hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
湖沼沿岸域におけるヨシ帯群落の機能ならびに成長要因に関する研究

平成9年10月に植栽されたヨシの2年強にわたる生育調査を中心に、調査・研究を展開した。ヨシは、琵琶湖南湖の人工わんど内に、マット・大株・ポット苗・土嚢・地下茎・ビットマンの6種類の工法で、わんど開口部からの距離、水位を変化させた約1000区画に植栽された。これら各々について、発芽ヨシ茎数・最長ヨシ長を継続的に計測し、その増殖特性に及ぼす、植栽工法・水位・地盤浸食・冠水期間等の影響を検討した。また、同時に、地盤変化・ヨシ優占度合い、さらに1週間ごと2年間にわたる定点撮影を、対象実験地および自然ヨシ群落で実施した。その結果、(1)マット>大株>ポット>土のう>地下茎>ビットマンの順の植栽工法別活着率。(2)植栽後1年目から2年目にかけ、平均密度は34本/m^2から51本/m^2に、最長草高が約200cmから280cmへと伸びた。(3)植栽ヨシの活着には、植栽工法以上に植栽配置の影響が大。(4)調査日、植栽工法、植栽位置、植栽年度の4因子による4元配置分散分析実施で、ヨシ茎個体数密度には、調査年度の主効果、植栽工法と調査年度の2因子交互作用を除くすべての作用で危険率0.1%有意性有り。(5)その影響では季節変化、植栽工法がヨシ生育に大きく寄与し、主効果のみで50%以上、2因子交互作用を加えると約80%が説明可能で、残差は9.1%にとどまる。(6)植栽後2年目は根圏の発達により、未植栽区域からも発芽が多く見られた。(7)植栽後1年目が比高-40cm以深、2年目が比高-35cm以深では無発芽率が30%を越える。(8)浸食幅が4cmを越えると無発芽率が30%を越え、浸食幅が11cmを越えると無発芽率が60%を越え、20cmを越える堆積もヨシの生育に悪影響を及ぼし、無発芽率が15%を越える。などの成果を得た。実際の現場湖沼におけるヨシ植栽の可否を検討するため、葉山川河口近くの琵琶湖南湖沿岸部において、昨年10月、多種の方法でヨシの植栽を実施し、その着生状況を調査開始した。実施した植栽方法は、(1)新芽部分を植える"ビットマン工法"、(2)ポットであらかじめ生育させた株を移設する"ポット苗工法"(3)そのポットを土のうで覆い移植する"土のう工法"、(4)マット状に生育させた株を移設する"マット工法"、(5)すでにヨシ帯となっている地域から大株ごと移植する"大株苗法"、(6)地下茎1本を埋設する"地下茎工法"の6種類である。さらに、その密度、地盤高、水際線よりの距離の差により、ヨシ植栽に関し200余りの評価地点を設け、そこでの新芽の成長状況、地盤変化を観察している。現時点はまだヨシの生育段階であり、その評価は困難であるが、琵琶湖冬期の強風、暖冬による高水位の影響で、なぎさ線での浸食が著しく、直接波の影響を受ける地点で、成長する新芽の数は著しく少なく、逆にその陸側では、マット工法やポット苗工法では、かなりの新芽が確認され、植栽方法、植栽地点の影響が大きいことが予想される。一方、並行して矢橋、帰帆島付近のヨシ着生地点で、定点撮影を10月より毎週実施し、そのヨシの消長を観察している。現在、ヨシは枯死し、新芽の誕生を待っている状況であり、新芽成長地点が前進するのか後退するのか今後の観察で明確化できるものと考えている。このような地点のさらに増やして10数点とし、自然環境の中でのヨシ帯の成長条件を検討する。(5)その影響では季節変化、植栽工法がヨシ生育に大きく寄与し、

主効果のみで50%以上、2因子交互作用を加えると約80%が説明可能で、残差は9.1%にとどまる。(6)植栽後2年目は根圏の発達により、未植栽区域からも発芽が多く見られた。(7)植栽後1年目が比高-40cm以深、2年目が比高-35cm以深では無発芽率が30%を越える。(8)浸食幅が4cmを越えると無発芽率が30%を越え、浸食幅が11cmを越えると無発芽率が60%を越え、20cmを越える堆積もヨシの生育に悪影響を及ぼし、無発芽率が15%を越える。などの成果を得た。実際の現場湖沼におけるヨシ植栽の可否を検討するため、葉山川河口近くの琵琶湖南湖沿岸部において、1昨年10月、多種の方法でヨシの植栽を実施し、その着生状況を調査開始した。実施した植栽法は、(1)ビットマン、(2)ポット、(3)土のう、(4)マット、(5)大株苗、(6)地下茎工法の6種類であり、これらについて、一ケ月ごとに生育調査を実施し、各工法を比較した。その結果、8月29日時点の1m^2あたりのヨシ存在数は、マット、ポット、土のう、大株工法で88、69、66、21本/m^2となり、ビットマン、地下茎については、波浪や水位などの影響によりあまり良好な生育が見られなかった。ヨシ密度が増加する条件としては季節的な影響とともに水深の影響が大きく、50cm以上の水位だと生育が明らかに阻害された。水深に対する耐久性でもマット工法が最もいい結果となった。さらに植栽密度について検討すると、ポット工法などでは、1m^2あたり2林も4林もほぼ同じ生育であり、植栽による混雑効果は生じていなかった。一方、並行して矢橋、帰帆島付近のヨシ着生地点で、定点撮影をデジタルカメラにより97年10月から毎週実施し、そのヨシの消長を観察している。その本画像データから経時的ヨシ成長に関するデータ、すなわちヨシ長さ、ヨシ帯面積およびヨシ色彩を数値情報として取得することを試みつつある。さらに、従来の研究よりヨシ帯における流砂・鳥類の営巣等の情報を整理し、現地での観察結果の評価を行いつつある。平成9年10月に植栽されたヨシの2年強にわたる生育調査を中心に、調査・研究を展開した。ヨシは、琵琶湖南湖の人工わんど内に、マット・大株・ポット苗・土嚢・地下茎・ビットマンの6種類の工法で、わんど開口部からの距離、水位を変化させた約1000区画に植栽された。これら各々について、発芽ヨシ茎数・最長ヨシ長を継続的に計測し、その増殖特性に及ぼす、植栽工法・水位・地盤侵食・冠水期間等の影響を検討した。また、同時に、地盤変化・ヨシ優占度合い、さらに1週間ごと2年間にわたる定点撮影を、対象実験地および自然ヨシ群落で実施した。その結果、(1)マット>大株>ポット>土のう>地下茎>ピットマンの順の植栽工法別活着率。(2)植栽後1年目から2年目にかけ、平均密度は34本/m^2から51本/m^2に、最長草高が約200cmから280cmへと伸びた。(3)植栽ヨシの活着には、植栽工法以上に植栽配置の影響が大。(4)調査日、植栽工法、植栽位置、植栽年度の4因子による4元配置分散分析実施で、ヨシ茎個体数密度には、調査年度の主効果、植栽工法と調査年度の2因子交互作用を除くすべての作用で危険率0.1%有意性有り。(5)その影響では季節変化、植栽工法がヨシ生育に大きく寄与し、主効果のみで50%以上、2因子交互作用を加えると約80%が説明可能で、残差は9.1%にとどまる。(7)植栽後1年目が比高-40cm以深、2年目が比高-35cm以深では無発芽率が30%を超える。
日系多国籍企業における知識共有・活用と人材マネジメントに関する研究

本研究は、主にミクロ組織論の視角から、日系多国籍企業内の知識共有・活用における担い手のマネジメントと人的資源管理制度に焦点をあてるものである。近年、海外子会社間の人的連携はますます緊密になっており、その結果ローカル人材によって、国境を越えた知識共有・活用が効果的に実行されている事例が発見できた。有効な知識共有・活用のためには、ローカル人材のモチベーションを高めることが重要であり、ローカル人材向けの人的資源管理制度の構築のみならず、ローカル人材と本国人材との心理的障壁を排除するような何らかの仕組みが必要であることも示唆された。本研究課題は、ミクロ的観点、すなわち集団や個人の観点からグローバルな知識共有・活用にアプローチし、特に日系多国籍企業のグローバルな知識共有・活用のメカニズムや問題点を明らかにすることを目的としている。3ヵ年にわたる本研究課題の1年目に相当する本年度は、研究実施計画に基づき、以下の項目を重点的に実施した。第1に本研究課題は、ミクロ組織論(モチベーション理論、職務に関わる理論など)、学習理論(特に集団・個人レベル)、コンテクスト理論、知識の理論など広範な理論領域が関連しているため、近年の研究蓄積を中心に文献レビューを行った。なかでも、多国籍企業内のチーム・マネジメントに関する既存研究、日本や中国における知識観に関する研究を中心に、既存研究を渉猟した。第2に、海外の学会(Academy of Japanese StudiesおよびKorea Trade Research Associa tion)において研究発表を得る機会を得たため、研究発表を行った。世界各国の参加者から示唆に富むアドバイスを得ることができたため、次年度以降の本研究に活かしていきたいと考えている。第3に、日系多国籍企業のケーススタディ調査を開始させている。ただ本年度は、成田空港での航空機事故により、3月に予定していた欧州での海外調査を実施することができなかった。これについては、次年度に改めて実施する予定である。次年度では、本年度に実施した項目をふまえて、日系多国籍企業に対するケーススタディを本格的にスタートさせる計画である。本研究課題は、ミクロ組織論的な視点から多国籍企業における国境を越える知識共有・活用のメカニズム、およびそのマネジメントについて分析し、その問題点やインプリケーションを明らかにすることを目的としている。3ヶ年にわたる本研究課題の2年目にあたる本年度では、研究実施計画にしたがって、以下の項目を重点的に実施した。第1に、本研究課題が学問分野を超えた広範な理論領域が関連しているため、1年目に引き続き、関連理論に関する文献を渉猟した。特に近年、教育学の分野において、企業におけるコミュニケーションのマネジメントに注目が集まっているため、それらの文献レビューを実施した。また、グローバル・チームにおける知識マネジメント、国際的な起業家精神(international entrepreneurship)も本研究課題に深く関連しているため、既存研究のレビューを行った。第2に、日系多国籍企業5社の本社および海外子会社に対し、上述の研究課題に関するインタビュー調査を実施した。9月に香港、広州(中国)、3月にロンドン、香港にて海外子会社へのインタビュー調査を行うことができた。なお香港(3月)では、中国系多国籍企業に対しても調査することができた。これらについては取り纏めを行っている段階である。第3に、今年度については研究実績を公表することはできなかったが、最終年度である来年度に向けて公表の準備や申込を行った。すでに決定しているものを述べれば、2010年7月にパリで開催されるIFSAM (International Federation of Scholarly Associations of Management)という国際学会にて報告を行う予定である。(これは、2010年1月に応募したものであり、報告することはすでにアクセプトされている)3カ年計画の最終年度にあたる本年度は、過去2年間にわたり行ってきた文献レビュー、および日系多国籍企業7社の本社ならびに海外子会社へのインタビューを整理する作業に注力した。日系多国籍企業における国境を越えた知識共有・活用のマネジメントについて、ミクロ組織論的な視角から文献レビューを実施してきたが、それらについて取り纏める作業を実施した。またこれらの成果の一部として、IFSAM(パリ)において海外学会報告を行った。同報告では、多国籍企業における「コラボレーティブ・イノベーション(collaborative innovation)」とそれに必要な人的資源管理・開発について論じた。具体的には、未知のナレッジを探索するタイプの人材開発と、獲得した知識を多国籍企業内部に取り込む「バウンダリー・スパナー(boundary spanner)型の人材開発という、異なるタイプの人材開発の双方が求められることを論じた。IFSAMにおいては、内外の研究者から研究発展に有意義なコメントを得ることができた。なお、この研究調査の内容については、大学紀要に論文として投稿を行っている。そして、必要に応じて継続的なインタビュー調査を実施した。シンガポールにおけるインタビュー調査からは、タイ、インド、中東地域などにおける中間層の拡大に伴い、新たな地域本社観や海外人材観がますます必要とされてきていることが明らかとなった。

すなわち、海外子会社間での人材交流や地域単位での人的資源配置がますます進展してきており、それに呼応する形で、人的資源に関わる制度構築が求められてきているという点である。こうした一部の日本企業の先駆的事例は、グローバル化が必要な日本企業にとって示唆に富むケースとなると考えられる。これら研究成果の未発表部分については、学術雑誌、学会等で今後も発表を継続することを予定している。
異方性固体の反応速度論

一次元拡散律速反応について,反応速度論の数値計算を行い,粒径分布(一次元ナノチャネルの長さの分布)が速度論データから導けることを確認した.速度論的振る舞いを記述する近時間数を得,これを用いてパーソナルコンピューターを用いて粒径分布を求める方法を提案した.この成果は熱分析分野の国際学会で発表すると共に,国際誌に投稿した.論文は現在,(印刷中)である.ここで提案した解析には,我が国で発明された熱分析技法である熱天秤(熱重量測定)が適していることから,熱分析分野における我が国の重要性を一層強くした.特定領域内の共同研究として,阪大の川田らが合成した錯体([Hdamel]_2[Cu^<II>(tdpd)_2]・2THF)結晶中の配位子のダイナミクスを精密熱容量測定により検討した.解析の結果,隣接する配位子が強く相関を保ったまま運動していることを明らかにした.さらに,この結果を基に低温における結晶構造解析をやり直し,相関した運動にかかわるエネルギー関係を決めることができた.このような「相関した運動」は,構造解析や分光学的実験ではモデルを仮定することなく検出するのは困難であり,熱力学的測定が一般に考えられている以上の情報を持つことを実証する研究となった.さらに,このように比較的複雑な試料の測定は,物性測定を生業とする研究者は通常考えないので,特定領域研究という異分野の研究者が交流する場が新しい研究を創出したといえる.本領域で開発される新規化合物の多くが強い構造異方性を持つことに注目し,反応過程の多様性の発現様式の一つである粒径分布を求めることを検討した.本年は界面律速反応について実際に解析を行う共に,拡散律速反応について理論的な検討を行った.反応が1次元的に進行する場合,適当に定義した「速度定数」はそのとき反応に参加している反応界面の面積に比例する.逆に反応が終了してしまった粒の断面はもはやそれ以上,反応に参加することは無いので,そのような「速度定数」を見出すことができれば見かけの「反応速度」から粒径分布を知ることができる.常に新たな反応界面が生成される界面律速(表面律速)反応では,界面の反応方向への進行速度は一定であるから,界面の進行速度そのものが先の「速度定数」の要件を満たしている.すなわち,時々刻々の見かけの反応進行度の時間微分(「見かけの反応速度」)はその瞬間において反応に参加している界面の面積に比例している.したがって,「見かけの反応速度」の微分はロッド長分布関数に比例する.実際の解析を行い結果を公表した.フレーム構造が強固で,分子の吸・脱着に対し安定な場合には,拡散過程を考えるのが妥当である(拡散律速反応).半無限の1次元ロッドに拡散する場合には拡散方程式を解くことにより,全拡散量は時間(t)の平方根に比例することが容易に示される.したがって拡散量の√<t>に対する微分が先の「速度定数」の候補である.ロッドの長さが有限の場合には解析的表現は得られないので,数値計算を行った.初期「速度」(√<t>に対する微分で定義)は半無限ロッドの場合の2倍に一致し,t<0.05ではほぼ一定値にとどまり,それ以降,急激に小さくなる.ある時刻以降,そのロッドの寄与が無くなるのが理想的ではあるが,減少がかなり急激であるので拡散量の√<t>に対する微分を用いてロッド長分布が求められる可能性があることがわかった.一次元拡散律速反応について,反応速度論の数値計算を行い,粒径分布(一次元ナノチャネルの長さの分布)が速度論データから導けることを確認した.速度論的振る舞いを記述する近時間数を得,これを用いてパーソナルコンピューターを用いて粒径分布を求める方法を提案した.この成果は熱分析分野の国際学会で発表すると共に,国際誌に投稿した.論文は現在,(印刷中)である.ここで提案した解析には,我が国で発明された熱分析技法である熱天秤(熱重量測定)が適していることから,熱分析分野における我が国の重要性を一層強くした.特定領域内の共同研究として,阪大の川田らが合成した錯体([Hdamel]_2[Cu^<II>(tdpd)_2]・2THF)結晶中の配位子のダイナミクスを精密熱容量測定により検討した.解析の結果,隣接する配位子が強く相関を保ったまま運動していることを明らかにした.さらに,この結果を基に低温における結晶構造解析をやり直し,相関した運動にかかわるエネルギー関係を決めることができた.このような「相関した運動」は,構造解析や分光学的実験ではモデルを仮定することなく検出するのは困難であり,熱力学的測定が一般に考えられている以上の情報を持つことを実証する研究となった.さらに,このように比較的複雑な試料の測定は,物性測定を生業とする研究者は通常考えないので,特定領域研究という異分野の研究者が交流する場が新しい研究を創出したといえる.
人と英知をユビキタスに結ぶクラウド型古文書デジタルアーカイブのための情報検索技術

本研究で達成した成果は次の通りである。(1)奈良文化財研究所の「木簡字典」と東京大学史料編纂所の「電子くずし字辞典」を一つの検索キー(字形画像)で検索可能な横断的字形検索システムを実現した。(2)画面サイズが数インチの携帯タブレットから、20インチクラスの大画面タッチパネルまで対応するスケーラブルな字形検索システムを提案、実現した。(3)様々なユーザ/クライアント環境とデジタルアーカイブを有機的に結合する技術的基盤を確立することができた。古代木簡を含む古文書解読支援のための情報検索技術に関する実績については次の通りである。破損字体検索技術については、字形として誤抽出された記録媒体の模様・汚損などの除去、および字形の欠損に対する補完を同時に処理する手法を実現した。これにより、抽出された字形に残るノイズを大幅に削減しつつ字形本来の形状を復元し、検索精度に影響する字形の形状評価を高度化することに成功した。高精度画像処理技術については、デジタル画像を構成する複数のチャネルを統合的に評価するモデルを実装した。これによって、画像の視認性向上および前述した字形抽出処理に必要となるユーザの操作を簡略化し、字形検索のユーザビリティ向上を果たした。絞り込み検索技術については、奈良文化財研究所の木簡字典の整備に合わせてメタデータの追加整備を継続している。また、後述する情報検索インタフェースとも関連するが、欠損部分を指示する方法として電子ペン・マウスによる領域指定方法の他に、タッチパネルを持つコンピュータ向けに指先での欠損領域指定を可能とする技術についても実装を行った。情報検索インタフェースについては、これまでMokkanshopが動作環境としてきたデスクトップ/ノート型PCとは異なるタッチ対応コンピュータ向けに、タッチ操作に対応した新しいGUIのプロトタイピングを行った。このGUIはフルHDあるいはそれ以上の解像度を持つ高精細液晶画面に対応しており、情報機器の進歩に合わせたアップデートとなっている。評価実験については、奈良文化財研究所の協力を得て実施している。2012年度の研究業績については、情報処理学会より「山下研究記念賞」を受賞するなど外部からの評価も含めて順調と考えている。「破損字体検索技術の高度化」と「高精度画像処理技術」の実現については、字形の距離画像化と異方性拡散技術を組み合わせたノイズ除去・字形平滑化のための技術を開発した。字形を構成する筆跡(ストローク)には運筆方向への連続性が見られる。一方で、ノイズにはこのような連続性が見られない。この差を利用して、木簡表面の経年変化などに起因する字形の掠れ、欠損などを補完しつつ、連続性の存在しない孤立点を削除しつつ、字形画像上には現れない情報を可視化できるのが本技術の特徴となる。この技術は、経年変化によって不明瞭となった字形そのものを復元するものではない(字形の「復元」をコンピュータで行うことは本研究の目的ではなく、またその意義について何ら見出すものでもない)が、不可視となった運筆の情報を復元する行動は人間が文字を読む際に無意識のレベルで働く機能である。それをコンピュータ上に実装し、パターンマッチング技術とデータベース技術を組み合わせることで、より人間の感覚に近い字形検索技術を提供することが可能になる。また、ノイズ除去・字形平滑化の際のパラメータをユーザが変更可能であり、この技術を利用した「絞り込み検索技術」についても同時に提供することができる。「スケーラブルなハイブリッド情報検索インタフェース」については、Android端末をターゲットとした類似字形検索システムのプロトタイピングを行い、その動作可能なシステムを学会発表の場で公開した。Androidは多数のタブレット型携帯端末で利用されるOSであり、これまでのWindows上で動作するシステム(Mokkanshop)に加えてより多くのユーザに、またより多くの場面で字形検索の技術を活用してもらえるようになると考えている。本研究課題の最終年度となる2014年度については、様々なコンピューティング環境で利用可能なスケーラブルな字形検索サービスの実現に向けて、そのインフラとなるクライアント・サーバ方式の情報検索システムの実現に注力した。膨大な情報を検索対象とする必要がある字形検索サービスでは、入力された字形とデータベース化された字形の比較を高精度に行うために大きな演算量/記憶量に耐える実装が不可欠である。しかし、携帯性を重視した多くのコンピュータにおいて、スタンドアロンベースで提供できる計算量/記憶容量はこれに及ばない。そのため、現時点においてはクライアント・サーバ方式が最も現実的な実装となる。研究代表者らは、マルチスレッドにより複数のトランザクションを並列処理可能な字形検索サーバを実現した。このサーバには、研究代表者らがこれまでに実現したグレーゾーン法、勾配特徴評価など字形類似度評価技術をすべて搭載した。このシステムは、当初は負荷分散の実現を目指したものであった。しかし、オンデマンドで字形情報の登録/削除が可能なリモートコマンドを追加実装することで、古文書の研究者が研究成果である字形情報を迅速に共有する知の共有インフラストラクチャーの提供にもつながった。今後は、実現した字形検索サーバを核とした多様なアプリケーションの実現が期待できる。

この他に、デジタルアーカイブの拡充作業にも参画し、検索可能な古文書の範囲拡大にも努めた。情報考古学交付申請書に記載した今年度の研究計画に照らして、各項目に対する成果をあげることができている。破損字体検索技術の高精度化に関しては、計画に準拠した活動を完了することができたと考えている。まず「ストローク形状特徴抽出/パターン類似土計算方法の改善」については距離画像化と異方性拡散を組み合わせた技術で達成することができた。次に「時代/用途によって変遷/変化する異体字」の整理についても、東京大学史料編纂所の協力によりデータベースを構築することができた。なお、このデータベースをAndroid端末での類似字形検索システム(プロトタイプ)の実装に利用し、その動作を研究会で公開している。高精度画像処理技術についても、距離画像化と異方性拡散を組み合わせた技術によって達成できたと考えている。ノイズ除去と不可視となった運筆情報の可視化により、これまで以上にユーザフレンドリーな解読支援技術が実現できたと考えている。絞り込み検索技術についても、類似字形検索/画像処理に関する各種パラメータをユーザが変更可能な実装によって実現できていると考えている。ただし、現状はパラメータの設定項目数が十分に整理されていない。この点については次年度以降にブラッシュアップを図りたいと考えている。スケーラブルなハイブリッド情報検索インタフェースでは、Android端末向けの類似字形検索システムのプロトタイピングにおいて、パターンマッチング処理をサーバ側で担う負荷分散型システムの実装を行った。Android端末は特にメモリ使用量/アクセス速度の制限が大きく、検索システムのコア一式を端末側で賄うことができない。そこで、サーバ側にテンプレート管理・類似度計算の処理を実装し、Android側ではメモリへの負荷が少ない処理のみを実行することで、検索に要する時間を数分から数秒に短縮することができた。なお、これらの成果に関する研究発表(論文+口頭発表)により、情報処理学会「山下研究記念賞」を受賞した。引き続き、研究計画に沿って推進する。なお、PC等に搭載されている液晶画面の高精細化が進んでおり、これまで以上にデジタル画像コンテンツに対する注目が集まっているため、本研究においてもそのような社会的ニーズに沿った成果が出せるよう努力する。24年度の研究はおおむね順調に進展しており、25年度以降についても当初の計画通り実施していきたいと考えている。なお、次年度の研究費については発表を行った学会・研究会の当初予定からの変更、物価変動など幾つかの要因が累積した結果であるが、研究計画そのものの大きな変更を表すものではない。申請時に購入を予定していた機材の価格変動などによって差分が生じたものである。
タンパク質超分子によるナノ粒子+カーボンナノチューブ複合体のナノ集積と機能発現

昨年度の、カーボンナノ材料認識ペプチド(CNBP)提示Dpsとカーボンナノチューブ(CNT)の複合体、CNT+mDpsの生成と、さらに完全に可溶化したCNT+mDpsのDps内にナノ粒子合成を行う手法を改良して、再現性良く行うことができる手法を確立した。得られたナノ粒子担持の可溶化CNT+mDpsを電子線リソグラフィーを用いて作製した電極間ギャップが100-200nmの複数種のナノギャップ電極にランダムに配置したが、電極間に可溶化CNT+mDps溶液を滴下して乾燥させただけの場合では、溶液に含まれる緩衝液の成分が析出し、走査型電子顕微鏡(SEM)での観察に支障があるだけではなく、電気特性測定にも問題があった。今年度はランダム配置後に純水でのリンス工程を追加することで、大幅なSEM観察像の改善が見られ、電気特性解析がより正確に行えるようになった。電気特性では、ギャップ間に複合体が存在しない場合、ナノギャップ電極が、印可電圧2-3Vにおいて、10fA程度しか電流を流さず電気特性測定に適していることが確認された。ギャップ間にコバルトナノ粒子担持複合体を配置した電気特性では、同じく印可電圧2-3Vにおいて、数μAの電流が流れることが確認され、電圧-電流特性では、プラスマイナス1V程度の範囲において電流がほぼ流れない不感電圧帯が確認された。このことは量子効果を示唆していると思われた。すなわち、ランダム配置された複合体ネットワークから、一つのナノ粒子が選ばれ、電子がそのナノ粒子を量子井戸として導電しているため、クーロンブロッケード様の特性を示したと考えられる。またメモリ効果と思われる特性も得られたが、その再現性は低く今後慎重に再現実験を行う必要がある。1.タンパク質・ペプチドによるカーボンナノチューブ可溶化に成功した。ナノ粒子合成:バクテリア由来球殻状タンパク質のDpsを遺伝子工学的に改変し、外表面に露出しているサブユニットのアミノ末端にアミノ酸鎖(リンカー)を介してカーボンナノ材料認識ペプチド(CNBP)を提示させた。このキメラタンパクは自己集合して、球殻状タンパク質超分子を形成することを確認した。この変異Dps(mDps)溶液を、CNTと混合して超音波印加強制攪拌を行ったところCNTが水溶液中に分散した。この分散溶液から、凝集体を遠心で除去し、完全に可溶化したCNT+mDpsだけを用意してmDps内にナノ粒子を合成した。このCNT+mDpsを電子顕微鏡で確認したところCNTと周囲に配置されたmDps(コア付き)が確認された。CNTとタンパク質殻厚は12nm程度離れていることも確認できた。2.可溶化CNT+mDpsのランダム配置に成功した。電子線リソグラフィーを用いて電極間ギャップが100-200nmの複数種のギャップを持つ電極対を複数個用意した後、この電極間に可溶化CNT+mDps溶液を滴下して乾燥させた。この配置状況は走査電子顕微鏡で確認を行った。走査電子顕微鏡像からCNTが電極間に配置されたことが確認された。しかしながらmDps(コア付き)は形状が極小で走査電子顕微鏡の分解能限界のため観察不可能であった。作製した構造の初期的電気特性の計測を行ったが、現状では明確な結果は得られていない。
クラミジア感染症治療薬としての可能性を秘めたカルパイン阻害剤

クラミジアは性感染症,眼病および肺炎の原因となる細胞内寄生菌である.本研究では,動物細胞内のカルシウム依存性プロテアーゼであるカルパインの阻害剤が,クラミジアの増殖を強力に阻害することを見出した.これらのクラミジアの増殖を抑制するカルパイン阻害剤には,疎水性アミノ酸で構成される共通した構造が存在することを明らかにした.また,カルパイン阻害剤はシグナル伝達のひとつであるNF-κB経路を遮断することで,クラミジア感染時に誘発されるサイトカイン産生を著しく阻害することを明らかにした.以上の結果はカルパイン阻害剤の共通構造からクラミジア感染症の新しい治療薬を開発する足がかりとなることが期待される.クラミジアは性感染症,眼病および肺炎の原因となる細胞内寄生菌である.本研究では,動物細胞内のカルシウム依存性プロテアーゼであるカルパインの阻害剤が,クラミジアの増殖を強力に阻害することを見出した.これらのクラミジアの増殖を抑制するカルパイン阻害剤には,疎水性アミノ酸で構成される共通した構造が存在することを明らかにした.また,カルパイン阻害剤はシグナル伝達のひとつであるNF-κB経路を遮断することで,クラミジア感染時に誘発されるサイトカイン産生を著しく阻害することを明らかにした.以上の結果はカルパイン阻害剤の共通構造からクラミジア感染症の新しい治療薬を開発する足がかりとなることが期待される.当初,初年度に実験動物に対するカルパイン阻害剤の投与を計画していたが,生体に対する安全性や作用機序等の情報に乏しいため,まずin vitroにおいて分子メカニズムの解明を行うこととした.カルパイン阻害剤MDL28170が,宿主細胞内におけるクラミジアの増殖抑制に極めて有効であることから,他の様々なカルパイン阻害剤を用いて同様にクラミジア増殖能を検討した.その結果,同じカルパイン阻害剤でも強い増殖抑制効果を持つものと効果を示さないものの2種類に分けられた.増殖抑制効果をもつカルパイン阻害剤に関してその構造を比較したところ,類似した疎水性ジペプチドから成る構造を有していることが明らかとなった.また,感染12時間後まで阻害剤の処理を遅らせても,増殖抑制効果は保持されることが明らかになった.また,カルシウムイオンのキレートによる内在性の不活化もクラミジアの増殖低下を引き起こすことを明らかにした.更に,クラミジア感染細胞において,カルパインがクラミジア封入体に局在することを明らかにした.これらの結果クラミジアがカルパインを自身の増殖に用いていることを強く示唆する次に,MDL28170は,クラミジア感染マクロファージの免疫応答,特に炎症性サイトカイン産生を強く抑制した.この現象について検証したところ,MDL28170はNF-kB経路の転写因子RelAタンパク質の核内移行を強く抑制し,その結果サイトカイン発現が抑制されることが明らかとなった.現在これらの分子メカニズムの解明の結果をまとめ現在論文執筆中である前年度に続き,カルパイン阻害剤のクラミジア増殖を抑制するメカニズムを分子レベルで解明するための研究を行った.shRNAを用いたノックダウン法,およびノックアウトマウス由来のカルパイン欠損培養細胞株を作成し,これらの細胞内におけるクラミジア増殖の速度を検討したが,野生型細胞との有意な差は認められなかった.この理由について,カルパインは少なくとも10以上のサブタイプが存在し,その1つを欠損しても残りのサブタイプが機能を補完する可能性が考えられる.一方,細菌側の因子に対してカルパイン阻害剤が影響を与え増殖の抑制につながることも可能性として考え,現在その分子を探索しているところである.ここまでのデータをまとめて論文として投稿する.初年度において計画をしたカルパイン阻害剤の実験動物に対する投与のため予備投与実験を行ったが,生体に対する毒性が認められたため,倫理的観点に則し中止することとした.細菌学動物実験の安全性,倫理的理由およびさらなる情報の収集のために研究計画の変更を行ったものの,それにより得られた情報は重要であり,今後の研究においておおきく役立つものと考えている.前年度までに論文を投稿完了させるのが理想的であったが,近日中に投稿を完了させる予定であり大きな狂いはないと考える.今後,研究計画に基づいて動物に対する投与実験,および感染実験を行う.
節句を彩る植物の自律神経調整作用の評価と日本人的嗜好の抗ストレス芳香性素材の開発

近年、日本でもストレスを癒すことを目的としたアロマテラピーが普及している。しかし西洋で伝統的に用いられてきた精油が用いられる場合が多く、必ずしも日本人、特に高齢者の嗜好に合致するものではない。本研究は、日本の伝統的な季節行事に利用される植物“香気成分"の自律神経調整機能を明らかにし、日本人の嗜好に合致した抗ストレス芳香性素材を開発することを目的とした。マウスにおける行動薬理学的実験では、白朮、松葉、白桃、桃仁、艾葉、菖蒲根、竹葉、菊花、呉茱萸などの植物材料から得た揮発性香気成分もしくはジャーマンカモミール、ペパーミント、ラベンダーの精油を密閉ケージ内に予め定量的に充満させ、新奇環境に曝された際のマウス自発運動量の増大に対する抑制効果を、抗ストレス・鎮静作用の指標として評価した。その結果、白朮、呉茱萸の香気成分がラベンダーと同等の鎮静効果を示すことを初めて明らかにした。この鎮静作用は臭覚破壊マウスでは認められず、本効果は香りを介したものであった。香りの効果を評価するためには、微細な生理的変化を明確に検出できる系が必要である。そこで、ヒトにも小動物にも応用可能な非侵襲的評価系の構築を検討する目的で、まずヒトにおいて種々のストレス負荷時の自律神経系の変調を、脳波、心電図、末梢血流量、末梢皮膚温及び唾液中の成分に着目して評価した。その結果、脳波中のα波やβ波、心拍R-R間隔変動のパワースペクトル値、唾液中のクロモグラニンAやアミラーゼ量は、個人差等による変動が極めて大きく評価が困難であった。一方、心拍数や心拍R-R間隔の変動係数は、ストレス負荷の有無を明確に識別でき、個人差が少なく、ストレス度やリラックス度を評価する指標として好適であることを確認した。本系では、コーヒーの摂取効果も検出できた。今後、マウスやヒトにおける香りの生理的作用の評価に応用していく予定である。本研究は、日本人の生活リズムに適合し育まれた季節行事である節句に利用される植物の香気成分の自律神経調整機能を明らかにし、より多くの日本人の嗜好に合致し日本の豊かな四季や伝統を楽しみながらストレスを解消し生活習慣病を予防できる芳香性素材の開発を目的とする。初年度は、評価系を構築する目的で、ヒトおよびマウスに種々の刺激を与え、自律神経系変調の測定を検討した。ヒトにおいては、学生を被験者とし、閉眼状態で簡単で短時間のタスクを実施させてストレスを付加し、脳波心電リアルタイム解析システムMemCalc/Makin2を用いて自律神経系の変調を解析した。タスクとしては、トランプの4種のマークがランダムに述べられる中で予め指定したマークが述べられた時にだけスイッチを押すタスク(トランプスイッチ)、15個の一桁数字の足し算、2つの二桁数字の足し算、三桁数字から指定した二桁数字の繰り返し引き算、の4種類を行なった。自律神経系活動の指標としては、脳波(α波)、α波の割合(α/β)、心拍パワースペクトル(LF/HF)、心拍数を用いたが、脳波は個人差が大きく、被験者10名程度では解析が困難であった。一方、心拍数の変動は個人差が少なく、感度よくストレスの付加による自律神経系の変調を捉えることが可能であった。各タスクのストレス強度は、トランプスイッチタスク<15個の足し算<二桁の足し算<引き算の順であった。

マウスにおいては、電極を装着し麻酔下で種々の薬物を投与し、心拍ゆらぎリアルタイム解析システムMemCalc/Tarawaで解析した。交感神経遮断薬Propranololや副交感神経作動薬Carbacholの副交感神経刺激効果、副交感神経遮断薬Atropineの交感神経刺激効果と共に、重陽の節供に菊花と共に用いられた呉茱萸のアルカロイドEvodiamineが交感神経刺激作用を有することが確認できた。本研究は、日本人の生活リズムに適合し育まれた季節行事である節句に利用される植物の香気成分の自律神経調整機能を明らかにし、より多くの日本人の嗜好に合致し日本の豊かな四季や伝統を楽しみながらストレスを解消し生活習慣病を予防できる芳香性素材の開発を目的とする。1.マウスにおける自律神経系調整作用を有する芳香性植物素材の探索白朮、松葉、白桃花、桃仁、艾葉、菖蒲根、竹葉、菊花などの植物材料から揮発性成分をヘキサン抽出後ヘキサンを減圧留去して試料を調整した。これらの試料をtriethyl citrateで10倍希釈し、その300μlを香り発生装置に滴下し、加熱してケージ内に揮発させた。次いで、別のケージで馴化させていた安静なマウスを、このケージに移し、1時間、探索行動による運動量を測定した。本系において香りがオープンフィールド試験における自発運動量に与える効果を検討した結果、白朮のみが、自発運動量を顕著に抑制し、他の試料は統計的に有意な効果を示さなかった。今後は、白朮の脳内カテコールアミンや心拍変動に及ぼす効果について検討する予定である。2.ヒトにおける自律神経系調整作用の評価系構築初年度は、学生を被験者とし、閉眼状態で簡単で短時間のタスクを実施させて軽微なストレスを付加し、脳波心電リアルタイム解析システムMemCalc/Makin2を用いて自律神経系の変調を、脳波(α波の割合)、心拍数、および心拍間隔変動のパワースペクトルに関して検討した結果、心拍数が自律神経系の変調を捉えるのに最も適した指標であることが明らかにした。そこで、本年度は、ワイヤレス心拍測定系を導入し、無拘束・開眼の状態でクレペリンテストを実施し、持続的に単純作業を繰り返させた際のストレスによって生じる心拍及び心拍パワースペクトルの変動に関する検討を行なった。クレペリンテストは、簡単な一桁の足し算を、5分間の休憩を挟んで2セット(15分間×2)行い、その作業量によって表れた曲線によってその能力特徴を判定する試験で、「タスクパフォーマンス」=「働きぶり」を測定するのに最適の検査と言われている。その結果、心拍数は、短時間(2分間の暗算)のストレス負荷時とは逆に低下した。また、心拍間隔変動のパワースペクトル解析によって得られるLF/HF値(LF=低周波成分=交感神経系成分、HF=高周波成分=副交感神経成分)も、一般に興奮で増大、リラックスで減少するといわれているが、クレペリンテストでは減少した。今後検討を続け、クレペリンテストにおける心拍解析によるストレス強度評価系を確立したい。1.マウスにおける自律神経系調整作用を有する芳香性植物素材の探索我々はこれまでに、白朮、松葉、白桃花、桃仁、艾葉、菖蒲根、竹葉、菊花から得られた揮発性抽出物のうち、白朮抽出物のみが、強制水泳試験における抗うつ作用(腹腔内・経口投与)、オープンフィールド試験における鎮静効果(香り負荷)を示すことを明らかにしている。
幾何的極限を利用した位相的クライン群の統一的研究

本研究の目的は,位相的クライン群論の主要な結果を統一的に説明する基本定理を証明することにあった.特に関心があったのが,クライン群の幾何的極限の位相的および幾何的な分類である.本研究以前は,擬フックス群のような特別なクライン群の列で代数的に収束する列の幾何的極限に関してのみ分類がされていたが.本研究では,同じ位相型を持つ任意の幾何的有限クライン群の列で,必ずしも代数的には収束するとは限らないものに関しても幾何的極限の位相的および幾何的分類に成功した.さらに,その応用として,幾何的極限に関するエンディング・ラミネーション定理が証明できた.本研究の目的は,位相的クライン群論の主要な結果を統一的に説明する基本定理を証明することにあった.特に関心があったのが,クライン群の幾何的極限の位相的および幾何的な分類である.本研究以前は,擬フックス群のような特別なクライン群の列で代数的に収束する列の幾何的極限に関してのみ分類がされていたが.本研究では,同じ位相型を持つ任意の幾何的有限クライン群の列で,必ずしも代数的には収束するとは限らないものに関しても幾何的極限の位相的および幾何的分類に成功した.さらに,その応用として,幾何的極限に関するエンディング・ラミネーション定理が証明できた.本研究課題は幾何的3次元多様体に関するものであり,特に平成22年度は,幾何構造を持つ3次元閉多様体Mの微分同相群のホモトピー型および位相型について研究した,Isom(M)をMの等長写像全体の作る群とし,isom(M)をM上の恒等写像Id_Mを含むIsom(M)の連結成分とする.また,Diff(M)をM上のC^∝級微分同相写像全体の作る群,diff(M)をId_Mを含むDiff(M)の連結成分とする.このとき,Smaleは任意の幾何構造を持つ3次元閉多様体Mに対し,包含写像isom(M)→diff(M)はホモトピー同値写像であろうと予想した,この予想は,MがHaken多様体のときは,N. Ivanov (1976), A. Hatcher (1976)によって独立に,3次元球面S^3の場合はA. Hatcher (1983)によって,双曲多様体の場合はD. Gabai (2001)によって肯定的に証明された,したがって,Smale予想でまだ未解決なのは,MがSeifert多様体の場合のみである。基本群π_1(M)が有限のSeifert多様体のとき,S. Hong, J, Kalliomgis, D. McCullough等によって部分解が得られているがまだ完成には至っていない.本研究では,π_1(M)が無限のSeifert多様体の場合を考えた.特に,D. McCullough氏(Univ. of Oklahoma)との共同研究で,Mが双曲底軌道面を持つSeifert多様体のときは,肯定的な解が得られた,さらに,Diff(M)の位相型も決定できた,平成23年度は,Seifert多様体多様体の底軌道面がEuclid構造を持つ場合のSmale予想の解決を目指すまた,桐木紳(京都教育大学),M.-C.Li氏(国立交通大学,台湾)との共同研究で,Henon写像族{f_<a,b>}のresidualな部分集合Rで,性質「任意のf_<a,b>∈Rは,SRB測度をもたない不変集合と,SRB測度をもつストレンジアトラクター同時に持つ」をもつものが構成できた本研究課題であったクライン群Γの位相的および幾何的分類の研究は,M=H^3/Γの境界が非圧縮というどちらかというと扱いが容易な場合は,ほぼ完成している.論文としてまとめ投稿中なのは,MがΣ×Rに同相な場合のみであるが,それ以外の場合への一般化に関しての研究は現在進行中である.ここで,Σは有限型のΣ曲面を意味する.Γ_nがπ_1(Σ)と同型となるようなクライン群の列{Γ_n}を考える.また,Gを{Γ_n}の部分列の幾何的極限とする.このとき,N=H^3/Gの位相型としてどのようなものが現れるかを研究した.本研究課題の研究者の以前の研究では,{Γ_n}が代数的に収束する場合のみを考えていた.しかし,平成23年度の研究では,この幾何的収束の仮定なしで幾何的極限となるための位相的必要条件を与えた.一般に,Nは無限個の位相的テームなエンドと,無限個のワイルドなエンドを同時にもつことが証明された.さらに,NはΣ×Rの中に位相的に埋め込まれることも証明した.逆に,この位相的必要条件をみたすような双曲多様体Nは,あるクライン群列{Γ_n}の幾何的極限であることも証明できた.この結果と関連して,曲線複体の強張測地線に同伴する双曲多様体内の測地線の長さは上から有界であることが,Y. MinskyやB. Bowditchによって証明されているが,本研究者は,幾何的極限を利用したより簡明な証明を与えた.このような証明は,クライン群の幾何的極限を統一的に研究する上で,意義があると考えている.さらに,桐木紳氏(京都教育大学)との共同研究により,エノン写像の列で,各要素が3次ホモクリニック接触をもつものが存在することを示した.

この結果と以前の共同研究を組み合わせることにより,エノン写像で3次多項式型ストレンジ・アトラクタをもつものの存在がはじめて明らかになった.本研究課題である幾何的に有限なクライン群の幾何的極限の分類は,大鹿健一氏(大阪大学教授)との共同研究で,完全に解決した.特に,幾何的極限クライン群による3次元双曲空間の商空間である双曲多様体の位相型が全て明らかになった.一般にこのような幾何的無限多様体は,有限個の幾何的有限エンド,無限個の幾何的無限テーム・エンド,無限個のワイルド・エンドを同時に持ち得ることが分かった.しかし,このような複雑さにもかかわらず,幾何的有限なクライン群を実現する多様体の中に,幾何的極限クライン群を位相的に埋め込めることも証明できた.さらに,Minskyのエンディング・ラミネーション定理も対応する剛性定理が,幾何的極限多様体でも成立することが分かった.この研究で得られた双曲幾何的手法を用いて,幾何構造を持つ3次元閉多様体に関するSmale予想へのアプローチが可能なことが分かった.特に,双曲軌道面を底空間として持つSeifert多様体に関して,Smale予想が成り立つことが証明できた.すなわち,このような多様体の等長群の恒等成分のホモトピー型と,微分同相群の恒等成分のホモトピー型が一致することが分かった.微分同相群は無限次元多様体であるので,構造を調べるのには困難がともなう.しかし,上記の多様体に関するSmale予想の解決により,微分同相群のホモトピー型だけでなく位相型も決定することができた.この手法をさらに一般化して,infranil構造を持つ3次元多様体に関するSmale予想を解決することが今後の目標である.本研究課題である,幾何的有限なクライン群の幾何的極限の分類については,大鹿健一氏(大阪大学)と共同で,継続的に研究を続けている.結果の第一段階は,論文としてまとめ現在論文誌に投稿中である.D. McCullough氏(オクラホマ大学)との共同研究で,双曲構造を持つ軌道面を底空間として持つザイフェルト閉多様体Mに対して,Smale予想が正しいことを証明した.すなわち,このような多様体の等長変換群の恒等成分から微分同相写像の恒等成分への包含写像はホモトピー同値写像であることが証明できた.この定理の証明には,一つの正則ファイバーが生成するMの基本群の巡回部分群に同伴するMの被覆が双曲平面に擬等長的であるという事実を使う.本研究代表者は2006年に,P. Scottによる無限基本群を持つザイフェルト多様体の剛性定理に対する別証明を与えている.そのとき証明した「フックス群は絶縁条件をみたす」という事実が,今回のSmale予想を解決する上で重要な役割を果たした.この結果は,J. Differential Geom. 93 (2013)から発表された.今後この議論を一般化して,ユーックリッド構造を持つ軌道面を底空間として持つザイフェルト閉多様体に対してもSmale予想が正しいことを証明したい.さらに,桐木紳氏(京都教育大学)との共同研究で,あるC2級の開条件をみたす微分同相写像は,C2-ロバスト・ヘテロ次元サイクル上のC2-ロバスト・ヘテロ次元接触を持つ微分同相写像でC2近似できることを証明した.この定理は,ロバストなヘテロ次元接触の存在を証明した初めてのものである.この結果は,Nonlinearity 25 (2012)から発表された.今後この結果を一般化して,さらに広い範囲の微分同相写像が,ロバスト・ヘテロ次元接触を持つことを証明したい.クライン群の幾何的極限の位相的,幾何的分類が特殊場合から,一般の場合への徐々に拡張されつつある.
複合免疫療法の開発～免疫チェックポイント阻害剤と癌ワクチン～

(1)WT1特異的CTLによる口腔扁平上皮癌(OSCC)細胞株殺傷活性における抗PD-1抗体の効果(in vitro実験):初年度と同様の、HLA-A*24:02あるいはHLA-A*02:01を保有する健常人あるいはOSCC患者由来の末梢血単核球(PBMC)より分離・培養したCD8+T細胞と同ドナー由来WT1ペプチドパルス樹状細胞(WT1-DC)を共培養する事によりWT1特異的細胞傷害性T細胞(WT1-CTL)を誘導する実験を、異なるドナー由来のPBMCにてリピートし、抗PD-1抗体添加により、より強力にWT1-CTLが誘導される事が確認された。さらに本年度は抗PD-L1抗体あるいは抗PD-L2抗体も添加したところ、抗PD-L1抗体で抗PD-1抗体と同程度のWT1-CTL誘導増強効果を認めた。抗PD-1抗体+抗PD-L1抗体の併用では増強効果は有意でなかった。(2)抗PD-1抗体+WT1-DCワクチン併用免疫療法の治療効果:同系腫瘍を移植された担癌マウスを、WT1ペプチドパルス同系マウス骨髄由来DCならびに抗PD-1抗体で治療する事により、各々単独治療と比較して強い抗腫瘍効果を認めた。治療開始7日目より腫瘍浸潤リンパ球および脾臓リンパ球においてWT1-CTLの誘導と血清中のIFNγ誘導を認めた。(3)OSCC組織の免疫組織化学的染色(PD-L1およびPD-L2タンパク等の発現解析):前年度から引き続き手術材料の免疫染色を実施しデータを蓄積した。来年度も引き続き行いデータ解析を行う。(4)抗PD-1抗体+WT1-DCワクチン併用免疫療法の第I/IIa相臨床試験:臨床用にLarge ScaleでのDC培養に成功した。パイロットスタディとして3例の切除不能口腔癌患者に同治療を行い経過観察中である。2例でWT1-CTLの誘導を確認した。今後症例を拡大してゆく予定である。基礎研究結果によりWT1-DCワクチン+抗PD-1併用療法の有効性が強く示唆され、少数例ながら臨床応用も実施できた。臨床研究を推進する。治療効果(臨床反応、生存期間)の解析とともに、患者検体(血液、手術ならびに生検材料)を詳細に解析する事により、同治療のResponder/Non-responderの判別可能なバイオマーカーの開発ならびに、Non-responderに対する対処法の確立を目指す。(1)WT1特異的CTLによるOSCC細胞株殺傷活性における抗PD-1抗体の効果(in vitro実験):HLA-A*24:02(日本人の約60%)あるいはHLA-A*02:01(日本人の約20%)を保有する健常人及び口腔扁平上皮癌(OSCC)患者由来末梢血単核球(PBMC)よりリンパ球分画と単球分画を分離し単球分画より樹状細胞(DC)を分離し、WT1ペプチドをパルスしWT1-DCワクチンを作製した。リンパ球分画からCD8+T細胞を分離・培養し、WT1-DCワクチンと共培養後WT1抗原、

HLA-A,B,C、PD-L1あるいはPD-L2の発現を確認されたOSCC細胞株に対するキラー活性を51Cr遊出法にて測定し、WT1特異的細胞傷害性T細胞(WT1-CTL)が誘導されている事を確認した。各濃度の抗PD-1抗体を加えることによりWT1-CTLのキラー活性が増強された。DCワクチンと抗PD-1抗体の併用により、WT1-CTLがより強力に誘導される事が明らかとなった。(2)抗PD-1抗体+WT1-DCワクチン併用免疫療法の治療効果(動物実験):前実験において、同系腫瘍細胞を移植された担癌マウスを、WT1ペプチドをパルスされた同系マウス骨髄由来DCワクチンと抗PD-1抗体の併用療法が、各々の単独治療と比較して治療効果(腫瘍増殖抑制、生存期間、WT1-CTL誘導等)が高い事を強く示唆する結果が得られた。次年度にはマウス数を増やして検証実験を行う。(3)OSCC組織の免疫組織化学的染色(PD-L1およびPD-L2タンパク等の発現解析):OSCC患者由来の手術あるいは生検材料を用いた免疫組織化学染色にてPD-L1およびPD-L2タンパクの発現を検索した。まだ少数例であるが、これらのPD-1リガンドの発現が高い症例は予後不良である傾向が認められた。次年度も引き続き行いデータを蓄積する。in vitro実験、in vivo実験、癌患者手術あるいは生検検体を用いた研究により、ほぼ当初の仮説通りの結果が得られ、繰越期間を含めた研究機関内に、おおむね予定通りの研究の進展があった。臨床研究を推進する。治療効果(臨床反応、生存期間)の解析とともに、患者検体(血液、手術ならびに生検材料)を詳細に解析する事により、同治療のResponder/Non-responderの判別可能なバイオマーカーの開発ならびに、Non-responderに対する対処法の確立を目指す。初年度(繰り越し期間を含む)に行ったin vitro及びin vivo実験、癌患者手術あるいは生検検体を用いた研究より得られた成果をもとに、さらに動物実験の拡大、患者検体解析の症例数拡大を行いデータを蓄積するとともに、抗PD-1抗体+WT1-DCワクチン併用免疫療法の第I/IIa相臨床試験の実施に向けて準備を整える。臨床研究の実施においては、実施する医療機関と充分に連携して進めるとともに、倫理的な問題点に十分に配慮し、各施設の倫理委員会の承認を得たのちに行う。また、樹状細胞ワクチンの臨床応用は、再生医療等安全性確保法(再生医療新法)にのっとって行われなければならない。
細胞表層でおこる精密分子認識の定量的評価

本研究の目的は、脂質二分子膜を被覆した水晶発振子をデバイスに用いて、細胞膜から脂質膜へのたんぱく分子の移動課程ならびに、移動したたんぱく分子上で起こる分子認識を振動数変化から定量し、細胞表層での精密分子認識を具体化し、定量的に評価することにある。今年度の研究により以下のような成果が得られた。1)直径9mm,ATカットの水晶発振子の電極上にリン脂質二分子膜をキャスト法あるいはLangmuir-Blodgett(LB)法を用いて固定化した。脂質膜被覆発振子が緩衝水溶液や細胞培養液などのイオン強度の高い水溶液中で安定に発振するための発振回路、水晶発振子の加工等を行ない、発振子の振動数変化と重量変化の検量線を作製した。発振回路の定高知を可変抵抗にすることにより、従来塩溶液中では発振しなかったものが安定に発振できるようになり、蛋白質や細胞の水溶液中でも水晶発振子を使用できることがわかった。2)Arg-Gly-Asp基を親水頭部にもつ脂質を合成し水晶発振子上に固定化し、Arg-Gly-Asp基に特異的に結合することが知られている細胞接着因子(IIb/IIIaたんぱく)、フィブリロネクチンなどのシグナル脂質膜への選択的移動過程を振動数変化から定量することに成功した。この結果、細胞接着因子やフィブリロネクチンは極めて選択的にArg-Gly-Asp基を認識できることがわかった。