hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
新規の細胞内膜融合機構p97/p37経路の解明

我々が1997年に発見した細胞内膜融合機構p97/p47経路に加えて、この程新規膜融合機構p97/p37経路を発見することが出来た。試験管内ゴルジ体再構成系を用いてp37の機能を検討した結果、p37単独では膜融合能を呈せず、p97/p37複合体を形成すると膜融合を引き起こすことが分かった。この新規膜融合経路の分子機構は、p97/p47経路とは幾つかの重要な点で異なっていた。例えば、受容体としてsyntaxin5ではなくてGS15を必要とし、同時に小胞繋留装置p115-GM130複合体を必要とする。さらに興味深いことに、VCIP135を必要とするものの、その脱ユビキチン化活性は新経路では必要ではなかった。p37並びにp47の細胞での機能をsiRNAを用いて検討した所、p37とp47の発現の抑制はゴルジ体の小胞化に加えて小胞体の網状構造の断裂をもたらした。そこで、試験管内において小胞体の網状構造を再構成する我々の独自の系(試験管内小胞体再構成系)を確立して、それを用いてVCIP135の脱ユビキチン化活性について検討を加えた。具体的には脱ユビキチン化活性を持たないアミノ酸変異のVCIP135(変異VCIP135)を作成して、その働きを検討した。その結果、小胞体においては、p97/p37経路のみならず、p97/p47経路でも変異VCIP135が野生型VCIP135と同様に機能した。即ち、小胞体の形成維持では、ユビキチン化が関与しないことが強く示唆された。このことは、ゴルジ体と小胞体の形成維持における大きな違いであり、二つの細胞内小器官の形成維持のための分子機構の理解の大きな手がかりになると考えられる。例えぱ、受容体としてsyntaxin5ではなくてGS15を必要とし、同時に小胞繋留装置p115-GM130複合体を必要とする。さらに、VCIP135を必要とするものの、その脱ユビキチン化活性は新経路では必要ではなかった。p37の細胞での機能をsiRNAを用いて検討した所、p37発現の抑制はゴルジ体の小胞化と小胞体の網状構造の断裂をもたらした。さちに、細胞周期の時期に分けてp37の機能を検討するために、間期と分裂期にある細胞それぞれに抗p37抗体の微量注入を行った。その結果、細胞分裂期でのゴルジ体・小胞体の再構成のみならず{間期でのそれらの維持にもp37が必須であることが示された。従って、p97/p47経路が細胞分裂期終期での娘細胞に於ける細胞内小器官の再構成に特化した細胞内膜融合機構であるのに対して、このp97/p37経路は細胞周期間期での細胞内小器官の維持に働いていることが分かった。同時に、小胞体の網状構造やゴルジ体の扁平膜積層構造とそれらの機能の関係を明らかにするために以下の実験を行っている。培養細胞においてp37siRNA処理をしてp37の発現を抑制すると小胞体の網目構造は断裂しゴルジ体は小胞化する。このような細胞を用いて、蛋白質輸送能を検討した。その結果、小胞化したゴルジ体では蛋白質の輸送が遅延し半分以上が輸送されないままゴルジ体に蓄積したところが意外なことに、断裂した網目構造の小胞体からゴルジ体への蛋白質の輸送には全く遅延が認められなかった。即ち、ゴルジ体の扁平膜積層構造は蛋白質の輸送に重要であるが、小胞体の網状構造自体は蛋白質の輸送には関係ないということである。

そこで、試験管内において小胞体の網状構造を再構成する我々の独自の系(試験管内小胞体再構成系)を確立して、それを用いてVCIP135の脱ユビキチン化活性について検討を加えた。具体的には脱ユビキチン化活性を持たないアミノ酸変異のVCIP135(変異VCIP135)を作成して、その働きを検討した。その結果、小胞体においては、p97/p37経路のみならず、p97/p47経路でも変異VCIP135が野生型VCIP135と同様に機能した。即ち、小胞体の形成維持では、ユビキチン化が関与しないことが強く示唆された。このことは、ゴルジ体と小胞体の形成維持における大きな違いであり、二つの細胞内小器官の形成維持のための分子機構の理解の大きな手がかりになると考えられる。
AE法による水素損傷一環検出法の確立に関する研究

本研究では、パイプ用鋼(SGP)およびガスボンベ用アルミニウム合金(5000系および6000系)を用いて、水素脆化の発生と進展、微視き裂の発生と成長およびガス漏洩を伴う巨視き裂の発生と進展と、時系列的に生じる一連の水素による損傷を、AE法によって一環して検出する手法の確立を図る。得られた新しい知見と成果を次に示す。1.水素マイクロプリント法により、水素損傷は、すべり線や粒界に集中するが明らかになった。さらに電子後方散乱パターン解析(EBSP)よって、その損傷の中でも生じやすい箇所の同定ができ、AE発生との関連性が認められた。2.材料内を伝搬する弾性波は、速度分散やモード変換を生じるため、AE波の特徴抽出を行うに当たって、第一到達波のS_0モードに着目する解析法を提案し、形状記憶合金単結晶および金属間化合物単結晶を用いてその有効性を明らかにした。この解析法を用いて、アルミニウム合金の引張試験と疲労試験中に検出されるAE波形により、転位の集団運動に起因する塑性変形と水素損傷による微視き裂の発生と成長の特徴を抽出することが可能になった。3.ピンホールやスリット状人工孔からのガス漏洩中に検出されるAE波により、巨視き裂を検証した結果、臨界圧力を超えると、検出されたAE波形のピーク周波数がガス圧力に伴い減少することから、漏洩箇所近傍においてジェット噴流を生成し、出口側にショックセルを形成し、騒音の一種であるスクリーチトーンの発生が認められた。このようにAE法を用いた漏洩監視の有力なパラメータの抽出に成功するとともに、流体力学分野への応用の可能性が示唆された。以上の結果から、AE法による材料評価技術の発展に寄与できるとともに、上記3の結果から、AE法を用いて省力化を目指した流体騒音分野への新展開を図ることが可能になり、新たな研究テーマの申請を行っている。1.大気溶解された5000系アルミニウム合金の引張試験において、辷り線上に水素の集積が顕著に検出され、これは、ひずみが20%を超えると増大した。また、粒界に集積する水素は、粒界に集積する転位の量が増大する、ねじり粒界において選択的に多く認められた。2.6000系アルミニウム合金の疲労試験中のアコースティック・エミッション(AE)挙動から、中程度の振幅の信号が突発的に検出される時点で亀裂の発生が認められた。また、延性の低下が認められた溶体化処理後の空冷材において、疲労最終破断近傍において高振幅のAEが検出され、これは水素マイクロプリントによって、辷り帯および粒界に集積した水素原子によるものであることが明らかになった。3.人工欠陥(スリット)を導入したガス管からのガス漏洩AE挙動を調べた結果、漏洩ガス流速が音速になるガス圧力(臨界圧力)を超えるとAE平均振幅が急速に増大し、信号に特徴的なピーク周波数力競れた。このピークは、圧力の増加とともに低周波数側に移行することから、ジェット噴流に見られるスクリーチトーンと断定された。一方、円周方向に平行に導入されたスリット(アスペクト比615)すべてにおいて、大気圧近傍のガス圧力において、噴出ガスの不安定な自励振動により、AE平均振幅の急速な増減が認められた。これらにより、ガス漏洩による特徴的なAE信号が得られたことにより、水素ガスボンベの全数検査AE法の適用の可能性が示唆された。

以上より、今後水素ガス利用に適している各種アルミニウム合金の水素による脆化および微視亀裂の発生をその場検出するためには、AE法が非常に有効な技術であるとともに、さらに、ガス漏洩を生じたときには、漏洩箇所から噴出するガスは、ジェット噴流に類似の挙動を示すことが明らかになり、これをAEによって十分に捉えることができることが明らかになり、水素損傷を一環して検出することができる足がかりが得られた。本研究では、パイプ用鋼(SGP)およびガスボンベ用アルミニウム合金(5000系および6000系)を用いて、水素脆化の発生と進展、微視き裂の発生と成長およびガス漏洩を伴う巨視き裂の発生と進展と、時系列的に生じる一連の水素による損傷を、AE法によって一環して検出する手法の確立を図る。当該材料の水素脆化とそれに続く微視き裂の発生に伴って発生し、材料内を伝搬する弾性波(AE)から、損傷箇所の位置標定を行い、別途、水素マイクロプリント法(水素MT法)により材料内部に分布する水素を可視化した位置との対応を図り、水素による損傷から生じる信号を特定し、特徴信号パラメータの抽出を行い、材料の劣化を推定する。次に、損傷が進み、巨視き裂にまで達したときには、このき裂箇所に生じるガス漏洩に伴って発生するAEを検出し、その発生源の機構を明らかにする。これによって、このき裂の形状、大きさやガス圧によるAE波形特徴パラメータの同定を行い、供用中監視に有効なデータを提供する。本年度は、以下の結果を得ることができた。1.人工時効後の冷却速度を変えることによって、水素損傷の違いによる延性の異なるアルミニウム合金の疲労過程中に得られたAE挙動の違いを明らかにした。2.水素損傷による割れを模擬したスリット状孔からのガスの漏洩中に発生するAE波形から、ジェット噴流によるスクリーチトーンの存在を見いだした。流体力学的な測定への応用の可能性を示唆していた。研究の発展性が確かめられた。3.パイプ内を伝搬するガイド波の速度分散とモード変換を明らかにした。
光配向性分子集合体の開発と有機デバイスへの応用

色素を用いる液晶の光配向挙動は自己位相変調効果に基づく自己回折像の観察により行ったところ、類似構造をもつクマリン誘導体の光応答性に差異がみられた。クマリン6を用いた系は、光照射中に干渉縞数の減少はないのに対して、クマリン545やクマリン545Tは、光照射中に減少することがわかり、従来とは異なる光応答を示すことが明らかとなった。この現象を利用した新しいセキュアなデバイス開発に期待が持てる。本研究では,分子集合体の配向を光で制御可能な手法を開発することにより,有機デバイスの高性能化・高機能化に資する材料の探索を容易にすることを目的とする。このため,光配向性に優れる系をいかに調製できるかが鍵である。これまでに,非線形性の向上や低光強度において誘起できる様々なホスト液晶やオリゴチオフェン誘導体が開発されているが,光配向変化にかかる閾値強度は数10 W/cm2以上と光強度が高い。このため,多様なデバイスへの応用には,配向にかかる光強度をできるだけ小さくすることが必要不可欠である。今年度は,低い光強度で配向変化できる系の開発を目指して,ホストとして高分子安定化液晶に着目し,オリゴチオフェンをドープした系の光応答性について検討した。室温でネマチック相を示す5CBとアクリレートモノマーA4CBを87 mol : 13 molで混合し,これにオリゴチオフェンTR5を0.1 mol,紫外線に吸収帯をもつ光重合開始剤Irgacure 651を0.5 mol加え,重合用試料を調製した。この試料をシランカップリング剤で垂直配向処理したセル厚100 μmのガラスセルに封入し,高圧水銀灯の366 nmの輝線を光強度1.0 mW/cm2で60 min照射して光重合し,色素ドープ型高分子安定化液晶サンプルを調製した。サンプルにArイオンレーザーの波長488 nmの鉛直偏光をサンプルに照射した。サンプルを透過したレーザー光は,閾値強度以上で,スクリーン上に環状の干渉縞を形成することから,高分子安定化液晶においても,液晶分子を安定に光配向変化できることが明らかとなった。これまでの低分子液晶を用いた系と比較すると,約6分の1の光強度で分子配向変化を誘起できることがわかった。本研究では,有機デバイスの高性能化・高機能化のために,新しい光分子配向技術を開発する。有機材料の光配向制御は,光異性化を利用した系が多いため,材料開発に歯止めがかかっている。このため,多種・多様な材料系に適応可能な光配向方法の開発を目指して,必須の要素技術や材料系を明確にすることを目的とした。このような背景を鑑み,これまでに配向変化が観測しやすい液晶系に着目し,光電場による分子配向変化について検討してきた。特に,材料系が吸収する波長領域において,分子配向変化を低光強度で誘起できることから,まずは光に対する安定性が高い色素の探索から行った。今年度は,色素の分子形状の違いに基づく分子配向変化挙動について検討を行った。吸収スペクトル形状がほぼ同一で分子形状が棒状の一方向性色素,および分子形状が三方向である三方向性色素を用いて,液晶における光配向変化挙動を観察した。アルゴンイオンレーザーからの488nmの光を,一方向の色素を含む液晶系に照射したところ,分子配向変化に基づく明確な干渉縞が観測された。それに対して,三方向性色素を含む液晶系では,観測されなかった。吸収スペクトルを測定すると,一方向性色素と三方向性色素のスペクトル形状に差異は見られないが,吸収遷移モーメントに違いが生じるため光配向変化挙動に違いが見られたと考えている。一般に,レーザー光の光電場を用いた分子配向変化は,色素分子の遷移モーメントが光電場と平行方向に起きることから,色素の吸収遷移モーメントが分子形状とほぼ平行方向にある一方向性色素は分子配向変化できるが,吸収遷移モーメントが三方向にある三方向性色素は配向の方向性が定まらないため,配向変化が誘起されないと考察した。本研究では,有機デバイスの性能や機能の向上に資する『光を用いた分子配向技術』を開発する。有機材料の光配向技法は光異性化を利用する系が多いため,有機電子デバイスの材料開発の探索幅が制限されている。このため,多種・多様な材料系に適応可能な光配向技法の開発を目指して,要素技術や材料系の明確化を目的とした。これまでに配向変化が観測しやすい液晶系に着目し,光電場による分子配向変化について検討してきた。特に,色素の吸収波長領域において,分子配向変化が効率よく誘起可能なことから,光安定性が高い色素と液晶系の組合せの探索を行った。今年度は,有機EL素子用発光材料であるクマリン系色素の中で,ベンゾチアゾール骨格構造をもつクマリン6,クマリン545およびクマリン545Tを用いて,色素の構造の違いが液晶の光配向変化挙動に及ぼす影響について詳細に検討を行った。アルゴンイオンレーザーからの488nmの光を,色素を含む液晶系に照射したところ,クマリン6,クマリン545およびクマリン545Tのいずれの色素を含むサンプルにておいて,分子配向変化に基づく明確な干渉縞が観測された。さらに,光を照射し続けたところ,クマリン6を含むサンプルにおいては干渉縞の減少が見られないのに対して,クマリン545およびクマリン545Tを含むサンプルにおいて干渉縞が減少する挙動が観測された。

詳細については検討中であるが,色素の分子構造計算を行ったところ,クマリン6と比較してクマリン545およびクマリン545Tは平面性が高いことがわかり,おそらく色素の平面性と液晶分子との相互作用の大きさの違いにより,干渉縞減少,つまり初期配向への緩和過程が確認されたと考察した。本研究では,光配向できる材料系を開発することが,配向手法の開発に繋がるため,材料系の探索を重要視している。これまでに,クマリン誘導体を中心としていくつかの色素が効率よく液晶の配向変化を誘起できることを明確にし,着実に成果を積み重ねてきた。本年度は,ほぼ同様な構造をもつクマリン色素を用いたところ,液晶の光配向挙動に差異が認められた。この結果は単に光配向制御に適切あるいは不適切というものでなく,光照射という刺激のON,OFFという,従来の切り替えスイッチイング特性に加えて,ある一定の時間刺激応答性が見られるという従来のスイッチング特性とは異にするものであり,新たな機能を付与できる可能性を大いに秘めている点が注目に値する成果である。秋の学会や研究発表会などにおいて外部発表を行ったところ,既存の概念にない新しい機能であると第三者から評価され,今後の応用展開に期待がもてる意見やアドバイスをいただいた。本研究では、有機デバイスの性能や機能の向上の鍵を握る分子配向手法を、多種・多様な材料系に適応可能にするために、特異な分子構造の光異性化を利用する光化学プロセスでなく、光電場と機能性色素の励起状態を利用する光物理プロセスに着眼点をおいて研究を行ってきた。従来のアントラキノンやオリゴチオフェンなどに加えて、これまでに有機EL素子用の発光性色素としても用いられているクマリン6においても光物理プロセスにより光によって分子配向変化できることが明らかにした。特に、クマリン骨格を基本骨格として、類似構造有する化合物の光配向挙動について検討し、光配向性と分子構造の相関関係の明確化を行った。ベンゾチアゾール骨格構造をもつクマリン6,クマリン545およびクマリン545Tについて比較検討したところ、光照射中はクマリン6が安定に液晶の光配向変化を誘起できるが、クマリン545およびクマリン545Tはある一定の時間で初期配向緩和することがわかり、従来にない光応答挙動を示すことがわかった。これは色素の平面性と液晶分子との相互作用の大きさの違いに基づいており、色素の分子骨格の平面性を増大させることにより、誘起された液晶の初期配向への配向緩和力が増大するためと考えている。材料科学的な観点からは、ある一定の時間光応答性を示すことができるので、一時的な表示機能を有するセキュリティーディスプレイなどへの応用に期待がもて、新たな有機デバイスへの可能性を拓く新たな結果となった。色素を用いる液晶の光配向挙動は自己位相変調効果に基づく自己回折像の観察により行ったところ、類似構造をもつクマリン誘導体の光応答性に差異がみられた。クマリン6を用いた系は、光照射中に干渉縞数の減少はないのに対して、クマリン545やクマリン545Tは、光照射中に減少することがわかり、従来とは異なる光応答を示すことが明らかとなった。この現象を利用した新しいセキュアなデバイス開発に期待が持てる。本研究では,光配向できる材料系を開発することが,配向手法の開発に繋がるため,材料系の探索が重要である。これまでに,オリゴチオフェンに加えて,クマリンやナフタイミドなどの蛍光色素などの色素や高分子安定化液晶系など,色素とホストの液晶の組み合わせで,光配向挙動が変化することを明らかにした。
授業における実践的知識獲得過程に基づく教師モデルの開発

今年度は、最終年度であり、2年間のまとめを行なった。まず、指導技術としての発問スキルの検討を行なった。特に、外側から計測可能である発問後の待ち時間の意味と発問スキルの多様性との2点を、場面・対象の把握・認知という点から検討した。その結果、教師の指導技術(経験・学習を通して獲得されたもの)および行動選択のための情報獲得方法としての注意の配分、さらに意思決定能力に代表される認知スキルの総合としての教授スキルレベルの指標として、発問後の待ち時間は用いることができると判断された。また、昨年度の研究成果から、教師モデル、特に初任者教師において教師としてのアイデンティティ確立が大きな意味を持つと考えられたため、同一学校に勤務した男女各1名の教師像の変容とその変容をもたらした出来事に関する調査を行なった。これは、本研究で開発された授業日誌法の変形版として1ヶ月単位で行われたものである。これにより、授業目誌法と命名した、記述型リフレクション様式は、教師の日常性をとらえる道具として有効であると考えられた。本研究の結果としては、初任者教師の発達は、教授技術の未熱さが障害となっていることが示唆された。それは、板書などのスキルレベルというよりもむしろ、子どもの情報獲得のスキルの未熟さである。そのために、授業認知が指導案に基づく枠組みに執着するという結果を招いていることが示唆された。最後に、本研究の報告書を作成した。報告書の内容は、教師による授業認知と教授スキルの関係を初任者教師のデータにより明らかにし、教師の発達過程に関するモデル提案している。その際、教師の教室の出来事の記憶という点を重視している。特に、行動決定のための記憶の働きに着目している。本研究ではこの点は明確にできなかったが、今後の研究課題である。今年度は、教師の実践的知識の獲得という観点から、初任者を対象に2つの研究を行なった。第1の研究は、初任者の授業を中心とした学校生活上の問題を明らかにし、その問題解決のための手立てと情報源を探ることにより、初任者の課題解決様式を明らかにすることである。これに関しては浅田(1994)が開発した授業日誌方式を用い、その記述をKJ法によりカテゴリー化、出現頻度を計測した。その結果、初任者は授業運営、特に学級経営面を課題として捉え、その後授業内容面、そして再び学級経営面へと課題が遷移していることが明らかになった。その課題解決に際しては、4月からの授業経験よりも教師自らが受けてきた授業での経験に基づく場合が多いようであるが、解決の手立ての種類は多くはない。初任者の場合、授業経験から実践的知識を獲得するスキルを十分に発達・成長していないことが考えられる。第2の研究は、実践的知識の獲得に影響すると考えられる指導技術の熟達化を明らかにすることである。同一初任者を対象に、毎月国語の授業をビデオ録画し、それに基づき授業プロトコルを作成した。このプロトコルに出現する質問を抽出し、質問後の指名もしくは教師の発現までの時間を計測した。指導技術が熟達化するということは、質問後に「待ち」ができるということを従来の研究知見から想定したのである。分析の結果、1学期間では変化は見られなかった。また、待ち時間も平均67秒であるが、分布を見てみると1秒未満が最頻値であり、初任者はほとんど待ちができていないことが明らかになった。同時に、質問を閉じた発問等8つに分類してみると、出現する発問は閉じた発問、など3つにほぼ限定され、ゆさぶり発問などはほとんど用いられていなかった。このことは、初任者が子どもから授業に関わる情報を引き出す手立てを持ち合わせていないことを示唆するものであると思われる。今年度は、昨年度の研究をうけて、以下の3つの研究を展開した。まず、2年目における小学校教師の成長過程を分析した。昨年と同一教師4名を対象に、4月、5月、6月、9月、11月、2月の合計6回、国語科授業をビデオ記録を取り、分析している。さらに、昨年度の教授経験がどのように活用されたかに関するインタビュー・自由記述による調査を行なった。本年度は、偶然であるが3名の教師が1年生を担任し、残り1名が昨年の学級の持ち上がりということになった。1年生を担任した3名の教師は、昨年度の教授経験(特に学習指導)にはほとんど役に立つことは見当たらないと指摘した。その理由としては、(1)昨年度担任した中学年の子どもとは1年生はまったく違うということ、(2)教材教授経験がないこと、の2つが主としてあげられた。一方、学級運営もしくは授業運営に関しては、昨年度(1年目)の失敗経験を踏まえて、よりコントロールを強化したり、学級新聞を頻繁に出すことによる保護者との関係に基づく子ども理解を図るなど、工夫がみられた。また、持ち上がりの教師は、教師自身に心的余裕は生まれるが、授業形態、学級経営についての大きな変化はみられないようである。また、昨年度に行なった初任者教師の指導技術と子ども理解との関係を明確にするために、1昨年実施された経験教師(15年目・1年生担任)の発問後の持ち時間と子ども理解の変容を明らかにするために、授業プロトコルを作成し、現在分析中である。さらに、教師の実践的知識獲得過程を明らかにするために、5年目の女性教師が自らの授業実践を振り返り、そこに現われた問題状況への想定される対処行動と実施した対処行動と実施理由のデータを整理し、現在分析中である。

今年度は、最終年度であり、2年間のまとめを行なった。まず、指導技術としての発問スキルの検討を行なった。特に、外側から計測可能である発問後の待ち時間の意味と発問スキルの多様性との2点を、場面・対象の把握・認知という点から検討した。その結果、教師の指導技術(経験・学習を通して獲得されたもの)および行動選択のための情報獲得方法としての注意の配分、さらに意思決定能力に代表される認知スキルの総合としての教授スキルレベルの指標として、発問後の待ち時間は用いることができると判断された。また、昨年度の研究成果から、教師モデル、特に初任者教師において教師としてのアイデンティティ確立が大きな意味を持つと考えられたため、同一学校に勤務した男女各1名の教師像の変容とその変容をもたらした出来事に関する調査を行なった。これは、本研究で開発された授業日誌法の変形版として1ヶ月単位で行われたものである。これにより、授業目誌法と命名した、記述型リフレクション様式は、教師の日常性をとらえる道具として有効であると考えられた。本研究の結果としては、初任者教師の発達は、教授技術の未熱さが障害となっていることが示唆された。それは、板書などのスキルレベルというよりもむしろ、子どもの情報獲得のスキルの未熟さである。そのために、授業認知が指導案に基づく枠組みに執着するという結果を招いていることが示唆された。最後に、本研究の報告書を作成した。報告書の内容は、教師による授業認知と教授スキルの関係を初任者教師のデータにより明らかにし、教師の発達過程に関するモデル提案している。その際、教師の教室の出来事の記憶という点を重視している。特に、行動決定のための記憶の働きに着目している。本研究ではこの点は明確にできなかったが、今後の研究課題である。
自己複製の最小単位としてのマイコプラズマのゲノム解析

Mycoplasma capricolumの28種のtRNAの一次構造を決定し、そのアンチコドンが一般の真正細菌とは違う以下の特徴を明らかにした。(1)4ーcodon boxに対応するtRNAはアンチコドン5'端が未修飾UのtRNA1種である。(2)スレオニンの4ーcodon boxにアンチコドン5'端が未修飾AのtRNAが存在する。これは原核生物においては特異な存在例である。(3)アルギニンコドンCGGに対応するtRNAが存在せず、これがこの微生物ではナンセンスコドンとなっている可能性がある。(4)アンチコドン5'端にCを持つtRNA種が少ない。これらはいずれもマイコプラズマゲノムのゲノム量を縮少する方向への進化的圧力、ゲノムGC含量減少への変異圧及び、その結果としてのコドン使用頻度の偏りによって、アンチコドン構造と構成が影響を受けたためと考えられる。生物界での特異な位置にある一個の細胞中での全てのアンチコドン構成が明らかになったことにより、これの大腸菌との比較からアンチコドンのコドン認識機構はWobbleのルールをも含めてかなりの柔軟性を持って対応、変化しうること、さらにその極端な場合にはナンセンスコドンを介して、ある種のセンスコドンの意味が変化するメカニズムと可能性が示唆される。各tRNA分子種の定量化によりアンチコドンの動的変化と遺伝情報の発現との相関を今後の課題とすると共に、パルスフィールド電気泳動法を用いた制限酵素地図を早急に完成せ、上記tRNA遺伝子をその染色体にマップしたい。その結果はGC含量の変化から変形した特異な遺伝システムを持つこの細菌の遺伝学的解析の基盤をなすものであり、ゲノムのコンパクト化を受けた特異な例を通して細胞の自己増殖という最も基本的な属性とその進化の理解のために極めて有用な系を提供し、細胞複製の総合的理解に貢献できると思われる。
マダイ稚魚選別自動化システムの研究

本研究では、マダイ稚魚の選別作業の自動化を図るために、マダイ稚魚の吻部、及び、外形形状の画像特徴の抽出手法の開発を主に実施した。代表的な人の顔認識手法であるActive Appearance Modelをマダイ稚魚の口に適用した。外形形状の画像特徴の抽出手法では、2値画像処理、エッジ検出、線検出を用いた。研究成果としては、Active Appearance Modelは、吻部の極端な変形、および、カメラに対する稚魚の顔の傾きの変化に対して弱い事がわかった。また、外形形状の画像特徴の抽出手法からの検出では、研究当初の検出能力と比較して飛躍的に検出能力が向上でき、かつ、タクトも非常に短くなった。従来機は、鯛稚魚を麻酔により不活性にした後、人で鯛稚魚を置き台に置き、下からのLED透過照明により鯛稚魚の側面全体のシルエット画像を上部のカメラにて撮像、画像処理をし、長さ、角度、曲率、傷などの鯛稚魚の幾何的な外形形状に関する特徴量を取得していた。本年度は、従来機に対して3項目の機能追加を実施、1鯛稚魚の正面画像を取得し「口の歪み」を計測、また、より詳細な口、尾部の画像を取得し「上下口の整合度」「尾部の詳細形状」を計測するために新規の実験装置の設計・製作2従来機との一体運用できるように、従来機と新規の実験装置のシステム統合を実施、3顔認識に広く用いられているActive Appearance Modelを応用したアルゴリズムの開発と実験装置へのC++プログラム実装を実現した。具体的には、新規の実験装置として、Gigカメラ3台、照明装置(リング照明2台、透過照明1台、照明電源、および付属品)、PCを購入、従来機とシステム統合する為に従来機からカメラ1台、画像処理装置を取り出し、新たにカメラスタンド、照明、鯛稚魚の置台、統合コントローラなど設計製作をした。また、従来機との一体運用するため、新規の実験装置のPCをMASTER、従来機の画像処理装置をSLAVEにする通信ソフトウエアを設計製作した。次に、AAMのプログラム実装により正面画像より「口の歪み」を検出できるようにした。具体的には、全ての鯛稚魚の訓練画像に対して口の輪郭に沿って12点のランドマークを付与登録し、訓練画像から得た口領域内の平均画像をアフィン変形させる事でモデル画像を構成する。変形に当たっては、計測対象の画像とモデル画像の輝度差が最小となるように変形する。口の歪みは、変形後の12点の特徴点を用いて、口の横方向と縦方向の2直線の角度から計算する。初年度で製作した新規の実験装置の残課題の対応を実施し、従来の実験装置との間で通信させ、2つの実験装置を統合運用して実験・評価を実施した。本学水産養殖種苗センターにおいては、生魚を使った実験、研究所においては、正常魚、変形魚を冷凍して持ち帰り実験した。1正面反射画像の撮影は生魚では失敗。以降、死魚にて実施したが、口が閉じているのでAAMでは口輪郭は追跡できなかった。2側面透過画像の撮影、特徴量算出は生魚で成功した。3従来のカメラの分解能が低く、ヒレを誤認識する場合があった。4側面透過画像を撮影するカメラと口形状を撮影する新規のカメラが干渉する為、カメラ2台設置は困難であった。5口変形は、多種多様の変形パターンがあり正面画像のみでの検出だけではカバーしきれず、側面画像の検出も必要であった。(平成26年4月8月)上記の実験結果を受けて、従来のカメラ、実験装置を廃止し、その機能を新規のカメラ、新規の実験装置で吸収する事にした。具体的には、従来の側面の透過画像処理の機能をMATLAB、および、MATLAB IMAGE PROCESSINGTOOLBOXを利用して新規の実験装置に実装し、正面反射画像処理の機能は、C++で実装し、MATLAB-C++連携を実現することにより、統合ソフトウエアとして実装した。この新実験装置を用いて、12月、翌年の2月の2回、本学水産養殖種苗センターにおいて生魚を使った実験を実施した。結果としては、112月の実験では、稚魚の正面反射画像の撮影は成功したが、画像が小さくAAMによる口輪郭の追跡はできなかった。レンズ、接写リングをつける事により、画像は大きくなり、2月の実験では撮影に成功した。2稚魚の口変形は、多種多様の変形パターンがあり、稚魚の口輪郭のAAMのみだけでは、追跡ができなかった。(平成26年9月平成27年3月)前年度までの総括として大きく3つの課題があった。1正面反射画像から顔認証のActive Appearance Model(以降、AAMと呼ぶ)による口の歪み量の取得に関しては、口の歪みが大きいとモデルの収束が非常に悪い。極端な口変形に対しては特に悪い。また、収束時間も1秒弱程度であり能力は低い。2側面シルエット画像から得られた外形形状の特徴量からの良否判別に関しては、変形魚を変形魚とする検出能力が悪い.3どちらも、麻酔済の稚魚を手で検査装置に取り置きする為、その時間もタクトに大きく影響していた。そこで、最終年度として、当初の研究の狙いである実用化に重点を置き、非常に効果のある検査項目に限り機械化を実施、その他の検査項目に関しては作業者で実施、効果を最大限出すようにする。検査装置に関しては、1良否判別の信頼性の大幅な向上2タクトの大幅短縮を目標にした。

今までは、作業者でも判別に迷うような疑似変形も変形に入れていていた為、検査装置の判断ロジックに混乱をきたし信頼性の低下を招いた。そこで、はっきりと判別できる変形魚を対象にして、数を大幅に増やして検証を実施、判定ロジックの信頼性を向上した。また、誤認識の大きい要因は、最初の認識ロジックの段階での稚魚の左/右、正立/倒立の逆認識、及び、ヒレを検出する事による誤認識が多かった。そこで、全てを一律の特徴量検出アルゴリズムではなく、変形の種類、ヒレの検出範囲により数種類のアリゴリズムで対応した。タクトを短縮するために、MATLABプログラムの高速化を図り、計算時間を約1/3に1秒/匹程度に処理時間を短縮した。また、手で検査装置に取り置きするのをなくす為、稚魚を取り置きする事なくコンベア上部から撮像できるLEDバックライトベルトコンベアの採用、検査コンベアに稚魚を移送する為の移送パイプ内での炭酸ガス入り海水の循環装置を検討した。本研究では、マダイ稚魚の選別作業の自動化を図るために、マダイ稚魚の吻部、及び、外形形状の画像特徴の抽出手法の開発を主に実施した。代表的な人の顔認識手法であるActive Appearance Modelをマダイ稚魚の口に適用した。外形形状の画像特徴の抽出手法では、2値画像処理、エッジ検出、線検出を用いた。研究成果としては、Active Appearance Modelは、吻部の極端な変形、および、カメラに対する稚魚の顔の傾きの変化に対して弱い事がわかった。また、外形形状の画像特徴の抽出手法からの検出では、研究当初の検出能力と比較して飛躍的に検出能力が向上でき、かつ、タクトも非常に短くなった。研究実績の概要で示した通り新規実験装置の課題対応に追われ作業者に関する研究項目は実施できなかった。実験装置の完成度向上ができた。具体的には、1従来の実験装置のカメラを廃止する事で、カメラが3台から2台に削減。各々のカメラで、稚魚側面の透過画像(側面輪郭画像)、稚魚正面の反射画像の撮影をできるようになり、実験装置とのIFもGigEの一つになりすっきりした形になった。2従来の実験装置を廃止し、その機能を新規の実験装置に吸収する事より、実験装置が1台となり、カメラ同様すっきりした形になった。従来の実験装置の機能はMATLAB、および、MATLAB IMAGE PROCESSINGTOOLBOXを利用して新規の実験装置に実装した。また、正面画像の処理などの新規機能は、C++で実装し、MATLAB-C++連携を実現することにより、統合ソフトウエアとして新規実験装置に実装した。以上の様に、新規の実験装置では、従来の実験装置ではできなかった機能の変更、追加が容易に実施できるようになった。その結果、稚魚側面輪郭形状の計測・検出に関しては、1カメラの分解能向上(30万画素⇒120万画素)、アルゴリズムの改良により、短躯、丸み、背部陥没・腹部陥没、尾部陥没、パグヘッドネス等の変形についてヒレとの誤検出が減少し検出能力が向上した。2しかし、尾柄短縮、特に、上弯症(尾部上がり)に関しては、正常魚の稚魚動作時の尾部形状と変形魚の尾部形状がよく似ており判別は困難である。稚魚正面反射画像の計測・検出に関しては、稚魚の口変形は、多種多様の変形パターンがあり、稚魚の口輪郭のAAM追跡のみだけでは難しく側面輪郭画像での追跡も必要と考えられる。
光合成系アンテナの構築原理の解明とその光エネルギー獲得システムへの応用

我々は2種の耐熱性緑色光合成細菌Chloroflexus aurantiacusおよびChlorobium tepidumの光合成膜から光合成アンテナを単離、精製した。固体状態での高分解能NMR(野澤担当)を活用し、単離した光合成アンテナの構造をin-situで解析し、ネイティブな状態でのクロロフィルの配位状態、クロロフィル-クロロフィル間相互作用、クロロフィルと周囲のアミノ酸残基との相互作用を明らかにした。アンテナタンパク質から光合成アンテナを構成する色素(バクテリオクロロフィルcおよびd)を有機溶媒抽出処理で単離し、HPLCで精製し、これらの色素、およびタンパク質の構造を液体NMR(野澤担当)表面増強IR法(大澤担当)を用いて決定した。さらにアンテナ系における励起エネルギー移動を耐熱性緑色硫黄光合成細菌Chlorobium tepidumのアンテナ系さらにはそこから反応中心への励起エネルギー移動を時間分解ケイ光法で検討を行い、生物が光エネルギー獲得のために構築しているアンテナ系の構造と組立、および集光機構を探った。また、人工光獲得アンテナの構築を構造の明かとなった色素を用いて行い、その会合特性を光化学特性とをあわせ検討した。これら会合体の構造の知見は固体高分解能NMR(野澤担当)と表面増強ラマン、表面増強IR(大澤担当)で初めて検討可能となった。この会合体は光合成系のアンテナをモデル的に合成できた初めての例であり、モデルアンテナ系を用いた光エネルギー獲得利用に一つの方向を与えたものである。本研究の目的は人工光合成系構築のための光エネルギ-補獲システムの開発にある。光生物はその光エネルギ-捕獲器官アンテナで光エネルギ-を励起エネルギ-の形で取り込み、これを反応中心タンパク質に伝達し光一化学エネルギ-の変換を行ないATP,NAD(P)Hを生成している。これらを利用して多くの酵素系がCO_2を有機物に固定して、自らの生育に必要な組織と栄養を得ている。本研究は生物の光エネルギ-獲得器官である光合成アンテナの構築原理を解明しこれに反応中心系を組み合わせ、工学的にATP,NAD(P)Hを生成するシステムを開発し、さらに、これと多様な酵素系を組み合わせ有用生理活性物質を生産できるシステムを構築することを目指している。このための基礎研究として本研究においては光合成アンテナのネイティブな状態での構造解析と、光合成系アンテナからの構成要素(色素(クロロフィル)とタンパク質)を分離精製して、その同定を行なった。耐熱性緑色光合成合細菌Chloroflexus aurantiacusおよびChlorobium tepidumの光合成膜から界面活性剤を用い光合成アンテナタンパク質を単離、精製した。単離した光合成アンテナの構造解析をinーsituで固体状態での高分解能NMRを活用し、ネイティブな状態でクロロフィルの配位状態、クロロフィルークロロフィル間相互作用、クロロフィルと周囲のアミノ酸残基との相互作用を明らかした。その結果クロロフィルはお互いに9位のカルボニル基と2a位のヒドロキシエチル基で水素結合を形成し5配位状態で会合構造を作っていることが明らかとなった。さらに,クロロゾ-ムの^<13>CーNMRと理論的に求めた環電流シフトの値との比較から会合構造を提察することができた。(雑誌論文1,2,4)また,アンテナタンパク質から光合成アンテナを構成する色素(クロロフィル)を有機溶媒抽出処理で単離し、HPLC(本科研費で購入済み)で精製した。これらの色素、およびタンパク質の構造を^1Hおよび^<13>C液体NMR、表面増強IR法、レ-ザ-ラマン法を用いて決定した。バクテリオクロロフィルの7位はファルネシルエステルであることとそれぞれの成分の4位および5位の置換基を決定した。(雑誌論文3)我々は2種の耐熱性緑色光合成細菌Chloroflexus aurantiacusおよびChlorobium tepidumの光合成膜から光合成アンテナを単離、精製した。

固体状態での高分解能NMR(野澤担当)を活用し、単離した光合成アンテナの構造をin-situで解析し、ネイティブな状態でのクロロフィルの配位状態、クロロフィルークロロフィル間相互作用、クロロフィルと周囲のアミノ酸残基との相互作用を明らかにした。アンテナタンパク質から光合成アンテナを構成する色素(バクテリオクロロフィルcおよびd)を有機溶媒抽出処理で単離し、HPLCで精製し、これらの色素、およびタンパク質の構造を液体NMR(野澤担当)表面増強IR法(大澤担当)を用いて決定した。さらにアンテナ系における励起エネルギー移動を耐熱性緑色硫黄光合成細菌Chlorobium tepidumのアンテナ系さらにはそこから反応中心への励起エネルギー移動を時間分解ケイ光法で検討を行い、生物が光エネルギー獲得のために構築しているアンテナ系の構造と組立、および集光機構を探った。また、人工光獲得アンテナの構築を構造の明らかとなった色素を用いて行い、その会合特性を光化学特性とをあわせ検討した。これら会合体の構造の知見は固体高分解能NMR(野澤担当)と表面増強ラマン、表面増強IR(大澤担当)で初めて検討可能となった。
ＲＮＡｉ医薬品の実用化に向けたｓｉＲＮＡの細胞内輸送機構の解析

siRNAやアンチセンスに代表される核酸医薬品は、治療法のない難治性疾患に対する革新的次世代医薬品として注目されている。しかし、核酸医薬がどのように細胞膜を通過し、細胞内で輸送されているかについては、輸送経路、分子実体とも明らかになっていない。本研究では、核酸医薬の細胞内取り込み・輸送に関わる因子についてスクリーニングを行い、「遺伝子K」と名付けた分子がこの経路に関与することを見出した。RNAi医薬品(siRNA)に代表される核酸医薬は、抗体医薬に続く革新的次世代医薬品として大きく注目されている。しかし、現状では個体投与における効果は限定的であり、細胞内へのsiRNAの導入効率を改善することが急務の課題となっている。本研究課題では、これまで分子基盤がほとんど明らかになっていない細胞内へのsiRNAの取り込み機構に関し、無脊椎動物(線虫、ショウジョウバエ等)の研究から明らかになった知見を元に、ヒト細胞を用いて機能的な相同性を検証する。また、siRNAライブラリーを用いた網羅的スクリーニングにより、細胞内へのsiRNAの取り込みに関わる分子を探索する。これにより、病態局所においてsiRNAの取り込みを促進する分子を同定する。24年度においては、当室にマルチイメージアナライザー(In Cell Analyzer 2000)を導入し、siRNAの細胞内への導入を評価するアッセイ系を構築した。具体的には、GFP安定発現細胞(HEK293, HeLa)にGFPに対するsiRNAを添加し、GFP蛍光の増減でsiRNAの細胞内到達を評価するアッセイ系を最適化した。また、siRNAの輸送経路を特定するため、蛍光標識したsiRNAを添加した条件で細胞内オルガネラの抗体染色を行い、どのような時間経過で細胞質に到達するかを明らかにした。一方で、「siRNAの細胞内への取り込みに必要な分子」の機能を阻害するため、1)候補分子をRNAiによって発現抑制する手法、および2)ゲノム編集技術で候補分子を遺伝子破壊する手法に関して、パイロット実験を行った(後者に関しては現在進行中)。siRNAやアンチセンスに代表される核酸医薬品は、抗体医薬品に続く次世代医薬品として大きく期待されている。ごく最近、全身投与性のアンチセンス医薬品(家族性高コレステロール血症治療薬)であるミポメルセンがFDAで承認されたが、現状では投与量が非常に大きく、細胞内への核酸医薬品(オリゴ核酸)の導入効率を改善することが急務の課題となっている。本研究課題ではこれまで分子基盤がほとんど明らかになっていない細胞内へのオリゴ核酸の取り込み機構に関し、無脊椎動物(線虫、ショウジョウバエ等)の解析から明らかになった知見をヒントに、ヒト細胞を用いて包括的に検証する。また、siRNAライブラリーを用いた網羅的スクリーニングにより、細胞内へのオリゴ核酸の取り込みに関わる分子を探索する。これにより、病態局所においてオリゴ核酸の取り込みを促進する分子を同定する。25年度においては、易分解性GFPを発現する細胞株を新たに樹立し、マルチイメージアナライザー(In Cell Analyzer 2000)を用いてオリゴ核酸の細胞内取り込みを評価するスクリーニング系を作製した。取り込みアッセイに用いるオリゴ核酸は数百の配列からスクリーニングを行い、GFPを効率よく分解するよう最適化した。この評価系を用いて、一本鎖オリゴ核酸(アンチセンス等)および二本鎖オリゴ核酸(siRNA等)について、取り込みに関わる分子を探索し、これまでに1つの候補分子を同定した(1次スクリーニング継続中)。この候補分子は、一本鎖オリゴ核酸と二本鎖オリゴ核酸の間で取り込みに対する寄与が異なっており、オリゴ核酸の構造、作用部位、作用機序等によって、取り込み機構が異なることが示唆された。核酸医薬品とは一般に、核酸が直鎖状に結合したオリゴ核酸を薬効本体とし、蛋白質発現を介さず直接生体に作用するもので、化学合成により製造される医薬品を指す。この中でsiRNAやアンチセンスに代表される「mRNAに作用する核酸医薬品」は、これまで“Undruggable"とされてきた分子を標的にすることが可能であることから、治療法のない難治性疾患や希少疾患に対する革新的次世代医薬品として注目されている。細胞の内側で機能する核酸医薬品は細胞膜を通過する必要があるが、核酸医薬品はポリアニオン構造を有するため細胞膜を透過しにくいことが問題となっている。中でも二本鎖であるsiRNAは一本鎖のアンチセンスと比べ負電荷、分子量共に大きいことから、細胞内への取り込みにはキャリアが必要となる。近年では、糖鎖や脂質などを修飾したキャリアを必要としないsiRNAが開発されつつあるが、この場合もより効率のよい細胞内送達が求められている。現在、核酸医薬品の有効性を高めるために、オリゴ核酸に膜との親和性を高める化学修飾や、オリゴ核酸を送達するキャリアを開発する試みが行われているが、「受け手側の細胞において、オリゴ核酸がどのように細胞膜を通過し、細胞の内側に取り込まれるか」といった分子機構や、取り込まれてから細胞内動態の理解はほとんど進んでいない。

そこで本研究では、この分子機構を明らかにするために、マルチイメージアナライザーを用いたスクリーニング系の構築し、siRNAが細胞に取り込まれてから標的mRNAを分解するまでに関わる因子の同定を行った。その結果、遺伝子Kと名付けた分子がこの経路に関与することを見出した。26年度が最終年度であるため、記入しない。生化学26年度が最終年度であるため、記入しない。24年度の研究到達目標は全てクリアしており、また、研究の進行に伴い、発案した新しいアプローチにも既に着手している。既にオリゴ核酸の取り込みに関わると思われる分子を同定している。当初の計画通り、線虫遺伝学の知見に基づいた候補遺伝子の解析を行う。また、新たに網羅的な候補分子のスクリーニングを導入する。これまでの研究方針に基づき遂行する。25年度以降に消耗品を多く使用するsiRNAスクリーニングを行うため研究計画に従い、siRNAスクリーニングに遂行に使用する。26年度に「網羅的RNAiスクリーニング」ならびに「ゲノム編集技術による遺伝子欠損細胞の作製」を行うが、研究給費の必要性が26年度の方が大きいため「網羅的RNAiスクリーニング」ならびに「ゲノム編集技術による遺伝子欠損細胞の作製」を遂行するために使用。
多段階剛性制御装置を用いた免震構造物の極限挙動と性能設計

今世紀中盤までにはその襲来が確実視される南海トラフの巨大地震や首都直下地震に対する備えとして、地震動のスペクトル特性に寄らずに地震動入力を低減する効果が期待される、3次元凹型曲面摩擦機構を有する多段階剛性免震装置の免震建物への適用が提案されている。多段階剛性免震装置による共振応答低減効果を評価すること、通常の免震建物と新型免震装置を有する免震建物それぞれに対して極限挙動を定量的に評価した設計方法を提案すること、を本研究の目的とする。研究2年目である本年度は、多段階剛性免震装置の設計法、具体的にはそれぞれの剛性領域での最適挙動を確保するために付与すべき各段階(中小地震時、大地震時、極大地震時)の剛性の決定方法を、関連する実験や数値解析による知見を参照して考案した。とりわけこの免震装置を特に高層建物に適用する場合を考え、高層免震における懸念材料である、転倒モーメントによって生じる免震装置への高圧縮軸力に対する性能、同じく免震装置への引張力に対する性能、極大地震下における免震層変形に対する性能、同じく上部構造の損傷に対する性能を検討した。この結果、多段階剛性免震装置の特徴である引張・圧縮力に対する安定した挙動を踏まえれば、極大地震時に対応する剛性はできるだけ大きいほど全体としての性能(安全性)が向上することを突き止めた。また、高層建物に免震を適用することをためらう米国にその得失を提示するために、典型的な高層免震建物に対する詳細設計・解析を実行した。その結果、変位応答としてみれば免震化による効果は極めて限られているが(せいぜい20%)、加速度応答としてみたときには50%70%の応答低減が可能になることを明かにし、とりわけ安全性ではなく機能性の向上という視点に立てば、高層構造物であっても免震効果は決して低くない、という所見を得た。(抄録なし)今世紀中盤までにはその襲来が確実視される南海トラフの巨大地震や首都直下地震に対する備えとして、地震動のスペクトル特性に寄らずに地震動入力を低減する効果が期待される、3次元凹型曲面摩擦機構を有する多段階剛性免震装置の免震建物への適用が提案されている。本年度はその端緒として、各国の免震指針における免震建物の大変形極限挙動への対応の検討、数値解析シミュレーションの対象とする免震建物の選定、免震建物の振動台共振実験および擁壁衝突実験を骨子とした研究を実施するとともに、既存の免震建物の擁壁衝突モデルの評価と大変形極限挙動の模擬にも着手した。具体的には首都圏に実際に建つ高層免震建物を姐上に上げ、極限応答までを模擬するために、上部構造の塑性化や部材劣化までを含む上部構造モデルと、多段階剛性免震装置の特性を模擬する免震層モデルからなる精緻な数値解析モデルを構築した。次いでこのモデルを用いて、長周期成分を含む長周期地震動とパルス性の高い直下地震動(断層直交成分)に対する応答を評価した。またこの挙動を振動台上で再現すべく、上部構造を等価な多自由度システムに置換した縮小模型を製作し、擁壁衝突を模擬するために裏留め土の柔性を考慮した擁壁部剛性とRC基礎の剛性を用いて表現した衝突モデルによる解析の妥当性を検討した。

本研究においては、できるだけ現実に即した建物の解析、実施設計に照らし合わせた現実的な設計地震動の選択、実際の巨大地震を想定した現実的なシナリオ地震の選択が不可欠となるが、幸いにも本研究に建設産業界からの支援を得ることができ、建築構造設計実践の最先端で働く技術者達と定期的な会合を持ちつつ、本研究にとって最適の免震建物を解析対象とすることができた。振動台を用いた実験に関しても、等価な多自由度系システムに置換した上部構造模型が十分な精度を有すること、上部構造の損傷の進展を各部材の剛性調節によって模擬できることを確認した。このように、本年度での達成をめざした研究項目については所定の成果を収めることができたと考えている。本年度で構築した数値解析モデルを用いて、多段階剛性免震装置を用いることによって期待できる応答低減効果と、この装置を用いた場合に想定される極限挙動を検討するとともに、多段階剛性免震装置を有する免震建物の振動台実験の実施に向けて、試験体や試験装置の実施設計にも取り組む予定である。(抄録なし)
三叉神経の痛覚刺激伝導系に対する一酸化窒素の直接・間接作用とその制御機構の解明

脊髄背側路核から調整した三叉神経知覚終末シナプトソーム分画、同部位に挿入したマイクロプローベ、さらには培養ヒト神経芽細胞を用いて、歯髄からの知覚(痛覚)刺激伝達に対する一酸化窒素の影響を検討した。三叉神経背側路核にプローべを挿入した実験動物の歯髄を刺激することにより、サブスタンスPが遊離された。また、グルタミン酸受容体刺激薬の投与により一酸化窒素が遊離された。さらに、一酸化窒素の関与は、痛覚過敏状態(アロディニア)でも認められた。さらに、脊髄背側路核の神経終末を用いた潅流実験では、一酸化窒素ドナーの存在下に脱分極刺激した場合、グルタミン酸遊離は影響されなかったが、サブスタンスP遊離は抑制された。また、一酸化窒素ドナーは神経終末のサイクリックGMPを増加させ、グアニル酸シクラーゼ系の関与を示唆した。また、培養細胞では一酸化窒素は神経細胞の接着たんぱく質をニトロ化し、刺激時の細胞内カルシウム上昇を促進するとともに、細胞死を誘導することを示した。以上より、脊髄背側路核レベルにおいては、グルタミン酸刺激により一酸化窒素が遊離され、さらにこの一酸化窒素は痛覚刺激伝導系を抑制的に制御していることが明らかとなった。また、過剰の一酸化窒素は神経細胞死を引き起こす可能性も示唆された。今年度は培養ヒト神経芽細胞腫、脊髄背側路核から調整した三叉神経終末分画、脊髄背側路核に挿入したマイクロプローベを用いて、一酸化窒素(ドナー)の影響を検討した。神経終末分画からの興奮性アミノ酸神経伝達物質(グルタミン酸)の遊離は一酸化窒素ドナーの共存下でも影響を受けなかったが、痛覚を伝達するといわれているサブスタンスPの遊離は抑制された。グルタミン酸神経の興奮は介在ニューロンの細胞内カルシウム濃度を上昇させ、一酸化窒素合成を促進することから、二種類の神経系の痛覚伝達に対する相互影響機構の存在をうかがわせた。また、培養細胞では一酸化窒素ドナー、特に、ペルオキシナイトライト・ドナーによりその神経活動、細胞機能が低下し、濃度によって死に至ることが示された。これは細胞内たんぱく質のニトロ化によって引き起こされており、一酸化窒素が神経活動を制御するとともに、過剰の一酸化窒素がスーパーオキシドと反応して生じるペルオキシナイトライトが細胞死を誘導すると考えられた。さらに、歯髄を損傷させることによりアロディニア状態を形成したラットを用いて、脊髄背側路核で一酸化窒素の産生が亢進していること、また、グルタミン酸受容体遮断薬などにより一酸化窒素の遊離が変化すること、それによりアロディニアの程度が変化すること、といったデータが蓄積されつつあるが、確証には至っていない。昨年度に引き続き、脊髄背側路核から調整した三叉神経知覚終末シナプトソーム分画、同部位に挿入したマイクロプローベ、さらには培養ヒト神経芽細胞を用いて、歯髄からの知覚(痛覚)刺激伝導に対する一酸化窒素の影響を検討し、昨年度に得られている結果を確証する実験を行った。まず、実験動物の歯髄刺激により、脊髄背側路核においてサブスタンスP、セロトニンが遊離されること、また、グルタミン酸受容体の刺激により一酸化窒素が遊離されることを確認した。脊髄背側路核の神経終末を用いた潅流実験では、一酸化窒素は神経終末分画からの脱分極刺激時のグルタミン酸遊離には影響せず、サブスタンスPの遊離のみを抑制した。また、培養細胞では一酸化窒素は神経細胞の接着たんばく質をニトロ化して、細胞死を誘導することを示した。以上より、脊髄背側路核レベルにおいても、グルタミン酸刺激により一酸化窒素が遊離され、さらにこの一酸化窒素は痛覚刺激伝導系を抑制的に制御していることが明らかとなった。また、過剰の一酸化窒素は神経細胞にとって、細胞死を引き起こす可能性も示唆された。