hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
星細胞機能制御による新しい肝癌術後管理と再発予防の研究

高度進行肝細胞癌の肝切除術後に、肝不全徴候を示した2例に腸瘻より大量に注入(経腸投与)、または経口的投与(内服)により、意識改善、ビリルビン値の低下に効果があった。また、活動性慢性肝炎の肝細胞癌患者の術後に投与し、肝機能の改善傾向を認めた。本患者に対する肝癌再発抑制効果は経過観察中である。II動物実験:抗酸化作用のある生理活性物資、チオレドキシンの星細胞活性化抑制効果を、チオレドキシン強発現のTg mouseで調べた。チオアセトアミド肝硬変モデルでは、Tg mouseではWT mouseに比べて肝線維化の程度が軽微であることが明らかとなった。また、星細胞活性化抑制作用のあるROCK/Rho kinase阻害剤Y27632がエンドトキシンラットで、肝微小循環の改善を通じて肝機能保護効果を有することが判明した。肝切除術後の周術期におけるN-アセチルシステイン(以下NAC)の効果を検討した。NACはアセチルシステイン内服液17.6%「センジュ」(千寿製薬(株)、日本標準商品分類番号873929、承認番号21400AM00471)を用いた。本製剤は、アセトアミノフェン中毒解毒剤にて2002年6月に薬価収載となっている。症例は53歳男性で横隔膜浸潤、下大静脈腫瘍栓を伴う巨大肝細胞癌を後区域に認めた。手術中、右肝静脈下大静脈腫瘍栓による肝うつ血が高度であったため止血コントロール困難で、術中ショック状態におちいったが、無事後区域切除術(横隔膜合併切除術)を終了した。術後2日目より全身状態悪化と同時に黄疸出現し、その後T-Bil 32mg/dlにまで上昇、肝不全に陥った。この症例に対して血漿交換を施行した後、インフォームドコンセントを得てNACの腸ろうからの大量経腸栄養療法を行った。NACの投与方法は、初回投与140mg/Kg、4時間ごとに70mg/Kgを72時間継続投与した。1クール施行した後、T-Bil 15-20mg/dlにまで減少、肝不全症状の軽快認めたため、投与量を減量し2クールをさらに追加した。肝不全症状・全身症状はさらに軽快し、2ヵ月後には10mg/dlまで改善した。以上より肝切除術後の肝不全症例に対して有効である可能性が認められ、さらに検討することにしている。その他にウイルスによる慢性肝炎患者にて肝酵素(GOT GPT)が上昇している症例(3例)に対してNAC経口投与による肝酵素変動の効果を検討した。現在、経過観察中であるが肝酵素値の低下を認めており、活動性慢性肝硬変患者に対しても有効である可能性が考えられた。今後さらに検討する予定である。
価数と軌道に由来した非磁性量子相転移と臨界現象

私は今年度、0.6 Kで軌道秩序を示すPrV2Al20の磁歪/熱膨張測定および米国国立高磁場研究所にて磁気抵抗およびホール効果の測定を行った。磁歪/熱膨張計は前年度に希釈冷凍機に取り付けて、最低温度100 mKまで測定ができるようにした。磁歪/熱膨張測定の結果、0.6 Kの相転移を観測し、その変化量が非常に小さいことから、電子軌道が互い違いに整列する"反強"的な軌道秩序であることを見出した。そして軌道秩序が壊れる臨界磁場に向かって、熱膨張係数が発散的に増大し、臨界磁場で符号が変わることを観測した。この結果を熱力学的に考えると、臨界磁場に向かってエントロピーが増大することに対応する。これは我々のグループで主張している、磁場誘起の軌道秩序の量子臨界揺らぎの存在をサポートする結果である。また我々は、まだ未解明だった[110]方向に磁場を印加した場合の磁気相図に関して、最大31 Tまでの磁気抵抗測定を行った。そして15 T-24 Tの領域に新たな軌道秩序相を見出し、24 Tより高磁場で軌道秩序が閉じることを明らかにした。さらに我々は軌道秩序相の数値シミュレーションを行い、実際に24 T付近で軌道秩序相が閉じることを再現した。これにより、前年度以前の結果と合わせて、PrV2Al20の軌道秩序の異方的な磁気相図の全容を明らかにした。最後にPrV2Al20のホール効果測定を行い、キャリア数が通常金属に近い値を示すことを明らかにした。これは通常金属とは大きく異なる電気抵抗率の温度依存性の起源が、半金属的なバンドからくるものではなく、我々が考えている四極子による近藤効果である可能性を支持する。29年度が最終年度であるため、記入しない。本研究員は、今年度、軌道(四極子)秩序を示すPrV2Al20、価数揺らぎを示す重い電子系alpha-YbAlB4に対して、新たな量子相転移を発見するため、磁場中での抵抗(磁気抵抗効果)を調べた。これらの物質はいずれも磁場と強く結び付く磁気モーメントを持たないため、磁場で相転移を誘起するためには非常に高い磁場が必要である。そこで、本研究員は最高で45 T (Tesla)の定常磁場を印加することができる、米国国立高磁場研究所(National High Magnetic Field Lab.)に向かい実験を行った。単結晶試料の合成やその評価は日本の物性研究所の所属研究室で行った。まず、0.6 K以下で四極子秩序を示す立方晶PrV2Al20に関して、その磁気相図が異方的である可能性が指摘されていたが、その全容は明らかにされていなかった。そこで、立方晶の主軸三方向([100], [110], [111])に平行な磁場中での磁気抵抗測定を行い、磁気相図を完成させた。その磁気相図は磁場に対して非常に異方的で、その臨界磁場が25 T ([100])> 16 T ([110])> 11 T ([111])であることを明らかにした。一方、alpha-YbAlB4に関しては、磁気抵抗において、比較的小さな周波数(F = 10 T)の量子振動(シュブニコフドハース振動)を示すことが知られていた。高磁場での磁気抵抗測定の結果、この量子振動が、約10 T - 15 Tの高磁場において、連続的に消失することを明らかにした。これはランダウ準位の分裂によるフェルミ面の消失(量子極限の発現)を示す。これは重い電子系化合物では初めての発見であると考えられる。本研究員は非磁性の磁場誘起の量子相転移を示す、alpha-YbAlB4とPrV2Al20に対して、超高磁場での磁気抵抗測定を行った。本研究はもともと、次年度に行うことを計画していたが、試料の準備が順調に行ったために今年度に行うことが出来た。具体的に得られた実験結果に関しても順調で、PrV2Al20に関しては主軸三方向([100], [110], [111])すべての磁気抵抗測定を行うことが出来たため、四極子相図の完成に至った。またalpha-YbAlB4に関しても、予期していなかった10 T近傍での量子極限を見出したことから、こちらに関しても予想以上に順調である。特別研究員は0.6 Kで軌道(四極子)秩序を示す重い電子化合物PrV2Al20および、強い価数揺動状態にあるYb系重い電子化合物alpha-YbAlB4、そして室温で巨大なホール効果を示す反強磁性体Mn3Snの高磁場下での研究を進めている。軌道(四極子)秩序を示す重い電子系PrV2Al20に関しては米国国立高磁場研究所にて6月初旬の高磁場下(最大磁場31 Tesla)での磁気抵抗測定、およびその後の日本の所属研究室での低磁場(9 Tesla以下)での測定により、前年度の結果と合わせて、立方晶の主軸方向である[100]および[110]の相図を完成させた。また、その[100]方向の磁気相図を数値シミュレーションによって再現することに成功した。さらに[100]方向には12 T以上で非常に巨大な磁気抵抗の変化を伴う高磁場相が現れることが知られている。

この高磁場相内で、磁気抵抗の異方性が顕著に増大することを見出し、反強四極子秩序が将来的にメモリデバイス等の応用にも役立つことを指摘した。さらに研究員はalpha-YbAlB4とMn3SnのdHvAを測定するためにHeliox VT (最低温度250 mK)および最近導入された高磁場マグネット(最大磁場16 T)を用いてキャパシタンス法による磁気トルクの測定系を立ち上げた。磁気トルク測定は磁化の絶対値を得られない反面、非常に高精度であるため、量子振動を見るのに適している。この装置を用いて、Mn3Snに対する予備測定を行い、高磁場研で実験を行うための試料の選定を進めている。研究員は磁気トルクに加えて、磁気抵抗の測定系も立ち上げた。磁気抵抗は同時に三つの試料が測定可能である。そしてalpha-YbAlB4で観測されている量子振動(SdH振動)を確認した。特別研究員は例年米国国立高磁場研究所で高磁場実験を行っているが、そのマシンタイムは貴重で、年に2-3週間が限度である。一方、特別研究員は最近研究室に導入された高磁場マグネットを用いて、低温での測定環境を立ち上げた。これは高磁場研究所の一部の施設と同程度の極限環境である。それゆえ、貴重なマグネットタイムに頼ることなく研究室内で存分に実験ができるようになった。さらに、より高磁場が必要な場合でも、研究室で予備的な実験を行い、十分に試料を選別したのちに高磁場研へ行くことが可能になった。これは次年度の研究に大いに役立つと考えられる。特にMn3Snに関しては、試料依存性が強く、たくさんの試料を測定、評価することは重要である。さらに特別研究員は立方晶の四極子秩序系PrV2Al20の主軸全方位30Teslaまでの磁気抵抗効果の実験データをそろえ、その異方的な相図を完成させた。そして、その結果を十分に解釈し、論文を投稿する直前まで至っている。以上の理由からおおむね順調に進展しているといえる。私は今年度、0.6 Kで軌道秩序を示すPrV2Al20の磁歪/熱膨張測定および米国国立高磁場研究所にて磁気抵抗およびホール効果の測定を行った。磁歪/熱膨張計は前年度に希釈冷凍機に取り付けて、最低温度100 mKまで測定ができるようにした。磁歪/熱膨張測定の結果、0.6 Kの相転移を観測し、その変化量が非常に小さいことから、電子軌道が互い違いに整列する"反強"的な軌道秩序であることを見出した。そして軌道秩序が壊れる臨界磁場に向かって、熱膨張係数が発散的に増大し、臨界磁場で符号が変わることを観測した。この結果を熱力学的に考えると、臨界磁場に向かってエントロピーが増大することに対応する。これは我々のグループで主張している、磁場誘起の軌道秩序の量子臨界揺らぎの存在をサポートする結果である。また我々は、まだ未解明だった[110]方向に磁場を印加した場合の磁気相図に関して、最大31 Tまでの磁気抵抗測定を行った。そして15 T-24 Tの領域に新たな軌道秩序相を見出し、24 Tより高磁場で軌道秩序が閉じることを明らかにした。さらに我々は軌道秩序相の数値シミュレーションを行い、実際に24 T付近で軌道秩序相が閉じることを再現した。これにより、前年度以前の結果と合わせて、PrV2Al20の軌道秩序の異方的な磁気相図の全容を明らかにした。最後にPrV2Al20のホール効果測定を行い、キャリア数が通常金属に近い値を示すことを明らかにした。これは通常金属とは大きく異なる電気抵抗率の温度依存性の起源が、半金属的なバンドからくるものではなく、我々が考えている四極子による近藤効果である可能性を支持する。
糸球体疾患の進展に関わる糸球体基底膜障害と尿中バイオマーカーの開発

今年度は、糸球体疾患の診断のために行われた腎生検の臨床検体を用いて、糸球体疾患の進展における糸球体基底膜障害をIV型コラーゲンのα鎖の変化や低真空走査電顕(LV-SEM)を用いて超微形態学的に検討した。昨年度に解析したIgA腎症に加え、今年度は幼少時期より血尿を認め、症例によっては高齢期に慢性腎不全にまで進行する係蹄基底膜IV型コラーゲンの遺伝的異常による菲薄基底膜病の糸球体基底膜障害の解析を行った。係蹄基底膜は菲薄化し、IV型コラーゲンα5鎖の不規則な減弱と、α2鎖が増強する糸球体基底膜の質的な変化や、低真空走査電顕(LV-SEM)による糸球体基底膜の削り取り像や裂孔の存在などの超微形態学的変化を確認した。しかし、菲薄基底膜病では係蹄基底膜障害が腎機能の低下に直接的には関連しておらず、他の腎疾患と同様に動脈硬化と荒廃化糸球体の頻度や尿細管間質障害の程度が腎機能と関連していた。菲薄基底膜病は良性家族性血尿とも言われている様に、その疾患そのものでは末期腎不全に進展することは少なく、一般的に知られている腎機能悪化因子によって他の糸球体疾患と同様に腎機能が低下していることを明らかにした。この結果は、小児期に発見されることの多い菲薄基底膜病の進展機序を考察する上で臨床的意義は非常に大きいと考えている。動物実験では、腎臓の発生過程での係蹄基底膜の発達、可逆性のThy-1実験腎炎や不可逆性のanti-GBM実験腎炎での係蹄基底膜の障害や障害からの回復過程、immune complex型の膜性腎症における係蹄基底膜障害について経時的にIV型コラーゲンα鎖による質的な変化や、透過電顕や低真空走査電顕(LV-SEM)による糸球体基底膜の超微形態所見について検討している。また、動物実験モデルでは蓄尿による尿検体を集め、尿中のIV型コラーゲンのα鎖の濃度測定の準備を進めている。今年度は、昨年度に行った本邦で最も多い糸球体腎炎であるIgA腎症の係蹄障害の検討に続いて、遺伝的な係蹄基底膜障害による菲薄基底膜病の係蹄障害と腎機能の悪化との関連について検討し、菲薄基底膜病ではIgA腎症に類似した係蹄基底膜障害所見がみられるが、この係蹄基底膜障害のみでは、高齢期になっても末期腎不全にまで進展する症例が少ないことを明らかにした(Clin Exp Nephrol 2019;23:638-649)。菲薄基底膜病でも高齢期に末期腎不全にまで進展する症例もあるが、これらには動脈硬化や荒廃化糸球体の頻度や尿細管間質障害の程度が関連していた。これらは他の腎疾患にも認められる共通した腎機能の増悪因子であり、菲薄基底膜病に特異的な因子ではない。これらの結果は小児期から発症する菲薄基底膜病の進展を考える上で臨床的意義は大きいと考える。動物実験系でも、腎臓の発生過程での係蹄基底膜の発達、可逆性のThy-1実験腎炎や不可逆性のanti-GBM実験腎炎での係蹄基底膜の障害や障害からの回復過程、immune complex型の膜性腎症における係蹄基底膜障害についての糸球体基底膜障害の検討が概ね順調に進んでいる。動物実験系では経時的な病理形態的な係蹄基底膜障害所見の観察に加え、蓄尿による尿検体も集積しており、尿中のIV型コラーゲンα鎖の濃度の測定の準備も進めている。臨床の腎生検検体や動物実験モデルの腎検体での係蹄基底膜障害の観察の成果も上がりつつあり、また尿検体の集積も進んでおり、本研究の進捗状況としては概ね順調に研究が進んでいると考えている。本研究は、糸球体疾患の係蹄基底膜障害をIV型コラーゲンのα鎖の変化により質的に、また、透過電顕および低真空走査電顕(LV-SEM)により超微形態学的に明らかにする。また、尿中のIV型コラーゲンのα3, α4, α5鎖の濃度を測定し糸球体基底膜障害の評価法を確立し、係蹄基底膜障害に関する尿中の新規バイオマーカーの開発を目指している。現在までに臨床検体を用いた検討でIgA腎症と菲薄基底膜病の係蹄障害についての病理学的な解析は論文にして報告し、IV型コラーゲンα5鎖の免疫染色やLV-SEMを用いて超微形態的に観察することにより糸球体基底膜障害を質的に超微形態的に評価することが可能であること示してきた。今後、臨床の糸球体疾患と動物実験系での糸球体疾患での比較検討(動物実験では経時的な変化を解析することが可能になる)を進める。臨床検体と動物実験系での係蹄基底膜障害を比較検討する。臨床と動物実験で比較することが可能な糸球体疾患として膜性腎症、anti-GBM腎炎、ANCA関連血管炎を想定している。臨床的な膜性腎症とラット膜性腎症モデルであるHeymann腎炎モデルを用いて、臨床症例とラット実験系でのanti-GBM腎炎とANCA関連血管炎を用いて、係蹄壁に沈着したimmune complexと係蹄基底膜障害や、anti-GBM抗体による係蹄障害、NETsや好中球による係蹄障害の質的な変化や超微形態的変化の関連を検討する。

動物実験モデルでは、経時的に蓄尿により尿検体を集め、尿中のIV型コラーゲンのα3, α4, α5鎖の濃度を測定し、尿を用いた糸球体基底膜障害の評価法の確立を目指す。そして、尿中IV型コラーゲンのα鎖の濃度と、病理組織所見との関連を確認する。本研究は、糸球体疾患の係蹄基底膜障害をIV型コラーゲンのα鎖の変化により質的に、また、透過電顕および低真空走査電顕(LV-SEM)により超微形態学的に明らかにすることを目的にしている。そして、尿中のIV型コラーゲンのα3, α4, α5鎖の濃度を測定し、尿の解析による糸球体基底膜障害の評価法を確立し、また糸球体疾患で増加する尿中蛋白を網羅的に検討し、係蹄基底膜障害に関する尿中の新規バイオマーカーの開発を目指している。今年度は、糸球体疾患の診断のために行われた腎生検の臨床検体を用いて、糸球体疾患の進展における糸球体基底膜障害を、IV型コラーゲンのα鎖の免疫染色や透過電顕やLV-SEMを用いて検討した。はじめに、本邦で最も頻度が高い糸球体疾患であるIgA腎症の糸球体基底膜障害を観察し、IV型コラーゲンα5鎖は減弱し不連続となりα2鎖が増強する糸球体基底膜の質的な変化、透過電顕による係蹄基底膜の菲薄化や融解像、LV-SEMによる糸球体基底膜の削り取り像や裂孔の存在を確認した。IgA腎症の係蹄基底膜障害の評価には、IV型コラーゲンのα鎖の変化や、透過電顕やLV-SEMによる解析が有効であることを確認した。さらに血尿を特徴とする菲薄基底膜病においても、透過電顕ではびまん性の係蹄基底膜の菲薄化を認めることを疾患診断基準としているが、菲薄基底膜病の係蹄基底膜にもIV型コラーゲンα5鎖の減弱やLV-SEMによる小孔などの障害像が認められた。現在、係蹄壁にimmune complexが沈着することにより発症・進展する膜性腎症における係蹄基底膜障害の経時的変化を、ラット膜性腎症モデルを用いて検討をはじめている。臨床の腎生検検体や動物実験モデルの腎検体を用いて、IV型コラーゲンのα5鎖とα2鎖の免疫染色により係蹄基底膜の質的変化を、透過電顕や低真空走査電顕(LV-SEM)により超微形態学的障害所見を観察し、各疾患や病期に特異的な糸球体基底膜障害の特徴を検討している。今年度は、本邦で最も頻度が多いIgA腎症や、血尿を特徴としている菲薄基底膜病において、診断のために行われた腎生検の病理検体を用いて係蹄基底膜障害を検討した。透過電顕では、IgA腎症は不規則な係蹄基底膜の菲薄化やmembranolysisが、菲薄基底膜病はびまん性の係蹄基底膜の菲薄化が認められた。凍結検体を用いたIV型コラーゲンα鎖の免疫染色では、IgA腎症と菲薄基底膜病では係蹄基底膜のα5鎖の不規則な減弱やα2鎖の増強が認められ、係蹄基底膜の質的な変化の検討が可能であることを確認した。腎生検の凍結標本やパラフィン固定標本を用いて、切片の厚さの3μmほどではあるがLV-SEMを用いることで係蹄基底膜の3次元的な超微形態学的観察が可能であることを確認した。光顕PAM染色標本のLV-SEMで、通常では平滑に観察される糸球体基底膜が、IgA腎症や菲薄基底膜病では粗造化や小孔などが認められ、係蹄基底膜の超微形態的障害像を確認している。腎生検病理検体を用いて、糸球体係蹄基底膜障害をIV型コラーゲンα5鎖やα2鎖の免疫染色やLV-SEMを用いて評価することが可能である基礎データが集まりつつある。今後に進める腎生検病理検体や各種実験的腎疾患動物モデルの腎組織を用いた係蹄基底膜障害の特徴の検討の基盤ができていることからは、本研究の進捗状況としては概ね順調に研究が行われていると考えている。今年度は、糸球体疾患の診断のために行われた腎生検の臨床検体を用いて、糸球体疾患の進展における糸球体基底膜障害をIV型コラーゲンのα鎖の変化や低真空走査電顕(LV-SEM)を用いて超微形態学的に検討した。
糖鎖と増殖・分化

本研究では、本年度は主として以下の研究成果を得た:(1)血球系の増殖・分化制御に関わる生物活性を担う糖脂質糖鎖の生合成においては、最終ステップの糖転移酵素や中間代謝に与える糖転移酵素群よりも、コア構造の振分けに与る糖転移酵素がダイナミックにコントロールされ、最終産物発現が制御されていることを実証した。今年度はヒトBリンパ球において、sialyl-Le^x構造発現とこれを介した細胞接着がコア構造生合成に与る糖転移酵素Core2 GlcNAc transferase (C2GnT)によって制御されていることを示した(斎藤)。(2)ヒトデ卵ゼリー層中の先体反応誘起物質の糖鎖構造を解明し、精子頭部の受容体の単離を追求している。ウニ卵のガングリオシド含量は高く、ガングリオシドM5が主要成分である。ウニ胚発生に伴いM5等の含量は殆ど変化しないが、遊泳胞胚では小胞体、卵黄顆粒以外に、細胞外マトリックスにもM5が存在していることを明らかにし、ガングリオシドが形態形成なども寄与していることを示唆した(星)。(3)スフィンゴ脂質阻害剤による神経系ガングリオシドの機能解析、アセチルCoAトランスポーターの遺伝子単離、スフィンゴ脂質合成変異株による機能解析を行った(平林)。(4)ガングリオシドGD3発生に伴う発現の変化が、少なくともGD3合成酵素遺伝子の発現レベルによって制御を受けていること、神経分化にともなうGD3合成酵素活性の増加はレチノイン酸によるGD3合成酵素遺伝子の誘導によると考えられること、癌遺伝子srcファミリーのチロシンキナーゼLynがガングリオシドによる神経分化のシグナル伝達に関わっている可能性、等を示した(佐内)。(5)ラット小脳形成期において時間的に厳密な制御を受けてい0-アセチルジジアロガングリオシド発現に与える0-Ac-GD3合成酵素のcDNAクローニングに成功した。系統的に作製してガングリオシド抗体応用の一環として、初代培養神経細胞における糖脂質糖鎖の機能解析を試みた(田井)。癌関連糖脂質GD1aがインターロイキン3(IL-3)の情報伝達に関与していることを示唆する結果を得た。IL-3依存性NFS-60細胞ではIL-3刺激と同様に、GD1aのみで170、110、86kDの蛋白のリン酸化が引き起こされた(斉藤)。ウニ卵の主要ガングリオシドは細胞内膜系に存在すること、さらに、哺乳動物卵母細胞内膜系にもガングリオシドGD1aが存在していた。受精時の先体反応を誘起する物質(ARIS)の糖鎖構造の解析し、精子頭部の一部に局在する個とを明らかにした(星)。alpha系列ガングリオシドGM1n,CD1alpha、コリン作動性ニユーロン特異的ガングリオシド、アルカリ不安定なポリシアロガングリオシド等の中枢神経系に於ける局在を免疫化学的に明らかにした(平林)。ホモロジークーニングにより、5種類のシアル酸転移酵素のクローンを得、その一つはGaINAcalpha2,6-シアル酸転移酵素のcDNAであることが判明した(辻)。ガングリオシドはカルジュリン(CaM)依存性酵素のCBS(Ca^<2+>/CaMに結合する部位)に結合することによって酵素を活性化し、CLBS(CBSと相補的に結合しているCaMに似た性質を持つた部位)に結合することで酵素活性を直接に、Ca^<2+>/CaMに結合することで間接的に阻害することが明らかになつた(山形)。牛乳腺で産生される糖蛋白質の糖鎖のN-アセチルガラクトサミニル化は、細胞の機能分化と密接に繋がっていることが判明した(古川清)。小脳ではガングリオシドGM3はグリア系細胞に、GD3に顆粒細胞層と白質に、GD2は顆粒細胞層に特異的に発現していることが免疫組織学的に証明できた。またガラクトシルセラミドとスルフアチドの発現はミエリンに限局し、GM4はアストログリアに特異的に観察された(田井)。β-ガラクトシド:シアル酸転移酵素(α2,6ST)は、ヒトBリンパ球系細胞の分化・成熟ステージ特異的に発現誘導されること、またヒト骨髄系細胞においても分化誘導に従ってα2,6STのmRNA及び酵素活性が発現誘導されることを見出した。さらに糖蛋白糖鎖の末端シアル酸化だけでなく、糖脂質の末端シアル酸化にも関与していることを遺伝子過剰発現系を用いて明らかにした(斎藤)。ホヤ、ヒトデ、ウニの卵・精子結合における糖蛋白、糖脂質の特異的分子構造及び機能について解析した。精子受容体活性の発現には、卵黄膜糖蛋白糖鎖の非還元末端L-フコース残基並びに硫酸基の存在が必須であること、先体反応誘起物質の主糖鎖フコイダン構造並びに3糖構造を明らかにした。またラットの性周期、卵胞発達に伴うガングリオシド発現変動を解析した(星)。神経系の機能を担っていると想定される微量ガングリオシド成分(αシリーズガングリオシド及びアセチル化ガングリオシド)について、単クローン抗体を用いて分子同定を進め、さらにアセチル転移酵素cDNAのクローニングに成功した。また糖脂質完全欠損のミュータント細胞を確立し、グルコース転移酵素の完全欠損が原因であることを見出した(平林)。発現クローニング法によりGD3合成酵素のcDNAの単離に成功し、酵素蛋白構造の推定並びに機能解析を行った。

ブタ顎下腺よりGM3合成酵素の単離精製を進め、ラット肝細胞の成熟過程で一過性に出現するGN3結合蛋白質を見出し、構造解析を進めている。さらにTGFγ2とガラクトース結合蛋白との相同について分子レベルの解析を行った(佐内)。山形はガングリオシドGM1合成酵素の分子クローニングを進め、高崎はマクロファージのFcレセプター介在の貧食能誘導における糖蛋白糖鎖の機能を解析している。田井は系統的に作製した糖鎖特異モノクローナル抗体を用いて、哺乳動物の中枢神経系器官形成における糖鎖機能の解明を推進した。本研究班は細胞の増殖・分化の制御因子としての糖鎖機能につき、本年度は主として以下の研究成果を得た:(1)悪性度の増大に伴って特異的に発現する糖脂質ガングリオシドGDlaが細胞増殖因子IL-3の機能と密接に関与していることをIL-3依存性マウス骨髄性白血病細胞NFS-60を使って実証した。IL-3遺伝子導入により造腫瘍性を獲得したNFS-60変異細胞はGDlaを特異的に発現し、これがIL-3の細胞内シグナル伝達に関与する蛋白のリン酸化を有意に増大させることが判明した(斎藤)。(2)受精反応で最も重要な先体反応は、卵ゼリー層の硫酸化糖蛋白質ARIS、ステロイドサポニンCo-ARIS、Asterosapペプチドの3者が協同作用して精子に形態的生理的劇的変化(先体突起形成、細胞内カルシウム濃度上昇、細胞内pH上昇)を起こさせることであるが、これを単一の精子について実証した。またARISの活性を担う硫酸化糖鎖構造を決定し最小機能分子量を推定した(星)。(3)幾つのかの細胞系でセラミドはアポトーシス誘導の細胞内情報分子として機能していると言われているが、小脳のプルキンエ細胞では、その生存に必須な分子であることが、スフィンゴ脂質の合成阻害剤フメニシンBlやISP-lを添加した初代培養系で証明した。全糖脂質を欠損したメラノーマB-16細胞変異株は糖脂質合成の最初のステップのセラミド:グルコシル転移酵素を欠損し、スフィンゴミエリンによって代償されていることを発見した(平林)。(4)成熟ラット肝細胞はN結合型糖鎖の末端β-ガラクトースを介して同種肝細胞と接着し、この反応が細胞周期や増殖、分化状態により影響されることが判明した。生後24日頃の肝細胞がガングリオシドGM3と特異的に結合し、この結合膜物質が単クローン抗体を使ったウェスタンブロットで46kDaの蛋白であると同定した。さらにガングリオシドGD3合成酵素遺伝子の発現は発生過程で変化することを明らかにした(佐内)。本研究では、本年度は主として以下の研究成果を得た:(1)血球系の増殖・分化制御に関わる生物活性を担う糖脂質糖鎖の生合成においては、最終ステップの糖転移酵素や中間代謝に与える糖転移酵素群よりも、コア構造の振分けに与る糖転移酵素がダイナミックにコントロールされ、最終産物発現が制御されていることを実証した。今年度はヒトBリンパ球において、sialyl-Le^x構造発現とこれを介した細胞接着がコア構造生合成に与る糖転移酵素Core2 GlcNAc transferase (C2GnT)によって制御されていることを示した(斎藤)。(2)ヒトデ卵ゼリー層中の先体反応誘起物質の糖鎖構造を解明し、精子頭部の受容体の単離を追求している。ウニ卵のガングリオシド含量は高く、ガングリオシドM5が主要成分である。
ポピュラー文化の収集・保存・展示をめぐる記憶とナショナリズムに関する国際比較研究

本研究では、消費・廃棄されてきたポピュラー・メディアを収集・保存・展示する博物館に注目し、誰によって、何が「文化」として選択されるのかを明らかにしようとした。調査の結果、フランスや韓国の事例では、「国家」を基準とし、「ミュージアムの思想」にもとつく芸術や歴史という観点からの選択が行われ、来館者にもそうした理解が求められていることがわかった。日本では、こうした価値を踏襲しない・できないために問題が生じていた。しかし、ここにポピュラー文化に即した価値創造の可能性を見出すこともできる。本研究は、消費・廃棄されるが、グローバルに流通するポピュラー・メディアを収集・保存・展示する博物館に着目し、文化を文化たらしめ、その消滅と保存を境界付ける力学を明確化・精緻化し、社会学的に探求するものである。21年度にはポピュラー・メディアの博物館における収集・保存・展示実態の把握を行った。具体的には、日本の京都国際マンガミュージアム、韓国の韓国マンガ映像振興院、フランスのCite international de la bande dessinee etdel'imageの実態を把握するためのフィールドワークを行った。各館の文化政策や地方行政とのかかわりなど、政治、経済的側面からの把握をはじめ、収集・保存・展示の理念やその実行の程度について文書資料、統計資料の収集を行うとともに、現地調査として博物館学芸員らへのインタビューを行った。これによって、各国の博物館の位置づけには、歴史意識やナショナリズムのありかたが大きく影響している様が明らかになった。また、京都国際マンガミュージアムにおいては、次年度の関心を先取りし、来館者調査を実施した。この結果、通常のミュージアムとは異なる来館者行動を把握することができ、「マンガ」という媒体が生み出す経験の特徴の一端を捉えることができた。本研究は、消費・廃棄されるが、グローバルに流通するポピュラー・メディアを収集・保存・展示する博物館に着目し、ポピュラー文化の消滅と保存を境界付ける力学とはいかなるものであるのかを、社会学的に探求するものである。これにあたり、(1)ポピュラー・メディアの博物館における収集・保存・展示実態の調査、(2)来館者の博物館体験や、博物館が存在することで生まれる実践を、ドキュメント分析、非構造化インタビュー調査および記述式質問紙調査の内容分析、トラッキング法などを用いてとらえようとしている。22年度には、特に(2)に重点を置いて研究を進め、博物館関係者および来館者にむけた調査を実施した。その結果、博物館に集う人々のポピュラー・メディア体験を捕らえるための調査方法論について、再検討が必要であることを確認した。また、博物館設立側の論理をより深く理解するために、村おこし、町おこしの文脈との関係に注目していくことが必要であることもわかった。この成果は、延辺大学で開催されたシンポジウムで発表し、有意義な意見をえた。地域振興政策としてのポピュラー文化の保存への動きは、グローバルな現象として共有されつつある。また、昨年度実施した京都国際マンガミュージアムでの来館者調査の結果を、論文等の形で報告することができた。今後、より深くこの調査結果を読み解くために、広島市立まんが図書館および、宝塚市立手塚治虫記念館での来館者調査の実施を検討しており、現在、パイロット調査を終了している。本研究は、消費・廃棄されるが、グローバルに流通するポピュラー・メディアを収集・保存・展示する博物館に着目し、ポピュラー文化の消滅と保存を境界付ける力学とはいかなるものであるのかを社会学的に探求するものである。23年度は、21年度、22年度に行った調査の追加、補足調査を行うとともに、これまでの成果を発表し、まとめた。特に、昨年度実施予定としたまんが関連施設来館者のポピュラー文化体験に関する調査を継続する形で発展させていくとともに、広島、宝塚も視野にいれ、これらの施設と京都国際マンガミュージアムとの比較可能性を探った。これに加え、フランスにおいて「メディアアート」を主に扱う「ラ・ゲテリリック:La Gaite Lyrique」の視察、韓国漫画映像振興院での追加インタビューを実施した。この結果、ポピュラー文化のミュージアムを標榜する国内施設の多くが、ポピュラー文化の保存や再生という課題が、「地域振興」や「観光客誘致」あるいは、地域住民の満足度といった尺度によってはかられる傾向があり、ポピュラー文化の再生産や持続可能性、共有可能性についての議論を行うための土台が、そもそも不足していることが明らかになった。
植物の生殖細胞系列におけるレトロトランスポゾンの転移機構の研究

本研究では、植物の生殖細胞系列においてトランスポゾンが活性化されるしくみを明らかにする事を目指し、花粉で高頻度に転移するミヤコグサのレトロトランスポゾンLORE1aについて解析している。今年度は主に、(1)LORE1a転写レベル上昇変異体の解析、(2)種間交雑組換え近交系(RI)集団におけるLORE1a活性化個体の解析を行った。(1)昨年度、ミヤコグサのLORE1a挿入変異集団から選抜したエピジェネティクス制御系遺伝子の変異体の中で、LORE1aの転写レベルが上昇していた系統を見出した。この系統について詳細を解析したところ、少なくとも3つのエピジェネティクス制御遺伝子が破壊されていることがわかった。これらの変異とLORE1aの転写レベルとの関係について解析したところ、small RNAの代謝に関わる遺伝子の変異とLORE1a転写レベルとの間に相関が見られた。また、さらなる変異体の同定を試みたが、これまでのところLORE1aの転写上昇が明らかな新しい変異体を見出すには至っていない。(2)について、種間交雑RI集団の中でLORE1aが転移していた系統について、F4以降の世代間でLORE1a転写レベルの比較を行なった。その結果、基本的に後期の世代になるにつれて転写レベルが上昇していた。この種間交雑RI集団の96系統について、全ゲノムショートリードが解析され公開されている。それらのデータを解析したところ、LORE1aが転移している系統が6系統見出され、そのうち5系統については今回の解析により初めてLORE1aの転移が明らかとなった。本研究では、植物の生殖細胞系列において、トランスポゾンが活性化され転移するしくみについて明らかにする事を目指している。そこで、ミヤコグサの生殖細胞系列において高頻度に転移するレトロトランスポゾンLORE1aについて、(1)LORE1aの転移の時期組織特異性の解析、(2)種間交雑組換え近交系(RI)集団におけるLORE1a活性化の原因の解析、を行っている。今年度の進捗は以下の通りである。(1)について、LORE1aのシス配列に、改変GFPタンパク質をコードする遺伝子を連結したコンストラクトを6種類作製し、それぞれのミヤコグサ形質転換体を複数系統ずつ作出した。また形質転換体の解析を開始し、一部の形質転換体の花粉においてGFP蛍光が観察された。(2)について、LORE1aのアンチセンス転写産物の発現量と、LORE1a活性化レベルの間に負の相関があるか検証した。LORE1aのセンス・アンチセンス転写産物を識別可能なリアルタイムRT-PCRを行い、それぞれの転写量を解析したが、両者に明らかな負の相関は見られなかった。次に、LORE1aが活性化された複数系統で共通して発現レベル変動が見られた2遺伝子を同定した。これらがLORE1aの活性化に関与している可能性を検証するため、これらの遺伝子の変異体におけるLORE1aの転写レベルを解析したが、転写上昇は起こっていない事が分かった。また、LORE1a活性化の再現性を見るために、新たに種間交雑集団を育成しているが、少なくともF2世代においてはLORE1aの転写レベルの上昇は確認されなかった。(1)LORE1aの転移の時期組織特異性の解析については、解析に必要な形質転換体の作出等、予定通り進んだ。一方、(2)種間交雑RI集団におけるLORE1a活性化の原因の解析については、2つの可能性について検証できたが、それぞれについて否定的なデータを得たにとどまっており、若干遅れていると考えている。今年度は、(1)LORE1aの活性の時期組織特異性の解析、(2)LORE1a転写レベル上昇変異体の同定、(3)種間交雑組換え近交系(RI)集団におけるLORE1a活性化研究の見直しを行った。(1)核移行シグナルを付加したGFP遺伝子をLORE1aプロモーターでドライブするコンストラクトを導入したミヤコグサ形質転換体について、花粉におけるGFPシグナルの発現様式を詳細に解析した。その結果GFPシグナルは、減数分裂以降・1核期以降の花粉の核で観察された。このことは、過去に遺伝学的データに基づいて推定されたLORE1aの転移様式と矛盾しなかった。(2)通常、ミヤコグサではLORE1aは不活化されている。LORE1aの不活化に関与している遺伝子を見出すため、ミヤコグサのLORE1a挿入変異集団からエピジェネティクス制御系遺伝子の変異体を選抜し、それらのLORE1aの転写レベルを解析したところ、通常よりも高いLORE1a転写レベルを示す系統を見出した。(3)過去に取得した、RI集団から見出されたLORE1a活性化個体のトランスクリプトームデータを再検討し、LORE1a活性化現象との関連が考えられる遺伝子発現変動を改めてリスト化した。(1)解析により得られたLORE1aの発現時期・組織特異性の詳細データと、LORE1aの転移様式に関する遺伝学的データとの間で一致が見られ、このレトロトランスポゾンの転移様式について信頼性が高いモデルを確立できた。(2)LORE1aの不活化に寄与している可能性が考えられる遺伝子候補を同定することができた。(3)種間交雑に伴うLORE1aの活性化現象を理解するための解析の新たな糸口を見いだすことができた。

本研究では、植物の生殖細胞系列においてトランスポゾンが活性化されるしくみを明らかにする事を目指し、花粉で高頻度に転移するミヤコグサのレトロトランスポゾンLORE1aについて解析している。今年度は主に、(1)LORE1a転写レベル上昇変異体の解析、(2)種間交雑組換え近交系(RI)集団におけるLORE1a活性化個体の解析を行った。(1)昨年度、ミヤコグサのLORE1a挿入変異集団から選抜したエピジェネティクス制御系遺伝子の変異体の中で、LORE1aの転写レベルが上昇していた系統を見出した。この系統について詳細を解析したところ、少なくとも3つのエピジェネティクス制御遺伝子が破壊されていることがわかった。これらの変異とLORE1aの転写レベルとの関係について解析したところ、small RNAの代謝に関わる遺伝子の変異とLORE1a転写レベルとの間に相関が見られた。また、さらなる変異体の同定を試みたが、これまでのところLORE1aの転写上昇が明らかな新しい変異体を見出すには至っていない。(2)について、種間交雑RI集団の中でLORE1aが転移していた系統について、F4以降の世代間でLORE1a転写レベルの比較を行なった。その結果、基本的に後期の世代になるにつれて転写レベルが上昇していた。この種間交雑RI集団の96系統について、全ゲノムショートリードが解析され公開されている。それらのデータを解析したところ、LORE1aが転移している系統が6系統見出され、そのうち5系統については今回の解析により初めてLORE1aの転移が明らかとなった。(1)については、形質転換体は多数得ることができたが、GFP蛍光が観察された系統は一部に限られた。形質転換体におけるGFP遺伝子の転写レベルをRT-PCRで解析したところ、全体的に転写レベルは低く、また系統間差異が大きい事が分かった。当初からLOER1aのプロモーターの活性が低い事は予想されていたので、それを増強するコンストラクトの形質転換体も作出したが、期待した効果は得られていない。今後の形質転換体の解析においては、導入遺伝子中のLORE1a配列を標的としたサイレンシングが起きている可能性を考慮する必要がある。また、形質転換体におけるGFPの発現様式が、活性化状態のLORE1aのそれを反映しているのかという点についても留意する。(2)については、遺伝学的な解析を行う。つまり、種間交雑RI集団において、LORE1aが活性化されている系統群と、活性化されない系統群の間で、遺伝の偏りがあるゲノム領域を探索する。しかしこの解析においては、これまでに同定できたLORE1aが活性化した系統の数が少ない事がネックとなっている。活性化はRI集団の最初期世代ではなく、途中の世代で起きた。そこで、世代間の遺伝的分離に着目した解析により、上記の問題を克服できる可能性があると考えられるので、その為の材料の整備を開始する。(1)については今後、花粉成熟期以降のGFPの発現パターンの詳細を解析する。(2)については、変異アリルとLORE1a活性化との連鎖関係について解析する。
新しい慢性疲労モデルの確立と食欲ホルモンの慢性疲労診断マーカーになる可能性の評価

本研究に着眼した血中グレリンとレプチンの疲労回復遅延への関与を明らかにするため、まず血中ホルモンの疲労負荷に伴う経時変化を中心に検討を行った。疲労負荷初期にACTHとコルチコステロンの血中濃度は上昇したが、その後ACTHは一過性に低下し、疲労負荷後期において再上昇するのに対して、コルチコステロンは持続的に上昇することを明らかにした。さらに、ACTHとコルチコステロンのネガティブフィードバック制御に担うMRとGRの発現が視床下部において負荷期間中継続的に増加したに対し、海馬においてMRが負荷早期低下しGRが負荷期間中継続的に減少した。要するに疲労負荷後期の海馬はACTHとコルチコステロンの増加を抑制できない状況にあり、ストレスホルモンのネガティブフィードバック調節機構が機能異常を示した。その理由として長期ストレスにより増え続けるコルチコステロンが海馬の神経細胞への過度な曝露が神経細胞萎縮を引き起こしたと考えられる。一方、疲労負荷後期の視床下部においてMRとGRの発現が継続的に増加しており、海馬の異常でネガティブフィードバック欠けた部分を何かの理由で対償的に補おうと考えられるが、血中のACTHとコルチコステロンの抑制に直結できず、増加したMRとGRの核内免疫活性の低下が示唆された。また、摂食調整に関わるレプチン/グレリンの血中濃度に関しては、食欲ホルモンであるグレリンは負荷初期から徐々に上昇し、レプチンは負荷初期には上昇する傾向を示し、負荷中期から著しく減少すること、さらに、摂食抑制効果を持つaMSHが負荷中期から上昇することを見出した。疲労負荷後期に食欲増進のグレリンと食欲減退のaMSHが共に上昇しており、疲労の蓄積に伴う食欲制御中枢の機能異常が示唆された。慢性疲労症候群(CFS)は、原因不明の疲労・倦怠感が6カ月以上続く病気である。慢性疲労は人々の日常的社会活動に支障をきたすだけではなく、過労死やうつ病、自殺など深刻な社会問題も引き起こしている。しかし、慢性疲労症候群の詳細な発症メカニズムは未だに分かっておらず、根本的な治療方法は確立されていない。本研究では、疲労の慢性化プロセスおよび慢性疲労症候群の詳細な分子・神経メカニズムを解明するために、慢性疲労モデルの確立を試みた。まず、既報の疲労回復が有意に遅延するIntermittent Water Immersion(IWI)モデルの負荷期間を5日間から14日間に延長した。次に、このモデルは慢性疲労状態にあるかを検討した。IWI疲労負荷を14日間まで延長した結果、自発行動量の回復が既報IWIモデルより有意に遅延した。その回復遅延はモデルが慢性疲労状態にあったことを示された。さらに、IWI疲労負荷の期間延長による強制水泳時間の変化は認められなかった。このことから14日間のIWI疲労負荷による自発行動量の回復遅延は身体性疲労より精神性疲労の寄与が大きいことを示唆された。また、疲労負荷中の休憩期における睡眠量は、疲労負荷初期に徐々に増加し、3日目を前後に一過性に低下に転じるが、負荷後期に再び増加した。ストレス関連ホルモンであるコルチコステロンの血中濃度は疲労負荷期間に伴い上昇したが、ACTHは疲労負荷初期には低下し、疲労負荷後期に上昇した。疲労負荷中の睡眠量、そして血中ストレス関連ホルモンの動態変化は生体内の恒常性維持機構が一旦疲労負荷に適応したものの、再度破綻に陥る可能性を示唆している。上記の結果より、この改変IWIモデルは慢性疲労のメカニズムを研究するには大変有効なモデルだと考えられる。本研究は、計画通りに一年目に慢性疲労モデルを確立できた。この慢性疲労モデルは現行の持続的な疲労負荷を行う上に、負荷最中に不定期な短い休憩を挟むことや負荷期間の延長した結果、既存疲労モデルより疲労回復期間が2倍に遅延した。この回復遅延は申請当時の予想と概ねに一致している。本研究では慢性疲労モデルを確立し、疲労の慢性化プロセスおよび詳細な分子・神経メカニズムの解明を目指している。前年度まで14日間のIntermittent WaterImmersion疲労負荷より慢性疲労モデルの作製に成功した。このモデルの自発行動量の回復が既報5日間IWIモデル、CWIモデルより顕著に遅延し、さらにこの自発行動量の回復遅延は身体性疲労より精神性疲労の寄与が大きいことを示唆された。本年度は血中ホルモンの疲労負荷に伴う経時変化を中心に検討を行った。これらの結果は、疲労負荷の後期におけるコルチコステロンよるネガティブフィードバック調節の機能異常を示唆している。また摂食調整に関わるレプチン/グレリンの血中濃度に関しては、食欲ホルモンであるグレリンは負荷初期から徐々に上昇し、レプチンは負荷初期には上昇する傾向を示し、負荷中期から著しく減少すること、さらに、摂食抑制効果を持つaMSHが負荷中期から上昇することを見出した。疲労負荷中期から酸化ストレスマーカーdROMが上昇したが、抗酸化力マーカーBAPが変化しなかった。

これらの結果は、疲労の蓄積に伴い睡眠調節機構の異常に加え、上昇する酸化ストレスやホルモンの制御機能異常が引き起こされ、疲労の慢性化を来す可能性を示唆された。本研究は、計画通りに2年目に慢性疲労モデルの疲労負荷前後の血中ホルモン(レプチン、グレリン、ACTH、コルチコステロン、aMSH)の測定を行った。特に摂食制御に関わる食欲ホルモンレプチン・グレリンの疲労負荷経時変化を検討した。グレリンは疲労負荷初期から徐々に上昇し、レプチンは疲労負荷初期には上昇する傾向を示し、疲労負荷中期から著しく減少すること、さらに、摂食抑制効果を持つaMSHが疲労負荷中期から上昇することを見出した。これらの結果は、疲労負荷中期から上昇する酸化ストレスマーカーdROMと合わせると、疲労の蓄積に伴う酸化ストレスの上昇が脳内・末梢のレプチン・グレリンのバランス制御異常が引き起こされ、疲労の慢性化を助長する可能性を示唆された。このため、レプチンとグレリンの是正により慢性疲労の改善を期待できる。本研究に着眼した血中グレリンとレプチンの疲労回復遅延への関与を明らかにするため、まず血中ホルモンの疲労負荷に伴う経時変化を中心に検討を行った。疲労負荷初期にACTHとコルチコステロンの血中濃度は上昇したが、その後ACTHは一過性に低下し、疲労負荷後期において再上昇するのに対して、コルチコステロンは持続的に上昇することを明らかにした。さらに、ACTHとコルチコステロンのネガティブフィードバック制御に担うMRとGRの発現が視床下部において負荷期間中継続的に増加したに対し、海馬においてMRが負荷早期低下しGRが負荷期間中継続的に減少した。要するに疲労負荷後期の海馬はACTHとコルチコステロンの増加を抑制できない状況にあり、ストレスホルモンのネガティブフィードバック調節機構が機能異常を示した。その理由として長期ストレスにより増え続けるコルチコステロンが海馬の神経細胞への過度な曝露が神経細胞萎縮を引き起こしたと考えられる。一方、疲労負荷後期の視床下部においてMRとGRの発現が継続的に増加しており、海馬の異常でネガティブフィードバック欠けた部分を何かの理由で対償的に補おうと考えられるが、血中のACTHとコルチコステロンの抑制に直結できず、増加したMRとGRの核内免疫活性の低下が示唆された。また、摂食調整に関わるレプチン/グレリンの血中濃度に関しては、食欲ホルモンであるグレリンは負荷初期から徐々に上昇し、レプチンは負荷初期には上昇する傾向を示し、負荷中期から著しく減少すること、さらに、摂食抑制効果を持つaMSHが負荷中期から上昇することを見出した。疲労負荷後期に食欲増進のグレリンと食欲減退のaMSHが共に上昇しており、疲労の蓄積に伴う食欲制御中枢の機能異常が示唆された。来年度から確立できた慢性疲労モデルの負荷前後の血中ホルモン(レプチン、グレリン、ACTH、コルチコステロン等)の測定を行う。特に食欲ホルモンであるレプチン・グレリンに対し、既知疲労に関連する酸化ストレスマーカーやサイトカインなどの疲労負荷経時変化から、両因子の慢性疲労との関連性を検討する。
マウス脊髄虚血モデルに対するヒト血管内皮前駆細胞移植による脊髄修復効果の検討

胸部下行、胸腹部大動脈瘤手術や血管内治療後の虚血性脊髄障害は重篤な術後合併症の1つである。近年、虚血性疾患や脊髄損傷に対する血管内皮前駆細胞による細胞治療の有効性が前臨床および臨床試験で明らかにされた。また、最近、C57BL/6マウスにおいて遅発型および即時型虚血性対麻痺モデルが確立された為、SCIDマウスで同モデルを検証した。SCIDマウスでは遅発型対麻痺は発生せず、即時型対麻痺モデルのみ誘導可能であった。同モデルに再灌流後8時間にヒトCD34陽性細胞の静脈投与を行い、40時間後の脊髄組織では移植細胞は虚血部位に多数集簇を認めたが脊髄前角細胞は消失。同細胞治療の有効性を見出せなかった。脊髄虚血モデルマウスの作成について、当研究グループでは、Kakinohanaら(2011)に準じて、全身麻酔、傍脊柱筋モニター、大腿動脈より観血的血圧測定下にマウスを開胸し、左総頚動脈と左鎖骨下動脈間の大動脈および左鎖骨下動脈をマイクロクリップで一定時間遮断することにより遅延型対麻痺モデルを作製を試みた。自施設における、モデルの再現性を確認するため、まず、C57BL/6Jマウスを用いた。結果、傍脊柱筋温度37.5°C、虚血時間6分という条件下で遅発性脊髄麻痺が生じることの再現性を確認し、組織学的にも脊髄前角細胞の脱落を確認した。ところが、免疫不全マウス(SCIDマウス)を用いて同様にモデル作成を行ったところ、C57BL/6Jマウスとは異なり、6分虚血では、再灌流直後に脊髄麻痺は認められるものの、48時間後には全て正常に回復した。7分、9分、9.5分でも同様であり、10分虚血で、脊髄麻痺が生じたものの、再灌流後72時間までに全て死亡した。死亡率を低下させるべく、当研究グループでは、一定時間のIschemic preconditioningを施すことで、再灌流後72時間までの死亡率を100%から38.7%にまで低下させ、さらに完全脊髄麻痺が生じたマウスでも85.7%が再灌流後少なくとも21日目まで生存することを確認した。今後、同モデルに対して、血管内皮前駆細胞(EPC)を移植し、1Basso Mouse Scale (BMS)を用いた定量的運動機能評価、2免疫組織学的解析により投与したEPCの局在そして虚血・再灌流後の神経細胞と脊髄組織のGlia細胞群(Microglia, Macrophage (M1/M2比), astrocyte等)の分布と血管修復・神経修復の評価、3血管・神経修復に関与する因子のmRNAおよびタンパクの表現解析、について経時的に観察ポイントを設定し、移植後8週までのEPC投与による対麻痺治療効果とその機序(神経細胞のapoptosis抑制効果、microenvironmentの変化)の解明を行う予定。C.B-17/Icr-scid/scidJclマウス(SCIDマウス)即時型対麻痺モデルに対するヒトCD34陽性細胞移植の検討:Ischemic preconditioning 30秒、10.5分虚血の条件で、即時型対麻痺モデルを用いた。モデルの検討時に対麻痺の発生は、再灌流後6時間から12時間でBMSスコア≤4点であるマウスは全例対麻痺を発生したことから、細胞あるいはPBSの投与のタイミングは再灌流後8時間と設定した。投与後、40時間(再灌流後48時間)における脊髄組織を観察したところ、DiIでラベリングされた移植細胞が虚血障害部位に多数集簇を認めた。細胞の局在は、BS-1 lectinで染色された血管にとどまらず、血管外にも多数観察された。しかし、この時点で、細胞移植群、PBS投与群ともに、Nissl染色による脊髄前角細胞は既に消滅していた。また、障害は後角にまで波及し、Rexed IおよびII相に至るまで神経細胞の著明な減少が認められた。移植後14日までで、細胞移植群とPBS投与群でのBMSスコアの推移および生存率に差異は認められなかった。今後の計画:SCIDマウスでは、C57BL/6マウスとは異なり、遅発型対麻痺が発生せず、また、発生した即時型対麻痺では脊髄障害程度が著しく高度で、ヒトCD34陽性細胞の移植による対麻痺改善効果を検証するには、本モデルの虚血重症度が高すぎるものと考えられた。一方、B6マウスでは、遅発型および即時型対麻痺モデルともに作成可能であること、また、B6マウスに免疫抑制剤を併用してヒト由来細胞を移植し、有効性を示した報告が多数あることから、現在、B6マウスを用いた脊髄虚血モデルに変更し実験を進めている。1) SCIDマウス即時型対麻痺モデルに対するヒトCD34陽性細胞移植の検討:傍脊柱筋温度37.5°C下Ischemic preconditioning 30秒、10.5分脊髄虚血の条件で即時型対麻痺モデルを作成した。再灌流後612時間で後肢運動機能スケールBasso Mouse Scale (BMS)≦4点であるマウスは全例対麻痺を発生した為、細胞(またはPBS)投与は再灌流後8時間と設定した。投与後40時間(再灌流後48時間)に脊髄組織を観察したところ、標識した移植細胞が虚血障害部位の血管内にとどまらず、血管外にも多数局在することを確認した。しかし、このモデルでは両群とも脊髄前角細胞は消滅していた。