hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
卵子が精子をエンドサイトーシスにより取りこむ過程の解析

配偶子膜融合から精子頭部が脱凝縮する過程でエクアトリンタンパク質と相互作用するタンパク質を同定すために精子タンパク質を可溶化する条件の最適化を行った。受精を阻害しない抗エクアトリン抗体EQ70-83を用いて免疫共沈降し質量解析を行なった結果、先体膜タンパク質や膜裏打ちタンパク質、プロテアソーム関連タンパク質を同定することができた。現在、エクアトリンノックアウトマウスや緑色蛍光タンパク質EGFPタグをつけたエクアトリンタンパク質を発現するトランスジェニックマウスを用いて解析を進めている。受精過程の解析のなかでエクアトリンタンパク質は先体反応過程で翻訳後修飾を受けることを発見した。エクアトリンタンパク質を基質としてエクアトリンタンパク質の分子量変化を指標にその酵素の精製条件を検討した結果、その酵素の活性を保ったまま可溶化してくることができた。現在、同定に向けた精製を行ってる。精子・卵子膜融合後のライブイメージング解析の結果、緑色蛍光タンパク質EGFPタグをつけたエクアトリンタンパク質の挙動を抗体によらない方法で追うことができた。解析をin vitroで行うために卵を用いない方法で精子頭部の脱凝縮を起こさせ比較を行っている。受精過程のライブイメージングを最適化する目的で行っていた精子先体反応の解析の結果、各種精子先体タンパク質の挙動と翻訳後修飾変化を詳細にに追うことができるようになった。(現在論文投稿中)26年度が最終年度であるため、記入しない。26年度が最終年度であるため、記入しない。本年度に計画していたequatorinと免疫共沈降する分子の質量解析による同定と、その結果得られた分子の細胞発現用ベクターの作成、さらにはEQT-EGFPマウスにおける遺伝子座を決定し高輝度EQT-EGFPマウスを作製することができ、1年目の計画はすべて達成できた。その結果、2年目に計画していたEQT-EGFPマウスを用いた受精におけるエンドサイトーシス過程のライブイメージングに取りかかることが出来た。その結果、より効率的に受精過程を撮影する条件検討の過程で、先体反応に関する新たな知見が得られ、現在、論文執筆中である。また、GALNT3 Knock outマウスの解析によって得られた知見は、equatorinの糖鎖修飾はMN9抗体認識部位の立体構造形成に重要であることを、精子を用いて初めて示唆する結果となった。以上の成果より、equatorinは先体および先体周囲のマトリクスと相互作用しており、より精密な分子間相互作用の解析が必要であることが明らかとなった。この中には、アミノ酸配列のみでなく糖鎖修飾も含まれる。さらに、今回行った先体反応の解析の結果、equatorinタンパク質に対して酵素活性を示す分子を発見することができた。このことは、真獣類で広くアミノ酸配列が保存されている1回膜貫通型N,O-sialogycoproteinであるequatorinにおいて、広く保存されたドメインおよび糖鎖の重要性、さらには翻訳後修飾変化を解析するうえで重要な基礎情報となる。昨年度は実施目標であるequatorinと共免疫沈降する分子の質量解析による同定と、その結果得られた分子の細胞発現用ベクターの作成を達成した。本年度は以上の結果をもとに解析を進めた。Equatorinの共免疫沈降では先体および先体周囲のマトリクスと相互作用により、非特異的な分子が多く得られ、より精密な分子間相互作用の解析が必要であることが明らかとなった。現在、直接な結合をする分子を得るため試行錯誤を行っている。また、培養細胞を用いた解析ではトランスフェクション効率と過剰発現の影響で解析に問題が発生している。その対策としてFlp-In T-Rexシステムを用いたテトラサイクリンで誘導する安定発現株を作製し、効率の良い系を確立することを開始した。上記問題の対策として、共免疫沈降によらない方法でequatorinと相互作用する分子の同定を開始した。先体反応の解析の結果、equatorinタンパク質に対して酵素活性を示す分子を発見することができた。equatorinの分子量の約半分は糖鎖修飾であり、それらの翻訳後修飾変化の解析はequatorinタンパク質のノックアウトマウスの解析では得られない翻訳後修飾の意義を明らかにすることができる。この酵素を同定するため、活性を指標にこの酵素の精製を行う系を確立した。エンドサイトーシス過程の解析に関してはEQT-EGFPマウスにおける遺伝子座を決定し高輝度EQT-EGFPマウスを作製することができている。EQT-EGFPマウスを用いた受精におけるエンドサイトーシス過程のライブイメージングに取りかかることが出来た。より効率的に初期の受精を撮影する方法を検討している。相互作用する分子の決定後、その分子の動態を解析する。

精子・卵子膜融合後のライブイメージング解析の結果、緑色蛍光タンパク質EGFPタグをつけたエクアトリンタンパク質の挙動を抗体によらない方法で追うことができた。解析をin vitroで行うために卵を用いない方法で精子頭部の脱凝縮を起こさせ比較を行っている。受精過程のライブイメージングを最適化する目的で行っていた精子先体反応の解析の結果、各種精子先体タンパク質の挙動と翻訳後修飾変化を詳細にに追うことができるようになった。(現在論文投稿中)26年度が最終年度であるため、記入しない。26年度が最終年度であるため、記入しない。一年目に計画していた内容は達成し、2年目の計画に着手しているが、細胞骨格と相互作用している精子先体膜タンパク質である性質上、相互作用の解析に困難が予想されるため、楽観視することはできない。しかし、多くの分子との相互作用や糖鎖に関わる情報など有用な結果が得られることが期待できるため。共免疫沈降による相互作用する分子の同定は遅れている状況であるが、別の方法で相互作用する分子の同定は進行している。また、糖鎖修飾などの翻訳後修飾に関する情報も得られているため。質量解析で得られた候補分子とequatorinの相互作用の確認を293T細胞を用いたリコンビナントタンパク質実験により行う。その際、精子成熟過程を経て合成されていないため、先体膜タンパク質として合成された場合と293T細胞によるリコンビナントタンパク質として合成された場合では修飾変化や相互作用の場での生理的条件が異なるという問題点が存在する。そのため、293T細胞を用いた実験としては最低限トランスフェクション効率に依存しない実験をおこなうため、それぞれのリコンビナントタンパク質を安定発現する細胞株を作製する。得られた結果から機能が予想されるドメインに変異を導入したequatorinを発現するマウスを作製することで、最終的には、マウスを用いたin vivo実験で証明を行う。共免疫沈降による相互作用する分子の同定は検証作業のための培養細胞を用いた実験において、トランスフェクション効率と過剰発現が一つの問題となり遅れている。この対策としてFlp-In T-Rexシステムを用いたテトラサイクリン誘導が可能な安定発現株の作製をおこなう。また、equatorinの性質上、間接的に結合した分子が多く、より直接的に結合する分子を得るには慎重を有するため遅れが生じている。対応策として別の方法で相互作用する分子の同定を試みており、順調に進行している。In vivoの実験系では有胎盤類で保存性の高いドメインに変異を導入したマウスを作製し、タンパク質のドメインの機能解析を進める。
高時空間解像度での高速すべり摩擦面の直接観察

高速せん断中の接触点温度と強度の関係を明らかにするために、高時空間分解能での温度分布の直接測定に取り組んだ。我々は、高速せん断される摩擦面の真実接触点の発熱による発光を高速カメラで撮影し、2色温度計の原理を適用することでコンタクトの温度を推定することに成功した。接触点の最高温度は常圧での試料の融点を越え2500°C程度まで上昇していたが、これは真実接触点が数GPa程度の高圧であることを考えれば不思議ではない。近年の地震時の断層運動に匹敵するすべり速度1m/sオーダーで行われた高速摩擦実験から、地震時の高速すべりでは摩擦発熱が引き起こす様々な物理的過程により断層の摩擦抵抗が大きく低下することが示唆されている。本研究では高速すべり(1m/s)まで実現できる回転式摩擦試験機を用いて摩擦実験を行い、高い時間空間解像度の摩擦面その場観察によって、摩擦接触面の接触点分布、温度分布と巨視的な摩擦抵抗との間の定量的関係式の確立を目指す。平成28年度は摩擦面のその場観察をするための試料ホルダーの設計・製作と光学系の選定をした。実験試料としては、関与する物理過程をシンプルにし、さらに剪断面の観察を可能にするために、透明な石英ガラスを用いた。実験では回転式剪断試験機の回転側に外形10mmの円柱状の石英ガラスを取りつけ、これを一定垂直荷重のもとで固定側の試料ホルダーに取りつけた石英ガラス板に押しつけて回転させる。円柱試料と板状試料との間の摩擦接触面は、板試料の接触面と反対側の面から、試料ホルダー下部に取りつけた超広帯域ミラーを通して光学的に観察した。すべり速度1m/sの高速せん断実験で、摩擦面の発光を確認した。モノクロ高速度カメラによる毎秒1000フレームの撮影を実施し、局所的な接触点が瞬間的に光っていることが分かった。二色温度法による温度計測のためにカラー高速度カメラによる撮影を実施し、約1000°C以上の温度を計測するのに十分な画像が撮影できることを確認した。予定通り摩擦面を撮影する実験系を構築できたため。平成29年度は、カラー高速度カメラの画像から温度計測をするための、二色温度法プログラムを作成し、標準光源を撮影して温度校正を実施した。二色比と温度の校正値はカメラの分光感度特性を考慮した理論曲線と良く一致した。前年度に構築した実験系で摩擦実験とその場観察を実施し、作成した二色温度法プログラムで摩擦接触面の温度分布を測定した。接触点の最高温度は常圧での試料の融点を越え2500°C程度まで上昇していたが、これは真実接触点が数GPa程度の高圧であることから説明できる。カラー高速度カメラを用いた二色法ではカバーできない1000度以下の温度を測定するために赤外線カメラによる計測を実施した。赤外線カメラで測定された温度は高くても約200度であり、二色温度法で得られた温度よりもはるかに低い。これは放射率や発熱点のサイズと赤外線カメラの画素分解能、時間分解能の効果で実際の温度よりも低く温度が推定された結果であるが、二色温度法ではこれらの影響を受けない。カラー高速度カメラと二色温度法による高い時空間解像度での温度測定の有効性が確認できた。カラー画像から温度分布を得るためのプログラムを構築する。赤外線カメラによる計測で1000°C以下の温度領域もカバーできるようにする。構築した実験系で系統的に摩擦実験とその場観察を実施する。実験地震物理学予備実験から既存の高速カメラが使用可能なことが分かったため。次年度に実施予定である二色温度法のプログラム作成と赤外線カメラによる1000°C以下の温度領域の測定に使用する。低温域をカバーする赤外線カメラを購入することでより良いデータが得られると考えている。
高度好塩菌における、代謝などのストレス負荷により誘導される抗癌剤排出蛋白の同定

過剰量の様々な栄養物質により活性化する抗癌剤排出ポンプ:抗癌剤を含む培地で培養しなくても、過剰量のグルコース、アミノ酸、アルコール存在下での培養により抗癌剤排出ポンプが誘導されてくることを明きらかにした。この活性化にはこれらの代謝が必須であることが明らかにした。通常の培地で培養した場合でも、少ないながらも排出活性が観察された。更に、これら誘導されてくる排出ポンプが同一であるか否かについて検討をおこなった。これら誘導されてくるポンプのエネルギー系はATPの加水分解であった。一方、ATP依存性は、抗癌剤により誘導されてくるポンプと過剰量アミノ酸により誘導されてくるものと同じであたったが、糖による誘導は異なっていた。このことにより、過剰量の糖により誘導されてくる排出ポンプは、抗癌剤あるいは過剰量アミノ酸により誘導されてくるものと異なることが示唆された。また、抗癌剤により誘導される排出ポンプ、過剰量グルコースにより誘導されるもの、内在的に存在するものは、基質特異性、阻害剤による阻害曲線が異なるという結果も得られており、いくつもの排出ポンプが存在すると推察された。現在、これら排出ポンプの分子種のシークエンスを行っている。5P-糖蛋白類似排出ポンプの遺伝子クローニング:抗癌剤、アミノ酸、及びグルコースにより誘導されてくる排出輸送担体性質が少しずつことなるが、どの輸送担体もATP依存的であり、ATP binding cassette(ABC)を有していると予想される。ABCの一部であるB-motifの保存配列をprimerとしてPCRをかけ、0.6kbp,1kbp,1.8kbpの産物が得られている。このPCR産物は、排出輸送担体の一部であると考えられる。このシークエンスを行った。現在、このPCR産物のなかに、排出ポンプの候補となるクローンをえており、排出ポンプの全シークエンスを行っている。
薬剤排出ポンプの分子集合機構の解明およびポンプ阻害剤のスクリーニング法の開発

日和見感染の主要起因菌である緑膿菌は高度多剤耐性を有するので、治療が難しく大きな問題となっている。本菌の多剤耐性は薬剤排出率が原因し、これまでに7種類のRNDファミリー型薬剤排出ポンプが緑膿菌で見出されている。これらは3種類の成分からなるが、緑膿菌で構成的に発現しているのはMexAB-OprMポンプだけである。薬剤排出にはどの成分も不可欠であるが、これらサブユニットがどの様な形の複合体をつくっているかは不明であり、四次構造の解明はポンプ機能の分子メカニズムを明らかにする上で必須である。そのためにサブユニット間相互作用をin vitro系で調べる方法を適用した。二つのサブユニットにおいて、一方のタンパクにヒスチジンタグを付加し、それをNi NTA樹脂にアプライすると、タンパクはヒスタグを介してNiカラムに吸着される。そこへもう一方のタンパクをカラムにかけた時もしタンパク間相互作用があれば、このタンパクはカラムに吸着される。この方法を用いて(1)MexAとOprMとの相互作用(2)MexAとMexBとの相互作用(3)MexBとOprMとの相互作用を調べた。その結果、これらサブユニット間で全て特異的に相互作用することが明らかとなった。これらの結果から内膜にあるMexBは外膜にあるOprMと直接相互作用し、内膜と外膜をまたぐ薬剤輸送経路を形成することが考えられた。またMexAは相互作用を介してポンプ構造を安定化する。しかしポンプサブユニット間相互作用の阻害剤をスクリーニングするにはこの方法は適さない。そこで簡便な方法として蛍光吸光エネルギー転移(FRET)法を用いた。MexAおよびOprMの特定部位をCysで置換し、それぞれドナーおよびアクセプター蛍光物質で修飾する。両者タンパクを混合した時、相互作用するのでFRETが起こる。これに相互作用を阻害する物質を添加すればFRETが解消されるはずである。現在蛍光物質標識したMexAおよびOprMタンパクの調製を行っている。その後FRET測定を行う予定である。細菌感染症の治療に抗生剤が広く使われ、劇的な効果を現わした。ところがそれにともなって多剤耐性菌が出現するようになった。多剤耐性は多くの場合多剤排出ポンプが原因となっている。日和見感染症の主要原因菌である緑膿菌も複数の排出ポンプを持っているが、最も問題となっているのはMexAB-OprMポンプである。MexBは内膜でトランスポーターとして、OprMは外膜でチャネルとして、MexAはこれらタンパク間のリンカーとして機能すると考えられている。ところがこのポンプはどのような集合体をつくっているかは未だに不明であり、この集合体構造の解明は排出ポンプの機能と構造を考えるための基本となる。そこでMexAB-OprMのタンパク間相互作用を調べた。まず目的とするタンパク質にヒスチジンタグを導入した。これはNiカラムに特異的に結合させるためである。つぎに相互作用するかを調べたいタンパク質をカラムにかける。もし相互作用があればこのタンパクはヒスチジンタグタンパクを介してカラムに吸着する。この方法を用いてまずMexAとOprM間で相互作用があるかを調べた。

MexAに6残基のヒスチジンを付加したMexA-Hisを構築し、このタンパクをNiカラムに結合させ、その後にOprMをカラムにかけた。その結果OprMはカラムに吸着することが分かった。次ぎに緑膿菌の外膜タンパクOprDをOprMのかわりに調べると、吸着は見られなかった。これはMexAとOprMが特異的に相互作用することを示している。同様にMexB-HisとOprM間での相互作用を調べた結果、これらタンパク間で相互作用のあることが判明した。これはポンプの内膜タンパクと外膜タンパクが他の因子の助けなしに結合できることを示している。これは大腸菌のトランスポータHlyBD-TolCとは異なるものであり、薬剤排出機構を考える上で重要な知見と考えられる。緑膿菌(Pseudomonas aeruginosa)は院内感染の主要起因菌であり、多くの抗生剤に高度耐性を示すので、臨床上大きな問題となっている。本菌に多剤耐性をもたらすのは多剤排出ポンプの働きによる。これまでの研究で、緑膿菌では7種類のRNDファミリーに属する排出ポンプの存在が明らかにされているが、その中で最も重要な働きをしているのがMexAB-OprMポンプである。このポンプはマルチコンポーネント型であり、MexBは内膜にあるトランスポーター、OprMは外膜チャネル、MexAは外膜と内膜をつなぐリンカータンパクとして機能すると考えられている。我々はOprMがチャネルであることを再構成系を用いた実験から証明した。排出ポンプ機能の大きな特徴は、細胞内に入って来た薬剤や異物を、ペリプラズムをバイパスして細胞外に排出する点で、これは三種類のサブユニットが集合して、内膜と外膜をまたぐ複合体を形成するからである。したがって複合体形成の基盤となるタンパク間相互作用に関する知見は、ポンプ機能の解明に必須である。タンパク間相互作用をin vitro系で調べるために、サブユニットタンパクにヒスチジン残基を導入し、Ni-NTA樹脂に吸着させる。次にパートナータンパクをこのカラムにかけ、その相互作用を調べた。その結果MexBはMexAと、またOprMとも相互作用すること、MexAはMexBと、またOprMとも相互作用することがわかった。また三種類のタンパクが同時に存在すると、タンパク間相互作用は強くなり、しっかりとした構造になることが示された。この結果、MexBは外膜にあるOprMと直接相互作用し、内膜と外膜をまたぐ構造体を形成していること、MexAはMexBとOprMの二つのタンパクに同時に結合して複合体を安定化することが明らかとなった。
ナノスペース強調分子場下での電子注入NO還元

1nmオーダーのナノスペースを大量に有する活性炭素繊維にPtあるいはRuを高分散し、比較的低温におけるNOの還元を検討した。それには反応過程の高感度追跡のために、気相成分決定用にFT・IRを取りつけた装置を作成した。PtおよびRuの高分散化はNOの150°CでのN_2への還元を促進した。特にRuの促進効果は従来知られている鉄酸化物より有効であった。これらのNOのN_2への還元反応の検討をもとに、電子注入実験装置の設計を行い、同時に10nmオーダーのナノスペースを持つカーボンジェルの調製をも行った。
日本ーカナダ共同学術研究「複合的変換プロセスによる石炭の有効利用」

本研究の目的,日本とカナダの研究者が協力して,カナダに大量に産出する亜瀝青炭,褐炭の新しい高度利用技術を開発する点にある。さらに,それを通じて日加両国により緊密な信頼・協力関係を構築して,石炭資源の輸出・輸入国として将来に渡って科学技術交流を続けていく途を開くことをも目的としている。本研究は単年度申請であるが,内容的には昭和62,63年度に実施した「日本ーカナダ共同学術研究ー石炭高度利用プロセスの開発」と,平成元年度実施の「日本ーカナダ共同学術研究ー複合的変換プロセスによる石炭の総合利用」に続くもので,本年度は4年間の研究を総括し,今後の新しい展開の展望を切り開くことを大きな目的とした。そのために,4年間の研究を総括する研究集会をバンク-バ-で開催することとし,新年度早々からそれに向けての準備を両国で開始した。日本側では,カナダ訪問を単に研究集会参加にとどめるのではなく,広くカナダの石炭利用技術開発の現況,さらには石炭鉱業の状況を調査するのに好機会であるとの位置付けの下に訪問計画を作成した。さらに,今回の訪問調査は企業関係者にとっても極めて有意義であると考えられたので,石炭関連の企業研究者に参加を呼びかけたところ,4名の参加を得ることができた。そして,9月23日より10月4日の日程で,日本側研究分担者の内の6名と上記の企業関係者4名の併せて10名がカナダ訪問調査を実施した。調査の概要を以下の記す。9月2325日は,British Columbia大学で開催された日加合同研究集会に参加した。カナダ側からは,大学,政府機関,民間併せて21名の参加があり,両国より併せて23件の研究発表が行われた。そのうち,日本側参加者による発表は9件であった。副学長R.Miller博士は歓迎の辞の中で,カナダ政府が向う4年間に2400万ドルを日加の大学間共同研究に支出する決定をしたことを紹介し,一層強力な共同研究の推進を強調された。研究発表は,文部省の重点領域研究における石炭研究の紹介,石炭チャ-のガス化反応性の検討,触媒ガス化機構の解明,真空熱分解,新迅速熱分解法,超臨界ガス抽出,高温脱硫剤の開発等の本等の本共同研究で得られた成果と,日加両国で進行している石炭ガス化による水素製造,IGCCプロジェクトの紹介,BC州の石炭資源の紹介と多岐に渡った。別途開催された会合では,今後の共同研究の進め方について議論された。カナダ側は上記の政府の援助に基き,何等かの型で共同研究を継続したいとの強い意向を示した。日本側では,より実質的な共同研究の推進のために,平成4年度に装いを新たにした共同研究の実施を文部省に申請することにした。バンク-バ-での研究集会出席後,アルバ-タ州政府研究所(ARC),コ-ルバレ-炭鉱を経営するLuscar Sterco社,Waterloo大学,それにカナダ連邦政府エネルギ-・資源研究所(CANMET)を歴訪した。ARC,CANMET,Waterloo大学は,British Columbia大学と共に本共同研究のカナダ側の拠点であった。ARCとCANMETでは石炭研究施設を見学するとともに,石炭セミナ-を開催した。ARCでは,アルバ-タ州の石炭資源の現況,石炭利用技術開発の状況を詳細に視察することができた。Luscar Sterco社では,2ケ所の露天掘りピットと選炭施設を見学できた。雄大なロッキ-山脈の麓に位置する本炭鉱の見学は,日本側参加者に大きな感銘を与えた。カナダ西部炭の多くま我国に輸出されており,今後のエネルギ-安定供給確保のためにも日加両国の一層緊密な協力関係構築の必要性が痛感された。CANMETでは,IGCCプロジェクトを支援する気流層ガス化装置,低品位炭の高効率燃焼ボイラ-,Coーprocessing等に関する最新の研究設備を見学する機会を得,カナダ政府の指向する方向を察知できた。このように,本共同研究の締めくくりとしての訪問調査を成功裏に終えることができた。本調査の成果は,過去3年の成果を併せて157頁に及ぶ報告書にまとめ,関係諸機関・研究者に配布した。平成4年度からは,より実質的な共同研究を実施すべく準備を進めている。文部省ならびに関係各位の一層の御理解と御協力をお願いする次第である。

さらに,今回の訪問調査は企業関係者にとっても極めて有意義であると考えられたので,石炭関連の企業研究者に参加を呼びかけたところ,4名の参加を得ることができた。そして,9月23日より10月4日の日程で,日本側研究分担者の内の6名と上記の企業関係者4名の併せて10名がカナダ訪問調査を実施した。調査の概要を以下の記す。9月2325日は,British Columbia大学で開催された日加合同研究集会に参加した。カナダ側からは,大学,政府機関,民間併せて21名の参加があり,両国より併せて23件の研究発表が行われた。そのうち,日本側参加者による発表は9件であった。副学長R.Miller博士は歓迎の辞の中で,カナダ政府が向う4年間に2400万ドルを日加の大学間共同研究に支出する決定をしたことを紹介し,一層強力な共同研究の推進を強調された。研究発表は,文部省の重点領域研究における石炭研究の紹介,石炭チャ-のガス化反応性の検討,触媒ガス化機構の解明,真空熱分解,新迅速熱分解法,超臨界ガス抽出,高温脱硫剤の開発等の本等の本共同研究で得られた成果と,日加両国で進行している石炭ガス化による水素製造,IGCCプロジェクトの紹介,BC州の石炭資源の紹介と多岐に渡った。別途開催された会合では,今後の共同研究の進め方について議論された。カナダ側は上記の政府の援助に基き,何等かの型で共同研究を継続したいとの強い意向を示した。日本側では,より実質的な共同研究の推進のために,平成4年度に装いを新たにした共同研究の実施を文部省に申請することにした。バンク-バ-での研究集会出席後,アルバ-タ州政府研究所(ARC),コ-ルバレ-炭鉱を経営するLuscar Sterco社,Waterloo大学,それにカナダ連邦政府エネルギ-・資源研究所(CANMET)を歴訪した。ARC,CANMET,Waterloo大学は,British Columbia大学と共に本共同研究のカナダ側の拠点であった。ARCとCANMETでは石炭研究施設を見学するとともに,石炭セミナ-を開催した。ARCでは,アルバ-タ州の石炭資源の現況,石炭利用技術開発の状況を詳細に視察することができた。Luscar Sterco社では,2ケ所の露天掘りピットと選炭施設を見学できた。雄大なロッキ-山脈の麓に位置する本炭鉱の見学は,日本側参加者に大きな感銘を与えた。カナダ西部炭の多くま我国に輸出されており,今後のエネルギ-安定供給確保のためにも日加両国の一層緊密な協力関係構築の必要性が痛感された。CANMETでは,IGCCプロジェクトを支援する気流層ガス化装置,低品位炭の高効率燃焼ボイラ-,Coーprocessing等に関する最新の研究設備を見学する機会を得,カナダ政府の指向する方向を察知できた。このように,本共同研究の締めくくりとしての訪問調査を成功裏に終えることができた。本調査の成果は,過去3年の成果を併せて157頁に及ぶ報告書にまとめ,関係諸機関・研究者に配布した。平成4年度からは,より実質的な共同研究を実施すべく準備を進めている。文部省ならびに関係各位の一層の御理解と御協力をお願いする次第である。
エピタキシャル成長におけるナノ構造自己形成機構の解明と制御

エピタキシャル成長におけるナノ構造自己形成機構の解明と制御の研究を行い以下の知見を得た。1.段差基板上に自己形成されるリッジ量子細線の光学的性質について有限要素法計算をおこない検討を加えた結果、量子細線の偏光特性は細線内の正孔の波動関数分布に大きく依存し、その結果リッジ細線の偏光は垂直の成分をもつ事、また実際の細線では揺らぎによる非対称性が存在しておりこの場合偏光方向は左右どちらかに傾いた斜め方向になることが明らかとなった。2.(111)B微傾斜基板上のGaAs成長で生じるステップバンチングの発生と消滅の自己形成機構について検討を加えた。GaAsを成長しステップバンチングを発生した後、InGaAs積層したサンプルを作製し、界面構造を走査型断面透過電子顕微鏡(STEM)により観察した。その結果、InGaAsとGaAs表面に形成されるステップバンチングがGaAs/AlAs超格子成長によって凹部の成長が促進され急速に平坦化し消滅する事が明らかとなった。またInGaAs層で観察されたバンチングの振幅は5nmであり、GaAsの振幅よりも大きくまたバンチング周期も異なっていることが明らかとなった。その理由としてIn原子のGaAs層へ侵入もしくは表面偏析が関係しているものと推測している。3.ナノ構造の組成制御を目的として混晶を短周期超格子に置き換えるデジタルアロイの周期効果を検討した。Al組成0.3の混晶に相当するGaAs/AlAs超格子を作製しx線回折とフォトルミネッセンス測定により評価した。とくに周期2.5原子層のものはAlAs層の厚みが1分子層に満たないのにも係わらず明瞭な超格子反射が観測され、AlとGa原子の混晶化が極めて少ないことが明らかとなった。また周期が5原子層より小さい領域では発光エネルギーとピーク半値幅に特異な性質が現れ、クローニッヒ・ペニーモデルとの比較の結果、超格子を周期長により多重量子井戸的領域とデジタルアロイ的領域に分けられることが判明した。エピタキシャル成長におけるナノ構造自己形成機構の解明と制御の研究を行い以下の知見を得ている。1.段差基板上に自己形成されるリッジ量子細線の光学的性質について有限要素法計算をおこない検討を加えた結果、量子細線の偏光特性は細線内の正孔の波動関数分布に大きく依存し、その結果リッジ細線の偏光は垂直の成分をもつ事、また実際の細線では揺らぎによる非対称性が存在しておりこの場合扁光方向は左右どちらかに傾いた斜め方向になることが明らかとなった。GaAsを成長しステップバンチングを発生した後、InGaAs積層したサンプルを作製し、界面構造を断面透過電子顕微鏡(TEM)により観察した。その結果InGaAs層上下の断面形状の違いからGaAs表面に形成されるステップバンチングがInGaAsの成長によって凹部の成長が促進され急速に平坦化し消滅する事が明らかとなった。またTEMで観察されたバンチングの周期は80-90nmであり、走査原子間力顕微鏡(AFM)のバンチング周期は20-30nmと異なっていることが明らかとなった。その理由として20nm程度のバンチングが45個ごとオーダー化し、複数の周期性をもっているものと推測している。Al組成0.3の混晶に相当するGaAs/AlAs

超格子を作製しx線回折とフォトルミネッセンス測定により評価した。超格子の周期は2.8nm、1.4nm、0.7nm、0.28nmとした。とくに周期0.7nmのものはAlAs層の厚みが1分子層に満たないのにも係わらず明瞭な超格子反射が観測され、AlとGa原子の混晶化が極めて少ないことが明らかとなった。エピタキシャル成長におけるナノ構造自己形成機構の解明と制御の研究を行い以下の知見を得た。1.段差基板上に自己形成されるリッジ量子細線の光学的性質について有限要素法計算をおこない検討を加えた結果、量子細線の偏光特性は細線内の正孔の波動関数分布に大きく依存し、その結果リッジ細線の偏光は垂直の成分をもつ事、また実際の細線では揺らぎによる非対称性が存在しておりこの場合偏光方向は左右どちらかに傾いた斜め方向になることが明らかとなった。2.(111)B微傾斜基板上のGaAs成長で生じるステップバンチングの発生と消滅の自己形成機構について検討を加えた。GaAsを成長しステップバンチングを発生した後、InGaAs積層したサンプルを作製し、界面構造を走査型断面透過電子顕微鏡(STEM)により観察した。その結果、InGaAsとGaAs表面に形成されるステップバンチングがGaAs/AlAs超格子成長によって凹部の成長が促進され急速に平坦化し消滅する事が明らかとなった。またInGaAs層で観察されたバンチングの振幅は5nmであり、GaAsの振幅よりも大きくまたバンチング周期も異なっていることが明らかとなった。その理由としてIn原子のGaAs層へ侵入もしくは表面偏析が関係しているものと推測している。3.ナノ構造の組成制御を目的として混晶を短周期超格子に置き換えるデジタルアロイの周期効果を検討した。Al組成0.3の混晶に相当するGaAs/AlAs超格子を作製しx線回折とフォトルミネッセンス測定により評価した。とくに周期2.5原子層のものはAlAs層の厚みが1分子層に満たないのにも係わらず明瞭な超格子反射が観測され、AlとGa原子の混晶化が極めて少ないことが明らかとなった。また周期が5原子層より小さい領域では発光エネルギーとピーク半値幅に特異な性質が現れ、クローニッヒ・ペニーモデルとの比較の結果、超格子を周期長により多重量子井戸的領域とデジタルアロイ的領域に分けられることが判明した。
行政分野で働く保健師のキャリア志向と職務満足度-適材適所の検討-

10府県における行政保健師7,170名を対象とし,自記式質問紙調査を行った.有効回答2,003名(27.9%)をもとに主因子分析を行った結果,5因子19項目が選定され,各因子に管理志向,協働志向,奉仕志向,専門志向,安定志向と命名した.累積寄与率46.9%,クロンバッハの信頼係数α=0.863(各志向はα=0.612-0.821)であった.職務満足度については,職務満足度は仕事満足度(R^2=0.46),仕事満足度と上司満足度(R2=0.68)に寄与するところが大きかった.10府県における行政保健師7,170名を対象とし,自記式質問紙調査を行った.有効回答2,003名(27.9%)をもとに主因子分析を行った結果,5因子19項目が選定され,各因子に管理志向,協働志向,奉仕志向,専門志向,安定志向と命名した.累積寄与率46.9%,クロンバッハの信頼係数α=0.863(各志向はα=0.612-0.821)であった.職務満足度については,職務満足度は仕事満足度(R^2=0.46),仕事満足度と上司満足度(R2=0.68)に寄与するところが大きかった.本研究の目的は,行政分野で働く保健師(行政保健師)に関して,所属機関および発達期別に,キャリア志向と職務満足度からみた適材適所のあり方について検討することである。10府県における行政保健師7,170名を対象に,自記式質問紙による郵送1次調査を実施した。回収数は2,065名(28.8%),有効回答数2,003名(97.0%)であった。1次調査実施の約2ヵ月後,協力同意者252名(対象数の3.5%,回収数の12.2%)に対して再テストを実施した。再テストの回収数は238名(94.4%),有効回答数223(93.75%)名であった。1次調査における対象の概要は,保健師としての経験年数は14.5±9.6年目,所属機関は府県15.1%,政令市・中核市21.5%,市町村62.2%であり,配属部署は保健部署59.6%,女性99.0%であった。保健師キャリア志向の基礎分析として,25項目についてバリマックス回転による主因子分析を行った結果,5因子19項目が選定され,各因子に管理志向,協働志向,奉仕志向,専門志向,安定志向と命名した。クロンバッハの信頼係数はα=0.863(各志向ではα=0.612-0.821)であり,内的整合性は良好と考えられる。今後は,所属機関および発達期別にキャリア志向ならびに職務満足度の回答得点の平均値に関してt検定あるいは一元配置分散分析を行うとともに,キャリア志向と職務満足度の関連に関して相関係数を算出する。また,データ分析の結果とその解釈について,統計学ならびに研究分野の専門家とともに,キャリア志向と職務満足度からみた適材適所のあり方についての妥当性を検討し,学会での発表および論文を投稿していく予定である。【目的】本研究の目的の1つとして,行政分野で働く保健師(行政保健師)の職務満足度と基本属性等との関連について検討した。【方法】10府県における行政保健師7,170名を対象に,自記式質問紙による郵送調査を実施した。質問紙の内容は,基本属性,職務経験,職務記述指標72項目,職務関与概念尺度4項目とした。調査協力の有無にかかわらず職務評価にはつながらないことを告知し,無記名とした。データ分析はSPSS15.0を用い,有意確率は5%水準とした。【結果】回収数2,065名(28.8%),有効回答数1,759名(85.20%),経験年数14.1±9.4年,女性1,741名(99.0%),市町村1,101名(62.6%)であった。職務満足度および仕事満足度が高かったのは,保健部署および保健福祉部署,役職あり,ロールモデルの存在あり,家族の仕事の理解度と協力の程度であった。なお,職務満足度は上司満足度(R^2=0.581),上司満足度と仕事満足度(R^2=0.866)に寄与するところが大きかった。各質問項目の内訳を検討すると,上司満足度は必要な時に頼りになる(R^2=0.578),仕事満足度は楽しい(R^2=0.535)の項目で5割以上の寄与となった。職務満足度と職務関与の相関係数はr=0.320であった。【考察】保健部署以外への配置が増加してきているが,保健部署に比べ職務満足度は低く,特に仕事自体に対する満足度が低かった。他分野配属の保健師自身および他職員に対して,保健師の専門性発揮の必要性を普及することが肝要と考える。また,単独あるいは少数配置における職場環境の整備,ロールモデルの存在,必要時に頼りになる管理職の教育の重要性が示唆された。今後は,保健師キャリア志向と職務満足度の関連について検討し,適材適所のあり方について考察する予定である。【目的】本研究の目的は,行政分野で働く保健師(以下,行政保健師とする)に求められる能力の自己評価について,基本属性および職務経験との関連を検討することとした。【方法】

10府県における行政保健師7,170名を対象に,自記式質問紙による郵送調査を実施した。求められる能力に関しては,厚生労働省による地域保健従事者の資質の向上に関する検討会報告書(2003)を参考にした47項目を用い,4件法によって自己評価を求めた。職務評価にはつながらないことを明記した上で無記名とし,大学医学系研究科倫理委員会の審査後に調査を実施した。【結果】回収数は2,065名(28.8%),有効回答数1,818名(88.0%),行政保健師としての経験年数は14.4±9.5年であった。ステップワイズによる重回帰分析の結果,いずれの項目も行政保健師としての経験年数,組織づくり立ち上げの経験あり,自主グループ立ち上げの経験あり,保健計画策定への関与ありに寄与するところが大きく,求められる能力全体としてはR^2=0.285,基本的な能力はR^2=0.162,行政職員としての能力はR^2=0.320,専門職員としての能力はR^2=0.271であった。【考察】単に経験年数を積むだけでなく,組織づくりや自主グループの立ち上げあるいは保健計画策定への関与といった住民との協働活動を主体的に行う経験を有することによって,行政職員あるいは専門職員としての能力を発揮し,自らの役割を自覚することにつながると考えられる。さらに,それらの経験は,行政保健師自身が自信を持った実践活動に至るために有効であると考えられる。但し,本研究は自己評価による採点であるため,実践能力の実態や活動の質評価につながる能力評価として示すには限界がある。
病原性酵母カンジダ・アルビカンスの染色体組換えを制御するタンパク質の検索

日和見感染菌である酵母C.albicansのゲノム全体に存在している反復配列RPS1は、染色体再配列の生じている部位に局在している。このような反復配列がゲノム上に存在している場合、組換えを制御するタンパク質が細胞中に存在しなければ、ランダムな組換えが生じ、ゲノムの不安定性を引き起こすと考えられる。本研究ではC.albicansの反復配列RPS1に結合する調節タンパク質をゲル・シフト法により探索した。ゲル・シフト法では、ポリアクリルアミド電気泳動において、DNA断片とタンパク質の複合体の移動度は遊離のDNA断片に比べて遅くなるという原理を利用する。RPS1配列から30100bpのDNA断片を調整、ラベルし、C.albicansからのタンパク質抽出液と反応させた。その結果、30bpのCOM29に対して強く結合するタンパク質と、RNAとして発現している領域のDNA断片に結合するタンパク質を検出できた。COM29配列に結合するタンパク質は、大過剰の未標識のプローブを加えた競合実験においてもシグナルが観察される事から配列特異性が非常に高く、かつ結合力がかなり大きい事が分かった。さらにサウス・ウエスタン法によりCOM29配列に結合するタンパク質の大きさを調べたところ、49、38、26.8kdの3つのポリペプチドが検出された。COM29配列はRPS1ユニット中に5個存在しているため、このタンパク質がRPS1内部、さらにはRPSクラスター全体をパッケージングすることにより、組換えの鋳型として機能させなくしている可能性が考えられる。現在、COM29配列をCNBr-sepharose 4Bに結合させたDNAアフィニティーカラムを作製し、結合タンパク質の単離を試みている。
成人T細胞白血病に対する免疫療法・ウイルス療法の開発

ヒトT細胞白血病ウイルス(HTLV-I)による成人T細胞白血病(ATL)の新規治療法をラットモデルで開発・検証した。本研究では、MHC-I単鎖三量体による抗HTLV-I免疫誘導システム、および低病原性ワクシニアウイルスm8ΔのHTLV-I腫瘍に対する腫瘍溶解性ウイルスとしての有用性を評価し、動物モデルにおいてHTLV-I腫瘍の増殖を抑制する可能性を示す結果が得られた。本研究成果は、ATLの発症予防・治療に役立つ知見になるものと考えられる。ラットHTLV-I感染モデルにおいて、抗HTLV-I免疫を効率的に誘導することを目的として、これまでの研究で確立したHTLV-I Taxエピトープ(Tax180-188)を提示するMHC-I単鎖三量体を応用し、レンチウイルスベクターおよびワクシニアベクターを用いた単鎖三量体発現系を構築した。樹立した両ベクターをそれぞれの感受性細胞に感染させ、Tax180-188特異的CTL細胞株(4O1/C8)と共培養したところ、どちらのベクターを感染した細胞においても4O1/C8細胞からのIFN-γ産生誘導が確認された。このIFN-γ産生はHIV-1 Envエピトープを提示する単鎖三量体発現ウイルスベクター感染細胞では誘導されないことから、構築したベクターがTax特異的にT細胞を活性化できることが確認された。次に、ベクターとして用いているワクシニアウイルスの腫瘍溶解性ウイルスとしての有用性について、ワクシニアウイルスをHTLV-I感染ラットT細胞株のFPM1細胞に感染させて解析した。その結果、FPM1細胞においてはワクシニアウイルスの増殖が起るとともに、その後にHTLV-I感染細胞が死滅することが確認された。このウイルス増殖、および細胞死は正常T細胞や、Tax特異的CTL細胞株では起らないことが確認されたことから、HTLV-I感染細胞の中には、ワクシニアウイルスによる腫瘍溶解活性に対する感受性が高いものが存在することが示された。本研究の成果は、Taxエピトープを提示するワクシニアウイルスが、Tax特異的CTL誘導と、HTLV-I感染細胞に対する腫瘍溶解作用の両面で有用であることを示唆しており、今後、HTLV-Iによる成人T細胞白血病の発症予防・治療に役立つ可能性が期待される。樹立したベクターに感染した細胞は、Tax180-188特異的CTL細胞株(4O1/C8)のIFN-γ産生を誘導することから、Tax特異的にT細胞を活性化できることが確認された。次に、ベクターとして用いているワクシニアウイルスの腫瘍溶解性ウイルスとしての有用性について、ワクシニアウイルスをHTLV-I感染ラットT細胞株のFPM1細胞に感染させて解析したところ、FPM1細胞においてはワクシニアウイルスの増殖が起るとともに、その後細胞死に至ることが確認された。このウイルス増殖、および細胞死はTax特異的CTL細胞株では起らず、しかもワクシニアウイルスとTax特異的CTLの併用によりHTLV-I感染細胞の細胞死が増強されることも確認できたことから、腫瘍溶解に伴いCTL活性の増強効果も期待できることが示唆された。さらに、同系ヌードラットを用いたHTLV-I腫瘍モデルにおいて、ワクシニアウイルスによる腫瘍溶解活性により腫瘍増殖が抑制可能であることが確認された。ラットHTLV-I感染モデルにおいて、抗HTLV-I免疫応答とHTLV-I感染細胞の溶解を同時に誘導することを目的として、HTLV-I Taxエピトープ(Tax180-188)を提示するMHC-I単鎖三量体を発現するワクシニアウイルスベクターを構築した。樹立したウイルスベクターを感染させたHTLV-I非感染ヒト由来細胞は、ラット由来Tax180-188特異的CTL細胞株(401/C8)のIFN-γ産生を誘導できることから、ラットMHC-Iによりエピトープが適切に提示されていることが確認された。次に、ワクシニアウイルスの腫瘍溶解性ウイルスとしての有用性について、これまでに樹立した種々のHTLV-I感染ラットT細胞株を用いて解析したところ、FPM1細胞等の多くの細胞株において、ワクシニアウイルスの増殖とともに、細胞増殖が抑制されることが確認された。他方、FCMT1細胞においては、ワクシニアウイルスが増殖している条件下で、細胞増殖抑制が弱い傾向が認められ、腫瘍溶解活性に抵抗性を示すことが示唆された。

また、FPM1と401C8の混合培養中にワクシニアウイルスを感染させた場合には、FPM1細胞のみに感染して細胞死が誘導されるとともに、CTL非存在時に比べてFPM1細胞の細胞死が増強されることも確認できたことから、ワクシニアウイルスとCTLとの相乗効果の可能性も示唆された。さらに、同系ヌードラットを用いたHTLV-I腫瘍モデルにおいて、ワクシニアウイルスによる腫瘍溶解活性により腫瘍増殖が抑制可能であることが確認された。本研究の成果は、Taxエピトープを提示するワクシニアウイルスが、Tax特異的CTL誘導と、HTLV-I感染細胞に対する腫瘍溶解作用の両面で有用であることを示唆しており、今後HTLV-Iによる成人T細胞白血病の発症予防・治療に役立つ可能性が期待される。
マイクロＲＮＡによる骨髄間葉系幹細胞の分化の運命付けに関する統合的研究

本研究において、骨芽細胞分化に重要な役割を持つ転写因子Osterixによって転写制御を受けるマイクロRNAを同定することができた。このマイクロRNAは、骨芽細胞分化を促進する遺伝子を標的として抑制し、またそのマイクロRNA自体の転写がOsterixにより抑制的に制御されていることが分かった。さらにこのマイクロRNAが骨芽細胞分化を負に制御することも明らかとなった。従って、本研究により、骨髄間葉系幹細胞において骨芽細胞の方向性に影響を与えるマイクロRNAを明らかにすることができた。これにより、骨粗鬆症や肥満を含む成人病の発症過程におけるmiRNA関与機構の解明が一段と明らかになった。平成24年度は、前年度に得られたデータを中心に論文化を進めるべく、さらに必要なデータを収集する実験を進めた。具体的には、Osterixをノックダウンさせたサンプルで発現が顕著に上昇していたマイクロRNAであるmiR-Xについて、前年度に得られた以下のデータについて、再現性を確認するために複数回の実験を行った。すなわち、qPCRによるmiRNA発現上昇の確認、miRNAプロモーター領域のOsterixによる転写制御を調べるためのレポーターアッセイ、骨芽細胞分化度合いの定量のためのqPCRやAlkaline phosphatase染色などである。さらに、骨芽細胞分化度合いについては、Osteocalcinに加えて、Alkaline phosphatase, Osterixについても定量を行い、データをさらに補完すると共に、実験の正確性を検証した。また、骨芽細胞分化時におけるmiR-Xの発現変動を調べるために、骨芽細胞分化過程での経時的なサンプルを採取し、qPCR法によりmiR-Xの経時発現変動パターンを詳細に解析した。その結果、miR-Xは骨芽細胞分化時に緩やかな発現上昇が見られるが、非分化誘導サンプルでは更に劇的な上昇が見られ、分化誘導サンプルと非誘導サンプルの間でのmiR-X発現パターンの顕著な違いが観察された。また、miR-Xが標的とする候補遺伝子2つについて、miR-Xによる制御関係をレポーターアッセイを行って解析した。その他、新たにRunx2をRNA干渉法でノックダウンさせ、その影響を受けて発現変動するmiRNAを発現アレイを用いて解析し、発現が変動する複数のmiRNAを同定した。それ以外のC/EBPbやSmad1についても順次miRNA発現アレイ解析を実施するべく、研究室内にてすでに所有していたsiRNAを用いて、ノックダウン効率の検討などの実験を行った。Osterixをノックダウンさせたサンプルで発現が顕著に上昇したマイクロRNAであるmiR-Xについて、Osterixによる転写支配を受けているかどうか、さらに骨芽細胞分化に対する影響を確認するため、qPCRによるmiRNA発現上昇の確認、miRNAプロモーター領域のレポーターアッセイ、骨芽細胞分化度合いの定量のためのqPCRやAlkaline phosphatase染色など行って解析した。その結果、miR-Xは骨芽細胞分化を抑制するマイクロRNAであり、またそれ自身はOsterixによって転写抑制を受けるものであることが明らかとなった。miR-Xの骨芽細胞分化過程での発現変動を調べるために、骨芽細胞分化誘導時のサンプルを経時的に採取し、qPCR法によりmiR-Xの経時発現変動パターンを詳細に解析した。さらに、miR-Xが抑制制御を行っていると考えられる標的候補遺伝子を同定し、その制御関係をレポーターアッセイを行って検証した。これらの研究成果より、間葉系幹細胞が脂肪細胞・骨芽細胞などへの分化に寄与するマイクロRNAを探索するために、本研究で行った一連のアプローチを用いることが有効であることが示された。平成23年度はまず、PPARγとOsterixをRNA干渉法でノックダウンさせたサンプルを用いて既に得られていたmiRNA発現アレイデータについて詳細に解析した。Osterixをノックダウンさせたサンプルで発現が顕著に上昇していた2つのmiRNA(miR-X, miR-Y)に特に着目し、以後の解析を行った。これらの発現変動を定量的RT-PCRを用いて詳細に確認した結果、miR-Xでは発現アレイと同様の発現量上昇が確認された。しかしmiR-Yの発現変動は確認されなかったことから、miRNA発現アレイデータには擬陽性データも含まれ、発現アレイで検出されたmiRNA発現変動量はその都度定量的RT-PCRで確認する必要性が認識された。また、miR-Xをコードしているホスト遺伝子の転写量も、成熟miRNA-Xの発現変動と同様に上昇している事が定量的RT-PCRにより確認できた。次に、miR-Xホスト遺伝子自体がOsterixによる発現制御を受けているかを調べるために、ホスト遺伝子上流プロモーター領域の転写活性を測定した結果、Osterixのノックダウンにより転写活性の増大が認められた。

さらに、miR-Xを細胞内に導入後に骨芽細胞分化刺激を加えた結果、骨芽細胞への分化が抑制される事が示された。このことから、miR-Xは骨芽細胞分化を抑制する性質を持ち、その発現はOsterixによって負の制御を受けていることが初めて示された。年度当初は更に別の転写因子をノックダウンしたサンプル、及び分化誘導刺激後早期に採取したサンプルを用いて発現アレイ解析を行う計画であった。しかし、上述した一連の成果が得られたため、これを早期に論文としてまとめていく必要が生じた。このため、本成果に関して論文化に必要な付加的データを収集するための実験を集中的に行う方向に切り替えて、研究を実施した。miR-Xが骨芽細胞分化キー転写因子であるOsterixによって転写制御を受けることや、miR-Xが骨芽細胞分化を抑制するマイクロRNAであることを骨子とする論文を作成するための主なデータを平成24年度までに概ね取得することができた。また、miR-Xが具体的にどの遺伝子を制御することで、骨芽細胞の抑制を行っているかについて、複数回のレポーターアッセイを実施して解析を行い、制御関係を一部示唆するデータが得られた。ただし、このデータについては、論文のデータとして示すために、さらに十分な結果を取得する必要がある。今年度はこれに関して急ぎデータを取得し、実際の論文提出を行いたい。転写因子がmiRNA転写調節を行うことを調べるためのレポーターアッセイは平成24年度に実施する計画であった。しかし、OsterixがmiR-Xの転写調節を行うデータに基づいた新知見については早急に論文化を行っていく必要性が高いことから、レポーターアッセイについては一部平成23年度に前倒しして実施した。また、同定されたmiRNAが骨芽細胞分化に実際に影響を及ぼすかどうかを調べる実験も平成24年度に行う計画を立てていたが、同様の理由から平成23年度に前倒しして実施した。一方で、C/EBPβやSmad1などの転写因子についてもRNAiでノックダウンして発現アレイ解析を行う計画を平成23年度中に含めていたが、OsterixとmiR-Xに関する系統的な新知見が得られたため、これを早期に論文化する方向性により注力した。これにより、新たなmiRNA発現アレイ実験については、平成24年度に行うこととした。全体の目的に照らし、新知見を蓄積して成果として論文にまとめていく必要性も加味した上でこれらを総合的に考えると、本研究は概ね順調に進展していると判断できる。miR-XとOsterixの関係性については、ほとんどのデータを取り終えた。今後は、miR-Xが標的対象とする遺伝子についての制御関係の検証実験を引き続き進め、論文化に必要なデータを取り揃えて投稿に持って行きたいと考えている。