hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
視神経乳頭刺激型電極による人工視覚システムの開発

組織学的に、電気刺激によると思われる組織障害は認めなかった。考察:視神経刺激型電極からの電流刺激により視覚誘発電位と同形の波形が得られたことより、進行した網脈絡膜疾患の患者においても視神経刺激により、誘発電位が得られる可能性がある。他の刺激方法と比較すると、視野については、網膜型の電極が視角10°程度なのに対し、視神経刺激型の場合、ほぼ全視野を得られる可能性があり、また、網膜型電極ではその設置、留置時の網膜剥離などの合併症、また大脳皮質刺激型電極ではその設置時の脳外科的手術における合併症などを考慮する必要があるが、我々の方法ではそれらの可能性は小さい。以上より、視神経刺激型電極による刺激方法は有用であると考えられた。研究目的:人工視覚における視覚路電流刺激部位には大脳皮質、網膜上、網膜下などさまざまな部位が考えられているが、昨年の班会議での報告のように、我々は視神経乳頭もその1つになりうると考える。前回は、家兎を用いた急性実験によりその可能性を示した。今回我々は、より細い電極を用いてその長期的な有効性につき検討したので報告する。対象と方法:顕微鏡下にて極細白金電極(50μm)を経硝子体的に家兎眼の視神経乳頭に刺入設置し、46か月の経過観察期間中、網膜電図、視覚誘発電位、電気刺激による誘発電位を記録した。また経過終了後、電極周囲の視神経乳頭の変化を組織学的に検討した。結果:50μm径の白金線を視神経乳頭に安全に刺入設置することが可能であった。経過観察期間中、設置した電極総計20本のうち19本が視神経乳頭内に保持され、電流刺激による誘発電位の記録が可能であった。術直後の電流閾値は19.3±9.2μA(6.0±2.9μC/cm^2)であり、術後1か月では78.8±31.9μA(24.6±10.0μC/cm^2)と上昇したが、その後6ヶ月までは術後1ヶ月の値と有意な相違を認めなかった。網膜電図のa波b波および視覚誘発電位の潜時と振幅には、有意な変化を認めなかった。組織学的に設置した電極周囲に薄い線維膜を認めたが、電極の長期留置あるいは電流刺激によると思われる変化は認めなかった。結論:視神経乳頭設置型電極からの電流刺激の長期的な有効性、またその安全性が示されたことにより、当方式が、人工視覚システムの一方式となり得る可能性が示唆された。本研究においてわれわれは、人工視覚における視覚路電流刺激部位の1つとして視神経乳頭を選択し、昨年度までに視神経乳頭設置型電極からの電流刺激の長期的な有効性、またその安全性が示した。本年度は以下の3点について、更に検討を進めたので、その結果を示す。(1)電極の開発:眼内において生体適合性のよい物質がパリレンであるとの報告に基づき、白金線をパリレンでコーティングし、視神経電極刺激用の電極線を作製した。電極線の先端1mmはコーティングを剥離して通電可能とした。また、電極刺入後の視神経をトルイジンブルー染色し、細胞密度を測定することにより、電極線の直径が大きい方が視神経の障害を大きいことを確認し、電極線には可能な限り細い、直径50および80μmの白金線を用いた。(2)電極設置術式の開発:豚眼、家兎眼を用いて、上記電極線の眼外設置方法を検討した。あらかじめ上下耳側、上下鼻側の4象限に強膜トンネルを作製し、加えて8-0あるいは9-0糸を強膜に3箇所設置しておいた。強膜創より電極線を眼内に挿入し、視神経乳頭に刺入した後、強膜上の糸で電極線を縫合固定し、また強膜トンネルをくぐらせ、電極線をさらに固定させた。
実解析学と偏微分方程式への応用

本年度は、当初の予定とは異なりドイツのBonn大学に2012年10月より2013年10月まで滞在したため、一年の半分はドイツでの研究となった。そこでは、受け入れのJaun J. L. Velázquez教授と九州大学の杉山由恵教授と共同でOthmar-Stevens modelとも呼ばれる細胞性粘菌の走化現象を記述するKeller-Segel系の域解の構成と漸近挙動について取り組んだ。扱った方程式系の特徴としては、粘菌が走化性を誘発する化学物質から受ける影響は、精神物理学におけるWeber-Fechnerの法則に従うとしているところと、その化学物質の拡散性の欠如にある。このような方程式系に対しては、どのような条件下で、有限時間または時間無限大で走化性の崩壊(解のL^¥infty normの発散)起きるか?を調べることが主要な問題となる。大域解の構成ついては、ほほ同時期に行われたAhn-Kangの研究により、走化性の強さを表す定数Cがある条件を満たすときlargedataに対しても有界な大域解が構成されることが示された。我々が取り組んだのは、それ以外の定数に対しても、初期値に適当な条件を課せば有界な大域解は構成できるか?という問題である。我々は、初期値がある位相で小さければこの命題は正しいことを証明した。漸近挙動については、1次元でC=1の場合に次のようなことが分かった:十分定数に近い平衡状態に時間無限大で収束するような初期値は選択可能。この結果はまだ成果として弱い部分があるため、さらに研究を発展させてから発表する予定である。また、非圧縮Navier-Stokes方程式の非線形項に関する一つの評価式であるdiv-curl lemmaを重みを考慮した一般化を行った。得られた不等式は考えている応用にはまだ不十分なところがあるが、Coifman-Lions-Meyer-Semmesらによるoriginalなもので抜け落ちていた場合を扱えることができたことは興味深い点である。非圧縮Navier-Stokes方程式のweightedHardy spacesを用いた、L^2 energyの時間減衰の解析は一定の結果が得られており、さらなる発展への手がかりも得られた。また、海外渡航中に行った、走化性方程式の研究も始め、本研究の主題である「実解析学の微分方程式への応用」に新たな局面が加わった。非圧縮Navier-Stokes方程式のL^2 energyの研究では、以前、最良の減衰が扱えていない。この原因は、上述のdiv-curl lemmaに関してさらなる発展が必要であることと、Duhamel項の時間に関する特異点を発生である。後者のほうが重い問題であり、新たなアイデアが必要とされる部分である。また、走化性方程式に関しては、これまでに得られている大域解の結果は空間3次元以上に関するものであるので、現象的に重要である2次元の場合に同様の結果を得ることを目指す。また、考える領域を全空間から滑らかな境界を持つ有界領域の場合で考える。問題となるのは、いくつかのnormの書き換えがこのような設定の変更に伴い、どのような影響を受けるかである。以下の3つの結果が得られた。一つ目は、非圧縮粘性流体の運動を記述するNavier-Stokes方程式の解のL^2-energyの時間減衰に関するものである。Wiegnerにより、初期値に対する仮定の下で(n+2)/4のorderでenergyが減衰する解が構成されている。その初期値に対する仮定はBesov空間の言葉を用いて言い換えられるので、初期値に滑らかさの仮定を課した研究とみなせる。滑らかさではなく減衰の視点から解析するため、重み付きHardy空間を用いた結果、energyの時間減衰のorderがWiegnerのものに限りなく近づくような解を構成できた。つまり、Wiegnerの指数と一致するような重みに対するcriticalな値が得られた。二つ目は、現在滞在中のBonn大学J. J. L. Velazquez教授と九州大学杉山由恵教授との共同研究である。走化性のある細胞性粘菌の運動を記述するKeller-Segel系で対数項を持ち、ODEとのcouplingで表されるmode1の大域解の構成を行った。具体的には、初期時刻に粘菌を誘導する化学物質の濃度が"1"という特別な場合で、大域解を構成した。局所解や一意性についても考察した。三つ目は、東京電機大学出来光夫先生と首都大学東京澤野嘉宏先生との共同研究である。変動指数Lebesgue空間の端点に対応する変動指数BMO空間に対するいくつかのnormの同値性を示した。変動指数空間は、電圧をかけると粘性の変わる電気粘性流体の数学的研究において用いられている。

このような方程式系に対しては、どのような条件下で、有限時間または時間無限大で走化性の崩壊(解のL^¥infty normの発散)起きるか?を調べることが主要な問題となる。大域解の構成ついては、ほほ同時期に行われたAhn-Kangの研究により、走化性の強さを表す定数Cがある条件を満たすときlargedataに対しても有界な大域解が構成されることが示された。我々が取り組んだのは、それ以外の定数に対しても、初期値に適当な条件を課せば有界な大域解は構成できるか?という問題である。我々は、初期値がある位相で小さければこの命題は正しいことを証明した。漸近挙動については、1次元でC=1の場合に次のようなことが分かった:十分定数に近い平衡状態に時間無限大で収束するような初期値は選択可能。この結果はまだ成果として弱い部分があるため、さらに研究を発展させてから発表する予定である。また、非圧縮Navier-Stokes方程式の非線形項に関する一つの評価式であるdiv-curl lemmaを重みを考慮した一般化を行った。得られた不等式は考えている応用にはまだ不十分なところがあるが、Coifman-Lions-Meyer-Semmesらによるoriginalなもので抜け落ちていた場合を扱えることができたことは興味深い点である。方程式に関する研究はおおむね順調に進んでいる。実解析学の研究については、あまり進展していない。非圧縮Navier-Stokes方程式のweightedHardy spacesを用いた、L^2 energyの時間減衰の解析は一定の結果が得られており、さらなる発展への手がかりも得られた。また、海外渡航中に行った、走化性方程式の研究も始め、本研究の主題である「実解析学の微分方程式への応用」に新たな局面が加わった。これまでのchemotaxis systemの可解性の問題でこれまでに扱った初期条件は、走化性を誘発する化学物質が0にならないというものであったが、今後はサポートが有界なものを扱う。この初期条件では、今までの手法は使えないので、新しいアプローチが必要とされる。Fourier制限問題にweightを付加したものを考えて行く。Muckenhoupt条件に対応するようなものをこの問題について考察する。非圧縮Navier-Stokes方程式のL^2 energyの研究では、以前、最良の減衰が扱えていない。この原因は、上述のdiv-curl lemmaに関してさらなる発展が必要であることと、Duhamel項の時間に関する特異点を発生である。後者のほうが重い問題であり、新たなアイデアが必要とされる部分である。また、走化性方程式に関しては、これまでに得られている大域解の結果は空間3次元以上に関するものであるので、現象的に重要である2次元の場合に同様の結果を得ることを目指す。また、考える領域を全空間から滑らかな境界を持つ有界領域の場合で考える。問題となるのは、いくつかのnormの書き換えがこのような設定の変更に伴い、どのような影響を受けるかである。
制限従属変数パネルデータの非線形動学ミクロ構造モデリングとその応用

本研究では、観測される質的変数に対応する潜在変数の理論構造や観測値自体に現れる様々な非線形関係を計量経済モデル分析によってモデル化し、新しい離散選択モデルを複数提案した。さらにその統計的モデリングの手続きとMCMCを用いた消費者異質性を取り入れた推定アルゴリズムを与えた。さらに従来のモデルとの比較を行い、提案したモデルが優れている点を整理した。また実際の様々なミクロデータおよびマーケティングデータに適用してその有効性を検証した。制限従属変数パネルデータの非線形動学ミクロ構造モデリングに関して、パラメトリックなモデリングについて閾値型の非線形モデルに視点をあて、下記の点について研究を行った。1.制限従属変数に対応する潜在変数の非線形構造のパラメトリックな統計的モデリング離散選択モデルにおける消費者の確率効用関数を通常の線形関数から非線形関数U=f(X)+εで一般化し、その計量モデル構築のために閾値変数の存在を仮定して、非線形関数を閾値定義域上で区分的に線形な関数で近似する方法を提案したTerui and Dahana(2006)のモデリングをさらに発展させるとともに、このモデルが適用可能な他の非線形構造を表わす経済理論や経済・経営現象を各分野の文献を精査して探った。そのひとつとして、広告量が消費者のブランド選択に与える影響が非線形であると認識されていることから、この問題の非線形モデリングを実施した。2.構造モデリングと政策シミュレーション上記のモデリングにおいては、価格は効用に対して外生変数として規定して簡略化されるが、現実には企業行動としては消費者のブランド選択および購買行動を見てそれによって価格を変化させていると考えるのが妥当であり、価格と売上げには同時決定の関係を仮定してモデル化する必要がある。本年度は、この内生性の問題あるいは構造モデリングを上記閾値型非線形制限従属変数モデルについて研究するうえで必要な先行研究のサーベイを実施した。さらに複数の制限従属変数間に内生的に同時決定される場合の未着手の問題に関して、この制限従属変数間に内生性が発生する場合のバイアスの評価および推定法についても、先行研究の文献を精査した。本年度は、制限従属変数の動学モデルを中心に研究を実施した。パネルデータの分析モデルとしてこれまで展開されてきた離散選択モデルは、対象となる選択肢が観測期間を通じて一定であるという仮定を置くものであるのに対し、本研究では外生的な変数の時間変化に伴う状態によって選択肢をスクリーニングし、選択肢が観測時間ごとに変化する新しい離散選択モデルを提案した。具体的には、消費者の選択行動に影響を与える外生変数が選択肢集合を非線形に規定し、これを閾値モデルにより2つの局面へ分解してある選択肢が選択対象となる状態を記述するモデルである。さらにこのモデルをパネルごとに異なるパラメータをもつ異質性モデルとして展開して、新しく異質性を取り入れた非線形動学離散選択モデルを展開した。またこのスクリーニング離散選択モデルの統計的推測法に関して、マルコフチェーン・モンテカルロ(MCMC)アルゴリズムを与えた。シミュレーション研究によって本アルゴリズムを評価し、優れた性能を持つこと示した。また提案モデルを用いた実証分析として、広告の閾値効果を分析した。具体的には、提案モデルをマーケティングにおける消費者のブランド選択行動を記述するモデルとして展開し、各ブランドの広告量が一定水準を上回ると考慮集合と呼ばれる選択肢集合に入り、広告量が閾値を下回ると選択肢集合から離脱するモデリングを展開した。実務家のいう広告の閾値効果の新しい構造モデリングであり、広告の役割に対して新しい定量評価を与えた。本年度は、動学モデルへの拡張、シミュレーション研究、応用研究としての実証分析、製品品質や属性評価を消費者のブランド選択行動から推測する研究、さらに研究の総括を行った。具体的には下記のとおりである。1.動学モデルの発展と内生性問題の処理潜在変数として効用関数を仮定した場合は、消費者の効用に慣性(inertia)が働くとするのが一般的であり、効用に時間的な要因を入れる動学モデルへの拡張として、セールスプロモーションへの期待変数を入れた動学モデルを提案した。同時に内生性問題を含むモデリングの一般化を図った。2.モデリングの統計的性質の比較シミュレーション研究提案する非線形動学モデリングの統計的性質を様々な状況下でのシミュレーション研究によって調べ、その有効性と前提条件の検討を行い、提案したモデルが従来のモデルよりも優れている点を総括した。3.経済・経営分野のパネルデータへの適用と各種実証分析提案した非線形動学モデリングを実際の経済・経営のマイクロデータに適用し、実証分析によってモデルの有効性を検証した。4.消費者学習理論を取り込んだ異質離散選択モデルの開発研究製品の品質など消費者にとって不確実性の伴う説明変数を効用関数の中に取り込む研究を行い、さらに広告の露出や製品の購入使用経験が品質に対する不確実性を減少させる消費者学習(consumer learning)過程を消費者異質性を取り入れた枠組みで展開するモデルとMCMCのアルゴリズムを与え、今後展開すべき研究の方向性を確認した。5.研究の総括3年間の研究を理論的側面、実証的側面の両方から総括した。
世界の瞬発系・持久系選手の全ゲノム塩基配列解析による運動能力関連遺伝子の解明

本研究の目的は、世界の瞬発系および持久系運動選手のゲノム全領域の塩基配列を次世代シークエンサによって決定し、遺伝子発現制御の特性、遺伝子産物の構造・機能に影響を与えるアミノ酸置換、さらにゲノムの構造変化を網羅的に解析することによって、運動能力に関連する遺伝的素因を解明することにある。骨格筋・血液細胞でのトランスクリプトーム・メタボローム等の解析結果との照合により、骨格筋の代謝的特性ならびに骨格筋・腱の強度に影響を与える多型、呼吸・循環系の適応能力に関連する遺伝的背景を明らかにすることができ、個人の特性に応じた競技種目の選択やトレーニング方法の改善などに役立てることができる。アスローム研究とは、アスリートのためのマルチオミクス研究“Multi-Omics Studies for Athletes"であり、ゲノム・トランスクリプトーム・エピゲノム・プロテオーム・メタボローム“genome, transcriptome, epigenome, proteome, metabolome"を包括的に解析する。Athlome Project Consortiumは具体的に4つの目標を掲げる。1)世界の研究拠点の相互協力体制とバイオバンクを構築する。2)運動能力、トレーニングに対する応答、筋損傷易罹患性に関連する遺伝子多型を発見する。3)探索的研究から得られた遺伝子マーカーの有用性を検証・確認する。4)新たに発見された生物学的プロセスを理解するために遺伝子産物の機能解析を行う。過去に集積されたDNAの質が低いため、高度な塩基配列解析に適さないサンプルが含まれていた。今年度は研究者の所属研究機関の異動に伴い、新たな倫理審査を受ける必要が生じた。研究参加者から再同意を得て、新たに唾液DNAを収集することを決定した。西および東アフリカ出身の短距離走者と長距離走者1000人の全ゲノム塩基配列解析を目指している。このプロジェクトのフェーズ1はすでに開始されており、最高レベルの12人の短距離走者と12人の長距離走者(世界記録保持者、オリンピック選手、世界チャンピオン)のシークエンシングが行われた。フェーズ2(2016-2018)は、配列決定のためのサンプルサイズを100ゲノムに増加させることを含む。全ゲノム塩基配列決定を行う対象者は、2020年までに1,000に拡大される(フェーズ3)。このシークエンシングプロジェクトの重要な目的は、エリート東アフリカ選手と西アフリカ選手の遺伝子型分布を記録することにある。1000Athlomes Projectから生成される大量の遺伝子型データは、1)将来のパフォーマンス研究のための参照パネル、および2)医学における他の極端な表現型研究のためのガイドとして役立つと期待される。保存されているサンプルからのDNAの再抽出、ならびに唾液などサンプルの再採取を行うこととした。倫理委員会の再審査が完了し、次年度は目標とするサンプル数を確保できる見通しとなった。全ゲノム塩基配列解析のコストが低下しつつあるので、解析できる試料数の増大が期待できる。今年度は、イルミナ社のHiSeq X Fiveを用いて、ケニア人7人、エチオピア人8人の長距離選手の全ゲノム塩基配列を決定した。対照群として日本人1人のゲノムを3回解析し、塩基配列決定の再現性を確認した。

Athlome Project Consortiumは具体的に4つの目標を掲げる。1)世界の研究拠点の相互協力体制とバイオバンクを構築する。2)運動能力、トレーニングに対する応答、筋損傷易罹患性に関連する遺伝子多型を発見する。3)探索的研究から得られた遺伝子マーカーの有用性を検証・確認する。4)新たに発見された生物学的プロセスを理解するために遺伝子産物の機能解析を行う。過去に集積されたDNAの質が低いため、高度な塩基配列解析に適さないサンプルが含まれていた。今年度は研究者の所属研究機関の異動に伴い、新たな倫理審査を受ける必要が生じた。研究参加者から再同意を得て、新たに唾液DNAを収集することを決定した。西および東アフリカ出身の短距離走者と長距離走者1000人の全ゲノム塩基配列解析を目指している。このプロジェクトのフェーズ1はすでに開始されており、最高レベルの12人の短距離走者と12人の長距離走者(世界記録保持者、オリンピック選手、世界チャンピオン)のシークエンシングが行われた。フェーズ2(2016-2018)は、配列決定のためのサンプルサイズを100ゲノムに増加させることを含む。全ゲノム塩基配列決定を行う対象者は、2020年までに1,000に拡大される(フェーズ3)。このシークエンシングプロジェクトの重要な目的は、エリート東アフリカ選手と西アフリカ選手の遺伝子型分布を記録することにある。1000Athlomes Projectから生成される大量の遺伝子型データは、1)将来のパフォーマンス研究のための参照パネル、および2)医学における他の極端な表現型研究のためのガイドとして役立つと期待される。本研究の目的は、世界の瞬発系および持久系運動選手のゲノム全領域の塩基配列を次世代シークエンサによって決定し、遺伝子発現制御の特性、遺伝子産物の構造・機能に影響を与えるアミノ酸置換、さらにゲノムの構造変化を網羅的に解析することによって、運動能力に関連する遺伝的素因を解明することにある。骨格筋・血液細胞でのトランスクリプトーム・メタボローム等の解析結果との照合により、骨格筋の代謝的特性ならびに骨格筋・腱の強度に影響を与える多型、呼吸・循環系の適応能力に関連する遺伝的背景を明らかにすることができ、個人の特性に応じた競技種目の選択やトレーニング方法の改善などに役立てることができる。アスローム研究とは、アスリートのためのマルチオミクス研究“Multi-Omics Studies for Athletes"であり、ゲノム・トランスクリプトーム・エピゲノム・プロテオーム・メタボローム“genome, transcriptome, epigenome, proteome, metabolome"を包括的に解析する。
動脈硬化マウスと早期老化マウスを用いた経時的な排尿動態の検討

私たちはこれまで動脈硬化を作成した慢性膀胱虚血ラットを使い、血管病変が膀胱機能に重大な影響を及ぼすことを明らかにしてきた。臨床的にも動脈硬化危険因子の増加は下部尿路症状の悪化をもたらすことが示されてきている。本研究は加齢に伴い増加する下部尿路症状の病態として血管病変の関与を明らかにすることを目的とした。そこで自然発症の動脈硬化モデル(ApolipoproteinEノックアウトマウス)の血管病変と膀胱機能を経時的に検討した。本年度は動脈硬化モデルApolipoproteinEノックアウトマウスとワイルドタイプのC57BL/6Jマウスを54週齢で検討した。動脈硬化モデルとコントロールでは体重や摘出膀胱重量に有意差はなかった。蓄尿機能に関して24時間の排尿記録上は飲水量、排尿量に有意差はなかった。一方、排尿回数は動脈硬化モデルで有意に増加し、1回排尿量は有意に減少した。無麻酔非拘束下の持続的膀胱内圧測定、排尿量測定では排尿時最大膀胱収縮圧は動脈硬化モデルとコントロールで有意差はなかった。一方、排尿記録の結果と一致して動脈硬化モデルは排尿間隔が有意に短縮し、1回排尿量が減少していた。摘出膀胱から膀胱切片を作成しオルガンバスでin vitroの膀胱収縮力を検討した。KCl、カルバコール、経壁神経電気刺激など膀胱平滑筋の主な収縮刺激を与えたがいずれも収縮反応は動脈硬化モデルで低い傾向はあったものの有意差はなかった。動脈硬化に関しては大動脈レベル、膀胱近傍の腸骨動脈レベルで組織学的にApolipoproteinEノックアウトマウスでプラークの付着などコントロールとあきらかに違いが認められた。以上の研究結果は動脈硬化モデルでは12週齢では膀胱機能に影響はなかったが54週齢では明らかな蓄尿機能の低下が認められた。動脈硬化の進展に伴い膀胱機能に影響することが明らかとなった。本研究は加齢に伴い増加する下部尿路症状の病態として血管病変の関与を明らかにする。これは超高齢社会を迎えQOLに影響する下部尿路症状の増加に対し血管というターゲットを対象とした新しい治療や予防に将来結びつく重要なものと考えている。そこで本研究では自然発症の動脈硬化モデル(ApolipoproteinEノックアウトマウス)と早期老化モデル(Klotho変異マウス)の血管病変と膀胱機能を経時的に検討する。本年度は動脈硬化モデルを使用した。ApolipoproteinEノックアウトマウスとワイルドタイプのC57BL/6Jマウスの12週齢での検討では体重、膀胱重量に有意な違いはみられなかった。蓄尿機能に関して24時間の排尿記録上は飲水量、排尿量、排尿回数、1回排尿量に有意な違いはみられなかった。膀胱機能に関して無麻酔非拘束下の持続的膀胱内圧測定、排尿量測定では排尿時最大膀胱収縮圧、排尿間隔、1回排尿量には同様に有意な差はみられなかった。KCl、カルバコール、経壁神経電気刺激など膀胱平滑筋の主な収縮刺激を与えたがいずれも収縮反応に有意な違いはみられなかった。動脈硬化に関しては大動脈レベルでは組織学的にApolipoproteinEノックアウトマウスでプラークの付着を認めたが膀胱近傍の腸骨動脈レベル、膀胱壁内血管ではC57BL/6Jマウスと違いはみられなかった。今後54週齢、70週齢で動脈硬化の進行と共に膀胱機能がどのように変わるか検討予定である。予定通り進んでいる。

ただし加齢に伴う変化をみるため実験週齢まで飼育する必要があり加齢マウスの検討はまだ残っている。予定通り実験を進めるがマウスの週齢数を計算に入れ能率よく施行する。
汎発性膿疱性乾癬の発症における免疫学的メカニズムの解析

膿痕性乾癬患者末梢血単核球を各種細菌由来のスーパー抗原などのmitogenで刺激後のサイトカイン産生をELISA法で測定したところ,コントロールと比較して,IL-8,IL-1βの産生が増加していた。さらに,単球を分離した実験及びフローサイトメトリーを用いた実験から,単球によるIL-Iβの産生は特にactive phaseの患者末梢血において,有意に高い傾向を示した。皮膚病変部においては,血管内皮細胞のICAM-1,ELAM-1の発現が亢進していることを我々は明かとしているが,これらの接着分子発現に対する上記各種サイトカインの影響を,ヒト皮膚培養血管内皮細胞(HMVEC)を用いてCELISA法により検討した。その結果,ICAM-1,ELAM-1ともに,IFN-γ,TNF-αにより,用量依存的に発現が亢進することが明かとなった。これらの結果は,遺伝的素因を持つ個体に、感染、ストレスなどの刺激が加わることにより、炎症反応が引き起こされ,その過程においてリンパ球の活性化、サイトカインの産生、細胞接着分子の発現誘導などが起こり、その結果特徴的な臨床症状が現われるという我々の膿庖性乾癬の発症に対する仮説を支持する結果と考えられた。また,これらのサイトカインによる細胞接着分子の発現亢進に対する,乾癬治療薬剤であるEtretinateの影響を検討した結果,Etretinateはサイトカインにより増強した細胞接着分子の発現を抑制する作用は認めず,Etretinateの臨床効果は,接着分子発現を介しない経路によるものと考えられた。1,患者末梢血単核球のサイトカイン産生能の解析汎発性濃疱性乾癬患者由来の末梢血単核球をSEA,SEB,LPSの存在下で48時間培養し、その培養上澄中の各種サイトカイン濃度を検討した。この結果、患者由来の末梢血単核球は,正常人由来の末梢血単核球と比較して、mitogen刺激時に有意に多くのIL-1b,TNF-aを産生することが示された。2,各々のサイトカイン産生細胞の分画についての検討汎発性濃疱性乾癬患者由来の末梢血単核球分画を上記と同様の条件下で24時間培養し,単球のマーカーであるCD14と各々のサイトカインに対する抗体を用いて二重染色を行ない,FACSにて解析した。その結果,単球の細胞内IL-6およびTNF-αは,LPS刺激により,上昇を示し,リンパ球の反応とは異なるタイムコースをとることも示唆された。現在さらに,この反応における,ビタミンD,レチノイドなどの治療薬剤の影響を検討中である。ヒト血管内皮細胞における細胞接着分子発現の検討ヒト由来培養血管内皮細胞(HMVEC)を用いてICAM-1,ELAM-1の発現における各種サイトカインおよび治療薬剤の検討を行なった。その結果,IL-1β,TNF-αによりICAM-1,ELAM-1ともに発現の増強を認めたが、活性型ビタミンD3およびサイクロスポリンは、1CAM-1の発現に影響を与えず,レチノイドはその発現を増強することが明らかとなった。
バクテリオファージの溶菌活性を利用した細菌感染性眼疾患の新規治療法の開発

家兎角膜にメチシリン耐性黄色ブドウ球菌を感染させて、バクテリオファージを点眼しその効果を抗菌薬点眼と比較検討した。対照群および抗菌点眼群に比してバクテリオファージ点眼群は有意に角膜混濁スコアが低下したが、角膜内の生菌数は統計学的有意差が得られなかった。細菌性眼内炎の動物モデルを確立するため、家兎およびマウスを用いて検討した結果、マウスの硝子体へ緑膿菌あるいは腸球菌を投与することで、多数の好中球浸潤を生じ組織破壊を伴う非常に激しい眼内炎を安定して誘導することが出来た。眼内炎を生じたマウスの硝子体にファージを投与すると、臨床スコアおよび眼内の生菌数が有意に低下した。今年度はメチシリン耐性黄色ブドウ球菌(MRSA)を用いて、角膜炎および眼内炎の動物モデルにおいてバクテリオファージによる治療効果の検討を行った。MRSA角膜炎モデルは、既報のマウスを用いたモデルにおいては感染が非常に弱く自然治癒するため、治療薬の検討に用いる事は不適切であると考えた。そこで次にウサギ(New Zealand white rabbit)を用いたモデルを検討した。ウサギの角膜上皮を剥離した後、MRSA(500CFU)を角膜実質内に注射することで感染させて作成した。翌日角膜に感染が生じているのを確認した後に、対照、バクテリオファージ、抗菌薬(セフメノキシム)の点眼(1日4回)による治療を開始した。治療開始2日後、安楽死させ角膜を摘出し、角膜内の生菌数を検討した。治療開始後2日後では、対照群および抗菌点眼群に比してバクテリオファージ点眼群が有意に角膜混濁スコアの低下が認められた。角膜内の生菌数は、バクテリオファージ点眼群において減少傾向が見られたが、3群間で統計学的有意差は得られなかった。またウサギ(New Zealand white rabbit)硝子体内にMRSA(500CFU)を投与することでMRSA眼内炎モデルを生じさせ、翌日に対照、バクテリオファージ、抗菌薬(バンコマイシン)を硝子体投与して治療を行い、治療開始2日後に安楽死させ眼球を摘出した。治療開始後の硝子体液のミエロペルオキシダーゼ活性は3群間で統計学的有意差は見られなかった。治療開始2日後バクテリオファージおよびバンコマイシン投与群は、対照群に比して眼内の生細菌数が低い傾向にあったが、個体差が大きく3群間で統計学的有意差は得られなかった。今年度は前年度に引き続き、メチシリン耐性黄色ブドウ球菌(MRSA)を用いた角膜炎の家兎モデルの条件検討およびバクテリオファージによる治療効果の検討を行った。家兎角膜炎モデルにおいて、角膜実質内への投与を確実にするために、投与量を前年度の半分の50 μlにし、菌数は2倍にした。家兎(New Zealand white rabbit)の角膜上皮を剥離した後、MRSA(103 CFU/50 μl)を角膜実質内に注射した。20時間後に対照、バクテリオファージの溶菌酵素であるリゾスタフィン(20 μg/ml)、抗菌点眼薬(セフメノキシム)の点眼(1日4回)による治療を開始した。治療開始3日後(10回点眼後)、安楽死させ角膜を摘出し、角膜内の生菌数および好中球浸潤の評価のためミエロペルオキシダーゼ活性を検討した。リゾスタフィン点眼群は生菌数が減少している個体もあったが、感染が成立していない個体などがあり個体差が大きく3群間で統計学的有意差は得られなかった。より安定した角膜炎モデルを作製するため、角膜実質に投与するMRSAの菌数を変えて検討した。MRSAを101 CFU、102 CFU、103 CFU、104 CFU、105 CFU、106 CFU投与して角膜の臨床所見を観察したところ、104 CFU投与した群が最も感染が成立することが明らかとなった。最も感染が成立しやすかったMRSAの菌数(104 CFU/50 μl)を角膜実質内に注射し、20時間後に対照、リゾスタフィン(20 μg/ml)、抗菌点眼薬(セフメノキシム)の点眼(1日4回)を開始した。点眼開始3日後(10回点眼後)、安楽死させ角膜を摘出し、角膜内の生菌数およびミエロペルオキシダーゼ活性を検討した。リゾスタフィン点眼群は対照群、セフメノキシム点眼群に比して、角膜内生菌数およびミエロペルオキシダーゼ活性が減少する傾向にあったが、対照群で自然治癒する個体などがあり個体差が大きく3群間で統計学的有意差は無かった。家兎を用いてMRSA角膜炎モデルの作製およびバクテリオファージ溶菌酵素の効果を検討した。これまでに検討したマウスに比して家兎はMRSAの角膜への感染が成立しやすかった。また種々の検討によりMRSA家兎角膜炎モデルの至適の菌数を明らかにしたが、やはり感染後に自然治癒する個体も見られ、治療効果を判定する本実験では有意な結果を得ることができなかった。家兎におけるMRSA角膜炎モデルでは、感染成立後の臨床症状の個体差が大きいために、治療効果を検討する実験系においては直接実験結果に影響を与えた。

家兎角膜にメチシリン耐性黄色ブドウ球菌を感染させて、バクテリオファージを点眼しその効果を抗菌薬点眼と比較検討した。対照群および抗菌点眼群に比してバクテリオファージ点眼群は有意に角膜混濁スコアが低下したが、角膜内の生菌数は統計学的有意差が得られなかった。細菌性眼内炎の動物モデルを確立するため、家兎およびマウスを用いて検討した結果、マウスの硝子体へ緑膿菌あるいは腸球菌を投与することで、多数の好中球浸潤を生じ組織破壊を伴う非常に激しい眼内炎を安定して誘導することが出来た。眼内炎を生じたマウスの硝子体にファージを投与すると、臨床スコアおよび眼内の生菌数が有意に低下した。これまでに行った家兎を用いた細菌性眼内炎モデルが、眼内の生細菌数や臨床所見など個体差でのばらつきが大きく薬剤の治療効果を検討する実験モデルとしては不適切であったため、本年度は使用する動物をマウスに変更して細菌性眼内炎のモデルの確立を行った。眼内に摂取する菌は緑膿菌と腸球菌を用いて、C57BL/6マウスの硝子体へこれらの菌を投与することで、マウス細菌性眼内炎モデルを発症するか検討した。まず投与する菌量の至適量を検討した。緑膿菌においては、12,500CFU、125,000CFU、1250,000CFUの3つの菌数を0.5μLの懸濁液として硝子体内に投与した。24時間後にはどの群においても眼内から生菌が検出されたが、125,000CFU以上の投与で安定して眼内炎が発症することが分かった。再検討においても100000 CFU/0.5μLを硝子体に投与すると24時間後には眼内の生菌数は約1000000 CFU/eyeが検出され、臨床スコアも悪化し、ミエロペルオキシダーゼ活性を用いて評価した好中球の浸潤も有意に促進された。腸球菌においては、1,250CFU、12,500CFU、125,000CFUの菌量を硝子体に投与した結果、感染24時間後では12,500CFU以上の投与で安定して眼内炎が生じることが分かった。至適濃度を10000 CFUを硝子体に投与すると24時間後には眼内の生菌数は約100000000 CFU/eyeに増加し、臨床所見も増悪し、好中球の浸潤も有意に促進し、至適濃度と考えた。菌を投与後、6、9、12、19、24時間後の病理所見および好中球の浸潤を検討したところ、病理所見もミエロペルオキシダーゼ活性を用いて評価した好中球の浸潤も菌投与後19時間から生じることが明らかとなった。これらの動物モデルを用いてファージ療法の効果を検討した。MRSAによる角膜炎と眼内炎のバクテリオファージの治療効果について検討した。既報のマウスのメチシリン耐性黄色ブドウ球菌(MRSA)角膜炎モデルにおいては、感染後の臨床症状が非常に弱く、自然治癒したため治療効果を判定する実験には不適切と考え、ウサギによる実験系に変更したためモデルの作成に時間を要している。眼内炎モデルでは、ラットでは硝子体の体積が狭く、注射時に水晶体に接触する可能性が高かったため、ウサギのモデルで検討を行う事とした。角膜炎および眼内炎モデルともに、感染の個体差が大きいのが実験結果に影響を与えるために感染モデルの改良を重ねている。採取しているサンプルを用いて今後サイトカイン測定や病理学的検討も行う。MRSAを用いた角膜炎モデルでは、免疫能が正常な動物においては感染が成立しにくく、臨床症状の個体差が大きく自然治癒する個体があることなどから、点眼による治療効果を見る実験系としては適さないと考えられた。次年度はより病原性が強いと考えられる腸球菌および緑膿菌を用いて角膜炎あるいは眼内炎モデルを作成し、バクテリオファージおよび溶菌酵素の効果を検討する予定である。眼科学角膜炎および眼内炎モデルともに、感染の個体差が大きい事が課題と考えられた。
腫瘍懐死因子(TNF)の特異なプロセシングの分子機構

[目的]マクロファージが産生する腫瘍懐死因子(TNF)は、76残基という極めて長い前駆領域を持った形で生合成され、分泌蛋白質でありながら、一旦活性を有する膜蛋白質として細胞表層に出現した後分泌されるという、極めて特異な分泌機構を有するが、そのプロセシング機構の詳細、ならびにその生理的意義については不明な点が多い。先に我々は、76残基からなるTNF前駆領域中の膜貫通領域の一部が、単独では典型的なシグナルペプチドとして機能すること、さらにこのシグナルペプチドの切断が、前駆領域中の細胞質領域により阻害されることにより、膜結合型TNFが生ずることを見い出した。本研究ではこの細胞質領域に存在する膜上トポロジー決定因子を明らかにすることを目的とした。[方法、結果]糖鎖付加部位を成熟領域に導入したPro-TNFの前駆領域内細胞質領域について種々の欠失、置換変異体を作製しin vitro-小胞体膜通過系及びCOS細胞発現させ、糖鎖付加の有無から膜上トポロジーを検討した。その結果、Pro-TNFの細胞質領域には、細胞質領域の長さと膜貫通領域近傍の正荷電アミノ酸という2つのトポロジー決定因子が存在することが示された。さらに、これらPro-TNF変異体のCOS細胞における発現及び分泌を詳細に検討した結果、Pro-TNFの細胞質領域は、Pro-TNFの細胞での安定な発現および成熟型TNFの細胞からの分泌に重要な役割を担っていることが明らかになった。[目的]マクロファージが産生するTNFは、活性を有するII型の膜蛋白質として細胞表面に出現した後分泌されるが、そのプロセシングの詳細には不明な点が多い。先に我々は、76残基から成るTNF前駆領域中の膜貫通領域の一部が、シグナルペプチドとして機能し得ることをin vitro-小胞体膜通過系を用いて示した。本研究では、この領域が細胞レベルにおいてもシグナルペプチドとして機能し、膜局在化を介さず活性を有する成熟型TNFを生じ得るか否かを検討した。[方法、結果]TNFの成熟領域の直前に、TNF前駆領域中の膜貫通鋤域のN-末端側半分(14残基)を融合させた変異蛋白質cDNAをCOS-細胞で発現させたところ、17kDaの成熟型TNFの効率良い分泌が認められ、その分泌量は野生型pro-TNF cDNAのトランスフェクタントでの分泌量の57倍に達した。この分泌型TNFのL929細胞に対する細胞毒性ならびにヒト末梢血好中球に対するプライミング活性は、rhTNFのそれとほぼ同程度であった。これらの結果より、膜結合型腫瘍壊死因子の膜貫通領域の一部は、細胞レベルにおいてもシグナルペプチドとして機能し、膜局在化を経ることなく生物活性を有する成熟型TNFを効率良く分泌させ得ることが明らかになった。[目的]マクロファージが産生する腫瘍壊死因子(TNF)は、76残基という極めて長い前駆領域を持った形で生合成され、分泌蛋白質でありながら、一旦活性を有する膜蛋白質として細胞表層に出現した後分泌されるという、極めて特異な分泌機構を有するが、そのプロセシング機構の詳細、ならびにその生理的意義については不明な点が多い。先に我々は、76残基から成るTNF前駆領域中の膜貫通領域の一部が、単独では典型的なシグナルペプチドとして機能すること、さらにこのシグナルペプチドの切断が、前駆領域中の細胞質領域により阻害されることにより、膜結合型TNFが生ずることを見い出した。[方法、結果]糖鎖付加部位を成熟領域に導入したPro-TNFの前駆領域内細胞質領域について種々の欠失、置換変異体を作製しin vitro-小胞体膜通過系及びCOS細胞発現系で発現させ、糖鎖付加の有無から膜上トポロジーを検討した。その結果、Pro-TNFの細胞質領域には、細胞質領域の長さと膜貫通領域近傍の正荷電アミノ酸という2つのトポロジ一決定因子が存在することが示された。

さらに、これらPro-TNF変異体のCOS細胞における発現及び分泌を詳細に検討した結果、Pro-TNFの細胞質領域は、Pro-TNFの細胞での安定な発現および成熟型TNFの細胞からの分泌に重要な役割を担っていることが明らかになった。
主要海産二枚貝の人工種苗生産高度化に向けた生殖機能の神経内分泌制御機構の解明

ホタテガイとマガキの中枢神経系から同定された生殖腺刺激ホルモン放出ホルモンペプチドは、エストロゲン合成の促進調節を介したホタテガイの精原細胞増殖促進機能を示した。ヨーロッパイガイ、ムラサキイガイ、ホタテガイで決定された2タイプのエストロゲン受容体(ER)は卵巣と精巣で発現し、レポーターアッセイによってpyERは転写因子として、pyERRは構成的な活性化因子として働くことが示唆された。セロトニンによる卵成熟と精子運動活性化を卵成熟休止因子(OMAF)は細胞外からのカルシウム流入抑制によって阻害し、抗体による生体内OMAFの機能解除によって、セロトニンによる産卵誘発効果が強く増強された。1)ホタテガイGnRHペプチドの同定と精原細胞増殖機能の検証ホタテガイGnRH(pyGnRH)に続き、マガキGnRH(cgGnRH)のGnRH前駆体cDNA完全長を明らかにすることができ得た。これらは、分子系統樹解析で既知の3タイプのGnRHとは別に、軟体動物でクラスターを形成した。さらに、ホタテガイの推定ペプチドとして11アミノ酸残基と12アミノ酸残基のペプチドが予想され、両推定ペプチドを合成し、ホタテガイ精巣培養系への添加実験を行った。両推定ペプチドともに、すでに報告しているmGnRH、よりも強い精原細胞増殖機能を発揮したが、アミド化の可能性から見て11アミノ酸残基からなる新規のGnRHであると示唆された。2)二枚貝のエストロゲン受容体(ER)のアソフォームの同定ヨーロッパイガイのMeER1、MeER2の配列をもとに、設計したORF両端の特異プライマーを用い、近縁種のムラサキイガイから2タイプのERの候補断片を獲得し、RACE法によってMgER1、MgER2のORFの全長を含むcDNAを得ることができた。近縁2種のイガイ類に共通して2タイプのERが存在することが明らかになり、既知の軟体動物ERに分類されるタイプとオーファン受容体である哺乳類のERR(エストロゲン関連受容体)に分類された。3)セロトニン(5-HT)による卵成熟と精子活性化に対するOMAFの抑制機構カルシウムイメージングによって、セロトニンやアンモニアによる精子運動能の活性化にともなう細胞外からのカルシウム流入と続くカルシウムの波動が観察された。組み換えOMAFは細胞外からのカルシウム流入に加えは同をも抑える運動能を強く抑制することが明らかになった。1)主要海産二枚貝のGnRHの配偶子形成への関与とステロイド生合成調節ホタテガイで推定されたpyGnRHペプチドのin vivo投与によって、対照群に比べ精巣の発達が促され、ホタテガイ精巣培養での精原細胞増殖に基づく精巣発達の効果がin vivoでも証明された。このことは、下垂体を経由しない原始的な内分泌調節による生殖細胞発達調節の存在を示唆している。一方、卵巣発達が著しく阻害され、生殖巣の雄への偏りが認められ、雌性から雄性への性転換の可能性が示唆された。今後は、性ステロイドホルモンの変化と生殖細胞の細胞生化学的な解析の結果に期待したい。2)エストロゲン受容体(ER)2型の機能評価ホタテガイで単離同定したpyERとpyERRの2タイプのリガンド結合能に注目して、ヒラメERαのリガンド結合領域にpyERとpyERRの同領域を組み込んだキメラベクターとルシフェラーゼ遺伝子上流にヒラメビテロゲニンの応答配列を含むベクターを共トランスフェクションしたメダカ肝細胞を用いたレポーターアッセイを試みた。エストロゲン(E2)によるpyERのキメラERでの高いルシフェラーゼ活性とpyERRのキメラERでの低いルシフェラーゼ活性が観察され、pyERがエストロゲンの転写因子として、pyERRが構成的な転写因子として働くことが示唆された。3)海産二枚貝のOMAFの構造機能と産卵調節セロトニンによる放精の前提となる精子運動活性化に、受容体を介したCaイオンの断続的な流入とともにカリウムの放出、細胞内pHの上昇が鍵となることが明らかになり、産卵誘発におけるOMAFによるCaイオンの流入阻害からの解除の重要性があらためてクローズアップされた。1)主要海産二枚貝のGnRHの配偶子形成への関与とステロイド生合成調節ホタテガイとマガキで11アミノ酸残基からなると推定されたpyGnRHとcgGnRHペプチドは、すでにホタテガイ精巣培養で報告しているmGnRHと同程度もしくは強い精原細胞増殖機能を発揮した。しかし、その機能は鳥類のウズラ下垂体培養に対しては、ニワトリI型のようなLH分泌誘導を起こすことはなかった。一方、ホタテガイ精巣での強い精原細胞増殖効果はエストラジオール-17βでも見られ、pyGnRHの効果がエストロゲン拮抗薬で阻害されたことから、下垂体を経由しない原始的な内分泌調節による生殖細胞発達調節の存在が示唆された。

2)ホタテガイのエストロゲン応答配列の同定とERアソフォームの機能連関ヨーロッパイガイのMeER1、MeER2とムラサキイガイのMgER1、MgER2の配列をもとに、設計した縮重プライマーと特異プライマーを用いたPCRクローニングによって、既知の軟体動物ERに分類されるpyERとERR(エストロゲン関連受容体)に分類されるpyERRの2タイプを単離同定した。pyER、pyERRともに精原細胞とその周辺で発現し、pyERRのみが卵母細胞で発現していた。特に、Q-PCRで精巣発達の初期にこれらの高い発現が観察された。3)主要海産二枚貝のOMAFとOMAFノックダウンによる抑制解除と産卵誘発増強OMAFのORF配列をもとにした組換えOMAFに推定されたCu,Zn-SOD様の活性が検出されたが、共存する緩衝液の影響を完全に除いた検証を要する。イタヤガイ科2種に対するOMAFの部分配列認識抗体の前処理による産卵抑制解除処理によって、セロトニンによる産卵誘発効果の強い増強効果が認められた。GnRHペプチド領域の推定および他の二枚貝での存在を示せた。二枚貝に共通して2種類のERの存在を証明できた。卵成熟と精子活性化にカルシウム流入と波動が必須であり、OMAFが両細胞において細胞内カルシウムを抑制調節していることを明らかにすることができた。25年度が最終年度であるため、記入しない。推定GnRHペプチドのステロイドホルモン調節を介した生殖機能を軟体動物ではじめて示せた。二枚貝に2種類のERが存在することを証明し、精巣発達との関係を示唆することができた。OMAFのSOD推定領域の機能が明らかになり、OMAFに対する特異抗体によるノックダウンに成功し、高効率な産卵誘発の可能性を示すことができた。二枚貝の内因性の成熟GnRHペプチドの最終的な確認のためののアミノ酸配列の決定をする必要がある。卵成熟と精子の活性化と抑制調節に関わるカルシウムイオンチャンネル解析や分泌動態に必要な組み換えOMAFの大量合成と、抑制調節の主体となる領域の特定のための部分配列の組み換えタンパク合成を進める必要がある。二枚貝類のGnRHの特徴付けのために事例を増やす必要がある。単離したホタテガイのER(pyERとpyERR)のレポーターアッセイによる機能の確認を行う予定である。OMAFに存在するSOD推定領域におけるSODとしての正確な比活性として組換えOMAFを作製し直して再検討する。さらに、OMAFの産卵抑制領域の特定を行い。より確実な産卵制御方法に繋げる。
高インテグリティを実現するin vitro精子産生系の開発

これまで私たちが行ってきた器官培養法によるin vitro精子形成法を改良し、生体内環境に近い培養環境を作ること、それにより機能的完成度が高い精子をin vitroにおいて産生することが本研究の目的である。そのために、培養環境を化学的側面と物理的側面から改善するための基礎研究をおこなってきた。化学的側面としては、培養液の改良が主題になるが、そのためには精子形成を誘導・促進する因子群の同定が必須である。中でも脂質が重要因子であると予想されたことから、共同研究先においてLipidomicsを行い、血清中および血清アルブミン中の脂質構成を明らかとし、候補となる脂質群を見出した。また、別個に行ったMetabolomicsから、他の幾つかの候補因子も同定された。化学組成の明らかな合成培地を作製し、それらの候補因子、および既知の重要因子・物質を添加して、それら因子の精子形成に及ぼす効果を検討してきた。現時点において、ビタミン、抗酸化物質、脂質群が重要であることを見出している。物理的側面としては、マイクル流体デバイスを用いることで、既存の気層液相境界部培養法よりも効率的な培養法を開発している。デバイス内では、培養液流が作れるのみならず、適度な半閉鎖空間にて組織を培養することで、組織特有の環境を作り、かつ適度な酸素濃度に維持することができたと考える。そのようなデバイス内培養環境を、よりシンプルな新しい設計のデバイスでも作り出すことも行った。引き続き、デバイスの設計を工夫し、生体内環境への近似を目指す。培養液の改良実験とLipidomics, Metabolomicsのデータから、in vitro精子形成に重要な働きをする因子群の概要が分かってきた。これらの因子群を組み合わせることで、精子形成誘導能力の高い培養液を作れる可能性がでてきた。これまでのマウスでのin vitro精子形成をラットや他の動物でも展開でき、機能的完成度の高い精子産生に結びつくと期待している。In vitro精子形成の課題として重要なものは、成長マウス精巣での精子形成が低効率であること、マウス以外の動物(特にラット)では精子形成誘導が減数分裂途中までであること、半数体産生後の精子完成が低効率であること、などある。今後、これらの課題の解決のための実験を推進してゆく。そのための一つとして、マウス精子形成の評価方法をこれまでのAcr-GFP発現での評価に加えて、Protamin-Cherry発現の評価を行う。Protamin-Cherryは精子完成段階におけるステップ11の精子細胞において発現開始となることから、より精子産生に近い段階での定量的評価が可能となる。この指標を目印に培養環境の適正化が可能になると期待できる。
中心体の分配と細胞質分裂の共役に関与する蛋白質の単離解析

本研究はDNA複製開始に関わる新規タンパク質複合体GINSの細胞周期に置ける働きを明らかにすることを目的としている。前年まではアフリカツメガエルタンパク質を用いて実験を進めていたが、培養細胞の扱いの容易さから、ヒトGINSタンパク質を用いて実験を進めるために、まずヒトGINSタンパク質を形成するHSld5,HPsf1,HPsf2,HPsf3の4種のタンパク質をクローニングした。クローニングされたタンパク質はいずれもアフリカツメガエルの相同タンパク質と90%以上という高い相同性を有していた。次にクローニングされたHSld5,HPsf2,HPsf3タンパク質をGFP融合タンパク質としてHeLa細胞内で発現させた。間期においては、HPsf2を除く2種類のタンパク質はいずれも主に核に局在していたが、HPsf2は、細胞によって主に核に存在しているものと細胞質にも局在が見られるものが観察された。また、分裂期において、HPsf2,HPsf3においては、紡錘体の極に分布が見られた。さらに3種類の蛋白ともに、分裂秋喜においてmid-bodyに濃縮されているのが観察された。分裂期に置けるこういった分布は、細胞質分裂に関与するパッセンジャープロテインと呼ばれる一連のタンパク質のものと類似しており、GINS複合体の構成タンパク質がDNA複製開始のみではなく、細胞質分裂にも何らかの関与をしていることを示唆している。一方で、抗体を用いたHPsf2の染色は、この蛋白質がS期に置いて量が増加し、一方でM期に置いては大きく減少することを示し、このタンパク質のヒト細胞においての主要な役割がDNA複製にあることを示唆している。本研究はアフリカツメガエルSld5/Psf1/Psf2/Psf3複合体(GINS)の細胞周期進行に関わる働きの解析を目的としている。第一に、Sld5、Psf1、Psf2、およびPsf3はアフリカツメガエル卵無細胞系において複合体GINSを形成し、DNA複製開始に必須であることを明らかにした。この複合体は、染色体上でpreRC(pre-Replicative Complex :複製前複合体)が形成された後に、Cdc45とともに働き、DNAポリメラーゼの複製開始点への誘導に必要とされる。また、電子顕微鏡観察によってこの複合体がリング状構造を有していることを見出した(Genes Dev.2003 in press)。第二に、抗Sld5抗体が、アフリカツメガエル培養細胞A6細胞において特異的な染色像を示すことを見出した。分裂期初期に、中心体の周囲に集合を開始し、中期には紡錘体の末端、後期には分離していく姉妹染色体の間、終期にはmid-bodyを明るく染色する。ところが、抗Psf1抗体ではそのような染色は見いだせず、かわりに間期・分裂期何れにおいても中心体を染色することが見られた。高解像度で観察すると、抗Psf1抗体による染色は抗チューブリンγ抗体による染色とよく一致したが、抗Sld5抗体による染色は一致しなかった。この結果からは、GINS複合体が細胞周期の時期によって解離していることを示唆するが、アフリカツメガエル卵抽出液においてはS期においても、M期においても、すべてのPsf1はSld5と複合体を形成していた。さらに解析を進めるために、ヒトGINS複合体のクローニングを進行中である。