hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
免疫抑制剤の投与を必要としない細胞移植療法

申請時のサブ課題とそれらの現在までの進捗状況をまとめる。背景:ラット皮下に塩基性線芽細胞増殖因子(bFGF)また放線菌由来環状ペプチド(SEK)を含侵させたアガローススポンジを用いて血管の豊富な膵島移植部位を作成し、同種膵島を移植したところ免疫抑制剤不使用下でも長期生着すること見出した。この結果が本科学研究費で行う研究の背景である。2018年度終了時までの研究実績の概要:1ラットを用いて皮下に移植された同種膵島の免疫抑制剤不使用下での生着機構の解析:膵島移植前後で移植部位の免疫学的な解析を行ったところ、両系において共通して組織中の制御性T細胞の密度が高くなり、免疫抑制環境が形成されていることが示唆された。これが拒絶反応が起こらない一つの要因であると考えている。この結果を論文にして投稿し採択された(報告論文1)。2移植部位形成に用いる材料:アガローススポンジは人臨床での使用が認められている材料ではない。そこで、既にヒト臨床で使用されているコラーゲンシートとヒアルロン酸溶液を用いて皮下に膵島の移植部を作成することを試みた。従来用いてきたアガローススポンジとそん色ない結果を得ることができた。この結果は論文として採択された(報告論文2)。3iPS/ES細胞からの膵島の分化誘導とその糖尿病マウスでの糖尿病正常化能の評価:ヒトiPS細胞から膵臓前駆細胞さらに膵島細胞へステップ分化誘導を行っている。膵臓前駆細胞がある条件下で、ほぼ無限に増殖できることを明らかにし、この結果を報告した論文が採択された(報告論文3)。4カニクイザルES細胞からの膵島の分化誘導:カニクイザルiPS細胞を入手し、実験用の凍結ストックが作成できた。5糖尿病カニクイザルをモデル:サル皮下に血管が豊富な部位の作成や、サル膵臓から分離した膵島を皮下に移植するなどの検討を行った。1ラット・マウスを用いて皮下に移植された同種膵島の免疫抑制剤不使用下での生着機構の解析:ラット系において組織中の制御性T細胞の密度が高くなり、免疫抑制環境が形成されていることが示唆された。岩田らは、これが拒絶反応が起こらない一つの要因であると考えている(論文1)。一方では、安波らはマウス同種膵島移植で、制御性T細胞に依存しない系もあることを示唆する結果を得ている。2ヒト臨床で使用できる材料:ヒト臨床使用可のコラーゲンシートとヒアルロン酸溶液を用いて皮下に膵島の移植部を作成を試みた。従来の結果と遜色ない結果を得ることができた(報告論文2)。3iPS/ES細胞からの膵島への分化誘導:培養液の組成を段階的に変更してヒトiPS細胞から膵臓前駆細胞へさらに膵島細胞へ分化誘導を行っている。分化誘導途中で得られた膵臓前駆細胞がある組成の培養液中で増殖することを見出した。また、その培養中に未分化細胞を除去できる(論文3)。この方法を用いると、細胞の純化でき、さらに、ヒト治療に必要な大量の細胞の確保が容易になる。4ヒトiPS細胞から分化誘導した膵臓前駆細胞また膵島細胞の移植にとる糖尿病治療効果:ヒトiPS細胞由来の膵臓前駆細胞また膵島細胞を安波が糖尿病免疫不全マウスに移植し、その糖尿病治療効果の判定を行っている。現在経過観察中である。5糖尿病カニクイザルをモデル:後藤らはカニクイサル皮下に血管が豊富な部位の作成や、サル膵臓から分離した膵島を皮下に移植するなどの検討を行った。カニクイザル皮下に自家膵島の移植を行ったところ、移植後23日経過した後も、生存している膵島を見出した。6カニクイザルES細胞からの膵島の分化誘導:カニクイザルiPS細胞を入手し、実験用の凍結ストックが作成できた。最終年度であるので、当初目標を達成すべく努力する。1マウス同種膵島移植モデル:皮下膵島移植で拒絶反応が起きない機構をより詳細に検討する。移植部位またリンパ節、脾臓などの免疫学的な解析等を行う。2カニクイザルを用いて免疫抑制不使用下での同種細胞の皮下移植を成功させる。:iPS細胞は多能性を有する細胞である。カニクザルへのカニクザルiPS細胞の移植は、同種細胞移植の拒絶反応の良いモデルになると考える。カニクイザルの皮下に血管網の豊富な部位を作成し、この部位にカニクイザルiPS細胞を移植し、テラトーマの形成の有無を調べる。もし、拒絶反応が起きれば、移植iPS細胞は死滅しテラトーマは形成されない。移植部位、移植部位近傍リンパ節、脾臓などの免疫学的な解析を行う。3カニクイザルiPS細胞から膵前駆細胞また膵島細胞の分化誘導:ヒトiPS細胞から膵前駆細胞また膵島細胞の分化誘導を行った方法を基に、カニクイザルiPS細胞から膵前駆細胞また膵島細胞の分化誘導を試みる。本科学研究費の交付されたころからカニクイザルES細胞の膵前駆細胞また膵島細胞への分化誘導を試みてきたが、種々困難に出会ってきた。この困難がヒトとカニクイザルの種の違いに起因するのか、または、ES細胞の細胞株の性質に起因するのか明らかでない。

新たに入手したカニクイザルiPS細胞を用いて分化誘導条件を詳細に検討することで膵前駆細胞また膵島細胞の分化誘導を行う。以上の研究が順調に進めば、4糖尿病カニクイザルの皮下にiPS細胞由来膵島の同種移植を行い、随時血糖値、糖負荷試験、組織学(H&E染色、インスリン、C-ペプチド、グルカゴンの免疫染色)的検討を行う。ラット同種移植系:塩基性繊維芽細胞増殖因子(bFGF)を含侵させたアガロースをHigh responderモデルLewisラット(ストレプトゾトシン投与で糖尿病にしてある)の背部皮下に埋め込み、膵島移植用スペースを作成した。この部位へWisterラット膵島を各1500個移植した。5匹のレシピエントの内5匹で移植膵島は拒絶されることなく100日以上生着し、血糖値が正常化した。免疫寛容部位作成用新規薬物の探索:放線菌から分離された環状ペプチド(SEK-???)を用いてラット皮下に免疫寛容部位形成し、免疫抑制剤不使用下で同種膵島の長期生着を可能にすることができた。この部位の免疫状態の解析を行ったところ制御性T細胞の比率が上昇していた。これらの結果はbFGFを用いた場合とほぼ同じ結果であった。マウス同種移植系: bFGFを含侵させたアガロースをHigh responderモデルC57/BL6マウス(ストレプトゾトシン投与で糖尿病にしてある)の背部皮下2カ所に埋め込み、膵島移植用スペースを作成した。Balb/c→B6間の同種膵島移植で、免疫抑制剤の投与をまったく行わない条件下でも、約60%のレシピエントで100日を超えるて移植膵島は生着、さらに、血糖値が正常化した。カニクイザルモデル:bFGFを含浸させたアガロースロッドを皮下に埋め込むことで、血管が豊富な組織に囲まれた空隙を形成することを試みた。ラットやマウスの場合と異なり、非常に多量の滲出液が見られ、膵島移植部位として好ましくない印象を持った。現在SEK-???を移植部位形成剤としての可能性を探索している。iPS/ES細胞からの膵島の分化誘導:ヒトiPS細胞の凝集体を形成させ、その後各種分化誘導培地で順次培養していくことでC-ペプチド陽性率25%以上を達成した。さらに、この途中の前駆細胞を増殖させることが可能であることを見出した。ラット同種移植系:High responderモデルLewisラットを用いた同種膵島の皮下移植で、免疫抑制剤不使用可で長期生着を実現できたので、当初の目的は達成できた。このモデルは、新規薬物の皮下に免疫寛容部位を作成するモデル系として用いる。免疫寛容部位作成用新規薬物の探索:環状ペプチド(SEK-1005)がラット皮下に免疫寛容部位形成し、免疫抑制剤不使用下で同種膵島の長期生着した。今後、制御性T細胞の誘導能が報告されているラパマイシン等、また、ラパマイシンと血管誘導能のある薬物の混合物を検討する。マウス同種移植系: Balb/c→B6間の同種膵島移植をモデルにして、免疫抑制剤不使用下で約60%のレシピエントで100日を超える移植膵島は生着、さらに、血糖値が正常化させることができた。免疫担当細胞に関係する遺伝子を改変したマウス、また、多様な抗体を購入できることから、今後免疫寛容部位形成機構の解析を行うモデルとして用いる。
動物細胞小胞体におけるタンパク質のジスルフィド結合形成機構

ジスルフィド結合形成は、分泌タンパク質(産業上有用なタンパク質の多くが含まれる)にとって立体構造形成上、重要な反応ステップである。哺乳動物細胞の小胞体内には、ジスルフィド結合の形成に関わると予想されるチオレドキシン様の酵素が20種存在している。しかし、各酵素の生理的な基質が不明であるため、各酵素の役割の違いはほとんど分かっていない。本研究では、これらの酵素のうちの一つであるJPDIの基質候補タンパク質をマウス組織中から同定した。更に、インシュリンの前駆体と直接相互作用するチオレドキシン様酵素を4種類同定した。これらの発見から分泌タンパク質の立体構造形成過程を理解する上で重要な知見を得た。ジスルフィド結合形成は、分泌タンパク質にとって立体構造形成上、重要な反応ステップである。哺乳動物細胞の小胞体内にはこの過程に関わると予想される酵素が20種知られている。その一つである、JPDIは、分子内に4個のチオレドキシンドメインと1個のJドメインをもつ。本酵素の生理的な機能を明らかにするために、平成25年度には前年度に引き続き、本酵素の生理的な基質の同定をすすめた。このためには、チオレドキシン様の酵素が、ジスルフィド結合の形成、還元、異性化をおこなう際に、酵素と基質がジスルフィド結合で連結した中間体が形成することを利用した。本年度には新たにNEM処理したマウスの前立腺試料から、JPDIと基質の複合体を、精製した。更に、マススペクトル解析により、JPDIと複合体を形成しているタンパク質を、網羅的に同定することに成功した。また、免疫沈降法を利用することよって、同定したタンパク質の幾つかは、組織内で実際に酵素であるJPDIと結合していることを見出した。よって、哺乳動物の組織からPDIファミリータンパク質のレドックスパートナーを取ってくることができることがわかった。この成果を論文にまとめ、BBRC誌に発表した。インシュリンは、分子内に3個のジスルフィド結合をもつ。インシュリンにジスルフィド結合を導入する酵素の同定を目指し、本年度は、前年度に引き続き実験条件を最適化した。目的の酵素の同定には、インシュリンにジスルフィド結合が導入される過程で形成される共有結合中間体を同定し、精製することが必要である。前年度までにインシュリンのプロ体を検出することには成功していいた。本年度は、条件検討の結果、インシュリンのプロ体だけでなく、分子量がきわめて小さく検出が困難であったインシュリンの成熟体も検出することが可能になった。これは、実験上の大きな進展である。哺乳動物細胞の小胞体内にはこの過程に関わると予想される酵素(チオレドキシン様のドメインを持つ)が約20種知られている。その一つであるJPDIは、分子内に4個のチオレドキシンドメインと1個のJドメインをもつ。本酵素の生理的な機能を解明するために、平成24年度は本酵素の生理的な基質の同定をすすめた。このためには、チオレドキシン様の酵素が、ジスルフィド結合の形成、還元、異性化をおこなう際には、酵素と基質がジスルフィド結合で連結した中間体が形成することを利用した。様々な工夫の後、NEM処理した精巣上体試料から、JPDIと基質の複合体を、精製した。その結果、本タンパク質の生理機能に関して有用な情報を得た。インシュリンにジスルフィド結合を導入する酵素の同定を目指し、本年度は、実験条件を最適化した。しかし、実際に実験を進めてみると、おそらくインシュリンが極めて小さな分子であるため、免疫沈降でタンパク質を回収することも、タンパク質をウエスタンブロッティングで、検出することも困難であった。そこで、各実験ステップの条件を最適化した。その結果、現在、インシュリン産生細胞から、インシュリンを効率よく回収するとともに、タンパク質を検出することが可能になった。これは実験上の大きな進展である。また、ジスルフィド結合等がうまく形成されなかったタンパク質は修復もしくは分解を受ける。この過程に関連する新知見も得たので報告した。本研究では、主に、2つのアプローチによって研究を進めている。第1のアプローチでは、JPDIの生理的な基質を同定することによって、本酵素の生体内における機能を解明することを目的としている。

前年度までに、JPDIとシステインを介して複合体を形成するタンパク質を、網羅的に同定した。その成果を論文にまとめ、BBRC誌に発表した。本年度は、JPDIを欠損する細胞を利用して、JPDIの役割の更なる解明を目指した。興味深いことにJPDIを欠損する細胞でも、JPDIとシステインを介して直接相互作用する因子の生合成に顕著な影響は認められなかった。このことは哺乳動物細胞の小胞体にはJPDIの機能を代替できる因子が存在する可能性を示唆する。これはJPDIの役割を解明する上で重要な情報である。第2のアプローチでは、インシュリンと共有結合中間体を形成する酵素をインシュリン産生細胞から精製することにより、インシュリンにジスルフィド結合を導入する酵素を同定することを目的にしている。前年度までに、実験条件の最適化をすすめた。本年度は、それらの情報に基づき、マウス膵臓β細胞由来の培養細胞株MIN6から、インシュリンと複合体を形成する因子を同定することに成功した。この中には、PDIファミリータンパク質が計4種類含まれていた。今後は、当該因子がインシュリンの生合成に果たす役割を解明するために、当該因子の発現をsiRNA法等で抑制した場合の影響をパルスチェイス実験により調べる必要がある。更に、本年度は、PDIの再酸化にはたらくEro1aとPDIとの相互作用を特異的に阻害する低分子化合物を発見しJBC誌に発表した。本阻害剤は、PDIの機能を特異的に抑制するため、インシュリンの生合成機構の解明にも、貢献すると期待している。また、以上の内容の一部も含めFree Radic Biol Medに総説を発表した。農学本研究では、主に、2つのアプローチによって研究を進めている。第1のアプローチでは、小胞体内のジスルフィド代謝に関与すると予想されているJPDIの生理的な基質を同定することによって、本酵素の生体内における機能を解明することを目的としている。本年度までに、NEM処理したマウスの精巣上体と前立腺の両方の組織試料から、JPDIと基質の複合体を、精製することに成功した。更に、マススペクトル解析により、JPDIと複合体を形成しているタンパク質を、網羅的に同定することに成功した。更に、同定したタンパク質の幾つかは、組織内で実際にERdj5と複合体を形成していることを見出した。この結果から哺乳動物の組織からPDIファミリータンパク質のレドックスパートナーを取ってくることができることがわかった。平成25年度中に、この成果を論文にまとめ、BBRC誌に発表した。よって、JPDIの基質の同定に関しては、研究はきわめて順調に進んでいると考えている。実際に実験を進めてみると、免疫沈降でタンパク質を回収することも、タンパク質をウエスタンブロッティングで、検出することも困難であった。この原因はインシュリンそのものが極めて小さな分子であり、かつ、血液中で極めて重要な働きをするタンパク質であるため、このタンパク質に対する抗体がそもそもできにくいことが原因と考えられる。
多時期ALOS-2/PALSAR-2を利用した法面の変位量推定

2018年度は、本研究の初年度として長大法面を対象とした現地調査地点の選定と調査、ならびに北向軌道および南向軌道のALOS-2/PALSAR-2データセットのインターフェロメトリー解析を行った。現地調査では、千葉県南部を現地調査地点に絞り込み、千葉県に対する本研究の協力要請に関する打ち合わせを行った後、現地踏査ならびに現地調査地点とした長大法面を管轄する道路管理機関との調整を経て、全10箇所の長大法面の現地調査を完了させた。現地調査では、全10箇所の現地調査地点において、三次元レーザースキャナを利用した三次元計測、ネットワーク型RTK-GPS測量による地理座標の観測、およびトータルステーションによる長大法面の実測を行い、現況を把握した。今年度の現地調査結果は、次回以降の調査結果の初期値となる重要なデータとなる。ALOS-2/PALSAR-2データセットのインターフェロメトリー解析では、千葉県南部を観測した北向軌道および南向軌道の10シーンずつから観測日が近いデータ同士の干渉ペアを選定し、衛星視線方向における地盤変動量を解析した。また、同時に干渉ペアと同時期に観測された国土地理院から提供を受けた電子基準点のデータをグリーン関数スプラインによ空間内挿し、地殻変動量について解析をした。電子基準点は高密度には配置されていないため、空間内挿した地殻変動量は必ずしも正確とは限らないが、ALOS-2/PALSAR-2から把握した地盤変動量と比較することで、法面の変位量を推定するために必要な干渉ペアの条件について分析することができた。今年度の解析は、今後の画像解析における重要な知見となった。研究対象地域として予め千葉県南部を選定していたが、現地調査地点となる長大法面を絞り込み、5月7日に千葉県庁にて本研究の協力要請に関する打ち合わせを行ったところ、現地調査地点を管轄する道路管理機関との調整が必要となった。結果として、7月4日、8月1日、9月6日に行った現地踏査ならびに現地調査地点を管轄する道路管理機関との調整を行ったため、現地調査を行う日程が当初計画より遅れた。よって、今年度の進捗状況が遅れた原因は道路管理機関との調整に時間を要したことにあるが、これは研究を遂行するために必要不可欠な期間であった。2019年度以降は、同一の現地調査地点を継続して調査するため、道路管理機関との調整については時間が短縮できる見込みである。なお、2018度は10月10日、10月16日および10月17日に順次現地調査を行い、全10箇所の長大法面の動態調査が完了した。2019年度は、2018年度に実施した10地点の現地調査地点の継続調査を実施し、長大法面全体の前回の調査からの変動量を把握する予定である。また、北向軌道および南向軌道のALOS-2/PALSAR-2データ数を増やし、データセットが20シーン程度になればSmall BAseline Subset algorithm(SBAS)法による地盤変動量の評価を試みる。なお、2018年度の研究成果から、ALOS-2/PALSAR-2のデータは電離層の影響等をかなり受けており、インターフェロメトリー解析に使用できるデータには制限があることがわかったため、少ないシーン数からでもSBAS法によって地盤変動量が推定するできるかを検討する予定である。さらに、少ないシーン数から地盤変動量が推定するにあたっては、現地調査結果または国土地理院が提供する電子基準点のデータを併用することで推定精度の向上を図る手法も考案する予定である。

よって、今年度の進捗状況が遅れた原因は道路管理機関との調整に時間を要したことにあるが、これは研究を遂行するために必要不可欠な期間であった。2019年度以降は、同一の現地調査地点を継続して調査するため、道路管理機関との調整については時間が短縮できる見込みである。なお、2018度は10月10日、10月16日および10月17日に順次現地調査を行い、全10箇所の長大法面の動態調査が完了した。2019年度は、2018年度に実施した10地点の現地調査地点の継続調査を実施し、長大法面全体の前回の調査からの変動量を把握する予定である。また、北向軌道および南向軌道のALOS-2/PALSAR-2データ数を増やし、データセットが20シーン程度になればSmall BAseline Subset algorithm(SBAS)法による地盤変動量の評価を試みる。なお、2018年度の研究成果から、ALOS-2/PALSAR-2のデータは電離層の影響等をかなり受けており、インターフェロメトリー解析に使用できるデータには制限があることがわかったため、少ないシーン数からでもSBAS法によって地盤変動量が推定するできるかを検討する予定である。さらに、少ないシーン数から地盤変動量が推定するにあたっては、現地調査結果または国土地理院が提供する電子基準点のデータを併用することで推定精度の向上を図る手法も考案する予定である。ALOS-2/PALSAR-2の観測は継続されているが、研究に必要な観測モードで観測されたアーカイブデータがなかったため、2018年度はALOS-2/PALSAR-2データ購入費について使用計画と実支出額との差が生じた。2019年度は、2018年度後半に観測されたアーカイブデータ等を購入するため、前年度分の助成金と合わせて使用する予定である。
プライマリーCD4T同時輸注によるCEAを標的としたCAR-T療法の増強と機序

造血器腫瘍に対してキメラ抗原受容体導入T細胞輸注療法の固形がんに対する適用拡大が期待されている。固形がんに特徴的ながん微小環境では免疫抑制機構が発達しており,その様な環境下でも優れた抗腫瘍活性が維持できるCAR-T輸注法を樹立する必要がある。本研究では、がん微小環境における免疫抑制に大きく寄与する制御性T細胞とPD-L1に対して抵抗性を付与するGITR副刺激分子のシグナル伝達ドメインを搭載するzG型CAR-Tを用いた輸注療法において、未加工のCD4陽性T細胞(primary CD4T)の同時輸注によるCD4Tのヘルパー機能を利用した抗腫瘍機能増強効果とその機序について明らかにする。
拡張型心筋症を伴う常染色体優性遺伝性ネマリンミオパチーの新規原因遺伝子同定

拡張型心筋症を伴う常染色体優性遺伝性ネマリンミオパチーの本邦一家系について解析を行った。連鎖解析にて候補領域(約800Mb)を定めた。発端者の網羅的ゲノム解析で得られたアミノ酸置換を伴う変異について、直接塩基配列解析にて家系内での変異を確認。日本人ゲノム変異データベース(Human Genetic Variation Database)、当院における正常対照および症例コントロールのインハウスデータベースにても検索した。これらのデータベースに存在せず、家系内で発症者にのみ共通している変異は2個に絞り込まれた。これらの変異について、機能解析を行い、病的変異の可能性について検討を行っている。拡張型心筋症を伴う常染色体優性遺伝性ネマリンミオパチーの一家系について解析を行った。発症者2名、非発症者2名、発端者の非発症の親ついて連鎖解析を行い、約800kbの候補領域を定めた。発端者についてexome解析を行ったところ、トータルのリード配列は79,617,248readsで、このうち99.38%がリファレンス配列にマップされた。連鎖解析から得られた候補領域内のexon領域において、既知のデータベース(dbSNP)にない新規一塩基置換変異(Single nucleotide variation: SNV)は77個であった。このうちcoverage 3x以上でアミノ酸置換を伴うSNVは42個であった。42個のSNVについて家系内変異解析を行ったところ、家系内で発症者のみ変異を認め、275名の正常対照者でのスクリーニングで変異を認めなかったSNVを1個認めた。このSNVを発現ベクターに組み込んだコンストラクトを作成した。Exome解析では、解読困難な領域も存在し変異を取りこぼす可能性もあるため、発端者について全ゲノム解析も行った。総リード数:1867795082readsで、そのうち1768531399readsがリファレンス配列にマップされた(マッピング率94.68%、カバー率は平均57.12)。全ゲノム解析の結果、既知のデータベースにない、新規SNV、挿入/欠失変異は11708個であった。このうち候補領域にある変異は67個で、母親由来と考えられるものが30個あり、残りの37個について、今後家系内解析、正常対照者スクリーニングを行っていく予定である。類似症例については、拡張型心筋症を呈するネマリンミオパチー症例が本邦に存在することがわかり、同意を得て、DNA抽出のための採血を行った。この症例については、ACTA1の既知変異が同定された。発症者2名(発端者およびその親)、発端者の親(Married in)について、次世代シークエンサーを用いた網羅的ゲノム解析を行った。発端者については、全ゲノム解析も行った。その結果、既知のデータベース(dbSNP)に認めない一塩基置換変異および小挿入/欠失変異は11708個で、候補領域内にある変異は67個であった。このうち、Married inの親のexome解析で検出された30個の変異を除き、発症者2名で共通している変異は16個あった。この16個の変異について、サンガー法を用いて家系内での変異を確認するとともに、日本人1200人ゲノムプロジェクトによるHuman Genetic Variation Browser、当院における正常対照および症例コントロールのインハウスデータベースにて検索した。その結果、これらのデータベースに存在せず、家系内で発症者にのみ共通している変異は2個に絞り込まれた。現在、この2個の候補変異については、変異を培養細胞に導入し、機能解析を行い、病的変異の可能性について検討を行っている。発症者2名、非発症者2名、発端者の非発症の親ついて当科で開発したSNP HiTLink(Fukuda et al., BMC Bioinformatics. 2009)を用いて連鎖解析を行い、候補領域を定めた。ロッドスコア0.6まで上昇を示している候補領域は約800kbで全ゲノムの約1/4であった。発端者についてexon enrichmentを行い、次世代シークエンサーを用いてpairedendでexome解析を行った。大規模並列処理塩基配列解析で得られたシークエンシングのリード配列をBWA alignment withdefault settingにてリファレンス配列(hg19)にマッピングを行った。トータルのリード配列は79,617,248reads (39,808,624 paired)であった。このうち79,127,507reads (99.38%)がリファレンス配列にマップされ、ペアでは76,815,970reads (96.48%)がマップされている。リファレンス配列と異なる168,530個の一塩基置換変異(Single nucleotide variation: SNV)を検出した。

このうち遺伝子上では7,849個のSNVを認め、連鎖解析から得られた候補領域内では1,653個のSNVを認めた。既知のデータベース(dbSNP)にない新規SNVは220個であった。新規SNVのうちexon領域のSNVは77個で、このうちcoverage 3x以上でアミノ酸置換を伴うSNVは42個であった。現在、42個のSNVについて家系内変異解析、正常対照者でのスクリーニングを行い病的変異の可能性のある変異の絞り込みを行っている。発端者におけるexome解析、全ゲノム解析は終了している。連鎖解析から得られた候補領域、既知のデータベースにないアミノ酸置換配列についてふるい分けを行い、検出された変異について絞り込みを行っている。家系内の連鎖解析により候補領域は約800kbであることを確認している。発端者におけるexome解析は終了している。トータル79,617,248readsのリード配列を高いマップ率で得られた。変異の検出および絞り込みについては、168,530個の一塩基置換変異(Single nucleotide variation: SNV)を検出をした。連鎖解析から得られた候補領域、既知のデータベースにないアミノ酸置換配列についてふるい分けを行い、現在42個の新規SNVについて絞り込みを行っている。全ゲノム解析で得られた37個の変異について、サンガー法による直接塩基配列解析を用いて発症者での変異を確認後、家系内解析(共分離の確認)、正常対照者でのスクリーニングを行い、候補遺伝子について絞り込んでいく。絞りこまれた候補遺伝子変異については、変異を培養細胞に導入して、機能解析を行うということによっても、病的変異の可能性について検討し、原因遺伝子変異同定を進めていく。現在得られている42個の新規一塩基置換変異(Single nucleotide variation: SNV)について、サンガー法による直接塩基配列解析を用いて発症者での変異を確認後、家系内解析(共分離の確認)、正常対照者でのスクリーニングを行い、候補遺伝子について絞り込んでいく。また、ショートリード配列における挿入/欠失変異についても、候補領域、既知のデータベースから絞り込みを行い、その後、サンガー法による直接塩基配列解析で変異の確認、家系内解析、正常対照者でのスクリーニングを行い候補遺伝子についても絞り込んでいく。絞りこまれた候補遺伝子については、他の類似症例家系おける変異のスクリーニングを行いたいと考えている。拡張型心筋症を伴うネマリンミオパチーは稀であるため、類似症例が集まりにくい。変異を培養細胞に導入して、機能解析を行うということによっても、病的変異の可能性について検討していく。全ゲノム解析で検出された変異について、引き続きサンガー法による直接塩基配列解析を行っていく。
キチン・キトサンから生体特異性新材料の開発

1)キチン・キトサンの酵素分解制御のin vitro試験生物組織内にキチンを加水分解するリゾチーム酵素の基質特異性を利用した生物組織内吸収材料開発を目指して、N-アシル構造と置換度の異なるN-アセチルキトサン誘導体を調整し、これらのリゾチームによる酵素分解性をin vitroで調べた。(1)N-アシル基のαやβ炭素のH基をSH、ハロゲンなどで置換すると酵素分解されなかった。(2)N-アシル基のαやβ炭素のH基をにNH_2、OH、CH_3基で置換すると酵素分解されたが、その反応速度は低下した。(3)N-アセチル基の置換度は酵素反応速度を制御し、置換度0.5-0.8付近で反応速度は4倍以上に高くなった。(4)過ヨウソ酸酸化でキチン鎖の非還元末端にアルデヒドの導入は酵素分解性を高めたが、水素化ホウ素ナトリウムによるキチン鎖の還元末端にアルコール基の導入は酵素分解性に影響しなかった。これらの結果から、リゾチーム酵素分解速度はキトサンのN-アシル基の構造と置換度で制御でき、キトサンはin vio消化性のDDS基剤になると結論される。2)径口投与用のDDS基剤産卵用および肉用鶏を慣用飼料に2%キトサン(0.7gキトサン/Kg体重/日)を添加して飼育し、ふん中のアミノ糖(加水分解後)を定量してキチンとキトサン消化率を算出した。(1)産卵用および肉用鶏はキチン、N-アセチルキトサン(再生キチン)、キトサンを75-95%で消化し、(2)N-ステアロイルキトサンを消化しなかった(これはin vitro結果に一致した)。(3)兎におけるキトサンの消化率は経日的に上昇し15日目で79%に上昇した。これらの結果から、キトサンは薬物の消化管指向性を目指した経口投与用担体に有用で、その消化率はN-アシル基の置換度と構造で制御できることが解る。(今後の計画)(1)筋肉、皮下注射および埋め込み用のDDS基剤、(2)静脈注射用のDDS基剤の開発。
休眠遺伝子エピジェネティック制御の新しい標的を利用する糸状菌代謝産物生産法の開発

糸状菌代謝産物の新たな生産法として注目されているケミカルエピジェネティクスに応用可能な細胞内因子の探索と様々な培養条件の検討を行った。Sirtuin活性化剤であるresveratrolを用いた添加培養から、海洋糸状菌Trichoderma sp. TPU199株によるbisabolane型セスキテルペンの生産を誘導した。本検討で見出したTPU199株においては、培地中のハロゲン化イオンを代謝物中に取り込む能力を見出し、NaI添加培地による培養から新規I含有化合物の誘導生産に成功した。また、本検討より得られた6株の糸状菌と1株の放線菌培養液より、16個の新規二次代謝産物を見出した。糸状菌が有する二次代謝産物生合成遺伝子の多くは休眠状態にあり、これら未利用遺伝子を活用するためにケミカルエピジェネティクスに基づいた遺伝子発現法が近年注目されている。本研究では、同手法に利用可能な新しいエピジェティック因子の探索と各種培養手法の検討から天然物探索の新しいアプローチの開発を目指す。1.市販で入手可能な低分子化合物を用いて、海洋糸状菌が生産する代謝産物に変化を与える化合物のスクリーニングを行った。(1)エピジェネティック因子の一つであるヒストンアセチル化酵素を始めとした様々な酵素に阻害活性を示すクルクミンを約50株の海洋糸状菌に添加して培養した結果、3株の糸状菌に代謝物の変化が見られた。新たに生成された成分は、いずれもクルクミンの代謝物であったが、新規クルクミン誘導体が得られた。このことから、本菌株が他の化合物の微生物変換に利用可能かの検討を行っている。(2)ヒストン脱アセチル化酵素活性化のため、sirtuin活性化剤レスベラトロールの添加培養を行った。スクリーニングによりパラオ産の海洋糸状菌TPU199株の代謝産物に変化が認められた。本菌株はアミノ酸から生合成されるepipolythiodiketopiperazine (ETP)類を生産するが、本検討によりイソプレノイド経路による代謝物の生産が確認された。2.本研究の一環として、TPU199株の培養検討を行ったところ、海水培養によりClを取り込んだETPを生産することを見出した。これを応用して、培地中にNaBrやNaIを添加した培養から、BrやIを取り込んだETP類の生産に成功した。さらに、本菌株は長期培養やDMSOを添加した培養に対しても生産性に変化を示し、新規化合物の取得に成功している。本菌株に関する研究は、本課題から派生した新たなテーマとして興味深いと考えている。前年度に引き続き、ケミカルエピジェネティクスに応用可能なエピジェネティック因子の探索と各種培養条件の検討から新規生物活性物質の発見を行った。1.市販で入手可能な低分子化合物を利用して、糸状菌が生産する二次代謝産物に変化を与える化合物のスクリニーングを行った。(1)ヒストン脱アセチル化酵素の一種であるsirtuinの活性化剤resveratrolの添加培養を50株の糸状菌に対して行った結果、海洋糸状菌Penicillium citrinum TPU1321株がresveratrolの芳香環にアルデヒド基を導入して新規誘導体へと変換した。このような変換酵素はほとんど知られていないため、基質等の検討を行っている。(2)ヒストン脱メチル化酵素阻害剤であるtranylcypromineを用いた培養検討から、海洋糸状菌Penicillium verruculosum TPU1311株が新たな代謝産物を生産することを見出した。さらに、10株の糸状菌に適応した結果、1株(糸状菌Aspergillus sp. TPU1343株)が本阻害剤による誘導生産を示した。現在、本手法により生産が誘導された成分の解析を行っている。2.本研究の過程において得られた培養液を用いて、抗結核作用や抗糖尿病作用(PTP1B阻害活性)を指標とした生物活性スクリーニングを行った。これまでに、新規抗結核物質としてstreptcytosine類、新規PTP1B阻害剤としてtrichoketide類やverruculide類を見出した。これら新規物質の生産菌株は、ケミカルエピジェネティクスによる培養検討の第一候補と考えている。ケミカルエピジェネティクスを基盤とする培養法に適応可能な新しい細胞内因子の探索を中心に、様々な培養条件検討を実施し、新規生物活性物質の生産を試みた。(1)前年度では市販で入手可能なエピジェネティック因子制御物質による、糸状菌の物質生産への影響を検討した。本年度は、エピジェネティック因子に対する作用が報告されているマイコトキシン類(Mycotoxin Res. 2013, 29, 235)であるシトリニンやペニシリン酸を、当研究室が有する菌株より取得し、海洋糸状菌50菌株(2014年度分離)に対する影響を確認した。現在までに、2株の糸状菌において、シトリニン添加培養による物質生産の変化が観察された。(2)ハロゲン化物塩の添加培養により、種々のハロゲン化epipolythiodiketopiperazine類(ETPs)を生産する海洋糸状菌Trichoderma sp. TPU199株について、HDAC阻害剤であるDMSOの添加と海水培地の組み合わせ培養を行った結果、新規trithiodiketopiperazineの誘導生産に成功した。また、一部のETPs類にヒストンメチル化酵素阻害活性が報告されているため(Bioorg. Med. Chem. Lett. 2013, 23, 733)、本菌株から得られるETPs類による、ケミカルエピジェネティクスへの応用も検討している。

(3)本研究過程で得られた培養液を用いて生物活性スクリーニングを行った。糖尿病や肥満症の新たな標的として期待されるPTP1Bの阻害剤として、新規化合物asperdichromeを糸状菌Aspergillus sp. TPU1343株より発見し、糸状菌Penicillium sp. TPU1271株より見出した既知化合物verrucosidinの新規活性として抗Mycobacterium活性を見出した。糸状菌代謝産物の新たな生産法として注目されているケミカルエピジェネティクスに応用可能な細胞内因子の探索と様々な培養条件の検討を行った。Sirtuin活性化剤であるresveratrolを用いた添加培養から、海洋糸状菌Trichoderma sp. TPU199株によるbisabolane型セスキテルペンの生産を誘導した。本検討で見出したTPU199株においては、培地中のハロゲン化イオンを代謝物中に取り込む能力を見出し、NaI添加培地による培養から新規I含有化合物の誘導生産に成功した。また、本検討より得られた6株の糸状菌と1株の放線菌培養液より、16個の新規二次代謝産物を見出した。種々の培養条件検討を基盤とした新規糸状菌二次代謝産物の探索は順調に進展している。平成26年度においても、本課題の重要な研究材料である糸状菌を、国内外の様々な環境(宮古島やインドネシア)より新たに分離した。ケミカルエピジェネティクスに利用可能な新しいエピジェネティクス因子の探索についても、引き続き行っている。天然物化学平成27年度も引き続き、ケミカルジェネティクスに応用可能な新しい因子の探索を中心に研究を進める。これまでの研究過程において、ペニシリン酸やシトリニン等の既知マイコトキシン生産株が高頻度で分離されるが、これらマイコトキシン類が種々のエピジェネティック因子に影響を与えることが近年報告された(Oh, S.-Y. et al., Mycotoxin Res. 2013, 29, 235)。そこで、マイコトキシン類を利用した培養検討も併せて進める予定である。また、新たな糸状菌の分離も国内外で行う。培養条件の検討により、糸状菌が生産する二次代謝産物の多様性を拡張させる点においては順調に進展しているといえる。また、重要な研究材料である海洋糸状菌も、国内外の海洋環境(西表島、函館、陸奥湾およびインドネシア)より新たに分離した。本課題で第一の目標としている休眠遺伝子を制御する新しいエピジェネティック因子の探索については、引き続き検討を行っている。平成26年度においては、対象とする菌株を絞って検討を進めた。これに伴って差額が生じたため次年度に繰り越すことにした。今年度に引き続き、ケミカルエピジェネティクスに応用可能な新しい因子の探索を進める。初年度は市販で安価に購入できる試薬を中心に検討を進めたが、その種類は多くはない。次年度以降は、微生物由来のエピジェネティクス因子作用物質を独自に培養・精製し、本研究に用いることで当研究室のみが行える研究として推進して行く予定である。また、次年度も海洋糸状菌の分離を国内外の海洋環境から行う。
原子分解能での電子軌道分離状態解析法の研究

本研究は球面収差補正器付き走査型透過電子顕微鏡(Cs-corrected STEM)と電子エネルギー損失分光法(EELS)を用いることで、実験的に結晶中の個々の原子の電子状態を空間分解能は原子分解能で電子軌道を分離して抽出することを目的とした研究である。研究ではペロブスカイト型酸化物であるSrTiO3結晶の酸素原子の電子状態について、実験データに対して理論処理を施すことで、原子分解能で電子線の入射方向に対して垂直方向の電子軌道成分を抽出することができた。これにより構造が既知の単結晶材料であれば理論計算を組み合わせることで電子軌道の異方性が検出できうることを実証したことになるが、一方で、実験rawデータでこれら異方性を検出することが困難であった。そこで特定方向に散乱された電子だけを取り込むスリットを装備した電子顕微鏡を使用することで実験を行ったが、実験的に優位な差を得ることが出来なかった。これはスリットが装備された電子顕微鏡の空間分解能にも依存している為、最新の顕微鏡による追試が必要になってくると考えている。電子軌道の異方性の検出はX吸収分光(XAS)やEELSでは古くからされている手法であるが、これを空間分解能が原子分解能にまで発展させることは材料研究において重要な測定技術である。翌年度、交付申請を辞退するため、記入しない。
山地畜産における渓流取水技術の確立に関する基礎的研究

近年、畜産基地は高標高地の山間未利用地や低利用地を開発して建設されてきている。その設設の用水は、山間渓流の表流水を水源とし、取水は渓流取水工によって行われている。これら渓流取水工では洪水時などに土砂礫や落葉・枯れ枝などが流下し、施設が壊されたり、土砂の堆積により計画の取水量が得られないなどの問題が生じてきている。そこで、畜産用水の渓流取水工について、その実態を調査し、取水渓流の地形的特徴を明らかにすることと、実態に基づく山間渓流の特性を考慮した改良型取水工を試作し、その水理実験を行い水理学的特性を検討した。(1)渓流取水工の設置された渓流河床と流域の地形的特徴について、高標高地の畜産基地の例として、北上山地の7地区79団地(取水工)の取水渓流の河床と流域について地形分析を行った。調査は出来高図と構造図及び現地調査によった。取水方式は集水暗渠型渓流取水工が多く、全体の85%であった。渓流河床は縦断形状の不安定なものが約47%を占め、また縦断形の遷移点の多い河床が約65%であった。流域面積は小面積が多いが、標高の高い取水工では面積の大きな流域もみられた。不安定要素の多い渓流での土砂礫の流下に対する対策も検討した。(2)平行暗渠型渓流取水工の試作とその実証実験について集水暗渠方式では、渓流河床に直交する方式より平行取水方式が有利であることを現地調査で明らかにし、平行暗渠型取水工を試作し、本学の実験水路で水理実験を行った。取水部がポ-ラス管では流水中のSS成分による目詰まりが取水量の急速な減少を、またフィルタ-材(礫)は損失が大きく、取水量は開孔面積率に左右されること、さらに損失は見かけの流速と直線関係にないことなどを明らかにした。以上により、山地畜産での取水施設の実態が把握でき、さらに試作取水工の水理特性が判明し、今後の取水技術確立の基礎資料を提起した。高標高地の山地未利用地を開発して建設される畜産基地では、畜舎や放牧地の用水の水源は、山間渓流に求めることになる。そのため、各種の渓流取水工が設置されている。しかし、これら取水施設では、流砂や落葉・枯枝等の堆積により十分な取水量が得られない場合が多い。本研究は、これらの実態を調査・研究し、実態にもとづく、改良型取水工を試作し、その取水工の水理学的特徴を把握した。本年度の研究実績の概要を以下に示す。(1).取水施設付近および渓流の地形的特徴北上山地の標高1,000m付近に建設された、酪農施設と放牧地について渓流取水工の設置された渓流と取水工付近の地形的特徴を現地調査によって把握した。とくに、渓流(取水地点の上流)については、縦横断形を測量した。北上山地に建設された7地区79団地の調査結果によると、縦断的に不安定な形状を成す渓流(Convex型)が約27%、やゝ不安定な、渓流(Uniform型)が、約20%を占めた。またこれらは、縦断形遷移点の分布を見ると遷急点が多く分布し、遷緩点も多く、全体の約65%を占めていた。この事から、これまで施工された取水工は、地形的に不安定な渓流にに多く設置されていることと、現地では流砂等の堆積が多く、取水が困難となっている施設が多く見られた。

(2).改良型取水工の試作とその実証実験結果について現地調査をもとに維持管理の容易な取水工として、簡易集水暗渠型渓流取水工を実験水路内に試作し、取水実験を行った。特徴は、ポーラス管を用い、それを流れの方向(縦断方向)に設置したこと。水理的特徴は、河床勾配、流れの状態、ポーラス管の損失などが取水量に影響することが判明した。土砂の混入はなく水質は問題ない。などである。次年度は、実態調査とともに、水理実験を積み重ね取水技術の確立を計る。本年度は、昨年度の継続として、北上山地での畜産用水の渓流取水工の実態調査を行い、それらの取りまとめを行った。また、実態に基づく山間渓流での特殊性を考慮した改良型取水工の実験を詳細に行った。主な研究成果は、次のとおりである。1.集水暗渠型取水工の取水方式について従来、集水暗渠型では、集水管は渓流河床に直交して設置(直交方式)されている。現地ではこの方式で土砂礫などの堆積などによって、所要の取水量が確保できないなどの問題が発生していた。そこで、渓流河床に集水管を平行に設置する(平行取水方式)改良型取水工を試作した。この平行取水方式は、直交方式に比べて、渓流という川幅の狭い条件において、横取水率の制約がなく、縦取水率が増加することから、所要の取水量を達成するための自由度が高いことが明らかとなった。2.平行暗渠型取水工の水理実験結果について本年度は、取水機能の低下要因となる項目について主に取り上げて実験した。実験には集水管としてポ-ラス管(連続多孔性コンクリ-ト管)と開孔した塩ビ管を用いた。ポ-ラス管では流水中のSS成分による目詰まりが取水量を急速に減少させること。また、フィルタ-材として礫を用いたが、集水管への流入等の損失が大きく現われた。開孔管では、開孔面積率によって取水量が左右されることなどが判明した。また、それらの損失は見かけの流速と直線的関係にないことも明らかになった。ただ、今回の実験では河床勾配や取水部の流れの流速の取水量への影響などは把握が難しく、さらに比較実験が必要であり今後の課題として残された。以上により、山間渓流での取水方式として平行取水方式が有利であることが明らかにでき、今後の渓流取水技術の基礎資料が得られた。
リーマン面のモジュライ空間の位相の研究

1。座標つきコンパクト=リーマン面とその上の局所自明化つき直線束の組のモジュライ空間をFとする。(種数および束の次数は固定しておく。)マニンらの観察によって、Fには円周上の高々1階の複素解析的微分作用素のリー代数(これをDとかく)が無限小的に等質作用している。本年度えられた主な結果は、フロベニウス相互律の型の仮設の下で、空間FのD同変(p、q)コホモロジーが、p>qのとき消滅するというものである。リーマン面の安定コホモロジーとの関係で重要なのは、同変(p、p)コホモロジーである。(1、1)コホモロジーは、アルバレロらによって、3次元あることが、既に知られている。今年度分かったのは、それらが、我々の枠組の中での「ファイバー積分」によって表わされることと、(2、2)コホモロジーが、10次元あり、うち4次元が分解不可能であることである。(p、p)コホモロジーの完全な決定およびそれらの幾何的意味の解明は、次年度をまちたい。なお、実際の計算は、開リーマン面上の高々1階の微分作用素の全体のリー代数のコホモロジー、つまり、一種のゲルファント=フックス=コホモロジーを扱っている。2。超楕円対合と可換な写像類の全体のつくる種数gの写像類群の部分群を種数g超楕円的写像類群とよぶ。gが2のときは、知られているように、写像類群全体に一致する。超楕円的写像類群のmodpホモロジー群は、F.R.コーエンらによって決定されている。今年度私は、彼等の結果の非常に簡単な(部分的)別証をあたえた。計算の困難さは、この群が、ねじれ元を含むことにあり、(コーエンらも含め)従来、レベルをつけることによって、それを回避しようとしてきたが、それでは充分でなく、結局、代数トポロジーの高度の技法を必要としていた。私は、1。にならい、ベクトルつき超楕円曲線のモジュライ空間を考えることにより、計算を著しく初等的にすることができた。実際、ギュシン完全列と、マイヤー=ヴイエトリス完全列だけを使って、p>gの場合の超楕円的写像類群のmodpコホモロジーの別計算を与えることができた。1。2。私は、1。
上腹部手術後に起こる横隔膜機能障害の治療法の開発

上腹部手術後には著しい横隔膜機能低下が起こり、これが集中治療の進歩にもかかわらず呼吸器の合併症が減少しない理由と考えられている。この横隔膜機能不全に対する治療法は知られておらず、この治療法を申請者等が開発した胸壁振動器を利用して検討すること、且つ胸壁振動器の改良型を開発することが本研究の主要な目的であった。今までの経過としては、先ず振動器を小型化し、マウスピースの代わりに鼻クリップセンサーから吸気、呼気の信号が取れ、患者へ与える不快感が少ない胸壁振動器が出来たことである。次に、この新型胸壁振動器を利用して上腹部手術患者での横隔膜機能への影響を検討した結果、低下した横隔腹機能の明らかな改善(レスピグラフ、ベル型スパイロメータで確認)、血液ガスの改善が見られた。さらに興味あることに、上腹部手術後にはしばしば腹部と上胸郭の位相のズレが見られるが、この位相のズレが吸気時胸壁振動で完全に矯正されたことである。また、興味あることに、下位肋間に、呼気相に一致して振動を行った場合の効果について健常者でレスピグラフを用いて検討した所、同様の横隔膜運動の増強が見られ、これは横隔膜筋電図でも確認出来た。この点を現在上腹部手術後患者でも検討を始めており、同様の横隔膜機能の増強を示唆する所見が得られている。この興味ある肋間横隔膜反射の機序(脊髄での反射レベルの解析)は現在脊椎麻酔患者で検討中だが、麻酔レベルの精密な判定が困難で、結果が一定せず、更に検討が必要と考えている。上腹部手術後に起こる肺合併症の原因として,横隔膜機能障害が深く関っており,その有効な治療法は知られていない。この治療法を開発し,術後の肺合併症を防ぐと共に,できれば,横隔膜機能障害の機序を明らかにすることが2年間に渡る本研究の目的である。本年度の研究では以下のような成果が得られた。上腹部手術後の横隔膜機能障害は呼吸インダクチブプレチスモグラフで観察した場合,一回換気量に対する胸郭貢献度の増加として表われるが,胸郭と腹部の動きを固時記録した場合,約30%の患者で両者の吸気運動の開始にずれが起こる(通常,腹部の動きが遅れる)ことが判明した。この際,上胸部両側第2,3肋間傍胸骨部に吸気に合わせて100Hzの振動を与えると,胸郭貢献度はやゝ減少し(有意ではない),一方一回換気量は著明に増加(平均51%)した。更に興味あることには,振動前に認められた胸郭と腹部の吸気運動の位相のずれが振動によって完全に消失した。これらの結果は胸壁振動が上腹部手術後の横隔膜機能障害を改善するのみでなく,各呼吸筋運動のタイミングを中枢性に調整し,協調させることを示している。同時に横隔膜機能障害そのものが反射性の抑制であることを示唆する。今回購入した振動器は今までのものと異り,マウスピ-ス,マスクを必要とせず,鼻翼に簡単に固定できる鼻熱線センサ-が鼻呼吸を感知して振動器を動かすので,被検者に不快感を与えず,より信頼できるデ-タが得られた。以上の結果は1月1821日行われた第2回日米麻酔会議で既に発表し,又4月の第39回日本麻酔学会総会にも演題が受理されている。
ＧＰＲ３９作動性のＰｄｘ－１発現により膵β細胞を保護する抗糖尿病亜鉛医薬品の開発

申請者は、新規の糖尿病薬を目指して多くの亜鉛錯体を合成し、培養細胞および実験動物による評価系に基づいた開発を行っている。一部の亜鉛錯体が、転写因子であるPdx-1の遺伝子発現を上昇させ、Pdx-1のリン酸化・活性化を促進し、インスリンの発現および分泌作用を示すことを培養細胞系から見出した。現状で有望な亜鉛錯体であるZn(opt)2およびZn(ac)2は、1型糖尿病モデルにおいて膵臓より肝臓における転写因子Foxo-1を活性化すること、および2型糖尿病モデルにおいて膵臓と肝臓の両臓器に作用することが示唆された。今後、標的臓器とターゲット分子、それらの治療効果への寄与をより明確にする必要がある。わが国における糖尿病は、2008年には糖尿病が強く疑われる人とその予備軍を合わせると2,210万人に達することが明らかにされた。近未来の高齢化社会の到来を考慮すると、何らかの画期的な対策が必要とされる待ったなしの状況である。生体微量元素であり、最近では細胞内情報伝達作用や組織再生能が大きく注目されている亜鉛は、20世紀後半にインスリン様作用が証明されて以来、多くの研究が進められてきた。本課題では、多くの配位子・亜鉛錯体を合成して亜鉛ライブラリーを構築し、細胞系および実験動物の評価系に基づいてヒトに応用可能な新規の糖尿病薬を目指した亜鉛含有医薬品の開発を目標としている。研究者らは、亜鉛錯体の抗糖尿病作用機構の一つとして、GPCRの一つであるGPR39の活性化を介した膵臓β細胞からのインスリン分泌促進作用があることを世界で初めて見出した。そこで、インスリノーマ様の培養細胞を用いて亜鉛錯体のインスリン分泌促進効果とその作用機構を検討し、この作用の一部が亜鉛錯体による膵臓β細胞の保護作用に起因するのではないかと考え、これについて検討を行った。さらに、亜鉛イオンがインスリン遺伝子やGLUT2遺伝子などの発現を制御する転写因子であるpdx-1の発現を調節しているという報告にもとづいて、本研究では、亜鉛錯体が膵臓β細胞におけるカルシウム動態に与える影響、インスリン分泌に与える影響、インスリン遺伝子とpdx-1遺伝子の発現に対する変動、およびpdx-1リン酸化によるpdx-1活性化についてラットインスリノーマ細胞をや実験糖尿病モデル動物を用いて検討し、初年度や二年度に得られた成果より当初の目的を達成しつつある。本課題では、新規の糖尿病薬を目指して多くの亜鉛錯体を合成して亜鉛ライブラリーを構築し、細胞系および実験動物の評価系に基づいた亜鉛含有医薬品の開発を目標としている。研究者らは、亜鉛錯体の抗糖尿病作用機構の一つとして、GPCRの一つであるGPR39の活性化を介した膵臓β細胞からのインスリン分泌促進があることを世界で初めて見出した。そこで、インスリノーマの培養細胞を用いて亜鉛錯体のインスリン分泌促進効果とその作用機構を検討し、この作用の一部が亜鉛錯体による膵臓β細胞の保護作用に起因するのではないかと考え、これについて検討を行った。さらに、亜鉛イオンがインスリン遺伝子などの発現を制御する転写因子であるpdx-1の発現を調節しているという報告にもとづいて、亜鉛錯体が膵臓β細胞におけるカルシウム動態に与える影響、インスリン分泌に与える影響、インスリン遺伝子とpdx-1遺伝子の発現に対する変動、およびpdx-1リン酸化によるpdx-1活性化についてインスリノーマ細胞をや実験糖尿病モデル動物を用いて検討した。初年度と2年度に得られた成果より最終年の検討を行い、現状で最も有望な亜鉛錯体であるZn(opt)2が、1型糖尿病モデルマウスにおいて主な作用点は肝臓であること、2型糖尿病モデルマウスにおいては膵臓と肝臓が主な作用臓器であると示唆された。今後の継続的課題として、標的臓器とターゲット分子、およびそれらの治療効果への寄与率をより明確にする必要があると結論された。