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インターフェロン制御転写因子(IRF)の生物学的機能について

「序論」IRF-2はインターフェロン制御転写因子のひとつであるが、H4,CIITA,VCAM-1等のプロモーターのISRE-like配列に結合してこれらの遺伝子発現を活性化する働きがあり、細胞の増殖・分化制御とも関わっているととが報告されてきた。私は以前IRF-2はH4遺伝子のプロモーター配列に結合し、PCAF,p300を動員して転写を活性化し、同時にIRF-2はこれらによってアセチル化を受けることを証明した(Masumi.A.et.al, J.Biol.Chem.2003)。NIH3T3の増殖状態においてIRF-2がアセチル化をうけ、アセチル化されたIRF-2がH4遺伝子プロモーターに結合してH4遺伝子を活性化し、細胞増殖を促進する。そこでIRF-2のH4遺伝子プロモーター活性化の機構を解明するため、アセチル化IRF-2と結合する細胞内タンパク質を検索・同定するという手法を用いて検討した。「実験・結果」293TにIRF-2とPCAF,p300を発現させる系を用いて、アセチル化IRF-2と結合する細胞内タンパク質nucleolinを同定した。NIH3T3細胞とH4レポーターを用いた遺伝子導入実験でnucleolinがPCAFとともにプロモーターを活性化することが明らかとなった。「考察」IRF-2が細胞増殖状態においてアセチル化を受け、H4遺伝子プロモーターに結合するとき、アセチル化IRF-2がnucleolinを動員して複合体となりPCAF,p300とともに転写活性化に寄与していることが明らかとなった(現在投稿準備中)。インターフェロン制御転写因子IRF-2は細胞内で内因性のPCAF,p300と複合体を形成し、in vivoでアセチル化をうけることが確認された。In vitroのヒストンアセチル化のアッセイ系においてIRF-2の添加はp300のヒストンアセチル化を阻害すること、またU937細胞のホルボールエステルによる細胞分化誘導の系においてPCAF,p300の発現レベルが上昇し、それに伴うヒストンのアセチル化の上昇を、IRF-2が抑制的に作用していることを前年度までに証明した(Masumi A.and Ozato K.J.Biol.Chem.276,20973-20980,2001)。このことはIRF-2がインターフェロン応答において負の制御因子として働くのでその際に重要な機構と密接に関わるものと考えている。さらにIRF-2のアセチル化の研究をNIH3T3細胞の増殖制御の系を用いておこなうとき、IRF-2はp300を共役転写因子としてH4遺伝子を活性化し、NIH3T3細胞が増殖している状態でIRF-2がアセチル化をうけ、増殖停止状態ではアセチル化がほとんど認められないことが明らかになった(Masumi A.et al.J.Biol.Chem.278,25401-25408,2003)。このことから、IRF-2がそのアセチル化を通してクロマチン修飾に影響を及ぼし、さらに細胞機能を制御していると考えられることから、アセチル化IRF-2と相互作用する宿主因子を検索するという着想に至った。293T細胞にIRF-2を発現させ、このときp300,PCAFと同時に発現させるとIRF-2は細胞内でアセチル化される。このとき特にPCAFとともに発現させるとき未知のアセチル化タンパク質がIRF-2とPCAFの複合体に含まれて検出されてくることがあきらかとなった。そこでこのアセチル化タンパク質を同定を試みる目的でIRF-2、PCAF複合体に含まれる細胞タンパク質を検索した。結合タンパク質が見い出されたが、未知のアセチル化タンパク質との関係をさらに検討している。「序論」IRF-2はインターフェロン制御転写因子のひとつであるが、H4,CIITA,VCAM-1等のプロモーターのISRE-like配列に結合してこれらの遺伝子発現を活性化する働きがあり、細胞の増殖・分化制御とも関わっていることが報告されてきた。

私は以前IRF-2はH4遺伝子のプロモーター配列に結合し、PCAF,p300を動員して転写を活性化し、同時にIRF-2はこれらによってアセチル化を受けることを証明した(Masumi.A.et al.,J.Biol.Chem.2003)。NIH3T3の増殖状態においてIRF-2がアセチル化をうけ、アセチル化されたIRF-2がH4遺伝子プロモーターに結合してH4遺伝子を活性化し、細胞増殖を促進する。そこでIRF-2のH4遺伝子プロモーター活性化の機構を解明するため、アセチル化IRF-2と結合する細胞内タンパク質を検索・同定するという手法を用いて検討した。「実験・結果」293TにIRF-2とPCAF,p300を発現させる系を用いて、アセチル化IRF-2と結合する細胞内タンパク質nucleolinを同定した。NIH3T3細胞とH4レポーターを用いた遺伝子導入実験でnucleolinがPCAFとともにプロモーターを活性化することが明らかとなった。「考察」IRF-2が細胞増殖状態においてアセチル化を受け、H4遺伝子プロモーターに結合するとき、アセチル化IRF-2がnucleolinを動員して複合体となりPCAF,p300とともに転写活性化に寄与していることが明らかとなった(現在投稿中)。
高等教育機関の社会福祉専門職養成課程における障害学生支援のあり方に関する研究

本年は、研究期間の最終年度にあたり、これまでの研究の取り組みを総括するとともに、あたらなツールを活用した障害学生支援を試行した。特に合理的配慮のありかたについては、障害特性や場面に応じて個別の調整や変更がいかになされるか、障害者差別解消法の施行の状況を踏まえて検討を行った。文部科学省の示す学校における合理的配慮の観点に基づき、教育現場における合理的配慮について、特に発達障害学生への具体的取り組みを踏まえつつ、論点の整理を行った。本年は研究初年度につき、研究基盤を確立するとともに高等教育機関における障害学生支援の実態の把握を行った。実態把握に関しては、2013年度に実施された日本学生支援機構主催による障害学生支援セミナーに年間を通して出席し、主として発達障害学生への支援について新たな知見を得るとともに他大学教職員との意見・情報交換、討議を行い、今後の課題整理および検討を継続的に行った。また大学・短期大学及び高等専門学校における障害のある学生の修学支援に関する全国実態調査のデータを基に、今日的な状況の分析、考察を行った。学内での実践については、聴覚障害学生に対する授業における情報保障(ノートテイク)の取り組みと合わせて、卒論作成、就職支援、資格取得のための実習指導等に関する関係教職員等の支援の実際の把握に努めた。また聴覚障害学生の卒業生へのインタビューを実施した。発達障害及びメンタルヘルスに課題をもつ学生への支援については、修学支援、職業選択に向けた支援を新たに実施し、その経緯についてまとめ、さらに今後の継続的な支援体制について検討を行った。また、資格取得ために実習指導にあたり、事前指導における関わり、実習中の指導者との連携、実習記録等を踏まえた実習内容の分析等を行った。障がい学生支援に先行的な取り組みを実施している拠点校にはセミナー等の機会を活用して訪問し、障害学生支援室職員への聞き取りを行い、今後の取り組みの方向性等の件等を行うことができた。本年は、研究2年目に当たり、研究基盤をさらに拡充するとともに、障害学生支援の実践に取り組んだ。障害学生支援の実態把握については、昨年度に引き続き日本学生支援機構の主催による障害学生支援セミナーへの出席と、全国調査報告結果の把握と分析を行った。また、特に社会福祉教育を行う高等教育機関での障害学生支援についての情報・意見交換を行うために社会福祉教育学会等への参加した。学内での障害学生支援の提供については、聴覚障害学生の社会福祉士資格取得のための学外実習の指導を担当し、当事者への聞き取りも含めその経緯と実績についてデータをとり成果の分析と精査を行っている。また、発達障害学生に対してはこれまで実施してこなかった支援(休憩室の提供、就労支援へのつなぎ等)を行い、当該学生への聞き取り調査を行った。高大連携の観点から、障害・疾病について事前申請のあった入学予定者に対して、入学前準備、入学時期の支援について、高等学校教諭、生徒、保護者との面談と支援準備のコーディネートを行い、今後学内の安定的なシステムとして構築できるよう、必要な要件を抽出・検討している。聴覚障害学生への情報保障の提供は、相応に安定的・継続的なサービスとして構築できており、実践には一定の成果を上げている。こうした実践の成果を、特に発達障害学生支援を中心に学会での発表を行い、大学教員、発達障害に関するNPO法人職員、支援者等と意見交換を行った。本年は研究3年目に当たり、研究基盤である高等教育機関における全国的な障害学生支援の取り組みの把握と併せて、社会福祉専門職養成課程での障害学生支援の実践に取り組み、特に学外実習への準備に向けての課題整理を行った。実態把握については、昨年度同様日本学生支援機構の実施する全国調査結果の分析、障害学生支援にかかる発表・報告を聴講し、全国的な動向の把握を行った。本年は、障害学会、大学教育学会での障害学生支援の報告、分科会に参加し、情報収集および意見交換を行った。また昨年度医療福祉学会での研究成果発表を踏まえ、高等教育機関における発達障害学生支援をテーマに学会誌に論文発表をした。学内でに障害学生支援については、実際の支援の取り組みを通して各学年での段階的な学習保障・修学支援の課題を整理するとともに、専門職養成課程で必要な学習支援、特に学外実習準備について聴覚障害学生、肢体不自由学生を対象にケーススタディを行っている。また、障害者差別解消法施行を前に、文部科学省の示す対応のガイドラインを参照しつつ、高等教育機関における合理的配慮の具体例を検討、分析を行い、学内での教職員への啓発・理解を促進する取り組みに参画した。社会福祉専門職養成課程をもつ高等教育機関(大学等)の特に資格取得に関する障害学生支援の課題をとらえるため調査の準備を進めた。本年は、昨年度に引き続き学内での障害学生支援について持続的、安定的に学習支援、情報保障の提供を行うことができ、その支援システムの構築について一定の成果を上げることができた。一方では、発達障害、精神障害を有する学生への、特に資格取得にかかる学習支援の課題については、具体的な成果をあげるところまで取り組めなかった。この点については、その要因について分析を行い、本人と教員、教員間、教職員間と重層的な連携、関係の構築について課題整理を行った。一定の考察内容を論文として公表した。支援対象学生の学年が進行しているため、学年ごとの支援要件、学外実習準備における学習支援についてケーススタディを実施できた。学会等でのディスカッション、情報収集、意見交換を通して、特に学外実習科目をもつ専門職養成課程での障害学生支援の課題を整理し、調査項目の精査を行い、調査表の作成を進めた。

本年は、研究最終年にあたり、これまでの高等教育機関における障害学生支援の取り組みの動向把握と分析とともに、社会福祉専門職養成課程における資格指定科目の履修、学外実習について事例検討を中心に実態把握と課題整理を進めた。実態把握については、全国的動向は昨年度同様に日本学生支援機構の実施する全国調査結果を分析するとともに、社会福祉士育成推進大会等で障害学生支援の分科会に参加するなど関係機関の教員、学生、実習施設指導者との意見交換を行った。社会福祉士専門職を目指すには、規定の指定科目の履修とともに、学外実習が必須となるが、これらの課程をスムーズに進めるために、学生相談室での心理的支援、保健室等での健康管理・相談との連携が重要となる。この点について、昨年度より引き続き大学等の学生相談室に関する研究にあたり、実際の機関への支援件数等のデータを収集し、分析を行った。また、具体的な試みとして、聴覚障害学生へのUDトークによりる授業支援を試行し、講義科目、演習科目での成果を検討し、分析、課題整理を行った。さらに今後学外実習でUDトーク、ブギーボード等のツールの活用方法、有効性を検討する研究基盤が形成できた。障害者差別解消法の施行に合わせ、高等教育機関における合理的配慮の具体的内容を検討し、その論点を整理、公表した。社会福祉専門職養成課程を持つ大学等の就職支援、障害学生の就労支援サービス等の活用について実態把握と調査準備を進めた。本年は、研究期間の最終年度にあたり、これまでの研究の取り組みを総括するとともに、あたらなツールを活用した障害学生支援を試行した。特に合理的配慮のありかたについては、障害特性や場面に応じて個別の調整や変更がいかになされるか、障害者差別解消法の施行の状況を踏まえて検討を行った。文部科学省の示す学校における合理的配慮の観点に基づき、教育現場における合理的配慮について、特に発達障害学生への具体的取り組みを踏まえつつ、論点の整理を行った。本年は特に学内での障害学生支援について、これまで提供してこなかった支援も含め取り組みを行うとともに、従来の支援の持続性、安定性の確保に成果を上げることができた。支援の対象となる学生への聞き取り調査を行い、今後の支援体制の構築に必要な要件を分析できる資を得られた。また、課題であった高大連携について、公立高等学校教諭との意見交換、入学予定者とその保護者、高等学校進路指導教諭との面談を行うことができ、入学前に必要な準備、支援について、取り組みながらその要件を検討することができた。発達障害学生への支援は、当該学生が卒業年次にあったこともあり、就労支援のつなぎなど、社会参入についても実践を通して課題を検討することができた。資格取得のための学外実習時の合理的配慮についても、同様に取り組みながら考察を行った。これらのことから、障害学生の社会参入についても検討を行うことができたことは一定の成果である。他大学の状況等について、学会でのディスカッションや情報収集、意見交換を行い、今後の調査に必要な項目、要件の検討を行うことができた。量的調査の実施に向けて準備を進めている。
染色体DNAの分子鎖内相分離と高次構造制御

DNA高次構造と生化学的活性の相関を、スペルミンの存在下でDNAが制限酵素によって切断されるかどうかを単分子レベルで調べる事により明らかにした。実験の結果、あるspermine濃度を境に、DNAが急激に制限酵素の切断を受けにくくなっていることが分かった。蛍光顕微鏡法を用いてspermine濃度に対するDNA分子の広がりを調べたところ、制限酵素の切断を受けにくくなるspermine濃度領域に対応して、DNA分子は広がった状態からコンパクトな状態へと変化していることが分かった。次いで、制限酵素ApaL Iによって切断される配列を持つ、88merの相補的オリゴヌクレオチドを合成し、spermine存在下で制限酵素による切断を行ったところ、短いDNAは高次構造変化を起こさないため、高濃度のspermine存在下でも相補的オリゴヌクレオチドは切断された。以上の結果から、高次構造変化を起こし得る程度に十分長いDNA分子は、DNA分子の凝縮転移に対応して、DNAが急激に制限酵素の切断を受けにくくなることが明らかとなった。また、Mbサイズの巨大DNAを細胞から浸透圧ショックによって取り出し、溶媒環境の異なる場へ光ピンセットによって搬送してDNA高次構造を制御するという操作を顕微鏡下で連続的に行うという実験を行い、単分子レベルの顕微鏡下での連続的な生化学実験の手法を提案した。平成14年度は、長鎖DNAの高次構造転移の様式、特に分子内相分離構造(多重ビーズ構造)生成メカニズムの理解と分子内相分離構造の安定性を調べるというテーマを中心として研究を行った。前者については、光ピンセットで補足した単一のDNA分子をイオン強度に勾配のある場の中を移動させてDNA高次構造変化を観察するという実験を行い、溶液のイオン強度が大きくなる程、DNA凝縮体の密度が小さくなり、ランダムコイル状態になっていく様子を蛍光顕微鏡法により、リアルタイムで直接観察した。多重ビーズ構造については、凝縮剤の種類や溶液のイオン強度を変化させて、出現する条件を探索し、安定的に存在する条件について検討を続けている。後者については、4価のポリアミンであるスペルミンの添加によってDNAがランダムコイル状態から凝縮状態へと高次構造変化する様子を蛍光顕微鏡法による単分子観察により行った。これと平行して、スペルミン存在下における制限酵素によるDNA切断反応を行い、DNA高次構造と制限酵素に対する感受性の相関を調べた。この結果、ある一定のスペルミン濃度以上で現れる凝縮状態のDNAは、高密度に折り畳まれた高次構造をとっており、制限酵素が切断部位に近づけなくなるために切断を受けないことが分かった。これらの結果は論文にまとめ、FEBS Letter誌に掲載された。また、高分子学会、生物物理学会等でも研究成果を発表した。平成15年度は、前年度に引き続き長鎖DNAの高次構造転移の様式、特に分子内相分離構造(多重ビーズ構造)生成メカニズムの理解と分子内相分離状態DNAの光ピンセットによる捕捉及び搬送についての研究を進めると共に、全長約2MbのDNA一本をゲノムDNAとして持っている始原歯という生物を用い、菌体からのDNAの取り出し、DNAの高次構造制御を顕微鏡下で連続的に行うという実験も行った。前者については、分子内相分離構造の長鎖DNAを光ピンセットで捕捉して搬送する事が可能である事を示した。ここでは凝縮剤としてスペルミジン(3価)、スペルミン(4価)、カチオン性界面活性剤(2価)を用いたが、界面活性剤で凝縮させた場合のDNA凝縮部分にもっとも強い捕捉力が働き、分子内相分離状態のDNAが、より容易にトラップされやすいという結果が得られた。後者については、浸透圧ショックによって菌体から露出させたゲノムDNAに対し、光ピンセットで補足してイオン強度に勾配のある場の中を移動させて周囲のイオン強度を変化させて高次構造制御が行える事を示した。これらの結果は、高分子学会において発表した。また始原菌ゲノムDNAの回収及び高次構造制御の実験については、結果をまとめ、現在投稿準備中である。
三宅島・神津島・新島近海群発地震活動に関する調査研究

平成12年6月26日に三宅島で始まった地震活動は三宅島・神津島間の海域に移動し、活発な活動が約2ヶ月続いた。その間に、三宅島では噴火と山頂部の陥没や、1日12回の長周期ステップ変動など、数多くの現象が観測された。本研究では、これらの現象とマグマの移動を把握するために様々な観測を行なった。まず、地震活動が海域で活発化したため、自己浮上型の海底地震計720台の設置・回収を繰り返し行なった。海底圧力計も2台設置し、海底の上下変動観測により海底地殻変動を把握した。さらにブイテレメータ方式の海底地震計も設置し、リアルタイムに海底での活動を知ることができた。式根島や三宅島では回線容量不足のため、新たに衛星テレメータ装置を設置し観測網の充実を図った。この海底地震計と陸上の地震観測網のデータを統合処理することにより、海域での震源決定精度が上がり、詳細な震源分布が得られた。それによると海域の震源は、深さ2km15kmに分布し、深さ約7km以深では薄い板状に分布しているが、それより浅部では広がっていることが明らかになった。この震源分布には様々な移動が見られ、地下のマグマの動きに関係するものと考えられる。このデータを元にして、トモグラフィー法による3次元速度構造の推定によれば、板状の震源分布や三宅島西方海域の地震の発生しなかった領域では、周辺より速度が遅く、マグマの貫入を示唆する。この三宅島西方海域では変色域が見つかっていたため、潜水艇で海底噴出物の調査も行ないマグマの起源の情報を得た。一方、強震計を三宅島・神津島・新島・式根島に設置し、震源過程の研究に用いられた。三宅島では、重力測定、磁場・電場・比抵抗の測定が行なわれ、マグマの位置や状態を知るための研究が進められている。さらに、GPS観測も行なわれ、三宅島の地殻変動を測定し、マグマの移動を知る手がかりになる。
V407I-BMP10が左室心筋緻密化障害を誘導する病態の解明

左室心筋緻密化障害は心筋細胞の発生段階における分化・成熟過程の障害が原因と考えられており、本疾患においてはNOTCH signaling pathwayが主要な役割を果たしているが、分子生物学的な病態に関しては依然不明な点が多い。本研究の目的は、同pathwayの鍵となる、新たに発見された変異BMP10タンパクが分子細胞生物学的にどのように本疾患をもたらすのか、iPS細胞から分化誘導した疾患特異的心筋モデルを用いて解明することである。心筋細胞の増殖・分化・アポトーシスの機序を解明することは、具体的な疾患治療への端緒となる可能性がある。今回我々はhuman induced pluripotent stem cell (hiPSC)を用いて、3次元細胞培養技術を用いた心筋細胞モデルを分化誘導することで、実際のヒトの心筋細胞における形態や機能の変化および分子生物学的な病態の解明を図っている。特にマイクロアレイを用いた隠されたsignaling pathwayの解明や細胞増殖、分化、アポトーシスの観点からNOTCHーBMP10→LVNCといった一連の病態を解明することを試みている。また、分泌型のタンパクであるため、正常BMP10タンパクを加えたり、CRISPR-Cas9システムを用いて、その病的な心筋のレスキュー実験を行うことでV407I-BMP10が病因遺伝子であることを同定するとともに、治療に結び付く可能性を探っている。一方で、in vivoの研究も推進している。CRISPR-Cas9systemにより変異導入したマウスを作成して、本疾患の本質に迫ることを考えている。実験系がうまく立ち上がっていない。他の心筋症遺伝子の研究や臨床研究との兼ね合いにより研究時間が限られている。患者以外の健常人コントロールの血液サンプル由来iPS細胞対して、適切なsgRNAをデザインしてCRISPR-Cas9システムにより、BMP10の遺伝子変異を導入し、人工的な変異iPS細胞を作成し、心筋細胞へ分化・誘導する。変異遺伝子が病因であることの検討および遺伝的背景の表現型への影響を検討する。3次元培養システムの確立をする。マウスモデルの生理学的評価、解剖学的評価、分子生物学的評価を行う。実験の遅れにより、当初より消耗品を使用していない。海外の学会へ参加予定であったが、本年度は参加できていない。
非コードRNAを分子基盤とするミトコンドリア病の新規発症機構の解明

平成30年度は前年度に引き続き、特定のミトコンドリア関連遺伝子をCRISPR/CASでノックアウトしたヒト線維芽細胞と、さらに別の複数のミトコンドリア関連遺伝子をRNA干渉法によりノックダウンしたヒト線維芽細胞用いた実験を行った。ミトコンドリアの分裂や融合、エネルギー産生能やストレス制御に関わるDNM1L、MFN2、p32等の遺伝子の機能が欠損・抑制された細胞では、ミトコンドリアの伸展、分裂、融合等の形態変化やエネルギー産生能の低下を生じる。こうした細胞ではミトコンドリア機能に関わる非コードRNAの発現量にも大きな変化が生じていると考えられる。このような非コードRNAを同定するため、ヒト培養細胞を用いてDNM1L, MFN2, p32遺伝子をRNA干渉法によりノックダウン、もしくはCRISPRシステムによりノックアウトした細胞からミトコンドリアおよびミトコンドリア内膜内成分(マイトプラスト)を分画して全RNAを抽出した。ミトコンドリア関連遺伝子を抑制させたことの効果として、ミトコンドリアの形態が変化していることを確認した。得られたミトコンドリアRNAについて発現アレイを用いてmRNA、長鎖非コードRNA、マイクロRNAの発現量を定量した結果、ミトコンドリア関連遺伝子の機能を抑制させた場合に、その影響を受けて発現量が変化したミトコンドリアmRNA、長鎖非コードRNA、マイクロRNAを検出することが出来た。ミトコンドリアの分裂や融合に関わる遺伝子を抑制することにより、共通して発現が変動する長鎖非コードRNAやマイクロRNAも複数検出することが出来た。この中に、ミトコンドリア機能を制御したり影響を及ぼし、ひいてはミトコンドリア病の発症要因にもなるRNAが含まれていると考えられる。引き続き次世代シーケンサーを用いて、詳細な発現解析を行っていきたいと考えている。平成30年度は十分なノックダウン効率が得られた細胞を用いて発現アレイ解析実験を行い、得られたデータを詳細に解析し、発現変動を示したRNAの検証実験を重点的に進めた。次世代シーケンサーによる未知のRNAを含めた発現解析については、令和元年度に詳細に実行したいと考えている。十分なノックダウン効率が得られた細胞サンプルを用いて、次世代シーケンサーを用いた未知のRNAも含めた詳細な発現解析を行う。発現変動が検出されるmiRNA、mRNAについて、ミトコンドリア機能への関りを検証するための実験を行い、新規の知見として取りまとめたいと考えている。平成29年度は特定のミトコンドリア関連遺伝子をCRISPR/CASでノックアウトしたヒト線維芽細胞と、さらに別の複数のミトコンドリア関連遺伝子をRNA干渉法によりノックダウンしたヒト線維芽細胞を用意し、RNAを抽出した。得られたミトコンドリアRNAについて、次世代シーケンサーを用いた発現RNA解析に先立ち、既知のmRNA、長鎖非コードRNA、マイクロRNAの発現変動を発現アレイを用いて検索した。その結果、ミトコンドリア関連遺伝子の機能を抑制させた場合に、その影響を受けて発現量が変化したミトコンドリアmRNA、長鎖非コードRNA、マイクロRNAを多く捉えることが出来た。ノックダウン効率の高い良質な細胞を得るために時間をかけたため、次世代シーケンサーによる発現解析は次年度に行うこととし、平成29年度はmRNA発現アレイとmiRNA発現アレイ解析を実施した。

複数のミトコンドリア関連遺伝子について十分なノックダウン効率が得られたため、次世代シーケンサーを用いた詳細な発現解析を行う。発現変動が検出されるmiRNA、mRNAについて、ミトコンドリア機能への関与について詳細に解析を行いたいと考えている。十分なノックダウン効率が得られた細胞サンプルを用いて、次世代シーケンサーを用いた未知のRNAも含めた詳細な発現解析を行う。発現変動が検出されるmiRNA、mRNAについて、ミトコンドリア機能への関りを検証するための実験を行い、新規の知見として取りまとめたいと考えている。平成29年度中に次世代シーケンサーを用いた発現解析実験を行う予定であったが、解析に用いる細胞の質を確保するために、各種条件検討を行うともに、発現アレイを用いた解析を行った。細胞の質はある程度確保できたため、平成30年度に次世代シーケンサーを用いた発現解析を実施する予定である。平成30年度中に次世代シーケンサーを用いた発現解析実験を行う予定であったが、解析に用いる細胞の質の確保と、これまで得られたデータにおける詳細な解析とその検証実験を行った。十分なノックダウン効率条件下でのデータ解析がある程度出来たため、令和元年度はそれを用いて次世代シーケンサーを用いた未知のRNAも対象にした発現解析を実施し、その検証実験も行って、新規の知見として取りまとめる予定である。
ＭＲＩ複素誘電率画像は細胞内水分子のネットワーク構造を反映するか？

病気によるタンパク濃度変化のMRIによる非侵襲的検出の可能性を検証するため、MRIで求まる縦緩和率、横緩和時間に加え誘電率のタンパク濃度依存性を調べ、横緩和率が最もタンパク濃度変化検出精度が高いことを明らかにした。特に、脳脊髄液の流れの影響を受けない信号抽出を工夫することで、細菌性髄膜炎などによる脳脊髄液中のタンパク濃度変化をT2値測定により判別できる可能性があることを示した。本研究はタンパク発現に伴う水構造の変化をMRIにより捉えることを目的としているが、水構造の変化により散逸構造(格子緩和過程)も変化するので、タンパク発現はMRIの縦緩和時間にも反映する可能性がある。そこで、時系列誘電率測定の対照実験として、時系列縦緩和時間測定も実施することとした。T1測定法として、現在までにIR法やLook-Locker法などが開発されてきたが、IR法は測定時間が非常に長く、また、Look-Locker法は精度が低いといった欠点がある。そのため、グラジエントエコー法を用いた新しいT1測定法を提案し、30秒の時間分解能で縦緩和時間を高速高精度に画像化できることを示した。また、MRI専用の高周波電磁界解析システム(SEMCAD)を用い、MRI受信信号の位相の詳細解析を行い、我々が開発した位相情報のみから比吸収率(SAR)を求める方法(「発熱分布情報を生成する装置と方法、磁気共鳴画像装置及びプログラム」、出願番号:PCT/JP2013/59784)は、用いる高周波磁界強度が小さなほど高精度であることが判明した。さらに、このことは、ファントム実験によっても実証した。これらの結果は、位相分布情報のみから電気伝導度を算出し、また、高周波磁界強度分布情報のみから誘電率を算出する方法(Voigt, Magn Reson Med, 2011)を用いる際、電気伝導度、誘電率の測定精度を向上させる上で参考となる。Katscherらが提案した方法(IEEE Trans Med Imag, 2009)を基にElectric Properties Tomography技術を導入する目的で、まず、MRIの受信信号に含まれる位相情報の詳細解析を行った。その結果、被検体の電気伝導度(σ)や誘電率(ε)などの電気的性質に従い、MRI撮像時に誘起される高周波渦電流によるMRI受信信号に発生する位相が、撮像時に用いる高周波電力に依存しないという重要な性質を発見した。その性質を応用し、MRI検査時に懸念される高周波熱傷を予測する理論を構築した。その理論構築の際、MRIの高周波磁界は静磁場に垂直であるという性質を用いたことが鍵である。さらに、その理論を実証するために、MRI撮像時の高周波により高温に発熱する部位を人工的に発生させる被検体(ファントム)モデルを確立し、MRIの高周波熱傷部位の予測が可能であることを示した。このことで、被検体のσやεなどの電気的性質が現れるMRI受信信号の位相情報についての理解が深まったが、生体中の電磁界の挙動を応用するこの分野は、用いる電磁波の周波数の増加を伴うMRIの高磁場化の進展とともに急速に発展しており、Katscherらの方法の問題も指摘されつつあったので、初めて開催されたこの分野の最先端研究者が集まる国際ワークショップ(MR Safety, Lund, Sweden, 2012.9)に参加し、MRIの高周波熱傷予測技術の発表を行うとともに、討議を行い最新の情報を取得した。その結果、ファントムとは異なりσ、εが複雑に分布する人体では、MRIの受信信号の位相のさらなる詳細解析が必要で、MRI専用の高周波電磁界解析システム(SEMCAD)の導入が有用であるとの情報がえられ、現在、SEMCADの導入を進めている。タンパク発現に伴う細胞内の水分子集団の構造変化をMRIにより検出できるかを検証した。BSA(bovine serum albumin)を対象にその水溶液の誘電率の濃度依存性を自作した装置を用いて測定した。MRIで用いる周波数ではBSA濃度の上昇に伴い誘電率は減少した。この依存性より生体中のタンパク濃度変化では、誘電率は1%未満しか変化せず、MRIの誘電率測定精度では検出が困難であることが判明した。次に、BSA水溶液の縦緩和率(R1)、横緩和率(R2)の濃度依存性を3T MRIを用いて調べた。R1、R2はBSA濃度に線形的に増加し、R2の測定誤差率はR1よりも低い値であった。病気による脳脊髄液(CSF: cerebrospinal fluid)中のタンパク濃度変化が報告されているので、MR画像上でCSFが広く現われる側脳室に着目し、CSFの非侵襲的R2測定により病気に伴うタンパク量変化の検出可能性を検討した。側脳室領域に設定した関心領域(ROI: region of interest)の平均R2には6%程度の違いが認められ、腹側のROIのR2が増加傾向にあり、脈絡叢からのCSF産出による微小流の影響が示唆された。R2測定に用いる脳室領域の信号を、20分割した閾値をもとにそれ以上のものに限定した場合、上位3閾値以上のデータを用いた際のR2測定誤差率が最小(1.5%)であった。

CSFの信号のR2測定から細菌性髄膜炎を判別するには、2.2%の違いを検出する必要があるので、MRIによる細菌性髄膜炎の非侵襲的判別が行える可能性がある。脳室全体の3次元撮像などのさらなる工夫で、他の疾病に伴うCSF溶存タンパクの濃度変化の判別も期待できる。磁気共鳴医学使用していた1.5T MRIが3T MRIに更新されることが急遽決まり、数ヶ月間、MRI装置の使用が不能となり、計画していた実験を行うことができなかった。被検体のε、σを画像化するElectric Properties Tomography技術を導入し、ファントム実験でその画像化の誤差を±5%とすることを目的としたが、当初予定していた導入技術の問題点が学会などで指摘されたために、その指摘事項の解決から着手した。現在、その解決のための設備導入を行っており、当初の誤差目標値(±5%)を達成し遅れを取り戻すことは可能である。MRI装置更新に伴い計画が遅れたため、当初の平成26年度計画で予定していた患者実験を割愛することとした。今年度は、MRI下でのタンパク発現実験を実施し、その後に正常ボランティア実験を行う。当初計画では1.5T MRIを用いる予定であったが、3T MRI装置に更新されたことで複素誘電率測定精度が向上するので、目的とするタンパク発現に伴う誘電率変化を捉えられるものと期待している。平成24年度のε、σの画像化は今年度中期に達成できる目途がある。そのために導入するMRI専用の高周波電磁界解析システム(SEMCAD)は、既存の設備で稼働するソフトウエアーであり、大学などの研究機関での使用の際、それを用いた研究成果を導入後1年以内に査読のある専門誌で公表すれば無償であるので、予定する研究費に変更はない。また、今年度計画しているin vitro実験については、その準備は、ε、σの画像化と独立に進められるので、当初の計画どおり遂行することが可能である。該当なし。
高脂血症の血液脳関門病態化における脳ペリサイトの役割

血液脳関門(BBB)は脳血管内皮細胞の強固な密着結合および薬物輸送担体により,薬物脳移行性を制限している。このBBB機能は,脳血管内皮細胞周囲に存在する脳ペリサイトおよびアストロサイトにより協調的に制御される。本研究者はこれまでに脳ペリサイトがBBB機能に促進的な役割を果たすことを明らかにした。一方,高脂血症は動脈硬化症を引き起こすことから,脳血管障害が易発症である。病態時におけるBBB機能変容の解明は,病態依存的な薬物脳移行に基づく副作用発現の予測、回避やBBB病態治療を指向した創薬研究に必要不可欠である。本研究では,高脂血症におけるBBB病態を明らかにする目的で,脳ペリサイトの形態機能的変化およびこれに伴う脳血管内皮細胞密着結合性の変化について追求することを企てた。脳ペリサイトの形態機能的変化(収縮、弛緩)の検討;脳ペリサイトの収縮、弛緩反応評価系を構築するため,血管弛緩因子adrenomedullin(AM)のペリサイトに対する作用を検討したところ,AMはcAMP/PKA経路を介してペリサイトを弛緩させることが明らかとなった。高脂血症病態下においての脳ペリサイトによる脳微小血管調節作用を評価するうえで,本評価系を確立したことは意義深い。OncostatinM(OSM)のBBB機能に対する影響;アテローム性動脈硬化症のプラーク形成時にプラーク内マクロファージから産生されるOSMのBBB機能に対する作用について検討した。脳血管内皮細胞から成るinvitroBBBモデルを作製し,OSMのtightjunction(TJ)機能に対する作用について検討したところ,OSMはZO-1およびclaudin-5の細胞局在を変化させTJ機能を低下させることが明らかになった。脳血管内皮細胞およびペリサイトを共培養したinvitroBBBモデルにおいても同様の知見が得られた。以上,本年度は脳ペリサイトの収縮、弛緩反応のinvitro評価系の確立及びBBB機能変容分子としてのOSMの役割を明らかにした。血液脳関門(BBB)は脳血管内皮細胞を実体とし、その強固な密着結合および薬物輸送担体により、薬物脳移行性を制限している。このBBB機能は、脳血管内皮細胞周囲に存在する脳ペリサイトおよびアストロサイトにより協調的に制御される。アストロサイトのBBB機能制御機構は明らかとなりつつあるが、脳ペリサイトのそれについては不明な点が多い。一方、糖尿病、高血圧および高脂血症などの生活習慣病では、脳血管障害が易発症である。病態時におけるBBB機能変容の解明は、病態依存的な薬物脳移行に基づく副作用発現の予測・回避やBBB病態治療を指向した創薬研究に必要不可欠である。そこで、生活習慣病におけるBBB病態を明らかにする目的で、脳ペリサイトの病変に着目し(1)機能的・形態学的変化および(2)これに伴う脳血管内皮細胞透過性の変化、について追求することを企てた。脳ペリサイトの収縮・弛緩反応のin vitro評価系確立脳ペリサイトの収縮・弛緩反応の評価系を構築するために、脳血管内皮細胞から分泌される血管弛緩因子adrenomedullin(AM)のペリサイトに対する作用を検討した。AM負荷により、面積増加を示したペリサイト(RP)の割合が増加した。このRPの増加は耐受容体阻害剤により抑制された。またペリサイト弛緩における細胞内情報伝達系を明らかにするために、AM負荷後のペリサイト内cAMP濃度を測定したところ、有意に上昇していた。さらにAM誘発RP増加は、PKAインヒビターにより抑制された。これらの成績は、AMがcAMP/PKA経路を介して脳ペリサイトを弛緩させることを示唆する。以上、脳血管内皮細胞-ペリサイトのクロストークが脳微小循環調節に重要であることが判った。脳ペリサイトによる脳微小血管の調節機構を明らかにする上で、本評価系は簡便かつ高感受性でありその有用性は高い。以上、本年度はin vitroにおける脳ペリサイトの収縮・弛緩評価系を確立し、その調節因子としてのAMの役割を明らかにした。

脳血管内皮細胞から成るinvitroBBBモデルを作製し,OSMのtightjunction(TJ)機能に対する作用について検討したところ,OSMはZO-1およびclaudin-5の細胞局在を変化させTJ機能を低下させることが明らかになった。脳血管内皮細胞およびペリサイトを共培養したinvitroBBBモデルにおいても同様の知見が得られた。以上,本年度は脳ペリサイトの収縮、弛緩反応のinvitro評価系の確立及びBBB機能変容分子としてのOSMの役割を明らかにした。
テラヘルツ分光分析による新規な繊維鑑別法の創出

本研究はテラヘルツ分光法を用いた繊維の識別方法を開発し、新規かつ信頼性の高い品質表示の鑑別法を確立することを目的としている。本研究で着目したのは、これら繊維は分子量の大きな有機物で構成されており、高分子材料の骨格振動やねじれ振動に加え、水素結合、分子間相互作用や結晶の格子振動などの低エネルギーの振動を用い繊維の種類を識別する方法である。本研究で用いたテラヘルツ分光器は、GaP結晶中での近赤外光の差周波発生によるものであり、発生するテラヘルツ波は広帯域性(0.56.2THz)と高出力性を合わせ持つ。各種繊維試料は、凍結粉砕により微粉末化した後にポリエチレン粉末と混合しペレットを形成し測定を行うことによって定量的分析を実現した。特に、本年度はセルロース由来の繊維識別に着目した。綿は結晶化したセルロースをその主成分としており、結晶化したセルロースに起因した吸収ピーク(2.1、3.2、4.3および5.2 THz)が観察された。これに対し、セルロースを化学的に分解せずに精製するリヨセルプロセスによって形成されるテンセル(商標)では、2.2、3.2、4.5および5.5 THzに比較的ブロードな吸収ピークが観測された。また、化学的反応を伴って形成される銅アンモニア法レーヨンであるキュプラ(商標)やブナパルプからつくられるポリノジックであるモダール(商標)では4-6 THzの広範囲においてなだらかな吸収が観測された。本研究の成果によって、同様の成分からなる繊維種であっても、その分子間結合状態や結晶構造の違いを高感度に検出でき、これが繊維種識別に有効な方法であることが示された。テラヘルツ分光分析法を用いて各種繊維のスペクトル分析を実施し、各種繊維に特有のスペクトルがテラヘルツ領域に発現することを確認した。分析にあたって、繊維試料を凍結粉砕によって均質化し、ポリエチレンを基材とする所定濃度の繊維種の測定試料を作製し、0.5-6 THzの範囲でテラヘルツ分光分析を行うことで、繊維判別に有効と思われるスペクトル情報を見出した。分析対象となった試料は、不当表示で問題となっている、カシミヤ原毛とその類似の獣毛(ヤクやメリノ種)の識別に関する研究と、セルロース系天然繊維とセルロース系再生繊維にセルロース結晶構造識別に関する研究である。本研究によって、これまの分光法で見過ごされてきた高分子の水素結合、分子間結合や内在する結晶構造の格子振動、分子内骨格振動などの低エネルギー振動を検出し、繊維を構成するポリマー高分子の結合状態の検出や、加工工程によって生じる繊維中に内在する微結晶の構造変化の検出を可能になったものと考えられる。例えば、獣毛の主成分はケラチンタンパク質で構成される紡錘型細胞(コルテックス)であり、直径数μm、長さ100μm程度の細胞群が規則的に配列している。テラヘルツ分光分析では、コルテックス構造間の相互結合に起因した、比較的マクロな構造の結合モードを検出し、獣毛種別による違いが検出されたものと考えられる。またセルロース由来の植物性繊維や再生繊維においては、繊維種固有のセルロース結晶の振動モードが検出されているものと考えられる。本研究によって、定性的ではあるが新規な繊維判別法の可能性が示された。今後は、各種繊維のテラヘルツスペクトルを主成分回帰法やクラスター分析等の多変量解析を用い、数学的プロセスによって繊維種を識別する手法の確立を目指す。

本研究で用いたテラヘルツ分光器は、GaP結晶中での近赤外光の差周波発生によるものであり、発生するテラヘルツ波は広帯域性(0.56.2THz)と高出力性を合わせ持つ。各種繊維試料は、凍結粉砕により微粉末化した後にポリエチレン粉末と混合しペレットを形成し測定を行うことによって定量的分析を実現した。特に、本年度はセルロース由来の繊維識別に着目した。綿は結晶化したセルロースをその主成分としており、結晶化したセルロースに起因した吸収ピーク(2.1、3.2、4.3および5.2 THz)が観察された。これに対し、セルロースを化学的に分解せずに精製するリヨセルプロセスによって形成されるテンセル(商標)では、2.2、3.2、4.5および5.5 THzに比較的ブロードな吸収ピークが観測された。また、化学的反応を伴って形成される銅アンモニア法レーヨンであるキュプラ(商標)やブナパルプからつくられるポリノジックであるモダール(商標)では4-6 THzの広範囲においてなだらかな吸収が観測された。本研究の成果によって、同様の成分からなる繊維種であっても、その分子間結合状態や結晶構造の違いを高感度に検出でき、これが繊維種識別に有効な方法であることが示された。本研究はテラヘルツ分光法を用いた繊維の識別方法を開発し、新規かつ信頼性の高い品質表示の鑑別法を確立することを目的としており、植物由来および獣毛に代表される天然繊維と、再生繊維および合成繊維における分子間結合や結晶構造の違いを高感度に検出することを目的としていたが、対象となる繊維種が広範囲にわたるため、本年度は植物由来の天然繊維と植物由来の再生繊維に範囲を限定し、その分子間結合状態や結晶構造の違いを高感度に検出できることを、実験的に初めて確認した。対象となる繊維種を限定したものの、テラヘルツ分光分析によって、同種成分でありながら分子間結合状態や結晶構造の違いを高感度に検出できたことは学術的価値も高い成果であると考えている。今後の研究では研究対象となる繊維種を当初予定されたまでは増やさず、繊維中の分子間結合状態や結晶構造の違いを反映したテラヘルツ領域に発現するスペクトルの違いを定量的に識別することを目指して、繊維種のテラヘルツスペクトルに与える各種パラメータの抽出と測定条件の最適化を行い、さらに数値解析の手法を取り入れることによって、新たな繊維種識別法を見出す。繊維試料の粉砕に関わる消耗品、分光分析を実施するために必要な消耗品、および得られた成果の国際会議発表をおこなうための旅費等に使用する予定である。
手指麻痺患者の自在な把持動作を実現する実用的ソフトパワーグローブの開発

麻痺した5指の自由な運動が可能となるパワーグローブの開発を行った。本グローブは腱に相当する駆動糸を内蔵した皮製の手袋と駆動糸を操る駆動装置とから成る。利用者の意図に基づいて駆動装置が駆動糸に張力を与えることで、利用者の指は操り人形のように自由に動く仕組みとなっている。試作したグローブを用いてテニスボールの投球・捕球動作、缶飲料の把持、シャンケンなどの動作の実現が確認できた。本研究では、手指麻痺患者の指先運動を実現するために、柔らかで使いやすいパワーグローブの開発に取組んでいる。頚椎損傷や脳梗塞などにより手指に麻痺を負い、日常生活で多くの不便を抱え、社会復帰を断念している人は全国に数多くいる。しかし、彼ら手指麻痺を負った人々のための工学的支援技術の開発は未だ充分ではない。本研究は実用的なパワーグローブを実現し、手指麻痺者の生活改善および社会復帰の手段を提供することを目的とする。本年度に行った主要な取り組みは以下のとおり。(1)グローブ部分の構造設計・試作-提案する駆動方式を採用したグローブ部分の試作を行った。まだ5本指のうち一本のみの駆動ではあるが、柔軟な構造で意図したとおりの指の屈曲・伸展の動作を実現することができた。今後は駆動可能な指の数を増やすと同時に、より複雑な動作が可能となるよう、改良を進める。(2)駆動システムの開発・評価-提案する駆動装置の試験装置を製作し、テストを行った。グローブ部分に搭載可能な小型、軽量で且つ充分な力を発生させることができる駆動装置の試作を行い、入力信号の変化により駆動力を安定的に増減出来ることを確かめた。来年度にはグローブ部分の更なる改良を行い、より複雑な指の動きを実現すると同時に、駆動装置と制御ソフトウェアの改善により、より繊細な握力制御を実現する。また利用者の操作意図を的確に読み取る専用入力装置の開発も進め、利用者の意図どおりに複雑な指の動作を可能とする実用的パワーグローブの実現を目指す。本研究では手指麻痺者の生活改善および社会復帰の手段を提供することを目的として、柔軟素材のみで構成され、五指の自由な運動が可能となるパワーグローブの開発に取り組んだ。本年度に行った研究活動の概要は以下のとおり。(1)五指を健常者と同程度の自由度で動かせることが可能なグローブの設計・試作:グローブは柔軟性と使用感の良さから豚革を素材として用いた。しかし、内部に駆動用の糸を張り巡らすにあたり、豚革の大きな摩擦抵抗が問題となった。効果的な駆動糸の配置や、摩擦低減のために縫い付けるガイドチューブおよび駆動糸の材質など、摩擦力測定実験と製作を繰り返し、最適な構造を模索した。(2)第一指(母指)の伸展/屈曲、内転/外転、内旋/外旋、さらに第二一五指の伸展/屈曲を実現するために、計7個のサーボモータを用いて、それぞれの駆動を行うための駆動装置の開発を行った。現時点ではシステムの簡素化のために、第二指と第三指、第四指と第五指の伸展・屈曲運動はそれぞれひとつのモータで同時に行う方式を採用した。(3)上記駆動装置を駆動させるためのコントローラをマイコンを用いて構成し、その制御プログラムの開発を行った。(4)実験を通して、五指を用いてのテニスボールの投球・捕球動作、缶飲料の把持、シャンケンなど麻痺した指で様々な動作の実現が確認できた。今後は実用化に向けて、更なる握力の向上、容易な着脱の実現、駆動装置の軽量化、などに取り組む予定である.現在特許申請の準備中であり、申請後ただちに論文発表など成果の公表を行う。
SAGE法を用いた担子菌におけるcAMP誘導性遺伝子発現プロファイリング

白色腐朽菌Phanerochaete chrysosoporiumは培養後期に特定条件下でリグニン分解酵素を発現する。リグニン分解酵素はリグニンやダイオキシンなどの難分解性有機物質分解に関与すると考えられており、未利用資源のビアオマス変換や環境浄化への利用が期待されている。しかしながら、これらの発現機構については不分明な点が多く、また、現在判明しているリグニン分解酵素と同時年発現する未知因子が基質分解に関与していることも示唆されている。前年度までにアデニル酸シクラーゼ阻害剤アトロピン添加によってP.chrysosoporiumのリグニン分解酵素が発現抑制されることを確認した。そこでアトロピン添加条件、無添加条件、および培養初期の菌体からmRNAを抽出し、発現遺伝子を比較することでリグニン分解酵素発現にかかわる遺伝子、基質に働きかける未知の因子をコードする遺伝子の検出を試みることとした。具体的にはSerial analysis of Gene Expression (SAGE)法を用いて各条件での遺伝子発現量を正確に反映すると考えられるタグを調べ、プロファイリングを行うこととした。同時に、研究を開始した当時は糸状菌についてSAGE法を行った報告例が存在しなかったため、技術の獲得を目的として比較的遺伝子解析の進んでいるいもち病菌についてSAGE法を用いた付着器形成に関与するcAMP誘導性遺伝子発現プロファイリングを14年度から15年度にかけて行った。結果としては、いもち病菌付着器形成に関与する新規のcAMP誘導性遺伝子が多数検出され、多くの知見が得られた。研究結果はIrie, T., H.masumura, R.Terauchi and H.Saitoh.(2003) Mol Genet Genomics 270:181-189にまとめた。現在、いもち病菌で得た技術を用いてP.chrysosoporiumのSAGE法解析を行っているところである。まだタグレベルでの解析段階であるが、今後はP.crysosoporiumの全ゲノムデータとの比較によりタグ遺伝子のアノテーションを行い、遺伝子を特定し、個々の遺伝子における詳細な解析を行う予定である。一方、糸状菌遺伝子発現に対するSAGE法解析についての技術評価を兼ねて「SAGE法を用いたいもち病菌付着器形成に関与するcAMP誘導性遺伝子発現プロファイリング」を行った。研究結果は3rd International Rice Blast Conference(2002)にて発表した。14年度における研究計画の達成率は50%程度であるが、15年度中にSAGE法解析を完成させ、計画通り目的を達成させる予定である。
細胞膜近傍に局在するタンパク質を同定するための可視化プローブ分子の開発

細胞膜近傍には「細胞の動き」に関連する重要なタンパク質が数多く存在すると考えられる.従来の分析法により,細胞膜界面に近接するタンパク質を同定することは難しい.そこで本研究では,細胞の内膜上および界面に存在するタンパク質を非破壊的に同定できる可視化プローブ開発を行った.細胞膜近傍には「細胞の動き」に関連する重要なタンパク質が数多く存在すると考えられる.従来の分析法により,細胞膜界面に近接するタンパク質を同定することは難しい.そこで本研究では,細胞の内膜上および界面に存在するタンパク質を非破壊的に同定できる可視化プローブ開発を行った.細胞膜近傍には「細胞そのものの動き」に関係のある重要なタンパク質が数多く存在すると考えられる.しかし,従来の分析法により,細胞膜界面に近接するタンパク質を同定することは難しい.そこで本申請研究ではこれまでの研究成果をもとに,細胞の内膜上および界面に存在するタンパク質を非破壊的に同定できる可視化プローブ開発を行っている.具体的には,プロテインスプライシング反応を起こすタンパク質インテインと分割した蛍光タンパク質GFPを利用し,細胞膜界面に分析対象のタンパク質が近接すると全長GFPを形成する蛍光可視化プローブ分子のcDNA設計および作製を行った.プローブのcDNA作製: GFPとインテインを用い,標的タンパク質が細胞膜近傍に局在してはじめて蛍光が回復する新規蛍光プローブ開発を行っている.特定のアミノ酸残基で分割したGFPのN末にN末インテインと細胞膜局在シグナルペプチド(MLS)を連結した「N末プローブ」のcDNAを作製した. C末GFPにC末インテインとMLSを連結した「C末プローブ」のcDNAを作製した.また,対照実験に用いるプローブのcDNAの作製も行っている.具体的は, C末プローブのMLSを,細胞膜近傍・細胞質・核のいずれかに局在することが知られているタンパク質で置き換えたプローブのcDNAを作製している.現在,これらのプローブcDNAをほ乳類由来の培養細胞に導入し,プローブ分子の発現確認および蛍光顕微鏡による培養細胞の観察を行っている.細胞膜近傍には「細胞の動き」に関連する重要なタンパク質が数多く存在すると考えられる.しかし,従来の分析法により,細胞膜界面に近接するタンパク質を同定することは難しい.そこで本申請研究ではこれまでの研究成果をもとに,細胞の内膜上および界面に存在するタンパク質を非破壊的に同定できる可視化プローブ開発を行った.具体的には,プロテインスプライシング反応を起こすタンパク質インテインと分割した蛍光タンパク質GFPを利用し,細胞膜界面に分析対象のタンパク質が近接すると全長GFPを形成する蛍光可視化プローブ分子を作製し,「細胞の動き」に関わるタンパク質の同定を目指した.プローブのcDNA作製:GFPとインテインを用い,標的タンパク質が細胞膜近傍に局在してはじめて蛍光が回復する新規蛍光プローブを作製した。特定のアミノ酸残基で分割したGFPのN末にN末インテインと細胞膜局在シグナルペプチド(MLS)を連結した「N末プローブ」のcDNAを作製した.C末GFPにC末インテインとMLSを連結した「C末プローブ」のcDNAを作製した.また,C末プローブのMLSを,細胞膜近傍・細胞質・核に局在することが知られているタンパク質で置き換えたプローブのcDNAを作製した.プローブを用いたタンパク質の同定法の確立:N末およびC末プローブをほ乳類細胞に発現させたところ,GFPの再構成に基づく蛍光の回復が観察された.また,N末プローブのMLSを細胞膜近傍に局在するタンパク質に置換したプローブおよびC末プローブを細胞に発現させたところ,蛍光の回復が確認された.一方,MLSを核局在タンパク質に置換したN末プローブおよびC末プローブを細胞に発現させたところ,微弱な蛍光の回復が観察された.本申請研究で開発したプローブ分子は,細胞膜近傍に局在するタンパク質を同定するツールとして有用であることいえる.