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電気化学分析のための金属基板－異種金属ナノ粒子複合修飾電極の開拓と機能探索

金属基板上に異種金属ナノ粒子を修飾することにより電気化学分析に有効な電極の開発と機能探索を行った。各種金属基板への金ナノ粒子修飾から検討を開始し、その初期段階で、ニッケル基板電極の有用性や、金属線をそのまま基板として電極を構築できること、異種金属間の酸化還元電位差を利用することで金属基板表面へ異種貴金属ナノ粒子を修飾できること、などを明らかにした。これらに基づき、金ナノ粒子修飾ニッケル線電極については、金の電極触媒能を活かして極少量の金しか使用しない機能性電極を構築した。また、ニッケル線へのパラジウムや白金ナノ粒子の修飾や、チタン線への金ナノ粒子修飾の特徴や機能についても明らかにした。本年度は、まず、各種金属基板と3.5 nmの金ナノ粒子との複合化について検討した。実際に検討を行いたい各種金属についてはディスク電極として販売されていないものが多いため、まず予備検討として、ディスク電極の代わりに金属線が使用できないかを、これまでに金ナノ粒子複合系での応答を明らかにしたニッケル電極を用いて検討した。その結果、基板が金属線になっても得られるサイクリックボルタモグラムに大きな変化はなかった。そのため、基板電極に関しては、金属線を用いて検討を行うこととした。実際の検討内容としては、銅・チタン・鉄・亜鉛・クロムなどの各種金属表面に金ナノ粒子の修飾を試みた。その結果、すでにその特性を明らかにしていたニッケル基板に加えて、チタン電極上に金ナノ粒子を修飾するとナノ粒子の電極触媒能が機能的に発揮できる可能性があることがわかった。また、この検討において、金ナノ粒子を修飾する方法としては、当初は金ナノ粒子溶液に金属基板を浸漬する方法のみを用いていたが、種々の試行の結果、塩化金酸などの貴金属イオンを直接基板金属に作用させ酸化還元電位差を利用して貴金属ナノ粒子を表面に修飾する方法も有効であることがわかった。そのため、チタン電極については、塩化金酸イオンを含む水溶液中での処理について系統的に検討した。その結果、還元剤であるクエン酸イオンを溶液中に共存させることで表面に析出して修飾できる金ナノ粒子の量を増大できることがわかった。また、その結果として得られたボルタモグラムの形状は、通常のものとは異なるS字状のものであった。このことは、チタン表面に修飾した金ナノ粒子上での拡散の状況が変化し、それぞれの金ナノ粒子が微小ナノ電極として機能していることを示している。本年度は、必要な予備検討に基づいて、簡便な金属線の利用という方向で検討を進め、各種金属基板の可能性について十分に検討できた。また、その結果、チタンと金ナノ粒子との複合化をひとつのターゲットとして確立できた。さらに、金属ナノ粒子を表面修飾するための新しい方法として、異種金属間での酸化還元電位差を利用した修飾についても着手して有効性を明らかにできた。これらの点で、研究はおおむね順調に進展しているものと考える。修飾法の変更などについても検討したため、貴金属種をいろいろ換えて行う検討は本年度中には遂行できず、次年度に継続して行うように考えているが、それにも増して先に述べた成果は研究全体の進展にも極めて有効であったと評価している。本年度は、おもにニッケル基板に貴金属ナノ粒子を修飾する方法について検討した。昨年の研究の結果、貴金属イオンの水溶液に金属ニッケルを一定時間浸漬するだけの簡便な方法により酸化還元電位差を利用して貴金属のナノ構造やマイクロ構造をニッケル表面に修飾できることがわかったので、その詳細に関して以下の点を検討した。まず、金の表面修飾に関しては、浸漬時間と塩化金酸濃度がニッケル線の表面修飾に与える影響について詳細に検討した。その結果、金の結晶をニッケル表面に修飾するためには、0.1 mM程度以上の濃度の溶液が必要であるが、例えば、1.0 mMの塩化金酸溶液では、1時間程度で表面全体が高密度で修飾され、24時間も浸漬してしまうと表面が錆状になるように過剰量の金が修飾されることがわかった。このことは、浸漬時間の制御によって表面に修飾できる金の量や状態を制御できることを示している。また、0.01 mM程度の希薄溶液では、浸漬時間を長くしても金の表面修飾がほとんどないことがSEM像の測定から観測できたが、グルコースの電極触媒応答を測定すると一定の触媒応答が観測できた。このことは、ごく少量の金がニッケル表面に存在するだけで触媒応答が発現することを示唆している。そのため、その詳細については金の省量化の観点から、さらに検討を進める予定である。また、パラジウムと白金のニッケル表面修飾についても検討した。その結果、パラジウムの表面修飾は金と同様の濃度や浸漬時間で進行させ得ることがわかった。それに加えて、2価と4価の塩化パラジウムイオンでの表面修飾の違いを明らかにした。しかし、白金に関しては、パラジウムに比べて高濃度の金属イオン溶液が修飾に必要であり、また、その再現性もあまりよくないことがわかった。白金に関しては、還元剤を加えて修飾を促進するような方法も用いて、さらに検討を進める計画である。本年度は、昨年度の検討に基づいて、酸化還元電位差を利用した金属表面の新しい修飾法に関して、特にニッケル表面への貴金属の修飾に集中して検討を進めることができた。その結果、貴金属イオン水溶液の濃度や浸漬時間が表面修飾に及ぼす影響や、化学種による表面修飾の違いに関して系統的な知見を得ることができた。そのため、研究は順調に進展しているものと考える。ニッケル基板に関して集中的に検討を進めた結果、本年度当初に挙げていたチタンやパラジウムの表面修飾については行えなかったが、来年度以降さらに検討を進める計画である。

本年度は、まず、昨年度にも検討したニッケル表面への金の修飾に関してさらに検討した。その結果、0.01 mMや0.001 mMの塩化金酸水溶液中にニッケル線を1時間浸漬した場合には、SEM像による観察の結果では金の析出がみられないものの、グルコースや尿酸の電解酸化反応に関しては金に由来するような一定の触媒効果があることがわかった。また、フェロシアン化物イオンの酸化反応に対しても、電極応答を金のものに改質する効果があることがわかった。これらの成果については、すでに論文にまとめた報告したが、SEM像で認識できない修飾状況については、基板であるニッケルの電気化学応答などを詳細に測定するなど、さらに検討を進めている。また、ニッケル線にパラジウムを修飾する試みについてもさらに検討を進め、反応温度などの条件の最適化によって、再現性良くパラジウムを修飾できる条件を明らかにした。また、塩基性溶液中でのエタノールの電極触媒反応についても検討して、ニッケルがパラジウムを担持する材料としても有効であることも明らかにした。パラジウム担持ニッケルの電極触媒応用に関しても、さらに検討を進めている。別の電極材料としては、チタン線を用いた金の修飾についても検討した。酸化還元電位差からは、チタンはニッケルより負の電位で酸化されるため、金の自発的な析出が期待できたが、実際には表面での不動態の形成のため反応は進行しなかった。しかし、反応溶液中にクエン酸イオンを共存させることにより、微小な金ナノ粒子をチタン表面に修飾できることを、微小電極に特有なシグモイダルの電気化学応答を観測して明らかにできた。このほかにも、パラジウムへの金の析出などについても検討を開始して、塩基性溶液中でのエタノールの電極触媒反応に関して単に双方の金属の応答を足し合わせただけではない興味深い電気化学応答を得ることができた。金属基板上に異種金属ナノ粒子を修飾することにより電気化学分析に有効な電極の開発と機能探索を行った。各種金属基板への金ナノ粒子修飾から検討を開始し、その初期段階で、ニッケル基板電極の有用性や、金属線をそのまま基板として電極を構築できること、異種金属間の酸化還元電位差を利用することで金属基板表面へ異種貴金属ナノ粒子を修飾できること、などを明らかにした。これらに基づき、金ナノ粒子修飾ニッケル線電極については、金の電極触媒能を活かして極少量の金しか使用しない機能性電極を構築した。また、ニッケル線へのパラジウムや白金ナノ粒子の修飾や、チタン線への金ナノ粒子修飾の特徴や機能についても明らかにした。本年度の成果に基づいて、今後の研究計画に関しては、特に以下の3つの事項を優先的かつ重点的に遂行していく考えである。1.本年度の検討において基板電極としての有用性が明らかになったチタンに関しては、金ナノ粒子だけではなく、白金・銀・パラジウムなどの貴金属ナノ粒子の表面修飾に関しても系統的に検討して、その機能や有効性を明らかにする。
マイクロビームによるスピン偏極走査電子顕微鏡の試作

平成8年度は、試料から放出される2次電子のスピン偏極度を測定するためのスピン偏極検出器を製作した。スピン偏極検出器としては、装置の製作が容易で低廉な低速電子回折検出器を採用した。本年度に購入した位置検出装置を別途製作した真空フランジに支柱を立てて取り付け、これを既存の小型超高真空装置の中に取り付けた。最後に、電流・電圧導入ターミナルと位置検出装置電源を電気的に接続した。超高真空装置を大気から封じて、これに真空ポンプ、真空系等を取り付けた。そして、装置全体を焼き出しを行いながら排気し、装置内部を超高真空にした。この状態で位置検出装置を動作可能状態にし、放電や破損なく正常にこれが動作することを確認した。次に、この小型超高真空装置を取り付けるべき既存の大型超高真空装置の改造を行った。まず、試料から放出される2次電子がスピン偏極検出器に導入される際に、軌道が曲がらないようにするために装置内部全体を覆う厚さ2mmの磁気遮蔽板の設計を行った。また、試料を保持し、これを入射電子ビームに対して平行移動、回転ができる様な試料保持装置の設計を行った。平成9年度は、まず磁気遮蔽板と試料保持装置の製作を行った。次に、試料から放出される2次電子を効率よく収束し、スピン偏極検出器に所定のエネルギーで入射させるための電子レンズを設計し製作した。真空用配管内に電子レンズが収まるようにし、高圧用電流・電圧導入ターミナルを介して電気的に真空用配管外と接続した。また、2次電子がエネルギー分解できる様に円筒鏡型エネルギー分析器を設計し製作した。そして、エネルギー分析器を電子レンズ系の途中に組み込んだ。最終的に、2つの超高真空装置を電子レンズによって接続した。試料位置にテレビ用の電子銃を置いて熱電子を放出させ、スピン偏極検出器に電子が実際に入射することを実験的に確認した。スピン偏極検出器には、高エネルギーモット検出器、阻止型モット検出器、低速電子回折検出器、散漫散乱検出器、吸収電流検出器等があるが、装置の製作が容易で低廉な低速電子回折検出器を採用した。本年度に購入した位置検出装置を別途製作した真空フランジに支柱を立てて取り付けた。次に、同フランジに用意した高圧用電流・電圧導入ターミナルを介して電気的にフランジ外と接続した。さらに、フランジ全体を既存の小型超高真空装置の中に取り付けた。そして、装置全体を焼きだしを行いながら排気し、装置内部を超高真空にした。次に、この小型超高真空装置を取り付けるべき既存の大型超高真空装置の改造に着手した。次年度にかけて、設計に基づいて実際の製作を進めていく予定である。

平成9年度は、前年度に製作したスピン偏極検出器を内包した小型超高真空装置を接続すべき、既存の大型超高真空装置の改造を行った。まず、試料から放出される2次電子がスピン偏極検出器に導入される際に、軌道が曲がらないようにするために装置内部全体を覆う厚さ2mmの磁気遮蔽板を製作し設置した。また、試料を保持し、これを入射電子ビームに対して平行移動、回転ができる様な試料保持装置の製作を行った。次に、試料から放出される2次電子を効率よく収束し、スピン偏極検出器に所定のエネルギーで入射させるための電子レンズを設計し製作した。真空用配管内に電子レンズが収まるようにし、高圧用電流・電圧導入ターミナルを介して電気的に真空用配管外と接続した。具体的には、まず真空外ではターミナルと既存の電源を同軸ケーブルでつないだ。真空用配管内では、真空用同軸ケーブルを用いてターミナルと電子レンズを接続し、電源からの所定の電圧が電子レンズの各部分に与えられるようにした。さらに、電子レンズの効率をシュミレーションによって求めた。その結果、80%の2次電子の捕捉が可能であることがわかった。また、2次電子がエネルギー分解できる様に円筒鏡型エネルギー分析器を設計し製作した。そして、エネルギー分析器を電子レンズ系の途中に組み込んだ。最終的に、2つの超高真空装置を電子レンズによって接続した。試料位置にテレビ用の電子銃を置いて熱電子を放出させ、スピン偏極検出器に電子が実際に入射することを実験的に確認した。
ウシ小型ピロプラズマ原虫表面蛋白質の機能解析と疾病制御への応用

ウシ赤血球に寄生し、貧血の原因となるタイレリア原虫ピロプラズム表面蛋白質であるp32の機能解析を行うため、そのモチーフ解析からアクチン結合活性を有すると考えられる配列(lys-glu-lys)を含む合成ペプチドを2種作製した。このペプチドを用いてアクチンの重合活性を測定したところ、2種のペプチドともにアクチン重合活性を有することが明らかとなった。また原虫をTriton X-100で可溶化し赤血球膜と混合、吸着成分を分析したところ、p32および分子量45kDaの蛋白質が赤血球膜に結合することが明らかとなった。この成績から、p32が赤血球膜骨格蛋白質であるアクチンあるいはスペクトリンに結合すると考えられた。さらに上記の合成ペプチドに対する抗体をウサギで作製し、その活性を検討したところ、これら抗体は原虫膜のp32の反応した。また、未固定原虫を凝集させる活性を有することから、このペプチド配列部分が原虫表面分子の外側に露出していることが明らかとなった。また、p32に対する酵素抗体法で、両血清間で交差反応が認められたことから、これらの配列がB細胞エピトープとなり、p32分子上で繰り返されていることも明らかにされた。本研究で、p32と宿主細胞骨格蛋白質との相互作用が初めて検出され、本分子が赤血球あるいはその他細胞中での増殖に重要な役割を果たす分子であることが明らかにできた。さらに、その機能を担う部分は動物体内での免疫反応の標的となりうることが明らかにでき、本原虫感染の防除法開発の上でも重要な知見を得ることができた。
青果物流通のトレーサビリティーシステムを高度化する品質予測モデルの開発

品質を保証した青果物の販売,あるいは品質保持に対して最大限の費用対効果が得られる流通条件の設定等に適用可能な品質予測モデルの構築を目的とし,昨年度までに,ブロッコリーの色調変化を経過時間と環境温度および酸素濃度の関数として表現したモデルを提案した。しかしながら,提案したモデルは1つの品種を対象とした実験データを基に構築されたものであり,多くの品種が存在する流通現場での適用の可能性について更に検討する必要があった。そこで今年度では,数種ブロッコリー品種の貯蔵試験を行い,緑色保持性における品種間差異を確認した。次に,収穫直後の糖含量に注目し,緑色保持日数との関連性のファクターについて検討した。供試材料には,静岡県掛川市の圃場で収穫されたブロッコリー11品種を用いた。色調変化を観察するための試料は,砕氷詰めで岐阜大学へと搬送し,5°C設定のインキュベータ内に貯蔵した。収穫直後の糖含量は,高速液体クロマトグラフィー法によりに分別定量した。貯蔵中の色調は,3個体について3ヶ所ずつ,色彩色差計により,L*,a*,b*値を求めた。ブロッコリーの緑色保持日数と収穫直後のFructose, Glucose, Sucrose含量それぞれの関係について検討した。5°C貯蔵における緑色保持日数は品種によって大きくことなり最短14日から最長49日と大きな差異が認められた。このことから品質予測モデルの構築にあたっては,品種間差異を十分に考慮しなければならないことが示された。緑色保持日数と収穫直後のFructose及びSucrose含量とは関連性が認められなかった。一方,Glucose含量との関係については相関が得られ,この含量が多いほど緑色保持日数が長くなることが示唆された。このことより収穫直後のGlucose含量をパラメータとした品種係数を新たに定義しモデルに導入したところ,種々の品種における品質予測が可能となった。平成15年度は,品質予測モデル構築に必要な基礎データを得る目的で,品質劣化が著しく流通過程での鮮度管理対策が重視されるブロッコリー5品種を対象として,1)種々の酸素濃度下での貯蔵中における花蕾色,ビタミンC含量の変化および呼吸速度の測定,2)貯蔵湿度が花蕾色変化に及ぼす影響,3)収穫時期(6月収穫と11月収穫)が貯蔵性に及ぼす影響について調査した。花蕾色は色差計により評価し,ビタミンCはヒドラジン比色法によって測定した。呼吸速度は,市販のガスクロマトグラフィーをベースとした自動ガス代謝速度計測装置によって測定した。なお,貯蔵温度はすべて10°Cとした。その結果,花蕾色およびビタミンC含量は低酸素環境に貯蔵すると保持されたが,それらの保持程度は品種間で差が認められた。種々の酸素濃度下における呼吸速度の測定値をMichaelis-Menten型の呼吸モデルに当てはめ,品種間差について解析したところ,酸素濃度に対する呼吸反応の挙動が品種によって異なることが明らかとなった。湿度が花蕾色変化に及ぼす影響についても品種間で差が認められ,湿度100%と90%での貯蔵期間中における花蕾色変化に差が認められた品種と,そうでない品種があった。収穫時期の違いによっても,花蕾色変化に差が認められ,11月収穫のブロッコリーが緑色をよく維持する傾向が認められた。以上の結果より,品質予測モデル構築においては品種間差や作型を十分考慮に入れた基礎データの収集と定式化が必要であることが分かった。本年度は品質予測モデルを構築するため,以下の実験を行った。供試材料には愛知県産のブロッコリー`グリーンパラソル'を用いた。材料は早朝,生産者の圃場より根付きの状態で収穫し,実験室に搬入後,葉柄を切断して実験に供試した。ブロッコリーは,インキュベータ内に設置した容器内に4日間貯蔵し,毎日,アスコルビン酸含量と色調を測定した。アスコルビン酸はヒドラジン比色法により定量し,色調は色彩色差計によりL, a, b値を得た。貯蔵中,ブロッコリーを静置した容器内に,ガス混合器により創出した修正ガスを流量100ml/minで通気し続けた。貯蔵条件は,温度を5,15,25°Cの3段階とし,修正ガス組成はO_2濃度を2,5,10,21,30%(バランスN_2)の5段階の組み合わせとした。得られたデータを基に重回帰式によるモデルの構築を試みた。従属変数は,収穫直後の還元型アスコルビン酸含量を1とした相対アスコルビン酸含量と,収穫時からの色差(ΔEab=((L-L_0)^2+(a-a_0)^2+(b-b_0)^2)^<1/2>)の対数とした。説明変数は,単独要因として収穫からの経過日数[day],貯蔵温度[temp],O_2濃度[O_2],非線形性に対応するため,それぞれについての2,3,1/2,1/3,-1,-1/2,-1/3乗,1次の項同士の相互作用に対応するため,[day]×[temp],[day]×[O_2],[temp]×[O_2],[temp]×[day]×[O_2]とした。重回帰分析は変数増加法によって行った。重回帰分析によって得られた,相対アスコルビン酸含量と色差を表現するモデル式を次式に示した。

相対アスコルビン酸:色差の対数:重回帰式の相関係数は,相対アスコルビン酸については0.910,色差については0.858となり,良好な予測が可能であると考える。次年度の課題として,流通現場で生じうる温度変動環境下での実測値とモデル値との比較を行いモデルの有効性を検討したい。また,昨年度に明らかとなった品種間差についても記述できるモデルの構築を目指す。品質を保証した青果物の販売,あるいは品質保持に対して最大限の費用対効果が得られる流通条件の設定等に適用可能な品質予測モデルの構築を目的とし,昨年度までに,ブロッコリーの色調変化を経過時間と環境温度および酸素濃度の関数として表現したモデルを提案した。しかしながら,提案したモデルは1つの品種を対象とした実験データを基に構築されたものであり,多くの品種が存在する流通現場での適用の可能性について更に検討する必要があった。そこで今年度では,数種ブロッコリー品種の貯蔵試験を行い,緑色保持性における品種間差異を確認した。次に,収穫直後の糖含量に注目し,緑色保持日数との関連性のファクターについて検討した。供試材料には,静岡県掛川市の圃場で収穫されたブロッコリー11品種を用いた。色調変化を観察するための試料は,砕氷詰めで岐阜大学へと搬送し,5°C設定のインキュベータ内に貯蔵した。収穫直後の糖含量は,高速液体クロマトグラフィー法によりに分別定量した。貯蔵中の色調は,3個体について3ヶ所ずつ,色彩色差計により,L*,a*,b*値を求めた。ブロッコリーの緑色保持日数と収穫直後のFructose, Glucose, Sucrose含量それぞれの関係について検討した。5°C貯蔵における緑色保持日数は品種によって大きくことなり最短14日から最長49日と大きな差異が認められた。このことから品質予測モデルの構築にあたっては,品種間差異を十分に考慮しなければならないことが示された。緑色保持日数と収穫直後のFructose及びSucrose含量とは関連性が認められなかった。一方,Glucose含量との関係については相関が得られ,この含量が多いほど緑色保持日数が長くなることが示唆された。このことより収穫直後のGlucose含量をパラメータとした品種係数を新たに定義しモデルに導入したところ,種々の品種における品質予測が可能となった。
培養腹膜細胞の積層化(人工腹膜)の研究

ラット尾より抽出した酸可溶性コラーゲンを4mg/mlの濃度にてトランスウェルに100μl入れゲル化した後、ラット腹膜繊維芽細胞を1×10^4、2×10^4、1×10^5/mlの細胞密度で懸濁した間質モデルを各100μl積層した。F12培地で2日間培養後、トランスウェル底部の膜の外側に腹膜中皮細胞を1×10^5/ml播種し、細胞接着が十分であると判断できるまで培養した。積層化した腹膜モデルはM199倍地で3週間培養し、その形態的変化を観察している。コラーゲンに包埋された繊維芽細胞は2×10^4/mlの細胞密度以上ではFCS未添加においても細胞の伸展がみられたが、それ以下では形態の変化は僅かであった。トランスウェル上において、本条件下ではコラーゲンの収縮は観察されなかった。間質モデルに隣接する膜上の腹膜中皮細胞は播種後3週間以内では玉石状の形状を保つことができるようになった。滲出性のマクロファージを用いた経マトリックスの遊走実験及びアルブミン、クレアチニンの透過実験はコラーゲンプラグ層の濃度を220mg/ml、プラグ層の厚みを110mmで行った。基盤研究C(平成8-9年)、国際学術研究(平成7-9年)中に確立した腹膜繊維芽細胞と腹膜中皮細胞の分離法(Differential Subculture)により継代・凍結保存した腹膜繊維芽細胞を用い細胞外マトリックスの過形成に炎症性サイトカインがどのように関与するか調べた。繊維芽細胞をIL-1β、TNF-α、IL-6にて刺激し、TGF-β1mRNA発現をRT-PCR法により定量化した。また、ラット尾より抽出・精製したコラーゲン中に繊維芽細胞を分散させた3次元培養系を作成し、単層培養系と同様、IL-6刺激に対するTGF-β1mRNAの発現を調べた。尚、由来の差異による遺伝子発現の相違を調べるため、市販の皮膚由来繊維芽細胞も実験に供した。繊維芽細胞の由来、培養系の差異にかかわらず、TGF-β1mRNAの発現量はIL-6の添加群において無添加群(control群)に比べ高く、IL-6が細胞外マトリックスの過形成に関与していることが示唆された。3次元培養系においてはIL-6濃度に正に依存してTGF-β1mRNAの発現量が増加し、単層培養系では10100pg/mlにおいて強い発現を示す傾向がみられた。由来の差異による繊維芽様細胞のTGF-β1mRNAの発現傾向は特に見られなかったが、皮膚由来の繊維芽細胞では若干、低濃度での発現量が高かった。ブドウ糖添加群(90mM)は無添加群(control群)に比べTGF-β1mRNAの発現量は高く、臨床における継続的なブドウ糖刺激はIL-6の刺激と重畳して、TGF-β1産生制御系に関与していることが示唆された。コラーゲンに繊維芽細胞を単純に分散させたモデルだとコラーゲンの収縮が起こり、当初予定していた3次元培養ハイブリッド型の複合膜を製作するには至らなかった。この問題の解決のためには、コラーゲン層と容器との物理的な接合が必要であり、次年度の課題と考えている。本研究は腹膜細胞の3次元培養と積層化により人工腹膜モデルを作成し、腹膜機能に及ぼす腹膜透析液組成、腹膜炎の影響を体系的把握することを目的とするものである。間質モデルとして細胞外マトリックスの主成分であるコラーゲン(I型+III型)に腹膜繊維芽細胞を分散・包埋後、腹膜中皮細胞と血管内皮細胞を両面に単層培養して積層化する方法を確立するもので、本年度は大量の腹膜中皮細胞の確保を目的に兎からの腹膜中皮細胞、線維芽細胞の分離を試みた。又、ラットからの血管内皮細胞の採取と培養の確立につとめた。腹膜細胞への腹膜透析液による経時的刺激によりVEGFやIL-6のサイトカインの発現及び減衰、細胞活性への影響を把握することができ、次年度の積層化試験に関連するおおかたの基礎研究は終了した。

ラット尾より抽出した酸可溶性コラーゲンを4mg/mlの濃度にてトランスウェルに100μl入れゲル化した後、ラット腹膜繊維芽細胞を1×10^4、2×10^4、1×10^5/mlの細胞密度で懸濁した間質モデルを各々100μl積層した。F12培地で2日間培養後、トランスウェル底部の膜の外側に腹膜中皮細胞を1×10^5/ml播種し、細胞接着が十分であると判断できるまで培養した。積層化した腹膜モデルはM199培地で3週間培養し、その形態的変化を観察している。コラーゲンに包埋された繊維芽細胞は2×10^4/mlの細胞密度以上ではFCS未添加においても細胞の伸展がみられたが、それ以下では形態の変化は僅かであった。トランスウェル上において、本条件下ではコラーゲンの収縮は観察されなかった。間質モデルに隣接する膜上の腹膜中皮細胞は播種後3週間以内では玉石状の形状を保つことができるようになった。滲出性のマクロファージを用いた経マトリックスの遊走実験及びアルブミン、クレアチニンの透過実験はコラーゲンプラグ層の濃度を220mg/ml、プラグ層の厚みを110mmで行った。
ダイヤモンド窒素中心の電気的磁気共鳴を利用した磁気センサーの実現

ダイヤモンド中の不純物を用いた磁気センサーの実現のために、次の3つ研究を行った。(1)窒素中心の電気的磁気共鳴検出を目指し、装置構築を行った。その結果、窒素中心の検出は成功しなかったが、炭素空孔の検出に成功した。(2)窒素中心の成長原理解明のために、窒素空孔中心の軸方向制御を行った。(111)ダイヤモンド基板上に成膜したダイヤモンド中の窒素空孔中心が[111]方向に揃っていることを発見し、その成長原理を解明した。(3)ダイヤモンド中の不純物と伝導電子との相互作用を解明するために、スピン注入の研究を行った。ダイヤモンド上にニッケル・鉄合金を成膜し、逆スピンホール電圧の検出に成功した。本研究の目的は、ダイヤモンド中の窒素中心のスピン状態の電気的な検出に挑戦し、磁気共鳴現象を利用した磁気センサーの実現を目指すことである。EDMR法は磁気共鳴によって変化するダイオード中を流れる電荷の量を測定する方法である.EDMR法を用いてダイヤモンド中の窒素中心のスピン状態と電荷の相互作用を明らかにすることができ,スピン状態を利用して電荷の流れを制御することができる.さらにこのEDMR法は,電気的な窒素中心の制御も可能になる.その応用として,ダイヤモンド窒素常磁性中心の磁気共鳴現象を利用した磁気センサーの実現を目指す.そのために、当該年度において、次の4つ計画を立て研究を行った。1)電気的磁気共鳴(EDMR)装置の構築、2)シリコンpnダイオードのEDMR測定、3)ダイヤモンドpnダイオードの準備、4)ダイヤモンドpnダイオードのEDMR測定次のそれぞれの結果について示す。まず、1)と2)について:本研究でEDMR装置の構築し、ダイヤモンド中のダングリングボンドのEDMR信号の検出に成功した。3)について:共同研究者と相談し、pnダイオードからさらに電気伝導度高いpinダイオードを準備した。4)について:構築したEDMR装置を用いて、ダイヤモンドpinダイオードのEDMR測定を試みたが、ダイヤモンド中の窒素中心の検出までは至らなかった。そこで、ダイヤモンド中の窒素中心のEDMR測定が報告されている試料とほぼ同等の試料を用意し、このEDMR信号検出にも研究を進めたが信号検出にまでは至らなかった。EDMR法は磁気共鳴によって変化する電気伝導度を測定する方法である.EDMR法を用いてダイヤモンド中の窒素中心のスピン状態と電荷の相互作用を明らかにすることができ,スピン状態を利用して電荷の流れを制御することができる.さらにこのEDMR法は,電気的な窒素中心の制御も可能になる.その応用として,ダイヤモンド窒素常磁性中心の磁気共鳴現象を利用した磁気センサーの実現を目指す.さらに当該年度は、不純物と電荷との相互作用を解明するために、ダイヤモンドへのスピン注入の実験を行った。ダイヤモンド半導体中の不純物は、室温下で1ミリ秒以上の位相緩和時間を有するために室温下で動作するスピントロニクスの実現に向けた半導体としても注目されている。まず、窒素中心のスピン状態のEDMR検出を目指し、1)窒素ドープダイヤモンド基板2)窒素イオン注入ダイヤモンド基板、そして3)リンドープダイヤモンド薄膜を成長した窒素ドープダイヤモンド基板のEDMR測定を行った。特に3)は過去に窒素中心のEDMR信号が報告されている試料と同等である。これらの試料すべてについてEDMR測定を行った結果、ダイヤモンドダングリングボンドの信号のみが検出され、窒素中心のEDMR信号の検出にはいたらなかった。次に、不純物と電荷の相互作用を解明するために、ダイヤモンドへのスピン注入研究を行った。まず、ダイヤモンド基板上にニッケル・鉄合金薄膜を蒸着した。この薄膜の強磁性共鳴下で発生する起電力を測定した。その起電力を解析した結果、スピン流の発生を示唆する逆スピンホール電圧の検出に成功した。26年度が最終年度であるため、記入しない。ナノ構造物理26年度が最終年度であるため、記入しない。当該年度の研究目的の電気的磁気共鳴(EDMR)装置の構築に成功し、ダイヤモンド中のダングリングボンドの信号検出に成功した。そして、ダイヤモンドpinダイオードを用意し、そのEDMR信号検出を試みたが、信号検出までは至らなかった。さらにその後,報告済みの試料とほぼ同様の試料を用意した.この試料を用いてダイヤモンド中の窒素中心のEDMR信号の検出も試みたが、信号検出までは至らなかった。その結果、当該年度では4つの計画のうち3つまで終わらせることが出来た。当該年度に構築した,電気的磁気共鳴(EDMR)装置を用いてダイヤモンド中の窒素中心のEDMR信号検出を目指す.

まずは,報告済み試料のEDMR信号検出を目指し,測定条件の最適化や装置の検出感度改善を目指す.そして,次の段階でダイヤモンド中に窒素をイオン注入した試料を用いる.この意図的にイオン注入したドーパントである窒素のEDMR検出を行うことは,次の段階でpinダイオードの中の窒素中心の検出だけではなく,濃度制御を行う上で欠くことのできない研究ステップになる.当初の申請書では,イオン注入についての研究計画に入っていなかったが,pinダイオード作成後のドーピング過程や今後の磁気センサーの実演において重要であると考え,イオン注入試料のEDMR測定を本研究方針に追加した.
脳虚血の病態解析および治療に対する蛋白質導入法の応用

蛋白質導入法(protein transduction)は、外来性の蛋白質を細胞内に直接輸送する方法で、血液脳関門の存在ゆえに従来不可能であった蛋白質脳内投与の問題を解決し、脳虚血の病態解析や新しい治療法の開発につながる可能性を有している。わずか11個のアミノ酸から成るペプチド(protein transduction domain ; PTD)に蛋白質を結合させ、それを適度に変性させて全身投与し、脳を含む生体内各組織の細胞内へ入れる方法である。まず基礎実験として、free radical scavenging enzynmesであるcatalase、superoxide dismutase、glutathione peroxidase、および新しく発見された脳内グロビン蛋白質であるneuroglobinについて、そのcomplementary DNAを準備している。今後、PTD融合蛋白質用の発現プラスミドcomplementary DNAを取り込み、それを大腸菌に導入し、大腸菌を用いた蛋白質合成を行う。さらに、蛋白質を変性、分離精製し、培養神経細胞や生体ラットへ導入し、神経細胞保護効果を検討する。
総合健診における検査値の有意な変化量推定の新しいアプローチとその有用性の評価

臨床検査値の変化の有意性の客観的判断には、個人の繰り返し測定の結果から推定される個体内変動幅に基づいて設定される基準変化値(reference change value: RCV)を利用することが国際的に推奨されている。しかし、この概念そのものは古くから存在するが、いくつかの問題点により、臨床ではあまり利用されていないのが現状である。そこで本研究では、臨床的に意義のある変動なのか、それとも自然な変動なのかを客観的に判断できる新たな指標を健診データベースから推定し、臨床に応用できるかを検証する。
複合負荷を用いた超塑性現象のメゾメカニクス的解明

まず工業的応用も考えたとき、最も有望で期待されているアルミニウム系超塑性材料を試験材料として選択した。また試験片は、これで作られた外径8mm,内径5mm,標準点間距離10mmの薄肉円筒とした。実験装置には、電気炉付環境制御型複合負荷自動試験機を用いた。本研究では、まず試験片の形状が及ぼす影響を調べるため、薄肉円筒および中実試験片それぞれに対し、523K条件で応力とひずみ速度の関係を調べた。その結果、2つの関係はよい一致を示し、この温度条件ではm値(超塑性特性の評価パラメータ)は、おおよそ0.4であった。このことから、特殊な試験片の影響を受ける事なく複合負荷条件下の超塑性材料の力学的特性を調べることができることが確認された。この事実は、材料のくびれ現象が、材料不安定と形状不安定の2つの要因によることを考えると極めて重要な知見である。つぎに、この円筒試験片を用いて、ねじり試験および圧縮試験を行い、ここではm値が0.35であることを確認した。この結果からも分かるように、超塑性発現の指標とされるm値は、変形速度により異なるとともに、負荷形態によっても異なる値を取る。すなわち、これまで材料不安定の指標とされるm値は、単軸負荷のみにて論じられ正当化されていたが、このような複合負荷の点から再検討し、実際に複雑な負荷条件の発生する超塑性加工への正確な情報提供が極めて大切であることが確認された。超塑性現象を利用した超精密加工技術実現の為に、金属学的材料設計と並んでこのような力学的検討をさらに推し進める必要がある。
慢性心不全における鉄代謝異常の検討

慢性心不全患者に貧血と鉄欠乏が合併すると、それが予後不良と強く関連することから、その発症メカニズムと治療について、慢性心不全モデルであるダール食塩感受性(DS)ラットを用いて検討した。まず治療法として、造血と鉄吸収を司る低酸素応答性転写因子HIF-2を活性化するSirtuin 1の活性化薬レスベラトロールの効果を検討したが効果はなかった。葉酸や静注鉄の補充も効果はなかった。貧血に有効とされる漢方薬の十全大補湯は貧血を改善させた。次に貧血の発症機序として、赤血球半減期の低下が重要であることが明らかになった。これらの知見は慢性心不全の貧血に対する新たな治療法の開発につながるものと考えられた。平成25年度に予定した実験、すなわち心腎貧血症候群モデルであるDahl食塩感受性高血圧(DS)ラットの貧血の機序を解明するために以下の実験を行った。1鉄補充の効果:まず経口で鉄補充を行う実験を行った。経口鉄補充では貧血は全く改善せず、血清鉄の上昇も見られなかった。そこで鉄剤を経静脈的に投与することにした。6週齡からDSラットを以下の3群に分けた。(1) LS群:常食を続行。(2) HS群:6週齢で8%NaCl食を開始。(3) HS+鉄補充群:6週齢で8%NaCl食を開始し、10週齢から含糖酸化鉄注射液0.2ml(鉄4mgに相当)を尾静脈注射により週に1回投与。14週齢において、HS群では貯蔵鉄(ベルリンブルー染色で評価)は脾臓では激減し、肝臓では微増していた。経静脈的に鉄補充を行い、脾臓や肝臓の貯蔵鉄は著増したにもかかわらず、血清鉄の上昇はわずかであり、貧血の改善は全く見られなかった。このことは、DSラットにおいて鉄欠乏は存在するものの、貧血の原因は鉄欠乏性貧血ではなく、むしろ鉄利用障害がその原因と考えられた。さらにDSラットの骨髄を検討したところ、有核細胞数はむしろ増加し、脂肪細胞がほぼ消失していた。このことから、DSラットにおいて骨髄における造血異常が貧血の発症に関与することが示唆された。2葉酸補充の効果:最近腎不全ラットでは葉酸(FA)トランスポーターの発現が低下していることが報告されたので、DSラットでも葉酸代謝異常の関与を疑い実験を行った。(1) LS群:常食を続ける。(2) HS群:8%NaCl食を開始する。(3) HS+FA群:7週齢で8%NaCl食を開始し、13週齢で8%NaCl+0.05%葉酸食を開始する。FA補充にて血中FA濃度は2倍以上に増加したが、貧血は全く改善されず、FA不足はDSラットにおける貧血の発症機序に関与していないと考えられた。本研究課題「慢性心不全における鉄代謝異常の検討」において、平成24年度に予定した実験、すなわち心腎貧血症候群モデルであるDahl食塩感受性高血圧(DS)ラットの貧血の機序を解明するために実験を行った。7週齡からラットへ8%食塩食を負荷し、レスベラトロール(18 mg/kg/day)の投与は17週齢から食餌内に混入して行った。22週齢で安楽死させ、各臓器のサンプリングは終了した。レスベラトロールの投与はDSラットの血圧、体重、左室肥大、肺重量に対する効果は有意ではなかったが、体重減少と左室肥大を軽減させ、肺うっ血を軽減させる傾向は認められた。有意な改善が見られたのは腎機能であった。これまでレスベラトロールの心血管系合併症に対する効果は、早期からの予防の効果のみが報告されていたが、今回我々は17週齢という、かなり臓器障害が進行した段階でレスベラトロールの投与を開始しても有効であることを見出した。このことは心不全に対する予防のみならず治療にもレスベラトロールを使用できる可能性を示したものといえる。しかしながらレスベラトロールの投与は貧血を改善させなかった。このことはDSラットの貧血がいわゆる腎性貧血ではないことを示しているといえる。また血清鉄濃度にも影響を与えなかった。次にDSラットにまず経口で鉄補充を行う実験も実施した。当初浸透圧ポンプで投与する計画を立てていたが、炎症を起こすことを懸念してまずは経口で投与した。現在はサンプリングを終了し、得られたサンプルの解析中であるが、経口で鉄補充を行っても貧血の改善は認められなかった。他にDSラットは骨量低下と高カルシウム血症をきたすことが判明した。骨粗鬆症は心不全患者によく見られる合併症であり、近年ビタミンD,klotho遺伝子、FGF-23などカルシウム代謝因子と老化の関係が注目されており、興味深い知見であった。

平成24年度から、慢性心不全モデルであるDahl食塩感受性高血圧ラットを用いて、慢性心不全における鉄代謝異常、貧血の発症機序、貧血の治療法について検討してきた。平成26年度は赤血球寿命の短縮、骨髄における赤芽球系細胞のアポトーシス、造血幹細胞およびそのニッシェの異常、髄外造血が関与するかどうかを検討した。また、貧血に効果があると考えられる漢方薬十全大補湯の投与がどのような影響を及ぼすかを検討した。すなわち以下の3群での検討を行った。(1) LS群:常食を続ける。(2)HS群:6週齢で8%NaCl食を開始する。(3) HS+十全群:6週齢で8%NaCl食を開始し、10週齢から十全大補湯1.25g/kg/dayを投与する。12週齢でN-hydroxysuccinimide-biotin (40 mg/kg)を3日連続尾静脈から静脈注射し、赤血球をラベリングし、その後34日毎に尾静脈から100μl採血し、antistreptavidin fluorescein isothiocyanate antibodyを用いてラベルされた赤血球をフローサイトメーターでカウントし、赤血球の半減期を求めた。その結果、HS群では赤血球半減期の著明な低下が見られた。一方、十全大補湯の投与により赤血球半減期の改善は見られなかった。大腿骨から採取した骨髄細胞において、赤芽球系細胞のアポトーシスの頻度に有意な差を見出すことはできなかった。脾臓や骨髄において、赤芽球系細胞の頻度は増加しており、骨髄内外において活発に造血は行われていた。十全大補湯がDSラットの貧血に有効であることが分かったので、交感神経系の関与を検討することよりも十全大補湯が予後に及ぼす影響を検討することを優先した。十全大補湯はHS群の予後を改善させることはできなかった。循環器内科学予定されていた動物実験の2つのプロトコール、すなわちDSラットの貧血に対する葉酸と鉄補充の効果を検討する2つのプロトコールを遂行できたので、おおむね順調に進展しているといえる。また、DSラットの骨髄ではむしろ有核細胞数が増加していることから、赤芽球系のアポトーシスや、成熟赤血球の半減期の増加の関与が疑われる。レスベラトロールの効果についての新たな検討はできなかったが、極端な増量を行って造血系にわずかな改善効果が得られたとしても、臨床的に応用できる可能性は低い。また、腎機能が改善すれば、それによる間接的な貧血改善効果なのか、骨髄に直接働いて改善させたのかの判別が困難である。それよりも、DSラットの骨髄における造血異常の方がより本質的で有用な検討と考えられるので、そちらに注力したい。また別の研究から、漢方薬十全大補湯がDSラットの貧血に有効であることが分かったので、この漢方薬の効果を通じてDSラットの貧血の原因を追究したい。予定されていた動物実験のプロトコール、すなわちDSラットの貧血に対するレスベラトロールと鉄補充の効果を検討する2つのプロトコールを遂行できたので、おおむね順調に進展しているといえる。またレスベラトロールの腎機能低下に対する治療効果を見出すことができた。さらにDSラットが高カルシウム血症をきたすこと、骨粗鬆症をきたすことも見出した。心不全患者には骨粗鬆症をきたすことが多いので、その機序を明らかにするよいモデルを見出したといえる。
心室組織ＥＣＭ足場と動的応力を用いたヒトｉＰＳ細胞の心室筋細胞の分化促進と選択

平成29年度は心室ECMの生化学的な解析と力学特性が異なる心室ECMゲル上でのヒトiPS細胞のサブタイプ心筋細胞への分化に関する評価を行った。2.力学特性の異なる心室ECMゲル上でのヒトiPS細胞のサブタイプ心筋細胞への分化:架橋剤EDACにより処理した力学特性が異なる4種類のvECMゲル上でmonolayer法により分化させたヒトiPS細胞の培養を行った。各サブタイプ心筋細胞への分化と分化心筋細胞の成熟について、それぞれの特異マーカーのmRNA発現についてリアルタイムPCRにより評価した。心室ECMゲル上の分化細胞における心室筋細胞マーカーMLC2vは瞬時弾性率が最も低く応力弛緩が最も遅い心室ECMゲル上で培養した細胞において他のゲル上での細胞よりも高い発現量を示す傾向であった。さらに瞬時弾性率が脱細胞組織と同程度であり応力弛緩が速い心室ECMゲル上で培養した細胞の心房筋細胞マーカーMLC2aの発現は他の種類のゲル上で培養したものよりも高値を示す傾向であった。さらに分化心筋細胞の拍動に起因する心室ECMゲルの変形エネルギー貯蔵や散逸とサブタイプ心筋細胞のmRNA発現との関連性について検討を行った。ゲル変形エネルギー密度が低くエネルギー散逸率が低い心室ECMゲルが心室筋細胞および心房筋細胞といった拍動性心筋細胞への分化を促進する効果が示唆された。29年度が最終年度であるため、記入しない。幹細胞の分化に対して足場素材の影響が重要視されつつある。これは足場に存在する接着性因子と足場素材の力学特性が分化のトリガーとなる新発見に端を発する。足場の力学特性が幹細胞の分化に重要な影響を及ぼすことを鑑み、ヒトiPS細胞の分化培養を行う際に重要な基礎データとなる心室ECMゲル(vECMゲル)の詳細な力学特性や細胞適合性の評価に焦点を絞り平成27年度は以下の2点の課題について研究を行った。1.カルボジイミド系架橋剤を用いたvECMゲルの力学特性の調整vECMゲルをカルボジイミド系架橋剤EDACにより室温で24時間処理した。本研究室で開発した圧縮試験装置でゲルの粘弾性特性を測定し、ECMゲルの力学特性の解析は非線形Kelvinモデルを適用した。12.5 mg/mlおよび17.5 mg/ml vECMゲルのYoung率はEDAC処理により無処理のものと比べ約3-5倍まで増加した。またEDAC濃度の増加に伴って弾性係数K1、K2は増加する傾向が確認できた。EDAC処理により脱細胞心室組織と同程度の力学特性を有するvECMゲルを作製することに成功した。2.架橋剤により力学特性を調整したvECMゲルの細胞適合性の評価脱細胞心室組織と同程度のYoung率を有するvECMゲル、脱細胞組織と比べ低いYoung率を有するvECMゲル、脱細胞組織と比べ高いYoung率を有するvECMゲルの3種類の異なるYoung率を有するvECMゲル上にラット胎児線維芽細胞を5000cellsずつ播種・培養を行った。EDAC処理を施したvECMゲル上の細胞をCelcein-AMにより蛍光観察を行ったところ、仮足を突出し良好にゲル表面に接着していることを確認した。培養4日間の単位面積あたりの細胞数の変化を評価したところ、脱細胞心室組織と同程度のYoung率および脱細胞組織と比べ低いYoung率を有するvECMゲル上の細胞が最も増殖した。これらの結果からvECMゲルの力学特性を調整することで線維芽細胞の増殖を制御できることが示唆された。今年度は非線形粘弾性モデルによるvECMゲルの力学特性の詳細な評価、架橋剤を用いた脱細胞心室組織と同程度の力学特性を有するECMゲルの作製、そして力学特性を調整したECMゲル上での細胞適合性を評価した。これらの研究は当初計画した通り、またはそれ以上に順調に進められた。しかしながら一方でiPS細胞胚様体の形成率が約25%と低く、vECMゲル上に播種するために十分な胚様体数を確保できない問題が生じたため、当該年度に当初予定していたvECMゲル上でのヒトiPS細胞の分化培養は予定よりやや遅れていると認識している。これは足場の接着性因子から幹細胞に分化を促進するシグナルが伝達されることと足場素材の力学特性が分化のトリガーとなる新発見に端を発する。各臓器および組織の細胞外マトリクス(ECM)を足場として幹細胞を分化させると、その臓器や組織に存在する細胞への分化が促進されることが報告されており、幹細胞を心筋細胞へ分化させるための足場素材として心臓組織ECMから成るハイドロゲルが利用されていることもその一例である。平成28年度はヒトiPS細胞を心筋細胞へ効率的に分化させる手法の確立とヒトiPS細胞由来心筋細胞(hiPSC-CMs)の拍動能に対する心室ECM(vECM)コーティングの影響について以下の研究課題に取り組んだ。1.ヒトiPS細胞の単一層での心筋細胞の分化誘導Matrigel上でヒトiPS細胞(253G1株)を培地mTeSR1で培養を行った。培養4日目においてALP染色を行ったところ、すべてのiPS細胞コロニーはALP陽性でありiPS細胞は未分化状態を維持し培養できたことが示唆された。

単一層で培養されたiPS細胞にCHIR99021(Wnt活性剤)とIWP2(Wnt阻害剤)を作用させたところ、分化7-8日目において自発的に拍動する心筋細胞へ分化した。vECM(15 mg/ml)をコーティングしたディッシュで分化心筋細胞を播種し、9日間の心筋細胞の拍動頻度を観察した。培養9日目においてvECM上の分化心筋細胞の拍動回数は40回/分であったのに対して、Matrigel上の拍動回数は23回/分であった。9日間の培養期間にわたってhiPSC-CMsの拍動頻度はMatrigel上で培養されたものよりもvECM上で培養されたもののほうが高い傾向が見られた。平成28年度は昨年度問題として浮上したヒトiPS細胞の心筋細胞への分化について精力的に取り組んだ。カリフォルニア大学サンディエゴ校医学部に半年間留学(2016年5月-同年11月)し、Wntシグナル経路の調節に着目したヒトiPS細胞の心筋細胞の分化手法を習得した。帰国後は留学中に習得した分化手法を用いて安定かつ効率的にヒトiPS細胞(253G1株)を心筋細胞へ分化させることに成功した。さらにvECMコーティング上に播種した分化心筋細胞は拍動能を有利に維持されるという非常に興味深い結果が得られた。平成29年度は心室ECMの生化学的な解析と力学特性が異なる心室ECMゲル上でのヒトiPS細胞のサブタイプ心筋細胞への分化に関する評価を行った。2.力学特性の異なる心室ECMゲル上でのヒトiPS細胞のサブタイプ心筋細胞への分化:架橋剤EDACにより処理した力学特性が異なる4種類のvECMゲル上でmonolayer法により分化させたヒトiPS細胞の培養を行った。各サブタイプ心筋細胞への分化と分化心筋細胞の成熟について、それぞれの特異マーカーのmRNA発現についてリアルタイムPCRにより評価した。心室ECMゲル上の分化細胞における心室筋細胞マーカーMLC2vは瞬時弾性率が最も低く応力弛緩が最も遅い心室ECMゲル上で培養した細胞において他のゲル上での細胞よりも高い発現量を示す傾向であった。さらに瞬時弾性率が脱細胞組織と同程度であり応力弛緩が速い心室ECMゲル上で培養した細胞の心房筋細胞マーカーMLC2aの発現は他の種類のゲル上で培養したものよりも高値を示す傾向であった。さらに分化心筋細胞の拍動に起因する心室ECMゲルの変形エネルギー貯蔵や散逸とサブタイプ心筋細胞のmRNA発現との関連性について検討を行った。ゲル変形エネルギー密度が低くエネルギー散逸率が低い心室ECMゲルが心室筋細胞および心房筋細胞といった拍動性心筋細胞への分化を促進する効果が示唆された。当該年度に浮上した問題点であるヒトiPS細胞の胚様体の形成率の低さに関しては、胚様体形成時に用いる培養液をStemPro34など胚様体が安定的に形成できるとされるものに変更するなど胚様体形成時のプロトコルを刷新することで形成率を向上させる。この問題を克服したのちに力学特性を調整したvECMゲル上にヒトiPS細胞胚様体を播種し遺伝子解析および免疫染色により心室筋細胞への分化能を評価し、平成28年度の計画は予定通りに進行・完成できることを確保する。平成29年度はヒトiPS細胞由来分化心筋細胞を力学特性を調整したvECMハイドロゲルへ播種し以下の項目について評価を行い、vECMハイドロゲルの力学特性が心室筋細胞への分化に対してどのような影響があるかを検討する。
産後早期の睡眠と自律神経活動との関連

産後うつ病は、乳幼児の精神的発達や身体的発育に悪影響を与えるだけでなく、女性の自殺の主要因と指摘されており、産後うつ病の重症化や遷延化を防ぐことは喫緊の課題である。特に産後早期には、授乳などの育児により夜間睡眠が分断されることで、睡眠時間の不足や睡眠の質の低下がみられ、産後早期に睡眠障害を有する女性は産後うつ病発症の可能性が高いことが先行研究で示唆されており、産後早期からの対策が望まれる。本研究では、産後早期の睡眠と自律神経活動との関連を明らかにすることを目的とする。本研究の成果により、今後、産後の睡眠に対する支援の有効性を検討するための客観的指標を提示できると考える。