hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
チオフェン-ピロール混合型オリゴマーを基盤とする機能性分子の合成

オリゴチオフェンにピロールを挿入した化合物を新たに設計・合成し、その半導体特性についての評価を行い、良好なp型の有機トランジスターとして機能することを明らかにした。さらに、その移動度が分子対称性の違いに起因するパッキングのしやすさに依存することを示した。一方、pドープ状態モデルとして、ジカチオン種の電子構造を系統的に調査したところ、5員環が8個以上に伸ばした時に、ジラジカル性が発現することを実証したオリゴチオフェンにピロールを挿入した化合物を新たに設計・合成し、その半導体特性についての評価を行い、良好なp型の有機トランジスターとして機能することを明らかにした。一方、pドープ状態モデルとして、ジカチオン種の電子構造を系統的に調査したところ、5員環が8個以上に伸ばした時に、ジラジカル性が発現することを実証したオリゴチオフェン類は導電性高分子のモデルや有機電子材料として興味が持たれ、さまざまな研究がなされているが、鎖長が長くなるに従い溶解度が低下していくという欠点がある。それに対し、我々はこれまでの研究でチオフェン環にフラン環を挿入したオリゴマーが比較的良好な溶解度を示し、チオフェンオリゴマーと同等のFET特性を示すことを報告した。同様に、ドナー性の高いピロール環を組み込んだ分子についても興味がもたれるが、そのようなチオフェン-ピロールオリゴマーの電子デバイスとしての性能評価は行われていなかった。そこで本研究では先ず末端チオフェンのα位をヘキシル基で置換したチオフェン(T)-N-メチルピロール(P)からなるオリゴマーTPTPT体1およびTPTTPT体2を合成し、その性質を検討した。その結果、1は空気中で安定かつ溶媒に可溶であり、その電界効果移動度は9.1×10^<-3>cm^2/Vsと、チオフェンオリゴマーの移動度とほぼ同等の結果を示すことがわかった。より共役系を拡張したオリゴマー2は溶解度の低下が見られたが、電界効果移動度は5.3×10^<-2>cm^2/Vsとよりよい値を示した。一方、N-ヘキシルピロール(P')とチオフェンを組み合わせたオリゴマーTP' TTP' T体の両端をフェニル基でキャップした化合物も合成し、加熱および圧力により結晶相が転移を起こし色調が変化するユニークな化合物であることを明らかにした。オリゴチオフェン類は導電性高分子のモデル分子として研究されてきた分子である。しかしながら、その分子自体も良好な有機半導体としての性質を示すため、近年様々な化合物が合成され、トランジスタ材料や太陽電池、電解発光材料など幅広く応用検討がなされており、π共役オリゴマーの中で最も広く研究されているものの一つである。本研究では、このオリゴチオフェンにピロールを挿入した化合物の設計し、その半導体特性についての評価をはじめて行い、良好なFET材料であることを明らかにした。さらに、その性能が分子対称性の違いに起因する分子同士のパッキングのしやすさに依存することを明らかにした。次に、導電性高分子のPドープ状態のモデルとして、このオリゴマーの酸化種の電子状態を実験と理論双方からの考察を行った。理論計算から、この分子のジカチオン状態において、スピンを持たない閉殻一重項状態ではなく、開殻種がより安定であることが示唆された。実験においても、分子鎖長の伸長にともない、閉殻一重項状態では説明できない吸収スペクトル変化が観測された。ESR測定により、この分子のジカチオン種が常磁性種であることが分かった。また、この分子の酸化においては、近年報告されているようなラジカル種の分子間相互作用による二量化は観測されなかった。この結果は、有機半導体の開発ならびに導電性高分子の電荷担体の解明に向けての研究に新たな知見を与えるものである。
抗癌剤耐性、薬物代謝に関連する新規遺伝子の解析

抗癌剤化学療法の適用、工夫により、癌、白血病、骨肉腫をはじめとする各種悪性腫瘍の治療成績は多大に改善されてきた。しかし、現在治療上の障壁となっているのは、これら化学療法に抵抗する薬剤耐性の問題である。薬剤耐性に関連する生物学的事象を明らかにし、治療に役立てる為、本研究を開始した。研究過程において、薬剤耐性関連候補遺伝子5ヶを同定したが、その内の1つ、新規分子RB1CC1(RB1-inducible Coiled-Coill)はRB1(網膜芽細胞腫)癌抑制遺伝子と密接に連関し、各種の癌の進展に関連することが明らかになった。本研究後半ではこの新規分子RB1CC1の機能解析、及び、癌における変異解析を中心にヒト疾患との関わりについて研究をすすめ、種々の成果を得た。今年度は、RB1CC1遺伝子の染色体局在部位8q11にLOH(loss of heterozygosity)が疑われる癌(乳癌、前立腺癌)については、本遺伝子がこれら癌腫の発がん機構に強く関わっている可能性が高かったため、これら癌腫の凍結保存組織よりRNA,DNAを採取し、その遺伝子構造の変異解析を行いました.この結果は現在学術雑誌に投稿中です.また、これまでの研究成果を基にRB1CC1遺伝子産物に対するprobe,抗体を作成しました.そして、乳癌や前立腺において、本遺伝子変異が関わっている頻度を、作成したRB1CC1 probe,抗体を使って、現在検索中です.更に、RB1CC1遺伝子座にLOH(loss of heterozygosity)の存在がみられた乳癌について、その遺伝子の変異、発現、機能解析を行いました。この結果、乳癌の1020%の症例において本遺伝子の遺伝子変異力が存在し、このことが乳癌の癌化に関わっていることが明らかとなりました(Chano, et al. Oncogene 2002)。この成果は2002年67月にかけて日本のテレビ、新聞紙上で取り上げられました。また、海外でも特に高い評価を受けました。その後、RB1CC1は細胞の増殖を抑えるだけでなく、組織の発生、器官形成においても重要な働きをし、細胞の分化に貢献していることも示唆しました(Chano, et al. Am J Patho12002)。抗癌剤耐性に関連のある遺伝子として、ヒト骨肉腫細胞より我々が単離した新規の癌抑制遺伝子RB1CC1 (RB1-inducible Coiled-Coil 1)は、ヒト各種組織における発現状態、機能、等、不明の新規の遺伝子でした。しかし、その後我々が行った、遺伝子クローニング、構造解析、染色体マッピング、更に、ヒト正常各種組織、悪性腫瘍における発現解析実験、RB1CC1遺伝子導入実験などにより、本遺伝子産物は哺乳動物細胞の核内に移行し、核内では転写因子として働きうることがわかりました。そして、RB1CC1が別の癌抑制因子RB1 (retinoblastoma tumor suppressor)の発現を上昇させ、RB1のリン酸化を調整することにより、癌細胞の増殖を抑える働きを持つことを明らかにしました。RB1CC1遺伝子座にLOH (loss of heterozygosity)の存在がみられた乳癌については、その遺伝子変異の解析、発現解析を行いました。その結果、乳癌の1020%の症例において、本遺伝子機能の異常がみられ、このことが乳癌の癌化に関わっていることを明らかにしました。また、他の癌ではRB1CC1分子の上流の異常や、遺伝子のメチル化が癌化に関与している可能性も示しました。癌以外には、RB1CC1が細胞の増殖抑制だけでなく、組織の分化、器官形成においても重要な働きをしていることを明らかにしました。現在、RB1CC1の細胞生物学的経路を明らかにし、治療に役立ててゆくための解析を行うとともに、神経組織等で発現されているRB1CC1の働きを明らかにするための研究を継続して進行しています。
水分／塩分欲求制御機構の解明

脳弓下器官のアンジオテンシンII受容体AT1a発現ニューロンの中に口渇感、塩欲求を制御する水ニューロン、塩ニューロンを見出した。前者はコレシストキニン、後者はNa+レベルセンサーNaxの下流で動くGABAニューロンにより抑制されていた。また、口渇感はNaxがエポキシエイコサトリエン酸を介してTRPV4を活性化することでも制御されていた。また自己免疫性の無飲症性高Na血症の発症機序を解明した。ヒトを含む哺乳動物は、脳の感覚性脳室周囲器官において、体液のNa+レベルや浸透圧を監視するとともに、アンジオテンシンIIなどの血中ホルモンを介して末梢からの情報を受け取り、水分/塩分の経口摂取量の制御(水分/塩分に対する欲求の制御)と腎臓における排泄/再吸収の制御を統合的に行っている。私は、マウスをモデル動物として感覚性脳室周囲器官のNaxチャンネルが体液Na+レベルセンサーであること、TRPV1チャンネルが体液浸透圧センサーとして機能し得ることなどを明らかにしてきた。本研究は、これらの研究成果を基盤に、解剖学的解析、行動学的解析、光活性化型チャンネルを用いた神経伝達のin vivo光制御、ウィルスを用いた遺伝子導入・発現等を組み合わせ、中枢において感知された体液情報に基づいて水分/塩分に対する欲求が出現する神経機構の解明を目指して進めている。本年度の実績は以下の通りである。1. Naxのニューロンにおける機能特性の解析:チャンネル分子Naxは脳室周囲器官のグリア細胞においてNa+レベルセンサーとして機能している。しかし、ニューロンにおける機能特性は不明のままであった。本年度、大脳皮質と扁桃体の一部のニューロンにおいてNaxの発現を確認した。ニューロン由来の株化細胞に発現させたNaxを機能解析し、グリア細胞に発現するNaxと同様にNa+レベル感受性を示すことを明らかにした。2. Naxの末梢神経系における役割:Naxは末梢神経系では非ミエリン化シュワン細胞に発現している。末梢神経の軸索は切断後に再伸長するが、その過程にNaxを介した乳酸分泌が関与することが明らかになった。1.脳弓下器官に発現する新たな脳内センサーの探索平成26年度に飲水行動制御に関与することが明らかになったTRPV4とNaxのダブルノックアウト(KO)マウスについて、高浸透圧溶液の脳室内注入によって誘発される飲水量を測定し、各KOマウスと比較した。予想と異なり、ダブルKOマウスの飲水量は各KOマウスとほぼ同じで、2つの分子を欠損したことによる加算効果は見られなかった。このことから、TRPV4とNaxは単独で飲水行動の制御に関与しているのではなく、両者が一つの制御システムの中で働く、未知の仕組みが存在することが明らかになった。さらに、薬理学的実験から、Naxの活性化とTRPV4の活性化を連関させるしくみが明らかになりつつある。また、RNA-seqによって見出したSFOやOVLTに特異的に発現する分子群について、in situハイブリダイゼーションによる発現解析を実施し、感覚性脳室周囲器官における発現を確認した。さらに、発現が確認できた分子についてイオンイメージングによってNaや浸透圧刺激に対する応答を調べたところ、Naや浸透圧に応答する、センサー候補分子を複数同定することに成功した。2. AT1a-KOマウスの水分・塩分摂取行動解析AT1aの発現を神経経路依存的に欠損させる解析から、脳弓下器官(SFO)から神経核Xに投射する神経が塩分摂取行動の制御に関わることが明らかになった。そこで、逆行性ウィルスを用いて光活性化型プロトンポンプArcT(光刺激により神経活動を抑制する働きを持つ)を神経核Xに投射するSFOニューロンに特異的に発現することに成功した。これを光刺激し、世界で初めて塩分摂取行動を人為的に光制御することに成功した。前年度から実施してきた研究から、予想外の成果が次々と出てきており、計画以上に進展した。現在、その成果を順次まとめているところである。まず、Naxについては、従来、脳室周囲器官のグリア細胞に発現していることがわかっていたが、新たな解析の結果、大脳皮質や扁桃体においてはニューロンに発現しており、足場タンパク質PSD95と結合してシナプス後部に存在していることが明らかになった。さらに、電気生理学的解析から、ニューロンに発現しているNaxも、グリア細胞に発現しているNaxと同様のNa感受性を示すことが明らかになった。Naxを開口させる陽イオンのイオン選択性について解析したところ、Na+ = Li+ > Rb+ > Cs+となっていることが明らかになった(Matsumoto et al., 2015)。また、脳室周囲器官に特異的に発現する分子を多数同定し、その機能をin vitroで解析したところ、Na感受性を示すセンサー候補分子を複数見出したことた。今後、個体を用いた解析により、飲水行動の制御への関与を検証する。また、従来、単独で飲水行動の制御に関わっていると考えられていたTRPV4が、Nax依存的に活性化し、飲水行動を制御するという全く新しい体液モニタリング機構を発見した(投稿中)。さらに、塩分摂取と水分摂取の制御を担う神経回路を同定することに成功した。それぞれの回路を光制御することにより塩分摂取量や水分摂取量を人為的に制御することに成功した。これは、味覚物質の摂取行動を光制御することに世界で初めて成功した成果である(投稿中)。

1.口渇感(水欲求)と塩欲求を制御する神経機構の解明:オプトジェネティクス(神経活動の光操作技術)や電気生理学的解析により、脳弓下器官(SFO)の口渇感と塩欲求を担うニューロンを同定し、それぞれを水ニューロン、塩ニューロンと命名した。さらに、SFOに水ニューロンを抑制するの抑制性ニューロンが存在し、塩欠乏時にコレシストキニン(CCK)によって活性化されること、それとは別に塩ニューロンを抑制する抑制性ニューロンが存在し、脱水時にNaxを発現するグリア細胞からの乳酸によって活性化されることを明らかにした。これにより、体液状態に応じた口渇感と塩欲求制御機構が解明された(Nature Neurosci.2017)。2. TRPV4とNaxが口渇感制御に関与する神経機構の解明:高張食塩水の脳室内投与によって誘発される飲水行動の脳内機構を解析した。従来脳の浸透圧センサーとして提唱されてきたTRPV1やTRPV4が食塩水投与による口渇感の調節に関与していないことを行動実験により証明した。一方、TRPV4がNaxの下流でEETを介して活性化し、飲水行動を活性化するという新しい機構の存在が明らかになった(Am J Physiol, 2016)。3.新しい高Na血症発症機構の提唱:原因不明の持続性高Na血症患者を多数解析し、その中にSFOを認識する自己抗体が体内で産生されている患者を複数見出した。患者血清を用いた動物実験から、SFOの炎症により口渇感や高利尿ホルモンの調節機構が失われ高Na血症になる新しい疾患として報告した(Brain. Pathol. 2016)。当初の計画に従い、塩分摂取行動の制御におけるアンジオテンシンII(AngII)の作用機構について解析を行ってきたが、思いがけず、塩分に加えて水分摂取行動の制御機構についても明らかにすることができた。1970年代にAngIIを脳内に投与すると水分や塩分摂取が誘発されることが示されて以来、そのメカニズムの解明が俟たれていた。本研究において、世界で初めて口渇感と塩分欲求を担うニューロンを同定し、AngII受容体AT1aを介して駆動されることや、その投射先、さらに局所神経回路による体液状態に応じた制御機構までも明らかにすることに成功した(Nature Neurosci.2017)。さらに、TRPV4がNaxの下流で飲水行動制御に関わる機構も、予想外の発見であった。TRPV4は2000年にLiedtkeらによって報告されて以降、15年以上にわたり浸透圧センサーであると信じられてきた分子である。我々も、その仮説に従って解析を進めてきたが、まったく予想外のことに、TRPV4は浸透圧センサーではなかった。センサーではなく、内在性の活性化物質であるEETによって活性化され、それによって飲水行動が誘発されていた。驚いたことに、TRPV4を活性化するEETはNa+センサーであるNaxの活性化を受けて産生されていることが明らかになった。我々は、既に、浸透圧センサーとされていたTRPV1が飲水行動の制御に関与していないことを明らかにしている。今回の成果は、これに加えて従来の常識を覆す成果として、飲水行動の制御機構の解明に大きく貢献するものと考えている(Am J Physiol, 2016)。
光周性を制御する脳の形態変化の制御機構の解明

鳥類の性腺の光周性を制御する脳の形態変化において、甲状腺ホルモンが深く関与していることを過去に明らかにした。しかし、甲状腺ホルモン(トリヨードチロニン;T_3)の投与のみでは長日刺激時ほどの性腺の発達が見られないことや、ウズラでは甲状腺を除去しても光周性が保存されることから他の光周性制御因子の存在が指摘されていた。そこで新規の光周性制御因子の探索をディファレンシャル解析にて行ったところ、形質転換増殖因子α(transforming growthfactor α;TGFα)が甲状腺ホルモンとは異なる経路で性腺の光周性を制御していることを明らかにした。TGFαも甲状腺ホルモン同様、脳の形態変化を介してGnRHの分泌を制御している可能性が考えられたため、TGFαを短日のウズラの脳室内へ投与した時の正中隆起の超微形態を解析した。TGFα投与により性腺の発達が見られたが、正中隆起の形態変化は観察されなかった。一方、陽性対照としてT_3を脳室内投与した動物では性腺の発達が見られ、正中隆起のグリア細胞の形態変化も観察された。さらにTGFαと甲状腺ホルモンの脳への同時投与により性腺の発達が長日刺激時の発達と同程度になることが分かった。これらのことから、TGFαは正中隆起の形態変化を介さずに甲状腺ホルモンとは異なる独立した経路でGnRH分泌を制御し、甲状腺ホルモンとTGFαが相加的にGnRH分泌を誘導することにより性腺の発達が制御されていることが示唆された。この成果は、性腺の光周性の制御において従来主要な因子と考えられていた甲状腺ホルモンのみならずTGFαという新たな因子が作用していることを示し、これらが複合的に作用することで性腺の光周性が制御されていることが示された。また性腺の光周性を制御する脳の形態変化においては改めて甲状腺ホルモンが重要な因子であることが示された。光周性を制御する脳の形態変化の解明において、まず甲状腺ホルモンの関与について調べた。その結果、長日刺激によって誘導される脳の形態変化が、短日下で甲状腺ホルモンを脳室内投与した動物においても同様の形態変化が確認された。このことから光周性における脳の形態変化には甲状腺ホルモンが深く関与していることが明らかになった。さらに脳の形態変化を制御する遺伝子の探索をディファレンシャル法により行った。その結果、新規の光周性制御遺伝子として形質転換成長因子アルファ(Transforming growth factor αTGFα)を発見した。このTGFαは、長日刺激を与えた初日から光周性制御の中枢である視床下部内側基底部で発現し、受容体も同じ部位に存在していることが分かった。さらに短日下でTGFαを脳室内投与することで性腺の発達が誘導され、さらに甲状腺ホルモンと同時に投与するとその効果が相加的になる傾向があった。またTGFα及び甲状腺ホルモンはそれぞれの遺伝子発現には影響を与えないことが分かり、TGFαは甲状腺ホルモンとは異なる経路で光周性の制御を行っていることが示された。これらのことから、長日刺激を受けると視床下部内側基底部でTGFαが甲状腺ホルモンとは独立して作用し、性腺の発達を制御していることが明らかになった。今後は、TGFαを脳室内へ浸透圧ポンプを用いて投与し、脳の形態変化への影響を調べていく予定である。
液体窒素温度下での低温塑性繰り返し変形の実験と構成関係の構築

低温構造体の重要性が高まるにつれて,低温構造材料の変形特性の把握が必要となってきている.本研究では,低温構造体として広く使われているSUS304鋼について,繰返し変形挙動に対する予ひずみの方向と大きさがどのような影響を実験的に調べた.また液体窒素温度および室温で予ひずみを与えた後に,繰返し変形挙動をそれぞれ室温と液体窒素温度で行い,予ひずみを与えた温度と繰返し変形の温度を変化させて,予ひずみの繰返し変形におよぼす影響も実験的に調べた.実験は,液体窒素中,または室温の大気中で薄肉円筒試験片に,ねじりまたは引張圧縮の負荷を加えて行った.予ひずみの繰り返し変形への影響につては次の結果が得られた.(1)予ひずみを繰返し方向と直角方向に与えた場合,繰返し変形の初期の段階で硬化が大きく進むが,繰返し負荷の回数が増加するにつれて硬化は緩やかになり,予ひずみを与えない場合の繰返し特性に近づく.(2)予ひずみを繰返し変形と同方向に与えた場合には,予ひずみと繰返し塑性ひずみはほぼ等価で,両方の硬化特性はほぼ同じになる.予ひずみを与える温度の繰り返し変形への影響につては次の結果が得られた.(1)繰返し方向と垂直な予ひずみは,室温で与えるより77Kで与える方が繰返し負荷の硬化量が大きくなる.しかし,繰返し回数が多くなると,予ひずみを与えるときの温度の影響は小さくなる.(2)繰返し方向と同方向の予ひずみは,77Kで与えても,室温で与えても,その後の繰返し変形に大きな影響を与えず,予ひずみを与えない場合の繰返し変形とほぼ同じである.これらの結果から低温繰り返し塑性変形の基礎的な構成関係が得られた.低温構造体の重要性が高まるにつれて,低温構造材料の変形特性の把握が必要となってきている.本研究では,低温構造体として広く使われているSUS304鋼について,繰返し変形挙動に対する予ひずみの方向と大きさがどのような影響を実験的に調べた.また液体窒素温度および室温で予ひずみを与えた後に,繰返し変形挙動をそれぞれ室温と液体窒素温度で行い,予ひずみを与えた温度と繰返し変形の温度を変化させて,予ひずみの繰返し変形におよぼす影響も実験的に調べた.実験は,液体窒素中,または室温の大気中で薄肉円筒試験片に,ねじりまたは引張圧縮の負荷を加えて行った.予ひずみの繰り返し変形への影響につては次の結果が得られた.(1)予ひずみを繰返し方向と直角方向に与えた場合,繰返し変形の初期の段階で硬化が大きく進むが,繰返し負荷の回数が増加するにつれて硬化は緩やかになり,予ひずみを与えない場合の繰返し特性に近づく.(2)予ひずみを繰返し変形と同方向に与えた場合には,予ひずみと繰返し塑性ひずみはほぼ等価で,両方の硬化特性はほぼ同じになる.予ひずみを与える温度の繰り返し変形への影響につては次の結果が得られた.(1)繰返し方向と垂直な予ひずみは,室温で与えるより77Kで与える方が繰返し負荷の硬化量が大きくなる.しかし,繰返し回数が多くなると,予ひずみを与えるときの温度の影響は小さくなる.(2)繰返し方向と同方向の予ひずみは,77Kで与えても,室温で与えても,その後の繰返し変形に大きな影響を与えず,予ひずみを与えない場合の繰返し変形とほぼ同じである.これらの結果から低温繰り返し塑性変形の基礎的な構成関係が得られた.本研究では,低温構造用材料として用いられるステンレス鋼SUS304を試験材料として選び,繰返し変形挙動に対する予ひずみの方向と大きさがどのような影響を与えるかについて実験的に調べた.実験は,液体窒素中で薄肉円筒試験片に予ひずみを与えた後、ねじり,引張と圧縮の繰返し変形を行い,予ひずみの大きさと方向が繰返し応力-ひずみ曲線に与える影響を調べた.繰返し変形挙動を調べるため,繰返し応力-ひずみ曲線の応力振幅と,予ひずみおよび繰返し変形によって生ずるひずみを加えた累積塑性ひずみの関係を用いた.得られた主な結果は次のとおりである.(1)予ひずみを繰返し方向と直角方向に与えた場合,繰返し変形の初期の段階で硬化が大きく進むが,繰返し負荷の回数が増加するにつれて硬化は緩やかになり,予ひずみを与えない場合の繰返し特性に近づく.(2)予ひずみを繰返し変形と同方向に与えた場合には,予ひずみと繰返し塑性ひずみはほぼ等価で,両方の硬化特性はほぼ同じになる.(3)異なった大きさの予ひずみを与え,予ひずみ方向と同方向で繰返し変形を行った場合,予ひずみの大きさによって硬化特性は変わる.しかし,異なった大きさの予ひずみに対する応力振幅と累積塑性ひずみの関係は,予ひずみの大きさを換算して繰返し塑性ひずみに加えると,ほぼ同じ傾向を示す曲線が得られる.本研究では,低温構造体として広く使われているSUS304鋼について,予ひずみを与えないときと,液体窒素温度および室温で予ひずみを与えた後に,繰返し変形挙動をそれぞれ室温と液体窒素温度で行い,予ひずみを与えた温度と繰返し変形の温度を変化させて,予ひずみの繰返し変形におよぼす影響を調べた.実験は,液体窒素中,または室温の大気中で薄肉円筒試験片に予ひずみを与えた後,ねじり,または引張圧縮の繰返し変形を行い,予ひずみが繰返し変形中の応カ-ひずみ曲線に与える影響を調べた.

繰返し変形挙動を調べるために,繰返し応カ-ひずみ曲線の応力振幅と,予ひずみ,および繰返し変形によって生ずるひずみを加えた累積塑性ひずみの関係を用いた.主な結果は次の通りである.(1)繰返し方向と垂直な予ひずみは,室温で与えるより77Kで与える方が繰返し負荷の硬化量が大きくなる.しかし,繰返し回数が多くなると,予ひずみを与えるときの温度の影響は小さくなる.(2)繰返し方向と同方向の予ひずみは,77Kで与えても,室温で与えても,その後の繰返し変形に大きな影響を与えず,予ひずみを与えない場合の繰返し変形とほぼ同じである.(3)室温で繰返し負荷を行う場合,繰返し方向と垂直方向の予ひずみを77Kで与えると,繰返し回数か多くなっても予ひずみの影響は残る.
リンパ球に発現するアセチルコリン受容体とその生理的役割に関する免疫薬理学的研究

本研究では,1)リンパ球に発現するムスカリンおよびニコチン受容体,2)ムスカリン受容体刺激による細胞内カルシウムシグナリング機構と転写調節因子c-fos活性化について検討した.実験材料として種々のヒト白血病細胞株およびヒト末梢血より調製した単核白血球を用いた.1)アセチルコリン受容体の解析:reverse transcription-polymerase chain reaction法により解析した.調べたすべてのTおよびB細胞系細胞株,さらに末梢血単核白血球において,ムスカリンおよびニコチン受容体遺伝子が発現していた.2)共焦点レーザー蛍光顕微鏡を用いた細胞内遊離カルシウムイオン動態の解析:カルシウム感受性蛍光色素をT細胞系細胞株CEMおよびB細胞系細胞株Daudiに負荷した後,スライドグラス上に固定した.アセチルコリン受容体に選択的な拮抗薬の存在下および非存在下に,ムスカリン受容体作用薬oxotremorine-M(Oxo-M)を作用させた.細胞内遊離カルシウムイオン濃度変化を,共焦点レーザー蛍光顕微鏡を用いて,経時的かつ空間的に観察した.Oxo-Mにより細胞内遊離カルシウムイオン濃度は上昇した.この上昇作用はムスカリンM3サブタイプ受容体拮抗薬4-DAMPにより選択的に拮抗された.3)転写調節因子c-fos遺伝子発現誘導機構の解析:Oxo-Mは,T細胞系細胞株CEMおよびB細胞系細胞株Daudiにおけるc-fos遺伝子発現を増強した.この作用はムスカリンM3サブタイプ受容体拮抗薬4-DAMPにより選択的に拮抗された.以上の結果より,TおよびBリンパ球には,1)ムスカリンおよびニコチン受容体が存在していること,2)M3サブタイプを介する細胞外から核へのシグナル伝達機構の存在が明らかとなった.Tリンパ球により合成および遊離されたアセチルコリンが,オートクラインあるいはパラクライン的に,TおよびBリンパ球の機能調節に関与している可能性が示唆された.本研究では、1)リンパ球に発現するムスカリン(mAChR)およびニコチン(nAChR)様アセチルコリン受容体,2)mAChR刺激による細胞内カルシウムシグナリング機構について検討した.実験材料として種々のヒト末梢血由来白血病細胞株およびヒト末梢血より調製した単核白血球を用いた.1)血球細胞上に発現するAChRの解析:各細胞株あるいは単核白血球におけるmAChRサブタイプおよびnAChRサブユニット遺伝子の発現をreverse transcription-plolymerase chain reaction(RT-PCR)法により解析した.調べたすべてのTおよびB細胞系株,単核白血球にmAChR受容体および神経型nAChRサブユニットが発現していることが確認された.しかし,骨格筋型nAChRサブユニットはいずれの細胞にも発現していなかった.さらに,細胞株あるいは各個人の単核白血球に発現しているmAChRサブタイプあるいは神経型nAChRサブユニットには相違が認められた.2)共焦点レーザー顕微鏡を用いた細胞内カルシウムイオン動態の解析:カルシウム感受性蛍光色素をT細胞系株CEMおよびB細胞系株Daudiに負荷した後,細胞をスライドグラス上に固定した.各AChRサブタイプに選択的な拮抗薬の存在下および非存在下に,mAChR作用薬Oxo-Mを作用させた.細胞内カルシウムイオン濃度の変化を,共焦点レーザー顕微鏡を用いて経時的かつ空間的に観察した.Oxo-Mにより細胞内遊離カルシウムイオン濃度は上昇した.この上昇作用は,M3サブタイプ選択的mAChR拮抗薬により選択的に拮抗された.以上の結果より,1)リンパ球にはmAChRおよびnAChが発現していること,2)M3サブタイプを介する細胞内カルシウムシグナリング機構の存在が示唆された.本研究では,1)リンパ球に発現するムスカリンおよびニコチン受容体,2)ムスカリン受容体刺激による細胞内カルシウムシグナリング機構と転写調節因子c-fos活性化について検討した.実験材料として種々のヒト白血病細胞株およびヒト末梢血より調製した単核白血球を用いた.1)アセチルコリン受容体の解析:reverse transcription-polymerase chain reaction法により解析した.調べたすべてのTおよびB細胞系細胞株,さらに末梢血単核白血球において,ムスカリンおよびニコチン受容体遺伝子が発現していた.2)共焦点レーザー蛍光顕微鏡を用いた細胞内遊離カルシウムイオン動態の解析:カルシウム感受性蛍光色素をT細胞系細胞株CEMおよびB細胞系細胞株Daudiに負荷した後,スライドグラス上に固定した.アセチルコリン受容体に選択的な拮抗薬の存在下および非存在下に,ムスカリン受容体作用薬oxotremorine-M(Oxo-M)を作用させた.細胞内遊離カルシウムイオン濃度変化を,共焦点レーザー蛍光顕微鏡を用いて,経時的かつ空間的に観察した.Oxo-Mにより細胞内遊離カルシウムイオン濃度は上昇した.この上昇作用はムスカリンM3サブタイプ受容体拮抗薬4-DAMPにより選択的に拮抗された.3)転写調節因子c-fos遺伝子発現誘導機構の解析:Oxo-Mは,T細胞系細胞株CEMおよびB細胞系細胞株Daudiにおけるc-fos遺伝子発現を増強した.

この作用はムスカリンM3サブタイプ受容体拮抗薬4-DAMPにより選択的に拮抗された.以上の結果より,TおよびBリンパ球には,1)ムスカリンおよびニコチン受容体が存在していること,2)M3サブタイプを介する細胞外から核へのシグナル伝達機構の存在が明らかとなった.Tリンパ球により合成および遊離されたアセチルコリンが,オートクラインあるいはパラクライン的に,TおよびBリンパ球の機能調節に関与している可能性が示唆された.
東アジア三国（日中韓）関係史料の研究資源共有化と実践的交流の研究

日本・中国・韓国三国の歴史編纂研究をめぐる国際研究集会の開催に向け、本研究課題の3つの重点テーマ:1王家・貴族の文庫形成と王朝史編纂の比較研究、2歴史情報の研究資源化研究、3海外所在史料の調査研究にもとづく研究報告の依頼と準備を推進した。そして、2018年10月15日・16日に中国社会科学院近代史研究所(北京市)で開催された「第6回東アジア史料研究編纂機関国際学術会議」(理事機関:東京大学史料編纂所・中国社会科学院近代史所・大韓民国国史編纂委員会、今回の主催は中国社会科学院近代史研究所)に参加し、本研究課題の代表者榎原、研究分担者深澤秋人、須田牧子の3名が報告した。またそのほか2名の日本人研究者に報告を要請し、予稿集の作成に協力した。シンポジウムでは日本、中国、韓国から各5人の報告者が立ち、東アジアの交渉に関わる史料ついて、A史料のデータベース化に関する課題、B史料の分析に関する課題、C原本史料の保存と修復に関する課題の3つのセッションにおいて報告と討議が行われた。また、2016年11月に東京大学において開催した「第5回東アジア史料研究編纂機関国際学術会議」の報告(日本、中国、韓国各5本)をおさめた書籍『アジア歴史資料の編纂と研究資源化』(編集・発行:東京大学史料編纂所、729ページ)を出版した。各報告はすべて日本語、中国語、韓国語の三カ国語で掲載されている。本研究課題は前回会議の主催者の一員として編集・刊行を担当した。翻訳にあたっては三カ国機関の間での緊密な連携を行った。1)今後の研究課題の最大の課題であった「第6回東アジア史料研究編纂機関国際学術会議」に参加し、中国、韓国の理事機関と協力して、学術会議を成功させることができた。本研究課題の重点テーマである1王家・貴族の文庫形成と王朝史編纂の比較研究、2歴史情報の研究資源化研究、3海外所在史料の調査研究の成果は、学術会議におけるACの3つのセッションに位置づけて報告し、活発な質疑を交換することができた。また学術会議の成功を通じて研究者間の信頼関係を構築することができ、次回の学術会議を韓国主催によって開催することを決定することができた。2)「第5回東アジア史料研究編纂機関国際学術会議」の報告集を刊行することができた。3)海外所在史料については、東アジア三国に関わるロシア国立歴史文書館所蔵史料目録の解析を進め、米国プリンストン大学東アジア図書館所蔵史料を調査し、未紹介の史料の所在を確認することができた。1)東京大学史料編纂所が所蔵する対馬宗家文書のうち、朝鮮通信使関係史料のデジタルアーカイヴズ化を進める。デジタル撮影ののち、メタデータを付与してWebによる公開を進める。またロシアに所在する東アジア・日本関係史料の収集と目録公開を進めたい。2)「第7回東アジア史料研究編纂機関国際学術会議」を2020年5月に韓国国史編纂委員会主催によって開催することが決定したため、この学術会議に向けて報告の準備を進める。東アジア三国(日中韓)の歴史編纂研究をめぐる国際研究集会の開催に向け、3つの重点テーマ:1王家・貴族の文庫形成と王朝史編纂の比較研究、2歴史情報の研究資源化研究、3海外所在史料の調査研究にもとづく研究報告の取りまとめを推進し、国際研究集会の実行委員会を組織して報告準備をおこなった。2016年11月6・7日、「アジア歴史資料の編纂と研究資源化」を全体テーマとする東アジア史料研究編纂機関第5回国際学術会議国際学術会議(理事機関:東京大学史料編纂所・韓国国史編纂委員会・中国社会科学院近代史研究所)を、東京大学史料編纂所主催・日本学士院共催として開催した。日中韓三か国からの報告者15名(各国5名宛)を組織し、報告者を含めて中韓から15名の研究者を招聘したほか、研究集会では日中韓の各国語に翻訳した予稿集を準備し、同時通訳によって実質的な議論や理解を深める工夫をおこなった。会場となった東京大学伊藤国際学術研究センター特別会議室には、中韓からの招聘研究者15名を含む40人前後の研究者が詰め、隣接する会議室では発表の様子がモニター中継されて多くの研究者が見守り、国際研究集会は成功裏に終了した。一方、東アジア三国関係史料の研究資源化と公開・共有化の取り組みとして、日中韓の対外交流にかかわる史料群のデジタルアーカイヴ化を推進した。2016年度は史料編纂所図書室によって「本邦朝鮮往復書」(全101冊)などのデジタル化が完了し、ウェブ公開されている。また、基盤研究(S)研究(課題番号26220402)と連携し、ロシア国立歴史文書館所蔵史料の中から、東アジア三国に共通して関係するロシア史料の目録化に取り組んだ。進捗状況を研究目的に沿って確認してみたい。1)東アジア三国(日中韓)関係史料の研究資源化と公開・共有化の実現1東京大学史料編纂所所蔵史料のうち、東アジアの対外交流に関わる史料群のデジタルアーカイヴズ化を、同研究所の図書部と連携し、順次計画してデジタル撮影を実施し、メタデータを付与してウェブ公開を進めた。2016年度は、本邦朝鮮往復書(全101冊)がその成果である。また、2日中韓に関わるロシア史料目録の作成と公開・出版を基盤研究(S)研究と連携して進めた(ロシア国立歴史文書館に委託)。2)重点的なテーマ研究の実施と国際研究集会での報告準備

1王家・貴族の文庫形成と王朝史編纂の比較研究、2歴史情報の研究資源化研究、3海外所在史料の調査研究をテーマとして、関係研究者を組織し、国際研究集会のなかでの報告の準備を進めた。その結果、日本側報告として、史料編纂所から3本の報告と、奈良文化財研究所・国立公文書館アジア歴史資料センターから各1本の報告を得た。さらに、中韓の代表的歴史研究機関から計10本の報告を組織した。3)日中韓の研究協力協定にもとづく国際研究集会の実施と研究交流2016年度の最大の課題は、東京(東大本郷キャンパス)で開催する国際研究集会の成功であった。本科研が中心となって実行委員会を組織し、東京大学や日本学士院の支援を得て、11月6・7日の東アジア史料研究編纂機関第5回国際学術会議国際学術会議を開催した。海外からの招へいや報告の組織、予稿集の作成、同時通訳による研究集会の実施など、研究集会の運営と中韓の研究者とのさまざまな交流活動を、前掲基盤研究(S)研究とも連携して本研究でおこなった。この研究集会は、日中韓三国における学術的な研究交流として、前後の取り組みを含めて大きな成功をおさめ、本科研の研究目的も順調に遂行されたと評価できる。2018年に中国社会科学院近代史研究所が幹事となって予定される東アジア史料研究編纂機関第6回国際学術会議(理事機関:東京大学史料編纂所・韓国国史編纂委員会・中国社会科学院近代史研究所)に向け、重点的なテーマ研究の実施と国際研究集会での報告準備を進めた。第6回会議では、災害史料の編纂を重点的なテーマとして設定しているため、2017年度は、地震学研究者と連携して、前近代日本の地震史料の収集とデータベースの構築、および歴史地震の事例や典拠史料の史料評価に関する研究を行った。また、豊臣政権下の日明交渉史料の研究を行い、特に明朝が秀吉家臣に官職を授けた文書原本の検討を紙質調査も含めて行うことで、文書の一部が改竄されていることを明らかにし、虚実の錯綜する複雑な外交交渉過程をあぶり出すなどの成果があった。また、基盤研究(S)研究(課題番号26220402)と連携し、ロシア国立歴史文書館から同館が所蔵する東アジア三国(極東)関係史料の解説目録を入手し、研究に供した。東京大学史料編纂所所蔵対馬宗家史料(全3000冊)のうち、江戸藩邸毎日記3698コマをデジタルアーカイヴ化し、ウェブ公開に供した。これは、東アジア三国(日中韓)関係史料の研究資源化と公開・共有化の実現である。また、2016年11月に開催した東アジア史料研究編纂機関第5回国際学術会議国際学術会議の報告集(日中韓3か国語)の刊行準備をおこない、次年度当初に刊行する予定である。1)東アジア三国(日中韓)関係史料の研究資源化と公開・共有化の実現1東京大学史料編纂所所蔵史料のうち、東アジアの対外交流に関わる史料群のデジタルアーカイヴズ化を、同研究所の図書部と連携し、順次計画してデジタル撮影を実施し、メタデータを付与してウェブ公開を進めた。2017年度は、対馬宗家文書江戸藩邸日記3698カットがその成果である。「江戸藩邸毎日記」は、対馬藩の江戸屋敷が作成した日記であり、朝鮮通信使を中心とする対馬藩が担っていた日朝外交、幕府や他藩などと対馬藩の間での政治的な交渉、対馬藩内部での政務処理など、多岐にわたっている。近世政治史をはじめとする諸分野の研究における基礎的かつ重要な史料群である。また、2日中韓三国に関わるロシア国立歴史文書館所蔵
ニューロピリン-1発現ナチュラルキラー細胞の乳がん治療における意義に関する研究

ニューロピリン-1発現の高い単球はヒト乳癌細胞株に対するトラスツズマブを介した細胞傷害活性を増強することが判明した。形態的特徴を確認するとニューロピリン-1発現の高い単球は球形で癌細胞を取り囲むように形態をなしていた。一方、ニューロピリン-1発現の低い単球は樹枝状の突起を有し形態的にはマクロファージ様であった。このように単球はニューロピリン-1の発現状況で細胞傷害性単球とそうでないサブセットに分類することができる可能性を示した。今後さらに詳細な単球におけるニューロピリン-1の意義ならびに乳癌治療効果との相関について検討を積み重ねていく。我々はNRP-1発現免疫細胞はVEGFにより抑制を受けるという仮説のもと、(1)エフェクター細胞のNRP-1発現強弱による9CCへの影響をVEGF存在下で検討した。また、(2)パイロットスタディーとして乳がん患者PBMCのNRP-1発現状況についてその発現強弱の有無の確認を行った。(1)健常者のPBMCを詳細に検討した結果、予想されていた結果と異なりNK細胞にはほとんどNRP-1は発現しておらず、その一方で単球にNRP-1の発現が認められその発現に強弱も認められた。そこでFACSAriaを用いてNRP-1陽性単球とNRP-1陰性単球を分離し、この細胞をエフェクター細胞として使用し佃CCアッセイを行った。NRP-1陰性細胞ではトラスツズマブ投与にても細胞傷害活性は認められなかったがNRP-1陽性細胞は陰性細胞と比較して有意に細胞傷害活性が高かった。さらにrecombinant VEGFを添加するとこの細胞傷害活性はさらに増強された。この単球の形態観察によりNRP-1陽性細胞は球形で標的癌細胞を密に取り囲んでおり細胞傷害活性で得られた結果と合致していた。一方NRP-1陰性細胞は樹枝状の突起を有し形態学的にはマクロファージ様の形態へと分化している様子が確認された。(2)包括同意の得られた乳がん患者のPBMCを用いてNRP-1の発現状況をフローサイトメトリーで解析した。解析した患者6人のうち単球のNRP-1発現増強が認められたのは2人であった。さらにNRP-1発現陽性単球は化学療法後減少する可能性が示唆された。現段階では治療効果との相関に関する検討は行えていない。乳癌治療におけるneuropilin (NRP)-1発現免疫細胞の意義を実験的、臨床的に解析を行った。【結果】1健常者のPBMC解析で、NK細胞にはほとんどNRP-1は発現していない。一方で単球にNRP-1の発現が認められた。FACSAriaを用いてNRP-1陽性単球と陰性単球に分離し、この細胞をエフェクター細胞としてADCCアッセイを行った。NRP-1陽性細胞は陰性細胞と比較して有意に細胞傷害活性が高かった。さらにVEGFを添加するとこの細胞傷害活性は増強された。現在NRP-1の他のリガンドであるSEMA3Aを用いて同様の実験を施行中である。また、NRP-1陽性細胞は球形で標的癌細胞を密に取り囲んでおり細胞傷害活性で得られた結果と合致していた。さらにCD107a抗体を用いたADCC活性評価においてもNRP-1高発現単球群はより高いCD107a発現を有することが確認された。2患者解析では6人のうち単球のNRP-1発現増強が認められたのは2人であった。化学療法に対する反応性について、治療前にNRP-1高値であった患者が減弱する症例が1例、治療前に低値であった患者が増強する患者が1例存在した。ごく少数での解析であるがこのNRP-1増強例は化学療法に対して腫瘍細胞の完全消失が確認された。【まとめ】NRP-1高発現はトラスツズマブによるADCC活性を増強する。その程度はVEGFにより正の修飾を受ける。乳がん患者間でNRP-1発現状況に高低が存在する。化学療法によりNRP-1発現単球が増加する患者と減弱する患者が存在する。【今後】さらにNRP-1発現の意義を単球において解析する。NRP-1発現とトラスツズマブ治療効果との関連を明らかにする。実験的研究に関しては当初予定したものと異なる結果が得られ、方向性の修正が必要であったが適切にその調整が行えていると考えられる。

患者検体の解析に関してはパイロットスタディーにとどまっており予定よりやや遅れている。24年度が最終年度であるため、記入しない。ターゲットとなるエフェクター細胞はNK細胞から単球へと変更する必要があった。しかしその他の実験計画においては大きな変更の必要は現段階では認められない。単球は様々な形態の細胞へ分化することが知られておりより詳細な検討が必要になることが予測される。患者検体の解析に関しては患者検体バンクの整備も進んでおり軌道に乗れば症例数も蓄積され予定通り解析が進むものと思われる。
マウスモデルを用いた消化器癌転移の研究

癌による死亡の中で消化器癌の占める割合は最も高く、その遠隔転移を抑制することは極めて重要である。今回我々は、身分化骨髄球(iMCs)がCCR1受容体に依存して大腸癌細胞の肝臓への転移に重要な役割を果たすことを示した。さらに、Notchシグナル伝達が大腸癌の悪性化に重要であり、Aes遺伝子はそれを阻害することも明らかにした。また、JNKがmTORC1経路の活性化を介して腫瘍形成を促進することも示すなど、新たな転移制御機構を複数同定することができた癌による死亡の中で消化器癌の占める割合は最も高く、その遠隔転移を抑制することは極めて重要である。また、JNKがmTORC1経路の活性化を介して腫瘍形成を促進することも示すなど、新たな転移制御機構を複数同定することができた1.大腸癌細胞の転移を水先案内する未分化骨髄球の研究未分化骨髄球(iMCs)の系譜を位置づけるには細胞内のtranscriptome解析が必須であるが、これらの細胞集団は均一とは限らないので、FACSで得られたCD34^+CD31^-の骨髄球全体ではなく個々の細胞に由来するcDNAを個別にmicroarrayで解析し、そのデータをクラスター解析して代表的な細胞集団のtranscriptomeを得る必要がある。本年度は本研究科斎藤通紀教授の支援の下で予備実験を行い、個々の段階の精度改善を試みた。また、ヒト大腸癌の転移におけるiMCsの役割を明らかにするため、5種類のヒト大腸癌細胞株をヌードマウスに移植したところ、HT29の転移巣にはiMCsが効率よく集簇し、LS174Tの転移巣も若干の集簇を示すことが分かった。2.癌細胞の転移を制御するAesとNotchシグナルの機構解明我々はこれまでに、Apc変異マウスの腸上皮特異的にAesノックアウトを導入すると、Notchシグナルが活性化される結果、腸腺腫の局所浸潤や血管内侵入が誘発されることを示した。本年度は、腸腫瘍の悪性化進展におけるNotchシグナルの影響を評価するため、iMCsにより腸腫瘍の局所浸潤が促進されるApc/Smad4複合変異マウス(上記)と腸上皮特異的Aesノックアウトマウスとの交配を行った。Apc/Smad4/Aes複合変異マウスでは局所浸潤の深逹度がApc/Smad4複合変異マウスに比べてより深くなっていたことから、iMCsにより引き起こされる局所浸潤がNotchシグナル活性化によって更に促進されることが分かった。また、転移能の異なる三種の前立腺癌細胞株でのAesの発現を調べたところ、転移能とAesの発現には逆相関が見られ、大腸癌のみならず前立腺癌においてもAesが悪性化進展を抑制している可能性が示唆された。1.未分化骨髄球(iMCs)による転移促進機構の解析ヒト大腸癌の転移におけるiMCsの役割を明らかにするためにマウスの脾臓に大腸癌細胞を注入して肝臓へ播種させる手法を用いて解析したところ、癌細胞の転移増殖に先立って大量のiMCsが集簇することが分かった。この反応はCCR1受容体遺伝子のノックアウトマウスを宿主にすると起きず、転移増殖が抑制される。また、MMP9やMMP2遺伝子のノックアウトマウスではiMCsの集簇が起きるにも拘らず転移増殖は抑制される。更に、CCR1受容体の阻害薬でも、転移増殖を抑制でき、治療戦略の可能性が実証された。(Kitamura etal.PNAS,2010.)我々はマウスの大腸癌の転移抑制遺伝子Aesを同定した。多数のヒトの大腸癌検体でもAES遺伝子の原発巣での発現が転移巣では消失していた。分子シグナル伝達の解析の結果、Aes/AESはNotchシグナルの内在性阻害蛋白であることが明らかになり、Notchシグナル伝達の阻害で大腸癌の転移が抑制できる可能性を示唆した。また、転移抑制の機序は癌細胞の血管内への侵入や游出をAESが抑制するという機構によるものである。(Sonoshita et al.Cancer Cell,2011)3.大腸癌進展の早期で重要なシグナル経路や分子が癌の転移の増大に果たす役割の解明我々は先にApc遺伝子の変異による家族性大腸腺腫症のモデルマウスでmTORC1シグナル伝達の活性化を報告したが、この現象を詳しく解析したところ、c-Jun N-terminal kinaseが直接mTORC1の構成要素の一つであるRaptorをリン酸化することで活性化し、サイクリン等のタンパク合成を介して腺腫を拡大することが分かった。(Fujishita et al.Gastroenterology,2011)1.大腸がん細胞の転移を水先案内する未分化骨髄球の研究今年度はCCR1プロモーターでGFP変異体の蛍光タンパクであるVenusを発現させるCCR1レポーターBACトランスジェニックマウスを作製した。現在までにこのマウスを作出することに成功し、骨髄や脾臓においてVenus陽性細胞の殆どが骨髄球系の細胞であること、蛍光強度とCCR1発現量が比例したことから、Venus陽性細胞がCCR1発現細胞であることが確認できた。予備実験から、大腸がん肝転移モデルにおいてVenus陽性細胞が転移巣に集積する事を確認している。

今後この細胞をFACSにより単離し、マイクロアレイ解析により特徴付けることを検討している。さらに、このCCR1発現細胞が転移を助けるメカニズムについて今後検討していく。2.がん細胞の転移を制御するAesとNotchシグナルの機構解明前年度までに、大腸癌細胞をピストン脱アセチル化酵素阻害剤(HDACi)で処理するとAESm RNA量が減少することが分かっている。経時変化を解析した結果、HDACi添加後すぐにAESm RNA量は減少し始めること、また、タンパク合成阻害剤であるシクロヘキシミドはこの減少に影響を及ぼさないことが分かり、タンパクの新規合成を介さないAES発現制御様式が示唆された。3.大腸がんの転移における、発がん初期シグナルや分子の評価大腸がんマウスモデルであるApc/Smad4複合変異マウスの腫瘍においては、mTORC1経路の活性化が観察される。このマウスにmTORC1阻害剤を投与したところ、非投与群と比べて阻害剤投与群では明確な生存期間の延長が確認できた。また腫瘍の数も阻害剤投与により減少しており、同時にがん細胞の浸潤も抑制できた。さらにmTORC1阻害剤の投与により腫瘍における大腸がん細胞増殖及び血管新生が抑制されている事が確認できた。また、CDX2はオートファジー必須酵素であるATG7に結合し、オートファジーを促進することを見出した。1.大腸がん細胞の転移を水先案内する未分化骨髄球の研究昨年度作出したCCR1-Venusレポーターマウスの肝臓に大腸がん細胞の転移巣を形成させたところ、転移巣周囲にVenus陽性細胞が集積することが確認できた。また、転移巣を構成する骨髄球系の細胞は4つの集団;顆粒球、単球、好酸球およびFibrocytesに分類でき、顆粒球の一部がCCR1を発現していることが分かった。さらに、CCR1陽性細胞を含む顆粒球細胞が転移1日後で最も早く集積し、その後、残りの細胞集団が増加することも分かった。CCR1欠損マウスでは、顆粒球細胞の集積が野生型マウスと比べ減少していたことから、CCR1陽性細胞を含む顆粒球細胞が転移巣の形成に重要な役割を果たしていると考えられた。2.がん細胞の転移を制御するAesとNotchシグナルの機構解明大腸がん細胞株を用いたノックダウン、クロマチン免疫沈降及びレポーターアッセイの結果から、YY1とZEB1がAESの転写を抑制することが示唆された。またHDAC阻害薬はYY1に間接的に影響を与えることで、AESプロモーターのクロマチン構造を閉鎖型にさせ、AES遺伝子の転写を減少させることが明らかとなった。3.大腸がんの転移における、発がん初期シグナルや分子の評価今年度は大腸がん組織においてmTORC1経路が活性化している細胞を免疫染色により検討した。興味深いことに、浸潤しているがん細胞ではmTORC1経路が活性化していなかった。また、既に浸潤が生じているマウスにmTORC1阻害薬を投与したところ、阻害薬投与により腫瘍の増大は抑制出来たものの、浸潤そのものを抑制する効果は確認できなかった。以上の結果から、大腸がんにおけるmTORC1経路の活性化は腫瘍の成長•拡大を促進するが、浸潤そのものはmTORC1経路に非依存的である事が明らかとなった。おおむね当初の計画通りに進行している。