hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
冷戦終結後におけるインドと米国の政治外交関係

こうした問題について、インド国内政治や経済などの専門家とも協力して調査を行った。本年度は、印米原子力協力協定の交渉過程(2008年締結)に関する追加調査、印米原子力協力協定がもたらした影響、ならびにエネルギー政策をめぐるインド国内の政治過程に関する研究を進めた。第1に、申請者の博士論文のテーマであった印米原子力協力協定をめぐる二国間関係について、従来から引き続いての追加的な調査として、インド・ニューデリーと、同ムンバイにおいて元政府関係者等への聞き取り等を実施した。2016年3月のムンバイでの調査では、2005年7月の両国間の交渉におけるキーパーソンと目されている当時のインド原子力委員会委員長に面会し、交渉において果たした役割に関して既存の研究では明かされていないエピソードを聞き出すことに成功した。第2に、印米原子力協力に向けた交渉に関する上記研究を発展させて、当該原子力協力がもたらした影響を、二国間関係とグローバルな核不拡散レジームの観点の両側面から分析した。両国間の原子力協力それ自体は実現していないが、米国の尽力によってインドが他国から原子力燃料を輸入することを可能にしたことにより、インドの原子力燃料不足を解消していたことを示した。世界的な影響に関しては、核不拡散レジームの原則を損ねた要素を指摘したが、その具体的な悪影響の出現は見られないと分析した。第3に、前年度からの新たなテーマとして、インドのエネルギー政策をめぐる政治についての調査を行った。インド国内政治や経済などの専門家とも協力して調査を行い、自身ではデリー首都圏における状況を担当した。デリー首都圏では2002年ごろに配電会社の民営化などの改革が行われ、その後は配送電ロスや停電の激減といった成果を挙げたが、近年は配電会社の累積赤字が問題化している。その背景に、首都圏政府、独立した規制委員会、民営化された配電会社の3者の間の協調の欠如という構造上の問題があることを明らかにした。インドでの現地調査を精力的に行うことができた。研究テーマにおいても、インドにおけるエネルギー政策をめぐる政治という新たな観点からの考察を進めることができた。また、成果公表においても、日本国際政治学会での研究発表を行った。総じて、計画通りの進展をしていると考えている。27年度が最終年度であるため、記入しない。最終年度となる平成27年度は、インドにおける調査を継続しつつも、成果公表に一層努める。国内の学会誌への論文投稿を当初の目標として、これまでの成果を集成した単著の準備も進める。調査対象国であるインドへの海外調査の実施など、研究において十分な進展が得られた。本年度は当該研究の成果について学会等における公表を行うことができなかったが、これは3年間の研究期間の1年目にあたる本年度に成果公表よりも調査の実施を重視したためである。総じて、計画通りの進展をしているものと評価する。調査・研究の実施にあたって計画の変更は予定していない。
T細胞の抗原認識と活性化制御

本研究においては、T細胞が抗原を認識して活性化され、機能分化や機能発現する際の、抗原ペプチド、抑制性アダプター分子、G蛋白、MAPKやCN系、などによるTCRシグナル伝達の制御を解析し、Th1/Th2分化やアナジー誘導などのT細胞機能調節系を解明した。1)部分アゴニストペプチドによるT細胞応答は、ZAP70/LAT/SLP76などを活性化せずに、PKCm/Ras/B-raf/Erkの活性化に依存した増殖を誘導することが判明した。CLIPペプチドを置換するライブラリーを用いたT細胞エピトープの同定法を開発し、I型糖尿病関連自己抗原を同定した。2)ラフト局在分子CbpがCbp-EBP50-ERM-Actinの会合によって細胞骨格系にアンカーし、ラフトの細胞膜状の可動性を調節するシステムが存在し、免疫シナプス形成をも制御していることを見いだした。Gab2がTCRシグナル系ではフィードバック抑制を担うアダプター分子であり、その抑制機構を明らかにした。細胞表面抑制分子CTLA-4がT細胞分化選択でも抑制機能を有することを示した。3)G蛋白Rap1がインテグリンの主要な活性化因子であることを見つけ、そのGAPであるSPA-1はRap1の制御を通して、免疫シナプス形成・活性化様式の決定に関わることを明らかにした。SPA-1欠損マウスを作製し、免疫応答不全とともに慢性骨髄性白血病を発症することから、SPA-1が癌抑制遺伝子であることを示した。4)Th2への分化に必要なTCRシグナル伝達系を解析し、Lck,Ras/Erk,Calcineurinの強い活性化がTh2分化に必要なことを見いだした。実際にマウス喘息モデルにおいて、Th2のRas/MAPKによる亢進と、SHP-1による抑制を証明した。また、Th2分化におけるGATA3によるクロマチンリモデリングの分子機構を解明し、遺伝子発現制御に関与するポリコーム遺伝子がTh2分化に必須であることを明らかにした。T細胞の抗原認識シグナルの伝達機構とその制御系について解析した。ヒトT細胞クローンを用いることにより、溶連菌由来ペプチドの一残基置換による部分アゴニストが引き起こす反応は、増殖反応を誘導するにも関わらず、ZAP-70やLATの活性化を伴わないことが判明し、部分ペプチドによる未知のT細胞活性化経路の存在を示唆した(西村)。TCRシグナル下流の調節分子として、small G蛋白rap-1とアダプター分子Gab-2を解析した。Rap-1はβ1-integrinのみでなく、β2-integrin,LFA-1の活性化に重要であることが、rap-1GAPであるSPA-1に解析から明らかになり、inside-outのシグナル伝達を主要に担うことが判明した(湊)。サイトカインシグナルではMAPK活性化に働くGab-2が、TCRシグナルにおいては抑制シグナルを伝え、SHP-2をリクルートしてCD3ζ脱リン酸化を誘導することが判明した(斉藤)。また、ナイーブT細胞からTh2への分化には、TCRシグナル伝達系としてカルシニューリンの活性化が重要であることが判明した(中山)。一方、TCRシグナルを制御する他のレセプター、co-stimulationシグナル、およびサイトカインシグナルとの相互制御の解析も進んだ。抑制レセプターCTLA-4の細胞内局在と発現制御を調べ、CD4^+T細胞ではCTLA-4はリソソームに蓄積しており、TCR刺激に伴ってリソソームが分泌されることによって細胞表面CTLA-4の昂進が起こる、ユニークな制御系を発見した(斉藤)。Th2分化にはIL-4レセプターのシグナル伝達に重要なJak3の転写誘導とSTAT5のIL-4レセプターへの会合が重要であり、TCRシグナルによるサイトカインシグナルの調節というクロストークが明らかになった(中山)。本研究班は、今年度T細胞の抗原認識と活性化の制御機構に関して、(1)免疫シナプスの形成とラフト凝集の制御、(2)アンタゴニストペプチドによる活性化シグナルの相違、(3)Th2分化へのTCRシグナルによる制御、(4)Rap-1によるシナプス形成と活性化の制御、について解析した。(1)Raftに局在し、Csk結合分子Cbpとの会合分子を解析し、EBP50をクローニングした。Cbp-EBP50の結合は細胞骨格と会合することによって、細胞表面のraftの動きを抑制する。T細胞活性化によってこの会合が離れ、raftが凝集し易くなり、活性化を誘導することが明らかになった。(2)ヒトT細胞を用いて、アゴニストと部分アゴニストとが同様にIFNγ産生や増殖反応を誘導するにも拘わらず、ZAP70/LAT/SLP-76のリン酸化は抑えられ、MEK/ERKの活性化が抑制されており、PKCやSrcなどに対する種々の阻害剤への感受性が非常に高い、等ユニークなシグナル系を活性化している可能性を示した。(3)ナイーブCD4T細胞がTh1/Th2細胞に分化する際、Th2サイトカインIL-4の遺伝子部位にヒストンアセチル化が誘導されることが判明した。その分子機構についてTCR下流のシグナル伝達経路を中心に解析し、ERK、MAPK系の活性化によりGATA3蛋白の安定性が上昇し、IL-4/IL-13の遺伝子部位に十分なヒストンアセチル化が起こることが分かった。(4)Rap-1がインテグリンの主たる活性化因子であり、インテグリン依存性のT細胞と抗原提示細胞との免疫シナプス形成に必須であるのみならず、その後のT細胞の活性化様式(活性化、細胞死、あるいは免疫アナジー)を支配する重要な役割を果たすことを明らかにした。さらにRap-1制御因子SPA

-1の遺伝子破壊マウスの解析から、Rap-1の異常な活性化により免疫アナージーと免疫記憶応答の喪失にいたることを個体レベルで証明した。本研究においては、T細胞が抗原を認識して活性化され、機能分化や機能発現する際の、抗原ペプチド、抑制性アダプター分子、G蛋白、MAPKやCN系、などによるTCRシグナル伝達の制御を解析し、Th1/Th2分化やアナジー誘導などのT細胞機能調節系を解明した。1)部分アゴニストペプチドによるT細胞応答は、ZAP70/LAT/SLP76などを活性化せずに、PKCm/Ras/B-raf/Erkの活性化に依存した増殖を誘導することが判明した。CLIPペプチドを置換するライブラリーを用いたT細胞エピトープの同定法を開発し、I型糖尿病関連自己抗原を同定した。2)ラフト局在分子CbpがCbp-EBP50-ERM-Actinの会合によって細胞骨格系にアンカーし、ラフトの細胞膜状の可動性を調節するシステムが存在し、免疫シナプス形成をも制御していることを見いだした。Gab2がTCRシグナル系ではフィードバック抑制を担うアダプター分子であり、その抑制機構を明らかにした。細胞表面抑制分子CTLA-4がT細胞分化選択でも抑制機能を有することを示した。3)G蛋白Rap1がインテグリンの主要な活性化因子であることを見つけ、そのGAPであるSPA-1はRap1の制御を通して、免疫シナプス形成・活性化様式の決定に関わることを明らかにした。SPA-1欠損マウスを作製し、免疫応答不全とともに慢性骨髄性白血病を発症することから、SPA-1が癌抑制遺伝子であることを示した。4)Th2への分化に必要なTCRシグナル伝達系を解析し、Lck,Ras/Erk,Calcineurinの強い活性化がTh2分化に必要なことを見いだした。実際にマウス喘息モデルにおいて、Th2のRas/MAPKによる亢進と、SHP-1による抑制を証明した。また、Th2分化におけるGATA3によるクロマチンリモデリングの分子機構を解明し、遺伝子発現制御に関与するポリコーム遺伝子がTh2分化に必須であることを明らかにした。
マウスにおけるアンジオテンシンIIタイプla受容体が骨格筋肥大に与える影響

レニン-アンジオテンシン系は血圧調節に重要な経路であるが、骨格筋に与える影響については報告が少ない.本研究は、アンジオテンシンIIタイプla (ATla)受容体欠損マウスを用いて, ATla受容体が骨格筋肥大に与える影響を明らかにすることを目的に検討した.足底筋に対する表現型解析により、ATla受容体欠損マウスの筋重量、筋線維横断面積、および筋線維数は野生型マウスよりも有意に大きかった.また、筋線維タイプの解析では、ATla受容体欠損マウスの足底筋においてType IIx/b線維の割合が野生型よりも有意に高く、一方でType IIa線維の割合は低かった.次に、足底筋に過負荷を与える筋肥大モデルを作成するため、共働筋である腓腹筋とヒラメ筋の部分切除手術を行い、14日後に足底筋の解析を行った.その結果、野生型の足底筋よりもATla受容体欠損マウスの筋の方が、筋重量や筋線維横断面積の増加が大きかった.そこで、筋肥大を起こした足底筋の遺伝子発現を解析したところ、MyoDやMyogeninのmRNA発現はATla受容体欠損マウスの方が野生型よりも高かった.しかしながら、Myf5のmRNA発現量において差は認められなかった。以上の結果から、ATla受容体は骨格筋量を制御している要因の一つであると考えられた。今後は、高齢者が自立した生活を保つための加齢による筋量低下の抑制などに、レニン-アンジオテンシン系の制御が有効であるかどうかを検討する必要があるだろう.レニン-アンジオテンシン系は血圧調節に重要な経路であるが、骨格筋に与える影響については報告が少ない.本研究は、アンジオテンシンIIタイプla (ATla)受容体欠損マウスを用いて, ATla受容体が骨格筋肥大に与える影響を明らかにすることを目的に検討した.足底筋に対する表現型解析により、ATla受容体欠損マウスの筋重量、筋線維横断面積、および筋線維数は野生型マウスよりも有意に大きかった.また、筋線維タイプの解析では、ATla受容体欠損マウスの足底筋においてType IIx/b線維の割合が野生型よりも有意に高く、一方でType IIa線維の割合は低かった.次に、足底筋に過負荷を与える筋肥大モデルを作成するため、共働筋である腓腹筋とヒラメ筋の部分切除手術を行い、14日後に足底筋の解析を行った.その結果、野生型の足底筋よりもATla受容体欠損マウスの筋の方が、筋重量や筋線維横断面積の増加が大きかった.そこで、筋肥大を起こした足底筋の遺伝子発現を解析したところ、MyoDやMyogeninのmRNA発現はATla受容体欠損マウスの方が野生型よりも高かった.しかしながら、Myf5のmRNA発現量において差は認められなかった。今後は、高齢者が自立した生活を保つための加齢による筋量低下の抑制などに、レニン-アンジオテンシン系の制御が有効であるかどうかを検討する必要があるだろう.
神経幹細胞の増殖・分化因子の同定とRNA干渉による神経細胞への分化誘導

神経幹細胞は自己増殖能と多分化能という性質を併せ持っているが、その制御機構についてはいまだに不明な点が多い。本研究はSELDI-TOF mass spectrometry (Protein Chip)を用いて神経幹細胞の増殖および分化を制御する因子を同定することを目的としている。まず、神経幹細胞の増殖に関与する分子機序の解明を行うために、マウス胎仔脳(E14)よりneurosphere法により、神経幹細胞を分離培養した。自己増殖脳の確認のため、βIII tublinやanti-04、GFAPなどの出現を免疫細胞化学染色で確認した。培養上清中に含まれる微量蛋白質をSELDI-TOF mass spectrometry(Protein Chip)を用いて検出した。NIH3T3細胞等のマウス体細胞上清中に認められない蛋白質ピークを同定しpeptide mass fingerprinting(PMF)法で同定を行った。この方法により、神経幹細胞の培養上清中にはPleiotrophinが存在すること見出し、この蛋白質が神経幹細胞の増殖に関与していることが示唆された。この実験結果より、我々はRNA interference(RNAi)法を用いて、この遺伝子をノックダウンし、神経幹細胞に及ぼす影響を解析したところ、神経幹細胞の分化が誘導されることを見出し、現在も解析中である。また生体哺乳類で神経幹細胞が局在している海馬顆粒細胞層や前脳の脳室下帯の脳組織から、蛋白質を分子量や等電点などで分離し、神経幹細胞の増殖を指標に増殖因子を推定し、同様のプロテオミクス解析を用いて同定を行っている。
炎症性腸疾患におけるヘムオキシゲナーゼの抗炎症作用に関する検討

炎症性腸疾患は再発を繰り返す原因不明の疾患で、その治療法は確立されていない。一方、ヘムオキシゲナーゼという酵素が抗炎症作用を有する事が知られてきたが、その詳細も分かっていなかった。本研究ではヘムオキシゲナーゼをマクロファージで発現させることにより、マウス実験腸炎の発症を抑制できた。また培養細胞を用いた実験から、抗炎症作用がSTAT1シグナルの抑制を介したIL-12の分泌減少によることが分かった。本研究ではDSSを用いたマウスの実験腸炎を再現することから始まった。条件検討の結果、4%のDSSを7日間投与して評価する事とした。ヘムオキシゲナーゼ1(以下HO-1)の腸管での発現誘導はヘミンという薬剤を用いて行うことができた。HO-1を腸管にて過剰発現させたマウスはDSSにより誘発される腸炎に抵抗性を示し、HO-1の抗炎症作用が示唆された。また腸管内ではインターフェロンγが低下しており、Th1型のリンパ球による炎症が抑制された可能性が考えられた。免疫染色からはHO-1がマクロファージで発現していることが確認されたので、機能解析にはマクロファージ系の培養細胞を用いる事にした。HO-1を過剰発現した培養細胞の機能を解明するために、発現アレイによる網羅的解析をしたところ、やはりインターフェロンのシグナルやその下流の転写因子であるSTAT1が抑制されていることが示唆された。マクロファージからはリンパ球をTh1型へ分化誘導するサイトカインであるIL-12が分泌されているが、その分泌にはインターフェロンγが重要である事やHO-1が分泌を抑制することも分かった。HO-1を恒常的に過剰発現する細胞株を新たに樹立したところ、STAT1の転写やリン酸化が抑制されていたことが分かった。現在はSTAT1欠損マウスを用いて、この抗炎症機構を検証中である。前年度の研究より、HO-1を誘導したマクロファージではIL-12p40の分泌が低下しており、この際に転写因子であるSTAT1のシグナルが抑制されている事が分かった。そこで前年度に樹立したHO-1発現RAW264.7細胞でリアルタイムPCRを行ったところ、IL-12p40の転写量は減少しておらず増加傾向であった。さらにIL-12p40の転写因子と報告されているIRF-8も同様に増加傾向であった。この結果より、STAT1シグナルはIL-12p40の転写ではなく、その後の分泌を制御している可能性が考えられた。また、本年度はSTAT1欠損マウスを用いてIL-12の分泌やDSS実験腸炎の重症度を検討した。STAT1欠損マウスにチオグリコレート培地の腹腔内注射を行い、活性化マクロファージを集めた。この活性化腹腔マクロファージにLPSとIFN-γの刺激を加えてIL-12分泌量をELISAで測定すると、コントロールで平均460pg/mlであったがSTAT1欠損マウスでは平均3pg/mlまで著しく減少していた。次にマウスにDSS腸炎を誘発したところ、腸炎重症度の指標となる体重減少はSTAT1欠損マウスで有意に改善していた。また大腸組織を用いたリアルタイムPCRではSTAT1欠損マウスでIFN-γの転写量が有意に減少しており、IL-12によって誘導されるはずのTh1型腸炎が軽症化している事が確認できた。さらにH&E染色による病理学的検討でも軽症化している事が確認できた。以上より、1)HO-1がIFN-γ/STAT1シグナル抑制を介してIL-12分泌を減少させること、2)STAT1によるIL-12分泌制御は機序不明ながらTh1型腸炎の発症に大きく関与していること、が合かった。今後は炎症性腸疾患への臨床応用が期待される。
自由大気圏を長距離移動するバイオエアロゾルが遺伝子の水平伝播に及ぼす影響

本研究では黄砂発生源地の一つであるタクラマカン砂漠の東端にある敦煌市と石川県上空において、エアロゾル(大気浮遊物質)を採集後、DNA抽出し、DNA濃度から微生物濃度を明らかにした。また、rRNA遺伝子や組み換え遺伝子の配列解析により微生物の多様性や同定を行なった。その結果、大気中のDNA濃度は黄砂飛来時には高くなること、地上付近になるほどDNA濃度は高くなること、生物の多様性は上空になるほど低くなる傾向が見出された。大気上空は低温、乾燥のほか強い紫外線に曝される環境であるが、近年、上空数kmの高度を中国から日本へ飛来してくる黄砂粒子にも細菌やDNAが存在することが明らかとなってきた。また、細菌ゲノムDNAには溶原ファージ(ウイルス)が共生しているものやトランスポゾンなど可動性DNA因子を含むものが多い。これら可動性DNA因子は、紫外線により活性化され、種を超えた生物間の遺伝子の移動(遺伝子の水平伝播)を引き起こし、親から子への垂直方向の遺伝のみに比べて生物の多様性(進化)に影響を与えるといわれている。そこで本研究では、自由大気圏を長距離移動するエアロゾルを中国の敦煌市(タクラマカン砂漠の東端に位置する)上空と日本上空で採集し、rDNA配列による微生物種の同定と、溶原ファージのDNA組換え遺伝子(integrase)やトランスポゾンの組換え遺伝子(transposase)配列により遺伝子の水平伝播における大気バイオエアロゾルの影響を明らかにすることを目的としている。本年度は中国敦煌市と石川県西岸沖の上空にて大気エアロゾルを採集し、培養過程を経ず直接エアロゾルからDNAを抽出し、rDNA解析による生物種の同定を進めた。このDNA抽出では、今年度購入のFastPrep24の使用により菌類のビーズ破砕処理を行うことができ従来よりも効率よく抽出することが可能となった。また、可動性DNA因子の組換え遺伝子integrase解析のため、増幅用プライマーの検討を行った。また春の黄砂飛来時に呼吸器疾患やアレルギーなどの患者が増加するといわれるが、大気中の微生物種やその濃度、気象条件によるそれらの変動など、まだまだ不明な点が多い。そこで本研究では、自由大気圏を長距離移動するエアロゾルを中国の敦煌市(タクラマカン砂漠の東端に位置する)と日本上空で採集し、rRNA遺伝子配列による微生物種の同定を同定と遺伝子の水平伝播の影響を評価するため、DNA組換え遺伝子配列の解析を行うことを目的としている。本年度は中国敦煌市の砂漠地帯でのエアロゾルを採集し、培養過程を経ず直接DNAを抽出し、rRNA遺伝子配列解析により微生物種の同定を進めた。その結果、地上付近(数十cm)で採取したエアロゾルと気球(上空800 m)で採集したエアロゾルとでは微生物の種が異なること、地上付近に比べ上空の方は多様性も低くなることが示唆された。また日本上空では中国から飛来するエアロゾルをとらえるため、中国で砂塵嵐の起きた後(約2,3日後)、日本への黄砂飛来情報、PM2.5濃度の情報を確認し、ヘリコプターにより石川県西岸沖で上空13kmのエアロゾル採集を行った。日本側のエアロゾル試料も培養過程を経ず直接DNAを抽出し、rRNA遺伝子配列解析により微生物種の同定を進めた。大気上空は低温、乾燥のほか強い紫外線に曝される環境であるが、近年、上空数kmの高度を中国から日本へ飛来してくる黄砂粒子にも細菌やDNAが存在することが明らかとなってきている。また春の黄砂飛来時に呼吸器疾患やアレルギーなどの患者が増加するといわれているが、大気の微生物濃度や微生物種、気象条件によるそれらの変動など、まだまだ不明な点が多い。そこで本研究では中国の敦煌市(タクラマカン砂漠の東端に位置する)と日本上空で自由大気圏を長距離移動するエアロゾル(気体中に浮遊する微小物質)を採集し、エアロゾルに含まれるDNAを抽出し、DNA濃度から微生物濃度を明らかにすること、またrRNA遺伝子配列による微生物種の同定と遺伝子の水平伝播の影響を評価するためDNA組み換え遺伝子の解析を行なうことを目的としている。中国敦煌市では砂漠地帯でエアロゾルを採集し、培養過程を経ず直接DNA抽出を行い、rRNA遺伝子配列により微生物種の同定や組み換え遺伝子の配列解析を進めた。また、日本上空では中国から飛来するエアロゾルをとらえるため、中国でダストストームの起きた後(約2,3日後)、日本への黄砂飛来情報を確認し、ヘリコプターにより石川県西沿岸沖の上空13kmのエアロゾル採集を行なった。日本側で採集したエアロゾルもDNA抽出し、rRNA遺伝子配列解析により微生物種の同定や組み換え遺伝子配列の解析を進めた。その結果、黄砂時にはDNA濃度が高くなること、地上付近で採集したエアロゾルとこれまで気球(上空800m)で採集したエアロゾルでは含まれる微生物種が異なること、地上付近に比べ上空の方は微生物種の多様性は低いことなどが示唆された。

大気エアロゾル発生源の中国および沈着地域の日本、石川県西岸沖でのエアロゾルを採集することができ、その後、DNAを抽出・濃度測定の結果から、各エアロゾル試料に含まれる微生物濃度を推定できた。またrDNA遺伝子解析を進めており、中国試料では地上付近よりも上空の方が微生物の多様性が低くなることがわかってきた。大気のエアロゾル採集に係留気球を使用しているが強風など天候によっては実施不可能となるため、中国では砂漠周辺の岩山上でエアロゾル採集することも検討する26年度が最終年度であるため、記入しない。生物情報工学3月に中国からの砂塵嵐発生後(約2ー3日後)、石川県西岸沖での上空エアロゾルをヘリコプターを用いて採集予定であったが、砂塵発生量が少ない、あるいは砂塵発生後、降雨により日本到達前にエアロゾルが沈降するなどの気象条件により、予定どおり実施できなかったため。26年度が最終年度であるため、記入しない。大気エアロゾル発生源の中国および沈着地域の日本、石川県西岸沖でのエアロゾルを採集し、DNAを効率よく抽出できた。rDNA遺伝子解析を進めており、interrase遺伝子解析のための増幅プライマーの検討も行った。4, 5月も中国では砂塵が発生し偏西風で日本へのエアロゾル到達が見込まれるため、残額は翌年度のヘリコプターでの試料採集の飛行料として使用予定である。物品の納入価が下がったため残額は翌年度の研究費と合わせて消耗品費として使用予定
軟骨細胞におけるbHLH型転写因子Handの機能解析

bHLH型転写因子Hand1およびHand2は、骨格系の中では下顎となる第一鰓弓のみに発現しており、鰓弓での発現を制御するエンハンサーを欠損させたHand2^<BA/BA>マウスでは、メッケル軟骨の欠損を認める。しかし、Hand転写因子の軟骨発生における標的遺伝子、機能は不明である。本研究の目的は、軟骨細胞での(1)Hand転写因子と他のシグナル伝達系のクロストークの同定および機能解析、(2)Hand転写因子の標的遺伝子の探索、を通じて下顎における軟骨発生の機構および軟骨細胞分化メカニズムを解明することである。軟骨細胞におけるHand転写因子と他のシグナル伝達系とのクロストークを同定するために、酵母ツーハイブリッド法にて、Hand2およびTwist1をbaitとしてヒト軟骨細胞のcDNAライブラリーから陽性クローンの遺伝子を同定した。Hand2に対して特異的に相互作用する分子を抽出するために、Hand2と相同性の高いbHLH型転写因子Twist1をコントロールとし、以下の分子が同定された。Twist1と相互作用する分子:(1)組織全般に発現するbHLH型転写因子であるE2-2、(2)コアクチベーターLIMタンパク質。Hand2と相互作用する分子:(1)組織全般に発現するbHLH型転写因子であるE2-2、HEB、E12、(2)zinc-fingerモチーフを有する新規の転写因子、(3)ホメオドメイン結合領域を持つキナーゼ、(4)SUMOリガーゼ、ユビキチン結合酵素、等。現在、興味ある全ての分子について全長のクローニングを終え、機能解析を行っている。
古期・中期インド・アーリア語統語法(syntax)の研究史・書誌調査

サンスクリット語をはぢめとする印度アーリア語の構文論(シンタックス)の研究は、印度學の中でどちらかといへば従来なほざりにされてきた分野である。これは、欧米の印度學者が、西洋古典語に類似ししかも構文の上ではやや簡単なサンスクリット語のシンタックスの精密かつ網羅的研究を必ずしも重要視しなかったためである。とはいへ、十九世紀から現在に至るまで、印度アーリア語シンタックスの個々に問題について、多くの學者がさまざまの研究書や論攻を著してゐる。しかし、全般的なサンスクリット語シンタックスの解説書は十九世紀末にJ.S.SpeijerがSanskrit Syntax(Leiden 1886)、Vedisehe und Sawkrit Syutax(Strasskurg 1896)の二書を世に問うて後は、これといったものが現れてゐない。個別的問題について秀れた研究がなされてゐることを別とすれば、印度語シンタックス研究は比較的低調であったといってよいであらう。しかし、近年、新しい言語理論を踏まへ、あるひは電算機を駆使してなされたとおぼしき従来にない方法による印度語シンタックス研究書がいろいろと著され、この分野の研究に新気運が生れつつあるかのごとくである。本年度の調査では、とりあへず今述べたやうな研究史的概報を把握することができた。同時にシンタックス研究文獻目録作製のため、主要印度學専門誌から闘傍する論文を吟味し、必要事項カードに記入してゆく作業を進めていったが、これは豫定より遅れ、引く続き来年度に継続されねばならなぬ見込である。
体温低下の発症メカニズムと芫齢者低体温の改善策

高齢者に見られる低体温は、施設入所後約1ヶ月間のケアーで回復するが、一つの要因としては、摂取エネルギー量および栄養のバランスの改善が考え得る。しかし、他の低体温発症要因としては、肺機能の低下による血液中酸素濃度の低下、脈拍増加による代償機能の活性化等を想定した。従って、摂取エネルギー量、体温、血中酸素飽和度、脈拍および肺機能測定を実施した。結果は、血中酸素飽和度が高い群(96%以上:HG)で酸素飽和度と脈拍との間に相関を認めず、酸素飽和度が低い群(95%以下:LG)では、両者の間に有意な負の相関を認めた。LGでは、血中酸素飽和度と体温の間に有意な正の相関を認め、HGでは認めない。また、心拍と体温の関係は、HGで有意な正の相関を認め、LGで認めない。これらは、スポット測定結果であり、個人の経過観察における生理的変化を観察すると、体温、摂取カロリー共に高い者では、両者の間に有意な関係を認めない。また、血中酸素飽和度96%以上である場合は、脈拍との間に有意な正の相関(P<0.05)若しくは両者の関係を認めない。即ち、前者は、生活活動状態の高いことによる結果と考える。しかし、血中酸素飽和度95%以下の場合は、スポット測定結果と同様に、酸素飽和度と脈拍の間には、負の有意な相関を認めた。以上の結果から、高齢者の低体温には、摂取エネルギー、血液中酸素飽和度、脈拍などが相互に影響し、生体防衛反応としての代償機能による恒常性を確認した。今後は、低体温者への、呼吸機能訓練、運動等による機能向上が体温に及ぼす影響を検討し、高齢者のADL向上をはかる施策を検討する。高齢者に見られる低体温は、施設入所後約1ヶ月間で回復する事を明らかにした。その原因の一つとして、食事による摂取エネルギー量および栄養のバランスの改善が考え得る。更に、就眠時間が長くADL低下の高齢者は、運動機能殊に肺機能の低下による低酸素を原因とする低体温を想定した。従って、高齢者の体温、血中酸素飽和度、脈拍および肺機能測定を実施した。現在の結果は、以下の通りである。高齢者の血中酸素飽和度と脈拍との関係は、飽和度が高い者で両者の間に相関を認めず、酸素飽和度が低くなると(95%以下)、両者の間には有意な負の相関を認めた。即ち、酸素飽和度が低くなると脈拍は高くなる。このことは、生体防衛反応としての代償機能が働き、恒常維持を図った結果であると考える。血中酸素飽和度を95%以下(Low group:LG)と96%以上(High group:HG)の2群に分け、両者を比較・検討すると、LGでは、血中酸素飽和度と体温の間に有意な正の相関を認め、HGでは認めない。これらの関係は、スポット測定結果であり、長期間の酸素飽和度の低下、および代償機能による生理的条件維持が出来なくなった場合の体温への影響は、未知である。従って、体温維持における代償機能の有効範囲と限界値を知る上で長期間の連続測定結果を必要とし、来年度に向けた研究の遂行をはかりたい。高齢者の低体温誘発要因を検討するため、設定した1年間内の新規施設入所者を対象に、入所時からのエネルギー摂取量、体温、血中酸素飽和度、脈拍および肺機能を指標として、経時的変化を観察した。協力を得た5名(平均年齢83.2歳、80-86歳)は、全員が補助具歩行または車椅子移動が出来る者であり、寝たきり者は含まれていない。

エネルギー摂取と体温の関係は、1名のみ有意な負の相関(r=-0.399p<0.05)を認めたが、入所時から約1ヶ月半の低い体温(36.0°C以下)の持続と入所後の適正な摂取カロリーによる関係と考える。他は、統計的有意な関係を認めない。また、対象者の測定期間中の平均エネルギー摂取量は最も低い者で23.4Kca/kg、最も多い者で39.1Kca/Kgであり、何れも摂取カロリーは十分であると考える。脈拍と血液中酸素飽和度の関係は、測定期間中の酸素飽和度が低酸素状態(95%以下)の占める割合が30%以上ある入所者の場合、有意な負の相関を示し、酸素飽和度96%以上が90%以上を占める者では、有意な正の相関若しくは、両者の間に相関を認めない。この結果は、多人数の横断的測定結果と同様であった。即ち、血液中酸素飽和度が低い場合は、脈拍を増加させることにより、酸素不足を補う代償機能の有効的な防衛反応であり、酸素飽和度と脈拍の間に有意な正の相関を認める者は、有酸素運動がなされた生活活動度の高い反映と考える。
口腔粘膜悪性境界病変の診断へのNBIの応用と上皮内血管配置の病理組織学的裏付け

口腔粘膜異型境界病変(異型上皮、上皮内癌)の上皮内に配置する異常血管(上皮内血管)を免疫組織学的に明らかにし、病変レベルごとに比較検討したところ、上皮内癌で有意に多く認められた。また、血管を評価することでその有用な診断を行うことができるNBIを口腔癌の診断、切除範囲の決定に応用し、切除標本の病理組織学的所見と対比させることで、口腔領域の診断においても有用な手法であることが判明した。狭帯域フィルター内視鏡(NBI)を口腔領域に導入し、上皮層内に取り込まれ孤立した様相の異常微小血管(上皮内血管)を中心に口腔粘膜悪性境界病変の客観的な早期診断、とりわけ上皮内癌、初期浸潤癌の早期診断を実現させる目的で、研究を行った。検討した病理組織標本は、正常粘膜15例、中等度異型上皮33例、上皮内癌36例、扁平上皮癌12例。血管内皮マーカーのCD31および、基底膜マーカーのIV型コラゲンの免疫組織化学を行い、上皮内血管の数量的解析および口腔粘膜形態(上皮釘脚)の解析を行った。上皮内血管の計測方法は、各病変ごとにすべての上皮内血管数をカウントし幅1mmあたりの血管数を算出した。結果は正常上皮、異型上皮が約2個/mmであったのに対し、上皮内癌は5.5個/mmで有意差を持って、上皮内血管が多いことが示された。また、上皮内血管の位置に関しては、粘膜表面から血管までの距離は、正常上皮で最大、異型上皮で最小であり、各病変間に有意差を認めた。上皮釘脚の長さは異型上皮よりも上皮内癌で有意に長いことから、上皮内血管は上皮内癌細胞の下方増殖に伴い、本来粘膜固有層に位置していた血管が、巻き込まれたため、上皮内に孤立しているように見えるものと考えられた。さらにこの現象は、釘脚周長が異型上皮より、上皮内癌で有意に長いこという結果から考えると、上皮内癌では、より複雑な突起形状を有すると考察できることからも見解が一致する。また、上皮内血管の存在する釘脚では表層から血管までの距離(A)、上皮釘脚の長さ(B)に関して、A/Bは上皮内癌で最小であった。したがって、上皮の長さを基準にして考えた時、上皮内癌で最も表層近くまで血管が侵入している印象があつた。扁平上皮癌では、極表層近くにも、血管は配置し、その数も他の病変と比較し圧倒的に多かった。以上の結果から、NBIがとらえる悪性化に伴って見出される、血管は上皮内血管である可能性が極めて高いと考えられた。昨年度の結果から、口腔粘膜の上皮内癌において、その前段階の病変である異型上皮よりも、上皮層内に取り込まれる孤立した以上微血管(上皮内血管)が有意差をもって多いことが判明した。この病理組織学的所見を、NBI (VISERA OLYMPUS ENF TYPE VQ, OTV-S7, CLV-S40)を用いた、生体血管観察との所見との対比をおこなった。正常口腔粘膜7名についてまず検査をおこなった。部位は、舌(舌側縁、舌背、舌下面)口底、頬粘膜、軟口蓋、硬口蓋、付着歯肉とした。NBIにより、粘膜に横走する微小血管が緑色に明瞭に描出され、さらには近接撮影または拡大撮影では、粘膜に垂直に走行し、上皮釘脚間でループを形成する微小血管の緑色ドット状の描出が確認された。また、正常粘膜での、角化の強い部位(視覚的には、通常よりも白色を呈する。病理学的には粘膜上皮の肥厚と錯角化の亢進)と考えられる、咬合線上の頬粘膜、付着歯肉および舌背では観察困難であった。口腔扁平上皮癌患者(舌:3名、頬粘膜:1名)についてNBIによる撮影を施行した。いずれも、正常粘膜では確認されなかった、褐色斑(Brownish area)が確認され、規則的な緑色ドットは確認できなかった。これは、病変内で白色の強い部位では確認困難であったことから、やはり、癌部においても上皮が厚く血管が表層に位置していない状態ではNBIの効果は薄いと考えられた。また、浸潤癌周囲に広がる悪性境界病変では、緑色ドットや、褐色に描出される血管の拡大や不規則な走行といった所見が認められた。これは、免疫組織化学で確認される上皮内血管と、浸潤癌周囲の新生血管と考えられた。
モーフィング技法による顔の感性印象の実験計量心理学的検討と感性福祉への応用

研究1では,モーフィング動画像を用いて,顔の印象評定に与える動きの影響を実験的に検討した.まず表情表出過程に着目し,笑顔の提示方法(動画・静止画),提示時間(1033ms・233ms)、笑顔強度(90%・120%)を組み合わせて顔刺激を作成し,印象評定を行った.その結果,動画提示でのみ,操作した笑顔強度の効果が笑顔の美感印象評価に反映されることが示された。本成果は,Tohoku Pschologica Folia誌に論文として掲載が決定している.次に表情戻り過程に着目し,笑顔と怒り顔の提示方法(動画・切替),変化のタイプ(笑顔→中立・中立のみ・怒り→中立)の組み合わせで顔刺激を作成し,中立顔の印象評定を行った.その結果,動画提示でのみ,中立顔の印象は,笑顔から変化した場合により怖い印象へ,怒り顔から変化した場合により優しい印象へとシフトした.本成果は,第三回日本顔学会において発表された.以上から,笑顔などの特定の時空間的な物理的な操作が,顔の印象評価にポジティブな影響をもたらすことが示された.また,研究2では,顔に障害(口唇裂・口蓋裂)を抱える方たちの笑顔の印象特性を調べる心理実験を行った.自発的に表出された笑顔と中立顔を用いて顔の印象評定を行った結果,笑顔表出場面において顔の印象がよりポジティブに評価され,笑顔が印象に及ぼす効果の頑健性が示された.顔の障害を目立たなくさせようとする努力が,表情抑制につながる可能性が指摘されているが,本研究結果から,笑顔などの表情表出を積極的に行うことによってポジティブな印象が創出される可能性が実験的に示された.研究1,2の成果を踏まえて,表情表出速度や表情強度を操作した動画像を用いて,観察者にポジティブな印象を与える最適な表情表出速度や最適表情表出強度などを,自覚的に学習させる表情表出トレーニング方法などの感性福祉的応用が考えられた.笑顔は社会的なコミュニケーション場面で最も頻繁に用いられ、対人関係を円滑に進める上で重要な役割を果たしている。一般に、笑顔は、真顔時の印象と比べてその表出者の印象をよりポジティブにすると報告されている。本研究では、モーフィング技法を用いて刺激となる顔の笑顔強度を連続量的に操作し、物理的変形量(画像的笑顔強度)に対する心理量(知覚的笑顔強度や魅力など観察者の受ける印象)を計測して、それらの関数関係を導出することを目的とし、笑顔強度評定(実験A)、品等法を用いた魅力評価(実験B)、ならびにSD法(Semantic Differential method)による印象評定(実験C)の3つの実験を行った。実験結果から以下の知見が示された。実験Aではモーフィングによって操作した笑顔強度に伴い、知覚的な強度も直線的に増加した。したがって、操作強度は知覚強度とほぼ等価であると解釈した。実験Bでは笑顔強度に伴って顔の魅力は徐々に増加し、ある笑顔強度で最高魅力となるが、その最適強度を過ぎて笑顔が強くなりすぎると魅力は減少傾向に転じることが示された。実験Cでは笑顔強度の異なる顔画像から受ける印象として、「活力性」、「柔和性」、「美感性」、「支配性」の4つの印象因子が抽出された。それぞれの印象因子は笑顔強度の増加に伴って独自の変容特性を有し、「活力性」「柔和性」は笑顔強度に依存して大きく変動する特性を持つのに対し、「美感性」「支配性」は笑顔強度に依存した大きな変動は見られないことが示された。重回帰分析により魅力度と各印象因子の関係を調べたところ、4因子の中で『柔和性』、『美感性』、『活力性』の3つの因子が笑顔による魅力評価に寄与していることが示された。これらの結果は、2003年9月、ヨーロッパ認知心理学会おいて発表され、日本顔学会誌において学術論文として掲載された。画像としての笑顔の提示方法やピークとなる強度の違いが,人に与える印象の程度に及ぼす影響を実験的に検討した.提示方法として,静止画提示,切替え提示(真顔静止画提示後に笑顔静止画提示方法),動画提示(真顔からピークとなる笑顔へ連続的に変化)の3条件を設けた.笑顔強度はモーフィング技法によって,真顔と笑顔のオリジナル画像を基に操作された.ピークとなる笑顔強度は,0%,30%,60%,90%,120%の中から選択された.先行研究に基づいて選択された5項目の印象評価用語(「魅力的な」,「思いやりのある」,「元気のよい」,「たくましい」,「美しい」)を用いて,刺激となる笑顔の印象を32人の評定者が7段階で評価した.その結果,動画提示は顔の美感的側面(「美しい」「魅力的な」「思いやりのある」)の評価において,ある特定のピークとなる笑顔強度のときに,それらの印象の増幅をもたらす傾向が見られたが,その効果は小さかった.一方,ピークとなる笑顔強度に関しては,強度が強まるほどに全ての評価用語において印象の顕著な増幅をもたらしていた.このことは,笑顔によるポジティブ印象の増幅は,提示方法や提示時間に関する笑顔の時間的特性というよりも,ピークとなる笑顔強度などの空間的布置変化の影響がより大きいことを示している.本研究結果は,HIP研究会(仙台)ならびにECVP(ハンガリー)において発表された.研究1では,モーフィング動画像を用いて,顔の印象評定に与える動きの影響を実験的に検討した.

まず表情表出過程に着目し,笑顔の提示方法(動画・静止画),提示時間(1033ms・233ms)、笑顔強度(90%・120%)を組み合わせて顔刺激を作成し,印象評定を行った.その結果,動画提示でのみ,操作した笑顔強度の効果が笑顔の美感印象評価に反映されることが示された。本成果は,Tohoku Pschologica Folia誌に論文として掲載が決定している.次に表情戻り過程に着目し,笑顔と怒り顔の提示方法(動画・切替),変化のタイプ(笑顔→中立・中立のみ・怒り→中立)の組み合わせで顔刺激を作成し,中立顔の印象評定を行った.その結果,動画提示でのみ,中立顔の印象は,笑顔から変化した場合により怖い印象へ,怒り顔から変化した場合により優しい印象へとシフトした.本成果は,第三回日本顔学会において発表された.以上から,笑顔などの特定の時空間的な物理的な操作が,顔の印象評価にポジティブな影響をもたらすことが示された.また,研究2では,顔に障害(口唇裂・口蓋裂)を抱える方たちの笑顔の印象特性を調べる心理実験を行った.自発的に表出された笑顔と中立顔を用いて顔の印象評定を行った結果,笑顔表出場面において顔の印象がよりポジティブに評価され,笑顔が印象に及ぼす効果の頑健性が示された.顔の障害を目立たなくさせようとする努力が,表情抑制につながる可能性が指摘されているが,本研究結果から,笑顔などの表情表出を積極的に行うことによってポジティブな印象が創出される可能性が実験的に示された.研究1,2の成果を踏まえて,表情表出速度や表情強度を操作した動画像を用いて,観察者にポジティブな印象を与える最適な表情表出速度や最適表情表出強度などを,自覚的に学習させる表情表出トレーニング方法などの感性福祉的応用が考えられた.
高度に局在化したナノ光源による近接場光学顕微鏡の３Dイメージング

テーパー型金属構造上でプラズモンを伝搬させ、先端で近接場光を発生させるプラズモンナノフォーカスは、近接場光学顕微鏡の分析能を大幅に向上し得る強力なツールである。入射光を探針先端に照射する必要がないため、入射光による散乱ノイズを除去することができる。また、プラズモンナノフォーカスは近接場光を探針先端に高度に局在化させるため、z方向の分解能も加えることによって、3Dイメージングの展開も見込める。本研究では、プラズモンナノフォーカスを近接場光学顕微鏡に応用するために、探針構造を最適化・作製した。また実際に、プラズモンナノフォーカスを用いた近接場光学ナノイメージングを実施した。本研究ではプラズモンフォーカス技術を用いて、“高度に局在化したナノ光源"を形成し、3次元空間全方向に高い空間分解能を有する近接場光学顕微鏡を構築する。ここで開発する手法は微細構造を用いて光とプラズモンのカップリングと伝搬を制御し、試料や近接場プローブ先端に直接光を照射せずにナノ光源を形成する。“高度に局在化したナノ光源"はバッククグランド信号を効果的に抑制するのみならず、深さ(z)方向を含めた3xyz次元方向に高い局在化を達成し、プローブの動作に追随して自由に走査することができる。このような自由度の高い光源を用いて分光イメージングシステムを作製し、近接場光学顕微鏡の3次元イメージングを行う。本年度では以下を達成することができたプラズモンナノフォーカシングは表面プラズモンの凝集による複雑な電磁場現象であるため、電磁場解析に適したFDTD法を用い、最適な金属探針の構造を見出す。プラズモンナノフォーカシングに用いる探針には、大きく分けて2つの重要な要素がある。1)入射レーザーとプラズモンのカップラー構造と2)プラズモン伝搬・集光過程に影響する構造である。プラズモン伝搬および集光仮定において、薄膜構造と伝搬モードが重要なパラメータとなる。真空蒸着法などの製膜法で金属探針を作製する場合、探針先端での近接場光強度が金属コーティングの膜厚に大きく依存することが我々の行ったシミュレーションで分かった。また探針の頂角や先端径にも依存するため、パラメータを変えながら計算を繰り返し、最適値を見出した。本研究は、有限差分時間領域(FDTD)法によるプラズモンナノフォーカシングに適した金属構造の探索を目的としていた。これまでのデータの解析方法を検討し改良することで、パラメータを変えながら計算を繰り返し、最適値を見出すことができた。従って順調な進展であると考えている。ナノ分光学FDTD法により見出した最適な金属探針の構造を実際に作製する。市販されている原子間力顕微鏡用シリコンカンチレバーを金属コーティングして作製する。プラズモンの伝搬効率は表面粗さに大きく依存するので、製膜法として真空蒸着法やスパッタリング法などを試み、適した方法を見出す。それぞれの製膜法で、製膜速度や製膜時の温度などのパラメータ依存性も精査し、原子レベルで滑らかな金属コーティングを実現する。一般的にシリコンカンチレバーへの製膜はコーティングが粗くなる傾向にあるが、申請者のグループは独自のアイディアによってコーティングを著しく改善できる技術を見出した。従って1 nm以下の粗さでコーティングを作製することを計画している。集束イオンビームリソグラフィを用いて金属コーティング上にグレーティング構造を作製する。このグレーティングにレーザーを照射することによってプラズモンナノフォーカシングを誘起し近接場光を探針先端に生成する。次年度への繰越金は4,514円と少額で、概ね計画通りの支出であった。この残額で研究に予定する実験器具を購入するのは難しく、次期に繰越すこととした。次年度の予算と併せて早急に使用することとしている。
神経ーミクログリア接触シグナルによる脳内環境制御メカニズムの解明

2つの膜タンパク質CD47とSIRPαが形成する細胞間接触シグナルが脳内環境を制御する可能性を検討した。昨年度見出した、SIRPαあるいはCD47の全身性KOマウスの脳内におけるCD11陽性ミクログリアの異常な増加について、この表現型の原因となるSIRPα発現細胞を明らかにするために、細胞特異的なSIRPαコンディショナルKOマウスを作製した。解析の結果、CD11c-Creマウスを使ったCD11c陽性特異的SIRPαコンディショナルKOマウス、LysM-Creマウスを使ったマクロファージ/ミクログリア特異的SIRPαコンディショナルKOマウスでは、全身性KOマウスでみられたような脳内CD11c陽性ミクログリアの増加は認められなかったが、その後、LysM-Creを用いたコンディショナルKOマウスでは、先行報告と異なり、多くのミクログリアでSIRPαの発現が依然として認められることが分かり、ミクログリアで発現するSIRPαがCD11c陽性ミクログリアの恒常性に関与する可能性は残された。一方、これらのコンディショナルKOマウスでは末梢のCD11c陽性細胞やマクロファージでSIRPαが高効率でKOされており、これらの末梢細胞のSIRPαは、脳内ミクログリア恒常性に関与しないことが分かった。また前脳神経細胞特異的SIRPαコンディショナルKOマウスの解析結果から、神経細胞側のSIRPαの関与の可能性は低いと考えられた。一方、CD11c陽性ミクログリアが高齢の野性型マウス脳内でも増加することを確認し、CD47-SIRPαシグナルが脳の老化と関連する可能性を新たに見出した。また、CD11c陽性ミクログリアが病態与える影響を検討するために、Cuprizone誘導性脱髄モデルとその評価システムを新たに導入し、SIRPαKOマウスでの病態変化を野性型マウスと比較する実験系の構築を完了した。25年度が最終年度であるため、記入しない。研究代表者はこれまで、貪食細胞と神経細胞に強く発現する膜型受容体SIRPファミリーの機能について解析を進め、マクロファージでは貪食を正負に制御すること、神経細胞ではうつ様行動を制御することなどを明らかとしてきた。これらの成果に基づき、本研究では脳内免疫系におけるSIRPファミリーの機能解析に取り組んでいる。本年度は、SIRPα遺伝子破壊(KO)マウスの脳で、樹状細胞(DC)マーカーであるCD11cや、マクロファージ系細胞の活性化の指標となる補体やLysozymeのmRNAの発現が顕著に増加することを見出し、さらに組織化学的解析やフローサイトメトリーを用いた解析により、野生型マウスの脳内ではわずかにしか認められないCD11c陽性のミクログリア様細胞が、SIRPαKOマウスの脳内では著しく増加することを明らかにした。さらにSIRPαの細胞外リガンドであるCD47のKOマウスでも同様の表現型が得られることを確認し、これらKOマウスの表現型が、CD47とSIRPαを介した細胞間相互作用シグナルの欠損に原因することを示した。さらに詳細な解析を進め、KOマウス脳内におけるCD11c陽性細胞の増加は、脳内の特定の領域に限局して認められることも明らかとした。現在、このCD11c陽性ミクログリアの詳細な性質や由来について、さらに解析を進めている。本研究を進めることで、SIRPαによる脳内免疫系の恒常性制御機構の解明をすすめ、さらに、その異常による脳内恒常性の破綻・神経障害への関与を明らかにする予定である。

マイクロアレイ解析により、SIRPαKOマウスの脳で、DCマーカーであるCD11cや、マクロファージ系細胞の活性化の指標となる補体(C4)やLysozymeのmRNAの発現が増加する可能性を見いだしていたが、本年度は、定量的PCRによりこれら分子の発現量の変化を定量的に確認するとともに、組織化学的解析により、CD11cを発現する細胞がKOマウスの脳内で増加しており、また、これらの細胞がミクログリアのマーカー分子を発現していることを明らかにすることができた。このようにKOマウスの表現型について、新たな知見が得られたため、これを手がかりとする解析に計画を修正した。そのため、当初計画していた、SIRPファミリーを指標としたミクログリアの分類と同定、in vitroでのミクログリア機能解析、SIRPβについての解析は計画通り展開できなかったが、一方で、新たに見いだしたCD11c陽性ミクログリア様細胞についての解析を進めることで、新しいミクログリアサブタイプの分類を進めることができると期待している。実際、この細胞群には、Dectin-1、CD14など自然免疫系に関わる分子が特徴的に発現していることなど、すでに新たな知見を見いだしつつあり、研究計画の修正は発展的なものであると考えている。また、当初計画していたコンディショナルKOマウスを用いた解析については、神経特異的SIRPαKOマウスに加えて、CD11c-Cre, LysM-Creを導入して樹状細胞やミクログリア特異的なKOマウスの作製も軌道に乗せることが出来ており、すでにこれらマウスの解析にも取り組んでいる。以上より、全体として計画はおおむね順調に進展していると評価した。今後の推進方策として、前年度に見いだしたCD11c陽性のミクログリア様細胞(マイクログリアのサブタイプと考えられる)についての解析を重点化することを計画している。計画としては、現在見いだしているDectin-1やCD14など、自然免疫系の膜表面マーカーを手がかりにさらに詳細な解析を行い、CD11c陽性細胞の性質と機能を解析する。また、SIRPαKOマウス脳内で、CD11c陽性ミクログリア様細胞が増加している脳内領域は、野生型マウスにおいて、幼若な時期にミクログリアの増加が認められる領域と一致することから、SIRPαの欠損により、時間的制御を逸脱して未熟なミクログリアが増加した可能性が考えられる。そこで、野生型マウスの生後に増加する未熟なミクログリアとの間で細胞表面マーカーなどの比較を行い、SIRPαシグナルがミクログリアの成熟過程に関わる可能性を探る。また、骨髄キメラマウスを作製してCD11c陽性ミクログリア様細胞の由来(末梢or中枢)を明らかにする。一方で、CD11c陽性細胞自身のSIRPα欠損が、SIRPαKOマウスの表現型の原因であるかどうかを、CD11cーCre, LysM-Creマウスを使ったコンディショナルKOマウスを用いて解析する。神経特異的なコンディショナルKOマウスについても解析を行い、どの細胞に発現するSIRPαが、KOマウスの表現型に関与するのかを検討する。また、当初の計画に従い、CD11c陽性ミクログリア様細胞の増加が脳内免疫系の機能に及ぼす影響について、脳梗塞などの神経障害モデル動物を用いて解析を行う。これらの解析により、SIRPシグナルによる脳内恒常性の制御メカニズムを明らかにする。25年度が最終年度であるため、記入しない。