hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
肺腺癌浸潤における癌幹細胞の役割についてのiPS細胞技術を用いた研究

特定の因子導入によりiLCSCを誘導できると考えられた。またiLCSCを用いることにより、肺癌組織に類似した肺癌オルガノイドを構築することに成功した。我々は本研究にて、体細胞初期化因子を導入したOSK-A549において、遺伝子導入後1015日にコロニーが出現し、誘導された細胞の癌幹細胞性の評価を行った。まず細胞増殖能に関して、OSK-A549細胞において、細胞増殖能の低下を認めている。これは遺伝子導入によりdormantな状態の癌幹細胞が誘導され、全体として増殖能が落ちていると考えられる。さらにCell cycle assayを用いた細胞周期解析により、誘導されたColonyにおいて、G0/G1期の細胞が多く存在していることが確認され、このことも癌幹細胞性を獲得した細胞が誘導されたことを示唆する所見である。癌幹細胞性の評価として用いられるSphere formation assayを用いた解析では、OSK-A549細胞においてのみ、著明なSphere形成能の上昇を認めている。以上の結果から、体細胞初期化因子の導入により、肺癌幹細胞様の細胞が得られると考えられる。26年度は肺癌幹細胞様細胞の作成法の確立を計画し順調に達成しており、現時点で、すでに27年度の計画に取り掛かっており、上記の区分に相当すると考える。これまでに、体細胞初期化因子を導入したOSK-A549において、遺伝子導入後10&#12316;15日にコロニーが出現し、誘導された細胞の周囲に、紡錘形の細胞が多数出現することを確認した。癌幹細胞は転移・再発の原因となると考えられているが、癌幹細胞がどのような機序により転移・再発に関わっているのかは、明らかになっていない。肺癌の浸潤部において、繊維芽細胞の増生、上皮間葉転換(Epithelial mesenchyme transition: EMT)を認めるが、この繊維芽細胞の増生・EMTの有無が手術後の肺癌患者の予後を大きく左右している。今後は、本研究で誘導されるOSK-A549-Colony、OSK-A549-SNと元のA549のRNAを抽出・精製し、得られたRNAをマイクロアレイによって解析し、癌幹細胞様特性獲得や、高い移動能の獲得に関与する遺伝子の候補を抽出する。これらの遺伝子候補の機能解析を細胞生物学的手法により行う。すなわち強制発現やノックダウンによる機能喪失実験によってこれらの遺伝子候補の関与を明らかにする。28年度が最終年度であるため、記入しない。肺腺癌細胞由来の癌幹細胞のフローサイトメトリーを用いた癌幹細胞の選択的回収、その機能解析を行う。上記により回収された細胞のRNAを抽出・精製し、得られたRNAをマイクロアレイによって解析し、癌幹細胞様特性獲得に関与する遺伝子の候補を抽出する。これらの遺伝子の中から、癌幹細胞の特性獲得に関与するものとして有力と考えられる遺伝子(群)を絞り込む。具体的には、遺伝子群の機能解析を細胞生物学的手法すなわち強制発現やノックダウンによる機能喪失実験によって行うことでこれらの遺伝子が癌幹細胞特性獲得に関与しているか否かを明らかにする。さらに癌幹細胞の性質獲得に重要と確認された遺伝子(群)の肺腺癌臨床検体における発現の有無を、免疫組織化学染色法を用いて調べ、癌細胞内での発現及び局在を確認する。またそれらの遺伝子の発現の有無と予後との相関を明らかにする。
レジオネラ膜タンパク質DotAのIV型分泌系による輸送機構の解析

レジオネラ(Legionella pneumophila)はDot/IcmIV型分泌系を持ち、多数のエフェクタータンパク質を宿主細胞質へ輸送している。DotAタンパク質はこのDot/Icm分泌系の一員としてエフェクター輸送に必須なタンパク質である。DotAタンパク質はこれまでに知られていない新しい輸送プロセスによりDot/Icm分泌系に依存して細菌内膜から菌体外へ分泌される。本研究では、DotA分泌には必要だがエフェクター輸送には必要ない、Dot/Icm分泌系の構成タンパク質を同定するために、1)Dot/Icm分泌系を構成するタンパク質の欠失株を作製し、2)得られたDot/Icm分泌系欠失株からのDotAの分泌、エフェクターの宿主細胞への輸送、およびマクロファージに対する細胞傷害活性を解析した。その結果、これまでに知られているIcmWおよびIcmS以外に少なくとも一つのDot/Icm欠失株において、DotAの分泌およびエフェクターの輸送が認められた。この株ではこれらのタンパク質輸送活性および細胞傷害活性のすべてが一様に減弱していることから、コアとなるDot/Icm分泌装置の機能発現あるいは活性が減弱しているものと考えられる。さらに、エフェクター輸送および細胞傷害活性が減弱しているが認められるもののDotA分泌を検出できないDot/Icm欠失株を一株分離した。この変異株ではDotAの分泌が特異的に阻害されている可能性があり、今後本萌芽研究の成果を発展させ新たな研究を行うことが必要である。一方、膜型DotAの分子構造を解析するためレジオネラから膜型DotAを精製する系を構築した。しかしながら収量が微少であるためその後の解析が困難であり、大量発現系の開発が必要であることが明らかになった。
精巣腫瘍浸潤キラーT細胞の解析と癌拒絶抗原遺伝子のクローニング

1)精巣腫瘍局所よりHLA-A2拘束性癌特異的キラーT細胞株(CTL)を樹立した。2)同キラーT細胞(CTL)は、HLA-A2拘束性自家癌細胞を含む癌細胞に対し細胞傷害活性性を示したが、試験管内で樹立した自己腫瘍細胞株に対しては、細胞傷害性を示さなかった。3)そこで、自家癌細胞株がCTLからエスケープする分子機構を明らかにする目的としてHLA-A2の発現や抗原指示に関与する分子群(TAP、LMP)を解析したが、いずれも発現していた。従って、腫瘍抗原の喪失もしくは他のエスケープ機構が関与していることが示唆された。4)以上、精巣腫瘍局所においてもHLA-拘束性キラーT細胞が存在し、特異免疫機構を担っていることが証明された。本研究では、樹立した癌細胞株がCTLよりエスケープしていたため拒絶抗原の同定まで至らなかった。今後、腫瘍抗原の同定などの研究が必要と考えられる。1.精巣腫瘍特異的キラーT細胞の樹立精巣腫瘍患者の手術摘出組織より単核球をFicoil-Conray比重遠心法にて分離し、インターロイキン2存在下に長期培養し、Tリンパ球細胞株を樹立した。これをMHCの判明している自家癌細胞株および他の組織型(腺癌、扁平上皮癌など)に対する細胞傷害性を^<51>Cr release assay法、IFN-γの発現をELISA法にて検討し、精巣腫瘍特異的細胞障害性Tリンパ球、MHC拘束性細胞障害性Tリンパ球を樹立した。2. MHC拘束性の決定CTLのMHC拘束性を決定した。まず、自家癌細胞株および他の組織型の癌細胞株のHLAのtype CTL感受性を調べ、その中でHLA拘束性を同定した。ついで、そのHLA特異的抗体によりCTL活性が抑制される否かを解析した。さらに拘束性を示すHLA gene(今回の場合A0206)を自家癌細胞株よりクローニングし、各種アロタイプ癌細胞株にトランスフェクションすることにより、CTL活性が獲得されるか否かを解析した。3.自家細胞癌株のHLS発現の確認同種の他の癌細胞株は傷害するが、自家癌細胞株を傷害しないものに対し、HLA-A locusのgenotypingを行い、クローニングベクター(pCR3ベクター)にクローニングした上で、COS7(サル正常腎細胞)にトランスフエクションし、HlA-A2発現の有無をFACSにて確認した。4.自家癌細胞株のTAP,LMP発現の確認Gene Bank85 RING4、PSF2、RING10、RING12よりプライマーを作製し、RT-PCR法によりメッセージレベルでのTAP,LMPの発現の有無を確認した。
腫瘍微小環境における免疫抑制細胞の作用と機序の解明と新規治療法への発展

制御性T細胞(Regulatory T cell)は、末梢の免疫寛容に関わる重要な免疫細胞である一方で、癌微小環境では抗腫瘍効果を有する免疫細胞の働きを抑制することで癌細胞の増殖や進展に深く関わる細胞である。本研究では、頭頸部扁平上皮癌患者と良性腫瘍患者の末梢血を用いて、頭頸部癌患者ではTregの中でも抑制効果が強い活性型Tregの割合が高いこと、免疫抑制細胞の一種であるMDSCと相関すること、さらに再発や予後などの臨床経過と相関した。また、TregがT細胞やNKT細胞などの強い抗腫瘍効果を持つ細胞に対して強力な機能抑制効果を発揮することをin vitroで示した。これらの結果は、頭頸部癌患者に対する治療において、Tregを抑制し免疫抑制を解除することが重要となることを示す結果であった。そこで、Tregの機能を抑制する薬剤の検討を介して、抗がん剤であるパクリタキセルがTreg機能を特異的に抑制することを示した。さらに活性型Tregをより特異的に抑制することを目的として、頭頸部扁平上皮癌患者の活性型Tregを末梢血より単離し、頭頸部癌患者の活性型Tregに有意に発現が上昇している遺伝子群を同定した。現在、これらの遺伝子群の治療標的としての妥当性について、症例数を増やして検討を行っている。さらにパクリタキセルを用いたTregを標的とした治療法の開発として、in vivoの検討は必須であったため、マウスの担癌モデルを作成し検討を行った。頭頸部癌患者では、増加した活性型Tregにより臨床経過が不良となる。パクリタキセルや、活性型Tregに特異的な遺伝子や表面抗原などを標的とした新規治療の開発は、Tregの抑制効果を減弱させ、担癌患者における免疫抑制の解除につながることから、今後の頭頸部癌患者の治療において非常に有意義と考える。頭頸部癌患者では、制御性T細胞(Treg)や骨髄性抑制細胞(MDSC)などの免疫抑制細胞により誘導された抗腫瘍免疫抑制が、腫瘍の進展や治療抵抗性に関与している可能性が示唆されている。これまでの申請者の研究により、Tregの中で活性化された抑制作用の強い細胞集団であるeffector Treg (eTreg)が頭頸部扁平上皮癌患者の臨床経過、予後と相関することが報告された。本研究では、eTregを誘導する因子の探索、さらにeTregに特異的な遺伝子発現を同定し、通常の血液検査で可能な、より簡便で鋭敏な再発診断マーカーの探索を目的とする。昨年度までに、他の分画と比較してeTregがより強力にT細胞、NKT細胞などエフェクター細胞の機能を抑制すること明らかにした。特にNKT細胞に関しては、今までヒトでは明らかになっていなかった、樹状細胞を介した細胞接触を必要とする抑制機序の一部を解明した。さらに、MDSCとTregは癌患者の末梢血において相関して増加することも明らかとしたが、この結果はMDSCがTregを誘導している可能性を示唆していると考える。今後は、腫瘍組織内に浸潤したTregやMDSCなどの免疫細胞について解析を行い、頭頸部癌患者の微小環境における抑制環境について詳細な検討を行いたいと考えている。さらに、現在までに健常人の末梢血を用いてeTregに特異的な遺伝子発現について探索を行なっており、候補遺伝子を明確としたのちに頭頸部扁平上皮癌患者の末梢血中の変動について検討を行っていく予定である。はじめに、eTregの機能や抑制機序について詳細な検討が必要であり、健常人の末梢血を用いたin vitroの基礎研究を行なった。この基礎研究を通して、Tregの中でeTregが他の分画と比較しても、T細胞やNKT細胞に対して非常に強力な抑制作用を持つことを見出した。さらに、同じ免疫抑制細胞であるMDCSとは正の相関を示しており、相互作用を有する可能性が考えられた。これらの解析に、十分な時間を用いたため、腫瘍組織の解析には至らず、腫瘍微小環境において免疫抑制を誘導している因子、特にTregをeTregへと誘導している因子の探索には至らなかった。また、eTregに特異的遺伝子の探索は、これまでに行われていない解析となるため、解析方法の確立が必要となった。昨年度までに、健常人の末梢血を用いて、eTregを単離する方法、純度の高いmRNAを得る実験的手法については確立できたと考えているため、今年度は昨年度に確立した方法を用いて健常人の末梢血、さらに頭頸部がん患者の末梢血を用いて特異的遺伝子の探索が行えるものと考えている。

そこで、Tregの機能を抑制する薬剤の検討を介して、抗がん剤であるパクリタキセルがTreg機能を特異的に抑制することを示した。さらに活性型Tregをより特異的に抑制することを目的として、頭頸部扁平上皮癌患者の活性型Tregを末梢血より単離し、頭頸部癌患者の活性型Tregに有意に発現が上昇している遺伝子群を同定した。現在、これらの遺伝子群の治療標的としての妥当性について、症例数を増やして検討を行っている。さらにパクリタキセルを用いたTregを標的とした治療法の開発として、in vivoの検討は必須であったため、マウスの担癌モデルを作成し検討を行った。頭頸部癌患者では、増加した活性型Tregにより臨床経過が不良となる。パクリタキセルや、活性型Tregに特異的な遺伝子や表面抗原などを標的とした新規治療の開発は、Tregの抑制効果を減弱させ、担癌患者における免疫抑制の解除につながることから、今後の頭頸部癌患者の治療において非常に有意義と考える。昨年度の研究で得られた実験方法を元に、eTregの特異的遺伝子の同定を進めると同時に、頭頸部扁平上皮癌患者の腫瘍組織を用いて腫瘍組織内の免疫環境の検討を行う。予定症例数に至らない場合は、扁平上皮癌に限らず、他の組織型の頭頸部癌患者も対象とする。また、同定された特異的遺伝子が再発、診断のマーカーとなり得るかについての評価は可能と考えているが、予後との相関については、治療後3年は経過観察が必要となるため、本年度の検討では不十分となると考えられるため、今後も引き続き臨床経過について観察が必要となると考えている。
ホスファチジルイノシトールの精密高純度合成のための高機能改変酵素の開発

機能性リン脂質ホスファチジルイノシトール(PI)の高純度合成を目的とし、リン脂質変換酵素であるホスホリパーゼD(PLD)の蛋白工学的改変を行った。基質ポケットに変異を導入した変異酵素から、PIを位置選択的に与える変異酵素を同定した。また,PLDの不安定ループを除去することで、安定かつ高選択性を併せ持ったPLDの作出にも成功した。さらにPIの収率を高める為に酵素反応条件を詳細に検討し、反応系に高濃度のNaClの添加という極めて単純な方法でPI収率を飛躍的に高める事に成功した。さらに、反応後の副生物であるホスファチジン酸を分解する酵素を探索し、適した酵素を産生する微生物を同定した。代表者が開発したホスファチジルイノシトール(PI)合成型PLD(PI-PLD)を用いると、ホスファチジルコリンとイノシトールという安価な原料からPIを酵素的に合成可能である。しかしなら、開発したPI-PLDはイノシトールの6個の水酸基に対する位置選択性が完全ではなく、天然型の1-PIに加えて他の一異性体も生成するという問題が有った。本研究ではPI-PLDの位置選択性を向上させることを目的として蛋白工学的改変を試みた。本研究開始以前に代表者は本酵素の基質結合部位においてイノシトールを受容するポケットの「壁」を形成しているループに着目し、それを構成する6アミノ酸残基を一つずつ他のアミノ酸に置換した変異酵素群を作成し、位置選択性を評価した。その結果、186位と189位の変異が特異性向上に有効であることがわかっていた。この結果を受け、本研究では186位に対する5種の変異体(186V, 186M, 186T, 186L, 186S)、と189位に対する5種の変異体(189L, 189N, 189R, 189W, 189Y)の変異を組み合わせ、5x5=25種の変異酵素を新たに調製し、それらの位置選択性を分析した。その結果、NYRに186T/189W、186S/189W、186L/189Wなる三種の2重変異体の位置選択性の向上させることに成功した。特に、親酵素の位置特異性は1-PI/3-PI比が74/26であったのに対し、186T/189Wでは95/5にまで飛躍的に向上した。また、PI-PLDの熱安定化を試み、分子表面に存在する不安定ループを除去する(ループトリミング)ことで、70度での半減期を10倍以上延長させることに成功した。しかしなら、開発したPI-PLDはイノシトールの6個の水酸基に対する位置選択性が完全ではなく、天然型の1-PIに加えて他の位置異性体も生成するという問題が有った。前年度、代表者は本酵素の基質結合部位においてイノシトールを受容するポケットの「壁」を形成しているループに着目し、それを構成する6アミノ酸残基を一つずつ他のアミノ酸に置換した各種の変異酵素群を作成し、位置選択性を評価し、親酵素と比較して1-PI選択性が飛躍的に向上する変異体の作出に成功した(親酵素の位置特異性は1-PI/3-PI比が74/26であったのに対し、変異体では95/5)。今年度は得られた高選択性変異体NYR-186Tを用いた酵素反応条件を種々検討した。低温での反応によりその選択性はさらに向上し、10°Cにおいて1-PI/3-PI選択性は97/3にまで上昇した。一般にイノシトールのようなポリオールを位置選択的に変換する場合、通常の有機合成化では反応させる位置以外を保護するのが常道である。今回の成果は無保護イノシトールを一カ所だけホスファチジル化に成功したという点で合成化学的にも大きな意味が有る。さらに、酵素反応系に高濃度の塩を添加すると高い位置選択性を維持したまま、反応効率が飛躍的に向上することを見いだした。これまで全リン脂質中のPI含量が10%程度であったが、反応条件の最適化により50%程度まで向上することに成功した。代表者が開発したホスファチジルイノシトール(PI)合成型PLD(PI-PLD)を用いると、安価なホスファチジルコリン(PC)とイノシトールからPIを酵素的に合成可能である。しかし、PI-PLDはイノシトールの6個の水酸基に対する位置選択性が完全ではなく、天然型の1-PIに加えて他の異性体も生成するという問題があった。本酵素の基質結合部位においてイノシトールを受容するポケットを形成する6アミノ酸残基を他のアミノ酸に置換した各種の変異酵素群を作成し、位置選択性を評価し、1-PI選択性が飛躍的に向上する変異体の作出に成功した。親酵素の位置特異性は1-PI/3-PI比が74/26であったのに対し、変異体では95/5となった。

低温での酵素反応により選択性はさらに向上し、10°Cにおいて1-PI/3-PI選択性は97/3にまで向上した。また、反応系内に高濃度の食塩を添加すると、高い位置選択性を維持したまま、反応効率が飛躍的に向上することを見いだした。最適化した条件で各種PCからのラージスケールでのPI合成を行い、各種の高純度PIを全体収率30%程度で調製することができた。有機溶媒・水二相反応系において、酵素の界面への結合を調べたところ、高濃度NaCl存在下では酵素が溶媒-水界面に局在することがわかった。このことから、高濃度塩によるPI合成効率の向上は、疎水性相互作用の増強により、水相に溶解している酵素が界面に局在し、基質との接触頻度が増加したことによると結論された。機能性リン脂質ホスファチジルイノシトール(PI)の高純度合成を目的とし、リン脂質変換酵素であるホスホリパーゼD(PLD)の蛋白工学的改変を行った。基質ポケットに変異を導入した変異酵素から、PIを位置選択的に与える変異酵素を同定した。また,PLDの不安定ループを除去することで、安定かつ高選択性を併せ持ったPLDの作出にも成功した。さらにPIの収率を高める為に酵素反応条件を詳細に検討し、反応系に高濃度のNaClの添加という極めて単純な方法でPI収率を飛躍的に高める事に成功した。さらに、反応後の副生物であるホスファチジン酸を分解する酵素を探索し、適した酵素を産生する微生物を同定した。イノシトール受容ポケットを形成するループ構造に変異を導入することで、1PI/3PI特異性が飛躍的に向上した変異型酵素を作出することに成功でき、さらに反応温度などの条件の検討により位置選択的かつ高収率で1PIを合成する事が出来た。したがって今年度の目的はおおむね達成したと考える。これまでの検討により改変型PLDによる1PIの選択的合成の目処がついた。今後はさらなる収率向上をめざし、PLDの安定化、副生成物であるホスファチジン酸の除去、さらに固定化による酵素の繰り返し利用といったより実生産を意識した検討を行う。イノシトール受容ポケットを形成するループ構造に変異を導入することで、1PI/3PI特異性が飛躍的に向上した変異型酵素を作出することに成功でき、今年度の目的はおおむね達成したと考える。当初購入を予定していた試薬類の一部が不要となったため。イノシトール受容ポケットを形成するループ構造に変異を導入することで、1PI/3PI特異性が向上した理由の一つとして親酵素の186位グリシン周囲は分子内キャビティを生じており、これがより嵩高い残基に置換されたことにより、ループ構造がより剛直になり、揺らぎが減少したためと予想される。これを検証するため、各種温度で酵素反応を行い、位置選択性の温度依存性を比較する予定である。また、不安定ループ除去により作出した熱安定酵素と高選択型酵素の変異の「掛け合わせ」を行い、安定かつ選択性の高いPI-PLDの作成を試みる。今年度の消耗品の購入に充当する予定である。
マウスゲノム刷り込み遺伝子座におけるエピジェネティック修飾制御の分子メカニズム

哺乳類のゲノム刷り込み現象では、アリル特異的なDNAメチル化(刷り込みメチル化)が制御の中心的役割を果たし、その破綻は個体発生の異常やヒト疾患の原因となる。しかし、同メチル化を確立・維持する分子メカニズムは、まだよくわかっていない。我々は、先行研究において、Igf2/H19遺伝子座の転写制御配列「H19 ICR」が、受精後、父由来アリル特異的メチル化を自律的に獲得できることを見出していた。本研究では、複数のH19 ICR配列トランスジェニックマウス、および、ノックアウトマウスを作製・解析し、そのメチル化制御の責任配列を、百数十bpの範囲に同定した。ゲノム刷り込み(genomic imprinting)は、親から伝わるエピジェネティックな情報が子で遺伝子発現を制御する、哺乳動物でみられる現象である。同現象が破綻すると発生・成長が異常となり、ヒトの疾患の原因となることも知られているため、制御メカニズムの解明は重要である。同現象の制御の中心となるエピジェネティック修飾は、刷り込み遺伝子座の発現制御領域(imprinting control region; ICR)におけるアリル特異的なDNAメチル化である。よって本研究は、遺伝子改変マウスを用いて、ICRにおけるDNAメチル化の分子メカニズムを明らかにすることを目的としている。以前作製したIgf2/H19遺伝子座ICR(H19 ICR)導入トランスジェニック(Tg)マウスでは、導入H19ICR断片は精子ではDNAメチル化されなかったが、受精後父由来特異的にDNAメチル化された。さらに、二分割したH19ICR断片を用いた場合は、上流半分のみでアリル特異的メチル化が再現された。そこで本研究では、H19 ICRの受精後の特異的メチル化を指令する責任配列を同定するために、H19 ICRの上流から二段階に配列を欠損した断片を用いてTgマウスを作製した。同Tgマウスを解析し、その結果をもとに、さらに短い間隔で段階的に配列を欠損させた複数のH19 ICR断片を使ってTgマウスの作製を開始した。H19ICR断片を導入したトランスジェニック(Tg)マウス、および、内在H19ICR変異マウスを解析した結果、H19 ICRは精子でDNAメチル化されていなくても、受精後すぐの胚で、父由来特異的にde novoメチル化されることを明らかにした。また、H19 ICRの末端から二段階に配列を欠損した断片を用いてTgマウスを作製し、そのメチル化状態を解析した結果から、受精後父由来特異的DNAメチル化に必要な配列のおおよその位置がわかった。この情報をもとに、さらに短い間隔で段階的に配列を欠損させた複数のH19 ICR断片を使ってTgマウスを作製し、メチル化解析を行った。その結果、受精後父由来特異的DNAメチル化に必要な配列を、百数十bpの範囲に同定した。同配列の必要性を内在遺伝子座においても検証するために、CRISPR/Casシステムを用いて、欠損マウスの作製を開始した。また、受精後に父由来特異的にDNAメチル化されるためには、生殖細胞からDNAメチル化以外のエピジェネティックな情報が伝えられると考えられる。そこで、精子のクロマチンの状態を解析する実験系の条件検討を行った。複数のTgマウス系統を作製・解析し、H19 ICRの受精後父由来特異的DNAメチル化に必要な配列を順調に同定できた。また、同配列の必要性について、内在遺伝子座での検証に展開できた。成果の一部を国際学術雑誌に発表できた。Igf2/H19遺伝子座では、制御領域「H19 ICR」が父由来アリルのみでDNAメチル化されることで、刷り込み遺伝子発現がおこる。その破綻は、シルバーラッセル症候群などのゲノム刷り込み病の原因の一つとされている。そこで、本研究は、同領域のアリル特異的なDNAメチル化の分子メカニズムを明らかにすることを目的とし、特に、我々が見出した受精後の新規DNAメチル化活性に焦点をあてて、遺伝子改変マウスを用いて解析をおこなっている。前年度までに、末端から段階的に配列を欠損させた一連のH19ICR断片を導入したトランスジェニックマウスを作製・解析し、父由来H19 ICRを受精後メチル化するための制御候補配列を百数十bpの範囲に絞り込んだ。そこで、本年度は、CRISPR/Casゲノム編集法によって、同配列を内在およびトランスジーンのH19 ICRから内部欠損させたマウスを作製することで、そのメチル化制御における必要性の検証をすすめた。さらに、同百数十bpの中の一部配列のみを欠損させたマウスも複数系統作製し、最小責任配列の同定を試みた。これらのノックアウトマウスのDNAメチル化状態を、出生後の体細胞において解析した結果、複数の制御配列が協調してH19 ICRの父由来メチル化を制御する可能性が見出された。同時に、DNAメチル化および発現制御に対する同配列の作用を、受精後胚発生の各段階で詳細に解析することが重要と考えられる結果が得られた。複数のノックアウトマウス系統の作製に成功し、H19 ICRの父由来特異的DNAメチル化を制御するシス配列の解析をすすめることができた。

我々は、先行研究において、Igf2/H19遺伝子座の転写制御配列「H19 ICR」が、受精後、父由来アリル特異的メチル化を自律的に獲得できることを見出していた。本研究では、複数のH19 ICR配列トランスジェニックマウス、および、ノックアウトマウスを作製・解析し、そのメチル化制御の責任配列を、百数十bpの範囲に同定した。本研究は、制御に必要なシス配列を決定した後、同配列がクロマチン状態へ与える影響の解析や作用するトランス因子の同定に発展させることで、H19 ICRにおけるDNAメチル化の分子メカニズムを解明する計画である。シス配列の決定のために、複数種類の欠損変異型H19 ICR断片を導入したTgマウスの作製・解析を順調に進めている。CRISPR/Casシステムによって作製した内在H19ICR内部欠損マウスのDNAメチル化状態を解析し、欠損配列の父由来特異的DNAメチル化における必要性を検証する。同配列に作用するトランス因子を細胞核抽出液からアフィニティー精製し、同定する。各種Tgマウス、内在H19ICR変異マウスの精子のクロマチンの状態を解析・比較し、生殖細胞から伝わるエピジェネティックな情報の本体を明らかにする。作製したH19 ICR内制御配列ノックアウトマウスの胚発生段階を追って、DNAメチル化状態と刷り込み遺伝子発現量の変化を解析する。分子遺伝学作製中のTgマウスを系統化した後、導入変異型H19 ICR断片のDNAメチル化状態を解析して、受精後父由来特異的DNAメチル化制御に必要な配列を数十bpの範囲に決定する。その後、CRISPR/Casシステムを用いて同配列を内在H19 ICRから欠損したマウスを作製し、DNAメチル化状態の変化の有無を解析することで、内在遺伝子座においても必要性を検証する。また、導入野生型H19ICRでは、DNAメチル化以外のエピジェネティックな情報が生殖細胞で付加されて子に伝わり、アリルが由来する親の性別の識別とメチル化の制御に使われていると予想される。この情報の特定を目指して、精子における導入H19ICRのクロマチンの状態を解析する。Tgマウス系統の作製と解析を効率的に行うことができた。CRISPR/Casシステムによる遺伝子欠損マウスの作製効率を改善できた。遺伝子改変マウスの管理・維持と解析を、当初予定していた金額よりも縮減し、効率的に行うことができた。H19ICR内部欠損マウスの繁殖に必要な野生型マウスと、解析に必要な試薬・消耗品購入する。DNA結合タンパク質の精製・同定や、精子クロマチンの解析に必要な試薬を購入する。得られた成果を学会で発表するための旅費として使用する。さらに詳細に分子メカニズムを明らかにするために、各発生段階の胚を得るのに必要な野生型マウスと、DNAメチル化・遺伝子発現解析に用いる試薬・消耗品を購入する。また、得られた成果を学会で発表するための旅費として使用する。作製したTgマウスの解析に必要な試薬・消耗品を購入する。内在H19ICR部分欠損マウスの作製を依頼する。
外来牧草の侵略性に及ぼす放牧家畜による地表攪乱の影響

宮崎県都井岬の放牧草地には外来牧草に侵略される草地と、侵略されない草地が存在する。このような違いが生じる理由を知ることは、「外来牧草が侵略的外来種になる条件は何か?」を知って外来牧草を適切に管理する上で重要である。そこで、数年間の禁牧処理等の野外実験を行った結果、禁牧区では種多様性が増加して外来牧草が消失したことが明らかとなり、高い放牧圧が外来牧草の侵略を導くと考えた。しかし、様々な模擬放牧処理を加えたポット栽培による競争実験を実施したが、予想に反し、外来牧草は在来植物との競争に常に負ける結果となった。競争に弱い外来牧草が放牧草地を侵略できるのはなぜか?この謎を解くために2018年度は、2000年から継続している月例調査を継続するとともに、放牧地での家畜による地表攪乱の影響を制御する実験区を都井岬の小松ヶ丘に設置した。プロテクトケージによる禁牧は、被食も馬糞や蹄傷による裸地形成も制限してしまう。そこで、新規に金網が無い枠組みだけのプロテクトケージ(縦横高さそれぞれ50cm)を制作して放牧地に設置すれば、馬は頭をケージ内に入れることが可能なので草は被食されるが、体全体や足はケージ内に入れることが困難なので馬糞や蹄傷による裸地形成は制限される。そこで、このケージと、金網でガードされたプロテクトケージ(被食も裸地形成も制限)をそれぞれ5個設置してケージ内外の植生調査を定時的に行うことで、外来牧草の消失に対して、被食制限と裸地形成の制限のどちらの効果が大きいかを明らかにできると考えられた。また、外来牧草の侵略が進行していない草地(扇山)では、放牧馬の密度が低く、馬による裸地形成頻度が少ない。そこで、固定植生調査枠(縦横それぞれ50cm)を2018年秋に20個設置し、これらを無処理区5個、馬糞裸地区5個、模擬蹄傷裸地区5個、馬糞+模擬蹄傷裸地区5個に区分して植生調査を行った。交付申請書には、都井岬の外来牧草の侵略が進行せず在来植物の種多様性が高い草地と、外来牧草の侵略が進行し在来植物の種多様性が低い草地を野外実験対象とし、都井岬以外の草地は、植生調査対象のみとすると書かれているが、まさに、この計画通りに進行している。2018年度は、2000年から継続している月例調査を継続するとともに、放牧地での家畜による地表攪乱の影響を制御する実験区を都井岬の小松ヶ丘に設置できた。新規に金網が無い枠組みだけのプロテクトケージ(縦横高さそれぞれ50cm)を制作して放牧地に設置すれば、馬は頭をケージ内に入れることが可能なので草は被食されるが、体全体や足はケージ内に入れることが困難なので馬糞や蹄傷による裸地形成は制限される。そこで、このケージと、金網でガードされたプロテクトケージ(被食も裸地形成も制限)をそれぞれ5個設置してケージ内外の植生調査を定時的に行うことで、外来牧草の消失に対して、被食制限と裸地形成の制限のどちらの効果が大きいかを明らかにできる。10個分のプロテクトケージを設置するのは想定以上に大変であったが、資材費、労力ともになんとか実現にこぎつけた。また、外来牧草の侵略が進行していない草地(扇山)では、放固定植生調査枠(縦横それぞれ50cm)を2018年秋に20個設置し、これらを無処理区5個、馬糞裸地区5個、模擬蹄傷裸地区5個、馬糞+模擬蹄傷裸地区5個に区分して植生調査を行うことができた。これらの野外実験区の結果が出るまでには少なくとも2年はかかるので継続的な調査が必要であるが、画期的な野外実験区を2シリーズ設定できたので、おおむね順調に進展していると判断した。また、2019年度に実施予定のポット実験に向けて、大量のシバとカーペットグラスの苗の養成が必要であるが、予定通り都井岬産のこれらの苗の確保と増殖に成功した。極めて順調である。2019年度は、2000年から継続している月例調査を継続するとともに、放牧地での家畜による地表攪乱の影響を制御する実験区を2018年に新設したので、その結果を調査する。外来牧草が優占する小松ヶ丘では、採食のみを可能にする実験区と採食と馬糞や蹄傷が可能な実験区、そして金網でガードされた禁牧区(被食も裸地形成も制限)をそれぞれ5個設置して植生調査を定時的に行うことで、外来牧草の消失に対して、被食制限と裸地形成の制限のどちらの効果が大きいかを明らかにできると期待される。そこで、固定植生調査枠(縦横それぞれ50cm)を2018年秋に20個設置し、これらを無処理区5個、馬糞裸地区5個、模擬蹄傷裸地区5個、馬糞+模擬蹄傷裸地区5個に区分したので、これらについても植生調査を行う。以前に行ったポット栽培による競争実験では放牧地での馬糞や蹄傷による裸地形成を想定しなかったために、外来牧草は在来植物との競争に常に負けたと考えられる。そこで、ポット栽培による置換型競争実験(de Wit, 1960)に馬糞と蹄傷による裸地形成の因子を追加する新たな工夫を考えた。まず、1/5000

aポットに黒ボク土を充填して植物を栽培する。単植区には、在来植物(シバ)もしくは外来牧草(カーペットグラス)を低密度(蹄傷を想定)、高密度で植栽し、混植区には、在来植物(シバ)と外来牧草(カーペットグラス)をそれぞれ半分づつ植栽する。これら通常の単植区と混植区に加えて、馬糞散布処理の処理区を新たに追加し、1単植区、2混植区、3単植+馬糞裸地区、4単植+蹄傷裸地区、5混植+馬糞裸地区、6混植+蹄傷裸地区の処理区構成とする(5反復)。全ての処理区に対して毎月刈り取る模擬放牧処理を行い、草種毎に乾物重を測定する。宮崎県都井岬の放牧草地には外来牧草に侵略される草地と、侵略されない草地が存在する。このような違いが生じる理由を知ることは、「外来牧草が侵略的外来種になる条件は何か?」を知って外来牧草を適切に管理する上で重要である。そこで、数年間の禁牧処理等の野外実験を行った結果、禁牧区では種多様性が増加して外来牧草が消失したことが明らかとなり、高い放牧圧が外来牧草の侵略を導くと考えた。しかし、様々な模擬放牧処理を加えたポット栽培による競争実験を実施したが、予想に反し、外来牧草は在来植物との競争に常に負ける結果となった。競争に弱い外来牧草が放牧草地を侵略できるのはなぜか?この謎を解くために2018年度は、2000年から継続している月例調査を継続するとともに、放牧地での家畜による地表攪乱の影響を制御する実験区を都井岬の小松ヶ丘に設置した。プロテクトケージによる禁牧は、被食も馬糞や蹄傷による裸地形成も制限してしまう。そこで、新規に金網が無い枠組みだけのプロテクトケージ(縦横高さそれぞれ50cm)を制作して放牧地に設置すれば、馬は頭をケージ内に入れることが可能なので草は被食されるが、体全体や足はケージ内に入れることが困難なので馬糞や蹄傷による裸地形成は制限される。そこで、このケージと、金網でガードされたプロテクトケージ(被食も裸地形成も制限)をそれぞれ5個設置してケージ内外の植生調査を定時的に行うことで、外来牧草の消失に対して、被食制限と裸地形成の制限のどちらの効果が大きいかを明らかにできると考えられた。また、外来牧草の侵略が進行していない草地(扇山)では、放牧馬の密度が低く、馬による裸地形成頻度が少ない。そこで、固定植生調査枠(縦横それぞれ50cm)を2018年秋に20個設置し、これらを無処理区5個、馬糞裸地区5個、模擬蹄傷裸地区5個、馬糞+模擬蹄傷裸地区5個に区分して植生調査を行った。交付申請書には、都井岬の外来牧草の侵略が進行せず在来植物の種多様性が高い草地と、外来牧草の侵略が進行し在来植物の種多様性が低い草地を野外実験対象とし、都井岬以外の草地は、植生調査対象のみとすると書かれているが、まさに、この計画通りに進行している。2018年度は、2000年から継続している月例調査を継続するとともに、放牧地での家畜による地表攪乱の影響を制御する実験区を都井岬の小松ヶ丘に設置できた。新規に金網が無い枠組みだけのプロテクトケージ(縦横高さそれぞれ50cm)を制作して放牧地に設置すれば、馬は頭をケージ内に入れることが可能なので草は被食されるが、体全体や足はケージ内に入れることが困難なので馬糞や蹄傷による裸地形成は制限される。そこで、このケージと、金網でガードされたプロテクトケージ(被食も裸地形成も制限)をそれぞれ5個設置してケージ内外の植生調査を定時的に行うことで、外来牧草の消失に対して、被食制限と裸地形成の制限のどちらの効果が大きいかを明らかにできる。10個分のプロテクトケージを設置するのは想定以上に大変であったが、資材費、労力ともになんとか実現にこぎつけた。
数値ファントムを用いた集束衝撃波胆石破砕のための数値シミュレータの開発

本研究では数値ファントムを用いた集束衝撃波胆石破砕のための数値シミュレータを開発した。シミュレータは集束衝撃波を発生する電磁誘導トランスジューサ設計のための振動解析部と非線形効果を含む音波伝搬解析部の2つの部分から構成されている。前者は,音響放射も含めた非定常応答特性を解析できるもので,磁界,弾性場,音場の連成系として軸対称有限要素法により定式化した。円形平面振動板をもつ平面型と球殻振動板をもつ集束型の2つのタイプの電磁誘導トランスジューサを考察し,さらに,集束型は開口の小さいタイプと大きなタイプの2種類について考察した。放射音圧波形,音圧空間分布などの応答特性について計算を行うとともに、2,3の実験により検証を行った。その結果,実験結果と計算結果は定性的には良く一致し,シミュレータの妥当性が検証された。音圧振幅が実験と計算で若干異なる結果となったが,これは実験装置が数値モデルを完全には模擬できなかったことが原因であろう。非線形集束音波のための数値シミュレータは,生体内部のような不均一場の音波のふるまいを考察するためのものである。生体内部を模した数値ファントム(有限要素法,ただし2次元)を計算機上に構築し2,3の数値実験を行った。体内に胆石などのターゲットがある場合を想定し,集束超音波がターゲットでどのように散乱,回析するか計算した。その結果,1)焦点位置にターゲットがある場合は,高い破砕能力が得られる可能性がある。また,衝撃波はターゲットで十分に散乱されるため,周囲の組織は高音圧にさらされない,2)ターゲットが音軸上で焦点位置からずれた場合は,ターゲット位置での破砕能力は低下する。さらに,ターゲットで散乱されなかった音波は焦点で集束するため,周囲組織が高音圧にさらされる危険性が増す,等のことがわかった。本年度は、有限要素法を用いて集束衝撃波胆石破砕のための数値シミュレータの開発を行った。まず、集束衝撃波の発生音源である電磁トランスジューサの応答特性解析を有限要素法を用いて行った。電磁トランスジューサは、磁界-振動-音響の各系が連成した系として取扱った。軸対象・時間依存問題として定式化を行うことで数値シミュレータを開発し、2,3の数値実験を行った。その結果、集束型の電磁トランスジューサではシェル構造の振動板を採用すれば曲げ振動が励起されるものの、全体的には伸び振動が励起されるため、振動板の厚さを薄くしてもよく、効率よい衝撃波放射が可能であることが示された。つぎに、集束型電磁トランスジューサを作製し、その応答特性を実測した。有限要素解析結果と比較検討したところ両者は良好に一致し、数値シミュレータの妥当性が示された。つぎに、音場の非線形効果を組み入れて定式化を行い、上記数値シミュレータを改良した。離散化に1次要素を採用して、密度・音速が異なる不均質対象媒質(数値ファントム)を扱うことができる。数値ファントムのデータ入力を容易にするために汎用の有限要素プリプロセッサからデータを受け取ることができる。密度・音速が異なる2,3の数値ファントムについて音場計算を行った結果、回折効果により焦点近傍で音圧波形が変化すること、不均質場では不均質の度合いに応じて焦点位置、集束強度が変化すること等が確かめられた。前年度に開発された有限要素法による集束衝撃波胆石破砕のための数値シミュレータの検証の一つとして、電磁誘導型の集束音源を作製し応答特性等の測定を行った。

基本的な検証実験は前年度すでに行われ、数値シミュレータの妥当性が示されているが、今年度は二、三の改良を行った。すなわち、駆動コイルに角形の線材を使用し電流密度を大きくする、凹面振動板の半径を大きくして集束の度合いを向上させる、等の改良によって数値モデルにより近い物理モデルを作製することができた。つぎに、寒天を使用したファントムを作製し、二、三の実験を行った。寒天にタングステンを混ぜることで密度を、またグリセリンを混ぜることで音速を変化させた。密度・音速が異なる2,3の寒天ファントムについて実験を行った結果、焦点位置、集束強度の変化等、定性的に数値ファントムと対応する結果が得られた。
機械構造部材の衝撃疲労破壊に関する研究

本研究は機械・構造部材の衝撃破壊および衝撃疲労破壊機構を解明するため,数値シミュレ-ションおよび実験解析によって固体中を伝播する弾性波の引張り応力集中現象を定量的に評価することを目的としている.現在までに得られた結果および今後の研究発展を次のように計画している.1.機械・構造部材の基本形状である平板および帯状板に関して,衝撃破壊の数値シミュレ-ションおよび衝撃破壊実験を行った.すなわち,動的有限要素法を用いた数値シミュレ-ション・システムを構築し,衝撃破壊の起点および破壊形式に及ぼす部材の形状および寸法比あるいは衝撃荷重の種類等による影響を調べた.次に,鋼平板の弾性波動実験ならびに石膏平板を用いた衝撃破壊実験との比較を行い,数値シミュレ-ションによって衝撃破壊が生ずる領域および破壊形式が予測できることを明らかにした.なお,衝撃実験は高圧空気発射式衝撃試験機(昭和61年度科学研究費一般研究C補助金にて設計・試作)を用いて,また衝撃荷重および波動測定はディジタル・オシロスコ-プNicolt,Model410(当該科学研究費補助金による設備)を用いて行った.現在,断面変化部を有する平板および円柱について同様な検討を行っている.2.機械・構造部材の衝撃疲労破壊に関する基礎資料を得るため,弾性波一次元伝播理論に基づく縦衝撃波動の伝播を応用して開発した落錘型衝撃疲労試験機の設計・試作を行った.繰り返し衝撃荷重波形の制御および測定系の改良と平行して基礎実験を進めている.本研究は機械・構造部材の衝撃破壊および衝撃疲労破壊機構を解明するため,数値シミュレ-ションおよび実験解析によって固体中を伝播する弾性波の引張り応力集中現象を定量的に評価することを目的としている.現在までに得られた結果および今後の研究発展を次のように計画している.1.機械・構造部材の基本形状である平板および帯状板に関して,衝撃破壊の数値シミュレ-ションおよび衝撃破壊実験を行った.すなわち,動的有限要素法を用いた数値シミュレ-ション・システムを構築し,衝撃破壊の起点および破壊形式に及ぼす部材の形状および寸法比あるいは衝撃荷重の種類等による影響を調べた.次に,鋼平板の弾性波動実験ならびに石膏平板を用いた衝撃破壊実験との比較を行い,数値シミュレ-ションによって衝撃破壊が生ずる領域および破壊形式が予測できることを明らかにした.なお,衝撃実験は高圧空気発射式衝撃試験機(昭和61年度科学研究費一般研究C補助金にて設計・試作)を用いて,また衝撃荷重および波動測定はディジタル・オシロスコ-プNicolt,Model410(当該科学研究費補助金による設備)を用いて行った.現在,断面変化部を有する平板および円柱について同様な検討を行っている.2.機械・構造部材の衝撃疲労破壊に関する基礎資料を得るため,弾性波一次元伝播理論に基づく縦衝撃波動の伝播を応用して開発した落錘型衝撃疲労試験機の設計・試作を行った.繰り返し衝撃荷重波形の制御および測定系の改良と平行して基礎実験を進めている.
三量体GTP結合蛋白質γサブユニットの分子多様性の生理的意義

G蛋白質はα、β、γの3つのサブユニットから成り、βとγは生理的条件下では常に結合して存在し、いろいろなサブタイプの組み合わせの複合体を形成している。本研究は、γの分子多様性の生理的意義を明らかにするため、γの違いによるβγの機能的な差異を検討し、次のような成果を得た。1.γ12のプロテインキナーゼCによるリン酸化部位はSer-2であることを明らかにした。2.γ12は線維芽細胞内で増殖因子などの刺激によりリン酸化されること、また、ラットの組織中にもリン酸化γ12が存在することを見いだし、リン酸化が様々な刺激で常に細胞内で起こっていることを示した。3.線維芽細胞において、γ12の一部がFアクチンと結合していることを見いだした。同じ細胞において、γ5は接着斑に存在するすることから、これらのγは異なる機能を持つことが示唆された。4.細胞内における各γの機能的差異を調べるため、NIH3T3細胞にβ1と各種γを共発現させた。γ12を強発現した細胞の多くは丸くなったが、γ2、γ5、およびγ7を同程度に強発現させた細胞では、ほとんどそのような変化はみられなかった。5.各種βγを発現させた細胞の走化性を調べると、γ12を発現させた細胞のみ走化性が有意に上昇した。6.γ12のN末端を除去したり、リン酸化部位のセリンをアラニンに置換したγ12を発現すると、細胞の形態変化や走化性の上昇が起こらなくなることより、γ12特異的な細胞の変化はリン酸化によって起こっていることが明らかになった。7.脳においてγ3は神経細胞に、γ12は一部のグリア細胞に存在することを示した。8.これまで、蛋白質が同定されていなかったβ4サブユニット蛋白質を、ウシ肺から精製したβγ5フラクション中に見いだした。β4はγ5およびγ12と選択的に結合することを明らかにした。これまでの研究結果から、βγの機能的な差はγによって決定されていると考えられている。本研究は、γの違いによるβγの機能的な差異を調べることにより、γの分子多様性の生理的意義を明らかにすることを目的にし、本年度は次のような成果を得た。1)γ^3とγ^<12>に対する抗体を用いて、脳におけるこれらのγの局在を免疫組織化学的に調べたところ、γ^3は神経細胞に、γ^<12>はグリア細胞の一部にそれぞれ特異的に存在することが明らかになった。培養細胞で検討すると、γ^3は神経細胞性のPC12細胞にのみ存在し、γ^<12>はグリオーマ細胞のC6やGA-1に高濃度存在しており、組織での局在とよく一致していた。2)Swiss 3T3線維芽細胞には主にγ^5とγ^<12>が存在するが、これらのγサブユニットに対する抗体で免疫染色すると、γ^5はfocal adhesionに、γ^<12>はストレスファイバーに一致して存在していた。粗細胞骨格標品から調整したF-アクチン画分にγ^<12>が含まれていることより、γ^<12>はF-アクチンに結合していることが明らかになった。

このような各γサブユニットの異なる局在はそれぞれのγの機能の違いを示唆していると考えられる。3)γ^<12>はプロテインキナーゼCによりリン酸化され、そのリン酸化部位はN末端の2つのセリンのどちらかであることすでに明らかにしている。今回、両部位にそれぞれリン酸基を導入したペプチドを合成して抗体を作製したところ、N末端のセリンがリン酸化されたペプチドに対する抗体がリン酸化γ^<12>を認識した。したがって、プロテインキナーゼCによるリン酸化部位はN末端セリンであると結論される。G蛋白質はα、β、γの3つのサブユニットから成り、βとγは生理的条件下では常に結合して存在し、いろいろなサブタイプの組み合わせの複合体を形成している。これまでの研究結果から、βγの機能的な差はγによって決定されていると考えられている。本研究は、γの違いによるβγの機能的な差異を調べることにより、γの分子多様性の生理的意義を明らかにすることを目的にし、本年度は次のような成果を得た。1)各種γのうちγ12はプロテインキナーゼC(PKC)でリン酸化されることが明らかになっており、昨年度はリン酸化γ12を認識する抗体を作製した。今年度はこの抗体を用いて、細胞内でのリン酸化について検討した。Swiss 3T3線維芽細胞をリゾホスファチジン酸(LPA)、エンドセリン、PDGFなどのホスフォリパーゼCを活性化することが知られているアゴニストで刺激すると、γ12のリン酸化がみられた。2)これらのリン酸化はPKCの阻害剤やPKCのdown-regulationで消失することから、細胞内でもPKCによりγ12のリン酸化が起きていることが明らかになった。3)LPAによるγ12のリン酸化は細胞を百日咳毒素で処理しておくと消失することからGi/oを介して起こっていると考えられる。4)PKCの強力な活性化剤ホルボールエステルによるγ12のリン酸化はあまり強くないが、細胞をLPAとホルボールエステルで同時に刺激すると、相乗的な増加がみられた。γ12はPKCとG蛋白質の活性化が同時に起こるときに強くリン酸化されることが明らかになった。5)各種γのうち蛋白質の同定がなされていなかったγ10とγ11をウシ肺より精製した。6)γ10とγ11に対する抗体を作成し、ラットの各組織における分布を調べたところ、両γとも多くの組織に存在した。血小板にγ11が特に高濃度存在することがわかった。l)これまで、蛋白質が同定されていなかったβ4サブユニット蛋白質を、ウシ肺から精製したβγ5フラクション中に見いだした。β4はγ5およびγ12と選択的に結合することを明らかにした。2)細胞内におけるγ12の役割およびγ12と他のγとの機能的差異を調べるため、NIH3T3細胞にβ1と各種γを共発現させた。γ12を強発現した細胞ではストレスファイバーが減少しているか、消失し、60-70%の細胞は丸くなった。一方、γ2、γ5、およびγ7を同程度に強発現させた細胞では、ストレスファイバーの減少が見られたが、丸くなる細胞は非常にわずかであった。3)各種βγを発現させた細胞の走化性をBoyden chamber法を用いて測定した。
ナノプローブを用いた高精度電位測定とナノ構造中電子状態の解明に関する研究

本研究では、ナノプローブの一種であるケルビン・プローブ・フォース顕微鏡(KFM)において、その動作モードに独自の改良を加え、電位測定における精度・空間分解能・信頼性の向上を図った。また、同手法を利用して、自己形成InAs量子ドット周囲の電位分布などの計測を行い、量子ドットへの電荷蓄積効果などについての議論を行った。さらに、光照射下でのKFM測定によって多結晶Si太陽電池材料の光起電力特性などの観測を行い、結晶粒界近傍での少数キャリア特性の劣化現象などを観測した。本研究では、ナノプローブによる精密・正確な電位計測系を構築し、それを用いることによって量子ナノ構造中の電子状態に関する知見を獲得することを主たる目的としている。特に、ナノプローブの一種であるケルビン・プローブ・フォース顕微鏡(KFM)において、その動作モードが本質的に含有する問題点を再点検し、それらを解決することによって、精度・空間分解能だけでなく信頼性も高い電位計測を実現することを目指している。今年度においては、静電引力の長距離性による分解能の低下を防ぐための間欠バイアス法や静電引力に対する測定感度を向上させるためのサンプリング手法、電位決定の応答速度を向上するための新アルゴリズムなどを提案するとともに、実際のKFMシステムに導入し、その効果の検証を行った。間欠バイアス法とサンプリング手法とを併用したKFMによって自己形成InAs量子ドット周囲の電位分布を観測した結果、10nm以下の領域で100mV程度の大きな電位変化が明瞭に観測され、本手法によって電位測定における空間分解能が向上していることが実証された。なお、電位決定の新アルゴリズムについては、同手法によって電位測定が可能であることを確認することはできたが、従来手法に対する十分な優位性を示すには至っていない。一方、自己変位検出型のカンチレバーを用いたKFMを光照射下で動作させることにより、多結晶シリコン太陽電池における光起電力分布を観測することにも取り組んだ。その結果、多結晶材料の結晶粒ごとに光起電力がばらついていることや結晶粒界付近で光起電力が低下していることを示すデータを得ることができた。また、これらの光起電力分布は、もともと試料表面が持っている電位分布から説明できることがわかった。さらに、照射光波長に対する光起電力の依存性の測定から、小数キャリアの拡散長を評価できることも示された。また、KFM測定を低温で行うことを目指し、KFMユニットの真空排気系の強化・改善などを行い、次年度以降の実験実施の準備を進めた。今年度においては、自己変位検出型のカンチレバーを用いたKFMによる光起電力測定手法を拡張し、単に光起電力の空間分布測定のみならず、少数キャリアの拡散長や寿命、移動度など、各種ダイナミクスを評価できることを示した。この手法を利用して、多結晶シリコン太陽電池材料の評価を行った結果、結晶粒界近傍で明らかに各特性が劣化していることが示された。これは、結晶粒界が少数キャリアの再結合サイトとして働いていることを強く示唆している。一方、KFMでの電位フィードバックを停止し、静電引力信号の直流バイアス依存性を測定することにより、局在準位などへの電荷蓄積効果を観測できる可能性がある。同手法を用いて、自己形成InAs量子ドット上での静電引力測定を行った結果、いくつかの不連続点が観測されると共に、それらの現れる電圧値が量子ドットのサイズに依存していることがわかった。この不連続信号の起源やドット中量子準位との関連性について、さらなる考察を進めている。本研究では、ナノプローブによる精密・正確な電位計測系を構築し、それを用いることによって量子ナノ構造中の電子状態に関する知見を獲得することを主たる目的とした。特に、ナノプローブの一種であるケルビン・プローブ・フォース顕微鏡(KFM)において、その動作モードが本質的に含有する問題点を再点検し、それらを解決することによって、精度・空間分解能だけでなく信頼性も高い電位計測を実現することを目指した。今年度は、従来から開発を続けていた間欠バイアス印加法およびサンプリング検出法を併用したKFMの有用性を、GaAs上自己形成InAs量子ドット周囲での電位分布観測を通じて検証した。両手法の条件を最適化することにより、空間分解能と電位決定精度の大きな改善が見込めることを示した。