hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
転写ネットワーク制御による成体脳神経幹細胞の未分化維持・破綻の分子機構解明

転写因子の包括的ネットワーク制御システムによる神経幹細胞の未分化維持・破綻機構の解明のために、成体脳神経幹細胞及び癌幹細胞特異的なmiRNAの新規同定を試みた結果、血管新生、癌細胞浸潤、転移及び細胞増殖に関わるmiRNAを検出した。さらにp53及びTLX依存的に働くmiRNAとしてmiR219とmiR132を同定し、それらの発現ベクターを用いて癌幹細胞のin vivoマウスモデルシステムの構築を試行した。またSox2及びTLXの転写制御下にある転写因子Prx1の機能解析の結果、Prx1がマウス成体脳におけるラジアルグリア様幹細胞の未分化維持機構制御に関わることが示唆された。前年度に引き続き、包括的転写因子ネットワーク制御システムによる成体脳海馬領域における神経幹細胞の未分化維持機構解明のために、成体脳神経幹細胞及び癌幹細胞特異的に発現する遺伝子及びmicroRNAの発現解析を試みた。前年度に得られたマウス成体脳由来培養系神経幹細胞における、核内受容体TLXによって制御される遺伝子及びmicroRNAの包括的データ解析から、血管新生、癌細胞浸潤・転移、細胞増殖に関わるmiRNAがp53及びTLX依存的に制御されることが明らかとなった。これらの結果は長崎医学会雑誌に発表した。定量PCR解析によりmiR219とmiR132がTLXの制御下にあることが明らかとなり、現在、さらなる機能解析のためにこれらのmicroRNA発現用レンチウィルスベクターの構築を行っている。また、TLXの下流遺伝子解析から着目された転写因子Prx1をノックダウンした神経幹細胞のマイクロアレイ遺伝子発現解析から、FGF受容体やp57といった幹細胞制御に関与する遺伝子の発現に関わっていることが示唆された。さらにPrx1遺伝子をマウス成体脳の海馬領域に構成発現させると、神経前駆細胞をラジアルグリア様神経幹細胞マーカー陽性細胞へ再系譜誘導することが明らかとなった。この誘導はin vivo脳特異的な現象であることから、ニッチ依存的にPrx1が幹細胞制御機構に関わっていることが示唆された。これらの結果はThe Journal of Neuroscience誌に報告した。最終年度も前年度に引き続き、申請研究計画に基づく包括的転写因子ネットワーク制御システムによる、成体脳海馬領域における神経幹細胞の未分化維持機構解明のために、成体脳神経幹細胞及び癌幹細胞特異的に発現するmiRNAの機能解析とin vivo細胞種起源特異的癌幹細胞の誘導システムの構築を行った。本申請研究によってTLX制御下にmiR219とmiR132がある可能性が高いことを明らかにしたが、それらmiRNAを組込んだ発現システムを構築した。PCR法によって増幅させたmiR219とmiR132のDNA断片をpSMPUW-miR-GFP-Puroレンチウィルスベクターに導入し、各組換え体を得た。得られたウィルスベクターの細胞感染効果を検討した結果、microRNAを導入するとその感染効率が極端に低下することが分かった(対照比;数十%以下)。感染効率を上げるため、ラージスケールによるウィルスベクター産生法を用いて神経幹細胞に感染導入させると、これらのmiRNAによる細胞毒性誘導効果が検出された。また成体脳神経幹細胞タイプ特異的なグリオーマ癌幹細胞解析システム構築のため、NIT-RFP及びCAG-RFPレトロウィルスベクターに、Flag-TLX-Cre遺伝子を発現するシステムの構築を行った。予備実験でloxP-stop-Smo/EYFPで発現システムを確認し、本実験に移行している。本申請研究期間全体において、成体脳由来神経幹細胞におけるp53及びTLX依存的に変動するmiRNAが明らかになり、それらの発現システムの構築と作用機序の示唆がなされた。さらにSox2-TLX転写因子ネットワークにおいて、転写因子Prx1が成体脳における神経幹細胞の未分化維持機構に重要な役割を果たしていることが明らかとなった。包括的転写因子ネットワーク制御システムによる成体脳海馬領域における神経幹細胞の未分化維持機構解明のために、成体脳神経幹細胞及び癌幹細胞特異的に発現する遺伝子及びmicroRNAの新規同定を試みた。核内受容体TLXによって制御される遺伝子群及びmicroRNA郡を包括的に解析し、その中で決定的に働くものを限定していくことを作業目的とした。p53欠損マウスの交配後、新生児マウスの遺伝子型を判定し、10週齢まで飼育後、野生型及びホモ変異体のマウス脳からbFGFとEGF存在下で増殖する神経幹/前駆細胞を培養樹立した。これらの細胞にTLX発現レトロウィルスベクター(CAG-TLX-IRES-GFP)を感染発現させ、bFGFとEGF存在下で数日間増殖培養した後GFP陽性細胞のみをFACS AriaIIによって分取した。コントロールベクターを加えた感染細胞郡から全RNAを抽出し、マイクロアレイ受託解析サービスにて比較解析を行なった。

その結果、WntやNotch経路に関連する遺伝子群の増減が検出された。さらに細胞増殖や神経細胞分化に関与する遺伝子に変化が見られた。現在その真偽を定量PCR法によって判定中である。またmicroRNAの解析では、細胞周期、細胞死並びにサイトカインシグナリングに関するものに増減が検出された。こちらも定量PCR法によって、その真偽の判定中である。また成体脳神経幹細胞の包括的転写因子ネットワーク制御システムの理解のため、今回神経幹細胞の増殖及び未分化維持制御機構に関与している遺伝子である転写因子Prx1とDNA脱メチル化酵素TET1をノックダウンした神経幹細胞より全RNAを抽出し、同様にマイクロアレイ受託解析サービスにて比較解析を行なった。現在そのデータの解析中である。申請書に記載した平成23年度研究計画に準じて研究を行い、おおむね相当する結果を得ているため。申請書に記載した平成23年度研究実施計画書に準じて研究を行い、それに相応する結果を得ているため。神経幹細胞及びグリオーマ癌幹細胞の重要因子であるTLXの下流因子、及び制御因子(遺伝子、miRNA)の発現誘導系とノックダウン系による細胞生物学的解析を進める。さらに適宜マウス個体を用い、in vitroとin vivoの両観点からその分子生物学的機能解明を試みる。TLXによって制御される遺伝子及びmicroRNAの確定後、それらの発現誘導系及びノックダウン系を構築し、培養細胞レベルの解析並びにマウス個体を用いた解析に発展させる。また新たに神経幹細胞の増殖及び未分化維持制御機構に関与している遺伝子群の解析を進めていく。Prx1及びTET1/2によって制御される遺伝子のプロファイリングとこれらの遺伝子ノックダウンによる機能解析を成体脳由来培養神経幹細胞で行う。さらにTLX誘導性グリオーマ癌幹細胞を用いて、得られたmiRNA発現ベクターやshRNAシステムを導入し、強制ニューロン分化誘導システムを構築する。さらにこれらの細胞を免疫抑制マウスに移植し、新規癌治療モデルの構築を試みる。本年度に得られたデータの精査作業を引き続き行いTLXによって制御される遺伝子及びmicroRNAを確定させ、それらの発現誘導系及びノックダウン系を構築する。その後、培養細胞レベルの解析並びにマウス個体を用いた解析に発展させる。また新たに神経幹細胞の増殖及び未分化維持制御機構に関与している遺伝子群の解析を進め、神経幹細胞と癌幹細胞における働きを検証していく。
大和における古代豪族の支配の領域についての復原的研究

1.大和盆地に活動していた古代豪族の名前を、平安中期以前についてカードをとり、それをコンピュータで処理したところ、次のような結果が得られた。まず、データは平安中期までを収集したわけであるから、その当時までの大和国内の豪族名をあつめたことになる。大和国内では渡来系の秦氏がもっとも多いデータを残しており、かつて、大和盆地に君臨していた、物部,大伴,区勢,平群といった五六世紀代の家族は、在地での地名と関連するような史料にはごくまれにしか名前をのこさなくなっている。このことは、これら五-六世紀の大豪族が中央貴族として八世紀以後は在地との関係をきわめて微弱にしたものであることをものがたっている。また秦氏のような渡来氏族は、上記の大豪族が中央貴族として上昇転化した後ち、大和盆地冬地域に分散発展したものではないかと考えられる。しかし、平群郡にみえる平群氏、葛下郡にみえる葛木氏など、七世紀以前からの根拠地にデータを残しているものもあり、この史料が七世紀以前における古代豪族のあり方を反映した一面もあることを確認した。2.モデルケースとして行った大和盆地、添上郡の場合は、従来は五世紀頃の和尓氏の本処地であったとされていたところである。ここでは、大春日、大宅、和尓部等の和尓系氏族の名称がみえる。大縮尺千分の一の地形図を作成した地域は古代の春日郷の一部と考えられ、春日県主(書紀)大宅氏がいたことが文献史料上確認されるか、後者は根拠地は大宅郷と考えられるから、当該地は春日氏の根拠地としてみてよく、護国神社境内古墳碑などは、風氏の墳墓群とみてさしつかえないと考えられ、また地形からみて岩井川水素を支配したことが地形図から読みとることができる。このように添上郡内でも一括して和尓氏が支配していたというだけでなく、文献,地形図,古墳の分布をつきあわせることによって、小支族のあり方を復元できるようになった。
コンポジットレジンの歯質とのカラーマッチングと物性の向上

エステックス^<TM>オペークの背景色の遮蔽効果と色差の偏移の研究では、以下の結果が得られた。0.5mmの厚さでは、A4、B2、C4とD3がTP値45.946.4の範囲で高いTP値を示し、WOは最も低い30.0を示した。白化偏移率はWOが最も大きく0.5mmの厚さで約67%、1.5mm以上の厚さでは83%以上の偏移率を示し、A2、C1、B2、D3、A4、C4の順に白化偏移率は小さくなった。黒化偏移率はC4が最も高くA4、D3、B2、C1、A2、WOの順に偏移率は小さくなった。色差の変化とL*a*b*値の相関は、全ての試料において二次関数で高い相関が得られた。L*値はb*あるいはa*よりも高い相関を示した。着色象牙質に対する遮蔽予測法の検討では、同一シェードの厚さの違いによるL*値あるいはb*値とTP値は良好な相関関係のあることが判明した。そして、本実験では着色歯のL*値を基にして、その着色を遮蔽するオペークレジンの厚さを算出できることが示唆された。着色歯に対するオペークレジンの厚さの研究では、本実験に使用したA2-oに関して、無着色象牙質および高度着色象牙質から得られた厚さの違いによる色差と高度着色象牙質のL*値とは良好な相関を示した。測色で得られた着色歯のL*値により、必要なオペークレジンの厚さを予測できるものと考えられた。L*値が55以下の場合は約2mm、5570では約1.5mm、7075では約1.0mm程度の厚さのA2-oが象牙質の着色を遮蔽するのに必要であろうと考えられた。試作オペークレジンの遮蔽効果の研究では、着色象牙質に対する遮蔽能と歯冠色レジンとの色差を調べ、その結果、アパタイト被覆型を2.00%配合した試作オペークレジンを0.50mmの厚さで使用すると、良好な遮蔽と歯冠色レジンの色に影響が少ないことが示された。コンポジットレジンは半透明性を有していることから、着色歯質の色調が大きく反映し、シェードガイドをもとに選択したレジンの色が、周囲歯質の色調と一致しなくなることがある。今日、患者側から求められる歯の審美的治療が多くなるにつれて周囲歯質とカラーマッチングする材料学的研究が重要となってきた。そこで、オペークレジンの重要性に着目し、エステックス^<TM>のオペークレジン7種類を用いて背景色遮蔽効果と色差の偏移を調べ以下の結論を得た。1.全て試料は厚さが厚くなる程TP値は減少し、0.5mmの厚さでA4、B2、C4とD3がTP値45.946.4の高い値を示した。2.白化偏移率はWOが最も大きく、A2、C1、B2、D3、A4、C4の順に小さくなった。黒化偏移率はC4が最も高くA4、D3、B2、C1、A2、WO小さくなった。

3.色差の偏移とL^*a^*b^*植相関は、全ての試料において2次関数で高い相関が得られ、L^*値はb^*やa^*よりも高い相関を示した。次に、ポイント4^<TM>のオペークレジンを用いて、着色歯質のL値からオペークレジンの厚さとTP値を予測する手段について検討した。その結果、同一シェードの厚さの違いによるL^*値あるいはb^*値とTP値は良好な相関関係のあることが判明し、本実験では着色歯のL^*値を基にして、その着色を遮蔽するオペークレジンの厚さを算出できることが示唆され、以下の結論を得た。1.本実験に使用したオペークレジンは黒色・白色背景板と黒色・白色象牙質を背景としたTP値の試料の厚さによる減少傾向が類似していた。2.オペークレジンの厚さの違いにおける、TP値とL^*a^*b^*値は良好な相関を示し、L^*とb^*において良好な相関が得られた。3.着色象牙質のL^*値から、近似式を用いて着色に相当するTP値を算出でき、そのTP値からオペークレジンの厚さを予測することが可能と考えられた。コンポジットレジンの透明性を現す指標としてtranslucency parameter(TP値)が用いられている。TP値は白色板と黒色板を背景として、その色差を求めることを基本としており、逆に考えると遮蔽効果の指標として用いることができると考えられる。しかし、各症例ごとにTP値を求め、背景色を遮蔽するオペークレジンの厚さを決めることは臨床的な手法として受け入れにくい。このTP値が半透明性材料に関する背景色の色差をもとに得られることから、白色、黒色象牙質を背景としたオペークレジンの厚さの違いによる色差と、その黒色象牙質背景のL^*値が良好な相関を示すことを利用して、単に測色した着色歯のL^*値からオペークレジンの厚さを予測する方法について報告した。しかし、この予測法が市販の他のオペークレジンにも応用が可能かどうかについての検証はなされておらず、遮蔽に効果的なオペークレジンの厚さを約0.5mm単位で想定できれば、より臨床に即した方法となるものと考えられた。この予測法は分光測色器を臨床応用する際の基本となるものであるが、実際の歯質を使用した場合の遮蔽効果について検証する必要がある。そこで、エステックス^<TM>のオペークレジンを使用して、着色歯のL^*値から必要なオペークレジン厚さを求める方法について抜去歯を用いて検討した。そして、コンポジットレジンのシェードガイドの色彩学的な分類を行い、これらのことについて第12回日本歯科色彩学会において報告を行った。コンポジットレジン修復において、窩底部に着色が存在する場合などには、半透明性を有するために周囲歯質に合わせたシェードを選択したにも関わらず、窩底部の色が浮き出てしまい周囲歯質との色調が合わなくなってしまうということがある。コンポジットレジン修復処置は、前歯部をはじめとする審美性も兼ねた修復材料であるため、周囲歯質との色の調和が治療の成否を左右すると言っても過言ではない。このような観点から、現在、多数のオペークレジンが市販されるようになり、研究されてきているが、コンポジットレジンと同様に半透明性を有するため、審美性は優れるものの背景色を十分に遮蔽するには2.0mm以上の厚さを要するという研究報告もある。そこで、本研究では、背景色の遮蔽に効果のある材料として二酸化チタンの応用を考え、従来のルチル型やアナターゼ型の他にアパタイト被覆型二酸化チタンについて検討した。その結果、市販のコンポジットレジンに各々の二酸化チタンを配合することで背景色遮蔽は得られるが、アパタイト被覆型二酸化チタンはルチル型とアナターゼ型に比べコンポジットレジンの重合硬化に影響が少ないことが示唆された。そこで、アパタイト被覆型二酸化チタンを市販の低粘性コンポジットレジンに配合することで試作オペークレジンを作製し、配合率と厚さの違いによる背景色の遮蔽効果を調べ、アパタイト被覆型二酸化チタンの配合率2.00重量%、0.50mmの厚さで、その上に積層されたコンポジットレジンが各々のシェードに最も影響を示さないという結果が得られた。
ガロア点を用いた射影多様体の分類理論と新展開

ガロア点を用いた射影多様体の分類理論を推進し,他分野との関係の中から新たな発展を創出するという2つを目的とする.これらの目的において用いられる手法はWeierstrass点の一般論,研究代表者の判定法,正標数代数曲線の分岐理論である.また,群論的手法も参考にしたい.研究手法の効果を高める為,群論と代数幾何関連の図書を購入し,関連する研究集会に参加する.新展開創出と他分野の知識吸収の為,符号理論や有限数学関連の図書を購入し,関連する研究集会に参加する.ガロア点を用いた射影多様体の分類理論を推進し,他分野との関係の中から新たな発展を創出するという2つを目的とする.これらの目的において用いられる手法はWeierstrass点の一般論,研究代表者の判定法,正標数代数曲線の分岐理論である.また,群論的手法も参考にしたい.研究手法の効果を高める為,群論と代数幾何関連の図書を購入し,関連する研究集会に参加する.新展開創出と他分野の知識吸収の為,符号理論や有限数学関連の図書を購入し,関連する研究集会に参加する.
tRNA様small RNAの機能解析

本研究の究極の目的は、乳酸菌にあるtRNA様small RNAの存在意義を明示し、生体への影響を解明することです。これまでに我々は、乳酸菌に存在するtRNAイソロイシン様のsmall RNAはIleではなくGlyを結合し、翻訳に利用されていない可能性があることを示しました。また、当該RNAは環状化構造をとる性質を併せ持っており、コドン翻訳以外の場所で機能している可能性が生じています。これら研究成果をさらに発展させるべく、本研究では「tRNA様small RNAの機能を解明」することを目指します。
脳血管疾患に対する静磁場刺激の効果とメカニズムの解明

経頭蓋磁気刺激は近年注目されている非侵襲的脳刺激法である。小型磁石による静磁場刺激により、神経活動を抑制する作用を有することがヒトを対象とした研究で報告されている。脳血管疾患は、一側の脳損傷により、半球間の神経活動バランスが不均衡となり、機能障害に影響を及ぼすと考えられている。静磁場刺激はその不均衡を是正する新規のニューロモジュレーション手法として期待されている。本研究課題では、脳血管疾患への応用を目的とした臨床研究、静磁場刺激の作用メカニズム解明を目的とした医学的基礎研究の2点から研究を行っている。臨床研究では、脳血管疾患患者への応用に向けた前段階として、健常者の一次運動野に対する静磁場刺激が対側半球に及ぼす影響について検証した。先行研究通り、刺激側の脳活動が抑制されることを示した。さらに、非刺激側の脳活動を一時的に高める作用が認められた。今後、別の神経生理学的指標を用いて、静磁場刺激の効果を検証していく予定である。医学的基礎研究ではマウスの脳スライスを用いて、静磁場刺激が神経活動に与える影響について解析している。電気生理学的手法により、ヒトで確認されている静磁場刺激による神経活動抑制作用を、細胞レベルで再現することができた。具体的には、静磁場刺激により、細胞膜の透過性が亢進し、神経細胞の発火閾値が上昇することが示された。今後は、その作用メカニズムを解明するための実験を継続していく予定である。当該年度では、静磁場刺激の効果について、ヒトおよび細胞レベルで検証し、一部成果について国内外の学会で発表した。論文作成に向けた準備も進めており、順調に進展していると考える。静磁場刺激の効果およびメカニズムを、ヒト、細胞レベルの両側面から明らかにする。当該年度は効率よく実験が遂行できたため、物品費を抑えることができた。一方、該当年度中に、所属先変更となり、実験環境の整備が必要となった。繰り越した費用については、基礎研究に用いる物品、実験資材、試薬等に使用する。また、所属先の変更に伴い学会参加には航空機の利用が必要となるため、移動費として使用する予定である。
樹木内生菌・病原菌類の伝播にマングローブ植物の散布体はどう寄与しているか

マングローブ植物の多くは、種子が樹上で発芽し、遠距離に散布され、定着後急速に成長する。この過程を通じて内生菌・病原菌の感染可能性は大きく異なった。内生菌・病原菌の種数・感染率の低い散布体は、定着先に樹木寄生菌を運ぶ「乗り物」たり得るが、定着後の茎葉の菌類組成を規定してはいない。稚樹・成木茎葉の内生菌・病原菌は、散布体経由よりも外部からの胞子感染が主要な感染経路であり、その感染に潮汐による冠水の影響を強く受けると示唆された。自然度の高い西表島西部地域のマングローブ林と、人為の影響の強い沖縄島東海岸のマングローブ林を調査として、マングローブ植物の茎葉と散布体(種子が樹上にのこったまま発芽したもので、これが落下し海上を漂流後、新たな場所に定着して実生苗として成長する)からの内生菌の分離試験を試みた。琉球列島のマングローブを構成するヒルギ科3樹種において、茎葉から優占的に分離される樹木内生菌は4菌種あるが、これら菌種が、散布体からは低頻度で分離された。散布体組織における樹木内生菌の種数や総分離率は、いずれも、茎葉の組織よりも明らかに小さかった。このことは、散布体は、低頻度ながら内生菌を寄生させて散布されるという点において、漂着し・定着する先で形成されるマングローブ林に菌を運搬する乗り物としての機能を相当程度は果たしていることを意味する。しかし、成木の茎葉における内生菌の多様な種組成や高い分離頻度は、散布体への内生菌寄生頻度を直接に反映したものではないことが示唆される。一方、ヒルギダマシ科のヒルギダマシにおいては、自生地外の沖縄島の埋め立て地の造成林の茎葉において、天然林の個体の場合とは大きく異なる種構成・分離頻度の菌種が、見いだされた。また、散布体の内生菌分離頻度は極めて低かった。以上のことから、マングローブ植物の茎葉の内生菌相は、散布体による運搬により伝播可能であるとはいえ、むしろ、周囲のマングローブ林や陸上森林からもたらされる胞子による感染の方が大きく寄与している可能性がある。それが事実であれば、森林の生物多様性の維持にとって重要な知見であると言え、上記の現象が再現されるか、同一調査地で、引き続き経時的に内生菌相の調査を継続する必要がある。人為の負荷の強い沖縄島のマングローブと、自然度の高い西表島のマングローブとに設けた調査区において、メヒルギとヒルギダマシを対象として、果実・樹上の散布体・漂流している散布体の幼組織、定着間もない稚樹の茎葉・低樹高の成木・高樹高の成木の茎葉を、それぞれ適切な時季に採取し、植物組織からの菌類の分離を行った。同一調査地の隣接する個体を比較すると、実生成木樹冠下部の水没位置の茎葉からは、メヒルギ成木の冠水しない樹冠上部よりも一般に内生菌の総分離率が低く、菌種構成も単純だった。散布体組織からの内生菌分離率はしばしば低かった。散布体や実生苗の菌種組成をみると、メヒルギ成木樹冠上部でふつう優占する内生菌群があまり出現しなかった。また、散布体を時系列的に採集して菌類の分離率や種構成を比較すると、散布体は、樹上で成熟中にも、林床で漂流または定着成長している間にも、内生菌感染が進まなかった。一方、メヒルギ枝枯病菌のような病原菌は、散布体、実生苗、成木を問わず、健全組織からはほとんど分離されなかった。散布体は低率ながら多様な菌類(主に内生菌類)を感染させて散布されていく点で内生菌の「乗り物」となり得ているが、それらの菌類は、散布体が定着した先で伸長させた茎葉組織には、そのまま優先的に侵入していけるわけではない。茎葉では、しばしば感染能力が非常に高い別の樹木内生菌群に取って代わられていく。しかし、実生苗など低樹高のマングローブ個体の茎葉は、潮汐の影響で冠水することもあり、菌類にとって感染環境が厳しいと推測され、高樹高の成木樹冠に比して内生菌の感染率が低い、すなわち、茎葉組織に内生菌が飽和しない可能性がある。自然度の高い西表島のマングローブ林で、メヒルギの果実・樹上の散布体・漂流している散布体の幼組織、定着間もない稚樹の茎葉・低樹高の成木・高樹高の成木の茎葉を、それぞれ適切な時季に採取し、植物組織から菌類を分離した。メヒルギの果実は、初夏に主に成木の樹冠上部につき、その位置の茎葉からは多種の内生菌が分離され、内生菌の総分離率も高い。

果実内で発芽した幼植物体では、同一枝の茎葉に比して、内生菌の菌種数も分離率も著しく低かった。この幼植物体(散布体)は数ヶ月間樹上で成長し、果実を破って胚軸が長く伸び、翌春に落下して漂流する。この過程を通じて、胚軸・子葉から分離される内生菌の種数・分離率は顕著に上昇しなかった。漂流後の散布体は、好条件の場所に流れ着くと発根して胚軸を直立させ、成長を始める。こうした稚樹が出す葉は、潮汐により毎日冠水する高さにある。この葉からの内生菌分離率・菌種数は、成木の樹冠上部よりも著しく低いが、時として高率で内生菌が分離される葉もあった。これは、成木の樹幹下部の茎葉と似た傾向であった。一方、成木の樹冠上部では、メヒルギ枝枯病の感染・発病による枝の枯れ下がりや、病原の特定されない梢端の壊死が、活発に起こっている。成木の樹幹下部や稚樹では、病原の特定されない梢端の壊死は活発に起こったが、メヒルギ枝枯病は、明らかに発生しているものの激害枝は少なかった。同病は、果実や散布体の組織からは全くみいだされなかった。このように、散布体と成木の茎葉では内生菌・病原菌の感染可能性が大きく異なり、したがって散布体は定着先に樹木寄生菌を運ぶ「乗り物」となり得ているが、定着後の茎葉の菌類組成を規定してはいない。一方、稚樹・成木の茎葉の組織にいる内生菌・病原菌は、外部からの胞子感染がその主要な感染経路であり、その過程で、潮汐による冠水が感染・発病に強く影響しているといえる。メヒルギとヒルギダマシを対象に、散布体から稚樹・成木にいたる茎葉の内生菌相について、沖縄島と西表島で明らかした。また、両樹種に優占的な多犯性の内生菌種について、茎葉への接種試験による感染性を検討した。以上は目標を十分に達成している。分離菌株の種同定が遅れており、今年度中の解決を目指す。また、散布体が樹上から落下漂流し定着成長する過程での樹木寄生菌相の時系列的変化については、昨年から実験を始め、今年度の実験で十分知見が得られる見通しである。散布体の組織解剖は今年度本格的に行う。菌類の拮抗性は予備試験で困難があり再検討して行う。24年度が最終年度であるため、記入しない。今年度は最終年度であり、マングローブ樹種のうちメヒルギとヒルギダマシに集中して検討を行い、まとまった成果を出すこととしたい。具体的には、メヒルギの散布体に優占的な不稔菌の種同定を始め、樹木内生菌の種同定を重視する。また、散布体が樹上から、落下漂流し、定着成長する過程での茎葉の樹木寄生菌相の時系列的変化について、今年度の実験で確実に追跡し、稚樹と成木など、樹冠が潮汐により日々冠水する低樹高の個体と満潮位よりも樹幹が上に届く高樹高の個体の間で、樹木寄生菌相が異なるという、陸上森林と異なる、マングローブに特徴的な現象について、確証的な知見を得て、本研究の中心的な成果としたい。一方、菌類の交互接種による拮抗性等の検討については、方法を再検討しつつ配分可能なエフォートの範囲で効果的に実施する。
PU.1によるマウス赤白血病細胞の分化抑制、アポトーシスに関わる遺伝子の単離

PU.1は骨髄単球系細胞およびBリンパ球系細胞の分化に必須な転写因子である。一方、赤血球系細胞における活性化がマウス赤白血病(MEL)発症の原因のひとつである考えられている。我々は発現ベクターによりPU.1を過剰発現したMEL細胞に分化誘導剤DMSOを投与しても分化誘導は起こらずアポトーシスが誘導されることを見い出した。本研究においては、Differential Display(DD)によりこの過程で発現が変化する100個の既知遺伝子と151個の未知遺伝子を単離・同定した。発現の上昇した既知遺伝子には、細胞周期や細胞増殖に関与するもの、骨髄単球系細胞やBリンパ球系細胞の分化の関与するものが、一方、発現の低下した機知遺伝子には、ミトコンドリアの機能に関わるのもが含まれており、これらの遺伝子がMEL細胞の分化抑制やアポトーシスに関与するものと考えられた。またPU.1を過剰発現したMEL細胞では、DDにより単離された以外にもGM-CSF受容体や、CD19など骨髄単球系やBリンパ系細胞の特異的な遺伝子の発現が上昇しており、細胞は付着性になり、ラテックスビーズに対する貪食能も認められ、さらにアポトーシスはGM-CSFの投与により部分的ではあるが回避された。これらの結果から、PU.1の過剰発現よりMEL細胞の分化方向がシフトしているものと考えられ、このことと分化抑制との間に関連がある可能性が推察された。一方、発現の上昇した未知遺伝子の中には、筋肉細胞や神経細胞の分化や生存、マクロファージの活性化等に関わる転写因子MEF2Cに一部相同性を持つものが存在した。現在この遺伝子のクローニングを進めている。今後は、今回単離された遺伝子について遺伝子導入実験等を用いてMEL細胞の分化抑制、アポトーシスへの関与を明らかにしていきたいと考えている。PU.1はEtsファミリーに属する転写因子であり、その活性化がマウス赤白血病(MEL)の発症に関与すると考えられている。我々はPU.1遺伝子の亜鉛誘導性発現べクターを導入したMEL細胞(PU.1細胞)に塩化亜鉛とともに分化誘導剤であるDMSOを投与すると、分化の誘導は起こらずアポトーシスが誘導されることを見い出し報告してきた。今回、これらの現象の誘導に伴い発現の変化する遺伝子の同定をDifferential Display(DD)法により試みた。塩化亜鉛とDMSOの同時投与前ならびに投与後24、48、72時間のPU.1細胞からRNAを抽出しDDを行った。シグナルに変化の見られたcDNA断片については、コントロールとして用いた細胞(塩化亜鉛あるいはDMSOを単独で投与したPU.1縦胞、および塩化亜鉛とDMSOを同時に投与したmock細胞)由来の対応するシグナルの変化と比較し、その変化が分化抑制およびアポトーシスの誘導時に特異的であることを確認した。上記の条件下で発現の変化するクローンは61であったが、そのうち24クローンは既知の遺伝子であり37クローンは未知の遺伝子であった。既知の24遺伝子のうち発現が増加したものは4遺伝子であり、その中にはmitochondrial tRNA geneなどが含まれていた。また発現が減少した20遺伝子のなかには、血球系細胞の増殖への関与が知られているnucleosome assembly protein 1(NAP-1)related geneや、神経系細胞の分化や機能に関与すると考えられているcerebellar degeneration related(cdr)gene 2,catechol O-methyltransferase(COMT)gene,monocarboxycylate transpoter(MCT1)gene,neural dfferentiation-associated gene,p205などが含まれていた。

昨年度に引き続き、PU.1の適剰発現によりMEL細胞に誘導される分化抑制およびアポトーシスの過程で発現の変化する遺伝子の同定をDifferential Display法により行い、これを完了した。全251遺伝子のうち、発現の上昇したものは138であり、そのうち37は既知の遺伝子であった。発現の低下したものは113であり、そのうち63は既知の遺伝子であった。現在、既知の遺伝子、未知の遺伝子のそれぞれについて以下に述べる解析を行っている。既知の遺伝子の中には、PU.1が本来発現している骨髄単球系細胞の分化に関わるosteopontin、B144、eosiniphil cationic protein等の遺伝子が含まれており、これら遺伝子の発現は上昇していた。そこでPU.1を過剰発現したMEL細胞での骨髄単球系細胞特異的遺伝子の発現誘導に注目してRT-PCRを行い、C/EBPα、C/EBPε、GM-CSF受容体、G-CSF受容体、M-CSF受容体、myeloperoxidase、CD18等の遺伝子発現が上昇することを明らかにした。これらの細胞のnitro blue tetrazolium還元能は著しく上昇しており、またラテックスビーズに対する貧食能も認められた。さらにこれらの細胞にGM-CSFを投与すると付着性の細胞が多数出現し、部分的にではあるがアポトーシスが回避された。これらのことから、PU.1はMEL細胞において単に分化を阻害するだけでなく、細胞分化の方向を骨髄単球系細胞へとシフトさせうることが示された。またPU.1の過剰発現により発現が誘導される未知の遺伝子の中に、筋肉細胞や神経細胞の分化や生存、マクロファージの活性化等に関わる転写因子MEF2Cに一部相同性を持つものが存在した。現在この遺伝子のクローニングを進めており、MEL細胞の分化抑制およびアポトーシスヘの関わりを追求していく予定である。
コンピュータを活用した学習場面での幼児のコミュニケーション過程について

本年度は、昨年度の結果をふまえて、普段の幼稚園生活でコンピュータを活用している場面を参与観察することにより、幼児にとってコンピュータ活用場面がどのようなコミュニケーションを形成しているのかを分析・考察した。その結果、幼稚園でコンピュータ活動を行う子どもたちについて、1)日常のほかの遊びとはまた違った「コンピュータ遊び特有のグループ」をもっている、2)コンピュータが友達とけんかをした時や、幼稚園になじめない時の「避難場所」「自己回復の場所」になっており、コンピュータ遊びをした後、集団(仲間・クラス)に戻っている、ということが明らかになった。1)については、他の遊びなどで見られる「仲良しグループ」ではなく、使用ソフトやその時々の興味や関心による「コンピュータ遊び特有の」友達との遊びが多いことから言える。2)については、コンピュータという応答性の高い遊具を使って一人でじっくり満足するまで遊びこむことで、相手に表現できなかった自分の思いを表現して満足させたり、けんかによって生まれた感情を落ち着かせたりすることができるためではないかと考えられる。また、日本の幼稚園の文化になじめず、情緒不安定だった帰国子女である幼児の例からも明らかになった。なお、昨年度の実験結果と異なり、今年度は、コンピュータ遊びから次の活動を展開するようなことはなかった。コンピュータが園の一部になった幼児たちには、他の遊び同様、先生の言葉がけが遊びのつながりや方向性を大きく決定することが明らかになった。さらに、先生たちのコンピュータ遊びを見る視点や子どもへの保育の考え方に変化が起きたため、「待つ」「見守る」保育の見直しが先生たちの間で行われ、実践されることにより、普段の保育活動がより充実し、先生として成長したと先生たち自身が満足感をもち、さらに保育についてより深く考えることができたと感じていることも明らかになった。本年度では、幼児が複数(2人)でコンピュータを用いて遊ぶ時、どのようなコミュニケーションを行っているのか実際に遊んでいる過程を分析することを目的とした予備実験およびフィールドワークによる観察を行っており、そこでは本実験を行うにあたっての環境構成上、留意しなければならない知見を得た。この結果はまた、本研究が目的としている、幼児のコミュニケーションの促進に影響する環境要因の1つとも考えられるものであり、幼児教育におけるコミュニケーションを促すマルチメディア環境の構成に関する留意点にも参考になるものと考える。大阪のH幼稚園における予備実験では、幼児の遊ぶソフトのテーマを絵本、音楽およびの2種類について、それぞれ幼児のコミュニケーション過程がどのようなものかを会話分析を中心に検討した。その結果、ソフトのテーマに関係なく、幼児たちは2人で楽しみながら遊んでいることが明らかになった。また、遊びながら感想を聞いたり話したりして、一人だけの遊びになっていないことも明らかになった。しかし、幼児によっては、やはり一人でじっくりやりたいという子もいた。この予備実験の結果を検討するために、名古屋のM幼稚園においてフィールドワークを行った。ここでは、集団遊びがあまり好きではないと教諭も心配している幼児以外は、ほぼ複数でコンピュータ遊びをしており、予備実験の環境に非常に近い環境である。フィールドワークの結果、主に次の2点が明らかになった。1)コンピュータで遊ぶ時の幼児の遊び仲間は、他の遊びでの仲間集団と異なる、2)コンピュータで遊ぶ時の幼児の遊び仲間は、異年齢集団になっている。以上の結果より、本実験ではソフトの種類を増やすだけでなく、1)普段から仲のよい幼児どうしでグループを形成するだけでなく、さまざまなグループパタンで行う、2)異年齢によるグループを作る、ということも検討する必要があるのではないかということが明らかになった。
疼痛伝達増幅機序の解明と難治性疼痛克服戦略

手術切開による組織神経損傷が1次、2次求心性知覚神経修飾に与える影響を,術後痛モデルを用いて確認した。術後痛モデルとして後足、眼窩下神経を切開し、逃避反応並びに病的行動を評価した。末梢神経活動は皮膚ー腓骨神経標本にて活動電位を測定した。1)脊髄後角における手術侵襲によるBDNF過剰発現はマイクログリア活性抑制薬により抑制されなかった。2)D2受容体は脊髄レベルにおいて、手術侵襲により障害・修飾を受けなかった。3)末梢神経においてPAR-2受容体の活性化が術後痛の発生に関連していることが明らかとなった。4)術後痛に対する電離還元水素水の影響は一定の結果を得られていない。手術切開による組織神経損傷により放出されるBDNF, NGF、乳酸の1次、2次求心性知覚神経修飾に与える影響を確認するために、1)足底切開を加えた術後痛モデルにおいてBDNF過剰発現がマイクログリア活性抑制薬のミノサイクリンにより抑制を受けるのか、また、ミノサイクリンは抗侵害作用を示すのか、2)抗酸化作用をもつ電離還元水素水によりBDNFの産生が抑えられ、抗侵害作用につながるのか、3)電離還元水素水により手術後の病的行動が変化するのかを検討した。によりD2レセプター作動薬、拮抗薬な脊髄内投与が、どのような侵害作用を示すかを検討した。ヤクシュらの方法により脊髄カテーテル挿入、1週後、ブレンナンらの方法によりラット後足切開を加え、術後痛モデルラットの作成を作成した。抗侵害作用は薬剤投与後、機械刺激、赤外線熱刺激試験にて経時的に評価を行った。病的行動評価はTraffiCagesystemを用い、自発的運動量を測定することにより評価した。1)足底切開により手術側脊髄後角でのBDNF過剰産生が認められた。この過剰産生はミノサイクリンでは抑制されず、また、ミノサイクリンは抗侵害作用を示さなかった。2)電離還元水素水の経口投与により熱刺激による抗侵害作用が認められたが、その作用は一過的であった。さらに電離還元水素水によりBDNF過剰産生は何の影響も受けなかった。3)電離還元水素水の病的行動に与える影響は現在一定の見解が得られていない。以上より、足底切開による脊髄BDNF過剰産生はこれまで考えられていたミクログリア由良腕ある可能性は低く、1次求心性神経終末より放出されていることが示唆された。また、電離還元水素水の抗侵害作用はBDNF産生抑制によるものではなく、その作用機序を明らかとするためには、病的行動への与える影響と同様に、さらならなる検討が必要である手術切開による組織神経損傷による1次、2次求心性知覚神経修飾に与える影響を確認するために、1)足底切開術後痛モデルにおいてBDNF過剰発現がマイクログリア活性抑制薬のミノサイクリンにより抑制を受けるのか、また、ミノサイクリンは抗侵害作用を示すのか、2)三叉神経の第2枝である眼窩下神経切断モデルにて抗酸化作用をもつ電離還元水素水が抗侵害作用を持ち手術後の病的行動が変化するのか、さらに三叉神経節にてBDNFの産生に影響を及ぼすのかを検討した。ブレンナンらの方法によりラット後足切開を加え、術後痛モデルラットの作成し、眼窩下神経切断モデルは眼窩下神経を露出しその部分切断を行うことにより作成した。抗侵害作用は、機械刺激、赤外線熱刺激試験にて評価を行った。また、ラット脊髄、三叉神経節のをBDNF産生量を免疫組織学的にを定量した。1)足底切開により手術側脊髄後角でのBDNF過剰産生が認められたがミグログリアの活性化は術後早期には確認できなかった。この過剰産生はミクログリアの抑制薬であるミノサイクリンでは抑制されず、また、ミノサイクリンは抗侵害作用を示さなかった。2)眼窩下神経切断モデルでは術後神経過敏状態の正確な評価ができない状態である。したがって電離還元水素水の抗侵害作用、ならびに、三叉神経節でのBDNF産生は現在のところ評価できていない。また、病的行動は眼窩下神経切断に切断により増加傾向を示した。以上より、足底切開による術後早期の脊髄BDNF過剰産生はミクログリアからのものである可能性は低く、1次求心性神経終末より放出されていることが示唆された。また、眼窩下神経切断による病的行動増加の機序、ならびにこのモデルにおける抗酸化作用の役割を明らかとするためには、さらならなる検討が必要である。手術侵襲による、BDNF過剰産生の発生源、また、過剰産生が行動に与える影響についての研究は、一定の成果を上げることができ、研究内容は学術論文として公表した。新たな、顔面領域での術後痛モデルを用いた研究では、その抗侵害作用や、病的行動の評価が一定していない。しかしながら、現在までの経験と改良を行い、評価がある程度可能になってきている。また、三叉神経節を用いた免疫組織化学的な研究は、豊富な経験を持っている研究者の協力を得て、進める予定である。

手術切開による組織神経損傷による1次、2次求心性知覚神経修飾に与える影響を確認するために、1)足底切開を加えた術後痛モデルにおいてBDNF過剰発現がマイクログリア活性抑制薬のミノサイクリンにより抑制を受けるのか、2)D2アゴニスト、アンタゴニストの投与によりD2受容体を介した抗侵害作用が逆説的に変化するのか、3)PAR-2受容体の活性化が術後痛の発生に関連するのかを検討した。ラット後足切開を加え、術後痛モデルラットの作成を作成し、眼窩下神経切断モデルは眼窩下神経を露出しその部分切断を行うことにより作成した。抗侵害作用は薬剤投与後、機械、赤外線熱刺激試験にて経時的に評価を行った。末梢神経記録は皮膚ー腓骨神経標本にて測定した。病的行動評価はTraffiCagesystemを用い、自発的運動量を測定することにより評価した。また、BDNF産生量は免疫組織学的に定量した。1)足底切開によりBDNF過剰産生が認められたがミグログリアの活性化は術後早期には確認できず、ミクログリアの抑制薬であるミノサイクリンによりは抑制されず、また、ミノサイクリンは抗侵害作用を示さなかった。2)D2アゴニストは濃度依存的な抗侵害作用を示したが、そのアンタゴニストはなんの効果も示さなかった。3)PAR-2受容体アゴニストにより自発痛の増加、熱、機械刺激による疼痛閾値の低下がみられ、末梢神経記録において自発的また、熱機械刺激による活動電位発射の頻度増加を認めた。以上より、足底切開による術後早期の脊髄BDNF過剰産生はミクログリアからのものである可能性は低く、1次求心性神経終末より放出されていること、D2受容体の修飾や障害は起きていないこと、PAR-2受容体の活性が術後痛と関連していることが示唆された。手術切開による組織神経損傷が1次、2次求心性知覚神経修飾に与える影響を,術後痛モデルを用いて確認した。術後痛モデルとして後足、眼窩下神経を切開し、逃避反応並びに病的行動を評価した。末梢神経活動は皮膚ー腓骨神経標本にて活動電位を測定した。1)脊髄後角における手術侵襲によるBDNF過剰発現はマイクログリア活性抑制薬により抑制されなかった。2)D2受容体は脊髄レベルにおいて、手術侵襲により障害・修飾を受けなかった。3)末梢神経においてPAR-2受容体の活性化が術後痛の発生に関連していることが明らかとなった。4)術後痛に対する電離還元水素水の影響は一定の結果を得られていない。手術侵襲による、BDNF過剰産生の発生源、また、過剰産生が行動に与える影響についての研究は、一定の成果を上げることができ、現在論文を投稿中である。経口電離還元水素水の抗侵害作用を見る行動評価は予定通りに進行しているが、病的行動評価は現在検討中で、一定の見解が得られていない。電離還元水素水のBDNF産生に与える影響に関し、足底切開モデルでは手術侵襲でBDNF過剰酸性が捉えすのが主義的に大変困難で、これは、最近使用を始めた、抗体によるものであるのか?もしくは脊髄標本を作製する過程に何か問題があるのかを確かめる必要性がある。したがって、今後は、脊髄内でのBDNF産生ばかりでなく、三叉神経切開モデルを用い、三叉神経節での確認も行う予定である。平成28年度は、眼窩下神経切断モデルを用いた経口電離還元水素水の術後痛に対する作用を検討するとともに、三叉神経節の神経切断による影響を免疫組織学的に検討する予定である。さらに、全身麻酔後の術後譫妄や覚醒遅延に与える影響を検討するため、吸入麻酔薬による全身麻酔後の行動評価をラットの年齢別に行う予定である。これらの評価が可能となったのちには、術後譫妄や覚醒遅延に与える電離還元水素水の抗酸化作用についての検討を加える。
マウスGemininの発生工学的手法を用いた機能解析

Gemininは、mitosisの間にだけに分解される分子を網羅的にスクリーングすることによつて発見された分子である。G1期には全く存在しないが、S期からG2期、M期の開始にかけて蓄積し、有糸分裂の中期(metaphase)から後期(anaphase)への移行期に急速に消失する。このタンパク量の急激な変化はAPC/Cによるユビキチン化によって分解を受けるためである。また、Gemininを過剰発現するとDNA複製が抑制されることから、DNA複製のライセンシングに関与する分子であると考えられてきた。このように細胞周期の進行に強く関わっていると考えられる分子Gemininのノックアウトマウスを作製することによって、そのin vivoでの生物学的役割を検討することが本研究の目的である。Geminin遺伝子をクローニングし遺伝子構造を明らかにした後、Cdt1結合領域をコードするエクソンをネマイシン耐性遺伝子に置換するターゲティングベクターを作製し、定法に則りノックアウトマウスを作製したところ、胎生早期に致死であることが確認された。現在までの解析では、ノックアウト胚は胎生7.5日には観察されていない。このような胎生初期の死亡からも細胞の正常な分裂に必須の分子であることが予想される。一方、2004年には、Gemininは、Polycomb遺伝子との相互作用によって、Hox遺伝子を制御することが報告された。今後は、分化におけるHox遺伝子との相互作用も検討したいと考えている。Gemininは、mitosisの間にだけに分解される分子を網羅的にスクリーングすることによって発見された分子である。Geminin遺伝子をクローニングし遺伝子構造を明らかにした後、Cdt1結合領域をコードするエクソンをネマイシン耐性遺伝子に置換するターゲティングベクターを作製し、定法に則りノックアウトマウスを作製した。さらにGemininは、DNA複製制御に必須の分子と考えられるので、胎生早期致死である可能性が大きいので、Geminin遺伝子をlox配列で挟んだタイプのベクターを作り、組織特異的にノックアウトすることを目指す。さらに、GemininはAPC/Cによって分解を受けるが、APC/C認識配列が決定されている。そこで、その認識配列に点変異を導入するノックインマウスを作製する。このマウスは、Gemininが分解を受けることができずに安定化することが予想される。このような三種のノックアウトベクターを構築した。Geminin遺伝子欠損マウスは胎生致死であることが、すでに判明した。来年度は、組織特異的ノックアウトマウスやノックインマウスの作製と同時に胎生致死の原因について検討する予定である。
歯状回神経細胞の発達における知的障害・精神疾患関連Rhoシグナル伝達系の機能解明

今年度は、脳組織におけるRac1、Rac3およびCdc42の発現を免疫組織染色によって解析した。新生仔マウス脳におけるRac1の発現を検討したところ、海馬錐体細胞と歯状回顆粒細胞で発現が見られるとともに、歯状回へ移動中の幼若神経細胞での発現が見られた。Rac3およびCdc42についても数種類の抗体を使用して内在性分子の検出を試みたが、脳組織における発現を確認できなかった。昨年度までに、in vivoエレクトロポレーションによる遺伝子導入法により、低分子量Gタンパク質Rac1、Rac3およびCdc42の発現を抑制すると、新生仔マウス海馬歯状回顆粒細胞の配置に異常が見られることを明らかにしている。今年度は、これらの低分子量Gタンパク質の歯状回の発達における機能を詳細に検討した。まず、これらの分子の発現抑制による歯状回顆粒細胞の配置異常の程度を比較した。その結果、Cdc42の発現を抑制した場合に比べてRac1およびRac3を抑制した場合の方が、より多くの細胞で配置異常が見られることがわかった。次に、歯状回顆粒細胞への分化に対する影響を検討した。その結果、Rac1の発現を抑制した場合には、歯状回顆粒細胞のマーカーであるProx1を発現している細胞の割合が減少していた。一方、Rac3およびCdc42の発現を抑制した場合には、そのような影響は見られなかった。これらのことから、新生仔マウス海馬歯状回顆粒細胞の発達過程では、Rac1、Rac3およびCdc42は、それぞれ異なる様式で機能していると考えられた。新生仔マウス海馬歯状回顆粒細胞の発達における低分子量Gタンパク質の機能解析については、学術論文として研究成果をまとめ、国際学術誌に掲載されることが決定している。さらに解析を進めた結果、Racによる歯状回顆粒細胞の発達制御に関与する、細胞内情報伝達経路についての知見も得られ始めている。これらのことから、本研究はおおむね順調に進展していると考えている。今後は、Racによる海馬歯状回顆粒細胞の発達制御に関与する、細胞内情報伝達経路について解析を進めていく予定である。私共の最近の解析から、Rac情報伝達系のアダプター分子であるCNK2の発現を抑制すると、歯状回顆粒細胞の配置に異常が見られることが分かってきた。CNK2は、X連鎖知的障害との関連が知られており、知的障害の病態を考える上で重要な分子の一つである。そこで、CNK2を中心とする分子ネットワークの機能解析を進める予定である。私共は、昨年度までに、新生仔マウスを用いたin vivoエレクトロポレーションによって、海馬歯状回神経細胞へ外来遺伝子を導入する手法を確立した。今年度は、この新規遺伝子導入法を用いて、新生仔期から生後発達期のマウス海馬歯状回神経細胞の発達における、低分子量Gタンパク質Racの機能解析を行った。生後0日のマウス脳にGFP発現ベクターと共にRac1の発現を抑制するベクター(ノックダウンベクター)を注入し、エレクトロポレーション法による遺伝子導入を行った。そして、21日後に脳組織切片を作製し、GFP陽性細胞の歯状回における分布を形態学的手法により解析した。その結果、Rac1をノックダウンした歯状回神経細胞は、歯状回顆粒細胞層での局在に異常が見られた。これらの局在異常を示した細胞の性質を、歯状回顆粒細胞の分化マーカーによる染色により解析したところ、成熟した顆粒細胞の性質を有していることが分かった。遺伝子導入してから4日後に、移動中の歯状回神経細胞の形態を詳細に解析したところ、神経突起の形成が抑制されていることが分かった。Racには、Rac1、Rac2、Rac3の3種類の分子が存在し、脳組織においてはRac1とRac3が発現していることが知られている。そこで、Rac3についてもノックダウン実験を行った。その結果、Rac3をノックダウンした場合にも、新生仔期に産生された歯状回神経細胞の局在異常が見られた。これらの結果から、新生仔期に産生された歯状回神経細胞の移動には、Racが重要な役割を果たしていると考えられた。今年度は、私共が独自に確立した新規遺伝子導入法により、新生仔期に産生される歯状回神経細胞の発達過程で、Racが重要な役割を果たしていることを明らかにできた。この結果は、私共の確立した新規手法が有用であることを示唆しており、研究の進展が期待できる。1年目で標的とする分子経路を特定できたため、おおむね順調に進展していると考えている。私共は、昨年度までに新生仔マウスを用いたin vivoエレクトロポレーションによる海馬歯状回神経細胞への遺伝子導入法を確立した。この方法により低分子量Gタンパク質Rac1あるいはRac3の発現を抑制すると、歯状回神経細胞の配置に異常が見られることを明らかにしている。今年度は、歯状回神経細胞の発達におけるRac1およびRac3の機能相関について検討した。新生仔マウス脳にRac1とRac3の発現を抑制するベクターを同時に遺伝子導入し、21日後に脳切片を作製し顕微鏡観察を行った。その結果、Rac1あるいはRac3を単独で抑制した場合と比べて有意な差は見られなかった。また、他の代表的な低分子量Gタンパク質であるCdc42の発現を抑制した場合にも歯状回神経細胞の配置異常が見られたが、その程度はRac1やRac3の発現を抑制した場合よりも弱かった。