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cAMP情報伝達系を標的にした気分障害と統合失調症の新規治療法開発に関する研究

ICD-10によってうつ病(と診断された長崎大学医学部・歯学部付属病院精神神経科を受診した50歳以上の患者のうち薬物抵抗性または薬物治療不耐性と判断する外来・入院症例を対象した。心疾疾患の既往またその他の重症な身体疾患がなく、頭部MRIを施行し、T2, T1画像にて確認される微小梗塞が存在するうつ病症例において書面にて同意を得た症例に対して脳梗塞の臨床適応が認められているcAMP増強薬(シロスタゾール)を使用した。シロスタゾールを脳梗塞後うつ病患者10名に関して50-200mg投与し、0、4、8, 12週時のHAMD、血清BDNFを測定した。HAMDは経時的に減少を示し、血中BDNFは経時的に増加を示した。一方統合失調症においては変化が認められなかった。基礎的検討としての神経幹細胞に対するリチウムとドーパミン作動薬でありメチルフェニデートの影響を検討した。リチウムは幼弱な神経細胞のマーカーであるTuj1陽性細胞数は、どの濃度でもコントロール群に比べ減少が認められ、1000μMではコントロール群に対して統計学的に有意に減少がみられた。メチルフェニデートは治療濃度においでは神経細胞の分化は促進し、高濃度では抑制を示した。一方グリアのマーカーであるGFAP陽性細胞に関しては、500μMまでは増加傾向を示したが、1000μMでは統計学的な有意差を持って減少が認められた。メチルフェニデートはグリアへの分化には影響は少なかった、また増殖能に関しては抑制的である。これまで我々は炭酸リチウムが濃度依存的に神経幹細胞の増殖能を促進することを報告しているが、このことは増殖の過程と分化は単純に同一というよりむしろ拮抗的なバランスが存在している可能性が示唆され、うつ病や統合失調症の難治化・慢性化にはグリア細胞の役割が重要であることが推察された。ICD-10によってうつ病(F31.双極性感情障害、F32.うつ病エピソード、F33.反復性うつ病性障害)と診断された長崎大学医学部・歯学部付属病院精神神経科を受診した50歳以上の患者のうちSackeim(1990)の薬物治療強度評価基準により薬物抵抗性または薬物治療不耐性と判断する外来・入院症例を対象とする。心疾疾患の既往またその他の重症な身体疾患がなく、頭部MRIを施行し、T2、T1画像にて確認される微小梗塞が存在するうつ病症例において書面にて同意を得た症例に対して脳梗塞の臨床適応が認められているcAMP増強薬(シロズタゾール)を使用した。血中BDNF測定の基礎検討(性差、時間、年齢、季節、食事)を行い15-35pg/mlの範囲で測定可能であり、環境による影響は比較的少ない結果であった。シロスタゾールを脳梗塞後うつ病患者10名に関して50-200mg投与し、0、4、8、12週時のHAMD、血清BDNFを測定した。BDNFをPromgea BDNF Emax^<TM> ImmunoAssay Systemを用いELISA法により測定した。またMRIの相関性は萎縮度、ラクナーの程度と症状、シロスタゾールの有効性、副作用の有無(頭痛等)、BDNF章に関しては有意な結果は見出せなかった。胎齢15.5日マウス胎仔脳から線条体原基を分離・分散後、neurosphere法により培養を行い、シロスタゾールによる神経幹細胞分化能に対する影響を検討した。未成熟神経細胞の指標であるTuj1とアストロサイトの指標であるGFAPは、シロスタゾールの濃度依存的に増加が認められた。このことよりcAMP系が神経幹細胞の分化に影響を及ぼしていることが明らかになった。

ICD-10によってうつ病(と診断された長崎大学医学部・歯学部付属病院精神神経科を受診した50歳以上の患者のうち薬物抵抗性または薬物治療不耐性と判断する外来・入院症例を対象した。心疾疾患の既往またその他の重症な身体疾患がなく、頭部MRIを施行し、T2,T1画像にて確認される微小梗塞が存在するうつ病症例において書面にて同意を得た症例に対して脳梗塞の臨床適応が認められているcAMP増強薬(シロスタゾール)を使用した。シロスタゾールを脳梗塞後うつ病患者10名に関して50-200mg投与し、0、4、8,12週時のHAMD、血清BDNFを測定した。HAMDは経時的に減少を示し、血中BDNFは経時的に増加を示した。一方統合失調症においては変化が認められなかった。基礎的検討としての神経幹細胞に対するリチウムとドーパミン作動薬でありメチルフェニデートの影響を検討した。リチウムは幼弱な神経細胞のマーカーであるTuj1陽性細胞数は、どの濃度でもコントロール群に比べ減少が認められ、1000μMではコントロール群に対して統計学的に有意に減少がみられた。メチルフェニデートは治療濃度においでは神経細胞の分化は促進し、高濃度では抑制を示した。一方グリアのマーカーであるGFAP陽性細胞に関しては、500μMまでは増加傾向を示したが、1000μMでは統計学的な有意差を持って減少が認められた。メチルフェニデートはグリアへの分化には影響は少なかった、また増殖能に関しては抑制的である。これまで我々は炭酸リチウムが濃度依存的に神経幹細胞の増殖能を促進することを報告しているが、このことは増殖の過程と分化は単純に同一というよりむしろ拮抗的なバランスが存在している可能性が示唆され、うつ病や統合失調症の難治化・慢性化にはグリア細胞の役割が重要であることが推察された。
マイクロ流路デバイスを用いたセンチュウの農作物寄生メカニズムの定量的解析

本研究では,世界中で農作物に深刻な被害を及ぼしている植物寄生性センチュウの代表種であるサツマイモネコブセンチュウ(Meloidogyne incognita,以下ネコブセンチュウ)を対象とし,マイクロ流路デバイスを用いることで,寄生にかかわる生化学的行動の新規分析手法を確立した。作製したマイクロ流路デバイス上で,アガロースゲルの導入によりネコブセンチュウが運動可能な環境を構築すると共に,拡散に伴う化学物質の濃度分布を定量的に明らかにした。本分析手法により,硝酸カリウムに対するネコブセンチュウの化学走性(濃度勾配に対する誘引,忌避行動)は,濃度勾配の値により変化することを見出した。本研究の目的は,世界中で農作物に深刻な被害を及ぼしている植物寄生性センチュウの代表種である,サツマイモネコブセンチュウ(以下ネコブセンチュウ)の行動分析用マイクロ流路デバイスを開発し,植物寄生に関わる物質やその濃度条件を明らかにし,環境に無害な新規防除法を実現することである。今年度実施した具体的な内容を以下に示す。【1.化学走性分析用マイクロ流路デバイスの開発】ネコブセンチュウの化学走性分析用マイクロ流路デバイスを新たに開発した。本デバイスは光透過性が高いPDMS(Poly dimethylpolysiloxane)およびガラスを材料とすることで,微小なネコブセンチュウ(体長1mm未満)の行動を,光学顕微鏡で容易かつ詳細に観察可能とした。【2.ネコブセンチュウの流路内泳動プロトコルの確立】マイクロ流路中へのアガロースゲルの導入により,ネコブセンチュウが自由に泳動出来る環境を形成した。本手法により,直線など単純な形状のマイクロ流路において行動分析が可能となり,濃度分布などの化学環境が容易に定量化出来る見通しを得た。【3.物質拡散による流路内濃度勾配の評価】開発したマイクロ流路デバイスに対し,蛍光物質(ローダミンB)を拡散させた際の蛍光観察より,流路内に濃度勾配が効果的に形成され,一定時間維持されることを確認した。この結果より,本デバイスによりネコブセンチュウの化学走性が効果的かつ定量的に実施できる見通しを得た。【4.新規忌避性物質の発見】開発した分析手法により,高濃度の硝酸カリウムに対し,ネコブセンチュウが強い忌避性を示すことを新たに見出した。硝酸カリウムは環境や人体への負荷が低く,土壌に同物質を導入し植物への寄生を防ぐ新規防除法確立への重要な知見となる。本研究では,植物寄生性センチュウの代表種であるサツマイモネコブセンチュウ(Meloidogyne incognita)を対象とした行動分析用マイクロ流路デバイスを開発し,その化学走性(濃度勾配に対する誘引および忌避行動)を定量的に明らかにすることで,安全かつ効果的な防除法の確立を目指した。初年度では,化学走性分析用マイクロ流路デバイスの試作を行い,流路中にアガロースゲルを導入することでネコブセンチュウの泳動プロトコルを確立した。更には,本分析手法により,硝酸カリウムがネコブセンチュウの行動を誘発し,かつ濃度勾配の高低に対して誘引性,忌避性が変化することを示唆する結果を得た。次年度(最終年度)においては,複数のマイクロ流路を連結した新規デバイスを開発し,一度に複数の濃度勾配を形成することで,化学走性分析のハイスループット化を目指した。本デバイスを用いた手法により,化学走性分析の高効率化を実現すると共に,ネコブセンチュウの行動を誘発するための硝酸カリウムの濃度勾配には,下限値が存在することを明らかにした。以上より,本研究では,ネコブセンチュウの定量的な化学走性分析手法を確立し,従来の分析手法では困難であった,同一物質の濃度勾配に対する化学走性の変化や,化学走性に必要な濃度勾配の下限値を明らかにした。これらは,化学走性によるネコブセンチュウの新規防除法を確立する上で非常に重要な知見となる。本研究で得られた成果は,国内外の学会や研究会で積極的に発表した(招待講演1件,国際学会4件,国内学会2件,セミナー2件)。また,マイクロ流路デバイスによるネコブセンチュウの化学走性の新規分析手法として学術雑誌に1件投稿中であり,並行して化学走性のハイスループット化に関して論文投稿の準備を進めている。ナノマイクロシステム申請書の計画に従い,本年度はサツマイモネコブセンチュウの化学走性用マイクロ流路デバイスを開発し,実証試験により新規忌避性物質およびその濃度条件を明らかにできたことから,おおむね順調に進展していると判断した。今後は,以下のテーマについて取り組む予定である。(1)化学走性分析のハイスループット化マイクロ流路をアレイ化することにより,分析効率の向上を図ると共に,流路中における化学物質の濃度分布の定量化を試みる。(2)新規誘引性物質の探索

今年度新たに明らかにしたサツマイモネコブセンチュウの忌避性物質に加え,誘引性物質,およびその濃度条件の解明を進め,それらを組み合わせることで,行動制御による植物寄生性センチュウの新規防除法の確立に繋げる。
地震破壊伝播機構解明のための長大岩石摩擦実験研究

長さ4mの岩石試料を用いた2軸摩擦試験機を用いて、岩石摩擦実験を行なった。いくつかの試験的な実験により、初期のゆっくりすべりは岩石の両端から開始し、徐々に中心部に向かって広がり、すべり残りがあるサイズになった時点で不安定すべりに移行し、中心部から両端に向かって高速すべりが伝播する様子をひずみゲージ、渦電流変位計、AEセンサーのアレイによってとらえることができた。この現象は、プレート境界上で発生している繰り返し地震の解析によって得られているアスペリティ周囲の定常的なすべりとアスペリティの周期的な破壊による繰り返し地震の発生と類似性が高く、プレート境界において起こっている不均質すべり現象のアナログ現象として、詳細な解析の意義のあるデータを得ることができた。また、不安定すべりの発生に先立ち、多数の前震の発生も確認されている。この現象は、本摩擦試験機によって再現性が高く得られている。データを詳細に解析し、ゆっくりすべりから不安定すべりへの移行過程を詳細に研究していく予定である。4m長の岩石資料を用いた岩石摩擦試験機により、実際に自然界で観測されている現象と類似したデータが十分な再現性をもって得られており、今後のデータの解析により、その発生メカニズムの解明に寄与できるものと考える。プロジェクトは、問題なく進展しているので、特に推進方策の変更はない。各種実験条件を設定しての実験を行い、得られた実験データから、破壊伝播速度と断層面の性質との関係、断層面の応力蓄積状態や断層面強度分布と破壊の生成伝播の関係を調べ、初期破壊の成長、不安定破壊への移行、破壊伝播の加速/減速、supershear破壊伝播モードへの移行などをコントロールする要因を精密に調査していく予定である。長さ4mの岩石試料を用いた2軸摩擦試験機を立ち上げ、動作確認のための実験を行った。動作確認実験により、試験機が期待通りの動作をしていることを確認した。さらに、模擬断層近くの岩石試料にひずみゲージ、変位計、音響センサーを多点アレーとして設置し、スティックスリップ地震の際の断層の動きとそこに働いている剪断応力や法線応力の変化、不安定滑りによる高周波波動の発生状況を時空間的にモニターすることに成功した。その結果、岩石試料にせん断変位を一定速度で与え続けると、スロースリップ域が加力とともに増大し、最後に残った固着域(アスペリティ)から不安定な地震性破壊が生成伝播していく様子を捉えることができた。この現象は、巨大地震の際に理論研究から予測されている、プレスリップや前震が発生したのち、巨大地震が発生するというシナリオと符合している。さらに、多点の変位計による断層変位の時空間モニターにより破壊伝播速度の推定を行うことに成功し、剪断応力と法線応力の応力比の時空間分布との関係から、断層面における強度変化と破壊伝播の関係を調査するための基本的なデータを得ることができた。これらの実験で得られたデータは、断層近傍で稠密に得られているため、実験室で発生する地震を理論に基づいたシミュレーション研究により再現するための貴重なデータとなっており、次年度以降、数値シミュレーションも併用して、物理現象の理解を進めていく予定である。4m長の岩石試料を用いた岩石摩擦試験機が稼働し、各種データを精度よく得ることに成功した。プロジェクトは、初年度としては、ほぼ、予定通りに進展していると言える。次年度以降は、各種実験条件を設定しての多数の実験を行い、それらの実験データを取得することにより、破壊伝播速度と断層面の性質との関係、断層面の応力蓄積状態や断層面強度分布と破壊の生成伝播の関係を、調べていき、初期破壊の成長、不安定破壊への移行、破壊伝播の加速/減速、supershear破壊伝播モードへの移行などをコントロールする要因を精密に調査していく予定である。
新規果物アレルゲンＧＲＰの特性を明らかにする

近年増加傾向にある果物アレルギーは、乳幼児に多い卵、乳、小麦のアレルギーと異なり、成長してから発症し、さらには対象となる果物が増えていくことが多いという特徴をもつ。これまでに、代表的な果物アレルゲンであるLipid Transfer Protein(LTP)の研究過程で新規アレルゲンGibberellin Regulated Protein(GRP)を発見し、桃GRPが重篤なアレルギー症状を引き起こすことを明らかにしてきた。本研究では、GRPの特性を明らかにし、果物アレルギーの診断・治療・予防に役立てることを目的としている。30年度は、GRPアレルギー患者が注意すべき食品の探索をめざした。既得のモノクローナル抗体を用いたウエスタンブロッティングによって、これまで同定されていたモモ以外にも多くの植物性食品にGRPが存在することが分かった。次に、それぞれのGRPに対する患者血清中IgEの反応性を確認することをこころみたが、ウエスタンブロッティングではうまくいかなかった。そこで、GRPを精製したのちにELISAにて患者血清中IgEの反応性を確認したところ、トマトやオレンジなどに反応することが明らかになった。したがって、モモGRPアレルギー患者は、トマトやオレンジにも反応する可能性が示唆された。また、トマトやオレンジの摂取により重篤なアレルギー症状を引き起こした場合、GRPが原因である可能性も検討する必要があると考えられる。先行研究にて、代表的な果物アレルゲンであるLipid Transfer Protein(LTP)の研究過程で新規アレルゲンGibberellin Regulated Protein(GRP)を発見した。これまでに、桃GRPが、重篤なアレルギー症状を引き起こすことを明らかにしている。本研究では、このGRPの特性を明らかにすることで、果物アレルギーの診断・治療・予防に役立てることを目的としている。平成28年度は、解析材料の調製と解析ツールの確立を目指して主に以下に述べる3点について研究を進めた。いずれも、これまでの先行研究を発展させるための下地作りである。1これまでの研究にて作製済みであった、桃GRP、LTPに対するモノクローナル抗体を用いて、桃果実からGRP、LTPの純化をおこなった。桃GRP、LTPともに、非常に純度の高いサンプルを確保することができた。2現在、アレルギー診断に用いられている抗原の多くが、リコンビナント抗原であることから、リコンビナント桃GRPを酵母と大腸菌でそれぞれ作製した。3これまでの研究にて作製済みであった、桃GRP、LTPに対するモノクローナル抗体を用いて、食品中の桃GRP、LTPを高感度に検出できる定量系を構築した。今後は、これらの解析をすすめ、GRPのアレルゲンとしての特性を明らかにしていく。平成28年度は、解析材料の調製と解析ツールの確立を目標として取り組み、おおむね予定どおりに進んでいると考える。従来、果物・野菜アレルギーのうち、重篤な症状を引き起こす主要な抗原はLTP(Lipid Transfer Protein)であると考えられてきたが、日本人においてはGRP(Gibberellin Regulated Protein)が主な抗原であることをこれまでの研究で示してきた。本年度は、前年度までに作製したリコンビナントGRPが、抗原解析に利用できるかどうかの評価と、桃GRPとLTPの比較定量をおこなった。1リコンビナントGRPの評価前年度までに作製したリコンビナント桃GRPを、既得のモノクローナル抗体や桃アレルギー患者血清で評価した。その結果、大腸菌で作製したものよりも、Pichia pastrisで作製したものの方が、桃から精製したGRPに近い反応性を示した。アレルゲンのコンポーネント解析に用いられる抗原の中にはリコンビナント抗原もあるが、立体構造まで考慮し、抗体がナチュラルなものと同等に反応することを示す必要があることが示唆された。2ELISAによる桃GRP、LTPの定量前年度までに確立した、桃GRP、LTPの定量系(サンドイッチELISA)を用いて、様々な品種、成長段階の桃について多数のサンプルで定量を行った。現在、解析中である。また、近年、桃を使用した加工品が増えてきていることから、種々の桃加工品の定量も行った。その結果、GRP、LTPともに残留していることが明らかになった。当初の予定に近いペースで進んでいる。

1桃GRPがなぜ強いアレルゲン性をもつのか、他の果物アレルギーにも関与しているのかどうかを明らかにする。2作製したリコンビナントGRPを、患者血清やモノクローナル抗体をもちいて免疫学的に評価する。今後は、GRPアレルギー患者が注意すべき食品を探索すべく、モノクローナル抗体や患者血清をもちいて、交差反応性を解析していく。また、多少の加熱では変性しないGRPのアレルゲン性を低下する方法を探索し、アレルギー患者でもおいしく、安全に食べられる調理・加工の方法の確立を目指す。キャンペーン価格で購入できたものが多かったことに加え、予定より効率的に研究が進んだため。また、スケジュールが調整できず学会発表ができなかったため。残額で購入できるものがなかったため、次年度の消耗品購入に充てる予定である。効率的に研究を進めるため、セミドライ式のウェスタンブロッティング用転写装置の購入にあてることを検討している。
ヒトの心理・習熟状態を察して自律学習する上肢BMIリハビリ機器の開発研究

本研究では,複雑な上肢の身体機能を再建するBMI(Brain Machine Interface)リハビリ機器の操作を容易に習得できるシステムの実現を目的として,1使用者の内部状態(心理状態・習熟状態(操作能力))のモデル化2使用者の能力推定に基づく自律学習型運動意図推定手法3身体機能代償・回復のための機械補助・神経刺激型リハビリロボット(義手・手指補助器・電気刺激)を実現した.本研究では,複雑な上肢の身体機能を再建するBMI(Brain Machine Interface)リハビリ機器の操作を容易に習得できるシステムの実現を目的として,1使用者の内部状態(心理状態・習熟状態(操作能力))のモデル化2使用者の能力推定に基づく自律学習型運動意図推定手法3身体機能代償・回復のための機械補助・神経刺激型リハビリロボット(義手・手指補助器・電気刺激)を実現した.本研究では,リハビリ機器が使用者の生体情報から心理状態や習熟状態を"察して"適切な運動自由度を提供し,かつ使用者の潜在的な能力を引き出すようなインタラクションを行うこと,多くの運動自由度を有し複雑な操作を要するリハビリ機器でも容易に習得できるリハビリシステムの実現を目指す.平成25年度では,(1)操作能力や心理状態,習熟状態を推定するための使用者内部状態のモデル化,(2)使用者の能力推定に基づく自律学習型運動意図推定手法の構築,(3)機能代償・回復のための機械補助・神経刺激型リハビリロボットの開発を行う.(1)では,麻痺症状を麻痺グレードによって分類し,麻痺症状と必要なリハビリ内容に応じた制御が可能となるよう選択可能な制御入力(角度,筋電)を,被験者実験を通じて体系化を実施した.また,リハビリ機器の運動意図推定結果が使用者の意図どおりであるかを自律的に判断するために,脳波(ERP)や皮膚電位などを用いた定量化を試みた.(2)では,操作習熟度(筋電から算出される動作クラス間の分離度)から訓練データ毎に適応度を点数づけそれに基づき訓練データが生成・淘汰されるような強化学習ベースの推定手法を構築した.それにより,訓練初期の不必要な訓練データを淘汰でき,識別率の向上が見られた.(3)では,ワイヤ駆動型外骨格型上肢パワーアシスト機構(機能回復)及び脱臼を許容し粗雑な扱いを受けても故障しないすべり関節有する骨格機構を併用した上肢義手(機能代償)の開発を行った.しかし,(1)(2)の基礎理論の構築の注力したため,当初予定していた麻痺肢筋群と感覚フィードバックのための多点表面電気刺激装置は平成26年度に開発を持ち越すこととなった.本研究では多くの運動自由度を有し複雑な操作を要するリハビリ機器でも容易に習得できるリハビリシステムの実現を目指す.平成26年度研究成果は以下の3点である.(1)使用者の内部状態のモデル化のために,生体情報から操作能力や心理状態を推定する方法論の探索を行った.筋電,眼電,心電,fNIRS,皮膚電位,唾液アミラーゼを複数PCで同時計測するシステムを準備し,義手使用時(物体把持)の生体信号計測と特徴解析を実施した結果,眼電情報が陽に心理状態(把持行動への注意度・集中度)を表すことが明らかとなり,自律学習型運動意図推定手法に用いることを可能にした.(2)自然な操作感をもつリハビリ機器を実現するために,運動の準備動作時の非常に微弱な筋電位を用いた手指運動の推定手法を確立し,違和感なく3種の把持運動の義手操作を可能にした.また,選択的線形回帰モデルを用いた発揮力と把持姿勢の同時推定を実現し,力の強弱に関わらず3種の把持姿勢の高精度推定が可能となり,容易な操作習熟が可能となった.また,(3)機能代償・回復のための機械補助・神経刺激型リハビリロボットの開発として,これまで開発してきた4ch表面電気刺激装置の出力を5x5マトリクス電極に出力する多段リレーを用いた多点刺激システムを開発した.またリハビリに必要な運動を最大限引き起こす刺激位置を自動探索するアルゴリズムとPCベースのシステムを開発し,未経験者でも約200秒で電極位置が決定可能となった.また,昨年度開発した過大な力がかかると脱臼して破損を防ぐ義手指関節を改良し,関節剛性を高めつつ自動回復機能を有する超弾性合金を用いた指関節を実現した.さらに,指背面からフックを指先に引っ掛けるだけで装着可能な伸縮ベースを用いたワイヤ駆動型手指アシスト装置を新たに開発し,屈曲拘縮した手に対しても素早く容易に装着可能な装置を実現した.福祉・介護用ロボット本研究開発項目は,(1)心理状態や習熟状態の推定とそれを用いた筋電動作識別に関する基礎理論の開発と(2)リハビリテーション機器の開発に2種類に大別される.(1)に関しては,心理状態および習熟状態の定量化については,次年度より再現性の高い特徴量の抽出は必要とはなるが概ね計画通りの達成度である.一方,(2)に関しては,(1)の構築・検証を先行および注力して行ったため,先行研究で開発した機器の一部改良に留まった.そこで平成26年度に,研究予算を繰越し,次年度も開発を継続することとなった.

今後は,機能代償・回復のための機械補助・神経刺激型リハビリロボットの開発を中心に,研究開発を進めていく.特に,麻痺肢筋群制御と感覚フィードバックのための多点表面電気刺激装置の開発を進め,電気刺激が制御信号となる生体信号のアーチファクトとならないような同時計測手法を確立する.また,生理指標からの心理状態の定量化についても,より再現性の高い特徴量の探索を行う.さらに,自然な形での操作習熟が可能となるよう,低筋収縮時の筋活動でも制御可能な識別手法の開発なども行う予定である.本研究開発項目は,(1)心理状態や習熟状態の推定とそれを用いた筋電動作識別に関する基礎理論の開発と(2)リハビリテーション機器の開発であったが,(1)の基礎理論の構築・検証を優先および注力して行ったため,リハビリテーション機器開発が先行研究で開発した機器の一部改良に留まった.そこでリハビリ機器の開発費用を平成26年度に繰越し,平成26年度に基礎理論で制御されるリハビリ機器の開発を行うことにした.平成26年度では,研究予算(直接経費約2,400,000円)として,リハビリ機器の開発(筋電義手,パワーアシスト機,および電気刺激装置の試作:1,500,000円)及び基礎理論検証のための被験者謝金(200,000円),実験者補助者謝金(300,000円),及び成果公表のための費用(400,000円)を計上する.
３次元脳回路モデルの再構成技術と神経伝達物質のリアルタイム計測技術の開発

脳組織モデルのin vitro再構成技術として、PDMSマイクロチャンバにより細胞体位置を制御し、コラーゲン繊維配向技術により神経突起の方向を制御した3次元培養技術を開発した。構築した3次元脳組織モデルは、生体組織と同等の細胞密度および活動電位の伝播スピードを有し、顕著な薬剤応答を示すことがわかった。また、カーボンナノチューブ微小平面多電極アレイを開発し、マウス線条体脳スライスよりドーパミンのリアルタイム検出に成功した。開発した脳組織モデルの3次元培養技術および神経伝達のリアルタイム計測技術は、創薬スクリーニングにおける評価系としての応用が期待できる。本年度は、平成24年度で得られた結果を踏まえ、脳神経回路の3次元培養技術と神経細胞から放出される神経伝達物質をリアルタイムに計測可能な平面微小多電極アレイチップの開発を進めた。具体的な成果は以下のとおりである。1.脳神経回路の3次元培養技術の開発コラーゲンゲル繊維の配向技術とPDMSマイクロチャンバを用いて細胞体位置と神経突起の伸長方向を制御した3次元脳組織モデルの構築を行った。構築した3次元脳組織モデルを非侵襲かつ長期間神経活動をモニタリングできる平面微小多電極アレイ上にマウントし、機能計測を詳細に行った。シナプス薬剤投与により、層間を伝播するスピードおよび同期発火率の変化が顕著に表れたことから、本研究で開発した3次元脳組織モデルは薬剤評価系としての応用が期待される。また、本技術をヒトiPS細胞由来ニューロンに応用し、ヒト細胞を用いた3次元脳回路モデルの作製に成功した。2.神経伝達物質をリアルタイムに計測可能な平面微小多電極アレイチップの開発カーボンナノチューブを微小ITO電極上に電気めっきする技術を平成24年度に開発し、本年度は更に詳細な電気めっき条件の抽出および64電極同時めっき法の確立を行った。カーボンナノチューブの分散化条件および電気めっき条件を検討したことで、低インピーダンスの電極作製に成功した。作製したカーボンナノチューブ平面微小多電極アレイチップ上にヒトiPS細胞由来ニューロンが培養できることを確認し、高いS/N比で電気信号が取得できることがわかった。本年度は、脳神経回路の3次元培養技術と細胞から放出される神経伝達物質をリアルタイムに計測可能な平面微小多電極アレイチップの開発を主に行った。1.脳神経回路の3次元培養技術の開発大脳皮質の層構造を模倣する神経回路の3次元培養技術を開発した。PDMSマイクロチャンバに初代神経細胞を積層化させ、細胞体位置を制御し、コラーゲン繊維配向技術を用いて、神経突起の伸長方向を3次元空間内に制御した脳回路モデルを構築した。細胞体層のZ軸断面をHE染色した結果、約50μmの厚さであり細胞体密度は生体脳と同等であった。また、層間を伝播する活動電位のスピードを計測したところ、脳スライス大脳皮質における層間の伝播スピードと同等であった。また、細胞数、細胞種、神経突起の伸長方向を制御した3次元マイクロネットワークの構築技術を開発した。コラーゲンゲル上に神経細胞を播種後、培養中に細胞周りのコラーゲンゲルをレーザエッチングすることにより、他の細胞から隔離する技術である。本研究成果はLab on a chip誌の表紙に採択された。他の課題として、エキシマレーザ加工技術を用いた生体適合性材料の3次元空間内に細胞を埋め込む技術を開発した。2.神経伝達物質をリアルタイム計測可能な平面微小多電極アレイの開発ITO微小電極上へのカーボンナノチューブ(CNT)電気めっき技術を開発し、CNT微小平面多電極アレイを開発した。作製したCNT微小電極を用いて、1nMの濃度でドーパミンの検出に成功した。また、マウス脳スライス線条体部位から放出されるドーパミン、海馬スライスからのシナプス後電位、培養細胞からの活動電位のリアルタイム計測に成功した。In vitro神経細胞の活動電位、プレシナプス、ポストシナプスの機能を非侵襲かつリアルタイムに計測できる技術である。3次元培養技術の開発においては、当初の予定より研究成果があがり、4報の論文を書いた(3報採択、現在1報のリバイズ中である)。また、神経伝達物質の計測においては、実際の脳スライスからドーパミンをリアルタイム検出することに成功し、論文2報を投稿した(1報採択、現在1報のリバイズ中である)。上記6報の論文と多電極アレイを用いた応用研究(アミロイドβが及ぼす神経活動への影響とチモキノンによる保護作用)に関して1報論文を書いたため、本年度は計7報の論文を書いた。当初の計画以上に進展した根拠である。今後は、開発した3次元培養技術の発展と新しい3次元培養技術を開発すると共に、3次元培養による神経細胞の成熟化を神経活動、各種イオンチャンネルの発現を指標に調べる。また、血管構造を組み込んだ3次元組織モデルの開発を行う予定である。

神経伝達物質の計測技術は、より高感度を示す材料の検討を行う。得られた研究成果をできる限り迅速に論文投稿する。実験に使用する消耗品費を主として使用するが、研究成果が出てきたため、論文投稿費と学会発表費に半額程度の50万円(今年度の直接経費:90万円)を使用する予定である。
腎組織レニン・アンジオテンシン系と腎糖新生の制御による糖尿病治療

腎臓は肝臓とともに糖新生を行える臓器であり、絶食時には糖新生の40%を担う。H+-ATPaseは細胞内小胞を酸性にして、酵素の活性化やチャネルのmembrane recyclingに重要な役割を果している。腎糖新生の基質のグルタミンはミトコンドリアでαケトグルタル酸に変換される時に2分子のアンモニアを産生し、αケトグルタル酸は糖新生に使われる。腎H+-ATPaseをバフィロマイシンで抑制するとアンモニア産生酵素、腎糖新生の蛋白発現が抑制され、血糖が正常レベルに改善した。H+-ATPase阻害薬による腎糖新生の調節は糖尿病の新たな治療戦略になり得る。腎臓は肝臓とともに糖新生を行うことのできる臓器である。特に、絶食時には糖新生の40%を腎臓が担うので、腎臓の糖新生を調節することは糖尿病の新たな治療戦略になり得る。当研究室では腎組織レニン・アンジオテンシン系(RAS)が糖尿病では近位尿細管のアンジオテンシノーゲンのエンドサイトーシスの亢進により活性化され、またエンドサイトーシスに重要な役割を果たすH+-ATPaseの制御により、腎RASが抑制されることを検討している。本研究では腎糖新生がRASにより活性化され、腎臓のH+-ATPaseの抑制により腎組織RASの抑制とともに腎糖新生が抑制され、血糖を改善するか検討することを目的とする。腎臓での糖新生の律速段階酵素のPhosphoenol pyruvate carboxykinase (PEPCK)やglucose-6-phosphatase(G6Pase)は糖尿病では発現が増加しており、特に24時間絶食下での腎糖新生が亢進していた。また近位尿細管のsodium glucose cotransporter (SGLT2)の発現が増加しており、腎臓細胞質内グルコースおよび血糖が増加してしていた。微量アルブミン尿のみられる糖尿尿性腎症ではアンジオテンシノーゲンとプロレニンの糸球体濾過が亢進し、近位尿細管でエンドサイトーシスされ、腎組織アンジオテンシンIIが増加しているが、アンジオテンシン受容体遮断薬で治療すると糖新生酵素の抑制とともにSGLT2の発現も抑制され、腎細胞質内グルコースと血糖も改善した。近位尿細管のエンドサイトーシスはH+-ATPaseにより亢進し、その阻害薬により腎組織RASの抑制とともに、腎糖新生酵素とSGLT2の発現が抑制され、新たな糖尿病治療標的になり得るので、さらにH+-ATPaseの制御による糖尿病治療の可能性を本研究で継続していく。内科研究棟の移転に伴い、引越しと新しい臨床研究センターでの動物実験の申請などの物理的理由でやや遅れている。動物の飼育室の利用ができない時期が続き、遺伝子改変マウスの購入に資金を残してあるが、今後、新しい研究棟での実験が順調に進行すると思われる。また、糖尿病ではアンジオテンシノーゲンの血中濃度が上昇しており、微量アルブミン尿を呈する時にはアルブミンより分子量の小さいアンジオテンシノーゲンとプロレニンは糸球体を濾過され、近位尿細管にエンドサイトーシスされ腎組織のレニン・アンジオテンシン系の亢進に関与している。プロレニンの受容体はH+-ATPaseの構成分子と関連があり、RAS系の抑制により、腎臓の糖新生が抑制され,絶食下での血糖が改善した。腎臓のH+-ATPaseの抑制により腎臓の糖新生が抑制され、血糖の改善がみられた。腎近位尿細管の小胞内のpHを上昇することは、糖新生酵素の活性化を抑制し、SGLT2輸送体のmembrane recyclingを抑制し、またRAS系因子の腎エンドサイトーシスを抑制し、糖尿病の新たな治療標的になり得る。新たな研究棟で動物飼育施設の使用ができないこと、また、海外のH+-ATPaseノックアウト動物の提供が難しくなったことから、また,6月から異動予定であり、新たな動物実験が遅れている。当研究室では腎組織レニン・アンジオテンシン系(RAS)が糖尿病では近位尿細管のアンジオテンシノーゲンのエンドサイトーシスの亢進により活性化され、またエンドサイトーシスに重要な役割を果たすH+-ATPaseの制御により、腎RASが抑制されることを検討してきた。1型糖尿病モデルではRAS阻害薬のテルミサルタンにより腎臓の糖新生が抑制され、絶食下での血糖が有意に低下した。近位尿細管のエンドサイトーシスを抑制するためにH+-ATPaseの阻害薬(バフィロマイシンBFM)を投与すると糖尿病では増加している腎臓の糖新生酵素ホスホエノールピルビン酸カルボキシナーゼPEPCKとグルコースー6ーホスファターゼ(G6Pase)が、有意に抑制された。H+-ATPaseは近位尿細管の小胞のmembrane recyclingにも関連しており、ナトリウム・グルコース共輸送体SGLT2の発現もBFMで抑制された。さらに2型糖尿病ラットモデルにおいてインスリン糖負荷試験によりインスリン抵抗性が改善することを確認した。2型糖尿病ラットの腎臓の蛋白発現を質量分析で解析するとミトコンドリアのアンモニア産生と糖新生が連動して働いており、BFMはよりミトコンドリアで作用していることが分かり今後の検討を予定している。

予想に反し、腎内のレニン及びアンジオテンシノーゲンの量はBFM治療で変化が少なかった。H+-ATPaseの阻害は有意に血糖を低下させる新たな治療標的になり得る。しかし、全身への影響もあり、今後はより腎臓特異的に阻害した場合の検討を要する。腎臓は肝臓とともに糖新生を行える臓器であり、絶食時には糖新生の40%を担う。H+-ATPaseは細胞内小胞を酸性にして、酵素の活性化やチャネルのmembrane recyclingに重要な役割を果している。腎糖新生の基質のグルタミンはミトコンドリアでαケトグルタル酸に変換される時に2分子のアンモニアを産生し、αケトグルタル酸は糖新生に使われる。腎H+-ATPaseをバフィロマイシンで抑制するとアンモニア産生酵素、腎糖新生の蛋白発現が抑制され、血糖が正常レベルに改善した。H+-ATPase阻害薬による腎糖新生の調節は糖尿病の新たな治療戦略になり得る。腎臓の近位曲尿細管における糖新生と細胞内小胞のH+-ATPaseとの関連を明らかにして、H+-ATPase阻害薬がなぜ腎臓の糖新生を抑制し血糖を下げるか解明する。細胞の輸送体や酵素は細胞質の小胞に存在することが多いので、糖新生の酵素PEPCK, G-6-Paseが細胞内小胞に存在するか免疫電顕で検討する。H+-ATPaseは尿細管のapical membraneと細胞内小胞の間を行き来して発現を調節しているが、angiotensin IIはH+-ATPaseをapical membraneから細胞質内にendocytosisして活性を低下させることを私たちは観察してきた。しかし小胞内のpHがどうなっているかは不明であり、pHセンサーにより細胞小胞内のpHを測定して、ARBやH+-ATPase阻害薬の効果を検討する。小胞内のpHが酸性でないとPEPCK, G-6-Paseの活性が低下し,糖新生が抑制されること、SGLT2のmembrane recyclingも抑制され,血糖低下に貢献することなど、機序を細胞レベルで明らかにする。酸排泄に関与するアンモニア産生と糖新生の関連を明らかにしていく。レニン受容体はH+-ATPaseのアクセサリサブユニットATP6ap2と相同性があるので,H+-ATPaseのATP6APの遺伝子改変マウスを用いて、糖尿病モデルを作成し、血糖降下作用や腎糖新生への影響を検討する。プロトンATPaseの抑制とアンモニア産生の関係を明らかにして、腎アンモニア産生と腎糖新生の連関を明らかにする。近位尿細管培養細胞を用いて小胞内のpHを可視化して、糖新生酵素PEPCKとG6Paseの活性化との関連を細胞レベルで明らかにする。培養細胞内でのグルコース産生量を測定し、H+-ATPase阻害薬の糖新生抑制効果を検討する。アンジオテンシノーゲンとプロレニンは近位尿細管のみならず、podocyteにも多くエンドサイトーシスされるので、podocyteのvesicle輸送の機序を明らかにすることにより、腎RAS系の糖尿病における活性化の機序を明らかにして、その抑制による糖尿病腎症の治療戦略を検討する。
多次元半空間における粘性気体方程式の時間大域解の漸近挙動について

本研究課題は,空間多次元での粘性気体のモデル方程式(粘性保存則)に対する非線形波の漸近安定性の解析を目的としていた.平成14年度に行った研究代表者等の研究によって、多次元半空間上の粘性保存則に対して,境界条件と無限遠方での条件との関係のより解の漸近挙動は空間一次元の場合と同様に,希薄波,定常波、及びそれらの重ね合わせ波に分類される事が分かった.さらに,その各々のケースに対して,初期摂動の属する関数空間に依存する詳細な漸近レートを得た.この単独方程式に対する結果をより物理的に意味のある方程式系に拡張する事を目標としていた平成15年度の研究では,空間多次元の圧縮性ナビエーストークス方程式の球対称解の外部問題に対して幾つかの結果が得られた.この外部問題は半空間上の問題となり,研究代表者等によって開発された様々な手法を用いる事が出来る。まず空間次元が2以上の等エントロピー流に対して,外力項を持つ方程式系が非有界領域上で時間大域解を持ち,それは対応する定常解に収束する事が示された.さらに,空間次元が3以上ならば熱伝導を含む方程式系に対しても,同様な結果が成立する証明された.その後,平成16年度に行った研究では,粘性保存則に対して成立する減衰レートに関する定理が、一次元半空間上のナビエーストークス方程式でも成立することが示された.具体的には,空間一次元半空間上で等エントロピーの定常解への詳細な収束レートを得た.この定理は超音速流と亜音速流の両者に置いて成立する.さらに,超音速の場合では、同じ結果が熱伝導を考慮に入れた一般的な圧縮性ナビエストークス方程式に対しても同様な定理を証明した.本研究課題は今年度が最終年度となるが,一次元半空間上で成立する定理を空間多次元の場合に拡張することを目的として研究を継続する予定である.本研究課題は,空間多次元での粘性気体のモデル方程式(粘性保存則)に対する非線形波の漸近安定性の解析を目的としていた.平成14年度に行った研究代表者等の研究によって、多次元半空間上の粘性保存則に対して,境界条件と無限遠方での条件との関係のより解の漸近挙動は空間一次元の場合と同様に,希薄波,定常波、及びそれらの重ね合わせ波に分類される事が分かった.さらに,その各々のケースに対して,初期摂動の属する関数空間に依存する詳細な漸近レートを得た.この単独方程式に対する結果をより物理的に意味のある方程式系に拡張する事を目標としていた平成15年度の研究では,空間多次元の圧縮性ナビエーストークス方程式の球対称解の外部問題に対して幾つかの結果が得られた.この外部問題は半空間上の問題となり,研究代表者等によって開発された様々な手法を用いる事が出来る。まず空間次元が2以上の等エントロピー流に対して,外力項を持つ方程式系が非有界領域上で時間大域解を持ち,それは対応する定常解に収束する事が示された.さらに,空間次元が3以上ならば熱伝導を含む方程式系に対しても,同様な結果が成立する証明された.その後,平成16年度に行った研究では,粘性保存則に対して成立する減衰レートに関する定理が、一次元半空間上のナビエーストークス方程式でも成立することが示された.具体的には,空間一次元半空間上で等エントロピーの定常解への詳細な収束レートを得た.この定理は超音速流と亜音速流の両者に置いて成立する.さらに,超音速の場合では、同じ結果が熱伝導を考慮に入れた一般的な圧縮性ナビエストークス方程式に対しても同様な定理を証明した.本研究課題は今年度が最終年度となるが,一次元半空間上で成立する定理を空間多次元の場合に拡張することを目的として研究を継続する予定である.本研究は多次元空間での粘性気体のモデル方程式(粘性保存則)における非線形波の漸近安定性の解析を目的としている。空間一次元かつ境界壁がない全空間に関しては、1960年のIl'in-Oleinikの先駆的な結果以来、多くの結果が得られている。一方、境界壁をもつ一次元半空間では1990年代の末期から分担者である西原等により研究が始まったばかりである。また、空間多次元上での粘性保存則の研究はGoodmann等により、1980年代に幾つかの結果が得られている。本年の研究としては、先ずこれらの結果を統合して空間多次元単独粘性保存則の研究を計画していた。幸い本年の研究計画は十分に達成されたと信じる。境界条件と無限遠方での条件との関係で、解の漸近状態は、空間一次元の場合と同様に、希薄波、定常波、及びそれらの重ね合わせ波に分類される事が分かった。さらに、その各々のケースに対して、初期値の属する関数空間に依存する詳細な漸近レートを得た。以上の研究結果は、三本の論文に分けて発表する予定である。内、1本は現在投稿中であり、2本は執筆中である。以上の単独方程式の結果をより物理的に意味のある方程式系に拡張する事を最終目標としていたが、その準備となる問題として分担者の1人(西原)は一次元粘性気体の方程式に対して次の結果を得た。圧縮性粘性流が一定圧力の大気と接しているとき,その流れは速度と密度の方程式系の自由境界条件を持つ初期値問題の解として捉えられる。その解の漸近状態は、境界での大気圧と無限遠方での速度及び密度の関係によって,希薄波または粘性衝撃波となる。

この結果は、掲載受理され既にインターネット上で公表されている。本研究は空間多次元での粘性気体のモデル方程式(粘性保存則)における非線形波の漸近安定性の解析を目的としている。粘性保存則の時間大域解の研究では、1960年代のIl'in-Oleinikの一次元全空間上の先駆的な結果以来、多くの結果が得られている。一方、境界壁をもつ一次元半空間では、1990年代の末期から分担者である西原等により研究が始まったばかりである。また、多次元全空間上での粘性保存則の研究はGoodmann等により、1980年代に幾つかの結果が報告されている。これらの研究を踏まえ、平成14年度に行った報告者等の研究によって、多次元半空間上の粘性保存則に対して、境界条件と無限遠方での条件との関係のより解の漸近挙動は空間一次元の場合と同様に、希薄波、定常波、及びそれらの重ね合わせ波に分類される事が分かった。さらに、その各々のケースに対して、初期摂動の属する関数空間に依存する詳細な漸近レートを得た。この単独方程式に対する結果をより物理的に意味のある方程式系に拡張する事を目標としていた本年度の研究によって、空間多次元の圧縮性ナビエーストークス方程式の球対称解の外部問題に関して幾つかの結果が得られた。なお、この外部問題は半空間上の問題となり、昨年度の報告者等による研究によって開発された様々な手法を用いる事が出来る。まず、空間次元が2以上の等エントロピー流に対して、外力項を持つ方程式系が非有界領域上で時間大域解を持ち、それは対応する定常解に収束する事が示された。この結果は既に論文としてまとめられ、現在登校中である。さらに、空間次元が3以上ならば熱伝導を含む方程式系に対しても、同様な結果が成立する事が最近の研究で証明された。後者の結果は、現在執筆中であり、近日中に投稿予定である。来年度はこれらの結果を、球対称解とは限らない一般的な解の漸近解析に拡張する事を目標とする。本研究課題は、空間多次元上での粘性気体のモデル方程式(粘性保存則)に対する、非線形波の漸近挙動の解析を目的としている。平成14年度に行った研究によって、多次元半空間上の粘性保存則に対し、境界条件と無限遠方での条件との関係に依存して、解の漸近挙動は、希薄波、定常波、及びそれらの重ね合わせ波に分類される事が判明した。また、その各々のケースに対して、初期摂動の属する関数空間に依存する詳細な漸近レートを得ている。この単独方程式に対する結果をより物理的に意味のある方程式系に拡張する事を目標としていた平成15年度以降の研究では、まず空間多次元上での圧縮性ナビエーストークス方程式の球対称解の外部問題に対して次の結果を得た。空間次元が2以上の等エントロピー流に対して、外力項を持つ方程式系は非有界領域上で時間大域解を持ち、それは対応する定常解に収束する(この結果は既に論文として発表されている)。さらに、空間次元が3以上ならば熱伝導を含む方程式系に対しても同様な結果が成立する事が、最近の研究で判明した(この結果は現在投稿中である)。その後平成16年度に行った研究によって、粘性保存則に対する結果を圧縮性ナビエストークス方程式に拡張する事にも成功した。具体的な定理としては、空間一次元半空間上での定常解への漸近の速さを得ている。この研究では、まず等エントロピー流に対して漸近の速さを求めたが、さらにその後、熱伝導を考慮に入れた一般的な方程式系に対しても同様の結果を示した。以上の定理では、無限遠方において、前者では超音速と亜音速、後者では超音速である事を仮定している。
仏教辞典の電子化とインタネット掲載

計画に従い、ルイス・ランキャスター編集による「The Korean Buddhist Canon : ADescriptive Catalogue」(韓国大蔵経解説事典)の完全電子化を達成した。プロジェクトの補助者達が最初に本をのデータのスキャニング、及びOCRを行い、そしてデータ訂正を行った。その後、研究代表者は再度詳細にデータを訂正し、そのデータにXML形式を入力した。データの電子化が完全に達成された後、以下の二種類の方法でデータをインターネット上で出版する。(1)その辞典の電子化されたページをそのままの形式で、HTML文書として東洋学園大学のホーム・ページに掲載する。辞典ユーザーはそのホームページでsourceデータをダウンロードすることが可能である。この作業が現在完成した。
造血器腫瘍の遺伝子異常をターゲットとしたアンチセンス療法の開発

本研究において、我々は活性化あるいは増幅された癌遺伝子に対するアンチセンス・オリゴヌクレオチド(AS ODN)を用いて白血病細胞の増殖抑制とその機序を検討し、以下の諸点を明らかにした。(1)慢性骨髄性白血病(CML)の特異的再構成遺伝子BCR-ABLに対するAS ODNがCML細胞の増殖を抑制し、その機序はアポトーシスの誘導であること。c-myc ASODNでc-mycの発現を低下させると白血病細胞株HL60の増殖が抑制され、さらにその状態からc-mycの発現を急に増強させると、G1/S期境界の細胞が選択的に、かつ大量にアポトーシスをおこすこと。また、慢性関節リウマチで増殖する滑膜細胞にc-mycアンチセンス核酸分子を導入したところ、Fas/Fas ligandを介したアポトーシスが誘導されることを示した。(2)アンチセンス核酸分子の5′端および3′端の両端から4塩基間の3つの化学結合をホスホロチオエート型結合とし、中央の塩基の化学結合をホスホジエステル型としたキメラ型分子の合成方法、精製方法を確立し、このキメラ型分子が、すべての塩基間結合がホスホロチオエート型結合の核酸分子と同様、ヌクレアーゼによる分解に耐性であること。(3)従来のホスホロチオエート型結合をもつアンチセンス核酸分子と異なり、同様上記のキメラ型アンチセンス核酸分子は非特異的に蛋白質と結合したり、Bリンパ球を非特異的に刺激するなどの非特異的作用や非アンチセンス作用を示す程度が少ないこと。(4)キメラ型骨格をもったBcl-2,c-myc,EPOレセプター、およびケモカインSDF-1のレセプターであるCXCR4に対するアンチセンス核酸分子が有効な機能を有していること。Bcl-2アンチセンス核酸分子の最も有効な、従来の報告とは異なる標的配列を決定したこと。最近、造血器腫瘍の病態が遺伝子レベルで解明され、得られた知見は遺伝子診断として臨床に還元されつつある。しかし、治療に関しては、レチノイン酸による急性前骨髄球性白血病の分化誘導療法以外に、分子標的を明確にしたものはないと言わざるを得ない。したがって次の目標は、異常遺伝子やその転写産物自体を標的とする疾患特異的な治療法の開発である。本研究では、白血病細胞の特異的再構成遺伝子に対するAS ODNを用いてその増殖を抑制しうる可能性を引き続き探るとともに、低濃度での配列特異的な作用発現にはどのようなAS分子の設計が必要なのか、選択的に腫瘍細胞の増殖抑制を図るためには、どの遺伝子配列を標的にすべきなのか検討した。また、エンドサイトーシスにより細胞内に取り込まれたAS ODNが、リソソームにトラップされずに標的mRNAと結合できるようなドラッグ・デリバリー・システム(DDS)について研究を進めた。その結果、アンチセンス核酸分子の塩基配列特異的効果の発現のためには、すべての塩基結合が従来のホスホジエステル型やホスホロチオエ-ト型である分子より、3'および5'の両端をホスホロチオエ-ト分子としてヌクレアーゼ耐性を保持し、しかも中央部をホスホジエステル型として標的となる塩基配列との結合力と特異性を高めたキメラ型分子が優れていることを明らかにした。また、N-(a-trimethylammonioacetyl)-didodecyl-D-glutamate chlorideを用いて調整したアンチセンス包埋リポソームにより、細胞内への取り込み効率が高まることを明らかにした。平成10年度においても、上記の成果をさらに詳細に検討する予定である。

本研究では、白血病細胞の特異的再構成遺伝子に対するアンチセンス核酸分子(ASODN)を用いてその増殖を抑制しうる可能性を探るとともに、低濃度での配列特異的な作用発現にはどのようなAS分子の設計が必要なのか、選択的に腫瘍細胞の増殖抑制を図るためには、どの遺伝子配列を標的にすべきなのか検討した。ホスホロチオエート型ASODNを用いた実験系では、分子自体が非特異的に蛋白質と結合したり、Bリンパ球を非特異的に刺激するなどの非特異的作用を示し、観察された細胞生物学的な現象が真にアンチセンス作用によるものか、アプタマー効果などの非アンチセンス作用によるものか慎重に検討する必要があった。今回、われわれが検討したキメラ型分子はこれらの非特異的な作用が少なく、ヌクレアーゼによる分解にも耐性で、有効でかつ塩基配列特異的なアンチセンス核酸分子として機能することを本研究で示すことができた。また、このキメラ型アンチセンス核酸分子をもちいて従来の報告とは異なるBcl-2の標的配列を決定することができた。さらに、抗アポトーシス作用を有すると考えられるBCR-ABL, c-myc,Bcl-2に対するキメラ型アンチセンス核酸分子をもちいて、これらの増幅、あるいは活性化されている遺伝子の発現を制御することにより、白血病細胞の増殖が抑制され、その機序はアポトーシスの誘導であることを示すことができた。これらのアポトーシス誘導はテロメラーゼ活性の抑制によるものと考えられるが、現在この機序についてさらに検討中である。腫瘍細胞においてBcl-2の発現を抑えることでテロメラーゼ活性が抑制されることが明らかになれば、造血幹細胞移植を併用したあたらしい分子標的治療法の開発につながると期待される。