hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
活性アセタール類を活用する新不斉合成反応の開発とその応用

活性アセタールを活用する新規立体制御法の開発と新規官能基導入試薬としての利用、アセタール構造の種類による生物活性に及ぼす影響などを中心課題として研究を行った。まずO, O-アセタールに関しては、エンドフェニルノルボルネンアルデヒド化合物を不斉補助剤として、分子内ハロエーテル化を鍵反応とするメソ-1,4-ジオールの高選択的不斉非対称化に成功した。さらにこの不斉補助剤を用いて、メソ-1,3-ジオール及びメソ-1,2-ジオールの不斉非対称化にも成功した。また独自に開発したO, O-アセタール構造を有するエトキシビニルエステルを用いるリパーゼ触媒不斉エステル交換反応で、対称性1,3-ジオール類の高効率的な不斉非対称化法を開発し、不斉四級炭素の短工程構築法を確立した。本法を応用して、制がん抗生物質フレデリカマイシンAのABCDE環部アナローグの両鏡像体の不斉合成した。またO, S-アセタールに関しては、収率良く単離したキノンモノ-O, S-アセタール体とシリルエノールエーテル又は電子豊富な芳香族化合物の、穏和な条件下で収率良く進行する新規なスルフェニル化反応を見いだした。さらに、芳香族化合物を求核種としてアセタール炭素β位でのSN2'反応による炭素-炭素結合形成反応を見いだした。またキノンモノ-O, S-アセタール体の構造を修飾することにより上記の硫黄原子あるいはアセタール炭素β位への求核反応のルートの制御に成功した。一方、N, S-アセタールに関しては、抗腫瘍性海洋アルカロイド、ディスコハブディン類含硫誘導体のコア構造である硫黄原子で架橋された特異なスピロ環部位の合成を検討し、超原子価ヨウ素試薬PIFAを用いてスピロ環構造を先に構築後、N, O-アセタールを経るN, S-アセタールへの効果的な変換反応をし、ディスコハブディンAの世界最初の全合成にも成功した。活性O,O-アセタール、O,S-アセタール、N,S-アセタールの、新規立体制御法の開発と新規官能基導入試薬としての利用、アセタール構造の種類による生物活性に及ぼす影響などを中心課題として研究を行った。まずO,O-アセタールに関しては、同一分子内にオレフィンとアセタールを併せ持つエンアセタール類の分子内ハロエーテル化反応で、キラルなオキソニウムイオン種を生成し、まず、1)σ-対称ジエン類の不斉非対称化-多不斉中心の立体選択的構築として、シクロヘキサジエンアセタールの立体選択的ハロエーテル化反応により2個の二重結合の識別に成功した。さらに数工程を経て3個の不斉中心を一気に構築できた。また2)σ-対称ジオール類の不斉非対称化として、我々の見い出した光学分割法により、エンド置換基を有するノルボルネンアルデヒド化合物を得、メソ-1,3-ジオールの不斉非対称化を高収率、高立体選択的に行うことに成功した。またO,S-アセタールに関しては、我々独自の手法により、収率良く単離したキノンモノ-O,S-アセタール体とシリルエノールエーテル及び電子豊富な芳香族化合物の、穏和な条件下で収率良く進行する新規なスルフェニル化反応を見いだした。一方、芳香族化合物を求核種としてキノンモノ-O,S-アセタール体と反応させ、アセタール炭素β位でのSN2'反応が進行し炭素-炭素結合形成した化合物を与えることを見いだした。

またキノンモノ-O,S-アセタール体の構造を修飾することにより上記の硫黄原子あるいはアセタール炭素β位への求核反応のルートを制御できることを見いだした。一方、N,S-アセタール合成に関しては超原子価ヨウ素試薬を用いるスルフィドへのα位アジド化法を既に見い出しているので、今年度はその不斉化の検討を行った。現在のところ、満足できる結果は得られていないが、次年度は更なる改良を加えたい。活性アセタールを活用する新規立体制御法の開発と新規官能基導入試薬としての利用、アセタール構造の種類による生物活性に及ぼす影響などを中心課題として研究を行った。まずO, O-アセタールに関しては、同一分子内にオレフィンとアセタールを併せ持つエンアセタール類の分子内ハロエーテル化反応を利用するσ-対称ジオール類の不斉非対称化のために、エンドフェニル基を有するノルボルネンアルデヒド化合物を光学的に純粋に得、この不斉源を用いて、これまで純化学的不斉非対称化によって良好な結果が得られていないメソ-1,4-ジオールの不斉非対称化を行ない、高い光学純度でメソ-1,4-ジオール誘導体を得た。またこのエンドフェニル基を有するノルボルネンアルデヒド化合物は、メソ-1,3-ジオール及びメソ-1,2-ジオールの不斉非対称化にも有効で、対応するジオール誘導体を高い光学純度で与えた。また我々が独自に開発したO, O-アセタール構造を有するエトキシビニルエステルを用いるリパーゼ触媒不斉エステル交換反応で、従来の酵素反応では困難であった対称性1,3-ジオール類の高効率的な不斉非対称化法を開発し、不斉四級炭素の短工程構築法を確立した。本法を応用して、制がん抗生物質フレデリカマイシンAのABCDE環部アナローグの両鏡像体の不斉合成し、本法が種々の類縁体の不斉合成に利用できることを明らかにした。一方、N, S-アセタール合成に関しては、抗腫瘍性海洋アルカロイド、ディスコハブディン類含硫誘導体のコア構造である硫黄原子で架橋された特異なスピロ環部位の合成を検討した。その結果、超原子価ヨウ素試薬PIFAを用いてスピロ環構造を先に構築後、N, O-アセタールを経るN, S-アセタールヘの効果的な変換反応を見出すと共に、その方法を利用してディスコハブディンAの世界最初の全合成にも成功した。
マウス半数体ES細胞の簡便な継代培養法の開発

半数体細胞はゲノムが1セットしかないため、遺伝子破壊による機能解析を容易に行うことができる。近年では、半数体ES細胞はマウスやラット、サルなど様々な動物種で樹立されており、哺乳類のゲノム解析を単純化することに貢献するものと考えられる。一方、半数体ES細胞は培養中に自発的にに2倍体化してしまうため、定期的に半数体のみを取り出す作業が必要である。本研究費の支援を受けて、我々は標準レーザーを搭載したFACSで実施可能な簡便な半数体細胞の抽出と培養法を開発した。平成27年度は、半数体ES細胞を簡便に分離する方法の開発を行った。半数体ES細胞はそのまま継代すると、およそ3週間で完全に2倍体化する。予備実験により、G1期の半数体細胞は2倍体化した細胞よりも小さいことが分かっているので、細胞の大きさにより分離するシステムを立ち上げることにした。具体的には、以下の2通りの実験を行った。1)精密ナイロンメッシュを用いた半数体細胞の分離通常の2倍体ES細胞の直径が16μm程度に対し、G1期の半数体ES細胞は10μmしかない。よって、半数体細胞のみ通過できるナイロンメッシュに細胞を通過させると、直径の小さい半数体細胞を効率的に分離できないか検討する。このナイロンメッシュは規格品では、5、10、15μmのものが市販されているので、これら3種類を試した。結果、もっとも大きなG2/M期の2倍体細胞はある程度取り除くことができたものの、半数体細胞のみを濃縮することはできなかった。2)FSCとSSCによる半数体細胞の分離市販のFACSはどの機器でもFSC(前方散乱=Forward Scatter)とSSC(側方散乱=Side Scatter)パラメーターを保有している。FSCは細胞の大きさに相関があり、SSCは細胞内の構造と相関がある。この2つのパラメーターを利用することにより、半数体ES細胞を効率良く分離できないか検討した。FSC/SSCの最も左下にある小さな細胞集団をソートし、固定PI染色の後、FACSを用いて半数体細胞の純度を調べたところ、約91%がG1期の半数体細胞の集団に濃縮できた。従来法では、細胞をヘキストで染色し、特殊なレーザーを搭載したFACSでしか半数体細胞を分離することはできなかったが、本方法により簡便でFACSがあればどこでも分離できるようになった。27年度は簡便な半数体分離方法の確立を予定していたが、FACSのFSC/SSCパラメーターを用いて簡便に分離できる方法を確立できたため、おおむね任務を遂行できたと思われる。細胞分裂異常によりゲノムが4倍体になるとp53依存的なチェックポイントがはたらき、細胞分裂の停止(p21活性化)および細胞死(Bax活性化)へと導く(Andreassen et al., Mol Biol Cell, 2001; Fujiwara et al., Nature, 2005)。我々は、ゲノムが半分量になっても、p53依存的チェックポイントがはたらき、2倍体化した細胞の増殖が有利となると予想している。また栄養膜幹細胞であるTS細胞などが多核化する場合、p57、p21の活性化により細胞質分裂が阻害されてゲノムが倍化する(Ullah et al., Gene Dev, 2008)。特にp57については、インプリントを受けており、母方由来のDNAからのみ発現する。すなわち、未受精卵由来の半数体ES細胞ではp57が過剰に発現している可能性がある。以上のことをふまえ、これらの因子をKOもしくは阻害することにより継代中の半数体細胞の比率がどのように変化するのか調べた。平成28年度は、p53 KO半数体ES細胞の樹立を行なった。p53+/-マウスを過排卵処理して未受精卵を回収した。未受精卵は塩化ストロンチウム活性化培地で培養することで単為発生させ、桑実期胚をES細胞樹立培地で培養することにより、半数体ES細胞の樹立を行なった。現在、倍数性の確認等を行なっている。平成2829年度にかけて、複数の遺伝子をKOした半数体ES細胞の樹立を予定している。平成28年度はp53-KO半数体ES細胞の樹立を行うことができたので、おおむね順調に遂行できていると考えられる。ゲノムを1セットしかもたない半数体ES細胞は、遺伝子の機能を調べる上で非常に有用である。しかし半数体ES細胞を継代培養するとおよそ3週間で全て2倍体化してしまう。我々は、ゲノムが半分量の半数体でも、p53依存的チェックポイントがはたらき、2倍体化した細胞の増殖が有利となると予想していた。そこで昨年度はCRISPR/Cas法によりp53-KO半数体ES細胞の樹立を行なった。今年度は、p53-KOおよび野生型の半数体ES細胞を、FACSで半数体細胞のみをソートし、培養7、9、21日目にサンプリングを行った。こららの細胞は70%エタノールによる細胞固定後、PI染色を行った後、FACSVerse (BD)により倍数性を確認した。

しかしながら、予想に反して、いずれもソート後21日目で完全に2倍体化していることが明らかとなった。念のため、p53転写阻害剤であるPifithrin-α(10 μM)添加区と非添加区でも同様の比較を行なったが、やはりp53を阻害しても2倍化を抑えることはできなかった。我々の研究から、4倍体の細胞死や排除はp53によって制御されているが(Horii et al., Sci Rep 2015)、半数体の細胞死や排除はp53とは別のシステムで行われていることが明らかとなった。半数体細胞はゲノムが1セットしかないため、遺伝子破壊による機能解析を容易に行うことができる。近年では、半数体ES細胞はマウスやラット、サルなど様々な動物種で樹立されており、哺乳類のゲノム解析を単純化することに貢献するものと考えられる。一方、半数体ES細胞は培養中に自発的にに2倍体化してしまうため、定期的に半数体のみを取り出す作業が必要である。本研究費の支援を受けて、我々は標準レーザーを搭載したFACSで実施可能な簡便な半数体細胞の抽出と培養法を開発した。28年度以降は、半数体細胞が2倍体化するメカニズムを調べるため、CRISPR/Cas法を用いた原因候補遺伝子の破壊を半数体ES細胞で行う予定である。KO細胞株を用いて、FACSで倍数性の確認を行う。KO細胞株では野生型と比べ、半数体の比率が多いと予想している。また、RNAおよびタンパクを抽出して、それぞれreal-time RT-PCRおよびウエスタンブロットによって、mRNA発現量や活性化タンパクの量を測定し、野生型細胞株と比較する。また、半数体のチェックポイントが存在するならば、G1期での細胞周期の停止およびアポトーシスが起きているかもしれない。そのため、G1期の細胞の割合およびTUNEL染色によるアポトーシス細胞の割合をFACS(FACSVerse, BD社)で解析する。さらに、これらの因子は染色体の安定性にも関わるので、染色体数が半数体(1N=20)を正確に維持しているのか染色体標本を作製して確認する。発生工学
乳癌臨床検体を用いたHER2標的療法効果予測法の開発

HER2陽性乳癌に対しては多数のHER2標的治療薬が開発されているが、HER2以外の効果予測因子は確立していない。本研究ではHER2標的療法効果予測因子についての検討を進めた。また臨床検体を対象とした研究として、HER2陽性乳癌と診断されtrastuzumabを含む術前化学療法が施行された乳癌症例を対象に、HER2-2 dimer発現と病理学的完全寛解の相関を検討した。HER2陽性乳癌23症例の解析において、HER2-2 dimer高発現症例ではHER2-2 dimer低発現症例よりも有意に高いpCR率を認めた(高発現11/16, 69%,低発現1/7, 14%, p=0.002)。我々はProximately ligation assay(PLA)法を用いたHER2およびHER2二量体発現解析をすすめ、in vitro研究として乳癌細胞株を対象とした研究を進め1PLA法によりHER2発現を定量化・数値化することが可能であり、HER2陽性細胞株とHER2陰性細胞株を明瞭に区別することが可能であった2PLA法によりHER2-2 dimer発現を定量化・数値化することが可能であり、HER2陽性細胞株間においてHER2-2 dimer高発現細胞株とHER2-2 dimer低発現細胞株に分類であった3HER2-2 dimer発現がtrastuzumabの効果予測因子となること、PLA法によるHER2発現がT-DM1の効果予測因子となることを発見した。臨床検体を対象としたin vivo研究として、HER2陽性乳癌と診断されtrastuzumabを含む術前化学療法が施行された乳癌症例を対象に、HER2二量体発現と臨床病理学的因子および薬物療法効果の相関を検討した。HER2 monomer発現、HER2-2 dimer発現、HER2-3 dimer発現は各症例によって異なるものの、各発現には有意な相関効果を認めることが確認された。各monomerおよびdimer発現と臨床病期および悪性度に有意な相関は認めなかった。HER2陽性乳癌に対する術前化学療法の効果予測として、各monomerおよびdimer発現が高い症例では病理学的完全寛解が得られる傾向が認められたが、有意な差は認められなかった。乳癌平成25年度はHER2陽性乳癌細胞に対するPLA法によるHER2およびHER2-2 dimer発現解析法の手技習得・確立のためにin vitroの研究を中心に施行した。臨床検体を対象とした研究はまだpreliminaryな検討を進めた段階であり、いまだ臨床検体についてのデータが不十分であるため、やや遅れていると評価した。またHER2-3 dimer経路についてはligand-dependant経路についてのアッセイが十分に検討されていない。今後はHER2標的治療が施行されたHER2陽性乳癌症例の検体を用いた検討を進め、PLA法によるHER2およびHER2-2 dimer発現が有望な効果予測因子となることを明らかとする。許可が得られれば、多施設共同臨床試験に登録された検体を対象としたトランスレーショナルリサーチに参画し研究を進める。
大強度の原子炉反ニュートリノを用いた長基線ニュートリノ振動現象の研究

本研究では、1000トンの液体シンチレータを用いた反ニュートリノ検出器(KamLAND)における原子炉反ニュートリノの観測において、検出器の較正を繰り返し、時間分解能を向上させて検出誤差の削減を行った。また、期待される事象数の見積もりに混入する誤差を減らすために、各原子炉における運転熱出力と燃料組成比の追跡を行った。時間分解能に対する較正は、窒素レーザによる波長500nmのレーザパルス光を検出器中心部から照射し、1325本の17インチ光電子増倍管と554本の20インチ光電子増倍管それぞれの出力波形の立ち上がり時刻と出力電荷の相関をnsオーダーで補正するものである。検出器に対する改良作業などに合わせてこの測定を行い、各測定環境下で最適な時間分解能を得た。原子炉での反ニュートリノの発生量の見積もりは、運転熱出力と核燃料の初期組成をパラメータとして典型的な原子炉に対する詳細な計算結果を補正することで求めた。KamLANDでは258個の反ニュートリノを3.4MeV以上のエネルギー領域に系統誤差5.5%で観測した。この期間に期待される、振動がない場合の予測事象数は365.2であり、系統誤差は3.4%である。全体の系統誤差は6.5%である。これらのKamLANDでのデータを用いると、ニュートリノ振動パラメータの最適値はΔm^2=7.9^<+0.6>_<-0.5>×10^<-5>eV^2、tan^2θ=0.46となり、太陽ニュートリノ実験による結果と矛盾しない。さらにKamLANDと太陽ニュートリノ実験の結果を組み合わせて解析した場合のニュートリノ振動パラメータの最適値は、現在最も高い精度の測定値となっている。所属する研究機関では、1000トンの液体シンチレータを用いた反ニュートリノ検出器(KamLAND)を用いて、原子炉反ニュートリノの観測によるニュートリノ振動現象の解明を続けてきた。これに関連し、本年度、検出器の主要要素である1325本の17インチ光電子増倍管の時間応答特性に対する較正を行なった。測定の光源として窒素レーザによる波長500nmのレーザパルス光を使用し、検出器の液体シンチレータ中心部に設置した光ファイバ先端部から全方向へ出力した。そして、このレーザーパルス光による各光電子増倍管の出力波形の立上り時刻と出力電荷の関係をエレクトロニクスの出力カウント値を用いて解析した。その結果、時間応答特性は光電子増倍管の出力電荷のカウント値に対して依存性があり、基本的には電荷の対数の2乗関数として表すことができた。また、この測定結果を用いて、各光電子増倍管に対する印加高電圧や信号ケーブルの長さが異なることなどが影響する出力時刻への補正を行なった。検出器全体の1p.e.相当光に対する時間分解能は当初の6ns程度から1.98nsまで向上し、反ニュートリノ検出事象数の系統誤差を減少させることができた。この測定は検出器のエレクトロニクスの改良などによる測定条件の変化に対応するため、今年度は5回行なった。そして、測定条件が変化していなければ時間応答特性の長期安定性が保たれていることが確かめられ、今後はこの程度の頻度で測定を続ければ十分であることがわかった。一方、各測定の間に少数の光電子増倍管に発生する時間応答特性の変化に対応するために、通常の反ニュートリノ測定時間内に検出器中心部で検出した宇宙線ミュー粒子による事象の解析により、時間応答特性の電荷に依存しない成分に対する補正をさらに加えることにしている。これに関連し、検出器の主要要素である1325本の17インチ光電子増倍管と554本の20インチ光電子増倍管の時間応答特性に対する較正を継続した。これは、窒素レーザによる波長500nmのレーザパルス光を検出器中心部から照射し、各光電子増倍管の出力波形の立ち上がり時刻と出力電荷の関係をns単位で解析するものである。昨年度の測定により、エレクトロニクスの改良などによる測定条件の変化がなければ時間応答特性は安定していることがわかっている。したがって今年度は、新しい光電子増倍管の使用開始やそれらに対する印加電圧の調整など、検出器の改良時期に合わせて測定を実施し、それぞれの測定条件下で最適な時間分解能を得ることができた。また、本年度は各原子炉における日々ごとの運転出力の変化を追跡して予想される事象数に反映させ、原子炉反ニュートリノ以外のバックグラウンドによる事象数の評価を行なった。これは、検出器の位置する岐阜県飛騨市神岡町における原子炉反ニュートリノフラックスが今年度7月頃に通常期の50%程度まで減少したことを利用し、検出事象数と期待事象数の相関関係を解析したものである。その結果、フラックスが低下していた期間は2ヶ月程度と短期間であったため統計的なふらつきが大きかったにもかかわらず、1σの範囲内で未知のバックグラウンドは0であることが確認できた。フラックスは現在75%程度にまで上昇しており、今後のデータも加えることによってさらに解析精度が上昇すると見込まれる。

時間分解能に対する較正は、窒素レーザによる波長500nmのレーザパルス光を検出器中心部から照射し、1325本の17インチ光電子増倍管と554本の20インチ光電子増倍管それぞれの出力波形の立ち上がり時刻と出力電荷の相関をnsオーダーで補正するものである。検出器に対する改良作業などに合わせてこの測定を行い、各測定環境下で最適な時間分解能を得た。原子炉での反ニュートリノの発生量の見積もりは、運転熱出力と核燃料の初期組成をパラメータとして典型的な原子炉に対する詳細な計算結果を補正することで求めた。KamLANDでは258個の反ニュートリノを3.4MeV以上のエネルギー領域に系統誤差5.5%で観測した。この期間に期待される、振動がない場合の予測事象数は365.2であり、系統誤差は3.4%である。全体の系統誤差は6.5%である。これらのKamLANDでのデータを用いると、ニュートリノ振動パラメータの最適値はΔm^2=7.9^<+0.6>_<-0.5>×10^<-5>eV^2、tan^2θ=0.46となり、太陽ニュートリノ実験による結果と矛盾しない。さらにKamLANDと太陽ニュートリノ実験の結果を組み合わせて解析した場合のニュートリノ振動パラメータの最適値は、現在最も高い精度の測定値となっている。
血管新生におけるVE-cadherinの機能の解明と血管新生抑制法の開発

VE-cadherin (Vascylar endothelial-Cadherin)の血管新生における役割を解明すること、特にVE-cadherin依存性の細胞内情報伝達系の調節機構を明らかにすることにより、癌の血管新生メカニズムを検討することを目的に研究を行った。主な研究成果(1)当該研究の初年度にあたるため、VE-cadherinプロモーター依存性に血管新生を可視化できるマウスを作製した。このマウスは虚血により新生血管が構築される部位でgreen fluorescent protein (GFP)を発現し、蛍光顕微鏡で容易に血管を観察することができた。他の血管新生モデルとして妊娠時の血管新生の誘導によっても、骨髄内と流血中にGFP陽性細胞が出現することを確認できたので血管構築細胞が骨髄から動員される可能性が示唆された。本マウスを用いて癌移植モデルでの血管新生が可視化可能となった。(2)VE-cadherinはCa2+依存性にホモフィリックな結合を起こして、血管内皮細胞間接着を強固にする細胞間接着分子である。VE-cadherin同士の接合により、低分子量GTP結合蛋白質が活性化されることをRap1の活性化可視化プローブで確認した。この接着依存性のRap1の活性化が細胞同士の結合を強固にするメカニズムを検討した。ビンキュリン分子は細胞間接着、細胞-基質間接着の両接着を調節する分子であるが、細胞間接着が形成されるときには細胞-細胞間に顕著に移動する。この分子の移動をRap1が制御することで細胞間接着が強化されることがわかった。(3)VE-cadherinの細胞外ドメインとイムノグロブリンのFcを結合させたキメラ分子をHEK293T細胞で作製して、これを量子ドットでラベルして、VE-cadherin同士の接着により細胞内に取り込まれることを確認した。VE-cadherinを発現する細胞つまり、血管新生の盛んな部位ではVE-cadherinが多く発現すると予想され、VE-cadherin発現部位を生体で量子ドットを検出することにより検出することが可能になることが予想された。
人形芝居における儀礼の復活と門付の伝統に関する研究－淡路人形芝居を中心として

本研究は、一度消滅した淡路人形伝統の再生にみられる様々なノスタルジアの輻輳に関するジェーンマリー・ローの研究に触発され、徳島県で被差別状況故に消滅しかかった人形芝居の門付が部落解放運動の一環として復活し伝承されている事例の調査を通して、現在の儀礼細則(新正月から旧正月への移行など)が被差別状況による変容の結果であること、そして、残存する人形や衣裳や記録などの資料形態と人形遣いの足跡にみられる活動形態(門付/大道芸/興行)から地理的意味が読み取れること(マレビトの地理学)、さらに、門付を受ける側は「三番叟」まわしを神事とし、夷舁きを物もらいとして区別あるいは差別していることを明らかにした。兵庫県淡路島における人形芝居ならびに徳島県における木偶箱廻しによる門付の現状について、現地での実態調査、関係者や斯界専門家へのインタビュ、文献調査などを通じて概観を得た。とりわけ、徳島県を中心に四国全域においてこの二〇年間に阿波木偶箱廻し保存会が復活に取り組んでいる、三番叟とエビス舞による門付の実態と活発さを現地調査から把握することができた。また、徳島県では、村の祭礼に三番叟やエビス舞、人形浄瑠璃をおこなう農村舞台も復活を遂げており、漂泊芸能または大道芸である木偶箱廻しと比較するために、農村舞台の現地調査を行った。それと同時に、淡路人形芝居や阿波人形芝居、阿波木偶箱廻しに関する文献や写真など資料の収集を行った。さらに、本研究の研究史上の位置づけに関して研究分担者ならびに研究協力者と意見を交換したうえで、阿波木偶箱廻しの史料収集、歴史研究、保存活動を行っている斯界研究者、民俗芸能および民俗宗教の研究者、歴史社会学の研究者を招聘して研究会を開催した。そこで、近世における漂泊芸能民や民間宗教者のありかたとかかわり、その社会的周縁性、徳島県における史料や事例などについて議論しつつ意見交換を行った。いっぽう、研究分担者ならびに研究協力者はそれぞれ、これまでの研究成果を活かして、人形が焦点化するオシラサマ信仰の現状、人形芝居への映像人類学的アプローチ、伊勢大神楽との比較について調査研究を行っている。研究計画の段階で目標として掲げていた実地調査のほとんどの項目に着手できており、代表者と分担者、分担者どうしの連携も円滑に行われていると判断されるため。平成28年度に研究代表者は、歴史的に人形芝居が盛んな徳島県西部の各地、とりわけ東みよし町や池田市等で、主として門付の現地調査、人形芝居の歴史や地域史に関する文献調査、市町村史(誌)並びに文化財行政関係者への関する聞き書き等を行った。それと並行して、近世以来当地に伝承されてきた三番叟廻しとエビス廻しを継承し、門付を復活させた阿波木偶箱廻し保存会(徳島市内、以下保存会)に対して複数回にわたる聞き書き調査を実施した。地域史の理解は、人形芝居の実践形態と従事者たちの社会的かつ歴史的な動態を把握し、淡路島の人形伝統と比較する上で不可欠な前提的作業である。保存会に対しては、差別の対象でもあった人形廻しを復興させた事情について調査することで、本研究にとって重要な事柄である、漂泊の門付を現代に蘇らせることへの誇りと、被差別経験による「痛み」のかかわりを理解しようとした。併せて、研究代表者および全研究分担者、ならびに関連する科研の研究代表者が、保存会による2017年旧正月の門付に同行し、現地調査を行った。今回の廻檀先は、先祖代々人形遣いに従事した保存会の師匠が自身の地元で長年門付をしていた地域の中にあることに意義がある。それらに加え、保存会が関わっている東みよし町法市の農村舞台の実地調査、人形師(徳島市)による人形の製作過程に関する聞き書き調査、さらに、人形芝居に関わる文化財指定の経緯と問題点に関する調査を実施した。研究実施計画に掲げた調査項目の調査を、計画した日程に沿って実施できているから。また、進捗状況に対するそうした判断は、代表者が所属研究機関の実施する監査を受けた際に、予算の執行状況の観点から研究の実施状況が妥当であるとの評価を受けたから。近世以来、徳島県西部において人形遣いが集住した地域の神社を調査し、その地理と景観の特徴を探った。また、当該地域で長年門付を受け入れてきている酒造と農家で聞き書きと映像撮影を行いつつ、歓待する側の様子や心情を探った。本科研にとって最も重要な研究協力者である阿波木偶箱廻し保存会が参加する四国部落史研究協議会の2017年度夏合宿に参加した。具体的には、愛媛県大洲市における「2017年部落史シンポジウム」と「宇和島市内の部落」に関するフィールドワークに参加し、四国地方の部落史に対する新しい知見を得た。筆者が密着して調査研究を行っている阿波木偶箱廻し保存会は、門付芸である三番叟廻しとエビス廻しを徳島県東みよし町昼間の人形遣い芸人から伝承しているが、その昼間の同じ町内の字法市には明治時代に氏神の船渡神社に農村舞台が建立され、一度廃れてから2002年頃に再発見され、秋祭りが復興した。阿波木偶箱廻し保存会は、自らの神事芸能の原点である東みよし町の農村舞台の復興に大きく貢献し、現在も秋祭りの農村舞台と深い関わりをもっているが、法市農村舞台保存会会長への聞き書き、10月1日の農村舞台本番の調査を実施した。そこで、徳島県で発達した農村舞台と漂白芸能民のかかわりあいを探った。

大正時代から毎年1月15日の小正月に美馬市脇町東俣名古屋敷で行われる阿波木偶の門付と、ムラの氏神である三社神社並びに三笠氏の同族神への三番叟の奉納の現地調査を行った。2018年1月15日当日は古屋敷において門付、三社神社への三番叟奉納、同族神への奉納を調査し、ムラの世話役に対する聞き書き調査を行った。そこで、いわゆる戎掻き阿波木偶箱廻し保存会が所属する芝原生活文化研究所の代表者への聞き書き調査を行った。そこで、いわゆる夷舁きと三番叟廻しに対する態度に厳然たる違いがあり、前者には差別的な態度を示していたことが分かった。本研究は、一度消滅した淡路人形伝統の再生にみられる様々なノスタルジアの輻輳に関するジェーンマリー・ローの研究に触発され、徳島県で被差別状況故に消滅しかかった人形芝居の門付が部落解放運動の一環として復活し伝承されている事例の調査を通して、現在の儀礼細則(新正月から旧正月への移行など)が被差別状況による変容の結果であること、そして、残存する人形や衣裳や記録などの資料形態と人形遣いの足跡にみられる活動形態(門付/大道芸/興行)から地理的意味が読み取れること(マレビトの地理学)、さらに、門付を受ける側は「三番叟」まわしを神事とし、夷舁きを物もらいとして区別あるいは差別していることを明らかにした。阿波木偶箱廻し保存会が三番叟廻しとエビス廻しを継承し活発化させたことの意義を、具体的な動機、部落の歴史と社会状況、部落解放運動及び同和教育運動、といった様々な観点で捉えたい。そこで、彼らが創り出した新しい漂泊性について考えつつ、民俗学や文化人類学の立場で本研究の成果をまとめたい。さらに、門付の研究を軸として、歴史学における身分的周縁論や、思想史における歓待(排除)論と連携できる学際的なテーマを構想し、本研究の発展を図りたい。文化人類学・民俗学追加採択であったために、初年度である平成27年度10月までの支出がなかった。主に研究分担者二名の直接経費の残額による。平成28年以降の研究計画を見直して、実地調査のさらなる充実をはかることに次年度使用額を充当したい。本研究の出発点である先行研究者、ジェーンマリー・ロー氏、あるいは、斯界の専門家を海外から招聘し、本研究と関連する領域の海外での研究動向や新知見について意見交換を行う企画を検討したい。また、研究成果は、学会発表、シンポジウム開催、図書の出版などのかたちで公表に取り組んでいるが、映像人類学の観点から映像記録を製作する企画を検討したい。
ホイスラー合金層を用いた多結晶面直電流型巨大磁気抵抗素子の高出力化

28年度が最終年度であるため、記入しない。
プラセオジウム化合物の核磁気相転移点近傍における臨界現象の研究

測定試料としてPrCu_2,PrCu_6,PrIn_3を,磁化測定用と電気抵抗測定用として,結晶軸をそろえてペアで用意した。この3つの試料を準備していたのは,相転移温度が約20mK,2mK,0.3mK以下と一桁ずつ異なっており,電子系の磁気相転移から核スピン系の磁気相転移の移り変わりも観測できるからである。この試料の結晶軸方向はX線より同定した。また,PrCu_6の結晶の欠陥や純度を評価する残留抵抗比(RRR)を測定した結果,63であった。この値はこの物質では非常に高く,純度のよいことがわかった。このPrCu_6について,電気抵抗とAC帯磁率の同時測定を現在進行中で,転移温度近傍でAC帯磁率の実数成分と虚数成分が各々ピークを持つことが判明した。しかし,まだそのピークがちょうど転移温度に当たるのか,転移温度の直上で起こっているのかは不明である。というのは,スピン緩和時間が1日以上と非常に長く(Critical Slowing Down)完全な熱平衡状態がまだ実現できていないからである。しかし,電気抵抗の振る舞いと帯磁率の振る舞いは1対1に対応しており,以前の電気抵抗測定の解析に用いた,帯磁率の効果は基本的には正しかったことが判明した。また,帯磁率測定と同時に磁化測定を行えることがわかったので,その結果も入れて,転移温度近傍の臨界現象の解明を行う予定である。現在,測定試料としてPrCu_2,PrCu_6PrIn_3を,磁化測定用と電気抵抗測定用を結晶軸をそろえてペアで用意している。この3つの試料を準備しているのは,相転移温度が約20mK,2mK,0.3mK以下と一桁ずつ異なっており,電子系の磁気相転移から核スピン系の磁気相転移の写り変わりも観測できるからである。この試料の結晶軸方向はX線より同定し,現在,結晶の欠陥や純度を評価する残留抵抗比(RRR)の測定を準備している。超低温で磁化および電気抵抗の測定を行う際,試料と冷媒の熱接触,試料と温度計の熱接触および測定による発熱を抑えることが重要となるが,この間の経験の蓄積により,試料と温度計と冷媒との熱接触に関しては1mKにおいて0.01mK以下の精度まで制御できるようになった。磁化測定における発熱については,計算上無視できる程度に小さいことがわかっている。しかし、電気抵抗の測定では,温度の低いところで問題となってくることが予想され,低電流値で測定の感度を上げる工夫をしている。テスト実験の結果,試料の抵抗値よりも電極と試料の接触抵抗の方が大きいことが判明したので,電極作製を材質を変えて試みている。また、PrIn_3の予想される転移温度が低いので,冷凍装置である核断熱消磁装置の性能のチェックを液体ヘリウムの研究と同時に行い,現在のところ,2段核断熱消磁の電子温度で約20muKに冷却可能となった。
排卵周期制御機構における卵巣-子宮-免疫系ネットワークの解明

本研究により、黄体で合成されるPGF2a、PGE2、コルチゾール、アセチルコリンが細胞死抑制因子として黄体機能の維持に作用すること、また、低酸素環境は黄体機能の衰退と消失(細胞死)に重要な環境要因であることが明らかにされた。また、コルチゾール、interleukin-1aは、子宮内膜のPGF2a合成制御因子として作用し、排卵周期の発現のみならず妊娠成立にも重要な役割を果たすことが示された本研究により、黄体で合成されるPGF2a、PGE2、コルチゾール、アセチルコリンが細胞死抑制因子として黄体機能の維持に作用すること、また、低酸素環境は黄体機能の衰退と消失(細胞死)に重要な環境要因であることが明らかにされた。また、コルチゾール、interleukin-1aは、子宮内膜のPGF2a合成制御因子として作用し、排卵周期の発現のみならず妊娠成立にも重要な役割を果たすことが示された本研究の目的は、排卵周期発現のための卵巣(黄体)及び子宮における局所ならびに相互調節機構を解明することであり、本年度は基礎的研究に注力した。即ち、卵巣周期制御における分子機構の解明を進めるべく、黄体におけるアポトーシス制御因子及び子宮内膜のPG合成調節因子の特定について解析を行い、以下の点を明らかにした。1.主要な細胞内シグナル活性化剤を用いた検索により、cAMPならびにプロテインキナーゼCを介する生理活性物質が黄体細胞のアポトーシスを抑制し、カルシウムイオンを介する生理活性物質がアポトーシスを促進する可能性を示唆した。2.ウシ黄体細胞において、一酸化窒素(NO)が黄体細胞のアポトーシスを誘導することをNOドナーを用いて示すとともに、その際の細胞内アポトーシス誘導経路について解明した。3.黄体退行時の「低酸素環境」を黄体機能制御に関わる微細環境として捉え、低酸素環境が黄体細胞のP4分泌能を減少させることにより黄体退行に関与する可能性を明らかにした。4.ウシ黄体において下垂体ホルモンとして知られるプロラクチン(PRL)とそのレセプターが発現していることを明らかにし、PRLが黄体内機能調節因子として役割を果たしている可能性を示した。5.ウシ子宮内膜において、植物性エストロジェンが核内に存在するエストロジェンレセプターを介したgenomic-effectによりPGF2αならびにPGE2分泌を促進することを示した。これらの成果は、生殖科学の分野において高く評価されている専門雑誌(Endocrinology, Biology of Reproduction等)に掲載された。また、次年度以降は本年度の研究を継続するとともに、再構築系細胞培養モデルを用いた細胞間相互作用について詳細な解析を行い、卵巣-子宮間のクロストースと免疫細胞とのネットワークの解明を試みる。本年度は、前年に引き続き卵巣周期制御における分子機構の解明を進めるべく、黄体細胞のアポトーシス制御因子および子宮内膜のプロスタグランジン(PG)合成調節因子の特定について解析を行い、以下の点を明らかにした。1.活性化型glucocorticoidであるcortisolがウシ黄体細胞のアポトーシスを抑制することにより黄体機能の維持に役割を果たす可能性を明らかにした。2.黄体退行時の低酸素環境下において黄体細胞のプロジェステロン分泌能が衰退し、アポトーシスが誘導されることを明らかにした。3.ウシ子宮内膜においてcortisolがPGF2α産生を抑制することにより黄体維持に作用する可能性を示した。4.発情周期を通じたウシ黄体におけるエストロジェンレセプター(ER)αおよびβの発現比の変化とともにER発現調節因子を明らかにした。これらの成果は生殖科学の専門雑誌であるBiology of Reproduction等に掲載された。次年度は本年度の研究を継続するとともに、再構築系細胞培養モデルを用いた細胞間相互作用について詳細な解析を行い、卵巣-子宮間のクロストークと免疫細胞とのネットワーク解明を試みる。本研究の目的は、排卵周期発現のための卵巣(黄体)及び子宮における局所ならびに相互調節機構を解明し、見出した知見をもとに排卵周期制御機構を新たに開発することにある。即ち、卵巣周期制御における分子機構の解明を進めるべく、黄体におけるアポトーシス制御因子及び子宮内膜のprostaglandin (PG)合成調節因子の特定について解析を行い、以下の点を明らかにした。1.ウシ黄体細胞でアセチルコリン(Ach)が合成されていることを初めて証明し、Achが局所調節因子として黄体細胞のアポトーシスを抑制することを示めした。2.排卵周期中期のウシにPGF2αを投与したところ、卵巣静脈中の酸素ならびに一酸化窒素(NO)の濃度が一過性に高まることから、PGF2αは活性酸素ならびにNOにより黄体細胞のアポトーシスを誘導し、黄体を退行させることを明らかにした。3.黄体退行時の「低酸素環境」を黄体機能制御に関わる微細環境として捉え、低酸素環境が黄体細胞のアポトーシスを誘発することにより黄体退行に関与する可能性を明らかにした。4.ウシ黄体細胞において,PGE2およびPGF2αはFAS,CASP8およびCASP3の発現または活性を抑制し、アポトーシスを抑制することによって黄体機能の維持に関与することを示した。5.ウシ子宮内膜において、局所で合成されるPGF2αが局所調節因子としてグルココルチコイド転換酵素の合成と活性を抑制することによって、発情周期中における過度のPGF2α合成が起こらないように働いていることを示した。これらの成果は、生殖科学の分野において高く評価されている専門雑誌(Biology of Reproduction等)に掲載された。
市町村合併に伴う都市圏再整備に関する地理学的研究

本年度の研究の一つ目の柱として,合併タイプ別の実態把握を引き続き行った。中心都市とその周辺地域の合併というタイプ(鳥取市など),生活圏と行政の関連が深い地域が異なるタイプ(兵庫県三田市・三木市と吉川町など),都市圏(生活圏)域全体ではなく,その一部の地域における合併タイプ(愛知県豊根村・富山村)などについて検討を進めた。さらに今年度はこれらの合併圏域と,公共サービスの供給圏域との関係を検討する目的で,公共施設データの整備を行った。具体的には空間的限界をもってサービスが供給される義務教育サービスについて戦後の時系列データを全国規模でデジタル化し,市町村合併との関係の分析をすすめた。研究の二つ目の柱として,市町村合併と都市圏構造の関係の史的変遷をGIS(地理情報システム)によって分析するために,鳥取県東部地域の明治期以降の旧版地形図から都市と農山村の中心施設とハード面でのネットワーク(道路網や鉄道など)に関するデジタルデータの作成を行った。道路ネットワークや諸側面における中心-周辺関係の実態分析から,都市圏における中心地機能と合併圏の関係について事例検討を展開した。またこれらの研究とも関係して,都市圏周辺地域(農山村)におけるハード面のネットワーク整備がいかに行われてきたかも含めて,その政策的側面について以前より研究を進めてきたが,本年度はその研究成果を最終的にとりまとめ,図書の一部として発表した(筒井一伸「国土空間の生産と日本型政治システム」,所収:水内俊雄編『空間の政治地理』(朝倉書店))。市町村合併と都市圏構造の関係を分析するため、都市圏構造の基礎となる道路ネットワークや機能配置、そして合併のタイプの分析を行った。具体的にはまず、新旧の地形図等から道路の整備と中心地関係の変化に関する分析などをすすめた。合併のタイプとしては、中心都市とその周辺地域の合併というパターン(鳥取市など)、生活圏と行政間の関連が深い地域が異なるタイプ(兵庫県三田市・三木市と吉川町など)、都市圏(生活圏)域全体ではなく、その一部の地域における合併(愛知県豊根村・富山村)などのタイプについて検討を進めた。地域政策との関連では、第1のタイプで中心市街地の空洞化を防ぎ、また合併した周辺町村の既存中心が衰退することもさけるために、機能分担関係や中心地ネットワークの中でいかに地方都市中心市街地の再生を図るかに関して研究を行った。この点に関しては鳥取市中心市街地のバリアフリーを基礎とする方策の再検討を行い、日本地理学会のシンポジウム「地方都市再生の指針」において報告を行った(山下)。また第3のタイプに関しては、都市圏における中心地機能の脆弱さから、合併圏の縮小が余儀なくされた事例の検討を通じて、道路ネットワークや諸側面における中心-周辺関係の実態を資料の分析から研究を行った。さらに住民が認識している生活圏、合併圏やまた合併圏設定に関する政治プロセスを明らかにすべく、現地に赴き、住民や行政担当者、首長への聞き取り調査をはじめとするフィールドワークを実施し、研究をすすめた。また鳥取県において実際の合併動向とは別の合併の可能性とその意味なども、都市圏構造の点から再検討を行いつつある。市町村合併をせずに単独存続を選択した市町村(鳥取県日南町)を含む都市圏に関しても、合併の3タイプとの比較検討のために資料収集や現地調査を行い分析をすすめた。
好酸球のM-CSF産生に関する研究

気管支喘息などのアレルギー疾患において、慢性の2型炎症に引き続いて起こる組織リモデリングに重要な役割を果たすM2a型マクロファージの分化に必須のサイトカインであるM-CSFを好酸球が産生することを見いだした。すなわち、ヒト末梢血(n = 11)から分離した好酸球はmembrane-bound isoformとsecretion isoformのM-CSFのmRNAを恒常的に発現しており、GM-CSFやIL-5、固相化したsecretory IgA(sIgA)の刺激によってmRNAの発現は有意に増強された。一方、platelet-activation factorやeotaxin 1の刺激ではmRNAの発現は変化しなかった。好酸球刺激後の培養上清や細胞の破砕物のM-CSFをELISAで測定したところ、上清中にはsIgA刺激でM-CSFの産生放出が確認された。一方、IL-5やGM-CSF刺激では上清にはM-CSFの放出は認められず、細胞の破砕物中のM-CSF濃度が上昇した。以上のことから、好酸球はM-CSFのmRNAやタンパクを恒常的に発現しており、IL-5やGM-CSF刺激では細胞表面へのmembrane-bound isoformの発現が強く誘導され、一方、sIgA刺激では、secretion isoformのM-CSFの上清中への放出が強く誘導される可能性が示唆された。今後は、細胞内のM-CSFの局在について検討する予定である。研究は当初の予定通り進捗している。当初の計画に沿って研究を実行しており、大きな障害無く、順調に成果が出ている。当初の研究計画書に記載された手順に従い、M-CSFタンパクの細胞内局在について、好酸球の刺激前と刺激後に細胞膜に透過処理を施す前・後で、M-CSFに対する特異的な抗体を用いて染色して、蛍光顕微鏡下に局在を検討すると同時に、Flow cytometoryを用いて定量をおこなう。また、獨協医科大学呼吸器内科との共同研究に基づき、気管支喘息および対照疾患患者の気管支肺胞洗浄液の採取をはじめる。2018年度末から蛍光免疫染色を開始する予定で、試薬(モノクローナル抗体)を発注したが、海外社製品のため、年度内に到着しなかった。そのため、22,986円分を次年度に繰り越す事とした。
超高速ドライブ用ベアリングレス誘導モータの5軸浮上制御

電動機を高速化するには高速回転に適した電動機構造が必要であると同時に、高速回転体を支持することが可能な軸受が必要である。既に、誘導電動機と磁気軸受を一体化したベアリングレスモータを提案し、その構造、原理を明らかにした。しかし、この電磁機械の高速運転時5軸磁気支持運転は行われていなかった。本年度は提案したベアリングレスモータの5軸磁気支持運転可能な試作機を製作し、10,000rpm以上の高速で運転する事を実現した。この際、主軸を支持するために、必要な追加巻線の電圧電流容量が十分小さいだろうかという疑問が生じる。このような疑問に答えるため、以下の点を明らかとした。1.機械的なアンバランスを除去し、この新しい電磁機械を制御するにフィードフォワード制御系を構成し、安定に磁気力により浮上して運転できることを明らかとした。2.極力アンバランスによる振れ周りを除去した状態で、磁気力による支持に必要な半径方向力発生巻線の端子電圧、電流を計測した。電動機巻線の端子電圧、電流の数%の電圧電流容量で済むことを明らかとした。3.さらに、理論解析を行い、主軸の機械的なアンバランスを取り除くことにより、電圧電流容量は1%以下に低減する可能性を示した。
ポピドンヨードの口腔内塗布による呼吸器装着患者の肺炎予防

人工呼吸器関連肺炎( VAP)は気管内挿管・人工呼吸器管理の患者に、人工呼吸開始後48時間以降に新たに発症した院内肺炎である。VAPを口腔ケアにより予防するために、さまざまな取り組みがなされているが、これまでの口腔ケアに加えてポビドンヨードの局所投与を行うことにより口腔咽頭の細菌数をどの程度の時間減少させることができるかをreal time PCR法を用いて直接測定する。その結果をもとに新たな口腔ケア方法を確立し実際にVAPの頻度を減少させることができるかを明らかにする。
有用物質蓄積機構の解析と制御

本研究は植物体内での同化産物の転流と子実での物質蓄積という一連の生理的過程について解明したものである。田沢は物質の細胞内輸送、特にアミノ酸の細胞内分配と光照射の関係についてタンパク合成との関係から検討した。茅野は篩管転流物質、特にそのアミノ酸組成が短時間に変動し、葉でのアミノ酸代謝の変動によって容易に影響されることを示すとともに、ダイズ子実貯蔵タンパク合成に関するメチオニンによる遺伝子発現制御系を確立し、さらにダイズ子実にメタロチオネイン様タンパクの存在する可能性を示した。中村(研)はサツマイモ貯蔵タンパク、スポラミンの細胞内分泌経路から液胞への輸送のシグナルペプチドの存在をより明確にするとともに、そのタンパクの遺伝子発現に転流物質であるショ糖が関与している可能性の高いことを示した。田中はイネの貯蔵タンパク、プロラミンのシグナルペプチドの塩基配列を明確にし、これがトウモロコシゼインのそれと強いホモロジーのあることを示すとともに、イネグルテリンのシグナルペプチドとは相同性の少ないことを示した。荒井はイネのオリザンスタチン(システィンプロティナーゼインヒビター)遺伝子のcDNAクローニングをおこない、全塩基配列を解明した。山田はヒマ種子の脂質転移タンパクをいくつか発見し、そのアミノ酸配列の決定、cDNAの調整、また抗体を用いた免疫電顕による子葉細胞内局在性を行った。稲永はダイズ子葉への脂質貯蔵も落花生と同様に光が影響し暗条件で多く集積することを示した。前はイネの強勢籾と弱勢籾でのタンパクの集積について比較し、弱勢籾でのグルテリン集積の遅れが、そのmRNAの転写レベルの制御によることを示した。池田はダイズでのタンパク集積と光強度および窒素栄養との関係について解明を深めた。中村(保)はイネのデンプン合成について酵素を単離精製した。
難治性うつ病の分子基盤としてアストロサイト由来GDNFに着目した研究

脳アストロサイトにおけるグリア細胞株由来神経栄養因子(GDNF)の産生能が障害されることがうつ病の重症化しいては難治化の分子基盤の一つを担っていると仮説を立て、その仮説を検証した。培養細胞を用いた検討から、アストロサイトを介したGDNF産生に重要な受容体としてリゾフォスファチジン酸受容体(LPA1)を同定した。動物実験を用いた検討から、抗うつ薬を長期投与した際にみられる抗うつ効果が、LPA1受容体阻害剤併用または、LPA1ヘテロKOマウスで抑制されることを明らかにした。また、線条体と海馬におけるGDNF発現変化が抗うつ行動に重要である可能性を見出した。本研究課題では、脳アストロサイトにおけるグリア細胞株由来神経栄養因子(GDNF)の産生が障害されることがうつ病の重症化しいては難治化の分子基盤の一つを担っていると仮説を立て、その作業仮説を検証するために、薬理学的・遺伝子工学的手法により検証すること、さらには、得られた成果の有用性をうつ病患者サンプルを用いて検証することを目的とする。本年度は以下の成果を得た。・培養アストロサイトにおいて、抗うつ薬により誘導されるGDNF産生作用にLPA(リゾフォスファチジン酸)1受容体が活性化されることが重要であることを示した(Kajitani et al. J Biol Chem. 2016)。・動物を用いて抗うつ薬難治化モデルとして評価するために、強制水泳試験・novelty suppressed feeding試験・open field試験等の行動実験系を立ち上げ、抗うつ薬(amitriptyline)急性投与並びに長期投与で抗うつ薬による行動変化が起きる実験系であることを確認した。・アストロサイトにおけるLPA1受容体の活性化におけるGDNF産生作用の障害が、抗うつ薬の治療抵抗性に関与している可能性を検証するため、LPA1ヘテロノックアウトマウスを購入した。現在、LPA1ヘテロノックアウトマウス及びLPA1ホモノックアウトマウスの繁殖を行っている。・うつ病患者サンプルの収集に関しては、研究協力者の協力のもと、抗うつ薬等の薬物治療抵抗性であり電気けいれん療法適応患者の末梢血及び脳脊髄液に関して、概ね目標数収集することができた。アストロサイトを介した抗うつ薬の治療効果に重要な受容体として、LPA1受容体を同定することができ、その成果は国際学術誌に受理された。難治性うつ病の分子基盤の一つとして、アストロサイトLPA1受容体シグナル経路をターゲットとして挙げることができ、今後研究が大きく進展する期待があるため。本研究課題では、脳アストロサイトにおけるグリア細胞株由来神経栄養因子(GDNF)の産生能が障害されることがうつ病の重症化しいては難治化の分子基盤の一つを担っていると仮説を立て、その作業仮説を検証するために、動物実験を用いた行動薬理学および遺伝子工学的手法により検証すること、さらには、得られた成果をうつ病患者サンプルを用いて検証するトランスレーショナルリサーチを行うことを目的とした。昨年度はアストロサイトを介したGDNF産生に重要な受容体としてLPA(リゾフォスファチジン酸)1受容体を同定することが出来た。そこで、本年度はアストロサイトLPA1受容体シグナルが、難治性うつ病の分子基盤の一つとなり得るか検討を行い、以下の成果を得た。・動物行動実験により抗うつ薬の効果を調べる強制水泳試験において、抗うつ薬を長期投与した際にみられる抗うつ効果が、LPA1受容体阻害剤を併用することで抑制された。・上記の抗うつ薬長期投与で抗うつ効果がみられる強制水泳試験において、LPA1ヘテロKOマウスでは抗うつ効果を示さなかった。従って、LPA1受容体シグナルが抗うつ薬治療抵抗性(難治性)の分子基盤の一つである可能性を動物実験レベルで示すことが出来た。・強制水泳試験後に、正常マウスと比較して、抗うつ薬長期投与並びにLPA1受容体阻害薬併用したマウス脳(前頭皮質・線条体・側坐核・海馬・偏桃体・視床下部・腹側被蓋野)からRNAを抽出し、GDNF mRNAの発現変化を調べたところ、線条体と海馬において、GDNFの発現変化と強制水泳試験における抗うつ行動が相関することを明らかにした。・研究協力者のもと収集したうつ病患者脳脊髄液を使用して、GDNF protein levelの測定をELISA法で試みたが、測定感度以下のため測定できなかった。現在繁殖しているLPA1ノックアウトマウスを用いて、通常マウスと比較し、うつ病様行動を示すか否か行動実験により検討し、合わせて、脳内または血清中のGDNFの発現に変化がないか検討する。また、通常マウスと比較し、抗うつ薬による行動変化に与える影響について検討し、LPA1受容体が抗うつ薬治療抵抗性の分子基盤を担うか否か検討する。精神神経科学