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アレクサンドル・ゲルツェンの思想を中心とする近代ロシア社会思想の包括的研究

平成13年度はコロンビア大学付属図書館が所蔵する「バフメーチェフ・アーカイヴ」のうち、Rodichev papersにより、19世紀末のリベラルの活動家ロジチェフに対するゲルツェンの影響について調べた。これは「ゲルツェンとロジチェフ」と題し、『横浜国立大学教育人間科学紀要III(社会科学)』(no.5,2002,pp25-40)に発表された。平成14年度はゲルツェンと同時代人で12歳年上の思想家チャアダーエフとゲルツェンの個人的な友好的関係とは裏腹な思想上の対立について考察した。その成果は「ゲルツェンの見たチャアダーエフ」と題し、『横浜国立大学教育人間科学部紀要III(社会科学)』(no.6,2003,pp.-16)に発表された。平成15年度は40年代のゲルツェンの哲学的著作である『学問におけるディレッタンチズム』を考察し、ゲルツェンのヘーゲル左派的立場の特質について論じた。この成果は「ゲルツェン『学問におけるディレッタンチズム』覚書」と題し、『ロシア思想史研究』第一号(2004年)に発表された。平成16年度は最終年であったことから、これまでのゲルツェン研究を改めて歴史的に跡付け、ゲルツェン研究の今日的意義を確認した。その過程で出会ったアイリーン・ケリー(Aileen Kelly)のゲルツェン研究『Toward Another Shore』(1998,Yale University Press)に対する書評論文を書いた。その論文の題は「アイリーン・ケリーのゲルツェン論」。発表の揚所は『ロシア思想史研究』第二号(2005年)である。アレクサンドル・ゲルツェンを中心とした近代ロシア社会思想の包括的研究の第一段階として、本年度は第1にゲルツェンの生涯において最も重要な時期であるニコライ一世の時代について、最新の研究に依拠しつつ、その概要をまとめ6月30日にロシア思想史研究会の6月例会において「ニコライー世の時代について-」と題して発表した。第2に夏休みを利用して行った(ニューヨーク)コロンビア大学附属図書館バラメーチェク、マーカイヴでのゲルツェン関係の資料調査をもとにして「ゲルツェンとロジチェフ」と題する報告を早稲田大学政治経済学部現代政治経済研究所10月例会(10月18日)において行った。いづれの報告も「横浜国立大学教育人間科学部紀要」ならびにロシア史研究会機関誌「ロシア史研究研」に投稿するために、手直し準備中である。近代ロシアを代表する知識人の一人、アレクサンドルゲルツェン(1812-1870)の思想は、19世紀から20世紀初頭のロシアの思想に対して多面的な影響力を持った。従来から語られて来たのは、19世紀後半のロシア的社会主義である「ナロードニキ主義(人民主義)」への影響である。だが、彼の思想の影響は同じ時期のリベラリズムの運動にも認められる。本研究の代表者(長縄)は昨年よりニューヨークのコロンビア大学の所蔵するバラメーチェフ・アーカイヴを調査し、ロシア19世紀の代表的自由主義者フヨードル・ロンチェフ(1854-1933)とゲルツェンの娘ナタリア・ゲルツェンとの交遊の軌跡を辿ることを通して、リベラリズムの運動に対するゲルツェンの思想の影響の跡を実証的に明らかにしようと努めた。本年度の紀要諮文「ゲルツェンとロジチェフ」はこの成果の一端である。近代ロシアを代表する知識人の一人アレクサンドル・ゲルツェン(1812-1870)の思想は19世紀から20世紀のロシア思想に対して多角的な影響力を持ち、今日に到っている。本年度は彼の思想的著作活動のうち、1840年の活動を中心に考察した。その成果の一つが「ゲルツェンの見たチャアダーエフ」である。ここでは、ゲルツェンの同時代人であるチャアダーエフのカトリシズムに対するゲルツェンの批判的見解を紹介した。もう一つの成果

「ゲルツェン『学問におけるディレタンチズム』覚書」では、ゲルツェンのヘーゲル哲学理解を分析し、ロシアにおけるヘーゲル哲学受容の一端を明らかにした。近代ロシアを代表する思想家、アレクサンドル・イヴァノヴィチ・ゲルツェン(1812-1870)の思想は19世紀後半から20世紀の今日にいたるロシア思想に対して、多角的にして多方面的な影響力を保持し続けている。本年度は、本研究の最後の年でもあることから、そのゲルツェンについての研究を改めて歴史的に跡付け、ゲルツェン研究の今日的意義を明らかにしようと努めた。その過程で、ロシア・ルネッサンス期の最中の1912年、ゲルツェン生誕100年を記念したロシアの各種の雑誌特集を収集し、急進的左翼グループによるゲルツェン論から、穏健な自由主義グループのゲルツェン論まで、多様なゲルツェン論を分類した。また、マーチン・メイリア、アイザイア・バーリン、アンジェイ・ヴァリツキ、フランコ・ヴェントゥーリなどの西欧の研究者によるゲルツェン論とロシア(ソヴィエト)のゲルツェン論とを比較し、その差異を明らかにした。中でも、アイリーン・ケリーの最新の研究『もう一つの岸に向かって』は極めて印象深いもので、本年度はこの著作の書評論文という形、上記の諸研究の包括的なサーヴェイも合わせて行った。従来の西欧とソヴィエトの研究がゲルツェンをロシアの急進的左翼グループのリーダーとして、主として「ナロードニキ主義」の鼻祖、あるいは、ボリシェヴィキ革命の先駆とみなし、彼を革命思想史の枠組みの中にのみ位置づけようとして来たのに対して、ケリーのゲルツェン論の特徴は、20世紀初頭のロシアにおける自由主義グループのゲルツェン論の系統を継承し、さらに、ゲルツェンを西欧の自由主義の流れの中に位置づけようとするバーリンのゲルツェン論をも踏まえ、ゲルツェンの思想がショーペンハウエル、ニーチェの問題関心を共有しつつも、ダーウィン以降の進化論思想をも先取りしていたことを明らかにしたところにある。さらに、ケリーはポスト・モダンの思想の行き詰まりをも克服する要因が、ゲルツェンの思想には含まれているとも主張している。
胃がんに対する腹腔内補助化学療法の開発―腹腔内遊離がん細胞の根治に向て―

われわれは、胃癌に対する腹腔内化学療法をより有効なものとするために、薬剤の持続放出が可能である生体内分解性粒子(Microsphere)に抗ガン剤(FUDR)を封入し、その新しい薬剤を用いた持続腹腔内化学療法の有効性を検討している。現在までに、作製したFUDR封入Microsphereの薬理動態をin vitroとin vivoで検討してきた。In vitroの結果では、FUDRがMicrosphereより持続的に約2週間放出されることが確認された。この放出は封入するFUDR濃度によって影響されなかった。また、Microsphereの素材の配合割合を変化させることにより放出期間をコントロールすることも可能であることが確認された。In vivoの結果では、通常の腹腔内投与であれば腹水中の抗ガン剤濃度は約4時間で検出限界以下となるのに対し、FUDR封入Microsphereであれば血中の50倍程度の抗ガン剤濃度が腹水中に約2週間得られ、持続腹腔内化学療法を可能とすることが確認できた。また、われわれが使用している抗ガン剤(FUDR)は、ヒト胃ガン細胞(MKN45)に対し、時間依存性に抗腫瘍効果が高くなることがMTT試験にて確認された。さらに、免疫不全マウスを使用した腹膜転移モデルでは、抗腫瘍効果がMicrosphereを用いた持続投与が急速投与を上回る事が確認された。現在、免疫不全マウスの腹腔内にMKN45を播種させ、その転移モデルに対する、FUDR封入Microsphereを用いた持続腹腔内化学療法と通常の間欠的腹腔内化学療法の治療効果を比較している。
福祉国家型教育財政の理論と法制に関する歴史的研究

本研究の目的は、(a)1920年代以降の米国における福祉国家型教育財政の理論と制度構想を分析し、(b)その理論と構想が戦後日本の教育財政制度の形成過程に与えた影響を明らかにすることにあった。研究1年目においては、(b)にかかわる研究に主に取り組み、また、それと並行して(a)にかかわる資料収集を行った。2年目にあたる本年は、(a)にかかわる研究にシフトした。1920年代米国における産業化・都市化は学校設置を促進させ、それに伴って教育財政制度改革が展開したことから、当時の教育財政改革に寄与したG. D. StrayerとPaul R. Mortの研究を中心に分析を行った。同時代に日本においてStrayerらの研究を取り入れようとした戦前の教育学研究者、阿部重孝は、「特別交付金」制度構想によって、教育の機会均等を実現しようとしていたことを明らかにした。この成果については、論稿としてとりまとめた。その他、これまでの本研究の成果を学位論文としてまとめた。29年度が最終年度であるため、記入しない。本研究1年目にあたる今年度は、研究目的(b)に関わり、1戦後教育改革期における教育財政関連法案の制定過程、および、2福祉国家型教育財政が戦後教育改革期において日の目を見ようとした際、その実質的な実行部隊となった教育条件整備行政の組織と機能の展開を明らかにした。1については、戦後日本の教育財政関連法案の生成過程を分析する上で必要とされる資料である、CIE文書(Education Finance OfficerのWalter E. Morganによる報告書(Conference Reports))約1,500枚の収集を計画通り完了した。このCIE文書の分析と、教育刷新審議会第18特別委員会の議事録の分析を通して、日本国憲法第26条に対するMorganの解釈、および、アメリカ合衆国からの日本への教育改革に関する指令、教育のナショナルミニマムスタンダードとしての意味合いが教育財政関連法案の制定過程において議論されていたことが明らかとなった。ここでの成果は論考としてとりまとめた。2については、戦後日本の教育改革期における教育条件整備行政として、中央教育行政(文部省)と地方教育行政(教育委員会)に設置された調査(普及)局および調査統計課の各組織構造と、これらの局課が実行した教育条件整備のための教育実態調査の種数の展開と衰退を歴史的に明らかにし、論考としてまとめた。これらの教育条件整備行政によって、義務教育無償化制度樹立のための調査(現「子供の学習費調査」)や、教育財政関連法案のための「地方教育費調査」が実施されていたことが明らかとなった。研究計画を起案した当初は、研究1年目において研究目的(a)にかかわり、1920年代米国における福祉国家型教育財政の理論と法制の生成にかかわる調査研究を進める予定であった。しかしながら、CIE文書の量および分析に必要とされる時間を鑑み、1年目と2年目の計画を逆転させ、研究目的(b)を優先的に進めるほうが妥当であると判断した。研究計画については前後があったものの、資料分析の過程で研究を深化させ、成果も2つの論考としてまとめることができているため、以上の進展状況が妥当であると判断した。研究目的(b)に関する成果を取りまとめることと並行し、1年目の年度末には研究目的(a)にかかわる1920年代米国の福祉国家型教育財政に関する文献収集に移ることができた。具体的には、1920年代から30年代の米国における教育財政の理論および制度構想を明らかにするため、当時の教育行政および教育財政研究の先駆者であるGeorge D. StrayerおよびPaul R.Mortによる主著、そして、その関連資料の収集である。そのため、New York City Library、およびColumbia University Teachers Collegeを訪問し、資料収集を行った(2017年1月30日から2月6日)。したがって次年度においては、研究目的(a)にかかわり、以上の著書を主として、米国における福祉国家型教育財政の理論と法制の内容を明らかにしていく予定である。
がんの不均一性・変動性制御にむけた抗がん剤オーダーメード投薬アプローチ

がんは、発生要因が多様で不均一、かつ形質変動も伴うため、化学療法で一度縮退が見られても薬剤耐性化により再発・進行してしまう場合がある。そこで本研究では不均一性が特に高い卵巣がんを対象に、種々の抗がん剤が、個々のがん細胞に与える変動を解析することで、感受性を維持し悪性度の低い状態に長く留めるためのオーダーメード投薬法を導き出すストラテジーの開発を目的とした。病理組織型・増殖因子感受性・薬剤感受性が異なる細胞、卵巣がんとの関連が示唆されている遺伝子変化・がん幹細胞様populationが認められる細胞などを複数用い、初回・二次化学療法で用いられる薬剤や、卵巣がん発生との関連が示唆されているシグナル伝達経路を阻害する分子標的薬群を数か月間継続処理し、薬剤耐性細胞を複数得た。薬剤処理の前後で、50%増殖阻害濃度測定、増殖速度測定、wound healing assayなどを検討した。その結果、耐性化しやすい細胞・薬剤に傾向が見られ、耐性化薬剤との併用で相乗効果が得られる組み合わせを見出した。また、ある薬剤に耐性となった細胞で、他の薬剤に対しより感受性を示したものもあった。さらに、耐性細胞に対して種々薬剤処理をし、新たな耐性克服薬選出の検討も行った。一方で、より効率的に薬剤感受性を保持させるべく、がん化に関わる因子を変動させる薬剤の検討を行い、見出すことができた。最終段階として、上記の薬剤感受性、がん化因子変動の要因を見出すため、種々解析を行った。その一環として、臨床応用されているいくつかの薬剤に耐性になった細胞についてマイクロアレイ解析を行った。その結果に基づき、ある遺伝子産物の阻害剤を用いたところ、薬剤耐性を減弱する効果が認められた。以上により、薬剤耐性化しやすい細胞・薬剤の情報や、耐性化した場合に次に処理するべき薬剤の選出、すなわちオーダーメード投薬法についての情報が得られた。がんは、発生要因や悪性度が多様で不均一、かつ形質変動も伴うため、化学療法で一度退縮が見られても薬剤耐性化により再発・進行してしまう場合がある。そこで本研究では不均一性が特に高い卵巣がんを対象に、種々の抗がん剤が、個々のがん細胞に与える変動を解析することで、感受性を維持し悪性度の低い状態に長く留めるためのオーダーメード投薬法を導き出すストラテジーの開発を目的とする。卵巣がん細胞は、異なる病理組織型由来の細胞、増殖因子感受性や薬剤感受性が異なることが知られている細胞、卵巣がん発生との関連が示唆されている遺伝子変化が見られる細胞、がん幹細胞様populationが認められる細胞など、性質の異なる細胞を複数用いた。用いる薬剤としては、初回・二次化学療法で用いられる薬剤や、卵巣がん発生との関連が示唆されているシグナル伝達経路を阻害する分子標的薬群を用いた。各細胞に対し、各薬剤を数か月間継続処理(耐性化処理)し、薬剤耐性化した細胞を複数得た。薬剤処理の前後で、50%増殖阻害濃度測定、増殖速度測定、would healing assayなどを検討した。更に得られた耐性細胞に対し、各薬剤単独、もしくは耐性化した薬剤との併用で増殖阻害濃度を測定・比較した。がんは、発生要因が多様で不均一、かつ形質変動も伴うため、化学療法で一度退縮が見られても薬剤耐性化により再発・進行してしまう場合がある。昨年度に引き続き、性質の異なる複数の卵巣がん細胞、種々の抗がん剤を用いて、薬剤耐性化した細胞を複数得た。その結果、耐性が得やすい細胞・薬剤に傾向が見られた。得られた耐性細胞に対し、耐性化した薬剤との併用で種々薬剤を処理したところ、相乗効果が得られる組み合わせを見出した。また、耐性細胞に対して種々薬剤処理をし、新たな耐性克服薬剤選出の検討も行った。産休・育休に入っため、その分後ろ倒しとなっている。まず、複数のヒト卵巣がん培養細胞と、複数の抗腫瘍活性のある薬剤の組み合わせで、薬剤を継続処理することで、薬剤耐性細胞を得る試みを続けていた。育休取得による一時中断のため、それまでに得られていた耐性細胞を凍結により保存していた。細胞を融解し解析しなおしたところ、薬剤耐性が失われたものが複数あった。そこでまずは薬剤耐性を残していた細胞に限定して解析を行うこととした。耐性を保持していたもののうち、ある薬剤に耐性となった細胞で、他の薬剤に対しより感受性を示したものがあったため、細胞内の変動を見出すべく解析を行っている。また、薬剤耐性が不安定な細胞や、薬剤耐性が失われた細胞に関して、再度薬剤耐性を取り直す検討も行っている。さらに、より効率的に薬剤感受性を保持させるべく、がん化に関わる因子を変動させうる薬剤の検討を行った。その結果、卵巣がんのがん化に関わる因子を減少させる薬剤が見出された。今後はそれら薬剤の影響や併用も合わせて解析する予定である。

産休・育休時に一旦凍結した薬剤耐性細胞群を融解し利用しようとしたが、耐性が失われてしまったものが複数あった。そのため細胞種を限定したり、再度耐性獲得を試みることで対応している。一方でがん化に関わる因子を減少させる薬剤が見出されるなど、新たな知見も得られている。がんは、発生要因が多様で不均一、かつ形質変動も伴うため、化学療法で一度退縮が見られても薬剤耐性化により再発・進行してしまう場合がある。そこで本研究では不均一性が特に高い卵巣がんを対象に、種々の抗がん剤が、個々のがん細胞に与える変動を解析することで、感受性を維持し悪性度の低い状態に長く留めるためのオーダーメード投薬法を導き出すストラテジーの開発を目的とする。まず、複数のヒト卵巣がん培養細胞と、複数の抗腫瘍活性のある薬剤の組み合わせで、薬剤を継続処理することによって、薬剤耐性細胞を複数得た。それら薬剤耐性細胞に対し、あらためて別の種々薬剤を処理し、その効果を薬剤耐性獲得前の細胞と比較した。その結果、ある薬剤に耐性となった細胞で、他の薬剤に対しより感受性を示したものがあった。そこで、薬剤感受性に寄与する変動を見出すべく解析を行っている。その一環として、薬剤感受性・耐性細胞からRNAを抽出し、マイクロアレイ解析に供した。今後それらの解析を進め、変動を見出し、薬剤感受性に与える影響を検証する予定である。また、得られた薬剤耐性細胞に対し、耐性化した薬剤との併用で種々薬剤を処理したところ、相乗効果が得られる薬剤の組み合わせを見出した。これらについても薬剤耐性獲得前の細胞と比較を行い、さらに薬剤の標的となるタンパク質の発現や関係するシグナル伝達について解析することで、薬剤感受性変動に関係する因子の解析を行う予定である。いくつかの薬剤耐性細胞と感受性薬剤や相乗効果薬剤の組み合わせが選出できているため、解析を進められる予定である。がんは、発生要因が多様で不均一、かつ形質変動も伴うため、化学療法で一度縮退が見られても薬剤耐性化により再発・進行してしまう場合がある。そこで本研究では不均一性が特に高い卵巣がんを対象に、種々の抗がん剤が、個々のがん細胞に与える変動を解析することで、感受性を維持し悪性度の低い状態に長く留めるためのオーダーメード投薬法を導き出すストラテジーの開発を目的とした。病理組織型・増殖因子感受性・薬剤感受性が異なる細胞、卵巣がんとの関連が示唆されている遺伝子変化・がん幹細胞様populationが認められる細胞などを複数用い、初回・二次化学療法で用いられる薬剤や、卵巣がん発生との関連が示唆されているシグナル伝達経路を阻害する分子標的薬群を数か月間継続処理し、薬剤耐性細胞を複数得た。薬剤処理の前後で、50%増殖阻害濃度測定、増殖速度測定、wound healing assayなどを検討した。その結果、耐性化しやすい細胞・薬剤に傾向が見られ、耐性化薬剤との併用で相乗効果が得られる組み合わせを見出した。また、ある薬剤に耐性となった細胞で、他の薬剤に対しより感受性を示したものもあった。さらに、耐性細胞に対して種々薬剤処理をし、新たな耐性克服薬選出の検討も行った。
高分子材料を培養基板としたヒト歯根膜細胞由来幹細胞の分化誘導および骨再生

歯根膜細胞は歯槽骨と歯牙の空隙を埋めている細胞で、外圧に対するクッション、圧受容器および骨分化能を持つ細胞群である。PMEA:Poly(2-methoxyethyl acrylate)とPHEMA:Poly(2-hydroxyethyl methacylate)を基板とし、歯根膜細胞の培養時の挙動を調べた。PMEA上では増殖能を示す一方、PHEMAでは凝集体を形成しRUNX2の発現が亢進した。以上の結果から、骨分化を亢進する基板としてPMEAとPHEMAの共重合体を使用することを考案し、実際に観察を行った。結果、PMEA:PHEMA=3:1にした基板上で目的に合致する結果を得ることが出来た。平成25度に関しては実験計画に示していたように、各種高分子材料上にて、ヒト歯根膜細胞の培養実験を行い、増殖数、培養形態、骨分化の評価を行った。まず、使用する高分子材料に関してはこれまで確認してきたPMEAおよびPHEMAに、再度着目した。これまでもPMEA基板上では良好な細胞形態、増殖数を確認してきたが、骨分化の促進ではPHEMA基板上の方が増殖数が少ないながら、良好な結果を得ていた。そのため、両方の性質を併せ持つ材料を得るために共重合体に着目し、その性質を調べた。細胞挙動は単純に重合比の通りにはならず、PHEMAの重合比を低めに設定した共重合体で増殖数、骨分化への良好な効果を得ることが出来た。しかし、共焦点レーザー顕微鏡にて確認した像とウェスタンブロッティングにて確認したタンパク質発現、PCR法にて確認した遺伝子発現の結果に差異が存在したため、今後さらに詳細な検討を要すると考えている。また、これとは別に、培養細胞におけるビンキュリン接着斑の数、面積、細胞あたりの面積等の確認を行っており、これに関しては重合比通りの一次曲線の相関を得ることが出来た。さらに上記の結果を他の細胞種と比較するため、骨分化マーカーであるRUNX2の遺伝子発現が確認されている癌細胞種のHT1080を用いて確認実験を行った。その結果、ヒト歯根膜細胞の培養結果と類似の結果を得ることが出来た。実験結果に現在まだ、差異が認められるため今後、更に確認を行うと共に、ヒト歯根膜細胞のアルカリフォスファターゼ活性の確認、幹細胞マーカーの確認等を行う予定である。ヒト歯根膜細胞は歯槽骨と歯牙の間に存在する空隙を埋めている細胞で、外圧に対するクッション、圧受容器および骨分化能を持つ細胞群である。歯科矯正治療を例に出せば、外力に対して骨の吸収と生成を担当している細胞群であることが明らかである。本研究は、歯根膜細胞の持つ間葉系幹細胞としてのポテンシャルを明らかにすると共に高分子材料を基板材料に用いた細胞培養によって、このヒト歯根膜細胞・細胞群に対して分化誘導を行うことが可能である事を明らかにした。我々研究グループが開発してきたPMEA:Poly(2-methoxyethyl acrylate)とコンタクトレンズによく使われているPHEMA:Poly(2-hydroxyethyl methacylate)を使用し、歯根膜細胞の培養挙動を調べた。PHEMAは実際、製品のレンズ使用後に白濁することがある。この原因には石灰化物の形成が部分的に関わっている。また、PMEA上では細胞が機能を維持したまま比較的高い増殖能を示したのに対して、PHEMA上では凝集体を形成しRUNX2の発現が亢進したが、増殖能は極めて低かった。以上の結果から、骨分化を亢進させながら増殖能を示す基板としてPMEAとPHEMAの共重合体を使用することを考案し、実際に観察を行った。その結果PMEA:PHEMA=3:1にした基板上で極めて良好な結果を得ることが出来た。またHT1080(線維肉腫)に対しても同様に3:1の共重合体を使用したところ同様の結果が示された。今後は、外部刺激に対してより敏感な挙動を示すHT1080に対して遺伝子発現等の確認を行いながら、歯周病に対する局所応用が可能な製品を考案していく。高分子材料の生体に対する影響の分子生物学的解析複数の新規高分子材料を作成・評価するという当初の実験計画とは、一部異なるが、これまで評価してきた高分子材料の延長線として、共重合体を使用する可能性を考案した。これによりヒト歯根膜細胞のもつポテンシャルを生かせる高分子材料の開発に目途を付けることが、現状においても可能であった。また、ヒト歯根膜細胞のみではなく、癌細胞種であるHT1080細胞においても、ヒト歯根膜細胞とほぼ同様の細胞挙動を確認することが出来た。この癌細胞種の類似性は細胞評価・基板材料作成の双方に有効であると考えている。

共重合体を用いた高分子材料にて、良好な細胞挙動を得ることが出来たため、更にこの実験系を発展させ、他の癌細胞種における細胞挙動の確認およびヒト歯根膜細胞にて、長期培養した場合の細胞の評価を行う。また、これまでの実験では、主にヒト歯根膜細胞の骨分化能を評価してきたが、今後は実験計画に従い、間葉系幹細胞のポテンシャルの評価も行う予定である。論文発表のために計上した経費が初年度においては未使用であったため。また、初年度はヒト歯根膜細胞の骨分化能評価を優先して行い、間葉系幹細胞マーカーの発現の評価は、次年度に回したため未使用金が発生した。平成26年度は、論文投稿を行う予定であるため、その経費を要し、またヒト歯根膜細胞の間葉系幹細胞マーカーの発現の確認を重点的に行う予定のため、平成25年度未使用金は、そのための経費として使用を予定している。
高真空プロセス用の高密度プラズマパルスの発生とそれを用いた表面過程の解明

高密度ガスパルスプラズマの発生について、イオン電流、発光特性、電子温度、電子密度、消費電力の時間変化を追跡し、つぎのことを明らかにした。1。小キャビティのマイクロ波放電室にマイクロ波電力を供給しておきそこにガスを短パルスとして供給すると、発生するプラズマの強度がガスパルスの導入打ち切り直後に大きく増大する(ガスパルスプラズマ)。プラズマイオン電流や発光特性、消費電力の時間変化より分析すると、この増大期間中のマイクロ波放電室内では「励起衝突確率の非励起化衝突に対する相対的な増加」と「マイクロ波とプラズマと結合状態の改善」が相互促進的に起こっていることがわかった。このうちの前者は圧力が高くに留まっている間に原料水素ガスの供給が打ち切られることに起因している。2。水素、ヘリウム、窒素、酸素のおのおのの特性を調べた結果、「活性種のうちに特に増大されるラジカルがある(ヘリウム)」、「電子温度、電子濃度が増大期間中に上昇している(窒素、酸素)」、「時間変化したときでも定常プラズマと比べてプラズマ強度を大きくできる条件がある(酸素)」ということが判明した。これらは1に述べたメカニズムを支持するものである。3。観測されるプラズマパルスの大きさと時間変化はガス種によって大きく異なる。これはマイクロ波放電室内に流れ込む原料ガスと放出されるプラズマ流との変化の速さがガス種によって異なるためで、分子量の小さいガス種(水素、ヘリウム)に対してはピーク高が大きくて持続時間の短いパルスが、分子量の大きいガス種(窒素、酸素)に対してはピーク高が低くて持続時間の長いパルスが得られる。またプラズマを放出する開口面積にもパルスの時間変化は依存しするが、これはガスパルスの導入打ち切り後の放電室内の圧力の変化速度が開口面積によるためである。1。2。3。高密度のガスパルスプラズマの発生について、そのメカニズムの解明と短パルス化学分子線成長への応用について、それぞれ個別に実験を行い、つぎのことを明らかにした。(1)小キャビティのマイクロ波放電室にマイクロ波電力を供給しておきそこにガスを短パルスとして供給すると、発生するプラズマの強度がガスパルスの導入直後に大きく増大する(ガスパルスプラズマ)。ヘリウムプラズマの発光を調べると、発生するパルスプラズマは定常プラズマとはちがった発光特性を示し、ラジカル分布などのプラズマ特性が異なっている。プラズマ増大のメカニズムは、原料ガス分子と励起分子との衝突の減少に基づいて起こる荷電粒子の増大とマイクロ波吸収の増大の相互促進作用によると推定される。(2)有機金属を短パルスにすることにより「表面反応の位相をそろえる」短パルス化学分子線成長に励起パルス(この場合はプラズマパルス)を組み合わせると、個別の表面素反応の解明が可能となる。(3)有機金属のDMAlHをAlの原料とするAlAsの選択成長において、プラズマの照射によって成長の選択性を消失させることができる。これはマスク膜表面がプラズマ照射によって帯電し、DMAlH分子のマスク膜上での分解が起こるようになるためである。この帯電による分解の生起は有機金属全般の特質ではなく、DMAlH分子のもつAl-H結合が電荷に敏感であることが推定される。1。プラズマイオン電流や発光特性、消費電力の時間変化より分析すると、この増大期間中のマイクロ波放電室内で「原料ガス分子と励起分子との衝突に基づいて起こる荷電粒子の増大」と「マイクロ波とプラズマと結合状態の改善」が相互促進的に起こっていることがわかった。2。

水素、ヘリウム、窒素、酵素のおのおのの特性を調べた結果、「活性種のうちに特に増大されるラジカルがある(ヘリウム)」、「電子温度、電子濃度が増大期間中に上昇している(窒素、酸素)」、「時間変化したときでも定常プラズマと比べてプラズマ強度を大きくできる条件がある(酸素)」ということが判明した。これらは1に述べたメカニズムを支持するものである。3。観測されるプラズマパルスの大きさと時間変化はガス種によって大きく異なる。これはマイクロ波放電室内に流れ込む原料ガスと放出されるプラズマ流との変化の速さがガス種によって異なるためで、分子量の小さいガス種(水素、ヘリウム)に対してはピーク高が大きくて持続時間の短パルスが、分子量の大きいガス種(窒素、酸素)に対してはピーク高が低くて持続時間の長いパルスが得られる。またプラズマを放出する開口面積にもパルスの時間変化は依存しするが、これはガスパルスの導入打ち切り後の放電室内の圧力の変化速度が開口面積によるためである。
なぜ耐糖能異常は動脈硬化性疾患の危険因子なのか：新規モデルマウスを用いた解析

耐糖能異常易発性と抵抗性(Prone系とResistant系)の新規モデルマウスを用いた動脈硬化巣形成モデル実験系を確立し、Prone系での動脈硬化巣形成の亢進を確認した。さらに、この実験系でのProne系マウスにおける動脈硬化巣形成が、メトホルミンの投与によって抑制されることを明らかにした。また、耐糖能異常における「血糖値変動の繰り返し」が動脈硬化巣形成に及ぼす影響をより直接的に評価するモデル実験系を構築し、グルコース投与によって血糖値変動を誘発したマウスで動脈硬化巣形成が亢進することを認めた。以上の結果は、耐糖能異常が生体レベルで動脈硬化巣初期形成を惹起することを明確に示している。研究実施計画に基づいて本年度は「動脈硬化巣の形成・進展に及ぼす耐糖能異常の影響を評価する動物モデルの確立」を目指した。具体的には、我々がこれまでに作成した耐糖能異常易発性および抵抗性(Prone系およびResistant系)の両系統のマウスに動脈硬化誘発飼料(コレステロール/コール酸含有高脂肪飼料)を与えることによって、大動脈弁周囲に動脈硬化巣を誘発させた。その結果、当初計画どおり、雌性マウスへの20週間(8-28週齢)の動脈硬化誘発飼料の給餌によって定量解析可能な動脈硬化巣が形成され、Prone系で動脈硬化巣が亢進していることを確認した。また、複数回の繰り返し実験において、この試験飼育条件で形成される動脈硬化巣の大きさには優れた再現性があり、Prone系における動脈硬化巣の平均サイズはResistant系の約4倍であった。また本年度は、耐糖能異常による動脈硬化亢進における血糖値変動の直接的な作用の評価により特化した新たな動物モデル系の作出を試みた。具体的には、一般に市販されている近交系マウスであるC57BL/6を用いて、上記同様、雌性マウスに動脈硬化誘発飼料を20週間給餌し、その試験飼育期間を通じて、グルコース溶液(50 mg glucose/mouse)の1日2回投与を継続した。その結果、グルコースを投与したマウスでは投与後に一過性の血糖値上昇を認め、試験飼育期間後の大動脈弁周囲における動脈硬化巣サイズは蒸留水を投与し続けた対照マウスの約4倍の大きさであった。このとき、グルコース投与マウスと対照マウスの間で、体重、脂肪組織重量、各血清脂質パラメーター等に有意な差を認めなかったことから、このC57BL/6マウスを用いたグルコース連投モデルは、動脈硬化巣形成における血糖値変動の直接的な作用の評価に有用と考えられた。本年度はまず、昨年度新たに開発した「動脈硬化亢進における血糖値変動の直接的な作用の評価により特化した動物モデル系(通常のC57BL/6マウスを用いたグルコース連続投与実験系)」での解析を進めた。この実験系では、血糖値変動の直接的な作用によって、我々がこれまでに作成した耐糖能異常モデルマウス(Prone系)での成果とほぼ同様の動脈硬化巣形成の亢進(対照群の約4倍)を大動脈弁周囲に認めていたが、さらなる解析によって、脂肪蓄積等の明らかな動脈硬化巣形成を認めない胸部大動脈壁においても、マクロファージの集積や接着分子群の発現上昇がおきていることを示唆する知見を得た。これらの結果は、血糖値の変動によって動脈硬化初期病変の形成が実際に生体レベルで動脈壁に誘導されることを示している。以上の成果をまとめて本年度新たに学術論文として報告した。また本年度からは、初年度に確立した「動脈硬化巣の形成・進展に及ぼす耐糖能異常の影響を評価する動物モデル系(Prone/Resistant系マウスを用いた実験系)」において、「耐糖能異常への薬理的な介入の有効性の検討」に着手しており、既にある種の血糖降下薬の投与によって、実際にProne系マウスの動脈硬化巣形成が抑制されることを見出している。このProne系マウスにおける動脈硬化巣形成の亢進とその薬理学的な抑制について、今後さらに作用機序の検討を進めることによって、「耐糖能異常を起因とする動脈硬化巣形成促進機序(生体内における主要経路)」の解明に繋がることが期待される。本年度は、昨年度より引き続いて「動脈硬化亢進における血糖値変動の直接的な作用の評価により特化した動物モデル系」での解析を進め、耐糖能異常において血糖値の変動自体が動脈硬化初期病変形成を誘導することを生体レベルで明らかにし、学術論文として報告することができた。また、当初より計画していた「耐糖能異常による動脈硬化巣形成促進に対する生理学的・薬理学的な介入の有効性の検討」についても研究に着手し、成果を見出しつつある。本研究課題では、まず我々がこれまでに作出した耐糖能異常易発性および抵抗性(Prone系およびResistant系)の両系統のマウスに動脈硬化誘発飼料を与えることによって、大動脈弁周囲に動脈硬化巣を誘発させる実験系を確立した。この実験系で形成される動脈硬化巣の大きさには優れた再現性があり、Prone系マウスにおける動脈硬化巣の平均サイズはResistant系マウスの約4倍であった[平成26年度]。この実験系において、動脈硬化巣形成に及ぼすメトホルミンの効果を検討し、Prone系マウスにおける動脈硬化巣形成がメトホルミンの投与によって有意に抑制されることを認めた[平成2728年度]。

また、耐糖能異常において「血糖値の変動」そのものが動脈硬化巣形成に及ぼす影響をより直接的に評価する実験系として、市販の通常マウス(C57BL/6)に動脈硬化誘発飼料を与えながらグルコースを連続投与する実験系を新たに構築した。この実験系においてもグルコース投与群の動脈硬化巣サイズは蒸留水投与対照群と比較して約4倍の大きさであった[平成2627年度]。これらの結果は、耐糖能異常(における血糖値の変動)が動脈硬化巣の初期形成過程を惹起することを、生体(動物)レベルで明確に示している。本研究課題で構築した実験系を用いて生体レベルでの検討を今後さらに進めることによって、「耐糖能異常を起因とする動脈硬化巣形成促進」の作用機序(生体内における主要作用経路)解明に繋がる重要な知見が得られるものと期待される。耐糖能異常易発性と抵抗性(Prone系とResistant系)の新規モデルマウスを用いた動脈硬化巣形成モデル実験系を確立し、Prone系での動脈硬化巣形成の亢進を確認した。さらに、この実験系でのProne系マウスにおける動脈硬化巣形成が、メトホルミンの投与によって抑制されることを明らかにした。また、耐糖能異常における「血糖値変動の繰り返し」が動脈硬化巣形成に及ぼす影響をより直接的に評価するモデル実験系を構築し、グルコース投与によって血糖値変動を誘発したマウスで動脈硬化巣形成が亢進することを認めた。以上の結果は、耐糖能異常が生体レベルで動脈硬化巣初期形成を惹起することを明確に示している。本年度の研究実施計画である「動脈硬化巣の形成・進展に及ぼす耐糖能異常の影響を評価する動物モデルの確立」について、おおむねその目的を達成することができた。加えて、動脈硬化巣形成における血糖値変動の直接的な作用の評価により特化した新たな動物モデル系の作出を試み、一定の成果を得た。これまでの研究で、研究実施計画で当初より計画していた「動脈硬化巣の形成・進展に及ぼす耐糖能異常の影響を評価する動物モデル系」と、新たに確立した「動脈硬化亢進における血糖値変動の直接的な作用の評価により特化した動物モデル系」の2系統の動物モデル系を確立した。研究最終年度となる来年度は、これらの実験系を用いて「耐糖能異常による動脈硬化巣形成促進に対する生理学的・薬理学的な介入の有効性の検討」を本年度に引き続いて行うとともに、それらの作用機序の検討を進めることによって、研究計画当初の目的である「耐糖能異常を起因とする動脈硬化巣形成促進機序(生体内における主要経路)の解明」を目指す。糖尿病代謝学当初の研究実施計画にもとづいて、来年度は「耐糖能異常が動脈硬化巣形成を促進する作用機序(主要経路)の動物レベルでの解析」を行う。具体的には、上記2つの実験系(Prone/Resistant系モデルとグルコース連投モデル)で飼育したマウスより大動脈を採取し、動脈硬化巣が形成される前段階での動脈硬化促進的な変化(糖化、酸化、炎症性マーカー等の変化)について組織レベルで解析する。また、「耐糖能異常による動脈硬化巣形成促進に対する生理学的・薬理学的な介入の有効性の検討」ついても具体的な介入方法・評価方法を検討し、試験を開始する。
CZ・FZ法単結晶育成融液内のGSMAC‐FEMによる流動解析

1.2次元移流拡散方程式の一般解を用いるFCBI法を考案し、更にその概念を拡張することにより、Brezzi教授により提案されたlink-cutting bubblesを2次元FCBI法のtrial functionへ導入した。また、FCBI法と、link-cutting bubblesを用いる有限要素法の類似性を示した。2.3角形非構造格子に適用し得る、MINI要素を基盤とした新たなFCBI法を開発した。代表的な単結晶育成手法であるCZ法とFZ法は、電磁場や微小重力環境の利用により、さらなる大口径化や高品質化の達成が期待されている。単結晶は融液が固化することによって形成されるため、自然対流とMarangoni対流が混在する融液の対流御予固液界面の形状制御は重要である。本年度は、これらの目的を達成し得る精度、経済性、汎用性、安定性に優れた数値解析スキームの構築を行った。以下にその概要を列挙する。1.有限要素法によるMarangoni対流解析スキームの構築2.Level Set法による解適合格手法を組み合わせたLSM-AMRの構築3.電磁場連成自由表面解析スキームの構築4.ALE法を適用した移動固液界面解析スキームの構築2では、FZ法など自由表面を有する融液の制御でしばしば生じる変形問題に対し、安定なLevel Set法に解適合格子法を組み合わせ、精度と経済性が両立する新たな解析スキームを構築した。その際、格子分割・削除の指針値としきい値の選択は、それぞれLevel Set関数とスムージング幅が適している。3では、電磁場解析において考慮すべき開領域の取り扱いに適した混合有限・境界要素法、および有限要素領域内で、大変形を伴う自由表面の計算に有効なLevel Set法を有機的に結合した、高周波交流磁場下における流体・電磁場連成解析スキームを構築した。4では、凝固・融解時における固液界面の変形問題に対して、ALE法を活用した解析スキームを構築した。その際、精度と安定性を保証すべく、最小格子幅を保ちながら指数関数を用いて界面近傍に格子を寄せる格子再生成法を考案した。本年度は、同スキームを用いて低Reynolds数の強制対流を解析し、他者の計算例と良好に一致する結果を得た。また、移流が支配的な流れ場に適した新たなtrial functionを考案し、Pe=010^6に対応する移流拡散問題において、良好な数値解析結果を得た。
歯の喪失が学習・記憶能に及ぼす影響-海馬グルタミン酸測定による検討-

臼歯喪失が学習記憶にもたらす影響を明らかにすること目的として,グルタミン酸バイオセンサーを用い,受動的回避実験時のラット海馬グルタミン酸放出量測定を行った.獲得試行前のグルタミン酸量は両群間に有意差は認めなかった.試行後では群間に有意差を認め,抜歯群は対象群に対して有意に低値を示した.保持試行では有意差は認めず,両群間のグルタミン酸放出量に有意な差はみられなかった.受動的回避実験の反応潜時は,獲得試行では有意差はなかったものの,保持試行では両群とも延長したが,特に抜歯群が有意に短かった.臼歯喪失が学習記憶にもたらす影響を明らかにすること目的として,グルタミン酸バイオセンサーを用い,受動的回避実験時のラット海馬グルタミン酸放出量測定を行った.獲得試行前のグルタミン酸量は両群間に有意差は認めなかった.試行後では群間に有意差を認め,抜歯群は対象群に対して有意に低値を示した.保持試行では有意差は認めず,両群間のグルタミン酸放出量に有意な差はみられなかった.受動的回避実験の反応潜時は,獲得試行では有意差はなかったものの,保持試行では両群とも延長したが,特に抜歯群が有意に短かった.歯の喪失が脳、特に学習記憶にどこまでの影響を与えるのか明らかにする事を目的として、完全自由行動下で実験可能なテレメトリーグルタミン酸バイオセンサーを用い,受動的回避実験時の海馬グルタミン酸放出量測定を行うことを目的とした.まずは行動学的知見を得るために臼歯喪失ラット群と有歯ラット群における受動的回避反応時間の評価を比較した。10匹のSD系雄性ラットを実験動物として用い、5週齢時に全身麻酔下で上顎臼歯を全て抜去した抜歯群,同量の麻酔のみを施し無処置とした対照群の2群に分けた.受動的回避実験は獲得試行と保持試行の2試行とした.まず獲得試行としてラットを明室に入れ,そこから暗室に入るまでの反応潜時を測定した.暗室に入った直後に床グリッドから電撃刺激を与えた後,24時間後の保持試行で反応潜時を測定し,両試行の潜時を比較した.獲得試行での反応潜時には有意差は見られなかったが,保持試行では獲得試行に対し両群共に反応潜時が延長し,刺激回避行動がみられた.このことから学習記憶の効果が伺えたが抜歯群の反応潜時が対照群に対して短縮する傾向が認められた.これにより臼歯喪失が学習記憶過程に障害をもたらす可能性が示唆されたが,まだ実験の個体数が少ない事,また脳内の活動や生理的影響についての検討が必要であることが伺えた.よって引き続き受動的回避実験を行い,個体数を増やすとともに,テレメトリーグルタミン酸バイオセンサーを用いた同時記録の方法について検討を加える必要があることが判明した.臼歯喪失が学習記憶にもたらす影響を明らかにすること目的として,テレメトリーグルタミン酸バイオセンサーを用い,受動的回避実験時のラット海馬グルタミン酸放出量測定を行った.5週齢SD系雄性ラットを実験動物として用い,全身麻酔下で上顎臼歯を全て抜歯したEXT群(n=8),同量の麻酔のみを施し無処置としたCON群(n=8)の2群とした.受動的回避実験は7週齢に行い獲得試行と保持試行の2試行とし,同時に海馬グルタミン酸の計測を行った.まず獲得試行としてラットを明室に入れ,そこから暗室に入るまでの反応潜時を測定した.暗室に入った直後に床グリッドから電撃刺激を与えた.24時間後同様に保持試行を行い反応潜時を測定し,両試行の反応潜時を比較した.なお海馬グルタミン酸放出量の測定にはバイオセンサーシステムを用い,各試行開始前後の計70分間のグルタミン酸放出量を比較した.両試行開始10分前から終了後60分までの全14サンプルの経時的変化を経過時間と実験群を主変動因子にして反復測定分散分析にて検定した.獲得試行では実験群と経過時間,交互作用に有意差を認めた.獲得試行前の2サンプルと試行後1サンプルにおけるグルタミン酸量は両群間に有意差は認めなかった.試行後の2サンプル目以降では群間に有意差を認め,EXT群はCON群に対して有意に低値を示した.保持試行では実験群と経過時間,交互作用に有意差は認めず,両群間のグルタミン酸放出量に有意な差はみられなかった.受動的回避実験の反応潜時は,獲得試行では有意差はなかったものの,保持試行では両群とも延長したがEXT群が有意に短かった.また海馬グルタミン酸放出量は獲得試行ではEXT群が有意に少なく,保持試行では両群に有意差はなかった.このことより臼歯喪失が学習記憶の障害を誘発する-要因になりうることが明らかとなった.
重要薬用植物ミシマサイコにおけるサイコサポニン生合成機構の全容解明

ミシマサイコのサイコサポニン生合成の全容を解明するために、ミシマサイコの根、茎、葉それぞれのESTデータベースを作成した。サイコサポニンの生合成に関与する酵素の遺伝子を単離するために、このESTデータベースを検索した結果、16種の新規シトクロムP450のcDNAを単離し、β-アミリンの28位の炭素を水酸化するシトクロムP450、R144792と、16α位の炭素を水酸化するシトクロムP450、Rnn2525を同定した。次にサイコゲニンの配糖体化酵素について、β-アミリンを基質とすると考えられるUGT73Cサブファミリーと類似性の高い2種のグリコシルトランスフェラーゼのcDNAを単離に成功した。ミシマサイコのサイコサポニン生合成の全容を分子生物学的に解明するために、次世代シークエンサーを用いて、ミシマサイコの根、茎、葉それぞれの部位についてトランスクリプトーム解析を行い、ESTデータベースを作成した。このESTデータベースを検索することで、サイコサポニン生合成に関与すると思われる候補遺伝子を得る事に成功した。サイコサポニンのアグリコンであるサイコゲニン生合成に関与するシトクロムP450の同定については、根、茎、葉での部位別遺伝子発現パターンから予想された6つの候補遺伝子、及び根特異的に発現していると考えられる5つの候補遺伝子の計11種のミシマサイコ由来の新規シトクロムP450についてcDNAクローニングを行い、その機能を解析した。ミシマサイコのβ-アミリン合成酵素遺伝子を発現させることで、サイコサポニン生合成の基質であるβ-アミリンを生産する酵母で、これらシトクロムP450遺伝子を発現させ、代謝物を解析したところ、β-アミリンを基質とし得るP450は、この内2種でR144792はβ-アミリンの28位の炭素を水酸化し、R197504は28位の炭素をカルボン酸にまで3段階酸化することを明らかにした。この2つのP450は互いのアミノ酸配列の類似性が高いことから、構造の僅かな違いにより反応生成物が異なっていると考えられる。次にサイコゲニンの配糖体化酵素についてもシトクロムP450と同様の方法で同定を試みた。β-アミリンを基質とすると考えられるUGT73Cサブファミリーと類似性の高い2種のグリコシルトランスフェラーゼcDNAの単離に成功し、現在機能解析中である。ミシマサイコにおけるサイコサポニン生合成の全容を分子生物学的に解明するために、次世代シークエンサーを用いて作成したミシマサイコの根、茎、葉のESTデータベースを検索し、サイコサポニン生合成に関与する酵素の遺伝子を得ることに成功した。これまでにオキシドスクアレンの環化酵素であるβーアミリン合成酵素遺伝子を単離し、その機能解析を行ったが、今回、11種のミシマサイコ由来の新規シトクロムP450についてcDNAクローニングを行い、その機能を解析した。ミシマサイコ由来のβーアミリン合成酵素遺伝子を発現させることで、サイコサポニン生合成の基質であるβーアミリンを生産する酵母で、これらシトクロムP450を発現させ、代謝物を解析したところ、11種の候補シトクロムP450の中の1つのシトクロムP450であるR144792によるβーアミリンの28位水酸化は確認できたが、その他の候補はβーアミリンを基質として酸化反応を行うことはなかった。そこで、さらにESTデータベース検索を行い、新たな3種の候補シトクロムP450、Rnn13181、Rnn17705、Rnn4327のcDNAの単離し、機能解析を行ったが、これらのP450もβーアミリンを基質とすることはなかった。βーアミリンからサイコゲニンまでの生合成は数種のシトクロムP450による逐次反応であると予想されるため、各候補シトクロムP450を組み合わせた解析を行うために、それぞれの酵素を発現させた酵母からタンパク質を抽出し、in vitroでの活性測定を試みた。しかしながら、in vitroでは酵素活性を検出することが出来なかったため、今後新たな活性測定法を試みる。このESTデータベースを検索することで、サイコサポニン生合成に関与すると考えられる候補遺伝子を得ることに成功した。サイコサポニンのアグリコンであるサイコゲニン生合成には、βーアミリンの酸化が必要で、シトクロムP450が、この酸化反応に関与していると思われる。そこで、根、茎、葉での部位別遺伝子発現パターンの解析、根特異的に発現しているシトクロムP450遺伝子の検索、さらに他の植物より得られたβーアミリンを基質とするシトクロムP450のアミノ酸配列との類似性をもとに、これまでにミシマサイコから16種の新規シトクロムP450のcDNAクローニングに成功した。これら候補遺伝子を酵母で発現させ、機能解析を行った結果、βーアミリンの28位の炭素を水酸化するシトクロムP450、R144792や、16α位の炭素を水酸化するシトクロムP450、Rnn2525を同定することができた。これら2種のシトクロムP450は部位別の発現パターン等から、サイコサポニンの生合成に関与していると考えられる。

その他にも、サイコサポニンの生合成に関与しているとは考えられないが、βーアミリンの28位の炭素をカルボン酸にまで3段階酸化しオレアノール酸を生合成するシトクロムP450、R197504を得ることにも成功した。次にサイコゲニンの配糖体化酵素についてもシトクロムP450と同様の方法で同定を試みた。βーアミリンを基質とすると考えられるUGT73Cサブファミリーと類似性の高い2種のグリコシストランスフェラーゼのcDNAを単離し、機能解析のための大腸菌での組換え酵素の発現に成功した。ミシマサイコのサイコサポニン生合成の全容を解明するために、ミシマサイコの根、茎、葉それぞれのESTデータベースを作成した。サイコサポニンの生合成に関与する酵素の遺伝子を単離するために、このESTデータベースを検索した結果、16種の新規シトクロムP450のcDNAを単離し、β-アミリンの28位の炭素を水酸化するシトクロムP450、R144792と、16α位の炭素を水酸化するシトクロムP450、Rnn2525を同定した。次にサイコゲニンの配糖体化酵素について、β-アミリンを基質とすると考えられるUGT73Cサブファミリーと類似性の高い2種のグリコシルトランスフェラーゼのcDNAを単離に成功した。今年度は新たな3種を含む14種のミシマサイコ由来のシトクロムP450について酵母を用いた機能解析を行ったが、βーアミリンを基質とする活性をもつシトクロムP450を得ることが出来なかった。そこで、βーアミリンからサイコゲニンまでの生合成は数種のシトクロムP450による逐次反応であると考え、R144792と他の候補シトクロムP450を組み合わせた場合の反応生成物について解析するために、それぞれの酵素を発現させた酵母からタンパク質を抽出し、in vitroでの活性測定を試みたが、in vitroでは酵素活性を検出することが出来なかった。酵母からのタンパク質抽出法をいろいろと試したが、酵母内(in vivo)では活性の見られるシトクロムP450であるR144792においても、in vitroでは活性を検出することが困難であった。そのため、シトクロムP450の逐次反応を検出する方法を変更する必要があった。そのため、当初の計画からやや遅れている達成度となった。天然資源系薬学βーアミリンからサイコゲニンまでの生合成は数種のシトクロムP450による逐次反応であると考えられるため、複数のシトクロムP450を組み合わせた活性を測定する必要がある。当初は各種シトクロムP450を発現させた酵母からタンパク質を抽出し、それらを組み合わせてin vitroで機能解析を行う計画だったが、この方法は困難であることが判明したため、今後は、複数のシトクロムP450遺伝子を同一の酵母内で共発現させ、in vivoで機能解析を行う予定である。まず、βーアミリンの28位を水酸化するシトクロムP450, R144792と他のシトクロムP450という組み合わせで解析を進めていきたい。また今年度はサイコゲニンの配糖体化酵素について、これまでに得られた2種の糖転移酵素の機能解析を大腸菌発現系を用いて行う予定である。サイコゲニン生合成に関与するシトクロムP450の同定のために、これまでミシマサイコより新規シトクロムP450遺伝子を11種単離し、それらの機能解析を行ったが、その中でサイコゲニン生合成に関与すると考えられるものはβ-アミリンの28位の炭素を水酸化するR144792のみであった。