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重金属輸送性P型ATPアーゼにおける基質選択性およびその反応サイクルの構造的基盤

生体内の銅ホメオスタシスを担う銅輸送性P型ATPアーゼの反応サイクルの構造的基盤を明らかにすべく、高度好熱菌T.thermophilus HB27由来銅輸送性P型ATPアーゼCopB(TtCopB)のX線結晶構造解析を試みた。しかしながら、現在のところX線結晶構造解析に耐えうる結晶は得られていない。そこで、米国オレゴン健康科学大学のEric Gouaux博士の研究室に渡航し、GFP-FSEC法による発現トライアル法を習得した。GFP-FSEC法は短期間かつ比較的低コストで結晶化に適した目的遺伝子の同定を可能とする手法である。また、前年度から引き続き、生体内のMg^<2+>ホメオスタシスに関わるMg^<2+>輸送体MgtEのの高分解構造およびそれに基づく機能解析を推進した。その結果、現在までに2.9Å分解能での構造決定に成功している。これにより、以前のMg^<2+>結合部位に加えて、新たなMg^<2+>結合部位の存在が明らかとなった。これらMg^<2+>結合部位変異体に対する電気生理学的解析および限定分解実験による生化学的解析から、MgtEが細胞質中のMg^<2+>濃度依存的にその輸送が制御されるMg^<2+>チャネルであり、細胞質ドメインへの協調的なMg^<2+>結合によって輸送体の閉状態が安定化されることが明らかとなった。これは、2007年に本特別研究員が発表した結晶構造から示唆されたMgtE細胞質ドメインによるMg^<2+>輸送制御機構を支持するものである。以上の結果について、誌EMBO Journalに発表した。生体内の銅ホメオスタシスを担う銅輸送性P型ATPアーゼの反応サイクルの構造的基盤を明らかにすべく、高度好熱菌T.thermophilus HB27由来銅輸送性P型ATPアーゼCopB(TtCopB)のX線結晶構造解析を試みている。まず、大腸菌にTtCopBを大量発現させ、その菌体から膜画分を調製し、界面活性剤ドデシルマルトシドを用いて、687残基から成る目的タンパク質の可溶化を行った。その後、ニッケルカラムによるアフィニティー精製およびゲルろ過クロマトグラフィーを行い、結晶化に適した単一ピークとして精製することができた。TtCopBの様々な反応中間体におけるX線結晶構造解析を行うべく、重金属イオンが結合したEl・Cu^+/Cu^<2+>/Ag^+、リン酸の転移直後のE1P・ADP、重金属イオン非存在下でリン酸が結合したE2P、重金属イオン非存在下でリン酸が解離した状態であるE2という4つの基本状態のうち前者3状態の結晶化を行った。また、生体内の重金属ホメオスタシスに関連する重金属輸送体ZitBの細胞質ドメインの結晶構造解析に成功し、重金属ホメオスタシス機構の一旦を明らかにし、現在その成果について論文執筆中である。また、前年度の修士課程までに行った細胞内のマグネシウムホメオスタシスに関わるMg^<2+>輸送体MgtEのX線結晶構造解析の研究成果を論文にまとめ、英国科学誌「Nature」に発表した。TtCopBの様々な反応中間体におけるX線結晶構造解析を行うべく、重金属イオンが結合したE1・Cu^+/Cu^<2+>/Ag^+、リン酸の転移直後のE1P・ADP、重金属イオン非存在下でリン酸が結合したE2P、重金属イオン非存在下でリン酸が解離した状態であるE2という4つの基本状態のうち前者3状態の結晶化を行った。また、前年度にその結晶構造についての論文を発表しているMg^<2+>輸送体MgtEの分子動力学シミュレーションの研究成果を論文にまとめ、米国科学誌「Proceedings of the National Academy of Sciences」に共著論文として発表した。

その結果、現在までに2.9Å分解能での構造決定に成功している。これにより、以前のMg^<2+>結合部位に加えて、新たなMg^<2+>結合部位の存在が明らかとなった。これらMg^<2+>結合部位変異体に対する電気生理学的解析および限定分解実験による生化学的解析から、MgtEが細胞質中のMg^<2+>濃度依存的にその輸送が制御されるMg^<2+>チャネルであり、細胞質ドメインへの協調的なMg^<2+>結合によって輸送体の閉状態が安定化されることが明らかとなった。これは、2007年に本特別研究員が発表した結晶構造から示唆されたMgtE細胞質ドメインによるMg^<2+>輸送制御機構を支持するものである。以上の結果について、誌EMBO Journalに発表した。
遺伝子多型に合わせた栄養教育法による骨粗鬆症予防効果

骨粗鬆症を予防するためには、若年期に最大骨量(ピーク・ボーン・マス)をできるだけ高めることが重要である。本研究では若年者の食生活に対する意識および栄養摂取状況、さらに骨代謝関連遺伝子の多型と栄養摂取状況との関連について検討を進めた。そして、朝食摂取の有無と体脂肪、栄養素摂取量との関連など、今後の骨粗鬆症予防のための若年者に対する栄養教育のための有用なデータを得ることができた。【研究の目的】骨粗鬆症予防のためには、若年期に最大骨量(ピーク・ボーン・マス)をできるだけ高めておくことが重要である。骨量は、一塩基多型などの遺伝因子と食生活などの環境因子の相互作用によって決定される。近年の研究から、骨粗鬆症の発症リスクが高い遺伝子タイプを持っていても、食生活を改善することで骨代謝を改善できる可能性が示されている。つまり、遺伝子タイプ別の栄養教育により食生活の改善へ導くことで、将来の骨粗鬆症予防できるのではないかと考えられるようになってきた。そこで本研究では、若年者への骨粗鬆症予防のための遺伝子多型にあわせた栄養教育について検討することを目的とした。本年度は、若年者の食生活状況、骨量などの身体状況の現状を把握し、栄養教育方法を検討するためのデータを得ることを目的とした。【実施方法】20歳代男性および女性を対象とした。食生活および生活状況調査は自記式調査票を用いて調査した。栄養素等摂取状況の把握は3日間の食事記録を用いた。身長、体重、体脂肪率を測定し、さらに超音波骨量測定器を用いて右足踵の超音波伝播速度(speed of sound : SOS)、超音波透過指標(transmission index : TI)、音響的骨評価値(osteosono assessment index : OSI)を測定した。また、オステオカルシン、非Gla化オステオカルシンなどの血中骨代謝マーカーも測定した。今後、栄養素摂取状況と骨代謝状況との関連についてさらに詳しく解析を進めていく。骨粗霧症の予防には、若年期に最大骨量(ピーク・ボーン・マス)をできるだけ高めておくことが重要である。骨量は、一塩基多型(SNP)などの遺伝因子と食生活などの環境因子の相互作用によって決定される。つまり、遺伝子タイプ別の栄養教育により食生活の改善へ導くことで、将来の骨粗霧症予防できるのではないかと考えられるようになってきた。アルカリホスファターゼ(ALP)は、リン酸エステルを無機リン酸とアルコールに加水分解する反応を触媒する酵素で、骨組織に存在する臓器非特異型ALP(TNSALP)は、石灰化との関連が深い。TNSALP遺伝子の787T>C(Tyr246His)多型が機能的SNPであり、その骨密度への影響は、加齢により顕著になることが報告され、骨粗鬆症の発症において重要な遺伝子であることを示されている。そこで本研究では、若年者への骨粗鬆症予防のための遺伝子多型にあわせた栄養教育のためのデータを得るために、TNSALP遺伝子多型787T>C(Tyr246His)と骨代謝マーカーおよび栄養摂取状況の関連について検討を進めた。20歳代男性および女性を対象とした。食生活および生活状況調査は自記式調査票を用いて調査し、栄養素等摂取状況の把握は3日間の食事記録を用いた。身長、体重、体脂肪率を測定し、超音波骨量測定器を用いて右足踵の骨量測定を行った。また、血清カルシウム、リン値を測定し、骨型アルカリホスファターゼ(BAP)、オステオカルシンなどの骨代謝マーカーを測定した。さらに、TNSALP787T>C遺伝子多型のタイピングなどを行った。今後、TNSALP787T>C遺伝子多型のTT型、TC型、CC型のそれぞれのタイプごとに、栄養素摂取状況と血清リン値やBAP値などの骨代謝との関連についてさらに詳しく解析を進めていく。骨粗鬆症は、低骨量と骨組織の微細構造の異常を特徴とし、骨の脆弱性が増大し、骨折の危険性が増加する疾患と定義されている。高齢期での骨粗鬆症を予防するためには、若年期に最大骨量(ピーク・ボーン・マス)をできるだけ高めておくことが重要である。骨量は、一塩基多型(SNP)などの遺伝因子と環境因子の相互作用により決定されると考えられているが、いまだ明らかにされていない点が多い。アルカリホスファターゼ(ALP)は、リン酸エステルを無機リン酸とアルコールに加水分解する反応を触媒する酵素であり、骨組織に存在する臓器非特異型ALP(TNSALP)は、石灰化との関連が深い。TNSALP遺伝子の787T>C(Tyr246His)多型が、その骨密度に影響を及ぼし、骨粗鬆症の発症において重要な遺伝子であることを示されている。

そこで本研究では、若年者への骨粗鬆症予防のための栄養教育のためのデータを得るために、若年者の食生活および栄養摂取状況、TNSALP遺伝子多型787T>C(Tyr246His)と骨代謝マーカーとの関連について検討を進めた。20歳代男性および女性を対象とした。食生活および生活状況調査は自記式調査票を用いて調査し、栄養素等摂取状況の把握は3日間の食事記録を用いた。身長、体重、体脂肪率を測定し、超音波骨量測定器を用いて右足踵の骨量測定を行った。また、血清カルシウム、リン値を測定し、骨型アルカリホスファターゼ(BAP)、オステオカルシンなどの骨代謝マーカーを測定した。さらに、TNSALP787T>C遺伝子多型のタイピングなどを行った。そして、TNSALP787T>C遺伝子多型のTT型、TC型、CC型のそれぞれのタイプごとに、血清リン値やBAP値などの骨代謝との関連について解析を進めた。さらに、食生活状況(朝食摂取状況や外食摂取頻度など)と体組成などとの関連についても検討を進め、今後の栄養教育を実施するための有用なデータを得ることができた。
ゼブラフィッシュ生殖細胞形成に関与する母性mRNAの安定性制御機構の研究

本年度は、ゼブラフィッシュ初期発生過程における母性mRNA産物の転写後制御機構に関して研究を行い、以下の知見を得た。1、microRNA miR-430によるnanosl mRNAの転写後制御機構前年度までの結果から、ゼブラフィッシュ初期発生過程において生殖細胞形成に必須な遺伝子nanoslがpoly(A)鎖長の制御を受けることが示唆されていたので、本年度はさらにその解析を行った。その結果、nanoslの3'UTR中にpoly(A)鎖長の短縮およびタンパク質合成の抑制を誘導する配列を見いだした。さらに、この配列に結合する因子としてmicroRNA miR-430を同定した。microRNA(以下、miRNA)は、約20塩基のタンパク質をコードしていないRNAの総称であり、自身の配列(おもに5'末端)と相補的な配列を持つmRNAに結合し、そのmRNAの翻訳抑制・分解を促進する。このことから、nanosl mRNAはmiRNAによって受精後に体細胞中では分解・翻訳抑制されることが明らかとなった。一方、nanosl mRNAは生殖細胞になる細胞ではmiRNAによる抑制を回避する配列を3'UTR中に有していた。このことから、ゼブラフィッシュ初期発生過程ではmiR-430による体細胞でのnanosl mRNAの抑制と、生殖細胞におけるmiR-430による抑制を回避によって体細胞-生殖細胞の違いが確立されることが強く示唆された。また、miRNAが標的mRNAのpoly(A)鎖を短縮する活性があることを初めて見いだした。2、miR-430による母性mRNAのpoly(A)鎖の短縮機構上述の結果は、miRNAの作用機序としてpoly(A)鎖の短縮が重要かつ普遍的な役割を果たしていることが予測される。そこで、ハーバード大学の研究室と共同研究を行い、miR-430の標的遺伝子の網羅的な解析を行った。その結果、miR-430は100以上の母性mRNAのpoly(A)鎖の短縮と、分解に関わっていることが明らかとなった。これらの結果についてはScience誌に発表した。本年度は、ゼブラフィッシュ生殖細胞形成過程におけるnanosl mRNAの3'UTRを介した転写後制御機構に関して以下の知見を得た。これまでの研究から、ゼブラフィッシュ1細胞期にpoly (A)なしのGFP-nanosl 3'UTR mRNAを導入すると生殖細胞特異的に安定化され、体細胞では分解されることがわかっている。一般にmRNAの安定性は5'CAP構造とpoly (A)鎖長が重要な役割を果たすことが知られているため、nansol 3'UTRを介した安定性制御も細胞質におけるpoly (A)鎖長の制御によるものである可能性が考えられる。つまり、体細胞ではpoly (A)鎖の伸長がおこらない結果、分解される可能性がある。この可能性を検証するため、GFP-nanosl 3'UTR mRNAの3'末端に150塩基程度のpoly (A)鎖をあらかじめ付加したmRNAのinjection実験を行った。in situ hybridization法により導入したmRNAの挙動を検討した結果、予備的ではあるが体細胞での分解にpoly (A)鎖の有無による差はないとの知見を得た。このことから、nanosl mRNAの体細胞における分解制御機構はpoly (A)鎖長の制御に依存しないことが示唆された。今後はノザン法により詳細に解析する必要があると考えている。2、トランス因子候補DAZLタンパク質の機能解析前年度までに、DAZLタンパク質がnanosl 3'UTRを介して遺伝子発現を正に制御するという知見を得ている。この制御機構を解析する第一歩として、ゼブラフィッシュ1細胞期へのmRNA injectionによるルシフェラーゼアッセイを行い、活性化を定量的に測定することを試みた。その結果、Dazlはnanoslの3'UTRを介して遺伝子発現を2倍程度活性化することがわかった。またDAZLタンパク質の生殖細胞内の局在をGFP融合タンパク質により検討し、DAZLタンパク質は生殖細胞内でRNA-タンパク質複合体として顆粒状に局在する可能性が示唆された。本年度は、ゼブラフィッシュ生殖細胞形成過程におけるnanos1 mRNAの3'UTRを介した転写後制御機構に関して5'cap構造とpolyA鎖を介した制御に着目して研究を行い、以下の知見を得た。1、nanos1 mRNAの安定性制御における5'cap構造の役割近年、3'UTRなどのシス配列を介して特異的に結合する因子が、5'capやpolyA鎖、エキソン連結部位など一般的なmRNA構造に結合する複合体と協調的に作用することで、様々な転写後制御を行なっていることが示唆されている。このような知見を鑑み、nanos1 3'UTRを介した生殖細胞特異的なmRNA安定化機構について、5'cap構造の必要性を検討した。通常のm7Gcapは、RNAの5'末端の保護と、キャップ結合因子の足場としての二つの役割を有している。そこで、5'末端の保護の機能を損なうことなく、キャップ結合因子の結合を阻害するために、人工的に作成された偽キャップ構造を持つレポーターmRNAを作成し、生殖細胞における安定性を検討した。その結果、偽キャップを持つレポーターmRNAは、生殖細胞特異的な安定化を受けないことを明らかにした。内在性nanos1 mRNAのpoly(A)鎖長の変化について検討を行い、予備的ながら受精後にnanos1 mRNAのpoly(A)鎖長が変化することを見いだした。このことから、nanos1 mRNAの安定性制御はpoly(A)鎖長の変化を介して行われることが示唆された。

生殖細胞内におけるnanos1 mRNAの局在を検討したところ、nanos1 mRNAは核膜近傍に顆粒状に局在することを見いだした。また、発生のある段階において、生殖細胞特異的RNAヘリケースであるVASA蛋白質と共局在することを見いだした。本年度は、ゼブラフィッシュ初期発生過程における母性mRNA産物の転写後制御機構に関して研究を行い、以下の知見を得た。1、microRNA miR-430によるnanosl mRNAの転写後制御機構前年度までの結果から、ゼブラフィッシュ初期発生過程において生殖細胞形成に必須な遺伝子nanoslがpoly(A)鎖長の制御を受けることが示唆されていたので、本年度はさらにその解析を行った。その結果、nanoslの3'UTR中にpoly(A)鎖長の短縮およびタンパク質合成の抑制を誘導する配列を見いだした。さらに、この配列に結合する因子としてmicroRNA miR-430を同定した。microRNA(以下、miRNA)は、約20塩基のタンパク質をコードしていないRNAの総称であり、自身の配列(おもに5'末端)と相補的な配列を持つmRNAに結合し、そのmRNAの翻訳抑制・分解を促進する。このことから、nanosl mRNAはmiRNAによって受精後に体細胞中では分解・翻訳抑制されることが明らかとなった。一方、nanosl mRNAは生殖細胞になる細胞ではmiRNAによる抑制を回避する配列を3'UTR中に有していた。このことから、ゼブラフィッシュ初期発生過程ではmiR-430による体細胞でのnanosl mRNAの抑制と、生殖細胞におけるmiR-430による抑制を回避によって体細胞-生殖細胞の違いが確立されることが強く示唆された。また、miRNAが標的mRNAのpoly(A)鎖を短縮する活性があることを初めて見いだした。2、miR-430による母性mRNAのpoly(A)鎖の短縮機構上述の結果は、miRNAの作用機序としてpoly(A)鎖の短縮が重要かつ普遍的な役割を果たしていることが予測される。そこで、ハーバード大学の研究室と共同研究を行い、miR-430の標的遺伝子の網羅的な解析を行った。その結果、miR-430は100以上の母性mRNAのpoly(A)鎖の短縮と、分解に関わっていることが明らかとなった。これらの結果についてはScience誌に発表した。
《山本憲関係書簡》に残る康有為の従兄康有儀等の手紙からみた近代日中交流史の特質

「山本憲関係資料」には、清末の変法派が山本憲に送った非常に多くの書簡があり、それらは近代の日中文化交流史のための貴重な史料である。本研究では、その変法派人士の書簡等について翻刻と現代日本語訳および解題・注を完成させた。また、山本に手紙を送った清人の多くは、1897年に山本が訪清した際面談した者であり、そのため、その漢文の旅行日記『燕山楚水紀遊』についても現代日本語訳・注・解題及び種類の索引を作った。【1】実際の研究に用いる複製版資料の作成○《山本憲関係書簡》の内、本研究主題に関係する書簡約450点を選定し、それらを専門の会社に依頼して一点ずつデジタル撮影し、それをもとに複製版を作成した。規格は、2000万画素でRAWデータ・約30MB、オリジナルデータTIFF16bit・約150MB、活用データJPEG・約5MB、PDF・5MB、約2000コマを撮影した。内、▼中国人の書簡(約280通)は、変法派の領袖の親書(約250通):汪康年、梁啓超、王照、康有為、羅振玉、葉瀚等著名な変法派人士の親書。:山本憲の漢学塾(梅清処塾)に学んだ康有為の従兄「康有儀」をはじめとする中国人門生の親書(約220通)▼他方、日本人の書簡は、中国人との交流に向かわせた山本憲自身の思想的前提、その交流を支えた人的ネットワークの核心部分に限定する観点から、自由民権運動家の書簡、「大阪事件」関係文書、その他山本の代表的著作『燕山楚水紀遊』・『東亜事宜』等80点を撮影した。【2】書簡の楷書による復元▼中国人の書簡:殆ど全て草書・行書で書かれているため、吉尾寛と研究分担者周雲喬、ならびに研究協力者数名が、まずそれぞれの問題関心に沿って、随意に解読作業に入った。書法等の関係図書を活用して「康有儀」の書簡(スタートの本年度は約60通)の復元から着手する。楷書体で復元した書簡の内容は、中国近代史を専門とする23名の研究協力者が評価し、必要に応じて、従前より応募者が当該《書簡》の読解に関して指導を仰いできている専門家等を招聘して教示を乞う。▲日本人の書簡については、中国人書簡の梗概が判明した後進めることとし、本年度は着手を見送った。1)前年度に引き続いて、『山本憲関係資料目録』(高知市立自由民権記念館発行)にもとづき、約1300コマをデジタル撮影し、複製資料を作成した。規格は、2100万画素でRAWデータ・約30MB、オリジナルデータTIFF16bit・約150MB、活用データJPEG・約5MB、PDF・5MB。本年度は日本人書簡を中心に撮影した。高知の自由民権運動の研究を専門とする共同研究者の方からご意見等をいただき、具体的には、▼山本憲の家族、父山本竹渓(小野湖山、田中光顕、深尾家、藤沢南岳等からの書簡)、▼山本憲の門生・友人(漢学者、政治家)・親族等(青木晋、伊藤陶山、茨木定興、今井貫一、大井憲太郎、大島常蔵、緒方拙齋、柏岡武兵衛、柏原益次、片岡完二、片岡ふみ、川田瑞穂等)からの書簡、ならびに▼「漢学研究会」、「芸備日々新聞社」(漢詩の添削指導)とのやりとりを記載した書簡を撮影した。本複製物も、当科研の代表者(HD+DVD)、分担者(DVD)、協力者(DVD)、高知市立自由民権記念館(HD+DVD)、顧問(DVD)、ならびにご遺族(HD+DVD)のもとに置くとともに、自由民権記念館において研究者が本資料を基本的に自由に閲覧・複写できることに供した。2)同じく、前年度に引き続き、安徽大学歴史系との研究交流を進めた。とくに本年度は、7月に安徽大学歴史系の共同研究者3名を高知大学に迎えて解読作業の現状・課題について意見交換するとともに、高知市立自由民権記念館において康有為書簡の実物等を直接確認した。3)2013年9月より、近代の日中交流史の専門家に新たに共同研究者として加わっていただき、山本憲の代表的著作の一つ『燕山楚水紀遊』の書き下し文・現代日本語訳の作成に専ら従事していただくことにした。1)前年度に引き続いて、『山本憲関係資料目録』(高知市立自由民権記念館発行)にもとづき、約1800コマをデジタル撮影し、複製資料を作成した。規格は、2000万画素でRAWデータ・約30MB、オリジナルデータTIFF16bit・約150MB、活用データJPEG・約5MB、PDF・5MB。内、▼中国人書簡:変法派以外の、山本憲の漢学塾「梅清処塾」の中国人門生の書簡約60通。▼山本憲の代表的著作:『論語私見』(稿本)、『漁樵餘事』等約30点。▼大阪(谷町・天神橋)・岡山(牛窓)における漢学塾の設置・運営・教材等に関する文書。

本複製物も、当科研の代表者(HD+DVD)、分担者(DVD)、協力者(DVD)、高知市立自由民権記念館(HD+DVD)、顧問(DVD)、ならびにご遺族(HD+DVD)のもとに置くとともに、自由民権記念館において研究者が本資料を基本的に自由に閲覧・複写できることに供した。2)2012年6月28日吉尾と分担者周雲喬が安徽大学歴史系を訪問し、改めて作業分担の基本方針について決定した。前年度までの日本側の研究成果を高知大学・安徽大学定期歴史研究会において明らかにするとともに、康有為関係書簡のデジタル複製を提供し、康有為書簡については安徽大学に一任した。3)2013年3月19日、本科研のメンバーに山本憲のご遺族が加わり、岡山県牛窓町牛窓において研究会「牛窓会議」(非公開)を開いた。会では、当年度の解読作業の内容とそれにもとづく考察結果を共有するとともに、山本憲の漢学塾(梅清処塾)があった当地における関係史跡等を調査した。4)2012年11月、顧問の狹間直樹のご紹介により、中国・清華大学国学研究院に「山本憲関係資料」の内、梁啓超書簡の複製(印刷)物を寄贈した。当研究院の梁啓超研究の専門家によっても「山本憲関係資料」の史料的価値の高さは確認された。1.山本憲関係書簡、同著作等の史料のデジタル撮影前年度に引き続いて、『山本憲関係資料目録』(高知市立自由民権記念館発行)にもとづき、約950コマをデジタル撮影し、複製資料を作成した。規格は、2100万画素でRAWデータ・約30MB、オリジナルデータTIFF16bit・約150MB、活用データJPEG・約5MB、PDF・5MB。本年度は日本人書簡を中心に撮影した。顧問の公文豪氏(自由民権運動の専門家)よりご意見等をいただき、具体的には、▼山本憲の著作『燕山楚水紀遊』、『(同)挿絵画帳』『論語私見』、『梅崖処存録』、『漢文教育論』等、▼山本家資料『山本氏系譜』等、▼漢学講学関係『東山左阿弥楼雅集』関係写真等、▼葉書(日本人関係)等々。当科研の代表者(HD+DVD)、分担者(DVD)、協力者(DVD)、高知市立自由民権記念館(HD+DVD)、顧問(DVD)、ならびにご遺族(HD+DVD)のもとに置くとともに、自由民権記念館において研究者が本資料を基本的に自由に閲覧・複写できることに供した。2.本科研内報告会の開催(2014年9月11・12日岡山県牛窓):以下の内容について2011年14年(8月)の作業進捗の報告と今後の作業計画を協議した。1康有儀関係書簡、2王照関係書簡、3汪康年関係書簡、4梁啓超関係書簡、5山本憲著『燕山楚水紀遊』(概要/名勝古蹟での感想/中国人との議論/在華日本人の動きなど)6大隈重信書簡、7梁啓超の『佳人奇遇』翻訳に関する疑義、8伊藤博文宛書簡3.山本憲の墨書・碑文等の牛窓における調査:牛窓郷土史家、瀬戸内市教育委員会の紹介により現存する当該資料を数点確認し、全て保存の重要性を指摘した。「山本憲関係資料」には、梁啓超、康有為、汪康年、王照等々の清末の変法派人士の親書のほか、山本憲の漢学塾「梅清処塾」の門人で、日本に亡命した変法派の連絡役も務めた、康有為の従兄「康有儀」の多数の書簡、そして変法派と関わった日本人の書簡が存在する。本年度は、これまでの分析作業に基づいて、纏まった内容が書かれていた書簡の翻刻と現代日本語訳及び解題・注を分担して完成させた。具体的には、康有儀が85通(呂順長、小野泰教、高橋俊、古谷創)、以下汪康年(吉尾寛、呂)、梁啓超(周雲喬)、康有為(呂、小野)、葉瀚(蒋海波)、王照(大坪慶之)、徐勤(同前)、羅振玉(蒋)、孫カン(周)、梅清処塾の弟子等の書簡(吉尾)、日本人書簡(古城貞吉、小倉久、西山志澄)(公文豪)、合計145通、及び同封文書(吉尾、公文、大坪)である。また、山本に手紙を送った清人の多くは、1897(明治30)年山本憲の訪清の中で面談した者であった。
養護実践力の向上を目指したケースメソッド教育プログラムの開発と評価

本研究の目的は、養護教諭の実践力の向上をめざしたケースメソッド教育プログラムを開発し評価することである。方法は、他の専門分野におけるケースメソッド教育プログラムと研究者間相互観察による研修運営方法の検討により研究課題の探索を行うこと、また、現職養護教諭から養護実践力に必要な課題を抽出し、さらに養護教諭に対するケースメソッド教育を用いた継続研修の実施からそのプログラム評価を行った。結果、ケースメソッド教育の講師には、他の専門分野で実施されているケースメソッド教授法の見学、実際の研修観察記録、研究者間相互評価を含むモニタリングの重要性が示唆された。また、本プログラムは、研修参加者の養護実践キャリアの違いを活かした研修運営方法と討論の仕組みづくりを行うことで養護実践に役立つと評価を得た。本研究は、子どもの健康課題に対応するための実践力の向上を目指し、健康教育をリードする養護教諭に対するケースメソッド教育プログラムを開発し評価することを目的としている。そのパイロット研究としてのH22年度は、養護教諭の多様なニーズに適したケース教材および教授用マニュアルの開発を中心として実施した。具体的には、プログラムを進めるための養護実践力を高めるケース教材の検討を行いながら、既存のケース教材を併用し、現職養護教諭を中心とした養護教育実践とその評価を実施することである。方法として、まず、他の専門分野のケースメソッド教授法に関する情報収集により教育目標の検討、また、ケースメソッド教育による養護教育(研修)実践の研究者間相互観察と事後評価によりその観察記録と事後評価の分析を行った。H22年度の成果として、養護教諭を対象とした7ケース教材・教授用マニュアルの加筆・修正を行った。かつ、他の専門分野のケースメソッド教授法の研修に参加することで研究に必要な技術の習得も行い、国際学会でその実践を報告した。また、養護教育(研修)実践においては、研究者間相互観察記録の質的分析により、チューターの発話内容および発問に関する実践的思考に特徴が認められ、特に、「議論のコントロール」、「議論の積み上げ」、「議論の深化」という受講者の討論の展開過程にかかわっていることが示された。これにより、養護教諭を対象としたケースメソッド教育を実践する機会に限界はあるものの、養護教育実践の記録および観察者による相互評価によるふり返り(モニタリング)によって、ケースメソッド教育において重要な役割を果たすチューター養成に必要な要素についての基礎資料を得た。本研究は、子どもの健康課題に対応するための実践力の向上を目指し、養護教諭に対するケースメソッド教育プログラムを開発し評価することを目的としている。H23年度は、「養護実践力」をキーワードに、ケースメソッド教育プログラムの構成を検討した。方法は、近畿圏現職養護教諭を対象として研究者が講師として企画した「ケースメソッド学習会」に登録した、指導的立場の養護教諭(以下、熟練養護教諭)6名、実務経験の少ない養護助教諭・養護教諭(以下、初任者)20名に対し、継続研修を実施した(平成23年9月平成24年2月)。前年度に開発されたケース教材の中から「発達過程にある子どもの理解」を教育目的としたプログラム構成した。研修はすべて同意を得て記録、参加者による事後評価(アンケート調査)、熟練養護教諭にグループインタビュー調査を行った。さらに、ケースメソッド専門家にコース全体の評価を依頼した。結果、同地域の熟練養護教諭と初任者の混合グループでは「議論の展開」が難しく、初任者だけの同質キャリア集団でのケース討論では養護実践に対する「議論の深化」に課題が残った。ケースメソッド講師の討論の運営スキルのみならず、研修構造の工夫の必要性が認められた。そこで、他の専門分野のケースメソッド指導者セミナーにて情報収集を行い、そこから「2段討論形式」を取り入れることとした。「2段討論形式」とは、初任者(または初任者ケースメソッド講師)の討論が終了したのち、熟練養護教諭(または熟練ケースメソッド講師)の討論を実施する方法である。その結果、討論の深化とともに、討論過程に対する熟練養護教諭による振りかえり(フィードバック)と養護実践に関する発言が、参加者全体の研修満足度のみならず、「学びの共同体」づくりを促進することが認められた。今後、養護実践プログラム評価尺度として検討される必要がある。本研究は、子どもの健康課題に対応するための実践力の向上を目指し、養護教諭に対するケースメソッド教育プログラムを開発し評価することを目的として実施した。最終年度にあたるH24年度は、「養護実践力」「連携」を教育目的としたケースメソッド教育研修プログラムを構成した。本年度は学校組織内外の連携に関する新たなケース教材の開発、さらに、昨年度の成果に基づき、熟練養護教諭と初任者養護教諭間の「2段討論形式」による研修運営を実施しこれを評価した。

対象は、主として近畿圏現職養護教諭を対象に「ケースメソッド学習会」に登録した指導的立場の養護教諭(以下、熟練養護教諭)6名、実務経験の少ない養護助教諭・養護教諭(以下、初任者)40名に対し継続研修を行った(平成24年6月平成25年1月)。研修の記録は参加者の同意を得て、参加者事後評価、熟練養護教諭に対してはグループインタビューによる研修プログラム評価を行った。結果、事後評価から、熟練現職養護教諭の討論が当該参加者だけの討論よりも日常の実践への振りかえりと日常の実践の具体的な活用の可能性が広がったという記述が認められた。熟練養護教諭による研修プログラムの評価の結果、自作ケース教材の作成とその提供までのケースメソッド教育講師との打ち合わせ過程から養護実践に関する洞察を与えられたこと、また、初任者の討論内容から現職養護教諭の研修課題を見出すことができたこと等から、養護実践力の向上に役立つ研修モデルとして評価を得た。以上の成果については、学会発表を行った。本研究の課題としては、特定のコミュニティを対象としたために質的なプログラム評価方法を実施したことがあげられる。汎用性をさらに検証していくことがあげられる。東日本大震災後、研究分担者の負担軽減と連携に支障が発生し、調査・打ち合わせ等の実施遅延等、年度内の研究計画の変更が行われた。24年度が最終年度であるため、記入しない。本研究の本年度(H23年度)の成果を踏まえつつ、最終年度にあわせて研究成果の発表を推進したい。
小児生体肝移植後長期経過症例における移植肝加齢変化の解明-テロメア長による検討-

小児生体肝移植後のグラフト肝の寿命、加齢速度などを知る目的に組織Q-FISH法を用いてグラフト肝の肝細胞テロメア長を測定した。全例でテロメア長の減少はドナーと同等かそれ以上であることが判明した。しかし、完全な免疫抑制剤離脱が可能であった1例ではレシピエントがドナーのテロメア長に比し長い傾向にあり(p=0.056)、レシピエント内でのテロメア長延長あるいは短縮の遅延が起こり得る可能性を示唆した。Telomere-Centromere ratio(TCR)を用いた組織Q-FISHによるテロメア長の測定法は、本研究の共同研究施設である東京都老人総合研究所老人病のゲノム解析研究チームにより様々な臓器で有効性と正確性を確認している(食道、甲状腺、舌、乳腺組織など)。しかし、肝細胞における測定実績がなかったため、測定条件の設定実験からのスタートを余儀なくされた。これらの前実験から、ホルマリン固定でも肝細胞でのテロメア長測定が可能であったが、凍結標本の方が測定に適していることを確認した。さらに、肝組織に適した核染色(DAPI)の条件設定を完了することが可能であった。また、線維芽細胞の安定したCell block作成も完成し、さらに同一プレパラート上に培養細胞Cell blockと肝組織を置き、測定を行うことにより測定結果の正確性、再現性の向上を得ることも可能となった。現在、標本材料の収集とともに測定を行い、すでに9例で結果を得ているが、現在のところドナー年齢(グラフトの実年齢)とグラフト肝テロメア長の間に有意な相関は認めていない(P=0.230,r=-0.445)。また、レシピエント肝機能検査(ALT、DB、ALB、PT-INR、ヒアルロン酸)とレシピエントテロメア長の間にも有意な相関を認めなかった。しかし、レシピエント血小板数とテロメア長の問には強い相関関係を認めており(P=0.025,r=0.731)、今後の考察が重要となる。さらに、これまでの研究でテロメア長に個人差があることが判明しているが、本研究において極端にテロメア長が長い症例(TCR=0.94)と極端に短縮している症例(TCR=0.4)があり、今後の症例数を増やした検討、合併症の有無、あるいはそれらの種類がテロメア長に及ぼす影響などの検討が必要である。Telomere-Centromere ratio(TCR)を用いた組織Q-FISEによるテロメア長の測定法は、本研究の共同研究施設である東京都老人総合研究所老人病のゲノム解析研究チームにより様々な臓器で有効性と正確性を確認している(食道、甲状腺、舌、乳腺組織など)。また、線維芽細胞の安定したCell block作成も完成し、さらに同-プレパラート上に培養細胞Cell blodkと肝組織を置き、測定を行うことにより測定結果の正確性、再現性の向上を得ることも可能となった。現在、標本材料の収集とともに測定を行い、すでに12例で結果を得ているが、現在のところドナー年齢(グラフトの実年齢)とグラフト肝テロメア長の間に有意な相関は認めていない。12例中7例は、レシピエント肝テロメア長とドナー肝テロメア長に有意差を認めず、4例でレシピエント肝のテロメア長が有意に短縮していた。他の1例ではレシピエント肝のテロメア長が有意に長く、今後の症例を増やした検討が必要であると考えられた。また、レシピエント肝機能検査(ALT、DB、ALB、PT-INR、ヒアルロン酸、血小板数)とレシピエントテロメア長の間にも有意な相関を認めなかった。さらに、これまでの研究でテロメア長に個人差があることが判明しているが、本研究において極端にテロメア長が長い症例(Nomlalized TCR=1.13)と極端に短縮している症例(Nomalized TCR=0.27)があり、今後の症例数を増やした検討、合併症の有無、あるいはそれらの種類がテロメア長に及ぼす影響などの検討が必要である。

また、線維芽細胞の安定したCell block作成も完成し、さらに同一プレパラート上に培養細胞Cell blockと肝組織を置き、測定を行うことにより測定結果の正確性、再現性の向上を得ることも可能となった。現在、標本材料の収集とともに測定を行い、すでに12例で結果を得ており、8例でレシピエント肝テロメア長とドナー肝テロメア長に有意差を認めず、4例でレシピエント肝のテロメア長が有意に短縮していた。完全な免疫抑制剤離脱が可能であった1例ではレシピエント肝のテロメア長がドナー肝のテロメア長に比し長い傾向にあり(p=0.056)、レシピエント内でのテロメア長延長あるいは短縮の遅延が起こり得る可能性を示唆した。また、レシピエント肝機能検査(ALT、DB、ALB、PT-INR、ヒアルロン酸、血小板数)とレシピエントテロメア長の間にも有意な相関を認めなかった。さらに、これまでの研究でテロメア長に個人差があることが判明しているが、本研究において極端にテロメア長が長い症例(Normalized TCR=1.13)と極端に短縮している症例(Normahzed TCR=027)があり、今後の症例数を増やした検討、合併症の有無、あるいはそれらの種類がテロメア長に及ぼす影響などの検討が必要であるが、現時点での研究成果の英語論文を作成中である。
新規膜貫通型転写因子の神経組織内小胞体ストレス応答機構の解明

「脳組織における小胞体ストレス応答の細胞種特異性」の全貌解明を目標に、脳組織に発現している新規の膜貫通型転写因子BBF2H7(BBF2 human homolog on chromosome 7)の機能解析を行った。以下の内容を、研究成果として雑誌論文に発表した。我々は、新規の小胞体ストレストランスデューサーBBF2H7を同定した。BBF2H7は、構造的にOASISと相同性が高いCREB/ATFファミリーに属する転写因子の1つで、bZIP(basic leucine zipper)ドメインおよび膜貫通ドメインを保持し、小胞体膜を貫通している。BBF2H7は、小胞体ストレスに反応して膜内切断を受ける。切断されたbZIPドメインを有する細胞質側のN末断片は、核内に移行し、サイクリックAMP応答配列(CRE)に作用することで、標的遺伝子の転写を活性化する能力をもつ。興味深いことに、BBF2H7蛋白質は、通常の状態では発現がみられないが、小胞体ストレス時においてのみ翻訳レベルでの急激な発現上昇がみられる。この結果は、BBF2H7がUPRシグナリングにおける後期においてのみ機能する可能性を示唆する。また、in vivoにおいて、BBF2H7タンパク質は、中大脳動脈永久閉塞モデルマウスの脳梗塞ペヌンブラ領域において神経細胞に強く発現しており、神経細胞において脳虚血時に生じる異常タンパク質蓄積の回避に重要な役割を担っていることが示唆された。アストロサイトで機能するOASIS、神経細胞で機能するBBF2H7の発見を通じて、世界に先駆けて「脳組織における小胞体ストレス応答の細胞種特異性」という概念を提示した。「脳組織における小胞体ストレス応答の細胞種特異性」の全貌解明を目標に、脳組織に発現している新規の膜貫通型転写因子BBF2H7(BBF2 humanhomolog on chromosome 7)の機能解析を行った。BBF2H7は、構造的にOASISと相同性が高いCREB/ATFファミリーに属する転写因子の1つで、bZIP(basic leucinezipper)ドメインおよび膜貫通ドメインを保持し、小胞体膜を貫通している。
動物の異物認識とタンパク質濃度変化について

本研究ではアフリカツメガエルの大腸菌に対する異物認識とタンパク質の濃度変化を調べることを目的とした。さらに、本研究を通して大半の高校生がタンパク質を栄養素の一種としか捉えていない現状を変え、生理活性を持ったタンパク質が多く存在することを知ることを通して、タンパク質の重要性を知ってもらうことも大きな目的である。大腸菌注射により血中タンパク質の濃度の経時的変化をSDS PAGEの各バンドの濃さを測定ことによって調べた。次に、抗菌タンパク質の単離をするために精製法の確立を試みた。高等学校において、FPLCやHPLC等の液体クロマトグラフィーのような高額な設備はないので、電気泳動の原理を活用した精製法の開発を試みた。まず、材料として卵白を用いて、LB寒天培地中で培養した枯草菌に対する抗菌活性を指標に、NATIVE PAGE後のゲルから自作の抽出装置を用いて抗菌タンパク質を抽出し精製を進めた。結果として抗菌タンパク質リゾチームの精製に成功した。さらに、この方法を用いて、大腸菌皮下注射後のアフリカツメガエル血中から抗菌タンパク質の精製を試みた。3種のタンパク質の血中濃度が大腸菌注射によって、注射3日目をピークに増加することが明らかになった。これらのタンパク質はSDS電気泳動の結果から、分子量は大きいものから約160kDa、67kDa、2.5kDaであることが明らかになった。そして、それらを大腸菌に対する抗菌活性を指標に本研究で開発したタンパク質抽出装置を用いて精製を試みたところ、不純物が混じり完全ではないがほぼ精製することができた。しかしながら、まだ純度は低いので分子量が近いものの除去をさらに行い精製度を高める研究を行っていきたい。また、これら3種のタンパク質は、共に注射3日目という早い時期にピークをむかえているので、抗体タンパク質がピークをむかえるのに通常早くとも15日は必要とされる抗原抗体反応には関与せず、自然免疫に関与していることが考えられる。
リチウムイオン電池の過渡応答解析の研究；高周波ノイズの安全性への影響を解明

本研究は、電力変換によるリップル、サージ等の高周波外乱がリチウムイオン電池に及ぼす影響の解析技術構築を目指す。しかしこの分野の研究例は少なく、その原因は高周波信号に対する電極応答計測の困難さや多孔質電極が分布定数系であり電流・電圧分布の解析が困難なためと考えられる。そこで本研究では第一に数十μSレベルの過渡応答特性の信頼性・再現性ある測定技術の習得とそれを実現する実験系の構築に注力してきた。第二に解析は電気工学のツールである回路シミュレータを活用し、複雑な分布定数系等価回路網の解析と電気化学反応速度論を結合した新たな多孔質電極解析技術の構築を進めた。このためリソースは全て実験関連に投入してきた。その結果30年度は最終年度として当初の研究項目【1,2,3】について概ね目標を達成し今後の方向性を見いだすことができた。研究項目【1,2】;反応種の拡散を考慮した電荷移動抵抗の解析昨年まで電極反応速度に相当する電荷移動抵抗は実測値を用いていた。これを理論的に解析するため電極の等価回路(伝送線回路)から回路シミュレータにより電流電圧を推算し、この値と拡散方程式とバトラーフォルマー式を連成し電荷移動抵抗の電圧依存性を逐次計算する手法を構築。リチウムイオン電池の過渡応答特性を理論的に解析する手法を構築した。研究項目【3】;実電池の電流分布解析円筒型電池はインダクタンスを有しモデル電池で得た過渡応答解析技術を適用できない。そこで実電池の巻回構造をモデル化しインダクタンスを考慮した等価回路モデルを構築した。このモデルで集電端子の配置による電流分布の発生を再現可能となった。将来的にはこの等価回路モデルと先に述べた多孔質電極の過渡応答解析理論を連成し実電池の過渡応答解析が可能となると考えられる。平成30年度が最終年度であるため、記入しない。今年度は、電池が回路から発生するノイズ等の外乱で受ける損傷を解析するため、初年度の課題として【1】ー(a)「実験系の構築」に対し、(1)実験環境の整備、(2)過渡応答を精度よく測定するためモデル電池構造の考案と試作を行った。(1)については露点-30°Cの極低湿度下のグローブボックス内で市販電池を分解し、取り出した電極でモデル電池を組み上げる技術を確立た。(2)につては、本年導入したポテンシオスタットをグローブボックス側壁を介してモデル電池に接続しμ秒オーダーの過渡応答測定ができる環境を構築した。また、モデル電池はサンプル極の特性を抽出するためサンプル極面積を対極の1/50に設定し、サンプル極が高インピーダンスになるように設計した。この条件を満たすよう市販セルを改造しモデル電池治具を考案した。さらに、この実験環境・測定系を用いて市販電池の正極インピーダンスを測定し、多孔質電極構造を等価回路に置換えた理論解析とシミュレーションに着手した。加えて構築した等価回路モデルを用いて、ステップ状の電圧等を印加した時の過渡応答波形の計測法とシミュレーションについても予備的な検討を始めた。この結果パルス信号が印加された場合、多孔質電極の電解液側に電流が集中することを確認した。これらの研究に基づき課題を抽出し次年度以降への研究の方向性を明確にすることができた。また、モデル電池構造の第2の候補としてラミネート構造の電池の試作も進め分極特性の解析結果を学会で発表した。成27年度は当初計画の項目【1】ー(b)の単純ステップ波入力時のリチウムイオン電池電極の過渡応答測定と理論解析を重点に研究に進めた。項目【2】の「モデル電池によるパルス応答解析」の予備検討は研究項【1】ーbを進める過程でパルス波も考慮しステップ波形状を検討。27年度はステップ波形のみで検討し、28年度に詳細を検討する事とした。【等価回路モデル】解析の高度化(再現性含む)のためセル構成、測定条件の確立を目指した。正極のインピーダンスは再現性あるデータ取得のノウハウを修得、等価回路は電極細孔を円筒形状に仮定,イオン伝導抵抗,電荷移動抵抗,電気二重層容量で構成される。円筒空間の合成インピーダンスはRC並列回路の漸化式で表した。合成インピーダンスと実測インピーダンスを比較し細孔内のイオン電導抵抗、電荷移動抵抗を決定した。【過渡応答解析】等価回路モデルをベースに、回路シミュレータによる過渡応答シミュレーション回路と電池構造との対応を考案。構造的に等価回路の一方は集電体(金属)に接続、電解質セパレータ側では溶液抵抗と接続している。RC回路が100個の等価回路モデルに1Vの定電圧ステップを印加し、正極のシミュレーションを実施。電極のセパレータ側に電流集中し、徐々に細孔内部が反応していく様子を観察、ステップ電圧入力時、セパレータ側の活物質に負担が掛かることが示唆された。この最も重要な過渡応答解析を強化するため当初計画のバースト試験器に替えポテンシオスタットを増強した。また、回路シミュレータ上で動作するリチウムイオン電池物理モデルを開発、システム中でのリチウムイオン電池の動作解析を行た。モータ加減速が発生する環境下では、電極表面近傍のみが入力に対して応答し得ることを、電池内のLi応答解析から明らかにした。また、これらのインピーダンス解析、過渡応答解析、電池物理モデルにつて学会発表を行った。

127年度の目標は、実験系を構築しモデル電池のインピーダンス解析、過渡応答解析技術の基本を構築し、再現性あるデータの取得が最重要課題であった。これに対し多孔質電極の細孔等価回路モデルを構築し、シミュレーション技術のベースと作った。2その結果、このシミュレーションモデルによれば電気二重層の充電電流と反応電流を分離して解析することができる。3この結果を基に、今後電極の如何なる部位に電流が集中する可能性があるのかを推定する道が開けた。28年度は当初計画の項目【1】ステップ波入力時のリチウムイオン電池電極の過渡応答測定と理論解析を重点に進め、過渡応答解析技術の高度化を優先した。一方、項目【2】の「モデル電池によるパルス応答解析」の検討は、研究期間も考慮し実用面の影響確認を加速するため、モデル電池を実電池へ変更し「実電池を用いたパルス応答解析」の予備検討に替えて実施した。これにより29年度予定の研究項目【3】実電池系への適用を先行的に検討した。【等価回路モデル】電極等価回路は過渡応答解析の鍵で、再現性あるインピーダンスデータ取得が重要となる。そこで試行錯誤を重ね電極径を従来の15mmから2mmとし面積を約1/50に縮小、再現性含め比較的良好なインピーダンス波形が得られる事を確認した。この現象はさらに再現性を検討する必要がある。また、インピーダンス波形に対する細孔径の影響についても理論解析に着手した。さらに負極のインピーダンス解析の検討では正極と同様に伝送路回路に基ずくインピーダンス波形が観察された。【過渡応答解析】等価回路を基に、回路シミュレータによる解析を進めた。等価回路では電気化学反応に関わる電気二重層容量と電池反応抵抗である電荷移動抵抗を如何に決定するかが鍵となる。電荷移動は印加電圧に依存し電圧可変抵抗として扱うため、I-V特性から電荷移動抵抗を電圧関数で表現、シミュレータ実装し良好な結果を得た。これは電気工学的視点から電気化学反応を解析する新しい取り組である。蓄電システムでは電池は回路に接続され寄生インダクタンス等の影響を受ける。電池にコイルを接続しパルス応答を解析して電池の劣化を評価、L成分の有無が電池の劣化に影響することを確認、検討を発展させ落雷等の高電圧パルスの電池への影響についても解析を行った。これらの成果は学会に於いて発表した。1平成28年度は研究項目【1】を継続して最も注力し、電荷移動抵抗を可変抵抗で表し等価回路モデルに取り入れることであった。これについてI-V特性から推算した電荷移動抵抗の電圧依存性をシミュレータに実装し実測過渡応答波形をシミュレーションで再現し、さらに高度化する方向性を明確にした。また2実際のノイズを考慮した波形の検討についても、実電池に連続パルスを印加し電池の劣化の有無を解析し、学会に於いて発表した。さらに、3負極についても等価回路モデルの検討を行い学会発表を行った。本研究は、電力変換によるリップル、サージ等の高周波外乱がリチウムイオン電池に及ぼす影響の解析技術構築を目指す。しかしこの分野の研究例は少なく、その原因は高周波信号に対する電極応答計測の困難さや多孔質電極が分布定数系であり電流・電圧分布の解析が困難なためと考えられる。
難治性消化器癌に対する次世代型鉄キレート剤治療の確立

肝細胞癌での鉄キレート剤の検討:6名の進行肝癌患者に対して経口鉄キレート剤(deferasirox,DFX)治療のパイロットスタディを施行したが、全例腎機能障害のため、高容量投与に至らず、1例SD (stable disease)、4例PD(progressive disease)[1例は評価不能]の結果であり、DFXの臨床応用は困難と考え、肝癌に対してはdeferoxamine (DFO)動注が鉄キレート剤の臨床応用には適していると判断した。さらに、DFO耐性株の解析を検討し、解糖系の遺伝子発現増加、解糖系に関わる代謝産物の増加ならびにミトコンドリア抑制を確認し、鉄キレート剤耐性機序の関連が示唆された。DFO投与により解糖系優位の代謝に変化することで蓄積する乳酸の排泄抑制効果を調べたところ、一部の癌細胞増殖に対して乳酸排泄抑制薬とDFOとの相乗的併用効果が認められた。膵癌でのDFXの検討:塩酸ゲムシタビン(GEM)とDFX併用により、DFX単剤より有意な増殖抑制効果を認め、DFXがRibnucleotide reductae(RR)を阻害する効果により、GEM耐性からプロテクトしていることを解明した。また、膵癌細胞株(BxPC3、Panc-1、HPAFII)を用いて浸潤・転移能を評価する目的でScratch assay、Boyden chamberassayを施行した。Scratch assayではcontrol群に比べ、DFX投与群で有意な浸潤能の低下を認めた。Boyden chamberassayでも同様にDFX投与群で有意な遊走能低下を認めた。そして、G-LISAでCdc42、Rac1の発現を検討したところ、DFX投与群で有意に発現低下を認めた。DFXはCdc42、Rac1の発現を低下させることで、癌細胞の浸潤・転移を抑制している可能性が示唆された。平成30年度が最終年度であるため、記入しない。肝細胞癌での経口鉄キレート剤の検討:3種類の肝癌細胞株(HepG2, Hep3B, HuH7)に対して鉄キレート剤であるdeferasirox(DFX)の効果MTTアッセイおよびCaspase-3活性で検討し、容量依存的な細胞増殖抑制効果とCaspase-3活性誘導を確認した(in vitro)。さらに肝腫瘍作成マウス(DEN投与により5カ月後肝腫瘍発生)を用いたDFX投与(12週間)においても腫瘍抑制効果を認め、生存率も改善した(in vitro)。さらにDFXによる体重減少もなく、DFXにてALTの有意な低下を認めた。また腫瘍部と非腫瘍部においてHepcidin,Transferrin receptor1,Hif-1αの有意な変動を認めた。膵癌での経口鉄キレート剤の検討:3種類の膵癌細胞株(BxPC-3, HPAF-II, Panc10.05)において容量依存的な腫瘍増殖抑制効果を認め、低用量(10μM)でS期において細胞周期の休止を、高容量(50, 100μM)でアポトーシスを誘導することを確認した(in vitro)。さらにBxPC-3において塩酸ゲムシタビン(Gem)とDFX併用による相乗効果についても検討したところ、DFX単剤と比較し、有意な増殖抑制効果、Late apoptosisの増加、Caspase活性の上昇を示した。肝細胞癌では、in vitroおよびin vivoでのDFXの腫瘍抑制効果を確認し、膵癌では、in vitroにおいてDFXの腫瘍増殖抑制効果ならびにGem併用による相乗効果を確認できた。肝細胞癌においてはin vitroおよびin vivoの両者から治療効果が確認し、膵癌においてもin vitroの治療効果確認し、おおむね順調である。肝がん細胞株(Huh7)と子宮頸がん細胞(HeLa)を用いて鉄キレート剤(deferoxamine,DFO)耐性株の解析を行った。耐性株の遺伝子発現解析では解糖系の遺伝子の発現増加など興味深い変化が認められた。さらに代謝産物の測定をメタボローム解析で行ったところ、解糖系に関わる代謝産物の増加とミトコンドリア活性の抑制が確認された。また核酸のサルベージ回路の上昇などが認められ、耐性に関与している可能性が示唆された。膵癌の代表的な抗がん剤であるゲムシタビン(GEM)との併用療法について解析を継続した。GEMと経口鉄キレート剤(deferasirox,DFX)を併用した新規膵癌治療法の有効性について膵癌細胞株BxPC3を用いてヌードマウスに移植したモデルを作成し、in vivoで検討を行った。GEM+DFX併用群は、GEM単独群およびDFX単独群と比較し、有意な増殖抑制効果とアポトーシスの上昇を認めた。またDFXの作用機序についても解析した。さらに、これまでに1種類の膵癌細胞株を用いて評価していたCell proliferation、Apoptosis analysis、Caspase analysisについて新たに複数の膵癌細胞株で評価を行い、併用療法が広く有用であることがわかった。肝細胞癌においては、DFO耐性株を樹立し、メタボローム解析を探索しており、膵癌に関しては、in vitro解析でのGEM+DFX併用に有用性が証明できた。肝細胞癌での鉄キレート剤の検討:6名の進行肝癌患者に対して経口鉄キレート剤(deferasirox,DFX)治療のパイロットスタディを施行したが、全例腎機能障害のため、高容量投与に至らず、1例SD (stable disease)、4例PD(progressive disease)