hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
精巣の発育制御

鱗翅目昆虫は幼虫期に精巣を発達させるものが多く、細胞分裂周期とその分化がどのように幼虫期のホルモンと関連して発達するかはまだあまりわかっていない。また鱗翅目幼虫に寄生する内部寄生バチは、寄生時に寄主体内に注入するポリドナウイルスと毒液によって直接寄主の精巣を退化させる。これらのことを利用しながら、精巣の発育過程における細胞分裂がどのようにホルモンと関連しているかを明らかにしていく。1。寄生されるステージによって、精巣内の細胞の壊れ方が違うことがわかった。特に寄主が終齢になると、寄生されてもかなりの精細胞が精巣にまで変態できることが、フローサイトメトリーとパラフィン切片から確かめられた。2。フローサイトメトリーの結果から、終齢の0日目からそれまでのステージで止まっていた分裂が動き出すことがわかった。3。幼若ホルモン類縁体(JHA,50ng/larva)を終前齢に塗布すると終齢のおける精巣の急激な成長は起こらなかった。以上の結果から、JH値が低くなるとG_2/M blockがはずれ、ポリドナウイルスによる制御は、細胞分裂周期のG_2/M blockがはずれたものには及ばないことが示唆された。4。精巣のcDNAライブラリーを作成し、その中で4kbp前後のものの一部のシークエンスを行ったが、既知のシークエンスにはホモロジーの高いものは見いだせなかった。引き続きクローンのシークエンスを行っている。1。2。3。4。
風車教材の開発と地域連携したサスティナブルな技術者および技術リテラシー教育の実践

本研究では,大型風力発電機のペーパークラフト模型の設計・開発・工作教室の企画と運営を通して,高専学生や大学工学部学生のエンジニアリングデザイン力やコミュニケーション力を鍛えるとともに次世代の産業界を担う小中学生に,風力発電の仕組みの理解,再生可能エネルギーの啓蒙そしてものづくりの奥深さを体験してもらうことが可能なサスティナブルな教育システムの開発をすることを目的とした.研究開発の成果として,風力発電機のペーパークラフト模型および3Dプリンタによる模型の設計,一般向け公開講座,教員向けの研修,大学や高専での授業内での実践が可能な教材化を達成した.本研究は,大型風車のペーパークラフト模型の設計・開発・工作教室の企画と運営を通して,高専学生や大学工学部学生などのエンジニアリングデザイン力やコミュニケーション力を鍛えるとともに次世代の産業界を担う小中学生に,風力発電の仕組みの理解,再生可能エネルギーの啓蒙そしてものづくりの奥深さを体験してもらうことが可能なサスティナブルな教育システムの開発をすることを目的として以下の開発などを行った.過去に開発したペーパークラフトの改良を行い完成度を高めた.また,その組み立て方法のマニュアル化などをした.ペーパークラフトの改良と平行して,本ペーパークラフトを用いて本格的に機械工学・電子工学・電気工学を実践的に学ぶことが可能な教材へと拡張を進めるために.実機と同様に翼型形状をしている風車のブレード部翼型周りの流れ場を解析可能なQBlade(フリーソフトウェア)による解析教材のマニュアル(β版)を開発した.また,ペーパークラフトでは難しい,ブレード形状を3DCADデータ化し3Dプリンタによるプリントを試みた.Arduino互換マイコンボードとプログラミングによる風車データ取得システムの構築をする手段を開発し,マニュアル化した.ペーパークラフト組立以外に関しては教材化および運用マニュアル化は不完全であった.しかしながら,大学工学部でのペーパークラフト風車の活用を打診されたので,ノウハウの一部を提供し,大学での利用方法を見学し,「エンジニアリングデザイン実践教材」の方向性を確認できた.風車および工作に関する公開講座は3回開催し,学生が主体的に公開講座などの活動するための機会を与えた.ペーパークラフト風車のWebページを開設し,世界中からのアクセスを確認した.成果の一部は研究講演会にて2回の口頭発表,研究紀要1本を発表した.本研究は,風車のペーパークラフト模型の設計・開発・工作教室の企画と運営を通して,高専学生や大学工学部学生などのエンジニアリングデザイン力やコミュニケーション力を鍛えるとともに次世代の産業界を担う小中学生に,風力発電の仕組みの理解,再生可能エネルギーの啓蒙そしてものづくりの奥深さを体験してもらうことが可能なサスティナブルな教育システムの開発をすることを目的として以下の開発などを行っている.過去に開発した水平軸型ペーパークラフト風車に加えて,垂直軸型ペーパークラフトの設計を行った.垂直軸型の設計はまだ不完全ではあるが,次年度に完成度を高めその組み立て方法のマニュアル化などを実施する予定である.ペーパークラフトの開発と平行して,風車模型を用いて本格的に機械工学・電子・電気工学を実践的に学ぶことが可能な教材へと拡張を進めているが,風車の翼型周りの流れ場解析可能なQBlade(オープンソース)のバージョンアップに伴う解析教材のマニュアルを改良した.また,ペーパークラフトでは難しいひねりのあるブレード形状を3DCADデータ化し,その他部品も新たに試作を設計し,3Dプリンタによるプリントを試みた.Arduino互換マイコンボードとプログラミングによる風車データ取得システムを構築する手段を電子工学科2年生の実習に取り入れ,「エンジニアリングデザイン実践教材」としての妥当性の確認をした.昨年度に引き続き,大学工学部でのペーパークラフト風車の活用を打診されたので,ノウハウの一部を提供し,大学での利用と意見をいただいた.風車および工作に関する公開講座は3回開催し,学生が主体的に公開講座などの活動するための機会を与えた.英語のペーパークラフト風車のWebページを更新し,アクセス解析を導入することで世界中からのアクセスを確認した.成果の一部は4回の口頭発表,研究紀要1本を発表した.ペーパークラフトの開発と平行して,風車模型を用いて機械工学・電子・電気工学を実践的に学ぶことが可能な教材へと拡張を進めているが,本年度はArduino互換マイコンボードとプログラミングによる風車データ取得システムを構築する手段を電子工学科2年生の実験実習の授業に取り入れ,「エンジニアリングデザイン実践教材」としての妥当性の確認をした.水平軸型ペーパークラフト風車においてトルクやスラスト荷重の実測と解析結果の比較ができる可能性も見出され,機械工学の教材化することを検討できる段階になった.本校学生の卒業研究および機械学会年次大会で報告した.また,ペーパークラフトでは難しいひねりのあるブレード形状を3DCADデータ化し,その他部品も設計し,3Dプリンタによる造形を試みた.具体的には歯車を用いた動力伝達部では歯車のモジュール(歯の間隔)や歯すじ(平,はすば,やまば)が違う3Dプリンタ部品の造形を試みた.材料力学への興味を高めるために,風力によるブレードたわみの関係を実験とシミュレーションでとらえるための弾性材料による3Dプリンタブレードの造形を試みた.風車や工作に関する公開講座は3回開催し,学生が主体的に公開講座などでコミュニケーション力を上げる機会を与えた.また,公開しているWebページは昨年度の国内と国外の比が約7:3(総アクセス約3500)であったのに対し,今年度は約3:7(総アクセス約5800)となり英語のWebページ開設による世界中からのアクセス増を確認した.

さらに欧州宇宙機関(ESA)ポルトガルでのイベントへのペーパークラフトの提供を実現した.成果の一部は3回の口頭発表,研究紀要1本を発表,また産業界へのアピールとして,国際産業フロンティアメッセ2015,平成27年度近畿地区7高専産学官マッチングフェアおよび高専女子フォーラム2015にてポスターを展示した.昨年度に続き,ペーパークラフト風車を用いて公開講座を実施した.ペーパークラフト風車の内容の一部は,科研費の申請書類の項目にある「研究成果を社会・国民に発信する方法」でも挙げた通り日本語と英語のWebページにて一部提供することで成果を直接発信し,アクセス解析を導入することでアクセス(関心)があるのかのデータを収集した.昨年に引き続き電子工学科2年生の実験実習にて「Arduino互換マイコンボードとプログラミングによる風車データ取得システムの構築」する課題を課した.また,大学の研究室(流体力学・風力関連)のゼミにて「ペーパークラフト風車の組立・改良とQBladeによる解析とを比較する」内容を実践してもらった.また,カリキュラム変更の関係で平成28年度以降に延期していた機械工学科での「風車を用いたエンジニアリングデザイン実践教材(授業での題目:風力タービン(風車)モデルを用いたエンジニアリング演習)」授業の準備が整い,学科の了承を経てカリキュラムに取り入れ,H28年度から実際に運用を始める(本報告書作成時にはすでに実施済み).目的のひとつである「理論と実践」の体験を通して,エンジニアリングへとつながるPDCAサイクルを実体験させることを,まだ深い加工技術や理論の理解がない段階の学生に対して授業時間内にて提供を開始しできるようになった.「サスティナブルな教育システム」として掲げた「社会貢献活動(公開講座)」と「工学教育」の一部は構築しつつある.一方で「産業」として企業との連携を掲げた部分については,過去具体的な成果はなかったものの,国際産業フロンティアメッセ2015,平成27年度近畿地区7高専産学官マッチングフェアおよび高専女子フォーラム2015にてポスターを展示する機会を得て,企業関係者に開発段階の教材をアピールすることができた.ペーパークラフトでは難しいひねりのあるブレード形状を3DCADデータ化し,その他部品(アップウィンド型およびダウンウィンド型用のシャフトや軸受の有無を切り替え可能なナセル)を設計し,3Dプリンタによる風車模型の造形を試みた.3Dプリンタ風車の性能を確認し,機械工学の教材化することが可能であることを確認でき,本校学生の卒業研究にて報告した.また,材料力学向け教材化のために,弾性材料による3Dプリンタブレードの造形を試み,センサー類やCPUボードを内包できる形状の設計,教材としての利用方法を提案し,機械学会年次大会で報告した.また,本校のカリキュラムの再編に合わせて,機械工学科2年生の「機械実習」において,ペーパークラフト風車の教材を試験的に導入し「導入教育段階での教材」として成立することを確認した.H29年度からは機械工学科1年生向けに正式に導入した.風車や工作の外部向け公開講座は3回開催し,学生が主体的にコミュニケーション力を上げる機会を与えた.
救急隊員の介護技術教育プログラムの開発

本研究は、平成27年度に実施した「救急隊員の介護技術実態調査」の結果を基として、問題となった救急隊員の介護技術を明らかとし、看護の視点より救急隊員養成課程の教育に加えることができる、介護技術教育プログラムを開発し、その効果を検証することを目的とする。平成30年度は、平成29年度の研究成果を基として、1.研究成果の社会還元、2.研究成果の消防隊員への還元、3.研究成果を基として次期研究に繋がるための論点整理と体制構築を行った。1.として、介護技術講習会を受講した後の救急隊員の意識の変化を「救急隊員の介護技術教育プログラムの開発救急隊員の介護技術講習会後の変化」として、第29回日本疫学会学術総会にて発表した。また、関連するものとして、救急搬送により救命センターに搬送された家族の思考過程と看護による援助を検討するため、「救急救命センターに緊急入院となった重度意識障害患者の家族の思い」として、第20回日本救急看護学会学術集会にて発表した。2.として、平成29年末に実施した、「救急隊員の介護技術教育プログラムの開発に関する研究3-救急隊員の介護技術実態調査-」「救急隊員の介護技術教育プログラムの開発に関する研究-指導救命士に対するインタビュー調査-」の報告書を作成し、消防局職員(救急隊員又は救急救命士)に配布した。3.として、消防学校初任者教育にて介護技術教育を盛り込み、実施するための関係部署との調整をおこなった。令和2年度からの開始を目指して準備を行った。平成28年度は、1「救急隊員の介護技術プログラムの開発」のため、既に着手している研究の評価とそれを踏まえた「介護技術講習会」の試行、2研究体制の再構築、3類似の研究に対する情報収集、4課題に関連する文献調査を行った。具体的には、1として、平成27年度に行った、鳥取県西部広域行政管理組合消防局、鳥取県中部ふるさと広域連合消防局、安来市消防局の救急隊員に対して行った「救急隊員の介護技術調査」(悉皆調査)結果の再評価を行い、救急隊員の介護技術ニーズを明らかにし、地元救急救命士会の助力を得て、救急救命士を中心とした救急隊員の一部に鳥取大学医学部を会場として「介護技術講習会」を試行した。2として、各消防局の鳥取県中部地震を踏まえた担当者の交代、幹部職交代等の影響による研究体制への影響を最小限とし、研究体制の維持を目的とした、大学と消防の信頼関係の再構築を行った。3として、看護系学会参加による基礎看護学技術の他の職種への教授方法の検討、日本医療教授システム学会参加をはじめとする教育プログラム作成関連の検討を行った。4として、救急隊員らに介護技術を教授し、介護技術を実践する際に法律上の課題となると考えられる「応急手当」に関する文献調査を行った。昨年度に研究対象者らが所在する鳥取県において、大規模な地震があった。このため、本研究では、主に県内の消防局所属の救急隊員を対象とする研究のため、災害対応が優先されたため、研究の進捗が遅れている。また、研究者らも鳥取県内に所在する大学に所属する医療関係者のため住民に対する災害対応が優先された。本研究は、平成27年度に実施した結果を基として、問題となった救急隊員の介護技術を明らかとし、看護の視点により救急隊員養成課程の教育に加えることができる、介護技術教育プログラムを開発し、その効果を検証することを目的とする。平成28年度は、研究体制の再構築、「介護技術講習会」の試行、類似の研究に対する情報収集、課題に関連する文献調査を行った。これを踏まえて、平成29年度は、1「介護技術講習会」の評価、2指導救命士に対する質的調査、3関連する学会等で情報収集を行った。具体的には、1として、平成29年末に鳥取県西部広域行政管理組合消防局職員の救急隊員(「介護技術講習会を受講した者を含む」)と鳥取県東部広域行政管理組合消防局の救急隊員に対してアンケート調査を実施した。過去に実施した「救急隊員の介護技術実態調査」と同様の調査票を使用することで、鳥取県西部広域行政管理組合消防局職員の救急隊員で平成28年度に実施した「介護技術講習会」を受講した者に介護技術に関する一定の意識(自信に対する認識)の変化と行動の変化があることが確認できた。2として、鳥取県西部広域行政管理組合の指導救命士全員に対して、半構造面接によるグループインタビュー調査を行い、逐後録を作成し、ラベルを作成した。3として、第20回日本臨床救急医学会総会に参加し、関連する研究についての情報収集と他の他県の消防職員である救急隊員及び他大学教員と意見交換を行った。本研究事業開始時の平成27年度に本学が位置する鳥取県中部に大規模な地震があった。本研究の対象者は鳥取県内の消防局所属の救急隊員であるため、災害対応が優先した関係により、本研究事業の開始の時期が遅れた影響を受けている。

平成30年度は、平成29年度の研究成果を基として、1.研究成果の社会還元、2.研究成果の消防隊員への還元、3.研究成果を基として次期研究に繋がるための論点整理と体制構築を行った。1.として、介護技術講習会を受講した後の救急隊員の意識の変化を「救急隊員の介護技術教育プログラムの開発救急隊員の介護技術講習会後の変化」として、第29回日本疫学会学術総会にて発表した。また、関連するものとして、救急搬送により救命センターに搬送された家族の思考過程と看護による援助を検討するため、「救急救命センターに緊急入院となった重度意識障害患者の家族の思い」として、第20回日本救急看護学会学術集会にて発表した。2.として、平成29年末に実施した、「救急隊員の介護技術教育プログラムの開発に関する研究3-救急隊員の介護技術実態調査-」「救急隊員の介護技術教育プログラムの開発に関する研究-指導救命士に対するインタビュー調査-」の報告書を作成し、消防局職員(救急隊員又は救急救命士)に配布した。3.として、消防学校初任者教育にて介護技術教育を盛り込み、実施するための関係部署との調整をおこなった。令和2年度からの開始を目指して準備を行った。災害対応もひと段落したため、今年度は、実施可能なものとして、昨年度より研究対象者である救急隊員の所属する消防局の指導救命士に対するインタビュー調査を基とした質的調査、また昨年度に実施した一部の救急隊員向けに行った「介護技術講習会」の試行を評価するためのアンケート調査の実施を計画し、準備に着手している。これを受けて、質的調査と量的調査の結果より、救急隊員の介護技術向上のため、新たな教育プログラムの開発を予定している。昨年度は、平成27年度に実施した「介護技術講習会」の評価を行うためのアンケート調査を実施し、救急隊員向けの介護技術教授の焦点を絞るため指導救命士に対してインタビュー調査を行った。本年度は、その成果を踏まえて、救急隊員向けの介護技術プログラムの確立とプロラムの最初のステップである消防学校での介護技術教育の開始に備えた関係各署との調整を予定している。昨年度、鳥取県にて大規模地震が発生し、本研究の客体となる救急隊員らが災害対応に従事したため、研究の進捗が遅れた。また、本研究の研究者が所在する大学も県内に位置し、本研究の研究者は全て医療関係者のため、被災者及び彼らに関連する支援を法が求める優先事項として実施したため、研究の進行が遅れた。(理由)本研究事業開始時の平成27年度に本学が位置する鳥取県中部に大規模な地震があった。本研究の対象者は鳥取県内の消防局所属の救急隊員であるため、災害対応が優先した関係により、本研究事業の開始の時期が遅れた影響を現在も受けている。(使用計画)昨年度は、予定通り、平成27年度に実施した「介護技術講習会」の評価を行うためのアンケート調査及び指導救命士に対してインタビュー調査を終えることができた。これを受けて今年度は、研究成果の社会還元と研究対象者への還元、救急隊員の介護技術向上のための、開発した介護技術教育の鳥取県消防学校での実施向けた環境整備と調整を予定している。今年度は、研究対象者である救急隊員の所属する消防局の指導救命士に対するインタビュー調査を基とした質的調査、また昨年度に実施した一部の救急隊員向けに行った「介護技術講習会」の試行を評価するためのアンケート調査の実施を計画している。
ソフト溶液プロセスによるセラミック/金属系傾斜機能材料のin situ作製

溶液と金属基板あるいは基材との界面化学反応によってセラミックスを必要な箇所に薄膜や厚膜などとしてその場(in situ)に作製してセラミックス/金属系傾斜機能材料を作るというプロセスを開発することを目的として、本研究では水熱反応のみならず電気化学反応なども利用した5つの研究を行った。得られた知見は以下の通りである。(1)チタン合金をCa^<2+>を含むアルカリ溶液中で反応させると表面にCaTiO3膜が生成する。(2)チタン金属基材をBa^<2+>またはSr^<2+>,Ca^<2+>を含むアルカリ溶液中で処理するとBaTiO_3,SrTiO_3,CaTiO_3あるいはそれらの固溶体が膜状に生成する。この時チタン金属多孔体や厚粉体を用いると孔の内面が一様に酸化物で覆われる。(3)金属間化合物TiAlやTi基あるいはAl基合金は新しい耐熱高温材料として期待されているが、耐酸化性が大きな欠点である。これらの基材を水溶液中で電気化学的に処理して表面に酸化物被膜をコーティングすると耐酸化性が向上する。(4)我々は、タングステン基板をBa^<2+>やCa^<2+>を含むアルカリ水溶液中で電気化学処理するとBaWO_4やCaWO_4の結晶が膜状に生成することを見出している。これらの膜は結晶性に優れ、そのままでも蛍光体として作動する。(5)Si-C-O系、Si-Ti-C-O系の繊維や他の炭化物基材を数百°Cの熱水中で処理すると表面に緻密なカーボン膜が生成し炭化物/炭素複合体となる。
重合体フィラメントの動的構造多型と結合タンパクの協同的結合の構造機能相関の解明

細胞活動に重要なアクチンフィラメントの内部構造の変化を単分子レベルで捉えることを目指し、FRETの偏光依存性を利用した計測法(偏光FRET法)の開発を進めている。偏光FRET法であれば、たとえ溶液中を回転拡散している生体分子であっても、その内部構造の変化(主に角度変化)を高感度で捉えられる。この偏光FRET法を実現するためにはタンパク質の部位特異的に修飾するためにシステイン反応性のmaleimide基を持つbifunctionaldyeが必要となる。そこで市販されているCy3-bis-NHSおよびCy5-bis-NHSを改変し、2つのmaleimide基を持つCy3-bis-maleimideおよびCy5-bis-maleimideを合成した。次に、これら合成した2種類のbifunctionaldyeをアクチンへ部位特異的に修飾するために4箇所のシステイン変異を導入したテトラシステイン変異体アクチンを用意した。HEK293細胞の発現系にてテトラシステイン変異体を発現・精製し、2種のbifunctional dyeで蛍光修飾を試みた。当初作成したテトラシステイン変異体ではbifunctional dyeによるアクチン同士の架橋が起きたため再度変異部位を検討し、新たに作成したテトラシステイン変異体では蛍光色素による架橋を大幅に減らすことができた。蛍光修飾アクチンにて1分子FRETイメージングを行いFRETが起きていること、また天然型アクチンとの混合ではあるが重合能も確認している。しかし、この精製段階の蛍光修飾アクチンにはドナーしかもたないアクチンも含まれている。ドナーしかもたないアクチンはFRETイメージングのバックグラウンドになるため、さらに精製を行うことで検出感度の向上を目指す。28年度が最終年度であるため、記入しない。重合しフィラメント形成する生体超分子(アクチンや微小管など)は細胞骨格を担い、その動的な重合・脱重合が細胞運動や形態変化など細胞活動の原動力となる。近年、重合体フィラメントの構造は均一かつ静的ではなく、不均一で動的に揺らぐことが示唆されている。例えば、F-アクチンとアクチン結合タンパクとの協同的結合は、アクチンモノマーに構造多型性があり、結合タンパクとの結合に伴うアクチンモノマーの構造変化が近傍へ伝播し、正のフィードバックが働き親和性が上昇するからと考えられている。F-アクチンの原子レベルの分子構造が解かれ、アクチンモノマーの構造のねじれが機能と密接に関係していることが分かってきた。しかし、依然F-アクチンの内部の構造ダイナミクスの情報が欠けている。よって、F-アクチンの動的な構造変化と機能の関係は明らかではない。そこで、偏光した蛍光色素間のFRET(偏光FRET)であれば溶液中を回転拡散している生体分子であっても、構造のねじれ(角度変化)を捉えられる。偏光FRET法により、細胞内のF-アクチンの構造状態について、モノマーレベルで、その時空間ダイナミクスを捉えることを目指している。偏光FRET法を実現するためにはタンパク質の部位特異的に修飾するためにシステイン反応性のmaleimide基のbifunctionaldyeが必要となる。そこで、市販の蛍光色素を改変し目的に合う蛍光色素を合成した。2つの偏光した蛍光間のFRETを利用した偏光FRET法であればアクチンのGF変換の動きを直接捉えられる可能性がある。この偏光FRET法を実現するには2つの蛍光色素を偏光させ、さらにタンパク質のCysへ部位特異的に蛍光修飾するために、システイン反応性のbifunctional dyeを2つ必要とする。当初計画では2つの蛍光色素の内1つはローダミンのbifunctional dyeを使用する予定であったが、製造中止となったため使用を中止した。そこで、Cy3-bis-NHSとCy5-bis-NHSを基にして蛍光色素の改変を進めることにした。Cy3-bis-NHSおよびCy5-bis-NHSの2つのNHS基をmaleimide基へ改変し、Cy3-bis-maleimideおよびCy5-bis-maleimideを合成した。他の研究目的で以前に用意していたkinesin-1のdouble Cys変異体に対してCy3-bis-maleimideを修飾したところ部位特異的に修飾できることを確認できた。しかし、蛍光修飾したサンプルの2割ほどで、タンパク分子同士の架橋が起きていた。これは変異導入した2つのCysの距離が近過ぎたためにCy3-bis-maleimideの2つのmaleimide基が同じタンパク質のCysと反応する前にそれぞれ別のタンパク分子のCysと反応して架橋が起きてしまったと考えられる。そこで、作成途中にあったアクチンのCys変異部位を再度検討する必要が出てきた。次に、これら合成した2種類のbifunctionaldyeをアクチンへ部位

特異的に修飾するために4箇所のシステイン変異を導入したテトラシステイン変異体アクチンを用意した。HEK293細胞の発現系にてテトラシステイン変異体を発現・精製し、2種のbifunctional dyeで蛍光修飾を試みた。当初作成したテトラシステイン変異体ではbifunctional dyeによるアクチン同士の架橋が起きたため再度変異部位を検討し、新たに作成したテトラシステイン変異体では蛍光色素による架橋を大幅に減らすことができた。蛍光修飾アクチンにて1分子FRETイメージングを行いFRETが起きていること、また天然型アクチンとの混合ではあるが重合能も確認している。しかし、この精製段階の蛍光修飾アクチンにはドナーしかもたないアクチンも含まれている。ドナーしかもたないアクチンはFRETイメージングのバックグラウンドになるため、さらに精製を行うことで検出感度の向上を目指す。合成したCy3-bis-maleimideおよびCy5-bis-maleimideをタンパク質へ部位特異的に修飾する際に、タンパク同士の架橋を防ぐために2つのCys変異部位をどの程度離せば良いかの指針を得た。これに基づいて、さらに予想されるGF変換に伴うFRET効率の変化が最大となるCys変異部位を再度探索し、アクチンのCys変異体の作成を進めている。本年度の前期にCys変異体の作成は終了する予定であり、Cy3-bis-maleimideおよびCy5-bis-maleimideの修飾の可否を試験し、アクチンの重合活性への影響などを確認する。重合能に重大な影響がないことを確認でき次第、偏光FRET計測を行い、アクチンのGF変換に伴う構造変化を検出する。28年度が最終年度であるため、記入しない。
周術期の悪性腫瘍患者における播種性血管内凝固症候群の早期診断基準に関する研究

悪性腫瘍切除術を受ける患者にinformed conscentを得て,手術直前,手術直後,術後の第1,第3,第5ならびに第7病日に臨床症状を観察するとともに,血小板,フィブリノーゲン,フィブリン分解産物(FDP),プロトロンビン時間,フィブリン分解産物ダイマー分画(D-dymer),プラスミン・α2プラスミンインヒビター複合体(PIC),トロンビン・アンチトロンビンIII複合体(TAT)を,加えて術前には腫瘍壊死因子(TNF)も併せて測定した.さらに術前,術直後ならびに術後第3病日には,インターロイキン1(IL-1)ならびにインターロイキン6(IL-6)も測定し,これらのデータの推移とその大きさを周術期の臨床症状の推移とその軽重へ関連づけることで,DIC早期診断のための各分子マーカーのcut off valueを求める試みを為した.またTNF,IL-1,IL-6,D-dymer,TAT,PICとDIC分子マーカーの推移から,術前よりDIC high risk群とDIC low risk群とを弁別するため基準を見い出そうとした.その結果,確かに術前のTNF値と術後のDIC分子マ-カの推移ならびに値の大きさととの相関が認められ,術前TNF値はDIC high risk群とDIC low risk群とを弁別するための要素となりうることがわかった.しかし本研究結果は定性的な段階であり,量的な確証を得る段階までには至らなかった.またIL-1,IL-6については得られた値が不安定になりやすく,一概にDICの早期診断要素となりうるとは言えなかった.なお術前のTNF値は口腔癌におけるTNM分類と相関している傾向があり,術前にTNF値を測定しなくてもTNM分類で代用できる可能性が示唆された.口腔外科悪性腫瘍患者の周術期における播種性血管内凝固症候群の早期診断基準を確立するためには以上の課題を踏まえながらさらなる研究が必要であろう.悪性腫瘍切除術を受ける患者にinformed conscentを得て,手術直前,手術直後,術後の第1,第3,第5ならびに第7病日に臨床症状を観察するとともに,血小板,フィブリノーゲン,フィブリン分解産物(FDP),プロトロンビン時間,フィブリン分解産物ダイマー分画(D-dymer),プラスミン・α2プラスミンインヒビター複合体(PIC),トロンビン・アンチトロンビンIII複合体(TAT)を,加えて術前には腫瘍壊死因子(TNF)も併せて測定した.さらに術前,術直後ならびに術後第3病日には,インターロイキン1(IL-1)ならびにインターロイキン6(IL-6)も測定し,これらのデータの推移とその大きさを周術期の臨床症状の推移とその軽重へ関連づけることで,DIC早期診断のための各分子マーカーのcut off valueを求める試みを為した.またTNF,IL-1,IL-6,D-dymer,TAT,PICとDIC分子マーカーの推移から,術前よりDIC high risk群とDIC low risk群とを弁別するため基準を見い出そうとした.その結果,確かに術前のTNF値と術後のDIC分子マ-カの推移ならびに値の大きさととの相関が認められ,術前TNF値はDIC high risk群とDIC low risk群とを弁別するための要素となりうることがわかった.しかし本研究結果は定性的な段階であり,量的な確証を得る段階までには至らなかった.またIL-1,IL-6については得られた値が不安定になりやすく,一概にDICの早期診断要素となりうるとは言えなかった.なお術前のTNF値は口腔癌におけるTNM分類と相関している傾向があり,術前にTNF値を測定しなくてもTNM分類で代用できる可能性が示唆された.口腔外科悪性腫瘍患者の周術期における播種性血管内凝固症候群の早期診断基準を確立するためには以上の課題を踏まえながらさらなる研究が必要であろう.
発生・分化過程における哺乳類染色体の普遍的構築原理とその意義

哺乳類染色体の構築におけるDNAメチル化の役割について研究した。マウスセントロメアヘテロクロマチン領域のメチル化阻害は,転写活性ヒストンH3.3の蓄積後にユークロマチン様ヒストン修飾が増加し,鎖の領域の転写活性化を誘導すること,複製タイミングがS期中期や後期から初期に移行することを見出し、DNAのメチル化がセントロメア周辺ヘテロクロマチンの適切な編成に不可欠であることを示した。また,DNA低メチル化によってDNA複製フォークの減速,停止を通してDNA損傷が起こることを発見し,その複製依存的DNA損傷誘導機構モデルを提案した。本研究によって,DNA低メチル化→DNA損傷→細胞死・細胞機能異常→DNA変異・細胞のがん化・老化という可能性を提唱する。本年は初年度でもあり,研究推進の準備段階で,特にクロマチン構造の解析技術の整備,およびこれらを用いたクロマチン構造とエピジェネティクスの解析等,実験系や技術的基盤の確立を目指した研究を進めた。その中で以下の成果をあげた。(1)マウスのセントロメア領域はminor satellite repeat(MiSat),major satellite repeat(MaSat)から構成され,高度にDNAがメチル化されている。DNAメチルトランスフェラーゼ阻害剤5-aza-2'-deoxycytidineを使って、メチル化を阻害した結果、MiSatとMaSatの転写が活性化され、DNAのメチル化レベルの減少がセントロメア領域のヘテロクロマチンの転写活性に関与していることがわかった。また、転写活性を持ったMaSatにはアセチル化ヒストンH4、ジメチル化またはトリメチル化H3K4といったユークロマチン様ヒストン修飾が増加していた。時空間的な解析により、ユークロマチン様ヒストン修飾の蓄積は処理後2回目のS期に生じ、MaSatの複製タイミングがS期中期や後期から初期に移行することと一致した。さらに転写活性ヒストンH3.3がユークロマチン様ヒストン修飾の蓄積よりも先行することを見出した。これらの結果は、DNAのメチル化は分化したマウスの細胞のセントロメア周辺ヘテロクロマチンの適切な編成に不可欠であることを示唆し,今後分化段階での検討を進める。(2)DNMT1特異的siRNAやDNMT阻害剤で処理した細胞を用い、その詳細なメカニズムを解析した。DNMT1ノックダウン細胞ではγ-H2AX fociが形成され、S期核で顕著に増加したことから、複製依存的にDNA二本鎖切断が誘導されることが示唆された。さらに、DNMT1ノックダウン細胞では複製フォーク進行が減速することがわかった。DNMT阻害剤でも同様の結果が得られた。一方,UHRF1ノックダウンにより、DNMT1ノックダウンによるDNA損傷レベルが有意に減少し、同時に複製フォーク進行速度も有意に回復した。以上の結果から、受動的脱メチル化後のDNA損傷誘導には、ヘミメチル化DNAに無秩序に結合したUHRF1が関与すると考えられる。哺乳類染色体の普遍的構築原理におけるDNAのメチル化の重要性を提示する目的で以下の成果を挙げた。(1) DNMT阻害剤の5-aza-2'-deoxycytidine (5-aza-dC),または,DNMT1特異的siRNAによりDNMT1を減少させた細胞において,分子コーミング法を用いて複製フォーク進行速度を解析し、通常細胞に比べて複製フォーク進行速度が減速すること,UHRF1とDNMT1の同時ノックダウンでは複製フォーク進行速度の減速は有意に回復することを示した。また,複製起点からの複製フォークの進行は,DNMT1ノックダウン細胞または5-aza-dC処理細胞では左右非対称となり,DNMT1とUHRF1の同時ノックダウンでは左右差は通常細胞レベルまで回復した。これらの結果から、複製フォーク進行速度の減速または停止は、DNAメチル化レベルの減少過程で一時的に生じるヘミメチル化DNAに結合して解離できなくなったUHRF1に複製フォークが衝突することが原因というモデルを提示した。(2)複製フォークの衝突によりDNA損傷が生じるモデルを検証した。DNMT1ノックダウン細胞では,ヘミメチル化DNAが通常時より多く出現し、UHRF1が多くクロマチン上に結合していた。また,DNMT1ノックダウン後のDNA損傷レベルはUHRF1のノックダウンにより有意に低減した。さらに、細胞内在性UHRF1をノックダウンし、ヘミメチル化CpG結合ドメイン(SRAドメイン)変異UHRF1を発現させると、DNMT1枯渇によるγ-H2AXの蓄積が有意に低減し,上記モデルを支持した。(3)その他,分子コーミング法に用いるガラスコーティング法の改良に成功した。また,繰越金を用いて次世代シーケンサーによってDNA低メチル化に伴っておこるゲノム上の損傷部位を網羅的に同定することに成功した。本年度の実施計画に沿って研究を進め以下の成果を挙げた。

(1)複製フォークの進行を指標として胚発生に伴う複製ドメインの形成過程を明らかにするためにゼブラフィッシュの発生系を導入し,卵から発生期にある細胞に対してハロゲン化ヌクレオシドを取込ませ,DNAファイバー上に複製フォークを可視化することに初めて成功した。(2) DNAメチル化レベルの低下により誘導されるDNA損傷遺伝子領域を網羅的に同定し,その領域の特徴を明らかにした。すなわち,クロマチン免疫沈降(ChIP)法によりDNA損傷マーカーであるγ-H2AX蓄積領域を濃縮し,メチル化CpGの豊富な遺伝子領域の定量をリアルタイムPCRにより行い,それらの領域にDNA損傷が誘導されていることを示した。さらに,ChIPにより回収されたγ-H2AX蓄積領域を次世代シークエンサーにより網羅的に配列を解読するChIP-sequence解析を行った結果,損傷領域として同定された遺伝子領域の多くにCpG islandが近接していた。(3)損傷について提案したモデルの検証として,5-aza-dC処理後,少なくとも一度はS期を通過させた細胞をその次のG1期に同調し,ChIP-リアルタイムPCR法によりUHRF1が結合している遺伝子領域を定量解析して,5-aza-dC処理により生じたヘミメチル化DNA領域にUHRF1が結合したままになるモデルを支持する結果を得た。ヘミメチル化DNAの生成についてもヘアピンバイサルファイト法で確認した。(4)最終年度であり,成果のとりまとめを行った。計画に挙げた「複製タイミングドメイン」形成に重要な役割を果たすと考えているエピジェネティクスについてDNA低メチル化によってDNA損傷が誘導される新たな現象を発見し,このメカニズムについてモデルを立て解析を行い,モデルを支持する結果を得つつある。すなわち,「複製タイミングドメイン」に関しては進んでいないが,当初の計画には含まれていない新しい現象の発見につながっており,上記の評価とした。24年度が最終年度であるため、記入しない。この2年間の研究により,計画に挙げた「複製タイミングドメイン」形成に重要な役割を果たすと考えているエピジェネティクスについてDNA低メチル化によってDNA損傷が誘導されるという新たな現象を発見し,このメカニズムについてモデルを提唱している。今後はこれについて重点的に研究を推進し,本研究の最も大きな成果としたい。
毒性物質の選択的細胞内取り込みを介した標的臓器特異的な毒性発現機構の解明

アオコが産生する肝臓毒マイクロシスチンLR(MCLR)の毒性発現ならびに中毒予防策の検討を試みた。MCLRの肝細胞への取り込み責任分子であるOATP1B3を強制発現するHEK293-OATP1B3細胞を用いた解析において、p53のリン酸化並びに安定化が検出され、p53の標的遺伝子産物であるp21およびBaxの発現が亢進していた。また、p53のリン酸化阻害であるpifithrin-αにより細胞毒性が抑制された。一方、細胞内取り込み段階の解析により、MCLRの細胞毒性は、OATP1B3の既知の輸送基質であるBSP、リファンピシン、及びシクロスポリンAにより抑制されることが確認された。MCLRの細胞内への取り込み(Km=1.2μM)もBSP、リファンピシン、及びシクロスポリンAにより抑制された。また、グレープフルーツに含まれるフラボノイドの一種であるナリンジンでMCLRの毒性並びに細胞内取り込みが抑制されることが判明した。以上の結果から、食品成分を用いた毒性シグナリングの阻害ならびに細胞内取り込み段階を標的にした毒性発現の化学予防が可能であることが示唆された。アオコ毒マイクロシスチンLR(MCLR)の肝臓特異的毒性の発現機序を解明することを目的に研究を行った。ヒト肝細胞特異的に発現し、有機陰イオン類の細胞内取り込みに機能するOATP1B1またはOATP1B3を強制的に発現させたHEK293細胞にMCLRを添加するとELISA法によりその細胞内蓄積が検出され、MTT法により3日間の培養後に細胞死が認められた。このMCLRの毒性発現濃度は、これまでの培養細胞を用いた報告より1000倍以上低いものであった。一方、対照の空ベクターを導入したHEK293-Control細胞では、MCLRの細胞内蓄積は検出されず、またその細胞毒性も認められなかった。これらの結果はOATP1B1およびOATP1B3がMCLRを選択的に細胞内に輸送し、その細胞毒性を引き起こすことを示している。また、セリン/スレオニンプロテインホスファターゼPP1およびPP2AがMCLRの標的分子として知られているために、その酵素活性を測定した結果、MCLRより酵素活性が有意に抑制された。さらに、リン酸化部位特異的抗体を用いたイムノブロットにより、MAPKであるp38およびERK1/2がリン酸化し、活性化しており、p38阻害剤のSB203580およびERK1/2のシグナルを上流で阻害するU0126によりMCLRの細胞毒性は有意に抑制された。また、平成17年7月から9月にかけて70日間、海外共同研究者のDietrich Keppler博士の研究室(ドイツ癌研究センター)において、OATP1B1またはOATP1B3を発現するHEK293細胞またはMDCKII細胞を用いて^3H-ジヒドロマイクロシスチンLRの輸送実験を共同研究として実施した。その結果、ある一定条件においてOATP1B3がOATP1B1の約5倍ジヒドロマイクロシスチンLRの輸送量が多いことが分かった。昨年度の研究において、HEK293-OATP1B3細胞を用いて、マイクロシスチンLRの細胞毒性発現機序について解析した結果、細胞膜上のOATP1B3を介して細胞内に選択的に取り込まれたマイクロシスチンLRがその標的分子であるプロテインホスファターゼPP2Aを阻害することにより細胞死が誘発されることが判明した。今年度も引き続き解析を進め、マイクロシスチンLRが誘導する細胞死は、アポトーシスでありネクローシスではないことが分かった。また、ERK、JNK、p38の各種MAPKのリン酸化が検出され、これらのMAPKシグナリングの阻害剤であるU0126、SP600125、SB203580の添加によりマイクロシスチンLRの細胞毒性は抑制された。さらにp53蛋白質のSer15、Ser46、およびSer392の部位でp53蛋白質がリン酸化され、Ser6、Ser9、およびSer20の部位はリン酸化されないことが明らかになり、p53とp21蛋白質の発現量が、添加したマイクロシスチンLRの作用時間の長さに依存して上昇することも明らかになった。従って、マイクロシスチンLRによる細胞死にはMAPKが関与することが明らかになった。また、p53蛋白質のSer15およびSer46のリン酸化によるp53蛋白質の安定化が示唆され、マイクロシスチンLRの細胞毒性の発現との関連が強く示唆された。また、活性酸素消去剤であるNACにより、マイクロシスチンLRが誘導する細胞死が部分的に抑制された。以上の結果から、マイクロシスチンLRの細胞毒性は、OATP1B3によるその細胞内取り込みを引き金にして、主にPP2Aの阻害に起因するが、部分的に活性酸素の産生も関与することが分かった。

一方、細胞内取り込み段階の解析により、MCLRの細胞毒性は、OATP1B3の既知の輸送基質であるBSP、リファンピシン、及びシクロスポリンAにより抑制されることが確認された。MCLRの細胞内への取り込み(Km=1.2μM)もBSP、リファンピシン、及びシクロスポリンAにより抑制された。また、グレープフルーツに含まれるフラボノイドの一種であるナリンジンでMCLRの毒性並びに細胞内取り込みが抑制されることが判明した。以上の結果から、食品成分を用いた毒性シグナリングの阻害ならびに細胞内取り込み段階を標的にした毒性発現の化学予防が可能であることが示唆された。
体内留置型バイオセンサ開発のための表面改質

イオン感応型電界効果トランジスタ(ISFET)を原理とする体内留置免疫センサの実現のためには、抗体を活性を保ったまま高密度に固定化することが重要となる。本研究では、抗体固定化の担体にプラズマ重合膜を用いた。有機膜の材質としてはシリコンとの接着性に優れているヘキサメチルジシロキサン(HMDS)を用いプラズマ重合法により膜を作成した。有機膜の表面に抗体固定化のための化学反応基としてSH基を導入した。エタンジチオ-ル気体中でプラズマ処理を行うことで膜表面にSH基を直接打ち込む。この表面修飾で疎水的な表面が親水的に変化したことを水の接触角を測定することにより確認した。すなわち、接触角が125度の表面が修飾後は52度になった。また、XPSでの表面分析で表面修飾した膜のみ硫黄の信号が観測され確かにSH基が導入されていることがわかった。これにシステインをSS結合で固定化する。さらに、システインのアミノ基と抗体(抗ヒト血清アルブミンIgG)のF_<ab>'のヒンジのSH基をマレイミド系の架橋剤で固定化した。酵素免疫測定法で行った結果、活性抗体固定化量は10^<11>[cm^<ー2>]オ-ダ-(最密は2×10^<12>)でかなり高密度に固定化されていることがわかった。また、非特異吸着の程度を調べるために抗体を固定化しない有機膜表面についても同様に行った。その結果、SH基とシステインを導入した膜はNH_2基を導入した膜に比べて非特異吸着が少ないこともわかった。この固定化抗体の抗原抗体反応による表面電位の測定を行った。その結果、抗原濃度が0.011mg/mlの範囲では0.1mVオ-ダ-の電位が発生した。他物質(ウシ血清)の存在する状況でも同様の結果を得ることができた。以上の結果より免疫センサ実現の可能性を示すことができた。本年度は研究計画に従い、電界効果トランジスタの上に抗体蛋白を固定化するための、有機膜の作成とその特性の評価を行った。有機膜の材質としては、シリコンとの接着性に優れている、ヘキサメチルジシロキサン(HMDS)を用い、プラズマ重合法により膜を作製した。有機膜表面には抗体固定化のための化学的反応基としてアミノ基を導入した。アンモニア気体中でプラズマ重合を行うことで、膜表面にアミノ基を直接打ち込む。この方法では、膜の表面に有効にアミノ基が生成しなかった。アミノ基特異的な結合性を持つ蛍光物質である,フルオレッセインイソチオシアネ-ト(FITC)の結合量は、アンモニア処理を行わない場合に比べても2倍程度で、非特異的な吸着とあまり違わない。また膜の表面は処理後も非常に疎水的である。この原因を、打ち込まれたモノマ-分子が、内部でお互いに結合を作ったり、フリ-ラジカルを生成しているためと推定し、そのような構造をできる限り安定な形に変換することを目的として、表面の還元・酸化処理を行った。還元の結果、有機膜の表面はやや親水化し、FITCの結合量も3倍程度に増加した。また酸化によって表面はかなり親水化するが、FITCの結合量はあまり増加しなかった。これらの方法は絶対量としては十分なアミノ基の生成をうながさなかった。酸化処理で見られた親水化は、酸化に用いた硫酸が有機膜上に基に結合したためと考えられる。

この反応を利用することにより、有機膜上にアミノ酸を導入し、そのアミノ基を直接利用することを検討した。これによってアミノ基を効率よく導入することが出来ると同時に、表面が十分に親水化されるものと考えられる。側鎖にSH基を持つアミノ酸のシステインは、他のSH基とSS結合をつくり固定される。今後、有機膜上の硫酸を還元し、SH基を生成し、システインを有機膜表面に結合することを検討する。本年度は研究計画に従い、イオン感応型電界効果トランジスタ(ISFET)の上に抗体蛋白を固定化するための有機膜作成とその特性の評価を行った。有機膜の材質としてはシリコンとの接着性に優れているヘキサメチルジシロキサン(HMDS)を用いプラズマ重合法により膜を作成した。有機膜の表面に抗体固定化のための化学反応基としてSH基を導入した。エタンジチオ-ル気体中でプラズマ処理を行うことで膜表面にSH基を直接打ち込む。この表面修飾で疎水的な表面が親水的に変化したことを水の接触角を測定することにより確認した。すなわち、接触角が125度の表面が修飾後は52度になった。また、XPSでの表面分析で表面修飾した膜のみ硫黄の信号が観測され確かにSH基が導入されていることがわかった。これにシステインをSS結合で固定化する。さらにシステインのアミノ基と抗体(抗ヒト血清アルブミンIgG)のF_<ab>'のヒンジのSH基をマレイミド系の架橋剤で固定化した。酵素免疫側定法で行った結果、活性抗体固定化量は10^<11>[cm^<-2>]オ-ダ-(最密は2×10^<12>)でかなり高密度に固定化されていることがわかった。また、非特異吸着の程度を調べるために抗体を固定化しない有機膜表面についても同様に行った。その結果、SH基とシステインを導入した膜はNH_2基を導入した膜に比べて非特異吸着が少ないこともわかった。この固定化抗体の抗原抗体反応による表面電位の測定を行った。その結果、抗原濃度が0.011mg/mlの範囲では0.1mVオ-ダ-の電位が発生した。他物質(ウシ血清)の存在する状況でも同様の結果を得ることができた。
慢性埋込み電極を用いた副腎交感神経の間歇的刺激による循環動態の変動に関する研究

ヒトの悪性高血圧症のモデル動物である脳卒中易発症高血圧自然発症ラット(Stroke-Prone Spontaneously Hypertensive Rats=SHRSP)を用いてアドレナリンと高血圧症発症あるいは増悪の機転を探らんとした.この動物は,種々のストレスに対する反応性が増大していると報告されている.そこでSHRSPの副腎髄質機能の指標として副腎髄質からカテコールアミン分泌速度を,また代謝的側面として,カテコールアミン分解酵素の一つであるモノアミンオキシターゼ(MAO)活性を測定した.ラットの週齢は高血圧発症前の5週齢については副腎静脈血の採取が困難であるため,高血圧確立期と考えられる15週齢,増悪期と考えられる30週齢とした.カテコールアミンの測定には高速液体クロマトグラフィー(医理化工業LC-500)を使用した.対照群として正常血圧のWistar系ラット(NWR)を用いて副腎カテコールアミン分泌速度を比較すると15週齢のSHRSPではNWRに比べて副腎アドレナリン分泌速度は約2倍の高値を示し両者の間に有意差があった.30週齢のSHRSPではアドレナリン分泌はさらに増加する傾向にあったが,個体差が大きくなり,有意差は認められなかったが, NWRに比べて約2倍以上の高値を示した.また,副腎アドレナリン分泌速度は副腎の支配神経である副腎交感神経を含む大内蔵神経を切断すると1時間後には著しく低下しNWRとSHRSPとの間に差はなくなった.また副腎MAO活性は30週齢ではNWRに比べて有意に上昇していた.これらSHRSP副腎における機能的代謝的変化が高血圧症の発展あるいは増悪にどのように関与しているかについては今後さらに研究を進める予定である.また慢性的に内因性アドレナリンを分泌させるため,刺激電極としての慢性電極の埋込みを試みた.二宮らの方法に準じてテフロン被覆銀線をリード線としてコラーゲン電極を試作した.作製した電極は抵抗値が大きく,また電極全体を小型化するためには熟練を要すると考られ引き続き改良を試みる予定である.ヒトの悪性高血圧症のモデル動物である脳卒中易発症高血圧自然発症ラット(Stroke-Prone Spontaneously Hypertensive Rats=SHRSP)を用いてアドレナリンと高血圧症発症あるいは増悪の機転を探らんとした.この動物は,種々のストレスに対する反応性が増大していると報告されている.そこでSHRSPの副腎髄質機能の指標として副腎髄質からカテコールアミン分泌速度を,また代謝的側面として,カテコールアミン分解酵素の一つであるモノアミンオキシターゼ(MAO)活性を測定した.ラットの週齢は高血圧発症前の5週齢については副腎静脈血の採取が困難であるため,高血圧確立期と考えられる15週齢,増悪期と考えられる30週齢とした.カテコールアミンの測定には高速液体クロマトグラフィー(医理化工業LC-500)を使用した.対照群として正常血圧のWistar系ラット(NWR)を用いて副腎カテコールアミン分泌速度を比較すると15週齢のSHRSPではNWRに比べて副腎アドレナリン分泌速度は約2倍の高値を示し両者の間に有意差があった.30週齢のSHRSPではアドレナリン分泌はさらに増加する傾向にあったが,個体差が大きくなり,有意差は認められなかったが, NWRに比べて約2倍以上の高値を示した.また,副腎アドレナリン分泌速度は副腎の支配神経である副腎交感神経を含む大内蔵神経を切断すると1時間後には著しく低下しNWRとSHRSPとの間に差はなくなった.また副腎MAO活性は30週齢ではNWRに比べて有意に上昇していた.これらSHRSP副腎における機能的代謝的変化が高血圧症の発展あるいは増悪にどのように関与しているかについては今後さらに研究を進める予定である.また慢性的に内因性アドレナリンを分泌させるため,刺激電極としての慢性電極の埋込みを試みた.二宮らの方法に準じてテフロン被覆銀線をリード線としてコラーゲン電極を試作した.作製した電極は抵抗値が大きく,また電極全体を小型化するためには熟練を要すると考られ引き続き改良を試みる予定である.