hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
A.actinomycetemcomitansの熱ショック蛋白質の研究

まずターゲットとしたActinobacillus actinomycetemcomitans(A.a.)の様々な蛋白質のアミノ酸コドンの使用頻度を遺伝子バンクより検証しそれぞれのアミノ酸の最頻用コドンを特定した.次に,既にクローニングされ塩基配列の決定された他菌種の70kDaヒートショック蛋白質のデータを基に,保存された領域を検索し,最頻用コドンのデータを考慮しA.a.の70kDaヒートショック蛋白質特異的なDNAプローブを作成した.それを用いてA.a.ゲノムを鋳型にしてPCR法を行い,予想されたサイズ(およそ400bp)に増幅されたPCR産物をクローニングし塩基配列の決定を行った.その結果大腸菌由来の70kDaヒートショック蛋白質(Dna K)とDNAで53%,アミノ酸で83%の相同性を示しA.a.由来70kDaヒートショック蛋白質遺伝子が増幅されていることが分かった.次に,得られた400bpフラグメントをプローブにしてA.a.染色体を制限酵素Hind III,Spe I,Acc Iで切断しサザンハイブリダイゼイションを行った.15.0kbp(Hind III),10.0kbp(Spe I),4.0kbp(Acc I)の位置に反応する単一のバンドを確認した.(以上の結果は,歯科基礎医学会,平成10月17,18日に発表)次に,A.a.ゲノムをSpe Iで切断し,電気泳動後10.0kbpを抽出し精製した.これを大腸菌用クローニングヴェクターに挿入し遺伝子ライブラリーを作成した.コロニーハイブリダイゼイション法により70kDaヒートショック蛋白質遺伝子を含むDNAフラグメントをクローニングした.現在,それの塩基配列を決定中である.まずターゲットとしたActinobacillus actinomycetemcomitans(A.a.)の様々な蛋白質のアミノ酸コドンの使用頻度を遺伝子バンクより検証しそれぞれのアミノ酸の最頻用コドンを特定した.次に,既にクローニングされ塩基配列の決定された他菌種の70kDaヒートショック蛋白質のデータを基に,保存された領域を検索し,最頻用コドンのデータを考慮しA.a.の70kDaヒートショック蛋白質特異的なDNAプローブを作成した.それを用いてA.a.ゲノムを鋳型にしてPCR法を行い,予想されたサイズ(およそ400bp)に増幅されたPCR産物をクローニングし塩基配列の決定を行った.その結果大腸菌由来の70kDaヒートショック蛋白質(Dna K)とDNAで53%,アミノ酸で83%の相同性を示しA.a.由来70kDaヒートショック蛋白質遺伝子が増幅されていることが分かった.次に,得られた400bpフラグメントをプローブにしてA.a.染色体を制限酵素Hind III,Spe I,Acc Iで切断しサザンハイブリダイゼイションを行った.15.0kbp(Hind III),10.0kbp(Spe I),4.0kbp(Acc I)の位置に反応する単一のバンドを確認した.(以上の結果は,歯科基礎医学会,平成10月17,18日に発表)次に,A.a.ゲノムをSpe Iで切断し,電気泳動後10.0kbpを抽出し精製した.これを大腸菌用クローニングヴェクターに挿入し遺伝子ライブラリーを作成した.コロニーハイブリダイゼイション法により70kDaヒートショック蛋白質遺伝子を含むDNAフラグメントをクローニングした.現在,それの塩基配列を決定中である.
超低消費電力・超広帯域12bitリングDCOの開発

申請者が提案したリコンフィギュアラブルRFフロントエンド用リング型発振器の設計法の妥当性を検証するために、まず回路論及びVDECが提供したCADツールを利用し、提案したフィボナッチ数列により最適化したインバータを用いたリング型デジタル信号により整合できるDCOを設計し、さらに0.18umCMOSプロセスにより試作・評価を行った。その結果、1GHzから4.2GHzまで広幅帯域で動作できる超帯広帯域リング型DCOを開発し、世界最高レベルのFOM(Figure of Merit=-163dBc/Hz)のDCOの開発ができた。超低消費電力・リコンフィギュアラブルRF回路は、ユビキタスネットワーク情報社会の実現のための、世界的に注目されているソフトウェア無線(SDR)に繋がる、最先端LSI回路の実現に不可欠である。リコンフィギュアラブルRF回路の実現には、CMOSプロセスの微小化に伴い、デジタル信号により制御できるDigitally-Assisted発振器(DCO)が不可欠である。従来のLC-VCOには、MEMSスイッチを利用し、インダクタンス(L)を可変する手法が報告されているが、チップ内のインダクタが不可欠であり、チップ面積は大きい。一方、リング型VCOは、LC-VCOより1/20に小型化できるが、周波数の上昇により、消費電力は急激に増加するため、SDR用リング型VCOの例は見られない。'このような背景の中、本研究の目的は、ユビキタスネットワーク社会実現のための超消費電力・超広帯域リング型12bitデジタル制御発振器(DCO)を開発することである。申請者が提案したリコンフィギュアラブルRFフロントエンド用リング型発振器の設計法の妥当性を検証するために、まず回路論及びVDECが提供したCADツールを利用し、transition-assistedインバータを用いたリング型電圧制御発振器を設計し、0.18um CMOSプロセスにより試作・評価を行った。その結果、1.8GHzから5.8GHzまで広幅帯域で動作できる超帯広帯域リング型発振器を開発し、位相雑音もほぼ設計値どおり、tuning range, FOM(figure of Merit)を計測することができた。超低消費電力・リコンフィギュアラブルRF回路は、ユビキタスネットワーク情報社会の実現のための、世界的に注目されているソフトウエア無線(SDR)に繋がる、最先端LSI回路の実現に不可欠である。一方、リング型VCOは、LC-VCOより1/20に小型化できるが、周波数の上昇により、消費電力は急激に増加するため、SDR用リング型VCOやDCOの例は見られない。このような背景の中、本研究の目的は、ユビキタスネットワーク社会実現のための超消費電力・超広帯域リング型12bitデジタル制御発振器(DCO)を開発することである。申請者が提案したリコンフィギュアラブルRFフロントエンド用リング型発振器の設計法の妥当性を検証するために、まず回路論及びVDECが提供したCADツールを利用し、提案したフィボナッチ数列により最適化したインバータを用いたリング型10ビットデジタル信号により整合できるDCOを設計し、さらに0.18umCMOSプロセスにより試作・評価を行った。その結果、1GHzから4.27GHzまで広幅帯域で動作できる超帯広帯域リング型DCOを開発し、位相雑音もほぼ設計値どおり、tuning range, FOM(figure of Merit)を計測することができた。申請者が提案したリコンフィギュアラブルRFフロントエンド用リング型発振器の設計法の妥当性を検証するために、まず回路論及びVDECが提供したCADツールを利用し、提案したフィボナッチ数列により最適化したインバータを用いたリング型14ビット

デジタル信号により整合できるDCOを設計し、さらに0.18um CMOSプロセスにより試作・評価を行った。その結果、1GHzから4.2GHzまで広幅帯域で動作できる超帯広帯域リング型DCOを開発し、世界最高レベルのFOM (Figure of Merit=-163dBc/Hz)のDCOの開発ができた。
手術用顕微鏡に対応した拡張現実型3Dニューロナビゲーションの開発

本研究の目的は、拡張現実技術を用いた脳神経外科手術支援システムの開発である。拡張現実は、スマートフォン等を通じて日常生活にも広く普及し、情報をわかりやすく表示する表現技術として注目されている。本研究はこの技術を脳神経外科の手術に導入し、新しい手術支援システムを構築する事を目指している。すでにタブレットを用いた拡張現実手術支援システムが完成しているが、この研究では、脳神経外科手術で重要なステージである顕微鏡を用いた手術に対しても有効に支援できるよう、顕微鏡を用いた拡張現実手術支援システムの開発を行う。本開発により脳神経外科手術の多くの段階に対応できる拡張現実手術支援システムの構築が実現する。
IL-6産生非小細胞肺癌に対するデコイ型核酸を用いた免疫遺伝子治療に関する研究

肺癌の治療成績は、診断技術ならびに治療の進歩により改善されつつある。しかし治癒切除例でも転移をきたす症例は多く、新たな転移制御法の開発が望まれる。一方肺癌の転移成立に際し、微小転移巣では免疫監視機構からの逸脱が起こるといわれている。これまで我々は肺癌細胞からIL-6(インターロイキン6)が高頻度に産生されることを明らかにし、IL-6の過剰産生から担癌宿主に腫瘍増殖促進ならびに免疫能の低下がおこり、肺癌の進行を早める可能性を指摘してきた。本研究ではIL-6により、肺癌細胞におこる遺伝子の変化ならびに腫瘍組織に浸潤する免疫担当細胞を解析することから、担癌宿主における腫瘍増殖促進機構ならびに免疫応答を解明する。また担癌宿主の免疫能を回復させ転移を制御するためにIL-6産生を抑制することが可能なデコイ型核酸をもちいた免疫遺伝子治療の実験的研究により転移制御効果と薬物動態を観察する。本計画によりIL-6により惹起される肺癌増殖促進および免疫能低下の機序を解明するとともに、IL-6制御を目的とした免疫遺伝子治療が、肺癌の転移制御に応用可能であることを示し、肺癌の治療成績の向上を目指した。本計画はIL-6により惹起される肺癌増殖促進および免疫能低下の機序を解明するとともに、IL-6制御を目的とした免疫遺伝子治療が、肺癌の転移制御に応用可能であることを示し、肺癌の治療成績の向上を目指して立案された。平成16年度は1.マイクロアレイシステムを用いたIL-6非産生肺癌細胞株(ABC-1)ならびにIL-6産生肺癌細胞株における発現遺伝子の比較と同定2.動物モデルを用いたIL-6非産生肺癌細胞株(ABC-1)ならびにIL-6産生肺癌細胞株の比較をおこない、ヒトIL-6非産生肺癌細胞株ならびにIL-6産生肺癌細胞株を、それぞれSCIDマウス、ヌードマウス、ならびに正常マウス皮下に移植し、増殖様式、Th1/Th2不均衡、腫瘍浸潤リンパ球分画などを比較することによってIL-6産生細胞がin vivoにおいてどのような影響を及ぼすか検討し報告した。今後ヒト肺癌切除組織を用いたIL-6ならびに浸潤リンパ球分画の免疫組織化学による検討ならびに血清中IL-6濃度の測定をおこない、NF_κB阻害剤(JTE-714、デコイ型核酸)ならびにアンチセンスの調整とIL-6産生腫瘍の増殖抑制効果の検討を行っていくことにより、肺癌においてIL-6が細胞傷害性T細胞の作用を抑制し,微小転移巣が増大し癌転移が形成される機序を明らかにしてゆくとともに、IL-6産生を阻害することにより肺癌の転移制御を目指す。我々は、これまで肺癌細胞はIL-6を産生し、IL-6の発現による腫瘍細胞の増殖ならびに患者血清IL-6値と臨床像との関連性を報告してきた(第43回日本肺癌学会総会、42巻、516、2002、第92回アメリカ癌学会抄録,42,874,2001)。本研究では、肺癌細胞より過剰産生されるIL-6が、宿主免疫能低下と密接な関連性があるといわれるサイトカインの不均衡をもたらし、肺癌患者の免疫能低下に重要な役割を担っているのではないかとの着想に至った。肺癌細胞からIL-6(インターロイキン6)が高頻度に産生されることを明らかにし、IL-6の過剰産生から担癌宿主に腫瘍増殖促進ならびに免疫能の低下がおこり、肺癌の進行を早める可能性を指摘した。さらにIL-6により、肺癌細胞におこる遺伝子の変化ならびに腫瘍組織に浸潤する免疫担当細胞を解析することから、担癌宿主における腫瘍増殖促進機構ならびに免疫応答の解明を目指した。また担癌宿主の免疫能を回復させ転移を制御するためにIL-6産生を抑制することが可能なデコイ型核酸をもちいた免疫遺伝子治療の実験的研究を試みた。

本計画によりIL-6により惹起される肺癌増殖促進および免疫能低下の機序を解明するとともに、IL-6制御を目的とした免疫遺伝子治療が、肺癌の転移制御に応用可能であることを示し、肺癌の治療成績の向上を目指した。
新世界ザルを用いたヒト熱帯熱マラリアモデルの開発

本年度は、昨年度確立したヒト熱帯熱マラリア(P.falciparum)リスザル感染実験系を用いた応用研究および脳性マラリアの確認のための基礎的検討を行った。1.マラリアワクチン候補SERA蛋白のヒト熱帯熱マラリア感染阻止実験:7頭のリスザルを用いて、人工合成SERA遺伝子を組み込むことによって大腸菌に大量に産生させたSERA蛋白SE47'の感染阻止能を検討した。免疫はアジュバントを用いずに、一頭あたり一回0.5mgを2週間おきに4回筋肉注射することによって行った。PBS投与対照群に比べ、ヒト熱帯熱マラリア特異的なSERA蛋白に特異的な抗体の上昇が確認できた。これら免疫リスザルでは未免疫対照ザルと比較して原虫増殖阻止が認められた。このことから、本研究で確立したリスザルin vivo感染実験系がマラリアワクチンなどの薬剤効果判定のために十分使用できることが示された。2.新世界ザル細胞接着因子の遺伝子クローニング:脳性マラリアの原因であるヒト熱帯熱マラリア由来感染赤血球表面微細突起(Knob)がリスザル毛細血管に付着する像が電顕で観察された。これがヒトで言われるような細胞接着因子によるか否かを検討する目的で、その付着部位が最も検討されているICAM-1のcDNAをリスザルおよびマ-モセットのmitogen刺激脾T細胞より作製したcDNA libraryからヒトICAM-1 cDNAをプローブとしてクローニングを試みた。その結果、部分的であるが各々のcDNAを得ることができた。現在、それら塩基配列を決定中である。3.新世界ザル細胞抗原特異的モノクローナル抗体(MoAb)の作製:新世界ザル赤血球およびリンパ球に対するMoAbの作製を試みた。リスザル赤血球に対するMoAbは現在まで得られていないが、マ-モセット末梢リンパ球に特異的な8種のMoAbが得られた。そのうちの2種はリスザルに交差することが確認されており、特にクローンMS7A4はヒト、カニクイザルとは交差せず、マ-モセットとリスザル末梢Tリンパ球にのみ反応することがわかっている。ヒト熱帯熱マラリアの症状の中でも重要視される脳性マラリアのための新世界ザル実験モデルの作製を目的に研究を行い、本年度は以下の結果を得ることができた。1.感染実験室の整備:新世界ザルへの感染実験のために、サル飼育ケージ8を収納可能な安全キャビネットを設置した、前室を保有する室内陰圧の感染実験室を整備した。2.in vivo感染実験:ヒト熱帯熱マラリア原虫に感受性が高いと考えられているポリビア産リスザル(東大医科研奄美病害動物研究施設より供給)およびコモンマーモセット(実中研より供給)に摘脾または未摘脾の状態でCDC由来P.falciparum Indochina-I株およびGeneve株を感染させ、その後の新世界ザルの血液生化学的、病理学的検索を行った。その結果、摘脾の有無にかかわらず、マーモセットでは感染が認めれなかったが、リスザルでは全頭感染が成立した。そのリスザルでは、感染後13週で感染赤血球が血中に認められ、最大感染赤血球比は十数%となった。感染後に大きな臨床所見は認められなかったものの、血液学および血液生化学的には一般にヒトで認められるRBC、Ht、HGの低下および肝機能低下を示唆するGPT、gamma-GTPの低下が認められた。病理像では、心、肺、腎、胸腺で変化が認められ、特に電顕像で心筋毛細血管内の感染赤血球表面にP.falciparumに特有な微細突起(Knob)が確認された。しかしながら、現在のところ典型的な脳性マラリアの症状を呈するリスザルは観察されていない。今後、さらに他原虫株を検討する必要がある。in vitro感染および赤血球接着性試験:上記実験に用いた2株のin vitro培養系を確立し、特にGeneve株を用いて、細胞接着因子を発現するヒト黒肉腫細胞株C32に接着性をもつ原虫クローンを選別した。モノクローナル抗体の作出:感染性を有するリスザル赤血球に対するHybridomaを作製し、現在クローン化中。

これがヒトで言われるような細胞接着因子によるか否かを検討する目的で、その付着部位が最も検討されているICAM-1のcDNAをリスザルおよびマ-モセットのmitogen刺激脾T細胞より作製したcDNA libraryからヒトICAM-1 cDNAをプローブとしてクローニングを試みた。その結果、部分的であるが各々のcDNAを得ることができた。現在、それら塩基配列を決定中である。3.新世界ザル細胞抗原特異的モノクローナル抗体(MoAb)の作製:新世界ザル赤血球およびリンパ球に対するMoAbの作製を試みた。リスザル赤血球に対するMoAbは現在まで得られていないが、マ-モセット末梢リンパ球に特異的な8種のMoAbが得られた。そのうちの2種はリスザルに交差することが確認されており、特にクローンMS7A4はヒト、カニクイザルとは交差せず、マ-モセットとリスザル末梢Tリンパ球にのみ反応することがわかっている。
ゲームの勝ち・負けに伴う情動とサル前頭連合野神経細胞活動

我々は日常生活において、コンテスト、スポーツ、ビジネスなど他人と競争しなければならない場面に遭遇する。そして、それらの競争に勝てば喜びを、負ければくやしさを感じるといったように、競争場面はしばしば我々に情動を引き起こす。また同じ報酬であっても、競争で相手に勝って得た場合と競争なしで単に得た場合では感じ方が違う。通常、前者の場合のほうがより大きな喜びを感じるだろう。逆に、単に報酬がもらえないときよりも、競争で負けて報酬がもらえないときのほうがフラストレーションを強く感じる。つまり、競争場面であるか、そうでないかによって、我々の物事に対する感じ方には違いが出てくる。このように競争に勝ったり負けたりすることは我々に様々な情動を引き起こすとともに、その競争場面は我々の認知様式に影響を与える。したがって、競争場面と非競争場面では、行動および脳活動に様々な違いがあると推定できる。我々はニホンザルに対戦ゲームをするように訓練し、ゲームで勝ったり負けたりしたときの行動および神経細胞活動を調べてきた。その結果、サルは競争時に動機づけが高まること、さらに前頭連合野の神経細胞は同じ報酬であっても競争に勝って得た報酬かどうかによって異なる活動を示すことを見出した。しかし、これまでの実験では、競争に勝てば必ず報酬が与えられたため、「競争に勝つこと」と「報酬をもらう」に対して前頭連合野の神経細胞がどのような活動を示すのかということを別々に調べることができなかった。この問題を解決するため、我々は「競争における勝ち・負け」と「報酬のあり・なし」を分離した課題を導入することにした。本年度(平成23年度)は必要なデータをすべて記録し、そのデータの解析を済ませた。得られたデータを論文としてまとめ国際的なジャーナルに投稿した(今現在審査中)。本年度(平成21年度)はその新しい課題においてサルの行動訓練を完了し、神経細胞活動の記録を開始することができた。本年度(平成22年度)はその新しい課題において神経細胞活動の記録を完了し、結果の一部を北米神経科学大会で発表した。

通常、前者の場合のほうがより大きな喜びを感じるだろう。逆に、単に報酬がもらえないときよりも、競争で負けて報酬がもらえないときのほうがフラストレーションを強く感じる。つまり、競争場面であるか、そうでないかによって、我々の物事に対する感じ方には違いが出てくる。このように競争に勝ったり負けたりすることは我々に様々な情動を引き起こすとともに、その競争場面は我々の認知様式に影響を与える。したがって、競争場面と非競争場面では、行動および脳活動に様々な違いがあると推定できる。我々はニホンザルに対戦ゲームをするように訓練し、ゲームで勝ったり負けたりしたときの行動および神経細胞活動を調べてきた。その結果、サルは競争時に動機づけが高まること、さらに前頭連合野の神経細胞は同じ報酬であっても競争に勝って得た報酬かどうかによって異なる活動を示すことを見出した。しかし、これまでの実験では、競争に勝てば必ず報酬が与えられたため、「競争に勝つこと」と「報酬をもらう」に対して前頭連合野の神経細胞がどのような活動を示すのかということを別々に調べることができなかった。この問題を解決するため、我々は「競争における勝ち・負け」と「報酬のあり・なし」を分離した課題を導入することにした。本年度(平成23年度)は必要なデータをすべて記録し、そのデータの解析を済ませた。得られたデータを論文としてまとめ国際的なジャーナルに投稿した(今現在審査中)。
RNAiによるユーイング肉腫、横紋筋肉腫のキメラ遺伝子を標的とした遺伝子治療

本年度は主にEWS/Fli1をKeyとしたシグナル伝達を解析した。PDGF刺激によりEwing肉腫細胞株TC135内のERK、Akt、p70S6Kのリン酸化と、PLDの活性が有意に増加した。それぞれの蛋白に特異的な阻害剤を添加することにより、蛋白のリン酸化は独立的に抑制され、各シグナル経路は独立した経路であることが判明した。それに伴い腫瘍細胞の増殖も有意に抑制された。次にsiRNAでEWS/Fli1の発現を抑制することにより、各シグナル経路は抑制され、PLD活性も低下し、細胞増殖も抑制された。またPDGF刺激によるERK、Akt、p70S6Kの活性化は1-butanolによりPLD活性を抑制することによって著明に低下した。さらにPLDに対するsiRNAを導入してPLDの発現を抑制した際にも同様の結果が得られた。これらの結果は、Ews/Fli1がPLD2を介したERK、Akt、p70S6Kなどの細胞増殖シグナル分子の活性化に深く関与していることを示している。Ewing肉腫において、これらの分子を標的とした治療の展望が開ける可能性があると思われた。これらのデータをJ.Biol.Chem.に発表した。また同時にEWS/ATF1に対する研究も行った。すなわちEWS/ATF1をsiRNAで抑制すると、BLCAPの発現が増加することが判明した。BLCAPは泌尿器領域の癌の抑制遺伝子候補として発見された分子であるが、これが明細胞肉腫の腫瘍発生にも関与していることが示唆された。現在これらのデータを投稿中である。RNAi(RNA interference)はRNAを細胞内に導入したとき、それと同じ配列を持った遺伝子の発現が抑制される現象である。平成15年度は骨軟部腫瘍の癌遺伝子を標的としたRNAiによる治療の可能性を探る目的で研究を行った。まずユーイング肉腫に発現するEWS/Fli-1キメラ遺伝子に対するRNAiを作成し、in vitroでキメラ遺伝子の発現を抑制するか否か検討した。発現はRT-PCRで確認した。8種類のRNAiを作成し発現ベクターにクローニング後、それぞれユーイング肉腫細胞にトランスフェクションしたところ、発現抑制が著明な2種類のRNAiを得ることができた。これを用いて細胞増殖抑制能を検討した結果、約60%の抑制効果を認めた。またその際、EWS/Fli-1の標的遺伝子と考えられているc-Mycの発現は1025%減少していた。さらにtelomerase reverse transcriptaseの発現と、telomerase活性も著明に減少していた。これらの結果はRNAiによるユーイング肉腫の治療の可能性を示唆するものと考える。また、ユーイング肉腫細胞の分化とEWS/Fli-1遺伝子の関係についても検討した。ユーイング肉腫はある条件下で神経分化を示すことが知られていたが、EWS/Fli-1との関連は不明であった。ユーイング肉腫を分化誘導してもEWS/Fli-1の発現に変化はなく、EWS/Fli-1を強発現させた神経細胞においては分化能に変化をきたさなかった。しかし、EWS/Fli-1発現を抑制すると分化が抑制され、NGFレセプターであるTrkAの発現が抑制された。すなわち、EWS/Fli-1はユーイング肉腫の造腫瘍性に関与するのみでなく神経分化に関しても重要な働きをしていると思われた。本年我々はEWS/FlilをKeyとしたシグナル伝達を解析した。特にこれまで行ってきたPLD, ERK, Aktなど細胞増殖に重要な役割をしている分子との関連を中心に研究を進めた。興味深いことにPDGF刺激によるPLD2活性の増大はsiRNAでEWS/Flilを抑制することにより著明に低下した。またPLDに対するsiRNAを合成し、ユーイング肉腫細胞に導入したところp70S6Kのリン酸化とcyclinD3などの発現が減少した。またPDGF刺激による,ERK、Akt, p70S6Kの活性化は1-butanolを添加してPLD活性を抑制することによって著明に減少した。これらの結果はEWS/FlilがPLD2を介したERK、Akt、p70S6Kなど細胞増殖シグナルに関与している蛋白の活性化に深く関与していることを示している。ユーイング肉腫において、これらの分子を標的とした治療の展望が開ける可能性がある。現在これらのデータをまとめ投稿中である。

またPDGF刺激によるERK、Akt、p70S6Kの活性化は1-butanolによりPLD活性を抑制することによって著明に低下した。さらにPLDに対するsiRNAを導入してPLDの発現を抑制した際にも同様の結果が得られた。これらの結果は、Ews/Fli1がPLD2を介したERK、Akt、p70S6Kなどの細胞増殖シグナル分子の活性化に深く関与していることを示している。Ewing肉腫において、これらの分子を標的とした治療の展望が開ける可能性があると思われた。これらのデータをJ.Biol.Chem.に発表した。また同時にEWS/ATF1に対する研究も行った。すなわちEWS/ATF1をsiRNAで抑制すると、BLCAPの発現が増加することが判明した。BLCAPは泌尿器領域の癌の抑制遺伝子候補として発見された分子であるが、これが明細胞肉腫の腫瘍発生にも関与していることが示唆された。現在これらのデータを投稿中である。
ＴＬＲ経路による角膜内皮機能抑制機構の解明

角膜内皮感染における代表的な病原体である単純ヘルペスウイルス(HSV)感染後の角膜内皮のトランスクリプトームは、インターフェロン応答、感染に対するパターン認識レセプター応答を主体とし、TLR9刺激は、Indoleamine 2,3-deoxygenase 1 (IDO1)を介した調節性T細胞の誘導機能により、感染内皮を破壊から保護する役割をもつことが示唆された。また、障害物質応答にかかわる重要候補レセプターとしてRAGEも発現し、RAGEも内皮における微生物認識機構に寄与していることが判明しつつある。角膜内皮が、炎症刺激に対していかなる分子応答を示すかを検討するため、炎症応答性レセプターを介した応答性を検討した。炎症応答機序は、感染性病原体に対する応答、さらに内因性の炎症性物質に対する応答に大別され,それぞれのリガンドは、Pathogen associated molecular pattern (PAMP)および、Damage associated molecular pattern (DAMP)に大別される。とくにPAMPに対する応答を検証した場合、角膜内皮はToll like receptor (TLR)のリガンドに対してIL-6やインターフェロン応答を誘導した。TLRの中では、角膜内皮は恒常的にTLR9を強く発現しており、各種細菌やウイルスに含まれる非メチル化DNAを認識する。また、DAMPにかかわる重要候補レセプターとしてRAGEがある。これまでRAGEはAdvanced glycosylation end productsのレセプターとしてしられてきたが、RAGEも内皮における微生物認識機構に寄与していることが判明した。角膜内皮感染における代表的な病原体である単純ヘルペスウイルス(HSV)感染後の角膜内皮のトランスクリプトームを用いて主たるカスケードを解析した結果、インターフェロン応答、感染に対するpattern recognition receptor(PRR)応答が主体であった。とくに発現上位の遺伝子においてIndoleamine 2,3-deoxygenase 1 (IDO1)が特徴的に誘導されており、以前認識された抗ウイルス作用というよりもむしろ、調節性T細胞の誘導機能を認め、その免疫調節機能は、感染内皮を破壊から保護する役割をもつことが示唆された。TLRの中では、角膜内皮は恒常的にTLR9を強く発現している。TLR9は、各種細菌やウイルスに含まれる非メチル化DNAに対するレセプターであり、これらの病原体を認識する機能がある。角膜内皮感染における代表的な病原体としては単純ヘルペスウイルス(HSV)が知られている。そこでHSV感染後の角膜内皮のトランスクリプトームを用いて主たるカスケードを解析した結果、インターフェロン応答、感染に対するpattern recognition receptor(PRR)応答が主体であり、これは、IL-29, IRF7などにより制御されている可能性がうかびあがってきた。とくに発現上位の遺伝子においてストレス応答タンパク群に加え、Indoleamine 2,3-deoxygenase 1 (IDO1)が特徴的に誘導されていた。IDO1の機能を抗ウイルス作用、免疫調節作用の両面から検証した結果、IDO1には抗ウイルス作用は認めず、調節性T細胞の誘導機能を認め、感染内皮を自己破壊から守る機能があることが判明した。PRRによるIDO1発現機構を検討した結果、TLR9およびTLR3経路による刺激が主体であることが判明した。角膜内皮の感染応答転写プロファイルを用いてbioinformatics手法による解析に着手した。感染応答刺激として単純ヘルペスウイルス感染を用いてグローバルな転写応答を包括的に提示することができた。転写応答制御にかかわる候補因子群を抽出し、このなかから代表的な因子としてIDO1の機能解析、さらにその制御機構に関する解析を行った。IDO1の機能解析の結果、IDO1は、感染応答制御因子の中でもっとも主要な因子である可能性が視された。とくに機能解析の中で、角膜内皮が獲得免疫系をいかに調節するかに関して、角膜内皮を抗原提示細胞として使用するアッセイ系を構築した。このアッセイ系によりIDO1が調節性Tリンパ球を末梢性に誘導することを示すことができた。IDO1の誘導経路を検索した結果、TLR3,TLR9といったPAMPに関連するレセプターにくわえ、細胞障害や加齢産物を認識するDAMPに関連するレセプターの中、RAGEも関与することを見いだした。これまでRAGEはAdvanced glycosylation end productsのレセプターとしてしられていたが、角膜における炎症応答に関してはその関与は未知である。そこで、これらが、角膜内皮の炎症応答をいかに制御しているのかの検証をしつつある。

角膜内皮における制御因子として重要と想定されるIDO1の発現調節機構についてさらに検証を進める。次に、角膜内皮感染にとって重要な病原体であるサイトメガロウイルスと角膜内皮の関連性に関して検証を進めていく。まず、CMVが内皮に感染しえるかにくわえ、感染しえるなら、その感染に関して利用されるPAMPあるいはDAMPにかかわるレセプター群を明らかにする。とくにCMV感染応答をグローバルに理解するため転写応答プロフィールをHSVと同様なbioinformatics手法を用いて解析をおこなっていく。とくに、CMV感染が角膜内皮を介してひきおこす炎症応答をひとつの病態モデルとして理解するためDAMP,あるいはPAMPに対する応答面から明らかにしていき、内皮の炎症応答反応の一般化を試みる。DAMPにかかわる重要候補レセプターとしてRAGEがあるが、これまでRAGEはAdvanced glycosylation end productsのレセプターとしてしられてきた。しかし、これまでの我々の結果から、RAGE自体も積極的な感染応答の制御機構の一員になりえる可能性が判明しつつある。このためその詳細をあきらからにし、DAMP, PAMPのクロストークにかかわる機構をあきらかにしていく。これまでの解析により明らかとなってきた内皮の炎症応答における主要制御因子の役割の詳細をさらに検証していく。PRRにより惹起されるインターフェロン応答あるいはNF-κB経路の役割の詳細を解析するためWestern blot、転写因子スクリーニングアッセイ、Enzyme mobility shift assay(EMSA)、レポータープラスミドのtransfectionによるルシフェラーゼを指標としたプロモーター活性測定を行い、RNAi、モルフォリノオリゴ、抗体投与による阻害およびシグナル分子の過剰発現系により検討する。抗原特異的T細胞lineは, IL-2の存在下で抗原とともにperipheral blood mononuclear cellを2週間培養して作成する。調節性T細胞の誘導性に関してT細胞サブセット特異的転写因子を指標にFACSを用いて検索する。さらに、抗原特異的Th1, Th2, Th17サイトカイン分泌に関してもFACSにより解析を行う。さらに主要制御因子の役割の詳細をin vivoで明らかにし、臨床応用への礎をつくっていく。特に標的となりうる重要なシグナル分子を遺伝子改変マウスあるいは、特異的阻害剤投与などの手法によりvivoでの寄与を明らかにする。
大腸癌の発癌や進展に深く関与しうる長鎖ｎｃＲＮＡの量的・質的な異常の探索

本研究は内視鏡によって得られる臨床検体を分子レベルで統合的・包括的に解析することにより、大腸癌において重要な役割を果たす長鎖ncRNAの量的・質的な異常を同定することを目的とした。これまでに20検体以上のヒストン修飾に関するChIPSeqデータを収集し、さらに公共データベースが提供するオミックスデータを用いて統合解析を行い、大腸癌において普遍的にDNAメチル化により不活性化している長鎖ncRNAや、癌で高発現しており発癌に関与しうる長鎖ncRNAを同定できた。また多数の臨床検体でのメチル化や発現状態の確認、さらに癌細胞株を用いた実験により、それら長鎖ncRNAが細胞に及ぼす影響を明らかにした。まず初めに微量の臨床検体から質の高い再現性のある結果を得るべく、検体からの細胞分離の方法並びに次世代シークエンサー(SOLiD4)を用いたChIPSeq法のプロトコールの各段階を詳細に検討し、最適化を行った。この改良したプロトコールを用いることで、1x10^5個の細胞、1ng程度のChIP-DNAからChIPSeq法を施行し、安定した結果が得られることを確認した。次に実際に大腸内視鏡検体と癌細胞株の約30検体でピストン修飾(H3K4me3,K27me3)に対するChIPSeq実験を施行し、これらのChIPSeqデータを用いてサンプル間での比較解析を試みた。ヒストンH3K4me3を認める長鎖ncTNAの79割はサンプル間で共通していたが、一部検体特異的にK4me3を認める長鎖ncRNAがあり、これらは何らかの病的意義があると考えられた。この解析を元に、大腸癌検体において特異的に活性化している長鎖ncRNAや、DNAメチル化により不活性化されている長鎖ncRNAの候補リストを作成した。大腸癌検体でDNAメチル化により抑制されている長鎖ncRNAに関しては、更に多くの臨床検体でメチル化のスクリーニングを行い、少なくとも二つの長鎖ncRNAに関しては多くの癌検体でメチル化を認めることを確認した。これらは癌抑制的な機能を有している可能性があり、現在その機能について細胞株を用いた機能的実験を試みている段階である。初年度に引き続き大腸内視鏡検体を用いたChIPSeq実験を行い、背景粘膜と癌部のヒストン修飾プロファイル(H3K4me3, H3K27me3)を取得し、サンプル間での比較解析を行った。更に近年充実が著しいTCGAやENCODEプロジェクト等の公共データベースを最大限に活用し、RNASeqやメチル化データの統合解析を試みた。それらの解析により、大腸癌において普遍的にDNAメチル化により不活性化している領域群を同定し、そこに存在するいくつかの長鎖ncRNAに着目して更なる解析を進めた。多数の臨床検体でメチル化や発現状態の確認を行うとともに、癌細胞株を用いた分子細胞生物学的な実験により、それら長鎖ncRNAが細胞に及ぼす影響を検証し、その生理的・病理的意義を解明するべく検討を進めている。また長鎖ncRNAの質的異常を検索する目的で、新学術領域「ゲノム支援」の支援を頂き、長鎖ncRNA領域を含む全エキソン解析を50検体で施行し、癌患者において変異を認める長鎖ncRNAのリストを作成した。現在、自施設の多数の臨床サンプルにおけるそれらの変異の出現頻度や臨床的特徴との関連の検証を進めている。また更にゲノム支援の支援により、大腸の癌部・非癌部の32検体のRNASeqを施行し、長鎖ncRNAの融合遺伝子の有無につき検索を進めている段階である。本研究課題は内視鏡によって得られる臨床検体を、次世代シークエンサーを用いて分子レベルで統合的・包括的に解析することにより、大腸癌において重要な役割を果たす長鎖非コードRNA(ncRNA)の量的・質的な異常を同定することを最終的な目的とした。初めに微量な内視鏡検体を次世代シークエンサーで解析するための基盤技術を確立した。これまでに大腸内視鏡検体39検体のヒストン修飾に関するChIPSeqデータ(H3K4me3, H3K27me3)を収集した。さらにTCGAやENCODEプロジェクト等の公共データベースが提供するRNASeqやメチル化データを用いて統合解析を行い、大腸癌において特異的に活性化・不活性化している長鎖ncRNAのリストを作成した。それらに関して多数の臨床検体でメチル化や発現状態の確認を行った。さらに癌細胞株を用いた分子細胞生物学的な実験により、それら長鎖ncRNAが細胞に及ぼす影響を検証した。これらの一連の解析により、大腸癌において普遍的にDNAメチル化により不活性化している長鎖ncRNAや、癌で高発現しており発癌に関与しうる長鎖ncRNAを同定できた。

いくつかの候補に関しては、より多くの臨床検体を用いた検証作業を行い、ある一定の頻度で変異を認めることを確認した。当初の計画通り大腸癌検体の各種分子プロファイリング(ChIPSeq, ExomeSeq, RNASeq)を施行し、更に公共データベースを最大限に活用し、詳細な統合解析を行った。癌における長鎖ncRNAの量的・質的異常の検索という視点から、候補となる長鎖ncRNAのリストを作成し、現在その中のいくつかの候補に関しては、検証作業と機能的な解析の段階に入ることができている。これまでに大腸癌でのみ活性化している長鎖ncRNAや、癌において不活性化していると思われる長鎖ncRNAの候補を同定してきた。本年度はsiRNA実験とMTTアッセイを組み合わせて、癌細胞株においてこれらの候補ncRNAの発現をノックダウンさせた時に細胞増殖に与える影響を測定し、機能的に重要と思われる長鎖ncRNA候補を絞り込む。上記スクリーニングで絞り込まれた長鎖ncRNA候補に関して、siRNAによるノックダウン、あるいは発現ベクターによる遺伝子導入を行い、それが細胞に与える影響を各種アッセイにより検証する。その際の遺伝子発現全体の変化をマイクロアレイにより解析する。またRNA-FISHによる長鎖ncRNAの細胞内局在を確認し、その情報を基にRNA-pull down法を用いて長鎖ncRNAと結合するタンパク質の同定を試みる。上記において同定し絞り込まれた長鎖ncRNAのリストに対し、多数の内視鏡臨床検体(DNAとRNA)を用いて、TaqMan-qPCRによる発現量の検討やpyrosequencingによるプロモーター部のDNAメチル化の定量等を施行する。また長鎖ncRNAの質的異常のスクリーニングとして新学術領域「ゲノム支援」事業の支援を得て、lincRNAを含む全エキソンシークエンスを50検体で、RNASeqを32検体で施行した。現在そのデータ解析を詳細に行い、多検体による検証を始めているが、今年度は候補となるlincRNAの突然変異を絞り込み、第3世代シークエンサー(IonPGM)を活用して多サンプルの多領域を同時に検証することを試みる。高頻度で突然変異を認めるlincRNAに関しては、細胞株を用いて分子細胞生物学的手法による機能的解析を行う。26年度が最終年度であるため、記入しない。分子生物学本年度にシークエンス解析を施行した検体数が当初の予定よりも少なく、かつ予定よりも低コストで施行できたため、助成金の一部に未使用額が生じた。初年度の目標である「大腸内視鏡の生検検体を用いたChlPSeq実験のワークフロー構築」はほぼ達成し、現在までにヒストン修飾に対するChIPSeqを約30検体で施行し、安定した結果を得ている。K36me3に対するChIPSeqやRNASeqは施行できていない。また当初の計画通り、インフォマティクスと公共データを用いた統合解析を試みており、癌において特異的に活性化・不活性化している長鎖ncRNA候補を同定することができた。次年度はその助成金と合わせ、細胞モデルを用いた機能的な実験や臨床検体での検証実験に必要な各種試薬類の購入に使用する。
がん間質での特異的免疫応答に着目した新規口腔粘膜炎治療の開発

平成30年度は研究計画に従い、口腔癌由来がん関連線維芽細胞モデルを用いて、研究を行った。前年度の解析の結果、歯肉線維芽細胞と口腔癌由来がん関連線維芽細胞モデルを比較すると、がん関連線維芽細胞は特異的な免疫機序を有していることが分かったため、さらに腫瘍免疫関連の解析を行った。その結果、腫瘍細胞がT細胞の活性を低下させるをPD-L1(programmed cell death-1)のmRNA発現が口腔癌細胞よりも口腔癌細胞から誘導されたがん関連線維芽細胞のほうが優位に高発現していることがわかった。また、腫瘍細胞がNK細胞と細胞障害性T細胞を活性化するMICA(クラスI鎖関連タンパク質A)のmRNAも同様に口腔癌細胞よりもがん関連線維芽細胞で優位に高発現していることがわかった。また、MMP-1(matrix metalloproteinase 1)も歯肉線維芽細胞と比較し、がん関連線維芽細胞で高発現していることが分かった。昨年の研究結果より、がん関連線維芽細胞ではCOX-2,VEGF(血管内皮細胞増殖因子)が歯肉線維芽細胞と比較し高発現していることから、以上の結果を踏まえるとがん関連線維芽細胞はがん細胞と比較し、癌の浸潤・転移に関わる腫瘍免疫において重要な役割を担っていることが推察された。口腔癌由来のがん関連線維芽細胞モデルをもちいて、口腔粘膜炎における初期免疫応答能における役割のみならず、腫瘍浸潤・転移についても今後の研究で行っていきたいと考えており、平成31年度も研究を進めていく予定である。腫瘍免疫学的な研究は進められたが、口腔粘膜炎に関する研究が遅れたため。研究計画に従い、研究を進める予定である。平成30年度の研究結果に加え、口腔粘膜炎に関する基礎的研究の側面も進めていきたい。平成29年度は研究計画に従い、各種口腔がん由来がん関連線維芽細胞モデルの確立とRIG-I、TLR-3,4発現、サイトカインの発現について研究を施行した。1各種口腔癌由来がん関連線維芽細胞モデルの確立:歯肉癌(Ca9-22)と舌癌(HSC-3)由来の細胞株を使用した。口腔癌細胞と歯肉線維芽細胞をそれぞれ培養ディッシュで培養した後に、共培養ディッシュを用いて、共培養を施行、mRNAを抽出しcDNAを作成後にRT-PCRを施行した。2各種口腔癌由来がん関連線維芽細胞のRIG-IとTLR-3発現について:口腔癌細胞とがん関連線維芽細胞を比較したところ、TLR3の発現はがん関連線維芽細胞で低い傾向にある一方、RIG-Iではがん関連線維芽細胞で高い傾向にあった。また、これは口腔がん細胞の由来によっても差が認められた。3サイトカイン等の発現について:1と2の結果により、これらの初期免疫応答の違いがどの様なサイトカインの発現につながるかを検討した。主要な炎症性サイトカインであるIL-6やIL-8は口腔癌細胞では発現が低い傾向にあるも、がん関連線維芽細胞では発現が高い傾向にあった。また、正常歯肉線維芽細胞と比較し、がん関連線維芽細胞ではCOX-2,VEGF(血管内皮細胞増殖因子)が発現が上昇している傾向にあった。このことより、がん関連線維芽細胞は歯肉線維芽細胞と比較し特異的な免疫機序を有していることが示唆された。この結果をもとに、研究計画に従い、平成30年度も進めていく予定である。研究計画に従い、がん関連線維芽細胞モデルの確立を行い、TLRs、RIG-Iや炎症性サイトカインの発現についても検討を進められているため平成30年度は研究計画に従い、口腔癌由来がん関連線維芽細胞モデルを用いて、研究を行った。昨年度の研究でがん関連線維芽細胞が特異的な免疫応答能有していることが示唆されている。そのため、口腔粘膜炎のみならず、がん免疫についても検討していきたいと考えている。

研究計画に従い、研究を進める予定である。平成30年度の研究結果に加え、口腔粘膜炎に関する基礎的研究の側面も進めていきたい。研究費を厳密に調整の上、執行していたため、次年度使用額が生じた。次年度の物品費や研究成果報告のための旅費に使用する予定である。
アナンダミド加水分解酵素の酵素学的および分子生物学的研究

アナンダミド加水分解酵素は,カンナビノイド受容体の内因性リガンドとして発見されたアナンダミド(N-アラキドノイルエタノールアミン)をアラキドン酸とエタノールアミンに加水分解して,その生物活性を消失させるアミダーゼである。本研究において,ラット肝由来の同酵素のcDNAを用いてバキュロウイルス昆虫細胞発現系で組換え酵素を大量に発現させ,高度に精製した。精製酵素を用いて同酵素の触媒するアナンダミド加水分解反応の可逆性を証明するとともに,反応の平衡定数を決定した。また,ブタの脳から同酵素のcDNAをクローニングした。この酵素が属するアミダーゼ・ファミリーでよく保存されているいくつかのアミノ酸残基を,部位特異的変異法でアラニン等に置換したところ,いずれの変異体も活性がほぼ消失または著しく低下した。さらに,ヒト巨核芽球系白血病細胞(CMK)にアナンダミド水解活性を見出した。この反応を触媒する酵素は,界面活性剤を用いずに凍結融解のみで膜から可溶化されること,反応の至適pHが約5であること,セリン水解酵素阻害剤による阻害効果が弱いこと,ジチオトレイトールによって活性化されること,およびアナンダミドよりもN-パルミトイルエタノールアミンを良い基質とすることから,既知の酵素とは異なるアイソザイムと考えられた。同様の性質を示す酵素の臓器分布をラットで検討したところ,肺で最も強い活性が認められ,次いで脾臓,胸腺,小腸などの順で検出された。界面活性剤のTween20が酵素を強く阻害したのに対し,Triton X-100は活性を最大で7倍高めた。肺から酵素を高度に精製した結果,SDS電気泳動で分子量31kDaに相当する位置に主要なバンドが認められた。精製酵素を種々のN-アシルエタノールアミンと反応させたところ,N-パルミトイルエタノールアミンを最も効率良く水解した。アナンダミド加水分解酵素は,カンナビノイド受容体の内因性アゴニストとして発見されたアナンダミド(N-アラキドノイルエタノールアミン)をアラキドン酸とエタノールアミンに水解して,その生物活性を失わせるアミダーゼである。ラット肝由来の同酵素のcDNAを用いてバキュロウイルス昆虫細胞発現系で組換え酵素を大量に発現させ,高度に精製した。この精製酵素を用いて同酵素の触媒するアナンダミド加水分解反応の可逆性を証明するとともに,反応の平衡定数を決定した。また,ブタ脳から同酵素のcDNAをクローニングした。ラット・マウス・ヒトの酵素とのアミノ酸の同一性はそれぞれ81,80,85%であった。ブタの組換え酵素はラットの酵素と同様に,アナンダミドに加えてオレアミド(内因性催眠誘導物質),2-アラキドノイルグリセロール(カンナビノイド受容体のもうひとつの内因性アゴニスト)およびアラキドン酸のメチルエステルを加水分解した。この酵素が属するアミダーゼ・ファミリーでよく保存されているいくつかのアミノ酸残基を,部位特異的変異法でアラニン等に置換したところ,いずれの変異体も上記すべての基質に対する加水分解反応が,ほぼ消失もしくは著しく低下した。一方,ヒト巨核芽球系白血病細胞(CMK)に見出されたアナンダミドに対する加水分解酵素は,至適pHが酸性であること,ジチオトレイトールによって活性化されること,既知の酵素に対する阻害剤のフッ化フェニルメチルスルホニルやメチルアラキドニルフルオロホスホネートによってほとんど阻害されないこと等から,既知の酵素とは異なるアイソザイムであると考えられた。アナンダミド

加水分解酵素は,カンナビノイド受容体の内因性リガンドとして発見されたアナンダミド(N-アラキドノイルエタノールアミン)をアラキドン酸とエタノールアミンに加水分解して,その生物活性を消失させるアミダーゼである。分子量63kDaの膜蛋白であり,至適pHが9付近にあり,フッ化フェニルメチルスルホニルやメチルアラキドニルフルオロホスホネートのようなセリン水解酵素阻害剤によって強く阻害される。本研究において,ヒト巨核芽球系白血病細胞(CMK)にアナンダミド水解活性を見出した。この反応を触媒する酵素は,界面活性剤を用いずに凍結融解のみで膜から可溶化されること,至適pHが約5であること,セリン水解酵素阻害剤による阻害効果が弱いこと,ジチオトレイトールによって活性化されること,およびアナンダミドよりもN-パルミトイルエタノールアミンを良い基質とすることから,既知の酵素とは異なるアイソザイムと考えられた。同様の性質を示す酵素の臓器分布をラットで検討したところ,肺で最も強い活性が認められ,次いで脾臓,胸腺,小腸などの順で検出された。界面活性剤が肺の酵素に及ぼす影響を調べたところ,Tween 20が強い阻害作用を示したのに対し,Triton X-100は活性を最大で7倍高めた。各種クロマトグラフィー等を用いて肺の12,000xg沈渣から酵素を精製した結果,SDS電気泳動で分子量31kDaに相当する位置に主要なバンドが認められた。精製酵素を0.1% TriotnX-100の存在下で種々のN-アシルエタノールアミンと反応させたところ,N-パルミトイルエタノールアミンを最も効率良く水解した。以上の結果から,既知のアナンダミド加水分解酵素と区別されるN-アシルエタノールアミン水解酵素が動物組織に存在することが明らかになった。
洪水氾濫計算とインテリジェント画像処理を融合した洪水時の住民避難システムの構築

洪水氾濫のソフト対策として、洪水氾濫計算の高度化と画像処理技法を融合した住民の避難システムを構築のための要素技術を確立した。洪水氾濫計算の高度化として堤防の崩壊過程を考慮できる計算技法を新しく提案するとともに、河川水の上昇をリアルタイムにモニタリングできる画像処理システムを開発した。住民の避難行動の解析にはマルチエージェントシミュレータを用いて避難状況を視覚的に表現した。平成19年度(初年度)においては、河川における水位抽出のためのアルゴリズムを現場に設置したカメラに応用した。この結果、水位を自動で計測しかつその情報を送信する手法について実地に検証を行った。洪水氾濫計算については、並列処理による高速化の検討を行い、並列化による高速化の効率が予想とほぼ同程度であることが分かった。また、洪水氾濫計算の高度化のため、土砂の輸送を洪水氾濫計算に付加する手法を検討し、実河川に適用した。特に洪水頻発地帯と言える、ミャンマーの中小都市河川を対象とした検討を行い、河川流からの土砂の供給、河床や平地の地盤からの土砂の生成(resuspension)や土砂の沈降(deposition)による地形変化も含めて計算を行った。この結果は本学大学院生の修士論文として公表を行った。さらに平成16年度に発生した新潟中越地区(刈谷田川)の洪水氾濫にも適用し、その妥当性について検討を行った。洪水による土砂の輸送はボランティア活動等の初動で必ず重要な位置づけとなることが確認されている。また、本システムの有効性を検討するために平成20年度には都市河川の周辺での住民アンケート調査を実施する予定であり、そのために必要なアンケートの構造や実施方法等を専門家と相談して検討を行った。都市域において地球温暖化に起因すると思われる水害の危険性は増加していると考えられる。その対策として河川改修などのハード面の他に情報技術によるソフト的な対策が重要である。災害をソフト面で捉える場合、1.数値シミュレーション技法の発展、2.河川のリアルタイムモニタリングシステムの開発、3.現地への通報とそれに対する市民自身による対応、の3つが挙げられる。これらに対応して本研究では、洪水氾濫シミュレーションの高度化として堤防の崩壊過程を考慮できる計算技法を新しく提案した。このモデルは河川水位が上昇して堤防天端上を越水した場合、それに応じて堤防上から浸食が進行し堤防の破壊に至るというモデルある。これを新潟福島豪雨災害(平成16年)の刈谷田川に適用して妥当性を検討した。また、河川水の上昇をリアルタイムにモニタリングできる画像処理システムを開発した。これは太陽光の自然エネルギーを利用した自立式インテリジェント画像処理システムであり、安価でランニングコストが安く、試験的にパイロット的に中越地区の中小都市河川に設置した。住民の避難行動の解析にはマルチエージェントシミュレータを用いて避難状況を視覚的に表現することを試みた。平成16年の福井豪雨時を対象として災害時の人間の避難行動についてシミュレーションを行った。このときの入力条件としては河川の氾濫シミュレーションの結果を用い、これをマルチエージェントシミュレータへ反映させた.この結果破堤の30分前に避難行動を起こすことができれば,災害による人的被害は減少する結果が得られた。