hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
プロラクチン受容体の選択的スプライシングによる黄体の運命決定機構の解明

成熟雌ラットの性周期各時期に卵巣を摘出し、プロラクチン受容体ロングフォーム、ショートフォームについてリアルタイムPCRおよびウェスタンブロットを行ったところ、黄体退行の始まる時期である発情休止期の午後に、ロングフォームとショートフォームの発現比率がRNA・タンパクレベルで逆転した。そこでロングフォームの発現のみを抑制するスプライシング切替オリゴマーを持続的に投与し、血中性ステロイド濃度の測定を行ったところ、薬剤用量依存的に発情休止期の延長がみられた。以上より、ロングフォームが黄体の機能、および寿命の決定に中心的な関わりをもつことが示唆された。ラットやマウスの黄体は、黄体形成後3日目にあたる発情休止期2日目の午前までにプロラクチン(PRL)の刺激を受けることで機能化し、十数日以上にわたってプロジェステロン産生能が維持される。ところが、同日の午後以降にPRLの刺激があると、黄体は機能化することなく、逆にアポトーシスを起こして退行する。すなわち、発情休止期2日目午後に、黄体細胞に不可逆的な機能変化が起こり、黄体の退行が運命づけられている。本研究では、PRL受容体のアイソフォームが黄体の運命決定に及ぼす分子メカニズムについて明らかにすることを目的とした。Wistar-Imamichi系成熟雌ラットを実験に供し、性周期各時期(発情休止期1日目、2日目、発情前期、発情期)の午前と午後に卵巣を摘出して、PRL受容体ロングフォーム、ショートフォーム、およびそのシグナル伝達因子についてReal-time RT PCRおよびウェスタンブロットを行った。その結果、黄体退行の始まる時期と考えられる発情休止期の午後に、ロングフォームとショートフォームの発現比率がRNAレベル、タンパクレベルともに入れ替わり、ロングフォーム主体の発現がみられるようになった。次に、ロングフォームの発現のみを抑制するスプライシング切替オリゴマーを設計した。オスモティックミニポンプを用いてこの薬剤を持続的に投与し、性周期の観察と投与後5日目の血中性ステロイド濃度の測定を行った。対照投与群では正常な性周期が観察されたのに対し、スプライシング切替オリゴマー投与群では、薬剤用量依存的に発情休止期の延長がみられた。もっとも高濃度のときには5日間の発情休止期の延長がみられた。投与後5日目の各マウスの血漿中プロジェステロンの濃度はロングフォームの発現量と正比例していた。前年度の本研究では、性周期各時期の、PRL受容体ロングフォーム、ショートフォーム、およびそのシグナル伝達因子について調べ、PRL受容体のアイソフォームが黄体の運命決定に及ぼす分子メカニズムについて明らかにした。本年度は、同じく生殖関連器官である乳腺の腫瘍におけるプロラクチン受容体の選択的スプライシングの役割について調べた。プロラクチン受容体を特異的に阻害する薬剤であるAntimaiaを用い、マウス乳腺腫瘍細胞4T1の培養液中にAntimaiaを添加して5日間培養すると、アポトーシス因子であるBax、Caspase 3のmRNA合成が増加するとともに生細胞数が減少した。乳癌幹細胞であるマンモスフィアの培養系にAntimaiaを添加したところ、マンモスフィアの成長が著しく抑制された。以上の結果より、PRLR-LFの発現抑制は、乳腺腫瘍原発巣のアポトーシスを促進するとともに、乳癌幹細胞の増殖を抑制し、乳腺腫瘍の転移を減少させることが示された。これまでに我々は、卵巣内に発現するゴナドトロピン放出ホルモン(GnRH)が黄体の退行因子として働くこと、偽妊娠黄体において、GnRHは黄体退行期に増加してプロジェステロン分泌能を低下させる作用を持つが、PRL受容体発現低下作用についてはPRLによって抑制されることを明らかにした。本年度は、プロラクチン受容体のアイソフォーム別に阻害を行って同様の変化がみられるか検討した。プロラクチン受容体には選択的スプライシングにより合成されるロングフォーム(PRLR-LF)とショートフォーム群が存在するが、細胞の増殖や分化を促進する作用は主にPRLR-LFを介したシグナル伝達経路であると考えられている。そこで、PRLR-LFの選択的スプライシングを特異的に阻害する薬剤であるAntimaia(研究者ら特許申請中)を用い、PRLR-LFの発現抑制が性周期に及ぼす影響について検討した。正常な性周期をもつ成熟メスC57BL/6マウスを実験動物として用いた。ALZETミニポンプにてAntimaiaを皮下に留置し、その後の性周期の変化について膣スメア法を用いて確認した。

また、卵巣におけるPRLR-LFの発現量についてリアルタイムRT-PCR法にて測定した。その結果、投与2日目のPRLR-LF mRNA発現は用量依存的に抑制された。とくに最も高い投与量のマウスではPRLR-LF mRNAの発現は限界以下で認められなかった。これらのマウスの性周期は、用量依存的に発情休止期の延長がみられた。投薬後1週間の卵巣をヘマトキシリン・エオジンで観察したところ、閉鎖卵胞が多く見られ、卵胞の発育までは正常に行われたことが示唆された。以上より、PRLR-LFは卵胞発育後、エストロジェンの産生の増加から黄体形成にかけて以降において必須のシグナル伝達経路であることが示された。26年度が最終年度であるため、記入しない。獣医生理学26年度が最終年度であるため、記入しない。当初予定した実験計画14のうち、平成24年分として計画した、度実験1と2について、一定以上の成果が得られたので。また、本研究で大きな山場である、マウスのスプライシング切替オリゴマーの作製に成功したので。当初予定した実験計画のうち、実験1と2について一定以上の成果が得られたので。また、乳腺について多くの知見をえることができたので。成熟雌ラットの卵巣嚢内にスプライシング切替オリゴマーをin vivoトランスフェクションし、特定のPRL受容体アイソフォームをノックダウンすることでアイソフォーム特異的な生理機能を解析する。成熟メスマウスの卵巣嚢内にスプライシング切替オリゴマーをin vivoトランスフェクションし、特定のPRL受容体アイソフォームをノックダウンすることでアイソフォーム特異的な生理機能を解析する。消耗品の消費が予定より下回り、繰越金384,602円のうち海外で使用した立替分257,303円を除いた127,299円が実際の繰越金として得られている。これと合わせて、次年度研究費は主にラット用のスプライシング切替オリゴマーの作製や組織のRNA発現の解析などに使用する。研究代表者の異動に伴い、マウスラットを用いた実験がやや滞っているため。マウス、ラットを用いた実験に用いる。
新たな乳癌治療のための家族性乳癌原因遺伝子の新規関連分子の機能解析

家族性乳癌原因遺伝子BRCA1は、変異により乳癌、卵巣癌を引き起こす癌抑制遺伝子で、近年は散発性乳癌との関わりも注目されている。BRCA1は、BARD1とヘテロダイマーを形成し、DNA修復や中心体制御に関与する。我々はBARD1に結合する新規分子BARD1-interacting protein(BIP)を同定し、その機能を解析した。その結果、BIPがBRCA1、BARD1とともに中心体制御や細胞質分裂で重要な機能を担うことを明らかにした。家族性乳癌原因遺伝子BRCA1はその生殖細胞系列変異による卵巣癌発症リスクが約40%、乳癌発症リスクは約80%とされる、重要な癌抑制遺伝子で、その遺伝子産物BRCA1は、転写制御、DNA修復、細胞周期制御、クロマチンリモデリングなどの細胞内の多様な機構に関与する。BARD1はBRCA1とヘテロダイマーを形成し、BRCA1の腫瘍由来の点突然変異によりBARD1との結合能とユビキチン化能は阻害される。よって、BARD1は、BRCA1の癌抑制機能を制御すると考えられる。そこで、BARD1と結合する分子をプロテオミクス解析で探索したところ、BRCA1/BARD1複合体に結合する新たな分子を同定した。その機能を解析したところ、細胞分裂に重要な中心体やmidbodyに局在することが明らかになった。さらにその分子の発現を抑制すると、中心体数の増加と多核細胞の増加、増殖速度の低下、細胞質分裂の異常が見られた。これまで、BRCA1とBARD1は、ともに紡錘体極に局在するが、ミッドボディーにはBARD1のみが局在することが報告されている。中心体に関しては、本分子の発現を抑制した場合と同様に、BRCA1の機能を阻害した場合も中心体数が増加することが報告されており、中心体の制御には、BRCA1、BARD1と共に本分子が関与していることが示唆される。一方、細胞質分裂においては、本分子はBARD1と共に機能することが示唆される。今後は、中心体の制御や細胞質分裂における本分子の機能をより詳細に明らかにするため、BRCA1やBARD1の発現を抑制した際の局在や、各細胞周期における他のタンパク質との相互作用を検討することが必要である。中心体制御や細胞質分裂機構におけるBRCA1やBARD1の機能は、その癌抑制能において大きな役割を果たしている可能性があり、これらの分子と相互作用する本分子の機能を明らかにすることは、新たな発癌機構の解明につながり、さらには治療法の開発にもつながると考えられる。家族性乳癌原因遺伝子BRCA1はその生殖細胞系列変異による卵巣癌発症リスクが約40%、乳癌発症リスクは約80%とされる重要な癌抑制遺伝子で、その遺伝子産物BRCA1は、DNA修復、中心体制御、クロマチンリモデリング、転写制御などの細胞内の多様な機構に関与する。その機能を解析したところ、細胞分裂制御に重要な中心体やmidbodyに局在することが明らかになり、その分子の発現を抑制すると、中心体数の増加と多核細胞の増加、増殖速度の低下、細胞質分裂の異常が見られた。また、乳癌細胞株で本分子の変異が既に同定されており、この遺伝子変異により、BRCA1の中心体制御能が変化することも明らかにした。今後、中心体の制御や細胞質分裂における本分子の機能をより詳細に明らかにすることで、新たな発癌機構の解明と治療法の開発のための分子基盤を築くことが可能になると考えられる。家族性乳癌原因遺伝子BRCA1はその生殖細胞系列変異による乳癌や卵巣癌を発症する重要な癌抑制遺伝子で、その遺伝子産物BRCA1は、DNA修復、中心体制御、クロマチンリモデリング、転写制御などの細胞内の多様な機構に関与する。

その機能を解析したところ、細胞分裂制御に重要な中心体やmidbodyに局在することが明らかになり、本分子の発現を抑制すると、中心体数の増加と多核細胞の増加、増殖速度の低下、細胞質分裂の異常が見られた。よって、本分子は中心体制御と細胞質分裂制御に関与していることが明らかになった。さらに、本分子の中心体制御のメカニズムについては、本分子がγ-tubulinと直接結合し、BRCA1と協調してγ-tubulinを安定化することが明らかになった。興味深いことに、乳癌細胞株で本分子の変異が既に同定されており、この遺伝子変異により、γ-tubulinとの結合能と安定化能が著しく減弱していた。また、臨床検体での検討も行い、本分子の局在が癌組織で変化していることも明らかになった。さらに、本分子に結合する新規分子の同定にも成功し、機能を解析したところ、本分子と同様に、中心体制御や細胞質分裂に関与することが分かった。また、個体レベルでの本分子の機能消失の影響を観察するため、ノックアウトマウスの作製も既に開始した。今後、本分子の中心体制御やさらに細胞質分裂における機能をより詳細に明らかにすることで、新たな発癌機構の解明と治療法の開発のための分子基盤を築くことが可能になると考えられる。
PETボトルから再生したマイクロ繊維の開発

繊維補強コンクリートは,斜面やトンネルの支保によく利用されている.コンクリートに混入された繊維により,亀裂の進展が阻害されて,靭性が増す.繊維をマイクロ化することによって単位体積あたりの表面積は増大し,寸法が小さくなることによって引張強度が増加する.それによって繊維の補強性が増大する.本研究では,ペットボトルから再生したマイクロPET繊維に関して多くの試験を実施し,その特性を把握した.その結果,マイクロ化することによって特性が改善することがわかった.繊維補強コンクリートは,斜面やトンネルの支保によく利用されている.コンクリートに混入された繊維により,亀裂の進展が阻害されて,靭性が増す.繊維をマイクロ化することによって単位体積あたりの表面積は増大し,寸法が小さくなることによって引張強度が増加する.それによって繊維の補強性が増大する.本研究では,ペットボトルから再生したマイクロPET繊維に関して多くの試験を実施し,その特性を把握した.その結果,マイクロ化することによって特性が改善することがわかった.本年度はPETマイクロ繊維補強コンクリートの実用化に向け,その諸特性を解明することを目的とし,フレッシュ性状,付着特性,力学的特性に関する検討を行った.PETマイクロ繊維補強コンクリートの混練性は従来の繊維と同じでまったく問題はなかった。スランプ試験を行い,フレッシュ性状を評価した結果,繊維混入率の上昇に伴い,スランプ値がやや減少し,流動性が低下することが確認されたが,従来の繊維と同程度であった.次にブリーディング試験を行い,PETマイクロ繊維がコンクリートの材料分離特性に与える影響を調べた結果,PETマイクロ繊維によるブリーディング水量への影響は確認されなかった.PETマイクロ繊維/セメントペースト間の付着特性を評価するために,まず試行錯誤を繰り返しながら,マイクロドロップレット法を応用した付着強度試験方法を開発した.その方法により試験を行ったところ,同体積の繊維を投入した場合,繊維をマイクロ化することにより,付着力が増大することを示した.力学的特性の検討として一軸圧縮試験と圧裂引張試験を行い,極細PETマイクロ繊維補強モルタルの力学特性を検討した.一軸圧縮試験結果から,PETマイクロ繊維の混入によって圧縮強度への影響はなかったが,繊維混入率の上昇にともない,残留強度が上昇し,PETマイクロ繊維による靭性の改善効果が確認された.また,試験後の試験片の様子からも剥離,落下防止性能があることがわかった.圧裂引張試験結果では,マトリックス破断後に繊維による補強効果を確認した.繊維補強コンクリートに投入される通常の繊維寸法は,直径1mm,長さ20-30mm程度である.一般に材料強度は寸法効果を示し,繊維が細くなる(繊維のマイクロ化)ほど繊維の引張強度が上昇することが知られている.また,繊維の比表面積は繊維の直径に反比例し繊維が細くなるほど,繊維の比表面積は上昇する.繊維の比表面積の上昇は,繊維補強コンクリートにおける繊維の補強効果であるひび割れ強度,粘り強さ,耐久性に上昇につながり,繊維を細くすることで繊維の補強効果が向上することが予想される.本研究は,コンクリートに混入させる再生PETマイクロ繊維を開発し,コンクリートの剥離・剥落防止などの性能向上をはかることを目的とする.昨年度は直径0.03mmのPETマイクロ繊維を開発し,繊維補強コンクリートのフレッシュ性状,付着特性,力学的特性に関する検討を行った.本年度は,直径0.12mmのPETマイクロ繊維を用い一軸圧縮試験,圧裂引張試験やマイクロドロップレット法を応用した付着強度試験などに関して検討を行った.その結果,繊維の混入により一軸圧縮強度や圧裂引張強度に関してさほど変化しなかったが,繊維混入率の増加により一軸圧縮試験での残留強度に関しては増加する傾向が見られた.繊維のマイクロ化によって繊維の耐久性に影響を与える可能性が考えられる.そこで,世界で最初にPET繊維をコンクリートの補強に用いた菱刈鉱山で現地調査を行った.その結果,コンクリートは高いアルカリ性を示すが,6年経過したPET繊維はほぼ元の直径を維持しており,劣化が進行していないことを確認した.コンクリートに投入される通常の繊維は直径1mm,長さ20-30mmであるが,繊維が細くなるほど寸法効果により繊維の引張強度は増加し,さらに繊維の比表面積(単位体積あたりの表面積)は増加する.そのため,繊維をマイクロ化することによって,繊維補強コンクリートの補強効果が向上することが予想される.本研究はコンクリートに混入させる再生PETマイクロ繊維を開発し,コンクリートの剥離・剥落防止などの性能向上をはかることを目的とした.再生PETマイクロ繊維として,直径0.03mmと直径0.12mmの2種類の繊維を試作し,各種試験を実施した.繊維補強コンクリートの混練性は従来の繊維と同じでまったく問題はなかった.ブリーディング試験を行い,PET繊維がコンクリートの材料分離特性に与える影響を調べた結果,PET繊維によるブリーディング水量への影響はみられなかった.スランプ試験によりフレッシュ性状を評価した結果,繊維混入率の上昇に伴い,スランプ値がやや減少し,流動性が低下することが確認されたが,従来の繊維と同程度であった.次にマイクロドロップレット法を利用した手法により付着特性に関して検討した結果,同体積の繊維を投入した場合,繊維をマイクロ化することにより付着力は増大したが,直径0.03mmの繊維の付着性はやや弱いことがわかった.一軸圧縮試験を実施したところ,繊維の混入により一軸圧縮強度はさほど変化しなかったが,残留強度に関しては増加することが確認された.

コンクリートは高いアルカリ性を示すことから繊維の極細化によって繊維の耐久性に不安があったため,原位置で耐久性の調査を行ったところ,コンクリート内で7年経過したPET繊維は劣化がほとんど進行していないことを確認した.
増殖因子受容体を標的とする組換え型イムノトキシンを用いた免疫ターゲッティング

本研究ではヒト胃癌に対し,増殖因子受容体を免疫ターゲッティングに用いた抗体治療の可能性を検討した。胃癌の悪性度に相関する増殖因子受容体としてはEGFR(HER-1),HER-2/neu, c-metなどが知られている.このうちHER-2/neuの過剰発現は高分化腺癌でみられ,転移能が高く予後不良である。昨年度までに我々は,HER-2/neuに対するモノクローナル抗体の遺伝子配列からFv領域をコードするDNA断片のみを分離精製してプラスミドベクターにサブクローニング,得られたプラスミドで大腸菌を形質転換し,緑膿菌外毒素(Pseudomonas exotoxin, PE)に連結した組換え型イムノトキシンerb-38[e23(dsFv)PE38]を精製することに成功し,HER2高発現性胃癌細胞に対するin vitroでの特異的細胞傷害活性が証明した。しかし組換え型抗増殖因子受容体イムノトキシンの治療効果は生体の臓器微小環境によって修飾される可能性があるので,我々は肝転移,リンパ節転移,腹膜播種性転移など,臨床胃癌でみられる種々の転移形式を想定したマウスモデルでのvivo実験を進めた。HER-2/neuを高発現するMKN45Pの脾注モデルにおいて,erb-38の静脈内投与(7,9,11日目,各5mcg)は肝転移,腹膜播種,腹水生成を有意に抑制した。また,対照群が70日目までに全て死亡したのに対し,治療群では100%の健存が得られた。MKN74を使った同モデルでは0.5mcgで十分な治療効果が得られた。本治療の臨床移行を目指し,現在,手術で切除した胃癌組織のerb-38に対する感受性をHistoculture Drug Response Assayにより解析し,同一組織片から解析した各増殖因子の発現強度との相関性を検討中である。近年,分子標的治療の発展が目覚しいが,本研究では,いわゆる癌特異抗原のうちでもモノクローナル抗体の標的となりやすい増殖因子受容体の免疫ターゲッティングを用いた,胃癌の新たな抗体療法の可能性を検討中である。今回我々は,HER-2/neuに対するモノクローナル抗体の遺伝子配列からFv領域をコードするDNA断片のみを分離精製してプラスミドベクターにサブクローニング,得られたプラスミドで大腸菌を形質転換し,緑膿菌外毒素(Pseudomonas exotoxin, PE)に連結した組換え型イムノトキシンerb-38[e23(dsFv)PE38]を精製することに成功した。HER2高発現胃癌細胞MKN-45Pに対するerb-38のIC_<50>は4ng/mlで,HER2発現レベルの低いMKN-45(IC_<50>=40ng/ml)の10倍高感受性であった。対照細胞として用いたHER2-/CD22+Burkitt'slymphoma細胞Rajiに対しては殺細胞性をもたなかった。一方,対照イムノトキシンanti-CD22はRajiに対してIC_<50>=3ng/mlと高い殺細胞性を示したが,いずれの胃癌細胞に対しても殺細胞性をもたなかったことから,erb-38のHER2高発現性胃癌細胞に対するin vitroでの特異的細胞傷害活性が証明できた。癌特異抗原の同定に伴って再評価されている抗体療法や細胞療法といった特異的免疫療法は,いわゆる個別化医療の究極の形と考えられるが,抗体治療のうちでもmAbを細胞障害物質の腫瘍までのキャリアとして用いるイムノトキシンにはより確実な抗腫瘍効果が期待できる。しかし組換え型抗増殖因子受容体イムノトキシンの治療効果は生体の臓器微小環境によって修飾される可能性があるので,今後は肝転移,リンパ節転移,腹膜播種性転移など,臨床胃癌でみられる種々の転移形式を想定したマウスモデルでのvivo実験を進めたい。

HER-2/neuを高発現するMKN45Pの脾注モデルにおいて,erb-38の静脈内投与(7,9,11日目,各5mcg)は肝転移,腹膜播種,腹水生成を有意に抑制した。また,対照群が70日目までに全て死亡したのに対し,治療群では100%の健存が得られた。MKN74を使った同モデルでは0.5mcgで十分な治療効果が得られた。本治療の臨床移行を目指し,現在,手術で切除した胃癌組織のerb-38に対する感受性をHistoculture Drug Response Assayにより解析し,同一組織片から解析した各増殖因子の発現強度との相関性を検討中である。
小学校国語科の読みと幼稚園領域ことばの教師の教授スタイルに関する研究

幼小移行の円滑な移行を促す幼小の教師の教授スタイルを検討した。日本、アメリカ、ベルギーとの国際比較も行った。日本では、幼小とも集団活動であるが、幼では自己発揮が求められ、小では学習規律、自己抑制を求める傾向にあった、また、小で文字指導が行われる他、言語性の促しレベルは幼小とも変わらなかった。アメリカでは、ともに文字指導が行われ、高度な言語性の促しがなされていた。幼小とも個別活動が多く、自己抑制を求める傾向が強かった。ベルギーも幼小とも集団活動で、幼では自己発揮、小で自己抑制を求めていた。文字指導は小から行われ、言語性の促しは幼稚園は日本の幼より低く、小は同程度であった。本研究では、幼児教育と小学校教育の接続期に起こる問題として大きな話題となっている「小1プロブレム」について、授業中の教師の子どもへの関わり、特に言葉かけや表情、環境設定といった教授スタイルのあり方、そして教材の取り扱い方の観点から問題点を明らかにし、幼児教育から小学校教育へ滑らかに接続させていく知見を明らかにすることである。このため、本研究では、1幼稚園、小学校での『おおきなかぶ』の読み聞かせ、授業場面を観察し、その教授スタイルの違いを分析し、幼稚園と小学校の連携のあり方を教師の教授スタイルという視点から考察すること、2『おおきなかぶ』の教材の取り扱いに関する幼稚園教諭・小学校教諭の意識の差異を、部分指導案、学習指導案の記述を分析することにより考察すること、の2点を研究する。現在1までの研究をほぼ終え、幼稚園・小学校両方での『おおきなかぶ』の実践を観察し、無藤(2013)の「自覚的な学び」の5つの力を観点として、教師の教授スタイルを分析した。その結果、幼稚園教諭の教授スタイルにおける言語性の促しのレベルの高さに対する小学校教諭の言語性の促しの相対的な低さ、幼稚園教諭に対して小学校教諭の集中性・自覚性の促しの相対的な強さというねじれ現象起きていることが明らかになった。このことが、小学校の学習に対する意欲の低下、また集中性や自覚性を強く促されることに対する心理的抵抗につながり、「小1プロブレム」という小学校への適応の問題を引き起こすことが示唆された。小1プロブレムの解決のための一方策として、1幼稚園と小学校の教師の教授スタイルを比較し、教師の関わりから子どもにとってのよりよい小学校への適応のあり方を検討した。特に、言語性の促しに関しては詳細を分析した。また、日本のみならず、アメリカ(1校)、ベルギー(2校)での調査も行った。その結果、日本では、幼稚園で相対的に自己発揮することが求められ、言語性も高いレベルで促しがされている一方、小学校1年生では学習規律が優先され自己抑制を求める傾向にあった。アメリカでは、幼小とも高い言語性の促しが見られ、自己抑制を求める傾向が強かった。言語性の促しの中でも、特に文字の読み書きに対する促しが日本・ベルギーに比べ、幼小共通して強く見られた。ベルギーでは、2校の傾向が分かれた。キリスト教系の公立学校では、日本と同様幼稚園で自己発揮、小学校で自己抑制を求める傾向が見られた。また言語性に関しては、幼稚園ではあまり高いレベルを求めず、小学校で高いレベルを求める傾向が見られた。フレネ式の公立学校では、幼小とも自己発揮することを求め、言語性の促しに関しては、どちらも高い促しが見られるものの、文字の読み書きに関しては、日本と同様、幼稚園では求めず、小学校から促されていた。また、2『おおきなかぶ』の教材の取り扱いに関する教師の意識調査に関しては、幼稚園教諭に対する調査を終え分析中であるが、小学校教諭に関しては引き続き調査中である。幼稚園教諭に関しては、教材を言語性を促すものと限定せず、多様な力を総合的に育むことを企図し、さらに生活経験との結びつきの中で教材を生かす意識が強いことが明らかとなっている。26年度が最終年度であるため、記入しない。国語教育26年度が最終年度であるため、記入しない。本研究では、2年間の研究期間中、1幼稚園、小学校での『おおきなかぶ』の読み聞かせ、授業場面を観察し、その教授スタイルの違いを分析し、幼稚園と小学校の連携のあり方を教師の教授スタイルという視点から考察すること2『おおきなかぶ』の教材の取り扱いに関する幼稚園教諭・小学校教諭の意識の差異を、部分指導案、学習指導案の記述を分析することにより考察することの2点を研究することである。現在1年目を終え、1までの研究をほぼ終えており、2の研究に着手しはじめるところである。研究の約半分を1年で終え、概ね順調な進展と言える。本年度は、2『おおきなかぶ』の教材の取り扱いに関する幼稚園教諭・小学校教諭の意識の差異を、部分指導案、学習指導案の記述を分析することにより考察することを重点的に推進していく。

1で明らかになったことをさらに、教師の教材に対する意識から、特に言語性の促し部分に着目して分析することとする。また、本年度は、諸外国の幼児教育・小学校教育の連携についても海外視察を含め、考察を深めていきたいと考えている。
新規蛋白質ARPPを指標とする横紋筋肉腫ならびに各種筋疾患の血清診断法の開発

我々は本研究で横紋筋肉腫で高発現する新規蛋白質ARPPを血液中で検出するためのELISAキットを開発した。捕捉抗体として我々が作製したマウス抗ヒトARPPモノクローナル抗体を96穴プレートに固相化し、ブロッキング後、固相化抗体と標準試料あるいは試料で第一反応した。標準試料にはGST/ヒトARPPリコンビナント融合タンパク0,0.16,0.8,4,20,100,500,2500ng/mlを、試料にはCOS-1細胞株とCHO細胞株の溶解液、およびヒトARPPを人為的に一過性強制発現させたCOS-1細胞株とCHO細胞株の細胞溶解液を用いた。反応後、検出抗体としてウサギ抗ヒトARPP抗体で第二反応、さらにHRP標識ヤギ抗ウサギ抗体で第三反応を行い、HRP活性をマイクロプレートリーダーで測定した。今回構築したヒトARPP ELISAのシステムでは、少なくとも0.16ng/mlのヒトARPPを検出する事が可能であった。また、ヒトARPPを一過性に強制発現させたCOS-1細胞株およびCHO細胞株の細胞溶解液のみにHRP活性がみられ、ヒトARPP特異的に反応することが証明された。また、横紋筋由来の悪性腫瘍である横紋筋肉腫24例を免疫組織化学的に解析したところ、全例でARPPの発現を検出したが、平滑筋肉腫では一例も検出されなかった(Am J Pathol,160,1767-78,2002)。これらのことはARPPが神経筋疾患ならびに横紋筋肉腫の新しいマーカーとなりうることを示唆している。一方、我々は最近、筋壊死を起こす薬物ブピバカインをマウスの後肢に筋注して後肢骨格筋の壊死を人工的に起こさせた後、血液を採取してウェスタン解析したところ、ARPPを検出した。したがってARPP発現細胞が破壊されると、ARPPが血中に放出され検出されることが明らかとなった。このことはARPPが高発現している神経筋疾患患者ならびに横紋筋肉腫患者の血中で検出可能であることを強く示唆している。そこで我々は、血中ARPP検出のために抗ARPPポリクローナル抗体とモノクローナル抗体を用いたELISA kitを完成させることにより横紋筋肉腫ならびに種々の筋疾患の病態をモニターできると考えた。我々はこれまでに、1)3種類のラビット抗ARPPポリクローナル抗体と1種類のモノクローナル抗体を作製した。ポリクローナル抗体はそれぞれ全長(1-333)N末(5-88),C末(285-333)部分のARPP蛋白質をGST融合蛋白質として大腸菌で合成、精製したものを抗原として作製した。また、モノクローナル抗体は全長GST-ARPP蛋白質を抗原として作製したが、その後の解析からARPPのN末部分を認識することを確認した。現在、これらの抗体を用いたサンドイッチ法による検出系を確立するために、まずcapture antibodyとdetection antibodyの組み合わせとしてどの抗体のペアの検出感度が高いかを解析中である。また、発色系として抗ウサギ(あるいはマウス)IgG HRP標識抗体を用いるたところ、preliminary dataではあるが、検出可能なデータを得つつある。
神経誘導因子Chordinの下流に働く神経分化制御因子の研究

脊椎動物の神経発生の初発段階は外胚葉に神経誘導が作用して始められる。神経誘導因子Chordinを作用させた未分化外胚葉とさせていないものとを用いてデファレンシャル・スクリーニングを行い、多数のChordinで誘導される神経特異的遺伝子を単離した。そのうち3つの転写因子(Zic-related 1,Sox-2,Sox-D)はこれらはごく初期神経板全体に発現しており「微細なパターン形成」が行われる前に働く遺伝子と考えられた。アフリカツメガエルのアニマル・キャップを用いた微量注入法の解析の結果、Zic-related1,Sox-Dは単独で外胚葉の神経分化を誘導することが明らかとなった。これらはChordinの下流で働き、神経誘導因子のエフェクターとして神経分化のごく早いタイミングで働き、proneural genesの発現の上流で働くことが示された。上記の2つのSox因子についての機能解析を行うため、DNA結合領域を欠損させたドミナント・ネガチィブ変異体を作成し、mRNA微量注入法により胚での神経発生における機能を検討した。SoxDのドミナント・ネガチィブ変異体を強制発現させ機能阻害をすると、胚の大脳の発生が顕著に抑制され、OTXなどのマーカーも抑えられた。このことはSoxDが大脳原基の発生に必須であることを示す。しかし、中脳より後方の発生は大きな変化が認められなかった。一方、Sox2のドミナント・ネガチィブ変異体を強制発現させた胚では、大脳のみならず神経板全体の神経マーカーの抑制が認められた。Chordinの下流因子の固定と生物学的活性の解析初期神経分化制御機構を明らかにするため、申請者らが単離した神経誘導因子Chordinを作用させた未分化外胚葉とさせていないものとを用いてデファレンシャル・スクリーニングを行い、多数のChordinで誘導される神経特異的遺伝子を単離した。そのうち3つの転写因子(Zic-related 1,Sox-2,Sox-D)はこれらはごく初期神経板全体に発現しており微細なパターン形成が行われる前に働く遺伝子と考えられた。アフリカツメガエルのアニマル・キャップを用いた微量注入法の解析の結果、Zic-related 1, Sox-Dは単独で外胚葉の神経分化を誘導することが明らかとなった。一方、Sox-2は単独では働かず、FGFと協同的に働いて神経分化を誘導し、コンピテンスを変化させる因子と考えられた。現在、これらの因子とともに、さらに他の多くの単離された因子の活性を詳しく検討中である。哺乳類を含めた脊椎動物の神経系は初期胚の未分化外胚葉から発生する。その際オーガナイザーからの誘導シグナルが分化を制御するが、神経誘導因子Chordinもそのひとつであり、未分化外胚葉に働くと神経組織を分化させる。我々は神経誘導因子Chordinを作用させた未分化外胚葉とさせていないものとを用いてデファレンシャル・スクリーニングを行い、神経特異的遺伝子を単離した。そのうち3つの転写因子(Zic-related 1,Sox-2,Sox-D)はこれらはごく初期神経板全体に発現していた。アフリカツメガエルのアニマル・キャップを用いた微量注入法の解析の結果、Zic-related 1,Sox-Dは単独で外胚葉の神経分化を誘導することが明らかとなった。Chordinの下流因子の機能解析を行うためドミナント・ネガチィブ変異体を作成し、mRNA微量注入法により胚での神経発生における機能を検討した。

一方、Sox2のドミナント・ネガチィブ変異体を強制発現させた胚では、大脳のみならず神経板全体の神経マーカーの抑制が認められた。このことはSox2は神経分化の制御により広範囲で必要とされていることを示す。SoxD,Sox2のドミナシト・ネガチィブ変異体ともアニマルキャップアッセイでは神経誘導を押さえた。
自閉症児の養育者における自閉症広域表現型の日本語版評価法の開発に関する研究

本研究では自閉症特性における広域表現型(Broad Autism Phenotype: BAP)を抽出する質問紙尺度の邦訳版(BAPQ-J)を作成し、成人男女179名(発達障害児および定型発達児を持つ養育者)を対象にその信頼性と妥当性を確認した。次に自閉症特性と社会的認知の関連を検討した結果、定型発達児に比して高機能自閉症児の方が表情認知の特異性を有しており、こうした傾向はBAPの中でも特に「融通の効かなさ」傾向を有する養育者においてみられた。自閉性障害児を持つ養育者や家族、親族において自閉性障害の診断基準は満たさないものの、自閉症特性における広域表現型(BAP : Broad Autism Phenotype)を有する者がいることが指摘されている。本研究では養育者におけBAPを抽出することを目的に、BAP測定尺度の選定および質問紙開発を行った。諸外国では面接調査を中心とした特性把握が行われており、質問紙法による特性把握は始まったばかりといえる。そこでJoseph Pivenを中心としたノースカロライナ大学のチームで開発されたBAPQを原著者から許可を得た上で邦訳、バックトランスレーションを行った上で、日本語版BAPQの妥当性検討を行うこととした。データ収集途中となる今回の分析対象者は、定型発達の子どもを持つ養育者38組(76名)と自閉症児を持つ養育者4組(8名)であった。BAPQは原著では3下位尺度:「打解けなさ」「実用的言語使用」「かたくなさ」から構成されている。基準連関妥当性を検討した結果、自閉症スペクトラム指数日本語版との間に有意な強い相関(r=.60.70)が確認された。一方、内部一貫法による信頼性を検討したところα=.15.55と低く、信頼性は確認されなかった。翻訳による語感の違いを再度検討することの必要性、および各項目が示す特性内容の再検討を文化的背景による意味づけの違いも考慮して再度検討し直す必要性が導き出された。構成概念妥当性を検討するために探索的因子分析を行ったところ、2因子解を採用することが適当であると判断され、それぞれ「社交性」と「柔軟性のなさ」と名付けられた。今後、原著のBAPQが測定する意味内容と本邦におけるそれの比較検討を原著者と議論を重ねた上で、本邦に適したBAPQの開発を行うことが求められる。自閉性障害児を持つ養育者や家族、親族において自閉性障害の診断基準は満たさないものの、自閉症特性における広域表現型(BAP:Broad Autism Phenotype)を有する者がいることが指摘され、こうした特徴を持つ者の認知特性には自閉性障害者のそれと類似する。対人関係場面で適応しにくくその特性に気づかれないことでうつなどの2次障害に発展することもある。したがってBAP概念を明確にし、支援のあり方を整備することは重要といえる。そこで本研究では、BAPを抽出できる質問紙尺度の邦訳版(BAPQ-J)を開発すること、そして認知的特性の特徴を検討することを目的に質問紙調査と認知機能課題調査を実施した。BAPQ(Hurley, et.al., 2007)の邦訳版開発研究では、自閉性障害児を持つ養育者(臨床群81名)と発達に課題を抱えていない子どもを持つ養育者(コントロール群116名)の解析結果から、BAPQの3下位尺度;aloof, Pragmatic language, Rigidおよび総得点における信頼性係数はα=.73.83と高く、また下位尺度間相関もr=.39.55と有意な相関関係が認められた。基準連関妥当性については、自閉症スペクトラム指数日本語版(AQ)との間に有意な強い相関(r=.50.74)が確認された。次に原著者と検討しAQを外的基準(AQのM+1.5SD)として便宜的にBAP有無の2群を設定し、BAPQの3下位尺度得点の差を検討した結果、すべてにおいてBAP有群の方がBAP無群に比して有意に得点が高かった。以上のことから、BAPQ-Jは邦訳版の妥当性、信頼性が確認されたといえよう。次に、表情や動作から感情や人への信頼度を判断する認知機能課題調査では、自閉性障害児とその養育者16組とコントロール群18組についてデータ収集を終え、予備分析からは自閉性障害児の方が目からの情報で感情を読み取ることが苦手であること、また怖いという感情についての認知が弱いことなどが示唆されている。今後被験者数を増やして、親子における特徴も含めて検討する。自閉症特性における広域表現型(Broad Autism Phenotype: BAP)は、自閉性障害児(ASD児)を持つ養育者や親族のみならず、一般人口内においても一定の割合でみられることが指摘されている。社会生活の困難さがこうした特性に起因することも示唆され、これらを正確に把握し支援につなげることが必要といえる。

そこで本研究では、BAPを抽出できる質問紙尺度の邦訳版(BAPQ-J)を作成すること、そして社会的認知的特性の傾向を検討することを目的に質問紙調査と社会的認知機能課題調査を実施した。BAPQ(Hurley, et.al., 2007)の邦訳版開発研究では、子どもを持つ養育者179名(臨床群90名、コントロール群89名)を最終解析対象とし、BAPQ-Jの信頼性と妥当性が確認された。次に、社会的認知特性に関する研究では、表情や動作から感情や人への信頼度を判断する社会的認知機能課題を用いた。予備調査において本邦における各課題の基準得点を算出した上で、本調査としてASD児と養育者を対象に、社会的認知特性と自閉症傾向との関連を検討した。その結果、高機能ASD児の認知特性として「恐れ」表情において感情の強度を弱く判断すること、多様な情動的情報が含まれた課題刺激では、「喜び」および「悲しみ」感情を適切に読み取ることが、またより複雑な感情や心的状態を顔の目元部分から読み取ることが、定型発達児と比して困難であることが認められた。次にASD児を持つ養育者の結果からは、BAPの「打ち解けなさ」の傾向がみられるほど「悲しみ」感情を適切に読み取ることが、また総合BAP得点の高いことや「厳格さや融通の効かなさ」がみられるほど、人の動きや複数の顔刺激から信頼性を判断することに困難な傾向が確認された。自閉症傾向やBAPといった特性が、部分的に社会的認知に影響を及ぼしていることが示唆された。BAPQ邦訳版(BAPQ-Jの妥当性検証に関する調査研究については、データ収集を終了し現在、原著者と最後の翻訳内容の確認を行っており、最終段階に入っている。また認知課題に関する研究ではデータ収集を行いつつ、予備分析を行い、臨床群とコントロール群間における差異が認められる結果が得られているなど大幅な方向性の修正を必要としない状況で研究を進めている状況にある。24年度が最終年度であるため、記入しない。BAPQ邦訳版(BAPQ・Jの妥当性検証に関する調査研究については、研究発表のための論文執筆を鋭意進める。認知課題に関する研究では、引き続き臨床群、コントロール群のデータ収集をすすめつつ、十分な解析ができるよう4月までにはデータ収集を終了し、解析と執筆に入る。
ツール制作を主とした書籍文化史研究のための基礎的研究

書籍・摺物の制作に関わる下職である彫工・摺師・製本師と、関連業者である経師屋・摺物所・団扇問屋に関わる記事を、書籍そのものや諸史料から収集した。そのデータを整理し、「諸職名寄」と題したPDFファイルにまとめた。これに架蔵資料の画像を加えてCDを制作、コピーフリーとして、研究者に広く配布した。研究情報の共有を図るために、書籍文化史研究文献の情報を収集し、分類を施して整理した。この文献目録に、研究者から寄せられた論文を加え、雑誌『書籍文化史』を第15集から第19集まで研究期間内に5冊編輯・発行し、研究機関と研究者に配布した。書籍の制作に関わる下職、すなわち、彫工・摺師・製本師に関わるデータを集積した。丸山季夫「刻師名寄」の記事を形式を整えて入力しテキストデータとした。また、これまでに集積したデータを同一の形式に直し(名前・種別・活動地・別称・依拠資料および業績の5フィールド)、地域別の名寄として整理し、データベース化した。奈良市・小千谷市・名古屋市・山口市等の文書館・図書館において調査を行うとともに、和古書や引札等の資料を収集し、これらについても画像として蓄積するとともに、上記地域別名寄に反映させた。書籍の流通に関わる資料を収集し、データ化した。具体的には、まず、これまでに写真で収集してきた仕入印をフィルムスキャナをもってデジタル化して電子画像として集積するとともに、それらについてのテキストデータの見直しを行った。また、調査等で新たに得た資料や、購入した和古書から得た仕入印についても順次それに加えて増補をはかった。弘暦印や貸本印についても、それらが押捺しえある資料を調査や購入で収集し、同様に増補・整備を行った。新着雑誌等から、書籍の文化史に関連する研究論文や資料を採取し、データとして蓄積した。2013年11月までに収集したデータをもって「『増補改訂近世書籍研究文献目録』補遺7」を編み、研究者間の情報共有化を目的として発行した雑誌『書籍文化史』第15集に収載した。同雑誌は、寄稿を受けた論考等を収載し2014年1月に発行し、研究者・研究機関に配布を行った。書籍の製作に関わる下職、すなわち、彫工・摺師・製本師に関わるデータの集積を継続した。丸山季夫『刻師名寄』の記事および、『芝居版画等図録』からの入力をほぼ終え、2014年度は、『原色浮世絵大百科事典』の「彫師と摺師」の記事のデータ化を行った。また東京都公文書館所蔵文書中の「板木工組合」「木版印刷工組合」設立願付載名簿からのデータ入力を行い、江戸(東京)の下職についてのデータの大幅な増加を図った。その他、各地の図書館・文書館所蔵資料、また購入資料資料から当該データの抽出を行い、これも増補した。書籍の流通に関わる資料の収集を継続し、仕入印等のデータの充実を図った。新著・雑誌等から書籍の文化史に関連する研究文献や資料を採取し、データとして蓄積した。2014年7月までに集積したデータに基づき、同年9月、勉誠出版より『近世・近代初期書籍研究文献目録』を編纂・刊行した。その後の増補分については、2015年1月発行『書籍文化史』16集に「『近世・近代初期書籍研究文献目録』補遺1」として公表した。書籍の制作に関わる下職、彫工・摺工・本仕立職に関わる資料の収集と整理を行い、地域単位の名寄せ形式のデータベースを作成した。なお、本年度は、銅版刻師のデータを加え、また明治20年代以後の本仕立職にも手を広げ、明治中期の教科書類からデータを拾い出す作業を行った。また、明治期の諸新聞の記事から、下職に関わる記事を収集し、データを大幅に増補した。書籍の流通に関わる研究としては、以前から継続中の仕入印・貸本印のデータの充実を図るとともに、弘暦印の備わる暦を収集し、弘暦の実態把握に努めた。さらに、書籍商の葉書の収集に力を入れ、翻字とデータ整理を行った。新著・雑誌類から書籍文化史にかかわる文献・資料を渉猟し、2015年9月までに収集したデータをまとめ、『書籍文化史』第17集に「『近世・近代初期書籍研究文献目録』補遺・2」として掲載した。書籍制作下職についての研究については、資料収集も順調で、着実に進展している。それに比べて、書籍流通に関わる仕入印・貸本印のデータについては、整理が若干遅れている。書籍の制作に関わる下職、彫工・摺工・本仕立職に関わる資料の収集と整理を継続し、地域単位の名寄せ形式のデータベース作成を行った。なお、本年度は、明治20年代以後の本仕立職のデータの収集に力を入れ、明治中期の教科書類の収集を行った。ここに押捺されている製本印からデータを拾い出していく作業を行ったが、これにより製本師と特定の版元との強い関係性を浮かび上がらせることができた。また、明治期の諸新聞の記事から、下職に関わる記事を収集する作業も継続し、今年度は「大坂朝日新聞」「伊勢新聞」からデータを収集し、データベースに付加した。一枚摺の名所絵図の調査による彫師データの収集にも着手したが、これについては、まだ中途段階である。浮世絵から彫工のデータを収集する作業も継続し、長年継続的に調査を行ってきた小千谷の「絵紙」からのデータ収集を行った。

これについては、2019年度にデータベースに付加する予定である。書籍の流通に関わる研究として、継続的に行っている仕入印・貸本印の収集を進めた。弘暦印の備わる暦の収集も継続し、弘暦の実態把握に努めた。書籍商の葉書の収集も継続し、翻字とデータ整理を行った。『書籍文化史』第18集を発行し、研究者間の情報共有を図った。これに、新著・雑誌類から書籍文化史にかかわる文献・資料を渉猟し、2016年10月までに収集したデータをまとめ、「『近世・近代初期書籍研究文献目録』補遺・3」として掲載した。書籍制作下職についての研究については、大幅なデータ増補を図る段階を過ぎ、これまでの資料収集・調査に漏れたものを拾い出していく段階となった。書籍流通に関わる仕入印・貸本印のデータについては、データ収集は安定的に継続できているが、蓄積されたデータの整理が若干遅れている。書籍の制作に関わる下職、彫工・摺工・本仕立職、また摺物所と経師等関連業者に関わる資料の収集と整理を継続し、地域単位の名寄せ形式のデータベース作成を行った。なお、本年度も、明治20年代以後の本仕立職のデータの収集に力を入れるため、明治中期の教科書類の収集を行った。また、明治期の諸新聞の記事から、下職に関わる記事を収集する作業も継続した。今年度は「信濃毎日新聞」「甲陽日報」「福岡日日新聞」「此花新聞」「神戸又新日報」等を調査対象とし、データの充実に努めた。これらデータを整備し、「諸職名寄」と題する索引付の工具書を編纂した。A4版で661ページのものとなった。これをPDFのファイルに作るとともに、架蔵資料の撮影を行い画像データとし、それらを複写したCDを制作、広く研究者に配布した。書籍流通研究に関わるツールを制作すべく、仕入印・貸本印・弘暦印のデータ収集も継続し、それらの画像とともにデータの整理も行ったが、これについては、網羅性がまだ低く、今後も継続すべき課題とした。書籍文化史に関わる研究情報を研究者に共有してもらうべく発行を続けてきた雑誌『書籍文化史』については、第19集の発行を行った。研究者からの寄稿原稿5本のほか、新著・雑誌類から書籍文化史にかかわる文献・資料を渉猟し、2017年10月までに収集したデータをまとめ、「『近世・近代初期書籍研究文献目録』補遺・4」としてこれに掲載した。書籍・摺物の制作に関わる下職である彫工・摺師・製本師と、関連業者である経師屋・摺物所・団扇問屋に関わる記事を、書籍そのものや諸史料から収集した。そのデータを整理し、「諸職名寄」と題したPDFファイルにまとめた。これに架蔵資料の画像を加えてCDを制作、コピーフリーとして、研究者に広く配布した。研究情報の共有を図るために、書籍文化史研究文献の情報を収集し、分類を施して整理した。この文献目録に、研究者から寄せられた論文を加え、雑誌『書籍文化史』を第15集から第19集まで研究期間内に5冊編輯・発行し、研究機関と研究者に配布した。下職に関わるデータについては、大きなデータの入力をほぼ終えている。その分、仕入印等書籍流通に関わるデータの整備が若干遅れている。書籍制作下職の研究については、浮世絵に印刷された彫工の印についてのデータ収集が不完全であり、これに注力するとともに、摺物所の資料収集に努める。2015年度手がけてみて、やや手ごたえのあった、明治期の新聞記事・広告からの資料収集を継続する。書籍流通の研究については、これまでどおり、仕入印・貸本印の収集と整理に努めるとともに、書籍商の葉書の収集に力を入れていく。
シナプス内AMPA型グルタミン酸受容体発現密度の生理的意義とメタ可塑性の可視化

本研究では、独自に開発した高分解能・高感度で膜タンパク質の分布を可視化できるSDS処理凍結割断レプリカ標識法(SDS-FRL法)を用いて、海馬及び歯状回のAMPA型グルタミン酸受容体(AMPAR)の神経細胞膜上発現分布と神経活動に応じたシナプス内局在変化、を解析し、単一シナプスレベルのシナプス機能制御機構とその生理的な意義の解明を目指した。さらに、光遺伝学的操作や種々の薬理学的処置を駆使し、「AMPARのシナプス内発現密度を制御している機構がシナプスのメタ可塑性(可塑性発現能)の構造基盤であること」を証明すると共に、その分子機構や関連する神経修飾系を明らかにして、「脳の記憶機構の本質」に迫ることを目的とした。平成28年度は、解析に使用する抗AMPAR特異抗体の不足により、抗体作製実験を追加するなどして計画の遅れが生じたが、年度末には作製を完了し、H29年度より1)細胞膜ドメイン毎のAMPAR分布の定量的比較、2)AMPARサブユニットの分布解析、3)AMPARのシナプス内配置の解析、4)シナプス可塑性誘導や光遺伝学的神経活動操作時のシナプス内AMPAR局在変化について解析を進め、細胞膜上に発現しているAMPARの95%がシナプス外の細胞膜上、特に樹状突起細胞膜に発現していること、これらシナプス外AMPARの発現がGluA1サブユニット依存的に制御されていること、シナプス内のAMPARは、シナプス内でクラスターを形成し、このクラスターは確率的に分布すること、そして、シナプス伝達の長期増強に伴いシナプス内AMPAR密度増加が一過性に起こることを突き止めた。H30年度は、5)AMPARのシナプス発現に関与する遺伝子を改変した動物(CaMKIIa KIマウスとArc遺伝子改変マウス)のシナプス内AMRAR局在の解析を実施し、AMPAR発現密度に関する知見を得た。現在これらの結果をまとめた論文を執筆中である。平成30年度が最終年度であるため、記入しない。本研究では、中枢神経系の興奮性情報伝達を担うAMPA型グルタミン酸受容体(AMPAR)のシナプス内発現分布とその神経活動に応じた変化を高分解能・高感度に膜タンパク質の分布を可視化できる、独自に開発した凍結割断レプリカ免疫標識法(SDS-FRL)を用いて定量的に解析し、単一シナプスレベルのシナプス機能制御のメカニズムとその生理学的な意義を解明することを目的とする。その際、光遺伝学的操作や種々の薬理学的実験下の海馬及び歯状回のシナプスを解析し、「AMPARのモザイク様シナプス内分布が脳(シナプス)が短時間に新たな状況に適応(記憶)するための構造基盤であること」を証明すると共に、「AMPARのシナプス内発現密度を制御している機構がシナプス機能のメタ可塑性(可塑性発現能)の構造基盤であること」も検証する。H28年度は、計画1)細胞膜ドメイン毎のAMPAR分布の定量的比較、計画2)AMPARサブユニットの分布解析、計画3)AMPARのシナプス内配置、計画4)シナプス可塑性誘導や光遺伝学的神経活動操作時のシナプス内AMPAR局在変化の解析に着手した。また、長期間にわたり安定したAMPAR標識効率が確保できる様、新たな抗AMPAR抗体の作製も開始した。計画1)では、海馬CA1錐体細胞と歯状回顆粒細胞の両方で、高いシナプス外AMPAR標識が観察され、引き続き樹状突起の分枝間の差や細胞体におけるAMPAR標識密度を計測して、神経細胞の細胞膜上分布を明らかにして行く。計画2)では、AMPARを構成するサブユニット、特にGluA1とGluA2サブユニットについて検討し、ほぼ終了した。計画3)は、観察された標識の二次元分布を統計的に評価する手法の開発を共同研究者と連携して進めたが、年度内に完了することができず、H29年度の継続課題となった。計画4)については、光刺激実験の実験基盤を構築した。予定していた実験計画の全てに着手し、更に新たな実験も加えた。既に完了した計画も有る一方で、予想以上に時間を要し翌年度も引き続き行う必要がある計画もある。特にシナプス内標識配置の評価には、計算論的アプローチが必須であり、評価法の確立だけでも予想以上の時間と労力を費やした。しかし、既に方法論確立の目途もたっていることから、研究計画の遂行に支障は無く、新たに加えた実験も行っているので、おおむね順調に進展していると判断した。本研究では、独自に開発した高分解能・高感度で膜タンパク質の分布を可視化できるSDS処理凍結割断レプリカ標識法(SDS-FRL法)を用いて、海馬及び歯状回のAMPA型グルタミン酸受容体(AMPAR)の神経細胞膜上発現分布と神経活動に応じたシナプス内局在変化を解析し、単一シナプスレベルのシナプス機能制御機構とその生理的な意義を解明する。さらに、光遺伝学的操作や種々の薬理学的処置を駆使し、「AMPARのシナプス内発現密度を制御している機構がシナプスのメタ可塑性(可塑性発現能)の構造基盤であること」を証明すると共に、その分子機構や関連する神経修飾系を明らかにして、「脳の記憶機構の本質」に迫ることを目的としている。平成29年度には、AMPAR特異抗体の作製を完了し、1)細胞膜ドメイン毎のAMPAR分布の定量的比較、2)AMPAR