hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
災害対応ナレッジデータベース(KDDM)の構築と自治体防災研修への実践的活用

本研究では,過去の災害対応から得た経験や情報を"災害対応ナレッジデータベース(KDDM)"として一元的に集約し,将来的に,国や県,市区町村,企業, NPOなどがWeb等を介して共有・活用できるシステムのデータベース(基盤)を構築した.また, KDDMを用いた実践例として,行政と被災者をつなぐコミュニケーション・ルールのあり方への提言や,過去の災害教訓に基づき,平常時に行われる防災研修のための教材を作成し,自治体や市民,企業, NPOに対して実践した.近年,東海・東南海・南海地震や地球温暖化に伴う集中豪雨など,大規模災害の発生が危惧される中,"過去の経験や教訓"を最大限生かし,減災に向けた行政,企業,NPOなどの災害対応力を向上させることが急務である.しかしながら,災害対応に関わる経験や情報を収集・整理し,知恵や教訓として活用する仕組みが存在せず,また,人づての対応業務の引き継ぎでは,部署の異動も相まって持続性に乏しく,過去の教訓を次の大規模災害に生かすことを困難にしてきた.本研究では,過去の災害対応から得た経験や情報を"災害対応ナレッジデータベース(Knowledge Database for Disaster Management : KDDM)"として一元的に集約し,国や県,市区町村,企業,NPOなどが利活用できるシステムを構築する.さらに,KDDMを用いた実践例として,過去の災害教訓に基づき,平常時に行われる防災研修のための教材を作成し,自治体への導入に展開するものである.本研究では,過去の災害対応から得た経験や情報を"災害対応ナレッジデータベース(KDDM)"として一元的に集約し,将来的に,国や県,市区町村,企業, NPOなどがWeb等を介して共有・活用できるシステムのデータベース(基盤)を構築した.また, KDDMを用いた実践例として,行政と被災者をつなぐコミュニケーション・ルールのあり方への提言や,過去の災害教訓に基づき,平常時に行われる防災研修のための教材を作成し,自治体や市民,企業, NPOに対して実践した.平成20年度においては, "災害対応ナレッジデータベース(Knowledge Database for Disaster Management : KDDM)"の基礎データとなる「災害対応からの教訓と知恵」の収集・整理を実施した.具体的には,「平成18年7月豪雨」(鹿児島県川内川流域, 2006年)の主要な災害対応者である行政(国土交通省中部地方整備局川内川河川事務所,同局鶴田ダム管理事務所,鹿児島県さつま町)のそれぞれ各部局,県建設協会長や自治会長を対象として,インタビュー調査を実施し,当時の詳細な災害対応経験をビデオ映像,音声及びテープ起こしによる文字情報データとして整理した.調査内容は,各災害対応者が遭遇した状況を発災時から時系列に聞き取り,中でも混乱に対する状況判断や対応行動について,災害発生後の時間に即してオープン(非構造型)インタビューを行った.また,東海豪雨水害(愛知県名古屋市, 2000年),平成20年8月末豪雨(愛知県岡崎市, 2008年),浅野川氾濫豪雨(石川県金沢市, 2008年)についても,行政及び自治会等に対する同様の調査を行った.その結果,気候変動に伴う水害リスクの増大によって,「自然外力が既存施設の計画容量を超え,十分な機能が果たせなくなる.予測し得ない急激な水位上昇に対して,的確な避難指示が出せなくなる」といった従来の治水政策の限界を超えるシナリオを想定した新たな治水政策への転換の必要性を示唆した.その上で,従来のハード整備や避難体制の強化のみならず,応急から復旧・復興までの災害プロセスを記録・共有し,自助・共助・公助の役割を明確にし,新たな治水計画として盛り込むべき具体的な課題を提示した.2008年7月がら8月にかけて発生した「浅野川氾濫水害」(石川県金沢市)、「平成20年8月末豪雨」(主に愛知県岡崎市)の主要な災害対応者である行政(金沢市,岡崎市)のそれぞれ各部局、社会福祉協議会、自治会長等を対象として、エスノグラフィー調査を実施し、当時の詳細な災害対応経験をビデオ映像、音声及びテープ起こしによる文字情報として記録・整理した。「鹿児島県北部豪雨災害」(鹿児島県さつま町)についても、昨年度に引き続き調査を実施し、上述の災害との比較検討を行った。さらに、上記の各部局が保管している河川改修資料をはじめ、被災度判定調査や避難所運営記録など一次業務記録文書を収集し、紙媒体をPDFデータとして整理した。その結果、水害からの地域再建には大別して2つのプロセスがあり、地域リーダーがいずれを選択するかによって復旧・復興の進捗が異なることを明らかにした。1つは、地域と行政との協働による自立再建、もう1つは、地域と行政とが対立した訴訟を通じた補償の追及である。まず、過去の水害訴訟事例を整理し、判決動向を見据えた上で、住民にとっての水害訴訟の困難さについて考察した。また、2006年7月鹿児島県北部豪雨災害を対象とし、一部の被災者が河川管理者の瑕疵と責任を追求し、訴訟を求める中、住民と行政の間を調整する地域リーダーの対応が、円滑な地域再建をもたらし、その後の協働川まちづくりに導いたプロセスを明らかにした。こうした地域再建プロセスの違いが、将来の水害に備えた川まちづくりへの展開に影響を及ぼすことから、地域と行政のリスク・コミュニケーションのあり方とその重要性を提起した。平成22年度においては、災害対応ナレッジデータベース(KDDM)の基礎データとなる「災害対応の教訓と知恵」の収集・整理を継続実施した。具体的には、「平成21年台風第9号災害(佐用町)」、「平成21年中国・九州北部豪雨(防府市)」、「平成22年奄美地方豪雨

災害(奄美市)」を対象とし、各自治体の各部局、社会福祉施設、自治会等を対象として、インタビュー調査を実施し、当時の詳細な災害対応経験をビデオ映像、音声及びテープ起こしによる文字情報として記録・整理した。得られた成果および実践的活用は次の通りである。(1)気候変動に適応した治水政策の提示気候変動に伴う水害リスクの増大によって、ダム等の既存ストックに頼る治水政策の限界シナリオを提示した上で、新たな治水政策への転換の必要性を示唆した。その上で、応急から復旧・復興までの災害プロセスを記録・共有し、自助・共助・公助の役割を明確にし、新たな治水政策として盛り込むべき具体的な課題を提示した。(2)水害訴訟回避に向けた行政と住民間のコミュニケーション・ルールの提案一部の被災者が河川管理者の暇疵と責任を追求し、訴訟を求める中、住民と行政の間を調整する地域リーダーの対応が円滑な地域再建をもたらし、その後の協働川まちづくりに導いたプロセスを明らかにした。こうした地域再建プロセスの違いが、将来の水害に備えた川まちづくりへの展開に影響を及ぼすことから、地域と行政のリスク・コミュニケーションのあり方とその重要性を提起した。(3)自治体防災研修へのKDDMの実践的活用KDDMに基づく研修教材を作成し、愛知県豊橋市、名古屋市、国土交通省地方整備局等において、行政職員ならびに河川管理者、関連事業者、住民に対する防災研修を行った。平成23年度においては、災害対応ナレッジデータベース(KDDM)の基礎データとなる「災害対応の教訓と知恵」の収集・整理を追加した。昨年度までに、昨今発生した豪雨災害を中心に、丹念なインタビュー調査を実施してきたが、平成23年3月11日に発生した東日本大震災は未曾有の災害であり、その教訓を紡ぎ、復旧・復興プロセスを見通すと共に、次の災害に活かすことが急務と言える。発災直後から主に岩手県陸前高田市に滞在し、参与観察しながら、被災された自治体や社会福祉施設、自治会等を対象として、インタビュー調査を実施し、当時の詳細な災害対応経験をビデオ映像、音声及びテープ起こしによる文字情報として記録・整理した。得られた主な成果および実践的活用は次の通りである。1.被災自治体における災害対応の実態と課題被災自治体(主に陸前高田市)における発災後の災害対応の実態と課題を、復旧・復興や広報担当者に対するインタビュー調査を通じて整理し、東海・東南海・南海地震など今後の災害への自治体危機管理のあり方について示唆した。2.地域リーダーによる仮設住宅自治会の立ち上げと運営発災後から避難所および仮設住宅に長期滞在し、被災者との協働を通じて、仮設住宅自治会の立ち上げから運営までのプロセスを追跡し、地域再建に向けた地元地域リーダーの役割を提起した。3.自治体防災研修へのKDDMの実践的活用KDDMに基づく研修教材を作成し、名古屋市、国土交通省、建設業協会、NPOなどにおいて、行政職員ならびに河川管理者、関連事業者、住民に対する防災研修を行った。最終年度になるが、今後もKDDMに基づく防災研修教材の更新を図り、多様なステークホルダーの防災力向上を目指す。
保健婦活動における予防機能の再構築に関する研究

21世紀初頭における国民の健康生活の課題に対して,予防の視点から,保健師が担うべき課題とその活動方法を検討し,保健師活動のあり方を見直すことを目指した。調査方法は,母子保健福祉対策・成人老人保健福祉対策,精神障害者対策・難病対策などについて,近年のわが国の保健師活動の実績の中から,先駆的事例を取り上げ,その活動を導いている保健師の認識や考えを分析した。さらには,基礎自治体の保健師活動を全体的にみた先駆的事例の分析をした。その結果,予防活動として保健師が実現しようとしていたこと,及びその援助を導くために保健師が関心を向けていたことについて、その内容・特徴を捉えることができた。すなわち,近年の保健師活動においては,障害者・高齢者の地域生活の自立の実現,疾病者や精神を含む傷害を持つ人を同じコミュニティの住民が受容することの促進,感染症発生時の人々の不安の軽減などを実現しようとした取り組みが予防活動として重要な位置を占めている事が確認された。その援助方法を導くために,保健師が関心を寄せていた事項は,疾病や健康障害への偏見,感染にかかわる不安・混乱,潜在化している生活上の課題,ライフサイクル各期の課題,サービス利用意識,住民の問題解決能力,地域生活を支える人びととのつながり等であった。保健師は,看護の専門性において予防的意義のある実践を導いているが,その方法上の特徴は,次のとおりであった。(1)ヒュウマンケアの基本の実践である看護の方法を地域基盤で展開する,(2)セルフケア支援の原則の応用と人と人を繋ぐ実践,(3)人々の意識と価値観への対応,(4)誰もがその居住地で暮らすことができるように支える,(5)サービス対象となる母集団を基本にした社会的責任の追求をする,などである。1.保健師の予防活動の指導理念と活動方式:文献資料分析により、保健師が過去に実施した予防活動の特質を抽出する枠組みとして、「予防活動の指導理念」と「活動の方式」に焦点化することを確認した。わが国の保健師活動は、昭和10年代に遡るので、当初からの活動を2つの枠組みで予防活動の変遷を整理した。分析資料の範囲は、公衆衛生看護の教科書等の基本40文献とし、現在分析中である。2.先駆的な予防活動事例の分析:過去3年間の保健師活動実績の中から、6領域(母子保健・成人保健及び高齢者対策、感染症対策、難病対策、精神保健福祉対策)に分けて先駆例8事例の分析を行った。素材は、多胎児の親支援、虐待予防、脳卒中予防、痴呆予防、O-157、結核集団発生、クローン病患者支援、精神障害者在宅支援である。予防活動の特徴を示す内容は、地域支援ネットワークづくり、虐待予防・痴呆予防についてボランティア活動促進である。さらに、脳卒中予防や感染症集団発生については、対象者の全数訪問による予防指導の回路づくり、罹患の不安・偏見への対応をとりあげ、保健師固有の予防活動を抽出中である。3.基礎自治体を一つの単位とした予防活動:予備的段階の調査として、研究方法を模索するため、一つは、白川町・鋸南町で、30年間の予防活動実績と対比させながら当該活動を担ってきた保健師の考えを調べた。予防をどうとらえていたか、基礎自治体の行政サービスという広い視点から見たときその予防の考えはどうサービスに反映したかを分析中である。もう一つは、予防活動実施の要件を追究するため、羽島市・総社市・伊那市等同一規模の自治体の予防活動の現状、保健師側の予防への考え方などの実態を対比検討するための情報収集を実施した。1.予防活動事象の分析1)保健師活動にかかわる基礎

文献調査:前年収集の基本文献40件中、本研究に有効な記述のある19件に絞り、予防活動の理念・方法を整理した。2)先駆的予防活動調査:宮崎市の母子活動から虐待予防・MCG、横須賀市の多胎児教室・子育て支援、堺市・高知市の感染症対策から0-157・結核予防、笹神村・揖斐川町の成人・高齢者対策から脳卒中予防、浦添市の精神保健福祉活動、船橋市の難病支援体制作り、銚子市の介護予防活動を素材とした資料収集と検討を行い、一部次年度の継続調査を加えて、予防活動のあり方を取りまとめる。2.基礎自治体調査白川町・高山市・鋸南町・高富町について情報収集を行ったが、各自治体とも、保健師活動の過去の実績、積み上げ方に特徴があった。また、自治体の現在の活動や保健師が重点をおいている活動を取り上げてみると、自治体単位でどの領域でも共通する保健師の考え方・方法があった。しかも、それを把握し追跡することにより、予防活動を構築するときの原則を効率的に導き出す可能性も確認された。3.カナダの看護職の実践における予防活動の現状調査保健師活動として実践されている母子保健・精神保健・感染症対策(結核・エイズ)・老人保健につき調べ、わが国の場合との共通点・相違点を整理した。とくに相違点としては、看護職の自立性の顕著なこと、判断・実施できる内容の広さ、当事者による問題解決の重視などの視点と、一般住民への働きかけが存在しないことや地域全体・全住民を対象とする視点の欠如が目立ったことである。1.予防活動の先駆事例調査、2、基礎自治体における予防活動調査、3.保健師教育の教科書的文献調査、4.海外における看護活動の現状調査,について,各調査のまとめと全体の総括作業を行った。全体総括としては、まず、予防活動の先駆事例調査と基礎自治体における予防活動調査の事例から、保健師が予防活動の実施に際して着目した人々の健康生活の側面を8区分24項目に、さらに予防的意味を込めて実現しようとしていたことを、13区分27項目に分類できた。また、先駆事例調査から、予防的意義のある実践方法を導いた看護の方法としては、1.ヒュウマンケアの基本を踏まえた助力の実践として区分されたもの、2.人々の多種多彩なニーズを充足するための地域でのケア体制づくり、3.地域的問題解決が重要となるのでその基盤となる住民の主体性を引き出す取り組み、4.家族を単位とした看護サービスの実施、5.看護の立場から悪化が予測される事象を未然に防ぐための対応,の5つに整理できた。行政サービスの特性を発揮して導いた予防活動を、基礎自治体調査から公務労働として保健師が行った予防活動方法の特徴を整理した。その結果、次の4カテゴリーに区分した。すなわち、1.全住民を対象として活動する、2.住民誰でもが地域で生活し続ける基盤をつくる、3.住民に利用されるサービス・資源の提供・創設、4.看護支援方法の適用である。以上から、保健師の予防活動として確認できたことは、1.ヒュウマンケアの基本の実践である看護の方法、2、セルフケア支援の原則の応用と人をつなぐ実践、3.人々の意識と価値観への対応、4.誰もが居住地で暮らすことができること、5.サービス対象となる母集団を基本にした社会的責任の追求である。
新規がん抑制遺伝子候補Jmjd5の血管新生・造血における役割と発がん機構の解明

本研究では、レトロウイルス挿入変異法によって同定された新規がん関連遺伝子候補、Jmjd5(ヒストン脱メチル化酵素をコード)について変異マウスを作製し、個体レベルでの生理機能・がん発症との関わりを調べ、発生過程に必須な因子の1つであることが証明された。つまりJmjd5はCdkn1a(p21)の発現量を負に制御することで胚細胞の正常な増殖に貢献することが明らかとなった。申請者の研究グループは、マウス白血病ウイルスによって引き起こされたリンパ腫瘍からウイルス挿入部位を同定することで、がんの原因遺伝子の網羅的スクリーニングを行ってきた。その結果、既知のものを含む複数のがん抑制遺伝子候補を同定することに成功し、そのうち新規候補の1つとして、ピストン脱メチル化酵素のモチーフ、JmjCドメインをコードするJmjd5を得た。本研究では、Jmjd5コンディショナル・ノックアウトマウスを作製し、Jmjd5の個体レベルにおける生理機能・がん発症メカニズムを解明することを目的とする。まず、ターゲティング・ベクター由来のNeo遺伝子カセットが挿入されたままのJmid5変異アレルをホモに持つマウス(Jmjd5^<neo/neo>)は、心臓浮腫や出血、そして卵黄膜上を走行する血管分布パターンの異常といった典型的な血管新生異常を示し、胎生11日目前後に胚性致死となった。一方、colony forming解析によって血液発生への影響を調べた結果、Jmid5^<neo/neo>卵黄膜から増殖してくる血液前駆細胞の数は、野生型と比べて明らかに減少していた。一方、生殖細胞でCreリコンビナーゼを発現するトランスジェニックマウスとの交配で得られたJmjd5 nullマウスは、胎生10日目前後に胚性致死となり、Jmid5^<neo/neo>マウスよりも強い表現型異常が認められた。つまり血管・造血発生異常のみならず、尿膜形成異常および胚全体の著しい成長阻害が観察された。従って平成21年度は、以上の結果から示唆されたJmid5の新しい生理機能((1)血管発生と血液発生の制御、(2)細胞の増殖制御)に関して、実験的に仮説の検証を行っていく。私達の研究グループは、レトロウイルス挿入変異法の結果、新規がん関連遺伝子候補としてヒストン脱メチル化酵素をコードする、Jmjd5を同定した。本研究では、Jmjd5変異マウスを作製し、個体レベルでの生理機能・がん発症との関わりを調べ、以下の実験結果を得ることに成功した。(1)Jmjd5 nullマウスの表現型解析の結果、この欠損マウスは著しい成長阻害や血管新生異常を伴い、胎生11日目前後に胚性致死となることが観察された。また、Jmjd5 hypomorphic変異MEFを用いた解析結果、細胞増殖能の著しい低下が観察された。(2)胚発生期に関わる細胞周期調節因子の網羅的な定量PCRスクリーニングの結果、欠損胚および変異MEFどちらにおいても、p21(Cdkn1a)の発現が有意に上昇していることを発見した。p21特異的siRNAを用いてノックダウン解析を行ったところ、p21ノックダウン変異MEFの細胞増殖活性が、未処理の変異MEFと比較して有意に回復した。(3)p21の発現亢進が、主要なp21発現誘導因子の1つであるp53の発現量変化に起因しているかを検討した結果、p53 mRNAとp53蛋白質の発現上昇は、欠損胚および変異MEF、どちらでも認められなかった。(4)ChIP解析の結果、変異MEFにおけるp21遺伝子座上のヒストンH3K36メチル化修飾が有意に上昇していることを見出した。以上より、Jmjd5はp21遺伝子座上のヒストンメチル化修飾の性状を負に制御することで胚細胞の正常な増殖に貢献する、発生過程に必須な因子の1つであることが証明された。今後、血管新生経路における関与を検討するために、最近作製に成功した血管特異的Jmjd5欠損マウス(tie2-Cre;Jmjd5^<flox/flox>)を用いて実験を進める予定である。
GPCRを標的とした新規迷走神経制御機構の探索とその生理機能の解析

本年度は、以下に示す1、2、3の事項について主に取り組んだ。1)求心性迷走神経神経節のRNA-sequence解析結果を元に、高い発現が認められたGPCRについて、高感度in situ hybridization系を用いることで、発現細胞の詳細な解析を行なった。その結果、(A)ほぼ全ての迷走神経細胞に発現するGPCR、(B)少数の細胞体に限局して発現するGPCR、(C)神経細胞以外に発現するGPCR、に分類された。この結果を受けて、(A)および(B)のパターンに属するGPCRを以降の解析対象とすることができた。また、その中でも(B)に属するGPCRは特定の臓器を支配する迷走神経を限局的に制御する可能性が示唆された。2)GPCR特異的作動薬と神経興奮マーカーc-fosの検出系を組み合わせることで、上記候補GPCRの中から、実際に生体内で迷走神経を活性化し得るものを絞り込むことに成功した。結果、生理活性脂質をリガンドとするGPCRを中心に7個のGPCRを選別した。今後、c-fos陽性のタイムコースにおけるそれぞれの迷走神経依存的な薬理作用を網羅的に解析することでこれらのGPCRの機能が明らかとなる可能性がある。3)リガンド未知のオーファンGPCRであるGPR149については、その機能解析においてKOマウスが必須の研究ツールとなることから、このKOマウスをCRISPR-Cas9システムを用いて作製した。結果、KOマウスを複数ライン確立することに成功した。今後、当マウスの表現型解析を通じてGPR149の迷走神経機能に与える影響を解析可能となった。当初の予定であった候補GPCRの絞り込みは順調に進展したため。今後の展望を考慮し、申請者らが既に多数の研究ツールを所有している生理活性脂質をリガンドとするGPCRを中心に複数個の候補が得られた。また、予備的データとして、これらのGPCRの作動薬のいくつかで迷走神経依存性が期待される薬理作用が確認されている。さらに、当初の課題であったvivoにおけるオーファンGPCRの解析についても、ゲノム編集技術によって短時間でKOマウスを得ることができたため、次年度余裕をもって表現型解析が可能となっている。一方で、当初計画していた点変異によるオーファンGPCRの恒常活性化およびマウス神経節での発現誘導は難航が予想されたため、一時pendingとした。今後は候補GPCRに対して個体レベルでの機能解析を中心に取り組む。具体的には、まず利用可能な作動薬の薬理作用および昨年度確立したGPR149 KOマウスを用いた表現型解析から機能の推定を行う。特に迷走神経の関与が強く疑われる血圧・心拍数、呼吸機能、耐糖能・摂食、炎症応答を中心に解析する。先行して進んでいるLPA3受容体については、迷走神経が関与する各種病態モデルを適用し、内在性の機能を検討していく。

特に迷走神経の関与が強く疑われる血圧・心拍数、呼吸機能、耐糖能・摂食、炎症応答を中心に解析する。先行して進んでいるLPA3受容体については、迷走神経が関与する各種病態モデルを適用し、内在性の機能を検討していく。本年度の実験に用いた高感度in situ hybridizationの試薬が既に十分量存在したため、予定より購入量が少なかったため。次年度のin vivoにおける実験において動物が多数必要となるため、こちらの予算に当てる予定である。
IceCube実験の超高エネルギー宇宙ニュートリノ世界初観測が切り開く新たな物理

IceCubeは、平成21年度に全体の75%の検出器を用いて観測が行われた。本補助金のサポートにより、本年度までに取得した観測データやシミュレーション結果の解析を進めた。以下に成果を要約する。(1)平成21年度(75%検出器)の観測データの一部を衛星回線で転送し、基礎的なデータチェックを行い、正確なデータ取得と解析が現地でなされていることを確認した。(2)平成21年度の観測と同条件で、観測信号のシミュレーションを行った。(3)(1)および(2)で得た、約3000事象の観測データと約20万事象のシミュレーションを比較し、シミュレーションの改善点を検討した。その結果、将来的に個々の光検出器に依存した詳細な解析方法を用いるためには、バックグラウンドのシミュレーションを改善すべきであるという結論に至った。(4)平成20年度(50%検出器)に取得した全観測データおよびシミュレーション結果を用いて、より信頼度の高い解析方法を研究した。この方法は、検出光子の幾何学的形状を定量化することでニュートリノ信号を識別ずる。今回は、新たな定量化方法をプログラムに追加し、信号同定の精度向上を目指した。(5)新たな計算機システムの導入を検討した。本実験の解析精度を担う要因の一つとして、光検出器の周囲を覆う氷中の光伝播を正確に計算することが挙げられる。氷河の散乱長・減衰長モデルを較正するあたり、あらゆる座標・角度に放射されるチェレンコフ光の伝播を計算しなければならない。そこで、この膨大な計算をより高速に処理できる計算機システムの導入を検討した。今回試みたのは、アクセラレータボードを用いた計算機であるが、コード書き換えの必要性やコストパフォーマンスを考慮した結果、本年度の導入は見送った。
中性からアルカリ性の湖沼における溶存アルミニウム濃度上昇のメカニズムの解明

天然水中に高濃度のアルミニウムが溶解すると、水中に棲む魚や藻類に毒性を示すことが懸念されている。酸性化した土壌や湖沼では溶存アルミニウム濃度の上昇が報告され、溶けだしたアルミニウムの挙動やその毒性が詳しく研究されている。最近、中性の湖沼においても溶存アルミニウム濃度が夏に上昇することがわかってきた。本研究では、琵琶湖における溶存アルミニウム濃度上昇のメカニズムの解明を目的として、実験室に持ち帰った湖水に無機イオン・有機キレート剤を加えて溶存アルミニウム濃度の変化を調べ、湖水で観測される変化と比較した。前年度に、ルモガリオン法、HPLC法、ICP-MS法を組み合わせて溶存アルミニウムの形態別分析を行った結果、琵琶湖の表層で夏に増加する溶存アルミニウムは、アルミニウムのヒドロキソ錯体あるいは非常に結合の弱い錯体であることが示唆された。今年度は、琵琶湖湖水に無機アルカリを加えて、夏にpHが上昇する際に、懸濁態アルミニウムから溶存アルミニウムが溶出する反応を再現した。さらに、琵琶湖湖水から抽出されたフミン物質(今井章雄氏より提供をうけた)を湖水中濃度の約8倍に濃縮して湖水に添加したところ、湖水に溶存するアルミニウムの約50%が有機錯体となった。琵琶湖でアルミニウムの有機錯体が検出されなかった理由は、湖水に溶存する有機物が錯生成能を持たないためではなく、錯生成能を持つ有機物の濃度が低すぎるためと考えられた。酸性化した土壌や湖沼では溶存アルミニウム濃度の上昇とその影響が詳しく研究されているが、中性からアルカリ性である琵琶湖でも、春から夏にかけて表水層の溶存アルミニウム濃度が上昇することがわかってきた。本研究では、溶存アルミニウム濃度上昇の機構解明を目的として、琵琶湖の溶存アルミニウムの形態別分析法を検討した。孔径0.4μmのフィルターを通過する溶存アルミニウムを、アルミニウムのヒドロキソ錯体(Al_f)、アルミニウムの有機錯体(Al_<org>、アルミニウムのコロイド(Al_<col>)に分画するために、以下の操作を行った。ルモガリオン法(試水とルモガリオン試薬を反応させたのち、蛍光強度を測定してアルミニウム濃度を求める)で(Al_f+Al_<org>)を定量した。Al_<org>はHPLC法(試水をカチオン交換カラムで分離したのち、ルモガリオン法を応用したポストカラム法で検出する)で定量した。さらに、ICP-MS法で(Al_f+Al_<org>+Al_<col>)を定量した。2000年8月、11月、及び2001年2月に、琵琶湖北湖Ie-1地点(水深73m)で、水深0mから72mまで深度を変えて12層から採取した湖水を分析した。アルミニウムのコロイドは2月の底層水以外では検出されず、アルミニウムの有機錯体は全く検出されなかった。琵琶湖の表水層で増減する溶存アルミニウムは、アルミニウムのヒドロキソ錯体(Al_f=Al^<3+>+Al(OH)^<2+>+Al(OH)_2^++Al(OH)_3^0+Al(OH)_4^-)あるいは非常に弱い(HPLC法で検出できない)有機錯体であることが示唆された。
空間グラフの位相幾何学的研究

空間グラフの頂点ホモトピーによる分類のために必要とされるであろう頂点ホモトピー不変量として新たに2成分絡み目のコンウェイ多項式の3次の係数に基づいたものを構成した。さらにこの不変量をより一般的な立場から説明するであろう不変量として空間グラフの補空間の基本群のある剰余群で頂点ホモトピー不変量となるものを定義した。また結び目理論では任意の絡み目の任意の正則射影図は交差の上下を適当に入れ換えて自明な絡み目の射影図にすることが出来ることが知られているが、同様のことは一般の平面グラフでは成立しないことを示した。すなわち正体グラフの正則射影でどのように上下をつけてもホップ絡み目を含むものが存在する。また非自明なハンドカフグラフの正則射影全体の集合は有限個の非自明なハントカフグラフの正則射影の集合の和集合とはならないことを示した。この結果は結び目、絡み目、テーター曲線に関する従来の結果から見て意外な結果である。
甲殻類の卵黄形成調節機構の解明と人為起源化学物質の影響評価に関する体系的研究

本研究では、海産の小型甲殻類アミ(Mysid crustacea;Americamysis bahia)を対象として、卵巣成熟に密接な関係を示す卵黄タンパク質前駆体(ビテロゲユン,Vtg)の一次構造を明らかにすること、また卵黄形成機構に対する環境化学物質の影響評価を行うことを目的とした。本年度は、卵黄タンパク質のアミノ酸配列自体を解析した。甲殻類のVtgはsubtilisin認識配列が存在し、エンドプロテアーゼによって複数の卵黄タンパク質(ビテリン,Vn)へ切断され、卵母細胞に蓄積される。そこで、個体発生に必要な栄養源として卵黄タンパク質を蓄積している未受精卵を試料とし、卵黄タンパク質のアミノ酸配列決定を試みた。未受精卵抽出試料をSDS-PAGEに供したところ、推定分子量89kDaの位置に主たるバンド、58kDaの位置に比較的明瞭なバンドを形成した。これらのN末端アミノ酸配列を決定したところ、それぞれ10残基のアミノ酸配列が得られ、ホモロジー検索から、LLTPs(脂質伝達タンパク質)スーパーファミリーに属することが明らかとなり、アミVtg一次構造の一部を明らかにした。また、抗アミ卵関連タンパク質抗体を作製し、幼若ホルモン様物質fenoxycarbを曝露したアミの雌特異的タンパク質の発現をウェスタンブロッティングにより調べたところ、これらの個体では推定分子量89kDaのタンパク質発現が減少しており、性成熟の遅延が惹起されることを明らかにした。すなわち、このタンパク質はアミVtgの一部であることから、アミVtg産生は幼若ホルモンによる制御を受けるものと推察された。以上のことから、不明な点が多い甲殻類の内分泌調節機構の重要な基礎的知見が得られ、化学物質の生態影響評価に使用可能である抗体作製に成功した。内分泌かく乱物質の水生脊椎動物に及ぼす影響については多くの研究がなされているが、甲殻類など水生無脊椎動物に関する知見は極めて少ないのが現状である。卵黄形成に関与する内分泌調節機構は、これらの化学物質によって生物学的恒常性の機能異常が容易に惹起される可能性があり、生物個体群の保全という観点からもそれら作用機序を明らかにする必要がある。そこで本研究では、甲殻類における卵黄形成の調節機構を明らかにし、人為起源化学物質の影響評価を行うことを目的とした。本年度の成果は以下のように要約される。海産甲殻類アミ(Mysid crustacea; Americamysis bahia)を対象として、卵巣成熟と密接な関係を示す卵黄タンパク質前駆体ビテロゲニン(Vtg)に着目し、Vtg cDNAクローニングを試みた。既に単離されている甲殻類のVtgアミノ酸配列情報から種々の縮重プライマーを作製し、RT-PCRによってcDNA断片のクローニングを試みてきたが、現在までのところ部分断片の取得には至っておらず、縮重プライマーを再設計し、クローニングを継続しているところである。また、これまで作製した抗アミ卵関連タンパク質抗体を用いたウエスタンブロッティングにより検出されたタンパク質について、アミノ酸配列を解析し、その情報をもとにcDNA断片のクローニングも試みている。アミにおける脱皮制御機構を調べるため、脱皮を制御する内因性ホルモン20-ヒドロキシエクジソン(20E)をリガンドとする核内受容体Ecdysonereceptor(EcR)およびUltraspiracle(USP)mRNAの発現解析を行った。脱皮周期に伴うEcR/USP mRNA発現変化は、イムノアッセイにより測定した20E分泌変動と同様の傾向を示し、20E分泌とEcR/USPの発現はアミの脱皮制御に重要な役割を果たしていると考えられた。
西表島地名データベースの構築

1974年に着手した西表島地域研究の中で、あらゆる分野の研究や地域発展の基盤となるべき伝統的地名についての確かな資料が公刊されていないことから、これまでに収集した約1000件の地名について、方言による発音の正確さに重点をおいて再確認のためのフィールドワークを実施し、地名の意味の現地での説明や、土地利用の変遷などについてのデータベースの構築をおこなった。沖縄県で沖縄島に次いで大きい面積を有する西表島で今日まで伝承されている地名を、可能な限り細大もらさず記録し、それを多様な利用が可能なデータベースの形にすることをめざしている。地名そのものについての情報収集は、西部地区では、これまでの30年余の調査によってほぼ完成に近づいているので、方言による発音の確認を地元の人々とともに実施した。比較的調査の密度が薄い東部地区においては、同様の方言確認調査を行うとともに、海中地名にも注意を払う補充調査に着手した。さらに、最近利用が可能になった1945年の米軍撮影の高精細な空中写真を用いたききとりも、集落とその周辺について実施中である。これまでに記録した1300項目の地名再確認の作業は、地元住民との十分な事前の連絡のもとで、実地調査をおこなっている。調査で持ち帰った資料は、デジタル化して、データベースに収録する準備を重ねている。とくに、19年度は、島の東部での追加調査に加えて、西部の網取、崎山廃村の地名の石垣島での聞取り、祖納、干立の話者からの発音の確認と現地調査、東部の古見における聞取り調査を実施し、さらに、従来報告されている地名(誤記を含む)の総点検をめざして文献調査を実施した。地名の発音や地名をめぐる様々な伝承や歌を記録するために、デジタルビデオカメラを用い、編集とデータベース管理のために画像編集に適したパソコンを購入してまとめを進めつつ、次年度の調査とデータベース化に供えている。1974年以来継続してきた西表島の地域研究の中で、地元との協力体制のなか収集記録できだ西表島の地名はシノニム等を含み1300項目に達している。とりまとめにあたって、複雑な方言の発音の記述に調査もれがあることがわかったため、再度の録音などによる確認をフィールドワークによって実施することとした。正確な発音を添えたテータベースを構築することは、学問の進展にとっても、地域の活性化にとっても基本的に重要な取り組みである。これまでに西表島の地名についての伝承を、申請者に語って下さった話者のみなさんの多くが故人となり、若者たちは多くの地名伝承とは無縁な暮らしのなかで、島の歴史や自然について知る機会を永遠に失おうとしているよりに見える。この調査は、島の文化の後継者たる人人とともに、あらためて西表島の各地を踏査することで、現場にたって地名伝承を再確認し、継承をめざす、という実践的な意味ももっている。この研究の実践を通して、(1)ともすれば、大きな島の語源考のような、思弁的な袋小路にはいりがちな南島地名研究を科学的分析的な水準に高めるとともに、(2)地域文化の伝承者を育てるという、二重の目的が果たすことを企図したのであるが、前者の目標はほぼ達成され、後者についても西表島の現地での講演会の開催などを通して、若者たちを含む地域の多世代の住民に、地名をはじめとする伝承研究のすばらしさと重要性の一端を伝えることができた。
新奇環状反応中間体の立体構造に基づくニトリル水和酵素触媒機構の全容解明

ニトリル水和酵素(NHase)は、非ヘム鉄に配位したニトリル炭素をαCys-SOー配位子の側鎖O原子が求核攻撃することで環状反応中間体を形成する。シリアルフェムト秒時間分割構造解析(SFX)を用いて環状中間体形成以降の触媒反応機構を明らかにするため、以下の研究を行った。既知の立体構造をもとにしたQM/MM法によって環状中間体に作用すると予測されたβTyr37の変異体の結晶構造を決定した。また、顕微紫外可視吸収スペクトル法によって触媒反応中間体の補足に成功した。更に、SFXに使用可能なNHase微結晶の作成条件の最適化を行った。ニトリルヒドラターゼ(NHase)は、システインスルフェン酸(Cys-SO-)とシステインスルフィン酸(Cys-SO2-)を配位子とする特異な非ヘム鉄または非コリンコバルト活性中心をもつ。これまでに、研究代表者らは、Rhodococcus erythropolis N771由来鉄型NHase (ReNHase)のβR56K変異体を用いた時間分割結晶構造解析を行い、Cys-SO-配位子の側鎖スルフェニル基が非ヘム鉄に配位した基質のニトリル炭素を求核攻撃し、環状中間体を形成することを明らかとしている。また、18Oラベルした水で調製した野生型ReNHaseにメタクリロニトリルを基質として十分量加えて触媒反応をさせたときのFTIRスペクトルから、システインスルフェン酸基(Cys-SO-基)のスルフェニル酸素が溶媒分子と交換されることが示唆された。2015年度は、触媒反応中のスルフェニル酸素の交換を、18Oラベルした水で調製した野生型ReNHaseの質量分析で解析することを試みた。しかし、触媒反応が極めて早く、触媒反応が酵素液中の局所のみで起きている可能性を否定できず、更なる反応条件の検討が必要であった。一方、時間分割結晶構造解析に使用したβR56K変異体の構造データを用いて理論計算によって反応モデルを検証したところ、この変異体では、時間分割結晶構造解析で得られた環状中間体から先に触媒反応が進みにくいことが予測された。新たな時間分割構造解析用変異体として、種々のニトリルヒドラターゼ間で高度に保存されているβTyr37をフェニルアラニン、アラニン、ロイシンに置換した変異体を構築し、時間分割結晶構造解析のための結晶化を開始した。また、中性子構造解析に向けて、野生型ReNHaseの大量調製と大型結晶を得るための条件検討を開始した。研究代表者は、平成26年度10月に秋田大学に着任し、平成27年度4月より実験スペースを確保して研究を開始した。しかし、平成27年度前半は研究協力者の交替による実験技術の向上に時間を割く必要があり、後半になって、タンパク質精製装置や研究用保冷庫等の故障による実験の停止を余儀なくされたため、当初の予定よりも実験の進捗状況に遅れを生じることとなった。故障した装置は、研究費の前倒し申請を承認いただいたことで回避されており、当初の予定よりも若干遅れが出ているが、現在は順調に研究を推進できている。そのため、アクリルアミド工業生産用触媒やシアン系廃液浄化への利用など産業に極めて重要な酵素であるが、触媒機構は明らかにされていない。これまでに、研究代表者らは、Rhodococcus erythropolis N771由来鉄型NHase (ReNHase)のβR56K変異体を用いた時間分割結晶構造解析を行い、Cys-SO-配位子の側鎖スルフェニル基が非ヘム鉄に配位した基質のニトリル炭素を求核攻撃し、環状中間体を形成することを明らかとした。しかし、得られた構造をもとにした理論計算によると、βR56K変異体では環状中間体以降の触媒反応が容易に進まないことが明らかにされた。すなわち、以降の触媒過程を解析するためには、他部位の変異体を用いた時間分割構造解析を行う必要が考えられた。そこで、理論計算から環状中間体以降の過程に関与すると予測されるβTyr37をフェニルアラニン、アラニン、ロイシンに置換した変異体を構築し、大腸菌による組換え体として発現・精製した。βY37F, βY37A, βY37Lの各変異体はいずれも野生型の30%程度の触媒活性を示した。βY37F変異体を結晶化して1.2Å分解能の結晶構造を決定したところ、変異部位以外に大きな立体構造変化はみられなかった。また、βTyr37の水酸基に相当する位置には水分子が存在し、野生型と類似の水素結合ネットワークを形成していた。これまでに、βTyr37近傍で水素結合ネットワークを形成するαSer113をAlaに置換した変位体でも同様な現象が観察されていることを考え合わせると、この水素結合ネットワークが触媒機構に関与する可能性が示唆された。中性子構造解析を行うために、多量の野生型酵素を発現・精製できるように、菌体の培養条件の最適化を改めて行った。研究代表者は、平成26年10月に秋田大学に着任し、平成27年度4月より実験スペースを確保して研究を開始した。

平成27年度には研究協力者の交替やタンパク質精製装置、クロマトチャンバー等の故障による実験の停止を余儀なくされたため、当初の予定よりも実験の進捗状況に遅れを生じている。故障した装置は、平成27年度に研究費の前倒し申請を承認いただいたことで回避することができ、当初の予定よりも若干遅れが出ているが、進捗状況は回復してきている。ニトリルヒドラターゼ(NHase)は、Cys-SO-とCys-SO2-を配位子とする特異な非ヘム鉄または非コリンコバルト活性中心をもつ。アクリルアミド工業生産用触媒やシアン系廃液浄化への利用など産業に極めて重要な酵素であるが、触媒機構は未解明である。研究代表者らは、Rhodococcus erythropolis N771由来鉄型NHase (ReNHase)の低活性型変異体を用いた時間分割結晶構造解析を行い、Cys-SO-配位子の側鎖スルフェニル基が非ヘム鉄に配位した基質のニトリル炭素を求核攻撃し、環状中間体を形成することを明らかとした。しかし、理論計算からこの変異体では環状中間体以降の反応が進行しないことが示された。そこで、X線レーザーによるフェムト秒時間分割構造解析で野生型酵素の触媒過程を解析することを目的とし、顕微分光測定による中間体の捕捉と微結晶の作製を試みた。NO結合型ReNHase結晶の紫外可視顕微分光スペクトルを解析した結果、溶液と同様に、暗状態では380nm付近に吸収ピークを示したのに対し、光照射後に凍結した後は380nm付近の吸収ピークが減少し、700nm付近に吸収極大が観察された。次にNO結合型ReNHase結晶に、基質としてメタクリロニトリルをソーキングした後、光照射をして時間分割スペクトル変化を観察した結果、450500nm付近で吸収ピークが見られた。すなわち、結晶中の反応中間体を顕微分光で捕捉できたものと考えられる。次に、NO結合型ReNHaseの微結晶の大量作成条件をバッチ法により確立した。ニトリル水和酵素(NHase)は、非ヘム鉄に配位したニトリル炭素をαCys-SOー配位子の側鎖O原子が求核攻撃することで環状反応中間体を形成する。シリアルフェムト秒時間分割構造解析(SFX)を用いて環状中間体形成以降の触媒反応機構を明らかにするため、以下の研究を行った。既知の立体構造をもとにしたQM/MM法によって環状中間体に作用すると予測されたβTyr37の変異体の結晶構造を決定した。また、顕微紫外可視吸収スペクトル法によって触媒反応中間体の補足に成功した。更に、SFXに使用可能なNHase微結晶の作成条件の最適化を行った。18Oラベルした溶媒中での触媒反応の解析に関しては、基質の添加方法の最適化と触媒活性を低下させた変異体の利用などにより、質量分析による解析を実現する。また、新たに構築したβTyr37の変異体を用いた時間分割結晶構造解析を行い、新たな反応中間体の立体構造を得る。得られた結果を理論計算に適用し、反応モデルを検証する。また、1 mm×1 mm×2 mmサイズの結晶作成条件を検討し、中性子構造解析を試みる。βTyr37変異体を始めとする触媒機構に深く関わると予想される水素結合ネットワークに関係するアミノ酸残基の多重変異体を構築して時間分割構造解析を行うことにより、新たな反応中間体構造を決定する。得られた構造をもとに理論計算を実行し、触媒機構モデルを検討する。一方、触媒機構を明らかにするためには、やはり、野生型酵素を用いた酵素基質複合体の構造解析が不可欠である。
新しい環境応答ハイドロゲル・ポリサイラミンの設計と評価

本年度は昨年度までに確立してきた両末端に2級アミノ基を有するポリサイラミンテレケリックスを出発材料として特に相転移に伴うハイドロゲルの自由体積分布の変化の評価を行うとともに、遺伝子複合体の調製とその評価について次のように研究を行った。i)ポリサイラミンゲル中に発光プローブを導入し、相転移に伴うモビリティーの緩和測定を行い、粘弾性相転移を示すポリサイラミンゲルの基礎物性の測定を行った。ii)ポリエチレングリコール(PEG)/ポリサイラミン/ポリアミン三元ブロック共重合体の合成:昨年合成した2元ブロックに比べて、細胞内でのバッファー効果の期待できるポリアミンセグメントをさらに結合させることにより、細胞内エンドソームエスケープ機能の向上に成功した。iii)得られた三元ブロック共重合体とDNAとの組織化体の調製:ポリアニオンであるDNAを利用し、PEG/ポリサイラミン/ポリアミン三元ブロック共重合体とのポリイオンコンプレックス複合体を調製するした。iv)PEG/ポリサイラミン/ポリアミン-DNA複合体の物理化学性質の解明:粒径や分散安定性のpH依存性等の解析を行った。v)PEG/ポリサイラミン/ポリアミン-DNA複合体の生化学的性質の解明:細胞導入、DNA発現等の解析を行った。vi)PEG/ポリサイラミン/ポリアミン三元ブロック共重合体のPEG末端へのリガンドの導入:細胞に対する導入効率を向上させるため、末端に糖やオリゴペプチドなどのリガンドの導入設計を行い、細胞取り込み能の向上を達成した。申請者は新規高分子合成の観点から、長年にわたり新しい骨格を有する高分子材料設計に携わってきた。この中で主鎖にアミノ基と有機シリル基を交互に有する「ポリサイラミン」化合物が、pHや温度によって疎水性から親水性に変化し相転移する信号応答性材料であるとともに、相分離に伴い堅く広がったロッド状態(親水性)から柔らかく縮まったグロビュール状態(疎水性)にゴム弾性を著しく変化させる「ゴム弾性転移」を併せ持つユニークな材料であることを見いだしてきた。さらに極めて最近、このポリサイラミンハイドロゲルが、pH変化による体積相転移に伴い、その粘弾性を著しく変化させることを見いだした。これは通常のハイドロゲルが膨潤することによって柔らかくなるのに対し、ポリサイラミンでは親水性ネットワークが堅く広がったコンフォメーションを取るため、結果として「膨潤するとともに堅くなる」、ユニークな材料となる。また、通常のpH応答ゲルがpHジャンプに伴い表面スキン層を形成した後に平衡収縮に達するのに対し、ポリサイラミンハイドロゲルのpHジャンプでは安定なスキン層が数ヶ月にわたって維持されることがわかってきた。本研究ではこのようにユニークな特性を示すポリサイラミンをプロトン化状態で水溶液とし、架橋させることに成功した。これまで脱プロトン化状態で有機溶媒中で合成してきたゲルに比べ、低イオン強度下においてもゲルの形状を維持していることが確認された。これは広がった棒状状態で架橋反応をせしめるため、理想的な架橋転換距離を有するネットワークが形成したためと考えられる。この材料を基本として本年度は以下のように研究を行った。i)アクリルアミドを末端に有するポリサイラミンテレケリックスの合成:両末端に2級アミノ基を有するので、アクリル酸無水物との反応により両末端に重合性官能基を導入した。ii)アクリルアミド末端ポリサイラミンテレケリックスによる化学結合ゲルの調製:両末端の重合官能基による化学架橋ゲルの合成を水中プロトン化状態及び有機溶媒中脱プロトン化状態での合成を行った。iii)化学架橋ゲルのpH応答

能:上述のようにして調製した平膜及び粒子のpH変化に対する応答性を平衡膨潤変化として従来の架橋ゲルと比較検討する。平衡膨潤測定に関しては秤量法及び熱重量分析法を併用する。pHジャンプ試験:平膜や粒子など、様々な形状の物理架橋ゲルのpHジャンプによるスキン層形成の速度過程を検討し、プロトン化及び脱プロトン化状態で合成した架橋ゲルとの挙動と比較検討を行った。特にこれまで困難であったゲルの形状とスキン層形成の速度過程との相関を詳細に検討し、ゴム弾性転移を有するポリサイラミンゲルの特徴を明らかにすることができた。本年度は昨年度までに確立してきた両末端に2級アミノ基を有するポリサイラミンテレケリックスを出発材料として特に遺伝子複合体の調製とその評価について次のように研究を進めた。1.ポリエチレングリコール(PEG)/ポリサイラミンブロック共重合体の合成:末端のアミノ基を利用し、アルデヒド末端PEGとの還元アミノ化反応によりブロック共重合体を調製した。2.得られたブロック共重合体とDNAとの組織化体の調製:ポリアニオンであるDNAを利用し、PEG/ポリサイラミンブロック共重合体とのポリイオンコンプレックス複合体を調製した。3.PEG/ポリサイラミン-DNA複合体の物理化学性質の解明:粒径や分散安定性のpH依存性等の解析を行い、100nm程度のナノ粒子ができていることを確認した。4.PEG/ポリサイラミン-DNA複合体の安定性:DNA分解酵素を混合し安定性を評価したところ、裸のDNAに比べて飛躍的に安定化することが確認された。5.PEG/ポリサイラミン-DNA複合体の生化学的性質の解明:細胞導入、DNA発現等の解析を行い、pH低下に伴い、発現効率が上がることを確認した。6.PEG/ポリサイラミンブロック共重合体のPEG末端へのリガンドの導入:細胞に対する導入効率を向上させるため、末端に糖やオリゴペプチドなどのリガンドの導入設計を行い、効率的遺伝子キャリアを創成した。本年度は昨年度までに確立してきた両末端に2級アミノ基を有するポリサイラミンテレケリックスを出発材料として特に相転移に伴うハイドロゲルの自由体積分布の変化の評価を行うとともに、遺伝子複合体の調製とその評価について次のように研究を行った。i)ポリサイラミンゲル中に発光プローブを導入し、相転移に伴うモビリティーの緩和測定を行い、粘弾性相転移を示すポリサイラミンゲルの基礎物性の測定を行った。ii)ポリエチレングリコール(PEG)/ポリサイラミン/ポリアミン三元ブロック共重合体の合成:昨年合成した2元ブロックに比べて、細胞内でのバッファー効果の期待できるポリアミンセグメントをさらに結合させることにより、細胞内エンドソームエスケープ機能の向上に成功した。iii)得られた三元ブロック共重合体とDNAとの組織化体の調製:ポリアニオンであるDNAを利用し、PEG/ポリサイラミン/ポリアミン三元ブロック共重合体とのポリイオンコンプレックス複合体を調製するした。
高血圧症の素因遺伝子の解明

吹田市一般住民約4000人を対象として、以下に順次述べる遺伝子遺伝型多型と高血圧の関連を調べた。1.アミロライド感受性ナトリウムチャンネルは、アルファ・ベータ・ガンマの3種のサブユニットからなる。昨年度、ガンマサブユニットのプロモーター領域の変異と血圧レベルに相関のあることを報告したが、今年度は、アルファサブユニットに注目して解析した。全長に渡り変異を検索し、代表的ハプロタイプをカバーする変異を選んで、血圧値との相関を調べた。その結果、プロモーター領域の変異をホモに持つと(11%の頻度)、高血圧になりにくく、尿蛋白の陽性率も極端に少ないことが判明した。2.エタノールの中等度以上の摂取は、高血圧の要因である。アルデヒド脱水素酵素2のアミノ酸487番目が、グルタミン酸からリジンに変異すると、エタノールの代謝産物アセトアルデヒドを代謝できないため、少量のエタノールで酔いの症状が出現する。この遺伝子変異とアルコール摂取量には強い相関関係があり、男性においては、リジン型を持つと、持たない場合に比べ、アルコール摂取が低く、高血圧の割合も低かった。女性でも、アルコールの摂取量と遺伝型には相関があったが、全般に摂取量が少なく、血圧レベルと遺伝型の相関は認められなかった。3.内皮型NO合成酵素のエクソン領域、プロモーター領域の変異と血圧の関連は認められなかった。4.アルドステロン合成酵素遺伝子多型と高血圧の関連も認められなかった。
微生物による芳香族アミノ酸生産のための分子細胞生物学的基盤研究

大腸菌におけるフェニルアラニン(Phe)の取り込みには、これまでAroPおよびPhePの2種のトランスポーターが関与しているとされていたが、我々はこれらを欠損した株が顕著なPhe取り込み能を有することを見出した。そこで本研究では、この取り込みを担う新規なPheトランスポーターの同定および機能解析を行った。既知の芳香族アミノ酸トランスポーターをすべて欠失させた大腸菌は、Phe生合成系遺伝子(pheA)を欠損させても低濃度のPheを含有する最少培地上において生育が可能であった。しかしながら、ロイシンおよびイソロイシンの共存下においては著しい生育阻害が観察されたため、分岐鎖アミノ酸トランスポーターLIV-I/LSもしくはBrnQのPhe取り込みへの関与が示唆された。遺伝子学的解析の結果、LIV-I/LSがPhe取り込みを担う第3のトランスポーターであることが明らかになった。アザセリンは種々の酵素反応の阻害剤として機能するほか、DNAに損傷を与えることで生体に毒性をおよぼす。大腸菌においては、これまでに種々のアザセリン耐性株が取得されているが、中程度耐性株(芳香族アミノ酸トランスポーターAroP欠損株)に未同定遺伝子の変異(azaB)を導入した高耐性株においてPhe取り込み能が低下すること、また分岐鎖アミノ酸がアザセリン感受性を低下させることが報告されていた。そこで、AroP欠損株にLIV-I/LS欠損を導入したところ、アザセリン耐性が上昇した。本菌株にLIV-I/LS遺伝子群をプラスミドにて導入したところ再び耐性が低下した。このことから、LIV-I/LSが大腸菌のアザセリン感受性に関与することが明らかになった。チロシンフェノールリアーゼ(TPL)は、チロシンをフェノールとピルビン酸およびアンモニアに分解する反応を触媒する。TPLは数種の腸内細菌に存在し、チロシンを炭素源や窒素源として利用するために重要な役割を果たしている。ところで、Erwinia herbicolaのtpl遺伝子のすぐ下流には、膜タンパク質をコードすると思われる機能未知のORF(TutB)が存在していた。tutB遺伝子をクローニングして遺伝子配列を解析したところ、その推定アミノ酸配列はトリプトファントランスポーターに非常に高い相同性生を示した。大腸菌内で発現させて機能解析を行った結果、TutBはチロシン特異的(Km=40μM)トランスポーターであり、トリプトファンはチロシン取り込みにおける拮抗阻害剤であることが明らかになった。また、Tpl-TutBシステムのチロシン代謝における役割を解明するために、tpl遺伝子およびtutB遺伝子の発現様式をlacレポーター遺伝子を用いて解析した。その結果、大腸菌のトリプトファナーゼオペロンと生理的役割が非常に似ているにもかかわらず、tutB遺伝子とtpl遺伝子はオペロンを形成しておらず、またtutB遺伝子の発現量は非常に低レベルであることが明らかになった。遺伝子学的解析の結果、LIV-I/LSがPhe取り込みを担う第3のトランスポーターであることを明らかにした。

本菌株にLIV-I/LS遺伝子群をプラスミドにて導入したところ再び耐性が低下した。このことから、LIV-I/LSが大腸菌のアザセリン感受性に関与することが明らかになった。