hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
キネシン分子が制御するシリア形成と中心小体接着の分子機構

紡錘体チェックポイント因子BUBR1が先天的に欠損すると、染色体数の不安定性(CIN)を特徴とするPCS症候群を発症する。PCS症候群は、染色体不安定性に起因する高発がん性を特徴とするが、一次シリアの形成不全による多発性腎嚢胞とDandy-Walker奇形も伴っており、「シリア病」でもあることが明らかとなっている。本研究は、PCS症候群のシリア形成不全のメカニズム解明を目的としている。PCS症候群患者細胞のシリア形成不全の原因としてPLK1活性の亢進が考えられた。最初に、PCS症候群患者細胞へのPLK1 siRNAを介したノックダウンを行った。その結果、シリア形成が部分的に回復したことから、PLK1はシリア形成を抑制することが示唆された。次に、PLK1の下流で繊毛形成を抑制する分子として、PLK1の基質である微小管脱重合活性をもつキネシンモーター分子KIF2Aに着目した。in vitrokinaseアッセイ法によりKIF2AのPLK1によるリン酸化部位を同定した。変異体解析により、PLK1によるKIF2Aリン酸化がその微小管脱重合活性を亢進させてシリア退縮を誘導することが明らかになった。また、人工ヌクレアーゼTALENsを用いて樹立したKIF2A欠損hTERT-RPE1細胞株では、静止期以外での異常な繊毛形成が引き起こされたことから、KIF2Aは生理的なシリア抑制に必須の分子であることが示された。さらに、抗リン酸化KIF2A抗体を作製して、PCS症候群患者細胞のPLK1によるKIF2Aリン酸化状態を検討したところ、患者細胞では細部周期を通じてKIF2Aリン酸化が亢進していた。これらの結果から、PLK1-KIF2A経路の恒常的な活性化がPCS症候群のシリア形成不全の分子病理機構の1つであることを証明した。26年度が最終年度であるため、記入しない。PCS症候群は、染色体不安定性に起因する高発がん性を特徴とするが、一次シリアの形成不全による多発性腎嚢胞とDandy-Walker奇形も伴っており、シリア病でもあることが明らかとなっている。シリアは細胞表面に1本の毛様に発達する微小管性の突起構造であり、細胞増殖シグナルを受容する。シリアはG0期に形成され、細胞が増殖期に入ると退縮する。最近、分裂期キナーゼPLK1が細胞増殖シグナルに依存した繊毛退縮に必要であることが報告された。しかし、シリア退縮過程でどのようにPLK1活性が繊毛構造に伝わるのかは不明な点が多い。本研究では、PLK1のシリア退縮活性のエフェクター候補分子として、PLK1の基質であり微小管脱重合活性をもつ分裂期キネシンKIF2Aに着目した。これまでの結果から、細胞増殖に共役したシリア退縮過程でKIF2AはPLK1のエフェクター分子として機能することが示唆された。平成25年8月、当初予定していた標的分子の探索実験で、得られた標的分子にKinesin分子との相互作用が見られなかった。標的分子を全細胞質分画から探索したために非特異的な結合分子が予想以上に多く得られたことが原因と考えられた。
新規な分子キャビティを活用した安定なセレネン酸および関連化合物の研究

セレネン酸はグルタチオンペルオキシダーゼ(GPX)の活性中心に出現する中間体として注目を集めているが、極めて不安定であるために研究が困難な化学種であった。本研究では、独自に開発したbowl型分子キャビティを活用することにより、セレネン酸を安定に合成・単離するとともにその構造および反応性を解明することを目的として検討を行った。官能基周辺に酸素などのヘテロ原子を含まない不活性なbowl型置換基として、側鎖にm-テルフェニルユニットをもつ新規な置換基(Bmt基)を有するセレノールを合成した。セレノールからセレネン酸への酸化過程は、GPX触媒サイクルにおいて過酸化物を無毒化する重要な過程であるが、これまで直接観測はおろか捕捉実験による確認すら報告されていない。Bmt基を有するセレノールを過酸化水素により酸化したところ対応するセレネン酸が主生成物として生成し、シリカゲルクロマトグラフィーにより77%の収率で単離することができた。酸化剤としてヨードソベンゼンを用いた場合にも、同様にセレネン酸を得ることができた。単離されたセレネン酸は、固体状態、溶液中いずれにおいても高い安定性を示し、重トルエン中80°Cで1日加熱しても変化は見られなかった。このセレネン酸のX線結晶構造解析を行ったところ、剛直なm-テルフェニル基がSeOH基をbowlの縁のように取り囲み、自己縮合を抑制していることがわかった。また、このセレネン酸とチオールとの反応では、対応するセレネニルスルフィドが定量的に得られた。このうちジチオスレイトールとの反応生成物に三級アミンを作用させたところ、セレノールへの還元が進行した。以上により、GPXの触媒サイクルとして提唱されている3過程を、初めて実験的に示すことができた。セレネン酸は、グルタチオンペルオキシダーゼの触媒サイクルなど種々の反応の重要な中間体として注目を集めているが、極めて高い反応性をもつためにこれまで安定な単離例がない。本研究では、申請者らが独自に開発した新規なbowl型反応場を活用して、セレネン酸を安定に合成・単離するとともにその構造および反応性を解明することを目的として検討を行った。bowl型反応場の基本骨格として、cone型配座および1,2,3-alternatc型配座に固定された架橋カリックス[6]アレーンを開発し、それらの骨格を有するブチルセレノキシドの熱分解により、安定なセレネン酸の単離に初めて成功した。cone型配座をもつセレネン酸についてはX線結晶構造解析によりその構造を明らかにすることができた。その結果、SeOH基がカリックス[6]アレーンのキャビティ内に収まり、自己縮合を起こしにくい構造をとっていることがわかった。いずれの配座をもつセレネン酸も極めて高い安定性を有しており、重トルエン中80°Cで12時間加熱しても分解は見られなかった。従来最もかさ高い立体保護基として知られている2,4,6-トリ-t-ブチルフェニル基をもつセレネン酸でさえも、溶液中室温で容易に自己縮合を起こすことが知られていることから、架橋カリックス[6]アレーン骨格の非常に高い保護効果が実証された。今回合成したセレネン酸はこのように極めて安定であるす一方で、m-クロロ過安息香酸なと適当な試剤とは速やかに反応した。特に1-ブタンチオールに対しては、cone型配座をもつ化合物と1,2,3-alternate型配座をもつものとでは異なる反応性を示した。このことは、カリックスアレーン骨格の配座によって内部官能基の反応性を制御できることを示しており興味深い。
流域水質管理システムの構築

湖沼河川系,沿岸海域系,地下水系等の流域への人為起源物質,栄養塩類の流入は水系の汚濁、流域の富栄養化現象を、国内でも全国的規模で、また諸外国でも各所で引き起こしている。これらの濁濁、富栄養化現象について、本研究の代表者らはすでにダム湖等を対象に、負荷発生,河川での浄化,湖沼内富栄養化を、システム構造として把握し、パソコン上でエキスパ-トシステムとして構築し,シミュレ-トを行なった。流域における負荷削減においては、種々の場において自然浄化機能を強化活用することが必要と思われる。計画研究において、種々の自然浄化機能の強化技術の定量的評価がなされるが、その知見を上記システムに組み込み,自然浄化機能強化技術メニュ-から、場の特性に応じた技術を選択するシステムを、知識工学的手法を利用して、パソコン上に構築するのが、本研究の目的であった。既開発のエキスパ-トシステムは、各種発生源よりのN、P、CODの発生負荷量計算と,河川でのその特性に応じた浄化の推測計算および湖の富栄養化シミュレ-ションが可能であり、本研究において各種の自然浄化機能強化策をこのエキスパ-トシステムに組み込む可能性を検討した。まず森林における浄化能強化策および水田,水路における浄化策および各種排水処理対策についてはその効果を負荷量計算において評価することとした。河川における強化策と地下浸透浄化は河川モデルに組み込んで試算した。ダムにおける曝気について上〓攪拌と上下攪拌を湖のモデルにおいて検討可能とした。これらのエキスパ-トシステムの自然浄化強化築の評価への応用可能性の検討とともに、エキスパ-トシステム自身の入出力の簡易化,グラフィク化による認識容易化をめざして、デジタイザ-の利用、マッキントッシュコンピュ-タ-への移植等を進めた。
ロシア・インテリゲンツィヤと国際協同組合運動

本研究はロシアの初期協同組合運動に指導的な影響を与えた三人の先駆的インテリゲンツィヤたちの社会的活動と思想とその国際的な背景の研究を通じてロシアの初期協同組合運動の特色を明らかにすること、およびその後のロシアにおける協同組合運動の発展と挫折の経過を社会思想史的に研究することを目指している。N.G.チェルヌィシェフスキーの協同組合思想については、本研究では彼の編集していた雑誌『ソヴレメンニク』の1860年4月号にすでにロッチデイル先駆者公正組合についての詳細な記事が掲載されていたことを紹介して、彼らがロッチデイルの組合の実績に注目して、ロシアの後進的状況の下で協同組合を普及させるために民衆教育と社会的対策の必要を挙げていること、それが後のチェルヌィシェフスキーの小説『何をなすべきか』の中での青年インテリゲンツィヤへの呼びかけにつながっていることを指摘した。第二の先駆者としては、ウクライナのハリコフで消費組合運動に献身したニコライ・バーリンが、1869年の訪欧で最も感銘を受けたイギリスの協同組合運動と彼の協同組合思想との関係、およびイギリスの協同組合指導者たちへの彼の国際協同組合連絡機関の創設の要請についての史実を明らかにした。第三の先駆者、A.I.ヴァシリチコフに関しては、彼が1872年にロシア自由経済協会で行った民衆貸付組合に関する講演を分析して、彼のロシア農村信用組合論がドイツのシュリツェ=デ-リチェの思想的影響とル-ギニン兄弟の実践に基づきながら、ロシアの農村の後進的特殊状況を配慮して、個人としてのインテリゲンツィヤの協力や地方自治体(ゼムストヴァ)と政府の援助を要請する内容のものであったことを明らかにした。その後のロシアおよびソビエトの協同組合運動の社会思想史的研究の成果も学会や講演会及び論文などで発表した。本研究は、ロシアの初期協同組合運動に指導的な影響を与えた三人のインテリゲンツィアの生涯と思想に関する研究によって、帝政時代のロシアにおける協同組合運動の民族的特性と国際性の両面を明らかにする社会思想的研究である。チェルヌイシェフスキーの研究では、彼の編集する雑誌『ソヴレメンニク』の1859年第一号のロバート・オウエンの社会改革論に続いて、1860年4月号の紙面にイギリスのロッチデイル先駆者公正協同組合についてのかなり詳細な解説論文が掲載されたことが確認された。チェルヌイシェフスキーらの急進改革派がこの段階で農奴制廃止後ロシアの改革にオウエンの思想やロッチデイル型の協同組合の導入を考えていたことが一層明らかになった。バーリンの研究では、彼が1869年8月12日にロッチデイルの先駆者協同組合の売店を訪ねて訪問者名簿に記帳していたことを現地で確認できた。さらに、マンチェスターの協同組合本部のアルヒ-フで、彼がニールらイギリスの協同組合運動の指導者たちと交わした手紙や報告書を見つけた。それらの資料で、バーリンがロシアの協同組合運動の発足のためにイギリスの協同組合からの物心両面の援助を要請すると共に、国際協同組合組織の創設の必要を熱心に説き、ニールたちの指導を促したことも資料的に明らかにできた。今後は、さらにA.ヴァシリチコフの協同組合思想の研究に取りかかる予定である。1856年のクリミア戦争敗北後に始まるロシアの改革運動の過程で、一部の改革派のインテリゲンツィヤたちは民衆の自立運動として西欧で発展していた協同組合運動に注目した。それがロシアでも民衆の自助運動として有効であると考えて、その導入を図ったのである。

本研究では、ソヴィエト体制崩壊後のロシアの民衆の自立という課題を念頭に置きながら、ロシアの協同組合運動の創設に貢献した三人の先駆的思想家をとりあげて、彼らの協同組合思想の特色と国際協同組合運動との関係を明らかにし、その後のロシアの協同組合運動への影響関係を調べることを目指していた。報告者はすでにチェルヌイシェフスキイの協同組合思想と、ロシア・ウクライナにおける初期の協同組合運動の先駆的活動家、ニコライ・バーリンについて研究し、その成果を内外の学会で発表してきた。今年度は、雑誌『ソヴレメンニク』の1860年4月号に掲載されたイワン・コノパセヴィッチの論文「ロッチデイル相互扶助組合」の分析を通じて、イギリスの協同組合運動についての急進的改革派インテリゲンツィヤたちの認識の特色を明らかにした。特に、彼がチェルヌィシェフスキイと同様に、ロッチデイルの協同組合の経験に学び、農奴解放後に予想されるロシアの資本主義化の進展とその結果としての農民階層の零落とプロレタリア化を防ぐために協同組合の普及が有益であることを主張していたことを確認した。ロシアの農村貸付協同組合運動の先駆的指導者として活動したA.I.ヴァシリチコフ侯爵は、リベラルな傾向の民衆擁護者としてゼムストボを通じての農村貸付協同組合の援助と普及に尽力した。協同組合によるロシア農民の貧困からの解放を目指すその思想の特色については、彼が1871年3月にペテルブルグの自由経済協会で報告した『ロシアにおける農村貸付組合』を中心にその研究をまとめつつあり、近く発表の予定である。ソヴィエト体制の崩壊後の体制転換に伴うロシア・中欧・東欧諸国での旧ソヴィエト型の協同組合の動向についても引き続き資料収集と検討を続けると共に、学会、大学(比較経済体制学会、慶応大学、龍谷大学など)でその成果を報告している。また、ロシア、イギリス、アメリカの研究機関や研究者との情報交換や人的交流を続けている。
弾性線維の形成と再生の分子機構

弾性線維は、伸び縮みする組織(皮膚・動脈・肺など)に多くあって、その伸縮性を担う細胞外マトリックスである。皮膚のたるみだけでなく、心疾患予後悪化因子である動脈中膜硬化、高齢者の主要疾患である肺気腫も弾性線維の劣化・断裂が直接原因と考えられているため、弾性線維の劣化予防と再生は高齢化社会における極めて重要な課題である。しかし弾性線維のターンオーバーは極めて遅く、弾性線維の再生は困難と考えられてきた。弾性線維形成には(1)ミクロフィブリルという線維の束が形成され、(2)エラスチンタンパク質がミクロフィブリルに沈着し、(3)エラスチンどうしが架橋される、というプロセスがある。我々はこれまでの研究で、それぞれのプロセスに必須のタンパク質(特にFibulinファミリー分子とLTBPファミリー分子)があることを明らかにしてきた。本研究では、それらの生体内での働きを明らかにし、弾性線維の形成と維持、再生の分子機構を解明することにより弾性線維再生技術の基盤を作る。本年度は、昨年度に引き続き、エラスチン架橋酵素リシルオキシダーゼの活性化におけるFibulin-4の役割に重点を置いて研究した。エラスチン、コラーゲンなどは分子どうしの非共有結合だけでは必要な弾性や強度を生み出すことができず、分子どうしが共有結合で架橋される必要がある。架橋を行うのはリシルオキシダーゼという酵素であるが、リシルオキシダーゼ遺伝子欠損マウスとFibulin-4遺伝子欠損マウスの表現型が同じ(動脈と横隔膜破裂による周産期死亡)であり、リシルオキシダーゼとFibulin-4が直接結合することから、それらの機能的関係を研究した。特に、リシルオキシダーゼは銅イオントランスポーターATP7aから銅イオンを受け取り、銅イオン依存的に活性中心LTQ(Lysine Tyrosyl Quinone)を形成することが知られているが、その過程においてFibulin-4が何らかの役割を持つかどうかを調べた。平成30年度が最終年度であるため、記入しない。我々はこれまでの研究で、それぞれのプロセスに必須のタンパク質があることを明らかにしてきた。本年度は、ミクロフィブリル形成について新たな発見があった。これまでLTBP-2という分泌タンパク質が毛様小帯(ミクロフィブリルのみでできている)の形成に必須であることを報告してきたが、Ltbp2 KOマウスは眼以外に表現型がなく、肺や動脈などにおける弾性線維の形成不全も認めなかった。我々はLtbp2/4ダブルKOマウスを作成し、このマウスが激しい肺胞破壊(肺気腫)のため早期に死亡すること、肺気腫は弾性線維形成不全によるものであることを見出した。またLTBP-4の異所性強制発現がLtbp2 KOマウスの毛様小帯形成不全をレスキューできることもわかり、LTBP-2とLTBP-4がミクロフィブリル形成において重複する役割を持つことが考えられた。この新知見はScientific Reports誌に報告した。LTBP-2 (Latent TGFβ-binding protein 2)の遺伝子欠損マウスは毛様小帯(ミクロフィブリルのみでできている)の線維束が形成されず水晶体脱臼をおこした。しかしLTBP-2は肺や動脈にも多く発現する分子であるにもかかわらず、これらの組織ではミクロフィブリルの形成に異常は無いため、別の因子、特に他のLTBPファミリー分子が代償している可能性が高い。LTBPファミリーのタンパク質は4つある。肺・大動脈ではすべてのLTBPが発現しているが、毛様体ではLTBP-4以外のLTBPが発現している。従って、LTBP-1, 3はLTBP-2の欠損を代償することはできず、LTBP-4にはLTBP-2を代償する機能がある可能性がある。この仮説をLtbp2/4ダブルKOマウス、Ltbp2 KO/Ltbp4 KIマウスを作成し組織を解析することにより証明した。

我々はこれまでの研究で、それぞれのプロセスに必須のタンパク質(特にFibulinファミリー分子とLTBPファミリー分子)があることを明らかにしてきた。本研究では、それらの生体内での働きを明らかにし、弾性線維の形成と維持、再生の分子機構を解明することにより弾性線維再生技術の基盤を作る。本年度は、エラスチン架橋酵素リシルオキシダーゼの活性化におけるFibulin-4の役割に重点を置いて研究した。エラスチン、コラーゲンなどは分子どうしの非共有結合だけでは必要な弾性や強度を生み出すことができず、分子どうしが共有結合で架橋される必要がある。架橋を行うのはリシルオキシダーゼという酵素であるが、リシルオキシダーゼ遺伝子欠損マウスとFibulin-4遺伝子欠損マウスの表現型が同じ(動脈と横隔膜破裂による周産期死亡)であり、リシルオキシダーゼとFibulin-4が直接結合することから、両者の機能的な関係を想定し、その分子機構を研究した。1.Fibulin-4のアミノ末端ドメインとリシルオキシダーゼのプロドメインが結合することをin vitro bindingアッセイで確認した。2.Fibulin-4欠損マウス組織が作るリシルオキシダーゼはSDS-PAGEでの流れ方が若干遅くなることを見いだした。3.Fibulin-4欠損マウス線維芽細胞が作るリシルオキシダーゼもSDS-PAGEでの流れ方が若干遅くなり、Fibulin-4の過剰発現により回復することを見いだした。4.Fibulin-4欠損マウス線維芽細胞が作るリシルオキシダーゼを精製したところ、活性が著しく低いことを見出した。すなわちFibulin-4はリシルオキシダーゼの活性そのものに必要であることが明らかとなった。弾性線維は、伸び縮みする組織(皮膚・動脈・肺など)に多くあって、その伸縮性を担う細胞外マトリックスである。皮膚のたるみだけでなく、心疾患予後悪化因子である動脈中膜硬化、高齢者の主要疾患である肺気腫も弾性線維の劣化・断裂が直接原因と考えられているため、弾性線維の劣化予防と再生は高齢化社会における極めて重要な課題である。しかし弾性線維のターンオーバーは極めて遅く、弾性線維の再生は困難と考えられてきた。弾性線維形成には(1)ミクロフィブリルという線維の束が形成され、(2)エラスチンタンパク質がミクロフィブリルに沈着し、(3)エラスチンどうしが架橋される、というプロセスがある。本年度は、昨年度に引き続き、エラスチン架橋酵素リシルオキシダーゼの活性化におけるFibulin-4の役割に重点を置いて研究した。架橋を行うのはリシルオキシダーゼという酵素であるが、リシルオキシダーゼ遺伝子欠損マウスとFibulin-
コラーゲン代謝異常の病因,病態解析

本研曼は代謝性結合織病、とくにコラーゲン代謝異常症の病態病因を解析して、欠損因子の同定に基づく病型分類を行い、適切な診断治療への道を拓き、さらに異常組織の解析から組織形成機構を解明することを目的に発足した。このため、初年度は各班員の従来の研究実績をふまえて疾患モデル動物の病態解析を行うとともに、測定困難な修飾酵素などの簡易微量測定法の確立に努めた。藤田班員は、骨形成不全症のモデルとしてODラットを用い、骨コラーゲン形成不全と骨梁形成不全の相関をカルシウム代謝酵素およびホルモンの動態との関連で調べた。新海班員はエーラスダンロス症候群20例につき皮膚、関節症状を提示するとともに欠損因子解析の現状にふれ、【I】型コラーゲンのプロα2鎖欠損例(本邦ではじめて)が報告された。同じ欠損因子をもつ患者第2例も見出され(永井)、ともに心血管障害を有することが指摘された。藤本班員は架橋形成不全(メンケス症候群)モデルとして、マキュラーマウス(劣性伴性遺伝)をとりあげ、架橋形成酵素、リジルオキシダーゼに必須の銅含量が肝、脳において著しく低値であること、9週令皮膚で塩可溶性コラーゲン量が正常より38%も高く、還元性架橋が低値であることを見出した。とくにリジルオキシダーゼ、コラゲナーゼ活性を体液、組織中で測定しようとするとき、前者は基質の面で、後者は阻害因子との結合により容易でない。このためともに精製酵素を用いたモノクローナル抗体の作成による免疫学的測定法の確立を目指し準備中である(早川、永井班員)、鈴木班員はマトリックス形成の分子アセンブリーを解析する系としてcmd/cmd軟骨細胞培養系をとり上げ、プロテオグリカン合成欠損が示す異常マトリックスの解析と、外部からのPG添加により補正が可能であることを示した。
日米における憲政政治-共和主義的公共哲学を中心として-

本研究においては、ハーバード大学のマイケル・サンデル(Michael Sandel)教授のDemocracy's Discontents-America in search ofa Public Philosophy(Belknap Press, 1996)の翻訳プロジェクトを進めると共に、マイケル・サンデル教授を招聘した国際シンポジウムを開催し、「憲政政治」についての世界的な水準での理論的検討を行なった。本研究プロジェクトは,これまでバラバラに理解されてきた「憲法」と「政治」を統合的に考察する「憲法政治」についての理論的な考察を行なうものである。特に,この分野で先駆的な研究を行っているハーヴァード大学のマイケル、サンテル教授の著したDemocracy'sDiscontentsーAmericainsearchofaPublicPhilosophy(BelknapPress,1996)の翻訳を進めている。現在のところ,初校の段階に至っており,順次公刊される予定である。また,平成20年度に予定されているマイケル、サンデル教授を招聘して行なう国際シンポジウムの打合せのために,アメリカに渡った。その結果として,極めて重要な知見を得ることができた。アメリカのワシントシD.C.では,コミュニタリアンのアミタイ、エッツィオーニが主導するジョージ、ワシントン大学のコミュニタリアン政策研究所InstitutionforCommunltarianPolicyStudies)を訪問し、アメリカのコミュニタリアニズムの最新の文献や資料を手にいれることができた。次に,ボストンにおいては,アメリカ憲政史の起源を辿り,自然環境保護に大きな影響を与えているラルフ,エマーソンや,ヘンリー、ディビッド、ソローなどの「超越主義」(transcendentarism)の理論家たちが大きな影響を与えていることを知ることになった。また、ハーヴァード大学においてマイケル、サンデル教授と会談し、平成20年度に行なう国際シンボシウムの企画の内容について意見を交わした。さらに、サンフランシスコにおいては、ロバート、N、ベラー教授と面会し、憲法政治における「市民宗教」(civilReligion)の役割についてご意見をいただいた。これらの準備を経たことから,平成20年度の国際シンポジウムは実りあるものになることが期待される。本年度においては、日本においてほとんど議論されてこなかったコミュニタリニズムについての研究会を行ない、サンデル教授を招聘するための準備を行ってきた。2008年9月21日には、研究会「コミュニズムからコミュニタリアニズム」(主催:21世紀COEプログラム「持続可能な福祉社会に向けた公共研究拠点」公共哲学部門対話研究会、共催:科学技術研究費基盤研究(C)「日米における憲政政治-」(代表:小林正弥、H19年度-H20年度)を開催した。この研究会には、三重中京大学の菊池理失教授と鈴鹿医療科学大学の青木孝平教授を招聴し、政治学と経済学の双方の観点からコミュニタリニズムを論じた。その報告の一部は、『公共研究』(5巻4号、2009年)に掲載されている。また、2009年3月20日にマイケル・サンデル教授を招聘した国際シンポジウム「アメリカの公共哲学:コミュニタリアニズムと共和主義」を開催した。このシンポジウムでは、マイケル・サンデル(ハーバード大学)教授を始め、井上達夫(東京教授)、五十嵐武士(東京大学)、菊池理夫(三重中京大学)、三浦信孝(中央大学)、伊藤洋典(熊本大学)、蕭高彦(中央研究院・台湾)、小林正弥(千葉大学)、中野剛充(千葉大学)が報告し、サンデル教授との直接的な対話を行い、有意義な成果を得ることができた。『民主主義の不満』の翻訳については、最終稿の段階にあり、出版を控えている状態にある。
ナノ化デキストラン・マグネタイトを用いた食道癌に対する誘導温熱免疫療法の開発

(1)誘導温熱療法併用樹状細胞腫瘍内局注療法の開発を行った。樹状細胞療法単独の場合に比較し、温熱療法を併用した場合において、より強力な抗腫瘍効果が確認され、また、分子生物学的評価にてヒートショックプロテイン発現変動が確認された。(2)ICGを付加したリポソームを作成し、光線力学的温熱療法の開発を行った。ナノ粒子の持つEPR効果により同リポソームが腫瘍に集積していることを確認し、また近赤外光にて腫瘍特異的加温が可能であることが確認された。申請者はこれまで食道癌細胞株を用いた動物実験において放射線照射によるヒートショックプロテイン(HSP)の発現増強と、それによる免疫反応の増強に成功した。今回、より汎用性の高い温熱療法を用いることでより効果的にHSP発現を増強させ、さらに強力な免疫療法の開発を引き続い行っている。特に本研究で独創的と考えている温熱療法における発熱量増加と抗腫瘍効果をもつ微小磁性体デキストラン・マグネタイト(DM)を併用する方法であるが、DMをリポソームに封入しナノ粒子化し、ナノ粒子のEPR効果によってDMを腫瘍に特異的に集積させることが確認できた。(1)誘導温熱療法併用樹状細胞腫瘍内局注療法の開発マウス担癌マウスモデルを用いて、樹状細胞腫瘍内局注による免疫療法治療単独による抗腫瘍効果の評価と、温熱療法単独における上乗せ効果およびLipo-DMによる誘導温熱療法による相乗効果の評価を行った。マウスの樹状細胞の腫瘍内局注は、温熱による樹状細胞のダメージを避けるため、すべての温熱療法の終了後、day7,8,9の連続3日間、1x106個/日とした。その結果、温熱療法を併用したマウスにおいて、樹状細胞による抗腫瘍効果が増強されることを確認した。(2)抗腫瘍効果の増強のメカニズムの証明上記の温熱療法による免疫療法の賦活効果、すなわち抗腫瘍効果増強の理論的裏付けとして、マウス扁平上皮癌細胞株SCCVIIおよび、ヒト食道癌細胞株T.TnとTE2を用いて抗腫瘍効果を増強するメカニズムの分子生物学的評価を行った。まずAbscopal Effectの中心的役割であるgp96(GRP94)の発現が誘導温熱療法によってどのように変化するかを凍結切片での蛍光染色、パラフィンブロック薄切切片での免疫染色にて確認したところ、温熱療法にておいて発現の増強がみられた。同様にin vitroにおいてもmRNAレベル(リアルタイムPCR)タンパクレベル(ウェスタンブロット)で評価したが、同じく発現の増強がみられた。【目的】我々はAbscopal Effectを応用し、治療局所のみならず全身の治療効果を誘導するために局所へ温熱療法を施行しその後樹状細胞を腫瘍内へ局注する治療モデルを作成し、その有用性を検討した。【方法】マウスの扁平上皮癌SCCVIIをC3Hマウスの大腿および胸部の皮下へ移植し担癌マウスを作成した。マウスはコントロールグループ、樹状細胞のみのグループ、温熱治療のみのグループ、樹状細胞と温熱療法の併用治療のグループの4つとした。樹状細胞は10の6乗個を腫瘍内へ直接注入する方法、温熱療法はオンコターム社のOncothermiaを用い、42度30分間の加温を行った。また、100ナノメートルのリポソームを作成し、EPR効果による腫瘍集積能を検討した。【結果】上記4つのグループの中で、腫瘍局所の縮小率は樹状細胞療法と温熱療法の併用のグループで最も顕著に見られた。また、治療範囲外である胸部の腫瘍の腫瘍増殖抑制効果も同様に樹状細胞療法と温熱治療の併用グループで最も大きかった。さらに、腫瘍近傍のリンパ節における細胞障害性T細胞の分画を見たところ、樹状細胞のみのグループに比べ温熱療法を併用した樹状細胞療法のほうがより顕著に増加していることが明らかになった。また、そのメカニズムとして温熱治療を加えることでヒートショックタンパクの1つであるgp96の発現が増加していることをRT-PCRで確認することができた。作成したリポソームにICGをラベル指、AVIS装置による測定で腫瘍への集積を確認できた。【まとめ】温熱療法は治療局所のみでなく、免疫療法である樹状細胞療法の効果を高める効果が認められた。これは温熱治療によりgp96の発現増強と、それを介したT細胞の活性化であり、免疫反応の賦活効果であることが示唆された。以上より、温熱療法と樹状細胞の併用療法は有用な治療法になる可能性が示唆された。1.誘導温熱療法併用樹状細胞腫瘍内局注療法の開発申請者はこれまで食道癌細胞株を用いた動物実験において、放射線照射によるヒートショックプロテイン(HSP)の発現増強と、それによる免疫増強に成功した。

今回、より汎用性の高い温熱療法を用いることでより効果的にHSP発現を増強させ、さらに強力な免疫療法の開発に成功した。担癌マウスモデルにおいて、樹状細胞腫瘍内局注による免疫療法単独群における抗腫瘍効果と、温熱療法単独を加えた群における抗腫瘍効果を比較した結果、温熱療法を併用することで樹状細胞局注療法の効果が増強されることが確認できた。これらの現象の理論的裏付けとして分子生物学的評価を行った。Abscpal Effectの中心的役割であるgp96が誘導温熱療法によってどのように変化するかを免疫染色、ウェスタンブロットにて確認したところ、発現の増強が観られた。このことから、温熱療法+樹状細胞腫瘍内局注療法は有用な免疫療法の手段になることが示された。2.ICG-リポソームによる光線力学的温熱療法の開発さらに、特に本研究で独創的と考えている点は、温熱療法として光線力学的に発熱量増強効果をもつICGをナノ粒子表面膜に埋め込んだICG-Liposome(ICG-L)の開発である。ICG-Lの水溶液に近赤外光を照射すると、濃度依存的に温度上昇がみられた。また、ICG-Lはナノ粒子のEPR効果によって腫瘍に特異的に集積することが確認できた。さらに、in vivoでの抗腫瘍効果について検討したところ、ICG-Lを投与した腫瘍が近赤外光によって強い抗腫瘍効果がみられた。腫瘍免疫本件研究の研究実施計画として、平成24年度の研究実施計画:(1)Lipo-DMの作成とEPR効果の確認、(2)Lipo-DMによる誘導温熱療法の増強効果についての検討、についてはほぼ予定通りの研究を行い、当初想定した結果が得られた。この結果については学術集会にて口演を行った後、英文論文を作成し現在投稿中である。また、平成25年度の研究実施計画:(3)誘導温熱療法併用樹状細胞腫瘍内局注療法の検討、(4)抗腫瘍効果の増強のメカニズムを科学的に証明する、についても、平成24年度同様順調に研究が進んでおり、これについても英文論文を作成し現在投稿中である。本研究の1年目は温熱療法と樹状細胞の併用療法の併用効果とそのメカニズムについて明らかにすることができた。また、本研究のテーマの一つであるEPR効果(enhanced permeability and retention効果)については、自作のリポソームにICGをラベルした。それをIVISは生体内の遺伝子発現やタンパク質の挙動を生きたまま体外からモニタリングすることを可能にした画期的な装置であるが、その装置を用いることにより担癌マウスにICGをラベルしたリポソームを静脈注射した後、腫瘍にICGをラベルしたリポソームが集積することを確認した。すなわち、自作のリポソームはEPR効果を持つことを確認することができた。アッセイ)、Th1/Th2バランスなどの免疫学的評価もあわせて行う。「免疫療法」を論ずるにあたって避けては通れない免疫逃避機構が本研究で考案した新規免疫治療でどのように変化するかもあわせて評価する。おもな免疫逃避機構関連物質(IL-6,IL-10,VEGF,TGF-&#61538;,PD-L1,SOCS,MHC-ClassI)の発現を評価するとともに、抑制性T細胞(Treg)の増減についてもFoxP3の免疫染色、フローサイトメトリーにて定量する。これらの免疫逃避機構を解明することで、さらなる免疫療法の新しい増強法開発への足掛かりを作り、次への研究へとつなげて行く。
ポリフェノール類の腸管吸収・代謝プロセスの可視化とin situ評価法の構築

本研究では、MALDI-MSイメージング法を基本技術として、ポリフェノール類の吸収・代謝動態を視覚的に網羅することを目的とした。まず、腸管内ポリフェノール類の可視化のためのMALDI-MSイメージング法の最適化を実施した。対象成分としては、非吸収性の機能性ポリフェノールであるtheaflavin-3'-O-gallate (TF3'G)および、そのモノマー構成単位であり腸管吸収可能なepicatechin-3-O-gallate (ECG)を用いた。申請者らがこれまでに開発したポリフェノールMALDI-MS検出のための新規マトリックス剤(Nifedipine)を用いることで、腸管組織内のECGが可視化され、さらにマトリックス添加剤としてフィチン酸を添加することで、そのシグナル強度の増強が確認された。本MALDI-MS条件を用いることで、Ussing Chamber透過試験後の小腸組織切片より、腸管透過過程のECGが検出され、頂膜側から側基底膜側への透過挙動が可視化された。また、本腸管MALDI-MS imaging法により、TF3`G透過試験後の小腸組織切片においてTF3'Gが頂膜側に局在することが可視化された。このことは、非吸収性ポリフェノールが一度、腸管組織内に取り込まれていることを初めて示すものであった。さらに阻害剤試験を用いたUssing Chamber透過試験において、ECGおよびTF3'Gともに、モノカルボン酸トランスポーター(MCT :阻害剤, phloretin)および有機アニオントランスポーター(OATP, Estron-3-sulfate)を介して腸管組織に取り込まれることが可視化された。MALDI-MSイメージング法を基本技術として、ポリフェノール類の吸収・代謝動態を視覚的に網羅する「ポリフェノール類の体内吸収・代謝プロセスの可視化とin situ評価法」の構築」を目的として、今年度は1腸管内ポリフェノール類の可視化のためのMALDI-MSイメージング法の最適化、および2各種阻害剤を用いた腸管取り込み経路の可視化を目標とした。それに対して、分析対象ポリフェノール類としてECGおよびTF3'Gを用いて、腸管透過過程(もしくは、取込過程)の当該ポリフェノールの可視化を達成し、両成分がMCTおよびOATPを介して腸管組織に取り込まれることを可視化するに至っている。本年度において確立した腸管in situ MALDI-MS imaging法を用いて、さらなるポリフェノール類の腸管吸収動態の可視化評価、各腸管部位でのポリフェノール類の吸収動態および腸管組織内での代謝挙動の可視化を目指す。本年度は、ポリフェノール類の体内吸収・代謝プロセスの可視化とin situ評価法の構築のため、対象成分をECGおよびTF3'Gに絞り、アッセイ系の構築を主として実施したため、その他の多様なポリフェノール類試薬の購入に至らなかった。また、小腸組織のうち、空腸に絞って検討を行ったことから、使用する動物個体数を制限することができた。

したがって、これら使用予定の経費については、次年度に繰越し、各種ポリフェノール類の透過挙動および代謝挙動の解明、さらには、各種腸管組織部位での挙動を可視化評価するために使用することで、さらに加速度的に研究を推進する予定である。
インターロイキン1のシグナル伝達機構の解析

インターロイキン1(IL-1)の細胞増殖抑制機構並びに耐性化獲得機構に関するIL-1のシグナル伝達機構について、ヒトメラノーマ細胞株A375を用い解析した。又、シグナル伝達に関与するI型IL-1レセプター(IL-1R)の発現機構をin vitro,in vivoにおいて解析した。1.IL-1の増殖抑制活性の作用機構IL-1Rを発現していない株A375-5にIL-1RcDNAをトランスフェクトさせ、IL-1R高発現株を用い解析した。その結果、IL-1処理により、ポリアミン合成酵素ODC活性が低下すること、ODCのmRNAに変化はないが蛋白量が減少すること、更にODCに結合し、ODC活性を抑制すると共に分解を促すアンチザイム(AZ)がIL-1により誘導されることが明らかとなった。2.IL-1に対する耐性化機構IL-1感受性株A375-6を長期培養中に耐性化したクローンを得、耐性化機構を解析した。耐性クローンはIL-1αを恒常的に産生しているので、感受性株にIL-1αの発現ベクターを、耐性株にIL-1αのアンチセンスの発現ベクターをトランスフェクトさせたが、いずれもIL-1に対する反応性に変化はみられなかった。従って、IL-1の発現のみでは耐性化には不十分であることが明らかとなった。ヒト線維芽細胞株TIG1を用い、I型IL-1Rの発現制御を解析したところ、チロシンキナーゼがIL-1Rの恒常的発現に関与していることが明らかとなった。又、マウスにエンドトキシンを投与したところ、肝臓で著るしいIL-1RmRNAの発現増強がみられ、それには、IL-1やIL-6等の内因性サイトカインが関与していることが明らかになった。IL-1レセプター(IL-1R)発現量が極めて少ないために,IL-1に抵抗性になっているヒト、メラノーマ細胞株(A375-5)にヒトI型IR-1R(TypeI)cDNAをトランスフェクトさせ、IL-1に感受性を獲得させたクローンを用い、IL-1の増殖阻害に至るシグナル伝達系を解析した。結果(1)、IL-1Rに対する抗体を用いたFACSにより高発現クローンを得、サブクRーンを得た。(2)このようにして得たサブクローンはIL-1RのmRNA発現量が、A375-5に比べて多かった。(3)、アイソトープラベルしたIL-1の結合実験から、トランスフェクタントは、多量のIL-1Rを細胞表面に発現していた。(4)、サブクローンは1L-1に対する感受性を獲得していた。(5)、IL-1に高感受性株を用い、IL-1で処理すると、経時的かつIL-1の量依存的にオルニチンデカルボキシラ-ザ(ODC)の活性が減少していた。(6)、また、活性と比例してODCの蛋白量の減少が認められた。(7)サブクローンのうちのいくつかは、IL-6も同時に産生していたが、IL-6の産生量とIL-1に対する感受性の間には相関が無かった。ヒト、線維芽細胞株を用い、IL-1RmRNAの安定性の機構について検討した。その結果、Tyrosine Kinaseの阻害剤、Herbimvcin.Genestatinで処理すると、HerbimycinはIL-1R mRNAを不安低下したが、Genestatinにはそのような活性が見られなかった。従って、Tyrのリン酸化よりも、むしろ細胞内の酸化還元状態が重要と思われる。マウスにエンドトキシンやIL-1を投与して、各臓器におけるIL-1R(TypeI)mRNAの発現量を調べた。その結果、肝臓において著しい増加が認められた。

IL-1に抵抗性ヒト.メラノーマ細胞株(A375-5)にヒトI型IL-1RcDNAをトランスフェクトさせ、IL-1に感受性を獲得したクローンを用い、IL-1の増殖阻害に至るシグナル伝達系を解析した。昨年までにIL-1処理により、ポリアミン合成酵素ODC活性が低下し、ODCの蛋白量も減少することが明らかとなった。本年度は以下のことが明らかとなった。(1)ODCのmRNA発現レベルは変化しなかった。(2)ODCに結合し、活性を抑制すると共に、ODCの分解を促すアンチザイム(AZ)のmRNA発現量が、IL-1処理により増加した。(3)AZ活性、(ODC活性の抑制)が、IL-1処理細胞の抽出液中に見出された。(4)AZの転写が増加した。(5)ヒトAZcDNAをクローニングし、AZのアンチセンスを発現させることにより、IL-1の増殖抑制活性とODCの活性低下が阻害された。従って、IL-1はAZの転写を増加させ、その結果ODCの分解が促進され、細胞内ポリアミン量が減少し、増殖が止まると結論できた。IL-1感受性クローンA375-6を長期培養することにより、IL-1に耐性化したクローンを得、耐性化機構を解析した。耐性クローンは、恒常的にIL-1αを産生しているので、感受性クローンにIL-1αの発現ベクターを、耐性クローンにIL-1αアンチセンス発現ベクターをトランスフェクトさせたが、いずれもIL-1に対する感受性に変化は見られなかった。従って、IL-1の発現のみでは耐性化には不十分であることが明らかになった。ヒト、線維芽細胞株TIG-1を用い、I型、IL-1R発現制御におけるチロシンキナーゼの関与について調べた結果、IL-1Rの恒常的な発現には、チロシンキナーゼが関与していることが明らかとなった。また、Herbimycinは、IL-1RのmRNAの不安定化を誘導し、mRNAの量を減少させることによってレセプター数を減少させること、Genestatinは、転写以後の過程を抑制していることが示された。マウスにエンドトキシンやIL-1を投与して、各臓器におけるIL-1R(Type I)mRNAの発現量を調べた。その結果、肝臓においてmRNA発現量の著しい増加が認められ、それは内因性のIL-1やIL-6が重要な役割を果たしていることが明らかになった。
ふり遊びにおけるメタ・コミュニケーション能力の発達

本研究の目的は遊びの<枠内>、<枠(枠組構成)>、および<枠外>発話を手がかりとしてふり遊び(pretend play)におけるメタ・コミュニケーション能力を発達的に検討することである。この目的のために、東京地区と京都地区の健常就学前児について、自然発生的なふり遊びにおいて産出されるテーマ数・種類、各テーマ内のエピソード数・命題数、および自他間のアイディア調整機能を年齢間で比較した。その結果、以下の点が明らかにされた。(1)生成された「ふり」のテーマ数については年齢間の差異が見られなかったが、3歳児で「ままごと」などの「家庭生活」を中心とするテーマが多いのに対して、5歳児では「パトカーを呼ぶ」などの「社会関係の」テーマも出現した。(2)各テーマ内のエピソード数については、5歳児が3歳児より若干多い傾向がみられた。1つのエピソード内に含まれる命題数は、5歳児において圧倒的に多く生成され、5歳児の「ふり」の内容がより詳細になっていることが判明した。(3)3歳児に比べて、5歳児に<枠内発話>が多く産出された。<枠内発話>における「転回」(仲間の遊びアイディアにそって次のアイディアを生成する)は、3歳児に比較して5歳児に頻繁に観察された。(4)京都地区の就学前児では、<枠内発話(セリフ)>をいう際に、方言ではなく共通語で述べることが年齢とともに飛躍的に増加した。(5)他者(人形)に主体性・能動性を付与する(人形を、あたかも意思をもっているかのように動かす)ことは、年齢とともに増加した。精神発達障害を持つ幼児には、「ふり」が発生しづらいことから、ふり前提となる保育者の「一致行動(模倣行動)」に着目して、6ヶ月間の自然観察をおこなった。その結果、ダウン症児では、保育者へ顔を向けたり、保育者と一致する行動が比較的頻繁にみられたが、自閉症児の反応傾向が低いことが判明し、自閉症児が「ふり」を苦手とするとの多くの研究結果との関連が示唆された。本研究は、〈遊びの枠内〉と〈遊びの枠外〉の発話と動作に現れるメタ・コミュニケーション能力の発達を、ごっこのテーマおよびその構成の複雑さの比較、テーマに関する知識量の比較、子どもの居住地域の比較(標準語との差異が大きい地域ほど、メタ的発話を際立たせることができる)、暦年齢および精神年齢の比較を通して、多角的・総合的に明らかにすることを目的としている。平成9年度は、東京都内の幼稚園2カ所、障害児施設1カ所、および京都市内の幼稚園1カ所において、幼児たちが自然発生的に自由に遊んでいる場面のVTR録画を収集した。いずれの幼稚園・施設においても暦年齢3歳・4歳・5歳の男児あるいは女児をターゲットとして、各ターゲット児を中心とする遊びのエピソードを20分間ずつ観察・録画・録音した。データ数が不足するため現在データ収集を継続中であるが、同時並行的に、すでに得られたVTR画像と音声を〈遊びの型〉、〈伝達スタイル〉、および新たに加えた〈表現の様式〉の3尺度に基づいて分析を続行している。〈遊びの型〉には「T(変換)」、「L(現実)」、「U(擬音、笑い等)」の3項目が含まれ、〈伝達スタイル〉には「よびかけ」、「提案」、「説明」、「転回」、「要求・命令・禁止」、「承認」、「否認」の7項目が含まれている。

〈表現の様式〉に含まれるのは、「せりふ」と「ふつうのnarration」の2項目である。本研究は、遊びの<枠内>、<枠(上)>、および<枠外>の発言と動作に現れるメタ・コミュニケーション能力の発達を、ごっこテーマの種類、テーマに関する知識、居住地域、暦年齢、性別の比較を通して、多角的・総合的に明らかにすることを目的としている。平成10年度は、東京地区健常幼児について、前年度に不足した幼稚園target児(3歳男女・4歳男女・5歳男女)について、資料収集の追加を完了した。(新たに東京都内の1幼稚園を加え、前年度と同様に自然発生的に発生した「ふり遊び」の場面を録音・録画した。)現在テープおこし作業と、テープおこしの済んだ資料の分析作業を続行中である。京都地区健常幼児についても、東京地区と同様の手続きによるVTR録画・録音の追加を完了し、資料の分析作業を続行中である。発達障害をもつ幼児については、資料収集・分析・まとめが完了した。精神発達障害児においては、「ふり」が発生しづらいことから、ふりの前提となる、保育者との「一致行動」(模倣行動)に着目した。東京都内にある心身障害福祉センター幼児部に通園する2歳3歳の幼児10名を、平成9年9月から平成10年2月までの6カ月間追跡観察(VTR録画・録音)し、比較的資料がそろっている4名(ダウン氏症児2名、自閉症児2名)の資料を分析したところ、ダウン氏症児では、保育者へ顔を向けたり、保育者と一致する行動が比較的頻繁に観察されたが、自閉症児の反応頻度は低いことが判明した。自閉症児は「ふり」を苦手とするとの研究結果が多く発表されていることとの関連が示唆された。
銅酸化物高温超伝導体の単結晶中の超音波の音速・吸収

1)Bi_2Sr_2CaCu_2O_<8+X>単結晶中の超音波の音速測定Bi_2Sr_2CaCu_2O_<8+X>単結晶中の超音波の音速を2重パルス重畳法により4Kから室温まで測定した。その結果、常伝導から超伝導への転移点でのC_<11>のソフトニングとそれに続く常伝導状態を上回る格子の硬化を観測した。これは在来の超伝導体にみられない現象である。ランタン系では広島大の藤田等により同様の現象が見い出され、その特異性が指摘されていた。しかしランタン系では超伝導転移と関連する構造不安定性が報告され、銅酸化物高温超伝導体の特徴と言えるか疑問があった。また、他の銅酸化物高温超伝導体単結晶では超伝導転移での音速変化は測定できた例がほとんどなかった。今回のビスマス系の測定はそれに継ぐものになる。しかも、大きな構造相転移やY123系にみられるCuO鎖がないなど2次的な問題の少ないビスマス系で見い出されたことで、これが銅酸化物超伝導体に一般的な電子-格子相互作用の特異性の一般化を示唆する。現在、音速の測定結果と単結晶作製について各1遍の論文を投稿準備するとともに高磁場中の測定を準備している。なお、試料は自らTSFZ法で作製したものである。測定システムは前年度、当科研費の補助も合わせて製作したものである。TSFZ法で作製した単結晶試料でのキャリアー密度制御のため、ガス・真空中での熱処理による酸素量制御を試行してきた。今年度、高温での熱処理中の電気抵抗変化をin-situ測定するなどして劈開した小型単結晶での転移温度制御に成功した。しかし、得られた緩和時間に対する知見から超音波測定可能な試料サイズでは均一な処理をするのは困難であることがわかった。現在はY置換単結晶試料の作製によるキャリアー密度制御に方針を変更し、試行している。また、酸素量制御した試料については、磁気抵抗から擬ギャップの対称性を探る研究を開始した。(1)超音波測定系の製作と銅酸化物高温超伝導体単結晶の予備測定本年度は、超音波2重パルス重畳法による音速の精密測定とパルスエコー法による吸収の同時測定システムを作製を重点とした。現在、我々の作製したTSFZ法によるビスマス2212銅酸化物高温超伝導体の単結晶を用いて、予備測定と各種パラメーターの最適化を進めている。音速・吸収の値からは良質な結晶であり、超音波測定は可能であることがわかった。一方で、高精度の測定は、かなりの測定パラメーターの最適化を行うか、単結晶の質のさらなる改善が必要とわかった。残念ながら今年度は温度変化測定、磁場変化測定まで至らなかった。(2)酸素量制御によるキャリアー密度制御単結晶試料中の酸素量を制御するための電気炉とガス雰囲気制御系を製作した。酸素量制御は、文献値の温度、酸素分圧を用い試行したが、制御できていない。結晶の質に大きく依存すると考え、我々の作製した試料に合わせた条件を模索している。(3) TSEZ法による単結晶作製の改善通常の成長法に加え、種結晶とネッキングを試行した。その結果、大形の単結晶が得られた。ネッキングから予想される溶融帯の最適組成からのズレが、結晶成長の安定性や育成結晶の質に、大きな悪影響を与えると懸念していたが、X線回折、電気抵抗測定では大きな悪影響は無い。この点に関しては超伝導特性や組成分析、構造解析などから、さらに詳しい評価の途中である。現在はY置換

単結晶試料の作製によるキャリアー密度制御に方針を変更し、試行している。また、酸素量制御した試料については、磁気抵抗から擬ギャップの対称性を探る研究を開始した。
統合型マイクロデバイス技術による疾患の高性能遺伝子診断システムの開発

本研究では、統合型マイクロデバイス技術による高性能遺伝子診断システムを開発するために研究を進め、下記のような成果を得た。1.石英チップ上に作成したマイクロチャンネル中を泳動するDNAの泳動挙動およびダイナミクスを直接観察するための蛍光顕微鏡型検出システムを開発した。この装置によって得られた結果より、DNAのサイズと泳動挙動およびDNAのダイナミクスとの関連を高分子物理的に考察し、その関係を定量的に評価できる理論を確立し、マイクロチップ上でのDNA解析の最適条件を決定した。2.上記の直接観察および確立した理論を基に、1000塩基対までのDNA断片を1分以内に解析できる条件を確立した。このシステムを用いて、疾患原因遺伝子における変異・多型を検出するシステムを開発し、このシステムを用いた場合の変異・多型検出の能力・速度・精度などを検討し、高速・高精度な疾患の遺伝子診断システムとしての可能性と限界を評価した。3.さらに、マイクロチャンネルを100本程度並列化したキャピラリー中を泳動するDNAを全て同時に高感度検出できるシステムを開発した。また、PCR用の小型反応容器を作成し、同一チップ上にPCR反応をも可能にする回路を組み込んだ統合型マイクロデバイスを試作した。これを用いて、異なる種類の疾患原因遺伝子の変異・多型解析を同時に行い、疾患の遺伝子診断における速度・精度を検討した。これらの成果は、疾患の遺伝子診断を高速化・高精度化する上で重要な貢献をなすものである。以上の研究成果を基礎に、さらに、今後は、システムを発展させて、多数の疾患関連遺伝子を同時に解析できるシステムを開発するために、同一チップ上にPCR反応回路をも組み込んだ統合型マイクロデバイスシステムを完成させ、多数の遺伝子の多型を同時に検出できる疾患の超高速遺伝子診断システムを確立するための検討を進める予定である。本研究は、がん、生活習慣病、痴呆症などの早期診断・早期治療をめざして、小型高性能DNA解析装置であるマイクロチップ化キャピラリー電気泳動(MC-CE)と高性能遺伝子増幅法であるPCR法を有機的に組み合せた統合型マイクロデバイスを開発し、従来法の数百倍の能力を有する疾患の次世代超高性能遺伝子診断システムを開発することを目的とする。1.石英基板(チップ)上に単一の分離用マイクロチャンネルを作製し、このマイクロチャンネルに電圧を印加する装置を作製し、マイクロチャンネル中を泳動するDNAを検出するためのレーザー誘起蛍光イメージ解析システムを開発した。この装置により、種々の条件を変化させて、DNAを検出し、DNAのサイズと泳動挙動との関係を定量的に評価できる理論を確立した。さらに、MC-CEによるDNA断片の解析を行い、1000塩基対までのDNA断片を1分以内に解析できる条件を確立した。2.確立した解析条件に従って、遺伝子の変異・多型検出用マイクロチップを作製した。このマイクロチップとレーザ誘起蛍光イメージ解析システムを組み合わせることにより、マイクロチップ化キャピラリー電気泳動(MC-CE)を開発し、単一の疾患原因遺伝子におけるの変異・多型を検出した。これらの疾患は、遺伝子診断を高速化・高精度化する上で重要な貢献をなすものである。以上の研究成果を基礎に、今後は、さらに、複数のマイクロチャンネル中を泳動するDNAを同時に検出できるマイクロチップ化キャピラリーアレイ電気泳動システムを開発し、多数のヒト遺伝子の多型を同時に検出できる超高速遺伝子診断システムを確立するための検討を行う。本研究は、小型高性能DNA解析装置であるマイクロチップ化キャピラリー電気泳動(MC-CE)と高性能遺伝子増幅法であるPCR法を有機的に組み合せた統合型マイクロデバイスを開発し、従来法の数百倍の能力を有する疾患の次世代超高性能遺伝子診断システムを開発することを目的とする。1.石英チップ上にマイクロチャンネルを作製し、マイクロチャンネル中を泳動するDNAの泳動挙動およびダイナミクスを直接観察するための蛍光顕微鏡型検出システムを開発した。