hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
ホヤ幼生におけるキラルな筋原線維の形成原理と動作原理の解明

動物が示す運動の多くにはキラリティーが見られ,また生体高分子もふつうキラリティーをもつが,細胞がキラルな構造体/運動体であるとの認識は一般的ではない。我々は,海産動物ホヤのオタマジャクシ幼生の運動機構を研究する中で,(1)ホヤ幼生が右ネジ方向に螺旋を描きながら泳ぎ上がる性質をもつこと,またそのホヤ幼生の尾部の筋肉細胞は左右対称に配置されているが,(2)細胞内部の筋原線維は左右いずれにおいても左螺旋のネジレを持つことを見出した。本研究は,この筋細胞の「螺旋性ができる仕組み」を明らかにするとともに,ねじれた筋原線維が「個体運動レベルの螺旋性を生み出す仕組み」を解明することを目的として取り組んでいる。平成30年度は,29年度までの結果を踏まえ,中期尾芽胚期から後期尾芽胚期にかけて出来上がる螺旋性をもったアクチン繊維の束が,細胞質型アクチンから筋肉型アクチンへの切り替えによって起こる可能性を検証した。筋肉型アクチン遺伝子のコーディング領域に成熟の速いタイプの緑色蛍光タンパク質の遺伝子を組み込み,この融合遺伝子を受精卵に導入して筋肉型アクチンタンパク質の発現時期を調べたところ,神経胚期にはすでに発現が見られた。このことから,尾芽胚期初期から見られる予定筋肉細胞表層に存在するアクチン繊維のメッシュワークは,既に発現していた筋肉型アクチンから構成されるものであり,その束化はアイソフォームのスイッチングによるものではないことが示された。さらに,中期尾芽胚期から阻害剤ライブラリを処理することにより,このネジレた筋原線維形成を制御するシグナル因子の探索を行ったところ,いくつかの候補因子を見出すことに成功した。ネジレた走行をもった筋原線維の形成に関与する因子をこれらの候補からさらに確定し,その作用点を明らかにすることができる。平成30年度は,そのきっかけを確かに得ることができた。昨年度明らかにした筋原線維形成の時間経過をもとにして,本年度はその形成機構について計画通りに解析を進めることができた。阻害剤ライブラリの処理から螺旋型の筋原線維形成に関係するシグナル経路の候補を見いだせたのは大きい進展であった。生きた胚における筋原線維の可視化も可能になり,またホヤ幼生の運動解析に関しても,個体の運動ばかりでなく,周囲の流体の運動を同時に高速度カメラで可視化することができるようになった。これらの分析はこれから行うものであるが,興味深い観察像が多数既に得られており,これらについては当初の予定を上回る成果といえる。定量的な分析を順調に進められれば,当初計画を上回る知見を得ることができると期待している。得られた成果のうち,螺旋型遊泳パターンとネジレた筋原線維の形成プロセスに関しては論文としてまとめる。平成31年度は,阻害剤ライブラリでのスクリーニングにかかった候補因子について,さらに分析を進めて効果を明らかにする。ターゲットとなる因子のクローニングや発現阻害実験を試みる。また,二方向からホヤ幼生の運動を高速度カメラで追跡する実験に本格的に取り組む。我々は最近,海産動物ホヤのオタマジャクシ幼生の運動機構を研究する中で,(1)ホヤ幼生が右ネジ方向に螺旋を描きながら泳ぎ上がる性質を持つこと,またそのホヤ幼生の尾部の筋肉細胞は左右対称に配置されているが,(2)細胞内部の筋原線維は左右いずれにおいても左螺旋のネジレを持つことを見出した。本研究は,このホヤ幼生の筋細胞が「簡単に見ることができるネジレをもつ」点に注目し,この筋細胞の「螺旋性ができる仕組み」を明らかにするとともに,ネジレた筋原線維が「個体運動レベルの螺旋性を生み出す仕組み」を解明することを目的とする。29年度はホヤの発生過程に沿ったアクチン繊維の蛍光による可視化を経時的に行い,螺旋型の筋原線維がどのように出来上がるかを明らかにすることができた。初期尾芽胚期までは筋細胞の表層にはメッシュ状のアクチン・ネットワークが張り巡らされているが,中期尾芽胚期になると,斜め方向に太いファイバーの集積が見られるようになることが分かった。その後,後期尾芽胚期になると斜め方向に形成されたアクチンファイバーは均質化し,さらにサルコメア構造が形成され,収縮運動が開始された。この観察から,螺旋型の筋原線維構造は中期尾芽胚期に形成される螺旋型のアクチンの太いファイバー形成として最初にとらえられうることが分かった。現在,このネジレが正常につくられなくなる条件の解析を進めているところである。また,2方向から高速度カメラにより撮影を行い,3次元的に遊泳運動軌跡を解析するシステムを構築し,記録が行える環境を整えた。これにより,尾部の運動と運動軌跡を同時に立体的に分析できる画像の取得に取り掛かっている。本年度に実験系の立ち上げはほぼ完了した。これを用いて,30年度以降の解析を着々と進めていく。また,アクチンをはじめ,収縮装置を形成するサルコメア構成タンパク質のアイソフォーム転換が,この螺旋型の筋原線維形成のきっかけになっている可能性を検証する実験系の立ち上げを行った。これは当初計画以上に進んだ点である。

我々は,海産動物ホヤのオタマジャクシ幼生の運動機構を研究する中で,(1)ホヤ幼生が右ネジ方向に螺旋を描きながら泳ぎ上がる性質をもつこと,またそのホヤ幼生の尾部の筋肉細胞は左右対称に配置されているが,(2)細胞内部の筋原線維は左右いずれにおいても左螺旋のネジレを持つことを見出した。本研究は,この筋細胞の「螺旋性ができる仕組み」を明らかにするとともに,ねじれた筋原線維が「個体運動レベルの螺旋性を生み出す仕組み」を解明することを目的として取り組んでいる。平成30年度は,29年度までの結果を踏まえ,中期尾芽胚期から後期尾芽胚期にかけて出来上がる螺旋性をもったアクチン繊維の束が,細胞質型アクチンから筋肉型アクチンへの切り替えによって起こる可能性を検証した。筋肉型アクチン遺伝子のコーディング領域に成熟の速いタイプの緑色蛍光タンパク質の遺伝子を組み込み,この融合遺伝子を受精卵に導入して筋肉型アクチンタンパク質の発現時期を調べたところ,神経胚期にはすでに発現が見られた。このことから,尾芽胚期初期から見られる予定筋肉細胞表層に存在するアクチン繊維のメッシュワークは,既に発現していた筋肉型アクチンから構成されるものであり,その束化はアイソフォームのスイッチングによるものではないことが示された。さらに,中期尾芽胚期から阻害剤ライブラリを処理することにより,このネジレた筋原線維形成を制御するシグナル因子の探索を行ったところ,いくつかの候補因子を見出すことに成功した。ネジレた走行をもった筋原線維の形成に関与する因子をこれらの候補からさらに確定し,その作用点を明らかにすることができる。平成30年度は,そのきっかけを確かに得ることができた。昨年度明らかにした筋原線維形成の時間経過をもとにして,本年度はその形成機構について計画通りに解析を進めることができた。阻害剤ライブラリの処理から螺旋型の筋原線維形成に関係するシグナル経路の候補を見いだせたのは大きい進展であった。生きた胚における筋原線維の可視化も可能になり,またホヤ幼生の運動解析に関しても,個体の運動ばかりでなく,周囲の流体の運動を同時に高速度カメラで可視化することができるようになった。これらの分析はこれから行うものであるが,興味深い観察像が多数既に得られており,これらについては当初の予定を上回る成果といえる。定量的な分析を順調に進められれば,当初計画を上回る知見を得ることができると期待している。まず,薬剤ライブラリーの処理を粘り強く行って,キラルな筋原線維形成を攪乱する因子の同定を目指すのを重視する。また,2方向からホヤ幼生の運動をぴったりのフォーカスで高速度カメラ記録し,データを蓄積したうえで詳細な運動解析を行う。単離した筋細胞の運動解析も同様に,高速度カメラを用いて行っていく。得られた成果のうち,螺旋型遊泳パターンとネジレた筋原線維の形成プロセスに関しては論文としてまとめる。平成31年度は,阻害剤ライブラリでのスクリーニングにかかった候補因子について,さらに分析を進めて効果を明らかにする。ターゲットとなる因子のクローニングや発現阻害実験を試みる。また,二方向からホヤ幼生の運動を高速度カメラで追跡する実験に本格的に取り組む。ほぼ計画通り使用できた。物品費が多めになったが,学会発表旅費を運営費交付金の方から出すことができたので,少し余りがでた。
光力学診断を応用した去勢抵抗性前立腺癌の予後予測

前立腺癌治療において最も重要な解決すべき課題は去勢抵抗性前立腺癌である。しかし、PSAが去勢抵抗性前立腺癌の30%程度で、PSA値と関連なく病勢進行を呈するため、去勢抵抗性前立腺癌の予後予測方法の確立は喫緊の課題である。今回、尿検体による前立腺癌検出を目的とした光力学的診断は、去勢抵抗性前立腺癌の診断に応用可能であり、尿中剥離細胞中にプロトポルフィリンIX(PpIX)陽性細胞の検出が可能となった。さらに、根治的治療で予後不良因子とされるPTEN遺伝子の欠失を、FISH法を用いて、去勢抵抗性前立腺癌患者の尿検体で評価可能となった。PTEN遺伝子の欠失は約40%で認められた。前立腺癌治療において最も重要な解決すべき課題は、転移性前立腺癌、特に去勢抵抗性前立腺癌であり、これが前立腺癌死の大部分を占めている。去勢抵抗性前立腺癌に対する根本的治療方法は確立されておらず、その予後は約2年と報告されており、抗癌剤ドセタキセルが治療の中心に位置づけられている。しかし、ドセタキセルの治療効果を予測することは困難であり、かつ、前立腺癌における診断・治療効果判定において極めて有用であるPSA(前立腺特異抗原)が去勢抵抗性前立腺癌の30%程度で、PSA値と関連なく病勢進行を呈することがあるため、去勢抵抗性前立腺癌の治療・予後予測方法の確立は喫緊の課題である。今回、患者尿検体による前立腺癌検出を目的とした光力学的診断を、去勢抵抗性前立腺癌の診断に応用できるかどうかの検証を行ってきたが、去勢抵抗性前立腺癌患者においても尿中剥離細胞中にプロトポルフィリンIX(PpIX)陽性細胞は検出可能であった。さらに、手術・放射線治療などの根治的治療で予後不良因子とされるPTEN遺伝子の欠失が、去勢抵抗性前立腺癌患者における尿中剥離細胞で評価できるかどうかをFISH法で検討している。現時点では、前立腺癌細胞株を用いて検証中である。去勢抵抗性前立腺癌におけるPTEN遺伝子欠失の程度は明らかではないが、今回の尿検体を用いてPTEN遺伝子の欠失と予後・治療効果との関連性が証明できれば、低侵襲かつ簡便に去勢抵抗性前立腺癌の予後・治療効果予測を行うことが期待できる。しかし、ドセタキセルの治療効果を予測することは困難であり、かつ前立腺癌における診断・治療効果判定において極めて有用であるPSA(前立腺特異抗原)が去勢抵抗性前立腺癌の30%程度で、PSA値と関連なく病勢進行を呈することがあるため、去勢抵抗性前立腺癌の治療・予後予測方法の確立は喫緊の課題である。今回の検討で、患者尿検体による前立腺癌検出を目的とした光力学的診断は、去勢抵抗性前立腺癌の診断に応用可能であり、去勢抵抗性前立腺癌患者においても尿中剝離細胞中にプロトポルフィリンIX(PpIX)陽性細胞の検出、ならびに分光光度計を用いた蛍光強度の定量化が可能となった。さらに、手術・放射線治療などの根治的治療で予後不良因子とされるPTEN遺伝子の欠失を、FISH法を用いて、去勢抵抗性前立腺癌患者の尿検体で評価可能となった。PTEN遺伝子の欠失は約40%の患者尿検体で認められた。ただ検討できた症例数は少数であったため、PTEN遺伝子の欠失と予後・治療効果の関連性については、今後の更なる検討が必要である。泌尿器腫瘍学これまでに約15例の去勢抵抗性前立腺癌患者の尿検体を収集し、尿中剥離細胞中のPpIX陽性細胞の検出を行っており、今後約2倍の症例集積が期待される。しかし、PTEN遺伝子欠失の基礎検討の進捗が遅れており、「(3)やや遅れている」と判断した。尿中はく離細胞におけるPTEN遺伝子の欠失を同定するために、細胞株を用いた基礎検討を一層重ねた上で、臨床検体への検討へ応用していく。さらに、光力学的診断でのマイクロ流体デバイスのFISH法検出へ応用し、それで分別できた陽性細胞における、PpIX陽性およびPTEN遺伝子欠失と関連する遺伝子解析を行う。PTEN遺伝子欠失を評価するためのFISH法の検討に時間を要したため、試薬購入が予定よりも少なかったため。残額を本年度に使用する。
シェアフォース顕微鏡におけるプローブ・表面間相互作用の起源の解明

平成9年度は、光検出型シェアフォース顕微鏡を用いて、シェアフォース相互作用の湿度依存性とプローブのバネ定数依存性を研究した。その結果、低湿度におけるシェアフォース相互作用は、プローブと表面の間の接触相互作用に起因し、高湿度のそれは、毛管凝集力に密接に関連する事がわかった。平成10年度は、まず、1997年にRuiter等とAtia等により開発された、音叉検出型シェアフォース顕微鏡を、新たに試作した。本装置は、プローブの共振周波数変化と振幅変化;こ追従できる回路を用いる事により、シェアフォース相互作用を高精度で測定する事ができる。本装置を用いて、前年度の研究の再検討を行った結果は、光検出型シェアフォース顕微鏡で得られた結果と同様であり、測定法の違いによる顕著な違いはなかった。以上の結果は、以前にGregor等により提案されたプローブ・表面の接触モデルと多くの不一致が生じる事がわかった。研究代表者は、本結果を説明するために、プローブの振動不安定性がシェアフォース相互作用と密接に関係している事を提案した。高湿度におけるプロープと表面間の接触時間とシェアフォース相互作用の関係を調べた結果、毛管凝集力に起因する相互作用のヒステリシス距離は、ほとんど変化しない事がわかった。この結果は、プローブと表面が接触すると、吸着水が1sec程度で、急速に凝集する事を示唆する。シェアフォース顕微鏡における、表面及び表面近傍の粘性、弾性の物性測定の可能性を評価するための試料の探索の中で、高分子ゲルの網目構造とその体積緩和の間に関する新たな現象を見つけた。大気中における表題相互作用の起源を解明するために、1.相対湿度に対するシェアフォース相互作用の詳細な測定、2.シェアフォース相互作用の定量化、及び、3.プローブ・表面間の接触位置測定を行った。既に我々の研究で定性的に分かっていたシェアフォースの湿度依存性を詳細に研究した結果、湿度の増加に対して相互作用距離が減少し、40%程度で急激な減少を示す事が初めて明らかになった。次に、様々な横バネ定数(数N/m-数10N/m)をもつプローブを用いて、シェアフォース相互作用の定量化を行った。その結果、バネ定数の増加に対して、相互作用距離が徐々に増加する傾向の存在を明らかにした。この実験結果は、シェアフォース相互作用が、単純な遠隔相互作用では説明できず、プローブ・表面間の接触等が寄与している事を示唆する。この事を検討するために、測定した相互作用力の大きさを、調和振動子モデルによる理論計算結果と比較した。その結果、測定した相互作用力が、過去に提案された何れの遠隔相互作用より大きく、プローブと表面の接触が、シェアフォースの重要な要因である事がわかった。そこで、プローブ・表面間の接触位置を正確に測定するために、プローブと表面に導体である金属を用いて、シェアフォースとトンネル電流の同時測定を行った。その結果、シェアフォース相互作用が生じている位置で、トンネル電流が流れ始める事が初めて分かった。しかし、この結果は未だ、定量的には評価できていない。なぜなら、このトンネル電流はパルス的電流であるので、微弱電流を高い応答速度で取り込む事が必要があるが、これは現段階の試作装置では完全に実現できていない。今後は、このトンネル電流シェアフォース相互作用の同時測定を更に進展させ、プローブと表面間の絶対位置を明らかにし、表面及び表面近傍の粘性、弾性の物性測定の可能性を評価する。
サーモグラフを用いた個々の汗腺活動の観察と発汗神経支配様式の追究

温熱性発汗部の汗腺は皮膚面のシワの凹部に開口しており,拍出された汗はそのシワの溝を伝わって広がり素早く蒸発するため,その拍出を肉眼的に観察することは難しい。そこで本研究では昨年度に,拡大レンズを装着したサーモグラフを用いて汗拍出時の汗孔部表面温低下(温度色の変化)を観察する方法をほぼ確立させた。今年度は,この手法を用いて大腿部の小範囲(0.12cm^2)における単一汗線の拍出活動を観察し,これらを発汗神経活動の指標となる局所発汗量の記録曲線上にみられる発汗波と関係づけて調べた。4名の被験者について,観察部へのアセチルコリンの皮内投与および下肢温浴による温熱負荷時のサーモグラフの映像をビデオ録画した。ビデオ再生より観察領域内で点状の皮膚温低下が現れた時点を汗拍出のタイミングとした。同時に汗腺観察の近接部で局所発汗量を換気カプセル法により記録した。アセチルコリンの投与後5-15分間中に汗を拍出した汗腺数は各被験者について10,14,15,16個であり,既に報告されている該当部位の汗腺密度に一致した。このうち15個の活動汗腺を示した一例では,軽度の温熱負荷中(約20分間)に9個の汗腺からの拍出が認められ,その活動頻度は汗腺毎に異なった(0.7-3.8回/分)。この様な汗腺間における活動頻度の差は少量発汗のレベル内では発汗波の出現頻度が増すほど大きくなる傾向が認められたので,比較的低レベルの発汗時には活動性の高い汗腺が主体的に汗を拍出していることが示唆された。また発汗神経衝撃の強度の指標となる発汗波の立ち上がりの速度(傾斜)と動員汗腺数との間に直線関係が認められた(P<0.001)。上述の様に本研究で認められた個々の汗腺活動の特徴は精神性発汗部における先行所見にほぼ一致した。これらより本研究方法は温熱性発汗部位における単一汗腺の活動やそれらへの神経支配様式を調べる方法として有用であると考えられた。本研究の目的は,温熱性発汗部の個々の汗腺における汗拍出活動をサーモグラフを用いて観察し,同時に同部位の汗腺を支配する発汗神経活動を微小電図法により記録し,両者の対応関係を調べることである.温熱性発汗部の汗腺は皮膚面のシワの凹部に開口しており,拍出された汗はそのシワの溝を素早く伝わって広がり蒸発するため,この汗拍出をビデオマイクロスコープ等により観察することは困難である.そこで拡大レンズを装着したサーモグラフを用い、汗滴蒸発時の汗孔部表面温低下(温度色の変化)を観察することにより,この汗拍出タイミングをより精密に記録できる可能性がある。今年度はサーモグラフ拡大レンズ(視野範囲3×4mm)を用いた汗拍出の観察方法を確立するための作業を中心に進め,以下の成果を得ている.サーモグラフ拡大レンズを用いて一定皮膚領域を観察するために,レンズ部に装着する筒型アタッチメントを作成した.観察時に,このアタッチメントの反対側を観察皮膚表面に接触させて固定すると,一定皮膚領域の連続観察が可能になった.また,比較的低強度の温熱負荷(室温29-32°C)時,サーモグラフの温度スケールを4-6°C幅に設定すると,前腕部の各汗腺からの汗拍出に伴う汗孔部表面温低下をより鮮明に観察できることが認められた.約10分間の観察中,個々の汗腺には非常に活発に汗を拍出するもの,またあまり活発でないものとがみられ,精神性発汗部と同様に各汗腺毎の活動性のばらつきが認められた.一方,観察範囲内で一度も拍出しなかった汗腺の同定は困難であった.さらに,中等度以上の発汗時には観察部に適量の乾燥空気を吹きかけて蒸発を早めると各拍出のタイミングをより高精度に観察できた.今後,温熱性発汗時における個々の汗線からの汗拍出と発汗神経活動の間接的指標となる発汗波との定量関係につて実験・分析を実施する.温熱性発汗部の汗腺は皮膚面のシワの凹部に開口しており,拍出された汗はそのシワの溝を伝わって広がり素早く蒸発するため,その拍出を肉眼的に観察することは難しい。

このうち15個の活動汗腺を示した一例では,軽度の温熱負荷中(約20分間)に9個の汗腺からの拍出が認められ,その活動頻度は汗腺毎に異なった(0.7-3.8回/分)。この様な汗腺間における活動頻度の差は少量発汗のレベル内では発汗波の出現頻度が増すほど大きくなる傾向が認められたので,比較的低レベルの発汗時には活動性の高い汗腺が主体的に汗を拍出していることが示唆された。また発汗神経衝撃の強度の指標となる発汗波の立ち上がりの速度(傾斜)と動員汗腺数との間に直線関係が認められた(P<0.001)。上述の様に本研究で認められた個々の汗腺活動の特徴は精神性発汗部における先行所見にほぼ一致した。これらより本研究方法は温熱性発汗部位における単一汗腺の活動やそれらへの神経支配様式を調べる方法として有用であると考えられた。
水晶振動式MEMSプローブを用いた卵細胞の非侵襲活性評価への挑戦

本研究では,振動誘起流れを用いて,卵細胞の位置と姿勢を操作し,水晶振動式MEMSプローブによりその力を計測するシステムを構築した.振動誘起流れは定常流れと非定常流れの合成流であり,非定常流れの影響を解析して実験的にその影響を評価した.また,高感度,高剛性な水晶振動式MEMSプローブを設計し,水晶振動子機式が高剛性である利点を活かし,ワイドレンジの力センサを実現した.このプローブを用いて細胞凝集体を用いて,機械的特性を計測,評価した.この系では卵子に限らず,様々な細胞の力学的特性の計測に応用が可能となる.また,品質評価を目指し,卵細胞の機械的特性から,透明帯のヤング率の変化を計測,評価した.マイクロ流体チップ上で,細胞の機械的特性をその場計測するシステムを構築し,評価実験を行った.実績を以下にまとめる.(1)細胞の操作:マイクロ構造体を有するマイクロ流体チップを加振し,局所流れを制御する方式を解析し,操作方法の有効性を確認した.振動誘起流れの解析として,チップ内にマイクロ構造体を配置した.圧電素子にてチップ全体に回転振動を与えた.細胞の周りの振動,流体場の解析を行い,細胞を操作するための設計論を構築した.また,実際にマイクロ構造体を有するチップおよび加振システムを構築し,顕微鏡画像から細胞の位置・姿勢を計測し評価した.(2)水晶振動式MEMSプローブ:高感度,高剛性な水晶振動式MEMSプローブを設計,試作し,評価した.水晶振動式MEMSプローブの解析,設計に基づき,加工を行った.水晶基板をドライエッチングプロセスによって加工し,常温ボンディングによって接合した.また,プローブの温度補償を行った.プローブ先端は平滑化し,倒立顕微鏡で明視野観察できるように透明にした.水晶振動式MEMSプローブの力計測キャリブレーションを行い,細胞の力を計測して評価した.(3)細胞の弾性特性の計測:プローブ先端で位置・姿勢制御した細胞を変形し,粘弾性を計測した.細胞の変形と力計測情報から,機械的特性指標を導出した.細胞の位置・姿勢を調整して,力計測するシステムを構築した.水晶振動式MEMSプローブを用いて細胞を変形し,力センサの値と接触変化から機械的特性を評価した.(4)細胞の活性評価:細胞の機械的特性指標から,細胞の硬さをその場計測した.細胞内部の特性の違いから細胞の活性を評価する実験を行った.この結果,力情報により細胞の状態を推定できる可能性を示した.本研究では,振動誘起流れを用いて,卵細胞の位置と姿勢を操作し,水晶振動式MEMSプローブによりその力を計測するシステムを構築した.振動誘起流れは定常流れと非定常流れの合成流であり,非定常流れの影響を解析して実験的にその影響を評価した.また,高感度,高剛性な水晶振動式MEMSプローブを設計し,水晶振動子機式が高剛性である利点を活かし,ワイドレンジの力センサを実現した.このプローブを用いて細胞凝集体を用いて,機械的特性を計測,評価した.この系では卵子に限らず,様々な細胞の力学的特性の計測に応用が可能となる.また,品質評価を目指し,卵細胞の機械的特性から,透明帯のヤング率の変化を計測,評価した.知能機械学・機械システム
フランシス・ベイコンの自然哲学の背景：エリザベス朝イングランドでの自然研究の諸相

本研究の目的は、イングランドの政治家・哲学者であるフランシス・ベイコン(1561-1626年)の思想的背景をさぐるとともに、16世紀後半から17世紀初頭にかけてのイングランドでの自然研究の実相を解明することであった。なかでも2018年度には、イングランドで当時読まれていた養生法書に注目し、その内実およびベイコンの自然哲学との関係を探った。ベイコンは健康と長寿、なかでもとくに後者に深い関心をもち、関連する複数の著作を書いていた。研究代表者自身のものも含めたこれまでの研究のなかでは、ベイコンと、先行する自然哲学者たちとの理論面での関係はある程度考察されてきた。他方で、当時の養生法の伝統に含まれる具体的な実践の指針とのかかわりが検討されることはほぼなかった。しかし実際には、16、17世紀の西欧では健康・長寿のための養生法をあつかった書物はきわめて人気を博し、多数出版されていた。本研究では、当時よく読まれていたと考えられる養生法書として、ラテン語・英語に訳されていた古代のプルタルコスの書物、13世紀頃に作られ読みつがれていた『サレルノ養生訓』、16世紀イングランドの養生法書作家であるトマス・エリオット、トマス・コーガン、トマス・マフェットらの書物に着目し、推奨される食生活や食材など、具体的な細部にかんしてベイコンの説との比較検討をおこなった。ベイコンは既存の健康・長寿法を根本から否定しているかのように見えるが、実際にはかなりの部分で伝統と重なる議論をおこなっていることがわかってきた。上記の「研究実績の概要」に記した研究成果は、口頭・論文でそれぞれ発表する計画であった。しかし実際には、口頭発表は下記の通りおこなう予定となっているものの、論文の出版にはいたっておらず、現在準備中である。2018年度は、フランシス・ベイコンの自然哲学の背景としての養生法の伝統を取りあげたが、このテーマにかんしては当初の想定よりも多くの検討事項があることが明らかになってきた。今年度中には十分に取りあげられなかったがベイコンの思想形成に関係する可能性が高いものとして、大陸の養生法書群が挙げられる。そのため、やや予定を変更して次年度以降も養生法の伝統にかんしてさらに研究を進める必要があると考えられる。
女性特有のリプロダクティブヘルス及び保健習慣と疾病についての大規模疫学調査

本研究では、2つのコホート研究のデータを使用して、検討可能な疾患発生や死亡についてのリスク要因の検討を行い、また介護サービス受給や医療サービス受療状況を含む個人特性と死亡や要介護度の変化などとの関連を明らかにすることを目的としている。第1の女性看護職を対象者としたコホート研究では、長期間の追跡調査とデータマネジメントの継続実施に参加している。このコホート研究では、疾病の既往の実態と、発生頻度が比較的多い疾患(高コレステロール血症、高血圧、子宮筋腫、子宮内膜症、良性乳腺腫瘍など)の発生の実態を明らかにし、リプロダクティブヘルス・保健習慣などとの関連を分析することを目的としている。第2の要介護高齢者コホート研究では、重篤な疾患や死亡の発生の関連要因を短期間の追跡調査で明らかにするため、地域の協力を得て要介護認定のなされた要介護高齢者を対象とする地域コホートを設定した。そして、介護認定審査にかかわる情報及び住民基本台帳に基づいて、要介護度の変化や死亡についての追跡調査を実施し、さらに介護サービス及び医療サービスの受給状況の情報を収集した。そして、要介護高齢者の死亡率や要介護度の変化などに対して、高齢者の特性、介護サービス利用状況及び医療サービス利用状況などとの関連明らかにし、要介護高齢者の要介護度進展抑制や健康維持につなげる介護サービス及び医療サービスのあり方を示して対策につなげる。本研究は、全国の女性看護職を対象者とした大規模コホート研究である日本ナースヘルス研究(JNHS)の追跡調査とデータマネジメントの継続実施に参加している。本研究では、JNHSのデータの一部を使用して、疾病の既往の実態と、発生頻度が比較的多い疾患(高コレステロール血症、高血圧、子宮筋腫、子宮内膜症、良性乳腺腫瘍など)の発生の実態を明らかにし、リプロダクティブヘルス・保健習慣などとの関連を分析することを目的としている。平成19年度には、30歳から59歳までの看護職女性従事者(約4万5千人)のデータを用いて5歳階級ごとの各疾患の既往状況を明らかにした。すなわち、既往割合の高い疾患は子宮筋腫(10.0%)、高コレステロール血症(8.2%)、子宮内膜症(5.3%)、高血圧(5.1%)などであり、卵巣がんを除くすべての疾患で5歳階級ごとの既往割合の単調な増加が認められた。子宮筋腫、子宮内膜症、子宮頸がん、良性乳腺腫瘍などの産婦人科疾患は特に30歳代から40歳前半にかけて既往割合が増加し、一方、高血圧、狭心症、脳梗塞、糖尿病、高コレステロール血症、骨粗鬆症などのいわゆる生活習慣病は40歳代後半から50歳代にかけて増加していた。曝露割合が20%のリスク要因についての統計的検出力を計算した結果、10年間の追跡によって子宮筋腫、高コレステロール血症、高血圧、甲状腺疾患、肝炎、胆石症、良性乳腺腫瘍に対する相対リスク1.5以上のわずかなリスク増大を70%以上の確率で検出可能であった。精度の高いJNHS追跡調査を継続することにより、日本女性の健康増進に資する科学的根拠の提供が可能であることが明らかになった。本研究では、女性コホート研究のデータを使用して、第1に横断調査データにより疾病の既往の実態を把握し、第2に追跡調査データにより検討可能な疾患や死亡についての発生についてのリスク要因の検討を行うことを目的としている。データを使用する女性看護職を対象者としたコホート研究は、郵送による自計式調査であるために回答には異常値や論理的不整合が多発していた。特に、経時的に調査を繰り返した場合に、そうした不整合が疾患発生であるのか、誤記入であるかは重大な問題であることが判明した。そこで、平成20年度には、異常値、論理的矛盾などを網羅的に検出して対処を行うデータマネジメント・システムの作成に着手した。このシステムはプログラムをその都度開発することなしにExcelファイルでの管理を可能にするものであり、他の大規模疫学調査にも転用可能なものを目指している。

なお、本研究の研究期間内では、このコホート研究によっては短い追跡期間にならざるを得ないことから、臨床検査値により把握可能な高脂血症や高血圧などの比較的発生頻度の高い疾患発生のみの検討が可能である。そこで、これらの疾患の発生の把握可能性についての点検を進めた。重篤な疾患や死亡の発生について短期間の追跡研究で検討を行うため、要介護認定のなされた女性高齢者を対象とする女性コホート(約1500人)を設定した。そして、平成20年度には疾患の保有状況を調査し、疾患発生や死亡についての追跡調査を開始した。本研究では、2つの女性コホート研究のデータを使用して、検討可能な疾患についての発生についてのリスク要因の検討を行い、また介護サービス受給や医療サービス受療状況を含む個人特性と死亡や介護度の変化などとの関連を明らかにすることを目的としている。第1の女性看護職を対象者としたコホート研究は、郵送による自計式調査であるために回答には異常値や論理的不整合が多発していた。特に、経時的に調査を繰り返した場合に、そうした不整合が疾患発生であるのか、誤記入であるかは重大な問題であることが判明した。そこで、平成21年度には、前年度に開発したデータマネジメント・システムを使用してデータクリーニングを継続した。平成22年度には、このコホート研究によっては短い追跡期間にならざるを得ないことから、臨床検査値により把握可能な高脂血症や高血圧などの比較的発生頻度の高い疾患発生についての検討を予定している。第2に、重篤な疾患や死亡の発生について短期間の追跡研究で検討を行うため、2003年4月から2004年12月までの間に要介護認定のなされた女性を主とする要介護高齢者を対象とする地域コホート(約2,300人)を設定した。そして、平成21年度には介護認定審査にかかわる情報及び住民基本台帳に基づいて、要介護度の変化や死亡についての追跡調査を実施し、さらに介護サービス及び医療サービスの受給状況の情報を収集した。平成22年度には、これらのデータの統計解析を実施して、成果を取りまとめる予定である。
静的破砕剤によるコンクリート構造物の無公害解体法に関する研究

本研究では,まず初年度に,従来用いられてきた種々の解体工法について,その施工法および特徴を調査すると共に,実際に解体工事の資料収集を行った.これらの資料を基に,工事例の比較設計を通じて効率的な施工方法に関する設計方法のフロー化を行ない,また,静的破砕剤を用いた工法の解体法に於ける位置付けを検討した.その結果,構造部材などに対しては油圧を用いた種々の圧砕工法が騒音対策も含めて有効と考えられるが,作業環境に問題がない場合には衝撃による破砕工法が効率的であること,これらの工法は基礎構造物など比較的寸法の大きいマス状コンクリートの解体には不向きであることなどが分かった.そこで,次年度には,マス状コンクリートの無騒音・無振動・無飛散解体に静的破砕剤を用いた工法の適用を考えた.静的破砕剤の適用に当たって,まず,膨張圧の発現特性と配合,温度,拘束度などの諸要因との関係を調べ,膨張圧とコンクリートの破砕条件について検討した.それらの結果を用いて破砕孔間隔の設計や鉄筋コンクリート部材の効果的解体法についての考察を行った.最終年度では,静的破砕剤を各種の鉄筋コンクリート部材の解体に用いる場合の問題や,破砕ひびわれの誘導方法,鉄筋コンクリート部材の局部破砕への使用方法などについて実験的検討を行った.破砕用ボーリング孔に数ミリのノッチを設ければひび割れ方向の制御が可能なこと,部材表面に設けたカッター溝の1つおきに破砕を注入すればかぶりコンクリートの除去が可能であること,部材解体法で局部破砕を行う場合には破砕孔とカッター孔を組み合わせひびわれ位置を限定することが効果的であることなどの結論を得た.本研究では,まず初年度に,従来用いられてきた種々の解体工法について,その施工法および特徴を調査すると共に,実際に解体工事の資料収集を行った.これらの資料を基に,工事例の比較設計を通じて効率的な施工方法に関する設計方法のフロー化を行ない,また,静的破砕剤を用いた工法の解体法に於ける位置付けを検討した.その結果,構造部材などに対しては油圧を用いた種々の圧砕工法が騒音対策も含めて有効と考えられるが,作業環境に問題がない場合には衝撃による破砕工法が効率的であること,これらの工法は基礎構造物など比較的寸法の大きいマス状コンクリートの解体には不向きであることなどが分かった.そこで,次年度には,マス状コンクリートの無騒音・無振動・無飛散解体に静的破砕剤を用いた工法の適用を考えた.静的破砕剤の適用に当たって,まず,膨張圧の発現特性と配合,温度,拘束度などの諸要因との関係を調べ,膨張圧とコンクリートの破砕条件について検討した.それらの結果を用いて破砕孔間隔の設計や鉄筋コンクリート部材の効果的解体法についての考察を行った.最終年度では,静的破砕剤を各種の鉄筋コンクリート部材の解体に用いる場合の問題や,破砕ひびわれの誘導方法,鉄筋コンクリート部材の局部破砕への使用方法などについて実験的検討を行った.破砕用ボーリング孔に数ミリのノッチを設ければひび割れ方向の制御が可能なこと,部材表面に設けたカッター溝の1つおきに破砕を注入すればかぶりコンクリートの除去が可能であること,部材解体法で局部破砕を行う場合には破砕孔とカッター孔を組み合わせひびわれ位置を限定することが効果的であることなどの結論を得た.本年度は最初の年であるから、先ず、過去の解体工事例を集め、それらを分析し、体系化することにより、現場の条件に合った工法の選択が可能となる解体計画立案作業のシステム化を試みた。右図はその概要を示すフロ-チャ-トである。1で対象物の規模・形態、立地条件、道路事情などを考慮して解体工法を定め、2で解体機器・作業の組み合せを決定する。まだ、デ-タ不足で適確な選定を下すに至らないが、パソコンで上記のフロ-を追うことができるようにした。静的破砕剤は生石灰の水和反応を利用した化学的破砕薬であり、爆薬に比べると反応はゆるやかで取り扱い易い。しかしながら、反面数分、数十分の短時間破砕は難かしい。また、鉄筋が入ったコンクリ-トでは、鋼材のじん性が高いため、破砕剤の膨張力をもってしても切断不可能である。したがって、鋼材切断機器との併用を考えなければならない。最近、橋梁床板の打ち直し工事が各地で行われており、旧コンクリ-ト床板の短時間無公害解体法の開発が急がれている。カッタ溝に破砕剤を注入しても500kgf/cm^2程度の膨張圧が得られることを確かめた。次年度は解体機器との併用に焦点をあて、無公害解体方法を確立する。研究初年度は主として過去の解体工事例から効率的な解体計画のフロ-チャ-ト化を図ると共に、破砕時間の推定法に目途をつけた。本年度は、それらの結果を踏まえて、効率的な破砕方法について実験的研究を行った。特に、鉄筋コンクリ-ト部材の主鉄筋方向に対するボ-リング孔の配置や、鉄筋量に見合った破砕圧力を得るための孔径の算定法など、実際の構造物に応じた破砕方法について考察した。それらの実験から得られた知見を以下に記す。(1)破砕剤充填孔は、1方向配筋RC部材では鉄筋を挟んで交互に、2方向配筋部材では鉄筋交叉部に設ければ、鉄筋の取り出しが容易である。(2)鉄筋に囲まれる部分のコンクリ-トは破砕されているので容易に徹去できる。(3)かぶり

コンクリ-トは、コンクリ-トカッタ-溝に破砕剤を充填することで除去できる。この時、破砕剤は溝1つおきに充填することが大切である。(4)孔間隔はコンクリ-ト強度で決定され、ひび割れ発生圧力も鉄筋量によって大差は生じないが、ひび割れ幅は鉄筋量の増加と共に小さくなり、解体時間も長くなる。(5)効率的にRC部材を解体するには、鉄筋とコンクリ-トが付着破壊を起こすようにひび割れを誘導することが大切である。以上、RC部材の効率的なひび割れ発生方法に関する結論を得たが、実際の構造物の解体には鉄筋の切断が重要な問題となる。次年度では、これらの破砕法と現場の解体機器とを組み合わせ、実用段階の対応策を考えて行く。平成元年度には過去の解体工事例の調査ならびにその効率的な施工計画に関する考察を行った。平成2年度には静的破砕剤を応用した解体工法の問題点について,特に効率的な解体を行う場合の破砕剤注入孔の配置や孔径,破砕圧力に関する実験的検討を行ってきた。本年度は破砕剤を注入しコンクリ-ト構造物に任意の方向へひびわれを誘導する工法の開発とその効果を実験的に確認した。その方法として,まず,ボ-リング孔堀削と同時に孔内にひびわれ誘導用ノッチを施工できる機械の開発を行った。この時,ノッチの施工は両側に35mmの突起を設けた中空リングを堀削ビット後方のドリル回転軸に取り付け,これを打撃することによって一定の方向にノッチを作るものである。ノッチ付ボ-リング孔のひびわれ誘導性や破砕時の圧力低減効果等を調べるため,最大2.9×1.9×0.7mのコンクリ-ト直方供試体を12体作製し破砕実験を実施した。その結果以下の知見を得た。(1)従来の円形ボ-リング孔では3方向へのひびわれを生じるが,ノッチ付ボ-リング孔では孔間隔Lに対し,自由面までの距離が3L/4以上であれば一方向に誘導ひびわれが得られる。(2)ノッチ深さ3mmと5mmとでは破砕時間および破砕圧力に大差なく,一般的には3mm程度のノッチでひびわれ誘導が可能である。(3)ノッチ付ボ-リング孔に破砕剤を注入した場合,円形ボ-リング孔を用いた場合に比べ約30%程度圧力,時間共に小さい値となった。(4)ビット付ボ-リング孔の掘削時間は円形に比べ4割程度長くなり,またその騒音低減についても今後の課題である。
溶接構造体に対する疲労寿命予測システムの確立

本研究では溶接構造物の溶接止端部における局所的な繰返し弾塑性挙動を明らかにし、それらの結果を用いて疲労き裂発生寿命を評価するシステムの開発を行った。まず熱弾塑性解析を実施することにより残留応力を導入し、その結果を反映した繰返し弾塑性解析により得られた結果を用いて疲労き裂発生寿命の評価を可能とした。さらにK値を用いた疲労き裂伝播寿命評価を行うことにより、全寿命を評価可能とした。2種類のビード形状を有する溶接十字継手を解析対象とし、ビード形状に加え、先行荷重および繰返し荷重の大きさの残留応力緩和挙動および疲労寿命への影響を評価可能なシステムを整備させた。各種構造物の変形や疲労,破壊を対象とした数値シミュレーション技術の向上は著しく,実験による計測が困難な局所的な情報も取得可能になりつつあるが,得られる結果は採用する材料モデルの特性に大きく依存する.疲労解析を目的とした既存モデルの多くは,材料の降伏応力を超えるような低サイクル疲労現象で観測される応力ひずみ曲線のヒステリシス・ループやラチェット現象などの塑性変形を再現可能である.しかしながら材料に生じる応力が降伏応力以下のいわゆる高サイクル疲労問題では,既往の材料モデルは実験的に観測されるラチェット挙動や繰返し軟化特性を表現し得ず,繰返し負荷により蓄積される塑性変形やダメージを過小評価し,危険側の寿命予測を与えることになる.つまり,任意形状の構造物に対する任意荷重条件下の疲労寿命予測を高精度に実現するためには,溶接熱影響部を含む材料の非弾性特性,さらに疲労き裂発生やその後の進展までを高精度・高効率に予測可能なモデルとそれを用いた解析技術の確立が不可欠である.なお,これまで著者らは,低サイクル疲労に限定されること無く,巨視的弾性・高サイクル疲労条件下にも適用可能な繰返し弾塑性モデルを導入したFEM解析技術の開発を行っている.そこで本研究では,開発中の材料モデルを組込んだFEM解析技術を用いて,実験による計測が困難な溶接止端部における残留応力の緩和挙動などに対する弾塑性挙動を明らかにし,さらにき裂発生寿命を予測することを目的とする.ここでは特に,非荷重伝達型十字溶接継手を模擬した解析モデルを対象に,溶接止端部の形状および溶接残留応力の有無を変化させたモデルを設定し,引張および圧縮予荷重の有無が,その後の繰返し負荷に伴う残留応力緩和挙動に与える影響などに関して考察を行い,開発システムの有用性を確認した.繰返し応力を受ける溶接構造物の疲労き裂発生とその後の伝播寿命は,作用する応力(振幅・平均応力・多軸状態)や荷重履歴(変動・過大負荷)に加えて,採用する溶接プロセスによっても変化する溶接残留応力やビード形状,さらには母材と溶接金属の希釈や急熱・急冷によって変化し局所的に分布する材料組織など,多くの力学および組織学的因子の影響を受ける.また溶接構造物の疲労寿命の高精度予測や疲労損傷部材の余寿命評価技術の確立対する要求は高い.そこで,疲労寿命に対する各種影響の解明を目的として,多くの実験的検討が行われているが,疲労き裂発生起点となる局所領域の残留応力分布や材料特性の取得は困難であり,また実働荷重は多岐に渡るため,一般に一定荷重振幅下で得られたS-N曲線に基づく疲労設計が主体となっている.また一般に,材料レベルでは降伏応力の上昇に比例して200万回疲労強度も上昇することが確認されている.しかし,高強度鋼を用いた溶接継手の疲労特性はバラつきが大きく,母材強度の向上にもかかわらず,継手の疲労強度は通常材と同等になることが報告されている.この原因としては,高強度材を用いたい場合,通常材と比べて止端部の応力集中が大きくなる傾向にあること,また残留応力が高くなることなどが考えられるが,明確な原因は不明と報告されている.そこで本研究では,低サイクル疲労に限定されること無く,巨視的弾性の応力状態となる高サイクル疲労条件下にも適用可能な高精度・繰返し弾塑性モデルの開発とそれを導入した高精度数値シミュレーション技術の開発を行った.本技術のプロトタイプシステムにより,各種材料の繰返し変形・応力に起因する諸問題、疲労寿命に対する溶接止端部形状・溶接残留応力分布・過大荷重の影響などに関して明らかにした.本研究では,低サイクル疲労に限定されること無く,巨視的弾性の応力状態となる高サイクル疲労条件下にも適用可能な高精度・繰返し弾塑性モデルの開発とそれを導入した高精度数値シミュレーション技術の開発を行っているが,本技術のプロトタイプシステムが完成した。また本システムを用いて,各種材料の繰返し変形・応力に起因する諸問題、疲労寿命に対する溶接止端部形状・溶接残留応力分布・過大荷重の影響などに関して明らかにした.また一般に,材料レベルでは降伏応力の上昇に比例して200万回疲労強度も上昇することが確認されている.しかし,高強度鋼を用いた溶接継手の疲労特性はバラつきが大きく,母材強度の向上にもかかわらず,継手の疲労強度は通常材と同等になることが報告されている.この原因としては,高強度材を用いたい場合,通常材と比べて止端部の応力集中が大きくなる傾向にあること,また残留応力が高くなることなどが考えられるが,明確な原因は不明と報告されていたが,そのメカニズムの解明の糸口を掴むことができた.これまで疲労損傷事例が数多く報告されており,将来疲労損傷による被害の拡大が予測される.一般に疲労寿命は,作用する応力範囲や平均応力,荷重順序や予負荷,残留応力など多くの力学的因子のみならず,材料学的因子の影響も強く受ける.更に,疲労き裂の起点となりやすい溶接止端部近傍においては,溶接入熱による金属組織変化,残留応力,複雑形状など各種要因が疲労寿命に影響を与えると言われている.

一方で,有限要素法などを用いて行われる数値シミュレーション技術の進歩は目覚ましく,適切な材料モデルを適用することで,実測が不可能な局所的・微視的領域での現象把握や設計の大きな手助けとなっている.また,これまでに著者らは,(極)低サイクル疲労に限定されること無く,高サイクル疲労にも適用可能な繰返し弾塑性モデルを開発するとともに,溶接止端部近傍における局所的な弾塑性挙動を用いた疲労寿命評価手法の確立を目指してシステムの改良を行ってきた.本研究では溶接止端部における局所的な繰返し弾塑性挙動を明らかにし,それらの結果を用いてビード止端形状が疲労き裂発生寿命に与える影響を明らかにすることを目的として数値シミュレーションを行った.まず熱弾塑性解析を実施することにより残留応力を導入し,その結果を反映した繰返し弾塑性解析により得られた結果を用いて疲労き裂発生寿命評価を実施した.さらに弾性解析により得られるK値を用いた疲労き裂伝播寿命評価を行った.なお,本研究では2種類のビード形状を有する溶接十字継手を解析対象とした.また,ビード形状に加え,先行荷重および繰返し荷重の大きさの残留応力緩和挙動および疲労寿命への影響について考察を行った.本研究では溶接構造物の溶接止端部における局所的な繰返し弾塑性挙動を明らかにし、それらの結果を用いて疲労き裂発生寿命を評価するシステムの開発を行った。まず熱弾塑性解析を実施することにより残留応力を導入し、その結果を反映した繰返し弾塑性解析により得られた結果を用いて疲労き裂発生寿命の評価を可能とした。さらにK値を用いた疲労き裂伝播寿命評価を行うことにより、全寿命を評価可能とした。2種類のビード形状を有する溶接十字継手を解析対象とし、ビード形状に加え、先行荷重および繰返し荷重の大きさの残留応力緩和挙動および疲労寿命への影響を評価可能なシステムを整備させた。非荷重伝達型十字溶接継手を対象として,開発中の材料モデルを組込んだFEM解析技術を実施した.また,実験による計測が困難な溶接止端部における残留応力の緩和挙動を明らかにし,さらにき裂発生寿命を予測できることを明らかにした.ここでは特に,溶接止端部の形状および溶接残留応力の有無を変化させたモデルを設定し,引張および圧縮予荷重の有無が,その後の繰返し負荷に伴う残留応力緩和挙動に与える影響などに関しても考察を行い,開発システムの有用性を確認することができ,さらに実験的検討の準備も進んでおり,おおむね順調に進展していると判断した.これまでに著者らが開発を進めている弾塑性モデルおよび疲労寿命推定システムは,低サイクル疲労に限定されること無く,巨視的弾性の応力状態となる高サイクル疲労条件下の変形挙動および寿命評価へ適用し得るように拡張されており,今後様々な具体的境界値問題への適用を通じて,モデルのさらなる高精度化を図るとともに,計測が困難な局所領域の応答や実験コストの問題に悩まされる大型構造物の応答など,具体的境界値問題の理解の助けとなることが期待される.具体的には,局所的な現象に限らず,繰返し載荷を伴う座屈問題,非比例負荷条件下の弾塑性挙動,極低サイクル延性破壊問題への対応など,進めていく予定である.28年度が最終年度であるため、記入しない。
薬用植物におけるフラボノイド類生産の基礎研究

クズ(Duer aria lobata)培養細胞を材料として、これにエリシタ-を処理しイソフラボン生合成系を活性化しCHS遺伝子を発現させcDNAを得て、これからゲノムDNAライブラリ-を検索レクロ-ン解析を行なった所独立と思わ激われる3種の遺伝子が得られ、中でキクロ-ン1,14と名付けた2種はいずれもエリシタ-で誘導される可能性が高い結果が得られた。現在までの所花弁の色素即ち5ヒドロキシ型カルコンから誘導されると考えられるアントシアン系色素生合成にかかわるカルコン合成酵素をコ-ドしていると考えられる遺伝子領域は得られていない。内生エリレタ-もしくはイ-スト抽出物を用いた際も、これまではイソフラボン生合成活性の上昇が見られると同時に細胞の死滅が生じないとされて来た所からプロトプラストの生成を試みたが、種々のセルラ-ゼ、マセロザイムを用い、また種々の細胞膜安定剤も生理的に健常なプロトプラストの生成に致らなかった。即ちプロトプラスト化によって遺伝子の読み出しが、即ちエリシタ-様作用が、生じるらしく、パセリにおけるカルコン合成遺伝子活性化解明にフットプリント法を用いたように都合の良い対照が得られないことが分った。またダイズ由来のレダクタ-ゼのシ-クエンスを調べ、これをPCR法によって得てクズのゲノムDNAにおける一連の生合成遺伝子のクラスタ-の可能性について検討中である。
蛍光性基質を利用した有機カチオントランスポーター類の新規機能評価系の開発

蛍光性の物質である4',6-diamino-2-phenylindole(DAPI)は有機カチオントランスポーターであるmultidrugand toxin extrusion protein1及び2-K及びorganic cation transporter1により効率的に輸送された。この特性を利用し、これらの有機カチオントランスポーターの基質または阻害剤の選別において、従来法より多検体を短時間で行うことができる効率的な方法を開発した。MATEを介したDAPIの細胞内取り込みを速度論的に解析した結果、ミカエリス定数(K_m)はヒトMATE1が1.13μM、ヒトMATE2-Kが6.78μMと算出された。一方、MATEの良好な基質であるcimetidineのヒトMATE安定発現細胞内取り込みに対するDAPIのIC_<50>はヒトMATE1が6.9μM、ヒトMATE2-Kが15.7μMであり、先述のK_m値とほぼ同等であった。このことよりヒトMATE1及び2-KにおけるDAPIの基質認識部位は他のカチオン性基質と同じであることが示唆され、本評価系にDAPIを使用することが適当であると再確認できた。MATEを介したDAPIの輸送は、TEA(tetraethylammonium)やcimetidine等のカチオン性基質と異なり、細胞内pHの影響を受けなかったが、各種阻害剤による影響は、カチオン性基質であるcimetidineに対するものと比較すると良好な相関が得られ、DAPIを用いてMATEの基質または阻害剤の選別(ないし判別)を行うことは可能であると考えられた。細胞内取り込み実験後から測定完了までに要する時間は、従来法のRIを用いた場合67時間程度(96サンプル)要していたが、本評価系では数分程度にまで短縮することができた。さらに、MATEの機能評価系に利用可能なDAPIを用いて、MATE以外の有機カチオントランスポーター類への適用の可能性を探った結果、ヒトorganic cation transporter 1 (hOCT1)にも適用可能であることが分かった。まず、ヒトOCT1 (hOCT1)のcDNAをMDCKII細胞に導入し、安定発現細胞株を作製した。これを用いて、hOCT1を介したDAPIの細胞内取り込みを速度論的に解析した結果、ミカエリス定数は8.9μMと算出された。比較のために、hOCT1の典型的な基質であるtetraethylammonium (TEA)についても同様の検討を行ったところ、そのミカエリス定数は1.8mMであったため、DAPIの方がTEAよりもはるかに高親和性であると考えられる。また、hOCTIを介したDAPI輸送の駆動力についての検討を行ったところ、有機カチオン性基質の輸送が細胞の膜電位に依存しているのに対し、DAPIの輸送は膜電位に非依存的であることが示された。さらに、有機カチオン性の基質の輸送が細胞外pHに非感受性であるのに対して、DAPIの輸送は細胞外pHに感受性であり、pHの上昇に伴いDAPIの輸送も上昇した。一方、hOCT1によるDAPI輸送に対する各種阻害剤の影響は、TEAの輸送に対するものとほぼ同程度であり、これらの間では良好な相関がみられた。これらのことより、hOCT1を介したDAPIの輸送は、有機カチオン性の基質とは輸送特性で異なる点が多いものの、基質認識部位については共通しており、hOCT1の基質または阻害剤の判別において、有効かつ迅速な評価系として利用可能であると考えられる。今後この新規評価系を利用することにより、薬物間相互作用の予測等の効率化が図れるものと期待される。