記す。1.血清ビリルビン種の分離および分画化:高速液体クロマトや高性能薄層クロマトグラフによりビリルビンを非抱合型(Bu),モノ抱合型(mBc),ジ抱合型(dBc),デルタビリルビン(Bδ)などに分画する測定系を確立するとともに、アフィニティークロマト牛技によりBδを高純度に精製することに成功した。2.ビリルビン種の性質:Bu,Bc,Bδなどの物理化学的性質を検討するとともに、血清アルブミンとの相互作用についても分光・蛍光学的およびクロマトグラフィーを用いて解析した。3.ジアゾ法の問題点:Bu,mBc,dBc,Bδなどのビリルビン分画に対する直接型および間接型ジアゾ試薬の反応性を調べ、教科書にも記載されている「直接型=Bc,間接型=Bu」の考えが必ずしも正しくないことを実験的に証明した。4.血清ビリルビン分画の酵素的測定法:ビリルビン酸化酵素のpH特性を利用して、Bu,Bc,Bδなどのビリルビン分画を酵素的に分別定量するための至適条件を検討し、日常検査に応用し得る測定系の確立に成功した。なお、残された最大の問題は標準物質とくに抱合型ビリルビンの標準物質の調製であり、今後も研究を続ける予定である。
ALPPS手術後肝再生促進因子の同定と機能解析

実験4:NOS阻害剤によるNOS活性化抑制の検証:L-NAME投与ALPPSモデルにおける術後1時間後,4時間後,6時間後,24時間後の予定残肝組織内でのeNOSタンパク量,リン酸化eNOSタンパク量の評価をWestern blottingで行い,eNOSタンパク量は変わらないもののリン酸化eNOS(Ser1177)タンパク量は低下していることを確認した.実験5:NO誘導剤による肝再生現象促進の検証:NO誘導剤であるMolsidomineをPVL手術24時間前および手術直前に100mg/体重Kgの用量で腹腔内投与するMolsidomine投与PVLモデルの作成し,Molsidomine投与/非投与PVLモデル間で,予定残肝重量増大率ならびにKi67標識率を比較した.その結果,術後48時間後の予定残肝重量はMolsidomine投与モデルで有意に重く,Ki67標識率も有意に高率であり,NO誘導剤による肝再生促進現象が確認された.平成29年度&#12316;平成30年度の研究実績内容は,研究計画調書における当初の研究計画内容と若干の相違がある.すなわち,平成29年度に行う予定であった術後肝機能推移の評価を平成31年度に行うこととし,平成30&#12316;31年度に行う予定であったNOS阻害剤投与による肝再生促進現象抑制の検討ならびにNO誘導剤投与による肝再生現象促進の検討を平成29&#12316;30年度中に繰り上げて行った.これは,作製モデルの有効活用ならびにデータ収集の効率性などを考慮した結果,本研究の実験仮設であるALPPS術後早期肝再生促進現象にNOSが関与していることをまず検証することで,仮に否定的な結果が確認された場合に,その後の実験内容の修正ならびに追加が容易であり,次年度以降の研究推進に重要と判断したためである.NOS阻害剤投与による肝再生促進現象抑制ならびにNO誘導剤による肝再生現象促進の実験結果は,本実験仮説を支持するものであり,当初の実験計画の方向性に沿った研究推進が可能と考えられる.従って,総合的に本研究の進捗状況は概ね予定通り進行していると判断される.NO誘導剤であるMolsidomine投与による肝再生促進の検証として,MolsidomineをPVL手術24時間前および手術直前に100mg/体重Kgの用量で腹腔内投与するMolsidomine投与PVLモデルにおける術後1時間後,4時間後,6時間後,24時間後の予定残肝組織内でのeNOSタンパク量,リン酸化eNOSタンパク量の評価(Western blotting)を行う.さらに,肝血流動態の変化に伴うeNOS活性化の原因としてeNOSの上流にあるAkt活性化に着目し,Aktタンパク量,リン酸化Akt(Ser473)タンパク量の評価(Western blotting)をPVLモデル,ALPPSモデル,ならびにHx群で行う.また,術後肝機能評価の検証として,PVLモデル,ALPPSモデルにおける,術後2日目,3日目,7日目における予定残肝の胆汁産生量および予定残肝組織内ATP含有量定量を行い,両群で比較検討する.以上の実験系で,ALPPS術後の迅速な肝再生促進現象に,NOSならびにNO産生が関与していることを直接的に証明する.実験1:ALPPS,門脈結紮(PVL)モデルにおける予定残肝内動門脈血流動態評価:コントロール,ALPPS,PVL,及びALPPS肝虚血領域切除(Hx)モデルにおける,術後予定残肝内肝動脈・門脈の血管径と血流流速を測定し,血流量を算出して比較検討した.その結果,上記3群間で門脈血流量には差はないが,肝動脈血流はPVLモデルで低下している一方,ALPPS, Hxモデルでは,PVLと比較して有意に増加していた.実験3:NOS阻害による肝再生現象抑制の検証:NOS阻害剤であるL-NAMEを事前に腹腔内投与し,L-NAME投与ALPPSモデルを作成,L-NAME投与/非投与ALPPSモデル間で予定残肝重量増大率ならびにKi67標識率を比較した.L-NAME投与モデルでは,非投与モデルと比較して,術後48時間後の予定残肝重量は有意に軽く,Ki67標識率も低率であった.平成29年度の研究実績内容は,研究計画調書における当初の研究計画内容と若干の相違がある.すなわち,平成29年度に行う予定であった術後肝機能推移の評価を平成30年度以降に行うこととし,平成30年度に行う予定であったNOS阻害剤投与による肝再生促進現象抑制の検討を平成29年度中に繰り上げて行った.これは,作製モデルの有効活用ならびにデータ収集の効率性などを考慮した結果,本研究の実験仮設であるALPPS術後早期肝再生促進現象にNOSが関与していることをまず初年度に検証することで,仮に否定的な結果が確認された場合に,その後の実験内容の修正ならびに追加が容易であり,次年度以降の研究推進に重要と判断したためである.NOS阻害剤投与による肝再生促進現象抑制の実験結果は,本実験仮説を支持するものであり,当初の実験計画の方向性に沿った研究推進が可能と考えられる.従って,総合的に本研究の進捗状況は概ね予定通り進行していると判断される.実験4:NOS阻害剤によるNOS活性化抑制の検証:L-NAME投与ALPPSモデルにおける術後1時間後,4時間後,6時間後,24時間後の予定残肝組織内でのeNOSタンパク量,リン酸化eNOSタンパク量の評価をWestern blottingで行い,eNOSタンパク量は変わらないもののリン酸化eNOS(Ser1177)タンパク量は低下していることを確認した.

実験5:NO誘導剤による肝再生現象促進の検証:NO誘導剤であるMolsidomineをPVL手術24時間前および手術直前に100mg/体重Kgの用量で腹腔内投与するMolsidomine投与PVLモデルの作成し,Molsidomine投与/非投与PVLモデル間で,予定残肝重量増大率ならびにKi67標識率を比較した.その結果,術後48時間後の予定残肝重量はMolsidomine投与モデルで有意に重く,Ki67標識率も有意に高率であり,NO誘導剤による肝再生促進現象が確認された.平成29年度&#12316;平成30年度の研究実績内容は,研究計画調書における当初の研究計画内容と若干の相違がある.すなわち,平成29年度に行う予定であった術後肝機能推移の評価を平成31年度に行うこととし,平成30&#12316;31年度に行う予定であったNOS阻害剤投与による肝再生促進現象抑制の検討ならびにNO誘導剤投与による肝再生現象促進の検討を平成29&#12316;30年度中に繰り上げて行った.これは,作製モデルの有効活用ならびにデータ収集の効率性などを考慮した結果,本研究の実験仮設であるALPPS術後早期肝再生促進現象にNOSが関与していることをまず検証することで,仮に否定的な結果が確認された場合に,その後の実験内容の修正ならびに追加が容易であり,次年度以降の研究推進に重要と判断したためである.NOS阻害剤投与による肝再生促進現象抑制ならびにNO誘導剤による肝再生現象促進の実験結果は,本実験仮説を支持するものであり,当初の実験計画の方向性に沿った研究推進が可能と考えられる.従って,総合的に本研究の進捗状況は概ね予定通り進行していると判断される.平成29年度と同様に,平成30年度においても引き続きALPPSモデルの迅速な肝再生促進現象における,NOSならびにNO誘導の関与を検証する実験系を優先的に行う予定とする.すなわち,NOS阻害剤であるL-NAME(N-nitro-arginine methyl ester)をALPPS手術24時間前および手術直前に100mg/体重Kgの用量で腹腔内投与するL-NAME投与ALPPSモデルの作成,L-NAME投与ALPPSモデルにおける術後1時間後,4時間後,6時間後,24時間後の予定残肝組織内でのeNOSタンパク量,リン酸化eNOSタンパク量の評価(Western blotting)を行う.さらにL-NAME投与/非投与ALPPSモデル間での,予定残肝重量増大率ならびにKi67標識率の比較を行い,L-NAME投与によるNOS阻害における予定残肝容積増大現象の抑制,肝細胞増殖率上昇の抑制の有無を検証する.また,NO誘導剤であるMolsidomine投与による肝再生促進の検証として,MolsidomineをPVL手術24時間前および手術直前に100mg/体重Kgの用量で腹腔内投与するMolsidomine投与PVLモデルの作成,Molsidomine投与PVLモデルにおける術後1時間後,4時間後,6時間後,24時間後の予定残肝組織内でのeNOSタンパク量,リン酸化eNOSタンパク量の評価(Western blotting)を行う.さらに,Molsidomine投与/非投与PVLモデル間で,予定残肝重量増大率
琉球列島ジュゴン個体群保全のための基礎生物学的研究

本研究の目的である琉球列島ジュゴン復元対策として得た結論は;(1)沖縄島に常住する34頭について、詳しく調査を行ない、その保全対策を充実させる。(2)フィリピンルソン島北部の沿岸と島嶼についてフィリピンと共同調査・共同保全を行い、増加個体が八重山諸島に分散してくるのを待つ。しかしそれらによる個体群回復や分布復元の可能性は乏しいと言わざるをえない。(3)マレーシアなどのジュゴンが数百頭レベルで常住している地域において、捕獲個体による人工繁殖を行う。その成功を待って、西表島に佐渡のトキの場合のようにジュゴン保護センターを設置し、増やした個体を適地を選んで放す。西表島西部および北部において海草藻場調査を計3回実施した。調査方法はシュノーケリングによりジュゴンの食み跡の探索および海草群落の生育状況を調査するため作成した100mグリットの調査メッシュ上の調査地点において、コドラート法による海草の種組成および被度、環境のデータとして底質および水深を記録した。合計で約360地点において調査を行ったがジュゴンの食み跡の確認はできなかった。しかし、いずれの調査でも西表島西部において5cm×1.5cm程から10cm×4cm程の大型草食獣の糞を計9つ発見・採取した。これらの糞は、昨年度実施した骨標本の分析と同様のプライマーを用いてのmtDNA調査および5mmメッシュを用いた内容物調査を行いジュゴンの糞であるか同定を試みた。その結果、PCR法ではmtDNAの増幅は認められなかった。内容物調査では、地下茎の一部と考えられる未消化物が含まれていたがジュゴンの糞であるという確証を得るには至らなかった。このため、今後はジュゴン以外の生物の可能性を検討するため、異なるプライマーを用いた解析および他の候補として考えられるアオウミガメなどの腸内容物もしくは糞を用いた比較対照調査を行う必要がある。また、ジュゴンの生息が現在も確認される最も近隣の分布域であり、遺伝的に比較的琉球列島個体群と近いと考えられるフィリピン個体群の生息状況の調査のため、Luzon島北部およびCalayan島にて聞き取り調査および海草藻場でのマンタ法およびシュノーケリングによる痕跡調査を行った。その結果、ジュゴンおよびその生息を示す痕跡の確認には至らなかったが、住民の目撃情報からLuzon島北部には現在もジュゴンが生息している可能性があると考えられた。また、いずれの地域においても健全な海草藻場が現存しており、今後より詳細なジュゴンの生息調査を行う必要があると考えられる。形態学的手法による地理的変異の検出を目的として、琉球列島、新城島の御嶽に保存されているジュゴンの頭骨の分析を実施。未同定の骨片の同定および復元作業を継続して行い、奉納された頭骨の最少個体数の推定、雌雄判別および成長段階の推定を行った。それらの成果を従来の国外の博物館等で計測した結果と合わせて考察し、Marine Mammal Scienceに投稿中。遺伝学的手法による琉球列島およびアジア海域のジュゴン個体群における集団遺伝学的解析を行った。ジュゴン頭骨のうち最も個体数が多かった左側の側頭骨49個隊ぶんを用いてミトコンドリアDNA(mtDNA)分析を行った。まず各骨の小片から細い電動ドリルの穿孔により微量の骨粉(約0.1-0.3g)を採取し、その骨粉をEDTA溶液に懸濁後、脱灰、DNA精製、濃縮を行い、DNA抽出液とした。その抽出DNAを鋳型とし、mtDNAコントロール領域の部分領域に着目した遺伝子増幅法(PCR法)を行った。さらに自動シーケンサを用いてそのPCR産物の塩基配列を決定し遺伝子タイプを分類した。その結果、少なくとも4つのmtDNA系統が沖縄周辺海域に分布していたことが明らかになった。西表島を中心に動力船の曳航によるマンタ法およびスキューバダイビングによる潜水調査を行いジュゴンの生息確認を実施したが、痕跡は認められなかった。同時にかつてのジュゴンの漁獲方法に関する聞き取り調査を行った。1)骨格標本は、その生物の生態や成長段階、個体群構造などを示す非常に重要な資料となる。しかし、八重山諸島のジュゴンの骨格標本は貝塚等からの出土品などに限られていた。そこで我々はかつて八重山諸島で捕獲され、御嶽内に奉納されたジュゴンの頭骨の中で比較的状態が良好に保存されていた頭骨を用いて形態学的解析を試みた。その結果、少なくとも幼獣から成獣までの72頭分の頭骨が保存されていたことが明らかとなった。2)八重山諸島周辺におけるジュゴンの遺伝的多様性を把握するため、個体識別された頭骨の一部から微量の骨粉を採取しDNAを抽出した後、ミトコンドリアDNAコントロール領域についてPCR法とPCR産物の塩基配列決定を行った。分析した約50個体の標本から高率に得られた遺伝情報を解析したところ、八重山諸島のジュゴン集団は少なくとも4つの母系列で構成されていたことが明らかとなった。3)環境省(2004)により、2000年代前半に西表島においてジュゴンと思われる目撃情報が複数報告されていたことから、食み跡の探索および海草群落の生育状況の調査を実施した。この結果、西表島西部において幅510cm×直径1.54cm程の大型草食獣の糞を複数採取したが、特定には至っていない。また、いずれの海域においても高い被度で海草が現存しており、かつてジュゴンの個体群を支えるに十分な環境であったことが推察された。

4)絶滅寸前となった日本のジュゴン個体群回復のためには近接する生息地からの個体の移入が重要であると考えられる。ジュゴンの移動能力や遺伝的特性などを考慮しフィリピンのバブヤン諸島およびルソン島北部に焦点を当て、海草藻場での潜水と地元漁業者への聴き取りによりジュゴンの生息調査を行った。その結果、直接的な生息を示す痕跡は発見できなかったものの、複数の目撃情報を得たとともに一定のジュゴン個体群を支え得る健全な海草藻場が現存していることを確認した。平成27年度には、これまでジュゴン奉納骨の調査を行ってきた竹富町新城下地島の七門御嶽が町の文化財に指定される運びとなった。そのためにこれまでの成果の説明会を同町で行うことを目的として、一般向け説明資料作成や旅費に用いるために本科研補助事業の延長申請を行って認められた。しかし指定は来年度の見通しとなったため、これまでの成果を「海洋と生物」誌の特集として取りまとめた。その結論として、本科研で目的としたジュゴンの復元のためには;1まず沖縄島に常住する34頭について、その保全対策を充実させること。2フィリピンルソン島の北部と島嶼についてフィリピンと共同調査・共同保全を行い、増加個体が八重山諸島に分散してくるのを待つことがあげられる。さらに3マレーシアなどのジュゴンが数百頭レベルで常住している地域において、捕獲個体による人工繁殖の共同研究を行う。その成功を待って、西表島に佐渡のトキの場合のようにジュゴン保護センターを設置する。そこで増やした個体を放して自然分布を促す。琉球王朝が300年以上の長きにわたって300頭レベルで維持してきた八重山のジュゴンは、明治末期に数年間で獲り尽くされた。ジュゴンは亜熱帯沿岸海洋生態系に欠かせない要素であり、奄美・琉球列島の世界自然遺産登録を期に、復元をめざすべきだと考える。平成27年度の調査・研究としては、東京国立博物館所蔵の根付130例について、北大総合博物館研究生の太子夕佳氏および国立科学博物館研究員の甲能純子氏と共にジュゴンの歯牙である可能性についての検討を行った。本研究の目的である琉球列島ジュゴン復元対策として得た結論は;(1)沖縄島に常住する34頭について、詳しく調査を行ない、その保全対策を充実させる。(2)フィリピンルソン島北部の沿岸と島嶼についてフィリピンと共同調査・共同保全を行い、増加個体が八重山諸島に分散してくるのを待つ。しかしそれらによる個体群回復や分布復元の可能性は乏しいと言わざるをえない。(3)マレーシアなどのジュゴンが数百頭レベルで常住している地域において、捕獲個体による人工繁殖を行う。その成功を待って、西表島に佐渡のトキの場合のようにジュゴン保護センターを設置し、増やした個体を適地を選んで放す。研究実績の概要に示すように、ほぼ目的を達成することができた。保全生物学我が国におけるジュゴンの保護のためには、沖縄島に残っている34頭の保全、および佐渡のトキ保護センターのように域外保全を行う必要がある。それらについて計画を作成して次の申請に臨みたい。形態学的解析および遺伝学的解析では現在サンプリングが終了し、データの解析を行っている段階にある。次年度での研究成果報告に向け準備を進めている。
新規貧血モデルマウスの解析を通じた脱核・赤芽球分化機構の理解とその制御法の確立

新たな血液供給システムとして臍帯血造血幹細胞やiPS細胞を用いた生体外での赤血球分化誘導技術の開発が近年重視されている。そのため、赤血球分化に関わる分子機構の全容を理解することが重要な課題である。本研究では、赤血球形成過程で高く発現するカルシウム結合タンパク質CaBPに着目し、造血細胞特異的CaBP遺伝子欠損マウスを作製・解析することで、赤血球分化におけるCaBPの生理的意義を明らかにした。さらにCaBPによる赤血球分化制御の分子メカニズムを検討し、新たな赤血球分化制御機構を見出した。本研究は、血液再生医療技術の開発基盤に重要な知見を提供できるものと考えられる。本課題では、カルシウム結合タンパク質CaBPを造血細胞系列で特異的に欠損させた遺伝子改変マウスの解析を通じて、[1] CaBPによる脱核及び赤血球分化制御の分子メカニズムを解明し、[2]CaBP及びその標的分子を介したin vitro赤血球形成誘導法の開発基盤を確立すること、を目指す。I. CaBP遺伝子コンディショナルノックアウト(CKO)マウスの作製: CaBP遺伝子のエクソン領域がloxPで挟まれたCaBP floxedマウスを、Vav-iCre TGマウスと交配させ、造血細胞系列特異的CaBP欠損マウスを作製した。さらにCre-ER TGマウスならびにMX1-Creマウスと交配させ、成体で任意の時期に遺伝子欠損を誘導できる時期特異的CKOマウスを作製した。II. CaBP遺伝子CKOマウスにおける赤血球解析:造血細胞系列特異的CaBP欠損マウスは生後1日以内に死亡することが認められたため、P0齢マウスの血液並びに胎児肝を用いて、1)血液一般検査、2)塗抹標本を用いた細胞診、3) Flowcytometerを用いた各種血液細胞マーカーの発現解析、4) SYTO-16色素を用いた脱核誘導率の評価、を実施し、赤血球分化異常を検討した。III前赤芽球を用いたin vitro赤血球分化培養系による検討:E12.5-14.5の胎児肝由来の赤芽球前駆細胞を用いたin vitro分化培養系を用いて、CaBPが関与する赤血球分化ステージを詳細に特定した。IV脱核・赤血球分化に必須のCaBP機能ドメインの特定:マウス赤白血病細胞株に、野生型CaBP遺伝子retoviral vectorにより過剰発現させ、赤血球分化に対する効果を検討した。さらにCRSIPR/Cas9システムによりCaBP欠損細胞株の作製も進めた。本課題では、カルシウム結合タンパク質CaBPを造血細胞系列で特異的欠損させた遺伝子改変マウスの解析を通じて、[1] CaBPによる脱核及び赤血球分化制御の分子メカニズムを解明し、[2] CaBP及びその標的分子を制御することで、高効率の脱核誘導法の開発基盤を確立すること、を目指す。I.脱核・赤血球分化に必須のCaBP機能ドメインの特定:前年度に、CRISPR/Cas9法によりCaBP遺伝子を欠損させた赤白血病細胞株を樹立した。当該細胞株ならびに胎仔肝由来の赤芽球前駆細胞を用いたin vitro培養系において、CaBPの各種ドメイン欠損変異体をretoviral vectorにより過剰発現させ、赤血球分化及び脱核制御を検討した。その結果、CaBP遺伝子内の必須機能ドメインを特定した。II.赤芽球を用いた網羅的トランスクリプトーム解析造血細胞特異的CaBP遺伝子欠損マウスならびに野生型マウスの胎仔肝から単離精製した前赤芽球を用いて、網羅的トランスクリプトーム解析実施した。赤芽球分化に関わる種々の分化誘導因子存在下の条件で検討し、CaBP遺伝子欠損によって生じる赤芽球内の遺伝子発現変動を見出した。以上の結果からCaBP下流の遺伝子群を抽出し、CaBPが関与する細胞内シグナル経路を明らかにした。担体に固定化したCaBPタンパク質全長をベイトとして、胎仔肝由来前赤芽球のタンパク質溶出液を用いてPull-down assayを行い、CaBP結合タンパク質をABSCIEX社四重極飛行時間型質量分析装置TripleTOFTM5600により解析を行った。同定されたCaBP結合候補因子については、MEL細胞株ならびに胎仔肝由来前赤芽球に遺伝子導入し、脱核・赤血球分化誘導に対する効果を検討した。以上の解析より、赤芽球内におけるCaBP機能に関与する結合分子の機能解析を実施し、IIの細胞内シグナル経路との関連性を検証した。骨免疫学当初の計画では、赤芽球特異的CaBP欠損マウスやマクロファージ特異的CaBP欠損マウスの作製も計画に入れていたが、造血細胞系列特異的CaBP欠損マウスの解析が計画以上に進展させることができ、CaBPが赤芽球分化ステージに特異的に関与していることを実証することができた。

そのため、上記のCreマウスとの交配の計画を止め、造血細胞系列特異的CaBP欠損マウスおよび時期特異的CKOマウスの解析に集中することにした。さらに、マウス赤白血病細胞株を用いたin vitro分化培養系も順調に進めることができ、近年話題となっているCRISPR/Cas9システムも導入することで、CaBP欠損異細胞株の樹立にも成功している。これらの研究材料は今後さらに解析を効率化させることが期待できる。造血細胞系列特異的CaBP欠損マウスの胎児肝から単離した赤芽球、およびCaBP欠損赤白血病細胞株を用いた網羅的トランスクリプトーム/プロテオーム解析を実施し、CaBP遺伝子欠損によって生じる赤芽球内の細胞内因子の発現変動を明らかにする。また赤芽球内でCaBPに結合するタンパク質を同定し、CaBPの機能に関与する結合分子を特定するとともに、CaBP-CaBP結合因子複合体によって誘導される細胞内因子の発現動態を理解する。最終的に、CaBP標的分子および結合分子を赤白血病細胞株に遺伝子導入し、赤血球分化誘導に対する効果を検討し、その発現や機能活性を制御できるようなアプローチを検討する。
肝細胞の分裂寿命からみた肝不全機構の解明と治療戦略への応用

当該研究課題では,テロメア長およびテロメアの伸長機構に関連するテロメラーゼ分子に注目して,(1)肝炎・肝硬変患者における肝細胞残存分裂回数の分子診断法の開発,ならびに,(2)テロメラーゼ誘導による肝細胞寿命の延長に関する基礎的検討を試みた.研究期間内に以下の成果を達成した.(2)エストロゲンのテロメラーゼ誘導による,肝細胞分裂寿命の延長に関する基礎的検討をヒト肝培養細胞株(Hc-cells, hNheps, WRL)を用いて行った.テロメラーゼ活性は2-4倍に上昇した.テロメラーゼ活性の上昇は,hTRET hTERT (human telomerase reverse transcriptase)の発現増強によるものであった.さらにエストロゲンの長期添加実験では,添加群でテロメア長の短縮が有意に抑制され,senescence-associated β-galactosidase陽性細胞比率も減少していた.(3)四塩化炭素肝硬変モデルラットを作製し,外因性エストロゲン投与によるテロメア長の短縮抑制効果を検討した.エストロゲン投与群で有意にテロメア長短縮が抑制されていた(文献22).以上より,肝細胞の分裂寿命は外因性のエストロゲン投与により延長させることが可能であり,新たな慢性肝疾患患者の治療戦略の可能性が示唆された.当該研究課題では,テロメア長およびテロメアの伸長機構に関連するテロメラーゼ分子に注目して,(1)肝炎・肝硬変患者における肝細胞残存分裂回数の分子診断法の開発,ならびに,(2)テロメラーゼ誘導による肝細胞寿命の延長に関する基礎的検討を試みた.研究期間内に以下の成果を達成した.(2)エストロゲンのテロメラーゼ誘導による,肝細胞分裂寿命の延長に関する基礎的検討をヒト肝培養細胞株(Hc-cells, hNheps, WRL)を用いて行った.テロメラーゼ活性は2-4倍に上昇した.テロメラーゼ活性の上昇は,hTRET hTERT (human telomerase reverse transcriptase)の発現増強によるものであった.さらにエストロゲンの長期添加実験では,添加群でテロメア長の短縮が有意に抑制され,senescence-associated β-galactosidase陽性細胞比率も減少していた.(3)四塩化炭素肝硬変モデルラットを作製し,外因性エストロゲン投与によるテロメア長の短縮抑制効果を検討した.エストロゲン投与群で有意にテロメア長短縮が抑制されていた(文献22).以上より,肝細胞の分裂寿命は外因性のエストロゲン投与により延長させることが可能であり,新たな慢性肝疾患患者の治療戦略の可能性が示唆された.本研究課題では2年間の研究期間内肝炎・肝硬変患者における肝の分裂寿命からみた,肝不全の発生機構を解明し,肝不全治療の新たな治療戦略を立脚することを目的に研究を進め,平成14年度分として以下の成果を得た.(2)エストロゲンのテロメラーゼ誘導による,肝細胞分裂寿命の延長に関する基礎的検討:ヒト肝培養細胞株(Hc-cells, hNheps, WRL)を用いて,エストロゲンの接触実験を行った.テロメラーゼ活性は2-4倍に上昇した.テロメラーゼ活性のの上昇は,hTRET(human telomerase reverse transcriptase)の発現増強によるものであることが明らかとなった.更にエストロゲンの長期添加実験では,添加群でテロメ長の短縮が有意に抑制され,senescence-associated beta-galactosidase陽性細胞比率も減少していた.さらに四塩化炭素肝硬変モデルラットを作製しテロメア長を計測したところ,エストロゲン投与群で有意にテロメア長短縮が抑制されていた.肝細胞の分裂寿命は外因性のエストロゲン投与により延長させることが可能であり,次年度以降はは肝幹細胞の分離を行い,この細胞の分裂寿命の評価と分裂寿命延長法に関する基礎的検討を行う.本研究課題では2年間の研究期間内に,肝炎・肝硬変患者の分裂寿命から見た,肝不全の発生機構を解明し,肝不全治療の新たな治療戦略を確立することを目的として研究を行い,以下の成果を得た.(1)肝正常培養細胞株(Hc-cells,hNheps,WRL)では継代数に比例して,テロメア長の短縮が確認された.(3)E2添加長期継代培養実験では,無添加群に比較してテロメア長の短縮が予防でき,分裂寿命が延長していた.(5)CCl_4肝硬変モデルラットにおける外因性E2投与は,テロメア長の短縮抑制効果を持っていた.以上の結果から,肝細胞の分裂寿命は外因性のエストロゲン投与により延長させることが可能であり,新たな肝不全治療の可能性が示唆された.一方で,以下の2つの問題点が残った.(1)hTERT遺伝子の過剰発現は,肝線維化の機構に重要な役割を担う肝星細胞の活性化を誘導する可能性があり,分離星細胞によるE2投与の実験を進める必要があると考えられた.(2)これとは別にABCトランスポーターの発現を指標に肝幹細胞を分離し,肝幹細胞の分裂寿命を解析しようと試みたが,解析に十分な量の幹細胞を採取することができなかった.今後は,上記の二点について解析を進めたい.
LRRK１による中心体複製サイクル／シリア伸長制御機構の解析

ROCOファミリーキナーゼLRRK1はRas様GTPaseドメインとMAPKKK様キナーゼドメインを持つ分子量240kDaの巨大な分子である。近年ファミリー分子LRRK2がパーキンソン病原因遺伝子(Park8)であることが明らかとなり、臨床的にも注目を集めている。しかしLRRK1及びLRRK2の生理的機能に関してはあまりよくわかっていない。申請者らはLRRK1が活性化したEGFRと複合体を形成し、キナーゼ活性依存的にEGFR細胞内トラフィック(早期エンドソームから後期エンドソームへの移行)を制御することを明らかにした(Nat. Commun. 2011, MBC 2012, JCS 2015)。また最近、LRRK1は中心体に局在し、M期中心体で活性化し、中心体の微小管形成活性に重要なことを見出した。M期中心体はスピンドル微小管の極として染色体分離などに機能している事が知られている。一方、間期中心体はG1/G0期シリア形成に重要である。そこで、シリア形成におけるLRRK1の機能を解析したところ、RPE1細胞でLRRK1をノックダウンするとシリアがectopicに形成されることを明らかにした。シリアは細胞がG0期からS期に再進行する際、退縮(disassembly)する必要がある。我々はLRRK1をノックダウンした細胞では、シリアのdisassemblyが阻害され、G0期からS期への再進行がおこらずG0アレストすることを明らかにした。このようにLRRK1は、細胞周期においてM期及びG1/G0期中心体で重要な機能を果たしている事を明らかにした。26年度が最終年度であるため、記入しない。ROCOファミリーキナーゼLRRK1はRas様GTPaseドメインとMAPKKK様キナーゼドメインを持つユニークな分子である。しかしLRRK1及びLRRK2の生理的機能に関してはほとんど明らかになっていない。申請者らはLRRK1が活性化したEGFRと複合体を形成し、キナーゼ活性依存的にEGFR細胞内トラフィックを制御することを明らかにした(Nat. Commun. 2011, MBC 2012)。これとは別に最近、活性化したLRRK1が母中心小体に局在し、シリアの形成に重要であることを明らかにしていた。LRRK1の作用機構を検討するため、LRRK1と相互作用する分子を探索したところ、NDE1を同定した。NDE1は母中心小体に局在し、G0期シリアの伸長を負に制御していることが報告されている。そこでLRRK1とNDE1との関係を中心に解析を進めた。その結果、(1)LRRK1はNDE1をin vitroでリン酸化すること、(2)質量分析からLRRK1によるリン酸化候補部位として複数の部位を同定すること、に成功した。今後はLRRK1によるNDE1のリン酸化部位の同定と、リン酸化の役割を中心に解析を行っていく予定である。今年度の解析から、LRRK1がNDE1をリン酸化することを明らかにした。また質量分析を用いた解析から、LRRK1によるリン酸化候補部位として3カ所のセリン、スレオニンを同定することに成功した。現在これらの部位に変異を導入し、LRRK1が実際にどの部位をリン酸化しているのか解析を進めている。このようにおおむね計画どおりに研究は進展している。今後は以下の点に焦点を絞り解析を行っていく予定である。

(1)質量分析によって同定したNDE1のリン酸化候補部位3カ所にアラニン変異を導入したGSTリコンビナントタンパク質を作製し、LRRK1が実際にどの部位をリン酸化するのか決定する。(2)同定した部位に変異を導入し、非リン酸化型NDE1及びリン酸化模倣型NDE1を作製し、培養細胞に発現させることでシリア形成にたいする効果を検討する。(3)NDE1はダイニン軽鎖LC8と相互作用し、シリア形成を制御していることが示唆されている。そこで、LRRK1によるNDE1のリン酸化が、NDE1とLC8との結合を変化させシリア形成を正に制御しているのか検討する。