hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
生体触媒を活用するマイクロファクトリーの構築

反応流路の形式が異なる数種類のマイクロリアクターを駆使して、フッ素系物質の室温での簡便な合成方法の開発とこのリアクター系での特異的な反応形式について検討した。1)立体選択的合成法の開発ジフルオロメチル基が炭素-炭素二重結合に結合した三置換オレフィンの立体選択的な勘弁な合成法を見いだした。マイクロリアクター内で末端ジフルオロオレフィンにTBAFを作用させることによりプロトンの転位反応が起こり、三置換オレフィンを立体選択的(>99:1<)に合成する経路を確立した。フラスコ内でこの反応を行うと温度コントロールが非常に難しく、立体選択性が低下する。2)合成中間体の創製と活用シリールエノールエーテルは、合成中間体として有用であることが知られている。トリフルオロブタノンから生成されるこの種の合成中間体は不安定であることが知られているが、この中間体を室温で安定に合成するためのマイクロリアクターを設計、作製して合成中間体の創製と活用についての研究を検討した。その結果、マイクロリアクターを活用した中間体の合成と合成化学的活用法を開発することができた。今年度は、各種マイクロリアクターを設計、作製し反応リアクターとしてどのような性質を発現するかについて検討した。例えば、反応経路の幅(100200μm)、深さ(2040μm)反応経路長(50500mm)等を詳細に検討した。その結果、合成反応においては、反応経路幅よりも経路の深さの方が反応効率が良いことを明らかにすることが出来た。さらに、反応経路長としては、50150mm度の経路長で十分であることが判明し、250500mmという反応経路長ではマイクロリアクターの安定性に改良の余地があることが分かった。有機合成反応としては、特にフッ素系物質の合成反応を検討した結果、Horner-Wadsworth-Emmons反応を利用するフルオロオレフィン類の合成では、生成するオレフィン類のE/Z選択性はフラスコ内での反応と変わらないことが判明した。しかしながら、反応時間は短縮できることが分かった。さらに、トリフルオロメチル化反応では、フラスコ内での反応では5時間という反応時間が必要であるが、マイクロリアクターを用いることにより20秒という短い時間で行うことが出来ることを明らかにするとともに、収率の向上もみられた。また、マイケル付加反応も進行し、立体選択性は発現させるためには分子内に光学活性部位を組み込んでおく必要があることも分かった。マイクロリアクターの特徴として、金属触媒を系中に存在させることにより室温で立体選択的な反応を行うことが可能であることを見いだしたので各種の金属触媒の検討をこれから行っていく予定である。大型の反応装置、大規模な工場、大量生産というようなスタイルから机の上に構築可能なマイクロファクトリーのような生産体系へと変化すると考えられている。数百マイクロメートルの流路巾を持つマイクロリアクターを用い、数マイクロリットル/毎秒単位での物質合成を行った。この生産システムは、廃棄物をできるだけ排出せず必要量だけを効率よく生産する、高効率的生産型産業への移行、資源の再使用、環境調和型システム等々を目指したもの作りである。この反応装置の特徴として、反応熱の効率的な放出が考えられる。この反応装置を利用し異性体比が>99/<1(片方しかない)という高選択的合成反応を見いだした。反応も、数秒から数十秒という短い時間で完結し高収率で望むフッ素系オレフィン類を生産することができた。また、トリフルオロメチル基を分子内へ組み込む反応においても、触媒を効率よく利用して行うことができ、数百マイクロメートルの流路巾と数センチの反応経路内で触媒が拡散しながら効率よく働くことを確認した。さらに、Michael付加反応やBaylis-Hillmann反応なども進行するが、収率の面で十分な値が得られておらず、現在反応条件等について検討している。今年の成果としては、もの作りにおいて単一の生成物のみを作ることの難しさと、重要性については良く知られており、この課題点の克服の可能性をこの装置を利用して示せたことである。
間期染色体の核内ダイナミクス決定機構の解明に向けて

分裂酵母を用いて、間期染色体の核内局在を制御するしくみを明らかにするため、染色体腕部に多数存在する機能領域として複製開始点を選び、それぞれ近傍にlac0リピートを挿入し、生細胞内でLacI-GFP結合シグナルを高解像度顕微鏡で解析するシステムを構築した。その結果、初期開始点とTaz1非依存後期開始点は核内のランダムな位置に存在したのに対し、Taz1依存後期複製開始点は、間期を通じての核膜内縁局在と複製タイミングが決定されるG1/S期特異的なテロメアへの近接という2つの特徴的核内局在を示した。テロメアを核膜に繋ぎとめるしくみに働く核膜構成因子Bqt3/4の遺伝子破壊株を用いた実験により、複製開始点の核膜局在は複製タイミング制御に必要ないことが結論された。いっぽう、Shelterin構成因子Rap1, Poz1は、染色体腕部のTaz1依存開始点テロメアへの近接と複製タイミング制御に必要であった。さらにRap1、Poz1を欠失した条件でTpz1-Taz1の融合タンパク質(minishelterin)を発現させた実験結果から、Taz1ならびにshelterin因子が腕部のTaz1依存開始点をテロメアに近接させ、テロメアに集積するRif1とPP1(脱リン酸化酵素)を介して複製タイミングを後期へと制御すると結論した。これらの結果は、複製制御に細胞核内局在が寄与することを示す結果として、論文"Shelterin promotes tethering of late replication origins to telomeres for replication-timing control"としてEMBO Joural誌(2018)に掲載され、写真が表紙に採用された。【1】間期染色体の核内局在制御機構の解明分裂酵母を用いて間期染色体の核内局在を制御するしくみを明らかにするため、染色体上に広範囲に分布する機能領域である複製開始点を生細胞内で可視化するシステムを構築した。異なる制御を受けることが明らかになっている複製開始点の近傍にlac0リピートを組み込み、発現させたLacI-GFPのシグナルを高解像度顕微鏡で解析した。核膜とテロメアとの相対位置をそれぞれIsh1-mCherryとTaz1-mCherryで検出し、統計的解析を行った。テロメア因子Taz1-Rif1に制御される後期開始点は細胞周期を通じて核膜内縁に局在し、さらにG1-S期にテロメアに隣接を示したのに対し、Rif1のみにより制御される後期開始点や初期開始点は核内のランダムな局在を示した。染色体の同じ腕部にある後期開始点同士の隣接が検出された。Taz1-Rif1で制御される後期開始点の特異的局在は、タイミング制御に必要な「開始点に隣接するテロメア様配列」と、Taz1, Rif1に依存し、時間的空間的制御がともにテロメア因子により制御されることが示唆された。【2】核内局在に関与する因子の機能解析後期複製開始点の核内局在に関わるRif1の機能ドメインとして、PP1(タンパク質フォスファターゼ1)結合モチーフ欠損株を作成した結果、染色体内部の後期複製開始点の核膜への局在とテロメア隣接が損なわれたことから、PP1が染色体の核内局在に関与する可能性が考えられる。染色体内部の複数の複製開始点をlacO-LacI-GFP系で可視化することに成功し、統計的解析を経て、複製開始点の制御と核内局在が密接に関わること、さらにその制御にテロメア結合因子が関与することを示すことができた(投稿準備中)。染色体上の2個所を同時に可視化するシステムの構築は酵母株の作成を進行中である。【1】間期染色体の核内局在制御機構の解明分裂酵母を用いて間期染色体の核内局在を制御するしくみを明らかにするため、染色体上に多数存在する機能領域として複製開始点を選び、生細胞内で可視化するシステムを構築した。複製開始点の近傍に組み込んだlac0リピートへのLacI-GFP結合シグナルを高解像度顕微鏡で解析した結果、複製開始点のタイミング制御特異的核内局在を検出した。初期開始点は核内にランダムに存在したのに対し、Taz1依存的に制御される後期複製開始点は、細胞周期を通じて核膜内縁に局在しさらにG1-S期にテロメアに隣接を示した。いっぽう、Taz1に依存しない後期開始点は上記の特異的局在を示さなかった。また、Taz1依存的開始点の特異的局在は、「開始点に隣接するテロメア様配列」と、Taz1, Rif1、さらにShelterin構成因子Rap1, Poz1に依存し、テロメアの核膜局在に必要なBqt4には依存しなかった。これらの結果から、テロメア因子が複製開始点の特定グループの時間的空間的制御に関与することが示された。【2】核内局在におけるRif1の機能解析後期複製開始点の核内局在に関わるRif1の機能ドメインとして、PP1(タンパク質フォスファターゼ1)結合モチーフの他に、Taz1結合領域とRif1-Rif1相互作用領域を同定し、これらが複製タイミング制御に関わることを示した。染色体内部の複数の複製開始点をlacO-LacI-GFP系で可視化することに成功し、統計的解析を経て、複製開始点の核内局在制御にテロメア結合因子が関与することを示すことができた(投稿準備中)。複製開始点の核膜局在とテロメアへの隣接が複製タイミングを制御する可能性を証明する実験系の作成

途中でありまだ結果を得ていない。人為的に染色体内部の局在を制御するしくみは方法論が確立していないため、様々のシステムを構築中である。分裂酵母を用いて、間期染色体の核内局在を制御するしくみを明らかにするため、染色体上に多数存在する機能領域として複製開始点を選び、それぞれ近傍にlac0リピートを挿入し、生細胞内でLacI-GFP結合シグナルを高解像度顕微鏡で解析するシステムを構築した。その結果、初期開始点とTaz1非依存後期開始点は核内のランダムな位置に存在したのに対し、Taz1依存後期複製開始点は間期を通じて核膜内縁に局在し、さらに複製タイミングが決定されるG1/S期特異的にテロメアに隣接する特徴的局在を示した。Taz1依存後期開始点の核膜内縁局在は、テロメアを核膜にけい留するしくみに働く核膜構成因子Bqt3/4を必要とすることが明らかとなった.興味深いことに、Bqt4欠損株では、G1/S期でのTaz1依存開始点と核膜から離れたテロメアとの近接は失われず、また複製タイミング制御も正常であった。よって、核膜近傍の局在は、複製タイミング制御に必要ないことが結論された。いっぽう、Shelterin構成因子Rap1, Poz1はテロメア付近の後期複製制御には必要ないが染色体腕部のTaz1依存開始点の制御に必要であり、またこれらのテロメア隣接にも必要であった。さらにRap1、Poz1を欠失した条件でTpz1-Taz1の融合タンパク質(minishelterin)を発現させると、腕部のTaz1依存開始点の複製制御とテロメア近接がいずれも回復した。これらの結果から、Taz1ならびにshelterin因子が腕部のTaz1依存開始点をテロメアに近接させ、テロメアに集積するRif1とPP1(脱リン酸化酵素)による複製に必須なリン酸化を阻害し、複製タイミングを後期に制御すると考えている。染色体腕部の複製開始点を特異的な核内コンパートメントに局在させるしくみに、核膜内膜タンパク質とテロメア結合因子が関わるという新規の発見を行い、染色体核内配置の概念を進展させることができた。論文投稿中(現在revise中)。分裂酵母を用いて、間期染色体の核内局在を制御するしくみを明らかにするため、染色体腕部に多数存在する機能領域として複製開始点を選び、それぞれ近傍にlac0リピートを挿入し、生細胞内でLacI-GFP結合シグナルを高解像度顕微鏡で解析するシステムを構築した。その結果、初期開始点とTaz1非依存後期開始点は核内のランダムな位置に存在したのに対し、Taz1依存後期複製開始点は、間期を通じての核膜内縁局在と複製タイミングが決定されるG1/S期特異的なテロメアへの近接という2つの特徴的核内局在を示した。テロメアを核膜に繋ぎとめるしくみに働く核膜構成因子Bqt3/4の遺伝子破壊株を用いた実験により、複製開始点の核膜局在は複製タイミング制御に必要ないことが結論された。いっぽう、Shelterin構成因子Rap1, Poz1は、染色体腕部のTaz1依存開始点テロメアへの近接と複製タイミング制御に必要であった。さらにRap1、Poz1を欠失した条件でTpz1-Taz1の融合タンパク質(minishelterin)を発現させた実験結果から、Taz1ならびにshelterin因子が腕部のTaz1依存開始点をテロメアに近接させ、テロメアに集積するRif1とPP1(脱リン酸化酵素)を介して複製タイミングを後期へと制御すると結論した。
標的臓器癌におけるホルモン依存性及び非依存性増殖の分子機構

アンドロゲン依存性マウス乳癌由来SCー3細胞と、エストロゲン依存性マウス睾丸間質細胞腫由来Bー1F細胞の無血清培養系をもちい、性ホルモン依存性癌増殖の分子機構を検討した。アンドロゲン刺激によりSCー3細胞が持続的増殖を示すためには、少なくとも2つの遺伝子の発現が必須であることが判明した。一つはヘパリン結合性増殖因子である。この構造が決定され、FGF受容体ーIに結合し得ることが判明した。しかし、この増殖因子のみでは、アンドロゲン刺激でみられる持続性増殖は生じず、増殖刺激活性は一過性であることが判明した。持続性増殖に必須の他の遺伝子の同定は今後の問題として残された。又、SCー3細胞のFGF受容体ーIには3ヶ所の変異があること、この受容体のmRNAは、アンドロゲンやbFGFの刺激により増加することが明らかとなった。このmRNAの増加はbFGF感受性細胞であるNIH3T3細胞(非癌細胞)では認められない。そこで、FGF受容体ーI遺伝子のプロモ-タ-領域の塩基配列を決定した。このプロモ-タ-領域の塩基配列を決定した。このプロモ-タ-領域の塩基配列は両細胞間で差がなかった。この遺伝子の発現に関与する転写因子に相違があると推論できる結果である。又、この増殖因子の活性とFGF受容体ーIの発現は、スラミンにより強力に抑制されることも判明した。一方、Bー1F細胞のエストロゲン依存性増殖は、ロイコトルエンの合成低下を介して生ずることがあきらかとなった。更に、ロイコトルエンが増殖抑制因子であり、この阻害効果はロイコトルエンD_4受容体を介して生じることが判明した。以上の結果より、アンドロゲン及びエストロゲン依存性癌増殖は、オ-トクリンル-プにより制御されていること、この機構に関与する分子とその発現機構が明らかとなってきた。
炎症局所での好中球浸潤支配機構とサイトカインカスケードの解明

ウサギ急性炎症モデルでのGROの発現動態およびその役割を調べるためには,その遺伝子組み換え体および抗体の作製が必要となる.そこで,LPS刺激ウサギ脾細胞のcDNAライブラリーからGRO cDNAをクローニングし,これを発現ベクター(pQE-30:QIAGEN社)に組み込み,試大腸菌(E.coli M15[pREP4])に導入,ウサギGROの発現を拭みた.次に,大腸菌抽出液からGROタンパクを単離精製し,これをマウスおよびヤギにアジュバントとともに免疫し,モノクローナル抗体およびポリクローナル抗体を作製した.得られた抗体はウサギGROは認識するものの,他のウサギサイトカイン(TNFα,IL-1β,lL-8,MCP-1,IL-1 receptor antagonist)は認識せず,したがって炎症局所のGROの産生動態を知るうえで有用なツールと考えられた.そこで,ウサギGROをウサギ膝関節内に投与し,その時誘導される炎症反応を観察しようと計画した.しかしながら,上記GROは不溶性(8M Ureaには可溶)であったため,これをin Vivoに投与できなかった.そのためBaculovirus Transfer Vectorを用いる方法(Invitrogen社)で再度遺伝子組み換え体の作製を行い,その培養上清および細胞中から可溶性のGROを得た.現在このタンパクを精製中であり,精製後はin Vivoに投与し,その時の炎症反応を観察するとともに,ウサギ炎症モデルでのGROの産生動態を解明しその炎症反応への関与を明らかにしていく予定である.ウサギ急性炎症モデルでのGROの発現動態およびその役割を調べるためには,その遺伝子組み換え体および抗体の作製が必要となる.そこで,LPS刺激ウサギ脾細胞のcDNAライブラリーからGRO cDNAをクローニングし,これを発現ベクター(pQE-30:QIAGEN社)に組み込み,試大腸菌(E.coli M15[pREP4])に導入,ウサギGROの発現を拭みた.次に,大腸菌抽出液からGROタンパクを単離精製し,これをマウスおよびヤギにアジュバントとともに免疫し,モノクローナル抗体およびポリクローナル抗体を作製した.得られた抗体はウサギGROは認識するものの,他のウサギサイトカイン(TNFα,IL-1β,lL-8,MCP-1,IL-1 receptor antagonist)は認識せず,したがって炎症局所のGROの産生動態を知るうえで有用なツールと考えられた.そこで,ウサギGROをウサギ膝関節内に投与し,その時誘導される炎症反応を観察しようと計画した.しかしながら,上記GROは不溶性(8M Ureaには可溶)であったため,これをin Vivoに投与できなかった.そのためBaculovirus Transfer Vectorを用いる方法(Invitrogen社)で再度遺伝子組み換え体の作製を行い,その培養上清および細胞中から可溶性のGROを得た.現在このタンパクを精製中であり,精製後はin Vivoに投与し,その時の炎症反応を観察するとともに,ウサギ炎症モデルでのGROの産生動態を解明しその炎症反応への関与を明らかにしていく予定である.
超ウラン化合物も含めた重い電子系の新しい展開

希土類化合物に関して約50種類、ウラン・超ウラン化合物に関して約20種類の単結晶を育成し、フェルミ面の性質、磁性及び超伝導に関して興味ある物質を開発した。1.ネール点がゼロになる量子臨界点で、電子状態がどう変貌するのかを、圧力下ドハース・ファンアルフェン効果により反強磁性体のCeRhln_5とCeIn_3で研究を行った、CeRhln_5では臨界圧P_c=2.35GPaで電子状態が4f電子局圧系から4f電子遍歴系へと1次の相転移を起こしていることを実験的に明らかにした。2.4種類の化合物(CeNiGe_3, Ce_2Ni_3Ga_5,CelrSi_3,UIr)で圧力誘起超伝導を発見した。特にCelrSi_3とUIrは結晶に反転対称性がなく、興味ある超伝導現象を発見した。すなわち、反強磁性体CeIrSi_3に圧力を加えると、圧力の増大とともに約2GPaで、ネール点T_N→0となり、それとともに超伝導が出現する。H//[001]方向での上部臨界磁場は約40Tであり、スピントリプレット超伝導が発現している可能性が大である。新しいタイプの超伝導を予想させる。3.ネプツニウム化合物NpPd_5Al_2で初めて超伝導(T_<sc>=5K)を発見した。超ウランのネプツニウム化合物(NpGe_3など)及びプルトニウム化合物(PuIn_3)で世界初のドハース・ファンアルフェン効果の検出に成功し、バンド理論とつき合わせたところ5f電子が遍歴していることが分かった。セリウム,トリウム,ウラン,超ウランのネプツニウム化合物のf電子系の純良単結晶を育成し,電子状態の研究を行った。セリウム化合物ではCeRhIn_5,CePt_3Si, Ce_2Ni_3Ge_5など6種類(他のLa, Pr化合物などでは71種類),ウラン化合物ではUFe_4P_<12>,UIrなど6種類,ネプツニウム化合物ではNpCoGa_5,NpRhGa_5など5種類の単結晶を育成した。大きな研究成果は次の通りである。1,約3GPaまでの高圧下でのCeRhIn_5のドハース・ファンアルフェン効果に成功し,2.4GPaを境にして4f電子の電子状態が局在から遍歴に変貌することを見出した。2.4GPaは臨界圧力(量子臨界点であると結論した。サイクロトン質量は超伝導が発現する1.6GPaから2.4GPaで最大値になるように著しく増大した。2,反強磁性体Ce_2Ni_3Ge_5において,3.5GPa以上の高圧下で超伝導を発見した。3.5GPaでの超伝導の発現する転移温度は0.15Kであった。Ce_2Ni_3Ge_3は斜方晶の結晶構造であるが,正方晶のCeNi_2Ge_2に類似性がある。3,結晶の反転対称性を持たないCePt_3Siの単結晶育成に成功し,その基本的物性を明らかにした。Bi, Sn, Alなどのフラックス法,テトロアーク溶解炉を使った引き上げ法などいろいろ試みたが,モリブデンに封入したブリッジマン法が良いことが分かった。4,反転対称性のない強磁性体UIrで2.6GPa付近で超伝導を発見した。この2.6GPaは強磁性状態から常磁性状態に変わる臨界圧力である。この成果はジャーナルのホームページの11月号に取り挙げられた。

5,反強磁性体NpCoGa_5,NpRhGa_5のドハース・ファンアルフェン効果の実験より,5f電子の遍歴性を強く示唆する実験結果を得た。セリウム,トリウム,ウラン,超ウランのネプツニウム化合物のf電子系の純良単結晶を育成し,電子状態の研究を行った。特筆すべきは,超ウランのプルトニウム化合物の単結晶を育成し,超伝導に関する研究成果を得たこと,及び世界初のドハース・ファンアルフェン効果の観測に成功したことである。大きな研究成果は次の通りである。1.CeRhIn_5とCeIn_3の約3GPaまでの高圧下でのドハース・ファンアルフェン効果の研究が終了し,J.Phys.Soc.Jpnに掲載された。特にCeRhIn_5に関しては,平成17年度の国際会議でしばしば引用された。これらの研究成果により,研究分担者の摂待力生助教授は平成18年の磁気国際会議に招待講演を依頼された。2・結晶に反転対称性のない反強磁性体CeIrSi_3の加圧下での電気揖抗を測定し,約1.8GPaから3.5GPaにかけて,超伝導を発見した。ネール点がゼロになる臨界圧力2.5GPaでの超伝導転移温度Tsc=1.5Kと高く,上部臨界磁場Hc_2=11Tと大きい。パウリリミットの磁場は約2Tなので,新しいタイプの超伝導体であることを意味している。3.トリウム化合物ThIn_3の純良単結晶を育成し,フェルミ面の性質を明らかにした。4.ネプツニウム化合物NpRhGa_5,NpGg_3などで,5f電子が遍歴していることをドハース・ファンアルフェン効果の実験結果とバンド計算の結果から明らかにした。5.プルトニウム化合物PuRhGa_5の単結晶が育成され,そのNQRの実験からd波超伝導が明らかにされた。また世界初のPuIn_3単結晶試料のドハース・ファンアルフェン効果の観測に成功し,5f電子が遍歴電子となっていることをバンド計算の結果に対比して明らかにした。この2件は,J.Phys.Soc.Jpnの注目論文に選ばれた。セリウム,トリウム,ウラン,超ウラン化合物のf電子系の純良単結晶を育成し,電子状態の研究を行った.今年度も大きな研究成果が多数得られた.1)結晶に反転対称性のない化合物の超伝導が著しく発展した.1つにはこれまで2年間研究してきたCePt_3Siに関して,更に良質な単結晶が育成され,超伝導ギャップにラインノードを示す比熱の実験結果を得て,論文となった.CePt_3Si以外に強磁性体UIrで圧力誘起の超伝導を発見したが,更に反強磁性体のCeIrSi_3とCeCoGe_3でも圧力誘起超伝導が発見された.CeIrSi_3の研究成果は,J. Phys. Soc. Jpnの注目論文となり,プレス発表された.研究は更に進展し,CeIrSi_3の純良な単結晶が育成され,反強磁性が抑えられた2.65GPaの圧力下での超伝導に関して,OKでの上部臨界磁場Hc2(0)は正方晶の[001]方向で300kOe,[110]方向で95kOeという大きなHc2(0)の値と大きな異方性を発見した.フェルミ面は3次元の形状をしていて,スピン・軌道相互作用によるフェルミ面の分裂は約1000Kあり,新しいタイプの超伝導を発見した可能性が大である.研究代表者の大貫は,平成18年9月の日本物理学会でシンポジウム「空間反転対称性の破れた重い電子系超伝導」を開催し,研究分担者の摂待と竹内が特別講演をした.また,摂待は関連する研究内容で,磁気国際会議(京都,平成18年8月)とNew3SC(超伝導物質の新しい理論の展開と応用)国際会議(シドニー,平成19年1月)で特別講演をした.2)2年前にThIn_3の単結晶を育成し,そのフェルミ面の性質を明らかにしたが,今年度はThRhIn_5の単結晶を育成し,そのフェルミ面の形状が重い電子系超伝導体のCeCoIn_5と同じであることを実験的に明らかにした.3)超ウランのNpRhGa_5の強磁場磁化測定が行われ,Npの5f電子による四極子相互作用が絡んだ特異な磁化過程が見出され,論文となった.
大腸癌臨床検体を用いたリン酸化プロテオーム解析およびSRM/MRM法による検証

進行度の異なる大腸癌の臨床検体を用いた大規模リン酸化プロテオーム解析により、バイオマーカー候補および悪性化に関わる分子の探索を行った。解析条件の最適化により、これまで同定されなかった多くの分子が同定された。転移性株の解析結果との比較とパスウェイ解析により、バイオマーカー候補分子の絞り込みを行った。またin vitro浸潤能試験により、癌浸潤に関わる新規機能分子を同定した。【最終年度の成果】大腸癌臨床検体のプロテオーム解析により得られた癌転移に関わるバイオマーカー候補について、候補分子の絞り込みを行った。マウス同所移植モデルにより樹立した、転移性ヒト大腸癌細胞株のプロテオーム解析の結果との比較から、両方で共通な変化が見られた分子をSRM/MRMによる検証の候補とした。また、癌転移との機能的な関連について調べるため、in vitroでの浸潤能試験を行った。siRNAによるスクリーニングにより、癌浸潤に関わる新規分子を同定した。また、プロテオーム解析の結果にはこれまで未同定であったタンパク及びリン酸化タンパクが多く含まれていたので、それらの結果をデータベースへ登録した(http://www.proteomexchange.org/)(ID:PXD000089)。【期間全体での成果】進行度の異なる大腸癌の臨床検体を用いた大規模リン酸化プロテオーム解析により、バイオマーカー候補および悪性化に関わる分子の探索を行った。今後は臨床検体でのSRM/MRMにより、癌転移マーカーとしての有用性について検証していく。【研究の目的】本研究では、大腸癌患者組織を用いた大規模リン酸化プロテオーム解析により、バイオマーカー候補となるリン酸化タンパク質の探索を行う。【23年度の成果】検体組織の難溶性の画分に存在するタンパク質も含めた網羅的なプロテオーム解析を行うため、界面活性剤を用いたタンパク質の抽出法の最適化を行った。抽出方法として、PTS法(Phase Transfer Surfactant:相間移動溶解法)、FASP法(Filter Aided Sample Preparation)の比較検討を行ったところ、組織からのペプチド回収率、サンプル処理中のタンパク質分解や脱リン酸化への影響といった点から、FASP法の方が優れていた。次に、抽出したサンプル中の微量なリン酸化ペプチドの濃縮法について検討した。金属カラムを用いた濃縮法として、IMAC法(Immobilized Metal-ion Affinity Chromatography)とHAMMOC法(Hydroxyl Acid Modified Metal Oxide Chromatography)で比較検討を行ったところ、回収率と濃縮率で共にIMAC法が上回った。これらの条件検討の結果、大腸癌臨床検体より10000以上のリン酸化ペプチドが同定された。この同定数はこれまでに報告された、臨床組織を用いた同様の研究を大幅に上回る。次に同定結果について、パスウェイ解析ソフトIngenuity (Ingenuity Systems)を用いたリン酸化シグナルのパスウェイ解析を行ったところ、細胞間接着や細胞極性形成など、癌転移に関わるシグナル経路の分子について、これまで知られていないタンパク質リン酸化の変化があることが確認された。これらのリン酸化タンパクを新規のバイオマーカーの候補とした。平成23年度研究実施計画に記した3つの項目毎の達成度について以下に示す。1.大腸癌組織での定量的リン酸化プロテオーム解析技術の最適化:タンパク質の可溶化、消化の過程において、特にタンパク質分解や脱リン酸化が同定数に大きくの影響することが予備実験でわかったため、界面活性剤と変性剤の濃度や種類について最適な条件を検討した。PTS法とFASP法で比較検討し、FASP法においてリン酸化ペプチドの回収率および同定数が最も良くなる条件を決定した。ペプチド濃縮法の検討においては、IMAC法とHAMMOC法の組み合わせにより、同定数が増加するか検討したが、サンプル処理量が多いとHAMMOC法においては、リン酸化ペプチド濃縮率が著しく低下したため、IMAC単独での精製が最もリン酸化ペプチドの同定数で優れていた。2.質量分析計によるリン酸化ペプチドの同定・定量:検討した条件で臨床サンプルを処理し、LTQ Orbitrap Velosによる大規模解析を行った。3.リン酸化シグナル経路のパスウェイ解析:パスウェイ解析ソフトIngenuity (Ingenuity Systems)用いて、同定されたリン酸化ペプチドの比較定量解析をインフォマティクスによる解析を行ったところ、癌の悪性化に関わるパスウェイに関わる分子の新規リン酸化部位のリン酸化量が変化していることが確認された。また、同定されたリン酸化部位に対するキナーゼについて、キナーゼ予測ソフトウェア(NetworKIN)による解析を行い、予想されるキナーゼについての絞込みを行った。以上、当初計画からの変更された点もあるが、変更により多くは改善された。計画していた3つの項目については達成できたので、概ね予定通りの進行であると評価する。

候補リン酸化タンパク質の機能解析およびバイオマーカーとしての検証同定されたバイオマーカー候補のリン酸化タンパク質について、癌悪性化に関連する機能解析を行う。具体的な方法として、リン酸化部位特異的抗体での免疫染色による細胞/組織内での局在の観察、リン酸化部位に変異を加えた遺伝子の培養細胞への導入実験等を行う。In vitroでの機能解析には、癌の浸潤、転移能への影響についてmigration assayやmatrigel invasion assayを行う。また、候補リン酸化タンパクに対するキナーゼの探索を行う。NetworKINやパスウェイ解析などにより予測されたキナーゼに対し、候補分子へのリン酸化活性があるかどうかを検討する。方法としては、予測キナーゼの細胞内強制発現とリン酸化抗体またはSRMによる検証を行う。2.候補リン酸化タンパク質のバイオマーカーとしての検証SRM/MRM法によるハイスループットな解析では、一度に100種類以上のマーカー候補の検証が可能である。少数の検体に対して検証された候補分子について、さらに多検体での検証を行うことでバイオマーカーとしての有用性を検証する。3.バイオマーカー候補を用いた大腸癌の診断法の開発多検体での検証でバイオマーカーとしての有効性が示された候補について、最終的に数種類に絞り込んで、大腸癌の早期発見や病態の進行の把握などに有用なマルチマーカーパネルの作成を目指す。研究の推進方策に従った、研究費使用内容を以下に示す。候補リン酸化タンパクの機能解析:候補リン酸化タンパク質に対するリン酸化抗体、発現解析のための遺伝子、in vitroでの機能解析用matrigel、その他細胞培養関連試薬類。バイオマーカーとしての検証:SRM/MRM用の合成ペプチド、および質量分析関連試薬類。
消化器癌における異常c-kit転写産物の発現と機能解析

これまでは大腸癌細胞株colo 201に検出される約3.5kbの異常転写産物の解析を行ない、本mRNAがイントロン15のほぼ中央部より、alternative promotorによって転写され、イントロン部分の75塩基(bp)が翻訳されるため、蛋白のN端に新たに25アミノ酸よりなる領域の生ずることを明らかにしてきた。本年度は、イントロン16の中央部とエクソン17の5′端にプライマーを設定し、RT-PCR法にて本異常転写産物の消化器癌および造血器腫瘍細胞株における発現を検討した。その結果、検討した25細胞株中10株に274bpと198bpの2種類のPCR産物が得られ、共にc-kit cDNAとハイブリダイズした。2つのバンドの相対的発現レベルは細胞株によって異なっていた。消化器癌細胞株では、RT-PCRでバンドを認めた5株中4株が198bpを強く発現しているのに対し、造血器腫瘍ではバンドを認めた4株すべてが274bpを強く発現していた。そこでこの2種のPCR産物の塩基配列を決定したところ、274bpは当初予想したとおり、イントロン16の中央よりエクソン17の5′端までの配列であったが、198bpはイントロン16において新たに転写される75bpを欠いていた。以上の結果から、colo201に見い出された異常転写産物は、RT-PCR法を用いると多くの細胞株に発現しており、さらにイントロン16の75bp領域がスプライスアウトされたmRNAの存在も明らかとなった。これらのmRNAによりコードされる蛋白は、正常c-kit蛋白の機能制御に何らかの役割を果していると推測される。大腸癌細胞株colo201において見い出した3.5kbの異常転写産物について、Colo201のcDNAライブラリーを作製し、これをc-kit cDNA断片をプローブを用いてスクリーニングを行ない、18の陽性クローンを解析して一次構造を決定した。その結果、本転写産物はc-kitキナーゼドメインのC末端側約1/2のみをコードしており、5'端はイントロン15に一致していた。エクソン16の上流75bpよりORFと考えられ、alternative promoterによる転写であることが推察された。ORFの5'上流にはいくつかの転写制御エレメントに一致する配列(CCAAT,GATA,TRF,TGGCA)が見い出された。本転写産物が蛋白レベルでも発現していることを調べるために、c-kit C末端に対するポリクローナル抗体を用いてフローサイトメトリーを行った。その結果、permeabilizedの条件下で、Colo201細胞に明らかな反応性を認めた。またウェスタンブロット法でも25kDの位置にバンドを検出しえた。以上の結果から、Colo201細胞においては、何らかの理由でalternative promoter活性が高まり、C端の一部に相当する産物が生じていると考えられた。本遺伝子の作用を明らかにする目的で、NIH 3T3細胞にトランスフェクションを行ないstable transfectomaを作製したが、細胞増殖に対する明らかな影響は認められなかった。現在、c-kitを過剰発現している細胞株に対する影響を検討中である。

その結果、検討した25細胞株中10株に274bpと198bpの2種類のPCR産物が得られ、共にc-kit cDNAとハイブリダイズした。2つのバンドの相対的発現レベルは細胞株によって異なっていた。消化器癌細胞株では、RT-PCRでバンドを認めた5株中4株が198bpを強く発現しているに対し、造血器腫瘍ではバンドを認めた4株すべてが274bpを強く発現していた。そこでこの2種のPCR産物の塩基配列を決定したところ、274bpは当初予想したとおり、イントロン16の中央よりエクソン17の5′端までの配列であったが、198bpはイントロン16において新たに転写される75bpを欠いていた。以上の結果から、colo201に見い出された異常転写産物は、RT-PCR法を用いると多くの細胞株に発現しており、さらにイントロン16の75bp領域がスプライスアウトされたmRNAの存在も明らかとなった。これらのmRNAによりコードされる蛋白は、正常c-kit蛋白の機能制御に何らかの役割を果していると推測される。
UV点字既存製法に代わる新規法提案と点字初心者用の触読し易いUV点字サイズの解明

点字学習者が点字パターンを習得するためには多くの時間を要する.それ故,当該領域の関係者からは点字学習環境の充実を望む声が多い.一方,最近,紙以外の素材に無色透明な紫外線硬化樹脂インクで印刷した点字(UV点字)が公共サイン等で普及し,点字学習者によりこうした点字サインの活用が促進することが期待されている.しかし,現在の製法のスクリーン印刷方式では印刷後の仕上がりが悪いことや点字学習者にとって触読し易い文字サイズが明らかにされていない点が問題視されている.そこで本研究では,既存の製法(スクリーン印刷法)の代替の新たなUV点字の製法を開発し,合わせてUV点字の文字サイズと触読性の関係を明らかにした.スクリーン印刷方式による無色透明な紫外線硬化樹脂インクを用いた点字(UV点字)を墨字(晴眼者が読む普通文字)上に付すことで晴眼者と視覚障害者がひとつの印刷物の情報を共有できる印刷物が急速に普及しつつある.一方,成人になってからの点字習得は難しく,点字を十分に触読できない中途視覚障害者は多い.このため,点字学習教材の充実が現場から求められ,紙製の点字よりも指先への刺激がはっきりしたUV点字が点字学習教材に活用されることが期待されている.しかし,現在の製法(スクリーン印刷方式)では点の高さが不十分かつ印刷後の仕上がりが悪いことや点字学習者にとって触読し易い条件(文字サイズ(高さ,点間隔),文字間隔(マス間隔)が明らかにされていない点が問題視されている.そこで本研究では,既存法代替の仕上がりの良い製法(高速でインクを吹き付ける製法)の提案と触読し易いUV点字を付す条件(文字サイズ(高さ,点間隔),文字間隔(マス間隔)を明らかにすることにした.本研究は,点字学習者にとって学び易い点字学習教材の作成に欠かせないものであり,点字識字率の向上に貢献できる.初年度は,紫外線硬化樹脂インクを非接触で噴射するノズルを搭載したリニアガイドテーブルをサーボモータで駆動する方法により,製版の工程を含まない仕上がりの良い点字を作成できる装置を開発することができた.また,触読し易い点間隔を明らかにするための本実験も行うことができた.研究成果の一部は,国内学会で誌上発表することができた.当初の計画以上に早く製版の工程を含まない仕上がりの良い点字を作成できる装置を開発することができている.また,当初の計画以上に早いスピードで触読し易い点間隔を明らかにするための本実験も行うことができている.それ故,当初の計画以上に進展している.スクリーン印刷方式による無色透明な紫外線硬化樹脂インクを用いた点字(UV点字)を墨字(晴眼者が読む普通文字)上に付すことで、晴眼者と視覚障害者がひとつの印刷物の情報を共有できる印刷物が急速に普及しつつある。一方、成人になってからの点字習得は難しく、点字を十分に触読できない中途視覚障害者は多い。このため、点字学習教材の充実が教育現場からは求められており、なおかつ紙製の点字よりも指先への刺激が強いUV点字が点字学習教材に活用されることが期待されている。しかし、現在の製法であるスクリーン印刷方式では、点の高さが不十分なことや、印刷後の仕上がりが悪いこと、点字学習者にとって触読し易い条件が明らかにされていないことが問題視されている。そこで本研究では、既存法代替の仕上がりの良い製法の提案と触読し易いUV点字を付す条件を明らかにすることを目的とした。昨年度は、紫外線硬化樹脂インクを非接触で噴射するノズルを搭載したリニアガイドテーブルをサーボモータで駆動する方法による新規UV点字作成装置を開発した成果について学会発表を行った。また、今年度はUV点字のテストピースを作成し、定量的にUV点字の触読性を評価する実験を継続して行うことができ,データの分析を終えたところである。次年度は、これらの研究成果を国際学会等で発表する予定である。初年度は、紫外線硬化樹脂インクを非接触で噴射するノズルを搭載したリニアガイドテーブルをサーボモータで駆動する方法による新規UV点字作成装置を開発した成果について学会発表を行った。また、本年度はUV点字の触読性に関する継続した実験を行うことができたため、順調に進んでいる。視覚障害者が自らのペースで読み書きできる文字として知られる点字であるが,現在,紙以外の素材に無色透明な紫外線硬化樹脂インクで印刷した点字(UV点字)が普及している.しかし,現在の製法(スクリーン印刷方式)では点の高さが不十分で印刷後の仕上がりが悪いことや点字学習者にとって触読し易い文字サイズが明らかにされていない点が問題視されている.そのような状況下において,現状では効果的な対策法は考案されていない.これでは識字率が低下する可能性がある.確かに,現在の製法であるスクリーン印刷方式は,印刷業者が新たな設備投資を必要としない製法である.しかし,点の高さが低く印刷後の仕上がりが悪いことは大きな問題である.そこで本研究では,新たなUV点字の製法として,シリンジと一体化したノズルを垂直方向に上下させずに紫外線硬化樹脂インクを高速かつ非接触で安定して噴射する方式でUV点字を作成できる新たな装置を開発した.

この製法に含まれる最大のチャレンジング性は,高粘度の紫外線硬化樹脂インクを高速かつ被印刷素材に非接触で安定して塗布できるようにすることであった.最終年度は,UV点字の触読性の評価実験の結果をまとめると共に,今回開発した装置により作成した点字教材や触知案内図を用いた触読性評価実験を行った.これらの研究成果は,国内外の学会で発表を行い,当該領域の関係者からも高い評価を得ることができた.今後は,この装置を用いて現場のニーズを踏まえた点字や触知案内図の教材の試作を手掛ける予定である.点字学習者が点字パターンを習得するためには多くの時間を要する.それ故,当該領域の関係者からは点字学習環境の充実を望む声が多い.一方,最近,紙以外の素材に無色透明な紫外線硬化樹脂インクで印刷した点字(UV点字)が公共サイン等で普及し,点字学習者によりこうした点字サインの活用が促進することが期待されている.しかし,現在の製法のスクリーン印刷方式では印刷後の仕上がりが悪いことや点字学習者にとって触読し易い文字サイズが明らかにされていない点が問題視されている.そこで本研究では,既存の製法(スクリーン印刷法)の代替の新たなUV点字の製法を開発し,合わせてUV点字の文字サイズと触読性の関係を明らかにした.平成28年度は,初年度に開発した装置に不具合や改良点が生じた場合に対応する.また,識別し易いマス間隔を明らかにするための予備実験及び本実験を行う予定である.初年度と本年度の研究の成果を学会で発表することができた。これらのことから、当初の計画以上に研究を推進できており、今後も、UV点字の識別容易性に関する実験を継続して行うとともに研究成果を学会等で公表する予定である。人間情報工学,人間工学当初年度内に開催が予定されていた国際学会が2017年度に開催されることになったために次年度使用額を残すこととになった.当初年度内に開催が予定されていた国際学会(tactile reading)が2017年度に開催するための費用として使用する.
エチオピアの無形文化遺産をめぐる文化の政治学

平成30年度は、4月に日本ナイル・エチオピア学会学術大会において、エチオピア連邦政府の担当部局からユネスコに提出され公開されている申請書類の記載内容を、「文化翻訳」という観点からとらえた研究発表を行った。8月から9月にかけてエチオピア連邦共和国オロミア州ボラナ県において、現地調査を行った。調査期間は新しい首相のもとで政治的な開放政策がはじめられた時期であり国外に退避していた活動家などが帰国しはじめており、オロミア州のボラナ県においても若い世代を中心にその影響があらわれていたが、一方でオロミア州においてエスノ・ナショナリズムの先鋭化も見られた。また、ガダ体系の役職者が仲介者として政治的に活躍している姿がメディアに報じられていた。現地調査では、オロモの無形文化遺産とされているガダ体系が、ローカルNGOによってどのように「文化資源化」されているのかについての調査を行った。このなかで、あるローカルNGOがアメリカの文化支援の基金から支援を受けたプロジェクトの一環として、無形文化遺産のリストに登録されたことが決定された日を「ガダの日」としてイベントが行われたことは興味深い事例であった。2月にはエチオピアのアジスアベバ市において、エチオピア連邦政府文化観光省文化遺産保護局とオロミア州立オロモ文化センターでインタビューと資料収集を行った。インタビューでは、申請書作成のプロセスにおいて、特定の地域集団の維持しているガダ体系が記載の根拠となっていることが明らかにされた。エチオピアにおいて二回の現地調査を実施し、連邦政府担当部局、オロミア政府文化センターといったナショナルな無形文化遺産の担い手から、オロモ系地域集団ボラナの「文化の資源化」ともいえる活動を行っているローカルNGOをはじめとする担い手にインタビューを行うことができた。引き続き現地調査を行う。特にボラナ県においてはガダ体系の儀礼の調査を行い、儀礼のプロセスについての調査を行う。また、当事者のボラナ人のほかに、NGOや政府、研究者などの外部者がどのように関係して儀礼が成立しているのかについても注目したい。本研究は、エチオピアの民族文化をユネスコの無形文化遺産として登録するプロセスを、グローバル・ナショナル・ローカルという三つのレベルのアクターの実践行為として捉える「文化の政治学」であり、エチオピアの最大民族オロモの年齢体系であるガダ体系を対象とする。本研究の申請時に登録には至っていなかったが、2016年12月にアジスアベバで開催されたユネスコの会議において、正式にガダ体系は「ガダ体系、オロモ固有の民主的社会政治体系」というタイトルでリストに登録された。本年度は、アーカイブ調査と現地調査の二つの方法で無形文化遺産ならびにガダ体系についての調査を行った。アーカイブ調査とは、無形文化遺産の登録のためにユネスコに提出された書類の分析である。ユネスコという国際機関が無形文化遺産の登録申請に際して書類にどのような条件を付け、その条件のなかでガダ体系がどのような特徴を持つものとして提示されているのかが記された資料である。この資料により、オロモのエリートによる民族文化の表象のあり方とその変化について検討することができた。エチオピアにおける研究調査では、ユネスコの無形文化遺産への登録によりガダ体系を全体テーマとした国際オロモ学会に参加し、オロモ人研究者によるガダ体系研究の動向を調査した。学会では、ガダ体系をテーマにしたシンポジウムのほか、これまで報告されていなかった地域におけるガダ体系の存在が報告されていた。こうした研究者による調査報告なども、無形文化遺産の登録と関係するオロモ民族文化をめぐる言説として捉えることができた。また、オロミア州南部ボラナ県においてガダ体系の変化および無形文化遺産としての登録の影響についての調査を行なった。2016年12月にガダ体系が正式にユネスコの無形文化遺産のリストに登録されたことにより、本研究のテーマと方法がより明確になった。特にユネスコにおいて公開された申請書類は、オロモの民族文化の表象がどのように行われているのか、その中にどのような政治的な配慮がなされているのかを明確に示している資料として扱うことができた。また、登録後のガダ体系をテーマとした国際オロモ学会におけるシンポジウムや個別研究の発表内容も、同様な観点から分析の対象となった。加えて、それらの発表がどのような意図で行われたのかもインタビューすることができた。これらのことから、オロモエリートたちが行っていた民族文化の表象の継承と変容についての検討を加えることができた。一方で、オロミア州ボラナ県における現地調査においては、無形文化遺産についての情報がごく一部に限定されており、地方の文化政策も大きな変化が見られなかったが、今後の変化には注目する必要がある。

このなかで、あるローカルNGOがアメリカの文化支援の基金から支援を受けたプロジェクトの一環として、無形文化遺産のリストに登録されたことが決定された日を「ガダの日」としてイベントが行われたことは興味深い事例であった。2月にはエチオピアのアジスアベバ市において、エチオピア連邦政府文化観光省文化遺産保護局とオロミア州立オロモ文化センターでインタビューと資料収集を行った。インタビューでは、申請書作成のプロセスにおいて、特定の地域集団の維持しているガダ体系が記載の根拠となっていることが明らかにされた。エチオピアにおいて二回の現地調査を実施し、連邦政府担当部局、オロミア政府文化センターといったナショナルな無形文化遺産の担い手から、オロモ系地域集団ボラナの「文化の資源化」ともいえる活動を行っているローカルNGOをはじめとする担い手にインタビューを行うことができた。エチオピア南部のオロモ地域社会のボラナでは、現在もガダ体系の儀礼が行われており、ボラナのガダ体系の役職者や儀礼はオロモの民族文化の表象においてしばしば用いられる。このため、引き続きボラナのガダ体系のあり方について現地調査を行う。特に遍在していた無形文化遺産の情報がどのように拡散していくのか、あるいは無形文化遺産という制度がどのように流用されるのかに注目したい。また、他のオロモ地域におけるガダ体系と国家政治との結びつき、オロモ研究におけるガダ体系の表象のあり方、行政の文化政策におけるガダ体系の扱いなどについて、現地調査を行うことを予定している。ただし、変動の激しいエチオピアの政治状況を見極めて調査地域を柔軟に選定する必要がある。引き続き現地調査を行う。特にボラナ県においてはガダ体系の儀礼の調査を行い、儀礼のプロセスについての調査を行う。また、当事者のボラナ人のほかに、NGOや政府、研究者などの外部者がどのように関係して儀礼が成立しているのかについても注目したい。当初アメリカ合衆国における国際オロモ学会に参加する予定であったが、エチオピアのオロミア州において開催された国際オロモ学会への参加することとなったため。学内事情により、年度末の海外現地調査の期間を短縮し調査地域も限定したことによる。令和元年度では長期の海外調査を予定しており、繰り越して使用する。
アデノ随伴ウイルスベクターを用いた卵巣癌腹膜播種を標的とした分子標的・遺伝子治療

卵巣癌において最も重要な進展様式である腹膜播種の形成にはVEGF、HGFなどの血管新生因子が深く関わっている。我々は腹膜播種抑制治療の確立を目指して、血管新生因子を標的とした分子標的治療、ならびに分子標的因子のウイレスベクター化による遺伝子治療の可能性について研究した。その結果、血管新生因子を阻害するsFlt-1、IL-10、HGF/NK4のアデノ随伴ウイルス(AAV)ベクター化に成功した。AAVベクターの至適投与経路は骨格筋であること、筋への遺伝子導入にはAAVベクターの1型が最も効率が良いことも明らかにした。また、血管新生抑制因子搭載AAVベクターによる治療で、卵巣癌腹膜播種動物モデルでの腹膜播種抑制、長期延命化がみられ、さらに重篤な有害反応がみられなかったことを確認した。次に本遺伝子治療の耐性化機序解明を目的に、HGF/NK4を遺伝子導入し強制発現させた卵巣癌培養細胞HRA/NK4での検討で、in vitroにおける細胞遊走能およびin vivoにおける腹膜播種形成能の著しい低下を確認し、HGF/NK4の腹膜播種抑制は遊走能の抑制を介した作用であることが示唆された。またHRA/NK4およびコントロールを対象としたマイクロアレイの解析では、コントロールに比べてHRA/NK4でproline dehydrogenase、porinなどの22遺伝子で2倍以上の発現増強がみられ、FLIP、EphB1、tyrosine kinase DDRなどの12遺伝子で1/2以下の発現低下がみられた。EphB1、tyrosine kinase DDRは、細胞遊走能に関与する遺伝子であり、HGF/NK4の腹膜播種抑制作用の機序解明の上で注目された。今後は、これらの候補遺伝子が耐性化獲得後にどのような発現変化を起こすかを詳細に検討することにより、血管新生抑制療法耐性化を克服したい。最終的には血管新生因子を標的とした分子標的治療・遺伝子治療による腹膜播種抑制治療(癌の休眠療法)の臨床応用への足掛かりにしたい。卵巣癌の腹膜播種抑制を標的とした分子標的・遺伝子治療の研究において、今年度は以下の研究成果が得られた。卵巣癌における血管新生抑制および腹膜播種抑制因子であるsoluble Flt-1(sFlt-1)、interleukin-10(IL-10)、HGF/NK4の各遺伝子に対して、既に作成に成功しているAAV-sFlt-1、AAV-IL-10に加えて、AAV-HGF/NK4の作成に成功した。その過程は、HGF/NK4 cDNAをP1.1c発現ベクターのマルチクローニングサイトに組み込みHGF/NK4発現ベクターを作成した。さらにHGF/NK4発現ベクター、ヘルパープラスミドおよびアデノ随伴ウイルス遺伝子発現プラスミドを、リン酸カルシウム共沈法により293細胞にトランスフェクションしAAV- HGF/NK4ベクターを作成、セシウムクロライド濃度勾配法により精製した。IL-10発現ベクターを、VEGF高分泌で、顕著な腹膜播種能を有する卵巣癌株SHIN-3に遺伝子導入し、IL-10強発現株(SHIN-3/IL-10)を樹立した。ex vivoにおいて、SHIN-3/IL-10接種マウスの新生血管数は、コントロールに比べて有意に少なかった(1.9本vs4.2本)。また、腹膜播種、生存期間の観察では、SHIN-3/IL-10腹膜播種マウスにおいて、播種巣数の抑制(7個vs96個)および生存期間の延長(≧96日vs48日)が確認された。