hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
大学生のコミュニケーション能力育成のための臨床心理学的カリキュラムの開発

調査会社会員の大学生にはインタビュー調査の募集は行っていない。大学教員は、調査会社会員対象に行った(平成29年1月)。研究者が直接募集する大学教員の調査は現在実施が遅れており、今後行う予定である。現在は得られたデータをもとに分析を行っている。自閉症スペクトラム指数の程度、自己概念、コミュニケーションスキル、実際のコミュニケーション行動、大学生活における主な活動経験との関連について分析を行っている。大学生のインタビュー調査によって得られた質的情報は、テキストデータに変換し、自己概念、コミュニケーションスキル、実際のコミュニケーション行動、大学生活における主な活動経験に分類して検討を行っている。今後はさらにテキストマイニング方法によって、定量的分析を行ってテキストデータを単位に分解し、それらの関係性をとらえる客観的分析によって調査対象者個別の分析を行うと同時に、調査対象者全体の統合されたデータの分析も行う予定である。自閉症スペクトラムに代表される社会性の発達障がいのグレーゾーンにいる大学生は支援につながりにくいことから、大学教育の中でコミュニケーション能力を育成する支援のためのカリキュラムを開発することを目的として研究を行っている。カリキュラムの開発においては、発達障がいによる二次障害の発症にかかわる問題に配慮し、コミュニケーション・スキルの向上及び行動の変化に加え、自己概念の肯定的変化をねらいとしている。さらに、発達障がい者のみならず全ての大学生の自尊心や自己肯定感を高め、社会に出るための意欲向上や自信の獲得につなげることもねらいとしている。当該年度においては、主としてホームルーム形式のクラス単位で行うカリキュラム内容の検討を行った。主に、他者理解・自己理解・コミュニケーション力・チームワーク力の向上を目的とした構成的グループエンカウンターなど教育現場で行われているプログラムをもとにグループワークを構成し試行的に実施した。グループワークは段階的に人数を増やしていく(2人から5人へ)構成とした。研究者らが担当する複数のホームルーム形式で行う授業(1クラス約4560名)15回のうち5回分の一部を用いて約1520分のグループワークを実施した。他大学においては、心理学専門教員が行う授業において実施してもらった。毎グループワーク実施後に大学生に「ふりかえりシート」に記入してもらい、コミュニケーション・スキル、自己肯定感、自己概念の変化については、1回目の前と5回目の後で質問紙を実施した。これらのデータとあわせて、自閉症スペクトラム指数との関連で分析を行った。当該年度では、主にホームルーム形式の授業をもとに作成したグループワークを実施し検討を行った。これらの授業は演習授業形態であった。
新規Na^+駆動性カチオントランスポーターの同定とその機能的・病態的役割の解明

本研究では、Na+^代謝異常が引き起こす病態機序(高血圧、動脈硬化、虚血性疾患、糖尿病、腎疾患)にかかわる新規なNa^+駆動性カチオントランスポーターの探索を実施した。具体的には、Na^+/Ca^<2+>交換輸送体(NCX)スーパーファミリーに共通の特徴的リピート構造(α領域)に注目し、この特殊配列を用いた遺伝子検索から、新規な候補遺伝子を単離することに成功した。この候補遺伝子を発現ベクターに挿入し、哺乳動物細胞およびアフリカツメガエル卵母細胞に発現させたところ、N^a+およびK^+依存性のCa^<2+>輸送活性を有することを確認した(当初、Ca^<2+>以外のカチオン輸送活性を見いだしていたが、Ca^<2+>輸送活性が最も高いことが判明した)。さらに、この候補遺伝子の特異抗体を作製し臓器分布を調べたところ、心筋・血管平滑筋などの筋細胞に高発現し、また他の臓器にも発現レベルは低いものの普遍的に発現していることが分かった。この候補遺伝子は、既存のNa^+/Ca^<2+>/K^+交換輸送体(NCKX)とアミノ酸配列が相同な領域が存在することから、新規NCKXアイソフォームの1つである可能性が高いと考えられた。そこで、この新規NCKXアイソフォームのノックアウトマウスおよび心血管系特異的なトランスジェニックマウスの作製に取り掛かった。現在、これらの遺伝子改変マウスを確立中であるが、今後、これら遺伝子改変マウスを用いて心筋細胞および血管平滑筋細胞における新規NCKXアイソフォームの機能的役割を解明し、さらにNa^+代謝異常が引き起こす病態機序とのかかわりについて追求したいと考えている。本研究では、Na^+代謝異常が引き起こす病態機序(高血圧、動脈硬化、虚血性疾患、糖尿病、腎疾患)にかかわる新規なNa^+駆動性カチオントランスポーターの同定を目指す。今回、Na^+/Ca^<2+>交換輸送体(NCX)スーパーファミリーに共通の特徴的リピート構造(α領域)に注目し、この特殊配列を用いた遺伝子検索から、新規な候補遺伝子(AおよびB)を単離することに成功した。まず、これらの候補遺伝子が新規なNa^+駆動性カチオントランスポーターであることを証明するため、候補遺伝子を発現ベクターに挿入し、高発現細胞を作製した。現在、この発現細胞を用いて、カチオン輸送のNa^+依存性をアイソトープを用いて解析中である。また、アフリカツメガエル卵母細胞への発現系を構築中であり、この発現系が完成すれば電気生理学的な機能解析を行う予定である。さらに、これら候補遺伝子の臓器および細胞内局在を調べるため、抗原蛋白を作製しウサギに免疫することにより、特異抗体を作製した。候補遺伝子Aの臓器分布をwestern blotで調べたところ、全ての臓器に普遍的に存在するものの、その発現は筋細胞で高いことが分かった。そこで、候補遺伝子Aについて、心筋細胞および平滑筋細胞での機能的役割を生体レベルで解析する目的で、心筋特異的なプロモーターおよび平滑筋特異的なプロモーターを用いたトランスジェニックマウスの作製に取り掛かった。現在、血管平滑筋特異的な候補遺伝子Aのトランスジェニックマウスをライン化している段階である。以上、本年度は、新規Na^+駆動性カチオントランスポーターの候補遺伝子を単離し(2種)、それらの機能解析へ向けての実験材料の調製を行った。本研究では、Na^+代謝異常が引き起こす病態機序(高血圧、動脈硬化、虚血性疾患、糖尿病、腎疾患)にかかわる新規なNa^+駆動性カチオントランスポーターの探索を実施した。

この候補遺伝子を発現ベクターに挿入し、哺乳動物細胞およびアフリカツメガエル卵母細胞に発現させたところ、Na^+およびK^+依存性のCa^<2+>輸送活性を有することを確認した(当初、Ca^<2+>以外のカチオン輸送活性を見いだしていたが、Ca^<2+>輸送活性が最も高いことが判明した)。さらに、この候補遺伝子の特異抗体を作製し臓器分布を調べたところ、心筋・血管平滑筋などの筋細胞に高発現し、また他の臓器にも発現レベルは低いものの普遍的に発現していることが分かった。この候補遺伝子は、既存のNa^+/Ca^<2+>/K^+交換輸送体(NCKX)とアミノ酸配列が相同な領域が存在することから、新規NCKXアイソフォームの1つである可能性が高いと考えられた。そこで、この新規NCKXアイソフォームのノックアウトマウスおよび心血管系特異的なトランスジェニックマウスの作製に取り掛かった。現在、これらの遺伝子改変マウスを確立中であるが、今後、これら遺伝子改変マウスを用いて心筋細胞および血管平滑筋細胞における新規NCKXアイソフォームの機能的役割を解明し、さらにNa^+代謝異常が引き起こす病態機序とのかかわりについて追求したいと考えている。
網羅的エクソーム解析による細胞傷害性抗がん剤感受性マーカーの同定

細胞傷害性抗がん剤に対する感受性あるいは抵抗性を予測するための遺伝的バイオマーカーを同定することを目的とした。9種類の細胞傷害性抗がん剤に対する感受性情報を取得済みである79 nude mouse xenograft(ヒト腫瘍組織異種移植片)より抽出したDNAを用いて、409がん関連遺伝子のエクソームシーケンスを行い、検出された変異と抗がん剤感受性の関連解析を行った。35変異において9種類の細胞傷害性抗がん剤いずれかとの関連が示唆された。これらのデータの蓄積により、最終的にはがん患者一人ひとりに、より効果的で毒性の低い抗がん剤治療の提供につながるものと期待される。本研究は、がん化学療法において中心となって使われている細胞傷害性抗がん剤の感受性を予測するための遺伝的マーカーを同定し、がん患者一人ひとりに最適な抗がん剤治療を提供することを目的とする。平成28年度に予定していた通り、がん細胞におけるがん関連遺伝子変異の同定および抗がん剤感受性との関連解析を行い、各抗がん剤感受性予測マーカー候補を同定後、追試を行いマーカーとなる変異を同定した。がん化学療法では、がん種や患者の状態により使用する薬剤が選択されている。しかしその治療効果には個人差が認められ、個人差が生じる原因メカニズムは明らかにされていない。治療効果の違いは、がん細胞における遺伝子レベルでの特性が関係している可能性が高いと考え、本研究ではがん細胞のゲノムシーケンス解析を行った。解析には、79種類のPDXモデルを用いて行われた9種類の細胞傷害性抗がん剤に対する感受性試験データおよびこれらのxenograftより抽出したゲノムDNAを使用した。スクリーニングとして、59検体を用いて409がん関連遺伝子のエクソンシーケンスを行い、検出された変異について腫瘍中の変異アレル頻度と抗がん剤感受性の関連解析を行った。関連が示唆された変異については、さらに20検体を用いて追試を行った。最も強い関連を示したのはActivin A Receptor Type 2A (ACVR2A)遺伝子上のrs79555258で、腫瘍中の変異アレル頻度が高いほどシクロホスファミド抵抗性を示した。複数の感受性関連変異が同定された薬剤については、変異を組み合わせて解析を行うことでより精度の高い予測が可能になることが示唆された。さらに有用性の高いマーカーを同定する、また抗がん剤感受性や抵抗性のメカニズムを明らかにするため、全エクソーム解析を進めている。これらのデータの蓄積により、最終的にはがん患者一人ひとりに対して、より効果的で毒性の低い抗がん剤治療の提供に繋がると期待される。抗がん剤感受性マーカーとして同定された遺伝子変異が機能へ及ぼす影響、また抗がん剤感受性との関連メカニズムについて分子生物学的手法を用いて解析を行う予定である。また、臨床検体を使用してマーカーとしての有用性を検証する予定である。マーカーとして有用であると考えられる変異を組み合わせて解析を行い、予測精度の向上を目指す。遺伝学遺伝子変異解析に用いた試薬、解析代金が当初の見積もりよりも安価となったため、次年度使用額が生じた。次年度に予定している遺伝子変異の機能解析において必要となる試薬等の購入にあてる。
婦人科腫瘍の悪性転化におけるRasシグナル経路活性化の意義の解明

【方法】子宮体癌細胞株12株のうち、PIK3CA/PTENに変異を有する5株、PIK3CA/K-Rasに変異を有する1株、PTENのみに変異を有する4株の計10株を、また、PIK3CA変異を有する乳癌細胞株5株と大腸癌細胞株2株を対象とした。PI3K経路の阻害剤として、Wortmannin、及びp110 isoformの選択的阻害剤4種類を3時間投与した後、Aktのリン酸化レベルを比較した。【成績】PIK3CA変異株は、癌種によらず、常にp110αが優位に活性化していた。また、PTENのみに変異を有する子宮体癌細胞株(4株)でもαが優位であるものが半数で、他の2株でもαは部分的にPI3K経路の活性化に関与していた。【意義、重要性】p110αの選択的阻害剤は、子宮体癌、乳癌、大腸癌に高い有効性をもつ可能性が示唆された。本研究をもとに、PI3K経路が活性化されている子宮体癌、乳癌、大腸癌症例において、p110α選択的阻害剤の臨床応用の可能性が期待される。【目的】PTEN,K-Ras変異(子宮内膜),HER2過剰発現(乳腺)は、浸潤癌同様、Early Eventとして非浸潤性病変においても高頻度に認められる。一方、PIK3CA (PI3Kの触媒サブユニットp110α)変異は、非浸潤癌では極めてまれである。我々は、PTEN,K-Ras変異(子宮体癌)とHER2過剰発現(乳癌)が、浸潤癌で高頻度にPIK3CA変異と共存することを報告してきた。今回、PIK3CA変異が、他のRas-PI3K経路の遺伝子発現異常と浸潤癌特異的に共存している意義について解析した。【方法】ヒト不死化乳腺細胞株に、変異型Ras,変異型PIK3CA,PTENshRNAの単独または複数を導入し、PI3K経路活性化の程度をAktser473のリン酸化(p-Akt)を指標に検討した。また、変異型Ras,変異型PIK3CA導入による悪性への形質転換能を、単独/共存の場合で、Soft agar assay法により比較した。【意義、重要性】PIK3CA変異以外のRas-PI3K経路の遺伝子発現異常は、非浸潤癌の腫瘍形成(Initiation)に強く関与し、PIK3CA変異はLate Eventとして、他の因子との共存によりRas-PI3K経路をより強く活性化し、効率的に浸潤癌への悪性転化(Progression)を誘導し丁いることが示された。この結果は、PI3K経路を標的とした分子標的治療法への開発に向けた基礎的なデータとして極めて重要である。
法システムへのアクセスを可能にする心理的要因の探究

本研究は特に社会的弱者(触法障害者、虞犯少年・少年院経験者、DV被害者)に焦点をあて、社会的弱者による法システムへのアクセスに伴う原理的な排除性を克服するメカニズムについて実証的に解明するものである。既存の法律扶助や法的救済機関の充実という枠組みでは捉えきれてこなかった当事者の心理的拒絶感に代表されるアクセス阻害要因の存在に着目し、法システムが持つ限界点を指摘する。法システム自体が原理的に内包する排除性と、当事者が持つアクセス阻害要因(拒否感・拒絶感)との悪循環を克服し得る方策について、ソフト面・ハード面の両面から解明を行うことにより、法システムが内包する排除性ジレンマの克服方法について当事者側に必要とされる要素の抽出を目的とする。最終的には、法システム活用の際に生じている当事者自身による心理的障壁を打破し、社会的弱者の法システムの活用を実質的に促進し得る方策の提言を行うことを目指すものである。助成最終年度にあたる平成30年度は、前年度までに実施したフィールド調査結果及び文献調査結果を踏まえ、本研究成果の公表を行うことに注力した。具体的には、国内外の学会・研究会において研究成果を発信するとともに他の研究者から批判や意見を仰ぎ、本研究の最終成果公表に向けた準備作業を行った。さらに、これら一連の成果公表に向けた作業と並行して、随時追加調査も実施した。その結果、とりわけ法システムへのアクセスを促進する上で重要になる心理的側面として、1法システム自体を「使えるもの」として認識しているか否か、2法システムを「使える」(活用できるもの)と思える背景要因には、身近に接する他者の属人的な要素が大きな影響を与えている点、が明らかになった。翌年度、交付申請を辞退するため、記入しない。本研究は、法システム自体が原理的に内包する排除性に着目し、法システムへのアクセス阻害要因と促進要因を探究するものである。とくに社会的弱者に焦点を当て、既存の法律扶助や法的救済機関の充実という枠組みだけでは十分に捉えきれてこなかった制度利用当事者の心理的拒絶感・拒否感・不信感に着目し、法システムが持つ限界点を指摘する。法システム自体が原理的に内包する排除性と、制度利用当事者が持つ心理的なアクセス阻害要因との悪循環を克服しうる方策についてフィールドワークを中心に実証的分析を行っていく。平成28年度は、法システムからの排除及び疎外がどのような場面で観察されているのかについて、1.そもそも法的トラブルへの気づきがない場合、2.法的トラブルへの気づきはあっても法システムへの接近や活用を避けている場合(弱い法拒絶)に焦点をあて研究を行った。具体的には、1及び2について、周囲の専門職たちのどのような関わりあいが法システムの活用を促進しているのか、法システムの活用に当たって当事者側にはどのような心理的変化があったのかについて文献調査とフィールド調査を行った。その結果、とくに当事者側に行ったインタビュー調査からは、専門職(弁護士、社会福祉士)たちによる言下の態度がシステム活用に大きな影響を与えていることが示された。システムの存在と実際の活用との間にあるギャップを埋める一つのアクセス促進要因として言下の態度というソフト面の有用性が示唆されたことは、今後の本研究を進める上で重要な意義を持つ。平成28年度は、文献調査とフィールド調査を行う計画を立てていた。そのうち文献調査及び一部のフィールド調査については遂行することができたが、予定していたフィールド調査先の全てに赴くことはできなかったため「やや遅れている」と評価した。採用第2年度目にあたる平成29年度は、(1)法律専門職に対する拒絶感が強い場合にもかかわらず専門職との関わりを受け入れた理由、(2)公的窓口との関わりあいを忌避している状況にも関わらず公的手続きを進めることができた理由、に焦点を絞り聴き取り調査を実施した。当事者自身が法的存在に対してより強い拒絶感・拒否感を抱いている場合、どのような心理的背景・経緯が拒絶感・拒否感を打破し得たのかについて把握することに努めた。その結果、1当事者に直接かかわる支援者たちの個別の魅力(属人性)に「安心感」「熱意」を感じ、「信頼してもよい」と思えたという経緯をたどる傾向がある点、2当事者たちは似たような境遇にいる他者を通してNPO法人や支援者たちに「信頼」を寄せる傾向がある点、の二点が発見できた。特に二点目、すなわち「似たような境遇にいる他者を通して支援側に信頼を寄せる」という実態の発見は、当事者が法システム自体や法的存在自体に対して信頼を抱く経緯に、専門職たちによる個別具体的な魅力(属人性)が作用する場合と、属人性に加えて似たような境遇にいる他者の存在が作用する場合の、二通りの信頼の発生経路の発見につながった。この点は本研究を深めていくうえで重要な研究視座であると捉えている。今後の分析の際に活かしていきたい。予定していたフィールドワークもおおむね遂行できたため。

法システム自体が原理的に内包する排除性と、当事者が持つアクセス阻害要因(拒否感・拒絶感)との悪循環を克服し得る方策について、ソフト面・ハード面の両面から解明を行うことにより、法システムが内包する排除性ジレンマの克服方法について当事者側に必要とされる要素の抽出を目的とする。最終的には、法システム活用の際に生じている当事者自身による心理的障壁を打破し、社会的弱者の法システムの活用を実質的に促進し得る方策の提言を行うことを目指すものである。助成最終年度にあたる平成30年度は、前年度までに実施したフィールド調査結果及び文献調査結果を踏まえ、本研究成果の公表を行うことに注力した。具体的には、国内外の学会・研究会において研究成果を発信するとともに他の研究者から批判や意見を仰ぎ、本研究の最終成果公表に向けた準備作業を行った。さらに、これら一連の成果公表に向けた作業と並行して、随時追加調査も実施した。その結果、とりわけ法システムへのアクセスを促進する上で重要になる心理的側面として、1法システム自体を「使えるもの」として認識しているか否か、2法システムを「使える」(活用できるもの)と思える背景要因には、身近に接する他者の属人的な要素が大きな影響を与えている点、が明らかになった。今後はまず平成28年度中に赴けなかったフィールド調査先に赴き実証的データの収集に努める。同時に、調査に行くことが有益だと思われる新たなフィールド調査先についても精力的に赴くこととする。随時国内外における学会や研究会に参加したり報告したりすることを通して、他の研究者からの批評を仰ぎ研究のブラッシュアップに努める。今後も引き続き国内外へフィールドワークへ赴く予定である。次年度は、現時点までで示されている研究の途中成果の一部を学会や研究会、論文の形で公表していくことにも力を入れたい。翌年度、交付申請を辞退するため、記入しない。
ザカフカ-スの民族問題と歴史記述

1ザカフカ-スにおける民族紛争の一つの典型的タイプは、地域名と同じ名称を持つ、いわゆる「名称民族」の地位を巡るものである。2名称民族のその名称の領域に於ける他の民族に対する様々な分野での優越権はソ連憲法では明確に保証されている訳ではなかった。しかし、現実には公的組織の重要な官職はその名称民族に与えられており、それに反する任命は地元住民から民族的権利の侵害であると考えられた。名称民族の一員であることは、他の諸民族との比較で表現すれば、それだけで人生の成功を約束された。3名称民族である権利は、当該地域での先住性によって規定された。過去を研究するべく歴史学は、民族紛争に関わることをよぎなくされた。アブハズ人は19世紀まで、アブハズ人が今日のアブハズィアの多数派民族であることを、グルジア人はグルジア人が多数派であったと主張する。4歴史学におけるアブハズ、グルジア紛争での主要な論争は以下の諸問題である。(1)起源前2千年紀以前の両民族の分布。(2)古代アブハズィアの住民であるアバスグ人、アブスィル人の民族的帰属。(3)9世紀に現れた中世アブハズ王国の民族的性格。(4)10世紀に出現したグルジアのバグラト王家の民族的出自。(5)19世紀まで今日のアブハズィアに存在したアブハズィア公国特にサムルザカノ地方における民族的、領土的構成。(6)ロシア革命後成立したグルジア共和国(1918-21年)の対アブハズ人政策。(7)ソ連時代のグルジア政府のアブハズィア政策。
シリコン表面上での金属錯体の精密組織化による触媒反応場の構築

研究代表者は、単結晶シリコン表面上に形成したビスオキサゾリンーパラジウム錯体単分子層が、ベンジルアルコール類の酸素酸化反応に著しく高い触媒活性を有することをこれまでに見出している。しかし、従来の触媒反応系はスケールが50mmolと小さいことが欠点であった。そこでまず、大きいシリコン板を触媒として用いる反応装置を種々試作して検討を行った結果、108mg(1.0mmol)のベンジルアルコールを酸素1気圧下オクタン中110°Cで20時間加熱すると86%の収率でベンズアルデヒドを与えた。この時の触媒回転数は500,000に達した。さらに、触媒の再利用についても検討したところ、高い触媒活性が繰り返し使用時にも現れた。別の触媒反応場構築法として、ジアゾニウム塩の電極還元によりピリジン部位を有する配位子分子層を単結晶シリコン表面上に形成する試みを行った。まず配位子となるピリジルフェニル基を単結晶シリコン表面上に導入するために、ピリジルベンゼンジアゾニウム塩溶液を水素終端シリコン表面電極上で電気化学的に還元した。得られた表面をX線光電子分光(XPS)および分光エリプソメトリーにより評価したところ、還元電位および電気量に応じて異なる構造の分子層が形成したことが明らかとなった。また、原子間力顕微鏡(AFM)による観察から、還元条件によって分子層の平滑さを制御できることも示唆された。この表面を酢酸パラジウムで錯体化した後に、ベンジルアルコールの酸素酸化反応の触媒として適用した。その結果、収率と配位子分子層の構造に相関があることを見出した。
腫瘍由来エクソゾーム中のマイクロRNAの機能解析と消化器癌診断への応用

ヒト消化器癌細胞が細胞外に放出する小胞であるエクソゾームには、腫瘍特異的マイクロRNAが含まれているが、その機能や診断的意義は不明であった。本研究では、大腸癌患者血清中のエクソゾームに含まれる腫瘍特異的マイクロRNAを網羅的解析により同定し、これらが多くの大腸癌患者血清エクソゾームに検出されること、大腸癌組織に特異的に発現している事を見いだした。さらにこの腫瘍由来マイクロRNAを含むエクソゾームは、腫瘍近傍の細胞内に取り込まれて、そこで遺伝子の翻訳制御に働くことを示した。本研究で腫瘍由来エクソゾームの機能と、診断的意義が示された。本研究の目標は、ヒトにおけるエクソゾームRNAの生物学的特性の解明と、悪性腫瘍とエクソゾームRNAの関連を解明して、診断・治療に役立てることであった。そのために当該研究期間内に我々は以下の点を明らかにすることを目標として研究を実施した。(1)ヒト末梢血単核球、腫瘍細胞株、血清中のエクソゾームに含まれるmicroRNAの種類、量を測定し、これらを調節し得る細胞刺激経路の同定を行う。(2)microRNAが細胞質より、エクソゾーム内に取り込まれて放出される分子機構を解析する。(3)細胞より放出されたエクソゾームRNAが、近傍の別の細胞に対してどのように作用するかその役割を解明する。(4)特にヒト血清中エクソゾームが含むmicroRNAプロファイルを測定し、健常者と、腫瘍特に大腸癌患者とで比較解析を行う。以上の目標について、ヒト腫瘍細胞株および消化器癌患者末梢血由来のエクソゾームを調整し、その中でmicroRNAが存在すること、その種類について、銀染色法、RT-PCR法およびmicroRNA arrayを用いて解析した。その結果、疾患特異的に増加している特定のmicroRNA候補を同定できたため、現在さらに検体を増して確認を行なっている(上記1、4)。腫瘍細胞が放出するエクソゾーム中に含まれるmicroRNAが、近傍の細胞に取り込まれる事は共焦点レーザー顕微鏡による観察で確認し、さらにこの取り込みに直接関与する細胞表面分子を同定しつつある。現在これについても確認実験中である(上記2、3)。【研究の目的】ヒト末梢血中に存在するエクソゾームは生体内の様々な細胞から放出されたものであり、その小胞内には親細胞由来のRNAが含まれている。悪性腫瘍患者の末梢血エクソゾームには腫瘍由来のRNAが含まれているが、これらの生物学的意義や診断・治療への応用可能性は未だ明らかでない。【研究計画とその結果】我々はヒト末梢血単核球、ヒト腫瘍細胞株から放出されるエクソゾームをELISAによって定量する方法を確立した。またこれらの細胞培養液、ヒト血清からエクソゾームを超遠心法により調整し、各検体からのエクソゾームよりmRNAおよびマイクロRNAを効率良く精製することが可能となった。エクソゾームに含まれる個別のmRNA、マイクロRNAはReal time-PCR法により定量、確認した。健常人血清と大腸癌患者血清よりそれぞれエクソゾームを調整し、マイクロRNAの発現プロファイルをmiRNAアレイにより網羅的に比較した。その結果、大腸癌患者血清エクソゾームに特異的に多く含まれるマイクロRNAを複数同定した(miRNA-CRCs)。これらの発現量は、別に調整した検体によるReal time-PCR測定により確認した。この大腸癌に特異的なマイクロRNA(miRNA-CRCs)を高発現するヒト腫瘍細胞株を樹立し、これより大量のエクソゾームを調整することに成功した。miRNA-CRCsを含むエクソゾームを、腫瘍微小環境を構成する細胞に添加した場合、これらの受け手細胞においてmiRNA-CRCsはその標的遺伝子の発現を抑制する機能を果たした。これは、腫瘍由来エクソゾームの含むマイクロRNAの新たな機能を示唆するものである。ヒト消化管上皮細胞や血球細胞など多くの細胞から、細胞外にエクソゾームと呼ばれる小胞が放出されている。これは細胞内小器官MVB内に形成される径50-90nmの小胞であり、エネルギー依存性に細胞内や膜上の蛋白質が小胞内に積み込まれ放出されるため、産生細胞外においては近傍の細胞との相互作用を行っている。このエクソゾーム内には、核酸、特にマイクロRNAが含まれている事が明らかになったが、その生理的、病理学的意義はほとんど不明である。RNAを含むエクソゾームが他の細胞に取り込まれると、その受け手細胞中でRNAが機能を発現することが予想され、核酸の新たな水平拡散機序としても注目されている。しかし消化器癌患者においても、腫瘍細胞が放出するエクソゾームの病的意義や、その生体内での機能は知られていないことから、これらを解明して病態解明や診断方法の開発に役立てる事が、本研究の目的であった。

我々はこの研究期間中に、大腸癌患者、健常人血清由来エクソゾーム中のマイクロRNAをアレイ法により比較し、患者血清エクソゾームに特異的に高発現するマイクロRNAを、1146プローブ中、19個個同定した。このうち、腫瘍組織において高発現が報告されているマイクロRNA 4個(miR-137など)について、さらに複数の患者検体の血清エクソゾーム中での高発現を確認した。これらのマイクロRNA群は大腸癌手術検体において、癌組織にのみ高発現し、正常粘膜では低いことを確認した。大腸癌細胞外に放出された、腫瘍特異的マイクロRNA含有エクソゾームは、腫瘍の微小環境を形成する様々な細胞(免疫細胞、線維芽細胞、血管内皮細胞など)に取り込まれることは、共焦点レーザー顕微鏡観察で確認し、受け手細胞内での機能発現も確認した。本研究により、ヒト大腸癌細胞は特定のマイクロRNAを含むエクソゾームを放出し、微小環境に影響を与える事が示された。また細胞内アダプター蛋白CIN85を過剰発現する細胞からのエクソゾームは、CIN85 mRNAを含み、受け手細胞内でCIN85を発現することを示した。一方、エクソゾームの産生を増加すると報告されていたSTEAP3蛋白は、腫瘍細胞においてエクソゾーム産生量に影響存与えないことも明らかになった。
微生物の全ゲノム解析を実現する「DNA非切断型」Target-AID技術の拡張

本研究は、DNAを切らないゲノム編集ツールTarget-AIDの応用を目的とする。塩基置換融合酵素dCas9-PmCDA1と配列認識ユニットCRISPR-gRNAを微生物に導入するだけで、複数の標的DNAの同時編集を簡便かつ高確率に行うようツールを改良し、実用化を目指す。現在、大腸菌の複数DNAへの同時変異導入はある程度可能であるが、その確率は高くない。そこで、効率を上げるためのツールの改良と評価(技術構築)、他の微生物にも適用できるツールの作製(技術拡張)、複数遺伝子操作技術の実証(実用化)の3つの計画を遂行する予定である。
皮膚マイクロバイオームの変動とアトピー性皮膚炎との関連性の解明

人体のさまざまな部位には微生物叢(マイクロバイオーム)があり、疾患との関わりが注目されている。微生物叢は皮膚にも存在するが、皮膚マイクロバイオームの生態や、それらがどのような疾患に、どのような微生物が、どのように関与しているのかは十分に明らかにされていない。アトピー性皮膚炎の患者では健常人ではみられない黄色ブドウ球菌の生着が認められることはよく知られている。これまでの報告では得られた検体を培養に供しコロニー形成により解析した結果が多く、細菌のゲノムを直接検出し量的な変動を解析したデータは乏しい。そこで本年度は小児のアトピー性皮膚炎患児における黄色ブドウ球菌と表皮ブドウ球菌の量的解析を行なった。アトピー性皮膚炎患児(1歳10歳:計14症例)の皮疹部と非皮疹部の双方をPBSに浸した綿棒で擦り、この皮膚スワブからDNAを採取した。対照は年齢をマッチさせた健常児皮膚とした。定量的リアルタイムPCR法で黄色ブドウ球菌、表皮ブドウ球菌のゲノムコピー数を測定した(コピー/ng DNA)。ここでは各細菌の特異的遺伝子(黄色ブドウ球菌:nuc、表皮ブドウ球菌)を標的にして量的解析を行なった。その結果、健常皮膚と比較して、アトピー性皮膚炎患児では皮疹部と非皮疹部ともに有意に黄色ブドウ球菌の量は増加していた(P < 0.05)。皮疹部と非皮疹部の間には有意差は認められなかった(P = 0.142)。一方、表皮ブドウ球菌の量に関しては、患児(皮疹部と非皮疹部)と対照の間には有意差は認められなかった。これらの結果はこれまでの培養を基にした解析結果を裏付けるものである。皮疹部と非皮疹部ともに黄色ブドウ球菌量が増加していたことから、アトピー性皮膚炎は全身的な炎症性疾患であることが示唆された。本年度行なった研究により、小児アトピー性皮膚炎患児の皮膚における、これまで乏しかった黄色ブドウ球菌と表皮ブドウ球菌の量的解析データを示すことができた。今後は小児発症のアトピー性皮膚炎の皮疹部および非皮疹部の双方において、細菌種に加えて、皮膚常在ウイルス群がどのように変動しているかを解析する予定である。最近、アトピー性皮膚炎患者の皮疹部では黄色ブドウ球菌が増えていることマウスを使った研究で示された。一方、不顕性感染ウイルスも皮膚に多く存在することがわかってきたが、この皮膚ウイルス叢(ウイローム)を構成する各種ウイルスの蔓延性や疾患との関連性については不明である。本年度はまず、アトピー性皮膚炎患者(16歳57歳)の皮疹部と非皮疹部のブドウ球菌感染量を比較した。対照は年齢をマッチさせた健常者皮膚とした。患者皮疹部と非皮疹部をPBSに浸した綿棒で擦り、この皮膚スワブからDNAを採取した。定量的リアルタイムPCR法で黄色ブドウ球菌、表皮ブドウ球菌、メチチリン耐性黄色ブドウ球菌(MRSA)のゲノムコピー数を測定した(コピー/ng DNA)。ここでは各細菌の特異的遺伝子(黄色ブドウ球菌:nuc、表皮ブドウ球菌:femA、MRSA:mecA)を標的にした。アトピー性皮膚炎患者の皮疹部では非皮疹部と比較して、黄色ブドウ球菌、表皮ブドウ球菌、MRSAともに有意差をもって増加していた。アトピー性皮膚炎患者の皮疹部と健常者皮膚との比較では、黄色ブドウ球菌のみが有意に増加していた。これらの結果は、黄色ブドウ球菌のアトピー性皮膚炎病態修飾への関与を裏付けるものであり、表皮ブドウ球菌も何らかの係わりを持つことが示唆された。本年度は主に16歳以上のアトピー性皮膚炎患者皮疹部におけるブドウ球菌の感染量の解析をおこなった。解析に供するに十分な小児のアトピー性皮膚炎サンプルを集積することができなかったためである。

その結果、健常皮膚と比較して、アトピー性皮膚炎患児では皮疹部と非皮疹部ともに有意に黄色ブドウ球菌の量は増加していた(P < 0.05)。皮疹部と非皮疹部の間には有意差は認められなかった(P = 0.142)。一方、表皮ブドウ球菌の量に関しては、患児(皮疹部と非皮疹部)と対照の間には有意差は認められなかった。これらの結果はこれまでの培養を基にした解析結果を裏付けるものである。皮疹部と非皮疹部ともに黄色ブドウ球菌量が増加していたことから、アトピー性皮膚炎は全身的な炎症性疾患であることが示唆された。本年度行なった研究により、小児アトピー性皮膚炎患児の皮膚における、これまで乏しかった黄色ブドウ球菌と表皮ブドウ球菌の量的解析データを示すことができた。今後は成人発症のアトピー性皮膚炎サンプル収集に平行して、小児発症アトピー性皮膚炎サンプルが得られるようにする。皮疹部におけるブドウ球菌のみならず皮膚ウイルス群集の変化についても解析していく予定である。今後は小児発症のアトピー性皮膚炎の皮疹部および非皮疹部の双方において、細菌種に加えて、皮膚常在ウイルス群がどのように変動しているかを解析する予定である。試薬を中心に物品費の支出を必要最低限に抑えて予算を執行したため、若干の繰越金が発生した。次年度も引き続き遺伝子検出関連試薬、蛋白発現解析用試薬、プラスティック器具、細胞培養関連試薬などの物品費を中心に予算を計上する。また必要に応じ備品購入に充てる。
リン酸化蛋白質の構造を変化させる新規蛋白質の発見

プロリルイソメラーゼPin1はリン酸化タンパク質の構造と機能を変化させる酵素であり、その生物学的な機能は多岐にわたっている。我々はPin1が作用するリン酸化タンパク質の探索を行った。Pin1-KOマウスと野生型マウスの各臓器における全てのプロリルイソメラーゼの発現をリアルタイムPCR法で調べた。その結果、表現型の観察されたPin1欠損マウスの脳や精巣などではFKBP6の発現が特に増加していた。しかし、タンパク質レベルでFKBP6の発現はあまり充進していなかった。我々はタンパク質に関して発現量だけでなくて、酵素活性を調べることにした。従来、Pin1についてはその活性測定が困難であることから、酵素量を測定するだけで、活性についての検討はほとんどされていなかった。我々は、本酵素活性の正確な測定や構造解析予測研究を行うために、プロリルイソメラーゼ研究の中心であるドイツマックスプランク研究所ハレのGunter Fischer所長のもとから博士研究員を招致して、プロリルイソメラーゼの組織での網羅的な活性測定を行うことに成功した。我々の得た結果はほんのわずかな活性であっても、生物学的なPin1の機能を発揮するためには十分であること、さらにPin1が細胞内で何らかの修飾を受けて活性を低下させていることを大腸菌で発現したPin1に細胞抽出液を混合するなどの実験によって明らかにした。これらは、たとえFKBPやサイクロフィリンの発現量があまり変化していなくてもPin1欠損細胞ではPin1の代わりにFKBPが機能している可能があることが推測された。さらにPin1とFKBP6の類似分子であるFKBP51/52の立体構造比較を行い、活性中心のアミノ酸の比較を行い、活性中心のアミノ酸配置が似ていることを明らかにした(投稿中)。Pin1以外のリン酸化タンパク質調節因子の探索をインフォーマティクスにより探索して、その遺伝子をかずさDNA研究所と共同研究で入手して、組み換え蛋白質を作成して、それをQCM(水晶発振子;.イニシアム)を用いて実際にPin1の基質蛋白質に結合するかどうかを調べた。その結果いくつかのクローンを得たが、そのなかには脳神経に特異的に発現していて、タウにも結合するものを発見した。現在そのクローンについて調べている。我々はPin1KOマウスを解析して、自分たちが、世界で初めて、特定の遺伝子を欠損させることでアルツハイマー病に関係する神経原線維変化を起こしたマウスを作成することに成功したことを発見した。Pin1がタウの神経原線維変化を阻害していることを示したが、この事実は、Pin1がアルツハイマー病などの神経変性疾患の発症を抑制する可能性があることを示している。我々の発見した新しい遺伝子もPin1のような機能を有している可能性があるので、検討する。Pin1に関する論文は一昨年に続きNatureに掲載されたほか、国内外の新聞、ラジオなどでも大きく取り上げられた。さらに、以前から私が指摘していた、Pin1が癌遺伝子mycの発現レベルを蛋白質の分解の過程で制御していることが証明されて、この報告は今年4月にNature Cell Biologyに印刷中である。我々は、本研究助成金を受けているテーマで、この3年以内に3報もの論文をNatureに掲載できたほか、Nature Cell Biology, Chem and Biol(Cell姉妹紙)、PNAS, JBC, JMBなどにも論文を出せた。この事実は、我々が非常に効率よく研究していることを示している。現在、本助成金での研究で新しいリン酸化蛋白質機能調節因子を発見しつつあるので、来年度、本研究をさらに発展させたい。本年度は我々が本グラントを利用して発見したGAS7に関する研究を発展させた。Gas7は繊維状のアクチンに結合することが知られているタンパク質であり、Pin1のリン酸化タンパク質結合部位と結合するWWモチーフを有するタンパク質として我々がデータベースからかずさDNA研究所と共同で再発見したのである。我々はGas7がリン酸化タウに結合することを明らかにしたが、現在、Gas7がタウを介して微小管重合にどのように関わっているかについて明らかにすべく研究している。すなわち微小管の重合か脱重合に関係しているのかどうかということである。現在までに、個体レベルでのGas7の機能について明らかになったことは、Gas7の発現がアルツハイマー病の患者脳でコントロールの脳よりも低いということである。Gas7の機能についてはまだわかっていないが、Tauのリン酸化と密接に関与してそれを制御しているのではないかという仮説を持っている。今後、Gas7遺伝子欠損マウスを作成し、また過剰発現トランスジェニックマウスを作成して、Gas7の個体や細胞での機能を明らかにしたい。また、Pin1に関しては今年度も大きな成果を成果報告につけることができたことは大変誇らしく思う。今年度はPin1がc-mycのユビキチン分解に関与しているという発見を報告した(Nature Cell Biology)。Mycは癌遺伝子であり、分解がスムーズに行われないと、細胞は不死化して増殖をやめなくなる。Pin1が癌や神経変性疾患に関わっていることからも、リン酸化タンパク質を制御している因子が生物学的に重要な働きをしており、重大な疾患特に老化疾患に強く関係していることが明らかとなった。

しかし、タンパク質レベルでFKBP6の発現はあまり充進していなかった。我々はタンパク質に関して発現量だけでなくて、酵素活性を調べることにした。従来、Pin1についてはその活性測定が困難であることから、酵素量を測定するだけで、活性についての検討はほとんどされていなかった。我々は、本酵素活性の正確な測定や構造解析予測研究を行うために、プロリルイソメラーゼ研究の中心であるドイツマックスプランク研究所ハレのGunter Fischer所長のもとから博士研究員を招致して、プロリルイソメラーゼの組織での網羅的な活性測定を行うことに成功した。我々の得た結果はほんのわずかな活性であっても、生物学的なPin1の機能を発揮するためには十分であること、さらにPin1が細胞内で何らかの修飾を受けて活性を低下させていることを大腸菌で発現したPin1に細胞抽出液を混合するなどの実験によって明らかにした。これらは、たとえFKBPやサイクロフィリンの発現量があまり変化していなくてもPin1欠損細胞ではPin1の代わりにFKBPが機能している可能があることが推測された。さらにPin1とFKBP6の類似分子であるFKBP51/52の立体構造比較を行い、活性中心のアミノ酸の比較を行い、活性中心のアミノ酸配置が似ていることを明らかにした(投稿中)。
超流動ヘリウム中における量子ドットの作製と光マニピュレーション

化合物半導体CuCl及びZnOのナノメートルサイズの微粒子、即ち量子ドットを、強力なレーザー照射で固体表面を破壊するレーザーアブレーション法で作製し、さらにそれらの運動を光によって制御、即ちマニピュレーションし、特定のサイズ、共鳴エネルギーをもったものだけを選別して移動させることに成功した。この際、超流動ヘリウムという極低温(約2K)かつ粘性が非常に小さい特殊な媒質で満たされた空間内で理想的な実験を行った。本研究では、半導体量子ドットの運動を光によって制御し、これまで困難であった量子ドットのサイズ選択や、より一般的にその「量子力学的個性」による選別を行う技術を開発することを目的としている。その最も理想的な環境場として、粘性が非常に小さく、極低温状態にある超流動ヘリウムを採用するが、その中に量子ドットを導入するため、液体ヘリウム中でレーザーアブレーションを行うことにより、半導体量子ドットを直接作製する技術も同時に開発する。まず、既設の実験系に本研究費で購入した長距離顕微鏡を導入し、レーザーアブレーションを行う際、そのターゲット試料の表面を数μm程度の分解能で観察することに成功した。さらに、作製された量子ドットを光で移動させる際の標的である、グリッドの表面も同様の高分解能で観察することができるように測定系を構築した。こうした準備に基づき、超流動ヘリウム中におけるレーザーアブレーション過程の詳細、並びにマニピュレートされた量子ドットの液体ヘリウム中での光学応答のその場観察を来年度に実施する予定である。一方、室温で励起子発光を示すことから、紫外光源としての利用など、実用化が期待されるワイドギャップ半導体Zn0に関しても、超流動ヘリウム中でのレーザーアブレーション実験を行った。作製された微粒子群の透過型電子顕微鏡(TEM)観測を行い、数ナノメートルの量子ドットも多数見いだした。また、格子縞が見られる程、結晶性のよい微粒子が存在することも明らかとなった。Zn0は六方晶系であるため、アブレーションによって球形粒子が得られることは多くないが、ヘリウム中では球形のものが多数生成されることも判明した。さらに、走査型電子顕微鏡によるカソードルミネッセンスの測定も行い、アブレーションによって生成された微粒子は、不純物に起因する緑色発光が抑えられ、紫外発光が強くなることも見出した。本研究では、半導体量子ドットの運動を光によって制御、すなわち光マニピュレーションし、これまで困難であった量子ドットのサイズ選択や、より一般的にその「量子力学的個性」による選別を行う手法を研究・開発することを目的としている。その最も理想的な環境場として、粘性が非常に小さく、極低温状態にある超流動ヘリウムを採用するが、その中に量子ドットを導入するため、液体ヘリウム中でレーザーアブレーションを行うことにより、半導体量子ドットを直接作製する技術も同時に獲得する.昨年度購入・整備した長距離顕微鏡を用い、レーザーアブレーションによって作製されたナノ粒子を含む微粒子群の発光スペクトルのその場観察に成功した。取り上げた試料はワイドギャップ半導体であるCuCl,ZnOであるが、いずれの場合も、結晶性の高さを示す狭い励起子発光線を観測することができ、作製された微粒子はクライオスタットから取り出す前に既に結晶化していることが確認された。さらに、作製後光マニピュレーションによって輸送されたCuCl量子ドット群が示す発光スペクトルのクライオスタット内での測定にも初めて成功した。多数の粒子群を対象とした測定であるため、量子ドット特有のサイズ量子化された発光線を観測することはできていないが、それらがCuCIからの発光であることは同定できた.一方、室温でも紫外域に励起子発光を示すことから実用化が期待されているZnOに関しても、昨年度のレーザーアブレーションに引き続き、光マニピュレーション実験を行った。その結果、CuCl量子ドットと同様、センチメートルオーダーのマクロな距離に亘り光照射によって量子ドット群を移動させるとに初めて成功した。その最も理想的な環境場として、粘性が非常に小さく、極低温状態にある超流動ヘリウムを採用するが、その中に量子ドットを導入するため、液体ヘリウム中でレーザーアブレーションを行うことにより、半導体量子ドットを直接作製する技術も同時に獲得する。昨年度まで主たる研究対象としたCuC1に代わり、室温でも発光が観測でき、大気中での安定性にも優れるZnOに関して実験を進めた。昨年度までのレーザーアブレーションによる量子ドット作製とその光マニピュレーションの成功に引き続き、より線幅(エネルギー幅)の狭いレーザーを用いたサイズ選別の可能性を探索した。使用するレーザーのパルス幅を100fsから1psに広げることで線幅を一桁程度狭窄化してマニピュレーションを行ったところ、サイズ分布が10-60nm程度から15-25nm程度に狭くなることを確認した。このように、サイズ選別を行うことに成功した。また、液体ヘリウム中のレーザーアブレーションによって、マイクロサイズの微小球も作製できることを発見した。

その発光は励起子による紫外成分と不純物による緑色を中心に可視全域をカバーする成分からなっており、いくつかの微粒子の発光スペクトルには、球内に光が閉じ込められることにより形成されるWhispering Gallery Mode (WGM)による構造が見られた。さらに、顕微分光を行うことで、単一微小球のレーザー発振にも初めて成功した。閾値はこれまで報告されたZnOナノロッドより桁違いに低く、非常に高いQ値をもつWGMが形成されていることがわかった。
代謝物に着目した大腸菌酸耐性の発現制御機構の解明とその感染予防法への応用

病原性大腸菌が有するGADシステムは強力な胃酸耐性機構であり、人を含む哺乳動物への感染に寄与している。しかしその発現制御系は極めて複雑であり、全容は解明されていない。本研究では、トリプトファンの分解産物であるインドールがGADシステムの発現を抑制すること、及びその生産酵素をコードするtnaA mRNAが酸性条件下で急激に減少することに着目した。インドールの生産制御メカニズムを解析することで、これまで困難であったGADシステム発現制御系の解明を目指した。
New POPsによるPPARαシグナル伝達撹乱の比較生物学的リスク評価

平成30年度は、PPARα-リガンド分子間相互作用において、より精度の高いインシリコアッセイ系を構築するため、従来から知られているPPARαリガンド結合ポケット(PPARα1st LBP)に加え、近年発見された第2のPPARαリガンド結合ポケット(PPARα2nd LBP)について、PFASsとのドッキングシュミレーション解析を行い、PPARαリガンド結合領域(LBD)の組換えタンパク質に対するPFASsのインビトロ競合結合試験の結果と比較した。その結果、ヒト(h)およびバイカルアザラシ(bs)のPPARα1st/2nd LBPsに対するPFASsの結合親和性が初めて明らかになった。また、hおよびbsPPARα1st/2nd LBPsに対するPFASsの異なる結合親和性には、PPARα1st/2nd LBPsの体積や水素結合相互作用に関与するアミノ酸、PFASsのフッ素化された炭素数(分子量)や疎水性などの関与が示唆された。さらに、インビトロ競合結合試験におけるPFASs結合強度とインシリコ評価系の結果との間で有意な相関関係がみられ、インシリコ評価系の有用性が示された。平成30年度は、従来から知られているPPARαリガンド結合ポケット(PPARα1st LBP)に加え、近年発見された第2のPPARαリガンド結合ポケット(PPARα2nd LBP)を対象に、PFASsとのドッキングシュミレーション解析を行い、PPARα1st/2nd LBPsに対するPFASsの結合親和性を初めて明らかにした。また、hおよびbsPPARα1st/2nd LBPsに対するPFASsの異なる結合親和性には、両生物種のPPARα1st/2nd LBPの体積や水素結合相互作用に関与するアミノ酸、PFASsのフッ素化された炭素数(分子量)や疎水性などが関与すると考えられた。さらに、PPARαリガンド結合領域(LBD)の組換えタンパク質に対するPFASsのインビトロ競合結合試験とインシリコ評価系の結果との比較から、両者の間に有意な相関関係がみられ、1stおよび2nd PPARαLBPーリガンド分子間相互作用を分子レベルで評価するためのインシリコ解析系を確立することができた。最終年度は、多種多様な生物種の各PPARαアッセイ系を用いてnew POPsの評価を行い、各生物種間でPPARαに影響するnew POPsのプロファイリングをする。また、最も活性の強いnew POPsに対する相対活性(REP値)を各生物種のPPARαで算出する。このREP値と各生物種におけるnew POPs蓄積量等を比較することで、生物種に影響するnew POPsのリストを生物種別に作成し、PPARαシグナル伝達撹乱を指標としたハイリスクアニマルの予測・把握を試み、さらには生態リスク評価に繋げる。ポリ臭素化ジフェニルエーテル(PBDEs)などの臭素系難燃剤(BFRs)やペルフルオロオクタンスルホン酸(PFOS)などの有機フッ素化合物(PFCs)は、ストックホルム条約により新たな残留性有機汚染物質(new POPs)として指定され、高い学術的・社会的関心を集めている。本申請課題では、系統学的・生態学的に重要と考えられる多種多様な生物種を対象として、new POPs曝露による核内受容体ペルオキシソーム増殖剤応答性受容体(PPARα)を介したシグナル伝達撹乱をin vitro系で明らかにし、new POPsの比較生物学的リスク評価を目的としている。当該年度(初年度)は、各生物種のin vitroレポーター遺伝子アッセイ系を確立するため、PPARαcDNAのクローン化に注力した。また、培養細胞に導入するためのPPARα発現ベクター類の作製や至適条件等の検討を行った。さらに一部の生物種のPPARαアミノ酸配列の比較によって、典型的PPARαリガンドとの感受性に関与すると考えられるアミノ酸の存在が明らかとなった。各生物種のin vitroレポーター遺伝子アッセイ系を確立するため、PPARαcDNAのクローン化に注力し、培養細胞に導入するためのPPARα発現ベクター類の作製や至適条件等の検討を行った。しかし、施設の整備等が遅れたため、当初計画していた一部の生物種についてはクローン化が未着手であり、今後早急に作業を進める必要がある。一方、一部の生物種のPPARαについては、典型的PPARαリガンドとの感受性に関与すると考えられるアミノ酸の存在が示唆された。今後、変異した発現ベクターの作製を試み、リガンド応答性を明らかにする必要がある。ストックホルム条約によって新たな残留性有機汚染物質(Persistent Organic Pollutants: POPs)に指定された臭素系難燃剤(Brominated Flame Retardants)や有機フッ素化合物(Perfluorochemicals)に対して、これまで高い学術的・社会的関心が集まってきたが、これらnew POPsによる環境汚染の実態や毒性影響については依然として不明な点が多いのが現状である。また、実験動物では、new POPsなど環境汚染物質による毒性影響において系統差・種間差などが存在することが知られており、これらを考慮した化学物質のリスク評価が極めて重要である。本申請課題では、実験動物に加え、生態学的に重要視されている野生生物を対象として、これら多種多様な生物種における、脂質代謝に関与するペルオキシソーム増殖剤応答性受容体(PPARα)シグナル伝達経路に対するnew POPsの比較生物学的リスク評価を目的としている。当該年度は、初年度に引き続き、哺乳類、鳥類、魚類など各生物種のPPARαcDNAのクローン化やそれらの構造解析を試みるとともに、インビトロアッセイ系を確立するため、PPARα発現ベクターの構築、細胞導入あるいはアッセイ系の至適条件などを検討した。