hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
生殖・周産期医療における内分泌・免疫ストレス要因の影響の解析

免疫抑制因子が妊娠中の様々な病態に関連し、酸化ストレスが子宮筋収縮に直接関与し、早産の要因となった。Fractalkineや6Ckineが、早産や子宮内感染の病態に関与し、子宮内感染においてリンパ球・NK細胞・樹状細胞にも影響を及ぼし、これら免疫系細胞システム・ストレスの変化による妊娠への影響の可能性が示唆され、これら免疫担当細胞をターゲットとした治療戦略の可能性が示された。母体ストレス定量化に関する検討から着床期の女性のストレスレベルが着床成功率と相関し、妊娠中のストレスレベルの推移が母体の抑うつ状態と連関しており、妊娠前からの女性のストレス軽減が重要であることが明らかとなった。本研究の目的はヒト臨床検体を用いて各種因子の蛋白および遺伝子レベルでの発現を解析し、さらに培養実験などを用いて確認検討をすると同時に臨床に即した母体ストレスの定量化により母体ストレスと産科異常との関連を分析し、妊娠中の望ましいライフスタイルを見出すことである。本年度は分娩時の胎盤、卵膜組織および母体血、臍帯血を総計120症例ほど採取し、保存し、それらをもとに酸化ストレスのもたらす妊娠への影響について基礎的・臨床的に検討し、酸化ストレスによって絨毛組織および血管内皮からのs-endoglin産生を更新させ、妊娠高血圧症候群などの病態に関与することを明らかとした(Mol Hum Reprod,2010)。また、不妊治療における患者ストレスを唾液中ストレスマーカーの測定および質問票から評価し、着床時期におけるストレスが有意に着床率に影響を及ぼすことを明らかとした(現在投稿準備中)。免疫抑制因子であるRCAS1(human tumor-associated receptor-bindingcancerantigen expressed on SiSo cells)が、妊娠高血圧症候群、妊娠糖尿病などの妊娠中の様々な病態に関連していることを示してきたが、実験動物モデルマウスにおいてRCAS1分子の子宮における免疫抑制に寄与して胎盤形成などに影響を及ぼすことを明らかとし、RCAS1分子が将来的に治療ターゲットとなりうることを明らかとした(Am J Reprod Immunol,2010)。さらに、実験モデルマウスにおける検討ではあるが、C-reactive proteinが、児の脳障害増悪因子の一つとなりうることを明らかとした(Reprod Sci,2010)。平成21年度における検討で酸化ストレス、内分泌的ストレス、炎症性ストレスいずれもが妊娠中の病態および母児の予後に影響を与えることを明らかとした。本研究の目的はヒト臨床検体を用いて各種因子の蛋白および遺伝子レベルでの発現を解析し、母体ストレスの定量化により母体ストレスと産科異常との関連を分析し、妊娠中の病態との関連を見出すことである。本年度は分娩時の胎盤、卵膜組織および母体血、臍帯血等の臨床検体を用いた解析により免疫抑制因子であるRCAS1(human tumor-associated receptor-bindingcancerantigen expressed on SiSo cells)が、妊娠高血圧症候群、妊娠糖尿病などの妊娠中の様々な病態に関連していることを明らかとし、RCAS1分子が将来的に治療ターゲットとなる可能性を示した(Am J Reprod Immunol,2010:Am J Obstet Gynecol)。また、酸化ストレス産生物である4-HNEが、子宮筋層に直接作用して早産に関与することを明らかとした(Gynecol Obstet Invest,2011)。さらに、妊娠中の母体ストレス定量化を行い、妊娠中の推移を明らかとし、母体の抑鬱状態によってストレス反応がむしろ抑制化されることを明らかとした(J Obstet Gynecol Res,2011 in press)。一方、慢性炎症などに関与するFractalkine(FRK)の妊娠中の動態を解析し、臍帯血FRKは母体血に比べて有意に高値で絨毛膜羊膜炎合併症例では臍帯血清FRKは高値を示し、早産症例では母体血清FRKは高値を示した。胎盤及び卵膜においてFRK及びその受容体蛋白の発現を確認した(現在投稿準備中)。平成22年度における検討で酸化ストレス、内分泌的ストレス、炎症性ストレスいずれもが妊娠中の病態に関与していることを明らかとした。本研究の目的はヒト臨床検体を用いて各種因子の蛋白および遺伝子レベルでの発現を解析し、内分泌ストレス因子・母体ストレスの定量化により母体ストレスと産科異常との関連を分析し、妊娠中の病態との関連を見出すことである。平成23年度は昨年度に引き続き、慢性炎症などに関与するFractalkine(FRK)の妊娠中の動態を解析し、臍帯血FRKは母体血に比べて有意に高値で絨毛膜羊膜炎合併症例では臍帯血清FRKは高値を示し、早産症例では母体血清FRKは高値を示した。さらに生殖領域において体外受精胚移植の際の卵胞液を採取保存し、卵の質と卵胞液中FRK濃度との関連解析を行った。

卵胞液中にFRK蛋白の存在を確認したが、妊娠成立群、妊娠不成立群、科学流産群では、卵胞液中及び血清中のFRK値は三群間で有意差を認めなかった。したがって本検討では卵胞液中FRKは卵胞発育・卵の質の評価に直接関連性を示すことはなかった。一方、単球や好中球に対する遊走・活性化作用を有さず、リンパ球・NK細胞・樹状細胞に対してのみ遊走・活性化作用を有する因子である6 Ckineについて周産期領域における病態とくに早産・子宮内感染への関与について検討した結果、胎盤組織・卵膜に6 Ckineの発現が認められ、母体血中に比して謄帯血中で高濃度であった。胎盤感染を伴う場合、母体血中で高値を示し、また早産でも同様の傾向であったが、臍帯血中ではこうした変化は確認できなかった。また、胎盤組織における6 Ckine蛋白の発現も感染および早産において増加する傾向が認められた。6 Ckineも感染および早産において他のサイトカイン同様に産生が増加し、母体血中にそれが反映されていた。このことは、子宮内感染において好中球・マクロファージ系のみならず、リンパ球・NK細胞・樹状細胞にも影響を及ぼし、これら免疫系細胞システム・ストレスの変化による妊娠への影響の可能性が示唆され、これら免疫担当細胞をターゲットとした治療戦略の可能性が示された。
オートインデューサー類似化合物が難治性根尖性歯周炎関連細菌に及ぼす影響の検策

難治性根尖性歯周炎の一種であるPorphyromonas gingivalisのバイオフィルム形成阻害に効果のある細菌間情報伝達物質(オートインデューサー:AI)の類似化合物と各種抗菌剤の併用がP. gingivalisのバイオフィルムに及ぼす影響の検索を行った。その結果,併用群でバイオフィルム抑制効果が最も高かった。また, AI類似化合物が,難治性根尖性歯周炎に関与するFusobacterium nucleatumのバイオフィルムに及ぼす影響の検索を行った。F. nucleatumにおいても,バイオフィルム抑制効果が認められた。細菌の情報伝達物質であるオートインデューサー(AI)類似化合物のうち,Porphyromonas gingivalisのバイオフィルム形成を抑制する化合物と抗菌剤の併用がバイオフィルムに及ぼす影響を検素した。抗菌剤として,ミノサイクリン(テトラサイクリン系),オフロキサシン(ニューキノロン系)およびセフロキシム(セフェム系)を用いた。P.gingivalisバイオフィルムに側鎖の炭素数が4であるAI類似化合物と各種抗菌剤を作用し,ATP量測定,微細形態学的観察および三次元的観察を行い,バイオフィルムに及ぼす影響を評価した。バイオフィルムの形成は既に確立したModified Robbins deviceを用いたフローセルモデルで行い,サンプルを無添加群・化合物添加群・抗菌剤添加群および併用群の4つに分けた。ATP測定の結果,併用群は他の3群と比較し有意にバイオフィルム量が低下した。SEMによる微細形態学的観察では,化合物添加群および併用群においてバイオフィルムの細胞外マトリックス様構造物が認められ部位があった。三次元的観察では,サンプルをLive/DeadR Bacterial Viability Kitsにて染色し,共焦点レーザー顕微鏡を用いてバイオフィルム内の細菌の生・死を解析した。ミノサイクリンおよびセフロキシム添加群では,バイオフィルムの表層のみ死菌が観察された。一方,併用群において,バイオフィルムの深層まで死菌が認められた。また,抗菌剤添加群および併用群において,バイオフィルムの剥離が見られた。以上より,抗菌剤とAI化合物の併用はオーラルバイオフィルムのコントロール法として有用である可能性が示唆された。細菌の情報伝達物質であるオートインデューサー(AI)類似化合物のうち,Porphyromanas gingivalisのバイオフィルム形成を抑制する化合物が,難治性根尖性歯周炎関連細菌であるFusobacterium nucleatumのバイオフィルム形成に及ぼす影響を検索した。バイオフィルムの形成は既に確立したModified Robbins deviceを用いたフローセルモデルで行った。ATP測定の結果,AI類似化合物作用群において,対照群と比較し,有意にバイオフィルム形成量の減少を認めた。さらに,AI類似化合物と抗菌剤の併用が,F. nucleatumのバイオフィルムに及ぼす影響を検索した。抗菌剤として,ミノサイクリン(テトラサイクリン系)およびセフロキシム(セフェム系)を用いた。F. nucleatumバイオフィルムに側鎖の炭素数が4であるAI類似化合物と各種抗菌剤を作用し,ATP量測定,微細形態学的観察および三次元的観察を行い,バイオフィルムに及ぼす影響を評価した。サンプルを無添加群・化合物添加群・抗菌剤添加群および併用群の4つに分けた。SEMによる微細形態学的観察では,いずれの群間においてもバイオフィルム形成細菌の形態に大きな違いは認めなかった。三次元的観察では,サンプルをLive/Dead[○!R]Bacterial Viability Kitsにて染色し,共焦点レーザー顕微鏡を用いてバイオフィルム内の細菌の生・死を解析した。以上より,P. gingigivalisのみならず,F. nucleatumのバイオフィルム形成においてもAI化合物の抑制効果があることが示された。また,抗菌剤とAI化合物の併用はオーラルバイオフィルムのコントロール法として有用である可能性が示唆された。
神経幹細胞から見た水頭症の病態解明と治療への応用

3週齢のWistar ratの大槽に25%kaolin溶液を0.025cc注入することで、数週のうちに脳室の拡大が認められ、約70%の確率でラット水頭症モデルの作成が可能であった。脳室の拡大の程度はさまざまであり、観察期間との関連ははっきりしないが、水頭症を起こしたラットでは、神経幹細胞が存在する側脳室周囲のsubventricular zone (SVZ)自体が縮小しており、同部の総細胞数の減少がみられた。また脳室が拡大しているほどSVZの総細胞数が減少していた。前年度に作製した放射線照射による水頭症モデルとkaolin溶液の髄腔内投与による水頭症モデルを比較すると、前者は放射線照射によるSVZそのものへの影響が無視できないと考えられるが、後者はSVZそのものへの影響は少ないと考えられる。しかしながら、最終的なSVZの総細胞数の減少には有意な所見はなく、どちらもSVZの総細胞数の減少ならびにnestin陽性細胞の減少が観察された。これらの結果は脳室拡大があるときにはその原因にかかわらず、SVZの総細胞数ならびにnestin陽性細胞数の減少が生じることを示唆している。ただし、前者では照射後6時間でSVZに劇的なapoptosisが観察されるのと比較して、後者では劇的なapoptosisの増加はなくSVZの細胞数減少はnecrosisが主体だと考えられた。またその他の事象として、水頭症ラットではSVZ近傍の脳室上衣の欠損と反応性の細胞集簇を認め、同部にはnestin陽性細胞およびapoptosisが複数観察された。正常ラットでは脳室上衣にapoptosisはほとんど認めないことから、これはSVZから脳室上衣欠損部にnestin陽性細胞が遊走し、反応性に分裂した可能性を示唆している。以上の結果から水頭症の病態にはSVZに存在する神経幹細胞が大きく関与していることが推察された。3週齢のWisterラットの大槽に25%Kaolin溶液を0.05ml注入することで、あるいは全脳照射(1, 2, 3Gy)を行うことで、水頭症モデルの作製に成功した。脳室の拡大は14日目ですでに認められ、以後も脳室の拡大が増悪していった。放射線照射後の水頭症ラットの体重に大きな変化は認めなかったが、脳重量は照射後60日で有意な低下を認めた。また脳室下帯の細胞数を計測したところ、脳室下帯の総細胞数は照射後7日目にはコントロール群の70%前後にまで減少しているが、14目にはコントロール群と同程度にまで改善していた。その中で神経幹細胞数の比率をnestin抗体による免疫組織染色で評価したところ、放射線照射後2日目までは神経幹細胞の脳室下帯総細胞数に対する比率がコントロール群の70%前後にまで低下するが、7日目から14日目にかけてはコントロール群の150%以上にまで増加していた。このことは、放射線照射により神経幹細胞がある程度選択的に障害されるが、反応性に神経幹細胞の増殖が誘発され、脳室下帯の細胞数を維持する方向へ働いていることが示唆された。これは脳室下帯の可塑性を表していると考えられ、放射線照射に対する微小環境の回復・維持に神経幹細胞が関与していることが示唆された。しかしながら水頭症ラットではその後の脳室拡大に伴い脳室下帯の縮小を認め、同部の総細胞数の低下および神経幹細胞数の低下が認められた。これは水頭症の増悪に伴い、脳室下帯の可塑性が消失した可能性がある一方、脳室下帯の不完全な回復に伴い、水頭症が増悪した可能性が示唆された。Kaolin溶液の大槽内注入により髄液の吸収障害を惹起する水頭症モデルと、放射線照射により誘発される水頭症モデルではその病態が異なる。本年度はこの違いに着目し、神経幹細胞が水頭症に及ぼす影響について検討し、水頭症の病態と神経幹細胞の役割について考察する。

正常ラットでは脳室上衣にapoptosisはほとんど認めないことから、これはSVZから脳室上衣欠損部にnestin陽性細胞が遊走し、反応性に分裂した可能性を示唆している。以上の結果から水頭症の病態にはSVZに存在する神経幹細胞が大きく関与していることが推察された。
歯髄疾患における炎症性および疼痛性物質の動態と抑制

歯髄には多くのイオンチャネルや神経ペプチドが存在しているが、それらの歯髄炎や根尖性歯周炎に対する影響は詳細には知られていない。本研究では、歯髄疾患モデルラットを作成し、歯髄疾患の病態やそれに伴う痛みの抑制方法について、神経科学的手法を用いて解明することを目的とした。今年度は、雄性7週令Wistarラットの上顎左側第一臼歯に、三種混合麻酔の腹腔内投与による鎮静下で露髄処置を施し、口腔内環境に暴露させることにより歯髄疾患モデルラットを作成した。過量麻酔後にザンボニ固定液を用いた灌流固定を行い、各種組織を取り出した。上顎骨については10%EDTAによる脱灰処置を行った。それぞれの組織から、クライオスタットを用いて凍結組織切片を作成した。H-E染色による組織学的変化の解析から、露髄処置後は歯髄腔内で経時的に炎症が拡大し、露髄処置28日後では根尖部周囲組織に炎症性細胞の浸潤が認められることが分かった。各種抗体を用いて免疫染色を行ったところ、神経ペプチドの一つであるpituitary adenylate cyclase-activating polypeptide(PACAP)を含む神経線維が、未処置群と比較して露髄処置後に増加することが分かった。蛍光二重免疫染色を行ったところ、PACAPを含む神経線維は、caltitonin-gene related peptide(CGRP)も有していることが分かった。歯髄感覚を受容する延髄の三叉神経脊髄路核において、侵害刺激受容のマーカーであるc-fosとPACAPおよびPACAP受容体との免疫染色を行った。その結果、c-fos陽性ニューロン周囲にはPACAP陽性神経線維が存在し、PACAP陽性神経線維周囲にはPACAP受容体の発現が認められることがわかった。本研究では、歯髄疾患モデルラットを作成し、歯髄疾患の病態やそれに伴う痛みの抑制方法について、神経科学的手法を用いて解明することを目的としている。今年度は、はじめにコントロール群におけるイオンチャネルや神経ペプチドの分布を確認した。雄性7週令未処置Wistarラットについて、過量麻酔後にザンボニ固定液を用いた灌流固定を行い、各種組織を取り出した。上顎骨については、10%EDTAを用いて3週間の脱灰処置を行った。この組織切片に対して、複数のイオンチャネルや神経ペプチドを用いた免疫染色を施し、蛍光顕微鏡や共焦点レーザー顕微鏡を用いて観察を行った。その結果、ラット歯髄の神経線維や周囲組織にtransient receptor potential (TRP)イオンチャネルが存在することが確認された。また、caltitonin-gene relatedpeptide(CGRP)も観察された。これらのイオンチャネルや神経ペプチドは、三叉神経節ニューロンにおいても存在することがわかった。これらのイオンチャネルや神経ペプチドの関係や役割を確認するために、蛍光二重染色または蛍光三重染色を行った。これにより、三叉神経節ニューロンにおいて、TRPイオンチャネルとCGRPの共存が確認された。また、ラットの歯に露髄処置を施した。三種混合麻酔薬の腹腔内投与による鎮静下においてラットを開口保持し、上顎左側第一臼歯を明示し、歯科用エンジンとダイヤモンドポイントにより露髄処置を行った。本年度はコントロール群を用いた基礎データを得ることができたため、次年度は処置群を用いて詳細な解析を実施する。未処置ラット歯髄の神経線維や周囲組織、三叉神経節におけるイオンチャネルと神経ペプチドの分布を免疫組織学的手法により観察することができた。また、ラットの歯に露髄処置を施すこともできた。以上より、当初の計画に対しておおむね順調に進捗していると考えられる。しかしながら、処置群に対するデータは不足しているため、今後さらに詳細に研究を遂行する。

その結果、c-fos陽性ニューロン周囲にはPACAP陽性神経線維が存在し、PACAP陽性神経線維周囲にはPACAP受容体の発現が認められることがわかった。本年度の結果を受け、次年度では歯に露髄処置を施したラット処置群を作成し、各種抗体を用いた免疫染色を実施し、データの解析を行う。その後、それらのアンタゴニスト等をラット処置群に適用することで、イオンチャネルや神経ペプチドの分布、あるいは歯髄や周囲組織の変化に違いがみられるか解析を行い、データをまとめる。当初の計画からおおむね順調に実験が進み、予定よりも効率よく研究を進めることができたために次年度使用が生じた。次年度請求額と併せて、今後の研究進捗のために使用する予定である。
強免疫原性ヒト悪性黒色腫抗原遺伝子の発現機構解析とその特異的能動免疫療法への応用

本研究は、ヒト生態(担癌生体)において、強い免疫応答を惹起しうる抗原の同定ならびに、その発現における諸条件の解析を目的とした。報告者らが遺伝子ライブラリーのスクリーニングの結果、得たcDNAクローン(D-1)は、1029bpよりなり、既報告の哺乳動物由来遺伝子とは相同性が低く、新しい黒色腫関連抗原遺伝子と考えられた。黒色腫以外には神経芽細胞腫、TおよびB細胞リンパ腫細胞に存在し、正常線維芽細胞、正常リンパ球、腎癌細胞には認められなかった。コードする蛋白は約34Kdで、生細胞では約50Kdの分子として膜表面に発現されることが抗D-1抗体を用いた免疫沈降反応で示された。このD-1蛋白を固層化して行ったELISAでは黒色腫患者群において正常に比し、約5倍高い血清力価を得た。このD-1 mRNAの生体内分布はD-1 cRNAを用いたin-situhybridizationにより、極めて黒色腫に限局した発現が認められ、主要正常臓器細胞(精巣を除く)では、ほとんどなかった。抗D-1多クローン性抗体を用いた免疫組織化学染色では、D-1 mRNAの発現に一致して、同抗原蛋白の局在を検出したが、黒色腫標本によっては、膜表面よりも、むしろ細胞質に強く局在を示唆する陽性所見を得、D-1蛋白抗原の膜表面発現には特定のHLA class分子の関与の必要性が考えられる。患者群は抗D-1抗体の高力価群と低力価群に分けられるので、その各々におけるHLA class I分子の比較解析を現在行っている。また、autologousなsystemを用いて行ったD-1活性化リンパ球の黒色腫細胞に対する細胞障害活性は、14日目までのco-cultureでは対象と大差なく、28日間cultureによりその差を認めたことから、D-1特異的T細胞のクローナルな拡大が考えられた。上記の如く得られた所見のもと、stage IV患者を中心に能動免疫療法を施行中であり、生存率の延長など、長中期的に観察中である。尚、当初、D-1以外のクローンについても同様実験を行う予定で会ったが、その核酸配列は既報告のE.coli由来のgeneと高い相同性を示すことが判明し、当計画より除外した。平成4年度における新しい知見を以下に列挙する。1.平成3年度までにクローニングされていた3種の強免疫原性ヒト悪性黒色腫抗原遺伝子(D-1,A-1,E-1)のうち、D-1に関しては完全に、A-1に関しても、ほぼ完全に核酸配列を決定した。いずれも既報告の哺乳動物由来蛋白をコードする核酸との顕著な相同性は認めなかった。2.組み換え蛋白発現のシステムを変更し、融合蛋白としてではなく、組み換え蛋白部分のみを精製しうるようになった。すなわち、プラスミドをpMALに変更し、まずマルトース結合蛋白質との融合蛋白を誘導し、アミロース・レジンで精製したあと、FactorXaにてマルトース結合蛋白を切断し、組み換え蛋白を得た。この蛋白をマウスに免疫し、D-1抗原の蛋白レベルでの生体内分布を知るに必要な単クローン性抗体を作成中である。

3.遺伝子レベルでのD-1抗原遺伝子の発現を生体内において立証するため、外科的に切除した黒色腫標本を用い、In-Situハイブリダイゼーションを行った。検索した20例全例の黒色腫に陽性で、その発現にはheterogeneityがあり、転移巣と原発巣での明らかな差異は現在の症例数では認めなかった。また母斑細胞性母斑では10例中9例が、有刺細胞癌,基底細胞上皮腫,脂漏性角化症では検索した全例が陰性であった。黒色腫周囲の緑維芽細胞,角化細胞においても陰性であり、このことからD-1抗原遺伝子の発現は、かなり黒色腫に制限されたものであること、および、D-1抗原遺伝子が実験操作中に生じた何らかのartifactではなく、実際に生体内で発現されていることが立証された。平成5年度において得られた新しい知見は,(1)当該遺伝子cDNA D-1(1029bps)を新しいVector(pMAL)にサブクローニングした結果、D-1がコードする組み換え蛋白のみを精製しうるようになり、その蛋白をマウスに免疫して獲得した多クローン性抗体により、蛋白レベルでのD-1の組織局在が検出可能となった事,(2)In situ hybridizationに従来使用していたcDNAプローブをcRNAに変更することにより、非特異的反応を抑制し、より詳細に遺伝子レベルでのD-1の局在を組織切片上で検討しうるようになった事である。以下に各々の結果につき説明する。(1)に関して:pMAL Vectorにより産生したマルトース結合蛋白とのD-1融合蛋白をFactor Xaで切断しaffinitychromatographyでD-1蛋白のみを分離。Balb/cマウスに免疫した。得られた血清をE.coli抽出物で吸収した後、パラフィン切片上に応用した。その結果、抗D-1多クローン性抗体は原発巣・転移巣を含め黒色腫細胞膜および細胞質内にD-1抗原の局在を検出した。従って、細胞質内のD-1蛋白抗原の細胞膜表出におけるHLA-class I抗原のhaplotypeやその結合に関する研究が更に必要となった。(2)に関して:plasmid Bluescript IIに組み込まれたD-1 cDNAをin vitro transcriptionにより、cRNAすなわちriboprobeとしin situ hybridizationに供した。この利点はRNA-RNA結合がより親和性が高いこと,従って更に厳しい条件下で反応を行うことが可能となり、非特異的反応を抑制できる。またsenseおよびantisenseの両probeが作成されるのでcontrol studyがより適切となった事が挙げられる。その結果、D-1 mRNAは極めて黒色腫に限局して存在することが判明し、また主要正常臓器にも、有意の反応がなかったことより、D-1組み換え蛋白抗原のワクチンとしての使用に有用な情報を得ることができた。現在、極く少数存在するD-1(-)の黒色腫患者において、その血清中の抗D-1抗体をマーカーに諸々のBRMでD-1のinductionを検討中である。当研究計画の最終年度として、強免疫原性ヒト悪性黒色腫抗原および、そのコードする遺伝子の組織分布をまず確定した。方法はpMAL vectorにおいて発現させた当該遺伝子産物(D-1蛋白抗原)をBalb/cマウスに免疫して獲得した抗D-1多クローン性抗体による免疫組織化学染色と、D-1 cDNAを組み込んだp
単一細胞オミックスデータに基づく細胞系譜推定および比較アルゴリズムの開発

本研究課題では、単一細胞オミックスデータに基づいて細胞系譜を推定し、それらの比較を通じて生物学的及び医学的知見を獲得するための高速かつ高精度な統合解析アルゴリズムを開発する。細胞系譜推定とそれらの比較手法が確立されれば、正常組織の発達や癌などの病理について重要な情報を提供することができるだけでなく、例えば、分化性能の良いiPS細胞を選別することや細胞が正常に分化しない場合の原因究明などに役立つと考えられるため、近年著しい発展を遂げているiPS・ES細胞を用いた再生医療研究の一助にもなることが期待される。
特定問題への新しい特異値分解アルゴリズムの適用に関する研究

非常に小さい特異値を持つ行列の特異値分解が可能となるように改良を行った.また,様々な特異値分解アルゴリズムの性能を調べるためのテスト行列の作成法について,まとめた.非常に小さい特異値を持つ行列の特異値分解が可能となるように改良を行った.また,様々な特異値分解アルゴリズムの性能を調べるためのテスト行列の作成法について,まとめた.1.新しい特異値分解アルゴリズムの開発既存の特異値分解法では,大規模な行列を扱えない.そこで,新たに可積分系の考えを取り入れて特異値分析アルゴリズムを開発している.本年度は,この一環として,特異値分解ライブラリI-SVDを開発し,その性能を比較調査した.上2重対角行列を対象とする実験を行った結果,計算時間が,従来の方法(QR法,DC法)では0(m^3)必要であるのに対して,新しいアルゴリズムでは0(m^2)であることが確認された.また,特異値分解された行列の直交性と真値に対する誤差を調べたところ,直行性は若干劣るものの,真値に対する誤差が小さいことがわかった.この研究を行う過程において,QR法は,直交性を重視するあまりに,与えられた行列によっては,真値に対する誤差が非常に悪く,本来得られるべき特異値分解とは違う結果が得られる場合があることもわかった.2.分割統治法の改良より大規模な行列を特異値分解するためには,並列化するべきである.しかし,I-SVDアルゴリズムで採用している特異値計算法mdLVsはデータの依存関係が強く,並列化に向かない.そこで,この問題を解決するために,分割統治法で利用されている特異値計算の部分のみを取り出し,その後,I-SVD法の特異ベクトル計算を行うように改良した.3.ツイスト分解を用いた特異ベクトル計算の改良新しく開発した特異値分解アルゴリズムI-SVDの特異ベクトル計算において,ツイスト分解が利用されている.このツイスト分解は,各特異ベクトルを独立に計算するため,既存の方法と比べ,直交性が悪い.この問題を解決するために,シフトとスケールを導入した.シフトによって,最小特異値が0に近づくように移動させる.スケールによって,密集した特異値を可能な限り分散させる.これらによって,従来にI-SVD法よりも1桁精度を向上することに成功した.1.ツイスト分解を用いた特異ベクトル計算の改良新しく開発された特異値分解アルゴリズムI-SVDの特異ベクトル計算において,ツイスト分解が利用されている.既存の方法であるQR法は,直交行列を作用させることによって,特異値分解を行う.そしため,直交性はよいが,真の値に対する誤差が大きい場合もある.一方,このツイスト分解は,特異値を計算後,各特異ベクトルを独立に計算するための方法である.そのため,誤差は小さいが,直交性が悪化することがある.この問題を解決するために,ツイスト分解で利用されるパラメータのチューニングを行い,さらに,シフトとスケールを導入した.パラメータチューニングによって,各特異値に適した値を見出すことができた.シフトによって,最小特異値が0に近づくように移動させる.スケールによって,密集した特異値を可能な限り分散させる.このシフトとスケールを組み合わせることによって,従来のI-SVD法よりも精度を向上することに成功した.2.新しい特異値分解アルゴリズムの改善開発中のI-SVD法では,特異ベクトルVの計算にはツイスト分解を適用しているものの,もう1つの特異ベクトルUの計算は一般的な行列計算で行っていた.しかし,実験の結果,特異値の分布によっては,特異ベクトルUの直交性が非常に悪化することがあった.この問題を解決するために,特異ベクトルUを計算する際にもツイスト分解を適用するように改善を行った1特異値分解ライブラリの構造解析開発中の特異値分解ライブラリは, FORTRAN77で開発されている,しかし,多くの開発環境がC言語に移行しつつあるこのことを踏まえ, C言語によるライブラリ開発を開始したこの際, FORTRAN77で開発されたライブラリの構造解析を行い, C言語への移植を試みた.その結果,判別式による分岐のうち,いくつかが不要であることが判明した2並列プログラムの開発特異ベクトル計算に関しては,完全独立で計算できるため.並列化は容易である.しかし,特異値計算に関しては,依存関係が強いため,新たな並列化手法の提案が必要である.そこで,本年度は,共有メモリ環境向けと分散メモリ環境向けの並列化手法をそれぞれ提案した.3ライブラリの性能評価のためのテスト作成手法の提案他の研究グループによって開発されたライブラリが苦手とするテスト行列を見出しその作成手法を提案した
肺神経内分泌癌におけるHedgehog 経路の治療標的の可能性の探索

肺原発神経内分泌がんは難治がんのひとつである。その増殖および抗がん薬の耐性にSonic Hedgehog経路が関与しているという仮説に基づき、肺原発神経内分泌がんにおける同経路の発現状況を明らかにした。また、同経路を阻害して抗がん薬の効果を改善させることを目的とし、同経路の阻害薬を用いたがん細胞株増殖抑制効果を明らかにした。また、同経路の重要な伝達因子であるGli1/2をRNAのレベルで阻害し、細胞障害性抗がん薬であるシスプラチンの効果を高めることを明らかにした。肺原発神経内分泌癌細胞株(H1155, H1299, SHP-77など)を用いて、Sonic Hedghog ligandおよびSmoothened agonistによるHedgehog経路活性化による細胞増殖能の変化や、経路内因子の発現強度の変化についてのmRNAおよびタンパクレベルでの検討を行っている。活性化ligandのみでは、現在のところ明らかな細胞増殖の変化は認められなかった。しかしながら、同経路は抗がん薬治療などに伴う細胞死を抑制、anti-apotosisに作用することが想定されており、肺原発神経内分泌癌に対するkey-drugであるシスプラチンを用いて、ligandとの併用、もしくはHedgehog経路活性化阻害薬を用いた増殖の変化を検討した。シスプラチンとともにHedgehog経路の中心に位置するSmo阻害薬であるcyclopamineを投与することによって、細胞死が増強される結果が得られつつある。その他にも、既に臨床応用をされているSmo阻害薬を複数用いた適切な濃度設定を行っており、Smo阻害の特異性を確認するとともに、Hedgehog経路内因子の発現変化をmRNAおよびタンパクレベルで検討している。現時点での結果の解釈は困難であるが、Smo阻害薬を含めたHedgehog経路阻害とシスプラチンを含めた細胞傷害性抗がん薬を組み合わせることにより、細胞増殖を抑制する可能性が示唆されており、その機序の解明について複数の実験を進めている。肺原発神経内分泌がん細胞株(H1155, H1299, SHP-77など)を用い、Sonic Hedgehog ligandおよびSmoothened agonistなどによるHedgehog経路活性化を試み、細胞増殖への影響を評価したが顕著な変化は認められなかった。しかしながら、Hedgehog経路の因子に対する阻害薬による影響を評価したところ、細胞増殖抑制効果が認められた。このことは、ligandによる経路刺激のない状況においても、神経内分泌がん細胞株においては恒常的にHedgehog経路が活性化されているものと考えられた。阻害薬による増殖抑制効果については、複数の薬剤による評価を行ったが、増殖抑制効果には大きなばらつきがあり、また、Hedgehog経路の重要な伝達因子であるGli-1やGli-2のmRNAの発現量には大きな変化が認められなかった。阻害薬によるHedgehog経路の阻害効果が非特異的かつ不完全であることが想定されたため、Gli-1, Gli-2のsiRNAによる経路阻害を図ったところ、mRNA levelでのGli-1, Gli-2の明らかな阻害効果を認め、かつ、腫瘍細胞株に対する顕著な増殖抑制効果を認めた。この効果は、細胞障害性抗がん薬であるシスプラチンとの併用において相乗的な効果を示しており、apoptosisの増加も認められた。Gli-1, Gli-2の発現を確実に抑制することが腫瘍細胞における増殖抑制に不可欠なものであることを明らかにした。臨床的にも、肺がん症例におけるSonic Hedgehog経路の阻害薬とシスプラチンなどの細胞障害性抗がん薬との併用による効果は限定的であったという結果が得られており、上記知見は、Sonic Hedgehog経路阻害薬による阻害効果が不完全なものであることに起因する可能性があるものと考えられた。Hedgehog pathwayのactive ligandによる細胞増殖が全くみられなかったことについて、各薬剤の濃度設定の見直しや、手技的な確認に時間を要した。結果、ligandの投与のみにては細胞増殖に大きな影響を与えないことが確定した。また、現時点で複数の新規のSmo阻害薬を用いていることから、適切な濃度設定選択に時間を要した。タンパクレベルでのHedgehog経路内因子の発現評価のためのWestern blottingについては、因子によってはタンパク発現量が少量であることが推測されており、実際に評価が困難となっている。現在手技的な見直しによる解決を図っている。臨床腫瘍学現時点で、Hedgehog経路の活性化による肺原発神経内分泌癌細胞株の細胞増殖への影響はあきらかとはなっていない。その経路内因子の発現を正しく評価することにより、ligandのHegdehog経路への作用と機序をまず明らかにしたいと考えている。その結果により、活性化・抑制について重要度の高い伝達因子を同定し、標的を絞ってより効率的に研究を推進することができると考える。in vivo実験への移行が遅れており、研究指導者および研究協力者との連携を密にして効率的な実験の遂行と、技術的な補助を得ることとする。
葉緑体を中心とする各種プラスチドの電子伝達反応の制御機構

これまでの2つの国際学術研究(平成4年からの2年間(04044110)および平成6年度1年間(06044086))で行って来た共同研究をさらに前進させ、葉緑体を中心とする各種のプラスチドの電子伝達反応の制御機構を解明することは、光合成から始まる植物の重要な同化機構までを一体として捉らえ、理解するために不可欠であると思われる。新しくスタートした共同研究(07044188)では、とくに以下の点を明らかにすることを目的とした。1)フェレドキシン(Fd)を中心とするプラスチド内の電子伝達反応に関して、光合成組織における葉緑体と非光合成組織におけるプラスチド間でどのような違いがあるか明らかにする。2)光化学系I反応中心複合体の電子伝達成分を高等植物の葉緑体、緑色イオウ細菌、さらに原始的と考えられているHeliobacteriaについて比較検討し、Fe-Sセンター型光化学系の電子伝達の調節機構を明らかにする。3)チオレドキシン系によるチオール=ジスルフィド交換反応と細胞内レドックス調節機構との関連および種々生理活性物質の機能調節について明らかにする。これらの点について研究は日米双方でそれぞれ独自に行うが、なるべく連絡を密にして情報交換を行うことにした。またそれぞれが研究を補完し合うために、互いに調製したサンプルを持参して結果の検討をすることとした。非光合成組織におけるプラスチドの電子伝達機構の研究はこれまでにも和田、松原、ブキャナンによって行われてキたが、今年度に至ってようやくホウレンソウ根から非光合成組織に特異的に発現するフェレドキシン-NADP還元酵素(FNR)のcDNAを得ることに成功したのは今後の研究に対しても大きな成果の一つであった。これまでの方法を再検討して、改めて作成したDNAプライマーを用いて、PCR法により正しいクローンを得ることができた。その結果、葉緑体で発現すつFNRとアミノ酸配列を比較することが可能となり、これまでに報告されてきたイネ、トウモロコシのものとも合わせ、非光合成組織のもの同士は相同性が高く、光合成組織のものと非光合成組織のものとは相同性が低いことが、これまでもFdのアミノ酸配列からも言われていたように、明らかになった。これは進化的に重要な意味をもっており、植物種の分化以前に光合成組織と非光合成組織の分化が起こったことの証明と考えられる。NADPHの結合サイトやフラビンの結合サイトでは互いに相同性が高いこと、またFd結合サイトを含むN-末端部で違いが大きいことも、非光合成組織においては葉緑体とは逆の電子伝達を行っているとする考えを指示するものである。また、非光合成組織型FNRが幼植物では葉緑体でも発現・機能している事実が明らかになり、発現調節は組織特異的ではなく、もっと複雑にプラスチドの機能と連携した機構で調節が行われている用である。得られた非光合成組織型FNRのcDNAを用いて、いよいよ発現調節の研究に着手できることになった。葉緑体の光化学系I複合体はいわゆるFe-Sセンター型で、緑色イオウ細菌の光化学系を祖先系とするものと考えられて来た。最近特にHiliobacteriaの光化学系の研究が進み、共通してFe-Sセンター型光化学系をもつことが明らかとなった。それらが有する複合体内の電子伝達成分についても相当の相同性が見られる。ゴルベックは光化学系I複合体のセンターXに着目し、そのFe-Sセンターを保持していると考えられるシステイン556とシステイン565をセリンに遺伝子改変によって変えたものを用いて、Fe-Sセンターを構成させ、電子伝達速度の変化を比較した。そしてFe-Sセンター結合部位近傍のどのアミノ酸残基が重要かについても明らかにした。これはブランケンシップらのHeliobacteriaの光化学反応中心複合体タンパク質の構造比較からの結論ともよく一致することが明らかとなった。ブキャナンらはチオレドキシン系によるチオール=ジスルフィド交換反応と細胞内レドックス調節の機構を解析して来た。最近では細胞内レドックス調節の重要性が細胞内でのウイルスの繁殖とも関連しているとの結果も出され、ますます重要視されている。また種々の生理的阻害物質、蛇毒、蜂毒等の生物毒、アレルゲンなどの生理活性物質の無力化にもこのチオレドキシン系が有効に利用できるという結果が集積されつつある。これらプラスチド内の電子伝達機構の調節は、それ自身で重要であるばかりか、ひいては細胞内の電子伝達とレドックス調節にも繋がりを持ち、あらゆる植物の環境適応や生育そのものにも関係し、植物研究の基礎となるものである。

3)チオレドキシン系によるチオール=ジスルフィド交換反応と細胞内レドックス調節機構との関連および種々生理活性物質の機能調節について明らかにする。これらの点について研究は日米双方でそれぞれ独自に行うが、なるべく連絡を密にして情報交換を行うことにした。またそれぞれが研究を補完し合うために、互いに調製したサンプルを持参して結果の検討をすることとした。非光合成組織におけるプラスチドの電子伝達機構の研究はこれまでにも和田、松原、ブキャナンによって行われてキたが、今年度に至ってようやくホウレンソウ根から非光合成組織に特異的に発現するフェレドキシン-NADP還元酵素(FNR)のcDNAを得ることに成功したのは今後の研究に対しても大きな成果の一つであった。これまでの方法を再検討して、改めて作成したDNAプライマーを用いて、PCR法により正しいクローンを得ることができた。その結果、葉緑体で発現すつFNRとアミノ酸配列を比較することが可能となり、これまでに報告されてきたイネ、トウモロコシのものとも合わせ、非光合成組織のもの同士は相同性が高く、光合成組織のものと非光合成組織のものとは相同性が低いことが、これまでもFdのアミノ酸配列からも言われていたように、明らかになった。これは進化的に重要な意味をもっており、植物種の分化以前に光合成組織と非光合成組織の分化が起こったことの証明と考えられる。NADPHの結合サイトやフラビンの結合サイトでは互いに相同性が高いこと、またFd結合サイトを含むN-末端部で違いが大きいことも、非光合成組織においては葉緑体とは逆の電子伝達を行っているとする考えを指示するものである。また、非光合成組織型FNRが幼植物では葉緑体でも発現・機能している事実が明らかになり、発現調節は組織特異的ではなく、もっと複雑にプラスチドの機能と連携した機構で調節が行われている用である。得られた非光合成組織型FNRのcDNAを用いて、いよいよ発現調節の研究に着手できることになった。葉緑体の光化学系I複合体はいわゆるFe-Sセンター型で、緑色イオウ細菌の光化学系を祖先系とするものと考えられて来た。最近特にHiliobacteriaの光化学系の研究が進み、共通してFe-Sセンター型光化学系をもつことが明らかとなった。それらが有する複合体内の電子伝達成分についても相当の相同性が見られる。ゴルベックは光化学系I複合体のセンターXに着目し、そのFe-Sセンターを保持していると考えられるシステイン556とシステイン565をセリンに遺伝子改変によって変えたものを用いて、Fe-Sセンターを構成させ、電子伝達速度の変化を比較した。そしてFe-Sセンター結合部位近傍のどのアミノ酸残基が重要かについても明らかにした。これはブランケンシップらのHeliobacteriaの光化学反応中心複合体タンパク質の構造比較からの結論ともよく一致することが明らかとなった。ブキャナンらはチオレドキシン系によるチオール=ジスルフィド交換反応と細胞内レドックス調節の機構を解析して来た。最近では細胞内レドックス調節の重要性が細胞内でのウイルスの繁殖とも関連しているとの結果も出され、ますます重要視されている。
ヒストンアセチル化誘導剤による頭頸部癌分化誘導療法

本研究では頭頸部癌分化誘導療法の開発を目指し,分化誘導剤ベスナリノンによるp21waf1およびTSC-22遺伝子の転写調節機構を解明を行った。まず,p21wafl遺伝子プロモーターのベスナリノン反応性領域の検索を行った。種々の長さのp21waf1遺伝子プロモーターを含むルシフェラーゼレポータープラスミドを用いた検索により,プロモーター領域のTATA Box上流の-168 bpから-13 bpの領域にべスナリノン反応性領域が存在することを明らかにした。次に,p21waf1遺伝子の転写活性化に関与する転写因子の同定をゲルシフトアッセイにより行った。その結果,ベスナリノン処理によりp21waf1遺伝子プロモーター領域に存在する6個のSp1サイトのうち,最も上流に存在するSp1-1とそのすぐ下流に存在するSp1-2サイトに転写因子Sp1およびSp3の結合することが明らかとなった。さらに,その転写調節にはヒストンアセチル化が関与しており,ベスナリノンによるp21waf1遺伝子の転写制御において,、DNA結合性転写因子Sp1およびSp3と相互作用する何らかのコアクチベーターの存在している可能性が示唆された。続いてTSC-22遺伝子をクローニングし,構造決定を行った。ヒトTSC-22遺伝子は3つのエキソンよりなり,蛋白読み取り枠は全エキソンにまたがって存在していた。TATA BoxはそのmRNAのサイズより2116に存在する(CATATATTTGC)が最も可能性の高いこと,また,転写開始点はTATA boxより7 bp下流の2126および29bp下流の2148に存在することが明らかとなった。TATAbox上流約2.1kbのプロモーター領域には多くの転写因子反応性領域が存在した。このプロモーター領域を用いてルシフェラーゼアッセイを行ったところベスナリノン,all trans-retinoic acid, dibutyryl cyclic AMPなどの分化誘導作用を有する薬剤により転写活性化が認められた。ベスナリノンは,TYS細胞において転写因子Sp1,Sp3を活性化させ,ヒストンアセチル化を誘導することによりp21waf1遺伝子を転写活性化することが明らかとなった。またTSC-22遺伝子もベスナリノンにより直接の転写活性化を受けることが示された。従来,我々は唾液腺癌などを含む消化器癌の分化・増殖のメカニズムおよび分化誘導療法の開発に関する研究を行っている。この過程で,2-(1H)-キノリノンの基本骨格を保有した分化誘導剤であるベスナリノンが,唾液腺癌細胞TYSにおいてp21waf1遺伝子の発現を誘導し,細胞周期をG1期に停止させることで細胞増殖抑制効果を発揮することを明らかにした。本研究では,ベスナリノンによるp21waf1遺伝子の転写機構のさらなる解明を目的とした。まず,ルシフェラーゼアッセイを用いてp21waf1遺伝子プロモーターのベスナリノン反応性領域の同定し,さらにEMSAによりベスナリノンによるp21waf1遺伝子の転写活性化にいかなる転写因子が関与しているかを検索した。さらに,近年,遺伝子の転写活性機構に非常に重要な役割を演じているヒストンアセチル化機構に着目し,TYS細胞においてベスナリノンがヒストンアセチル化を誘導するか否かを検討した。以上のような実験から,TYS細胞におけるベスナリノン処理によるp21waf1遺伝子の発現調節は,転写因子Sp1が活性化され,Sp1サイトへの結合が促進し,そこにp300などがリクルートされた結果,ヒストンのアセチル化が誘導され,クロマチン構造が変化し,転写活性化が促進された結果だと結論づけた。このようにp21waf1遺伝子の転写調節機構を分子レベルで解明することは,単に特定の薬剤による特定の遺伝子の作用機序を明らかにすることのみならず,普遍的な分化誘導のメカニズムの解明につながり,分子標的診断あるいは分子標的治療の開発にもつながると考える。

TATA BoxはそのmRNAのサイズより2116に存在する(CATATATTTGC)が最も可能性の高いこと,また,転写開始点はTATA boxより7 bp下流の2126および29bp下流の2148に存在することが明らかとなった。TATAbox上流約2.1kbのプロモーター領域には多くの転写因子反応性領域が存在した。このプロモーター領域を用いてルシフェラーゼアッセイを行ったところベスナリノン,all trans-retinoic acid, dibutyryl cyclic AMPなどの分化誘導作用を有する薬剤により転写活性化が認められた。ベスナリノンは,TYS細胞において転写因子Sp1,Sp3を活性化させ,ヒストンアセチル化を誘導することによりp21waf1遺伝子を転写活性化することが明らかとなった。またTSC-22遺伝子もベスナリノンにより直接の転写活性化を受けることが示された。
骨格筋の損傷及び再生に対する運動と加齢の影響

下肢筋に対して一定負荷(伸展角度、伸展速度)のエキセントリック収縮を起こさせる機械刺激装置を開発し、筋に大きな崩壊を引き起こし再生過程の構造変化を検討した。昨年度は同じ電気刺激・伸展条件に対して崩壊量が25-80%と違いが見られたことに関して、腓腹筋上の刺激電極位置を調整することによりほぼ一定とすることが可能となった。そこで平成10年度には本装置を用いて伸張性収縮後の筋損傷部位別の差違を検討し、さらに損傷を受けやすい筋線維タイプに関して検討を行った。伸張性収縮の後27日には強縮張力の低下が認められ、3日後に最低値を示した。そこで3日後を含む15日後の筋横断面を近位部、筋幅部、遠位部位別の損傷筋線維の割合は、それぞれが43.56、30.88、25.11%と異なり、近位の方が損傷を受けていた。このことから、筋の損傷を評価する場合には近位部に注目すべきことが示された。次に連続切片を用いることにより、損傷を受けていた筋線維のタイプを他の損傷のない部位で同定したところ、観察できた筋線維の全てがType IIbであり、機械的な伸張性収縮では筋の近位部に損傷が多く、筋線維タイプではType IIbがより損傷を受けやすいことが示された。また、トレーニング筋は下肢筋のエキセントリック収縮による損傷に強い耐性がみられた。これに対し本年度実施した老齢筋に対する下り走による被験筋へエキセントリック収縮は、若齢筋に比べ損傷の程度、回復速度ともに劣っていた。老齢筋においては明らかに損傷筋線維数が増加、張力の低下、シナプス遅延の延長が認められた。平成9年度の実験計画では、「筋再生過程の組織学的変化として機会刺激装置の開発」であり、これにより下肢筋に対して一定負荷のエキセントリック収縮を起こさせること、また大きな崩壊を引き起こし再生過程を金の構造面から明確に捉えることを目的とした。機械刺激装置は電気刺激装置からのトリガー信号によりサーボモーターが牽引開始し、トリガー信号に対してサーボモーターの開始遅廷時間、回転速度(0-120度)と回転角度(0-300度/sec)が調整できる装置を作成した。次ぎにこの装置により成熟ラットに対し腓腹筋・足底筋筋のエキセントリックな収縮を行った結果、30秒毎450msec間の強縮刺激を1時間継続するのに対して、遅廷時間100msec、回転角度60-80度、回転速度250度/secにて足関節を背屈させ筋にエキセントリック収縮を起こさせることで十分量の崩壊を起こすことが確認できた。しかし、現時点で、同じ電気刺激・伸展条件に対して崩壊量が25-80%がみられており、刺激部位などの再検討の必要性が感じられている。また、再生過程は大きな崩壊後にも3週間でほぼ完了することが確認された。もう1つの計画であった「トレーニングによる筋崩壊耐性と可塑性」に関しては、発育期から成熟期までの3ヶ月間に走トレーニングを行ったラットに対し、下り走を用いた下肢筋のエキセントリックな収縮を行わせ、損傷の程度、回復速度を生理的組織化学的特性から調べた。トレーニング筋においては明らかに損傷を起こす筋腺維数は対照筋よりも少なく、張力の低下、シナプス遅廷の延長、運動終板の刺激伝達量の減少などは抑えられた。この結果は、常に運動ストレスが加わるトレーニング筋では防御機構としての免疫細胞を活性化や調整を行うサイトカインが増加が起こっていることを示唆するものであった。

昨年度は同じ電気刺激・伸展条件に対して崩壊量が25-80%と違いが見られたことに関して、腓腹筋上の刺激電極位置を調整することによりほぼ一定とすることが可能となった。そこで平成10年度には本装置を用いて伸張性収縮後の筋損傷部位別の差違を検討し、さらに損傷を受けやすい筋線維タイプに関して検討を行った。伸張性収縮の後27日には強縮張力の低下が認められ、3日後に最低値を示した。そこで3日後を含む15日後の筋横断面を近位部、筋幅部、遠位部位別の損傷筋線維の割合は、それぞれが43.56、30.88、25.11%と異なり、近位の方が損傷を受けていた。このことから、筋の損傷を評価する場合には近位部に注目すべきことが示された。次に連続切片を用いることにより、損傷を受けていた筋線維のタイプを他の損傷のない部位で同定したところ、観察できた筋線維の全てがType IIbであり、機械的な伸張性収縮では筋の近位部に損傷が多く、筋線維タイブではType IIbがより損傷を受けやすいことが示された。また、トレーニング筋は下肢筋のエキセントリック収縮による損傷に強い耐性がみられた。これに対し本年度実施した老齢筋に対する下り走による被験筋へエキセントリック収縮は、若齢筋に比べ損傷の程度、回復速度ともに劣っていた。老齢筋においては明らかに損傷筋線維数が増加、張力の低下、シナプス遅延の延長が認められた。
非侵襲的細胞脂質解析を目指した生体触媒モジュールの開発

脂質・脂肪酸分子種の網羅的解析技術の開発は、その生命活動における重要性にも関わらず、他の分子種に比べ遅れている。将来的に、細胞非侵襲的かつ連続的な時系列での分析を可能とするためには、新たな手法の開発が必要である。生体触媒モジュール(酵素)を用いる分析法は、その基盤技術になると考える。本研究では、脂質・脂肪酸分子種の酵素分析法として、1)脂質クラス特異的脂肪酸遊離酵素(リパーゼ、ホスホリパーゼ、グリコリパーゼ、セラミダーゼ等)による遊離脂肪酸の生成、2)遊離脂肪酸のシトクロームP450による分子種分別、3)シトクロームP450反応生成物(過酸化物)のペルオキシダーゼ反応によるモニタリング、の3ステップにより構成される系の構築を試みた。本年度は、本分析系においてセンシングの要となるシトクロームP450の開発に関して、前年度に、引き続き、脂肪酸水酸化酵素であるBacillus megaterium由来シトクロームP450 BM-3の変異型酵素ライブラリーの作成、ならびに、様々な変異型酵素・基質の組み合わせについてペルオキシダーゼとのカップリングによる脂肪酸の検出を試みた。その結果、明瞭な差異ではないものの、脂肪酸鎖長や不飽和度の違いをモニターしうる変異型酵素群の作成を達成した。また、その過程で、スーパーオキシドジスムターゼによるP450 BM-3の活性化/安定化現象を見いだした。この活性化/安定化は、スーパーオキシドジスムターゼの触媒機能に起因していたため、活性酸素消去がP450 BM-3の活性化/安定化に有効であることが示唆され、スーパーオキシドジスムターゼのP450 BM-3変異型酵素群による脂肪酸センシングの活性化/安定化への応用が期待された。本年度は、本分析系においてセンシングの要となるシトクロームP450の開発を行った。具体的には、脂肪酸水酸化酵素であるBacillus megaterium由来シトクロームP450 BM-3に関して、脂肪酸選択性に影響を与えるアミノ酸残基を選抜し、8種類の変異型酵素を設計した。また、これらの変異型酵素についてN末にHis-tagを付与し、大腸菌における高発現系、ならびに簡易精製法を確立した。さらに、得られた変異型酵素ならびに野生型酵素につき、各種脂肪酸存在下でのNADPH消費速度を比較検討した。その結果、変異型酵素において、不飽和脂肪酸に対する基質特異性が変化していることを確認した。また、過酸化水素(活性酸素)消去系の存在下にてNADPH消費速度の変化を認め、過酸化水素の発生が予想された。そこで、様々な変異型酵素・基質の組み合わせについて、ペルオキシダーゼとのカップリングによる脂肪酸の検出を試み、脂肪酸鎖長や不飽和度の違いがどのようにモニターされるかを観察した。その結果、変異型酵素群が、明瞭な差異ではないものの、脂肪酸分子種を識別しうることを確認した。