hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
Dutta重複度とRoberts環の研究

「局所環等が標数0の体を含む場合は、下が孤立特異点であれば単射である。一般の場合も、剰余体の拡大が有限生成であれば、下が孤立特異点のときは単射である。」結局、上の問題は忠実平坦射が完備化から誘導されるものであるときが最も重要であり、そのケースは昨年度の当研究で扱われている。今年度は、昨年度の研究を一般の忠実平坦射の場合に拡張したものである。応用として、ある条件の下で、上がRoberts環であることと下がRoberts環であることが同値になることが証明できた。2.有限生成加群によって次数付けられたネーター環のチャウ群が斉次な素イデアルと斉次元から来る有理同値関係で決まるかについて研究を行った。得た結果は次のとおりである。「ねじれの無い有限生成加群によって次数付けられたネーター環のチャウ群は斉次な素イデアルのクラスによって生成され、さらにそれらの関係式は斉次元から来る有理同値関係で決まる。」さらに、本研究では、ねじれを持つ有限生成加群によって次数付けられたネーター環のチャウ群も扱った。ただし、このケースでは斉次素イデアルを考えるだけでは不充分であり、研究分担者の鴨井氏によって定義されたG-素イデアルという概念が必要である。研究実績は以下のとおり。1.グラスマン多様体のアフィン・コーンの局所環が、いつRoberts環になるかを研究した。その結果、Roberts環になるための必要十分条件を与えることに成功した。2.局所環の間の忠実平坦射から誘導される有限生成加群のグロタンディェク群の間の射がいつ単射になるかについて研究を行った。得た結果は、一局所環等が標数0の体を含む場合は、下が孤立特異点であれば単射である。一般の場合も剰余体の拡大が有限生成であれば、下が孤立特異点のときは単射である。」結局、上の問題は忠実平坦射が完備化から誘導されるものであるときが最も重要である。3.次数付けられたネーター環のチャウ群が斉次な素イデアルと斉次元から来る有理同値関係で決まるかについて研究を行った。得た結果は、「ねじれの無い有限生成加群によって次数付けられたネーター環のチャウ群は斉次な素イデアルのクラスによって生成され、さらにそれらの関係式は斉次元から来る有理同値関係で決まる。
脂肪組織由来間葉系前駆細胞移植による血管新生療法の試み

脂肪組織由来間葉系前駆細胞(ADRCs)は、様々な血管新生増強因子を分泌する細胞として注目されている。我々は、マウス下肢虚血モデルへのADRCs移植が虚血骨格筋における血管新生を増強することを確認した。さらに、ADRCsがVEGF-Cを放出していることに着目し、難治性リンパ浮腫組織におけるリンパ管新生増強効果や炎症細胞浸潤抑制効果による浮腫軽減をきたすことを見いだした。その機序としてM2型マクロファージの関与が考えらた。平成21年度、我々は脂肪組織由来間葉系前駆細胞移植が、これまで行われてきた骨髄単核球細胞移植による血管新生療法に比較しより強力な血管新生効果を見いだすか検討した。マウス虚血骨格筋へ脂肪組織由来間葉系前駆細胞を移植すると、虚血組織における血管新生効果が増強することが明らかになった。これは、移植細胞が血管内皮細胞へ分化するのではなく、細胞および虚血骨格筋から放出されたSDF-1やVEGF-Aといった血管新生増強因子が骨髄を刺激し、末梢流血中への血管内皮前駆細胞の動員を惹起するためであることが明らかになった。これらキーサイトカインの検討で、我々はSDF-1やVEGF-Aのみならず、VEGF familyの1種であるVEGF-CやHGFも増加していることを見いだした。特にVEGF-Cは、血管新生のみならずリンパ管新生にも携わっている重要なサイトカインである。虚血に引き続いて起こる組織浮腫は、毛細血管網の破綻や組織内圧の上昇による血行障害や組織壊死を引き起こし、梗塞範囲を拡大させ機能低下や機能不全を招く。リンパ管は組織浮腫を軽減させるための重要な排管であり、脂肪組織由来間葉系前駆細胞移植が血管新生増強効果のみならずリンパ管新生増強効果をも有するならば、従来の細胞治療と比してより強力な治療効果が期待できる。我々は、脂肪組織由来間葉系前駆細胞を培養した培養上清が成熟リンパ管細胞の遊走能や増殖能を増強することをin vitro実験で確認した。今後、マウス尾部リンパ浮腫モデルを作製し、脂肪組織由来間葉系前駆細胞移植によるリンパ浮腫軽減効果を検討する。我々は、マウス下肢虚血モデルへの脂肪組織由来培養増幅間葉系前駆細胞移植が血管新生を増強することを明らかにしたが、臨床導入の際には、セリューションシステムを用いて単離された非培養間葉系前駆細胞を使用予定である。そこで、虚血骨格筋へ脂肪組織由来非培養新鮮細胞を移植したところ、培養細胞移植同様に皮下血流および毛細血管密度の増加が認められた。さらに、前臨床試験として、大型動物での安全性確認試験を行った。ウサギ下肢虚血モデルは、遺伝子治療や細胞移植による血管新生効果を評価するために確立した良いモデルではあるが、セリューションシステムを用いた移植細胞抽出には80gもの皮下脂肪の採取が必要であり、ウサギからは採取困難である。そこで、側副血行の発達が良く下肢虚血モデルとしては不適ではあるが、ブタを用いた安全性の評価を行った。全身麻酔下に下肢虚血を作製したブタ腹部より脂肪吸引用カニューラを用いて皮下脂肪組織の採取を行なった。セリューションシステムにより間葉系前駆細胞を単離し、虚血骨格筋内への移植を行なった。これらの手技および使用機材はすべて我々が予定している臨床試験と同一のものである。細胞移植4週間後まで、皮下脂肪採取部の感染を含め特記すべき異常なく生存し、骨格筋、脳、心臓、肺、肝臓、膵臓、脾臓、腎臓の肉眼的および病理学的検討や一般生化学検査においても異常所見は見られず、観血的手技を含めた移植による合併症・副作用は認めず、前臨床試験としての安全性が確認された。本研究の臨床導入については、現在、名古屋大学医学部生命倫理委員会を通過し、厚生労働省「ヒト幹細胞臨床研究に関する審査委員会」で審議中である。我々が臨床導入を行った「重症末梢性血管疾患に対する自己骨髄単核球細胞移植療法」は、我が国最初の循環器領域における再生医療として注目されたが、長期経過観察の結果、多数の動脈硬化危険因子を有する患者においては、移植細胞の数的不足および機能低下が原因となり、治療有効性が低下していることも明らかになった。我々は、皮下脂肪組織から分離同定された間葉系前駆細胞(ADRCs)移植が、骨髄細胞移植で救肢し得なかった重症例に対する次世代の血管新生療法となりうると考えた。既に、マウス下肢虚血モデルにおいての有効性は示しており、臨床導入に向け、大動物(ウサギ)下肢虚血モデルによる治療有効性および安全性を評価した。下肢虚血を作製されたウサギは3群に分けられ、1週間後、それぞれADRCs、骨髄細胞、生理食塩水を虚血骨格筋内へ移植した。

細胞移植群では、治療2週間後より虚血/正常下腿血圧比が上昇し、4週間後の血管造影では豊富な側副血行の発達および毛細血管密度の増加が見られた。また、移植部を含め健常臓器における組織過形成を起こさない事も確認した。以上の研究成果より、臨床導入可能であると判断した。また、我々は、ADRCsがリンパ管新生を増強するサイトカインを放出することを見いだし、既存の治療では十分な患者QOLが保たれていない難治性疾患であるリンパ浮腫に対する新規治療としての可能性についても検討した。マウス尾部リンパ浮腫モデルにおいて、ADRCs移植はリンパ管新生を増強させ、炎症細胞の浸潤を抑え、組織浮腫を軽減させることが明らかとなった。その機序として骨髄由来のM2型マクロファージの動員が関与していると考えられ、現在、検討中である。
微量液体ディスペンサを利用したマイクロ・ナノリアクターアレイの構築

本研究では,簡便な操作によって多数の微量液体を定量的に扱うことを可能とするマイクロデイスペンサを開発し,これを並列化してナノリットルからピコリットルの容積のマイクロ・ナノリアクターアレイを構築することを目的とした。主要な研究成果を以下に示す。1.開発した微量液体ディスペンサーアレイの性能評価本提案の方法は,流路径の変化を利用してバルブ機能を創出し,流路分岐構造を利用して微量液体を秤量して搬送することが可能な(可動構造が不要な)受動微量液体ディスペンサである。前者の構造は,一般には受動バルブと呼ばれ,濡れ難い(接触角が90度以上の)材料表面を有する狭隘部分が必要とされるが,本提案の構造であれば,材料の加工精度にも依存するが,接触角90度以下の濡れ易い液体と材料の組み合わせであっても,バルブ機能を有することを明らかした。これは,ヤング・ラプラス式に従って,広範囲の物性の液体秤取が可能であることを示している。2.ディスペンサの秤取性能向上のための局所表面処理上記のラプラス圧変化を利用したバルブを有効に機能させるためには,流路狭隘部分の構造変化を鋭角的にする(段差を明確につける)ことの他に,材料の表面物性を変化させることも有効であった。そのための方法として,疎水鎖を有するシランカップリング剤による局所修飾が有効であったが,新規な方法として,高分子微粒子をウェルに集積させた後に,材料表面に融着させる方法を提案しその有効性も実証した。この方法によれば,単に流路に微粒子懸濁液を導入するだけで,その構造に依存して表面の一部を化学的に修飾することが可能であった。3.マルチディスペンサーを用いたマイクロ・ナノリアクターアレイの構築マイクロディスペンサを集積化させた新規なマイクロリアクターアレイとして,2種類の薬剤濃度の変化させたスクリーニングが可能な3液混合型の2次元マイクロリアクターアレイ,アルギン酸溶液を秤取して微小ゲルを作製し,細胞スクリーニングに利用できるゲルコンパートメントアレイ,2種の液体を様々な比率で簡単に混合することのできる液体交換型のグラジエントアレイを提案し,その性能を実証した。1.物性の異なる各種液体とディスペンシングに適した流路構造およびその操作性の関係の解明PDMSを材料として提案したマイクロチャネルネットワークを作製し,実際に数十ナノリットル数十ピコリットルの微量液体を正確に枝の数だけ並列的に秤取することが可能であることを示した。続いて,その秤取原理を明らかにするために,界面張力,接触角,粘度等の異なる種々の液体に対してディスペンシグを行い,操作圧力,秤取時間,再現性,繰り返し使用の可否等について検討を行った。その結果,濡れにくい液体(接触角が90度以上)では,秤取の際に,細いチャネルの入り口で液体が止まっていたのに対し,接触角が90度以下の濡れやすい溶液では細い流路の出口で止まっていることが明らかになった。このことから,このディスペンサー構造は接触角に拠らずに液体を秤取できる可能性があると考えられた。しかしながら,出口でのバルブ機能は,出口付近の構造や加工精度に強く依存することが示唆されたため,異なる構造を用いた秤取も試みている。また,秤取液体の分割やスラリー状物質の秤取などの応用も試みている。

2.各種表面処理による界面物性の変化が液体操作(ディスペンシング)に与える影響PDMSの表面物性を変化させるために,酸素プラズマ照射,UV照射,酸処理,種々のシランカップリング剤による処理を試みた。その結果,ジメチルオクタデシルシランによる修飾により,安定な気液二相系が構築できることが示された。また,微粒子をウェルに充填することによって流路表面の局所を修飾するという新規な手法も提案した。3.PIV解析による流路内の流動計測操作液体に蛍光微粒子(サブミクロンミクロンオーダー)を混ぜて,その挙動を顕微鏡下で高速度カメラ追跡することにより,流線および流速の流路内でのプロファイルを明らかにできることが示さ,ディスペンサーにも適用を試みた。本研究では,簡便な操作によって多数の微量液体を定量的に扱うことを可能とするマイクロデイスペンサーを開発し,これを並列化してナノリットルからピコリットルの容積のマイクロ・ナノリアクターアレイを構築することを目的としている。本年度は以下の検討を行った。(1)物性の異なる各種液体とディスペンシングに適した流路構造およびその操作性の関係の解明前年度に引き続き,各種スケールおよび形状のディスペンシング構造を試作し,種々の液体のディスペンシグと二液混合の実験を行い,操作圧力,秤取時間,秤取再現性等について検討した。(2)各種表面処理の影響評価材料の表面物性を部分的に変化させるための新規な方法として,高分子微粒子をウェルに集積させた後に,材料表面に融着させる方法を提案しその有効性を実証した。この方法によれば,単に流路に微粒子懸濁液を導入するだけで,その構造に依存して表面の一部を化学的に修飾することが可能であった。(3)PIV解析による流路内の流動計測操作液体に蛍光微粒子を混ぜて,その挙動を顕微鏡下で追跡するPIV解析により,アルギン酸のような高分子溶液を用いた場合,高粘性のために導入に時間を要するものの,秤取が可能であること,一度秤取した液体を,別の液体で置換することができることなどを明らかにした。(4)液体の動的物性の測定本提案のディスペンシング機構に取って重要な液体表面物性として表面張力(気固界面張力)および接触角の測定を,前年度に引き続いて行った。(5)マルチディスペンサーを用いたマイクロ・ナノリアクターアレイの構築マイクロディスペンサーを集積化させた新規なマイクロリアクターアレイとして,アルギン酸溶液を秤取して細胞培養用のゲルコンパートメントアレイを作製するためのデバイス,2種の液体を様々な比率で簡単に混合することのできる液体交換型のグラジエントアレイを提案し,実証した。本研究では,簡便な操作によって多数の微量液体を定量的に扱うことを可能とするマイクロデイスペンサーを開発し,これを並列化してナノリットルからピコリットルの容積のマイクロ・ナノリアクターアレイを構築することを目的とした。本年度の主要な検討結果は以下のとおりである。(1)物性の異なる各種液体とディスペンシングに適した流路構造およびその操作性の関係の解明前年度に引き続き,各種スケールおよび形状のディスペンシング構造を試作し,種々の液体のディスペンシグの実験を行い,操作圧力,秤取時間,秤取再現性等について検討した。本年度は,特に,主流路と枝流路に段差をつけることの有効性を明らかにした。(2)表面局所修飾法の開発本秤取
異常金属の放射光X線非弾性散乱による電子励起の研究

第三世代大型放射光X線が利用できるようになりX線非弾性散乱法が発展し、エネルギー・運動量空間で電子励起状態、格子振動の観測が可能となってきている。我々は、本科研費のサポートを受け、酸化物高温超電導体における電子-格子相互作用の研究を行った。酸化物超伝導体の超伝導発現機構を議論するためには、電子ドープ系とホールドープ系で同じ物理で理解できるのかどうかを明らかにすることが重要である。我々は、電子ドープ系としてNd2-XCeXCuO4(NCCO-系)、ホールドープ系としてYBCO-系、Ca2-XNiXCuO4Br系、さらに低次元で半強磁性スピン1/2系にホールをドープすることで超伝導が出現するSr14-XCaXcu24041で電子励起とその分散関係、ドーピング依存性を観測し、それぞれの比較を行うことで超伝導発現機構を理解する上で重要な情報が得られると考え研究を行った。電子ドープ系では、ハバードギャップ(inter-band transition)に対応する2eVの励起がキャリアーを導入してもゾーンセンターで船名に観測されており運動量が大きくなると急速に消失していく。この様子は、ホールドープ系ではこの励起はほとんど運動量依存性がないのと対照的である。これらの結果は、理論計算と定量的な比較をすることができ、超伝導をもたらしている電子は、金属状態で非常に強く相互作用している「異常金属」状態であることを確認した。最近、ダイヤモンドにボロンをドープすることにより比較的高い超伝導転移温度を示すことが発見され、その超伝導発現機構とさらなる高い転移温度を示すダイヤモンドを作成することが注目されている。そこで我々は、CVDで作成された超伝導ダイヤモンドと日超伝導ダイヤモンドの格子振動をX線非弾性散乱によって運動量依存性の詳細を観測した。この結果、最高エネルギー(160meV)の縦波光学モードが、超伝導体においてゾンセンターで大きくソフト化し、ゾーン境界に向かってソフト化が小さくなっていくこと、ソフト化と格子振動の巾の相関が観測された。これで、ダイヤモンド超伝導は、160meVの縦光学格子振動が超伝導発現に重要な働きをしていることが明らかとなった。強相関電子系物質における電子相関の本質を探ることを目標に、酸化物超伝導体を対象に共鳴非弾性X線散乱によって広い運動量およびエネルギー空間での電子励起状態を直接観察し、これらを理論計算と比較することにより電子相関の定量的な議論を行った。第三世代放射光源の利用によりX線非弾性散乱実験が現実のものとなり、X線は電子と直接相互作用をするためにこのような議論が可能となったものである。実験は、SPring-8の原子力機構の専用ビームラインBL-11XUで行い、電子ドープ系のNd_<1.85>Ce_<0.15>CuO_4(NCCO),ホールドープ系のYB_2Cu_3O_<7-δ>(YBCO)のCuのK-edge共鳴を利用して電子励起状態を観測し、モットギャップの状態がキャリアードーピングでどのように変化していくかを観察した。YBCOではtwin-freeの単結晶を用意しCuO chainとCuO2 planeに帰属される電子励起を分けて議論することに成功し、chainの電荷移動ギャップがplaneのそれより小さいことが明らかとなった。また、NCCOではドーピングしたことによってバンド間励起に加えてバンド内励起も観測することができ、前者はゾーンセンターで約2eVのエネルギーを持ち(π,π),(π,0)の方向に運動量増加に伴ってエネルギーが広がっていく。後者は広がったスペクトルを示し(0,0)から(π,π),(π,0)へと運動量が増加するにしたがって高いエネルギーにシフトしていく分散が観測された。ホールドープ系と比較するとこれらのデータは反強磁性相関の違いがスペクトルに反映されているようである。このスペクトルは、ハバードモデルに基づいた厳密対角化による理論計算において電荷密度揺らぎスペクトルとよい一致を見ることができた。このように理論計算で求められる物理量を直接実験データとして得られることは今後の強相関電子系の研究において大きな意義がある。

これらの結果は、理論計算と定量的な比較をすることができ、超伝導をもたらしている電子は、金属状態で非常に強く相互作用している「異常金属」状態であることを確認した。最近、ダイヤモンドにボロンをドープすることにより比較的高い超伝導転移温度を示すことが発見され、その超伝導発現機構とさらなる高い転移温度を示すダイヤモンドを作成することが注目されている。そこで我々は、CVDで作成された超伝導ダイヤモンドと日超伝導ダイヤモンドの格子振動をX線非弾性散乱によって運動量依存性の詳細を観測した。この結果、最高エネルギー(160meV)の縦波光学モードが、超伝導体においてゾンセンターで大きくソフト化し、ゾーン境界に向かってソフト化が小さくなっていくこと、ソフト化と格子振動の巾の相関が観測された。これで、ダイヤモンド超伝導は、160meVの縦光学格子振動が超伝導発現に重要な働きをしていることが明らかとなった。
高等担子菌類ミトコンドリアゲノムの全構造の解明

高等担子菌類ミトコンドリアゲノムの全体構造や遺伝子の構造・機能に関する分子遺伝学的知見は極めて少ない。本研究は、高等担子菌類の一種、ヒラタケPleurotus ostreatusミトコンドリアゲノムの全体構造と本菌自然集団で認められた極めて高い程度の制限酵素断片長多型(RFLP)の基礎の解明を目的に、2種類(517株および286株)の本菌ミトコンドリアゲノムの全塩基配列を決定した。その結果、両ゲノムDNAはそれぞれ71,948および72,466塩基対からなる環状分子で、両ゲノムの塩基組成にはA+T含量が73%を越える極端な偏りが認められた。517株ゲノムの塩基配列に対するBLASTやtRNA-scanプログラムを用いた検索により合計55個の遺伝子(2個のリボソーム遺伝子、26個のtRNA、14個の既知蛋白質遺伝子、イントロンorfを除いた13個の機能未知orf)の配列が同定された。本菌ミトコンドリアゲノムの遺伝容量は菌類で報告されているものとほぼ同じであると考えられた。同定されたtRNAの数はミトコンドリア蛋白質の合成を行うためには十分でなく、ミトコンドリアゲノムで検出できなかったtRNAは核ゲノムにコードされているものと思われる。517株と286株のミトコンドリアゲノム構造を比較したところ、同定された遺伝子数とその並び順および読み枠の方向に差は認められなかった。しかしながら、塩基配列レベルの比較においては複数の小規模な挿入/欠失や点変異が遺伝子間領域を中心に認められ、新たな制限酵素切断点の生成につながっているものも認められた。さらに、1kb以上の大規模な挿入/欠失が遺伝子間領域において、また、遺伝子内領域においては異なるイントロン配列の有無として認められた。とくにそれぞれのゲノムに保有されるイントロン配列の差異が両ゲノムで認められたRFLP生成の主たる基礎になっていることが示された。高等担子菌類ヒラタケの自然集団は多様性に富むミトコンドリアゲノムを保有している。しかしながら、その多様性の遺伝学的および育種的意義については明らかでない。本研究では、ヒラタケミトコンドリアゲノムの多様性に関する分子遺伝学的知見を得るため、ヒラタケ517株のミトコンドリアゲノムを材料として、全一時構造の解析を進めた。塩基配列の解析を制限酵素切断点地図に基づいて進めるため、制限酵素BamHI、EcoRI、EcoRVおよびPstIの切断点をもつ断片をできる限りクローニングし、その中で3kbを越えるクローンについては欠失処理等を行って、できるだけ低分子サイズのサブクローンを調整した。その結果、全体の60%近くの領域をクローン化することができた。クローン化できなかった領域については、その領域の上下流域の塩基配列に基づいてプライマーをデザインし、LA-PCRにより増幅し、直接、解析に供した。以上の調整したDNA試料についてプライマーウォーキング法を取り入れて解析した後、異なるプラスミドクローン間の重複や両端からの解析結果などに基づいて、正確な塩基配列を決定し、アライメントした結果、本菌ミトコンドリアゲノム74.5kbのおよそ85%の領域について塩基配列を明らかにすることができた。決定領域の塩基組成を調べたところ、スエヒロタケのミトコンドリアゲノムで認められた特徴と同様に、アデニンとチミンの含量は全体の75%前後に達することが明らかとなった。現在、塩基配列解析の継続と並行して、解析を終えた領域について、遺伝子領域等を明らかにするための検討を進めている。

高等担子菌類の一種、ヒラタケの自然集団は制限酵素断片長多型(RFLP)に富むミトコンドリアゲノムを保有しているが、その遺伝学的および育種学的意義の理解につながる分子生物学的知見はほとんど得られていない。本研究では、上記のRFLPをヒラタケミトコンドリアゲノムの全体構造に基づいて説明することを第一の目的とし、前年度に引き続き、517株ミトコンドリアゲノムおよび本ゲノムと制限酵素BamHI、EcoRI、EcoRVおよびPstIの切断パターンにおいて顕著なRFLPが観察された286株ミトコンドリアゲノムの全塩基配列を決定した。その結果、517株のミトコンドリアゲノムDNAは71,948塩基対からなり、アデニン+チミンの含量は73%に達することが明らかとなった。決定した塩基配列より合計55個の遺伝子(2個のリボソームRNA遺伝子、26個のtRNA遺伝子、14個の既知タンパク質遺伝子、イントロンのORFを除いた13個の機能未知ORF)の配列が同定された。この遺伝容量は他の菌類で報告されているものと同程度と考えられる。517株と286株のミトコンドリアゲノム構造を比較したところ、同定された既知タンパク質遺伝子数とその並び順および読み枠の方向に差は認められなかった。しかしながら、塩基配列レベルの比較において、遺伝子間領域を中心に多くの小規模な挿入/欠失や点変異が認められ、そのうちのいくつかは新たな制限酵素切断点の生成/消失に関与していた。さらに、大規模な挿入/欠失が遺伝子間領域おいて、また、遺伝子内領域においては内部にLAGI-DADGモチーフをコードするORFを有する可動性イントロンの有無として認められた。それぞれのゲノムに保有されるイントロン配列の差異は両ゲノムで認められたRFLPと深く関わっていることが示された。
トランスポーター発現プロファイルに基づく細胞分化・増殖制御手法

細胞の分化や増殖を決定・進行する上においては様々な因子が関与する。サイトカインのような高分子物質が細胞に作用し、その結果細胞活動が変化する。しかし、実際に細胞が分化・増殖するためには、そのようなシグナルに反応し、栄養性分子等を細胞内に取り込むような細胞活動を行う必要がある。そのような細胞内への物質摂取を調節するのがトランスポータータンパク質であり、その発現は細胞の分化・増殖と密接に関わっているはずである。本研究では、この様なトランスポーター分子の発現プロファイルから疾患原因やその治療法の提唱目的とした。OCTN1(SLC22A4)は有機カチオントランスポーターとして申請者らが見いだしたトランスポーター分子であるが、本分子は関節リウマチ患者やクローン病など自己免疫疾患に分類される疾患を有する患者において遺伝子上に変異が見られることが見いだされ、この様な難知性疾患との関係が示唆されている。本研究では、このようなOCTN1の疾患との関係や生理的役割解析を目的に、その発現調節機構や発現量変動による細胞増殖・分化への影響について検討を行った。その結果、OCTN1は炎症性サイトカインや血液細胞に発現する転写因子であるRUNX1等によって発現調節を受けていることが見いだされた。また、OCTN1の発現が発現する赤血球由来K562細胞において、siRNA手法によりOCTN1の発現をノックダウンすることによって、細胞の分化・増殖が低下した。同時に最近OCTN1の生理的基質として示された抗酸化物質エルゴチオネインの細胞内取り込み活性も顕著に低下した。以上の結果より、OCTN1は炎症時における発現変動が考えられ、またその結果としてエルゴチオネインあるいはその他の低分子化合物の細胞内外物質交換に変動が生じるために、細胞の増殖や分化に異常が生じることが示された。現在、その原因となるOCTN1生理的基質が明確でなく、その同定により難知性疾患の新しい治療法の開発が可能になると期待できる。細胞の分化と増殖を左右する因子としてサイトカインを中心としたタンパク・ペプチド性の生理活性物質がある。しかし、それらが実際に細胞の増殖・分化の調節を引き起こしていくためには、細胞を形成するための低分子栄養物を選択的に摂取したり、増殖・分化過程で生成した不要代謝産物を処理するためのトランスポーターを必要とする。本研究では、トランスポーターの発現が細胞の分化・増殖過程の必要性に応じて変動すると考え、トランスポーターの発現プロファイル変動から細胞が必要とする低分子栄養物の同定を試みた。モデル細胞として、分化・増殖活性の高い血球細胞を用いた。塩基性アミノ酸を輸送するCAT1トランスポーターを欠損したマウスでは貧血を発症することがわかっている。そこで、CAT1に着目し、その基質となるアミノ酸の血球分化に対する影響を調べた。ヒト赤血球への分化を誘導することが可能な細胞株であるK562細胞を用い、ブチレート刺激による赤血球への分化に対するアルギニンの影響を測定した。その結果、アルギニン非存在下で培養した場合、赤血球への分化は消失した。しかし、赤血球以外の血球細胞への分化にはほとんど影響しなかった。さらに、CD34+のマウス造血幹細胞を調製し、その分化を評価したところ、同様にアルギニン非存在下では赤血球への分化の指標となる細胞外抗原は検出されなくなった。また、アルギニン以外のCAT1基質となるリジンやヒスチジンを欠乏させた細胞では、赤血球分化は進行した。以上の結果より、アルギニンが赤血球形成に極めて重要な役割を果たしていることが、トランスポーターの発現プロファイリングによって見いだされた。
ハギア・ソフィア大聖堂を中心とする歴史的建築物の劣化診断法の確立と保全方法の提案

平成9年度の研究成果は,以下のとおりである。1)炭酸化養生したモルタルは気中養生した場合の圧縮強度では約2.33.6倍,引張強度では約1.73.4倍,動弾性係数では約1.82.7倍の値が得られた。炭酸化したモルタルの引張強度は,圧縮強度の約1/81/12程度であることを明らかにした。また細骨材の混入によって脆度係数が小さくなり,粘り強く成ることが分かった。2)炭酸化したモルタルの耐薬品性試験結果,炭酸化促進養生したモルタルが連による劣化を遅らせていることが分かった。さらに凍結融解試験を行った結果では炭酸化促進養生した試験体が耐凍害性に優れていることが分かった。3)部材劣化の原因となる空間内に滞留する湿気について,同様の事例分析と試算からその対策を検討した結果,空間が、密閉されている場合に,主発生源である人体から発生した高湿空気は空間上部に滞留した後結露する可能性が高くこれには動力の必要の無い煙突効果による換気が有望であることが分かった。4)地動加速度が80100Gal程度の地震時の層剪断力係数はイスタンブールの組積造では0.18となり.自重と水平荷重を考慮した構造解析結果,大聖堂は東西・南北両方向とも安全であることが分かった。しかし,300400Gal程度の地震に対しては,東西・南北共危険であることが分かった。5)構造解析の結果,大聖堂の構造的弱点が東側と西側の横断アーチの中間の高さに発生するヒンジにあると推定し,構造保存のためには横断アーチの補強が必要であることが分かった。本研究は、トルコのイスタンブールにあるハギア・ソフィア大聖堂を対象に設定し、1)史料に基づくモルタルの構成材料の容積比の推定、2)材料実験による調合と強度、動弾性係数の関係の把握、3)モルタルの耐薬品性の検討を行った。以下のその成果を示す。1.紀元前1世紀のウィトル-ウィウスの『建築書』によるモルタルの構成材料の容積比が15世紀のアルベルティの『建築論』で追認されていることから、当時使用されていたモルタルの構成材料の容積比を川砂2、消石灰1、レンガ2/3と推定した。2.推定された容積比を中心に36種類の試験体を作成して実験した結果、消石灰量の割合が細骨材量に比べて大きくなれば、また水/消石灰比が小さくなれば圧縮強度が大きくなることが分かった。曲げ強度と引張強度はそれぞれ圧縮強度の約1/2、約1/10であることが分かった。3.レンガ粒径0.6mm未満を混入した試験体は粒径0.6mm以上を混入したものより圧縮強度が大きくなっているが、これは微細分のレンガが試験体内の空隙を埋め組織としては密実になっているためである。このことが既にアルベルティの『建築論』で言及されていることは興味深い。4.消石灰モルタルの動弾性係数は2.04.2x10^3N/mm^2で、コンクリートのヤング係数の約1/101/5であることが分かった。この動弾性係数は、ミナレットの常時微動測定から同定されたヤング係数と良い一致をみた。5.耐薬品性試験として酸性雨(硫酸)と消石灰がもっとも激しく反応する状況(塩酸)を想定し、モル濃度10%の溶液に試験体を浸漬した結果、硫酸による反応ではレンガ粒径1.22.5mm、あるいは2.55.0mmを混入したモルタルが動弾性係数の変化で若干優れていることが分かった。平成8年度の研究成果は,以下のとおりである。1)組積造試験体による実験では,組積造としての強度特性と変形(静弾性係数)に関する検討の結果,レンガ粒径0.6mm未満を混入した試験体の圧縮強度が大きくなること,また,付着せん断強度は圧縮強度の約1/10であることが分かった。

静弾性係数はミナレットの常時微動測定から同定されたヤング係数に良い一致をみた。2)1)の実験で得られた材料定数を用いてハギア・ソフィア大聖堂の水平荷重に対する応答性状を分析した結果,地動加速度80gal程度に相当する中規模地震に対して大聖堂は安全であることが分かった。3)消石灰モルタルとCO_2濃度5%を反応させた中性化試験を行った結果,中性化しない試験体と比べて圧縮強度が1.31.6,引張強度が1.42.3倍の強さであることが分かった。4)耐薬品性は塩酸・硫酸のモル濃度10%溶液をスプレーする方法で行った結果,試験体の表面状態は中性化したものに顕著な劣化が認められた。なお,現在実験は継続中である。5)耐薬品性試験では,本モルタルの強度性状が普通コンクリートの約1/10,イスタンブールの気候条件を考慮して,5-5°Cの凍結融解試験(B法)による試験の結果,中性化したモルタルが耐凍害性に優れていることが分かった。6)天井高さ7mの室で人体発生熱・水分の流動実測を行った結果,冬季の空間密閉時では人体発生水分による結露発生の危険性が高いこと,流体数値計算では,人体周辺の気流と人体発生水分の運搬軌道を明らかにした。また,その効果的な対策の方向性を見出した。7)保全対策として重要な塵埃被害については,エア-シャワー設備などを含む対策案の可能性を検討した。平成9年度の研究成果は,以下のとおりである。1)炭酸化養生したモルタルは気中養生した場合の圧縮強度では約2.33.6倍,引張強度では約1.73.4倍,動弾性係数では約1.82.7倍の値が得られた。炭酸化したモルタルの引張強度は,圧縮強度の約1/81/12程度であることを明らかにした。また細骨材の混入によって脆度係数が小さくなり,粘り強く成ることが分かった。2)炭酸化したモルタルの耐薬品性試験結果,炭酸化促進養生したモルタルが連による劣化を遅らせていることが分かった。さらに凍結融解試験を行った結果では炭酸化促進養生した試験体が耐凍害性に優れていることが分かった。3)部材劣化の原因となる空間内に滞留する湿気について,同様の事例分析と試算からその対策を検討した結果,空間が密閉されている場合に,主発生源である人体から発生した高湿空気は空間上部に滞留した後結露する可能性が高くこれには動力の必要の無い煙突効果による換気が有望であることが分かった。4)地動加速度が80100Gal程度の地震時の層剪断力係数はイスタンブールの組積造では0.18となり,自重と水平荷重を考慮した構造解析結果,大聖堂は東西・南北両方向とも安全であることが分かった。しかし,300400Gal程度の地震に対しては,東西・南北共危険であることが分かった。5)構造解析の結果,大聖堂の構造的弱点が東側と西側の横断アーチの中間の高さに発生するヒンジにあると推定し,構造保存のためには横断アーチの補強が必要であることが分かった。
IL2レセプターβ鎖トランスジェニックマウスを用いたIL2特異的シグナルの解析

IL-2のシグナル伝達に選択的に共役する二次メッセンジャー系および標的遺伝子の同定を目的として,以下の実験を行った.【1】IL-2刺激により活性化する細胞内シグナル伝達遺伝子の解析種々の細胞をIL-2刺激後可溶化し,抗リン酸化チロシン抗体を用いたウエスタン法により,IL-2依存性にチロシンリン酸化をうける細胞内基質を探索した.その結果,ヒトNK様細胞YTSおよびIL-2レセプターβ鎖(IL-2Rβ)を導入したBAF/B03細胞では,IL-2刺激依存的にpp100が共通なリン酸化基質として検出されたが,これまでのところIL-2Rβトランスジェニックマウス由来細胞で同様な結果は得られていない.【2】IL-2刺激に応答する標的遺伝子単離の試みIL-2刺激に対する標的遺伝子を同定するためには,IL-2刺激前後の遺伝子発現の変化を高感度で検出できる実験系が必要である.この目的のため,Okuboらの方法に準じて3′末端特異的cDNAライブラリを作製し,ライブラリのシークエンス解析およびデータベース検索を行っている.本方法でクローニングされるcDNAは3′末端の約250bpを含み,mRNA分子種を区別するに十分な情報を持つ.また,標的遺伝子は出現頻度の変化として同定できる.現在までのところ,IL-2刺激した細胞由来ライブラリの解析には至っていないが,未刺激T細胞由来ライブラリを約400クロン解析した結果,複数の新規遺伝子の候補を得ている.今後IL-2刺激依存性に発現誘導される遺伝子群の同定を行いたい.IL-2のシグナル伝達に選択的に共役する二次メッセンジャー系および標的遺伝子の同定を目的として,以下の実験を行った.【1】IL-2刺激により活性化する細胞内シグナル伝達遺伝子の解析種々の細胞をIL-2刺激後可溶化し,抗リン酸化チロシン抗体を用いたウエスタン法により,IL-2依存性にチロシンリン酸化をうける細胞内基質を探索した.その結果,ヒトNK様細胞YTSおよびIL-2レセプターβ鎖(IL-2Rβ)を導入したBAF/B03細胞では,IL-2刺激依存的にpp100が共通なリン酸化基質として検出されたが,これまでのところIL-2Rβトランスジェニックマウス由来細胞で同様な結果は得られていない.【2】IL-2刺激に応答する標的遺伝子単離の試みIL-2刺激に対する標的遺伝子を同定するためには,IL-2刺激前後の遺伝子発現の変化を高感度で検出できる実験系が必要である.この目的のため,Okuboらの方法に準じて3′末端特異的cDNAライブラリを作製し,ライブラリのシークエンス解析およびデータベース検索を行っている.本方法でクローニングされるcDNAは3′末端の約250bpを含み,mRNA分子種を区別するに十分な情報を持つ.また,標的遺伝子は出現頻度の変化として同定できる.現在までのところ,IL-2刺激した細胞由来ライブラリの解析には至っていないが,未刺激T細胞由来ライブラリを約400クロン解析した結果,複数の新規遺伝子の候補を得ている.今後IL-2刺激依存性に発現誘導される遺伝子群の同定を行いたい.
黄斑疾患の発症機序における網膜幹細胞の関与

中心窩に神経幹細胞が存在するという仮説のもとに,サル眼を用いて神経幹細胞マーカー(Nestin, PAX6, SOX2)の遺伝子発現を網膜各部位で調べた。カニクイザルの中心窩,赤道部,最周辺部の網膜を1mm×1mm摘出しRNAを抽出した。リアルタイムPCR法により各サンプル中の遺伝子発現を定量した。Nestinは中心窩に発現が最も多く,赤道部,最周辺部では少なかった。PAX6は,各部位で差は見られなかった。SOX2は最周辺部に最も発現が高く,赤道部,中心窩にいくにつれて低下した。黄斑部にはNestin陽性の未分化な細胞が多く,種々の黄斑疾患の病態に関与している可能性が示唆された。●サル眼網膜の各部位におけるに幹細胞関連因子のリアルタイムPCR:サル眼球を4眼,摘出後、網膜伸展標本を作製し、最周辺部,赤道部,中間周辺部,黄斑部外側,中心窩の5箇所の網膜を1mm×1mmの大きさに採取し,凍結保存した。その後,リアルタイムPCRを用いて各部位におけるNestin,Ki67,CD44, CD133, Notch1,CyclinD14),Chx10, Ephrin A2, Ephrin A3の発現を免疫組織化学染色により再度検討した。Nestinは2眼では中心窩に発現が最も多かったが,他の2眼ではばらつきが大きく,一定した結果が得られなかった。PAX6については前回と同様に各部位で明らかな差は認めなかった。Sox2についても周辺部から中心窩に向かって発現が減少しており,前回と同様の結果であった。●培養ミュラー細胞におけるヒアルロン酸結合蛋白の発現:培養ミュラー細胞にインスリンとbFGFを添加し,未分化な状態にしたうえで,ヒアルロン酸結合蛋白(CD44),VEGFの発現をウエスタンブロットでみた。その結果,インスリン単独,bFGF単独では両者の発現に大きな変化を認めなかったが,インスリンとbFGFを共にに添加した時に,両者の発現が亢進した。リアルタイムPCRによるサル眼網膜の神経幹細胞関連遺伝子の解析を行った。2.網膜各部位の採取:アカゲザルを安楽死させた後,眼球を摘出し,アイカップを作成し,実体顕微鏡観察下で,網膜の最周辺部,赤道部,中間周辺部,黄斑部外側,中心窩の5箇所から各1mm×1mm平方の網膜を採取し,RNAを抽出した。その後,cDNAの合成:前処理後の各検体についてcDNAを合成した。3.合成したcDNAを鋳型として、リアルタイムPCR反応を目的遺伝子および標準遺伝子に対して行った。4.相対定量値の算出:各サンプルについて、標準遺伝子のQty(SDM)の平均値(Qty Avg.(SDM))を指標に目的遺伝子のQty(SDM)の平均値(Qty Avg.(SDM))を標準化することにより、各サンプル中の目的遺伝子の相対定量値(Rel.Qty(SDM))を算出した。今回はNestin, PAX6, Sox2についてpreliminaryな実験を行い,最周辺部,赤道部,中心窩の3箇所から採取した網膜に対してリアルタイムPCRを施行した。その結果Nestinでは,最周辺部と中心窩が赤道部に比較して発現が高いといった興味深い結果を得た。PAX6については3者で特に差を認めず, Sox2は周辺部から中心窩に向って発現が減少していた。目的)特発性黄斑上膜の病態を生化学的な面から検討する目的で,セリンプロテアーゼの一つであるトリプターゼおよび抗2型コラーゲン抗体との関連について調べる。対象と方法)網膜硝子体疾患の硝子体手術時に硝子体を採取し,トリプターゼ活性を測定した。対象は54例54眼で,疾患の内訳は特発性黄斑円孔14例14眼,増殖糖尿病網膜症14例14眼,特発性黄斑上膜13例13眼,裂孔原性網膜剥離13例13眼であった。トリプターゼ活性は,吸光度分析法を用いて測定した。抗2型コラーゲン抗体は特発性黄斑上膜患者の血清15例を用い,コントロールには白内障手術症例の血清を10例用いた。抗2型コラーゲン抗体の測定にはhuman/monkey anti-type type II collagen IgG assay kitを用いた。結果)

特発性黄斑円孔,増殖糖尿病網膜症,特発性黄斑上膜,裂孔原性網膜剥離の硝子体中のトリプターゼ活性はそれぞれ,0.0146±0.0053, 0.0018±0.0018,0.0166±0.0046, 0.0117±0.0029 mU/mg protein(平均±標準偏差)で,特発性黄斑円孔と特発性黄斑上膜が有意に高値を呈した(p<0.05,Fisher PSLD検定)。抗2型コラーゲン抗体価は,特発性黄斑上膜が56.417 ±35.627 units/mlであったのに対して,コントロールは30.424 ±16.128 units/mlで,特発性黄斑上膜が有意に高値を呈した(p=0.042, Mann-Whitney test.)。結論)特発性黄斑上膜では,硝子体中のトリプターゼ活性上昇が組織の線維化に,血清中の抗2型コラーゲン抗体上昇が網膜硝子体界面の免役反応に関与して膜形成が生じている可能性が示唆された。分子生物学(理由)サル眼の各部位におけるに幹細胞関連因子のリアルタイムPCRの結果,ややばらつきがみられたが,これは採取時の技術の問題と思われる。サル眼摘出後に実体顕微鏡で,網膜の各部位,特に黄斑部を確実に同定しようと試みたが,ややずれが生じている可能性があり,今後はさらに解像度,拡大率の高い顕微鏡を使用する予定である。また,網膜を採取する時のメスの切れ具合によっても,微妙に採取部位がずれる可能性があるので,ディスポのよく切れるメスを使用する予定である。培養ミュラー細胞におけるヒアルロン酸結合蛋白の発現は,予想していた通りの結果が得られたが,今後はインスリンおよびbFGFの濃度を変化させて,ヒアルロン酸結合蛋白およびVEGFの発現をみる予定である。また,その他のサイトカインの発現の変化についても検討する予定である。われわれは網膜の中心窩に幹細胞が存在するのではないかという仮説のもとに,特発性黄斑円孔や特発性黄斑上膜の発症機序に関する研究を継続的に行ってきた。黄斑上膜は中心窩の未分化な細胞がグリア系の細胞に分化増殖した可能性が考えられる。また,特発性黄斑円孔に対する硝子体手術後の経過として,あたかも中心窩の未分化な網膜幹細胞が時間をかけて感覚網膜を構成する各種細胞に分化した後に視機能を獲得しているような印象をうける。我々は,以前にサル眼から得られた黄斑部近傍,黄斑と赤道部の中間部,赤道部,周辺部の切片に神経幹細胞のマーカーであるネスチンによる免疫染色を施行した。その結果,中心窩周囲にネスチン陽性細胞が散見された。また,ネスチン陽性細胞の密度を各部位ごとに比較すると,黄斑部でのみ他の部位と比較して有意に高かった。この結果をもとに今回は,培養ミュラー細胞を用いた実験を行った。これは糖尿病黄斑浮腫がなぜ黄斑部に特異的に生じるのかを解明する目的である。ミュラー細胞を未分化にするためにbFGFとIGF-1を培養液中に添加し,そのうえでミュラー細胞におけるヒアルロン酸結合蛋白の遺伝子発現および蛋白の定量を行った。その結果,未分化になったミュラー細胞はヒアルロン酸結合蛋白を遺伝子レベルおよび蛋白レベルで発現することがわかった。これは,黄斑部にヒアルロン酸が増加して,その結果周囲の水を引きつけて黄斑浮腫が生じているのではないかという仮説を支持する結果と考えられた。今年度は到達することが困難であった下記の実験を主体に行う予定である。●共焦点レーザー顕微鏡による幹細胞関連因子の免疫染色:サル眼球を摘出後、4%パラフォルムアルデヒド溶液を用いて固定する。網膜伸展標本を作製した後、最周辺部,赤道部,中間周辺部,黄斑部外側,中心窩の5箇所におけるNestin,Ki67,CD44, CD133, Notch1 CyclinD14),Chx10, Ephrin A2, Ephrin A3の発現を免疫組織化学染色により検討する。
低分子量G蛋白質Rap2の皮膚創傷治癒における機能解析

Rap2はRasの類縁分子であり、3つのサブタイプ(Rap2A, Rap2B, Rap2C)を持つ。マウスケラチノサイト細胞株であるPam212細胞では、Rap2が細胞間接着部位に発現しており、Rap2の発現を欠く娘細胞株では細胞間接着が緩く疎なコロニーを形成する。Rap2発現を抑制したPam212細胞では集団遊走が促進した。マウス表皮ではRap2B, Rap2Cが主要なサブタイプであった。Rap2Bノックアウト(KO)マウスと野生型同胞では創傷治癒に有意差はなかった。Rap2C KOマウスでは、受傷3日目のみ創縮小が有意に遅延した。Rap2は創傷治癒に機能する可能性がある。低分子量Gタンパク質Rap2は、癌遺伝子rasの産物であるRasの類縁分子であり、3つのサブタイプを持つ(Rap2A, Rap2B, Rap2C)。マウスケラチノサイトモデル細胞株であるPam212細胞では、Rap2Bが主要なサブタイプとして発現しており、その発現はこのケラチノサイトの細胞間接着部位に集積していた。また、Rap2Bの発現を欠くPam212由来娘細胞株(LY, LU)では親株と比較して細胞間接着が緩く疎なコロニーを形成する。RNAiによりRap2BをノックダウンしたPam212細胞では、細胞の集団遊走が促進した。このことからRap2はケラチノサイトの細胞間接着や創傷治癒を制御している可能性があると考えた。Western解析では、マウス表皮で発現しているRap2の主要サブタイプはRap2Bであることが確認された。そこで、Rap2Bノックアウト(KO)マウスを用いて皮膚創傷治癒解析を行った。オスKOマウス5匹、オス野生型同胞を対象として背部に作製した創傷の治癒速度を観察したが、両者に有意差はみられなかった。その理由として、Rap2B以外のサブタイプであるRap2A, Rap2Cが喪失したRap2Bの機能を補完している可能性があるので、創傷部位におけるRap2A, Rap2Cの発現を確認したいと考えている。Rap2A, Rap2CのKOマウスは既に作成済みである。マウス表皮における主要なRap2のサブタイプがRap2Bであることより、Rap2は表皮においてモデル細胞株と同様の機能を有することが推測された。また、Rap2A, Rap2CのKOマウスも作製しており、予定通りの解析が可能であると考えている。Rap2B特異的プローブを用いたin situ hybridizationにより、野生型マウスの表皮ではRap2Bが発現していることが明らかになった。新たに作成したRap2A KOおよびRap2C KOマウスを加えたWestern解析では、マウス表皮で発現しているRap2の主要サブタイプはRap2BおよびRap2Cであることが確認された。Rap2Bノックアウト(KO)マウスにおいてオスKOマウス6匹、同野生型同胞6匹を対象として背部に作製した創傷の治癒速度を観察したが、両者に有意差はみられなかった。また、オスRap2C KOマウスとオス野生型同胞を用いた背部創傷治癒速度を観察中であるが、Rap2B KOマウスの場合と同様に有意差が見られていない。その理由として、欠失したRap2サブタイプ以外のサブタイプが喪失したRap2の機能を補完している可能性があると考えている。マウス表皮における主要なRap2のサブタイプはRap2BとRap2Cであることより、1種類のみでの喪失では機能が補完され、表現型が現れにくいことが推測された。このことから、表皮に発現するサブタイプを全て欠損させたマウスを作成し、解析を継続する。既にRap2A, Rap2CのKOマウスが完成しており、予定通りの解析が可能であると考えている。皮膚創傷治癒におけるRap2の関与を調べる為に、Rap2A, B, Cの各knockout (KO)マウスを作製し、戻し交配9世代まで完成した。Western解析を行った結果、マウス表皮におけるRap2の主要なサブタイプはRap2BとRap2Cであった。前年度までの解析で、Rap2B KOマウスの創傷治癒解析では、KOマウスと野生型同胞との間に創傷治癒過程および速度の有意差はみられず、共に表皮に発現しているRap2Cが喪失したRap2Bの機能を代償しているためではないかと考えた。このため、812週齢のオスRap2C KOマウス6匹と同胞野生型7匹の背部を剃毛し、4mmパンチにより創傷を作成した。当日を0日とし、連日創面積を計測した結果、3日目のみKOマウスで創縮小が有意に遅延した。しかし、他の観察日には創傷治癒に有意差は認められず、創傷治癒速度に差は検出されなかった。

創傷は受傷直後から数時間が「出血凝固期」、受傷数時間から数日が「炎症期」、受傷数日以降に「増殖期」、「成熟期」を経て治癒するとされる。従ってRap2Cは炎症期から増殖期にかけて機能する可能性があるが、表皮にはRap2Bも発現しており、喪失したRap2Cの機能を代償していると思われる。このため、Rap2BおよびRap2Cの両方を欠失させたRap2BCダブルKOマウス解析を試みた。しかし、作製したメスRap2BCダブルへテロマウスは妊娠せず、オスRap2BCダブルへテロマウスには成長遅延がみられ、Rap2BCダブルKOマウスでの解析は行えなかった。現在、表皮特異的なRap2BCダブルKOマウスの作出を試みている。Rap2はRasの類縁分子であり、3つのサブタイプ(Rap2A, Rap2B, Rap2C)を持つ。マウスケラチノサイト細胞株であるPam212細胞では、Rap2が細胞間接着部位に発現しており、Rap2の発現を欠く娘細胞株では細胞間接着が緩く疎なコロニーを形成する。Rap2発現を抑制したPam212細胞では集団遊走が促進した。マウス表皮ではRap2B, Rap2Cが主要なサブタイプであった。Rap2Bノックアウト(KO)マウスと野生型同胞では創傷治癒に有意差はなかった。Rap2C KOマウスでは、受傷3日目のみ創縮小が有意に遅延した。Rap2は創傷治癒に機能する可能性がある。創傷治癒速度に有意差が出ない理由として、個体差による結果のばらつきがあるので、Rap2B KOマウスの解析数を増やして更に検討したい。創傷治癒過程におけるケラチノサイトの変化をみるために、創傷治癒経過に応じた病理組織を観察し、表皮伸張の差異を検討する。また、Rap2B KOマウス表皮の創傷治癒過程において発現が増加しRap2Bの機能を補完しているサブタイプを特定し、必要があればダブルKO、トリプルKOを作製して検討したい。創傷治癒速度に有意差が出ない理由として、サブタイプ間の相互補完が挙げられるので、Rap2BCダブルKOマウスを作成して更に検討したい。また、創傷治癒過程におけるケラチノサイトの変化をみるために、創傷治癒経過に応じた病理組織を観察し、表皮伸張の差異や発現分子の違いを検討する。Rap2BCダブルKOマウスの産生や成長に障害が見られる場合は表皮特異的Rap2BCダブルKOマウスを作出し、創傷治癒過程を検討したい。皮膚科学Western解析の結果、マウス表皮におけるRap2の主要サブタイプがRap2Bであることが明らかになったため、オスRap2B KOマウスとオス野生型同胞で創傷治癒速度を計測したが、有意差が見られなかった。その理由として、Rap2B以外のサブタイプであるRap2A, Rap2Cが喪失したRap2Bの機能を補完している可能性を考えた。以上の理由のため、Rap2A, Rap2C KOマウスの戻し交配をRap2B KOマウス増産(創傷からの検体採取や新生仔からのケラチノサイト初代培養実験)より優先したため、当初予定よりもマウス飼育数が減少し、次年度使用額が発生した。Rap2B KO
慢性心不全患者に対する睡眠時無呼吸の早期発見と精神的健康の向上を目指した検討

超高齢社会の進展に伴い我が国では慢性心不全患者が増加している。慢性心不全患者は入院を繰り返すことで様々な生活上の制限を受け安楽や精神的健康が徐々に低下していく。さらに、慢性心不全患者においてしばしば睡眠時無呼吸がみられ、これも心不全急性増悪による再入院率を高める。睡眠時無呼吸は一般集団にてうつ病の発症など精神的健康にも悪影響を及ぼすことが示されている。しかし、多くの慢性心不全患者は睡眠時無呼吸特有の症状を訴えないため見逃されている。本研究では睡眠時無呼吸による低酸素血症に着目し、慢性心不全患者を対象とし1睡眠時無呼吸の簡便な早期発見法の構築と2低酸素血症の蓄積と精神的健康との関連を検討する。
SN38長時間低濃度曝射における放射線との相互殺細胞効果に関する検討

SN-38長時間低濃度曝射における放射線との相互殺細胞効果に関して、腫瘍および急性反応正常組織の細胞を対象とする実験としてChinese hamstar V79cellを用いて行った。ヒトにおける、塩酸イリノテカン100mg点滴静注直後から72時間後までのSN-38の血中濃度である0.05μg/ml、0.02μg/ml、0.005μg/ml、0.002μg/mlの濃度で、実験を行った。SN-38の濃度-反応曲線は下に凸を、作用時間-反応曲線は、3相性を示した。この結果は、先の高濃度を中心に行った実験結果と一致した。これらの結果から実験は、0.02μg/ml、8時間曝射の条件で行うことにした。放射線とのSequential treatmentで薬剤曝射すると、薬剤曝射開始直後から曝射8時間後まで等しく強い殺細胞効果を認めた。この結果から、薬剤曝射4時間後に放射線照射を行うタイミングでGraded doseの照射を行った。nは、4.6→2.1、D0は、2.8→2.0と変化した。以上から、0.02ug/m、8時間曝射という長時間低濃度曝射においても相補的な殺細胞効果がありかつ、その併用タイミングは曝射いずれでも同じであった。このことは、臨床において、塩酸イリノテカンと放射線照射を併用する上で重要な知見と思われる。