hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
中心体制御における発癌機序の解明

セリン/スレオニンキナーゼの1つであるAuroraキナーゼは細胞分裂を制御している分子です。Auroraファミリーの一つ、Aurora-Aは細胞分裂期(G2-M)に発現し、中心体の制御に関与しています。乳癌においては遺伝子増幅が見られる20q13に染色体座位を持ち、高発現することが報告されています。このAurora-Aは、ヒストンのリン酸化とユビキチン化経路に係るととの報告から2つの機能をプロテオミクス的実験手法を用いて解析しました。Aurora-Aが機能するには複数のタンパク質と複合体を形成する事が示唆されました。2つの酵素活性が別経路で機能することも示唆される結果となりました。平成19年度研究計画に沿って2項目の実験を行い、Aurora-Aのヒストン・リン酸化、ユビキチン化経路の解析を行った。ヒストン・リン酸化の解析:クロマチン免疫沈降法と質量分析を組み合わせてAurora-Aに関連するゲノム領域とそこに供局在するタンパク質を解析した。実験に用いたサンプルは培養細胞をG2-M期に同調させた物を使用した。Aurora-Aに関与するゲノム領域を特定するため、PCR法を用いて予測される複数の領域を検討したが検出が不可能であった。次年度でマイクロアレイ解析を行う予定である。質量分析の結果、多数の候補タンパク質が同定された。実際にリン酸化に係るか検討する予定である。Aurora-Aによるヒストン・リン酸化が単体ではなく、複合体で行われている事が解明された。研究継続の次年度ではさらに解析を進め、複合体の解明及び結合領域の解明を行う予定である。ユビキチン化経路の解明:ショットガンプロテオミクス法を用いてAurora-Aがユビキチン化経路にどの様に関わるか検討した。多数の結合タンパク質が同定されたことにより細胞内にてAurora-Aがタンパク質複合体を形成しうる事が解明された。今後同定されたタンパク質からユビキチン化に係るものを選定し、In-Vivo、In-Vitroにて実際にユビキチン化経路を確立した後、Aurora-Aがユビキチン化にどの様に影響を与えるか検討する予定である。質量分析の結果Aurora-Aが複数のタンパク質と結合することが解明された。この事が、複数の経路(ヒストンのリン酸化、及びユビキチン化)の存在を示唆する結果となった。2項目の実験にて質量分析を用いて関連タンパク質を同定した結果2つの経路で重複するタンパク質は同定されなかった。この事からAurora-Aが係るヒストン・リン酸化とユビキチン化は全く別の機能として働いている事が示唆された。19年度から引き続きAurora-Aに結合するタンパク質が実際にリン酸化されるか検討を行った。培養細胞内にてsiRNAを用いてAurora-Aをノックダウン後19年度に同定した候補タンパク質の抗体とProQ Diamond Phosphoprotein Stainを用いてウエスタンブロティング、ゲル染色を行ったところタンパクのリン酸化に変動が観察できなかった。他のリン酸化酵素の影響も考慮してin vitoroでの実験を検討しなければならないと考えられる。平成20年度研究計画に沿って2項目の実験を行い、Aurora-Aのプロテオミクス解析、生化学的機能解析を行ったAurora-Aが及ぼす細胞内タンパク質の動態を網羅的に解析した。平成19年度の実験と同様に実験に用いたサンプルは培養細胞をG2-M期に同調させた物を使用した。2次元電気泳動を用いた実験系では2系統に分け、Aurora-Aを一過性過剰発現させた系とsiRNAを用いてAurora-Aタンパクをノックダウンさせた系で検討をした。一過性過剰発現においても、siRNAを用いたノックダウン実験でも多数のスポットに変動が見られた。増減に関しては共通するタンパク質スポットも多数発見され、2つの実験系で共通するスポットを中心に質量分析を行い、タンパク質の同定を試みた。今回同定できたスポットに直接癌化に関係すると思われるタンパク質は同定出来なかったが、同定できた幾つかのタンパク質の機能解析を行った。リン酸化等の翻訳後修飾に関しては再現性が得られず、2次元電気泳動での精度の改善が必要となった。発現量の増減が認められ、質量分析で同定できた数種類のタンパク質の機能解析を行い、顕微鏡による細胞内局在を確認したところ分裂期に共局在するものを確認した。これらのタンパク質が実際にAurora-Aとどの様に関与しているのか解明するのが今後の課題である。Aurora-Aによる中心体制御は、複数のタンパク質のリン酸化による発現量調節や細胞内局在を調節して行っているものと考えられるが、今回同定した複数のタンパク質の関与を解明することが必須となった。
ノイマン-ポアンカレ作用素のスペクトル解析とその応用

本研究は、2次元のノイマン-ポアンカレ(NP)作用素のスペクトル解析を行い、プラズモン共鳴の解析などへの応用を目的とする。当初の計画では、角がある領域でのNP作用素のスペクトルの摂動理論および散乱理論を行う予定であったが、連携研究者の宮西氏および研究協力者のKang氏と研究打ち合わせを行い、これまでの共同研究の流れから直近の研究課題として以下のような内容の研究を優先して行った。いずれもNP作用素のスペクトル解析の研究としては最新の結果であり、以下のような理由により応用上重要であると考える。(1)3次元トーラス曲面上のNP作用素の負の固有値が無限個あることの証明、3次元曲面上のNP作用素の負の固有値が無限個存在することの証明としては最初の結果である。宮西氏、Kang氏とさらに2人の研究者の川越氏とJi氏との共同研究である。(2)2次元の滑らかな境界上の弾性NP作用素の固有値の集積点への収束の速さと境界の滑らかさの関係、この結果はラプラシアンに対するNP作用素に対する我々の結果の弾性方程式への拡張版であり、角がある境界上の弾性NP作用素のスペクトル解析への発展につながる点で重要な結果であると考える。宮西氏、Kang氏との共同研究である。(3)3次元の滑らかな領域が摂動した時のNP作用素の固有値の挙動についての研究、この研究では3次元球面が滑らかに摂動した時の"1/2予想"と呼んでいる結果についての部分的な結果を得た。NP作用素の固有値の摂動については、シュレーディンガー作用素などの微分作用素に比べてまだ分かってないことが多く、NP作用素のスペクトル解析についての基本的かつ重要な結果であると考える。宮西氏、Kang氏、牛越氏との共同研究である。共同研究者とのこれまでの研究経緯から、必ずしも研究の方向性が同じであるとは言えないため、研究のリソースを本研究に集中することがうまくいっていない。しかし、本研究の関連研究について共同研究者との良好な関係のもと進めることができているので、2次元で角がある領域上のノイマン-ポアンカレ作用そのスペクトル解析および散乱理論についての研究についてまとめたい。研究代表者である安藤が中心となり、2次元で角がある領域におけるノイマン-ポアンカレ作用素のスペクトル解析および散乱理論を核とする研究課題を推進する。安藤が時間的・技術的にフォロー仕切れない部分については、連携研究者である宮西氏や研究協力者であるKang氏に助言を求めていくこととする。(2)国内で開かれた関連研究集会(「加藤敏夫生誕100周年記念研究集会」、「スペクトル・散乱とその周辺」、「葛飾スペクトル・散乱セミナー」など)に積極的に参加し、最新の研究関連最新情報の収集に努めた。また、国内から関連研究者を愛媛大学に招聘して講演(「愛媛大学スペクトル・散乱セミナー」)を依頼した。(3) (1)で挙げた国際研究集会に参加して、海外の関連研究者との情報交換を行った。また、海外の共同研究者を日本に招いて(愛媛大学、大阪大学)日本の共同研究者を交えて打ち合わせを行ったり、海外の共同研究者を訪ねて(韓国・仁荷大学)研究打ち合わせを行った。(4)タブレットPCを購入して、研究活動に用いた。また、研究資料として数理物理学および解析学の専門書を購入して研究活動に役立てた。既存の研究において「角が2つ」あるintersecting diskと呼ばれる有界平面領域におけるNP作用素のスペクトルは絶対連続であることが分かっていたが、これまでの調査で「角が1つ」ある特殊な有界平面領域(cardioid、lemniscate)でも同様の手法を用いてNP作用素のスペクトルが絶対連続でありスペクトル表示を得ることができた。また、2次元有界領域の境界が滑らかな場合、NP作用素はコンパクトになり、有限多重度の固有値が原点に収束するが、その収束の速さと領域境界の滑らかさとの関係を示す評価を得ることができた。

宮西氏、Kang氏、牛越氏との共同研究である。共同研究者とのこれまでの研究経緯から、必ずしも研究の方向性が同じであるとは言えないため、研究のリソースを本研究に集中することがうまくいっていない。しかし、本研究の関連研究について共同研究者との良好な関係のもと進めることができているので、2次元で角がある領域上のノイマン-ポアンカレ作用そのスペクトル解析および散乱理論についての研究についてまとめたい。当初は「角が2つ」あるintersecting diskと呼ばれる有界平面領域を摂動したNP作用素を解析する予定であったが、「角が1つ」の場合(cardioid、lemniscate)の方がNP作用素のスペクトル表現が簡単なので、今後は「角が1つ」の場合の有界平面領域に対してNP作用素のスペクトル解析を行い、散乱理論を展開して散乱行列を求めることにする。また、NP作用素の散乱行列の性質とanomalous localized resonanceとの関係を考察する。研究代表者である安藤が中心となり、2次元で角がある領域におけるノイマン-ポアンカレ作用素のスペクトル解析および散乱理論を核とする研究課題を推進する。安藤が時間的・技術的にフォロー仕切れない部分については、連携研究者である宮西氏や研究協力者であるKang氏に助言を求めていくこととする。当初、研究発表、研究関連の情報資料の収集・整理に必要なノートPCの購入を予定していたが、既存のものを使い続けたため、ノートPCの購入に科研費の支出が生じなかった。また、人件費およびその他の支出がなかったため、次年度使用額が生じた。今年度は、既存のノートPCの諸元を鑑みて、ノートPCの買い替えに科研費を当てる。書籍を購入予定であったが金額の残予算を超えていたので、次年度に持ち越すことにしたことにより次年度使用額が生じた。
植物育成や栽培活動で容易に活用できる畑の要らない「バケツスイカ」の開発

畑にない場所でも栽培でき、子ども達の学習意欲を引出し教師の専門的な知識や技術、経験が無くても容易に指導できる教材として,「バケツスイカ」を提案しその栽培法の開発を2年間で行った。第1年目は、子ども達が直接収穫できるように植付け時期を調節して夏休み前あるいは後における収穫の可能性を検討する。第2年目は、育成方法の検討と子ども達に対するアンケート調査から学校現場における本教材の適応性を検討した。本研究は学校現場における植物育成や栽培活動で畑のない場所でも栽培でき、子ども達の学習意欲を引出し教師の専門的な知識や技術、経験が無くても容易に指導できる教材として「バケツスイカ」を提案し、その育成方法の開発を目的としている。本年は教育的な効果を図るため、子ども達が直接収穫できるように植付け時期を調節して、夏休み前又は後における収穫の可能性を検討するために、以下のように苗の種類と植付け日の異なる2つの試験について授業実践を通して行った。(1)購入苗と実生苗による比較:植付け日がそれぞれ6月4日と6月7日(2)実生苗の適期植付け:植付け時期は7月57日(1)は北海道教育大学附属札幌中学校特別支援学級(ふじのめ学級;13年生)で(2)は同大附属中学校の3年生のクラスで行った。試験に用いたスイカ品種は小玉系の姫甘泉であった。これらの苗は、約20lのプラスティック製丸鉢(バケツ)に畑土とバーミキュライト(6:4)と市販乾燥牛糞(500g)を配合した培養土に植えられた。施肥量はN:P_2O_5:K_2O=15:18:16の割合でバケツ当り総量で150gを3回分施した。これらは、寒風を避けるため無加温のガラスハウスで3週間1か月育成され、(1)は6月28日、(2)は8月5日にそれぞれの校舎前に移され、高さ約2mのアーチ状支柱につるを誘引して育成を屋外で継続した。上記(1)の試験結果は、購入苗および実生苗とも平均収穫果実数はそれぞれ1.2、1.1と株あたり確実に1果以上を収穫できたが、収穫期はそれぞれ夏休みの直前と直後となり、実生苗を購入苗と同様に早い時期に収穫するためにはおよそ1か月早く播種する必要のあることが明らかになった。また、(2)の結果については苗の生育が遅れたことによりほとんど収穫できず、(1)の実生苗と同様に早期の播種が必要であることも知ることが出来た。幼稚園や小・中学校等の学校現場において、教師に専門的な知識や技術、経験が無くても容易に指導できる植物育成・栽培教材として「バケツスイカ」を検討している。前年度に植え付け時期の調節による北海道における夏休み前の収穫の可能性を確認したが、本年度は下記のように実践授業を通して、育成方法の検討と子ども達に対するアンケート調査から学校現場における本教材の適応性を検討した。基本的な育成方法は前年度と同様であった。1生育程度における大玉系と小玉系の品種比較:北海道教育大学附属札幌小学校の3年生2クラス、合計80人により、「みかく」(大玉系)および「姫甘泉」(小玉系)、それぞれ10個体の生育と収穫時期の比較試験を行い、教材としては小玉系品種が有効であることが認められた。2施肥方法の検討:全体の施肥量は同量とし、植え付けから果実肥大期までの異なる施肥回数による効果を比較した。同大附属札幌中学校の1年生3クラス合計約120人の生徒による授業実践で行った。合計21個体による育成の結果、1株当り平均収穫果実数は全体で0.7個、平均果実重は735.3gで、処理間の明確な差異は見られなかったので、施肥回数は3回でよいことが分かった。3アンケート調査:「作り易さ」や「栽培の満足度」などに関して調査したが、小学校および中学校とも概ね栽培実践に対する子ども達の満足度が高く、教材としての有効性が認められた。しかし、当然のことながら小学校と中学校では教員の関わりの違いを明確にすることや、小学3年生のため糖度のパーセントの理解が出来なかったり、中学生には水やりの回数や量に具体的な指示が必要であることも明らかになった。4つる(分枝)数による収穫物への影響:確実に大きな果実を収穫できるために必要なつる数を検討する試験を同大附属中学校特別支援学級(ふじのめ学級)の授業実践として行ったが、育成が不十分であったため調査を中断した。
中国における21世紀型・中等職業教育政策の展開メカニズム

本研究では中国の職業教育を対象とし、中央・地方政府の制定した職業教育改革に関わる関係法規の具体的な規定の分析、および職業学校の専攻やカリキュラム、生徒募集等の分析を通じて、2000年以降の職業教育政策の展開メカニズムを明らかにすることを目的とした。考察の結果、21世紀における職業教育政策は、2000年半ば以降、市場化期という新たな局面を迎え、政府の直接的なコントロールから開放された職業学校が自主裁量権を大幅に拡大させていることが分かった。中国では改革・開放政策の始まった1980年代初頭から、国家レベルの重要課題として中等レベルでの職業教育の拡大に取り組んできたものの、2000年以降、進学率の低下とともに職業教育政策は停滞に転じた。しかし、およそ10年後の2010年に中央政府が「国家中長期教育改革と発展計画綱要(2010-2020年)」を打ち出し、再び職業教育の拡大政策を重要課題として位置づけ、職業教育の実施過程を構造的に変化させることを決断した。すなわち、労働市場に見合った形で職業教育の量的拡大を達成するため、ある程度、市場の自由度を取り入れることを目的とし、職業学校の設置、運営主体を政府から民間にシフトする方針がとられることになったのである。そこで、本研究では21世紀を迎え新たな局面に展開される中国の職業教育政策について、政府の直接的なコントロールから開放された中等職業学校の市場が、どのような量的拡大を見せ、どのような質的な変容を遂げるのか、その展開メカニズムを明らかにすることを目的としている。具体的な分析の視点としては、第一に、2010年以降の職業高校をはじめ中等レベルの職業学校の入学者数の推移を把握することにより、新しい職業教育政策がどの程度の量的拡大をもたらしたのかを明らかにする。第二に、職業学校の設置・運営の主体が民間にシフトすることで、誰が新しい学校の管理・運営者となり、経費財源の構造、教育の実態がどのように様変わりしていくのかを個別具体的に明らかにする。初年度に実施した現地調査において、職業高校を中心とした中等職業学校の入学者数を把握するための関連データ・資料の収集を行うことができた。併せて、新しい学校設置者を確認するため、教育部主導で実施された職業学校普及調査レポートを入手することができた。中国では、改革・開放政策の始まった1980年代初頭から、国家レベルの重要課題として職業高校を中心に中等レベルでの職業教育の拡大に取り組んできた。しかし、2000年以降、職業高校への進学率は徐々に低下していき、職業教育政策は停滞に転じた。「一人っ子政策」による少子化も相俟って、多くの職業高校が募集定員を確保できず、また卒業生の就職難という出口の問題点も浮上するようになった。2000年以降、本格的に市場経済が導入され、経済のグローバル化の波が押し迫る中、職業高校の専攻やカリキュラムが実際の労働市場に対応しなくなってきたのである。そこで、28年度は、21世紀を迎え新たな局面に展開される中国の職業教育政策について、政府の直接的なコントロールから開放された中等職業学校の市場が、どのような量的拡大を見せ、どのような質的な変容を遂げるのか、その展開メカニズムを明らかにすることを目的として、北京市、天津市において関連法規、資料、データの収集を行った。その結果、第一に2000年以降、本格的に市場経済が導入され、経済のグローバル化の波が押し迫る中、職業高校の専攻やカリキュラムが労働市場に見合った形にシフトされていること、第二に今現在においても職業高校は進学にあたって積極的な選択の対象とはなっていないこと、第三に都市部の職業高校では当該地戸籍を持たない農村出身者を主な受け入れ対象としていること、が明らかになった。28年度に実施した調査において、順調に関連法規、資料、データの収集を行うことができた。21世紀における中国の中等職業教育制度の展開メカニズムについて、政策の推移と実際の職業学校における生徒募集の戦略を中心に考察を行った。改革・開放政策以降、国家レベルの重要課題として職業教育拡大政策が展開されてきたが、これまでの先行研究によると、その経緯は(1)回復・振興期(1970年代末1980年代前半)、(2)拡大期(1980年代後半1990年代後半)、(3)調整期(1990年代末)と大きく三つの時期に区分されていた。しかし、2002年に国務院による「聯合弁学(産学連携)」が提唱されたことを皮切りに、職業学校は企業と連携する形で生徒募集、カリキュラム開発、職場実習等を行うようになり、また教育の受益者である生徒やその保護者も労働需要や市場メカニズムに対応して学校選択を行うようになっていった。そこで、本研究では、21世紀以降の中等職業教育政策が(4)市場化期(2000年代半ば)という新たな局面を迎え、政府の直接的なコントロールから開放された職業学校が企業とともに自主裁量権を大幅に拡大させたことを指摘した。

1年目では中等職業学校の入学者数、学校設置者に係る統計調査データを収集した。それらを踏まえ、2年目では実際に職業学校を訪問し、学校の経営戦略を把握するためのインタビュー調査を実施する予定にしている。最終年度である29年度では最終報告書の作成に向けて、収集した関連法規、データの分析に励んでいく。比較教育学交付された補助金を使用するにあたり、10円単位では把握していなかったため21円の次年度繰越額が発生してしまった。基本的には交付された補助金のすべてをその年度内で使う予定にしているため、使用に際し詳細に把握していきたい。
亜鉛フィンガー蛋白質の揺らぎによる特異的ＤＮＡ認識とスマート転写因子への展開

亜鉛フィンガー蛋白質によるDNA結合・認識は、鍵と鍵穴のような絶対的な様式ではなく、周囲の環境に応じて変化しやすい分子同士の柔軟な相互作用に基づいていると考えられた。マルチ亜鉛フィンガードメインは3塩基認識/1フィンガーのモジュール構造ではなく、各亜鉛フィンガーは必ずしもDNA認識において等価ではなく個性があることが明らかになった。天然亜鉛フィンガーと変異導入亜鉛フィンガーとの比較から、DNA認識の寛容さや非最適配列への結合を指標にして、亜鉛フィンガーの個性・位置とDNA複合体の揺らぎに関する興味ある情報を得た。さらに、亜鉛イオン濃度に依存したスイッチ機能を持った人工転写因子などを創製した。転写因子亜鉛フィンガー蛋白質によるDNA塩基認識は、いわゆる"鍵と鍵穴"モデルのような一対一の絶対的なものではなく、周りの環境に応じて変化しやすい分子同士の柔軟な相互作用であるという仮説を証明すべく本研究を開始した。本年度は、従来、マルチ亜鉛フィンガードメインは、"3塩基認識/1フィンガー"のモジュール構造と考えられてきたが、各フィンガーは必ずしも等価ではないと推測し、天然亜鉛フィンガードメインおよび系統的にそのDNA結合を調節する改変型人工亜鉛フィンガー連結体を作製して、各亜鉛フィンガーの個性と複合体の揺らぎとの関係、特にSNA結合配列特異性を決定している要因、すなわち塩基配列選択的結合の駆動力、および亜鉛フィンガー蛋白質-DNA複合体もダイナミクスについて追及した。その結果、天然亜鉛フィンガーと変異導入亜鉛フィンガーとの比較検討から、DNA認識配列の寛容さや非最適配列への結合を指標にして、各亜鉛フィンガーの個性・位置とDNA複合体の揺らぎに関する有力な情報を得た。また、マルチ亜鉛フィンガードメインの各亜鉛フィンガーは、DNA塩基特異的認識において決して等価ではなく、それぞれ個性があることが明らかになった。亜鉛フィンガー蛋白質によるDNA認識は、いわゆる“鍵と鍵穴"モデルのような厳密な相互作用ではなく、周りの環境に応じて変化する柔軟な相互作用、すなわち蛋白質の揺らぎによるDNA認識が重要であるということを実証することを目指した研究である。先ず、マルチ亜鉛フィンガードメインは“3塩基認識/1フィンガー"のモジュール構造と考えられていたが。各フィンガーは必ずしも等価ではないことを、改変型マルチ亜鉛フィンガー蛋白質を用いた選択的DNA塩基認識実験および各亜鉛フィンガードメインの酸化実験の結果から強く示すことができた。マルチ亜鉛フィンガードメインによるDNA塩基認識は決して等価ではなく、それぞれに個性があり、揺らぎによる柔軟な相互作用を推察させる結果であった。DNA認識配列の寛容さや非最適塩基配列への結合実験からも各亜鉛フィンガードメインの個性や位置が重要な因子になっていることからも亜鉛フィンガータンパク質の揺らぎによるDNA認識が推測された。さらに、細胞内における揺らぎによる相互作用の重要性を検証するため、亜鉛フィンガードメインの連結数を段階的に変化させた人工亜鉛フィンガー蛋白質を遺伝子工学的に作製し、細胞内での見かけの拡散速度や速度論的因子を追求した結果、亜鉛フィンガードメイン周辺の環境の違いに依存した“揺らぎ"が蛋白質ーDNA相互作用に強くかかわっていることが推測された。また、細胞核内とサイトゾルとにおいて、亜鉛フィンガー蛋白質によるDNA結合に明確な差異が観察された。このように亜鉛フィンガードメインとDNAとの結合における相互作用の揺らぎが、塩基配列特異的なDNA認識に重大に関与していることがうかがわれた。亜鉛フィンガードメインの連結数を段階的に増加させた人工マルチ亜鉛フィンガーに蛍光標識させた融合蛋白質を作成し、FRAP法を駆使して細胞内での亜鉛フィンガー蛋白質によるDNA結合における拡散速度や速度論的因子を検討し、亜鉛フィンガードメインの連結数が増えるほど蛋白質の揺らぎが大きいことがわかった。さらに、亜鉛フィンガー欠失体についても同様の実験を行い、各亜鉛フィンガーは必ずしもDNA結合において等価ではなく、亜鉛フィンガードメインには個性があり、亜鉛フィンガー蛋白質による揺らぎ構造が柔軟な相互作用を生み出していることが強く推察された。細胞内において、蛍光ラベルした亜鉛フィンガー蛋白質を発現させて、共焦点レーザー顕微鏡を用い、細胞内の特定領域の蛍光をレーザー照射で褪色させ、その後の蛍光回復を経時的に観察すると、亜鉛フィンガードメインの環境の違いよるDNA結合の揺らぎが強く暗示された。塩基性蛋白質である亜鉛フィンガー蛋白質は、それ自身細胞透過性を有しているので、蛍光ラベルした二本鎖DNAをミクロインジェクション法により細胞内に注入して、亜鉛フィンガー蛋白質とDNAとの相互作用の運動性についても追跡した。他方、内在遺伝子を標的とする新規亜鉛フィンガー転写因子をデザインし、スマート転写因子としての可能性についても予備的検討を行った。26年度が最終年度であるため、記入しない。医歯薬学26年度が最終年度であるため、記入しない。マルチ亜鉛フィンガーにおいて、各亜鉛フィンガーがそのDNA結合過程で等価でないことを実験的に明らかにすることができ、亜鉛フィンガーの個性と複合体の揺らぎの重要性を示した。今後は、複合体の揺らぎのダイナミクスの追跡や計算科学的追究を行いたい。亜鉛フィンガー連結体を用いたDNA結合の塩基

配列選択性や亜鉛フィンガーの個性・位置とDNA複合体の揺らぎの相関性については、興味深い結果が得られたが、蛍光蛋白質との融合蛋白質の細胞内での挙動(速度論的因子など)については追跡中である。26年度が最終年度であるため、記入しない。特異的結合の細胞内での揺らぎを調べるため、蛍光標識人工マルチ亜鉛フィンガー蛋白質の細胞内での速度的パラメーターを算出したり、またFRAP法の適用も考えてみたい。亜鉛フィンガー蛋白質自身の細胞内透過性を利用して、亜鉛フィンガー蛋白質と標的DNAとの相互の運動性を解析し、また亜鉛フィンガー周辺の環境の違いに依存した揺らぎについても検討する。年度末に残額が生じたので、無理に使用することよりも来年度予定の細胞内実験に対する新規な物品費に加えて使用することを選んだ。来年度に予定している細胞内実験には、高額な新規な物品費が考えられる為。予算の一部を繰り越して、来年度の研究費と合わせて使用する計画である。
還元応答型HPLC/ECDを用いた簡便・高選択的な生体分析および食品分析法の開発

昨年度の研究により,還元応答型HPLC/ECDシステムを用いた芳香族ニトロ化合物の簡便・高選択的な分析法を確立した。しかし,その研究過程で本分析法の迅速化を試みたところ,測定試料中の溶存酸素が妨害物質となり,分析データの確度や精度が大幅に低下することが分かった。そこで本年度では,オンライン溶存酸素除去システムを開発し還元応答型HPLC/ECDシステムと連結することで,本分析法のハイスループット化を検討した。オンライン溶存酸素除去システムは,カラムスイッチング法を活用することにより構築した。前処理カラムとして細孔径の大きなODSを用いた場合に,酸素除去効率は高くなり測定試料中の溶存酸素を約90%除去できるととが分かった。一方,同条件下,試料中のp-nitrophenol (p-NP)は100%回収された。そこで本システムを還元応答型HPLC/ECDに連結し,本分析法のハイスループット化を検討したところ,1サンプル20秒以内で測定可能なp-NPのFIA分析法の開発に成功した。本FIA法のp-NPの定量範囲は0.225μM,検出下限は0.15μMであった。また分析値の日内・日間変動はそれぞれ2%以内,5%以内であり,本FIA法が高感度で再現性の高い分析法であることが分かった。本FIA法の尿中および血中ホスファターゼ活性試験法としての適用を検討したところ,尿中酸性ホスファターゼおよび血中アルカリホスファターゼともに本FIA法により良好かつ迅速に測定された。また,その分析値と既存の比色法(Bessey-Lowry-Brock法)での分析値との間には良好な相関が観測された。以上の結果より,本FIA法(ハイスループット化-還元応答型HPLC/ECD分析法)の生体試料分析法あるいは臨床化学分析法としての適用性が確認された。HPLCの溶離液をヘリウムを用いて断続的に脱酸素し全ての配管にPEEK樹脂製チューブを採用することにより,特殊な装置を用いなくとも溶離液中の溶存酸素を効率的に除去でき,簡便で実用的な還元応答型HPLC/ECD分析システムを構築できることを見出した。芳香族ニトロ化合物の一種であるp-nitrophenol(p-NP)を分析モデル化合物として用いて本分析システムの分析特性を評価したところ,検出下限濃度は0.2μM(2pmol),定量濃度範囲は0.25-50μMであった。また,分析値の日内および日間変動(n=6)はそれぞれ1%以内および3%以内であり,本分析法が高感度で再現性の高い手法であることが確認された。p-NPを添加した尿および血しょう試料を還元応答型HPLC/ECD分析システムで測定したところ,尿や血液中に存在する生体成分に妨害されることなくp-NPが良好に検出された。また生体試料を連続測定した場合においても,ECD検出器の劣化等による測定感度の低下などは観察されなかった。還元応答型HPLC/ECD分析システムの臨床検査試験法としての有用性を検証するため,人の尿を用いて本分析システムの尿中酸性ホスファターゼ活性試験法への適用を検討した。その結果,尿中酸性ホスファターゼの酵素反応により人工基質であるp-nitrophenylphosphateから生成したp-NPが本分析システムにより良好に検出されることが分かった。また,本方法により算定された酵素活性値と,既存の比色法(Bessey-Lowry-Brock法)により測定された酵素活性値との間には良好な相関(n=7,r^2=0.995)が観測された。以上の結果より,本分析システムが生体分析へ適用可能であることが確認された。

以上の結果より,本FIA法(ハイスループット化-還元応答型HPLC/ECD分析法)の生体試料分析法あるいは臨床化学分析法としての適用性が確認された。
HAM患者における口腔乾燥症の病態の解明

目的・HTLV-Iに併発したミエロパチー(HAM)患者大唾液腺の臨床画像を明らかにし、それとシェーグレン症候群患者大唾液腺の異常とを比較すること。対象・この研究では、31名のHAM患者(うち12名はシェーグレン症候群様の口腔乾燥症が発症)と15名のHTLV-I陽性の非HAM患者及び41名のHTLV-I陰性のシェーグレン症候群患者を用いた。また、非HAMでかつ原因不明の口腔乾燥症を主計とする患者20名も合わせて検討した。画像診断としては1、唾液腺造影、2、MR検査、3、超音波画像検査を行った。その他口唇腺生検、シルマーテスト、サクソンテスト及び血中清学的検査を行い、画像診断の結果と比較検討した。結果・シェーグレン症候群様症状を併発した12名のHAM患者のうち11名(92%)において、大唾液腺造影像は正常のそれと変化なく、シェーグレン症候群に特徴的な所見は認められなかった。しかしながら、一方ではこれらのHAM患者では唾液分泌機能が著しく低下し、その点ではシェーグレン症候群患者と区別できなかった。HAM患者口唇腺生検病理所見はシェーグレン症候群のそれと比較すると有意に軽度でシェーグレン症候群に特徴的である単核球並びにリンパ球の浸潤、集簇もあまり認められなかった。対照的にシェーグレン症候群患者では大唾液腺画像や口唇腺生検病理所見の程度と唾液分泌機能低下とは強い相関を示していた。結論・これらの結果より、HAM患者に認められるシェーグレン症候群様症状(口腔乾燥症並びに眼乾燥症)発症の機序は、非HAM患者におけるそれと異なっていると考えられた。HAM患者における唾液腺の変化を促える目的でHAM患者31名、HTLV-I陽性かつHAM陰性シェーグレン症候群患者15名、およびHTLV-I陰性シェーグレン症候群患者41名を用いてMRI、超音波及び唾液腺造影法による画像診断を行った。31名のHAM患者中、シェーグレン症候群用症状を伴った者は12名(全体の39%)であり、このうち11名(92%)において、耳下腺、顎下線は共に画像上正常像を呈し、シェーグレン症候群に典型的な変化を認めなかった。典型的なシェーグレン症候群患者(HAM陰性)においてはMRIによる大唾液腺と口腔乾燥症の重症度とはよく一致することが知られている。しかしながら、HAM患者における口腔乾燥症の程度は、MRIにおける画像所見を基準にして得られた重症度と一致しなかった。次に、これらHAM患者の唾液腺での変化を解明するために、患者の口唇腺より得られた生検材料にて病理組織学的検討を行った。その結果、HAM患者の唾液腺では、典型的なシェーグレン症候群患者(HAM陰性)のそれと比べて、単球の浸潤の程度が低く、MRIで認められた画像所見と一致していた。以上の結果より、これら患者群の血清学的データと考え合わせると、次のように結論できる。すなわち、HAM患者に発症するシェーグレン症候群様の口腔乾燥症は、典型的なシェーグレン症候群とは全く別のメカニズムで生じている可能性があるということである。

その他口唇腺生検、シルマーテスト、サクソンテスト及び血中清学的検査を行い、画像診断の結果と比較検討した。結果・シェーグレン症候群様症状を併発した12名のHAM患者のうち11名(92%)において、大唾液腺造影像は正常のそれと変化なく、シェーグレン症候群に特徴的な所見は認められなかった。しかしながら、一方ではこれらのHAM患者では唾液分泌機能が著しく低下し、その点ではシェーグレン症候群患者と区別できなかった。HAM患者口唇腺生検病理所見はシェーグレン症候群のそれと比較すると有意に軽度でシェーグレン症候群に特徴的である単核球並びにリンパ球の浸潤、集簇もあまり認められなかった。対象的にシェーグレン症候群患者では大唾液腺画像や口唇腺生検病理所見の程度と唾液分泌機能低下とは強い相関を示していた。結論・これらの結果より、HAM患者に認められるシェーグレン症候群様症状(口腔乾燥症並びに眼乾燥症)発症の機序は、非HAM患者におけるそれと異なっていると考えられた。
脈動するオーロラに対する中間圏大気の化学的応答の理解

本研究ではオーロラ降下粒子による電離に伴ったナトリウム密度減少のメカニズムをEISCATレーダーとナトリウムライダーの同時観測結果から調査した。その結果、オーロラ降下粒子による中性大気の電離によって生成されたNO+、O2+とナトリウム原子との電荷交換反応がナトリウム密度減少のメカニズムであることを明らかにした。また、ナトリウムライダーを改良することで、0.2秒でのナトリウム密度観測を実現し、EISCATレーダーとの高速同時観測を行った。これにより、脈動オーロラの明滅周期と同調したナトリウム密度変動の調査を行なった。本研究では、数十秒周期で明滅する脈動オーロラに伴う、中間圏・下部熱圏の電子密度、ナトリウム密度の変動を秒オーダーのリモートセンシング観測によって捉え、その時間変化をコントロールする化学過程を観測的・理論的に明らかにする。これにより、太陽風エネルギーの入力に伴う、地球大気の化学的応答の素過程、特にその反応の時定数に関する定量的な理解を得ることを目指す。本研究の初年度には、ナトリウムライダーの高時間分解能化を行った。2015年9月までのナトリウムライダーの時間分解能はナトリウム密度観測で最速で5秒であった。2015年10月から12月に電気通信大学でのナトリウムライダー制御プログラムの改良及び、動作実験を実施した。その結果、当初目標としていたサブミリ秒(0.2秒)での観測が可能となった。本システムを1月にトロムソに渡航し、現行のナトリウムライダーシステムに組み込んだ。トロムソでの観測では0.2秒での観測には成功したものの、観測データと観測情報データ(周波数、レーザーパワー等を記述)が同時に保存されない事例が確認された。この問題は、来年度に観測プログラムを修正または、不正なデータだけを取り除くプログラムを作成することで解決できる見通してある。また、今年度は当初、次年度に行う予定であったEISCATレーダーとの同時観測も前倒しで、本年度に行った。この観測はEISCAT VHFレーダー、UHFレーダーの高速観測に加えて、フィンランドのKAIRAシステムとの同時観測キャンペーンと時期を合わせる形で行った。この結果は現在解析中である。これらの研究成果を国内学会・研究集会で3件の発表を行った。現在、学術論文としてまとめていて、次年度中に提出予定である。ナトリウムライダーの高速観測システムの開発が予定していた分解能まで向上できたこと、次年度行う予定であったEISCATレーダーとの同時観測を今年度中に執り行うことができたことなど、当初の予定のほとんどを達成することができた。しかし、データ保存に関して、多少の改善の余地が見られることから、「おおむね順調に進展している」とする。オーロラ降下粒子によるナトリウム(Na)密度減少のメカニズムを明らかにするために、2012年1月に観測されたEISCATレーダーとNaライダーの同時観測データを解析した。EISCATレーダーで観測された電子密度の増大量と中性大気-電子間に働く化学反応プロセスからNa密度を減少させると考えられているNO+, O2+の分布を推定した。推定されたNO+、O2+密度とNaライダーで観測されたNa密度の変動量を比較した。これにより、Na密度はオーロラ降下粒子によって生成されたNO+、O2+とNa原子との電荷交換反応によって引き起こされた可能性を強く示唆する結果を得た。この内容は論文として出版されている。移流の効果をできるだけ無視するために、数秒程度で準周期的なオーロラ効果粒子の降り込みによるNa密度現象のメカニズムを調査する。脈動オーロラはエネルギーの高い粒子によって準周期的に明滅する現象で、この周期に同調したNa密度変動を捉えるために2015年度にNaライダーの高速化を行なった。この高速化では、Na密度導出の時間分解能を5秒から0.2秒まで改善したものの、データ保存系に問題を残していた。そこで、2016年度にデータ内の問題箇所を補正するプログラムを作成した。これにより、1晩通した高速観測データの解析が可能となった。EISCATレーダーとNaライダーの同時観測(時間分解能1秒以下)を10晩合計46時間において実施した。この中で、2018年2月18日、19日、20日はオーロラ活動度が高く、脈動オーロラによって高度70 km付近まで電離が確認された。今後はこの同時観測で取得された電子密度とNa密度データを比較することで、脈動オーロラの明滅周期に同調したNa密度減少を抽出し、その減少が電荷交換反応によって説明できるか調査を行う予定である。最終年度である2016年度は、2015年度に取られたデータの解析と、高速観測システムの修正を行う。2016年3月にはEISCATレーダーとの同時観測を実現しており、同観測期間中に脈動オーロラも発生している。これらの観測データの解析結果を2016年5月に開催されるJpGU連合大会で発表予定である。夏は主に、2015年度で見つかった高速観測システムの問題点を洗い出し、修正をする。この修正は電気通信大学の津田卓雄助教と協同して行う予定である。

また、7月にはスウェーデンで開催されるレーダースクールに参加し、これまで知識の浅かったEISCATレーダーに関しての知識を深め、より深くから運用、データ解析を理解する。秋をめどに学術論文をまとめ上げ、提出する予定である。28年度が最終年度であるため、記入しない。電離圏物理学28年度が最終年度であるため、記入しない。
ロシア極東経済の発展の可能性と日本の役割

平成8年度の研究は、(1)ロシア極東の経済現状がロシア全体と比較してかなり悪い状況であること、(2)ロシア極東の外国貿易および外国からの直接投資が期待したほど進展していないことを、ロシア極東の大学・研究所国家統計委員会の訪問による資料収集と、ロシア側専門家との議論を通じて明らかにした。平成8年度の論文発表は露文1(次号掲載予定)英文1.日本語1であるが、学会報告としては、(1)1966年11月1日の釧路公立大学において「極東ロシアと日本の経済関係」(2)1966年11月27日.防衛研究所において(重点領域研究:スラブユーラシアの変動、極東班)「ロシア経済の現状と展望」を行った。さらに、1997年4月には南京理工大学の国際シンポジュウムにおいて「ロシアと中国の経済移行の比較」を研究報告する予定である。
アースシステム教育の国際比較研究に基づいた教育システムの開発に関する実証的研究

本研究は,自然環境理解を促進する総合的な理科教育として、また生徒が生き生きと学習する教育システムを構築する基軸としてアースシステム教育の可能性を研究することにある。本研究は4年間で、4力国のアースシステム教育の国際比較を行い、日本の理科教育の文脈に適したアースシステム教育の教育システムの開発とその教師教育プログラムの開発を行なった。今年度の研究実績は以下の通りである。1.4年間で、教師教育プログラムの開発とその実践に重点を置いて研究が進められた。分担者は、大学における教員養成プログラムを開発し、その実践・評価を行った。研究代表者は、現職教員研修を県レベル、市レベル、学校レベルで実施し、そのプログラムの評価を行った。そして、幼稚園、小学校、中学校、高等学校、大学、現職教育を含む体系的な研究を行い、報告書を2冊作成した。『「アースシステム教育」の日本での検討と実践』の論文を初め27件の研究著作、21件の学会発表など、アースシステム教育の普及に努めた。2.小学校・中学校・高等学校の研究協力校でアースシステム教育の実践を行い、指導法、カリキュラム、評価法、教材教具などについて研究を深めた。三崎中学校で、日本学生科学賞内閣総理大臣賞や読売教育賞理科部門最優秀賞を受賞した。3.アースシステム教育の国際比較を行うために、アースシステム教育を実施している施設を訪問し、教科書、文献、参考資料を収集し研究を行った。本研究は自然環境理解を促進する総合的な理科教育として、また生徒が生き生きと学習する教育システム(以下、システムとは、指導法、カリキュラム、評価法、教材教具、教師教育、学習を支える学校内外の組織の連携の在り方等を総合的に構成したものである)を構築する基軸としてアースシステム教育の可能性を研究することにある。本研究は4年間で、4カ国のアースシステム教育の国際比較を行い、日本の中学校理科教育の文脈に適したアースシステム教育のシステム開発とその教師教育プログラムの開発を行なうことを目的としている。1.代表者1名、分担者6名に、研究協力者の小中高等学校の教師、教育センターの指導主事で構成される研究組織を構成し、三浦市立三崎中学校、横浜中学校をアースシステム教育研究指定校に委託し、指導法、カリキュラム、評価法、教材教具などについて実践研究を行った。特に、三崎中学校では、身近な地域の自然を利用した理科教育(アースシステム教育)の教育システム開発を行い、その成果とひとつとして、探究的な研究を行った生徒の研究が、読売学生科学賞中央審査会で内閣総理大臣賞を受賞した。2.アースシステム教育の国際比較を行うために、スペインとオーストラリアのアースシステム教育を実施している施設を訪問し、教科書、文献、参考資料を収集し研究を行った。3.アースシステム教育普及のために、研究代表者がアースシステム教育に関するホームページを作成、またはポスターを作製するなどして、アースシステム教育の普及に努めた。1.本年度は、教師教育プログラムの開発とその実践に重点を置いて研究が進められた。分担者は、大学における教員養成プログラムを開発し、その一部を実践・評価を行った。国立教育政策研究所で研究分担者であるクリス・キング氏をイギリスから招聘し地学教育に関するワークショップを実施し、約50名の参加者からプログラムの内容を高く評価された。そして、アースシステム教育の教師教育に関する報告書を作成した。2.三浦市立三崎中学校、横浜中学校、松ヶ丘小学校でアースシステム教育の実践を行い、指導法、カリキュラム、評価法、教材教具などについて研究を深めた。

特に、三崎中学校での教育成果は、科学研究コンクールで優秀な成績をおさめ、新聞などで取り上げられた。3.アースシステム教育の国際比較を行うために、台湾のアースシステム教育を実施している施設を訪問し、教科書、文献、参考資料を収集し研究を行った。4.アースシステム教育普及のために、研究代表者がアースシステム教育に関するホームページを改善し、アースシステム教育の普及に努めた。本研究は,自然環境理解を促進する総合的な理科教育として、また生徒が生き生きと学習する教育システム(以下、システムとは、指導法、カリキュラム、評価法、教材教具、教師教育、学習を支える学校内外の組織の連携の在り方等を総合的に構成したものである)を構築する基軸としてアースシステム教育(ESE)の可能性を研究することにある。本研究は4年間で、アースシステム教育の国際比較を行い、日本の中学校理科教育の文脈に適したアースシステム教育のシステム開発とその教師教育プログラムの開発を行なうことを目的としている。今年度の研究実績は以下の通りである。1.代表者1名、分担者6名に、研究協力者の小中高等学校の教師、教育センターの指導主事で構成される研究組織を構成し、三浦市立三崎中学校、横浜中学校など13校でアースシステム教育研究の指導法、カリキュラム、評価法、教材教具開発などについて実践研究を行った。特に、三崎中学校では、学校外の社会施設・人材を利用した理科教育の教育システム開発を行い、その成果の研究について研究を行った。2.研究分担者であるVictor Mayer氏を招聘し、一般の教師や研究者のために講演会を行い、ESEの普及に努めた。韓国の大学で日本のESEについて講演を行い、韓国と日本のESE研究者とESEの教師教育とカリキュラム開発について議論し研究を深めた。3.カナダで開催された国際地学教育会議と日本地学教育学会(上越大会)この3年間の研究成果を発表し、アースシステム教育普及に努めた。本研究は,自然環境理解を促進する総合的な理科教育として、また生徒が生き生きと学習する教育システムを構築する基軸としてアースシステム教育の可能性を研究することにある。本研究は4年間で、4カ国のアースシステム教育の国際比較を行い、日本の中学校理科教育の文脈に適したアースシステム教育のシステム開発とその教師教育プログラムの開発を行なうことを目的としている。1.本年度は、教師教育プログラムの開発とその実践に重点を置いて研究が進められた。分担者は、大学における教員養成プログラムを開発し、その一部を実践・評価を行った。研究代表者は、現職教員研修を県レベル、市レベル、学校レベルで実施し、そのプログラムの評価を行った。そして、幼稚園、小学校、中学校、高等学校、大学、現職教育を含む体系的な研究を行い、最終報告書を作成した。2.千葉県立柏高等学校なとの高等学校と小学校でアースシステム教育の実践を行い、指導法、カリキュラム、評価法、教材教具などについて研究を深めた。
出芽酵母における圧力ストレス適応メカニズムの解明

我々の体は常に様々な圧力ストレスに曝されており,その適応障害が疾病の原因となる可能性を秘めている.そこで,本研究は真核生物のモデル生物である出芽酵母を用いて,高圧増殖におけるEGO複合体,機能未知遺伝子YPR153W及びMTC6の意義を明らかにすることを試みた.その結果,EGO複合体形成メカニズムとEGO複合体依存的なTOR複合体1のキナーゼ活性が高圧増殖に必須なことを明らかにした.また,機能未知遺伝子の解析から,小胞体膜タンパク質の機能が関与する高圧増殖適応メカニズムの存在も示唆された.これらの研究成果は動物細胞へも応用可能であり,今後の発展が期待される.高圧増殖におけるEGO複合体の意義液胞膜に局在するEGO複合体(Ego1,Ego3,Gtr1,Gtr2)は,高圧増殖において重要な機能を持つことが示唆されているが,その詳細は不明である.これまでに,EGO複合体が液胞膜近傍に存在するセリン・スレオニンキナーゼであるTOR複合体1(Tor1/Tor2(触媒サブユニット),Tco89,Kog1,Lst8)の機能に影響を与えることが報告されている.そこで,TOR複合体1の中で非必須遺伝子であるTor1とTco89の欠損株用いて高圧下で培養したところ,両変異体は高圧感受性を示した.キナーゼ活性の消失したTor1変異体の発現はtor1Δ変異体の高圧感受性を回復させることはできないため,Tor1のキナーゼ活性が高圧増殖に必須であることが明らかである.また,EGO複合体の欠損はTco89-GFPの局在が液胞膜から細胞質に変化させるため,液胞膜近傍でTOR複合体1がキナーゼ活性を保持していることが高圧増殖に必須であることを示唆した.機能未知遺伝子の解析機能未知遺伝子の内,MTC6とYPR153Wに着目して解析を進め,両タンパク質の膜トポロジーを実験的に明らかにした.また,Mtc6に関しては,N末側にタグを付加すると小胞体に局在し,その機能は保持されたが,C末側にタグを付加するとエンドソーム/液胞に局在し,その機能は消失した.従って,Mtc6は小胞体で機能していることが示唆される.一方でYpr153wに関しては,過去の網羅的解析からYpr153wと相互作用することが示唆されていたFrt1と,そのFrt1と複合体を形成するFrt2の2重欠損株(frt1Δfrt2Δ)が高圧感受性を引き起こすことを見出し,Ypr153wとFrt1/Frt2が協調して高圧増殖に関わっている可能性が示唆した.我々の体は常に様々な圧力ストレスに曝されており,その適応障害が疾病の原因となる可能性を秘めている.そこで,本研究は真核生物のモデル生物である出芽酵母を用いて,高圧増殖におけるEGO複合体,機能未知遺伝子YPR153W及びMTC6の意義を明らかにすることを試みた.その結果,EGO複合体形成メカニズムとEGO複合体依存的なTOR複合体1のキナーゼ活性が高圧増殖に必須なことを明らかにした.また,機能未知遺伝子の解析から,小胞体膜タンパク質の機能が関与する高圧増殖適応メカニズムの存在も示唆された.これらの研究成果は動物細胞へも応用可能であり,今後の発展が期待される.EGO複合体形成メカニズムの解析Ego1,Ego3,Gtr1,Gtr2によって形成されるEGO複合体は液胞膜に局在し,高圧耐性において重要な機能を持っていることが示唆されているが,その詳細は不明である.Ego1はG2がミリストイル化,C6とC7がパルミトイル化され,それによってEGO複合体は液胞膜にアンカーできる. Ego1をパルミトイル化するゴルジ体局在型の酵素Akr1の欠損株もまた,高圧感受性を示すため,akr1Δ株におけるEgo1とEgo3の局在を調べた.その結果,Ego1の一部は液胞膜に局在していたが,Ego3は細胞質に局在していた.Ego1のC6/7S変異体がほとんど液胞膜に局在しなかったことから,akr1Δ株のEgo1はAkr1以外のパルミトイル化酵素の作用によって,液胞膜に局在していると考えられた.そこで,液胞膜に局在するパルミトイル化酵素Pfa3とAkr1の2重欠損株におけるEgo1の局在を調べた所,C6/7S変異体と類似した局在パターンを示した.つまり,akr1Δ株において,Ego1の一部は液胞膜上でパルミトイル化されるが,その場合,EGO複合体は形成されないことが明らかとなった.これらの結果は,ゴルジ体から液胞への輸送過程がEGO複合体の形成に必須であることを示している.機能未知遺伝子の解析高圧下での増殖に必要な機能未知遺伝子の内,MTC2,MTC6,YPR153Wの機能解析を行った.各タンパク質のC末端側にGFPを融合したタンパク質を発現させると,Mtc2は細胞質,Mtc6は細胞膜/液胞,Ypr153wは小胞体に局在した.Mtc6に関しては,N結合型糖鎖を複数持つ糖タンパク質であること,Ypr153wに関しては,その欠損株が高塩濃度に対しても感受性を示す事も見出した.これら基礎的データは,今後,各タンパク質の機能を調べていく上で有益な情報となる.◯高圧増殖におけるEGO複合体の意義

これまでの我々の研究は,EGO複合体の形成がEgo1のゴルジ体から液胞への輸送過程で起こることを示唆してきた.このメカニズムを明らかにするために, Ego1と相互作用するEgo3の1変異導入による機能部位スクリーニングを行った.その結果,Ego3の発現や液胞膜局在に影響を与えずにEGO複合体機能を消失させる変異を発見した.興味深いことに,この変異はEGO複合体の下流に位置するTOR複合体1の液胞膜局在にも影響を与えないことも示唆された.つまり, EGO複合体の下流のTOR複合体1経路以外の未同定の経路も高圧増殖に必須であることが考えられる.◯機能未知遺伝子(YPR153W)の解析ypr153wΔ株を用いて,挿入変異導入によりその高圧感受性を回復させる変異をスクリーニングした.その結果,液胞分解に関わるESCRT関連分子の変異が,ypr153wΔ株の高圧感受性を回復させることを見出した.つまり,ypr153wΔ株により液胞で分解を受ける特定のタンパク質の不安定化が高圧感受性の原因になっていることが示唆された.さらに,Yeast two hybrid membrane systemによって,Ypr153wと相互作用する分子も複数同定した.これら分子がypr153wΔ株でどのような影響を受けているかを今後調べていく.◯全体を通しての意義これまで不明な点が多かった,高圧増殖適応メカニズムであるが,本研究により,液胞膜に存在するEGO複合体-TOR複合体1経路が重要な意味を持つことが分かってきた.この経路は哺乳動物でも保存されているため,さらなる発展が見込まれる.また,機能未知遺伝子の解析により,小胞体が関連する高圧増殖適応経路の存在も見えつつある.今後はYpr153wやMtc6の具体的な機能を明らかにすることが望まれる.分子生物学酵母の圧力増殖において,EGO複合体の下流にTOR複合体1が存在することを明らかにできたことの意義は大きい.また,TOR複合体のセリン・スレオニンキナーゼ活性のみならず,液胞膜近傍に存在することが圧力増殖に必要であるという事実は,圧力増殖に特異的なシグナルカスケードがあることを期待させる.また,研究実績の概要では述べなかったが,野生型酵母において,高圧処理がTOR複合体1のキナーゼ活性を低下させることを示唆する実験結果も得られており,この作用が野生型酵母の高圧処理による増殖低下の一因になっている可能性もある.Mtc6に関しては,N末端側の切断に関する検討を通して,Mtc6の膜トポロジーだけでなく,Mtc6が小胞体で機能することとその細胞内局在を決定する領域が明らかになってきた.この成果は,Mtc6の機能を考える上で非常に有益な情報となる.Ypr153wに関しては,Ypr153wと相互作用する可能性が高いFrt1/Frt2複合体の欠損株が圧力感受性を示すことを見出したのは大きな進展である.Frt1/Frt2複合体の機能にはまだ不明な点が多いが,Ypr153wがこの複合体と協調して機能し,圧力増殖に関与している可能性が高いと考えている.ただし,ego1Δ株,mtc6Δ株,ypr153wΔ株の圧力感受性を回復させるマルチコピーサプレッサーのスクリーニングで思うような結果は得られていない.そのため,挿入変異挿入法による変異体解析に移行する必要がある.予定していた実験が必ずしも順調に進んでいるわけではないが,それに変わる研究成果が得られている.そのため,少しずつではあるが出芽酵母の圧力適応メカニズムが明らかになってきている.