hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
非侵襲性出生前診断法の開発を目指した妊娠初期母体血中の胎児細胞分離技術の確立

したがって、それに代わる新しい非侵襲性検査法の開発は極めて重要である。妊娠10週前後の妊婦の母体血中におよそ血球10万個に1個程度の割合で胎児細胞が存在するとされている。そこで、本研究の目的はその胎児細胞の特性を利用した効率的な方法で胎児細胞を濃縮し、最終的に胎児細胞を分離する方法の確立を目指すことである。この方法が樹立されると、母体血から非侵襲的に得られた胎児細胞によって、重篤な遺伝性疾患等の出生前診断が可能になり、その意義は極めて大きい。母体血球と異なる胎児細胞の特性とは、胎児有核赤血球nRBCと他の血球細胞間の比重差、有核でヘモグロビンを多量に含む特徴的な細胞形態、胎児細胞膜特異抗原、胎児nRBCに特異なmRNAの発現などである。本年度から妊娠初期の女性から母体血の提供を受けて実験に着手した。提供を受けた血液から定法によりまず赤血球を分離除去した。次に厳密な密度勾配液を用いた遠沈分離法による胎児細胞の濃縮、胎児細胞膜特異抗体を塗布した特殊な培養チャンバーによる胎児細胞の吸着、FACSを用いた分離法などで胎児細胞の分離を目指した。そして、これらの方法で得た細胞をスライドガラス上に伸展し、胎児nRBCに特異なmRNA probeなどを用いたin situ hybridization(FISH)法で胎児細胞の特定を図った。また、これらの分離細胞で、特定遺伝子および染色体のDNAをprobeにしたFISH法で胎児細胞の遺伝子・染色体情報を取得して診断法の確立を目指して取り組み、本年度は一定の成果を得ることができた。【研究目的】妊娠初期の女性の末梢血に低頻度で含まれる胎児有核赤血球nRBCなどをその細胞特性を利用して母体血中から分離する方法を開発することである。【研究方法】研究協力に同意した妊娠9週齢以降の女性から末梢血の提供を受けて本研究に用いた。密度勾配液を用いた遠心分離法で胎児細胞を濃縮し、母体血球との比重の違い、有核でヘモグロビンを多量に含む特徴的な細胞形態、胎児有核赤血球に特異的なmRNA、及び胎児細胞膜特異抗原などの細胞特性を利用して分離を行った。【研究結果と考察】本研究の協力に同意した妊娠9週以降の女性から、それぞれ10ml程度の末梢血の提供を受けた。末梢血から赤血球を分離除去し、密度勾配液を用いた遠心分離を繰り返して胎児細胞を濃縮した。遠心分離等で得た胎児細胞リッチな細胞液を、胎児細胞膜特異抗体を内壁に塗布した培養チャンバーに入れて胎児細胞を選択的に壁面に付着させて回収を図る方法を検討した。既知の抗体のほかに胎児細胞膜に特異性を有するナノ抗体について情報収集したが、これまで有用な情報を入手できなかった。また、蛍光色素標識した胎児細胞特異抗体を胎児細胞に付着させ、FACSによる分離法を検討した。これらの方法で濃縮、分離した細胞のスライド標本を作製し、形態学的特性により胎児nRBC細胞を特定し、各種のプローブ(各染色体識別プローブ、サブテロメアプローブ(TEL)、及び動原体近傍領域標識プローブ(CEP)など)を用いたin situ hybridizationで胎児細胞の染色体構成を確認した。我が国でも非侵襲的出生前検査(NIPT)が漸く開始されたが、この検査はリスクを確率で示す検査であり、確定診断にはならない。本研究の目的は妊婦の母体血中に含まれる胎児由来の細胞を直接分離して「確定診断」に近づくことである。
種子からの花芽分化抑制シグナルの解明

花の数と種子生産量には正の相関があり、花の数を増大させることで作物の種子生産性の増大に貢献する。本研究は未解明である、種子形成の開始を茎頂分裂組織へ伝え、花原基分化を抑制する仕組みに着目した。変異体スクリーニングにより、側枝の花の数が増大している変異体を選抜し、その原因遺伝子を同定した。同定された3つの原因遺伝子は葉緑体分解に関わるものであり、これら遺伝子の欠損は野生株よりも葉の老化が遅れる表現型を示した。この結果から、花の数と個体の老化が密接に関係することを示す新規な知見を得た。本研究の目的は植物における花の数を制御する機構の解明である。花は茎頂分裂組織で分化した花原基から作られるため、花原基の数により花の数が決定される。通常、野生株では主茎の種子形成が開始されると、側枝の茎頂分裂組織における花原基分化が抑制される。花の数と種子生産量には正の相関があり、花の数を増大させることは、種子生産量の増大につながり、作物の収量増加に貢献する。本研究では全くの未解明である、種子形成の開始を茎頂分裂組織へ伝え、花原基分化を抑制するシグナル(花芽分化抑制シグナル)伝達系の解明を目指す。平成25年度は、シロイヌナズナにおいて主茎の種子形成が開始されても、側枝の茎頂分裂組織における花原基分化が抑制されない、つまり側枝の花の数が増大している変異株をスクリーニングした。これまでに約5000の変異株を観察し、側枝の花の数が増大している変異株を1つ選抜した。この変異株は側枝の成長が旺盛で、野生株よりも多くの花をつけ、結果としてより多くの種子を生産する結果を得ている。また、この変異株の原因遺伝子を同定するために必要な戻し交配、および遺伝子マッピングが行われ、原因遺伝子である遺伝子Aを明らかにした。選抜した変異株では、遺伝子AのmRNAはほとんど検出されないことより、この変異株は、遺伝子A機能欠損株であると考えられる。今後の研究によって遺伝子Aの機能を明らかにし、花芽分化抑制シグナルの解明を目指す。平成26年度は、前年度に同定された、側枝の花の数をコントロールする遺伝子Aの機能解析を行った。遺伝子Aはタンパク質分解酵素をコードしており、この酵素は葉緑体に局在することを明らかにした。また、この酵素の欠損株は植物体の老化が抑制され、野生株よりも長い期間、緑色を維持することが明らかになった。この欠損株では、野生株に比べて老化が抑制されるため、より長期間光合成を行うことができると示唆される。そのため、より多量の光合成産物を側枝の分裂組織に供給することができ、野生株よりも多くの花をつけることができると考えられる。今後の研究によって、遺伝子Aが制御する花芽分化抑制シグナルの分子機構に迫る。本研究は未解明である、種子形成の開始を茎頂分裂組織へ伝え、花原基分化を抑制するシグナル(花芽分化抑制シグナル)伝達系の解明を目指す。平成27年度は、植物の花の数を決定する遺伝子Aによってコントロールされている花芽分化抑制シグナルの解析を行った。遺伝子Aは葉緑体に局在するタンパク質分解酵素であり、この酵素の欠損により老化遅延が起こり、野生株よりもより長期間、光合成を維持することを明らかにした。さらに、遺伝子発現レベルにおいても遺伝子Aの欠損による老化遅延および、より長期間の光合成活性維持を確認した。この結果は花芽の数を決定する機構の初発が老化に関わるシグナルであることを示唆しており、花芽分化抑制シグナル伝達系は植物個体の老化と深く関係していることを示す興味深い結果を得た。平成26年度に、花芽分化抑制シグナルが破綻した変異体の成長解析および遺伝子発現解析を行っていたところ、培養室に害虫およびカビが発生した。そのため、解析を中断し、培養室の燻蒸を行う必要があったため。植物分子生物学平成26年度における計画遅延の原因となった、害虫およびカビの駆除は完了している。

速やかに研究を再開し、計画していた実験を遂行する。平成25年度の計画では、花芽分化抑制シグナルが欠損した変異体を選抜し、その原因遺伝子を同定することが目標であった。本年度は、花芽分化抑制シグナルが欠損していると考えられる、側枝の花の数が増大している変異株を選抜した。さらに、遺伝子マッピングにより、この変異体の原因遺伝子Aも明らかになった。このことから、本研究は当初の計画どおり、順調に進展している。平成26年度に、花芽分化抑制シグナルが破綻した変異体の成長解析および遺伝子発現解析を行っていたところ、培養室に害虫およびカビが発生した。そのため、解析を中断し、培養室の燻蒸を行う必要があった。これより、変異体の解析、学会発表、論文作成のスケジュールが遅延したため、未使用額が生じた。これまで、順調に進展している。そのため、今後の研究も当初の予定に従い、推進する。変異体の解析、学会発表および論文作成を平成27年度に行うこととし、未使用額はその経費に充てることとしたい。研究の進捗状況および機器の準備状況から、平成25年度に予定していたトランスクリプトーム解析の予備実験の開始時期を遅らせて、26年度から開始するため。26年度に集中的に実験を行うことで、より精度の高い解析データを得ることができると判断した。次年度使用額は平成25年度に予定していたトランスクリプトーム解析の予備実験を、平成26年度に行うために必要な、物品費として使用する予定である。
二環性[3.1.0]骨格の不斉構築とその応用

いくつかの手法により、光学活性な二環性[3.1.0]型化合物の高立体選択的合成を開発することができた。また、本研究の途上においてパラジウム触媒によるフェニルベンゾエート誘導体の分子内ピアリールカップリング反応についての重要な知見を得、それらを用いて天然物合成等への応用に展開できた。以下にその概要を述べる。1.対称ケトン類に対するエナンチオ選択的脱プロトン化反応(1)σ-対称[3.1.0]化合物に対する反応ノルボルナジエンからMeinwald転位を経由して基質となる対称ケトンを調製した。これに対して種々の光学活性アミド塩基を作用させ、エナンチオ選択的な脱プロトン化反応について詳細に検討を加えた。本反応は極めて良好に進行し、高立体選択的に二環性[3.1.0]化合物を得ることができた。(2)σ-対称エポキシケトンに対する反応対称エポキシケトンに対してキラルリチウムアミドを用いると、エナンチオ選択的な脱プロトン化が進行、さらにエポキシドの開環を伴う渡環的炭素-炭素結合形成反応を起こすことが見出された。これをさらに酸化的に結合を開裂させ、光学活性な二環性[3.1.0]化合物へと誘導した。2.パン酵母を用いる速度論的光学分割に関する検討安価でかつ操作性が容易なパン酵母を利用して、ラセミ体の二環性[3.1.0]化合物に対する速度論的光学分割法を試みた。種々の反応条件および、後処理方法を最適化した結果、極めて良好な反応性・立体選択性で分割が実現できた。光学純度ならびに絶対配置は文献値と比較し決定した。二環性[3.1.0]骨格を有する分子の不斉構築法についてはいくつかの手法が考えられるが、最も実用性に富むものとしては、シクロペンテノンに対するシクロプロパン化反応が優れている。とりわけ硫黄イリドを用いた三員環形成は、ラセミ合成ですでに確立された手法である。この反応をエナンチオ選択的に行なうための最初の段階として、光学活性リガンドの設計を検討した。ここでは、軸不斉を有するビフェニル誘導体の合成を目的として、次の二つの研究を行なった。1.銅試薬によるベンジルベンゾエートの分子内ビアリールカップリング反応芳香環上が高度に官能基化されたベンジルベンゾエート類に対して銅の存在下、加熱を行なうことにより、分子内ビアリールカップリング反応が進行することを期待した。しかしながら、分子間反応が優先して起こり、目的物はごく低収率で生じるに過ぎないことがわかった。(Heterocycles,2003,67,521-528.)2.パラジウム試薬系によるフェニルベンゾエートの分子内ビアリールカップリング反応高度に酸素官能基化された芳香環部位を有するフェニルベンゾエート類に対して、パラジウム-ホスフィン試薬系を用いて反応性を検討した。その結果、分子内ビアリールカップリング反応が速やかに進行し、ジベンゾピラノン誘導体の合成に成功した。3.ジベンゾピラノン誘導体の還元的不斉開環ジベンゾピラノン誘導体に対して、ボラン-光学活性オキサアザボロリジンを作用させ、ラクトン環の不斉開環反応を検討した。低温条件下反応を行なえば、光学活性ビフェニル誘導体が高い光学収率で生じることを見いだした。また、得られたビフェニル誘導体の絶対配置を決定した。(Tetrahedron Lett.,2004,45,2327-2329.)二環性[3.1.0]骨格は、MSG0008に代表される選択的mGluR2アゴニストの基本骨格であり、統合失調症改善薬開発のための鍵となる分子骨格である。特に本系化合物を光学活性体として入手するための効率的な方法を開発することは重要な課題である。

これまで、キラルカラムを用いたHPLCによりラセミ化合物の光学分割が行なわれてきた。しかしこの方法を大量スケールに適用することは困難であるため、簡便な不斉合成法の開発が求められている。まず、ethyl bromoacetateとdimethyl sulfideから誘導される硫黄イリドを用いて、cyclopentenoneとのシクロプロパン化を行ない、ラセミ体のethyl 2-oxobicyclo[3.1.0]hexane-6-carboxylateを合成した。これに対してパン酵母を作用させると、速度論的光学分割が円滑に進行し、還元体の二級アルコールと未変化体のケトンがそれぞれ高い光学収率で得られた。光学収率の算出は、アルコール体を対応するベンゾエートに誘導し、HPLCを用いて行なった。さらにそれらの旋光度の符号から両者の絶対配置を決定し、本還元反応が一般的なPrelog則に従っていることを明らかとした。以上、パン酵母による速度論的光学分割法を用いて、二環性[3.1.0]骨格の不斉構築を達成した。今後、これを用いて更なる応用へと展開する予定である。光学活性の二環性[3.1.0]ヘキサン骨格はしばしば重要な生物活性を有する化合物中に見られる部分構造である。さらには、この骨格の特性を利用して、より複雑な構造を持つ有機化合物への化学変換も可能である。本年度の研究では、この骨格のより簡便な不斉合成法を提案し、昨年度までの結果とあわせてさらに幅広い応用を目指すためにいくつかの検討を加えた。また、本方法をより幅広い基質へと適用しる目的で、二環性[n.1.0]型化合物の不斉合成への展開を試みた。1)ラセミ体[n.1.0]型化合物の合成とその速度論的光学分割エチルブロモアセテートから誘導される硫黄イリドを用いて、種々の共役エノンとのシクロプロパン化反応を行なった。得られたラセミ体[n.1.0]システムに対する速度論的光学分割を検討した。ここでは、前年度の検討により良好な結果を与えたパン酵母を用いてその一般性について種々検討したが、良好な結果を与えることはなかった。これはパン酵母の基質特性が本系化合物には適さなかったものと考えられる。2)[n.1.0]型化合物のエナンチオ選択的合成光学活性二環性[n.1.0]型化合物はそれ自身がしばしば重要な化合物中に見られる骨格ではあるが、それだけではなく、多様な化学変換が可能な合成中間体としても有用である。プロリン誘導体をキラル触媒として用い、環状共役エノンに対する硫黄イリド誘導体の付加反応を行なえば、エナンチオ選択的シクロプロパン化反応が可能であると考えた。種々検討の結果、一部の基室については光学活性体の[n.1.0]型化合物が得られた。しかしながら、その光学純度は充分ではなく、今後のさらなる検討が必要であると考えられる。
リン酸化プロテオミクスを用いた進行大腸癌分子標的薬効果予測バイオマーカー探索

適切な個別化医療の実践のためには、分子標的薬の効果を予測し、患者の選別を行う必要がある。薬効は、標的分子が関与する増殖シグナルの活性化状態に依存するが、その活性化の指標として、細胞内タンパク質リン酸化が重要である。本研究では、網羅的なタンパク質リン酸化定量法の確立およびその手法を用いた大腸癌分子標的薬の薬効予測バイオマーカーの同定を目的とした。従来のリン酸化プロテオミクス法に改良を加えた結果、世界最高レベルのリン酸化ペプチドの同定に成功した。また、抗EGFR抗体薬に対する感受性にEGFRシグナルパスウェイの下流に存在するPDPK1キナーゼの活性化が関与することが示唆された。近年の大腸癌術後化学療法の進歩、特に抗EGFR抗体薬の登場により生存期間が著明に伸びた。しかし分子標的薬の効果は個人差があり、また高価であるため、事前に効果予測による投与対象の選別が必須である。現在の効果予測はKRAS遺伝子の変異の有無で判断しているが、それだけでは不十分である。そこで、本研究では、薬剤感受性の異なる大腸癌細胞株および大腸癌手術組織を用いて、最先端のリン酸化プロテオミクス技術による網羅的なリン酸化タンパク質の解析を行い、新規薬剤効果予測バイオマーカーの同定および定量法の確立を目的とした。平成25年度は、より多くの細胞内リン酸化タンパク質・リン酸化ペプチドの定量を目指して、網羅的側面とターゲットを絞った側面からの技術的改良を加えた。網羅的リン酸化タンパク質・ペプチド解析法の改良としては、これまでリン酸化ペプチドの濃縮に用いてきたIMACだけでなく、抗チロシン抗体を用いた免疫沈降法を併用することにより、従来の2倍以上のチロシンリン酸化ペプチドを同定することに成功した。また、IMAC濃縮後のHPLC分画法の改良により、1回の実験で30,000リン酸化ペプチドの定量に成功した。ターゲットリン酸化プロテオミクスにおいては、細胞内シグナル伝達に関わる主要なキナーゼ・基質のリン酸化ペプチド287種類について、SRM/MRM法を用いた定量法の基礎検討を行った。現在までに20種類のリン酸化ペプチドの定量に成功した。また、EGFR下流のパスウェイ上のキナーゼに絞ってウエスタンブロットを行ったところ、リン酸化PDPK1は抗EGFR抗体薬耐性株に比して、感受性株で発現が増大していることが示された。このことから、PDPK1キナーゼの活性化が抗EGFR抗体薬の感受性に関与していることが示唆された。平成24年度は、iTRAQ法とリン酸化ペプチド濃縮法を組み合わせた網羅的リン酸化タンパク質比較定量法を確立した。また、安定同位体標識内部標準ペプチド添加することで、特定のタンパク質リン酸化修飾レベルをSRM/MRM法で定量する技術開発を行った。特に、細胞内主要シグナルを担うキナーゼに着目し、その活性化レベルのSRM/MRM測定のための検討を行った。400種類弱の活性型リコンビナントキナーゼをLC-MS/MSで解析し、そのMS/MSデータからSRM測定パラメータリストを作成した。大腸癌培養細胞株24種類を抗EGFR抗体薬感受性株、耐性株に分類し、それら細胞株についてキナーゼ活性化状態のプロファイリングを進めた。抗EGFR抗体薬耐性株ではMekやAktの活性化が検出でき、これらの結果はキナーゼ活性化レベル測定が抗EGFR抗体薬の効果予測に有用であることを示唆した。また、細胞株の解析から得られた薬効予測マーカーの検証に用いる大腸癌切除標本の収集を行える耐性を整えた。平成24年度は主にリン酸化プロテオミクス解析の技術開発に取り組んだ。網羅的解析法はすでに確立し、ターゲットを絞ったリン酸化タンパク質のSRM/MRM法も測定系はほぼ完成した。大腸癌培養細胞株の解析に関しては、24種類の抗EGFR抗体薬感受性試験を終え、感受性株と耐性株に分類できた。また、薬剤感受性に関与することが知られている既知のシグナルの変動も予想どおりの結果が得られた。この系を用いることで、今年度中に薬効予測バイオマーカーの同定が達成できると期待される。昨年度検討した抗EGFR抗体薬感受性株群と耐性株群に対して、薬剤処理前後で網羅的リン酸化タンパク質の解析を行い、変動するリン酸化タンパク質を比較する。その解析で得られた結果から、薬剤感受性に関与するリン酸化シグナルについて検討する。

同時に、細胞内主要シグナルを担うキナーゼのリン酸化活性化レベルのSRM/MRM測定系を確立させ、網羅的解析の結果と合わせて、薬効予測バイオマーカーを絞り込む。細胞株の解析で得られたバイオマーカー候補リン酸化タンパク質の検証を大腸癌組織を用いて行う。抗EGFR抗体薬を投与された大腸癌症例のうち、薬剤感受性群と耐性群を予測できるリン酸化タンパク質を抽出する。さらに、それらのバイオマーカー候補タンパク質が薬剤耐性に関与しているかどうか調べる。そのために、大腸癌薬剤感受性株、耐性株のタンパク質発現量を増減させた際に薬剤感受性が変化するか検討する。細胞培養に必要な、培養液や血清、リン酸化プロテオミクス解析に必要な試薬、SRM/MRM解析に必要な安定同位体標識ペプチド等の消耗品の購入に充てる予定。
ミニブタ神経上皮型幹細胞を用いた脳内移植ドナーの確立に関する基礎的研究

ラット中脳胞部神経板組織又はneurosphereを神経移植ドナーとした正常成熟脳への移植実験では、移植片は長期に渡り生着した。移植片内には多数のHu陽性である神経細胞および少数のGFAP陽性細胞を認めた。特にneurosphereを移植ドナーとした移植実験では、移植2週後の移植片内には多数のHu陽性細胞及び少数のpestin陽性細胞が確認されたが、GFAP陽性細胞は認めなかった。以上より、移植成体脳環境下においても神経上皮型幹細胞の神経細胞への旺盛な分化能が維持される事が示唆された。ブタ中脳胞部神経管組織をドナーとしたパーキンソン病モデルラットへの移植実験では、周術期1週間の免疫抑制剤投与のみで、移植片は長期に渡り生着した。移植片内にはブタ特異的NF陽性細胞を多数認め、その中にはTH陽性細胞も存在していた。また、電子顕微鏡による観察では、ブタとラット異種神経細胞間に双方向性のシナプス結合が形成され、ドナー由来細胞突起には髄鞘形成も認められた。ラット中脳胞部神経板またはミニブタ中脳胞部神経管由来神経上皮型幹細胞を神経移植ドナーとしたパーキンソン病モデルラットに対する移植実験では、移植後長期に渡り移植片は生着し、アンフェタミン誘発回転運動による行動学的検討にてホストラットの機能回復を認めた。ラット中脳胞部神経板由来神経上皮型幹細胞による同種移植では経時的な機能回復を認めたが、ミニブタ中脳胞部神経管由来神経上皮型幹細胞による異種移植では移植4週後まで変化なく、その後劇的に回転数が減少し症状改善を認めた。組織学的検討では、両群とも移植後長期の移植片生着を認め、特にミニブタ神経上皮型幹細胞による異種移植では、周術期1週間の免疫抑制剤投与のみで可能であった。ま免疫組織化学的検討では、両群とも移植後早期よりドナー由来TA陽性細胞を認めた。以上より、神経上皮型幹細胞が種を超えたfunctional effectを持ち、神経症状を改善しうる事が示唆された。これより、神経上皮型幹細胞の損傷神経回路網再建を目的とした脳内移植ドナーとしての可能性が強く示唆された。胎齢10.5日ウィスターラット中脳胞部神経板は、免疫組織学的にnestin陽性かつFGF receptor陽性細胞から構成されていた。この中脳胞部神経板の分化条件での組織培養では、全ての細胞が免疫組織学的に神経細胞へ分化したが、basic FGF(10ng/ml)添加では神経突起の伸展は抑制され、周囲にneurosphereの形成を認めた。さらに、中脳胞部神経板の細胞培養では、basic FGF(10ng/ml)添加においてのみneurosphereの形成を認めた。このbasic FGF反応性neurosphereはnestin陽性細胞からなり、継代培養可能であった。また、このbFGF添加増殖1週以内のneurosphereは、分化条件で培養すると、ほぼ全ての細胞が神経細胞へと分化した。他の増殖因子または栄養因子(FGF、EGF、NGF、BDNF、NT-3、PDGF、CNTF、LIF、IL-1β、TNFα)には神経幹細胞の増殖や特定の分化を誘導する作用はみられなかった。

bFGFにより1週間増殖培養したラット中脳胞部神経板由来神経幹細胞の移植ドナーとしての有用性を評価するため、ドナー細胞をBrdUラベルし、正常ラット線条体へ移植した。移植後、BrdU陽性細胞のホスト脳内における生着を認め、この移植片内にnestin、Hu、GFAP陽性細胞を確認した。特にHuの発現が著明であった。このことから中脳胞部神経板由来bFGF反応性neurosphereは移植環境下においても神経細胞への分化傾向が強いことが分かった。ヒトへの臨床応用を考慮して、治療用動物として注目されているミニブタを用いて、より有効で実用的な神経幹細胞ドナーの分離を試みた。妊娠17-18日ミニブタにおいて初期胚の摘出は可能であった。胎齢18日ミニブタ初期胚の冠状断切片を作成し、免疫組織化学的検討および電子題微鏡によるその形態の確認を行った。抗human Nestin抗体、抗TuJl抗体による二重染色では、nestin陽性、一部にTuJl陽性の偽多層性を示す未分化細胞が確認できた。抗Musashi-1抗体染色では、すべての細胞がMusashi 1陽性であった。電子顕微鏡では、N/C比の高い、細胞内器官の発達のない未分化細胞が確認できた。Fibroblast growthfactor-2(FGF-2)反応性neurosphereは、nestin陽性細胞からなり、これは継代培養が可能であった。この初代neurosphereを分化条件にて培養すると、組織培養と同様にほぼ全ての細胞がNF陽性である神経細胞に分化し、GFAP陽性細胞は認められなかった。以上より、ラット中脳胞部神経板細胞は、FGF-2添加培養1週までは神経細胞への旺盛な分化傾向を維持することが示唆された。Neurochemical markerに関する検討では、中脳胞部神経板組織培養と同様に、多数のglutamate陽性細胞および少数のTH陽性細胞とGABA陽性細胞を認めた。ラット中脳胞部神経板組織またはneurosphereを神経移植ドナーとした正常成熟脳への移植実験では、移植片は長期に渡り生着した。移植片内には多数のHu陽性である神経細胞および少数のGFAP陽性細胞を認め、移植脳環境でも神経上皮型幹細胞の神経細胞への旺盛な分化能が維持されていた。また、パーキンソン病モデルラットに対する移植実験でも、移植後長期に渡り移植片は生着し、行動学的検討にてホストラットの機能回復を認めた。ブタ中脳胞部神経管組織をドナーとしたパーキンソン病モデルラットへの移植実験では、周術期一週間の免疫抑制剤投与のみで、移植片は長期に渡り生着した。移植片内にはブタ特異的NF陽性細胞を多数認め、その中にはTH陽性細胞も存在していた。また、電子顕微鏡による観察では、ブタとラット異種神経細胞間に双方向性のシナプス結合が形成され、ドナー由来細胞突起には髄鞘形成も認められた。ラット中脳胞部神経板由来神経上皮型幹細胞またはfibroblast growthfactor(FGF)-2反応性neurosphereを神経移植ドナーとした正常成熟脳への移植実験では、移植片は長期に渡り生着した。そして、移植片内には多数のHu陽性である神経細胞を認めていた。特にFGF-2反応性neurosphereを神経移植ドナーとして用いた移植実験では、移植2週後の移植片内には多数のHu陽性細胞および少数のnestin陽性細胞が確認されたが、glial fibrially acidic protein(GFAP)
一次元プロセッサアレイによる超音波エコー動画像の即時並列処理

1, 256個の8ビットプロセッサエメント(PE)、PE間を貫く2組の奇遇シフトレジスタ、各PE毎に1KBの内部メモリ、16MBの外部共有メモリを装備する一次元プロセッサアレイを、ホストPCであるCIバスPC(パソコン)に組み込んで、奇遇シフトレジスタを用いて画像データの横一行中256画素を一度に処理できる動画像の即時並列処理システムを構築した。2,構築した動画像即時並列処理システムを用いて、新生児頭部超音波エコー動画像中の動脈拍動抽出をリアルタイム実行できる最適アルゴリズムを考案した。考案したアルゴリズムを用いて、新生児頭部エコー動画像(512×480画素、8ビット/画素)からの動脈拍動抽出と描画をビデオレート(33ms/フレーム)で実行できることを示すと共に、本システムを医療現場に設置されている超音波診断装置に容易に接続して臨床現場での拍動のその場診断が可能であることを示した。3,以上の研究成果を超音波エレクトロニクスの基礎と応用に関するシンポジウムに発表したところ、その有用性が大いに認められた。新生児頭部超音波画像以外の他の医用動画像にも適用可能な本システムは他方面での利用が大いに期待された。
ホスト幹細胞集積による新規組織再生療法の開発

本申請研究は,創傷治癒過程における,再生の場に宿主間葉系幹細胞を集積させることによって組織を再生させる新規再生療法を開発することを目的とする.マウス大腿骨骨欠損モデルにおいて,宿主間葉系幹細胞の集積が,骨欠損作製後1日で確認され,cDNAマイクロアレイ法による網羅的解析では,幹細胞集積因子として炎症性サイトカインのひとつであるTNFaが検出された.TNFaが間葉系幹細胞の機能に与える影響を検討したところ,TNFaによって,幹細胞の増殖が抑制されるとともに,走化性が向上し,さらにはFASLの発現が促進されることによって免疫調節能が促進されていることが明らかとなった.本研究の目的は1ホストの間葉系幹細胞を再生局所に集積させる新しい方法の開発に加え,2間葉系幹細胞が本来持つ,この免疫調節機能や炎症再生連関の起始点となるキーファクターを分子生物学的に解明する.その結果,遠隔や局所に存在するホストの幹細胞を集め,免疫反応を調節することにより,適度な炎症環境を誘導し,ひいては組織再生を強力に促進する新しい再生療法の基盤を構築する事である.これを遂行する為以下の研究を行った.(1)マウス大腿骨皮質骨に直径1ミリの骨欠損を作製し,骨欠損作製後1,3,5,7日で宿主幹細胞の動員をフローサイトメトリー解析により検討した.また,骨欠損を作製しない個体をコントロールとし,各群と比較検討した.その結果,骨欠損作製後1日目において,間葉系幹細胞マーカーであるCD146, CD90, Sca-1陽性,Lineage陰性の細胞数(3x10^6個骨髄細胞当たり,2355±141個)がコントロール(1505±80個)と比べ有意に増加し,3日(1658±85個),5日(1450±73個),7日後(1461±115個)ではコントロール群と同レベルまで減少していることが明らかとなった.(2)骨欠損作製後,前述のタイムポイントにて屠殺,骨髄を回収し抗体アレイ法にてサイトカインの発現量を比較した所,骨欠損作製1日後において,炎症性サイトカインであるTNFaの増加を確認した.同時に,抗炎症作用のあるTIMP-1やMCP-1の発現も上昇している事が明らかとなった.これらの結果は,宿主幹細胞の炎症・創傷治癒部位への集積・動員を示す強力な証拠であり,それには各種サイトカインが関与している可能性が示唆された.本研究は創傷治癒過程において,内在性の宿主間葉系幹細胞がどのような動態および機能を示すのかを把握し,組織再生の現場に幹細胞を集積させる事によって再生を促進する新しい治療法を開発する事を目的としている.そのため,1組織損傷部位に間葉系幹細胞を集積させる因子群を分子生物学的手法を用いて網羅的に検索し,2幹細胞集積因子を添加した組織再生療法を様々な骨欠損モデルで検討する.さらに,3幹細胞の免疫調節作用をコントロールする因子を上記集積因子と併用するコンビネーション療法の組織再生効果を検討する.上記目的を達成する為に,我々はこれまでにマウス大腿骨穿孔モデルを用い、創傷治癒過程における宿主間葉系幹細胞の集積タイミングを検討した結果,損傷後1日目で最も多くの幹細胞の集積が観察され,損傷後,3,5日目では集積幹細胞数の減少を認めた.同時に,創傷治癒部位での炎症性サイトカインであるTNFaが間葉系幹細胞の免疫調節作用発揮に重要とされるFasLの発現を促進させる事を明らかにした.実際に幹細胞集積部位では宿主T細胞のアポトーシス上昇が検出され、集積幹細胞による、免疫調節がなされた可能性が示唆された.今後は幹細胞集積因子群の網羅的検索を経て、集積因子添加療法との併用を検討する予定である.これまでに創傷治癒過程における宿主間葉系幹細胞の集積時期を検討して来た.集積時期は組織損傷後3日目でピークを迎えるという報告がなされていたが、本研究においては組織損傷後1日目で細胞の集積が組織学的解析で判明した.フローサイトメトリー解析においても幹細胞マーカー陽性細胞数が組織損傷後1日で増加し,骨髄損傷モデルにおいては,周囲骨髄に内在性幹細胞が豊富であり,集積までの時間が短縮されたと考察した.そのため,集積部位での炎症性サイトカインの幹細胞に対する影響の検討が先行した結果となった.現在,組織損傷後1日目,3日目,損傷直後で発現遺伝子の網羅的解析を実行中であり,組織損傷後1日目で上昇し,3日目で低下している因子を幹細胞集積因子群候補として幹細胞への影響を検討して行く.本研究は,創傷治癒過程における内在性宿主間葉系幹細胞がどのような動態および機能を示すのかを解明し,組織再生の場に間葉系幹細胞を集積させることによって,局所での免疫寛容獲得および組織再生を促進する新規組織再生療法の開発を目的としている.この目的を達成する為に,1マウス大腿骨損傷モデルの治癒過程における宿主幹細胞の動態・集積を検討した.その結果,骨欠損作製1日後をピークに,幹細胞陽性マーカーのひとつであるCD146陽性細胞数が,受傷部位の周囲に多く観察され,受傷後3日目には減少していることが明らかとなった.2続いて,創傷治癒過程における宿主幹細胞の集積動態に伴い,どのような因子が幹細胞集積を誘導しているのかを検討した.cDNA

マイクロアレイによる網羅的解析の結果,High Mobility Group Box 1(HMGB1),Tumor necrosis factor alpha (TNF-a), interleukin -11 (IL-11)等の候補因子群が,幹細胞の集積に伴い上昇していることが明らかとなった.3候補因子群のうち,炎症性サイトカインのひとつであるTNF-aの骨髄由来間葉系幹細胞への影響を詳細に検討した結果,細胞増殖を抑制し,細胞走加性を促進させ,免疫調節能を上昇させることが明らかとなった.今後は他の因子も併せて,これらの因子が幹細胞の分化能にどのような影響を与えるのかを検討して行くとともに,組織再生にどのように関連するのかを,骨欠損モデルに対する組織再生効果を比較検討して行くことで明らかにする予定である.本申請研究は,創傷治癒過程における,再生の場に宿主間葉系幹細胞を集積させることによって組織を再生させる新規再生療法を開発することを目的とする.マウス大腿骨骨欠損モデルにおいて,宿主間葉系幹細胞の集積が,骨欠損作製後1日で確認され,cDNAマイクロアレイ法による網羅的解析では,幹細胞集積因子として炎症性サイトカインのひとつであるTNFaが検出された.TNFaが間葉系幹細胞の機能に与える影響を検討したところ,TNFaによって,幹細胞の増殖が抑制されるとともに,走化性が向上し,さらにはFASLの発現が促進されることによって免疫調節能が促進されていることが明らかとなった.マウス下顎骨欠損モデルの作製は順調であり,骨欠損の前後もしくは経時的に骨欠損部位を含む再生組織の回収が可能であった.しかしながら回収後のタンパク,RNA,集積幹細胞が解析するには十分な獲得量に至らず,何度か繰り返したが,マウス下顎骨欠損モデルよりも骨髄間葉系幹細胞が豊富で集積宿主幹細胞の解析が行いやすい大腿骨骨欠損モデルでの解析を行うように修正したため予定よりも遅れが生じている.現在cDNAマイクロアレイによる網羅的遺伝子検索を実施している.幹細胞集積時期に特異的に発現が上昇している遺伝子群を幹細胞集積因子候補群として同定し,それらの間葉系幹細胞への影響を細胞増殖,走化性,多分化能,免疫調節能の観点から検討する.また,幹細胞集積候補遺伝子を添加する事で骨再生が促進されるかどうかを様々な骨欠損モデルについて検討する.さらには,炎症性サイトカインのTNFaのFasL発現促進効果との組み合わせを検討し,より組織再生を促進するような再生療法の開発を目指す.28年度が最終年度であるため、記入しない。歯科補綴学前述の研究目的のうち,宿主幹細胞集積因子を同定し,新規組織再生療法を開発する為,骨欠損作製後,宿主幹細胞の集積が見られた1日目において屠殺,骨髄を回収し,マイクロアレイ解析,サイトカインアレイ解析等の網羅的解析を骨欠損作製前と比較する事で幹細胞集積因子の候補を検討する.また,得られた候補因子の間葉系幹細胞への影響をin vitroにて検討し幹細胞機能の評価を多分化能,細胞増殖,免疫抑制作用の観点から解析する.一方で,集積した間葉系幹細胞を回収し,骨欠損作製前の骨髄由来幹細胞と比較して同様の手法を用いて集積幹細胞の性質を比較検討する事で集積した幹細胞に発現する因子を同定し,組織再生の際の発現遺伝子群を検討する.28年度が最終年度であるため、記入しない。28年度が最終年度であるため、記入しない。
抗肥満を目指した脂肪細胞分化・脂肪滴形成の分子機構解析

食の欧米化が進む現代社会において、肥満人口は増加の一途を辿っている。肥満は生活習慣病惹起の危険因子であるため、その予防は重要な課題であると考えられる。本年度、研究代表者は脂肪酸合成に重要な役割を果たす転写因子SREBP-1に着目し、脂肪細胞分化過程におけるその活性化(プロセシング)機構の解明を試みた。SREBP-1は3T3-L1細胞、MEFの脂肪細胞分化過程においてプロセシングを受け、その標的遺伝子のmRNA発現最も一様に増加することから、脂肪細胞分化過程においてSREBP-1は活性化することが明らかとなった。3T3-L1細胞にPPARγのアゴニストを処理、もしくはPPARγを強制発現することで脂肪滴の形成を促進させると、SREBP-1の活性化はさらに増強されたことから、SREBP-1は脂肪滴の形成に伴い活性化を受けることが示唆された。そこで、次に脂肪滴の形成に重要な役割を果たすperilipinのノックアウト(Plin-/-)マウスを用いた解析を行った。Plin-/-マウスよりMEFを調製し、脂肪細胞へと分化させると、野生型に比べ脂肪滴の形成が抑制され、PPARγの活性化は両者の間で大きな変化は認められなかったものの、SREBP-1の不活性化が認められた。このSREBP-1の不活性化は、perilipinを強制発現することで脂肪滴の形成を促進させると解除されたことから、脂肪滴の形成そのものがSREBP-1の活性化に寄与することが判明した。以上の結果より、脂肪細胞分化に伴い脂肪滴が形成されるとSREBP-1の活性化が引き起こされ、活性化したSREBP-1は脂肪酸合成酵素の発現を誘導することで脂肪滴の形成をさらに促進する、すなわち、脂肪滴の形成が一旦起こると、それは正のフィードバック的にさらに促進されるという機構が存在することが明らかとなった。高齢化や食の欧米化が進む現代社会において、肥満人口は増加の一途を辿っている。肥満は糖尿病や高血圧、脂質異常症などの生活習慣病を引き起こしやすく、さらにこれらの疾患が一個人に集積すると冠動脈疾患や脳卒中による死亡率が飛躍的に高まることが統計学的に知られている。そのため、肥満の予防・治療は非常に重要な課題であり、肥満と直結する脂肪細胞文化のメカニズムを解明することは、生活習慣病の根本治療を目指した創薬などの用研に結びつく可能性が高く、急務となっている。本年度、研究代表者はTRB3と呼ばれる偽キナーゼが脂肪細胞分化を抑制することを見出し、それは脂肪細胞分化のマスターレギュレーターであるPPARγと直接タンパク質感で結合することでその転写因子としての活性を抑制するためであることを明らかにした。TRB3は脂肪細胞分化の進行に伴い発現が誘導されることから、脂肪細胞分化が進め過ぎないようにするブレーキ役として作用しているのではないかと考えられるが、同時にエネルギー過多の肥満状態では、通常レベルのTRB3によるブレーキでは分化の進行を十分に抑えきれないのではないかとも推察される。TRB3は脂肪細胞分化のマスターレギュレーターに作用することから、分化のバランスを根底から制御する鍵分子であると言え、特異的なTRB3の研究成果は米国の脂質研究雑誌「Journal of Lipid Research」に掲載された(J.Lipid.Res.2008.49:880-892)。高齢化や食の欧米化が進む現代社会において、生活習慣病の頂点に位置する肥満症が今後増加することは確実となっており、生活習慣病の予防のため、肥満に直結する脂肪細胞分化の分子機構およびその制御機構の解明は非常に重要な課題である。本年度、研究代表者は、脂肪細胞分化過程におけるapoC-IIIの発現誘導調節機構をテーマとして、その解析を試みた。昨年度までの研究により、apoC-IIIのmRNA発現量は、3T3-L1細胞の脂肪細胞分化過程において分化前の発現量に比べ約800倍近く誘導され、さらにその誘導はRXR(retinoid X receptor)アゴニスト処理によって増強されることが明らかになっていた。本年度では、マウス胚性幹細胞および初代前駆脂肪細胞の脂肪細胞分化過程においてもapoC-IIIのmRNA発現量が誘導され、その発現量はRXRアゴニスト処理によってさらに増加することを明らかにした。続いて、マウスapoC-IIIプロモーターを組み込んだレポーターベクターを作製し、脂肪細胞分化に関わると報告のある様々な転写因子を3T3-L1細胞に強制発現させ、apoC-IIIプロモーターが応答するかどうかを検討した。その結果、apoC-IIIプロモーターの活性はRXRαの強制発現およびそのリガンドを処理したときのみ応答することが判明した。さらにRXRαのタンパク質発現量は脂肪細胞分化に伴い亢進することが示され、ChIPアッセイの結果から、3T3-L1脂肪細胞においてapoC-IIIプロモーターには内因性のRXRαが結合することが明らかとなった。一方、3T3-L1細胞においてapoC-IIIを強制発現、もしくは内因性の発現を抑制しても脂肪細胞分化や細胞内に蓄積される中性脂質量に変化は認められず、apoC-IIIが脂肪細胞でどのような機能を果たしているかは今後の研究課題である。

SREBP-1は3T3-L1細胞、MEFの脂肪細胞分化過程においてプロセシングを受け、その標的遺伝子のmRNA発現最も一様に増加することから、脂肪細胞分化過程においてSREBP-1は活性化することが明らかとなった。3T3-L1細胞にPPARγのアゴニストを処理、もしくはPPARγを強制発現することで脂肪滴の形成を促進させると、SREBP-1の活性化はさらに増強されたことから、SREBP-1は脂肪滴の形成に伴い活性化を受けることが示唆された。そこで、次に脂肪滴の形成に重要な役割を果たすperilipinのノックアウト(Plin-/-)マウスを用いた解析を行った。Plin-/-マウスよりMEFを調製し、脂肪細胞へと分化させると、野生型に比べ脂肪滴の形成が抑制され、PPARγの活性化は両者の間で大きな変化は認められなかったものの、SREBP-1の不活性化が認められた。このSREBP-1の不活性化は、perilipinを強制発現することで脂肪滴の形成を促進させると解除されたことから、脂肪滴の形成そのものがSREBP-1の活性化に寄与することが判明した。以上の結果より、脂肪細胞分化に伴い脂肪滴が形成されるとSREBP-1の活性化が引き起こされ、活性化したSREBP-1は脂肪酸合成酵素の発現を誘導することで脂肪滴の形成をさらに促進する、すなわち、脂肪滴の形成が一旦起こると、それは正のフィードバック的にさらに促進されるという機構が存在することが明らかとなった。
超高圧水素環境下で使用される金属材料の簡易疲労試験方法の確立と疲労強度特性の解明

水素利用に関する研究開発が世界各国で活発化する中で,安全な水素利用社会実現のために本研究の重要性は益々高まっている.本研究では,水素陰極チャージを施した試験片を用いて,燃料電池システムへの使用が想定される各種ステンレス鋼の疲労強度に及ぼす水素の影響の解明を試みた.1.陰極チャージ条件を様々に変化させた場合の試験片中の水素濃度,表面からの水素の侵入深さおよび水素の存在状態を昇温脱離分析(TDA)によって明らかにした.燃料電池システムへ向けへの使用が想定されているFCC構造を有するオーステナイト系ステンレス鋼(SUS304,SUS316およびSUS316L)ではBCC構造のフェライト系のステンレス鋼に比べて水素の拡散が桁違いに小さく,水素チャージを24週間施しても水素は材料表面から100μm200μm程度しか拡散しなかった.水素チャージを施した材料では,高圧水素ガス中に曝露した場合と同様,トラップエネルギーが小さい拡散性水素が増加した.このことから,高圧水素ガスに曝される実機部材の水素固溶状態は陰極チャージによって再現できているといえる.2.陰極チャージにより水素チャージを施した試験片の疲労試験を行った.SUS304およびSUS316に水素チャージを施すと,き裂進展寿命が約半分に低下した.一方,SUS316LやSUS405(フェライト系)では水素チャージによるき裂進展の加速は見られなかった.き裂先端における塑性誘起マルテンサイト変態量を破面のX線回折により測定したところ,SUS304>SUS316>SUS316Lの順で大きいことから,オーステナイト系ステンレス鋼の水素によるき裂進展の加速には,き裂先端で生じるマルテンサイト変態が関与していると考えられる.3.水素マイクロプリント法(HMT)により,水素チャージを施したSUS304の疲労試験中の水素の放出挙動を観察した.疲労き裂先端近傍では,周辺に比べて多くの水素の放出が観察された.このことから,き裂先端では水素の集積が起こっていると考えられる.また,繰返し塑性変形によりすべり帯が生じると,転位線に沿って水素の侵入・放出が容易になることも明らかになった.水素利用に関する研究開発が世界各国で活発化する中で,安全な水素利用社会実現のために本研究の重要性は益々高まっている.本研究では,水素陰極チャージを施した試験片を用いて,燃料電池システムへの使用が想定される各種ステンレス鋼の疲労強度に及ぼす水素の影響の解明を試みた.得られた成果・知見を以下に示す.1.陰極チャージの各パラメータ(チャージ液の種類・濃度・温度,電流密度,チャージ時間)を変化させた場合の試験片中の水素濃度,表面からの水素の侵入深さおよび水素の存在状態を昇温脱離分析(TDA)によって調べた.燃料電池システムへ向けへの使用が想定されているFCC構造を有するオーステナイト系ステンレス鋼(SUS304,SUS316およびSUS316L)ではBCC構造のフェライト系のステンレス鋼に比べて水素の拡散が桁違いに小さく,水素チャージを24週間施しても水素は材料表面から100μm200μm程度しか拡散しないことがわかった.水素チャージを施した材料では,高圧水素ガス中に曝露した場合と同様,トラップエネルギーが小さい拡散性水素が増加することから,陰極チャージによって高圧水素ガスに曝される実機部材の水素固溶状態を再現できているといえる.燃料電池システムの10年を超える長期間安全利用を保証するためのデータの取得には,さらに長期間水素チャージを施した場合のデータを取得する必要がある.2.得られたチャージ条件により水素チャージを施した試験片を用いて疲労試験を行った.SUS304およびSUS316に水素チャージを施すと,き裂進展寿命が約半分に低下した.一方,SUS316LやSUS405(フェライト系)では水素チャージによるき裂進展の加速は見られなかった.き裂先端における塑性誘起マルテンサイト変態量を破面のX線回折により測定したところ,SUS304>SUS316>SUS316Lの順で大きいことがわかった.マルテンサイト組織を有する材料の疲労強度は水素により大きく低下することが報告されていることから,オーステナイト系ステンレス鋼の水素によるき裂進展の加速には,き裂先端で生じるマルテンサイト変態が大きく関っているといえる.水素利用に関する研究開発が世界各国で活発化する中で,安全な水素利用社会実現のために本研究の重要性は益々高まっている.本研究では,水素陰極チャージを施した試験片を用いて,燃料電池システムへの使用が想定される各種ステンレス鋼の疲労強度に及ぼす水素の影響の解明を試みた.1.陰極チャージ条件を様々に変化させた場合の試験片中の水素濃度,表面からの水素の侵入深さおよび水素の存在状態を昇温脱離分析(TDA)によって明らかにした.燃料電池システムへ向けへの使用が想定されているFCC構造を有するオーステナイト系ステンレス鋼(SUS304,SUS316およびSUS316L)ではBCC構造のフェライト系のステンレス鋼に比べて水素の拡散が桁違いに小さく,水素チャージを24週間施しても水素は材料表面から100μm200μm程度しか拡散しなかった.水素チャージを施した材料では,高圧水素ガス中に曝露した場合と同様,トラップエネルギーが小さい拡散性水素が増加した.このことから,高圧水素ガスに曝される実機部材の水素固溶状態は陰極チャージによって再現できているといえる.2.陰極チャージにより水素チャージを施した試験片の疲労試験を行った.SUS304およびSUS316に水素チャージを施すと,き裂進展寿命が約半分に低下した.一方,SUS316LやSUS405(フェライト系)では水素チャージによるき裂進展の加速は見られなかった.

き裂先端における塑性誘起マルテンサイト変態量を破面のX線回折により測定したところ,SUS304>SUS316>SUS316Lの順で大きいことから,オーステナイト系ステンレス鋼の水素によるき裂進展の加速には,き裂先端で生じるマルテンサイト変態が関与していると考えられる.3.水素マイクロプリント法(HMT)により,水素チャージを施したSUS304の疲労試験中の水素の放出挙動を観察した.疲労き裂先端近傍では,周辺に比べて多くの水素の放出が観察された.このことから,き裂先端では水素の集積が起こっていると考えられる.また,繰返し塑性変形によりすべり帯が生じると,転位線に沿って水素の侵入・放出が容易になることも明らかになった.
超集積植物を用いたカドミウム汚染土壌の浄化

1.日本の気候環境における超集積植物によるファイトレメディエーションの浄化能評価本年度は、超集積植物を用いたポット試験を日本の気候条件下の野外で実施した。供試植物としては極めてCd集積能が高いとして知られるアブラナ科グンバイナズナ属(Thlaspi caerulescens)を、供試土壌としては日本の代表的な土壌である沖積土のCdで5ppmに汚染されたものを用い、京都市において12ヶ月間栽培試験を行った。その結果、汚染土壌に植栽したT.cのバイオマスは2.24t/haに達し、そのカドミウム濃度は最大で66.1ppmとなった。従って制御された環境における室内試験の結果と比べると吸収効率はかなり劣るものの、1年間で約90g/haのカドミウムを吸収できた。時期別では春季(36月)のカドミウム吸収量が、年間総吸収量の80%強に相当した。従って、日本の気候条件下において、T.cを用いた効果的なファイトレメディエーションを行うには、春季に集中して行うのが適当であると考えられた。以上の結果、日本の気候条件下においてCd汚染土壌に対してもThlaspi caerulescensを用いたファイトレメディエーションは現実的な対策になり得ることが実証された。2.根圏・根域土壌におけるCd可給度評価と吸収機構の推定また、栽培後の土壌のカドミウム濃度を測定したところ、全カドミウム濃度は植物による吸収に応じてバルク>根域>根圏土壌の順となった。一方、可給態カドミウム濃度はバルク<根域<根圏土壌の順になり、pHはバルク>根域>根圏土壌の順となった。従って、T.cは根の有機酸放出などにより、根近傍のpHを下げてカドミウムの可給度を上昇させることで、カドミウムの集積を効率良く行っているものと考えられた。1.各種重金属汚染土壌における超集積植物によるファイトレメディエーションの浄化能評価本年度は、超集積植物を用いたポット試験を実施した。供試植物としては極めてCd集積能が高いとして知られるアブラナ科グンバイナズナ属(Thlaspi caerulescens)を、供試土壌としては日本の代表的な土壌である沖積土と黒ボク土のCdで5ppmに汚染されたものをそれぞれ用い、4ヶ月間栽培試験を行った。その結果、地上部バイオマスは、沖積土で5.7ton/ha相当量と黒ボク土1.5ton/haの3倍程度となった。地上部Cd濃度は土壌によらず100ppmを上回り、極めて高濃度に集積しうることが確認された。さらにCd吸収量は、沖積土で766gCd/ha、黒ボク土で222gCd/ha相当量となり、土壌中のCdの28%、13%が除去された。従って、日本のCd汚染土壌に対してもThlaspi caerulescnesを用いたファイトレメディエーションは現実的な対策になり得ることが実証された。2.根圏・根域土壌におけるCd可給度ならびに植物Cd吸収量に及ぼす各種土壌管理の影響評価に基づく効率的なファイトレメディエーションのための合理的土壌管理技術の確立従来得られた知見とも合わせて結果を解析した結果、土壌pHが低く(5以上)、土性が粗く、可給態Cd量が多いほど、浄化効率は高いことが明らかとなった。さらに、栽培方法として2ヶ月を2回行った処理と4ヶ月を1回行った処理を比較したところ、2ヶ月を2回行った処理の浄化効率の方が50%程度高く、根域を拡げる意味でも植替え頻度を高めることが浄化効率の向上につながることも示された。次年度は以上の結果を踏まえ、現場の圃場環境の下でのグンバイナズナの浄化効率をいくつかの条件で明らかにする予定である。