hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
「体質遺伝子検査」技術に関する社会ネットワークと社会的認識の調査研究

一般疾患への罹患しやすさを予測する「体質遺伝子検査」商品について、以下の調査研究を実施した。(1)日本を含めた各国の規制状況と商業的遺伝子検査の歴史調査、(2)日本における事業者、検査を利用している医師、利用者、遺伝カウンセラーや遺伝学の専門家への聞き取り調査、(3)新聞報道における遺伝子検査の扱いについてのアジェンダ・フレーム分析。医師・利用者と遺伝学専門家との間に一定の乖離を認めた。また現行の規制が社会にとっても事業者にとっても望ましい状況ではないことを確認した。平成21年度は、4月25日に全体打合せ会議を行い、予算減やウィーン側の研究資金取得状況などを鑑みて研究計画を再構成し、今年度についてはビデオ作成を見合わせる方針とした。8月19-21日に、山中と霜田はチュービンゲンで開催された医学医療哲学会に出席、欧州における規制や研究状況について情報を収集した。なお、当初ウィーン大学のプロジェクトの統括委員会のメンバーであった中岡が渡欧し、会議に出席する予定であったが、ウィーン大学のプロジェクトの資金取得の見通しがつかなくなったため渡欧を中止した。グループAは、体質遺伝子検査の商業的事業に関連する研究資料を収集し、電子媒体に収録した。グループBは、人の疾病に関わる遺伝子検査をあつかった新聞記事約650件を取得しパイロットスタディを実施。グループCは、体質遺伝子検査など消費者に直接販売ないし宣伝を行っている遺伝子検査事業者2社を訪問し詳細な情報を得た。また個人遺伝情報取扱協議会の代表者からも現状についての報告も得た。グループDは、研究者および医療関係者4名にインタビューを行った。上述のように平成21年度には中岡のウィーン渡航を中止したため、予算の繰越を行い、平成22年8月末から9月上旬にかけて、Bernhard Hadoltウィーン大学教授を招き、東京における4S学会にて、8月28日遺伝子検査の日中欧における規制状況に関する合同セッションを開催し、関係者と情報交換を行った。また8月31日に大阪大学において、ワークショップを行い、日欧における体質遺伝子検査に関する実施状況と規制状況について情報交換を行った。ウィーンにおける体質遺伝子検査の調査については未だ資金のめどが立たず困難な状況であるが、Hadolt教授が平成23年度に京都大学に滞在する期間に、共同で調査研究を行うことについて話し合いをもつことができた。平成22年度は、4月に打合会議を行い年度計画を作成した。5月にはPhiladelphiaで行われたPersonalized Medicineに関する国際会議に研究代表者が出席し、日本における体質遺伝子検査の規制と現状について報告を行った(グループA, C)。4-7月にかけて、グループCは体質遺伝子検査を診療活動に利用している医療機関4カ所、事業所3カ所、研究者2名のインタビュー調査を実施した。7月1-2日には、グループAは遺伝子検査関係のアカデミシャンをビジネスの合同の大規模イベント(バイオエキスポ2010)に調査協力者を派遣し、資料収集とヒアリングを実施。また同月には、研究協力者で大学院生のWen Hui氏に依頼し、中国における子供の能力遺体子検査の現地調査を実施した(グループC)。8月には東京で行われた米国4S学会大会において、代表者が「規制の構築:遺伝医学と科学における多様な利害関係者の役割」のセッションオルガナイザーを務め、日本側から3名(山中、上山、Wen)、ウィーン側から1名(Hadolt)が報告を行った。8月31日には、グループAはHadolt講師を交えて、研究ワークショップを開催し、日欧の遺伝子検査の規制状況、中国における現状などについて報告を行った。また、Hadolt講師とは来年度における研究調査の協力関係について話し合いをもった。9-11月には、インタビュー調査のデータをもとに英国の雑紙Personalized MedicineにSpecial Reportを寄稿した(グループA, C)。11月には日本社会学会において、代表者が「医療技術におけるリスクと社会」について報告を行った。12月にはパリ控訴院判事の生命倫理学者Christian Byk氏を招き、セミナー「欧州におけるDTC遺伝子検査について」を実施。10-2月にかけてグループBは、遺伝子検査に関する新聞記事分析を朝日、読売、毎日新聞について行い、1995-2005年における記事の趨勢を分析した。2月には合同会議を行い、各グループの作業状況について確認を行った。今年度は最終年度にあたり、Aグループでは、日本、米国、欧州、中国における体質遺伝子検査の規制状況についてまとめ、日本生命倫理学会大会での報告を行った。体質遺伝子検査の規制については、現状では、確定的な規制枠組みはどの地域でも存在せず、状況は依然として流動的であるとの結論を得た。Bグループでは、1995-2009年における全国新聞での遺伝子検査の報道について議題およびフレーム分析を行い、その結果を日本社会学会大会において報告した。新聞報道では遺伝子検査は、一部着床前診断問題をのぞいてほとんど社会問題化することなく、体質遺伝子検査についての報道も学会等の声明をのぞいては、大きくとりあげられていない点に注目した。

Cグループでは、体質遺伝子提供事業者への聞き取りを進め、ビジネスネットワーク状況の調査を行った。米国と日本における事業の進展の方向性や段階がやや異なる点を認めた。Dグループでは、遺伝カウンセラー、体質遺伝子検査を患者に提供している医療者、その利用者への聞き取りから、三者の見解の共通点と相違点について分析を行った。医療者、利用者からは比較的ポジティヴな意見があったが、カウンセラーの評価はネガティヴであった。これについて、研究成果を米国4S学会で報告した。Eグループでは、ウィーン大学のBernhard Hadolt教授との連携を模索したが、先方の研究資金が途絶したままであったため、同様の体質遺伝子検査に関する小規模な調査を比較として対照し、Hadolt教授とは日本に滞在中に詳細な情報交換を行った。
会計基準の国際的調和化の理論的・実証的研究

国際会計基準とわが国の会計基準との主要な相違点について,理論的に研究した。その成果は,「国際会計基準とわが国の会計基準との比較」という論文として公表した。会計基準の違いについての公認会計士の方々の意見を聞くためにアンケート調査を実施した。実務を担当し,会計基準の国際的調和化に一番関心のある方々であるが,結果として意見がバラバラであることが判った。それだけ,実務的には,いろいろな考え方のありうることが実証されたのである。したがって,会計基準の国際的調和ということは,それぞれの国の会計慣行,取引形態,経済的発展段階などの違いに応じて簡単には進まないことがはっきりした。時間をかけた、粘り強い討議と協調が必要である。
越境汚染時における大気中アンモニア態窒素の存在状態と濃度

本研究では、越境汚染時の大気中に含まれるアンモニア態窒素のガス態・粒子態での濃度とその変動要因を知るために、海に面した石川県羽咋市で2012年3月と5月、11月に2週間ずつ、鳥取県鳥取市でも2013年67月にかけて、それぞれ集中観測を行った。解析の結果、大気中の寿命が長い粒子態のみならず、ガス態のアンモニアについても越境汚染していることがわかった。一方、アンモニウムの対アニオンとして重要な全硝酸の連続観測を石川県珠洲市で行った。大陸からの汚染気塊が卓越する春季に高濃度となったが、同じく大陸由来の気塊が多い冬季が最も低濃度となり、その主たる原因として、全硝酸の湿性沈着が考えられた。大気中のアンモニア態窒素は、ガス態での大気化学的・生態学的な影響の他、粒子態として存在することによる気候への影響など、様々な環境影響をもたらす。近年、中国など東アジアからのアンモニア排出量が増加しており、日本など風下域への影響が懸念されているが、大気中でのアンモニア態窒素の動態については不明な点が多い。そこで、越境汚染時のアンモニア態窒素濃度の気相-固相の分配状態を、日本国内からの汚染を受けにくい場所で観測し、変動要因について検討する。初年度には、上記目的に合致する石川県羽咋市千里浜の国民休暇村にて観測をおこなった。平成23年12月に予備観測、平成24年2月下旬3月中旬にかけて本観測の1回目をおこなった。観測項目は、ガス態・粒子態のアンモニア態窒素、硝酸ガスを含む酸性ガスと粒子態イオン成分、SO_2、CO、気象要素(温度、湿度、風向、風速、雨量)、CPC/OPCによるエアロゾル粒子個数粒径分布、PM2.5濃度などである。3月の観測では、偏西風が卓越する時期で、かつ、中国でのアンモニア排出量が増加し始める時期を狙った。その結果、様相の異なる2回の吹き出しを観測できた。どちらもアンモニア濃度は1ppbv以下とごく低く、大気中では大半が粒子態のアンモニウム塩として存在していた。また、アンモニア濃度は、名古屋など都市域での値の数分の11/10であった(長田)。能登半島珠洲において全硝酸を通年観測し、その季節変動を調べたところ、大陸由来の気塊が卓越する春季に高濃度であった。しかしながら、大陸由来の気塊が少ない夏季に最小とはならず、大陸由来の気塊の飛来が春季と同様に多い冬季が最も低濃度であった。これは夏季には日本からの影響を強く受けること、冬季の日本海側は降水量が多いため、全硝酸の一部が湿性沈着されてしまうことなどが理由として考えられる(定永)。最終年度には、越境汚染大気を観測するのに適した立地条件である、鳥取大学・乾燥地研究センター(鳥取市)にて、6月中旬から約1ヶ月間、大気中の粒子状アンモニウム塩・ガス状アンモニアの連続観測を行った。ここでの観測項目は、ガス態・粒子態のアンモニア態窒素、SO2、CO、PM10/2.5濃度、粒径別エアロゾル数濃度、CN濃度、黒色炭素エアロゾル濃度であり、昨年度まで行っていた石川県羽咋市での観測項目とほぼ同等である。今年度は、梅雨時初夏にかけての越境汚染を狙った。集中観測の期間中に、風速が弱くて日射量が多い日は12日間あった。このような海陸風の発達しやすい日に絞って解析した結果、海風にあたる西北風の条件ではガス態アンモニアの濃度が高く、逆に陸風時には濃度が下がっており、初夏にも越境汚染により日本へガス態アンモニアが輸送されてきている可能性が示唆された。ただし、そのような時間帯における後方流跡線としては、必ずしも中国・韓国からのみではなく、九州や西日本をかすめて輸送されているようなケースもあったので、越境汚染の寄与量についてはさらに解析を進める必要がある(長田)。一方、無機・有機全硝酸を含めた窒素酸化物の包括的連続観測は、今年度も能登半島珠洲で継続した。珠洲における大気中の窒素酸化物の構成成分としては、2013年の冬季夏季の期間ではNOxと有機・無機全硝酸とでほぼ100%を説明できることがわかった。無機・有機全硝酸の存在比については、冬季は無機よりも有機全硝酸のほうが高かったが、季節が進むにつれて、両者の割合が逆転した。この理由としては、有機全硝酸は春季夏季に、気温の上昇や光化学反応の活発化で寿命が短くなること、無機全硝酸については日本海側の降水による湿性沈着により、冬季における寿命が短いことが挙げられる(定永)。2年次も初年度に引き続き、石川県羽咋市千里浜の国民休暇村にて、2週間の集中観測を5月と11月におこなった。

観測項目は、ガス態・粒子態のアンモニア態窒素、硝酸ガスを含む酸性ガスと粒子態イオン成分、SO2、CO、気象要素(温度、湿度、風向、風速、雨量)、CPC/OPCによるエアロゾル粒子個数粒径分布、PM2.5濃度などである。また、越境汚染と国内都市大気とを比較するために、ほぼ同じ観測項目で、名古屋で3週間の集中観測を6月と12月におこなった。羽咋での5月の観測では、中国でのアンモニア排出量が最も多い時期を狙い、11月は、気象条件的には3月と似つつも排出量がまだ多い時期を狙った。5月も11月も、良質の連続データが取得できた。アンモニア態窒素濃度としては、3月や11月よりも5月の方が高く、ローカルな風向で整理したところ、5月には西方(海風)からの空気塊でアンモニア濃度が高くなっていた。これは、ガス態のアンモニアが越境汚染している可能性を示すものでる。(長田)今年度も能登半島珠洲において、無機全硝酸の連続観測を続けている一方、2012年6月からNOxを、11月からは有機全硝酸の連続観測を開始した。冬場の例として、2013年1月の窒素酸化物の構成成分比を調べたところ、半分程度の割合でNOxとして存在していることが明らかになった。また、有機、無機全硝酸の存在比はそれぞれ30, 20%であり、無機よりも有機全硝酸のほうが高い結果となった。無機全硝酸は湿性沈着の影響を受けやすい一方、有機全硝酸はほとんど受けないため、この結果も冬季の日本海側における降水による無機全硝酸の湿性沈着の促進を支持していると考えられる。(定永)観測の準備を整え、目的に合致した適地にて観測をおこない、狙いの時期に観測データを得ることができたので、概ね順調に進展したと言える。25年度が最終年度であるため、記入しない。初年度の結果を踏まえ、目的に合致した適地にて計画通りの集中観測を実施できた。狙いの時期に、予定していたパラメータについて良質の観測データを得ることができたので、概ね順調に進展したと言える。来年度は、当初の予定通り、中国でのアンモニア排出量が高く、しかも西風頻度の高い56月に羽咋で観測をおこなう。H23年度の観測が順調であったので、この観測も概ね順調に推移すると予想される。野外観測の後、得られた大量のガス・エアロゾルサンプルの分析をおこない、総合的な解析を進めたい。羽咋で観測される西北風は、中国-ロシア方面からの空気塊を観測するには適しているが、韓国の影響も受ける可能性がある。より中国に近く、韓国の影響を受けにくい場所での観測結果との比較が有用かもしれない。そのためには、西日本地域での観測適地を探し、そこでの観測を秋冬におこなうことも検討する予定である。2年次までの結果を補強するために、もう少し越境汚染の影響が強いことが予想され、かつ、アンモニアの観測に適した場所を探した。その結果、鳥取市の鳥取大学・乾燥地研究所を候補として下見し、共同利用の申請をおこなった。最終年度も、観測項目はガス態・粒子態のアンモニア態窒素、粒径別(PM2.5/10サンプラーによる)エアロゾル中イオン成分、粒子態硫酸イオンの先駆物質として二酸化硫黄、燃焼由来の汚染空気塊の指標として一酸化炭素(CO計をレンタル)、ローカルな湿性沈着や反応に影響を及ぼす気象要素(温度、湿度、風向、風速、雨量)、PM2.5/10、CPC/OPCによるエアロゾル粒子個数粒径分布を予定している。鳥取での集中観測は、中国でのアンモニア排出量が高い67月に2週間程度、できればもう少し長い期間のデータを得たい。
肝小胞体膜の形成機構の研究

(1)シグナル/アンカ-の系統的解析我々はPー450分子のN末端に存在するシグナル/アンカ-の機能がN末端の荷電アミノ酸の数と疎水領域の長さとのバランスによって決定されることを推定していたが、今回N末端の荷電アミノ酸の数と疎水領域の長さとを系統的に変えた人工的シグナル/アンカ-を持つ蛋白質を18種類構築しERへの挿入様式をin vitroで解析し、この仮説を実証することに成功した。(2)膜透過停止配列(ST)の系統的解析ER膜を通過する蛋白質の分子内に疎水性アミノ酸に富む領域が存在すると膜透過はその部分で停止し蛋白分子は膜にアンカ-される。今回はロイシン、ロイシン/アラニン、アラニンより構成されるいろいろな長さのクラスタ-を分泌蛋白質分子の中に挿入したこれらの分子のER膜透過の様子を解析することによりST機能に必要な条件を検討した。ロイシンでは9残基の、またアラニンでは19残基クラスタ-で完全な停止が見られた。またSTのC末端側に塩基性アミノ酸が存在するとST機能が増強されることも分かった。(3)カルボキシエステラ-ゼの細胞内局在従来カルボキシエステラ-ゼはすべてER内腔にのみ局在するものと考えられていたが、我々がラット肝より単離したcDNAがコ-ドするカルボキシエステラ-ゼのC末端にはER局在化のコンセンサス配列が見られなかった。このcDNAをCOS細胞に導入し、発現した蛋白質の細胞内局在を検討したところ、極めて速やかに細胞外へ分泌され、且つ複合型の糖修飾を受けていることが分かった。一方、分泌型カルボキシエステラ-ゼのC末端部分を別のタイプのエステラ-ゼのC末端部で置換したものはERにとどまっていた。さらにラット血清中にかなりの量の複合糖型カルボキシエステラ-ゼが存在することを見いだした。
クロルデンによる人体汚染に関する研究

クロルデンによる白アリ防除処理は必然的に居住環境や地域環境のクロルデン汚染を起こし、延いては人体汚染に連がる。本研究はその実態を明らかにしたものである。1)沖縄地域一般住民(某病院勤務者17名)の血液及び皮脂中クロルデン類(5種)は徳島地域一般人(22名)よりもかなりの高レベルであった。しかし徳島地域の白アリ防除作業者(20名)よりは低値であった。沖縄地域はクロルデンによる処理密度が高いことが高レベルをもたらしている原因である。2)自宅を白アリ防除処理した一家庭について経日的に観察した結果(1)室内空気は処理後9日を経ても0.10.2μg/【m^3】を示していた。(2)処理後23日間に集積したハウスダスト中のクロルデンは約0.1μg/【cm^2】、23105日間のそれは0.4μg/【cm^2】一板面積であった。空気及びダスト中のクロルデン組成はテクニカルクロルデンのそれと類似していた。(3)居住者(2名)の血中及び皮脂中クロルデンは処理後明らかに上昇し、105日後も処理前のレベルに復さず、皮脂中ではその時点で25日目よりも高値であった。3)皮脂中クロルデン測定の意義(1)皮脂中クロルデンはほぼ体内由来のものであることが被検者4名で実験的に確められた。(2)血中と皮脂中のクロルデン組成はやゝ異なっており、血中はより代謝されたもの、皮脂中は未代謝のものの割合が多いようであった。(3)皮脂は血液よりもクロルデン曝露の累積量をよりよく反映するようであり、他の有機塩素化合物の場合にも有用指標となり得る可能性がある。4)クロルデンの開放系での使用が禁止されたが、残留性が高いので、環境汚染及び人体影響について今後の監視が必要である。
肝発癌抑制戦略としてのmitophagy機能回復

酸化ストレスは肝発癌に関連する病態であるが、C型肝炎ではマイトファジーと呼ばれるミトコンドリアの品質管理が障害されて、酸化ストレスが増強することを報告した(Am J Pathol 2014)。本研究ではHCV感染細胞に鉄キレート剤を添加すると、ミトコンドリア内の2価鉄が減少し、マイトファジーが回復することを明らかにした。マイトファジーの回復は肝発癌抑制にも繋がるが、ミトコンドリア内の鉄欠乏がどのようにしてマイトファジーを誘導するかは今後の検討課題である。申請者はこれまでにC型肝炎ウイルス(HCV)全遺伝子が組み込まれたレプリコン細胞、ヒト肝細胞移植キメラマウス、HCV全遺伝子が組み込まれたトランスジェニックマウス(HCV TgM)を用いて、HCVコア蛋白がE3 ubiquitin ligaseであるParkinと結合することでParkinのミトコンドリアへの局在を阻害し、ミトコンドリア特異的autophagy(mitophagy)を抑制することを明らかにしてきた。しかし、これらの実験系ではHCV粒子は産生されておらず、ヒトのHCV感染状態とは異なる。そこで今年度は培養上清中のHCVが細胞に感染しうるHCV-JFH1株をnaive Huh7に感染させ、実際のHCV感染系におけるコア蛋白とParkinの相互関係について検討した。これまでの成績と同様にJFH1感染細胞においてもParkinのミトコンドリアへの局在が抑制された。Parkinのミトコンドリアへの局在にはリン酸化酵素であるPINK1によるParkinのリン酸化が必要であるが、HCV感染時にもPINK1によるリン酸化は阻害されておらず、コア蛋白とParkinのdirect interactionが想定された。そこでParkinをN端側とC端側の2つの領域のcDNAを合成し、yeast two hybrid assayによりコア蛋白との結合性を解析したところ、Parkinのミトコンドリアへの局在に重要な働きをする211番目のアミノ酸を含むN端側のParkinとのみ結合することが明らかとなった。次にParkinとコア蛋白との結合の生物学的意義を検討するため、ParkinがHCV増殖に与える影響について検討した。上記のHCV感染をParkinのsiRNAでknock downしたところHCVの増殖が抑制されることが明らかとなった。こうした一連の成績はヒトのHCV感染における持続的な酸化ストレスの誘導を説明しうる一機序ではないかと考えられた。平成25年度はHCVコア蛋白がE3 ubiquitin ligaseであるParkinと結合してミトコンドリア特異的オートファジー(マイトファジー)が阻害されることを明らかにした。このHCVによるマイトファジーの阻害はHCVによる酸化ストレス誘導の根幹をなす病態と考え、当初HCVコア蛋白と結合するParkinの責任領域を決定し、この領域を含むParkinのdecoy蛋白を発現させることで、内因性のParkinによるマイトファジーの回復を目指した。しかし、本研究過程で鉄キレートによる細胞内の鉄欠乏が、PINK1/Parkinのシグナル経路とは独立してマイトファジーを誘導するという論文(EMBO reports 2013)を見いだした。HCV-JFH1株感染細胞に鉄キレート剤(Deferiprone, DFP)を添加したところ、細胞内やミトコンドリア内Parkinの発現量に影響を及ぼすことなく、LC3-IIの発現が増強し、マイトファゴソームの数が増加した。これらの成績はHCV感染下でも鉄キレートはマイトファジーを誘導しうることを示すものである。また、ミトコンドリア内の2価鉄を特異的に検出する蛍光プローブ(Ac-MT-FluNox1)(岐阜薬科大学との共同研究)を用いて、ミトコンドリア内の2価鉄の定量を行った。HCV感染細胞は非感染細胞に比べてミトコンドリア内の2価鉄が多く、またDFPによりHCV感染細胞、非感染細胞ともにミトコンドリア内の鉄が用量依存性に減少することが明らかとなった。今後は、ミトコンドリア内の2価鉄量とミトコンドリア機能(電子伝達系複合体の活性やATP産生量)との関係を明らかにし、マイトファジー誘導にどのような影響を与えるかを明らかにするとともに、HCVトランスジェニックマウスを用いて鉄キレートによりマイトファジーの回復をin vivoでも検討する。肝臓病学当初の予定ではHCVコア蛋白と結合したN端側215個のアミノ酸からなるParkinについて、さらに細分化した領域を組み込んだベクターを作成してyeast two hybrid assayを行い、HCVコア蛋白と結合するParkinの責任領域を絞り込む予定であった。現在、HCVコアとParkinとの結合によるmitophagyの抑制結果についての論文を投稿中であるが、査読者から一連の現象をHCVレプリコン細胞のみならずHCV感染系(JFH1株感染細胞)で再現するようにとの指示があり、すべての実験をやり直したため当初の予定より進捗状況がやや遅れている。当初の予定通りHCVコア蛋白と結合するParkinの責任領域を決定するとともに、HCVコア蛋白の結合責任領域を決定する予定で研究を進めていく。

研究期間内に可能であればHCVコア蛋白と結合するParkinの責任領域、いわゆるdecoy Parkinを細胞内で発現させるHCV感染細胞を作成し、decoy ParkinとHCVコアが結合することによって内因性のParkinが引き起こすmitophagyが回復するか否かを確認したいと考えている。研究計画進捗状況の項で記載したように、投稿論文の追加実験のため平成25年度の研究計画が当初の予定よりやや遅れたため、研究経費を若干次年度に持ち越した。当初の平成26年度の研究計画に加えて、平成25年度の研究計画の一部が平成26年度にずれ込んだため、持ち越し助成金と平成26年度助成金の両方を使って、当初予定した研究を遂行していきたい。
新規マウスモデルを用いた間質性肺炎(肺線維症)原因遺伝子解明と治療薬開発

これまでの研究でIL-18はIL-12と同様にTh1の強力なinducerとして考えられていた。しかし我々と兵庫医大の中西らによってIL-18がTh1型サイトカインだけでなくTh2型サイトカインIL-4,IL-5,IL-10,IL-13やCD40リガンド(CD40L/CD154)の発現誘導を介してIgE, IgG1産生誘導に関与していることを証明した。これらの研究の過程で我々はIL-18がIL-2と共同してマウスに急性の肺障害を引き起こし、死亡させることを発見した。IL-18とIL-2を同時に投与した群においては、いずれのマウス(B6、Balb/c、129)でも急性の致死反応がIL-18,IL-2の容量依存性に認められた。IL-2或いはIL-18の単独投与では肺障害はなかった。組織学的には急性期(IL-18/2投与後47日後)には著明なNK細胞を主体の細胞浸潤を伴った肺の間質肥厚を認め慢性期(投与約2週後)には肺線維化を認めた。他臓器には全く異常がなかった。またIL-18/2を投与したマウスでは肺Hydroxyproline値、血清中や肺組織中のTNF-α、IFN-γ、MIP-1α、MIP-2、IL-6等の著明な上昇が認められた。この肺障害はMMPインヒビターの前処置でも変化がなかった。この致死反応はIL-18RαKOマウスでは完全に、IFN-γKOマウスでは部分的に抑制された。IL-4KO、IL-13KO, IL-4/13KO、STAT6KOマウスではWild typeと同様の致死反応が認められた。また抗アシアロGM1抗体または抗NK1.1抗体の前処置によるNK細胞除去で致死反応は完全に抑制された。以上よりIL-18とIL-2の投与によって誘導される急性の間質性肺炎にはサイトカイン、ケモカイン、NK細胞が重要な役割を果たすと考えられた。
スパイラルリエントリーの成立機構とその制御

心筋活動電位の高分解能光学マッピングシステムを開発し、致死性不整脈である心室頻拍や細動に重要な役割を果たすスパイラルリエントリーのダイナミクスを解析した。1.活動電位光学マッピングシステムの開発高輝度発光ダイオードを励起光源とし、高速度ビデオカメラを用いた新たな光学マッピングシステムを開発した。本システムは時間分解能1.3ms、空間分解能0.1mm、画像(4x4画素の平均)S/N比10.6、連続記録時間約10秒、蛍光退色率2.4%minであり、従来報告されているシステムと比べて高分解能で高品位のデータを長時間繰り返して記録することが可能であった。2.心室スパイラルリエントリーの解析家兎二次元灌流心に直流通電を加えて誘発した心室スパイラルリエントリーのダイナミクスを解析した。心室スパイラルには、旋回中心部に線状の機能的ブロックラインが形成される型と、旋回のpivot pointがほぼ円形の軌跡を描くコア形成型が認められた。ブロックラインは、両側で活動電位位相が大きく異なる(不応期により形成される)部分と、旋回のpivot point付近で興奮伝導が遅延することによる(心筋線維を横切るように興奮が旋回する際に興奮前面の曲率が増大するために形成される)部分から成り、後者は常に心筋繊維走行と平行に形成された。Pivot point付近での活動電位波形は立ち上がりが遅く、興奮前面が方向転換した後では活動電位の立ち上がり速度が増大した。コア形成型は心筋線維走向が一様でない心尖部付近に多く形成された。以上より、心筋二次元スパイラルのダイナミクスは、(1)興奮波面の曲率、(2)興奮波脱分極前面と再分極終末部との相互作用、(3)心筋構築の異方性(anisotropy)によって規定されることが判明した。我々は、致死性不整脈である多形性心室頻拍(PVT)や心室細動(VF)の発生に重要な役割を果たすスパイラルリエントリーのダイナミクスを解析することが可能な光学計測システムの開発を行ってきた。今年度の研究では、コンピュータに画像データをデジタル転送することが可能な高速ビデオカメラ(Fastcam Ultima 40K,Photoron)を用いて、新たな心筋活動電位光シグナルマッピングシステムを構築した。このシステムでは、青緑色高輝度発光ダイオード(LED)を励起光源に用いて、電位感受性色素(di-4-ANEPPS)の二次元蛍光画像を、時間分解能約1ms、空間分解能約0.1mmの解像度で約4秒間連続記録することが可能であった。背景光の時間的減衰率も少なく、長時間にわたり安定して記録することができた。ウサギ摘出灌流心臓を用いた実験では、直流通電により誘発されるPVT/VFの発生中に、心室表面を旋回するスパイラル興奮波を明瞭に捉えることができ、興奮波の旋回に伴うスパイラルtipの移動(meanderingやdrift)についても解析が可能であった。また、従来の高速ビデオカメラシステムと組み合わせて心臓の2方向からの同時撮影を行うことにより、心表面のより広範囲にわたるスパイラル興奮波のダイナミクスを解析することも可能であった。本システムはPVT/PVなど致死性不整脈の発生機構の解明や薬物作用の解析に有用であると考えられる。心筋スパイラルリエントリーのダイナミクスを、我々が独自に開発した高速度ビデオカメラを用いた心筋活動電位高分解能光学マッピングシステム(時間分解能1.3ms,空間分解能0.1mm)により解析した。

家兎摘出灌流心の心内膜側心室筋を液体窒素により凍結凝固させた心外膜下心筋二次元標本では、基本刺激活動電位に受攻期に単相性直流通電(20V)を加えると心室表面を旋回するスパイラル旋回興奮が誘発され、心電図では多形性心室頻拍(PVT)が認められた。このPVT中の心室スパイラル興奮波には、旋回中心部に線状の機能的ブロックラインが形成されるブロックライン型と、旋回のpivot pointがほぼ円形の軌跡を描くコア形成型が認められた。ブロックライン型スパイラルでは、両側で活動電位の位相が大きく異なる(不応期により形成される)ブロックライン部分と旋回のpivot point付近で興奮伝導が遅延することにより形成される(心筋線維を横切るように興奮が旋回する際に興奮前面の曲率が増大するために形成される)ブロックライン部分から成り立っていた。前者ブロックラインの方向は心筋繊維走行との間には一定の関係は認められなかったが、後者のブロックラインは常に心筋繊維走行と平行に形成された。Pivot point付近での活動電位波形は立ち上がりが緩やかであったが、興奮前面が方向転換した後では活動電位の立ち上がり速度が増大した。コア形成型スパイラルは心筋線維走向が一様でない心尖部付近に形成されることが多かった。以上の結果より、心筋二次元スパイラルのダイナミクスは、(1)興奮波面の曲率による効果(curvature effect)、(2)興奮波脱分極前面と再分極終末部との相互作用(wavefront-tail interaction)、(3)心筋構築の異方性(anisotropy)によって規定されることが明らかになった。
過酸化脂質測定による急性心筋虚血診断の試み

心筋に対する低酸素後の急激な酸素の再導入が活性酵素を生じる結果、心筋細胞膜の脂質過酸化反応を招来する事を利用し、心筋内過酸化脂質を測定し超早期の心筋虚血の診断に応用することを目的とし、次の実験を行った。体重712Kgの雑種成犬18頭を用い、ペントバルビタール麻酔後気管内挿管、人工呼吸下で開胸し心臓前面を露出し、左冠状動脈本幹を回旋枝の分岐部直前に剥離結紮した。実験系は大別して再灌流系と非再灌流系に分け、1時間結紮後30分再灌流した群、2時間結紮後30分再灌流した群、1時間結紮群、2時間結紮群、結紮後30分以内に心停止した群、開胸のみの群の6群、それぞれ3頭ずつとした。摘出した心臓から左心室の前壁と側壁、心尖部、心室中隔の心筋を採取し、過酸化脂質量をTBA(チオバルビツール酸)法を用いて測定した。また同一部位より切出して、パラフイン包埋後薄切し、ヘマトキシリン塩基性フクシンピクリン酸(HBFP)染色を施した。その結果、結紮処理した5群れはいずれも開胸のみの対照群と比べて過酸化脂質量はほぼ34倍となったがこれら5群間では明らかな差はなく、心筋の虚血再灌流のみなず虚血障害時にも心筋内で過酸化脂質が産生されること、つまり活性酸素が生じていることが明らかとなった。またTBA法を用いて心筋の過酸化脂質量の測定する方法はHBFP法による病理組織学的方法に比べて、再灌流や長時間の虚血による心筋の障害のみならず30分以内に心停止した例でも生前の心筋虚血の状態を定量的に捉えられる点で優れており、早期の心筋虚血の診断に充分応用可能であることが示唆された。
転写因子E2F-1が染色体DNA複製開始を誘導する機構の分子解析

転写因子E2Fが染色体DNA複製開始を誘導する機構を二つの系を用いて解析した。(1)哺乳類培養細胞系を用いた解析マウス線維芽細胞株NIH3T3にメタロチオネインプロモーターと連結したヒトE2F-1cDNAを導入し、亜鉛を培地に添加することによりE2F-1の発現を誘導できる細胞株を樹立した。この細胞を低血清培地にて休止期に同調させ、E2F-1の発現誘導により細胞がS期へと進行する過程を詳細に検討した結果、E2F-1の下流には、サイクリンEの発現によるCdk2の活性化とDNA複製開始装置の構成因子であるMCMの染色体への結合を促進する過程の、少なくとも、二つの経路が律速段階として存在することを明らかにした。(2)アフリカツメガエル卵を用いた解析われわれは昨年度までに、アフリカツメガエルの未成熟卵を用いてDNA複製開始を検定できる系を構築していたので、これを用いてE2FとCdk2活性の関与を解析した。その結果、カエル卵においては、E2F活性のみでは不十分であるが、サイクリンE/Cdk2複合体と協調するとDNA複製開始が誘導できること、この系においてはサイクリンEの発現はE2Fに依存しないこと、さらにはE2Fの標的遺伝子にサイクリンE以外のものが存在することを明らかにした。カエル卵においては、ほとんどの蛋白質の発現はすでに存在しているmRNAのpolyA付加により制御されることが知られているので、外部から導入した転写因子により活性化された遺伝子を同定するには理想的な系である。この利点を生かし、ディファレンシャルディスプレイ法を用いてE2Fにより発現が特異的に上昇する遺伝子の断片を4種類同定した(仮称CET-1、-2、-3、-4)。このうち比較的強く誘導された遺伝子断片(CET-1と2)をクローニングし、現在、完全長のcDNAを単離し、解析中である。
冠動脈・心外膜前駆細胞の動態とその制御

心臓が一生にわたって拍動を続けられるのは、心壁を走る冠動脈が酸素と栄養分を心筋のすみずみに供給するからである。冠動脈の形成には心臓の表面を覆う心外膜が必須である。心外膜は、心臓の外に生じた前駆細胞集団が、ある特定の発生段階に心臓に追加されることによって生じる。われわれは、胚が大きく母体外で発生する鳥類胚の利点を生かして実験発生学的解析や遺伝子導入実験等を行い、主に以下の点を明らかにした。(1)心外膜前駆体の心臓への融合はEph-ephrinシグナル伝達を介した接触依存性のシグナル伝達の制御を受ける。(2)心外膜由来間充織の形成と冠動脈の形成はともに血管内皮細胞増殖因子により促進される。心外膜原基は、胚発生の過程で肝臓原基の近くに一過的に現れる中胚葉性の突起である。心外膜原基は心臓の冠動脈と心外膜の重要な起源であり、心臓が正常に発生するためは、心外膜原基が正しく心臓へと統合される必要がある。心外膜原基はループ状の原始心臓に向かって成長し、その表面への接着を経て心臓へと進入する。その接着は必ず心臓の特定の部位、すなわち房室接合部でおこるが、そのしくみについてはよくわかっていない。そこで平成23年度はまず、正常発生において心外膜原基が心臓表面へと接着する過程を詳しく観察した。艀卵開始後2.5-4日のニワトリ胚心臓を、ホールマウントおよび組織切片を作製して観察し、心外膜原基が房室接合部に接着する際に、心臓の他の部分、すなわち心房にも接触していることを明らかにした。研究代表者らはすでに、房室接合部からの分泌性シグナルが心外膜原基の成長を促進することを明らかにしているが、今回の観察結果は、それに加えて、心臓表面の心外膜原基に対する接着親和性が、心外膜原基の心臓への進入を制御している可能性を示している。その可能性を、実験発生学的アプローチにより検討するため、心外膜原基と心臓断片を互いに接触した状態で培養する新たな三次元培養法を確立した。くわえて、Par3,ZO1、B-カテニン、サイトケラチン等の抗体を用いた免疫染色の条件検討を行い、それらの抗体が心外膜原基の心臓への進入機構の解析に利用できることを確認した。心臓全体に血液を供給する冠動脈は、その主な起源である中胚葉性の突起-心外膜原基-が、心臓の外から、初期の原始的な心臓に新たに付け加わることによって生じる。心外膜原基の心臓への融合の仕組みおよびその心臓発生における意義を理解することは、器官を構成する細胞の多様性に関する理解を深めるとともに、心疾患に対する血管再生療法の開発や効率化にも資する。平成25年度は、心外膜原基が心臓に融合する際の細胞学的変化および組織間相互作用の解析を行うとともに、平成26年度以降遂行予定の、冠動脈形成機構の解析に必要となる新たな遺伝子導入プロトコルを確立した。1.心外膜原基融合時の細胞学的変化:心外膜原基が心臓に融合する際に起こる細胞学的変化を、in vitro共培養法を用いて時間を追って解析し、心外膜原基を覆う上皮組織が、心臓との接触部位で、細胞突起の伸長、細胞外基質成分の蓄積を経て開口し、心臓表面を覆い始めることがわかった。アポトーシスの関与を支持する証拠は得られなかった。2.融合を制御する組織間相互作用の分子機構:心外膜原基の心臓への融合は、必ず心臓の房室接合部で起こり、同じく心外膜原基の近傍に位置する心房では起こらない。単離したウズラ胚の房室接合部または心房を、卵殻内のニワトリ胚心外膜原基の近傍に移植する実験を行った結果、心外膜原基にとって、心房よりも房室接合部の方がより融合しやすいことがわかった。心外膜原基と房室接合部の間で特異的に起こるEph-ephrinシグナル伝達が心外膜原基の融合を促進することを示唆する結果を得た。3.遺伝子導入法の確立:従来のリポフェクション法を改良し、トランスポゾンベクターを導入することにより、心外膜原基に遺伝子を効率よく導入し、長期間にわたって発現させることが可能となった。心臓がたえず拍動を続けられるのは、心臓内部を走る冠動脈が酸素と栄養分を心筋に供給するからである。冠動脈の重要な起源の一つが心外膜原基である。心外膜原基は発生過程の特定の時期に心臓の外に生じる中胚葉性の突起であり、心臓表面へと向かう成長および接着を経て心臓と融合する。この融合は、心臓の発生にとって必要不可欠なイベントであるが、そのメカニズムはよくわかっていない。心外膜原基の融合は常に心臓の決まった部位で起こる。平成23年度の観察から、心臓表面と心外膜原基の間の親和性が心外膜原基の融合部位を決めている可能性が示された。平成24年度は、その可能性について実験発生学的手法により検討した。In vitro三次元共培養法を用いて、心外膜原基と本来融合の起こる房室接合部を互いに接触した状態で培養したところ、本来融合の起こらない心房を用いた場合よりも高い頻度で融合が観察された。これは心外膜原基の心臓への融合が、両者の間の直接の接触を介したメカニズムによって制御されるという考えを支持している。また上記のメカニズムが実際に生体内で働いているかどうかを検討するために必要なin vivo実験系を確立した。

ウズラ由来の心臓断片をニワトリ胚の心外膜原基近傍へと移植したところ、3時間後には心外膜原基と移植片の間の融合が観察され、今後さらに解析を進めていくこととなった。加えて、マイクロアレイ法を用いた解析を行い、心外膜原基の融合に関わる分子に関する情報を得るとともに、接触依存性の細胞間相互作用に関与するephrin, Eph遺伝子群を単離した。以上のように、平成24年度は冠動脈発生の初期イベントに関する仮説を実験的手法により検討するともに、今後の細胞レベル、分子レベルでの解析の基盤となる実験技術および情報を得た。心臓が拍動を続けられるのは、心臓の中を走る冠動脈が酸素を心臓のすみずみに供給するからである。しかし、拍動を始めてまもない発生初期の心臓は冠動脈をもたない。冠動脈は、心外膜原基と呼ばれる肝臓の近くに生じる中胚葉性の突起が、拍動を開始した心臓に後から追加されることによって生じる。平成26年度は、鳥類(ニワトリ・ウズラ)胚心外膜原基の心臓表面への接着、心臓内での心外膜原基細胞の移動および分化を制御する分子機構に関して解析を行った。1.心外膜原基の心臓への接着を制御する機構:心外膜原基の心臓への接着は、必ず心臓の房室接合部で起こる。われわれは、シグナル伝達分子EphB3が心臓の房室接合部で、そのパートナー分子ephrinB1が心外膜原基で発現することを見いだすとともに、in ovoリポフェクション法を用いた強制発現実験およびin vitro培養系を用いた添加実験により、EphB3発現の局在が心外膜原基の接着部位を房室接合部へと限定させることを明らかにした。Eph-ephrinシグナル伝達を介した接触依存的組織間相互作用の心臓発生における新たな役割が明らかとなった。2.心臓発生におけるタイミング制御:ニワトリ2日胚を低温で発生させると、心外膜原基の心臓への接着が胚全体の発生の進行に対して遅れて起こることがわかった。鳥類胚心臓が、器官形成のタイミングがどのように制御されているかを研究するためのモデル系として有用であることがわかった。3.冠血管形成における心外膜細胞の役割: In ovoリポフェクション法を用いて、培養した心外膜細胞の移動に影響を与えるさまざまな成長因子遺伝子を、ニワトリ・ウズラ胚心臓の心外膜で強制発現させた。血管内皮細胞増殖因子VEGF-Aが心外膜細胞の移動と血管形成をともに促進することがわかった。心臓に冠動脈が発生するためには、心臓表面を覆う心外膜が必須である。しかし、心外膜がどのような因子の制御のもとでどのような役割を果たしているかは、現在のところよくわかっていない。冠動脈をもたないアフリカツメガエルの心臓では、心外膜と心筋の間に分布する結合組織がきわめて少ない。鳥類ではこの結合組織は、心外膜の細胞の一部が心臓表面を離れて心壁内部に向かってもぐり込むことによって生じる。われわれはこの結合組織の形成と冠動脈発生の間の関係を調べるため遺伝子導入実験を行った。培養した心外膜細胞に特定の成長因子を添加すると、シート状だった細胞が解離し、間充織様の形態を示すようになる。われわれはそのような作用をもつことが知られる7種類の成長因子遺伝子(Vegf-A, Vegf-C, Vegf-D、Fgf2、Pdgf-B, Tgf-b1, Tgf-b2)を、それぞれTol2トランスポゾンベクターに挿入し、in ovoリポフェクション法を用いてニワトリ胚およびウズラ胚の心外膜前駆体に導入し、冠動脈が発生する時期まで強制的かつ継続的に発現させた。
英語が使える日本人育成のための英語学習文法の体系構築と個別的記述の見直し

3年間にわたる本研究は、学習英文法に内包される諸問題を明らかにし、あらたな学習英文法構築を目的とする単独の研究として開始した。最初の2年間の単独の研究は、数多くの学習文法の問題点を具体的に明らかにし、その成果を、学会発表、論文、招待講演、著書などの形で広く知らせてきた。日本の英語教育の問題点は、英語教材である学習参考書、準教科書、英文法書などの他に、英語教員採用試験にまでおよんでいることを明らかにし,著書を通じて試験問題の公開を呼びかけた。最終年度(平成19年度)に井上亜依を研究分担者に加えることによって、英語学研究に新たな分野を拓くことが期待されるphraseologyの研究を採り入れることができた。そうすることによって、学習英文法がかかえる問題点を明らかにすると同時に、あらたに学習英文法に加えるべき教育内容を研究する方向付けをすることができるようになった。雑誌『英語教育』の「クエスチョン・ボックス」を通じても、現場の英語教員や学生、大学院生などの多くの質問に答えてきた。日本国内での英語教育の基本となる学習英文法の種々の問題点の指摘と改良点、新しい知見の公表のために次のような活動を続けてきた。講演・研究報告は以下の通り。1.平成17年6月25日「英語が使える日本人育成と英語学習文法事情」言語コミュニケーションセミナー(関西学院大学言語コミュニケーション文化研究科主催.関西学院大学大阪梅田キャンパス)2.平成17年8月2日「ユースプログレッシブ英和辞典」英語語法文法学会第1回英語語法セミナー(大阪市立大学文化交流センター)3.平成17年11月13日「英語理解と発信の道具としての辞書と英文法再考」(シンポジウム「英文解釈を支える英語学的知見」)日本英語学会第23会大会(九州大学)4.平成17年12月3日「「前置詞+that節」の種々相-provided that, beyond that, talk about thatをめぐって-」関西英語語法文法研究会第12回例会(関西学院大学)連載記事は次の通り。小学館のホームページ「ランゲージ・ワールド」で「語法の鉄人」を月2回の連載を継続し、種々の英和辞典や英文法書の問題点をとりあげて論じた。また、雑誌『英語教育』誌上で、「クエスチョンボックス」欄のレギュラー回答者として、高校教員、大学生、大学院生、一般の研究者からの種々の問いに答えてきた。このような種々の研究活動はすべて、最終目標の総合的な英文典をつくりあげるための基礎研究の意味をもち、英文典執筆も着実に前進中である。また今年度は、平成18年4月出版予定の『現代英語語法辞典』(三省堂)の編集に力を注ぎ、平成18年度内出版予定の『新版英語学概論』(英宝社)の編集責任者として、企画をしてきた。学習英文法の種々の問題点のうち、英和辞典がその草創期からかかえる問題点をまとめた、『英和辞典の研究-英語認識改善のために』(開拓社)から出版した。また、その著書の中には、今後あらたに英和辞典や英語学習文法に含めるべき内容の提言を行った。この著書の中に記述した内容の主な事柄は、次のようなものである。1.現在の英語学習文法やその根拠となる英和辞典の記述の諸問題を考える前に、英和辞典の歴史をたどった。2.今現在使われている英和辞典や英語学習文法の問題点を洗い出し、それの背景を歴史的にたどる。その結果、(1)多くの問題点は、大正から昭和初期に出された英和辞典に起源があること、(2)さらに、それらの英和辞典の問題点は、イギリスのConcise Oxford English Dictionaryの初版(以下、COD1)に依存し、その後のCODの改定に必ずしも対応した記述になっていないこと、(3)また、伝統的に英和辞典は外国の英語辞書に負うところが多く、上に述べたCOD以外にも、CODの親版であるThe Oxford English Dictionaryをはじめ、多くの辞書に書かれた古い英語の記述を現代英語のものとして記述していることにも深刻な問題となっていること、などが明らかになった。3.そのような欠点をもちながらも、英和辞典は改良を重ね、世界的なレベルからみてもすぐれた記述をしていることが知られている。それに対して、学習英文法として市販される英文法書や文法の問題集には問題点が多い。またさらに、学校で教える教師の英文法に対する認識そのものにも大きな問題があることを明らかにした。

4.その一方で、生きた英語は常に変化を起しており、生きた英語の認識のために、常に英語の記述をすすめなければならないことを、具体的に指摘した。(1)日本の英語教育に必要な新たな英文典の構築のための基礎的研究の一部として、日本の学習英文法や受験参考書の記述にみられる誤った記述をはじめ、英和辞典・教員採用試験に少なからず見られる問題点を具体的に数多く指摘してきた。また、そのような誤った認識がどのよう,にして日本で形成され、継承されてきたかを跡付ける研究を進めてきた。その成果の一部は八木克正著『世界に通用しない英語-あなたの教室英語、大丈夫?』(開拓社)の中にまとめた。(2)新しい英語研究の視点としての英語phraseology研究をすすめた。その研究を通じて、現代英語の特質を学会発表などを通じて明らかにしてきた。その成果の一部は、井上の著書Spoken English:A Phrasiological Approach(Kaitakusha)で公表した。同時に、そのような視点が英語教育にきわめて重要な役割を果たすこと、日本の英語教育の問題点は教育の方法ばかりでなく、その中身が問われなければならないことを明らかにしてきた。副次的な成果として、phraseologyの方法論に基づいて、日本の学習英文法がもつ様々な問題点を改善する方針をとった大学用教科書(Express Yourself in English-A Comprehensive Approach(仮題))の編纂をほぼ完了した。(3)phraseology関連の文献収集、現代英語のデータベース構築作業などの基礎作業とともに、各種学会・研究会で研究報告を行い、日本における英語のphraseology研究をリードした。その研究成果は、多くの実証的英語研究者や英語教育学者にphraseologyという分野の存在を広く知らしめ、その研究が英語教育にも重要な影響を与えることの認識を広めたと考えている。(4)八木は学会や大学で講演を行い、シンポジウム講師を務めた。その中で、日本で行われている学習英文法の問題的を数多く指摘し、その問題点の由来を明らかにした。この影響はさまざまなところに現れてきている。また、八木は雑誌『英語教育』で中学・高等学校などの英語教員などからの質問に回答を続けてきた。研究会などを通じて後継者養成も継続的に行ってきた。
脳発達と記憶・学習を亢進する薬剤の開発

妊娠中のラット母体に軽度ストレスを負荷すると、短時間のストレス負荷(1日30分間の拘束ストレスを妊娠15-17日の3日間負荷、以下では30分ストレス群と呼ぶ)では胎仔脳ニューロンの形態はtrophicな変化を示すが、長時間のストレス(1日4時間の拘束、以下では4時間ストレス群と呼ぶ)では逆にtoxicな変化を示した。これらの結果に基づいて、私たちは、特に30分ストレス群動物の成熟後の記憶・学習行動実験を行い、これら動物の学習効果が有意に亢進することを明らかにした。本研究では、上記のような研究成果をもとに海馬ニューロンの分化・発達と生後の記憶・学習の亢進にかかわる遺伝子を同定するために、DNAチップを用いて検討を行った。30分ストレス群、240分ストレス群、対照群の3群における遺伝子の発現をDNAチップ(各群3枚)で検索した。使用したDNAチップは、Affymetrix社製のRat Genome U34Aで約8800遺伝子を含むものであった。解析した遺伝子の内訳は、receptor (808), channel (187), transporter (138), enzyme (1822), kinase (382), phosphatase (129), transcription factor (57)等である。実験では、胎仔の全脳あるいは海馬からtotalRNAを抽出して解析した。遺伝子発現の再現性、強度、有意な変動の基準によって注目すべき遺伝子をランク付けした。さらに、対照群に比べて、30分ストレス群及び240分ストレス群で増加あるいは減少する遺伝子(520遺伝子)をリストアップした。海馬における有力な遺伝子の中には、神経栄養因子、アルツハイマー病関連遺伝子、神経細胞のガイダンスに係わる遺伝子等が含まれていた。また、全脳と海馬では、変動を示す遺伝子が大きく異なっていた。私たちは、妊娠中に軽度のストレスをラット母体に負荷すると、記憶に重要な海馬を含む胎仔脳ニューロンにおいて形態的発達が促進されることを見出している。さらに、胎生期に軽度ストレスを負荷された胎仔脳の海馬を培養すると、培養下でも海馬ニューロンの分化・発達が促進されることを確認した。これらの結果に基づいて、私たちは、この動物モデルにおいて学習効果が有意に亢進することを明らかにした。本研究は、この動物モデルを用いて脳の発達と記憶・学習効果の促進に関与する遺伝子を、DNAチップを用いて同定することを目的とする。研究1年目では、ラット胎仔の全脳をもちいてaffymetrix社のGeneChipによる遺伝子の解析を行った。今回は、受容体、イオンチャネル、トランスポータ、酵素、カイネース、フォスファターゼ、転写因子などに関連した遺伝子の約8800について検討した。そのために、ラット遺伝子のDNAチップのRat GenomeU34Aを使用した。その結果、脳発達と記憶・学習を促進する動物モデルにおいて対照群と比較して発現が明瞭に増加あるいは減少している遺伝子を十数個同定することができた。現在、胎仔脳海馬だけを取り出し、海馬での遺伝子発現について検討する準備を進めている。海馬での発現遺伝子と全脳での遺伝子の発現を比較して、特に海馬で発現する遺伝子に注目して今後の解析を行う予定である。次年度では、上記の解析で絞り込んだ海馬遺伝子について、海馬培養細胞での形態発達及び生後の記憶・学習効果に対する関与について検討する。

妊娠中のラット母体に軽度ストレスを負荷すると、短時間のストレス負荷(1日30分間の拘束ストレスを妊娠15-17日の3日間負荷、以下では30分ストレス群と呼ぶ)では胎仔脳ニューロンの形態はtrophicな変化を示すが、長時間のストレス(1日4時間の拘束、以下では4時間ストレス群と呼ぶ)では逆にtoxicな変化を示した。これらの結果に基づいて、私たちは、特に30分ストレス群動物の成熟後の記憶・学習行動実験を行い、これら動物の学習効果が有意に亢進することを明らかにした。本研究では、上記のような研究成果をもとに海馬ニューロンの分化・発達と生後の記憶・学習の亢進にかかわる遺伝子を同定するために、DNAチップを用いて検討を行った。30分ストレス群、240分ストレス群、対照群の3群における遺伝子の発現をDNAチップ(各群3枚)で検索した。使用したDNAチップは、Affymetrix社製のRat Genome U34Aで約8800遺伝子を含むものであった。解析した遺伝子の内訳は、receptor, channel, transporter, enzyme, kinase, phosphatase, transcription factor等である。実験では、全脳および海馬の両方について検討した。胎仔の全脳あるいは海馬からtotal RNAを抽出、Poly(A)+RNAの抽出、逆転写酵素によるcDNAの合成、in vitro転写によるビオチン化cRNAの量産・精製、ビオチン化cRNAの断片化、内部標準物質を添加後チップに注入、ハイブリダイゼーション及び洗浄、スキャナーによる情報の読み取り、データ解析の手順で結果を得た。遺伝子発現の再現性、強度、有意な変動の基準によって注目すべき遺伝子をランク付けした。さらに、対照群に比べて、30分ストレス群及び240分ストレス群で増加あるいは減少する遺伝子(520遺伝子)をリストアップした。海馬における有力な遺伝子の中には、神経栄養因子、アルツハイマー病関連遺伝子、神経細胞のガイダンスに係わる遺伝子等が含まれていた。また、全脳と海馬では、変動を下す遺伝子が大きく異なっていた。