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合成基質法による血中エンドトキシン濃度の推移とエンドトキシンショックの病態の関係

近年開発されたエンドトキシン(ET)定量法ーエンドスペ-シ-テストーはETに特異性が高く、精度のよい定量法として臨床にも応用されている。この定量法を用いて、精製ETの静脈内一回投与法により作成した犬のETショックモデルにおいて血中ETを測定すると、従来の投与量(>1mg/kg)では非生理的異常高値が長時間持続するするのが認められた。これより、我々ははるかに少量の投与量でも十分なモデルが作成できることを予想し、種々の投与量における血中ET濃度の経時的方化を調べた。同時に血液学的パラメ-タ-(白血球,血小板)循環動態(心拍出量,平均動脈圧)を測定し、少量投与によるエンドトキシンショックモデルの作成を試みた。血中ET濃度の測定結果、0.2mg/kg以上の投与量では、数時間の観察期間中5000pg/ml以上の極度のET血症となることが判明した。このレベルは臨床におけるグラム陰性桿菌敗血症ショック患者の血中濃度が10100pg/ml(>3pg/mlを正常値とする)であることを考えるといかに非生理的高値であるかが理解できる。これに対し0.02及び0.002mg/kgの投与量では血中濃度変化は追跡可能であり、特に0.002mg/kgでは臨床レベルに近似した。同時にETによる生理学的変化の指標として循環動態、血液学的パラメ-タ-の測定結果、0.002mg/kgの少量投与においても、有意な血圧低下、心拍出量減少、血小板・白血球減少を惹起しており、エンドトキシンショックモデルとして有効であることを示した。従来用いられてきた1mg/kg以上の投与量では極端に重要なET血症となることが本研究で認められたが、ETショックの病態生理の解明を目的とする研究には臨床的ET血症の血中ET血症の血中ETレベルにより近似モデル、つまり従来よりはるかに少ない投与量(0.002mg/kg)によるモデルが適切であることを示した。エンドトキシン・ショックに於いては各種のchemical mediatorが複雑に関与しているため、その病態の解剖には困難な点が少なくない。従来、イヌを用いたエンドトキシン・ショックモデルでは1mg/kg以上のエンドトキシンが静脈内投与されていたが、近年開発された発色合成基質であるエンドスペシ-・テストにて、このモデル犬の血中エンドトキシン濃度を測定すると、5000pg/ml以上の極端な高濃度が数時間以上にわたって持続することが判明し、エンドトキシンを1mg/kg以上も投与されたイヌはエンドトキシン・ショックモデル犬として不適切と判断するに至った。そこで、エンドトキシン・ショックの病態を解明するにあたり、まずエンドトキシンの至適静注量をエンドスペシ-・テストによるエンドトキシンの血中濃度の推移や白血球数・血小板数の推移等から検討した。従って、まずコントロ-ルとしてのエンドトキシン投与前のイヌの血中エンドトキシン濃度の検討から研究を開始した。従来、イヌでは血中エンドトキシン濃度が高く(50100pg/ml)、エンドトキシン・ショックモデルとしては必ずしも適当ではないとされていたが、我々は実験時に消毒を厳重に行ない、滅菌済みの手術器械で処置をすれば、健康なイヌではエンドトキシンフリ-であることを見い出し、1つの成果を得た。

これを基礎として種々の濃度のエンドトキシンを静注してその血中濃度の推移等から至適投与量を検討し、我々は0.0020.02mg/kgが至適投与量であると結論するに至った。そして、このような微量のエンドトキシンの1回静注にても、血圧の中程度の低下や血小板数・白血球数の著名な低下が起こることも確認し得た。以上の成果を第36回日本麻酔学会総会および第5回世界集中治療医学会議で報告し、注目を集めた。近年開発されたエンドトキシン(ET)定量法ーエンドスペ-シ-テスト-はETに特異性が高く、精度のよい定量法として臨床にも応用されている。この定量法を用いて、精製ETの静脈内一回投与法により作成した犬のETショックモデルにおいて血中ETを測定すると、従来の投与量(〉1mg/kg)では非生理的異常高値が長時間持続するするのが認められた。これより、我々ははるかに少量の投与量でも十分なモデルが作成できることを予想し、種々の投与量における血中ET濃度の経時的変化を調べた。同時に血液学的パラメ-タ-(白血球,血小板)循環動態(心拍出量,平均動脈圧)を測定し、小量投与によるエンドキシンショックモデルの作成を試みた。血中ET濃度の測定結果、0.02mg/kg以上の投与量では、数時間の観察期間中5000pg/ml以上の極度のET血症となることが判明した。このレベルは臨床におけるグラム陰性桿菌敗血症ショック患者の血中濃度が10100pg/ml(〉3pg/mlを正常値とする)であることを考えるといかに非生理的高値であるかが理解できる。これに対し0.02及び0.02mg/kgの投与量では血中濃度変化は追跡可能であり、特に0.002mg/kgでは臨床レベルに近似した。同時にETによる生理学的変化の指標として循環動態、血液学的パラメ-タ-の測定結果、0.002mg/kgの小量投与においても、有意な血圧低下、心拍出量減少、血小板・白血球減少を惹起しており、エンドトキシンショックモデルとして有効であることを示した。従来用いられてきた1mg/kg以上の投与量では極端に重要なET血症となることが本研究で認められたが、ETショックの病態生理の解明を目的とする研究には臨床的ET血症の血中ET血症の血中ETレベルにより近似したモデル、つまり従来よりはるかに少ない投与量(0.002mg/kg)によるモデルが適切であることを示した。
中越震災地域の農業・農村環境の経時変化を考慮した計画手法の開発

フィジカルプランニングの立場から、農村地域の震災復旧(とりわけ重要性をもつ被害後の5年間)における農地資源及び地域景観の経時的変化を調査し、復旧過程における経時的課題を整理すると共に、長期的な復旧対策の必要性を明らかにした。また、復旧過程における経験知を災害対応マニュアル「農業・農村震災対応ガイドブック2009」として纏め、各農政局・都道府県・新潟県内市町村の関連行政窓口担当者に、参考資料として配布した。(1)農業等生産基盤・施設の復旧手法の開発1)農業生産基盤・施設災害の経時的変化特性に対応した復旧手法の開発(1)農地災害の経年変化とこれ対応した復旧・保全手法を開発するため、農地災害が最も多かった小千谷市を対象として平坦部・中間部・山間部に区分し、実態調査を行い、地震の他災害とは異なる特性を抽出した。(2)農業水利施設災害の経年変化に対応した復旧・保全手法を開発するため、旧栃尾市の山間部における山腹水路の被害状況と、水利条件の経時的変化を調査するとともに、農家の意向把握を行った。(3)震災地区における耕作放棄防止型復旧手法を開発するため、山古志地域を対象として耕作放棄・荒廃化の経時的な変化を追跡するため、地域のオルソ画像をもとに、土地利用実態を把握した。2)養鯉施設災害の経時的変化特性把握に基づく復旧手法の開発(1)養鯉池・農業用溜め池の1970年代以降の立地変化をオルソ画像を用いて追跡調査し、減反・水利用技術の影響によって立地傾向が変化したことを明らかにした。(2)農村集落再建における景観保全手法の開発1)農村住宅再建における集落景観変化の要因解明(1)住宅の建て替えと住民意識の把握による景観変化の実態調査を行い、景観変化の要因を明らかにするため、小千谷市の農業集落を対象として住宅形態の実態調査を行うとともに、住宅選考に関わり予備的調査を実施した。2)農村住宅再建における効率的な住宅供給システムの開発(1)小千谷市における被災後の住宅の供給実態を調査し、住宅の供給側の条件による景観形成上の課題を抽出した。(1)農業等生産基盤・施設の復旧手法の開発1)農業生産基盤・施設災害の経時的変化特性に対応した復旧手法の開発(1)農地災害の経年変化とこれ対応した復旧・保全手法を開発するため、農地災害が最も多かった小千谷市を対象として平坦部・中間部・山間部に区分して実態調査を行い、地震災害においては大規模災害と同様に小規模災害が多いため、これらへの対応が復旧のあり方を左右することを示した。(2)農業水利施設災害の経年変化に対応した復旧・保全手法を開発するため、地震災害後に遅れて発現する被害の実態調査を、小千谷市・長岡市において行い、多様な被害実態を把握した。(3)震災地区における耕作放棄防止型復旧手法を開発するため、山古志地域を対象として耕作放棄・荒廃化の経時的な変化を追跡するため、全筆調査を実施し詳細な農地管理情報を把握・整理した。2)養鯉施設災害の経時的変化特性把握に基づく復旧手法の開発(1)養鯉池・農業用溜め池の1970年代以降の立地変化を用水の確保技術と関連づけて把握し、これを定式化した。また、地震が養鯉業の階層分化及ぼす影響を把握するための基礎的データを取得した。(2)農村集落再建における景観保全手法の開発1)農村住宅再建における集落景観変化の要因解明(1)住宅を建て替えた被害者住宅の建て替え前と立て替え後の実態調査を小千谷市の農村集落で実施し、立て替え前後の住宅の形態を比較し変化を把握した。また、景観構成要素の変化を構造的に理解するための基礎的な概念整理を行った。2)農村住宅再建における効率的な住宅供給システムの開発(1)長岡市・川口町の集落を対象として、指針による被害度と再建形態の実態を把握し、住宅再建のあり方を比較考察するための基礎的データを蓄積した。(1)農業等生産基盤・施設の復旧手法の開発1)農業生産基盤・施設災害の経時的変化特性に対応した復旧手法の開発:(1)地震災害で被害の素因が広範に形成されるため、被害発現は長期化し、中越地域の追加的被害件数は「手づくり田直し等支援事業」の37%に達したことを示し、モニタリングを基礎とした長期的支援体制の必要性を論じた。(2)農業水利施設の経年的被害実態を把握し、災害発生後3年間は通常年を上回り、追加的被害の合計件数は復旧事業実施件数の20%に達することを示した。また、旧栃尾市の山腹水路の被害実態を記録した。(3)山古志地域の不耕作地の経時的変化を全筆調査によって把握し、地震発生後の耕作復旧過程を明らかにし、地震前の75%に止まる実態を明らかにした。災害復旧事業は耕作放棄の抑制に効果があると考えられるが、組織的な復旧手法の必要を指摘し、新たな棚田整備の技術提案を行った。

2)養鯉施設災害の経時的変化特性把握に基づく復旧手法の開発:養鯉池・水田の復旧事業の実施状況を整理し,復旧過程での小規模・転出層の養鯉経営からの離脱進行,条件不利地での未復旧の多発、養鯉経営の二極化を示した。(2)農村集落再建における景観保全手法の開発1)農村住宅再建における集落景観変化の要因解明:地震後の屋敷林変化を小千谷市農業集落の落悉皆調査によって把握した。中山間地では倒木等が原因で伐木された例もあったが、多くは相隣関係悪化の回避が目的であった。倒木被害への保険制度等の対策を講じない限り、屋敷林は都市部から急速に後退する可能性のあることを指摘した。2)農村住宅再建における効率的な住宅供給システムの開発:地震に伴う環境変化の中で、住宅で保持される生活の型、すなわち裏側にヘヤ、前側にチャノマを配置する型を確認できた。一方で、新しいタイプの再建住宅は、耐震性能や雪処理や出入りを優先してつくられたが、住宅の評価は今後の経緯を見て判断する必要がある。
遺伝性プリオン病を対象とした病態機構の解明と克服への展開

ヒトプリオン病においてプリオンタンパク(PrP)遺伝子変異による遺伝性は十数%を占める。本研究では遺伝性プリオン病であるGSS(P102L変異)20例、FFI(D178N変異)12例、遺伝性CJD(E200K変異)22例について、我々が以前開発した高感度異常型PrP増幅検出法であるRT-QUIC法により髄液検査を行ったところいずれも80%前後以上の感度を示し、臨床的に有用性が高いことを確認した。さらに免疫抑制剤であるFK506がオートリソソーム系を活性化して異常型PrPの分解を促進し、予防・治療的効果を示すことを明らかにした。目的の(1)である遺伝性プリオン病に対する試験管内異常型プリオンタンパク(PrP)増幅法(Real-time QUIC法)を中心とした髄液検査はすでに数十症例について検証を行い、早期診断への応用が期待できるなど、臨床的にも非常に有用性が高いことを確認した(論文投稿準備中)。特にこれまでの14-3-3タンパク等の髄液マーカーで陰性になることが多い、、PrPのP102L変異によるGerstmann-Straussler syndrome(GSS)やまた症例数は少ないもののD178N変異によるFatal Familial Insomnia (FFI)でもReal-time QUIC法で高い陽性率を示したことは特筆すべき結果であると考えている。目的(2)で作製する予定の遺伝性プリオン病モデルマウス(GPIアンカ「を欠損させたP102L、変異を導入したヒトPrP配列トランスジェニツクマウス)についてはすでにFOマウスが得られており、それらの系統を繁殖させた後、発現レベルの確認を行うとともに、長期観察を開始する。目的(3)の遺伝性プリオン病の予防・治療法の探索と開発のため、ハイスループットスクリーニング法となりうる可能性のあるrecombinant PrPを用いたThermalStabilityAssay(TSA)を立ち上げ、解析を開始した。こめTSAアッセイを用いて低分子化合物ライブラリーのスクリーニングを近く始める予定である。目的の(1)である遺伝性プリオン病に対する試験管内異常型プリオンタンパク(PrP)増幅法(Real-time QUIC法)を中心とした髄液数十症例について検証を行い、その結果を論文にまとめ報告した(PLoS One 8(1): e54915, 2013)。これまでの14-3-3タンパク等の髄液マーカーで陰性になることが多い、PrPのP102L変異によるGerstmann-Straussler syndrome(GSS)や症例数は少ないもののD178N変異によるFatal Familial Insomnia(FFI)でもReal-time QUIC法で高い陽性率を示したことは臨床的な有用性の観点から特筆すべき結果であると考えている。目的(2)に関しては、遺伝性プリオン病モデルマウス(GPIアンカーを欠損させたP102L変異を導入したヒトPrP配列トランスジェニック[Tg]マウスとGPIアンカーを持つ同変異PrP発現Tgマウス)を作製し、脳組織中で変異PrPの発現量の高いF0系統がいくつか得られたことを確認した。現在それらのTgマウスの観察を継続中である。また内在性のマウスプリオンタンパクの影響を排除するため遺伝子欠損マウス(Prnp0/0)と掛け合わせ、遺伝的背景をPrnp0/0に置き換えている途中である。目的(3)の遺伝性プリオン病の予防・治療法の探索と開発のため、ハイスループットスクリーニング法となりうる可能性のあるrecombinant PrPを用いたThermal Stability Assay(TSA)の解析を行っている。目的の(1)である遺伝性プリオン病に対する試験管内異常型プリオンタンパク(PrP)増幅法(Real-time QUIC法)を中心とした髄液検査はすでに数十症例について検証を行い、早期診断への応用が期待できるなど、臨床的にも非常に有用性が高いことを確認し,報告した(PLoS One 8(1): e54915, 2013)。特にこれまでの14-3-3タンパク等の髄液マーカーで陰性になることが多い、PrPのP102L変異によるGerstmann-Straussler syndrome(GSS)やまた症例数は少ないもののD178N変異によるFatal Familial Insomnia(FFI)でもReal-time QUIC法で高い陽性率を示したことは特筆すべき結果であると考えている。目的(2)で作製する予定の遺伝性プリオン病モデルマウス(GPIアンカーを欠損させたP102L変異を導入したヒトPrP配列トランスジェニックマウス)については現在、山形大学医学部遺伝子実験施設に依頼中である。

目的(3)の遺伝性プリオン病の予防・治療法の探索と開発のため、ハイスループットスクリーニング法となりうる可能性のあるrecombinant PrPを用いたThermal Stability Assay(TSA)を立ち上げ、解析を開始した。ヒトプリオン病においては、約80%を占める原因のわからない孤発性、プリオン汚染による獲得性、そしてプリオンタンパク(PrP)遺伝子変異による遺伝性は十数%程度を占める。本研究では特に遺伝性プリオン病を主要対象としてその病態機構の解明と克服を目指して研究を開始した。まず遺伝性プリオン病であるGSS (Gerstmann-Straussler-Schenker症候群、P102L変異)20例、FFI(Fatal familial Insomnia、D178N変異)12例、遺伝性CJD(E200K変異)22例について、我々が以前に開発した高感度異常型PrP増幅検出法である、Real-time QUIC法により髄液検査を行ったところ、いずれも80%以上の感度を示し、臨床的にも有用性が高いことを確認した。その他、遺伝性プリオン病モデルマウス(P102L変異を導入したヒトPrP配列トランスジェニックマウス)を作製し、遺伝的背景をPrP遺伝子ノックアウトマウスに置き換え、現在解析が進行中である。さらに免疫抑制剤として使用されるFK506(タクロリムス)がオートファジーを活性化することにより異常型PrPを減少させ、治療効果を示すことを明らかにした。26年度が最終年度であるため、記入しない。神経解剖学・神経病理学26年度が最終年度であるため、記入しない。目的(1)の遺伝性プリオン病における試験管内異常型プリオンタンパク(PrP)増幅法(Real-time QUIC法)を中心とした髄液検査についてはほぼ目処がついた。また(2)のモデルマウス作製も開始しているなど順調に進展しているといえる。目的(1)の遺伝性プリオン病における試験管内異常型プリオンタンパク(PrP)増幅法(Real-time QUIC法)を中心とした髄液検査についての結果については論文にまとめた。一方(2)のモデルマウス作製については遺伝的背景をPrnp0/0にするための繁殖に時間を要している。そのためTgマウスの解析についてはもうしばらく時間が必要である。目的(1)の遺伝性プリオン病における試験管内異常型プリオンタンパク(PrP)増幅法(Real-time QUIC法)を中心とした髄液検査についてはほぼ終了し、論文にまとめた。一方(2)のモデルマウス作製についてはトランスジーンの発現が低かったため、作製を再度依頼している。したがってトランスジェニックマウスの解析についてはやや遅れているといわざるをえない。今後も交付申請書に記載した研究計画に則り、遂行していく予定である。モデルマウスは変異PrPの発現レベルが重要となることが予想されるので、導入した遺伝子が多量に発現するクローンを得ることができるかどうかがポイントとなる。特に今年度の研究の中心となるTgマウスはPrPの発現レベルも確認しており、今後遺伝的背景をPrnp0/0にした後詳細に解析を行う予定である。
ＤＮＡ二重鎖切断修復装置の３Ｄ作動原理

DNAの二重鎖切断(DNA double strand break; DSB)は、細胞にとって最も危機的なDNA損傷の一つである。DSBの修復には相同組換えが主要なDNA修復機構の一つとして機能する。本計画では、DSBが導入された染色体はいかなるメカニズムによってDSB修復を実現しているのか、染色体の時空間制御機構解析、組換え反応の試験管内再構成系、さらに、リアルタイム解析・1分子解析などによって多面的に切り込み、且つ、接合型変換をモデル系として4D情報を解析することで、DSB修復装置が核内でどのように時空間を制御して作動するのか、分子基盤や基本原理を明らかにしようとしている。特に、申請者が発見した相同組換え因子を主軸に、分裂酵母をモデル系としてDSBの修復過程における染色体の3D・4Dダイナミズムを明らかにしようとするもので、当該年度は次の実績をあげた。(1)Rad51リコンビナーゼの単鎖DNA(ssDNA)への結合様式について、リアルタイムの単分子解析を行なった。その結果、まず、分裂酵母Rad51について、その補助因子である補助因子Swi5-Sfr1がRad51のDNAからの解離を抑制することを明らかにした。また、マウスRad51についても行い、マウスSwi5-Sfr1が、同様にssDNAからの解離を抑制することを明らかにした(Lu et al, PNAS, 2018)。(2)分裂酵母の接合型変換に関与する遺伝子を網羅的に明らかにする目的で、欠失ライブラリーを作成して、すべての非必須遺伝子について、接合型変換能を解析した。その結果、新たにSet1C複合体等が接合型変換に関与することを発見し、その成果を論文に発表した(Maki et al, PLoS Gen, 2018)。台湾のグループとの共同研究で、Rad51リコンビナーゼのssDNA結合について、単分子解析アッセイ方法を確立した。これを用いて、結合モードを解析し、補助因子Swi5-Sfr1複合体が分裂酵母Rad51の解離定数を低下させることでRad51-ssDNA複合体を安定することを証明した。また、同様なモードがマウスRad51でも働くことを示し、リコンビナーゼのプレシナプティックフィラメントの活性化モードが生物種を超えて保存されていることを示した。また、接合型変換の分子機構を解析する目的で、接合型特異的に蛍光タンパク質を産生する株を作成し、接合型変換能をより容易にかつ正確にアッセイするシステムを構築した。すなわち、P細胞はCFPが発現しM細胞はYFPが発現するようにデザインし、それぞれの遺伝子破壊株で、どちらの蛍光タンパク質が発現しているのか検鏡下で計測することで、M細胞とP細胞の比を求めることができるというものである。3240個の非必須遺伝子についてこれを調べ、新たに、7個の遺伝子が接合型変換に関与することを明らかにした。これらは、Pof3 (F-boxタンパク質)、Ckb1(CK2制御サブユニット)、Elp6 (RNA pol II elongator)、Brl2 (E3 ubiquitin ligase, HULCサブユニット),Swd1, Swd2及びSpf1 [Set1/compass complex (Set1C)]である。これらを詳細に解析して、Swi6とともに、M細胞におけるmat2-Pの選択に関与している証拠を得た。これらを纏めて論文に発表した(Maki et al, PLoS Gen, 2018)。1)これまで開発したリアルタイムモニター系を利用して、分裂酵母Rad51によるDNA鎖交換反応における2つの反応中間体形成のメカニズムをさらに詳細に解析する。特に、突然変異体を用いて、それぞれのステップに関与するアミノ酸残基の同定やその機能解析に注力する。これまでのところ、DNA結合モチーフとして知られているL1ループやL2ループのいくつかのアミノ酸残基がそれぞれ重要な機能をしていることが明らかになりつつあるので、これをさらに推し進めて、詳細に解析していく。最終的には、鎖交換反応の活性中心を解明する。また、Swi5-Sfr1によるRad51鎖交換反応活性化の作用機序を詳細に解析する。さらに、減数分裂特異的なリコンビナーゼであるDmc1との鎖交換における機能的な違いや相同性認識機構、さらに、ヒトRad51との相違についても拡張して解析する。2019年度は最終年度であるので、これらを論文に纏める。2)接合型変換の分子機構:Set1CやHULCがどのように接合型変換に関与するのかその分子機構に迫る。これまでの解析から、Set1CとHULCは同一経路で、M細胞におけるmat2-Pの選択に関与していることを強く示唆する結果を得ている。これには、細胞型特異的にヘテロクロマチンの構造が一部変化することが重要な役割をしている可能性が考えられる。また、細胞型特異的な転写との共役も示唆される。これらの可能性について、ChIP-Seqなどをつかって、mat領域のヘテロクロマチン構造や、mat領域のヒストンH2のユビキチン化やH3-K4のメチル化などを解析する。さらに、これを纏めて論文発表する。本計画では、DSBが導入された染色体はいかなるメカニズムによってDSB修復を実現しているのか、染色体の時空間制御機構解析、組換え反応の試験

管内再構成系、さらに、リアルタイム解析・1分子解析などによって多面的に切り込み、且つ、接合型変換をモデル系として4D情報を解析することで、DSB修復装置が核内でどのように時空間を制御して作動するのか、分子基盤や基本原理を明らかにしようとしている。特に、申請者が発見した相同組換え因子を主軸に、分裂酵母をモデル系としてDSBの修復過程における染色体の3D・4Dダイナミズムを明らかにしようとするもので、当該年度は次の実績をあげた。(1)相同組換えによるDNA二重鎖切断修復の3D構築解析として、蛍光偏光解消法や蛍光共鳴エネルギー移動(FRET)を用いて、Rad51 presynapticフィラメント形成とDNA鎖交換反応のリアルタイム解析を行った。とくに、FRETを用いたリアルタイムアッセイ系から、予備的ながら、DNA鎖交換反応が3ステップで進行することを示唆する証拠を得た。(2)分裂酵母の接合型変換におけるドナーDNAの選択機構をモデル系として、組換えにおける染色体の時空間制御、すなわち、4D情報を解析する。該当年度は、3C解析の精度を上げることに成功し、より詳細なmat領域の染色体空間配置を解析した。また、欠失ライブラリーを作成して、接合型変換に関与する遺伝子の網羅的解析を行い、約8割の非必須遺伝子欠失変異体の表現型を解析し、接合型変換に異常があるものを特定した。27年度計画として、i)蛍光偏光解消法や蛍光共鳴エネルギー移動(FRET)を用いて、Rad51 presynapticフィラメント形成とDNA鎖交換反応のリアルタイム解析を行う。ii)接合型変換をモデル系として、DNA組換え反応の試験管内再構成系の構築し解析する。iii)分裂酵母の接合型変換におけるドナーDNAの選択機構をモデル系として組換えにおける染色体の時空間制御を解明する、などを計画し実施してきた。このなかで、FRETを用いたDNA鎖交換反応のアッセイ系については、特段の進捗を遂げることができたと考えている。すなわち、DNA strand displacement (DSD)アッセイとDNA strand pairing (DSP)アッセイを確立して、リアルタイムでDNA鎖交換をモニターすることに成功した。これを用いて、反応速度論についてシミュレーションを行い、この反応が、2つの反応中間体を通る3ステップで進行する証拠を得ることができた。また、Rad51が持つATPase活性について、それがどのステップに関係するかを解析し、最初のペアリングには、ATPの加水分解は必要でないことを示すことができた。また、分裂酵母の接合型変換の解析では、3C解析の精度を上げることに成功し、より詳細なmat領域の染色体空間配置を解析した。また、欠失ライブラリーを作成して、接合型変換に関与する遺伝子の網羅的解析を行い、新しく接合型変換に関与する遺伝子候補を多数同定した。今後は、遺伝解析によって、接合型変換のどのステップに欠損があるのか、詳細に解析していきたい。DNAの二重鎖切断(DNA double strand break; DSB)は、細胞にとって最も危機的なDNA損傷の一つである。
発症予防に向けた動脈疾患の病因解明と病態の理解

本研究は、疾患コホートや未診断で病変を有する症例について遺伝学的解析により病因遺伝子変異バリアント検出法の評価を行い、また、RNA解析を併用して既存のDNA検査では同定困難な病因遺伝子変異バリアントの検出手法を確立して、病状発症予防に資する遺伝学的検査の改善を行い、あわせて、対象とすべき患者選別についての基準も検討する。さらに、高精度な新規病因遺伝子バリアント同定法や疾患コホート研究で得られたゲノム情報を活用して病型分類や病態修飾につながる遺伝型の同定についても検討する。以上により、遺伝性動脈疾患の病因解明をすすめ、致命的イベントの予防につながる診断法開発につながる新知見の獲得を目指す。
生きた結合振動子システムによる生物の非線形振動子集団のダイナミクスの研究

真正粘菌変形体は、アメーバ様の単細胞生物であり、様々な振動現象を示す。本研究の目的は、真正粘菌変形体を用いて、生きたままの状態で結合振動子系を構築し、粘菌における非線形振動子集団のダイナミクスを調べることにある。これまでの研究で、申請者は2つの粘菌振動子が結合した系を構築してきた。この研究では、この方法を多数の振動子の結合系に拡張し、粘菌を2次元上にパターニングする方法を検討した。その結果、マイクロ加工技術の1つである、フォトリソグラフィーの方法を用いることで、粘菌結合振動子間の結合強度をシステマティックに制御できることがわかった。また、この粘菌結合振動子系を用いて外部刺激を入力しその応答を調べることで、非線形ダイナミクスに関して様々な知見を得られることが期待される。本年度の研究では、刺激入力方法として光り刺激による方法を検討した。光刺激は、コンピュータで光りの強弱を空間的にパターニングしたものをデジタルプロジェクタを用いて、粘菌試料に投射して与えた。その結果、光パターンに応じて粘菌の移動行動が観察された。よって、本研究により、このようなセットアップでの光刺激入力が粘菌結合振動子系においても有効であることが確認された。さらに、この刺激入力方法によって、生きた粘菌結合振動子系における刺激応答を観察し、非線形ダイナミクスを検討していくことが、今後の課題である。
脱ユビキチン化酵素AMSHによる細胞内小胞輸送の制御機構の解析

昨年、エンドソームの肥大化や細胞膜レセプターの分解阻害を誘導するHrsの過剰発現がSTAMの共発現により解消される一方、AMSHによる同様の効果が見られないことを報告した。STAMはそのCoiled-coilドメインを介してHrsと、SH3ドメインを介してAMSHと結合することから、STAMのドメイン欠損変異体(それぞれSTAM-DCC、STAM-DSH3)それぞれをHrsと共発現したところ、共にエンドソームの肥大化を抑制することはできなかった。このとき、STAM-DCCは細胞質中に拡散していたが、STAM-DSH3は肥大化エンドソーム上でHrsと共存していた。この結果は、Hrs-STAM共発現による肥大化エンドソームの解消にAMSHが必要であることを示唆している。さらにこれを検証するため、Hrs-STAM共発現293T細胞にAMSHの脱ユビキチン化活性欠損点変異体AMSH-D348Aを導入したところ、肥大化エンドソームが観察され、それには3者が共存していた。また、この肥大化エンドソームはクラスリンや後期エンドソーム蛋白質であるLAMP3が局在することから、マルチベシキュラボディ(MVB)の形成が阻害されたものと考えられた。そこで、MVB形成に関与するESCRT-I複合体の構成成分であるTsg101のHrs過剰発現293T及びHeLa細胞での局在を観察したところ、本来HrsによりMVBにリクルートされるべきTsg101は肥大化エンドソームには全く存在しなかった。以上のことから、MVB形成に必須であるESCRT複合体のエンドソームへのリクルートにはHrsのみならずAMSHの脱ユビキチン化活性が関与していることが示唆された。○細胞内小胞輸送に対するAMSHの過剰発現の影響これまでにHrsの細胞内での過剰発現がレセプターの分解を阻害することが知られている。同様の現象がAMSHの過剰発現により観察されるのか、AMSH野生型と数種のドメイン欠損変異体をHEK293T細胞に導入し、TGFレセプターの存在量を指標に検討した。このなかで、AMSHの活性中心であるJAMMモチーフの欠損変異体の過剰発現によりレセプターの蓄積が観察された。また、我々はHrs過剰発現によるレセプター分解阻害がSTAMの共発現により解消されることを見出した。そこで、AMSHのHrsとの共発現について検討を行ったが、STAMと同様の効果は観察されなかった。以上のことから、AMSHの脱ユビキチン化活性がエンドサイトーシス経路でのレセプター分解が進行するために必要ではあるが、それに先んじたHrs/STAM複合体の作用が必要であると考えられた。また、Hrs過剰発現により初期エンドソームに蓄積したTGFレセプターを免疫沈降した際に、Hrs/STAM複合体に比べ、AMSHが優位に共沈した。細胞内に取り込まれたTGFレセプターは通常、初期エンドソーム上から細胞膜へとリサイクルされることからAMSHによるレセプターの脱ユビキチン化がレセプターのリサイクルに必要であることが示唆された。○STAMのモノユビキチン化、脱ユビキチン化に対するチロシンリン酸化の要求性STAMにはサイトカイン刺激依存的にチロシンリン酸化を受けると考えられるITAMドメインを持ち、この領域がコイルドコイル領域と隣接することから、他の分子との相互作用とITAMドメインのチロシンリン酸化との関係は興味深い。そこで、この領域のチロシン残基の変異がSTAMのユビキチン化、及びAMSHによる脱ユビキチン化に及ぼす影響を検討した。STAMとJAK2とを共発現させたところ、野生型STAMではそのモノユビキチン化とJAK2の発現量に相関が見られたが、ITAMドメイン内チロシンの変異体はユビキチン化のレベルが低下し、JAK2発現量との相関は見られなかった。一方、AMSHによる脱ユビキチン化はこの変異の影響は観察されなかった。

以上のことから、MVB形成に必須であるESCRT複合体のエンドソームへのリクルートにはHrsのみならずAMSHの脱ユビキチン化活性が関与していることが示唆された。
気孔の開閉をめぐる植物－病原菌共進化の分子基盤の解明

気孔は、外界とのガス交換を担う生育に必須の器官であると同時に、病原菌の侵入経路でもある。植物は病原菌を認識して気孔を閉じる免疫機構を持つが、いくつかの病原菌はこの免疫機構を乗り越える。我々は最近、病原細菌Pseudomonas syringaeが産生する植物毒素コロナチンが、孔辺細胞に特異的に存在するシグナル伝達経路を転用することで気孔を開くことを発見した。興味深いことに、シロイヌナズナはコロナチンに感受性を示す一方で、いくつかの近縁種は抵抗性を示した。本年度は、シロイヌナズナ近縁種が示すコロナチンに対する抵抗性の仕組みの解明を試みた。さらに、昨年度からの継続課題であるゲノム編集技術を用いたコロナチン標的遺伝子のプロモーターの改変に取り組んだ。シロイヌナズナ近縁種が示すコロナチンに対する抵抗性の分子メカニズムに迫るため、コロナチン標的遺伝子のプロモーター置換実験を行った。その結果、シロイヌナズナとその近縁種におけるわずかなDNA配列の違いが、コロナチンに対する応答性を説明する可能性が示唆された。今後は、どの部分の違いがコロナチンに対する応答性に重要なのか調べていく。これまでに、コロナチン標的遺伝子の発現誘導に必要な転写因子を同定している。コロナチンによる気孔開口に対する抵抗性を人為的に導入する試みとして、シロイヌナズナのコロナチン標的遺伝子のプロモーターに存在するこの転写因子の結合部位を、2つの異なるゲノム編集技術を用いて改変することに成功した。我々は最近、病原性細菌Pseudomonas syringaeが産生する植物毒素コロナチンが、孔辺細胞に特異的に存在するシグナル伝達経路を転用することで気孔を開くことを発見した。昨年度は、コロナチンが転用するシグナル伝達経路の全容解明、および、シロイヌナズナ近縁種が示すコロナチンに対する耐性の仕組みの解明を試みた。シロイヌナズナにおいて、コロナチンが転用するシグナル伝達経路は本来、明け方の速やかな気孔開口に必要であることを見出した。さらに、この明け方の速やかな気孔開口は、光合成の促進に必要であることも明らかにした。興味深いことに、コロナチンによる気孔開口に対して感受性を示すシロイヌナズナ近縁種は、明け方の速やかな気孔開口を示したのに対して、抵抗性を示す近縁種は、明け方の気孔開口に遅延を示すことが分かった。この結果から、コロナチンによる気孔開口に対する抵抗性の獲得と、明け方の速やかな気孔開口の間で、進化的なトレードオフが起こっていることが示唆された。また、シロイヌナズナの近縁種が示すコロナチンに対する非感受性の分子メカニズムに迫るため、コロナチンが標的とする遺伝子プロモーター上のDNAメチル化の違いをbisulfite sequencing法で調べたところ、応答性の違いを説明できる差は見つからなかった。今後は、第二の可能性として、ヒストン修飾の違いを調べて行く予定である。コロナチンが標的とする遺伝子のプロモーターを改変したゲノム編集シロイヌナズナの作出に、想定以上の時間がかかっている。その主な原因は、Golden Gate Cloningによる部位特異的ヌクレアーゼTALENの作成過程が非常に複雑、かつ、低効率であったことである。しかし、時間はかかったものの、TALENの作成に成功し、現在ゲノム編集個体の選抜を行っている。この遅れは本年度に十分取り戻せると考える。コロナチンが標的とする遺伝子のプロモーターを改変したゲノム編集シロイヌナズナのコロナチンに対する応答性(遺伝子発現誘導と気孔開口)を調べる。また、P. syringaeに対する抵抗性も調べる。さらに、夜明けにおける気孔開度と光合成速度を調べる。シロイヌナズナと近縁種の間で、コロナチンの標的遺伝子のプロモーター領域におけるDNAメチル化の違いは見られなかった。

そこで、ヒストン修飾に違いがあるかどうかを調べる。転写抑制との関連がみられるリジンのメチル化(H3K9メチル化など)を中心に解析する。それぞれのヒストン修飾を特異的に認識する抗体を用いてクロマチン免疫沈降を行い、精製されたDNAをPCR増幅することでヒストン修飾の有無を調べる。
ペルー・べラスコ軍事政権の軍内政治の力学

「ペルー革命」と呼ばれたペルーの軍事政権(1968年10月1980年7月)について、1968年10月から1975年10月までの閣議録下書きを精査することによって、軍内政治のあり方、政権の内部事情、各閣僚の志向、当時のペルーの状況などについて、多くの情報を得ることができた。また、軍事政権第二期(1975年8月1980年7月)の統治綱領であるトゥパック・アマル計画の第一次草稿を後の確定版と比較することによって、政府の志向がどのように変化したかを確認することができた。当初の予定通り、平成17年度は準備期間と位置づけ、海外調査は行なわず、日本で準備作業を行なった。具体的には、申請者が以前にこのテーマで研究成果を刊行した時(1993年)以降に刊行された文献について収集し、その一部の内容を検討した。平成17年度に収集・検討した文献は、以下の5種類に分けられる。平成18年度からは文献調査を継続するとともに、海外調査を実施する。当初の予定通り、7月19日から8月28日までペルーに滞在し、リマ市のポンティフィシア・カトリカ大学で軍事政権の資料を調査した。軍事政権の閣議録下書きは付属資料を後回しにして本体部分のみを閲覧したが、当初見込んでいたよりも早く進むことができた。これにより、来年度の在外研究では本体の調査を終えて、付属資料の調査に進むことができる見込みとなった。ペルー滞在中に主要な書店を回り、ペルー軍政関係およびペルーの政治一般に関する文献を購入した。現地の研究者との交流と意見交換も行なった。ペルーでの作業は予想以上に進行したが、日本における資料の整理と分析は当初の見込みほど進まなかった。来年度の課題となる。上記のように資料の分析は充分に進んではいないが、資料から以下のことが浮かび上がってきたと考えている。1.ベラスコ大統領が主宰する閣議は思いのほか「民主的」で、ベラスコが自由な討議を促し、それに呼応してかなり率直な意見交換が行なわれていること。2.閣議録の議論からは、軍内の派閥対立が明確に浮かび上がってこないこと。意見の対立や応酬はかなりあるが、それらは部分集団間の体系的対立ではなかったこと。3.閣議の多くの時間が経済状況の報告や国家が当事者である契約の詳しい説明に費やされていたこと。4.閣僚は全員将官であったが、自分が担当するセクターについてよく情報を把握していたこと。以上が、ベラスコ政権前半期の閣議録下書きから見えてくる印象である。当初の予定通り,7月18日から8月30日までペルーに滞在し,リマ市のポンティフィシア,カトリカ大学で軍事政権の資料を調査した。軍事政権の閣議録下書きは予定通り本体部分の調査を完了し,閣議付属資料の一部を調査した。ペルー滞在中には,ポンティフィシア,カトリカ大学文学部教授でペルー現代史を担当するイバン,イノホサ氏等と意見交換を行なった。また同じくペルー滞在中に主要な書店や国際ブックフェアを回り,ペルー軍政関係およびペルーの政治一般に関する文献を購入した。ペルーでの作業は順調に進行したが,日本における資料の整理と分析は今年も当初予定していたほど進まなかった。今年度に調査した資料の中では,トゥパックアマル計画(軍事政権第二期(19751980年)の統治綱領)のオリジナル版が興味深かった。すでに筆者による過去の研究で,当初バルデス将軍が中心になって作成したバージョンがかなり急進的であり,後に軍事政権が保守化してから公表されたバージョンと大きく異なっていたことが知られていた。今回調査できたのは,バルデス将軍が作成したトゥパックアマル計画のオリジナル版と,その作成の過程で各省庁が提出したセクター別の資料(インカ計画(第一期統治綱領)の実施状況,今後の目標など)である。これにより,トゥパックアマル計画の当初の内容を正確に把握することが可能になった。7月20日から8月28日までペルーに滞在し、リマ市のポンティフィシア・カトリカ大学で軍事政権の資料を調査した。当初の予定通り、軍事政権の閣議録下書きの調査をすべて完了した。ペルー滞在中には、ポンティフィシア・カトリカ大学社会科学部政治学科教授ロランド・アメス氏等と意見交換を行なった。また同じくペルー滞在中に、主要な書店や国際ブックフェアを回り、ペルー軍事政権関係およびペルーの政治一般に関する文献を購入した。日本においては、ペルーで取ったメモを整理するとともに、ベラスコ政権、ペルーの政軍関係史、ペルーおよびラテンアメリカの軍思想、ラテンアメリカおよび世界の軍事政権等に関する文献を、近年刊行されたものを中心に検討した。当初の私の意図は、ペルーでの調査の成果を踏まえて、かつて公刊したベラスコ政権に関する本を大幅に改訂し、スペイン語で出版することであった。

しかし、本研究の対象時期からすでに30年以上が経過したため、本研究の対象時期に米国大使館が本国に送った公電をはじめとして、かなりの米国の資料が米国立公文書館で利用可能になっていることがわかった。そのため、平成21年度前半に米国立公文書館において調査を行ない、その後に著書の改訂作業に着手する予定である。
疾患特異的iPS細胞を用いたヒト遺伝性腫瘍疾患モデルの構築

本研究は、様々な腫瘍を発症・併発する遺伝性腫瘍症候群であるvon Hippel-Lindau(VHL)病患者由来の疾患特異的iPS細胞を用い、ヒトVHL病疾患モデルの構築とVHL病の発症・進展の機序の解明を目的とした。NOD/SCIDマウスを用いたVHL病腫瘍の再現性のin vivo評価系とヒト細胞株のないVHL病腫瘍の発生母地細胞への新規in vitro iPS細胞分化誘導実験系の確立・分化誘導を促進し得る候補分子の絞り込みに至る結果が得られた。以上のことから、本研究の基盤となるin vivo及びin vitro実験系の確立に至り、VHL病の発症・進展の機序の解明に近づく成果が得られた。Von Hippel-Lindau(VHL)病は、VHL癌抑制遺伝子のgermline mutationを原因とする常染色体優性遺伝性の家族性腫瘍症候群であり、腎細胞癌、褐色細胞腫、血管芽腫など様々な腫瘍を発症・併発する。遺伝性VHL病は若年性に発症し、高リスクの場合QOLの低下が問題となる。VHL病遺伝性腫瘍のリスク因子としてVHL遺伝子を含む複数の遺伝子変異が報告されているが、VHL病の発症・進展のメカニズムは未だ不明な点が多く、根治療法の開発には至っていない。本研究は、より最適なin vivo及びin vitroのヒトVHL病疾患モデルの構築を目指し、樹立したVHL病患者(VHL mut/+)由来の疾患特異的iPS(VHL iPS)細胞を用いて、ヒトVHL病の表現型を再現し得るin vivo疾患モデルの構築と、ヒト腫瘍由来細胞株が樹立されていない褐色細胞腫や血管芽腫などのVHL病腫瘍細胞株の樹立(in vitro実験系の確立)を目的とする。研究成果としては、新規in vitro分化誘導法による目的の褐色細胞腫の発生母地細胞への分化誘導の可能性を示し、また分化誘導を促進し得る候補分子ついても絞り込みに至る結果が得られた。一方、年度内にVHL mut/ーを誘発するVHL iPS細胞は得られなかったが、目的細胞を獲得できた場合、本年度の成果よりヒトVHL病疾患モデルの構築が可能と考える。VHL iPS(VHL mut/+)樹立細胞をNOD/SCIDマウスに移植した今回の実験条件下においてはVHL病腫瘍の再現は確認できず、当初予想した通り、片側alleleのみのVHL遺伝子変異(VHL mut/+)ではVHL病腫瘍の発生には不十分と思われた。効率良くVHL病腫瘍を再現するためには、任意にVHL mut/ーを誘発するシステムをVHL iPS(VHL mut/+)樹立細胞に組み込んだ目的細胞が必須であると考える。しかし、年度内に目的細胞の獲得には至らなかった。一方、201B7ヒト正常iPS細胞を用いた先行実験の結果、新規in vitro分化誘導法を用いて得られた分化細胞群において、分化マーカー遺伝子のmRNAならびにタンパク質発現が認められた。今後さらに目的細胞を単離・培養して評価・検討を行う必要はあるが、ヒトiPS細胞から褐色細胞腫の発生母地細胞への分化誘導の可能性を示唆する結果が得られた。これは当初予定していた以上の成果である。さらに、褐色細胞腫の発生母地細胞への分化誘導を促進すると推測される複数の候補分子について遺伝子発現ベクターを作製し、適当な細胞へ遺伝子導入して評価・検討を行った結果、候補分子の絞り込みに至る結果が得られた。Von Hippel-Lindau(VHL)病は、VHL癌抑制遺伝子のgermline mutationを原因とする常染色体優性遺伝性の家族性腫瘍症候群であり、腎細胞癌、褐色細胞腫(Pheo)など様々な腫瘍を発症・併発する。VHL遺伝子を含む複数の遺伝子変異が報告されているが、VHL病の発症・進展のメカニズムは未だ不明な点が多く、根治療法の開発には至っていない。本研究は、より最適なin vivo及びin vitroのヒトVHL病疾患モデルの構築を目指し、樹立したVHL病患者(VHL mut/+)由来の疾患特異的iPS(VHL iPS)細胞を用いて、ヒトVHL病の表現型を再現し得るin vivo疾患モデルの構築と、ヒト腫瘍由来細胞株が樹立されていないVHL病腫瘍細胞株の樹立(in vitro実験系の確立)を目的とする。1. in vitro分化誘導法(in vitro実験系)の確立:ヒトiPS細胞からPheoの発生母地細胞への新規分化誘導法を評価・検討した。分化誘導細胞群にて複数の分化マーカー遺伝子のmRNA・タンパク発現が確認され、有用性が示された。また、分化誘導促進可能な候補分子・単離指標となる分化マーカー遺伝子の選択に至る結果が得られた。2. in vivo疾患モデルの構築:新規分化誘導法による正常iPS細胞由来分化誘導細胞群をNOD/SCIDマウスに移植し、得られた腫瘍様組織を評価・検討した。免疫蛍光染色・mRNA発現解析の結果、分化マーカー遺伝子の発現が確認され、in vivo疾患モデルの構築の可能性が示唆された。以上のことから、本研究の基盤となるin vivo及びin vitro実験系については概ね確立に至る成果が得られた。今後、作製に至らなかった任意にVHL mut/ー誘発可能なVHL iPS細胞を獲得した際、本成果よりヒトVHL病疾患モデルの構築が期待できる。NOD/SCID

マウスを用いたVHL病腫瘍の再現性のin vivo評価系とヒト細胞株のないVHL病腫瘍の発生母地細胞への新規in vitro iPS細胞分化誘導実験系の確立・分化誘導を促進し得る候補分子の絞り込みに至る結果が得られた。以上のことから、本研究の基盤となるin vivo及びin vitro実験系の確立に至り、VHL病の発症・進展の機序の解明に近づく成果が得られた。新規in vitro分化誘導法を用いて得られた分化細胞群は、培養条件ならびに分化マーカー遺伝子の発現パターンの結果から様々な細胞が混在している可能性が示唆された。そのため、次には、分化マーカー遺伝子を指標にして目的の褐色細胞腫の発生母地細胞を単離・培養し、その特徴づけを行うとともに、新規in vitro分化誘導法の評価を行う予定である。一方、平成27年度に予定していた、任意にVHL mut/ーの誘発を可能とするVHL iPS細胞の作製は本研究の最重要事項であるため、目的細胞の樹立が急務である。そのため、ゲノム編集効率の改善・向上に向けて、発現プロモーターの改変、TALENあるいはCRISPR/Cas9のゲノム編集技術の導入などを計画している。目的細胞を獲得できれば、in vivo実験系ならびにin vitro分化誘導実験系については概ね確立に至っているので、次年度に予定している研究計画を遂行できるものと考える。分子腫瘍学、分子標的治療学
脳腫瘍に対するシスプラチン誘導体の効果に関する研究

シスプラチンアナログであるジアミノ白金とpyridoxic acidとの錯体(以下誘導体と略す)を用い、シスプラチンと抗腫瘍効果を比較し、悪性脳腫瘍の化学療法における誘導体の有用性を検討した。1、誘導体の分配係数は、シスプラチンより約25%脂溶性を示した。2、脳腫瘍移植ラットを用い、マイクロダイアリシス法による脳腫瘍部位での透過薬物量の検討脳腫瘍部における経時的なPt濃度の変化のパターンは、誘導体投与群とCDDP投与群とでは異なり、誘導体投与群では、脳腫瘍部での濃度半減期が、CDDP投与群に比べて有意に延長した。一方正常脳部におけるPt濃度は、両薬剤投与群共に、腫瘍部のPt濃度に比べて顕著に低かった。3、脳腫瘍移植ラットを用いた頚動脈動注法による薬物臓器内分布の検討2mg/kg投与では、有意差がでなかったが5mg/kgでの頚動脈投与では、各臓器(腎、肝、脾臓)の白金濃度は明らかに誘導体の方が低かった。4、脳腫瘍移植ラットを用いた頚動脈動注法による平均生存日数の検討誘導体は、シスプラチンと同等の生存日数を示した。誘導体は、コントロール群とくらべ有意差を酔めた。なおこれらの結果については、下記の学会において報告した。第12回日本薬物動態学会(1997.11.4、名古屋)シスプラチンアナログであるジアミノ白金とpyridoxic acidとの錯体(以下誘導体と略す)を用い、シスプラチンと抗腫瘍効果を比較し、悪性脳腫瘍の化学療法における誘導体の有用性を検討した。2、脳腫瘍移植ラットを用い、マイクロダイアリシス法による脳腫瘍部位での透過薬物量の経時変化の検討脳腫瘍部における経時的なPt濃度の変化のパターンは、誘導体投与群とCDDP投与群とでは異なり、誘導体投与群では、脳腫瘍部での濃度半減期が、CDDP投与群に比べて有意に延長した。第11回日本薬物動態学会(1996.12.6、金沢)脳腫瘍株を用いたMTT assay法によるin vitro cytotoxicityの検討、脳腫瘍移植ラットを用いた頚動脈動注法による平均生存日数の検討は現在進行中である。5、脳腫瘍株を用いたMTTassay法によるin vitro cytotoxicityについては検討ではシスプラチンと同等の効果が人脳腫瘍株において認められた。第12回日本薬物動態学会(1997.11.4、名古屋)シスプラチンアナログであるジアミノ白金とpyridoxic acidとの錯体(以下誘導体と略す)を用い、シスプラチンと抗腫瘍効果を比較し、悪性脳腫瘍の化学療法ににおける誘導体の有用性を検討した。脳腫瘍移植ラットを用いた頚動脈動注法による薬物臓器内分布の検討2mg/kg投与では、有意差がでなかったが5mg/kgでの頸動脈投与では、各臓器(腎、肝、脾臓)の白金濃度は明らかに誘導体の方か低かった。脳腫瘍移植ラットを用いた頚動脈動注法による平均生存日数の検討誘導体は、シスプラチンと同等の生存日数を示した。誘導体は、コントロール群とくらべ有意差を認めた。

第12回日本薬物動態学会(1997.11.4、名古屋)シスプラチンアナログであるジアミノ白金とpyridoxic acidとの錯体(以下誘導体と略す)を用い、シスプラチンと抗腫瘍効果を比較し、悪性脳腫瘍の化学療法における誘導体の有用性を検討した。1、誘導体の分配係数は、シスプラチンより約25%脂溶性を示した。2、脳腫瘍移植ラットを用い、マイクロダイアリシス法による脳腫瘍部位での透過薬物量の検討脳腫瘍部における経時的なPt濃度の変化のパターンは、誘導体投与群とCDDP投与群とでは異なり、誘導体投与群では、脳腫瘍部での濃度半減期が、CDDP投与群に比べて有意に延長した。一方正常脳部におけるPt濃度は、両薬剤投与群共に、腫瘍部のPt濃度に比べて顕著に低かった。3、脳腫瘍移植ラットを用いた頚動脈注法による薬物内分布の検討2mg/kg投与では、有意差がでなかったが5mg/kgでの頚動脈投与では、各臓器(腎、肝、脾臓)の白金濃度は明らかに誘導体の方が低かった。4、脳腫瘍移植ラットを用いた頚動脈動注法による平均生存日数の検討誘導体は、シスプラチンと同等の生存日数を示した。誘導体は、コントロール群とくらべ有意差を認めた。なおこれらの結果については、下記の学会において報告した。第12回日本薬物動態学会(1997.11.4、名古屋)