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係争事例の合意形成への手続き的公正の役割：議題設題と当事者性が受容に及ぼす影響

利害の異なるステークホルダーが対立する係争事例において、建設的な話し合いが成立し、合意形成に到る要件について検討し、次の3点の成果が得られた。1)北海道銭函海岸での風力発電を巡る事例調査から、行政への信頼が低いときには手続き的公正が重要であることを示した。2)北海道幌延深地層研究センターの事例を元にした仮想シナリオ調査から、特定の価値のみを重視しそれ以外の価値を認めないという保護価値の緩和には、手続き的公正を高める手法の一つである権威統制のなさが重要である。3)風力発電合意形成ゲームを開発し、ゼロサムゲーム的ではなく共通目標の共有化が重要であることが示した。本研究の目的はどのような決定プロセスを経れば少しでも合意形成に近づけるかを明らかにすることである。賛否が拮抗する係争的な事例でも共通目標の設定ができた場合には対立を乗り越えた合意が可能だが、その共通目標を発見する道筋と議論の場の作り方の関係について、係争的事例の社会調査と実験からアプローチする。係争事例の調査として、石狩湾に面した小樽市銭函海岸に持ち上がった風力発電所建設計画をめぐる問題を取り上げた。とくに、ある特定の価値を絶対視し他の価値を認めない「保護価値」に着目し、保護価値を緩衝する要因として場所愛着を取り入れた。分析の結果、場所愛着は直接的には計画の受容への影響は小さいが、受容と強く関連する保護価値を緩和する効果が見られた。以上の成果をヨーロッパリスク学会にて報告した。さらに、係争事例の典型であるNIMBY問題として、幌延深地層処分研究センターを題材に取り上げた。ステークホルダーへのインタビューから、住民説明会時に反対している団体に司会進行を委ねたところヤジなどで説明にならないという事態が収まり、質疑応答が成立するようになったという情報を得た。これは、手続き的公正の重要な要素であると見なせる。この効果を検証するため、都市部住民に対して社会調査を実施した。その結果司会進行を委ねるという手続きが保護価値を緩和する効果があることが確認された。以上の結果を、平成26年度ヨーロッパリスク学会にて報告する予定である。また、議題設定を操作したシナリオ実験も実施した。ある論点について、利点・不利点を3つずつ記述した文章を提示するという点では共通だが、不利点は反対団体が、利点は推進団体が述べており、両者が対立しているというフレームをした条件では、当該問題への反対の割合が増え、熟考せずに判断しがちな傾向が見られた。以上の成果を、日本社会心理学会にて報告した。本研究の目的はどのような決定プロセスを経れば合意形成に近づけるかを明らかにすることである。1.係争事例の典型であるNIMBY問題として、幌延深地層処分研究センターを題材に調査を実施した。住民説明会時に反対している団体に司会進行を委ねたところヤジなどで説明にならないという事態が収まり、質疑応答が成立するようになったという。この事例を手続き的公正の要素である権威統制(authority control)の観点から再解釈を試みた。権威統制の効果を検証するため実験的な調査を実施した。その結果、権威統制のなさは直接的には受容を高めないが、保護価値(他の価値とくに経済的価値とのトレードオフを認めない価値)を緩和する効果が確認された。権威統制のなさは、保護価値を緩和することによって間接的に受容に影響を及ぼすことが示された。2.NIMBY施設の受容を補償金が促進するか実験を行った。経済的利益に焦点を当てた条件では、補償がない統制条件よりも嫌悪感が高まった。健康や福祉、教育など焦点を当てた条件でも、統制条件と受容の程度は変わらなかった。以上より、補償金はNIMBY施設の受容を高めないと結論づけた。3.風力発電所の建設を巡る係争事例を元に、利害の異なるステークホルダーが議論をして合意形成に至る過程を模したゲーミングを開発した。このゲーミングでは個人別と集団全体での目標達成度を数値化して評価できる。利害の不一致ではなく共通する問題への認識が共有化されているほど、両目標達成度が高くなっていた。一方、単なる情報共有だけでは共通目標の共有化が促進されず、個人と集団全体の目標達成に至らないことが示された。本研究の目的は、どのような決定プロセスを経れば合意形成に近づけるかを明らかにすることである。本年度は、以下の研究を推進した。1.風力発電を巡る事例調査を追加で実施した。メリットとデメリット、リスクとベネフィットといったトレードオフを総合的に勘案して評価していくという考え方を認めず、ある特定の価値に絶対的な重きを置く“保護価値"が、多様な価値を認めて議論をしていく合意形成過程を阻害する場合がある。調査の結果、行政が手続き的公正を満たすことで保護価値が緩和される可能性が示唆された。2.前年度、係争事例の典型であるNIMBY問題として、幌延深地層処分研究センターを題材に実施した調査について、さらに分析を進めてとりまとめた成果を、リスク研究学会誌に投稿し掲載された。

3.風力発電所の建設を巡る係争事例を元に開発したゲーミングについて、International Association for Simulation and Gamingで実演し、また成果を報告した。利害の不一致ではなく共通する問題への認識が共有化されているほど、両目標達成度が高くなるが、単なる情報共有だけでは共通目標の共有化が促進されず、個人と集団全体の目標達成に至らないことが示されたという知見を報告した。4.集団間葛藤を乗り越えるための合意形成には共通目標の共有が重要であるということを、仮想世界ゲームを用いて検討した。話し合いが出発点として重要であるが、ただ話し合えばよいというわけではなく、情報が共有され、さらに共有化された共通のゴールが重要であることが示唆された。利害の異なるステークホルダーが対立する係争事例において、建設的な話し合いが成立し、合意形成に到る要件について検討し、次の3点の成果が得られた。1)北海道銭函海岸での風力発電を巡る事例調査から、行政への信頼が低いときには手続き的公正が重要であることを示した。2)北海道幌延深地層研究センターの事例を元にした仮想シナリオ調査から、特定の価値のみを重視しそれ以外の価値を認めないという保護価値の緩和には、手続き的公正を高める手法の一つである権威統制のなさが重要である。3)風力発電合意形成ゲームを開発し、ゼロサムゲーム的ではなく共通目標の共有化が重要であることが示した。係争的な社会問題の合意形成における手続き的公正の役割について、新たな機能を見出した。第一に、トレードオフを認めない譲れない価値を有する場合でも、権威者による統制をなくしていくことで緩和できることを、事例調査を通じて実証的に示した。一方、補償金といったカネでは保護価値は緩和されず、受容には繋がらないことを実験的に示した。第二に、利害の異なる複数のステークホルダーが対立する状況でも、共通の問題認識の枠組みが形成されれば、社会全体にとってもどの個人にとっても望ましいと思える状況に近づけることを、ゲーム実験から示した。これらは、経験的には知られている部分があったとしても、実証的な証拠はほとんど示されてこなかった点であり、合意形成問題にとって貴重な一歩となる。環境社会心理学保護価値の緩和要件についてさらに検討を進める。補償金が保護価値を緩和しない効果について追試を試みる。また、情報共有が必ずしも共有信念の形成に至らない場合があるので、これについてさらなる検討を行う。以上を通じて、手続き的公正が受容に及ぼす効果について統合的な考察を行う。以上の研究成果を投稿論文としてとりまとめ、その成果を世に問う。上記概要1の成果は既に投稿済みで、審査が順調に進行中である。3の成果は、国際シミュレーション&ゲーミング学会で報告すると同時に、Full Paperとして国際学会誌に投稿したところである。また、2の成果は、日本リスク研究学会等で報告していく予定である。当初は、事例調査は一つだけの予定であったが、幸いにももう一つの事例調査を行うことができ、しかも、詳細なインタビューと社会調査が実施できた。
生体情報を用いた繰り返し学習の達成度評価に関する研究

本研究は、事象関連電位(ERP)を中心とした生体情報を用いた反復学習の達成度の客観的把握を目的とした。データ選択加算平均法(舩田他2010)によりERPを測定し、問題提示後の各標本化時刻における脳波の分布が反復学習により変化し、ERPの潜時を速めることを確認した。この変化を反映したモデルを作成し、反復学習による学習の達成度評価法を提案した。また、ERPの個人差の主要な要因は、習熟度の差であることを示した。効果的な学習を実現するには、学習効果を適切に測定・評価できる尺度が必要である。しかし、学習効果は個人差が大きい。そこで本研究は、大脳活動を中心とした生理データを用いて学習効果を適切に評価する方法(尺度)を定めることを目的とした。具体的には、(1)学習効果を評価するための適切な尺度を定め、その正当性を検証する、(2)異なる学習法による学習効果の違いを生理情報から検知できるか検証する、(3)学習完了状態の推定の可能を検証する、(4)事象関連電位の代替となる生理指標(呼吸、体温、筋電図など)の可能性を検証することを目標とした。実験に用いた反復学習は、(3桁の数)÷(2桁の数)の計算課題で、生理データは、主に課題実行中の事象関連電位(ERP)とした。ERPは、潜時を明確に測定するため、抽出データ加算平均法(DSAM)を使用して求めた。(1)に関しては、反復によるERPの変化をモデル化し、ERPの特徴値を用いて正答率で示される学習の進捗を説明する線形尺度を作成し、正答率と高い一致度を得た。(2)に関しては、除算と虫食除算を用いてERPの相違から両者の学習法の違いを認識できるか否かを検討した。(3)に関しては、正答率から推定する学習曲線を求め、この曲線上で学習完了状態を推定するモデルを作成し、ERPの変化と学習完了状態へ至る過程との関係を線形モデルで示した。(4)に関しては、今回の研究では、ERPの代替的生理データは確認できなかった。今後さらに検討が必要である。本研究を通して、「ERP上の個人差は、『課題に対する習熟度に起因する部分』と『それ以外に起因する部分』に分けられ」、「前者はERPの個人差の主要部分(本研究では約83.6%)である」という結果が得られた。生体データ(ERP)の個人差の主要部分が、課題の習熟に起因している可能性の示唆は、今回の研究の成果の一つである。本研究は、「学習は個別作業であり、個人差が極めて大きく、個々の学習者に適した学習方法の選択が可能となるためには、個々の学習者の学習中の生理指標を適切に測定・評価できる尺度が必要である」という認識のもとに、「学習中の大脳活動を中心とした生理データを測定し、そのデータを適切に評価する方法(尺度)を定め、そのような尺度を学習者の個別の達成度評価に応用することを目的」としたものである。1年目の研究では、計算課題を反復実行(学習)することにした。学習中の脳波を測定し、抽出データ加算平均法(Data Selecting and Averaging Method、DSAM)を用いてERPを測定した。DSAMは、標的とする電位(P3もしくはP300、課題提示後300ms付近に出現する正の電位)の分布を用いて、加算データ用の脳波を3クラスに分類し、それぞれのクラスの脳波を加算平均してERPを求める方法である。これにより、反復によるERPの変化を表すモデルを作成し、そのモデル上で学習効果を評価する尺度の作成を試みた。一方、学習の進捗を正答率から推定する学習曲線を求め、この曲線上で学習完了状態を推定するモデルを作成し、ERPと学習完了状態へ至る過程との関係を考察した。本研究では、研究期間内に「(1)学習効果を評定するための適切な尺度を定め、その正当性を検証する」、「(2)異なる学習法による学習効果の違いを生理情報から検知できるがどうかを検証する」、「(3)学習完了状態を推定することは可能であるかどうかを検証する」、「(4)事象関連電位の代替となる生理指標(呼吸、体温、筋電図など)の有用性を検証する」ことを研究の目標としている。従って、れらの細目の(1)、(3)を現在までに達成したと考えられる。本研究は、研究期間内に「(1)学習効果を評定するための適切な尺度を定め、その正当性を検証する」、「(2)異なる学習法による学習効果の違いを生理情報から検知できるカどうかを検証する」、「(3)学習完了状態を推定することは可能であるかどうかを検証する」、「(4)事象関連電位の代替となる生理指標(呼吸、体温、筋電図など)の有用性を検証する」ことを研究の目標としている。

すでに(1)の尺度は、モデルを定め、そのモデル上でのERPの変化からその正当性を検証した。その再現性の検証は本年度の研究の推進目標である。(3)の学習完了状態の推定は、学習完了状態を正答率から定義し、その変化に伴うERPの変化からその可能性を示した。従って今後は、「(2)異なる学習法による学習効果の違いを生理情報から検知できるがどうかを検証する」ことと、「(4)事象関連電位の代替となる生理指標(呼吸、体温、筋電図など)の有用性を検証する」ことに重点をおいて研究を進める。そのために、異なる学習法を設定し、課題実行時に脳波(ERP)だけでなく、導入した機器を用いて、他の生理的データも測定し、研究を推進する予定である。今後は、同一課題について、異なる学習法による学習効果の相違を検討する実験を行う。無学習、ICT機器を用いた学習、筆記による学習、暗記カードによる学習などを行う実験を計画し、予備実験後に、本実験を行う。事象関連電位と他の生理指標データを全て記録し、学習中の被験者の状態をポリグラフの形で記録する。この間の事象関連電位の変化と他の生理指標との間の関連性を調べ、学習効果の評定のための尺度の精度の向上をはかる。また、できるだけ少ない生理指標を用いた尺度を検討する。研究成果は、論文の形でまとめ、国内および国際会議で発表するなど研究成果を公表することに努める。次年度は、研究目的の細目である「(2)異なる学習法による学習効果の違いを生理情報から検知できるがどうかを検証する」ことと、「(4)事象関連電位の代替となる生理指標(呼吸、体温、筋電図など)の有用性を検証する」ことに重点をおいて研究を進める予定である。そのため、研究の目的(2)では、事象関連電位測定のための消耗品としての脳波計用記録用紙、インク、電極ペースト、電極、心電図測定用のカルジオクリームなどが必要である。大量の測定データが得られるので、ハードディスク、MO、USBメモリ等の記憶媒体も必要である。また、成果報告を論文にまとめるに際して、結果の説得力と客観性の観点から少なくとも被験者12名の測定データは必要となる。研究目的(4)の事象関連電位の代替生理指標の探索では、呼吸、体温、筋電図の測定のための新たな測定装置一式を1年目に準備したので、それらの機器を用いて測定を行う。消耗品としてデータ保存用の媒体(ハードディスク、MO、USBメモリ等)も必要である。実験協力者への謝礼も(2)と同様である。これらの実験と解析を行いながら、その結果を順次、国際会議、国内学会発表を行い、会議におけるコメントなども生かして、研究を続けたい。そのために、旅費・学会の参加登録料等が発生する。また、研究成果を論文としてまとめたり、最終的な研究報告書の作成にも印刷費等が必要となる。可能な範囲でこれらの費用に研究費を使用する計画である。
発癌過程におけるＲＢ１ＣＣ１、ｐ６２／ＳＱＳＴＭ１異常と臨床適用

肺癌手術症例のtissue microarrayを用いてRB1CC1とp62/SQSTM1の染色態度スコアリングを行った。肺癌ではRB1CC1が全て細胞質を示しており、肺癌の予後不良を反映していた。p62の発現を検討したところ、RB1CC1およびp62が共発現している群は他に比べて5年生存率が特に不良であり、p62は肺癌症例予後不良のバイオマーカーになり得ると考えた。口腔扁平上皮癌では、p62は癌細胞のグルタチオン誘導に寄与し、放射線治療抵抗性を惹起することが解った。臨床病理評価においてもp62蓄積を認める症例はやはり予後不良であり、p62は新しいバイオマーカーとなることが明らかとなった。肺癌手術症例を含むTMA(tissue microarray)を用いてautophagyに関与するRB1CC1とp62の免疫染色を施行し、腫瘍細胞の細胞質および核における染色態度のスコアリングを行った。RB1CC1の核内発現は腫瘍抑制に関与していると考えられ、乳癌においてはその発現の増加が臨床的予後の良好なことを示唆する。しかし肺癌ではRB1CC1の核内発現率が低く腫瘍抑制的には機能しておらず、このことよりRB1CC1は組織依存性のバイオマーカーである可能性が示唆された。一方、RB1CC1の細胞質内発現はオートファジーの制御に必須と考えられている。肺癌ではRB1CC1が細胞質で発現しており、予後不良化と関連している可能性が考えられた。次にp62の発現を検討したところ、RB1CC1およびp62が共発現している群は他に比べて5年生存率は不良であった。p62の発現を陰性、弱陽性、強陽性に分けて評価したところ、p62強陽性群では5年生存率が最も不良となり、p62/SQSTM1の過剰発現は肺癌症例予後不良のバイオマーカーになり得ると考えた。一方、口腔扁平上皮癌化におけるp62/SQSTM1の役割とその臨床的意義を検討した。口腔扁平上皮癌、異形成上皮、正常上皮においてp62の免疫組織化学的評価を行い、ヒト口腔扁平上皮癌細胞株を用いたp62の生物学的機能解析も行った。細胞生物学的な解析より、p62は癌細胞のグルタチオン誘導に寄与し、放射線治療抵抗性と関連することが示唆された。組織評価において口腔扁平上皮癌でp62の過剰発現を示す症例は予後不良であった。p62/SQSTM1の過剰発現は口腔扁平上皮の癌化に寄与し放射線治療治療抵抗性、予後不良のバイオマーカーになり得ることが実証でき、論文報告し得た。本内容は新聞各紙でも報道された。p62/SQSTM1の過剰発現は口腔扁平上皮の癌化に寄与し治療抵抗性、予後不良のバイオマーカーになり得ると考えた。口腔扁平上皮癌における解析では、p62/SQSTM

1が癌細胞のグルタチオン誘導に寄与し、放射線治療抵抗性と関連することを明らかにした。組織評価における口腔扁平上皮癌p62/SQSTM1の過剰発現は口腔扁平上皮の癌化に寄与し治療抵抗性、予後不良のバイオマーカーになり得ると証明し得た。p62の発現を抑制しRB1CC1の発現にも関与し、肺癌の臨床予後を示唆し得る因子の候補を絞り込み、その発現をTMAを用いて調べRB1CC1、p62、そして、肺癌症例の臨床経過との関連を検討する。免疫染色の結果をより客観的に評価するために、画像解析装置を用いて分析し鏡検との結果と比較する。組織提供者の臨床情報と併せて統計学的な検索を施行し、これらの分子発現が肺癌の有用なバイオマーカーとなりうるかを検討する。また、肺癌患者のp62蛋白の血清学的検出を目的としてELISA法の確立をめざす。口腔扁平上皮癌では従来の半定性的な免疫組織化学的評価が組織に於けるp62の過剰を定量的に正確に反映し、真に臨床予後不良のバイオマーカーとなり得るか、これを組織内分子の定量的評価が可能なDuoLink法を用いて解析する。肺癌、頭頸部扁平上皮癌の新規バイオマーカー候補となる分子の解析、免疫組織学的検討を行うための試薬などを購入する。海外共同研究者(Dr. Stephen Hewitt, National Cancer Institute in US)と共同で、画像解析装置を用いた病理組織の客観的定量解析を施行する目的で、薄切標本を一部海外に輸送するコストが必要かもしれない。一方で、p62蛋白の血清学的検出を目的としてELISA法の系を確立するために、一般試薬・酵素、臨床検体解析試薬、細胞培養諸製品の購入費ならびに抗体・核酸試薬準備費用として使用する予定である。
養殖魚の有害化学物質の残留・排出におけるMDRの役割

有機塩素系農薬エンドスルファンにより曝露されたティラピアMDR遺伝子の発現を解析し,エンドスルファンの体内動態との関連を調べた。その結果,肝臓におけるMDRの発現が,曝露後にタンパク質レベルで経時的に亢進されることが明らかとなったが,体内エンドスルファン濃度との相関は認められなかった。そこで,ティラピアMDRおよびその制御因子PXRの全長cDNAをクローニングしたところ,いずれも多くの多型がみられ,これらがエンドスルファンの体内動態の個体差に影響している可能性が考えられた。また,両者の発現パターンは大きく異なっていたことから,有害化学物質曝露によるティラピアMDRの転写は,哺乳類とは異なるメカニズムで制御されている可能性が示唆された。食の安全が脅かされる事件が多発している中,平成18年から日本ではポジティブリスト制度が導入され,水産用医薬品だけでなく,最大残留基準値を超える農薬類を含有する水産物の流通が禁止されるようになった。しかしながらここ数年,輸入水産物において薬事法で使用が禁止されているマラカイトグリーンの検出事例が多数報告された。また,国内の養殖環境においては,農薬が直接使用されることはないが,近隣の畑やゴルフ場からの流入など,生産者の意図しない農薬汚染があり,そのリスク管理が課題となっている。一方で,これらの薬物の魚体内での残留メカニズムに関する研究は少ない。本年度は,マラカイトグリーンやクリスタルバイオレットなどのトリフェニルメタン系色素の曝露によるティラピアMDR(multidrug resistance)遺伝子の発現誘導をmRNAレベルおよびタンパク質レベルの両方から解析し,薬物動態との関連を調べた。その結果,マラカイトグリーンの曝露により,筋肉において,MDR遺伝子の発現がmRNAレベルおよびタンパク質レベルの両方で亢進され,残留マラカイトグリーンの濃度とも相関を示した。解析した個体数が少なかったものの,MDRはマラカイトグリーンの残留・排出に関与し,魚体内での残留をモニタリングする上でのバイオマーカーとなりうる可能性が示唆された。MDRは薬物受容体PXRにより転写が調節されることから,CYP3Aなどその他のPXR標的遺伝子の発現解析を合わせて行うことにより,モニタリングの精度の向上と発現調節機構の解明につながることが期待される。一方,クリスタルバイオレットの曝露では,MDRの有意な発現誘導は見られなかったことから,他の薬物受容体の関連が予想され,新たなマーカー遺伝子を探索する必要性が生じた。食品の安全性確保は世界的に重要性が増してきており,我が国では水産物をはじめとした食品中への農薬類およびそれらの代謝物の残留は,ポジティブリスト制により規制されるようになった。これにより,近隣の畑から養殖場への農薬の流入など,生産者の意図しない農薬汚染へのリスク管理が課題となってきた。本研究では,養殖魚ティラピアにおける農薬類の残留・排出のメカニズムを明らかにすることを目的とし,農薬類がどのようにしてティラピアの薬物トランスポーターMDRの発現を制御するのかを解析した。本年度は,有機塩素系農薬エンドスルファンの曝露によるティラピアMDR遺伝子の発現誘導をmRNAレベルおよびタンパク質レベルの両方から解析し,薬物動態との関連を調べた。その結果,エンドスルファンの曝露により,肝臓におけるMDRの発現がタンパク質レベルで経時的に亢進された。しかし,mRNAレベルでの発現亢進は見られず,残留エンドスルファンおよびその代謝物であるエンドスルファンスルフェートの体内濃度との相関も認められなかった。MDRは薬物受容体PXRにより転写が調節されることから,MDR遺伝子の転写制御機構を解明するために,ティラピアMDRおよびPXRの全長cDNAをクローニングした(DDB Jaccession no. : AB699095,AB699096)。その結果,ティラピアMDRの全体およびPXRのリガンド結合ドメインには多型が多くみられ,これらの変異がエンドスルファンの体内動態データのバラツキに影響している可能性が考えられた。また,各組織におけるMDRおよびPXR遺伝子の発現を調べたところ,両者の発現パターンは大きく異なっていた。このことから,ティラピアMDRの転写は哺乳類のそれとは異なり,PXRを介さずに行われる可能性が示唆された。食品の安全性確保は世界的に重要性が増してきており,水産物においては,近隣の畑から養殖場への農薬の流入など,生産者の意図しない農薬汚染へのリスク管理が課題となってきた。これまでに,養殖魚ティラピアにおける農薬類の残留・排出のメカニズムを明らかにするために,薬物トランスポーターのひとつであるMDRの発現を解析した。その結果,有機塩素系農薬エンドスルファンの経口曝露により,肝臓のMDRタンパク質の発現が経時的に亢進されることを見出した。しかし,mRNAレベルでの発現亢進は顕著ではなく,残留エンドスルファンおよびその代謝物であるエンドスルファンスルフェートの体内濃度との相関も認められなかった。

本年度は,MDR以外の薬物代謝関連遺伝子にも着目し,それら発現変動との関係について解析した。なお,環境要因や個体差による影響を軽減するため,曝露試験にはティラピアの遊離肝細胞を用いた。その結果,MDRの他に,CYP1A,CYP1B,CYP3A,GSTθ1,UGTの5遺伝子の発現が50 ppmのエンドスルファン曝露により一過性に亢進することが明らかとなった。また,哺乳類との比較から,これらの遺伝子の発現はいずれも薬物受容体AhRまたはPXRに制御されていることが予想された。一方,MDR遺伝子の転写制御機構を明らかにするためにはプロモーターを含む5'上流領域のクローニングが不可欠であるが,ティラピアMDR遺伝子のプロモーター領域は一部しか明らかとなっていない。そこで,inverse PCRによるMDR遺伝子の5'上流領域約5 kbのクローニングを行った。その結果,5'上流領域約5 kbの中にはPXRの認識配列であるER-6やDR-3は見当たらなかった。今後,さらに上流の領域のクローニングやPXR以外の薬物受容体による発現調節の可能性などについて解析する必要性が生じた。当初の計画のうち,最も時間がかかると予想されたMDRおよびPXRのcDNAクローニングに成功し,おおむね順調に進展しているといえる。MDR遺伝子の5'上流領域の解析も現在進行中である。発現解析がやや遅れているものの,曝露実験およびサンプリングは順調である。また,FLAG-tagged PXR発現コンストラクトの作製が終了し,in vitroにおけるMDR遺伝子の転写制御機構解析の準備が整った。24年度が最終年度であるため、記入しない。ティラピアの全ゲノムショットガンシークエンスのデータが2011年9月30日に公開されたため,その配列をもとにMDR遺伝子のさらに5'上流領域の解析を進める。クローニングしたMDR遺伝子のプロモーターの下流にホタルのルシフェラーゼ遺伝子を連結したレポーターベクターを作製し,PXR発現ベクターとともにティラピア肝臓由来の培養細胞株に導入し,ルシフェラーゼアッセイによりMDRの発現のメカニズムを明らかにする。これにより,MDRが有害化学物質の残留・排出に関与し,魚体内での残留をモニタリングする上でのバイオマーカーとなりうるかどうかを明らかにする。
負電荷ハイペロン励起状態の輻射崩壊の研究

負の電荷を持つハイペロン粒子がガンマ線を放出して崩壊するという稀な過程の測定を通し、基本粒子クォークからどの様に物質が構成されているか、その構造や機構の理解を目指して高エネルギーガンマ線によるハドロン生成過程に伴い発生する中性子を検出するための検出器を開発した。当初目的としていた反応はビーム強度の不足等の要因により測定には至らなかったが、その他様々なハドロン生成反応において中性子検出により新たな情報を得る事が可能になった。平成20年度は、本課題研究の実験に向け、検出器の詳細検討とそれに関わるデータ収集系の整備を行った。本研究課題では、Σマイナス(1385)ハイペロンの崩壊を正確に検出する必要があるが、その基本となる中性子検出器について検討の結果、当初計画していた液体シンチレーターを用いたものではなく、プラスチックシンチレーター検出器を使用した方が良いという結論を得た。プラスチックシンチレーター検出器を用いることによって、検出器が細かく分割され、位置検出の精度が高くなるからである。一方で、処理すべき信号の数が増えて検出器のコストが増大する可能性があるが、本研究課題について国内外の研究者と議論したところ、検出器の一部について協力が得られる事となり、コスト面の問題は解消した。また、崩壊過程に生成するΣマイナス(1197)粒子の崩壊点を精度良く測定するために、シリコンストリップ検出器を用いる必要があることが分かった。これらの検討結果を踏まえ、検出器整備の優先度としてシリコンストリップの読み出し回路系の構築が高いと判断し、これらの開発を開始した。この読み出し回路は、従来使われていた読み出し回路に比べて非常に短い100ナノ秒程度というパルス整形時間で信号を処理できる性能を有しており、本課題研究に必要な大強度ビームでの実験に適したものである。平成20年度末の段階では、検出器から得られる信号を処理する回路の開発にとどまっているが、来年度以降検出器全体の開発、整備を進めて行く計画である。平成21年度は昨年度に引き続き、課題研究実験の遂行に向け、実験セットアップの詳細検討、検出器系の準備を行った。検出器の一部であるシリコンストリシプ検出器については、京都大学、ソウル大学グループと共同でプロトタイプ検出器を用いた基本動作の確認及びデータ読み出し回路系の開発を行った。また、東北大学電子光科学研究センターの電子ビームを用いてプロトタイプ検出器の性能評価を行った。テスト実験では、検出器を高計数率で荷電粒子が通過する状況を作り、高速読み出し性能の評価を行った。その結果本研究の要求を十分満たす事が確認出来た。中性子検出器の準備としては、米国オハイオ大学が現在所有するプラスチックシンチレーターを借用して実験セットアップの充実することで中性子の検出効率、立体角の増加を図る検討が進み、そのための準備及びセットアップの設計を進めた。本研究課題の実施のためのビームタイムの割り当てを受けるため、現有のレーザー電子光実験装置に中性子検出器を追加することによって成果が期待できる物理の検討を更に進め、「Λ-核子相互作用の測定」という実験提案を平成21年10月のレーザー電子光実験施設共同利用の課題採択委員会に提出し、実験が採択された。レーザー電子光実験全体の実施スケジュールや、レーザー電子光ビーム増強計画の進行状況との関連もあり、本年度の研究は実験の準備段階にとどまったが、来年度は実際にビームを用いた実験を開始出来る予定である。SPring-8レーザー電子光実験施設において、高エネルギーガンマ線によるハドロン生成反応に伴って生成される中性子を検出するため、既存の荷電粒子測定装置に新たに中性子検出器システムを設置した。既存の荷電粒子測定装置は、前方に放出される荷電粒子の運動量を測定するための磁気スペクトロメーターと、飛行時間測定装置で構成されている。本課題研究により、飛行時間測定装置の下流側に高さ170cm×幅160cmの領域を覆う、厚さ10cmのプラスチックシンチレーターから成る壁状の中性子検出器系を構築した。この検出器系により、標的から約25度よりも前方に放出される中性子をおよそ10%の検出効率で測定できると期待される。本年度は本中性子検出器を稼働させ、重水素標的からのハドロン生成反応の実験を実施した。レーザー電子光施設の増強計画の進行状況およびレーザー電子光実験全体の実施スケジュールとの関係から実験を実施後、十分に解析が進むところまでは至らなかった。今後の解析により本検出器系の性能として、検出効率、位置分解能、運動量分解能を評価する予定である。さらに本検出器系の構築に合わせて採択された共同利用課題である「Λ-核子相互作用の測定」に関する結果を出せると期待される。本課題研究である負電荷ハイペロン励起状態からの輻射過程という稀な崩壊過程の研究に対しては、レーザー電子光強度の増強後の測定方法の指針となる情報を得る予定である。本課題研究で中性子検出器系を構築した事により、重水素中の中性子からのファイ中間子光生成反応や、ペンタクォークのシータ粒子からの崩壊中性子の検出等、これまで測定できなかった様々な反応の研究の展開も期待される。
環状配位子-金属錯体を触媒として用いる芳香族ハロゲン化物の脱ハロゲン化

新しい環状配位子の金属錯体を合成し、芳香族ハロゲン化物の脱ハロゲン化における、これら金属錯体の触媒作用について研究した。その過程で、光を利用し、環状配位子-ニッケル錯体を触媒として用いた芳香族臭化物の脱臭素化システムを、新たに開発した。今年度、樹脂への固定化や光感応基を導入するための“鍵配位子"となるピリジン環の第4位に水酸基を導入した環状配位子L3を合成した。ケリダム酸を出発物質として4工程を経てジアルデヒドAを合成し、これとトリアミンBを銅イオン存在下でテンプレート反応させて、環状配位子L1を合成した。さらに、L1の窒素原子をトリフルオロアセチル基(TFA)で保護して得られるL2から、水酸基の脱保護を行い、目的の環状配位子L3を得ることができた。さらに、環状配位子L3を、側鎖として反応性の官能基である塩化ベンジル基をもつ樹脂(RX)と反応させ、樹脂上に固定化を図る研究を行った。環状配位子L3は樹脂上に固定できることは分かったが、固定効率を向上する必要があることが判明した。さらに、光感応基を持つ環状配位子-金属錯体の合成を行った。これまでに“鍵配位子"L3と4-プロモメチルビピリジンを反応させ、配位子L5を合成し、これを、ジクロロビス(ビピリジン)ルテニウム錯体と反応させ光感応基であるルテニウムトリスビピリジン錯体が結合した配位子L6を得ることができた。今年度、樹脂への固定化や光感応基を導入するための"鍵配位子"となるピリジン環の第4位に水酸基を導入した環状配位子L3の合成法を改善し確立した。すなわち、ケリダム酸を出発物質として4工程を経てジアルデヒドAを合成し、これとトリアミンBを銅イオン存在下でテンプレート反応させて、環状配位子L1を合成した。これらの結果は、論文として発表するよう今年度準備する。引き続き、環状配位子L3を、側鎖として反応性の官能基である塩化ベンジル基をもつ樹脂(RX)と反応させ、樹脂上に固定化を研究した。固定効率をさらに向上する必要がある事や触媒として機能させるためには錯体全体の電荷をコントロールする必要がある事がわかったさらに、光官能基を持つ新しい環状配位子-金属錯体の合成を行った。光官能基であるルテニウムトリスビピリジン錯体を様々な架橋基を用いて環状配位子に繋ぐ方法を検討した。その結果、3種類の新しいルテニウムーニッケル2核錯体を合成することが出来た。これらの結果は、2010年度の錯体化学討論会に発表する予定である。本研究では、脱ハロゲン化反応において優れた触媒作用を示す環状配位子-金属錯体を作り出すことや環状配位子金属錯体を触媒として用いる新しい脱ハロゲン化反応を開拓することを目的として研究を行った。私は近年、ピリジン環を有する環状配位子-ニッケル錯体1が、比較的温和な条件下で、1-ブロモ-4-tert-ブチルベンゼンのような芳香族臭素化物の還元的脱臭素化に有効に働く触媒となることを見出した。同時に、ニッケル錯体1の窒素原子上に官能基を導入すると脱臭素化反応における触媒活性が著しく減少するが、1のピリジン環第4位に新たな官能基を導入しても、触媒活性は保たれることを明らかにしてきた。そこで今年度は、このピリジン環の第4位に新たな官能基を導入することで、(1)脱ハロゲン化(臭素化)の触媒機能を保ったまま、球状の樹脂やシリカゲル粒子の表面などに固定し、不均一系触媒を合成することを目指した。そして、実際に環状配位子-金属錯体が樹脂に固定化できることを見出した。しかし、触媒反応の効率は低く、さらなる工夫が必要であることも分かった。(2)次に、環状配位子金属錯体を触媒として用い、光を利用した新しい脱ハロゲン化反応を開拓する事を目指した。実際に、触媒である環状配位子-ニッケル錯体を光増感剤であるルテニウム錯体と組み合わせることで、今回初めて、光を利用した芳香族臭化物の脱ハロゲン化に成功した。この成果については、速報誌に掲載が確定し、現在印刷中である。さらに進んで、(3)錯体1の4位にルテニウム錯体のような光感応基を導入し、光エネルギーを利用する新しい脱ハロゲン化触媒を合成も進め、いくつかの新しく興味深い錯体を合成でき、錯体化学討論会などで、報告した。これらの成果については、現在、論文作成中である。
In vitro毒性試験に必要十分な再構築型細胞組織の極小化限界を探る

本研究では、三次元細胞凝集体の大きさを制御し、生体内での主要な毒性発現メカニズムと同質の応答を示す凝集体の最小サイズを明らかにすることを目的とした。マイクロウェル構造を配備したポリジメチルシロキサン(PDMS)テンプレートを作製し、マイクロウェル内でヒト肝ガン細胞株Hep G2の凝集体を形成させた。マイクロウェルの大きさを調節することにより、細胞凝集体の大きさを制御した。薬物代謝酵素シトクロムP450 1A1/2(CYP 1A1/2)の活性を調べたところ、直径200μm・高さ約60μm以上の大きさの凝集体の活性は、直径63μm・高さ約70μmの凝集体のものよりも3. 5倍高くなった。また、CYP 1A1/2に代謝されてより強い毒性を示すアフラトキシンB1(AFB1)を凝集体に暴露したところ、直径200μm以上での凝集体の用量作用曲線は、直径63μmのものよりも1桁低濃度側にシフトした。また、ラット成熟初代肝細胞でも同様の検討を行ったところ、直径110μmの球状の凝集体のAFB1に対する用量作用曲線は、直径35μmの球状のものよりも1桁低濃度側にシフトした。一方、酸素感受性の発光色素白金オクタエチルポルフィリン(PtOEP)をマイクロウェルの底面にコートした、凝集体の呼吸活性を非侵襲的に評価可能なガラス製プレートの開発も試みた。マイクロウェル内で肝ガン細胞株Hep G2の三次元細胞組織を培養したところ、PtOEPの発光強度から、細胞組織の呼吸活性能を評価できた。これらのことから、本方法論を用いることにより、生理学的に同質の応答を示す各種臓器由来の細胞凝集体の大きさを決定できるものと期待される。本研究では、平面上に形成したマイクロウェル構造を利用して、三次元細胞組織の大きさを数十個細胞レベルから数千数万個レベルまで広範な領域で変え、生体内での主要な毒性発現メカニズムと応答とを再現するのに必要十分な細胞組織の極小化限界(閾値)を明確にすることを目指している。作製したマイクロウェル構造を持つポリジメチルシロキサンシート上で細胞を培養したところ、マイクロウェルの直径が小さくなるほど、高さ方向に細胞増殖が進行し、培養3日目以降で停止した。一方、マイクロウェルの直径が大きくなるほど、2次元に近い組織を形成した。このようにして得られた培養5日目の三次元組織を用いて、肝機能のサイズ依存性を調べたところ、直径200μm以上の組織の肝機能は、直径63μmのものよりも3-5倍高くなった。つまり、直径63μmと200μmの間に、肝機能の閾値が存在した。次に、チトクロムP450(CYP) 1A1/2によって代謝されるとより強い毒性を示す天然の発ガン性物質アフラトキシンB1(AFB1)の毒性を、細胞生存率を指標として調べた。予測通り、AFB1の毒性はCYP 1A1/2の活性に依存した。直径200μm以上でのAFB1用量作用曲線は、直径63μmのものよりも1桁低濃度側にシフトし、一般的に用いられる96穴プレート(1穴の直径6400μm)と同等であった。以上から、間接的変異原などの毒性試験に必要十分な三次元肝組織は直径200μm(このときの高さ65μm)のものであり、このときの細胞数はおおよそ500個と見積もられた。この数字は、96ウェルプレートの1ウェル内に高密度で単層の細胞が存在するときの細胞数の500-1000分の1に相当することが明らかになった。

昨年度は、大きさの異なる三次元細胞組織を構築するためのテンプレートを開発し、間接的変異原アフラトキシンB1に対する応答の大きさ依存性を評価できたものの、球形の三次元細胞組織を構築することは困難であった。本年度は、球形の三次元細胞組織を効率よく形成させるため、ハニカム構造のマイクロウェルを有するポリジメチルシロキサン(PDMS)シートを作製した。その表面をタンパク非接着性のMPCポリマーでコートした後、成熟ラット初代肝細胞を播種し、PDMSシート側から細胞へ酸素を供給しながら培養すると、三次元細胞組織を2日間で構築させることが可能であった。マイクロウェルの大きさを変えることにより、直径約35-300μmの大きさの球形の三次元細胞組織を構築できることに成功した。単位面積当たりに構築できる三次元細胞組織の個数は、前年度のテンプレートよりも約2桁以上大きくできた。また、直径110μmの成熟ラット肝細胞の三次元細胞組織の酵素チトクロムP450 1A1/2による肝代謝機能は、直径35μmのものよりも約2倍高まることが明らかになった。アフラトキシンB1に対するEC50を比較したところ、前者の三次元細胞組織は後者のものよりも約1桁低濃度側にシフトした。一方、三次元細胞組織に色素を取り込ませて細胞応答の評価を行っていたものの、三次元細胞組織の大きさが大きくなるほどその中心部分に色素が入りにくくなっている問題が明らかになった。そこで、酸素感受性の発光色素白金オクタエチルポルフィリン(OEP)をマイクロウェルの底面にコートしたガラス製の呼吸活性評価プレートの開発も試みた。マイクロウェル内で肝ガン細胞株Hep G2の三次元細胞組織を培養したところ、OEPの発光強度から、細胞組織の呼吸活性能を評価できた。また、呼吸活性を阻害するシアンを、発光強度の減少量から検出できることも明らかになった。
骨と位牌―東アジア周縁社会における先祖祭祀の象徴に関する比較民俗学的研究―

本研究では、韓国、日本本土、沖縄、台湾における先祖祭祀を、骨と位牌をいう2つの象徴を通して考察することを目的とした。これらの社会では、伝統的に複葬制が採られており(あるいは採られてきた)、第一次葬においては死者は棺に入れられ、一定期間放置される。二次葬においては棺から死体を取り出して骨を洗う。韓国では新しい棺に入れて、新しい墓に安置する。沖縄では大きな骨壷に入れて門中の墓地に入れる。沖縄および台湾ではこの段階で位牌が作られ、家庭の祭壇で祭られる。韓国では朝鮮時代の儒教の影響により、現在のような位牌祭祀になったと考えられ、他の地区との相違を際立たせている。日本本土では火葬の普及が早かったことから、納骨スペースを持つ石塔墓が整備され、骨に対する観念が変化してきた。わが国の両墓制についてであるが、これはこれまでの研究では近代に入って急速に消滅に向かっているといわれてきた。しかし、屋敷墓の地域では、墓地を個別に持っていた形態から共同墓地を持つようにとの働きかけを受けて、墓地の共有の観念がもたらされ、両墓制が新たに生まれたとも考えられる。こうした地域では、墓制つまり骨の処理方法が改変された一方で、位牌祭祀は不変であるという現象が観察される。また、近年の葬儀の盛大化にともない、祭壇とそこに置かれる白位牌についても注目した。こうした変差を観念の領域に渡って検討することが今後の課題である。東アジアの中国周縁社会における先祖祭祀を、骨と位牌という2つの象徴の双方の関連においてとらえるため、本年度は研究分担者合同の研究会を行った。その際、これらの象徴の比較の指標としての有効性を検討し、比較のための基礎資料として各地域の文献目録の作成、重要文献の収集を行った。韓国では葬儀における親族の役割が重視されており、特に長男子への期待は大きいことが注意された。また、実地調査として韓国慶尚北道と京畿道のいくつかの集落、台湾の南部都市化地域、日本の会津地方とつくば市周辺において先祖祭祀を調査し、具体的な比較研究のための資料収集を行った。慶尚北道の門中の宗家では過去4代の先祖を祭る祭祀堂が維持されており、それらの先祖の命日には親族が集まって祭祀を行うことが、近年の生活の変化の中においても当然のごとく継続されている。個人の視点に立って、制度の内面を明らかにする必要が感じられた。いずれの地域でも、最近の斎場を巡る問題等、現代民俗論の観点からの関心を保ちつつ、伝統を対比的に明らかにすることとした。韓国、台湾、日本における先祖祭祀を、骨と位牌という2つの象徴に注目して、それらの関連性を明らかにしつつ比較検討するのが、この研究の課題である。昨年度の調査と討論によって、骨と位牌を比較の指標とすることが有効であることを確認したので、今年度は具体的に儀礼行為を観察記録する作業を行い、その内容の分析を進めた。韓国の草墳の移葬儀礼を観察し、遺骨の扱いの特徴を映像記録化できたことに加え、風水師からの意味付けと依頼者のそれとを詳細に検討できた。さらに、位牌を中心とする先祖祭祀を観察して、骨と対比できる祭祀のありかたをとらえることができた。昨年度の慶州北道の事例に加え、西海岸の事例を得たことは、地域差と普遍性を考察するうえで大いに益するところである。また、韓国の研究者が日本の先祖祭祀を調査し、分析を試みるために、会津若松、土浦、つくば周辺の民俗調査を行い、盆行事を中心とした儀礼を記録した。次年度以降に分析を進めることとした。韓国、台湾、日本における先祖祭祀を、骨と位牌という2つの象徴に注目して比較検討するのが、この研究の課題である。一昨年度の調査と討論によって、この2つの指標によって比較することが妥当であることを確認し、昨年度には儀礼の行為を観察することによって資料の集積を進めてきた。

今年度はさらに同一の調査地(会津若松、筑波周辺)における盆行事の調査を継続して、民俗芸能に関する資料の集積も行った。両墓制の調査を行えたことにより、韓国の草墳との対比を新たな視野から行う見通しを得た。韓国ではソウル周辺の火葬の普及状況を調べ、土葬からの移行に伴う軋轢から、先祖祭祀の変容を把握する糸口を得た。台湾では視野を広げて、ハレの行事の一方を代表する神の祭祀も検討して、霊的対象として神の存在を、先祖とともに考察する可能性を検討した。次年度以降にさらに分析を加えることとした。韓国、台湾、日本における先祖祭祀の具体的様相を、骨と位牌という2つの象徴に注目して、それらの関連性の下に比較検討するのが本研究の課題である。12,13,14年度の調査によって、日本本土と韓国の事例研究にひとつの見通しを得たので、15年度には鹿児島県与論島にフィールドを移して日韓の研究者が合同で調査,検討会を行い、これまでの資料を踏まえた討論を行った。与論島の調査においては、2003年に火葬場が新設されることに伴う、葬墓制の変化を調査したが、崖葬から、土葬、火葬に変わっていく全過程が記録でき、奄美大島の石材店が新築した納骨スペースを持つ和式墓地に納骨する儀礼も観察でき、遺骨に対する観念の把握に資すること大であった。数箇所に点在する共同墓地の現状も墓石、納骨器、配置のすべてにわたって記録し、近藤功行氏の記録との対照が可能となって、変化の相を具体的に把握できることになった。また、死に先立つ年祝い習俗も調べ、従来、民俗学で提起されてきた循環的生死観を再検討した。韓国の調査では、ソウル近郊のムーダンを訪ね、先祖祭祀にかかわる都市化した儀礼を観察し、従来の理想的儀礼パターンとの対照を可能とした。規範から外れる事例を集積することによって、現実の先祖祭祀の様態を明らかにできるとの感触をつかんだ。4年度にわたる調査研究をまとめるべく、報告書を作成した。
血漿中過酸化脂質のセミミクロ自動一斉分析システムの開発

遊離脂肪酸(FA)やリン脂質(PL),トリグリセロール(TG),コレステロールエステル(CE)など極性の大きく異なる過酸化脂質を逆相ODSカラムを用い,移動相溶媒組成を徐々に変化させながら溶出するグラジエント溶出法を適用する事により一斉分離した。更に,このカラムからの溶出液に蛍光検出試薬であるジフェニル-1-ピレニルホスフィン(DPPP)溶液を用い蛍光強度を検出するポストカラム法を採用することによりこれら過酸化脂質を一斉にpmolレベルで再現性の良く高選択的に検出・定量するシステムを開発した。更に,感度・再現性を損なうことなしにシステムのダウンサイジング化に成功し,試薬消費量を約1/10に,溶媒消費量を約1/3に減少させると同時に分析時間も約5分短縮でき,迅速化・省コスト化を図ることができた。更にODSカラムよりも,脂質を構成するアシル基の鎖長及び不飽和結合数の識別能が劣るフェニル化シルカゲルカラムを用い,新たにFA,PL,及び中性脂質(TG,及びCE)の各過酸化脂質をクラスレベルで分析できるセミミクロシステムを開発した。このシステムにより2pmol150pmolレベルの過酸化脂質を約30分で再現性良く分析できた。更に,試料導入部を一部改良する事により,90μlまでの試料の導入を可能とし,オンライン濃縮法に関連する技術を確立した。このシステムを用い,新しい活性酸素の消去システムとして報告されたX(活性酸素種)-Y(触媒種)-Z(受容種)化学発光系の評価を行った。その結果、この系が実際に過酸化脂質消去系として働いていること,更にMnイオンなどの金属イオンの添加により増幅される事を確認した。また,食品中の過酸化物消去成分の検索に応用し,いくつかの食品中に強い過酸化脂質消去活性があることを明らかとした。これらの活性は過酸化脂種により異なった事から,これらを一斉分析できる本分析システムが非常に有効であった。本年度は、ジフェニル-1-ピレニルホスフィン(DPPP)を用いたヒドロベルオキシドの高感度ポストカラム検出システムとグラジエント溶出法を組み合わせた遊離脂肪酸、リン脂質、コレステロールエステル、及びトリアシルグリセロールの各ヒドロベルオキシドの一斉分析システムの構築を行った。遊離脂肪酸としてリノール酸とオレイン酸、リン脂質としてホスファチジルコリンジリノレオイルとジオレオイル、コレステロールエステルとしてコレステリルリノレートとオレート、及びトリアシルグリセロールとしてトリリノレインとトリオレインの各モノヒドロペルオキシドを調整し検討を行った。ポストカラム検出法へのグラジエント溶出法の適応上で最大の問題となるベースラインのドリフトの低減と高分離、高感度検出の実現のため、フローインジェクションシステムを併用しながら、各脂質ヒドロベルオキシドの反応性に与える溶媒組成、移動相と試薬溶液の混合比率、及び反応コイル長等の反応条件の影響ついて詳細な検討を行った。これらの結果を基に、ヒドロベルオキシドとDPPPの反応率を上げ相対的なベルライン変動を低減すると同時に、移動相溶液に対する試薬溶液の混合比率を高め、反応溶液組成の変化を可能な限り小さくすることにより、45分以内で各ヒドロペルオキシドを分離し、pmolレベルで検出・定量するシステムを構築することができた。更に、システムのセミミクロ化を行うことにより、感度及び分離をほとんど損なうことなく試薬及び溶媒の使用量をそれぞれ1/5、1/3にすることができ、ランニングコスト、及び廃液の低減化を可能とした。このセミミクロシステムでは、移動相溶液に対する試薬溶液の混台比率を従来サイズのシステムよりも高めることができ、ベースラインドリフトの影響は更に少なくなった。

前年度開発したODSカラムを用いたセミミクロ過酸化脂質分析システムの改良を行い、新たに遊離脂肪酸、リン脂質、及び中性脂質(トリアシルグリセロール、及びコレステロールエステル)の各過酸化脂質をクラスレベルで分析できるセミミクロシステムを開発した。このシステムでは、ODSカラムによりも、脂質を構成するアシル基の鎖長及び不飽和結合数の識別能が劣るフェニル化シルカゲルカラムを用いたことにより脂質クラスレベルでの分離を、またグラジエント溶出法の採用により比較的短時間で分析を行うことを可能とした。検出には、カラムからの溶出液に蛍光検出試薬であるジフェニル-1-ピレニルホスフィン(DPPP)溶液をon-lineで混合し、80°Cに加温したステンレス製の反応コイルを通すことにより反応させ無蛍光性のDPPPを過酸化資質により蛍光性のオキシドへと酸化した後、その蛍光強度を検出するポストカラム法を採用することにより高感度検出を実感することができた。このシステムにより2pmol200pmolレベルの過酸化脂質を約30分で再現性良く分析することができ、従来法に比べ試料、及び溶媒の使用量をそれぞれ1/10、及び1/3に削減することができた。本システムの実用性を評価する目的で、食品試料(牛乳プリン)中の過酸化脂質分析への応用をおこなった。牛乳プリンに光照射し経日的に試料採取し脂質を抽出後、本システムで分析した結果、過酸化脂質生成過程を高感度に追跡することができた。今後、血漿試料中の過酸化脂質分析への応用展開を行うと共に、試料の前処理の自動化と本システムの接続について検討を行う。フェニル化シルカゲルカラムを用いたグラジエント溶出法よる分離と蛍光検出試薬であるジフェニル-1-ピレニルホスフィン(DPPP)溶液を用いたセミミクロHPLC過酸化脂質分析システムを用い、生体内活性酸素の新しい消去システムの可能性が示唆されているX(活性酸素種)-Y(触媒種)-Z(受容種)化学発光系の評価を行った。活性酸素種(X)として過酸化水素を、Y種として没食子酸を、Z種としてアセトアルデヒドを用いた系について、過酸化水素の減少量を本システムで追跡するとともに、過酸化水素以外の過酸化物の生成の有無を確認した。その結果、過酸化水素はY、Z成分と混合した直後から徐々に減少し、実際に過酸化脂質消去系として働いていることを確認した。また、Mnイオンなどの金属イオンの添加により発光強度増加が報告されていることから、それらの効果についても検討した。その結果、添加量に応じ過酸化水素の減少速度は増加した。化学発光検出では金属イオンには至適濃度が存在するとの報告があったが、過酸化水素減少で観測した限りではその様な現象は認められず、金属イオンによる消光現象がある物と考えられ、直接過酸化物の減少を追跡する本法が有効性であることが明らかとなった。また、食品中の過酸化物消去成分の検索システムとしての応用を検討した。遊離脂肪酸、ホスファチジルコリン、及びトリグリセリドの各ヒドロペルオキシド混合溶液と各種飲料を混合し37°Cで振騰した後、抽出してHPLC分析を行った結果、いくつかの食品中に強い過酸化脂質分解活性があることを明らかとした。