hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
非接触人体検出技術を用いた独居高齢者の元気度モニタリングシステムの開発

独居者の安否確認のみならず元気度を知る手段として歩行運動に着目した。そこで、歩行により生じる人体電位の変化を、静電誘導電流を検出することにより非接触で検出する技術を開発した。また、被験者の歩行運動を非接触・無装着で検出可能であることを明らかにした。さらに、誘導電流が発生する理論モデルを構築し、歩行動作との対応関係を明らかにした。一方、独居者の歩行運動検出を想定し、一般家庭の家屋に歩行信号検出用のスタンドアローン型電極やワイヤレスセンサを設置することにより、被験者の歩行運動を非接触で検出することを試みた。その結果、本手法は足の引き摺り等の歩行運動の僅かな差異の検出が可能であることを明らかにした。本研究では独居高齢者の歩行運動を非接触で検出することにより、安否確認のみならず、従来法では困難だった独居高齢者の元気度の評価を行なう技術を確立することを目的としている。我々は、被験者の歩行運動による人体電位変動を、被験者から数メートル離れた位置に設置した電極に誘起される静電誘導電流を検出することにより非接触で歩行運動を検出する技術を開発した。本年度は、この技術を用いて歩行信号からの元気度を推定する方法を確立することを目的とした研究を実施した。実際に独居者の住む一般家庭に25cm角の電極を有する検出システムを配置し、独居者の歩行運動を非接触で検出することを試みた。その結果、静電誘導電流波形には歩行運動による足の接地や離地のタイミングで発生するピークが観測された。また、一般家庭に設置した電極により検出される静電誘導電流波形から被験者の歩行信号を検出し、インターネットを経由して歩行データの取得が可能なシステムを構築した。さらに、検出した歩行信号から平均1歩行周期を算出することにより、被験者の元気度評価が可能であることを明らかにした。一方、システムの小型化を行なうため、歩行信号の検出感度を向上させることにより電極サイズを2cm角まで小型化することを可能にした。また、センサ内部にこの電極を組み込んだ小型センサを製作し、センサとパソコン間の配線を不要とするためデータ通信をワイヤレス化するシステムを構築した。その結果、歩行信号検出センサの一般家庭への装着が容易となった。実際にこのワイヤレスセンサを独居者の住む一般家庭の天井に配置し、独居者に一切のセンサを装着することなく独居者の歩行運動が検出可能であることを示した。加えて、本研究で開発した超高感度静電誘導検出技術により、被験者の動作や心電信号等の生体情報の非接触計測も可能であることを明らかにした。本研究では独居高齢者の歩行運動を非接触で検出することにより、安否確認のみならず、従来法では困難だった独居高齢者の元気度の評価を行なう技術を確立することを目的とした研究を実施した。歩行運動中の足の接地や離地の際の足裏接地面積の変化の時間微分が元気度と相関があることを明らかにした。さらに、センサの耐ノイズ性能と感度を向上させることにより、従来使用していた20cm角の電極を2cm角に小型化することに成功した。一方、ワイヤレス送受信が可能なXBeeを用いた静電誘導による歩行信号検出用の小型ワイヤレスセンサを開発し、独居者の歩行データをワイヤレスで検出可能であることを確認した。このデータから、被験者の歩行データを蓄積して元気度データとして算出することが可能であることを明らかにした。また、センサにスリープ機能を付加し、歩行信号に検出時のみセンサを起動することにより、バッテリーの長寿命化を実現した。また、RS-232Cから受信したデータをEメールに変換し携帯メールに送信可能なFOMAユビキタスモジュールを内蔵するセンサを開発し、データ転送が可能であることを確認した。これにより、インターネットを用いることなく元気度データ送信が可能であることを明らかにした。この結果から、インターネットが普及している家庭ではインターネットを、普及していない家庭ではFOMAユビキタスモジュールを用いることにより、独居高齢者の元気度データの送信が可能であることを実証した。本年度は、歩行運動中の足の接地や離地の際の足裏接地面積の変化の時間微分が元気度と相関があることを明らかにした。

さらに、センサの耐ノイズ性能と感度を向上させることにより、従来使用していた20cm角の電極を2cm角に小型化することに成功した。一方、XBeeを用いた静電誘導による歩行信号検出用の小型ワイヤレスセンサを開発し、独居者の歩行データをワイヤレスで検出可能であることを確認した。このデータから、被験者の歩行データを蓄積して元気度データとして算出する間隔として、最大1時間程度でも元気度の推定が可能であることを明らかにした。また、検出した歩行信号をFFT解析し元気度を算出するロジックを明らかにした。さらに、FOMAを用いた元気度転送システムを構築し、データ転送が可能であることを確認した。データ転送のコストを低減させるため、通信距離が1km程度の複数のXBeeをメッシュ配置として使用し、元気度データの転送を実証した。その結果、元気度のデータ転送方法としてFOMA等のパケット通信方式のみならず、XBeeもコスト面で極めて有効であることを明らかにした。これにより、インターネットを用いることなく元気度データ送信も可能であることを明らかにした。これにより、インターネットが普及している家庭ではインターネットを、普及していない家庭ではXBeeを用いることにより、独居高齢者の元気度データの送信が可能であることを実証した。歩行信号に基づく歩行周期や足の引きずりの検出のみならず、検出システムの小型化やワイヤレス化を実現することができ順調に進展している。25年度が最終年度であるため、記入しない。足の引き摺り等の歩行運動の僅かな変化が歩行運動により誘起される静電誘導電流波形に反映されることが明らかになり、元気度の推定法、データ送信方法を具体化し検証することができ順調に進展している。独居高齢者の歩行運動を非接触で検出することにより、安否確認のみならず、従来法では困難だった独居高齢者の元気度の評価を行なう技術を確立することを目的として、当初の計画通り、歩行データ転送手法の最適化や実証実験による課題抽出と対策の具体化を実施する。独居高齢者の歩行運動を非接触で検出することにより、安否確認のみならず、従来法では困難だった独居高齢者の元気度の評価を行なう技術を確立することを目的として、当初の計画通り、元気度評価システムの実証試験を行ない運用上の課題やシステムの改良等を実施する。
アトピー性皮膚炎に合併する網膜剥離・白内障の発生機序に関する研究

背景:アトピー性皮膚炎に伴う網膜剥離や白内障が本邦では増加傾向にある。失明に繋がる本症は若年者に多く患者自身の生涯に大きく影響する問題である。しかし、本症の発生機序の解明、治療法の改善は重要な課題であるが、確立しているとはいえない。本研究の目的は、(1)アトピー性皮膚炎に伴う網膜剥離の疫学的動向と臨床的特徴の把握(2)硝子体手術や白内障手術の現状の問題点の評価(3)術中に採取する眼組織の病理学的検討(4)網膜剥離や白内障を合併するアトピー性皮膚炎の免疫学的異常の特徴を検討することである。結果:網膜剥離手術を多数施行している33施設からのアンケート調査による多施設全国調査を検討した。初回手術を施行し術後6か月以上経過観察した348例417眼が報告された。反復して眼瞼を強く擦る、叩くなどの行為が発症原因として大きく関与している可能性やその他の臨床的特徴について従来からの報告を確認する結果となった。初回手術として、78%が強膜バックリング,22%に硝子体手術が行われ、初回および最終復位術は75.3%,92.6%と不良であった。杏林アイセンターの網膜剥離や増殖硝子体網膜症の硝子体手術成績から、後部硝子体剥離作製の完成の有無が長期予後に影響することが示唆された。網膜剥離症例の89%に白内障を合併し、網膜剥離の診断が遅れる原因ともなった。白内障の手術を契機に網膜剥離が発症、悪化することもあり、手術手技および白内障手術の周術期の眼底検査が重要であることが確認された。後発白内障抑制の検討から、眼内レンズのシャープエッジが後発白内障を抑制するが、その機序はエッジと後嚢の間に発生する高い接触圧による機械的遊走抑制であり、挿入後に形成される鋭利な嚢屈曲は高い接触圧のマーカーではあるが、それ自体には遊走抑制効果はないと考えられた。アトピー性皮膚炎に伴う網膜剥離や白内障の発生機序に関して眼内の免疫学的異常の影響を探るため、手術中に採取した硝子体液や結膜組織のサイトカインの特徴的な発現を検討したが、一定の結果が得られなかった。しかし、アトピー性皮膚炎患者の抹消血リンパ球中にはIL-4やIL-13を産生するTh2細胞が増加しており、その多くがCLA陽性細胞であることを示し、IFN-γを産生するTh1,Tc1細胞はむしろCLA-分画に多いことを示した。一方、末梢血中のIFN-γが増加していた。これらの結果は、アトピー性皮膚炎におけるサイトカインのアンバランスや炎症部位への細胞遊走がアトピー性皮膚炎の病態に重要にかかわっていることを示唆し、網膜剥離や白内障を有する臨床例や動物モデルの眼内のT細胞の動態を検討することは、今後の治療の開発にも重要であると考えられた。

一方、末梢血中のIFN-γが増加していた。これらの結果は、アトピー性皮膚炎におけるサイトカインのアンバランスや炎症部位への細胞遊走がアトピー性皮膚炎の病態に重要にかかわっていることを示唆し、網膜剥離や白内障を有する臨床例や動物モデルの眼内のT細胞の動態を検討することは、今後の治療の開発にも重要であると考えられた。アトピー性皮膚炎に伴う網膜剥離に関する全国調査(33施設)結果をまとめ(日眼学会誌103:40-47,1999)、原因検索と患者の指導に関して、皮膚科領域とともに今後の共同研究の重要性を啓蒙した。本調査によると網膜剥離は年々増加傾向にあり、同時期の網膜剥離全体症例に占める割合は2.3%であった。東京地区に限ると4.7%で有意に都会で高かった。眼瞼を叩くなどの行為が発症要因として重要であること、網膜剥離や網膜裂孔の臨床的特徴は従来の特徴を確認する結果であった。初回手術としてバックル手術は78%、硝子体手術が22%に施行され、初回および最終復位率は75.3%、92.6%と不良であった。一般にアレルギー炎症は、IL-3,IL-4,IL-5,IL-6,IL-10などを産生するTh-2細胞が重要と考えられているが、細胞傷害に直接的に影響するIL-2,Interferon-γ,TNF-βなどを産生するTh-1細胞の関与も無視できない。初回手術として硝子体手術を適応した症例について炎症細胞腫の検出を目的に、炎症細胞が産生するサイトカインをフローサイトメトリーを用いて検索した。まず、4例を対象に硝子体手術時の硝子体検体採取の方法を検討したところ、硝子体手術の灌流開始前に硝子体腔中央より硝子体カッターで約1cc採取可能であり、適応した4症例中3例で多数の細胞成分を認めた。残る1例はほとんど細胞が観察できなかった。細胞を認めた3例のうち2例はリンパ球主体、1例は好中球および色素上皮細胞、繊維細胞主体であった。フローサイトメトリーでサイトカインを検索したところIL-4,Interferon-γが検出され、これはTh-2細胞とTh-1細胞の混在を示した。このプロフィールは同患者の末梢血液中のプロフィールと異なり、眼組織という局所に選択的あるいは特徴的に存在する炎症像と考えられた。しかし、本症例の問題点は、網膜裂孔の大きさや時間的経過、網膜色素上皮細胞によるサイトカインの関与のバリエーションも広く、さらに症例数を増やし再現性を検討しなければならない。そして、ステロイドなどの治療歴との比較検討を行い、本疾患の発症機序や治療に結びつけることが平成11年以降の研究計画である。硝子体手術適応症例のリンパ球の検索では、初期の数症例において、フローサイトメトリーを用いて硝子体手術で採取した硝子体のサイトカインを測定したところ、Th-1,Th-2細胞の両者の活性化が存在することが推測された。しかし、症例を増やしたところ、連続する5例の検索では、ほとんど活性化が測定できなかった。これはリンパ球自体の存在が採取した硝子体中では少ないことによるためと判断された。そこで、アトピー性網膜剥離が他の網膜剥離と異なる炎症因子を有するか検索するために、ELISA法で測定できるサイトカインについて比較検討することとした。その測定条件を整える目的で、硝子体手術が適応される糖尿病網膜症、裂孔原性網膜剥離、黄斑上膜、黄斑円孔の疾患の硝子体を採取し、結果を集積しているところである。また、その結果に基づいて、採取している結膜の免疫組織学的検討を行う予定である。
海水の直接浄化に寄与する細菌の活用方法に関する研究

閉鎖性の内湾や海域の水を直接浄化する試みにおいて、特に有機物に対する除去効果が低い点を改善するため、海水中の難分解性有機物を分解する能力を有する細菌を見いだした上で、その特性を把握し、これを工学的に活用することにより、分解可能な有機物の範囲を広げることを目的とする研究を行った。効率的細菌とはpseudomonas paucimobilisである。得られた成果は以下の通りである。1.P.paucimobilisの分解特性に関する実験の結果、水温20°C以上、pH7.58.0、塩分30程度でも最も分解活性が大きかった。2.付着細菌との混合培養系においてより効果的になることを見いだしているので、この共生分解が、いかなる機構で行われているのか調べた。その結果、P.paucimobilisは高分子の有機物を低分子化しながら、易分解性の有機物に変換し、これを自然の細菌群が分解していることがわかった。3.礫、および海岸構造物の一部として利用できるポーラスコンクリートをとりあげ、浄化能を調査した。その結果、まず、ポーラスコンクリートは普通コンクリーとの1.5倍の分解能を有することがわかり、ポーラスコンクリートにP.paucimobilisを付着させればさらに分解能は1.5倍になることがわかった。また、付着させたP.paucimobilisは、水環境中で3ヵ月以上生残し、剥離したり淘汰されたりすることはなかった。
炎症・免疫シグナルを制御する新規脱ユビキチン化酵素の同定と阻害剤探索

脱ユビキチン化酵素(DUB)はユビキチン修飾を介した生理機能発現を負に制御するプロテアーゼで、ヒトでは約100種存在する。本研究では我々が同定したLUBACユビキチンリガーゼを介したNF-κBシグナル抑制に関与するDUBの機能を解析した。その結果、LUBACはTNF-α誘導性アポトーシスに伴ってHOIPサブニットが限定分解を受け、そのN末端側断片にNF-κB活性を抑制するDUBであるOTULINやCYLD-SPATA2複合体が結合すること、一方、C末端側断片はユビキチンリガーゼ活性を保持し、アポトーシスの過程で基質タンパク質(FADDやNEMO)の直鎖状ユビキチン化が減弱することを見出した。本研究で我々は、「炎症・免疫シグナルを制御する新規脱ユビキチン化酵素(DUB)の同定と阻害剤探索」として、ヒト全93種のDUBから炎症・免疫シグナルに重要なNF-κBとインターフェロン(IFN)産生経路の制御に関わるものを同定することを目指した。特に、LUBACによる直鎖状ユビキチン鎖生成を介したNF-κB活性化に対して抑制的に働くDUBを重点的に研究するとともに、同定されたDUBに対する阻害性化合物を探索し、生化学・細胞生物学的に解析することを目的とした。さらに我々は、直鎖状ユビキチン鎖を特異的に分解するOTULINに対する阻害剤を探索し、共通構造を持った4つの化合物を同定した。これらは少なくともin vitroではOTULINの活性を抑制することを突き止めた。今後、より詳細な細胞レベル、個体レベルでの機能解析を進める予定である。本年度は、本研究に関連して上記のBBRC (2017)に加えてNature Communications (2016)など6編の原著論文発表を行った。これらを通して、NF-κBを中心とする炎症・免疫シグナルを制御する直鎖状ユビキチン修飾の生理的・病理的役割の解明を進めることができた。また、28年度の研究からOTULINに対する新規阻害剤も同定されており、29年度により詳細な研究進展が期待できるため、本研究は「おおむね順調に進展している」と判断した。本研究で我々は、「炎症・免疫シグナルを制御する新規脱ユビキチン化酵素の同定と阻害剤探索」として、ヒト全93種の脱ユビキチン化酵素(DUB)から炎症・免疫シグナルに重要なNF-κBとインターフェロン(IFN)産生経路の制御に関わるものを同定することを目指した。特に、LUBACによる直鎖状ユビキチン鎖生成を介したNF-κB活性化に対して抑制的に働くDUBを重点的に研究するとともに、同定されたDUBに対する阻害性化合物を探索し、生化学・細胞生物学的に解析することを目的とする。既に我々は、アポトーシス惹起時にLUBACの活性中心サブユニットであるHOIPがカスパーゼによって特異的に限定分解を受け、N末端領域ではNF-κB活性を抑制するDUBであるOTULINやCYLD-SPATA2複合体に結合し、基質であるNEMOやFADDの脱ユビキチン化を亢進することを報告した(Goto E. & Tokunaga F., BBRC, 2017)。本年度の研究で我々は、LUBACによるNF-κB活性化を抑制するDUBのスクリーニングを行い、OTU型DUBの1種が顕著なNF-κB抑制能を示すことを見出し、ConBio2017にて学会発表した。昨年度、直鎖状ユビキチン鎖を特異的に分解するOTULINに対する阻害剤を探索し、共通構造を持った4つの化合物を同定したが、今年度はさらにこれを基に11種の展開体を合成し、in vitro及び細胞レベルでの炎症・免疫シグナル抑制能を解析し、少なくともin vitroではOTULINの活性を抑制することを突き止めており、細胞レベルや個体レベルでの薬効解析を進めている。平成29年度には、平成28年度の研究成果を更に発展させ、次の解析を行う。I.免疫・炎症シグナル制御に関わる新規DUBの生理機能1平成28年度のスクリーニングから同定される炎症・免疫シグナル制御性DUBの生理機能を明らかにするため、Cas9/CRISPR法によりノックアウト細胞・マウスの作製に着手する。2得られたKO細胞・マウスを用いて、NF-κB、MAPキナーゼ、IFN産生シグナル、リンパ球やマクロファージなどの数・機能、生化学的数値、全身的な表現型を解析する。平成28年度の研究と併せて、新規DUBの生化学、細胞生物学、in vivoでの役割が解明される。1OTULINインヒビターに関しては、共結晶構造解析を進め、化合物による直鎖状ユビキチン結合やOTULIN阻害の分子基盤を明らかにするとともに、より選択的で阻害能の高い化合物をモデリングし、創薬シーズとしてブラッシュアップする。化合物のコア構造と生理機能に関して知財獲得を目指す。

2OTULINインヒビターのがん転移や病態モデルマウスへの影響を明らかにするため、まず候補化合物をマウス(B6や免疫不全マウス)に投与した場合の毒性を確認し、がん細胞株を免疫不全マウスに異種接種した場合の腫瘍形成に与える影響を検討する。関節リウマチ(SKGマウスなど)やSLE(CD72欠損マウスなど)の自己免疫疾患モデルマウスを用いて、候補化合物を投与した場合の病態発現への影響を明らかにする。3平成28年度の研究から同定された新規炎症・免疫シグナル制御性DUBの阻害剤を化合物ライブラリーからアルファスクリーン法にて探索する。得られた化合物については、先行するOTULINインヒビターと同様に生化学・細胞生物学的解析を行い、モデルマウスを用いた疾患への応用を検討する。医化学一般28年度は、7月に研究室の異動があったことや、主にin vitroレベルでの研究を進めたため、当初の計画より少額で研究を進展することができた。研究成果の遅延はなく、当初の研究目標はおおむね達成できたと考えている。次年度の消耗品購入費が予定より多く必要になると考えられ、次年度に活用する。29年度では研究の進展に伴って、細胞レベルでの研究を行うと伴に、免疫不全マウスなどモデル実験動物を使用する予定であり、これらの高価な消耗品購入のため前年度の経費を合わせて使用する。現在のところ、実験期間については延長の予定はなく、他の経費の増額や備品の購入はない。また、今年度中に全額を使用し、研究目的の達成を図る。
タミフル固定担体を用いた生化学的手法による生体内におけるタミフルの作用点の探索

オセルタミビル(タミフル[○!R])は、インフルエンザA型およびB型ウイルスのノイラミニダーゼを阻害し、インフルエンザウイルスの増殖を抑制する。タミフルは数少ないインフルエンザウイルス特効薬の一つであり、その社会的重要性は非常に高い。しかし近年、日本を中心として、タミフルを服用した若年の患者に異常行動が報告されており、若年選択的な副作用の可能性が指摘されるようになった。タミフルと異常行動の因果関係は今のところ明らかになっていないが、私たちはもしタミフルの服用と異常行動に因果関係があるのなら、脳にタミフルと結合するタンパク質が存在するはずであると考えた。そこで、タミフルを固定した担体を有機化学的に作製し、アフィニティクロマトグラフィーにより、生化学的および遺伝子工学的にタミフルと親和性のあるタンパク質を探索した。生体内からタミフルと親和性のあるタンパク質を単離するために、2つの方法でアプローチした。1)まず、分画したマウスの大脳抽出液からアフィニティクロマトグラフィーによりタミフル結合タンパク質を単離した。その結果、タミフルに親和性のあるタンパク質を検出することができ、質量分析により数種類の候補タンパク質を同定した。2)また、発現量の少ないタンパク質を検出するため、ヒト脳cDNAライブラリーを用いたファージディスプレイ法を併用した。タミフル結合アッセイを数回繰り返し、タミフルと親和性のあるファージを増幅したところ、約200個のプラークを得ることができた。それらのファージの遺伝子配列をBLAST検索し、タミフルと親和性のあるタンパク質の候補を得た。今後はこれらの候補タンパク質の機能にタミフルが影響するかどうかを解析し、タミフルの安全使用につなげたいと考えている。
水産増殖における物質フローの解析とゼロエミッション化

1.研究目的内湾・河川・湖沼等を利用する水産増殖技術は海外各地へ輸出され,地域産業の振興に貢献している一方で,養殖の自家汚染による水域汚濁が深刻となっている。本研究は養殖の自家汚染を防止し生産性向上と環境破壊防止を図るゼロエミッション型水域浄化システムの技術開発を目的とする。2.研究成果本技術は自然界生態系の浄化力を利用したもので,構成生物は魚類,細菌類,植物(微細藻類含む),小動物(動物プランクトン・底生動物含む)であった。この自然浄化力を強化する各要素技術は(1)水流制御,(2)直接水浄化,(3)底質改善および(4)利用植物の回収と飼料への変換に分類された。増殖系における物質フローの解析及び各要素技術の開発を行った。飼料→魚→バクテリア→藻類までの物質フローの解析及び各要素技術はほぼ確立できた。3.今後の課題現在、藻類→バクテリア→飼料→小型魚→大型魚及び無機栄養塩→野菜→食料の経路に必要な各要素技術について実験・検討中である。今後の課題として、全循環経路の物質フローを把握し,その実用化システム及び経済性評価を行うことである。
がん遺伝子産物の生理活性阻害作用に基づいた制がん剤の開発研究

昭和61年度における本研究課題は、(1)がん遺伝子産物の1つであるrasp21蛋白質の生理活性を特異的に阻害する細胞内成分を分離精製し、(2)その化学構造および細胞増殖阻害作用を明らかにすることである。61年度に交付された補助金による研究によって次の事柄が明らかになった。1.阻害物質の精製法:(1)本阻害物質は脳および肝組織に多く含み、熱水抽出される。(2)本阻害物質は低分子(分子量約500)であるのでSephadex G-25によるゲル瀘過法によって部分精製される。(3)部分精製標品は、FPLCおよびHPLCによるカラムクロマトグラフィーによって単一物質にまで精製される。2.物性に関する知見:(1)本阻害物質は熱安定性,光感受性の低分子核酸前駆体類似物質である。(2)本物質の完全化学構造については62年度までに解決する見通しである。3.生理活性に関する知見:(1)本物質はNDP kinaseによるrasp21の活性化を特異的に阻害するばかりか、rasp21蛋白質同様のGTP結合蛋白質の活性化を阻害する。(2)rasp21蛋白質の活性化を阻害する本阻害物質の濃度で各種培養細胞の増殖を阻害する。(3)がん化した細胞およびウイルスによるトランスホーム細胞内のNDP-kinase濃度と阻害物質の細胞内濃度とは送相関の関係にある。さらに、(4)本阻害物質は非増殖細胞中にも存在するが、細胞増殖因子や各種マイトゲン刺激によって細胞増殖のシグナルが誘導されると、本物質の細胞内濃度が有意に減少する。以上の知見を総合すると、がん遺伝子産物であるrasp21蛋白質の生理活性を特異的に阻害する低分子物質の存在が実証される。さらに本物質の作用機作からrasp21蛋白質の細胞増殖における生理的役割が明確になった。今後の研究によって、本物質の化学構造が明らかにすると共に、その誘導体の合成による新しい細胞抑制物質としての開発が期待される。
草地の生物多様性が家畜糞尿中窒素の再吸収・利用に及ぼす影響に関する研究

種の多様性は草地生態系の生産性と持続性と安定性に影響を及ぼすと言われている。種多様性の問題は群集生態学上の重要なテーマの一つであると同時に応用生態学的にも重要なテーマである。本研究では以下の2点を扱った。1、種多様性の高い放牧草地ほど、家畜尿中の窒素の囲収率が高いか否か?2、種多様性の高い放牧草地ほど、持続性が高いか否か?菜食圧の違いが被食植物の種類組成に及ぼす影響の解明を目的として、放牧地の植生調査を行い、草種構成の変化や種多様性の高さに放牧圧が大きく関係していることを見いだした。放牧圧の異なる管理が行われてきた酪農家の放牧草地の植生を調査した結果、放牧圧が高い管理がなされてきた草地では短草型草種の放牧圧が比較的低い管理の草地では長草型草種の優占が認められた。また適正な放牧管理を行っている草地では、長草型草種と短草型草種が安定的に共存し、高い種多様性を示すことを明らかにした。さらに、低投入酪農方式を採用する酪農家が存在することが確認され、その方式の是非を検討した結果、それらの放牧草地は、生物多様性を高く保ちながら牛乳生産効率が高いことが明らかとなった。さらに、酪農家レベルでの窒素収支を算出し、放牧利用への依存度が高い酪農家では、窒素の循環利用の効率が高いことを見いだした。さらに、低投入酪農家の放牧草地で観察された高い種多様性と環境保全性の理由を知るために検証実験を試みた。人工草地の安定住・持続性と種多様性および施肥管理との関係について野外実験を行った結果,放牧草地への長年の施肥によって草地の持続性が低下し種多様性が低下する場合があることを明らかにした。さらに、長草型の半自然草地において、種多様性の違いが、家畜糞尿中の安定同位体窒素で標識した泉素態窒素の回収率に与える影響を検討した結果,種多様性の高い草地ほど窒素の回収率が高いことを示した。本年度の実験は同農場内のオーチャードグラス草地、ペレニアルライグラス草地において10月8日より12月3日まで行った。これらは播種された牧草地であり、牧草が優占し種多様性が低い。実験に用いた牛尿は同農場内の搾乳牛より採取した。採取した牛尿に99.9atm%の重窒素(^<15>N)を含む尿素態窒素を添加し、尿中^<15>Nの存在率比を約1.9atm%に調整した。対象草地に1.5m×1.5mの区画を設定し、中心に牛尿を半径8cmとなるように施用した。その際、オーチャードグラス草地には実際の放牧草地での排尿地点を想定した50cc施用区、その3倍量の150cc施用区、無処理区の3処理区、ペレニアルライグラス草地には50cc施用区、無処理区の2処理区を設けた。反復はいずれの区も4反復とした。施用尿の窒素量、^<15>N量は下表に示した。尿施用後、オーチャードグラス草地では14、28、56日目、ペレニアルライグラス草地では56日目に、区画中心より08cm(中心部)および818cm(周辺部)の牧草を採取した。

14、28日目は地上部のみ、56日目は地上部と地下部を採取した。採取した牧草は78°Cで48時間乾燥後に秤量し、全窒素含有率および^<15>N atom%の分析に供した。全窒素含有率はケルダール法、^<15> Natom%は発光分析法により測定した。試料の^<15>N atom%から自然界の^<15>N atom%(0.365atom%)を差し引いて、試料の^<15>N excess%を求めた。牧草の^<15>N excess%を尿の^<15>Nexcess%で除した値を、牧草窒素中の尿由来窒素の割合とした。また、試料の全窒素含有量に^<15>Nexcess%を乗じて^<15>N 15Nexcess量を求め、牧草^<15>N15Nexcess量を尿^<15>N 15Nexcess量で除した値を、牧草による尿窒素回収率とした。その結果、牧草による尿中窒素の回収率は、オーチャードグラス草地での尿50cc施用区で39.4%、150cc施用区で21.6%であり、ペレニアルライグラス草地での50cc施用区で27.0%であった。多くの尿中窒素が吸収されずに土壌中に残留したり揮発や脱窒による大気中への移動や地下水とともに流亡したものと考えられる。種の多様性は草地生態系の生産性と持続性と安定性に影響を及ぼすと言われている。種多様性の問題は群集生態学上の重要なテーマの一つであると同時に応用生態学的にも重要なテーマである。本研究では以下の2点を扱った。1、種多様性の高い放牧草地ほど、家畜尿中の窒素の回収率が高いか否か?2、種多様性の高い放牧草地ほど、持続性が高いか否か?採食圧の違いが被食植物の種類組成に及ぼす影響の解明を目的として、放牧地の植生調査を行い、草種構成の変化や種多様性の高さに放牧圧が大きく関係していることを見いだした。放牧圧の異なる管理が行われてきた酪農家の放牧草地の植生を調査した結果、放牧圧が高い管理がなされてきた草地では短草型草種の放牧圧が比較的低い管理の草地では長草型草種の優占が認められた。また適正な放牧管理を行っている草地では、長草型草種と短草型草種が安定的に共存し、高い種多様性を示すことを明らかにした。さらに、低投入酪農方式を採用する酪農家が存在することが確認され、その方式の是非を検討した結果、それらの放牧草地は、生物多様性を高く保ちながら牛乳生産効率が高いことが明らかとなった。さらに、酪農家レベルでの窒素収支を算出し、放牧利用への依存度が高い酪農家では、窒素の循環利用の効率が高いことを見いだした。さらに、低投入酪農家の放牧草地で観察された高い多様性と環境保全性の理由を知るために検証実験を試みた。人工草地の安定性・持続性と種多様性および施肥管理との関係について野外実験を行った結果、放牧草地への長年の施肥によって草地の持続性が低下し種多様性があ低下する場合があることを明らかにした。さらに、長草型の半自然草地において、種多様性の違いが、家畜糞尿中の安定同位体窒素で標識した尿素態窒素の回収率に与える影響を検討した結果、種多様性の高い草地ほど窒素の回収率が高いことを示した。
タキサン系抗癌剤による末梢神経障害性疼痛の予防・治療法の開発

パクリタキセルによる神経障害性疼痛のモデル動物の作成に難渋したため、神経学的に類似した糖尿病性神経障害性痛モデルの解析を中心に行った。ストレプトゾトシン投与による糖尿病モデルをラットおよびマウスに作成、ストレプトゾトシン投与後に機械刺激に対して逃避反応を示す閾値の低下が認められ、痛覚過敏が生じることが示された。小胞体ストレスマーカーであるGRP78の発現は上昇する傾向を示したが、GRP78およびCHOPの遺伝子発現は不変または減少する傾向があり、一定の結論は得られなかった。また、臨床データではタキサン系薬剤の末梢神経障害のしびれと痛みにはデュロキセチンの効果が弱いことが明らかとなった。本年度は当初の予定を変更し、パクリタキセルによる神経傷害性疼痛と関連性の深い、糖尿病性神経障害の治療(主に低反応レベルレーザーを用いた治療)の検討に時間を費やした。この結果、低反応レベルレーザーの糖尿病性神経障害に対する有効性が示唆されたため、今後、本研究のテーマであるパクリタキセルによる神経傷害性疼痛の予防、治療の一助となる可能性があり、次年度以降に検討していく予定である。今後、本課題の主目的である、有効薬剤の同定を早急に進めていく。このため、当初の予定を一部割愛して、一般に神経障害性疼痛に治療効果が高いとされる抗けいれん薬(プレガバリン、ガバペンチン)、抗うつ薬(アミトリプチリン、デュロキセチン)、各種オピオイド(モルヒネ、オキシコドン、フェンタニル)、またパクリタキセルによる末梢神経傷害性疼痛に有効と考えられている塩化リチウム、カンナビノイドの有効性の検討を行う。まずはラットモデルで検討し、実際の臨床での有効性の検討を急ぐ。本年度は、研究計画の順序を変更して、抗癌剤による末梢神経障害で疼痛・緩和ケア科に紹介されてきた症例に対する症状マネジメントに関するデータの蓄積を行った。主にパクリタキセルによる化学療法後に残存した四肢末梢の疼痛・しびれ症状に対して、薬物療法を中心にマネジメントが行われた。その投薬内容では、デュロキセチン、プレガバリンの使用頻度が高く、程度の差はあるが多くの症例で改善効果を認めた。また、オピオイド鎮痛薬であるオキシコドン徐放剤を用いて劇的にしびれが改善した症例も見られた。さらに、これらの鎮痛補助薬に加えて、芍薬甘草湯、牛車腎気丸などの漢方薬の使用や、低出力レーザー(LLLT)照射を併用することで症状緩和が促進された症例も何例かあった。次年度が本課題の最終年度となるが、研究の進行が遅れており、抗けいれん薬(プレガバリン、ガバペンチン)、抗うつ薬(アミトリプチリン、デュロキセチン)、各種オピオイド(モルヒネ、オキシコドン、フェンタニル)の中で、実臨床で神経障害による症状緩和に有効な薬剤の選出と、漢方薬やLLLTによる光線療法など補助的治療法の有効性についての検討を早急に行っていく。時間が許せば、Bennettらによって開発されたラットのパクリタキセルによる末梢神経障害モデルを用いた神経障害のメカニズムの解明と、それに基づいて実臨床で有効な治療法の作用機序を、疼痛関連遺伝子の発現変化や組織形態的に検討していく予定である。本年度は、研究最終年度と考えていたため、本研究の臨床データを獲得するため、京都府立医科大学附属病院緩和ケアセンター(主として緩和ケア病棟、緩和ケア外来)の基盤整備を行った。また、研究生や緩和ケアセンタースタッフと共同して、過去の患者データを解析して、昨年度までの研究結果で末梢神経障害による疼痛、しびれに有効な症例が多く見られたデュロキセチンについて、さらに症例数を追加して有効性の検討と有効性の予測因子の抽出を行った。その結果、デュロキセチンの症状改善に対する有効性とその特徴(性差や効果的な部位など)が明らかとなった。昨年度までに確認したオピオイド製剤、漢方製剤(牛車腎気丸など)、LLLTなどの光線療法の有効性に加えて、新たな知見が得られた。研究期間延長が承認されたため、本年度は実臨床に有用な何らかの結論を出すことに主眼を置いて進めていく。具体的には、本研究の最大の目的である「タキサン系抗癌剤による末梢神経障害の症状緩和に有効な治療法」を具体的に提示できるように研究を遂行していく。まずは既存のデータ(京都府立医科大学附属病院の過去のカルテ情報と現在治療中の患者データ)から各種薬剤(鎮痛補助薬、オピオイド、漢方薬)の有効性の程度を比較し、有効性の高い薬剤をリストアップする。可能であれば、同薬剤の前向き調査を行いその有効性を検証する予定である。時間が許せば同時並行で、大学院生、スタッフと共同して、末梢神経障害のメカニズムの解明のための組織学的検討を行う予定である。本年度は、昨年度に引き続いて、本研究の臨床データを獲得するため、京都府立医科大学附属病院緩和ケアセンター(主として緩和ケア病棟、緩和ケア外来)の基盤整備に時間を費やした。本年度の実際の進捗としては、研究生と共同して、過去の患者データを解析し、末梢神経障害の症状改善のキードラッグであるデュロキセチンについてその有効性の検討と有効性の予測因子の抽出を行った。一部結果は導き出せたが、本研究の目的に対する結論には至っていない。当初予定していた動物実験に時間を費やすことができず、研究計画は、遅れた状況となっている。

抗がん剤誘発性末梢神経障害性疼痛のモデル動物の作成に難渋したため、神経学的に類似した糖尿病性神経障害性痛モデルの作成と一次知覚神経の機能解析に焦点をあて研究を行った。糖尿病性神経障害性疼痛モデルとして、ストレプトゾトシン投与による糖尿病モデルをラットおよびマウスに作成した。膵ランゲルハンス細胞を破壊し、1型糖尿病に類似した高血糖・低インスリン血症を誘発する薬剤であるストレプトゾトシン(5mg/Kg)の腹腔内投与を行った後、血液を採取し血糖を測定したところ、投与したラット・マウスにおいて血糖値の優位な上昇を認め、8割程度の動物では血糖値が400mg/dlを超えることが確認できた。次に、ストレプトゾトシン投与前後における痛覚閾値の変化を評価するため、von Frey刺激による機械刺激に対する逃避反応、radiant heatによる熱刺激に対する逃避反応を観察し、ストレプトゾトシン投与ごに刺激に対する反応が変化するかどうかを検討した。その結果、ラットおよびマウスにおいて、機械刺激および熱刺激に対する痛覚過敏が生じることが示された。高血糖や抗がん剤は神経細胞に対し小胞体ストレスを引き起こすことが示されている。高血糖状態における痛覚過敏と一次知覚神経における小胞体ストレスの関係を調査するため、小胞体ストレスマーカーであるGRP78、CHOPの発現を調査した。免疫組織化学法によりGRP78の発現は上昇する傾向を示したが、リアルタイムPCRによるGRP78およびCHOPの遺伝子発現は不変または減少する傾向があり、一定の結論を得ることができなかった。また、臨床的事項として、タキサン系抗癌剤の末梢神経障害によるしびれ・疼痛に対して、研究期間中に臨床的に有効であった治療法について検討した。パクリタキセルによる神経障害性疼痛のモデル動物の作成に難渋したため、神経学的に類似した糖尿病性神経障害性痛モデルの解析を中心に行った。ストレプトゾトシン投与による糖尿病モデルをラットおよびマウスに作成、ストレプトゾトシン投与後に機械刺激に対して逃避反応を示す閾値の低下が認められ、痛覚過敏が生じることが示された。小胞体ストレスマーカーであるGRP78の発現は上昇する傾向を示したが、GRP78およびCHOPの遺伝子発現は不変または減少する傾向があり、一定の結論は得られなかった。また、臨床データではタキサン系薬剤の末梢神経障害のしびれと痛みにはデュロキセチンの効果が弱いことが明らかとなった。本年度は、京都府立医科大学附属病院の緩和ケア病棟および緩和ケアセンターが設置され、本研究の中でも臨床データを獲得するための基盤整備を中心に行った。実際には、臨床での末梢神経障害の症状マネジメントのデータの蓄積と、その内容から有効性の高い薬剤の推定と、補助的治療法(漢方薬、光線療法)の有効性の検討を行った。当初の研究計画では後半に予定されていた、実臨床でのタキサン系抗癌剤に対する有効な治療法の開発の準備を前倒しで開始したことになる。このため、動物実験に時間を費やすことができず、当初の研究計画からは、遅れた状況となっている。研究期間延長を承認していただき、本年度1年間で研究を完結させなければならないため、実臨床に有用な何らかの結論を出すことに主眼を置いて進めていく。具体的には、本研究の最大の目的である「タキサン系抗癌剤による末梢神経障害の症状緩和に有効な治療法」を具体的に提示できるように研究を遂行していく。
昆虫脳神経ペプチドホルモンの細胞内シグナル伝達機構の解明

フェロモン腺の培養系を用いた実験から、カイコのフェロモン生合成活性化神経ペプチド(PBAN)のシグナルはフェロモン腺細胞膜のレセプターに伝えられた後、カルシウムイオンチャンネルの開口→カルシウム-カルモジュリン(CaM)複合体の形成→プロテインホスファターゼの活性化→アシルCoAレダクターゼの活性化、という細胞内情報伝達系を介してボンビコール生合成系に伝えられ、その最終過程であるアシル基の還元反応が促進されるものと考えられた。そこで、PBANのシグナル伝達の流れを酵素等シグナル伝達に介在する機能性タンパク質の活性化として捉え、各ステップを分子レベルで解析するため、まず、フェロモン腺細胞内に存在する伝達因子の分画を試みた。その結果、CaM、プロテインホスファターゼは細胞質画分に、また、ボンビコール前躯体、アシルCoAシンセターゼおよびアシルCoAレダクターゼはミクロソーム画分に見いだされ、後者の各因子はCHAPSにより可溶化された。そこで、PBANシグナル伝達の初期過程に関与するCaMの精製を試み、順次イオン交換および逆相HPLCを行うことによりこれを単離した。さらに、酵素による断片化とアミノ酸配列分析より、単離されたカイコフェロモン腺のCaMの一次構造を明らかとした。今後の計画としては、CaM結合タンパク質および他の伝達因子の精製を進め、PBANによるシグナル伝達の流れを分子レベルから実体的に明らかにする。
簡単なファンデアワールス分子気体のガラス化の試み

極端に簡単なファンデアワールス分子においてガラス状態を実現し,その構造や性質を解明することはガラス状態,ガラス転移の本質に迫る上で非常に重要であり,多くの科学者が描く夢の一つである。本研究では,窒素等の簡単な分子を数nmの細孔内に閉じ込め,まずガラス状態を実現し,ガラス転移の熱的性質を実験的に解明することの方途を探ることを目的とした。まずは細孔剤の合成を進めた。一般に細孔径の均一なものが作り易いシリカMCM-41を取り上げ,細孔直径14nmの合成に成功したが,それ以上では難しかった。クライオスタットとして,最初に冷凍機内蔵型のものを用いて気体分子の凝縮を試みた。試料導入管を通して外部から熱が入るために,また冷凍機の振動のために,試料容器の温度としては20Kを達成するのが限界であった。窒素およびキセノンをそれぞれの液体温度領域で試料容器内に導入し,温度を下げた後に熱測定を行った。直径が2nm以上では冷却時に結晶化するのが観測された。直径が1nmの場合には結晶化と融解の挙動は見られなかったが,ガラス化の現象も見られず,液体のままにあるか,あるいは細孔壁構造に支配された固体状態にあるかは結論できなかった。より低温を安定に実現することが必要である。現在は,液体窒素と液体ヘリウムを寒剤とするクライオスタットを利用し,試料導入管を設置することに努めている。1nmから2nmの細孔直径をもち,その細孔分布が極めて小さい細孔剤MCM-41の作り分けも重要になる。本研究から,これらの改善により,窒素やキセノンの細孔内ガラス化挙動の熱的解明が可能になることが見いだされたものと結論される。
爬虫類における高温・低温感受遺伝子の探索と発現解析

恒温動物である哺乳類の温度感覚の受容体として,6種類のthermo transient receptor potential(TRP)遺伝子が見つかっている.本研究では,変温動物である爬虫類におけるTRP遺伝子ホモログの塩基配列を決定し,特徴付けることを目的とした.材料は主にミドリガメ,シマヘビを用いた.実験方法は,異なる組織からtotal RNAを抽出して,RT-PCR法により,TRP遺伝子ホモログのcDNAを合成し,ABIDNAシーケンサーにより塩基配列を決定した.また,併せて発現解析も行った,その結果,ミドリガメにおいてTRPV2(哺乳類では52°C<で活性がある報告がある),TRPV3(3239<°C),TRPM8(28°C>),TRPA1(17°C>)の4種類の,シマヘビではTRPV3,TRPA1の2種類のTRP遺伝子ホモログの一部の塩基配列を同定することができた.得られた配列をアミノ酸に翻訳したものをヒト,ニワトリとアライメントしたところ,配列の類似性は高く,各主要ドメインは保持していることが分かった.また,発現解析の結果,それぞれ脳,舌,肺,心臓,肝臓,皮膚などにおいて発現しており,哺乳類の発現パターンと類似していることから,これらの遺伝子は爬虫類の温度センサーとして機能しているのではないかと推測された.さらに,得られた配列と脊椎動物複数種の配列を用いて系統樹を作成したところ,鳥類であるニワトリとクレードを形成し,配列も非常に類似していたが,同じ変温動物である両生類のアフリカツメガエルの配列とはそれほど似ていなく,樹型の距離も遠いことが分かった.このことから,爬虫類は変温動物であるが,温度感受能力は恒温動物と同程度の機能を持っているのではないかと考えられる.恒温動物である哺乳類の温度感覚の受容体として,6種類のthermo transient receptor potential(TRP)遺伝子が見つかっている.本研究では,変温動物である爬虫類におけるTRP遺伝子ホモログの塩基配列を決定し,特徴付けることを目的とした.材料は主にミドリガメ,シマヘビを用いた.実験方法は,異なる組織からtotal RNAを抽出して,RT-PCR法により,TRP遺伝子ホモログのcDNAを合成し,ABIDNAシーケンサーにより塩基配列を決定した.また,併せて発現解析も行った,その結果,ミドリガメにおいてTRPV2(哺乳類では52°C<で活性がある報告がある),TRPV3(3239<°C),TRPM8(28°C>),TRPA1(17°C>)の4種類の,シマヘビではTRPV3,TRPA1の2種類のTRP遺伝子ホモログの一部の塩基配列を同定することができた.得られた配列をアミノ酸に翻訳したものをヒト,ニワトリとアライメントしたところ,配列の類似性は高く,各主要ドメインは保持していることが分かった.また,発現解析の結果,それぞれ脳,舌,肺,心臓,肝臓,皮膚などにおいて発現しており,哺乳類の発現パターンと類似していることから,これらの遺伝子は爬虫類の温度センサーとして機能しているのではないかと推測された.さらに,得られた配列と脊椎動物複数種の配列を用いて系統樹を作成したところ,鳥類であるニワトリとクレードを形成し,配列も非常に類似していたが,同じ変温動物である両生類のアフリカツメガエルの配列とはそれほど似ていなく,樹型の距離も遠いことが分かった.このことから,爬虫類は変温動物であるが,温度感受能力は恒温動物と同程度の機能を持っているのではないかと考えられる.
新規PDK1結合タンパク質によるPDK1/Akt経路の制御

がん細胞の増殖シグナル伝達系の代表的なものとして、PI3K/PDK1/Akt経路が知られている。本研究では新規PDK1結合タンパク質を同定し、Aki1[Akt kinase(PDKI)-interacting protein 1]と命名した。そして、Aki1がEGFシグナル選択的にPI3K/PDK1/Akt経路で足場タンパク質として働き、細胞の生存・増殖を促すことを明らかにしてきた。こうした分子生物学的な成果を踏まえ、次にはAki1の生理的な意義を明らかにするべく、ヒトAki1を全身性に発現するトランスジェニックマウス(以下、Aki1-Tgマウス)の作製を行った。これまでの培養細胞レベルでの解析では、足場タンパク質であるAki1を過剰発現させるとAktのリン酸化は抑制された。この結果を考慮すると、Aki1がマウス個体内でもPDK1/Akt経路の足場タンパク質として機能しているならば、Aki1-TgマウスのフェノタイプはAktのノックアウトマウス(KOマウス)のフェノタイプと類似する可能性が予想された。実際に、生まれてきたAki1-Tgマウスは野生型マウスに比べ個体のサイズが小さかった。それだけでなく、マウスの臓器を用いてウエスタンブロットを行ったところ、いくつかの臓器でAktのリン酸化レベルの減弱が認められた。Aktには3つのアイソフォームが存在し、それぞれのKOマウスは、Akt1-全身サイズの縮小、Akt2-高血糖、Akt3-脳発達障害というフェノタイプを示すことが知られている。Aki1-TgマウスのフェノタイプはAkt1-KOマウスのものとよく似ており、Aki1がマウス個体内でPDK1/Akt1経路の足場タンパク質として機能していることが示唆された。今後、Aki1-Tgマウスで糖代謝や脳の発達に変化が見られるかを検討していく必要がある。EGFやIGF-1などの増殖因子の刺激によって活性化したAktは基質のリン酸化を介して、抗アポトーシス・増殖促進作用をもたらす。私はこれまでの研究から、新規PDK1結合タンパク質XがPDK1/Akt経路の活性化因子であることを明らかにした。今回、siRNAを用いてXを発現抑制すると、PDK1依存的なAktのリン酸化は抑制されたが、他のPDK1の基質であるS6K,SGK,PKC,PRK2のリン酸化レベルの変化は見られなかった。また、Xと各々のタンパク質(Akt,S6K,SGK)を共発現させ免疫沈降・ウエスタンブロットを行った結果、XはAktとは結合するがS6KやSGKとは結合しないことが分かった。Xを過剰発現あるいは発現抑制させた際のPDK1とAktの結合を検討したところ、X過剰発現時には両者の結合は増大し、X発現抑制時にはEGF刺激時に見られる両者の結合が抑制された。以上の結果から、XはPDK1の基質の中でもAktと選択的に結合し、両者の足場タンパク質として機能していることが明らかとなった。また私はこれまで、XがEGF刺激によるPDK1依存的なAktのリン酸化を選択的に亢進する一方で、IGF-1やPDGF刺激によるAktのリン酸化には寄与しないことを明らかにしてきた。今回、EGF刺激時にのみEGF受容体とXが結合することを見出した。またこの時、XとAkt間の結合もEGF刺激依存的に起こることが明らかとなった。XとPDK1間の結合は見られなかったことから、PDK1結合タンパク質であるXは刺激に関わらずPDK1と結合しており、EGF刺激依存的にEGF受容体およびAktと複合体を形成することでPDK1によるAktのリン酸化を促していることが強く示唆された。本研究ではすでにPDK1結合タンパク質としてXを同定している。Xは機能に基づく名前がつけられておらず、これをAki1[Akt kinase(PDK1)-interacting protein1]と命名した。これまではRNAi実験を中心に解析を行ってきたが、Aki1の過剰発現の効果を知るためにEGF刺激下でAki1を発現させた。すると、発現させたAki1の量が増えるにつれてPDK1によるAktのリン酸化レベルは上昇した後、減少に転じた。このような2相性の挙動は足場タンパク質を過剰発現させた時に見られる現象として知られており、Aki1が足場タンパク質として機能することが証明された。これまでPI3K/PDK1/Akt経路において明らかにされてこなかった足場タンパク質を同定した点は非常に意義深いと考えている。次なる課題としてAki1の個体内での生理的な意義を明らかにするべく、ヒトAki1トランスジェニックマウスの作製を開始した。ジェノタイピングの結果、5匹のマウスにAki1遺伝子の挿入が認められた。今後germline transmissionの有無を確認し、フェノタイプ解析を進める予定である。上述したように細胞レベルでの解析ではAki1を強く発現させると、Aktのリン酸化が抑制された。

この事実を考慮すると、Aki1が個体内でもPDK1/Akt経路の足場タンパク質として機能しているならば、ヒトAki1トランスジェニックマウスのフェノタイプはAktのノックアウトマウスに近いものになると予想され、今後の解析に期待したい。がん細胞の増殖シグナル伝達系の代表的なものとして、PI3K/PDK1/Akt経路が知られている。本研究では新規PDK1結合タンパク質を同定し、Aki1[Akt kinase(PDKI)-interacting protein 1]と命名した。そして、Aki1がEGFシグナル選択的にPI3K/PDK1/Akt経路で足場タンパク質として働き、細胞の生存・増殖を促すことを明らかにしてきた。こうした分子生物学的な成果を踏まえ、次にはAki1の生理的な意義を明らかにするべく、ヒトAki1を全身性に発現するトランスジェニックマウス(以下、Aki1-Tgマウス)の作製を行った。これまでの培養細胞レベルでの解析では、足場タンパク質であるAki1を過剰発現させるとAktのリン酸化は抑制された。この結果を考慮すると、Aki1がマウス個体内でもPDK1/Akt経路の足場タンパク質として機能しているならば、Aki1-TgマウスのフェノタイプはAktのノックアウトマウス(KOマウス)のフェノタイプと類似する可能性が予想された。実際に、生まれてきたAki1-Tgマウスは野生型マウスに比べ個体のサイズが小さかった。それだけでなく、マウスの臓器を用いてウエスタンブロットを行ったところ、いくつかの臓器でAktのリン酸化レベルの減弱が認められた。Aktには3つのアイソフォームが存在し、それぞれのKOマウスは、Akt1-全身サイズの縮小、Akt2-高血糖、Akt3-脳発達障害というフェノタイプを示すことが知られている。Aki1-TgマウスのフェノタイプはAkt1-KOマウスのものとよく似ており、Aki1がマウス個体内でPDK1/Akt1経路の足場タンパク質として機能していることが示唆された。今後、Aki1-Tgマウスで糖代謝や脳の発達に変化が見られるかを検討していく必要がある。
幼児の食事行為の獲得と社会化－境界線を越える意味とおとなの支援

2か所の幼稚園3歳児クラスにおいて、7月から3月までの8ヶ月間に渡り、月1回の給食時のVTR観察をおこなった。クラスの約束事や保育の枠組みと子どもたちの食スクリプトや食事に関する知識、会話への参加と、それに対する保育者の働きかけや支援を中心にデータ収集と相互行為資料の文字化をおこなった。その結果、給食スクリプトは、この決まった時間と空間の制約のなかで保育活動を運営するための機能を果たしており、保育者はクラス全体でこれを共有するための働きかけをおこなっていた。7月当初は、子どもたちの多くは給食の配布や配膳、片づけの手順について十分に理解しておらず、保育者の指示や手がかり提示が必要であったのが、12月頃になると配膳やおかわり、片づけなどの手順を理解して、次の行為を見据えた参加ができるようになっていった。さらに、食事の量の調整やおかわり、食事中の会話についてはかなり自由に展開されており、各子どもが自分のスタイルに応じて主張、交流できる形をとっていた。幼稚園における食スクリプトは、参加する子どもたちが場面を共有し、食事のマナーを獲得しながら完食を目指すための枠組みであることが示唆された。さらに、この枠組みは子どもたちの食事行為を形成すると同時に、それを越えて目の前の食事の採り方、次の行為の計画、会話における話題提供に至るまで、それぞれの子どもたちに応じた参加スタイルの許容を保証するものとして機能していた。観察方法やクラスの選定などの交渉に少し時間を要したため、観察を開始できたのが7月になり、かつ3歳児クラスから開始することになった。調査については、質問内容の選定までは終了たものの、研究者間でその内容の調整に時間を要したため、実施開始は次年度となった。2年目はこれまでの2園において、3歳児および4歳児の各クラスの観察を月1回おこなう。観察方法は初年度と同様である。さらに、26歳児をもつ母親を対象にweb調査を開始する。次年度に観察対象クラスが倍になることを見越した、小型カメラとICレコーダの購入が次年度になってしまったこと、さらに、幼児をもつ親を対象とするweb調査の項目選定が遅れたために、開始が次年度になってしまったためである。