hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
東アジアにおける人の流れ－振武学校・陸軍士官学校への留学生達の国際関係史

戦前、日本陸軍士官学校に留学していた中国人留学生の中でも、特に日本と関係が深かった中国東北(満洲)からの留日学生を中心として、その陸士人脈の解明と、彼らが帰国後東アジアの歴史の中でいかなる役割を果たしたかについて分析する。研究方法は、コンピューターのカードソフトを用いて留日学生の経歴を整理し追うとともに、関わった可能性のある日本軍人の動向も整理し、陸士の同期や教官に誰がいたのか、日本軍人の誰と関わりがあったかの解明に努め、また陸士関連の史料を本研究の観点から見直し、それが満洲事変や満洲国、日中戦争そして戦後の東アジアの国際関係とどう関わるのかー人的流れと東アジアの国際関係について考察する。
肝がんで過剰発現しているガンキリンとHSCOとを標的とする肝がん治療法の開発

1.ガンキリン発現をRNAi及びアンチセンスオリゴヌクレオチドにより抑制したところ、がん細胞株の増殖には影響がなかった。しかし、造腫瘍性は4割程度抑制された。2.酵母2-ハイブリッド法によりガンキリンに結合する蛋白質として得られたMAGE-A4(GKBP2)の変異体を作成して解析した。C末端側の92アミノ酸がガンキリンと結合した。このガンキリン結合領域を細胞内で発現させると、MAGE-A4全長では造腫瘍性を抑制するものの細胞増殖に対する影響が見られないのに対し、顕著な細胞増殖抑制効果が認められた。そこで、C末端側MAGE-A4にHIVのTAT蛋白質のPTDを融合させ、培養細胞に添加したところ、細胞増殖を抑制した。さらに、ヌードマウスに腫瘍を形成させ、腫瘍内に融合蛋白質を注射したところ、腫瘍の増殖が抑制された。なお、ガンキリンとMAGE-A4全長との結合は、ガンキリンとRb、S6、あるいはCdk4との結合には影響を与えなかった。3.ヒト肝がん細胞に対し、HSCOの発現をRNAiにより抑制した。それ単独では何の影響もないがDNA損傷を与える抗癌剤の投与によるアポトーシスが増強される事が明らかになった。HSCOはNF-κB p65と結合し、その核から細胞質への排出を促進することによりNF-κBの転写活性を阻害するという新奇な作用を有していた。また、肝がん細胞ではp65が活性化の刺激によっても核内に貯蓄されず、HSCOの発現を抑制すれば貯蓄され転写因子活性を示すことが明らかになった。4.肝細胞がん組織と正常部肝組職との遺伝子発現の差をcDNAサブトラクション法により検索し、これまでガンキリンとHSCOについて解析、報告してきた。さらに16種類の遺伝子の発現が、肝細胞がんの過半数の症例で亢進していることを見出した。
乳癌幹細胞におけるNF-kappaB活性化の解析

乳癌は異常な乳腺上皮細胞が乳癌幹細胞として自己複製と分化を繰り返しながら増殖することで形成される。腫瘍中に維持された乳癌幹細胞が転移や再発に関与する可能性が示唆されているが、腫瘍中における乳癌幹細胞を維持する機構は未だ未解明である。一方、転写因子NF-κBはその標的遺伝子として抗アポトーシス・細胞遊走・血管新生等に関わる遺伝子を持ち様々な癌腫において悪性化との関係が報告されている。我々は昨年中にBasal-like乳癌という悪性度が高く、有効な治療標的の無い乳癌サブタイプの細胞株において乳癌幹細胞画分の割合が恒常的もしくは誘導性のNF-κB活性化によって維持・増加されることを明らかにした。また、その機構として腫瘍の大部分を占める乳癌細胞におけるNF-κB活性化によって誘導されたJAG1が乳癌幹細胞を維持するというパラクライン仮説を証明してきた。本年度はまずこのJAG1の発現解析を行い、様々なサブタイプの乳癌細胞株のうち、Basal-like乳癌のみにおいてNF-κB活性化によってJAG1が誘導されることを明らかとした。一方、腫瘍中には癌細胞以外にもマクロファージや繊維芽細胞、正常上皮細胞が含まれており癌の悪性化に影響を与えることが知られている。そこでこれらの細胞におけるJAG1発現を調べたところ、マクロファージや繊維芽細胞ではNF-kBを活性化するとJAG1が誘導されることが分かった。更に卵巣ホルモンの投与によって、正常乳腺上皮細胞のうちBasal細胞においてJAG1発現が誘導されることが分かった。卵巣ホルモン刺激によってLuminal細胞がRANK ligandを発現し、Basal細胞のRANKを刺激することによってNF-κBを活性化させることが明らかとなっているため、こうして活性化されたNF-kBによってJAG1が誘導されたと考えられる。また、我々は以前にNF-κB inducing kinase(NIK)の過剰発現がBasal-like乳癌の恒常的NF-κB活性化を誘導していることを報告していた。そこでNIKのJAG1発現および乳癌幹細胞維持機構への影響を検討したところ、NIKの発現抑制によってJAG1発現が低下し、逆にNIKを過剰発現させることでJAG1発現が増加して乳癌幹細胞画分が増加することが分かった。以上より癌細胞自身のエピゲノム異常によるNIK過剰発現や炎症性サイトカインによるNF-κB活性化による乳癌細胞におけるJAG1発現が乳癌幹細胞を維持していることが示唆された。さらに、腫瘍を形成する様々な正常細胞も癌に関連した刺激依存的にJAG1を発現することから、これらの細胞も癌微小環境において乳癌幹細胞を維持する機能を持つ可能性が示唆された。一方、転写因子NF-κBはその標的遺伝子として抗アポトーシス・細胞遊走・血管新生等に関わる遺伝子を持ち様々な癌腫において悪性化への関与が報告されている。我々はこれまでに乳癌の中でも難治性のBasalサブタイプにおいてNF-κBが恒常的に活性化しアポトーシスを抑制することを報告した。本年度はこのNF-κB活性化が乳癌幹細胞に与える影響について検討を行った。13種類の乳癌細胞株の乳癌幹細胞マーカー発現のFACSによる解析、およびレトロウイルスベクターを用いてNF-κB活性化を調節した細砲を作成し乳癌幹細胞の割合をFACS・スフィア形成実験・免疫不全マウスへの移植実験で検討した実験から、恒常的および誘導性のNF-κB活性化がBasal-Aサブタイプの乳癌幹細胞の増殖・維持を担うことを明らかにした。また乳癌幹細胞とバルク乳癌細胞のNF-κB活性化には差が見られなかったことから「NF-κBの作用点は乳癌幹細胞そのものではなく癌細胞全体で活性化されたNF-κBの下流で誘導される因子がパラクラインに働く」という仮説を立て、GFPラベルした細胞を用いた共培養実験でこの仮説が正しいことを確認した。さらに乳癌細胞株のマイクロアレイ解析からシグナル伝達系リガンドに注目して解析を行い、NF-κB下流でこのリガンド発現が誘導され、このリガンドの発現抑制によってNF-κB活性化による乳癌幹細胞の増殖・維持が抑制されることを見出した。以上より乳癌細胞におけるNF-κB活性化が下流遺伝子の発現誘導を介してパラクラインに乳癌幹細胞の増殖・維持を促進している可能性が示唆された。

また、その機構として腫瘍の大部分を占める乳癌細胞におけるNF-κB活性化によって誘導されたJAG1が乳癌幹細胞を維持するというパラクライン仮説を証明してきた。本年度はまずこのJAG1の発現解析を行い、様々なサブタイプの乳癌細胞株のうち、Basal-like乳癌のみにおいてNF-κB活性化によってJAG1が誘導されることを明らかとした。一方、腫瘍中には癌細胞以外にもマクロファージや繊維芽細胞、正常上皮細胞が含まれており癌の悪性化に影響を与えることが知られている。そこでこれらの細胞におけるJAG1発現を調べたところ、マクロファージや繊維芽細胞ではNF-kBを活性化するとJAG1が誘導されることが分かった。更に卵巣ホルモンの投与によって、正常乳腺上皮細胞のうちBasal細胞においてJAG1発現が誘導されることが分かった。卵巣ホルモン刺激によってLuminal細胞がRANK ligandを発現し、Basal細胞のRANKを刺激することによってNF-κBを活性化させることが明らかとなっているため、こうして活性化されたNF-kBによってJAG1が誘導されたと考えられる。また、我々は以前にNF-κB inducing kinase(NIK)の過剰発現がBasal-like乳癌の恒常的NF-κB活性化を誘導していることを報告していた。そこでNIKのJAG1発現および乳癌幹細胞維持機構への影響を検討したところ、NIKの発現抑制によってJAG1発現が低下し、逆にNIKを過剰発現させることでJAG1発現が増加して乳癌幹細胞画分が増加することが分かった。以上より癌細胞自身のエピゲノム異常によるNIK過剰発現や炎症性サイトカインによるNF-κB活性化による乳癌細胞におけるJAG1発現が乳癌幹細胞を維持していることが示唆された。さらに、腫瘍を形成する様々な正常細胞も癌に関連した刺激依存的にJAG1を発現することから、これらの細胞も癌微小環境において乳癌幹細胞を維持する機能を持つ可能性が示唆された。
地域アイデンティティの形成と民俗地理の分節化に関する研究-琉球列島を事例として-

本研究は、琉球列島を事例に、地域アイデンティティの形成と民俗地理の分節化という二つのテーマについて、はじめに、地域アイデンティティの基盤となる郷土概念の歴史的形成過程とその後の展開の諸相の両面の検討を行った。1900年代中葉からの内務省主導による地方改良運動を概念形成の嚆矢とし、1920年代に農村部の生活様式や民俗への関心がアカデミアの内外で顕著になる中、1930年代に文部省主導の郷土教育運動が興り、郷土に関する教育が制度化されることとなった。郷土教育は身近な生活空間への愛着を謳い、それを喚起させるモジュールを装置化することを目的とし、そこから連続的にモジュールの空間尺度を拡大し、皇道に沿った国家/国土への情緒的な愛着心の涵養をも目指すものであったが、ここでは形式的な空間的範域への情動的なつながりをモジュール化し身体化する作業が反復されるその機制を明らかにした。民俗地理が分節化されるのもこの契機を介してである。つぎにその今日的展開の一事例として、1990年代後半の「沖縄イニシアティヴ」なる保守派のマニュフェストをめぐる論争を取り上げ、地域アイデンティティが顕在化し動員されるそのコンテクストの分析を行った。その結果、それが沖縄県政のヘゲモニー争奪の政治的道具として用いられただけでなく、中央政府との関係における県民の歴史認識の修正をもくろむものでもあったことを明らかにした。また、民俗地理の現代的様相を把握するために、現代の若者文化を民俗と捉えることで、民俗が今日直面する概念的妥当性を検討した。民俗とは、ある種空間的な範域を設定して語られてきた「物語」ということが出来るが、今日の民俗地理は年齢階梯的契機により強く影響を受けながらも、なおかつ特定の場所性を必要とすることを「ストリート」の若者化を事例に考察した。本年度は、琉球列島の地域意識(アイデンティティ)と民俗地理の関係に関する基礎的な情報の蓄積を重点的に行った。具体的には、沖縄県公文書館でのマイクロフィルムや資料の閲覧・複写および、沖縄本島北部国頭村奥間における現地調査によるものである。後者においては、奥間区長ならびに区長経験者へのヒアリングを中心におこなった。その際のテーマは、第二次大戦前後の同区における米軍施設の敷設と日本への施政権返還(1972年)後の施設の一部返還に伴う地元の反応である。文書をはじめとする史資料と、現実にその歴史を生きた人々の証言をクロスチェックし、そのズレを検証していく作業であるが、これまで試みられなかった、地元(局所的地域)と、県ないしは琉球政府、そして米軍政府ないしは日本政府という、三層の主体が、それぞれ空間的スケールを異にしながら切り結んでいく過程の一端を明らかにし始めることができたといえよう。2月には、地域アイデンティティ研究の推進者であるデュースブルク大学(ドイツ)のブローテフォーゲル教授に面会し、この研究テーマに関するレヴューを受けた。英語圏や仏語圏に比して、独語圏では地域意識研究が盛んである。もっとも、地域意識研究が現在は批判的地政学という形をとり、社会理論の摂取と連動しながら発展しているということも、その際の議論の話題となった。なお、今年度の成果の一部は、来月『「郷土」の表象と実践(仮題)』として出版する予定であり、現在その校正作業を行っている。本年度は前年に引き続き、1)地域アイデンティティ形成の機制に関する構造的問題と、2)琉球列島においてこの問題にかかわる事例の収集を行った。また、3)中間報告として国際学会で発表を行い、アジアならびに欧米の研究者達と意見交換し議論を行った。

1)についてはミクロな空間尺度である「郷土」について、その概念の歴史的形成過程とその後の展開の諸相の両面から検討した。概念形成については、1900年代中葉から内務省主導の「地方改良運動」にその嚆矢を認めることができる。その後1920年代に農村部の生活様式や民俗への関心がアカデミアの内外で顕著になる中、1930年代に文部省の主導で「郷土教育運動」が興り、「郷土」に関する教育が制度化されることとなる。これにより「教科」として「郷土」が教え込まれることとなった。郷土教育は身近な生活空間への愛着を謳い、それを喚起させるモジュールを装置化することを目的とし、連続的にモジュールの空間尺度を拡大し「皇道」に沿った国家/国土への情緒的な愛着心の涵養をも目指すものであった。この装置自体は、内務省による「地方改良運動」の際の、旧藩政村の様な直近の集落単位を越えた空間的範域である行政村に対する郷土表象の意識化の試みを基盤としているといえる。形式的な空間的範域への情動的なつながりをモジュール化し身体化する作業が反復されたというわけである。このモジュール化され身体化された(「郷土」もそのひとつである)「地域への愛着」はどの空間尺度においても作動する。2)については、そのミクロなスケールについて確認するべく那覇市内において調査を行った。ただ、フィールド調査については、琉球列島全域をカバーすることを前提としているので、次年度の前半期に積極的に行うこととしたい。3)については、8月に東京と大阪で開催された第3回批判地理学東アジア地域会議に出席し、報告を行うことでこのテーマについてアジアや欧米の地理学者たちと活発に議論することができた。本年度は、本科研の最終年度に当たる。夏期にこれまでの成果の一端を示すべく、ボッフム大学(ドイツ)で開催された日独地理学会において、Changing the commercial strip for youth flavour : thelandscapes of alternative socio-cultural conjunction inmetropolitanareaof Japanと題する報告を行い、討議および意見交換を行った。本報告は沖縄の一番の繁華街である国際通りから分岐する衰退商店街が、ここ15年程の間に「若者化」とでもいえる、特定の年齢層をターゲットとする店舗の増殖によって、賑わいを生み出していく様相に着目し行った実態調査であるが、この現象が、沖縄だけでなく、日本全国の一定規模以上の大都市圏(100万人規模以上)において共通して見られることであることについても言及した。これもまた景観変化の現象に関するものであり、本科研のキーワードである民俗地理およびごくローカルな場所アイデンティティの分節化の一形態であると報告者は考える。当初の計画では、奄美から八重山までの広範な地域の民俗地理と地域意識の把握を目指したが、最終年度においては、大きく転回することとなった。従来の、民俗に関する研究では、年齢ごとに異なる生活様式の仔細、特に場所に関わる問題については記述されることが少なかった。関連する事項として、毛遊びの具体的な場所などについても記録しておく必要があるだろう。浮島通りのような対象も、年齢特化的で、その点で、新たな風俗/民俗に関する地理学的研究領域の開拓対象と考えることも出来る。むろん民俗と風俗は異なるという意見もあろう。
プラトンの後期政治思想の展開とアリストテレスへの影響

研究代表者藤澤は、プラトン初期の政治思想を、『弁明』『クリト』『ゴルギアス』および『第七書簡』等からさぐり、プラトンの哲人王の理念がすでに初期の段階に萌芽していることを指摘した。さらに中期における政治思想の集大成である『国家』に論述を進めることはできなかったが、後期の作品『ポリティコス』に研究を進め、プラトン政治思想の展開を以下の順序でまとめた。(1)宇宙における人間の位置、(2)政治家ないし王のもつべき知識の特性、(3)パラデイグマのパラデイグマ、(4)パラデイグマとしての機織術、(5)パラデイグマの成果によって政治家を見る、(6)プラトンによる国制論、(7)唯一正しい国制とその模倣、(8)法律の限界と効用、(9)政治術の核心に向けて。研究分担者の斉藤はアリストテレス『政治学』第3巻と第4巻における国制論の差異を解明した。第3巻はプラトンの『ポリティコス』及び『法律』に従っており独創性はない。しかし、第4巻では、6つの国制の各々に多数の亜種を確定し、さらに、その多数性の根拠が最高権力に参与する社会的・経済的諸階層の相違にあることを解明している。以上の分析に基づき、プラトン国制論の理論的な受容と批判の概要を次のように展望することができる。アリストテレスは第4巻で現実的に最善な国制たる混合国制を提起するが、すでにプラトンが『ノモイ』で混合国制論を提示している。アリストテレスは探究目標の条件設定を受容しこれを独自の視点から探究した。研究代表者藤澤は、研究課題の遂行のために、まずプラトンの初期政治思想の確認作業をおこなった。『ゴルギアス』『クリトン』『弁明』『第七書簡』等を参照にして、プラトンの初期政治思想を、所属大学の研究紀要に発表することができた。なお加えて、後期政治思想が緒に就く『政治家』の研究をすすめている。研究分担者の本年度の状況は以下のとおりである。アリストテレスは、最善の国制の構想と現実の国制の維持と変革という重層的な理論構成のもとで国制論の探求を進めている。現実の国制の分析は、動物学の手法を援用したものであり、国制の諸部分の析出とそれら諸部分の組み合わせによる諸国制のモデル的構成に基づきつつ、それに適合した法律と制度の工夫による国制の安定化を目標とする。最善の国制論については、その概念的基礎として「カタ・ピュシン(自然に適った)」という概念が重要である。本年度は、『ポリティカ』第1巻におけるその概念の使用法を分析した後掲論文の発展的研究として、自然性を規範とする思考法の起源をプラトンの『ノモイ』第10巻の神学に求め、目下、その成果をまとめている。研究代表者の藤澤は、本年度については、後期プラトン政治思想の展開例として『ポリティコス』を研究した。前期政治思想を承けて、プラトンは中期政治思想の集大成『国家』を書き上げた。しかし、中期思想は哲人王の理想を善のイデアと関係づけたが、王の術が何を作り出すのかはまだ不明であった。『ポリティコス』はなによりもこの点を解明する使命をもっていた。対話の進行によりながら、以下の諸点を考察した.1宇宙における人間の位置、2政治家ないし王のもつべき知識の特性、3パラデイグマのパラデイグマ、4パラデイグマとしての機織術、5パラデイグマの成果によって政治家を見る、6プラトンによる国制論、7唯一正しい国制とその模倣、8法律の限界と効用、9政治術の核心に向けて。研究分担者の斉藤は、本年度は、『政治学』第3巻と第4巻におけるアリストテレスの国制論の相違に注目し、彼がプラトンから受け継いだ国制分類を展開して各国制の下位分類にまで考察の目を向けた理由を研究した。

第4巻における理論的発展は、国制の差異の原因が社会経済的諸階層の権力への参与の差異にあることを解明したことである。また、「ポリスの部分(ポリスの機能)」論にも注目した。それらは社会経済的階層と国制の機能とを含むが、これらが並列されているのは、カテゴリーの混乱ではなく、むしろそう考えるのは、我々自身における制度の実体視のせいであって、アリストテレスはこれらをその担い手たるポリス市民(人間)の仕事として捉えていたのである。
抗HMGB1単クローン抗体による出血性脳卒中の治療薬可能性の検討

我々はHigh mobility group box1(HMGB1)はマクロファージ、単球、好中球、内皮細胞、上皮細胞、樹状細胞、平滑筋細胞等様々な細胞で発現して、炎症性メディエーターであることを着目し、創薬研究してきた。本研究では、特異的抗HMGB1単クローン抗体を作製し、出血性脳卒中の治療効果及びメカニズムの解明を目的とした。前年度に引き続いて、脳実質内及び硬膜下出血における遅発性血管攣縮とHMGB1の関連性を検討した。血管攣縮を起こしている血管壁の平滑筋細胞からHMGB1が細胞外へ放出されることが免疫染色で確認され、そのHMGB1の働きで血管の収縮を誘導する受容体の発現量が上昇することを示唆された。したがって、発症直後、抗HMGB1抗体を投与することによってほぼ100%の血管攣縮が抑制された。抗体の有効治療時間帯の検討で、発症後3時間まで治療が有効であることがわかった。さらに、蛍光物質フルオレセイン(FITC)で標識したデキストランを静脈注射し、共焦点レーザー顕微鏡で脳実質の血管攣縮像を観察した。脳内出血後24時間、出血側と健側の大脳皮質における毛細血管網の画像を比較した。健側に満たした毛細血管網の蛍光染色像に対し、出血側は点状の蛍光染色像しか見えなかった。この結果より、血管に通過可能のFITCで標識したデキストランは、血管攣縮になると通過できなくなって、点状の蛍光染色像が見えた。脳内出血障害の急性期に血管攣縮が亢進していることは明らかになった。抗HMGB1抗体の投与は、血管攣縮と脳内全体で生じる炎症応答を抑えることが分かった。High mobility group box1(HMGB1)は、有核細胞の核内に存在する非ヒストンタンパク質で、転写調節やDNA修復に関与するタンパク質である。HMGB1は壊死細胞やある種の刺激を受けた細胞から細胞外へ放出され、炎症メディエーターとして注目される。申請者は、HMGB1を標的とする抗体医薬を発想し、すでにラットの脳梗塞、脳外傷モデルで、抗HMGB1単クローン抗体が血液脳関門保護と脳内炎症抑制を介し、劇的な脳浮腫抑制作用を発揮することを明らかにしてきた。脳卒中は、虚血性と出血性に大別できるが本研究では脳実質及び硬膜下出血動物モデルを用いて、出血性脳卒中に対する抗HMGB1単クローン抗体の評価を行い、汎用性治療薬としての可能性を検討した。脳実質出血好発部位である線条体へコラゲナーゼを微量投与することにより安定したラットの脳実質出血モデルを作成した。ラット頭蓋骨に小穴を開け、硬膜下に27G針を挿入し,動脈より採取した0.3mlの自家血を3分間かけて注入し、硬膜下出血モデルを作成した。両者ともX線CT装置で血腫を確認し、一定の神経症状を呈する個体を選別し、抗HMGB1抗体の治療効果の評価を行った。抗HMGB1抗体の投与は硬膜外出血後の脳血管攣縮及び脳内出血後の血腫周囲の炎症反応を著明に抑制した。脳出血障害によって、血腫周囲の神経細胞の核内に局在したHMGB1は核膜部位に集積後、細胞質へ移行した像が観察された。脳障害によって神経細胞の核から放出されるHMGB1は脳血管攣縮及び脳内出血後の二次性炎症反応を引き起こす重要な因子であることを実験によって、証明できた。上述したように、安定したラットの脳実質出血及び硬膜外出血モデルを用いることで、脳の出血性損傷における抗HMGB1抗体の役割についての結果を得た。本研究の第一の目標である、脳内出血することによる二次性炎症反応、脳血管攣縮の発症を抗HMGB1抗体で抑制できることを明らかにし、最初の目的を達成することができたものと考える。HMGB1はマクロファージ、単球、好中球、内皮細胞、上皮細胞、樹状細胞、平滑筋細胞等さまざまな細胞で発現し、炎症性メディエーターであることに注目し研究を行なう中で、我々は特異的単クローン抗体を作製し、出血性脳卒中の治療効果及びメカニズムの解明を目的とした。脳実質及び硬膜下出血の動物モデルを用いて出血後の脳組織中並びに血中炎症性因子、血管攣縮関連分子を調べた。脳内出血モデルの場合は出血24時間後に、炎症性サイトカイン(TNF-α,iNOS,IL-1β,IL-6,IL-8R,COX-2,MMP2,MMP9)及び血管収縮受容体(AT1,PAR1,V1,TXA2)、硬膜下出血モデルの場合は出血48時間後に、炎症サイトカイン(IL-6,TNF-α,iNOS)及び血管収縮受容体(PAR1,TXA2,AT1,ETA)のレベルが正常ラットと比較して上昇した。また、脳出血性神経細胞死における酸化ストレス因子におけるHMGB1の役割について組織二重免疫染色で解析した。その結果、脳内出血モデルにて、線条体及び頭頂葉から側頭葉大脳皮質領域で、ニューロンとグリア細胞の核内に局在したHMGB1は核膜部位に集積後、細胞質へ時間依存性に移行することが観察された。さらに抗体の脳内分布をヒト化HMGB1抗体の投与で追跡した際には、大脳皮質領域の血管に沿って血腫周囲領域に神経細胞質内、血腫中心に細胞核内に抗体が発現し、脳血腫の周囲にIL-1β、AQP4、活性化されたミトログリア細胞が高発現された。

硬膜下出血モデルに対して、脳底動脈の血管平滑筋とHMGB1共染した結果、硬膜下出血48時間後に平滑筋細胞核内のHMGB1は細胞外へ放出することを確認された。脳出血後の微小循環障害に関して、出血障害6時間後、3日後に血管透過性をエバンスブルー色素の漏出を指標として評価した。このような神経細胞障害の関連因子に対して抗HMGB1抗体の末梢投与で著明な抑制効果として低酸素ストレス下にある神経細胞の代謝の制御に関与する可能性がわかった。平成29年度末に若干の遅延がみられるが,最終年度までに目標値を十分に達成できる見込みのあるもの我々はHigh mobility group box1(HMGB1)はマクロファージ、単球、好中球、内皮細胞、上皮細胞、樹状細胞、平滑筋細胞等様々な細胞で発現して、炎症性メディエーターであることを着目し、創薬研究してきた。本研究では、特異的抗HMGB1単クローン抗体を作製し、出血性脳卒中の治療効果及びメカニズムの解明を目的とした。前年度に引き続いて、脳実質内及び硬膜下出血における遅発性血管攣縮とHMGB1の関連性を検討した。血管攣縮を起こしている血管壁の平滑筋細胞からHMGB1が細胞外へ放出されることが免疫染色で確認され、そのHMGB1の働きで血管の収縮を誘導する受容体の発現量が上昇することを示唆された。したがって、発症直後、抗HMGB1抗体を投与することによってほぼ100%の血管攣縮が抑制された。抗体の有効治療時間帯の検討で、発症後3時間まで治療が有効であることがわかった。さらに、蛍光物質フルオレセイン(FITC)で標識したデキストランを静脈注射し、共焦点レーザー顕微鏡で脳実質の血管攣縮像を観察した。脳内出血後24時間、出血側と健側の大脳皮質における毛細血管網の画像を比較した。健側に満たした毛細血管網の蛍光染色像に対し、出血側は点状の蛍光染色像しか見えなかった。この結果より、血管に通過可能のFITCで標識したデキストランは、血管攣縮になると通過できなくなって、点状の蛍光染色像が見えた。脳内出血障害の急性期に血管攣縮が亢進していることは明らかになった。抗HMGB1抗体の投与は、血管攣縮と脳内全体で生じる炎症応答を抑えることが分かった。今後の検討要因としては、脳出血による血管攣縮、脳血流量の変化と抗体投与効果を解析するため、レーザードップラー血流測定計で経時的に脳血流を測定する。さらに、血液凝固因子トロンビンにより誘発される神経細胞死の過程におけるHMGB1の役割を解明することを目的としている。前年度の研究で明らかになった出血性脳損傷におけるHMGB1の経時変化の結果を基に、今後の研究ではHMGB1と血液因子や標的細胞の解析を進めて出血性脳損傷におけるHMGB1の役割を明らかにしていく。また、HMGB1の炎症性サイトカインとしての機能に対する抗HMGB1抗体の阻害効果のin vitro評価方法についても濃度設定や測定条件を変更して安定したデータを得るための実験の設定を進める。
サービスチェイニングにおける応用数理計画のアプローチに基づいた資源割当手法の研究

仮想化されたネットワーク機能をデータフローが一定順序で通過することにより、所望のサービスをネットワーク上で提供する、サービスチェイニングと呼ばれる手法が検討されている。本研究では、応用数理計画の一手法である列生成法を適用した、高精度かつ実用的時間で動作するサービスチェインの経路およびネットワーク機能配置の計算モデルを確立する。本計算モデルについて、解の精度および計算時間をシミュレーションにより評価する。また、列生成法の過程で得られる暫定解をサービスチェインの制御に逐次反映することで性能を段階的に改善する手法を検討し、プロトタイプシステムの構築により実ネットワークシステムへの適用性を検証する。
デフィニティブな造血発生における、PEBP2・c-Myb転写因子の相互作用の解析

哺乳類の造血能の発生はマウスの場合、先ず胎齢7.5日に卵黄嚢にてプリミティブな造血細胞が出現し、これは一過性に終息する。次いで11.5日齢に肝に、デフィニテイブな造血細胞が出現して、これが一生にわたる造血を担う。近年、デフィニティブな造血前駆細胞は卵黄嚢よりは遅く、しかし肝よりは早く、AGM(aorta,gonad and mesonephros)領域に発生することがE.Dzierzakらにより示された。一方東大・分生研の宮嶋らは、11.5日齢のマウス胎仔のAGM領域を細胞培養することにより、血球細胞をin vitroで発生・増殖できる系を開発した。本研究ではこの系を用いることにより、培養細胞中のAML1及びPEBP2β/CBFβ蛋白の発現、更にこれら遺伝子の欠損による血球細胞産生への影響につき解析した。AML1、PEBP2β/CBFβ遺伝子は、ヘテロ2量体として機能するPEBP2/CBF転写因子の各サブユニットをコードする。また両遺伝子ともに、マウス胎仔肝におけるデフィニティブな造血能の発生に必須の機能を担うことが知られている。先ず遺伝子変異のないAGM培養下に出現する(血球を含む)大部分の細胞で、AML1、PEBP2β/CBFβ蛋白の陽性染色像が観察された。一方AML1(-/-)やPEBP2β/CBFβ(-/-)のAGM培養系においては、血球細胞は全く出現しなかった。また各遺伝子につき(+/-)であるAGM培養系では、得られるCFU-C活性が野生型に比べ著明に減少していた。以上の観察から次の2点が結論された。即ち、1)近年我々を含めて報告したAML1(-/-)またはPEBP2β/CBFβ(-/-)胎仔肝におけるデフィニティブな造血の欠如は、本来なら肝に先行してAGM領域に局在するはずの、造血前駆細胞の傷害によるものである。2)AGMにおける造血前駆細胞の発生・増殖は、PEBP2/CBF転写因子の両サブユニットの量に依存する。なおc-Myb転写因子の機能については、c-myb(-/-)のAGM培養を現在行っており、検討中である。
微生物のカルボニルレダクタ-ゼ類の基質認識機構の解析と生物活性物質生産への応用

酵素反応の在する高い立体選択性を利用して,Dーパントテン酸あるいはその合成中間原料であるDーパントイルラクトンなどの光学活性アルコ-ル類の新しい生産方式を確立するために,(1)化学的合成法で得られるケトパントテン酸,ケトパントイルラクトン類のDーパントテン酸またはDーパントイルラクトン類への不斉還元,(2)脱水素酵素または酸化酵素によるLー体基質の立体選択的酸化反応を含むラセミ型パントテン酸またはパントイルラクトン類のDーパントテン酸またはDーパントイルラクトン類への変換について検討した。(1)については,グルコ-スを還元のエネルギ-源として<candida>___ー属や<Sporobolomyces>___ー属酵母のあるものが,ケトパントイルラクトンあるいはケトパントテン酸エステル類を,<Agrobacterium>___ー属細菌がケトパント酸をそれぞれ特異的に対応するDー体アルコ-ルへと変換することを認め,培養条件および反応条件の検討を行った結果,光学的に純粋な生成物を80120g/lの収量(変換率90%以上)で得ることができた。また,これらの還元反応に関与する酵素の精製単離を行い,それぞれが基質特異性を異にするNADPH依存性のカルボニルレダクタ-ゼであることを明らかにした。
APPと新規膜タンパク質の複合体形成によるβ-アミロイド生成抑制効果とAD病態

アルツハイマー病の発病原因として、β-アミロイド(Aβ)の生成・分泌・凝集・細胞外蓄積が考えられている(アミロイド仮説)。Aβは、前駆体タンパク質APPから細胞内で生成されるが、その制御機構はよくわかっていない。APPの代謝・生理機能を分子レベルで理解する目的で、APP細胞質ドメイと相互作用するタンパク質X11Lを単離・同定してきたが、今回、X11Lに結合する新規膜タンパク質を単離した。マウス脳組織を分画して、発現を調べたところ、この蛋白質の発現はX11Lの発現と良く一致した。新規膜タンパク質の細胞質ドメインはX11LのPIドメインと相互作用した。X11LはAPPの細胞内代謝を抑制し、β-アミロイドの産生を減少させるが、新規膜タンパク質が共存すると、X11LによるAPP代謝抑制効果が増強された。新規膜タンパク質に対する抗体を作製して、アルツハイマー病患者脳病理標本を染色したところ、β-アミロイド抗体で染色される老人斑周辺に存在する神経腫大突起部にAPPの染色と共に検出された。X11Lはこの部位に存在しなかった。正常な脳組織ではAPPとX11Lおよび新規膜タンパク質は共局在が認められているので、変性しつつある神経細胞では、APPと新規膜タンパク質のX11Lを介した相互作用の不調がβ-アミロイドの生成を含むAPPの代謝に変化を与え、結果的に神経変性を進行させているのではないかと考えられた。ゲノム解析から新規膜タンパク質はα、β、γと少なくとも3種類のアイソフォームが存在することが明らかになった。これら全てのアイソフォームが同じ機能を担っているのか、アルツハイマー患者脳で同様の分布を示すのかは未解明である。APPの代謝調節に関連する新規蛋白質の同定は、新たな創薬ターゲットの開発に貢献するものである。
内部モデルとブール値高階論理・Ω論理

平成27年度の研究では、昨年度の研究実績報告書で述べた、Ω論理を用いて得られる集合論のモデルMの性質について調べた。昨年度の研究報告書では、「今後の研究推進方策」として、上記モデルMの性質について4つの問いを立てた。今年度の研究では、4つの問いについて考えるうえで、以下の予想が成り立つかどうかが重要であることが分かった:予想;ウディン基数が非有界に存在し、実数をパラメータにするΩ予想が任意の順序集合による強制拡大で成り立っているとする。このとき、モデルMは、以下の方法によって得られる:「Vの充分大きなウディン基数たちの極限においてDerived modelと呼ばれるADのモデルNを構成すると、そのNにおけるHODにおいて、κ= (N内のω_1)は可測基数になり、それをwitnessする自然な超フィルターUが存在する。このとき、NにおけるHODのV_κに対して、Uを用いて超冪を取る操作をOrd回繰り返すと、モデルMが得られる。」本研究では、上記予想が成り立つとすると、上記4つの問いについて、以下のa)d)が成り立つことがわかった:a)Mにおいて、弱いcondensation principleが成り立つ。b) M内では、任意の可算でない基数κに対して、◇_κと□_κが成り立つ。c) M内に可測基数は存在しない。d) MとVの間にweak covering propertyは成り立たない。上記予想が成り立つかどうかはわかっておらず、現在はこれを調べている。27年度が最終年度であるため、記入しない。平成26年度は、高階のブール値論理やΩ論理を用いて得られる集合論のモデルについて研究した。集合論のモデルで最も基本的なものであるゲーデルのLの構成では一階述語論理を用いるが、本研究では、一階述語論理の代わりに高階のブール値論理やΩ論理を適用することにより、いくつかの新しい集合論のモデルを構成し、それらのモデルたちの関係と、同モデルたちの基本的な性質について成果を得た。具体的には、ZFCに、適切な巨大基数公理とΩ論理についての仮定を加えた公理系の下で、1)三階以上のブール値高階論理やΩ論理によって得られる集合論のモデルたちが全て等しくなること、2)これらのモデルが強制法で不変であること(つまり、集合全体のクラスVとその任意の強制拡大のどこで構成しても不変であること)、3)これらのモデルに属する実数全体が、現在の記述集合論で分析が可能な実数全体(つまり、“\Delta 2 1 (uB) in a countable ordinal"な実数全体)と一致すること、4)これらのモデルが、現在の記述集合論で分析が可能な(つまり、“\Delta 2 1(uB)な")普遍ベール集合全てについて閉じていること、5)これらのモデルにおいて、一般連続体仮説が成り立つこと、を証明した。本研究の目標はHOD予想の解決であり、そのために、集合論のモデルHODに“近く"、HODより分析しやすい新しい集合論のモデルを構成することが本研究の課題の一つである。今年度の研究では、記述集合論・内部モデル理論の意味でHODに“近く"、HODより分析しやすいモデルが構成できた。このモデルが、どのくらいHODに“近く"、どのくらい分析できるかは、来年度以降の研究課題である。今年度は、ゲーデルのLの構成を高階のブール値論理やΩ論理に適用することで、記述集合論・内部モデル理論の意味でHODに“近く"、HODより分析しやすい集合論のモデルが構成でき、HOD予想の解決への足掛かりとすることができた。今後は、今年度に得られた集合論のモデルMをさらに分析し、モデルMと集合全体のクラスVとの関係をより明らかにしていく。具体的には、1) Mの階層でどのくらいのcondensation propertyが得られるか、2) Mでどのくらいのsquare principleが成り立つか、3) Mにどのくらい強い巨大基数が存在しうるか、4) MとVの間でどのくらいweak covering propertyが成り立つか、ということについて調べる。
プロテオミクスを用いた新しいカルモデュリン標的分子の同定とシグナル伝達機構の解明

CaMKKカスケードはこれまでの研究成果より、CaMKKは多様な細胞内カルシウム依存性反応においてマスターレギュレーターとして機能することが推定されている。すなわち、CaMMKの新規リン酸化基質分子を同定することは、CaMKKを介した新しいカルシウムシグナル伝達経路の解明につながる。本研究においては、リン酸化供与体として生理的なATPではなくGTPを使用することで、新規リン酸化基質の探索に有用なCaMKKの酵素的特性について明らかにした。一方で、細胞内には数多くの内因性タンパク質リン酸化酵素が存在しているため、組織、細胞抽出溶液から標的タンパク質リン酸化酵素の生理的基質を同定することは技術的に困難である。そこで、まず初めにATP以外のヌクレオチドを用いたCaMKKのリン酸化能について検討した。組み換えCaMKKアイソフォームは、CaMKIとAMPKに対するリン酸化反応においてMg-GTPをリン酸基供与体として利用する能力を持つことが明らかとなった。また、Mg-GTPを用いる事で潜在的なCaMKK基質候補分子として、STO-609で阻害されるCa^<2+>/CaM依存的にリン酸化されるのタンパク質を検出することに成功した。CaMKKがリン酸化供与体としてMg-GTPを用い、さらにCaMKK阻害剤STO-609を組み合わせる本手法がCaMKKの標的基質分子の網羅的同定に有用な手段であることが示唆された。Mg-GTPでCaMKIとAMPKのサブユニットは活性化ループにそれぞれ、Thr177とThr172がリン酸化されていることがわかった。この結果は、効率的にin vitroでのThr177でCaMKIの触媒ドメインをリン酸化するリン酸供与体としてのMg-GTPを活用した組換えCaMKK isoformと一致する。CaMKK isoformは、Mg-ATPとAMPKのサブユニットをリン酸化しながら、唯一のCaMKKは、in vitroでのMg-GTPでAMPKをリン酸化することが可能である。今後は、GTPを用いた動態解析を行い、リン酸供与体としてのMg-GTPを利用するCaMKKのユニークな能力は、阻害剤のSTO-609を使用した組み合わせでCaMKKのための新たな下流の標的キナーゼをスクリーニングしたい。カルシウム受容タンパク質であるカルモデュリン(CaM)は多くのCa^<2+>/CaM-依存性酵素の活性化因子として、タンパク質リン酸化酵素群(CaM-キナーゼ)、脱リン酸化酵素(Calcineurin)による翻訳後修飾を介した細胞内情報伝達機構やNO合成酵素(NOS)などの代謝調節酵素の活性化といった多様なカルシウムシグナル伝達を支える中心的な情報変換分子の一つである。本研究では、CaM/標的分子環の相互作用を利用したプロテオミクス解析法を用いることにより、生理的なCaM結合タンパク質の網羅的な同定を行い、Ca^<2+>/CaMを介した新しいCa^<2+>シグナル伝達経路を見出すことを目的としている。申請者は上記の方法を用いてCaMの標的基質分子として36種類の既知のCaM結合タンパク質を同定しており、更に新規Ca^<2+>/CaM結合タンパク質として神経膜タンパク質であるPlastic related Gene 1 (PRG1)が得られた。申請者は、研究結果をBiochemical Journal (IF=5.115)に発表した。(Identification and characterization of PRG-1 as a neuronal calmodulin-binding protein. 2010Biochemical J. 431, 81)当該研究は、PRG1がCa^<2+>/CaM結合タンパク質であること及び、本分子が海馬神経細胞の樹状突起に存在し、興奮性シナプスのシナプス後膜に局在することを確認し、神経伝達における新しいCa^<2+>シグナル伝達経路の可能性を示唆するものであった。Mg-GTPでCaMKKとAMPKのサブユニットは活性化ループにそれぞれ、Thr177とThr172がリン酸化されていることがわかった。この結果は、効率的にin vitroでのThr177でのCaMKIの触媒ドメインをリン酸化するリン酸供与体としてのMg-GTPを活用した組換えCaMKK isoformと一致する。

今後は、GTPを用いた動態解析を行い、リン酸供与体としてのMg-GTPを利用するCaMKKのユニークな能力は、阻害剤のSTO-609を使用した組み合わせでCaMKKのための新たな下流の標的キナーゼをスクリーニングしたい。CaMKKがリン酸化供与体としてMg-GTPを用い、さらにCaMKK阻害剤STO-609を組み合わせる本手法がCaMKKの標的基質分子の網羅的同定に有用な手段であることが示唆された。Mg-GTPでCaMKIとAMPKのサブユニットは活性化ループにそれぞれ、Thr177とThr172がリン酸化されていることがわかった。この結果は、効率的にin vitroでのThr177でCaMKIの触媒ドメインをリン酸化するリン酸供与体としてのMg-GTPを活用した組換えCaMKK isoformと一致する。CaMKK isoformは、Mg-ATPとAMPKのサブユニットをリン酸化しながら、唯一のCaMKKは、in vitroでのMg-GTPでAMPKをリン酸化することが可能である。
臍帯血単球由来の樹状細胞による臍帯血移植後の抗白血病効果(GVL効果)の増強

臍帯血幹細胞移植では移植片対宿主病(GVHD)が軽く、白血病では移植片対白血病効果(GVL効果)が期待できない可能性もある。GVHDの発症にはいくつかの免疫担当細胞が関与している。樹状細胞などの抗原提示細胞はヒト主要組織適合抗原HLA上のアロ抗原ペプチドをT細胞に提示し、このT細胞は宿主を攻撃する。今回は臍帯血単球からサイトカインで誘導した樹状細胞によるT細胞のアロ反応性増強効果について調べ、樹状細胞によりGVHD/GVL効果を増強できるかどうかについて基礎的検討を行った。予備実験より樹状細胞は臍帯血単球から誘導可能であることを確認していたので、まず臍帯血単球の特性について検討した。臍帯血単球は成人血単球に比べて抗原提示能が低く、その機能は未熟であることを報告した(Pediatrics International,2001、印刷中)。次に、樹状細胞によりT細胞を活性化したあと早期にT細胞死が誘導されるとGVL効果を持続させるには都合が悪い。そこで樹状細胞のアロ反応性増強効果後の結果について調べるために、活性化したT細胞がアポトーシスを起こす機構について検討して報告した(Eur.J.Immunol,2000)。更に、臍帯血移植後の免疫学的回復について、ドナーの年令が移植後の免疫学的回復に逆相関し臍帯血移植では早期に免疫学的回復が得られることを報告した(Brit.J.Haematol,2000)。このように臍帯血移植後に早期のT細胞回復が起こることを利用して、早期回復したT細胞のGVL効果が臍帯血樹状細胞によって増強されることが期待される。臍帯血移植の利点の一つは移植片対宿主病(GVHD)が少ないこと、その程度が軽いことである。一方、白血病ではGVHDを発症したほうが白血病の再発が少ないという結果が骨髄移植で報告されており、これを移植片対白血病効果(GVL効果)と称している。臍帯血幹細胞移植ではGVHDが軽く、白血病ではGVL効果が期待できない可能性もある。樹状細胞(Dendritic細胞)などの抗原提示細胞はHLAのアロ抗原ペプチドをT細胞に提示し、このT細胞は宿主を攻撃する。そこで臍帯血CD34陽性細胞あるいは臍帯血単球からサイトカインで誘導した樹状細胞によりGVHD/GVL効果を増強できるかどうかについて検討している。臍帯血CD34陽性細胞よりサイトカインを使用して誘導した樹状細胞は強力な抗原提示能を示し、これらはトロンボポエチン受容体を発現していることを報告した(Brit J Haematol.105:1025-1033,1999)。また臍帯血中には成人の約4倍と単球が豊富にあることを報告し(小児血液学会、1999)、臍帯血単球よりサイトカインで樹状細胞が容易に誘導されることを見いだした(投稿中、1999)。これらの樹状細胞は強力な抗原提示能を示した。

予備実験より樹状細胞は臍帯血単球から誘導可能であることを確認していたので、まず臍帯血単球の特性について検討した。臍帯血単球は成人血単球に比べて抗原提示能が低く、その機能は未熟であることを報告した(Pediatrics International,2001、印刷中)。次に、樹状細胞によりT細胞を活性化したあと早期にT細胞死が誘導されるとGVL効果を持続させるには都合が悪い。そこで樹状細胞のアロ反応性増強効果後の結果について調べるために、活性化したT細胞がアポトーシスを起こす機構について検討して報告した(Eur.J.Immunol,2000)。更に、臍帯血移植後の免疫学的回復について、ドナーの年令が移植後の免疫学的回復に逆相関し臍帯血移植では早期に免疫学的回復が得られることを報告した(Brit.J.Haematol,2000)。このように臍帯血移植後に早期のT細胞同復が起こることを利用して、早期回復したT細胞のGVL効果が臍帯血樹状細胞によって増強されることが期待される。
がん細胞特有のII型ヘキソキナーゼをターゲットとした抗がん剤の開発

我々は、がん細胞ではII型ヘキソキナーゼが著しく発現し、がん細胞の活発な増殖を支えていることを見いだした。本研究では、がん細胞特有のII型ヘキソキナーゼをターゲットとした抗がん剤の開発を志向し、以下の成果を得た。1.上述のような抗がん剤開発のためには、がん細胞におけるII型ヘキソキナーゼの転写促進という事実の普遍性が重要である。そこで、ヒトのII型ヘキソキナーゼのcDNA断片を調製し、ヒトのがん細胞での転写レベルを解析した。その結果、悪性度が高いヒトのがん細胞(HepG2)でも、II型ヘキソキナーゼが顕著に発現していることを見いだした。2.II型ヘキソキナーゼ遺伝子の単離ならびに構造解析を行い、がん細胞での高い転写レベルを担っていると考えられる領域の同定に成功した。現在、この領域の詳細な解析を進めるとともに、II型ヘキソキナーゼの転写を抑制するための戦略を検討している。3.がん細胞では、ヘキソキナーゼはミトコンドリアに結合することによっても活性を亢進しており、その結合部位は外膜のポーリンであるとされている。我々はATPを直接引き渡す窓口として、内膜のADP/ATP透過担体が重要な役割を担うものと考え、その構造と機能に関する研究を行った。その結果、本輸送担体によるヌクレオチド輸送機構を分子レベルで説明することに成功した。現在、ADP/ATP透過担体の阻害が、ヘキソキナーゼ活性に及ぼす影響について解析を行っている。4.実際に抗がん剤の候補となる化合物を見いだすために、がん細胞特有のII型ヘキソキナーゼを阻害する化合物のスクリーニング系の確立を試みた。従来、純粋なII型ヘキソキナーゼの大量調製は困難であったが、大腸菌での発現系を用いた大量発現系の確立に成功した。現在、このようにして調製したII型ヘキソキナーゼを用いて、特異的な阻害剤のスクリーニングを行っている。本研究では、がん細胞に特異的かつ多量に発現していることを明らかにしたII型ヘキソキナーゼを選択的に阻害する活性を有する抗がん剤の開発を志向し、以下の研究を行った.1.II型ヘキソキナーゼの選択的阻害剤のスクリーニング当初、がん細胞からII型ヘキソキナーゼを精製し、その選択的阻害剤のスクリーニングを試みた.しかし、実際のスクリーニングには多量のヘキソキナーゼを必要とするため、ラットのII型ヘキソキナーゼを大腸菌(BL21(DE3)pLysS株)で大量に発現させる系を確立した.発現させたII型ヘキソキナーゼを用いて、引き続きスクリーニングを行っている.2.II型ヘキソキナーゼをコードする遺伝子の構造解析がん細胞において、II型ヘキソキナーゼの転写レベルがどのような分子機構で高まるのかを明らかにするために、申請者らは世界に先駆けてこの遺伝子を単離し、その構造解析を行った.更に、本遺伝子の転写調節機構を担うプロモーター領域の解析も行い(投稿中)、現在、転写を阻害することによってII型ヘキソキナーゼの活性発現を阻害するタイプの抗がん剤のスクリーニングをも行っている.3.ヒト

がん細胞でのヘキソキナーゼの転写レベルの解析従来、ヒトのII型ヘキソキナーゼに関する知見は全く得られてなかったため、申請者らは、まず、その一部の構造決定を行った.得られた知見をもとに、ヒトのがん細胞株でのヘキソキナーゼの転写レベルの解析を行ったところ、悪性度が比較的低いHeLa細胞やA431細胞ではI型のヘキソキナーゼが発現しており、解糖活性が高く、悪性度も高いとされてきたHepG2細胞では、II型ヘキソキナーゼが発現していることを見いだした.申請者らは、がん細胞で観察される高いヘキソキナーゼ活性が、正常細胞ではほとんど発現していないII型と呼ばれるアイソザイムの顕著な転写亢進によって支えられているという事実を見いだした.本研究では、がん細胞特有のII型ヘキソキナーゼをターゲットとした抗がん剤の開発を志向した実験を行い、以下の成果を得た.1.上述のような抗がん剤開発のためには、見いだされたII型ヘキソキナーゼの転写促進という事実が、ヒトにおいても普遍的に成り立つことが非常に重要である.現在まで、ヒトのII型ヘキソキナーゼに関する報告は全くなされていなかったので、まず、そのcDNA断片を調製し、ヒトのがん細胞での転写レベルを解析した.その結果、悪性度が高いヒトのがん細胞(HepG2)でも、II型ヘキソキナーゼが顕著に発現していることを見いだした(Cancer Lett.82(1994)27).2.申請者らは前年度に、世界に先駆けてII型ヘキソキナーゼ遺伝子を単離することに成功し、その構造的特徴を明らかにした(生化学67(1995)137).本年度は、がん細胞において、本アイソザイムが、どのようにして高い転写活性を示すのか明らかにする目的で、プロモーター領域の解析を行った(Biochim.Biophys.Acta印刷中).現在、この領域の詳細な解析を進めるとともに、抗がん剤開発に向け、IIヘキソキナーゼの転写を抑制するための戦略を検討している.がん細胞では、ヘキソキナーゼはミトコンドリアに結合することによっても活性を亢進しており、その結合部位は外膜のポーリンであるとされている.我々はATPを直接引き渡す窓口として、内膜のADP/ATP透過担体が重要な役割を担うものと考え、その構造と機能に関する研究を行った.その結果、本輸送担体のヌクレオチド輸送機構を分子レベルで説明することに成功した(Biochim.Biophys.Acta印刷中、Biochemistry33(1994)9530).現在、ADP/ATP透過担体の阻害が、ヘキソキナーゼ活性に及ぼす影響について解析を行っている.