hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
向社会行動の生後発達に関わる神経機構

ヒト以外の霊長類のなかでも協調的な社会性を示すコモンマーモセットの行動特性とその神経機構を明らかにするため、同種他者との関わり方を定量化する行動評価法を開発した。また、陽電子断層撮影装置(PET)による脳機能イメージング技術を用いて、セロトニン神経系と社会行動との関連、安静時脳ネットワークとの関連を明らかにした。向社会行動の生後発達に関わる神経機構を明らかにするため、ヒト以外の霊長類のなかでも協調性が高い社会性をもつコモンマーモセットを用いた実験的研究を行った。本年度は以下の項目を実施した。1.向社会行動の定量的評価方法の確立向社会行動評価のためのオペラント課題は、トレーを引いても自らは報酬を得られないがレシピエント側では報酬をえられる実験装置内で、レシピエント側分室にケージメートがいる状況(WP:with partner)といない状況(WOP:without partner)でテストを行う。WP条件ではWOP条件よりも有意に反応回数が多かった。WP条件とWOP条件における反応回数の差異を、各個体の向社会行動の指標とした。2.非侵襲的イメージング技術(陽電子断層撮影:PET)による脳機能イメージング動物用microPETスキャナーを用いて無麻酔マーモセットPET実験を行った(成獣、オス8頭)。セロトニントランスポーター結合実験には、特異的PETトレーサーとして[(11)C]DASBを用いた。動態解析モデル(MRTM2)を用いてbindingpotential(BP)画像を算出したのち、向社会行動の個体差との関連について画像統計解析を行った。向社会行動の高発現と関連するセロトニントランスポーター結合部位は内側前頭前野および島皮質に認められた。また、[(18)F]FDGを用いた脳代謝活性実験では、15時間のアイソレーションの後ケージメート(あるいは非ケージメート)が隣接する状況と単独で置かれる状況での脳代謝活性を測定した。行動観察を同時に行い、同種他個体認識に関わる脳回路について統計解析を遂行中である。1.向社会行動の定量的評価方法の開発向社会行動評価めためのオペラント課題は、反応(response)しても自らは報酬(reward)を得られないがレシピエント側では報酬をえられる実験装置内で、レシピエント側分室にケージメートがいる状況(WP:with partner)といない状況(WOP:without partner)でテストを行う。本年度はレバーと給餌器をつなげたPC制御タスク装置を開発し、トレーニングを開始した。2.セロトニン神経系と社会行動との関連:PETによる脳機能イメージング動物用microPETスキャナーを用いてセロトニントランスポーター特異的PETトレーサーとして[(11)C]DASBによる無麻酔マーモセットPET実験を行った。社会行動の評価は、上記オペラント課題とは別に、新奇他個体との遭遇場面で発現する行動の因子分析によって得られた、攻撃的態度、友好的態度、不安関連行動の3指標の因子得点を用いた。3指標と関連するセロトニントランスポーター結合部位はそれぞれ後帯状回、背内側前頭皮質、前帯状回に認められた。また、[(18)F]FDGを用いた脳代謝活性実験では、ケージメート(あるいは非ケージメート)が隣接する状況と単独で置かれる状況での脳代謝活性を統計解析した結果、後帯状回が社会的情報処理に中心的な役割を示すことがわかった。3.早期養育環境の違いによる社会行動発現の差異人工哺育および親哺育の個体を準備し、対個体行動の行動評価を行った。1.向社会行動定量評価のための課題開発:向社会行動評価のためのオペラント課題は、反応(response)しても自らは報酬(reward)を得られないがレシピエント側では報酬をえられる実験装置内で、レシピエント側分室にケージメートがいる状況(WP: with partner)といない状況(WOP: without partner)でテストを行い、レバーと給餌器をつなげたPC制御タスク装置を開発し、オス4頭メス4頭のトレーニングを行った。2.PETによる脳機能イメージング:動物用microPETスキャナーを用いてセロトニントランスポーター特異的PETトレーサーとして[(11)C]DASBおよびセロトニン2A受容体特異的PETトレーサー[(11)C]MDL100907による無麻酔マーモセットPET実験を行った。これまでに、セロトニントランスポーター結合活性と上記オペラント課題および観察ベースによる行動評価との関連性が内側大脳皮質領域に認められた。また[(18)F]FDGを用いた脳代謝活性実験では、社会的状況に応じて、内側大脳皮質領域を含む脳内ネットワークの変化を明らかにした。

3.早期養育環境の違い:人工哺育および親哺育の個体の、対個体行動の行動評価および[(11)C]DASBを用いたPET実験を行い、人工哺育個体の社会的引きこもり傾向とセロトニントランスポーター結合活性の中脳および視床における減少を明らかにした。向社会行動の定量的評価方法の開発については、レバー反応を利用したPC制御タスクの開発に手間取った。新奇他個体との遭遇実験で得られた行動指標をもちいて、PET実験結果([(11)C]DASBおよび[(18)F]FDG)との関連性が明らかになった。また早期養育環境の違いによるモデル動物の作成に成功しその社会行動評価を追加していることから、おおむね順調に進展していると考えられる。24年度が最終年度であるため、記入しない。今後さらに向社会行動指標について評価方法を確立し、セロトニントランスポーターに加えてセロトニン2a受容体の結合活性との関連を調査する予定である。オピエート受容体に関しては、[(11)C]Carfentanilの高親和性によりトレーサー量が薬効量ときわめて近いことがわかったため、現在[(18)F]Carfentanilの製造にむけて準備をすすめている。早期養育環境によるモデル動物だけでなく、社会的情報処理に中心的役割を示す部位をターゲットにセロトニン作動薬や拮抗薬の投与、さらには遺伝子導入ウイルスベクターを投与する生物学的介入モデルの開発を目指す。
カテキンによる脂溶性抗酸化剤の高度耗生反応を利用した生理活性物質の完全酸化防止

本研究は、新規な抗酸化剤であるカテキン類の抗酸化活性を評価すると共に、カテキン類による酸化抑制機構を解明し、生理活性物質の完全酸化防止を実用レベルにおいて実現することを目的としている。平成13年度は、生理活性物質にβ-カロチンを取り上げ、不活性なn-デカン溶媒中において2種類のカテキン(エピガロカテキンガレード;EGCG、エピカテキンガレート;ECG)添加条件下で酸化実験を行った。どちらのカテキンを添加した場合も、カロチン濃度が緩やかに減少する期間が観察されたことから、カロチン酸化が抑制されたと考えられる。また、この酸化抑制期間は、ECGの場合添加濃度の増加に伴い長くなったが、EGCGの場合ある添加濃度で最大となった。EGCGはECGとは異なりピロガロ構造を有することから、抗酸化活性以外に、自身の酸化により反応性の高い活性酸素を生成し、この活性酸素が目的物質の酸化を促進させている可能性があると考えられる。しかし、これらの実験ではカテキンをn-デカン中に溶解させるために微量のエタノールを用いており、このエタノール量に応じてカテキンの抗酸化活性が変化することも分かった。脂溶性のカロチンは一般にoil in waterエマルションの形で食品に添加されており、カテキンは両親媒性であるが水相により溶解し易いことから、脂溶性のカロチンやビタミンEとカテキンとの反応は、油水界面で生じると考えられる。そこで平成14年度は、界面積既知の単純な油水二相系でビタミンEのみを添加してカロチンの酸化実験を行った。そして、水相の存在によって油相でのビタミンEの消費が抑制され、その結果、カロチン酸化の抑制期間が油相均相系よりも長くなることを明らかにした。このビタミンEの消費が抑制される物理化学過程として、ビタミンE自身の酸化によって生じた極性の高い連鎖成長ラジカルが油相から水相に移動して除去されることを考え、新たな速度論モデルを構築した。このモデルは、種々の初期ビタミンE濃度条件において、カロチンおよびビタミンE濃度の減少挙動を良好に表現することができた。本研究は新規な抗酸化剤であるカテキン類の抗酸化活性を評価すると共に、カテキン類による酸化抑制機構を解明し、生理活性物質の完全酸化防止を実用レベルにおいて実現することを目的としている。本年度は、生理活性物質にβ-カロチンを取り上げ、その酸化に対するカテキン類の抗酸化活性ならびにその反応機構を検討するために、溶媒に不活性なn-デカンを用い、2種類のカテキン(エピガロカテキンガレート、EGCG、エピカテキンガレート、ECG)を種々の濃度で添加してカロチンの酸化実験を行った。カテキン類を添加しない場合のカロチン濃度は実験開始時から速やかに減少するのに対し、EGCGまたはECGを添加した場合のカロチン濃度は、どの添加濃度でも始め緩やかに減少した後、速やかに減少した。このことから、カテキン類の添加はカロチン酸化を抑制すると考えられる。そして、カロチン濃度が緩やかに減少する期間(酸化抑制期間)は、EGCGを添加した場合では、初期濃度の増加と共に始め増大し、極大となった後減少しているのに対し、ECGを添加した場合では初期濃度と共に増大した。一般にラジカル捕捉型抗酸化剤は、カロチン酸化の連鎖成長ラジカルを捕捉することにより酸化の進行を抑制するため、酸化抑制期間は添加濃度の増加に伴い長くなる。カテキン類もラジカル捕捉型抗酸化剤であり、同様の機構で酸化を抑制していると考えられる。

一方、ピロガロ構造を持つカテキン類は、自身の酸化により反応性の高い活性酸素を生成するという報告もあり、この活性酸素は酸化の促進因子になると考えられる。従って、ピロガロ構造を持つEGCG存在下では、相反する効果を持つ反応が併発し、かつ各反応の濃度依存性が異なるため、酸化抑制期間が極大値を持つような特異的な傾向を示したのに対し、ピロガロ構造を持たないECG存在下では、一般的なラジカル捕捉型抗酸化剤と同様の傾向を示したと考えられる。本研究では、水溶性抗酸化剤であるカテキンの抗酸化活性を評価すると共に、カテキンによる脂溶性抗酸化剤ビタミンEの再生メカニズムを解明し、目的生理活性物質の完全酸化防止を実用レベルにおいて実現することを目的としている。昨年度は、生理活性物質としてカロチンを取り上げ、その酸化に対するカテキン類の抗酸化活性ならびに反応機構の検討を行った。本年度は、脂溶性のカロチンやビタミンEと水溶性カテキンとの反応が油水界面で生じると考えられることから、油相に不活性なn-デカンを水相にTris-HCl緩衝液を用い、油水界面積既知の単純な二相系でカロチンの酸化実験を行った。そして、二相系での実験結果をデカン均相系での結果と比較したところ、水相が存在する二相系では油相のビタミンEの消費が抑制され、その結果、ビタミンEによるカロチン酸化の抑制期間がデカン均相系よりも長くなることが分かった。このビタミンEの消費が抑制される物理化学課程として、ビタミンE自身の酸化によって生じた極性の高い連鎖成長ラジカルがデカン相から水相に移動し除去されることを考え、新たな速度論モデルを構築した。このモデルは、種々の初期ビタミンE濃度条件において、本二相系でのカロチンおよびビタミンE濃度の減少挙動を良好に表現することができた。また、油水界面積や水相体積を変化させた条件で同様に行ったカロチンの酸化実験結果と、モデルによるシミュレーション結果が良好に一致したことから、ビタミンEの連鎖成長ラジカルの油相から水相への物質移動を考慮した本モデルの妥当性を実証した。
助産外来で活用できる助産診断名の開発

助産外来で医師と共有できる妊娠期の診断名を開発する事を目的に検討した。助産診断名は妊娠経過の診断と健康生活診断に分けて、経過診断は、妊娠の確定、妊娠の経過、胎児の状態、胎児付属物の状態を診断するための診断名42項目とそれぞれの診断指標を作成し、健康生活診断は、基本的生活行動、精神心理的生活行動、社会的生活行動、出産育児行動の4類型に沿って29の診断名とそれぞれの診断指標を作成した。これらの診断名は電子カルテに対応できるようにシステム化した。今後、実際に助産外来で、使用していくことで、医師と共通に妊産婦管理ができる様になり、連携した妊婦健診に繋がる事が期待できる。平成24年度に実施したマタニティ診断の妊娠期における経過診断名と健康生活診断名の臨床での利用状況に関する医師と助産師の結果を日本看護診断学会に報告し、意見交換をした。マタニティ診断名を毎日の妊婦健診のなかで、カルテに記載していくことは、外来の業務として、難渋しており、実際に取り入れている施設は少ないことがわかった。そこで、それを実施している施設を訪問し、どのようないきさつで導入できたのか、外来の妊婦健診のどの時期に診断名を入力し、活用しているのかについて検討することにした。島根県の某施設で妊娠期から産褥期の診断名を電子カルテに導入しているとの情報を得て、研究協力を依頼し訪問した。その施設の看護体制や電子カルテの実際を見せて頂き、診断名が直接どのように電子カルテに記載されており、どのように活用されているのかの説明を受けた。さらに3月の助産学会の際に、電子カルテに診断名を導入していくためにはどのようなプロセスが必要なのかを検討する交流集会を設けた。2施設の協力を得て開催し、現状を聞き、意見交換を行った。電子カルテに診断名を導入しても診断指標を確実にチェックするということは困難で、診断指標を全て列記しての診断ではなく、カルテに診断指標は導入されていなかった。また、NANDAの電子カルテを導入している施設では、他の診断名を追加することの不具合などもみられた。助産診断は、現在ウェルネスの診断名として出しているが、昨今のハイリスク妊婦の増加に伴い、実在型の診断名を同時に診断できるように検討する必要がある。今後は、ハイリスクも含めた、実際の外来で見かける妊産婦の状況を適切に診断できる助産診断名として、電子カルテへの導入を進めていく方向で検討していくこととする。研究者らは妊産婦に対するアセスメントガイドとして「マタニティ診断」を開発し、2004年にマタニティ診断ガイドブックを発行した。本研究では、産科医との共通言語として助産診断名を活用するために、マタニティ診断の妊娠期の経過診断名の診断指標49項目の使用状況を検討した。【方法】都内近県に勤務する助産師外来を実施している産科施設に勤務する助産師と医師を対象に、妊娠期の経過診断22診断名の49診断指標について、その活用状況を「よく使用する」から「全く使用しない」の4件法で調査した。助産師34名、医師16名から回答を得た。本研究は大学の倫理審査委員会の承認を受けて実施した。【結果】49の診断指標の中で、医師、助産師共に高い使用率(70%以上)を示した指標は、妊娠の診断では「尿検査で妊娠反応が確認できる」、「超音波画像で子宮内に胎嚢、胎児が確認できる」、「超音波画像で胎児心拍動が確認できる」の3項目、妊娠週数に応じた変化では「性器出血がみられない」の項目、胎位の診断では「超音波画像による胎位の診断」の項目、胎児発育状態では「超音波画像により胎児の測定値が妊娠週数に相当している」の項目、胎児の健康状態では「胎児心拍数が110-160bpmである」「胎児心拍のリズムが整調である」「胎児心拍陣痛図は良好なサインを示している」の項目、胎児付属物では「羊水所見が正常範囲である」「超音波画像・胎児心拍陣痛図では胎盤機能は正常である」の項目で、全13項目(27%)であった。一方、母体の身体的変化に関する指標6項目は、助産師は64-97%、医師は18-68%の使用率であった。医師は、診断指標として超音波診断や胎児心拍など胎児の診断を重視する傾向にあり、助産師は体重・尿蛋白・浮腫・Hb値、胎動、腹部触診など母体の心身の診断を重視しており、妊婦健診での両者の関りの相違がみられた。平成26年度は、妊娠期の助産診断名と診断指標を作成した。25年度までに検討した妊娠期の経過診断と健康生活診断について、更に、表現を見直し、具体的には電子カルテに使用できるように文言を整理し統一した。妊娠期の診断

名の中で、妊娠経過の診断については、正常な経過の診断のみでなく、異常の予測診断として、医師と共通で診断できるように要精査/妊娠高血圧症候群、要精査/妊娠貧血などと、医師が何を精査したら良いのかが分かる程度に具体的に診断名を入れることとした。又、その根拠となる検査値や超音波画像などの判断基準は、産婦人科診療ガイドラインの記述に基づいて作成した。健康生活診断は、基本的生活として、食事、睡眠、排泄、休息、運動、動作、清潔の7項目、社会的生活行動として、パートナーとの関係、支援体制、家族関係、家族の役割の4項目、精神心理的生活行動として情緒、不安の表出、妊娠の受け止め、ボディイメージの4項目、身体的準備として、乳房の手当、呼吸法の練習、弛緩法の練習、出産に向けた身体づくり、エクササイズの取り入れ、出産のイメージ、入院時期の理解、必要物品の準備の8項目、出産育児行動としてマイナートラブル、バースプラン、夫の立会い、出産育児の学習、母親学級参加、母子健康手帳の活用の6項目を評価するようにした。これらの項目は、適切または不適切と診断して、不適切の場合は、自由記述欄に不適切な状態を具体的に記載する形に作成した。診断項目と診断指標はエクセル画面にて作成し、電子カルテとして使用できるように整理した。今後、実際に助産外来で試用して、実践での有用性について検証していきたいと考えている。生涯発達看護学助産学医師の意見は聞き取り調査により、ほぼ現状でよいという意見で集約された。助産師の意見は、助産外来での診断の意味や保健指導との関係などの理解を促し、さらに活用しやすくするための意見を求めていく。そのために対象を拡大して、意見を聴取する。24年度の調査においては、協力してくれる医師・助産師からの回収が少なかったが、診断指標の理解しにくい表現などが明確になったので、これらの診断指標を見直し、25年度に見直した指標について対象を拡大して追加調査する予定である。特に医師の回答が少なかったので、医師への面接調査を行い、少ない分をカバーできるようにする。25年度は医師・助産師共に全国レベルの調査を実施する予定である。26年度は妊娠期の診断名を明確にして、電子カルテへの導入の可能性を検討する。診断名を整理し、電子カルテを作成したい。共同研究者として電子工学の専門家に研究協力を依頼して電子媒体としての診断名を入れた電子カルテを作成する。また、看護診断学会に参加して、マタニティ診断の電子カルテ作成に関する情報を得る。マタニティ診断に関する研究の成果を踏まえて、研究会を開催し、診断名の活用に関する意見交換、及び作成した電子カルテを試用してみる。最終的には外来で活用できる形にしていくために、診断名をいれた電子カルテの作成を試みる。見直した診断指標を用いて新たな質問紙を作成して、全国の助産外来を実施している施設の助産師を対象に使用状況を調査し、診断指標の有用性を明確にする。また、使用されていない施設においては、助産外来でのアセスメントと記録の方法を聞き、医師との共通理解のためにどのようなことばや診断名を使用しているのかを調査し、分析する。次年度の使用額が生じた理由は次のとおりである。1面接調査の相手との面談を学会時に併せて会場で行ったため、交通費を使用しなかった。2調査表を個人宛に発送する予定で、切手代などの通信費を計上していたが、まとめて送ることが出来たため残金が生じた。3国際学会への参加旅費を使用しなかった。
分子カプセルを利用したヨード造影剤の開発

ヨード造影剤は不安定な炭素ーヨウ素結合を有する小分子を主成分としており、一定条件下で炭素ーヨウ素結合が解離し、わずかにヨウ化物イオンを放出することが知られている。また、血管造影を行うには多量のヨード造影剤を血中に投与する必要である。そのため、ヨード過敏症の患者にヨード造影剤を投与するのは禁忌となっている。本研究では、炭素ーヨウ素結合を複数導入した分子サイズのカプセルを合成する。単位分子あたりのヨウ素含有量の増加と、炭素ーヨウ素結合をカプセル内に被覆した新規ヨード内包分子カプセルの合成を行う。この分子カプセル特有の性質を明らかにすることで、炭素ーヨウ素結合の解離を完全に抑えた次世代のヨード造影剤の開発を目的としている。本年度は、ヘミクリプトファンと呼ばれるナノカプセル内部に、ヨウ素を含む分子の包接挙動について研究を行った。まずヨウ素を含む大きな分子を内包可能な新規ナノカプセルの合成を行った。カプセルの合成はジベンゾ-24-クラウン8-エーテルの一方の芳香族にアルデヒド基導入した一置換クラウンエーテルを出発原料とした。まず、強酸性条件下ホルムアルデヒドと反応させることで、環化三量体を得た。ついでトリス(2-アミノエチル)アミンとイミノ化した後、水素化ホウ素ナトリウムで還元することにより、トリエチレングリコールを6本有する空孔サイズの大きなナノカプセルを合成した。一方、ナノカプセルの半球部分に相当するシクロトリベラトリレンの誘導体とヨードホルムの包接挙動を検討したところ、包接挙動はNMRでは観測されなかった。今後このポリエチレングリコール鎖を有する新規ナノカプセルを用いて、ヨウ素を含む分子の包接挙動を検討することで、炭素ーヨウ素結合をカプセル内に被覆したヨード内包分子カプセルの合成を行う本年度の目標としていた新規ナノカプセルの合成に成功したので、おおむね順調に進展している。本年度合成したナノカプセルによるヨウ素を含む分子の被覆について検討していく。当該年度におけるナノカプセルの合成の実験がスムーズに進んだため、試薬代などが予定額より余ったため、それを次年度の実験費用に充てる。
『19世紀英国議会報告書集』にみるイギリス帝国植民地政策の諸相

(1)『19世紀英国議会報告書集』(通称ブルーブックス)中の南部アフリカを対象とした報告書・電文・書簡等を、1899年からの南アフリカ戦争の前史としてのメルクマ-ルとなる1895年のジェイムソン侵入事件からの期間を中心に分類・整理を行った。この中において、イギリス帝国政府の南アフリカ現地出先機関の情勢判断と本国政府の思惑とには、微妙な認識の差があるのではないかという仮説を実証すべき手掛りを見い出すことを念頭において体系的な分析を試みた。(2)収集された『報告書集』中の各特別委員会の報告書等について、目録作成のためのデーター化を現在進めており、完成次第、関連研究進展のために供与することを試みたい。(3)この『報告書』以外の史料、例えばイギリス帝国下院議事録等の史料との照合を試みることと、関連する稀少史料の収集のため、京都大学、東北大学等の図書館等にて、鋭意史料の収集を試みた。(4)また、最新の研究成果を本研究課題にとり入れるために、内外の関連図書を収集して、本研究成果の位置づけを明確化するよう努めた。
単一巨大リポソームによる開口放出様の膜融合の可視化解析

マスト細胞には、炎症性メディエーターを含む分泌顆粒がある。細胞が抗原を感知すると、分泌顆粒が形質膜と融合して、内容物を細胞外に放出する(開口放出)。この開口放出の膜融合過程には、SNAREと呼ばれるタンパク質群が重要な役割を果たしている。我々は、形質膜上のSNAREタンパク質(SNAP-23/syntaxin-3)と分泌顆粒上のSNAREタンパク質(VAMP-8)を、それぞれ微小リポソームに組み込むことで、リポソーム間で膜融合が引き起こされることを明らかにした。本研究では、これらのSNAREタンパク質を巨大リポソームに組み込むことで、SNARE依存性の膜融合の可視化解析を行うことを目的とした。無細胞タンパク質合成系を利用することで、巨大リポソームにsyntaxin-3を外向きに組み込むことに成功した。しかしながら、SNAP-23とVAMP-8に関しては合成量が少なく条件を変えても改善がみられず、リポソームに組み込むまでには至らなかった。そこで無細胞タンパク質合成系を利用した方法ではなく、Yanagisawaらが報告した精製タンパク質を用いる方法で、巨大リポソームへの再構成を試みた。その結果、SNAP-23とsyntaxin-3が組み込まれた巨大リポソームと、VAMP-8が組み込まれた巨大リポソームを作製することに成功した。今後はリポソームに組み込まれたSNAREタンパク質の配向性を決定して、SNARE依存性の膜融合の可視化解析へと進める予定であったが、研究代表者が転職により科研費応募資格を喪失することになり、研究は中途で廃止申請を行った。この開口放出の膜融合過程には、SNAREと呼ばれるタンパク質が重要な役割を果たしている。我々は、形質膜上のSNAREタンパク質(SNAP-23/syntaxin-3)と分泌顆粒膜上のSNAREタンパク質(VAMP-8)を、それぞれ微小リポソームに組み込み、混合するとリポソーム間で膜融合が引き起こされることを明らかにした。本研究では、これらのSNAREタンパク質を、細胞サイズの巨大リポソームに組み込むことで、開口放出様の膜融合の可視化解析を行うことを目的とする。初年度は、SNAREタンパク質が組み込まれた、巨大プロテオリポソームの作製を試みた。無細胞タンパク質合成系を用いて、マスト細胞のSNAREタンパク質を合成した。抗SNARE抗体を用いたウエスタンブロットを行ったところ、syntaxin-3とわずかながらSNAP-23の合成を確認することができた。その一方で、VAMP-8の合成は確認することができなかった。次に、巨大リポソーム存在下で同様に合成を行い、SNAP-23とsyntaxin-3が組み込まれたリポソームの作製を試みた。ウエスタンブロットを行った結果、syntaxin-3の組み込みは確認することができたが、SNAP-23の組み込みは確認することができなかった。またプロテアーゼ処理により、組み込まれたsyntaxin-3の配向性を確認したところ、ほぼ100%が外向きに組み込まれていることが確認された。本研究成果は、新たなSNAREリポソームの作製方法の開発に向けて役立つものと考えられる。現在までのところ、細胞サイズの巨大リポソームに、syntaxin-3を外向きに組み込むことに成功している。その一方で、SNAP-23とVAMP-8を巨大リポソームに組み込むまでには至らなかった。したがって、現在までの達成度としては、やや遅れていると判断した。今後は引き続き、SNAP-23, VAMP-8を巨大リポソームに組み込むための条件検討を行い、SNARE依存性の膜融合の可視化解析へと進める予定である。

克服すべき課題としては、無細胞タンパク質合成系を用いた際に、SNAP-23とVAMP-8の合成量が低いことがあげられる。そこで次の2つの実験条件を検討し、合成量の改善を図る。(1)コドンの最適化を行った遺伝子を用いて合成を行う。(2)可溶性のタグ(GST等)を付加させて合成を行う。また並行して、油中水滴法をアレンジした方法も行い、巨大SNAREリポソームの作製を試みる。具体的には、油中水滴法の水層に大腸菌を用いて発現・精製したSNAREタンパク質を展開する。油層中で水溶液を懸濁し、遠心を行い、SNAREタンパク質が組み込まれた巨大リポソームを得る方法である。「次年度使用額」が生じた状況については、サンディエゴにて開催された、米国細胞生物学会への参加を予定していたが、校務のために参加をキャンセルしたことから生じたものである。平成28年度は1,100,000円配分されており、また平成27年度「次年度使用する予定」の139,021円を加えると、合計1,239,021円となる。使用計画は、次のとおりである。物品費:1,100,000円、旅費:100,000円、その他:39,021円。主に、SNAREタンパク質の合成、リポソームの作製、膜融合の可視化解析に必要な消耗品、及び学会等での情報収集のための旅費である。
国内一流棒高跳選手のパフォーマンスに影響を与える質的要因と量的要因の関係

本研究では、国内一流棒高跳選手を対象として、パフォーマンスに影響を与える質的要因を選手の自己観察分析、コーチの他者観察分析から、量的要因をバイオメカニクス的分析から明らかにし、それらの知見の関係性明らかにすることを目的とした。研究の結果、選手の自己観察、コーチの他者観察の結果から、試技の正否は助走局面で決定し、そこでは助走リズムを中核に据えた上で、助走スタートから中盤にかけてのポール保持態勢との関係に留意することが重要であることが指摘された。さらに、この局面での試技の正否判断は、バイオメカニクス的分析におけるポール角度の変化からもモニタリング出来ることが明らかとなった。平成24年度の研究目的は、23年度と同様に選手の自己観察、コーチの他者観察、バイオメカニクスの3つの分析方法から、選手の技術的な運動問題を検討すると共にそれらの関係性について検討することであった。さらにこれに加えて、バイオメカニクスデータについて、選手、コーチによる解釈学的考察を試みた。今年度の分析結果から、昨年度と同様に運動問題の発生は、主に助走局面での運動抑制現象に由来するものであることが確認された。助走局面の運動問題は、選手とコーチの運動感覚的な観察結果からは、助走の「流れ」といった助走全体に関する全体印象において把握されていた。また、踏切準備時のポールプランティングにおける身体各部の使い方にも運動問題の発生兆候が確認された。助走局面についてバイオメカニクスの観点から分析を行った結果、成功試技と失敗試技では、ポール角度に大きな差異が認められた。具体的には、助走開始時から34歩に及び突っ込み・踏切局面おいてポールの保持角度で差異が認められた。この結果は、跳躍の正否に対して、助走の開始局面と突っ込み・踏切局面がバイオメカニクス観点からみた場合、パフォーマンスに対して大きな影響を与えていることを示しているといえる。以上のことから、選手の自己観察とコーチの他者観察という主観的情報では、助走全体が運動抑制現象の把握局面として観察対象となっていたが、バイオメカニクス的分析からは助走の初期と終末の局面で運動問題の把握が行われていたといえる。最後に、バイオメカニクスデータの解釈学的考察として、選手とコーチのやりとりの中で、助走においてポールをキャリーする際に、「ポールの重さを感じないようにする」という技術的ポイントに対して、助走初期と終末におけるデータの差異は、助走構成上有益な視点を与えていると考えられた。平成25年度の研究目的は、選手の自己観察、コーチの他者観察、バイオメカニクス的分析から選手の技術的な運動問題を検討するとともにそれらの関係性について検討することである。さらに、バイオメカニクス・データについて選手とコーチの間で解釈学的考察を行い共通する解釈内容を取り出すことを試みた。まず、選手の自己観察分析とコーチの他者観察内容について半構造化面接と指導メモを用いて質的分析を行った結果、運動抑制現象の発生は主に助走局面と突っ込み局面であることが明らかにされた。それぞれの局面における技術として重要な運動感覚意識は、助走時ではポールと選手自身の関係に関する事項が中心であった。ポールドロップは、その適切なパターンが破壊されると選手の助走スプリント技術に大きな影響を与え、後続の突っ込み動作に悪影響を及ぼすことになる。この突っ込み局面では、両腕を上方へパンチングするような運動感覚意識が重要であることが選手の自己観察内容から明らかにされた。コーチの他者観察では、失敗試技において不適切なポールドロップと不完全な突っ込み動作が指摘されていた。両者の運動感覚意識については、運動共感が成立し、共に同様な運動局面で同様な運動問題を把握していたといえる。また、バイオメカニクス的分析では、運動問題は主に助走において顕著であった。助走の特徴を示すポール角、速度、ピッチ、ストライドを見ると、試技の成功した場合と失敗した場合を比較した結果、その相違がポール角と速度に表れた。成功試技では、助走開始から中盤での高い角度でのポール保持が運動感覚的に良好で大きな助走速度を獲得するために有効であるといえる。これらの三つの分析結果から、すべての分析で助走局面の重要性が指摘された。このようなことから、助走の運動感覚的診断とバイオメカニクス的客観診断の解釈学的すり合わせが技術トレーニングにおいて重要であるといえよう。平成23年度の研究目的は、選手の自己観察、コーチの他者観察、バイオメカニクスの3つの分析方法の観点から、選手の技術的な運動問題を検討し、それらの関係を検討することであった。本研究の結果から、選手とコーチの観察分析からは運動観察のポイントは助走局面に置かれていることが明らかとなった。具体的な観察内容は、助走の流れなどの助走全体に関する運動感覚的な内容を基底にした「ポールの倒し方」と「ポールの保持位置」であった。

助走の流れというような全体印象は、この二つの観点から選手とコーチが認識していることが明らかとなった。また、この助走局面についてバイオメカニクス的な観点から分析を行ったところ、ポール角度、つまり、「ポールの倒れ方」で試技の成功・失敗間で差異が認められた。これらのことから、前述した選手とコーチの観察分析の結果をふまえると、助走におけるポール操作特に、ポールの倒し方に試技の正否が大きく関係しており、それは主観的な観点からも客観的な観点からも確認できることが明らかになった。平成24年度の研究は、研究課題もほぼ順調に達成することができ概ね順調に行えたと評価できる。ただ、測定を行った試技の多くが完全な跳躍とならなかった試技も多く見られ、測定回数の割には良好なデータの数が少なかった。しかし、全体としては研究は順調に進んだといえる。平成23年度の研究は、研究課題もほぼ達成することができ概ね順調に行えたと評価できる。その理由としては、多大な分析時間を要するバイオメカニクス的分析が順調に進んだことがあげられる。平成24年度は研究計画書にも示してあるとおり、平成23・24年度の研究を継続して進めると共に、研究成果をまとめていきたい。また、平成24年度末より取り組んでいる技術的な新しい課題があるので、それらの内容が平成23・24年度の研究結果とどような差異を示すかについても注目していきたい。これらの研究進展のためには、昨年度のように不完全な跳躍の分析では無く、完全な跳躍の分析が可能となるように選手と頻繁に連絡をとりながら研究を進める必要がある。平成24年度は、研究計画書にも示しているように、昨年度実施した3つの分析方法からの運動問題の把握を継続するとともに、これらの関係性について検討することによって、運動問題の解決方法について検討していく。特に、バイオメカニクスデータの解釈学的考察が行われる必要がある。また、前年度は不十分だった選手の内観分析についても進めていきたい。平成25年度は、研究の推進のためにバイオメカニクス的分析のための人件費や表消耗品等に使用したい。平成23年度は、当初予定していた動作分析ソフトの購入が安価になったことと分析の機会がトレーニングの関係から予定したように多く確保できなかったために約900,000円の残金がでることとなった。本年度はバイオメカニクス的な動作分析の機会を増やし多くのデータ収集を行い、また、前年度には不十分だった半構造化面接による選手の内観分析を複数回行っていきたい。残金はバイオメカニクスデータ分析や内観分析のテープ起こし作業等に充当していきたい。
Super-p53を用いた新しいがん遺伝子治療法の開発

【結果1】p53欠失ヒト腫瘍細胞株であるSaos-2を用いてスクリーニングし、新たに見つかった強力なアポトーシス誘導能をもつ変異型p53、すなわちSuper-p53をアデノウイルスに組み込んだ。これにより培養細胞およびマウス移植腫瘍に対する簡便かつ高率な遺伝子導入実験を可能にした。これらを用いて、種々の培養細胞株における細胞増殖抑制効果を調べ、癌種・p53ステータスに対応させた細胞増殖抑制効果についてパネルを作成した。この過程で、Saos-2のみでなく、その他の癌細胞株(U20S、SF126、DLD-1、HCTl16など;data not shown)においても、Super p53のアポトーシス誘導のタイミングが変異体によって若干異なることが判明した。すなわち、コドン121の変異体群はアポトーシス誘導が惹起されるタイミングが、その他の変異体と比べて有意に早いことが確認された。【結果2】細胞増殖抑制効果パネルにもとづいて、複数のがん細胞に対し、またp53のステータスにindependentに細胞増殖抑制効果を示した変異体S121Y、S121C、S121F、E221Q、R290G、K291Eについての抗腫瘍効果をin vivo(ヌードマウス皮下移植腫瘍モデル、癌性腹膜炎モデル)で検討した。【結果3】その結果、皮下移植腫瘍モデルにおいては、変異体S121Y、S121C、S121F、E221Q、R290G、E291Eは野生型p53よりも有意に強い抗腫瘍効果を認めた。しかし、癌性腹膜炎モデルにおいては、いずれの変異体も野生型p53と比較し、生存期間の有意な延長は認めず、抗腫瘍効果の増強は確認できなかった。逆に、変異体S121Y、S121C、S121Fは野生型p53に比べ、著明な体重減少と生存期間の短縮を認めた。【結論】以上の結果から、われわれが同定したSuper-p53のうち、局所治療に関しては野生型p53を上回る抗腫瘍効果をもつ変異体を複数認めたが、腹腔内投与などの全身性投与に明らかな有用性を示す変異体は認められなかった。1、報告者の研究室では既に、出芽酵母のアッセイ系において、全2314種類を網羅したp53ミスセンス変異体ライブラリーを構築し、これらの全てについて8種類の標的遺伝子に対する転写活性化能を検討した(Proc Natl Acad Sci USA, 100:8424-8429)。この結果をもとに、転写活性化能に多様性を示す変異体群(635種類)をSuper-p53候補として抽出し、この中から無作為にヒト型p53発現プラスミドを作成した(179種類)。これらを、p53欠失ヒト腫瘍細胞株であるSaos-2にリポフェクションで導入し、フローサイトメーターを用いてアポトーシス誘導能を調べた。その結果、H214Q、K291E、K292T、Q144R、R290G、I162M、K291T、S121A、S121C、F212Y、E221Q、K291Q、S121Y、R156C、S215C、K292I、P153H(17種類)が、Super-p53として新たに見つかった。2、17種類のSuper-P53は、アデノウイルスベクターに組み込んだ。アデノウイルスベクターをSaos-2のみならず複数のヒト腫瘍細胞株(SF125、U2OS、DLD-1)に導入し、フローサイトメーターを用いてアポトーシス誘導能を評価した。この結果、H214Q、K291E、R290G、I162M、K291T、S121C、F212Y、E221Q、K291Q、S121Y(10種類)がいずれの細胞株においても強いアポトーシス誘導能を示し、既にSuper-p53として報告されているS121Fと同等であることが明らかとなった。さらに、それぞれの変異体でアポトーシス誘導のタイミングが異なることも判明した。【結果3】

その結果、皮下移植腫瘍モデルにおいては、変異体S121Y、S121C、S121F、E221Q、R290G、E291Eは野生型p53よりも有意に強い抗腫瘍効果を認めた。しかし、癌性腹膜炎モデルにおいては、いずれの変異体も野生型p53と比較し、生存期間の有意な延長は認めず、抗腫瘍効果の増強は確認できなかった。逆に、変異体S121Y、S121C、S121Fは野生型p53に比べ、著明な体重減少と生存期間の短縮を認めた。【結論】以上の結果から、われわれが同定したSuper-p53のうち、局所治療に関しては野生型p53を上回る抗腫瘍効果をもつ変異体を複数認めたが、腹腔内投与などの全身性投与に明らかな有用性を示す変異体は認められなかった。
統合失調症と気分障害のω3脂肪酸と脳部位間結合障害の関連を明らかにする縦断研究

本研究では、オメガ3脂肪酸と脳部位間結合性に着目して統合失調症と気分障害における認知機能障害の病態生理を解明し、さらに認知機能障害が社会機能と生活の質(QOL)とどのように関連するかを明らかにする。本研究では、末梢血オメガ3脂肪酸の低下と神経炎症・酸化ストレスの増強が脳白質神経線維と灰白質皮質の器質的変化を引き起こし、脳部位間結合性を障害するという仮説をたてており、具体的には、健常対照群と比較して疾患群で有意差をもつ脳画像変化を明らかにし、脳画像変化と末梢血オメガ3脂肪酸、炎症・酸化ストレスマーカー、臨床指標(認知機能、社会機能アウトカム)の関連を検討する。2018年度は被験者のリクルート、画像撮影、血液検査の研究体制を整備するとともに画像解析技術の向上に努めた。画像解析技術については、研究代表者がDepartment of Psychiatry and Psychotherapy, University Hospital, LMU Munichに出向し、主に脳構造画像(皮質厚、脳白質神経線維)の最新の画像解析手法を習得した。統合失調症患者を対象として運動療法前後の灰白質皮質厚の変化を検討し、結果の一部を第41回Fmシータ研究会で発表した。また、研究代表者および研究分担者らは、健常者および統合失調症と気分障害患者における脳部位間機能的結合の評価法の開発にも努め、結果の一部を学会発表した。2018年度は研究体制の整備と画像解析技術の習得に重点をおいたため、被験者リクルートが遅れている。2019年度は被験者リクルートを重点的にすすめたい。2018年度は研究体制の整備と画像解析技術の習得に重点をおき、被験者リクルートが遅れたため、頭部MRI撮影費用や血液検査費用に余剰が生じた。2019年度は被験者リクルートを重点的にすすめ、諸検査費用に当該予算を使用したい。
核四極子共鳴を用いた可搬型不正薬物・偽造医薬品検知装置の開発

微量結晶粉末(10 100mg)の物質同定を可能にする小型NQR検査装置の開発を目指し、二重共鳴法を用いた高感度化技術の開発に挑戦した。高磁場で分極した水素原子核スピンの磁化を窒素原子核スピンに移動させることで、窒素原子核からのNQR信号が増大するか検証を行った。磁化の移動には、サンプルを高磁場からゼロ磁場に移す必要があるため、磁力を用いたサンプル移動機構を試作した。また、低インピーダンス送受信回路を備えた小型NQR装置とその制御プログラムの開発を行った。その結果、窒素原子を含む複数の医薬品原料(100 mg以下)からNQR信号を検出することに成功した。窒素原子核を含む微量結晶粉末(10100mg)の物質同定を可能にする高感度核四極子共鳴(NQR)装置の開発研究を行った。NQR高感度化技術として、高磁場下で分極した水素原子核スピンの磁化を窒素原子核スピンに移動させる二重共鳴法(交差偏極法)を用いた。NQRによる窒素原子核スピンの検出は、ゼロ磁場下で行い、高磁場は市販ハードディスクに内蔵されている磁気回路を用いた。当初計画では、サンプルの移動機構としてディスク状の回転台を用いることを検討していたが、より構造が単純な機構であるリニアシャフトを用いた方法でサンプルの移動を行った。その結果、医薬品であるメタホルミン塩酸塩60mgからの信号取得に成功した。微量結晶粉末の物質同定を可能にする高感度核四極子共鳴(NQR)装置を開発することを目的として、NMR-NQR二重共鳴法を用いた高感度技術の研究を行った。磁場下で分極した水素原子核スピンの磁化を窒素原子核スピンに移動させる交差分極法において、その信号強度は磁場強度に比例することが分かっている。そのため、可能な限り高磁場を水素原子核スピンに印加し、NQR検出前に分極させておく必要がある。また、小型可搬型装置の開発を目指していることから、水素原子核分極用の磁場の発生源として2個の小型ネオジウム永久磁石を用いた。2個の磁石を互いに向かい合わせることにより、磁極間距離6.2mmの中央に設置したサンプルに磁場を1Tまで印加することができる構造を開発した。水素原子核スピンの分極を窒素原子核スピンに効率良く移動させるには、サンプルを素早く(水素原子核スピンの縦緩和時間に比べ)ゼロ磁場下に移動させる必要がある。そのため、平成26年度に開発したリニアシャフト・サンプル移動機構の駆動電源回路を新規に設計し、移動時間160ms程度での安定したサンプルの移動を実現した。その結果、二重共鳴法を用いることによりNQR信号強度は、解熱剤であるアセトアミノフェンの場合7倍、経口糖尿病治療薬であるメタホルミン塩酸塩の場合17倍、医薬原料であるジエチルアミン塩酸塩の場合9.1倍にそれぞれ増加し、目標としていた100mgグラム以下での検出が可能となった。当初計画通りに、研究が進んでいるため。平成27年度までは、市販のNMR制御装置を用いて、送信パルス波形の生成と、受信信号の位相検波をすることにより、NQR信号を検出していたが、可搬型のNQR装置を開発するにあたり、本年度は、バッテリー駆動型のNQR制御装置の設計とテストを行った。開発したNQR装置は、NQRシーケンスの生成と受信信号の信号処理を行うField programmable array (FPGA,アルテラ社製CYCLONE V)からなる制御ボード、送信パルス制御信号から出力インピーダンスが低い送信パルスを生成するD級アンプ送信ボード、アンテナから受信された信号に対して帯域外のノイズを低減する帯域通過型フィルタとシリアルADCからなる受信ボード、受信用前段トランスインピーダンスアンプ付き低インピーダンス送受信切替ボード、送受信用コイルプローブから構成している。また、NQR信号強度を増大させるため、サンプルを高磁場下に一定時間保持し、その後、ゼロ磁場下に移動させるサンプル移動機構とその駆動回路を再度設計することにより、自作NQR装置から制御できるように改良した。送信用のD級アンプとして、両電源駆動ハーフブリッジ構造を採用し、従来の50Ω送信アンプに比べ、より小さい駆動電圧で大きな電圧をコイルプローブに印加できるようになった。その結果、送受信切替回路に含まれる受信アンプや切替素子の保護電圧を約10倍程度下げることが可能となり、耐電圧が低い小型で高性能な電子部品の使用が可能となった。結晶粉末(10100 mg)を検出できる持ち運び可能なNQR装置の開発を目指し、平成28年度から引き続き、可搬型試作装置の開発を行った。FPGA上にAltera社のNios IIプロセッサを構築することで、PC制御が不要な小型NQR装置の試作をすすめ、NQR信号検出シーケンスの一つであるStrong off-resonance comb (SORC)シーケンスの実装を試みた。また、新たなNQR信号検出方法として、高速周波数掃引を用いたNQR装置の開発を進めた。高速周波数掃引を行うには、NQR検出に用いるプローブの共振周波数を送信周波数に追従する必要があり、これまで実現していなかった。共振周波数の自動制御は、目的の周波数において50Ωの抵抗とリアルタイムに比較することで行った。NQRプローブのインピーダンスが50Ωになると、目的の周波数においてリアクタンス成分がゼロとなり、プローブがその周波数数において共振していることを意味する。インピーダンスの比較にはブリッジ回路を用い、平衡状態からのずれを電流として検出することにより、NQRプローブのインピーダンスを50Ωに制御することに成功した。

NQRプローブのインピーダンスの調整には、2つの可変容量ダイオードを用い、逆バイアス電圧を印加することで行った。その制御信号は、平衡状態のずれにより生じる電流を高速ADCで検出し、デジタル信号処理により摘出した振幅と位相情報から生成した。期間全体では、結晶粉末(10100 mg)を検出できるNQR装置の開発を実施し、二重共鳴法を用いることによりNQR信号強度は、解熱剤であるアセトアミノフェンの場合7倍、経口糖尿病治療薬であるメタホルミン塩酸塩の場合17倍、医薬原料であるジエチルアミン塩酸塩の場合9倍にそれぞれ増加し、目標としていた100mgグラム以下での検出が可能となった。微量結晶粉末(10 100mg)の物質同定を可能にする小型NQR検査装置の開発を目指し、二重共鳴法を用いた高感度化技術の開発に挑戦した。高磁場で分極した水素原子核スピンの磁化を窒素原子核スピンに移動させることで、窒素原子核からのNQR信号が増大するか検証を行った。磁化の移動には、サンプルを高磁場からゼロ磁場に移す必要があるため、磁力を用いたサンプル移動機構を試作した。また、低インピーダンス送受信回路を備えた小型NQR装置とその制御プログラムの開発を行った。その結果、窒素原子を含む複数の医薬品原料(100 mg以下)からNQR信号を検出することに成功した。当初計画どおりに研究が進んでいるため。平成26-27年度に開発・検証したNQR高感度化技術を備えた小型NQR装置を試作する。その際、磁気回路やFPGA基板を新規に設計したのち、各コンポーネントの配置を最適化する。また、装置の評価には、偽造医薬品の模擬物質として、アセトアミノフェンやメタホルミン塩酸塩を用いる。平成29年度は、最終年度となるため、NMR-NQR交差分極の為のサンプル移動機構と前年度に開発した小型NQR装置を組み合わせ、微小サンプルの測定が可能な可搬型NQR装置の開発を行う。また、パルスNQR法以外の連続波を用いたNQR検出技術が適応可能か検証する。29年度が最終年度であるため、記入しない。センシング工学前年度は、NQR-NMR二重共鳴用の磁気回路として市販のハードディスクに内蔵されていたものを用いて実験を行っていた。そのため、磁場の大きさ、サンプルの大きさ、移動機構などに制限があった。今年度は、磁気回路を設計することで、これらの問題を解決することを目指す。また、高感度化の為に、複数周波数の励起が可能なNQR装置の開発も行う。研究の進捗にあわせ、装置の改良のためNQR制御用FPGA基板の作製とその基板への電子部品の実装を複数回検討していたが、年度内での改良が間に合わなかったため、年度内の購入を見送った。研究の進捗にあわせ、FPGA基板の作製の為に基板作製支援ソフトウエアの購入を検討していたが、検証実験には市販のFPGA評価ボードを用いることができたため、年度内の購入を見送った。当初予定通りにNQR制御用FPGA基板の作製と電子部品の実装を複数回行い、開発装置の仕様に適したNQR制御用FPGA基板の開発を試みる。
死因究明に資する恒常性維持の分子メカニズム解明及び凍死診断への応用

凍死(低体温症)の診断は、寒冷暴露されたことで生じる左右心臓血の色調差や胃十二指腸粘膜下出血などの所見を組み合わせることで行われる。しかし、これらは主観的に捉えられる所見であることに加え、凍死以外の死因でも認められるため凍死特異的な所見とはいえず、その確定診断は難しい。本研究は、生体の恒常性維持の分子メカニズムを明らかにし、死因究明が最も困難な病態の一つである凍死の確定診断に応用可能な分子マーカーを同定すべく、体温依存的(軽度・中等度・重度)な寒冷動物モデルを作製した。生体の恒常性維持に関連する視床下部・腸腰筋・褐色脂肪組織に着目し、次世代シークエンスを用いてこれら組織における体温依存的に発現誘導される遺伝子の同定を行った。その結果、各組織において多数の遺伝子発現が、体温依存的に変動した。これらの遺伝子群に対しGene ontology解析を行ったところ、ストレス応答や脂質応答、低酸素症への反応などのbiological processに関与していることを明らかにした。腸腰筋においては重度低体温特異的に発現変動する遺伝子が同定された。これらの遺伝子群は、重度の低体温による恒常性維持及び呼吸中枢の麻痺によってその発現が誘導され、また、凍死の確定診断を補完する新規分子マーカーとなりうる可能性が示唆された。近年、より死後変化に耐えうる分子として、microRNA(miRNA)の有用性が提唱されてきた。miRNAは、標的mRNAに結合し、蛋白質合成を阻害する非コードRNAである。更に精度の高い凍死診断法を確立するためには、他臓器において、寒冷暴露によってのみその発現が変化し、また死後変化に耐えうるmiRNAを同定することが必要不可欠である。そこで、体温依存的寒冷動物モデルの腸腰筋において変動するmiRNAをマイクロアレイを用いて同定した。その結果、多数のmiRNAが、体温依存的に変動したことを明らかにした。申請者らは、凍死時に多臓器で複数の遺伝子が発現変動する事を見出した。そこで本研究は、凍死経過中の寒冷暴露における生体の恒常性維持システムの分子メカニズムを明らかにし、死因究明が最も困難な病態の一つである凍死の診断に応用可能な分子マーカーを同定すべく、体温依存的な寒冷動物モデルを作製し、次世代シークエンスを用いて、腸腰筋における凍死特異的に発現誘導される遺伝子の同定を行った。その結果、100以上の遺伝子が凍死特異的な発現変動を示した。同定された遺伝子群に対し、Gene ontology解析を行ったところ、ストレス応答や脂質応答、低酸素症への反応などのbiological processに関与していることを明らかにした。腸腰筋におけるこれらの遺伝子群は、凍死、つまり重度の低体温による恒常性維持及び呼吸中枢の麻痺によってその発現が誘導されたことが示唆された。寒冷環境下での恒常性維持に関与する褐色脂肪組織についても同様に解析を行う。本年度に予定していた実験は、6割程度の進展であったが、来年度に予定していた実験の一部を行うことができたため、概ね順調である。凍死の診断は、特異的な所見がないため除外診断に頼らざるを得ず、凍死の確定診断は困難である。より精度の高い法医解剖鑑定を実現するためには、確定診断に有用な新規分子マーカーを同定することは重要である。そこで、本研究は、凍死経過中における生体の恒常性維持システムの分子メカニズムを解明し、多臓器で変動する複数の分子マーカーを組み合わせた新規マーカーの同定を試みた。対象臓器として寒冷暴露時に熱産生を行う腸腰筋に着目した。軽度・中等度・重度(凍死)の低体温を伴うラットモデルを作製し、Next-generation sequencing (NGS)を用いた体温依存的遺伝子発現解析を行ったところ、他群と比較して重度低体温群のみで91のmRNAが2倍以上の発現増加を示した。これら91mRNAに対するGO解析の結果、脂質やストレス、低酸素など様々な生物学的プロセスにこれらの遺伝子が関与していることを明らかにした。qPCRによる詳細な遺伝子発現検討により、4遺伝子が重度低体温特異的に発現変化したことを明らかにした。また、免疫組織化学によりこれらの遺伝子は、体温低下に伴い、激しいふるえ熱産生を行う腸腰筋の組織修復や炎症、再生により誘導されたことが示唆された。同様に熱産生に関与する褐色脂肪組織においても複数の遺伝子が重度低体温特異的な発現変化を示したことを明らかにした。今後、これら複数臓器における遺伝子発現を組み合わせた、凍死の法医分子病理学的診断法を確立する。動物レベルでの一臓器における診断マーカー候補の同定に成功したが、他臓器における解析が必要である。