hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
心血管細胞内Caイオン代謝蛋白の細胞工学的および遺伝子工学的解析とその臨床応用

勤態を各種の血管作動性物質で刺激し、二次元画像として解析中に、(1)Caイオンの応答は細胞毎に大きく異なり、(2)従来多数の細胞集団を用いて、同時に得られた現象の多くは、個々の反応性の全く異なる現像の総和を観測していた事、(3)特に培養後期には、筋小胞体上のCaチャンネルのカフェイン・リアノジン感受性CaチャンネルとIP_3感受性Caチャンネルを有する細胞は、同一細胞に認められるのではなく、それぞれ別の細胞に発現する事、(4)しかし電位依存性Caチャンネルは、全ての血管平滑筋細胞に、ほぼ等しく発現していた。従って血管平滑筋細胞のCaチャンネルは、その培養時期に依存して変化し、かつその変化の具合もチャンネルの種類により、全く異なって制御されている事が示された。またCaチャンネルの分離中に副産物として収縮蛋白が得られる。これを用い血管内に発現しているミオシンを各種の電気泳動で解析した結果、(1)動脈では2種類、(2)静脈では1種類のみ形成されているが、(3)これは血管内の圧力を感じて変化するのではなく、(4)全くアミノ酸配列の異なるミオシンが形成されている事が判明した。次の課題の遺伝子工学的解析のために、現在プロ-ブの作製、クロ-ニングが進行中である。来年度以降の進展を期している。現在心筋および血管平滑筋細胞内Ca動態を規定する各種Caチャンネル、CaポンプであるCaATPaseおよびNa^+-Ca^<2+>交換体を遺伝子レヴェルで解析するためその準備を進めているが、まだその結果を供覧する段階に至っていない。本報告では並行して行っている血管平滑筋内Caストアの筋小胞体からのCa2+の放出機構の発現機構に関する研究の進展を報告する。この研究の背景には心筋と血管のCa^<2+>調節系には現在大きな相違は報告されていないので実験結果の解析の容易な血管平滑筋を用いて得られる結果は将来の心筋を用いる研究の重要なヒントとなると予想される。今回血管作動性物質としてエンドセリンー1(ET)を用いた。ごく最近の薬理学実験と遺伝子工学を用いた実験により心筋自身に対しETー1が陽性変力作用と変時作用を示し、また固有の受容体が心筋に発現しており、ETー1が何等かの作用を心にする事は確実であろう。またETは電位依存Caチャンネルに直接作用すると当初考えられたが、その後直接作用は無く、特有の受容体とIP_3による細胞内情報伝達系を介して細胞内Ca^<2+>濃度を変化させると現在考えられている。【方法および結果】細胞内のCa^<2+>の二次元観測法の詳細は既に昨年度報告した。今回は血管平滑筋が細胞増殖や分化の過程でその表現型が変わる事に注目し、(1)細胞分裂を極めて遅くするため0.5%のウシ胎児血清(FCS)を含む培養液、(2)この中の成長因子などを完全に取り除くため、全く血清を含まず、代わりにインシュリン等を含んだ完全無血清培養液、および(3)この系にPDGFを10ng/ml含んだ培養液の3種類の系でエンドセリン(ET)、バゾプレッシン(V)および40mMのK脱分極刺激を行った。なお今回も細胞内Ca^<2+>の筋小胞体(SR)からの放出機構を解析するために前2者では細胞外液に生理的な1mMのCa^<2+>が存在する場合と、Ca^<2+>を外から加えず、かつCa^<2+>を完全にキレ-トするために1mMのEGTAを加えた場合を用いた。K刺激の時には電位依存性Caチャンネルの機能を確認し、かつ一端SRから放出されたCa^<2+>をSRに再度取り込ませる目的で1mMのCa^<2+>共存下で行った。【結果の要約および考案】(1)FCSを0.5%含む培養液で2日間培養後ETには細胞外にCa^<2+>が存在する時は全ての細胞が反応したが、その様式にはET添加後一過性の細胞内Ca^<2+>の上昇相を示した後、平坦な相の2種の反応を呈する群を約半数の細胞が示し、残りの半数の細胞は一過性の相を呈さず、後の平坦相のみ呈した。(2)細胞外にCa^<2+>が存在しない時は一過性の反応のみ呈する約半数の細胞と全く反応しない約半数の細胞とが同一視野内に共存した。次に細胞外に1mMのCa^<2+
肝組織修復における類洞内皮細胞、星細胞の役割解明と骨髄、脾臓との臓器相関の解析

肝硬変症例において、脾臓後に肝予備能が改善することが報告されているため、同肝組織修復機構における肝非実質細胞の役割に注目して検討を行った。ヒト肝硬変をよく反映するチオアセトアミド長期投与マウス肝硬変モデルを作製すると、肝線維化に血小板減少を伴い、肝組織傷害部位に一致して肝幹細胞マーカーを有する細胞集団が多数出現した。これに脾摘術を行うと、肝線維化の改善に加え、肝幹細胞様細胞に隣接して多数の単球系細胞の集積がみられ、これらがWntシグナルを介して幹細胞様細胞に働きかけ、肝細胞への分化を誘導する可能性が示された。ヒト肝硬変症例における脾摘後の肝臓の組織学的検討でも類似の現象が確認された。1.脾臓摘出に伴う硬変肝マウスモデルの線維化改善現象のメカニズム解明チオアセトアミド(TAA)をマウスに長期投与して、脾機能亢進症(血小板減少)を伴う硬変肝モデルを作製した。同モデルで脾摘を行うと、TAAを継続投与したにも関わらず、肝線維化が有意に軽減されていた。このメカニズムを探るために肝組織に変化発現するmRNAを、マイクロアレイを用いて検討すると、マクロファージおよび単球に由来するケモカインとそのレセプターの増強発現が認められた。脾臓摘出後のマクロファージ・単球の動態をFACSおよび免疫組織染色で検討したところ、血中および肝臓内におけるマクロファージ系細胞の有意な増加を確認した。また、これら肝臓にリクルートされた細胞は線維組織を分解するマトリックスメタロプロテアーゼ(MMP)を産生していた。一方、TAA長期投与により、肝臓内に肝幹細胞様の細胞集団が多数出現していることが確認された。これらの幹細胞様集団は、脾臓摘出による線維化の改善とともに、その数が減少していた。この現象は、肝臓外からリクルートされたマクロファージ系細胞が肝幹細胞様細胞の肝細胞への誘導に関与している可能性を示唆していた。つまり、肝組織修復において、脾臓・骨髄由来の細胞が関与している可能性が明らかとなった。2.ヒト肝組織における類洞内皮細胞の神経伝達物質発現の検討以前の自身の研究で、ヒト肝類洞内皮細胞に神経細胞表面に発現する受容体を確認していることから、その下流蛋白の存在を免疫組織染色で検討した。これまで、ストレス存在下で神経細胞から分泌されるとされている物質が、類洞内皮細胞に多数発現していることを確認した。つまり、内皮細胞による神経細胞様の機能の存在が、示唆された。1.脾臓摘出に伴う硬変肝マウスモデルの線維化改善現象のメカニズム解明昨年度に引き続き、硬変肝モデルで脾摘による障害肝の改善メカニズムを検討したところ、脾摘後急激に増加した単球/マクロファージ(MF)系細胞が硬変肝障害部位に集積し、硬変肝に出現していた肝幹細胞様細胞にWntシグナルを介して働きかけ、肝細胞に分化誘導するメカニズムを解明した。一方、線維の分解に働くMMPの検討では、脾摘後肝臓に集積した好中球がMMP-9の産生に関与していることが明らかとなった。これらの結果を、現在論文にまとめ投稿中である。2.ヒト肝組織における脾摘の影響に関する検討実験動物と同様のメカニズムがヒトにおいても存在するかを検討する目的で、脾機能亢進症合併肝細胞癌患者において、脾摘術を先行させ、その後の肝切除時に得られる非癌部肝組織を詳細に検討した。動物での検討と同様に、脾摘後肝臓内への著明な単球/MF系細胞の集積が見られた。また、肝硬変症例に見られるductular reactionに単球/MFが働きかけ、肝細胞への分化促進を行う可能性を示唆する所見が得られた。1.脾臓摘出に伴う硬変肝マウスモデルの線維化改善現象のメカニズム解明と報告平成25年度から継続している、硬変肝マウスモデルにおける脾摘による障害肝の改善メカニズムの検討を行い、脾摘後障害肝に集積して肝幹細胞様細胞にWntシグナルを介して働きかける単球/マクロファージが、Ly6Clowの細胞表面マーカーを有する特殊な細胞集団であることを解明した。一方、線維分解に関与すると考えられるMMP-9産生細胞は、Ly6Clowマクロファージではなく、好中球であることが確認された。これらの結果は、2015年10月にJournal of Hepatologyに掲載された。2.ヒト硬変肝組織における脾摘後の変化に関する検討昨年度に引き続き、ヒト肝組織においてもマウスモデルと同様の現象が見られるかを、脾機能亢進合併肝細胞癌患者において、脾摘術を先行させ、その後の肝切除時に得られる非癌部肝組織を用いた組織学的検討を行った。その結果、ヒトにおいても脾摘後に多数の単球/マクロファージが硬変肝組織内に集積し、マトリックス分解酵素を発現していた。また、ductular reaction構成細胞から肝細胞への分化が促進される現象が観察された。さらに、血液検査から脾摘後に一部の肝予備能の改善が確認された。一方、摘出した脾臓の組織学的検討では、肝線維化の進行に伴い、脾臓内での線維化が進行することが確認された。現在、この結果をまとめ、投稿準備中である。

肝硬変症例において、脾臓後に肝予備能が改善することが報告されているため、同肝組織修復機構における肝非実質細胞の役割に注目して検討を行った。ヒト肝硬変をよく反映するチオアセトアミド長期投与マウス肝硬変モデルを作製すると、肝線維化に血小板減少を伴い、肝組織傷害部位に一致して肝幹細胞マーカーを有する細胞集団が多数出現した。これに脾摘術を行うと、肝線維化の改善に加え、肝幹細胞様細胞に隣接して多数の単球系細胞の集積がみられ、これらがWntシグナルを介して幹細胞様細胞に働きかけ、肝細胞への分化を誘導する可能性が示された。ヒト肝硬変症例における脾摘後の肝臓の組織学的検討でも類似の現象が確認された。マウスによる研究は、ほぼ予定通りに進行している。一方、ヒト肝組織についての研究予定では、肝臓の類洞内皮細胞上におけるストレス受容体、および関連分子の同定や脾摘の硬変肝への影響を検討する予定であったが、一部の免疫組織染色学的検討までしか行えていないため、全体としてはやや遅れている状況である。消化器外科これまでに得られたヒト肝組織材料を中心に、脾摘後の肝組織変化とそのメカニズムを検討していく。一方、ヒト肝類洞内皮細胞上に発現していることが確認されたストレス受容体がマウスにも同様に発現しているかの確認を行っていく。免疫組織染色による検討は、順調に進んでいるが、その現象を裏付けるWestern解析などがやや遅れている。また、実験動物による肝類洞内皮細胞の検討が、やや遅れている。動物モデルにおける分子生物学的検討はほぼ順調に進行したが、ヒト肝組織における検討がやや遅れたため、同組織を使った免疫染色用抗体や分子生物学的測定キットの購入が行えず、次年度使用額が生じた。肝硬変マウスモデルの脾摘による肝線維化改善のメカニズムの解明は、順調に進んでおり、今後もマクロファージ系細胞がどのようにして肝幹細胞様細胞を肝細胞へ分化誘導するかを検討していく。また、ヒト肝組織のみならず、マウス肝臓における類洞内皮細胞の神経細胞様機能の解明を進めていく。現在確保しているヒト肝組織を用いて、やや遅れている免疫組織学的検討、分子生物学的検討を進めるとともに、ヒト肝組織再生に関する検討に繰り越し費用の一部をあてる予定である。動物実験およびWestern解析などの進捗状況がやや遅れたため、その分の予算を支出できなかったため、次年度に繰り越された。平成26年度には、当初の計画に平成25年度でやや遅れている研究を重点的に行うことで、予定の予算が支出される可能性が高い。また、支出額が当初の計画を下回った場合、最終年度へ繰越し、最終年度の実験遂行のために支出する。
「厚生芸術」の萌芽的研究

少子高齢化社会において芸術が高齢者や障害者、病人を治癒するのみならず、社会そのものをも治癒する「効能」をもっていることを1)ヨーゼフ・ボイスの社会彫刻2)アウトサイダー・アート3)環境倫理学の横断的かつ学際的研究によって明らかにし、《厚生芸術》という新しい概念が21世紀の芸術と社会において極めて有効な概念であることを理論と実践現場の双方から理論化、概念化する。平成22年度は1)ヨーゼフ・ボイスの思想を光学に偏向した旧来の芸術を批判した熱学的芸術としてとらえ直し、「社会彫刻」概念を創造的資本論として再解釈する研究を中心軸として2)芸術の社会的役割を「芸術の効用再考」、「厚生芸術=芸術(教育+医療・福祉+環境)」「芸術という労働市場」の三方向から文献によって定立し直すとともに、それらをアウトサイダー・アートと厚生(福祉)経済学との連関からも多層的研究を深めた。結果として、これらの背景になっている物理学における熱学が近代社会を駆動する基盤となったことを確認し、ボイスの芸術がまさにこの熱学の導入によって、芸術が社会的に有用なものであることを目指すものであることを解明するにいたった。少子高齢社会の厚生を創造性が支えることはすでにヨーゼフ・ボイスの芸術が示したとおりであるが、21世紀の社会では従来型とは異なる社会的意義を担った新たなタイプのアーティストの出現が望まれる環境になってきている。以上の理論的研究は堅冷化していない若い創造性へと接続される必要があるために、芸術系大学での実践プログラムとして大学が革新されるべきことを本研究の成果報告書としてまとめた。タイトルは以下のとおりである。「厚生芸術の萌芽的研究少子高齢化社会における社会厚生のための熱学思想と創造的資本論の接続による実践美学試論」少子高齢化社会において芸術が高齢者や障害者、病人を治癒するのみならず、社会そのものをも治癒する「効果」をもっていることを1)環境倫理学2)アウトサイダー・アート3)ヨーゼフ・ボイスの社会彫刻の横断的かつ学際的研究によって明らかにし、《厚生芸術》という概念が21世紀の芸術と社会において極めて有効な概念であることを理論と実践現場の双方から理論化、概念化する。1)環境倫理学よりも現実の金融危機による「グリーン・リカバリー」など環境政策や経済政策が「短期的」な成果を目指す傾向が見られるが、環境そのものを対象とした環境主義芸術(足利市でのKlaus Dauvenの作品)が本来の環境を「長期的」に思考し、社会に浸透させる役割を着実に果たしている。2)高齢者や障害者の作品を鑑賞する「古典的施設=美術館」では社会の需要に対応しきれていない。少子高齢化の現場となる医療機関や高齢者施設での社会化された実践(秋田の外旭川病院etc.)事例を体系化することが本研究の課題としてより鮮明に浮上してきた。3)社会を治癒するヨーゼフ・ボイスの芸術は没後20年間を迎え、やはり「古典的な見方」から「実践的で社会化された治癒の実践としての見方」が主流となった。ここにおいて「芸術と倫理の総合を目指したボイス」と「<貧困>の視点から経済と倫理の総合を目指したノーベル賞経済学者アマルティア・セン」と重なる重要性が明らかに浮上してきた。《厚生芸術》は将来的に臨床精神医学や環境システム工学、ヘルスケア産業さらには地球温暖化対策、経済政策、厚生行政などの先行事例と協同して、芸術に本来内包されていたさまざまな力を回復し、「21世紀の社会に益する芸術」を究明するその萌芽を確実につみ取ることを目指している。少子高齢化社会において芸術が高齢者や障害者、病人を治癒するのみならず、社会そのものをも治癒する「効果」をもっていることを1)ヨーゼフ・ボイスの社会彫刻2)アウトサイダー・アート3)環境倫理学の横断的かつ学際的研究によって明らかにし、《厚生芸術》という概念が21世紀の芸術と社会において極めて有効な概念であることを理論と実践現場の双方から理論化、概念化する。平成21年度は1)ヨーゼフ・ボイスの思想的究極目標の研究と世界的認知度の研究2)13に共通するアーティストの社会的役割を「医療福祉とアート」そして「アーティストの雇用」という観点からの研究を進めた。・ボイスの究極目標は社会のユートピア化であり、それは芸術(教育+医療福祉+環境倫理)と因数分解できる。水戸芸術館「ヨーゼフ・ボイス展」との共同研究・医療福祉は本来アートと不可分のものであり、新たなタイプのアーティストが今後その社会的役割を担う。名古屋造形大学「やさしい美術」との共同研究・アーティストの雇用拡大と増進が社会のユートピア化に貢献する。東北芸術工科大学、東京藝術大学、国立国際美術館との「芸術経済学者ハンス・アビング講演会」共同開催少子高齢社会の厚生を創造性が支えることはヨーゼフ・ボイスの芸術が示したとおりであるが、21世紀の社会では従来型とは異なる社会的意義を担った新たなタイプのアーティストの出現が望まれる環境になってきている。

平成22年度は1)ヨーゼフ・ボイスの思想を光学に偏向した旧来の芸術を批判した熱学的芸術としてとらえ直し、「社会彫刻」概念を創造的資本論として再解釈する研究を中心軸として2)芸術の社会的役割を「芸術の効用再考」、「厚生芸術=芸術(教育+医療・福祉+環境)」「芸術という労働市場」の三方向から文献によって定立し直すとともに、それらをアウトサイダー・アートと厚生(福祉)経済学との連関からも多層的研究を深めた。結果として、これらの背景になっている物理学における熱学が近代社会を駆動する基盤となったことを確認し、ボイスの芸術がまさにこの熱学の導入によって、芸術が社会的に有用なものであることを目指すものであることを解明するにいたった。少子高齢社会の厚生を創造性が支えることはすでにヨーゼフ・ボイスの芸術が示したとおりであるが、21世紀の社会では従来型とは異なる社会的意義を担った新たなタイプのアーティストの出現が望まれる環境になってきている。以上の理論的研究は堅冷化していない若い創造性へと接続される必要があるために、芸術系大学での実践プログラムとして大学が革新されるべきことを本研究の成果報告書としてまとめた。タイトルは以下のとおりである。「厚生芸術の萌芽的研究少子高齢化社会における社会厚生のための熱学思想と創造的資本論の接続による実践美学試論」
バイリンガルとセミリンガルの狭間：グローバル化時代の言語格差と多言語運用能力像

本研究の最終ステージとして、国内外における研究発表を中心とする以下の活動(1と2)を展開し、`セミリンガル'の定義を深めると共に、本研究の社会的・教育的意義の啓蒙に努めた。更に、本研究の完成度を高めるための準備活動(3)を行った。2国内においては、英語圏に顕著に顕在化する音韻性ディスレクシアとの関連性と英語一極集中現象と連動して起こり得るセミリンガル現象の可能性について、ディスレクシアの研究者の集う発達性ディスレクシア研究会(2018年9月開催)にて、その見解の一端を発表した。また、より広い社会一般に対する啓蒙活動の一端として、AIが外国語運用能力像に及ぼす影響についての見解をWASEDA-YOMIURI ONLINE〈2018年6月〉にて発表した。3超多言語地域の少数派言語の一例として、タガカウロ語(フィリピン、ミンダナオ島)の辞書項目分析を統計の手法を使って完了させた。当データの使用目的は、今後の研究の推進方策の(1)に記載したとおりである。本研究の最終ステージとして計画した国内外における研究発表と啓蒙活動は順調に進展し、目的はおおむね達成できたと考える。その過程で、本研究課題の普遍性の高さを認識し、補助期間の延長を申請した。下記今後の推進方策に記載した活動を展開し、本研究の完成度を高める。本研究の完成度を高めるため、以下の活動を展開する。(1)超多言語地域の少数派言語の一例として、タガカウロ語(フィリピン、ミンダナオ島)の辞書項目分析を完了させたデータの形態素境界の正確性を確認した後、当言語の教育言語としての妥当性を現地にて分析し、学習力に関して子ども達の被る不利益の有無を考察する。(2)本研究テーマが世界に存在する様々な継承言語にも通じる普遍性の高さを再認識し、日本国内の状況調査に加え、南米(ボリビア)の状況を現地在住の研究協力者の協力を得て行う。(3)より統合的な論文を執筆する。平成28年度(本研究の初年度)は、本研究の目的を達成するための第一ステージとして、バイリンガルとセミリンガルの間のパラドックスを明確にするためのデータ収集を行った。主な活動の概要は以下の通りである。1教育の言語を英語に収れんする言語政策を実施して久しいフィリピン共和国における言語環境を、現地研究協力者の協力を得て、ミンダナオ島に焦点をおき調査・整理した。殊に、誕生から家庭で使用され、母語として習得する現地語に対し、いくつかのフィリピン語を小学校3年次までの教育言語として採用し、更に小学校3年次後半から教育の言語を英語に転換する教育言語政策の背景事情を調査・整理した。2同じく現地研究協力者の協力の下に、ミンダナオ島における児童生徒の保護者と教員、及び大学生を対象とするアンケート調査票を作成し、言語意識を問うパイロット調査を実施した。また、日本語が遺産言語として機能している家庭の言語意識パイロット調査をオーストリアにおいて実施した。(ミンダナオ島におけるアンケート調査に関しては、アンケート調査で回答された言語意識の信憑性を測り高めるため、フォッカス・グループ・ディスカッション(FGD: Focus Group Discussion)を研究代表者も出席して実施する予定であったが、現地研究協力者の所属する機関の都合と現地の治安事情等の理由から延期となった。)3ミンダナオ島におけるタガカウロ語(Tagakaulo)に焦点をおき、母語として習得する現地語と教育の言語(ビサヤ語および英語)との間の乖離を探るため、タガカウロ語で語られる民話とそれらのビサヤ語と英語への翻訳のデータを整理した。更に、使用された単語を辞書項目化し、分析の準備を整えた。本研究の中心的な位置を占めるミンダナオ島の言語意識調査において、現地研究協力者の所属する機関の学事歴の変更と現地の治安事情等の理由から、研究代表者の現地への渡航計画を実施することができず、アンケートの調査結果の信憑性を高めるためのフォッカス・グループ・ディスカッション(FGD: Focus Group Discussion)を延期することになった。これに連動して、成果を発表する活動も延期となった。但し、パイロット調査や得られたデータの解析は順調に進行しており、包括的にはおおむね順調に進展しているといえる。平成29年度は、バイリンガルとセミリンガルが表裏一体の言語能力現象として表出する可能性のあることを明確にし、グロバール化時代の言語格差の観察を深めた。また、研究協力の可能性を開拓し、モンゴルとボリビアへの言語意識調査の拡大を図った。11999年にユネスコが宣言した国際母語デーの基本精神を推進する上で、世界の多言語事情の前に直面する問題点を明確にした。特にフィリピン共和国のミンダナオ島の現地語の多様性と教育言語の実情に基づき、母語による公教育の実行が困難な地域の言語事情には、世界に存在する様々な継承言語にも通じる普遍性があることを示した。2超多言語地域において母語として習得される現地語と教育の言語との間の乖離を示すため、前年度に辞書項目化したミンダナオ島のタガカウロ族に伝わる民話のデータを基に、タガカウロ語と教育の言語に表れる語彙間の差を分析し、教育を現地語で行う際に予測される認知的な不利益について考察を深めた。分析の完了と結果の数値化は次年度に完成させる。3前年度と同様に現地研究協力者の協力の下で言語意識アンケート調査を続行した。

一方、回答の信憑性を高めるためのフォッカス・グループ・ディスカッションは、現地の治安事情のため、研究代表者が出席して実施する計画を再び延期することとなった。4グローバル化の時代において国際語の必要性が謳われる中、情報分野において発達を続ける翻訳・通訳技術をサイバー・リンガ・フランカと名称し、すべての人がオートリンガルになる日がやってくるという見解をまとめた。平成29年度(2017年度)は、人工世界言語であるエスペラント語の創案者であるルドヴィコ・ザメンホフの死後100年にあたり、生誕地ポーランドで開催された国際記念フォーラムにて、言語格差を解消する手段はサイバー・リンガ・フランカであるという見解を発表した。本研究の中心的な位置を占めるミンダナオ島の言語意識調査において、現地の治安事情の理由から、研究代表者の現地への渡航計画を前年度に続いて延期することになった。これに伴い、代表者同席の元に実施する計画であったフォッカス・グループ・ディスカッション(FGD: Focus Group Discussion)も次年度に延期することになった。しかし、国内外の学会等での問題提起は順調に進展し、調査地域の拡大とセミリンガルやオートリンガルという新用語の定義の検討も順調に進み、総体としておおむね順調に進んでいるといえる。本研究の最終ステージとして、国内外における研究発表を中心とする以下の活動(1と2)を展開し、`セミリンガル'の定義を深めると共に、本研究の社会的・教育的意義の啓蒙に努めた。更に、本研究の完成度を高めるための準備活動(3)を行った。2国内においては、英語圏に顕著に顕在化する音韻性ディスレクシアとの関連性と英語一極集中現象と連動して起こり得るセミリンガル現象の可能性について、ディスレクシアの研究者の集う発達性ディスレクシア研究会(2018年9月開催)にて、その見解の一端を発表した。また、より広い社会一般に対する啓蒙活動の一端として、AIが外国語運用能力像に及ぼす影響についての見解をWASEDA-YOMIURI ONLINE〈2018年6月〉にて発表した。3超多言語地域の少数派言語の一例として、タガカウロ語(フィリピン、ミンダナオ島)の辞書項目分析を統計の手法を使って完了させた。当データの使用目的は、今後の研究の推進方策の(1)に記載したとおりである。本研究の最終ステージとして計画した国内外における研究発表と啓蒙活動は順調に進展し、目的はおおむね達成できたと考える。その過程で、本研究課題の普遍性の高さを認識し、補助期間の延長を申請した。下記今後の推進方策に記載した活動を展開し、本研究の完成度を高める。バイリンガル'と`セミリンガル'の関係性を精査することを中心に、以下の活動を展開する。1平成28年度に作成した「母語と教育の言語」との間の意識的乖離を問う言語意識調査票の多言語版を作成し、国内外における調査を拡大すると共に、やや遅滞している部分(フィリピン共和国におけるアンケート調査の拡大とフォッカス・グループ・ディスカッションの実施)を進展させる。2言語意識調査の結果に基づき、言語環境が学習熟達に及ぼす影響を可能な限りパターン化する。その結果に基づき、バイリンガルの定義を再確認した後、思考に直結する言語の習得度が不完全な状態を意味する`セミリンガル'という用語の呈示が妥当であるかどうかを精査する。
活性酸素種誘導性の破骨細胞活性化シグナルへのASK1関与の検討

活性酸素種が破骨細胞分化に関与すること、ASK1が活性酸素種により活性されることが報告されているが、破骨細胞分化におけるASK1の役割は未だ不明である。そこで、本研究で破骨細胞分化におけるASK1の役割を検討したところ、活性酸素種による破骨細胞分化にASK1が関与することが明らかとなった。活性酸素種による破骨細胞分化にApoptosis signal regulation kinase 1(ASK1)が関与するか否か検討することを目的とし以下の実験を行った。野生型マウスおよびASK1欠損マウスの骨髄細胞を6cm dishに捲き、12時間後に浮遊しているものを造血系幹細胞として破骨細胞形成実験に用いた。破骨細胞前駆細胞をmacrophage colony stimulating factor存在下で12wellのプレートに野生型およびASK1欠損マウス由来の骨髄細胞を1.0x10^6cells/cm^2で撒き過酸化水素(0μM100μM)、イソプレナリン(0μM100μM)を加え4日間培養を行い、破骨細胞数の計測を行った。結果はASK1と野生型との間に有意な変化が確認された。また、過酸化水素(0μM100μM)、イソプレナリン(0μM100μM)によりASK1が活性化型になることがWestern blotにより確認された。以上の結果から活性酸素種やイソプレナリンによる破骨細胞誘導にASK1が関与することが示された。次に、野生型マウスおよびASK1欠損マウスにイソプレナリンを投与し骨量を減少させる実験を行ったところやはり野生型と比較しASK1欠損マウスにて明らかな変化が観察された、これについては現在解析を行っており次年度報告する予定である。β作動薬イソプレナリン(5μg/g body weight/day i.p)を10日間投与することにより骨組織にて酸化ストレスの指標である過酸化脂質が有意に増加し、破骨細胞の増加、骨形成の低下により骨量減少がみられることがこれまでの研究により明らかにされている。本研究では活性酸素種(reactive oxygen species: ROS)による破骨細胞分化にapoptosis signal regulatingkinase 1(ASK1)が関与するか否か検討することを目的とした。野生型およびASK1欠損型の57BL6/Jマウスにイソプレナリン(5μg/g body weight/day i.p)を2週間投与し骨粗鬆症を誘導したところ、野生型マウスではイソプレナリン投与により破骨細胞数の増加、骨形成低下により骨量減少が確認されたのに対し、ASK1欠損動物では破骨細胞増加と骨量の減少がともに抑制傾向にあった。また骨その他の解析項目については現在検討中である。また、ROSが関与する骨減少モデルとして卵巣摘出モデルを用いた検討も行ったが、本データに関しては現在なお検討中である。これらin vivoの結果では骨吸収のみならず骨形成に関しても本実験を通して酸化ストレスとの関連を示唆する結果が得られた。以上の結果から活性酸素種による破骨細胞分化にASK1が関与することが示唆された。本研究の発展によりからASK1をターゲットとした骨粗鬆症の新規治療法の確立へ発展することが期待される。
強誘電体ナノデバイスの機能制御と構造物性

昨年度に引き続き、強誘電体デバイス材料であるPZT(PbZr^<1-x>Ti_xO_3)のバルク結晶の立方晶相での電子密度分布及びPb原子の挙動のZr/Ti組成依存性を調べた。昨年度は合成した試料の純度が低いことが問題となっていたが、今年度は合成法を改良し、高純度試料の合成に成功した。Ti濃度xが0,0.15,0.25,0.35,0.48,0.55,0.60,0.65,0.75,1の高純度PZT粉末試料を合成し、大型放射光施設SPring-8のビームラインBL02B2で放射光粉末回折実験を行なった。立方晶相の850KのデータをMEM/Rietveld解析した結果、次のことが分かった。Zr濃度が高いPZTでは、Pb原子が1aサイトからある方向に変位した複数のサイトにランダムに配置するようなdisorder状態にあった。Pb原子の変位の方向は組成によって異なり、PbZrO_3では<110>方向であり、Ti原子が加わると<111>方向に変化した。1対1の組成比を境にTi高濃度側では再び<110>方向へと変化し、x=1のPbTiO_3ではPbのdisorderは見られなかった。このことから、Pb原子の熱的挙動に注目すると、PZTの立方晶は同一構造ではなく、1対1の組成比付近に境界があると考えられる。また、立方晶で見られるPb原子の変位の方向と低温相の構造歪とはうまく対応しており、PZTにおけるMPB(morphotropic phase boundary)形成はPb原子の熱的挙動と密接な関係があるように思われる。PbZrO_3のZrをHfに置換したPbHfO_3はPbZrO_3と同様に反強誘電性を示す。本年度はPZT以外にPbHfO_3の立方晶相の電子密度分布解析も行なった。その結果、PbHfO_3でもPbのdisorderが見られた。但し、変位方向が異なっておりPbHFO_3では<100>方向であった。PZT(PbZr_<1-x>Ti_xO_3)は現在最も広く実用化されている強誘電体デバイス材料である。Ti濃度x=0.48付近に相境界を有し,相境界付近の組成で異常に大きい圧電性を示すために応用上の価値が高い。本年度は、PZTのバルク結晶の常誘電相での電子密度分布及びPb原子の挙動のZr/Ti組成依存性を調べた。以前の研究で,x=0(PbZrO_3)とx=1(PbTiO_3)の常誘電相におけるPb原子の挙動を比較すると,PbTiO_3ではPbが+2価のイオンとして静的に孤立しているのに対し、PbZrO_3では最近接の酸素原子と共有結合を形成していてしかも複数のサイトを占有する無秩序状態にあることが分かっている。本年度は新たにTi濃度xが0.25,0.48,0.75のPZT粉末試料を合成し、大型放射光施設SPring-8のビームラインBL02B2で放射光粉末回折実験を行なった。測定データをリートベルト解析した結果,x=0.25,0.48ではPbが無秩序状態にあり、x=0.75ではPbが秩序状態にあることが分かった。この結果から,相境界を境にTi高濃度側でPbが秩序化しているのではないかと推測している。相境界での大きな圧電性とPb原子の秩序化との関連に興味が持たれる。電子密度分布については、試料中に混在した不純物が問題となって、現在解析が難航している。来年度は、より高純度の試料の合成と、より細かいZr/Ti組成依存性の調査が必要である。PZT以外に本年度は,SAWフィルターや圧電、焦電デバイス材料であるLiTaO_3の電子密度分布解析、最も代表的なペロブスカイト型強誘電体であるBaTiO_3の電子密度分布の粒径依存性の調査も行った。

1対1の組成比を境にTi高濃度側では再び<110>方向へと変化し、x=1のPbTiO_3ではPbのdisorderは見られなかった。このことから、Pb原子の熱的挙動に注目すると、PZTの立方晶は同一構造ではなく、1対1の組成比付近に境界があると考えられる。また、立方晶で見られるPb原子の変位の方向と低温相の構造歪とはうまく対応しており、PZTにおけるMPB(morphotropic phase boundary)形成はPb原子の熱的挙動と密接な関係があるように思われる。PbZrO_3のZrをHfに置換したPbHfO_3はPbZrO_3と同様に反強誘電性を示す。本年度はPZT以外にPbHfO_3の立方晶相の電子密度分布解析も行なった。その結果、PbHfO_3でもPbのdisorderが見られた。但し、変位方向が異なっておりPbHFO_3では<100>方向であった。
非ホフマイスター型陰イオン分離素材開発に関する基礎研究

従来の陰イオン交換樹脂ならびに液状陰イオン交換体はホフマイスター型の陰イオン選択性を示すが、本研究では非ホフマイスター型の選択性を示す新規陰イオン吸着素材の開発に関する研究を行い、以下の成果を得た。1)ジオキソサイクラムのコバルト(III)錯体は、軸方向陰イオン配位反応において、ビタミンB_<12>誘導体、ポルフイリン遷移金属錯体などの陰イオンキャリヤーと類似の性質を示す。すなわちこの錯体は、中心金属への配位力の弱い陰イオン(硝酸イオン、過塩素酸イオンなど)の大過剰の共存下で、コバルト中心への配位力の強い陰イオン(亜硝酸イオン、チオシアン酸イオンなど)を高選択的に識別する。2)オクタデシル基導入により疎水化されたジオキソサイクラムのコバルト(III)錯体のクロロホルム溶液は、非ホフマイスター型陰イオン選択性を有する液状陰イオン交換体として挙動する。3)上記2の疎水性錯体を担持した合成吸着剤Amberlite XAD-7は、過剰の硝酸イオン存在下で亜硝酸イオンを選択的に吸着する。しかしこの方式では、コバルト錯体担持量の上限は0.3mmol/g程度である。4)ジオキソサイクラムをグリシジルメタクリラート-ジビニルベンゼン球状共重合体に付加して得たキレート樹脂(RGD)では、コバルト(III)を0.7mmol/g程度まで担持可能である。このコバルト(III)担持RGDは非ホフマイスター型の陰イオン交換樹脂として挙動する。たとえば、10倍モルの過塩素酸イオンの共存下でチオシアン酸イオンの吸着が可能である。一方、従来の陰イオン交換樹脂は同条件下でチオシアン酸イオンを殆ど吸着できない。この新規陰イオン吸着剤ではコバルト(III)の溶出も殆ど起こらず、吸着・溶離・再生の反復使用も可能である。さらに疎水性の陰イオンの溶離も、従来樹脂より格段に容易である。1.dioxocyclamにピリジルエチル基、オクタデシル基などを導入した配位子のコバルト(III)錯体を合成するとともに、新たにdioxocyclamの二個のアミン窒素原子にベンジル基などを導入した配位子を合成した。2.ピリジルエチル基を導入したdioxocyclamのコバルト(III)錯体の単結晶X線構造解析の精密化を行うとともに、テトラフェニルポルフィリンのモリブデン(V)錯体のフッ化物塩の構造決定を行った。これらの構造解析の結果より、錯体に親油性を付与する置換基が軸方向陰イオン交換反応を阻害しないなどの非ホフマイスタ-型陰イオン吸着素材開発に関する有用な構造化学的知見が得られた。3.dioxocyclamのジベンジル誘導体などについて、pH滴定法による酸解離定数ならびに錯形成定数を測定したところアミン窒素原子に置換基を導入すると錯体の安定度が減少することが判った。また伝導度滴定法により各種金属錯陽イオンと陰イオンの会合状態を検討した結果、中心金属チオシアン酸イオンなどの特定陰イオンとの会合は、古典的陰イオン交換体における会合より格段に強いことが明らかになった。4.電子スペクトル(吸光光度)法によりdioxocyclamのコバルト(III)錯体と亜硝酸イオンなどとの会合を検討し、この錯体の中心金属イオンと亜硝酸イオンなどとの結合力は強く、中心金属はこれら陰イオンを2分子まで配位可能であることが判った。5.Dioxocyclamを固定化したキレ-ト樹脂を合成するとともに、コバルト(III)の担持法を開発した。このコバルト(III)

担持樹脂は過剰の硝酸イオン、塩化物イオンの共存下でも亜硝酸イオンに強い吸着力を示し、非ホフマイスタ-型陰イオン吸着素材開発に有望な見通しを得ることができた。本年度の実施計画に従い、以下の成果を得た。1.オクタデシル基を導入したジオキソサイクラムのコバルト(III)錯体のクロロホルム溶液により過塩素酸イオンの大過剰の共存下からでも、チオシアン酸イオンを高選択的に抽出可能であった。すなわち、この鎖体は非ホフマイスター型の液状イオン交換体を与える。2.上記1の疎水性コバルト錯体を合成吸着剤Amberlite XAD7樹脂に担持した陰イオン吸着剤を開発した。この吸着剤は過剰の硝酸イオン共存下でも亜硝酸イオンを吸着可能であり、非ホフマイスター型陰イオン選択性を示した。しかし、この方法ではコバルトの担持量は0.3mmol/g程度が限度であった。3.共有結合でジオキソサイクラムが高分子基体に結合されたキレート樹脂を開発した。特にグリシジルメタクリラート-ジビニルベンゼン球状共重合体にジオキソサイクラムを固定化した樹脂では、コバルト(III)を0.6-0.7mmol/g程度まで担持可能であった。4.上記3で得たコバルト(III)担持キレート樹脂は、硝酸イオンよりは亜硝酸イオンに、また過塩素酸イオンよりはチオシアン酸イオンに高選択性を示した。吸着された各陰イオンはpH13程度のアルカリ水溶液で容易かつ迅速に溶離されることも明かになった。5.市販陰イオン交換樹脂を充填したカラムでは10倍モル以上の硝酸イオンまたは過塩素酸イオンが共存するとそれぞれ亜硝酸イオンまたはチオシアン酸イオンを吸着できないが、上記3で得た吸着剤を充填したカラムでは同条件下でそれぞれの陰イオンが吸着可能であった。また吸着-溶離-再生の反復使用も可能であった。
Ｇｒａｄｅｄ　ｒｅａｄｅｒｓ　ａｎｄ　ｎａｔｉｖｅ　ｓｐｅａｋｅｒ　ｂｏｏｋｓ

多読管理ソフトMReaderで英語学習者がネイティブ・リーダーレベルに到達する道筋を作りました。各レベルで児童文学などを盛り込みながら、MReader説明資料の中でグレイディッド・リーダー(英語学習者用の本)とネイティブ・リーダー用の本の違いとそれぞれのメリットを明確にしました。一方で公共の図書館と連携取りながら、レベル別推奨本リストを提供した後、京都市2館では約2千冊の英語多読の本が導入されました。公共図書館と小中学校で英語多読のアプローチを広めるため、TRC株式会社、京都市教育委員会の英語シャワー担当矢野先生と東京都台東区の区議会議員さん(文教委員)と会いました。論文は現在作成中です。平成24年度の元の計画によると、初年度は研究を実施するにあたって必要な設備を購入、調整することを中心に平成25年度から本格的に実施する新教材の試行やインタビューによるフィードバックの事前準備等を行う予定でした。平成24年度研究計画のポイントをもとに、実績の概要を述べます:1,研究環境の整備(多読教材の増設、多読教材貸出しシステムの改良):所属機関の図書館の協力を得て、本研究計画に関係する図書を整備し、24年度末で1323冊(同一タイトルの副本を含む)の図書が整備された。また、本研究課題の活動として、LL(本研究で主に使う施設)に887冊のreading-bookを整備し、また、貸出システムの改善及び貸出カードの整備を行うことが出来た(カード発行実績133名分)。そして、学生が英語学習のreaderとnative speakerの図書の違いについての理解を高めるため、Moodle Readerプログラムの改良を行い、2つのカテゴリに分けました。2, L1リテラシーに関する国際学会への参加:10月3日4日シドニー(オーストラリア)にて開催された学会「Three Bells」に参加しました。3,実際の授業など教育カリキュラムにおいて新教材を試行する:英米語学科2回生(120人)に対し、必修科目(120人)と講義科目(70人)において新教材を施行しました。4,インタビューによる新教材の適切性などの調査:初年度のため、主たるフィードバックはレポート形式で実施しました。その上、Moodle Readerの中に'book evaluation'制度を設置しました。英語教育本研究を遂行するにあたり、充分な制度や設備を整えました。思ったより早く学生からのフィードバック制度ができましたので、24年中に本研究関係でMoodle Readerのため84タイトルのクイズを作成し、学生が使えるようにしました。その上、京都市岩倉図書館(公共図書館)での講演がきっかけで、大学生だけでなく社会人のフィードバック制度も作りはじめました。公共図書館での多読状況を分かるため、名古屋市の三つの図書館を見学しました。更に、公共図書館に多読図書をいれるため、12月には京都市図書館、出版社2社、TRC((株)図書館流通センター:http://www.trc.co.jp)で会議を行いました。元の予定は変わっていません。つまり、平成25年度は本研究の本格的活動を行う年である。前年度からの調査に引き続き、次の活動を実施する。1)データを集める(MoodleReader、アンケート、インタビューなど)2)L1リテラシーにおける教材調査、収集3)L1リテラシーに関する国際学会への参加4)MoodleReaderを利用した多読システムのブラッシュアップ5)実際の授業など教育カリキュラムにおいて新教材を試行する6)インタビューによる新教材の適切性などの調査該当なし
ELID研削を施した硬質被膜材料のトライボロジー特性の解明

ELID研削とは国内外で実用化され始めている新しい加工技術である。このように加工技術が多様化高度化してきたのにかかわらず,平面加工においては,依然として加工表面の評価は主に表面粗さ,平面度等でなされることが多い。本研究では加工面品質を評価する手段の一つとして摩擦摩耗試験を行い,表面加工条件の違いがのトライボロジー特性に及ぼす影響を明らかにする。具体的には,加工条件の中でELID電解効果が硬質被膜材料のトライボロジー特性に及ぼす影響を調べるために,比較実験として同一の加工装置を用い,砥石粒径,砥石回転数,ワーク回転数,送り速度等の加工条件を一致させ,通常の研削を行った硬質被膜材料も使用する。本研究において,研削にはELID装置を搭載した横形精密ロータリ平面研削盤,片面ラップ盤及び立形ロータリ平面研削盤を用いて,_<400>8000の幅広い粒度の砥石を使用し,電解条件等の各種研削加工条件を変化させ,硬質被膜材料の鏡面研削を行った。種々の条件下でELID研削加工が行われた各種硬質被膜材料に対し,摩擦条件を変化させ,摩耗試験を行い,以下の知見を明らかにした;1.通常の研削を施した場合,いずれの荷重においても比摩耗量は1.0×10^<-10>mm^2/N以上の高い値を示すが,ELID研削を施した場合,いずれも1.0×10^<-10>mm^2/N以下の値を示し最小荷重下では,通常の研削を施した場合の約1/17の値を示す。2.摩擦摩耗試験を行うことにより,微細加工面の評価を行うことが可能である。以上より,2種類の研削法において,加工後の表面粗さの違いは極わずかであるが,その僅かな表面粗さの違いは,大きな摩耗特性の違いとなって拡大されることが明らかとなった。ELID(electrolytic in process dressing)研削とは、高効率な超精密加工が可能な新たな研削加工法であり,ELID研究会を中心に国内外の企業に普及してきている。このような表面加工技術の多様化・高度化に伴い,トライボロジー分野では表面加工条件のトライボロジー特性に及ぼす影響を把握しておくことが必要になってきている。一方,平面加工分野では加工面の評価は主に表面粗さ,平面度のみでなされることが多い。セラミックス系材料のトライボロジー特性は表面性状に敏感であることから,本研究では加工面の詳価の一つにトライボロジー試験を行うことの有効性も検討する。以上より本年度は,研削条件を変化させELID研削により仕上げられた各種硬質被膜材料のトライボロジー特性に及ぼす影響を初めて明らかにすることを研究の目的とした。本研究において,研削にはELID装置を搭載した横形精密ロータリ平面研削盤,片面ラップ盤及び立形ロータリ平面研削盤を用いて,#400#8000の幅広い粒度の砥石を使用し,電解条件等の各種研削加工条件を変化させ,炭化ケイ素被膜材料,酸化クロム被膜材料,アルミナ被膜及びダイヤモンド被膜の鏡面研削を行った。種々の条件下でELID研削加工が行われた各種被膜材料に対し,摩擦条件を変化させ,摩耗試験を行い,以下の知見を明らかにした;1.ELID研削を施した炭化ケイ素被膜材料,酸化クロム被膜材料,アルミナ被膜材料について,低摩擦,低摩耗を表す臨界条件を示し,臨界条件以下では摺動特性に優れる。2.通常の研削仕上げ面における微視的摩耗形態はパウダー形成型が支配的であるが,ELID研削を施した場合の摩耗形態は,ヘルツ最大接触圧力の増加に伴い,パウダー形成型が生じない場合からパウダー形成型の摩耗形態に遷移する。3.パウダー形成型の摩耗形態の発生条件は,無次元パラメータを用いて分類できる。

以上より,2種類の研削法において,加工後の表面粗さの違いは極わずかであるが,その僅かな表面粗さの違いは,大きな摩耗特性の違いとなって拡大されることが明らかとなった。
金属鉄から水素を発生する新奇ヒドロゲナーゼの反応機構の解明

本研究の目的は、鉄腐食性メタン生成菌において見つかった新奇ヒドロゲナーゼの機能と構造を明らかにすることであった。残念ながら、精製および立体構造決定には至らなかったが、本酵素に由来すると思われる水素発生条件の最適化と統合計算ソフトを用いた立体構造のシミュレーションを行った。至適水素発生条件は、本菌の生育条件とよく一致していた。また、立体構造のシミュレーションから、スモールサブユニットが特に既知ヒドロゲナーゼと異なり、金属材料からの電子伝達に機能していると推定された。今後は、非腐食性メタン生成菌を用いた異種発現系の確立とスモールサブユニットに焦点を当てた電気化学的解析を行う予定である。本研究の目的は、申請者が発見した鉄腐食性のメタン生成菌のみが持っている新奇ヒドロゲナーゼを精製し、その反応機構を明らかにすることである。微生物による金属腐食の大きな問題は、反応機構が不明ということである。申請者は、世界に先駆けて金属腐食能とリンクした新奇ヒドロゲナーゼを発見している。本研究では、本酵素を精製して金属腐食能を直接証明し、さらに、立体構造を決定することで新奇反応機構の解明を目指す。本酵素の反応機構の解明は、固体界面で機能する新奇酵素の開発や有効な微生物腐食防食剤の開発等の発展性を持っており、学術面と応用面から価値のある研究である。さらに、金属腐食のコストは日本で約2兆円/年も掛かっており、経済的な側面からも実社会への貢献が大きい。本目的を達成するため研究期間内に、次の二点を明らかにする。新奇ヒドロゲナーゼを精製し、単独で金属腐食が生じることを証明する。そして、新奇ヒドロゲナーゼの立体構造を決定し、その反応機構を明らかにする。平成26年度は、新奇ヒドロゲナーゼの精製について重点的に行い、水素発生条件の検討、メタン菌からの精製、および大腸菌での異種発現を行った。水素発生条件の検討は概ね完了し、その条件を用いてメタン菌からの酵素精製を検討している。酵素精製については、当初懸念された通り、酸素により急速に失活してしまうため、無酸素条件での精製法の確立を進めている。また、大腸菌での異種発現については、メタン菌と大腸菌の生物種の差から遺伝子暗号(コドン)の頻度の問題が懸念されたため、人工合成により大腸菌のコドン使用頻度に合わせて遺伝子を作成した。平成27年度は、前年度までに得られた情報に基づいて研究を進め、メタン菌あるいは大腸菌で発現させた酵素を用いて結晶化、および、X線結晶構造解析を進める予定である。水素発生条件の検討は概ね完了し、その条件を用いてメタン菌からの酵素精製を検討したが精製には至らなかった。平成27年度は、各種方法で精製を進めると共に、遺伝子配列から推定されるアミノ酸配列に基づき、統合計算ソフトを用いて詳細に構造をモデリングした。その結果、水素の発生に寄与すると考えられているラージサブユニットでは既知のヒドロゲナーゼと構造の一致度が高く、分子内電子伝達に関与するスモールサブユニットでは構造が著しく異なることが明らかとなった。したがって、本酵素が金属表面から電子を受け取る際に、スモールサブユニットが重要な役割を演じていることを明らかにした。本研究の目的は、鉄腐食性メタン生成菌のみに確認されている新奇ヒドロゲナーゼを精製し、その反応機構を明らかにすることである。したがって、平成26年度は、新奇ヒドロゲナーゼの生化学的な特徴を理解するとともに、酵素の精製を目指して、以下の三項目を実施した。a)水素発生条件の検討:精製を行う上で酵素活性の測定は必須である。

したがって、最初に、酵素活性の至適条件(pH、温度、塩濃度)を決定した。嫌気瓶に鉄ホイル(Fe=99.9%以上:10×10×0.1 mm)の入った緩衝液を用意し、N2ガスで置換したところに、鉄腐食性メタン生成菌の培養上清を接種して、種々の条件で水素発生量を調べた。その結果、pH 7、40度、3% NaClを粗酵素液の至適条件として決定した。b)メタン菌からの精製:本酵素が腐食原因の因子であることを直接証明するために、a)で決定した条件を用いて活性を追跡することで、メタン菌培養液からの酵素精製を目指した。ヒドロゲナーゼが酸素で失活する可能性があったため、簡易の嫌気グローブボックスを用いて操作を行っていたが、鉄腐食培養液中に大量に存在する鉄イオンが酵素精製の操作において顕著に悪影響を及ぼした。平成27年度は、鉄培地ではなく、水素をエネルギー源とした鉄抜き培地を用いて培養を行い、酵素精製を検討する。c)大腸菌での異種発現:メタン菌からの精製が難しいこともあり、当該酵素の大腸菌での異種発現を検討している。ゲノム情報に基づき、当該酵素の推定アミノ酸配列から大腸菌のコドン使用頻度を持つ遺伝子を人工合成した。サブユニットが二つ存在するので、一つのベクター上に二つの遺伝子を導入し、それぞれの上流に誘導プロモーターがあるものと、誘導プロモーター一つでモノシストロニックに発現できるプラスミドの二種類を構築した。農学初年度に引き続きメタン菌からの酵素精製と大腸菌での異種発現酵素調製を続けると共に、調製した精製酵素もしくは異種発現酵素を用いて、タンパク質結晶の作成、およびX線結晶構造解析を実施し、その反応機構を解明する。a)メタン菌からの精製:精製操作に悪影響を及ぼす高濃度の鉄の持ち込みをよくせいするために、水素培養菌体を用いて酵素精製を目指す。b)大腸菌での異種発現:メタン菌由来当該ヒドロゲナーゼ遺伝子を持つプラスミドを大腸菌に導入し、嫌気培養下で酵素の生産および精製を試みる。精製酵素にHisタグを付与しておくことで、精製ステップをシンプルにし、酸素への接触による阻害を最低限に抑える。c)結晶作成条件のスクリーニング:b)で大量に発現した酵素を用いてタンパク質の結晶を作る。異種発現酵素は、活性中心等の修飾が正常に行えていない可能性もあるので、発現タンパク質を用いて結晶化条件を確定した後、メタン生成菌から精製した酵素でも結晶化を行う。d) X線結晶構造解析:結晶が作成できた酵素(精製酵素もしくは異種発現酵素)を用いて、Spring-8にてタンパク質の結晶構造解析を行う。新奇ヒドロゲナーゼは、既知のヒドロゲナーゼとの相同性が低く、金属表面との反応ドメインでこれまでにない構造を取っている可能性がある。この構造を明らかにし、既知ヒドロゲナーゼとの立体構造の比較から、金属表面から電子を受け取る(奪い取る)ドメインを特定する。