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糖類アモルファス組織の乾燥形式過程とその分子包埋機能の利用

本研究課題では糖類アモルファス組織の乾燥形成過程とその分子包埋機能に着目し,糖類アモルファス構造による酵素の熱安定化作用について実験による検討を行った.以下に概要を述べる.1.糖類による酵素の熱安定化作用の検討数種類の糖(グルコース,スクロース,トレハロース,etc.)と3種類の酵素(ADH,LDH,MDH)を用いて糖の種類による酵素の熱安定化作用の違いについて調べた.酵素を含む糖類水溶液(酵素濃度0.44mg/ml,糖濃度5.5×10^<-2>mmol/ml)を均質な試料が得られるように液体窒素を用いて瞬間凍結し,自作の装置により-15°Cで凍結乾燥した.得られた試料を高温(65°C)の乾燥空気中に保管して,酵素活性の経時変化を調べた.その結果トレハロースが最も活性保持の度合いが高いこと,還元糖ではメイラード反応により失活が生じやすいことがわかった.2.酵素活性保持の度合いと糖類のアモルファス化度との関係X線回折によりアモルファス化度を測定したところ,酵素活性保持の度合いが高いトレハロースではアモルファス化度が高く,酵素活性の度合いが低いスクロースではアモルファス化度が低いことがわかった.また,スクロールにおいても凍結乾燥条件を変更してアモルファス化度が高い試料を作製したところ,酵素活性保持の度合いが高くなることがわかった.これより糖類アモルファスは酵素を包埋することで糖類が結晶化した状態よりも高い熱安定化作用を示すと考えられる.3.糖類アモルファス構造の熱安定化作用に関する分子論的検討糖類アモルファス構造による熱安定化作用の微視的機構として,糖-酵素間の水素結合が酵素の高次構造を保持すると考えられる.そこで糖-酵素間の水素結合を検証するためにFT-IRで解析を行った.糖,酵素としてスクロースとLDHを用い,スクロース濃度が0,4,10,20,30mg/mlの5種類で,LDH濃度3.5mg/mlの水溶液を調製し、凍結乾燥試料を作製した.XRDならびにFT-IRの測定より,スクロース濃度4mg/mlの凍結乾燥試料ではLDH本来の結合水よりはるかに少ない水分しか含有していないにもかかわらず比較的多くの水素結合が生じていることがわかった.これより糖類アモルファス組織中において糖-酵素間に水素結合が生じており,この水素結合により酵素が熱安定化されていると考えられる.本研究課題では糖類アモルファス組織の乾燥形成過程とその分子包埋機能に着目し,糖類アモルファス構造による酵素の熱安定化作用について実験による検討を行った.以下に概要を述べる.1.糖類による酵素の熱安定化作用の検討数種類の糖(グルコース,スクロース,トレハロース,etc.)と3種類の酵素(ADH,LDH,MDH)を用いて糖の種類による酵素の熱安定化作用の違いについて調べた.酵素を含む糖類水溶液(酵素濃度0.44mg/ml,糖濃度5.5×10^<-2>mmol/ml)を均質な試料が得られるように液体窒素を用いて瞬間凍結し,自作の装置により-15°Cで凍結乾燥した.得られた試料を高温(65°C)の乾燥空気中に保管して,酵素活性の経時変化を調べた.その結果トレハロースが最も活性保持の度合いが高いこと,還元糖ではメイラード反応により失活が生じやすいことがわかった.2.酵素活性保持の度合いと糖類のアモルファス化度との関係X線回折によりアモルファス化度を測定したところ,酵素活性保持の度合いが高いトレハロースではアモルファス化度が高く,酵素活性の度合いが低いスクロースではアモルファス化度が低いことがわかった.また,スクロールにおいても凍結乾燥条件を変更してアモルファス化度が高い試料を作製したところ,酵素活性保持の度合いが高くなることがわかった.これより糖類アモルファスは酵素を包埋することで糖類が結晶化した状態よりも高い熱安定化作用を示すと考えられる.3.糖類アモルファス構造の熱安定化作用に関する分子論的検討糖類アモルファス構造による熱安定化作用の微視的機構として,糖-酵素間の水素結合が酵素の高次構造を保持すると考えられる.そこで糖-酵素間の水素結合を検証するためにFT-IRで解析を行った.糖,酵素としてスクロースとLDHを用い,スクロース濃度が0,4,10,20,30mg/mlの5種類で,LDH濃度3.5mg/mlの水溶液を調製し、凍結乾燥試料を作製した.XRDならびにFT-IRの測定より,スクロース濃度4mg/mlの凍結乾燥試料ではLDH本来の結合水よりはるかに少ない水分しか含有していないにもかかわらず比較的多くの水素結合が生じていることがわかった.これより糖類アモルファス組織中において糖-酵素間に水素結合が生じており,この水素結合により酵素が熱安定化されていると考えられる.1.糖類による酵素の熱安定化作用の検討数種類の糖を用いて糖の種類による酵素の熱安定化作用の違いを調べた.酵素には分光法で活性が測定可能な酵素としてアルコール脱水素酵素(ADH),ラクトース脱水素酵素(LDH),リンゴ酸脱水素酵素(MDH)を用いた.糖類には単糖のグルコース,二糖類のスクロース,トレハロース,マルトース,ラクトース,三糖類のマルトトリオース,ラフィノースを用いた.酵素を含む糖類水溶液(酵素:糖:水のモル比が1:10^4:10^7)を均質な試料が得られるように液体窒素を用いて瞬間凍結し,自作の装置により-15°Cで凍結乾燥した.得られた試料を高温(65°C)の乾燥空気中に保管して,酵素活性の経時変化を調べた.その結果

(1)活性保持の度合が一番高いのはトレハロースである(2)大略として還元糖を用いるとメイラード反応が起こるために失活が生じやすい,という結果が得られた.2.酵素活性保持の度合と糖類のアモルファス化度との関係次に酵素活性保持の度合と試料中の糖類のアモルファス化度との関係について検討した.X線回折によりアモルファス化度を測定したところ,酵素活性保持の度合が高いトレハロースではアモルファス化度が高く,酵素活性保持の度合が低いスクロースではアモルファス化度が低いことがわかった.また,スクロールにおいても凍結乾燥条件を変更してアモルファス化度が高い試料を作成したところ,酵素活性保持の度合が高くなることがわかった.これより糖類アモルファスは酵素を包埋することで糖類が結晶化した状態よりも高い熱安定化作用を示すと考えられる.糖類アモルファス構造の熱安定化作用に関する分子論的検討前年度の研究により,糖類アモルファス構造が酵素の熱安定化に大きく寄与していることがわかった.そこで糖類アモルファス構造の熱安定化作用について微視的な機構の解明をめざして検討を加えた.具体的には糖-酵素間の水素結合に着目し,FT-IRでの解析を行った.糖,酵素としてそれぞれスクロース,LDHを用い、スクロース濃度を0から30mg/mlの範囲で変え,LDH濃度は3.5mg/mlにした糖-酵素水溶液を調製した.この水溶液を液体窒素で瞬時凍結し,-30°Cで24時間乾燥し,さらに0°Cで10時間乾燥した.トラップ温度は-60°Cに設定した.次に水分活性をそろえることと,アモルファスならびに結晶化試料の2種類の試料を得るため,水分活性を調整した.アモルファス試料は水分活性調整剤である酢酸カリウムの過飽和水溶液(RH23%, 25°C)を入れたデシケーター内で5日間水分活性を調整した.結晶化試料はNaClの過飽和水溶液(RH75%, 25°C)を入れたデシケーター内で4時間保存し結晶化させ,その後,酢酸カリウムの過飽和水溶液を入れたデシケーター内で5日間水分活性を調製した.この方法によりスクロース濃度が低濃度(20mg/ml以下)の場合にはアモルファス試料が得られ,高濃度(20mg/ml以上)の場合には結晶化試料が得られる.調製した試料を,窒素雰囲気中,65°Cで保存した.酵素活性の経時変化は分光光度計で,結晶化度はXRDとDSCで測定した.水素結合についてはFT-IRで各試料のアミドI,アミドIIのピーク波数のシフトを調べた.酵素活性の保持度合いを調べたところ,アモルファス化した試料の方が酵素活性をより高度に保持することがわかった.また,FT-IRの測定より,スクロースの濃度が4mg/mlの試料の場合,LDH本来の結合水よりはるかに少ない水分しか含有していないにもかかわらず比較的多くの水素結合が生じていることがわかった.これよりアモルファス試料中でのアミドI,アミドIIのピークシフトは糖-酵素間の水素結合によるものであり,この水素結合により酵素が熱安定化されていると考えられる.
福井県出身者のライフコース展望と地域移動:教育・就業・居住地選択

福井県福井市内の普通高校3校の50年間の卒業者に対し、高校卒業後の進学行動、就業行動および居住地選択を中心に、回顧法によるライフコースに関する質問紙調査を実施した。調査の結果からは、卒業時に他出した者がUターンするタイミングは、進学先の卒業時点が最も多く、他出先での生活基盤が固まる30歳代なかばを過ぎてからのUターンは稀であること、また卒業後の県外への移動の理由が大学等への進学に限定されてきており、県外移動にかかるコストが増大する傾向にあること、また長男が家を継ぐという規範が強く、長男と次三男、また女性では福井県定住率が大きく異なることが明らかとなった。高校卒業後の進路選択と地域移動に関する調査として、福井県福井市内の県立普通高校2校(高志高校、足羽高校)の卒業生を調査対象として選定した。この2校は普通科のみが設置されている高校であるが、それぞれ進学校、進路多様校という違いがあり、高校入学時の学力にできるだけ偏りのない標本作製を行なった。2010年6月から11月にかけて研究会を実施し、A4要旨16頁の調査票の検討、作成を行なった。なお、調査票は調査対象の実情に沿うよう、福井県庁職員および調査対象となる高校2校の同窓会役員にも回覧し、より良い調査票の作成に努めた。調査票の作成と平行して、2010年9月に上記2校の同窓会との交渉、調整を行ない、調査協力への同窓会の同意を得て、名簿管理事業者である同窓会を経由するかたちで対象者への調査票の送付、回収を行なった。なお、調査実施にあたっては、個人情報保護に留意し、具体的には、同窓会名簿を利用した標本抽出を同窓会側(実際の作業は名簿管理業者)に依頼、2011年11月に同窓会名での当事者の意思確認を往復はがきにて行ない、調査協力のみなし同意を得られた者のみに、2010年12月に調査票を送付した。なお、設計標本のサイズは3,041、同窓会名慕情での住所不明者521名を除いた2520名に意思確認はがきを送付、そのうち住所不明による未達者589名、調査協力への不同意者174名を除き、調査票送付数は2,286であった。記入済調査票は、2010年12月から2011年1月にかけて、郵便により回収を行なった。2011年3月末時点での回収数は796(うち無効票1)、調査票発送数を分母とした有効回収率は34.8%であった。調査票回収後、2011年2月から3月にかけてコーディング作業を行なった。2011年度にデータの入力作業を行なう予定である。2010年度に実施した福井県福井市内の県立普通高校2校(高志高校、足羽高校)の卒業生を対象とする地域移動調査のデータ入力及びクリーニング作業を、2011年5月から6月にかけて行なった。2011年7月に福井市内で開催された「ふくいの希望を考えるフォーラム」に登壇し、暫定版のデータを元に、調査概要、地域移動パターン概略、地域移動の発生時期に関する中間報告を行なった。フォーラム終了後は、福井県庁・教育委員会担当者との意見交換を行なった。上記フォーラムでの討論を分析に反映し、2012年2月に『「福井市内高校卒業後の地域移動調査」中間報告書』および、全質問項目についての単純集計、性別、世代別、家族構成別、職業別、現住地、地域移動歴別のクロス集計を収録した基礎集計表を作成、各高校および同窓会、福井県庁関係部署への報告と意見交換を行なった。中間報告書は、「Uターンへの意識、福井への意識」(平井太郎)、「住まいと居住地移動」(西野淑美)、「高校卒業後の進路と将来イメージ」(元森絵里子)、「仕事と居住地選択」(西村幸満)、「希望の有無とその対象」(石倉義博)、「地域移動と家族構成」(石倉義博)の6部構成とである。また、2010年度には実施できなかった普通高校1校(羽水高校)同窓会と再度交渉を行ない、調査実施の目算が立ったため、研究費の繰越を行ない、他校同窓会調査と同様の設計にて2013年1月から2月にかけて、調査を実施した。2010年度に実施した福井県福井市内の県立普通高校2校(高志高校、足羽高校)の卒業生を対象とする地域移動調査のデータ分析をすすめ、定期的に研究会を開催して、研究メンバー間での積極的な討論を行なった。中間的な分析結果は、地方紙『福井新聞』8月4日、11日、18日、25日、9月1日号で一般向けに発表を行ない、成果の社会的還元に努めた。また、2012年12月に福井県で開催されたシンポジウム「希望の福井、福井の希望」に参加し、石倉と平井が報告を行なった。

あわせて、研究メンバー各人も『福井新聞』連載原稿をもとにポスター報告を行ない、研究者だけでなく、一般の参加者との積極的な意見交換を行なった。この成果は、2013年度に刊行される書籍『希望学あしたの向こうに』に収録予定である。また、2010年度調査時には実施できなかった普通高校1校(羽水高校)同窓会との合意を取り付け、名簿管理事業者である同窓会を経由するかたちで対象者への調査票の送付、回収を行なった。なお、調査実施にあたっては、個人情報保護に留意し、同窓会名簿を利用した標本抽出を同窓会側(実際の作業は名簿管理業者)に依頼、2012年12月に同窓会名での当事者の意思確認を往復はがきにて行ない、調査協力のみなし同意を得られた者のみに、2013年1月に調査票を送付した。なお、設計標本のサイズは1,673、同窓会名慕情での住所不明者265名を除いた1,408名に意思確認はがきを送付、そのうち住所不明による未達者、調査協力への不同意者83名を除き、調査票送付数は1,325であった。記入済調査票は、2013年1月から2013年2月にかけて、郵便により回収を行なった。回収数は304、調査票発送数を分母とした有効回収率は22.9%であった。当初の計画では、2011年度の前半は、前年度に実施した調査で回収した調査票のデータチェック・エディティングを行い、データ入力を経て、データセットの作成を行なう予定であった。また、2011年度の後半は、作成したデータセットを用いて、分析を行い、報告書にまとめる前に、分析結果について、現地有識者や高校関係者と意見交換を行なう予定であった。この作業工程については、おおむね予定どおり達成することができたが、2010年度の調査にあたっては、当初計画していた高校同窓会の協力が得られなかった高校が1校、また同窓会組織が休眠状態にあって交渉することができない高校が1校あり、データの代表性という点では問題なしとはいえなかった。データセットの代表性を高めるため、2011年度は両校同窓会に対し再度交渉を行なった。そのうち、2010年度時には同窓会組織が休眠状態にあった羽水高校同窓会については、組織再編がなされたこともあり、標本抽出台帳となる同窓会名簿の利用に関して、同窓会から会員に対して個人情報提供の意思確認を行なう合意を得ることができた。しかし、改訂された同窓会名簿の完成は2012年度10月であったため、調査は2012年度に実施することとし、その費用として、2011年度予算のうち197,000円を翌年度に繰り越すとととした。なお、追加調査は2013年1月から2月にかけて問題なく実施することができたが、データセットの確定は当初よりも遅れることとなり、その間は2010年度に実施した調査データを用いた暫定的な分析を行なわざるを得なくなった。24年度が最終年度であるため、記入しない。2012年度は、2010年度(第1期調査)において実施できなかった福井市内公立普通高校1校(羽水高校)卒業生を対象とする第2期調査を実施する。2011年度予算のうち197,000を繰り越し、調査費用に充当する。調査の実施にあたっては、名簿管理事業者である同窓会を経由して対象者への調査票の送付、回収を行なう。個人情報保護に留意し、具体的には、同窓会名簿を利用した標本抽出を同窓会側(実際の作業は名簿管理業者)に依頼、同窓会名での当事者の意思確認を往復はがきにて行ない、調査協力のみなし同意を得られた者のみに、調査票を送付する。また、回答済み調査票の回収については、同様に郵便で行なうが、返送窓口については、調査対象の不安を取り除き、協力を取りつけやすくするため、羽水高校事務室に委託できるよう交渉をすすめる。
カスパーゼ3の骨代謝に及ぼす影響に関する研究

アポトーシスとは、細胞の縮小や断片化、核の凝集と断片化といった形態的な特長を呈するあらかじめプログラムされた細胞死のことで、様々な分子間のシグナル伝達によるコントロールを受けている。そのなかでも、カスパーゼ3はシステインプロテアーゼの一種で、刺激により活性化されると、PARP(ADP-リボースポリメラーゼ)をはじめとするさまざまな細胞内基質を分解し、アポトーシスを誘導すると考えられている。骨形成を担う骨芽細胞は、骨細胞となり骨内に埋め込まれる際にその半数はアポトーシスすると考えられている。また、破骨細胞も骨吸収終了後に骨面から離れアポトーシスすることが示されている。骨系細胞のアポトーシスは骨組織における重要な代謝機構のひとつと考えられ、その調節を担うカスパーゼ3は何らかの関与をする可能性がある。そこで今回、カスパーゼ3遺伝子欠損マウスを用い、その役割を検索した。8週齢マウス頭蓋骨について肉眼観察及びX線撮影を行ったところ、遺伝子欠損型マウスの頭蓋冠はドーム状を呈し、眼耳平面と後頭蓋底前後径との交線は野生型に比べて鈍角となり、頭蓋の成長抑制が認められた。さらに、遺伝子欠損型では加齢に伴い頭蓋骨の膜性骨化の亢進と下顎前突症の所見が認められた。新生仔脛骨を通法に従い固定、脱灰後,パラフィン包埋による組織切片とし、TRAP染色を施したのち、顕微鏡にて破骨細胞の数を計測したところ、遺伝子欠損型では破骨細胞数の減少が認められた。この減少が骨芽細胞からの支持能減少に伴うものかどうかを検討するためにカルバリアより骨芽細胞を調整し、OPG mRNAの発現を検討した。遺伝子欠損型の骨芽細胞では野生型に比べ培養開始から、その発現量の増加が見られた。また遺伝子欠損型骨芽細胞のin vitroにおける石灰化亢進も認められた。アポトーシスを制御するカスパーゼ3の遺伝子欠損マウスでは、石灰化亢進を伴う頭蓋形成異常と、成熟破骨細胞数の減少を認めた。これらのことから、カスパーゼ3遺伝子は、骨芽細胞と破骨細胞のアポトーシス制御という面から、骨形成と骨吸収の微妙なバランスを保ち、正常な頭蓋の成長発育などを調整していることが示された。研究の初年度であるので、まずは当初の計画通り、細胞培養実験を中心に行った。骨芽細胞による破骨細胞支持能に関する影響の検討するために、マウス新生児より頭頂骨を摘出し、酵素液(0.1%Collagenase、0.2%Dispase)にて消化し、初代骨芽細胞を回収した。調整した野生型及びカスパーゼ3遺伝子欠損型の骨芽細胞をプレート上に播種し、活性型ビタミンD3を添加した培地にて骨髄細胞との一週間にわたる共存培養を行った。培養終了後、固定、洗浄し、酒石酸抵抗性酸性ボスファターゼ(TRAP)染色にて破骨細胞を同定した。数を計測した結果、カスパーゼ3の有無に関わらず、誘導される破骨細胞数に変化は認められなかった。このことから破骨細胞分化には、カスパーゼ3の有無は関与が無いことが明らかになった。しかしながら、誘導された破骨細胞の骨吸収能偉充進されていること。

破骨細胞はアポトーシスに対して抵抗性を持つことが示唆された。このアポトーシス抵抗性の機序は、ミトコンドリア経路に関与するBimタンパクのdegradationをカスパーゼ3が関与しているためであることも明らかにした。さらにこのことが生体でも同様に生じているかを検索するために遺伝子欠損マウスの脛骨組織標本を作成した。光学的顕微鏡下による観察からも骨形成と骨吸収が亢進していることが明らかになった。以上のことから、カスパーゼ3は破骨細胞形成には影響を直接与えないけれども、破骨細胞の活性化を充進させ、結果的に骨吸収を充進させる。亢進した骨吸収に伴い骨形成も充進させることが示唆された。本年度は研究の中間年であるので、昨年度のin vitroにおける成果(破骨細胞のアポトーシスにおけるカスパーゼ3の重要な役割)を基礎として主にin vivo実験を行った。in vitro実験では、骨吸収抑制薬であるNSAIDやビスフォスホネート製剤が破骨細胞のアポトーシスに及ぼす影響も合わせて検討をはじめた。連携研究者の高橋により作製したカスパーゼ3遺伝子欠損マウスを用いた。4-10週齢のマウス頭蓋骨について肉眼観察及びX線撮影を行った。遺伝子欠損型マウスの頭蓋冠は生まれた直後には、野生型と比較して異常は認められなかったが、成長に伴いドーム状を呈し、眼耳平面と後頭蓋底前後径との交線は野生型に比べて鈍角となり、頭蓋の成長抑制が認められた。さらに、遺伝子欠損型では頭蓋骨の膜性骨化の石灰化亢進と下顎前突症の所見が著明になる傾向が認められた。つまり10週になると臼歯ばかりではなく、切歯も前突を呈する頭蓋形成異常を示すようになった。脛骨の組織標本を作製するとカスパーゼ3遺伝子欠損マウスでは、長管骨では逆に加齢により破骨細胞数の上昇と骨量減少を認めた。以上のことから、カスパーゼ3遺伝子は、骨芽細胞と破骨細胞のアポトーシス制御という面から、骨形成と骨吸収の微妙なバランスを保ち、正常な頭蓋及び長管骨の成長発育などを調整していることが示された。また下顎前突症の発症機序にカスパーゼ3遺伝子欠損によるアポトーシス異常が関与する可能性が示唆された。本年度は、研究の最終年度なので、これまで3年間の研究総括を行った。当初2年間のin vitro, in vivo研究により、破骨細胞が骨吸収をした後に、生じる正常なアポトーシスは、破骨細胞自身が分泌する酸や酵素により骨基質に多く含まれるRGDシークエンスが断片化されて取り込まれ、取り込まれたRGDがカスパーゼ3が活性化することで制御されていると示唆された。またこの骨吸収は引き続き骨形成を誘導することもin vivo研究により示せた。このようなカップリング現象という骨吸収と骨形成の微妙なバランスを保たせることで、生体では正常な骨成長もあわせて行われていた。ところが、カスパーゼ3遺伝子欠損マウスではこのバランスが崩れて、破骨細胞の生存延長と骨吸収亢進、併せて骨形成の促進(特に軟骨性骨化)が生じることで下顎骨の過成長を示し、下顎前突症発症の要因となっていた。一方、ビスフォスホネート製剤投与による異常なアポトーシスでは、造血幹細胞から破骨細胞へ分化した直後に死滅してしまうことがわかった。つまり、骨吸収型成熟破骨細胞になる前に死滅してしまうことにより、骨形成因子や走化性因子が欠乏し、吸収窩に骨形成が添加されなくなってしまう可能性が強く示唆された。
Zymomonas属細菌の遺伝生化学的研究

エタノールをバイオマスから醗酵生産することは,潜在的な石油資源の不足の時代を迎えて重要な意義をもっている.他方,エタノールの生産はこれまで酵母に依存してきたが,エネルギー資源としてエタノールを生産するためには,エタノール生産性の高いZymomonas細菌(2菌)が酵母よりも有利と考えられる.しかし, Z菌の最大の欠点は醗酵できる糖の種類がグルコース,フラクトース,スクロースに限られることである.本研究では,遺伝子組換え技術を用いてZ菌を育種して,本菌の醗酵性糖の種類を拡大することを目的として,その基礎となるZ菌の遺伝生化学的検討を行った.以下に, 3年間の研究成果をまとめた.1)Zymomonas細菌と大腸菌間のシャトルベクターの作製2)Zymomonas細菌における異種遺伝子の発現3)Zymomonas細菌のプロモーター検索用ベクターの作製と,プロモーターDNAの検索分離4)Zymomonas細菌のプロモーターDNAの解析5)Zymomonas細菌の形質転換法の確立6)Lac^+プラスミドを有するZymomonas細菌の,ラクトースからのエタノールの生成7)Zymomonas細菌のガラクトース代謝8)Zymomonas細菌へのα-カラクトシダーゼ遺伝子の導入と発現9)Zymomonas細菌のスクロース醗酵性遺伝子のクローニング10)Zymomonas細菌に見出された一本鎖DNAに特異的に作用するスクレアーゼZ_1エタノールをバイオマスから醗酵生産することは,潜在的な石油資源の不足の時代を迎えて重要な意義をもっている.他方,エタノールの生産はこれまで酵母に依存してきたが,エネルギー資源としてエタノールを生産するためには,エタノール生産性の高いZymomonas細菌(2菌)が酵母よりも有利と考えられる.しかし, Z菌の最大の欠点は醗酵できる糖の種類がグルコース,フラクトース,スクロースに限られることである.本研究では,遺伝子組換え技術を用いてZ菌を育種して,本菌の醗酵性糖の種類を拡大することを目的として,その基礎となるZ菌の遺伝生化学的検討を行った.以下に, 3年間の研究成果をまとめた.1)Zymomonas細菌と大腸菌間のシャトルベクターの作製2)Zymomonas細菌における異種遺伝子の発現3)Zymomonas細菌のプロモーター検索用ベクターの作製と,プロモーターDNAの検索分離4)Zymomonas細菌のプロモーターDNAの解析5)Zymomonas細菌の形質転換法の確立6)Lac^+プラスミドを有するZymomonas細菌の,ラクトースからのエタノールの生成7)Zymomonas細菌のガラクトース代謝8)Zymomonas細菌へのα-カラクトシダーゼ遺伝子の導入と発現9)Zymomonas細菌のスクロース醗酵性遺伝子のクローニング10)Zymomonas細菌に見出された一本鎖DNAに特異的に作用するスクレアーゼZ_1エタノールの生産はこれまで酵母に依存してきたが、エネルギー資源としてのエタノールを生産するためには、酵母よりもエタノール生産性が高いZymomonas細菌(Z菌)の方が有利と考えられる。しかし、Z菌は酵母に比べて醗酵性糖の範囲がせままいなどの短所があり、菌株の改良が必要である。ところが、Z菌の遺伝生化学的基礎知見が乏しいため、育種方法が限定され、これまで、研究の発展が妨げられてきた。本研究は、遺伝子組換え技術を用いるZ菌の育種に必要な遺伝生化学的基礎知見を得ようとするものである。2年目にあたる61年度に実施した研究の内容を要約すると、次の通りである。1.60年度の研究において作製したZ菌と大腸菌間のシャトルベクターを用いて、Z菌の形質転換法を開発した。このことにより、Z菌の宿主ーベクター系はほぼ確立できた。2.Z菌の醗酵性糖の種類の拡大を目的として、開発した宿主ーベクター系を利用して、大腸菌由来のラフィノースおよびラクトース醗酵性遺伝子をZ菌へ導入した。しかし、大腸菌由来のプロモーターの支配下にあるこれら遺伝子はZ菌内で発現は微弱であり、発現にはZ菌のプロモーターが必要であった。3.Z菌のプロモーター検索用ベクターを作製し、これを用いてZ菌の染色体由来のプロモーターを多数分離した。4.Z菌のプロモーターを挿入したラクトース醗酵性遺伝子は、Z菌内で高い発現を示した。また、これらZ菌のグルコース生育菌体をラクトースやホエー培地に加えることにより、エタノールが生成された。すなわち、Z菌に新たに、ラクトース醗酵性を付与することができた。エタノールをバイオマスから醗酵生産することは,潜在的な石油資源の不足の時代を迎えて重要な意義をもっている.他方,エタノールの生産はこれまで酵母に依存してきたが,エネルギー資源としてのエタノールを生産するためには,エタノール生産性の高いZymomonas細菌(Z菌)が酵母よりも有利と考えられる.申請者は,これまでZ菌の菌株改良を研究してきたが,Z菌の遺伝生化学的知見が乏しいため,育種方法も限定され,研究の発展を阻害してきた.本研究は,遺伝子組換え技術を用いるZ菌の育種に必要な遺伝生化学的基礎知見を得ようとするものである.最終年度にあたる62年度に実施した研究の内容を要約すると,次の通りである.1.61年度の研究において分離したZ菌のプロモーターDNA断片(329bp)の塩基配列を決定するとともに,プロモーター域の転写開始点をSiヌクレアーゼマッピング法を用いて決定した.

2.分離したZ菌のプロモーター下流に,大腸菌由来のラクトース醗酵性やガラクトース醗酵性やラフィノース醗酵性遺伝子を挿入し,Z菌内でのこれら遺伝子の発現を検討した.ラクトース醗醗性遺伝子はZ菌内で充分に発現したが,他の遺伝子の発現は微弱であった.これは,Z菌のプロモーターに原因があるのではなく,挿入した遺伝子に問題があると推定している.3.大腸菌のラクトース醗酵性遺伝子を導入したZ菌のグルコース生育菌体は,ラクトースのグルコース部分を醗酵してエタノールを生成した.さらに,酪業廃棄物ホエーからもエタノールを生成することを初めて明らかにした.他方,大腸菌由来のガラクトース醗酵性遺伝子を導入したZ菌も,微量ながらガラクトースからエタノールを生成した.
大腸菌染色体複製の開始機構

染色体DNAの複製は起点における開始反応のレベルで制御されている.大腸菌では複製起点(oriC)を持つプラスミドの複製反応を精製酵素を用いて再構成することが可能になりつつある.oriCでの複製蛋白複合体の形成に先がけて開始蛋白DnaAの他にRNAポリトラーゼとHU蛋白がoriCDNAに作用することが示唆されているが,その機能は不明である.これら2種類の蛋白の複製開始における機能を知る目的で以下の研究を行なった.1.転写産物の解析:oriCDNAを鋳型に用いてRNAポリメラーゼによる転写反応を行ない,転写物の解析を行なった.oriCに右接する16KD蛋白遺伝子の転写が複製制御に関与する事が知られているが,この転写はDnaAにより抑制される事が判明した.RNAポリメラーゼとDnaAのバランスが転写抑制の程度に影響を及ぼすが,実際に複製開始反応が起きる条件で転写制御が起さる事が示唆された.次にoriC近傍での他の転写物を探索した所, oriC内177番目の塩基からunc遺伝子方向に転写が起きる事が判明した.この転写物は蛋白をコードしておらず, DnaAおよびHU蛋白により転写が抑制される. 16KD遺伝子の転写は複製開始に必須でない事が判明しており,今回新たに見出されたoriC内で開始する転写が複製開始に直接関与している可能性が考えられる.2.HU蛋白欠損株におけるDNA複製:今本(理研)らによって分離されたHU蛋白欠損株におけるDNA複製の様式を解析した.この株はHU蛋白を完全に欠失しているが生育可能で, oriCから複製開始することが判明した.核様体の構造異常が見られ,また核様体の分配機構,細胞分裂機構の異常が観察された.粗酵素画分での解析から,他の核様体蛋白が複製開始反応に際してHU蛋白の代りを務めている可能性が示唆された.染色体DNAの複製は起点における開始反応のレベルで制御されている.大腸菌では複製起点(oriC)を持つプラスミドの複製反応を精製酵素を用いて再構成することが可能になりつつある.oriCでの複製蛋白複合体の形成に先がけて開始蛋白DnaAの他にRNAポリトラーゼとHU蛋白がoriCDNAに作用することが示唆されているが,その機能は不明である.これら2種類の蛋白の複製開始における機能を知る目的で以下の研究を行なった.1.転写産物の解析:oriCDNAを鋳型に用いてRNAポリメラーゼによる転写反応を行ない,転写物の解析を行なった.oriCに右接する16KD蛋白遺伝子の転写が複製制御に関与する事が知られているが,この転写はDnaAにより抑制される事が判明した.RNAポリメラーゼとDnaAのバランスが転写抑制の程度に影響を及ぼすが,実際に複製開始反応が起きる条件で転写制御が起さる事が示唆された.次にoriC近傍での他の転写物を探索した所, oriC内177番目の塩基からunc遺伝子方向に転写が起きる事が判明した.この転写物は蛋白をコードしておらず, DnaAおよびHU蛋白により転写が抑制される. 16KD遺伝子の転写は複製開始に必須でない事が判明しており,今回新たに見出されたoriC内で開始する転写が複製開始に直接関与している可能性が考えられる.2.HU蛋白欠損株におけるDNA複製:今本(理研)らによって分離されたHU蛋白欠損株におけるDNA複製の様式を解析した.この株はHU蛋白を完全に欠失しているが生育可能で, oriCから複製開始することが判明した.核様体の構造異常が見られ,また核様体の分配機構,細胞分裂機構の異常が観察された.粗酵素画分での解析から,他の核様体蛋白が複製開始反応に際してHU蛋白の代りを務めている可能性が示唆された.
リソソーム蓄積を標的としたSCA6の治療法開発

脊髄小脳失調症6型は本邦に多い神経変性疾患で小脳の神経細胞が徐々に脱落し運動機能が低下します。SCA6患者ではアミノ酸の1種であるグルタミンの繰り返し配列(ポリグルタミン)が異常に伸長した分子が産生され、次第に細胞内のリソソームに蓄積することが知られていましたが、神経細胞変性に至るメカニズムは不明でした。本研究では脊髄小脳失調症6型の病態に、神経炎症が関与することを初めて示すとともにミクログリア細胞の活性を抑えることで脊髄小脳失調症6型モデルマウスの初期病態を軽減させることに成功しました。1)リソソーム生合成系路の活性化によりSCA6の病態が改善できるかどうか検討するため、まず今年度はテトラサイクリン依存的に転写因子TFEBを過剰発現するTRE-3xFLAG-hTFEBトランスジェニックマウスの作製を行なった。その結果、現在までに8匹のF0マウスを得た。また並行してCRISPR/Cas9法を利用して恒常的活性化変異をTfeb遺伝子に有するmTfebS269Aノックインマウスの作製を開始した。2)NeuroinflammationのSCA6病態への関与を明らかにする目的でToll-like-receptor (TLR)のシグナル伝達に必要なアダプター分子MyD88ノックアウトマウスとSca6 MPI-118Qマウスとの2重変異マウスを作製し、その解析を行なった。2重変異マウスではコントロールマウスと比較して協調運動障害が有意に改善しており、TLR系を介した自然免疫がSCA6病態に関与している可能性が考えられた。3)分子シャペロンiHsp70によるリソソーム膜安定化とリソソームストレス軽減作用により、SCA6の病態が改善できるかどうかを明らかにするため、iHsp70を過剰発現するトランスジェニックマウスとMPI-118Qマウスとの2重変異マウスを作製し、その行動学的・病理学的解析を行なった。現在までのところ2重変異マウスで協調運動障害及びプルキンエ細胞変性に有意な改善傾向は認められておらず、iHsp70単独の過剰発現では治療効果は期待できない可能性が示唆された。1)小脳プルキンエ細胞特異的なリソソーム生合成系路の活性化によりSCA6の病態が改善できるかどうか検討するため、テトラサイクリン依存的にリソソーム生合成のマスター転写因子TFEBをプルキンエ細胞特異的に過剰発現するPcp2-tTA/TRE-3xFLAG-hTFEBトランスジェニックマウスの作製を行なった。また並行してCRISPR/Cas9法を利用して恒常的活性化変異をTfeb遺伝子に有するmTfebS269Aノックインマウスの作製をを行ない、いずれも目的のマウスの作製に成功した。今後これらのマウスとSca6 MPI-118Qノックインマウスとの交配により多重変異マウスを作成し、その効果を検討する。2)小脳の神経炎症の修飾によりSCA6病態を改善しうるかどうか検討する目的で、ミクログリアの活性化に関与するToll-like-receptor (TLR)のシグナル伝達に必要なアダプター分子MyD88のノックアウトマウスとSca6 MPI-118Qマウスとの2重変異マウスを作製し、その解析を行なった。生後7週齢2重変異マウスではコントロールマウスと比較してミクログリアの極性が好炎症性のM1タイプから神経保護的なM2タイプにシフトしており、協調運動障害・プルキンエ細胞変性が有意に改善していた。一方SCA6患者小脳においても病理解析の結果TLRを発現するミクログリアが活性化していることが確認できた。従って自然免疫系の活性化を修飾することでがSCA6病態の進行を遅延させうる可能性が考えられた。1)前年度に引き続きリソソーム生合成経路の活性化によるSCA6病態の改善を試みた。テトラサイクリン依存性にリソソーム生合成のマスター転写因子TFEBを小脳プルキンエ細胞に特異的に過剰発現するPcp2-tTA/TRE-3xFLAG-hTFEBトランスジェニックマウスとSca6 MPI-118Qノックインマウスの交配により3重変異マウスの作成を行った。得られた3重変異の病理学的解析を行ったところ、明らかな病態の改善は認められず、むしろやや悪化する傾向が認められた。また恒常的活性化変異をマウスTfeb遺伝子に有するmTfebS269AノックインマウスとSca6 MPI-118Qノックインマウスの交配により得られた2重変異マウスでは現在までのところ明らかなプルキンエ細胞変性の改善は認められていない。これらの結果に関して、リソソーム経路の発生期からの過剰活性化が小脳神経回路の正常な構築などに悪影響を及ぼしている可能性があるため、ドキシサイクリン含有餌の投与を生後3週程度まで行うことにより、生後4週齢以降でTFEBを過剰発現させるようにして効果を再検証する予定である。2)前年度、Toll様受容体の共通のアダプター分子MyD88のノックアウトマウスとSca6 MPI-118ノックインマウスの2重変異マウスで、パーシャルな病態の改善が生後7週齢で認められたので、同様な神経炎症制御による病態改善効果が老齢まで持続するかどうかを検討した。その結果生後11週では明らかな改善は認められなかった。このことは、神経炎症の病態への関与が病期によって変化する可能性を示唆している。

リソソーム生合成経路活性化によるSCA6モデルマウスの病態改善を試みるため、海外からのCAG-floxTFEBマウス(Dr.Ballabio作成)作成)を導入する予定で導入する予定で、承諾も得ていたが、研究開始後先方の都合により導入できなくなり、代わりに自ら薬剤導入性にTFEBを発現するマウスの作成を行ったため、全体の計画に遅れが生じた。1)リソソーム生合成経路の活性化によるSca6 KIマウス病態の改善を試みた。恒常的活性化変異をマウスTfeb遺伝子に有するmTfebS269AノックインマウスとSca6 MPI-118Qノックインマウスとの交配によって得られた2重変異マウスにおいて、生後7週齢でロータロッド解析を行ったところ、2重変異マウスではコントロールと比較して、有意に運動症状の改善が認められた。しかし病理学的には残存小脳プルキンエ細胞数には明らかな改善は認められなかった。これらの結果はS269A変異はfunctionalには協調運動障害を改善するものの、その神経変性改善効果は軽度或いはほとんどないことを示しており、今後運動障害改善効果のメカニズムについてさらなる詳細な検討が必要と考えられた。2)前年度までの検討により、M1型ミクログリア優位の神経炎症を遺伝学的に抑制することによりSca6 KIマウスでみられる神経変性の初期病態を改善できることがあきらかになった。そこで次にCSF-1R阻害剤(PLX----)を生後3週齢からSca6 KIマウスに投与して、小脳ミクログリオーシス全般の抑制を試み、病態を改善できるかどうかの検討を行った。その結果、投与群では小脳でのミクログリオーシスが著明に抑制されたが、プルキンエ細胞の脱落の程度や運動機能障害には明らかな効果は認められなかった。これらの結果から、SCA6初期病態の改善にはミクログリアのablationは有効ではなく、活性化スペクトラムを制御できる薬剤を開発する必要があることが示唆された。脊髄小脳失調症6型は本邦に多い神経変性疾患で小脳の神経細胞が徐々に脱落し運動機能が低下します。SCA6患者ではアミノ酸の1種であるグルタミンの繰り返し配列(ポリグルタミン)が異常に伸長した分子が産生され、次第に細胞内のリソソームに蓄積することが知られていましたが、神経細胞変性に至るメカニズムは不明でした。本研究では脊髄小脳失調症6型の病態に、神経炎症が関与することを初めて示すとともにミクログリア細胞の活性を抑えることで脊髄小脳失調症6型モデルマウスの初期病態を軽減させることに成功しました。当初CAG-floxStop TFEBマウスをイタリアの研究者から導入することを予定していたが、先方の都合で導入することができず、代わりに自らテトラサイクリン依存性にTFEBを過剰発現するマウスや恒常的活性化型Tfebを発現するノックインマウスを作製したため、当初の予定よりはやや進捗は遅れている。Pcp2-tTA/TRE-3xFLAG-hTFEB/Sca6 MPI-118Qマウスに関して、ドキシサイクリン含有餌の時期選択的投与によって、生後4-5週齢以降にTFEBを過剰発現させてその効果を再検討する。さらに最近アルツハイマー病APPマウスモデルにおいて、アストロサイトのリソソーム経路活性化により」病態が改善することが報告されている。Sca6マウスでも病態が進行に伴い細胞外への変異タンパク陽性凝集体沈着が認められるようになるので、アストログリア
触媒膜導入マイクロ流路反応デバイスの創製

本報告者は前年度までに(A)触媒活性高分子膜をマイクロ流路内に2液系層流を発生させ,また同膜状高分子マトリクス内でのナノ金属粒子を発生・調製;(B)これら触媒膜導入マイクロ流路デバイスを用いハロベンゼン類の水素化脱ハロゲン化反応をギ酸を水素源として達成;(C)イミダゾール残基を配位基とするポリアクリロアミドと各種金属(Pd, Cu,など)との配位結合架橋に依る不溶性高分子触媒創成を達成してきた。本年度は独自に開発してきた両親媒高分子担持Ptナノ粒子触媒をカートリッジ化し,「固/液/気」3相系反応を実行しえる連続フロー反応装置に適用することで,アルコール類の酸素酸化触媒反応を実践的なレベルへと展開した。完成した連続フロー酸素酸化システムは各種アルコール類に有効で,多様なのカルボン酸(1級アルコール原料)ケトン(2級アルコール原料)を高収率で与えた。またフェノールスルホン酸とホルムアルデヒドの縮合ポリマーを高分子ブレンステッド酸触媒として脱水縮合エステル化反応に適用した。開発した高分子ブレンステッド酸触媒は他の代表的高分子触媒よりも圧倒的にエステル化活性が高いのみならず,有機芳香族スルホン酸触媒(均一系条件)との比較においてさえも,むしろ高活性であることが見いだされた。本高分子触媒をカートリッジ化しオレイン酸とメタノールの直接エステル化によるバイオディーゼル燃料エステルの連続フロー合成へと展開した。25年度が最終年度であるため、記入しない。平成24年度には「触媒膜導入マイクロ流路反応デバイスの創製」を目的とし申請書研究計画に則って研究を推進した。(1)機能性高分子固定化不斉触媒を創製しその連続反応デバイスへの導入を実施した。具体的にはビオロゲンポリマーとの多価不斉配位子から高分子塩形成を検討した。本触媒創製によって汎用性に富むカップリング反応の不均一条件での不斉触媒化を実現し高い選択性と一般性を確認した。連続反応デバイスへの展開においても高度選択性を保ちつつ反応が連続的に進行した。平成24年度内に於ける反応実施例数は限定的であった。(2)マイクロ流路デバイス内での金属ナノ触媒膜形成によるフロー化学合成デバイスの創製を実現した。すなわちマイクロ流路層流界面上での錯体触媒・金属塩触媒の「ship-in-a-bottle」形成手法を利用しポリピリジニウムカチオンと遷移金属多価アニオンとから創製しうる高分子錯体を流路内で膜形成・固定化し,さらに同錯体を還元分解することで金属ナノ触媒膜を創製した。ナノ触媒導入によって秒単位の保持時間で完結するハロゲン化芳香族化合物に対する水素化脱ハロゲン化反応を実現した。(3)加えてアリル位置換反応,Heck反応,さらに酸塩基触媒膜の形成を経て,酸触媒プロセスのマイクロ流路デバイス創製の検討を開始した。なかでも高分子性プロトン酸触媒膜のマイクロ流路内固定化に成功し,そのマイクロ流路デバイスを用いる事でカルボニル基のアセタール化やカルボン酸類のエステル化のインスタント実施に成功した。(理由)研究計画に掲げた全検討項目にわたり実験研究を推進し,いずれも良好な成果をあげつつある。ただし連続型不斉触媒反応では実施例が現時点で限定的であり,フロー反応システムへの展開では一般性の確立・確認を必要とする段階である。一方,当初計画以上に高分子プロトン酸触媒膜の創製と応用に成果が上がっている。これら2点の進捗を勘案し達成度を判断した。今後は不斉触媒系のフロー化に注力する。すなわち申請者は世界に先駆けてマイクロ流路反応デバイスの層流界面において配位性高分子錯体膜触媒を導入する「ship-in-a-bottle」手法を開発している。この「ship-in-a-bottle」手法を不均一不斉触媒に適用することで不斉触媒膜導入マイクロ反応デバイスが構築でき,多くの基質を用いた不斉反応に適用できる。加えてナノ触媒膜の流路導入も順調に進みつつある。既に触媒反応に適用済みであり,さらに酸化型反応にと展開を深める。

特にプロトン酸触媒は既にのマイクロ流路反応システムに適用済みであり,今後論文作製に向けた詳細なデータのブラッシュアップを推進する。ナノ粒子触媒は触媒創製,流路内導入,触媒反応展開を終え,さらに論文も発表した。さらなる適用反応の拡充を進める。25年度が最終年度であるため、記入しない。
糖類を用いた吸血昆虫の病原体媒介に関与する中腸要因の解析

マラリアやリーシュマニア症は、ヒトに深刻な症状を呈する吸血昆虫媒介感染症である。それらの病原体はそれぞれ感染可能な吸血昆虫が決まっているが、どのような因子によって規定されているかは未だ不明である。本研究では、病原体の発育・ヒト感染能力を獲得する場である吸血昆虫の腸内に着目し、腸内環境を改変する糖類を用いて感染の成否を規定する因子を明らかにする。本研究で得られる成果は、糖類を用いた腸内環境の制御による吸血昆虫コントロール法の開発などにつながるものと考えられる。
運動システムの干渉機構とそこに現れる適応学習の神経機構(前庭動眼反射と滑動性眼球運動の干渉系を用いた研究)

脳は視覚入力を適切に取り込むために、種々の眼球運動サブシステムを使い分けるが、実際の運動中はサブシステムが単独で働くことは殆どなく、サブシステム同士で干渉しながら視覚入力を取り込む。さらにこのような干渉が持続すると、これらサブシステムにおける適応学習をも引き起こす。本研究では、まず視線信号の形成における滑動性眼球運動と前庭動眼反射系の干渉機構を調べるため、訓練した日本サルを用い、小脳虫部から滑動性眼球運動に応答した42個のプルキンエ細胞活動を、滑動性眼球運動、前庭動眼反射抑制課題、前庭動眼反射(x1)課題を用いて調べた。虫部の滑動性眼球運動に応答したプルキンエ細胞は、殆どすべて、前庭動眼反射抑制課題にも応答し、両課題における最適応答方向はあらゆる方向を向いていた。個々の細胞について応答特性を詳細に調べると、約半数の細胞は、滑動性眼球運動と前庭動眼反射抑制課題における最適応答方向がほぼ一致し、両課題における個々の細胞の応答の大きさは、有意に相関したが、前庭動眼反射(x1)課題とは有意の相関を示さなかった。この結果は、虫部の応答が、前回調べた前頭眼野の応答と類似することを示す。次に滑動性眼球運動と前庭刺激の干渉による適応学習機構を調べるため、両刺激を直交軸で与え、この干渉刺激の訓練中に前頭眼野の滑動性眼球運動応答ニューロンを記録し、同一ニューロンの応答を訓練前後で比較した。訓練前は完全な暗黒下での前庭回転刺激単独によっては、この刺激と直交する眼球運動応答は見られず、ニューロン応答も見られなかった。30-60分の訓練後、直交軸に前庭回転刺激単独により、有意な眼球運動応答が出現し、それに対応してニューロン応答も出現した。以上の結果は、滑動性眼球運動と前庭刺激の干渉による適応学習には、小脳片葉・傍片葉のみならず、前頭眼野も関わることを示唆する。滑動性眼球運動刺激と前庭回転刺激を直行軸で与え続け、滑動性眼球運動を短時間訓練することにより、本来出現しない前庭動眼反射が出現することが本研究グループから報告されている。今回、速度がステップ状に変化する前庭回転刺激を加えることにより、この適応性の前庭動眼反射の潜時を明らかにした。前頭眼野から単一神経細胞記録を行い、この領域の滑動性眼球運動関連ニューロンに対し、視覚刺激と回転台刺激を組み合わせた課題を使うことでこの領域のニューロンの応答が滑動性眼球運動の眼球運動信号のみに関連するのかそれに前庭信号が加わった視線信号に対応するのかを明らかにした。その結果、前頭眼野領域で滑動性眼球運動関連ニューロンの大部分が眼窩内ではなく、空間での視線運動情報をコードしていることが分った。さらに、これらのニューロンのうちのあるものぱ動物がーっの視標を固視している最中にもう一つの視標をそのまわりで動かしたときにも応答を示し、この領域では視標速度もコードされていることを明らかにした。前頭眼野領域に対し、GABA作動薬muscimolを注入して化学的に不活性化し、視覚刺激と回転台刺激を組み合わせた眼球運動課題遂行時の眼球運動を注入前と比較を行った。その結果、滑動性眼球運動遂行時、および前庭回転刺激を加えた視線移動課題いずれにおいてもmuscimol注入前に比べ注入後は視線速度が減少した。さらに、これらの課題を実行中に、ごく短時間であれば視標を消している間も、動物は視線速度を維持することができるが、muscimolを注入した後ではこのとき眼球速度が著しく低下することが判明した脳は視覚入力を適切に取り込むために、種々の眼球運動サブシステムを使い分けるが、実際の運動中はサブシステムが単独で働くことは殆どなく、サブシステム同士で干渉しながら視覚入力を取り込む。

以上の結果は、滑動性眼球運動と前庭刺激の干渉による適応学習には、小脳片葉・傍片葉のみならず、前頭眼野も関わることを示唆する。
海洋微生物ライブラリー由来の神経性ネクローシス抑制活性を有する低分子物質の探索

本研究では、これまで治療標的に成り得なかった神経性ネクローシスの分子基盤に細胞膜上のGLUTの内在化によるグルコース取り込みが減少することが一因であることを示すと共に、核蛋白質であるProTαは、この内在化したGLUTをGi-PLC-PKCβを介して積極的に表在化させることで神経性ネクローシスを抑制する事を明らかにした。さらにProTαはミクログリアに働きかけ、神経栄養因子の発現増加を引き起こすことで虚血時に誘導されるアポトーシスをも抑制することが示さた。一方、ProTα同様、神経性ネクローシス抑制活性を有する物質の存在が海洋微生物培養上清に見出され、未精製ではあるものの動物個体での虚血傷害において、ネクローシスを抑制することで強力な保護効果を示したこと事から、中枢神経系における虚血性神経傷害保護の新たな可能性を提示する研究であった。本研究では、これまで創薬標的とされてこなかった神経性ネクローシスに着目し、ネクローシス抑制物質を海洋微生物ライブラリーより探索すると共に、そのリード分子として見いだした核蛋白質であるプロサイモシンα(ProTα)の分子基盤解明及び受容体同定を行うことを目的としている。本年度の研究では、脳卒中モデルとしてラット中大脳動脈結紮(1h)に対して、ProTαを再灌流後3時間以内に全身投与することで虚血によって誘導される脳組織傷害及び運動機能障害を抑制することを見いだした。この際、ProTαは、脳虚血で誘導されるネクローシス及びアポトーシスの両方を抑制することが、PI染色とTUNEL染色の応用によって明らかになった。ProTαによるアポトーシスの抑制のメカニズムは内在性のBDNF及びerythropoietinが関与している事が吸収抗体を用いた検討によって明らかとなった。以上の結果、脳卒中傷害に対してProTαは直接神経細胞に作用し、虚血によって減少したグルコースの取り込みを促進することで神経ネクローシスを抑制すると同時に、アポトーシス誘導因子であるBax発現を増加し、アポトーシス経路を活性化する。しかしながら、誘導したアポトーシスは内在的に存在する神経栄養因子の働きを利用することで結果としてネクローシスとアポトーシスの両方を抑制する事が示唆された。一方、ProTαは培養ミクログリア細胞に処置することで、ミクログリアの形態変化及び神経栄養因子の発現を増加させることを見いだした。さらにミクログリア培養上清を培養神経細胞に処置することで、神経細胞でも神経栄養因子を発現増加が観察された。現在、詳細について検討中である。海洋微生物ライブラリーからのネクローシス抑制分子を探索については、神経ネクローシスを簡便に評価する実験系を確立したことから、本系を用いてライブラリーからのスクリーニングを進めていく。最終年度の研究では、これまでに確立した初代培養神経細胞に対する無血清飢餓ストレスの負荷によってネクローシスを誘導する系を用いて、保有する海洋微生物ライブラリーよりネクローシス抑制活性を有する培養上清のスクリーニングを行い、数種類の海洋微生物の培養上清に神経ネクローシス抑制活性があることを明らかにした。ProTαの分子基盤解明では、脳と同じ中枢神経である網膜神経細胞を標的とした、網膜虚血モデル(45分虚血後再灌流)を用いた虚血性網膜神経細胞死に対するProTαの効果を検討し、虚血・再灌流処置24時間後の全身投与でも有意な保護効果を示すこと見出した。また、この保護機構は光に対する網膜の電気応答を検出すElectroretinogram法においても改善がみられ、機能的にも保護していることが示唆された。この様なProTαの保護機構には、直接的な神経ネクローシスの抑制と神経細胞及びグリア細胞からのBDNF等の神経栄養医因子の発現上昇による間接的なアポトーシス抑制機構があることが明らかになった。一方、ProTαによるBDNFの発現上昇機構を解明するため、細胞レベルでの検討を行い神経細胞のみの培養ではProTαによるBDNF発現上昇が認められない事、しかしながら、ミクログリアと神経細胞の共培養条件下では、ミクログリア及び神経細胞の両方でBDNF発現が増加することを見出した。さらに培養ミクログリアにProTαを処置した後回収した培養上清でも、神経細胞でのBDNF発現上昇が認められた事から、ProTαによるミクログリアから遊離分子が神経細胞のBDNFの発現に関与することが明らかになった。