hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
数理形態学をMRIに応用した新しい骨梁形態解析法の開発

骨質評価のための三次元的骨梁形態解析法を確立するため、MRIに数理形態学を応用し以下の結果を得た。研究に用いた1.5tesla MRI装置で現実的に設定し得る撮像時間の範囲では、十分な緩和時間により信号強度を稼ぐスピンエコー法よりも、緩和時間が不十分でも加算回数を増やして信号強度を稼ぐ3Dグラディエントエコー法の方が、高空間分解能で信号雑音比の高いMRIデータを得られることが明らかとなった。そして、橈骨と脛骨には膝用クアドラチャーコイル、踵骨には2個の円形サーフェイスコイルを2チャンネルのフェーズドアレイコイルとして用いることにより、高空間分解能のサンプリングデータを得ることができた。しかしながら、腰椎では解析に耐える撮像条件を見付け出すことは出来なかった。獲得したMRIサンプリングデータは、TARフォーマットを介して富士CR用フォーマットに変換することにより、CRワークステーション上での画像処理が可能であった。CR画像データに変換後のMRIサンプリングデータを数理形態学フィルターで画像処理することにより、橈骨、脛骨、踵骨における骨梁形態の構造的特徴を骨梁パターンとして抽出することができた。そして、フィルターが数理形態学の集合演算式に一致する空間周波数領域の骨梁を特異的に抽出し得たことから、デジタルX線画像用の数理形態学フィルターはMR画像に対しても有効であることが明らかとなった。また、MR撮像の断層方向や位置を任意に変更することにより、骨梁形態の三次元的解析が可能であった。しかしながら、同フィルターは元のMR画像では認識されない画像ノイズや被写体の僅かなモーションアーチファクトも抽出し、解析画像に影響を及ぼした。さらに、腰椎では高空間分解能のMR画像が得られなかったことから、フィルターは十分な骨梁パターンを抽出できなかった。MRIを用いた三次元的骨梁形態解析法を確立するために、まず解析に使用するためのMR画像データのサンプリング法について研究を行った。MRI装置には、東芝社製1.5tesla超伝導MRI装置VISART/Hyperを用いた。信号雑音比の高いMRデータを得るための受信コイルとして、四肢用クアドラチャーコイル、脊髄用クアドラチャーコイル、円形サーフェイスコイルなどを比較検討し、踵骨および橈骨は口径が適した円形サーフェイスコイルが、腰椎には脊髄用クアドラチャーコイルが最適であることが明らかとなった。さらに、撮像シーケンスとして、2Dスピンエコー法、2Dグラディエントエコー法、3Dグラディエントエコー法などを比較検討した結果、ピクセルサイズが小さく、スライス厚が1.5mm以下の高空間分解能MR画像データを得るためには、現実的に設定し得る撮像時間の範囲内では、十分な緩和時間により信号強度を稼ぐスピンエコー法よりも、むしろ緩和時間は不十分でも加算回数を増やして信号強度を稼ぎやすい3Dグラディエントエコー法の方が適していることを明らかにした。そして、踵骨および橈骨に関しては円形サーフェイスコイルを用いた3Dグラディエントエコー法による撮像で、実効スライス厚1mm、ピクセルサイズ約200μMの空間分解能を持ち、解析に使用可能な信号雑音比を持つサンプリングデータを得ることができた。獲得したサンプリングデータは、一旦MRI装着付属のMOディスクにダウンロードし、TARフォーマットに変換した後に再度ストリーマーデーターテープにダウンロードした。このストリーマーテープを冨士フィルム社製CR用ワークステーションで取り込みCR用フォーマットに再変換し、CRワークステーション上での画像処理を可能とした。
心理的ストレスが動物のアルコ-ル摂取行動におよぼす効果

さまざまな心理的ストレスがヒトの飲酒のひきがねになると言われている。本実験はこの問題を動物モデルにより確かめた。ウイスタ-系オスラットを被験体に、RunningーwheelでのPassive回避を心理的ストレスとして、そのアルコ-ル(A、10%、v/v)ー水(W)選択におよぼす効果をしらべた。まず、ホ-ムケ-ジにおいて2びん法を用いてA嗜好性を調べた後、Passive回避を学習させた。翌日より12日間の連続セッションを行った。1日を10ー150分の24の期間に分け、うち12回はストレス(S)期(回避)、残る12日は休息(R)期とし、SとR期を交互に与えた。最初の2日間はWーWの選択を、次の10日間はWーAの選択を、常にW、A、餌をとれるようにして調べた。その後4日間、再びホ-ムケ-ジのもどし、2びん法によりA嗜好性の変化を調べた。結果:1.ラットはSとR期の弁別を確実に学習し、S期には1時間あたり1回程度の電撃を受けただけで静止行動を続けた。これはラットにとって心理的なストレスとなった。2.ラットのA選択行動はこの心理的ストレスの影響を受け、大きな個体差があらわれ、A嗜好動物は、Aばかりを摂取し、逆にW嗜好動物はAを忌避した。3.全般にS期のA摂取はR期よりも低い。4.セッション終了後、ラットのA嗜好性は大きく低下した。これらの結果は、一部の動物で心理的ストレスはストレス中のA摂取を強め、その場合R期の摂取量がS期を上回ることから、「ストレスからの解放がA摂取を強める」という仮説を支持した。しかしながら、たとえA嗜好動物でもストレス経験後のホ-ムケ-ジでのA摂取は大きく減少し、またW嗜好動物はストレスセッション中のA摂取を減少させたため、ラットにとってストレスはA摂取を抑制する効果を持つようである。この点はヒトで一般に言われている飲酒のストレス原因説を支持しない。今後さらに強いストレスを用いて検討したい。
小学生における短距離走動作発達・指導モデルの構築

本研究の目的は,小学生を対象とした短距離走動作の発育モデルの作成,および短距離走動作の指導モデルを構築することである.なお,これらのモデルは,個人の相対的な成長度によっても異なることが推察されることから,アロメトリー(相対成長)を考慮したモデルの構築を目指す.主な研究課題は,学年縦断的な調査により,変化の様相が異なる時期(学年または発育段階)の有無を検討すること,またすべての対象者に同一のプログラムを実施し,その効果の程度を時期(学年または発育段階)によって比較し,効果の高い時期を見つけ出すことである.本研究の目的は,小学生を対象とした短距離走動作の発育モデルの作成,および短距離走動作の指導モデルを構築することである.なお,これらのモデルは,個人の相対的な成長度によっても異なることが推察されることから,アロメトリー(相対成長)を考慮したモデルの構築を目指す.主な研究課題は,学年縦断的な調査により,変化の様相が異なる時期(学年または発育段階)の有無を検討すること,またすべての対象者に同一のプログラムを実施し,その効果の程度を時期(学年または発育段階)によって比較し,効果の高い時期を見つけ出すことである.
バイオマーカーを用いた妊娠期からの産後鬱スクリーニングプログラム開発に関する検討

その結果,産後1か月の母親の抑うつ傾向にはSOC,主観的睡眠状態,adrenalineが影響しており,SOCが高いと抑うつ傾向が低く,主観的睡眠状態が悪いと抑うつ傾向が高く,adrenalineが低いと抑うつ傾向が高いことが分かった。産後うつのバイオマーカーとしてadrenalineの有用可能性があること,さらに産後うつの要因としてSOCが最も強く影響することが明らかとなったことから,SOCが低い母親に対して早期に介入を行うことで,産後1か月の母親の抑うつ傾向を軽減することができる可能性が示唆された。本研究の目的は、産後うつ防止のための妊娠期からのスクリーニングシステムの構築である。妊娠期の母親の心理的状態が産後鬱の発症と関連があるとの先行研究から、妊娠中からの状態にも重点をおいたスクリーニング実施の妥当性を検討し予防的介入の必要性がある母親への早期対応を可能とするためのシステム構築の一環とすることが目的である。妊娠期の女性を対象として産褥期にかけて縦断的にバイオマーカーを測定しEPDSとの関連や妊娠期と産褥期のデータの関連性を検討し、妊娠期からのバイオマーカーのデータが産後鬱の可能性や早期発見の評価に妥当であるか明らかにする。平成27年度は妊娠期からの周産期の女性10名を対象にパイロットスタディを行い、研究計画の見直し・修正を通して平成28年度本調査の研究計画を検討する予定であった。しかし指標とするバイオマーカーについて先行文献や学会出席における討議等により再検討の必要性が生じたため、今年度はパイロットスタディに入る前に研究計画の再検討を進めた。血液中免疫グロブリンA、副腎皮質ホルモン(DHEA、DHEA-S)、白血球分画(好中球、リンパ球、単球、好酸球、好塩基球)、尿中コルチゾール、カテコラミンが有用な指標として挙げられた。本研究で扱うものとして適切である指標について現在検討中である。さらにバイオマーカーに影響するストレス以外の因子(生活習慣、疾病等)や検体採取時の条件等について先行文献等により再検討中である。今年度は、指標とするバイオマーカーや研究方法について再検討を中心として進めた。産後うつ早期発見・早期介入のための妊娠期からのスクリーニングシステムの構築を目的とした研究である。妊娠期の女性を対象として産褥期にかけて縦断的にストレス指標となるバイオマーカー並びに質問紙によるストレス診断、バイオマーカーに影響する因子としてEPDSを調査し、妊娠期と産褥期のデータの関連性の検討、妊娠期からの評価の妥当性について明らかにする目的で研究を遂行中である。昨年度、指標とするバイオマーカーについて学会などの場における討論を重ね、再検討を行ってきた。心理状態の把握を目的としたバイオマーカーの研究報告が数多くあり知見も様々となってきた状況の中で、特に妊娠期産褥期と通常の身体状態とは異なった女性を対象として指標とするに最も妥当なバイオマーカーを産後のうつを視点として再考察する必要が生じ、本年においても使用するバイオマーカーさらにストレス指標(質問紙)の再検討を行った。近年の産後うつに関連した研究では、母親に対する心理的サポートだけではなく、母親自らの力(レジリエンス、首尾一貫能力)のを引き出す看護が必要であることについての報告が散見されることから、本研究でも取り入れる必要性を検討したこと、並びにバイオマーカーもストレスに反応する指標のみならず、肯定的な感情に反映する指標についても取り入れる方向性を検討した。今年度は、調査項目(バイオマーカー、質問紙)の再検討を中心として進めた。心理状態の把握を目的としたバイオマーカーに関する新たな研究報告が数多くあり知見も様々となってきた状況の中で、本研究で扱う調査項目(バイオマーカー、質問紙)の再検討を行った。平成28年度では母親自らの力(レジリエンス、首尾一貫能力)のを引き出す看護が必要であることについての報告が散見されることから、本研究でもストレスのみならず肯定的な心理状態を把握するための指標を取り入れる必要性を検討した。平成29年度ではバイオマーカーの交絡因子である睡眠の影響について本研究でも検討し、cortisolが就寝起床時間帯および自覚する睡眠満足度に関連すること、adorenalinが睡眠時間に関連することが示唆された。これらのバイオマーカーを扱う際には対象者の生活状況、睡眠状況などを詳しく聞き取りを行い、関連性を分析していく必要がある。それらを踏まえて今回の調査で指標とするバイオマーカーおよび調査項目を検討し、本調査を開始した。現在は調査および分析中であり、研究成果を取りまとめる準備を行っている。調査項目(バイオマーカー、質問紙)の再検討に時間を要し、予定していた調査・実験に遅延・変更が生じた。平成28年度から調査に入る。

妊娠初期から産褥1ヵ月まで縦断的に測定したバイオマーカーのデータをもとに、周産期女性のストレスマーカーの推移を明らかにする。平成29年度は妊娠期から産褥期までのバイオマーカーのデータとEPDSとの関連、妊娠期と産褥期のデータの関連性を検討し、妊娠期からのバイオマーカーのデータが、産後鬱の可能性や早期発見の評価に妥当であるか明らかにする。平成29年度から調査に入る。まず妊娠初期から産褥1か月までのバイオマーカーの推移を検討する。並行して、EPDSとの関連、SOC(首尾一貫能力)、妊娠期と産褥期のデータの関連性を検討し、妊娠期からのバイオマーカーおよび心理尺度のデータが産後うつの可能性や早期発見の評価に妥当であるか明らかにする。期間を延長して引き続き調査・分析を実施し、研究成果をとりまとめる。調査開始を来年度としたため、その費用が残額として生じた。次年度より調査を開始するため。研究代表者の病気により、予定していた調査・実験が実施できず、研究計画の遅延・変更が発生した。そのため期間を延長して実施し、臨床検査とデータ解析、学会発表、論文執筆を次年度に行うこととし、未使用額はその経費に充てることとしたい。検体検査・データ分析にかかる費用、学会発表や投稿料として次年度使用予定。バイオマーカーのデータ分析、調査用具(質問紙等)、学会発表や投稿料として次年度使用予定。
森林キャノピー層のエネルギー減衰特性に及ぼす大規模主流乱れの影響解析

本研究では,大気の流れが本来的に有している大規模な乱れが,森林キャノピー層の防風機能に及ぼす流体力学的影響を,大型乱流風洞実験及び流れの数値シミュレーションの二つの手法により解明する.1.大気の乱れの効果を解析する第一段階として,大型乱流風洞中に主流速度が流れ場全体で空間的には一様に時間的には調和振動する流れを作り出し,この流れの中に置かれた森林模型下流域の乱れ度,レイノルズ応力などの乱流特性量が計測された.(1)キャノピー樹冠部下流域では,振動流と一様流とで乱れ強さに大きな相違はない.(2)キャノピー樹冠部の上部と下部の時間平均速度が急勾配を示す範囲では,振動流乱れ度は大きな値を取る.(3)レイノルズ応力は,振動流では樹冠部上辺で特に大きな値となる.2.次に,より現実の自然風の流れに近づけるために,大気境界層内の速度分布を直線型せん断流で近似化し,最大20%程度の大きな乱れを含む直線型せん断流(以下,強乱流れと記す)を乱流風洞内に生成した.この強乱流れの中にキャノピー模型が置かれているとき,流れ場の三次元速度変動が計則された.特に,乱れの少ない直線型せん断流(以下,低乱流れと記す)中の分布と比較した.(1)森林キャノピーの樹高の2.5倍より下流域においては,強乱流れ中の防風効果は,低乱流れの場合よりも弱められる.(2)森林キャノピー樹冠部下流域では,3方向乱れ強さはほぼ同程度となっている.3.森林キャノピーまわりの流れ場が,数値的に解析された.樹冠部の振動を,互いにばねとダンパーで連結された質点としての樹冠要素の運動で表現し,樹冠要素の働く流体力と流れが受ける反力とをリンクさせる手法により,森林キャノピーまわりの乱流構造の特性量が計算された.(1)時間平均速度,乱れ強さ,レイノルズ応力などの分布は,風洞実験の結果を良く再現している.(2)広範囲に計算領域を設定することにより,実験では困難な森林キャノピー模型の十分下流域における流れの特長が明らかにされた.特に,森林キャノピー上部領域に発達するはく離せん断層が,樹高の5倍程度の下流において地面に再付着し,その再付着点近傍では,強い乱れとなっている.本研究では,大気の流れが本来的に有している大規模な乱れが,森林キャノピー層の防風機能に及ぼす流体力学的影響を,大型乱流風洞実験及び流れの数値シミュレーションの二つの手法により解明する.1.大気の乱れの効果を解析する第一段階として,大型乱流風洞中に主流速度が流れ場全体で空間的には一様に時間的には調和振動する流れを作り出し,この流れの中に置かれた森林模型下流域の乱れ度,レイノルズ応力などの乱流特性量が計測された.(1)キャノピー樹冠部下流域では,振動流と一様流とで乱れ強さに大きな相違はない.(2)キャノピー樹冠部の上部と下部の時間平均速度が急勾配を示す範囲では,振動流乱れ度は大きな値を取る.(3)レイノルズ応力は,振動流では樹冠部上辺で特に大きな値となる.2.次に,より現実の自然風の流れに近づけるために,大気境界層内の速度分布を直線型せん断流で近似化し,最大20%程度の大きな乱れを含む直線型せん断流(以下,強乱流れと記す)を乱流風洞内に生成した.この強乱流れの中にキャノピー模型が置かれているとき,流れ場の三次元速度変動が計則された.特に,乱れの少ない直線型せん断流(以下,低乱流れと記す)中の分布と比較した.(1)森林キャノピーの樹高の2.5倍より下流域においては,強乱流れ中の防風効果は,低乱流れの場合よりも弱められる.(2)森林キャノピー樹冠部下流域では,3方向乱れ強さはほぼ同程度となっている.3.森林キャノピーまわりの流れ場が,数値的に解析された.樹冠部の振動を,互いにばねとダンパーで連結された質点としての樹冠要素の運動で表現し,樹冠要素の働く流体力と流れが受ける反力とをリンクさせる手法により,森林キャノピーまわりの乱流構造の特性量が計算された.(1)時間平均速度,乱れ強さ,レイノルズ応力などの分布は,風洞実験の結果を良く再現している.(2)広範囲に計算領域を設定することにより,実験では困難な森林キャノピー模型の十分下流域における流れの特長が明らかにされた.特に,森林キャノピー上部領域に発達するはく離せん断層が,樹高の5倍程度の下流において地面に再付着し,その再付着点近傍では,強い乱れとなっている.本研究は2年計画の初年度であり,主に大型乱流風洞装置による風洞実験が行われた。1.乱流風洞による振動流の発生:大気乱流の最も基本的な流れとして、主流速度の時間的変化が正弦波状であるような場合を研究対象とした.この様に流れ方向速度が振動する流れの中に,キャノピー模型が置かれている.このときのキャノピー模型下流域での乱れ度,レイノルズ応力などの乱流特性量が求められた.2.特に,振動流中では熱線流速計により測定される

乱れ度は,キャノピーによる狭義の乱れ,振動流の実効値としての乱れ,及び振動する主流と乱れとの干渉項の三つで構成される「振動流乱れ度」であることを定義した.これらの乱流特性量が,振動しない流れの乱流特性量と比較された.3.その結果,以下のことが明らかにされた.(1)キャノピーの樹冠部下流域では,振動流と一様流とで乱れ強さに大きな相違はない.即ち,この領域では,振動流の実効値と干渉項が打ち消し合っていると考えられる.このために,一様流中の乱れとほぼ同じ乱れ特性となっていると考えられる.(2)キャノピー樹冠部の上部と下部の時間平均速度が急匂配を示す範囲では,振動流乱れ度は一様流乱れ度に較べて大きな値を取る.(3)キャノピー上部では,キャノピー自体のよる乱れが小さくなる.その結果、干渉項も小さくなり,振動流の実効値のみが乱れの主成分となる.(4)乱れエネルギーの生成に大きな影響を与えるレイノルズ応力は,振動流では樹冠部上辺で特に大きな値となり,乱れエネルギーが,より大きくなることが示された.本研究は2年計画のまとめの年度であり,大型乱流風洞装置による風洞実験及び流れの数値シミュレーションに関する二つの手法による研究のまとめが行われた.1.大型乱流風洞による森林キャノピーまわりの乱れ構造の計則:大気境界層内の自然風により一層近づけた流れとして,最大20%程度の大きな乱れを含む直線型せん断流(以下,強乱流れと記す)を乱流風洞内に生成した.この強乱流れの中にキャノピー模型が置かれているとき,流れ場の三次元速度変動が計則され,模型下流域での乱れ度,レイノルズ応力などの乱流特性量が求められた.特に,乱流特性量の分布と乱れの少ない直線型せん断流(以下,低乱流れと記す)中の分布との相違点について検討された.実験により得られた主な結果は,以下である.(1)森林キャノピーの樹高の2.5倍より下流域においては,強乱流れ中の防風効果は,乱れにより時間平均速度分布に対する平滑化が強められるために,低乱流れの場合よりも弱められる.(2)森林キャノピー樹冠部下流域では,3方向乱れ強さはほぼ同程度となっていることが明らかにされた.しかし,樹冠部上方位置においては,主流方向乱れに比較して,流れに垂直方向の乱れは弱められる.2.森林キャノピーまわりの流れ場が,数値的に解析された.この森林樹冠部による乱れ生成を解析する手法は,従来の手法とは全く異なっている.即ち,樹冠部の振動を,互いにばねとダンパーで連結された質点としての樹冠要素の運動で表現し,樹冠要素の働く流体力と流れが受ける反力とをリンクさせる手法である.この新しい手法により,森林キャノピーまわりの乱流構造の特性量が計算された.得られた主な結果は,以下である.(1)数値計算結果による時間平均速度,乱れ強さ,レイノルズ応力などの分布は,風洞実験の結果を良く再現しており,本手法の有効性が確認された.(2)広範囲に計算領域を設定することにより,実験では困難な森林キャノピー模型の十分な下流域における流れの特長が明らかにされた.特に,森林キャノピー上部領域に発達するはく離せん断層が,樹高の5倍程度の下流において地面に再付着し,その再付着点近傍では,強い乱れとなっている.
ホウレンソウにおけるシュウ酸蓄積機構に関する研究

ホウレンソウは栄養価が高く、人気のある野菜であるが、シュウ酸や硝酸の含量が高いため、これまではアク抜きをして利用するのが普通であった。しかし、近年ではサラダとして利用することも増え、シュウ酸や硝酸の含量が低いホウレンソウの需要が高まっている。ところで、シュウ酸蓄積に関しては、植物に吸収された硝酸が還元される際に、体内のカチオン・アニオンバランスを維持するためにシュウ酸が生成するという仮説が提出されている。ホウレンソウのシュウ酸含量と硝酸含量の間に負の相関があることは、この仮説を裏付けるものであり、両者を同時に減少させることは難しいとされてきた。しかし、もし上記の仮説が正しいならば、アンモニア態窒素を用いることによって、シュウ酸と硝酸を同時に減らすことができるはずである。そこで、培養液pHを6に維持し、アンモニアと硝酸を窒素源としてホウレンソウを水耕し、体内のアニオン組成を調べた。ホウレンソウの有機酸としては、シュウ酸がもっとも多く、次いでリンゴ酸、クエン酸、コハク酸の順であった。アンモニア態窒素を用いると、硝酸態窒素を用いた場合に比べ、シュウ酸含量は45%、リンゴ酸含量は15%、クエン酸含量は29%低下したが、コハク酸含量は2.43倍に上昇した。一方、硝酸含量はアンモニア態窒素を与えると、1/6に低下した。このように、アンモニア態窒素を施用することは、シュウ酸と硝酸の含量を低下させる上で有効な方法であることが明らかとなった。しかし、アンモニアを窒素源とした場合には地上部生体重が60%程度低下したことから、窒素形態を変えることによって、シュウ酸と硝酸の含量を低下させる方法を実用化するためには、アンモニア耐性の強い品種を育成することが必要と思われた。
保護基を全く用いない水中での糖質モノマーの一段階合成とその重合

糖は、分子内に多くのヒドロキシ基を持つ化合物である。これまでは、糖のヒドロキシ基を保護してから、有用な物質に変換しなければならなかった。本研究では、そのような常識を覆し、ヒドロキシを全く保護することなく、糖質モノマーを合成する手法を開発した。糖質モノマーとは、さまざまな糖を含むポリマー合成の重要な原料である。この反応は、水中で行うことができるので、環境にやさしい合成プロセスである。従来、オリゴ糖鎖合成の常識は、合成プロセスのどこかで、保護基の導入が必要であり、また、活性中間体の単離が不可欠なことであった。本研究では、このような常識を打ち破り、無保護かつワンポットでオリゴ糖を、位置ならびに立体選択的に合成することを目的とする。これは、申請者が世界に先駆けて開発してきた、水中における活性中間体の調製、および水中での完全立体選択的配糖化、という二つの基盤技術の融合により、初めて可能となるものである。(1)糖オキサゾリン糖供与体の一段階合成糖オキサゾリン誘導体は、酵素的配糖化反応における有用な中間体であることが知られている。しかし、その合成は、水酸基の保護、脱保護、アノマー位の活性化等の複数のステップを経て行われている。本研究では、2-アセタミド糖を、保護基を全く用いることなく、水中で、対応する糖オキサゾリン誘導体への変換する新しい方法論を開発する。(2)新規糖供与体DMT配糖体の一段階合成酵素的配当化に用いる典型的な糖供与体であるフッ化糖やp^-ニトロフェニル誘導体の合成は、これまで多段階の反応を経て合成されている。本研究は、トリアジン系脱水縮合剤であるDMT-MMを、無保護糖に作用させることにより、水中で、対応する糖供与体を一段階で合成する新しい手法を開発する。(3)酵素触媒によるオリゴ糖の合成配糖化反応は、本研究の根幹をなす部分で、特に綿密な実験計画が必要であり、以下の3つの観点から詳細な検討を行う。具体的には、活性化モノマーを最もよく認識する酵素触媒の探索、反応系内に混在するさまざまな化学種に対する酵素触媒の安定性に関する基礎的知見の集積、配糖化条件の最適化を行う。従来、オリゴ糖鎖合成の常織は、合成プロセスのどこかで保護基の導入が必須であり、活性中間体の単離が必要なことであった。本研究では、このような常織を打ち破り、無保護かつワンポットでオリゴ糖合成を達成する。これは、水中における活性中間体の合成、ならびに水中での完全選択的配糖化という、二つの基盤技術の融合により初めて可能になるものである。これらの技術を、高分子合成・酵素化学の観点から、より精巧な連続プロセスへ発展させることにより、広範な配糖体の合成における一般性の高い方法論を確立する。多糖バイオマスから本研究に不可欠なリファイン化原料の調製2-アセタミド-2-デオキシ糖を還元末端に有するオリゴ原料の調製グリコサミノグリカンから、還元末端に2-アセタミド-2-デオキシ糖を有するオリゴ糖を調製する。すなわち、市販のヒアルロン酸を酵素により限定的に加水分解することにより、断片化し、これらを分取液体クロマトグラフィーにより分離・精製した。グルコースを還元末端に有するオリゴ糖リファイン化原料の調製タマリンド種(Tamarindus indica)由来のキシログルカンを出発原料とし、一連の酵素反応ならびにクロマトグラフィーによる分離を経て、リファイン化原料を調製した。キシログルカンオリゴ糖と脱水縮合剤DMT-MMから対応する活性化糖誘導体の調製キシログルカンオリゴ糖に、2, 6-ルチジンの存在下、脱水縮合剤DMT-MMを作用させたところ、対応するβ型の活性化糖誘導体が高収率で得られることを見出した。また、生成活性化糖は、セルラーゼによる加水分解を受け、糖供与体としても利用できることを明らかにした。今後、酵素的重合反応により、新規多糖を合成する予定である。従来のオリゴ糖の合成の常識を覆すような全く保護基を用いない合成プロセスを開発した。そのために必要な基礎反応として以下に記載する糖オキサゾリンの水中における一段合成を達成した。無保護糖の2位にアセタミドを有する糖原料を分子内で脱水することにより目的とする糖オキサゾリンが得られるものと考え、本年度は、水溶性脱水縮合剤を徹底的にスクリーングした。その結果、カルボジイミド系試薬、トリアジン系試薬に加え、新たにイミダゾリジニウム塩系試薬が、極めて有効な脱水縮合剤であることを突き止めた。各種アセタミド糖を水中で、トリエチルアミンの存在下、DMC(dimethylimidazolinium chloride)で処理すると、目的とする糖オキサゾリシ誘導体が高収率で合成できることを見出した。この事実は、従来技術では不可能であったような、オリゴ糖のオキサゾリン化も可能になることを示している。

そこで、キトオリゴ糖に対して、同様の反応を行ったところ、いずれの場合も高い収率で対応するオキサゾリン誘導体へ変換できることが分かった。キトオリゴ糖から水中で対応するオキサソリンが効率よく調製できることが分かったので、引き続きキチナーゼの存在下、さまざまな糖受容体を反応させることにより、糖オキサゾリンを反応中間体とする酵素的オリゴ糖合成を行った。すなわち、キトペンタオースにトリエチルアミン存在下、DMCを作用させ、対応するオキサゾリンとした後、これを単離することなく、キチナーゼおよびキトビオースを添加したところ、キトヘプタオースがワンポットで合成できることを示した。キトヘプタオースは、強いエリシター活性をもつ物質として近年注目を集めている化合物であるが、これまでその有効な合成法が確立されていなかった。本手法を用いることにより、簡便な操作で無保護糖からキトヘプタオースを効率よく合成することができるようになった。本研究では、無保護かつワンポットでオリゴ糖合成を達成することを目的とした。これは、申請者らが独自に開発してきた水中における活性中間体の合成、ならびに水中での完全選択的配糖化という二つの基盤技術の融合により初めて可能になったものである。トリアジン系脱水縮合剤であるDMT-MMを無保護糖に作用させることにより、水中で、対応する活性糖供与体を一段階で合成した。すなわち、グルコース、セロビオース、キシロピオースならびにキシログルカンオリゴ糖を、対応するDMT糖へと変換した。配糖化反応は、本研究の根幹をなす部分であり、特に綿密な実験計画が必要であったので、以下の3つの観点から周到な準備を行った。すなわち、1:得られた活性糖モノマーを最もよく認識する酵素触媒の探索、2:反応系内に混在すると予想されるさまざまな化学種に対する触媒酵素の安定性に関する基礎的知見の集積、3:配糖体収率向上のために必要な諸条件(温度、濃度、pH等)の最適化、について詳細に検討した。以上の結果を基に、最適な糖転移反応条件の設定を行った結果、DMT化反応をオリゴ糖に適用することにより、これまで合成困難とされていたDMT化オリゴ糖を調製することができた。さらに、対応する糖加水分解酵素の存在下、適切な糖受容体に対して配糖化反応を行うことにより、各種オリゴ糖を収率よく合碗する手法を開発した。本研究では、申請者らが独自に開発してきた水中における活性中間体の合成、ならびに、水中での完全選択的配糖化、という二つの基盤技術を融合することにより、無保護から複雑な構造を持つ配糖体を合成する手法の開発を目的とした。1.N-結合型オリゴ糖オキサゾリンの一段階合成2-クロロ-N,N-ジメチルイミダゾリニウム系脱水縮合剤を、卵黄から調製される非還元末端にシアル酸を有するN-結合型オリゴ糖に作用させることにより、水中で対応する糖オキサゾリン誘導体を一段階で合成した。2.酵素触媒による配糖化配糖化反応は、特に綿密な実験計画が必要であるので、以下の3つの観点から詳細な検討を行った。(1)糖オキサゾリンを最もよく認識する酵素触媒の探索EndoM酵素の変異体について、その糖転移能力を比較検討した結果、N175Q変異体を用いると最も高い収率で配糖体が生成することが分かった。(2)反応系内に混在すると予想されるさまざまな化学種に対する触媒酵素の安定性に関する基礎的知見の集積
動物の中枢神経系再生と記憶保持に関する学習心理学的研究

中枢神経系の再生能を持つが,これまで心理学ではあまり利用されてこなかった動物を用いて,切除後再生した中枢神経系と記憶保持との関連について,学習心理学の立場から比較検討することが本研究の目的である。具体的な被験体の種は,中枢神経系の再生能を有する幼若期の被験体を安定的に得ることができると昨年度の研究でわかったグッピーのオスとゼブラフィッシュのオス,ならびに飼育や繁殖の容易なプラナリアを用いた。グッピーとゼブラフィッシュに関しては,条件刺激として色や光を用いた条件づけの確立を目指した。その結果,餌を強化子とした場所学習より,電撃を強化子としてシャトルボックス装置を用いた回避条件づけ法の方が比較的有効であることがわかった。しかし,学習成績はあまりよくなく,ラットやマウスを用いた学習実験に比べると,記憶保持の指標として曖昧さの残るものであった。この学習成績の低さは,他の先行研究とも一致するものであるが,より明確な指標が得られないか,学習心理学的研究としては今後さらなる検討が必要である。一方,プラナリアに関しては,強化子として餌を用いても電撃を用いても,被験体が装置内で動かなくなってしまい,有効な学習実験法を研究期間内に確立することは出来なかった。中枢神経系の再生に関しては,実体顕微鏡と眼科用手術器具を用いれば,サカナの大脳の一部を破壊することは可能であるが,位置を特定したより正確な切除はできなかった。この点に関しても,さらに道具や手技を向上させ,今後検討を継続していく必要がある。本研究の目的は,中枢神経系の再生能を持つ多様な動物を用いて,切除後再生した中枢神経と記憶保持との関連について,学習心理学の立場から検討することである。本格的な学習実験を開始する前段階として,本年度は(1)飼育法の確立,(2)条件づけの確立,(3)手術法の習得の3点を目標に研究を進めた。これは本研究で利用する中枢神経再生能を持つといわれる動物(プラナリア,アフリカツメガエルの幼生,グッピーとゼブラフィッシュの幼生)が,いずれも心理学的研究においてほとんど用いられてこなかった動物だからである。プラナリアに関しては自然採取で入手し,カエルと魚類の幼生は成体を繁殖させることで入手した。飼育法に関しては,いずれの動物においてもそれぞれの動物にあった水質と水温をしっかり管理すれば長期飼育可能であることが分かった。ただし繁殖は簡単ではなく,ゼブラフィッシュとアフリカツメガエルの産卵にはまだ成功していない。条件づけに関しては,餌を報酬にしたり電撃や酢酸を罰に用いた明暗弁別や左右弁別学習を試みたが,いずれの種でも多くの個体が装置内で動かなくなってしまうなど,実験手続や実験装置の改良がさらに必要である。被験体の動きをビデオカメラで撮影し,その動きを後に画像解析を行うことについては問題がないことが確認できた。手術法に関しては,肉眼または顕微鏡と眼科用手術器具を用いれば十分解剖が可能であることが確認できた。本格的な手技の習得については,条件づけの目処がついた段階で開始したいと考えている。
アレルゲン親和性によるIgE受容体動的多様性とシグナルエディティングの分子基盤

アレルギー疾患は、患者数が増加の一途をたどっているにもかかわらず、現在においても根治療法が存在しないため、発症機構の解明と新規治療法の確立が急務の課題となっている。これまでの研究成果から、アレルゲン親和性がIgE受容体の活性化、転写調節、そして浸潤細胞の種類など、様々なレベルでアレルギー疾患を制御していることが明らかになっている。本年度は、単一分泌顆粒レベルでの顆粒放出機構や転写因子によるアレルゲン親和性認識機構、そして細胞間相互作用によるアレルギー疾患調節メカニズムについて解析を行った。具体的には、1IgE Crosslinking-induced Luciferase Expression(EXiLE)法を用いた、転写因子によるアレルゲン親和性認識機構の解析を行った。2マスト細胞の分泌顆粒に存在する不均質性に着目し、個々の分泌顆粒に局在する炎症性メディエータや分泌機能分子について、単一分泌顆粒レベルでの顆粒放出メカニズムの解明と顆粒不均質性の形成メカニズムについて追究した。3本研究で確立したマスト細胞と浸潤細胞の相互作用研究システムを用いて、細胞間相互作用がアレルギー疾患の調節機構について分子・細胞・動物レベルでの解析を行った。4アレルゲンや異なる親和性を有するアレルゲンによるマスト細胞の活性化が浸潤細胞の生存や分化に与える影響を追究した。5細胞間相互作用がアレルギー応答調節機構について疾患モデル動物を用いてin vivoレベルで追究した。平成30年度が最終年度であるため、記入しない。アレルゲン(抗原)と特異的IgEのアフィニティーが、IgE受容体活性化の多様性を制御していることが申請者の研究から明らかになっている。本研究は、アフィニティー特異的なシグナル伝達のエディティング機構を明らかにし、複雑なアレルギー反応の実体を解明しようとするものである。具体的には以下の項目について追究した。(1)はじめにアレルゲン親和性による転写制御機構を追究することを試みた。その手段として、マスト細胞株(RBL-2H3細胞)にNF-AT(Nuclear Factor of Activated T-cells)・ルシフェラーゼ遺伝子を導入したRS-ATL8細胞を用い、IgEの架橋による転写制御機構を高感度に検出するIgE Crosslinking-induced Luciferase Expression(EXiLE)法を用い、親和性アレルゲンによる転写調節機構を追究した。しかしながら現在まで有効なシグナルを検出するまでには至っていない。そのため現在は、様々な転写調節因子について、リン酸化を指標に解析を行っている。(2)分泌顆粒の不均質性と親和性による炎症性メディエータ分泌制御機構を追究した。我々の研究成果から、アレルゲンの親和性が分泌するサイトカイン/ケモカインの種類や量を厳密に制御していた。そこで、ここの分泌顆粒は一様ではなく個々に異なっているのではないかと考え、単一分泌顆粒に着目し分泌制御機構の解析を行った。(3)さらに、アレルゲン親和性が、浸潤細胞の違いを誘導していたことから、両者の相互作用を分子・細胞レベルで解析凝ることが可能なin vitro共存培養系の確立を行った。その前段階としてマウス骨髄および末梢血からの好中球の単離及び培養方法の確立に着手した。はじめに予定していたRS-ATL8細胞を用いたEXiLE法を用いて、アレルゲン親和性による転写調節機構を追究したが、アレルゲンの濃度依存性応答や親和性応答によって十分なシグナルが検出されなかった。これらの原因については現在検討を行っているところである。先述の理由から、アレルゲン親和性による転写制御機構を解明するため、様々な転写調節因子について、ウエスタンブロット法による転写調節因子のリン酸化(活性化)の解析を行っている。さらに、分泌顆粒の不均質性に関する研究では、初代培養マスト細胞やマウス皮膚組織において、サイトカインやケモカインが、別々の顆粒に独立して存在することを明らかにした。また、サイトカインやケモカインが含まれる個々の分泌顆粒には、それぞれ特異的な分泌機能蛋白質が存在していることが画像解析の結果から明らかになった。このことから個々の分泌顆粒に不均質性が存在していることが明らかになった。また、マスト細胞の親和性アレルゲンの刺激応答に伴い、親和性の違いによって選択的に誘導される浸潤細胞とマスト細胞の相互作用を追究するためin vitro共存培養系の確立を目指した。その前段階としてマウス体内より好中球の単離及び培養方法の検討を行った。そして、共存培養をするのに十分な細胞数及び純度の骨髄由来マウス好中球の単離・培養に成功した。アレルギー疾患はマスト細胞上のIgE受容体が、アレルゲン(抗原)によって抗原特異的IgEを介して架橋(クラスター形成)されることによって惹起される。我々は異なる親和性を持つアレルゲンを用いた研究から、アレルゲン親和性がアレルギー反応の「強弱」だけでなく「質的」にも異なる免疫応答を示すこと、すなわちアレルゲンとIgEの親和性がアレルギー疾患に重要な役割を担っていることを明らかにした。しかし、その詳細な分子・細胞レベルでのアレルゲン親和性認識メカニズム、またアレルギー応答における役割については未だ不明な点も多いのが現状である。

本研究では、親和性アレルゲンや独自の研究システムを用いた細胞内・細胞間情伝達機構の解析を通して、アレルギー反応におけるアレルゲン親和性の役割を追究した。具体的には以下の項目に大別できる。1NFAT(nuclear factor of activated T cells)とLuciferaseを発現させたマスト細胞を用いた解析により、アレルゲン親和性による転写因子活性化制御機構の追究。2マスト細胞に存在する個々の分泌顆粒の不均質性に関する単一分泌顆粒レベルでの解析とそれらの分泌制御機構の解析。3マスト細胞とアレルゲン親和性依存的な浸潤細胞の相互作用の実体を解明するための生細胞イメージング解析。本研究は、アレルゲン親和性によるシグナル伝達のエディティング機構を明らかにし、多様なアレルギー応答の実体を明らかにしようとするものである。初めにIgE Crosslinking-induced Luciferase Expression(EXiLE)法を用いたアレルゲン親和性による転写調節機構の解析では、様々な条件検討の結果、十分なシグナル検出に成功し、転写因子活性化におけるアレルゲン濃度及び親和性の関係についてその分子メカニズムの一端について明らかにした。NFATはアレルゲンの親和性の違いにより異なるレベルで活性化していることが明らかになった。また、単一顆粒レベルでのマスト細胞分泌顆粒における解析では、これまでin vitroやin vivoのマスト細胞において、個々の分泌顆粒には内包されているケミカルメディエータや分泌機能タンパク質に違いが存在しており、本年度の研究によって新たな複合体を形成するタンパク質についても明らかにできた。現在はこれらタンパク質複合体のアレルゲン親和性依存的な分泌メカニズムについて解析を行っている。また、アレルゲンの親和性特異的に炎症組織に浸潤する細胞とマスト細胞の相互作用の解析では、細胞内カルシウムイオン動態を指標とした細胞間相互作用や相互作用に寄与する可能性がある接着分子など、新たな知見を得た。このように上記のような研究の試みから、マスト細胞の活性化におけるアレルゲン親和性の機能の一端が明らかになった。アレルギー疾患は、患者数が増加の一途をたどっているにもかかわらず、現在においても根治療法が存在しないため、発症機構の解明と新規治療法の確立が急務の課題となっている。これまでの研究成果から、アレルゲン親和性がIgE受容体の活性化、転写調節、そして浸潤細胞の種類など、様々なレベルでアレルギー疾患を制御していることが明らかになっている。本年度は、単一分泌顆粒レベルでの顆粒放出機構や転写因子によるアレルゲン親和性認識機構、そして細胞間相互作用によるアレルギー疾患調節メカニズムについて解析を行った。具体的には、1IgE Crosslinking-induced Luciferase Expression(EXiLE)法を用いた、転写因子によるアレルゲン親和性認識機構の解析を行った。
優性遺伝性痙性対麻痺の遺伝子解析

1)遺伝性痙性対麻痺(spastic paraplegia;SPG)をきたす原因は多様でり、現時点では13の遺伝子座(SPG1-13)が決定されている。そのうちSPG4は第2染色体短腕2p21-p22に位置するspastin遺伝子の変異に因ることが1999年に明らかにされた。我々は我が国にもSPG4のあることを連鎖解析により1997年に報告した。SPG4は優性遺伝性SPGの中では最も多い疾患であろうと予想されているが、我が国の疾患構成については知られていない。そこで、予め同意を得た後、遺伝性FSPと臨床診断された12家系の発端者について、spastin遺伝子の変異を検討した。spastin遺伝子の全exonを網羅するよう設定されたプライマーを用いて、PCR法で増幅の後、ダイレクトシークエンスにより塩基配列を決定した。その結果、5家系で各々異なった遺伝子変異が認められた(全SPG家系の42%)。その内訳はmissense変異(R499C,Q347K,K388R)とsplice site変異(1370+1g→t,1742-1g→t)であった。すなわち、(1)本邦の遺伝性FSPにはspastinの変異に起因するもの(SPG4)のあること、(2)我が国の家族性SPGにおいてはSPG4が40%前後を占めること、(3)複数のmutationのあることから家系毎にSPG4変異の由来の異なること、などが明らかになった。2)遺伝性皮質小脳萎縮症(CCA)の40%は原因不明である。遺伝学的に既知の疾患と異なることが確認された1家系について、連鎖解析を行い遺伝子座を第19染色体長腕19q13.4上に決定し、SCA14として報告した。3)北海道内の家族性脊髄小脳変性症228人に占める痙性対麻痺の頻度を検討した。その結果、家族性患者の5.7%が純粋型、4.8%が複合型痙性対麻痺であった。4)複合型痙性対麻痺の臨床および遺伝学的検討を行い、(1)優性遺伝形式をとる白質脳症で小脳失調と痙性対麻痺を呈する疾患、(2)劣性遺伝形式をとる痙性対麻痺で、先天性白内障、運動失調、脳梁萎縮、軸索ニューロパチーを呈する疾患、について検討し報告した。(1)自験例における変性疾患としての“痙性対麻痺"の頻度を検討した。(2)優性遺伝性痙性対麻痺は病因から見た場合には不均一な疾患群である。既に連鎖解析により第2染色体短腕、第14染色体長腕14q11.2-q24.3、第15染色体長腕15q11.1に遺伝子座が決定されているが、不明のものも残されている。我が国の痙性対麻痺については、遺伝学的な検索はなされていない。そこで、北海道在住の遺伝性痙性対麻痺の家系について、遺伝子連鎖解析を行った。

その結果、第2染色体短腕のマイクロサテライトマーカーであるD2S400とD2S367において、統計学的に有意な連鎖が検出された。この結果は、我が国にも欧米と同じく第2染色体短腕に遺伝子座を有する痙性対麻痺が存在していることを強く示唆している。本疾患がトリプレットリピート病である可能性を考慮して、発病年齢や臨床像を検討したが、促進現象は必ずしも明らかではなかった。(3)優性遺伝形式で発病し、小脳失調と痙性を呈し、白質脳症を伴う疾患について検討した。その結果、既知の遺伝子異常とは異なる疾患であることを明らかにし、報告した。家族性痙性対麻痺の遺伝子異常は現時点では、不明である。連鎖解析により遺伝子座を特定し、遺伝子異常を解明することが今後の課題である。家族歴を認めない孤発性脊髄小脳変性症(n=264)の中で、7.2%が原因不明の痙性対麻痺であった。また、家族性脊髄小脳変性症(n=228)においては、痙性対麻痺純粋型は5.7%、複合型は4.8%の頻度であった。すなわち、遺伝性痙性対麻痺は我が国では、比較的稀な疾患であると推定される。1.痙性対麻痺の頻度を検討する目的で、16年間にわたり北大神経内科で診療した脊髄小脳変性症500例の疾患構成を検討した。その結果、孤発例患者の7.2%が原因不明の痙性対麻痺であった。また、家族性に発症をみた患者の5.7%が痙性対麻痺純粋型、4.8%が複合型であった。この結果について発表した。2.遺伝性痙性対麻痺の病因は不均一であり、遺伝子異常は解明されていない。一部に第2染色体上に遺伝子座の決定されている疾患があり、SPG4と命名されている。遺伝性痙性対麻痺には促進現象が稀にあること、グルタミンリピートの異常伸長した転写産物が検出されたとの報告がある。これらは、既に知られているトリプレットリピート病と同じく、CAGリピートの異常伸長による疾患が本疾患群にも含まれている可能性を示唆している。そこで、SPG4と診断された家系について、異常伸長したCAGリピートの有無を検討した。初めに行ったrepeatexpansion detection法では、疾患に特異的な異常伸長は検出されなかった。ついで、SPG4遺伝子座を網羅するCEPH Yacクローンについても検討したが、20回以上に伸長したCAGリピートは検出されなかった。3.病態としての痙性対麻痺は脊髄小脳変性症においても認められる神経徴候の1つである。そこで遺伝性脊髄小脳変性症において、遺伝子異常の解明されているSCA1,SCA2,ジョセフ病(MJD)、SCA6についてDNA解析を行い、臨床所見との相関性を検討して報告した。(1)神経変性疾患としての痙性対麻痺(spastic paraplegia;SPG)をきたす原因は多様である。家族性SPGでは、少なくとも11以上の遺伝子座(SPG-11)が決定されている。そのうちSPG4は遺伝子座が第2染色体短腕2p21-p22に位置し、spastin遺伝子の変異に因ることが1999年に明らかにされた(Hazan J,et al.Nat Genet 1999; 23: 296-303)。変異はエクソンもしくはイントロン領域における塩基の欠失もしくは置換によるもので、5カ所の変異が報告されている。我々は連鎖解析によりSPG4と推定される1家系について、この変異を検討したが、対応する異常を認めなかった。すなわち、従来には知られていない部位に変異があるものと推定されるので、分析を進めている。(2)第16染色体16q24.3に位置しているSPG7は劣性遺伝性疾患で、ミトコンドリア蛋白であるparapleginの変異による疾患である(Casari G,et al.Cell 1998; 93:973-983)。
日本産ミヤマヌカボ複合体の細胞分類・地理学的研究

本研究は、地理的種分化と倍数性進化の両方を含むミヤマヌカボ複合体の分化の実体を追求し、えられた結果を日本の植物相の由来や発達の過程の解明に役立てることを目的としてなされたが、この複合体に属する植物は形態的に互いによく似ていて、実際の染色体数調査により、どの倍数レベルの植物がどこに分布しているかをまず解明する必要があった。本研究計画の3年間に、北海道各地をはじめとして、沢山の山域において採集調査をおこない、32地域個体群からの約800個体の染色体数を調べた。えられた結果を、本研究計画に着手する前にすでにえられていた結果とあわせてみると、2倍体(x=7)は九州から北海道にかけてもっとも広く分布し、4倍体は北海道中部と北部に限られ、6倍体は本州中北部のいくつかの山と北海道の山に、8倍体は本州中部以北の高山に分布していることが明らかになった。他に若干の山においての3倍体と7倍体の生起が見出された。2倍体の地域個体群間の分化の実体などについては現在研究続行中である。外部形態の調査により、2倍体4倍体は種としてはミヤマヌカボに、本州産6倍体はタテヤマヌカボに、8倍体はコミヤマヌカボに属すること、そして北海道産6倍体は、8倍体コミヤマヌカボと区別できずそれと同種として扱われるべきことが確かめられた。タテヤマヌカボと北海道産6倍体は、より低倍数の植物の異なる組合せから生まれた複倍数体であろうとの推測、および北海道産6倍体は、現在北半球北部に広く分布している8倍体コミヤマヌカボの祖先の1つであろうとの推測がえられた。この北海道産6倍体の存在の明確化は、北海道山地の植物地理学上の重要さに示唆を与えた。つまり、北海道が氷期においての植物の避難場所として役立ったのではないかということと、現在極地に広がっている植物種の祖先的な系統を温存している地域ではないかということである。
非アルコール性脂肪肝炎進展に関与するERストレスの同定と新規治療法の開発

本研究の目的は、鳥取大学独自で交配を続ける非アルコール性脂肪性肝炎(NASH)モデルであるFLSおよびFLS-obobマウスを用いて、正常肝から単純性脂肪肝、NASHへ進展する過程における小胞体(ER)ストレスを同定し、ERストレスのNASHバイオマーカーを明らかにすることである。本年度は、単純性脂肪肝モデルであるFLS 24、36、49週齢およびNASHモデルであるFLS-obob 24、36、48週齢を作成し、と殺した。血清ALTや肝脂質量を測定し、マトリックス代謝酵素や各種サイトカイン、ERストレスマーカーをqRT-PCR法にて測定した。FLSマウスでは、血清ALTは経時的に上昇したが、肝中性脂肪および肝コレステロール量は経時的に減少した。シリウスレッド染色による肝線維化は24週にF1、36週にF1、48週でF1-2相当であった。ERストレスマーカーであるATF3、NUPR1遺伝子発現は、0.77:1.72:1.60、0.96:1.65:2.04とそれぞれ経時的に増加した。次にFLS-ob/obマウスでは、体重は経時的に増加したが、肝中性脂肪量は経時的に減少した。肝線維化は、24週F2、36週F3、48週F4相当であった。JUN、ATF3遺伝子発現は、0.83:1.38:1.56、1.27:1.62:2.48であり経時的に増加した。血清NASHに関するERストレスの影響は、未だ解明されていない点が多く、本モデルでは重度の脂肪肝であることが確認されており、ヒトNASHモデルとして肝線維化や炎症、アポトーシス、そしてERストレスに関わる様々な因子の変化が推測されており、今後も研究を継続していく意義が十分にあると考えられる。特定のERストレスが同定できれば、NASH診断バイオマーカーとしての有用性を明らかにし、NASH改善の治療薬の開発も期待される。本年度は、単純性脂肪肝モデルであるFLS24週齢およびNASHモデルであるFLS-obob 24週齢を作成し、と殺した。FLS群(F)とFLS-obob群(ob)で比較すると、平均体重はF群で43.9g、ob群で56.3g、平均肝重量はF群で2.69g、ob群で7.17g、と殺時平均血糖はF群で94mg/dl、ob群で234mg/dl、平均内臓脂肪量はF群で1.39g、ob群で2.25gであり、ob群で、体重、歓重量、血糖、内臓脂肪量で高値であり、各群間に有意な差を認めた。このことは、FLS-obob群において、従来の報告通りレプチン欠損による肝細胞の脂肪化に伴い、高度な脂肪肝となっていることが証明され、FLS群は単純性脂肪肝、FLS-obob群はNASHモデルであることが確認された。NASHに関するERストレスの影響は、未だ解明されていない点が多く、本モデルでは重度の脂肪肝であることが確認されており、ヒトNASHモデルとして肝線維化や炎症、アポトーシス、そしてERストレスに関わる様々な因子の変化が推測されており、今後も研究を継続していく意義が十分にあると考えられる。RT-PCR法によりNASH関連ERストレス遺伝子発現を確認し、ウェスタンブロット法により関連タンパク質を同定していくことはNASHのERストレスにおける病態解明において重要である。研究計画書では、平成28年度にNASH関連ERストレスに関わるmRNA遺伝子発現をRT-PCR array法にて同定予定であったが、諸事情によりマウスの作成状況が大幅に遅れている。ただ、研究の目的とするマウス検体の採取が終了していることは、今後の研究継続にとって良い点である。RT-PCR array法は予算の都合上行う事ができないため、既知のERストレスマーカーを遺伝子レベルではqRT-PCR法にて、蛋白質レベルではウェスタンブロット法にて測定することとしている。肝組織より蛋白質を抽出し、ウェスタンブロット法を行っているが、本モデルは脂肪肝が強く、本手技においては困難を極めている。肝組織からのmRNAを抽出している。本研究の目的は、鳥取大学独自で交配を続ける非アルコール性脂肪肝炎(NASH)モデルであるFLSおよびFLS-obobマウスを用いて、正常肝から単純性脂肪肝、NASHへ進展する過程における小胞体(ER)ストレスを同定し、ERストレスのNASHバイオマーカーを明らかにすることである。