hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
高分子集合体間の相互作用力制御に基づいた35nmサイズの微細レジストパターン開発

ギガビットクラスの電子デバイスは、年々縮小化は加速され、2008年には設計ルールが40nmである微細デバイスの実現を目指している。ここで、リソグラフィー技術におけるレジストパターンは、1020nmサイズの高分子集合体の凝集に起因するラインエッジラフネス(LER)および付着性の低下が問題となっている。本研究では、原子間力顕微鏡(AFM)を用いて、個々の高分子集合体間の相互作用力、および凝集形態の直接観察により、レジストパターン内の高分子集合体の凝集性を直接制御することを目的とする。これにより、加工精度の高く、かつ付着性の良好なレジスト材料の設計モデルを構築し、35nmサイズの微小レジストパターンの実現を目指す。研究の実施により、液体メニスカスとレジストパターン変形の関連について解析した。次いで、AFM探針を用いて、レジストパターンを基板から剥離させて、現像プロセスを反映するために、溶液中での付着力を測定した。特に、設備導入した環境制御型電子顕微鏡(ESEM)を用いて、液滴の濡れ挙動を動的に解析することが可能となった。その結果、液体メニスカス形状と高分子集合体クラスのパターン変形との関連が明らかになった。現像時のウェット処理の際のラプラスカの知見に基づき、レジストパターン形成に注目した。最初にラプラスカの低減実験に取り組んだ。まず、2個のパターンの中央にAFM探針を接触させて分離させた。これらの実験から、高分子集合体は、凝集力を有した個別の粒子として取り扱えることを示した。以上の技術を用いて、現像液中で、高分子集合体の凝集挙動を直接解析した。具体的には、レジストパターンを倒壊させて、その断面を詳細に観察した。マニピュレーションできる高分子集合体のサイズは、1030nmの微細サイズから100nmクラスのものまで可能である。本研究期間には、著書6冊、原著論文14報、国際学会発表21件、国内学会発表24件の成果発表を行った。近年、半導体高集積デバイス(LSI)に代表される電子デバイスは、縮小化は加速され、2007年には設計ルールが45nmである微細デバイスの実現を目指している。研究の実施により、2個の高分子集合体間の相互作用力と、測定系のサイズ・距離との相関をDerajaguin近似に基づいて解析した。これにより、様々な集合体間の相互作用力を推定することが可能となった。その結果、高分子集合体は、個々の表面エネルギーにより、数10個単位で凝集していることが分かった。また、集合体間の相互作用力解析により、最初は2個に観察された高分子集合体を10個以上の小さい集合体に細分化することができた。

これらの実験から、高分子集合体は、凝集力を有した個別の粒子として取り扱えることを示した。この高分子集合体のvacancyは、基板界面だけでなくパターン内にも存在することを実験的に明確にした。H17年度には、ESEMを用いて、in-situ観察を行い、ラプラス力が35nmサイズのレジストパターン倒壊に及ぼす影響を明確にする。本研究期間には、原著論文10報、国際学会発表15件、国内学会発表21件の成果発表を行った。ギガビットクラスの電子デバイスは、年々縮小化は加速され、2008年には設計ルールが40nmである微細デバイスの実現を目指している。ここで、リソグラフィー技術におけるレジストパターンは、1020nmサイズの高分子集合体の凝集に起因するラインエッジラフネス(LER)および付着性の低下が問題となっている。本研究では、原子間力顕微鏡(AFM)を用いて、個々の高分子集合体間の相互作用力、および凝集形態の直接観察により、レジストパターン内の高分子集合体の凝集性を直接制御することを目的とする。これにより、加工精度の高く、かつ付着性の良好なレジスト材料の設計モデルを構築し、35nmサイズの微小レジストパターンの実現を目指す。研究の実施により、液体メニスカスとレジストパターン変形の関連について解析した。これにより、様々な集合体間の相互作用力を推定することが可能となった。次いで、AFM探針を用いて、レジストパターンを基板から剥離させて、現像プロセスを反映するために、溶液中での付着力を測定した。特に、設備導入した環境制御型電子顕微鏡(ESEM)を用いて、液滴の濡れ挙動を動的に解析することが可能となった。その結果、液体メニスカス形状と高分子集合体クラスのパターン変形との関連が明らかになった。H18年度には、ESEMを用いて、in-situ観察を行い、ラプラスカが35nmサイズのレジストパターン倒壊に及ぼす影響を明確にする。本研究期間には、原著論文6報、国際学会発表10件、国内学会発表5件の成果発表を行った。現像時のウェット処理の際のラプラス力の知見に基づき、レジストパターン形成に注目した。最初にラプラス力の低減実験に取り組む。まず、2個のパターンの中央にAFM探針を接触させて分離させる。この際の荷重を分離力として測定する。そして、パターンの分離実験の終了後に、各高分子集合体の付着力測定に取り組む。2個の高分子集合体間の相互作用力と、測定系のサイズ・距離との相関をDerajaguin近似に基づいて解析する。これにより、様々な集合体間の相互作用力を推定することが可能となる。以上の技術を用いて、現像液中で、高分子集合体の凝集挙動を直接解析した。具体的には、レジストパターンを倒壊させて、その断面を詳細に観察した。また、残さ、および表面から高分子集合体をマニピュレーションする。このとき、レジストパターン内の様々な箇所から、高分子集合体を選択して取り出すことができる。マニピュレーションできる高分子集合体のサイズは、1030nmの微細サイズから100nmクラスのものまで可能である。
血清シスタチンC濃度を腎機能マーカーとした腎排泄型薬物の投与設計法の開発

従来、腎機能の評価は血清クレアチニン(Scr)値やクレアチニンクリアランス(Ccr)値が汎用され、例えば塩酸バンコマイシン(VCM)やカルボプラチンの用量設定に用いられている。しかし、Ccr値の実測は煩雑であるほか、Scr値は筋肉量の多少によって大きく変動し、これに基づいて算出される予測Ccr値は必ずしも腎機能を正確には反映せず、上記の各種薬剤の投与設計を誤らせる恐れが指摘されている。一方、全身の有核細胞から産生される塩基性低分子タンパク質である血清中のシスタチンC(Cys C)濃度が腎機能の新しいマーカーとして注目され、臨床検査領域では腎障害の指標としての応用が具体化し始めている。しかし、Cys Cを薬物の投与設計に応用する動きは未だみられていない。本研究では医薬品適正使用の観点から、血清Cys C濃度を指標とした新しい投与設計法の構築を試みた。VCMおよびテイコプラニン(TEIC)の血中濃度モニタリング(TDM)用血清検体のうち、ScrやBUNが把握できた114症例由来の359検体を対象とし、ネフェロメトリー法にてCys C濃度を測定し、VCMおよびTEICのクリアランス(CL)との相関性を解析した。その結果、Cys C値は両薬剤のCLと良好な相関性を示し、Ccr値よりも精度良く両薬剤のCLを反映することが示された。Ccr値に基づくMatzkeらのVCM投与間隔設定用ノモグラムにCys C値を当てはめることで実際のVCM投与症例に対する投与設計を試みたところ、この改良ノモグラムの有用性が示唆された。抗がん剤であるカルボプラチンのCL(白金としてのCL)とCys C値との相関性を解析した結果、先述のVCMやTEICの場合と同様に、白金のCLとCys C値との間には予測Ccr値よりも高い相関性が認められ、Cys C値に基づいたカルボプラチンの投与設計の可能性が示唆された。CockcroftとGaultの式などから算出されるクレアチニンクリアランス(予測Ccr)値は腎排泄型薬物の投与設計に汎用されているが、血清クレアチニン(Scr)値自体が筋肉量や腎前性の影響を受けるため、その信憑性が問題となる場合が少なくない。近年、このScr値の欠点を克服できる新しい腎機能マーカーとして血清シスタチンC(Cys C)濃度が注目されているが、腎排泄型薬物の投与設計に応用する動きは未だ見られていない。本年度は、薬物血中濃度モニタリング(TDM)用検体のうち、Scr値およびBUN値も併せて得られた162検体を対象とし、腎排泄型薬物の代表例としてグリコペプチド系抗生物質である塩酸バンコマイシン(VCM)やテイコプラニン(TEIC)に焦点をあて、これらが点滴静注された後の血中濃度推移と血清Cys C濃度との関係をretrospectiveに解析した。対象検体の血清Cys C濃度は0.5-5.4mg/Lに、Scr値は0.1-6.5mg/dLに、血清尿素窒素(BUN)の値は2.0-40.4mg/dLにそれぞれ分散していた。血清Cys C濃度とScr、BUNあるいは予測Ccrとの間には有意な相関性が認められ、同様の傾向はVCMやTEICのトラフ濃度/用量比(L/D比)との間にも見出された。一方、予測Ccr値が150ml/min以上の異常高値を呈する症例では、回帰直線から大きく逸脱する例が少なくないことが判明した。

Cys Cは、細胞内外の環境変化には影響されず常に一定の割合で産生され、糸球体濾過されるという特色をもつ。今回の結果は、血清Cys C濃度が単なる腎機能マーカーとしてのみならず腎排泄型薬物の投与設計に活用でき得ること、特に従来より信憑性が問題とされてきた異常に高い予測Ccr値を呈する症例への投与設計にも、血清Cys C濃度は有用であることが示唆された。CockcroftとGaultの式などから算出されるクレアチニンクリアランス(予測Ccr)値は腎排泄型薬物の投与設計に汎用されているが、血清クレアチニン(Scr)値自体が筋肉量や腎前性の影響を受けるため、その信憑性が問題となる場合が少なくない。近年、このScr値の欠点を克服できる新しい腎機能マーカーとして血清シスタチンC(Cys C)濃度が注目されているが、腎排泄型薬物の投与設計への応用は未だなされていない。昨年度は、薬物血中濃度モニタリング(TDM)用検体のうち、グリコペプチド系抗生物質である塩酸バンコマイシン(VCM)やテイコプラニン(TEIC)に焦点をあて、これらの血中濃度推移と血清Cys C濃度との関係をretrospectiveに解析することで血清Cys C濃度が単なる腎機能マーカーとしてのみならず腎排泄型薬物の投与設計に活用でき得ること、特に従来より信憑性が問題とされてきた異常に高い予測Ccr値を呈する症例への投与設計にも血清Cys C濃度は有用であることをつきとめた。本年度は、抗悪性腫瘍薬として繁用されている腎排泄型のメトトレキサート(MTX)ならびにカルボプラチン(CBDCA)の投与を受けている非小細胞肺がん患者に焦点をあて、MTXおよびCBDCAの血中濃度推移と腎機能の関係を解析し、これら抗悪性腫瘍薬の投与設計に血中Cys C濃度が有用であるか否かを検討した。その結果、MTXならびにCBDCAの血中濃度/用量比(L/D比)とCys C濃度は良好な相関性を示し、これらの相関係数は従来用いられてきた腎機能マーカーであるCcr値とのそれよりも高いことが判明した。以上のことから、血清中Cys C濃度は腎排泄型の抗菌薬ならびに抗悪性腫瘍薬の投与設計に有用であることが示唆された。
経営戦略策定支援のためのシステム・ダイナミックス応用に関する研究

企業の戦略立案のために、過去作成されてきたシステム・ダイナミクスモデルを調べるとともに、実際の経営問題への応用を行いこれまでに作られてきたモデルの応用方法と不足する点について調査を行った。あわせて、方法論的な側面についても研究を進め、システム・ダイナミクスのモデリングを適切に行うための一般性を保ちながらも応用に使いやすいモデル構造の開発を行った。具体的には、実在の企業の協力を得て、実際に起きている問題やこれから解決したいと考えている課題について広く情報を集め、その問題を解くことに(1)システム・ダイナミクスが利用できるか否か、(2)利用できる場合に何をストックとしてフィードバック・ループ構造を抽出する必要があるのか、そして(3)戦略の実装のためにはどんなインタフェイスが必要となるのかを調査した。その結果、(1)と(3)については文献研究と実地での調査の結果は一致し、本研究の目指すアウトプットの一部である文献リストの作成は戦略作成に貢献することが分かった。いっぽうで、(2)については一般論的なことは整理できつつあるが、それがわかりやすく表現されることについてはまだ工夫が必要であると認識している。研究の経過については各学会の研究大会発表や学会誌投稿論文の形でまとめている。企業事例についても、公開の承諾を得られたものについて、順次発表や論文の形で公表してきている。いわゆる「教科書的なモデル」(極度に単純化されていて、他の応用に結びつけるためには深い理解と応用力を読者に要求するようなモデル)ではなく実際の問題を扱ったモデルについて、その構築家庭も含めて報告することによってシステム・ダイナミクスを企業の戦略立案に使うことを目指す研究者と実践家の両方に貢献するものと考えている。学会の研究大会発表や学会誌への論文投稿の形で、研究の成果物を発表している。また、資料の入手も順調に進んでいる。最終年度になるため、特に文献DBの充実と公開についてこれまで以上に力を入れる方針である。また、実在の企業との連携を図り、モデリング技術の更なる容易な利用を進めることと、モデルの効果的な戦略立案とその実装の方法については昨年度から継続して議論を深めていきたい。研究計画の変更や研究を遂行する上での困難な課題等は特にない。1.欧米企業のシステム・ダイナミックスを企業の経営戦略に応用した例について調査した。経営戦略策定において、システム・ダイナミックスを利用している研究者にヒアリングを行い、その導入と利用におけるポイントについての把握を行った。海外のヒアリングにおいては、定型化されたシステム・ダイナミックスの利用プロセスが成功事例につながっていることがわかった。2.日本におけるシステム・ダイナミックス輸入の経緯と受容の過程を調査した。日本におけるシステム・ダイナミックスは、いまだ利用プロセスを軽視する傾向があり、そのため導入を試行した段階で困難に直面する、あるいは導入後に臨まれる成果を得るまえに中止・中断をしている例が多いことが分かった。システム・ダイナミックスの手法の背景にある様々な理論的背景や考え方、問題意識の形成方法について注意が全く払われず、単にシミュレーション用ソフトウェアを導入することによって何らかのインサイトが得られることを期待している例や、いわゆるピンポイント予測を期待していることが多く、着地点の見えない導入をして効果的な利用に失敗している例が多くあった。これらの事実は、研究会のような小規模の会合での座談や、企業訪問時のヒアリングで明らかとなった。3.システム・ダイナミックスの各種ツールについて調査した。日本においてはかつてはSTELLAが多く使われていたが、現在ではVensim PLEが多く使われていることが分かった。ただし、Vensimの利用の理由はPLE版が無料で入手できることにあり、機能によって選択されているというわけではなかった。Vensim PLEは本来用途が限定されているものであり、この点に関する理解不足も散見され、これは今後のシステムダイナミックス利用・普及の問題点になりえる。もっとも作業の比重が高いと想定されていたヒアリングについて、特に訪問してのヒアリングは予定通りで、かつ想定された内容を得ることができたため、順調に進展していると考えている。これに加えて、個別の研究会合や企業訪問によって、形式にとらわれないフリーディスカッションが実施でき、その中で実社会でのシステム・ダイナミックスやシミュレーション利用に関する疑問点が一層明確になった。こうして得られた視点は、最終成果物の方向性やプレゼンテーションの仕方を決めるのに重要な情報になる。日本と他のシステム・ダイナミックス先進国との違いについても仮説を裏付ける情報が得られたため、研究の方向性を大きく変更する必要はなく順調に進展している。データベースは核となる部分について着手できたため、今後の進捗を妨げるものではなく順調といえる。

いっぽうで、(2)については一般論的なことは整理できつつあるが、それがわかりやすく表現されることについてはまだ工夫が必要であると認識している。研究の経過については各学会の研究大会発表や学会誌投稿論文の形でまとめている。企業事例についても、公開の承諾を得られたものについて、順次発表や論文の形で公表してきている。いわゆる「教科書的なモデル」(極度に単純化されていて、他の応用に結びつけるためには深い理解と応用力を読者に要求するようなモデル)ではなく実際の問題を扱ったモデルについて、その構築家庭も含めて報告することによってシステム・ダイナミクスを企業の戦略立案に使うことを目指す研究者と実践家の両方に貢献するものと考えている。学会の研究大会発表や学会誌への論文投稿の形で、研究の成果物を発表している。また、資料の入手も順調に進んでいる。1.システム・ダイナミックスで経営戦略の策定を行うための具体的な手法を構築する。企業で特にシステム・ダイナミックスに関心がないという場合であっても利用できる手順・インタフェイスの開発を行い、実用的なサンドボックスを提示することを当初は計画していたが、サンドボックスという提示よりもテンプレートという形のほうが、実社会においてはイメージされやすいという意見が得られたので、この点について調整をしながら進める。2.研究成果の利用しやすい形での公開を行う。インターネットでの経営戦略のシステム・ダイナミックスによる表現方法の公開を行う。利用者からのフィードバックを得て、随時更新を行う。また、パンフレットなどの利用しやすい媒体で経営戦略の策定のためのシステム・ダイナミックス手法を説明する。勤務先のWWWサーバによる公開を行うにあたり、簡易的なCMSを利用する方法を検討している。ただし、必要な機能によっては、フリーで利用可能なクラウド・サービスも利用の視野に入れており、できるだけ早い時期にその選定は終わり実装に移る。当初、簡便な一覧できる情報での社会への還元を想定していたが、ヒアリングの間に得られた意見では必ずしも簡便さを要求していない情報ニーズが実業界側から多く得られた。簡便なものはあればあったほうが良いものの、日本においては整理された情報がそもそも不足しているので、それを補う網羅的資料やリファレンス・ブックを求める声も多くあった。本研究課題の範囲を超える部分はあるが、将来の研究や社会への還元につながるものであるので、そういった点も視野に入れながら資料を作成する。3.初年度で完了しなかった調査については継続する。データベースの作成が進んでいるものの、コンテンツと操作性の両面において更なる拡充が可能であると考えられる。今後も継続的にこの点を推進する。最終年度になるため、特に文献DBの充実と公開についてこれまで以上に力を入れる方針である。
MR像による声道形状の推定と音声の再合成実験

本研究は,より人間の振る舞いに近い高度な音声合成,音声認識を目指すため,人間の音声生成過程を模擬した声道シミュレータを計算機上に構築することを主目的とする.声道シミュレータは声帯モデル,声道モデル,口唇放射モデルの3つの縦続モデルから構成されており,声帯モデルと声道モデルの相互作用は,フーリエ変換と離散化たたみこみにより両モデルを結合することで再現されている.この声道シミュレータを用いて,合成による分析法により,日本人成人男性が発話した日本語5母音に対して,実音声信号から発話時の声道形状の逆推定を試みた.逆推定により得られた声道形状は,各母音とも,スペクトル包絡およびフォルマントが実音声信号と良好的に一致しているが,推定した声道形状とMRI(磁気共鳴画像)による実測例との比較では、母音によってその適合度合いに差が生じた.しかし,推定された声道形状に基づく合成音声は,十分に各母音と認識可能な品質であり,基本周波数のゆらぎを与えたことにより,より自然で話者の特徴を捉えた合成音声が得らた.声道形状を表すMR像は,フィルムに現像されたアナログ画像をディジタル化して用いているために,声道輪郭が不鮮明な箇所もあり,声道形状を正確に復元しているかどうか問題が若干残されている.この点に関しては,現在,MRシステムから直接ディジタル化された画像を処理できるシステムを構築している.ここでは,定常な母音について取り扱ったが,音声現象を考えると音声の過渡部分に重要な情報が含まれている.本研究をさらに発展させて,子音を含んだ連続音声の合成およびその時の声道形状の推定について実施したい.本研究は,より人間の振る舞いに近い高度な音声合成,音声認識を目指すため,人間の音声生成過程を模擬した声道シミュレータを計算機上に構築することを主目的とする.声道シミュレータは声帯モデル,声道モデル,口唇放射モデルの3つの縦続モデルから構成されており,声帯モデルと声道モデルの相互作用は,フーリエ変換と離散化たたみこみにより両モデルを結合することで再現されている.この声道シミュレータを用いて,合成による分析法により,日本人成人男性が発話した日本語5母音に対して,実音声信号から発話時の声道形状の逆推定を試みた.逆推定により得られた声道形状は,各母音とも,スペクトル包絡およびフォルマントが実音声信号と良好的に一致しているが,推定した声道形状とMRI(磁気共鳴画像)による実測例との比較では、母音によってその適合度合いに差が生じた.しかし,推定された声道形状に基づく合成音声は,十分に各母音と認識可能な品質であり,基本周波数のゆらぎを与えたことにより,より自然で話者の特徴を捉えた合成音声が得らた.声道形状を表すMR像は,フィルムに現像されたアナログ画像をディジタル化して用いているために,声道輪郭が不鮮明な箇所もあり,声道形状を正確に復元しているかどうか問題が若干残されている.この点に関しては,現在,MRシステムから直接ディジタル化された画像を処理できるシステムを構築している.ここでは,定常な母音について取り扱ったが,音声現象を考えると音声の過渡部分に重要な情報が含まれている.本研究をさらに発展させて,子音を含んだ連続音声の合成およびその時の声道形状の推定について実施したい.本年度は,MR(磁気共鳴)画像からの声道の3次元形状の復元,および声道形状から音声信号を合成する声道シミュレータの開発を行なった.発話時のMR像の撮影は,成人男性1名が日本語5母音を発話した時を対象とした.冠状断面図と水平断面図について,スライス厚7mm,スライス間隔5mmのデータを,冠状断面図16枚,水平断面図26枚収集した.得られたMR像は以下の手順を行ない,3次元の声道形状を推定した.(1)しきい値処理を施し,声道を含む小領域を2値化する.(2)冠状断面図と水平断面図からそれぞれ抽出した声道輪郭をスプライン補間し,3次元形状を構成する.この場合,(3)MRの特性上,歯部は不鮮明な画像となり,輪郭を抽出することが困難な場合が多い.ここでは,石膏で歯形を作り,これを形状測定装置で計測・画像化し,MR像から抽出した声道輪郭と合成することで正確な形状を推定する.声道シミュレータは,音源,声道および放射部の3つの部分に分割したものをワークステーション上に作成した.MR像から得られた声道形状を,声道断面積関数として表現する場合,パラメータの数を少なくする必要がある.ここでは前腔部と後腔部を余弦関数で表現し,また狭めの断面積,声門から狭めまでの距離,等のパラメータを6個用いることで5母音を合成することができた.本研究は,主に(1)MR(磁気共鳴)画像による声道の3次元形状の推定,及び(2)音声信号からの声道形状の推定,の2項目について研究を実施した.このうち本年度では,(2)の音声信号からの声道形状の推定について重点的に行なった.これは,ヒトの音声生成過程を模擬した声道シミュレータを計算機上に構築し,「合成による分析(A-b-S)」法を用いて,発話時の声道形状を推定するものである.声道シミュレータの開発は,本研究では重要な課題であり,ここでは損失の挿入が容易な周波数域・時間域の混成であるハイブリッド系を用いた.このシミュレータは,声帯音源(時間域),声道(周波数域)および口唇放射(周波数域)の3つの部分から構成されている.声道部は,長さは等しいが断面積が異なる20個の円筒形を縦続接続したモデルで表した.

MR画像から推定した形状(断面積)を20個の円筒形に対応させて日本語5母音の合成実験を行なった.その結果,母音/a/と/o/の第1フォルマント周波数がそれぞれ約120Hz,70Hzと実音声のそれより低めに見積った.また/i/の第4フォルマントは900Hz程度高めの値を示したが,その他の母音では5%以内の誤差で良好な近似を示した.次に,実音声信号および適当な声道断面積を与えた声道シミュレータの合成音の,それぞれのスペクトルを比較し,誤差が最小になるように声道シミュレータの断面積を調整することで,声道形状を推定する実験を行なった.その結果,/a/,/u/および/e/の第1フォルマント周波数は89%の誤差を示したが,それ以外の母音あるいはフォルマント周波数は3%以内の値を示し,実音声と合成音声では良好なスペクトルの一致を見た.
敗血症時の自然免疫におけるシグナル伝達の分子機構の解明

IL-10は炎症性サイトカイン産生抑制を通して敗血症時の局所および全身性の炎症反応を抑制する。IL-10のシグナル伝達因子はStat3である。まず、IL-10の抗炎症作用が自然免疫担当細胞であるマクロファージ・好中球(食細胞)のStat3によって支配されるかを知るべく、Stat3を食細胞特異的に欠失したマウスに実験的に感染性腹膜炎を誘導し、その後の生体反応を観察した。その結果、マクロファージ・好中球特異的にStat3が欠失したマウスは、過剰なサイトカイン産生による全身性炎症症候群のため敗血症に対し致死性であることが明らかとなり、食細胞に発現するStat3が敗血症時の全身性炎症の制御に中心的な役割を担うことを初めて示した。次に、食細胞による炎症制御機構の詳細を解析した。腹膜炎に関与する食細胞としては、腹腔常在マクロファージと末梢血から動員される浸潤好中球・マクロファージがある。Stat3改変マウスの末梢血白血球を枯渇させた状態でも、炎症局所で高サイトカインを示すことから、炎症制御に関わる細胞は腹腔常在マクロファージである可能性が考えられた。そこで、Stat3欠損常在マクロファージを野生型マウスの腹腔内に移入した状態での炎症反応を観察した。その結果、Stat3+/+腹腔常在マクロファージを移入されたマウスに比べ、Stat3欠損常在マクロファージを移入されたマウスでは、局所の炎症性サイトカインおよび炎症細胞浸潤は有意に増加した。この結果より、炎症反応は腹腔常在マクロファージに発現するStat3によって負に制御されることが初めて示された(投稿中)。従来、マウス種差間での免疫反応の違いが示唆されてきた。そこで、Balb/cマウスとC57BL6マウスに感染性敗血症を誘導し、自然免疫に対する反応を観察した。その結果、C57BL6マウスの免疫反応は細菌排除に働くTh1型有意であること、これにより敗血症抵抗性であることを見いだした。Balb/cマウスはTh2型有意で、敗血症に対し致死性であった。この免疫反応の違いは、食細胞のStat因子活性化の違いによることが示唆された。一方、獲得免疫の観点からTh2ケモカインとされるC10が、自然免疫の局面では食細胞の動員に働くことも示した。IL-10は炎症性サイトカイン産生抑制を通して敗血症時の局所および全身性の炎症反応を抑制すると考えられる。そこで、本年度は、この抗炎症作用が自然免疫の担当細胞であるマクロファージ・好中球(食細胞)によって行われているかどうかを知るべく、Stat3を食細胞特異的に欠失した遺伝子改変マウス(Stat3変異マウス)に実験的に感染性腹膜炎(cecal ligation puncture, CLP)を誘導し、その後の生体反応をコントロールマウスと比較検討した。その結果、Stat3変異マウスはコントロールマウスに比べ、CLP後の生存率は有意に減少した。

腹腔内に細菌を直接投与した場合も同様の結果をえた。CLP後の腹腔局所の炎症浸潤細胞数を観察すると、Stat3変異マウスでは極めて有意な炎症細胞浸潤の増加があり、局所のサイトカイン・ケモカイン産生量は著しく増加していた。Stat3変異マウスでは、CLP後の末梢血中のサイトカイン・ケモカイン産生量にも著しい上昇が確認された。次に、全身炎症の指標である急性期蛋白の推移をみると、Stat3変異マウスでは血中アミロイドAタンパクやフィブリノーゲンの増加、逆に血清アルブミンの低下が観察され、Stat3変異マウスでの全身性炎症反応の悪化が示唆された。そこで、敗血症時の主要な標的臓器である肝臓および腎臓の傷害の程度を観察した。その結果、Stat3変異マウスでの肝傷害、腎傷害は有意に悪化していた。これらの結果から、マクロファージ・好中球特異的にStat3が欠失したマウスは、高サイトカイン血症による全身性炎症症候群により、敗血症に対して高感受性を示す、と考えられた。以上より、食細胞に発現するStat3が、敗血症時の全身性炎症の制御に中心的な役割を担うことを初めて示した。IL-10は炎症性サイトカイン産生抑制を通して敗血症時の局所および全身性の炎症反応を抑制する。IL-10のシグナル伝達因子はStat3である。15年度は、IL-10の抗炎症作用が自然免疫の担当細胞であるマクロファージ・好中球(食細胞)によって行われているかどうかを知るべく、Stat3を食細胞特異的に欠失したStat3改変マウスに実験的に感染性腹膜炎を誘導し、その後の生体反応をコントロールマウスと比較検討した。その結果、マクロファージ・好中球特異的にStat3が欠失したマウスは、高サイトカイン血症による全身性炎症症候群により、敗血症に対して高感受性であることが明らかとなり、食細胞に発現するStat3が、敗血症時の全身性炎症の制御に中心的な役割を担うことを初めて示した。この結果をもとに,16年度は,食細胞による炎症制御機構の詳細を解析した。腹膜炎に関与する食細胞としては,腹腔常在マクロファージと末梢血から動員される浸潤好中球・マクロファージがある。先のStat3改変マウスの末梢血白血球を枯渇させた状態でも,同マウスは炎症局所で高サイトカインを示すことから,炎症制御に関わる細胞は腹腔常在マクロファージである可能性が示唆された。そこで,Stat3欠損常在マクロファージを野生型マウスの腹腔内に移入した状態での炎症反応を観察した。その結果,Stat3+/+腹腔常在マクロファージを移入されたマウスに比べ,Stat3欠損常在マクロファージを移入されたマウスでは,局所の炎症性サイトカインおよび炎症細胞浸潤は有意に増加した。この結果より,炎症反応は腹腔常在マクロファージに発現するStat3によって負に制御されることが初めて示された(投稿中)。一方,Stat3改変マウスにみるTh1サイトカイン産生過剰が,獲得免疫形成に及ぼす影響についても解析し,このマウスでは,Th1型,Th2型の獲得免疫反応はいずれも増幅されることを示した。このメカニズムとして,Stat3欠損マクロファージ/樹状細胞にみる抗原提示細胞の能力の亢進が考えられた(投稿準備中)。
Fuchs角膜内皮変性症のトリプレットリピート伸長が病態に与える影響の解明

Fuchs角膜内皮変性症の主要な変異であるTCF4intron2のCTGリピートを挟む様なguideRNAを持つCRISPR/Cas9とGFPを発現するpX458プラスミドを作成した。不死化角膜内皮細胞株HCEnCにトランスフェクションし、6時間、24時間、48時間のトランスフェクション効率を検討したところ、48時間が22.97%と最も効率が高いことがわかった。2週間の培養後、FACSでsingle cell sortingを行い、培養できたコロニーからDNAを採取し、アガロースゲル電気泳動を行い、各バンドを切り出してSanger sequenceを行ったところ、トランスフェクション細胞ではCTGリピートが見られず、リピート切除の成功を確認できた。この結果を2019年4月の日本眼科学会(東京)及び5月のAssociation for Research in Vision and Ophthalmology(バンクーバー)で発表を行う。ゲノム編集の細胞増殖曲線及び、TCF4の発現に与える影響、Off-target候補の配列に対してのPrimerを作成して、T7E1endonuclease cleavage assayに着手、検討を現在行っている。また、80CTGリピートを持つドナーDNAを作成、精製し現在Knock-in実験を行っているところでもある。また先進ゲノム支援に採択され、Fuchs角膜内皮変性症の患者血液からのDNAの全ゲノムシークエンスによる原因となる変異の探索についてシークエンス及び解析角膜移植時採取した検体及び研究用正常ヒト角膜内皮から抽出したRNA、及びHCEnCとCRISPR/Cas9でリピート切断した細胞のRNAについてのRNAseqについての支援を受ける予定である。4年計画の1年目としては、不死化角膜内皮細胞株に対して、リピートの切断実験が成功し、ノックイン実験の準備、細胞増殖曲線の比較研究、T7E1 endonuclease cleavage assayも順調に進んでいる。また、TCF4のリピートを持つ角膜内皮細胞株を同志社大学よりMTAで入手するメドがたっていることより今後さらなる研究の進展が予想される。更に、先進ゲノム支援に採択され、Fuchs角膜内皮変性症患者の角膜移植時の検体のRNAseqや、患者血液からの全ゲノムシーケンスについて、9月に当院倫理委員会での承認をうけて、検体採取を開始し、DNA検体24検体、RNA検体疾患3検体、正常6検体を集めることができ、解析を依頼している状況であり、初年度の研究の進展状況としては十分と言える。また、Vitroの系でのリピートのknock-in手法が確立すれば、CRISPR/Cas9を用いたリピートを持つマウスの作成を行う予定である。日本人のFuchs角膜内皮変性症の原因の変異として、TCF4のCTGリピート伸長が25%を占めると言う報告があるが、残り75%についてはいまだにわかっておらず、患者血液からのDNA解析によって、Fuchs角膜内皮変性症のTCF4のCTGリピート以外の原因の探索も行う予定である。今回先進ゲノム支援に出している検体の解析結果で、新規変異が見つかった場合はその変異についてのメカニズム解析も行う予定である。

日本人のFuchs角膜内皮変性症の原因の変異として、TCF4のCTGリピート伸長が25%を占めると言う報告があるが、残り75%についてはいまだにわかっておらず、患者血液からのDNA解析によって、Fuchs角膜内皮変性症のTCF4のCTGリピート以外の原因の探索も行う予定である。今回先進ゲノム支援に出している検体の解析結果で、新規変異が見つかった場合はその変異についてのメカニズム解析も行う予定である。
腎細胞癌における新規ＶＨＬ関連蛋白の発見とその分子間相互作用と細胞応答の究明

腎細胞癌では、VHL-HIFとその下流遺伝子のシグナル伝達経路の異常が腎細胞癌の血管新生・増殖のメカニズムの一つと考えられている。我々は、EMT関連蛋白Twist分子に注目し、VHL-HIFと下流遺伝子のシグナル伝達経路にどのような影響を与えているか検討した。プロモーターアッセイでは、Twist蛋白を強発現させるとHIF結合モチーフを組み込んだプロモーター活性が上昇した。ChIPアッセイ、Gel ShiftアッセイにてTwistがVEGFプロモーター領域に結合していることが分かった。これらの結果は、TwistはVHL-HIF経路に関与していることが示唆された。本研究の目的となっているVHL関連タンパクの候補として選定した分子マーカーを用いて腎細胞癌の病理検体における発現の違いを免疫染色で確認した。とくに腎細胞癌のサブタイプにおけるEMTマーカーの発現の違いを検討した。EMTマーカーの一つであるSnailの発現が腎細胞癌のサブタイプである乳頭状腎癌の特にTypeIとTypeIIにおいて発現の差が認められた。この結果は学会で報告した。さらに免疫染色の発現の結果をmRNAレベルで証明するために、免疫染色に用いた病理組織標本よりmRNAを抽出しsemiquantitativePCRを行いmRNAレベルでの発現の相違を確認した。免疫組織染色の結果と同じ傾向を確認することができ、この結果を学会で報告した。VHL-HIFシグナル伝達経路に対するTWISTの関与の検討については、TWISTの転写活性をみるためにレポーターアッセイを行った。HIF binding elementを組み込んだレポーターベクター(Luc-HRE)とTWIST発現ベクターを培養細胞内に共発現させると、TWISTはレポーターベクターの転写活性を亢進させた。この結果を基に、VEGF遺伝子のプロモーターのHREエレメント領域にTWISTが結合しているかChIPアッセイで確認した。この結果、TWISTはVEGFの一部のHREエレメントの周辺領域に結合していることが分かった。この結果を基に平成25年度にはsiRNAを用いてTWISTをノックダウンさせた細胞におけるアッセイや、オリゴDNAにTWISTタンパクが本当に結合するか確認するためのGel shiftアッセイ、TWISTの発現に対する細胞応答を見るためにin vitro血管新生アッセイを行い、これらをまとめて学会報告、論文発表する予定である。本研究課題は、様々な癌細胞で発現している転写因子Twist分子に注目し、この分子のの発現がVHL-HIFと下流遺伝子のシグナル伝達経路にどのような影響を与えるかを解明するものである。助成期間において以下のような実験を遂行した。プロモーターアッセイ:VEGFプロモーター欠損変異ベクターを用いて、低酸素下においてTwistによる転写活性の影響を受ける部位を確認した。ChIPアッセイ:培養細胞の核内において、VEGFのプロモーター領域にTwist蛋白が結合していることを確認し、TwistがHIFと同様に低酸素状況下において新たに結合する領域を確認した。EMSAアッセイ:GST-Twist精製タンパク質がVEGFプロモーター領域のTwist認識配列を含んだ二重鎖オリゴヌクレオチドに結合することをEMSA(Electrophoresis mobility shift assay)により確認した。以上より、Twist蛋白がVEGFプロモーターに結合してVEGFの発現を調節していることを本研究で明らかにすることができた。以上の研究結果は、2014年開催の学会において報告した。また、EMT(epithelial-Mesenchymal-Transition)マーカーを用いた免疫組織染色により、腎癌をはじめとして尿路上皮系の癌組織においてTwist他の蛋白の発現を確認することができた。mRNAレベルにおけるTwistの発現を見るためにsemi-quantitative PCRを行い、腎細胞癌組織においてEMTマーカーのmRNAの発現レベルが増強していることを確認した。以上の研究結果は2013年までに開催された学会で報告した。VHL-HIFとその下流遺伝子VEGFシグナル伝達経路において、Twistの存在がHIFの転写活性に影響することを明らかにでき、腎細胞癌の低酸素下におけるシグナル伝達に新たな機序を加えることができた。以上の結果は英文雑誌に投稿準備中である。今年度は新規採択となった初年度であった。実験の立ち上げを中心に、実験に必要なExpression Vectorのサブクローニング、海外の研究室からのExpression Vectorの入手、必要試薬の購入と実験のセットアップを進めてきた。平成23年度に予定していた実験の立ち上げに時間がかかるため、当初平成24年度以降に計画していた免疫染色の実験を前倒しで進めることとした。当大学病院病理部の協力のもとに、当研究室での免疫染色の実験系を行うために必要な試薬を購入し当大学附属病院病理部で作成依頼した薄切標本を用いて、当研究室で免疫染色してプレパラート固定までの作業を立ち上げた。本研究においてVHL関連タンパクの候補となる分子を選定した。なかでもVHL関連分子として仮定したEMT関連抗体とHMG(High Mobility Group)ファミリー抗体を中心に購入した。

また細胞応答として細胞周期調節因子・細胞接着因子となるマーカーや上皮・間葉系マーカーも同時に購入し、これらを用いて免疫染色を行った。本大学・附属病院に検体として豊富にある膀胱癌の検体を用いて試験的な実験を行ったところ一定の結果が出たためその結果を第21回泌尿器科分子・細胞研究会で報告した。この結果を基に英文誌(査読有)へ投稿するための執筆を開始している。またさらに検体数を増やした結果を平成24年4月開催の日本泌尿器科学会総会で発表する予定である。現在、課題の一つとなっているVHL関連タンパクの候補として選定した分子マーカーを用いて腎細胞癌の病理検体における免疫染色を開始している。この結果に関しては平成24年9月の日本癌学会総会にて報告する予定である。昨年度は実験の立ち上げ、実験に必要なExpression Vectorの作成・クローニング、供与・購入に時間がかかったが、その代わりに免疫染色実験を先行させた。昨年度より引き続き本研究の目的となっているVHL関連タンパクの候補として選定した分子マーカーを用いて、腎細胞癌の病理検体における免疫染色を行った。EMTマーカーの一つであるSnailの発現が腎細胞癌のサブタイプである乳頭状腎癌の特にTypeIとTypeIIにおいて発現の差があることを見つけることができた。また、この免疫染色の発現の結果をさらにmRNAレベルで証明するために免疫染色に用いた病理組織よりmRNAを抽出しsemiquantitativePCRを行いmRNAレベルでの発現の相違を確認し、免疫組織染色の結果と同じ傾向を示すことを確認することができた。これらの発見により、次年度に症例数を増やして病理・臨床パラメーターとの統計学的有意差を確認し、この結果を論文として発表する予定であり、3年間の研究助成期間内に一定の結果を出すことができる予定となり、おおむね順調に進展していると判断した。VHL-HIFシグナル伝達経路に対するTWISTの関与の検討については、昨年度から引き続き、TWISTの転写活性をみるためにレポーターアッセイを行いTWISTはレポーターベクターの転写活性を亢進させることを見出すことができた。この結果を基に、VEGF遺伝子のプロモーターのHREエレメント領域にTWISTが結合しているかChIPアッセイで確認しTWISTはVEGFの一部のHREエレメントの周辺領域に結合していることを見出すことができた。
システム構造化手法を用いた細胞分化メカニズムの解明

平成30年度は、ネットワークグラフの構造に制約条件を入れたネットワークモデルの開発を実施した。特に、生物学的知見等から因果関係の有無が確定している遺伝子間において、その知見を包含したネットワークモデルを構築するため、最適化アルゴリズムを実施する時、共分散行列上で特定の要素に値を持たせたままで数値のみ最適化する方法を開発し、適用した。平成29年度までに、システム構造化手法を適用したネットワークモデル推定手法の開発を行ってきた。開発していく中で、最適化したネットワークモデルが局所解になっている可能性が考えられたので、GAの点変異を利用して最適化アルゴリズムの改良を行った。そのうえで、構築したネットワークモデル構造において、一部を固定したうえでこの最適化アルゴリズムを実施することで、少数の特定条件下で活性化するサブグラフ構造の抽出方法を開発した。具体的には、従来モデル最適化アルゴリズムで使用してきたModification Index(MI)スコアについて、閾値を設定し2段階でモデル構築を行うアルゴリズムを開発した。次に、昨年開発した疑似逆行列をつかった重み行列からの活性化部位の推定手法について、疑似逆行列とSEMで最適化された重み行列の構造類似性について、ハミング距離、相関係数等で比較した。SEMで最適化された重み行列からの差異を計算した。これらの手法をまとめた結果を、国際学会で発表するとともに、開発した手法を実データに適用した結果の論文を作成中である。また、個別の手法については、随時各生物のデータに適用し、論文発表を行った。平成29年度は、これまでに開発したネットワークモデル推定手法を各モデル生物における遺伝子発現プロファイルに適用し、遺伝子ネットワークモデルを構築を行った。さらに、構築したモデル構造を制約条件とした、構造方程式モデリングを基盤とする新規活性化部位推定予測手法を開発を試みた。具体的には、第一に初期モデルの構築手法を新規に開発した。従来、既知の知見からSEMの第一段階である初期モデルの構築してきたが、ベイジアンモデルやブーリアンモデルを遺伝子発現データに適用し、複数のモデル推定手法でロバストな構造を抽出を抽出することで、初期モデルを自動的に生成することを可能にした。次に、特定の条件下で活性化している部位を推定するため、疑似逆行列をつかった重み行列を計算し、SEMで最適化された重み行列からの差異を計算した。特に、3)で構築した包括的遺伝子ネットワークモデルのグラフ構造を制約条件とした最適化では従来のMIスコアによる最適化では、精度が保証されなかったことから、エッジの削除や追加は行わず、エッジの持つ係数を調整することで特定条件下にて測定された遺伝子発現プロファイルと同じパターンの発現プロファイルになるような手法の開発を試みた。さらに、構築した包括的遺伝子ネットワークモデルで推定された各エッジのweightやp値を元にランダムに数値を与えることで、ネットワークを構成する遺伝子群の値を計算し、実測値との差を検定した。初年度が出向でほぼ1年研究できなかったことで、開発予定が当初より多少ずれこんでいるが、残り1年で予定通りになると思われる。当初の予定では想定していなかった箇所に問題がでてきたが、昨年度中にその問題は解決できた。また、当初予定ではこれまでに扱ったことのあるデータでモデル構築を行う予定だったが、公的データの拡充に伴い、扱うことのできるデータ数が増加したので、それに適した解析手法の開発に努めた。最終年度でもあるので、本課題についての成果をまとめる予定である。そのため、まずは1)係数行列間の比較手法の確立2)1)からのグラフ上の活性化部位推定技術の開発の2点を重点的に実施する。上記2点が開発されれば、SEMによって最適化されたネットワーク構造上で、特定の条件下で活性化している部位の推定が可能になる。手法確立ののちは、公的初年度に収集した各種モデル生物の公的データに適用し、適用例について論文発表や国際学会での発表を実施する。初年度(H28年度)に所内出向で約半年間研究活動ができず、初年度分として計上していた予算を平成29年度に繰り越し、使用させていただきました。

そのため、元々平成29年度分として計上していた額以上の予算を配賦いただきました。当初H29年度分の予算相当を使用いたしましたが、初年度分の残りが多かったため、次年度使用額が生じるにいたりました。
電気工学用語標準化の調査研究

現行学術用語集電気工学編の各用語をカード化し、その分類や関連する定義などの情報を付加するとともに、これらの情報をコード化して計算機処理に適するようにした。関連の電気・電子通信・テレビ・照明・情報処理の5学会でこれらの用語を21の分野に分類した。第1次作業では約30%の用語が未分類として残された。これらは、対象分野が複数の領域にかかるもの、基礎的で分類の難しいもの、実務用語で区分の明確でないものなどであったが、電気工学の専門家が用語の定義内容にまで立戻って詳細に調査し、分類を確定した。これらのすべての情報は計算機に入力され、キーインなどに伴う誤りを除くために必要な校正作業が行われた。畜積データはアイウエオ順に全用語出力リストと分類毎に細別した分類出力リストの二つの形で資料にまとめられ、次年度の用語の削除・追加・修正作業のための基礎資料が整えられ、また最終的な入力の校正も可能になった。これらは、各学会の用語の専門家に配布され、検討中である。本年度作業の過程で、現用用語の表現・対応英語などの問題点が明らかにされ、それらの標準化の手法や根拠とすべきデータベースをも確定した。長期的な用語の管理とupdatingを考えると、各分野の専門用語集などの制定の際に自動的に関連用語の見直しと将来の改版に備えた情報の追加修正が行われることが望ましく、そのためのシステム化や用語のコード化についても検討を加えている。
癌特異的Ｔｅｎａｓｃｉｎ－Ｃ　ｉｓｏｆｏｒｍを標的とする癌治療に向けた研究

またヒト膵癌組織においてEGF-like domainを認識する抗体により免疫染色を行ったところ、癌の間質及び基底膜領域において強い発現が確認されたが、癌周囲の正常膵実質では膵管の基底膜領域に弱い発現がみられるのみだった。現在、Tn-CのFibronectin type IIIdomainの一部を認識する抗体でも免疫染色を行っており、各domainの発現パターンと膵癌患者の臨床病理学的因子についての相関性の検討を予定している。本事業が廃止となったため、記入しない。(平成26年10月3日付け)本事業が廃止となったため、記入しない。(平成26年10月3日付け)細胞外基質の一つTenascin-C (Tn-C)は、癌細胞の増殖、浸潤、転移に重要よ役割を菓たすたとが明らかとなっている。しかしこれまでの我々の研究で、イヌの乳腺癌では悪性度に関わらず豊富な発現が認められた。そこで、Tn-C蛋白の産生源となる細胞を同定するため、branched DNA技術を用いた高感度in situ hybridization法と免疫組織化学の二重染色を実施した。その結果、低悪性度のイヌの乳腺癌に発現するTn-C蛋白は筋上皮細胞が産生しており、一方で高悪性度の乳腺癌のTn-C蛋白は主に癌間質の筋線維芽細胞が産生していることが明らかになった。Tn-Cには複数のsplicing isoformが存在するため、これら産生源の異なるTn-C蛋白は違った種類のisoformであり、それぞれが別の機能を有している可能性がある。そこで次に、4種類のヒト膵癌細胞株(PK-1, PK-45H, PK-8, PANC-1)、1種類のヒト膵癌間質線維芽細胞(ACBR-1)、4種類のヒトグリオーマ細胞株(YKG-1, T98G, A172, KG-1-C)において、選択的スプライシング領域を挟むように設計したプライマーによるReverse transcription PCR (RT-PCR)法を実施した。その結果、A172を除くすべての細胞株で、すくなくとも三本のバンドが検出された。PK-1のバンドについてシークエンス解析を行った結果、選択的スプライシング領域内のすべてのドメインが欠落したisoform、すべてのドメインが保持されたisoformに加えて、すべてのドメイン新たなドメインが挿入されたisoformが存在することが明らかになった。(平成26年10月3日付け)ヒトの膵癌細胞株において、3種類のisoformが存在することが確認されたため、今後これら三つのisoformの磯能の違いを調べ、治療標的としての可能性を検討することが可能と考えている。今後はこれら3種類のTn-C isoformの遺伝子発現ベクターを作製し、それぞれを細胞に遺体子導入することで、細胞機能に及ぼす効果を検討する。さらにはshort hairpin RNAを用いてTn-Cの各isoformの発現をノックダウンし、癌の進行を促進するTn-C isoformを標的にした癌治療の可能性について検討を行っていく。また、それぞれのisoformを認識する抗体を用いた免疫組織化学とそれぞれに特徴的なプローブによるin situ hybridizationを行い、ヒト膵癌におけるTn-C isoformの発現と臨床病理学的因子との関係を検討する予定である。