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マンガン酸化物における新奇な電場誘起ドメインスイッチング現象の機構解明

マンガン酸化物や鉄酸化物の一部は、冷却に伴い、電荷・軌道整列という一種の構造相転移を示す。近年、電荷・軌道整列によって生じる微細組織(電荷・軌道整列ドメイン)を電場、磁場、圧力などの外場を用いて制御し、それを通して新しい材料機能の獲得を模索するという研究が活発に行われている。本研究では、外場による電荷・軌道整列ドメインの操作に関わる微視的メカニズムを、透過電子顕微鏡によるその場観察技術を駆使して調べた。【研究の目的、研究実施計画】電荷・軌道整列ドメインの構造を電流/電圧で操作するという新奇なドメインスイッチング現象のメカニズムを、独自の電子顕微鏡観察技術により明らかにする。スイッチング現象を誘発する主要な機構を解明するとともに、電荷・軌道整列相の核生成・成長に及ぼす電場効果や、ドメイン界面のモビリティに関わるその場観察実験を行い、スイッチング現象の制御と工学的応用展開に向けた基軸的性質の理解を図る。【平成23年度の研究成果】(1)ドメインスイッチング現象の観察技術の開発:設備備品として購入した高感度CCDカメラを、オメガ型エネルギーフィルタを搭載した200kV透過電子顕微鏡に搭載した。本研究では、微弱な散漫散乱を利用した暗視野像の観察が重要な実験手段となる。これまで暗視野像の取得には数秒の露光時間が必要で、冷却過程の動的観察を行うことは困難であった。高感度カメラの導入により、ドメインの生成過程等を動画レベルで観察できるようになった。その結果、ミクロンスケールの電荷・軌道整列ドメインの内部に、数百nmオーダーのサブドメインが階層的に生じることが確認された。このサブドメインが、印加電場の下で移動する電荷・軌道整列ドメインの界面をイビツな形態にしていることがわかった。(2)軌道整列状態で観察される磁気的ドメインの異常:軌道整列ドメインの観察対象としてMn-V-O酸化物を観察したところ、その磁気構造(磁気的ドメインの状態)が、圧力に対して敏感に反応するという現象を見出した。本研究の主要課題、即ち外場による新奇なドメイン構造制御に関わる成果として、次年度も引き続き研究を進める予定である。本年度は、電荷・軌道整列ドメインの組織形成と外場効果について詳細な実験を行った。研究当初に注目したLa-Sr-Mn-Oは電荷・軌道整列に伴う格子定数変化が小さく、ドメイン形態は試料に負荷される応力にも影響を受けることが、複数試料の電子顕微鏡観察を通してわかった。実際に、薄片化した試料を転移温度まで冷却すると、支持台である金属プレートとの熱膨張率の違いを反映して応力が発生し、電荷・軌道整列相はシングルドメイン化する事象が見受けられた。これに対して、軌道整列に伴う格子定数変化が大きいMn-V-Oでは上記の傾向が相対的に弱く、試料の一部が金属プレートと接触していても殆どの場合でマルチドメインが観察された。従って、電場誘起のドメインスイッチング現象を考察する際には、個々のドメインに蓄積される静電エネルギーの効果に加えて、弾性エネルギーの効果も考慮すべき一因子であることがわかった。上記の研究を通して、応力場を利用した効果的なドメイン制御の手法を構築することができた。前述の通りMn-V-Oでは軌道整列相転移に伴い比較的大きな格子定数変化が生じるが、熱膨張係数の大きな金属プレートに試料片を埋め込むと、室温から60Kまでの冷却によって0.05%程度の圧縮応力を効果的に印加できることがわかった。この手法によってシングルドメインとマルチドメインの切り替えを意図的に行うことが可能となった。一方、界面移動のダイナミクスを考察する上で、結晶中の構造欠陥と界面の相互作用を評価することが重要となる。界面移動に関わるモデル実験として、本研究ではMn-V-Oと同じくスピネル型の構造を持つFe-Zn-Oに注目し、Fe-O-Feの軌道結合に関わる逆位相境界の効果を詳しく調べた。多くの電荷・軌道整列ドメインも比較的高密度の逆位相境界を含んでおり、本実験は重要な知見を与えるものとなった。ペロブスカイト型Mn酸化物で発見された、電場による電荷・軌道整列ドメインのスイッチング現象の機構解明を目指して23年度から研究を開始した。以下に24年度の研究成果を要約する。(1) TEM内での電圧印加・電場観測技術の開発:ペロブスカイト型酸化物を集束イオンビームで薄片化するとともに、それにミクロンサイズのPt (Au)電極を設置して、擬似的なコンデンサー状の試料を作製した。この微細加工・微細配線技術の活用により、透過電子顕微鏡内で10000V/cmを越える高電場を容易に印加できる仕組みを確立することができた。一方、多くのペロブスカイト型酸化物は絶縁体であり、電子線照射によって試料が帯電する。この帯電による不要な電場情報は、試料への印加電圧に起因する情報(内部電位の情報)と重畳し、電子線ホログラフィーによる等電位線分布の決定を阻む大きな問題となった。

これを解決するために、異なる印加電圧の下で収集したホログラムを使って位相情報の差分を求め、必要とする内部電位の情報を正確に求める解析手法を構築した。(2) Mn酸化物、V酸化物のドメイン構造解析:集束イオンビームを用いてLa-Sr-Mn-Oの薄片化、並びに微小電極の設置を行った。透過電子顕微鏡内で試料を冷却し、110Kで電荷・軌道整列ドメインの生成を確認できたものの、単一ドメインであるために電場によるスイッチング(界面移動)効果の検証を行うことはできなかった。ドメイン構造は、冷却時に試料に負荷される圧力に依存するものと考えられる。一方、同様の手法で薄片化したMnV2O4の解析を行ったところ、軌道整列ドメインと磁区の両方に顕著な圧力依存性があることがわかった。いずれの結果も、ドメインスイッチングを誘発する要因として、圧力の効果を考慮すべきことを指摘しており、微細組織の外場応答に関して重要な知見を得ることができた。本研究の目的を達成するためには、電荷・軌道整列ドメインの複雑な内部組織やその生成過程を詳細に評価できる顕微鏡技術の構築が必要である。初年度の大きな課題であった本件は、予定通りに達成することができた。薄膜化した試料片にサブミクロンサイズの配線を施すという実験は、高度な技術開発を伴うことから次年度も引き続き取り組む結果となったが、基礎実験の過程で、前頁で述べた磁気的ドメインの圧力効果を新発見するなど、予想外の成果もあった。これらをふまえて、研究はおおむね順調に進展していると判断される。25年度が最終年度であるため、記入しない。当初の目的の一つに、電圧印加した試料の内部の等電位線を、電子線ホログラフィーで正確に決定し、誘電率の均一性を考察することを掲げていた。平成24年度にこの課題を推進したところ、電子線照射に伴う帯電効果が予想以上に強いことが判明した。しかし、上述した位相データの演算を通してこの問題を解決できることを示し、電圧印加時の等電位線分布を精緻に観測できる技術を構築できた。Mn酸化物やV酸化物を使った軌道整列ドメインの解析でも、微細構造の外場応答性の理解に関わる重要な情報を得ている。以上の点から、本研究はおおむね順調に進んでいると判断される。薄片状試料への電極設置については、集束イオンビーム装置を利用した基礎実験を次年度も引き続き行う。技術的な問題点は、薄片化した試料に対する圧力の負荷、イオンビーム加工に伴うデポジションで回路上の絶縁部分にリークが生じる点の二つである。後者については、加速電圧の低減等により問題の克服を図る。前者に関しては、結果的に圧力による磁性のコントロールという電子顕微鏡観察に端を発する新現象の発見を導いたものの、電顕内での電圧印加技術としては引き続き手法・プロセスの最適化を進める予定である。当初の計画に従って平成25年度も研究を進める。具体的には、軌道整列ドメインの核生成・成長機構、界面ダイナミクス、並びに外場応答性に関わる研究を、La-Sr-Mn-OやMn-V-Oなどの強相関電子系酸化物を用いて進める計画である。また、TEM内でのその場観察実験を行う上で要の技術となる、試料への微小電極の設置については、薄片化した領域への応力負荷を低減できるようなデザインの最適化を図る予定である。
中国宋代天目茶碗の総合的調査研究―新出土資料と科学分析を踏まえた伝世品の再検討

本年は、昨年度行った新発見の曜変天目片(伝杭州出土)に関する調査成果を公表するとともに、当該資料及び関連資料について、台北の國立故宮博物院において、蛍光X線分析、顕微ラマン分光分析、光学・電子顕微鏡による顕微構造観察等の各種分析調査を行った。出土品の曜変天目資料については世界で初めての科学分析調査となり、曜変天目の製作技法や光彩の発色原理、斑文の生成過程などの謎を解明する上でも極めて重要な意義を持つものとなった。分析調査はなお継続中であり、次年度にも引き続き分析を行うとともにその研究成果の公表に向け準備を行う予定である。一方、日本の伝世品については、大徳寺塔頭龍光院所蔵の国宝曜変天目及び油滴天目の調査を行った。その調査成果については、MIHO MUSEUMの特別展「大徳寺龍光院国宝曜変天目と破草鞋」の図録や講演会等で広く公表した。さらに、奈良国立博物館で行ったNHKによる藤田美術館所蔵国宝曜変天目茶碗の8K撮影に立ち会い、超高精細な8K映像により光彩部分には複数の微粒子状の集合体が確認できるなど多くの新知見が得られ、NHKニュースでもその一端が紹介された。その他、天目に関する南宋絵画や現代の再現品、中国での新出土資料に関する最新動向などの情報収集や調査を実施し、今後の伝世品の再検討のための基礎的な資料となった。その他、曜変天目の再現に取り組み陶芸家とも積極的に意見交換を行った。なお、調査に際しては、多くの研究協力者や現地研究者、関連機関などの協力を得ることができ、活発な意見交換を行い、今後の研究にとっての有意義な情報や新知見を得ることができた。新発見の曜変天目片(伝杭州出土)に関する調査成果の公表を予定通り行うとともにを、当該資料及び関連資料について、曜変天目の製作技法や光彩の発色原理、斑文の生成過程などの謎を解明する上でも極めて重要な意義を持つものとなった。さらに伝世の国宝曜変天目についての調査も併せて実施しており、また8K映像など新たな技術などにより、宋代天目茶碗の研究における新たな可能性も見出すことができた。本年度の研究成果についても学界のみならず広く一般に公表、還元する予定である。引き続き新発見の曜変天目片(伝杭州出土)に関する分析調査を進めることによって曜変天目の製作技法や光彩の発色原理、斑文の生成過程などの謎を解明する上でも極めて重要な手がかりが得られるものと期待される。分析の成果については、次年度に公表する予定であり、出土曜変天目の世界初の分析成果は曜変天目研究にとって画期的な成果をもたらすものと確信している。また、南宋の都のあった杭州をはじめ中国国内の新出土資料についても引き続き調査を進めるとともに、天目関連窯址や遺跡の調査を行い、さらに国内外での再現研究についても出来る限り把握し、宋代天目茶碗の伝世品の研究への新たな視点をさぐっていきたい。こうした研究の成果については、論文や学術発表のみならず、講演や講座、雑誌など広く一般にも還元していく予定である。本年は新発見の個人蔵の曜変天目片(伝杭州出土、未発表)の初歩的調査(採寸、写真撮影、顕微観察等)を研究協力者らと行うことができたことがまず大きな収穫であった。南宋の都のあった杭州からは2009年に初めて曜変天目が発見されて大きな話題となり、筆者も早くに調査を行い紹介したことがある。今回の発見は中国における曜変天目の出土の第二例目となるもので、曜変天目の歴史的位置づけを考える上でも、またその技術の謎を考える上でも極めて重要な意義をもった資料である。当該資料については、次年度以降に国内外で正式に紹介するとともに、台北の國立故宮博物院の協力を得て、科学分析を行い、曜変天目の光彩や斑紋のメカニズムの解明を目指す予定である。一方、国内調査では根津美術館所蔵の加賀前田家伝来の重要美術品「曜変天目(油滴天目)」をはじめとした伝世天目作品の調査を実施した。かつて「曜変天目」と見なされたこともある重要美術品「曜変天目(油滴天目)」については、その特徴の詳細な観察や顕微観察などによって新たな発見や知見も得られた。とりわけ、南宋宮廷で使われたと考えられる杭州出土の天目には露胎部を漆で覆うという特殊な方法が見られるが、この伝世品にもかすかにそうした漆の痕跡が確認できたことは、その来歴を考える上で重要な発見といえる。また、中国河南地区の北方天目についても調査を行い、日本にも少なからず伝世する北方天目の産地やその流通過程を考える参考となった。本年の調査に際しては、多くの研究協力者や現地研究者の協力を得るとともに、活発な意見交換を行い、科学分析を含めた今後の研究方法にとって有意義な情報や知見を得ることができた。なお、研究成果の一部は中国や日本の学会や講演会などにおいて発表した。新発見かつ未公表の新出土資料の調査を行うとともに、今後の科学分析を踏まえた研究の目途がたったことことは本研究にとって極めて大きな収穫となった。一方、日本などの伝世品の調査も計画的に進めており、新出土資料や科学分析を踏まえた伝世品の再検討という今回の研究目的にたいして着実に調査成果を上げている。また、研究成果については、すでにその一部を中国や日本の学会や講演会などで公表しており、次年度以降もさらに様々な形で公表する予定である。

本年は、昨年度行った新発見の曜変天目片(伝杭州出土)に関する調査成果を公表するとともに、当該資料及び関連資料について、台北の國立故宮博物院において、蛍光X線分析、顕微ラマン分光分析、光学・電子顕微鏡による顕微構造観察等の各種分析調査を行った。出土品の曜変天目資料については世界で初めての科学分析調査となり、曜変天目の製作技法や光彩の発色原理、斑文の生成過程などの謎を解明する上でも極めて重要な意義を持つものとなった。分析調査はなお継続中であり、次年度にも引き続き分析を行うとともにその研究成果の公表に向け準備を行う予定である。一方、日本の伝世品については、大徳寺塔頭龍光院所蔵の国宝曜変天目及び油滴天目の調査を行った。その調査成果については、MIHO MUSEUMの特別展「大徳寺龍光院国宝曜変天目と破草鞋」の図録や講演会等で広く公表した。さらに、奈良国立博物館で行ったNHKによる藤田美術館所蔵国宝曜変天目茶碗の8K撮影に立ち会い、超高精細な8K映像により光彩部分には複数の微粒子状の集合体が確認できるなど多くの新知見が得られ、NHKニュースでもその一端が紹介された。その他、天目に関する南宋絵画や現代の再現品、中国での新出土資料に関する最新動向などの情報収集や調査を実施し、今後の伝世品の再検討のための基礎的な資料となった。その他、曜変天目の再現に取り組み陶芸家とも積極的に意見交換を行った。なお、調査に際しては、多くの研究協力者や現地研究者、関連機関などの協力を得ることができ、活発な意見交換を行い、今後の研究にとっての有意義な情報や新知見を得ることができた。新発見の曜変天目片(伝杭州出土)に関する調査成果の公表を予定通り行うとともにを、当該資料及び関連資料について、曜変天目の製作技法や光彩の発色原理、斑文の生成過程などの謎を解明する上でも極めて重要な意義を持つものとなった。さらに伝世の国宝曜変天目についての調査も併せて実施しており、また8K映像など新たな技術などにより、宋代天目茶碗の研究における新たな可能性も見出すことができた。本年度の研究成果についても学界のみならず広く一般に公表、還元する予定である。新発見の個人蔵の曜変天目片(未発表)は、本研究においても極めて重要な資料となるものであり、すでに所蔵者の了承も得ており、今後、台北の國立故宮博物院の協力を得ながら、様々な科学分析を行い、曜変の光彩や斑紋のメカニズムの謎に迫りたい。筆者は以前、藤田美術館所蔵の国宝の曜変天目の科学分析調査に関与したこともあり、その分析成果も併せることで、本研究は曜変天目の研究において画期的な研究成果をあげることができると期待できる。さらに、南宋の都のあった杭州から出土した様々な天目資料は、日本の伝世品だけでは分からない南宋宮廷の天目の様相を考える上で重要な資料といえる。引き続き、杭州出土の天目の調査を進めるとともに、その成果を踏まえ、日本伝世品及び海外所蔵の伝世品(多くは日本の伝世品の可能性が高い)について新たな視点から調査研究を進めていきたい。また、建窯製品以外の吉州窯な北方天目などの日本伝世品や関連の窯址、遺跡出土資料についても同時に調査を行いながら、産地や年代、さらにはその流通過程、日本における受容の問題などについて、科学分析も踏まえ、多角的に考えていきたい。科学分析や制作技法に関して分析方面の研究者や陶芸家などの多方面の研究協力者の協力を得ながら効率的に進めていく予定である。なお、研究成果については、すでにその一部を中国や日本の学会や講演会などで公表しており、次年度以降もさらに様々な形で公表する予定である。
神経回路形成におけるGTP結合蛋白質Rac1のin vivoでの機能解析

(1)rac遺伝子座にloxPを導入したマウスの作製rac1遺伝子の開始コドンを含むエキソンをloxPで挟んだアリルを導入したrac1(flox/flox)マウス、rac3遺伝子の開始コドンを含むエキソンの5'非翻訳領域にloxPを導入し、rac3遺伝子の最終エキソンのpolyA付加シグナルの3領域にloxP-HcRedを導入したrac3(+/flox-HcRed)マウスを作製した。(2)コンディショナルRac1ノックアウトマウスの解析小脳プルキンエ細胞特異的にCreを発現するL7(+/cre)マウスを用い、rac1(flox/flox)L7(+/cre)マウスを作製した。rac1(flox/flox)L7(+/cre)マウスは小脳失調を示さず、ヘマトキシリンーエオシン染色での観察では大きな構造上の異常は見られなかった。カルビンジン染色によりプルキンエ細胞の樹上突起の形状を観察した結果、樹状突起の形態に異常が観察された。また、電子顕微鏡観察により、Rac1欠損プルキンエ細胞上での平行線維シナプスの密度を測定したところ、Rac1欠損細胞では明らかにシナプス密度が野生型より低く、Rac1がシナプスの形成もしくは維持に関与していることが示唆された。(3)領域特異的Cre発現マウスの作製神経細胞特異的Racコンディショナルノックアウト作製のための領域特異的Cre発現マウスとして、大脳皮質、海馬等でCreを発現するEmx1-creノックインマウスを作製し、小脳顆粒細胞でCreを発現するNR2C(GluRe3)-cre Tg(2系統のファウンダーを交配中)を作製した。(4)セマフォリン3F(sema3F)ノックアウトマウスの作製Sema3Fの神経回路形成及び神経機能への関与を個体レベルで調べるため、マウスSema3F遺伝子座にlacZ遺伝子をノックインしたマウスを作製した。低分子量G蛋白質Racの神経回路形成およびシナプス可塑性における機能をin vivoで明らかにするため、1)rac1遺伝子の開始コドンを含むエキソンをloxPで挟んだアリルを導入したヘテロ型rac1(+/flox)マウス、2)rac3遺伝子の開始コドンを含むエキソンの5'非翻訳領域にloxPを導入し、rac3遺伝子の最終エキソンのpolyA付加シグナルの3'領域にloxP-HcRedを導入したヘテロ型rac3(+/flox-HcRed)マウスをジーンターゲッティング法により作製した。rac1(+/flox)キメラマウスは、すでに作成していた小脳プルキンエ細胞特異的にCreを発現するrac1(+/-)/L7(+/cre)と交配しており、その仔マウスでは1/8の確率でRac1をプルキンエ細胞で欠損するrac1(flox/-)/ L7(+/cre)が得られる予定である。また、in situハイブリダイゼーション法によりrac1,rac3 mRNAの発現を検討し、rac1は神経系において幼弱期から成熟脳にいたるまで、神経系のほとんどの細胞(ニューロンおよびグリア)で強い発現が見られるのに対し、rac3は幼弱期から神経系での発現が強く、特に発達期に強いシグナルが脳全体で見られるが、成熟脳での発現は低いことが明らかとなった。また、Racコンディショナルノックアウト作製のための領域特異的Cre発現マウスとして、Emxl-creノックインマウス(ターゲッティングベクターをES細胞に導入し、G418耐性クローンをサザンブロット中)、NR2C(GluRε3)-cre Tg(2系統のファウンダーを交配中)を作製中である。(4)セマフォリン3F(sema3F)

ノックアウトマウスの作製Sema3Fの神経回路形成及び神経機能への関与を個体レベルで調べるため、マウスSema3F遺伝子座にlacZ遺伝子をノックインしたマウスを作製した。
白血病幹細胞に対するDNA修復関連分子を標的にした新規治療法の開発

急性骨髄性白血病は予後不良な難治性造血器腫瘍である。抗癌剤抵抗性な細胞群である白血病幹細胞の存在が難治性の重大な原因となっており、治癒を目指すためには白血病幹細胞を標的とした治療法の開発が急務である。急性骨髄性白血病ならびに白血病幹細胞に対し、DNA修復機構に関連する遺伝子のknockdownや新規特異的阻害剤でのin vitro, in vivoの効果判定ならびに分子学的メカニズムの解析を行うことで、急性骨髄性白血病を治癒に導くことが可能な新規治療薬の開発や前臨床における評価を行い、それらの阻害薬の実際の臨床応用を目指し、新たな白血病幹細胞を標的にした治療薬の開発を行うことを目的とする。
腐植酸の収着と生分解が相互作用したベンゾピレンの生物毒性に及ぼす影響

ベンゾ[a]ピレン(BaP)の異なる土壌由来腐植酸に対する収着特性と腐植酸との相互作用によるBaPの藻類生育阻害率の変化を検討した。その結果,腐植酸の種類によりその程度は異なったが,腐植酸濃度に伴いBaPの収着量は増大し,藻類生育阻害率は低下する傾向が認められ,腐植酸への収着によりBaPの急性毒性は軽減することが示唆された。さらに,HAと収着させたBaPをlaccaseによる生分解処理をした場合,藻類生育阻害率はBaP単体の場合と大きく異なり極めて低い値を示し,腐植酸と相互作用したBaPは生分解を受ける際も単体の場合と異なる毒性挙動を示すことが示唆された。本研究では,多環式芳香族炭化水素の生物毒性発現に及ぼす土壌有機物の影響を評価することを目的とし,ベンゾ[a]ピレンを対象として土壌有機物の主要成分である腐植酸への収着ならびにその微生物分解産物の生物毒性変化を検討するものである。平成25年度においては,ベンゾ[a]ピレンの生物に対する急性毒性に及ぼす腐植酸の影響評価として,緑藻Pseudokirchneriella subcapitataの生育阻害を検討した。使用した腐植酸は昨年度に抽出・精製し,ベンゾ[a]ピレンとの収着係数を算出した3種類の土壌腐植酸(褐色森林土,黒ボク土,泥炭土)を用いた。エチレングリコールモノメチルエーテルに溶解したベンゾ[a]ピレン(最終濃度5mg/L)と腐植酸溶液(最終濃度01mg/L)を藻類生育用合成培地に添加して一晩振とうさせた。これにP. subcapitataを10000cells/ mlとなるように接種して96時間振とう培養した。培養終了後,細胞数を計測し,ベンゾ[a]ピレン未添加区に対するベンゾ[a]ピレン添加区の生育阻害率を算出した。その結果,いずれの腐植酸においても腐植酸添加濃度の増大とともにP. subcapitataの生育阻害率は低下する傾向が認められた。これらのことから,ベンゾ[a]ピレンによる藻類に対する急性毒性は既報におけるベンゾ[a]ピレンの生物濃縮と同様に腐植酸の存在下で軽減することが示された。また,ベンゾ[a]ピレンと最も高い収着係数を示す黒ぼく土腐植酸では,1 mg C/Lの添加濃度において90%もの高い生育阻害軽減効果が認められた。従って,腐植酸による生育阻害の軽減には,ベンゾ[a]ピレンと腐植酸の収着が関与していると考えられるが,厳密な収着係数との相関関係は認められなかったことから,腐植酸自身の生育促進効果などの関与も考えられた。本研究では,多環式芳香族炭化水素の生物毒性発現に及ぼす土壌有機物の影響を評価することを目的とし,ベンゾ[a]ピレン(BaP)を対象として土壌有機物の主要成分である腐植酸への収着ならびにその微生物分解産物の生物毒性変化を検討するものである。平成24年度においては,まず本研究で使用する腐植酸を3種類の異なる土壌(褐色森林土,黒ボク土,泥炭土)から抽出・精製した。得られた腐植酸の特性を把握するために,元素組成を測定したところ土壌型によってその組成が異なることが示された。さらに,これらの腐植酸とBaPとの収着程度を確認するため回分式収着実験をおこなった。その結果,全ての腐植酸に対してBaPの収着は認められ,収着係数は0.9991.885×10-5L/kgの値を示した。これにより,由来土壌の違いによって腐植酸とBaPの収着程度が異なることが示された。次に,BaPの生物毒性を評価するために,BaPによる緑藻Pseudokirchneriella subcapitataの生育阻害試験法の検討を行った。BaPの水への溶解度は低いことから,有機溶媒からの転溶と直接溶解の2種類の方法をいくつかの溶媒を用いて検討したところ,転溶法やDMSO溶解BaPの添加では認められなかったが,エチレングリコールモノメチルエーテル溶解BaPの添加ではP. subcapitataに対する生育阻害の濃度依存性が確認された。また,その半数影響濃度LC50は55.9 mg/L-1であり,既存の報告と類似した値であった。今後は,この条件下にて先に得られた腐植酸を添加した際のBaPによるP. subcapitata生育阻害活性の変化を検討し,さらにBaPと収着した腐植酸の分解産物についても生物毒性変化を検討する予定である。平成26年度においては,昨年度までで使用した腐植酸に加えて新たに3点を追加して,蛍光消光法によるベンゾ[a]ピレン(BaP)の収着特性,ならびにP. subcapitataに対する生育阻害軽減効果を検討した。

収着特性については,いずれの腐植酸においても腐植酸濃度の増大とともに収着量は増大し,収着係数(Koc)は2.514.8 ×106 L/kgCの範囲を示した。また,P. subcapitataの生育阻害軽減効果も,いずれの腐植酸についても濃度の増大とともにBaPの毒性は軽減される傾向が認められた。しかしながら,泥炭土腐植酸2点については高い腐植酸濃度において再び生育阻害が認められた。そこで,泥炭土を除いた腐植酸4点のKocと生育阻害軽減プロットの回帰直線の傾きとの関係を検討したところ,高い相関関係が認められ腐植酸分子への収着によりBaPの急性毒性は軽減されることが示唆された。また,腐植酸の芳香属性がBaPの収着ならびに毒性軽減に関与することも示唆された。さらに,生分解による毒性の変化を検討するためにBaPを収着させた褐色森林土腐植酸にLaccaseを加えて分解反応を行った培地にP. subcapitataを接種してその生育割合を算出した。その結果,Laccase量の増大に伴い未処理区と比べて毒性の軽減が認められたが,特に腐植酸存在下での高濃度条件(Laccase:56mg/L)では極めて高い毒性軽減効果を示した。三次元蛍光スペクトルにより腐植酸およびBaPの変化を検討したところ,腐植酸・Laccase添加区ではBaPに帰属されるピークの減少が顕著に認められ,同時に腐植酸に由来するスペクトルの形状変化も認められた。これらのことから,腐植分解酵素によりBaPと腐植酸の両方が変化することで,BaPの毒性が変化する可能性が考えられた。土壌化学平成25年4月に研究代表者が所属機関を異動することとなり,研究新たな研究環境の整備が必要となった。それに伴い予定した実験計画に全体的な遅れが生じている。生育阻害試験において,BaPによる生育阻害が当初予定していた方法で発現せず,手法の検討を行わざるを得なかったこと,さらに,研究代表者の所属機関の異動が決まり,その異動の準備のため研究が予定よりも行えなかったことにより,遅れが生じている。今後はベンゾ[a]ピレンー腐植酸収着体の分解産物についても同様にして生物毒性評価を行い,その毒性変化について検討する。また,分解反応中におけるベンゾ[a]ピレンの自然分解や低濃度による毒性の未発現などの問題が生じた場合にはより小スケールで短時間で行える酵素分解を利用する予定である。今後は生育阻害試験法が確立されたことから,これに従って腐植酸を添加した状況下でのBaPの毒性発現を検討する。また,BaPー腐植酸収着体の微生物分解試験を行い,得られた分解産物についても同様の試験に供試して,BaP毒性の挙動を検討する。平成25年4月に研究代表者が所属機関を異動することとなり,新たな研究環境の整備が必要となった。それに伴い予定した実験計画に全体的な遅れが生じたため,次年度使用額が発生した。遅れているベンゾ[a]ピレンー腐植酸分解産物の毒性評価試験の遂行とともに国際学会での成果発表に使用する予定である。今年度は予定外の手法の検討や研究代表者の異動により研究に遅れが生じたことから当該研究費が生じることとなった。次年度においては,毒性発現試験を行うために必要な安全キャビネットの購入に当該研究費を充てる計画である。
複素係数弾性表面波フィルタの検討

本研究では、弾性表面波(SAW)方向性変換器を利用した複素係数フィルタとそれを利用した高周波信号処理を提案している。まず、SAW方向性変換器をモデル化し、その妥当性と複素係数フィルタ動作を確認した。また、複数の変換器をずらして配置することにより、優れた複素係数フィルタが実現できることを明らかにした。最後に、このSAW複素フィルタを利用した平衡増幅器について検討し、ほぼ理想的な特性が得られることを示した。本研究では,弾性表面波(Surface AcousticWave:SAW)方向性変換器を利用した複素係数フィルタとそれを利用した高周波信号処理を提案すると共に,その可能性とその有効性を多面的に検討することを目的としている。まず,SAW方向性変換器について検討した。この素子の動作をモデル化し,その特性を理論的に詳細に検討すると共に,実際に素子を作成し,モデルの妥当性と複素フィルタとしての動作を確認した。また,複素フィルタとしての性能に影響を及ぼすと考えられる各ポート間の電気的結合を詳細に検討し,最適構造を探索した。そして,複数のSAW変換器をずらして配置した構成により,大きな方向性を持つと共に,IQポート間の分離に優れた複素係数フィルタが実現できることが明らかになった。次に,このSAW複素フィルタを90°ハイブリッドとして利用し,それと高効率なAB級電力増幅回路と組み合わせて平衡増幅器を構成した場合の性能をシミュレーションにより詳細に評価した。そして,この構成により,散乱行列特性,電力付加効率等において,ほぼ理想的な特性が得られることを確認した。さらに,実際にSAW複素フィルタと高効率AB級電力増幅回路を試作し,それらを組み合わせて平衡増幅器を構成した。SAW変換器の個数が少なかったため,十分な電力付加効率はえられなかったが,散乱行列特性はほぼ理論通りの特性が得られた。次年度には,多くのSAW変換器からなるSAW複素フィルタを実現し,その有効性を明らかにしたい。本研究では、弾性表面波(Surface Acoustic Wave:SAW)方向性変換器を利用した複素係数フィルタとそれを利用した高周波信号処理を提案すると共に、その可能性とその有効性を多面的に検討することを目的としている。まず、SAW方向性変換器について検許した。この素子の動作をモデル化し、その特性を理論的に詳細に検討すると共に、実際に素子を作成し、モデルの妥当性と複素フィルタとしての動作を確認した。また、複素フィルタとしての性能に影響を及ぼすと考えられる各ポート間の電気的結合を詳細に検討し、最適構造を探索した。そして、複数のSAW変換器をずらして配置した構成により、大きな方向性を持つと共に、IQポート間の分離に優れた複素係数フィルタが実現できることが明らかになった。次に、このSAW複素フィルタを90°ハイブリッドとして利用し、それと高効率なAB級電力増幅回路と組み合わせて平衡増幅器を構成した場合の性能をシミュレーションにより詳細に評価した。そして、この構成により、散乱行列特性、電力付加効率等において、ほぼ理想的な特性が得られることを確認した。さらに、実際にSAW複素フィルタと高効率AB級電力増幅回路を試作し、それらを組み合わせて平衡増幅器を構成した。SAW変換器の個数が少なかったため、十分な電力付加効率はえられなかったが、散乱行列特性はほぼ理論通りの特性が得られた。次年度には、多くのSAW変換器からなるSAW複素フィルタを実現し、その有効性を明らかにしたい。
廃水の生物浄化機能の促進と汚泥の利用

1.活性汚泥の浄化機能の促進について次の結果が得られた:脱ハロゲン能を持つ微生物4種のうち、【IAM_(1202)】株が塩素放出量が最も多かった。嫌気好気法によるリン酸の除去について菌の単離・培養過程での培養を経ることにより、嫌気好気法の汚泥のもつ特性が失なわれてしまう可能性が高く、高塩濃度や老廃物質の阻害効果も考慮する必要があること、嫌気条件におけるリンの放出は窒素ガスを吹き込まないで嫌気条件を与えた場合は、どの菌株でも認められた。好気条件において菌体内に過剰に蓄積されたリン酸の状態は比較的低分子のポリリン酸であった。高希釈率でかつ低溶存酸素濃度下では亜硝酸の相対的な蓄積がみられた。2.余剰汚泥発生量の低減化に関しては次の結果が得られた。:CODでは消化温度が高く、消化日数が長いほど細胞物質の自己酸化が活発化し、溶解した物質が蓄積増加した。変異株について、菌体の維持代謝に消費される基質の増加することが菌体収率の低下につながった。現行の標準活性汚泥法に与えられた技術的基準が、流入水量からみて1565%の余裕を持ったことがわかった。微生物集合体におけるグルコースと酸素の拡散係数は微生物密度の増加につれて減少し、屈曲係数は生物密度の増大とともに増大すること、また微生物COD/Kj-Nに影響されることがわかった。3.余剰汚泥の有効利用に関して次のことが明らかになった::堆肥化反応モデルを組み立て、定温条件下でのコンポストの一次発酵過程での分解率の経時変化はContoisモデルをもとにした式で表現されることが判った。下水汚泥を6年間にわたって施用した圃場において、亜鉛は表層から25cmの層まで漸減的に流出し、銅は下層へはあまり流亡しないことが示された。小河川から汚泥までの病原細菌の消長を調べた結果、市街地小河川には少なからぬ病原性細菌が検出された。
ハイパーソニック・エフェクト簡易モニタリング・システムの開発

この研究は、ハイパーソニック・エフェクトを臨床に応用する<情報医療>の第一段階として、ハイパーソニック・サウンドの投与効果を迅速にモニタするシステムを開発することを目的として行った。1.音響情報投与指標計測システムの開発:投与したハイパーソニック・サウンドの量や質を評価する指標の開発を行い、それを視覚化して表示するシステムを開発した。被験者の体表面上に設置したマイクロフォンによって空気振動を記録し、FFTスペクトルを表示するとともに、<超高周波成分パワー>および<超高周波成分レート>を計算するシステムを開発した。また、最大エントロピースペクトルアレイ法(MESAM)をもとにした2種類の複雑性指標、すなわち、変化の大きさを測る<MEスペクトル1階微分累積変化量>、および起伏の複雑さを測る<MEスペクトル2階微分累積変化量>を計算し、それらを視覚化して表示するシステムを開発した。2.脳深部活性指標計測システムの開発:ハイパーソニック・サウンド投与の効果を評価するために、脳深部活性の簡便な代替指標を設定し、脳深部活性を迅速・簡易にモニタするシステムを開発した。すなわち、頭頂部及び後頭部の脳波α2帯域のポテンシャルが脳深部ネットワークの血流と高い相関を示すことを利用して、脳波計測データから脳深部活性を推定する<脳深部活性指標>を計算し、表示するシステムを開発した。3.情報投与効果の遅延・残留検出システムの開発:投与効果が時間的な遅れを伴って現れることを仮定したモデルを導入し、遅延・残留効果を検出可能なシステムのプロトタイプを開発した。4.行動指標計測システムの構築:<最適聴取音量>をモニタするシステムのプロトタイプを構築した。5.システムの評価とフィードバック:開発したシステムの有効性を評価するための予備実験を行った。この研究は、ハイパーソニック・エフェクトを臨床に応用する<情報医療>の第一段階として、ハイパーソニック・サウンドの投与効果を迅速にモニタするシステムを開発することを目的としている。初年度である平成18年度は、以下の項目を実施した。1.音響情報投与指標計測システムの開発まず、投与した情報の量や質を計測するために、知覚限界を超える超高周波成分を含む音響情報の指標の開発を行い、それを視覚化して表示するシステムを開発した。被験者にハイパーソニック・サウンド投与している時に、被験者の体表面上の顔、首、胸、腹などの位置に設置したマイクロフォンによって空気振動を記録し、FFTスペクトルを表示するとともに、<超高周波成分パワー>および<超高周波成分レート>を計算するシステムを開発した。また、最大エントロピースペクトルアレイ(MESAM)をもとにした2種類の複雑性指標、すなわち、変化の大きさを測る<MEスペクトル1階微分累積変化量>、および起伏の複雑さを測る<MEスペクトル2階微分累積変化量>を計算し、それを視覚化して表示するシステムを開発した。2.脳深部活性指標計測システムの開発つぎに、情報投与の効果を評価するために、脳深部活性をモニタするシステムを開発した。直接的な指標である脳深部の血流変化を測るには、大規模な装置を必要とし、被験者に対する負担も大きく、迅速・簡易なモニタリングには適合性が高いとはいえない。このため、脳深部活性の簡便な代替指標を設定した。この研究は、ハイパーソニック・エフェクトを臨床に応用する〈情報医療〉の第一段階として、ハイパーソニック・サウンドの投与効果を迅速にモニタするシステムを開発することを目的として行なった。2年目である平成19年度は、以下の項目を実施した。1.情報投与効果の遅延・残留検出システムの開発先行研究から、ハイパーソニック・エフェクトの発現は遅延と残留を伴うという結果が得られている。

これに着目して、投与した音響情報が脳深部活性に時間的な遅れを伴って作用することを仮定したモデルを導入し、情報投与における遅延・残留効果を検出可能なシステムのプロトタイプを開発した。2.行動指標計測システムの構築先行研究によってハイパーソニック・エフェクトの行動的指標として有効性を確認している〈最適聴取音量〉をモニタするシステムのプロトタイプを構築した。被験者が調整した〈最適聴取音量〉を検出するために、被験者の体表面近傍に積分型騒音センサを設置し、遠隔地にいる実験者がセンサのデータを受信する。得られたデータは、視覚化して表示するとともに、後で詳細に解析するために自動保存を行うシステムを構築した。3.システムの評価とフィードバック19年度に開発した、音響情報投与指標計測システムおよび脳深部活性指標計測システムとあわせた〈ハイパーソニック・エフェクト簡易モニタリングーシステム〉を実際に稼動させ、有効性を評価する予備実験を行った。その結果、いくつかの課題が明らかになり、改良すべき点を整理することができた。
原発性肝細胞癌におけるKi-67,p53,c-myc,bcl-2染色の予後因子の評価

(対象および方法)p53、c-myc遺伝子に関して癌遺伝子産物の染色を行い、肝細胞癌の予後判定因子としての有用性を検討した。対象は教室で施行した肝切除例のうち、病理組織学的に変性壊死のない52例である。Shiらの方法に準じ、一次抗体としてDO-7(DAKO)、c-myc抗体(MEDAC Diagnostika)を用い、免疫染色を行った。(結果)肝細胞癌の分化度別にp53染色の陽性率を比較してみると。分化度が低くなるにつれ、陽性率は高値を示した。またp53染色陽性症例では陰性症例と比較し、増殖活性を示すKi-67 labelingindexは有意に高値を示した。肝切除後再発部位とp53染色性を検討してみると、p53染色陰性例はいずれも残肝再発であるのに対し、p53染色陽性例では肝外再発例が存在し、有意差を認めた。p53染色陽性例と陰性例で累積生存率を比較してみたが有意差は認められなかった。しかし、c-myc染色陰性症例でp53染色陽性例と陰性例の累積生存率を比較してみると、陰性症例で有意に高値であった。(結語)肝細胞癌は多数の遺伝子が関与しており、p53・c-myc遺伝子は互いに関与しながら、肝細胞癌を進展させていくことが疑われ、p53・c-myc蛋白染色は予後判定因子として有用であることが示唆された。(対象および方法)肝切除で得られた癌組織56検体、非癌部組織47検体、肝生検にて得られた肝硬変組織16検体を、MIB-1抗体を一次抗体として、免疫染色を行なった。核が褐色に染色された細胞をKi-67陽性細胞とし、細胞2000個を無作為に光顕下に計測し、そのうちの陽性細胞数を百分率で表し標識率(labeling index,L.I.)とした。(結果)正常肝と比較し、慢性肝炎、肝硬変症で有意にKi-67 L.I.は高値であった。また、肝細胞癌合併症例の非癌部は他の肝疾患より有意に高値を示した。肝細胞癌合併症例の癌部は非癌部と比較し、有意に高値であった。また、以前の門脈圧亢進症手術時と、その後肝細胞癌合併時の非癌部のKi-67 L.I.を比較してみると、肝細胞癌合併時の非癌部のL.I.の方が有意に高値であった。病理組織学的因子と、癌部Ki-67 L.I.では、im陽性の症例では陰性の症例に比べ有意に高値であった。また、vp陽性、fc-inf陽性、aneuploidの症例、低分化の症例で高値を示す傾向を認めた。癌部のKi-67L.I.が10%以下の症例とそれより高値の症例で累積生存率を比較してみると、10%より高値の症例で、有意に累積生存率は不良であった。肝切除術後再発までの期間と癌部Ki-67L.I.では、12カ月以内の短期間に再発した症例では、それ以降に再発した症例に比べ、有意に高値であった。また、肝切除後多発再発を来した症例のKi-67L.I.は単発再発症例より有意に高値を示した。(結語)(1)慢性肝炎、肝硬変症において増殖能の異常亢進が持続した症例では肝癌発癌が高値であり、肝細胞増殖能の亢進が肝発癌の引き金になることが示唆された。(2)癌部のKi-67L.I.が高値の症例ではたとえ切除が可能であっても、術後再発、遠隔転移を来しやすく、術前術後の補助療法が必要と思われ、Ki-67染色は肝細胞癌の予後判定因子として有用と思われた。
海洋表層における微量栄養物質(鉄)の広域水平分布観測技術の開発

船速度15ノットにて曳航できる曳航体を作成し、テフロンインライン採水装置と組み合わせることで「表層海水連続クリーン採水システム」を作成した。キレート樹脂濃縮-ルミノール化学発光系の微量栄養物質(鉄)分析装置を改良し、連続自動分析が可能な装置の作成を行った。装置にはサンプルを溜め込んで前処理を行うユニットを作成し、自動で15分に一度サンプルをフローセルに溜め込み、分析に供するシーケンスを設定した。また、実験室内において、上記「表層海水連続クリーン採水システム」のテフロンインライン採水装置より「微量栄養物質連続自動分析装置」にサンプルを引き込めるようにしてシステム化を行った。テストの結果、ブランク値も十分に低く、自動連続分析が出来ることを確認した。さらに北海道水産研究所が運行の研究調査航海に(1月、釧路発着、航海日数各14日)に乗船し、実海域において「表層海水連続クリーン採水システム」と「微量栄養物質連続自動分析装置」の統合(観測システム化)テストを行った。ここでは、サンプル間の入れ替わり時の汚染など、実海域で用いた場合の問題点・改良すべき点等を抽出した。18年度は構築した表層海水連続自動微量栄養物質(鉄)分析システムをさらに実用化に向けて改良した。サンプルの導入のシークエンスを組み替えて,前サンプルの汚染を抑えることで実用にも耐える装置とした。構築した本システムを,北海道区水産研究所の行ったHK0701航海で使用し,北海道沿岸から親潮域にかけての観測を行った。その結果,本装置を用いて船の走行中約15分から20分毎に表層海水の鉄濃度を観測し,親潮外洋から北海道陸棚域にかけての鉄濃度の広域の水平分布を把握する事に成功した。・船速度15ノットにて曳航できる曳航体を作成し、テフロンインライン採水装置を装備と組み合わせることで「表層海水連続クリーン採水システム」を作成した。実海域でのテストの結果、波高2-4mにおいても巡航速度15ノットで曳航体は安定し、表層海水を無汚染で連続的にくみ上げるシステムとして十分使用できることを確認した。・キレート樹脂濃縮-ルミノール化学発光系の微量栄養物質(鉄)分析装置を改良し、連続自動分析が可能な装置の作成を行った。・さらに北海道水産研究所が運行の研究調査航海に(1月、釧路発着、航海日数各14日)に乗船し、実海域において「表層海水連続クリーン採水システム」と「微量栄養物質連続自動分析装置」の統合(観測システム化)テストを行った。
新規組織工学によるiPS細胞からの心臓血管臓器再生療法の開発

接着系細胞が元来有する細胞凝集現象により細胞のみで構成される細胞凝集塊=スフェロイドに着目し、さらにスフェロイドを一つの単位として複雑な形状の組織をロボットにて作成するシステムを開発し、研究を進めてきた。本研究ではiPS細胞技術を我々の3次元化システムに導入し、ヒトiPS由来細胞を用いた心筋・血管構造体を構築するモデルの確立と機能解析を行った。構造体同士の連結による組織の大型化、高機能化のため、より生理的な環境下で長期的に培養できるバイオリアクターを開発した。線維芽細胞を主体とする体細胞からなる血管構造体を用いて大動物(ミニブタ)に短期移植可能な構造体の作製に成功した。我々は元来細胞が有する自己凝集能力スフェロイド形成および、スフェロイド同士を融合させてより3次元的な立体組織をつくり心臓血管手術に臨床応用出来る技術を開発している。本研究期間内にて明らかにすべきことは、ヒトiPS細胞を用いて、心筋細胞、血管内皮細胞、壁細胞などに分化させた細胞を純化・増殖し、我々の3次元化システムでヒトiPS由来分化細胞のみで構成された心筋・血管・弁組織を構築するモデルを確立すること。さらに、免疫抑制イヌ、ブタなどの中動物にたいする移植法を検討しデータを採取、移植モデルの構築とその検証である。本年度は、ヒトiPS細胞を用いて、心筋、血管内皮細胞、血管平滑筋細胞など心血管系への分化・純化法を確立を目指すと同時に、ヒトiPS細胞由来細胞が、従来開発してきたスフェロイド形成、およびスフェロイド融合により機能的な3次元組織を構築できるかの検討を行った。市販されている、ヒトiPS細胞由来心筋と血管内皮細胞、ヒト初代培養の繊維芽細胞を用いてスフェロイド形成を行った。シングルセルから拍動する心筋スフェロイドを形成する際、48-72時間程度を要するがスフェロイド形成は可能であった。一方、組織を3次元化して成熟させる3次元培養システムを構築した。パッチ状にスフェロイドを配列し、融合させたのちに、その形状をできるだけ維持して培養を続けるシステムがなかったが、完全にスキャホルドをふくまず、細胞だけで3次元化したパッチ状の3次元組織をつくるシステムを開発した。最大径1cm厚み1mm程度の細胞だけで構築された組織を、刺激を加えながら、形状を維持しつつ、強度を増すことができる簡便な培養装置の開発に成功した。iPS細胞技術は画期的な再生医療ソースとして世界中で注目され研究されている技術である。近い将来、ヒトへの臨床応用がなされる場合、これらの幹細胞由来細胞を移植する技術の開発も同時に急務であると考えられる。本研究ではこの技術をヒトiPS細胞等の自己由来幹細胞を応用し、心臓・血管・弁の作成モデルを作成しiPS細胞を始めとした自己幹細胞由来体細胞の臨床への効果的利用方法・移植方法の開発を行うことである。本年度、京都大学iPS細胞研究所(CiRA)のプロトコールを用いてSNLフィーダー細胞の準備および、ヒトiPS細胞(201B7)の維持培養技術を確立した。ヒトiPS細胞の心筋分化技術確立後を見据えて、市販のヒトiPS細胞由来心筋細胞を用いて、スフェロイドを作製し、解凍後の拍動開始日数や拍動日数(平均30日程度)を確認した。スフェロイド同士は翌日には融合し、5日後には蛍光輝度の同期を確認できた。血管再生に関しては、Cell lineとして市販されているヒト皮膚繊維芽細胞、大動脈平滑筋細胞、臍帯静脈由来血管内皮細胞を用いてスフェロイドを作成し、バイオ3Dプリンタでを用いて血管構造体を構築した。本年度、構造体同士の連結ができることを確認し、大動物への短期移植実験に成功した。本研究の目的でもあるiPS細胞由来細胞での構造体の構築へと発展させるため、ヒトiPS細胞の分化誘導法、(大量)維持培養技術を習得した。近年の幹細胞研究、特に我が国の山中教授が開発した、iPS細胞技術は画期的な再生医療ソースとして世界中で注目され研究されている技術である。京都大学iPS細胞研究所(CiRA)のプロトコールを用いてSNLフィーダー細胞やMEFの準備および、ヒトiPS細胞(201B7および251G1)の維持培養を行いつつ、その未分化iPS細胞を拍動する心筋細胞へと分化させ、その後スフェロイドを作製が可能である。心筋細胞への分化効率を安定的に上げられるような培地やフィーダー細胞の検討を行った結果、AK03培地にて効率的に未分化iPS細胞を増やすことができ、さらにSNLフィーダーもしくはMEFを用いた方が、フィーダーフリーよりも安定的に心筋に分化させられることがわかった。心筋細胞が純化されている市販のヒトiPS細胞由来心筋細胞を用いて、ヒト皮下線維芽細胞やヒトiPS細胞由来内皮細胞を任意の配合比率で混ぜることによりスフェロイドを作製し、それぞれの拍動数や拍動維持日数などを確認した。スフェロイドの拍動維持に関しては線維芽細胞も内皮細胞の配合比率も重要であるが、培地によっても変動する治験を得た。血管構造体に関しては混合型スフェロイド内に混合する線維芽細胞がコラーゲン産生の促進、血管構造体強度維持に関与している結果を得た。混合する繊維芽細胞の比率を上げ、かつ培養期間の延長によりより強度が高い管状構造体の作製が可能となった。

接着系細胞が元来有する細胞凝集現象により細胞のみで構成される細胞凝集塊=スフェロイドに着目し、さらにスフェロイドを一つの単位として複雑な形状の組織をロボットにて作成するシステムを開発し、研究を進めてきた。本研究ではiPS細胞技術を我々の3次元化システムに導入し、ヒトiPS由来細胞を用いた心筋・血管構造体を構築するモデルの確立と機能解析を行った。構造体同士の連結による組織の大型化、高機能化のため、より生理的な環境下で長期的に培養できるバイオリアクターを開発した。線維芽細胞を主体とする体細胞からなる血管構造体を用いて大動物(ミニブタ)に短期移植可能な構造体の作製に成功した。市販されているiPS由来心筋細胞からスフェロイドを作成し、スフェロイドの拍動持続日数、収縮率など機能解析を行った。ヒトiPS細胞由来の心筋細胞・内皮細胞、ヒト初代培養の皮膚線維芽細胞は混ぜると、心筋100%のスフェロイドと比べ、凝集が改善することは確認できており、今後はその細胞比率などの検討が必要である。ヒトiPS細胞の心筋への分化、純化法の確立はできておらず、また血管構造体の作成においても当初予定としていたiPS由来血管内皮細胞、平滑筋細胞などへの分化、純化の確立が未であり、構造体を構築するだけの大量培養まで至らなかった。目的の達成度としてはやや遅れていると判断した。27年度が最終年度であるため、記入しない。心臓血管外科今後、心筋構造体、血管構造体に適したヒトiPS細胞の分化誘導法、維持培養技術を習得した上で、機能的なiPS細胞由来構築へと発展させる。グラフト作製には大量の細胞が必要となるため、大量培養できるシステムも開発あるいは、他研究施設で開発され出しているシステムを応用する。技術補助員はすでに雇用しており、今後はiPS由来細胞の大量培養、構造体構築、機能解析もできるよう、本年度中期7月ごろには研究室拡大を予定してる。3次元培養装置の開発には成功したが、iPS細胞の安定的な維持培養や、心筋への効率的分化誘導、心筋のみを選別する純化方法がまだ研究室で定着しておらず、今後新たな技術を学会やバイオの見本市などから学び導入する必要がある。平成26年度の研究で、心筋、血管内皮、血管平滑筋への分化を確立したい。以上の理由で、研究計画書の計画に比較しやや遅れていると判断した。平成26年度から、技術補助員を2名新規雇用した。これまで、1名の大学院生が行っていた細胞培養作業が、より効率的に行えると考えられる。昨年度まで遅れていた、iPS細胞の維持培養や分化誘導効率を上げ、研究を遂行していきたい。同時により、機能的な立体組織を作成する技術開発も同時に進めていくこととしている。動物実験は再来年度を目標に計画を立てていきたい。