hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
筋ジストロフィーにおけるスプライシング異常機構の解析と治療への応用

筋ジストロフィー患者において、変異を持ったエクソンをスキップすることで、内部が少し短いが機能的なジストロフィンタンパク質を作らせ、症状の改善を目指す方法を目指し、いくつかの患者ではTG003というリン酸化酵素阻害剤が有用であることを見出した。またTG003によるエクソンスキッピングの影響を網羅的に解析し、TG003がスプライシングに影響を与える遺伝子についても情報を得た。本研究では、筋ジストロフィー患者に見出されたジストロフィン遺伝子第31エクソン変異とそれに伴うスプライシング異常の解析を通して、筋肉におけるスプライシング調節機構の解明を目指します。また、そのような異常スプライシングを是正する低分子化合物のスクリーニングを行うことで、現在治療法がない筋ジストロフィーについて、スプライシング変異を持った患者の治療薬開発につなげたいと考えています。この患者では、その変異のため機能のある蛋白質ができないと予想されましたが、患者組織を用いた免疫染色像より、ジストロフィン蛋白質がある程度発現しているのが観察されました。そこでRNAを解析したところ、変異を持った第31エクソンを含むmRNAの他に、このエクソンを含まないmRNAが発現していることが明らかになりました。そこでこの患者にみられる変異は、第31エクソン内のExonic Sphcing Enhancer(ESE)が活性を失い、エクソンとして認識されない結果、とばされるものと考えられました。このことを詳細に解析するため、第31エクソン付近の配列を別のレポーター遺伝子コンストラクト中に挿入し、同様のエクソンがとばされる現象がみられるかどうかを検討しました。その結果、HeLa細胞内においても、変異を持った第31エクソンがとばされるのが観察されました。また、ESEに結合する因子としてSRp30cを同定し、患者の持つ変異がこの蛋白質の結合を阻害し、代わりにhnRNPA1蛋白質の結合を強めることでエクソンとしての認識を弱めていることを見出しました。デュシェンヌ型筋ジストロフィー(Duchenne muscular dystrophy,DMD)は、ジストロフィン遺伝子に変異が生じたことによりジストロフィン蛋白質が全く欠損した疾患です。現在までのところ、根本的な治療法はありません。本研究では、筋ジストロフィー患者に見出されたDystrophin遺伝子変異とそれに伴うスプライシング異常の解析を行います。また、この患者では、変異がみられるエクソンをスキップさせることで、ある程度の活性を持つタンパク質が産生されていますが、申請者らはこのエクソンスキップを促進させることができる低分子化合物を見出しており、その作用機序の解明を行うことで、筋ジストロフィー患者の治療薬開発につなげたいと考えています。平成23年度は、以下の実験を行いました。1)低分子化合物スクリーニングのためのレポータープラスミドの構築申請者らは、Clk(Cdc2 like kinase)の特異的阻害剤であるTG003が、第31エクソンのスキップを促進することを見出しました。今後さらにスクリーニングを行うため、変異型エクソンレポーター遺伝子の3'エクソンの下流に、Renilla LuciferaseのcDNAを、エクソンがスキップした場合にのみ読み枠が合うように連結しました。このレポータープラスミドを培養細胞に導入し、患者での異常スプライシングを再現できることを確認しました。2)他の筋ジストロフィー患者にみられるスプライシング異常の解析神戸学院大学の松尾雅文教授との共同研究により、申請者はスプライシング異常を伴った患者の例を他にも同定しています。これらの変異のうち、イントロン内に変異がおき、偽エクソンを生じた例について解析を行いました。これらの変異を持ったジストロフィン遺伝子の領域を用いてレポーターを作製し、培養細胞内で異常スプライシングが再現できることを確認しました。また、試験管内スプライシング系も構築し、試験管内においても異常スプライシングが反映されることを確認しました。デュシェンヌ型筋ジストロフィー(Duchenne muscular dystrophy, DMD)は、ジストロフィン遺伝子に変異が生じたことによりジストロフィン蛋白質が全く欠損した疾患です。また、この患者では、変異がみられるエクソンをスキップさせることで、ある程度の活性を持つタンパク質が産生されていますが、申請者らはこのエクソンスキップを促進させることができる低分子化合物を見出しており、その作用機序の解明を行うことで、筋ジストロフィー患者の治療薬開発につなげたいと考えました。平成24年度は、以下の実験を行いました。我々はClk阻害剤であるTG003が他の患者のスプライシングに与える影響を解析したところ、少なくとも2例についてTG003は終止コドンを持ったエクソンのスキップを促進することが明らかになりました。また、TG003によるエクソンのスキップ機構、および他の遺伝子のスプライシングに与える影響について、さらにTG003による副作用を検討するため、筋芽細胞であるマウスC2C12細胞をTG003処理し、細胞内mRNAのスプライシングパターンの網羅的解析を行いました。

その結果、200個程度のイントロンのスプライシングが影響を受けることが明らかになりました。TG003によるスプライシングの影響は、エクソンのスキップ、包含の両方向が存在していましたが、それらのイントロンはピリミジントラクトと呼ばれる、3'スプライス部位認識に重要な配列の長さが短いことがわかり、TG003はピロミジントラクトを認識し、3'スプライス部位認識を補助する因子に影響を与えることが強く示唆されました。薬剤候補を探索する目的で、筋ジストロフィー患者のレポータープラスミドを構築しました。また、他の筋ジストロフィーのスプライシング異常についても、解析できる系を構築することができました。これらの系は、最終的な薬剤スクリーニングおよび異常スプライシング分子機構解明のためには欠かせないものであり、治療薬候補の探索および薬剤作用機構の解明に向けて順調に進んでいると考えます。24年度が最終年度であるため、記入しない。作製したレポーターを安定に発現する培養細胞株を樹立し、ケミカルライブラリーのスクリーニングに用いる予定です。ライブラリーはFDA認可化合物や東京大学や京都大学が所有する化合物を用い、候補化合物の早期同定を目指します。また、試験管内スプライシング反応系は、トランス因子やシス配列の同定だけではなく、スプライシングのどの過程に影響があるかを調べるのに非常に強力な系です。今後この系と、培養細胞から調整した核抽出液を用いて分子機構の解明を目指します。
全身性強皮症モデルマウスの皮膚硬化・肺線維症に対するｖｏｒｉｎｏｓｔａｔの効果

全身性強皮症は全身の皮膚硬化をきたす膠原病である。全身性強皮症のモデルマウスにヒストン脱アセチル化酵素阻害剤であるvorinostatを皮下注射し、皮膚硬化の改善を検討した。だが、vorinostat投与群で皮膚硬化の改善はみられなかった。正常ヒト線維芽細胞とSSc線維芽細胞を用い、in vitroでvorinostatの濃度を検討し、COL1A2などの変動をmRNAレベルで検討したが有意な発現の変動はみられなかった。原因として、Vorinostatは他のHDAC阻害剤と比較してHDACを抑制する効果が弱いことや強皮症に対して特異的作用が弱いためではないかと考えられた。SAHAの投与: SAHAはDMSOで溶解した。34週齢のTSK/+マウスに、25, 50, 100mg/kgのSAHAを連日4週間腹腔内投与をおこなった。対照としてC57BL/6マウスにも同様のスケジュールで腹腔内投与を行った。試薬の対照として、DMSOのみをTSK/+マウス、C57BL/6マウスに同様のスケジュールで投与した。組織学的評価:投与後、マウスの背部を剃毛し、70%アルコールで消毒をおこなった。頚部から上背部にかけての皮膚を下床の筋肉・骨も含めて一括として横断した。皮膚組織は4%パラホルムアルデヒドにて固定し、パラフィン包埋をおこなった。6μmの厚さのセクションを作り、ヘマトキシリン&エオジン染色を行った。TSK/+マウスの皮膚硬化・肥厚は真皮の線維化によるものではなく、皮下の粗な結合組織層の肥厚を測定する。これはTSK/+の場合、皮膚硬化が皮下の粗な結合組織層の肥厚によるものだからである。従って皮膚の厚さは、この皮下結合組織の厚さを測定することによって評価をおこなう。一つのセクションに対して10カ所を無作為に選んで、その厚さを測定した。すべてのセクションにおいて、3人の研究者が独立して皮下結合組織層の厚さをマウスや試薬投与に関する情報を伏せた状態で測定し、最終的に平均値を算出した。また、硬化皮膚のコラーゲン量を定量的に測定するため、回収したマウス皮膚より膠原線維のマーカーであるハイドロキシプロリンを抽出した。現在、硬化皮膚の厚さ、ハイドロキシプロリン量の統計学的検討中である。血清学的評価:マウス皮膚を回収する際に眼窩より血液を採取、血清分離を行いストックした。SAHAの投与がマウスの全身的な免疫に与える影響を解析するため準備中である。TSK/+マウスならびにC57BL/6マウスにSAHAを25,50,100mg/kg連日4週間腹腔内投与し、背部の皮膚を採取し硬化皮膚を測定するなどして組織学的評価を行った。その結果、C57BL/6マウスと比較してSAHAはTSK/+マウスで特異的に有意差を持って皮膚硬化を抑制しえなかった。また、マウスより採取した血清を用いて線維化に関与するとされるTGF-βなど各種サイトカインを検討したが、2群間で有意な差は見られなかった。原因として、SAHAの至適濃度や投与方法を検討する必要があると考えた。まずはin vitroにおいて正常皮膚線維芽細胞とヒト強皮症皮膚組織から抽出した線維芽細胞をサンプルとし、MTSアッセイにてSAHAの細胞毒性を検証した。その結果、いずれの細胞においてもSAHAは濃度1.0-1.2μM、投与時間24時間が至適であると判断した。一方で、SAHAと同じHDAC阻害剤であるTSAを用い、HDAC阻害剤が正常皮膚線維芽細胞に及ぼす影響を検証するためマイクロアレイを用いてmRNAの発現を検討した。その結果、HDAC阻害剤の投与によって、COL1A2など強皮症で増加しているコラーゲン分子のmRNAが低下することがわかった。サイトカインに関してIL-1βやIL-6はTSA投与により上昇したものの、TGF-βやIL-4、IL-13については変動がみられなかった。現在、正常線維芽細胞と強皮症由来の線維芽細胞を培養したのちSAHAの至適濃度および投与時間にて反応させ、mRNAを回収し、今後の解析のための準備を行っている。遺伝子発現を制御するエピジェネシスに注目が集まっているが、今回ヒストンアセチル化(HDAC)に着目し、全身に線維化をもたらす全身性強皮症について、HDAC阻害剤であるSAHAがもたらす効果について検討した。まず強皮症マウスモデルであるTSK/+マウスならびにC57BL/6マウスにSAHAを25,50,100mg/kg連日4週間腹腔内投与し、背部の皮膚を採取し硬化皮膚を測定するなどして組織学的評価を行った。

次に同条件で正常線維芽細胞とヒト強皮症皮膚組織から抽出した線維芽細胞を培養後、mRNAを回収しrealtime-PCRを行った。検討項目として、COL1A2を中心に細胞外マトリックスの沈着を検討したが、複数の細胞株においてSAHA投与前後で発現の変動に変化は見られなかった。また、サイトカインに関してもSAHA投与前後でほぼ変動に差はみられなかった。原因として、SAHAはTrichostatinAなどの他のHDAC阻害剤と比較してHDACを抑制する効果が弱いことや、強皮症線維芽細胞に対して特異的に作用しないためではないかと推察された。今後は、SAHAの濃度条件の再検討に加え、他のHDAC阻害剤を用いて全身性強皮症の線維化が抑制しうるかを検討すべきと考えた。全身性強皮症は全身の皮膚硬化をきたす膠原病である。全身性強皮症のモデルマウスにヒストン脱アセチル化酵素阻害剤であるvorinostatを皮下注射し、皮膚硬化の改善を検討した。だが、vorinostat投与群で皮膚硬化の改善はみられなかった。正常ヒト線維芽細胞とSSc線維芽細胞を用い、in vitroでvorinostatの濃度を検討し、COL1A2などの変動をmRNAレベルで検討したが有意な発現の変動はみられなかった。原因として、Vorinostatは他のHDAC阻害剤と比較してHDACを抑制する効果が弱いことや強皮症に対して特異的作用が弱いためではないかと考えられた。当初想定されていたSAHAの投与濃度と反応時間では不適切と考えられたため、実験方法の修正などが必要であった。皮膚科学SAHAを投与した正常線維芽細胞ならびに強皮症由来の線維芽細胞から採取したmRNAの解析をすみやかに行い、細胞外マトリックスの評価に加え、膠原線維産生に関わるサイトカインであるIL-4、Il-6、IL-13などの発現について検討する。また細胞成長因子であるbFGF、PDGF、TGF-βなどについて検討を行う。その後、TSK/+マウスモデルを用いて再度SAHAを投与し上記項目の検討を行う。なお、その際SAHAの濃度は1.0μMに準じる形で投与を行う。また投与方法に関しては、腹腔内投与のほか皮下注投与についても検討する。SAHAの至適濃度の確認と実験に使用するマウスの準備にやや時間がかかってしまった。SAHAの至適濃度を決定するために時間がかかってしまったため、SAHA投与実験を速やかに始めることができなかった。今後は解析と追加実験、培養実験が主体となるため、これまでの遅れは十分に取り戻せると考えている。PCRプライマープローブ40万円、HDAC活性測定キット10万円、培養試薬その他試薬19万円SAHAの至適濃度を決定するために時間がかかってしまったため、SAHA投与実験を速やかに始めることができなかった。PCRプライマープローブ120万円培養試薬、その他試薬30万円
2型糖尿病個別化療法の確立を目指した糖尿病における分化転換の分子基盤の研究

膵β細胞の非β膵島構成細胞への「分化転換」は、β細胞の絶対数低下をもたらすことから、従来から提唱されていたβ細胞の内分泌機能の低下状態を意味する「機能疲弊」と共に、2型糖尿病の発症に寄与する機構として注目されている。その一方、機能疲弊との関係性を含め、詳細な制御機構は不明である。本申請課題では、2型糖尿病におけるβ細胞障害を研究対象とし、「分化転換の機能疲弊依存性」及び「分化転換の多様性」を明らかにすることで、糖尿病におけるβ細胞の分化転換の分子基盤を確立する。現在までに、糖、脂肪酸、炎症性サイトカインによるβ細胞の機能疲弊および分化転換に対する知見を集積している。また分化転換レポーター細胞の作成にも着手している。糖尿病の分子病態を明らかにする上で、膵島構成細胞を用いた解析系を確立し、動物実験との相関を注視しながら、膵島に対する直接効果および間接効果を把握し、研究を推進していく。所属研究機関の変更によって、動物実験をペンディングし、培養細胞のみの研究を先に進めているため(なお、2019年4月より移籍期間にて動物の使用が可能になった)。機能疲弊の表現系に関しては、細胞集団としての解析で確認できている一方で、分化転換に関しては細胞集団での解析系では、明確な表現系を捉えられていない。したがって、フローサイトメーターによる1細胞レベルでの解析を通して、各培養条件中の機能疲弊あるいは分化転換のポピュレーションを把握するとともに、次世代シークエンサーによる網羅的遺伝子解析も行う。所属機関の移籍に伴い、研究体制の再構築を行った。その際、学内予算を優先的に執行したため使用残額が生じた。今年度は、研究の本格始動ができるため、網羅的遺伝子解析の受託費用等、適切に執行していく。
多数のカルコゲン原子が集積した新しい反応場の確立

多数のカルコゲン原子が集積するときに創出される立体化学的な空間を反応場として利用することを目的として、本年度はいくつかの硫黄-硫黄及び硫黄-セレン結合を環内に有するベンゾポリカルコゲニド類の化学的性質の解明を実施した。(1)ベンゼン環に3個のカルコゲン原子を含む8員環が接合した化合物の合成とその化学的性質の解明環状ポリカルコゲニド類の合成において硫黄及びセレンを任意の位置に導入する方法はまだ確立されていない。本研究ではカルコゲン原子-炭素-炭素-カルコゲン原子-カルコゲン原子という配列を有するベンゾトリカルコゲネピンの合成を検討した。ベンゼンジカルコゲナスタノール類とチイランの塩基性条件下の反応で2位及び5位に硫黄又はセレン原子が導入された新しいベンゾトリカルコゲネピンが合成された。(2)ベンゾペンタチエピン環の動力学的な挙動の解明ベンゼン環に5個の硫黄が環状に接合したベンゾペンタチエピンの動力学的な性質は全く解明されていない。本研究ではペンタチエピン環の挙動を核磁気共鳴スペクトル法によってはじめて観察することに成功した。その結果ペンタチエピン環は室温では非常に遅い立体配座変換が行われることがわかった。この結果は環状ポリスルフィド類の不斉場の創出を意味するもので極めて重要な意義を持つものである。以上のように多数のカルコゲン原子が集積したベンゾポリカルコゲニド類の新しい合成法の確立そしてこれらの化合物が創出する新しい反応場について検討した結果、新しい化合物群の生成そして環状に結合した硫黄原子の運動論に基づく新しい反応場を設計することが出来た。
カーボンナノチューブの神経細胞への取り込みと神経線維伸長方向制御

アミノ基修飾カーボンナノチューブ(CNT)に神経成長因子(NGF)をアミド結合させたNGF結合CNTにはNGFと同様な生物活性があった。アミノ基修飾CNTとNGF結合CNTは神経細胞内に取り込まれ、ERKシグナル伝達経路のリン酸化ERK量を増加させた。CNTはERKシグナル伝達経路のRas/Raf/MEKカスケードではなく、PLCシグナル伝達経路を活性化して、PKCがERKをリン酸化した。つぎに、CNT基板による神経突起の伸長制御を検討し、細胞は幅50-100μmの帯状基板に接着でき、神経突起を帯状基板に沿って伸長し、大きな神経ネットワークを形成できた。アミノ基で修飾したカーボンナノチューブ(CNT)に架橋剤を用いて神経成長因子(NGF)をアミド結合させてNGF結合CNTを作製した。NGF結合CNTは可溶性NGFと同様な生物活性があり、さらに、CNTが神経細胞の分化を促進した。NGF結合CNTとアミノ基修飾CNTを同時に神経細胞培養液に添加した場合、CNTは細胞内に取り込まれ、ERKシグナル伝達経路のリン酸化ERK量を増加させた。続いて、ERK上流のMEKの阻害剤を添加してもERKがリン酸化されること、また、ERKの阻害剤を添加するとCNTによる神経突起伸長が生じないことから、CNTはERKシグナル伝達経路のRas/Raf/MEKカスケードではなくPLCシグナル伝達経路を刺激し、ERKをリン酸化すると推測された。PLCシグナル伝達経路において、PLC阻害剤、IP3R阻害剤やPKC阻害剤を用いた実験、CNTによる細胞内Caイオン濃度上昇の実験の結果、CNTはPLCシグナル伝達経路のPLCを最初に活性化し、CaイオンによるPKCの活性化を経て、最終的にERKをリン酸化することを明らかにした。つぎに、神経細胞の神経突起の伸長を制御するためCNT基板を作製した。カバーガラス上に幅5-100μmの帯状金薄膜を形成させた上に、アミノ基修飾アルカンチオールを介してNGF結合CNTを配置したところ、神経細胞は幅50-100μmの帯状基板に接着でき、神経突起を帯状基板に沿って伸長した。さらに、曲線状の金蒸着基板領域を作製した結果、神経細胞は曲線の金蒸着領域上でも同様に領域に沿って神経突起を伸長した。また、6日間培養すると約1mmの長さに神経突起を伸長し、大きな神経ネットワークを形成した。以上より、NGF結合CNTを特定領域上に配置することで神経突起の伸長方向を制御でき、長期間培養により広範囲な神経ネットワークを形成できることを明らかにした。NGF結合CNTと同時にアミノ基修飾CNTを低濃度で神経細胞培養液に添加した場合に、NGFと一緒に添加した場合と同様に神経突起の伸長を促進した。NGF結合CNTは可溶性のNGFと同様な生物活性があること、また、CNTが神経細胞の分化を促進する効果もあった。NGF結合CNTとアミノ基修飾CNTを同時に神経細胞培養液に添加した場合、ERKシグナル伝達経路のリン酸化ERK量がNGFとアミノ基修飾CNTやNGFのみを用いた場合よりも増加したことから、CNTはERKシグナル伝達経路を刺激していることが分かった。また、PI3K/Aktシグナル伝達経路はCNTにより活性化されなかった。さらに、細胞内Caイオン濃度変化を蛍光色素(fluo4-AM)で測定したところ、NGF結合CNTの添加後、アミノ基修飾CNTを添加すると細胞内Caイオン濃度がさらに上昇した。このことは、NGFによる刺激後CNTを添加すると、細胞内シグナル伝達に関係するCaイオンが細胞内ストックからさらに放出されて神経突起の伸長を促進させることを示している。蛍光標識したNGF結合CNTとアミノ基修飾CNTの細胞への取り込みを共焦点顕微鏡の焦点深度を変えて観察し、さらに細胞切片をTEMとエネルギー分散型X線分析装置を用いて観察した。その結果、NGF結合CNTは神経細胞の細胞質と細胞核に、アミノ基修飾CNTは細胞質にのみ局在することが判明した。神経細胞の神経突起の伸長制御をCNTにより行うために予備検討した。カバーガラス上に幅50μmの帯状金薄膜を形成させた上に、アミノ基修飾アルカンチオールを介してNGF結合CNTを配置したところ、神経突起をこの帯状基板に沿って伸長できることが分かった。平成23年度の研究目標とした課題において、神経細胞がNGFで分化を刺激されている場合に、アミノ基修飾CNTを神経細胞培養液に低濃度で添加すると、神経突起の伸長を促進することを、NGF結合CNTにおいても生じることを明らかにした。また、CNTがERKシグナル伝達経路を活性化することと、本年度にはCNTが細胞内Caイオンレベルを向上させることを初めて明らかにしたことは、CNTのシグナル伝達経路を明らかにする上で一歩前進したと考えられる。

これより、CNTの刺激にはERKの経路とCaイオンの経路があることが考えられ、これらの経路はお互いに関連していることから、今後これらの経路の関連について深く検討する予定である。NGF結合CNTとアミノ基修飾CNTは細胞に取り込まれ、とくにNGF結合CNTが細胞核にまで取り込まれることを明らかにしたことは、機能性タンパク質の細胞への輸送にCNTを利用する際に大きなメリットになると考えられる。しかし、CNTのサイズによる取り込みについてはサイズの異なったCNTを得ることが難しいので今後の課題である。CNTの細胞への取り込みの経時変化については次年度の輸送された機能性タンパク質が機能を発揮するかどうかを調べる際に検討したいと考えている。以上述べたように平成23年度の課題についてはほぼ達成できたと評価する。平成23年度の結果を基にして、機能性タンパク質を結合したCNTによる機能性タンパク質の細胞内への輸送について検討する。細胞のアポトーシスを誘導するチトクロムCをNGFと同時にCNTに結合させ、この2種類のタンパク質が結合したCNTが細胞核にまで輸送されて細胞のアポトーシスが誘導されるかどうかを検討する。これまでは、蛍光色素を結合したCNTを顕微鏡で観察したが、今回はCNTに結合された機能性タンパク質が細胞内で機能を発揮するかどうかを調べる。さらに、CNTが神経細胞のどのシグナル伝達経路を刺激しているかを明らかにするため、ERKシグナル伝達経路とPLCーCaイオンシグナル伝達経路の関連を検討する。CNTには電気伝導性や神経突起伸長を刺激する効果があることから、神経細胞の培養基板に用いることで神経突起伸長を促進できると考えられる。そこで、NGF結合CNTを培養基板上に配列することにより、配列方向に神経突起の伸長を促進することを検討する。培養基板上に幅10-100μmのスリットを配置して金蒸着することで、帯状の金薄膜を形成させた後、金薄膜上にアミノ基修飾アルカンチオールの自己組織化単分子膜(SAM)を形成させ、架橋剤を用いてNGF結合CNTをアルカンチオールに結合させることにより、NGF結合CNTを帯状に配列させる。アミノ基修飾アルカンチオールのSAMは、以前の研究で、神経細胞が接着しやすいことが明らかになっている。平成23年度にこの方法の予備検討を行い、実現の可能性があることを確認している。平成24年度では、帯状の金蒸着膜の幅の最適化や各種形状のパターン化金蒸着膜などを作製し、神経細胞の接着と神経突起の伸長を制御することが可能かどうかを検討する。これらの研究成果を活かして、CNTを神経細胞の培養基板や損傷した神経の修復などに適用することを推進する。研究費は実験消耗品(85万円)を中心に使用する。培養試薬として、F-12K培地、DMEM、非働化ウマ血清、非働化ウシ胎児血清、MEM非必須アミノ酸溶液などを購入する。標準物質、抗体、酵素として、PLC、NGF、PLC抗体、レセプター抗体、神経細胞検出用抗体、シグナル伝達経路の阻害剤などを購入する。
牛乳ラクトパーオキシダーゼによる食品汚染細菌の防除

牛乳中に多く含まれるラクトパーオキシダーゼ(LPO)は過酸化水素とチオシアン酸塩からヒポチオシアン酸を産生し、食品汚染菌の増殖を抑える。食品中でLPOが有効に働くためのシステムを構築し、LPOによる効果的殺菌方法の改善を試みた。LPOシステムにグルコース(Glc)とグルコースオキシダーゼ(GO)を用いるための最適条件を検索し、サルモネラ菌に対する抗菌活性が最も良い条件である4.5U/ml LPO,0.2%Glc,0.05U/mlGO,10ppm KSCNを確立した。食品成分によるLPOシステムの妨害を調べたところ、遊離SH基を有するタンパク質はLPOシステムを妨害することが分かった。同様に、高濃度の糖はLPOシステムを妨害した。食品成分によるLPO作用の阻害を分子レベルで解析するために、モデル系を用いて実験を行った。食品成分フリーの状態では、LPO4.5U/mlの通常濃度でパパイン、システインともに効果的にSH基が酸化された。しかしながら、2-3%の食塩、タンパク質及びクリーム、20%のシュークロースの存在下ではパパイン、システインの酸化が抑制された。そこで、LPO濃度を5-10倍に引き上げたところSH基の酸化は進行した。サルモネラ菌の細胞壁を保護しているマグネシウムやカルシウムを取り除くためにポリリン酸を共存させてLPOシステムを作用させると、高い菌の生育抑制作用を示すことから、ポリリン酸にLPOシステムとの相乗効果があることが明らかになった。また、ニンジンジュース中でのLPOシステムの効果を調べたところ、極めて効果的な抗菌作用を示し、ニンジン中にLPOの抗菌作用に対し相乗効果をもたらす成分が存在することが明らかとなった。LPOシステムはこのような特徴的機能を有するにもかかわらず、食品への利用は全く行われていない。その理由として、ヒポチオシアン酸のライフタイムが短くて素早く反応させる必要があること、食品中に含まれるタンパク質、糖質および脂質がLPOシステムの妨害をすることがあげられる。そこで、これらの障害を取り除き、食品中でLPOが有効に働くためのシステムを構築し、LPOによる効果的殺菌方法の改善を試みた。生乳から凝乳酵素を用いて得られる乳清を、高速イオン交換クロマトにかけることにより短時間でLPOを多量に精製することが可能となった。LPOシステムに必要とする過酸化水素を外部から加えることなく、グルコース(Glc)とグルコースオキシダーゼ(GO)を利用するための最適条件を検索し、サルモネラ菌に対する抗菌活性が最も良い条件である4.5U/ml LPO,0.2% Glc,0.05U/ml GO,10ppm KSCNを確立した。サルモネラ菌がLPOによりどのように損傷を受けるかについて、細菌表層のタンパク質遊離SH基に特異的な蛍光試薬を用いて調べたところ、多くのサルモネラ菌タンパク質の遊離SH基がLPOシステムにより損傷を受けていることが明かとなった。食品成分によるLPOシステムの妨害を調べたところ、還元性を有する成分である含硫アミノ酸や遊離SH基を有するタンパク質はLPOシステムを妨害することが分かった。また、5%の糖はLPOシステムを妨害しないが、20%濃度になると妨害することが認められた。したがって、溶液状の食品にLPOシステムを用いるためには、これらの妨害を消去する方法を開発する必要があることが判明した。

その理由として、ヒポチオシアン酸のライフタイムが短くて素早く反応させる必要があること、食品中に含まれるタンパク質、糖質および脂質がLPOシステムの妨害をすることがあげられる。そこで、これらの障害を取り除き、食品中でLPOが有効に働くためのシステムを構築し、LPOによる効果的殺菌方法の改善を試みた。食品成分によるLPO作用の阻害を分子レベルで解析するために、モデル系を用いて実験を行った。遊離SH基を有するサルモネラ菌の表層タンパク質が酸化されるが明らかになったので、遊離SH基を有する代表的酵素であるパパインと遊離SH基を持つアミノ酸システインをモデル物質としてLPOによる酸化を調べた。食品成分フリーの状態では、LPO4.5U/mlの通常濃度でパパイン、システインともに効果的にSH基が酸化された。しかしながら、2-3%の食塩、タンパク質及びクリーム、20%のシュークロースの存在下ではパパイン、システインの酸化が抑制された。そこで、LPO濃度を5-10倍に引き上げたところSH基の酸化は進行した。なお、LPO濃度増加がサルモネラ菌生育抑制に対する効果的に働くかどうかは今年度の課題として行う。サルモネラ菌に対する抗体作成を試み、感度の良い抗血清が得られた。サルモネラ菌と抗血清とを混合し、LPOを作用させたところ、効果的な生育抑制は見られなかった。抗血清に含まれる抗体以外のタンパク質がLPO活性を阻害することが考えられた。そのため、抗血清を利用するための条件設定を行う必要があると考えられた。牛乳中に多く含まれるラクトパーオキシダーゼ(LPO)は過酸化水素とチオシアン酸塩からヒポチオシアン酸を産生し、食品汚染菌の増殖を抑える。これまでに、食品への効果的利用法を開発するために、モデル化合物を用いた最適条件の検討を行い、LPOとグルコースオキシダーゼを用いる条件を明らかにした。そこで、食品中におけるLPOシステムの効果について検討を行った。牛乳・脱脂乳、ニワトリ卵およびチキンスキン抽出物を対象にして、LPOシステムの有効性を検討した。サルモネラ菌を接種した牛乳にLPOシステムを添加すると2時間後には生菌数増加は見られないが、保温時間を長くすると生菌数が数10倍に増加した。また、菌を接種した脱脂乳にLPOシステムを添加すると2時間後には生菌数の低下が見られたが、その後増加することが認められた。LPOシステムを加えない場合に比べると生育抑制効果はある程度は認められるものの、それほど大きなものではなかった。このことから、牛乳中の脂肪、タンパク質および糖質がLPOシステムの効果を抑えてしまうことが分かった。同様に、全卵やスキン抽出物を用いた場合でも、LPOシステムによるサルモネラ菌のある程度の抑制は出来たが、共存するタンパク質等による阻害により、十分効果的なものではなかった。しかしながら、サルモネラ菌の細胞壁を保護しているマグネシウムやカルシウムを取り除くためにポリリン酸を共存させてLPOシステムを作用させると、高い菌の生育抑制作用を示すことから、ポリリン酸にLPOシステムとの相乗効果があることが明らかになった。また、ニンジンジュース中でのLPOシステムの効果を調べたところ、極めて効果的な抗菌作用を示した。
CD82の機能的特性を用いたメラノーマ免疫遺伝子治療の基礎研究

CD82は、Transmembrane4superfamily(TM4SF)に属し様々な細胞上に発現してる。我々は同分子を認識する抗体(53H5)あるいはCD82cDNAを用いることでT細胞上に発現するCD82の機能解析を行い、以下のことを明らかにした。すなわち、1、T細胞が抗原提示細胞により活性化される際、両者に発現するCD82が重要な役割を担っている。2、CD82の発現性は活性化刺激により亢進する。3、CD82cDNAをtransfectさせたT細胞同士は接着性が亢進する。同様にCD82cDNAをtransfectさせ発現を冗進させた単球との接着性も亢進する。4、CD82の発現を亢進させた細胞は、親細胞株に比べallogeneicityが上昇する。これらの結果は、細胞上のCD82が細胞接着に関与していることを示唆している。一方CD82は、メラノーマ細胞を含む腫瘍細胞上にも発現しており、最近CD82の属するTM4SF proteinの腫瘍細胞上の発現性低下が、転移能と相関していることが報告されている。そこで我々は、CD82低発現メラノーマ細胞株に、CD82cDNAを導入することによりCD82を高発現させた細胞を作製し、Jurkat T細胞とco-cultureし、細胞間の接着性に違いが生ずるかどうかを検討してみた。その結果、CD82高発現性メラノーマ細胞のほうがより強くT細胞と接着することが判明した。以上の結果は、腫瘍細胞上のCD82の発現性がT細胞の活性化にも影響を与えうることを示唆している。CD82は、Transmembrane 4 superfamily(TM4SF)に属し様々な細胞上に発現してる。このCD82は、メラノーマ細胞を含む腫瘍細胞上にも発現しており、我々の実験によりこの発現性を亢進させると細胞外基質(ECM)に対する接着性が増強することが判明した。また我々は過去にT細胞上のCD82発現性を亢進させると、homotypic cell aggregationが増強されることを報告している。一方最近CD82の属するTM4SF proteinの腫瘍細胞上の発現性低下が、転移能と相関していることが報告されている。そこで我々は、腫瘍細胞上のCD82の発現性低下が腫瘍転移に相関する機序として、ECMに対する接着性の変化のみならず、免疫担当細胞、特にT細胞との相互作用に影響を及ぼしている可能性はないかを検討することにした。まず我々は、CD82低発現メラノーマ細胞株と、これにCD82cDNAを導入することによりCD82を高発現させた細胞を、Jurkat T細胞とco-cultureし、細胞間の接着性に違いが生ずるかどうかを検討してみた。そこで我々は、腫瘍細胞上のCD82の発現性の違いが、実際いT細胞活性化に影響を与えうるかを検討するため、各メラノーマ細胞をstimulatorとし、正常末梢血リンパ球をeffectorとした、mixed lymphocyte tumor reaction(MLTR)を行い、リンパ球の増殖反応の違いを比較検討することにした。その結果、CD82高発現性メラノーマ細胞のほうがより強いallogeneicityを示した。

3、CD82cDNAをtransfectさせたT細胞同士は接着性が亢進する。同様にCD82cDNAをtransfectさせ発現を亢進させた単球との接着性も亢進する。4、CD82の発現を亢進させた細胞は、親細胞株に比べallogeneicityが上昇する。これらの結果は、細胞上のCD82が細胞接着に関与していることを示唆している。一方CD82は、メラノーマ細胞を含む腫瘍細胞上にも発現しており、最近CD82の属するTM4SF proteinの腫瘍細胞上の発現性低下が、転移能と相関していることが報告されている。そこで我々は、CD82低発現メラノーマ細胞株に、CD82cDNAを導入することによりCD82を高発現させた細胞を作製し、Jurkat T細胞とco-cultureし、細胞間の接着性に違いが生ずるかどうかを検討してみた。その結果、CD82高発現性メラノーマ細胞のほうがより強くT細胞と接着することが判明した。以上の結果は、腫瘍細胞上のCD82の発現性がT細胞の活性化にも影響を与えうることを示唆している。
新情報技術による教育発展計画と教員の質に関する国際共同研究

1)新情報技術は3つの教育的側面、(1)教授・学習の新しい道具として、(2)コンピュ-タをベ-スとした学習環境、(3)教育情報交換のための電子通信網、をもっているとの共通理解のもとに、新情報技術の成功事例とこの分野における各国の国際的戦略の発展と関係づけた必要条件を分析し、かつ、教授・学習のプロセスを改善するのに貢献する方法が、どのように関連しているかを解明するため、OECD・CERIからの要請により、とくに大学の機能と役割に焦点をあてケ-ス・スタディをおこなった。日本では岐阜大学、上越教育大学、鳴門教育大学、東京学芸大学、筑波大学、学習ソフトウェア情報研究センタ-の6機関を取り上げた。OECD加盟国全体の調査研究は、“New Information Technologies in School;Teacher Training,Research and the Role of Universities"としてまとめられ刊行されている。2)新情報技術は当然カリキュラムの改革をせまり、教師教育と教員研修の内容を変革させていかなければならない。そこで、日本における教育課程および学習指導要領の改訂と教育職員免許法の一部改正に焦点をあてて、調査研究をおこなった。概要はつぎの通りである。I.高度情報社会と新しい教育課程(初等・中等教育)1)新しい教育課程の概要、2)中学校における教育課程、3)高等学校における教育課程、4)技術・学庭科における情報基礎のカリキュラム、5)情報教育における検討事項II教育職員免許法の改正に伴う、新しい科目“教育の方法・技術"のカリキュラムの枠組みこのような2つの調査研究をおこない、OECD・CERIを通じて日本における新情報技術にかかわる情報をOECD加盟各国に配布した。
わが国における高齢者ソーシャルワークの実践モデルの開発に関する理論的・実証的研究

地域包括支援センターの社会福祉士のソーシャルワーク実践について調査と分析を進めた。まず、昨年度実施した地域包括支援センターにおける援助事例分析をさらに発展させた。援助事例分析の目的は、在宅高齢者のニーズおよびソーシャルワークの機能をより詳細に明らかにすることである。昨年度実施した13事例の分析に加え、新たに2カ所の地域包括支援センターの社会福祉士4名の協力を得て、11事例を分析した。分析にはソーシャルワーク理論であるエコロジカル視点に基づいて作成した枠組みを用いた。エコロジカル視点によれば、ニーズはライフ・ストレッサーとそれに対する人間のコーピングの相互作用から生じると考えられる。本研究においては、援助事例ごとのケース記録の文書分析、援助を受けている高齢者への個別インタビューおよび担当ソーシャルワーカーへの個別インタビューの逐語録の分析により、在宅高齢者のライフ・ストレッサーとコーピング、および高齢者に対するソーシャルワーカーの支援を捉えた。高齢者のコーピング・タイプは、多様なコーピング行動を併用しながらライフ・ストレッサーに対処する「高コーピングタイプ」、いずれのコーピング行動も取ることが少ない「低コーピングタイプ」、問題そのものの解決をはかろうとする「積極的問題解決タイプ」、趣味や娯楽等により気分転換をはかることで対処しようとする「気分転換タイプ」、物事に対する自分の考え方を変えることによって対処しようとする「視点転換タイプ」に大きく分けられることがわかった。高齢者のコーピングタイプによって、ライフ・ストレッサーとの相互作用のあり方に特徴があり、それに合わせてソーシャルワーカーは支援を行っていることが明らかになった。地域包括支援センターの社会福祉士のソーシャルワーク実践について、量的および質的に調査・分析を行った。まず、地域包括支援センターの社会福祉士の現状とセンター開設以降の変化を把握すること、および在宅高齢者の抱える様々なニーズに対応するために社会福祉士が発揮している専門的機能を捉えることを目的として、郵送調査を実施した。対象は東京・神奈川・千葉・埼玉の全地域包括支援センターの社会福祉士である。調査の結果、以下の点が明らかとなった。第一に、制度的問題の影響が落ち着きを見せ始めていた。社会福祉士が担当する介護予防ケアプラン数は増加しているものの、業務全体で社会福祉士としての専門的業務に割く時間も増えていた。第二に、社会福祉士の専門性の課題として、今後は地域援助活動に力を入れる必要がある。個別援助活動の自己評価は高い回答が多かったが、地域援助活動には自信のない社会福祉士が目立った。第三に、在宅高齢者の持つニーズと、それを援助するソーシャルワーカーの発揮する機能に一定の対応関係が見られた。制度的問題が落ち着きつつある中、社会福祉士の専門的機能をいかに発揮できるかが問われているといえる。次に、在宅高齢者のニーズおよびソーシャルワークの機能をより詳細に明らかにすることを目的として、地域包括支援センターにおける援助事例分析を行った。事例分析の枠組は、ソーシャルワーク理論であるエコロジカル視点に基づいて作成した。地域包括支援センター3ヶ所の社会福祉士の協力を得て、合計13事例を対象として質的に分析を行った。在宅高齢者のもつニーズは、ライフ・ストレッサーと高齢者のコーピングの相互作用から捉えられた。それに対して社会福祉士は、複数のソーシャルワーク機能を組み合わせて対応していた。今後は、さらに分析する事例の数を増やし、高齢者のニーズと、ソーシャルワーク機能の詳細な対応関係を継続して分析する。
経動脈的微細血管塞栓術における短時間溶解型ゼラチンの応用

当初予定の実験施設(インスティチュート宮崎)で動物慢性実験ができなくなった。このため、株式会社アイビーテック神戸ラボで実験を行うこととした。豚数頭に対して慢性実験を行うには、日程予約が必要であり、本実験の予約が2019年9月に開始となった。このため、2018年度は、まず、講座研究費や奨学寄附金を使用して、豚1頭を用いて異常血管の出現を確認する実験を行うこととした。株式会社アイビーテック神戸ラボにて予備実験(異常血管の生成が薬液投与後、何日を行った。SPF家畜豚(LWD系)雌1頭に対して、ケタミン5mg/kgおよびキシラジン10mg/kgの混合液を筋注し鎮静させ、気管チューブを挿管後、isoflurane 23%濃度、酸素流量24L/minで全身麻酔を行った。その後、関節腔を肢の屈曲により確認し、粉末状のパパインを生理食塩水に5%濃度で溶かした溶液3mLを左右膝関節の外側、膝蓋靭帯より約2指分外側の部分から垂直にアプローチし、23G針を使用して大腿骨遠位端関節腔内に注入した。注入後は肢の伸展を行い、関節部分への薬液を浸透させた。初回投与日をDay0とし、Day3、Day7、Day14、21、42、45に血管造影を行ったところ、day42に膝関節に異常血管の確認ができた。これにより、パパイン投与後42日後に異常血管の出現が確認されたため、この日を目安に塞栓術が施行できることが判明した。当初の予定では、パパイン投与3日後に異常血管が出現すると考えていたが、異常血管出現のためには、時間がかかることが判明した。これらの結果を踏まえて、本実験を行う予定である。当初予定の実験施設(インスティチュート宮崎)で慢性実験が施行できなくなった。本実験の予約が2019年9月に開始となる。2019/9/272020/1/13に本実験を施行する予定。具体的には、SPF家畜豚(LWD系)雌6頭に対して、全身麻酔を施行後、膝関節腔を肢の屈曲により確認し、粉末状のパパインを生理食塩水に10%濃度で溶かした溶液5mLを左右膝関節の外側、膝蓋靭帯より約2指分外側の部分から垂直にアプローチし、23G針を使用して大腿骨遠位端関節腔内に注入する。注入後は肢の伸展を行い、左右関節部分への薬液を浸透させる。パパイン溶液注入1回目をDay0とし、Day3,7,14,21にも同様の処置を施行する。Day0、3、7,14,21,42,45に、豚を全身麻酔にかけ、その後、血管造影を行う。血管造影を行う際、両側大腿動脈より4Frシースを逆行性に挿入し、それぞれ対側大腿動脈から腸骨動脈分基部を超え、4Fr造影カテーテルを挿入し、シースの隙間を通過させ、膝窩動脈レベルの血管造影を行う。その際、異常血管(異常濃染像)の有無を観察する。Day42に異常血管をイミペネム・シラスタチンあるいはRMゼラチン(50kDa、120°C,24時間で熱架橋;in vitroでは数時間で溶解)で塞栓する。塞栓のendpointは異常血管が消失するまで、とする。パパイン投与による関節炎に伴う疼痛をできるだけ緩和させるため、メタカム(消炎鎮痛剤)を0.4mg/kg皮下注(1回/日)を行う。初回投与日から解剖日まで飼育管理を行い、症状観察を行う。異常を認めた際は、試験責任者に報告する。なお、day0day45まで、以下の疼痛スコア表を毎日つける。Day45に血管造影を施行後、安楽死させる。膝関節周囲組織をホルマリン固定する。後日、病理標本作成を行い、炎症性変化や虚血性変化(浮腫、炎症性細胞浸潤有無、出血・壊死)を観察する。

これにより、パパイン投与後42日後に異常血管の出現が確認されたため、この日を目安に塞栓術が施行できることが判明した。当初の予定では、パパイン投与3日後に異常血管が出現すると考えていたが、異常血管出現のためには、時間がかかることが判明した。これらの結果を踏まえて、本実験を行う予定である。当初予定の実験施設(インスティチュート宮崎)で慢性実験が施行できなくなった。このため、株式会社アイビーテック神戸ラボで実験を行うこととした。本実験の予約が2019年9月に開始となる。2019/9/272020/1/13に本実験を施行する予定。具体的には、SPF家畜豚(LWD系)雌6頭に対して、全身麻酔を施行後、膝関節腔を肢の屈曲により確認し、粉末状のパパインを生理食塩水に10%濃度で溶かした溶液5mLを左右膝関節の外側、膝蓋靭帯より約2指分外側の部分から垂直にアプローチし、23G針を使用して大腿骨遠位端関節腔内に注入する。注入後は肢の伸展を行い、左右関節部分への薬液を浸透させる。パパイン溶液注入1回目をDay0とし、Day3,7,14,21にも同様の処置を施行する。Day0、3、7,14,21,42,45に、豚を全身麻酔にかけ、その後、血管造影を行う。血管造影を行う際、両側大腿動脈より4Frシースを逆行性に挿入し、それぞれ対側大腿動脈から腸骨動脈分基部を超え、4Fr造影カテーテルを挿入し、シースの隙間を通過させ、膝窩動脈レベルの血管造影を行う。その際、異常血管(異常濃染像)の有無を観察する。Day42に異常血管をイミペネム・シラスタチンあるいはRMゼラチン(50kDa、120°C,24時間で熱架橋;in vitroでは数時間で溶解)で塞栓する。塞栓のendpointは異常血管が消失するまで、とする。パパイン投与による関節炎に伴う疼痛をできるだけ緩和させるため、メタカム(消炎鎮痛剤)を0.4mg/kg皮下注(1回/日)を行う。初回投与日から解剖日まで飼育管理を行い、症状観察を行う。異常を認めた際は、試験責任者に報告する。なお、day0day45まで、以下の疼痛スコア表を毎日つける。Day45に血管造影を施行後、安楽死させる。膝関節周囲組織をホルマリン固定する。後日、病理標本作成を行い、炎症性変化や虚血性変化(浮腫、炎症性細胞浸潤有無、出血・壊死)を観察する。当初予定の実験施設(インスティチュート宮崎)で動物慢性実験ができなくなった。豚数頭に対して慢性実験を行うには、大幅な日程予約が必要であり、本実験の予約が2019年9月に開始となった。このように本実験が次年度にずれ込んだために、次年度使用額が生じた。
ヌ-ドマウスに移入されたアロT細胞の消長に関する実験病理学的研究

ヌ-ドマウスはT細胞が欠損しているがアロ細胞の移入に対しては抗H-2抗体を産生しドナ-細胞を排除する。一方抗アロ抗体が産生されにくいドナ-細胞を使用した場合レシピエントヌ-ドマウスはGVH病により一定の頻度で死亡する。この時レシピエントを前もって400R照射しておくことにより生存期間の短縮及び死亡率の増加がみられることからヌ-ドマウスにはT,B非依存性で400R照射感受性の抗ドナ-反応が存在することがわかる。この現象をX線400R照射、非照射(BALB/C×C57BL/6)(CB6)F_1ヌ-ドマウスにB6脾細胞を移入することによって誘導されるGVH病を用いて解析した。(1)400R照射CB6F_1ヌ-ドマウスにB6脾細胞を移入するとGVH病により810日で死ぬ。非照射マウスでは1050日と生存が延長する。(2)照射マウスでは抗CD8抗体の投与により5070日に生存期間が延長したが、抗CD4抗体の投与は効果がなかった。非照射マウスではいずれの抗体でも100日以上の生存が認められた。(3)Thy-1陽性細胞は照射マウス(7日目)では対照群94.6%、抗CD4抗体投与群81.4%、抗CD8抗体投与群50.6%であったが、非照射マウス(14日目)ではそれぞれ74.7%、55.6%、1.8%であった。以上の事実は400R照射マウスに惹起されるGVH病は主としてドナ-由来のCD8細胞による。非照射マウスにB6脾細胞を移入すると抗ドナ-反応が認められる。この抗ドナ-反応はCD8細胞に対してはrepopulationは抑制せずにGVH病惹起能を抑制し、CD4細胞に対してはrepopulationを抑制することを示唆している。ドナーとして(B10.Thy-1.1×B10.D2)F_1及び(BALB.B×B10Thy-1.1)F_1マウスの2系統を準備し夫々とminor及びmajor移植抗原の異なる(BALB/c×C57BL/6)F_1ヌードマウスをレシピアントとしてGVH反応を誘導しその差異を検討した。majorな移植抗原系の異なる(BALB.B×B10.Thy-1.1)F_1→CB6F_1ーnu/nuに誘導されるGVHDでは細胞移入811日後に脾腫がみられ、この時ドナー由来のT細胞が増殖し約50%に達していたが以後著減し3週後にはドナー由来T細胞は消失した。またレシピアントマウスは細胞移入後60日までに約50%がGVHD症状にて死亡したが、それ以降に死亡するマウスは少く約40%が長期生存(6ケ月以上)であった。これらのマウスではドナー由来のT細胞は完全に排除され、脾細胞ではLPSに対するB細胞反応のみ観察された。他方minor移植抗原系の(B10.Thy-1.1×B10.D2)F_1→CB6F_1-nu/nuで誘導されるGVHDでは上記の系と同時期に脾腫が観察されるが、ドナーT細胞が強く増殖することもなく全経過を通して脾細胞のうち約5%がドナー由来である。この系ではGVH病にてマウスが死亡することはなく全例1年以上生存する。

脾腫のみられる期間のみマイトジェンに対するT及びB細胞の反応性は低下、消失しているが以後は回復し、コントロールと同程度の反応性を示した。T細胞反応性はThy-1.1陽性のドナーT細胞によるものであった。この長期生存マウスに残存するドナーT細胞はPopliteal lymph wode assayでみる限りレシピアント(CB6F_1-nu/nu)に対する反応性は低下〔消失ではない〕していたが、third partyであるDBA/2などに対する反応性は完全に保持されていた。更にこれらの長期生存マウスは外見上健康であり、chronic GVHDの徴候は全くみられなかった。以上の事実はこの系に何等かの抑制機構が作用し一種のキメリズムが成立していることを示唆する。はじめに(BALB/C×C578U/6)(CB6)F_1ヌ-ドマウスに非H-2遺伝子群が同一でH-2遺伝子のみ異なる(BALB.B×BIO.Thy-1.1)F_1と非H-2遺伝子群が異なり同一のH-2遺伝子を有する(BIO.D2×BIO.Thy-1.1)F_1の脾細胞を移入することによりそれぞれに誘導されるGVH反応と移入されたドナ-T細胞の消長を解析した。前者脾細胞の移入により比較的強いGVH反応が誘導され約60%が死亡したが約40%のCB6F_1ヌ-ドマウスは生存した。生存ヌ-ドマウスではドナ-T細胞はThy-1.1抗原を指標にした検索の結果除去されていた。この結果はConA反応がみられないことからも確認された。また非H-2のみ異なる後者の系ではCB6_1ヌ-ドマウスはGVH反応による症状を呈することなく全例長期生存した。ドナ-T細胞も長期にわたり体内を循環しておりConAにも反応することから機能性と考えられた。このドナ-T細胞は局所GVH反応を利用したアッセイによりレシピエントであるCB6F_1マウスに対する反応性は若干低下はみられるものの維持されていること、DBA/2第3者マウスに対する反応性は正常に保持されていることが判明した。このような安定したキメリズムが成立するためには何等かの調節機序が作用していることを示唆する。次にGVH病を誘導するT細胞亜群をC57BL/6の脾細胞をドナ-、CB6F_1ヌ-ドマウスをレシピエントに用いた系で解析した。400R照射CB6F_1ヌ-ドマウスに惹起されるGVH反応(病)は主としてドナ-由来のCD8細胞によること及び非照射CB6F_1ヌ-ドマウスには抗ドナ-がみとめられことが見出された。この抗ドナ-反応はCD8細胞に対してはレシピエント体内でのrepopulationは抑制せずにGVH病惹起能を抑制し、CD4陽性細胞に対してはrepopulationを抑制することが示された。