hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
先天性風疹症候群の誘起に関与する風疹ウイルスの分子疫学

風疹ウイルスは先天性風疹症候群(CRS)を引き起こす原因ウイルスであるが、この風疹ウイルスの病原性と流行様式との解析を目的として、我が国を含むアジア地域における分離ウイルス株の遺伝子RNAの塩基配列を比較し、分子疫学的研究を行った。RNAの中のE1翻訳領域1443塩基を含む1484塩基を主な対象として、塩基配列を決定した。使用したウイルス株は15株あり、日本12株(1960年代5株、1990年前後7株)、香港2株(1980年代)、中国1株(1980年)である。分析の結果(1)1960年代の日本においては、少なくとも3グループのウイルス株が同時に平行して流行していたと思われた。3グループは、それぞれ西日本、中日本、東日本の3地域に対応していた。(2)1990年頃の日本においては、1960年代とは異なったグループの株が全国的に1グループで流行していた。(3)中国大陸の株は、日本の株とは別のグループに属すると思われる。その中では、中国株と香港の1株との間に強い近縁関係が見られた。(4)弱毒化した日本のワクチン3株においてその原株との比較ができたが、弱毒化に共通した変異は、見られなかった。弱毒化に関与する部位が株毎に異なるのか、または、E1以外の他の領域が関与しているのか、の何れかであると思われた。(5)CRS患者からの分離株においては、同じグループに属していても変異数が多いという傾向があり、持続感染による影響があった可能性が考えられた。本年は、初年度であるので、次の2点について研究を行い、次年度以降の基礎となる以下の実績を得た。(1)遺伝子診断平成3年9月に確立し風疹感染の遺伝子診断法を3疾患に対して応用し、現在までの通算で以下の成績を得た。今後ウイルス遺伝子の検出された症例において、ウイルス分離と、E1遺伝子の変異の比較を行う。a)胎児風疹診断。112症例の診断を行い、33例において胎児由来組織から風疹ウイルス遺伝子が検出され、胎児感染陽性と診断された。陰性と診断された79例の内、55例は、既に出生しているが、その内には1例も障害はなく、この遺伝子診断法の信頼度が高い事が認められた。b)風疹脳炎。風疹脳炎患者の髄液から、18例中5例においてウィルス遺伝子が検出された。検出は、脳炎発症1日目だけという極めて短期間であった。c)先天性風疹症候群(CRS)の確定診断。CRSの疑いのある患者27名について、遺伝子診断を行い、14名に陽性の結果を得た。(2)カニクイザルにおける催奇形モデルの確立。3頭の妊娠カニクイザルに風疹ウイルス野外株を接種した。妊娠8周で接種した場合、11週の胎児には、血液中にのみ、ウイルス遺伝子が検出された。妊娠6周で接種した場合、9周で胎盤絨毛と胎児の脾臓、肝臓、大脳等に、検出され、ウイルスの母子間移行が確認された。今後、出生児が障害を持つか否かを検討し、モデル系作成の可能性を調べる。我国で流行している風疹ウイルスの病原性と流行様式との関係に注目して分離ウイルス株の遺伝子の塩基配列を比較する事により、分子疫学的分析を行った。ウイルスE1遺伝子のほぼ全長を含む1462塩基について、1960年代の分離株5株について比較した。この5株は、その後弱毒化されて生ワクチンとなったものであり、各ワクチン株の塩基配列による同定のデータとしても利用可能である。米国で分離されたTherien株と比較して、夫々の株固有の変異を調べた。1)5株に共通する変異が15塩基に存在する。

これは、我国の分離株の共通の特徴の様に思えるが、米国での他の分離株の塩基配列と比較してみると、むしろ、Therien株固有の特徴が表れていたものと解釈できる。2)Takahashi株及びMatsuba株のみに共通する変異が18塩基に存在する。また、Matsuura株及びTo-336株のみに共通する変異が6塩基に存在する。TCRB19株の固有変異が8塩基に存在した。この5株が大きく3つのグループに分けられる事がわかったが、これは各株の分離場所と分離年を反映しているものと思われる。即ち、Takahashi株(島根1968)とMatsuba株(熊本1969)は西日本、Matsuura株(大阪1966)とTo-336株(富山1967)は中日本、TCRB19株(東京1965)は東日本と地理的に分ける事ができる。三つの異なるウイルス株がそれぞれの地域で別個に流行していた可能性が考えられる。現在の流行ウイルス株において、1960年代の分離株との間に、どの様な類似性や系統関係があるのかを調べるのが、今後の課題である。風疹ウイルスは先天性風疹症候群(CRS)を引き起こす原因ウイルスであるが、この風疹ウイルスの病原性と流行様式との解析を目的として、我が国を含むアジア地域における分離ウイルス株の遺伝子RNAの塩基配列を比較し、分子疫学的研究を行った。RNAの中のE1翻訳領域1443塩基を含む1484塩基を主な対象として、塩基配列を決定した。使用したウイルス株は15株あり、日本12株(1960年代5株、1990年前後7株)、香港2株(1980年代)、中国1株(1980年)である。分析の結果、(1)1960年代の日本においては、少なくとも3グループのウイルス株が同時に平行して流行していたと思われた。3グループは、それぞれ西日本、中日本、東日本の3地域に対応していた。(2)1990年頃の日本においては、1960年代とは異なったグループの株が全国的に1グループで流行していた。(3)中国大陸の株は、日本の株とは別のグループに属すると思われる。その中では、中国株と香港の1株との間に強い近縁関係が見られた。(4)弱毒化した日本のワクチン3株においてその原株との比較ができたが、弱毒化に共通した変異は、見られなかった。弱毒化に関与する部位が株毎に異なるのか、または、E1以外の他の領域が関与しているのか、の何れかであると思われた。(5)CRS患者からの分離株においては、同じグループに属していても変異数が多いという傾向があり、持続感染による影響があった可能性が考えられた。
ヒト細胞の紫外線誘発プロテアーゼの抽出精製

ヒト細胞は紫外線照射により多面的応答をするが、その応答の初期の過程に関与するプロテアーゼを求める方法の基礎を確立した。即ち、直接プロテアーゼタンパク質を分離抽出する方法と、プロテアーゼタンパク質の構造遺伝子ないし活性制御遺伝子を探索する方法の2方法である。タンパク質の分離抽出法については、用いる培養細胞の生理的条件を決め、次に、その細胞からの抽出条件を決定した。また、目的プロテアーゼがアンチパインと呼ばれるプロテアーゼインヒビターに高感受性であることから、アンチパイン結合能のあるタンパク質を分離するアフィニティーカラムクロマトグラフィー法を確立した。遺伝子の探索については、アンチパイン高感受性プロテアーゼの活性レベルが紫外線照射直後上昇する細胞と上昇しない細胞との同一系統株を得ていることから、そのプロテアーゼ誘発が遺伝的支配形質であることを両細胞遺伝子DNAの相互移入法により確認した。次に、Differential display法により、両細胞で発現の違いがある遺伝子類を抽出することに成功した。これら候補となる遺伝子の中から目的プロテアーゼに関連する遺伝子を求める為の他の基礎実験、例えば、遺伝子決定判断となるトランスフィクションアッセイ法などを準備した。今後の課題は、求めるプロテアーゼが極めて不安定物質であり、活性を長期間維持する方法を求める必要がある。一方、複数遺伝子から目的遺伝子を可能な限り能力よく探す方策が必要である。しかし、これらの諸問題解決する方策は基本的にできあがったと考えられ、あとは人手と資金を必要とする段階となってる。ヒト細胞が紫外線照射後多面的応答をする初期の課程で,アンチパインに高感受性のプロテアーゼが関与することを,これまでの研究成果から想定している。今回,このプロテアーゼの抽出精製に至適な条件について,デタ-ジェントなど使用する試薬の改善ができた。目的プロテアーゼの細胞内局右については,これまでの細胞膜局右という予測に反し単離核でもその活性が確認された。一方,インターフェロンにより誘導されるアンチパイン高感受性のプロテアーゼ活性を見い出しているが,このプロテアーゼと上述のプロテアーゼの両活性共に,G1細胞周期でレベルが最大であった。以上の目的プロテアーゼ代謝の特色を目印として,分離抽出を次年度も続ける予定である。紫外線照射直後の培養ヒト細胞で活性増大を示し,照射後の多面的細胞応答を制御するプロテアーゼを求めている。これまでの研究成果をふまえて,モデル細胞を用い,直接プロテアーゼ蛋白質を分離抽出するための方策とプロテアーゼ蛋白質の構造遺伝子が活性制御因子の遺伝子を探索するための方策を検討した。前者では目的プロテアーゼがアンチパイン高感受性であることから,アンチパイン結合タンパク質を分離抽出する方法を確立した。後者では,目的プロテアーゼ活性の紫外線によるレベル上昇がある細胞とない細胞を同一系統株として樹立してあるので,Differential display法により候補遺伝子断片を複数個得ることに成功した。この両面から,目的プロテアーゼを求める方策が一応確立できたと考える。
強磁性ハーフメタル状態を発現する層状コバルト酸化物の合成とその特性評価

本研究では、層状コバルト酸化物Na_xCoO_2において、強磁性ハーフメタル状態など強電子相関効果がもたらす特異な電子状態の発現を目指し、化学組成・局所構造を精密制御した試料の作製、及びその電磁気特性評価を行った。以下に主な成果を示す。1.Na_xCoO_2の試料作製法を最適化することで、Na量xを精密制御する手法:"rapid heat-up"法を確立した。本手法を用いてNa-rich試料(x=0.75)を作製したところ、Tm=22Kにおいて新しい異常磁気相転移を発見した。この磁気相転移は2次転移であることが比熱測定により確認され、極めて小さな自発磁化、抵抗率と熱起電力の温度曲線における折れ曲がり、巨大な正の磁気抵抗を伴う特異なものであることが明らかになった。2.Na_xCoO_2のウィスカー単結晶の育成に初めて成功した。本物質は通常のフラックス法を用いると平板状の結晶が得られるが、本研究では仕込原料にカリウム源を加え高温熱処理を施すことで1次元的形状を持つウィスカーを作製する手法を確立した。結晶の長さは最大で1.6mm程度であり、ICP及びSEM-EDSよりNa量はx0.5であることが明らかになった。ウィスカー結晶の電気抵抗率及び熱起電力測定により、本物質のウィスカー結晶が優れた熱電変換特性を有することが確認された。3.Na_xCoO_2の関連物質である様々な層状ミスフィット酸化物[Ca-Co-O, (Bi, Pb)-Sr-Co-Oなど]について、酸素不定比性やCoイオンの原子価状態と熱電変換特性の関係を調べた。熱天秤を用いた熱分析によって、本物質の酸素不定比牲の大きさは化学組成により幅広く変化することが判明した。また、酸化還元滴定法の結果より、本物質中のCoイオンは3.03.3+という高い原子価状態を持つことが実験的に明らかになった。
プラスミド解析によるクラミジアの疫学的研究

男子尿道炎患者4例、子宮頸管炎患者2例、新生児結膜炎患者1例から分離、経代したChlamydia trachomatis7株とC.trachomatis L_2/434/Bu(予研分与)の基本小体(EB)を精製し、常法に従って可溶化後、アガロース電気泳動法によってプラスミド分離を試みた。その結果、患者27(男、19歳、IgG1:64、IgM1:16)由来株に3.4、4.6×10^6ダルトンの2種のプラスミドを認めた。患者607(男、19歳、IgG1:256、IgMー、IgA1:4)、688(女、26歳、IgG1:512、IgMー、IgA1:32)、756(女、13日、母のIgG1:256、IgM-、IgA1:64)由来株のプラスミドは3.4×10^6ダルトン、患者491(男、31歳、IgG1:128、IgM-、IgA-、パートナーからも同一株を分離)、641(女、20歳、IgG1:256、IgM-、IgA1:8)由来株のプラスミドは3.6×10^6ダルトンであった。L_2株には患者27同様、3.6、4.6×10^6ダルトンのプラスミドを認めた。各分離株の血清型を単クローン抗体(Washington Research Foundationより購入)によるmicro IF法で調べたところ、患者27と641由来株はE株、607由来株はJ株、756由来株はJ/B株、688由来株はG株、491株はF/B/D株であった。患者524(男、45歳、IgG1:4、IgMー、IgA-)の血清型は複雑で決定できず、また十分量のEBを得られなかったためプラスミドを認め得なかった。L_2株及びプラスミド非保有TWAR株を基準として分離株のMINO、DOXY、EM、TE031、OFLXに対する感受性を検索した結果、これらの間に有意差を全く認めなかった。また分離株EBのPAGEパターンにも差を認めなかった。以上の結果はC.trachomatisが3.4または3.6×10^6ダルトンのプラスミドを有しており、その普遍性から抗原に代るマーカーとして利用できる可能性を示唆すると同時にプラスミドは少なくとも薬剤感受性、外膜蛋白組成、抗原性、増殖性に関与していないcryptic formであることを示している。分離プラスミドの制限酵素によるマッピング、塩基配列に関しては現在検索中である。
ファジィ理論等を用いた京都の昼夜の景観様相変化の識別構造の研究

1)京都の景観に対するTEXT調査:江戸期名所図絵・近代絵画・現代観光情報誌に描写された京都の昼・夕・夜景画像の視点場・景観構成要素、構図的特徴を整理し、各時間帯においてどのような景観が捉えられやすいかを把握した。2)光景画像の作成:上記の景観(空・山・市街地・水面からなるマクロスケールな景観)に対し、定点観測による写真撮影(昼から夜まで5分間隔で撮影)を行い、得られた写真をコンピュータに取り込み光景画像を作成した。3)分析尺度の検討:分析処理の対象である光景画像の明暗・色彩の扱いについて、RGB表色系とマンセル表色系のHVCの関係を検証し、MTMによるRGBからHVCへの変換方法によって、本研究で尺度として用いる(H, V, C)を定義した。4)分析1:光景画像(濃淡画像)の2次元ウェーブレット変換を行い、レベルごとの特徴から、光景画像を景観構成要素の分化として捉えることが可能であることを示した。5)分析2:光景画像の明度および彩度分布を、判別基準に基づき二値化処理して、画像の明暗・彩度の構成を把握する方法を提案した。これにより夕刻の光景の変化の過程を、景観構成要素(空・山・水面・市街地)の明度・彩度の変化から生じる明暗・彩度のまとまり構成の変化として把握した。6)分析3:ラプラシアンフィルタによるエッジ検出の手法を用いてエッジを抽出し、判別基準に基づいて、光景の時系列変化における相対的に強い輪郭線の出現・消失を把握した。7)以上により、曖昧で複雑な夕刻の光景変化の特徴を把握する方法として、画像の明暗・色彩分布を分析する方法を検討し、画像処理の方法を用いて、山・空・水面・市街地の景観構成要素の組み合わせからなる夕刻の光景変化の特徴を、景観構成要素の分化・同化の過程として捉え、視覚的なまとまり構成と輪郭線の強さが変化していく過程として把握・表現できることを示した。○京都の景観に対するTEXT調査江戸期名所図絵・近代絵画・現代観光情報誌に描写された京都の昼・夕・夜景画像の視点場・景観構成要素、構図的特徴を整理し、各時間帯においてどのような景観が捉えられやすいかを把握した。その結果、京都が基本的に備えている地形的特徴(三山、都市内河川といった自然的要素)が昼夜の景観を構成する大きな要素となっていることがわかった。また寺社仏閣と、それらとの関わりで行われる年中行事の様子が、京都の景観のイメージに大きな役割を果たしていることがわかった。○分析対象景観の選定上記の結果から、いくつかの典型的な景観(山並み、河川、池などの組み合わせからなる景観)を選定し、それらを分析対象とすることとした。○景観画像の作成と分析方法の検討上記の景観に対し、定点観測による写真撮影(昼から夜まで5分間隔で撮影)を行い基礎資料とした。得られた写真をコンピュータに取り込み景観画像を作成した。景観画像上の明るさや色彩、テクスチャーなどの情報の時間的変化の特徴を画像処理によって定量的に把握するための基礎となる尺度について検討した。今後の識別実験との関係、および画像の再現性の観点から、画像のRGB値を心理的な直線性のよいHVC値に数学的に変換するプログラムを作成して、変換方法の妥当性を検討し、画像分析の尺度としてこのHVC値を用いることとした。○識別実験(予備実験)数名の被験者を用いて、昼から夜への景観写真の変化に対する印象変化を調べる実験を試験的に行ない、昼夜間の景観の印象変化と景観構成要素の関係について考察することを試みた。その結果、変化を感じる時間帯や時刻について、人工的な景観構成要素の有無や、山が主たる景観構成要素の一つとなっているか否かの違いが影響を与えることが推察された。あわせて実験方法の再検討が必要であることもわかった。

7)以上により、曖昧で複雑な夕刻の光景変化の特徴を把握する方法として、画像の明暗・色彩分布を分析する方法を検討し、画像処理の方法を用いて、山・空・水面・市街地の景観構成要素の組み合わせからなる夕刻の光景変化の特徴を、景観構成要素の分化・同化の過程として捉え、視覚的なまとまり構成と輪郭線の強さが変化していく過程として把握・表現できることを示した。
電気めっきを利用したナノ多層膜形成とその力学特性

異なる金属を交互に積層させることにより作製する多層膜は,一層あたりの層間隔をナノスケールまで減少させることによって優れた強度特性が期待できる.これまでの研究結果から多層膜の硬度は層間隔に依存し,硬度は層間隔の減少にともなって増加するが,層間隔が10nm付近で極大値となり,それより短い間隔では急激に硬度が低下するということがわかっている.本研究ではこの原因を明らかにするため,TEMを用いて銅単結晶上に作製したNi/Cuナノ多層膜の微視的構造を調査した.正面方位(111)の銅単結晶を作製し,それぞれの基盤の上に層間隔h=5nmおよび100nmのNi/Cuナノ多層膜コーティングを施した.多層膜の作製法には電気めっき法を利用した.層間隔100nmの多層膜断面のTEM観察では,Ni層とCu層の交互の積層が確認できた.その電子線回折像では斑点は分裂していた.これは銅とニッケルの格子定数が異なることに起因しているが,このことからNiとCu層は同じ方位に成長していることが明らかになった.結晶方位が同じで,格子定数が異なる金属間の界面には幾何学的にミスフィット転位が存在するはずであるが,TEM像からもミスフィット転位のコントラストが確認できた.このようなミスフィット転位が多層膜の高強度の原因である可能性がある.層間隔5nmの多層膜断面のTEM観察では,この多層膜では複数の結晶粒から構成されていることがわかった.EDS分析の結果,この多層膜ではNiとCu濃度が均一ではなかった.その微視的構造も均一ではなく,多層膜構造が見られた領域や多層膜がない領域,さらには双晶が形成された領域が混在していた.多層膜が見られた領域でも層間隔100nm多層膜のような回折斑点の分離が見られないため,界面にミスフィット転位が存在していない可能性がある.多層膜のない領域やミスフィット転位がない多層膜がこの多層膜の強度低下の原因の一つと考えられる.ニッケルと銅の交互の積層から構成されるNi/Cu多層膜をイオン化傾向の差を利用した電気めっき法により作製し,その硬度および耐熱性を測定し,さらに微視的構造をX線回折で調査した.Ni/Cu多層膜の作製には,アミド硫酸ニッケルと少量の硫酸銅を含んだ水溶液を用いて,電位を矩形波的に与えることによって焼鈍した銅多結晶表面に形成させた.ニッケル層と銅層との厚さの比率を1:1に固定し,個々の層の1層あたりの厚さと積層数を変化させた多層膜を作製し,それに対してビッカース硬さ試験をおこなった.硬度は層厚さが薄く,積層数が多いほど増加し,一層あたりの厚さが25nm,積層数60層の条件では硬度は最大となり約Hv400に達した.また,一定温度で多層膜を焼鈍した後に,硬度を測定した結果,焼鈍温度が300°Cの条件で硬度が一旦極大値に達するが,それ以上の温度では急激に硬度が低下した.X線解析でも,300°CまではNiとCu相の存在が確認できたが,それより高い温度ではNi-Cu合金相が現れ,全率固溶型のNi-Cu系では拡散によって容易に多層膜構造が失われてしまうことが判明した.このようなNi/Cuナノ多層膜の欠点を克服するために,Co/Cuナノ多層膜の形成も試みた.Ni-Cu系とは異なり,Co-Cu系は高温でも2相に分離したままなので高い耐熱性が期待できる.硫酸コバルトと少量の硫酸銅を含む水溶液を用いることで,Co/Cu多層膜を作製することに成功した.Co/Cu多層膜もNi/Cu多層膜と同様に優れた硬度特性を有していることを確認した.異なる金属を交互に積層させることにより作製する多層膜は,一層あたりの層間隔をナノスケールまで減少させることによって優れた強度特性が期待できる.これまでの研究結果から多層膜の硬度は層間隔に依存し,硬度は層間隔の減少にともなって増加するが,層間隔が10nm付近で極大値となり,それより短い間隔では急激に硬度が低下するということがわかっている.本研究ではこの原因を明らかにするため,TEMを用いて銅単結晶上に作製したNi/Cuナノ多層膜の微視的構造を調査した.正面方位(111)の銅単結晶を作製し,それぞれの基盤の上に層間隔h=5nmおよび100nmのNi/Cuナノ多層膜コーティングを施した.多層膜の作製法には電気めっき法を利用した.層間隔100nmの多層膜断面のTEM観察では,Ni層とCu層の交互の積層が確認できた.その電子線回折像では斑点は分裂していた.これは銅とニッケルの格子定数が異なることに起因しているが,このことからNiとCu層は同じ方位に成長していることが明らかになった.結晶方位が同じで,格子定数が異なる金属間の界面には幾何学的にミスフィット転位が存在するはずであるが,TEM像からもミスフィット転位のコントラストが確認できた.このようなミスフィット転位が多層膜の高強度の原因である可能性がある.層間隔5nmの多層膜断面のTEM観察では,この多層膜では複数の結晶粒から構成されていることがわかった.EDS分析の結果,この多層膜ではNiとCu濃度が均一ではなかった.その微視的構造も均一ではなく,多層膜構造が見られた領域や多層膜がない領域,さらには双晶が形成された領域が混在していた.

多層膜が見られた領域でも層間隔100nm多層膜のような回折斑点の分離が見られないため,界面にミスフィット転位が存在していない可能性がある.多層膜のない領域やミスフィット転位がない多層膜がこの多層膜の強度低下の原因の一つと考えられる.
ポドサイトの細胞認識と形態調節機能から探る腎糸球体硬化症発症の分子機構

【背景】家族性ネフローゼ症候群の遺伝子解析によって、現在まで2つの疾患遺伝子NPHS1(ネフリン)、NPHS2(ポドシン)が同定されている。これらはいずれも、ポドサイトスリット膜に限局して発現していること、特殊な脂質マイクロドマインに存在していることなどの共通点がある。ポドシンは、ストマチン関連蛋白で、ラフトマイクロドメインを形成するScaffolding(足場)蛋白と推測されているが詳細は不明である。【目的】本研究では、ポドシンの結合蛋白を酵母2ハイブリット法でスクリーニングすることで、スリット膜に形成される蛋白複合体の性状を明らかにし、ネフローゼ症候群発症の鍵となる分子の同定を試みる。【結果】Bait-Preyの相互作用をProQuest Syetemを用いて解析した(Invitrogen)。ラット糸球体を単離した後、mRNAを抽出し、サイズ分画2-4kbのcDNAライブラリーを作成し、pDEST22preyベクターに挿入した(Gal 4ADとの融合蛋白)。ポドシンのC端100 bpをpDEST32 baitベクターにサブクローニングした(Gal4DBDとの融合蛋白)。BaitとpPC86ベクターで指示酵母MaV203を形質転換し至適3AT濃度(10mM)を決定した。次に、一次スクリーニングとして100万クローンのラージスケールでMaV203をトランスフォームし、3ATプレートに生育した36クローンを選択した。現在2次スクリーニングとして、β-Gal,5FOA, Uraで選択を行っている。【考察】ポドシン結合蛋白の同定は疾患の発症機序解明に大きく貢献すると考えられる。今後酵母の実験系で得た相互作用を、真核生物やin vivoで検証することや、実際のヒトネフローゼ患者でどうなっているかを検討する必要がある。背景近年、ヒト家族性腎糸球体硬化症のポジショナルクローニングにより新たな疾患遺伝子ポドシンが同定された。この蛋白はカベオリン様のヘアピンループ膜貫通構造を持つ、新規糸球体蛋白であるがその機能は不明である。目的ポドシンは、糸球体ポドサイトに特異的に発現しているが線虫触覚センサーを構成分子であるmec2と40%のアミノ酸相同性を示す。このことはポドサイトの外的要因認知と細胞応答に関わる分子機構が腎糸球体硬化症の病因に関与していることを示している。そこでポドシンに結合する蛋白群の分子特性を解析することにより、糸球体硬化症発症に重要な遺伝子を同定する。方法酵母2ハイブリッドスクリーニングで、新規ポドシン結合蛋白をクローニングする。この際、ポドシンのC端側200アミノ酸をベイトとして、ラット腎糸球体ライブラリー(1x10^7 CHU)をスクリーニングする。結果ラット腎糸球体からmRNAを抽出し、CloneMiner Kit (Invitrogen)を用いてcDNAライブラリーを作成した。Gateway technologyを用いてcDNA挿入長1.5-4.0 kbを、挿入効率90%でpDEST22ベクターにサブクローニングし、総クローン数1×10^7 CFUを得た。ベイトについても、同様にGateway technologyでpDEST32ベクターに挿入し、シークエンスで塩基配列に人工的な変異がないことを確認した。考察ラット腎糸球体cDNAライブラリーの構築が完成し、スクリーニングを開始する。
細胞壁形成の空間的制御機構に関する細胞生物学的研究

1.イチイ有縁壁孔の形成過程にも表層微小管が関与しており、細胞壁の局在的沈着と微小管との関係がみられた。2.エンドウ上胚軸の細胞壁内面のセルロース微繊維の配列を立体的に観察する方法を検討、確立し、道管要素の微繊維の配列を調べた結果、微繊維がセルロース合成の無い壁孔部に侵入すると直ちに途切れることが観察された。このことは、道管要素の原形質膜の性質が二次肥厚部と壁孔部とで異なっていることを示している。3.ヘミセルロースの沈着を調べたところ、管状要素中の分布は、二次肥厚パターンに完全に一致していた。ヘミセルロースはセルロースと違い、細胞質中で合成されてから細胞外へ小胞輸送されることから、2つの成分の異なる沈着機構を共通に制御する仕組みが存在するものと推定された。4.微小管阻害剤で処理すると、セルロースの沈着もヘミセルロースの沈着も、肥厚パターンの乱れと全く同じパターンで乱れた。このことは、微小管が二次肥厚部と壁孔部の原形質膜の堺の位置を決めるのに関与していることを示している。5.以上の結果より、次のような仮説を提案した。「セルロース合成酵素複合体やヘミセルロースを運ぶゴルジ小胞は二次肥厚部の原形質膜にのみ融合する。原形質膜に運ばれた複合体は微繊維を合成しながら原形質膜中を移動するが、壁孔部には入りにくい。たまたま入ると解離して失活してしまう。ヘミセルロースは、二次肥厚部にのみ沈着することになる。一方、表層微小管は二次肥厚部と壁孔部との境界の位置を定める。」6.この仮説を検証するために、細胞壁合成にかかわる原形質膜蛋白質を分離、同定しようと試みた。セルロース合成を盛んに行っている時期と合成をほとんど行っていない時期のミカヅキモの原形質膜蛋白質を比較すると、いくつかのスポットで差が見られた。今年度の研究では、細胞壁形成の分布の制御に関連して、導管要素の二次壁肥厚に対する二種類の新しい知見を得た。レプリカ法を用い、エンドウ根の導管要素の細胞壁内面における微繊維の配列を調べた。エンドウの根の管状要素は、楕円形の壁孔を持つ孔紋と呼ばれる模様の二次壁肥厚を形成する。このような肥厚では、丁度、岩が点在する川の中の流れのように、平行に走る微繊維が観察された。一方、壁孔が互いに違いに並んでいる所では、微繊維が壁孔の中へ流れ込むように向かって進み壁孔の緑で中断しているのが見られた。このことを合成酵素顆粒の動きに翻訳すると、顆粒が壁孔部の原形質膜領域に入ると合成活性を失うということになる。つまり、導管要素の原形質膜はセルロ-ス合成酵素顆粒を活性化する領域と不活性化する領域とに分かれており、前者が二次壁肥厚部、後者が壁孔に対応しているものと考えられる。一方、表層微小管は二次壁肥厚を裏打ちするように分布していた。薬剤で微小管を破壊すると、本来比較的規則的なはずの紋様が様々に変形した。しかし、二次肥厚部と壁孔の境は依然として明瞭であった。このことは、表層微小管が、原形質膜の二つの領域への分離には関与していないが、二次肥厚の紋様パタ-ンを決定、維定するためには不可欠であることを示している。

一方、微小管を薬剤で破壊すると、FーWGA結合ヘミセルロ-スの分布も、二次肥厚と同じパタ-ンで乱れる。このことは、ヘミセルロ-スの沈着も、微小管によって制御されているこを示してする。ヘミセルロ-スはセルロ-スと違い、細胞質中で合成されているから細胞外へ小胞輸送されると考えられることから、二つの異なる沈着機構を共通に制御する仕組みが、微小管を介して働いていると推定される。局在的細胞壁形成の一例である、イチイの有縁壁孔の形成過程でも、微小管が重要な働きをしていることを明らかにした。当初計画では、水性二層分配法によってミカヅキモから原形質膜を分離し、原形質膜蛋白質を調べその局在性を検討する予定であったが、実際やってみると葉緑体膜が多く混入し原形質膜の純度が上がらないことが解った。そのため、原形質膜を単離し易いタバコBY-2細胞を用い阻害剤によって人為的に不均一な成長をする状態をつくり原形質膜蛋白質を調べることにした。様々な試行の後、APM処理をすると局在的な成長が見られることを見いだした。こうした局在的な成長は局在的な細胞壁の変化に由来すると考えられるので、次にこの局在的な成長にともなって細胞壁の微細構造にどのような変化が見られるかを調べた。タバコBY-2細胞から細胞壁を単離し、ポリリジンを塗ったカバーグラスにはりつけ、100%t-ブタノールにまで脱水して凍結乾燥した。ロータリーシャドーした後、電子顕微鏡で立体的に観察した。また、単離した細胞壁を直接ネガティブ染色して観察した。その結果、APM処理した細胞の細胞壁ミクロフィブリルには、一定の間隔でマトリックス成分が結合していることが観察された。今後、このような構造を構成している多糖類の特徴を明らかにすることが重要であろう。一方、細胞壁沈着の局在性への微小管の関与について、その普遍性を検討するために、イチイの有縁壁孔の形成過程を検討した。イチイの有縁壁孔は細胞壁の局在的な沈着によって起こるが、その形成過程をSEM、間接蛍光抗体染色法、電顕観察で検討した結果、縁の形成にも表層微小管が関与しており、細胞壁の局在的沈着と微小管との関係は、この場合にもみられることが明らかになった。タバコBY-2細胞をアミプロフォスメチルで処理すると、細胞成長の方向性が失われ、細胞は丸く膨潤するが、その膨潤は細胞全体ではなく細胞の一部から起こることが解った。このことは、膨潤の起こった部分と起こらなかった部分で、細胞壁に何らかの違いがあることを意味している。そこで、膨潤の起こった部分と起こらなかった部分の細胞壁の構造的違いを、超薄切片法、真空蒸着法を用いて調べることにした。その結果、細胞壁の厚さ、およびミクロフィブリルの配向には大きな違いが見つからなかった。さらに、細胞壁のメッシュワークの微細構造を調べるために、細胞壁をカバーグラスに張り付け、t-ブチルアルコール凍結乾燥法によって乾燥した後回転真空蒸着法によってレプリカを作り、電顕で観察したが、微細構造にも大きな違いは見いだされなかった。今後、さらに、明確に違いを検出できる別の方法を考案する必要がある。一方、ミカヅキモで細胞壁の局在的合成が起こる時期と起こらない時期で、原形質膜を多く含む分画を水性二層分配法で集め、二次元電気泳動法で膜蛋白の違いを調べた。その結果、いくつかのスポットで違いがあることが解った。これらのスポットを一つ一つ分離、同定するところまで至らなかったが、今後それをすることにより、細胞壁の局在的合成にかかわる原形質膜蛋白質を明らかにできるであろう。ところで、細胞壁の局在的合成に重要な役割を果たしている表層微小管の特徴をよりよく理解するために、トウモロコシの節間における随状分裂組織の分化過程で微小管配列がどのように変わるかも、間接蛍光抗体染色法によって調べた。
アクチビンによるシナプス形態の可塑性と記憶形成の制御機構

アクチビンの機能改変動物を作成しその行動解析を行うことで,アクチビンが記憶の形成や保持に果たす役割を調べた。学習課題として文脈依存的恐怖条件付けを用いて,脳のアクチビン機能が恐怖記憶の固定化に必要であることを明らかにした。さらに,恐怖記憶の再固定化・消去過程における前脳のアクチビン機能を検討した。Tet-OFF systemを利用して,アクチビン阻害タンパク質ラォリスタチン(fol)の発現を前脳特異的にDOXでON/OFF制御できるtransgenic miceを作成した。Fol/OFFで条件付けを行うと,恐怖記憶は正常に形成され1週間以上保持された。この条件で記憶を形成させたあと,fal/ON、すなわち前脳のアクチビン機能が阻害された状態で恐怖記憶を想起させると,その後の恐怖記憶の抑制が観察された。このことは,想起時にアクチビン機能を阻害することで一度形成された恐怖記憶が抑制できる事を示しており,恐怖記憶の再固定化にアクチビンが重要な働きをしていることを示唆している。以上の結果は,恐怖記憶の想起時に前脳のアクチビン機能を阻害すると,一旦強固に形成された恐怖記憶を減弱させることができる事を示唆している。トラウマ体験により引き起こされるPTSDを始めとする精神疾患の根本的な新規治療法への展開が期待される。アクチビンの機能改変動物を作成しその行動解析を行うことで、アクチビンが記憶の形成や保持に果たす役割を調べた。学習課題として、文脈依存的恐怖条件付けを用いた。アクチビンと、その阻害タンパクであるフォリスタチンをそれぞれ前脳特異的に過剰発現させた動物を作成し、恐怖条件付けを行った。これにより、アクチビン機能は長期記憶に必要のみならず、記憶の再固定化を促進させることが判明した。次に、Tet-OFF systemを利用したアクチビンとフォリスタチンの前脳特異的薬物(ドキシサイクリン、DOX)制御型のtransgenic miceを作成した。文脈依存的恐怖記憶の保持と想起時のみにアクチビンを過剰発現すると、記憶の再固定化の増強作用が観察された。一方、文脈依存的恐怖条件付けを行った後の記憶の保持期間中のみにフォリスタチンを発現させると、一度形成された恐怖記憶が見かけ上消去された。恐怖記憶の獲得時・保持期間・想起時にわたって連続してフォリスタチン発現を抑制すると恐怖記憶は正常に保持されていた。このことは、このtransgenic miceでは脳の発生が正常であることを示している。さらに、恐怖記憶想起時にフォリスタチンを発現させた場合は影響がなかったことから、アクチビンは恐怖記憶の想起には関与していないことが示唆された。短期記憶はフォリスタチンが常時発現している状態でも正常であった。以上の結果は、恐怖記憶の保持期間中に前脳のアクチビン機能を阻害すると、一旦強固に形成された恐怖記憶が消去できることを示している。PTSDの根本的な新規治療法への展開が期待される。
XPD変異を共通する二つの遺伝疾患でなぜ紫外線皮膚発がん感受性が異なるか?

同じXPD遺伝子に突然変異をもつ色素性乾皮症D群患者と硫黄欠乏性毛髪発育異常症(TTD)患者の間で紫外線皮膚がん発生頻度が大きく異なる機序を検討した。XPDを含む蛋白複合体TFIIHのヘリカーゼ活性は両患者細胞で低下しDNA修復欠損に差は見られなかった。TTD細胞では転写コアクチベーターとしても働くTFIIHの濃度が半減することから、栄養不足によるがん細胞の成長抑制がTTD患者の低発がん性に関係するかもしれない。太陽紫外線により高頻度に誘発されるピリミジンニ量体型DNA損傷は、ヒト細胞ではヌクレオチド除去修復(NER)で修復される。このNERに欠陥をもつ色素性乾皮症(XP)は、太陽露光部での高頻度皮膚発がん(健常人の5,000倍)などを特徴とする疾患であり、XP-Dを含む8種類の相補性群からなる。一方、硫黄欠乏性毛髪発育異常症(TTD)は脆弱な毛髪などを主徴とする疾患で、症例の約半数は日光過敏症を示し、その大半はXPD遺伝子に突然変異をもつ。しかし、太陽露光部での皮膚発がん頻度は健常人と変わらない。つまり、同じXPD遺伝子に変異をもつXP-D患者とTTD患者で皮膚がん発症頻度が大きく異なるがその分子機序は未だ明らかではない。本年度の研究では、皮膚発がん感受性差の機序を解明するため、両患者由来細胞のNER欠陥機序について詳細に比較検討した。その結果、XP-D細胞とTTD細胞は共に紫外線主要DNA損傷に対し修復欠陥を示すが、その修復欠陥の機序は両細胞間で異なることがわかった。つまり、XP-D細胞では基本転写・修復因子TFIIH(Transcription Factor IIH)のヘリカーゼ活性低下のみが起こるのに対し、TTD細胞ではこれに加え、TFIIHの細胞内濃度低下や損傷部位への集積異常も起こることがわかった。この結果は、DNA修復は両患者における皮膚がん発症頻度の差異に関係しないことを示す。一方、TTD細胞に特異的に起こるTFIIHの細胞内濃度低下は、TFIIHが甲状腺ホルモン標的遺伝子においてcoactivator作用を示すとする最近の報告を考慮すると、一部特定遺伝子の発現低下を導くことが考えられる。それ故、TTD患者における低発がん性の機序として、紫外線でinitiationされた細胞が一部遺伝子の発現不足のために皮膚がんに十分成長できないことが考えられ、来年度研究での検証が望まれるところである。XPD遺伝子変異を共通する色素性乾皮症D群(XP-D)患者と硫黄欠乏性毛髪発育異常症(TTD)患者で紫外線皮膚発がん感受性に大差が生じる原因を明らかにすることを目指す。昨年度の研究で、XP-D細胞とTTD細胞はXPDを含む複合体TFIIHのヘリカーゼ活性を低下させ、紫外線誘発ピリミジン二量体型損傷の修復に欠陥を示したことから、発がん感受性差にDNA修復が関係しない可能性が高くなった。一方、強調すべき点として、TTD細胞特異的に、TFIIHの細胞内濃度低下および損傷部位へのTFIIH集積量低下が生じることがわかった。また、Compeらの研究で、TFIIHは甲状腺ホルモン標的遺伝子においてcoactivator作用をもつこと、TFIIHの細胞内濃度低下は主に当該遺伝子の発現低下を導くことが示された。この結果は、TTD患者の低発がん性は、紫外線でinitiationされた細胞が一部遺伝子の発現不足のために皮膚がんに成長できないことが原因であることを示唆するので、本年度は、この可能性について検討した。まず、XP-DおよびTTD細胞に50%致死線量の紫外線を照射後培養し、細胞数が回復した時点で再び紫外線照射して培養した。このサイクルを数回繰り返すことで、initiationを受けた後、種々の期間増殖した細胞サンプルを用意した。これらの細胞について、紫外線皮膚発がんに最も深く関係する遺伝子の一つである変異型p53発現細胞の出現頻度をPAb240を用いた蛍光免疫染色で検討した。しかし、これまでの結果では両細胞間での有意な差異は観察されていない。また、正常、XP-DおよびTTD細胞の低濃度牛胎児血清培地中(0.1%10%)での増殖能を検討したが、甲状腺ホルモン(T3)の添加・非添加に関係なく差異は観察されていない。今後、両細胞間における蛋白発現量の差について網羅的に解析する。XPD遺伝子変異を共通する色素性乾皮症D群(XP-D)患者と硫黄欠乏性毛髪発育異常症(TTD)患者で紫外線皮膚発がん感受性に大差が生じる機序を解明することを目的とした。昨年度までの研究で、XP-D細胞とTTD細胞は共にTFIIHへりカーゼ活性の低下、およびピリミジンニ量体型紫外線損傷の修復欠損を示すことから、DNA修復は発がん感受性差に関係しないことが示唆された。一方、TTD細胞特異的な現象として、TFIIHの細胞内濃度低下および損傷部位へのTFIIH集積量低下が生じた。

最近の論文で、TFIIHは甲状腺ホルモン標的遺伝子においてcoactivator作用をもち、TFIIH濃度低下は主に標的遺伝子の発現低下を導くことが示された。この結果は、TTD患者の低発がん性は、紫外線でinitiationされた細胞がホルモン標的遺伝子などの発現低下のために増殖能を落とすことが原因であることを示唆するので、今年度はこの可能性について検討した。XP-DおよびTTD細胞に50%致死線量の紫外線を照射後培養し、細胞数が回復した時点で再び同線量の紫外線を照射して培養した。こうしてinitiationされてpromotion過程にあるモデル細胞を作製した。これらの細胞について、牛胎児血清濃度を低下させた培地(10%0.1%)で4目間の増殖能を調べた結果、TTD細胞は正常およびXP-D細胞に比べ増殖能が低下する結果を得た。この細胞増殖実験を低酸素(2%)下で行った場合も、同様の結果を得た。しかし、新たに5J/m2の同一紫外線量を照射した細胞モデルで増殖実験を行った結果、正常酸素の場合も、低酸素の場合も、XP-D細胞とTTD細胞間で有意な増殖差が観察されなかった。それ故、現時点ではTTD患者の低発がん性を増殖能の低下と結びつけられる証拠は限定的であり、さらなる検証実験が必要である。
画像処理を援用したレーザースペックル法による先進複合材料の疲労き裂発生機構の解明

画像処理を援用したレーザースペックル法を用いて、粒子強化複合材料の疲労き裂発生挙動の詳細観察を行った。供試材料としては、強化粒子としてSiC、Siの2種類を選び、母材金属としてはアルミニウム合金を用い、溶湯鍛造法および粉末冶金法により製造したものを用いた。溶湯鍛造法による複合材料では、比較的大きなSiC粒子が存在し疲労き裂は界面割れを起点として比較的初期に発生するため、疲労強度も低下する。それに対し粉末冶金法による複合材料では、き裂は母材とSiC粒子の界面近傍で発生するものの界面が割れることはなく、母材中のすべりにより発生することから疲労強度は母材に比較して特に低下することはない。き裂の進展は、前者の材料では小数の主き裂が成長するのに対し、後者では主としてき裂先端繰返し塑性域内に発生する微視き裂との合体により進展する結果、巨視的には荷重軸直角方向に進展するが、微視的にはジグザグを繰返し進展する。また、疲労き裂がSiC粒子にぶつかる場合、通常はSiC粒子の界面にそって進展するため、多くの微視的な屈曲をもたらしき裂進展抵抗を高める。さらに、き裂発生応力が高いため、微小き裂の進展下限界値の減少も小さいことなどを明らかにした。以上の結果、強化粒子を十分小さくし、均一に分布させた粒子分散型粉末冶金金属基複合材料は耐磨耗性のみでなく耐疲労強度材としても十分実用に耐えることがわかった。なお本研究では、走査電子顕微鏡観察画像の直接取込みと画像処理によりき裂進展長さ、き裂開口変位ならびにき裂先端近傍の変形場の定量的解析をも可能とした。さらに画像処理技術を用い、き裂発生起点となる介在物あるいは分散粒子寸法分布の計測とその極値統計解析から、実部材寸法における疲労強度推定法を提案した。
二核金属錯体の積層化による一次元鎖多核錯体への分子構築と新機能発現に関する研究

研究の初期過程は,スタッキング能力を有する目的配位子の合成から始められた。目的配位子(1)合成のために,(1)[架橋部分の合成→配位サイトの導入]とつながる経路と,(2)〔2核形成配位子の合成→架橋形成〕の2種類の反応経路を考慮したが,配位子生成が確認されたのは経路(1)の合成法であった。しかしながら様々な改善を試みても合成収率は10%に未だ届かず,今後も引き続き収率向上を目的とした合成・精製法の確立に取り組む必要がある。これと並行して,連結部位にn-ブチレン(2),p-キシレン(3)を有する配位子の合成を試みた。配位子2,3は,1に比べ立体制約を受け難いことから比較的良い収率で合成することができた。次に基本となる2核形成配位子の錯生成の評価を行った。二核化配位子と酢酸銅(II)や塩化銅(II)との反応では淡緑色の微結晶が得られ,一方臭化銅(II)との反応では青紫色の微結晶が得られた。緑色結晶はスタック型高分子錯体を形成しているものと推定され,一方紫色の錯体は臭素イオンの架橋能力によりμ_4-オキソ架橋の4核錯体を生成していると推定され,臭素イオン等の無い条件では強いスタック効果を誘発することが示された。次いで,目的配位子を用いた多核銅(II)錯体の合成を行った。配位子と酢酸銅(II)との反応では,いずれの配位子からも緑色の難溶性沈殿が生成した。いずれの錯体も配位子と銅イオンが1:2の組成比であり,また室温での磁気モーメントは1.41.6B.M.を示し,銅イオン間に反強磁性的相互作用が働いていることから,これらの錯体は高分子状多核構造を有していることが予想された。近似として4スタック分の分子データを作成しab initio計算による最適構造の推測を試みたところ,配位子1は強いスタック効果を誘発させるが,2や3では立体的制約から直鎖構造が最適構造であることが示唆された。当該年度の研究は,研究計画に従いスタッキング能力を有する配位子の合成から始めた。目的配位子の構造を簡単に説明すると,「平面状の2核形成配位子を上下に重ねそれぞれを有機的に架橋したもの」と,表現することができる。これを合成するために,我々は[架橋部分を作り,そこに配位サイトを導入する]方法と[2核形成配位子を作った後,架橋を行う]2通りの反応経路を考慮して実験を行った。このうち目的配位子の生成が確認されたのは前者の合成法であった。合成を確認はできたものの合成収率は10%以下と低く,また十分な精製法の確立も未だできておらず,引き続き収率向上を目的とした合成法の改善に取り組む必要がある。また,基本となる2核形成配位子の錯生成について評価を行った。配位子と酢酸銅(II)一水和物もしくは塩化銅(II)との反応では,弱アルカリ性の条件下で淡緑色の微結晶,一方臭化銅(II)との反応では青紫色の微結晶が得られた。

緑色結晶の方は,銅イオンの定量から銅の配位子が1:1の化合物を形成していることがわかり,また水や他の有機溶媒に不溶性であることからポリマー構造をとっているものと推定される。この場合,2種類のポリマーが考えられる。一つは2核化配位子がジグザグ上に架橋していく横方向の鎖状構造であり,もう一つは2核錯体自体が層状に積層したスタック型の鎖状構造である。現段階ではいずれのタイプの錯体が生成しているかを決めるには至っていないが,もしスタック型の錯体が生成しているのであれば,我々の目的とする化合物の比較対象として重要である。一方紫色の錯体は,近年いくつか報告されているμ_4-オキソ架橋の4核錯体ではないかと推定される。これは他の報告された錯体同様,反応溶液中に存在する臭素イオンが架橋配位子として働き,4核構造を安定化していることが推定され,対イオンによる構造の相違が現れており非常に興味深い。現在,ワークステーションを用いてこれらの錯種の分子軌道計算に取り組んでいる。当年度は,配位子精製法の確立及びこれによる多核銅(II)錯体の合成を中心に,研究計画に従い実験を進めた。連結部位にm-キシレンを有する当初予定の配位子(1)は,合成収率の改善にいまだ至らないため,n-ブチレン(2),p-キシレン(3)を連結部位に有する配位子の合成を試みた。配位子2,3は,立体制約を受け難いことから1に比べると良い収率で合成することができた。しかしながら,副生成物の分離が未だできておらず,引き続き収率向上を目的とした合成法の改善に取り組む必要がある。次にこれらの配位子を用いた多核銅(II)錯体の合成を行った。配位子と酢酸銅(II)-水和物とのメタノール中での反応により,いずれの配位子からも緑色の難溶性沈殿が生成した。銅イオンの定量により,配位子と銅イオンが1:2の組成比で存在していることが示された。また,室温での磁気モーメントは1.41.6B.M.を示し,銅イオン間に反強磁性的相互作用が働いていることから,これらの錯体はいずれも多核構造を有していることが予想される。残念ながらX線結晶構造解析に適した単結晶が得られないため,ワークステーションを使用したab initio計算による最適構造と電子状態の推測を試みた。構造最適化は,近似として4スタック分の分子データを作成し,SYBYL分子力場計算によって一次の最適化を行った後,3-21G^<(*)>計算を適用した。その結果,配位子1は強いスタック効果を誘発させるものの,2では熱力学的安定性から,そして3では立体的制約から直鎖構造が最適構造であることが示唆された。
C型肝炎ウイルスによる自然免疫の攪乱機構の解明

●申請者らは,HCV増殖細胞におけるHCV増殖と自然免疫系分子TLR3/RIG-1シグナルの関連について検討を進めてきた。そして前年度までにTLR3/RIG-1自身およびその下流のIPS-1,IKKepsilon,IRF3などのシグナル分子の発現を,siRNAおよび強制発現により制御し,HCV増殖の変化を解析することにより,HCVによる自然免疫シグナル伝達の阻害点を検討した。その結果,IPS-1より上流のRIG-1,MDA-5からのシグナルがHCV増殖により抑制されていることを示した。●今年度においては,まずHCVの非構造蛋白であるNS3/4AによってRIG-Iシグナルが阻害されることを示した。すなわちHCV-N株由来の種々の非構造蛋白発現プラスミドを作成,RIG-I,MDA-5,IPS-1発現プラスミドとco-transfectionし,ISRE活性をアウトプットとしてRIG-Iシグナル阻害能を検討したところ,NS3/4Aを発現させた場合においてのみ,RIG-Iのシグナル伝達は約30-50%に抑制された。またIPS-1より下流のTBK1,IKKepsilonとNS3/4Aのco-transfectionでは,RIG-Iシグナルは阻害されなかったことからNS3/4Aのターゲット分子は,IPS-1であることが考えられた。●申請者らはさらに,HCV株毎にそのRIG-Iシグナル阻害の程度が異なること,さらに阻害の程度と細胞内HCV増殖能が関連することを明らかにした。すなわち,培養細胞における高増殖性株であるHCV-Nとは別に,培養細胞における低増殖性株であるHC-J4由来のNS3/4A蛋白をRIG-I,MDA-5,IPS-1と共発現し,ISRE活性をアウトプットとしてRIG-Iシグナル阻害能を検討したところ,HCV-N株由来のNS3/4A蛋白による阻害能と比べて有意に弱かった。一方,RIG-Iシグナル経路のdefectiveな細胞であるHuh7.5.1細胞においては,ナイーブなHuh7細胞で低増殖性であったHC-J4株由来のHCVも,HCV-N株と同等に強い増殖活性を呈することを示し,NS3/4A蛋白による阻害能とHCV増殖に関連が認められることを明らかにした。●RNAウイルス増殖細胞では細胞内2本鎖RNAに対する自然免疫系が作動し、TLR3あるいはRIG-Iといった2本鎖RNAセンサー分子によるインターフェロン誘導遺伝子を活性化するが、HCVにおいてはこの系が抑制されていると考えられる。HCV増殖細胞でのTLR3,RIG-Iの発現変化、および2本鎖RNA刺激であるHCV増殖によるインターフェロン誘導遺伝子発現の修飾をISRE reporterassayおよびIRF3核内移行を指標に検討し、HCVによる自然免疫シグナル抑制とHCV増殖との関連を解析した。その結果、HCV増殖細胞においてはIRF3の活性化が抑制されていることが明らかとなった。●HCV増殖細胞においてTLR3およびRIG-I自身およびその下流のTRIF,IPS-1,IKKepsilon,IRF3などのシグナル分子の発現を、siRNAおよび強制発現により制御し、HCV増殖の変化を解析することにより、HCVによる自然免疫シグナル伝達の阻害点を検討した。その結果、IPS-1より上流のRIG-I、MDA-5からのシグナルがHCV増殖により抑制されていることが示唆された。●一方、HCV非構造蛋白であるNS3/4/5からなる増殖複合体がTLR3/RIG-I下流のシグナル伝達を阻害する結果を我々の研究グループは既に得ている。この機序を解明するために、種々のNS3/4/5変異体を作成し、HCV遺伝子変異がRIG-Iシグナル伝達に与える影響を明らかとして、HCV蛋白による自然免疫撹乱機構を解析した。その結果、NS3のヘリカーゼドメインの配列の相違によってIPS-1の活性阻害作用が影響されることが示唆された。これは、既報のプロテアーゼドメインによるIPS-1切断とは異なる機序で、HCV NS3蛋白が自然免疫系を抑制することを示唆しており、今後更に検討する予定である。

すなわち,培養細胞における高増殖性株であるHCV-Nとは別に,培養細胞における低増殖性株であるHC-J4由来のNS3/4A蛋白をRIG-I,MDA-5,IPS-1と共発現し,ISRE活性をアウトプットとしてRIG-Iシグナル阻害能を検討したところ,HCV-N株由来のNS3/4A蛋白による阻害能と比べて有意に弱かった。一方,RIG-Iシグナル経路のdefectiveな細胞であるHuh7.5.1細胞においては,ナイーブなHuh7細胞で低増殖性であったHC-J4株由来のHCVも,HCV-N株と同等に強い増殖活性を呈することを示し,NS3/4A蛋白による阻害能とHCV増殖に関連が認められることを明らかにした。