hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
デュアルキュアー型レジンの重合特性に及ぼす重合触媒系の影響

試作コンポジットレジンのマトリクスはBisGMA:TEGDMA=60:40mol%で、無機質フィラー50wt%を配合した。重合開始剤としてカンファーキノン(CQ)と過酸化ベンゾイル(BPO)、還元剤としてジメチル-p-トルイジン(DMPT)、ヒドロキシエチル-p-トルイジン(HEPT)あるいはジメチルアミノエチルメタクリレート(DMAEMA)を選択し、これらの組合せによってデュアルキュアー型、化学重合型および光重合型レジンを試作し、重合特性を評価した。いずれの還元剤においても、デュアルキュアー型の重合性は化学重合型や光重合型よりよかった。化学重合型ではDMAEMAあるいは還元剤なしでは重合しなかったが、対応するデュアルキュアー型では光重合型より反応率、重合率とも高かった。このことはBPOは脂肪族アミンあるいは還元剤なしでは分解しないが、光照射によってレジンの重合が開始されるとその局所的発熱でBPOが分解し重合性を高めたものと考えられる。したがって、光重合型では還元剤が脂肪族アミンであるならば、BPOの併用によって重合性が高まることが示唆された。芳香族と脂肪族アミンを併用した場合、デュアルキュアー型の重合性は芳香族アミン単独使用と同程度であった。各還元剤のレジンの臨界照射量(レジンを硬化させるのに必要最低限の照射量)はDMPTが最も小さく、DMAEMA,HEPTは同程度であり、光照射によってDMPTやHEPTの方がDMAEMAより先に消費され、重合性が高まらなかったものと考えられる。芳香族、脂肪族の両アミンを併用する場合には、芳香族アミンより臨界照射量の小さい脂肪族アミンを選択すべきものと考えられる。インレー体を介した場合、デュアルキュアー型の反応率はインレー体の厚さが厚くなるに従い低下したが、低下率は光重合型ほど大きくなかった。0.1254.0mol%の還元剤の濃度範囲では、厚さ5mmのインレー体を介してもデュアルキュアー型の反応率は化学重合型と同程度かそれ以上であった。
多様な配送計画問題に対する自動的なメタ戦略アルゴリズム構成法の開発

実務で必要とされる配送計画問題は複雑でさまざまな制約を持つことが多く,配送計画問題を対象とした汎用ソルバーでもそのまま適用することが難しいという問題がある.本研究では徳島県内の配送業務に携わる企業のインタビューに基づき,実際の業務で解決を必要とされる複雑性を持った車両配送問題のモデル化を行った.また,実際の配送現場では,配送中に受けた追加注文に対応するための動的スケジューリングが必要とされる場合が多い.本研究ではこの問題に対する動的スケジューリングのモデリングも行い,動的スケジューリングに対応した最適化手法も提案した.以前の研究で巡回セールスマン問題に対して非常に高性能な遺伝的アルゴリズム(GA-EAX)を開発し,この手法をクラスタ計算機上で並列実行する手法を考案していた.しかし,この方法で計算機間の通信量を減らすために,もともとのアルゴリズムに変更を許していた.今年度はもとのアルゴリズムを変えることなく,計算機間の通信量を減らす方法を考案した.これまでの研究でさまざまな車両配送問題に対して非常に高性能なメメティックアルゴリズム(遺伝的アルゴリズムと局所探索を融合した手法)を考案してきたが,集団の多様性維持を明示的に行う方法を導入していなかった.一般にメメティックアルゴリズムに対しては,明示的な多様性維持戦略を用いることは少ないが,本研究では,既に開発していた高性能メメティックアルゴリズムに明示的な多様性維持戦略を組み込んだ.この結果,僅かではあるが探索性能を向上させることに成功した.以前の研究で巡回セールスマン問題に対して非常に高性能な遺伝的アルゴリズム(GA-EAX)を開発していた.これまでに,GA-EAXの集団の多様性を維持するための新しい方法として,変数間の高次の依存関係を考慮したエントロピーを導入した多様性指標を提案していた.この多様性指標は集団を構成する個体の確率分布をm次のマルコフ過程でモデル化して,そのエントロピーレートとして定義されていたが,本年度は個体の確率分布を可変長のマルコフ過程(variable-order Markov process)でモデル化する方法に拡張する手法を開発した.このアイデアにより,GAの集団の多様性維持がより適切に行われて,探索性能が改善することを確認した.この結果は国際会議PPSN2016に投稿中である.これまでに,さまざまな代表的車両配送問題のベンチマーク問題に対するメタ戦略を用いた高性能な近似解法(memetic algorithmを用いた手法)を考案してきた.本年度は,配送業務を必要とするいくつかの地元企業の協力を得て,それぞれの企業で必要とされる配送業務の最適化システムを構築する研究を開始した.これまでに,2つの企業との打合せを繰返し行い,問題のモデル化とモデル化した問題を最適化するための簡単な局所探索法を開発した.今後は問題のモデル化を協力企業の要求に合わせて修正し,最適化手法もこれまでに開発した高度な近似解法を適用していく予定である.当初の研究計画ではさまざまな配送計画問題に問題に対して,その問題に適したメタ戦略アルゴリズムを自動的に構成する機能を持つ汎用的な最適化システムを構築する予定であったが,実際に企業と共同研究を進めるにつれて,この目標を達成することが非常に難しいことが分かってきた.この理由は各企業が最適化したい配送計画問題が非常に個別的な性格を持つために,これらの要求を含むような問題のモデル化を事前に想定することが困難だからである.そこで妥協案として,個別の共同企業ごとに想定される問題の制約や目的関数を考え,それらの制約や目的関数の組合せの範囲内で,その問題を解くために適したメタ戦略を自動構成する最適化システムを構築することとした.徳島県内の配送業務に携わる企業のインタビューに基づき,実際の業務で解決を必要とされる複雑性を持った車両配送問題のモデル化を行った.また,モデル化した問題の問題例として徳島県内100個所の公共施設を配送先とする問題例を作成した.実際の2地点間の移動時間や移動距離などの情報はゼンリン社のデジタル地図情報から取得して,現実に近い状況を反映した問題を作成した.また,実際の配送現場では,配送中に受けた追加注文に対応するための動的スケジューリングが必要とされる場合が多い.本研究ではこの問題に対する動的スケジューリングのモデリングも行い,動的スケジューリングに対応した最適化手法も提案した.本研究ではモデル化した車両配送問題の解法として,タブー探索とIterated local searchを基本とした探索手法を提案した.作成した問題に開発した手法を適用した結果,妥当と思われる配送スケジュールを得ることができることを確認した.ファミリーレストランなどの飲食店において複数人のグループが料理を注文する時,大抵,それらの料理をできるだけ同時に提供する「同時同卓提供」が望まれる.しかし,多くの注文が殺到する昼時や夕方時には,料理人が注文内容や調理状況を判断して,同時同卓提供を実現するような調理順序を決定・管理することは困難である.そこで,本研究では飲食店において同時同卓提供を実現するための調理業務支援システムを開発した.具体的には,全ての注文内容を元に,同時同卓提供を実現するための料理人ごとの調理スケジュールを生成する方法を開発した.実務で必要とされる配送計画問題は複雑でさまざまな制約を持つことが多く,配送計画問題を対象とした汎用ソルバーでもそのまま適用することが難しいという問題がある.本研究では徳島県内の配送業務に携わる企業のインタビューに基づき,実際の業務で解決を必要とされる複雑性を持った車両配送問題のモデル化を行った.また,実際の配送現場では,配送中に受けた追加注文に対応するための動的スケジューリングが必要とされる場合が多い.本研究ではこの問題に対する動的スケジューリングのモデリングも行い,動的スケジューリングに対応した最適化手法も提案した.メタ戦略

アルゴリズムは,非常に強力な最適化法である反面,優れた性能を実現するためには問題の性質をうまく取り込んだ設計が必要となるため,問題ごとに専用アルゴリズムを考案する必要がある.このため,企業で解決を求められている最適化問題を効率的に最適化するためのメタ戦略アルゴリズムを構成するためには,研究者が現場担当者と連携して最適化システムを構築する必要がある.しかし,メタ戦略アルゴリズムの問題点として,最適化アルゴリズムの構築後に問題に変更が加えられた時に,アルゴリズムを再構築しなくてはならない問題があった.今後の研究の推進方針として,多種多様な配送計画問題を統一的にモデル化するモデリング方式を開発し,このモデル上で記述される任意の配送計画問題を効率的に最適化する最適化アルゴリズムを自動構成する方式を開発する.最適化これまで,いくつかの代表的な車両配送問題に対して,メメティクアルゴリズムやタブ探索を中心とした高性能な近似解法アルゴリズムを考案してきた.これらの手法は自然に融合することができるので,シームレスにこれらの手法を融合する統一的な手法を開発する.また,さまざまな車両配送問題を統一的に定式化する定式化法を考案し,提案する最適化法を広い範囲の車両配送問題に適用できるようにする.車両配送問題にはさまざまな問題クラスが存在するが,その中でも最も基本的なクラスであるCapacitated VRP (CVRP)やvehicle routing problem with time window (VRPTW)に対して,同じ枠組みで良い結果を実現するメメティックアルゴリズムを今年度の研究で考案した.この手法をベースとして,より複雑な制約を持つさまざまなVRP問題に対しても,高性能な近似解法を構築することができると期待できる.研究最終年度に配送計画問題の解決を必要としている地元企業との共同研究を開始し,その会社の配送業務を支援する配送計画システムを構築する研究を開始した.この研究は当初の研究予定にはなかったものであるが,本研究課題でこれまでに開発したアルゴリズムを応用する上で良い応用研究課題である.この研究を遂行するために研究期間を来年度まで延長する必要が生じた.そのため,当該年度で使用予定であった計算機購入予算を次年度使用額に回すこととした.当該年度は国際会議に2回参加予定であったが,1回のみの参加となった.そのため,国際会議参加費として計上していた予算を次年度に移行することにした.現在,共同研究企業との打ち合わせを経て,基本的な最適化システムのフレームワークが完成している.ここまでの研究内容をまとめた論文を国内学会で発表する予定であるので,そのための学会参加費および旅費として使用する.また,最適化システムを構築する上で,商用の地図データを使用する予定であるので,そのための費用として使用する.これまでに,VRPのいくつかの問題に対する高性能メメティックアルゴリズムを構築してきたが,集団の多様性維持についてはあまり考慮してこなかった.
環境科学研究のための新計測手法の開発と利用に関する研究

環境科学に関する研究は極めて広範囲であるが、実験科学的手法を必要とする研究課題においては、あらゆる環境物質に関する詳細・緻密な情報の取得が必要不可欠である。本研究班は、上記のような各種環境物質情報を得るために(1)誘導結合プラズマ(ICP)発光分析法(2)分析電子顕微鏡(AEM)(3)ガスクロマトグラフ質量分析法(GC-MS)(4)サブミクロン二次イオン質量分析法(SIMS)など、4種類の新しい計測法を開発・整備するとともに、これらの装置を十分な管理下に置いて広く環境科学研究者の利用に供し、それぞれの研究の発展に寄与することを目的としている。(1)誘導結合プラズマ(ICP)発光分析法の水圏環境試料への応用として、沿岸海域や湖沼など人間活動の影響を受け易い水域における重金属の分布とその動態に関する研究を重点的に行った。(2)生物試料を用いて細胞内、細胞間に沈着している金属元素分析を行う目的の研究課題にしたがい利用者を公募し、運用委員会の採用決定にしたがい実施した。また利用者の便宜をはかるために「生物試料の分析電子顕微鏡使用論文集」(改訂第6版)を発行した。(3)GC/MS法の内標準(IS)として、昨年度検討した安定同位体標準化合物を用いる方法を実際試料に適用し、大気浮遊粉塵・ディーゼル排気粒子中の多環芳香族炭化水素飛灰中のダイオキシン、ベンゾフラン等について、測定を行った。(4)試作したサブミクロンSIMSを用いて石灰フライアッシュ,食塩,鉱物などの微粒子を試料として二次イオン質量分析,走査型イオン顕微鏡像の観察を行い、装置の評価を行った。
再生核の漸近解析

滑らかな境界を持つ強擬凸領域において,ベルグマン核と局所双正則不変なゼゲ-核の漸近展開を考え,それらを再生核の漸近解析として統一的に捉えようと試みた.双正則不変性を考慮に入れなければ,ソボレフ空間に属する正則函数の空間に付随する再生核として,ソボレフ-ベルグマン核が定義される.他方,ベルグマン核と不変なゼゲ-核を超局所化したものは,超局所ソボレフ-ベルグマン核に一般化される.従って,これを超局所化とする双正則不変なソボレフ-ベルグマン核を大域的に定義して,その漸近展開の性質を調べることがまず第一の問題となる.次に第二の問題は,この漸近展開を通してベルグマン核と不変なゼゲ-核の特異性を統一的に理解することである.当研究において,上記の二つの問題について幾つかのことがわかった.まず第一の問題については,負の次数のソボレフ-ベルグマン核で近似的に双正則不変なものを大域的に定義する方法がわかった.これはベルグマン核やゼゲ-核と同様の漸近展開をもつと思われるが,そのことを特別な場合に粗く検証した.第二の問題には,複素モンジュ・アンペ-ル境界値問題の漸近解の構造が深くかかわっていると思われる.従来の研究では,この漸近解の具体的な計算において,ベルグマン核と不変なゼゲ-核の具体的な計算結果を援用していた.当研究においては,この漸近解のモーザーの標準形の係数へのパラメーター依存性について,精度を上げていくためのアルゴリズムを得た.これにより漸近解の具体的な計算が直接に出来るようになったが,このことは今後の研究において大きな助けになると期待できる.また,上記の問題に関連して,解析学の諸問題,特に非線形偏微分方程式の問題について,幾つかの成果を得た。
ヘムオキシゲナーゼの構造と機能との関連(特に酸素活性化について)

ヘムオキシゲナーゼ(HO)はヘムをビリベルジン,CO,鉄に酸化的に分解するミクロソーム酵素である.本酵素によるヘム分解反応では基質であるヘムが酸素活性化のための補欠分子族としても機能しているという特異な反応機構を持つ.反応機構は複雑であり,中間代謝産物としてヒドロキシヘム,ベルドヘム,ビリベルジン・鉄錯塩が存在する.この間の反応は本酵素の上で逐次的に進行し,しかもヒドロキシヘム,ベルドヘムからの反応でもそれぞれ一分子の酸素が消費されるので,三つの連続したモノオキシゲナーゼ反応が一つの酵素蛋白の上で起こっていることになる.今回,私共はα-ヒドロキシヘムを化学合成しヘムオキシゲナーゼとの複合体を作り,それら複合体の性質や反応機構を各種生物物理学的測定法を用いて検討した.その結果次の事実が知られた.1.酸化型α-ヒドロキシヘムはヒドロキシル基のプロトンが外れたオキソフロリン構造をとっていること.2.酸素に曝すとポルフィリン環が酸化され,構造未知の物質に転換すること.3.この物質に一電子を供給すると速やかにベルドヘムに転換すること.4.還元型ヒドロキシヘムは酸化型とは異なりオキソフロリン構造を取らないこと.5.この還元型に酸素を導入すると速やかにベルドヘムに転換すること.などが知られた.以上の結果から,ヒドロムキシヘムからベルドヘムに至る反応では一当量の還元力と酸素分子が必須であることが知られた.然し,酸素が先か電子が先かについては未だ決着がついていない.その他ベルドヘム・HO複合体も作り検討したところ,ベルドヘム・HO複合体の吸収像は私共が以前688nm物質と称した中間体のそれと同じであり,従ってベルドヘムが実際に中間体であることの最終的な結論が得られた.ヘムオキシゲナーゼ(HO)はヘムをビリベルジン,CO,鉄に酸化的に分解するミクロソーム酵素である.本酵素によるヘム分解反応では基質であるヘムが酸素活性化のための補欠分子族としても機能しているという特異な反応機構を持つ.反応機構は複雑であり,中間代謝産物としてヒドロキシヘム,ベルドヘム,ビリベルジン・鉄錯塩が存在する.この間の反応は本酵素の上で逐次的に進行し,しかもヒドロキシヘム,ベルドヘムからの反応でもそれぞれ一分子の酸素が消費されるので,三つの連続したモノオキシゲナーゼ反応が一つの酵素蛋白の上で起こっていることになる.今回,私共はα-ヒドロキシヘムを化学合成しヘムオキシゲナーゼとの複合体を作り,それら複合体の性質や反応機構を各種生物物理学的測定法を用いて検討した.その結果次の事実が知られた.1.酸化型α-ヒドロキシヘムはヒドロキシル基のプロトンが外れたオキソフロリン構造をとっていること.2.酸素に曝すとポルフィリン環が酸化され,構造未知の物質に転換すること.3.この物質に一電子を供給すると速やかにベルドヘムに転換すること.4.還元型ヒドロキシヘムは酸化型とは異なりオキソフロリン構造を取らないこと.5.この還元型に酸素を導入すると速やかにベルドヘムに転換すること.などが知られた.以上の結果から,ヒドロムキシヘムからベルドヘムに至る反応では一当量の還元力と酸素分子が必須であることが知られた.然し,酸素が先か電子が先かについては未だ決着がついていない.その他ベルドヘム・HO複合体も作り検討したところ,ベルドヘム・HO複合体の吸収像は私共が以前688nm物質と称した中間体のそれと同じであり,従ってベルドヘムが実際に中間体であることの最終的な結論が得られた.
身体運動時の脳内情報処理過程における心理的構えの影響

心理的構えがスポーツ課題遂行時の脳内情報処理過程・パフォーマンスに与える影響について、人の情報処理プロセスの情報認知、中枢での記憶、判断、意思決定、動作操作の各段階について詳細に検討を行うため、1.心理的構えと事象関連電位に関係する先行研究の検討と精査2.ERP実験システム、分析システムの構築を行った。実験・分析システムについては、予告反応パラダイムを用いたボタン押し課題について、一連の刺激にフェイント刺激を挿入した際のERPが検討可能なものを作成した。本システムによって、CNV(随伴性陰性電位)、P300、Ne(ERN)などのERPを同時に測定することが可能となった。また、今回新たに16チャンネルのERP測定(モニタリングは8チャンネル分)、A/D変換、データ分析を同時に行うことが出来るようになった。また、SPSSパッケージを用いることによって、大量データの瞬時の分析が可能となった。育休申請に伴い、平成13年9月3日廃止承認申請書を提出することになったが、本システムを用いて引き続き研究を進めていきたい。
二段階過程による植物細胞壁多糖の合成・分解

本研究の目的は、植物の成長調節において中心的な役割を果たしている細胞壁多糖が中間多糖を経由して分解されるという仮説を実証することにあった。本研究の結果、キシログルカン並びに(1→3),(1→4)-β-D-グルカンについて二段階分解過程が確認され、各過程に関与する細胞壁酵素の性質が明らかになった。また、各酵素の活性が光や重力などの環境シグナルによって調節されることも明らかにできた。1.粗細胞壁タンパク質画分を用いたin vitroアッセイにより、主要なマトリックス多糖であるキシログルカン並びに(1→3),(1→4)-β-D-グルカンが、分子量数万あるいは10万の中間的な大きさの産物を経由する二段階過程により分解されることが確認された。2.アズキ上胚軸細胞壁より、キシログルカンの二段階分解過程に関与する酵素を抽出、精製した。第一段階の酵素は構造上はエンド型キシログルカン転移酵素の仲間であるが、全くあるいは特殊な条件を除いて転移活性を示さず、分子量数万単位での加水分解作用のみを示した。第二段階の分解のきっかけとなるα-フコシダーゼも精製された。3.イネ幼葉鞘細胞壁より、(1→3),(1→4)-β-D-グルカンの二段階分解過程に関与する酵素を抽出、精製した。分解の第一段階は約20kDaのエンドグルカナーゼにより、また第二段階は約58kDaの大きさのエキソグルカナーゼによってなされる。4.光や重力は、キシログルカン分解酵素あるいはエキソグルカナーゼの活性を低下させて両多糖の分解を阻害し、その結果細胞壁を固くして植物の芽ばえの成長を抑制する。植物の成長・分化や形態の調節において中心的な役割を果たしている細胞壁多糖がどのような過程で合成・分解されるかは、植物生理学上の重要な課題である。双子葉植物の細胞壁構築の核となるキシログルカンの分解経路を解析したところ、この多糖は単糖やオリゴ糖に直接分解されるのではなく、分子量数万程度の中間的な大きさの多糖を経由する二段階過程により分解されることが示唆された。そこで、この反応に関与すると推定される細胞壁酵素を抽出・精製し、その作用機作を解析した。キシログルカンの分子量と比例した呈色を示すヨウ素法を指標として、アズキ上胚軸細胞壁より1M NaClで抽出されるタンパク質画分に含まれるキシログルカン分解酵素を精製した。低分子化を引き起こす活性画分を数種のFPLCカラムを用いて精製したところ、最終的に少なくとも6つの画分に分離された。精製酵素はゲルろ過カラムでは吸着のため分子量より遅れて溶出したが、SDS-PAGE上ではいずれも約32kDaの主バンドを示した。精製したキシログルカン分解酵素の作用様式を明らかにするため、様々な大きさのキシログルカンと反応させ、産物をHPLCで分析した。高分子のキシログルカンに作用させると分子量数万の最終産物を生じたが、分子量数万以下のキシログルカンには作用しなかった。いずれの場合もオリゴ糖や単糖の生成は観察されなかったが、わずかではあるが還元力の増加が認められた。また、エンド型キシログルカン転移酵素の活性は、オリゴ糖をアクセプターとしたときのみ検出され、分子量数万単位の加水分解が本酵素の主反応であることが示された。以上のように、今年度の研究の結果、キシログルカンの二段階分解過程を司る新規細胞壁酵素が精製された。

今年度は、単子葉イネ科植物の細胞壁構築の中核を担う(1→3),(1→4)-β-グルカンの二段階分解過程を解析し、それに関与する酵素をイネ幼葉鞘細胞壁より抽出・精製した。水中で速く成長しているイネ幼葉鞘の細胞壁標品より1M NaClを用いて抽出される細胞壁タンパク質画分には、(1→3),(1→4)-β-グルカン分解活性が含まれていた。この分解活性を各種カラムを用いて精製したところ、数種の画分に分けられた。精製酵素の反応過程をHPLCで解析した結果、これらの多くはエキソ型の分解反応を示したが、中間的な大きさの産物を生成するエンドグルカナーゼも含まれていた。エキソグルカナーゼは、最終的に3つのサブフラクションに分けられた。その分子量はいずれも約60kDaであり、等電点のみが異なっていた。そのN末のアミノ酸配列は、オオムギ穎果で報告されているグルカナーゼと約60%の相同性を示した。細胞壁内でのこの酵素の実際の気質は、エンドグルカナーゼの作用によって産生される分子量12万の(1→3),(1→4)-β-グルカンであると推定されるが、in vitro系では分子量100万程度の高分子グルカンをも分解し、(1→3)-β-グルカンに対して(1→3),(1→4)-β-グルカンより強い作用を示すことがわかった。以上のように、今年度の研究の結果、(1→3),(1→4)-β-グルカンの二段階分解過程のうち、特に後半を司るエキソグルカナーゼがイネ幼葉鞘細胞壁より抽出・精製され、その作用機作が明らかになった。本研究の目的は、植物の成長調節において中心的な役割を果たしている細胞壁多糖が数万Daの中間多糖を経由して分解されるという仮説を実証することにあった。昨年度までの研究で、細胞壁構築上重要なキシログルカン及び(1→3),(1→4)-β-D-グルカンの二段階分解過程に関与する細胞壁酵素が精製された。今年度は、環境シグナルによって成長が調節される際にこれらの酵素の活性がどのように変化するかを中心に解析した。芽ばえに光を照射すると、細胞壁が固くなり伸長成長が抑制される。この時双子葉植物ではキシログルカンの高分子化が起きており、これが細胞壁が伸びにくくなる原因となっていると考えられた。そこで、この多糖の二段階分解機構の第一段階に関与するキシログルカン分解活性を測定したところ、活性は有意に低下していた。一方、芽ばえに過重力をかけた時も、キシログルカン分解活性の低下、キシログルカンの高分子化、細胞壁伸展性の低下、成長抑制が誘導された。過重力処理したアズキ上胚軸では、アポプラストのpHが上昇し、in situにおけるキシログルカン分解の抑制に関与することがわかった。水中、暗所で生育したイネ幼葉鞘を空気に曝すか白色光を照射すると、(1→3),(1→4)-β-D-グルカンの分解が阻害され、成長が抑制された。この時、(1→3),(1→4)-β-D-グルカンの二段階分解機構の第二段階に関与するグルカナーゼ活性が低下し、これがグルカン分解の抑制の原因となることがわかった。また、トウモロコシ芽ばえに過重力を与えた時も、幼葉鞘及び中胚軸細胞壁に含まれる(1→3),(1→4)-β-D-グルカンのレベル並びに分子量が増加し、グルカナーゼ活性が低下した。さらに、トウモロコシでも過重力処理によりアポプラストのpHが上昇し、これが活性低下に関与することが明らかになった。
直接トルク、速度制御高性能ACサ-ボシステムの開発

誘導電動機の高性能制御に対して従来ベクトル制御が使用されていたが、ここでは回転磁界の瞬時制御に基づいた新しい制御法を開発しそれを用いて、トルク、回転数、位置制御サ-ボを構成し実用化した。1.トルク制御では2000Hzの大振幅周波数応答、定格の20倍のインパクトトルク、定格まで300μsのトルクステップ応答が得られた。また、DSPを用いて全デジタル化し1制御ル-プ80μsで演算できドライブシステムに適用した。大容量サ-ボに対しては最適なスイッチングテ-ブルを使用しGTOインバ-タを考慮した優先順位制御法を明らかにした。また急加減速時の状態における種々の飽和現象について調べた結果30倍程度までトルクが発生することがわかった。これらの応用として企業ではHSST,産業用、負荷装置など、すでに200例余りの使用例がある。2.速度制御に対する応用としては、瞬時回転磁束のオン、オフ制御によりインパルシブトルクを発生させ制御する手法を提案した。これを用いて1日1回転、1:200万の速度制御が可能となった。またその速度度ドリフトは1週1回転、脈動回転数は0.1rphのなめらか回転速度制御が可能なことが判明した。このシステムの企業化に対しては着々と進んでおり本年中に商品する予定である。3.位置制御に関してはDSPと高分解能位置センサを使用し、更にリニア領域を有するスライテングモ-ド制御、オ-トチュニングなどの理論を前述の理論と併用した。その結果、1秒の角度精度が90%の確立で得られ、インパクト負荷に対する過渡誤差は40秒、0.1秒であった。これに対しては、現在試作中で商品化は来年頃を予定している。以上の成果はいずれも誘導機で実験的に得られた世界記録で従来のベクトル制御に比べ勝っていることが実証された。本年度は理論面と実用化に対して以下のような成果が得られた。1.主磁束の飽和に関しては一次磁束を一定制御することにより二次側も含め飽和の問題はない。しかし、漏れ磁束は定格電流の15倍程度以上流すと飽和が始まる。この場合、トルク応答が速くなるだけで性能上の問題はないようである。この結果、定格の20倍電流を流し15倍のトルクを発生することができた。これを用いて速度制御した結果1.5kwの誘導機で1000rpmのステップで立上り時間が4msである。2.この制御法を用い高速トルク制御を試みたところ正弦波状の定格トルク変化に対して2000Hz(-3dB)を実現できた。これは汎用大形サーボでは世界記録であり文献(IEEE)で発表する。3.DSPを用いて、全ディジタル制御を試みた。使用したDSPはTMS320ー10であり、演算時間が25μs以下の場合は満足するトルクリップル値が得られた。この演算時間に相当する無駄時間の補正には線形一次近似による入力電流予測の手法を用いている。4.トルクが小さいとき磁束も弱めることにより騒音と無負荷損を軽減できる。無負荷損は40%に、騒音は10dB減少した。5.GTOを用いるより大容量トランジスタを使用した方が価格、性能的に有利な時代になった。本制御の応用例としてリニアモータ駆動(埼玉博、横浜博)を試み低駆音、高速トルク制御が結果として得られた。6.超低速1rpd(1日1回転)が得られ、1:2×10^6の速度制御範囲が可能になった。

負荷が一定であれば、PI回路の調整は不要であるが、可変負荷に対しても学習制御を導入することを確めている。現在、高速トルク制御は上記のリニアモータ制御の外に自動車負荷装置80kwに実用化されている。広範囲速度制御は実用化の段階で、今年中にメーカより発表されるであろう。誘導電動機に使用されていたベクトル制御の概念を根本からくずし、新しい直接瞬時トルク、速度制御の理念の下で従来方式に勝る高性能サ-ボを実用化した。本年度行なった主なものは次のようなものである。1.高速トルク制御による低回転むらの電動機駆動については次の実用化を行なった。負荷の共振周波数が回転むらに大きく影響することがわかりトルク計より共振周波数にあったバンドパスフィルタ用いてフィ-ドバックすることによりトルクリプルを1%内にすることができた。超広範囲速度制御の低速における回転むらを減少させるためにスイッチングパタ-ンを変更する手法を開発し現在研究続行中である。2.大容量機に対する応用は、三菱電機が主回路構成に対しては500KWのシステムに対しGTOを使用し1KHzのスイッチング周波数で実用化した。また東洋電機製造はDSPを使用し完全デジタル制御によるHSSTシステムにGTOインバ-タを使用し750KWのシステムを制作し横浜博に使用した。トランジスタインバ-タを用いたものは、300KWのシステムを自動車走行試験用負荷装置に、280KWのシステムを水道用ポンプ駆動に使用している。これらを使用したシステムは200台以上の販売実積がある。3.超広範囲速度、位置制御に対し負荷の慣性モ-メント、負荷トルクなどの変化に伴うオ-トチュニングの手法を開発しDSPを使用し位置制御の方は実験的に確かめた。速度制御の方はシミュレ-ションの方では完成しており実用化を現在検討中であるが、現在の仕様ではシステムがロバストであるためここまで使用する必要はない。4.高精度位置決めに関してはDSPによる高速演算、高精度位置センサ、リニアモ-ドスライテング制御、オ-トチュニングなど使用し1秒の角度誤差のサ-ボを得ることができた。等満足できる結果が得られた。
パーソナル画像通信のための輪郭領域画像処理システムの構築

本研究では,対話的な画像編集,画像加工を目的として,ウェーブレット変換による画像輪郭抽出を用い,輪郭情報をユーザーに提示することで,対話的に画像処理を行うシステムの構築を行った.本課題で得られた成果は下記の2つである.(1)ウェーブレット基底に基づく画像輪郭表現画像輪郭に基づく画像処理のために,画像を平滑化成分と輝度不連続を記述する高周波成分へ分離し,それぞれを画像輪郭座標と付加情報で表す画像表現を構築した.高周波成分に関しては平滑化関数の1階導関数と一致するウェーブレット基底の線形和により合成し,平滑化成分は輪郭上での平均輝度と輝度差から記述する方法を提案した.画像再構成では,高周波成分を輪郭上で定義されたウェーブレット基底の線形和から合成する.平滑化画像の復元では,画像平坦部に対してペナルティ関数を定義し,これを最小化することにより輪郭近傍以外の輝度値を補間する方法を用いた.以上の画像輪郭表現は,従来の画像輪郭表現よりも少ない計算量で画像を再構成できることを示し,本研究が目的とする対話的な画像編集へ応用できることを示した.(2)画像輸郭表現に基づく画像編集システム人間の視覚認識に適合する画像輪郭を提示し,これを操作することで画像内容編集を行うことができるシステムを構築した。ユーザーは画像輪郭を示す線画に対する編集のみで,濃淡自然画像の内容を編集することが可能である.このシステムのために必要なユーザーインターフェースを検討し,パーソナルコンピュータ上へ実装を行った.構築したシステムによる画像編集実験を行い,提案したシステムを用いることで,ユーザーが少ない手間で容易に複雑な画像内容編集を実現できることを確認した.本研究では,輪郭表現に基づく新しい画像処理システムの構築を目的としている.本システムでは,ユーザーと対話的に輪郭線の選択と加工を行うことで自然画像処理を実現する.今年度は,高速復元可能な画像輪郭表現の実現と,ユーザーインターフェースの構築を目的とし,従来から提案されている画像輪郭表現の改良とパーソナルコンピュータ上でのアプリケーション作成を行った.研究代表者によって提案されたエッジベース画像合成モデルは,画像を輪郭線上のウェーブレット関数の線形和によって近似する画像表現であり,画像輪郭の加工により画像処理を実現することができるが,画像表現には原画像を平滑化した画像を含み,完全な輪郭表現ではないため,画像加工を実現するためには,輪郭と独立した平滑化画像に対する処理が必要であった.今年度は目標とする画像処理を実現するために,平滑化画像の輪郭に基づく適応的な標本化と復元法に関して研究を行い,エッジベース画像合成モデルから完全な画像輪郭表現を構築した.さらに,提案した画像表現を用いてパーソナルコンピュータ上で画像内容の編集を行うシステムを構築した.提案法の画像復元に要する計算量は従来法の約1/2程度であり,高速な画像復元を実現できる.実験より提案法とそれを用いた画像編集システムは,ユーザーとの対話性を損なうことなく,任意のオブジェクトの移動,除去,変形等の処理を実現できることを確認した.本研究では,対話的な画像編集,画像加工を目的として,ウェーブレット変換による画像輪郭抽出を用い,輪郭情報をユーザーに提示することで,対話的に画像処理を行うシステムの構築を行った.本課題で得られた成果は下記の2つである.(1)ウェーブレット基底に基づく画像輪郭表現画像輪郭に基づく画像処理のために,画像を平滑化成分と輝度不連続を記述する高周波成分へ分離し,それぞれを画像輪郭座標と付加情報で表す画像表現を構築した.高周波成分に関しては平滑化関数の1階導関数と一致するウェーブレット基底の線形和により合成し,平滑化成分は輪郭上での平均輝度と輝度差から記述する方法を提案した.画像再構成では,高周波成分を輪郭上で定義されたウェーブレット基底の線形和から合成する.平滑化画像の復元では,画像平坦部に対してペナルティ関数を定義し,これを最小化することにより輪郭近傍以外の輝度値を補間する方法を用いた.以上の画像輪郭表現は,従来の画像輪郭表現よりも少ない計算量で画像を再構成できることを示し,本研究が目的とする対話的な画像編集へ応用できることを示した.(2)画像輸郭表現に基づく画像編集システム人間の視覚認識に適合する画像輪郭を提示し,これを操作することで画像内容編集を行うことができるシステムを構築した。ユーザーは画像輪郭を示す線画に対する編集のみで,濃淡自然画像の内容を編集することが可能である.このシステムのために必要なユーザーインターフェースを検討し,パーソナルコンピュータ上へ実装を行った.構築したシステムによる画像編集実験を行い,提案したシステムを用いることで,ユーザーが少ない手間で容易に複雑な画像内容編集を実現できることを確認した.
自己組織化による組織完全再生を目指した成長する新規素材人工血管の開発

心臓血管外科領域を中心に血管の代替物として使用されている人工血管は、耐久性の面では半永久的に使用可能で良好な臨床成績を収めている一方、依然解決されない問題(1.血栓形成や内膜肥厚に伴う閉塞,2.感染のリスク,3.成長追随性の欠如)を抱えている。そこでTssue Enginpeeringの手法を応用し細胞親和性の高い生体分解性素材のみを材料として用いることにより術前の細胞操作を行わずして組織の再構築を促す新規素材人工血上管の開発を目的とした。さらに、このコンセプトを発展させて、繊維自体を二重構造とし、芯がPLLAで鞘がPGAの糸を製糸し、それを平織りした人工血管もしくは血管修復用パッチを作製した、血管修復用材料については動物実験モデル(イヌ)での細織再生構築(in situ cellularizatio)の経時的変化や再生組織の機能を観察・解析を進めた結果、より良好な抗血栓性や生体適合性に優れ,かつ完全自己組織化を可能とするのが確認された。今後、次世代人工血管の臨床応用として、特に小口径化の実現に有用な技術と考えている。そこでTissue Engineeringの手法を応用し細胞親和性の高い生体分解性素材のみを材料として用いることにより術前の細胞操作を行わずして組織の再構築を促す(in situcellularization)新規素材人工血管の開発を目指した。生体分解性でかつ生体適合性に優れるPoly-L-Lactic Acid(PLLA)及びPolyGlycolic Acid(PGA)を用い、内腔面にはその疎な構造により組織再構築のための足場環境を提供するようにknit形状のPGAを配し、外側にはPLLAを高密度の織物として仕上げることにより高圧条件下での耐久性向上を図ったデザインの人工血管を作成した。生体内への移植により人工血管の素材が個体内で吸収されていく過程で人工血管はscaffoldとして働き、血管構成組織の再生が誘導されるように人工血管のデザインを検討・評価し最適化した。基礎的研究にて十分な検討した後、人工血管を動物実験モデル(ブタ)の高圧系である大動脈や低圧系である下大静脈に長期(12ケ月)移植し,高圧環境下での耐久性や低圧系における抗血栓性の評価に加え、生体内での組織再生構築(in situ cellularization)の経時的変化や再生組織の機能を観察・解析を進めた結果、良好な抗血栓性や生体適合性に優れ,かつ完全自己組織化を可能とするのが確認された。今後更なる検討が必要ではあるが最終的に次世代人工血管の臨床応用の実現が可能と考えている。
モデル微生物共生系を用いた酢酸分解メタン生成機構の解明

酢酸からの微生物によるメタン生成には単独型、共生型の2種類が存在する。本研究ではモデル微生物共生系を用いて、高アンモニア濃度、高圧力という2種類のストレス条件下で、2種類のメタン生成経路がそれぞれどのような影響を受けるのかを調べた。アンモニアストレスはメタン生成酵素の直接阻害、細胞内pH恒常性の崩壊、細胞内酸化ストレスの上昇を引き起こし、共生型よりも単独型を強く阻害することを明らかにした。高圧ストレスは逆に共生型に強く阻害的に働き、高圧下でのメタン生成には変性タンパクの再構成、細胞膜・細胞壁構造の変化が必要であることを明らかにした。本研究では、異なる2つの酢酸分解メタン生成経路(単独型、共生型)に対し高濃度アンモニア、および高圧力がどのような影響を及ぼすのかを、各経路を触媒する代表的な菌株の純粋培養、共培養を使用して調べている。高濃度アンモニアによるメタン生成阻害の研究では、各微生物の培養実験の結果、単独型のメタン生成が顕著にアンモニア阻害に弱いことを見出した。さらに単独型のメタン生成菌に対し詳細な培養実験、および遺伝子発現解析を行うことで、(1)細胞内pHホメオスタシスの崩壊、(2)メタン生成酵素群の直接的な阻害、(3)細胞内酸化ストレスの上昇、といった様々な要因がアンモニア阻害により引き起こされることが明らかとなった。以上の結果に関しては現在投稿論文を作成中である。高圧力がメタン生成に及ぼす影響の研究に関しては、各微生物種の純粋培養を高い静水圧力(15MPa、150気圧相当)で培養を行えるシステムの構築に成功し、メタン生成が高圧力下でも進行しうることを確認した。酢酸からの微生物によるメタン生成には酢酸利用メタン生成菌単独による経路(単独型)と酢酸酸化細菌と水素利用メタン生成菌との共生による経路(共生型)の二種類の経路が存在する。本研究では、異なる2つの酢酸分解メタン生成経路に対し高濃度アンモニア、および高圧力がどのような影響を及ぼすのかを、各経路を触媒する代表的な菌株を用いたモデル共生系を用いて調査した。高濃度アンモニアによるメタン生成阻害の研究では、各微生物の純粋培養およびモデル共生系の培養実験の結果、単独型のメタン生成が顕著にアンモニア阻害に弱いことを見出した。さらに単独型のメタン生成菌に対し詳細な生理学的解析および遺伝子発現解析を行うことで、細胞内pHホメオスタシスの崩壊、メタン生成酵素群の直接的な阻害、細胞内酸化ストレスの上昇といった様々な要因がアンモニア阻害により引き起こされることを明らかとした。高圧力がメタン生成に及ぼす影響の研究に関しては、各微生物種の純粋培養およびモデル共生系を高い静水圧力下(15MPa、150気圧相当)で培養可能なシステムの構築に成功した。各種培養実験の結果、高圧力は各メタン生成経路に抑制的に働くが、特に共生型への抑制効果が大きいことが明らかとなった。遺伝子発現解析の結果、高圧力条件ではシャペロンタンパクや細胞膜・細胞壁合成酵素の発現変動が顕著であり、変性タンパク質の構造回復や細胞膜・細胞壁構造の変化が高圧力条件でのメタン生成に必須であることが示唆された。アンモニア阻害の実験に関しては、当初の計画以上に実験が進展した。各微生物種の純粋培養、共培養条件でのアンモニア阻害の定量評価、および特に阻害体制の低い微生物についての遺伝子発現解析を行い、アンモニア阻害のメカニズムについて深い洞察を得ることができた。今後は得られた成果の対外発表を行う予定である。高圧実験に関しては、初年度の目標であった高水圧下培養システムの構築、並びに高圧下での微生物の増殖、メタン生成の確認に関して達成することができた。次年度は当初の予定通り、高圧下での各微生物の共培養と各メタン生成経路の活性の定量、高圧下での各微生物の遺伝子発現変化の解析を行っていく。25年度が最終年度であるため、記入しない。1.アンモニア阻害軽減法の開発高アンモニア含有嫌気廃水処理においては、しばしばゼオライトなどのカチオン吸着材がアンモニア阻害の軽減を目的として用いられている。吸着材の使用はアンモニア阻害軽減に一定の成果を示しているが、実際のリアクターを対象とした実験では数多くのカチオン吸着材を比較する実験、吸着の最適条件を探る実験をおこなうのは困難である。一方、本研究で用いているモデル共生系は小スケール・ハイスループットな培養実験が可能である。そこで本研究では、各種カチオン吸着材(ゼオライト、アンデサイト等)を高アンモニア培養系に添加し、微生物の増殖およびメタン生成への影響を評価し、効果的なアンモニア阻害軽減法の創出を目指す。2.高圧力がメタン生成微生物に与える影響の評価各微生物を0.1 MPa(大気圧下に相当)15 MPaの静水圧下で培養し、生育・代謝産物の測定をおこない、増殖速度を算出、圧力による影響を定量的に評価する。また遺伝子発現解析を行い、高圧条件下でどのような遺伝子が発現するのかを調べる。さらにモデル共生系の培養、炭素同位体実験、定量PCR、蛍光顕微鏡観察をおこない、共生条件下における圧力の影響を評価する。
単一分子テラヘルツ分光イメージングの創成

テラヘルツ電磁波を用いた分光イメージング技術では、解像度の向上が課題である。本研究は、特に物質科学・分子科学・生命科学の分野において求められているナノメータレベルの解像度を目的とした。高精度走査機構と周波数可変テラヘルツ検出器を融合させることで近接場テラヘルツ分光素子を創出した。これにより、微細な半導体試料のテラヘルツ画像・分光解析を可能にした。テラヘルツ(THz)波計測の中でも分光イメージングは、対象物を可視化して直接的な情報を得ることができるため、きわめて有用な手段である。特に物質科学や生命科学ではナノメータレベルの分解能が求められることがしばしばある。ところが、従来の技術では、ミリメータやマイクロメータレベルの分解能にとどまっており、ナノメータ分解能のTHzイメージングに向けては、さらなるブレークスルー的進展が必要となる。本研究では、波長に依存しない近接場光の特徴を利用し、これとTHz分光検出素子とを組み合わせる。この技術を基にした高解像度THz分光イメージングを開発し、単一ナノ材料や単一分子のTHz画像・分光解析を実現する。従来のTHz計測では、多数ナノ材料や多数分子の平均的な振舞いを見ているにすぎず、ナノスケールで真に限定された領域での情報が得られない。本研究で開発する技術は、ナノ領域での局所情報を高感度に抽出することが可能であり、ナノ電子材料(ナノチューブ、ナノワイヤ、量子ドット等)やバイオ物質(生体高分子、生体細胞等)を探求する、ユニークで強力な計測法になると期待できる。2014年度は、THz分光検出素子にイメージング用の機能を施す研究を行った。検出素子表面に近接場光が発生する仕組みを導入し、検出器とのエバネッセント結合により直接検出することが可能となった。この素子を用いて被測定試料の分光イメージングを行ったところ、プレリミナリな結果であるが、画像化かつ、局所的なTHz分光測定が可能であることを確認した。テラヘルツ分光イメージングは、物質科学・分子科学・生命科学の研究に強力な手段として使用できることが実証されている。ところが、ナノメータ空間分解能のテラヘルツイメージングの実現に向けては、さらなるブレークスルー的進展が必要となる。したがって、単一ナノ材料・単一分子のテラヘルツ計測は、これまで世界的に例がなく、挑戦的な課題である。本研究では、ナノメータレベルのテラヘルツ分光イメージングを創出する。これにより、単一ナノ材料・単一分子のテラヘルツ画像・分光解析を実現する。本研究により、ナノ空間中の電子や高分子についての理解が進展することが期待できる。本年度は、フィードバックメカニズムを用いて、テラヘルツ検出器そのものを試料表面上で位置制御しながら高精度に走査する機構を開発した。結果的に、波長よりも遙かに微小なサイズに対応する、高い空間解像度で、かつ周波数を選択可能な、“近接場テラヘルツ分光素子"を創出した。この素子により、テラヘルツ波に対する透明/非透明試料の透過分布観察を達成した。さらに、半導体の電子伝導に伴うテラヘルツ発光を画像化し、電極からの電子注入の機構について、テラヘルツ周波数の違いに基づいて理解することが可能となった。また、単一ナノ材料のテラヘルツ透過分布、ならびにスペクトルを得ることができた。透過スペクトルはナノ材料中のドーパント分布を反映していると解釈できることが分かった。プレリミナリな結果であるものの、固体チップ型で局所的なTHz分光イメージングができたことは大きな進展であった。単一分子THz計測という大変チャレンジングな課題であるが、その実現に向けた基盤技術を開発することができた。エレクトロニクス、計測工学今後は、特に走査系の安定化に着目した研究を行う。本技術において、被測定試料に対する検出素子の位置制御は大変重要であり、測定の精度に直接的に関係する。制御システムの改良を行い、電子材料・分子計測に適用する。元々はテラヘルツ波集光用の放物面鏡を購入予定であったが、当面はレンズで代用できたため、今年度は購入を見送った。テラヘルツ波計測用の光学部品を購入するために使用する。
ヒトES細胞の神経分化を制御するノンコーディングRNAの解析

ヒトES細胞・iPS細胞から神経幹細胞へと分化誘導する過程において、ゲノムタイリングアレイによるゲノムワイドな転写産物解析を行い、神経分化と共に発現が上昇するnon-coding RNAを同定した。さらに、同定したnon-coding RNAの機能解析のための、培養システムを構築した。本研究では、ヒトES細胞の神経分化に伴い発現が上昇するnon-coding RNAを同定し、その神経分化における役割を明らかにする。昨年度までに、ゲノムタイリングアレイを用いて、ヒトES細胞から神経幹細胞へと分化誘導する過程において、発現が上昇するnon-coding RNAを57個同定した。さらに、神経幹細胞のマーカーであるSOX1を発現する神経系前駆細胞を約一週間で誘導することのできる、迅速単層神経分化誘導法を開発した。今年度は、SOX1のBAC(Bacterial Artificial Chromosome)を用いて、ヒトES細胞の神経分化を、蛍光タンパクと発光タンパクの両方で定量的に可視化できる(ffLuc)、レポーターヒトES細胞を作成した。この細胞は、ニューロスフェア法においても、迅速単層神経分化誘導法においても、神経分化と共にffLucの発現が速やかに上昇し、簡便に神経分化をモニタリングできることを確認した。さらに、ヒトES細胞、およびレポーターヒトES細胞に、エレクトロポレーション法により、同定したncRNAに対するsiRNAを導入して、神経分化に与える影響を解析するスクリーニングを行っている。これまでの研究で確立したヒトES細胞からの神経幹細胞の誘導システムを、ヒト神経発生のin vitroモデルとして活用し、神経分化に重要な役割を果たすncRNAを同定し、その機能を解析する。今年度は、ヒトES細胞から神経分化誘導の各段階においてゲノムタイリングアレイによる解析を行い、神経分化に伴って発現が大きく上昇する転写領域を同定した。その中で、非翻訳領域と考えられ、これまでに報告されていない、57個の転写領域を同定した。定量的RT-PCR解析により、この57個の転写領域では、未分化状態に比べて最大10,000倍以上に発現が上昇していることを確認した。次に、ヒトES細胞を、単層接着培養で迅速・簡便に神経分化誘導する培養システムの開発を行った(迅速神経分化誘導法)。この方法では、未分化ヒトES細胞を単一細胞まで分散した上で、接着培養のプレートに単層接着培養で播種することで、分化誘導の開始から6日間で、神経幹細胞のマーカーであるSOX1を発現誘導することに成功した。また、この方法では、分化誘導の開始から神経細胞の誘導まで、細胞を継代することなく、培地交換のみで培養することができるため、簡便に培養でき、スクリーニングに適していると考えられた。そこで、この方法を用いて、神経分化に重要な役割を果たすことが知られる既知の遺伝子を、Neonを用いたエレクトロポレーション法によりノックダウンしたところ、分化誘導に伴うSOX1の発現上昇が抑えられることを確認できた。この結果から、これらの既知遺伝子は、スクリーニングにおけるpositive controlとして使用できること、迅速神経分化誘導法が、神経分化誘導において重要な役割を果たす遺伝子のスクリーニングに有用であると考えられた。また、SOX1のレポーターヒトES細胞である、ヒトSOX1-ffLucヒトES細胞の作成を開始した。当初の計画通り、ゲノムタイリングアレイを用いて神経分化に伴って発現が上昇するncRNAを57個(114個)同定することができた。また、スクリーニングのための迅速神経分化誘導法の開発に成功した。また、神経分化を可視化するSOX1レポーターヒトES細胞は、現在樹立中であり、次年度にかけて進める予定である。1. SOX1レポーターヒトES細胞の樹立とその評価樹立したSOX1レポーターヒトES細胞の各クローンを、従来より用いてきたヒトES細胞から神経幹細胞を誘導する方法を用いて神経分化誘導し、各クローンの神経分化能を評価する。また、神経分化誘導前後で、レポーターである蛍光タンパクVenusまたは、Luciferaseの活性により評価し、神経分化レポーターとしての機能を評価する。さらに、迅速神経分化誘導法を用いて、同様に神経分化能の評価とレポーターであるVenus、Luciferaseの発現を評価する。さらに、同定したpositive controlのノックダウンにより、神経分化誘導を阻害できるかを確認する。2. siRNAを用いたノックダウンによるスクリーニングと機能解析次に、57個の転写領域(114個の転写領域)について、Neonによるエレクトロポレーションにより、siRNAを導入し、神経分化の程度をSOX1レポーター遺伝子の発現、または、SOX1の発現定量解析(定量的RT-PCR)により評価することで、スクリーニングを行う。数回のスクリーニングを行ってターゲットを20個以下に絞り込んだ上で、さらに複数のsiRNAを作成し、再現性の確認を行う。最終的には5個以下に絞り込み、shRNAによる長期抑制、全長クローニング、強制発現などの実験を行い、同定したncRNAの機能解析を行う。今年度に引き続き、ヒトES細胞の培養を行う予定である。特に神経分化を可視化するSOX1レポーターヒトES細胞の樹立は、次年度に引き続き行う予定であり、この樹立に必要な試薬、器具類は、今年度より繰り越して次年度においても購入予定である。未使用額の発生は、効率的な物品調達を行った結果であり、翌年度の消耗品の購入に充てる予定である。次年度からは、本格的にノックダウンによるスクリーニングを開始するため、必要な試薬、器具類などの消耗品を主に購入予定である。
運動神経の成長円錐ガイダンス・軸索分岐・神経筋結合における包括的な制御機構の解析

ゼブラフィッシュには遺伝子重複によって2つのSema3A遺伝子が存在する。前年度ではそのうちの一方であるsema3a1が脊髄運動神経の軸索ガイダンスを制御するとともに過剰な軸索側鎖を抑制する働きのあることを明らかにしたが、今年度はこれに引き続いて、もう一方のsema3a2が、軸索を生じる以前の神経細胞体の細胞移動を制御し、体節と脊髄運動神経の空間的なマッチングを担っていることを明らかにした。ゼブラフィッシュの脊髄においてCaudal Primary Motoneuron (CaP)は最も早く発生し、その軸索は神経細胞直下の基底膜を突き破って最初に脊髄外へ伸展するパイオニア・ニューロンとなることから、必然的にこの細胞の位置が各分節レベルごとの運動神経の共通の出口(Exit point)を定めることにとなる。CaPにはSema3Aのレセプター・サブユニットであるNrp1が特異的に発現しており、脊髄に隣接する体節が分節構造をとる前の未熟な段階では前後軸に沿ってランダムに存在するが、体節の分節構造が形成されると前後方向への移動を開始し、体節のちょうど中央に規則正しく配列するようになる。このとき体節にはSema3a2が発現し、反発作用によってこの細胞運動を制御していることを明らかにした。体節は各分節レベルの体幹筋になるとともに椎骨に分化していく組織であり、運動神経は規則正しい出口から椎骨の間をくぐり抜けて同じレベルの体幹筋を支配する。Sema3a2/Nrp1にシグナルは、それぞれ別々に発生する神経系と中胚葉系の協調した発生を支えているといえる。これまでの研究結果から私たちは、軸索ガイド因子Sema3aがゼブラフィッシュ脊髄でCaPと呼ばれるパイオニア運動神経を特異的に反発し、その成長円錐を伸展経路途上のチョイスポイントと呼ばれる位置に導く作用を持つことを予測していた。この仮説をSema3aおよびNeuripilin1のノックダウン実験により検証したところ、予想通り軸索ガイダンスのエラーを見いだすと同時に、これまでの研究でははっきりしていなかった、セマフォリンの新たな作用を発見した。その一つは、Sema3a/neuropilin1のノックダウン胚では軸索に多数の異常なフィロポディアが生じることを見いだし、さらにこれが過剰な軸索側鎖を形成するプロセスを明らかにしたことである。これまでのノックアウトマウスの研究から、セマフォリン非存在下では軸索の非束状化の起きることが知られていたが、本研究はこれに加えて、セマフォリン・シグナルがフィロポディアの抑制を通して側鎖形成をコントロールすることを新たに示したものといえる。2つめの発見はノックダウン胚では軸索伸長の一時停止が見られなくなったことがあげられる。正しい軸索ガイダンスを実現するために、多くの神経で中間標的との結合、その場での軸索伸長伸長の停止が報告されている。CaPの場合は、チョイスポイントと呼ばれる場所での一時停止とそこでのパイオニア筋管細胞とのコンタクトが神経細胞および軸索の維持に重要であり、これがセマフォリンにより制御されていることを明らかにした。私たちの発見は、軸索ガイダンス因子が一時停止のシグナルとしても作用することを示す初めての例である。