hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
児童虐待防止法とその運用の日米比較研究

わが国の児童虐待防止法の問題点と児童虐待対策の実態・運用の問題点について、アメリカ法を研究することにより検討を行った。(1)まず、わが国では通告義務が徹底されていない。虐待の疑いの段階で通告すべきこと、通告が誤報でも刑事・民事の責任は問われないことを明文化すること、そして通告義務に違反した場合の罰則規定についても今後検討していく必要がある。(2)次に、児童相談所(以後児相とする)の充実については、アメリカに比べ職員の数が圧倒的に不足しており、施設も整備されていない。早急な対策が必要である。(3)法的手続については、一時保護の後に司法審査を行わないわが国の現制度では親と子の適正手続の権利が守られていない。任意の行政不服申立ではなく、必須の司法審査によらなければ、児相は引取り要求に来た親に対抗する法的根拠を持たない。さらに、児相の計画(親子再統合か長期の引離しか)に対する司法審査や、28条審判後に施設から子が戻る場合の司法審査が現在存在しないため、法的根拠のないままで児相はその方針を親に説得できず、児相はその役割に矛盾を抱え、積極的な行動をとりにくい状況である。被虐待児の処遇について行政(児相)ひとりに任せるのではなく、司法主導による、法的権限に基づいた一連の手続体制が整えられるべきである。(4)最後に、司法審査の充実と共に弁護士の役割が重視されなければならない。現在弁護士の立場は曖昧で、親と児相と子との調整役として活動せざるを得ない状態だが、三者各自に代理人をつけるべきである。子どもの利益を守るためには、代理人の役割は重要である。親権喪失については子どもに申立権がないため、子どもの代理人がそれを行うことはできないが、民法は検察官による申立を認めている。実際、親族や児相が親権喪失申立に消極的な場合には検察官による申立が必要なケースが少なくない。今後、検察官の役割について検討していく必要がある。「アメリカにおける児童虐待に関する法制度の概要」(未公表)をまとめ、各種研究会で報告を行った。1.1974年に成立し、1996年に改正された連邦「児童虐待の防止と対応に関する法(Child Abuse Prevention and Treatment Act、以下CAPTAとする)」は、各州が児童虐待の定義、児童虐待通告手続、子どもの代理人の選任等に関する立法を義務づけた。しかし、各州が制定する立法には裁量があるため、その内容には幅がある。そこで、50州法の(1)児童虐待の定義、(2)通告義務者、(3)秘密記録の閲覧ができる者、(4)親権終了の要件、(5)通告を怠った場合の措置について、その違いと特徴を比較検討した。2.アメリカでは児童虐待が発見されてすぐに司法が関わるが、この一連の手続については未だわが国では明らかにされていない。本研究では、1997年に成立した連邦「養子縁組および安全な家族に関する法(Adoption and Safe Families Act、以下ASFAとする)」に基づき、児童虐待の発見後、家庭裁判所により行われる未決拘束審理、事実認定審理、処分決定審理、恒久的計画審理、親権終了審理、そして養子縁組審理に続く司法手続きについて、特にペンシルバニア州の立法をもとに図式化し、基本的な司法の流れを明らかにした。3.CAPTAおよびASFAにより、州は児童虐待法制度を体系化することが義務づけられたが、州はそれに従った法制度を確立し、それを正常に運用させなければ連邦からの予算が生じない。そこで、連邦は州の児童福祉機関および裁判所の審理に関する連邦の審査しており、これまでにジョージア、ニューヨーク、カリフォルニア州など、いずれも150200万ドルの罰金が科せられている。現地で調査したアメリカの裁判所においても、その審査はシビアなものと言っているが、連邦と州との関係について、本研究では予算の観点から検討する重要性があることを指摘した。4.親権を終了させ、子どもを養子縁組に出す期限に制限を設けたASFAは、一方では子どもの安全に迅速な対応をとるものと支持されているが、他方、批判も生じている。そこで、(1)ASFAには子どもの最善の利益項目が欠けている、(2)年齢による対応の違いを考慮していない、(3)裁判官、弁護士、ソーシャルワーカーの仕事の負担増などの点から、ASFAに対する学説上の批判を検討した。

被虐待児の処遇について行政(児相)ひとりに任せるのではなく、司法主導による、法的権限に基づいた一連の手続体制が整えられるべきである。(4)最後に、司法審査の充実と共に弁護士の役割が重視されなければならない。現在弁護士の立場は曖昧で、親と児相と子との調整役として活動せざるを得ない状態だが、三者各自に代理人をつけるべきである。子どもの利益を守るためには、代理人の役割は重要である。親権喪失については子どもに申立権がないため、子どもの代理人がそれを行うことはできないが、民法は検察官による申立を認めている。実際、親族や児相が親権喪失申立に消極的な場合には検察官による申立が必要なケースが少なくない。今後、検察官の役割について検討していく必要がある。
先端の因果推論手法を用いた、ビッグデータからの口腔と全身の健康の関連

口腔と全身の健康のRCTには様々な限界が存在することが指摘されており、RCTと異なる現実社会の一般化しやすいデータ(Real world data)でのエビデンスの構築の重要性が認識されている。そこで本研究では大規模疫学調査によるデータや、地理情報などのデータを含む、多面的なビッグデータを利用し、口腔から全身の健康への因果効果は存在するのかの検証を行う。
乳癌における癌抑制遺伝子候補ING1遺伝子の解析

ING1遺伝子は第13番染色体長腕に位置し、細胞周期を制御し、p53と協調して細胞増殖を抑制する核内蛋白をコードする遺伝子である。ING1遺伝子には2つのスプライシング変異体が存在し、それぞれ2つのエクソンからなっているが共通のエクソンは全コーディング領域の約80%を占めるため、その共通エクソンにおいて原発性乳癌組織427例、乳癌細胞株10例を対象にSSCP-PCR法を用いて突然変異の検索を実施したが、1例にgermline missense alteration、3種類のgermline silent alteration(polymorphism)を認めたのみで、体細胞変異は認められなかった。mRNA発現の解析はRT-PCR法を用いて半定量的な解析を施行した。対象は、乳癌組織と付随正常乳腺組織各48例と細胞株10例で、乳癌組織の45%および乳癌細胞株全10例で発現低下を認めた。また、ING1mRNAの発現と臨床病理学的因子を検討したところ、発現低下と局所リンパ節転移の有無に相関を認めた。以上よりING1の発現低下が乳癌の発生・進展に関与している可能性が示唆された。ING1遺伝子には2つのスプライシング変異体が存在し、それぞれ2つのエクソンからなっているが共通のエクソンは全コーディング領域の約80%を占めるため、その共通エクソンにおいて原発性乳癌組織377例、乳癌細胞株10例を対象にSSCP-PCR法を用いて突然変異の検索を実施したが、1例にgermline missense alteration、3種類のgermline silent alteration(polymorphism)を認めたのみで、体細胞変異は認められなかった。対象は、乳癌組織と付随正常乳腺組織各60例と細胞株10例で、乳癌組織の45%および乳癌細胞株全10例で発現低下を認めた。以上よりING1の発現低下が乳癌の発生・進展に関与している可能性が示唆されたING1遺伝子は第13番染色体長腕に位置し、細胞周期を制御し、p53と協調して細胞増殖を抑制する核内蛋白をコードする遺伝子である。
異常なヒステリシスを伴う新奇一次相転移現象の理論的解析

ヒステリシスループを伴わない「異常な履歴現象」の発現条件と数学的構造を明らかにした。この異常な履歴現象では、相転移の経路が初期状態に依存するだけでなく相転移の有無自体が初期状態に依存する。我々は、冷却原子気体系や量子スピン系における異常履歴現象を調べ、個々の系を比較することで最終的な異常履歴現象発現条件を確定した。この発見は「一次相転移はヒステリシスループを必ず伴う」という教科書的知識を覆すものである。近年、双極子モーメントが非常に大きい極性冷却気体に関する実験が盛んに行われるようになってきた。我々は以前、三角光格子中の極性Bose気体の系において超流動-固体-超流動間のリエントラント相転移が二段階一次相転移になることを示した。さらに、この相転移過程における履歴現象を詳細に調べ、ヒステリシスループを伴わない新奇な振る舞いを示すことを明らかにしている。この「異常な履歴現象」では、相転移の経路が初期状態に依存するだけでなく相転移の有無自体が初期状態に依存する。本年度は研究計画通り、主に立方格子中の反強磁性スピン1Bose気体を解析することで、異常な履歴現象の発現条件と数学的構造を明らかにした。この系では、以前解析した三角光格子系とは異なり幾何学的フラストレーションも超固体相のような量子共存相も存在しない。それにも関わらず、この系の超流動-Mott絶縁体-超流動間の二段階一次相転移においても以前発見したものと同様の異常な履歴現象が存在することが分かった。したがって、異常な履歴現象は「リエントラント一次相転移系」全般の持つ新たな固有の相転移現象であるといえる。また、Landau理論による定式化にも成功し、エネルギー関数のべき指数ではなく係数の振る舞いが重要であることを示した。これらの成果は統計力学基礎論的観点からも重要であるとともに、次年度の研究計画である「磁性体における異常な履歴現象探索」に対しても非常に有益な示唆を与えるものである。我々は昨年度の研究により、ヒステリシスループを伴わない「異常な履歴現象」の発現条件と数学的構造を明らかにした。我々はこれまでに三角光格子中の極性Bose気体や立方格子中の反強磁性スピン-1Bose気体の系において、この異常な履歴現象が発現し得ることを提案してきた。しかしながら、これら冷却原子気体系は相互作用のエネルギースケールが達成可能な温度に比べて低く、現在の冷却技術では履歴現象をはっきり観測するのが難しいと思われる。そこで本年度は研究計画通り、「磁性体における異常な履歴現象探索」を行った。その結果、三角格子上スピン二量体物質の模型におけるマグノンBose-Einstein凝縮相と磁化プラトー状態間の一次相転移で異常な履歴現象が存在することを示した。磁性体の系は交換相互作用の強さが温度に対して十分大きいため、印加磁場をコントロールすることで異常な履歴現象を明確に観測できると期待している。この系以外にも、幾つかの異常履歴現象を持つ系を調べ、それらを比較することで最終的な異常履歴現象発現条件を確定した。重要なことは、Lobe型の相領域が一次相転移境界で囲まれているという相図の特徴的な構造である。系の相図がこのような構造を持つ場合、必然的に異常な履歴現象が現れる。本年度研究計画では「異常な履歴現象」の発現条件・数学的構造を明らかにすることが目的であったが、上述した通り完全に遂行することができた。加えて我々の開発したクラスター平均場法を、スケーリングを用いてさらに著しく改良することに成功し、次年度の研究計画を遂行するにあたっての下準備まで完了させることが出来た。24年度が最終年度であるため、記入しない。現在のところ本研究課題の遂行状況は非常に良好であり、特に大きな問題点は存在しない。しかしながら、本年度の研究成果に関する論文一報が未だ作成途中であり、本年度中の完成・投稿が急務であるといえる。
アジア・ヨーロッパ大陸間のマルチモード国際物流シミュレーションモデルと政策分析

世界の基幹航路のひとつである東アジア=欧州間国際貨物輸送に着目し,海上(スエズ運河ルート,パナマ運河ルート,北極海航路)・陸上(シベリアランドブリッジ,チャイナランドブリッジ)・航空の各輸送ルートの実態を調査・分析した上で,1インターモーダル国際物流ネットワークモデルをユーラシア大陸(中央アジア・南アジア発着貨物,および中央アジアを通過する国際陸上貨物)へ適用し,国境抵抗の削減やインフラ投資・改善等の政策シミュレーションを実施するとともに,2コンテナ船・ドライバルク船等の航行ルートの推計および選択モデルの構築を行い,パナマ運河拡張や燃料費下落などの影響についてシミュレーションを実施した.1)研究テーマ1:東アジア=欧州間国際貨物輸送の輸送ルート別実態調査、研究テーマ2:国際貨物輸送の動向に関する地域別調査の一環として、中央アジア地域(アゼルバイジャン、トルクメニスタン、ウズベキスタン、キルギス、中国新疆ウイグル自治区)の現地調査を行った。各国において政府関係者、物流業者、荷主(商社など)へインタビューを行うとともに、実際に主要国境地点を訪問するなどして、越境輸送の実態の把握に努めた(柴崎・加藤)。またこれに関連し、CAREC(中央アジア地域敬愛協力)などを通じて中央アジア地域における交通分野の国際協力を中心的に推進しているアジア開発銀行(ADB)と連携し、ADB内部に蓄積されている情報の収集・発掘を行った(加藤・柴崎)。さらに、拡張工事の進むパナマ運河についても、研究代表者が他の業務において訪問する機会があったため、ヒアリング調査を実施するなど、情報収集を行った(柴崎・菅原)。2)研究テーマ3:海賊発生に関する地理的分析に関連し、国際海運の安定的運航を大きく阻害しているソマリア周辺海域で発生する海賊活動の地理的特性を明らかにすることを目的とし、海賊出没位置の空間データベースを作成した上で,カーネル密度推定等の空間分析手法を用いて長期的な海賊出没位置の変化を分析した(渡部・鳥海)。3)研究テーマ4:東アジア=欧州間国際貨物輸送における各輸送ルートの現状について情報収集・データ分析を行い、モデル構築の基礎的情報を収集した(柴崎)。また、北極海航路利用時における船種ごとのコスト構造について情報収集・分析を行った(古市)。4)研究テーマ5:中央アジア地域の国際陸上輸送を対象とした国際物流モデルのプロトタイプを構築した(加藤・柴崎)。モデルとしては、鉄道および越境時のキャパシティを考慮した利用者均衡配分モデルを採用した。研究テーマ1および研究テーマ2(国際貨物輸送の実態に関する現地調査と現状分析):北極海航路の現状について,ロシア国内の関係者へのインタビュー調査および現地港湾訪問調査を実施した.また研究代表者は,本件とは別のプロジェクトにおいて,ノルウェーおよびデンマークで関係者インタビューおよび現地港湾訪問調査も実施した.また,パナマ運河拡張によるアメリカのインターモーダル輸送への影響について鉄道貨物輸送を中心に現地調査を行い成果を取りまとめた.研究テーマ3(テーマ別現状分析):海賊発生に関する地理的分析については,地理情報システムを用いて海賊出没位置の空間データベースを作成した上で,東南アジア周辺海域で発生する海賊活動の地理的特性を明らかにした.そして,カーネル密度推定により,海賊出没ホットスポットの経年変化を確認した.研究テーマ4および6(東アジア=欧州間国際輸送におけるルート選択モデルの構築と政策シミュレーション):北極海航路利用に関わる3つの不確実要因を考慮した複数のシナリオを設定し,その貿易パターン(対中東等との輸入量比率の変化)や各国のGDPに与えるインパクトを分析した.また,配船スケジュールを考慮した平均待ち時間と四種類の海上輸送時間を考慮した集計ロジットモデルにより輸出入コンテナ貨物の荷主の港湾選択行動分析を行った.さらに,コンテナ船の寄港先に加えて,原油タンカーやLNG船などの寄港先を海上航路ネットワークに組み込んだ上で,エネルギー資源の輸送に対し,カントリーリスク,海賊リスク,海難事故リスクに関するリスク分析を行った.研究テーマ5および6(中央アジア地域のマルチモード国際物流モデルと政策シミュレーション):昨年度構築したモデルの見直しを行い精度を向上させるとともに,関税同盟の進展や国境の税関手続き改善の影響に関するシミュレーションを実施した.国際貨物輸送の実態に関する現地調査(研究テーマ1および2)については,今後中央アジアの海港ゲートウェイと位置づけられるパキスタンを中心とした南アジア地域の現地調査を実施した。研究テーマ3(テーマ別現状分析)については,1)中央アジアの交通インフラを理解するために重要なロシアおよびソ連の鉄道網の発展の歴史を調査した。結果として,ロシア(およびソ連)における鉄道建設は,投資効率面からは地域差があり,資源開発のために人口増加を狙ったものや,安全保障面の効果を狙ったものがあることがわかった。2)LNG輸送船を対象として,実データに基づいて算出された現状の船速を基準としたCO2排出規制を行った場合の影響を,運航コストという観点から分析した。3)海賊活動の監視に対する新技術の一つである成層圏プラットフォーム(以下,PF)を活用した海賊監視システムであるSSRPに注目し,PFの最適配置について,代表的な施設配置問題の一つである最大被覆問題を拡張したモデルを提案し,ソマリア沖での海賊監視を対象として最適配置について考察した。4)北極海域から東アジアへのLNG輸送について,航路,積み替えの有無,冬季の耐氷船投入航路などのシナリオ別に運航費用を推計し,既存の調達先との比較を行った。研究テーマ4(東アジア=欧州間国際貨物輸送におけるルート選択モデル)およびテーマ5(中央アジア地域の国際陸上輸送を対象としたマルチモード国際物流モデル)については,陸上モデル(道路・鉄道)についてもリンク容量を考慮したうえで,両者を統合した海上まで含めたユーラシア大陸マルチモード国際物流モデルのプロトタイプを構築した。さらに研究テーマ6(モデルお用いたシミュレーション)については,上述のモデルを用いて,将来対象地域内で行われると想定される交通インフラ整備や越境サービス改善のインパクトを分析した。

概ね計画通り現地調査を実施し,マルチモード国際物流モデルの構築についても,東アジア=欧州間国際貨物輸送におけるルート選択モデルと中央アジア地域の国際陸上輸送を対象としたマルチモード国際物流モデルを統合した,海上まで含めたユーラシア大陸マルチモード国際物流モデルのプロトタイプを構築することができた。また,最終年度である次年度に集中的に実施する予定であった政策シミュレーションについても,既に,上で構築したプロトタイプモデルを用いて,将来対象地域内で行われると想定される交通インフラ整備や越境サービス改善のインパクトを分析するなど,研究全体の最終的な成果目標に順調に近づきつつある。最終年度である平成28年度は,これまでの成果を論文や学会発表などの形で取りまとめることを中心的に実施した.なお,成果の一部は引き続き取りまとめ・論文執筆中であり,平成29年度内に投稿・採択見込みの論文等も5件以上(南アジアを対象としたインターモーダル国際物流モデル,中央アジアを対象としたユーラシア大陸のほぼ全域を包含する国際物流モデル,ドライバルク船を対象とした海上輸送経路選択モデル,北極海航路およびパナマ運河拡張を踏まえたLNG輸送パターンの変化予測分析など)ある見込みである.さらに,研究成果をとりまとめた英語書籍がElsevier社から発刊されることが決定した.さらにモデルを用いて,いくつかの具体的なプロジェクト(インド・アンドラプラデーシュ州における新規港湾開発計画や,パキスタンのグワダル港と背後鉄道の整備計画等)に関するシナリオ別の政策シミュレーションを実施した.これらについても,本研究課題で構築したモデルを用いて,引き続き今後もいくつかのプロジェクト(バングラデシュ・マタバリ港開発や,スリランカにおける港湾政策策定など)においてシミュレーション分析を行う予定でる.また,個別課題の成果については以下の通りである.1エネルギー資源の安定輸送を目指すために,種類の異なる輸送手段を考慮し,輸出国で問題が発生し輸入が不可能となるカントリーリスクと輸送中に問題が発生し輸送が不可能となる輸送リスクの2つの観点から,数理モデルを用いて輸入量や輸送手段について評価した.2国際海上輸送について,海賊監視に関する最大被覆問題を拡張したモデルを定式化し,海賊監視システムの最適運用について検討した.3国際航空貨物について,韓国における航空貨物流動の現状とハブ空港戦略に関する政策について調査を行った.4パナマ運河,スエズ運河,鉄道の戦略を協力ゲームにより表現し,協力実現の可能性を検討した.世界の基幹航路のひとつである東アジア=欧州間国際貨物輸送に着目し,海上(スエズ運河ルート,パナマ運河ルート,北極海航路)
植物病原菌を利用したバイオエタノール生産

1.H19年度に作出した、上流に常時発現型プロモーターpTEFを接続したピルビン酸脱炭酸遺伝子導入形質転換株について、ピルビン酸脱炭酸酵素遺伝子の転写を確認した。同株によるエタノール生産は、親株(Fusarrum oxysporum f. sp. lycopersici、以降FOL)に比べて有意に上昇しなかった。以上のことは、FOLによるエタノール生産の律速段階がピルビン酸脱炭酸酵素が司る、ピルビン酸→アセトアルデヒドの反応以外に存在することを示した。2.酵母の発芽関連因子と相同であることが推測されるタンパク質をコードする遺伝子をゲノムデータベースを参考にクローン化、FOLを親株として遺伝子破壊株を作出した。この破壊株はPDB培地での液体振とう培養で、親株と異なり、bud cellを形成することができなくなった。同時に、液体振とう培養でのエタノール生産も見られなくなった。固体培地での菌糸生育状態での菌学的性状やエタノール生産能の親株との比較は進行中である。3.ピルビン酸脱炭酸酵素遺伝子の発現様式をRT-PCR等によって解析した結果、セルロースやペクチンなど高分子の糖を炭素源とすると、スクロースやグルコースを炭素源にした場合よりも発現が低下することが判明した。そこで、セルロースとグルコースを炭素源にして生育させたFOLから抽出したタンパク質を二次元電気泳動によってそれぞれプロファイリングした。両条件下で発現が異なるタンパク質スポット複数が見いだされたが、1.によって、ピルビン酸脱炭酸酵素がFOLのエタノール生産のキーエンザイムでないことが判明したため、各スポットの解析は中止した。4.植物病原性子嚢菌20種、約30菌株を対象に、基質としてスクロースおよびセルロースを炭素源とする液体培地での振とう培養におけるエタノール生産能を調査した。エタノール生産が確認された菌は、F. oxysporum、F. moniliforme、Geotrichum sp.等であり、FOLを含むF. oxysporum複数菌株が1.3%程度のエタノールを生産した。トマト萎凋病菌(Fusarium oxysporum f. sp. lycopersici)は、液体培地および寒天培地中に最大0.7%程度のエタノールを生産した。この他にも、アセトアルデヒド、イソアミルアルコール等を培地中に生産した。アルコール生産のキーエンザイムであるピルビン酸脱炭酸酵素(ピルビン酸→アセトアルデヒドの変換を触媒)をコードする遺伝子(pdc1)をトマト萎凋病菌ゲノムからクローン化した。トマト萎凋病菌ゲノム中には、pdc1が1コピーが存在する事を明らかにした。pdc1は、ジャガイモブドウ糖液体培地(PSB),異なる炭素源添加MM液体培地での培養で発現(転写)することが明らかになった。また、萎凋病菌に感染したトマト根部組織中でもpdc1が発現している事が判明した。トマト萎凋病菌のpdc1-破壊株を同領域の二回相同組換えによって作出した。pdc1-破壊株は、好気条件下での生育は野生株と差が見られないものの、微好気および嫌気条件下では野生株に比べて生育が劣った。それ以外の菌学的性状は、野生株と大差なかった。pdc-1破壊株は、培地中でのエタノール生産量がほぼ0となり、トマト萎凋病菌におけるエタノール生産にPDC1が必須である事を明らかにできた。pdc1-破壊株は、トマトに対して野生株と同等な病原性を示し、PDC1が病原性に関与しないと考えられた。pdc1の上流にPTEFなどの常時発現型プロモーターを接続したベクターを作成、これを用いてPDC1過剰発現株作出の準備を整えた。
SV40 VLP免疫活性化剤による免疫活性化と獲得免疫誘導機構の解明

サルのポリオーマウイルスのsimian Virus 40 (SV40)のウイルス様粒子(VLP, virus-like particle)に対する免疫応答として、SV40 VLPに対する、ヘルパーT細胞、B細胞、natural killer細胞、細胞傷害性T細胞の各々の免疫細胞の免疫活性化を解析することで、SV40 VLPによる免疫活性化機構の概観が明らかになると期待される。この解析によって、SV40 VLPの免疫活性化の効率と強度が明確になるものと思われる。また、この解析によって、目的とする抗原を内包したSV40 VLPをワクチンとして利用することの妥当性が確立されるものと期待される。
脳皮質-軸索画像による運動・言語機能画像化と統合型ナビゲーションによる局在検証

【目的】脳神経疾患の病態を把握するとともに、その治療計画を立案するためには、患者毎に言語優位半球の同定と高次脳機能の局在を把握することが重要である。近年は脳機能画像の普及にともない言語優位半球を非侵襲的に同定することが可能になりつつある。しかし、機能画像の活動領域局在に関する検証は十分に行われていないため、未だ臨床への積極的な応用にはいたっていない。本検討では言語課題による機能画像と、慢性硬膜下電極による皮質電気刺激、誘発課題による皮質電位(ECoG)計測による脳機能マッピングを比較することで、言語機能誘発課題の確立と、得られた結果の検討を行った。【方法】頭蓋内病変を有する患者117例を対象として、全例Wadaテストにより言語優位半球をの同定を試みた。機能MRIでは単語提示による動詞想起と文字読み課題をおこない、取得データの統計処理後に有意な信号変化があるピクセルを表示した。脳磁図は機能MRI課題に類似した文字読み課題を行いながら計測・加算平均し、single dipole modelを用いて信号源推定を行った。さらに外科治療が必要と考えられた難治性てんかんの13症例では、てんかん焦点同定のために慢性硬膜下電極を留置した。その留置電極を用いて50Hzの双極電気刺激による言語機能マッピングを行い、機能画像で同定した言語関連機能の局在を検証した。また、機能MRI、脳磁図と類似した課題を行いながら、ECoG計測を行った。【結果】機能MRIでは、主に片側の中、または下前頭回周辺、縁上回-頭頂葉に活動を認めた。脳磁図では優位半球側内紡錘回と、上側頭回後部にダイポールの集積を認めた。Wadaテストでは91例(93.8%)で優位半球を同定することができた。この91例中機能MRIでは83症例(91.2%)、脳磁図では76例(83.5%)で言語優位半球側を同定できた。機能MRIと脳磁図の結果が一致した72例全例でWadaテストと結果が100%一致していた。皮質電気刺激によるマッピングでは、下前頭回(機能MRI)と上側頭回(脳磁図)刺激によりspeech arrest(11/13;84.6%)、錯語(10/13;76,9%)を認めた。また、優位側紡錘回刺激で高率に純粋失読を誘発した(12/13;92.3%)。一方、中前頭回の刺激では言語機能の抑制はほとんど認めなかった(3/13;23%)。ECoGは文字読み課題では紡錘回後部に200-300msecの潜時で顕著な電位変化をみとめ(100%)、優位半球上側頭回縁上回、頭頂葉に400msec以降の遅い認知反応(77%)が検出された。しかし、文字読み課題機能MRIで活動していた前頭葉では認知EcoGをほとんど捉えることができなかった。【総括】ECoG計測は皮質電気刺激マッピングに比しててんかん発作誘発のリスクがなく、短時間に広範な脳皮質の活動状況を捉えることできた。しかし、機能画像、皮質電気刺激、ECoGのそれぞれの結果は必ずしも一致していないため、今後さらに課題、解析方法の改良することが重要である。

皮質電気刺激によるマッピングでは、下前頭回(機能MRI)と上側頭回(脳磁図)刺激によりspeech arrest(11/13;84.6%)、錯語(10/13;76,9%)を認めた。また、優位側紡錘回刺激で高率に純粋失読を誘発した(12/13;92.3%)。一方、中前頭回の刺激では言語機能の抑制はほとんど認めなかった(3/13;23%)。ECoGは文字読み課題では紡錘回後部に200-300msecの潜時で顕著な電位変化をみとめ(100%)、優位半球上側頭回縁上回、頭頂葉に400msec以降の遅い認知反応(77%)が検出された。しかし、文字読み課題機能MRIで活動していた前頭葉では認知EcoGをほとんど捉えることができなかった。【総括】ECoG計測は皮質電気刺激マッピングに比しててんかん発作誘発のリスクがなく、短時間に広範な脳皮質の活動状況を捉えることできた。しかし、機能画像、皮質電気刺激、ECoGのそれぞれの結果は必ずしも一致していないため、今後さらに課題、解析方法の改良することが重要である。言語課題MEG:視覚誘発装置により2m程はなれたスクリーンに視野角3°ほどのひらがな3文字で構成された単語、または漢字1文字を提示した。患者は提示単語(漢字)が、抽象語、具象語かをクラス分けを行い、その判断により左右のボタンを押し分け、反応速度、正答率をモニターする。文字認知反応は刺激後200から600msecの間に上側頭領域、紡錘回に周辺部に局在されておるため、単一ダイポールモデルにより解析したダイポールの潜時、局在部位について検討している。また、文字認知では複数の活動部位があるため空間フィルター法、電流密度分布法も応用してより信頼性に高い信号源解析する。また、500msec以内に調整された音声単語刺激により、関連する動詞想起を行い前頭葉領域の言語MEGも計測する。この前頭葉のMEG活動は、視覚・聴覚刺刺激認知後に引き続く反応であり、信号同期が悪く、加算平均では現れにくい可能性がある。このため、同時に加算をしないMEG生データも取得し、刺激と信号の周波数成分とその位相変化をwavelet解析を用いて分析する。機能MRI:言語関連機能MRIは、1検査につき20秒間の刺激期と20秒間の無刺激期を交互に繰返して、約3分間(40スキャン)の全頭を含めた機能MRI画像を取得する。検査課題は1、単語想起、2、具象語/抽象語クラス分け、3,図の名称(naming)課題、4,finger tapping課題の計4種類施行する。単語想起課題ではコンピュータ処理された音声による名詞を聞かせ、それに関連する動詞を想起させる。非課題時に音声刺激を逆再生した音刺激をあたえることにより、一次聴覚野の反応をキャンセルする。具象語/抽象語クラス分け課題も同様に、一次視覚反応をキャンセルするために、非課題時にランダムドットを呈示する。刺激期と非課題時のMRI画像を統計処理(cross-correlation)することにより、有意な信号変化を示した領域を表示する。Tractography : MRI装置で12-16軸方向から拡散強調磁場パルスを印加することで各ピクセルのテンソル値を算出できる。異方向性の高いピクセルを追跡することで、皮質脊髄路、弓状束等のtractographyが作成される。弓状束は機能MRIの前頭頂活動域、MEGの側頭葉内ダイポールを結んでいる線維連絡に着目する。以上の異なる機能情報をVOLUME-ONEにより半自動座標変換を行い、合成表示することが可能を可能とした。昨年度につづいて、機能MRIと脳磁図を用いて言語優位半球方法を確立した。
テンサイにおける細胞質雄性不稔の原因遺伝子の同定と花粉退化メカニズムの解明

[1]Owen雄性不稔細胞質のミトコンドリアゲノムの全一次構造を決めた。ゲノムサイズは501020塩基対(bp)であり、正常株ミトコンドリアゲノム(368799bp)のコードする51種の遺伝子全てを含んでいる。[2]遺伝子コード域をOwen細胞質雄性不稔株と正常株間で比較した結果、tRNAとrRNAコード域には全く変異が見当たらなかった。また、タンパク質コード遺伝子については24箇所の点突然変異が見出されたが、いずれも遺伝子機能を損う変異ではない。したがってこれらの点突然変異は雄性不稔とは無関係と考えてよい。[3]Ower雌性不稔細胞質に固有で、葯組織において活発に転写されている4種のORF(読み取り枠)をみつけた。[4]正常株とOwen細胞質雄性不稔株の肥大根からミトコンドリアを単離し、35Sで標識したアミノ酸を取り込ませてin organello翻訳実験を試みた。その結果、Owen株に固有の35kDaタンパク質を検出した。このタンパク質はOwen株固有のORFの1個に相当する、preSatp6の翻訳産物であることが明らかとなった。[5]35kDaタンパク質(preSATP6)の特性解明の一助として、ミトコンドリア内での局在性について検討を加えた。その結果、preSATP6はトウモロコシの細胞質雄性不稔に関与するミトコンドリアタンパク質URF13等と同様、ミトコンドリア膜結合タンパク質であることが判明した。[6]以上の結果より、Owen細胞質雄性不稔の原因遺伝子はpreSatp6である可能性が最も高いと結論した。今年度得られた研究成果は次の通りである。[1]Owen細胞質雄性不稔株ミトコンドリアゲノムの全塩基配列Owen細胞質のミトコンドリアゲノムの全一次構造を決めた。ゲノムサイズは501020塩基対であり、G+C含量は43.9%と計算された。得られた塩基配列の7.7%はテンサイ正常株配列も含めて、いかなる配列とも相同性を示さない。[2]Owen株におけるミトコンドリア遺伝子の変異Owen株ミトコンドリアゲノムは正常株ミトコンドリアのコードする51種の遺伝子すべてを含んでいる。遺伝子コード域をOwen株と正常株間で比較した結果、tRNAとrRNAコード域には全く変異が見当たらなかった。一方、Owen株のタンパク質コード遺伝子については24箇所の点突然変異が見出された。アミノ酸配列の変化を伴う変異も含まれているが、進化的保存サイトではなかったり、あるいは同一のアミノ酸残基をもつ植物種が報告されているなどの理由により、これらの点突然変異が遺伝子機能を損なう可能性は極めて低いと考えられる。[3]Owen株固有配列の発現解析Owen細胞質雄性不稔株固有のORFやキメラ遺伝子の発現を調べた。これら固有配列をプローブに供してノーザン解析を行ったところ、4遺伝子に関して明瞭なシグナルバンドを検出した。稔性回復核遺伝子との相互作用を調査した結果、いずれにおいてもシグナルパターンの変化は見られなかった。現在それぞれの翻訳産物に対する抗体を作製し、ウエスタン解析を進めている。Owen株ミトコンドリアゲノムの全一次構造を解析した結果、コード遺伝子の機能を損なうような突然変異は見出されなかった。そこでOwen株に固有のミトコンドリアタンパク質が存在し、これが花粉不稔をもたらしていると仮定した。まず、正常株とOwen株の肥大根からミトコンドリアを単離し、35S標識アミノ酸を取り込ませてin organello翻訳を試みた。SDS-PAGEのデータによれば、このタンパク質以外にシグナルバンドの欠失や移や移動度の変化は認められない。

[2]35kDaタンパク質の産生遺伝子次に、ミトコンドリアゲノム全塩基配列の比較解析を通じて明らかになったOwen株固有ORFについて、翻訳産物の検出を試みた。転写の確認された3個の固有ORF(orf324、Scox2-2およびorf119)にに対する抗体を作りウエスタン解析を行ったが、Owen株ミトコンドリアタンパク質との反応は見出されなかった。これに対してatp6遺伝子のアミノ末端伸長領域(preSatp6)に対応する抗体を用いた場合には、35kDaの位置にOwen株固有シグナルが検出された。また、この抗体を使ってin organello翻訳産物の免疫沈降を試みた結果、35kDaポリペプチドの沈降反応が認められた。以上のデータはpreSatp6がOwen細胞質雄性不稔の原因遺伝子である可能性を強く示唆する。今年度得られた研究成果は次の通りである。[1]Owen型細胞質雄性不稔をひき起こすpreSATP6タンパク質の局在性前年度までに、Owen細胞質雄性不稔の原因ミトコンドリア遺伝子preSatp6は35kDaタンパク質を産生することを証明した。このタンパク質(preSATP6)の特性解明の一助として、ミトコンドリア内での局在性について検討を加えた.Owen型不稔株の肥大根から単離したミトコンドリアを膜画分と可溶性画分とに分別し、両画分に対してウエスタンブロット解析を試みた。その結果、膜画分にのみシグナルが検出された。従って、preSATP6はトウモロコシの細胞質雄性不稔に関与するURF13等と同様、膜結合タンパク質と考えられる。preSatp6配列は下流のSatp6コア配列とin-frameで融合し、1個のキメラ遺伝子を形作っている.ノーザンブロット解析を通じて、両配列を含むジシストロニック転写物が検出された。両配列の境界域に終止コドンはみられず、またRNAエディティングによる終止コドンの形成も見出されない。そこで、ジシストロニック転写物から先ずpreSATP6-SATP6の融合タンパク質が翻訳され、その後プロテアーゼでpreSATP6タンパク質とSATP6タンパク質に切断されるのではないかと仮定した.これを確かめるため、プロテアーゼ活性を阻害するEDTA添加の下にin organello翻訳実験と免疫沈降実験を試みた。その結果,preSATP6タンパク質の蓄積量が著しく減少することが判明し、プロテアーゼによるプロセシングの可能性が示唆された.ただ、preSATP6とSATP6の両者を含む前駆体タンパク質は検出されなかった.
活動電位伝導速度の差異を利用した非観血的な咀嚼筋線維組成測定の試み

顎顔面骨格パターンの成立や矯正治療後の予後などを評価するには,咀嚼筋の機能的解析が重要である.特に筋電図によって得られる筋機能は,筋線維組成の相違を反映し,遺伝的影響を強く受けているものと考えられるが,これまではバイオプシーなどの観血的な処置を行なわない限り明らかにすることはできなかった.そこで本研究の目的は,咀嚼筋の筋線維組成を非観血的に測定するシステムを考案し,顎顔面骨格パターンとの関連性について明らかとすることである.本研究で開発したシステムは,塩化ビニールシート上にAg-AgCl線9本を5mm間隔で平行に配列したアレイ電極を用いて咬筋の活動電位を導出し,各チャンネル間の活動電位ピーク遅れ時間で電極間距離を除して活動電位伝導速度の算出を行うものである.咬筋の活動電位伝導速度と顎顔面骨格パターンとの間に関連性が得られるかどうかについて,被験者7名を用いて検討したところ,上顔面高と下顔面高との比率と100%MVC(maximum voluntary contraction)における活動電位伝導速度との間に1%レベルでの有意な負の相関性が認められ,mandibular pl.to SN,gonial angleとの間にも負の相関が認められた.このことから,咬筋の活動電位伝導速度,ひいては筋線維組成と垂直的顎顔面骨格パターンとの間に強い関連のあることが示唆された.また,筋の収縮強度に違いによる活動電位伝導速度の差異を検討したところ,long faceとshort faceでは異なる傾向を示し,このことから運動単位の動員様式に違いがある可能性も考えられた.今後は測定精度を高めるため,資料の収集の継続と顎顔面骨格パターンや他の機能検査の分析結果との関連性について検討し,さらにバイオプシーを行い咬筋の筋線維組成と活動電位伝導速度との間の相関性についての確認が必要である.顔面骨格パターンの成立,矯正治療目標の設定,矯正治療後の予後などを評価するには,咀嚼筋の機能的解析が重要であることは周知の事実である.このうち,特に筋電図による筋機能,咀嚼リズム,咬合力などは咀嚼筋線維の組成,すなわち速筋(白筋)と遅筋(赤筋)の比率の相違を反映し,遺伝的に決定されていると考えられる.しかし,これまではバイオプシーなど観血的な処置を行わない限り筋線維組織を明らかにすることはできなかった.そこで本研究では,咀嚼筋の筋線維組成を悲観血的に測定するシステムを考案・視察し,他の機能的検査の結果や顎顔面パターンとの関連について明らかとすることを目的とした。筋線維組成測定の原理は,表面筋電図を応用して筋の活動電位伝導速度を測り,その速度が速筋線維と遅筋線維では異なることを利用して筋線維の組成を推定しようとするものである。まず本研究では咀嚼筋測定用の小型の表面電極を開発する必要があった。測定は,被験者を安静位に保持し,新たに開発された表面電極を咬筋浅層の腹筋中央で筋線維に沿って表面電極を貼付し,誘発電位検査装置を用いて咬筋の活動電位速度の測定を試みた。被験者の姿勢や測定時の条件などについて測定精度や再現性などの点から,活動電位速度の測定手法の確立のための検討を行っている。また,得られたデータをパーソナル・コンピュータに転送し,データ処理方法についても検討中である。同時に,セファロ撮影等のデータ収集を開始している。さらに,顎矯正外科手術適用患者を対象として咬筋のバイオプシーを行うための準備を始めた。今後はデータの蓄積を行い,顎顔面パターンや顎機能等との関連性について検討する予定である。顎顔面骨格パターンの成立や矯正治療後の予後などを評価するには,咀嚼筋の機能的解析が重要である.特に筋電図によって得られる筋機能は,筋線維組成の相違を反映し,遺伝的影響を強く受けているものと考えられるが,これまではバイオプシーなどの観血的な処置を行なわない限り明らかにすることはできなかった.そこで本研究の目的は,咀嚼筋の筋線維組成を非観血的に測定するシステムを考案し,顎顔面骨格パターンとの関連性について明らかとすることである.本研究で開発したシステムは,塩化ビニールシート上にAg-AgCl線9本を5mm間隔で平行に配列したアレイ電極を用いて咬筋の活動電位を導出し,各チャンネル間の活動電位ピーク遅れ時間で電極間距離を除して活動電位伝導速度の算出を行うものである.咬筋の活動電位伝導速度と顎顔面骨格パターンとの間に関連性が得られるかどうかについて,被験者7名を用いて検討したところ,上顔面高と下顔面高との比率と100%MVC(maximum voluntary contraction)における活動電位伝導速度との間に1%レベルでの有意な負の相関性が認められ,mandibular pl.to SN,gonial angleとの間にも負の相関が認められた.このことから,咬筋の活動電位伝導速度,ひいては筋線維組成と垂直的顎顔面骨格パターンとの間に強い関連のあることが示唆された.また,筋の収縮強度に違いによる活動電位伝導速度の差異を検討したところ,long faceとshort faceでは異なる傾向を示し,このことから運動単位の動員様式に違いがある可能性も考えられた.今後は測定精度を高めるため,資料の収集の継続と顎顔面骨格パターンや他の機能検査の分析結果との関連性について検討し,さらにバイオプシーを行い咬筋の筋線維組成と活動電位伝導速度との間の相関性についての確認が必要である.
小児難治性固形腫瘍に対する同種ナチュラルキラー細胞による抗腫瘍効果

我々はNK細胞による小児固形腫瘍への細胞傷害活性とその機構について検討した。NK細胞抑制性受容体のリガンドであるHLAclass1の発現は神経芽腫細胞で他の細胞株に比較して低値であった。また、NK活性化受容体のリガンドの発現も神経芽腫細胞では低かったが、一部の腫瘍細胞では高かった。我々はNK細胞による神経芽腫細胞および悪性ラブドイド腫瘍に対する抗腫瘍活性を確認したが、ドナーNK細胞および腫瘍細胞でのHLA-Cのミスマッチによる影響は明らかではなかった。進行期の神経芽腫、横紋筋肉腫、骨肉腫などの予後は集学的治療の進歩にも関わらず未だ不良である。固形腫瘍に対する同種移植例は世界的にも少ないが、一部でgraft-versus tumor(GVT)効果について報告が散見される。近年、NK細胞抑制性受容体のであるKIRリガンド不一致移植において、NK細胞による移植片対白血病効果が報告された。本研究では、同種末梢血、臍帯血由来のNK細胞KIRリガンド不一致ドナーの小児難治性固形腫瘍に対する影響を検証し、難治性小児固形腫瘍に対する臍帯血を含むKIRリガンド不一致移植ドナーの有用性とNK細胞による抗腫瘍効果の機構を明らかにすることで、合併症の少ないミニ移植をベースとしたNK細胞療法によりこれら疾患の治療成績の向上をめざすものである。我々はすでに神経芽腫、横紋筋肉腫、骨肉腫細胞株における、NK細胞受容体リガンドの発現を検討し、細胞株によりNK細胞活性化受容体リガンドの発現に差異があること、さらに同種NK細胞による抗腫瘍効果にも差がある事を確認した。悪性ラブドイド腫瘍(malignant rhabdoid tumor,MRT)は幼小児期に腎、脳など様々な部位に発生する難治な固形腫瘍であり、その予後は他の難治性固形腫瘍と比較しても極めて不良である。MRT細胞株おけるNK細胞受容体のリガンド発現と同種末梢血NK細胞によるMRT細胞株に対する細胞傷害活性を検討したところ、活性型受容体のリガンドは一部の細胞株で強く発現しており、MRT細胞株を成人末梢血NK細胞と混合培養後、生細胞比率を測定したところ、2細胞株でNK細胞との共培養により著明な生細胞比率の低下が認められたことから、MRTにおいても同種NK細胞の傷害活性による免疫療法の可能性が示唆された。近年、NK細胞抑制性受容体であるKIRリガンド不一致移植において、NK細胞による移植片対白血病効果が報告された。我々は初めに神経芽腫、横紋筋肉腫、骨肉腫、悪性ラブドイド腫瘍(malignant rhabdoid tumor,MRT)細胞株におけるNK細胞受容体リガンドの発現を検討した。その結果、HLA class1の発現は一般に神経芽腫で低値である一方、骨肉腫細胞株、MRT細胞株では高く、横紋筋肉腫は細胞株により様々であった。NK活性化受容体のリガンドであるULBP,MICA/Bの発現も骨肉腫、MRT細胞株の一部で認められた以外は全体的に低値であった。一方、NK細胞の活性化副受容体である接着因子DNAM-1のリガンドは一部の神経芽腫細胞を除く、全ての細胞株で高発現していた。次に同種NK細胞による抗腫瘍効果を検討したが、末梢血NK細胞による細胞傷害活性を測定したところ、MRT細胞株および一部の神経芽腫細胞株で著明な生細胞比率の低下が認められたが、HLA-C groupのミスマッチによる効果はin vitroで末梢血、臍帯血NK細胞ともに明らかではなかった。本研究は急性リンパ性白血病(acute lymphoblastic leukemia : ALL)や神経芽腫などの難治性小児悪性腫瘍に対して、臍帯血移植を含む同種移植におけるkiller cell immunoglobulin-like receptors (KIR)リガンド不一致ドナーの有用性および機構を明らかにし、移植成績の向上をめざすものである。小児難治性白血病の1つである11q23型急性リンパ性白血病細胞株に対する末梢血、臍帯血ドナーNK細胞の細胞傷害活性を51Cr releasing assay法により測定したところ、末梢血NK細胞、臍帯血NK細胞ともにKIRリガンド不一致ドナーが一致ドナーと比較して、より傷害活性が高かった。

他の細胞株では、T細胞型急性リンパ性白血病がNK活性化型受容体NKG2Dのリガンドの発現が極めて高いことにより、末梢血、臍帯血NK細胞によるT細胞型急性リンパ性白血病に対する傷害活性は非常に強く、KIRリガンド不一致ドナーを選択することにより、その効果がより増強することを確認した。さらに、臍帯血NK細胞の細胞傷害活性が、ドナーのNKG2DのSNPにより活性の差があることが示唆された。小児難治性腫瘍であるEwing肉腫、神経芽腫、骨肉腫、横紋筋肉腫瘍様腫瘍細胞株でもNK受容体リガンドを検討したところ、一部の細胞株でNKG2DリガンドのMICA/BおよびDNAM-1リガンドの発現が高いことが確認され、神経芽腫、横紋筋肉腫瘍様腫瘍細胞株で末梢血NK細胞による細胞傷害活性が示された。しかし、骨肉腫細胞株ではHLA-classIの発現が極めて高く、NK細胞よりT細胞による傷害活性が高い可能性が示唆された。小児難治性腫瘍各細胞株におけるNK細胞受容体リガンドの発現の詳細な検討については、ほぼ終了し、現在、薬剤によるリガンド発現の増強に関する検討を進めている。およびドナーNK細胞による抗腫瘍活性の検討については、末梢血および臍帯血NK細胞による抗腫瘍効果の比較も行っている。また、一部の腫瘍細胞株においてはKIRリガンドミスマッチにによる抗腫瘍効果の増強も期待できるのではないかと思われるが、日本人に於けるKIRリガンドミスマッチの頻度は低く、臍帯血NK細胞でのKIRリガンドミスマッチの検討はしばしば困難となっている。また、現在、ドナーNK細胞による抗腫瘍活性の得られ難い細胞株でのその原因についても検討しており、これが解明されれば様々な細胞株での新たな免疫療法の可能性が期待できるのではないかと思われる。末梢血NK細胞による細胞傷害のメカニズムおよび細胞傷害活性の増幅についての解析するための、各腫瘍細胞株のNK細胞受容体リガンドおよび接着因子発現の解析は終了し、さらに、Calcein AM/PI染色での健常ドナー末梢血NK細胞の腫瘍細胞株に対する細胞傷害活性の測定も検討中である。さらに、薬剤添加、DNA傷害、サイトカインによる腫瘍細胞のNK受容体リガンド、接着因子、chemokineの発現誘導についても検討中であるが、現段階で発現誘導に効果的な薬剤は発見されていない。また、末梢血、臍帯血NK細胞に於けるNKG2DのSNPによるNKG2Dを介する抗腫瘍効果の差についても進行中である。NK細胞による抗腫瘍効果の得られやすい固形腫瘍細胞株の特徴を明らかにし、一方、抗腫瘍効果が得られにくい細胞株での原因と抗腫瘍効果の増強について検討する。抗腫瘍剤、レチノイン酸、Histon deacetylase(HDAC)阻害剤、移植後に使用する免疫抑制剤(シクロスポリン、FK506)、サイトカイン、放射線照射などの処理を各腫瘍細胞に行い、これによる抗腫瘍効果の増強について検討する。また、腫瘍特異的抗体(抗GD2抗体、抗HER-2抗体)で腫瘍細胞を前処置した後、ドナーNK細胞による細胞傷害活性を測定し、ADCCによる細胞傷害活性の増強についての検討をおこなう。また、これらの結果により、マウスの実験モデルを用いて、in vivoでの解析を進めていきたい。腫瘍
尿中ボウマン嚢上皮細胞mRNAによる糸球体腎炎の非侵襲的バイオマーカーの確立

IgA腎症などの慢性糸球体腎炎の重症度を簡便に組織重症度を評価できるバイオマーカーの確立のためにCD44などのボウマン嚢上皮細胞活性化マーカーの尿中mRNA発現プロファイルと半月体形成率および臨床的重症度との相関を検討した。「ボウマン嚢上皮細胞の活性化とともに活性化ボウマン嚢上皮細胞が尿中に脱落し、尿中の活性化PEC mRNAの発現が亢進する」と仮定し著名な半月体形成を特徴とする抗糸球体基底膜抗体で惹起したラット半月体形成性腎炎を用いて、PECの活性化マーカーであるCD44について検討を行ったところ、尿中CD44 mRNAの発現は蛋白尿の増加とともに亢進し、また、半月体が形成される時期に発現のピークを認めた。しかし、尿中落下細胞は複数の細胞が含まれており、そこから抽出したmRNAもどの細胞由来かは判別が不能である。そのためCD44mRNAの発現亢進をどの細胞由来であるかを推測するために、ボウマン嚢上皮細胞マーカーであるPGP9.5, PAX2、その他の主要な尿中落下細胞である尿細管細胞の主要なマーカーであるAQP2に対する発現比を検討した。CD44/PGP9.5 mRNA比、CD44/PAX2 mRNA比およびCD44/AQP2 mRNA比においても、CD44の発現亢進は確認された。また、近年、尿中の細胞フリーRNAがバイオマーカーとして注目されていることから、本研究においても尿中落下細胞から抽出したRNAに加え、細胞フリーRNAも検討に加え解析を行っている。尿中の細胞フリーRNAがバイオマーカーとして注目されていることから、本研究においても尿中落下細胞から抽出したRNAに加え、細胞フリーRNAも検討に加え解析を加えたことから、サンプル調整や条件設定に時間を要している。人の尿サンプルの収集も行い人の慢性糸球体腎炎のマーカーとなりうるかも同時に解析を行う予定である。また、より病勢を反映するマーカーの探索のために細胞フリーRNAも検討に加え解析を行う予定である。そこで、それぞれのプライマーが認識する塩基配列を含むプラスミドを作成し、コントロールサンプルを作成した。これにより、より定量的に発現解析を行っている。尿中落下細胞は複数の細胞が含まれており、そこから抽出したmRNAの発現亢進がどの細胞由来かは判別が不能である。そのために、ボウマン嚢上皮細胞以外の尿中落下細胞のマーカーとの発現比較を行う必要があった。条件設定やプラスミドの作成に時間を要しており、サンプル数も限られていることから、サンプルの再採取の必要性が生じており予定通り進んでいない。

尿中の細胞フリーRNAがバイオマーカーとして注目されていることから、本研究においても尿中落下細胞から抽出したRNAに加え、細胞フリーRNAも検討に加え解析を加えたことから、サンプル調整や条件設定に時間を要している。動物実験による解析と並行して、人の尿サンプルの収集も行い人の慢性糸球体腎炎のマーカーとなりうるかも同時に解析を行う予定である。また、より病勢を反映するマーカーの探索のために他のmRNA発現解析も行う予定である。人の尿サンプルの収集も行い人の慢性糸球体腎炎のマーカーとなりうるかも同時に解析を行う予定である。また、より病勢を反映するマーカーの探索のために細胞フリーRNAも検討に加え解析を行う予定である。当初作成したサンプル数が限られており、また、より正確な評価のためにコントロールとして使用するプラスミドを作成する必要が生じた。そのため、予定よりも解析したサンプル数が減少した。また、学術集会において研究成果を発表する予定であったが、研究の遅れのため発表することができず出張旅費を使用しなかったため使用額が予定よりも減少した。今後、動物実験のサンプル再採取を行い解析数を増やすとともに、臨床サンプルを用いた実験を行う予定であり、解析するサンプル数が増加することが予想されるため、次年度の使用額は増加する見込みである。学術集会において研究成果を発表する予定であったが、研究の遅れのため発表することができず出張旅費を使用しなかったため使用額が予定よりも減少した。今後、臨床サンプルを用いた実験を行う予定であり、当初の計画に加え尿中細胞フリーRNAの解析を行うことになったため、次年度の使用額は増加する見込みである。