hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
末梢血を用いた腫瘍由来の染色体不安定性の検出:新たなバイオマーカーの開発

同意を得た婦人科悪性腫瘍に罹患した患者で術前の血清より末梢血cell-free DNA中のCNVを解析する。64例中4例に全ての、19例で部分的に染色体にCNVを検出した。悪性腫瘍を有する患者のcell-free DNAを解析することにより悪性腫瘍を検出することにつながると考えられた。本研究では癌罹患患者の血液内に浮遊する染色体不安定性による遺伝子産物の測定を行い、新しい癌バイオマーカーの検索を行なうことを目的としている。NIPT(無侵襲的出生前遺伝学的検査(Noninvasive prenatal genetic testing))コンソーシアムにて採取され測定された約12000人の血液より異常な遺伝子産物を確認し得た3人より腫瘍性病変が確認されている。NIPTで採取される血液は妊婦の血液であり癌罹患患者を対象としたものではない。そこで、本研究では癌に罹患していることが判明している患者、癌が疑わしい患者、前がん状態にある患者の血液より同様の測定をすることで癌バイオマーカーとなりうる遺伝子産物の測定を行ない、特定する事を目的とする。対象疾患は子宮体癌(含、子宮内膜増殖症)、子宮頸癌(含、子宮頸部異形成)、卵巣癌(含、境界悪性腫瘍)である。サンプル(血液)の採取は、治療開始前(手術・放射線治療・化学療法など)、治療中、治療後に採取する。平成27年度は当院IRB承認後、遺伝子研究のための血液採取の同意の取れた患者からサンプルの採取を開始した。サンプルの保存やデータ管理の方法を構築し患者の同意から検体採取までがスムーズに進むように環境整備を行った。現在までにMPS法による解析を28名に開始し結果を検証中である。サンプル保存やデータ管理の基盤作りに時間を要したため検体回収開始が遅れたたため当初予定していた数には及ばない。遺伝子解析も開始はしているが、まだ検体数が少ないために評価は平成28年度以降に検体数が増加した状況で行う予定である。IRBへの申請・承認に時間を要し、検体の保存やデータの管理方法の構築にも時間を要したため、検体採取の開始時期が予定よりも遅れた。そのため全体として平成27年度に採取できた検体の数が少なくなった。遺伝子解析は少しずつ開始しているものの評価を行なうには検体数が少ないため未だ評価はできていない状況である。染色体不安定性を持つ腫瘍細胞に由来するDNAが細胞崩壊に伴い末梢血中に放出される。末梢血cell-free DNAを網羅的に次世代シークエンサーで解析する(MPS法)ことで、担癌状態の患者の染色体レベルでのDNA量の変化を捉えることが可能かを検討する。婦人科悪性を疑う患者を対象に、術前に採血し、それをMPS法で解析する。どのような症例で染色体不安定性を持つ腫瘍細胞が存在するかを明らかにすることで、腫瘍マーカーとしての応用の可能性も解明することを目的とした。同意を得た婦人科悪性腫瘍に罹患した患者の血清より、出生前検査で使用されている方法を用いて、末梢血cell-freeDNA中のCNV(copy number variations)を検出する。現在までに64名の患者から血清を得た(卵巣癌:37例、子宮体癌:23例、子宮頸癌:4例)。64例中4例に全ての染色体においてCNVを検出することができた(卵巣癌stageIII:2例、子宮体癌stageIII:1例、子宮頸癌stageIII:1例)。64例中19例で部分的に染色体でCMVを検出することができた(卵巣癌:10例、子宮体癌:9例、子宮頸癌:0例)。婦人科悪性腫瘍患者においてcell-freeDNA中のCNVを検出できることが明らかになった。しかしながら、現時点で感度は未だ低く、今後症例の集積及び解析を追加し検討する必要がある同意を得た婦人科悪性腫瘍に罹患した患者で術前の血清より末梢血cell-free DNA中のCNVを解析する。患者同意を得るとともに検体の回収に努める。また、検体の解析を同時に進行させ発表・論文作成に着手する。婦人科腫瘍本年度は研究準備に時間がかかり、検体の採取等の実務的な作業の開始が当初の予定より遅れたため次年度使用額が生じた。本年度予定していた検体の回収を急ぎ、検体回収後は順次解析を行っていく。解析終了後は学会発表・論文作製を行なう予定である。解析及び学会発表・論文校正に費用がかかるものと見込まれる。
網膜色素上皮障害モデルの作製

検眼鏡的に網膜に異常のないことを確認した成熟有色家兎を用い、全身麻酔下に実験を行った。硝子体切除を行った後に、ガラス製毛細管を網膜表面に当て、小量の眼内潅流液を網膜下に注入することにより網膜剥離を作製し、網膜切開を施し、神経網膜の下でシリコンブラシを用いて網膜色素上皮を定量的に擦過、除去した。術直後、7日後、14日後、21日後、28日後に眼底写真撮影、蛍光眼底撮影を行った。光学顕微鏡、走査型電子顕微鏡、透過型電子顕微鏡により組織学的に観察した。光学顕微鏡では、障害部位の網膜色素上皮細胞の細胞数をカウントし、その増加の状態を観察した。b-FGF投与群として、1mugのb-FGFを術直後に硝子体腔に注入し、細胞数の増加状態を非投与群と比較した。再生している網膜色素上皮細胞は28日目迄は、ほぼ直線的に増加しており、手術後28日の時点で、細胞数は非手術眼の約4倍となっていた。走査型電子顕微鏡観察では、14日目までに欠損部は網膜色素上皮細胞で覆われていた。透過型電子顕微鏡により、再生網膜色素上皮細胞の胞体は小型で、色素顆粒に分布に変化が観察された。術7、21日後の時点で、細胞数は、b-FGF投与群が非投与群に対し有意に増加していた。家兎を用いた実験系では比較的早期に網膜色素上皮の修復が行われた。網膜色素上皮障害眼での網膜色素上皮の再生過程の定量に初めて成功した。b-FGFは、本実験系において網膜色素上皮の修復を促進することが判明した。この網膜色素上皮障害モデルは、網膜下病巣の除去手術後の網膜色素上皮の動態の観察や、治療法を検索するために有用であると考えられた。
先天性心疾患における心肥大から心筋障害への進展に対する冠循環の関与

近年、先天性心疾患の治療成績は著しく向上したが、未だ術前・術中・術後の管理で難渋する例が多い。また、手術が成功したとしても術後に不可逆的心筋障害が残存し、不整脈・心機能障害のためQOLが障害される例も多い。従来から肥大心では容易に心筋虚血から心筋障害へ進展することが指摘されており、先天性心疾患においても同様の病態が存在することが危惧される。そこで本研究では、先天性心疾患における心肥大・心筋障害あるいは心機能障害の発現機序における冠循環の関与と意義を解明するため、明らかな心肥大を呈するチアノーゼ性先天性心疾患の術前・術後の患児28例(フアロー四徴症19例、大血管転位症2例、両大血管右室起始症7例)(年齢:5.1±4.9歳)を対象として冠血流動態および予備能を血流速動態の面から検討した。術前・術後の心臓カテーテル検査時に、冠動脈内へdoppler guidewire(Flowire【□!R】,Cardiometrics社製,USA)を挿入して、各冠血管血流速波形を記録。その波形から平均血流速および拡張期収縮期血流速比から冠血流量および血流プロファイルを定量的に評価。また、各血管内にadenosine triphosphate(ATP)1.0μg/kgを注入し、血流速パラメーターの変動および血流速の変動比から、冠血流量増加度(冠末梢血管拡張能=冠血流予備能)を算出し検討した。その結果、術前例(16例)では、逆流血流の出現・冠血流プロファイルの異常・冠血流予備能の低下、など冠循環動態異常が全例でみられ、冠血管床での微小循環障害あるいは心筋コンプライアンス低下の存在が示された。一方、術後例(12例)では術前例に比して冠循環異常は統計学的に明らかに低頻度であった。また、同一症例(4例)での術前・術後の評価から、術後に冠循環・予備能の改善が見られるものの、乳児期手術であってもその改善には数年(2-3年以上)を要することが示された。この結果から、より早期の外科手術による負荷軽減が冠循環の改善に効果的であることが示唆された。また、姑息術のみの年長児例(今回の対象例では10歳以上)では冠循環異常が残存しており、加齢による冠循環異常の不可逆化ならびに心筋障害の進展の可能性が危惧される。本研究では、先天性心疾患における心肥大・心筋障害と心筋虚血の因果関係を明らかとするため、心肥大を伴う各種先天性心疾患における冠血流動態および冠血流予備能を血流速動態の面から検討した。平成12年度においては、診断および病態評価のために心臓カテーテル検査を施行し、本研究に対して承諾のえられたチアノーゼ性心疾患16例(ファロー四徴症13例、大血管転位症1例、肺動脈閉鎖症1例、両大血管右室起始症1例)(年齢:4.0±3.8歳)を対象とした。

心臓カテーテル検査終了後、0.018inch dopplerguidewire Flowire【□!R】,Cardiometrics社製,USA)を左前下行枝(LAD)と右冠動脈(RCA)に挿入して、各血管での血流速波形を記録。ついで、ATP(1.0μg/kg)冠注負荷による冠血流予備能を検討した。その結果、LADでは16例中5例(31%)で、RCAでは16例中8例(50%)で収縮期における明らかな逆流シグナルが見られた。拡張期収縮期の血流速比から血流プロファイルをみたところ、5歳以下の例ではRCAでは12例中8例(67%)、LADでは12例中7例(58%)に異常が見られたが、6歳以上の例での異常出現率はRCAで4例中3例(75%)と同様に高かったものの、LADでは4例中1例(25%)にすぎなかった。次に、5歳以下の例ではRCAで12例中9例(75%)、LADで8例(67%)に冠血流予備能の低下がみられたのに対して、6歳以上の例ではLADで4例中2例(50%)に低下がみられたものの術後の3例ではRCAでは正常であった。以上の通り、心筋肥大を呈する先天性心疾患では、逆流血流の出現、拡張期と収縮期での冠血流プロファイルの異常、および冠血流予備能の低下、などがみられ、冠血管床での微小循環障害の存在が示された。また、術後の症例では冠予備能の改善がみられ、早期の外科手術による負荷軽減が冠循環の改善にも効果的であることが示唆された。平成13年度では症例を重ねて年齢および術前後での推移を含めて更に検討を続けていく予定である。近年、先天性心疾患の治療成績は著しく向上したが、未だ術前・術中・術後の管理で難渋する例が多い。また、手術が成功したとしても術後に不可逆的心筋障害が残存し、不整脈・心機能障害のためQOLが障害される例も多い。従来から肥大心では容易に心筋虚血から心筋障害へ進展することが指摘されており、先天性心疾患においても同様の病態が存在することが危倶される。そこで本研究では、先天性心疾患における心肥大・心筋障害あるいは心機能障害の発現機序における冠循環の関与と意義を解明するため、明らかな心肥大を呈するチアノーゼ性先天性心疾患の術前・術後の患児28例(ファロー四徴症19例、大血管転位症2例、両大血管右室起始症7例)(年齢:5.1±4.9歳)を対象として冠血流動態および予備能を血流速動態の面から検討した。術前・術後の心臓カテーテル検査時に、冠動脈内へdoppler guidewire(Flowire【□!R】,Cardiometrics社製,USA)を挿入して、各冠血管血流速波形を記録。その波形から平均血流速および拡張期収縮期血流速比から冠血流量および血流プロファイルを定量的に評価。また、各血管内にadenosine triphosphate(ATP)1.0μg/kgを注入し、血流速パラメーターの変動および血流速の変動比から、冠血流量増加度(冠末梢血管拡張能=冠血流予備能)を算出し検討した。その結果、術前例(16例)では、逆流血流の出現・冠血流プロファイルの異常・冠血流予備能の低下、など冠循環動態異常が全例でみられ、冠血管床での微小循環障害あるいは心筋コンプライアンス低下の存在が示された。一方、術後例(12例)では術前例に比して冠循環異常は統計学的に明らかに低頻度であった。また、同一症例(4例)での術前・術後の評価から、術後に冠循環・予備能の改善が見られるものの、乳児期手術であってもその改善には数年(2-3年以上)を要することが示された。この結果から、より早期の外科手術による負荷軽減が冠循環の改善に効果的であることが示唆された。また、姑息術のみの年長児例(今回の対象例では10歳以上)では冠循環異常が残存しており、加齢による冠循環異常の不可逆化
環状リゾホスファチジン酸に基づく機能性脂質の創製と機能解析

環状リゾホスファチジン酸(cPA)は生体内に普遍的に存在するリン脂質の一種である。従来はリゾホスファチジン酸(LPA)がリン脂質メディエーターと考えられてきた。本申請者らはLPAとcPAがともにリゾホスファチジルコリン(LPC)から酵素的に生成され、さらに両者は相反する生理作用を示すことを明らかにしてきた。これらの事実はLPAとcPAがカップルした情報伝達系が存在することを示唆している。本研究は、この未解明の情報伝達系を解明することを目的とし、そのための第一歩としてcPAの生体内標的タンパク質を探索・特定することを試みた。本年度は、まず初めに3-O-カルバ誘導体、および2-O-カルバ誘導体の合成を行った。3-O-カルバ誘導体は既に合成法を確立しており、生物活性評価の比較のため、種々のアシル側鎖を導入した類縁体の合成を行った。また、2-O-カルバ誘導体に関しては、リパーゼを用いた不斉アシル化を利用して光学活性対の合成を行った。また、分子プローブとしては、ビオチンを導入した分子プローブの合成を試みた。最後に環状リン酸化を行う方法では目的を達することができなかったが、アジドを末端に有するリン脂質とアセチレンを末端に有するビオチン誘導体の環化付加によって目的の化合物を合成することができた。今後は本分子プローブを用いて分子標的を探索する計画である。一方、カルバ誘導体がLPAの産生を促進するAutotaxinの活性を抑制することを新たに見出した。LPAの産生は癌細胞の浸潤を誘導することが知られているので、本結果はcPAおよびカルバcPAの癌の浸潤抑制、転移抑制のメカニズムの一つであることを示唆するものと捉えることができる。
真核生物の染色体DNA複製の試験管内再構成と、複製開始制御機構の解明

本研究では、真核生物のDNA複製開始反応において中心的な役割を果たすOrigin recognition complex(ORC)に変異を導入し、再複製開始反応抑制機構の分子機構を解明しようとしたものである。モデル生物である出芽酵母では、CdkによるORCのリン酸化が再複製反応の抑制に関与することが既に分かっている。そこで、ORCのリン酸化されるサブユニットであるOrc2pおよびOrc6pのCdkリン酸化のコンセンサス配列に変異を導入し、リン酸化状態を模倣した変異蛋白質(Orc2-6DpおよびOrc6-4Dp)を発現するplasmidを構築し、これらを細胞に発現させた場合の機能を検討した。Plasmid shuffling法によってOrc2-6Dpの細胞内機能を検討したところ、この変異蛋白質は細胞内で機能しないことが分かった。Orc2-6Dpの細胞内安定性は野生型Orc2pと変わらなかったので、Orc2-6Dpが機能しない原因は分解に因っているのではないことが分かった。私は、Orc2-6Dpが通常の開始反応を抑制している可能性を考えている。また、同様な解析をOrc6-4Dpについても行ったところ、この変異蛋白質は細胞内で機能した。すなわち、Orc6pのリン酸化は、通常の開始反応を抑制しないことが示された。これまで、ORCのリン酸化は、もっぱら再複製反応の抑制に関与すると考えられてきたが、リン酸化されるサブユニットによって開始反応に対する役割が異なることが示唆された。遺伝情報を正確に子孫へ伝達する為に、染色体DNA複製反応は一回の細胞周期に一度だけ行われるように、厳密に制御されている。この制御において中心的な役割を果たしているのが、複製開始蛋白質の活性制御である。遺伝学的には、ATP結合能を欠損したOrc5pを発現する株(orc5A株)の温度感受性が、ORC4遺伝子によって抑圧されることを見出した。Orc4pを過剰発現したorc5A株では、過剰発現していない時に見られたORCの分解が抑制された。更にYeast-two hybrid法によってOrc5pのATP結合領域がOrc4pと結合することが示唆された。以上から、Orc5pのATP結合はOrc4pを介して、ORCの構造を安定化すると考えられた。一方生化学的に、ATP結合能を欠損したOrc1p或いはOrc5pから構成される変異ORCと、野生型ORCのATP結合能を比較した結果、Orc5pのATP結合がOrc1pのATPに対する親和性を高める可能性を示した。これまでにOrc4pがOrc1pのATP結合に対して補助的に働くことが示唆されているので、ATPと結合したOrc5pはOrc4pとの結合を介してqrc1pのATP結合能を変化させ、複製開始反応に関わるORCの活性を変化させている可能性が考えられた。染色体DNAを過不足無く子孫に伝達するために、DNA複製反応は一回の細胞周期に一度だけ起こるように厳密に調節されなくてはならない。したがって、複製開始反応の調節機構の解明は大変重要である。出芽酵母のDNA複製反応が開始するためには、Origin recognition complex (ORC)と呼ばれる6サブユニット構成(Orc1p-Orc6p)の蛋白質複合体が複製開始点(origin)に特異的に結合する必要がある。この特異的な結合にはATPが必須であり、これまでにOrc1PおよびOrc5pがATPと結合すること、およびOrc1pはATPase活性を持つことも報告されている。しかしながら、ORCにADP結合活性があるかどうか、およびATPase活性の生理的な役割は不明であった。そこで私はATPと結合する2つのサブユニットの一方だけATP結合活性を欠損している変異ORC(ORC1A、およびORC5A)を精製し、これらのADP結合活性を生化学的に解析した。その結果私は、Orc5pはADPと結合するが、Orc1pはADPとほとんど結合しないこと、およびこれらのADP結合はATP結合に比べ非常に不安定であることを見出した。また、野生型ORCを用いた検討から、ADP結合型ORCはATP結合型ORCとは異なりoriginへの特異的な結合を示さないことを明らかにした。以上から私はORCのATPase活性が複製開始反応を調節する可能性を考えている。すなわち内在性ATPaseがORCに結合したATPをADPに加水分解すると、origin DNAからORCが解離して複製開始反応が抑制される可能性、および、ORCのADP結合は不安定なので、ORCに結合したADPは速やかにATPと置換し、再びORCがoriginに結合して複製開始反応の待機状態になる可能性である。

Orc2-6Dpの細胞内安定性は野生型Orc2pと変わらなかったので、Orc2-6Dpが機能しない原因は分解に因っているのではないことが分かった。私は、Orc2-6Dpが通常の開始反応を抑制している可能性を考えている。また、同様な解析をOrc6-4Dpについても行ったところ、この変異蛋白質は細胞内で機能した。すなわち、Orc6pのリン酸化は、通常の開始反応を抑制しないことが示された。これまで、ORCのリン酸化は、もっぱら再複製反応の抑制に関与すると考えられてきたが、リン酸化されるサブユニットによって開始反応に対する役割が異なることが示唆された。
小児肥満と喘息に共通して関与するアディポサイトカイン等の検討：出生コホート研究

本研究は、出生前向きコホートを用いて、生後早期の過剰な体重増加や肥満が学童期・青年期の喘息を増加させるかを明らかにする。さらに、出生時・学童期・青年期の3時点でのアディポサイトカイン等が小児肥満と喘息に共通して関与するか明らかにする。本研究により小児肥満と喘息が共通して発症するメカニズムを解明すると共に、著しく増加の一途をたどる喘息・肥満の予防医学に貢献する。
チャの自家不和合性遺伝子産物の分子的解析

チャの栽培品種は配偶体型自家不和合性を有し,その不和合性は単一遺伝子座の複対立遺伝子(S遺伝子)によって制御されている.本研究は,チャの雌蕊において特異的に発現している蛋白質を同定し,その蛋白質をコードする遺伝子の解析などを通して,チャが属するツバキ科の自家不和合性の分子生物学的機構を解明することを目的としている.数品種のチャの雌蕊から抽出した粗蛋白質を2次元電気泳動で分析し,品種間で等電点や分子量に関して多型を示す2種類の蛋白質スポット(AおよびB蛋白質)を検出した.A蛋白質スポット(pH9,ca.18kDa)については,電気泳動ゲルからPVDF膜に転写し,プロテインシーケンサーによってN末端アミノ酸配列を明らかにした.このアミノ酸配列をもとにdegenerated primerを合成し,このプライマーと雌蕊mRNAを用いて3'-RACEによるRT-PCRを行なった.このPCR断片をプローブとして,雌蕊cDNAライブラリーのスクリーニングを行ない全鎖長のcDNAクローンを得た.その塩基配列を解析した結果,タバコのPR-1遺伝子と約40%の相同性を認められ耐病性関連遺伝子であることが明らかになった.また,B蛋白質スポット(pH6、15kDa)についても上記の蛋白質と同様にN末端アミノ酸配列を調べたが,N末端がブロックされているためデータを得ることができなかった.そこでこの蛋白質をリシルエンドペプチダーゼで消化した後,4個のペプチド断片についてアミノ酸配列を明らかにした.これらのアミノ酸配列データをもとにホモロジー検索を行なったところ,種々の植物からクローニングされているGlycine-rich RNA-binding Proteinと高い相同性が認められた.この蛋白質については,全鎖長のcDNAクローンの解析や遺伝子発現パターンの分析などを行ない,その構造と機能を今後明らかにしたいと考えている.以上の研究結果から,チャの雌蕊でメジャーに発現している2種類の蛋白質が明らかになったが,自家不和合性との関連性については今後さらに検討する必要がある.チャの栽培品種は配偶体型自家不和合性を有し,その不和合性は単一遺伝子座の複対立遺伝子(S遺伝子)によって制御されている.本研究は,チャの雌蕊において特異的に発現している蛋白質を同定し,その蛋白質をコードする遺伝子の解析などを通して,チャが属するツバキ科の自家不和合性の分子生物学的機構を解明することを目的としている.数品種のチャの雌蕊から抽出した粗蛋白質を2次元電気泳動で分析し,品種間で等電点や分子量に関して多型を示す2種類の蛋白質スポット(AおよびB蛋白質)を検出した.A蛋白質スポット(pH9,ca.18kDa)については,電気泳動ゲルからPVDF膜に転写し,プロテインシーケンサーによってN末端アミノ酸配列を明らかにした.このアミノ酸配列をもとにdegenerated primerを合成し,このプライマーと雌蕊mRNAを用いて3'-RACEによるRT-PCRを行なった.このPCR断片をプローブとして,雌蕊cDNAライブラリーのスクリーニングを行ない全鎖長のcDNAクローンを得た.その塩基配列を解析した結果,タバコのPR-1遺伝子と約40%の相同性を認められ耐病性関連遺伝子であることが明らかになった.また,B蛋白質スポット(pH6、15kDa)についても上記の蛋白質と同様にN末端アミノ酸配列を調べたが,N末端がブロックされているためデータを得ることができなかった.そこでこの蛋白質をリシルエンドペプチダーゼで消化した後,4個のペプチド断片についてアミノ酸配列を明らかにした.これらのアミノ酸配列データをもとにホモロジー検索を行なったところ,種々の植物からクローニングされているGlycine-rich RNA-binding Proteinと高い相同性が認められた.この蛋白質については,全鎖長のcDNAクローンの解析や遺伝子発現パターンの分析などを行ない,その構造と機能を今後明らかにしたいと考えている.以上の研究結果から,チャの雌蕊でメジャーに発現している2種類の蛋白質が明らかになったが,自家不和合性との関連性については今後さらに検討する必要がある.本研究は,チャにおける自家不和合性の遺伝子型が明らかな品種ならびに自家和合性突然変異体などを実験材料として,雌蘂ならびに雄蘂における自家不和合性遺伝子(S遺伝子)産物の同定とその分子生物学的解析を行ない,ツバキ科の自家不和合性の分子機構を解明することを目的としている.本年度は,雌蘂におけるS遺伝子産物の同定のために,抽出した花柱蛋白質の2次元電気泳動を行なった.その結果.供試したチャの4品種において分子量が18.5kDに相当する塩基性蛋白質に多型が認められた.この蛋白質のN末端アミノ酸配列を解析した結果,タバコのPR-1蛋白質(Pathogenesis-related protein)と高い相同性が認められた.さらに.チャ品種"やぶきた"では2種のPR-1様蛋白質が発現しており,これらのN末端アミノ酸配列は完全に一致しており,高度に保存されていることも明らかとなった.雌蘂の発育ステージにおけるこれらPR-1様蛋白質の発現を調べた結果,開花前3日以降の雌蘂で発現することが示された。

これらの結果から,チャの雌蘂で発現するPR-1様蛋白質は成熟花柱において生理的な機能を担っているものと推察される.PR-1様蛋白質の全アミノ酸配列を明らかにしその生理的役割を明らかにするため,花柱からRNAを抽出し逆転写酵素によりcDNAを合成した後,cDNAライブラリーを構築した.また,PR-1様蛋白質のN末端アミノ酸配列にもとずいて,オリゴヌクレオチオドの合成を行なった.今後,この合成DNAをプローブにして花柱cDNAライブラリーのスクリーニングを行ない,得られた全鎖長の塩基配列の解析やアミノ酸配列の推定ならびその遺伝子発現の解明など分子生物学的解析を行なう予定である.チャの栽培品種は配偶体型自家不和合性を有し,その不和合性は単一遺伝子座の複対立遺伝子(S遺伝子)によって制御されている.本研究は,チャの雌蕊において特異的に発現している蛋白質を同定し,その蛋白質をコードする遺伝子の解析などを通して,チャが属するツバキ科の自家不和合性の分子生物学的機構を解明することを目的としている.数品種のチャの雌蕊から抽出した粗蛋白質を2次元電気泳動で分析し,品種間で等電点や分子量に関して多型を示す2種類の蛋白質スポット(AおよびB蛋白質)を検出した.A蛋白質スポット(pH9,ca.18kDa)については,電気泳動ゲルからPVDF膜に転写し,プロテインシーケンサーによってN末端アミノ酸配列を明らかにした.このアミノ酸配列をもとにdegenerated primerを合成し,このプライマーと雌蕊mRNAを用いて3 ́-RACEによるRT-PCRを行なった.このPCR断片をプローブとして,雌蕊cDNAライブラリーのスクリーニングを行ない全鎖長のcDNAクローンを得た.その塩基配列を解析した結果,タバコのPR-1遺伝子と約40%の相同性が認められ耐病性関連遺伝子であることが明らかになった.また,B蛋白質スポット(pH6,15kDa)についても上記の蛋白質と同様にN末端アミノ酸配列を調べたが,N末端がブロックされているためデータを得ることができなかった.そこでこの蛋白質をリシルエンドペプチダーゼで消化した後,4個のペプチド断片についてアミノ酸配列を明らかにした.これらのアミノ酸配列データをもとにホモロジー検索を行なったところ,種々の植物からクローニングされているGlycine-rich RNA-binding Proteinと高い相同性が認められた.この蛋白質については,全鎖長のcDNAクローンの解析や遺伝子発現パターンの分析などを行ない,その構造と機能を今後明らかにしたいと考えている.以上の研究結果から,チャの雌蕊でメジャーに発現している2種類の蛋白質が明らかになったが,自家不和合性との関連性については今後さらに検討する必要がある.
視覚障害レベルに応じた疑似体験による公共施設の分かりやすさ評価に関する研究

視覚能力にかかわりなく分かりやすい環境を実現するための基礎研究として、独自に開発したWay-finding Active Simulation System環境(WASS環境と称す)を用いて識別実験と経路探索実験を行い、視覚障害レベルに応じた疑似体験の有効性を検討した。具体的には、視覚能力レベルをランドルト環視力(再現視力)であらわし、再現視力0.6、0.3、0.1の識別特性、探索能力、迷い点の発生特性を明らかにした。2006年バリアフリー新法下において重要となる、視覚障害レベルに応じた公共施設のわかりやすさに関する系統的評価を実現するための「視覚障害レベルに応じた疑似体験のシステム」の開発とその有効性検討を目的とする。第1年目は共同研究者(眼科専門医)の助言を受け、視覚障害レベルに応じた視覚映像((1)情報視認、(2)場所認知、(3)経路探索、(4)空間認識)を試作・検討し、「視覚障害レベルに対応する映像処理法」を決定した。具体的には以下の3つの実験を行った。(1)ランドルト環視力にもとづく視力低下再現映像処理レベルの測定視力低下再現環境で視力低下再現映像処理の多段階レベルごと、ランドルト環視力を測定し、映像処理レベルと視力との相互関係表を作成した。(2)視力低下再現環境での情報視認・場所視認の計測手法の検討視力低下再現環境で視力低下再現映像処理の多段階レベルごとに情報視認・場所視認の計測を行い、視認閾値を特定し、ランドルト環視力との対応を整理した。(3)視力低下再現環境での経路探索・空間認知の計測手法の検討視力低下散見環境で3段階の視力低下(0.1,0.3,0.6)について経路探索、空間認知の性能測定に関する有効性検討実験を行った。この結果、開発した「視覚障害レベルに対応する映像処理法」が有効に使用できることを、確認したと共に、実用に際して配慮が求められる実環境の差異を整理できた。今後、具体的な病院や交通機関などの公共施設でのわかりやすさ評価実験を実施し、その評価手法の有効性と課題を明らかにする。第2年目は第1年目に開発した視覚障害レベルに応じた視覚映像実験装置を活用して、迷路における視覚障害レベルの特性、および空間的対処法(目印、ライン)における特性と視覚レベル閾値を明らかにした。(1)グリッド迷路における視力低下の実験視力低下再現映像処理の多段階レベルごと、迷路での探索課題を実施し、映像処理レベルと探索行動との関係を分析した。(2)グリッド迷路における目印効果の測定グリッド迷路環境で視力低下再現映像処理の多段階レベルごとに探索課題を実施し、迷路内における各種の目印の効果の特徴と視覚レベルの閾値を計測した。(3)グリッド迷路におけるライン効果の測定グリッド迷路環境で視力低下再現映像処理の多段階レベルごとに探索課題を実施し、迷路内における各種のライン(経路床面上の線)の効果の特徴と視覚レベルの閾値を計測した。この結果、開発した「視覚障害レベルに応じた疑似体験システム」による空間探索実験の有効性を確認したと共に、公共施設でのわかりやすさ評価実験として、「目印」と「ライン(床上線)」の特性と視覚障害レベルの閾値を測定した。第3年目には、それらを総合的にまとめ、情報障害レベルに応じて迷いやすい地点を明らかにする方法を検討した。(1)グリッド迷路における視力低下レベルに応じた迷い実験視力低下再現映像処理の多段階レベルごと、均一なグリッド迷路での探索課題を実施し、立ち止まり回数の多い点、見回し回数の多い点、間違い回数の多い点を特定し、それを総合化して迷い地点の発生特性を分析した。(2)行き止まりのあるグリッド迷路における視力低下レベルに応じた迷い実験グリッド迷路における視力低下レベルに応じた迷い実験上記実験と同様に、均一なグリッド迷路での探索課題を実施し、迷い地点の発生特性を分析した。この実験の結果、迷い地点は視覚障害レベルによって異なり、特に視力0.3以上と0.3未満では、その発生特性が大きく異なることが明らかになった。さらに行き止まりのあるグリッド迷路では、上記の特徴がより顕著になることが明らかになった。
環境と経済が調和した農山漁村型産業クラスターの形成と発展に関する研究

本年度は、主として以下の課題に取り組んだ。第1に、農山漁村型産業クラスターの重要な構成要素である商業について実態把握調査を行い、現在の地域商業が抱える問題の把握を行った。結果では、市人口の減少に伴う消費人口の減少と郊外型小売店の台頭により、商店街への客足が減り、個店経営が厳しい状況である一方で、地域の農林漁業と結びついた商売の可能性を指摘する意見や、地産地消の実践、地域ブランドの利用といった例もみられ、地域商業と農林漁業が連携した地域産業クラスター形成の萌芽が見られた。第2に、農山漁村型産業クラスターの形成・発展の条件に関わる問題に取り組んだ。具体的には、「山村地域における産業の創出・発展の条件」という問題に絞込み、戦前期の農民資本製糸場の事例から、産業の創出・発展条件を明らかにした。創出条件では、第1に、地域の資源に目を付け、その加工を考えたこと、第2に、製糸業に対する社会的需要が存在したこと、第3に、産業創出に対する地域内のニーズが存在したこと、第4に、地域の課題をみつけ、地域の実状に合った課題解決方法を考え、実行できる主体が存在したこと、第5に、産業の創出を技術的・資金的に支援する外部の主体が存在したこと、の5点が導出された。発展条件では、第1に、あくまでも地域の資源をベースにしたこと、第2に、地域の農林業と製糸業が調和していたこと、第3に、利用可能な地域資源が存在したこと、第4に、得られた利益は最大限地域民に還元したこと、第5に、地域の資源を、地域の実状に応じて、地域のためになる事業を遂行する運営主体が存在したこと、の5点が導出された。以上の創出・発展条件を踏まえ、現代産業創出への示唆としては、第1に、地域農林業の重要性、第2に産業の創出・発展を担う主体の重要性、第3に、産業の創出・発展への支援の重要性、が挙げられる。本年度は、本研究で提唱している農山漁村型産業クラスターの構築にあたり、その基盤である社会・経済構造の解明に主眼を置き、具体的には以下の3点について調査・研究等を行った。第1に、研究対象地域(岩手県陸前高田市)の数戸の林家を対象にヒアリング調査を実施した。これは農山漁村型産業クラスターの中核部分である林業について、その経営実態を把握するためのものであった。調査結果として、分散する林地所有形態と停滞・縮小する林業経営が浮き彫りになった。なお、この結果については本年度7月に学会報告を行った。第2に、研究対象地域のA集落(30戸)を対象に集落悉皆調査を行った。これは、農山漁村型産業クラスターの構成要素となる農家や林家について、その経営の問題点や生活上の問題点を探ることにより、クラスター構築の際の必要条件を明らかにすることを目的とし、農林業経営の実態把握ならびにそこで生活している各世帯の生活実態把握を行ったものである。結果として、各戸の農林業収入は年々縮小し、職業としても、また生活としても農林業とは疎遠になってきていることが明らかになった。第3に、環境技術の先進地視察のために欧州渡航(ドイツ・イギリス)を行った。これは先進的な環境技術の利用実態を把握することに加え、日本と欧州の農山村地域の相違点を見出すことを目的とした。結果として、欧州では行政主導の環境技術導入が図られている一方で、法整備や構造・規模の面で日本とは大きな相違点があることが見いだされた。以上の3点を総じて、農山漁村型産業クラスターの構築にあたっては、地域の特殊性を十分加味したモデル作りが必要であることが明らかになった。本年度は、本研究で提唱している農山漁村型産業クラスターの構築にあたり、その基盤である社会・経済構造の解明に主眼を置き、具体的には以下の点について調査・研究等を行った。第1に、研究対象地域(岩手県陸前高田市)の12戸の専業漁業者(養殖漁業、沿岸漁業)を対象にヒアリング調査を実施した。これは農山漁村型産業クラスターの中核部分である漁業について、その経営実態を把握するためのものであった。調査結果として、沿岸漁業では漁獲高の減少を受けて経営状況が悪化している一方で、カキ・ワカメを中心とする養殖漁業は収入も比較的安定しており良好な経営状況であった。しかしいずれも後継者不足という共通の課題を抱えており、経営の抱える将来的な不安要素も大きいことが分かった。第2に、研究対象地域のA集落(16戸)を対象に漁業集落調査を行った。漁家の経営の問題点や生活上の問題点を探ることにより、クラスター構築の際の必要条件を明らかにすることを目的とし、漁業経営の実態把握ならびにそこで生活している各世帯の生活実態把握を行ったものである。結果として、漁業者の経営は一定の所得が得られる養殖業に多く依存していたが、一方で養殖業経営の持続性を阻む恐れのある漁場環境汚染が進行しており、その対策が半ば放置されている現状が明らかになった。第3に、研究対象地域のB地区(114戸)の全戸を対象に生活実態把握アンケート調査を行った。この調査は、山村地域住民の消費面に注目し、どのくらいの圏域で購買や現物取引を行っているかを明らかにし、クラスター構築の可能性を消費サイドから検討したものである。結果として、食料については高い自給率であった。

生活物資は、自家用車を用いて市中心部で調達するケースが多い反面、高齢者は移動販売に依存するケースが見られた。以上の3点から、農山漁村型産業クラスターの構築にあたっては、地域の抱える課題をまず明らかにし、課題解決を導くようにモデル作りを行うことが必要であると考えられる。本年度は、主として以下の課題に取り組んだ。第1に、農山漁村型産業クラスターの重要な構成要素である商業について実態把握調査を行い、現在の地域商業が抱える問題の把握を行った。結果では、市人口の減少に伴う消費人口の減少と郊外型小売店の台頭により、商店街への客足が減り、個店経営が厳しい状況である一方で、地域の農林漁業と結びついた商売の可能性を指摘する意見や、地産地消の実践、地域ブランドの利用といった例もみられ、地域商業と農林漁業が連携した地域産業クラスター形成の萌芽が見られた。第2に、農山漁村型産業クラスターの形成・発展の条件に関わる問題に取り組んだ。具体的には、「山村地域における産業の創出・発展の条件」という問題に絞込み、戦前期の農民資本製糸場の事例から、産業の創出・発展条件を明らかにした。創出条件では、第1に、地域の資源に目を付け、その加工を考えたこと、第2に、製糸業に対する社会的需要が存在したこと、第3に、産業創出に対する地域内のニーズが存在したこと、第4に、地域の課題をみつけ、地域の実状に合った課題解決方法を考え、実行できる主体が存在したこと、第5に、産業の創出を技術的・資金的に支援する外部の主体が存在したこと、の5点が導出された。発展条件では、第1に、あくまでも地域の資源をベースにしたこと、第2に、地域の農林業と製糸業が調和していたこと、第3に、利用可能な地域資源が存在したこと、第4に、得られた利益は最大限地域民に還元したこと、第5に、地域の資源を、地域の実状に応じて、地域のためになる事業を遂行する運営主体が存在したこと、の5点が導出された。以上の創出・発展条件を踏まえ、現代産業創出への示唆としては、第1に、地域農林業の重要性、第2に産業の創出・発展を担う主体の重要性、第3に、産業の創出・発展への支援の重要性、が挙げられる。
戦前・戦中期における家庭教育対策史

本年度は、1942年2月の大日本婦人会発会以降、戦時下家庭生活の刷新・振興を図る「場」として位置づけられた隣組・常会の特質の検討に努め、以下の点を確認した。1、大日本婦人会の下部組織を部落会町内会組織と一体化させたことで、母親並びに家庭の主婦を含む「婦人」は婦人会の構成員のみならず隣組・常会の構成員として二つの国家統制網の中へと組み込まれた。2、隣組・常会への参加が義務づけられた「婦人」は、そこでの活動を通して「錬成」という精神的統制と共に「銃後後援」「生産力拡充」「貯蓄奨励」といった生活の統制に従ずることが要請された。3、銃後後援を目的に掲げる種々の施策に直接あるいは間接的に関わり合いを持たされた「婦人」は、縦の国家統制下に位置づく地域社会の中へと活動の「場」を広げていった。そこには、町会制度を支える「家」の構成員としての資格を「婦人」に付与することで、銃後を支える「人材」として彼女達を活用したい政策側の思惑が存在していた。しかし一方で、家族の健康と生活を維持する為、率先して銃後活動(共同農園、共同献立、廃品回収等)に参加する「婦人」の姿も見られた。即ちこのことは、隣組・常会が家庭生活に直接かかわる衣食住を統制する為の「場」とされたが故に、彼女たちが国家統制網から脱する退路が塞がれていたことを意味するのである。上述の成果は、母親並びに家庭の主婦を動員することで家庭及び家庭教育の再編・組織化を図ろうとした戦時下家庭教育政策のメカニズムを描き出すことに寄与すると判断される。本研究の目的は、戦前・戦中期に全国で実施された家庭教育対策事業の展開過程を明らかにすることにある。21年度においては、以下の2点を明らかにした。1、戦時体制へ母親を動員する方途として文部省によって実施された家庭教育講座は、一貫した方針の下で展開したものではなかったことを確認した。即ち、文部省下の学校教育の範疇に入らない「教育」をコントロールするねらいを以て実施された家庭教育講座は、決戦段階という時局を境に、その目的を「家庭教育」対策から「家庭生活」対策へ、そして動員効率を第一義に掲げるが故に、講座実施の形態を文部省中心から他機関合同へと転換したことで、崩壊の途を進んだことを明らかにした。2、学校を介して母親を動員することで、総力戦体制下での家庭教育実践網の確立を目指すという文部省の意向を含み込むかたちで全国の小学校に設置された小学校母の会においても、上記同様、個別の学校母の会の活動レベルにおいては、必ずしも統一がとれた活動実践が行われていたわけではなかったことを確認した。即ち、母の会の設置・組織化が文部省によって推奨されたものとしても、それに向けた方針や活動内容を規定する明確な施策が出されなかったため、母親を取り込む組織としての活動の内実が強く意識されたとき、地域さらには学校が有する性格の違いによって実際の活動に隔たりを生じさせたことが明らかにされた。上述した研究成果は、家庭及び家庭教育の文部省による再編・組織化のメカニズムを描き出すことに寄与するものである。また、戦時下のすべての「家」及びその構成員を包摂する形で、家庭教育という「私」的教育の刷新を目的とした教育施設・団体の再編・組織化がどのように図られたのかを研究の俎上に挙げたこれら研究は、家庭教育政策の総力戦への参画・責任研究への切り口を拓くものであると判断される。
膜の世界における局在化に関する研究

「膜の世界」の研究に関連して、主に2つの研究を行った。1.「膜の世界」のアイディアが現実に実現されるためには、我々の世界を記述している4次元膜上に局所場が局在化される必要がある。この局在化を引き起こす機構として重力相互作用だけを使った全く新しい局在化の機構を作った。この機構では、ワープ因子は指数関数的に減衰するのではなくて、多項式的に緩やかに減衰するが、確かに4次元膜上にすべての局所場が局在化される。2.1984年にグリーンとシュワルツは、時空の超対称性が明白である超弦理論の古典的な作用を提出した。その後この作用は超膜理論に対しても拡張された。この作用をローレンツ共変に量子化することが難しかったので、光円錐ゲージで量子化されたが、このゲージでは外線の数が多いときのツリー振幅や多重ループの計算を行うことは不可能であった。従って、グリーン・シュワルツの作用をローレンツ共変な形で量子化するという問題は重要な問題であるにも関わらず、約20年間未解決の問題として残っていた。しかし、最近この作用は、ピューアスピナーを用いればローレンツ共変な形で量子化可能であるかもしれないことをバーコビッツが指摘された。バーコビッツの論文には、彼の作用とグリーン、シュワルツの作用の関係が明確でないこと、起源となる理論が明らかでないことなどの問題があったので、我々はこれらの問題を解決した。また、この量子化の方法を11次元のM理論に対応するローレンツ共変な行列模型を構成することに成功した。さらに、理論内に存在するb場の構成とその性質を明らかにした。1、ここ数年の超弦理論の非摂動的な振る舞いの研究から、「膜の世界」という考えが発展してきた。もしこの考えが正しいならば、素粒子物理学の多くの未解決な問題、例えば、階層性の問題、余分の次元のコンパクト化の問題、宇宙項の問題、超対称性の問題などが明らかにされると期待されている。「膜の世界」において、色々な場の膜上の局在化の問題を考察し、上記の未解決の問題を解明しようというのが本研究の目的であった。「膜の世界」の考えに従うと、我々の世界とは高次元の世界に埋め込まれた4次元的に広がった膜である。このとき、我々の次元である4次元以外の次元は、従来のカルツァークラインのコンパクト化の考えのように、小さく丸まって、マクロ的には見えなくなる必要はなく、無限大の体積を持っていると考えられている。このために、今までの超弦理論において、最も難しい問題であった余分の次元のコンパクト化の問題が自然に解消している。しかし、その見返りとして、高次元に存在している色々な量子場が、4次元の膜上に局在化することを証明する必要がある。本研究においては、我々の世界に存在している色々な量子場がどういったメカニズムで4次元の膜上に局在化されるかという問題について解答を与えた。2、超弦理論から自然に出現する場として、計量テンソルと含まないトポロジカルな場がある。この場がある場合、素粒子に質量を与えるメカニズムであるヒッグス機構が変更を受けることを指摘した。つまり、トポロジカルな項の前の係数だけ、ゲージ場の質量が変化する。実験と矛盾しないようにするためには、この係数は小さな値をとる必要があることも指摘した。また、新たに質量ゼロのスカラー場が出現する事も、理論を量子化することによって証明した。3、最近、バーコビッツによって、超弦理論や超膜理論がローレンツ共変な形で量子化できることが指摘された。これは、「膜の世界」を量子論的に理解するためにも極めて重要な研究である。

私は、イタリアのパドヴァ大学のグループとの共同研究を通じて、この仕事をさらに発展させた。例えば、バーコビッツの理論の起源となる理論を作り、それをゲージ固定することによって、バーコビッツの理論が導けることを古典的な範囲で証明した。今年度は「膜の世界」の研究に関連して、主に2つの研究を行ってきた。1、「膜の世界」のアイディアが現実に実現されるためには、我々の世界を記述している4次元膜上に色々なスピンを持った局所場が局在化される必要がある。この局在化を引き起こす機構として最も自然なものは、恣意的な外力を手で加えるのではなくて、重力相互作用に起因する引力だけを使うことである。しかし、そのためには余次元が2の渦糸タイプのブレーン解を使う必要があることを以前、私が証明した。しかし、オリジナルな膜の世界のモデルは余次元が1のときに定式化されていて、しかもこの場合に現象論的に最も面白いことがわかっている。だから、今までのやり方では、この余次元1のオリジナルなモデルは理論的に排除されることになる。この問題を回避するために、重力相互作用だけを使った全く新しい局在化の機構を作った。この機構では、ワープ因子は指数関数的に減衰するのではなくて、多項式的に緩やかに減衰するが、確かに4次元膜上にすべての局所場が局在化されることを証明することができる。2、昨年度、グリーン・シュワルツの第一量子化された超弦理論のローレンツ共変な量子化の問題について、イタリアのパドヴァ大学のグループと共同研究を行い、2本の論文を出版した。今年度は引き続きその研究を行列模型の分野に発展させた。この分野の研究として重要なことは、11次元のM理論に対応するローレンツ共変な行列模型を構成することである。新しく開発されたビューア・スピナーを用いた理論は自然な形で、超膜理論にも拡張できるので、この理論を量子化することによって、11次元のM理論に対するローレンツ共変な行列模型を構成しようとした。しかし、残念ながらBRST不変性の要請を課すと、この膜の理論はそのままでは存在できず、11次元の超粒子に対するローレンツ共変な行列模型になることを証明した。1984年にグリーンとシュワルツは、時空の超対称性が明白である超弦理論の古典的な作用を提出した。その後すぐにこの作用は超弦のみならず、超膜や一般のp-braneに対しても拡張できることがわかった。ところがこの古典的な作用はこの理論の持つκ対称性のためにローレンツ共変な第一量子化が難しいことが示された。その為にグリーンとシュワルツはローレンツ共変性を破る光円錐ゲージで量子化したが、このゲージでは、外線の数が多いときのツリー振幅や多重ループの計算を行うことは不可能であった。従って、グリーン・シュワルツの古典的な作用をローレンツ共変な形で量子化するという問題は、その後多くの研究者たちの注目を集め、この問題に関係する多くの論文が出版されたにも関わらず、約10数年間未解決の問題として残っていた。こういった状況の中で、2000年にブラジル人のバーコビッツがグリーン・シュワルツの作用は、以前数学者のカルタンが作ったピューアスピナーを用いればローレンツ共変な形で量子化可能であるかもしれないことを指摘した。当時、短期滞在でイタリアのパドバ大学に滞在していた私はこの論文の重要性に着目し、当地のマリオ・トーニン教授との共同研究に着手した。
アラビドプシスの過敏感細胞死を制御する遺伝子、Rar1とSgt1bに関する研究

植物の耐病性に関する研究は農作物生産性の向上のためにも非常に重要である。植物の抵抗性遺伝子を介した耐病性誘導シグナリングの初期段階において、植物種を超えて重要な働きをしていることが遺伝学的に明らかにされたRar1とSgt1の機能を、遺伝的に操作の容易なアラビドプシスを用いてproteomicsとgenomicsを融合させた手法を用いて、より詳細に分子レベルで明らかとする事が当研究の目的である。平成16年度においては、特別研究員としての受入機関の神戸大学からの研究指導の委託により、Rar1およびSgt1bを初めてクローニングしたJane Parker研究室(ドイツ、ケルンのMax-Planck-Institute for Plant Breeding Research)に滞在し、活発な議論、研究交流を通して非常に有益な研究活動を行った。その成果としては1、アラビドプシスの2コピーあるSgt1遺伝子Sgt1aとSgt1bは花や根などの器官では非常に異なった転写制御を受けているが、耐病性シグナリングにおけるSgt1bの機能の特異性はプロモータによる制御によるものではなく,タンパク質レベルでの違いに起因するらしいこと、Sgt1aも大量に発現させれば耐病性シグナリングにおけるsgt1b表現型を相補することを明らかとした、2、エピトープタグを融合させたRar1タンパク質を発現する形質転換rar1植物を作成し、この融合タンパク質が野生型Rar1同様に耐病性に起いて機能することを明らかとした。この形質転換植物を用いてRar1の新規な植物細胞内での結合タンパク質候補を用いて生化学的手法により幾つか見いだし、現在、マススペクトロメトリーを用いてそれらの同定を行なっている。現在、これらのデータを学術雑誌等に公表できるようにするためにさらなる実験を行なっているところである。
カイコ緑繭の分子基盤ならびに生理・生化学的特性の解明と利用

緑繭品種大造の第6染色体を白繭品種日01号のものと置換したDH6系統は笹繭となる。笹繭化の原因遺伝子として第6染色体に座乗するBmP5CR1遺伝子が予測されたので、DH6系統のBmP5CR1をTalenによりノックアウトすると繭にprolinylflavonol類が含まれる緑繭となった。In vitroにおいてquercetinとP5Cを反応させるとprolinlqurcetin類が生成されるので、緑繭の原因物質であるprolinylflavonol類はBmP5CR1の欠損によりP5Cが蓄積することによって非酵素的生じると結論された。カイコの保存系統の中には繭にフラボノイドを含むものがあり、色調の違いにより笹繭(淡黄色)と緑繭(濃黄緑色)の2種類に分類されている。繭のフラボノイドはもともとカイコの飼料であるクワに由来するが、クワのフラボノイドがどのように代謝、輸送されて笹繭や緑繭の繭色素となるのか、本研究ではその分子基盤と生理生化学的特性の解明を目的とする。本年度は緑繭色素であるprolinylflavonol類の生成のメカニズムを明らかにするため、緑繭品種である大造とその第6染色体が白繭品種日01号のものと置き換わることによって笹繭となった系統(大CSL6)を用いて、生化学的、遺伝学的解析を行った。大造絹糸腺ではpyrolline-5-calboxylicacid(P5C)をプロリンに変換する酵素pyrolline-5-calboxylate reductase (P5CR)の活性が顕著に減少していることを見いだした。第6染色体にはヒトP5CR遺伝子であるPYCR1と相同の配列があり、緑繭の原因遺伝子であると予想されたので、その配列を調べた。正常型である大CSL6の遺伝子と比較し、大造の遺伝子には第1イントロンに約2kbの挿入が見られ、その結果としてこの遺伝子の発現が抑制されることを見いだした。さらには、(大造×大CSL6)♂に大CSL6♀を戻し交雑し、このP5CR様遺伝子の多型と繭色形質の連鎖を調べた結果、本遺伝子の変異によって緑繭が生じていることが強く推測された。繭の原因物質であるprolinylflavonol類のin vitro生成法を検討し、比較的高濃度のP5Cとケルセチンを中性条件下で反応させた。この2つの基質が反応液中に含まれていれば、酵素等を含んでいなくてprolinylflavonol類と思われる反応生成物が生じることが、LC/MSの解析から推測された。緑繭原因遺伝子と推測されたカイコP5CR遺伝子(BmP5CR1)をTalen法によってノックアウトした。この結果、笹色の繭が緑色に変化した。緑色化の原因はP5CRの機能消失によってP5Cが蓄積し、これがflavonol類と反応してProlinylflavonol類が生成することが明確になった。また、Quercetin以外のフラボノイドもin VitroでP5Cと反応し、proline残基を持ったフラボノイドを生成させることができた。また、大造は緑繭であるが、大造の第20染色体を日01号のものと置換されたDH20系統の繭は薄い笹色となる。今年度は大造の第20染色体上に存在するこの笹繭関連遺伝子(Gd)についてもマッピングを開始した。(大造×DH20)♂にDH20♀を戻し交雑し、SNPマーカーによって候補領域を253kbまで絞り込むことができた。この領域にはglycoside hydrolaseのクラスターが存在し、候補遺伝子がフラボノイド配糖体の分解酵素であると推測された。また、フラボノイド吸収に関与している中腸のフラボノイド配糖体分解酵素を大造の中腸から各種クロマトグラフィーにより部分精製し、MS/MS分析したところLactase phrorizin hydrolaseと相同性が高いことがわかった。笹繭系統DH20のBmP5CR1をTalenによりノックアウトし、後代を系統として確立した。このノックアウト系統の各組織におけるP5CR酵素活性を測定したところ、後部、中部、前部の各絹糸腺組織における活性が消失していた。一方、絹糸腺以外の脂肪体、筋肉等の組織のP5CR活性は保持されていたが、カイコのもうひとつのP5CR遺伝子であるBmP5CR2はこれらの組織で正常に発現していた。以上の結果、絹糸腺で主に発現しているBmP5CR1の機能消失によって、本来の反応とは異なるP5Cとflavonol類との化学反応が促進されてProlinylflavonol類が絹糸腺内(特に中部絹糸線)で生成するために緑繭が生じると結論づけられた。大造以外の緑繭品種(韓三眠、青白、長城)についても絹糸腺BmP5CR活性の消失が認められたが、BmP5CR1の変異は一様ではなかった。このことから、笹繭から緑繭への突然変異は品種育成の過程で、何度か独立して起こったものと推測された。