hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
膜融合と切断によりモルフォロジーを変化させるペプチド分子集合体の構築と機能化

研究成果は7報の論文発表に纏めており、その概要は以下の通りである。1)ベンジルエステル基の数が異なる環状トリbetaーペプチドを合成し、それらのペプチドナノチューブバンドルを調製した。表面電位とコンダクタンスはベンジルエステル基の数と共に上昇し、圧電係数はベンジルエステル基を1個もつものが高くなった。2)poly(N-ethyl glycine)-b-(L-Leu-Aib)6とpoly(sarcosine)-b-(L-Leu-Aib)6との混合物からチューブ状分子集合体を調製し、90°Cで熱処理することで両者が相分離したtertiary structureを導いた。3) poly(sarcosine)-b-(L-Leu-Aib)6-Eczとpoly(sarcosine)-b-(D-Leu-Aib)8-Npiのそれぞれを用いてチューブ分子集合体を調製し、両者が接合して相分離チューブ構造(tertiary structure)となることを示した。4)poly(sarcosine)-b-(L-Leu-Aib)8を用いてベシクルを調製し、このベシクルが高い浸透圧抵抗性を示すことを明らかにした。5)両親媒性ブロックポリペプチドの親水性ブロックの末端に、アデニンおよびチミンを結合し、それぞれのチューブを調製した。両者のチューブの会合は抑制されたが、アデニンを呈示したチューブは、チューブ同士の接合の起こることがわかった。6)ヘリックスペプチドー芳香環ーヘリックスペプチドの分子集合体がシートになることを示した。このシートの膜の中央層にはホスト空間が存在し、芳香環ゲスト分子を取り込むことができることを示した。7)βアミノ酸とαアミノ酸とを組み合わせた環状ペプチドが、スタックしてペプチドナノチューブになるとき、αアミノ酸の側鎖がナノチューブ表面に直線上に並ぶことを示した。平成30年度が最終年度であるため、記入しない。2種類の両親媒性ポリペプチドを用いて、相分離ナノチューブを作製することを試みた。一つのポリペプチドは、(L-Leu-Aib)6の疎水性ヘリックスを、もう一方は、(D-Leu-Aib)6の疎水性ヘリックスを有しており、それぞれ分子集合化させるとナノチューブの形状をとった。C末端がメチルエステルの場合、2種類のナノチューブを混合して、特定の温度でインキュベーションすることで相分離ナノチューブを得ることができた。一方、それぞれのC末端にN-エチルカルバゾリル基およびナフタルイミド誘導体を結合し、これらを含むナノチューブを作製後、両者を混合して接合したナノチューブを解析したところ、相分離を維持することが困難であることがわかった。具体的には、エチルカルバゾールからナフタルイミドへの光励起エネルギー移動を観察することで、15°Cでは接合したナノチューブの相分離状態が保たれるのに対し、30°Cでは2種類のポリペプチドが側方拡散により混合することがわかった。膜中でのポリペプチドの側方拡散が、C末端に芳香族を導入することにより著しく促進されることが示された。次に、(L-Leu-Aib)8の疎水性ヘリックスを有するポリペプチドを用いてベシクルを調製し、ベシクルの物性を解析した。ベシクル内外にカリウムイオンの濃度差を設定して、浸透圧によるベシクル破壊挙動を解析した。その結果、直径100 nm程度のベシクルに5x106 Paの浸透圧がかかってもベシクルは破壊されず、(L-Leu-Aib)8の疎水性ヘリックス同士が、インターディジテート構造をとってタイトに会合していることが示唆された。この結果に基づき、ヘリックスがお互いに少し傾いて会合すると、二つのヘリックスの側鎖のイソブチル基が一列に並ぶことが強固な膜を形成する原因であると考察した。本研究の目的の一つに、分子集合体を形成するポリペプチド成分が、相分離あるいは混合することで、それぞれの混合状態に応じたモルフォロジーを形成し、さらに、分子集合体の切断に伴うモルフォロジー変化を誘導する分子システムを確立することがある。これまでは、ポリペプチドの膜内での側方拡散が抑制されており、90°Cの高温にすることで初めて成分の混合が可能であった。今回の研究結果から、ヘリックスペプチドのC末端に芳香族を導入することで、ポリペプチドの側方拡散を劇的に促進できることが示された。一方、(L-Leu-Aib)8ヘリックス同士の会合は極めて強く、隣接するヘリックス間でイソブチル基のかみ合わせが良好であるのがその原因であると推察された。これらのことから、C末端に芳香族を有する(L-Leu-Aib)nヘリックスは、側鎖イソブチル基のかみ合わせに基づいて硬い膜を提供する一方、末端の芳香族基が膜のパッキングを緩め、構成成分の側方拡散を誘導できることがわかった。このように、膜の硬さについて相反する因子を明らかにすることができたことから、動的分子集合体システムの分子設計指針の幅を広げることができた。また、ヘリックス部位の構成成分をLeuからVal等に変えることにより、ヘリックスの会合を弱め、構成成分の混合を促進することも可能と考えられる。実際、Valを含むヘリックスを有するポリペプチドを構成成分とすると、膜の弾性率が低下することを見出している。

このようにダイナミクス制御した分子集合体の調製指針について、構成するポリペプチドの構造に基づいて分子集合体の特性を制御できる因子を、増やすことができ、今後の両親媒性ポリペプチドを用いた動的分子集合体システムの開発について展望が広がった。poly(sarcosine)-b-(L-Leu-Aib)6-OMeおよびpoly(N-ethyl glycine)-b-(L-Leu-Aib)6-OMeの両親媒性ポリペプチドを合成した。各両親媒性ポリペプチドは、水中にてナノチューブを形成した。両者のナノチューブを混合してトリフルオロエタノールを添加することで、ナノチューブの接合が起こることを見出した。リポ酸をpoly(sarcosine)ブロックの末端に導入した両親媒性ポリペプチドを混合し、金のナノ粒子がナノチューブに結合する様子を解析して、ナノチューブの相分離状態を解析した。その結果、50°Cでは、2種類の両親媒性ポリペプチドが混合し、相分離状態は維持されないことがわかった。一方、90°Cに加熱すると、poly(N-ethyl glycine)ブロックが会合することにより、相分離が誘導され、トリフルオロエタノールが系中から除かれることで低温に戻しても相分離が維持されることが示された。次に、二種類の両親媒性ポリペプチドを予め混合しておき、90°Cに加熱して相分離を試みた。しかしながら、相分離は観察されなかった。ヘリックスの会合が強いことが相分離に至らない原因と考え、トリフルオロエタノールを加えて90°C加熱を行ったところ、金のナノ粒子を用いたマッピングにより、相分離を観察できた。この現象は、親水性ブロックの曇点を利用した、均一なナノチューブの相分離を実現した最初の例と考えている。このように、モルフォロジーの変化を伴わず、温度刺激により、構成する両親媒性化合物の親水性ブロックの曇点を利用して、分子集合体であるナノチューブに相分離を誘導できたが、このためには、前もっては考えることができなかった、トリフルオロエタノールの適切な添加が必要であった。両親媒性ポリペプチドの親水性ブロックに、poly(sarcosine)とpoly(N-ethyl glycine)を用いた2種類のポリペプチドを合成した。当初、両者を混ぜて調製したナノチューブは、親水性ブロックの種類が異なるため相分離を誘導すると考えたが、実験を行ってみると、両者は混合した。疎水性ブロックが、両者で同じであることが原因と考えられる。一連の測定を行う中で、poly(N-ethyl glycine)を有する両親媒性ペプチドで調製したペプチドナノチューブが、70°Cに加温することで凝集することを見出した。温度変化で可逆的に凝集、解離したことから、曇点をもつことがわかった。poly(N-ethyl glycine)だけでは曇点を示さないことから、分子集合体表面に、密度高くpoly(N-ethyl glycine)を導入することで、曇点を示すようになったと考えられる。そこで、二種類の両親媒性ポリペプチドを混合してナノチューブを作製し、昇温して相分離を誘導することを試みたが、相分離には至らなかった。疎水性ヘリックス間の会合が強いと考え、トリフルオロエタノール存在下に昇温したところ、ナノチューブに相分離を認めることができた。このように、相分離ナノチューブを得るには、幾つかの重要な要因があることを見つけ、それらの要因を解決することで、相分離現象に繋げることに成功した。
消費者市民社会の持続可能性を支える環境意識の形成過程に関する研究

環境配慮意識の形成に係る生活知識・スキル獲得のための教育手法を検討した。その結果は以下のとおりである。(1)教育手法の検討:日常生活に由来する環境問題を取り上げ、「自分の問題」が「社会の問題」につながっていることに気付くための授業実践を試みた。大学生を対象とし、1環境意識形成に影響する生活知識・スキルに関する意識調査を行い、2日常生活に由来する環境問題の中からテーマを設定してグループディスカッションを行った。3さらに、テーマに係るドキュメンタリー映画を鑑賞後、再度グループディスカッションを行った。13のアクティブ・ラーニングを通し、SDGs(持続可能な開発目標)と日常生活との係わりについて、理解がどのように深まっていくかを分析した。取り上げたテーマが身近なものであり、よく知っている内容だと考えていた学生も、グループディスカッションを繰り返し行っていく過程で、自分とは異なる見方があることを知り、問題の複雑さ・捉え方の多様性に気付くことが明らかとなった(木村)。(2)教育手法の評価基準の検討:生活知識・生活スキルを身に付ける教育機会については、小中高における家庭科の授業が想定される。そこでESD(持続可能な開発のための教育)を意識した家庭科の授業を行うためのチェックシートを開発し、授業の有効性を検証する評価基準を作成した。このことによって、授業者自身が「ESDとして身につけたい能力」とは何かを明確に意識することができた(佐藤)。(3)消費・環境分野における教材の検討::ICTを活用した家庭科の教材開発及び授業実践を行い、消費・環境領域においてICTを活用することにより指導力が向上し得ることを明らかにした。日韓における小学校家庭科の教育課程や教科書の内容について、共通点・相違点を比較したところ、同じ題材であっても、それを取り上げる領域や学習内容に違いがあることがわかった(鄭)。生活知識・生活スキル獲得および環境配慮に関する意識調査を実施した。この結果を踏まえて、グループディスカッションや映像を活用したアクティブ・ラーニングを実施し、その効果を検証することができた。調査や教育手法については、国内での調査を主として進めて詳細な分析を行った結果、評価基準や教材などの有効性を確認することができた。以下の点について、日韓の比較を行う。(1)大学生の環境配慮意識に関する意識調査を実施する。国内での調査結果を踏まえて、環境意識形成への影響因子を分析する。(2)生活知識・生活スキル獲得に対するアクティブ・ラーニング等の有効性を比較検討する。(3)消費者市民の環境意識を培う教育手法を提案する。環境に配慮したライフスタイルの創造は消費者市民社会を実現するための基盤である。こうした考えのもとに、市民の環境意識の形成に影響を及ぼす「生活知識・生活スキル」の獲得の実態を明らかにし、環境意識を培う教育手法を提案することが本研究の目的である。29年度は、生活知識・生活スキル獲得に関する調査の枠組みを設定し、予備調査を行うとともに、教育手法としてのゲーミング・シミュレーションの可能性を探った。(1)調査の枠組み設定:生活知識・生活スキルを身に付けるための教育の機会は、小中高等学校では、家庭科での授業がまず考えられる。研究分担者である佐藤は、家庭科はESD(持続可能な開発のための教育)の観点からも、本研究における環境意識の形成に寄与する可能性があることを明らかにした。(2)予備調査の実施:研究代表者である木村は、佐藤の結果を踏まえて家庭科の衣生活分野に着目し、大学生の生活知識・生活スキルを調査するとともに、環境意識と行動との関連性を分析した。具体的には、洗濯に関する知識や環境に配慮した洗剤・水使用に関する知識と、実際の洗濯行動とを調査・分析した。また、研究分担者である鄭は、家庭科における消費生活・環境領域の教材研究において、大学生によるICTを活用した教材開発及び授業実践を通した生徒の学習効果を明らかにするとともに、この分野における日本と韓国の生徒の意識の違いを検討した。(3)教育手法の開発:以上のような意識調査を行う一方、環境意識を培う教育手法としてゲーミング・シミュレーションに着目しており、その可能性を探るため、木村はディスカッションや映像をとおした授業実践を試みた。大学生の生活知識・生活スキル獲得に関する実態調査のための予備調査を実施し、調査の枠組みを検討することができた。この結果を整理することにより、30年度以降に予定している日本と韓国での調査を進めていく。ゲーミング・シミュレーションについては、授業への導入を試みており、教育効果の評価・分析を進めている。

そこでESD(持続可能な開発のための教育)を意識した家庭科の授業を行うためのチェックシートを開発し、授業の有効性を検証する評価基準を作成した。このことによって、授業者自身が「ESDとして身につけたい能力」とは何かを明確に意識することができた(佐藤)。(3)消費・環境分野における教材の検討::ICTを活用した家庭科の教材開発及び授業実践を行い、消費・環境領域においてICTを活用することにより指導力が向上し得ることを明らかにした。日韓における小学校家庭科の教育課程や教科書の内容について、共通点・相違点を比較したところ、同じ題材であっても、それを取り上げる領域や学習内容に違いがあることがわかった(鄭)。生活知識・生活スキル獲得および環境配慮に関する意識調査を実施した。この結果を踏まえて、グループディスカッションや映像を活用したアクティブ・ラーニングを実施し、その効果を検証することができた。調査や教育手法については、国内での調査を主として進めて詳細な分析を行った結果、評価基準や教材などの有効性を確認することができた。(1)日韓の大学生の生活知識・生活スキル獲得に関する調査枠組みの確認と最終調査票を作成する。予備調査の結果を踏まえ、環境意識の形成過程に及ぼす生活知識・生活スキルの影響分析や、ゲーミングシミュレーションの設計を踏まえて、最終調査票を作成・実施する。(2)大学生への実態調査の分析結果を踏まえ、生活知識・積極的環境意識を高めるゲーミング・シミュレーションを実施し、消費者教育や家庭科教育におけるゲーミングの教育効果を検証する。(3)実態調査の結果およびゲーミング・シミュレーションの教育効果を踏まえて消費者市民の環境意識を培う教育手法を提案する。以下の点について、日韓の比較を行う。(1)大学生の環境配慮意識に関する意識調査を実施する。国内での調査結果を踏まえて、環境意識形成への影響因子を分析する。(2)生活知識・生活スキル獲得に対するアクティブ・ラーニング等の有効性を比較検討する。(3)消費者市民の環境意識を培う教育手法を提案する。29年度中は各自が本研究テーマに基づき研究を進めてきたが、調査範囲が国内のみに留まったこともあり、当初予定していた助成金の使用が抑えられたと考えられる。30年度は韓国での調査活動を進める計画であり、旅費ならびに調査実施費用、調査結果の整理等への謝金を予定しているため、この活動に助成金を使用する。2018年度は、国内を中心に研究調査を進めたため、当初予定していた助成金の使用が抑えられたと考えられる。2019年度は韓国での調査活動を進める計画であるため、旅費ならびに調査実施費用、調査結果の整理等への謝金を予定しており、こうした活動に対して助成金を使用する。木村美智子、家庭科教育の現状と課題、茨城県教育研修センター主催研修講座、2017年
培養中脳切片におけるドパミンニューロン死実験系の確立

ラット新生仔中脳切片の培養法とその培養切片における細胞死評価系を確立することならびにNMDAの生存への影響について検討した。はじめに中脳切片培養の至適条件を検討し、培養切片についてドパミンニューロンを特異的に標識する抗チロシン水酸化酵素(TH)抗体を用いて免疫組織化学染色を行った。その結果、顕微鏡下でのドパミン神経細胞数の評価系が確立された。また、初代培養系で観察されたNMDA受容体作用薬であるNMDAのドパミンニューロンに対する毒性について調べた。NMDAの24時間投与により中脳ドパミンニューロン死が惹起された。さらに、黒質ドパミンニューロンの主要な投射領域である線条体の切片を中脳切片と共培養し、黒質-線条体ドパミン神経系のin vitroにおける再構築を行った。その結果、中脳と線条体を接触させた共培養では線条体領域における中脳ドパミンニューロン突起伸展が観察された。しかし、小脳と接触させて共培養した小脳領域および線条体と接触させずに共培養した線条体領域ではドパミンニューロンの突起伸展は観察されなかった。次にNMDA誘発ドパミンニューロン死に対する共培養の影響について検討した。NMDA誘発ドパミンニューロン死は線条体と接触させた共培養により中脳単独培養切片に比べて減少した。しかし、小脳と接触させた共培養および線条体との非接触共培養によりNMDA誘発ドパミンニューロン死は影響を受けなかった。以上の結果は中脳ドパミンニューロンの線条体への投射はNMDA誘発ドパミンニューロン死を減弱することを示唆する。
男女差から検討するたこつぼ型心筋症の病態解明

本研究は、たこつぼ型心筋症患者における、全身で起こっている自律神経系、内分泌系の評価、採血サンプルで得られるアドレナリン受容体の遺伝子多型タイプの抽出、並びに心筋局所で起こっている事象を評価するため、心筋でのカテコラミン、エストロゲンの遺伝子発現量について検討を行い、男女差を比較することで病態解明に繋げることを目的としている。自律神経系の精査目的に行う高分解能Holter検査は、ストレスを契機に発症することから交感神経系賦活化が急性期に認められることが定説であったが、副交感神経系の働きがほとんど認められない状況となり、交感副交感神経のバランスが崩れている可能性を見出しているが、この検討における男女差は現時点で見出していない状況である。心筋生検により遺伝子発現も男性1例、女性1例の検討であるため差異については症例数の追加をもって解析を行っていく。たこつぼ型心筋症は稀な疾患であり、例年より発症する方の数が少ないこともあり登録数が少ないのが現状である。自律神経系の精査目的に行う高分解能Holter検査は、以前から登録していたものを合わせ50例(男性12例、女性38例)の登録を行うことが出来ており、解析を行っている段階である。ストレスを契機に発症することから交感神経系賦活化が急性期に認められることが定説であったが、副交感神経系の働きがほとんど認められない状況となり、交感副交感神経のバランスが崩れている可能性を見出している。また、たこつぼ型心筋症発症急性期の心筋生検を行い、遺伝子発現を精査は男性1例、女性1例で行っており解析を進めている状況である。たこつぼ型心筋症は、急性冠症候群の2%程度と言われており、稀な疾患であるとされる。さらに、たこつぼ型心筋症は女性が80-90%の割合を占めており、男性のたこつぼ型心筋症は非常に稀である。特に男性のたこつぼ型心筋症の登録が不可欠であり、付属病院である東海大学八王子病院、大磯病院、東京病院に入院した方の登録をお願いすることとしている。たこつぼ型心筋症急性期の心筋検体の検査費に使用予定であったが、たこつぼ型心筋症自体の登録が少なかったため繰越金が発生しました。次年度におきましては、検査費、学会参加費に対する使用を主に考えております。2019年度請求分+繰越金は1300000円+500361円となります。
胆道系細胞における化学発癌の可能性とその短期検出法の開発と応用に関する研究

胆道癌は極めて予後が悪く、本邦はその高率発生国であるが、臨床及び疫学データは本症が化学発癌であることを示唆しているものの、その発癌因子については殆んどわかっていない。本研究は胆道癌の化学発癌因子をスクリーニングする方法を開発し、膵胆管合流異常の胆道癌発癌過程での関与が推測されているphospholipase A_2、lysolecithinなどのDNA傷害性を検討することを目的とし、胆道癌発癌因子スクリーニングモデルとしてウシ胆嚢、胆管及びヒト胆嚢粘膜上皮初代培養細胞を用いて、不定期DNA合成検出法、アルカリ及び中性溶出法でDNA傷害性を検討した。既知発癌物質のなかで、実験動物に胆道癌を誘発しているMNNG、ENNG、AFB_1、DNN、MCAはいずれも胆道粘膜上皮細胞に対し、DNA傷害性を持つことが明らかとなったが、その活性化における肝ミクロゾーム分画要求性は異なっており、これにより発癌過程での胆道粘膜への接触ルートの違いにつき推測した。また、この活性化機構には種差があり、ヒトではDMN、MCAは胆嚢粘膜でも活性化され、直接DNA傷害性を示すことが判明した。アルカリ及び中性溶出法は不定期DNA合成検出法よりさらに鋭敏な方法で、これらはいずれもDNAの二本鎖切断ではなく、一本鎖切断であることがわかった。ここで、AFB_1、DMNは経口的に摂取され、或いは生体内で合成されうる化学物質であることを考慮すれば、これらが胆道癌発癌に関与している可能性も示唆される。一方、phospholipase A_2及びlysolecithinはいずれもDNA損傷性は軽度で、これらが単独で膵胆管合流異常において胆道癌発癌のイニシェーターとして作用する可能性は低いと考えられた。膵胆管合流異常など胆道癌のhigh risk groupが存在することより,その原因として化学発癌が推定される.今年度は胆道系細胞に対する化学発癌物質の検出モデルの作成及びそのモデルとしての妥当性につき検討を行った.これに先き立ち,胆道上皮細胞の初代培養系を開発したが,この系を用い,癌原物質(変異原)によるDNA傷害の修復過程である不定期DNA合成の検出を試みた.初代培養胆道系細胞は活発な定期DNA合成を行うが, Hydroxyureaによりこれを効果的に抑制しえた.かかる条件下で,まず既知発癌物質である4NQOを用い, Autoradiographyにより不定期DNA合成(UDS)を検出したところ,著明にこれを惹起した.そこで実験動物において胆道癌を誘発することが報告されているMNNG, ENNG, DMN, MCA, AFB_1をラット肝ミクロゾーム抽出物であるS-9mixtureを添加,不添加の条件下で作用させ,その胆道系細胞に対するUDS惹起作用を検討した. MNNG, ENNGはS-9mixture添加の有無に拘らずUDSを惹起し, DMNはいずれにおいても誘導しなかった.MCAはS-9mixture添加時にのみこれを誘発し, AFB_1はその添加により,さらに強いUDSを惹起した.これはMNNG, ENNGは経口的に混入した場合,消化管からの逆流によっても胆道系細胞にDNA損傷を誘発することを示し, MCAは腸管から吸収され,肝で活性化されたときにのみこれを引き起こすことを意味している.さらに, AFB_1はいずれの接触経路においても作用しうるが,肝で活性化され,胆道に排泄されたときにさらに強い遺伝子毒性をもつと推測される.DMNがUDSを惹起しなかった理由は不明だが,アルカリ溶出法により検討したところ, DNA損傷を誘発しうることが判明した.

従って次年度はアルカリ及び中性溶出法により,胆道癌ハイリスク疾患において胆汁中に見い出される化学物質の胆道系細胞に対する遺伝子毒性作用を検討したい.胆道癌を化学発癌と仮定し、前年度はその発癌化学物質の検出モデルとして、ウシ胆管粘膜上皮細胞初代培養/不定期DNA合成検出法を作成し、既知発癌物質を用いて胆道発癌における発癌物質の接触ルートを推測しえた。しかし、実験動物において胆道癌を誘発しており、しかも経口的に摂取され、生体内で合成される可能性の高いdimethylnitrosamine(DMN)の不定期DNA合成は検出しえず、種特異性と検出感度の二つの問題点が明らかとなったため、さらに鋭敏なアルカリ溶出法を導入し、DMNによるDNA鎖切断を検出し得た。今年度は種特異性の問題を解決するためにヒト胆嚢粘膜上皮初代培養細胞を用いたところ、DMNによる不定期DNA合成が検出され、さらにウシではラット肝ミクロゾーム分画(S9)添加時にのみ陽性であった20-methyl-cholanthrene(MCA)でもS9なしにこれを誘導し、ヒト胆嚢粘膜においてはMCAが活性化されることも判明した。即ち、ヒト胆嚢では、胆汁中にMCAが存在すれば胆嚢粘膜細胞もDNAを傷害しうる。一方、胆道癌のhigh risk groupである膵胆管合流異常症例において、活性化膵酵素及び、これによる胆汁代謝物であるlysolecithinなどの発癌への関与が示唆されているが、その役割は明らかでない。活性化膵酵素であるphospholipaseA_2とlysolecithinを用いてDNA傷害性を検討したところ、不定期DNA合成検出法では、いずれも検出されず、アルカリ溶出法ではともにわずかにDNA鎖切断を惹起したが、対照に比し有意差を認めなかった。従って、これらは単独では胆道癌発癌のイニシエーターにはなり得ないことが推測された。また、経口的に混入しうる既知発癌物質であるaflatoxinB_1、DMNはいずれも胆道粘膜細胞の核DNAの一本鎖切断を惹起し、胆道癌を誘発しうることが明らかとなった。
分子生物学的手法とGFP分子可視化法の併用による受容体構造-機能相関の研究

ATP受容体チャネル(P2X受容体)の構造と機能の関係を探究する目的で,分子生物学的手法による変異導入(アミノ酸置換)を行ない,また,その発現状態を確認する目的でGFP分子可視化法を併用した.これまでの研究で,P2X2受容体タンパク質の細胞外領域のサブクラス間で保存性の高い並列したグリシン残基のうち,247番目のグリシンをアラニンに変えると受容体のイオン・チャネル活性が失われることを見い出している.この領域はtRNAアミノアシルシンテターゼのATP結合部位と構造が似ていると推定されている.tRNAアミノアシルシンテターゼでは,ATP分子のアデニン部分の認識に芳香族アミノ酸残基が関与するとされている.そこで,P2X2受容体のこのグリシン残基付近の保存性の高い芳香族アミノ酸残基である240番目のフェニルアラニンと256番目のトリプトファンに対してアミノ酸置換を行なった.その結果,256番目のトリプトファンがイオン・チャネル活性に必須であり,チロシンで置換した場合には活性が残るものの,他のアミノ酸では活性が完全に消失することが判明した.活性が認められない変異体の細胞膜上への発現はGFPを結合させた受容体の蛍光像および膜分画のウェスタンブロットにより確認された.よって,トリプトファンに対する置換は受容体タンパク質の翻訳あるいはトラフィッキングに影響するのではなく,膜上のタンパク質の構造を変化させるものであることが示唆された.以上の研究より,分子生物学的手法とGFP可視化法の併用が,受容体の構造-機能相関を解明する上で有用であることが示された.この他,チャネル開口部に存在する333番目に中性アミノ酸残基を導入した実験より,この部位のアミノ酸残基がカルシウムのチャネル孔への接近を立体障害的に妨害することを示した.さらに,細胞内のジスルフィド結合が受容体のATP感受性に影響することを示した.細胞外アデノシン三リン酸(ATP)により開口するイオン・チャネル型受容体であるP2X2受容体を発蛍光タンパク質であるEGFPと連結させた複合タンパク質を分子生物学的手法により作製した.PX受容体をコードするcDNAを含むpP2X2-Bluescript II SK(-)プラスミドによりP2X2受容体コード配列を2か所のSacIIサイトで切り出しpEGFP-C1プラスミドに連結し,pP2X2-EGFP-C1プラスミドとした.pP2X2-EGFP-C1よりP2X2-EGFPコード配列をPCRにより複製し,これをpBluescript II SK(-)に連結してpP2X2-EGFP-Bluscript II SK(-)とした.pPX-EGFP-C1をリポフェクトアミン法により哺乳動物株細胞であるMCF-7あるいはC6BU-1に導入し共焦点顕微鏡で観察したところ,蛍光が細胞膜部位に特異的に観察された.また,pP2X2-EGFP-Bluscript II SK(-)によりRNAをin Vitro転写し,これをアフリカツメガエル卵母細胞に注入したところ,ATPにより開口するイオン・チャネルの活性が確認された.このイオン・チャネルのATP感受性はP2X受容体と同等であった.異常のことから,EGFP連結型PX受容体は細胞膜まで清浄にトラフィキングされ,かつ正常な機能を保持しており,細胞内分布等の研究に有用であることが示された.ATP受容体チャネル(P2X受容体)の構造と機能の関係を探究する目的で,分子生物学的手法による変異導入(アミノ酸置換)を行ない,また,その発現状態を確認する目的でGFP分子可視化法を併用した.これまでの研究で,P2X2受容体タンパク質の細胞外領域のサブクラス間で保存性の高い並列したグリシン残基のうち,247番目のグリシンをアラニンに変えると受容体のイオン・チャネル活性が失われることを見い出している.この領域はtRNAアミノアシルシンテターゼのATP結合部位と構造が似ていると推定されている.tRNAアミノアシルシンテターゼでは,ATP分子のアデニン部分の認識に芳香族アミノ酸残基が関与するとされている.そこで,P2X2受容体のこのグリシン残基付近の保存性の高い芳香族アミノ酸残基である240番目のフェニルアラニンと256番目のトリプトファンに対してアミノ酸置換を行なった.その結果,256番目のトリプトファンがイオン・チャネル活性に必須であり,チロシンで置換した場合には活性が残るものの,他のアミノ酸では活性が完全に消失することが判明した.活性が認められない変異体の細胞膜上への発現はGFPを結合させた受容体の蛍光像および膜分画のウェスタンブロットにより確認された.よって,トリプトファンに対する置換は受容体タンパク質の翻訳あるいはトラフィッキングに影響するのではなく,膜上のタンパク質の構造を変化させるものであることが示唆された.以上の研究より,分子生物学的手法とGFP可視化法の併用が,受容体の構造-機能相関を解明する上で有用であることが示された.この他,チャネル開口部に存在する333番目に中性アミノ酸残基を導入した実験より,この部位のアミノ酸残基がカルシウムのチャネル孔への接近を立体障害的に妨害することを示した.さらに,細胞内のジスルフィド結合が受容体のATP感受性に影響することを示した.ATP受容体チャネル(P2X受容体)の構造と機能の関係を探究する目的で,分子生物学的手法による変異導入(アミノ酸置換)を行ない,また,その発現状態を確認する目的でGFP分子可視化法を併用した.

これまでの研究で,P2X2受容体タンパク質の細胞外領域のサブクラス間で保存性の高い並列したグリシン残基のうち,247番目のグリシンをアラニンに変えると受容体のイオン・チャネル活性が失われることを見い出している.この領域はtRNAアミノアシルシンチターゼのATP結合部位と構造が似ていると推定されている.tRNAアミノアシルシンチターゼでは,ATP分子のアデニン部分の認識に芳香族アミノ酸残基が関与するとされている.そこで,P2X2受容体のこのグリシン残基付近の保存性の高い芳香族アミノ酸残基である240番目のフェニルアラニンと256番目のトリプトファンに対してアミノ酸置換を行なった.その結果,256番目のトリプトファンがイオン・チャネル活性に必須であり,チロシンで置換した場合には活性が残るものの,他のアミノ酸では活性が完全に消失することが判明した.活性が認められない変異体の細胞膜上への発現はGFPを結合させた受容体の蛍光像および膜分画のウェスタンブロットにより確認された.よって,トリプトファンに対する置換は受容体タンパク質の翻訳あるいはトラフィッキングに影響するのではなく,膜上のタンパク質の構造を変化させるものであることが示唆された.以上の研究より,分子生物学的手法とGFP可視化法の併用が,受容体の構造-機能相関を解明する上で有用であることが示された.この他,チャネル開口部に存在する333番目に中性アミノ酸残基を導入した実験より,この部位のアミノ酸残基がカルシウムのチャネル孔への接近を立体障害的に妨害することを示した.
ミオシンナノシステムによる細胞内情報制御

ミオシンやダイニンの細胞内機能をあきらかにする一環として、ミオシン6が相互作用するパートナーをスクリーニングし、その機能を細胞生物学を用いてあきらかにするとともに、我々が世界に先駆けて確立した細胞質ダイニン・モータードメイン発現系を駆使して、電子顕微鏡法、ATPaseキネティックス、FRET法などを用いながらダイニンの構造機構相関を詳細に解析した.ミオシンやダイニンの細胞内機能をあきらかにする一環として、ミオシン6が相互作用するパートナーをスクリーニングし、その機能を細胞生物学を用いてあきらかにするとともに、我々が世界に先駆けて確立した細胞質ダイニン・モータードメイン発現系を駆使して、電子顕微鏡法、ATPaseキネティックス、FRET法などを用いながらダイニンの構造機構相関を詳細に解析した.ミオシンが細胞内でおりなすネットワークの実体をあきらかにするため、ヒトミオシンスーパーファミリータンパク質と相互作用するタンパク質群を、酵母ツーハイブリッド法でヒトcDNAライブラリーからスクリーニングした。このスクリーニングでは、特に、ミオシンスーパーファミリーのなかでも最もアミノ酸配列が変わっているミオシン18と、ミオシンスーパーファミリーのなかでただひとつアクチンフィラメントのマイナス端方向にすべり運動するミオシン6に焦点を当てた。ミオシン18ではそのサブファミリーであるミオシン18Bの尾部領域と相互作用する因子として、プロテアソーム構成タンパク質のひとつが見つかった。培養細胞でのツーハイブリッド実験、GSTプルダウン実験、細胞内タンパク質どうしの免疫沈降実験により、ミオシン18Bとこの因子との相互作用が細胞内で実際におこっていることを確かめた。細胞内輸送系と細胞内のタンパク質分解系の共役を示唆するものとして興味深い。ミオシン6と相互作用するタンパク質としては、膜結合型チロシンキナーゼが見出された。上記のようにして細胞内での相互作用を確認したのち、このチロシンキナーゼの局在の検討、ノックダウンによる機能解析をおこなった。ミオシン6とこのチロシンキナーゼは、エンドサトーシスの初期過程で共役していることが示唆された。ミオシン6は細胞膜から細胞中心方向への輸送を担うモータータンパク質として知られており、本研究の結果と一致する。本研究の目的は、ミオシン尾部領域を通して相互作用するタンパク質群のハイスループットスクリーニングにより、ミオシンスーパーファミリーに属するタンパク質が細胞内でどのようなタンパク質と相互作用し、その結果生じる複合体がどのような機能をはたしているかを明らかにすることである。これまでに、ヒト胎児脳cDNAライブラリーを用いた酵母two-hybridスクリーニングから哺乳類細胞two-hybridアッセイ,GST pull-down,免疫共沈降実験といったin vivo, in vitroにおける一連の結合実験により、ミオシンVIの新規相互作用因子として膜貫通型セリン/スレオニンキナーゼKPI-2を同定した。siRNAによる細胞内在性KPI-2の発現抑制、細胞のトランスフェリン取り込み及び放出の経時的定量的解析、KPI-2の細胞内局在の解析などから、KPI-2が細胞内小胞輸送経路、特に初期エンドソームからリサイクリングエンドソームへの輸送において重要な働きをしていることを明らかにした。また同様に、MYO18Bと相互作用する因子を酵母two-hybridスクリーニングによりヒト肺のcDNAライブラリーより探索し、その結果、相互作用候補タンパク質の一つとして26Sプロテアソーム構成要素Sug1を同定した。また、プロテアソーム阻害剤やsiRNAによるSug1の発現抑制によってMYO18Bタンパク質レベルの上昇が見られたことから、両者が機能的に相互作用していることがわかった。さらに、in vivoユビキチン化実験によりMYO18Bは細胞内でユビキチン化を受けることも明らかにした。(1)ダイニンモータードメイン(MD)の大量発現系を構築し,高純度のMDを得ることに成功した.(2)リンカー末端にGFPを融合し,AAAリングにBFPを融合したMDを用い,ATP加水分解サイクルにともなうリンカーの動きをFRETシグナルの変化として追った.この結果,ATP加水分解にともないリンカーが2つの位置の間を行き来することがわかった.MDには3箇所のATP加水分解部位があるが,そのうちのひとつがこのリンカーの動きにかかわっていた.(3)リンカーの動きがパワーストロークとなってダイニンの動きを駆動するというモデルの当否を確かめるため.MDのさまざまな位置にビオチンタグを挿入し,これをストレプトアビジンでガラス基板上に固定した.リンカー末端近くで固定されたMDは速い微小管滑りを駆動したが,リンカー末端から離れると,しだいに滑り速度は低下し,最後には数十分の一にまでなった.このことは,リンカー末端がレバーアームのように動いているというモデルを支持する.一方,リングを固定してもゆっくりした微小管滑り運動は停止しなかった.この滑り運動は速い滑り運動と同じ方向性をもっていた.このことは,MDによる微小管滑り運動には,パワーストローク機構によるものと,それとはまったく異なる機構によるものがあることを示している(Shimaら,PN4S2006).(4)MDを構成する6個のAAAモジュールのうちAAA1,AAA3,AAA4にはATP加水分解部位があり,AAA2にはADP結合部位があることが変異導入実験であきらかになった.AAA3とAAA4のATP加水分解サイクルはダイニン力発生で中心的な役割を担っているAAA1のATP加水分解と強く共役しており,これらがダイニン力発生でどのような役割を担っているか興味深い.モーターシステムの動態を明らかにするため、われわれは微小管上を滑り運動する細胞質ダイニン組換え体を用い、そのATP加水分解に伴う構造変化と、構造変化に共役した滑り運動機構の研究を続けてきた.昨年度は、負染色電子顕微鏡法を用いた、ダイニンモータードメイン(MD)の構造解析を終了した.

ここでは、レバーアームに相当するリンカーがAAAリングに沿って16nmものスイングをすることが明らかになった.また、ダイニンモータードメインを構成するサブドメインのマッピングも完了した.次に、ダイニンの微小管上での滑り運動を1分子力学計測あるいは1分子FRET/TIRF解析するためのツールの構築に成功した。まず、MDヘテロダイマー形成のためのタグの開発をおこなった.さらにMD上の反応性の高いCys残基をすべて除いたCys-Lightダイニン構築にも成功した.こうしたツールは今後の1分子計測の基礎技術となる.これを用いて、1分子のMDダイマーが微小管上を歩行する様を可視化する.本年度は、ダイニンが微小管上を長距離連続歩行する機構を調べるため、ダイニンモータードメインのヘテロダイマーを構築した.このため、ラパマイシン存在下で安定なヘテロダイマーを形成するFKBPとFRBとともに、やはり安定なヘテロダイマーを形成するMBP (maltose-binding protein)アンキリンリピートタンパク質(off7)を用いることにした.FKBPとoff7を遺伝子上でつなぎ、またFRBとMBPを遺伝子上でつないでヘテロダイマータグ1、ヘテロダイマータグ2とした.ダイニンモータードメインの上流にヘテロダイマータグ1あるいはヘテロダイマータグ2を遺伝子上でつなぎ、これらを細胞性粘菌で発現すると各々安定な単量体モータードメインが得られた。この2種類のモータードメインを混合し、ラバマイシンを加えると、安定なダイマーが得られた.このダイマー1分子は微小管上をGSTでホモダイマー化した分子と同様に長距離連続歩行できた.こうして構築したヘテロダイマー系は、本研究において細胞内でのモータータンパク質の挙動を詳細に調べるのに役立つ極めて重要なツールとなる.たとえば、モータードメインの片側にATP結合ができなくなるような変異を入れ、もう一方は野生型モータードメインとしてヘテロダイマーを作ると、ダイニンでは野生型ダイマーとほぼ同じような長距離歩行をすることがわかった.この実験結果は、ダイニンというモータータンパク質の細胞内での物質輸送機構の理解にあたって重要なカギとなる.さらに、こうしたモータータンパク質の作動機構研究のツールとしてダイニンモータードメイン中の反応性の高いCys残基をすべて他のアミノ酸残基に置き換えたCyslightダイニンの構築をおこなった.このためダイニンモータードメイン中の22残基のCys中12残基をAla, Ile, Valなどに置換した.このCyslightダイニンでは、微小管で活性化されるATPase活性は野生型の半分ほど、Cyslightダイニン上での微小管の滑り運動速度も野生型の半分ほどで、以後の研究に用いるには十分なモーター活性を維持していた.
高転移性転移因子による遺伝子破壊法を用いた生殖関連遺伝子の探索と機能解析

高頻度で転移し,コピー数の多いトランスポゾンdTph1を持つペチュニアW138系統を用いてトランスポゾンによる挿入突然変異体を作製する目的で植物体の集団(1024個体)を育成した。この集団を用いて花粉管や花粉で発現している2つのグルカナーゼ遺伝子PhPOGLUとPhPTGLU内に挿入突然変異体の選抜を試みた.その結果,PhPOGLUにトランスポゾンの挿入が検出された。挿入の位置を調査したところ、56番目のイソロイシンコドンにdTph1の挿入が起こっており、遺伝子のグルカナーゼとしての機能が破壊されていることが確認された。しかし、花粉管伸長には影響が見られず、花粉稔性はホモ変異体で68.4%とやや低下していたが、ヘテロ変異体では30%程度の稔性しかなく、原因がPhPOGLUの突然変異によるものかどうかは確認できなかった。一方、ペチュニアW138の集団からピンクの花弁を持つ雌性不稔pfs系統が得られた。このpfs系統はAn1がトランスポゾンのfoot printより部分的に機能を回復した対立遺伝子(an1-pfs)とAn1にdTph1が挿入した対立遺伝子(an1-w138)をヘテロ接合に持つときに現れ、an1-pfsやan1-w138のホモ接合では雌性稔性は正常になるこれまでに報告のないタイプの雌性不稔であることが明らかになった。一方,イネの葯のESTの発現動態をマイクロアレイで調査,小胞子期の葯で特異的に発現するクローン約90を同定した.これらのクローンの内,Osc4,Osc6の形質転換体4系統は雄性不稔性を示し,これらの後代を展開するには困難であったため,形質転換当代を株保存し再度雄性不稔性の調査を行った.いずれの形質転換体においても稔花粉率が平均で20%以下に減少するとともに,総花粉数が最大で95%減少していた.これらの形質転換体の葯を顕微鏡下で観察したところ,一部にタペート組織の異常が見いだされた.高頻度で転移し,コピー数の多いトランスポゾンdTph1を持つペチュニアW138系統を用いてトランスポゾンによる挿入突然変異体を作製する目的で植物体の集団(1024個体)を育成した。一方,イネの葯のESTの発現動態をマイクロアレイで調査,小胞子期の葯で特異的に発現するクローン約90を同定した.これらのクローンの内,Osc4,Osc6の形質転換体4系統は雄性不稔性を示し,これらの後代を展開するには困難であったため,形質転換当代を株保存し再度雄性不稔性の調査を行った.いずれの形質転換体においても稔花粉率が平均で20%以下に減少するとともに,総花粉数が最大で95%減少していた.これらの形質転換体の葯を顕微鏡下で観察したところ,一部にタペート組織の異常が見いだされた.高頻度で移転し,コピー数の多いトランスポゾンdTph1を持つペチュニアW138系統を用いて植物体の集団(512個体)を育成し,3通りのグループ分けを行った後,各グループについてDNAを抽出した.その結果,8+8+8=24のDNAサンプルを得た.その集団と,昨年度に作成した集団,合計1024個体に対して,花粉管や花粉で発現している2つのグルカナーゼ遺伝子内にトランスポゾンが挿入されて遺伝子が正常に働かなくなっている個体の選抜を試みた.その結果,花粉で発現していたグルカナーゼ遺伝子にトランスポゾンの挿入が検出された.現在,その個体の後代でトランスポゾン挿入の確認を行っている.トランスポゾン挿入のあった個体については,ホモ個体を得て,その花粉形成,花粉管伸長における表現型について野生型との違いを調査する予定である.一方,イネの葯のEST(約2000クローン)の発現動態をマイクロアレイで調査,小胞子期の葯で特異的に発現するクローン約90を同定した.これらの内,2つの遺伝子Osc4ならびにOsc6について,小胞子期の葯に置いてセンス及びアンチセンス方向で発現するコンストラクトを作成しイネに導入した.形質転換体の草型ならびに生育特性は非形質転換体と比較して差異は認められなかったが、全ての形質転換体において花粉稔性が低下していた.

特にOsc4遺伝子をセンス方向で発現させた形質転換体においては稔花粉が殆ど認められなかった.これらの結果より,タペートで発現するOsc4及びOsc6遺伝子が,小胞子の正常な発達に大きく寄与していることが推定された.今後,これらの遺伝子の発現と雄性不稔性との関連を調査する。昨年度ペチュニアW138の植物集団から選抜された、グルカナーゼ遺伝子PHPOGLU内に挿入突然変異のあった個体は、トランスポゾンの挿入位置が既知の配列の外側にあった。そのため、ゲノミックライブラリーを作製して、PHPOGLUのゲノミッククローン単離を行った。現在、塩基配列の決定を行っており、配列に基づいてトランスポゾンの挿入位置が決定される予定である。一方、ペチュニアW138の集団から得られたピンクの花弁を持つ雌性不稔はAnlがトランスポゾンのfoot printより部分的に機能を回復した植物であることが判明した。また、この、花粉はほぼ完全な稔性を持ち、正常型Anlを母本にすると花粉からAnl^<pink>が伝達されることも確認された。それにもかかわらず、anlのホモ個体にAnl^<pink>を交配してもAnl^<pin>kが後代の植物で確認されることはなかった。Anlが種子形成過程で胚や胚乳の成長に何らかの重要な役割を果たしていることが示唆された。昨年度作成したイネの小胞子期の葯で特異的に発現する遺伝子Osc4,Osc6の形質転換体4系統(Osc4pro::senseOsc4,Osc4pro::antisenseOsc4,Osc6pro::senseOsc6,Osc6pro::antisenseOsc6)は雄性不稔性を示し,これらの後代を展開するには困難であったため,形質転換当代を株保存し再度雄性不稔性の調査を行った.いずれの形質転換体においても稔花粉率が平均で20%以下に減少するとともに,総花粉数が最大で95%減少していた.これらの形質転換体の葯を顕微鏡下で観察したが,非形質転換体と比較して極端な形態的差違を見いだすことはできなかったが,一部にタペート組織の異常が見いだされた.これらの形質転換体におけるOsc4,Osc6の機能を推定しこれらの遺伝子による雄性不稔性への影響を正確に評価するためには,電子顕微鏡による観察が必要であると思われる.
細胞外シグナルと細胞内調節の相互作用による器官形成ロジックの多元的理解

本研究では、細胞アイデンティティー決定において重要な役割を果たす鍵転写因子や発生制御に関わる細胞間情報伝達因子の同定を行うことを目的とした。CLE9遺伝子とCLE10遺伝子は同一の成熟ペプチドをコードしている。CLE9ペプチドは、維管束においては原生木部、葉においては孔辺細胞前駆細胞で発現しており、CLE10ペプチドは葉においては孔辺細胞前駆細胞で発現していた。CLE9/10は気孔前駆細胞と道管前駆細胞では全く別の受容体(前者ではHSL1、後者ではBAM)によって受容され、それぞれ気孔数と道管数を制御していることを確定し、論文として公表した。また、師管で発現するDof転写因子群の解析をおこない、これが篩部と原形成層の細胞列の数を制御するとともに篩部前駆細胞で発現するCLE遺伝子の発現制御をしていることを見出した。これらの篩部前駆細胞で発現するCLEペプチドは篩部への分化の負の制御因子として働いていた。篩部で働くDof転写因子群と細胞間情報伝達因子の協調作用によって篩部のパターンが形成される様が明らかになってきた。また、本研究では、内鞘細胞のアイデンティティーを決定する転写因子の同定を行い、これら因子をコードする転写因子の多重変異体を作成した。突然変異体では側根原基が減少していた。これらの一群の転写因子は過剰発現では異所的に内鞘細胞アイデンティティーを付与することを以前に見出している。これらを合わせて解釈すると、これら転写因子群が内鞘細胞のアイデンティティーを決定する鍵因子であると言える。平成29年度が最終年度であるため、記入しない。植物の様々な細胞がどのようにしてそれぞれのアイデンティティーを獲得するのかを理解する事は発生生物学上極めて重要である。細胞は自らの置かれた状況を認識し、遺伝子発現制御を介して特異化する。多くの場合、少数の転写因子が中心となって遺伝子発現ネットワークを支配している。そういった転写因子を同定することは一つの研究目的である。本研究では、内鞘細胞、師部、根冠細胞のアイデンティティー決定に関わる転写因子を見いだす為のスクリーニングを行なった。まず、細胞タイプ別のトランスクリプトームのデータを用いて各細胞タイプ特異的に発現する転写因子遺伝子を選び出した。これらを、細胞タイプ特異的にGFPを発現するシロイヌナズナに導入し、過剰発現、転写抑制ドメインを融合して発現、転写活性化ドメインを融合して発現を行い、細胞タイプマーカーとなるGFPの発現パターンが変化するかどうかを指標にスクリーニングを行なった。その結果、過剰発現などにより細胞タイプを変える能力を持つ遺伝子を複数見いだした。内鞘細胞については、転写促進ドメイン融合遺伝子の発現により内鞘細胞アイデンティティーマーカーを誘導し、転写抑制ドメイン融合遺伝子の発現により内鞘細胞マーカーの消失と側根形成の阻害を引き起こす遺伝子を見いだした。スクリーニングにおいては、転写因子の細胞間移動の可能性も考え、当初計画よりも規模を大きくして行なった。その他、過剰発現により師部アイデンティティーを調節する能力のある転写因子遺伝子も見いだした。本研究においては、植物の師部構成要素、内鞘細胞、及び根冠の細胞の分化を制御する鍵転写因子を同定することが大きな目標である。また、それらの転写因子により制御される遺伝子の解明も目標としている。昨年度に引き続き、細胞タイプ別のトランスクリプトームのデータより選んだ師部、内鞘細胞、または根冠細胞で特異的に発現している転写因子遺伝子を異所的に発現させ、これらの細胞が異所的に現れることを指標としたスクリーニングを行った。その際、師部、内鞘細胞、根冠細胞特異的にGFPを発現しているマーカー系統を用いた。師部に関しては、原生師部マーカーGFP系統であるS32以外に、師部伴細胞マーカーであるSUC2プロモーター:GFP系統も用い、師部分化をより詳細に観察した。その結果、伴細胞を誘導する能力がある転写因子、内鞘細胞を誘導できる転写因子などが見出された。内鞘細胞を誘導できる転写因子(転写因子No.51)は、内鞘細胞の性質であるオーキシンに応答した細胞分裂能を与えることも明らかにした。転写因子は、複合体として働くことがある。細胞タイプ決定因子と相互作用する転写因子を見出すため、産総研との共同研究を行った。支援班が関与して開発したシロイヌナズナ転写因子個別ライブラリーを用いた酵母2ハイブリッドスクリーニングにより、内鞘細胞を誘導できる転写因子はヘテロ複合体を形成して働いていることを見出した。また、発生を制御する分泌型ペプチドシグナル分子(CLE9)も見出した。CLE9は葉の表皮幹細胞で特異的に発現しており、葉の表皮幹細胞数を抑制していること、同じCLEグループの中でも、CLV3は葉の幹細胞には働かないのに対して、CLE9は葉の幹細胞数を抑制すること、葉の幹細胞抑制は新規の機構が関わっていることなどを見出した。植物の重要な細胞タイプでありながら、その分化の仕組みが明らかになっていない細胞として、師部細胞、内鞘細胞、根冠細胞がある。これらの細胞タイプを支配する転写因子を見出した。また、これらの転写因子の働きを理解するために、これら転写因子と相互作用する転写因子見い出すためのスクリーニングを、研究分担者との共同研究によっておこなった。研究分担者は、転写因子ライブラリーを用い、自動化した酵母2ハイブリッドスクリーニングを開発したので、信頼性の高いスクリーニングを行い、内鞘細胞決定因子が複合体で働くことを明らかにできた。また、これら転写因子の過剰発現体を用いたマイクロアレーにより、下流の制御系も明らかになりつつある。