hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
不確実性対応型アルゴリズムの理論と工学的応用に関する研究

グラフの木状被覆問題は,グラフの各頂点に隣接するように施設を木状配置する問題との関連から,Arkinらによって導入された問題である.と同時に彼らは,一様コストの場合に$2$倍近似保証アルゴリズムを,一般コストの場合に3.55倍近似保証をを提示している.実のところ一様コストの場合には,より早くからより簡単な2倍近似アルゴリズムが,Savageにより開発されている.一方,一般コストの場合は,その後アルゴリズムの改善が見られ,近似保証は3+εまで下げられている.この時点では,木状被覆問題では,一様コストと一般コストの場合で,保証できる近似精度に差があることを意味する.更に悪いことには,上述の(3+ε)倍近似アルゴリズムは,多項式時間とはいえとても実用的であるとはいえない代物である.このような状況を背景に,一般コストをもつ木状被覆問題に対し,より良い近似アルゴリズムを開発し,近似保証ならびに計算時間をともに向上させることを本研究の目標とした.得られた成果を要約すると,以下の通りである:・まず,与えられるコストは2倍以上の開きがある2種類だけの場合に制限して検証した.その結果,線形計画の主双対法に基づいて設計された近似アルゴリズムにより,最大フロー問題の解法と同じ計算量で,2倍近似保証することが可能であることを示した.・上記制限下での成功を基に,一般の場合について検討した結菓,高速な組合せアルゴリズムにより,この場合も2倍近似保証することが可能であることを示した.一般コスト用にこれまでに開発された,いずれのアルゴリズムもが,まず頂点被覆Cを計算してから,Cの頂点をシュタイナー木で連結させるという方法をとっていたのに対し,同アルゴリズムの特徴は,最小全域木に枝刈りを施すことで木状被覆を構成するところにある.集合被覆問題(SC)は,よく知られた組合せ最適化問題で,与えられた部分集合の位数がいずれもk以下であるとき,それをk集合被覆問題(k-SC)と呼ぶ.同問題に対しては,食欲法を改良することで,一様コストの場合にH(k)-1/6の近似保証が示され,更に様々な局所探索の手法を取り入れることで,現在のところH(k)-1/2まで知られている.残念ながら,一様コストにおける,これらの改良方法は,一般コストの場合には通用せず,食欲法のH(k)を改善できるか否かは未解決問題として残されていた.本研究では,この未解決問題に対する最初の回答を,次のように条件付ながら,肯定的に与えた:一般コスト3-SCにおいて,異なる部分集合コストには2倍以上の開きがある場合には,食欲法を改良することでH(3)-1/6の近似保証が得られる.グラフの木状被覆問題は,無向グラフの各頂点に隣接するように施設を木状配置する問題との関連から,Arkinらによって導入され,同時に,一様コストの場合に2倍近似保証アルゴリズムが,一般コストの場合に3.55倍近似保証が示された。その後アルゴリズムの改善が見られ,一般コストの場合の近似保証は3+εまで下げられ,更に最近申請者により2倍近似保証することが可能であることが示された。このように,オリジナルの木状被覆問題に対する近似可能性の追求には一応の決着が見られたため,以下のように同問題の拡張版について検討し,その近似可能性について新たに知見を得ることを本研究の目標とした。得られた成果を要約すると,以下の通りである:・無向グラフにおける木状被覆問題を,有向グラフ上に拡張した。同問題に対し,一様コストの場合,無向グラフの際に用いた手法で2倍近似可能であることを示した。
日本語学習者のためのプレゼンテーション支援e-ラーニング教材の開発と実践研究

中級レベルの日本語学習者のスピーチやプレゼンテーション(以下プレゼン)を分析したところ、聞き手に配慮した語の選択ができていないことから、多様な国籍のクラスメートが理解できるわかりやすい語彙や表現を使用することを提案し、適切な語の選択と言い換えを学ぶことができるe-learningシステムを開発している。今年度は昨年度作成したデータベースをさらに充実させるために、引き続きクラス内でのプレゼンの発話データの文字起こしを行い、プレゼンコーパスを充実させた。また、語彙の不適切な使用例を収集し、データベースに追加した。収集したデータベースから不適切な例を分析したところ、コロケーションの誤用が最も多く、続いて自動詞と他動詞の誤用も多く見られた。それ以外に多かったものは、漢語の多用、書き言葉の使用、スル動詞の誤用などであった。この結果について、The 2018 International Conference on Japanese Language Educationで発表を行った。e-learningシステムの出題はトピック別にすることにし、それぞれのトピックと当てはまる語を選ぶために、山内博之編『実践日本語教育スタンダード』(2013)から、話題とその話題で使われる語彙を3つのレベル別に抜き出した。そのリストを参考にして、漢語から和語への言い換え表現を収集し、データベースに追加した。システムの基本的設計として、漢語と和語の言い換えを入力する練習問題を出題することにし、例文と練習問題の作成に取り掛かった。また、学習履歴取得画面と学習履歴表示画面などの作成も行った。まだ十分な量の言い換え表現がデータベースに蓄積されていないため、さらに多くのコーパスを集め、言い換えリストを収集する必要がある。そのリストをもとに、練習問題の追加も行いたい。また、プレゼンの構成も学べるような教材を作成することにしていたが、見積もりを取ったところ予算が不足することが分かった。予算内に収めるためには、予定していた機能を削る必要があることが分かり、システムの設計を再構築することにしたため、当初の計画より遅れることになった。今年度は、作成した言い換えリストを元に引き続き練習問題を作成する。それらの練習問題と学習履歴の取得を行えるシステムの基本設計を元に、業者に発注を行い、システムを完成させる。そして、学習者を対象に試行を行い、フィードバックを得、システムの検証を行う。その上で問題点を洗い出し、教材の改良に反映させる。また、各問題の修正も行う。伝えたいことを的確に伝えるプレゼンテーション(以下プレゼン)をするために、プレゼン全体の構成を意識し、適切な表現を選択するのに役立つe-learning教材開発に向け、その第一段階として基礎データとなるプレゼンコーパスを作成している。研究の対象を中級レベルの日本語学習者とし、実際に2大学の中級レベルのクラスで行った一般的な話題のスピーチやプレゼンの音声データを収集し、約100人分(1人3分から10分)の発話データの文字起こしを行った。作成したコーパスから、わかりにくいプレゼンの一因となっている難しい語彙やコロケーションの誤用及び正用を抜き出した。それらを分析した結果、わかりにくさの原因を次のように分類した。(1)漢語動詞の多用、(2)漢語名詞の多用、(3)書き言葉の使用、(4)カジュアルすぎる言葉の使用、(5)自動詞と他動詞の混同、(6)コロケーションの誤用本研究では、わかりにくい表現をより簡単で身近な言葉で言い換える教材作成を目的としており、今年度は言い換えリストを作成した。また、プレゼンの構成に意識を向けた発表原稿を作成させるための談話型タスクを考えた。その際、プレゼンの種類を情報提供型(紹介や説明など)と意見表明型(問題提起や提言など)に分けた。タスクの手順は、まず、大きな枠組み(導入→本論→結び)を提示する。次に、トピック毎に、枠組みの構成を示すキーワード(例えば、導入では{あいさつ、トピック紹介、聴衆への呼びかけ、列挙、理由}など)を与え、学習者自身にどのような構成にすればよいかについて考えさせる。そして、キーワード毎に提示される発表文型の中から適切なものを選択させる。最後に必要な語句や文を補い発表原稿を完成させる。これらのタスクを作成予定のe-learning教材に反映させる。以上の研究をまとめ、次年度に日本語教育国際研究大会において発表を行う。プレゼンコーパスの作成、練習問題に採用する正用と誤用の語彙リストの作成と分類、言い換え表現の決定などに時間がかかったこと、及び、プレゼンの構成についても新たに教材に含めることにしたため、これらを反映したe-learning学習システムの基本設計の作成に遅れが生じている。

e-learningシステムの出題はトピック別にすることにし、それぞれのトピックと当てはまる語を選ぶために、山内博之編『実践日本語教育スタンダード』(2013)から、話題とその話題で使われる語彙を3つのレベル別に抜き出した。そのリストを参考にして、漢語から和語への言い換え表現を収集し、データベースに追加した。システムの基本的設計として、漢語と和語の言い換えを入力する練習問題を出題することにし、例文と練習問題の作成に取り掛かった。また、学習履歴取得画面と学習履歴表示画面などの作成も行った。まだ十分な量の言い換え表現がデータベースに蓄積されていないため、さらに多くのコーパスを集め、言い換えリストを収集する必要がある。そのリストをもとに、練習問題の追加も行いたい。また、プレゼンの構成も学べるような教材を作成することにしていたが、見積もりを取ったところ予算が不足することが分かった。予算内に収めるためには、予定していた機能を削る必要があることが分かり、システムの設計を再構築することにしたため、当初の計画より遅れることになった。プレゼンの文字起こしの作業を引き続き行い、プレゼンコーパスの充実を図る。そして作成した語彙リストと言い換えリストに基づき、トピックに分けて練習問題を作成する。また、プレゼンの構成についてもさらに分析を深め、枠組みの構成を示すキーワードと発表文型についてリストを完成させる。それらを基にシステムの基本設計を行い、e-learning教材の試行版の完成を目指す。今年度は、作成した言い換えリストを元に引き続き練習問題を作成する。それらの練習問題と学習履歴の取得を行えるシステムの基本設計を元に、業者に発注を行い、システムを完成させる。そして、学習者を対象に試行を行い、フィードバックを得、システムの検証を行う。その上で問題点を洗い出し、教材の改良に反映させる。また、各問題の修正も行う。コーパスデータの作成と練習問題の作成に時間がかかったため、また、新たにプレゼンの構成についてのタスクを教材に組み込むことにしたため、今年度予定していたシステムの基本設計が遅れ、次年度にシステム設計の発注を行うことにした。それに付随し、サーバー用のパソコンの購入も次年度に行いたい。当初、システム設計とサーバー購入を本年度に行う予定していたが、システム設計の見積額が予算内に収まらず、基本設計に変更が生じたことから、本年度使用できなかった。システム設計とサーバー購入は次年度の予算と合わせて、次年度に行う予定である。
歯周組織破壊の進行過程における免疫担当細胞の動態

可逆的な歯肉炎から不可逆的な歯周炎への移行にともないT細胞主体の病変からB細胞主体の病変へ移行すると考えられているが、実際これらの細胞がどのように歯周組織破壊に関与しているかは不明である。そこで、T細胞とB細胞がどのような関係にあるときに組織破壊が起こるかを、線維芽細胞を歯周組織破壊の指標として免疫組織学的に検討した。すなわち歯周外科処置時または歯周ポケット掻爬時に採取した炎症歯肉を用い、T細胞は抗CD3抗体、B細胞は抗CD20抗体、そして線維芽細胞はヘマトキシリンによる対比染色の多重染色により同一切片上でこれらの細胞を同定し解析した。その結果、炎症浸潤細胞の増加にともないT細胞、B細胞ともに増加するが、T細胞は炎症浸潤細胞が少ないときより出現し、その後徐々に増加するのに対して、B細胞は炎症細胞数が約150cells/0.1mm^2になるまで出現せず、その後急激に増加することが明らかとなった。また炎症浸潤細胞に対するB細胞の割合が正の相関(r=0.702)を示したのに対し、T細胞の割合は負の相関(r=-0.595)を示した。線維芽細胞は炎症浸潤細胞の増加に従いその数が減少し、炎症浸潤細胞と負の相関(r=-0.583)を示した。またB細胞も線維芽細胞と負の相関(r=-0.489)を示したが、T細胞は線維芽細胞と有意な相関を示さなかった。これらの結果より、炎症初期においてはT細胞が浸潤し、遅れてB細胞が浸潤するが、B細胞の増加はT細胞のそれより大きく、炎症の進行過程で炎症浸潤細胞中に占めるT細胞とB細胞の割合が逆転することが示めされた。また線維芽細胞は炎症浸潤細胞と負の相関を示し、炎症の進展に伴い組織破壊の進行することが示めされたが、この組織破壊はT細胞の増加には相関せず、B細胞の増加と相関したことより、歯周組織破壊はB細胞の浸潤が増加するような免疫応答と関連すると考えられた。
クオーラムセンシングを標的とした抗細菌剤の開発

クオーラムセンシング(QS:菌密度依存的遺伝子発現制御機構)は近年の細菌学において大変注目されている細菌界で広く見られる現象である。特に、病原性細菌の病原因子発現がこのQSにより制御されている例が多く報告されていることから、QSはポスト抗生物質薬剤開発のターゲットの一つとして注目されている。本研究では、申請者が発見した腸球菌の病原性プロテアーゼの発現制御に関わるQS(fsr制御系)を標的とした薬剤の開発を最終目的として、(1)腸球菌自然変異株を用いたfsr制御系に関する分子遺伝学的解析、(2)腸球菌のfsr制御系を標的としたクォーラムセンシング阻害物質の探索を行なった。(1)においては臨床分離株149株の遺伝子解析を行い、28株にfsr制御系遺伝子中の点突然変異を見出した。そして、これらの変異株のゼラチナーゼ生産性、GBAP(gelatinase biosynthesis-activating pheromone)生産性、GBAP応答性を解析し、fsr遺伝子のシグナル伝達系における機能を考察した。(2)においては、放線菌二次代謝産物を対象にスクリーニングを行なった。腸球菌の病原性プロテアーゼ発現の阻害を一次スクリーニングの指標とした。次に、腸球菌の病原性プロテアーゼ発現を誘導する因子GBAPの生産阻害を二次スクリーニングの指標とした。約200株の放線菌を土壌より分離し、培養液上清を一次スクリーニングに供した。阻害活性株は、さらに二次スクリーニングに供した。両アッセイで最も強い活性を示したQU-Y33-1株を選択し、阻害物質Y33-1を単離精製した。Y33-1は1μM以下の濃度で、腸球菌のプロテアーゼ生産およびGBAPの生産を阻害した。腸球菌自身の増殖は10μM以上で阻害した。Y33-1は腸球菌のfsr制御系を標的としたQS阻害剤であると考えられ、新しいタイプの抗感染症剤のリード化合物として期待される。クオーラムセンシング(菌密度依存的遺伝子発現制御機構)は近年の細菌学において大変注目されている細菌界で広く見られる現象である。特に、病原性細菌の病原因子発現がこのクオーラムセンシングにより制御されている例が多く報告されていることから、クオーラムセンシングはポスト抗生物質薬剤開発のターゲットの一つとして注目されている。本研究は、申請者が発見した腸球菌の病原性プロテアーゼの発現制御に関わるクオーラムセンシングを標的とした薬剤の開発を最終目的としている。具体的には、そのクオーラムセンシングにかかわる二つの分子をターゲットに薬剤開発を進めている。一つは、クオーラムセンシングの誘導因子である環状ペプチドフェロモンGBAPの受容体FsrC拮抗剤の開発である。これに関しては、種々のGBAPアナログを合成し構造活性相関実験を行うことから始めている。これまでの研究から、GBAPの活性には環を形成している9アミノ酸残基のコアの部分だけでなく、N末端2残基のテール部分をその活性およびFsrCへの結合に必須であることは示唆された。もう一つはGBAPの生合成酵素であるFsrBをターゲットとした薬剤の開発である。これに関しては、まずFsrBの阻害を検出するためのアッセイ系を構築した。臨床分離株からFsrBのフレームシフト変異株OU510株を見出し、OU510株を指不菌として利用することでGBAPの定量が正確に行えることが判明した。現在OU510株を用いて、GBAP生合成阻害剤を生産する放線菌のスクリーニングを行っている。

さらにFsrBの腸球菌における大量発現系の構築にも成功した。本発現系を用いることで、今後、FsrBのGBAP生合成における詳細な分子機構を解析できるものと考えられ、それらの情報からFsrB阻害剤の開発のヒントが得られるものと期待される。クオーラムセンシング(菌密度依存的遺伝子発現制御機構)は近年の細菌学において大変注目されている細菌界で広く見られる現象である。特に、病原性細菌の病原因子発現がこのクオーラムセンシングにより制御されている例が多く報告されていることから、クオーラムセンシングはポスト抗生物質薬剤開発のターゲットの一つとして注目されている。本研究では、申請者が発見した腸球菌の病原性プロテアーゼの発現制御に関わるクオーラムセンシングを標的とした薬剤の開発を最終目的として、この腸球菌のクオーラムセンシング阻害剤を放線菌二次代謝産物よりスクリーニングした。腸球菌の病原性プロテアーゼ発現の阻害を一次スクリーニングの指標とした。次に、腸球菌の病原性プロテアーゼ発現を誘導する因子GBAP(gelatinase biosynthesis-activating pheromone)の生産阻害を二次スクリーニングの指標とした。約200株の放線菌を土壌より分離し、培養液上清を一次スクリーニングに供した。阻害活性株は、さらに二次スクリーニングに供した。両アッセイで最も強い活性を示したQU-Y33-1株を選択し、阻害物質Y33-1を単離精製した。Y33-1はμM以下の濃度で、腸球菌のプロテアーゼ生産およびGBAPの生産を阻害した。腸球菌自身の増殖は10μM以上で阻害した。つまり、Y33-1は腸球菌のクオーラムセンシング阻害剤であると考えられる。現在Y33-1の構造解析を行なっている。
RET融合陽性肺がん薬剤耐性における転写因子を介したシグナル制御機構の解明

肺腺がんに認められるRET融合遺伝子は、数ヶ月程度でRETチロシンキナーゼ阻害薬(TKI)へ薬剤耐性が出現する。本研究では、RET融合遺伝子陽性肺がんの薬剤耐性機構を明らかにし、その制御に向けた知見を得ることを目標に行った。RETチロシンキナーゼ阻害剤バンデタニブ耐性例より、RETタンパク質の活性化ループ上に薬剤耐性変異S904Fを同定した。さらに、分子動力学シミュレーション解析を行うことで、薬剤とキナーゼとの相互作用に変化を引き起こし、アロステリック効果によって薬剤結合が不安定化する過渡的なタンパク構造を誘導させることを見出した(Nakaoku T, et al. Nat Commun. 2018)。現在は、その薬剤による制御機構の解明を行っている。一方で、治療耐性例で2次変異を認めない症例もあり、その他の機構による耐性機構獲得が示唆された。バイパスシグナル経路の探索のため、樹立したRET融合遺伝子陽性ヒト肺がん細胞株LC-2/ad由来の薬剤耐性クローンに対して、抗体アレイを行い、耐性細胞では複数のキナーゼタンパク質の活性化が認められた。また、そうしたシグナル変化をもたらす細胞内の転写因子の活性化を見るために、アレイ型のマルチレポーターアッセイを行い、NF-kBを含む複数の転写因子の活性型認められた。これらのシグナル活性化を惹起するリガンド加えることで、親株における薬剤感受性の低下が認められた。また、活性化タンパク質を抑制する阻害剤をRET阻害剤と併用することで、より高い腫瘍抑制効果が認められ、RETタンパク質とのクロストークが示唆された。同定している候補には、がん幹細胞様形質の獲得に寄与する因子も含まれており、現在は機能解析を行っている。非小細胞肺がん治療にけるEGFR変異やALK融合を標的とするチロシンキナーゼ阻害剤(TKI)は高い奏効性を示すが、治療経過中にほぼ全例で耐性を獲得する。EGFRのT790M等の2次変異の発見は、変異特異的に有効なTKIの開発により克服され、無増悪生存期間の延長につながったが、バイパスシグナル経路形成などにより再増悪に至ることは避けられず、依然薬剤耐性の完全な制御には至っていない。そうした中、報告者らの所属する研究室らにより報告された(Kohno T, et al. Nat Med. 2012)、肺腺がんの約2%に存在するRET融合遺伝子は肺がんにおける新たな治療標的であることが明らかとなってきた(Yoh K, et al. Lancet Respir Med. 2016)。しかしながら、RET融合陽性例においてもほぼ全例でTKIへの耐性が半年程度で出現し、その克服を目指した治療法の開発が求められている。最近、我々はRET融合治療後の耐性獲得症例の資料を解析する中で新たに同定した2次変異S904Fが薬剤耐性に寄与することを報告した(Nakaoku T, et al. Nat Commun. 2018)。しかしながら、治療耐性例で2次変異を認めない場合もあり、その他の機序による耐性機構獲得の可能性も示唆される。本研究では、RET融合遺伝子陽性肺がんにおける薬剤耐性を対象に、主にバイパス経路形成に関わる細胞内因子に着目し、耐性機構解明とその制御に向けた知見を得ることを目標としている。RET融合遺伝子陽性肺がん細胞を株を用いて、がん関連遺伝子のターゲットシークエンスを行い薬剤耐性株での遺伝子変化を調べた。また、薬剤暴露下の細胞内外のシグナル関連遺伝子活性化の変化を調べ、細胞内シグナルの変化を確認し、その機能解析を行っている。薬剤耐性細胞株を作成し、耐性に関わる因子の同定および検証を行った。現在市販されている唯一のRET融合遺伝子陽性ヒト肺がん細胞であるLC-2/adを用いて、バンデタニブおよびカボザンチニブ等の複数のRET阻害剤に対する薬剤耐性株を樹立した。臨床応用の期待されるRET阻害剤に対する耐性株をすでに樹立した。これらのLC2/ad耐性細胞株に対して、癌関連遺伝子90個のホットスポットを調べるターゲットシークエンスを行ったが、遺伝子変化は認めなかった。バイパス経路の探索のため、抗体アレイを行い、耐性細胞では複数のキナーゼタンパク質の活性化が認められた。また、シグナル変化をもたらす細胞内の発現機構を見るために、アレイ型のマルチレポーターアッセイを行い、細胞膜受容体及び複数の転写因子の活性型認められた。また、LC2/ad親株に対して、活性化の認められた受容体に作用するリガンド加えることで、薬剤感受性は実際に低下させた。同定している候補因子には、がん幹細胞様形質の獲得に寄与することが報告されているものも含まれていることを確認し、機能解析を行っている。バイパスシグナル経路の探索のため、樹立したRET融合遺伝子陽性ヒト

肺がん細胞株LC-2/ad由来の薬剤耐性クローンに対して、抗体アレイを行い、耐性細胞では複数のキナーゼタンパク質の活性化が認められた。また、そうしたシグナル変化をもたらす細胞内の転写因子の活性化を見るために、アレイ型のマルチレポーターアッセイを行い、NF-kBを含む複数の転写因子の活性型認められた。これらのシグナル活性化を惹起するリガンド加えることで、親株における薬剤感受性の低下が認められた。また、活性化タンパク質を抑制する阻害剤をRET阻害剤と併用することで、より高い腫瘍抑制効果が認められ、RETタンパク質とのクロストークが示唆された。同定している候補には、がん幹細胞様形質の獲得に寄与する因子も含まれており、現在は機能解析を行っている。候補因子として抽出した、関連する有望な耐性関連遺伝子は、RNA干渉発現抑制やORFレンチウイルスベクター並びにその他経路を抑制する阻害剤を用いて、薬剤の存在の有無によって変動する耐性候補遺伝子に関連するシグナル経路を調べる。その際には、シグナルサーキット形成に関連する成長因子等に着目し、それらのシグナルサーキットにおける機能的な意義を明らかにする。また、その制御によるシグナルの変化を調べ、耐性克服に向けた知見を得ることを目指す。得られた結果を、マウスの移植モデルを用いて検証する他、RET-TKI治療例の臨床検体を用いて、免疫染色解析等にて実際の肺がん症例における意義についても確認していく。細胞内遺伝子の活性化状況を調べるスクリーニングに関わる高額なライブラリーの購入費用およびその解析に関わる外注サービス費用に用いることを目的に、次年度に使用額として繰越計上した。
衛星マルチスペクトルデータを用いた土地被覆時系列分析に関する研究

本研究は、衛星マルチスペクトルデータを用いて土地被覆の経年変化を分析することを目的に、フラクタルを導入した新たな土地被覆変化の分析手法(TAFモデル:multi-Temporal Analysis model with the Fractal using satellite multispectral data)の提案とその実用性について検討したものである。研究の成果は次の3点にまとめられる。(1)観測時期の異なる複数の土地被覆分類図から変化域を抽出する際の技術的な限界を指摘した上で、変化域の広がりの分析にフラクタルを導入しようとする着想に至った意義と本研究で取り扱う範囲を整理した。(2)観測時期の異なる衛星データから複数の土地被覆分類図を作成した上で、市街地へ変化したと判定される画素(変化画素)を抽出した「差画像」を視覚表示するとともに、変化画素の面的分布形態が一定の空間スケール範囲においてフラクタル性を有することが確認された。(3)この変化画素に対して算出されるフラクタル次元を介して「単焦点状型、放射環状型、多心型、複眼型」といった市街地形成パターンが類型化できることが判った。さらに、フラクタル次元と差画像とを相互に参照することによって、将来にわたる市街地の変遷を推定できる可能性を見い出し、提案手法の実用性、発展性を示した。光学センサ、合成開口レーダに代表されるように、高分解能化、多バンド化を目指した衛星搭載センサの開発計画が積極的に推進されている今日、異種衛星データの併用とともに、多時期にわたってデータを活用しようとする研究は、現在世界的にも重要な課題となっている。衛星リモートセンシングとフラクタルといった2つの技術を融合利用するTAFモデルは、これらの課題に十分に対応できる可能性を秘めたモデルであり、衛星データの有効利用技術の一つとして今後の活用に期待できる。
マイクロナノバイオトランスポート機構を基軸にした肝臓組織再生

肝臓組織再生を目的に、物質移動を伴う肝細胞組織の血管化と肝臓組織の形成の実現に取り組み、細胞の自己組織機能を誘導するマイクロナノ環境を見出す事が出来た。積層モデルと、MEMS技術を応用したマイクロ流路モデルにおいて、3次元組織形成に寄与する細胞の振る舞いを明らかにした。血管化に関しては、血管網は、増殖因子の濃度勾配の方向に伸展し、マイクロ流路では間質流によって血管網が効率的に誘導され、周皮細胞形成による血管網安定化や肝細胞による血管網形成の促進という興味深い結果が得られた。(1)再生肝臓組織の再構築組織モデル:積層型培養モデルとマイクロ流路型(MEMS)培養モデルの2種類のアプローチによって、3次元組織を再構築して、組織内の血管化の要因を検討した。(2)組織再構築を実現するための増殖因子の役割:現在増殖因子の濃度勾配を組織内でリアルタイムに計測する手段が開発されていない。そこで、組織のサンプル標本を直接enzyme-linked immunosorbentassay (ELISA)による方法によって、サンプル組織全体の平均値として計測して、その影響に関して検討を行った。増殖因子の濃度場の把握が重要で、今後さらに検討が必要である。(3)星細胞の役割:積層型培養モデルを用いて、星細胞の介在が、肝細胞と血管内皮細胞による3次元組織形成に影響を及ぼす事を明らかにした。(4)血管内皮前駆細胞による血管網形成:分化機能を有する血管内皮前駆細胞を用いて血管網形成を試みた。血管内皮前駆細胞から、多種類の増殖因子が分泌して、血管網を誘導する事が知られている。そこで、積層型培養モデルにおいて、前駆細胞の影響により、3次元血管網が顕著に増殖して、前駆細胞の活用の重要性が明らかになった。(5)葉状仮足による血管網形成の促進:血管網が伸展する先端には、葉状仮足が増殖因子の濃度勾配の方向に伸長する。即ち、濃度勾配により血管網の伸展方向の制御が可能になる。そこで、葉状仮足と3次元血管網形成との関係を明らかにした。(6)マイクロ流路型培養モデルによるアプローチ:MEMS技術を活用して、マイクロ流路を作成し、細胞、増殖因子及び足場の三要素をマイクロ環境で統合する方法が有効である。特に間質流による影響が顕著であることが明らかになり、新しい血管網形成の重要な手法になる事を示した。26年度では、3次元血管網の構築と肝臓組織内の胆管網の形成に関して種々の実験を行い、組織形成に関わる物質輸送の役割に関して検討を行った。特に、幹細胞、肝細胞、血管内皮細胞、星細胞から分泌される増殖因子が近傍の細胞に輸送され、組織形成に至る仕組みに対して実験的なアプローチを行った。1.マイクロ流路による組織形成2.足場の硬さによる血管形成誘導の制御3.胆管と毛細胆管の結合4.計算機シミュレーションによるアプローチそこで、得られた研究実績で重要な点は以下の通りである。マイクロ流路内で、上皮細胞との共培養により、血管内皮細胞による3次元血管網の構築を行った。マイクロ流路内で重要な要因は、間質流の影響によって3次元血管網の構築が促進される点である。間質流の影響として、2つの要因が考えられる。一つは、間質流による微小対流による流体力学的な刺激による影響である。二つ目は、間質流によるバイオトランスポート機構によるプロセスである。両者は相互に関連している要因であり、間質流による対流拡散機構の詳細を明らかにする必要がある。マイクロ流路デバイスの長所は、間質流による対流拡散機構を可視化する事が可能であるという点で、本研究のアプローチの主流となる。血管網形成で重要な点は、血管網を安定化させているペリサイトの存在である。そこで、マイクロ流路デバイスで、血管内皮細胞と間葉系幹細胞の共培養を行ったところ、ペリサイトを伴う毛細血管網が再構築された。血管基底側からVEGFを供給したところ、ゲル環境内にVEGFによる濃度勾配が形成され、血管新生が促進された。ゲル環境において、VEGFの濃度勾配を形成させる事がきる。血管新生モデルにおいて、増殖因子の濃度勾配の形成が、血管網形成のために重要な役割を果たしている事が分かった。正にバイオトランスポートが血管網形成において重要な要因である。27年度では、肝細胞組織構築内における血管網3次元形成の課題にさらに取り組んだ。即ち、1.マイクロ流体デバイスによる組織形成の継続、2.マイクロ流体デバイスにおける3次元肝組織の形成とマイクロゲルビーズによる血管化の促進、3.マイクロ流体デバイスにおける細胞応答、4.バイオトランスポートの計算機シミュレーションに取り組んだ。そこで、得られた研究実績の概要は以下の通りである。3次元血管網の形成には、細胞配置と増殖因子の濃度勾配が、血管径の成長に影響を及ぼす事が明らかになった。正に、バイオトランスポートが血管網形成に主たる影響を及ぼす結果となった。このような血管網形成におけるバイオトランスポートは、マイクロ流路を活用する事により、極めて微細な形態を把握事が出来るので、有効な手段であることが、改めて確認出来た。さらに血管網形成で重要な側面が、血管吻合である。マイクロ流路デバイスによって、毛細血管吻合の条件を実験的に検討を行った。肝細胞組織内での血管網形成が最終的な目的であるが、微小培養環境において、肝細胞供給因子と血管網との相互作用を定量評価する事が出来た。肝細胞組織内で血管網形成が進行する場合には、肝細胞組織内に深く浸透させる必要がある。

即ち、肝細胞組織内で形成された血管伸長がどの程度生じるかを定量的に評価した。バイオトランスポートの計算機シミュレーションに関しては、マイクロ流路内に形成された血管網の3次元形態データを基に、シミュレーションを行うが、対象となる血管網データと肝細胞組織データなどに関して検討を行った。肝細胞組織内における血管形成に関しては、実験データが必須で、培養された細胞の挙動を明確に把握する事が肝要である。本研究では、肝細胞や血管内皮細胞の3次元組織構築の実験結果を重要視しており、実現象を基にして、工学的な考察を加える事によって、より意味のあるバイオトランスポートの検討が出来ると考えている。従って、最初に実験ありきという点では、マイクロ流路による実験が、細胞の3次元組織構築を明瞭に観測でき、本研究の目的に叶った方向で進んでいると考えられる。本研究課題で最終年度の28年度では、マイクロ流路デバイスを活用して、以下の様な課題に取り組んだ。即ち、1.マイクロ流路デバイスによる組織形成の継続的実験、2.マイクロ流路デバイスにおける3次元肝臓組織の形成、3.マイクロ流路デバイスにおける細胞応答、4.バイオトランスポートの計算機シミュレーションである。それらの課題に対して得られた研究実績の概要は以下の通りである。肝臓組織内に血管網を導入する血管化に関しては、肝細胞と血管内皮細胞を共培養すると、血管が肝細胞に向かって伸長して行く。そこで、肝細胞と同程度の大きさを持つマイクロゲルビーズを肝細胞の混成組織を血管化するための要因を明らかにした。さらに、肝細胞が分泌する因子が血管形成を促進するという仮説の基で、肝細胞調整培養液で修飾させたゲル内で3次元血管網が形成された。肝臓組織形成のためのバイオトランスポートとして有用な結果と思われる。さらに、脱細胞化肝臓内で、血管内皮細胞と間葉系幹細胞を共培養させた所、内皮細胞の遊走が見られ、血管新生を誘導する要因として有用な知見と思われた。3次元の血管網形成に関しては、血管網の安定化を達成させるために、間葉系幹細胞と血管内皮細胞との共培養系では、間葉系幹細胞が壁細胞ペリサイトに分化することで、血管の安定化に寄与する事が明らかになり、さらにペリサイトは血管を被覆する事で、血管の成熟化を促し、結果的に血管系の縮小という血管のリモデリングを引き起こしており、血管網形成の安定化の要因として、極めて興味深い結果と思われる。マイクロ流路内で形成された肝臓組織用ネットワークや血管網ネットワークは、共焦点レーザ顕微鏡により得られたスライス画像を、マテリアライズ社が開発したソフトによって、3次元のSTLデータに変換する事が出来、ゲル内の圧力分布や拡散に関してダルシーフローの解析方法を明らかにした。肝臓組織再生を目的に、物質移動を伴う肝細胞組織の血管化と肝臓組織の形成の実現に取り組み、細胞の自己組織機能を誘導するマイクロナノ環境を見出す事が出来た。積層モデルと、MEMS技術を応用したマイクロ流路モデルにおいて、3次元組織形成に寄与する細胞の振る舞いを明らかにした。
「戦後らしさ」とその形成の相関社会科学的研究

以下4分野の研究行った。(1)戦後の理念「戦後日本形成」が日本の近代社会の形成であることはいうまでもないが、それは単純な意味での近代社会の形成であるといえない面を含んでいる。それは欧米の知識人のいう「日本的」な近代社会の形成としての側面である。奥井は「日本問題」という視点から、このような欧米知識人の「戦後日本形成」についての理解の変遷をたどる作業を行った。(2)経済統計から見た戦後戦後は「経済成長」というタ-ムによって、相当のの部分認識され識別される特徴的内容を含んでいる。すなわち、計量戦後史、統計戦後史と形容される面によって特徴付けられている。松原は耐久消費財(自動車をその典型とする)のもつ役割を、生産誘発係数、輸出誘発係数の数値をながめながら論ずることにより、戦後日本の可視的理解に迫る表現法を考案した。(3)地域の研究1岸野は「戦後日本」という盾のもう一つの世界、すなわち没落が一般的イメージとなっている農山漁村の地域調査を行い、戦後日本が漁村においてたどりついた状況を、地域活性化という展望をまじぇながら分析した。(4)地域の研究2奥井は、「戦後日本」が演出された大きな場である「都市」を「アジール」という視点からとらえ、まず東京人の定住過程をたどる作業を行った。
ガス遮断器への新材料適用におけるアーク特性の研究

電力用ガス遮断器の環境負荷低減と国際競争力強化のために、新しい材料を用いた時、どのように遮断性能向上が図られるかを調べることは重要である。本研究では、遮断性能を決定づける遮断器内アークの基礎特性(電子密度や電子温度)に着目し、新材料による遮断性能向上のための基礎データを得ることを目指した。研究の結果、ガス種や高分子材料有無で、電子密度や電子温度の時間・空間変化に大きな差異が現れることが確認できた。現状、実験で用いたアークと実際の遮断器内アークでは発生条件が大きく異なる。しかし、アークの電子密度・電子温度の差異を実測できたことは、今後の研究のための基礎データとして価値があるものである。電力の送配電では系統事故時に事故電流が流れるが、この事故電流を瞬時に遮断して系統に繋がれている機器を保護するために、電力用遮断器が用いられる。70kVを超えるような高い電圧では、SF6ガスを用いたSF6ガス遮断器が一般に用いられている。しかし、SF6ガスは温暖化係数がCO2の約24000倍と高い値を示しているので、環境負荷低減の観点から、SF6の代替ガスの模索が急務であり、そのための研究が盛んに行われている。ガス遮断器では事故電流を遮断する際、電極を機械的に切り離すが、この時に大電流アークが電極間に発生する。遮断の成否は、電流遮断時のアークのプラズマパラメータ、特に電子密度に強く依存すると言われているが、その直接測定は極めて困難であり、このことが代替ガス模索の大きな障害となっている。本研究ではこのような現状に対し、レーザートムソン散乱による電流ゼロ点近傍アークの電子密度や電子温度の実計測法の確立を目指している。これまでに対向電極間で発生させた電圧6kV、電流600A、時定数25μ秒の小規模アーク放電に対して、トムソン散乱法を適用し、その電子密度、電子温度の時間空間的変化を詳細にとらえてきた。遮断器内アークにはノズルの高分子材料や電極接点の金属蒸気(主に銅)が混入し、プラズマ状態を大きく変えてしまうことが知られている。そこで、電極にPTFEチューブを付与した場合や、電極をタングステンや銅タングステンに変更した場合のアーク状態の時間空間変化を明らかにした。これまでに、金属蒸気や高分子材料の混入により、アーク状態が時間空間的に著しく変化することを、電子密度や電子温度といった定量的な数値を用いて示すことができている。本研究では、電力用ガス遮断器の環境負荷低減と国際競争力強化を目的として、遮断ガス及び消弧室を構成する部材に新しい材料を用いた時に、どのように遮断性能向上が図られるかを、遮断性能を決定づける遮断器内アークの基礎特性(アークプラズマの電子密度・電子温度、特に電子密度)を、レーザートムソン散乱法を用いた測定で明らかにすることを目標としている。研究は、まずはアーク放電発生装置、および微弱なトムソン散乱光を検出するための、特殊な分光器の作製から行った。アーク放電の発生は、対向電極(電極間隔1mm)を用いて行った。装置規模の関係上、電圧・電流のピークはそれぞれ8kV、800Aと、比較的小規模とした。このアークの減衰過程(減衰時定数は25μ秒)における電子密度・電子温度の時間変化を、トムソン散乱法で計測した。ガス種によるアーク放電特性の変化を調べるために、真空容器内に1気圧の空気・二酸化炭素・窒素を封入し、トムソン散乱計測を行った。また、電極周辺材料の違いによるアーク特性の変化を調べるために、電極(タングステン製)の周辺に高分子材料(PTFE)を付与した場合の計測も、併せて行った。実験の結果、ガス種やPTFE材料の有無で、電子密度や電子温度の時間・空間変化に大きな差異が現れる事が確認できた。現状では、遮断器内アークとは電圧・電流をはじめ、動作圧力範囲やガス吹付けの有無などで、状況は大きく異なるが、ガス種の変更や高分子材料の混入で、アーク遮断の成否に大きく関与する電子密度・電子温度の違いが実測できたことは、基礎資料として価値があるものである。本研究では、電力用SF6ガス遮断器の環境負荷低減と国際競争力強化を目的として、遮断ガスおよび消弧室を構成する部材に新しい材料を適用して性能向上を図る場合に、その遮断性能を決定するアークの基礎特性(電子密度・電子温度)を、レーザートムソン散乱法を用いた測定等で明らかにする事を目標としている。研究初年度である平成23年度は、そのためのアーク放電発生装置の作製おおびトムソン散乱を検出するための分光器の作製を行った。アーク放電の発生は、直径1mmで、先端が球状になったタングステン電極を使用して行った。電極を対向して配置し、電極間隔0.8mmの所に、約8kV、800Aで、減衰時定数25マイクロ秒のアーク放電を発生させた。今後遮断器内アーク放電を模擬したいので、真空容器内に電極を配置した。

まずははじめに大気中でアーク放電を発生させ、二酸化炭素や窒素、酸素雰囲気中でも、放電が生成できることを確かめた。トムソン散乱計測システムについては、トムソン散乱信号強度が非常に弱いことを考慮し、信号検出の障害となる計測レーザーの乱反射光(迷光)を十分に低減できる差分散型の3回折格子分光器(トリプル分光器)の作製を行った。トリプル分光器の透過率は10%程度で、波長分解能は1nmほどである。これにより、電極表面で発生する迷光を十分に低減した。トムソン散乱計測のためには、計測レーザーのパルス幅(約10ns)より十分に高い精度で検出器(ICCDカメラ)のゲートとレーザーを同期させないとならない。実験当初は放電発生に伴うノイズでこれらの同期がうまくいかなかったが、ノイズカットトランスの使用でノイズ低減を行い、安定した同期精度を確保した。これらの工夫により、大気中アーク放電にトムソン散乱を適用できることを確認した。これまでに、アーク発生のための電気回路および真空容器の構築を行い、二酸化炭素や窒素を充填するためのガス充填設備の構築を行った。さらに、アーク放電の電子密度や電子温度を測定するための、トムソン散乱計測システムの構築を行った。さらに、アーク、計測用レーザー、検出器の同期をナノ秒オーダーで制御可能とした。これらの結果、当初の目標の一つであったアーク減衰過程へのトムソン散乱法の適用を達成した。さらに、もう一つの目標であった、金属蒸気や高分子蒸気混入の影響や、ガス(二酸化炭素、窒素)を変更した時の影響を、アーク発光の様子だけでなく、電子密度や電子温度といった定量値で比較することに成功した。本研究では、遮断器内アーク放電プラズマを模擬した放電を発生させ、それに対してトムソン散乱法を適用し、プラズマの基本パラメータである電子密度・電子温度の計測を行う。最終的には、どのような材料が遮断性能によい影響を及ぼすかを、プラズマの基礎パラメータの計測を通して検討する。本年度はそのためのシステムの土台を作ることが大きなテーマであった。このテーマに対して、実際いアーク放電プラズマを安定的に発生できる電源を準備し、アーク放電を発生させ、トムソン散乱計測を実施し、初期的な散乱光取得を達成した。したがって、本年度に達成すべき目標を、大方達成したといえる。比較的高電圧・大電流の実験であるため、放電発生に伴う電磁ノイズが、予想以上に大きかった。このことがナノ秒の同期精度を必要とするトムソン散乱計測にとっては大きな障害となり、その対策に思った以上の時間を費やしてしまった。また、現在のところ放電時定数の2倍程度(放電発生から50マイクロ秒)までの計測しかできていない。本研究の主旨からすると、電流ゼロ点付近での電子密度・電子温度の計測が重要となるため、今の結果は少々物足りないものである。これは、得られたトムソン散乱光に対して、放電の自発光強度が思った以上に大きかったため、十分なSN比での散乱計測が、遅い時間では困難であったためである。この対策として、計測レーザーのエネルギーの増加や、ゲート幅をより狭くするなどがある。現在最良の方法を検討中である。
気道上皮細胞が作る流れの共焦点マイクロＰＩＶ計測

本年度は、マウスから摘出した気道を用い、繊毛が作り出す流れを共焦点マイクロPIVシステムを用いて可視化計測した。特に、粘液粘度の影響に着目し、粘度増加による繊毛打の変化や、繊毛流れの変化を計測した。その結果、高い粘度環境下においても繊毛打は消滅しないが、繊毛打周波数は低下し、繊毛流れが遅くなることを明らかにした。また、気管と気管支における繊毛流れの違いを調べたところ、両者には大きな違いがないことが明らかになった。これらの実験により、病変等で粘液粘度が高くなった条件下における、気道内における繊毛流れの機能、および粒子の輸送効率を議論することが可能となった。こうした成果は、気道のクリアランス機能の病理を理解する上で重要であり、PCDなどの疾患のメカニズムの理解に役立つと考えられる。さらに、修得したマイクロ流れの計測技術を生かし、微小流体流路内の血液流れなど、他の生物流れの計測も並行して行った。特筆すべきは、PDMSマイクロ流路の壁内にバイパス流路を埋め込むことで、血球成分が壁面から離れ、血漿層の厚みを増幅できることを世界で初めて示した。この壁面形状を、血液に接触する医療機器の表面に応用することで、血液の凝固や溶血などを予防できると期待される。この成果は、国際会議にて口頭発表している。こうした派生的な研究成果も、本課題の研究手法の開発に資するのみならず、特別研究員の将来の活躍の場を広げるものであり、重要である。26年度が最終年度であるため、記入しない。本年度は、まず始めに、気道内の繊毛流れを観察するための実験系を確立した。共焦点マイクロPIVシステムをセットアップし、流速計測が精度よく行えるかキャリブレーションを行った。キャリブレーションにはPDMS製の微小流路を用い、デキストラン溶液にトレーサー粒子を混入して流した。粒子の軌跡をハイスピードカメラで計測しPTV (Particle Tracking Velocimetry)解析を行うことで、速度ベクトルを求めた。そして速度分布を解析解と比較し、計測精度を検証した。その結果、本システムでマイクロスケールの流れ場を精度良く計測できることが確認できた。次に、マウスから気道を摘出し、共焦点マイクロPIVシステムを用いて繊毛流れ中のトレーサー粒子の挙動を可視化した。得られた画像をPTV解析することにより、高さ方向の速度分布および流れの乱れの強さを計測した。また、気道粘液を模擬するため、流体の粘度を変化させた計測も行った。これらの実験により、健常な気道内における繊毛流れの機能および輸送効率を議論することが可能となる。こうした実績は、気道のクリアランス機能の生理を理解する上で非常に重要であり、PCDなどの疾患のメカニズムの理解にも役立つと考えられる。これらの研究でも順調に結果が出てきており、本手法が幅広い生物流れに応用できることが分かった。こうした派生的な研究成果は、本研究課題の研究手法の開発に資するのみならず、特別研究員の将来の活躍の場を広げるものであり、重要である。当初予定していた実験装置の構築、実験・解析技術の習得を予定通りに行えたこと。また、予定通りマウスを用いた実験を実施し、既に興味深い結果が計測できていること。さらに、開発した技術を他の生物流れに応用展開できており、研究の質・量ともに良好であるため。研究を遂行する上での問題点は特にない。今後は、まず始めに、繊毛流れに及ぼす粘液粘度の影響を調べていく。そして、まばらに存在する繊毛細胞の非定常な繊打によって、一定方向の定常な流れが形成されるメカニズムを解明する。
自由液膜流の乱流遷移現象の解明とこれを応用した液体微粒化法の確立

回転している円盤上を流れている液膜が,円盤周端より大気中に放出されてできる放射状自由液膜流れの乱流遷移を調べた。まず,円盤周端より下流に向かうにつれて変化する層流速度分布を数値解析し,液膜はねじれ型速度分布をもっめ流れることを明らかにした。次に,レーザ・ドップラー流速計により液膜内部の速度分布を測定し,数値解析の結果と一致することを確認した。さらに,高レイノルズ数流れにおいて,円盤周端のすぐ下流で急激な乱流遷移が生じることを液面性状の観察より明らかにした。また、遷移に先駆して液面に現れる錯乱波の波長,ねじれ角を明らかにした。現在,これらの遷移が,液面のせん断や気液の相互作用ではなく,液膜内部のねじれ型速度分布に起因して生じていることを明らかにするため,線形安定性理論を適用して調べている。上記の乱流遷移を応用した液体微粒化法の開発のため,拘束の液膜流れが得られる実験装置を製作し,遷移に伴って液体の微粒化が起こるか否かを調べた。その結果,遷移直後で液膜に穿孔が生じ,孔の中に,粒径20mum程度の微小液滴が飛翔していることを写真撮影して確認した。穿孔が生じる条件(円盤直径,液膜速度,液膜厚さなど)および穿孔のメカニズムについては今後の課題である。
ドライアイの病態におけるインフラマゾームの関与についての研究

本研究において必要になるドライアイモデルマウスの構築を行った結果、眼窩外涙腺摘出、眼窩内・外涙腺摘出モデルマウスの有用性を確認した。上記モデルを用いた検討では、インフラマゾーム形成カスケードにおいて必要とされるIL-1β変換酵素(caspase-1)を欠失させたcaspase-1 KO、およびそのwild typeマウスにおいて、眼表面で涙液減少に伴う二次的炎症が生じていた。しかしcaspase-1 KOにおいても涙液中IL-1βの増加が認められたことより、ドライアイによって生じる眼表面の炎症にはインフラマゾームは関連していない可能性が高いと考えられ、我々が提唱した仮説は証明できなかった。平成24年度は、昨年度に予定を前倒しして眼窩外涙腺摘出マウスドライアイモデルを確立できたため、本モデルを使用した動物実験をメインに行った。また、眼窩外涙腺摘出マウスドライアイモデルの有用性および、ドライアイ眼における涙液中IL-1βの上昇の知見に関して、学会発表を国内1報(第116回日本眼科学会総会)、海外1報(ARVO2012)行った。平成24年度の研究実績(1)C57BL/6 (wild type)マウスを用いてドライアイを惹起させた際の角結膜下への炎症性細胞浸潤の程度を組織学的に検討した。その結果、ドライアイ眼において結膜下への好中球主体の炎症性細胞浸潤が観察された。一方で、マウスは本来非特異的炎症反応が出やすい動物であるため、非処置眼と比べて炎症性細胞の浸潤程度に統計学的有意差は認められなかった。(2)次に、好中球がEGFP由来の蛍光を発する遺伝子改変マウス(LysM-eGFPマウス)を用いてドライアイを惹起させた際の角結膜下への炎症性細胞浸潤の程度を検討した。角結膜の伸展標本(whole mount)を作製して検討した結果、ドライアイ眼において結膜下への好中球主体の炎症性細胞浸潤が観察された。しかし検討例数が少なかったこともあり、非処置眼と比べて炎症性細胞の浸潤程度に統計学的有意差は認められなかった。以上のように、マウスを用いたドライアイ症状に誘発される眼表面の炎症性細胞浸潤に関する組織学的解析では、現在のところ十分な結果が得られていない。このため、平成25年度ではこれらの問題をクリアする必要があると考えている。平成25年度は昨年度までに確立した眼窩外涙腺摘出ドライアイモデルマウスの問題点をクリアするため、動物モデルの改良を主に行った。新規に開発した動物モデルの有用性の知見に関して、国内1報の学会発表(第38回日本角膜学会総会)を行った。(1)平成25年度の研究成果これまでのドライアイモデルマウスでは炎症反応の惹起が不十分であった。そのため、より強い炎症を惹起できる可能性がある眼窩内・外涙腺摘出モデルの検討を行った。LysM-eGFPおよびC57BL/6マウスの眼窩内・外涙腺を摘出し、ドライアイを惹起させた際の角結膜の炎症性変化を組織学的に検討した。その結果、ドライアイ眼において結膜下に強い炎症性細胞浸潤が観察され、眼窩外涙腺のみ摘出モデルに比べて炎症反応は有意に強かった。また角膜にも強い炎症性変化が確認された。さらにLysM-eGFPマウスでは、浸潤する炎症性細胞はその多くがeGFP由来の蛍光を発しており、本モデルでは好中球主体の強い炎症反応が見られることが判明した。(2)研究期間全体の成果ドライアイとインフラマゾームの関連を明らかにするため、ドライアイモデルマウスの作製を検討した。種々のモデルのうち、眼窩外涙腺摘出、あるいは眼窩内・外涙腺摘出モデルがドライアイ状態を良好に維持でき、眼表面の炎症を観察するために有用であるモデルであることが判明し、眼表面の炎症性変化を組織学的にも検討した。これらのモデルの眼表面では強い炎症性変化が観察された。さらに眼窩外涙腺摘出モデルでは涙液中のIL-1βが有意に増加していた。しかしインフラマゾーム形成カスケードにおいて必要とされるIL-1β変換酵素(caspase-1)を欠失させたcaspase-1 KOマウスにおいても涙液中IL-1βの増加が認められた。以上より、ドライアイにおける炎症反応にはインフラマゾームは関連していない可能性が示唆された。平成23年度は、当初の予定では培養細胞を用いた実験をメインに行うこととしていたが、caspase-1 knockoutマウス(casp-1 KO)が入手でき、順調に個体数を増やすことができたため、計画を前倒しして動物実験を先行実施することとした。

(1)まず動物実験を行うにあたり、適切なマウスのドライアイモデルが必要となるため、その作製方法について検討した。C57BL/6マウスを用い、マウスドライアイモデルとして既報のベンザルコニウム塩化物点眼、ラットドライアイモデルとして既報の眼窩外涙腺摘出の2法を検討した。その結果、眼窩外涙腺摘出で安定した涙液減少および軽度の角膜上皮障害を惹起できることが判明した。本法は簡単な外科手術で長期間にわたり涙液減少を持続できる。眼窩外涙腺摘出はマウスにドライアイ症状を惹起させる手法として有用であり、我々の実験にも適切と考えられた。(2)次にcasp-1 KO、wild type(WT)マウスに眼窩外涙腺摘出を施し、涙液減少および角膜上皮障害の程度を比較した。その結果、いずれも同程度の変化を示し、明らかな差は見られないことが判明した。また雌雄差も見られなかった。(3)さらに、眼窩外涙腺摘出および正常Casp-1 KO、WTマウスの涙液を採取し、ELISA法にて涙液中のInterleukin-1 beta(IL-1β)を測定した。その結果、casp-1 KO、WTマウスいずれもドライアイ眼において、正常眼と比較して涙液中のIL-1βが増加する傾向にあり、眼表面に何らかの炎症性変化が起こっていると考えられた。Casp-1 KOマウスはIL-1β変換酵素を欠損しているにも関わらず、ドライアイ症状の惹起に伴って涙液中のIL-1βが増加した。これは我々の予想とは反するものであり、その意味するものについては今後詳細に検討していく必要があると考えている。マウスのドライアイモデルを用いた検討は予定を前倒しして進めることができた。またドライアイ症状と角結膜下組織に浸潤する炎症性細胞との相関も、統計学的に有意ではないものの確認することができている。以上より、本研究はおおむね順調に進展していると自己評価した。本研究の中で重要なステップであった、マウスのドライアイモデルを確立することができたことは意義が大きかった。Casp-1 KOおよびWTマウスに眼窩外涙腺摘出を施すことによってドライアイモデルマウスを作製することができた。これらの動物を用いて、ドライアイ症状の惹起により涙液中でIL-1βの上昇が見られることを確認できた。以上のように、ドライアイと涙液中IL-1βの増加に関連があることを示唆するデータが得られており、平成23年度の達成度はおおむね順調に進展していると自己評価した。本年度も動物実験を主として行う。ドライアイ症状と角結膜下への炎症性細胞浸潤の関連を有意差をもって証明するために動物実験を追加する。またドライアイ症状と炎症性サイトカインIL-1βの関連についてmRNAレベルの解析を進める。ドライアイによるIL-1βの産生経路にinflammasomeが関与しているかは現時点では判明していない。我々が予想したものとは異なる機序が関与している可能性も明らかとなってきている。また涙液中IL-1βの由来も明らかではない。本年度は前述のような不明点も解消すべく研究を進める予定である。ドライアイ症状とIL-1βの関連については、タンパクレベルで確認はできているが、mRNAレベルの解析はまだできていない。ドライアイによるIL-