hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
気液界面を通してのスカラ輸送に及ぼす雨滴とウインドシアーの相乗効果

上部に降雨装置を取り付けた風波水槽を用いた実験により,風波気液界面を通しての物質移動が降雨により促進されること,また,降雨およびウインドシアーが共存する場合の物質移動量がそれぞれ単独の物質移動量の足し合わせにより概ね予測可能であることを明らかにした.さらに,単一液滴の気液界面衝突現象に着目した実験と数値計算により,液滴の界面衝突が液側の表面更新渦を生成し,気液界面を通しての物質移動を促進することを明らかにした.上部に降雨装置を取り付けた風波水槽を用いた実験により,風波気液界面を通しての物質移動が降雨により促進されること,また,降雨およびウインドシアーが共存する場合の物質移動量がそれぞれ単独の物質移動量の足し合わせにより概ね予測可能であることを明らかにした.さらに,単一液滴の気液界面衝突現象に着目した実験と数値計算により,液滴の界面衝突が液側の表面更新渦を生成し,気液界面を通しての物質移動を促進することを明らかにした.地球温暖化予測の精度を向上させるうえで,気液界面を通しての物質移動機構を解明することは非常に重要である.本研究では,降雨のみが単独で存在する場合と,降雨と風が共存する場合の2つの場合に対して,熱および物質の輸送に関する室内実験を行うことにより,降雨が気液界面下の乱流構造および気液界面を通してのスカラ輸送に及ぼす影響と,降雨とウインドシアーの相乗効果により気液両相の乱流構造とスカラ輸送機構がどのように変化するかを明らかにすることを目的としている.今年度はまず,単一液滴の衝突実験を行うことにより,液滴の気液界面衝突時における気液間物質移動機構の検討を行った.単一液滴衝突装置は,注射針を一本取り付けたヘッドタンクおよびその下方に設置されたレシーバタンクから構成される.液側流動場の測定にPIVを,溶解したCO2濃度の可視化にLIFを用いた.本研究の結果,液滴の衝突を伴う気液界面を通しての物質移動は液滴の衝突によってつくられる表面更新渦によって促進されること,また,その発生周波数は液滴の運動量で一意に決定されることがわかった.このことは,表面更新渦の概念に従えば,降雨を伴う気液界面を通しての物質移動係数と降雨の運動量フラックスの間に強い相関関係が存在することを示している.また,次年度に行う降雨とウィンドシアーの相乗効果の評価実験のために,降雨発生装置を作成し,風波乱流水槽上部に設置した.降雨発生装置のヘッドタンク底に多数の注射針を取り付けることにより,気液界面上に多数の液滴を落下させることを可能とした.ウィンドシアーと降雨の共存下での実験条件の選定のための予備実験行った結果,降雨により風波気液界面近傍における液流の流速および乱れは大きくなることが明らかになった.また,この影響は低風速時には顕著であるが高風速時には非常に小さいことを明らかにした.地球温暖化予測の精度を向上させるうえで,気液界面を通しての物質移動機構を解明することは非常に重要である.本研究では,降雨のみが単独で存在する場合と,降雨と風が共存する場合の2つの場合に対して,熱および物質の輸送に関する室内実験を行うことにより,降雨が気液界面下の乱流構造および気液界面を通してのスカラ輸送に及ぼす影響と,降雨とウィンドシアーの相乗効果により気液両相の乱流構造とスカラ輸送機構がどのように変化するかを明らかにすることを目的としている.今年度は,昨年度に行った単一液滴の落下衝突実験より得られた知見(1.液滴の衝突を伴う気液界面を通しての物質移動は液滴の衝突によってつくられる表面更新渦によって促進される,2.その発生周波数は液滴の運動量と良好な相関関係にある)が,実験では再現不可能な液滴径が2mm以下という小さな液滴の衝突現象に対しても成り立つかどうかを,レベルセット法を用いた3次元直接数値計算法を用いて検討した.その結果,液滴径が1.2mm2.2mmという小さな液滴の衝突現象に対しても,衝突液滴の運動量と生成される渦輪の平均強度の間には良好な相関関係が成り立つことを明らかにした.また,昨年度に風波乱流水槽上部に設置した降雨発生装置を用いて,雨が降り,風が吹く状態における風波気液界面を通しての二酸化炭素放散量を測定した.その結果,雨が降る場合の物質移動係数は,雨が降らない場合の物質移動係数よりも概ね増大することを明らかにした.これは,風波気液界面を通しての物質移動は降雨により促進されることを示唆している.地球温暖化予測の精度を向上させるうえで,気液界面を通しての物質移動機構を解明することは非常に重要である.本研究では,降雨のみが単独で存在する場合と,降雨と風が共存する場合の2つの場合に対して,物質輸送に関する室内実験を行うことにより,降雨が気液界面下の乱流構造および気液界面を通してのスカラ輸送に及ぼす影響と,降雨とウィンドシアーの相乗効果により気液両相の乱流構造とスカラ輸送機構がどのように変化するかを明らかにすることを目的としている.今年度は,昨年度に行われた降雨中における二酸化炭素ガスの放散実験を通して確立された測定手法を用い,様々な降雨・風速の条件に対して二酸化炭素ガスの放散実験を行った.その結果,降雨による物質移動係数は風の有無によらず,雨滴の鉛直方向運動量フラックスにより良好に相関されることを明らかにした.また,昨年度確立された落下液滴衝突現象に関するLevel-set法をベースにした数値計算手法を用い,実験的に観察が困難な液滴衝突直後の気液界面近傍の流動構造および気液界面を通しての物質輸送機構について検討した.

その結果,径が小さな液滴の自由界面衝突時における運動量と生成される渦輪の強度の間には,径が大きな液滴と同様の相関関係が成立することを明らかにした.さらに,液滴が界面に対して斜めに衝突する場合では,気液界面を通しての物質移動が鉛直衝突時に比べてより促進される可能性を示した.以上,3年の研究期間を通して,単一液滴衝突により引き起こされる気液間物質移動機構を実験・計算研究を行うことにより解明した.さらに,降雨装置を上部に取り付けた風波水槽を用いることにより,風波気液界面を通しての物質移動は降雨により促進されること,そして降雨強度と物質移動係数との相関関係の一端を明らかにした.
情報基盤定量プロテオミクスで全身代謝ネットワークを可視化する

本課題においては、個体レベルでの代謝ネットワークの包括的な理解を目的とし、マウス各臓器における全代謝酵素の絶対量の測定と、その定量値を用いた代謝ネットワーク特性の解析を可能にするための研究を遂行した。その成果として、マウス各臓器を対象として「情報基盤定量プロテオミクス」を行うにあたっての代謝酵素絶対定量方法の最適化や、代謝ネットワークの統合的な解析を可能にする新たな数理科学的方法論である、絶対量ベース代謝システム解析(AMSA)の開発を達成し、マウス各臓器の代謝ネットワークの多面的な解析が可能になった。本課題においては、個体レベルでの代謝ネットワークの包括的な理解を目的とし、マウス各臓器における全代謝酵素の絶対量の測定と、その定量値を用いた代謝ネットワーク特性の解析(可視化)を行う。平成25年度は、本課題目標の達成に向けて、以下の2点について研究を遂行した。1)代謝酵素絶対定量方法の検討マウス各臓器を対象として「情報基盤定量プロテオミクス」を行うにあたり、標準物質としてリコンビナントタンパク質を用いる方法と、合成ペプチドを用いる方法を比較検討し、代謝酵素の定量方針を決定した。計画では全てのマウス代謝酵素のリコンビナントタンパク質を作製して質量分析を行い、定量に必要なペプチド情報を取得することを第1選択としていたが、労力・コスト面において負担が大きすぎたため、ヒトのリコンビナントタンパク質を用いて得られたペプチド情報を基に、マウスを対象とした定量において有効なペプチドを選別し、定量測定に利用する方法を検討した。その結果、合成ペプチドを用いた方法は、労力・コスト面での負担が軽いだけでなく、質量分析時のスループットも非常に高いことが明らかになったことから、標準物質として合成ペプチドを用いた定量方法を採用することとした。2)代謝ネットワーク解析法の開発取得予定の代謝酵素絶対量データと既知のネットワーク構造情報を活用して各臓器の代謝ネットワーク特性を解析するために、新たな数理科学的方法論である絶対量ベース代謝システム解析(Absolute quantity-based metabolic systems analysis (AMSA))を開発した。この方法では、定常状態における代謝酵素と代謝物の絶対量データ、および一部の流束値を用いて、各代謝経路の定常状態流束の推定、各代謝酵素が各代謝物濃度や流束に与える影響の推定(感度解析)、代謝物濃度のダイナミックシミュレーション等が可能である。本成果については現在論文投稿準備を進めている。本課題の胆である代謝ネットワークの包括的理解のための実験的・解析的プラットフォームの構築に向けて、本年度はマウス臓器におけるプロテオミクスの検討と、代謝酵素定量データを用いた数理科学的解析を行った。1)マウス臓器における代謝酵素量計測まずマウス各臓器からのプロテオームサンプル調製・質量分析プロトコールを最適化した。C57BL/6マウスより採取した各臓器(肝臓・筋肉等)を粉砕し、2% SDS緩衝液中にて超音波処理することによりタンパク質抽出液を調製することとした。臓器プロテオームは発現の偏りが大きいため、SDS-PAGE後高発現タンパク質を除去して、さらに12分画することで網羅性と定量性を向上させた。タンパク質定量の網羅性をSpike-in SILAC法で確認したところ、臓器あたり約3000タンパク質が同定され、代謝酵素の多くが定量可能であった。2)代謝ネットワークの数理科学的解析ヒト正常繊維芽細胞TIG-3において情報基盤定量プロテオミクス法で計測した全代謝酵素の定量値を用いて、数理科学的解析(絶対量ベース代謝システム解析)を行った。まずは既知の代謝ネットワーク構造の情報と代謝酵素の検出の有無より、対象細胞における代謝ネットワーク構造を決定した。このネットワーク構造と、全代謝酵素定量値、一部の流束実測値を用いることで、各経路の流束の推定に併せて、各代謝酵素の量的変動が各代謝物濃度や流束に与える影響の推定(感度解析)や、その際の代謝物濃度変化のシミュレーションを行い、各代謝経路の障害が代謝ネットワークの各部位に与える影響を定量的に解析した。本課題において構築された、マウス臓器における代謝酵素の網羅的定量と、取得データを用いた代謝ネットワークの特性解析のためのプラットフォームを用いることで、代謝ネットワークの破綻としての疾病の理解が促進することが期待される。定量生物学各種条件検討および方法論開発は順調に進行し、期間終了までに本課題の目標を達成できる見通しが立った。一部計画を修正したが、課題の実行に際して発生した問題への適切な対処であったと評価している。平成25年度の成果により、実際にマウス臓器において全代謝酵素絶対量を測定し、代謝ネットワークの特性解析を行う準備が整ったことを踏まえて、今後以下2点を遂行する。1)全代謝酵素絶対量の計測マウス各臓器からのプロテオームサンプル調製プロトコールを最適化した後、全代謝酵素の絶対定量を目指して、大規模に「情報基盤定量プロテオミクス」を実施する。具体的には、C57BL/6野生型マウスを用いて、特に肝臓・骨格筋より抽出したタンパク質を酵素消化した試料を調製し、代謝酵素の絶対量を網羅的に測定する。

同時に各臓器の代謝物絶対量の測定も実施する。代謝異常の一例として肥満モデルマウス(レプチン欠損ob/obマウス)についても同様に全代謝酵素と代謝物の絶対量データの取得を行う。2)代謝ネットワークの数理科学的解析1)で取得した各種絶対量データを基に、平成25年度に確立した絶対量ベース代謝システム解析(AMSA)を実施し、各臓器の代謝ネットワーク特性を解析する。まずは、既知の代謝ネットワーク構造と絶対定量時の代謝酵素の検出の有無により、各臓器のネットワーク構造を特定する。その後に、臓器ごとに各代謝経路の定常状態流束と各代謝酵素の感度値を算出することで、各臓器の代謝特性を明らかにする。そして、各臓器の代謝ネットワーク情報を、臓器間の代謝物のやりとりや、ホルモン制御等による相互作用の知見により連結し、「代謝ボディマップ」を作製する。さらに、野生型と肥満モデルマウスの代謝ボディマップを比較することで、肥満状態で変化が見られる部分代謝ネットワークの抽出や特性評価を行う。これらの解析を通して、代謝ネットワークの破綻としての疾病や、個体レベルでの代謝の包括的理解を目指す。
沖縄県宜野湾市大山方言の文法記述および諸方言との比較研究

本研究は大山方言の文法を記述することを目的とした大山方言の総合的研究である。主な成果は以下の3点である。(1)音韻体系および音韻変化の過程を考察し、大山方言における緩やかな口蓋化を指摘した。(2)はだか格を含めて16個の格形式を整理し、その機能を明らかにした。(3)動詞の形態について、動詞活用のタイプ、文末形式、連体形、テンス・アスペクトについて整理した。平成22年度における本研究の具体的内容は以下のとおりである。1)大山方言の臨地調査を実施し、方言資料を収集した。自然会話の聞き取り、録音の他、単語の調査票による調査を実施した。調査票による調査では、使用単語の意味内容において、世代による違いが見られた。たとえば、親族名称において、[su:](父)、[amma:](母)の語形が80代・90代で得られたが、70代では[oto:](父)、[oka:](母)に変化し、[su:]、[amma:]には少しけなしたような意味が付加されるなどの意味内容の変化が見られた。2)文法記述として、まず、格助詞のタイプを整理した。大山方言ではga、nu、ni、sa:i、ci、kai、ndzi、tu:ti、kara、tu、mari、jekaの12個を見いだした。手段表示機能として、sa:i、ciの2種類が得られた。また、kaiは方向、帰着点、場所などの表示機能を有している。これらの詳しい使い分けや機能について、引き続き研究を進めていく。3)実地調査において、文法のみならず、音韻にもいくらかの特徴が見いだされた。大山方言は多くの琉球方言圏で現れる/tci/が/ki/で現れるなど、口蓋化現象の特徴を持つ。しかし一方で、カ行の音については、口蓋化の消失が認められることが話者の説明から得られた。すなわち、古くは/kja・ki・kju・ke・kjo/であったが、大正期頃を境に/ka・ki・ku・ke・ko/の音へと変化したことが指摘される。また、70代を境に音韻の変化が見られる。例えば[tcu]>[tsu]、[dzu]>[dzu][zu]などの変化が見られた。方言研究において、音韻研究は基礎的研究でもあるといえる。文法のみならず、音声・音韻についても平行して記述研究を進める必要があると思われ、今後の研究課題の中に取り入れる。平成23年度における本研究の具体的成果内容は以下のとおりである。1.大山方言の臨地調査を実施し、方言資料を収集した。2.音韻体系の整理をおこなった。前年度の調査において、音韻にもいくらかの特徴が見いだされたので、それを整理した。一般的に沖縄本島の多くの方言では、[ki][gi]の音声を口蓋化させて[tci][dzi]となっているが、大山方言では、[ki][gi]のままで口蓋化をせずに元の音声が保持されている語形も多く見られる。大山方言は周辺地域との音声がやや異なることが従来指摘されてきたが、その一つの原因は軟口蓋音[k][g]における弱い口蓋化であったと言える。口蓋化の弱さゆえに、[ki][gi]を保持することにつながった。また、歯茎音までの口蓋化には至らず、硬口蓋までの口蓋化にとどまったことで[kja][kju]の音声が生まれた。それは大正時代あたりまで保持されたが、戦前には[ka][ku]と直音化が進み、現在の発音に至ったものと考えられる。したがって、拍体系としても、/kja/、kju/は戦前には/ka、/ku/に統合されたと考えられることをまとめた。3.文法記述では、格助詞について、前年度の調査で得られた12個の格に新たに2つの格形式を加え、はだか格とあわせて、ga、nu、Nka、naka、ni、Nzi、uti、uto:ti、sa:i、si、tu、kara、mari、jukaの15個を見いだした。大山方言の格助詞には同機能を持った形式がある。動作・行為が行われる場所を表示するNzi格、uti格、uto:ti格の3つの形式は、機能差の面での違いというよりは、使用場面や話し手の属性、闘き手の属性などが形式の選択に関わっている可能性が考えられる。また、移動手段を表示するkara格とsa:i格・si格とのあいだに自分の力が必要とされるか否かの意識が関わっていることの内省の説明が得られた。名詞と動詞とのつながりのみならず、使用場面や話し手、聞き手の属性を意識した分析の観点や、名詞の性質、動詞の性質のより微細な記述と分類が必要であることが得られた。平成25年度における本研究の具体的成果内容は以下のとおりである。

1.大山方言の臨地調査を実施し、方言資料を収集した。自然会話の聞き取り、絵カードを用いた会話聞き取り調査をおこなった。2.文法記述においては、動詞の形態についての整理を進めた。特に動詞活用の形態について整理を進めることができた。大山方言の動詞においては、強変化動詞、弱変化動詞、不規則変化動詞のタイプ別に整理することができた。一方、比較研究の観点から、津堅島方言の動詞についてみると、強変化動詞A、強変化動詞B、混合変化動詞A、混合変化動詞B、混合変化動詞C、不規則変化動詞にタイプ別され、津堅島方言の動詞変化がやや複雑な傾向にあることが示された。その要因として、大山方言では、混合変化動詞ではki-iN(切る)、koo-iN(買う)のように、連用語幹(基本形)において「母音語幹-iN」となるのに対して、津堅方言では、ki-N(切る)、koo-iN(買う)のように、「母音語幹-N」「母音語幹-iN」のタイプの二つが生じるからである。3.動詞のテンス・アスペクト形式の整理を進めた。1過去形は弱変化タイプではukitaN(起きた)のように非過去(基本形)の語末-iNを-taNに変化させることで過去形式が作られる。一方、強変化タイプ動詞では、語幹末が子音のため、音融合した形として-raN、-caN、-zjaN、-taNが表れる。2継続相非過去は、完成相過去-taNを-tooNというようにaNをooNに変えることによって作られる(ukitaN→ukitooN)。3継続相過去の形式は継続相非過去の語末NをtaNに変えることによって作られる(ukitooN→ukitootaN)。4過去形式には直接体験、目撃性を表示する形式がある。平成23年度における本研究の具体的成果内容は以下のとおりである。また、格助詞Nka、naka、niの、いわゆる標準日本語の「に」助詞相当の助詞の機能差について、津堅島方言との比較研究をおこなった。大山方言におけるNkai、Nka、kai、kaをNkaiの音声的バリエーションとして扱うと、移動の目的地、移動と待機場所、変化結果、動作・行為の対象、対応関係などを表す格助詞として表出する。さらに、存在場所の表示として、上記4つの助詞に加えて、nakaiの形式が併用される。これらは、機能面における使い分けの差異はほとんどみられない。一方、津堅島方言においては、移動の目的表示にはsi、移動と待機場所にはNka、変化結果にはsiとNka、動作・行為の対象にはsiとNka、対応関係にはni、存在場所にはNkaがそれぞれ用いられるなど、機能差が大山方言よりも明確に区別されていることを指摘した。大山方言の文法的特徴は順調に整理できている。一方、予定していた周辺地域での臨地調査がほとんどできておらず、大山の周辺地域における調査研究が進んでいない状況である。調査票の準備は整いつつあるので、今年度は大山地域だけでなく、周辺地域への調査も実施したい。25年度が最終年度であるため、記入しない。大山方言の文法記述を丁寧に、着実にする必要があると判断し、周辺地域での臨地調査より優先して大山方言の記述をまとめることとした。ただし、本研究目的の一つである比較研究は津堅島方言との比較を優先しておこなうこととする。
郡性廃止後の郡域行政問題、郡町村長会から地方事務所まで

科学研究費補助金を得て、郡制廃止一九二三年、郡役所廃止一九二六年以後の、郡域における広域的な地方行政を、研究した結果、概ね次のような結論が得られた。郡役所廃止後、府県知事ー郡長・市長(郡・市長会議)ー町村長(郡町村長会議)という指導・監督ルートは、府県ー市町村長会議というルートにとって代わられた。しかし、郡域の行政問題の自主的な協議機関として郡町村長会が存続し、町村役場吏員の処遇問題、郡域の地方利益の集約、教育会・尚武会・郡農会等の郡域団体の管理運営を協議した。ところが、日米開戦によって、いっそう行政町村が、戦時動員・国策遂行機関に特化して行く中で、地方事務所が、市町村に対する戦時行政の指導監督機関として設置された。地方事務所は、当初、法令上の独自の権限は有しないとされたものの、内務省は、知事の許認可権を地方事務所長が専決(代決)することとし、地方事務所長が、事実上、知事権限を行使することとなった。さらに、戦局の深刻化にともない、一九四四年までに、府県の権限は、代決処分事項の拡張という形で、地方事務所に大幅に委譲され、地方事務所は、戦時行政の「名実共ニ第一線機関」となった。敗戦により、戦後改革の一環として、地方自治法が制定され、府県ー市町村の関係も平等なものとされた。しかし、日本社会全般に対する戦後改革・民主化が、上からの画一的な改革としてなされたために、市町村の改革を指導する機関として、地方事務所が維持され、むしろ、民主化を理由として、いっそうの強化・拡充がなされた。その後、地方事務所が実地に指導する市町村合併によって、市が増加し、町村の行政能力が向上するにつれ、町村の指導機関たる地方事務所は、府県の財政なくもあり、昭和三十年代に、廃止・改組・存続・再配置等の様々な対応が、各都道府県によってとられ、今日におよんでいる。本研究は、平成10年度と11年度の二年間を期間とするものであり、第一年目にあたる本年度は、資料の収集と整理を中心に研究を展開した。まず、設備備品費で購入した各道府県町村会の刊行した団体史の分析から、郡制廃止後も、全国-各府県町村長会の末端は、各府県の郡レベルの町村長会におかれ、対府県および対国に対する利益要求も、先ずは、郡レベルで集約されたものが府県→全国レベルへとあがってゆくことが確認された。また、資料収集旅費等による愛知県の郡町村長会の調査により、郡教育会・郡農会・尚武会などの半官の社会的自治団体の運営も郡町村長会に委ねられていることが明らかとなった。また、国立国会図書館等での資料収集により、各府県の地方事務所設置(昭和17年)に至る中央政府および各府県の動向を明らかにしたいと考えたが、現時点では、十分に資料を得るに至っていない。しかし、一般的には、戦時動員体制の下で町村行政が画一化することにより、地方事務所の主要な任務は、府県知事の時局事務及び法令の定める(主として徴収、挑発、召集)を執行する知事の補助機関とされた。その中で、府県は、地方事務所を経て、各町村会を含む各町村間の連絡調整を超え、事実上の指揮命令を行ったといえ・る。また、戦後の地方自治法施行に伴う、愛知・兵庫・広島各県の地方事務所の設置に関する条例の検討を行った。

その結果、上述の戦時動員のための中間指導機関が、戦後地方自治法の下で、国の機関委任事務が残されたことに対応し、県知事に委任された国の機関委任事務を地域で執行し、また、町村長に委任されたそれ等を、府県が監督するための出先機関として、戦後の地方事務所として位置づけ直されたとの見通しを得ることができた。平成10年度に引き続き、本年度前半は、愛知県立図書館や兵庫県立図書館その他で、旧村(区有)文書の調査・収集を行った。また、地方事務所については、本年度後半にも、愛知、兵庫、広島の各県の中央図書館で各県県庁文書の補充調査も行った。その中で、愛知県立公文書館所蔵の地方事務所関係文書の存在を知り、愛知県における地方事務所の成立を、内務省との往復文書も含めて、詳細に知ることができた。また、愛知、兵庫や広島の各県における『公報』から、地方事務所制度の法令上の変遷と、訓令・条例上の規定に関する各県毎の異動などを発見することができた。なお、上記の資料の検索と複写については、その一部を、博士後期課程院生に補助作業として委託した。各県の町村会関係資料等については、公刊文献を中心に、収集に努め、刊行済みの主要諸県の町村会史を入手することができた。その結果、各県の町村会の活動の大要を把握することができた。しかし、町村会と地方事務所の関係については、これら資料からは、明確にし得なかった。特に、今年度の成果としては、上記愛知県の地方事務所関係文書の複写と解読を進めた結果、内務省は、地方町村会の反対を回避するために、地方事務所を法令上の独自の根拠を有しないものと設置しておきながら、当初から、地方事務所長に知事権限の一部を委譲して、代決・専決処分を認めたこと、さらに、戦局の悪化とともに、代決処分事項の大幅な拡張を行い、地方事務所長の権限を大幅に拡大したこと、を明らかにすることができた。また、戦後改革の中でも、地方事務所は、内容的には民主化・分権化改革を手法的には中央集権的に押し進める、第一千指導機関として、活動したことが明らかになった。以上の成果は、研究成果報告書(冊子体)にまとめられている。
K-ras系シグナルの抑制を目指したlet-7誘導ベクターによる癌遺伝子治療

let-7はmicro RNAで,この発現減弱がヒト癌遺伝子K-rasの蛋白の過剰発現を起こすことが報告された.このK-ras蛋白の過剰発現は,様々なシグナル系を介し,腫瘍増殖及び血管新生を促進する.そこで,我々はlet-7発現誘導ウィルスベクターによる癌遺伝子治療の研究を行ってきた.まず,ヒト癌細胞株におけるlet-7発現を評価するために,様々なヒト癌細胞株におけるlet-7発現を測定し,A549がlet-7保持癌細胞株で,MAC10がlet-7低発現癌細胞株と判定した.我々はlet-7発現誘導ベクターの作製を,shRNA(short hairpin RNA)タイプで行った.let-7配列を含むshRNA配列を,pBApo-CMVベクターに組込み,let-7発現プラスミドベクターMIR09を作製した.このMIR09ベクターをリポフェクション法によりlet-7低発現細胞株MAC10にトランスフェクションしたところ,let-7発現の誘導が良好にみられた.そこで,我々は更let-7発現アデノウィルスベクターの作製も行った.このMIR09ベクターからEcoR Vで「CMV IE promoter+shRNA配列」を切出し,pAxcwitコスミドベクターに組入れ,COS-TPC法によりlet-7発現アデノウィルスベクターlet7-Ad5を作製した.ベクターの構造確認とlet-7の発現誘導を確認後,このlet7-Ad5ベクターを塩化セシウム法で濃縮・精製した.In vitroの遺伝子治療実験として,1et-7低発現癌細胞株MAC10にこのlet7-Ad5ベクターを導入したところ,let-7の発現誘導とMTTアッセイにおける癌細胞増殖抑制効果がみられた.そして,その機序として,let-7誘導によるK-ras蛋白とc-Myc蛋白の発現抑制が示された.現在,他のlet-7低発現癌細胞株を用いて,このlet-7誘導ベクターによる抗腫瘍効果を追加検討中である.更に我々はMAC10細胞をヌードマウスに移植し担癌モデルを作製し,let-7誘導ベクターによるin vivo遺伝子治療実験も行っており,現在ベクターの投与量を含めて追加実験中である.let-7はmicro RNAで,この発現減弱がヒト癌遺伝子K-rasの蛋白の過剰発現を起こすことが報告された.このK-ras蛋白の過剰発現は,様々なシグナル系を介し,腫瘍増殖及び血管新生を促進する.そこで,我々はlet-7発現誘導ウィルスベクターによる癌遺伝子治療の研究を行ってきた.まず,ヒト癌細胞株におけるlet-7発現を評価するために,様々なヒト癌細胞株におけるlet-7発現を測定し,A549がlet-7保持癌細胞株で,MAC10がlet-7低発現癌細胞株と判定した.我々はlet-7発現誘導ベクターの作製を,shRNA(short hairpin RNA)タイプで行った.let-7配列を含むshRNA配列を,pBApo-CMVベクターに組込み,let-7発現プラスミドベクターMIR09を作製した.このMIR09ベクターをリポフェクション法によりlet-7低発現細胞株MAC10にトランスフェクションしたところ,let-7発現の誘導が良好にみられた.そこで,我々は更let-7発現アデノウィルスベクターの作製も行った.このMIR09ベクターからEcoR Vで「CMV IE promoter+shRNA配列」を切出し,pAxcwitコスミドベクターに組入れ,COS-TPC法によりlet-7発現アデノウィルスベクターlet7-Ad5を作製した.ベクターの構造確認とlet-7の発現誘導を確認後,このlet7-Ad5ベクターを塩化セシウム法で濃縮・精製した.In vitroの遺伝子治療実験として,1et-7低発現癌細胞株MAC10にこのlet7-Ad5ベクターを導入したところ,let-7の発現誘導とMTTアッセイにおける癌細胞増殖抑制効果がみられた.そして,その機序として,let-7誘導によるK-ras蛋白とc-Myc蛋白の発現抑制が示された.現在,他のlet-7低発現癌細胞株を用いて,このlet-7誘導ベクターによる抗腫瘍効果を追加検討中である.更に我々はMAC10細胞をヌードマウスに移植し担癌モデルを作製し,let-7誘導ベクターによるin vivo遺伝子治療実験も行っており,現在ベクターの投与量を含めて追加実験中である.let-7はmicro RNA(miRNA)で,この発現減弱が,ヒト癌遺伝子K-rasの蛋白の過剰発現を起こすことが報告された.このK-ras蛋白の過剰発現は,様々なシグナル系を介し,腫瘍増殖及び血管新生を促進する.これまでの我々の研究からヒト肺癌ではK-rasの遺伝子変異は少なく,このlet-7発現減弱によるK-rasシグナルの増強が深く関わっていることが示唆された.そこで,我々はlet-7発現誘導ウィルスベクターによる癌遺伝子治療の研究を行っている.まず,ヒト癌細胞株におけるlet-7発現を評価するために,TaqMan MicroRNA Reverse Transcription KitでmiRNAを含むcDNAを作製し,TaqMan MicroRNA Assayによるreal-time quantitative RT-PCRで,様々なヒト癌細胞株におけるlet-7発現を測定した.我々はlet-7発現誘導ウィルスベクターの作製を,shRNA(short hairpin RNA)タイプで行った.let-7のセンス配列とループ配列,アンチセンス配列を含むshRNA配列を,miRNA発現用ベクターであるpBApo-CMVベクターに組込み,let-7発現プラスミドベクターを作製した.このlet-7発現

プラスミドベクターをリポフェクション法によりlet-7低発現細胞株にトランスフェクションしたところ,real-time quantitative RT-PCRで,let-7発現の誘導が良好にみられた.そこで,我々は更に良好な誘導を目指し,let-7発現アデノウィルスベクターの作製も行った.このlet-7発現プラスミドベクターからEcoRVでCMV IE promoter+shRNA配列+poly Aシグナルを切り出し,pAxcwitコスミドベクターに組み入れた.そして,COS-TPC法により,非増殖型のlet-7発現アデノウィルスベクターを作製した.その結果,このlet-7発現アデノウィルスベクターにより,細胞株におけるlet-7の良好な発現誘導がみられた.我々はこのlet-7発現誘導アデノウィルスベクターの大量培養と濃縮・精製を行い,担癌ヌードマウスによる遺伝子治療実験を追加検討中である.let-7はmicro RNAで、この発現減弱がヒト癌遺伝子K-rasの蛋白の過剰発現を起こすことが報告された。このK-ras蛋白の過剰発現は、様々なシグナル系を介し、腫瘍増殖及び血管新生を促進する。そこで、我々はlet-7発現誘導ウィルスベクターによる癌遺伝子治療の研究を行ってきた、まず、ヒト癌細胞株におけるlet-7発現を評価するために、様々なヒト癌細胞株におけるlet-7発現を測定し、A549がlet-7保持癌細胞株で、MAC10がlet-7低発現癌細胞株と判定した。我々はlet-7発現誘導ベクターの作製を、shRNA(short hairpin RNA)タイプで行った。let-7配列を含むshRNA配列を、pBApo-CMVベクターに組込み、let-7発現プラスミドベクターMIRO9を作製した。このMIRO9ベクターをリポフェクション法によりlet-7低発現細胞株MAC10にトランスフェクションしたところ、let-7発現の誘導が良好にみられた。そこで、我々は更let-7発現アデノウィルスベクターの作製も行った。このMIRO9ベクターからEcoR Vで「CMV IE promoter+shRNA配列」を切出し、pAxcwitコスミドベクターに組入れ、COS-TPC法によりlet-7発現アデノウィルスベクターlet7-Ad5を作製した。ベクターの構造確認とlet-7の発現誘導を確認後、このlet7-Ad5ベクターを塩化セシウム法で濃縮・精製した。In vitroの遺伝子治療実験として、let-7低発現癌細胞株MAC10にこのlet7-Ad5ベクターを導入したところ、let-7の発現誘導とMTTアッセイにおける癌細胞増殖抑制効果がみられた。
アルファ粒子計測用負イオン源開発のための基礎過程の解明

H^-、He^-、Li^-の負イオン源開発は、DTプラズマ中のα粒子計測を実現する上で重要と考えられており、本研究ではそのシステム設計に必要なこれら負イオン生成に関するイオン源内の基礎過程について実験的及び理論的研究を行った。He^-については表面生成型負イオン源を用いてどの程度のHe^-が生成可能か調査した。この時セシウム蒸気を供給して負イオン生成表面の仕事関数を低下させる。負イオン生成時にこの仕事関数を評価するため、Arレーザーや色素レーザーを入射して光電子電流を測定するシステムを開発し、生成表面状態を最適化した上でHe^-生成量を求めた。その結果負イオン生成効率は水素放電時に生成されるH^-の千分の一以下であり、α粒子計測用イオン源として実用化するのはかなり困難である事が判明した。しかし今回の研究のために開発した仕事関数のモニター法は、プラズマ電位測定用の重イオン源等、他の表面生成型負イオン源の開発にも応用する事ができる。Li^-については、表面生成、体積生成の二方式のイオン源を開発し、それぞれの生成量と特性を調査した。表面生成では、Li金属上にセシウムや酸素を吸着させて低仕事関数面を作り、ここからスパッタリングでLi^-を生成した。同時にO^-/H^-等の不純物イオンもかなり生成されるものの、仕事関数の調整によりα粒子計測に必要となる程度のLi^-電流が可能である事が判明した。Li^-の体積生成型イオン源については、放電電力7Wに対し約7μA/cm^2の電流密度が得られ、放電電力の増大、放電容器の内壁温度の増加により更に増大の可能性がある。しかも不純物負イオン量が極めて少なく、α粒子計測への適用の可能性は充分ある。今回の研究により表面法と体積法による負イオン生成にかかわる重要因子を明らかにする事ができ、今後の計測用負イオン開発が期待される。
長鎖癌抗原ペプチドと免疫抑制解除の併用による強力な癌免疫療法の開発

健常人とがん患者より、CTLとTh1細胞を誘導できる腫瘍関連抗原由来の短鎖および長鎖ペプチドで、頻度が高い複数のHLA分子により提示されるものを多数同定した。またHLA発現マウスに長鎖ペプチドを免疫し、内包された短鎖ペプチドに特異的なCTLを交差抗原提示により誘導できた。担がんマウスとがん患者では、骨髄球系細胞が産生するIL-6と可溶性IL-6受容体が増加し、IL-6シグナルによりTh1細胞分化とCTLを介した腫瘍免疫が減弱するが、抗IL-6抗体投与により腫瘍免疫を回復できた。腫瘍関連抗原の能動免疫とIL-6シグナル抑制を併用する、新しいがん免疫療法の開発に資する研究成果を得た。本年度の研究では、新たな癌抗原として口腔・食道癌、肺癌および膵臓癌ほかに高頻度に高発現する癌精巣抗原IMP3、肝細胞癌に高頻度に高発現する癌胎児性抗原GPC3、ならびに膀胱癌に高頻度に高発現する癌精巣抗原DEPDC1を対象として、細胞傷害性T細胞(CTL)とCD4+タイプ1ヘルパーT細胞(Th1)細胞を、共に誘導することにより強力な腫瘍免疫を誘導できる、長鎖癌抗原ペプチドの同定を試みた。HLAクラスII分子(HLA-II)に結合するペプチドを推定する最新のアルゴリズムで、候補ペプチドを探索して合成し、健常人あるいはペプチドワクチン接種前後の口腔癌または膀胱癌患者の末梢血単核細胞(PBMC)を刺激して、Th1細胞を誘導する長鎖ペプチドと抗原提示に関与するHLA-IIを同定した。その結果、日本人で頻度が高い複数のHLA-IIに結合して、主にTh1細胞を誘導できる長鎖ペプチドを、IMP3とGPC3については複数同定できた。またDEPDC1についても、同様の長鎖ペプチドの同定を開始した。さらに長鎖ペプチドを樹状細胞に負荷した際に、短鎖CTLエピトープが産生され、CTLを活性化するものを同定した。また一部の長鎖ペプチド特異的なTh1細胞が、in vitroにおいてCTLの抗腫瘍免疫応答を増強できることを確認した。平成28年度以降に使用する予定である、樹状細胞内に取り込まれた長鎖ペプチドをエンドソームから細胞質へ送達するための、pH感受性ポリマー修飾リポソームに包埋された長鎖癌抗原ペプチドを作製した。先駆的実験により特定の長鎖ペプチドについては、その樹状細胞への負荷により、期待どおりに長鎖ペプチドに内包された短鎖ペプチドに特異的なCTLを誘導する(Cross presentation)効率が、増強することを確認できた。当初の研究目標である、従来の研究によりHLA-A2あるいはHLA-A24分子に結合して提示されることにより、CTLを誘導できる癌抗原由来の短鎖ペプチドで、口腔癌あるいは肝細胞癌の患者への免疫療法の臨床研究が奏功した、癌精巣抗原IMP3あるいは癌胎児性抗原GPC3について、日本人で頻度が高い複数のHLAクラスII分子に結合して、主にTh1細胞を誘導できる長鎖ペプチドを複数同定できた。また、これらの長鎖ペプチドの一部は、樹状細胞に負荷した後にCTLをも活性化できた。さらに膀胱癌に高率に高発現するがん精巣抗原であるDEPDC1についても、同様の解析を開始することができ、平成28年度には成果が期待できる。また当初先駆的研究として計画していた、pH感受性ポリマーで修飾されたリポソームに包埋された長鎖癌抗原ペプチドを作製し、これを樹状細胞に負荷することにより、期待どおりにCTL誘導効率が著明に増強することも確認できた。したがって当初の研究計画は、おおむね順調に進展しており、年次計画の目標を十分に達成できていると判断した。これまでの研究により、がん細胞に高頻度に高発現するが、免疫系から隔離された精巣や胎児期の臓器以外の正常成人臓器にはほとんど発現しない、がん抗原を複数同定した。これらのがん抗原に由来しHLAクラス1分子に結合してがん細胞表面に発現し、これを認識したキラーT細胞(CTL)に、がん細胞の死滅を誘導できる短鎖ペプチドで、がん患者への投与によりCTLを誘導できたがん抗原を厳選した。本年度の研究成果として、これらのがん抗原について、日本人で頻度が高い複数のHLAクラスII分子に結合して、CTLの誘導を増強できるヘルパーT(Th)細胞に認識され、同細胞を活性化できる合成長鎖ペプチドを多数同定した。さらに合成がん抗原長鎖ペプチドで誘導したTh細胞が、がん抗原タンパク質を取り込ませた樹状細胞に反応することを確認した。また、これらの長鎖ペプチドの中から、樹状細胞に取り込まれ分解されて出来た短鎖ペプチドにより、CTLをも同時に活性化できるものを、従来よりさらに多数同定した。このような現象を、複数の健常人とがん患者の血液サンプルを用いて観察できた。また試験管内での培養系にT細胞の免疫抑制を解除するPD-1に対する抗体を添加することにより、CTLとTh1細胞のがん抗原に対する免疫反応が増強されることを観察した。さらにCD14陽性のヒト単球に、細胞増殖を促進あるいは細胞死を抑制する遺伝子を導入して発現させ、増殖特性が優れたミエロイド系細胞株(CD14-ML)を樹立して、同細胞株より大量の樹状細胞(CD14-ML-DC)を分化誘導する方法を開発した。このCD14-ML-DCに上記の長鎖がん抗原ペプチドを負荷し、ヒト末梢血T細胞を刺激したところ、効率良くCTLおよびTh細胞を誘導できた。以上の研究成果は、同定したがん抗原長鎖ペプチドの、がん免疫療法への応用の可能性を支持するものである。

既に我々が過去の研究により同定した、がん免疫療法の臨床応用に適した性質を有する、新規がん抗原(がん精巣抗原とがん胎児性抗原)について、当初計画していた以下の研究を遂行し成果を得ることが出来た。1)日本人で頻度が高いHLAクラスII分子により提示され、Th細胞を活性化できる長鎖ペプチドを多数同定した。2)誘導されたTh細胞がCTLの誘導を増強できることを確認した。3)CTLが認識する短鎖ペプチドを内包する、がん抗原長鎖ペプチドでTh細胞のみならずCTLをも同時に活性化できるものを多数同定した。4)試験管内でがん抗原ペプチドに対するCTL/Thの免疫応答が、抗PD-1抗体により増強されることを観察した。5)ヒト単球に遺伝子操作を加えることにより、がん抗原長鎖ペプチドの負荷により、CTLとTh細胞を誘導できる樹状細胞を大量に作成する方法を開発した。当初予定していた、低pH感受性ポリマーで修飾されたリポソームに包埋された長鎖癌抗原ペプチドが、樹状細胞においてCTLを活性化する短鎖ペプチドの産生効率を、増強できるか否か検討する実験については、リポソーム作成を担当する共同研究者の逝去により実現できなかった。平成29年度には、これを検討する準備が整っているので、これを実施したい。既に我々は、新規がん精巣抗原に由来し日本人で頻度が高いHLAクラスII分子により提示され、Th細胞を活性化できる長鎖ペプチドを多数同定して来た。このような長鎖ペプチドのうち、CTLが認識する短鎖ペプチドを内包するものについて、これらを単にヒト樹状細胞に負荷しても、CTLへの短鎖ペプチドのCross presentationは観察されなかった。そこで内容物をエンドソームから細胞質へ効率良く送達できる、低pH感受性ポリマーで修飾されたリポソームに長鎖ペプチドを包埋し、これを樹状細胞に負荷してCross presentationの有無を検討した。しかし、従来の長鎖ペプチドでは奏功したが、今回対象とした長鎖ペプチドについては、残念ながら効果は認められなかった。我々は従来の研究により、担がんマウスにおいて増加するミエロイド系細胞が産生するIL-6が、がん抗原特異的Th1細胞の分化を抑制することにより、CTLを介した腫瘍免疫を抑制することを発見した。今年度は担がんマウスのミエロイド系細胞の膜表面より遊離した、IL-6受容体(sIL-6R)とIL-6複合体を介したシグナルに起因する、CD4+T細胞におけるC-Mafの発現増加がTh1細胞の分化を抑制することを明らかにした。さらに口腔癌患者では健常人と比較して、血清IL-6およびsIL-6Rの濃度が増加し、血清sIL-6Rが高値を示す患者では、ミエロイド系細胞表面におけるIL-6Rの発現が減少していることを観察した。また口腔癌患者のCD14+ミエロイド系細胞が分泌するIL-6/sIL-6Rが、ヒトCD4+T細胞からのTh1細胞の分化誘導をc-Mafの発現増強を介して、抑制していることを発見した。つまり、がん患者でも担がんマウスと同様の機序により、IL-6/sIL-6Rシグナルを介してTh1細胞の分化が抑制されていることを明らかにした。
成人期女性の生きがい形成プロセス：キャリア意識のタイプ別での実証研究

本研究の目的は,成人期女性が生きがい感を形成する心理プロセスを,これまでに構築してきた時間と状況の2次元からみた生きがい形成の価値過程モデル(生きがい形成モデル)を適用して,キャリア意識の観点から明らかにすることである。上記の目的を達成するために,平成30年度においては,下記3つの観点から研究を行った。(1)生きがい感・幸福感に関する基礎的文献研究:生きがい感・幸福感について,欧米の考え方とわが国の考え方について文献を収集し,文献の解析を行い,日本人の生きがい感や幸福感の特徴を検討した。また,最近では,日本語の生きがいは海外からも注目され,多くのマスメディアで取り上げられている(New York Post, 2017; BBC, 2017; the New York Times, 2018)。その現状をweb上で調査し,書籍・資料等を収集し,分析した。(2)成人期女性の生きがいに関する文献研究:生きがい形成モデルを成人期女性に適用するために,成人期女性の生きがい感・幸福感や仕事や子育て環境に関する文献収集や事例収集を行い,文献や事例の解析や評価を行った。(3)成人期女性のキャリア意識に関する文献研究:成人期女性のキャリア意識について,その現状や希望がどうなっているか,現状や希望の背景要因に関する文献収集や事例収集を行い,文献や事例の解析や評価を行った。また,キャリア意識やキャリア形成の理論に関する文献収集や事例収集を行い,成人期女性のキャリア意識と生きがい感の関係を検討した。成人期女性の生きがい感・幸福感やキャリア意識に関する文献や事例の解析や評価を行った。これらをもとに,成人期女性の生きがい感とキャリア意識に関するウェブ調査の計画を立案中である。成人期女性の生きがい感とキャリア意識に関するウェブ調査を行う。調査データに対して統計解析を行い,研究発表を行う。次年度使用額が生じた理由は,一部の統計ソフトの購入の検討に時間がかかっているからである。使用計画は,統計ソフトの購入,文献研究,調査研究,学会等の研究集会への参加にかかわる費用が中心となる。
有機結晶環境下での絶対不斉合成と動的分子挙動解析

本研究は有機分子の結晶化の特性を利用した新現象の開発と反応解析を目的とした。結晶中の分子は運動が制限されており,トポケミカル則に従って反応するため溶液中とは異なる反応挙動を示す。その中で最も興味ある現象は,アキラルな基質の形成する不斉結晶のキラリティーだけを不斉源として用いる絶対不斉反応であり,生命の起源にも関連している。我々はアキラルな2-ベンゾイル安息香酸アミドが他の有機化合物とは比較にならないほど高い割合で不斉結晶を形成する事を見いだした。窒素原子上がフェニル基の場合には,固相光反応によりアミノ基の転移を伴い高光学純度のフタリドが合成できた。ベンジル基の場合には分子内カルボニル基による遠隔水素引き抜き反応が進行した。本反応について置換基と不斉結晶との関係,温度や転化率と光学純度との関係,結晶構造解析,結晶中での反応機構解析などの詳細を明らかにした。さらにこの概念を展開し,嵩高い置換基を有するアキラルな鎖状イミドが不斉結晶を形成し,低温で溶解後もキラルな分子配座を保持していることを見いだした。-30°C以下の溶液中の光反応により光学活性な双環性オキセタンを生成し,nブチルリチウムとの反応では,ブチル付加体とカルボニル基の還元体が光学活性体として得られた。本反応は結晶化により記録された分子不斉情報を均一系の不斉合成へと展開できることを示した初めての例であり今後の発展が期待できる。結晶の特性を利用した次の2つのテーマについて研究した。第1は,アキラルな分子が形成する不斉結晶場を不斉源とする新しい絶対不斉合成を開拓した。第2として,結晶化により発現したキラリティを溶液系での反応に応用し,新しい不斉合成の概念を確立した。すなわち結晶化により形成された不斉な分子環境を均一系へと導き,溶液中での絶対不斉合成を達成できた事である。配座変換や結合回転にある程度の活性化自由エネルギーを必要とする分子,すなわち室温付近では自由に回転が起こり,低温ではその変換が抑制できるような分子を構築した。このような分子は室温ではアキラルであるが不斉結晶を形成した場合,その結晶を低温で溶解後もキラリティを保つことができる。低温状態を保持したまま反応させ,新たな不斉中心を構築することにより,光学活性体を合成することができる。窒素原子上の芳香環に嵩高い置換基を特つ鎖状のイミド光学不活性であるが,C-N結合の回転阻害により軸不斉となる。置換墓を種々変えてイミドを合成し結晶構造を解析したところ数種の基質が不斉結晶を形成した。これらの結晶を用いた固相光反応では,単一の立体配置の光学活性体が得られた。これらの基質はアリール基の嵩高い置換基の影響で自由な配座変換が押さえられている。すなわち,プロキラルなイミドの不斉結晶を溶解すると,その光学活性な配座が保持されている可能性がある。-20°Cでは溶解直後にラセミ化してしまう。しかしこれらの基質を-60°Cで溶解し,その温度にて光照射したところ,生成物は2つの立体異性体の混合物であるが,それぞれが光学活性体として得られた。これらの分子が低温溶液中でも不斉環境を保持し,結晶化により記録された不斉環境を溶液系へ伝達,さらに,不斉合成も達成できることを明らかにした。

窒素原子上がフェニル基の場合には,固相光反応によりアミノ基の転移を伴い高光学純度のフタリドが合成できた。ベンジル基の場合には分子内カルボニル基による遠隔水素引き抜き反応が進行した。本反応について置換基と不斉結晶との関係,温度や転化率と光学純度との関係,結晶構造解析,結晶中での反応機構解析などの詳細を明らかにした。さらにこの概念を展開し,嵩高い置換基を有するアキラルな鎖状イミドが不斉結晶を形成し,低温で溶解後もキラルな分子配座を保持していることを見いだした。-30°C以下の溶液中の光反応により光学活性な双環性オキセタンを生成し,nブチルリチウムとの反応では,ブチル付加体とカルボニル基の還元体が光学活性体として得られた。本反応は結晶化により記録された分子不斉情報を均一系の不斉合成へと展開できることを示した初めての例であり今後の発展が期待できる。