hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
太陽紫外線の脅威を軽減させる光回復酵素の特性解析とその分子進化論的考察

1.異なる生物種からの(6-4)光回復酵素遺伝子の単離我々が単離したショウジョウバエの遺伝子とヒトホモログ遺伝子の間で保存されている領域を利用して、アフリカツメガエル、アラビドプシス及びセブラフィッシュから(6-4)光回復酵素遺伝子を単離した。2.(6-4)光回復酵素の生化学的特性精製したツメガエルの酵素を用いた解析から、この酵素の光受容体の一つはフラビンアデニン・ジヌクレオチド(FAD)であることを明らかにした。また、2本鎖DNA中の(6-4)光産物に対する酵素の結合及び解離定数を決定した。3.他生物種の光回復酵素遺伝子のヒト細胞における発現紫外線高感受性の色素性乾皮症(XP)細胞に、オポッサムのピリミジンダイマー(CPD)光回復酵素遺伝子を発現させた。この細胞では、紫外線の致死作用の顕著な光回復が認められた。また、紫外線を照射したシャトルベクタープラスミドにおけるSupF遺伝子の突然変異頻度は、細胞の光回復処理によって約1/4に低下すると共に、紫外線に特徴的な2塩基同時置換突然変異が大幅に減少した。4.(6-4)光回復酵素の分子進化アミノ酸配列の類似性から一つのファミリーを形成している単細胞のClass I CPD光回復酵素、高等生物のClass II CPD光回復酵素、(6-4)光回復酵素、(6-4)光回復酵素ホモログ及び植物の青色光受容体について、分子進化論的に解析した。その結果、これらのタンパク質は祖先遺伝子であるCPD光回復酵素遺伝子が、原核生物が真核生物と分岐する以前に最低5回の遺伝子重複を起こし、(6-4)光回復酵素や青色光受容体に変化したとの考えを示した。1.異なる生物種からの(6-4)光回復酵素遺伝子の単離我々が単離したショウジョウバエの遺伝子をプローブとして用いることで、アフリカツメガエル及びキンギョから(6-4)光回復酵素遺伝子を単離することに成功した。2.(6-4)光回復酵素の生化学的特性の解析高度(純度98%)に精製したツメガエルの酵素を用いて、種々の生化学的特性を解析した。まず、この酵素は2種類の光受容体を持ち、その一つはフランビンアデニン・ジヌクレオチド(FAD)であることを明らかにした。2本鎖DNA中の(6-4)光産物に対する酵素の結合定数は大きく、ピリミジンダイマー光回復酵素の結合定数とほぼ同じであった。しかし、結合した酵素の解離定数はそれ程大きなものでなかった。また、酵素の吸収スペクトルと光回復能の作用スペクトルとの比較から、還元型のFADH-を持つ酵素が(6-4)光産物の修復を担っていることが判明した。3.(6-4)光回復酵素のヒトホモログの解析我々は、ショウジョウバエの光回復酵素のヒトホモログ遺伝子(H64PRH)を単離した。この遺伝子はヒト12番染色体の長腕(12q24.1)に位置することが分った。ノザンブロットでヒトの各種臓器のおける発現を解析したところ、調べた範囲の全ての臓器で発現が認められ、特に腎臓、精巣、骨格筋などで強く発現していた。このことは、この遺伝子の産物が何らかの生理機能を持つことを意味している。しかし、H64PRH遺伝子を光回復能欠損の大腸菌に導入して発現させても、(6-4)光産物の光回復能を示さなかった。1.太陽紫外線に高感受性を示すヒト遺伝病の遺伝子解析太陽紫外線の露光部に皮膚癌を多発する色素性乾皮症(XP)の相補性群(原因遺伝子)の分布を、日本人と中国人の患者で比較した。中国人XP患者にはC群が非常に多く、欧米における分布と類似していたが、日本人XP患者ではC群が稀であることと対照的であった。

また、皮膚が紫外線高感受性のコケイン症患者で、神経症状を伴わない世界で最初の例を見出した。2.異なる生物種からの(6-4)光回復酵素遺伝子の単離すでに我々が単離したショウジョウバエとツメガエルの遺伝子、及びこのヒトホモログ遺伝子の間でアミノ酸レベルでよく保存されている領域を利用して、ゼブラフィッシュと高等植物のアラビドプシスから(6-4)光回復酵素遺伝子を単離した。これらの遺伝子を、酵素欠損の大腸菌で発現させると、紫外線の致死効果の著しい光回復が認められた。また、大腸菌で高発現させたタンパクを精製し、(6-4)光産物を特異的に修復することを確認した。3. (6-4)光回復酵素の分子進化アミノ酸の一次構造の類似性から、単細胞のClass Iピリミジンダイマー(CPD)光回復酵素、高等生物のClass II CPD光回復酵素、(6-4)光回復酵素、ヒト(6-4)光回復酵素ホモログ、植物の青色光受容体は、一つのファミリーを形成していることを明らかにした。分子進化論的解析から、これらのタンパク質は祖先遺伝子であるCPD光回復酵素遺伝子が、原核生物が真核生物と分岐する以前に最低8回の遺伝子重複を起こし、(6-4)-光回復酵素や青色光受容体に変化したと考えられる。1.他生物種の光回復酵素遺伝子のヒト細胞における発現DNA除去修復能を欠損している色素性乾皮症(XP)患者由来の細胞に、オポッサムのピリミジンダイマー(CPD)光回復酵素遺伝子を発現させた。この細胞では、紫外線の致死作用の顕著な光回復が認められた。また、紫外線を照射したシャトルベクタープラスミドを感染させた細胞を可視光で照明すると、SupF遺伝子の突然変異頻度が約1/4に低下すると共に、紫外線に特徴的な2塩基同時置換突然変異が大幅に減少した。2.CPDと(6-4)光産物の突然変異誘発効率の比較紫外線を照射したプラスミドを、インビトロで2種類の光回復酵素で処理した後にXP細胞中で増殖させ、生じた突然変異を解析した。光回復酵素でプラスミドからCPDまたは(6-4)光産物だけを取り除くと、突然変異頻度が紫外線照射だけの約1/10または1/2.5に減少した。このことから、紫外線誘発突然変異の主要な原因はCPDであること、1個の損傷当たりの変異誘発効率はほぼ同じであることが明らかになった。3.光回復酵素ホモログと概日リズムショウジョウバエの光回復酵素ホモログ遺伝子(dcry)を過剰に発現させたハエでは、光依存的な行動の概日リズムの制御に異常が認められた。このことは、CRY蛋白がリズムの光受容体として機能していることを意味する。一方、マウスからは2種類のホモログ、mcry1とmcry2を単離した。興味深いことに、両遺伝子のダブルノックアウトマウスは、恒暗条件下では完全に行動の概日リズムを失っていた。このことは、マウスのホモログ蛋白は体内時計の本体として機能していることを示唆する。
生体電気信号から魚の心理を推定する：『生物感性工学』への挑戦

本研究では,モデル生物であるゼブラフィッシュとメダカの心理状態推定法の開発を目指す.具体的には,生体電気信号から魚の生理状態と運動状態を計測し,魚の心理状態の表現軸を見出してこれにマッピングすることにより,ストレスを含めた心理状態を推定する.本研究課題は以下の4つの小目標で構成される:(1)魚の生体電気信号から生理状態と運動状態を同時計測するアルゴリズムの開発.(2)心理刺激実験プロトコルを設計し,生理状態と運動状態を解析することにより魚の心理状態を表現する空間軸の構成.(3)計測した生理・運動指標を心理状態空間に変換するアルゴリズムの開発.(4)心理状態モデルを構築することによる魚の情動状態の未来予測の実現.平成29年度までに,1匹の魚の呼吸波計測を行い(目標(1)),人工的に恐怖情動と快情動を誘発して呼吸のリズムと運動を抽出し(目標(2)),恐怖情動と快情動が表現可能な心理軸を導いた(目標(2)・(3)).平成30年度は,魚の馴化開始時間予測を試みた.魚は未知の環境刺激が提示されると恐怖や不安情動を発現し,馴化するにしたがってこれらの情動が消失する.この情動の遷移はこれまでに抽出した遊泳状態と生理状態を反映する評価指標の分布の変化によって表現できると考えられるため,主成分空間上における評価指標の分布の時間変化をKL情報量により評価するという手法を提案した.新奇環境刺激を魚に提示するという実験を行った結果,時間経過とともに指標分布の変動が小さくなっていることを確認した.そして,専門家の評価と提案法が予測した馴化開始時間との間に有意な強い相関(r = 0.87,p = 0.025)が認められた.以上より馴化という現象を対象として情動状態の遷移予測に成功した.本研究では,モデル生物であるゼブラフィッシュとメダカの心理状態推定法の開発を目指す.具体的には,生体電気信号から魚の生理状態と運動状態を計測し,魚の心理状態の表現軸を見出してこれにマッピングすることにより,ストレスを含めた心理状態を推定する.本手法が開発できれば,飼育魚の精神衛生管理や外部刺激を利用した魚の心理状態制御,さらにはヒトとのコミュニケーションツールなどを実現できる可能性がある.本研究課題は以下の4つの小目標で構成される:(1)魚の生体電気信号から生理状態と運動状態を同時計測するアルゴリズムの開発.(2)心理刺激実験プロトコルを設計し,生理状態と運動状態を解析することにより魚の心理状態を表現する空間軸を見出す.(3)計測した生理・運動指標を心理状態空間に変換するアルゴリズムの開発.(4)心理状態制御モデルを構築することにより魚の心理状態の制御と未来予測を実現.平成28年度は(1)(3)項について以下を実施した.(1):3Dプリンタを用いて計測水槽を製作し,水槽底面に多数の計測電極を配置することにより,生体電気信号中に含まれる呼吸波の発生源の位置を推定するアルゴリズムを開発した.そして,推定位置周辺の電極で計測された生体電気信号をバンドパスフィルタで濾波することにより呼吸波を抽出し,呼吸のリズムなど生理状態を表す指標を抽出した.(2):計測した生理状態と運動状態から心理状態を表現する空間軸を見出すため,心理刺激実験を行った.本年度は,恐怖行動を誘発する刺激を魚に与え,生体電気信号と行動を計測した.(3):当初の研究計画では平成29年度以降に実施予定であった魚の心理状態を表現する空間軸についても検討し,判別分析に基づいて呼吸のリズムと運動速度から得られた指標を用いて恐怖感情を構成する心理軸を導いた(松野ら,第25回計測自動制御学会中国支部講演会).当初の計画においては,H28年度までに魚の生体電気信号から生理状態と運動状態を同時計測するアルゴリズムの開発を行い,心理刺激実験プロトコルを設計するとともに,心理状態推定のためのデータ収集実験を行う予定であった.研究実績の概要で述べたようにH28年度までに以上の項目は達成済である.さらに,判別成分分析を用いて魚に恐怖行動が表出した時の生理指標と運動指標を解析することにより,魚の心理状態(恐怖)を表現する空間軸を見出した.これは,当初の計画では29年度から実施する予定であった項目であり,当初の計画以上の成果が得られたため.本研究では,モデル生物であるゼブラフィッシュとメダカの心理状態推定法の開発を目指す.具体的には,生体電気信号から魚の生理状態と運動状態を計測し,魚の心理状態の表現軸を見出してこれにマッピングすることにより,ストレスを含めた心理状態を推定する.本研究課題は以下の4つの小目標で構成される:(1)魚の生体電気信号から生理状態と運動状態を同時計測するアルゴリズムの開発.(2)心理刺激実験プロトコルを設計し,生理状態と運動状態を解析することにより魚の心理状態を表現する空間軸の構成.(3)計測した生理・運動指標を心理状態空間に変換するアルゴリズムの開発.(4)心理状態制御モデルを構築することによる魚の心理状態の制御と未来予測の実現.平成28年度までに,1匹の魚の呼吸波計測を行い(目標(1)),人工的に恐怖を誘発して呼吸のリズムと運動を抽出し(目標(2)),恐怖情動が表現可能な心理軸を導いた(目標(2)).平成29年度は,上記成果を学術論文として発表した(Soh et al. 2018, Zebrafish).また,エタノールを用いて快情動を誘発し,生体電気信号と行動から各種指標を抽出し,線形判別分析を用いて,快・不快・ニュートラルの3種類の情動識別を行った.

その結果,不快情動は約70%の正答率で識別できるが,快情動の正答率は10%以下であった.そこで,正規分布を内包する確率ニューラルネットLog-Linearized Gaussian Mixture Network(LLGMN)を用いて識別を行ったところ快情動の正答率は50%60%に以上に上昇し,チャンスレベルである33%を大きく上回った.この結果は,快情動の識別には非線形性が重要であることを示している.また,快情動を発現している魚からは多様な行動様式が観測され,不快情動のように画一的な行動を示さないことが分かった.H28年度までに魚の生体電気信号から生理状態と運動状態を同時計測するアルゴリズムの開発を行い,心理刺激実験プロトコルを設計するとともに,心理状態推定のためのデータ収集実験を行った,H29年度は,生理状態と運動状態を解析することにより魚の心理状態を表現する空間軸を見出し,計測した生理・運動指標を心理状態空間に変換するアルゴリズムを開発した.この進捗は,研究計画調書に記載した当初の計画通りであるため.本研究では,モデル生物であるゼブラフィッシュとメダカの心理状態推定法の開発を目指す.具体的には,生体電気信号から魚の生理状態と運動状態を計測し,魚の心理状態の表現軸を見出してこれにマッピングすることにより,ストレスを含めた心理状態を推定する.本研究課題は以下の4つの小目標で構成される:(1)魚の生体電気信号から生理状態と運動状態を同時計測するアルゴリズムの開発.(2)心理刺激実験プロトコルを設計し,生理状態と運動状態を解析することにより魚の心理状態を表現する空間軸の構成.(3)計測した生理・運動指標を心理状態空間に変換するアルゴリズムの開発.(4)心理状態モデルを構築することによる魚の情動状態の未来予測の実現.平成29年度までに,1匹の魚の呼吸波計測を行い(目標(1)),人工的に恐怖情動と快情動を誘発して呼吸のリズムと運動を抽出し(目標(2)),恐怖情動と快情動が表現可能な心理軸を導いた(目標(2)・(3)).平成30年度は,魚の馴化開始時間予測を試みた.魚は未知の環境刺激が提示されると恐怖や不安情動を発現し,馴化するにしたがってこれらの情動が消失する.この情動の遷移はこれまでに抽出した遊泳状態と生理状態を反映する評価指標の分布の変化によって表現できると考えられるため,主成分空間上における評価指標の分布の時間変化をKL情報量により評価するという手法を提案した.新奇環境刺激を魚に提示するという実験を行った結果,時間経過とともに指標分布の変動が小さくなっていることを確認した.そして,専門家の評価と提案法が予測した馴化開始時間との間に有意な強い相関(r = 0.87,p = 0.025)が認められた.以上より馴化という現象を対象として情動状態の遷移予測に成功した.H28年度までに,小型魚類の生体電気信号が計測可能な実験環境を整備し,生体電気信号から呼吸指標と行動指標を抽出するシステムの構築に成功した.また,恐怖行動を誘発する化学物質を魚に与えたときの魚の行動と呼吸リズムを計測し,恐怖が表現可能な心理空間軸を生理指標と運動指標から構成することに成功した.
光異性化反応による液晶の分子配向制御と光応答性に関する研究

本研究では、光による液晶の配向制御を目指す研究の一環として、固体表面分子の光異性化反応と、これに伴うネマチック液晶の分子配尚の変化を明らかにした。すなわち、金蒸着膜の表面にアゾベンゼンチオール分子:AZO11を溶液から吸着させることにより、self-assembly単分子層を作製し、その紫外光(可視光)照射によるトランス(シス)→シス(トランス)体への異性化を紫外・可視、赤外吸収およびラマン散乱スペクトルにより解析・評価した。また、上記のAZO11単分子層の上にネマチック液晶(5CB)の薄膜を作製し、光異性化によって5CB液晶分子の配向が変化することが実証された。トランス体AZO11単分子層に接する5CB液晶においては5CB分子の長軸は金表面に対して垂直方向に配向することがわかったが、シス体への移行によりこの垂直配向性は低下した。これは、AZO11-5CB分子間のファンデル・ワールスカ(主として双極子間相互作用)の変化に帰せられる。その他の成果として、(1)金表面に吸着したトランス体AZO11のπ-π^*遷移に基づく吸収バンドの波長はAZO11の表面密度(分子間相互作用)の増加と共に短波長側にシフトする。したがって、このバンドから膜の状態を知ることができる。(2)溶液中と比較して、金表面に吸着したAZO11のトランス→シス異性化は著しく抑制される。この問題はシス→トランス異性化ではかなり緩和される。(3)固体表面におけるAZO11の光異性化収率の向上には鎖の短い分子との共吸着による表面濃度の希釈が有効である。(4)単分子層の光異性化の研究に表面赤外・ラマン分光法を初めて適用し、その有効性を実証した。本年度においては、基板表面分子の光異性化を確認するための分光解析装置の製作と、次年度へ向けての準備として、基板表面にアゾ系分子層を形成させる実験、およびそれを確認するための赤外吸収とラマン散乱の測定を行なった。まず、基板表面に光活性の単分子層を形成させる方法として、次のような実験を行なった。シリコンウエハ-に真空蒸着した銀の島状膜上にパラニトロ安息香酸(PNBA)の薄膜を形成させ、これにAr^+レーザーを照射し、銀表面に吸着したPNBA^-イオンと周囲のPNBAとの反応により、表面第1層としてパラカルボキシアゾベンゾエ-ト(PCAB)を形成させることを試みた。島状銀表面においては赤外吸収およびラマン散乱の強度が著しく増大することが予想されたが、本実験でもこれが確認され、吸着したPCABMの赤外、ラマンスペクトルを高感度で測定することができた。次いで、PCABの生成速度がAr^+レーザーのパワーとその照射時間に依存することが確認できたので、その詳細をラマンスペクトルにより明らかにした。その結果、PCABのN=N伸縮振動のレーザー照射によるバンド強度の増加は、例えば100mWのパワーでは約30分で飽和に達することがわかった。以上の実験により。液晶の光配向制御の測定に有用と思われる基板表面(コマンドサーフェス)の作製が可能であることが実証できたので、現在HeCdレーザー(紫外)とAr^+レーザー(可視)によるPCABの光異性化を確認するための赤外吸収測定を行なっている。PCABはアゾベンゼンと同様にN=N基を有しているので、トランス型とシス型が存在し得る。それゆえ、アゾベンゼンと同様に紫外および可視光により、それぞれ、シス型、トランス型へと変化すると思われる。これが確認でき次第、異性化に伴う液晶分子配向の変化を赤外、ラマンスペクトルにより明らかにする。

本研究は、固体表面に光異性化分子を結合させる方法を開発し、光異性化分子と接触する液晶の分子配向を光によって制御できることを分光学的に実証するとともに、光異性化分子-液晶分子間相互作用を明らかにすることを目指している。平成9年度においては、銀や金の表面において単分子層を形成する光異性化分子としてアゾベンゼンのチオール誘導体の一つ(以下SH系と略す)を選び以下の測定を行った。SH系分子のクロロホルム溶液に紫外線(325nm)を照射し、紫外・可視吸収スペクトルを測定した。紫外線照射によりπ-π^*遷移によるバンドの強度が減少し、n-π^*遷移によるバンド強度が増加したことから、SH系分子のトランス体からシス体への異性化が確認できた。そこで、SH系のクロロホルム溶液に島状銀蒸着膜を浸積した後、大気に取り出し赤外透過スペクトルを測定した。このスペクトルにはSH系粉末試料で確認されたS-H伸縮振動バンドは観測されず、SH系分子はその水素を解離して銀表面に吸着することが示唆された。この吸着SH系分子層をシアノビフェニル系ネマチック液晶(K15)で被覆した試料について赤外高感度反射スペクトルを測定したところ、液晶分子がランダムに配向する等方性温度ではCN基の伸縮振動バンドの強度が減少し、液晶温度では増加することがわかった。この結果より吸着SH系分子との相互作用により液晶分子が基板に対して垂直に配向することが示された。さらに、この試料の紫外線を照射したところCN基の伸縮振動バンドの強度は減少し、続いて可視光を照射すると増加した。これらの変化は吸着SH系分子のトランス体→シス体→トランス体への移行に伴う液晶分子の配向状態の変化に対応すると考えられる。以上のように、表面第一層の光異性化による液晶の配向変化が確認できたが、今後は光照射条件をさらに検討し異性化効率の向上を図る予定である。本年度においては、アゾベンゼンアルカンチオール:4-(4'-methoxyphenylazo)phenoxy)undecane-1-thiol(以下AZO11SHと略記)の金表面単分子膜のトランス-シス光異性化と、これによるネマチック液晶分子の配向変化を明らかにした。トランス体AZO11SHのクロロホルム溶液に金基板を浸漬することにより作製したトランス体AZO11S単分子膜では、紫外光照射によるトランス体→シス体への異性化率が小さいことがわかった,この結果は、高密度で配列したトランス体AZO11S膜においては断面積の大きなシス体への移行が許される十分な空隙が存在しないことを示唆すると考え、まずこの点を実証するために電子スペクトルおよび赤外反射スペクトルの測定を行った。すなわち、それぞれトランス体およびシス体AZO11SH溶液から作製したAZO11S単分子膜の光異性化の測定を行い、トランス体→シス体への異性化と比べてシス体→トランス体への異性化が起こりやすいことを明らかにした。また、AZO11S単分子膜表面上のシアノビフェニル系ネマチック液晶(K15)薄膜の赤外反射スペクトルが紫外光あるいは可視光照射により変化することから、これらの変化がAZO11Sの光異性化によるものであることが確認できた。今後は、光異性化に伴う液晶分子の動的応答性を明らかにするほか、構造の異なるアブベンゼン系チオール分子のセルファッセンブリー膜について上記と同様の実験を行い、液晶の光配向制御にさらに有用な分子を探索したい。
産科看護におけるインフォームド・コンセント

分娩時に医療者が行う医療行為「会陰切開・剃毛・浣腸」に対し、(1)各医療行為の実施状況(2)インフォームド・コンセントの現状(3)医療行為が行われたことに対する産婦の気持ち、などについてアンケート調査を実施した。九州二県の5市町で行われる35ヶ月乳児健診に来所した女性、1107名のうち承諾を得られた1003名にアンケート用紙を配布し、健診会場と郵送法を用いて回収を行った。回収数は657、回収率は65.5%であった。今後九州二県での地域比較をより具体的に実施するため現在一町で継続調査を実施している。(平成13年6月終了予定。現在回収数103、回収率70%)-結果-〇実施率は、会陰切開(帝王切開を除く)416名(71.4%)・剃毛385名(59.1%)・浣腸361名(55%)であり、各医療行為ともに高い実施率となった。特に初産婦の会陰切開率は88.8%であり今だに慣例的に行われていることが示唆される結果となった。○各医療行為に対する説明割合は、会陰切開192名(46.5%)・剃毛223名(58.1%)・浣腸243名(67.5%)であり、会陰切開が最も少ない結果となった。会陰切開後の痛みや性行為痛などの後遺症が明らかになっており、確実な説明と対象からの同意が必要と考える。○脱明を行った医療者は会陰切開は医師よりの説明が115名(60.2%)、看護者よりが102名(53.4%)、剃毛は医師が26名(11.7%)、看護者が212名(95.1%)であった。浣腸は医師よりが32名(13.2%)、看護者が232名(95.5%)と剃毛と浣腸は看護者の説明が多い結果となった。特に剃毛と浣腸は看護者が直接関わる行為であり施行前には必ず説明を行うことを徹底させなければならないと考える。説明の時期も大切で、陣痛の苦しい中での説明より妊娠中の余裕のある時期での説明はより効果的と考える。○インフォームド・コンセントの認知割合は「知っている」が255名(39.1%)、「知らない」が397名(60.9%)でありマスメディアで連日のように取り扱われているが、対象の認知割合は低いものとなった。看護者が関わる出産時の医療行為「浣腸・剃毛・会陰切開」に対し、(1)3つの医療行為の有無(2)インフォームド・コンセントの現状(3)医療行為が行われたことに対する産婦の気持ち、などについて調査を実施した。平成11年6月から平成12年1月にかけて、2県、4市町村の乳児健診(4ヶ月)に来所した女性1107名のうち、1003名に自記式調査票を配布し、会場で、及び郵送で回収した。回収数は657名、回収率は65.5%だった。(1)医療行為が「行われた」と答えた対象者は、会陰切開(帝王切開74名を除く)、416名(71.4%)、剃毛385名(59.1%)、浣腸361名(55.0%)だった。(2)医療行為に対して、「何らかの説明があった」と答えた対象者は、会陰切開192名(46.5%)、剃毛223名(58.1%)、浣腸243名(67.5%)だった。(3)医療行為が行われたことに対し、何の説明もなかったが「納得出来た」と答えた対象者は、会陰切開60.8%、剃毛56.0%、浣腸62.3%だった。(4)出産時に医療行為が行われることに対し、「普通だと思う」と答えた対象者は、会陰切開50.5%、剃毛56.9%、浣腸66.8%だった。以上の結果より、会陰切開は慣例的に行われていると言え、説明は不十分であると思われる。医療者から産婦への偏った情報の提供があると考えられ、産む側本意の医療行為が行われていないと思われる。

特に初産婦の会陰切開率は88.8%であり今だに慣例的に行われていることが示唆される結果となった。○各医療行為に対する説明割合は、会陰切開192名(46.5%)・剃毛223名(58.1%)・浣腸243名(67.5%)であり、会陰切開が最も少ない結果となった。会陰切開後の痛みや性行為痛などの後遺症が明らかになっており、確実な説明と対象からの同意が必要と考える。○脱明を行った医療者は会陰切開は医師よりの説明が115名(60.2%)、看護者よりが102名(53.4%)、剃毛は医師が26名(11.7%)、看護者が212名(95.1%)であった。浣腸は医師よりが32名(13.2%)、看護者が232名(95.5%)と剃毛と浣腸は看護者の説明が多い結果となった。特に剃毛と浣腸は看護者が直接関わる行為であり施行前には必ず説明を行うことを徹底させなければならないと考える。説明の時期も大切で、陣痛の苦しい中での説明より妊娠中の余裕のある時期での説明はより効果的と考える。○インフォームド・コンセントの認知割合は「知っている」が255名(39.1%)、「知らない」が397名(60.9%)でありマスメディアで連日のように取り扱われているが、対象の認知割合は低いものとなった。
Florence Nightingaleの著作におけるクリミア戦争の影響

Florence Nightingaleはクリミア戦争(1854-56)で経験したことを基に、『平時および戦時下の陸軍病院へ女性による看護を導入することに関する補助的な覚え書』(1858)を戦後すぐに著した。この著作がその後の『病院覚え書』(1859)と『看護覚え書』(1860)にどのように展開され体系化されているかという本研究の目的を達成するために、2018年度はクリミア戦争以前と戦時中の彼女の経験に関して社会的背景を踏まえながら調査し、それが『陸軍病院へ女性による看護を導入することに関する覚え書』に反映されているかどうか検討した。19世紀前半の英国社会では看護は女性の専門職として確立されていなかった。それどころか看護婦の地位は低く、教育を受けた女性が携わる仕事とみなされていなかった。Nightingaleは看護を専門職として確立することを望んでいた。クリミアの野戦病院の劣悪な環境が報道されると、世間では戦地での看護への関心が一気に高まった。彼女がすぐさま看護婦達を率いてクリミアへ赴いた理由の一つに、注目を集めている戦地での活動が、看護および看護婦に対する偏見を打ち砕く足掛かりにとなると考えたかである。戦地では彼女は傷病兵の置かれた状態を改善することに心を砕く一方で、前述の目的のために、看護婦達を彼女の管理下で職務に就かせることに注力した。結果として、病院の環境は著しく改善したが問題も残った。例えば、看護婦、看護兵、医師との関係の問題であり、それらは『陸軍病院へ女性による看護を導入することに関する覚え書』に「野戦病院での看護の"System"を構築すること」、「看護婦と看護兵および医師との関係性」、「看護の教育」として著されている。また、著作に記されている彼女が直面し解決しようとした事柄は、クリミアで彼女を直接知る者達が残した書簡や日記に見られる内容とも一致している。当初の予定では、社会的背景を調べるために19世紀イギリスの1)医療の実情の把握2)看護の実情・看護婦の役割の把握を行うことになっていたが、1)の調査がまだ十分行われていない。今後はクリミア戦争の戦地での病院の状態・看護の状況を1次資料を基に調査し『平時および戦時下の陸軍病院へ女性による看護を導入することに関する補助的な覚え書』の内容をさらに検証すると共に、その内容がその後の著作『病院覚え書き』(1859)と『看護覚え書』(1860)にどのように引き継がれ、反映されているかを考察する。購入書籍(デジタルデータベース)が予定額よりも低額であったため、残金が生じた。この金額は繰り越して、次年度の書籍購入に使用する予定である。
新たなプローブを用いたゴルジ体-小胞体間輸送の解析

細胞の小胞体で新たに合成された分泌タンパク質は、正常なものを選び出して、小胞体からゴルジ体へと運ばれていく。しかし、ゴルジ体で異常が検知された場合は逆行輸送経路を用いて小胞体へと運び戻される。この過程を顕微鏡下でリアルタイムで観察することができる新しいシステムを開発した。さらにこのシステムを利用して、この逆行輸送経路を制御する一連のタンパク質を同定し、その仕組みの解明に成功した。小胞体で合成された分泌蛋白質、膜蛋白質はその機能すべき場所に正確に輸送される必要がある。またこの際、まだ的確にフォールディングされていなかったり変性してしまった異常な構造をした蛋白質は、小胞体およびゴルジ体といった分泌の初期過程において取り除かれなければならない。小胞体とは別にゴルジ体は積極的に異常蛋白質を小胞体へと送り返す機構などを通じて品質管理を行うための仕組みに深く関与していると考えられる。本研究ではゴルジ体から小胞体への逆行輸送経路の制御を司る因子を解明することを目的とする。本年度はこの目的達成のために次のような実験を行った。1.逆行輸送をモニターするためのプローブの設計、そのプローブを発現するためのプラスミドの構築、さらにそのプローブを安定的に発現する細胞株の作製。2.逆行輸送に関わる因子の中で、関与が予想されるタンパク質Rab2およびGolgin245、GMAP210をコードする遺伝子のクローニング、発現および発現抑制プラスミドの作製、タンパク質精製のためのタグ付きタンパク質の発現システムの開発。3.ヒト培養細胞を用いたタンパク質の発現と精製システムの開発。4.逆行輸送経路の観察を行うための顕微鏡システムの最適化。これらの実験により、現在までに次のような結果を得ている。1.Rab2タンパク質とその複合体の精製。複合体を形成するタンパク質の同定。以上の結果を総合して研究を今後進めることにより、逆行輸送経路を司る因子や制御する因子の同定が進み、経路の解明に寄与することができると考えられる。前年度までに逆行輸送に関連するタンパク質として知られるRab2GTP結合型タンパク質の複合体を単離することに成功した。本年度はこれを受けてさらに次のような実験を行った。1.複合体に含まれるタンパク質の同定2.Rab2結合タンパク質の一つ、TBC1D16のクローニングとその機能の研究3.別の結合タンパク質Golgin-45のクローニングと複合体の精製以上の実験より次のことを明らかにした。1.Rab2タンパク質は活性化することにより、別のRabタンパク質を不活性化するGAPである、TBC1D16を膜上にリクルートする。このことにより輸送段階の一つ前で機能していたRabタンパク質を不活性化し、次の段階へと導く。2.Rab2により膜上へとリクルートされるGolgin-45タンパク質はゴルジ体同士の結合に関与しており、小胞体・ゴルジ体中間体から新たなゴルジ体を形成する際に機能し、Rab2はそのステップを制御していると考えられる。これらのことからタンパク質輸送の過程でRab-Cascadeと呼ばれるあるステップから次のステップに移る際に次々へとRabを取り替え、進行していく仕組みの一端が明らかとなった。本研究ではゴルジ体から小胞体への逆行輸送経路の制御を司る因子を解明することを目的とした。本年度は前年度までの結果を受けてさらに次のような実験を行った。1.Rab2結合タンパク質であるTBC1D16の機能の解析2.別の結合タンパク質Golgin-45の機能の解析3.逆行輸送経路を定量化するアッセイの開発。その結果次のことが明らかとなった。1:Rab2タンパク質は活性化することにより、別のRabタンパク質を不活性化するGAPである、TBC1D16を膜上にリクルートする。

このことによりまだ機能するべきでないRabタンパク質を膜から排除し、輸送ステップの逐次的な進行を制御している。この次のRabはおそらくRab43およびRab30であると考えられる。2:Golgin-45はその発現を抑えることによりゴルジ体のパラレルな結合が阻害され、ゴルジ体が単体として(ミニスタック)細胞中に分散するようになること、一方で順行輸送に阻害効果はないこと、逆行輸送が一部促進する傾向があることなどから、逆行輸送に対して、ゴルジ体をコーティングルすることにより阻害的な働きを持っていることが示唆された。以上によりゴルジ体ー小胞体間でいくつものRabタンパク質とその結合タンパク質の共同作業により形成される、Rab-Cascadeの仕組みの一端が明らかになった。作製中または作製済みであった細胞株などが、震災による事故により失われてしまった。それ以外では順調に進展しているが、予想外の展開もあり、当初予想していた方向的には少し遅れが生じているが、成果は出ていると考えている。24年度が最終年度であるため、記入しない。研究課題の立案当時は、細胞内逆行輸送のアッセイ系の確立を中心に据え、その開発を大きな目的としていたが、その過程で、細胞逆行輸送を制御する因子をいくつか同定することに成功したので、その解析を優先することに変更した。アッセイ系の開発も当然続行しているが、実際に細胞内で機能するメカニズムの解明を最優先として今後の実験の計画を立てることとした。この変更によっても、細胞内輸送機構の解明という大きな目的から離れることはなく嘱むしろ近づいたと考えられるので、今年度は現在の計画に沿って進める予定である。
エージェントベースシミュレーションによる理論とケーススタディの架け橋に関する研究

本研究では,社会科学における3つアプローチ(理論的アプローチ,ケーススタディ・アプローチ,社会シミュレーション)の利点と欠点を明らかにし,その関係から社会シミュレーションの可能性と役割の探究を目的とする.その目的遂行のため,本年度は昨年度に構築したシミュレーションモデルを活用し,残りの課題である(i)異なる結果を導く条件分析と(ii)見出された条件からの理論とケーススタディの関連付けを探究する.具体的には,交渉ゲームの1つであるバーゲニングを例題とし,以下の2つに取り組んだ.(i)異なる結果を導く条件分:構築したシミュレーションモデルから共通項(具体的には,強化学習の1つであるQ学習)を抜き出し,そのパラメータ(ランダム度合い)やモデリング要素(行動選択手法)を変更しながら感度分析を行うことによって,理論とケーススタディの異なる結果を導く条件を見出した.この条件はPCクラスタを活用し,1000万回以上のシミュレーション結果から見出している(これらの結果は,MABS'06,M2M'07において発表している).(ii)理論とケーススタディの関連付け:見出された条件(ランダム度合いと行動選択手法の組み合わせ)を変化させ,理論からケーススタディの結果へと変わる(あるいはその逆の)境目を明らかにすることによって,両者の関連付け(接点を見出すこと)に成功した.さらに,この接点を利用して人間の持つ高い能力に近いエージェントの設計方法を考案し,新たな社会シミュレーションの可能性と役割を明確にした(これらの結果は,日本機械学会研究分科会の招待講演として講演するとともに,その重要性を申請者がオーガナイズしたM2M'07という国際会議で議論している).本研究では,社会科学における3つアプローチ(理論的アプローチ,ケーススタディ・アプローチ,社会シミュレーション)の利点と欠点を明らかにし,その関係から社会シミュレーションの可能性と役割の探求を目的とする.その目的遂行のため,本研究では同一例題の同一条件上で3つアプローチの結果を比較する.具体的には,本年度では社会的行為の1つである複数回交渉バーゲニングを例題とし,下記の課題に取り組んだ.(1)理論解析と被験者実験の結果収集理論的アプローチとして複数回交渉バーゲニングにおける利得と交渉回数を計算し,ケーススタディアプローチとして被験者実験を行い,被験者による利得と交渉回数の結果を収集した.そして,両者を比較したところ,異なっていることが分かった(これらはIFSR'05において発表している).(2)シミュレーションモデルの構築(1)で得られた異なる2つの結果を導出できる個別のシミュレーションモデルを強化学習の1つであるQ学習を用いて構築した.具体的には,理論的アプローチではQ学習にεグリーディに基づく行動選択方法を導入したモデル,ケーススタディアプローチではQ学習にボルツマン分布に基づく行動選択方法を導入したモデルによって,それぞれ異なる結果を導くことができた.これより,この2つのモデルの共通項はQ学習であることが分かった(これらはAESCS'05,ACESS'05において発表している).本研究では,社会科学における3つアプローチ(理論的アプローチ,ケーススタディ・アプローチ,社会シミュレーション)の利点と欠点を明らかにし,その関係から社会シミュレーションの可能性と役割の探究を目的とする.その目的遂行のため,本年度は昨年度に構築したシミュレーションモデルを活用し,残りの課題である(i)異なる結果を導く条件分析と(ii)見出された条件からの理論とケーススタディの関連付けを探究する.具体的には,交渉ゲームの1つであるバーゲニングを例題とし,以下の2つに取り組んだ.(i)異なる結果を導く条件分:構築したシミュレーションモデルから共通項(具体的には,強化学習の1つであるQ学習)を抜き出し,そのパラメータ(ランダム度合い)やモデリング要素(行動選択手法)を変更しながら感度分析を行うことによって,理論とケーススタディの異なる結果を導く条件を見出した.この条件はPCクラスタを活用し,1000万回以上のシミュレーション結果から見出している(これらの結果は,MABS'06,M2M'07において発表している).(ii)理論とケーススタディの関連付け:見出された条件(ランダム度合いと行動選択手法の組み合わせ)を変化させ,理論からケーススタディの結果へと変わる(あるいはその逆の)境目を明らかにすることによって,両者の関連付け(接点を見出すこと)に成功した.さらに,この接点を利用して人間の持つ高い能力に近いエージェントの設計方法を考案し,新たな社会シミュレーションの可能性と役割を明確にした(これらの結果は,日本機械学会研究分科会の招待講演として講演するとともに,その重要性を申請者がオーガナイズしたM2M'07という国際会議で議論している).
遣伝子導入を用いたサイロキシン結合グロブリンの糖鎖の生理的役割に関する研究

サイロキシン(T4)結合グロブリン(TBG)は血中の主要なT4結合蛋白で、肝において合成される糖蛋白である。本研究では、TBG分子中の糖鎖の生理的役割を研究するため、肝癌細胞株を用いて最初の検討を行った。TBGの糖鎖付加をツニカマイシンにより阻害した場合、TBCが全く分泌されず、T4結合能を持たない変性TBGと抗原性を同じくすることを明らかにした。この研究は、糖鎖付加がTBG分子の細胞内移送、T4結合能に大きな影響を与えることを明らかにした。ついで、正常及び異常TBG症患者(TBGーGary)のゲノムTBG遺伝子をクロ-ニングした。塩基配列の決定により、TBGーGaryゲノムの第一エキソンに単一塩基置換を見いだし、この置換が、TBGの96番目のアミノ酸イソロイシンをアスパラギンに変え、異常TBGには新たにアスパラギンーシスチン-セリンからなるNー結合性糖鎖付加部位が生じることを明らかにした。この塩基置換を有する患者のTBGは、熱に著しく不安定で、血中濃度も著しく低い事が知られているため、新たな糖鎖付加が、患者血中のTBGの異常を起こしていることが示唆された。このことを証明するため、正常並びにTBGーGaryをコ-ドする構造遺伝子を作成し、これらの遺伝子を動物細胞発現ベクタ-であるpEUKーC1に挿入、Cos1細胞へ導入した。この細胞を用いたパルス-チェイス実験により、TBGーGaryに見いだされた単一塩基置換によるアミノ酸変異部位が糖鎖付加を受けていること、またこの異常TBGが細胞内分解を受け易く、分泌されにくいことを明らかにした。更に、部位特異的突然変異作成法を用いて、TBGーGaryの新たな糖鎖付加部位であるアスパラギンをアスパラギン酸に変異させた場合、TBGーGaryの物理化学的特性はほぼ正常となり、TBGーGary蛋白の異常はアミノ酸変異によるよりは、糖鎖付加が原因であることが示された。以上、本研究により、アスパラギン部位に付加される糖鎖がTBGの分泌、代謝並びにT4結合能に重要な役割を果たしていることが明かにされた。1.正常及び異常TBG症患者のゲノムTBG遺伝子のクローニング正常及びサイロキシン(T4)結合能の損なわれた異常TBG症患者の末梢白血球からDNAを抽出、制限酵素EcoRlを用いて完全に消化後、DNAをバクテリオファージEMBL4のDNAに組み込み、in vitroでパッケージングし、宿主細胞LE392(大腸菌K12株由来)に感染させ、ゲノムDNAライブラリーを作成した。このライブラリーを、既にクローニングしたTBG cDNAを用いてスクリーニングし、ゲノムTBG遺伝子をクローニングした。更にM1.3バクテリオファージを用いてエキソン部分の塩基配列を決定した。2.キメラTBG遺伝子の作成と真核細胞発現ベクターへの組み込み当初の計画ではゲノム遺伝子を直接COS-1細胞に導入し、発現されたTBGの物理生化学的正常を検討することにより、TBGの糖鎖の役割を検討する予定であった。しかしながら効率よくTBG遺伝子を発現するためには強力なプロモーターの下流に構造遺伝子を挿入してCOSー1に導入した方が良いと考えられた。

従って、我々のクローニングしたTBGcDNA(λcTBGna)に欠けいてる5'末端の塩基配列を正常ゲノムDNAより切り出し、これとλcTBGnaを結合して、キメラTBG構造遺伝子を作成し、これを真核細胞発現ベクターpSV2に組み込み、COS-1細胞に導入した。この結果TBG cDNAとハイブリタイズするmRNAが効率よく発現されることがNorthern blot法により確認された。しかしながら、TBGそのものの培養液中への分泌は認められず、エキソンIの5'上流の配列が構造遺伝子に含まれていたことが、正常のTBG mRNAの生成を妨げていることが示唆された。今後翻訳領域のみを有するTBG構造遺伝子を作成し、TBGの合成・分泌、生理活性に果たす糖鎖の役割を研究したい。1.表現ベクタ-に挿入したTBG構造遺伝子の作成:TBG遺伝子を効率よく動物細胞に発現させるためには、ゲノム遺伝子を直接動物細胞に導入するより、強力なプロモタ-の下流にTBGの構造遺伝子を組み込んだ組替え体を導入した方が良いと考えられたため、TBGの構造遺伝子を作成した。即ち、我々が既にクロ-ニングしたTBG cDNAに不足する部分を、ゲノムクロ-ンのエキソンを用いて補い、構造遺伝子を作成した。作成した構造遺伝子は、真核細胞発現ベクタ-pSV2に挿入し、キメラプラスミドを作成した。2.発現ベクタ-に挿入した異常TBG遺伝子(TBG-Gary)の構造遺伝子の作成:1の如く作成した正常TBG構造遺伝子の一部を異常TBG(TBG-Gary)のゲノム遺伝子の突然変異を含むエキソンの一部と置換し、TBG Gary構造遺伝子を作成、上述の如くpSV2に挿入した。3.正常並びに異常TBG遺伝子のCOS1細胞への導入と産物の解析:1の如く作成した正常TBG構造遺伝子をCOS1細胞にDEAE-dextran法にて導入した。^<35>S-メチオニンを用いたパルスラベル法により、遺伝子の導入が、ヒトTBGの合成・分泌をもたらすことを確認した。しかしながら遺伝子の導入効率が悪いため、産生されるTBGの物理化学的性状を検討することは困難であった。リポフェクションを遺伝子導入法として用いた場合、DEAE-dextran法に比し、10倍以上のTBG産生を得、産生されたTBGの生物学的活性を等電点電気泳動を用いて確認することが出来た。次年度にはTBG-Gary遺伝子の導入により、TBG分子内の異常糖鎖が生物学的活性、安定性等にどの様に影響するかを検討すると共に、糖鎖負荷部位をコ-ドする塩基配列の部位特異的突然変異法を用いて糖鎖の役割を更に研究する。1.糖鎖付加異常の存在すると考えられる異常TBG症(TBGーGary)の発症機序の研究:昨年の研究で得られたTBGーGaryの構造遺伝子を発現ベクタ-pEUKーC1に挿入し、COS1細胞にトランスフェクトした。トランスフェクトした細胞を35Sーメチオニンを用いて、パルス-チェイスすることにより、TBGーGaryの合成分解過程を詳細に検討した結果、TBGーGaryには新たな糖鎖が付加されていること、サイロキシン(T4)結合能が低下していること、著しい分泌障害のあること、細胞内の分解を受け易いことなどが明らかにされた。2.部位特異的突然変異作成法(Site Specific Mutagenesis)を用いた変異TBG遺伝子の作成:部位
エンド・リソソーム性タンパク質分解の破綻による慢性炎症増悪メカニズムの解明

歯周病や根尖性歯周炎、シェーグレン症候群など歯科系疾患には難治性の慢性炎症を呈するものが多い。本研究の目的は、慢性炎症の原因として、エンド・リソソーム性タンパク質分解の異常が内的刺激物質の蓄積を起こすことにあり、それが炎症の遷延化と重篤化を招くことを示すものである。我々はプロテアーゼの欠損が慢性炎症やマクロファージの機能異常・脂肪組織の分化異常を引き起こすことを見出した。本研究は口腔内疾患の大部分を占める慢性炎症に留まらず、全身性の炎症における慢性化メカニズムの一面を解明するものである。エンド・リソソーム性プロテアーゼ(タンパク質分解酵素)の1つであるカテプシンE(CE)の欠損マウスにおけるマクロファージの解析から、エンド・リソソーム性タンパク質分解の異常が炎症応答に関する様々な物質の細胞内蓄積を起こすことが示された。TLR2やTLR4などのパターン認識受容体、CCR2などのケモカインレセプター、NADPHオキシターゼの主成分であるgp91phoxなどがこれに含まれている。また、CE欠損マウスでは還元型グルタチオンが有意に減少し、血清中の過酸化水素が増大するなど酸化ストレスを受けていることも明らかとなった。これに伴い、酸化ストレスにより誘導されるアネキシン1や酸化型ペルオキシレドキシン6の蓄積も見られた。さらにCE欠損マクロファージでは、オートファゴソームとリソソームの融合阻害が見られ、異常ミトコンドリアの細胞内蓄積も認められたことから、これが酸化ストレスの要因の一つであると考えられる。このようにエンド・リソソーム性プロテアーゼの異常は、細胞内あるいは細胞表面の分子やオルガネラの質的・量的異常を引き起こし、生体応答の異常を惹起・持続させ、炎症反応を増大させることが示唆された。平成26年度末に立ち上がった新しい研究室であるため、P2実験室の整備、機器の調達などインフラ整備に予定よりも時間がかかり、平成27年度に計画していた網羅的解析と動物実験が行えなかった。しかしながら、これらの問題はすでに解決されているので、平成28年度は円滑に研究遂行できると見込んでいる。我々はこれまでにエンド・リソソーム性プロテアーゼであるカテプシン群の欠損マウスの解析から、エンド・リソソームの異常が様々な物質の細胞内蓄積をきたすことを明らかにしてきた。本研究は、エンド・リソソームの異常による蓄積物質がDAMPとして働き、炎症応答の増大や遷延を誘導することを示すものである。また、エンド・リソソームの機能異常は酸化ストレスを誘導するとともに、ミトコンドリアやオートファゴソームなどの細胞内オルガネラの形態ならびに機能異常を誘導することを示してきた。さらに今回、我々は、タンパク質のオルガネラ間選択的輸送に関わる新規因子を同定し、この因子の異常がリソソームの機能異常を誘導し、白血球・破骨細胞の形態的ならびに機能的異常を導くことを見出した。このようにメンブレントラフィックとエンド・リソソーム機能は、細胞内あるいは細胞表面の分子やオルガネラの質的・量的異常と密接に関与しており、生体応答を制御することが示唆された。初年度には細胞培養室、動物実験施設等の準備のためやや遅れ気味であったが、2年目となる今年度には施設設備も整い、当初の予定通り円滑に進んでいる。培養細胞によるスクリーニングも行い、炎症応答に関わる新規因子も見つかりつつある。我々は、これまでに、エンド・リソソーム性プロテアーゼであるカテプシン群の欠損マウスおよびトランスジェニックマウスの解析から、エンド・リソソームの異常によって、パターン認識受容体やケモカインレセプター、NADPHオキシダーゼなどの膜タンパク質の蓄積が起こり炎症性応答が惹起されることを示した。また、エンド・リソソームの異常により全身的な酸化ストレス状態が引き起こされ、生体応答の異常が持続し、炎症反応が増幅されることを示した。このようにして慢性炎症が引き起こされると考えられる。さらに我々は、エンド・リソソームを含む細胞内小胞輸送を制御する新規分子を見出し、この分子の発現を抑制すると破骨前駆細胞から破骨細胞への分化が促進され、過剰発現させると分化が抑制されることを示した。つまり、エンド・リソソームの機能は細胞の分化や機能を制御する重要な因子であることもわかった。さらに本分子によってリソソーム内酵素を含むさまざまな炎症性分子の分泌が制御されていることもわかりつつある。これまでは、予測される分子について解析を行ってきたので、網羅的解析についても進めていく。エンド・リソソーム性タンパク分解酵素を欠損させたマクロファージ系細胞で蓄積するタンパク質を2次元電気泳動/TOF-MSによって同定する。それらが内因性リガンドとして炎症応答を惹起するのか否かNF-kBの活性化を指標にして調べる。また、細胞全体としての量に変化はないが、細胞での局在が変化する(例えば細胞表面への輸送が増減する)

タンパク質についても細胞分画とフローサイトメトリーによって同定し、これらのDAMPとしての作用を解析する。これまでの研究から、カテプシンE酵素活性がWnt5aの細胞内輸送に関与することが示唆されているので、このメカニズムを調べるとともに、エンド・リソソーム性タンパク質分解とWntシグナルの関連性を明らかにし、癌との相関についても解明する。当初計画に従って、エンド・リソソーム性タンパク質分解酵素の欠損マクロファージの解析と、蓄積するタンパク質の同定とその炎症応答との関与について解析を進めていく。これと同時に、これまでの研究で見つかったエンド・リソソーム機能とメンブレントラフィックに影響を与える新規因子についても解析を進める。歯科薬理学研究代表者の研究室は平成26年11月に発足した新しい研究室であるため、当初予定では、必需品の冷凍冷蔵庫、小型超低温槽、恒温振とう器などの汎用機器の購入を計画していた。しかしながら、本研究で使用する消耗品が、フローサイトメトリー、リアルタイムPCRなど高額試薬を必要とするため、これら消耗品費を確保するため、設備備品については廃棄予定物品を譲り受けたり、他研究室から借用するなどで努力した結果である。研究代表者の研究室は平成26年11月に発足した新しい研究室であるため、当初予定では、実験必需品の冷凍冷蔵庫、小型超低温槽、恒温振とう器などの汎用機器の購入を計画していた。平成28年度のフローサイトメトリー、リアルタイムPCRなどの試薬や実験用動物の購入、TOF-MS使用料に充てる。細胞培養のための血清も購入予定である。フローサイトメトリーや細胞染色などで使用する抗体が多種類必要であり、これらを購入する。また、同定した因子の遺伝子発現解析のため、siRNAやリアルタイムPCRなどを行う必要があり、これらの試薬を購入する。実験用動物の購入、TOF-MS使用料、細胞培養のための血清も購入予定である。