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原子効率的金属カルベノイドの発生と応用

アルキンと遷移金属との反応によって生じるカルベン錯体を鍵中間体とする新規触媒反応の開発を行った。本研究では,独自に開発したカルベン錯体の発生法を利用した触媒的カルベン移動反応をさらに発展させることを目的に,ヘテロ芳香族化合物との開環・挿入反応およびオリゴインの異性化反応におけるカルベン転位反応に関する検討を行った。酢酸プロパルギルと遷移金属錯体との反応によりビニルカルベン錯体が発生する。この反応には様々な後期遷移金属錯体が活性を示すが,特に活性の高いルテニウム錯体および白金錯体を用いてヘテロ芳香族化合物との反応を検討したところ,ヘテロ芳香族の開環ならびに形式的挿入反応生成物を与えることが明かとなった。例えば,ルテニウム触媒[RuCl_2(CO)_3]_2の存在下,酢酸プロパルギルとフランおよび2-メチルフランとの反応では,フラン環の開環によりそれぞれトリエンが生成した。反応は,ルテニウム-ビニルカルベン錯体のカルベン中心がフランの2位へ求電子的に付加することによって進行すると考えられる。一方,2,5-ジメチルフランとの反応では,3位がアリル化された生成物が得られた。これは,カルベン中心がフランの3位C-H結合へ形式的に挿入した生成物とみなされる。また,同様の触媒反応が白金触媒によっても効率的に進行する事を明らかにした。酢酸プロパルギル部位を両末端に有するジインおよびトリインに対して[RuCl_2(CO)_3]_2触媒を作用させると,アセタートが転位したジエンインまたはジェンジインがそれぞれ得られた。この反応では,生じたビニルカルベンルテニウム錯体のカルベン中心が,隣接するアルキン炭素上を移動(1,3-および1,5-金属シフト)して触媒的異性化が進行したと考えられる。本研究では,カルベン錯体の反応性を利用した触媒的カルベン移動反応をさらに発展させることを目的にヘテロ芳香族化合物との開環・挿入反応に関する検討を行った。酢酸プロパルギルと遷移金属錯体との反応により,ビニルカルベン錯体が発生する。この反応には様な後期遷移金属錯体が活性を示すが,特に活性の高いルテニウム触媒を用いてヘテロ芳香族化合物との反応を検討したところ,ヘテロ芳香族の開環ならびに形式的挿入反応生成物を与えることが明かとなった。ルテニウム触媒[RuCl_2(CO)_3]_2の存在下,酢酸プロパルギルとフランおよび2-メチルフランとの反応では,フラン環の開環によりそれぞれトリエンが生成した。反応は,生じたルテニウム-ビニルカルベン錯体のカルベン中心がフランの2位へ求電子的に付加することによって進行すると考えられる。これは,カルベン中心がフランの3位C-H結合へ形式的に挿入した生成物とみなされるが,ルテニウム-ビニルカルベン錯体のカルベン中心がフラン環3位に求電子的に反応することによって生成したと考えられる。その他,同触媒反応を利用してピロールやインドール類との反応の検討も行った。(1)酢酸プロパルギルと遷移金属錯体との反応によりビニルカルベン錯体が発生する。

この反応には様々な後期遷移金属錯体が活性を示すが,特に活性の高いルテニウム錯体および白金錯体を用いてヘテロ芳香族化合物との反応を検討したところ,ヘテロ芳香族の開環ならびに形式的挿入反応生成物を与えることが明かとなった。例えば,ルテニウム触媒[RuCl_2(CO)_3]_2の存在下,酢酸プロパルギルとフランおよび2-メチルフランとの反応では,フラン環の開環によりそれぞれトリエンが生成した。反応は,ルテニウム-ビニルカルベン錯体のカルベン中心がフランの2位へ求電子的に付加することによって進行すると考えられる。一方,2,5-ジメチルフランとの反応では,3位がアリル化された生成物が得られた。これは,カルベン中心がフランの3位C-H結合へ形式的に挿入した生成物とみなされる。また,同様の触媒反応が白金触媒によっても効率的に進行する事を明らかにした。(2)酢酸プロパルギル部位を両末端に有するジインおよびトリインに対して[RuCl_2(CO)_3]_2触媒を作用させると,アセタートが転位したジエンインまたはジエンジインがそれぞれ得られた。この反応では,生じたビニルカルベンルテニウム錯体のカルベン中心が,隣接するアルキン炭素上を移動(1,3-および1,5-金属シフト)して触媒的異性化が進行したと考えられる。
潜在エラーの予見的分析法による注射事故防止システムの開発

1.研究目的潜在エラーの予見的分析法(FMEA)を活用して,病院における看護師の注射事故を防止するための新システムを設計し,その実用性を評価することが目的である。本年度は特に、研究対象施設における注射実施過程に潜在する失敗モードを分析し、注射事故を防止するための新システムを設計した。2.研究成果データ収集と分析を次のとおり行った。(1)期間:平成20年10月平成21年3月(2)場所:1カ所の総合病院(3)方法:7名の病棟看護師が患者に注射を行う場面のビデオ撮影と看護師へのインタビュー(4)分析:撮影動画から注射実施工程を抽出し、インシデント報告分析支援システム「ePower/CLIP」を活用して失敗モードを抽出し、重要失敗モードを抽出して根本原因を検討した。結果として、看護師の注射実施には、指示確認、注射準備、患者への実施、観察の各工程において様々な確認行為があるが、(1)確認すべき事項があまりにも多い、(2)確認の遵守が個人の能力に任されておりパーソナル・ルールで行いがちである、(3)確認行為が形式的で流れている、(4)注射準備環境や確認に使用する物品が確認しやすい形態や配置になっていないという4点が明らかになった。そしてこれらの点を改善する環境整備と実施工程の新システムを設計した。今後は、新システムを評価すると共に、本成果を発展させた研究として、平成2123年度科学研究費補助金基盤研究(C)「注視行動ビジョン・リサーチに基づく看護師の注射事故防止システムの開発」(課題番号21592734)を行う。1.本研究の目的本研究の目的は,潜在エラーの予見的分析法(FMEA)を活用して,病院における看護師の注射事故を防止するための新システムを設計し,その実用性を評価することである。3年間で次の目標に取り組む。1)注射実施過程における問題点を予見的に把握するために,研究施設における注射実施過程に潜在する失敗モードを分析する。2)注射事故防止に先駆的に取り組んでいる国内施設における,システムの現状と課題を把握する。3)研究施設における注射実施過程に潜在する失敗モードの分析,及び先駆的施設におけるシステムの現状と課題を基に,注射事故を防止するための新システムを設計し,看護師の注射実施行動の変化から実用性を評価する。2.調査本年度から研究施設の注射実施状況を調査する計画であったが、実施状況の調査に先立って文献調査、ヒヤリ・ハット事例の分析、注射技術の映像分析などを行い、調査の基盤を作成した。詳細は下記のとおりである。来年度は、これらの結果に基づいて、研究施設の看護師と共に分析方法に関する学習会を開催した後に、実施状況の調査を行う。1)文献調査によりFMEAの分析方法を検討した。2)厚生労働省医療事故情報収集等事業ヒヤリ・ハット事例および日本医療機能評価機構医療事故情報収集等事業ヒヤリ・ハット事例を分析し、注射実施過程のうちエラーが起こりやすい工程を抽出した。3)市販されている注射技術のビデオ映像を分析し、実施工程を抽出すると共に、各工程で必要とされる知識と技術を抽出した。4)医療の質・安全学会(11月2324日)および日本看護科学学会(12月23日)に参加し、医療事故防止に関する情報収集を行った。5)日本航空安全啓発センターを見学し、航空機事故の防止システムについて情報収集を行った(11月27日)。1.本研究の目的潜在エラーの予見的分析法(FMEA)を活用して,病院における看護師の注射事故を防止するための新システムを設計し,その実用性を評価することで、目標は次の3点である。(1)注射実施過程における問題点を予見的に把握するために,研究施設における注射実施過程に潜在する失敗モードを分析する。(2)注射事故防止に先駆的に取り組んでいる国内施設におけるシステムの現状と課題を把握する。(3)研究施設における注射実施過程に潜在する失敗モードの分析,及び先駆的施設におけるシステムの現状と課題をもとに,注射事故を防止するための新システムを設計し,看護師の注射実施行動の変化から実用性を評価する。2.調査昨年度の文献調査、ヒヤリ、ハット事例の分析、注射技術の映像分析を継続すると共に、看護師の注射実施に関する文献から注射実施工程を分析し,次のとおり調査の基盤を作成した。(1)文献調査によりFMEAの分析方法を検討した。(2)厚生労働省医療事故情報収集等事業および日本医療機能評価機構医療事故情報収集等事業ヒヤリ、ハット事例を分析し、エラーが起こりやすい注射実施工程を抽出した。(3)市販の注射技術のビデオ映像を分析し、実施工程を抽出し、各工程で必要とされる知識と技術を抽出した。(4)看護師の注射実施に関する和洋文献から,注射実施工程を抽出して日米比較し,我が国特有の注射実施工程と潜在するエラーを分析した。(5)医療の質、安全学会(11月2324日)および日本看護科学学会(12月78日)に参加し情報収集を行った。来年度は、これらの結果に基づいて、研究対象施設の注射実施状況の調査と新システムの設計、評価を行う。

(1)期間:平成20年10月平成21年3月(2)場所:1カ所の総合病院(3)方法:7名の病棟看護師が患者に注射を行う場面のビデオ撮影と看護師へのインタビュー(4)分析:撮影動画から注射実施工程を抽出し、インシデント報告分析支援システム「ePower/CLIP」を活用して失敗モードを抽出し、重要失敗モードを抽出して根本原因を検討した。結果として、看護師の注射実施には、指示確認、注射準備、患者への実施、観察の各工程において様々な確認行為があるが、(1)確認すべき事項があまりにも多い、(2)確認の遵守が個人の能力に任されておりパーソナル・ルールで行いがちである、(3)確認行為が形式的で流れている、(4)注射準備環境や確認に使用する物品が確認しやすい形態や配置になっていないという4点が明らかになった。そしてこれらの点を改善する環境整備と実施工程の新システムを設計した。今後は、新システムを評価すると共に、本成果を発展させた研究として、平成2123年度科学研究費補助金基盤研究(C)「注視行動ビジョン・リサーチに基づく看護師の注射事故防止システムの開発」(課題番号21592734)を行う。
多因子疾患全身性強皮症治療薬のリード創製と最適化

全身性強皮症は皮膚や組織にコラーゲンが蓄積して硬化、線維化する自己免疫疾患である。明確な原因が不明で、対症療法のみで根治薬がなく、難病に指定されている。しばしば間質性肺炎、腎クリーゼなどの内臓線維化による重篤な疾患を併発し、死に至る場合もある。全身性強皮症はTGF-β/Smad系、PI3K/Akt系、自己免疫系などの諸因子が複合的に関与する疾患で、1つの蛋白質を標的として特異的に抑えても他の経路をバイパスとして病態が進行するため、単一標的アプローチでは治癒が困難である。全身性強皮症を治癒させるにはマルチ標的アプローチが必要と考えられる。本研究では単一の蛋白質を指標としたスクリーニングではなく、細胞の形態変化を光学的に検出するスクリーニング法を採用し、研究代表者の合成した各種化合物のなかから良好な活性をもつ化合物HPH-15を見出した。本研究では化合物HPH-15が作用する標的タンパク質を同定し、HPH-15の活性と体内動態を改良すべく構造最適化を行うことを目的とした。化合物HPH-15の10種類の誘導体を合成し、TGF-β刺激成人由来皮膚細胞に加え、コラーゲン産生抑制効果を調べた。そのうち4個の化合物はHPH-15と同等の活性を示した。HPH-15の標的タンパク質同定のためにHPH-15にビオチンを導入したBiotin-HPH-15の合成を行った。Biotin-HPH-15は成人由来皮膚細胞にTGF-βを作用させない場合においてのみ、コラーゲン産生を抑制した。Biotin-HPH-15をアビジン担持磁気ビーズに固定化し、プルダウン法により線維芽細胞からHPH-15標的タンパク質のバンドを得た。そのバンドが何のタンパク質のバンドであるか検討中である。化合物HPH-15の誘導体を10種類合成することができ、そのうち4種類は活性の良好であった。また、Biotin-HPH-15により標的タンパク質のバンドを得ることができた。よって、おおむね順調に進展しているということができる。Biotin-HPH-15を用いHPH-15の標的タンパク質のバンドを得るところまで達成できたので、そのバンドが何のタンパク質のバンドであるか検討する。HPH-15の体内動態について、マウスを用いて検討する。
HTLV-1ぶどう膜炎における分子標的治療の開発

HTLV-1ぶどう膜炎における分子標的治療の開発のために、眼内炎症発症に関与するサイトカイン・ケモカインの同定を行った。血液眼柵に深く関与する網膜色素上皮細胞とHTLV-1感染細胞の接触によって生じるサイトカイン・ケモカインを網羅的に測定したところ、炎症性サイトカインIL-6,IL-8とケモカインMCP-1,RANTESが深く関与することが明らかになった。またHTLV-1ぶどう膜炎の合併症に多い緑内障の発症に関与する線維柱帯細胞とHTLV-1感染細胞との接触でも同様な傾向がみられ、本疾患おける治療のための分子標的を特定することができた。HTLV-1ぶどう膜炎は現在ステロイド治療が主であるが、それによる副作用が懸念されている。ステロイドはHTLV-1感染細胞を腫瘍化する可能性があり、新たな分子標的療法が開発されることが急務である。ステロイドのHTLV-1感染細胞への影響を調べるために、HTLV-1ぶどう膜炎患者におけるステロイド内服群と非内服群でのプロウイルスロードの比較したところ、2.5倍程度ステロイド投与群でプロウイルスロードが高値であった。これはHTLV-1感染細胞が不死化するリスクファクターであるプロウイルロードの増加にステロイドが影響を与えている可能性が示唆され、ステロイド治療に代わる分子標的療法の必要性が明らかになった。続いてHTLV-1ぶどう膜炎の炎症惹起機序にどのような分子が眼内で関与するかを明らかにするために、眼免疫恒常性の維持における重要な役割を担うヒト網膜色素上皮細胞に着目した。ヒト網膜色素上皮細胞のセルラインとして、付着細胞であるARPE-19、H-RPEのシート状培養を効率的に行う条件を検討した。またHTLV-1感染細胞のセルラインとして、浮遊細胞であるMT-2、TLOm1を導入した。これら付着細胞(網膜色素上皮細胞)と浮遊細胞(HTLV-1感染細胞)を共培養するための最適な条件の検討を行った。さらに各細胞におけるエピジェネティクス関連分子を中心とした変化をフローサイトメトリー、Western blot、PCRを用いて解析中であり、同時に共培養した上清のサイトカインの変化を検討している。HTLV-1ぶどう膜炎の分子標的を検索するために、眼内組織にHTLV-1感染が及ぼす影響についての研究を行った。網膜色素上皮細胞は血液眼関門柵を形成する重要な眼内組織で、その位置や役割からHTLV-1ぶどう膜炎の発症に深く関与していると考えられるため、網膜色素上皮細胞にHTLV-1ウイルスが接触することで生じる炎症性変化を調べた。HTLV-1感染細胞株と網膜色素上皮細胞を共培養しHTLV-1が網膜色素上皮細胞に接触することで惹起される炎症性変化について、共培養上清を回収して炎症性サイトカインおよびケモカイン産生を測定した。網膜色素上皮細胞とHTLV-1感染細胞が直接・間接接触することで、炎症性サイトカインIL-6、IL-8の産生が著しく上昇する一方、IL-10, TNF-α, IL-1β, IL-12p70,の変化はみられなかった。またケモカインでは、直接・間接接触においてMCP-1, RANTESの著名な産生がみられた。一方、IP-10は直接接触でのみ産生されることが明らかになった。HTLV-1ウイルスが網膜色素上皮細胞と接触することによって、TNF-α, IL-1βの上昇はみられないが、IL-6 IL-8という特定の炎症性サイトカインが産生されることで、炎症惹起される可能性が考えられた。また抑制性サイトカインIL-10の産生を抑制することで炎症をより促進することが考えられた。さらにMCP-1, RANTESなどのケモカインの産生で、炎症を維持することが考えられた。以上により、HTLV-1ぶどう膜炎における眼内炎症惹起・維持機序の一端が明らかになった。HTLV-1ぶどう膜炎における新たな治療標的分子を明らかにするために、眼内炎症惹起に関与する眼内組織である網膜色素上皮細胞(ARPE-19、H-RPE)とHTLV-1感染細胞(MT-2、TLOm1)の共培養を行い、cytometric beads arrayでサイトカイン・ケモカインを測定した。炎症性サイトカインでは、IL-6、IL-8の産生が上昇することが明らかになった一方、抑制性サイトカインIL-10の上昇はみられなかった。またケモカインでは、MCP-1とRANTESの著名な上昇がみられた。これら複数の眼内組織とHTLV-1感染細胞の共培養実験により、各眼内組織とHTLV-1感染細胞の接触(直接・間接)によって産生される共通するサイトカイン、ケモカインを同定することができた。また、炎症を抑制する分子標的治療として、HTLV-1感染細胞(MT-2、TLOm1)に発現しているCCR4を標的に抗CCR4抗体を投与して検討したところ、HTLV-1感染細胞由来の炎症性サイトカイン・ケモカインを抑制することができた。しかしながら、HTLV-1感染細胞と網膜色素上皮細胞間の接触で産生されるサイトカイン・ケモカインの抑制は限定的であることが明らかになった。血液眼柵に深く関与する網膜色素上皮細胞とHTLV-1感染細胞の接触によって生じる

サイトカイン・ケモカインを網羅的に測定したところ、炎症性サイトカインIL-6,IL-8とケモカインMCP-1,RANTESが深く関与することが明らかになった。またHTLV-1ぶどう膜炎の合併症に多い緑内障の発症に関与する線維柱帯細胞とHTLV-1感染細胞との接触でも同様な傾向がみられ、本疾患おける治療のための分子標的を特定することができた。HTLV-1感染細胞と網膜色素細胞の培養条件や最適細胞数などを検討するために多くの時間を要した。条件を慎重に決定した後、HTLV-1ウイルスの網膜色素上皮細胞への接触によって産生される炎症性サイトカイン、ケモカインを測定したところ、特定のサイトカインやケモカインがHTLV-1ぶどう膜炎の発症機序に関与している可能性があることを明らかにすることができた。これらの結果によって、HTLV-1ぶどう膜炎治療における分子標的療法のターゲットを決定するためのデータの蓄積ができてきているため。眼科学HTLV-1ウイルスの網膜色素上皮細胞への接触によって産生される炎症性サイトカイン、ケモカインが明らかになってきたため、今後、サイトカイン、ケモカインのどれを標的にすることで、最も効率良く炎症が抑制できるか検討する。また、網膜色素上皮細胞以外の眼内組織についても、HTLV-1ウイルスとの接触によって起きる炎症性変化を比較検討し、眼内において最も抗炎症効果を示す分子標的の探索を行う。実験に導入した細胞の適切な培養条件などの検討に時間が必要であった。実験自体は順調に進んでいると考えるが、HTLV-1感染細胞の取り扱いに関わる実験室の整備と、細胞培養条件や感染条件などの検討に時間がかかり、次年度使用額が生じた。実験に導入した細胞を培養した際に得られた知見を踏まえ、HTLV-1感染細胞が眼内で炎症を惹起する際に関与する分子、サイトカインの同定を進めて行く。上記実験室の整備が整ったことと、様々な条件検討が終わっているため、HTLV-1ぶどう膜炎の分子標的のターゲットを決める実験を進めるため、HTLV-1が眼内組織に接触、感染することによるサイトカイン・ケモカインなどの測定を進める。さらに有効と考えられる分子を標的にした治療法の検討を行い、効果を検討する。実験に導入した細胞の培養条件などの検討に時間がかかり、抗体、実験キットなどの高額な品目を購入する機会が少なかったため。今後はフローサイトメトリーやサイトカイン測定などで多くの抗体、実験キットなどを購入する機会が増えると考えられるので、目的に応じて、適切にまた計画的に使用する予定である。
小脳における記憶の神経過程と運動学習の機序

本研究は小脳における記憶過程の実体として長期抑圧現象をえ,その生理学的性質と分子機構を解明するとともに,長期抑圧を記憶過程とする運動学習の機序を眼球運動を実験系として動物実験およびシミレーション研究により解明することを目的として行われた.昭和58年度より5年間にわたり研究代表者1分担者6のほか,研究協力者13(うち外国人3名)の計20名により実施された,研究には麻酔ウサギにおける電気生理学実験,覚醒サルにおける眼球運動の測定とニューロン信号の解析,覚醒ラットにおける2-デオキシグルコズ法,脳切片法における樹状突起内誘導,ニューロンの組織培養法が用いられた,その主な成果は, 1.研究代表者らが昭和57年発見した小脳の長期抑圧現象を,脳内に存在するシナプス可塑性の4つの主要型の1つとして確立した, 2.長期抑圧の分子過程について, Ca^<2+>イオンの樹状突起への流入がその一つの段階であること,最終的にはキスカル酸特異性グルタミン酸受容体の脱感作が起こるのを明らかにした, 3.小脳片葉が前庭動眼反射のみならず,視機性眼球運動に対しても適応中枢として働くことを示し,長期抑圧を記憶過程とする小脳性運動学習機構の原理を明らかにした, 4.小脳による眼球運動制御の原理を表現するモデルの構成を行った,ことである.これらの成果により当初の目標はほぼ達成されたが,更に付随する重要な成果として, 5.組織培養において,神経細胞の突起の成長を制御する技術が進み,また, 6.大脳の認知記憶系について平行して進めた研究において,図形記憶ニューロンとも言うべき新しいニューロン群が発見されたことを挙げることが出来る.これらの成果はNATURE2篇を始めとする英文論文32,プロシーデイングス13,著書2により発表,また,国外の国際学界,シンポジュウム,ワークショップにおいて講演26,一般発表5,国内学会において発表32を行った.本研究は小脳における記憶過程の実体として長期抑圧現象をえ,その生理学的性質と分子機構を解明するとともに,長期抑圧を記憶過程とする運動学習の機序を眼球運動を実験系として動物実験およびシミレーション研究により解明することを目的として行われた.昭和58年度より5年間にわたり研究代表者1分担者6のほか,研究協力者13(うち外国人3名)の計20名により実施された,研究には麻酔ウサギにおける電気生理学実験,覚醒サルにおける眼球運動の測定とニューロン信号の解析,覚醒ラットにおける2-デオキシグルコズ法,脳切片法における樹状突起内誘導,ニューロンの組織培養法が用いられた,その主な成果は, 1.研究代表者らが昭和57年発見した小脳の長期抑圧現象を,脳内に存在するシナプス可塑性の4つの主要型の1つとして確立した, 2.長期抑圧の分子過程について, Ca^<2+>イオンの樹状突起への流入がその一つの段階であること,最終的にはキスカル酸特異性グルタミン酸受容体の脱感作が起こるのを明らかにした, 3.小脳片葉が前庭動眼反射のみならず,視機性眼球運動に対しても適応中枢として働くことを示し,長期抑圧を記憶過程とする小脳性運動学習機構の原理を明らかにした, 4.小脳による眼球運動制御の原理を表現するモデルの構成を行った,ことである.これらの成果により当初の目標はほぼ達成されたが,更に付随する重要な成果として, 5.組織培養において,神経細胞の突起の成長を制御する技術が進み,また, 6.大脳の認知記憶系について平行して進めた研究において,図形記憶ニューロンとも言うべき新しいニューロン群が発見されたことを挙げることが出来る.これらの成果はNATURE2篇を始めとする英文論文32,プロシーデイングス13,著書2により発表,また,国外の国際学界,シンポジュウム,ワークショップにおいて講演26,一般発表5,国内学会において発表32を行った.小脳における記憶系の構造と機能を解明し、その分子過程を明らかにするとともに、この記憶系の働きに基づいて行われる運動学習の機序を解明するのが本研究の目的である。この目的のため次の5つの実験計画を実施した。登上線維の信号と平行線維の信号の異シナプス間干渉によって、その平行線維とプルキン工細胞間のシナプス伝達に「長期抑圧」がおこり、これが小脳の記憶の本質的なメカニズムを現わすと考えられるが、1)伊藤は狩野と協力し、平行線維の伝達物質グルタメイトとその類似物質に対するプルキン工細胞の感受性をしらべた。またこれにより長期抑圧に関与するグルタメイト受容体はキスカール酸特異性をもつものであることが判明した。2)桜井は小脳切片において長期抑圧を安定に再現することに成功しこの発現に関与する種々の因子の分析を行った。3)福田はプルキン工細胞のグルタメイト受容体を標識するため単クーロン抗体を作製し、その作用の検定を続けている。これら小脳のシナプス可塑性の分子過程に関する研究と平行して小脳による運動学習の機序の研究を前庭動眼反射の適応制御を材料として進めている。そして、4)渡辺は家兎の視機性眼球運動と前庭動眼反射の適応の間に相互干渉がおこることを見出しこの現象に対応して片葉のプルキン工細胞の反応が変化することを明らかにした。藤田は小脳の適応フィルターモデルにより、この干渉現象のシミュレーションによる再構成を行い長期抑圧と眼球運動制御の対応関係を裏づけるべく努力している。5)宮下は視機性眼球運動時にグルコーズ消費の増加する脳部位を2デオキシグルコーズ法によりとらえることに成功し、関係する小脳領域のマッピングを行っている。

小脳における記憶系の構造と機能を解明し、その分子過程を明らかにするとともに、この記憶系の働きに基づいて行われる運動学習の機序を解明するのが本研究の目的である。この目的のため次の5つの実験計画を実施した。登上線維の信号と平行線維の信号の異シナプス間干渉によって、その平行線維とプルキンエ細胞間のシナプス伝達に「長期抑圧」がおこり、これが小脳の記憶の本質的なメカニズムを現わすと考えられるが、1)伊藤は金井と協力して長期抑圧の時間経過の長時間にわたる追跡を試み、電場電位の記録により一部これに成功している。2)桜井は小脳切片標本において長期抑圧を安定に再現することに成功し、カルシウムイオンの長期抑圧の発現に関与するメカニズムの解明を行っている。3)福田は河西と協力して組織培養した小脳細胞についてグルタメイト受容体の性質をしらべ、長期抑圧発現の分子機構の解明を試みている。これら小脳のシナプス可塑性の分子機構に関する研究と平行して小脳による運動学習の機序の研究を覚醒状態の動物を用いて行っている。4)永雄は小脳切片による前庭動眼反射の適応制御のメカニズムについて家兎による研究をつづけ、片葉への前庭、視覚、眼球速度の3種類入力の相対的な強さの測定を行っている。5)宮下は森と協力して片葉への視覚入力の局在を2デオキシグルコーズ法により明らかにした。6)藤田はこれら小脳の働きを表現する理論モデルの構成を試み、前庭動眼反射のみならず、サッケード眼球運動の小脳制御についてのシミュレーションモデルを提案するに至っている。
2歳児から3歳児の主体性の育ちと保育--認定子ども園における縦断観察事例研究--

認定こども園(幼保連携型)における2歳児クラスから3歳児クラスにかけての2年間の縦断的保育観察事例から,(1)モノの占有をめぐる自己と他者の関係調整と主体性の育ちについて,(2)認定こども園の保育の多様性,特に満3歳児保育との関連について検討し,従来の幼稚園や保育所の子どもの同質性を前提とした発達理論並びに保育実践を,子どもの保育経験や保育形態の多様性を前提として問い直すことの必要性を示唆した。本研究は,2歳児から3歳児にかけての子どもの主体性の育ちとそれを支える認定こども園における保育・教育実践のありようを,継続的な個別観察事例の検討により,保育学および発達心理学の観点から,特に保育者と子どもの間身体的・間主観的水準での関係性の形成・維持・変容過程を記述考察することを通じて,明らかにしようとするものである。平成19年度は,幼保連携型認定こども園の保育所2歳児クラスにおいて,週1日の保育観察(予備観察を5月に開始し,本観察を9月から3月まで実施した)を実施し,採録された事例の検討により,主に以下の点について考察した。(1)2歳児の主体性の育ちの観点から,ある女児のモノの占有や譲り合いに関する事例を検討した。保育室で子ども一人に1つずつ確保された専用おもちゃ箱(保育室の共有の玩具を入れておくとその間はその子どもの占有が認められる)という環境とそれについての保育者のかかわりが絡み合い,モノを介した女児の主体的な対人関係の育ちを支えていることを明らかにした(日本発達心理学会第19回大会で発表)。(2)認定こども園における実践の観点から,満3歳児保育との関連で,年度途中で3歳の誕生日を迎えた時点で同園内の幼稚園3歳児クラスへ移籍する女児2名と,保育所2歳児クラスに在籍し続ける女児1名が同一園内で生活することに関する事例を検討した。特に後者の女児に「大きくなる=幼稚園に入る」ことへのアンビバレントな思いが見られることを指摘すると共に,そうした新しい状況への対応を,幼保連携型認定こども園における満3歳児保育の課題の一端として提起した(発表は平成20年5月の日本保育学会第61回大会にて行う)。平成20年度は,幼保連携型認定こども園の幼稚園3歳児クラス(長時間保育児中心)において,週1日の保育観察を実施し,採録した事例の検討により,主に以下の点について考察した。(1)認定こども園における実践の観点から,満3歳児保育との関連で,年度途中で3歳の誕生日を迎えた時点で同園内の幼稚園3歳児クラスへ移籍する女児2名と,保育所2歳児クラスに在籍し続ける女児1名が同一園内で生活することに関する事例を検討した。特に後者の女児に「大きくなる=幼稚園に入る」ことへのアンビバレントな思いが見られることを指摘すると共に,そうした新しい状況への対応を,幼保連携型認定こども園における満3歳児保育の課題の一端として提起した(平成20年5月の日本保育学会第61回大会で発表)。(2)認定こども園の実践が抱える課題として,保育所からの進級児,幼稚園での新入園児,満3歳保育経験児,満3歳保育での年度途中入園児など,多様な保育経験を持つ子どもたちを一つのクラスに包摂することに注目した。子どもたちが,2歳から3歳にかけての保育所から幼稚園への進級という事態や,互いの多様な状況をどう捉えているかを観察事例によって検討し,多様性がもたらす子ども同士の関係の非対称性が,保育者の配慮性の下で初めて子どもたちに主体的に受け止められることを示唆した。子どもたちの保育形態や家庭状況の同質性を前提とする従来の保育から,多様性を前提として保育実践を組み立てていく必要性を論じた(平成21年5月の日本保育学会第62回大会で発表予定)
深層水の水塊特性とマッピング

この研究は深層海流の挙動を調べる目的で、海水の温度、溶在酸素、塩分、水圧などの測定値から物理的解析を行い、上記諸量に依存する音波の伝搬特性を利用した音響トモグラフィ法を中心に、深層水塊構造、流動特性を計測する手法を開発する。物理解析では、伊豆・小笠原海嶺を中心に海底地形の影響も考慮し、北西太平洋の深層循環の物理的解釈を行った。まず大洋規模の循環に不可欠な水平分布、特に等ポテンシャル温度面、等ポテンシャル渦度面の水平分布図を作成した。続いて深層での水温、塩分、溶在酸素の三つの関係を調べた。中立面分布、ソレノイド項についても考察した。黒潮流域について先に表面海流の解析を終え、本年は各層の観測データから無流面深度の分布および季節変化等を考慮し、深層海流の全体像を求めた。さらにインバース法により両者のマッチングを行った。計測関係では、長距離音波伝搬に必要な低周波音源として、円筒振動子を2枚の金属で挾んでリール形共振器とした新型音源を開発し、充分な性能を持つことを確かめた。また音波の伝搬時間に影響する水面反射について水槽による実験を行い、その解析法を求めた。IESによる広域(数10km程度)の平均海流計測法については更に実績をつみ実用化を図った。またモータ駆動音波切離装置についても6000m、10000m用の装置を開発し、テストを行った。多数の物体を海流に乗せ、これにLPM音波をあて、反射波から物体の位置と速度をパターン的に計測する方法について、従来2個のパルスを用いていたが、これを1個で行える方法を開発した。また簡単な構造で3次元的に流速パターンを得る計測システムとして円環アレイセンサを提案し、基礎的実験を行った。
新人看護師の離職とストレス対処能力（ＳＯＣ）に関する研究

本研究では新人看護師の離職とストレス対処能力(SOC)の関連についてアンケート調査を実施した。新人看護師の離職願望は64.3%であった。離職願望と関連があったのは、気分転換、心理的な仕事の負担(質)、仕事の裁量権、技術の活用度、働きがい、疲労感、仕事や生活の満足度であった。離職を防止するためには、「心理的な仕事の負担(質)」「疲労感」「職場の対人関係でのストレス」を軽減し、「働きがい」「仕事や生活の満足度」を高めることが重要である。平成25年度は、離職願望、SOC(ストレス対処能力)、GHQ(精神健康度)の推移と関連等を調査することを目的とし、質問紙調査を実施した。質問紙調査は、二段無作為抽出法にて抽出された、15府県の450施設のうち同意の得られた53施設の556名の新人看護師を対象に縦断的に実施した。556名中168名から質問紙を回収した(回収率30.2%)。対象者の平均年齢は25.01±6.78歳で、最年長が58歳、最年少が20歳であった。性別は男性が11%、女性が89%で、基礎教育課程は4年制大卒が21.0%、3年制専門学校卒が58.7%、その他が20.3%であった。看護師を辞めたいと思ったことが「よくある」「ときどきある」が40.7%で、「全くない」「ほとんどない」が38.9%とほとんど差がなかった。病院を辞めたいと思ったことが「よくある」「ときどきある」は36.5%で、「全くない」「ほとんどない」が43.7%と、僅かながら看護師を辞めたいと思った比率の方が高かった。SOCの平均値は51.69±10.52と一般成人を対象とした先行研究の結果(57±13)よりも低い値となった。さらに、GHQの平均値は17.69±6.49で、一般成人を対象とした先行研究の結果(20.3±6.2)よりも低かったことから、調査時点での対象者のストレス対処能力及び精神健康度が低かったと考えられる。看護師を辞めたい群と辞めたくない群のt検定では、SOC、GHQ、レジリエンスで有意差があり、コーピング方略では、「積極的問題解決」「他者を巻き込んだ情動発散」で有意差が見られた。平成24年度は、離職願望とSOC、ストレッサー等の関連要因を調査することを目的とし質問紙調査を実施した。東京都、大阪府、福岡県の300床以上の機能評価認定病院のうち、37施設の2012年度の新人看護師914人に質問紙を配布し郵送で283名分を回収した(回収率30.9%)。調査内容は、属性調査、離職願望、SOC、コーピング尺度、職業性ストレス尺度による質問紙調査とした。離職願望は「看護師を辞めたいと思った」、「病院を辞めたいと思った」ことがあるかを5件法で測定した。調査に際しあらかじめ福岡県立大学倫理審査委員会の承認を得た。対象者の平均年齢は25.6±6.0歳で、最年少が20歳、最年長が49歳であった。看護師を辞めたいと思ったことが「よくある」・「時々ある」対象者は全体の64.3%で、病院を辞めたいと思ったことが「よくある」・「時々ある」対象者は全体の52.1%であった。順序回帰分析の結果、『看護師を辞めたい』と関連があったのは、気分転換(β=.066*)、心理的な仕事の負担(質)(β=-.115*)、仕事のコントロール度(β=-.110*)、あなたの技術の活用度(β=.269**)、働きがい(β=-.395***)、疲労感(β=.092*)、仕事や生活の満足度(β=.170**)であった(疑似R2乗CoxとSnell=0.443)。一方、『病院を辞めたい』と関連があったのは、SOC(β=-.039*)、職場の対人関係でのストレス(β=-.241***)、働きがい(β=-.252*)、仕事や生活の満足度(β=.171*)であった(疑似R2乗CoxとSnell=0.428)(***p<.001、**p<.01、*p<.05)。両方に関連する因子は「働きがい」であったことから、就職後早期に職業性アイデンティティの確立と働きがいを見出せるような卒後教育が重要と考える。平成25年度にSOC(ストレス対処能力)、GHQ(精神健康度)の関連等を調査する目的で質問紙調査を実施し、平成26年度に調査結果の分析を行った。

二段無作為抽出法にて抽出された15府県53施設の新人看護師556名に質問紙調査を行ない、167名分を回収した(回収率30.0%)。調査内容は基本属性、日本版GHQ-30、SOC、レジリエンス、コーピング特性とした。分析は、GHQを従属変数とし、SOC、レジリエンス、コーピングを独立変数とする重回帰分析(ステップワイズ法)を行った。対象者の平均年齢は25.0±6.8歳で、最年少が20歳、最年長が58歳であった。性別は、男性11%、女性89%であった。GHQ-30(0-30点)の平均12.1±6.4点で、「抑うつ・神経症傾向あり」とされる精神的不健康群(8点以上)は123名(73.6%)であった。重回帰分析の結果、SOC***、レジリエンスの「肯定的な未来志向*」、コーピングの「他者を巻き込んだ情動発散**」との関連がみられた(***p<.001、**p<.01)。GHQ-30は一般成人においては精神的不健康群が約15%と報告されている。看護師(20-60歳)を対象とした先行研究では46.2%が8点以上であり、一般成人より精神的健康度が低い傾向が認められている。本研究の対象者はさらに高く、73.6%と極めて精神的不健康な状態であった。疲労やストレスなどの蓄積により精神的不健康度が高まると考えられるため、睡眠や休息が十分取れる勤務体制の考慮が必要と考える。SOCは、一般成人を対象とした調査(57±13点)よりも低く、ストレス対処能力が低い集団であると示唆された。SOCが低いため、ストレスコーピングが上手くいかなかった時の抑うつ感や不安感といったストレス反応として、精神的健康度が下がったのではないかと考える。看護教育学,看護管理学平成25年度は縦断調査により離職願望、SOC、GHQの推移及び、離職願望、SOC、GHQとの関連を明らかにすることを目的に二段無作為抽出法による縦断調査(調査用紙を3回配布)を実施した。現在、第3回目の調査用紙の回収中で、第1回目、第2回目の分析を行っていることから、おおむね計画通りに進展していると思われる。さらに、平成24年度の調査結果を平成25年度に分析し、平成25年8月の日本看護学教育学会第23回学術集会(仙台市)、11月の第17回世界看護研究学会学術集会(スペイン)、12月の第33回日本看護科学学会学術集会(大阪市)で発表し、広く世間に向けた好評も行えていると考える。当初の計画通りに調査を行ったが、研究の同意が得られた施設が計画よりも少なく、調査対象も当初計画より少なくなってしまったことと、インタビュー調査の協力者が選定できずインタビューを実施できたなかった。しかし、調査結果から「看護師を辞めたい」と「病院を辞めたい」と思う要因の差や、離職を考えたときの相談相手や求めるサポート等を明らかにすることができた。分析結果に関しては国内外での学会での発表を予定しているため、広く世間に向け公表することから、おおむね順調に進展していると考える。平成25年度の質問紙調査の結果から、新人看護師の就職後のSOCの推移と、SOCと因果関係のある要因を明らかにする。さらに、離職に至った要因と離職を思いとどまった要因についてインタビュー調査を実施する予定である。平成24年度の調査結果は、7月にThe 25th International Nursing Research Congress(香港)で発表予定であり、平成25年度の縦断調査の結果は、12月の第34回日本看護科学学会学術集会(名古屋市)に於いて発表予定である。平成25年度は5月に調査依頼を行い、6月7月に第一次調査を実施する。その後、10月11月、2月3月に第二次、第三次調査を行い、第三次調査の後にインタビュー調査を実施する。質問紙調査の内容は、新人看護師の就職後のSOCの推移と、SOCと因果関係のある要因を明らかにする。さらに、離職に至った要因と離職を思いとどまった要因についてインタビュー調査を実施する。
機能性反応を組み合わせた逆相ミセル型高度分離・精製プロセスの開発

1.逆相ミセル粒径分布と蛋白質の溶解機構:AOT/イソオクタンを用いた逆相ミセル系において、ミセル粒径分布の定量化、蛋白質のミセル内への可溶化モデルについて検討した。さらにこのモデルに基づき、蛋白質混合物の相互分離について実験的に検討した。ミセル粒径分布は、ミセル相AOT濃度によらず、水相塩濃度により決まる含水率によって相関できた。また蛋白質のミセル内への溶解特性は、ミセル粒径分布に基づき、界面に吸着した蛋白質が、それより大きいミセルと衝突することによって、可溶化させると仮定する簡単なモデルにより、定量化することができた。またミセルー蛋白質間の静電的な相互作用とミセル粒径分布との関係についても検討した。さらに、このモデルの応用として、Lysozyme、α-Chymotrypsin、BSAの相互分離を行った。2.逆相ミセル液膜を利用した蛋白質の分離:逆相ミセル-蛋白質間の静電的相互作用、立体的相互作用(立体的排除効果)を利用して、逆相ミセルバルク液膜による、蛋白質の高選択的な分離を行った。蛋白質相互の等電点、表面電荷、分子量等の差に応じて、液膜の両側の二つの水相における、pH,KC1濃度や液膜相の初期含水率を調整し、さらにはアニオン性ないしカチオン性界面活性剤を選択することによって、蛋白質を液膜を経て、一方の水相から回収側水相へ、高選択的に能動輸送することが可能である。蛋白質の変性は、主として回収側の水相において、低塩濃度条件下でAOTとの複合体形成により生じるが、通常の条件では、従来の回分抽出法と比較してはるかに少ない。速度差を利用する液膜分離法やAOT、CTAB両液膜を併用する複合液膜分離法も、蛋白質の分離に有効である。分離場の母体として、アニオン性界面活性剤ーAOTを所定量溶解させたイソオクタンー塩化ナトリウム水溶液からなる二相分配系を用い、リゾチーム、キモトリプシン、リパーゼ、BSA等各種分子量・等電点の蛋白質の分配係数を測定し、分配特性のpHおよび塩濃度等各種操作条件依存性を定量化した。また動的光散乱法により逆相ミセル粒径分布を測定し、有機相内含水量の変化ならびに、上記各種蛋白質の可溶化に伴うミセルサイズの変化を検討した。ミセル粒径分布は対数正規分布で相関され、平均径と含水量との間には同心球殻モデルに基づく相関が成立しており、塩濃度の増加と共に平均径は減少し、ミセル総数は増加する。一方、蛋白質を可溶化してもミセル粒径分布は殆んど影響を受けず、また蛋白質の種類や濃度にも依存しない。したがって、蛋白質分子量が大きい程、立体的排除効果が増加し分配係数は減少する。また等電点、pIとpHとの差に基づく、蛋白質表面電荷ーミセル内電気二重層間静電的相互作用は、蛋白質径とミセル内水相半径の比に依存し、両者がほぼ等しい条件で最大となる。さらに、各種の側鎖を有するエーロゾル系界面活性剤を用いて、上と同様の測定を行なって、ミセル粒径分布と分離特性に及ぼす効果や、水相中への溶解に起因する活性剤の消失量等を比較検討した結果、蛋白質の可溶化・分離・精製の目的からは、AOTが最適であることが判明した。最後に、多成分系混合液よりの酵素・蛋白質の分離・分画法として、上記立体的・静電的相互作用の差異による分配係数のpH、塩濃度依存性の違いを利用して、正抽出・逆抽出を組み合わせた3段階の分離スキームを提出した。

一例として、高pH域で最も小さいリゾチームのみを抽出し、次いで低pH、低塩濃度でキモトリプシンのみをエセル相に可溶化させる方法によって、3成分系の分離も可能であることを示した。1.逆相ミセル粒径分布と蛋白質の溶解機構:AOT/イソオクタンを用いた逆相ミセル系において、ミセル粒径分布の定量化、蛋白質のミセル内への可溶化モデルについて検討した。さらにこのモデルに基づき、蛋白質混合物の相互分離について実験的に検討した。ミセル粒径分布は、ミセル相AOT濃度によらず、水相塩濃度により決まる含水率によって相関できた。また蛋白質のミセル内への溶解特性はミセル粒径分布に基づき、界面に吸着した蛋白質が、それより大きいミセルと衝突することによって、可溶化されると仮定する簡単なモデルにより、定量化することができた。またミセル-蛋白質間の静電的な相互作用とミセル粒径分布との関係についても検討した。さらに、このモデルの応用として、Lysozyme,α-Chymotrypsin,BSAの相互分離を行った。2.逆相ミセル液膜を利用した蛋白質の分離:逆相ミセル-蛋白質間の静電的相互作用、立体的相互作用(立体的排除効果)を利用して、逆相ミセルバルク液膜による、蛋白質の高選択的な分離を行った。蛋白質相互の等電点、表面電荷、分子量等の差に応じて、液膜の両側の二つの水相における、pH,KCl濃度や液膜相の初期含水率を調整し、さらにはアニオン性ないしカチオン性界面活性剤を選択することによって、蛋白質を液膜を経て、一方の水相から回収側水相へ、高選択的に能動輸送することが可能である。蛋白質の変性は、主として回収側の水相において、低塩濃度条件下でAOTとの複合体形成により生じるが、通常の条件では、従来の回分抽出法と比較してはるかに少ない。速度差を利用する液膜分離法や、AOT,CTAB両液膜を併用する複合液膜分離法も、蛋白質の分離に有効である。
腸内細菌による大腸炎が大腸異型陰窩の幹細胞に作用し腺腫形成を誘導する機構

Apc-Min/+マウスにデキストラン硫酸塩(DSS)を投与すると定常状態を保っている大腸のβカテニン蓄積陰窩(BCAC)が腺腫に進展する。組織の連続切片の3次元再構築と種々の免疫染色を行ってこの過程を詳細に観察し、BCACの総細胞数ならびに増殖細胞数などを定量解析した。私達はすでに正常陰窩で間欠的に増殖している細胞が存在することを明らかにしていたが、BCACでも同様に間欠的に増殖している細胞が存在し、BCACでは正常陰窩に比べてその数が増加し、全体の半数以上を占めていた。しかし、陰窩を形成している総細胞数の増加はわずかに留まっていた。ここにDSS投与が加わると、増殖細胞が増え、BCACは枝分かれしながら、総細胞数が一気に増加して腫瘍化し始めた。この解析過程で、3次元空間内の一定の範囲内に存在する細胞数をカウントする新規の方法を共同開発し特許を出願した。DSSの投与により正常の陰窩も過形成を示したが、その際には間欠的な細胞増殖を示す細胞の増加は見られず、この変化はApc遺伝子変異に基づくもので炎症による影響を受けなかった。さらにこのような細胞動態の解析を可視化することを目指して、間欠的に増殖する細胞に発現する遺伝子の同定を目的とした研究を進めた。種々の幹細胞マーカー分子のタンパク質レベルでの発現は特異的な分子の同定に至らず、現在、他の解析から注目するに至った転写因子とその標的遺伝子産物について、腫瘍化に関わる間欠的増殖細胞との関係を調べている。この分子の発現が間欠的に増殖している細胞に強く出ているという結果が得られたら、この遺伝子の発現依存的に蛍光物質を発現する細胞を作製し、間欠性増殖細胞の増殖動態の解析、ならびにこの細胞が組織幹細胞としての特性を持つか否かについてさらに解析を続けて行く予定である。24年度が最終年度であるため、記入しない。Apc^<Min/+>マウスにDSSを飲水投与すると腸内細菌に依存した大腸炎が起こり、大腸腺腫の発生が誘導される。この系を用いて、DSS投与時の大腸粘膜の変化について経時的観察を行った。正常粘膜部では、DSS投与により表層粘膜の剥離が起き、続いて炎症細胞浸潤と陰窩上皮の増殖亢進がみられたが、少なくとも高度の粘膜傷害がない部分では、組織幹細胞と思われる間欠的な増殖を示す細胞(間欠性増殖細胞;Geyser cell)の増加は認めなかった。一方、Apc^<Min/+>マウスの大腸に見られるβ-catenin蓄積陰窩(BCAC)では、DSSなしで間欠性増殖細胞の増加が著しく、Apc遺伝子のセカンドヒットによる変化と考えられた。このBCACに炎症刺激が加わると、間欠性増殖細胞の増加と一過性増殖細胞への分化あるいはその増殖促進の両者が起こり、総細胞数が持続的に増加して腫瘍形成に至ると解釈された。この発がん機構は、数学的な解析とそれを元にしたコンピューターシミュレーションでも確からしさが示された。この成果は、3次元組織内で特定の細胞数を数える定量的な解析によってもたらされる独創的な研究成果であると考える。間欠性増殖細胞が組織幹細胞である可能性を解析するために、この細胞の分子マーカーの検討を進めているが、これまでのところ、Bim-1,CD133,Lgr5などのタンパクレベルを免疫組織化学的に解析した結果では、特異的なマーカー分子を同定できていない。Apc^<Min/+>マウスとTMEPAIノックアウトマウスの交配では、TMEPAI+/+マウスでも腫瘍数が激減しており、この腫瘍形成はB6系列のバックグラウンドに依存するので、バッククロスがいまだ不十分である可能性が示唆された。C18orf1マウスも作製できたので、今後、腫瘍形成に対する影響を解析する交配実験を行う予定である。

この分子の発現が間欠的に増殖している細胞に強く出ているという結果が得られたら、この遺伝子の発現依存的に蛍光物質を発現する細胞を作製し、間欠性増殖細胞の増殖動態の解析、ならびにこの細胞が組織幹細胞としての特性を持つか否かについてさらに解析を続けて行く予定である。24年度が最終年度であるため、記入しない。マウスの大腸粘膜において、間欠的に増殖する細胞の存在を同定し、その細胞動態を炎症惹起時やBCACで解析できたことは、独創性の高い、当初計画を超える成果である。しかし、この細胞の増殖や分化に関与する可能性がるサイトカインの同定とこの細胞の分子マーカーの同定は終わっておらずこの点ではやや遅れている。間欠性増殖細胞の分子マーカーを同定し、この遺伝子座に赤色蛍光タンパク質(RFP)遺伝子を組み込んだマウスを作製して、間欠性増殖細胞が赤色蛍光で同定できるマウスを作製する。さらに、すでに作製したKi-67遺伝子座にGFP遺伝子を導入したマウスと交配し、live imagingを行い、間欠性増殖細胞が自己複製能と多分化能をもつか確認する。さらにこの細胞の増殖動態に炎症が及ぼす影響について検討する。また、細胞分化の階層性がある細胞動態の中で、炎症性サイトカインが粘膜上皮の増殖動態に及ぼす作用について検討する。
Ｂｕｉｌｄｉｎｇ　ｂｌｏｃｋｓ法による高効率多重遺伝子サイレンシング系の確立

ポストゲノム時代の逆遺伝学的なアプローチにおける技術的問題の一つは、機能的に重複を持つファミリー遺伝子の機能解析である。本研究では、この問題を解決するために、40-60bp程度のターゲット配列を複数個タンデムにつなげた合成DNAをトリガー配列としたRNAiであるBuilding Blocks法を開発し、その適用を試みた。その結果、植物細胞壁構成成分であるキシロースやセルロースの分解酵素であるキシラナーゼやセルラーゼファミリーに属する約10個の遺伝子を効率的にノックダウンすることが出来た。この方法によりこれまで明らかでなかった植物細胞壁分解酵素のいもち病菌における病原性への関与が明らかとした。本研究で提案しているBuliding Blocks法はRNAiの新しい手法であり、複数のターゲット遺伝子から4060bp程度の配列を選び、それらをつないだ合成DNA配列によりサイレンシングを誘導するものである。昨年度、この手法を用いてイネ科植物いもち病菌の病原性因子である細胞壁加水分解酵素を対象とし、ゲノム上の11個のendoxylanasesおよび9個のcellobiohydrolasesを同時にサイレンシングさせることに成功した。その結果、これらの酵素が単独の破壊株では病原性への寄与が明確でないにも関わらず、全体としては有意に病原性の発現に寄与していることを明らかにすることができた。本年度は、お互いに塩基配列に類似性のあるファミリー遺伝子ではなく、まったく異なった配列を持つ複数の遺伝子にBuliding Blocks法が適応可能かどうか調査した。対象としては、プログラム細胞死に関与すると想定される二種のメタカスパーゼ様遺伝子、AIF様遺伝子、EndG様遺伝子の4つである。これらから複数の60bp配列を組み合わせて、サイレンシングを誘導したが、すべての遺伝子を同時に効率よくサイレンシングさせることはできなかった。サイレンシングの効率は、ベクター上の位置や順番ではなく、トリガーとなる塩基配列が重要であることが示された。これらの解析の結果、メタカスパーゼ様遺伝子の一種が付着器形成に大きな影響を与えていることが示唆された。本研究で提案しているBuilding blocks法はRNAiの新しい手法であり、複数のターゲット遺伝子から4060bp程度配列を選び、それらをつないだ合成DNA配列によりサイレンシングを誘導するものである。本年度は、イネ科植物いもち病菌を用い、その病原性因子である細胞壁加水分解酵素を解析対象とした。いもち病菌は2002年にゲノム配列が公開されており、今回対象とするキシラナーゼとセルラーゼの一種であるCellobiohydrolaseは、それぞれゲノム上に11個、9個の遺伝子が存在し、ファミリーを形成している。これらの保存領域から、各遺伝子に固有の配列をそれぞれ約50bpずつ選抜してつなげた仮想上の保存配列を化学合成し、トリガー配列とした。当研究室で開発したpSD1ベクターを用いていもち病菌に導入した所、対象とするすべての遺伝子で、発現が低下した形質転換体を得ることができた。これらの形質転換体の病原性を調査すると、キシラナーゼのRNAi株では細胞壁をまったく陥入できない変異体が半数以上となり、CellobiohydrolaseのRNAi株では、細胞壁までは侵入するもののパピラ形成により、細胞内への侵入が阻止されていることが明らかとなった。これらのRNAi株では完全に病原性を消失はしていないものの、形成される病斑の数や大きさが有意に減少していた。以上のことから、これまで変異体作成による表現型が得られなかったキシラナーゼやセルラーゼといった細胞壁加水分解酵素がいもち病菌の病原性因子として有効に機能していることが明らかとなった。当初の計画は、一年目にBuilding blocks法を用いていもち病菌における細胞壁加水分解酵素の機能解析を行うこととなっており、研究は計画通りに進み、得られた結果も妥当なものであると考えられる。これまでは、Building blocks法により、保存配列を共有するファミリー遺伝子のマルチRNAiを行ったが、次年度は配列にまったく共通性がない複数の遺伝子のマルチRNAiに取り組む予定である。これにより糸状菌において、本当に50bp程度のトリガー配列でサイレンシングが起こせるのか、またどのような配列が効率よくサイレンシングを誘導するのかといった点を精査する予定である。どのようなRNAiトリガーが有効にサイレンシングを誘導するかを調査するために、DNA合成に重点を置いて研究費を使用する。また、PCRが一台故障して使用不能となったため、これを補うために、新規に購入する予定である。