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視覚障害者の睡眠に関する生理心理学的研究:日常生活場面における記録と分析

視覚障害者の終夜睡眠構造に関する生理・心理学的研究は極めて少ない。わずかに見られる内外の研究も、夢見とREM睡眠に関するものがほとんどである。Krieger et al.(1971)は、先天性視覚障害者では徐波睡眠(段階3+段階4)の出現率が、同年令の晴眼者に比べて著しく少ないことを報告している。しかし、この問題に対する組織的研究はほとんど行われていない。視覚障害者の睡眠に関する生理・心理的機能を理解するために、また、視覚入力と睡眠調節との関連を調べるために、本課題による睡眠研究を3年間にわたり実施してきた。我々はこれまでに、先天性障害による全盲者13名(男子9名、女子4名、平均年齢28.1歳、年齢範囲18ー61歳)、外傷などによる全盲者3名(全員男子、平均年齢26.0歳、年齢範囲22ー32歳)、弱視者5名(男子4名、女子1名、平均年齢39歳、年齢範囲20ー53歳)を対象に日常生活場面において23夜の連続終夜睡眠ポリグラフ記録を実施した。今後、さらに記録例数を増やし、視覚障害者の睡眠経過を調べ、失明期間や障害内容との関連を調べることが必要である。今年度は、(1)基本的睡眠生活習慣(睡眠時間、睡眠障害の有無など)を評価するための点字による調査紙を作成し、(2)視覚障害者を対象にこの点字式睡眠生活習慣調査および面接を実施し、睡眠時間、睡眠ー覚醒リズムの乱れや睡眠障害の発生などを把握する、(3)睡眠構造を客観的・量的に評価するため、日常生活場面で終夜睡眠ポリグラフ記録(脳波、筋電図、眼球運動)を行い、視覚障害の程度、失明経過年数、睡眠の主観的評価と以上の睡眠に関する生理指標との関連性を調べること、さらに、健常晴眼者の睡眠構造と比較し、両者の類似点・相違点を明かにし、視覚障害者にとってよりよい睡眠経過をもたらす要因の同定を行った。現在までに、日常生活場面で睡眠状態を記録・観察するシステムを構成した。これは、脳波、心電図などの生理指標の電位変動を、FM変調方式により送信機から受信機に送信し、小型カセットテ-プに記録した後、実験室にテ-プを持ち帰り脳波計によって再生・記録するものである。大学生2名を対象に自宅にて試験的記録を行った結果、実験室にて脳波計で記録するのと同様の記録・再生が可能であることが確かめられた。続いて、このシステムを用い、3名の視覚障害者を対象に、3夜連続の終夜睡眠ポリグラフ記録を訓練施設内のベッドサイドで実施した。その結果、このシステムによる訓練施設内での記録が十分に可能であり、今後の実験に適用できることが確かめられた。また、3名の睡眠ポリグラフデ-タを分析した結果、深睡眠である徐波睡眠の出現量が健康晴眼者に比べ、低い値を示した。研究目的の(1)及び(2)は現在尚進行中である。(3)についてもこの計画を来年度も引続き行い、被験者数をさらに増やす計画である。昨年度は、(1)基本的睡眠生活習慣(睡眠時間、睡眠障害の有無など)を評価するための点字による調査紙を試作した。また、(2)日常生活場面での睡眠構造を客観的・量的に評価するため、テレメトリ-方式による終夜睡眠ポリグラフ(脳波・筋電図・眼球運動など)記録システムを構成し、日常場面での記録、実験室での再生が可能であることを確認した。今年度は、(1)点字による質問紙の不備を改良するのに加え、カセットテ-プを利用した調査システムを考案した。現在、予備的な調査を健常者及び視覚障害者を対象に実施している。また、(2)昨年度に構成した終夜睡眠ポリグラフ記録システムを用い、7名(女性1名、男性6名)の視覚障害者を対象に、3夜連続の終夜睡眠ポリグラフ記録を訓練施設内のベッドサイドで実施した。7名のうち6名の睡眠ポリグラムを分析した結果、4名で深睡眠である徐波睡眠の出現量が健康晴眼者に比べ低い値を示した。2名では健康晴眼者のそれとほぼ等しかった。脳波的睡眠段階の出現量などの睡眠変数と失明経過年数、光覚の有無などと一貫した関連は見られていない。

来年度は、(1)点字、カセットテ-プによる基本的睡眠生活習慣調査を数百名の対象者に行い、その分析とまとめを行う、(2)睡眠ポリグラフ記録では、さらに被験者数を増やし、終夜睡眠構造の詳細な分析を行い、視覚障害との関連からその睡眠構造の心理・生理的特徴をまとめる予定である。視覚障害者の終夜睡眠構造に関する生理・心理学的研究は極めて少ない。わずかに見られる内外の研究も、夢見とREM睡眠に関するものがほとんどである。Krieger et al.(1971)は、先天性視覚障害者では徐波睡眠(段階3+段階4)の出現率が、同年令の晴眼者に比べて著しく少ないことを報告している。しかし、この問題に対する組織的研究はほとんど行われていない。視覚障害者の睡眠に関する生理・心理的機能を理解するために、また、視覚入力と睡眠調節との関連を調べるために、本課題による睡眠研究を3年間にわたり実施してきた。我々はこれまでに、先天性障害による全盲者13名(男子9名、女子4名、平均年齢28.1歳、年齢範囲18ー61歳)、外傷などによる全盲者3名(全員男子、平均年齢26.0歳、年齢範囲22ー32歳)、弱視者5名(男子4名、女子1名、平均年齢39歳、年齢範囲20ー53歳)を対象に日常生活場面において23夜の連続終夜睡眠ポリグラフ記録を実施した。今後、さらに記録例数を増やし、視覚障害者の睡眠経過を調べ、失明期間や障害内容との関連を調べることが必要である。
細菌病原因子としてのストレス蛋白質の機能に関する研究(マクロファージ貧食により誘発されるストレス蛋白質の病原性発現における役割)

Yersinia enterocoliticaは、マクロファージ等の食細胞による食菌作用に抵抗し、増殖することが可能な細胞寄生性を有している。本研究においてY.enterocoliticaのマクロファージ内生残と増殖には、高温や過酸化物等の環境ストレス下での生育に必須なストレスタンパク質のひとつであるGsrAが要求されることが明らかとなった。gsrA遺伝子の全塩基配列を決定し、それに基ずくアミノ酸配列のホモロジー検索を行ったところ、GsrAは大腸菌HtrAのホモログであることが明らかとなった。HtrAはペリプラズムに存在するプロテアーゼであるが、種々の環境ストレスおよびマクロファージ内ストレスにより生じた変性タンパク質を分解する機能が、Y.enterocoliticaの細胞外および細胞内ストレス下での生育に要求されるものと考えられる。Y.enterocoliticaのマクロファージ内増殖能は、上皮細胞に侵襲する能力とあわせて病原性発現に必須の因子である。本菌固有の病原因子としては病原プラスミド性のYop蛋白質群が知られているが、それらの中で,YopHとYopDはマクロファージ抵抗性に関与すると報告されている。これらのY.enterocolitica特有の病原因子に加え、GsrAストレス蛋白質が病原性発現に至る複雑なネットワークに関与しているものと考えられる。今後は、マクロファージ貧食で誘発される一群のストレスタンパク質の機能解明をはじめ、ストレスタンパク質の病原因子としての役割を明らかにしていきたい。細菌病原性発現におけるストレス蛋白質の役割を解明するために、通性細胞内寄生細菌であるYersinia enterocoliticaがマクロファージに貪食された際、細胞内ストレスを関知して誘導産生するストレスタンパク質を同定し、それらの性状を解析した。2次元ゲル電気泳動法により、マクロファージ貪食後1時間以内にY.enterocoliticaの17種類の蛋白質が誘発されることを見いだした。その合成は貪食22時間後においても続いていた。さらにこれらのなかで8種類が熱ショックや過酸化物ストレスによっても誘発されるストレス蛋白質と一致した。それらを分子量と等電点に基きB60.0,B57.0,D52.0,A38.0,F36.0,B25.5,H18.5,C16.5と名ずけた。それぞれのN末端アミノ酸配列を決定したところ、Hsp70.0(B60.0),Hsp60(B57.0),GrpE(B25.5)およびHsp10(C16.5)が同定された。これらはいずれも分子シャペロンと呼ばれるストレス蛋白質であり、本菌がマクロファージ内で増殖する際に大量の分子シャペロンが必要とされることを示唆する結果である。さらに最も優位に産生されるストレス蛋白質のひとつであるH18.5は、そのN末端アミノ酸配列から新規のストレス蛋白質であると思われ、現在遺伝子のクローニングが進行中である。前年度の研究において、マクロファージ等の食細胞内増殖性を有するYersinia enterocoliticaを用いて、本菌の温度や過酸化物等の環境ストレス下での生育とマクロファージ細胞内ストレス下での生残に共通に関与する遺伝子gsrAを単離した。本年度は、gsrAの分子遺伝学的解析を行い、以下の成果を得た。(1)gsrA遺伝子の構造解析gsrA遺伝子の全塩基配列を決定した。その結果gsrAは49500ダルトンの分子サイズを持つ塩基性蛋白質を支配していることが明らかとなった。GsrA蛋白はN末端にリーダーペプチドをもち、中央にセリンプロテアーゼ活性を持つ分泌型のプロテアーゼであると考えられた。ホモロジー検索の結果、GsrAは最初に大腸菌で発見されたストレス蛋白質HtrAのホモログであることが明らかとなった。(2)GsrA蛋白質の機能

GsrA蛋白質の機能を明らかにするために、gsrAの挿入変異株を試験管内で作製した後、野性株のY.enterocolitica WA314に移入し、相同的組み替えにより再度、gsrA遺伝子の変異をもつ株を分離した。この変異株の性状を検討した結果、gsrA遺伝子は高温トスレス、過酸化物ストレス、高塩ストレス下でのY.enterocoliticaの生育に必須であると同時に、本菌のマクロファジ-内ストレス下での生残と増殖に不可欠なストレス蛋白質遺伝子であることが明らかとなった。
脳虚血耐性モデルにおける虚血負荷神経細胞の形態・機能における可逆性の解析

脳虚血耐性獲得確認のため、砂ネズミの両側総頚動脈2分間閉塞による虚血前処置を行った群(前処置群)と虚血前処置を行わなかった群(前処置無群)を準備した。虚血群と前処置各群に総頚動脈5分間閉塞の虚血負荷を行い、対照として虚血Sham群を作製した。その1日後と6ヵ月後にその3群から脳海馬スライス標本を作り、神経興奮伝播画像解析装置を用い、電気刺激誘起の興奮伝播を観察した。その結果、前処置無群と前処置群の両群で興奮伝播範囲の減少が認められた。その程度は前処置無群において顕著で虚血Sham群に対し統計的有意であった。さらに、前処置無群で前処置群に対し有意に興奮伝播範囲の減少が観察された。以上から神経興奮という機能面でも、2分間虚血によりその後の虚血負荷に対する耐性獲得が確認された。前述の前処置群と虚血群の両者より脳海馬スライス標本を作製し近赤外線光画像化システムで経時的観察を行った。その結果、虚血群では虚血負荷開始から、約6分後に細胞辺縁が不鮮明になり細胞体に小胞状突起が観察され、その後小胞は融合し細胞体全体が膨化した。変化の直後から再酸素化してもほとんどの細胞は回復しなかった。次に前処置群では、やや遅く約7分後に細胞形態の変化が発生した。膨化の進展速度は緩徐で、変化発生直後から再酸素化をすると、約半数の細胞で形態がほぼ虚血負荷前までに回復した。形態変化と電気生理学的変化の同時記録を行うため、細胞膜の電気的応答を観察した。虚血群では虚血開始後約2分から緩徐な外向き電流が観察され、約6分後には急激な内向き電流が観察され、その後は正常な神経活動はなくなった。急激な内向き電流の直後に再酸素化しても細胞応答は回復しなかった。前処置群では、虚血負荷開始約2分後から緩徐な外向き電流が観察され、約7分後に急激な内向き電流が発生し、その後、正常な神経細胞活動は観察されなくなった。急激な内向き電流の直後に酸素化を再開すると記録した約半数の細胞で虚血前状態に回復したが、細胞からのリーク電流が虚血前より増加していた。砂ネズミ脳神経細胞における虚血後早期の細胞膨化および電気生理学的変化の経時的同時測定1、砂ネズミ脳虚血耐性獲4モヂルの確認砂ネズミの虚血耐性獲得の確認を行うため、両側総頚動脈2分間閉塞による虚血前処置を行った群(前処置群)と虚血前処置を何も行わなかった群(虚血群)2つの砂ネズミ群を準備した。前処置を行った24時間後、虚血、処置各群に総頚動脈5分間閉塞の虚血負荷を行い、さらに虚血前処置も行わず5分虚血用に総頚動脈露出だけ行ったが虚血を負荷しない群(虚血Sham群)を加えて、その1日後と6ヵ月後にそれぞれ3群から脳海馬スライス標本を作製し、膜電位感受性色素による神経興奮伝播画像解析装置を用い、CA1放射層への電気刺激により誘起される興奮伝播を観察した。

その結果、虚血群と前処置群の両群で虚血Sham群に比べ與奮伝播範囲の滅少が認められた。その程度は虚血群において顕著で虚血Sham群に対し統計的有意であったが、前処置群はSham群に対し有意ではなかった。さらに、虚血群と前処置群との比較では虚血群で有意に興奮伝播範囲の減少が観察された。上記の所見は5分間虚血負荷6ヵ月後の経時的観察でも同様であった。以上のことから形態的変化だけでなく神経興奮という機能面でも、2分間虚血によりその後の虚血負荷に対する耐性獲得の可能性が確認された。2、近赤外線微分干渉顕微鏡を用いた脳スライス標本おげる細胞の可視化砂ネズミから厚さ約400μmの脳海馬スライス標本を作製し近赤外線微分干渉顕微鏡で観察した。その結果、生きた神経細胞にマイクロマニピュレーター誘導下に記録用ガラス微小電極を吸引接着し、ホールセルパッチクランプ法によって電気生理学的記録を行うことが可能であった。このことから、低酸素・無グルコース灌流液置換による虚血類似環境下での神経細胞形態変化と細胞内電気生理学的変化の経時的同時記録施行の準備が整った。1、砂ネズミ脳神経細胞における虚血後早期の細胞膨化及び電気生理学的変化の経時的同時測定砂ネズミ両側総頚動脈2分間閉塞による脳虚血耐性獲得モデルと脳虚血耐性非獲得砂ネズミの両者より脳海馬スライス標本を作製し近赤外線光画像化システムでの経時的観察を行った。その結果、脳虚血耐性非獲得砂ネズミの脳海馬スライス標本では低酸素・無グルコース負荷後、約6分後に細胞辺縁が不鮮明になり細胞体に小胞状突起が観察される。その後小胞は融合し細胞体全体の膨化へと変化する。脳虚血耐性獲得モデルから作製した脳海馬スライス標本では、形態学的変化の開始がやや遅れる傾向にある。今後詳細に検討する必要がある。この一連の形態学変化と神経細胞の電気生理学的変化の同時記録を行うため、ホールセルパッチクランプ法による細胞膜の電気的応答の変化の観察を試みたが、神経細胞の形態変化が開始されると時期に一致して電気生理学的記録が不安定となり、一連の形態変化を追従した観察が可能となっていない。以下の2項目に関しては本研究年度中に検討することができなかった。2、虚血侵襲による神経細胞形態変化に及ぼす各種薬剤の影響3、虚血侵襲による神経細胞障害に対する保護因子の影響砂ネズミ脳神経細胞における虚血後早期の細胞膨化及び電気生理学的変化の経時的同時測定砂ネズミ両側総頚動脈2分間閉塞による脳虚血耐性獲得モデル(耐性群)と脳虚血耐性非獲得砂ネズミ(通常群)の両者より脳海馬スライス標本を作製し近赤外線光画像化システムでの経時的観察を行った。その結果、通常群の脳海馬スライス標本では虚血負荷開始から、約6分後に細胞辺縁が不鮮明になり細胞体に小胞状突起が観察され、その後に小胞は融合し、されに小胞の融合とその拡大が起こり細胞体全体が膨化した。負荷開始約6分後の細胞形態の変化発生直後から酸素化灌流液を再開してもほとんどすべての細胞で形態の回復は起こらなかった。次に耐性群の脳海馬スライス標本では、形態学的変化の開始がやや遅れ、約7分後に細胞形態の変化が発生する。通常群で見られた形態変化の進展速度は全体に緩徐で、細胞形態の変化発生直後から酸素化灌流液を再開すると、約半数の細胞で形態がほぼ虚血負荷前までに回復する様子が観察された。この一連の形態学変化と神経細胞の電気生理学的変化の同時記録を行うため、細胞膜の電気的応答の変化の観察した。通常群の脳海馬スライス標本では虚血負荷開始後約2分からゆっくりとした外向き電流が観察され、約6分後には急激な内向き電流が観察され、その後は持続的し、正常な神経細胞活動は観察されなくなった。急激な内向き電流の観察直後に酸素化
アレルギー、免疫疾患制御に向けてのシグナル調節機構の解明

免疫、神経等の高次生体統御系の恒常性の維持にはサイトカインの存在が不可欠であり、その異常産生やシグナル異常はアレルギー、自己免疫疾患の発症に深く関与している。申請者はこれまで免疫/アレルギー応答を担うサイトカインの機能制御に重要なSTAT3/NF-κB関連シグナルを中心に新規制御分子の同定ならびにその機能解析を行ってきた。しかしながら、それら分子群の免疫/アレルギー疾患発症への関与についての詳細は未だ明らかではない。本研究ではそれらSTAT3/NF-κB関連シグナル分子に注目し、アレルギー、免疫疾患等の疾患発症における機能と新たな疾患標的分子としての可能性を明らかにするとともに、その人為的制御法の確立を目指す。
タンパク質のサイボーグ化手法の開拓と機能制御

生命現象は、特定の化学反応が絶妙なタイミングで進行することで維持される、極めてダイナミックな性質を有している。これを分子レベルで紐解くと、構造が大きく変化することでその機能のON/OFFを完全に切り替え可能なタンパク質がその一端を担っていることが分かる。このようなシステムを人工的に構築できれば、現代科学の大きな挑戦である非平衡系の精密制御が実現できる。タンパク質の主鎖構造の一部を外部刺激に応答可能な人工分子と完全に入れ替え、言わばタンパク質をサイボーグ化することで、タンパク質の大きな構造変化を可能とし、その機能を大胆に制御することを目指す。
Proton pump inhibitorを用いての新しい消化器癌治療戦略

いずれもp53変異株であり、通常の抗癌剤ではアポトーシスを起こしにくい5種類の膵癌細胞株(Capan-1,AsPC-1,BxPC-3,Panc-1,MIAPaCa-2)および7種類の大腸癌細胞株(SW48,SW480,SW620,CaR-1,colo320-DM,HT29,DLD-1)に対するbafilomycin A1のID_<50>(72時間培養,MTT assay法)は5nM-40nMときわめて高い感受性を示した。そして、bafilomycin A1や25-C prodigiosinの液胞型プロトンポンプ阻害剤は、Capan-1膵癌細胞のヌードマウス皮下移植腫瘍に対して有意に腫瘍の増殖を抑制し、病理組織学的には癌細胞の縮小や核の濃縮などアポトーシスに特徴的な所見が観察された。次に、最もアポトーシス抵抗性の強いHT-29を用いて、アポトーシスに至る経時的推移について検討したところ、細胞膜表面の微絨毛の減少およびブレブ形成、細胞膜表面へのPS基の表出はbafilomycin A1処理24時間目から、細胞の縮小および核クロマチンの凝集や分断化は処理48時間目から観察された。アポトーシス関連蛋白の経時的推移では、bafilomycin A1処理でp53蛋白の発現は増強せず、またp21^<Waf1>蛋白の発現も終始誘導されなかった。Bcl-2、Bcl-XL蛋白の発現程度には変化がみられず、Bax蛋白は発現しなかった。カスパーゼ蛋白分解酵素ではカスパーゼ3、カスパーゼ9は処理後48時間目から活性体が観察されたが、カスパーゼ6、カスパーゼ7の活性体は認められなかった。加えて、この一連のアポトーシスの誘導はイミダゾール投与によって抑制されなかった。これらの成績より、bafilomycin A1によって誘導されるアポトーシスは、癌細胞のp53蛋白のstatusや細胞周期とは無関係に誘導されるものであり、しかもカスパーゼ9およびカスパーゼ3を介したミトコンドリア依存性経路であることが示唆された。以上より、液胞型プロトンポンプを標的にしたbafilomycin A1を用いての消化器癌治療の有用性が示唆された。癌細胞が円滑に増殖、浸潤していくには至適環境(すなわち、至適pH)が重要であり、この至適pHをコントロールするものとして最近vacuolar type proton pump(V-ATPase)が注目されている。そこで本年度は、(1)分化度の異なった6種類のヒト膵癌細胞株でのV-ATPaseの発現を蛋白レベルならびにmRNAレベルで調べること、(2)V-ATPaseが癌細胞の浸潤能に及ぼす影響をみること、の2課題について研究したので、その成績を報告する。以上の成績より、V-ATPaseが癌の浸潤に重要な役割を演じていることが示唆された。本年度は、消化器癌のなかでも近年発生率の高い大腸癌に注目し、ヒト大腸癌の培養細胞株を用いて、Baf-A1がアポトーシスを介してその増殖能を抑制することが可能か否かを研究した。[材料と方法]

1)癌細胞株:7種類のヒト大腸癌細胞株(SW48,SW480,SW620,caR-1,colo320-DM,HT29,DLD-1)を使用した。2)薬剤:BafilomycinA1は和光純薬社より購入した。3)増殖能の測定:種々のBaf-A1濃度に対する培養細胞の増殖能をMTT assayで評価した。4)アポトーシスの有無:DNA抽出後にアガロースゲル電気泳動を行い、DNAラダーの有無を観察した。またDNAの細胞周期をフローサイトメーターで解析し、subG0/G1 phaseの占める割合をみた。さらに、形態学的観察としてサイトスピン法を用いてHE染色を行った。さらに、癌細胞の細胞膜表面のphosphatidylserine(PS)表出の程度をAnnexin V Apoptosis Kit(CLONTECH社製)で検討した。[結果]ヒト大腸癌細胞株に対するBaf-A1のID_<50>(72時間培養)はSW48で10nM,SW480で20nM,SW620で25nM,CaR-1で10nM,colo320-DMで25nM,HT-29で5nM,DLD-1で10nMと、いずれも5nMから25nMの間で高い感受性を示した。またいずれの細胞もBaf-A1処理により形態学的に細胞の縮小(cell shrinkage),核の濃縮と分断(unclear fragmentation)が観察された。また、フローサイトメーター法でもコントロールに比し24時間目でsub G0/G1の占める割合が増加してきた。さらに、これら核の変化とほぼ同時にBaf-A1処理された細胞にPS表出が確認された。[まとめ]以上、液胞型プロトンポンプはアポトーシスを介して大腸癌細胞の増殖を抑制したことより、今後大腸癌における化学療法として、本薬剤を用いた新しい治療戦略の可能性が示唆された。本年度は、bafilomycinA1と同様にV-ATPaseのinhibitor作用を有する25-C Prodigiosinを用いて、Capan-1膵癌細胞のヌードマウス皮下移植腫瘍における増殖抑制効果について研究し、bafilomycin Aiによる抗腫瘍効果と比較検討した。さらに、p53変異株でアポトーシス抵抗性の強いHT-29大腸癌細胞株を用いて、bafilomycin A1によるアポトーシス実行過程での形態学的変化やアポトーシス関連分子の関与についても研究した。[研究1]まず、Capan-1細胞を1x106個ヌードマウスの背部皮下に移植し(n=30)、移植10日目に腫瘍の大きさが60mm^3前後の21匹を選別して、25C Prodigiosin無投与群(n=7),0.1mg/kg連日皮下投与群(n=7),1.0mg/kg連日皮下投与群(n=7)の3群に分けて腫瘍の増殖程度を観察した。その結果、投与21日目以降で、無処置群の推定腫瘍堆積が884±328mm^3であったのに対し、1.0mg/kg投与群では507±190mm^3と有意(p<0.05)に増殖が抑制された。この効果は、bafilomycin A1とほぼ同等であった。体重の推移は統計学的に有意差はみられなかった。[研究2]次に、HT-29を用いて、アポトーシスの関与およびその経時的推移について検討した。細胞膜表面の微絨毛の減少およびブレブ形成、細胞膜表面へのPS基の表出はbafilomycin A1処理の24時間目から、細胞の縮小および核クロマチンの凝集や分断化は処理48時間目から観察された。
胚性幹(ES)細胞における分化多能性の維持機構

本研究の目的は、多能性の誘導・維持における転写因子Sox2の機能を解明、ならびにSox2非依存的にOct3/4-Sox2標的遺伝子が活性化される分子機序を解明することである。ES細胞が分化多能性を維持する上において、複数の転写因子の重要性が示唆されているが、私達は、4つの転写因子(Oct3/4、Sox2、c-Myc、Klf4)をマウス線維芽細胞にレトロウイルスベクターで導入することにより、ES細胞に類似した多能性幹細胞(ips細胞)が誘導されることを報告した。Sox2以外の3転写因子をマウス線維芽細胞に導入した場合、形態や遺伝子発現でES細胞に類似した細胞が誘導されるが、多能性は有していない。この現象をふまえて、3因子導入により得られるES細胞類似細胞を用いて、Sox2追加導入効果、Oct3/4-Sox2標的遺伝子発現に与える影響、およびSox2以外のSoxファミリーの発現・機能の確認などを行った。その結果、転写因子導入による体細胞の多能性獲得機構において、4因子におけるOct3/4に比肩したSox2の重要性を確認するとともに、ES細胞特異的遺伝子の再活性化にはたす大きな役割が推察された。今後、3因子によるES細胞類似細胞を基軸としたiPS細胞樹立法に向けて、ES細胞遺伝子発現プロファイルやSoxファミリータンパク質のゲノム上の標的部位のさらなる解析により、Sox2によるエピジェネティックリプログラミング過程における機能の詳細な解明が期待される。胚性幹(ES)細胞は体を構成するすべての細胞へと分化できる多能性を維持したまま長期に培養することが可能である。分化多能性の維持にはOct3/4、Sox2、Nanog、Klf4およびSTAT3などの転写因子が必須であることが知られている。しかしこれらの転写因子が制御する標的遺伝子に関しては、ほとんどわかっていない。本研究の目的は、クロマチン免疫沈降法とDNAマイクロアレーを組み合わせたいわゆるChip on Chip法により、ES細胞の多能性維持に関わる転写因子群の標的遺伝子を探索することである。本年度の成果クロマチン免疫沈降法の最適化各転写因子に対する抗体に関して、反応時間、温度、洗浄バッファーの組成、沈降法(遠心またはマグネティックビーズの吸着)を検討し、最適のクロマチン免疫沈降法を決定した。抗体も複数種類を購入に、最良の結果が得られるものを検討した。DNAマイクロアレー法の最適化マイクロアレーとして、アジレント社から発売予定のもの、およびカスタムメードで作製するものを比較した。ハイブリの温度、洗浄条件などを検討し、シグナルとノイズの比が最良の条件を決定した。またクロマチン免疫沈降法の後にPCRを行う通常の方法と比較することにより、Chip on Chip法の解析結果がどれくらい信頼できるかを評価した。またゲルシフト法により、実際に転写因子がゲノムDNAに結合することを確認した。研究の目的胚性幹(ES)細胞は体を構成するすべての細胞へと分化できる多能性を維持したまま長期に培養することが可能である。分化多能性の維持にはOct3/4、Sox2、Nanog、などの転写因子が必須であることが知られている。しかし私たちはこれらの転写因子の発現が、未分化ES細胞の中でオンオフを繰り返していることを見いだした。本研究の目的は、ES細胞における遺伝子発現ゆらぎのメカニズムと、その意義を明らかにすることである。本年度の研究実施計画内在性遺伝子発現のゆらぎの検討これまでの研究で、Oct3/4、Sox2、Nanog遺伝子を含む巨大DNA(大腸菌人工染色体、BAC)において各遺伝子に緑色蛍光蛋白(GFP)遺伝子を挿入し、同改変BACをES細胞に導入すると、GFPの発現のオンオフの繰り返し(ゆらぎ)が認められることを示した。本年度は、内在性遺伝子からの転写もゆらぎを示すかを検討した。その結果、内在性遺伝子の発現も確かにゆらいでいるが、BACレポーターのゆらぎとは位相がずれていることが明らかとなった。ゆらぎのメカニズム遺伝子発現がゆらぐメカニズムとして、エピジェネティックな修飾が考えられる。そこでDNAバイサルファイト法にてDNAメチル化状態を観察するとともに、CHIP (Chromatin immunoprecipitation)法でヒストンのメチル化やアセチル化を検討している。内在性遺伝子のゆらぎと、BACレポーターのゆらぎが一致していないため、それぞれのDNAを特異的に解析する必要があり、現在、条件検討を行っている。

その結果、転写因子導入による体細胞の多能性獲得機構において、4因子におけるOct3/4に比肩したSox2の重要性を確認するとともに、ES細胞特異的遺伝子の再活性化にはたす大きな役割が推察された。今後、3因子によるES細胞類似細胞を基軸としたiPS細胞樹立法に向けて、ES細胞遺伝子発現プロファイルやSoxファミリータンパク質のゲノム上の標的部位のさらなる解析により、Sox2によるエピジェネティックリプログラミング過程における機能の詳細な解明が期待される。
地域課題への解決行動を促すモバイルアプリケーションの参加型デザイン機構

本年度は、当初の計画では開発したシステムを用いて長期利用の実験を行う予定であったが、昨年度の実験によりシステム改良の必要性が明らかとなったことから、計画を一部変更し、システムの大幅な改良作業と利用シーンの整理、昨年度の実験結果の分析を行なった。1.システムの改良については、昨年度に開発した地域情報の通知を行うスマートフォンアプリケーションと住民参加型の通知デザイン環境について、消費電力の低減、ユーザ入力機能の強化、beaconやプロジェクター等の通知への気づきを強化するデバイス利用のための機能拡張を行った。2.利用シーンの整理については、様々な団体との意見交換を通じて実現価値の高い利用シナリオを描くことができた。具体的には、研究成果を基に事業化構想の立案を行う東京大学edgeプログラムに参加し、本システムを地域観光に活用する可能性を検討した。本成果はビジネスプランとしてまとめ、シリコンバレーで発表を行った。現地の投資家らから有益な助言を得たことから、今後プランと実装を洗練させることで、本システムの活用法の一つとして社会にアピールできると考える。また、地域住民や空き家活用支援団体へのインタビューから、空き家の状態情報を地域で収集する仕組みとして本システムの活用可能性を検討した。本成果の一部は、国内外の学会ワークショップ等で発表を行った。3.昨年度の実験分析については、通知の受信・返信ログの蓄積を利用することで、素早く回答されやすい通知や通知の設定場所を推測できる可能性を中心に行った。本成果は、国際会議で発表を行いBest Paper Awardを受賞するに至った。本研究で、スマートフォンの通知が実世界環境の一要素として、公共的な思考を持ってデザインされるべき対象であることを定量的に示したことから、コンテクストアウェア通知の汎用的活用を促す上で多くの洞察を提供できたと考える。28年度が最終年度であるため、記入しない。今年度は、まち単位で定義可能な場所連動型地域支援アプリケーションと場所連動型地域支援に必要な通知を住民参加型で作るためのデザイン環境の設計及び開発を行った。さらに、1つの地域を対象に、システムが地域に与える効果を探索的に評価するための実証実験を行い、システムの特性・有用性・欠点を明らかにした。加えて、システムの発展的活用法について基礎研究を行った。1.プロトタイプの開発に関しては、まち歩きワークショップの参与観察および地域住民・まちづくり専門家へのヒアリングを基にシステム設計を行った。この設計の過程で明らかとなった機能や地域に導入する際の課題については、CHI'15のDoctoral Consortiumで口頭発表を行った。2.プロトタイプを利用した基礎的な実証実験に関しては、つくば市の1地区を対象に、住民参加型の通知制作と1ヶ月間日常生活の中で通知の受信を体験してもらう実験を実施した。実験を通して、コンテクストアウェア通知が住民の意識や行動に影響を与え、地域とのつながりを深めるきっかけになったことを定量データおよび定性データから明らかにした。この成果は論文誌に投稿した(2017年に掲載が確定)。3.システムの発展的活用法に関する基礎研究として、(1)「現場での複雑な活動を通知化するためのレシピフォーマット」(2)「通知の受信・返信ログの蓄積を活用した素早く回答されやすい通知のデザイン支援」(3)「クラウドソーシングによる通知の生成手法」を行い、(1)については国際会議で口頭発表した他、(2)(3)は来年度に国際会議での口頭発表が確定している。これらは、2の実験フィールドに留まらない活用の可能性を探求するものであり、コンテクストアウェア通知の汎用的活用が進んでいない問題や地域の中で公益性の高い活用に向けての課題についての議論を深める上で多くの洞察を提供すると思われる。短期間小規模実験に耐えうるプロトタイプを開発し終えた。また短期間小規模での実験を実施し、得られたデータから有用な結果を導くことができた。このうち3-(1)の成果は国際学会で口頭発表を終え、3-(2),(3)についても成果の発表が確定している。ただし、2の実験結果をまとめた論文においては執筆を終えているものの、投稿中であり、採録が決定していない(2017年に掲載が確定した)。また計画では、次年度に3拠点で開発したシステムを用いて3ヶ月間の実験を予定しており、今年度中に実験準備を完了させる予定であったが、開発したプロトタイプは電池の消耗等の問題を抱えていることが明らかになっており、長期的な利用を実現するためこれらの問題をまず解決しシステムの改良を行うことになった。これらの状況を総合し、当初の計画を変更する必要が出てきたものの、おおむね順調に進展していると判断した。

現地の投資家らから有益な助言を得たことから、今後プランと実装を洗練させることで、本システムの活用法の一つとして社会にアピールできると考える。また、地域住民や空き家活用支援団体へのインタビューから、空き家の状態情報を地域で収集する仕組みとして本システムの活用可能性を検討した。本成果の一部は、国内外の学会ワークショップ等で発表を行った。3.昨年度の実験分析については、通知の受信・返信ログの蓄積を利用することで、素早く回答されやすい通知や通知の設定場所を推測できる可能性を中心に行った。本成果は、国際会議で発表を行いBest Paper Awardを受賞するに至った。本研究で、スマートフォンの通知が実世界環境の一要素として、公共的な思考を持ってデザインされるべき対象であることを定量的に示したことから、コンテクストアウェア通知の汎用的活用を促す上で多くの洞察を提供できたと考える。当初の計画ではシステムを利用した3拠点での実験を中心として研究を進める予定であったが、システムの改良の重要性から、計画を一部変更し、システムの一般利用実現に向けた整備を優先する。システムの公開によって潜在的なシステム利用者を発掘し、新規性のある地域に根付いたシステム活用に向けて共同実験を実施する。平成28年6月までに、長期間利用可能な動作の安定したシステムの実現に向けて改良を行った上で、システムを一般公開するためのホームページおよびシステムの一般利用を想定したデータ蓄積用のサーバの整備を行う。その後、システム利用者と実験計画を打ち合わせ、実証実験を実施する。実験の成果は学会で発表するとともに、ホームページ上や地域のイベントでも実験の推移や成果物を広く公開し、住民や潜在的なシステム利用者との接点を増やすことに注力する。28年度が最終年度であるため、記入しない。
肝癌の陽子線治療効果判定のための画像診断に関する研究

肝癌に対する放射線単独療法は未開拓の分野で、その臨床経過については未知の部分が多かった。しかし陽子線を用いて高線量を安全に照射することが可能となり、いままで知られていなかった放射線による肝癌の治療過程を観察することができるようになってきた。約1.5カ月間に平均74Gyを照射する陽子線治療を施行した28例の経過観察の結果、治療開始から1年後の平均縮小率は88%だが、腫瘍縮小過程は緩徐で、殆どの症例がPartial Regressionを示すのに約6カ月を要することがわかった。1年後の時点でComplete Regressionを示したのは17%しかなかったが、残存腫瘍が全て壊死に陥っていると考えられた症例も多く、治療の効果判定には腫瘍の大きさ以外に、腫瘍のviabilityを評価する方法が必要であると考えられた。この評価には主にCTを用いたが、機器の発達により最近ではMRIの法がより正確な情報が得られるようであり、症例を重ねて検討したい。長期間の観察により照射野内あるいは辺縁部から再発する症例を4例経験した。これらの再増殖はいずれも照射開始から10カ月以上経過した後に認められ、どの症例も最大効果はPRであり、12カ月の時点においてなおviabilityを残していると考えられる症例に関してはその時点で追加治療をすることがより長期の局所制御を得るために有用であると考えられた。今後新しいプロトコールを立案し、この治療法の確立を目指したい。肝癌に対する放射線単独療法はほとんど報告例がなく、その臨床経過については未知の部分が多かった。しかし陽子線を用いて高線量を安全に照射することが可能となり、いままで知られていなかった放射線による肝癌の治癒過程を観察することができるようになってきた。20例の経過観察の結果、約1.5カ月の治療期間終了時においては肝癌の縮小は体積にしてもとの約8040%程度にとどまっていることがわかった。さらにその後他の治療を全く行わずに経過を観察しても腫瘍の縮小は持続し、約8から約12カ月後に完全消失にいたることがわかった。この縮小率は治療前の腫瘍体積が6cc350ccにいたるものまでほぼ同様であった。しかし大型(65.4cc以上)のものになると、腫瘍内に壊死巣が存在し、完全消失にはいたり難い傾向をしめした。長期間の観察により照射野内あるいは辺縁部から再発する症例も4例経験した。これらの再増殖はいずれも照射開始から10カ月以上経過した後に認められたが、どの症例も経過中に完全消失には至らず、詳細に読影するとviableな腫瘍成分が確認されていた。以上より、肝癌の画像診断的な効果判定は照射開始からの縮小速度によらず、1012カ月の時点において完全消失に至っているか否かが指標になると考えられた。肝癌に対する放射線単独治療法は未開拓の分野で、その臨床経過については未知の部分が多かった。長期間の観察により照射野内あるいは辺縁部か再発する症例を4例経験した。
コラ-ゲンの小胞体・ゴルジ間輸送におけるHSP47の役割

一般に分泌蛋白質は、小胞体からゴルジを経て細胞外へ分泌されるが、小胞体において正しいfoldingを受けたり、種々の修飾を受ける際に、GRP78などの分子シャペロンがその過程に密接に関係している。HSP47は、我々によって1986年に発見されたストレス蛋白質であるが、熱ショックをはじめとする種々のストレスによる誘導性の他に、細胞の癌化や分化によっても発現調節を受けている。HSP47は、コラ-ゲンに対する結合性をもっていることから、コラ-ゲン分子の合成初期過程における成熟、folding、プロセシングや分秘などになんらかの役割を果たしていると考えられるが、その詳細はいまだわかっていない。細胞内でのHSP47の役割をはっきりさせるため、細胞内クロスリンキング法に免疫沈降法を組み合わせた実験などにより、以下の点を明らかにした。プロコラ-ゲン分子は、合成されて小胞体に入ると同時に、HSP47に結合し、ゴルジへ輸送される前にHSP47から解離する。α,α'ーdipyridylなどの薬剤処理、または低温にするなどの処理によってプロコラ-ゲンの分泌を抑制した場合には、プロコラ-ゲン分子はいつまでもHSP47に結合したまま、小胞体の中にとどめ置かれる。プロコラ-ゲンとHSP47との結合は、2MのNaCl存在下にも解離しない程の強いものであるが、pHが6.3程度にまで低下すると完全に解離した。以上のことから、HSP47は、プロコラ-ゲン合成・分泌の初期過程において、その三本領形成・プロセシング・分泌などのいずれかのステップに重要な役割をもっていることが示唆された。
高エネルギー粒子測定用高分解能位置及び時間検出器の開発研究

昨年度(昭和61年度)はデータ・アクイジション・システムを完成し,さらに実用型プラナー・スパーク・カウンター(以下「PSC」と呼ぶ)を試作した.今年度は昨年度試作したPSCに以下の改良を加え,実用型PSCの完成を目指した.改良点は(1)昨年のアノード半導体ガラスは厚さ3mmであったが,横方向の位置分解能を良くするために厚さを6mmとしたこと.(2)昨年はアノードおよびカソード共に半導体ガラスでしたが,カソードについてはより安価な真空蒸着ガラスとしたこと.(3)アノードおよびカソードを組込むインナー・ベッセルの構造を改善しプレッシャー・ベッセルへの組込みを簡単にするとともに,アノードとカソード間のギャップ(200μm)を流れるガスの流れを改善した.これ等の改善により実用サイズ(1m)のPSCで(1)時間分解能60psを割る高分解能が得られたこと.(2)位置分解能については,これを精度良く測定するためには狭く絞られた素粒子ビームを必要とするのでいまだ実測されてはいないが,横方向の信号に関する電荷分割の割合から推定すると約300μmとなり位置精度についても十分な分解能がえられた.以上今回の科研費補助金により, 1)データ・アクイジション・システムが完成したPSCの開発研究に活用されたこと, 2)高分解能PSCが実用化されたこと,これを実際の素粒子実験に応用することが可能であると判断される.昨年度(昭和61年度)はデータ・アクイジション・システムを完成し,さらに実用型プラナー・スパーク・カウンター(以下「PSC」と呼ぶ)を試作した.今年度は昨年度試作したPSCに以下の改良を加え,実用型PSCの完成を目指した.改良点は(1)昨年のアノード半導体ガラスは厚さ3mmであったが,横方向の位置分解能を良くするために厚さを6mmとしたこと.(2)昨年はアノードおよびカソード共に半導体ガラスでしたが,カソードについてはより安価な真空蒸着ガラスとしたこと.(3)アノードおよびカソードを組込むインナー・ベッセルの構造を改善しプレッシャー・ベッセルへの組込みを簡単にするとともに,アノードとカソード間のギャップ(200μm)を流れるガスの流れを改善した.これ等の改善により実用サイズ(1m)のPSCで(1)時間分解能60psを割る高分解能が得られたこと.(2)位置分解能については,これを精度良く測定するためには狭く絞られた素粒子ビームを必要とするのでいまだ実測されてはいないが,横方向の信号に関する電荷分割の割合から推定すると約300μmとなり位置精度についても十分な分解能がえられた.以上今回の科研費補助金により, 1)データ・アクイジション・システムが完成したPSCの開発研究に活用されたこと, 2)高分解能PSCが実用化されたこと,これを実際の素粒子実験に応用することが可能であると判断される.昭和61年度は、プラナー,スパークカウンター(高分解能位置及び、時間検出器)を、開発し、その性能を調べるのに不可欠であるData Acquisitionシステム及びそのオンライン,ソフトウェアの製作を、完成した。このシステムはμPDP11を中心にしたシステムである。このシステムのオンライン機能のテストを行うために、既存のドリフト,チェンバー検出器を用いてData Acquisitionのテストを行い、プラナースパーク検出器の性能を調べる上で、十分なシステムである事を確認した。プラナー,スパーク,カウンターについては、高エネルギー研究所の協力のもとに、実用サイズである10cm×100cmの検出器を設計,試作し、高エネルギー研究所の施設を利用して、宇宙線によるテストを行った。このデータを今回の科研費で、奈良女子大学に設置された上記μPDP11で解析を、行った結果60PSの時間分解能が得られ、実用サイズのプラナー,スパーク,カウンターとしては、世界最良の時間分解能を得る事が出来た。ひきつづき62年度は、時間分解能とともに、位置分解能についても、良い結果が得られるようアノードを改良し試作テストを行う予定である。
教育の情報化に対応した効果的な教育の推進策に関する調査研究

本研究で得られた成果を列挙すると以下のようになる。(1)コンピュータ活用に関する教員の実態調査と今後の展開昨年度実施した学校教員と管理職を対象にした実態調査結果を踏まえて、第2回目の実態調査を行った。第2回の調査では、第1回調査で回答していただいた3,591件に対して調査した。その結果、授業でのコンピュータ活用やインターネット活用に関する実態等を明らかにすることができた。また、今後の展開を検討する資料としての分析を行った。(2)今後のIT技術の進展に関する予測と教育との関連分析IT技術に関して公表されている多くの文献、資料、書籍等を調査して、2010年、2015年におけるIT関連技術予測を行った。その結果、活用するデータをセンターに保存しておき、必要な時点で必要な情報をネットワーク利用によって取得する方法が主になると考えられる。その結果を踏まえて教育との関連を整理して、今後のIT技術の教育における活用をまとめることができた。(3)今後の情報社会が求める人材の能力に関する調査急速に進展している高度情報社会が必要とする人材の能力を検討する資料として、米国の教育省が委託して検討している「21世紀のスキル」を調査してまとめた。この結果は今後の展開を検討する際に有用となると考えられる。(4)2005年度のIT環境に於ける教育のイメージ化2005年度の整備計画終了後の環境におけるITを活用した教育の場面を100事例挙げて、そのイメージをイラストで示した。これらは、小学校段階から中学、高等学校に於ける各教科の種々の指導場面を想定しており、それらのイメージを示すことによって、今後の教員のIT活用指導力の向上に役立つことを期待している。(5)教育の情報化に対応した効果的な教育に関する推進策の検討以上の種々の観点を総合的に検討した結果として、今後の推進策の例を列挙することができた。(6)研究成果報告書の作成昨年後の成果と今年度の成果を総合的にまとめて、最終報告書をまとめた。(1)コンピュータ活用に関する教員の実態調査教員がコンピュータやインターネットを活用した効果的な教育方法に関する検討を行うために、5,000校の学校を対象にして、教員と管理職に対する実態調査を実施した。調査の結果、例えば次のような現状が得られている。学校が用意した教員用のコンピュータは少ないが、ほとんどの教員は個人で購入したコンピュータを持っている。そのため、セキュリティの問題が不安である。ただし、ほとんどの学校の職員室にはコンピュータが整備されており、校務処理のためにはコンピュータ活用に関しては、ほとんど教員が行っている。校長をはじめ管理職からの回答によると、教室で使えるコンピュータの設置と、教員1人に1台のコンピュータを強く望んでいる。また、コンピュータやインターネットを教科指導に活用することは効果的を考えており、著作権教育の必要性、有害情報をカットするフィルタリングを望んでいる。教育の情報化を推進に対する阻害要因では、教員が使えるコンピュータの不足、学校のコンピュータ機能の不足、教育用コンテンツの不足、事前の準備時間の不足、ITに関する教員の知識とスキル不足などを挙げている。(2)海外における教育の情報化に関する調査今年度は、米国、英国、韓国、シンガポールを調査した。その結果、いずれの国も我が国より進んでいる現状を知ることができた。
白血病幹細胞の病態におけるNotchの役割の解明とその阻害薬の感受性検査法の開発

白血病を効果的に治療するには、白血病幹細胞の病態の理解が必要である。Notchシグナルは白血病幹細胞の自己複製の制御に重要である。本研究でNotchリガンドが白血病細胞のNotch蛋白を活性化し、細胞増殖をきたす分子機序を明らかにした。さらにNotchシグナルを阻害するガンマセクレターゼ阻害薬が、白血病細胞の増殖を抑制することを示し、その効果を予測する検査法の基礎を開発した。白血病の効果的な治療には、白血病幹細胞の病態の理解が必要である。Notchシグナルは白血病幹細胞の自己複製の制御に重要な役割を持つと考えられるので、このシグナルを研究対象とした。平成20年度は、第1に、白血病細胞株を遺伝子組換え型Notchリガンドで刺激してNotchシグナルを活性化させた時の、網羅的な遺伝子発現の解析を行った。c-MYCなどの増殖関連遺伝子、細胞周期関連遺伝子、NF-kB関連遺伝子などの変化を認めたが、興味深いことに細胞株によって、同じリガンド刺激に対して正反対の変化を示す遺伝子があり、その作用の多様性が示唆された。また、白血病細胞においてNotchシグナルがNF-kB系を活性化することを見出した(論文投稿中)。第2に、Notchシグナルを阻害するガンマセクレターゼーインヒビター(GSI)の白血病細胞の増殖に対する効果を調べた。GSIはT細胞性白血病だけでなく、骨髄性白血病やB細胞性リンパ腫の一部の細胞の増殖を抑制しアポトーシスを誘導したが、興味深いことに、GSIによって増殖が促進する白血病細胞があることがわかった。また、GSIによって分化誘導される白血病細胞もあることがわかった。GSIを白血病に対する分子標的治療薬として臨床応用するには、その作用機序のさらなる検討が必要と思われた。現在は、small interfering RNAを用いたNotchシグナルの阻害でも、同様の効果が得られるかを検討している。白血病に対する効果的な治療には、白血病幹細胞の病態の理解が必要である。Notchシグナルは白血病幹細胞の自己複製の制御に重要であるため、このシグナルの研究に取り組んでいる。我々は、白血病細胞に対し、Notchリガンド蛋白による刺激後の、Notch蛋白の活性化の経時的な変化や、さまざまな遺伝子のmRNA発現の定量的な変化を解析して、Notch活性化が増殖、細胞周期、stemnessに関わる遺伝子の発現に影響を与えることを報告した。さらに、Notchリガンド刺激によるNotch活性化は、一部の白血病細胞において、NF-κBシグナルの構成分子の遺伝子発現を亢進させ、NF-κBシグナルを活性化させることを報告した。このようにNotchシグナルは白血病細胞の増殖に関与しているため、このシグナルの阻害が、新たな分子標的治療となりうる。我々は、Notch蛋白の活性化を阻害するガンマセクレターゼ阻害剤(GSI)が、T細胞性白血病、骨髄性白血病、B細胞性リンパ腫の細胞増殖を抑制することを明らかにした。これらは、in vitroでのWST-1アッセイにより、その感受性を検査することができる。この過程において、一部の白血病細胞ではGSI投与によって、増殖がむしろ促進することがあることを見出し、その機序として、これらの細胞では、GSI投与によりNF-κB関連遺伝子の発現が亢進することを見出した。Notchシグナルのほか、HedgehogシグナルやWntシグナルも幹細胞の自己複製制御に関与することが知られている。我々は、Hedgehogシグナルの阻害剤であるシクロパミンやWntシグナルの阻害剤であるケルセチンが、白血病細胞の増殖を抑制することを見出して報告した。GSIとこれらの薬剤との組み合わせによる効果を現在検討中である。Notchシグナルは白血病幹細胞の自己複製の制御に重要であるため、このシグナルの研究に取り組んだ。Notch蛋白の活性化を阻害するガンマセクレターゼ阻害剤(GSI)が、T細胞性白血病、骨髄性白血病、B細胞性リンパ腫の細胞増殖やコロニー形成能を抑制することをこれまで明らかにした。今年度は、一部の白血病細胞ではGSI投与によって、増殖がむしろ促進することがあることを見いだし、その分子機序として、これらの細胞ではGSI投与によりNF-κB関連遺伝子の発現が亢進することを報告した。このようにNotchシグナルの作用は多様であるため、臨床応用する場合には事前の薬剤感受性試験が必要であると考えられた。さらに、赤白血病細胞株にGSIを投与すると白血病細胞が赤芽球様に分化することを見いだした。GSIは赤白血病の分化誘導療法薬として利用できる可能性を示した。また、白血病幹細胞はNotchシグナルのほか、HedgehogシグナルやWntシグナルによっても制御されている。我々はこの3シグナルの阻害剤を組み合わせて白血病細胞に投与することにより、より有効に細胞増殖を抑制できることがあることを見いだした。これらの知見より、白血病幹細胞の病態にNotchが関与していることを示し、そのシグナル阻害剤が増殖抑制に有効であることを見いだし、さらにはその効果を予測する検査法の基礎を開発することができた。