hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
回転場の境界層における伝熱促進に関する基礎研究

以上の結果をもとに、加熱面全体の平均ヌセルト数をレイノルズ数と回転パラメータの関数として整理した。なお、本実験ではトリッピングワイヤを用いて境界層を強制的に遷移させているが、非加熱実験の結果では、加熱開始点付近ではまだ完全な乱流境界層は形成されていなかった。したがって本実験は必ずしも良く整理された環境で行われたとは言えず、今後この点を改善した上で、実験を継続する必要がある。平成11年度に引き続き、回転平板上の境界層熱伝達について、層流から乱流へ遷移する段階と十分発達した乱流の段階との両方について実験的に検討した。回転風洞中に試験平板を設置し、前縁に平行な軸の周りに一定角速度で風洞を回転させ、等熱流束条件下で熱伝達率を測定した。壁温の測定には温度範囲に応じて感温液晶とCC熱電対を使用し、熱線流速計による流速測定および熱電対トラバースによる流れの温度分布の測定も行った。主流速と風洞回転速度のほか、遠心浮力の影響を調べるために壁面温度も変化させた。この系では、コリオリ力が壁面に直角に作用するため,回転方向に応じて境界層の安定性が影響を受け,局所熱伝達率が変化する。本年度は特に、前年度の実験で不充分だった乱流熱伝達率の測定および、壁温を変化させて遠心浮力の効果について検討した。実験に先立ち、レイノルズ平均の運動量式とエネルギー式に付随するコリオリ力項ならびに遠心浮力項について吟味し、乱流熱伝達に与える座標系の回転による効果について検討した。得られた主な結論は以下の通りである。1.コリオリ力が壁面に向かって作用する高圧側境界層では層流から乱流への遷移が促進され、熱伝達率が大幅に向上する。乱流境界層でも熱伝達率は向上する傾向を示すが、変化は層流に比べて小さい。2.コリオリ力が壁面から外向きに作用する低圧面境界層では、乱流熱伝達が抑制される傾向を示すが、層流熱伝達は全く影響されない。3.壁面と主流の温度差が増加すると遠心浮力の影響が徐々に現れ、高圧面、低圧面とも乱流熱伝達が促進される。以上のように、ガスタービン動翼を始めとする回転機器の対流冷却技術の基礎となる知見が得ることができた。
日中戦争(1931〜1945年)の国際共同研究

日中戦争に関するこの研究計画は4つの部分からなる。(1)戦時中国の地方政権(2)軍事史、(3)戦時の文化と社会、(4)外交と国際関係。平成15年度の重点は、2002年にハーヴァード大学で行われた(1)の地方政権に関する国際会議の論文集を編集することであった.現在3編の英文論文の訳文点検を除いて編集作業は完了している。平成16年6月に慶応義塾大学出版会に原稿を渡し、秋に出版する予定である.平成16年1月ハワイ・マウイ島において(2)の日中戦争の軍事史に関する国際会議を開催した.日米中台の専門家約50人が参加し、そのうちに日本の研究者12人が含まれている.この会議に参加するために日本において毎月1回の割合で報告会を開催した。(この会議については、添付した『会報』第4号参照)。現在提出された論文の編集にあたっており、平成16年末までに編集を終え、平成17年夏に論文集の出版を目指している。現在(3)の日中戦争中の文化と社会に関する研究会を隔月に行っている。平成18年に日本で第3回目の国際会議を開催することを計画している。1本研究計画は、日米中3国の研究者が共同して、(1)地方政権、(2)軍事史、(3)外交・国際関係、(4)社会・文化・文学の4つの領域から日中戦争を総合的に研究することを目指す。米中両国の委員会と密接な連絡を取りながら研究が進められた。2本年度の研究の重点領域は(1)地方政権、(2)軍事史に置かれた。3各研究者はそれぞれの分担に従って約50人の若い研究者を動員して、重慶国民政府史研究会、延安研究会、東北研究会、上海史研究会、軍事史研究会を組織した。各研究会は1-2カ月に1回研究会を開き、その研究会活動の一部はニューズ・レター第2号に報告されている。4去る2001年12月1日、2002年1月26日、3月27日には全体会議を開き、各研究会の研究成果として井上久(延安)、塚瀬進(東北)、久保享(華北)、味岡徹(重慶)、高綱博文(上海)、金丸裕一(上海・南京)の諸氏が研究報告を行った。5本研究会は、2002年度の活動の一環として、5月17日東方学会(「日中戦争中の垂慶国民政府」)、6月27-29日ハーヴァード大学(「地方政権」)において2つの国際シンポジウムを計画している。全体会議における6人の報告者はハーヴァード大学の会議に参加して、報告を行うことになっている。(1)この研究は、(1)日中戦時中の地方政権、(2)戦争の軍事史的側面、(3)外交を含む国際関係、(4)社会・文化活動・文学の4つの領域からなる。本年度の重点研究領域は、(1)の日中戦時中の地方政権の研究にあった。(2)毎月1回の割合で研究報告会を行った。研究活動の一端は、添付したニューズ・レターに示されている。(4)会議終了後直ちに『中国の抗戦体制と日本の統治』と題する論文集の編集にとりかかった。現在、論文の修正、翻訳が進行中である。目次添付。(5)(2)の課題との関連で日中戦争の軍事史研究グループ(責任者:波多野澄雄)が2004年1月のハワイにおける国際会議開催を目指し、米中両国の研究者と連絡をとりながら、研究報告会を行っている。(6)(4)の社会・文化活動。文学のグループ(責任者:平野健一郎)が研究の準備を開始した。(1)戦時中国の地方政権、(2)軍事史、(3)戦時の文化と社会、(4)外交と国際関係。平成15年度の重点は、2002年にハーヴァード大学で行われた(1)の地方政権に関する国際会議の論文集を編集することであった。現在3編の英文論文の訳文点検を除いて編集作業は完了している。

平成16年6月に慶応義塾大学出版会に原稿を渡し、秋に出版する予定である。平成16年1月ハワイ・マウイ島において(2)の日中戦争の軍事史に関する国際会議を開催した。日米中台の専門家約50人が参加し、そのうちに日本の研究者12人が含まれている。この会議に参加するために日本において毎月1回の割合で報告会を開催した。(この会議については、添付した『会報』第4号参照)。現在提出された論文の編集にあたっており、平成16年末までに編集を終え、平成17年夏に論文集の出版を目指している。現在(3)の日中戦争中の文化と社会に関する研究会を隔月に行っている。平成18年に日本で第3回目の国際会議を開催することを計画している。
蛍光標識アミノ酸の部位特異的導入による細胞内タンパク質の動態機能解析法の開発

1)カルモジュリンへの2種類の蛍光性アミノ酸の導入による、コンフォメーション変化の検出蛍光ドナーアミノ酸;BODIPYFL-AF、蛍光アクセプターアミノ酸;BODIPY558-AFに、4塩基コドンCGGG、GGGUをそれぞれ割り当てることにより、部位特異的に二種類の蛍光性アミノ酸が導入されたカルモジュリンを生合成した。さまざまな部位にドナーアミノ酸を導入したカルモジュリンを合成し、基質ペプチドの添加に伴う蛍光スペクトルの変化を追跡した。その結果、アクセプターアミノ酸をN末端に持ち、ドナーアミノ酸を40位、99位、112位にそれぞれ有する二重標識カルモジュリンにおいて、ドナー強度の上昇と、アクセプター強度の減少という、FRET効率の変化が確認された。すなわち基質ペプチドの結合によるカルモジュリンのコンホメーション変化が観測できた。また、蛍光偏光度測定により二重蛍光標識カルモジュリンのペプチドに対する結合活性を確認したところ、FRET変化の起こったカルモジュリンに関してはすべて結合活性の保持が確認された。さらに、ストップトフローを用いて、その蛍光変化をリアルタイムに検出することができた。2)マルトースバインディングプロテイン(MBP5)のシャペロニンGroEL中でのフォールディング過程の検出シャペロニン中での基質タンパク質のフォールディングメカニズムの解明を行うためには、GroEL、GroES、ATPなどが混在する中での目的タンパク質のみの構造変化をリアルタイムに検出する必要がある。そこで、上記手法を用いたFRET分析により、シャペロニン中でのMBP5のフォールディング過程の検出を行った。変性MBP5をシャペロニンGroEL/ES/ATP存在下で同様にFRET分析したところ、FRET効率の回復が確認された。これにより、シャペロニン中でのリフォールディング過程が検出できる可能性を示した。本年度は、4塩基コドン法を用いた、2種類の蛍光標識アミノ酸を部位特異的に有するタンパク質合成法の最適化と、そのタンパク質のコンフォメーション変化を蛍光共鳴エネルギー移動(FRET)の変化として検出することを試みた。カルシウム結合タンパク質カルモジュリン遺伝子のN末端領域、C末端領域をそれぞれ4塩基コドンCGGG、GGGTに置換したmRNAを作製した。また、それとは別にアンチコドンにCCCG、またはACCCを持つtRNAを作製し、蛍光標識アミノ酸、BODIPY FL-p-aminophenylalanin、BODIPY 558/568-p-aminophenylalaninを用いて、それぞれを化学的にtRNAの3'末端をアミノアシル化した。それらを、大腸菌由来無細胞タンパク質合成系に加えたところ、BODIPY FL、BODIPY 558/568の両方が導入された完全長のカルモジュリンの発現が確認された。また、その蛍光スペクトルを測定したところ、BODIPYFLの極大励起波長付近の490nmで励起した際に、BODIPY 558/568由来と思われる強い蛍光が確認されたことから、カルモジュリンの両末端に位置する蛍光基が近接しFRETを起こしていることが確認された。また、Ureaによる変性滴定実験を行ったところ、Urea濃度の上昇に伴いB558AF由来の蛍光が減少し、BFLAF由来の蛍光の増加が確認された。このことから、カルモジュリンの構造変化をFRET効率の変化として検出できることが示された。また、本研究においては新規蛍光標識アミノ酸の設計も行い、幾つかの蛍光標識アミノ酸に関しては、タンパク質への導入が確認された。今後、これらの新規蛍光標識アミノ酸の組み合わせを検討することにより、より汎用性の高いタンパク質コンフォメーション変化の検出技術として確立する予定である。
３次元軌道・スピン分解STMによる強相関トポロジカル絶縁体の原子分解能観察

強い電子相関を示し、極低温で金属絶縁体転移を起こすYbB12は近年、トポロジカル近藤絶縁体として理論的に予測され、強相関電子系特有の新奇なトポロジカル量子現象の発現が期待されている。そこで、本研究では、走査トンネル顕微鏡を用いてYbB12の表面状態を3次元(面直・面内方向)に軌道・スピン分解してその起源や発現機構を原子スケールで解明し、強相関トポロジカル絶縁体を将来的なデバイス応用に繋げるための基盤研究を行う。
コミック同人誌即売会「コミック・マーケット」の文化社会学的研究

本研究の目的は、今日、世界的にも注目を集めている我が国「おたく文化」の文化社会学的分析を行ない、文化に関する社会学理論の再構築を行なうことである。具体的な研究対象はコミック同人誌即売会「コミックマーケット」(通称「コミケ」)である。このイベントは現在、東京、有明の国際展示場を借り切って夏と冬の年2回、3日間日程で催行されており、参加者は一日あたり15万人を超える。運営はボランティアによるものであり、世界最大規模の文化運動と呼ぶことができる。本研究では初年度(平成16年度)に以下の(1)(3)の3調査、そして平成17年度には(4)の調査を実施し、調査対象の巨大さに対応して、文化社会学分野でこれまでにない規模の、極めて膨大なデータを集積した。このデータについてその後の各年度において分析作業を行なってきた。(1)【サークル参加者質問紙調査】サークル参加者全数調査。得られた質問紙回答は37,620票。(2)【スタッフ参加者質問紙調査】コミックマーケットを運営するボランティア・スタッフに郵送法によって行なった質問紙調査。得られた質問紙回答は336票。(3)【スタッフ参加者グループ・インタビュー調査】コミックマーケットを運営するボランティア・スタッフに対して行なったグループ・インタビュー調査。6グループについて実施。テープ起こし字数、総計23万5千字。(4)【米澤嘉博氏インタビュー調査】コミックマーケット準備会代表、米澤嘉博氏への聞き取り調査。テープ起こし数、総計3万5千字。データ分析・検討の結果、大衆操作という観点から立論された大衆文化論、ならびに、反抗の契機として大衆文化を捉えるカルチュラル・スタディーズといった、これまでの文化理論のいずれもが適用できない、"中間文化的"な現代日本文の動態が明らかとなった。本研究は、コミック同人誌即売会「コミックマーケット」を文化社会学的に研究するものである。本年度は以下の三つの調査を実施した。(1.)サークル参加者アンケート調査コミックマーケットに参加するサークルの代表者に質問紙調査を行なった。質問紙の配布は即売会主催者の協力により、「コミックマーケット66参加申し込み書」に折り込んでもらい、回収も参加申込書送付封筒に同封してもらうことにより行なった。配布5万2千に対し37,620票の回収を得た。本年度はこの回収票のコーディング、データ入力、第一次分析まで行なった。参加申し込みサークル代表者の男女構成は、女性71.2%、男性27.2%、平均年齢は女性28.32歳、男性28.64歳、女性代表者のサークルではサークルのメンバー数1名のケースが70.8%であるのに対して、男性代表者のサークルではサークルメンバー数1名のケースは47.0%、などの結果が得られた。(2)スタッフ参加者アンケート調査コミックマーケットは「スタッフ参加者」と呼ばれるボランティアによって運営されている。「コミックマーケット66」スタッフ参加者に対して郵送法により質問紙調査を行なった。配布数2,331、回収数336票であった。「コミックマーケットを文化運動として意識することがありますか」という質問に対して、「よく意識する」19.5%、「時々意識する」37.1%、といった回答が得られた。(3)スタッフ参加者グループインタビュー調査スタッフ参加者に対してグループインタビュー調査を実施した。6集団27人から延べ12時間の質疑応答記録テープが得られ、テープ起こしを行ない、質的データを収集した。「文化運動」という言葉の理解について、世代によって大きな差異があることが確認された。

本年度は、以下の3項目の作業を行なった。(1)昨年実施した3つの調査の分析作業を進めた。【サークル参加者調査】サークル参加者全数調査によって得られた質問紙回答37,620票について、数量的分析を行なった。女性代表者のサークルでは70.8%が構成員1名のサークル。これに対し男性代表者のサークルでは構成員1名のサークルは47.0%。女性代表者のサークルではコミックマーケット以外の同人誌即売会への参加も活発。男性代表者サークルではコミックマーケット以外の同人誌即売会参加は少なくその代わり書店委託が活発。【スタッフ参加者質問紙調査】コミックマーケットを運営するボランティア・スタッフに郵送法によって行なった質問紙調査について、得られた336票の回答について数量的分析を行なった。スタッフ参加をするようになったきっかけとしては、「スタッフをしている友人知人に勧められて」という理由が最多(58.6%)。半数以上のスタッフ参加者がコミックマーケットの文化運動としての側面を意識(「よく意識する」19.5%、「時々意識する」37.1%)。【スタッフ参加者グループ・インタビュー調査】同じくボランティア・スタッフに対して行なったグループ・インタビュー調査の会話記録についてディスコース分析(質的分析)を行なった。コミックマーケットの文化運動としての側面について「結局先日あったビエンナーレですか」という発言もあれば「学生運動の流れでコミケって始まってるはずなんですよ、漫画で革命を起こす」といった発言もあった。(2)コミックマーケット主催者への聞き取り調査2005年7月6日15時より、コミックマーケット準備会代表の米澤嘉博氏に対し聞き取り調査を行った。歴史的経緯の確認、調査結果についての確認など。(3)フォローアップ調査の企画前2項目を参考に、必要なフォローアップ調査について検討を行なった。既に実施済みの調査データについての分析を進めたのが、本年度の作業である。サークル参加者調査について、2次分析からいくつかの知見が得られたが、最も興味深いものは次の点であった。好きな作品の要素についての因子分析を、全体を対象として行なうのではなく、女性・男性に分けて分析した結果、性別によって因子構成がはっきりと異なっていた。性描写と結びついて因子を構成するものが、女性で「やおい系・JUNE系」、男性で「萌え系・美少女系」となっているのは当然の結果であるが、「ドラマティックな展開のある作品」と結びついて因子を構成するものが、女性では「内面描写の多い作品」であるのに対して、男性では「ヒーローやヒロインの活躍する作品」であった。また、女性では「癒してくれる作品」と「生活感のある作品」は同一の因子を構成するのに対して、男性では独立であった。既に1次分析で明らかになったように女性サークルと男性サークルでは規模や行動様式において大きな違いがあったが、作品内容の認知の仕方についても相違があると考えられる。
触知覚に影響を及ぼす力学的要因の解明

本研究では,知覚に影響を及ぼす力学的要因のモデル化と定量評価を目的とし,指先の動特性を数理モデルで表した.得られた知見は,力触覚提示装置へ応用した.数理モデルは解剖学的知見と材料的特性に基づく動特性の簡略化モデルであり,実験により妥当性を検討した.実験では接触条件の変化と振動覚閾値との関係を示した.力触覚提示装置は前述のモデルに基づき提示情報を調整するものであり,面型とジョイスティック型を用いた.本研究では,知覚に影響を及ぼす力学的要因のモデル化と定量評価を目的とし,指先の動特性を数理モデルで表した.得られた知見は,力触覚提示装置へ応用した.数理モデルは解剖学的知見と材料的特性に基づく動特性の簡略化モデルであり,実験により妥当性を検討した.実験では接触条件の変化と振動覚閾値との関係を示した.力触覚提示装置は前述のモデルに基づき提示情報を調整するものであり,面型とジョイスティック型を用いた.人間の触知覚は,ウェーバー・フェヒナーの法則に基づき非線形に変化することが知られており,皮膚表面に印加された刺激は,弱い刺激は感度良く,強い刺激でも発散せずに広帯城に知覚される.この触知覚の非線形性は,ヒト固有の巧みな触覚センシング能力の要因とも考えられ,その解明は生理学的な観点から興味深いばかりでなく,触覚提示デバイスなどの開発に際しても重要な基礎データを提供できる可能性を持つ.本年度は,モデルを構築し,これに基づく情報伝達特性を明らかにすることを目的とした.本年度は,触覚受容器の一つであるマイスナー小体へ若目した.マイスナー小体は,皮下の真皮乳頭へ位置する機械受容器であり,螺旋状の神経軸索,層状に積み重なった層板細胞,およびコラゲン繊維から構成される.本研究では,これを非線形ばねと仮定してモデルを導出した.また,より現実的なモデル構築にも着手した.具体的には,複数の小体が繊維により結合されたモデルを導出し,機械系のパラレルメカニズムの概念を規範に伝達関数の構造を考察した.考察結果は,指先による柔軟体の知覚に関する心理物理実験などの結果と比較検討をおこなった.ここでは,指の力学モデルによる解析と心理物理実験をおこない,データ分析をおこなった.その結果,指先による弾性体の知覚においては,指先皮下の触覚受容器の応答に加えて,指先の姿勢或いは発揮力のオーダと弾性体の弾性率との関係,さらには指先の制御課題の難易度がその識別精度へ大きく影響する可能性を見出した.他方,得られた知見は,力触覚提示デバイスの構築へも展開されつつある.実際,球面超音波モータを利用した力触覚提示デバイスの開発に際し,本研究成果の一部が参考結果として吟味された.実際に近いパラメータ値を用いた場合に関する検討,及び人間の制御系との統合による能動センシングメカニズムの考察などが課題として残っている.触知覚の非線形性は,ヒト固有の巧みな触覚センシング能力の要因とも考えられ,その解明は生理学的な観点から興味深いばかりでなく,力触覚提示装置などの開発に際しても重要な基礎データを提供できる可能性を持つ.本研究は,触知覚に影響を及ぼす力学的要因のモデル化と定量評価を目的とし,数理モデルを構築するとともに,得られた知見を力触覚提示装置へ展開する21年度は,指先の数理モデルを構築し,様々な接触条件と知覚との関係について力学的解釈を試みた.そこで22年度は,前述の数理モデルを拡張して再構築するとともに,得られた知見を力触覚提示装置へと展開した。新たに構築した数理モデルは,無毛皮膚と機械受容器に関するもので,解剖学的データと材料的特性に基づく動特性の簡略化モデルである.力触覚提示装置は,構築した数理モデルに基づき提示情報を調整するもので,面型とジョイスティック型の二種を構築した.面型の装置では,指先との動的接触状態を考慮した接触面のインピーダンス調整法について検討した.また,ジョイスティック型の装置では,操作者へ伝搬される駆動系振動に関し,ユーザビリティ向上の観点から,把持力の変動による振動感覚閾値の変化に関して検証した.さらに,発展的課題として,ヒトの制御系との統合による能動触原理に関して,タブレットPCの操作タスクを例に分析を進めている本研究は,触知覚の基礎原理を力学的観点から分析し,定量的解釈を得る目的がある.ただし,これまでの成果は,研究遂行に応じて心理物理実験などを取り入れており,厳密な意味での力学的な定量評価指標とはなり得ないと考える.一方で,ある種の定性的な解釈を含みながらも,各種の力触覚提示装置の機能評価に際して評価基準を策定可能であることが確認されており,本基準に基づく相対的評価を可能とする.以上より,幾つかの課題を新たに提起するとともに,本研究計画は達成されたと結論づける
T細胞受容体トランスジェニックマウスを用いた尋常性天疱瘡自己抗体産生機構の解明

天疱瘡の自己抗原であるDsg3に対する特異的なTCRを有するT細胞トランスジェニックマウスH1(以下H1)はinterface dermatitisを生じる。interface dermatitisはTh1サイトカインであるIFN-γ依存性であった。特異的TCRの由来となったT細胞クローンはTh2サイトカインであるIL-4依存性にB細胞に対して抗Dsg3抗体産生誘導能を有していたことから、同じTCRを有する自己反応性T細胞であってもそのcytokine profileの違いにより異なる皮膚炎が生じる事が示唆された。自己反応性T細胞のcytokine profileと自己免疫による皮膚炎の関係性を解析するため、H1由来のT細胞を自己免疫疾患における代表的なサブセットの1つであるTh17へとin vitroで分化させて免疫不全マウスであるRag2KOマウスへと養子移入した。レシピエントマウスは鱗屑を伴う皮膚炎を認め、病理組織学的には表皮の肥厚、不全角化、顆粒層の現症、表皮への好中球の浸潤を認めた。これらの所見は慢性炎症性皮膚疾患の乾癬に類似した所見であった。この皮膚炎は抗IL-17A抗体、抗IL-23p40抗体により抑制された。さらに乾癬様皮膚炎マウスの解析を進めたところ乾癬で代表的に発現しているサイトカイン、ケモカイン、タンパクの発現も上昇しており、分子レベルにおいても乾癬を再現していると考えられた。ヒトの尋常性乾癬の原因は未だ不明であり、乾癬皮膚に浸潤しているリンパ球が何を認識して免疫応答しているのか明らかではない。本研究において、表皮抗原反応性のTh17細胞により乾癬様皮膚炎を誘導できたことから、これまで不明であった乾癬病変部において浸潤しているT細胞の抗原が表皮抗原である可能性を示唆しており、今後の乾癬の研究の進歩に寄与すると考えられる。尋常性天庖瘡はDsg3に対する自己抗体産生によって生じる自己免疫疾患である。自己抗体産生にはB細胞のみならず、それらを指揮するCD4T細胞の関与が重要である。これまでに当グループではDsg3特異的なTCRを有するT細胞トランスジェニックマウスH1(以下H1)を作製した。このH1マウスはDsg3に対する自己反応性CD4T細胞を有するものの自己抗体産生を行わず、interface dermatitisというTh1型の皮膚炎を生じさせた。このことから、同一自己抗原を認識するCD4T細胞であってもサイトカインプロファイルの違いにより生じる皮膚炎が異なることが示唆された。サイトカインプロファイルを制御により皮膚炎の制御を試みた。まず、H1マウスにおいてTh1に偏ったサイトカインプロファイルをTh2に誘導するために、H1マウスとTh2に偏りやすいSOCS3 Tgマウスと交配したが、SOCS3Tg-H1マウス自体では自己抗体産生には至らなかった。自己抗体産生には、T細胞のみならず、B細胞の免疫寛容の破綻が同時に必要であるためと考えられた。次にH1よりnaive CD4 T細胞を採取し、in vitroにおいて各Th条件で培養/分化させてRag2KOマウスへと移入した。H1 Th17細胞のRag2KOマウスへの移入により、表皮内への稠密な好中球浸潤を伴う皮膚炎を誘導した。また、皮膚以外でDsg3が発現している食道、胃前庭においても好中球を伴う炎症を引き起こし、Dsg3の発現していない臓器には炎症を引き起こさなかった。これは、抗原特異的なT細胞が抗原の発現している臓器特異的にT細胞のサイトカインプロファイルに応じて特徴的な炎症を引き起こしており、同じTCRを有するT細胞であってもそのサイトカインプロファイルが異なれば誘導する炎症が異なることが示唆された。尋常性天疱瘡はDsg3に対する自己抗体産生によって生じる自己免疫疾患である。まず、H1マウスにおいてTh1に偏ったサイトカインプロファイルをTh2に誘導するために、H1マウスとTh2に偏りやすいSOCS3Tgマウスと交配したが、SOCS3 Tg・H1マゥス自体では自己抗体産生には至らなかった。次にH1よりnaive CD4T細胞を採取し、in vitroにおいて各Th条件で培養/分化させてRag2KOマウスへと移入した。H1Th17細胞のRag2KOマウスへの移入により、表皮内への稠密な好中球浸潤を伴う皮膚炎を誘導した。HITh1細胞の移入では起こらなかったので、Th17関連サイトカインもしくはケモカイン受容体が皮膚炎発症に重要であることが考えられる。しかしH1Th17細胞の移入後、サイトカイン産生を細胞内染色法で調べたところIFNγIL-17両陽性の細胞が顕著に増えていた。

現在IFNγあるいはIL-17欠損マウスにHITCR-Tgを導入することを進めており、どのサイトカインが重要かを明らかにしたい。天疱瘡の自己抗原であるDsg3に対する特異的なTCRを有するT細胞トランスジェニックマウスH1(以下H1)はinterface dermatitisを生じる。interface dermatitisはTh1サイトカインであるIFN-γ依存性であった。特異的TCRの由来となったT細胞クローンはTh2サイトカインであるIL-4依存性にB細胞に対して抗Dsg3抗体産生誘導能を有していたことから、同じTCRを有する自己反応性T細胞であってもそのcytokine profileの違いにより異なる皮膚炎が生じる事が示唆された。自己反応性T細胞のcytokine profileと自己免疫による皮膚炎の関係性を解析するため、H1由来のT細胞を自己免疫疾患における代表的なサブセットの1つであるTh17へとin vitroで分化させて免疫不全マウスであるRag2KOマウスへと養子移入した。レシピエントマウスは鱗屑を伴う皮膚炎を認め、病理組織学的には表皮の肥厚、不全角化、顆粒層の現症、表皮への好中球の浸潤を認めた。これらの所見は慢性炎症性皮膚疾患の乾癬に類似した所見であった。この皮膚炎は抗IL-17A抗体、抗IL-23p40抗体により抑制された。さらに乾癬様皮膚炎マウスの解析を進めたところ乾癬で代表的に発現しているサイトカイン、ケモカイン、タンパクの発現も上昇しており、分子レベルにおいても乾癬を再現していると考えられた。ヒトの尋常性乾癬の原因は未だ不明であり、乾癬皮膚に浸潤しているリンパ球が何を認識して免疫応答しているのか明らかではない。本研究において、表皮抗原反応性のTh17細胞により乾癬様皮膚炎を誘導できたことから、これまで不明であった乾癬病変部において浸潤しているT細胞の抗原が表皮抗原である可能性を示唆しており、今後の乾癬の研究の進歩に寄与すると考えられる。H1-Th17の移入で好中球を主体とした皮膚炎症が誘導できる系が確立したこと、またこのときTh1/17型のIFNγ、IL-17両陽性細胞が出現することを明らかにした点が評価できる。現在IFNγ欠損マウスおよびIL-17欠損マウスとH1-TCR-トランスジェニックマウスを交配させており、マウスができ次第、IFNγとIL-17どちらが重要かを明らかにする。また皮膚への集積にケモカイン受容体の発現が重要と考えられるので皮膚での各種ケモカインの発現量およびTh17でのケモカイン受容体の発現パターンを調べる。
細胞の生存・死に関わるチロシンホスファターゼに視点を当てた卵胞発育機構の解析

卵胞の発育・閉鎖の運命決定には卵胞顆粒膜細胞の生存・死が密接に関わっている。顆粒細胞の生存には、チロシンキナーゼによるシグナル分子のチロシンリン酸化が深く関与するが、その逆反応を司るチロシソンホスファターゼ(PTP)の卵巣における研究は極めて遅れている。我々は、25種のチロシンホスファターゼが顆粒膜細胞で発現し、PTP20やPTPεMを含む幾つかめPTPが性周期に伴い劇的な発現変動をすることを明らにした。このうち、健常卵胞に比べ閉鎖卵胞に多いPTPεMに着目して、その卵巣における機能とその作用機序解析した。その結果、以下の知見を得た。1)顆粒膜細胞PTPεMを過剰発現したところ、細胞の中心部が収縮。し神経突起の構造を示した後、アポトージスを起こした。2)この時、アクチンファイバーが消失し、接着班の形成に重要なRho活性が低下した。3)Rhoにより制御されるRhoキナーゼ阻害剤の添加は、PTPεMの過剰発現と同様の変化を細胞にもたらした。4)PTPεMは接着班の形成と密接に関わるチロシンキナーゼFAKのTyr925とTyr576/577のリン酸化レベルを低下させた。5)PTPεMとFAKは共沈殿を起こした。以上の結果は、PTPεMが接着班やアクチンファイバーの形成に深く関与するFAKの脱リン酸化やRhoの活性低下を通して、顆粒膜細胞と細胞外マトリックス因子との結合を切る、すなわち細胞にanoikisを起こすことにより細胞死を誘導することを示している。これらのデータは、PTPεMが可融膜細胞の生存を負に制御し、卵胞閉鎖を導くシグナル因子であることを意味するものである卵胞の発育・閉鎖の運命決定には卵胞顆粒膜細胞の生存・死が密接に関わっている。これらのデータは、PTPεMが可融膜細胞の生存を負に制御し、卵胞閉鎖を導くシグナル因子であることを意味するものである卵胞顆粒膜細胞の生存・死は卵胞の発育・閉鎖と密接に絡み、子孫の数を決定する鍵を握る。一方、研究代表者等は、遺伝子ファミリーを形成するプロテインチロシンホスファターゼ(PTP)のうち少なくとも25種が、ラット性周期の種々のステージで顆粒膜細胞に発現することを見出した。本課題では、このうち、PTP1B、PTPεM、TC-PTP、SHP-1に着目し、その作用や分子機序を細胞および個体レベルで解析することを目的としている。平成16年度は以下の成果を得た。(1)トランスフェクション効率の極端に低い顆粒膜細胞において、細胞レベルの実験を進める上で、アデノウイルスベクターの利用が不可欠である。これまでに、TC-PTP、SHP-1の野生型と基質トラップ型を含む組み換えアデノウイルス、さらにノックダウンに必要なSiRNAを入れた組み換えアデノウイルスをPTP1B、PTPεM、TC-PTPそれぞれに関して作製し、さらなる研究の材料作りを行った。(2)PTPεMは、顆粒膜細胞の生存に対する負の制御因子であることを以前に同定したが、その機序に関して細胞レベルでさらに詳しく解析し、分子メカニズムをほぼ明らかにすることができた。(3)PTP1BはPTPεMとは逆に、顆粒膜細胞の生存に対する正の制御因子として働くことを明らかにし、その作用機序の一部を明らかにした。今後、SiRNAを用いたノックダウン系等を用い解析を進めて行く。性周期において、多くの卵胞は発育・成熟途中で卵胞顆粒膜細胞のアポトーシスにより閉鎖に陥り退縮する。この排卵数決定機構の仕組みの詳細は未だ不明である。研究代表者は、顆粒膜細胞中に25種類ものプロテインチロシンホスファターゼの発現を見出した。

本研究では、卵胞発育を正に制御する(あるいはそう予想される)PTP(PTP1B、TC-PTP)と、負に制御する(あるいはそう予想される)PTP(PTPε、SHP-1)の計4種のPTPに焦点を当て、その機能と作用機序を明らかにすることを目的として実験を行っている。現在までに、PTP1BおよびPTPεのsiRNAをアデノウイルスベクターに組み込み、顆粒膜細胞の初代培養系でこれらPTPを特異的にノックダウンする系を確立した。その結果、少なくともPTPεは予想どおり顆粒膜細胞の生存を負に制御し、アポトーシスを誘導することを明らかにした。さらに、その作用機序として、細胞が細胞骨格を介して細胞外マトリックス因子に接着する際に重要となるFocal Adhesion Kinaseを脱リン酸化し、それにより細胞接着が減少しanoikisを起こすことにより細胞死に至ることが判明した。現在、PTP1Bに関しても同様の手法でその機能の解析を行っている。また、SHP-1とTC-PTPに関しては、それらの野生型およびドミナントネガティブ型を挿入した組み換えアデノウイルスベクターの作製は完了し、siRNAの系を作製中である.当研究室では、卵胞発育および動脈硬化の発症・進展におけるチロシンホスファターゼの関与に関する研究を行なっている。卵胞発育は顆粒膜細胞の生死が鍵を握っており、顆粒膜細胞が増殖を続ければ排卵に至る一方、途中でアポトーシスを起こせば卵胞閉鎖に陥る。当研究室では、少なくとも25種のチロシンホスファターゼが顆粒膜細胞に発現しており、このうち数種が性周期に応じてその発現が大きく変動することを見出した。このうち、PTPεMと呼ばれるチロシンホスファターゼは、顆粒膜細胞がアポトーシスを起こす閉鎖卵胞で発現が増加することを観察した。培養顆粒膜細胞にアデノウイルスを用いてPTPεMの野生型および基質トラッピング変異体を過剰発現したところ、以下のことが明らかとなった。(1)PTPεMは顆粒膜細胞と細胞外マトリックスの結合を低下させ、anoikisにより細胞のアポトーシスを誘導すること、(2)PTPεMは、細胞と細胞外マトリックスの結合の結合(focal adhesion)に重要なチロシンキナーゼFAK(Focal Adhesion kinase)を基質とし、Tyr925を脱リン酸化すること、(3)FAKを脱リン酸化した結果、低分子量Gタンパク質Rhoが不活性化され、focal adhesionの形成が阻害され、細胞外マトリックスから細胞が離脱すること。これらの結果は、PTPεMが卵胞発育の負の制御因子として機能していることを示すものである。また同時に、PTPεMが血管平滑筋細胞の増殖抑制、血内皮細胞の創傷治癒促進を介して、動脈硬化の発症・進展を負に制御する可能性も示唆した。
高磁場MR構造面像に基づいたサル大脳連合野記憶ニューロンの層分布マッピング

本研究では、電気生理学的手法と磁気共鳴画像法(MRI)の併用により個々の神経細胞の活動記録部位を正確に同定することで、視覚連合記憶に関わる神経細胞の性質と大脳皮質層構造の関係を解明することを目的としている。昨年度までにおいては単一神経細胞活動の記録部位を高磁場4.7テスラMRIにより150μmの高解像度で同定する手法を開発した。しかしながら、視覚連合記憶にとって重要な下部側頭葉傍嗅皮質においては第4層が薄く大脳皮質層構造のMRI画像化が困難であるため、層構造の同定には組織切片を併用するなどの改良を行わなければならない。そこで本年度においては、MRI画像と組織切片との対応づけを正確に行うため、両者で確認できるような標識を脳内につけ、これを基準として位置合わせを行う手法を開発した。脳内に挿入したエルジロイ電極を電気分解して金属成分を組織に沈着させ、MRI画像と組織切片の双方で可視化可能な標識を生成した。MRI撮像と組織切片の作成を繰り返しながら電気分解パラメータを検討した結果、直径150-200μm程度の小さな金属沈着標識を安定して生成することができるようになった。この標識は少なくとも7ケ月以上残存し、サルを用いた慢性実験に適用可能であることが示された。上記手法の要点を2007年に東京で行われた東京大学生命科学研究ネットーワークシンポジウム、米国アシロマにて行われたカルフォルニア大学サンフランシスコ校神経科学リトリート、および2008年に富浦で行われたグローバルCOE「生体シグナルを基盤とする統合生命学」第1回リトリートで報告した。また上記の手法開発の実験と並行して、1頭目のサルの訓練を終了させた。対連合記憶課題を用い、12ペア24種類の図形を学習させ、その後に頭部に固定具を取り付ける手術を行い、頭部を固定した姿勢で課題を遂行させる訓練を行った。本年度においては、単一神経細胞活動の記録部位を高磁場4.7テスラMRIにより同定する手法の開発を主に行なった。この手法の開発には、ニホンザル1頭およびアカゲザル2頭を用いた。最初に、予備実験により側頭葉の大脳皮質層構造が判別可能な超高解像度(150μm^2)のMRI構造画像の撮像条件を検討した。麻酔下のサルを用いて、動きや磁化率の違いに起因するアーチファクトを軽減し、かつ高いS/N比と良好なコントラストを共に実現する撮像シークエンスおよび送受信コイルを決定した。次いでガラス被覆タングステン微小電極を用いて、その記録部位をMRIにより同定するための手法を確立した。まず、微小電極を硫酸銅溶液中に沈め撮像することで、微小電極の記録部位を同定するための撮像条件を検討した。その結果、撮像時の磁場との位置関係を調整することで、MRI画像上における微小電極の記録部位が正確に同定できることを見出した。また、この条件はサル大脳側頭葉の超高解像度構造画像を取得するために必要な撮像条件と両立することを確認した。これら成果の概要は、2005年に米国ワシントンDCにて行なわれた北米神経科学大会にて報告した。最後に、上記の予備実験により最適化された諸条件を用いて、実際にサル側頭葉内に刺入したタングステン電極を撮像し、その記録部位の位置を超高解像度(150μm^2)の構造画像上で同定した。組織切片上で同定した電気的凝固標識と比較しその誤差を評価したところ、MRIによる位置同定は画像の解像度と同程度の±150μmという高い精度を持つことが示された。上記成果は論文としてまとめ投稿中である。昨年度においては単一神経細胞活動の記録部位を高磁場4.7テスラMRIにより同定する原理的手法を開発したが、本年度においてはこれを課題遂行中のサルへと応用するための実用化を最初に行った。そのためにまず、高磁場MRIと単一神経細胞活動記録を両立させるため、MRI対応の非磁性超小型記録電極マニピュレータの開発を行った。ナリシゲ科学器械研究所の協力を得て、高磁場でも使用可能な非磁性ジュラコン樹脂を材料とし、MRI装置内部の限られた空間でも使用可能なように小型(22x16x5mm)だが必要な剛性を保ち、かつ高精度のマニピュレータを開発した。次にこの非磁性小型マニピュレータを用いて実際にサル側頭葉へ記録電極を刺入し、超高解像度(150μm^2)MRIによって電極位置の保持牲能を調べた。その結果、飼育ケージでの覚醒状態を経ているにもかかわらず、複数日にわたって安定して電極先端の位置を保持できることが示された。このような安定した保持性能は、覚醒下で課題遂行中のサルからの神経細胞活動記録と麻酔下での超高解像度MRI構造画像の取得を異なる日に行うことをも可能とし、日常的に使用可能な手法としての利便性が実現された。上記手法の要点を2006年に京都で行われた第29回日本神経科学大会、米国アトランタにて行われた北米神経科学大会、および2007年に大阪で行われた第84回日本生理学会大会にて報告した。

また、上記手法の原理から実用化段階まで含めた成果を論文としてまとめNature Methods誌に投稿して受理され、2007年2月号に掲載された。その後、位置同定精度の向上を目的とし、さらなる高解像度の構造画像を取得するため、新しいサーフェス受信コイルを導入し最適の撮像シーケンスを決定した。また、1頭目のサルについて連合記憶課題の訓練を開始した。本研究では、電気生理学的手法と磁気共鳴画像法(MRI)の併用により個々の神経細胞の活動記録部位を正確に同定することで、視覚連合記憶に関わる神経細胞の性質と大脳皮質層構造の関係を解明することを目的としている。昨年度までにおいては単一神経細胞活動の記録部位を高磁場4.7テスラMRIにより150μmの高解像度で同定する手法を開発した。しかしながら、視覚連合記憶にとって重要な下部側頭葉傍嗅皮質においては第4層が薄く大脳皮質層構造のMRI画像化が困難であるため、層構造の同定には組織切片を併用するなどの改良を行わなければならない。そこで本年度においては、MRI画像と組織切片との対応づけを正確に行うため、両者で確認できるような標識を脳内につけ、これを基準として位置合わせを行う手法を開発した。脳内に挿入したエルジロイ電極を電気分解して金属成分を組織に沈着させ、MRI画像と組織切片の双方で可視化可能な標識を生成した。MRI撮像と組織切片の作成を繰り返しながら電気分解パラメータを検討した結果、直径150-200μm程度の小さな金属沈着標識を安定して生成することができるようになった。この標識は少なくとも7ケ月以上残存し、サルを用いた慢性実験に適用可能であることが示された。上記手法の要点を2007年に東京で行われた東京大学生命科学研究ネットーワークシンポジウム、米国アシロマにて行われたカルフォルニア大学サンフランシスコ校神経科学リトリート、および2008年に富浦で行われたグローバルCOE「生体シグナルを基盤とする統合生命学」第1回リトリートで報告した。また上記の手法開発の実験と並行して、1頭目のサルの訓練を終了させた。対連合記憶課題を用い、12ペア24種類の図形を学習させ、その後に頭部に固定具を取り付ける手術を行い、頭部を固定した姿勢で課題を遂行させる訓練を行った。
咬合異常に伴う骨量減少及び骨成長抑制に対するβアドレナリンレセプターの関与

過去の文献を参考に成長期咬合異常マウスモデルを確立した。近年、血中グルココルチコイド濃度と骨芽細胞上のβアドレナリンレセプターとの密接な関係が示唆されており、咬合異常群の血中グルココルチコイド濃度を測定したところ対照群と比較して有意に増加していた。末梢骨用定量的CT (pQCT)により、脛骨において咬合異常に伴い有意な骨量減少および骨強度の減少が確認された。マイクロCTによる骨微細構造の解析では、咬合異常群における椎骨の骨量および骨梁幅の有意な減少が認められた。歯科臨床において、咬合異常により全身症状を訴える患者は多い。近年、動物実験において、咬合異常が副腎皮質ホルモンであるグルココルチコイドを増加させることが報告された。グルココルチコイドの過剰分泌は、成長期および成人の両時期において骨量を減少させる。本研究では、咬合異常が副腎皮質ホルモンならびに骨密度に与える影響を明らかにする目的のもと、実験を行った。実験動物としては成長期に当たる5週齢のC57BL/6 miceを用い、咬合異常モデルは先行研究を参考に、上下顎切歯にレジンを築盛することで作成した。咬合異常付与後、血中のグルココルチコイドは有意に増加していた。また、咬合異常付与により、1週間後の長管骨(脛骨および大腿骨)の骨密度(pQCT:末梢骨用定量的CTを用いて測定)は有意に減少し、骨の強度指標(Strength Strain Index: SSI)は有意に減少していた。今回の実験は国内外で未だ行われておらず、その内容で第11回日本歯科骨粗鬆症研究会学術大会(2013年3月)にて発表を行ったところ、日本歯科骨粗鬆症研究会学術大会学術奨励賞を受賞し、その独創性および着想力の高さが評価された。過去より、動物実験において、咬合異常が副腎皮質ホルモンであるグルココルチコイドを増加させることが報告されてきた。最近では、ステロイド(グルココルチコイド)誘発性骨粗鬆症がβアドレナリンレセプター遮断薬投与によって回復することから、グルココルチコイド誘発性の骨粗鬆症に交感神経系が関与していることが示唆されていた。しかしながら、これまで咬合異常が全身の骨代謝に与える影響についての報告はされていなかった。我々は、成長期における咬合異常が、全身の骨代謝に与える影響を明らかにすることを目的として実験を行った。まずは過去の文献を参考に、成長期にあたる5週齢C57BL/6 miceを用い、上下顎切歯にコンポジットレジンを築盛することで、咬合異常マウスモデルを確立した。咬合異常付与3日前に、固形飼料から粉末飼料への変更を行ったが、前後で糞便中のコルチコステロン濃度を計測し、食物形状の変化に伴うストレス反応が惹起されていないことを確認した。咬合異常付与後、翌日、および一週間後の血中グルココルチコイド濃度は有意に増加しており、末梢骨用定量的CT (pQCT)による骨密度や骨強度の評価を行ったところ、咬合異常に伴い、下肢骨において有意な骨量減少および骨強度の減少が確認された。さらに、椎骨に対してマイクロCTによる骨微細構造の解析を行ったところ、骨量および骨量幅の有意な減少が認められた。過剰のステロイド(グルココルチコイド)は骨粗鬆症を引き起こし、ステロイド性骨粗鬆症は成長期における骨粗鬆症の代表的な病態である。成長期のステロイド系抗炎症薬使用患者においては、骨折や成長障害が重篤な問題とされている中、近年、成長期において咬合異常がストレスを引き起こし、グルココルチコイドを増加させることが報告された。それまでに咬合異常マウスモデルは存在しておらず、今回、過去の文献を参考に、実験モデルを確立することに成功した。過去の報告通り、咬合異常付与後、血中のグルココルチコイドは有意に増加していた。また、咬合異常付与により、1週間後の長管骨の骨密度および骨の強度指標は有意に減少しており、骨の脆弱化が認められた。今年度に導き出したデータで、第11回日本歯科骨粗鬆症研究会学術大会において、学術奨励賞が受賞された。25年度が最終年度であるため、記入しない。研究は極めて順調であり、まずは、過去の文献(Neuroscience Letters. 2009, 2011)を参考に、咬合異常マウスモデルを確立することに成功した。そして過去の報告通り、咬合異常付与後に血中のグルココルチコイドの有意な増加が確認された。

本課題の仮説通り、末梢骨用定量的CTを用いて測定したところ、脛骨および大腿骨の骨密度は低下しており、今後は、マイクロCTを用いて3次元微細構造の変化を確認してゆくとともに、椎骨などの他の骨を対象にさらなる実験を進めてゆく予定である。現在のところ、研究を遂行する上での問題は、特に生じていない状況である。25年度が最終年度であるため、記入しない。
不完全変態昆虫の概日時計振動機構とその機能の解析

不完全変態昆虫であるコロオギおよびシミの概日時計発振の仕組みを分子レベルで解析し、ハエなど完全変態昆虫と同様に遺伝子の周期的発現がリズムの発振にかかわるが、時計遺伝子cycle、timelessなどの役割の解析から、その振動機構は完全変態昆虫よりも脊椎動物に類似することが示唆された。一方、概日時計が光周測時機構に不可欠であること、また、光周受容にはオプシン系が関わることも明らかにした。不完全変態の直翅目昆虫コオロギと無翅目昆虫シミの概日時計の分子機構を明らかにすることにより、昆虫時計発振の分子機構の一般性と多様性を検討するとともに、その行動リズムおよび光周性への関与を明らかにすることを目的とする。具体的には、(1)各種光条件下での時計遺伝子mRNAの発現リズムの解析、(2)時計蛋白質の発現リズムと細胞内挙動の解析、(3)RNA干渉を利用した振動機構および光周測時機構における時計遺伝子機能の解析の3点に絞って解析を進め、直翅目および無翅目昆虫での概日時計発振の分子機構の解明とその行動および光周測時機構における役割の解明を目指す。不完全変態の直翅目昆虫コオロギと無翅目昆虫シミの概日時計の分子機構を明らかにすることにより、昆虫時計発振の分子機構の一般性と多様性を検討するとともに、その行動リズムおよび光周性への関与を明らかにすることを目的とした研究を行い、本年度は以下の成果を得た。1.コオロギ時計遺伝子period (per),timeless (tim)について,発現リズムを昼行性の幼虫と夜行性の成虫で比較したところ、いずれも明暗条件下では明期の終わりから暗期の初めにかけてピークを持つリズムを示し、このリズムが恒暗条件下でも継続することがわかった。幼虫初期には恒暗条件下でのリズムがやや不明瞭となる傾向があった。2.RNA干渉によりperをノックダウンした上で、光周期下でper, timおよび時計関連遺伝子pdfの発現をreal-time PCRで測定したところ、成虫ではper以外の遺伝子の発現レベルは低下しなかったが、3令幼虫ではtim, pdfも低下することから、成虫と幼虫の時計機構が異なる可能性が示唆された。3.クローニングしたDNAから推定されるアミノ酸配列に基づいて、ペプチドを合成してウサギを免疫し、コオロギ時計蛋白質PERIOD、TIMELESSのポリクローナル抗体を作成した。現在、免疫組織化学を行い、抗体の特性を解析中である。また、CLOCKとDOUBLETIMEについてもペプチドを合成し、ウサギを免疫する準備を整えている。4.光電式センサーを用いて、恒温・明暗周期、恒暗の各条件下でマダラシミ成虫の歩行活動を解析し、夜行性のリズムを示すことを明らかにした。5.既知の時計遺伝子の塩基配列を参考にして設計した縮重型プライマーを用いて、マダラシミ概日時計遺伝子のクローニングを行い、tim, clockの部分配列を得た。1.コオロギ時計タンパク質の発現リズムの解析:作成した抗PERIOD抗体を用いて、免疫組織化学的解析を試みた。これまでに、視葉内に抗PER抗体で標識される細胞を確認した。これらの細胞の免疫染色性は夜間に高く、昼にはほとんど標識されなかった。ウエスタンブロットでも、PERIODタンパク量は夜間に多いことを確認した。今後、さらに詳細を検討する計画である。2.コオロギ時計遺伝子の行動および光周測時における機能の解析:RNA干渉法により、period, timeless, clockの機能解析を進めた。periodおよびclockについてはRNA干渉により大多数の個体で活動リズムが消失した。timelessについては、周期は異常になるが周期性は失われなかった。従って、period, clockは時計機構に主要な役割を演ずること、timelessはハエとは異なり、時計機構への関与は弱いことが示唆された。3.peridoの光周測時機構への関与:period mRNA発現リズムが光周期に依存して変化することを明らかにした。また、period2本鎖RNA処理した幼虫では、peirod mRNAレベルが有意に低下し、その発育過程が光周期にほとんど影響されないことを確認した。一方、DsRed2 2本鎖RNA投与群の光周反応は無処理個体とほぼ同様であった。この結果から、periodが光周測時機構に決定的な役割を持つことが示唆された。4.シミ時計遺伝子の発現解析:マダラシミtimeless, clock遺伝子の全長cDNAの約90%を得た。明暗周期下および恒暗条件下で、これらのmRNA発現量を解析した結果、いまのところ有意な周期変動は確認できていない。これらのパートナーである、period, cycleのクローニングを行っており、今後それらの発現リズムをあわせて解析する予定である。コロオギ時計機構の解析については、以下の結果を得た。2)脳・腹部末端神経節(TAG)および前胃等の末梢組織からtotal RNAを抽出し、Real-time PCRにより、per, timの発現パターンを検討した。その結果、これらの組織でもper, timの発現に概日リズムがあること、さらに、視葉切除後も、脳ではリズムが継続するが、そのリズムの位相が数時間前進することがわかった。

一方TAGでは、perのリズムは継続するが、timは無周期となること、前胃ではリズムがper, timともに消失することがわかった。従って、末梢の時計機構は組織によりその振動機構、中枢時計依存性が異なることが示唆された。タンボコオロギ光周性機構の解析については、3)2種のロドプシン遺伝子cDNAをクローニングにより取得し、その発現パターンが光周期により変化すること、また、それらのRNA干渉による光周測時機構への関与の検討から、特に長日反応に複眼ロドプシンが関与する可能性を示唆する結果を得た。マダラシミの時計機構の解析については、4)timelessとclockのdsRNAを作成して成虫に投与し、これらのmRNAが低下すること、活動リズムが消失することを確認し、RNA干渉が有効であることを明らかにした。1.コオロギ時計機構の解析:RNAiによりperiod(per),timeless(tim),Clock(Clk),cycle(cyc)をノックダウンし、他の時計遺伝子発現への影響を解析した。ClkおよびcycのRNAiではいずれの遺伝子も発現レベルが低下すること、per RNAiではtimは低下するがcry2は増加すること、また、tim RNAiではperは低下するがcry2はリズムを継続することがわかった。これらの結果から、Clk、cycが転写活性化に関わること、per,timのリズムにはいずれもが必要であること、cry2はper,timから独立に制御されることなどが示唆された。一方、cycには明期後半にピークとなる発現リズムがあることもわかった。2.マダラシミ時計機構の解析:cyc遺伝子がコオロギ同様に明期後半にピークをもつ発現リズムを示し、発現を抑制すると行動リズムが消失することを明らかにした。一方、per RNAiでは行動リズムの継続が見られた。tim,Clk cycのRNAiの他の時計遺伝子発現への影響を検討し、cycとtimの発現はClkに依存すること、cycの発現はtimに依存することなどが示唆された。3.昨年度までの結果と総合し、コオロギおよびシミは、ともにcycが振動すること、cry2が重要な転写抑制因子であること、timもしくはperが必須ではないことなど、ハエとは異なる振動機構をもつことが明らかとなった。4.タンボコオロギ光周性機構の解析:Cry1のcDNAを取得し、RNA干渉法により光周測時機構への関与を解析したが、これまでのところ光周反応への影響は観察されていない。昨年度までの結果と総合し、タンボコオロギ光周性機構には、概日時計が関与すること、光受容には複眼オプシン系が関わることが明らかとなった。