hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
末梢血流動態から見た各種病態における運動耐容能および運動療法効果の検討

漸増運動負荷時下肢インピーダンスは、運動強度の変化とともに増加するが、運動強度がある強度を超えると、運動強度の増加比率以上に変化する偏曲点(BP)が出現し、呼気ガス分析での呼吸性代償ポイント出現より約120秒前に出現することが確認された。この変化は末梢血流の再分布による可能性があり、健常例、高血圧、心不全例でも確認された。この変曲点(BP)出現強度は、運動トレーニングで増加した。以上の結果より、末梢インピーダンス測定による運動トレーニング強度の設定、運動効果判定が可能となった。1生体電気インピーダンス測定時の電極装着位置の検討電極配置を決めるにあたり,大腿部と下腿部をそれぞれ10等分し,各部分ごとに下肢インピーダンスを,ペダルが最下位置と最上位置で測定(静特性)しその差を求めた。その結果、インピーダンス測定は運動負荷試験開始後4分経過した後(4分間の安静後)に開始し、サンプリング周波数は2.5[Hz]で最もノイズの少ない信号が取得できた。2インピーダンスによる血液量および血液量変化の算の出法の検討ペダル回転数と同周期で出現する変動成分を除去するため,計測したインピーダンス時系列データに対してローパスフィルタ(移動平均)処理をして平滑化を行い、移動平均の区間は前後30秒とし,平滑化後のインピーダンスZを血液量の指標として算出した。3漸増運動負荷時の血流再分布現象をインピーダンス法にて評価運動時のインピーダンスの変化は、運動強度の変化とともに増加するが、運動強度がある強度を超えると、運動強度の増加比率以上に血流が増加するようになる。この点を血流再分布開始点ととらえ、健常例において、運動強度の評価として、心拍数、酸素摂取量、負荷量を定量評価し、同時に下肢インピーダンスの変化と比較検討した。その結果、下肢インピーダンスの変化は、運動強度の増加と一致せず、AT以上の強度において大きく増加する点を認めた。現在この偏曲点を血流変化点として解析中である。このポイントは、血流再分布と関連する可能性があり、現在、従来の運動耐容能(酸素摂取量、無酸素運動閾値、呼吸性代償ポイント)、筋力、筋量、心機能などとの関連につき検討している。今後本研究にてこの関係を明らかにし、さらにインピーダンスと言う電気特性の変化より呼吸性代償、すなわち代謝性変化を推定することの妥当性につき検討する予定である。前年度の検討により、漸増運動負荷時下肢インピーダンス変化を詳細に評価することが可能となった。この運動時のインピーダンスの変化は、運動強度の変化とともに増加するが、運動強度がある強度を超えると、運動強度の増加比率以上に変化する偏曲点が出現することが確認された。健常例30例において、この偏曲点を運動時の呼気ガス分析による運動耐容能の指標と比較した結果、呼吸性代償ポイント出現より約120秒前に出現することが確認された。このインピーダンス偏曲点の出現時間と、個人の運動耐容能を比較した結果、有酸素運動閾値および最大酸素摂取量と有意な正の関係を認めた。すなわち、運動能力が低いほど、インピーダンス偏曲点が早期に出現すると考えられた。また下肢の筋量を(他の)インピーダンス法による体脂肪計で評価し、インピーダンス偏曲点の出現時間との関係をみると、筋量の少ない例ほど偏曲点が早期に出現する傾向を認めた。次に運動習慣のない健常例20例に約3ヶ月の運動療法を施行し、運動療法前後に運動負荷試験を施行し、インピーダンス偏曲点を求めた。運動療法は週2回以上のATレベルでの歩行、自転車エルゴ等に有酸素運動、レジスタンストレーニングを合計約60分施行した。その結果、運動療法によりATVO2、peakVO2は有意に増加し、体脂肪は有意に減少した。インピーダンス偏曲点の出現時間は有意に増加した。このインピーダンス偏曲点出現時間の増加率とpeakVO2の増加量は有意な正の関係を認め、また、下肢筋量とも正の関係を認めた。今後この運動効果とインピーダンス偏曲点の変化との関係を詳細に検討し、インピーダンス偏曲点の生理的意義を明らかにし、運動効果の新たな指標に同様に応用できるか検討する予定である。
眼科領域における新しい免疫療法の開発

眼科領域における新しい免疫療法の開発を目的として、下記の基礎研究並びに臨床研究をおこなった。(1)難治性ぶどう膜炎に対する免疫療法:ヒトのぶどう膜炎モデルとしてラットとサルにおける実験的自己免疫性ぶどう膜炎(EAU)を用い、各種免疫抑制剤の免疫薬理作用を検討した。シクロスポリンA(CsA)はコルヒチンやシクロフォスファミドに比べ効果が優れ、シクロスポリンGも副作用が少なく、EAUに対して有効な結果がえられた。臨床的に、難治性ベーチェット病にGA治療をおこない、全体で69症例が観察期間6ケ月以上であった。この患者群で、4ー6mg/kg/日のCsAが、有効かつ安全な用量と考えられた。しかし、この用量でも、〓機能のモニターは月1回はおこなう必要がある。(2)全層角膜移植拒絶反応に対する免疫療法:ラットにおける全層角膜移植の実験系を確立した。この系において、拒絶反応の免疫病理反応を解析し、シクロスポリンの効果を解析した。また、数回の拒絶反応をくりかえし角膜片が混濁し、再度移植をおこなう例に、シクロスポリン療法を併用して、極めて良好な結果をえた。(3)網膜芽細胞腫に対する免疫療法:ヒト網膜芽細胞腫継代細胞Y-79に対する単クローン抗体m-1131を作製した。m-1131は網膜芽細胞腫の新蘇腫瘍にはよく反応し、他の腫瘍には反応しない抗体であった。これを細胞障害物害に結合させることは現在おこなっているが当該年度に完成しなかった。更に、各種プロスタグランディン(PG)の網膜芽細胞腫に対する作用を検討した。PGA_2、A_1、D_2、J_2及び64Eが網膜芽細胞腫を抑制することが判明した。眼科領域における新しい免疫療法の開発を目的として、昭和60年度に下記の如くの研究成果を得た。1)実験的ブドウ膜炎におけるシクロスポリンA,D,G及びステロイド,サイクロフォスファミドの各種免疫抑制剤の効果をルイス系ラットで比較した。ブドウ膜炎に対する発症抑制効果はシクロスポリンA(CsA)が最も強く、5mg/kg/日でほぼ完全に抑制し、CsGは20mg/kg/日でほぼ完全に抑制した。CsDにはブドウ膜炎発症抑制効果は極めて低かった。一方、腎障害を組織学的に検討したところ、CsA(10mg/kg/日)ですでに近位尿細管の浮腫が認められたが、CsD,CsGにはほとんど腎毒性が認められなかった。感作に使用した抗原に対する細胞性免疫反応のみを選択的に抑制した。サイクロフォスファミド及びデキサメサゾンは、投与期間中はよくブドウ膜炎を抑制したが、投与中止後しばらくして発病し、全免疫反応を非選択的に抑制した。以上の動物実験の結果より、CsGはCsAと同様にブドウ膜炎治療に有効と考えられた。2)網膜芽細胞腫に対する免疫療法:ヒト網膜芽細胞腫継代細胞(Y-79)に対するモノクローナル抗体を作製し、その特異性を検討した。Y-79細胞に対する反応は良好に認められたが、網膜芽細胞腫の患者より得た新鮮腫瘍細胞に対する反応が極めて低く、又、神経芽細胞に対する交又反応が弱く認められた。3)角膜移植後拒絶反応に対する免疫療法:CsA,CsG,CsDを、ピーナツ油に溶解し、点眼剤とし家兎に点眼しその刺激反応を調べたが、角膜ビラン、結膜刺激作用は軽微であった。点眼後の血中CsA濃度を測定したところ点眼後のCsA血中濃度の上昇が認められた。今後の実験で点眼による全身吸収の作用を念頭におく必要があると考えられた。

眼科領域における新しい免疫療法の開発を目的として昭和61年度に行なった研究で、下記の如くの成果が得られた。1.(1)実験的自己免疫性ぶどう膜炎に対するシクロスポリンA、D、G(CsA,CsD,CsG)の治療効果と副作用を前年度に検討したが、今年度はラットの腎機能障害について検討し、40mg/kg/日でもCsGは腎機能障害を生じないことがわかった。更に、CsAは、ラットの実験的自己免疫性ぶどう膜炎に対して、免疫寛容を誘導し、抗原特異的なサプレッサー細胞を活性化することが判明した。(2)ベーチェット病を主に難治性ぶどう膜炎の症例に対し、CsA療法を行ない、安全かつ有効な投与法について検討した。その結果、従来の初期量10mg/kg/日で1日1回内服よりも、46mg/kg/日で1日2回分服する方が、腎障害の発生率が低く、ぶどう膜炎に対する有効性も同等であることがわかった。今後は、この方法で症例を重ねる予定である。2.(1)網膜芽細胞腫に対する単クーロン抗体を前年度作製したが、この抗体の、ヒト網膜芽細胞腫の新鮮標本に対する免疫学的特異反応を今年度は検討した。この抗体は他の悪性腫瘍には反応しないが、網膜芽細胞腫に反応することが免疫組織化学的に示された。(2)網膜芽細胞腫に対するプロスタグランディンズの抑制効果について検討した。PG【D_2】、【J_2】がin vitroでの網膜芽細胞腫の増殖抑制作用をもつことが判明した。3.角膜移植に対する免疫療法開発のための実験モデルとして、ラットにおける角膜移植の実験系を確立した。ラットでは、種々の単クローナル抗体が市販されており、拒絶反応の免疫学的検索が可能なので、次年度以降の研究課題とする。1)ぶどう膜炎に対する免疫療法:CsA,CsD,CsGの腎毒性をラットを用い,病理組織学的,およびメタボリックケージにより24時間蓄尿して腎機能検査をした. CsAは20mg/kg以上で腎組織障害を生じたが,CsDとCsGは40mg/kgでも障害は軽く,又,腎機能も正常であった.前年度, CsGはこの用量でラットの実験的ぶどう膜炎抑制に有効だった結果から, CsGはぶどう膜炎治療の応用に有望である.ベーチェット病に対するCsA療法で,副作用を軽減し治療効果をあげるために,プロラクチン阻害剤のブロモクリプチンの併用療法を6例に行なった.併用前後で, CsAの血中濃度,プロラクチン濃度,腎機能を検討した.併用により,プロラクチンは減少したが, CsA濃度が上昇することが判明したので,以後はCsA投与量を2/3に減じた.腎機能は全例改善傾向を示した.2)網膜芽細胞腫:ヌードマウスに移植したYー79網膜芽細胞腫に対するPGD2と64Eの薬効を検討した.いずれも,特に64Eは, invivoにおいて,網膜芽細胞腫の成長を著明に抑制した.3)角膜移植:主要組織適合抗原の異なる系統間のラット(BN→ルイス),近い系統間(フィッシャー→ルイス)いずれの組み合わせでも,全層角膜移植された移植片は術後2週間後に拒絶反応を起した.これに対する, CsAの作用を検討したところ, 10mg/kgの用量でほぼ完全に拒絶反応を抑制した.しかし,投与を中止すると約2週間後には拒絶反応が生じた.難治性ぶどう膜炎を伴うベーチェット病の治療にシクロスポリン療法を前年度にひきつづいておこなった。合計69症例に対してもちい、眼発作頻度と視力予後に対する効果と副作用について、シクロスポリンの用量との関係を検討し、安全かつ有効な用量を決めるように努めた。
造血幹細胞レベルでのT細胞レセプターN配列挿入の調節機構

胎生14日胎児肝臓および成体骨髄よりThy-1^<10>Lineage marker-Sca-1^+ c-kit^+である造血幹細胞をfluorescence activated cell sorterを用いて単離し、limiting dilution条件下でデオキシグアノシン処理した胎児胸腺とhanging drop培養及び器官培養し、T細胞に分化させた。幹細胞の胸腺への再構成の頻度は約30細胞に1回であった。胸腺1個あたり幹細胞3ないし10細胞の割合で再構成させた8個の胸腺の細胞からmRNAを抽出し、V_<γ4>、V_<γ2>とJ_<γ1>プライマーおよびV_<β8>とC_βプライマーを用い、プログラムテンプコントロールシステムによりRT-PCRで増幅した。得られたPCR産物をクローニングしその塩基配列を約30個ずつ調べた。V_<γ4>配列に関して、N配列を持つ割合が0%から79%の巾で幹細胞が連続的に分布した(平均36%)。この内、N配列挿入が0-25%の低レベルのものは4個、25-70%の中レベルが3個、70%以上の高レベルのものが1個であった。一方、成体骨髄の幹細胞では85%と高レベルを示した。この結果は、幹細胞の胎児型から成体型への変化が連続的に起こっており、2つの型が細胞系列としてつながっていることを示している。また、N配列挿入能に関して幹細胞集団が不均一であることを示している。さらに、V_<γ2>とV_<β8>も解析した5個の幹細胞については、N配列挿入が3種類のV遺伝子の種類によらず一様に低レベルか高レベルになる傾向が認められた。この結果は、N配列挿入がT細胞レセプターの種類により決定されるのではなく、幹細胞における段階ですでにプログラミングされていることを示している。
乳癌術後リンパ浮腫に対する細胞移植療法の検討

<目的>乳癌術後のリンパ浮腫に対する治療として、血管新生療法と同様の細胞移植療法が有効である可能性がある。細胞移植療法の効果を検証できる皮膚欠損のないリンパ浮腫モデルを開発することを目的とした。<方法>生後6週齢のヌードマウス(BALB/c, nu/nu)を1週間訓化した後に5%パテントブルーを手掌皮下に0.02ml注入しリンパ流を同定し手術操作を行った。正確に0.5Nの圧力を加えられるマイクロメーターを使用して、肘遠位、拇指球に相当する部位で直径を測定した。<結果>(1):腋窩部リンパ節郭清、(2):(1)+皮下組織熱焼灼、(3):(1)+肩周囲リンパ管結紮、(4):(1)+大胸筋切除、(5):(4)+肩周囲全周皮下環状焼灼のいずれの操作でも有意な上肢径の増大は認められなかった。パテントブルーは撓骨側の皮下を走行する静脈に流入していたので、肘部でこれに伴走するリンパ管のみではなく静脈自体も結紮すると、肘部分で内側に向かうャントが顕在化して色素が腋窩静脈に流入することが判明した。この操作を行うと拇指球部の直径は術後7日で患側、健側はそれぞれ1.837mm、1.779mm(t-test、p=0.0024)、14日で1.891mm、1.827mm(p=0.024)、28日で1.823mm、1.774mm(p=0.021)、56日で1.787mm、1.808mm(p=0.567)で術後28日まで患側で有意な径の増大を認めた。肘部では径の差はなかった。組織学的検討では径の差がなくなった術後56日目でも皮下の浮腫は明確に残存していたが、84日目には組織学的にも浮腫の遺残は認めなかった。<結論>術後56日程度まで評価が可能なリンパ浮腫動物モデルを確立できた。リンパ浮腫の発生にはリンパ流が流入する静脈系の障害が重要な要因であることが推測された。これまでの結果をまとめ今年度中に学会報告を予定している<目的>乳癌術後のリンパ浮腫はQOLを損なう大きな要因の一つであるが、現在でも治療は理学療法による予防が中心で根本的な治療法はない。細胞移植による血管新生治療はすでに臨床応用が始まっており、血管新生とリンパ管再生はそれに関与する細胞や増殖因子などがかなり共通していることが知られているので、同様の手法でリンパ管再生を行える可能性は高い。リンパ浮腫の動物モデルは皮膚が欠損しており、細胞移植を行うべき部位が存在しないことから皮膚欠損のないリンパ浮腫モデルが存在すれば、細胞移植治療によるリンパ管再生の研究やリンパ浮腫の治療法の開発に大きく寄与すると考えられる。そこで乳癌術後リンパ浮腫に相当する皮膚欠損のない動物モデルを開発を試みた。<方法>生後6週齢のヌードマウス(BALB/c, nu/nu)を1週間訓化した後に手術操作を行った。操作後14日目に0.5Nの圧力下に上肢直径、皮膚厚の測定を行った。<結果>(1)ヒトの手術に準じ、腋窩リンパ節郭清を行ったモデルでは、平均上肢(肘部)直径は健側2.44mm、患側2.67mm、上肢(肘部)の平均皮膚厚は健側0.34mm、患側0.39mmでいずれも有意差はなかった。次いで行った(2)腋窩リンパ節郭清に広範な胸部から腋窩の皮下組織を切除するモデルでは、平均上肢直径は健側2.70mm、患側で2.45、平均皮膚厚は健側0.38mm、患側0.46でいずれも有意差はなかった。(3)(2)のモデルにリンパ管焼灼(結紮)を加えたモデルでは平均上肢直径は健側2.45mm、患側2.41mmであった。平均皮膚厚は健側0.40mm、患側0.35mmであった。これらのモデルでは上肢直径、皮膚厚にはいずれも有意差がみとめられなかった。

パテントブルーは撓骨側の皮下を走行する静脈に流入していたので、肘部でこれに伴走するリンパ管のみではなく静脈自体も結紮すると、肘部分で内側に向かうャントが顕在化して色素が腋窩静脈に流入することが判明した。この操作を行うと拇指球部の直径は術後7日で患側、健側はそれぞれ1.837mm、1.779mm(t-test、p=0.0024)、14日で1.891mm、1.827mm(p=0.024)、28日で1.823mm、1.774mm(p=0.021)、56日で1.787mm、1.808mm(p=0.567)で術後28日まで患側で有意な径の増大を認めた。肘部では径の差はなかった。組織学的検討では径の差がなくなった術後56日目でも皮下の浮腫は明確に残存していたが、84日目には組織学的にも浮腫の遺残は認めなかった。<結論>術後56日程度まで評価が可能なリンパ浮腫動物モデルを確立できた。リンパ浮腫の発生にはリンパ流が流入する静脈系の障害が重要な要因であることが推測された。これまでの結果をまとめ今年度中に学会報告を予定している
亜熱帯域に生息する有毒甲殻類に含まれる高機能性新規構造多糖類に関する研究

キチンは直鎖型の構造アミノ多糖類であり、幅広い生物相に分布していることから、地球上で最も豊富に分布する機能性バイオマス資源とされている。そこで、亜熱帯海域に生息するヤシガニ甲殻から新たにキチンを調製し、その諸性状を明らかにするとともに、新素材としての可能性を探るため、様々なゲルを調製しその物性についても検討した。本キチンは、機器分析の結果から、α型キチンであると考えられたが、その特徴的な網目構造から、強い強度を有し、さらに、キトサンホルムアルデヒドゲルにおいても、エビやカニ由来のキチンから調製される同様のゲルに比べ、強度の強いゲルが得られることから環境に優しい新素材としての期待が持たれた。亜熱帯域に生息する有毒甲殻類の甲殻を研究対象としてキチンなどの新規機能性構造多糖類を探索する過程で、食中毒原因種であるオカヤドカリ科ヤシガニBirguslatro甲殻にズワイガニ甲殻に主成分として含まれるキチンとはその諸性状が異なる構造多糖類の存在することを認めた。本研究では、1)ヤシガニ甲殻由来の機能性構造多糖類(I)の性状解明、2)(I)より精製されるキトサン(II)の性状解明、3) (I)より調製される機能性ゲルの諸性状とその微細構造の解明、並びに4)上記3点を総括する高次有効利用法の検討を目的としている。研究計画2年目となる平成24年度は、まず、初年度に確立したカニ類甲殻からの(I)の精製法を用いて、石垣島で入手したヤシガニ甲殻から(I)の大量精製を試みた。これにより洗浄したヤシガニ甲殻(乾燥物重量4.5kg)より(I)を627g得ることができた(収率は14%)。一方、昨年度採取した石垣島産の麻痺性貝毒を著量含むスベスベマンジュウガニ甲殻からのキチンの精製も行い(I)を50g得ることができた。さらに、得られた(I)の化学構造に関する情報を得る目的で、それぞれの赤外線吸収(IR)スペクトルの測定をATR法により行った。(I)におけるNHCOCH3のうち、C=Oの伸縮に起因するamideIの特徴的な吸収(1661cm-1)、N-Hの変角に起因するamideIIの特徴的な吸収(1558cm-1)が共通して認められたが、キチン標品の吸収パターンと比較すると標品に認められない大きな吸収帯(30003500 cm-1)がヤシガニより精製した構造多糖類(I)において認められ、構造の違いが示唆された。ヤシガニ甲殻より多量の(I)が精製されたことはこれまでに例がなく、多方面への研究展開が期待できる。現在、電界放出形走査電子顕微鏡(FE-SEM)による詳細な元素分析を実施している。キチンは直鎖型の構造アミノ多糖類であり、地球上で最も豊富なバイオマス資源とされている。今回、亜熱帯海域に生息するヤシガニ甲殻よりキチンを精製し、その構造情報を得ることを目的として、機器分析を試みた。まず、ヤシガニ甲殻由来精製キチンの表面組織を電解放出型走査電子顕微鏡により観察したところ、エビやカニ甲殻に由来するキチンには見られない特徴的な規則正しい細かな網目構造(φ≒5.00μm)が観察された。一方、赤外線吸収スペクトルにおける吸収パターンは、α-キチンに類似したものであり、X線ディフラクトメトリーからも同様の結果が得られた。キチンはほとんどの溶剤に対して難溶性であることから、固体NMR分析法により13C-NMRスペクトルの測定を試みた。NMRスペクトルの測定は、JEOL ECA600を用い、4mm CPMASプローブにより、室温条件下で行った。その結果、23ppm付近(22.975ppm)にN-アセチルグルコサミン構造由来の特徴的なN-アセチルメチル基(N-COCH3)の鋭い吸収が観測され、さらに、174ppm付近(173.674ppm)にもアセチルカルボニル基由来と思われるカルボニル炭素(C=O)の吸収が観測された。ところで、ズワイガニ、ヤシガニのN-アセチルキトサンのゲル強度は、それぞれ408 gf、440 gfでほぼ同等であったが、アリリデン化することによりヤシガニ由来のキトサン-ホルムアルデヒドゲルのゲル強度は、ズワイガニ由来のものと比較して約6倍の強度(1504 gf)が認められた。以上、ヤシガニ甲殻由来キチンは、α-キチンであると考えらるが、その物理的な構造から、強い強度を有し、さらに、キトサンホルムアルデヒドゲルにおいても、エビやカニ由来のキチンから調製される同様のゲルに比べ、強度の強いゲルが得られることから環境に優しい新素材としての期待が持たれた。

亜熱帯域に生息する有毒甲殻類の甲殻を研究対象としてキチンなどの新規機能性構造多糖類を探索する過程で、食中毒原因種であるオカヤドカリ科ヤシガニBirguslatro甲殻にズワイガニ甲殻に主成分として含まれるキチンとはその諸性状が異なる構造多糖類の存在することが認められた。本研究では、1)ヤシガニ甲殻中の機能性構造多糖類(I)の諸性状の解明、2)機能性多糖類より精製されるキトサン(II)の諸性状の解明、3)構造多糖類(I)より調製される機能性ゲルの諸性状とその微細構造の解明、ならびに4)上記3点を総括する高次有効利用法の検討を目的としている。初年度となる平成23年度は、B. latroを沖縄県石垣島で採取し、まず、その甲殻から対象となる構造多糖類(I)を精製する方法を確立する。次いで、得られた構造多糖類(I)の物理的強度をはじめとする物性測定を既知物質であるズワイガニ甲殻から精製されるキチンの物性と比較しながら行う。この際、構造多糖類の微細構造を電子顕微鏡により観察し、構造強度相関を考慮しながら考察する。精製法については、塩酸による脱灰、アルカリによる除タンパク、過マンガン酸カリウムによる脱色による一連の精製法が適しており、本精製法によりヤシガニ甲殻から収率24%で淡黄色の構造多糖類(I:キチン)が得られた。一方、ズワイガニからは収率32%で純白のキチン(構造多糖類)が得られた。次いで、これらキチンの表面構造を電界放出型走査電子顕微鏡(FE-SEM)にて観察した。その結果、ヤシガニ由来のキチン(I)が層状構造であるのに対してズワイガニ由来のキチンは繊維状構造であり、両者の強度に明瞭な違いが認められた(素材としての強度:ヤシガニ由来キチン>ズワイガニ由来のキチン)。本研究では、1)ヤシガニ甲殻由来の機能性構造多糖類(I)の性状解明、2)(I)より精製されるキトサン(II)の性状解明、3) (I)より調製される機能性ゲルの諸性状とその微細構造の解明、並びに4)上記3点を総括する高次有効利用法の検討を目的としている。研究計画2年目となる平成24年度は、初年度に確立したカニ類甲殻からの(I)の精製法を用いて、石垣島で入手したヤシガニ甲殻から(I)の大量精製を試み、そのIRスペクトルから機能性構造多糖類(I)の構造について検討を加えた。その後、(I)の化学構造について検討したが、大量精製に時間を要し、化学構造の詳細は解明できなかったが既知物質との構造上の違いを大筋で明らかにすることができた。また、同様に調製した(I)の誘導体キトサンについても既知物質との構造上の違いを明らかにすることができた。なお、引き続き、化学構造の検討を行っている。一方、本法により精製されるヤシガニ甲殻構造多糖類(I)は、同じ方法でスベスベマンジュウガニ甲殻より精製されるキチンと明らかに強度の点で明瞭な差があり、特に、FE-SEMによるキチンの表面構造に明瞭な際が認められた。すなわち、ヤシガニ甲殻由来キチンでは、表面が多くの板(面)による層状構造であるのに対して、スベスベマンジュウガニ甲殻由来の(I)は、多くの繊維状の組織が観察され、このような構造上の差異が組織強度に反映しているものと考えられた。引き続き、想定される高次機能(貝毒やフグ毒の吸着能など)についての検討を行っている。おおむね目標は達成されたものと考えられる。平成23年度の本研究課題における主目標は、1)ヤシガニ甲殻中の機能性構造多糖類(I:キチン)の諸性状の解明、
酸化物セラミックスのクリ-プとクリ-プ破壊

酸化物セラミックスの高温変形挙動(クリ-プ変形及びクリ-プ破壊)に及ぼす微構造(粒径、粒界第二相など)の効果について、以下の種々の特徴を持つ材料に対し研究を行った:典型的な単純酸化物としてのマグネシア、超微粒多結晶の超塑性セラミックスとして近年注目されるジルコニア(Y-TZP)、微粒のリチウムアルミノシリケ-トで粒界に残留ガラス相をのこす結晶化ガラス(βスポジュメン)及び耐クリ-プ性高温構造材料として期待される単相ムライト(定比3Al_2O_3・2SiO_2)・焼結助剤を含むマグネシアや結晶化ガラス中の液相は、溶解-析出機構により変形を促進させ高温での塑性加工性を高めるものの、粒界キャビティの発生源としてクリ-プ損傷・破壊の原因となる。したがって、焼結特性の改良などの目的で導入される液相は高温での強度低下を導くのみならず、材料中に変形損傷を導入することにもなる。一方、近年の完成度の高いセラミックスは細かな微構造を持ち、脆性域での破壊強度はかなり高くなっている。しかし、耐クリ-プ(難変形)性という観点からは、粒径依存の大きな変形領域(拡散クリ-プでε〓σ/d^<2-3>、超塑性域でε〓σ^2/d^<1-2>)では、微粒多結晶は好ましくないといえる。単相ムライトは小粒径ながら(1.5μm)変形しにくく、ガラス相をほとんど含まないことからかなりの高温下でも強度が低下せず、高温構造材料として優れた酸化物であることがわかった。ただし、粒径の増大は知クリ-プ性を高めるより、キャビティの発生を導き、その結果クリ-プ破壊強度は低下した。粒径の増大は耐クリ-プ性を高めるより、キャビティの発生を導き、その結果クリ-プ破壊強度は低下した。粒径の増大にともなってキャビティが発生しやすくなることはY-TZPで観察された。種々の微構造を持つ酸化物セラミックスに対して、クリ-プ破壊の前駆現象としてのキャビテ-ションの発生条件を一般化することは難しく、今後この課題を発展させて研究を継続して行きたい。研究対象とした試料は、マクネシア(高純度単相のもの及び粒界にガラス相を含むもの)、ムライト(単相)、ジルコニア(Y-TZP)及びβスポジュメン結晶化ガラスである。粒径の小さなY-TZPと結晶化ガラスは大きな変形量と変形速度を示した。後者については残留ガラス(8%)の寄与が大きい。Y-TZPではサブミクロンの粒径のものは応力指数2となり、いわゆる超塑性を示し塑性加工の可能なセラミックスとして特異なものとわかった。しかし、粒径の増大とともに変形応力は増しキャビティや粒界クラックの発生が認められた。この様な状況下では変形は拡散クリープであった。キャビティの発生、成長、合体を経て破壊に至る過程は高温下でも変形の困難な脆性材料のクリープ破壊においてしばしば観察される現象で、低速き裂成長(SCG)、応力腐食割れと並んで重要な研究課題である。耐クリープ性の材料として期待されるムライトにおいてもキャビテーションとSCGによるクリープ破壊が認められた。比較的小料径ではSCGにより、やや大粒径になるとキャビテーションの発生・成長・合体によるクリープ破壊が生じている。

変形は拡散クリープであり、律速拡散種の拡散係数の小さなこと(例えばアルミナに比べて)が耐クリープ性に寄与しており、またクリープ破壊強度、高温即時破壊強度ともにアルミナに優っていることがわかった。一方、ガラス相を含む2相系セラミックスの代表である結晶化ガラスでは、比較的低温減で拡散クリープとなり、粒界キャビティの発生が顕著であるのに対し、高温域での変形は溶解ー析出機構であり、ひずみ速度は大きく変形量も大きなものとなった。さらに、結晶粒界へのガラス相の導入は変形の活性化エネルギーを増大させることも明らかになった(マグネシア、結晶化ガラス)。前年度は、粒界にガラス相を残す結晶化ガラス(βスポジュメン)の高温変形試験を曲げ及び圧縮様式で行い、その結果の一部を発表した。セラミックス(とくに酸化物多結晶)の変形に及ぼす液相の効果については今後ともさらに実験を続ける予定である。一方粒界相を含まないシリケ-トの代表として近年開発された高純度微粒ムライト焼結体は耐クリ-プ性の観点から興味深く、前年度に続いて本年度の主要課題とした。多結晶の粒界液相はしばしば不純物起源のシリケ-トより成り、一般に変形を促進させるとともに粒界キャビテ-ションの原因となる。このことは、MgOや結晶化ガラスに対しても観察された。それに対し結晶性のシリケ-トが本来難変形性の物質であることは、Si-Oの強固な結合から予想される。尤も、これはSiO_4単位の結合様式にも関連し、例えばフォルステライト(Mg_2SiO_4)は単独のSiO_4単位から構成されており、格子中に水が入ると変形が大きく促進されるといわれている。ムライトも同様にSiO_4の単離型であるが酸化物中最も優れた耐クリ-プ性の材料であるとともに,高温強度、クリ-プ破壊強度も大きく、高温構造材料として優れたものであることがわかった。変形は典型的な拡散クリ-プであり、ムライト中の構成元素の拡散が遅いことが微粒であるにもかかわらず難変形性であることの原因と考えられる。ただし、粒径が大きくなると(>2μm)粒界キャビティが発生しやすくなることから、粒界に残留する微量ガラス相の影響などが今後の検討課題として残った。さらに、高温下で観測されたひずみ速度と応力指数の増大についても現在その機構の解明のため研究を継続している。また、キャビティの発生とクリ-プ破壊に関しては、MgO、Y-TZP、結晶化ガラスなど種々の材料について一部の結果を発表してきたが、本課題を発展させて今後の研究を継続する予定である。
核膜による細胞周期・分化依存的転写制御機構の解明

本研究は核膜内膜特異的タンパク質ラミンB受容体(LBR)による転写制御機構をゲノムワイドに解明することを通して、核膜による転写制御機構を明らかにすることを目的とした。HL60細胞をレチノイン酸で分化させ、分化前後での遺伝子発現量の変動およびLBRの染色体結合量の変動を網羅的に解析したところ、LBRが細胞外マトリクス関連遺伝子の発現調節を行っていることが示唆された。一方、LBRをノックダウンしたHeLa細胞での遺伝子発現解析においても細胞外マトリクス関連遺伝子の発現変動が見られたことから、核膜が分化などのシグナルに応じて細胞外環境を変化させるという新たな知見を得ることができた。細胞は数万の遺伝子の中から細胞周期や分化過程に応じて必要な遺伝子のみを正確に取り出し、厳密にその転写を制御している。このような厳密な転写制御には核内構造体が関与する。本研究では核膜内膜特異的タンパク質であるラミンB受容体(LBR)に着目し、LBRの転写制御メカニズムの解明を通して、核膜による転写制御のメカニズムを明らかにすることを目的としている。昨年度は、HeLa細胞・HL60細胞を用いてLBRが結合する染色体部位の網羅的同定を、クロマチン免疫沈降と次世代シーケンシングにより行った。その結果、LBRはヘテロクロマチンと呼ばれる染色体領域に主に結合すること、HeLa細胞では特定の染色体末端領域に結合すること、HL60細胞ではHeLa細胞で見られた特定の染色体末端への結合が見られなくなることなどがわかった。この結果は異なる細胞種への分化の過程で細胞核内の染色体配置が大きく変化したことを示唆している。また、LBRの発現を約90%恒常的に抑えたHeLa細胞株を作成し、それによって影響を受ける遺伝子群をマイクロアレイ法によって検討したところ、600種を超える遺伝子群の発現が2倍以上変動していることがわかった。現在これらの遺伝子群がどのような生物学的な意義を持っているかについて解析を進めている。昨年度で得たこれらの結果を詳細に解析することで、核膜直下においてLBRに直接的に転写制御される遺伝子群を同定でき、これらが細胞分化に与える影響を明らかにするための基礎的なデータとなることが期待される。昨年度は、一昨年度より行っているChIP-seqによるLBRの染色体結合部位の網羅的同定の精査を重点的に行った。その結果、一昨年度にHeLa細胞から得られていたChIP-seqの結果は、免疫沈降効率が低くいことに起因するバックグランドノイズの高いデータであったことが判明した。免疫沈降条件を改善して再測定したところ、LBRは巨視的には細胞の分化状態に寄らず決まった染色体結合パターンを示すことがわかった。また、LBRの染色体結合部位は、LBRの結合タンパク質であるラミンBの染色体結合部位とほぼ一致したが、LBRのみしか結合していない、「LBR特異的染色体結合部位」が存在した。LBR特異的染色体結合部位に存在する遺伝子はLBRによって直接転写制御を受けていることが予想されるため、一昨年度に得られたマイクロアレイの結果の中から、LBR特異的染色体結合部位に存在し、LBRのノックダウンによって遺伝子発現が変化する候補遺伝子についてその転写機構を検討している。一方、特定の遺伝子座を可視化するため、ゲノム編集技術であるCRISPR/Cas9を利用した染色体部位特異的なイメージングシステムの導入も行った。これによりHeLa細胞のテロメアを生細胞で観察することができた。本研究では核膜内膜特異的タンパク質であるラミンB受容体(LBR)に着目し、LBRの転写制御メカニズムの解明を通して、核膜による転写制御メカニズムを明らかにすることを目的としている。最終年度は、HL60細胞におけるLBRの分化依存的な染色体結合部位の変化と遺伝子発現量の相関に関する解析を行った。その結果、分化に伴ってLBRが染色体に結合することにより、転写が負に制御される遺伝子として236種の候補を得た。ジーンオントロジーを用いた解析から、この遺伝子群には細胞外マトリクス関連遺伝子が多く含まれることが分かった。一方、これまでの研究で作製したLBRを約90%恒常的にノックダウンしたHeLa細胞株における遺伝子発現パターンの解析においても細胞外マトリクス関連遺伝子の変動が確認された。そこでLBRノックダウンHeLa細胞株をコラーゲン上で培養すると、仮足の伸長と細胞の移動速度の抑制が見られた。以上のことから、LBRは分化誘導などのシグナルに応答し、細胞外環境を変化させる役割を持つことが強く示唆された。近年LBR以外の核膜タンパク質でも細胞外マトリクス関連遺伝子を制御していることが報告されており、核膜の新たな機能について解析を行う足がかりを得ることが出来た。本研究は核膜内膜

特異的タンパク質ラミンB受容体(LBR)による転写制御機構をゲノムワイドに解明することを通して、核膜による転写制御機構を明らかにすることを目的とした。HL60細胞をレチノイン酸で分化させ、分化前後での遺伝子発現量の変動およびLBRの染色体結合量の変動を網羅的に解析したところ、LBRが細胞外マトリクス関連遺伝子の発現調節を行っていることが示唆された。一方、LBRをノックダウンしたHeLa細胞での遺伝子発現解析においても細胞外マトリクス関連遺伝子の発現変動が見られたことから、核膜が分化などのシグナルに応じて細胞外環境を変化させるという新たな知見を得ることができた。昨年度は(1)LBRによって直接転写制御される遺伝子の転写機構の解析、(2)特定の遺伝子座の転写を可視化できるイメージングシステムの構築を行う予定であった。(1)についてはChIP-seqのデータを得るまでの条件検討に時間がかかり、当初の予定よりも遅れている。しかしながら、LBRの染色体結合部位のデータは本研究の骨格をなすものであるため、引き続き精査をしていく。(2)に関しては、当初ZEN法を用いる予定であったが、より導入しやすいCRISPR/Cas9法に変更したことで、イメージングツールの開発は予定よりも早く行えた。生化学、分子生物学、細胞生物学本年度はLBRによる直接的な転写制御の可能性が示唆された候補遺伝子について、分化依存性や転写制御メカニズムの解析を進める。当初は分化中に大規模な染色体配置の変換が起こることも予想していたため、詳細な転写制御メカニズムもChIP-seqによって解析を行う予定であったが、これまでの研究で局所における転写状態の変動が主として起こることが示唆されたため、qPCRによる定量解析に切り替えることで研究全体のスピードアップを図る。昨年度はHL60細胞、HeLa細胞についてLBRが関与する転写調節機構を明らかにすることを主な目的としていた。実験はほぼ計画通り進み、マイクロアレイによるLBRが制御する遺伝子群の解析・ChIP-seqによるLBRが結合する染色体部位の同定のための実験を行った。現在これらの結果からLBRによる転写調節機構の詳細なメカニズムを解析中である。一方、HL60細胞のLBRのノックダウン細胞の作製が一般的なリポフェクション法では困難であったため、エレクトロポレーション法やウイルスベクターを用いたトランスフェクション法を検討中である。昨年度行う予定であった解析を本年度も引き続き行うため、分子生物学試薬の購入が必要となった。本年度は昨年度の解析から得られた情報を精査し、LBRによる転写制御メカニズムの解析を進める。また、細胞分化とLBRの転写制御の関連を明らかにするための細胞株の作成、イメージングシステムの検討を行い、システム構築が終了し次第、解析を開始する予定である。一方、昨年度作成が出来なかったHL60細胞でのLBRノックダウン細胞株の作成を多方面から進め、遺伝子発現解析を行う。qPCR用試薬など分子生物学試薬を購入する予定である。次世代シーケンサーを用いた解析を共同研究で行うこととなったが、昨年度内で終了せず、次年度も引き続き行うことになったため。繰り越した助成金は、今年度も引き続き次世代シーケンサーによる網羅的解析を進めるための消耗品費として使用する。
シロイヌナズナT-DNA挿入株を用いた植物特異的なオートファジー欠損株の探索

オートファジーは、栄養欠乏条件下で自らの構成成分を分解する真核生物に共通の機構である。植物では、栄養欠乏条件下だけでなく様々なストレスによってオートファジーが誘導されることが分かっている。またシロイヌナズナの根の伸長領域において、栄養存在下でも常にオートファジーが起こっていることも明らかになっているが、その誘導メカニズムはまだ明らかになっていない。そこで本研究では、植物特異的なオートファジー関連遺伝子変異株のスクリーニングを行なった。年度内に新奇のオートファジー関連遺伝子の同定には至らなかったが、発根をマーカーとした一次スクリーニングを継続して行なっている。オートファジーは、栄養が欠乏した際に細胞内で自らの細胞成分を膜成分で包み込み、液胞へと運び込んで分解するメカニズムである。オートファジーは多くの真核生物に共通の機構であり、酵母を用いた研究で報告されたオートファジー関連遺伝子群(ATGs)のホモログは様々な生物に保存されていることが分かっている。これまで私たちはシロイヌナズナのATG破壊株を用いた解析を行ってきた。それらの解析から、1)栄養条件に関わらず根端では恒常的にオートファジーが起こっていること、2)根の伸長速度が野生株に比べてオートファジー欠損株の方が遅いことを見いだした。またさらに2)がもたらす結果として、シロイヌナズナの発芽時の発根が野生株に比べて遅いことが分かった。この表現系を利用して、シロイヌナズナT-DNA挿入株の中から根の発根の遅い個体を選別するスクリーニングを行っている。このスクリーニングにより、ATG以外のオートファジー関連遺伝子を欠損した個体を得て、その解析を行うことを最終的な目的としている。野生株とATG破壊株を比較した場合には、根の発根速度は有為に差が見られたが、T-DNA挿入株をバックグラウンドにすると根の発根速度に野生株以上のばらつきが見られ、一次スクリーニングで選抜する株がかなり多いため目的の株を選別するのは見積もったより多くの二次スクリーニングが必要になりそうである。マクロオートファジー(以下オートファジとする)は、細胞内の構成成分を自ら分解する機構であり、その複雑な膜動態は多くの真核生物でかなりの部分において共通していることが明らかになっている。膜動態を制御しているオートファジー関連タンパク質をコードする遺伝子群(ATGs)は酵母を用いた研究によって同定されており、多くの生物にホモログが保存されていることも明らかになっている。これまでに私たちは植物におけるオートファジーの生理的な意義を解析することを目的として、シロイヌナズナを材料として、ATGのホモログ遺伝子破壊株を用いた解析を行ってきた。表現系の解析から、シロイヌナズナの根端では栄養条件に関わらず常にオートファジーが起こっていることをすでに明らかにしている。また、ATG遺伝子欠損株の発根が野生株に比べて遅いことも分かった。このことから私たちは、栄養条件下にも関わらず根端で起こっているオートファジーは、根の伸長に寄与しているのではないかと考えた。そこで発根が遅延する表現系を利用して、シロイヌナズナT-DNA挿入株の中から発根の遅い個体を選別した。また私たちはこれまでに、蛍光試薬とタンパク質分解阻害剤を含む培地中で切り取った根端を培養することで、オートファジーの分解産物の蓄積を蛍光顕微鏡下で観察する方法を見いだした。そこでこの方法を二次スクリーニングとして、選抜した発根の遅い株をさらに培養して根端を顕微鏡下で観察し、オートファジーを欠損する株の選別を試みている。これらの解析から新規のオートファジー関連遺伝子を同定することが出来たならば、植物におけるオートファジーの生理的な意義を明らかにすることができるのではないかと考えている。バックグラウンドに用いているT-DNA挿入株の発芽速度は条件によってはかなりばらつきがあり、発根速度での一次スクリーニングでかなり多くの株が選抜され、見積もったよりさらに多くの時間がスクリーニングにかかりそうである。オートファジは、細胞内で膜小胞内に隔離した自らの構成成分を液胞やリソソームに運んで分解する機構である。これまでの研究から、その複雑な膜動態は真核生物において多くの点で共通していることが明らかになっている。膜動態を制御しているオートファジー関連タンパク質をコードする遺伝子群(ATGs)は酵母を用いた研究によってすでに明らかにされており、真核生物にホモログがよく保存されていることも分かっている。私たちはこれまでに、植物を材料としてオートファジーの生理的な意義を解析することを目的として研究を行ってきた。その中で、シロイヌナズナを材料としてATGのホモログ遺伝子破壊株を用いた解析を行い、シロイヌナズナの根端では栄養条件に関わらず常に一定レベルのオートファジーが起こっていることを明らかにしている。また、オートファジーができない欠損株の発根は野生株より遅れることも分かった。このことから私たちは、栄養条件下において根で起こっているオートファジーは、根の伸長に寄与しているのではないかと考えた。そこでこの表現系を利用して、シロイヌナズナT-DNA挿入株を用いたスクリーニングを行った。さらに、蛍光試薬とタンパク質分解阻害剤を含む培地中で切り取った根端を培養することで、オートファジーの分解産物の蓄積を蛍光顕微鏡下で観察する方法を二次スクリーニングとして用い、選抜した発根の遅い株をさらに培養して根端を顕微鏡下で観察し、オートファジーを欠損する株の選別を試みた。これらの解析から新規のオートファジー関連遺伝子を同定することが出来たならば、植物におけるオートファジーの生理的な意義を明らかにすることができるのではないかと考えた。

オートファジーは、栄養欠乏条件下で自らの構成成分を分解する真核生物に共通の機構である。植物では、栄養欠乏条件下だけでなく様々なストレスによってオートファジーが誘導されることが分かっている。またシロイヌナズナの根の伸長領域において、栄養存在下でも常にオートファジーが起こっていることも明らかになっているが、その誘導メカニズムはまだ明らかになっていない。そこで本研究では、植物特異的なオートファジー関連遺伝子変異株のスクリーニングを行なった。年度内に新奇のオートファジー関連遺伝子の同定には至らなかったが、発根をマーカーとした一次スクリーニングを継続して行なっている。シロイヌナズナの野生株とATG破壊株を様々な条件の培地上で発芽させて、野生株とATG破壊株との発芽速度の差が最大になる条件を見いだそうとしている。野生株との差がもっとも顕著な条件を今後のスクリーニングに用いる。現在検討しているのは、炭素飢餓および窒素飢餓条件化などで、これらの条件化ではATG破壊株では根の伸長が顕著に遅いことはすでに報告されている。野生株とATG欠損株を様々な条件下で発芽させ、シロイヌナズナの発根速度にオートファジーの影響が最も多く見られる条件を見いだそうとしている。これまでの報告で、炭素および窒素の欠乏によってオートファジー欠損株の根の伸長が野生株より強く阻害されることがすでに明らかになっているが、種子の発根速度においては、培地の栄養条件の影響はあまり受けなかった。今後は二次スクリーニングにさらに時間を使って、新規のオートファジー欠損株を選抜したいと考えている。植物生理学前年度未使用額(8,510円)の範囲で購入出来る必要な物品などがなかったため。3,173円で購入出来る必要なものがなかったため。次年度の予算と合算して必要な物品の購入費にあてる。次年度の予算とあわせて使用する。
大動脈瘤の新規治療薬の開発

心臓血管領域で画期的な薬剤が次々と開発される中、大動脈瘤は数少ない未開発領域である。炎症性疾患や動脈硬化により動脈壁の脆弱化が進み、大血管が拡張あるいは動脈の壁部分の解離が進行すると大動脈瘤を生ずる。大動脈瘤は加齢とともに進行するが、動脈瘤の治療は外科的な手術のみであり、進展を抑える薬理学的治療法はない。我々は血管リモデリングの研究を通じて、大動脈瘤の進展を抑制する薬物療法を見出した。脂質異常症や高血圧、心不全に対する画期的な薬剤が次々と開発される中、大動脈瘤は数少ない未開発領域である。炎症性疾患や動脈硬化により動脈壁の脆弱化が進み、大血管が拡張あるいは壁解離が進行すると大動脈瘤を生ずる。我々は血管リモデリングの研究を通じて、大動脈瘤にはプロスタグランジン受容体を通じた弾性線維の制御メカニズムが存在すること、さらに大動脈瘤の進展を抑制する薬物療法を見出した。さらに胎児血管系においてもプロスタグランジンが弾性線維形成に重要な役割を果たすことを見出した。とりわけ、これまで正常の大動脈では比較的発現が少ないとされていたプロスタグランジン受容体EP4は、大動脈瘤形成などの慢性炎症の結果発現が亢進していることが確立された。このことは、正常大動脈にはEP4拮抗剤は作用しないが、病的な大動脈瘤を形成した部位において薬効を示すことを意味する。我々はEP4シグナルが弾性線維の合成酵素の一つであるリジルオキシダーゼの活性を調整することによって、弾性線維の形成を強く制御すること、さらに弾性線維の分解酵素の活性も制御することによって、弾性線維のターンオーバーを強く制御することを培養細胞や動物モデルを用いて実証することができた。これらの実験結果から、これまで治療薬がないとされていた大動脈瘤疾患において、EP4拮抗剤を活用することによって、積極的な薬物療法が可能となると期待された。本申請ではこの分子メカニズムの解明を進め、臨床応用が可能な大動脈瘤の治療薬を開発し、高齢化社会における先進医療の基盤確立を目指した。二年間にわたる萌芽研究において、現在では治療あるいは予防困難と考えられている大動脈瘤に対して、経口薬を投与することによって、進展の悪化が防止可能であるのかの検討を終了した。これまでの他の研究者の報告によっても、大動脈瘤の悪化には周辺組織における炎症の存在が不可欠である。そこで炎症ホルモンであるプロスタグランジンの拮抗剤を投与することによって、局所の炎症を抑え、大動脈瘤の進行を抑えることができるかを検討した。動物実験や器官培養実験結果から、経口剤による炎症の低下、さらに大動脈瘤の発症を抑えることが可能である結果が得られた。これはこれまで治療法のなかった大動脈瘤の患者に対して、安全かつ安心の医療を提供する可能性を意味する。循環器病学平成25年度はEP4シグナルがどのように大動脈瘤において亢進しているかの検討を進めた。これまでの研究成果から、EP4拮抗剤を投与された大動脈の病理標本では、血管弾性線維の発現が保たれていた。これは弾性繊維成分であるエラスチンの、合成が亢進あるいは分解が低下したことを示す。エラスチンはタンパク分解酵素であるMMPによって分解されることから、血管平滑筋組織におけるMMP活性を検討したところ分解活性が上昇し、EP4拮抗剤の存在下にて減少した。さらに正常およびEP4欠損マウスに様々な大動脈瘤形成術をほどこして大動脈瘤の形成を比較したところ、欠損マウスにおいて減少していることが分かった。これらのモデルでの検討から、リジルオキシダーゼの合成および分泌における分子レベルでの制御が解明され、EP4拮抗剤の投与により大動脈瘤病変の薬理学的治療が可能であることがわかってきた。これらの結果は、研究計画において予想されたように、炎症型大動脈瘤モデルにおいて、EP4拮抗剤により大動脈瘤の発症と進展の予防が可能と考えられる。血管平滑筋特異的なEP4過大発現モデルでの大動脈瘤形成(平成26年度計画にて予定)当初の計画通りに本内容を平成26年度は試行していく。マウス大動脈瘤組織を用いた器官培養実験では、高濃度のEP4拮抗剤ではMMP活性は亢進し、低濃度では抑制される。

そこで、新鮮ヒト大動脈瘤組織においても同様に器官培養を行い、高濃度のEP4拮抗剤ではMMP活性は亢進し、低濃度では抑制されることを実証するとともに、MMPサブタイプとそれぞれの発現変化を比較検討する。またEP4シグナルによって発現・分泌が亢進する物質を質量分析で解析していく。さらに血管平滑筋のEP4発現が、動脈瘤発生に重要な役割を果たすことを実証するために、動物モデルにおいて、血管平滑筋特異的にEP4を発現する遺伝子操作動物を作成した。血管平滑筋特異的なプロモーターを用いて、血管平滑筋にヒトEP4を選択的に過大発現した。すでに3系統が得られており、十分なコロニーを確立することができた。すでに大動脈組織において弾性低下が判明している。そこで本モデルを用いて、EP4刺激による血管弾性線維形成の低下と動脈瘤病変の検討を行う。これまでの薬物治療は血圧降下など消極的なものだけである。このため動脈瘤そのものの進展を抑制する積極的な治療は存在しない。我々はEP4シグナルの調節による弾性線維の制御により、積極的な大動脈瘤の薬物治療を開発する。大動脈瘤性疾患は循環器系疾患の薬物治療における最後の未開拓分野であり、この分野における萌芽的な研究として完成させたい。
骨折と循環器疾患予防における終末糖化産物の細胞外受容体の測定意義

藤原京スタディ対象者2012人の5年間追跡期間中の、冠動脈疾患発症の有無別ではesRAGE値に差はなかった。追跡時の頸動脈内膜中膜複合体厚(IMT)値との関連では、esRAGE値が高い程、IMT値が低かったが、esRAGE/ペントシジン比とIMT値とに有意な関連は認めなかった。脆弱性骨折については、年齢・骨密度と独立してesRAGE/ペントシジン比値が高い程、発生リスクが有意に低下する可能性が示された。藤原京スタディの対象者のうちベースライン調査を完遂した男性2012人を対象とし、藤原京スタディの部分研究として5年次追跡調査を実施し(追跡率、71.1%)、骨折発生状況については、2010年時郵送調査の回答と併せ計1584人から回答を得た。循環器疾患発症については、追跡調査時に5年間に冠動脈疾患発症の有無について回答を得た1519名中、ベースライン時に心筋梗塞(24例)、脳梗塞(45例)の既往があった者を除いた1360名について、ベースライン時の終末糖化産物(ペントシジン)とその細胞外受容体(esRAGE)値と、その後の冠動脈疾患発症の有無について検討した。ペントシジン値は、冠動脈疾患発症群(195名)で有意に高かったが、esRAGE、esRAGE/ペントシジン比は有り無しの両群で差がなかった。追跡時に測定した動脈硬化指標である頸動脈内膜中膜複合体厚(IMT)値との関連については、esRAGE値を四分位に分けて検討すると、esRAGE値が大きい区分程、年齢、体格、血圧、生活習慣で調整したIMT値が有意に低い傾向を認めたが、ペントシジンやesRAGE/ペントシジン比値とIMT値との有意な関連は認めなかった。脆弱性骨折発生との関連については、脆弱性骨折発生群でペントシジン値が有意に高く、esRAGE/ペントシジン比が有意に低かった、esRAGEについては有り無しの両群で差がなかった。脆弱性骨折発生に関する年齢と大腿骨頸部骨密度で調整したesRAGE/ペントシジン比の1標準偏差増加毎のハザード比は0.48で、esRAGE/ペントシジン比値が高い程、骨折発生リスクが有意に低下する可能性が示された。本年度は、藤原京スタディの対象者のうちベースライン調査を完遂した男性2012人を対象とし、藤原京スタディの部分研究として5年次追跡調査を実施し、1431人が受診した。(追跡率、71.1%)終末糖化産物の細胞外受容体(esRAGE)の測定を、ベースライン時の凍結保存血清を用いて、B-Bridge esRAGE ELISA Kitを用いて行った。また、主要結果指標である症候的骨折の把握については、5年次追跡調査を受診した1431人については調査時の問診で把握し、未受診者153人については、2010年時に実施した骨折発生状況調査によって、情報収集し、計1584人から回答を得た。ベースライン時以降に発生した頭・手指・下腿を除いた部位の脆弱性骨折の発生は30人に認めた。副次的結果指標である頸動脈内膜中膜複合体厚については、専任の測定者2名が、超音波測定装置を用い、1421人について測定した。既に測定済みのベースライン時の血清ペントシジン及びesRAGEと脆弱性骨折の関連を多重ロジスティック回帰分析で検討した結果、年齢、大腿骨頸部骨密度、1型糖尿病、血糖高値(空腹時血糖≥160 mg/dl又はHbA1c(JDS) ≥8.0%)の影響と独立して、血清ペントシジン値が高い程骨折発生リスクが有意に上昇し(1標準偏差増加毎のオッズ比は、1.54)、また血清esRAGE値が高い程、骨折発生リスクが有意に低下(1標準偏差増加毎のオッズ比は、0.66)する可能性が示された。5年次調査未受診者を対象とする骨折、循環器疾患発症に関する補完郵送調査は実施済みで平成24年度内に、今後アウトカムの情報を補完する。また、問診によって収集した回答から新規循環器疾患発症の把握を行い、循環器疾患発症に関する血清ペントシジン、esRAGEの影響評価を行う。藤原京スタディの部分研究として5年次追跡調査を実施し、対象者であるベースライン時2012人中1431人が受診し、骨折の発生把握と心血管疾患発生関連情報を把握した。また、動脈硬化指標の測定を対象者2012人中1421人に実施した。また、5年次追跡調査の未受診者に対する骨折、循環器疾患発症に関する調査は、既に本年度内に終了した。よって、現在までの達成度はおおむね順調に進展していると言える。5年次追跡調査の未受診者調査を結果をもとに、データベースを構築する。