hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
有用二次代謝物質生産に資する抗酸化反応に注目した植物ストレス応答反応のメタボロミクス

当該研究では,抗酸化反応という視点から環境ストレス応答反応における二次代謝の代謝変動解析を行った.二次代謝物質として強い生理活性を有し医薬品原料として利用されているアルカロイドに注目し,ニチニチソウ,ベラドンナ等を実験植物として環境ストレスに対する代謝変動解析に取り組んだ.まず,それぞれの植物体において一次代謝物および二次代謝物を精密に解析するための植物材料ならびに代謝分析手法の構築を行った.構築した代謝解析系を用いて環境ストレス負荷に対する代謝変動解析を試みた.変動が顕著な代謝物を同定し,アルカロイドを中心とした各代謝物の相関関係を解析した結果,ストレスに対して挙動を共にする代謝物群を同定した.また,当該代謝解析系を用いて他の植物においても応用研究を行い,各種代謝物における環境ストレスによる変動を確認した.当該研究により植物の二次代謝とストレス応答反応の関係が明らかになり,有用二次代謝産物の生産に向けた基礎的な知見が取得できた.当該研究では,抗酸化反応という視点から環境ストレス応答反応における二次代謝の代謝変動解析を行った.二次代謝物質として強い生理活性を有し医薬品原料として利用されているアルカロイドに注目し,ニチニチソウ,ベラドンナ等を実験植物として環境ストレスに対する代謝変動解析に取り組んだ.まず,それぞれの植物体において一次代謝物および二次代謝物を精密に解析するための植物材料ならびに代謝分析手法の構築を行った.構築した代謝解析系を用いて環境ストレス負荷に対する代謝変動解析を試みた.変動が顕著な代謝物を同定し,アルカロイドを中心とした各代謝物の相関関係を解析した結果,ストレスに対して挙動を共にする代謝物群を同定した.また,当該代謝解析系を用いて他の植物においても応用研究を行い,各種代謝物における環境ストレスによる変動を確認した.当該研究により植物の二次代謝とストレス応答反応の関係が明らかになり,有用二次代謝産物の生産に向けた基礎的な知見が取得できた.植物は多種多様な二次代謝物質を産生するが,その生理的な意義については不明な点が多い.そこで,当該研究では,植物は酸化ストレスから身を守るために抗酸化物質を生産し,それが結果的として酸化され生理活性を有する二次代謝物質となっているという仮説をたて,抗酸化反応という視点から環境ストレス応答反応における二次代謝の代謝変動解析を行い,植物における二次代謝の生理的な意義の解明を目指した.本年度は,二次代謝物質として強い生理活性を有し医薬品原料として利用されているアルカロイドに注目し,ニチニチソウを実験植物として環境ストレスに対する代謝変動解析に取り組んだ.まず,前駆体であるcatharanthine,vindolineとその酸化重合物である二量体アルカロイドのvinblastine,anhydrovinblastine,1eurosineの分析系の構築を試み,蛍光検出器用いることによりHPLCでの高感度定量分析系の構築に成功した.また,アルカロイドの産生能が高い系統のシュートカルチャー培養系および植物体への順化系を構築し,当該研究に耐えうる植物材料の準備をした.さらに,各種環境ストレスの負荷方法および代謝物の抽出・精製方法など再現性および精度の高いデータを取得するための各種条件の検討を行い,ストレス応答反応の代謝レベルでの精密解析に耐えうる手法の構築を行った.実際に上記の手法を用いてニチニチソウ葉における解析を行ったところ,光酸化ストレス(近紫外光照射)により前駆体の含量が大きく減少し,二量体の増加が確認された.さらに,低温条件下(4°C)でも同様の現象が認められたことから,当該反応は非酵素的にも進行することが明らかになった.今後,二量体生合成系の環境ストレス応答反応としての生理的意義について考察するために,様々な酸化ストレス条件下で代謝産物一斉解析を行っていく予定である。植物は多種多様な二次代謝物質を産生するが,その生理的な意義については不明な点が多い.そこで,当該研究では,植物は酸化ストレスから身を守るために抗酸化物質を生産し、それが結果的として酸化され生理活性を有する二次代謝物質となっているという仮説をたて,抗酸化反応という視点から環境ストレス応答反応における二次代謝の代謝変動解析を行い,植物における二珠代謝の生理的な意義の解明を目指した.本年度は,昨年に引き続きアルカロイド産生植物における代謝変動解析のため技術構築を行うとともに,環境ストレス負荷における代謝変動解析に取り組んだ.1.アルカロイド産生植物における代謝変動解析のため技術構築昨年度に引き続きアルカロイドをターゲットした二次代謝と関連代謝の精密解析手法の構築に取り組んだ. ^<15>N無機塩を用い安定同位体希釈法による各種アルカロイドならびに関運代謝物の精密分析法を構築しベラドンナにおける代謝変動解析に成功した.また,電子スピン共鳴(ESR)などを用いた活性酸素種の解析手法の構築し,ニチニチソウの二量体アルカロイドが生成する酸化ストレス条件下においる活性酸素種の発生が示唆された.2.環境ストレス負荷における代謝変動解析ニチニチソウの懸濁培養細胞およびシュートカルチャー,ベラドンナ毛状根などを用いて,環境ストレス負荷に対する代謝変動解析を試みた.ニチニチソウの懸濁培養細胞において変動が顕著な代謝物を同定し,アルカロイドを中心とした各代謝物の相関関係を解析した結果,ストレスに対して挙動を共にする代謝物群を同定した.また,シロイヌナズナにおける光応答反応についても解析し,ストレス応答物質であるポリアミン生合成系が活性化されることが明らかになった。さらに,応用研究として,緑茶や生薬植物であるトウキの代謝プロファイリングを行い,各種代謝物における環境ストレスによる変動が確認された.当該研究により植物の二次代謝とストレス応答反応の関係が明らかになり,有用二次代謝産物の生産に向けた基礎な知見が取得できた.
ヒト悪性腫瘍のin vitro, in vivoの放射線感受性を規定する遺伝子解明

本研究では見いだしたヒト悪性腫瘍におけるin vitroとin vivoの放射線感受性の乖離現象を元に、それぞれの感受性を規定する遺伝子を特定する研究を行った。新規ヒトゲノムをクローニングするために、新たなdegenerative primer法変法を編み出した。すなわち、intercept-PCRによるcDNAライブラリースクリーニングにより多数の新規遺伝子を入手することができた。これらのうち、6つの遺伝子断片に注目し、完全長cDNAの決定と機能解析を実施し細胞レベルの放射線感受性を規定する、細胞周期あるいは細胞の分化に関連した新規ヒトゲノム4つの全長クローニングに成功し、その機能解析結果とともに報告した。細胞レベルでの放射線感受性の検討の結果、従来言われていたp53ステータスのみでは差が大きくなく、元の組織型の放射線感受性とは全く相関しないことが確認できた。更に、10種類のヒト悪性腫瘍細胞由来ヌードマウス移植腫瘍組織レベルでの放射線感受性を検討した。腫瘍組織レベルでの放射線感受性を規定する因子を検討し、酸素電極を用いた研究によって上記10種類の移植腫瘍において、酸素分圧と放射線感受性との相関を立証することができた。更に分子レベルでの検討から、血管新生因子、凝固線溶系因子の細胞レベルでの発現よりもむしろ組織レベルでの発現が重要との結論に達した。即ち、in vitroとin vivoの放射線感受性は、細胞レベルでは細胞周期制御やDNA修復に関連したp53など複数の因子によって、組織レベルでは血管新生因子、凝固線溶系因子によって規定される酸素分圧によってというように、それぞれ全く違った機序で規定されている可能性が示唆された。今年度各種培養ヒト悪性腫瘍由来細胞を用いて、培養上清中の凝固線溶系因子tPA,uPA,TF,PAI-1,uPARをELISA法で検討した。その結果定常状態で、放射線高感受性のU87MG細胞はPAI-1の産生が高く、抵抗性のA7細胞ではPAI-1の産生が前者の約1/4と低かった。逆にuPARは増殖期で、A7細胞で前者よりも約3倍高い結果が得られた。HeLa S3,U87MG,AOI腫瘍については、従来腫瘍局所照射に用いていた無麻酔固定下での腫瘍内の酸素分圧を測定した。いずれの腫瘍も中心部と辺縁部で、温度と酸素分圧に明らかな差があり、特にU87MG腫瘍では中心部の温度は高く、酸素分圧は低く、辺縁部では温度は低く、酸素分圧は高いという結果が得られた。その結果in vitroとin vivoヌードマウス腫瘍の放射線感受性の逆転現象に相関していた因子は、むしろ低酸素マーカーと呼ばれつつあるPAI-1である可能性が示唆された。既に血栓溶解を妨げるPAI-1の血中濃度が高い患者の局所制御率が悪く、かつ遠隔成績が悪いとの報告もある。一方、昨年度クローニングを始めた新規ヒト遺伝子ヘリケースの全長7037bpに及ぶクローニングが完了し、機能解析を進めRNAヘリケースという機能が固まった段階でBBAに投稿し採択された。現在までDNAヘリケースは6つ発見されているが、最近はDNAヘリケースとRNAヘリケースとの区別が明確にできないというのが現実であり、我々のクローニングしたものがDNA修復に関与する可能性は少なくなく、放射線障害とこの新規ヘリケースとの関連についても解析する必要がある。平成12年度には、ヌードマウス移植腫瘍でのPAI-1などの発現をRT-PCRで確認するとともに、酸素分圧の変化をA7腫瘍など他の腫瘍でも確認する予定である。またクローニングした新規ヘリカーゼの機能解析も更に進める予定である。平成12年度は平成11年度までの研究を元に以下の研究を行った。まずp53のステータスの不明な細胞については、モノクローナル抗体を用いたウェスタンブロッティングで検討した。その結果、U87MGを除いてほとんどの細胞がp53の突然変異型を発現しているか、ヌルの状態であった。

また、組織レベルの放射線感受性とp53の発現レベルとの相関も明確ではなかった。そこでAOI, QG56, HeLa S3, U-87MG, A7, Detroit 562, N2, MX-1, HMG-1, SK Mel 26の10種類のKSNヌードマウス移植腫瘍(径15-30mm)について、各々の腫瘍潰瘍部位を避けて、ユニークメディカル社製の酸素電極を用いて酸素分圧の測定を行い、酸素分圧と放射線感受性との相関を立証することができた。そこで、低酸素状態に関係した因子について、血管新生、凝固線溶系因子を中心として、X-線照射後経時的に培養細胞あるいは壊死部を除いた腫瘍組織からmRNAを抽出し、RT-PCRで検討した。その結果、血管新生因子、凝固線溶系因子の細胞レベルでの発現よりもむしろ組織レベルでの発現が重要との結論に達した。即ち、in vitroとin vivoの放射線感受性は、細胞レベルでは細胞周期制御やDNA修復に関連したp53など複数の因子によって、組織レベルではPAI-1など血管新生因子、凝固線溶系因子によって規定される酸素分圧によってというように、それぞれ全く違った機序で規定されている可能性が示唆された。
甲状腺腫瘍、特に乳頭癌の予後因子に関する分子病理学的検討

現在、甲状腺の乳頭癌には種々の亜型が報告されているが、各々が独立した疾患概念として認められるべきか否かは未だ十分に解析されているとは言いがたい。それらの中で我々は家族性大腸ポリポーシスに合併する甲状腺篩状・モルラ型乳頭癌を対象に研究を行ってきた。この亜型は極めて予後のよい乳頭癌であり、その発生にはAPC遺伝子の胚細胞突然変異が関与しているとされている。我々は5例の篩状・モルラ型乳頭癌を検索したところ、APC遺伝子の胚細胞突然変異がみられたのは1例のみであった。一方、βカテニン遺伝子(CTNNB1)の体細胞突然変異は全例にみられ、これが腫瘍の発生に関与していることが示唆された。また、本腫瘍では通常免疫組織化学的に細胞膜に陽性局在を示すβカテニンが核内および細胞膜に発現することが特徴的とされているが、CTNNB1の突然変異の存在がこの現象の説明を可能とした。また、本亜型にみられるモルラは形態的に予後不良なびまん性硬化型乳頭癌にみられる扁平上皮化生と混同されることがあることから、両者の相違点を明確にする目的で免疫組織化学的検討を行った。モルラは高分子量サイトケラチンに陰性ないし弱陽性で、βカテニンでは細胞質が弱陽性で、核に陽性局在を示すものもみられた。一方、扁平上皮化生部は高分子量サイトケラチンに陽性で、βカテニンは細胞膜が陽性であった。Bcl-2はモルラが強陽性で、扁平上皮化生部は陰性であった。モルラの発生にはβカテニンの遺伝子変異が関与しており、扁平上皮化生の初期像でないと結論した。現在,甲状腺の乳頭癌には種々の亜型が報告されているが,各々が独立した疾患概念として認められるべきか否かは未だ十分に解析されているとは言い難い。甲状腺乳頭癌が家族性大腸ポリポーシスに合併することは古くから知られているが,近年その組織像や免疫組織化学的染色結果の特徴が次第に明らかになりつつある。家族性ポリポーシスに合併する甲状腺乳頭癌は,圧倒的に女性に多く,組織学的に篩状構造,morule形成,ビオチン含有淡明核などが特徴的である。免疫組織化学的にも,βカテニンが核にも陽性を示すことが特異的であり,さらに,estrogen receptorやprogesterone receptorも陽性である。この亜型はcribriform-morular variantと呼ばれており,ポリープが出現する前に甲状腺腫瘍が発見される場合もある。しかし,この組織型はポリポーシスを有さない症例でも出現することがあり,この亜型がAPC遺伝子の胚細胞変異を有しているのか、あるいは体細胞変異を有しているのかはその発生に関して非常に興味深い。我々は,現在cribriform-morular variantの症例を集めている最中であり,来年度にはそれらの腫瘍を対象に,免疫組織化学的検索,ならびにAPC遺伝子や甲状腺乳頭癌でしばしば陽性となるret/ptc遺伝子の検索を行なうつもりである。一般的に甲状腺乳頭癌は予後のよい悪性腫瘍として知られているが,甲状腺悪性腫瘍の90%以上を占めるこの腫瘍には現在種々の亜型が報告されており,その発生原因や臨床経過は様々である。しかし,各々が独立した疾患概念として認められるべきか否かは未だ十分に解析されているとは言い難い。甲状腺乳頭癌が家族性大腸ポリポーシスに合併することは古くから知られており,近年その組織像や免疫組織化学的染色結果の特徴が次第に明らかになるにつれて一つの臨床病理学的な疾患概念として定着しつつある。

免疫組織化学的にも,βカテニンが核にも陽性を示すことが特異的であり,さらに,estrogen receptorやprogesterone receptorも陽性である。この亜型は病理学的にはcribriform-morular variantと呼ばれており,ポリープが出現する前に甲状腺腫瘍が発見される場合もある。しかし,この組織型はポリポーシスを有さない症例でも出現することがあり,この亜型がAPC遺伝子の胚細胞変異を有しているのか,あるいは体細胞変異を有しているのかはその発生に関して非常に興味深い。我々は,現在cribriform-morular variantの5症例を集めており,それらの腫瘍を対象に,免疫組織化学的検索,ならびにAPC遺伝子や甲状腺乳頭癌でしばしば陽性となるret/ptc遺伝子の検索を行なっている状態である。また,その他の組織型として,甲状腺全体にびまん性に浸潤し,高頻度にリンパ節転移を来す予後不良の亜型として知られているび慢性硬化型乳頭癌についても,その悪性度と細胞接着因子との関連を研究している。現在、甲状腺の乳頭癌には種々の亜型が報告されているが、各々が独立した疾患概念として認められるべきか否かは未だ十分に解析されているとは言いがたい。甲状腺乳頭癌が家族性ポリポーシスに合併することは古くから知られているが、近年その組織像や免疫組織化学的染色結果の特徴が次第に明らかになりつつある。家族性ポリポーシスに合併する甲状腺乳頭癌は、圧倒的に女性に多く、組織学的に篩状構造、morules形成、ビオチン含有淡明核などが特徴的である。免疫組織化学的にも、βカテニンが核にも陽性を示すことが特異的であり、さらに、estrogen receptorやprogesterone receptorも陽性でもある。この亜型はcribriform-morular variantと呼ばれており、ポリープが出現する前に甲状腺腫瘍が発見される場合もある。しかし、この組織型はポリポーシスを有さない症例でも出現することがあり、この亜型APC遺伝子の胚細胞変異を有しているのか、あるいは体細胞変異を有しているのかはその発生に関して非常に興味深い。我々はこのcribriform-morular variantの5症例を集めて検討した結果、1例のみしかAPC遺伝子異常を有しておらず、5例全例がβカテニンの遺伝子異常を有していることを明らかにした。また、これらの腫瘍では、特に、morulesにおいて、アポトーシスを抑制するbcl-2の過剰発現がみられることを明らかにした。これらのことから、cribriform-morular variantは、bcl-2の過剰発現により細胞の寿命が長くなり、そのことによって遺伝子異常の起こすチャンスが増加した細胞に、βカテニンの遺伝子異常が起こることにより発生すると推測される。我々は現在、この研究結果を報告する準備している。それらの中で我々は家族性大腸ポリポーシスに合併する甲状腺篩状・モルラ型乳頭癌を対象に研究を行ってきた。この亜型は極めて予後のよい乳頭癌であり、その発生にはAPC遺伝子の胚細胞突然変異が関与しているとされている。一方、びまん性硬化型乳頭癌はびまん性の浸潤増殖、間質の硝子化、リンパ濾胞の形成などを特徴とする予後不良の乳頭癌であり、組織学的にモルラに類似した扁平上皮化生を示す。
日本・英米との比較から見たフランス現代哲学の主体・人格概念（愛・性・家族を軸に）

本研究は、フランス現代哲学の主体・人格概念を、日・英の潮流と比較しつつ、愛・性・家族の解体・再構築に関する事例分析に即して再検討することを目的とする。多様な思想潮流に属する現代フランスの思想家たちは、愛・性・家族に関する諸現象が主体や人格という概念に対して提起する諸問題をどう取り扱ってきたのか。次世代のフランス哲学や英米圏の分析哲学の流れも検討対象に加えつつ、近現代日本精神史における主体・人格概念との比較をより力強く推進することで、主体・人格概念の徹底的な改変を試みたフランス現代哲学を、現代社会において動揺する愛・性・家族に関する新たな理論の模索として読み直す可能性を探りたい。
敗血症性急性腎不全が慢性透析へ進行する病態でのCaチャネルの関与と予防療法の検討

重症敗血症では腎不全を併発することで、死亡率が上昇する。急性腎不全から慢性腎不全に至り、維持透析が必要となった場合、医療費の増大は計り知れない。本研究では、ラットやマウス敗血症モデルを用いて急性腎不全から慢性腎不全に移行する新たなる病態を解明するとともに、慢性腎不全に進行しない予防治療法の検討を行うことを最終目的とする。急性腎不全は、敗血症性ショックでの全身臓器低潅流に伴う腎臓低潅流から、糸球体・尿細管細胞の虚血壊死を来たすことに依る。急性腎不全後の腎機能回復例では一過性の腎機能障害を来たした後に、再潅流による腎臓の生存細胞の機能再開や糸球体・尿細管細胞の再生により機能回復を見る。しかし、この後に腎機能が悪化して急性腎不全から慢性腎不全へと進行する症例も多い。詳細な病態解明には、敗血症性ショック後にリンパ球を中心とした炎症反応が腎臓間質でどの様に生じているかの病態解明と、腎尿細管細胞におけるアポトーシスの病態解明が不可欠である。また、リンパ球浸潤と尿細管アポトースに多大な影響を与えるKv1.3チャネルやCaチャネルが本病態へどのように関与しているかの解明も不可欠である。我々は昨年度、第二世代抗ヒスタミン薬(セチリジン、フェキソフェナジン、アゼラスチン、テルフェナジン)を用いて、Kv1.3チャネル電流の抑制と電気的細胞膜容量の測定からこれらの薬剤と細胞膜との相互作用による免疫抑制作用の機序を証明した。さらに、本年度は、ラット腎を用いて、慢性腎不全モデルを作成し、腎臓皮質領域にリンパ球やマクロファージなどの炎症性細胞が数多く浸潤し、浮腫と線維化で拡大していることを証明し、さらに、腎不全の進行とともに、浸潤したリンパ球の細胞膜上にKv1.3チャネルが過剰発現していることを明らかにした。今後は、第二世代抗ヒスタミン薬の腎線維化抑制作用を検討する予定である。我々は昨年度、第二世代抗ヒスタミン薬であるセチリジン、フェキソフェナジン、アゼラスチン、テルフェナジンを用いて、リンパ球に優位に発現するKv1.3チャネル電流の抑制と電気的細胞膜容量の測定からこれらの薬剤と細胞膜との相互作用による免疫抑制作用の機序を証明した。さらに、本年度は、ラット腎を用いて、5/6腎摘除後慢性腎不全モデルを作成し、腎組織像を観察した。腎臓皮質領域にリンパ球やマクロファージなどの炎症性細胞が数多く浸潤し、腎間質領域は、浮腫と線維化で拡大していることを証明し、さらに、腎不全の進行とともに、浸潤したリンパ球の細胞膜上にKv1.3チャネルが過剰発現していることを明らかにした。第二世代抗ヒスタミン薬であるセチリジン、フェキソフェナジン、アゼラスチン、テルフェナジンを用いて、Kv1.3チャネル電流の抑制と電気的細胞膜容量の測定からこれらの薬剤と細胞膜との相互作用による免疫抑制作用の機序を証明した。腎臓皮質領域にリンパ球やマクロファージなどの炎症性細胞が数多く浸潤し、腎臓間質領域は、浮腫と線維化で拡大していることを証明した。さらに、腎不全の進行とともに、浸潤したリンパ球の細胞膜上にKv1.3チャネルが過剰発現していることを明らかにした。今後は、第二世代抗ヒスタミン薬を慢性腎不全ラットに投与することで、腎組織像の変化を観察し、第二世代抗ヒスタミン薬の腎線維化に対する抑制作用を検討する予定である。重症敗血症の死亡率が高くなる原因として、腎不全を併発しやすいことが挙げられる。さらに、急性腎不全から慢性腎不全に至る場合も少なからずあり、この様な症例に透析導入を行った場合の医療費への負担は計り知れない。本研究では、ラットもしくはマウス敗血症モデルを用いて急性腎不全から慢性腎不全に移行する新たなる病態の解明と、慢性腎不全に進行しない予防法と治療法の検討を行うことを目的とする。急性腎不全の発症は、敗血症性ショック状態での循環状態の悪化(全身の低血圧・低灌流)による腎臓低灌流から、糸球体・尿細管細胞の虚血壊死を来たすことが本態である。急性腎不全発症後の腎機能回復例では一過性の腎機能障害を来たした後に、再潅流による腎臓の生存細胞の機能再開や糸球体・尿細管細胞の再生により機能回復を見る。しかし、この後に徐々に腎機能が悪化して急性腎不全から慢性腎不全へと進行する症例も多い。急性腎不全から慢性腎不全への進行の詳細な病態解明には、敗血症性ショック後にリンパ球を中心とした炎症反応が腎臓間質でどの様に生じているかの病態解明と、腎尿細管細胞におけるアポトーシスの病態解明が不可欠である。また、リンパ球浸潤と尿細管アポトースに多大な影響を与えるKv1.3チャネルやCaチャネルが病態へどのように関与しているか、この機序の解明も不可欠である。その足がかりとして、現在、正常マウス胸腺細胞より採取したリンパ球を用いて、Kv1.3チャネルに対する影響を電気生理学的手法であるパッチクランプ法を用いて、抗ヒスタミン薬、ステロイド、Ca拮抗薬等がリンパ球に与える影響を検討している。

パッチクランプ法で細胞膜電流および細胞膜容量(Cm)を測定し、電流の抑制の程度、持続性を計測することで、各薬剤の免疫抑制作用を推し量ることが可能となる。リンパ球に数多く存在するKv1.3チャネルやCaチャネルに対する各薬剤の影響を正常のマウス胸腺細胞(約8週齢)より採取したリンパ球を用いて、抗ヒスタミン薬、ステロイド、Ca拮抗薬等がKv1.3チャネルに与える影響を検討している。抗ヒスタミン薬のうち、第二世代(フェキソフェナジン、テルフェナジン、オロパタジン、ロラタジン、アゼラスチン)を中心に検討を加えている。多くがKv1.3チャネルを抑制するなかで、現在は、その細胞膜容量低下作用からテルフェナジンとアゼラスチンに着目している。重症敗血症では腎不全を併発することで、死亡率が上昇する。急性腎不全から慢性腎不全に至り、維持透析が必要となった場合、医療費の増大は計り知れない。本研究では、ラットやマウス敗血症モデルを用いて急性腎不全から慢性腎不全に移行する新たなる病態を解明するとともに、慢性腎不全に進行しない予防治療法の検討を行うことを最終目的とする。急性腎不全は、敗血症性ショックでの全身臓器低潅流に伴う腎臓低潅流から、糸球体・尿細管細胞の虚血壊死を来たすことに依る。急性腎不全後の腎機能回復例では一過性の腎機能障害を来たした後に、再潅流による腎臓の生存細胞の機能再開や糸球体・尿細管細胞の再生により機能回復を見る。しかし、この後に腎機能が悪化して急性腎不全から慢性腎不全へと進行する症例も多い。詳細な病態解明には、敗血症性ショック後にリンパ球を中心とした炎症反応が腎臓間質でどの様に生じているかの病態解明と、腎尿細管細胞におけるアポトーシスの病態解明が不可欠である。また、リンパ球浸潤と尿細管アポトースに多大な影響を与えるKv1.3チャネルやCaチャネルが本病態へどのように関与しているかの解明も不可欠である。現在、正常マウス胸腺細胞より採取したTリンパ球を用いて、Kv1.3チャネルに対する影響をパッチクランプ法により検討している。非ステロイド性抗炎症薬(ジクロフェナクやサリチル酸など)、カルシウム拮抗薬(ニフェジピンやベニジピンなど)やマクロライド系抗生物質の中には本来の薬理作用に加え、胸腺細胞膜のKv1.3チャネル電流を介した免疫抑制作用を併せ持つことが電気生理学研究により明らかにされているが、我々は第二世代抗ヒスタミン薬(セチリジン、フェキソフェナジン、アゼラスチン、テルフェナジン)を用いて、Kv1.3チャネル電流の抑制と細胞膜容量の測定からこれらの薬剤と細胞膜との相互作用による機序を明らかにした。リンパ球に数多く存在するKv1.3チャネルに対する第二世代抗ヒスタミン薬の影響を正常マウス胸腺細胞(約45週齢)より採取したTリンパ球を用いて、電気生理学的手法であるホールセル・パッチクランプ法により検討した。第二世代抗ヒスタミン薬であるセチリジン、フェキソフェナジン、アゼラスチン、テルフェナジンを用いて、それらがKv1.3チャネル電流と細胞膜容量(membrane capacitance:Cm)に対する影響を比較した。これらの薬剤がTリンパ球に発現したKv1.3チャネル電流を抑制することを初めて示すとともに、アゼラスチンとテルフェナジンが与える影響は、細胞膜容量を減少させることから、薬剤と細胞膜の相互作用によることも併せて示した。
釧路湿原の自然環境修復を目的とした生態系再生ポテンシャルの推定と最適地抽出

研究最終年度では,湿原を含む流域構造の変化(特に河川内横断構造物による河川ネットワーク分断の実態解明)とそれに起因する水生生物の生息地ポテンシャルの変化に関連する研究を行った。研究の具体的な推進手順は以下の通りである。1)データベースと空間解析モジュールの開発:釧路湿原及び釧路川流域を対象とし,流域分断ポリゴンデータ,河川内横断構造物,水生生物(主に国内の絶滅危惧種を含む淡水魚類全体)等をデジタル化し,さらにGISの処理モジュールを開発した。収集データは全てGIS環境で操作可能とし,ESRIのshpファイル及びGRID形式に統一して研究最終成果物とした。2)空間情報解析及びマッピング:釧路湿原を含む流域全体における水生生物の生息環境を評価し,その経年変化を抽出する目的で,潜在生息適地モデル(Predictive Habitat Model)を開発し,釧路側流域と北海道全体に適応した。実際のモデルの処理過程は次の通りである。水辺の国勢調査における魚類捕獲情報(情報有りor無し)と捕獲地点における生息環境情報(水質=公共用水域水質データ・気象・流域構造・流域分断状況等)を統合する線形回帰モデルを個々の選択種(例えば絶滅危惧種等)毎に決定する。次に推定対象河川における生息地の環境パラメターをデータベースと連動させ,新たな環境アセス候補地点において生息地ポテンシャルを再計算する。第一段階では,現在の生息環境と考えられる2002年データをパラメターとして用い「現在の生物生息状況」を予測した。次にインプットデータを1977年データとし,過去に遡り「25年前の生息地状態」を逆推定した。最終段階においてこの二つの時代(2002年と1977年)の差を同一地点で計算する事により,2次期の間の生物生息ポテンシャル変化の時空間的な解析を可能とした。本システムではモデルの適応時において,対象種毎に,生息ポテンシャルに有意に影響する環境パラメターとその寄与率が統計的に有意に決定される。これらの「生息地再生に必要となる生息地環境パラメター」と「寄与率」は釧路湿原を含む釧路川全流域の対象地点で全て定量化可能である。つまり実際の湿原再生を考慮した場合,対象種を限定した後の再生シナリオとして,再生候補地点と復元パラメター決定さらにその必要改善量の自動計算が実現する。本研究成果を用いることにより,自然再生における具体的効果とそれに必要なコストのバランスをより正確に把握することが可能となり,高い実効性とスピーディな湿原再生プランの策定に大きく貢献するものである。研究初年度では、主にリモートセンシングとGIS解析を用いた地理条件による候補地の抽出に重点を置いた。特にGISの活用では、データベース構築・空間解析アルゴリズム開発・解析結果のマッピングを行い、次年度以降の事前調査資料とした。また、データベースの充実を図り流域内河川のネットワークに着目した解析を行った。データベース構築:解析対象地のラスターデータとして、50mメッシュDEMを基にした起伏量データ、ハンノキなどの湿原木本分布データ、3次メッシュ気象データ、100mメッシュ土地利用データを整備した。ベクターデータとしては、湿原流入河川の時代別ベクトル化(大正以後の4時代)、およびサブ流域ネットワークポリゴン(集水域を細分化して上流下流のトポロジー構造を持たせたGISデータ)を作成した。空間解析アルゴリズム:湿原流入河川に含まれる個々のサブ流域ネットワークポリゴンに対し、任意の地点から上流・下流を自動検索するアルゴリズムを開発し、このデータと河川構造物・河川改修区間のデータを統合化して、流域分断化の解析、河川改修の影響範囲を抽出可能とした。マッピング:上記解析を、湿原を含む流域全体に適応して次年度以降の調査対象地の絞込みを可能とした。【研究成果】データベース構築と空間解析アルゴリズムの部分を中心に、関連する内容で以下の学術発表を行った。口頭発表は研究代表者本人がすべて行った。紙上発表は連名を含む。(口頭発表)国内3回:景観生態学会第13北九州大会(北九州)2003年6月。(講演要旨集O-7)応用生態工学会2003年第7回福岡大会,北九州,2003年10月(第7回応用生態学会発表要旨集pp.145-148)第22回琵琶湖研究シンポジウム2004,大津市琵琶湖研究所,2004年2月23日;(講演要旨集pp.2-4)国内誌1報国立環境研究所ニュース研究次年度では,河川構造改変(河道直線化)に関わる空間情報解析とそれに活用するリレーショナルデータベースの構築に重点を置き主にGISを活用して作業を行った。1)データベース構築:釧路川流域と日本全国を対象とし,河川(サブ流域ポリゴン)ネットワーク,河川改修区間,基幹農業用排水路区間,河川内横断構造物,水生生物(主に水辺の国勢調査と自然環境基礎調査による魚類)等。2)空間情報解析及びマッピング:特に湿原植生群落構造の変化に最大の影響を与える土砂供給源の特定を目的とし,2時期の河川ラインデータ(1970年と2000年,1/25000スケール)と100mDEMおよび湿原ポリゴンを用い,河川リーチごとの屈曲度と河川縦断勾配の変化量から河床侵食ポテンシャル(河床崩壊予測値)を算出した。次にGISの中で抽出された各ポテンシャルのポイントデータ値と実際の湿原流入河川(久著呂川)に於ける河川崩壊区間の測量データを演算した。本解析結果を基に土砂生産が確実と考えられる立地条件の閾値を求め,釧路湿原流入河川全域に適用して崩壊地点の広域的予測を実現した。

最終ステップでは,各サブ流域の崩壊地点数をクロス集計し,土砂流入インパクトを個々の水系単位で定量化した。開発技術の特許出願:今回研究代表者が開発したアルゴリズム(湿原流入河川に含まれる全サブ流域ネットワークポリゴンに法則性を持つIDテーブルを持たせ、任意の地点から上流・下流を自動検索する解析技術)については名称「流域内河川区間識別方法」として平成16年4月特許出願を行った。平成16年度中に筆者が筆頭で行った研究実績(口頭発表・誌上発表)は以下のとおりである。(口頭発表)国内2回,海外3回国内誌1報:資源環境対策2004年9月号,Vol.40 No.11,pp41-49(特許)1件:発明代表者亀山哲,【特許名称】流域内河川区間識別方法,平成16年4月26日出願研究最終年度では,湿原を含む流域構造の変化(特に河川内横断構造物による河川ネットワーク分断の実態解明)とそれに起因する水生生物の生息地ポテンシャルの変化に関連する研究を行った。研究の具体的な推進手順は以下の通りである。1)データベースと空間解析モジュールの開発:釧路湿原及び釧路川流域を対象とし,流域分断ポリゴンデータ,河川内横断構造物,水生生物(主に国内の絶滅危惧種を含む淡水魚類全体)等をデジタル化し,さらにGISの処理モジュールを開発した。収集データは全てGIS環境で操作可能とし,ESRIのshpファイル及びGRID形式に統一して研究最終成果物とした。2)空間情報解析及びマッピング:釧路湿原を含む流域全体における水生生物の生息環境を評価し,その経年変化を抽出する目的で,潜在生息適地モデル(Predictive Habitat Model)を開発し,釧路側流域と北海道全体に適応した。実際のモデルの処理過程は次の通りである。水辺の国勢調査における魚類捕獲情報(情報有りor無し)と捕獲地点における生息環境情報(水質=公共用水域水質データ・気象・流域構造・流域分断状況等)を統合する線形回帰モデルを個々の選択種(例えば絶滅危惧種等)毎に決定する。次に推定対象河川における生息地の環境パラメターをデータベースと連動させ,新たな環境アセス候補地点において生息地ポテンシャルを再計算する。第一段階では,現在の生息環境と考えられる2002年データをパラメターとして用い「現在の生物生息状況」を予測した。次にインプットデータを1977年データとし,過去に遡り「25年前の生息地状態」を逆推定した。最終段階においてこの二つの時代(2002年と1977年)の差を同一地点で計算する事により,2次期の間の生物生息ポテンシャル変化の時空間的な解析を可能とした。本システムではモデルの適応時において,対象種毎に,生息ポテンシャルに有意に影響する環境パラメターとその寄与率が統計的に有意に決定される。これらの「生息地再生に必要となる生息地環境パラメター」と「寄与率」は釧路湿原を含む釧路川全流域の対象地点で全て定量化可能である。つまり実際の湿原再生を考慮した場合,対象種を限定した後の再生シナリオとして,再生候補地点と復元パラメター決定さらにその必要改善量の自動計算が実現する。
難治性不眠症の認知科学的基盤の解明とその治療的応用

慢性不眠症における睡眠状態誤認のメカニズムを明らかにするため、睡眠圧の高い条件(高睡眠圧)と睡眠圧の低い条件(低睡眠圧)において、主観的睡眠時間について検討した。被験者は若年健常男性7人(21-23歳)で、実験は室温・湿度・照度・騒音レベルを厳密に統制して4日間に渡って行った。被験者は、第1日目の夕刻に来所し、0時より7時まで適応睡眠をとったあと、第2日朝から第3日昼にかけて28時間の断眠を行った。断眠中は室内の照度は150luxに保ち、運動は控えさせた。第3日の12時より21時まで、高睡眠圧条件での睡眠をとり、第4日の12時より21時まで低睡眠圧条件での睡眠をとった。高睡眠圧および低睡眠圧条件における9時間の睡眠ポリグラフ記録(PSG)を90分ごとの6睡眠区間に分割し、それぞれの区間で睡眠段階2の時に覚醒させ、構造化面接を行い、主観的睡眠時間、主観的時刻、主観的入眠潜時を聴取した。それぞれの面接は照度5lux以下で行い、2分以内に終了させ、直ちに消灯した。PSGは国際判定基準に従って判定し、客観的睡眠時間、入眠潜時を求めた。統計解析には分散分析、Spearman順位相関を用いた。合計84の睡眠区間のうち、高睡眠圧条件の41区間、低睡眠圧条件の38区間で、1エポック以上の睡眠が記録され、この79区間を解析した。主観的睡眠時間は両条件下で客観的睡眠時間より有意に長かった。その他の客観的睡眠指標は条件による違いがなかった.主観的睡眠時間は低睡眠圧条件で高睡眠圧条件より有意に短かかった。主観的睡眠時間は客観的覚醒時間(分)、客観的覚醒時間(%)、面接施行時刻と有意な負の相関を示した。しかし、客観的睡眠時間(分)とは相関を示さなかった。主観的睡眠時間は低睡眠圧条件において高睡眠圧条件より短く、客観的睡眠時間ではなく、客観的覚醒時間と相関を示した。難治性不眠症において、主観的睡眠時間と客観的睡眠時間が乖離し、主観的睡眠時間が極端に短いことが多い。この現象の認知科学的基盤について明らかにするため、健常若年被験者を用いて、睡眠中の時間認知の睡眠経過に伴う変化、脳波的睡眠構造との関連について検討した。健常な睡眠習慣を持っており、不眠を自覚していない男性12名を対象とした。実験に際し、前日の夜間睡眠および、日中の行動量・カロリー摂取量、実験室内の気温・湿度・照度を厳密に統制した。深夜0時より睡眠ポリグラフ検査を開始し、約1時間半ごとに6回、睡眠段階2から覚醒させ、30秒以内に構造化面接を終了させ、主観的時刻を得た。時刻に対する質問に対して注意が向けられ、結果に影響を及ぼさないように、気分、眠気等の質問を加えた。各覚醒試行間の主観的経過時間を実経過時間で除したものを時間認知比とした。各覚醒試行に先立つ睡眠のポリグラフ記録は国際判定基準に従って睡眠段階を判定し、各覚醒試行に先立っ睡眠の諸指標を求めた。さらに、深部体温記録により体温の最低点を求め、生体リズム位相の指標とした。各覚醒試行における時間認知比と、それに先立つ睡眠の諸指標・生体リズム位相との関係を検討した。時間認知比は睡眠の前半と比較して後半では減少した。時間認知比は各覚醒試行に先立つ睡眠の段階3+4出現率と正の相関を、段階REM出現率と負の相関を示した。重回帰分析により、時間認知比に最も影響を与える要因は生体リズム位相であることがわかった。

しかし、客観的睡眠時間(分)とは相関を示さなかった。主観的睡眠時間は低睡眠圧条件において高睡眠圧条件より短く、客観的睡眠時間ではなく、客観的覚醒時間と相関を示した。
歯を試料としたDNA分析による個人識別への応用

本研究は個人識別において極めて有用性の高い歯科的所見と、DNA分析による個人識別技法とを結びつけることにより、確実性の高い個人識別法の確立を最終目的としたものである。1.平成7年度の成果として、amelogenin遺伝子領域を対象としたDNA分析による性別判定において、プライマーの部位を新たに設定し、PCR増幅領域を狭めることに成功した。平成8年度にこの方法を歯牙抽出のDNAに応用したところ、歯髄および歯牙硬組織のいずれを用いても血液試料の場合と同様に明瞭な性別判定が可能であった。平成9年度はさらに増幅領域を狭めたMunnucci et.al(1994)の方法を導入し、より低分子化した乳歯抽出のDNAについても正確な性別判定が可能であった。このように積極的に歯牙抽出DNAの特異性に適合した性別判定を行うことが可能となり、歯牙の個人識別における役割はさらに大きな意味を持ったと思われる。2.個人識別の指標と成り得る遺伝子座位のうち、PCR法による増幅バンドが小さいD4S43 locusを対照としたVNTRの変異について歯牙抽出DNAを用いた検討を試みたところ、血液試料のデータとは異なり、歯牙硬組織においては大きなサイズの増幅バンドは検出できなかった。しかしながら、最もサイズの小さい184bpのバンドについてはいずれの試料からも検出することが可能であり、平成8年度の研究成果で、すでにこの184bpのバンドの中にはサイズの微妙に異なる4種類のバリエーションが存在することが見出された。平成9年度、これを乳歯を含めた歯牙抽出のDNAに応用したところ、全ての試料において184bpのバンドが検出され、さらにシークエンスゲルによる分析により、4種類全てのサイズバリエーションを見出した。このことから低分子化した歯牙DNAを資料としても、このVNTRの変異による個人識別が十分に可能であることが示唆された。本研究は個人識別において極めて有用性の高い歯科的所見と、DNA分析にyru個人識別技法とを結びつけ、より確実性の高い個人識別法の確立を最終目的としたものである。1.個人識別の第一歩とも言える性別判定を、DNA分析法を用いalphid satellite familyの反復配列をtargetとしたPCR法により試みたところ、歯髄および歯牙硬組織より抽出したDNAを試料とした場合でも血液試料の場合と同様target bandの増幅効率は高かった。しかしながら、非特異的なバンドの出現による誤判定の危険性が存在し、特に歯牙硬組織を試料とした場合にその傾向は顕著であった。従って本法を歯牙硬組織のような低分子化したDNAを多く含む試料に応用する場合には、これまで指摘されていなかったが、制限酵素切断による検索が必須であるとの結果を得た。2. Amelogenin遺伝子をtargetとした従来の性別判定法では、歯牙硬組織を試料とした場合、特異的バンドの増幅されない試料が多数存在した。そこでPCR増幅におけるプライマー部位を新たに設定し、400bp以上増幅範囲を狭めることに成功した。前段階の実験として、血液より抽出したDNAを試料とし、これを機械的に分解、低分子化させて本法を応用したところ、明瞭に特異的バンドが検出されたため、歯牙への応用生が高いものと判断された。しかしながら、Amelogenin遺伝子がsingle copy geneであることから、増幅効率についてはさらに検討が必要であると思われる。1.平成7年度の成果として、amelogenin遺伝子領域を対象としたDNA分析による判別判定において、プライマーの部位を新たに設定し、従来の方法に比べPCR増幅領域を狭めることに成功した。

平成8年度においてこの方法を歯牙より抽出したDNAに応用し、その適否について検討したところ、歯髄および歯牙硬組織のいずれから抽出したDNAを用いても、血液試料の場合と同様に明瞭な性別判定が可能であった。これにより従来までの血液中心の方法を単に歯牙に応用するのではなく、より積極的に歯牙抽出DNAの特異性に適合した性別判定を行うことが可能で、歯牙の個人識別における役割はさらに大きな意味を持ったと思われる。今後は本法の適用範囲を乳歯にまで広げ、より低分子化したDNAを対照とした検索を続けていく。2.これまでに報告された個人識別の指標と成り得る遺伝子座位のうち、PCR法による増幅バンドが小さいD4S43 locusを対照としたVNTRの変異について、歯牙抽出DNAを用いた検討を試みたところ、申請者がすでに得ている血液試料のデータとは異なり、歯牙硬組織においては、大きなサイズの増幅バンドは検出することができなかった。しかしながら、14塩基の繰り返し数1と言われる最も小さい184bpのバンドについては、いずれの試料からも検出することが可能であった。すでに申請者は、血液試料から、この184bpのバンドの中にはさらにサイズの微妙に異なる4種類のバリエーションが存在することを見出しており、これを応用すれば、十分に歯牙硬組織抽出のDNAからも、このVNTRの変異による個人識別が可能であることが示唆された。今後さらに、シークエンスゲルによる分析等を試み、変異の再現性を検討していく。本研究は個人識別において極めて有用性の高い歯科的所見と、DNA分析による個人識別技法とを結びつけることにより、確実性の高い個人識別法の確立を最終目的としたものである。1.平成7年度の成果として,amelogenin遺伝子領域を対象としたDNA分析による性別判定において、プライマーの部位を新たに設定し、PCR増幅領域を狭めることに成功した。平成8年度にこの方法を歯牙抽出のDNAにおうようしたところ、歯髄および歯牙硬組織のいずれを用いても血液試料の場合と同様に明瞭な性別判定が可能であった。平成9年度はさらに増幅領域を狭めたMunnucci et.al(1994)の方法を導入し、より低分子化した乳歯抽出したDNAについても正確な性別判定が可能であった。このように積極的に歯牙抽出DNAの特異性に適合した性別判定を行うことが可能となり、歯牙の個人識別における役割はさらに大きな意味を持ったと思われる。2.個人識別の指標と成り得る遺伝子座位のうち、PCR方による増幅バンドが小さいD4S43locusを対照としたVNTRの変異について歯牙抽出DNAを用いた検討を試みたところ、血液試料のデータとは異なり、歯牙硬組織においては大きなサイズの増幅バンドは検出できなかった。しかしながら、最もサイズの小さい184bpのバンドについてはいすれの試料からも検出することが可能であり、平成8年度の研究成果で、すでにこの184bpのバンドの中にはサイズの微妙に異なる4種類のバリエーションが存在することが見出された。
老化細胞制御による肝臓病の新しい治療法の開発

この研究課題では,仮説:“老化細胞を除去すると,原発性胆汁性胆管炎/肝硬変(PBC)は治る"を検証し, PBCの新しい治療法の開発をめざした基礎的研究を行う。また,現在明らかでない,細胞老化の発生状況とPBCの病型やUDCA治療反応性などとの関連の検証もめざしている。今年度は,まず, 1PBC肝組織における細胞老化発生状況と臨床病理学的特徴との関連の検討を行った。老化関連p16INK4a, p21WAF1/Cip1発現(免疫染色)を指標に,老化細胞の分布と種類,胆管病変や線維化など病理所見との関連, PBCの病型やUDCA治療反応性などとの関連を検討した。また, 2培養胆管細胞を用いて,代表的な老化細胞除去薬(Dasatinibなど)を用いて老化胆管細胞除去を試みた。その結果, 1PBCの肝内小型胆管では,病期,胆管炎の活動性に関わらず,対照肝Cの小型胆管より高率に細胞老化を認めた。PBCの細胆管細胞における細胞老化は,病期,胆管消失,線維化,オルセイン陽性顆粒,肝炎活動性と正相関,胆管炎活動性と逆相関を示した。さらに,細胆管細胞でのp16INK4a発現は, UDCA反応性と逆相関を示した。また, 2培養胆管細胞では,全ての老化誘導条件で,代表的な老化細胞除去薬Dasatinib, A-1331852投与は老化細胞除去効果を示した。さらに, Fisetin, Navitoclaxは, Etoposidによる老化誘導細胞で,除去効果を示した(p<0.05)。PBCでは,胆管細胞老化が組織所見,病期, UDCA治療反応性と関連すること,培養胆管細胞において,老化細胞除去薬による老化細胞除去が可能であることが明らかとなった。当初の計画通り, PBC肝組織における細胞老化発生状況と臨床病理学的特徴との関連の検討を行い、胆管細胞老化が組織所見,病期, UDCA治療反応性と関連することを明らかにした。また、培養胆管細胞を用いた検討で、老化細胞除去薬による老化細胞除去が可能であることを確認できた。1老化細胞の発生状況,臨床的項目と老化関連分泌因子(SASP)発現(CCL2,IL-6など),老化細胞特有のアポトーシス耐性経路(SCAPs)関連分子発現などとの関連を検討する。また, Spider SA-β-Gal蛍光標識, HMGB-1発現を用いて,老化細胞の定量的評価を行う。2培養胆管細胞を用いて、老化細胞と正常細胞とのトランスクリプトーム比較解析を行う。SASPs, SCAPsなどについて網羅的に解析し、老化細胞除去の標的となる分子,経路を明らかにする。また、老化細胞除去薬候補のスクリーニング法を確立する。

SASPs, SCAPsなどについて網羅的に解析し、老化細胞除去の標的となる分子,経路を明らかにする。また、老化細胞除去薬候補のスクリーニング法を確立する。初年度である今年度は,次年度以降より多く予算を計上した(今年度:140万;次年度以降100万)。概ね予定通りの研究進捗状況で、最終的に15259円の残高がでた。この残高は次年度の予算に繰り越し、SCAPs関連分子の抗体(約7万)の購入に充てる予定である。
RNA依存RNA合成酵素系による転写シグナルの認識

RNA型動物ウイルスがもつRNA依存RNA合成酵素による転写反応の分子機構を明らかにすることを目的に、非分節マイナス鎖RNAをゲノムにもフセンダイウイルス(HVJ)を用いてin vitro転写系を確立し、その反応を解析して以下の結果を得た。(1)マイナス鎖RNAウイルスは、通常、ウイルス粒子中にウイルスゲノムでコードされるRNA依存RNA合成酵素を含んでおり、in vitroでmRNA合成活性を有する。しかし、HVJの場合、粒子だけでは全く転写活性を示さず、RNA合成が起るためには宿主(HeLa細胞)由来のタンパク質性因子を必要とすることを見出した。(2)in vitroで合成されるRNAのサイズはin vivo mRNAとほぼ同一(18s種および12s種)であり、3'末端にポリA鎖を、5'末端にキャップ構造を有した。また、ゲノムマイナス鎖RNAとのアニーリング実験から、in vitro RNAはプラス鎖であり、その時形成される2重鎖RNAのサイズから、正確な領域からの転写が起っている事が示された。(3)in vitro mRNAのキャップ構造を分析した結果、【m^7】GpppAmが唯一のキャップ構造として検出された。しかも、この構造はin vivo mRNAのキャップと全く同一であった。すなわち、in vitro系でも正しい5'末端修飾が起っており、HVJmRNAのすべての分子種はAで開始していると思われる。又、このAはHVJゲノムにある6つの遺伝子すべての5'上流に隣接する共通配列Rl(UCCCACUUUC)の左端のuに対応するものと推定された。(4)転写促進活性(宿主因子)はHeLa細胞のみならず、他の動物細胞、さらには植物細胞にも存在した。すなわち、HVJは真核細胞に普遍的に存在するタンパク質をその転写系に利用していると思われる。HeLa細胞の因子を部分精製したところ、活性は複数の成分からなり、そのうちの1つは微小管画分に存在した。
発達の最近接領域(ZPD)を踏まえた授業内言語活動における教授行為分析

本研究の2018年度の成果としては、理論的な枠組みの整理(2017年度)を経て、小中高等学校での授業実践の記録と分析を行ったことが第一にあげられる。小中高の授業事例を分析することで、学習者にとってのZPDの創出という点に加えて、教員にとって学習者とのやり取りの中で創出するZPDという観点に加えて、教室でのやり取りと、その後と省察(授業研究)が、教員自身の成長に資する場としてのZPDの創出にもなっていることが、明らかになってきた。これを研究の新たな視点として加えて、授業とその後の省察を、教師自身の成長の場にするために、研究者がのどのような視点で支援を行えばよいのか(教師教育の視点)、その結果えられる教師の成長が、学習者とのやり取りにどのような影響を及ぼすかを関連づけて研究を進めることになった。小学校の英語教育現場は、安定した授業実践の傾向分析の場というよりも、日々変化が必要とされその支援をする場にならざるを得ない状況であり、上記のような、教員の成長の場となっている。教員の成長により、児童たちとのやり取りの質が変化する、またその変化に対して教員が応じようとすることが、次の成長の契機になる場面を観察記録できつつある。中高とは異なる実状のため、研究の視点も中高は学習者をその軸に、小学校では教員を軸に学習者の様子も観察分析するといった具合に、異なる対象に対して、ZPD、活動理論、パフォーマンス心理学等の理論を用いた分析を行っており、その成果をどこまで統合できるかが、今後の課題にもなる。研究成果を論文化できるまでに至っていない状況であるが、これまでデータ分析は進めており、新たな視点での分析を急ぐことで、計画に追いつくことができると考えている。学習者の言語学習上の伸長・成長と、教師の成長を、授業の場面でのやり取りの分析により明らかにする研究方法の開発を試行錯誤もしながら進める一方で、教師の成長研究の成果を生かして、教師の成長を促す支援方法の開発・試行、データ収集をおこなう。本研究「発達の最近接領域(ZPD)を踏まえた授業内言語活動における教授行為分析」実施1年目の実績成果は,以下の2点にまとめられる。1点目は対話的で協働的な言語学習活動開発(タスク)の実践事例収集と理論枠に照らした分類整理である。研究者3名自身の実践に加え,年間を通して,高等学校,中学校での授業実践事例収集(学校訪問による授業観察とフィールドノート,授業関連資料収集とビデオ録画)を行った。当初の計画外ではあるが,小学校英語の教科化推進に伴い,多くの小学校が中高等学校の英語教育とのスムーズな連携を志向し,授業展開方法の共有を求めている実情を踏まえ,小学校での授業実践記録収集も並行して行った。その結果,年間50件の指導者や学校種のことなる授業実践事例を収集することができた。これらの授業実践事例の分析分類は現在進行中で,言語活動(タスク)デザイン時に考慮すべき要素の抽出とそのモデル化を行っている。2点目の実績は30年度に向けての準備でもあるが,研究成果を学会,研究会,教員研修会,出版等の形式での発表に向けて研究者間で継続的に資料情報共有を行っていることである。特に高等学校での実践事例を踏まえた,中高等学校で実践可能な言語活動の事例を,学習指導要領の枠組みでもある「知識および技能」「思考力,判断力,表現力」を養うための活動に分類して,学校教育関係者との事例の共有を図る準備を進めることができた。この成果は30年度に出版できる予定である。これらの研究実績を踏まえ,授業内言語活動(タスク)の実践の促進,一般化を図るべく研究研修会でのワークショップや講演で発表することを今年度の課題とし,同時にその実践事例のより詳細な教師と学習者の行動分析を通して発達の最近説領域(ZPD)を踏まえた教授行為のあり方を理論化する予定である。当初の計画では,中高等学校の授業実践事例を研究課題とする予定であったが,小学校の外国語教育の教科化に伴い,授業展開や学習目標がより近しくなったため,小学校の授業事例の研究も行うことにしたため分析対象が増加し,その分析に時間がかかっているが,おおむね順調に進展している。