hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
血管付き神経移植による視神経再生促進作用の解析

平成22年度は、これに基づき、栄養血管なし移植を陰性対照とし、血管付き移植による視神経軸索の再生促進効果を、網膜神経節細胞の逆行性標識により評価するとともに、移植片内に再生する軸索の微細形態を明らかにすることを目指した。【方法】正常ラット(8週齢オス)の1眼の視神経を切断した。血管付き群では、移植神経である正中神経の栄養血管の血流を維持したまま、血管なし群では栄養血管を切断した後に、眼球の視神経切断端に神経片を吻合移植した。移植手術後4週間を経過したラットにおいて、移植神経片内に逆行性標識物質を注入し、軸索を再生した網膜神経節細胞を逆行性に標識、3日後に網膜を回収し、網膜神経節細胞数を定量した。また、移植神経片の微細構造を形態学的に明らかにした。【結果】血管なし群では再生軸索を有する網膜神経節細胞は712±78個/網膜であったが、血管付き群では1199±120個/網膜であり、統計学的に有意に再生軸索数が増加していた(p<0.05)。移植片を組織学的に検討すると、再生軸索の周りのシュワン細胞によるミエリン鞘は、血管なし群ではほとんど認められなかったのに対し、血管付き群では良好に形成されており、その周りに神経周膜も形成されていた。【考察】血管付き神経移植は視神経切断後において、単に網膜神経節細胞の軸索再生数を促進するのみならず、再生軸索がより正常に近い形態を持って再形成されることを促進する働きがあることがわかった。このことは、より高度な神経機能が再生されうることを示しており、血管付き神経移植の有用性が明らかになった。
エストロゲンおよび内分泌攪乱物質への発達期曝露が海馬機能に及ぼす影響に関する研究

昨年までに,β-estradiol(E2)が苔上線維-CA3シナプス特異的にシナプス形成を促進すること,また,E2がBDNFをmediatorとして作用を発揮することを明らかにした.そこで,生後海馬のアンモン角,歯状回から作製した部位特異的な初代培養系を用いて,E2による苔上線維-CA3シナプス形成とBDNFとの関連を詳細に検討した.まず,アンモン角初代培養系(主に錐体細胞からなる)と歯状回初代培養系(主に穎粒細胞からなる)におけるBDNFの発現量をWestern blotting法を用いて検討したところ,歯状回細胞に強い発現を確認した.アンモン角細胞にもわずかな発現が認められたが,歯状回に比較すると非常に弱い発現であった.また,両培養系において,E2はBDNFの発現レベルに何ら影響を及ぼさなかった.そこで,E2が歯状回顆粒細胞からのBDNF放出を促進し,その結果,シナプス形成を促進する可能性について検討した.歯状回初代培養系におけるBDNF放出に対するE2の作用をELISA法を用いて検討したところ,E2はBDNF放出を有意に促進した.また,薬理学的検討により,この作用がestrogen receptor (ER)α/β非依存性かつPKA依存性であることを明らかにした.以上の結果はE2が歯状回顆粒細胞からのBDNF放出をERα/β非依存性かつPKA依存性に促進し,放出されたBDNFが苔上線維-CA3シナプスのシナプス形成を促進することを示している.これらの結果は海馬におけるエストロゲンのERα/β非依存的な作用,歯状回顆粒細胞に高濃度で局在することがかねてより知られていたBDNFのシナプス形成への関与,さらに,エストロゲンとBDNFのシナプス形成におけるクロストークを示した初めての結果である.Whole animalを用いた実験の準備実験として,エストロゲンおよび内分泌撹乱物質の標的となりうる部位もしくは分子の探索を行った.培養海馬スライス標本においてエストロゲンおよび内分泌撹乱物質の標的が苔上線維-CA3シナプスであったことから,これらの化学物質のターゲット部位同定を試みた.培養海馬切片および培養歯状回切除海馬切片における後シナプスマーカーPSD95とDiIを用いた二重染色,歯状回,アンモン角各神経細胞の高純度単離培養におけるFM1-43を用いたシナプス活動の可視化により,エストロゲンによる苔上線維-CA3シナプス過形成におけるターゲットが歯状回顆粒細胞であることを明らかにした.内分泌撹乱物質が脳内へ移行する際,神経細胞に到達する前にアストロサイト層を通過することをふまえ,エストロゲンおよび内分泌撹乱物質のアストロサイトに対する作用についても初代培養アストロサイトを用いて検討した.近年,アストロサイトは神経細胞間シナプス伝達において積極的な役割を果たしている可能性が示唆されているが,そのメカニズムの一つとして注目されている神経伝達物質グルタミン酸の取り込み能力に対する作用について検討した所,エストロゲンはアストロサイトの細胞膜上に存在するアルファタイプエストロゲン受容体を介してグルタミン酸取り込みを阻害するという,新規の作用を発見した.また,これらの作用に,アルファタイプ膜エストロゲン受容体→PI3K→Akt→NOS活性化によるNO産生という情報伝達カスケードが関与する可能性を見出した.昨年度,培養海馬スライス標本おいてエストロゲンおよび内分泌撹乱物質が苔上線維-CA3シナプス形成を促進することを発見した.今年度はこのメカニズムについてさらに詳細に検討を進めた.具体的には,培養歯状回切除海馬切片における,後シナプスマーカーPSD95とDiIを用いた二重染色,歯状回,アンモン角,およびこれらの混合神経細胞からなる3種類の部位特異的初代培養系を用いて,エストロゲンによるシナプス形成促進が苔上線維-CA3シナプス特異的であること,さらに歯状回に高濃度に局在しているBDNFをmediatorとしてエストロゲンが作用を発揮していることを明らかにした.内分泌撹乱物質が脳内へ移行する際,神経細胞に到達する前にアストロサイト層を通過することをふまえ,エストロゲンおよび内分泌撹乱物質のアストロサイトに対する作用についても検討した.近年,アストロサイトは神経細胞間のシナプス伝達において積極的な役割を果たしている可能性が示唆されているが,その代表的メカニズムの一つがグルタミン酸トランスポーターを介した神経伝達物質グルタミン酸の取り込みである.昨年度,エストロゲンがアストロサイト細胞膜上に存在するアルファタイプエストロゲン受容体を介してグルタミン酸取り込みを阻害するという,新規の作用を発見した.今年度は,この作用メカニズムを詳細に検討し,アルファタイプ膜エストロゲン受容体→PI3K活性化→Akt活性化→NOS活性化によるNO産生→グルタミン酸トランスポーターの機能阻害というカスケードがエストロゲンによって活性化されることを,リン酸化AktのWestern blotting, NOキレーターDAF2-DAを用いたNO可視化により証明した.昨年までに,β-estradiol(E2)が苔上線維-CA3シナプス特異的にシナプス形成を促進すること,また,E2がBDNFをmediatorとして作用を発揮することを明らかにした.そこで,生後海馬のアンモン角,歯状回から作製した部位特異的な初代培養系を用いて,E2による苔上線維-CA3シナプス形成とBDNFとの関連を詳細に検討した.まず,アンモン角初代培養系(主に錐体細胞からなる)と歯状回初代培養系(主に穎粒細胞からなる)におけるBDNFの発現量をWestern blotting法を用いて検討したところ,歯状回細胞に強い発現を確認した.

アンモン角細胞にもわずかな発現が認められたが,歯状回に比較すると非常に弱い発現であった.また,両培養系において,E2はBDNFの発現レベルに何ら影響を及ぼさなかった.そこで,E2が歯状回顆粒細胞からのBDNF放出を促進し,その結果,シナプス形成を促進する可能性について検討した.歯状回初代培養系におけるBDNF放出に対するE2の作用をELISA法を用いて検討したところ,E2はBDNF放出を有意に促進した.また,薬理学的検討により,この作用がestrogen receptor (ER)α/β非依存性かつPKA依存性であることを明らかにした.以上の結果はE2が歯状回顆粒細胞からのBDNF放出をERα/β非依存性かつPKA依存性に促進し,放出されたBDNFが苔上線維-CA3シナプスのシナプス形成を促進することを示している.これらの結果は海馬におけるエストロゲンのERα/β非依存的な作用,歯状回顆粒細胞に高濃度で局在することがかねてより知られていたBDNFのシナプス形成への関与,さらに,エストロゲンとBDNFのシナプス形成におけるクロストークを示した初めての結果である.
筋性拘縮の発生機序に関わる分子メカニズムの探索と理学療法学的戦略の開発

本研究では筋性拘縮の発生契機となる筋核のアポトーシスを介したマクロファージの集積機序を明らかにするために,アポトーシスの促進に直接的に影響するミトコンドリアの動態変化を検索する.そして,不動化した骨格筋内のミトコンドリア恒常性とアポトーシス関連分子の変化を検索し,筋性拘縮の発生機序の詳細な分子メカニズムを明らかにすることを第1の目的とする.加えて,第1の目的を明らかにした上で現行の理学療法戦略によってミトコンドリアの機能不全を予防できるかを検証することを第2の目的とする.本研究では筋性拘縮の発生契機となる筋核のアポトーシスを介したマクロファージの集積機序を明らかにするために,アポトーシスの促進に直接的に影響するミトコンドリアの動態変化を検索する.そして,不動化した骨格筋内のミトコンドリア恒常性とアポトーシス関連分子の変化を検索し,筋性拘縮の発生機序の詳細な分子メカニズムを明らかにすることを第1の目的とする.加えて,第1の目的を明らかにした上で現行の理学療法戦略によってミトコンドリアの機能不全を予防できるかを検証することを第2の目的とする.
特発性心筋症の発症と進展における成長因子6FGF,TGFβの役割

近年,細胞増殖因子の多彩な生理機能と疾患への関与が注目されている.本研究では特発性心筋症における細胞増殖因子の関与を明らかにする目的で,FGF,TGFβなど各種細胞増殖因子の発現を免疫組織化学,in situハイブリダイゼーション法,ウェスタンブロットなどの手法により分析検討した.1.特発性心筋症患者の左室心内膜心筋生検より得た心筋組織について検討した.aFGFの免疫組織化学の結果,心筋症の心筋細胞にaFGFの集積が顕著であり,心筋aFGF陽性例は心筋症患者が対照群に比較して有意に高かった.また組織計測により算出した平均心筋細胞径,間質線維化率,毛細血管密度との関連について,aFGF陽性例の心筋細胞径は陰性例に比較して有意に大であった.心筋症の心筋細胞におけるaFGFmRNAの発現はin situハイブリダイゼーション法により確認された.2.心筋症モデル動物の心筋組織における細胞増殖因子の発現について検討した.心肥大期の20週令ハムスターのaFGF染色では変性心筋を中心に非変性心筋にも広範に強い陽性像が認められた.肥大前期6週令ハムスターにおいても,非変性心筋にFGF染色が中程度陽性であり対照動物に比較して差を認めた.同所見はFGF蛋白のWestern blotにおいても確認された.以上より,ヒト特発性心筋症の左室心筋細胞において成長因子の一つであるaFGFの発現が増加していることが明らかとなった.また心筋症モデル動物におけるaFGF発現の増加も確認された.aFGFが心筋症の病態生理に重要な関連を有することは明らかである.aFGFの心筋細胞肥大との関連について,aFGFの組織修復作用の一つとして代償性の心筋細胞肥大を生じさせる可能性があるが,これが心筋症の病態を悪化させるか否か,なお解決すべき点が残されている.今後,成長因子の果たす意義について,アポトーシスとの関連も含めて,さらに検討を重ねる必要がある.近年,細胞増殖因子の多彩な生理機能と疾患への関与が注目されている.本研究では特発性心筋症における細胞増殖因子の関与を明らかにする目的で,FGF,TGFβなど各種細胞増殖因子の発現を免疫組織化学,in situハイブリダイゼーション法,ウェスタンブロットなどの手法により分析検討した.1.特発性心筋症患者の左室心内膜心筋生検より得た心筋組織について検討した.aFGFの免疫組織化学の結果,心筋症の心筋細胞にaFGFの集積が顕著であり,心筋aFGF陽性例は心筋症患者が対照群に比較して有意に高かった.また組織計測により算出した平均心筋細胞径,間質線維化率,毛細血管密度との関連について,aFGF陽性例の心筋細胞径は陰性例に比較して有意に大であった.心筋症の心筋細胞におけるaFGFmRNAの発現はin situハイブリダイゼーション法により確認された.2.心筋症モデル動物の心筋組織における細胞増殖因子の発現について検討した.心肥大期の20週令ハムスターのaFGF染色では変性心筋を中心に非変性心筋にも広範に強い陽性像が認められた.肥大前期6週令ハムスターにおいても,非変性心筋にFGF染色が中程度陽性であり対照動物に比較して差を認めた.同所見はFGF蛋白のWestern blotにおいても確認された.以上より,ヒト特発性心筋症の左室心筋細胞において成長因子の一つであるaFGFの発現が増加していることが明らかとなった.また心筋症モデル動物におけるaFGF発現の増加も確認された.aFGFが心筋症の病態生理に重要な関連を有することは明らかである.aFGFの心筋細胞肥大との関連について,aFGFの組織修復作用の一つとして代償性の心筋細胞肥大を生じさせる可能性があるが,これが心筋症の病態を悪化させるか否か,なお解決すべき点が残されている.今後,成長因子の果たす意義について,アポトーシスとの関連も含めて,さらに検討を重ねる必要がある.特発性心筋症における細胞増殖因子の役割を明らかにする目的で特発性心筋症をはじめ,急性心筋炎を含む45人の患者より内膜心筋生検標本を得て,生検心筋組織の凍結切片に対して,抗ヒト酸性FGF,塩基性FGF,TGFβ抗体,抗FGFレセプター抗体を用いたABC法による免疫染色を施行した.さらに組織計測として心筋細胞横径および間質線維化率,抗第8因子関連抗原抗体の染色による心筋組織の毛細血管密度などを算出して増殖因子の染色結果と比較した.特発性心筋症21例(HCM 9,DCM 12例),高血圧性心疾患3例,および心エコー図および心筋生検の光顕所見で異常を認めないコントロール例6例の合計30例の検討の結果,心筋症患者における酸性FGF,塩基性FGF免疫染色の陽性率は,非心筋症対照群に比して有意に高率であった.(酸性FGF:71.4%対0%,塩基性FGF:73%対33.3%).また,光顕組織計測による心筋細胞径は酸性FGFの免疫染色陽性例で有意に大であった(23.1±6.3μm対18.3±3.9μm).FGFの染色性による間質線維化率および毛細血管密度の差はなかった.

一方,FGFの染色性により左室駆出率,および心エコー図より求めた左室拡張末期径,左室重量等を比較したところ,酸性FGF陽性例において左室重量は有意に大であった.以上,心筋症患者の生検組織における免疫組織化学的解析によって,ヒト心筋症の心筋細胞における細胞増殖因子FGFの発現が明らかにされ,FGF,特に酸性FGFが心筋症の心筋細胞肥大にたいして重要な役割を演ずることが強く示唆された.加えて,mRNAレベルでの増殖因子の発現を明らかにするため,FGFのcDNAプルーブを得てin situ hybridizationを施行中である.特発性心筋症における細胞増殖因子の役割を明らかにする目的で,心筋症における細胞増殖因子に発現について検討した.ヒト心筋症において,前年度に酸性FGFの蛋白の発現が増大していることを免疫組織化学的手法により明らかにしたが,今年度は酸性FGFのmRNAレベルでの発現をアンチセンスオリゴDNAプローブを用いたin situ hybridization法により検討した.その結果,酸性FGF免疫染色陽性の心筋生検組織において,心筋細胞におけるmRNAの著明な発現を認めた.心筋症における増殖因子の関与をさらに明らかにする目的で,心筋症モデル動物を用いて検討を行った.心筋症モデル動物として20週齢心筋症ハムスターBIO14.6を用い,対照ハムスターF1βとの比較を行った(n=12).BIO 14.6ハムスターの心筋組織では,いずれも心筋細胞の肥大,変性,間質の線維化,石灰化巣などを有し,BIO 14.6とF1βとの比較では,心重量対体重量比4.53対3.44,左室平均心筋細胞径17.2±2.1対12.9±1.3μm(p<0.001)とBIO 14.6ハムスターの心筋の肥大・変性が明らかであった.左室心筋ホモジネートのWestern blotにて,BIO 14.6の19kDの酸性FGF蛋白の発現は対照ハムスターに比較して明らかに大であった.また,免疫組織化学により心筋細胞に局在を有する酸性FGFの免疫染色はBIO 14.6ハムスター6/6で陽性で,F1β1/6(p<0.05)より有意に陽性率が高かった.以上の結果から心筋症のモデル動物においても心筋細胞における酸性FGFの発現の増加が明らかとなり,心筋症における増殖因子の密接な関与が示唆された.ヒト心筋症における本研究の結果は平成8年3月に行われる米国心臓病会議(ACC)において報告される.前年度までのヒト心筋症での検討結果より,fibroblast growth factor(FGF)の発現がヒト特発性心筋症のみならず心筋症モデル動物の心筋にも増加していることが明らかとなった.本年度は心筋症ハムスターBIO14.6を用いて、前年度に引き続き心筋症モデル動物における成長因子の関与について検討を行った.心肥大期の20週齢に加え肥大発症前期の6週齢ハムスターを用い,対照として同週齢のシリアンハムスター(F1β)を用いた.成長因子検索の方法として,組織所見の検討,FGF,TGF-B1,IGF-Iなどの免疫組織化学に加え,心筋ホモジネートより蛋白発現の検索としてWestern blottingを施行した.また,心筋症における成長因子とアポトーシスの関連について検討する目的で,心筋組織のin situ TdT染色(Tunel法)を行った.結果心筋症ハムスターの心・体重量比,心筋細胞径は20週令では対照動物に比較し有意に大であったが,6週令での比較では差がなかった.20週令ハムスターのFGF染色では変性心筋を中心に非変性心筋にも広範に強い陽性像が認められた.6週令ハムスターにおいても,非変性心筋にFGF染色が軽度から中程度陽性であり対照動物に比較して差を認めた.同所見はFGF蛋白のWestern blotによる検討でも確認された.
表層改質による細胞の高次機能化

片末端に塩化シアヌルを有するポリジメチルアクリルアミド(PDMAA-CC)を、縮胞外皮に存在する糖鎖の水酸基、或いは膜タンパク質のアミノ基を介して細胞膜に導入し、細胞機能の変換を試みた。1)好中球様細胞の機能変化:活性酸素産生量を指標として検討を行った。ポリスチレン(PS)微粒子を添加した場合、PDMAA-CCを作用させた細胞では未処理の系、及び塩化シアヌルを固定していない高分子(PDMAA-NH_2)の系と比較して活性酸素産生量の減少がみられた。このような効果を示した濃度域においては、高分子鎖による毒性発現及び細胞の活性化は認められなかった。更に、この改質した細胞に走化性ペプチドであるfMLPを添加した場合、未処理の系と同様の活性酸素産生がみられ、機能低下が起こっていないことが分かった。一方、塩化シアヌルのみを作用させた系では、PS刺激、fMLP刺激ともに活性酸素の放出がみられなかった。2)血小板の機層変化:PDMAA-CCを添加したごく初期の血小板内遊離Ca^<2+>濃度([Ca^<2+>]i)の観察から、膜表面への高分子鎖の導入に際して血小板の[Ca^<2+>]iは変化せず、過度な刺激を受けていないことが確認された。血小板の機能変化については凝集能を指標として検討を行った。改質した細胞に凝集惹起物質トロンビン(分子量約4万)を添加した場合、凝集能の低下がみられた。一方、低分子惹起物質であるカルシウムイオノフォアA23187を作用させたところ、未改質の系と同様の凝集能を示し、トロンビンに対する凝集抑制は機能低下によるものではないことが分かった。これらのことから、PDMAA-CCは細胞外皮の官能基を介して細胞膜に固定化され、新たに形成された遮蔽層によってある程度以上の大きさを有する物質の膜表面への直接的な到達が物理的に阻害され、細胞の認識能の低下に至ったものと考えられる。1,細胞膜へ高分子鎖を導入させるために、疎水性アンカー(octadecyl基)を有するポリジメチルアクリルアミド(PDMAAC18)を合成した。これを白血球懸濁液に添加(0.1g・L-1)し、過剰分を除去した後に細胞の異物認識能の変化を測定した。ポリスチレン表面との接触によって起こる活性酸素の産生が顕著に抑制された。改質細胞では刺激剤であるfMLPに対する応答性が低下してしまった。おそらく膜物性変化の影響が無視できないと考えられる。細胞膜へのアンカー数をできるだけ少なくして、最表面領域で後添加した高分子鎖との架橋を形成させることにより改善が図れるかもしれない。次に種々の濃度のPDMAAC18を血小板懸濁液に添加し、細胞表層に保護層を形成させることを試みた。添加濃度が0.1g/Lのとき、トロンビン添加によって誘起される血小板凝集に対して抑制効果を示す結果を得た。アンカー基のないPDMAAではいずれの濃度の場合にも抑制は認められなかった。この濃度(0.1g/L)で、血小板内部の遊離Ca2+濃度を測定したところ、ほとんど変動を示さなかった。おそらく、この凝集能の低下は、導入された高分子鎖由来の立体的反発作用によるものと、トロンビンと細胞レセプターとの結合部位がこの高分子層によって遮蔽されたためであると考えている。2,膜レセプターを介して高分子鎖を導入するために、片末端に細胞接着性ペプチドRGDSを有するポリアクリルアミド(RGDS-PAAm)を合成した。白血球に添加して、ポリスチレン表面と接触させると、活性酸素の産生が顕著に抑制された。改質細胞にRGDS固定化微粒子を後添加したところ、固定化微粒子による活性化をも阻害することがわかった。RGDS-PAAmの細胞への結合はRGD-インテグリンを介したものであることも確かめた。これらはともにこの高分子鎖の保護効果を示している。

一方、低分子惹起物質であるカルシウムイオノフォアA23187を作用させたところ、未改質の系と同様の凝集能を示し、トロンビンに対する凝集抑制は機能低下によるものではないことが分かった。これらのことから、PDMAA-CCは細胞外皮の官能基を介して細胞膜に固定化され、新たに形成された遮蔽層によってある程度以上の大きさを有する物質の膜表面への直接的な到達が物理的に阻害され、細胞の認識能の低下に至ったものと考えられる。
地下生担子菌類香気成分の繁殖生態学的意義の解明と系統進化・分類学への適用

種多様性に関する知見の不足している、日本産地下生菌の分類学的・生態学的・進化学的知見の蓄積を目的として、イグチ科ヤマイグチ属との共通祖先から派生した地下生菌を対象に、形態学的・分子系統学的検討に加え、子実体の香気成分分析による化学分類学的検討を試みた。1.Octaviania属の分類:本属菌はこれまでに日本からは1種が報告されていたが、核およびリボソームDNA複数領域データセットによる系統解析を行った結果、日本国内に種レベルの系統が少なくとも12系統存在することが新たに確認された。そのうちの4系統は形態的・生態的に識別が極めて困難な隠蔽的系統であった。更に、これらの隠蔽的な系統について、形態学的検討のほか、生物地理学的検討およびDNAデータに基づく系統ネットワークを用い、これらが互いに独立した隠蔽種であると結論付けた。2.Chamonixiaの分類:分子系統解析および形態学的検討の結果、アジアおよびオーストラレーシア産本属菌は属のタイプ種と異なる祖先から進化したことが示され、新属Rosbeeva T.Lebel & Orihara、新組み合わせ1種および日本産2新種の記載を含む論文を現在投稿中である。3.上記の地下生菌および近縁の地上生菌の子実体を用い、ガスクロマトグラフィーおよびマススペクトロメトリーによる成分分析を行った。その結果、各地下生菌の系統ではマツタケオールが共通して検出されたが、近縁の地上生イグチ類では同物質が検出されなかった。しかし、本物質はきのこ類に広く含まれる物質であり、本研究において供試された地下生菌の特有な香気には、他の微量成分も大きく影響している可能性がある。今後、これらの微量成分をより詳細に分析し組成を明らかにすることで、化学分類への応用だけでなく、ヤマイグチ類における地下生化と香気物質との進化学的関連性や生態学的意義の解明に繋がることが期待される。生物学的多様性に関する知見の不足している、日本産地下生菌(シクエストレート菌)の種多様性の解明と、分類学的・生態学的・進化学的知見の蓄積を目的として、主としてイグチ科に含まれる地下生菌を対象に、形態観察の他、DNA情報に基づく分子系統解析、電子顕微鏡を用いた超微細構造観察、子実体中の香気成分分析などの手法を用いて多面的検討を行った。その結果、以下の結果が得られた。1.これまでOctaviania属に分類されていたジャガイモタケO.columelliferaの系統関係を明らかにするとともに、本種に対し新属Heliogasterを設立した。これらの成果は国際学術雑誌で発表された。2.これまで1種のみが知られていた日本産Octaviania属菌の種多様性を明らかにし、少なくとも10の種レベルの系統が確かめられた。また、これらの菌の生態学的特徴および超微細構造観察から、分類学的評価基準を提案した。3.Octaviania属と同じく、地上生菌ヤマイグチ属Leccinumと系統的類縁関係の強い地下生菌Chamonixia属を検討した結果、日本国内に少なくとも7つの種レベルの系統が存在することが明らかになった。それらはオーストラリア産の同属菌と単系統群を形成した一方、属のタイプ種とは異なる系統に含まれた。前者の系統は更に2つの亜属レベルに相当するサブクレードに分けられた。4.上記の地下生菌について子実体中の香気成分分析を行った結果、属レベルで異なる香気成分組成を有する傾向があることが示された。上記2-4の結果は、国際学会にて発表された。以上の結果から、日本産地下生菌は、これまで知られていた以上の高い多様性を有することが示唆され、本研究により得られた知見は、多くの希少種が含まれると考えられる日本産地下生菌の保全とその評価法に寄与するものと考えられる。

今後、これらの微量成分をより詳細に分析し組成を明らかにすることで、化学分類への応用だけでなく、ヤマイグチ類における地下生化と香気物質との進化学的関連性や生態学的意義の解明に繋がることが期待される。
幼小の学びを効果的に接続する話す能力・聞く能力のカリキュラム開発

本研究の目的は,年長5歳児, 1年生6歳児の実態をもとに,それぞれの発達段階における話す能力・聞く能力のねらいを具体化し,そのねらいに基づいた第1学年の「話すこと・聞くこと」に関するカリキュラムの開発を行うことであった。研究の方法としては,年長5歳児(10月中旬)の遊びや生活における発話,および1年生6歳児(10月中旬)の遊びや学習における発話を記録した。その際,話し方・聞き方に関する事項(声の大きさ・速さ,順序,理由,言葉遣い)と感情の種類(嬉しい,怒り,悲しい等の有無)の相関を整理した。その結果,怒りや悲しさ,喜びといった感情の起伏が生じるときに非言語性のコミュニケーションの表出頻度が高く, 5歳児においてはそれが顕著であった。そこで,第1学年において,単元「こだわりのおみせやさんをひらこう」という単元を開発した。本単元では, 1非言語性コミュニケーションから言語性コミュニケーションへの移行を促すことと, 2非言語性コミュニケーションを効果的に表出させることという二つのねらいをもって,環境構成を含めた支援を考案した。1の手立てとして,イメージするお店のこだわりを「○○なお店」と言葉に表し,自分たちの作る商品がその「○○なお店」に合っているかどうかを確かめながら商品作りを進めさせた。その結果,自分の作る商品のイメージを言語化して語る姿が9割以上の子どもに見られた。また, 2の手立てとして,グループの話し合いにおいて葛藤が生まれ感情の起伏が生じやすくなるタイミングで,自分の思いが相手に伝わりやすくなる声の大きさや強さ,体の姿勢,表情などの非言語性コミュニケーションの表出のさせ方を支援した。その結果,非言語性コミュニケーションについても自分の思いを伝えるためにより適した表出のさせ方をする子どもが約2割増加した。
海洋島における海流散布植物の内陸環境への適応と進化

南太平洋諸島に生育する海流散布植物オオハマボウの内陸ー海岸集団の形態・遺伝的特徴を明らかにすることで、海洋島における海流散布植物の内陸適応の過程を解明することを目的とした。形態解析の結果、内陸集団の花は柱頭から雄ずい群まで距離が著しく短くなっており、自殖を促進するような形になっていた。分子系統学的解析の結果、オオハマボウは小笠原、タヒチ、マルケサス諸島の3箇所で独立に内陸適応を遂げたことが明らかとなった。また、南太平洋諸島の内陸集団と海岸集団の間では顕著な遺伝的分化は見られなかった。以上の結果は、オオハマボウが自動自家受粉を獲得しながら急速に内陸環境に適応した可能性を示唆された。海洋島の生物にはいくつもの進化の共通パターンが観察される。特に海流散布植物が島の内陸環境で生育する生態的シフトは、多くの海洋島で見られる進化現象である。本研究では、海流散布植物が内陸環境へ適応する際の種子散布様式の進化と遺伝的基盤を解明することを目的している。今年度は野外調査による海流散布植物の生育環境調査と試料採集を中心に実施した。9-10月に小笠原諸島の父島と母島で野外調査を行い、遺伝子解析用の試料約600点と散布様式を調べるための種子を収集した。母島で採集したモンテンボク(アオイ科)は、これまで父島の個体で報告されていたのと同様に種子が水に浮かなくなっていることが明らかとなった。種子散布様式の変化が、父島と母島で同時並行的に生じたのかどうかは大変興味深く、更なる検討が必要である。2-3月に仏領ポリネシアのタヒチ島、ヌクヒバ島、ヒバオア島、ウアフカ島で野外調査を行い、遺伝子解析用の試料約800点と種子を収集した。仏領ポリネシアの各島では内陸部の高標高域にまで海流散布植物のオオハマボウが進入しており、さらに、内陸集団は海岸集団とは花の形態に僅かな差異が見られることを発見した。また、タヒチ島の一部の個体は種子が海水に長時間は浮かないことが、現地での予備的な実験で明らかとなった。遺伝解析に関してはDNAの抽出を順次進め、次世代シーケンサーによる一塩基多型の検出ための実験条件設定をおこなった。本研究では、海流散布植物が内陸環境へ適応する際の種子散布様式の進化と遺伝的基盤を解明することを目的にしている。平成26年度は奄美大島と小笠原諸島父島で野外調査を行い、遺伝子解析用試料の採集と証拠標本の作成をおこなった。これまでに採集した小笠原諸島、琉球列島、南太平洋諸島の約700点の遺伝子解析用試料について、DNAの抽出と定量を完了した。DNA抽出の予備実験ではCTAB法とカラム法の両者を比較し、多糖類を多く含む本種ではカラム法が適していたため、実験はすべてカラム法で実施した。次に、次世代シーケンサーによる一塩基多型の検出(改良ddRAD)ための実験条件の設定をおこなった。本種は正確なゲノムサイズが分かっていないため、4組の制限酵素の組み合わせ(SphI-EcoRI, SphI-MluCI, NlaIII-EcoRI, MluCI-NlaIII)を試し、適正な断片長が得られる組み合わせを検討した。その結果、SphI-MluCIの組み合わせで理想的な断片長さを得られることが分かった。次年度は各集団役20個体ずつを用いて、一塩基多型に関するデータを取得していく。一部のサンプルを用いて葉緑体DNAの全塩基配列を比較し、種内に10箇所の突然変異があることを明らかにした。次年度はddRADの解析を中心に進めるが、必要に応じて葉緑体DNAの全塩基配列を比較も含めていきたいと考えている。本研究では、海流散布植物が内陸環境へ適応する際の種子散布様式の進化と遺伝的基盤を解明することを目的としている。平成2627年度の野外調査(奄美大島、小笠原諸島、琉球列島、南太平洋諸島、日本列島本州)で得た試料を用いて、南太平洋諸島(マルケサス諸島・タヒチ諸島)の内陸集団と海岸集団の形態比較と遺伝解析を実施した。遺伝解析は昨年度に引き続きddRAD法による分析を試みたが、一部のサンプルで多糖類の影響によって十分な純度のDNAが抽出できないことや、適切な制限酵素の組み合わせが得られなかったことから、実験法を核および葉緑体DNAの通常シーケンス法に切り替えて実験を行った。分子系統解析の結果、マルケサスとタヒチの集団はその起源が異なる可能性が示唆された。さらにマルケサス諸島の内陸集団と海岸集団には有為な遺伝的差異は見られないことが明らかとなった。形態比較の結果、マルケサス諸島の内陸集団と海岸集団は花形態が明らかに異なっていることが明らかとなった。花形態の違いは、柱頭と雄蘂群の距離の差に顕著であったことから、内陸集団では自植性の獲得が急速に生じた可能性が示唆された。種子の浮遊実験では一部のサンプルで種子の浮遊能力が減少していることを確認した。南太平洋諸島に生育する海流散布植物オオハマボウの内

陸ー海岸集団の形態・遺伝的特徴を明らかにすることで、海洋島における海流散布植物の内陸適応の過程を解明することを目的とした。形態解析の結果、内陸集団の花は柱頭から雄ずい群まで距離が著しく短くなっており、自殖を促進するような形になっていた。分子系統学的解析の結果、オオハマボウは小笠原、タヒチ、マルケサス諸島の3箇所で独立に内陸適応を遂げたことが明らかとなった。また、南太平洋諸島の内陸集団と海岸集団の間では顕著な遺伝的分化は見られなかった。以上の結果は、オオハマボウが自動自家受粉を獲得しながら急速に内陸環境に適応した可能性を示唆された。研究実施計画における平成26年度の目標とその達成度(◎:十分に達成できた、○:順調に進行中、△:予定よりやや遅れた、×:予定よりかなり遅れた)は以下の通りである。種子散布特性の解析(内部構造)△、種子散布特性の解析(浮遊能力)△、遺伝解析(データ作出)◎、研究成果発表○種子散布特性に関する実験にやや遅れがあるが、マイクロCTスキャンの共同利用など研究協力体制の構築ができたので、次年度中にはデータを作出できると考えている。遺伝解析や研究成果発表はおおむね順調に進んでいる。植物系統地理学、島嶼生物学代表者の高山は平成27年4月1日付で、静岡県ふじのくに地球環境史ミュージアムに准教授として着任する。解析に必要な小・中型の実験機材はすでに設置してあるので、隣接する静岡大学グリーン科学技術研究所の大型機器の共同利用を図りながら、確実に研究を実施していきたいと考えている。20162017年に国際会議Island Biologyが行われる予定があるので、その際に研究成果を発表できるように、計画通り実験解析を実施していく。野外調査による試料採集は現地研究者の積極的な協力もあり、予定していたよりも多くの採集地点から遺伝解析に用いる試料を得ることができた。遺伝子解析に関しては、条件設定や試薬類の納期の遅れなどもあったが、概ね計画通り進んでいる。次年度は、種子散布特性の解析と次世代シークエンサーを用いた遺伝解析を中心に進める。遺伝解析ではできるだけ多くの個体を実験に用いるために、DNA抽出を含めた実験作業の効率化や実験補助員の協力を得るなどの工夫が必要であると考えている。
高性能イオン・ガスセンサの開発

本研究では,種々のセンサ材料の合成と探索及びその性能の検討を行ない高度の性能と機能をもつイオンセンサ並びにガスセンサの開発を行なった.高性能イオンセンサ疎水性のイオン交換体を用いたアセチルコリンやビタミンB1などに高感度に応答する電極を開発し,この種の電極のチューブ状微小電極検出器を試作し流れ分析へ応用した.また,クロロテトラサイクリンを光ファイバー先端に固定した光学的Ca^<2+>イオンセンサを開発した.非環状含硫黄化合物を合成し,これとキャリアとする高感度な銅イオンセンサを開発した. 14-クラウンー4誘導体を含むポリ塩化ビニル膜と透析膜の複合膜を用いた血清測定用のLi^+イオンセンサを開発した.また,カリクス[4]アレン誘導体をキャリアとする高選択性のNa^+イオンセンサを開発した.特定の組成のリン酸ガラス膜電極がハロゲン化物イオンなどの陰イオンに応答することを見いだし,この電極を陰イオンクロマトグラフィーの検出器に応用した.さらに高速で動作する超小型血液pHモニタ用のマイクロバルブを開発した.高性能ガスセンサフルオレセインを分散したポリエチレングリコ-ル薄膜を光ファイバ-の先端に取り付け、蛍光法に基づく光CO_2センサを開発し、内部溶液を必要としないため安定性に優れていることを示した。前年度開発したNa_2SOD_4-Y_2(SO_4)_3-SiO_<2>系固体電解質を用いたSOD_<2>センサのH_<2>S及びNH_<3>共存下における応答について検討を行い、これら共存ガスのよる妨害のメカニズムについて新しいD知見を得た。また、H_<2>/H_2O系における安定下ジルコニア/Pt電極の界面イDンピ-ダンス、分極特性などを測定し、CO/CO_2>系の結果と比較検討を行い、H_2>/H_ 2O系の反応速度が1000倍以上大きいことを明らかにした。さらに、プロトン導電体(アンチモン酸)を用いた常温作動型ガスセンサの開発を行い、これを四探針型センサとした場合、湿D度の影響を全く受けない優れたH_2_センサとなることを見出した。
開発利益の公共還元支援システムの構築

本研究は広域的社会資本整備における財源負担問題の一解決策として,開発利益還元方策を具体的に提案し,一連の研究成果をシステム化することにより実用化を図ることを目的としており,研究成果として以下を挙げることができる.(1)取引事例の収集本研究では,複数の自治体に跨る既存の鉄道路線および分析対象年を選定し,それら自治体で実際的に行われた取引事例データを不動産業者のヒアリングおよびデータを購入することにより数百地点のデータを収集し,地図情報として整備した.(2)取引事例の現地調査また,本研究では取引事例に記載されていない地点情報を確保するために,現地調査を行い,当該地点属性を把握した.具体的には,調査地点毎の写真撮影等を実施し,地点毎の詳細かつ実態に即した情報を得,さらに,データベース化を図った.(3)ネットワーク・データの構築本研究の分析対象が鉄道整備であることから,鉄道および道路という交通機関毎の地点別交通利便性に関する情報を整備するために,分析対象地域における鉄道および道路ネットワークを作成し,交通機関別地点時間距離および費用を算出するための,ネットワーク・シミュレーションを実行した.(4)開発利益還元方策の検討前項までの,開発利益の計測に関するデータ収集および分析とは異なり,ここでは,開発利益が計測された後の問題となる,公共への還元方策について検討した.特に,本研究では地点毎の開発利益の徴収方法およびその額をはじめとして,自治体間の財源負担割合のあり方について,専門家のヒアリングを交えて検討し,種々の代替案をメニュー化することにより,後述する対話型システムに結び付けた.(5)対話型システムの設計および構築以上の研究成果を実際に自治体で適用し得るものにするため,データ・ベースを構築し,対話型のシステムとしてしシステム化した.その際,システム構築の専門家に対するヒアリングを行い,システムが具備すべき条件を整理し,本システムに反映させた.本研究は広域的社会資本整備における財源負担問題の一解決策として,開発利益還元方策を具体的に提案し,一連の研究成果をシステム化することにより実用化を図ることを目的としており,研究成果として以下を挙げることができる.(1)取引事例の収集本研究では,複数の自治体に跨る既存の鉄道路線および分析対象年を選定し,それら自治体で実際的に行われた取引事例データを不動産業者のヒアリングおよびデータを購入することにより数百地点のデータを収集し,地図情報として整備した.(2)取引事例の現地調査また,本研究では取引事例に記載されていない地点情報を確保するために,現地調査を行い,当該地点属性を把握した.具体的には,調査地点毎の写真撮影等を実施し,地点毎の詳細かつ実態に即した情報を得,さらに,データベース化を図った.(3)ネットワーク・データの構築本研究の分析対象が鉄道整備であることから,鉄道および道路という交通機関毎の地点別交通利便性に関する情報を整備するために,分析対象地域における鉄道および道路ネットワークを作成し,交通機関別地点時間距離および費用を算出するための,ネットワーク・シミュレーションを実行した.(4)開発利益還元方策の検討前項までの,開発利益の計測に関するデータ収集および分析とは異なり,ここでは,開発利益が計測された後の問題となる,公共への還元方策について検討した.特に,本研究では地点毎の開発利益の徴収方法およびその額をはじめとして,自治体間の財源負担割合のあり方について,専門家のヒアリングを交えて検討し,種々の代替案をメニュー化することにより,後述する対話型システムに結び付けた.(5)対話型システムの設計および構築以上の研究成果を実際に自治体で適用し得るものにするため,データ・ベースを構築し,対話型のシステムとしてしシステム化した.その際,システム構築の専門家に対するヒアリングを行い,システムが具備すべき条件を整理し,本システムに反映させた.
二次元的高温超伝導体のc軸方向の磁束線の縦相関距離

2次元的なBi-2212超伝導単結晶試料の臨界電流密度のピーク効果をCampbell法を用いて観測した結果、ピーク磁界近傍で臨界電流密度が二つの安定な値をもった状態が存在するとともに、臨界電流密度の不連続な変化を伴った1次移転であることが明かになった。これは磁束線の3次元状態から2次元状態へのクロスオーバーに誘起されたピンニング転移であると結論された。しかし、高磁界側のいわゆる3次元状態においてもc軸方向の磁束線の長さ方向の磁気的な相関距離は10\mumのオーダーであり、パンケーキ磁束モデルで仮定されているようにCu02面間で切れ切れの状態にはなっていない。この現象は超伝導の位相が磁束線の長さ方向には相関を失いつつも、磁束線が量子化しているために常伝導核の周囲の磁気的な結合が強く残っていることによるものと考えられる。次元性の異なるBi-2212(単結晶)、Bi-2223(テープ線材)、Sm-123(熔融法バルク材)について磁化の緩和率と不可逆磁界を測定し、磁束クリープ・フロー理論の予想と比較しよい一致を得た。これによれば超伝導体が2次元的になるほど熱活性化による磁束クリープの影響を受けやすくなるのは磁束バンドルの体積が小さくなるからであるが、これは上述のようにパンケーキ磁束モデルの予想のように長さが短くなっているからではなく、逆に横方向のサイズが小さくなっているからである。2次元的な超伝導体ではブロック層が絶縁的になり、かつ厚くなるので全体の凝縮エネルギー密度が低くなり、磁束線格子の剪断変形に対する弾性定数が小さくなる。このために磁束クリープの際に容易に剪断変形を起こし、少数の単位のバンドルを形成する。バンドルを形成する磁束線の典型的な数は最も2次元的なBi-2212で1本、最も3次元的なSm-123で4本程度、中間的なBi-2223で2本弱である。厚みを5μmから10μmまで変えたBi-2212超伝導試料について厚みの方向(c軸方向)の不可逆磁界を測定した。その結果、当初の予想と異なって、厚みが薄い試料の方が不可逆磁界が高かった。この結果について、ピンカの不均一分布を考慮した磁束クリープ・フロー・モデルによる理論解析と比較した。解析に必要なピンニング・パラメーターは広い温度、磁界領域におれる臨界電流密度が実験結果に一致するように選んだ。これによる理論結果は実験結果とよく一致した。厚みの薄い試料の方が不可逆磁界が高かったのは、一つにはピン力が強く、臨界電流密度が大きかったためであり、またもう一つには不可逆磁界近傍では磁束線の縦相関距離が数μmのオーダーであって、すでにバルク・ピンニングの領域にあったためである。このことからこの理論的モデルの記述は正しいことが明らかになったが、直接超伝導体試料の厚み依存性を実験で確かめるには、その厚みを5μm以下にしなければならないことが明らかになった。一方、同様に二次元的なBi-2223超伝導テープ線材および三次元的なY-123超伝導単結晶について、磁化の緩和率の測定から見かけのピンポテンシャルを求め、これから磁束バンドル中の磁束線の平均の数を評価した。この値は磁束バンドルの横方向のサイズに関係している。

その結果、この磁束線数はBi-2223では1から2の間の値となり、Y-123では3以上の値となった。これまでに得られた最も二次元的なBi-2212ではこの値が1であることから、次元性が低くなるにつれて磁束バンドルの横方向のサイズが小さくなることが明らかとなった。この結果はパンケーキ磁束モデルの予想とは根本的に異なる。二次元的なBi-2212超伝導体単結晶試料について臨界電流密度のピーク効果が観測される温度・磁界領域でCampbell法を用いて磁束線の振る舞いを詳細に調べた結果、ピークが漫然と現れるのではなく、二つの異なる臨界電流密度をもつ状態が安定に存在し、ピーク効果が臨界電流密度の不連続な変化を伴う一次相転移であることが明らかになった。またこの転移に際してピンニングの強さを表すLabuschパラメーターは変化がない一方で、磁束線がピンから外れる距離である相互作用距離が不連続に増加する。したがってこのピーク効果はピンニング機構の変化ではなく、磁束線の性質の変化によるものであることが示された。その原因としては磁界の増加とともに磁束線が3次元状態から2次元状態にクロスオーバーしたことが考えられる。ただし、その場合でも磁束線の長さ方向の相関距離は数μm以上あり、磁束線は長さ方向には強く結合しており、パンケーキ磁束モデルで仮定されているようにCuO_2面間で切れ切れになっていない。この現象は超伝導の位相が磁束線の長さ方向には相関を失いつつも、磁束線が量子化しているために常伝導核の周囲の磁気的な結合が強く残っているものと解釈される。同じBi-2212単結晶試料について、磁束線の2次元状態と3次元状態の両方の領域で不可逆磁界と磁化の緩和率を測定した。一方、両方の領域で広く臨界電流密度を測定し、磁束クリープ理論でこれを説明できるようなピンポテンシャルを抽出し、これを用いて同じ理論から不可逆磁界と磁化の緩和率を求めた。その結果、理論と実験はほぼ一致し、この理論で仮定している磁束バンドルの形状、すなわち長さ方向には長く、一方で横方向には超伝導体の次元性の影響で短いという形状が唯一、現象を説明するものであることが明らかになった。Bi-2212などの二次元的超伝導体の対極としての三次元的超伝導体の例として、熔融法で製作したピンニングの強いSm-123超伝導体の磁化およびその時間緩和を測定し、臨界電流密度、見かけのピンポテンシャル、不可逆磁界を測定した。その結果は磁束バンドル中の磁束線の数を4.3として大体説明することができた。これはBi-2212などでは1となることと対照的である。なお、磁束バンドルの長さ方向のサイズは、これまでに示したように、与えられた磁界の下ではピンニングの強さのみで決定し、超伝導体の次元性に依存せず、パンケーキ磁束モデルで仮定したようにブロック層間でnmサイズに切れ切れになることはなく、10μmの程度にまで達する。したがって、超伝導体の次元性が不可逆性に及ぼす影響は横方向のサイズであると結論される。Bi-2212超伝導体でこのように磁束バンドルの横方向サイズが小さくなるのは、ブロック層の厚みが厚く、この部分の超伝導性がほとんどないために磁束線格子の剪断変形に対する弾性定数C_<66>が小さくなるためである。一般に磁束線格子の横方向の弾性相関距離はC_<66>の1/2乗に比例する。すなわち磁束線格子が剪断変形をしても弾性エネルギーの上昇は小さく、熱活性化運動の際に各磁束線は単独で行動しやすいと考えられる。逆に、Sm-123などの三次元的超伝導体ではブロック層の厚みが厚くないばかりでなく、その部分の超伝導性もある程度強いので磁束線格子は剪断変形しにくく、横方向に大きな磁束バンドルを形成することになる。
シャペロニン反応メカニズムの再検証：円順列変異型ＧｒｏＥＬの構造・機能解析

変性蛋白質の構造回復を促すシャペロニンは大小2種類の蛋白質がATPの結合・加水分解に依存してダイナミックに構造を変化させ,解離会合を繰り返すことで機能を発揮する。本研究では,シャペロニンの作用機構を分子レベルで理解するため,大腸菌由来のシャペロニンGroELに様々な機能障害を引きおこす変異を導入し,変異型GroELがATP依存的に構造を変化させる様子を蛍光ストップト・フロー法で解析した。計3種類の変異体を解析した結果,GroELの分子機構において複数の重要イベント(変性蛋白質に対する親和性を調節する,等)が同時進行している「並列型」の反応機構が確認できた。大腸菌のシャペロニンGroELが変性蛋白質のフォールディングを補助する分子メカニズムを詳細に解析するため,円順列型GroEL変異体CP86-C4を中心に解析を進めた。平成25年度はCP86-C4変異体,および以下に示す2種類のGroEL変異体を用いて,シャペロニンの分子メカニズム理解に寄与する結果を得ることに成功した。1.配列特異的蛍光ラベルを用いたCP86-C4変異体の標識,機能変換:FlAsH-EDT2はCCXXCCという4つのシステインからなる配列を特異的に認識し,結合する蛍光色素である。本研究ではGroEL CP86-C4がポリペプチド鎖末端をまたいでこれに類似した配列を持つことに注目し,FlAsH-EDT2を用いてポリペプチド鎖末端を連結することを試みた。実験の結果,FlAsH-EDT2がGroEL CP86-C4を特異的に修飾することを確認し,さらにこの修飾はGroEL CP86-C4の機能変換を伴うことも突き止め,FlAsH-EDT2を用いたGroEL CP86-C4の新たな機能改変メカニズムを見いだすことができた。2.GroEL変異体を用いたストップト・フロー解析: GroELが本来示すATPase活性を大幅に抑制させた変異体を蛍光ストップト・フロー法により解析した。実験の結果,ATPase活性を抑制したGroEL D398A変異体のサブユニット構造変化はある特異的な構造変化において野生型と異なった挙動を示し,この違いがD398A変異体の機能の違いと連動していることが示唆された。3.新規GroEL変異体の作成と機能評価:「ATPを全く消費しないが,変性蛋白質を野生型GroELとほぼ同等の能力で補助する」変異体を作成し,その評価に着手した。この変異体はシャペロニンの分子メカニズムに新たな視点を提供してくれるものと期待している。大腸菌シャペロニンGroELの蛋白質フォールディング補助メカニズムを各種変異体の解析を通して再検証することを目指す本研究計画において,平成26年度に得た主な成果を以下に変異体種別に要約する。1.円順列変異体GroELCP86-C4の詳細解析:GroELのドメイン間を連結するポリペプチド鎖主鎖が1本「切断」された状態を模しているCP86-C4変異体について,その性質を引き続き詳細に解析した。平成26年度では特異的試薬の結合によりGroELCP86-C4の機能的性質,特にATP加水分解活性と補助シャペロニンであるGroESとの結合様式において差異を誘発することに成功した。成果の一部は米国Protein Society年会で発表した。2.GroEL D398A変異体の詳細解析:ATP加水分解活性が野生型の2%程度に低下したGroEL D398A変異体では,トリプトファン蛍光を指標にしたストップト・フロー速度論的解析を実施した。その結果,D398A変異体ではGroELのサブユニット間で交わされる情報に違いが見られ、機能変化につながっていると思われた。3.GroEL "CXXC"変異体の詳細解析:GroEL "CXXC"変異体はGroELの蛋白質フォールディング補助能力に新たな機能を付加することを目指して作成された変異体であるが,この変異体は当初の想定と異なる新しい性質(ATP加水分解をほとんど必要としないフォールディング補助能力)を示したため,GroELの分子メカニズムを解析する上の新しい研究道具として注目していた。平成26年度ではこの変異体のストップト・フロー解析に成功し,その結果GroEL "CXXC"変異体は野生型GroELが見せない複雑な動的振る舞いを見せることが明らかとなった。この分子運動はATPがGroELに結合しない状態でも観測された点が最も興味深い特徴であった。大腸菌由来シャペロニンGroELの蛋白質フォールディング補助分子メカニズムを様々な変異体の解析により再検証することを目指す本研究では,研究最終年に以下の成果を得ることに成功した。1.シャペロニン内部に「ジスルフィド交換モチーフ」を導入したGroELCXXC変異体の詳細解析:変性蛋白質のフォールディング反応を補助する際,ジスルフィド結合の形成を促進する能力を付加することを目指して作成したCXXC変異体の解析において,研究最終年ではこのCXXC配列モチーフの酸化・還元状態とシャペロニンとしての機能に極めて密接な関連が見いだされた。この点に注目し,フォールディング中にジスルフィド結合の正しい形成が必要な蛋白質のフォールディング反応を利用して野生型GroELと本変異体の効果を比較したところ,わずかながらフォールディング速度において差を確認した。今後は,この差についてより詳細な条件検討と効果確認を実施する予定である。2.円順列変異体や様々な機能制限