hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
進行性筋ジストロフィーによる心筋障害を定量する；MRIとバイオマーカーの臨床応用

進行性筋ジストロフィーによる心筋障害とそれによる心不全死が増加しており、新たな治療戦略の開発が求められている。申請者はこれまで、心臓を死角なく評価できる核磁気共鳴画像(MRI)に着目し、この心筋障害を正確に診断するための研究に取り組んできた。本研究では、1MRIを用いた画期的な心筋組織性状評価法であるT1 mapping法に使って進行性筋ジストロフィーによる心筋障害をより正確に検出・定量する新たな手法を確立し、さらに2MRIで定量された心筋障害を検出できる新規血中バイオマーカーの探索を行う。
結晶工学を駆使した光運動結晶材料の構築

光メカニカル結晶材料の構築について研究を行い、アゾベンゼン、サリチリデンアニリン、フリルフルギドなどの代表的なフォトクロミック結晶のメカニカル機能を明らかにした。また、サリチリデンアニリンの微小結晶の光照射後のX線結晶解析に成功し、光照射後の長軸方向の長さが伸びるために結晶は曲がるという、分子レベルでの光屈曲発現機構を解明できた。さらに、サリチリデンフェニルエチルアミンのキラル結晶とラセミ体の結晶の力学的特性を測定し、キラル結晶よりもラセミ体結晶の方が、ヤング率、応力、仕事などの機械的特性のみならず、繰り返し屈曲の耐久性もよく、光運動材料として優れていることを明らかにした。結晶中で起きるフォトクロミック反応を利用すれば、結晶をメカニカルに動かすことができることを、アゾベンゼン、サリチリデンアニリンなどの代表的なフォトクロミック化合物について明らかにしてきた。今年度は新たに、アントリルメチレンインダノン結晶は、光照射によって屈曲することを見いだした。このような光屈曲は微結晶で観察されることが多いが、トランス体結晶については、バルクの単結晶でも屈曲することがわかった。結晶のメカニカル機能の発現機構を解明するために、10μm程度の微小結晶を用いて光照射時間を変えてX線結晶構造解析を行ったところ、成長方向であるa軸の長さが増加したことがわかった。その結果、結晶が光で屈曲する理由は、光の当たった結晶表面は異性化反応が進行して少し伸びるかあるいは縮むが、光の当たらない裏面は最初と変わらないためであることが確定できた。メチル基を導入したトランス体アントリルメチレンインダノンの粉末結晶に紫外光照射を行うと、吸収スペクトルは長波長側にシフトした。次に、トランス体板状微結晶に紫外光照射を行うと、微結晶は光源とは逆方向に屈曲することがわかった。また、この光屈曲は、メチル基を含まない結晶に比べ非常に速かった。X線結晶構造解析により、この結晶の密度は0.934g/cm^3と小さく、結晶中で広い空間が存在することがわかった。このため、トランス体からシス体への光異性化が起こりやすく、素早い光屈曲を示したと考えられる。光メカニカル結晶材料の構築について研究を行い、これまでアゾベンゼン、サリチリデンアニリン、フリルフルギドなどの代表的なフォトクロミック結晶のメカニカル機能を示すことを明らかにした。今年度は、サリチリデンアニリンの微小結晶を用いて光照射前後のX結晶構造解析を行った結果、出発物質と生成物のディスオーダー構造として解析され、光照射後は長軸方向の単位格子長さがわずかに伸びるために結晶は曲がるという、分子レベルでのメカニカル機能の発現機構を解明できた。また、サリチリデンアニリン類似化合物であるサリチリデンフェニルエチルアミンのキラルな結晶とラセミ体の結晶は、ミリメータ長さの棒状単結晶でも光照射により屈曲運動を示したため、これら結晶の力学的特性を測定した。その結果、キラル結晶よりもラセミ体結晶の方が、ヤング率、光屈曲による応力、仕事などの機械的特性が良く、また繰り返し屈曲の耐久性もあることから、光運動結晶材料として優れていることがわかった。これまで、アゾベンゼン、サリチリデンアニリン、フリルフルギドなどの結晶は光で屈曲することを明らかにしてきた。今年度は、キラル結晶のフォトメカニカル機能について検討し、光屈曲を示すキラルなアゾベンゼン、サリチリデンアニリン結晶を創製することができた。また結晶の複合化についても検討し、光屈曲性のキラル複合結晶を創製することができた。さらに、キラル結晶のフォトメカニカル特性とキラル光学特性の関係について検討した。その結果、光屈曲性のキラルなサリチリデンフェニルエチルアミン結晶の旋光性、円二色性のキラル光学特性をG-HAUP(Generalized High Accuracy Universal Polarimeter)を用いて測定することができた。多形結晶のフォトメカニカル機能についても、各種サリチリデンアニリンを用いて検討し、結晶構造と光屈曲特性の関係を明らかにするなど、結晶工学に基づくフォトメカニカル結晶の研究をかなり進展させることができた。化学これまで、アゾベンゼン、サリチリデンアニリン、フリルフルギド、スピロピランなど、代表的なフォトクロミック結晶は光メカニカル機能を有することを明らかにした。サリチリデンアニリン結晶の光照射前後のX線結晶構造解析に成功し、結晶中で反応生成物が生成して単位格子が少し変化するために結晶は曲がるという、分子レベルでのメカニカル機能の発現機構を解明した。また、これら結晶を運動材料として用いる場合に必要な機械的特性として、結晶のヤング率、光屈曲による応力、仕事などの力学的特性を測定し、評価した。25年度が最終年度であるため、記入しない。

これまで積み上げてきた結晶工学的手法を駆使して、複合系結晶について検討する。また、結晶に紫外光を照射すると、光熱効果により結晶の温度が上昇することがわかったため、赤外線サーモグラフィを用いて正確に温度を測定する予定である。25年度が最終年度であるため、記入しない。
ヘムオキシゲナーゼ反応の中間過程および電子授受機構の解明

ヘムオキシゲナーゼ(HO)はNADPH-シトクロムP450還元酵素(CPR)からの還元力と分子状酸素を用いて、ヘムを分解する酵素である。本研究ではNADPHから反応中間体ベルドヘムへの還元力の供給経路の解明をめざした。α-ベルドヘムとHOの複合体を嫌気下で調製し,複合体におけるベルドヘムのオキサポルフィリン環の一電子還元について光電気化学的手法により還元電位を求めた。また,この電気化学的還元およびCPRから複合体への電子伝達における, CO等のリガンドの効果について検討した。さらに,嫌気条件で複合体の結晶構造を解明し,ヘムオキシゲナーゼによる生理的なベルドヘム分解機構について考察した。ヘムオキシゲナーゼ(HO)反応によって、ヘムは3段階の酸素添加反応により、α-ヒドロキシヘム、α-ベルドヘム、ビリベルジン鉄錯体の中間体を経てビリベルジン、CO、Fe^<2+>に分解される。今回、鉄(II)ベルドヘム-ラットHO-1複合体の構造を2.2Åの分解能で得た。その全体構造は、ヘム-HO-1複合体と同様であった。ベルドヘムの鉄に対する遠位軸配位子として、H_2OまたはOH^-が配位していた。ベルドヘムの遠位側には複数の水分子とアミノ酸残基で構成される水素結合ネットワークが観測されたことから、ヘムからα-ヒドロキシヘムへの酸素添加反応と同様に、α-ベルドヘムの分解反応においても、この水素結合ネットワークが活性酸素種(おそらくはFe-OOH)の生成に必要なプロトンを供与する可能性を示唆している。ベルドヘムがビリベルジン鉄錯体に転換される中間過程には,ベルドヘムのオキサポルフィリン環が一電子還元されたベルドヘムπ-中性ラジカル体が中間体として関与する可能性が示唆されてきた。そこで,COなどを軸配位子とする鉄(II)α-ベルドヘム-ラットHO-1(rHO-1)複合体のオキサポルフィリン環に対する一電子還元反応の還元電位を電気化学的手法により求めた。rHO-1に結合したCO配位型鉄(II)ベルドヘムの環の還元電位は-0.41Vであった。この値は,外来配位子を加えない場合に比べて0.06Vほど高い。この結果は,COが配位することによつて,P450還元酵素(CPR)からオキサポルフィリン環への電子伝達が容易になったことを示している。生理的条件におけるHOによるベルドヘムの分解過程でも,O_2が鉄に軸配位した後,オキサポルフィリン環がCPRにより還元されて,ビリベルジン鉄錯体への転換が進むものと推測される。ベルドヘムがビリベルジン鉄錯体に転換される中間過程には,ベルドヘムのオキサポルフィリン環が一電子還元されたベルドヘムπ-中性ラジカル体[Fe^<II>(verdoheme^●)]が関与する可能性が示唆されてきた。昨年度、COなどを軸配位子とする鉄(II)α-ベルドヘム-ラットHO-1(rHO-1)複合体のオキサポルフィリン環に対する一電子還元反応の還元電位を電気化学的手法により求めたところ、rHO-1に結合したCO配位型鉄(II)ベルドヘム環の還元電位が,外来配位子を加えない場合に比べて0.06Vほど高いことを見いだした。この結果は,COが配位することによって,P450還元酵素(CPR)からオキサポルフィリン環への電子伝達が容易になることを示している。今年度はこの可能性を検討するために、嫌気条件下における鉄(II)ベルドヘム環の還元電位を再測定し、その還元電位がCO結合によって-0.465から-0.392Vに上昇することを確認した。後者の電位はCPRのFADのセミキノン/還元型の酸化還元電位に近いので、FADによるCO配位型鉄(II)ベルドヘム環の一電子還元は熱力学的に可能であると考えられた。事実、CO存在下、CPRおよびFMN欠失CPRによって、Fe^<II>(verdoheme^●)が生成されることを、紫外可視分光および電子スピン共鳴を用いて明らかにした。よって生理的条件下でも、ベルドヘムの分解は,最初にO_2が鉄に軸配位し、ついでオキサポルフィリン環がCPR(おそらくFAD)により還元されて,ビリベルジン鉄錯体への転換が進むものと判断された。ヘムオキシゲナーゼー

1(HO-1)と反応中間体α-ベルドヘムの複合体を嫌気下で調製し,複合体におけるベルドヘムのオキサポルフィリン環の一電子還元について光電気化学的手法により還元電位を求めた。また,この電気化学的還元およびシトクロムP450還元酵素から複合体への電子伝達における,CO等のリガンドの効果について検討した。まず、光電気化学的手法により各電位における鉄(II)α-ベルドヘム・HO-1複合体の吸収スペクトルを測定したところ、ベルドヘムπ-中性ラジカル体の生成が確認された。ネルンストプロット解析により,HO-1に結合した鉄(II)ベルドヘムのオキサポルフィリン環に対する一電子還元反応の還元電位として-0.47V vs.NHEを得た。しかしながら,この値はCPRの補欠分子族FMN,FADや補酵素NADPHの酸化還元電位よりも0.1V以上低い。一方HO-1に結合したCO配位型鉄(II)ベルドヘムの環の還元電位は-0.41V vs.NHEであり,HO-1に結合したco配位型ベルドヘムの環がNADPH/cPR系によって還元される可能性を示唆していた。HO-1に結合したCO配位型ベルドヘムにCPRとNADPHを反応系に加えところ,外来配位子を添加しない場合には反応が進行しないのに対し,COを配位させた場合には一電子還元反応によるπ-中性ラジカル体の生成が確認できた。この結果は,生理的条件におけるHO-1による鉄(II)α-ベルドヘムの分解過程でも,まず0_2が鉄に軸配位した後,オキサポルフィリン環がCPRにより還元されて,ビリベルジン鉄錯体への転換が進行するものと推測される。
放射性医薬用レニウム(V)錯体の分子設計と合成に関する研究

放射性核種である^<186>Reは、γ線とβ線を放出することから、放射性医薬品として、特に診断と骨ガンの治療薬として注目されている。本研究では、放射性医薬品としてのRe化合物の開発を目的に、Reの安定同位体を用い、特に診断薬として利用されているTc((V)錯体をモデルとして、Re(V)錯体を合成し、その結晶構造および溶液系での構造および反応性について研究する。具体的には、ReOCl_3(PPh_3)_2(PPh_3=triphenylphosphine)を出発物質として、ReOCl_2(PPh_3)(L)(L=semicarbazone)錯体、NO_2,NS_2ドナー3座配位子、N_2O_2,N_2S_2,NS_3ドナー4座配位子を配位した新規Re(V)錯体を合成し、これら錯体の単結晶X線構造解析を行うとともに、溶液系での構造をNMR,IR,ラマン分光法により検討する。また、サイクリックボルタンメトリー法により、これら錯体の酸化還元挙動を調べる。さらに、これらの研究を基に、錯体の反応性(錯形成反応、配位子交換・置換反応)についても研究する。具体的には、ReOCl_3(PPh_3)_2(PPh_3=triphenylphosphine)を出発物質として、ReOCl_2(PPh_3)(L)(L=semicarbazone)錯体、NO_2,NS_2,ドナー3座配位子、N_2O_2,N_2S_2,NS_3ドナー4座配位子を配位した新規Re(V)錯体を合成し、これら錯体の単結晶X線構造解析を行うとともに、溶液系での構造をNMR,IR,ラマン分光法により検討する。さらに、ReOS3ClにおけるCl^-のSCN^-による置換反応の速度論的解析を行い、SCN^-濃度に依存する二次反応であることを明らかにし、速度論的パラメーターとして、ΔH^≠=31.9kJ mol^<-1>,ΔS^≠=-138JK^<-1>mol^<-1>を得た。
深海化学合成系における腹足類の進化・適応と分散

熱水・冷湧水や鯨骨・沈木周辺堆積物を含む化学合成生物群集は、近年の深海生物研究の中心的存在である。しかし、少数の分類群を除き、これらの動物がいつどのような環境から化学合成系に進出したのか、現生型の深海化学合成群集がどの地質時代に成立したのかはよく分かっていない。本研究では、軟体動物門腹足綱の複数系統について、深海、干潟の嫌気環境および様々な好気環境の種を含めた網羅的な種間系統樹を作成し、化石記録と幼生生態の詳細な検討とあわせて、各環境への進出の絶対年代とルートに関しての傾向とその放散の要因を探った。平成29年度には、これまでに得た成果を11編の論文として公表できた。特に、発生初期の生息環境復元に関して、ミョウジンシンカイフネアマガイの浮遊幼生飼育実施結果をEcology誌にて公表したほか、原殻安定同位体比と微量元素の解析手法をいずれも世界で始めて確立し、着底稚貝の生活史復元に成功した。後者については、国内外の学会等で発表し、論文化に向けて現在鋭意準備中である。また、深海性腹足類の上位系統・種内の集団解析についても、それぞれ原著論文として公表した。異鰓亜綱については、ドイツの共同研究者を学術振興会特別研究員制度により受け入れ、試料の収集と形態・分子系統解析を大きく進めることができた。また、干潟・マングローブ域を含む浅海の還元環境や好気環境に生息する種を採集するため、国内外での野外調査を行ったほか、深海遺骸群集に関連して東北沖での漸深海トロール調査を継続、大きな成果を得た。化石試料の収集と形態解析も順調に進めることができ、学会大会ほかにおいて発表を行ったうえ、複数の論文として出版できた。上記により得られた試料ならびに解析データは、平成30年度からの基盤研究(B)課題「深海ベントスの分布と幼生生態:化学合成群集と海溝最深部動物相の進化を探る」にて活用する。29年度が最終年度であるため、記入しない。本研究では、軟体動物門腹足綱の複数系統について、深海、干潟の嫌気環境および様々な好気環境の種を含めた網羅的な種間系統樹を作成し、化石記録と幼生生態の詳細な検討とあわせて、各環境への進出の絶対年代とルートに関しての傾向とその放散の要因を探る。平成27年度は、アマオブネ亜綱を中心に重点的な分子系統解析を行ったほか、古腹足亜綱についてミトコンドリアゲノム解析の結果を論文化した。さらに、ミジンハグルマ科を含む異鰓亜綱について、国際共同研究による系統解析を進め、国内外の学会大会で発表した。また、干潟・マングローブ域を含む浅海の還元環境や好気環境に生息する種を採集するため、奄美大島ほか国内での野外調査を行ったほか、沈木などの深海遺骸群集に関連して東北沖での漸深海トロール調査を実施、大きな成果を得た。化石試料の収集と形態解析も順調に進めることができ、学会大会ほかにおいて発表を行った。発生初期の生息環境温度復元の観点では、ミョウジンシンカイフネアマガイの浮遊幼生飼育実施結果について、論文化にむけてとりまとめを開始したほか、国際学会等にて発表した。平成27年度9月に、国外の研究協力者を訪問し研究打ち合わせならびにデータ収集を行う予定であったが、同協力者が体調不良のため入院、予定延期の必要が生じた。その他の点では概ね当初計画の通りである。平成28年度は、アマオブネ亜綱についてミトコンドリアゲノム解析の結果を論文化した。また、属・種レベルの詳細な解析について、結果を国際学会で発表した。さらに、ミジンハグルマ科を含む異鰓亜綱について、国際共同研究による系統解析を進め、国内外の学会大会で発表したほか、一部の成果を論文として出版した。また、干潟・マングローブ域を含む浅海の還元環境や好気環境に生息する種を採集するため、南西諸島での野外調査を行ったほか、沈木などの深海遺骸群集に関連して東北沖での漸深海トロール調査を継続実施、大きな成果を得た。遺骸群集系統のひとつ、ワダツミシロガサ上科の進化と生態的放散については、過去の知見のレビューも含めた包括的な論文を出版した。一部の系統について結果の論文化が遅れているが、試料の収集と解析については、概ね当初計画の通りである。

熱水・冷湧水や鯨骨・沈木周辺堆積物を含む化学合成生物群集は、近年の深海生物研究の中心的存在である。しかし、少数の分類群を除き、これらの動物がいつどのような環境から化学合成系に進出したのか、現生型の深海化学合成群集がどの地質時代に成立したのかはよく分かっていない。本研究では、軟体動物門腹足綱の複数系統について、深海、干潟の嫌気環境および様々な好気環境の種を含めた網羅的な種間系統樹を作成し、化石記録と幼生生態の詳細な検討とあわせて、各環境への進出の絶対年代とルートに関しての傾向とその放散の要因を探った。平成29年度には、これまでに得た成果を11編の論文として公表できた。特に、発生初期の生息環境復元に関して、ミョウジンシンカイフネアマガイの浮遊幼生飼育実施結果をEcology誌にて公表したほか、原殻安定同位体比と微量元素の解析手法をいずれも世界で始めて確立し、着底稚貝の生活史復元に成功した。後者については、国内外の学会等で発表し、論文化に向けて現在鋭意準備中である。また、深海性腹足類の上位系統・種内の集団解析についても、それぞれ原著論文として公表した。異鰓亜綱については、ドイツの共同研究者を学術振興会特別研究員制度により受け入れ、試料の収集と形態・分子系統解析を大きく進めることができた。また、干潟・マングローブ域を含む浅海の還元環境や好気環境に生息する種を採集するため、国内外での野外調査を行ったほか、深海遺骸群集に関連して東北沖での漸深海トロール調査を継続、大きな成果を得た。化石試料の収集と形態解析も順調に進めることができ、学会大会ほかにおいて発表を行ったうえ、複数の論文として出版できた。上記により得られた試料ならびに解析データは、平成30年度からの基盤研究(B)課題「深海ベントスの分布と幼生生態:化学合成群集と海溝最深部動物相の進化を探る」にて活用する。当初計画の予定通り、分子系統解析と化石記録の検討、形態比較ならびに幼生期を含めた生態に関する検討を継続、学会大会などで発表し、原著論文化する。当初計画の通り、分子系統解析と化石記録の検討、形態比較ならびに幼生期を含めた生態に関する検討を継続、学会大会などで発表し、原著論文化する。特に、浮遊幼生期ならびに変態・着底後の殻(原殻/後成殻)について安定同位体比と微量元素の解析手法を確立し、着底稚貝の生活史復元を試みることを予定している。29年度が最終年度であるため、記入しない。
微好気培養法による未知水生菌類の探索と培養株の収集・保存

淡水域および汽水域の低酸素環境に適応した真菌類の取得を目指し、2段階低酸素分離法や低酸素釣菌法で菌を分離し、培養性状を調べた結果、分離株の多くは高酸素菌(好気性菌)であったが、少数ながら、低酸素菌や中酸素菌(微好気菌)も分離できた。さらに、嫌気微好気好気の各条件で生育が変わらない広範囲菌が分離され、これらは低酸素環境に適応して生息できる菌類と考えられた。水生菌類では、淡水域からはSigmoidea sp.、汽水域からはLulwoana spp.などが高または高中酸素菌として見いだされた。これらは未記載種と考えられ、新たな低酸素分離法により、未知の菌が取得できた可能性がある。本研究は、水生菌類を微好気(低酸素)培養法を用いて探索し、これまで見逃されていた水界に生息する微好気性真菌類を分離培養して、水界における真菌類の多様性とその生態的役割を明らかにすること、および、その培養株を新たな生物資源として確立することを目的としている。その達成に向けて、平成25年度は、1自然界で真菌が生息するさまざまな基質中の酸素濃度、二酸化炭素濃度を実測、調査し、その環境に即した培養条件を設定すること、2様々な酸素濃度、二酸化炭素濃度の条件下で基質から出現する真菌類を分離すること、3通常の好気培養で分離される真菌類とは異なる菌種が多く分離される条件を見出し、微好気分離法を開発することを目指して研究を行った。その結果、溜池などの止水環境では、水深30cm程度の水底に堆積した落葉リター内の溶存酸素(DO)が0-10%程度と、低酸素環境になっていることがわかり、その落葉リターを微好気性菌の分離源として実験に用いることとした。菌の分離法を検討した結果、まず前培養として、炭素源を抜いた液体培地中に落葉試料片を入れて、窒素ガスおよび酸素ガスをガス混合器を用いてその割合を調整して吹き込み、低酸素条件(DO=5-30%)、中酸素条件(DO=50-80%)、高酸素条件(DO=90-100%)の3条件で1週間培養した。次に、本培養として、落葉試料片を寒天培地上に置き、雰囲気を低酸素、中酸素、高酸素に調整したチャンバー内で培養を行い、出現した菌を分離した。分離菌の詳細な同定は進行中であるが、3つの培養条件で得られる菌類相には違いが見られた。特に、低酸素条件での分離株(18株)には、胞子を形成せず菌糸状態のものが多く出現する傾向があった。今後、開発した2段階分離法を異なる基質を用いて実施するとともに、分離株の同定、系統解析、性状調査を進めて、微好気生菌を特定して、その特性を明らかにしていく。本研究は、水中の微好気(低酸素)環境に生息する菌類を、基質を微好気条件下で培養することによって、これまでの真菌類の一般的な分離法である好気培養では見逃されてきた菌類を分離して、未知の水生菌を見出すこと、そしてその菌類の分類位置や特性を明らかにし、新たな菌類資源として確立することを目的としている。H26年度は、昨年度開発した2段階分離法を用いて、異なる酸素条件に適応した菌を選択的に分離することを目指した。2014年6、7、9月に鳥取市内の池の水底に堆積したコナラ、アラカシ、サクラの枯死葉を採集し、改変LCA液体培地で1週間の前培養(溶存酸素濃度低: 3.4-24.4%、中: 31.8-52.0%、高:71.2-100.4%)の後、寒天平板培地上で本培養(気相酸素濃度低:約0%、中:約10%、高:約21%)を行い、出現菌を分離した。分離菌は形態およびDNA塩基配列情報に基づき同定した。さらに、分離株を用いて、本培養と同様3種類の酸素条件で菌糸生長および胞子形成を調査した。その結果、分離菌は菌糸生長や胞子形成が良好な酸素条件に基づき低酸素菌、中酸素菌、高酸素菌、広範囲菌に類別できた。分離菌のうち、低酸素菌はDactylaria cf. obtriangularia、Aspergillus sp.の2種、中酸素菌はGeotrichum sp.の1種であった。高酸素菌(7種)や広範囲菌(5種)は低酸素条件でも生育可能であった。一方、低酸素菌は低酸素条件でも生育が遅く、低酸素分離法で選択的には分離できなかった。この点については、基質の選択や分離方法の改良が必要と考えている。低酸素菌や低酸素分離菌株の中には未記載種の可能性がある菌も存在したため、分類学的検討を行っている。本研究は、水界において有機物の分解に関わる水生菌類を、微好気や嫌気培養法を用いて探索し、一般に行われている好気条件下での培養では見逃されていた水界に生息する微好気性真菌類を分離培養して、水界における真菌類の多様性とその生態的役割を明らかにすること、および、その培養株を新たな生物資源として確立することを目的としている。

平成27年度は、汽水の低酸素環境に適応した菌類を分離する目的で、汽水湖である湖山池(鳥取市)の湖底の低酸素状態の底泥中の落葉などの基質を洗浄後に海水寒天培地上で培養して、また、底泥を実験室に持ち帰り、滅菌した落葉を基質として加えて嫌気条件下で培養する釣菌法を用いて、出現する菌の分離を行った。基質を載せた分離培地は微好気および嫌気条件で培養して、出現する菌糸を分離した。分離菌の多くはFusarium属やPenicillium属のような土壌菌であったが、Lulwoana sp.のような海生菌も分離された。分離株を使って、異なる酸素濃度条件下での菌糸成長速度を比較した結果、酸素濃度を大気条件と低酸素条件とで比較した場合に成長速度が変わらない菌や有意に生育が低下する菌などいくつかの菌糸成長パターンが得られた。嫌気条件でも大気条件下とほぼ同等の菌糸生長を示す菌として、Fusarium sp., Sarocladium sp., Aureobasidium sp.が各1株分離された。また、Fusarium sp., Lulwoana sp.などは、嫌気条件下で硝酸塩を添加すると菌体量や分生子形成量の増加を示した。今後、これらの菌類が硝酸呼吸系の酵素遺伝子を保有しているか、実際に硝酸呼吸を行っているかなど低酸素環境での代謝生理の解明が必要である。なお、分離された菌株は、TUFCコレクションに寄託予定である。淡水域および汽水域の低酸素環境に適応した真菌類の取得を目指し、2段階低酸素分離法や低酸素釣菌法で菌を分離し、培養性状を調べた結果、分離株の多くは高酸素菌(好気性菌)であったが、少数ながら、低酸素菌や中酸素菌(微好気菌)も分離できた。さらに、嫌気微好気好気の各条件で生育が変わらない広範囲菌が分離され、これらは低酸素環境に適応して生息できる菌類と考えられた。水生菌類では、淡水域からはSigmoidea sp.、汽水域からはLulwoana spp.などが高または高中酸素菌として見いだされた。これらは未記載種と考えられ、新たな低酸素分離法により、未知の菌が取得できた可能性がある。菌類多様性、菌株保存H26年度の研究では、低酸素菌、中酸素菌と言える菌も分離できたが、分離株の多くはいわゆる好気的な高酸素菌であった。これは、真菌類は高酸素菌と言える菌でも、低い酸素濃度に対してかなりの耐性があることが原因と考えられる。このことから、用いた2段階分離法では、低酸素菌を効率よく分離することは難しいことが分かった。そこで、H27年度は、低酸素についてより選択圧を高めた分離法を用いるとともに、基質もより低酸素嫌気的環境にあるものを用いて、より効率的に低酸素菌を分離することを試みる。また、H26年度は淡水中の基質を分離源としたが、H27年度は汽水湖の底部(塩分躍層により湖底の海水層が低酸素化する)の基質を分離源として、海水の低酸素環境に生息する菌類の探索を行う。分離した菌株は分類学的所属を明らかにするとともに、酸素に対する培養性状を明らかにする。また、H27年度は最終年度であるので、本研究で分離された淡水域および汽水(海水)域からの低酸素菌、中酸素菌の性状比較および分類研究を行い、さらに、菌株を適正に保存して、新たな遺伝資源として保存菌株を確立する。当初の計画では、初年度であるH25年度は、1水界の微好気環境の把握、および、2微好気分離培養法の確立と新規糸状菌類の分離を行うことを目標に研究を実施した。その結果、ため池など止水環境では、浅い水底の落葉リターなどでも低酸素環境が作り出されていることを明らかにした。また、このような水底の落葉を基質として、新たに開発した2段階培養法によって、微好気性菌の可能性がある菌株18株を分離することができた。以上のように、H25年度は、概ね計画通り実施できたと考える。研究に必要なものは、計画的に適宜購入したが、割引等があり、予想よりも安価に購入できるものがあったため、残金が生じた。無理に使わず、次年度に有効に使うことととした。H26年度以降は、開発した2段階分離法を用いて、さまざまな水生環境から、基質も変えて、菌の分離を継続する。
乱流熱対流場の確率微分方程式近似に関する基礎的検討

蔵本・シバシンスキー方程式(KSE)をノイズを含むバーガース方程式(NBE)で近似すると,有効粘性係数(nu_eff)とノイズ強度(N)の二つのパラメータが現れる.本研究ではNBEの数値伊藤積分によりKSEの解の特性を再現する最適なnu_effとNを見積もった.NBEの解の平均と分散をKSEのものと一致させた場合,nu_effとNの間には広範囲に指数関数で示される特性があることが分かった.この曲線上に二つの値を定め,KSEとNBEの大偏差関数を比較した所,カルマン・ブーシーフィルタでKSEから求めた値をnu_effに定めると,両者は一致することが確認でき,Yakhot仮説が数値的に検証された.蔵本・シバシンスキー方程式(KSE)をノイズを含むバーガース方程式(NBE)で近似すると,有効粘性係数(nu_eff)とノイズ強度(N)の二つのパラメータが現れる.本研究ではNBEの数値伊藤積分によりKSEの解の特性を再現する最適なnu_effとNを見積もった.NBEの解の平均と分散をKSEのものと一致させた場合,nu_effとNの間には広範囲に指数関数で示される特性があることが分かった.この曲線上に二つの値を定め,KSEとNBEの大偏差関数を比較した所,カルマン・ブーシーフィルタでKSEから求めた値をnu_effに定めると,両者は一致することが確認でき,Yakhot仮説が数値的に検証された.位相乱流方程式として知られる蔵本・シバシンスキー方程式の巨視的振る舞いはYakhotらの研究によりノイズを付加したバーガーズ方程式で近似できることが知られている.Zaleski, Sakaguchi, Sneppenらはこの近似方程式中に現れる有効粘性係数,ノイズレベルの2つの係数を何らかの方法を用いて解の高波数変動から求めている.これらの方法には1)遮断波数を設定していること,2)有効粘性係数の空間分布が求まらないこと,3)このようにして得られた値の妥当性が検討されていないこと,の3つの問題点があるそこで本年度は,これらの問題を解決すべく,カルマン・ブーシーフィルタを用いた係数値推定を試みた.その結果,従来の方法のように遮断波数を設定することなく,係数の空間分布を求めることができた.この値の妥当性を検証するため,大偏差統計を適用して,ノイズに対応する項のクラメル関数を求めたところ,そめ分布は理論的に期待される分布に一致し,また分布の平均値,分散(拡散係数)は従来法で求められている値に比べて妥当であることが裏付けられた.これらの結果は雑誌論文においては未発表ながら,以下の形で発表,もしくは発表予定である岡本友里子,Kuramoto-Sivashinsky方程式の確率微分方程式近似,大阪大学修士論文,2010年度岡本友里子,石田秀士,河原源太,(タイトル同じ),日本機械学会関西支部第86期定時総会講演会,2013石田秀士,岡本友里子,河原源太,(タイトル同じ),第6回非線形テクノサイエンス講演会,2013本年度は前年度までに求まった近似方程式の高精度検証を行った.まず蔵本・シバシンスキー方程式(K-S方程式)の数値計算法について計算スキームの高精度化をおこない,乱流状態のスペクトルを計算した結果,定波数から高波数までスペクトル法と完全に一致する高精度解が得られた.この計算コードを用いて前年度に行った有効粘性係数をカルマン・ブーシーフィルタを用いて計算した結果,その値はほぼ一致し,ノイズレベルの検討を新たに行った結果,この値がZ可測推定であると同時に,この有効粘性においてほぼノイズレベルが最小になっていることが明らかとなった.これはこの係数が物理的にも有効であることが確認されたことを意味する.さらに大偏差統計を用いて揺動力項のクラメル関数を求めた.前年度までに得られた分布は粗視化パラメータTの値の妥当性の検証がなされていなかったが,本年度はこれをもパラメータにして適切なTを検討した結果,このTが前述の有効粘性係数を求めるのに必要なTのほぼ最小値となることが明らかとなった.以上のように本年度は得られた近似方程式が伊藤過程(ノイズを付加したバーガース方程式)で近似でき,、本研究で得られた係数が最適であることが明らかとなった.一方,本年度の研究の過程でK-S方程式のエネルギー散逸構造を維持するためにはこのようにして得られた近似方程式を単純に数値積分(数値伊藤積分)するだけでは不十分であること,さらにそもそもこのような数値積分法は発展途上であり,和書は存在しないことが明らかとなった.これは新たな(数値)確率積分が必要であることを意味しており,文献サーベイも含め来年度の課題である.Kuramoto-Sivashinsky方程式(KSE)の解の振舞いをノイズを含むBurgers方程式(NBE)で近似する問題について,前年度までに有効粘性nu_effをカルマン・ブーシフィルタで求めた上で,その有効粘性においてNBEの解の平均と分散がKSEのそれと一致するノイズ強度Nを採用すると,KSEとNBEの解の大偏差関数が一致することが分かっていたが,この決定法にはNBEの数値計算を必要とする問題点があった.このような近似を乱流モデルの構築と捉えるとき,未定定数は元の方程式から求められることが望ましい.この推定法については22年度において初歩的な検討を行っていたが,Nの値を過大評価してしまう問題点があった.

そこで本年度はこの手法の問題がKSEの解uと揺動項の相関にあると考え,この相関を除去するためにuの時系列をTakensの埋め込みを用いて多次元化した上で,直交化を施すことで揺動項との相関を除去する推定法を試みた.その結果,Nの推定値は以前の方法による推定値に比べて適正値に近づいたが,完全には一致しなかった.この理由を考察するために,有効粘性係数を変えながらNの推定値の変化を調べ,これを24年度に求まっていたN-nu_effの曲線と比較した所,nu_eff/alpha=1で両曲線が交差し,この有効粘性においては適切にNを推定していることが分かった.これは,本年度の手法がエネルギーバランスを満足させるような推定法を用いていることが要因であることが判明し,以上の結果から,目的に応じて適切な推定法を用いることで,大偏差関数の上で最適なNの推定法を開発することが可能であると考えられる.これは今後の課題である.本年度に研究を開始した当初はKuramoro-Sivashinsky方程式(KSE)のエネルギーの流入・散逸構造をノイズを含むBurgers方程式(NBE)で再現することはきわめて困難であり,この構造を再現するための新しい揺動力と確率積分の導入の必要性が想定された.しかしながら伊藤過程の特性を調べていくうちに,NBEを単純に伊藤過程で解釈することでKSEの上記の構造を再現できる期待が高まった.そこで本年度はNBEに含まれる有効粘性係数とノイズレベルの二つの係数について,実際にこの伊藤過程の方程式を数値積分することにより最適値を決定することを試みた.まず確率偏微分方程式(SPDE)であるNBEをある一点における確率微分方程式(SDE)と解釈し,この方程式中に含まれる空間微分を評価するのに必要な情報をKSEの解から供給することで,実際にこのSDEを数値的に解く手法を確立した.この方法を用いて得られた数値解の分布はHuseらが理論的に導いているガウス分布に一致し,SPDEとしての特性の再現に成功した.さらにKSEの平均・分散を再現する上では有効粘性係数・ノイズレベルには1自由度があり,有効粘性係数の広範囲にわたる領域に対して指数関数的振る舞いを確認した.この曲線上でKSEとNBEの解のクラメル関数が一致する最適な有効粘性係数(ノイズレベル)を決定することが出来て,この値は従来から知られている値に比べてかなり小さいこと,そしてこの値はKSEの解からKalman-Bucyフィルタを用いて求められること,そしてノイズレベルを最小にすることが明らかとなった.今年度得られた結果は時間粗視化特性を時間平均特性と解釈することで任意の方程式のカオス的振る舞いが伊藤過程で近似できる可能性を示しており,重要である.当初予想できなかった問題を解決しながら,着実に当初の目的であるモデル化方程式の構築方法の提案に向かっている.25年度が最終年度であるため、記入しない。数値伊藤積分を実行し,最適な有効粘性係数とノイズレベルを決定することで,今年度中までにKSEの時間粗視化特性をNBEで完全に再現できることを数値的に確認できた.当初想定していなかった,新たな確率積分法の提案が必要となっているが,来年度はまず物理的に妥当な数値積分法を射影演算子法・伊藤テイラー展開を参照しながら構築し,その後対応する確率積分を数学的に定義する方向性を考えている.25年度が最終年度であるため、記入しない。
現生霊長類における関節形状の3次元的解析と中新世化石類人猿への応用

原生霊長類7種(新世界ザル3種、旧世界ザル1種、類人猿3種)の上腕骨頭の骨計測・非計測観察及び3次元計測を行い、ロコモーション様式と形態特徴の関連について検討を行った。その結果、懸垂、腕渡り型の運動に固有、また木登り型の運動に固有な関節形状のパターンが明らかになった。機能面から見ると、懸垂様行動は挙上した上腕の回旋の自由度を、また木登り様行動は矢状面内てせの前肢の屈伸域、とりわけ伸展域の拡大に関係している。この結果については第47回日本人類学会、民族学会連合大会において報告した。さらに、中新世類人猿(ケニアピテクス、プロコンスル)と原世霊長類の大腿骨近位部の形態比較を行った。中新世類人猿の大腿骨の形態特徴は発達した殿筋粗面、小殿筋付着部の外側への張り出し、深い転子窩、頚部後面の小結節、比較的長く、頚体角の大きな頚部、骨頭よりも低い大転子、球状に近い骨頭関節面、内側よりを向き大きめの小転子などがある。これらの特徴から大殿筋、小殿筋、外閉鎖筋など股関節の回旋、伸展に関する筋肉が発達していたこと、また股関節構造がそうした運動の自由度を妨げないものであることが推測された。チンパンジーの垂直木登りにおいて股関節の伸展と同時に大腿の内旋がおこることから、この機能形態はこれら化石類人猿のロコモーションに垂直木登り様の運動が比較的多く含まれていた可能性を示唆する。また、ケニアピテクスはプロコンスルに比べ頚部が短い反面、上記の筋付着部がより発達していることから、この2属の霊長類の間で異なった行動様式がとられていた可能性がある。この結果については第99回日本解剖学会総会において報告予定である。
酵母におけるグルコース効果調節因子GID複合体のヒト相同体に関する筋細胞での機能

本研究では酵母におけるグルコース効果調節因子GID複合体のヒト相同体に関して解析し以下の結果を得た。2)酵母グルコース効果調節因子GID複合体の構成因子Gid1/Vid30, Gid2/YDR255C, Gid5/Vid28, Gid7 and Gid9/Fyv10はそれぞれRanBPM, p44CTLH, ARMC8α,Muskelin, p48EMLPの相同体と考えられた。これらの酵母タンパクは欠損株の解析から、複数の糖新生因子のタンパク分解において、プロテオソームおよびバキュオーレ依存性双方に必須な因子であることが判明している。ヒトCTLH複合体のプロテオリシスにおける機能を明らかにするためにαカテニンのプロテオリシスの解析を行った。ARMC8αとαカテニンの結合がまず確認された。ARMC8αのαカテニン結合領域はβカテニンの結合ドメインとほぼ一致しており、競合的であることが判明した。ARMC8αを過剰発現させることによりαカテニンのプロテオソーム依存性のタンパク分解は促進され、siRNAによるノックダウンでこれは抑制された。βカテニンの過剰発現がαカテニンのプロテオソーム依存性のタンパク分解が抑制されることは知られているが、これはARMC8αとαカテニンの結合を阻害するためと考えられた。本研究では酵母におけるグルコース効果調節因子GID複合体のヒト相同体に関し解析し以下の結果を得た3)ARMC8が複合体形成に重要な蛋白であることが判明し、この蛋白をbeitにYeast-Two-Hybrid法を用いた結合蛋白のスクリーニングを行なったところ、予想どうりTwa1が単離された。興味深いことにEndosome/Lisosome系のプロテオリシス制御因子であるHrsも結合蛋白として単離された。この結合は免疫共沈法でも確認され、Hrsのユビキチン結合部位であるUIMを介することが判明した。Proteosomeのユビキチン結合蛋白であるRpn10のUIMもARMC8と結合することが判明した。2)酵母グルコース効果調節因子GID複合体の構成因子Gidl/Vid30,Gid2/YDR255C, Gid5/Vid28,Gid7 and Gid9/Fyv10はそれぞれRanBPM, 44CTLH, ARMC8α,Muskelin, p48EMLPの相同体と考えられた。これらの酵母タンパクは欠損株の解析から、複数の糖新生因子のタンパク分解において、プロテオソームおよびパキュオーレ依存性双方に必須な因子であることが判明している。βカテニンの過剰発現がαカテニンのプロテオソーム依存性のタンパク分解が抑制されることは知られているが、これはARMiC80cとαカテニンの結合を阻害するためと考えられた。
癌局所再発モデルを用いた再発機序の解析および再発治療の研究

癌の局所再発モデルを作成した。腫瘍細胞はWKAラットにNBUで誘発したKNLー5細胞を用いた。KNLー5細胞は放射線照射細胞の2回免疫で宿主ラットに移植抵抗性を誘導しない、きわめて抗原性の弱い腫瘍である。また、細胞表面マ-カ-の解析からKNLー5細胞は分化階段の未熟なリンパ系白血病細胞であることが知られた。このKNLー5細胞をフレンドウイルス寛容ラットの腹腔内に継代することにより、各継代数別のウイルス感染KNLー5細胞を作製した。各細胞を正常WKAラットの皮下に移植すると、P1(1代継代)細胞は10日前後に平均径10mmの腫瘍を形成した後、完全に退縮した。しかし、2-5日後に再増殖をはじめ、50-60日で宿主ラットを腫瘍死させた。P3(3代継代)細胞も同様であるが、退縮後再発までの期間は3-10日に延長した。P5(5代継代)細胞は完全退縮の14-17日後にその約半数が再発した。P6-P8細胞の再発は完全退縮後3カ月までの観察では20%以下であった。P5細胞が完全退縮した2週間後のラットを用い、皮下移植部位を鉛板で遮蔽し600radの全身放射線照射を施行すると、非照射ラットに比較し再発率の有意の増加がみられた。P3細胞退縮ラットに退縮後から8日間、rILー2またはrーIFNγを投与すると、局所再発は約30%に抑制された。今回作製に成功した局所再発モデルは癌の再発機序の解析および再発予防治療の検討に有用であることが示された。本研究の目的とする癌局所再発モデルをラットを用いて作成することができた。BNUで誘発した癌細胞(KNL-5)にフレンドウイルスを至適条件で感染させ、正常ラットの背部皮下に移植すると、一旦増殖するがその後自然退縮する。至適条件はフレンド寛容ラットの腹腔内にKNL-5細胞を5代継代することで得られた。退縮の710日後に局所再発した癌は致死的増殖を示し、宿主を全例腫瘍死させる。皮下に移植した腫瘍が退縮した直後にIL-2(5×10^4U)を8日間連続投与すると局所再発は有意に抑制された。IFN-γ(1×10^4U)を用いた場合も同様であった。この再発モデルは化学療法剤、免疫療法剤の有効性をみるスクリーニングモデルとしても有用と考えられる。一方、癌細胞にフレンドウイルスを充分に感染(フレンド寛容ラットに7代以上継代)させると退縮後に再発を起こさないが、退縮時に宿主ラットの免疫を抑制(放射線照射を利用)すると、癌は再発してくる。即ち、癌が肉眼的に退縮した後も少数の癌細胞は局所に存続していることが証明された。以上の実験結果から、癌の潜伏状態(dormant state)とその破壊が人為的にコントロールできるモデルが作成できたと考える。今後はこの局所再発の機序を解析する研究に着手する。別の実験モデル(米国Wheelock博士)では免疫抑制性マクロファージが癌の潜伏状態を破壊する主要因として考えられている。われわれの実験モデルにおけるマクロファージの役割を検討する。マクロファージの産生する内因性PGE_2の癌細胞増殖への関与を調べることが緊急のテーマと考えられる。現在その基礎実験として、培養マクロファージのPGE_2産生を培養上清を経時的に測定すること、LPS刺激によるPGE_2産生能の変化をみること等により進めている。ラットにおいてマウス白血病ウイルス感染同系腫瘍が自然退縮する現象を利用し、自然退縮後に局所再発をきたす新しいモデルを作成した。また免疫抑制を加えることにより退縮後潜伏状態(Dormant state)にあると思われる腫瘍細胞の増殖(再発)が示された。

WKA/Hokラットの同系腫瘍KNL-5細胞をFriendmurine leukemiavirus(FV)寛容ラットに腹腔内接種することにより、FV感染KNL-5(FV-KNL-5)細胞を得、その継代数によりP_1P_5のFV-KNL-5を作成した。継代を重ねるにつれ、細胞あたりのウイルス関連抗原(VAA)は増加する。FV-KNL-5(P_1)では腫瘍は一担退縮後全例で再発し、約80%のラットは腫瘍死した。しかし20%はその後再び自然退縮した。FV-KNL-5(P_2)は全例一担退縮後再発腫瘍死した。FV-KNL-5(P_3)は60%で再発死し、40%は再発はみられなかった。FV-KNL-5(P_4)では全例で再発したが、うち30%が腫瘍死、残り70%で再発腫瘍も退縮するという現象がみられた。FV-KNL-5(P_5)は全例で自然退縮し、その後の再発もみられなかった。しかし腫瘍退縮後600radの全身照射を施行すると腫瘍の再発が認められた。FV-KNL-5(P_3)では腫瘍は退縮後70%が再発腫瘍死したが、ラットrIFN-γを退縮後局所投与すると再発は30%に抑えられた。またヒトrIL-2の局所投与群は局所再発は30%に抑えられたが最終的には80%が白血病死した。なお、免疫抑制性マクロファ-ジの関与を検討するため、マクロファ-ジのPGE_2産生能を測定している。この研究は現在進行中であり、今後の課題である。
磁性細菌粒子生成系遺伝子の解明

1.磁性細菌の遺伝子組み換え系の開発筆者らは接合伝達を用いて磁性細菌への遺伝子導入法の開発に成功し、宿主ベクター系を確立した。受容菌体として磁性細菌Magnetospirillumsp.AMB-1を、供与菌体としてE.coli S17-1(tra^+)を用いた。プラスミドには、グラム陰性菌に対して広域宿主であるRSF1010由来のpKT230同じく広域宿主であるRK2由来のpRK415を用いたときに接合伝達体が得られた。pKT230の接合伝達効率は、メイティング比、供与菌体:受容菌体が10:1の時、メイティング時間6時間で最大効率3.0x10^<-3>(接合伝達対数/受容菌体数)を得た。pRK415では、メイティング時間は6時間で、メイティング比、100:1において最大効率5.0x10^<-2>が得られた。2.トランスポゾン変異株を利用した磁性細菌粒子生成系遺伝子のクローニングとシークエンストランスポゾン変異株NM5株の遺伝子断片について解析を行った。このNM5株の変異遺伝子の野生株菌体内での発現について調べるために、ノーザンハイブリダイゼーションを行った結果、この遺伝子の発現が鉄イオン濃度で制御されていることが明らかとなった。さらに、NM5株の変異遺伝子をシークエンスから、Tn5の挿入部位において1050bpのオープンリーディングフレーム(magA)が発見され、magAの上流にはプロモーターと思われる配列が発見された。次に、予測されるmagAのコードしたアミノ酸配列についてコンピューターのデータベースからホモロジー検索を行った結果、アミノ酸配列は、カチオン輸送に関与したタンパク質のアミノ酸配列とホモロジーが高いことが明かとなり、非常に疎水性度の高いアミノ酸配列の領域が繰り返し出現する構造を有していることがわかった。これらから、magAはカチオン輸送のチャンネル膜タンパク質をコードしている遺伝子であると推察された。本年度は、磁性細菌の遺伝子導入法及び宿主ベクタ-系の開発を試み、すでに得られているトランスポゾンミュ-タントのキャラクタリゼ-ションを行うことを目的とした。まず、遺伝子導入法として接合伝達に着目し、磁性細菌の菌体内で複製可能なベクタ-プラスミドの検索と接合伝達における条件、効率についての検討を行った。供与菌体として、染色体内に自己伝達遺伝子(PR4tra)を有するEscherichia coliS17ー1を用い、磁性細菌AMBー1に接合伝達を行った。ベクタ-はグラム陰性菌の広域宿主であり、被伝達能(mob)を有するベクタ-であるpKT230、pRK415を用いた。その結果、接合時間6時間でpT230においては3.0x10^<-3>、pRK415では4.5x10^<-2>(接合伝達体数/受容菌体数)の効率で接合伝達体が得られた。また、pKT230、pRK415の接合伝達体はともに液体培地で継代培養が可能であり、それぞれのレプリコンは正常に機能していることがわかった。さらに、サザンハイブリダイゼ-ションにより磁性細菌の菌体内で複製しているプラスミドの解析を行ったところ、顕著な修飾は観察されなかった。さらに、接合伝達により得られた5株のトラスポゾンTn5ミュ-タント(NM1、NM2、NM3、NM5、NM7)のキャラクタリゼ-ションを行った結果、カナマイシン耐性の5株の磁気微粒子生成能欠損ミュ-タントは、ミュ-タントの5株すべてに炭素源資化能、鉄取り込み能において顕著な変化は観察されなかった。また、現在考えられている磁性細菌の磁気微粒子生成に関する機能の一つに鉄還元があげられるが、ミュ-タントの菌体破砕物中の可溶性タンパクの鉄還元活性を測定したところ、NM3の鉄還元活性は野生株の鉄還元能の20%程度であることがわかった。現在、プラスミドpUC19を用いてTn5を含むクロモソ-ム断片のクロ-ニングし、NM3の遺伝子のシ-クエンスを行っている。

さらに、NM5株の変異遺伝子をシークエンスから、Tn5の挿入部位において1050bpのオープンリーディングフレーム(magA)が発見され、magAの上流にはプロモーターと思われる配列が発見された。次に、予測されるmagAのコードしたアミノ酸配列についてコンピューターのデータベースからホモロジー検索を行った結果、アミノ酸配列は、カチオン輸送に関与したタンパク質のアミノ酸配列とホモロジーが高いことが明かとなり、非常に疎水性度の高いアミノ酸配列の領域が繰り返し出現する構造を有していることがわかった。これらから、magAはカチオン輸送のチャンネル膜タンパク質をコードしている遺伝子であると推察された。磁気微粒子生成能欠損株のクローニングされた変異遺伝子断片のうち、NM3、NM5株の遺伝子断片は同一遺伝子であることがわかり、NM5株の遺伝子について解析を行った。このNM5株の変異遺伝子の野生株菌体内での発現について調べるためにノーザンハイブリダイゼーションを行った結果、鉄イオン濃度を制限した条件で培養したAMB-1野生株の菌体において、mRNAの発現量が多いことがわかった。このことからNM5株が欠損している遺伝子には、鉄イオン濃度で発現が制御されている遺伝子が存在していることが明らかとなった。またさらに、NM5株の変異遺伝子をシークエンスすることによって、2640bpの変異遺伝子の塩基配列を決定した。解析の結果、Tn5の挿入部位において1050bpのオープンリーディングフレーム(ORF)が発見され、このORFをmagAと名付け遺伝子解析を行った。magAの上流には-35領域、-10領域と思われる配列が発見され、これはmagAのプロモーターとして機能している領域であると推察された。また、magのA下流域では転写終結を担うターミネーターと思われる領域が発見された。次に、予測されるmagAのコードしたアミノ酸配列についてコンピューターのデータベースからホモロジー検索を行った結果アミノ酸配列は、K^+、Na^+、Ca^+などのカチオン輸送に関与したタンパク質のアミノ酸配列とホモロジーが高いことが明かとなった。これらの中で、大腸菌の膨圧コントロールを行うカリウム流出タンパク質KefCと最も高いホモロジーを示したが、そのホモロジー領域はKefCタンパク質において膜に局在するカリウムチャンネル領域であるといわれており、非常に疎水性度の高いアミノ酸配列の領域が繰り返し出現する構造を有している。magAがコードしたタンパク質は、これと同様の疎水性度のパターンを示し、何らかのカチオン輸送の関わるチャンネル膜タンパク質であると考えられる。