hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
少数のダイニンと微小管から成る振動系の作成と構造・機能研究

繊毛・鞭毛の波打ち運動は、ATP加水分解のエネルギーを利用して微小管上をマイナス端方向に移動する分子モーターダイニンによって駆動されるが、その複雑な運動は個々のダイニン分子の機能の足し合わせでは説明できない。微小管上に規則的に配列したダイニンが互いに協調し、また、力などによる制御を受けながら機能する仕組みを理解するためには、軸糸内と同様に規則的に配列し、力を出して運動しているダイニンの構造を高分解能で明らかにする必要がある。しかし、力学的負荷のもとで運動中のダイニンの構造に関する知見は、現在までほとんど得られていない。そこで本研究では、このようなダイニンの構造を低温電子顕微鏡で解析することを目的とし、少数のダイニン分子と微小管、微小管架橋構造から成る系を開発した。緑藻クラミドモナスから軸糸外腕ダイニンを抽出し、長さを短くした微小管に結合させて、1マイクロメートル程度の微小管二本の間に十数十個のダイニン分子が規則的に並んだ複合体を作成することができた。ATPを加えて運動が起こると微小管が滑り合って複合体が解離してしまうため、DNA折り紙法を利用したリンカーで微小管同士を架橋した。ビオチン化した微小管を用いてダイニン-微小管複合体を作成し、両端をビオチン化したDNA折り紙架橋構造を用いて、ストレプトアビジンを介した架橋を行った。作成したダイニン-微小管-DNA架橋複合体にATPを加えることにより、力発生中のダイニンの構造を電子顕微鏡で観察することができた。今後、この構造の解析を進める必要がある。25年度が最終年度であるため、記入しない。まず、軸糸外腕ダイニン分子が、鞭毛・繊毛内のように微小管を規則的に架橋し、ATP存在下で滑り運動を起こすような複合体の作成を目指した。緑藻クラミドモナスを培養し、その鞭毛から軸糸外腕ダイニンを精製して微小管に結合させ、複合体を作成した。複合体形成の有無や、ダイニンの結合の状態は、ネガティブ染色電子顕微鏡法で観察した。2本から数本の微小管がダイニンによって架橋された複合体ができたが、複合体の多くは数マイクロメートルの微小管から成り、電子顕微鏡で全体像を観察するのが困難だった。そこで、複合体のサイズを小さくして、少数個の分子から成るシステムを作るため、微小管の長さを短くし、1マイクロメートル程度の微小管の間に十数十個のダイニン分子が並んだ複合体を作成した。次に、この複合体にATPを加え、in vitro運動アッセイで観察したが、滑り運動が確認できなかった。これは、精製したダイニンの活性の低さや、不純物によって運動が妨げられているためと考えられたので、このような問題の改善に取り組んだ。まず、人工気象器を購入・設置し、クラミドモナスの培養条件をコントロールすることによって、鞭毛の動きのよい状態で精製を行うことができるようにした。また、数回にわたってクラミドモナス培養、ダイニン精製、電顕観察、運動観察を行い、不純物を減らす努力をした結果、微小管への規則的結合と、運動が観察されるようになった。今後さらに改良を重ねて、不純物を減らす必要がある。我々は以前、ウニ精子から抽出した外腕ダイニンを用いて微小管との複合体の構造を解析したが、ダイニン分子の尾部と微小管の結合が弱く、運動中に外れやすいという問題があった。そこで本研究では、クラミドモナス鞭毛から抽出したダイニンを用いることにしたが、培養・精製のシステムを立ち上げて、良質のダイニンを得るために予想以上の時間を要したため、進捗状況にやや遅れが出た。まず、安定して滑り運動が観察されるようなダイニン・微小管複合体を早急に作成できるように努力する。この後、微小管同士を架橋する条件を検討する。

ビオチン化チューブリンを混ぜて重合した微小管を用いて複合体を作成し、両端をビオチン化したDNAを、ストレプトアビジンを介して結合させることを計画している。当初の計画では二重鎖DNAを用いる予定であるが、DNA折り紙の使用も検討したい。架橋された複合体で運動を観察し、複合体が解離しないことが確かめられたら、クライオ電子顕微鏡法によって、力発生中のダイニンの構造を高分解能で観察し、静的条件下での構造と比較する。25年度が最終年度であるため、記入しない。
C型肝炎ウイルス感染肝細胞の鉄蓄積に関わる分子のクローニングと機能解析

Nramp2の抗血清を作成し,生検肝組織を用いた免疫組織化学染色にて発現を検討したが,Nramp2は肝細胞膜にはほとんど発現せず,主に細胞質内に発現していた.このことから,肝細胞においてはNramp2が細胞内へ取り込まれたトランスフェリン鉄をエンドソームから細胞質へくみ出すポンプとして主に機能していることが明らかになった.次にC型慢性肝炎患者肝組織および対照として正常肝組織を使用し,鉄染色,Transferrin receptor(TfR)およびNramp2の免疫染色を施行した.C型慢性肝炎においては(1)線維化のステージが進むと鉄の蓄積が増加する,(2)TfRは正常肝細胞では発現していないが,C型慢性肝炎では発現が増加する,(3)Nramp2は線維化のステージが進むと発現が低下する傾向を認める,(4)Nramp2の発現は鉄の蓄積に依存し,鉄の蓄積が増加すると発現が低下する傾向が認められるが,TfRの発現は鉄の蓄積に依存せず,鉄の蓄積により発現が低下する傾向は認めなかった.以上よりTfRはC型慢性肝炎において発現が増加し,その発現は鉄の蓄積に依存しないことから,TfRの発現増加がC型慢性肝炎における鉄過剰蓄積に関与する可能性が示唆された.われわれは以前に肝癌細胞株HepG2に炎症性サイトカインを負荷し,TfRの発現が増加することを報告しており,C型慢性肝炎におけるTfRの発現増加は高サイトカイン血症による可能性が考えられた.(2)Nramp1および2のペプタイドをそれぞれ合成し,野兎に免疫しポリクローナル抗体を作成した.肝生検組織を用いて免疫組織化学染色にて両蛋白の発現を検討した.Nramp1および2は肝細胞内に顆粒状に発現していた.現在,鉄過剰蓄積が起こっている組織(瀉血療法施行症例)における両蛋白の発現に関し検討中である.Nramp2の抗血清を作成し,生検肝組織を用いた免疫組織化学染色にて発現を検討したが,Nramp2は肝細胞膜にはほとんど発現せず,主に細胞質内に発現していた.このことから,肝細胞においてはNramp2が細胞内へ取り込まれたトランスフェリン鉄をエンドソームから細胞質へくみ出すポンプとして主に機能していることが明らかになった.次にC型慢性肝炎患者肝組織および対照として正常肝組織を使用し,鉄染色,Transferrin receptor(TfR)およびNramp2の免疫染色を施行した.C型慢性肝炎においては(1)線維化のステージが進むと鉄の蓄積が増加する,(2)TfRは正常肝細胞では発現していないが,C型慢性肝炎では発現が増加する,(3)Nramp2は線維化のステージが進むと発現が低下する傾向を認める,(4)Nramp2の発現は鉄の蓄積に依存し,鉄の蓄積が増加すると発現が低下する傾向が認められるが,TfRの発現は鉄の蓄積に依存せず,鉄の蓄積により発現が低下する傾向は認めなかった.以上よりTfRはC型慢性肝炎において発現が増加し,その発現は鉄の蓄積に依存しないことから,TfRの発現増加がC型慢性肝炎における鉄過剰蓄積に関与する可能性が示唆された.われわれは以前に肝癌細胞株HepG2に炎症性サイトカインを負荷し,TfRの発現が増加することを報告しており,C型慢性肝炎におけるTfRの発現増加は高サイトカイン血症による可能性が考えられた.
近接場振動スペクトロスコピーの開発と光ナノ加工技術への応用

動脈硬化の原因となるオレイン酸コレステリルを分解・除去する方法として、赤外自由電子レーザー(FEL)を用いたレーザー治療法が提案されている。これにより分子構造変化が誘起される領域を特定することは臨床応用上重要であるが、ミクロ領域における分子構造変化を報告した例はない。そこで、試作した赤外近接場顕微分光装置を用いて、オレイン酸コレステリルを赤外自由電子レーザーによりオレイン酸とコレステロールに分解した領域の近接場観察を試みた。具体的には、赤外顕微鏡を用いて赤外自由電子レーザーのパルス光(λ=5.75μm、5μJ(試料面上))をオレイン酸コレステリルフィルム(膜厚2μm)に照射し、照射領域を差周波発生(DFG)による赤外パルス光(λ=5.75μm、0.1nJ(試料面上))と開口径2μmのカンチレバーを用いた近接場赤外顕微鏡で観察した。非照射領域はエステル結合による赤外光の吸収が観察される一方、照射領域は吸収量が少ないことを示し、この結果からFEL光照射領域内ではエステル結合が切断され、オレイン酸コレステリルが分解していることを回折限界以下の空間分解能で確認することができた。また非照射領域との吸収光量を比較することでFEL光照射領域の表面下1μmまで分子構造変化が起こっていることを確かめた。また、チップ増強ラマン散乱分光に非線形光学効果を取り入れることで、近接場フォトンの閉じ込め効果を高め、空間分解能の向上を図った。具体的にはアンチストークスラマン散乱を金属チップ先端によりナノスケールで誘起した。DNAネットワーク構造を観察した結果、15nmの空間分解能を達成することができた。金属探針プローブを用いた近接場顕微分光装置を設計・試作し、近接場ラマンスペクトルの測定を試みた。具体的には、カンチレバー先端に銀を40nmコーティングした金属プローブを用い、その先端で電場を局所的に増強することで、ローダミン6Gやクリスタルバイオレット等の有機分子からのラマン散乱光を誘起し、スペクトルを測定した。さらに、試料を2次元走査しながらラマンスペクトルの中の特定のストークス線の散乱光強度を検出することで、空間的な分子の分布の画像化を行うことに成功し、30nmの空間分解能を達成した。金属探針を用いたことで、これまで報告されている近接場ラマンイメージングと比べて、分解能で3倍以上、測定時間では1桁以上の向上を図ることができた。さらに、探針先端の金属と分子間の化学的な相互作用によると見られるスペクトルの特異的な変化を観察することができ、分子の配向状態等をも可視化できる可能性を見出した。また、ラマン分光法の相補的な情報を与える赤外近接場顕微分光法を実現するため、微小開口型カンチレバーの作製、その基礎特性の測定、さらに制御するための原子間力顕微モジュールの試作を行った。カンチレバーの作製にはシリコンプロセスを採用したことで、再現性の高い微小開口径を実現でき、かつ、複数のカンチレバーを同時に作製することを可能とし、しかも異方性エッチング過程で形成される広角の探針形状により高い光学的スループット(10^<-3>)を達成した。また、この微小開口型カンチレバーと原子間力顕微モジュールを用いて、コンタクトモードによる原子間力像も得た。赤外顕微鏡と昨年度作製した原子間力顕微モジュールおよび微小開口型カンチレバーを用いた赤外近接場分光システムの設計、試作を行った。光源にはオプティカルパラメトリック差周波発生システムと赤外自由電子レーザー(FEL-SUT)を用い、波長316μmの赤外パルス光を利用した。まず、カンチレバーの微小開口部の赤外パルス光強度に対する耐性を検証し、赤外顕微鏡導入時のパワーとして0.22mJ以下であれば、開口部が破壊されないことを確認した。この値は微小開口部では2.8μJ/μm^2に相当する。つづいて、構築した赤外近接場光学顕微システムの空間分解能を評価した。BaF_2基板上に作製した微細周期構造(周期4μm)を試料に用いた。近接場検出を行うことで、波長11μmの赤外光を用いても、この周期構造が観察できることを確認し、試作した装置が超解像性を有することを示せた。さらに、レーザー波長を掃引してPMMAフィルムの透過光量を測定し、C=O結合による1750cm^<-1>付近の吸収スペクトルを近接場計測することに成功した。また、光ナノ加工技術の開発をめざして、金属プローブ先端に形成される局所増強場による光加工を試みた。プラチナコートしたカンチレバーをプローブとし、これをポジ型フォトレジストにコンタクトさせ、GaN半導体レーザーを照射した。その結果、フォトレジストフィルムに100nm幅のトレンチ構造を作製することができた。局所的な増強効果を利用したことで、ファーフィールド加工での閾値(28.5mJ/cm^2)よりも低い照射エネルギー(6.3mJ/cm^2)で加工できることを確かめた。金属チップ先端での局所増強場を用いて単一の単層カーボンナノチューブのラマンスペクトルを近接場測定した。金属チップを近接させることで、グラフェンシートでは単一のピークであるグラファイトの振動モード(Gモード)が増強されかつ2つのピークに分離することを確認した。

さらに、低波数側に観察されるリングブリージングモードのストークスピークを測定し、それから推定されるカーボンナノチューブの直径と共鳴ラマン状況下で観察したことから、カーボンナノチューブのエネルギーバンド構造の直径に対する依存性から、そのカイラルベクトルを見積もることができた。また、DNA塩基分子の1つであるアデニン分子のナノ結晶の近接場ラマンスペクトルを測定することに成功した。とくに、近接場ラマンスペクトルで観察された739cm^<-1>ラマンピークは、金属探針を用いず測定したラマンスペクトルのピーク位置(724cm^<-1>)からシフトして観察されている。これはアデニン分子がプローブ先端の金属と化学的に吸着することで、分子と金属間での電荷移動が可能となり、その電荷移動が入射光と共鳴することで生じる共鳴ラマン効果によるものと考えられる。さらに、密度汎関数法を用いて、アデニン分子の振動解析を行い、各ピークを振動モードに帰属することができた。他のDNA塩基分子についても振動解析を行った結果、分子の骨格振動によるスペクトルを測定することで、各塩基分子を特定できることを明らかにした。動脈硬化の原因となるオレイン酸コレステリルを分解・除去する方法として、赤外自由電子レーザー(FEL)を用いたレーザー治療法が提案されている。これにより分子構造変化が誘起される領域を特定することは臨床応用上重要であるが、ミクロ領域における分子構造変化を報告した例はない。そこで、試作した赤外近接場顕微分光装置を用いて、オレイン酸コレステリルを赤外自由電子レーザーによりオレイン酸とコレステロールに分解した領域の近接場観察を試みた。具体的には、赤外顕微鏡を用いて赤外自由電子レーザーのパルス光(λ=5.75μm、5μJ(試料面上))をオレイン酸コレステリルフィルム(膜厚2μm)に照射し、照射領域を差周波発生(DFG)による赤外パルス光(λ=5.75μm、0.1nJ(試料面上))と開口径2μmのカンチレバーを用いた近接場赤外顕微鏡で観察した。非照射領域はエステル結合による赤外光の吸収が観察される一方、照射領域は吸収量が少ないことを示し、この結果からFEL光照射領域内ではエステル結合が切断され、オレイン酸コレステリルが分解していることを回折限界以下の空間分解能で確認することができた。また非照射領域との吸収光量を比較することでFEL光照射領域の表面下1μmまで分子構造変化が起こっていることを確かめた。また、チップ増強ラマン散乱分光に非線形光学効果を取り入れることで、近接場フォトンの閉じ込め効果を高め、空間分解能の向上を図った。具体的にはアンチストークスラマン散乱を金属チップ先端によりナノスケールで誘起した。DNAネットワーク構造を観察した結果、15nmの空間分解能を達成することができた。
再発性多発軟骨炎の診断を可能にする血清ペプチドの検出

再発性多発軟骨炎(relapsing polychondritis, RP)は全身の軟骨組織が再発性かつ進行性に侵され、耳・鼻・眼・気管・関節などに炎症を来たす慢性炎症性疾患である。McAdamらが提唱した方法がRP診断に使用されている。しかし、発症初期には臨床症状が揃わず診断基準を満たさないこともあり、RP診断に有用な検査は現時点では確立されていない。本研究では、RPの診断マーカー候補となる血清ペプチドを検出し、単独または複数の血清ペプチドからなるRPの診断モデルを作成し、異なる症例から成るコホートを用いて有用性を検討する。さらに、モデル作成に用いたペプチドが軟骨細胞に与える影響を検討する。
非侵襲観測による好中球の生体内1分子機能解析

半導体ナノ粒子(量子ドット:QD)を用いてマウス体内の非侵襲観察において十分な輝度を持つ蛍光粒子の開発に成功した。高解像度イメージング装置を開発し、量子ドットにより標識された好中球がマウス耳介内において遊走する様子を非侵襲観察することに成功した。更に、好中球内で小胞が高速に輸送される様子の観察・解析を行った。また、大きさの不明な物質に関しても発生する運動量の変化を測定できる顕微鏡の開発・構築し、その正確性を検証した。この系によって、Hela細胞中における小胞輸送の力は2-38pNと広く分布していることを計測した。私は、高出力レーザーと高開口数レンズを備えた、スピニングディスク共焦点顕微鏡から構成される高解像度イメージング装置を開発し、量子ドットにより標識された好中球がマウス耳介内において遊走する様子を非侵襲観察することに成功した。更に、好中球表面に結合した量子ドットは好中球内へとエンドサイトーシスされ、この好中球内での小胞輸送を観測することも可能であった。測定の結果、小胞輸送は4μm/secと、in vitroで観測されるモータータンパク質の運動速度をはるかに超える速度で行われていることが明らかとなった。この機構を解明すべく、私は、精製した好中球においても、小胞を量子ドットによって標識する手法を開発することに成功した。精製された好中球内部においても高速での小胞輸送は観測されたが、その輸送速度は小胞のサイズに依存することが判明した。また、これまでに当研究室では、バルセロナ大学のM. Montes-Usategui氏との共同開発により、レーザートラップの透過光を後焦点面においてフーリエ変換することにより、大きさの不明な物質に関しても発生する運動量の変化を測定できる顕微鏡を開発した。しかし、このシステムにより計測される力は、これまでタンパク質の力測定に用いられていた系との比較がなされておらず、その信頼性や精度について問題があった。そこで、本年度は、このシステムをより高精度なものに改良を行うと同時に、従来から用いられてきたビーズの変位を測定することによって力を測定する方法と、この後散乱により運動量を測定するシステムとの比較を行い、この系の各種パラメーターについてのキャリブレーションを行った。これまでに、Hela細胞中における小胞輸送の力は2-38pNと広く分布していることを計測したが、今後、この系を応用することで、好中球内における高速小胞輸送機構の解明が進むものと期待される。本研究では独自に作製した高輝度量子ドット(QD)集合体を用い、非侵襲条件でin vivoでのマウス好中球表面の1分子の挙動を観察することを目標としている。以前に、我々はQDを適切な濃度条件下で急速凍結させることにより凝集させることのできる手法を見出し、blinkingを克服すると同時に、高輝度のQD凝集体を作成することに成功した。本研究では、この手法により作成されたQD集合体を遠心、ゲル濾過等の手法を通じて、輝度ならびにサイズの揃ったQD集合体を精製する方法を確立した。このようにして得られたQD集合体を用いることで、10 nm以下の精度での位置検出が可能であることが明らかとなり、現在、この集合体を用いて細胞をラベリングする手法を検討中である。また、ポリスチレンビーズの周りに多数のQDを結合させるといった、新たな高輝度QD集合体の作製方法を樹立することにも成功した。このようにして作成されたQD集合体は、急速凍結により精製されたQD集合体に比べて、輝度が明るくかつ質が揃っており、高い収率で生成することが可能である。また、このQD集合体はavidin-biotin反応を通じて生成されたものであり、容易に抗体等を付加することができる。このようにして得られたQD集合体について、細胞等のラベリング条件を検討すると同時に、マウス体内に投与した場合に、非侵襲下での観察に十分な輝度を発するかどうか、また、マウスの健康に影響がないかどうかを検討している。また、バルセロナ大学のM. Montes-Usategui氏との共同研究により、後焦点面における光圧力の測定により、正確な大きさの不明な物質であっても発生する力の測定できる顕微鏡のセットアップに着手している。現在、この顕微鏡の測定機器を新しく構築するとともに、光路の微調整に取り掛かっている。急速凍結によって非侵襲観察に用いることのできる高輝度QD集合体の生成方法を確立することに成功した。このようにして作成された高輝度QD集合体は高精度での位置計測が可能であることが明らかとなり、好中球をラベリングすることにより、in vivoにおいても高精度での測定が可能になるものと期待される。しかし、このようにして作成したQD集合体に関して、特定の物質を標識する方法を確立する必要がある。

そこで我々は、ポリスチレンビーズの周りに多数のQDを結合させるといった新たな手法を通じて、高輝度QD集合体を作製することに成功した。このQD集合体は質が均一であり、avidin-biotin反応を通じて容易に分子等の標識が可能である。このような粒子の作製に成功したことは、想定以上の成果であるといえる。また、光圧力の測定による力測定顕微鏡の改良にも取り組んでいる。これまでに、レーザーの光路、測定に用いる機器やソフトウェア等の改良を行った。しかしトラップに用いるレーザービームの形を整えることに苦労しており、現在、共同研究者からのアドヴァイスを得て対処を行っている。作製に成功した高輝度QD集合体を用いて、まずは体外へと精製した好中球へのラベリングについて検討を行いたい。それと同時に、マウス体内において、非侵襲下での観察における観察、測定する系の構築を行う。また、このQD集合体は分子の標識をおこなうのに適しているものと考えられる。好中球以外にも、マクロファージやT細胞といった白血球への標識、ならびに、VEGFなどの因子を標識することも検討したい。また、後焦点面における光圧力の測定により、正確な大きさの不明な物質であっても発生する力の測定できる顕微鏡を確立させる。現在、トラップに用いるレーザー光路の調整に取り掛かっている。また、得られたシグナルには多くのノイズが含まれており、これを除去する作業を行う。この系を用いて、精製した好中球によるin vitroでの貪食作用時の力の計測を行う予定である。高輝度QD集合体の作製にあたって、多くのQDが必要とされる。また、それを修飾するための試薬も必要である。ラベリングに際して各種の抗体を用いることになる。非侵襲下でのin vivoイメージングにあわせて装置を改良に備品を要し、データ解析のためのソフト購入、開発も必要となると考えられる。また、本研究ではin vivoイメージングだけでなく、好中球を採取するためにもマウスが必要となり、その購入・維持・飼育などの費用は研究者独自に用意しなければならない。マウスから好中球を採取するだけでなく、解析の過程で種々の培養細胞も使用するため、シャーレなどのプラスチック消耗品や培地血清類も多く消費することが予想される。本研究によって得られた研究結果は特許の取得、ならびに国際論文に投稿・掲載を目指しており、そのために経費が必要となる。
ホッジ理論と数論的類似

ホッジ理論およびその1進表現の観点からの超幾何関数あるいは超幾何微分方程式を研究を課題としてきた。ゲルファント=ゼレビンスキー=カプラノフ型超幾何関数のなす空間にはいるホッジ数がツイストされたエールハルト多項式により表せること、それからえられる行列式のホッジ数がベルンシュタインの定理のある一般化を与えることなどが昨年から分かってきていたが、さらにゲルファント達の論文に出てくるケーリ-消去法がある代数的対応から来ることがわかった。これは積分表示の段階では、ラドン変換といわれるもので、これに代数的対応を付与するには、フェルマ-超曲面の族を構成する事によって得られることがわかった。この代数的対応はどのコホモロジーにも使える普遍的な方法であるので色々な応用が期待されるがそれはこれからの課題である。さらに新しい方向として有限体上の超幾何関数によって対応する代数多様体の有理点の個数を表す原理が一般的にわかった。これはガウスの超幾何関数のときは超特異楕円曲線のかずを数えるときに使われるものの一般化であり、一般のゲルファント=カプラノフ=ゼレビンスキー型超幾何関数にも適用される。一つの応用として有限体上の超幾何関数の絶対値最小の代表元に対する個数の評価が応用考えられる。
ペルーにおけるHTLV-1重複感染による高頻度ATL発症の比較ゲノム解析

HTLV-1は日本、南米、アフリカ、カリブ海沿岸諸国が高浸淫地域であり、日本を除くこれらの地域では寄生虫感染症である糞線虫症が流行している。HTLV-1キャリアへの糞線虫感染は、重症糞線虫症の発症、及びそれに伴う成人T細胞白血病リンパ腫(ATLL)の発症を促進する。本研究では、ペルーにおける糞線虫重複感染によるATLL発症加速機構を解明し、ATLL発症予防治療法の開発につなげる。今年度において、ペルーカジェタノ大学との共同で、糞線虫感染または非感染HTLV-1キャリアおよびATLL患者の末梢血を採取し、糞線虫重複感染とHTLV-1プロウイルス配列との関連を検討した。これまで43検体を収集し、そのうちの12例のDNAを用いて、ウイルスの全長をPCR増幅し、Hiseq3000により解析した。系統樹解析から、我々が解析した症例のウイルスは、全てHTLV-1aサブタイプであり、transcontinental subgroup Aのラテンアメリカクラスターに含まれることが分かった。さらに、HTLV-1・糞線虫重複感染キャリアは、特定のクラスターを形成することを示唆した。一方、関連解析では、サンプルサイズからウイルス配列の特徴と糞線虫感染との関連において、有意差が得られなかった。また、糞線虫重複感染による腸内細菌叢への影響を検討するため、これらのコホートから糞便を採取し、16S rDNAシークエンスによる腸内細菌叢解析を行った所、重複感染との関連が予想される菌叢変化が存在する可能性が示唆された。引き続き症例数を増やし、これらのゲノム解析を進め、糞線虫重複感染または重症糞線虫症と腸内細菌叢変化、さらには、HTLV-1感染リンパ球のゲノム変異との関連を明らかにしていく予定である。検体収集が順調に進み、次年度までに100例程度を収集できる見込みであり、すでに収集されている保存検体を含め、解析に必要な症例数を十分に確保できることが分かった。また、腸内細菌叢解析から、糞線虫重複感染により特異的な腸内細菌叢変動が生ずる可能性が示唆されたことから、糞線虫感染が宿主の免疫学的な変化を誘導し、HTLV-1感染リンパ球の増殖を促進することでATLLの発症を加速させる機構が推察された。そこで、HTLV-1のクローナリティ解析やHTLV-1感染リンパ球のゲノム変異を詳細に明らかにする必要があると考えられ、今後の検討課題として進める。以上、これまでの解析は、次年度につながる結果が得られており、おおむね順調に進展していると判断した。ペルーにおける糞線虫重複感染とATLL発症との関連を検討するため、糞線虫感染あり、または糞線虫感染のないHTLV-1キャリアのHTLV-1感染リンパ球のゲノム解析とクローナリティ解析を進める。また、HTLV-1ゲノムの多型、および構造的異常を検討する。HTLV-1キャリアの末梢血に含まれるHTLV-1感染リンパ球の割合は数%程度であることから、効率かつ正確にゲノム解析を進めるためターゲットエンリッチメント法を用いてHTLV-1プロウイルス配列を濃縮し、HTLV-1の挿入部位と配列解析を行う。また、HTLV-1感染リンパ球のゲノム解析はがん関連遺伝子変異パネルを用いて、ディープシークエンスにより変異の有無を詳細に解析する。これらの解析から、糞線虫重複感染によるHTLV-1感染リンパ球のクローナルな変化や、ATLL発症に関わるゲノム変異の蓄積など、ATLL発症加速機構を明らかにする知見が得られるものと考えている。さらに、腸内細菌叢解析を進め、HTLV-1プロウイルス量と相関する菌叢変化の同定を進める予定である。

検体収集が順調に進み、次年度までに100例程度を収集できる見込みであり、すでに収集されている保存検体を含め、解析に必要な症例数を十分に確保できることが分かった。また、腸内細菌叢解析から、糞線虫重複感染により特異的な腸内細菌叢変動が生ずる可能性が示唆されたことから、糞線虫感染が宿主の免疫学的な変化を誘導し、HTLV-1感染リンパ球の増殖を促進することでATLLの発症を加速させる機構が推察された。そこで、HTLV-1のクローナリティ解析やHTLV-1感染リンパ球のゲノム変異を詳細に明らかにする必要があると考えられ、今後の検討課題として進める。以上、これまでの解析は、次年度につながる結果が得られており、おおむね順調に進展していると判断した。ペルーにおける糞線虫重複感染とATLL発症との関連を検討するため、糞線虫感染あり、または糞線虫感染のないHTLV-1キャリアのHTLV-1感染リンパ球のゲノム解析とクローナリティ解析を進める。また、HTLV-1ゲノムの多型、および構造的異常を検討する。HTLV-1キャリアの末梢血に含まれるHTLV-1感染リンパ球の割合は数%程度であることから、効率かつ正確にゲノム解析を進めるためターゲットエンリッチメント法を用いてHTLV-1プロウイルス配列を濃縮し、HTLV-1の挿入部位と配列解析を行う。また、HTLV-1感染リンパ球のゲノム解析はがん関連遺伝子変異パネルを用いて、ディープシークエンスにより変異の有無を詳細に解析する。これらの解析から、糞線虫重複感染によるHTLV-1感染リンパ球のクローナルな変化や、ATLL発症に関わるゲノム変異の蓄積など、ATLL発症加速機構を明らかにする知見が得られるものと考えている。さらに、腸内細菌叢解析を進め、HTLV-1プロウイルス量と相関する菌叢変化の同定を進める予定である。
ストレスによる機能性胃腸症の発症メカニズム解明とイメージングバイオマーカーの開発

本研究では、ラット迷走神経系を介した脳腸の相互作用(脳腸相関)を超高磁場機能的MRI(fMRI)を用いてリアルタイムかつ非侵襲的に可視化する方法を開発し、ストレスによる機能性胃腸症(functional dyspepsia : FD)の発症メカニズムを解明するための基盤を構築する。現在、FDの発症に重要な部位と考えられる視床下部や延髄の神経活動を観察するため、高感度かつ高解像度の超高磁場fMRIの開発に注力している。2018年度は、2ナノ磁性粒子を用いたCE-fBVIでグレリン受容体アゴニスト投与後の視床下部と延髄における賦活部位について検討した結果、視床下部からは昨年度同様賦活化が長時間(3h)にわたって観察されたが、延髄からは明確な結果が得られなかった。3直接的に神経活動部位を可視化できる可能性があるMn2+を用いたfMRIについては、継続して脳の賦活部位や脳内情報伝達経路の可視化への可能性を確認中である。1高い時空間分解能を有する超高磁場fMRIを用いた脳機能評価法の確立ナノ磁性粒子を用いた超高磁場fMRI(CE-fBVI)による視床下部の賦活部位の可視化については測定条件の検討がほぼ終了。しかし、延髄の賦活化部位の可視化条件については現在検討中。また、直接的に神経活動部位を可視化できると思われるMn2+を用いた超高磁場fMRIの測定条件等についても検討中。いずれの場合も、詳細検討に時間を要している。2ストレスによる脳賦活部位の詳細な可視化ナノ磁性粒子を用いた超高磁場CE-fBVIにより、ラット拘束ストレス負荷時の視床下部を中心とした脳賦活部位の可視化を検討中。上記の超高磁場fMRIを用いた脳機能評価法の確立が遅れているため、ストレス負荷時の検討が遅れている。1ナノ磁性粒子を用いた超高磁場CE-fBVIおよびMn2+を用いた超高磁場fMRIの条件検討に注力し、脳機能評価法の確立を急ぐ。2特にナノ磁性粒子を用いた超高磁場CE-fBVIの視床下部及び延髄の賦活化の可視化を優先して、脳機能評価法を確立する。3ラット拘束ストレス負荷時の脳賦活化部位の可視化をナノ磁性粒子による超高磁場CE-fBVIを用いて優先的に実施する。本研究では、ストレス負荷時の迷走神経を介した脳腸相関を、超高磁場機能的MRI(fMRI)を用いてリアルタイムかつ非侵襲的に可視化する方法を開発し、ストレスによる機能性胃腸症(functional dyspepsia : FD)の発症メカニズムを解明するための基盤を構築する。FDの発症に重要な部位と考えられる視床下部や延髄の神経活動を観察するには、高感度かつ高解像度のfMRIの開発が必須である。2017年度は、2ナノ磁性粒子を用いて、CE-fBVIでグレリン受容体アゴニスト投与後の脳賦活部位の可視化を試みた結果、c-Fosの発現と相関して視床下部の賦活化が長時間(3h)にわたって観察された。海馬ではこれらの賦活化は見られなかった。現在、他の部位について検討中。3直接的に神経活動部位を可視化できる可能性があるMn2+造影を試みた結果、脳の賦活部位や脳内情報伝達経路を可視化できる可能性を確認した。1高い時空間分解能を有する超高磁場fMRIを用いた脳機能評価法の確立ナノ磁性粒子を用いた超高磁場fMRI(CE-fBVI)による脳賦活部位の詳細な可視化について検討中。また、直接的に神経活動部位を可視化できると思われるMn2+を用いた超高磁場fMRIを検討中。2ストレスによる脳賦活部位の詳細な可視化ナノ磁性粒子を用いた超高磁場CE-fBVIにより、ラット拘束ストレス負荷時の脳賦活部位の可視化を検討中。

しかし、延髄の賦活化部位の可視化条件については現在検討中。また、直接的に神経活動部位を可視化できると思われるMn2+を用いた超高磁場fMRIの測定条件等についても検討中。いずれの場合も、詳細検討に時間を要している。2ストレスによる脳賦活部位の詳細な可視化ナノ磁性粒子を用いた超高磁場CE-fBVIにより、ラット拘束ストレス負荷時の視床下部を中心とした脳賦活部位の可視化を検討中。上記の超高磁場fMRIを用いた脳機能評価法の確立が遅れているため、ストレス負荷時の検討が遅れている。以下の推進方策を取る。1遅れている高い時空間分解能を有する超高磁場fMRIを用いた脳機能評価法の確立を急ぐ。中でも有力な方法と思われるナノ磁性粒子を用いた超高磁場fMRI(CE-fBVI)による脳賦活部位の可視化法を優先して、脳機能評価法を確立する。2ラット拘束ストレス負荷時の脳賦活部位の可視化をナノ磁性粒子を用いた超高磁場fMRI(CE-fBVI)で優先的に実施する。1ナノ磁性粒子を用いた超高磁場CE-fBVIおよびMn2+を用いた超高磁場fMRIの条件検討に注力し、脳機能評価法の確立を急ぐ。2特にナノ磁性粒子を用いた超高磁場CE-fBVIの視床下部及び延髄の賦活化の可視化を優先して、脳機能評価法を確立する。3ラット拘束ストレス負荷時の脳賦活化部位の可視化をナノ磁性粒子による超高磁場CE-fBVIを用いて優先的に実施する。2017年度の研究計画の中で、方法論の確立に時間を要し、計画に遅れが生じているため。翌年度、方法論の確立を優先し、集中的に助成金を使用することを計画している。2018年度の研究計画の中で方法論の確立に時間を要し、計画に遅れが生じているため。翌年度、方法論の確立に注力し、集中的に助成金を使用することを計画している。
LC/MS/MSを用いたリゾリン脂質超高感度精密定量分析に関する研究

本研究の目的は、LC/MS/MSを用いる超高感度リゾリン脂質検出系を構築し、レーザーマイクロダイセクション(LMD)によって切り出された微量組織切片によるリゾリン脂質解析を実施することである。初めに、分析カラムの最適化、カラムスイッチグ法の導入、流路の改善等のHPLC条件の最適化により、リゾリン脂質の検出限界を100倍程度向上させた。さらに、ヒートスタビライザーを用いLMD処理中における組織中リゾリン脂質の分解を抑制する条件を最適化し、構築した定量法を用い、マウス組織切片(肝臓及び脾臓)数百から数千細胞におけるリゾリン脂質の検出に成功し、組織分布局在を明らかにした。本研究の目的は、LC/MS/MSを用いる超高感度リゾリン脂質精密定量分析系を構築し、レーザーマイクロディセクション(LMD)によって切り出された微量組織によるリゾリン脂質定量解析を実施することである。現在までに、Nanoviperによる分析システムの流路系の改善、ジャケットヒーターによるトラップカラムの再現性向上等により、リゾリン脂質超高感度カラムスイッチングシステムの構築に成功した。また、測定に用いる分析カラムの内径を0.3μmとしたところ、クロマトグラム上に大きなピークテーリングが見られたが、カラム合成時に新たな処理を加えることにより(資生堂との共同研究)改善することに成功した。本システムでのリゾリン脂質の検出限界は数pmol/Lであり、現在分析法バリデーションを実施している。次に、LMD組織切片からの定量解析を実施した。超高感度化により、リゾリン脂質の分布が比較的低いとされる脾臓において、600細胞程度からの定量に成功した。現在までにLMDによる微量組織定量に必要な細胞数は、数百から数千細胞と考えられる。さらに、LMDに用いるフィルムに酵素阻害剤を予め塗布することにより、安定した測定条件を確立した。また、固相抽出カラムによるリゾリン脂質選択的な前処理手法として、現在までにODSカラム(BondElutC18)による前処理条件を構築した。今後、ジルコニア修飾前処理用カラム(固相抽出カラム:Hybrid SPE)を用いた際の回収率及び感度等を比較することにより、リゾリン脂質を選択的に精製する前処理法を構築する。また本研究において、固相抽出カラムにおけるリゾリン脂質の保持を安定させる条件を確立するため、原子間力顕微鏡による球状シリカの表面状態の観察を実施したところ、100 nm程度の分解能にて表面画像を得ることに成功した(生体分子計測研究所との共同研究)。本研究の目的は、LC/MS/MSを用いる超高感度リゾリン脂質検出系を構築し、レーザーマイクロダイセクション(LMD)によって切り出された微量組織によるリゾリン脂質定量解析を実施することである。平成26年度は、はじめに超高感度測定系分析法バリデーションを実施した。先行研究にて測定が困難とされていたLysoPSは、定量限界値100 pmol/Lにおける添加回収試験の日内及び日間再現性の評価項目である真度及び精度は、いずれも20%以下と良好な値が得られた。また、スフィンゴシン一リン酸(S1P)も定量限界値が10 pmol/Lと超高感度な定量系の構築に成功した。また、本測定系を用い、S1Pトランスポーター発現遺伝子のノックアウト(KO)マウスと野生型(WT)マウスの組織中S1Pの定量を実施したところ、WTマウスと比較しKOマウスにてS1Pが有意に高値となることを示した。また、LMDによる微量組織切片を作成し、肝臓及び脾臓における組織分布を定量したところ、脾臓のS1PはRed Pulpにおいて、White Pulpと比較し有意に高値となることが示された。現在までに組織切片600細胞程度にてリゾリン脂質の測定が可能である。平成25年度の課題であったリゾリン脂質選択的固相抽出カラムの開発は、リゾリン脂質標準品の回収率が十分に得られなかった。そこで、リゾリン脂質とカラムの固定相の疎水性相互作用を確認することを目的とし、原子間力顕微鏡(AFM)による測定を実施したところ、脂質分子によって固定相表面における分子形状の違いを確認することが出来た。今後、AFMを用い、リゾリン脂質選択的な分析カラムの固定相と移動相の組み合わせを明らかにする。以上の様に、二年間における研究で数多くの研究成果を挙げることが出来たことから、本研究が今後のリゾリン脂質分析に大きく貢献すると考えられる。分析化学LC/MS/MSによるリゾリン脂質の超高感度検出系に関しては、当初目標としていた数pmolより高い感度にてリゾリン脂質の検出を可能としたことから、測定システムの構築に関する研究は順調に進捗している。

これに加え、リン酸基フリーのリゾリン脂質(スフィンゴシン-1-リン酸、S1P)のテーリングを抑えて検出することを可能とする、新たな分析カラムの作成を資生堂の研究協力を受けて成功した。しかしながら、ジルコニアコートシリカ担体カラムを用いるリゾリン脂質の選択的検出法の構築に関しては、最適条件の設定を現在検討中であることから、平成26年度も継続して研究を進める予定である。LMDによる微量組織からのリゾリン脂質の検出に関しては、脾臓組織を用い、血管組織で覆われた、ろ胞内部を円(輪)状切り出した後、600から4000細胞程度を準備し、メタノール除タンパクのみによる処理にて前処理し、S1Pの検出に成功した。当初目標としていた数千細胞よりも少ない600細胞程度の脾臓組織切片からの検出に成功したことから、研究は順調に進んでいると考えられる。組織の前処理として、Hybrid SPEを用いる手法を検討中であるが、リゾリン脂質のカラムへの保持状態をより視覚的に観察することを目的とし、原子間力顕微鏡による球状シリカの表面状態の観察に成功している。今後、リン脂質を保持したカラムの状態と溶出したカラムの状態を比較することにより、安定した溶出条件を精査する予定である。以上のことから、検出系の構築は予定通り進んでいるが、その一方で、より選択的な前処理法の構築に関しては、予定通り進んでいないためおおむね順調に進展していると評価した。リゾリン脂質の超高感度検出系の構築は、添加回収試験に用いるサンプルを準備し、分析法のバリデーション評価を実施している。今後、測定系の信頼度と再現性を評価する予定である。また、標的化合物はS1Pだけでなく、その他のリゾリン脂質(リゾフォスファチジン酸等)の定量に関しても、検討を開始する。また、構築した定量系をマウス組織切片に応用し、リゾリン脂質の分布局在を示す定量マッピングを作成する。LPA受容体やS1Pトランスポーター発現遺伝子の欠損マウスを用い、局所細胞毎におけるリゾリン脂質を定量し、正常マウスにて作成したマッピングと比較することで分布局在の変化を明らかとする。非染色組織切片のみにてリゾリン脂質の組織分布を明らかにすることは困難である為、連続組織切片を準備し、一方をトランスポーターの染色、他方をLMD切片の作成に用い、結果を統合して解析を進める。また現在、脳及び脾臓以外の組織を用いる測定にも着手しており、今後、組織毎の違いや組織量(細胞数)に応じたリゾリン脂質濃度の直線性を明らかにする予定である。これに加え、リゾリン脂質選択的な前処理法として、Hybrid SPEによるリゾリン脂質の最適溶出条件を決定し、組織切片の安定解析手法を構築する予定である。さらに、高分解能質量分析装置を用いる組織切片メタボローム解析により、リゾリン脂質のプロファイリングを実施し、代謝物の違いを明らかにする予定である。メタボローム解析の基盤としては、QExactive及びSynapt-G2Siの両者を用い、データベースはHMDB、METLINに加えLipidSearchを組み合わせることにより、脂質選択的な解析を実施する。
表面プラズモン共鳴を介した極短電子バンチ長の非破壊・即時計測技術の開発

数十フェムト秒(FWHM)の電子バンチの空間電荷分布を加速器真空系の外で非破壊・リアルタイムで計測する測定系を開発した。真空ダクトにメタマテリアル層を蒸着したプリズムを設置し、電子バンチ起因のクーロン場で表面プラズモン共鳴(SPR)を励起させ、これを計測する。SPR基板の構造は、実際の加速器の運転条件を反映した数値計算で最適化した。2015、2016年に京大ナノハブで製作し、レーザー顕微鏡でパターンの寸法・表面粗さの評価を行った。実証試験はSPring-8のRFフォトカソード電子銃試験加速器で行う。加速器の増強工事と制御系の整備が予定よりも大幅に遅れた為、2017年12月以降を予定している。フェムト秒単一電子バンチについて、加速器真空系の外で測定系の放射線損傷を気にすることなく、非破壊・リアルタイムでバンチ長測定を実現する系の開発を行う。具体的には、真空ダクトに設けたメタマテリアル媒質と電子バンチ起因のクーロン場で表面プラズモン共鳴(SPR)を真空ダクト外に励起させ、このSPRをEOサンプリング(EOS)等で計測する測定系を開発する。目標とする電子バンチ長は30 fs (FWHM)程度である。SPR基板は、合成石英と金薄膜から成り、二者の接着層にはNiストライクを採用する。平成27年度は、実施計画に則り、SPRを効率的に励起する基板構造(接着層・金薄膜の厚さ、金薄膜に施すパターン等)の数値計算による最適化を行った。またこの最適化されたパラメータをもとに、2015年12月より、京都大学ナノテクノロジーハブ拠点にて、SPR基板の製作を行った。平行して、SPR基板を交換して試験可能な真空チェンバーの設計を行い、製作した。SPR基板の実証実験を行うために必要な、製作物・調達品は全て揃った。電子ビーム線型加速器を用いたSPR基板の実証実験に関しては、加速器増強工事が平行して実施されたため、未実施である。この増強工事は平成27年度一杯で完工し、平成28年度6月までに運転に必要なパラメータ調整を行い、7月より稼働する予定である。研究実績の概要でも記述した通り、SPR基板の実証試験を行う、SPring-8 RF電子銃試験加速器の加速管増強工事を平成27年度に行った。工事自体は昨年度内に終了したが、加速器を運転する上で必要なパラメータ調整は間に合わず、昨年度内に加速器を運転できなかった。従って昨年度予定していた、SPR基板の実証試験は実施できなかった。電子バンチの空間電荷分布を有機ポッケルス電気光学効果(EO)結晶を用いたEOサンプリングにより、加速器真空系の外で非破壊・リアルタイムでの計測を実現する測定系の開発を実施した。計測対象の電子バンチ長は数十フェムト秒(FWHM)である。測定系を真空系の外に導く理由は、有機物を含む測定系を電子ビーム軌道から可能な限り離し、空間線量の低い場所に設置することにより、測定系を放射線損傷から保護するためである。真空ダクトにメタマテリアル層を蒸着したプリズムをクレッチマン配置で設置し、電子バンチ起因のクーロン場で表面プラズモン励起(SPR)を励起させ、これをEO計測するものである。製作上の制限から、合成石英薄板にメタマテリアル層を蒸着したSPR基板を製作し、この基板とプリズムをオプティカル接合させた。SPR基板の構造は、実証試験を行う加速器の運転条件を課した数値計算(CST STUDIO)でSPR強度が最大となる様に最適化し、2015年12月と2016年1月に、京大ナノハブでリフトオフ法により試作した。基板のメタマテリアル層を三次元レーザー顕微鏡で観察し、パターンの寸法・表面粗さの評価を行った。パターンのスリット間隔は凹部が設計に比べて3%程度狭く、深さは10%浅い結果となった(いずれも代表値)。また表面粗さは±5 nmである一方、レーザー顕微鏡の繰り返し精度も±6 nmと大きく、現時点ではパターン設計寸法の一割程度が加工・計測精度となっているのが実情である。実証試験については、SPring-8/SACLA附設のRFフォトカソード電子銃試験加速器で行う。2016年10月以降に実施する予定であったが、加速器及びレーザー光源の増強工事と制御系の整備が予定よりも大幅に遅れ、2017年12月以降を予定している。2016年6月までには、計算・実験による加速器運転パラメータの最適化を計り、7月から加速器の運転を開始する。その後、電子バンチとプローブレーザーのタイミング調整、プローブレーザー光学系の最適化を順次行い、SPR基板の実証試験を実施する。

試験を通して得られた問題点・反省点を克服・反映し、必要に応じてSPR基板構造の最適化、製作、実証試験を行い、最終総括を行う。加速器科学SPR基板の製作にあたり、金薄膜と合成石英の間に設ける接着層の材質にNiを採用した。これはSPRをより効率的に励起するための数値計算の結果によるものである。しかしながら接着層は通常Crであり、Niは一般的ではないため、条件出しに必要な試作の材料代を予め余分に設けたが、京都大学ナノテクノロジーハブ拠点の優秀なスタッフの助力により、試作の数を抑えることが出来た。結果として2万円程度の次年度使用額が発生した。次年度使用額の発生により、SPR基板を2台ほど多く製作する。これが意味することは、より多くのパラメータで実験を行うことが出来るということで、より有意義なデータ取得が可能となった。
沿岸性カイアシ類の再生産に対する餌料プランクトンの栄養学的影響

実験室内において9種類の微細藻類(渦鞭毛藻4種、クリプト藻1種、ハプト藻1種、ラフィド藻1種、プラシノ藻1種、珪藻1種)を沿岸性カイアシ類にそれぞれ単独で与えた時のカイアシ類の摂食活性と再生産規模について調べ、さらに各微細藻の脂肪酸組成を測定し、カイアシ類の各脂肪酸摂取量を求めた。その結果、n-3系高度不飽和脂肪酸、特に22:6(n-3)脂肪酸の摂取量が多いほどカイアシ類の産卵数が多くなることが明らかとなった。また、現場におけるカイアシ類の微細プランクトンに対する摂食活性と産卵数との関係について調べたところ、渦鞭毛藻および少毛類繊毛虫に対する摂食速度と産卵数との間に有意な正の相関が認められた。本邦の亜寒帯から亜熱帯まで幅広い範囲の沿岸および内湾域に生息するカイアシ類Acartia steueriの再生産に与える餌料生物の影響について現場実験を用いて調査した。実験は2015年の秋季から冬季にかけて岩手県大船渡市の越喜来湾において行った。現場において採集した海水を透明ボトルに満たし、ここに同じく現場で採集したA.steueriの雌成体を5個体ずつ入れ(実験区)、海水のみのボトル(対照区)とともに現場の水深5mに24時間垂下した。その後ボトルを回収し、実験区のボトル中より産生されたA.steueriの卵を取り出し計数した。さらに両実験区の海水を濃縮し、、試料中の微細プランクトンを中心目および羽状目珪藻、渦鞭毛藻、少毛類および有鐘類繊毛虫、珪質鞭毛藻の6グループに分類しそれぞれ計数した。この計数結果より、A.steueriの各微細プランクトンに対する摂食速度を算出した。実験期間中のA. steueriの総産卵数は9月中旬が15個/雌/日と最も高く、10月に入ると2.2個/雌/日まで急激に減少し、以降は12月上旬まで0.22.8個/雌/日の範囲で変化した。13月には本種の出現は確認されなかった。本種の各微細プランクトンに対する摂食速度を比較したところ、渦鞭毛藻に対する値が最も高く、特に9月中旬には12.9細胞/雌/時と最高値を記録し、以降は12月上旬まで4.110.2細胞/雌/時の範囲で推移した。次いで少毛類繊毛虫に対する摂食速度が高く、9月中旬から12月上旬にかけて時間の経過とともに1.9から0.5細胞/雌/時まで緩やかに減少した。一方、中心目、羽状目珪藻、有鐘繊毛虫および珪質鞭毛藻に対する摂食はほとんど確認されなかった。以上のことから本種の主要な餌生物は渦鞭毛藻および少毛類であり、これらの増減が本種の摂食活性、さらには再生産規模に影響することが示唆された。研究代表者はこれまでに沿岸性カイアシ類Eurytemora pacificaを用いて摂餌および産卵実験を行なってきたが、本種の数度にわたる大量へい死が発生し、十分に実験を行なうことができなかった。さらに、餌料として用いた微細プランクトン中に含まれる脂肪酸測定に使用する機器(ガスクロマトグラフィー)が故障し、修理に時間を要したため、本項目についても十分な結果を得ることができなかった。したがって、全体の達成度はやや遅れている。実験室内で飼育したカイアシ類Pseudodiaptomus marinusに8種の微細藻類(クリプト藻Rhodomonas salina、ハプト藻Isochrysis galbana、プラシノ藻Tetraselmis sp.、渦鞭毛藻Alexandrium tamarense、Prorocentrum micans、Heterocapsa triquetra、ラフィド藻Heteroshigma akashiwo、珪藻Chaetocerosdidyms)をそれぞれ単独で与え、各微細藻に対する摂食速度を測定し、さらに成体雌の産卵数を求めた。本種カイアシ類成体雌の摂食速度(炭素重量ベース)は、R. salinaに対して最も高く(0.74ugC個体-1 h-1)、C. didymsで最も低くなった(0.016)。本種カイアシ類雌成体の生涯産卵数は、R. salinaを与えた場合が最も高く(51.3個)、Hs. akashiwoを与えた場合が最も少なかった(2.2個)。カイアシ類の餌として用いた各微細藻類の脂肪酸組成を分析したところ、全脂肪酸量に占めるn-3系脂肪酸の占める割合がR. salinaで最も高く(47.8%)、C. didymsには全く含まれていなかった。これらの値と、カイアシ類の摂食速度(炭素重量ベース)との間には有意な正の相関が認められた。さらに、微細藻1細胞あたりの脂肪酸含有量を求め、カイアシ類の各微細藻に対する摂食細胞数を乗じてカイアシ類の各脂肪酸に対する取り込み速度を求めたところ、22:6(n-3)脂肪酸の取り込み速度がR. salinaを摂食させた場合に最も高く(659 fg個体-1 h-1)、C. didymsを摂食させた場合は全く取り込まれていなかった。これらの値と、カイアシ類の生涯産卵数との間には有意な正の相関が認められた。