hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
連続的環化芳香族化反応を用いた多環縮環型フランの合成による抗腫瘍活性化合物の創生

生物活性物質のためのプリビレッジド構造として、多環が縮環した複素環構造が知られており、これらは構造的自由度の低さと、多環相互の縮環歪みによる高反応性の特徴を有している。これらの高反応性構造は、生体分子との反応においては有利に作用するが、母核の不安定性のために、合成的には極めて困難な物質である。本研究課題における解析の結果、多環縮環型複素環の合成法の開発に成功し、これら手法を用いた誘導体合成により、種々の強力な活性物質の創製に成功した。生物活性天然物の多くはその母核中に多環縮環型の複素環を有しており,これら基本骨格の効率的合成法の開発は,新規生物活性物質の創製において,不可欠な課題といえる.なかでも多環縮環型のフラン環化合物や含窒素環化合物は,抗腫瘍活性をはじめとする種々の生物活性天然物が知られているが,その簡便合成法は現在開発段階であるといえる.本研究課題において,多環縮環型複素環の簡便合成法の開発とともに,開発した反応を応用して化合物ライブラリーの構築しさらにその機能評価を実施しており,特に今期においては次年度に引き続き,抗腫瘍活性の評価系の確立,および含窒素複素環化合物の合成に成功した.抗腫瘍活性の評価系として,前年度までの検討により,細胞内ミトコンドリアの電子伝達鎖の活性を指標としたMTT法およびWST-1法の測定条件の最適化を成功している.しかしこれらの方法は,DNAインターカレーターに対しては不充分であることが当該年度の検討で明らかとなり,インターカレーターに対する両評価法の最適化を実施した.インターカレーターとしてはcalothrixin類を用いたところ,2回の分裂に相当する時間の薬剤処理によってのみ,充分な抗腫瘍活性を発揮することが明らかとなった.これら評価系の堅牢性を確認する意味において,類似の作用を有するbenzo[c]phenanthridine類についても抗腫瘍活性を測定したところ,前年度までで確立した方法では不充分であった結果が改善され,充分な抗腫瘍活性を認めることに成功した.これら多環縮環型含窒素天然物であるcalothrixin類, benzo[c]phenanthridine類,yuehchukeneやisocryptolepineの全合成法の開発に成功しており,これら合成法を駆使してそれらの誘導体よりなるライブラリーの構築に成功している.生物活性を示す化合物の多くは、その母核中に多環縮環型複素環からなるプリビレッジド構造を有する。このため多環縮環型複素環骨格の効率的合成法の開発は、新規生物活性物質の創製において、不可欠な課題であるといえる。今期において、主に、1)多環縮環型フラン環化合物の合成法の解析、2)calothrixin類による血液癌での抗腫瘍活性誘導体の創製を行った。1)多環縮環型フラン環化合物の合成法として、連続的環化芳香族化反応の詳細について解析した。本反応の初期段階における環化反応としては、過去の報告により[4+2]型と[2+2]型が競合的に進行すると考えられる。今回、ジエンの置換基を種々検討したところ、[4+2]型のみを優先的に進行させることに成功した。[4+2]型が優先した理由について、汎電子密度計算法によるB3LYP/6-31G(d)で計算したところ、本反応制御が生成物の安定性に依存していることを明らかとした。本環化反応が進行した後、ジエン上の置換基が脱離基としてさようすることで、三環が縮環した化合物の創製に成功した。2)calothrixin類はCalothrix cyanobacteriaより単離された強力な抗腫瘍活性天然物であり、その母核中に多環縮環型のカルバゾールキノンを含有している。calothrixin類は、その抗腫瘍活性の強力さにより、さまざまな合成展開がなされたが、多環縮環型構造をコア構造とすることによる合成的困難さ等により、未だ天然物を上回る抗腫瘍活性物質の創製には到っていない。また本化合物は、固形癌への活性は著しいものの、血液癌への活性が低いことが報告されている。これらのことより、今期において、血液癌に活性を示すcalothrixin誘導体の創製に着手した。その結果、インドール環上に種々置換基を導入した誘導体において、固形癌のみではなく、血液癌に対しても強力な抗腫瘍活性を有する誘導体の創製に成功した。

生物活性天然物の多くはその母核中に多環縮環型の複素環を有しており,これら基本骨格の効率的合成法の開発は,新規生物活性物質の創製において,不可欠な課題といえる.なかでも多環縮環型のフラン環化合物や含窒素環化合物は,抗腫瘍活性をはじめとする種々の生物活性天然物が知られているが,その簡便合成法は現在開発段階であるといえる.本研究において,多環縮環型複素環の簡便合成法の開発とともに,開発した反応を応用して化合物ライブラリーの構築しさらにその機能評価を実施しており,特に今期においては,抗腫瘍活性の評価系の確立,および含窒素複素環化合物の合成に成功した.抗腫瘍活性の評価系としては,細胞内ミトコンドリアの電子伝達鎖の活性を指標としたMTT活性の測定に加え,浮遊の癌細胞であるHL-60細胞に対してはWST-1法の測定条件の最適化を実施した.これらの実験系の堅牢性を確認する意味において,多環縮環型複素環以外の化合物よりなるライブラリーにおける抗腫瘍活性を測定したところ,あらたな抗腫瘍活性化合物群として1,3-ジ-O-シリル化-myo-イノシトール類が顕著な抗腫瘍活性を有することを見いだすことに成功した.さらにこれら化合物は癌細胞におけるcaspase-3の活性化が認められたことより,アポトーシスを誘導することで抗腫瘍活性を惹起していることが示唆された.またPictet-Spengler反応を応用した,多環縮環型含窒素インドール化合物の簡便合成法の開発に成功した.塩基性条件下,N(b)ベンジルセロトニンとαβ不飽和アルデヒドとのPictet-Spengler反応を利用して,ピラノ[3,2-e]インドールの合成に成功した.本反応によって得られた化合物の一部は強い抗腫瘍活性を有することが明らかとなったことより,生物活性物質合成のための有用な反応の開発に成功している.本研究課題の目標は,多環縮環型複素環化合物の簡便合成法の開発と,開発した反応を用いた化合物ライブラリーの構築による生物活性物質の探索の二つである.これらの目標を実現するためには,新規反応開発と生物活性評価系の構築の両者を平行して実施していかなければならない.当該年度においては,新規反応開発として,多環縮環型含窒素天然物の全合成法の開発,ならびにそれらの誘導体合成を行うことで,特に含窒素複素環化合物ライブラリーの充実に成功した.また前年度に成功していた抗腫瘍活性評価系が、化合物の作用機序に依存して不充分であることが明らかとなったため,さらに詳細なる最適化を実施し,一定の成果を得ることに成功した.新規反応開発においては,calothrixin類の全合成,yuehchukeneの全合成,およびisocryptolepineの全合成に成功した.またcalothrixin類の全合成においては,生合成模倣型合成法を展開させた誘導体合成,および全3工程による簡便合成法の開発に成功しており,これらの方法を駆使して、構造的多様性を有するcalothrixin誘導体の化合物ライブラリーの構築に成功してきている.Calothrixin類およびbenzo[c]phenanthridine類は,ともに転写・複製にの際にDNA複合体を形成することでその機能を発揮することが知られている.これら化合物群による抗腫瘍活性の測定は,若干の最適化が必要であり,最適化も含めて,これら化合物群による抗腫瘍活性の評価を達成した.当該年度初頭の予定では,多環縮環型フラン環化合物群の合成法を完成させることを予定していたが,当該課題の担当者の所属変更のため,若干の遅れが生じている.合成法の構築は既に終了し,化合物ライブラリーの構築途中である.本研究課題の目標は,多環縮環型複素環化合物の簡便合成法の開発と,開発した反応を用いた化合物ライブラリーの構築による生物活性物質の探索の二つである.これらの目標を実現するためには,新規反応開発と生物活性評価系の構築の両者を平行して実施していかなければならない.当該年度においては,新規反応開発,および抗腫瘍活性評価系の両者に関して実践し,一定の成果を得ることに成功した.
切削過程の過酷な変形場に着目した材料の極限環境下の動的変形特性推定システムの構築

切削過程のせん断域の過酷な変形場を推定することで,高ひずみ,高ひずみ速度,高温の変形場における材料の流動応力特性を把握するシステムを提案した.これは被削材材料の加工硬化係数を未知数として切削過程のFEM解析を行い,FEM結果が,設定した境界条件(切りくず形状,切削力,切りくず自由表面側の温度分布,工具ー切りくず接触域の温度分布)を満足するよう,流線に沿った加工硬化係数を見出すことで,せん断域の変形場を推定するものである.本研究では,提案する流動応力推定システム構築において最も重要な切りくずの工具との擦過面を含めた表面全域の温度分布を把握する手法を確立した.本研究では,切削のせん断域の変形場をうまく利用することで,通常の材料試験では実現困難な材料の高温,高ひずみ,高ひずみ速度の変形場での流動応力特性を把握する手法の確立を目指すものである.具体的には,旋削により,切削力,切りくず形状を計測する.ついでに,得られた測定値を境界条件とし,申請者の開発しているFEM切削シミュレータにより材料の流動応力特性を推定する.FEM解析では,加工硬化係数を変数とし,シミュレートされた切りくず形状や温度場が,実験で得られた切りくず形状や温度分布と一致するようにするものである.本年度は,境界条件となる,切りくずの工具との擦過面温度と切りくずの自由表面の温度分布を詳細に把握するシステム構築を行った.切りくず擦過面の温度分布は,申請者の開発した刃先交換チップのすくい面上に7対の微細Cu/Ni熱電対群を内蔵させた工具で,高温接点部の位置を変えた工具を多数作成し,工具ー切りくず接触域全域の温度分布を計測する手法により計測した.被削材のせん断域部分から切りくず自由表面の温度分布は,赤外線サーモグラフィにより計測した.赤外線サーモグラフィカメラは切りくずとの干渉を防止するために刃先点から遠ざける必要があるが,計測する切りくずの大きさは2mm四方程度であるため,そのままでは,分解能が低下する.そこで,Geレンズにより刃先点を望遠拡大する機構を作成した.アルミニウム合金A5056を被削材とし,切り込み深さ2mm,送り速度0.25mm/rev,切削速度386m/minで温度場測定実験を行った結果,工具ー切りくず接触界面では,中央部より,切りくず末端部分の温度が高く,自由表面側も同じ傾向であること,切りくず断面の中央部分では,擦過面と自由表面の温度差は約400Kあることなど,切削FEMシミュレーションの境界条件となる温度分布を計測するシステムを確立することができた.研究計画では,本年度は,旋削試験により境界条件の獲得(切りくず形状,切削力,切削温度,切削データの解析により得られる各種物理量)である.切りくず擦過面の温度分布,切りくず自由表面側の温度分布を計測できており,また旋削試験では切削三分力も計測している.よって当初の目標どおり順調に進捗している.本研究は,旋削過程のせん断域の過酷な変形場(高ひずみ,高ひずみ速度,高温)をうまく利用することで,材料の流動応力特性を推定するシステムの構築を目的とする.昨年度までに,流動応力特性推定システムに必要不可欠なデータである,切りくず形状,切削力,工具ー切りくず接触界面の温度分布,切りくず自由表面の温度分布を汎用旋盤における旋削試験により得られることを確認した.ただし,切りくず自由表面の温度分布は市販の赤外線サーモグラフィーカメラで撮影することで得るが,旋削中の切りくず流出により赤外線カメラが破損しないように,刃先点とカメラレンズまでの距離を250mm程度は離す必要があり,このため倍率が低下し,解像度が落ちることになってしまった.そこで昨年は,市販のGeメニスカスレンズを刃先点とカメラレンズの間に入れることで,倍率を稼ごうとしたがあまり良い結果とはならなかった.そこで,今年度は,市販の赤外線サーモグラフィーカメラのレンズを取り去り,新規にレンズ計を設計し,自作のカメラレンズシステムを構築した.赤外線を透過する材質で作られた汎用の市販のレンズは少ない.凸レンズはゲルマニウム製のレンズが比較的多く出回っているが,凹レンズは選択肢が極めて少なく,セレン化亜鉛製のレンズのみ市販されているようである.そこで,汎用のレンズ設計ソフトを用いて,F=100mmのGe平凸レンズとF=-100mmのZnSe平凹レンズを組み合わせた2枚レンズ系の赤外線カメラレンズシステムを開発した.作成したレンズ系で,刃先点とカメラレンズまでの距離を265 mm離して,倍率1.31.4倍で刃先点の様子を撮影できるようになった.またシステム構築に必要なFEM切削シミュレーションについては,反復収束法のアルゴリズムを利用し,加工硬化係数のみを変更することで解を得るようプログラムを開発中である.旋削試験により,解析の境界条件となる,切りくず形状,切削力,工具ー切りくず接触界面の温度分布,切りくず自由表面の温度分布,を詳細に把握できるツールを隔離したため.またFEMシミュレーションについても,まだ確固たる結果はでていないがアルゴリズムの検討とプログラム作成は順調に進展しているため.本研究は,旋削を材料試験の一つととらえ,切削中のせん断域の変形場を推定することで,高ひずみ,高ひずみ速度,高温の変形場における材料の流動応力特性を把握するシステムの構築を提案するものである.

本システムでは,被削材材料の加工硬化係数を未知数として切削過程のFEM解析を行い,得られたFEM結果が,設定した境界条件(切りくず形状,切削力,切りくず表面の温度分布)を満足するよう,流線に沿った各位置の加工硬化係数の変化を見出すことで,せん断域の変形場を推定するものである.本システム構築で最も重要なことは設定する境界条件の把握である.特に,表面の温度の分布の把握が重要となる.旋削試験では,切削条件における切りくず形状,切削力は容易に把握できる.切りくず自由表面側の温度分布は,市販の赤外線サーモグラフィカメラに本研究で開発した望遠レンズシステムを組み合わせて計測することで把握できた.これは刃先点より250mm離れた箇所から,倍率1.2倍で刃先近傍を撮影できるものである.工具ー切りくず接触域の温度分布は,刃先交換チップの刃先近傍のすくい面上に7対の微細な銅ーニッケル熱電対を設置した温度センサ内蔵工具を用いるが,面全域の温度を同時には測定できない.そこで,高温接点部の位置を変えた複数のセンサ内蔵工具を作成し,得られたデータをニューラルネットワークで統合することで未計測の位置の温度を補間するシステムを構築することで切りくず裏面の温度分布を把握できた.アルミニウム合金の旋削試験を実施し,切削条件が切りくずの自由表面側と工具ー切りくず接触域側の温度分布の違いを把握できることが確認できた.得られた境界条件を数値解析に導入し,流線に沿った各位置の加工硬化係数の最良分布の探索については各種検討しているが,良好な結果が得られていない.このシステムの構築については今後も引き続き研究を行うこととする.切削過程のせん断域の過酷な変形場を推定することで,高ひずみ,高ひずみ速度,高温の変形場における材料の流動応力特性を把握するシステムを提案した.これは被削材材料の加工硬化係数を未知数として切削過程のFEM解析を行い,FEM結果が,設定した境界条件(切りくず形状,切削力,切りくず自由表面側の温度分布,工具ー切りくず接触域の温度分布)を満足するよう,流線に沿った加工硬化係数を見出すことで,せん断域の変形場を推定するものである.本研究では,提案する流動応力推定システム構築において最も重要な切りくずの工具との擦過面を含めた表面全域の温度分布を把握する手法を確立した.切りくず自由表面側の温度分布は,自作のGeレンズ系を追加した赤外線サーモグラフィカメラで動画撮影したが,さらに解像度を上げるために,望遠ズームレンズ系の設計を行う.今後は,切削FEMシミュレータでの解析に重点を行う.シミュレーションでは,定常切削過程を想定し,反復収束法による切削機構の解析手法をベースとするが,弾塑性解析ルーチンでは,加工硬化係数をパラメータとする.ある状況で得られた収束解と,実験で得られた境界条件が一致していない場合,せん断域の加工硬化係数を増減させる必要があるが,このアルゴリズムについて検討する.アルゴリズは,まずは,遺伝的アルゴリズムを採用するが,複数の解が存在する,あるいは,最適解が見つからないなど,うまくいかない場合には,せん断域や切りくずの応力や温度の分布形状,さらに工具ー切りくず接触界面の摩擦特性の感度も考慮したエキスパートシステムなど,別の最適化手法の検討,さらには試行錯誤による手動の探索も検討することにする.シミュレートされた結果と実験結果が一致した場合,流線に沿って変形場(温度,ひずみ,ひずみ速度)に対する流動応力のデータを収集することで,流動応力特性の素データを獲得できる.
環境配慮型ライフスタイルの世代間・文化間での伝播:日米独の比較

本研究では、他者と影響を及ぼしあいながら環境配慮型のライフスタイルが世代間、文化内で伝播していくプロセスを検討した。そのために、1)小学生の親子ペアデータによる環境配慮型ライフスタイルの伝播の経年調査と、2)他者の行動の影響を実験的に比較する国際比較調査を行った。その結果、親の行動の観察学習が子どもの行動に影響を及ぼすこと、他者の行動の影響は国や性別により異なることなどが示された。本研究では、環境規範の伝播に焦点を当て、どのように他者と影響を及ぼしあいながら環境配慮型のライフスタイルが伝播していくかを検討する。20年度前半(48月)には、カリフォルニア州立大学の研究者らに協力し、アメリカ、ドイツ、メキシコ、日本におけるインターネット調査を実施し、大学生の飲酒行動における記述的規範(他者の行動)の効果を検討した。その結果、日本において記述的規範の影響が確認された。この知見は、環境配慮行動の伝播にも応用できると考えられる。20年度後半(93月)には、昨年度調査を行った名古屋市の小学校2校に対し、再度調査の依頼を行った。昨年度と同じ小学校を対象にすることによって、1年前からの変化を継続的に検討する。12月までに質問紙を作成し、1月後半から2月にかけて調査を実施した。調査方法は小学4, 5年生を対象としてクラス内で担任の先生から質問紙を配布してもらい、児童がその質問紙を家庭に持ち帰り、保護者の1人に渡して、それぞれ独自に質問紙に回答し、小学校において回収を行った。質問紙の配布数は290組であり、回収数は約220組であった。調査の結果については簡単な集計をまず行い、協力していただいた各小学校に調査結果の速報として3月にフィードバックを行った。18, 19年度の科研費による成果も合わせたこれまでの研究成果については、社会心理学会、北海道大学COEワークショップ、群馬大学社会心理学小集会において発表を行った。本研究では、環境配慮行動の規定因の中でも、特に環境規範の伝播に焦点を当て、どのように他者と影響を及ぼし合いながら環境配慮型ライフスタイルが広がっていくかを検討した。本年度前半には、これまでに2年続けて行った小学生とその保護者を対象とした調査の結果の分析を行い、今後の調査の計画を検討した。また、小学校に対してはこれまでの調査結果のフィードバックを行い、再度継続調査への協力を依頼した。本年度後半には、20年度に調査を行った小学校2校を対象とし、3回目の調査を実施した。これで、3年間連続して親から子どもへの規範の伝播の様子と、親子の行動の変化を検討できることとなる。昨年度は4,5年生を対象としたため、21年度は5,6年生を対象とし、対象学年の全員に対して担任の先生から質問紙を配布してもらった。児童がその質問紙を家庭に持ち帰り、保護者と児童が独自に質問紙に回答し、小学校において回収を行った。質問紙の回収数は225組(有効回収率78%)であった。分析の結果、子どもの方が家族からの期待が環境配慮行動に強く影響を及ぼしており、特に親の行動の影響が強いことなどが明らかになった。これまでの研究成果については、チューリッヒで行われたドイツ環境心理学会、日本社会心理学会・グループ・ダイナミクス学会合同大会において発表を行った。また、アメリカなどの研究者と協力して行った、インターネットによる記述的規範(他者の行動の伝播)の調査について、分析結果を共同研究者らとメールで協議すると共に、ドイツ環境心理学会では、ドイツの研究者との打ち合わせを行った。今年度前半においては、アメリカ・カリフォルニア州立大学の研究者Wesley Schultzらと再び共同研究を行い、環境問題の認知に関する国際比較の調査を行った。調査では、地域の環境問題と地球規模の環境問題それぞれについての深刻度認知や、自己と自然との関係の認知を尋ね、文化によってどのような違いが見られるか、地球規模の環境問題の方が地域の環境問題より深刻に捉えられるというバイアスが見られるか検討した。日本、アメリカ、ドイツ以外に南米諸国においても質問紙調査を実施した。Wesley Schultzらと、記述的規範の影響の文化による違いを検討するために日本、アメリカ、ドイツ、メキシコでインターネットを用いた調査をこれまでに行ったが、今年度はその結果を詳細に分析すると共にメールで協議を行い、共同で論文を執筆・投稿した。記述的規範の影響は、どの国においても見られたが、性別によってその影響が異なることが明らかになった。名古屋市の小学校において3年間に渡って実施した小学生とその保護者を対象とした環境配慮の規範と行動スタイルの伝播の調査について、親子のデータをマッチさせた詳しい分析を行い、その結果を社会心理学会において発表した。特に、社会規範に着目し、子どもの方が大人よりも、親や社会からの規範の影響を受けやすいことを明らかにした。子どもは、親や社会全体の価値観に対して感受性が強く、それが自分自身の価値観となっていくと考えられる。イギリス・グリニッジ大学において子どもの環境配慮行動の研究を行っている研究者らと情報交換を行い、今後の研究としてどのような方向性が有意義であるか、また今後の共同研究の可能性について協議した。
イネ根圏窒素固定菌の窒素固定能と生態学的生存力の改良強化の研究

イネの根圏において空中窒素(N_2)を強力に固定しかつ生態学的に強い生存力を有する菌株を獲得することを目的として、イネ科植物の根圏から新たな窒素固定菌のスクリーニングをおこなった。イネとススキをふくむ多数の植物根および付着土壌から、無窒素培地に生育し、窒素固定酵素の活性としてアセチレン還元能を示す菌株を探索した結果、グラム陰性通性嫌気性の桿菌4株と、グラム陰性胞子形成運動性通性嫌気性の桿菌2株を取得した。API20システムによる同定の結果、前者のうち3株は既知の窒素固定菌Klebsiella pneumoniaeと一致し、残り1株(E1030株)はPanatoea sp.に属すると判定された。E1030株は強い窒素固定能をしめし、かつ広スペクトルの抗菌性物質の生産性を示したので、目的の菌株の候補となったが、菌株の保存中に抗菌性が失われた。後者の2株は、API20とAPI50による生理学的テストと16SrDNAの配列決定の結果、Paenibacillus sp.に属することが判明し、16SrDNA配列の相同性が既知菌株にたいして97%あるいは96%であったので新種と判断し、それぞれPaenibacillus fujiensis sp.nov.Br1、Paenibacillus abekawaensis sp.nov.MG1と命名してDDBJデータバンクに登録し、Br1株のAccession No.AB092351,Taxonomy ID:208550と、MG1株のAccession No.AB119649,Taxonomy ID:244733を得た。イネ根圏に生息するKlebsiellaoxytoca、Azospirillum lipoferumなどの窒素固定菌を遺伝子工学的に改良した菌株は、アンモニアなどの窒素源の存在下でも窒素固定能を発現するので、化学肥料を節約する効果が期待される。一方、野生型窒素固定菌は、窒素肥料の存在下では窒素固定酵素系の遺伝子の発現が抑制されるので、肥料と併用しても効果を期待できないが、窒素固定を行うためのエネルギーの無駄使いがないので、自然界における生存力が窒素固定能改良株よりも勝っている。このような理由により、窒素固定能の改良株をイネに接種しても、数週間程度で消滅することが問題となっている。本研究では、窒素固定能改良株にバクテリオシンの生産性を付与することにより、自然状態の土壌中で野生株よりも生存力の強い窒素固定能改良株を作成することを目的とし、本年度の研究では、Klebsiella属、Azospirillum属並びにSphingomonas属の野生型窒素固定菌に対する抗菌物質を生産する菌株を土壌分離菌からスクリーニングした。イネ科雑草の根圏土壌を主とする78の土壌サンプルから、184株の細菌を分離し、野生型の窒素固定菌Klebsiella属2株、Azospirillum属2株、Sphingomonas属1株に対する抗菌物質の生産性を調べた結果、グラム陰性菌5株とグラム陽性菌1株が、抗菌物質を生産していた。この内の1株グラム陰性菌N-7-Bは窒素固定能を持たず、その生産する抗菌物質はAzospirillumの生育を阻止した。この物質は低分子であり、その吸収スペクトルなどから既知の抗生物質ピオシアニンであると判断された。別の1株グラム陰性菌N-F-1は、窒素固定能とKlebsiellaに対する抗菌性を示し、その抗菌物質は硫安塩析によって沈殿するので、バクテリオシンの可能性がある。またグラム陰性菌N-A-1は、強い窒素固定能とKlebsiellaに対する抗菌性を示した。これらの抗菌物質についてさらに検討を続ける予定である。

イネ根圏に生息する窒素固定菌を遺伝子工学的に改良し、アンモニアなどの窒素源の存在下でも窒素固定能を発現させることは、試験管中では十分に達成されている。しかし、改良菌株は窒素固定にともなうエネルギーの負担が大きく、イネに接種しても数週間程度で消滅してしまうことが問題である。一方、野生型窒素固定菌は、窒素肥料の存在下では窒素固定酵素系の遺伝子の発現が抑制されているので、化学肥料と併用した場合に効果を期待できない。本研究では、窒素固定能が強く、かつバクテリオシンなど抗菌物質の生産能をもつ菌株をあらたにスクリーニングし、これを改良することによって、自然状態の土壌中で野生株よりも生存力の強い窒素固定能改良株を得ることを目的として研究を行っている。本年度の研究では、Klebsiella属、Azospirillum属、Sphingomonas属、herbaspirillum属など既知の窒素固定菌の5倍程度の窒素固定能をもつ菌株(Br-1)をイネの根圏から単離することに成功した。顕微鏡観察、生化学的テスト、16SrRNA遺伝子の塩基配列決定などによって、本菌株は、Paenibacillus属に属し、P.azotofixansともっとも近縁であることが判明した。しかし、52種の生化学的テスト中で5種の結果が異なり、16S rRNAのホモロジーが98パーセントであることから、本菌株はPaenibacillus属の新種であると結論した。また、イネ科の雑草の根圏から、窒素固定能と抗菌物質生産能を併せ持つ菌株(E-1030)を分離し、同定の結果にPantoea dispersaに属すると判定した。次年度の研究ではこれらの菌株を改良し、イネに接種して窒素肥料節約の実用的な効果を判定する予定である。イネ根圏の窒素固定菌を改良強化して化学窒素肥料を節約することを最終目標として、イネ科植物の根圏から新たに単離した128の菌株中から、窒素固定活性が非常に強い1菌株(Br1株)を得た。Br1株は、胞子を形成する桿菌であり、好気条件下で生育し、周鞭毛による運動性を示し、カタラーゼ陽性であることから、Bacillusグループに属すると判定した。さらに、16S rDNAの塩基配列を決定した結果、Br1株はPaenibacillus azotofixans、Paenibacillus borealis、Paenibacillus stelliferとそれぞれ97%の相同性を示した。また、API50とAPI20による生理学的なテストの結果、60項目のうち、P.azotofixansとは6項目、P.borealisとは10項目において異なる性状を示した。これらの結果から、Br1株はPaenibacillus属の新種であると結論し、Paenibacillus fujiensis sp. nov. Br1としてDNAデータバンク(DBBJ)に登録した。Br1株は、嫌気的条件で窒素源としてアンモニアがない時にのみ窒素固定能を発現した。窒素源としてアンモニアが存在する場合は窒素固定が抑制されるのに対して、窒素源として硝酸が存在する場合には窒素固定が抑制されず、むしろ強かった。また、一旦誘導された窒素固定活性は、アンモニアを添加しても阻害されなかった。P.fujiensis Br1株の窒素固定能(アセチレン還元活性)は、既知のKlebsiella、Azospirillum、Herbaspirillumに属する諸菌株に比べて715倍の強さを示した。
デジタルスパイクニューロンのパルス結合系:学習法の構築と応用の基礎固め

本研究では離散状態と連続遷移時刻を持つ非同期式セルオートマトンで動作が記述される神経細胞モデルを提案する.また,生物の神経細胞が持つ非線形ダイナミクスを自動的にFPGA上に獲得するための同モデルの学習則を提案する.さらに,同モデルの結合系を提案し,様々な時空間現象を理論と数値実験の両面から解析する.そして,それらの結果のニューラル人工器官への応用の可能性を探る.本研究では離散状態と連続遷移時刻を持つ非同期式セルオートマトンで動作が記述される神経細胞モデルを提案する.また,生物の神経細胞が持つ非線形ダイナミクスを自動的にFPGA上に獲得するための同モデルの学習則を提案する.さらに,同モデルの結合系を提案し,様々な時空間現象を理論と数値実験の両面から解析する.そして,それらの結果のニューラル人工器官への応用の可能性を探る.本研究では,離散状態力学系を用いた神経細胞モデルの構築その応用の基礎固めに取り組んでいる.今年度は以下の研究成果を得た.(1)離散状態神経細胞モデル(Digital Spiking Neuron, DSNと略す)を合成するための基礎として,連続状態神経細胞モデルの動力学とその信号符号化機能を考察した.例えば,複数の神経細胞モデルが並列化された系を考え,同系が任意の信号を複数のスパイク列の集合へと符号化できる事を理論と数値実験で示した.また同系をアナログ電子回路を用いて実装し,符号化機能をハードウェア実験で確認した.(2)上記(1)の結果を参考にして,様々な信号が入力される一般化されたDSNを新たに提案した.また,同DNSの解析手法として連続・離散ハイブリッド写像を導出し,同DSNが呈する様々な分岐現象を解析した.さらに,ハイブリッド写像を用いて,同DSNがスパイク列入力に対して呈する様々な応答特性を解析した.(3)未知パラメータを有する神経細胞モデルの応答特性を自動的に獲得する為のDSNの学習則を提案し,学習性能を解析した.また,よく知られているヒューリスティックなパラメータ最適化手法との比較を行った.そしてDSNと学習則をField Programmable Gate Array(FPGAと略す)に実装し,学習機能をハードウェァ実験で確認した.上記の研究成果は,動的再構成可能FPGA等のVLSI内に神経細胞結合系の動力学を再構成するための方法論構築の基礎となる.その様な神経回路VLSIは,インプラント後に自律的にパラメータの最適化を続ける事が可能な神経補綴技術の開発に貢献できる.これまでに電子回蹄実装を念頭に置いた人工神経細胞モデルに関する研究が盛んに行われて来ました,代表的なアプローチとしては「非線形微分方程式による神経細胞ダイナミクスのモデル化とそのアナログ非線形電子回路による実装」と「数値積分による神経細胞ダイナミクスのモデル化とそのデジタル数値演算プロセッサによる実装」が挙げられます.これらのアプローチに対して,近年我々の研究グループでは「非同期セルオートマトンによる神経細胞ダイナミクスのモデル化とその非同期順序回路による実装」という新しいアプローチを提案し,その有効性を示すための基礎研究を続けて来ました.本年度は,非同期セルオートマトンニューロンモデルに対する学習法の構築と,それらの応用の基礎固めを目的として以下のテーマに取り組みました.1.様々なスパイク刺激を入力できる一般化された非同期セルオートマトンニューロンモデルを新たに提案し,神経細胞モデルとしての応答特性を解析しました.2.未知の神経細胞の応答特性を近似する為の非同期セルオートマトンニューロンモデルの学習則を提案し,その近似性能を解析しました.また同ニューロンと学習則をField Programmable Gate Array上に実装し,実機実験にて学習機能を確認しました.3.非同期セルオートマトンニューロンモデルのパルス結合系を提案し,その疑似同期現象を理論と数値実験で解析しました.上記1.3.の結果は,非同期セルオートマトンニューロンモデルとそのパルス結合系の神経補綴(Neural Prosthesis)への応用の基礎となる重要な結果です.本研究では離散状態スパイクニューロン(Discrete-state Spikjng Neuron,以下DSNと略す)とその結合系に対する学習法の構築と,それらの応用に関する基礎固めを目的としました.23年度は特に以下の成果を得ました.(1)DSNの学習則の解析:未知のニューロンの非線形応答特性をDSNを用いて近似するためのDSNに対するパラメータ更新則(学習則)を構築しました.そして同学習則に関して,未知のニューロンから得られるデータとDSNから得られるデータの間の誤差(近似誤差)やDSNの学習に要する時間の特性(収束特性)などを解析しました.その結果,DSNとその学習則を用いた未知のニューロンの非線形応答特性の近似、手法は,計算コストが低いにも関わらず,他の計算コストが高い学習手法と遜色のない近似能力を実現すことが出来ることを示しました.(2)再構成可能ハードウェアを用いた実装:DSNとその学習則を再構成可能ハードウェアであるField Programmable Gate Array(以下FPGAと略す)に実装し,そのハードウェアとしての特性を解析しました.例えば,学習の収束速度,回路面積,消費電力等の関係を数値実験と実機実験の両面から解析しました,その結果,DSNとその学習則を用いた未知のニューロンの非線形応答特性の近似手法は,ニューロンのスタンダードな微分方程式モデルの数値積分とその学習則をハードウェとして実装する場合に比べて,ハードウェアコスト(FPGAのConfiguration Logic Blockの数)が6割程度低く抑えることが出来る事を示しました.(3)DSNのパルス結合系:22年度に提案したDSNのパルス結合系を一般化し,その時空間現象を解析しました.
癌特異的キラーT細胞を軸にした新規放射線・免疫併用癌治療モデルの開発

放射線治療後に腫瘍内、所属リンパ節に誘導され癌特異的キラーT細胞(癌特異的CTL)を体外へ取り出し、それを癌の治療に利用するという治療法の有効性を担癌マウスを用いて調べている。EG7(OVA遺伝子導入EL4、lymphoma)をC57BL/6マウスの右脚部に皮内移植(2×10^6/匹)する担癌マウスを実験に用いた。腫瘍サイズが約1cmになったところで腫瘍に向はて3Gy(腫瘍増殖抑制が可能な線量)のX線照射を行った。照射から57日目に所属リンパ節内・腫瘍内のCD8陽性細胞に対する癌特異的CTLの割合をフローサイトメトリーにて測定したところ、未照射ではそれぞれ0.4%、5.7%だったところ1.7%、10.5%と上昇していた。癌待異的CTLが増加していた所属リンパ節細胞を体外に取り出し、それをIL-2、IL-12、EG7(マイトマイシンC処理により不活化)存在下で培養したところ、全リンパ球に対する癌特異的CTLが割合が最初は0.6%であるのに対し、培養10日目では20.6%にもなった。全細胞数も培養前に比べて約5倍に増加した。増加した全リンパ球を別の担癌マウスに癌特異的CTLが1×10^7/匹になるように投与したところ5匹中4匹が完治した。また、リンパ節細胞を抗CD3抗体によって癌抗原非特異的に増殖・活性化させたリンパ球の投与を対照としたところ、腫瘍増殖抑制がほとんど見られなかった。この結果は担癌患者へ放射線照射後に生検した、あるい外科的に摘出した腫瘍組織や所属リンパ節から癌特異的CTLを分取し、体外で培養・増殖させそれらを担癌患者に戻すことで遠隔微小転移消失、あるいは原発巣の再発防止といった治療のモデルとなる可能性がある。
食べ方の指導による嗅神経再生効果の画像解析研究

金沢医科大学病院嗅覚外来で文書による参加同意を得られた嗅覚障害患者を対象として、鼻腔刺激法と口腔刺激法とに無作為に振り分け3ヶ月間の嗅覚リハビリテーションの臨床試験を行なった。両群間の自己訓練施行率に有意差は認めなかった。また両群ともに3ヶ月後の嗅覚域値の有意な改善は認めなかった。オルファクトシンチグラフィによる臨床試験で、嗅覚障害患者におけるタリウム-201嗅神経移行の低下を認めた。さらにマウスでインスリン成長因子-1経鼻的脳内輸送が嗅球除去により阻害されることを明らかとした。嗅神経画像解析方法の検討ではタリウム-201経鼻投与とSPECT-MRI融合画像によるオルファクトシンチグラフィの臨床試験を嗅覚障害者に対し施行した。鼻副鼻腔炎、感冒、外傷性など一般的原因の嗅覚障害に加えて原因不明の嗅覚障害者の多くでもタリウム-201嗅神経移行度の低下が明らかとなった。その結果嗅神経再生を促すリハビリテーション法の確立の重要性が改めて明らかとなった。リハビリテーション法の具体的方法について検討した結果次のように臨床試験を実施することに決定し倫理委員会の承認を得て試験を行った。二つの嗅覚刺激法(A法:鼻腔からの刺激法;B法:口腔からの刺激法)のいずれかを無作為に選択し、被験者に自宅で実施してもらった。一日3回の食事毎にA法では食物を鼻腔に近づけ良く香りを嗅いでから口に入れて、B法では食物を口に入れて10回程度咀嚼し食物の香りを良く味わいながら食事をする。両者の方法の選択は封筒法により無作為に選択しまた原因疾患ごとに2群均等な症例数になるよう割り振った。1ヶ月に1回程度来院してもらい言語聴覚士により咀嚼嚥下訓練を行なった。また毎日の食事の際に指導を受けたとおりの食事法を実践したか日誌に記録をつけてもらった。咀嚼嚥下訓練の際の食物の選択でカレー風味など嗅覚障害者でもにおいがわかりやすいトウモロコシスナック菓子の使用が効果的であることが明らかとなった。新たな嗅神経トレーサーの開発に関してマウス鼻腔へIGF-1を投与し大脳内のIGF-1シグナルへの影響を検討したところNa+-K+ ATPase阻害薬によりIGF-1の経鼻的脳内輸送が阻害され、軸索輸送阻害薬(コルヒチン)の影響は受けないことが明らかとなった。以上よりIGF-1は経鼻的脳内輸送において嗅神経内ではなく神経外側を通過するが、嗅神経の活動亢進に伴うIGF-1の血液脳関門通過の促進効果によることが示唆された。中等症以上の嗅覚障害患者に対して、二つの刺激法(A法:鼻腔からの刺激;B法:口腔からの刺激)の無作為比較試験を施行した。1日3回の食事の度にA法では食事を鼻腔に近づけて良くにおいを嗅いでから口に入れ、B法では食物を口に入れて少なくとも10回以上咀嚼し食物の香りを良く味わいながら食事するよう指導した。リハビリ開始時にトウモロコシスナックを用いて上記の刺激法の訓練を行なった。被験者には1ヶ月に1回程度来院してもらい指導を繰り返した。平成27年度までに両群合わせて42例を対象に試験を施行した。嗅覚検査はリハビリ開始後3ヶ月後、6ヶ月後に施行しその後の試験継続は希望者のみに行なった。これまで特に有害事象は認めなかった。リハビリの自己記録日誌で自己訓練の実施状況を確認した。リハビリ開始後の嗅覚機能はT&T平均認知域値においては目立った変化は認めなかったが、カード式嗅覚同定能力検査(オープンエッセンス)の正解数は増加傾向を認めた。その他、嗅神経の障害程度を画像評価する目的でタリウム-201経鼻投与とSPECT-CT、MRIを用いたオルファクトシンチグラフィを施行した。またMRIで嗅球体積を推定した。薬物治療の前後でオルファクトシンチを施行した症例では、嗅神経の改善を認めても嗅球体積の増加が乏しい傾向を認めた。マウスを用いた動物実験では新規嗅神経トレーサーとしてインスリンに注目し、蛍光標識したインスリンをマウスに経鼻投与したところ、投与30分後ですみやかに嗅球を含めた脳内にインスリンが移行することが明らかとなった。嗅覚障害リハビリテーションの無作為試験は順調に推移しているほか、嗅神経イメージングの開発も概ね予定通りに経過している。マウスの嗅覚行動記録装置を用いた嗅覚行動試験の実験は条件設定を検討中である。最終年度は前年度に引き続いて、中等症以上の嗅覚障害患者に対して、食べ方の指導による嗅覚刺激療法のうち二つの方法(A法:鼻腔からの刺激;B法:口腔からの刺激)の無作為比較試験を施行した。具体的には1日3回の食事の度にA法では食事を鼻腔に近づけて3回良くにおいを嗅いでから口に入れ、B法では食物を口に入れて少なくとも20回以上咀嚼し食物の香りを良く味わいながら食事するよう指導した。1ヶ月に1回、自己訓練状況を記録表により確認し、上記の食事法を指導した。嗅覚検査はリハビリ開始後に施行した。試験実施期間において特に有害事象は認めなかった。脱落例や記録表の記入が無かった症例を除外して検討した結果、3ヶ月間における平均自己施行率はA法が71%、B法が70%で有意差は認めなかった。

またリハビリ開始3ヶ月後の嗅覚機能はA法、B法ともに明らかな改善は認めなかった。以上よりどちらの指導法でも一定期間継続可能であり、有害事象も生じないことが明らかになった。3ヶ月以降の治療成績については今後の課題である。その他、嗅神経の障害程度を画像評価する目的でタリウム-201経鼻投与とSPECT-CT、MRIを用いたオルファクトシンチグラフィを施行した。これまでの研究結果と同様に嗅覚障害患者全般でタリウム-201の嗅球移行度の低下を認めた。動物実験では嗅上皮を傷害するメチマゾールを投与した嗅神経障害モデルマウスにおける、タリウム-201嗅球移行度の低下が明らかとなった。金沢医科大学病院嗅覚外来で文書による参加同意を得られた嗅覚障害患者を対象として、鼻腔刺激法と口腔刺激法とに無作為に振り分け3ヶ月間の嗅覚リハビリテーションの臨床試験を行なった。両群間の自己訓練施行率に有意差は認めなかった。また両群ともに3ヶ月後の嗅覚域値の有意な改善は認めなかった。オルファクトシンチグラフィによる臨床試験で、嗅覚障害患者におけるタリウム-201嗅神経移行の低下を認めた。さらにマウスでインスリン成長因子-1経鼻的脳内輸送が嗅球除去により阻害されることを明らかとした。嗅覚障害リハビリテーションの無作為試験を従来通り進め今年度内に統計解析をすすめる予定である。具体的にはA群とB群との間に治療効果や自己訓練の実施状況に有意差を認めるか明らかとする。また動物実験ではにおい刺激で嗅神経再生の促進を促す実験を開始し、嗅神経トレーサーと嗅覚行動試験でにおい刺激による嗅神経再生効果を評価する予定である。嗅覚障害嗅覚障害のリハビリテーションの具体的方法について検討を重ね、効果的な方法を考案し倫理委員会の承認を得て臨床試験を開始することができた。また従来から行なっているタリウムー201使用のオルファクトシンチグラフィの臨床試験も順調に推移し新たな研究結果を得る事ができた。さらにIGF-1が更なる嗅神経トレーサーへ発展の可能性が示唆される基礎実験の成果が得られた。食べ方の指導による嗅覚障害リハビリテーション法の無作為比較試験をさらに継続し、タリウム-201オルファクトシンチグラフィでリハビリテーションによる治療効果を検討してゆく予定である。またIGF-1に人体に使用可能な放射性アイソトープを付加して嗅神経の画像解析を行なう基礎実験も計画している。また動物の嗅覚行動を効率良くモニタリングするシステムの構築も目指している。
免疫研究バイオリソースとしてのT細胞クローンマウスの有用性

免疫学の進歩に貢献する新たな研究基盤構築を目指す。申請者らが作出した抗原特異的T細胞由来クローンマウスにより、人工的な発現調節を受けたT細胞受容体(TCR)を発現するトランスジェニック(Tg)マウスを用いた研究が孕む問題が解消でき、これまで得られなかった多くの特徴的なマウスを作出できる。それらとTCR-Tgマウスの間で、TCRを介する生体現象や免疫病態を比較し、既存の免疫学的理論の再検証や、未解明の免疫機構の解明、新たな病態モデル樹立を目指す。さらに、特異的T細胞の動態解析ならびにTCR-Tgマウスとの厳密な比較を行うための改変、TCRのヒト化等を行うことによってその有用性をさらに高める。
超音波発生による放射壊変効果の評価とその装置の開発

本研究においては放射壌変後の超音波測定という世界ではじめての研究をおこない、種々の成果を得た。東北金属製PZTを音波検出に用いて検出部を試作した。検出部は試料用セルと参照用セルの2個に対して用いた。本補助金によって購入した超音波測定用ウェ-ブメモリ-(エヌエフ社製)を試作検出器に接続し、試料セルからの音響と参照セルからの音響を同時に測定することによって真のシグナルとノイズとの区別を明確にした。この装置によりチタン金属膜(銅基板)にトリチウムを吸着させた試料を測定したところ、試料セル側からノイズとは明らかに区別される突発型の音響シグナルが現れることが分かった。これはトリチウム試料に特有のものでふつう150μs程度で終る。これには少なくとも3種の成分があり、本研究ではA型、B型、C型と名付けた。A型がもっとも多く見られ、200kHz前後、B型が400kHz以上、C型は100kHz前後の音響である。これらの成分は複合して現われることもあり、Bにひき続いてAが現われることや、Aにひき続いてCが現われることもある。また同じA型でも時間差をもって繰返し現われることもある。これらはBetteridgeらが以前に化学反応後の音響測定をおこなった例と比較することができる。われわれの得たA型シグナルはかれらのガス発生型に似ており、B型は亀裂発生型に似ている。実際にトリチウム壊変によって生成する^3Heが系外に放出されることを四重極質量分析計により確認した。したがってわれわれの実験でもっともよく見られるA型は^3He放出のさいの音響である可能性が強い。音響シグナルは発生源付近の状態を反映していることを推定させるパタ-ンとなっており、今後この方面の研究の発展に期待がもたれる。放射壊変のあとの超音波発生は從来研究されたことがなく、われわれのグループの研究が世界ではじめてのものである。本年度は超音波測定のため同種のPZT検出器を2個用意して測定することとし、東北金属株式会社製2MHz用のものを購入した。予備テストによれば本品は1MHzあるいは500kHz用のものより本実験系についての音響感度が若干よい。さらに本年度購入した超音波測定用ウェーブメモリー(エヌエフ社)によって予備検討を開始した。装置が正常に動作することをまず確認した。上記したPZTについてトリチウムを装置したものと、装着していないものと動作機能を比較したが、両者とも音響感度は良好で、ノイズも少ないことがわかった。トリチウムを使用した試料セルと、トリチウムを使用しない参照セルはつねに同時に併列しておく実験系を組上げた。測定データが放射壊変に関係のある真のシグナルか、ノイズかをできるだけ明瞭に区別するための回路を設計した。その要点は(1)試料用PZTからウェーブメモリーへの通路を2チャンネル(Channel1,2)とし、(2)参照用PZTからウェーブメモリへの通路も2チャンネル(同3,4)とした。ただし(3)試料側にシグナルが来たときにディスクリミネーターからChannel1,4へのゲートが開かれ、(4)参照側にシグナルが来たときに3,2へのゲートが開くようにできる。このようにして各チャンネルに入った音波パターンを比較し、真のシグナルと単なるノイズの区別をおこなった。室温でトリチウム試料を測定したときは、壊変後に突発型のシグナルが観測された。ただしその頻度は全体的に非常に少ない。低温で測定をおこなうと、頻度は増加することが見られた。今後なお音響パターンの解析をおこなう予定である。

平成元年度は前年度に購入、完成した装置を用いて、トリチウムの放射壊後に発生する音響を詳細に測定した。その結果いくつかの新しい事実がわかって来たのでここにまとめておく。まず音響シグナルのパタ-ン分類から作業を始めた。音響はいわゆる突発型のものが現われ150μsくらいの時間で減衰する。さらに詳しく見ると、少なくとも3種の成分、A型、B型、C型がある。A型は200kHz前後、B型は400kHz以上、C型は100kHz前後の音響で、A型がもっともしばしば現われる。これらの成分が複合した形で現われることもある。興味があるのはたとえばB型にひきつづきA型が現われるように見える場合がある。またA型が時間差をもっていくつか繰返しているように見えることがある。さらにA型に続いてC型が現われる場合がある。このような結果はまったく新しいものであるが、以前にBetteridgeらが化学反応後の音波発生を測定した例と比較することができる。かれらは音響パタ-ンにはガス発生型と亀裂発生型があることを述べている。われわれの測定結果は放射壊変についてであり、用いている物質もまったく違うが、A型はかれらのガス発生型に似ており、またB型は亀裂発生型に似ている。そこで実際にトリチウム壊変によって生成する^3Heが系外に放出されているかどうかを確める実験をおこなった。トチリウム線源を密閉系におき、そこにたまったガスを四重極質量分析計に導くと、明らかに質量3のピ-クが認められ、その出現電圧は24eV前後となって、^3Heの放出が確認された。以上のことからA型は^3Heの放出のさいに発生する音響であることが有力になった。音響シグナルは発生源付近の状態を反映していると思われ、今後いろいろの方面に新しい問題提起をしている。
光感受性ニトリル保護基の開発とそれを用いた光応答性NOドナーフロキサンの創製

光は照射後も後に残らないため有用な外部刺激であり、光により駆動する有機反応は様々なところで応用することができる。今回我々は、光を照射すると医薬品や機能性分子に多く見られるニトリル基が発現するような分子デザインを開発することができた。この技術を応用すると、例えば光照射を行わない状態では何も起こらないが、光照射を行った場合には薬効が発現する医薬品を開発することができる。本研究では「光感受性ニトリル保護基の開発とそれを用いた光応答性NOドナーフロキサンの創製」を具体的な目的と設定した。NOは様々な生理活性を有し病理解明や創薬の標的分子として注目されているが、局所への定量的供給が困難であるため、NOを用いた生理学実験が制約を受けているのが実情である。申請者は、フロキサンを母骨格とし、光照射に応答してNOを定量的に放出する分子を創製する。光応答性をフロキサンに付与するため、これまでに全く報告例のない光感受性ニトリル保護基の開発から始めることとした。光感受性ニトリル保護基として、オキシムを設定した。オキシムは酸化状態がニトリルと同じであるため、レドックスニュートラルにニトリルへと変換できるものと考えた。光によるスイッチングを可能にするため、オキシムの安息香酸エステルを基質とした。合成はアルデヒドから二段階で行った。オキシムの安息香酸エステルに対して光照射を行ったが何も変化しなかった。これは、ニトリル生成においては基質の光励起状態が必要なわけではなく、一電子移動反応が進行する必要があるのではないかと予想を立てた。そこで、光励起されると酸化還元力が変化し、大きな還元力を有する励起種が生成する光増感剤を検討することとした。よく知られた光増感を数種類試したところ、いくつかの光増感剤を用いた場合に期待した通りニトリルが生成することが分かり、光感受性ニトリル保護基のプロトタイプとなる分子デザインを確立することができた。初年度で光誘起電子移動を利用したニトリルの生成を行う予定でいた。計画通り、基質の合成と反応検討を行うことができた。その結果、ニトリルの生成を確認することができたため、現在までの進捗状況としてはおおむね順調に進展していると言える。一酸化窒素(NO)は、重要な生体内シグナル伝達物質であり、血管拡張作用、血小板凝集抑制作用、神経細胞間長期増強現象の逆行性シグナルなど生体内で様々な機能を有する。そのため、医薬品のターゲット分子として活発に研究がなされている。しかしながら、常温で気体、難水溶性のNOを、場所・時間・量を制御して供給する手法の開発はいまだ発展途上である。フロキサン(1,2,5-oxadiazole 2-oxide)は、1990年代に、生理条件下にて一酸化窒素を放出することが報告された。安定で扱いやすく、さらに薬剤耐性が起こらないことから、新しい分子骨格を有する一酸化窒素ドナーとして研究が活発化している。申請者らは近年、強いNO放出能を有する3-シアノフロキサン(R1 = CN、以下3CFと略す)の短段階効率的合成法を確立した。また、得られた3CFのニトリル基を、より電子吸引性の乏しい官能基へ変換することで、NO放出能を大きく抑制できることを明らかにした。そこで申請者は、3CFのニトリル基を光感受性保護基で保護した3CF前駆体を創製すれば、光照射によって場所・時間・量を制御して3CFを生成させることができると考えた。今回カルバゾール由来の光増感剤を用いるとオキシムエーテルからシアノ基が発現することを見出した。基質の適用範囲は広く、アルキルアルデヒド由来のオキシムエーテルだけでなく、芳香族アルデヒド由来のオキシムエーテルも反応に適用できることを示した。さらに、官能基共存性の調査を行ったところ、一般的に存在するアルコールやアミン、アルデヒドなど広い範囲にわたり共存性が高いことが分かった。これにより初めてニトリル基をターゲットとする光感受性保護基の創製に成功した。現在のところ、いくつかの課題がなお残されている。一つは、光増感剤を使用する必要がある点である。今後細胞や生体内での応用を考えているため、非常に薄い濃度で用いる必要が生じる。光増感剤を別途基質に対して添加する必要があることは、反応速度が薄い濃度下では著しく低下する恐れがある。二つ目の課題としては水溶性の問題である。上記の理由から基質や増感剤には一定以上の水溶性が要求される。そこで今後は、光増感剤と基質が一体化した分子を創製する予定である。また、その分子に水溶性の置換基を導入することで、溶解度の向上を試みることとする。光増感剤と基質を一体にすることができれば、反応速度が濃度の影響を受けることはない。また、応用を考えた場合に、操作もより簡便になるため、集中的に検討を行うこととする。その後、開発したニトリル保護基を実際にNOドナーに付与する検討を行う。

これにより、光照射を行うことでNOが放出される分子を創製し、生理学実験などにも利用できる分子を目指す。有機光化学消耗品代が予想より少なかったため。少額の消耗品代に充当する。