hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
生物群集の多様性とその決定機構の空間スケール依存性:潮間帯における大規模比較実験

その結果、群集構造は、空間スケールごとに有意な変異を示し、その変異には各空間スケールに固有の非ランダムな要因が関与していることが明らかになった。本研究は、岩礁潮間帯群集を対象に、10-100cmのパッチ群集スケールから100-1000kmの地域群集スケールまでを階層的に組み合わせた定量調査・実験を行うことにより、群集の多様性や安定性、およびその決定機構に対する空間スケールの効果を検討することを目的とする。2年目となる本年度は、異なる4つの空間スケールを階層的に配置した野外定量調査を継続すると共に、環境要因の詳細なモニタリングを開始した。また、群集の時間的変化を解析するための生物遷移実験、ベントス幼生の加入量の効果を検討する加入量定量を開始した。1:定量調査:九州から北海道に至る太平洋沿岸の岩礁潮間帯群集に、地域群集スケール、メタ群集スケール、局所群集スケール、パッチ群集スケールの4つの空間階層構造を持つように設定した計150の調査点において、春季(4-5月)、夏季(7-8月)と秋季(10-12月)にベントス群集の種多様性、被度、密度を一斉に調査した。2:環境要因の調査:上記で設定した全調査地点において、地質、地形、測点間の距離、乾燥度、干出時間、波浪の強さ、沿岸水のクロロフィル量、栄養塩濃度を定期的に測定し、その空間変異パターンを解析した。3:生物遷移実験:上記1の調査点に隣接して、岩礁の生物を全部剥す実験区(遷移区)を設定し、生物群集の裸地からの回復過程をさまざまな空間スケールで比較した。4:ベントスの加入量の解析:上記1,3と隣接して、更に岩礁の生物を一定間隔で剥す実験区(加入区)を設置し、潮間帯ベントス優占種の個体群(フジツボ類など)の新規加入量の時間的、空間的変動パターンを解析した。その結果、ベントス加入量と成体の被度の相関関係は地域ごとに大きく変異し、複数の環境要因が相互作用しながら両者の関係に影響していることが判明した。3年目となる本年度は、野外定量調査、環境観測、生物遷移実験、ベントス幼生の加入量のモニタリングを継続すると共に、これまで得られたデータを元に、1:生物多様性の緯度勾配、2:生産性と生物多様性の関連性の空間スケール依存性、3:フジツボ個体群の加入量と成体被度の関連性の解析を行った。1:日本列島太平洋岸の岩礁潮間帯固着動物群集において、異なる空間スケールにおける種多様性の緯度勾配パターンを解析した。その結果、地域レベルの種の豊富さ(γ多様性)に明瞭な緯度勾配が見られた。また、γ多様性の緯度勾配は全ての空間スケールの多様性成分(α多様性とβ多様性)において消失されずに保たれていた。2:岩礁潮間帯生物群集を対象に、生産性・多様性関係の空間スケールに伴う変化を解析し、その関係の生物分類群間、生産性の指標間、地域間、季節間での変異を比較検討した。その結果、従来陸上や淡水の生態系の研究で見られていたスケール依存的なパターンは検出されず、その原因として、環境異質性、メタ群集分散を通じた局所群集の連続性および移出入の頻度、空間を巡る競争などが他の生態系と異なる点が考えられた。3:全国に見られるイワフジツボを対象に、空間スケールを階層的に設定した調査方法で、幼生加入量と成体被度の関連性を解明した。
ポドサイト特異的に発現する蛋白の機能解析

我々は、ポドサイトのスリット膜の裏打ち蛋白である、dendrinの遺伝子配列を用いてYeast two hybrid screeningを行い、dendrinと結合しうる蛋白を同定した。その中で、Yes associated protein 2(YAP2)を選択し、生化学的手法を用い、dendrinがYAP2と結合する蛋白であることを確認した。さらに、dendrinにより誘発される、転写因子AP-1の活性の増加や、アポトーシスシグナルの誘導をYAP2が抑制することを見出した。さらに、その抑制にはDendrinがもつPPXYモチーフとYAP2が持つWWドメインとの結合が関係することがわかった。我々は、ヒトDendrinを認識する抗体を作製し、ヒト腎生検検体において、ヒトにおいてもDendrinがポドサイトに発現し、糸球体障害を来たす病態においてにポドサイトの核に移行していることを見出してきた。特に、IgA腎症患者の腎生検組織の検討において、Dendrinの核移行は、急性管外性病変と相関していることを示した。さらに、多くの尿中に脱落したポドサイトの核にDendrinは集積していた。また、その尿中ポドサイトはアポトーシスに陥っていることも見出した。以上の研究成果は、2010年アメリカ腎臓学会にて報告された。我々は、ポドサイトのスリット膜関連タンパクであるPodocinに注目し、Podocinに対する抗体を作製し、ラットネフローゼモデル、ヒト腎生検組織を用い蛍光免疫組織染色を行い、Podocinの発現量の変化と局在変化と糸球体の組織変化と相関するかを検討中である。Adriamycin(ADR)腎症モデルマウスは、ネフローゼ症候群・糸球体硬化モデルとして便用されるが、ポドサイトアポトーシスが糸球体硬化進展に関係していることを見つけ、スリット膜裏打ち部から核に移行したdendrinをADR投与早期に確認することができた。これまで、動物実験と培養ポドサイトを使用した実験からdendrinのポドサイトにおける役割を明らかにしてきたが、ヒト腎疾患においてもポドサイト障害が、dendrinの核への移行を引き起こし、アポトーシスが助長されているのであろうか?我々は、ヒト腎生検組織を用い、dendrinの免疫蛍光染色を行った。微小変化型ネフローゼ症候群(MCNS)症例では、糸球体基底膜(GBM)からのポドサイトの脱落は起きないと言われているが、MCNS患者腎組織では、dendrinは核にほとんど局在していなかった。一方、急性病変を伴うIgA腎症、ループス腎炎、膜性腎症患者腎組織には、はっきりと核に移行したdendrinを確認することができた。核に移行したdendrinがポドサイトアポトーシスを助長し、GBMからのポドサイトの脱落を導くのであれば、尿中に脱落したポドサイトのdendrinは核に集積しているはずである。尿中ポドサイトをpodocalyxinとdendrinの二重染色で検討したところ、podocalyxin陽性である尿中ポドサイトのdendrinは核内に集積していた。さらに、IgA腎症患者において、糸球体内の核内dendrin数とIgA腎症の予後や糸球体内急性病変とは、相関のあることが判明した。以上より、新規スリット膜裏打ち蛋白dendrinは、動物モデルだけでなくヒト腎疾患においても、ポドサイト障害時に核へ移行し、アポトーシスを助長することで糸球体硬化の進展に重要な役割を果たしていることが示めされた。
マーク付き点過程に対するネットワーク構造推定と実データ解析への応用

本研究の目的は、複数の構成要素からなるシステムから同時に観測される時系列が点過程時系列であるような場合に対して、時系列データのみから元のシステムのネットワーク構造を推定する手法を提案し、さらに提案手法を実データへ応用することを目的としている。前年度において、多次元尺度法を用いてSpike Time Metricにより求められた距離情報からユークリッド空間に埋め込まれた座標値を求め、埋め込まれた座標値を線形重回帰モデルにあてはめることにより、解析的に偏解析を適用できるような手法を提案したが、本年度では、この手法の有用性について詳しく調べた。まず、結合強度の分布が推定できるか調べたところ、結合強度が弱い場合は、推定が困難になるが、一定以上の結合強度があれば、推定指標と結合強度が比例することがわかり、結合強度の分布を推定することが可能なことを示した。また、連続時系列である膜電位を用いた場合とスパイク列を用いた提案法の推定精度の比較を行った。連続時系列である膜電位を用いた方が推定精度は少し高い結果となったが、スパイク列を用いた場合でも推定精度に大きな差は現れず、提案手法の性能が高いことが検証できた。また、前年度では、従来指標であるマーク付き点過程間の距離を求める指標を用いて、マーク付き点過程データの距離からネットワーク構造を推定する手法を提案していた。しかし、従来指標では、マーク値を考慮せずに距離を定義している問題があった。そこで、本年度はマークの値を考慮した新たな指標を提案した。その結果、パラメータに依存せずに、正しくマーク付き点過程間の距離を求めることができることがわかった。この提案指標を用いて、マーク付き点過程の距離からネットワーク構造を推定したところ、高精度にネットワーク構造を推定できることが示された。本年度はパラメータに依存しないマーク付き点過程間の距離を求める指標を提案し,それを用いたネットワーク構造推定を行った結果,高精度にマーク付き点過程時系列データからネットワーク構造が推定可能なことが示されたため.本研究では,主にニューラルシステムを対象とし,実験を行ったが,点過程時系列は経済システムや自然システムなど,様々な分野で観測されるため,各分野の点過程時系列データに対して提案手法の応用を行っていきたい.私たちの周りには,複数の要素が互いに影響を及ぼし合うことにより,非常に複雑な振る舞いを示すシステムが存在する.このような複数の構成要素からなるシステムを理解するためには,要素間の結合形態,すなわちネットワーク構造を知ることが重要となる.それらのシステムからネットワーク構造を直接調べることは容易ではないが,システムの各構成要素から観測される多変量時系列からネットワーク構造が推定できると考えられる.しかし,ニューラルシステム,経済システム,自然システムなど様々な分野で観測される時系列は離散的な点過程時系列であることが多い.そこで本研究では,システムから観測される多変量時系列が点過程時系列であるような場合に対して,時系列データのみから元のシステムのネットワーク構造を推定する手法を提案し,さらに提案手法を実データへ応用することを目的とする.当該年度は,点過程時系列の中でもイベント発生時刻の情報のみを持つスパイク列からネットワーク構造を推定する新たな手法の開発を行い,従来の提案手法では推定できなかったネットワークの結合方向の推定を可能とした.また,提案手法の応用として,ニューラルシステムにおける学習によってネットワーク構造が時間経過と共にどのように変化して行くかを同定し,学習を検出する解析手法を構築した.さらに,イベント発生時刻の情報のみだけでなく,イベントに付加された情報を持つマーク付き点過程時系列からネットワーク構造を推定する手法を開発し,数値実験により,提案手法を用いることで,イベント発生時刻の情報のみの場合よりも,マーク付き点過程時系列を用いる方が,さらに精度良く推定できることを確認した.本研究の目的は、複数の構成要素からなるシステムから同時に観測される時系列が点過程時系列であるような場合に対して、時系列データのみから元のシステムのネットワーク構造を推定する手法を提案し、さらに提案手法を実データへ応用することを目的としている。当該年度はスパイク列,およびマーク付き点過程のデータのみから元のシステムのネットワーク構造を推定する手法の開発に取り組んだ.

提案手法を用いることで従来手法より高精度にネットワーク構造が推定できること,さらに従来手法では推定できなかった結合方向が推定可能になったことから,順調に研究が進展しているといえる.本年度はパラメータに依存しないマーク付き点過程間の距離を求める指標を提案し,それを用いたネットワーク構造推定を行った結果,高精度にマーク付き点過程時系列データからネットワーク構造が推定可能なことが示されたため.今後の研究推進方策として,提案手法を実データに適用し,解析を行う.まず一つ目に,ニューラルネットワーク構造推定手法の応用として,実データからニューラルシステムの状態変化を同定し,脳内の学習の検出,解析を行う.二つ目に,マーク付き点過程からネットワーク構造推定する手法の応用として,マーク付き点過程時系列である地震データや,為替や株取引などの経済データを対象とし,提案手法を適用することで,各要素間の因果関係の解析を行う.本研究では,主にニューラルシステムを対象とし,実験を行ったが,点過程時系列は経済システムや自然システムなど,様々な分野で観測されるため,各分野の点過程時系列データに対して提案手法の応用を行っていきたい.
冬季カエデ属樹種の糖利用特性と樹液流出特性の解明

初春に流出するカエデ樹液は高濃度の糖を含む。糖はカエデの樹液流出に寄与するが、一方で低温・凍結ストレス耐性にも関与する。しかし、樹液流出特性と樹木の生理生態的特性との関連性は未解明のままである。本計画では異なる分布域を持つカエデ属樹木を対象として、樹液糖濃度の蓄積や糖組成の変化を明らかにするとともに、樹液流出との関連性を検討する。特に単木当たりの樹液流出量と木部糖濃度がそれぞれ気温とどのような連動を示すかという点に注目し、樹液流出の種間差に関わる生理的特性を明らかにする。
歯を用いた内部被曝量・被曝歴の解析

福島第一原発事故警戒区域内で捕獲した被災牛や野生アカネズミ、野生ニホンザルの歯について、歯質中に含まれる放射性同位元素の量を測定した。その結果、すべての動物の歯にはSr-90やCs-134, Cs-137が検出され、それらの濃度は、環境の空間線量率に比例していた。また、同一個体内の歯についてみると、原発事故後に形成された歯では高い放射能値を示したのに対して、原発事故以前に形成された歯では低値を示した。これらの事実は、環境中の放射性物質は歯の形成期に歯質中に取り込まれること、また、その量は、歯が形成される時期における個体の内部被曝量を知る重要な指標となり得ると考えられた。東京電力福島第一原発事故による被ばく状況を歯を用いて評価することが本研究の目的である。具体的には被災動物(ウシ、サル、野生アカネズミ)の歯を用いて、イメージンググプレートを用いたオートラジオグラフの作成、歯質中放射性SrやCsの測定を行い、(1)原発事故由来の放射性物質が、歯の中に蓄積性に保持されていること、(2)歯の中の放射性物質の量は、環境の空間線量率と比例していること、また、(3)歯の形成時期は歯種により異ることから、歯種ごとの線量測定を行うことにより、被ばくの時間的推移を個体単位で知ることができるなどを証明することであった。さらに、被災動物で得られた基礎情報をもとに、(4)ヒト乳歯の収集を開始し、動物実験で得られた方法論をヒトの乳歯の解析にも適用し、ヒトの内部被ばく量、被ばく歴の解析を始めることであった。平成26年度までに収集した被災動物の数はウシ250頭、サル200頭、アカネズミ400匹に達しており、それら動物の歯の解析から、(1)から(3)の目的はほぼ達成している。これらの成果は第57回日本放射線影響学会(鹿児島)で、6つの演題として公表しており、現在論文としてまとめる作業を行っている。また(4)のヒト乳歯の収集も福島県歯科医師会と共同で始めており、主にイメージングプレートを用いて、それら歯の中に含まれる放射性物質量のスクリーニングを行っている。ヒトの歯については、これまで収集している乳歯はいずれも3.11以前に形成が終わっている歯なので、現在得られている結果は次年度以降に収集予定の歯のコントロール値に相当しており、基礎値として重要な意味を持つと考えられる。次年度、次々年度において引き続き解析を継続する。福島第一原発事故旧警戒区域内で捕獲した被災牛、および岩手県内でと畜されたコントロール牛の下顎臼歯、計72本について、歯質中に含まれる放射性ストロンチウム(Sr-90)量を測定した。その結果、すべての歯にはSr-90が検出され、その濃度は8ー831mBq/gCaの範囲内にあった。また、歯質中のSr-90濃度や比放射能値は、環境の空間線量率や土壌中のSr-90濃度に比例していた。同一個体内の歯についてみると、原発事故後に形成された歯には高いSr-90濃度や比放射能値が認められたのに対して、原発事故以前に形成された歯では、低い値を示した。これらの事実は、環境中のSr-90は(飲食物等を介して体内に入り)歯の形成期に歯質中にとり込まれ、そのまま歯質中に保持されることを示している。歯が形成される時期は既知であるので、歯質中のSr-90濃度は歯が形成される時期における個体の内部被曝量を示す重要な指標となり得ることが示された。一方、歯質中の放射性セシウム(Cs-137, Cs-134)についてみると、原発事故後に形成された歯と、事故以前に形成された歯との間に大きな濃度の差はなく、Sr-90のように主に歯の形成期に歯質中に取り込まれるという機序とは異なる可能性があると考えられた。ヒト乳歯については、福島県歯科医師会との協力のもと、福島県内を中心に全国より4000本を超える歯を収集し、それらをバンク化している。それら乳歯の解析は、イメージングプレートやオートラジオグラフィーにより次年度より開始する。被災動物(牛)の歯のSr-90濃度については測定を終了しているが、Cs-137, Cs-134の歯質内への移行や濃度分布については不明な点があり、現在解析中であるため。「歯を用いた内部被ばく量の推定」本研究班では、福島県相双地区の山中において被ばくし、捕獲された野生ニホンザルの標本を多数保持している。それらの中で、歯を含む全身骨格を有している個体を用い、対象核種をSr-90に限定し、歯に含まれるSr-90量のから個体の内部被ばく量(Sr-90に対する骨髄被ばく量)を推定するモデルを試作した。このモデルの適用により、ヒトをも含め歯を持つ様々な動物について、歯の形成期における個体の骨髄被ばく量を推定することが可能になったと考えられる。現在、福島県在住小児から収集した5,000本規模の乳歯について、イメージングプレート法(IP法)により内部被ばく量をスクリーニングする作業を行っているが、このIP法により高値を示した個体については、上記の手法を用いて骨髄被ばく量を推測することが可能と考えられる。「歯を用いた外部被ばく量の推定」

放射線被ばくにより、歯質中には被ばく線量に比例して炭酸ラジカルが発生する。したがって被ばく線量と炭酸ラジカル量発生の関係をあらかじめ検量線として得ておけば歯質中の炭酸ラジカル量を測定することにより、この検量線から外部被ばく線量を直接測定することが可能である。歯質中のラジカルの測定は、ESR法(電子スピン共鳴法)を用いて行うが、これまでに行われてきたIAEA等のプロトコールに基づくESR法では感度が十分でないため(100-200mGy以上)、今回の原発事故で問題となる低線量・慢性被ばく状況の把握には十分な感度を有していないのが現状であった。本研究では、測定ソフトの改良や試料調整法に改良を加え、その感度を10-20mGy以下まで測定可能な技術として確立した。改良したこのESR法を用いて、現在、福島県在住小児より収集した乳歯について、歯から外部被ばくした量を推定する疫学調査を始めている。福島第一原発事故警戒区域内で捕獲した被災牛や野生アカネズミ、野生ニホンザルの歯について、歯質中に含まれる放射性同位元素の量を測定した。その結果、すべての動物の歯にはSr-90やCs-134, Cs-137が検出され、それらの濃度は、環境の空間線量率に比例していた。また、同一個体内の歯についてみると、原発事故後に形成された歯では高い放射能値を示したのに対して、原発事故以前に形成された歯では低値を示した。これらの事実は、環境中の放射性物質は歯の形成期に歯質中に取り込まれること、また、その量は、歯が形成される時期における個体の内部被曝量を知る重要な指標となり得ると考えられた。被災動物の歯、ヒト乳歯の収集ともに順調に進んでおり、また、イメージングプレートによる解析法、Sr-90やCs-137,134の定量法等、技術的な面での実験手法が確立している。研究のとりまとめが遅れている面はあるが、概ね研究の進捗状況は順調である。歯質中のSr-90濃度の測定から、具体的な数値として、歯の形成期間中に体内に存在したSr-90の総量を算出し、内部被曝量を推測する。具体的には福島原発事故旧警戒区域内で捕獲した被曝ニホンザル、および野生アカネズミを用いて以下の手順により内部被曝量の推計モデルを構築する。1歯の比放射能値(Sr-90/Sr)の測定する、2体重から骨組織総重量の推測を行う。3骨組織中のSr安定同位体量の測定から骨中総Sr量を算出する、4歯から得られた非放射能値を骨組織にあてはめ、体内総Sr-90量(Srの99%は骨組織中に存在する)を推定する、5組織荷重係数と等価線量との積を求め、Sr-90による内部被曝の実効線量を推計する。上記の推測手順の妥当性について上記被災動物を用いて検証し、最終的には、ヒト乳歯を用いての内部被曝量の推測に結びつける。また、収集したヒト乳歯について歯質中の放射性物質濃度をイメージングプレートを用いてスクリーニングし、高い値を示した歯については放射性ストロンチウムやセシウムの測定を行う。硬組織の生理薬理平成26年度に実施した研究体制を継続し、データの厚みを増して信頼性のある結果の構築に努める。また、被災動物で得られた結果を基礎に、ヒト乳歯の解析の方に比重を高める。協同研究者として参加している別の科学研究費補助金や環境省からの委託研究費により本研究の実施にも必要な物品の購入費やその他の諸経費を使用することが可能であったため、研究計画を変えることなく、計画的に次年度に100万円弱の当該補助金を繰り越すことが可能となった。Sr-90やCs-134,137などの定量のため予定していた経費が別予算から支出可能になったため。
細胞膜透過ペプチドによる舌癌を標的とした新規治療戦略の開発

細胞膜不透過性の分子を細胞内に導入する方法として、細胞透過性ペプチド(Cell Penetrate Peptide:CPP)の開発が進められている。CPPを任意のタンパクやペプチド等と結合させることにより、それら結合物質を容易に細胞内に導入することができる。近年では10個前後の塩基性アミノ酸(アルギニン、リジン)を基本としたペプチドが導入効率や副作用の面から研究の対象とされており、我々のグループではこれまでに9個のアルギニンより構成されるペプチド(9R-ペプチド)を用いて細胞内への導入が困難な巨大タンパクの細胞内導入に成功している。しかしながら9R-ペプチドはあらゆる細胞に極めて効率よく導入されるため、特定の病巣へのドラッグデリバリーには不向きであった。頭頸部に発生する癌のうち、口腔領域に発生する癌は全体の約40%を占め、このうちの約60%が舌癌である。舌癌の治療には外科的切除が必須であるが、舌の切除後には発音や摂食、顔貌への変化を与える。そのため、不要な拡大切除や予防切除を避けるための正確な病巣範囲の特定法や新たな治療法の開発が切望されている。本研究では、外科的切除範囲の縮小が望まれる舌癌に選択的透過性をもつペプチドを創出し、生体腫瘍イメージングおよびドラッグデリバリーによる制ガン医療技術の治療戦略を開発することを目的としている。本年度は新規CPPの候補配列を絞り込むための二次スクリーニングまで研究を進められたが、一次スクリーニングを肯定する結果を得られなかったため実験系の見直しを迫られた。並行して行ったモデルマウスの作成については、舌癌のみならず歯肉癌など数種類の癌細胞を免疫不全マウスに生着させることに成功している。今後はペプチド配列の設計から刷新し、新たな候補配列を検索することを目的として研究を継続する予定である。舌癌を標的とする細胞侵入性ペプチドのスクリーニングを行ったが、2次スクリーニングの時点で1次スクリーニングの結果を肯定する結果が認めらなかったため実験系の見直しを迫られた。スクリーニング法をmRNAディスプレイ法からファージディスプレイ法に変更し、標的とする細胞を舌癌のみならず歯肉癌まで拡大したため扱うデータ数の増大を認め、当初計画に対し結果の獲得に遅れが生じているスクリーニング法をmRNAディスプレイ法からファージディスプレイ法に変更し、標的とする細胞を舌癌のみならず歯肉癌まで拡大。今後は実験により得られた候補CPPにFITCを融合し、舌癌・歯肉癌細胞株に添加する。FITC融合CPPの侵入効率を蛍光顕微鏡を用いて観察し、蛍光強度の定量により導入効率を解析する。また、本研究におけるCPPは舌癌への特異的侵入が要求されるため、コントロールとしてマウスのprimary cultureより得られたMEF、Hippocampal neuron等の細胞でも同様の実験を行う。第2次スクリーニングにより候補CPPを3種以下まで絞り込む予定である。スクリーニング法をmRNAディスプレイ法からファージディスプレイ法に変更し、標的とする細胞を舌癌のみならず歯肉癌まで拡大したため扱うデータ数の増大を認め、当初計画に対し結果の獲得に遅れが生じている。

近年では10個前後の塩基性アミノ酸(アルギニン、リジン)を基本としたペプチドが導入効率や副作用の面から研究の対象とされており、我々のグループではこれまでに9個のアルギニンより構成されるペプチド(9R-ペプチド)を用いて細胞内への導入が困難な巨大タンパクの細胞内導入に成功している。しかしながら9R-ペプチドはあらゆる細胞に極めて効率よく導入されるため、特定の病巣へのドラッグデリバリーには不向きであった。頭頸部に発生する癌のうち、口腔領域に発生する癌は全体の約40%を占め、このうちの約60%が舌癌である。舌癌の治療には外科的切除が必須であるが、舌の切除後には発音や摂食、顔貌への変化を与える。そのため、不要な拡大切除や予防切除を避けるための正確な病巣範囲の特定法や新たな治療法の開発が切望されている。本研究では、外科的切除範囲の縮小が望まれる舌癌に選択的透過性をもつペプチドを創出し、生体腫瘍イメージングおよびドラッグデリバリーによる制ガン医療技術の治療戦略を開発することを目的としている。本年度は新規CPPの候補配列を絞り込むための二次スクリーニングまで研究を進められたが、一次スクリーニングを肯定する結果を得られなかったため実験系の見直しを迫られた。並行して行ったモデルマウスの作成については、舌癌のみならず歯肉癌など数種類の癌細胞を免疫不全マウスに生着させることに成功している。今後はペプチド配列の設計から刷新し、新たな候補配列を検索することを目的として研究を継続する予定である。舌癌を標的とする細胞侵入性ペプチドのスクリーニングを行ったが、2次スクリーニングの時点で1次スクリーニングの結果を肯定する結果が認めらなかったため実験系の見直しを迫られた。スクリーニング法をmRNAディスプレイ法からファージディスプレイ法に変更し、標的とする細胞を舌癌のみならず歯肉癌まで拡大したため扱うデータ数の増大を認め、当初計画に対し結果の獲得に遅れが生じているスクリーニング法をmRNAディスプレイ法からファージディスプレイ法に変更し、標的とする細胞を舌癌のみならず歯肉癌まで拡大。今後は実験により得られた候補CPPにFITCを融合し、舌癌・歯肉癌細胞株に添加する。FITC融合CPPの侵入効率を蛍光顕微鏡を用いて観察し、蛍光強度の定量により導入効率を解析する。また、本研究におけるCPPは舌癌への特異的侵入が要求されるため、コントロールとしてマウスのp rimary cultureより得られたMEF、Hippocampal neuron等の細胞でも同様の実験を行う。第2次スクリーニングにより候補CPPを3種以下まで絞り込む予定である。スクリーニング法をmRNAディスプレイ法からファージディスプレイ法に変更し、標的とする細胞を舌癌のみならず歯肉癌まで拡大。また、本研究におけるCPPは舌癌への特異的侵入が要求されるため、コントロールとしてマウスのprimary cultureより得られたMEF、Hippocampal neuron等の細胞でも同様の実験を行う。
セレンの特徴を生かした機能性分子の設計

今年度はSe-Se結合をもつ3種類のホスト分子の新規合成およびX線構造解析を行った。さらにホスト分子に取り込まれた銅(II)イオンとSe-Se結合との間に容易に電子移動が起こることを示唆する実験結果が得られた。まず、セレンユニットの最も基本的なモデル系として、無置換のo-異性体o-C_6H_4(SeCN)COClにホスト部位を導入した後に-SeCN同士のカップリングを行い、クラウンエ-テル型ホスト分子(1)、クリプタンド型ホスト分子(2)、およびキレ-ト型ホスト分子(3)をそれぞれ合成した。合成したホスト分子(1,2)についてX線構造解析を自分で行い分子構造を明かにした。1は長方形の空洞をもち2個の金属イオンを同時に取り込む可能性がある。セレン原子の超原子価性に起因すると考えられる分子内相互作用が明かとなった。同様に2においても、SeとOの原子間距離が異常に短くなっており、これらの原子間に引力的相互作用が存在することが判明した。セレン原子の超原子価性は大環状分子の安定化に大きく寄与する一方で、ホスト部位の配座を固定化し、ポリエ-テル鎖の立体配座を歪ませている。3の構造を決定するため、塩化銅(II)とメタノ-ル中で攪はんして生じる緑色沈澱を集め、クロロホルムより結晶化したところ少量の濃青色結晶が得られた。これをX線構造解析したところ、銅は6配位でSe-Se結合が酸化的に返断されセレネニルクロリドとなっていることがわかった。これは銅とSe-Se結合との間に何等かの電子的相互作用があったことを強く示唆している。この錯体はメタノ-ル中でアルケンと反応させると、ほぼ定量的にメトキシセレン化反応を生起した。今後、この錯体の反応性解明も含めて、ホスト分子1-3の錯体合成とその構造・性質に関する検討を行って行きたい。
落花生の連鎖地図の作成とオレイン酸含有量に関わる選抜マーカーの同定

落花生は油脂作物としそ世界中で栽培されているが、品質の安定性のため、酸化しにくいオレイン酸(脂肪酸の一種)の含有量を高めることが求められている。一方、落花生は異質4倍体で栽培品種間のDNA多型が極めて低いことが知られており、連鎖地図などゲノム解析に必要な情報の蓄積が少ない。そこで本研究では落花生の連鎖地図を作成し、オレイン酸含有量に関わる選抜マーカーを同定して成分育種のための育種ツールを開発した。昨年度までに、オレイン酸含有量に関する2つの選抜マーカー(FAD2AとFAD2B)および「ナカテユタカ」「YI03-11」間で多型を検出するゲノムワイドな64のDNAマーカーを同定した。この中から両親間で多型が安定して検出される34のDNAマーカーおよび選抜マーカーを利用して、オレイン酸含有量に関する領域は「八103-11」型でそれ以外の領域が「ナカテユタカ」型となるように選抜を行った。現在「ナカテユタカ」による戻し交雑を2回、自殖を5回行ったBC_2F_5世代の種子を採種中である。ゲノムワイドなDNAマーカーによる遺伝子型解析の結果、BC_1F_3世代(108個体)においてはオレイン酸含有量に関わる領域以外のナカテユタ型のゲノムの割合は33.3%75.0%であり、平均で64.8%だった。一方、BC_2F_4世代においては、オレイン酸含有量に関わる領域以外のナカテユタ型のゲノムの割合は85.3%95.6%であり、平均で91.7%だった。ゲノムワイドな選抜マーカーを用いなかった場合、供試BC_1F_3世代に2回戻し交雑することで、ナカテユタ型のゲノムの割合期待値は91.2%に、3回戻し交雑することで95.6%となる。一方、本研究では1回の戻し交雑でナカテ型のゲノム割合を平均91.7%,最高95.6%まで高められたことから、通常の育種に比べて12年の期間短縮を図れたことが明らかとなった。落花生種子中に含まれる脂肪酸は通常型ではオレイン酸とリノール酸がそれぞれ50%ずつ占める。通常型の落花生で農業形質に優れる「ナカテユタカ」にオレイン酸含有量がほぼ100%である「八I-0311」を交配したF_1に由来するF_2集団188個体をを解析集団として、落花生子実中における落花生のオレイン酸含有量の遺伝解析を行った。本年度は落花生のEST(Expressed Sequence Tag)に由来するマイクロサテライトマーカー(以下EST-SSRマーカー)3188,落花生ゲノムSSR濃縮ライブラリーに由来するマイクロサテライトマーカー(以下ゲノムSSRマーカー)714および既報のマイクロサテライトマーカー648を用いて両親間で多型を検出するマーカーのスクリーニングを10%アクリルアミドゲルを用いて行った。その結果、EST-SSRマーカーは90,ゲノムSSRマーカーは50,既報のマイクロサテライトマーカーは249が両親間で多型を示した。これらのマーカーを用いてF_26個体で多型解析を行ったところ、合計64マーカーF_2個体間で多型が分離した。現在、F_2188個体で多型性の解析を行っている。また、F_2集団種子のオレイン酸とリノール含有量を測定したところ、188個体中8個体が高いオレイン酸/リノール酸含有比を示した。またオレイン酸/リノール酸含有比はF_2集団において二項分布したことから、脂肪酸組成を支配する遺伝子は主働遺伝子である可能性が示唆された。落花生は油脂作物として世界中で栽培されているが、品質の安定性のため、酸化しにくいオレイン酸(脂肪酸の一種)の含有量を高めることが求められている。昨年度に開発したオレイン酸からリノール酸への変換時に働く不飽和酵素を制御する遺伝子として同定されたFAD2AおよびFAD2B由来の選抜DNAマーカーを用いて落花生系統「ナカテユタカ」×「八I03-11」のF_2個体を選抜し、高オレイン酸遺伝子型のF_2後代に「ナカテユタカ」の戻し交配を行い、159個体のBC_1F_3を作成した。各個体の葉から抽出したDNAを用いてオレイン酸選抜マーカーおよび両親間で多型が検出された42のDNAマーカーを用いてBC_1F_3個体の遺伝子型を調査し、FAD2遺伝子の変位遺伝子型をヘテロで有しかつFAD2遺伝子以外の領域がより「ナカテユタカ」に近い個体を選抜した。落花生由来のゲノムSSRマーカー1020およびEST-SSRマーカー3187を用いて「郷の香」×「金時」問の多型解析を行った。両親間で多型を示したマーカーはゲノムSSRマーカーが50(4.9%)、EST-SSRマーカーが119(3.7%)で全体では169マーカーだった。

一方、落花生は異質4倍体で栽培品種間のDNA多型が極めて低いことが知られており、連鎖地図などゲノム解析に必要な情報の蓄積が少ない。そこで本研究では落花生の連鎖地図を作成し、オレイン酸含有量に関わる選抜マーカーを同定して成分育種のための育種ツールを開発した。昨年度までに、オレイン酸含有量に関する2つの選抜マーカー(FAD2AとFAD2B)および「ナカテユタカ」「YI03-11」間で多型を検出するゲノムワイドな64のDNAマーカーを同定した。この中から両親間で多型が安定して検出される34のDNAマーカーおよび選抜マーカーを利用して、オレイン酸含有量に関する領域は「八103-11」型でそれ以外の領域が「ナカテユタカ」型となるように選抜を行った。現在「ナカテユタカ」による戻し交雑を2回、自殖を5回行ったBC_2F_5世代の種子を採種中である。ゲノムワイドなDNAマーカーによる遺伝子型解析の結果、BC_1F_3世代(108個体)においてはオレイン酸含有量に関わる領域以外のナカテユタ型のゲノムの割合は33.3%75.0%であり、平均で64.8%だった。一方、BC_2F_4世代においては、オレイン酸含有量に関わる領域以外のナカテユタ型のゲノムの割合は85.3%95.6%であり、平均で91.7%だった。ゲノムワイドな選抜マーカーを用いなかった場合、供試BC_1F_3世代に2回戻し交雑することで、ナカテユタ型のゲノムの割合期待値は91.2%に、3回戻し交雑することで95.6%となる。一方、本研究では1回の戻し交雑でナカテ型のゲノム割合を平均91.7%,最高95.6%まで高められたことから、通常の育種に比べて12年の期間短縮を図れたことが明らかとなった。
プラズマ計測と数値解析の協同によるホール推進機の電子輸送現象の解明

放電室内部の電子の輸送現象を解明するために,数値解析コストが低い小型の100W級ホールスラスタを昨年度までに設計,製作し,今年度はこのスラスタの推進性能,真空度依存性および排気プルーム特性の評価を実施した.昨年度本予算で整備したキセノン排気速度2,000 L/sの小型真空チャンバーとJAXA共同利用設備であるキセノン排気速度22,000 L/sの大型チャンバーの2つの実験環境を用いて,小型ホールスラスタの性能評価を実施し,真空チャンバー内圧力が1/6になると,同一作動条件でのアノード効率が最大で5%減少すること,また,放電電流振動が開始する磁束密度が低磁場側にシフトすることを確認した.また,大型チャンバーを用いた高真空環境下において,放電電流振動が比較的抑制されている放電電圧225 Vでの放電電力100 W作動時のホールスラスタヘッドの代表性能として,推力5.7 mN,比推力1,060 s,推力電力比57 mN/kW,アノード効率0.30を確認し,現在各国が開発している小型ホールスラスタと同程度の性能であることを確認した.加えて,昨年度までに設計,製作した排気プルームの計測装置を使用し,排気プルームを計測した結果,中型・大型ホールスラスタと比べて,放電電流振動を抑制するために必要な磁束密度が高磁場側にシフトすること,また,小型化に起因する狭い放電チャネルにより推進剤利用効率の低下も確認された.さらに,放電電流振動によりイオンの生成量に変化が生じることも明らかになり,これらの顕著な特性を数値解析が捉えることができるか,今後評価を進める必要がある.実験と数値解析の協同を進めるために,今年度は数値解析の検証に必要な実験データの取得と数値解析の実施を進める計画であった.概要に記述した通り,数値解析コストが低い100W級ホールスラスタの推進性能および排気プローム特性を順調に取得し,数値解析技術の評価に必要な実験データベースを整備することができた.また,流れの主体であるイオンと電子を粒子として取り扱った2次元のFull-PICコードによる100W級ホールスラスタの解析にも着手することができ,研究協力者と連携を取りながら,次年度以降,数値解析結果の評価を行える状況に達した.以上の観点から,研究は「おおむね順調に進展している」と自己評価する.今後はより詳細にホールスラスタ内部の流れの描像を捉えるために,放電チャネル内のプラズマ物性を高速移動機構と静電プローブを用いた方法により計測し,実験データベースの拡充を進める.一方で,数値解析技術に関しては,今年度から計算を開始した2次元のFull-PIC計算を進め,実験結果との比較評価を実施する.これにより,実験と数値解析からホールスラスタの電子輸送についての考察を進めるとともに,磁場強度,電場強度,推進剤密度に対する電子の移動度モデルを構築し,スラスタの設計ツールとして有用な2次元のHybrid-PICコードへの適用を試み,ホールスラスタ開発への貢献を目指す.マグネティックシールディング形状の磁場を持った2kW級ホールスラスタを用いて,スラスタ筐体電位および下流端面電位を真空チャンバー電位・浮遊電位・カソード電位と変更し,その影響を評価した結果,スラスタ筐体電位が放電特性に強い感度を持つことを確認した.また,中型および大型の真空チャンバーを用いて,真空チャンバー内の圧力が放電特性に与える影響に関しても評価を実施し,筐体電位と同様に放電特性に強い感度をチャンバー内圧力が持つことを確認した.この結果を踏まえ,次年度以降,筐体電位・真空チャンバー内圧力が電子の輸送現象に与える影響をプラズマ計測により評価を進める.一方,放電室内部の電子の輸送現象を実験および数値解析の面から評価するため,数値解析コストが低い小型の100W級ホールスラスタの設計・試作を実施するとともに,スラスタを作動させるための直径0.8m・長さ1.6mの真空チャンバーの設計・製作を実施した.また,放電室内部のプラズマ計測を実施するためのプローブ移動機構の設計・製作・初期作動確認を実施した.製作した真空チャンバーの排気性能を評価するために,キセノンガス導入試験を実施し,0.4 mg/sのガス導入時で3×10^-3 Pa以下の高真空を維持できることを確認した.また,試作した100W級ホールスラスタの予備放電試験を実施し,タングステンフィラメントカソードによる主放電誘起を確認した.100W級ホールスラスタに合わせた六ホウ化ランタンを用いた小型ホローカソードも試作したが,プラズマ生成が確認できなかったため,次年度以降,100W級ホールスラスタの性能評価,数値解析を進めるとともに,小型ホローカソードの改修を進める必要がある.実験と数値解析の協同を進めるために,今年度は実験系の準備および性能評価を進める計画であった.概要に記述した通り,100W級ホールスラスタ・真空チャンバー・高速プローブ移動機構の設計・製作・作動確認を順調に実施した.また,2kW級ホールスラスタを用いた放電特性に強い感度持つパラメータの抽出も行えた.一方,小型ホローカソードに課題があり,3次元のFull-PICコードの開発が遅れているため,研究協力者と連携を取りながら,引き続き,研究を進めて行く必要がある.以上の観点から,研究は「おおむね順調に進展している」と自己評価する.放電室内部の電子の輸送現象を解明するために,数値解析コストが低い小型の100W級ホールスラスタを昨年度までに設計,製作し,今年度はこのスラスタの推進性能,真空度依存性および排気プルーム特性の評価を実施した.昨年度本予算で整備したキセノン排気速度2,000 L/sの小型真空チャンバーとJAXA共同利用設備であるキセノン排気速度

22,000 L/sの大型チャンバーの2つの実験環境を用いて,小型ホールスラスタの性能評価を実施し,真空チャンバー内圧力が1/6になると,同一作動条件でのアノード効率が最大で5%減少すること,また,放電電流振動が開始する磁束密度が低磁場側にシフトすることを確認した.また,大型チャンバーを用いた高真空環境下において,放電電流振動が比較的抑制されている放電電圧225 Vでの放電電力100 W作動時のホールスラスタヘッドの代表性能として,推力5.7 mN,比推力1,060 s,推力電力比57 mN/kW,アノード効率0.30を確認し,現在各国が開発している小型ホールスラスタと同程度の性能であることを確認した.加えて,昨年度までに設計,製作した排気プルームの計測装置を使用し,排気プルームを計測した結果,中型・大型ホールスラスタと比べて,放電電流振動を抑制するために必要な磁束密度が高磁場側にシフトすること,また,小型化に起因する狭い放電チャネルにより推進剤利用効率の低下も確認された.さらに,放電電流振動によりイオンの生成量に変化が生じることも明らかになり,これらの顕著な特性を数値解析が捉えることができるか,今後評価を進める必要がある.実験と数値解析の協同を進めるために,今年度は数値解析の検証に必要な実験データの取得と数値解析の実施を進める計画であった.概要に記述した通り,数値解析コストが低い100W級ホールスラスタの推進性能および排気プローム特性を順調に取得し,数値解析技術の評価に必要な実験データベースを整備することができた.また,流れの主体であるイオンと電子を粒子として取り扱った2次元のFull-PICコードによる100W級ホールスラスタの解析にも着手することができ,研究協力者と連携を取りながら,次年度以降,数値解析結果の評価を行える状況に達した.以上の観点から,研究は「おおむね順調に進展している」と自己評価する.今年度整備した真空チャンバー,ホールスラスタおよびプローブ計測系を用いて,放電室内外のプラズマ計測を次年度以降進めるとともに,研究協力者と協力して小型ホールスラスタの数値解析評価を進める.当初はプローブ計測に加えて,光学計測系を整備する予定であったが,計画時の予算額から採択時に減額があったため,本研究での整備は実施せず,他研究機関が所有する計測系を利用することにより,プローブ計測系のダブルチェックを進めて行く.また,真空チャンバー内の圧力がスラスタの放電特性に感度があることが本研究および他研究機関の実験結果から示唆されているため,電子の輸送現象と真空チャンバー内圧力の関係性を評価するため,共同利用制度を用いた宇宙科学研究所の大型真空チャンバーでの試験も次年度以降実施する.今後はより詳細にホールスラスタ内部の流れの描像を捉えるために,放電チャネル内のプラズマ物性を高速移動機構と静電プローブを用いた方法により計測し,実験データベースの拡充を進める.一方で,数値解析技術に関しては,今年度から計算を開始した2次元のFull-PIC計算を進め,実験結果との比較評価を実施する.これにより,実験と数値解析からホールスラスタの電子輸送についての考察を進めるとともに,磁場強度,電場強度,推進剤密度に対する電子の移動度モデルを構築し,スラスタの設計ツールとして有用な2次元のHybrid-PICコードへの適用を試み,ホールスラスタ開発への貢献を目指す.
ヨ-ロッパにおける統合的諸権力の構造と展開

この2年間我々は、《特殊ヨ-ロッパ的》社会構造に着目しつつ前近代の統合的諸権力の構造と展開を把握することに努めてきたが、その際独断に陥らないよう研究史をフォロウし、その研究史を対象化するために史料に沈潜し、また研究成果の相互批判に努めてきた。これらの目的は、本研究費補助金により著しく促進された。さて我々の研究は、第1領域《地域的諸集団と統合的諸権力》、第2領域《統合的諸権力における教会の地位》、第3領域《統合的諸権力と官僚》を単位に進められ、その結果は、未発表の独立した諸論文(もしくはその要約)からなる『研究成果報告書』としてまとめられた。その中で、佐藤伊久男が中世イングランドの国家と教会との関係において12世紀が大転換期であることを解明したのに続き、第1領域で、三浦弘万氏はカ-ル大帝による他部族併合過程におけるグラ-フシャフト制の導入の意義を強調し、斎藤泰氏は原スイス永久同盟の形成過程における渓谷指導層の利害の決定性を示し、柳沢伸一氏は宗教改革期の帝国都市とスイス都市との同盟に帝国の統治構造の特殊性を見、斎藤寛海氏は16世紀ヴェネチアの食糧政策の中から特殊イタリア的な支配構造の特質を摘出した。第2領域では、渡部治雄氏は帝国教会制との絡みでドイツ王国成立を国王ジッペからディナスティ-への構造的転換として把握し、鶴島博和氏はイングランド統一国家の原理が部族国家統合のへゲモニ-ではなく教会に由来すると主張した。第3領域では、小野善彦氏は領邦国家において君主の公的経営と学識法曹の私的経営とが役得プフリュンデとしての地方行政官職の形で癒着していたとし、神宝秀夫氏は絶対主義時代の領邦軍制(職業的常備軍と選抜民兵制)に見られる君主と内外の権力者との二元主義が特殊ヨ-ロッパ的特質の1つであると指摘した。今後は国家史を「官僚と軍隊」の観点から追究していく計画である。昭和63年度では、3つの領域、すなわち第1領域《地域的諸集団と統合的諸権力》、第2領域《統合的諸権力における「教会」の地位》、第3領域《統合的諸権力と官僚》において、その一つに属する各分担者はぞぞれの課題に沿って史料および文献の嵬集にあたった。またそれと並行して全体集会が開催された。まず第1領域から三浦弘万氏のゲルマン社会における共同体と農民戦士の生活形態、また斉藤寛海氏より16世紀ヴェネツィアの穀物補給政策の観点から都市国家的統合の分析が報告され、さらに柳沢伸一氏はハプスブルグの家領政策とスイスとをめぐる・宗教政策期の南ドイツ帝国都市の動向を検討し報告した。第2領域では、渡部治雄氏よりドイツの帝国協会制の構造とその意義について、また鶴島博和氏よりイングランドとフランス、とくにノルマンディの封建制の構造的比較について報告があり、最後に第3領域では、小野喜彦氏が1617世紀バイエルンの地方行政の構造的特質について報告した。また研究打ち合わせと論点の整理を行いつつ、平成元年度には第1領域から斉藤泰氏、第2領域から研究補助者として前山総一郎氏(東北大学大学院)の報告が行われることになった。なおドイツに留学の神宝秀夫氏が加わり、ドイツの学会の現状を報告してもらう予定であるが、これは第3領域に関わる。

われわれの研究は前近代の《特殊ヨーロッパ的》社会構造に注目しつつ統合的諸権力の展開を把握することに主眼があるが、そのさい独断に落ち入らないためにもヨーロッパにおける枢要な研究史を着実にフォロウすること、またその研究史を対象化するためには史料に沈潜することが肝要である。本研究補助金により以上のための文献・史料の嵬集が著しく促進された。我々の研究の主眼は、《特殊ヨ-ロッパ的》社会構造に着目しつつ前近代の統合的諸権力の構造と展開を把握することにあるが、その際独断に陥らないよう枢要な研究史をフォロウし、その研究史を対象化するために史料を沈潜し、そして研究成果を深化させるために相互批判に努めてきた。本研究費補助金により、この文献・史料の蒐集、研究成果の深化が著しく促進された。昨年度に引き続き平成元年度も、3つの領域、つまり第1領域《地域的諸集団と統合的諸権力》、第2領域《統合的諸権力における教会の地位》、第3領域《統合的諸権力と官僚》を組織単位とし、その中で各研究分担者はそれぞれの課題に応じて、史料および文献を調査し、蒐集(購入・複写)にあたった。同時にこれと並行して全体研究集会が開催され、各研究分担者から新知見が提示された。第1領域からは、斎藤泰氏が原スイス永同盟の形成過程を渓谷共同体の統合=平和樹立の観点の下に報告し、渓谷指導層の利害が決定的であったことを示した。第2領域からは、研究補助者の前山総一郎氏(東北大学大学院)が叙任権闘争前後におけるレ-ガ-リアを分析してドイツにおける帝国教会制の重要な軍事的側面につき報告し、さらに佐藤伊久男が中世イングランドの国制を決定づける国家と教会との関係を検討して12世紀がこの関係における大転換期であることを明らかにした。最後に第3領域では、研究補助者の楠義彦氏(東北大学大学院)がイングランド・エリザベス朝期の魔術禁止法の分析により、枢密院を通じての同教会体制確立のモメントを示した。以上の活動から明らかになってきた諸国家のヨ-ロッパ的特質を、次年度からはより絞られた問題点、即ち「官僚および軍隊」の観点から一層比較史的に追究していく計画をたてており、既に準備を進めている。
ロイシンtRNAのアイデンティティー決定メカニズムの解明

申請者はこれまで大腸菌において20種類全てのアミノ酸に対応するtRNAに対してのtRNAアイデンティティーを決定する仕組みについて調べてきた結果、共通のL字構造の中の少数の特徴的な塩基の組み合わせをアミノアシル-tRNA合成酵素が塩基特異的に認識することでtRNAアイデンティティーの決定が行われることを明らかにしてきた。tRNA^<Ser>、tRNA^<Leu>及びtRNA^<Tyr>は通常のクローバー葉様の二次構造に加えてもう一つのアーム(長いバリアブルアーム)を持つという構造上の特徴を有する(class II tRNA)。そしてこの3種類のclass II tRNAにおいては塩基特異的な認識というよりもむしろ立体構造の違いがアミノ酸受容特異性の決定に中心的な働きをしているという、従来考えられていなかったタイプの認識識別の機構が存在していることを明らかにしてきた。バリアブルアームの長さは進化の過程で大きく変化する。真核生物では長いバリアブルアームを持つtRNAはtRNA^<Ser>とtRNA^<Leu>の2種類だけであるという点が原核生物のものとの大きく異なる。本研究では、このように他のtRNAとは異なり特殊な立場にあるclass II tRNA、特にロイシンtRNAに焦点を当て、酵母におけるtRNA^<Ser>、tRNA^<Leu>の認識、識別の機構を明らかにすることで、class II tRNAの認識の進化の過程を明らかにし、これがtRNAの構造の進化やアミノアシル-tRNA合成酵素の進化とどのような関係にあるかを明らかにすることを目的として実験を行った。本研究の結果、酵母におけるロイシル-tRNA合成酵素はtRNA^<Leu>を認識識別する際に、立体構造にもとずいた識別を行っておらず、この点において大腸菌とは根本的に異なった認識識別の戦略をとっていることが明らかになった。また本研究は、アンチコドン認識の有無に関して生物によって異なることがあることを示した最初の例となった。申請者はこれまでin vitroで作成したtRNA転写産物を用いて、大腸菌tRNA^<Ser>,tRNA^<Leu>,tRNA^<Tyr>それぞれの認識にとって必要な塩基を調べている過程でtRNA^<Tyr>からtRNA^<Ser>への変換、tRNA^<Leu>からtRNA^<Ser>への変換、tRNA^<Ser>からtRNA^<Leu>への変換、tRNA^<Tyr>からtRNA^<Leu>への変換がいずれも構造変化を引き起こすような変異を導入するだけで可能となることを発見している。本研究では、真核性物である酵母のtRNA^<Leu>の認識機構およびtRNA^<Ser>に対する識別機構を明らかにすることができた。ロイシル-tRNA合成酵素はdiscriminator塩基であるA73の他、アンチコドン2文字目のA35、アンチコドンの3'側に隣接する塩基であるG37を認識していることが明らかになった。アンチコドン認識の有無に関して原核生物と真核生物との間で違いが見られたのは本研究のtRNA^<Leu>の例が初めてである。また、酵母では他種のclass II tRNA(tRNA^<Ser>)を識別するにあたって立体構造の違いを全く必要としていなかった。以上のように原核生物と真核生物とでは、他種のclass II tRNAを識別する戦略が根本的に異なっていることが明らかになった。このことはclass II tRNAが3種類の原核

生物と2種類の真核生物の差、すなわち、排除すべき類似tRNA分子の数の差を反映しているものと思われる。現在、第3の生物界とも言うべき古細菌(好塩菌)からロイシル-tRNA合成酵素を精製しているところである。古細菌は2種類のclass II tRNAを持つ点では真核生物に似ているということができるが、tRNA^<Leu>の構造はどちらかというと原核生物のものに似ており、認識識別戦略の様式を明らかにすることで、class II tRNAの起源、立体構造を中心とした認識識別戦略の起源などにせまることができるものと考えている。申請者はこれまで大腸菌において20種類全てのアミノ酸に対応するtRNAに対してのtRNAアイデンティティーを決定する仕組みについて調べてきた結果、共通のL字構造の中の少数の特徴的な塩基の組み合わせをアミノアシル-tRNA合成酵素が塩基特異的に認識することでtRNAアイデンティティーの決定が行われることを明らかにしてきた。tRNA^<Ser>、tRNA^<Leu>及びtRNA^<Tyr>は通常のクローバー葉様の二次構造に加えてもう一つのアーム(長いバリアブルアーム)を持つという構造上の特徴を有する(class II tRNA)。そしてこの3種類のclass II tRNAにおいては塩基特異的な認識というよりもむしろ立体構造の違いがアミノ酸受容特異性の決定に中心的な働きをしているという、従来考えられていなかったタイプの認識識別の機構が存在していることを明らかにしてきた。バリアブルアームの長さは進化の過程で大きく変化する。真核生物では長いバリアブルアームを持つtRNAはtRNA^<Ser>とtRNA^<Leu>の2種類だけであるという点が原核生物のものとの大きく異なる。本研究では、このように他のtRNAとは異なり特殊な立場にあるclass II tRNA、特にロイシンtRNAに焦点を当て、酵母におけるtRNA^<Ser>、tRNA^<Leu>の認識、識別の機構を明らかにすることで、class II tRNAの認識の進化の過程を明らかにし、これがtRNAの構造の進化やアミノアシル-tRNA合成酵素の進化とどのような関係にあるかを明らかにすることを目的として実験を行った。本研究の結果、酵母におけるロイシル-tRNA合成酵素はtRNA^<Leu>を認識識別する際に、立体構造にもとずいた識別を行っておらず、この点において大腸菌とは根本的に異なった認識識別の戦略をとっていることが明らかになった。また本研究は、アンチコドン認識の有無に関して生物によって異なることがあることを示した最初の例となった。