hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
家畜の行動と心拍変動を指標にした管理ストレス評価に関する研究

夏季放牧牛は飛来昆虫に対し様々な身繕い行動(頭振り、脚上げ、尾振り)を頻繁に行うので、飛来昆虫は放牧牛にとってストレッサーになっていると考えられる。そこで、それら飛来昆虫に対する忌避反応の指標として尾振り回数記録用のデータロガを開発し、その装置が野外調査で有用であることを実証した。さらに飛来昆虫が放牧牛の食草行動、休息行動および心拍数に及ぼす影響を調べた。その結果、食草時の顎運動回数は頭振りの出現により減少した。また、飛来昆虫が食草行動及び横臥休息・反芻行動を阻害していることが明確となった。さらに、立位休息時の平均心拍数は飛来昆虫により有意に高くなり、飛来昆虫が放牧牛のストレッサーとなっていることが明らかとなった。次に、産卵鶏を用いて、小型テレメーターを腹腔内に装着して、無拘束状態で心拍数・体温、活動量の日周変化を調べた。さらに一般的な不断給餌から2日間、1日につき20時間絶食させる(絶食処理)、ケージ床面積を62.5%に減少させる(スペース制限処理)、および照明時間を6時間短縮させる(明期短縮処理)3つのストレス環境を設定して実験を行った。絶食処理では心拍数、体温および活動量が減少した。スペース制限処理では心拍数、体温ともに、明期および暗期において増加した。明期短縮処理では、心拍数は明期で減少し、暗期で増加した。短期間の3つのストレス処理が産卵鶏の行動及び体温、心拍数に及ぼす影響を明らかにした。また木曽馬を用いて、夜間の姿勢(立位、伏臥、横臥)、体温及び心電図を記録した。横臥時では心電図の基線に混入していた筋電図が消失し、更に徐脈に頻脈が混在して出現したことから、横臥時にレム睡眠に入ることが示唆された。夜間の心電図を用いて心拍変動パワースペクトル解析を行ったが、各パラメーターから自律神経活動を評価することはできなかった。木曽馬を用いて、妊娠、分娩、哺乳、さらには離乳へと経過する各段階で、身体的・心理的な負荷の指標として心電図(A・B誘導、軽保定時)とテレメーターによる夜間の心電図記録を用いた心拍変動パワースペクトル解析(2時4時の立位安静時)による自律神経機能の推定を行った。夜間のテレメーター記録から、妊娠経過に伴い心拍数(HR)の増加、HF成分の減少、LF/HFの増加が、分娩10日目でHRの減少、LF成分の減少、LF/HFの減少が見られた。その後90日目までHR、LF成分、HF成分、LF/HF、CV_<R-R>は増加した。軽保定の心電図記録から、分娩後12カ月間のHRは漸増し、その後漸減した。T波の電位の代数和は分娩当初では陽性成分優勢を示し、その後陰性成分優勢となり増大した。離乳当日の夜間立位安静時において、CV_<R-R>、LF成分、HF成分は減少し、LF/HFは増加し、離乳5日目には離乳前の値を示した。馬では、妊娠進行に伴う母体の身体的な負荷、分娩後に一過性の負荷からの開放、また哺乳期の身体的な負荷、さらに離乳時の心理的なストレス状態が、心拍数、T波の電位、心拍変動パワースペクトル解析の各データから評価された(日本畜産学会第98大会発表)。

一方、吸血飛来昆虫が放牧牛の身繕い行動(頭振り、耳振り、脚舐め、体舐め、皮膚の振戦、脚上げ、尾振り)、さらに食草行動(食草時の顎運動回数)に及ぼす影響について、データロガを用いて6月10月まで信大農学部附属農場にて調べた。身繕い行動は6月、10月に比較して7、8、9月で有意に増加した。食草時の顎運動回数は頭振り行動の出現により著しく減少した。牛に付着した飛来昆虫数と身繕い行動の発現頻度には個体差が見られた。また尾振り回数記録用のデータロガを開発し、その性能を実証した(平成13年日本草地学会大会発表)。1、夏季放牧牛は飛来昆虫に対し頻繁に付着昆虫を追い払うための様々な身繕い行動を行う。その結果として充分な休息および食草行動が妨げられている。従って、飛来する吸血昆虫をはじめとする各種昆虫は放牧牛にとってストレッサーになっていると考えられる。そこで、飛来昆虫が最も多い7月下旬から8月下旬に、対照区(殺虫剤非散布)と実験区(殺虫剤散布)を設定して、飛来昆虫が放牧時の食草行動、昼間の休息行動、心拍数に及ぼす影響を調べた。殺虫剤の散布により対照区では飛来昆虫はほとんどいなかった。昼間の時間制限放牧時のFeeding station当たりの滞在時間は対照区に比べ実験区で有意に長く、飛来昆虫が食草行動を阻害していることが明確となった。また放牧地での横臥休息・反芻時間も対照区に比べ実験区で有意に長いことが明らかとなった。さらに昼間の繋留時における立位休息時の平均心拍数は実験区に比べ対照区で有意に高く、心拍数と身繕い行動の出現回数との間に有意な正の相関が見られた。これらの結果から飛来昆虫が放牧牛の維持行動(食草、休息)及び心拍数に及ぼす影響が明らかとなった。2、また木曽馬を用いて、基礎的データとして一般的な飼育形態での夜間の姿勢(立位、伏臥、横臥)、体温(膣温)及び心電図を記録した。その結果、深夜から早朝に立位から伏臥、横臥への姿勢変化が繰り返し出現し、この変化に伴い体温と心拍数が増減した。横臥時では心電図の基線に混入していた筋電図が消失し、更に頻脈と徐脈が混在して出現したことから、横臥時にレム睡眠に入ることが示唆された。夜間の心電図を用いて心拍変動パワースペクトル解析を行ったが、各パラメーターから自律神経活動を推定することができなかった。また第2度房室ブロックを多発する個体では、伏臥、横臥を反復する時刻にブロック数が明らかに減少しており、この時刻に自律神経活動が不安定になることが示唆された。これまで夏季に放牧牛に付着する刺咬性ならびに非刺咬性昆虫は直接的に各種の身繕い行動を頻繁に誘起させ、食草行動、休息行動を撹乱させ、また心拍数も増加させることを明らかにした。そこで、放牧牛にとってストレッサーとなっている付着昆虫と身繕い行動反応について調べた。ほぼ同一条件下で飼育管理されている黒毛和種繁殖雌牛26頭(314歳)を供試し、放牧牛に付著する昆虫数と付着昆虫数に対する頭振り、脚上げ、尻尾振りの3種類の身繕い行動回数との関連を調べた。付着昆虫数は放牧牛間で有意な差があり、また身繕い行動回数も個体間で有意な差がみられた。さらにこれらの牛を埋設型体重計の中に誘導し、体重計枠内に1分間静置した時の逃避反応をSato(1981)の気質評点基準に従って、4つのカテゴリーに分類した。その結果、身繕い行動回数は気質評点1(おとなしい)よりも落ち着きのない牛群(気質評点3、4)の方が有意に多かった。付着昆虫は放牧牛にとってストレス刺激であり、またその反応に個体差が存在することを明らかにした。また、産卵鶏を用いて、対照として、単飼ケージ飼育、照明時間を15時間、餌および水を自由摂取、室温を20°Cとして飼育した(対照群)。
血流を指標とした歯髄炎の病態解析ならびに歯髄診断法の確立

歯髄炎と血流とは常に密接な関係にあり、歯髄炎の組織変化が主として脈管系の変化に起因することはこれまでの病理組織学的見地からも明らかである。したがって、歯髄血流を解析することによって歯髄炎の病態を解析することができる可能性は極めて高い。本研究は、歯髄炎の診断をこれまでとは全く異なる血流という視点から解析するものであり、患者に痛みを与えない、より正確で客観的・定量的な歯髄診断法を確立することにより、歯科臨床において最も頻度の高い歯髄炎の診断および治療の発展に寄与することを目的とする。実験方法として、ビーグル犬の犬歯(6歯)に対して、(1)エナメル質表層、(2)エナメル象牙境、(3)象牙質露髄寸前部へ電気刺激を5分間与えて歯髄血流の変化を調べ、さらに(4)炎症性歯髄に対しても同様の実験を行い比較検討した。血流測定は、今回開発した出力可変式透過型血流計を用い、レーザー出力は7mWで行った。炎症歯髄の作成は、露髄寸前まで窩洞形成を行い、2週間放置した。その結果、1)(1)、(2)への電気刺激により血流は有意に増加し、刺激終了後は速やかに刺激前の血流値へと戻った。この反応は、歯髄内における軸索反射性血管拡張と考えられる。2)(3)への電気刺激によっても血流が増加したが、刺激終了後は(1)、(2)とは異なり、すみやかには血流増加が消失しなかった。この理由として、血管拡張による歯髄内圧亢進の痛みがさらなる血管拡張(神経原性炎症)を引き起こしたと考えられる(歯髄充血)。3)(4)への電気刺激では、血流ははじめ増加するが、その後有意に減少した。このことは、過度の血管拡張によって歯髄内はうっ血状態となったことが考えられる。以上の結果より、炎症性歯髄への刺激は歯髄うっ血を招き、歯髄壊死を起こす可能性が示唆された。本研究を遂行するにあたっては、歯髄血流の定量的測定が前提条件であり、本年度は先ず、透過レーザー光を用いたエナメル質表面からの歯髄血流の導出法を確立し、次いで循環血流量を指標とした歯髄炎の病態解析を行うこととした。実際の血流想定方法は、エナメル質表面の唇側からレーザー光を送光し、これを直線上の舌側歯面で受光し、血流中の赤血球の運動速度をドプラー効果を応用して計測した。本年度の実績として、動物(ビーグル犬又はネコ)を対象として透過レーザー光を用いた歯髄血流の導出方法を考案、成功に至った。この方法は、従来の報告とは異なり、純粋に歯髄のみの血流を導出できる点で意義深い。

この成果を踏まえ、窩洞形成または熱刺激により実験的に種々のレベルの歯髄炎を誘発した実験モデルを作成し、歯髄血流を経時的に測定し歯髄病態と血流量との連関を導き出すこととする。歯髄炎と血流とは常に密接な関係にあり、歯髄炎の組織変化が主として脈管系の変化に起因することはこれまでの病理組織学的見地からも明らかである。したがって、歯髄血流を解析することによって歯髄炎の病態を解析することができる可能性は極めて高い。本研究は、歯髄炎の診断をこれまでとは全く異なる血流という視点から解析するものであり、患者に痛みを与えない、より正確で客観的・定量的な歯髄診断法を確立することにより、歯科臨床において最も頻度の高い歯髄炎の診断および治療の発展に寄与することを目的とする。実験方法として、ビーグル犬の犬歯に対して、様々なレベルの痛み刺激を与えて歯髄血流の変化を調べ、さらに炎症性歯髄に対しても同様の実験を行い比較検討した。歯髄血流量の測定は、今回開発した出力可変式透過型血流計を用い、レーザー出力は7mWで行った。炎症歯髄の作成は、露髄寸前まで窩洞形成を行い、2週間放置した。その結果、(1)エナメル質表層、エナメル象牙境への電気刺激により血流増加反応が認められた。この反応は、歯髄内における軸索反射性血管拡張と考えられる。(2)象牙質露髄寸前部への電気刺激によっても血流増加反応が惹起されたが、この場合の血流増加反応は(1)とは異なり、刺激終了後もすみやかには消失しなかった。この理由として、歯髄内の血管拡張による痛みによってさらなる血管拡張(神経原性炎症)が起こったためと考えられる(歯髄充血の状態と考えられる)。(3)炎症歯髄への電気刺激では、(1)(2)と同様に血流増加反応が生じたが、刺激を与えている間に血流の減少反応がみられた。このことは、過度の血管拡張によって歯髄内はうっ血状態となったことが考えられる。歯髄炎は、日常の歯科臨床で最も頻繁に遭遇するポピュラーな歯科疾患である。歯髄炎の鑑別は、その処置及び予後を決定する重要な因子であるが、臨床所見と病理組織学的所見とは必ずしも一致しない症例がみられ、歯髄炎の鑑別診断は必ずしも容易ではない。本研究は、歯髄炎の診断をこれまでとは全く異なる血流という視点から解析したものであり、患者に痛みを与えない、より正確で客観的・定量的な歯髄診断法を確立することにより、歯髄炎の診断および治療法の開発に寄与することを目的としたものである。その結果、歯髄炎と血流とは常に密接な関係にあり、歯髄炎の組織変化が主として脈管系の変化に起因すること、歯髄血流を解析することによって歯髄炎の病態を解析することができる可能性があることが示唆された。
Ca2+透過性AMPA受容体過剰発現による緩徐な運動ニューロン死の分子病態解析

孤発性ALSの分子病態モデルであるAR2マウス運動ニューロンに観察される異常な核内空泡形成には、運動ニューロンへのCa2+の流入増加が主要な役割を果たしていると考えられるため、以下の検討を行った。細胞質のCa2+濃度上昇が核の形態異常を引き起こすには細胞質と核質の物質輸送を制御する核膜孔複合体(NPC)の異常が関與していると考えられる。また、AR2マウス運動ニューロンでは細胞質のCa2+濃度上昇に伴い、Ca2+依存性プロテアーゼであるカルパインが活性化することが分かっている。NPCに構造的な変化が起きているか如何かをNPCを構成する分子である各種nucleoporin (NUP)に対する特異抗体で免疫組織化学的に検討した。NCPを校正する主要なNUPであるNUP62, 88, 153タンパクの免疫活性が、AR2マウスのADAR2を缺損した運動ニューロンでは消失していた。これに対し、同一切片上のADAR2を発現する運動ニューロンには、野生型マウス運動ニューロンと同様に、鮮明な免疫活性を呈していた。次に、NUP62, 88, 153蛋白がカルパインにより切断されるかどうかを検討した。何れのNUPも特異的にカルパインによる切断を受けることが明らかになり、AMPA受容体からのCa2+流入に伴い活性化したカルパインがNUPを断片化することによりNPCの機能異常を引き起こしていることが考察される。孤発性ALS患者剖検脊髄の検討から、運動ニューロンでは一部のNUPに染色性の異常が報告されており、本研究の結果は、AR2マウスが孤発性ALSの分子病態の解明に有用である更なる証左を与えたと考えられる。したがって、孤発性ALSの病因には、ADAR2の発現低下に依り引き起こされる細胞死カスケードは、Ca2+シグナリング調節機構の破綻に伴う様々な分子異常であることを強く示唆する。26年度が最終年度であるため、記入しない。変性性神経疾患では、カルシウムシグナリング異常、および核の機能異常を示唆する知見が蓄積しているが、両者の分子連関は未解明の部分が多い。シナプスにおけるAMPA受容体のCa2+透過性の変化による緩徐進行性の神経細胞死を引き起こすコンディショナルADAR2ノックアウトマウス(AR2)では、神経細胞核のnucleophagosome様核内空胞が形成され、両者の分子連関を解明するための良いツールであると考えられる。AR2マウス運動ニューロンでは、未編集型GluA2の発現によるCa2+透過性AMPA受容体が発現しており早期から運動ニューロン死が進行するが、ヘテロ接合体AR2(AR2H)マウスではホモ接合体AR2マウスに比べ未編集型GluA2発現割合は遙かに低く、しかも緩徐な神経細胞死をもたらすため核内空胞の形成の観察に適している。AR2Hマウスについて週齢を追って核内空胞の出現頻度をみると、5週齢で既に半数の運動ニューロンに観察され、1歳齢までは変化が見られないが、1歳齢以降徐々にその数が減少していくものの、2歳齢でも観察されることが明らかになった。また、超微形態の観察から、この核内構造物には限界膜がなく、空胞内にも電子密度の高い構造物は観察されず、構造物のない空胞であることが明らかになった。ただし、核内空胞は週齢と共に大きさを増し、2歳齢では核の大部分を占める程に成長していた。また、ADAR2を缺損しながら編集型GluA2を発現するAR2resマウスのADAR2欠損運動ニューロンにはこの核内空胞が観察されないことから、核内空胞の形成は、ADAR2欠損自体ではなく専らAMPA受容体からのCa2+流入増加がもたらしたものであることが明らかになった。今後、細胞内Ca2+濃度上昇に伴う分子変化に着目して検討を進める。

孤発性ALS患者剖検脊髄の検討から、運動ニューロンでは一部のNUPに染色性の異常が報告されており、本研究の結果は、AR2マウスが孤発性ALSの分子病態の解明に有用である更なる証左を与えたと考えられる。したがって、孤発性ALSの病因には、ADAR2の発現低下に依り引き起こされる細胞死カスケードは、Ca2+シグナリング調節機構の破綻に伴う様々な分子異常であることを強く示唆する。26年度が最終年度であるため、記入しない。RNA編集酵素ADAR2のコンディショナルノックアウトマウス(AR2)に観察される核内空胞の形態観察を行い、これが慢性の細胞内カルシウム濃度上昇に伴う変化であることを明らかにした。AR2マウスは慢性のカルシウム毒性によるニューロン死の初めての動物モデルであり、この核内空胞は従来観察されていなかったものである。カルシウムシグナリング異常が想定されている神経変性疾患の病因研究にとって、この核内空胞の形成メカニズムの解析は大いに役立つと考えられる。今回の検討から、核質と細胞質の物質輸送の障害が、過剰な細胞質カルシウム濃度上昇によりもたらされたと考えられる。核膜には顕著な形態的変化が観察されないのに対し、核質の空胞化が著明であることから、これは核膜の物質通過を制御しているNuclear pore complex (NPC)の機能に異常を来したためと考えられる。細胞質Ca2+濃度上昇がどの様な機序によりNPCの機能異常を引き起こすかを検討する。
仮想食道造影、仮想内視鏡像と組織特性を用いた高精細CTによる食道癌診断法の確立

食道胃接合部(ECJ)に存在する腫瘍の形態診断は、通常はECJ部が収縮した状態にあるため、従来のCT検査法では困難であった。我々は食道の伸展法としての食道内持続空気注入法とマルチスライスCTによる仮想食道造影、仮想内視鏡像といった三次元画像診断を用いて食道胃接合部(ECJ)腫瘍診断の有用性を評価することが本研究の目的であった。対象は造影検査、内視鏡検査にてECJに存在すると診断された腫瘍12例.胃癌:5例、食道胃境界部癌:4例、食道癌:4例、平滑筋腫:2例である。研究結果は内腔の伸展性は、excellent6例(50%),good6例(50%)でpoorは0例であった。全12例でMPR、仮想内視鏡、仮想消化管造影像のいずれでも腫瘍が同定された(径6mm病変を含む)。2cm以下の小病変2例を除く10例で、ECJを超えた腫瘍の進展がMPRおよび仮想造影像で描出可能であった。食道胃接合部の伸展法としての食道内持続空気注入法と、三次元CT画像を用いることによる食道胃接合部病変の描出能を向上させる可能性が示唆された。症例:38例の治療前症例(進行癌32例、表在型6例)においてわれわれが考案した食道内持続空気注入法を施行。方法:当初予定していたtubeよりもスタイレット付き5Fr.feeding tubeの方が侵襲性が低く挿入も容易と判断し現在こちらを主に使用している。3D画像では、仮想食道造影、仮想内視鏡とともにMPR(multiplanar reformation)像も作成している。結果:食道の伸展性は、口側で97%、肛側76%で良好な伸展が得られている。肛側の伸展不良例はいずれもUt-portionに病変があるものであり、病変による食道狭窄のために、空気が口側へ逆流するため肛側の伸展が不良になるものと考えている。腫瘍の同定は、進行癌ではいずれの3D画像においても全例で同定が可能であった。しかし表在型は0-I型の1例のみ同定され、0-IIc症例は5例いずれも同定不可であった。病変の上下方向への伸展範囲をMPR像とバリウムを用いた食道造影と比較したところ、12.5%の症例でMPRにおいて10mm以上も腫瘍長径が長く測定された。これは、病変が壁外で広範囲にひろがることがあるためで、特に放射線治療を行う上で照射範囲を決定する際、注意すべき結果と考えられた。本法は、空気で伸展することでバリウム造影と同様の腔内での食道癌の伸展範囲が評価でき、かつ壁外での伸展範囲も同時に評価可能であり、病変範囲の評価には非常に有用な検査法と考えている。また、腫瘍の微細構造に関しても、潰瘍形成の有無に関してはバリウム造影と同等の検出率を示した。ただし、腫瘍が全周性かどうかの判定および狭窄の程度(口側径と腫瘍内部の内腔径の比)の検討では、バリウム造影と比較して仮想内視鏡や仮想食道造影では高率に全周性、完全閉塞にみえやすい特徴がみられた。今後は組織像と3D画像像の対比、腫瘍の病理組織学的特徴(増殖活性)の判定、さらに放射線治療後の変化を検討する予定である。今年度は腫瘍の病理組織学的特徴(増殖活性)の検討を開始した。病理組織像の検討対象症例は高精細CTにより仮想食道造影、仮想内視鏡像を得られた症例と同一の症例とした。病理組織像の検討項目としては(1)組織型(2)増殖活性が挙げられた。また、食道癌の分布に地域特性が認められることから、なんらかのウイルス感染が関与していると想像している。近年、扁平上皮癌とHuman papillomavirus(HPV)感染の関連性が示唆されていることから、本症についても検討の価値があると考えた。そこでさらに検討項目に(3)癌遺伝子活性(4)癌抑制遺伝子活性(5)癌関連ウイルス感染の有無を挙げた。

組織は治療前内視鏡的生検術、あるいは根治的外科的切除術にて得られた癌組織を、通常の病理組織検査と同様にホルマリン固定し、パラフィン包埋したものを使用した。(1)組織型については各パラフィンブロックより3μmの厚さで薄切し、通常のHematoxylin Eosin(HE)染色法を用いて確認を行った。同標本上にて局所浸潤度についても評価を行った。(2)増殖活性は細胞増殖関連タンパクの一つであるMIB-5を指標とした。組織型の確認と同様にパラフィンブロックより3μmの厚さで薄切し、酵素抗体法を用いて組織免疫染色を行った。抗MIB-5抗体はDAKO社より購入した。抗原の賦活化には95°Cに熱したpH6.0クエン酸緩衝液を用いた。(3)癌遺伝子活性(4)癌抑制遺伝子活性について、HPV関連癌遺伝子であるE6及びE7、癌抑制遺伝子であるp53、Rbを検討対象とし、(2)同様に免疫染色法による評価を試みた。(5)癌関連ウイルス感染の有無について、HPV mRNAの局在をin situ hybridization法を用いて検討を試みた。今後はこれら病理学的検査で得られた知見と、3D画像像を対比させ、病理学的特性と画像的特徴の関係について探索していく予定である。今年度は腫瘍の病理組織学的特徴と放射線治療効果、画像所見との関連の検討を開始した。病理組織像の検討対象症例は高精度CTにより仮想食道、仮想内視鏡を得られた症例と同一の症例とした。食道癌において放射線治療は重要な役割を占めているが、酸素効果は放射線治療効果を規定する強力な因子であり、低酸素細胞は通常の細胞よりも放射線治療効果が著しく落ちることが指摘されている。従って、腫瘍組織内においては低酸素に関与する遺伝子発現、例えばHIF-1αやその下流のVEGF等の遺伝子群が放射線治療効果を予測する可能性があると考えられる。さらに食道癌においては、形態学的特徴が、MVD, VEGF等の低酸素に関連する遺伝子群と相関があることも報告されている。従って、今年度の検討では、食道癌に対して放射線化学療法を施行した50症例において、低酸素状態に関連していると考えられる遺伝子群について免疫染色法による検討を開始した。組織は治療前内視鏡生検術によって得られた癌組織を通常の病理学的検査と同様にホルマリン固定し、パラフィン包埋したものを使用した。組織型については、各パラフィンブロックより3μmの厚さで薄切し、通常のHematoxylin-Eosin (HE)染色法を用いて確認を行った。次に、HIF-1α、CA9,GLUT1,DEC-1,MVD, VEGFについて、酵素抗体法を用いて組織免疫染色を行った。これらの試薬は主にDAKOJapan社、コスモ・バイオ社より購入した。今後はこれら病理学的組織検査で得られた知見と放射線治療治療効果、3D画像像と対比させ、高精度CTによる画像所見の臨床的有用生について探索していく予定である。
線虫C.elegansをモデル動物としたストレス応答シグナル伝達経路の解析

線虫における感染ストレスとMAPKカスケードとの関係について調べた。その結果、NSY-1, SEK-1, PMK-1からなるp38型MAPKカスケードが、線虫における緑濃菌などの感染に対する自然免疫機構において重要な役割を果たしていることを明らかにした。またMAPKホスファターゼであるVHP-1がこのカスケードを負に制御することも見いだした。線虫における酸化ストレス応答とMAPKカスケードとの関係について解析を行った。その結果、酸化ストレスによりSEK-1とPMK-1とからなるMAPKカスケードが線虫の腸で活性化することを見いだした。さらに、活性化したSEK-1-PMK-1 MAPKカスケードは、転写因子SKN-1を介してグルタチオン合成酵素の線虫ホモログであるGCS-1の転写を誘導することにより、個体レベルでの酸化ストレスに対する耐性を与えることを示した。線虫における重金属ストレス応答とMAPKカスケードとの関係について解析した。その結果MLK-1, MEK-1, KGB-1からなるJNK型MAPKカスケードが重金属ストレスに対する耐性に必要であること、またVHP-1はそのカスケードを負に制御する因子として機能することを見いだした。さらに、重金属ストレスに対する耐性には前述のSEK-1とPMK-1からなるp38型MAPKカスケードも弱いながら貢献しており、またVHP-1によって負に制御されるということを遺伝学的に明らかにした。JNKの足場蛋白質であるUNC-16(ヒトJIP3の線虫ホモログ)が、キネシンと複合体を形成し、オートファジーを制御する蛋白質UNC-14を適切な位置に局在化させることによりシナプス小胞の局在を制御することを明らかにした。生物は外界からのストレスに対して、そのストレスに応じてさまざまな応答を行うことにより生体防御を行っている。われわれは、線虫C.elegansをモデル動物として、ストレス応答型MAPKカスケードの機能を解析している。本年度は、外界からのストレスのひとつである細菌感染に対して、線虫のストレス応答型MAPKカスケードがどのような役割を果たしているのかについて調べた。C.elegansに感染する菌のひとつとして、緑濃菌Pseudomonas aeruginosaが知られている。野生型のC.elegansは、緑濃菌感染に対して抵抗性を示し、感染してもすぐには死なないことから、感染に対する防御機構が働いていると考えられた。そこで、線虫のストレス応答型MAPKカスケードと、緑濃菌感染に対する感染防御機構との関係を調べたところ、哺乳動物のMAPキナーゼキナーゼキナーゼ(MAPKKK) ASK1の線虫ホモログNSY-1と、MAPキナーゼキナーゼ(MAPKK) MKK3/6の線虫ホモログSEK-1の変異株が、ともに緑濃菌感染に対する抵抗性が低下していることが明らかになった。SEK-1は線虫のp38 MAPKホモログであるPMK-1の上流で機能することが示唆されていたので、緑濃菌に感染された線虫において、PMK-1がNSY-1およびSEK-1依存的にリン酸化されているかどうか調べたところ、そのリン酸化が確認された。さらに、RNAiによる遺伝子発現抑制実験により、PMK-1も緑濃菌感染に対する抵抗性に関わることが明らかになった。これらの結果から、NSY-1-SEK-1-PMK-1から成るMAPキナーゼカスケードが、C.elegansの自然免疫機構において重要な役割をはたしていることが明らかになった。申請者は、線虫C.elegansをモデル動物として、ストレス応答型MAPKカスケードの機能を解析している。

本年度は、ストレスとして亜ヒ酸(アルセナイト)を用いて、個体レベルでのストレス応答とMAPKかすケードとの関係について調べた。その結果、線虫にアルセナイトを投与すると、p38MAPKの線虫ホモログであるPMK-1が活性化することが明らかとなった。PMK-1の上流因子を探索したところ、SEK-1がこの活性化に必須であることが判明した。SEK-1の上流の因子としては、これまでにNSY-1が報告されている。そこで、NSY-1の関与を調べたが、NSY-1はこの応答には部分的にしか関与していないことが判明した。また、PMK-1変異体とSEK-1変異体はアルセナイトに対して野生型よりも感受性が高く、野生型が致死にならない濃度で致死性を示した。さらに、sek-1変異体のアルセナイト感受性は、SEK-1遺伝子を腸特異的に発現させることによりレスキューされた。これらのことから、アルセナイトに対するストレス応答には、SEK-1-PMK-1からなるキナゼカスケードが腸で活性化することが必須であることが明らかとなった。PMK-1の下流で機能する因子を探索したところ、グルタチオン合成の律速酵素であるGCSの線虫ホモログGCS-1がアルセナイトストレスによSEK-1-PMK-1カスケード依存的に発現誘導されることが判明した。哺乳動物ではGCSは転写因子Nrf2により転写制御されることが報告されている。そこで、Nrf2の線虫ホモログであるSKN-1の関与を調べたところ、SKN-1はアルセナイトストレスによるGCS-1の転写誘導に必須であることが判明した。さらに、SKN-1はアルセナイトにより核に移行するが、この核移行にSEK-1が必須であることを見い出した。広範な生物に対して毒物である重金属の銅をストレス源として用いた場合の、線虫の個体レベルでのストレス応答とMAPKカスケードとの関係について調べた。その結果、銅ストレスによりMLK-1(MAPKKK)、MEK-1(MAPKK)およびKGB-1(JNK型MAPK)からなるキナーゼカスケードが活性化すること、そしてそれが個体レベルにおける銅ストレス耐性に必須であることが明らかとなった。また、新規MAPKホスファターゼとして線虫VHP-1を同定した。VHP-1は、in vitroにおいてKGB-1のキナーゼ活性を抑圧できる。一方、in vivoにおいてvhp-1が欠損すると線虫は致死性を示すが、その致死性はmlk-1、mek-1あるいはkgb-1の変異により抑圧された。このことから、vhp-1は、MLK-1、MEK-1およびKGB-1からなるキナーゼカスケードを負に制御する因子であることが示唆された。さらに遺伝学的解析から、SEK-1(MAPKK)およびPMK-1(p38型MAPK)からなるキナーゼカスケードも銅ストレス耐性に関与しており、そのカスケードもVHP-1によって負に制御することが判明した。これらのことから、銅ストレス耐性にはMLK-1,MEK-1およびKGB-1からなるキナーゼカスケードとSEK-1とPMK-1からなるキナーゼカスケードが関与し、またそれらはVHP-1ホスファターゼによって負に制御されていることが示唆された。
平滑筋ミオシンBから新しく単離した平滑筋収縮制御因子の同定と性質

平滑筋の収縮弛緩はミオシン軽鎖のリン酸化と脱リン酸化によって制御されるという説が現在の主流であるが、張力とリン酸化レベルが一致しない結果も報告されており、いまだ未解決である。そこで本研究では平滑筋の収縮弛緩制御を調べるにあたってまずニワトリ砂嚢の収縮制御因子を正確に理解することを目的とした。15EA02:はじめにミオシンBを脱感作する際に分離する制御因子の精製を試みた。硫安分画の35-60%飽和硫安画分をハイドロキシルアパタイトカラムにかけて主要な不純物のトロポミオシンを除き、Mono Qカラムに2度かけることによってほぼ完全に精製した。この因子はWalshらの方法で精製したミオシン軽鎖キナーゼ(MLCK)とLaemmli、Weber-Osbomの2つの系で電気泳動の移動度が等しく、またトリプシン分解ペプチドの部分アミノ酸配列もMLCKから推定されているものと一致することから、MLCKそのものであることが明らかになった。この結果はニワトリ砂嚢においてはMLCKが主として機能している収縮制御因子であることを示している。次に種々の収縮系、調節系タンパク質を単離して収縮活性を与える最少単位を検討した結果、少なくともアクチン、ミオシン、MLCKによりCa^<2+>/カルモデュリン依存的な超沈殿が起こり、トロポミオシンは超沈殿の初速を加速することが分かった。また超沈殿終了と同時に同一標品でリン酸化レベルを調べたところ、超沈殿とほぼ平行してリン酸化レベルも変化する結果が得られた。興味深いことにミオシンのみとアクトミオシンのリン酸化レベルを比較すると後者のリン酸化レベルの方が有意に高かった。これはアクチン-ミオシン相互作用がリン酸化に影響を与えることを示唆しており、現在詳細な検討を行っている。
ブラックホールへの物質降着

本研究から次のようなことが明らかになった。1.X線新星、LMXB(低質量連星型X線星)それぞれのX線スペクトルには二成分が存在する。この内の一成分はどちらにも共通しており、降着円盤から期待されるスペクトルによく合う。この降着円盤成分はどちらのX線源においても強度の時間変動がきわめて少ないか、あってもゆるやかである。このことから中性子星のまわりにも、またブラックホールのまわりにも同じような性質の降着円盤が形成されているといえる。2.スペクトルのもう一方の成分は、X線新星の場合は、ベキ型のスペクトル、LMXBの場合は黒体輻射のスペクトルでよく表わされる。ベキ型の成分はブラックホールの近傍でホットプラズマによるcomptonizationあるいは非熱的なプロセスでつくられるのであろう。一方、黒体輻射成分は中性子星表面からの放射と考えられる。3.ベキ型成分、黒体輻射成分はどちらも激しい強度変動を示す。X線新星でもLMXBでも、スペクトルの二成分はそれぞれ独立に変動することをみつけた。もしこれらの二成分が正の相関をも動するならば、降着円盤を通過した物質がブラックホールや中性子星表面に到達することになる。したがって、二成分間に相関がないということから、中心天体への物資降着には降着円盤(幾何学的にうすく光学的にあつい円盤)を通過するチャンネルの他にもう一つ別のチャンネルがあると結論できる。もう一つのチャンネルに対し、私たちは降着降着円盤が二重構造、つまり光学的にあつく幾何学的にうすい円盤が光学的にうすい円盤ではさまれたサンドイッチ状の構造になっているのではないかと考えている。現在、観測との比較のため必要になる二重構造円盤のより詳細な性質に向けて研究を進めている。平成3年度の研究計画の第一は、低質量X線星について観測結果を説明できるモデル・スペクトルを求めることであった。低質量X線源GX17+2は「ぎんが」衛星による観測期間中に2倍以上の強度変動を示し、その変動に伴なってスペクトルが大きく変化し、上記の研究には最適の天体である。このX線源の観測デ-タとモデル・スペクトルの比較から次のことがわかった。1.X線スペクトルは超高密度星(中性子星)の表面から放射される成分と降着円盤からの成分の2成分モデルで変動に伴なうスペクトルの変化を全て説明できる。2.X線強度の時間変動は中性子星表面から放射される成分のみによる。一方降着円盤からの成分の強度は一定に保たれていた。また、GS1124ー68に代表されるtransient X線源(ブラックホ-ル候補)は発生から10日ほどでX線強度が最大になり、その後指数関数的に強度が強くなる。減光の時間尺度はこの種のX線源ではすべて約30日である。X線源が矮新星のような過程で明るくなり、連星系の相手の星の表面を緩め、そこから放出された物質を降着すれば、このような指数関数的な減光を説明できる。減光の時間尺度はブラックホ-ルを含む連星系の性質に関係するので、観測から得られる制限から連星系についての興味ある結果が得られるかもしれない。新たに得られた知見限られたケ-スについてではあるが、低質量X線星のX線スペクトルが中性子星表面から放射される成分と降着円盤からの2成分モデルで表すことができる非常に明解な解答が得られた。また、時間変動を示すのは中性子表面からの成分であり、降着円盤成分は時間変動を示さないことも分った。ブラックホ-ル型transient X線源の性質は上記の性質と極めて似ている。

低質量X線源とtransient X線源では中心星は異なるが、物質降着について共通の性質を持つことが明かであると考える。これらのX線源への物質降着が単なる降着円盤のみよるものでないことがはっきりした。この解明はこれから行なう。ブラックホールと考えられているX線新星は以下の特徴をもっている。(1)これらの天体はお互いに極めて接近した連星系である。(2)急激に明るくなった後、時間と共に指数関数的に減光する。半減期はどのX線新星でも約20日である。(3)X線新星のスペクトルは温度が約1KeV(10^7K)の黒体輻射成分と高エネルギー成分の2成分であらわされる。(4)黒体輻射成分は時間と共にゆるやかに変化するが、高エネルギー成分は早い時間尺度で変化する。上記(3)の黒体輻射成分はブラックホールをとり囲む降着円盤からのX線放射であり、高エネルギー成分はブラックホール近傍で放射されるX線であるとされている。ブラックホールへの物質降着は降着円盤を経由するものとされているが、上記(3)を考えると降着円盤を経由しなく、直接ブラックホール近傍に達する降着物質があることを示している。このような現象はブラックホールのみの特徴かどうかを調べるために、低質量X線星(中性子星への物質降着によるとされている)について調べてみた。その結果、黒体輻射成分と高エネルギー成分がそれぞれ独立に変動することがわかった。したがって、これらのX線天体には降着する物質の流れに2つのチャンネルが必要であることが明らかとなった。ブラックホール型X線新星の指数関数的減光現象を次のようなアイデアで研究している。X線新星の誘因はブラックホールのまわりにドーナツ状に蓄積した物質の不安定性に由来する(矮新星と呼ばれる天体ではこういった過程によることが明らかである)と考える。この不安定性により物質がブラックホールへ降着することにより、強いX線が放射される。このX線が連星系の相手の星の表面を暖め、物質の降着を容易にする。したがって、物質の降着量はX線強度と正の相関があることになり、X線強度が弱くなると降着率も減少する。このようにして指数関数的な減光が得られるのではないかと考えており、X線を照射された相手の星の大気の状態および降着率の数値計算を行なっている。
腎炎モデル動物を用いた慢性腎障害に対する麻酔薬の腎保護作用の検討

最近の病理学的研究や免疫学的研究により、腎機能の低下する過程で糸球体の構成要素であるメサンギウム細胞の増殖および基質の増加が認められることがin vitro,in vivoの実験で証明されており、メサンギウム細胞の障害と腎機能の関係が注目されている。現在までの筆者らのメサンギウム細胞を用いた研究において、1.ケタミンは、[^3H]-thymidineの取り込みと細胞数の増加を濃度依存性に抑制した。しかし、プロポフォールは[^3H]-thymidineの取り込みには影響を及ぼさなかった。2.ケタミンは細胞内のcAMP濃度を濃度依存性に増加させた。3、ケタミンはIL-1,IL-6やTNF刺激によりメサンギウム細胞の増殖に対すの作用に対して抑制することを確認をしている(Jimi et al.,1997)。さらに、プロポフォールは増殖に関与するカルシウムチャンネルを抑制しないことも確認した(Minami et al.,1996)。現在、これらの結果をもとに抗胸腺抗体を用いてメサンギウム増殖性腎炎モデルを作り、in Vitroの結果を証明を試みている。そこで、アドレノメヂュリン(Segawa et al.,1996)のように循環抑制作用のある蛋白においてもそのメサンギウム細胞の増殖に対する抑制作用を証明した。さらにプロタミンなどの循環抑制作用のある薬剤においてもそのメサンギウム細胞の増殖に対する作用を現在検討し、現在まで増殖に関与するカルシウムチャンネルを抑制することも確認している(Minami et al.,1996)。また、カルモジュリンキナーゼIIなどの燐酸化酵素阻害薬も増殖に関与するカルシウムチャンネルを抑制することも確認している(Tsutsui et al.,1996)。さらに、サイトカインが臨床病態に関与しているとされる透析患者や原発性閉塞性肝硬変の患者におけるケタミンの血中サイトカインの動態にいかに関与しているかも検討している(Segawa et al.,1997)。今回の結果は、麻酔薬が神経系だけでなく種々の細胞機能に影響していることを示す結果だと考えられる。
遺伝子ノックアウトを用いた新規クラスE分子群による小胞輸送の研究

エスコートに分類される輸送関連Hrsの機能解析を行う目的で、ノックアウトマウスからHrs欠損マウス由来不死化細胞株を樹立した。EGF受容体の分解と細胞内コンパートメント動態を検討した。cycloheximide存在下においてタンパク分解の時間経過を観察したところ、Hrs欠損細胞において受容体分解が有意に遅延しシグナル伝達の継続時間の延長が認められた。HrsはIL-2によりSTATと同様にチロシンリン酸化を受ける蛋白であることから、サイトカイン受容体と小胞輸送を結びつける分子群であることが予想された。Hrsノックアウト細胞およびSTAM1/STAM2ダブルノックアウト線維芽細胞株をIL-6で刺激したところ、STAT3活性化が長時間持続した。gp130はIL-6非依存性の状態においてプロテアソームおよびライソソーム系による分解を受けるが、IL-6刺激後の挙動はライソソーム系による分解が主であった。Hrsはgp130のライソソーム依存性分解を制御していた。IL-6刺激後のgp130の細胞内トラフィック動態を検討したところ、IL-6刺激後早期にインターナライズされ早期エンドソーム(EE)に輸送され、STAMs/Hrs複合体と一過性に共局在した。STAM/Hrsはユビキチン結合性ドメイン(UIM,VHS)を持ちユビキチン化蛋白(Cargo)を認識することからgp130のユビキチン化を検討したところポリユビキチン化・モノユビキチン化の両者からなる修飾を受けていた。したがってSTAMs・Hrs複合体はEE経由のgp130分解に関与し、最終的にリソソーム依存性受容体分解とシグナル停止に関与していた。エスコートに分類される輸送関連Hrsの機能解析を行う目的でHrs欠損マウス由来不死化細胞株を調整した。細胞内コンパートメント動態を検討したところEEA1陽性の巨大エンドソーム形成を認めた。この異常構造の出現にはHrsの細胞内ドメインのうちユビキチン結合およびPIP3結合ドメインのいずれも必要であった。Hrs欠損細胞における積荷タンパク(カーゴ)の分解異常の有無を検討する過程において、Hrs結合蛋白STAM1およびSTAM2がHrs欠損下ではほぼ完全に分解されていた。この原因としてライソソームあるいはプロテアソーム依存性分解のいずれが関与しているか検討した結果、STAMはプロテアソーム依存性に分解されており、STAMはポリユビキチン修飾を受けユビキチン化酵素の標的となっていた。さらにSTAMの分子内ドメインと分解の相関を検討したところ、UIMドメインの存在がSTAMのプロアソーム依存性分解に必須であった。したがってSTAMのUIMはカーゴの認識のみならず、STAM自身のユビキチン依存性分解を制御していることが明らかとなった。STAMの発現と細胞内ユビキチン化蛋白に何らかの関連がないか調べた結果、Hrs欠損細胞においては細胞内ユビキチン化蛋白の総量が低下しているのに対し、Hrs戻し細胞においては細胞内ユビキチン化タンパクの蓄積が観察された。以上の結果から、Hrsはエンドソームの形態維持に必須であるのみならず細胞内ユビキチン化蛋白、特にカーゴの運命決定に密接に関与していることが示唆された。
新生児の創傷治癒に関する研究

(1)研究目的:本研究の目的は新生児の創傷治癒を検討することにある。さらに胎児型創傷治癒およびadult型創傷治癒との比較を行うことである。今回はケラチンについての検討を行った。(2)研究対象および方法:(1)実験動物:Sprague-dawleyラット新生児(生後15日目)(2)創傷治癒モデルの作成:新生児ラットの背部に約1cmの全層皮膚切開創及び直径2mmの全層皮膚欠損創を作成し、この創傷治癒過程を観察する。さらに経時的に組織標本を採取し、切片を作成する。(3)プローブの作製:ケラチンのm-RNAに対するプローブを作製する。プローブはオリゴヌクレオチドプローブとした。(4) in situハイブリダイゼーション:作成したプローブを[^<35>S]で標識し、in situハイブリダイゼーションを行う。(6)標本の現像: 12日間、暗所保存した標本を現像する。(7)写真撮影:暗視野顕微鏡を用いて、写真撮影を行う。以上の実験より得られた標本で、経時的な変化を比較検討する。さらに胎児の結果やacultの結果と比較検討を行う。(3)これまでの結果及び考察これまでは、ケラチンの発現を経時的に検討してきたがどちらのモデルにおいても、創作成後12時間で創周辺に広範囲にK6ケラチンの発現が認められ、その発現は以後創傷治癒に伴って急速に消退していき、10日前後で消失してゆくことがわかった。また消退速度は、2種類のモデルの比較では切開縫合創の方が速いことがわかった。従ってK6ケラチンは創傷治癒の1つのよい指標となることがわかった。(4)今後の検討課題今回の研究では、新生児のケラチンの発現のみの検討しかできなかったが、今後はさらに胎児型及びadult型の創傷治癒との比較検討を行っていきたいと考えている。
視覚反復刺激療法と大脳刺激による視野障害の治療法の開発と臨床応用

脳卒中による同名半盲患者の視覚反復刺激療法による訓練効果を観察するため、赤外線による眼球運動測定装置を作成した。これは、被験者の頭部を固定し、コンピューター画面上の動く視標を追従するもので、眼球の追従運動、サッケードを詳細に計測することができる。また、画面の四隅にランダムに現れる視標に素早く目を向ける課題では、視野と注意障害の影響を定量的に評価することができる。現在、健常人において、眼球運動を精度良く記録できることを確認中である。今後、同名半盲、注意障害を有する脳卒中患者において測定を行う予定である。視覚反復刺激療法施行前後における、同名半盲の改善を、視野計測とともに、眼球運動の変化でも観察していくことができる。複視を有する脊髄小脳変性症患者に対し、経頭蓋磁気刺激を後頭葉、運動野に行うことで、複視の出現する範囲を縮小することができた。患者本人が複視の改善を自覚することができた。運動野付近の広範な部位を、経頭蓋磁気刺激で刺激することが、視覚障害、眼球運動に対して良い影響を与えることを症例報告として論文化し、Cerebellum & Ataxia誌に投稿し、掲載された。視覚的な障害に対する大脳刺激の効果については、まだ報告が少なく、より良い刺激法、治療法開発の端緒となると思われる。今後、視野障害を有する中枢神経疾患患者に、視覚反復刺激療法と経頭蓋直流電流刺激を行い、その効果を視野検査、眼球運動計測で検討する。同名半盲の改善を評価する眼球運動測定装置の設定に時間を要したため。視覚反復刺激療法、経頭蓋直流電流刺激、反復経頭蓋磁気刺激について、実施可能で効果的な方法を探った。視覚反復刺激療法については、同名半盲を有する脳卒中患者3名に視覚反復刺激療法を行い、視標の大きさ、色、訓練時間を検討した。注視点の視標の大きさはできるだけ小さくし、黄色から緑色に変わるときに、視野の境界線上に指標を点滅させ、繰り返し認識させることとした。認識できたときはボタンを押してもらい、正解率が9割を越えれば、視標を障害視野に向けて少し移動させることとした。1日の訓練時間は、患者の集中力を勘案して、40分を2セットとした。また、眼球運動測定装置を購入し、視野障害者の、半盲側への眼球運動によるスキャン能力を計測することとした。経頭蓋直流電流刺激については、健常者において、刺激位置、刺激強度、時間について検討を行った。刺激位置については、後頭葉に陽極、頭部中心部の10-20法のCzに陰極を置くこととした。刺激強度は1-2mA、刺激時間は20-30分間が良いと思われた。経頭蓋直流電流刺激を行いながら、視覚反復刺激療法を行うことは可能であった。装着に時間がかかるため、頭皮の皮膚抵抗を落として、装着時間を短くする工夫が必要と思われた。反復経頭蓋磁気刺激については、視覚野への影響に関する先行研究が少ないため、運動野への刺激条件を適用することとした。障害側の視覚野に5Hz、10分間(10秒刺激、50秒休みの10セット)の刺激を行うこととした。その効果については、視覚誘発電位を用いて確かめる予定である。今後、視覚反復刺激療法と経頭蓋直流電流刺激、反復経頭蓋磁気刺激後の視覚反復刺激療法の方法を決めて、治療を行う予定である。脳刺激の効果を調べる視覚誘発電位の計測の準備が遅れたため、視野障害の患者への治療の開始が遅れている。視覚反復刺激療法について、効果的な方法を工夫した。脳卒中による同名半盲の患者2名に対し視覚反復刺激療法を行い、訓練時間、視標の数を変え、その影響を見た。視野の境界線上に視標となる点を点滅させ、そこを繰り返し認識させ、視標を認識できたときはボタンを押してもらい、正解率が9割を越えれば、視標を障害視野に向けて移動させることとした。視野の境界線上の視標に、繰り返し注意を向けることで、視覚に関する回復可能な脳細胞を賦活することができると思われる。また、複視を有する脊髄小脳変性症患者に対し、経頭蓋磁気刺激を後頭葉、運動野に行うことで、複視を改善させることを確認した。経頭蓋磁気刺激が、視覚障害、眼球運動に対して良い影響を与えることが示唆された。眼球運動測定装置により、詳細な検討が可能と思われる。視覚野への経頭蓋直流電流刺激、反復経頭蓋磁気刺激について、実施可能で効果的な方法を探った。経頭蓋直流電流刺激については、健常者において、刺激条件について検討を行った。刺激位置については、後頭葉に陽極、頭部中心部の10-20法のCzに陰極を置き、刺激強度は1-2mA、刺激時間は20分間すると、痛みなく、電極の装着も容易であった。経頭蓋直流電流刺激を行いながら、視覚反復刺激療法を行うことで注意は妨げられなかった。反復経頭蓋磁気刺激については、視覚野を確実に刺激するため、運動閾値以上の刺激強度で、高頻度刺激(5Hzまたは10Hz)を行うこととした。視覚誘発電位を用いて、視覚野への影響を確かめていく。

今後、視野障害を有する中枢神経疾患患者に、視覚反復刺激療法と経頭蓋直流電流刺激、反復経頭蓋磁気刺激後を組み合わせて、視野改善のための治療を行っていく予定である。反復経頭蓋磁気刺激、経頭蓋直流電流刺激による視覚野の刺激法について、確立された方法がなく、健常被験者において、有効な治療法を探ったため。有効な刺激法について知見が得られたため、実際の治療を行っていく予定である。脳卒中による同名半盲患者の視覚反復刺激療法による訓練効果を観察するため、赤外線による眼球運動測定装置を作成した。これは、被験者の頭部を固定し、コンピューター画面上の動く視標を追従するもので、眼球の追従運動、サッケードを詳細に計測することができる。また、画面の四隅にランダムに現れる視標に素早く目を向ける課題では、視野と注意障害の影響を定量的に評価することができる。現在、健常人において、眼球運動を精度良く記録できることを確認中である。今後、同名半盲、注意障害を有する脳卒中患者において測定を行う予定である。視覚反復刺激療法施行前後における、同名半盲の改善を、視野計測とともに、眼球運動の変化でも観察していくことができる。複視を有する脊髄小脳変性症患者に対し、経頭蓋磁気刺激を後頭葉、運動野に行うことで、複視の出現する範囲を縮小することができた。患者本人が複視の改善を自覚することができた。運動野付近の広範な部位を、経頭蓋磁気刺激で刺激することが、視覚障害、眼球運動に対して良い影響を与えることを症例報告として論文化し、Cerebellum & Ataxia誌に投稿し、掲載された。視覚的な障害に対する大脳刺激の効果については、まだ報告が少なく、より良い刺激法、治療法開発の端緒となると思われる。今後、視野障害を有する中枢神経疾患患者に、視覚反復刺激療法と経頭蓋直流電流刺激を行い、その効果を視野検査、眼球運動計測で検討する。同名半盲の改善を評価する眼球運動測定装置の設定に時間を要したため。視覚誘発電位の計測のための機材を購入し、実際の計測を行う。あわせて、視覚障害患者への治療プロトコールを作成し、実際の治療に入る。健常人で視覚反復刺激療法と経頭蓋磁気刺激、または経頭蓋直流電流刺激の組み合わせを行い、副作用の有無、視覚誘発電位の反応の変化、眼球運動操作の変化等を調べる。本治療の安全性を確認した後、中枢神経疾患による視野障害患者の治療を行う。TalkEye Lite (眼球運動測定装置)の値段が、当初の見込みより安かったため、次年度繰越金が生じた。視野計を購入予定であったが、現存のもので計測可能であることが判明し、購入する必要がなくなったため、次年度使用額が生じた。今後の刺激、計測に必要な、電気刺激装置の購入を考えている。研究が遅れているため、研究期間を延長した。助成金により、データ処理のためのコンピューターを購入し、データ入力を行う人に支払いを行う。また、助成金により、学会での成果発表、消耗品の購入も行う。視覚誘発電位の計測のための機材が必要となったため、その器材購入の費用にあてる。