hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
ｍｉＲＮＡによる関節リウマチ滑膜細胞リプログラミングの誘導

TGFβにより誘導されるmiRNA候補と、これらmiRNAの標的となりうるmRNAの探索を複数の方法で行い、関節リウマチとの関連が予想される候補遺伝子の選択に至った。TGFβ誘導性miRNAとこれらの候補標的遺伝子発現との関連を観察する為の細胞生物学的手技も、合成miRNAがリポフェクション法を確立した事で確立したと言える。一方で、mRNAの分解を伴わない翻訳抑制を介した標的分子に関しては現在のところ確実な標的が確認できていない。さらに、Exiqon社miRCURY LNA; microRNAInhibitorsを用いたmiRNA阻害の確認が完了しておらず、これを進める。達成できている点として以下の3点が挙げられる。1:TGFβ誘導性miRNAの標的mRNAの同定候補を決定する事ができた。2:候補分子のFLSにおける発現を確認できた。3:アンチセンスLNAデザインの完了。予定より遅れている点として、アンチセンスLNAのFLSへの効果の評価が平成23年度中には完了しなかった。最も重要な標的分子の同定ができた点は予定より早いが、アンチセンスLNAのFLSへの導入とその効果(TGFβ誘導性miRNA効果の減弱)の確認を急ぐ必要がある。1)選択されたmiRNAとその標的分子の挙動解析:選択されたmiRNAの合成RNAをリポフェクション方で導入した滑膜細胞において、標的遺伝子の発現をmRNAレベルおよび蛋白レベルで確認する。この方法として、免疫染色及びウェスタンブロット法、フローサイトメーター、polymerase chain reaction (PCR法)の方法を用いて行う。この解析により滑膜細胞での選択されたmiRNAと標的mRNAの関連を解析する。2)TGFβにより誘導されるmiRNAの細胞機能に対する効果判定:標的遺伝子の中には既知の機能があるものも選択されており、これらの分子に関しては挙動解析に整合性が見られた場合には機能解析へと展開する。例として、ある酵素が標的遺伝子であるがこれに対応する基質発現および分解を検討できるアッセイを予定している。3)microRNA阻害剤による検討:上記研究により得られた実験系に対して、以下の検証を行う。FLSをTGF βで刺激してmiRNAの細胞への導入と同様の結果が得られた場合、microRNA阻害剤によりTGFβによつ表現系をキャンセルできるか否かの検証を行う。TGFβ誘導性miRNAの配列依存性の影響を直接的に証明する目的で、アンチセンスLNAのFLSへの導入とその効果発揮の確認を優先事項と考える。平行して、有力候補分子のFLSにおける意義の探索を行ない、TGFβ→miRNA →FLS機能の軸を証明していく。1)細胞培養:ほぼ全ての実験が細胞生物学的手法を用いており、通常の継代細胞培養に必要な消耗品の購入が必要である。
柑橘系フラボノイドであるヘスペリジンによる骨代謝調節機構の解明

柑橘系フラボノイドであるフラバノン配糖体のヘスペリジンはコレステロール合成の律速酵素である3-ヒドロキシ-3-メチルグルタリルCoAレダクターゼ(HMG-CoA)還元酵素を阻害し、肝臓のコレステロール合成を調節することが報告されている。一方、Mundyらはスタチン系薬剤のコレステロール低下作用だけでなく、骨形成促進および骨吸収について報告している。本研究ではヘスペリジンの骨代謝に及ぼす影響について骨粗鬆症モデルマウスである卵巣摘出マウスを用いて検討したところ、スタチンと同様なメカニズムで骨量減少を抑制する可能性が示唆され、低分子GTP結合タンパク質のRho-Aの活性化が抑制されることで骨代謝調節が行われることが推察された。本年度の目標として卵巣摘出骨粗鬆症モデルマウチを用いて、ヘスペリジンによる骨代謝調節機序を推定するための検討を行った。その結果、ヘスペリジンの投与は子宮重量、最終体重および摂餌量に影響することなく、大腿骨のBMDおよびCa含量を増加させた。血中骨吸収マーカーであるCTxはOVXにより増加したが、ヘスペリジン投与によりその増加が抑制された。一方で、骨形成マーカーであるOCはヘスペリジンの影響を受けなかった。大腿骨遠位部海綿骨の形態計測では、ヘスペリジン投与により、破骨細胞数が減少し、骨吸収速度の低下が示された。さらに、破骨細胞の分化抑制に関与する血清中RANKL濃度を調べたところ、OVXで大きく増加するもののヘスペリジン投与によって低下した。次に、ヘスペリジンによるグラニルゲラニルピロリン酸経路に及ぼす効果をみたところ、骨髄中の活性型Rho-AレベルはOVXで増加したが、ヘスペリジンによりShamレベルまで低下した。以上のことからエストロゲン欠乏による骨粗鬆症モデル動物において、ヘスペリジンは骨吸収の抑制により骨量現象効果を発現し、その作用機序として、低分子量G蛋白質の関与が示唆された。今後は細胞レベルでの検討を行い、ヘスペリジンによる骨代謝調節機構をとさらに明らかにしていく予定である。本年度の目標としてヘスペリジンおよびαGヘスペリジンによる骨代謝調節機序を検討するために下記の実験を行った。動物実験の結果において、大腿骨の骨形態計測の所見と動的パラメータの結果をみると、αGヘスペリジン投与によって骨の浸食度が浅く、骨吸収速度および骨吸収速度の正常食群と周様なレベルまで改善した。また、骨質の指標である骨細胞をみると、αGヘスペリジン投与によって類骨中に埋入したばかりの骨細胞が認められ、骨基質申にも多くの骨細胞が存在することから、骨芽細胞から骨細胞に誘導している可能性が考えられた。一方、破骨細胞の分化抑制に関与するRANKL mRMA発現量を調べたところ、OVXで大きく増加するもののαGヘスペジジン投与によって低下し、破骨細胞形成抑制因子のOPG mRNA発現量は逆に増加した。さらに、脛骨由来の骨髄を採取し、低分子量G蛋白質を測定したところ、ヘスペリジンでは影響はみられなかったが、αGヘスペリジンによって低下していることが観察された。これらの結果から動物実験ではヘスペリジンによる低分子G蛋白質を介した骨代謝調節機構が示唆された。これらの結果に基づき、現在、骨細胞培養実験を行い、ヘスペリジンによる破骨細胞の分化抑制活性や培養破骨細胞による骨吸収抑制活性を評価しているところである。本年度はヘスペリジンを酵素処理し、水溶性を1万倍に高めた糖転移ヘスペリジン(αG)と未処理ヘスペリジン(H)による骨代謝調節作用への差異に関して、卵巣摘出骨粗鬆症モデルマウスを用いて検討した。次に、ヘスベリジンのアグリコンであるヘスペレチンによる破骨細胞分化抑制作用について破骨細胞培養キットを用いて検討した。動物実験の結果において、Hと同等のヘスペリジンを含有しているαGをHの混餌量の1/4に設定した餌を摂取させたところ、Hと同等の骨量減少抑制効果がみられた。さらに、脛骨中破骨細胞関連遺伝子のRANKLmRNA発現量はHよりもαGで抑制し、骨形成修飾遺伝子であるBMP-2mRNA発現量はαGで高値を示した。すなわち、Hより水溶性を高めたαGでの骨代謝調節作用の反応性が高いことが示唆され、Hよりも低い用量での骨粗鬆症予防効果がみられた。一方、骨粗鬆症は骨吸収と骨形成のバランスが破綻し、破骨細胞の骨吸収が活発になることが原因の一つとされているが、骨吸収抑制作用に関与するか調べるために、ヘスペレチンによる破骨細胞の分化への影響を検討した。

その結果、ヘスペレチンは濃度依存的に破骨細胞への分化を抑制することを示したことからヘスペリジンの骨量減少抑制効果は破骨細胞の分化を抑制することで発現することが推測された。フラボノイドは配糖体の糖を腸内細菌により切断することでアグリコンとなるが、効率的にアグリコンとして生理作用を発揮させるために、ヘスペリジンの吸収機構についても検討する必要があると思われる。
量子的エルゴード性とその応用としての素測地線定理の誤差項の改善

本研究の目的は、3次元数論的多様体に対する量子エルゴード性を考察し、その応用として素測地線定理の誤差項の改善を試みる事であった。2次元の数論的多様体に関しては、既に2年前にサルナック・ルオらにより、量子エルゴード性が証明され、素測地線定理の誤差項の改善も得られていたが、3次元以上の多様体に関しては、一切結果が知られていなかった。また、2次元の場合には、計算機による数値計算により、量子エルゴード性を示唆するデータが得られていたが、3次元以上の場合にはそうしたデータが全く存在しない。こうしたことから、この問題はデータから結果を推測することが不可能であり、量子エルゴード性の成立の可否そのものも推測がなされていなかった。本研究によって得られた主な研究結果は、アイゼンシュタイン級数に対する量子エルゴード性がリーマン・ゼータ関数のリンデレ-フ予想(より正確には凸境界の改善)と同値である事を証明したことである。リーマン・ゼータ関数とは、整数論で最も重要な関数であり、特にその臨界線上の値は素数分布などの未解決問題に決定的に影響することが知られているが、リンデレ-フ予想とはそうした値の漸近評価に関する予想であり、その成立はほぼ確からしいと言われている。この定理により、最新の概念である量子エルゴード性が、古典的な解析数論の未解決問題と結びつけられ、この分野の重要性が一層明確に認識されるに至った。また、リンデレ-フ予想は未証明でありながらその成立が信じられているが、それと等しい確度を持って3次元の量子エルゴード性が成立することが示されたことになり、結論として、量子エルゴード性の成立が推測できることとなった。この結果は既に京都大学における解析数論研究集会において報告され、同報告集は現在執筆中である。
植物個体内のクロロフィル蛍光分布を利用したストレス要因の同定

本研究では、植物にストレスを与えている要因を、クロロフィル蛍光を用いて推定する可能性を検討するために、植物体内でのクロロフィル蛍光パラメータの分布およびその変化パターンと各種ストレスとの関係を調べることを目的とした。環境制御温室内において、水ストレスを与えたコーヒー苗のクロロフィル蛍光パラメータΔF/F'm (yield : PSIIの量子収率に対応)を、PAM方式携帯用クロロフィル蛍光測定装置を用いて、個体内の異なる葉齢の葉(上位葉、中位葉、下位葉に分類)において測定した。その結果、水ストレスを与えると、クロロフィル蛍光パラメータΔF/F'mの値が低下するとともに、個体内でのΔF/F'mの値のばらつきが大きくなった。また、正常な状態では、上位葉においてΔF/F'mの値が小さくなる傾向が認められたのに対し、水ストレス区では、中位、下位葉の方が小さくなり、明らかに個体内におけるクロロフィル蛍光パラメータΔF/F'mの分布パターンに変化が生じた。さらに、環境制御グロースインキュベータ内で水耕栽培したホウレンソウを用いて、高温ストレス、弱光ストレス、接触ストレス時のクロロフィル蛍光パラメータFv/Fm(PSIIの最大量子収率に対応)分布を調べたところ、高温ストレス時には、個体内におけるFv/Fm値のばらつきが大きなる傾向が認められたが、弱光ストレスでは、分布はほとんど変化しなかった。また、個葉に接触等によるストレスを与えた場合は、ストレスを受けた個葉のみのFv/Fm値が低下した。さらに、バレイショ培養小植物体においても、培地条件(ショ糖の有無)の変化によるクロロフィル蛍光パラメータFv/Fm分布の変化が検出された。以上のことから、受けるストレスの種類により、クロロフィル蛍光パラメータの分布パターンに違いが生じる可能性が示唆された。本研究では、植物体内におけるクロロフィル蛍光パラメータの分布から、植物にストレスを与えている要因を推定する可能性を探ることを目的とし、本年度は、植物体内でのクロロフィル蛍光パラメータの分布およびその変化パターンを調べるためのクロロフィル蛍光測定法について、画像解析の利用およびPAM方式クロロフィル蛍光測定装置の利用の2つ方法で検討した。クロロフィル蛍光の画像計測に関しては、バレイショの培養植物体を材料とし、高感度冷却式CCDカメラにより培養器外からクロロフィル蛍光を画像計測するシステムを開発した。光源には光ファイバー式ハロゲンランプを用い、光学フィルターを組み合わせることで光量を調節し、さらにCCDの電荷蓄積時間を変化させることで、クロロフィル蛍光パラメータFv/Fm(PSIIの最大の量子収率に対応)の画像計測が可能であった。本システムでは、一度に数枚の葉を撮影することが可能であった。さらに光源の数を増やし、飽和光を照射できる範囲を広げることで、培養植物体一個体全体を一度に撮影して、個体内でのFv/Fmの分布を画像化することも可能であると思われる。さらに、温室内で栽培されているコーヒー苗を用いて、水ストレスを与えた時のクロロフィル蛍光パラメータΔF/Fm(PSIIの実際の量子収率)の個体内分布を、PAM方式クロロフィル蛍光測定装置を用いて測定した。その結果、ΔF/Fmの値は、測定点おける光強度に大きく依存しているため、日中の測定では、直達光を遮る等して、1)周囲光の急激な変化を抑える、2)なるべく植物体全体に均一な光が当たるようにすることが、個体内でのクロロフィル蛍光パラメータの分布を測定する上で重要であることが示唆された。
重症複合型免疫不全を呈する希少難病（細網異形成症）の病態解明と治療法の開発

Tet誘導型FOXP3発現ベクターを血球系Jurkat細胞に種々の方法で遺伝子導入し,薬剤選択を行い,47クローンを得た。得られた細胞クローンを解析したものの,Doxycycline添加によりFOXP3遺伝子発現を有効に誘導したものはなかった。検証実験から, Jurkat細胞ではFoxP3遺伝子完全長型アイソフォーム(v1)はexon2を欠失するv2アイソフォームに比べて発現効率がかなり低く,細胞特異的安定性が関与することが示され,本研究での特異的細胞株樹立における困難さの一因であったと考えられた。AK2遺伝子は重症複合型免疫不全症(細網異形成症(RD))の責任遺伝子である。AK2はミトコンドリア膜間に存在するアデニンヌクレオチド代謝に関わる酵素であるが、AK2遺伝子変異がRDという病態の発症機序については全く不明のままである。我々はショウジョウバエを用いて、AK2遺伝子ノックアウトフライを作製し、その発生過程で幼虫第2期に致死性変化をもたらすことを見い出した。次いで、AK2欠損に伴う個体発生の変化と血球分化異常との関連性について着目し、AK2遺伝子の欠失がHL-60細胞の分化誘導系でマクロファージ分化には障害を与えないものの、好中球特異的に成熟分化障害をもたらすことを見い出し、AK2欠損によるbipotentの血球幹細胞の系列細胞特異的な遺伝子発現制御を介した好中球特異的な分化障害モデルを提唱し、報告した。さらに、ショウジョウバエのAK2欠失動物モデルを用いた遺伝子発現変動の網羅的なin silico解析結果から、AK2によって惹起されるミトコンドリア代謝シグナル仮説を提唱し、報告した。以上の研究成果を踏まえ、AK2遺伝子変異は血球幹細胞から各系列分化制御過程において、ミトコンドリア機能依存的に免疫担当細胞のうちのT細胞と好中球を選択的に障害することが病態発症機序の本質であると考えるに至った。このAK2機能異常仮説をRDにおいて選択的障害を受けるT細胞において検証し、発症機序に基づいた治療法を開発するのに必要な標的を見い出すことに繋がる可能性が期待される。そこで、T細胞のうちミトコンドリア依存性があるTreg細胞の試験管内誘導系を確立し、AK2欠損による障害の標的を探索し、病態解明に繋げることを試みた。そこで、Treg細胞誘導に必須のFoxP3cDNAをクローニングし、Tet誘導型FoxP3発現ベクターの構築を完了した。現在、安定型発現ベクターの導入細胞の樹立の作業中である。Treg細胞誘導系に必須のTet誘導型FOXP3遺伝子発現ベクターの作製を終えたことから、安定的T細胞株を樹立するのは時間の問題と考えている。血球系細胞への遺伝子導入効率が低い点を考慮し、現在遺伝子導入法について、エレクトロポレーション法などを含め、改善方法も検討していることから、遺伝子導入効率の改善の課題は解決できるものと考えている。細網異形成症(RD)の原因として,ミトコンドリア酵素であるAK2遺伝子変異が報告されているものの,その発症機序については不明のままである。RDでは,免疫細胞の分化障害が病態の基盤になっており,その発症機序を明らかにするためには,T細胞分化におけるAK2の役割の解明が必要であると考えている。一方,制御性T細胞(Treg)については,解糖系を阻害するとnaive T細胞からTregの分化誘導が促進されることから,酸化的リン酸化によるエネルギー代謝がTregの分化誘導に重要な役割を担っている。今年度は誘導型Foxp3発現ベクターを安定的に保持するJurkat細胞株を取得するために,1.リポソームによる遺伝子導入法,2.Nucleofectionによる遺伝子導入法をそれぞれ独立して実験した。1.リポソームによる遺伝子導入Jurkat細胞への誘導型Foxp3発現ベクターの遺伝子導入は, TransIT-JurkatおよびX-tremeGENE-HPを用いて行った。その結果,この2種類のリポソームを用いたリポフェクション法では,GFP発現ベクターのトランスフェクション後24時間でのGFPの発現細胞の割合を計測した結果から,遺伝子導入効率は,せいぜい1%前後であった。outgrowthしてくるクローンはいずれの実験条件でも得られなかった。2.Nucleofectionによる遺伝子導入Jurkat細胞にベクターとpuromycin耐性遺伝子を20:1で, co-nucleofectionした。クローニングは96-well plateに1細胞ずつ蒔いた。その結果,30 well以上で増殖する細胞クローンとして樹立された。現在,各クローンの細胞増殖を待って,保存とDoxycyclinによるFoxp3の発現誘導能を確認する実験の準備中である。今年度の目標は,昨年度達成できなかった課題である安定的FoxP3発現誘導細胞株の樹立である。まず昨年度の方法論を再検討し,FoxP3発現誘導ベクターの遺伝子導入において,改善すべき点として,導入効率の改善が明らかになった。通常のリポフェクション法と電気穿孔法(Nucleofection)の2つの方法のうち,リポフェクション法はNucleofection法に比べて,T細胞株であるJurkat細胞への遺伝子導入効率が極端に低いことが分かった。この点を踏まえて,FoxP3発現誘導ベクターの遺伝子導入をNucleofection法を用いた。さらに,細胞がPuromycinに感受性が高いことが分かったので、これを考慮して,Nucleofection後の細胞の回復期間を2種類用意するとともに,薬剤選択期間を設定した。

このような実験条件の検討を踏まえて、現在クローンが30以上選抜することができ,Doxycyclinによる誘導活性の検討に入っている。研究計画全体ではやや遅れが見られるものの,改善の効果が認められており、着実な進展を認めている今年度は、昨年に引き続き、細網異形成症(RD)の病態解明のために、Jurkat細胞への誘導型FoxP3遺伝子導入細胞株の樹立である。その安定細胞株が樹立できれば、それを制御性T細胞(Treg) in vitroモデルとして用い、エネルギー代謝酵素AK2の役割を解明することを目的とした。これまでに、Jurkat細胞への導入効率が良いとされたTransIT-Jurkat試薬を用いた誘導型FoxP3遺伝子のリポフェクション法で安定的遺伝子株が得られなかったことから、FoxP3導入細胞方法として、エレクトロポレーション後にGFPマーカーで遺伝子導入細胞群を選抜し、その後Puromycinによる薬剤選択のステップを加えた。具体的には、coding領域全長を有するヒトFOXP3cDNA挿入したpTetOne誘導型FoxP3遺伝子発現ベクターを作製した。次いで、Necleofectorを用いて、FOXP3発現ベクターとPuromycin耐性遺伝子のコトランスフェクションを行った。遺伝子導入操作後、Pyuromycin(0.62 μg/mL)による選択を行った。Puromycin選択後の細胞を,限界希釈法により薬剤耐性クローン化細胞を選抜した。その結果、47クローンのうち、細胞増殖に問題のあった2クローンを除き、45クローンを取得した。それらのクローンについて、Doxycycline添加(100 ng/mL)培養にて、FOXP3遺伝子の発現誘導能を検討したところ、いずれのクローンにおいてもFOXP3遺伝子発現が認められなかった。これまでに確認できたことは、coding領域全長を有するヒトFOXP3cDNAをTet-Onシステムで発現させる場合、splice variant(v2)型に比べ、発現効率が悪いことがわかった。現在この結果の詳細について検討を行なっている。Tet誘導型FOXP3発現ベクターを血球系Jurkat細胞に種々の方法で遺伝子導入し,薬剤選択を行い,47クローンを得た。得られた細胞クローンを解析したものの,Doxycycline添加によりFOXP3遺伝子発現を有効に誘導したものはなかった。検証実験から, Jurkat細胞ではFoxP3遺伝子完全長型アイソフォーム(v1)はexon2を欠失するv2アイソフォームに比べて発現効率がかなり低く,細胞特異的安定性が関与することが示され,本研究での特異的細胞株樹立における困難さの一因であったと考えられた。Treg細胞誘導系の確立に引き続き、平成28年度は血球分化のレスキュー実験の確認とそれに基づいた新規誘導剤のスクリーニングの研究を進めたいと考えている。研究計画の遅れを回復するために、研究分担者を二人追加することとした。
神経性血圧調節能力の非侵襲的測定法の開発

自律神経の血圧調節能力は急激な血圧変動に対する生体の恒常性を保つ上でもっとも重要な機能である。この能力は虚血性心疾患に伴う心源性の突然死の危険度と逆相関する可能性などがあり,循環器学上重要である。この能力を測定するために従来から連続血圧および心電図を記録し、薬剤で昇圧してゲインを求めている。今回の研究の目的は、この薬剤投与という侵襲をなくし、自発的な血圧変動とそれに付随する心拍変動の相互相関のゲインを周波数解析の手法でためすことにあった。実際に15名の被験者で薬剤による昇圧で求めた血圧調節能力と周波数解析による血圧調節能力を求めて解析した結果、両者の線形相関は相関係数0.80で、周波数解析による方法が十分神経性の血圧調節能力の指標となりうると考えられた。そこで合計101人の神経性血圧調節能力を非侵襲的に測定し、さらに全身持久力を測定して自律神経機能と体力の関係を調べる方法に応用した。その結果、健常男子で体力まで測定できた70名の中では、神経性の血圧調節能力と体力とは有意な相関が見られた。以上のように今回試した周波数解析による圧受容体反射機能の評価法は、臨床的にも十分使用可能な方法と考えられた。しかし神経性の血圧調節はフィードバック系であり、開ループゲインを求める周波数解析の方法で測定できることに基礎的な疑問も残る。この点について、血圧調節のフィードバックループにおける心周期の変化の役割が、一般に考えられるほど大きくない可能性が考えられ、この点を確認する実験系を現在構築中である。
口腔悪性腫瘍における転移制御抑制遺伝子(CD82)異常の検索

60症例分の組織標本と口腔癌組織から抽出精製したDNAを用いて以下の結果を得た。1) PCR-SSCP法とsequencingにより、3.2%の症例でDNAの構造異常(mutation)が認められた。2) RT-PCR法により、38%の症例でmRNAの発現減弱を認め、さらに、24%の症例でmajor mRNAとは異なる長さと構造を有するmRNAの発現を認めた。3)免疫染色(ABC法)で56%の症例で、CD82タンパクの発現が減弱あるいは消失していた。4) methylation分析により、18%の症例でDNAのmethylationが認められた。5) 2)3)のmRNAあるいはCD82タンパク発現異常とリンパ節転移との間には強い相関が認められた。以上の結果から、CD82遺伝子の発現異常は口腔癌においてもリンパ節移転に強く関与していること、その発現減弱の原因としてはDNAの構造異常は考えにくく、一部はDNAのmethylationによるが、その他にもっと大きな原因(他の遺伝子産物に寄る制御等)があるものと考えられた。口腔扁平上皮癌組織、前癌病変さらに転移巣組織を用いて、CD82遺伝子の発現状況と癌の悪性度(易転移性、増殖様式、組織分化度等)との相関を検討するため、以下の研究を行った。1)すべての試料よりDNAを抽出し、凍結保存した。それぞれの組織の一部をHE染色、ならびに免疫組織染色(ABC染色)のために、10%ホルマリンで固定した。2)抗CD82抗体を用いて、ABC染色を行ない、CD82蛋白の発現状況を調べた。以上の実験により以下の結果を得た。1) CD82i遺伝子蛋白の発現状況は、正常に発現しているもの、発現が減寂しているもの、全く発現がみとめられないものの3群が認められた。リンパ節転移を有するものほど、また、転移組織においてその発現減弱が認められ、CD82は前立腺癌と同様に口腔癌においても重要な役割を演じているものと考えられた。2)しかし、PCR-SSCP assay、PCR-Direct sequencingによってもCD82遺伝子の構造異常の検出率は非常に低率で、必ずしも、構造異常によりCD82遺伝子の発現が制御されているわけではないことが明らかになった。今後の研究においては、メチレーション等の発現調節機構に焦点をあてて研究を進める予定である。
キトサンイオン交換樹脂によるタンパク質のクロマト分離

キトサンイオン交換樹脂は,カニやエビの甲羅から抽出したキチンを脱アセチル化処理して得られるキトサンに陰イオン交換基を導入した金く新しい超多孔性樹脂である。本研究では,このキトサン樹脂のタンパク質吸着分離剤としての適用の可能性について検討を加え,以下の知見を得た。1.強塩基性キトサン樹脂による牛血清アルブミン(BSA)の吸着平衡関係は,pHの影響を顕著に受け,中性付近で最大の吸着量を示した。また,食塩を溶離剤として用いることが出来る。2.弱塩基性キトサン樹脂は,濃厚な無機電解質が共存する(例えば血液)からのタンパク質の吸着剤として非常に有効であることが判明した。吸着したタンパク質の溶離は,アルカリ性の緩衝液を用いるとよいことも明らかにした。3.BSAの粒子内拡散機構は,BSAの液相体濃度が1g/dm^3以下では表面拡散とポア-拡散の並列拡散機構に従うこと,また1gdm^3以下ではポア拡散律速となり収縮核モデルが適用出来ることを明らかにした。表面拡散係頭およびポア-拡散係数はpHに強く依存した。4.キトサン樹脂をカラムに充填し,破過曲線および溶離曲線を測定した。キトサン樹脂は超多孔構造を有しているにもかかわらず非常に硬いため,カラム内で圧密が起こらず,塔長,流速に無関係に液はスム-スに流れた。破過曲線の実測値は,筆者らの直角平衡に対する解析解と良い一致を示した。得られた粒子内拡散係数は,シャロ-ベッド法および攪伴槽実験で求めた結果とほぼ一致した。一方,市販のタンパク質分離用樹脂として最も一般的なデキストラン系樹脂では,塔長1cm以上になると圧密により,中圧ポンプでは液はカラム内を流れなかった。以上の結果から,市販のタンパク質分離用の樹脂よりかなり安価に製造出来るキトサン樹脂は,タンパク質の吸着分離剤あるいは大量分取クロマト用樹脂として適用可能であることが明らかとなった。キトサンイオン交換樹脂は、カニやエビの甲羅から抽出したキチンを脱アセチル化処理して得られるキトサンに陰イオン交換基を導入した全く新しい超多孔性イオン交換樹脂である。本研究では、このキトサン樹脂のタンパク質吸着分離剤としての適用の可能性について検討を加え、以下の知見を得た。1.強塩基性キトサンイオン交換樹脂によ牛血清アルブミン(BSA)の吸着平衡関係は、BSA初濃度の影響は受けない、pHの影響を顕著に受ける、食塩共存下では、食塩濃度の増加とともに、吸着量が減少し、0.2mol/dm^3でBSAは全く吸着しない等、市販のデキストラン系樹脂と類似した傾向を示した。2.弱塩基性キトサン樹脂におけるBSAの吸着平衡関係は、食塩共存下で特異な挙動を示した。すなわち、高濃度食塩中でも、pHの値に依らずタンパク質が高選択的に吸着された。このような挙動を示す市販の吸着剤は水酸化アパタイトのみで他に全く見られないため、弱塩基性キトサン樹脂は、濃厚食塩中からのタンパク質の分離に道を開く新しい樹脂と言える。3.BSAの粒内有効拡散係数は、BSAの低濃度域(0.3g/dm^3以下)では、デキストラン系樹脂と大差が見られなかったが、1g/dm^3以上では、デキストラン系樹脂の1/31/8と小さくなった。

4.吸脱着に伴う粒径変化は無視出来、カラムに充填しても圧密は起らず、デキストラン系樹脂に比べ取り扱いは非常に簡単である。以上の結果から、キトサン樹脂は、タンパク質吸着分離剤として適用可能である事が明らかとなった。以上の内容は、化学工学協会第53年会(講演要旨集、P.236、1988)、第4回日本イオン交換研究発表会(講演要旨集、P.31&32、1988)、化学工学協会第21回秋期大会(講演要旨集、P.188、1988)および第2回日本吸着学会研究発表会(講演要旨集、P.60、1988)で発表した。また、上記2.の内容は、Biochemical Eng.J.に印刷中である。キトサンイオン交換樹脂は、カニやエビの甲羅から抽出したキチンを脱アセチル化処理して得られるキトサンに陰イオン交換基を導入した全く新しい超多孔性イオン交換樹脂である。本研究では、このキトサン樹脂のタンパク質吸着分離剤としての適用の可能性について検討を加え、以下の知見を得た。1.牛血清アルブミン(BSA)の粒子内拡散機構は、BSAの液相本体濃度が1g/dm^3以下では、表面拡散とポア拡散の並列拡散機構に従うこと、また、BSAの液相濃度が1g/dm^3以上ではポア-拡散律速となり、収縮核モデルで近似出来ることが判明した。表面拡散係数およびポア-拡散係数は、BSA溶液のpHに強く依存した。2.キトサンイオン交換樹脂をカラムに充填し、BSAの破過曲線および溶離曲線を測定した。キトサン樹脂は、超多孔構造を有しているにもかかわらず、非常に硬いため、カラム内で圧密が起こらず、塔長および流速に無関係に液はスム-スに流れた。一方市販のデキストラン系樹脂の場合、樹脂が柔らかいため、塔長が1cm以上では圧密のため、中圧ポンプでは液は流れなかった。破過曲線の実測値は、筆者らの直角平衡に対する破過曲線の解析解と良い一致を示した。得られた粒子内有効拡散係数は、シャロ-ベッド法および攪拌槽実験から求めた結果とほぼ一致した。デキストラン系樹脂の場合、塔長約0.6cmにおける破過曲線から求めた粒内有効拡散係数は圧密のため、シャロ-ベッド法で求めた値の約1/10と小さくなった。以上の結果から、市販のタンパク質分離用吸着剤よりかなり安価に製造出来るキトサン樹脂は、タンパク質の吸着分離剤として適用可能であることが明らかとなった。以上の内容は、化学工学会徳島大会(講演要旨集,P.129,1989)および化学工学会第55年会(講演要旨集,Q118,1990)で発表した。
韓孟聯句研究

中国古典詩のなかの「聯句」と称されるジャンルが、どのように生まれ、展開していったか、その歴史を調べることによって、直接の研究対象である韓孟聯句の特質を明らかにした。聯句は従来は君臣間の、また文人どうしの間の交遊の手だてであったが、韓愈・孟郊二人の手になる聯句では新たな詩的表現を模索する試みとしての性格が中心となった。彼らは古典詩の表現の規格を故意に逸脱する。それは詩語として定着していた語彙を敢えて避けて新奇な語を作り出すところから、外界を捉える見方が従来とは異なるところまで、詩を構成する要素の全体にわたっている。そこで開拓された表現手法は、その後の詩人たちの表現にも浸透し、中国古典詩の世界を豊饒にしていった。我々は多くの研究者を集めて会読を行い、韓孟聯句のすべてを読了した。関連の資料を収集するため、書物を購入したほか、旅費を用いて各地の図書館を調査した。会読の結果は、パソコンを用いて詳細な訳注を作った。共同研究によって他の詩人を研究する人たちの参加が得られたために、韓愈・孟郊の表現の特徴がより鮮明に理解することができた。これによって聯句という一つの文学様式が、時代の流れのなかでどのように継承され、また変化していくかを追跡できた。さらに会読に際しては、訓読・訳・注のみならず、詳細緻密な分析を叙述することによって、古典詩読解に一つの新たな方法を作り出した。これは今後、聯句以外の作品においても、有効な方法として受け入れられよう。聯句という文学様式はそもそも参加者相互の間の交流、人的交わりを基本とし、またともに詩を作ることによってその結び付きを確認し、高めあう、いわば社交的な性格が伴うものであるが、しかし韓孟聯句の場合はそうした詩作の場のもたらす効果を越えた性格が認められる。二人の間にこそ持ち得た敬愛と信頼に基づきつつ、新しい表現を奔放に試みる実験が行われている。そこで獲得された表現手法は、二人を取り巻く李賀などによって一層徹底され、洗練されて中国の詩表現を豊かにすることになる。また韓愈と孟郊という本質的に異質な詩人がぶつかりあうことによって、両者はそれぞれ独自の文学をその後展開する契機にもなった。しかしながら、激しい個性が競い合ったこの聯句は、その後の文学史において必ずしも確固たる伝統として受け継がれることはなかったようだ。聯句のその後の展開については今後の研究が待たれる。
敗血症におけるInnate Lymphoid Cell の機能解析

2018年度は、予備実験を行い現在の計画での研究遂行で有ることの確認を行った。現在、予定よりやや遅れているものの、研究遂行に当たり抗体などの購入を勧め、次年度中には予定の実験計画まで遂行できるものと計画を行っている。現在は患者からのリンパ球が解析解析可能な質の担保は完了しており、今後は抗体を使用し患者リンパ球の解析を行う。また計画書にあるよう、セルソーターの使用にあたっても、事前準備は完了しており、直ちに染色後解析を行うこととしている。基礎的な研究環境を整えるのにやや時間がかかったため。2019年度すぐに、抗体の購入を行い、実際の患者での解析を進め、遅れていた研究を予定の進捗まで行う予定としている。初年度に購入せずに行った、基礎実験が完了しており、次年度に繰り越して購入を行い予定通りに研究を遂行する予定ちょしている。準備に問題はなく、遂行は可能である。
高感度シナプスカルシウムプローブを用いたスパイン内代謝の病態進行の研究

海馬は記憶の形成や想起を担う脳部位であり、海馬錐体細胞においてグルタミン酸作動性の興奮性シナプス入力部位である個々の樹状突起棘(スパイン)が記憶に重要であると考えられている。統合失調症等の一部の精神疾患では海馬でのスパインの萎縮やスパイン数の減少等に伴って進行性の記憶障害が生じるが、その1つのマイクロ病態としてミトコンドリアの障害による代謝異常が関与する可能性が明らかにされ始めている。しかしミトコンドリア障害とシナプス病態が経時的にどのように進行するのかは未だに明らかにされていない。本研究では、統合失調症様の症状を誘発させる薬物の投与や遺伝子の操作によって個々のスパインのCa2+活動・代謝活動、およびシナプス近傍の神経内外環境がどのように変化するのかを明らかにし、記憶障害の発現・進行に関わるマイクロ病態を解明することを目的としている。28年度は前年度に引き続きスパイン内のCa2+活動・代謝活動の経時変化をイメージングで測定することを可能にする蛍光プローブの作製を行った。さらにシナプス病態の経時的な進行を明らかにするため、統合失調症様精神症状の誘発との関連が想定されている異常なDisc1変異体等を上記の蛍光プローブとともに神経細胞に発現させて蛍光イメージングによる検討を行った。また、Ca2+活動の変容に影響を及ぼす機能分子を見出し、その効果を神経細胞での蛍光イメージングにより評価した。28年度が最終年度であるため、記入しない。27年度はスパイン内Ca2+活動と代謝活動の経時変化をイメージングで測定することを可能にする蛍光プローブの作製を行った。さらにシナプス病態の経時的な進行を明らかにするため、長時間培養下での蛍光イメージングを行うための実験条件を検討した。一方、生体レベルでの2光子イメージング法による神経発火活動の検出に適した蛍光Ca2+プローブの比較検討を行った結果、研究代表者らが以前に開発した緑色Ca2+プローブであるG-CaMP7が特に優れたパフォーマンスを示すことを見出した。そこでテトラサイクリン応答配列の使用によりG-CaMP7を特定の時期にだけ発現させることができるトランスジェニックマウスの作成を行った。そしてこのトランスジェニックマウスの活用により、海馬等の部位において単一神経細胞レベルで高精度に神経Ca2+活動を解析できることを示した。スパイン内Ca2+活動と代謝活動の解析用プローブの作製や長時間培養イメージングの条件検討が順調に進んでいるため。最終年度は、これまでの研究成果に基づき、統合失調症様精神症状を誘発させる薬物の投与や遺伝子の操作によりシナプス病態がどのように進行するのかを解析する。
胎児脳循環・胎児脳組織酸素分圧から見た分娩管理 -胎児二酸化炭素分圧の重要性-

胎児低酸素血症の同定を目的とする胎児心拍数モニタリングを用いた現在の分娩管理によっても脳性麻痺の頻度は減少していない。胎児二酸化炭素分圧は母体の二酸化炭素分圧と強い関連を示す。我々は、胎児脳組織酸素化に影響を与えることが示されている胎児二酸化炭素分圧に着目し、診察指装着型オキシメーターを用いて、胎児脳組織酸素化との関連を検討した。その結果、臍帯静脈血二酸化炭素分圧と胎児脳組織酸素化とで相関傾向が認められた。少数例での検討ではあるが、胎児低二酸化炭素血症を防ぐという新しい観点からの最適な分娩管理方法について一定の意義が見いだせたと考える分娩中の母体二酸化炭素分圧を経皮的二酸化炭素分圧モニターを用いて測定し、母体の二酸化炭素レベルに関与する因子を多数例の分娩から検討することが本研究の目的である。本年度は研究計画のはじめとして、経皮二酸化炭素分圧センサーtcPCO2 electrode(Radiometer Tina TCM4 capnographを購入した。また、分娩の胎児二酸化炭素分圧に関連する様々な因子を多数例の分娩から検討する基礎研究として、分娩中の輸液量が分娩経過に与える影響を検討した。分娩中の適切な輸液は帝王切開や遷延分娩の減少、また胎児低酸素症の予防に寄与する可能性があると考えられている。また、様々な分娩中の要因が、分娩中の過換気に影響していると考えられている。本研究の結果、ほとんどの分娩では妊婦は分娩中に輸液にもかかわらず脱水になっていること、また脱水の程度が進むにつれて分娩の進行が緩徐になることを見出した(第38回日本産科婦人科栄養・代謝研究会で発表)。今後は分娩中の輸液量および脱水の程度と母体の経皮二酸化炭素分圧との関連を検討する予定である。また、平成27年には胎児の脳血流や脳内酸素飽和度を測定する機器(測定者の指に装着可能)が静岡大学および浜松医科大学によって開発され第33回周産期学シンポジウム(2015年1月23,24)にて発表された。当学会に参加し実際に検討を行ったが、本機器は、母体二酸化炭素分圧と出生時の胎児脳血流および脳内酸素飽和度を直接検討できる画期的な機器と考えられ、当機器を用いた母体二酸化炭素分圧と胎児脳血流および脳内酸素飽和度の関係についても検討していく予定で準備を進めている。分娩中の母体二酸化炭素分圧を経皮的二酸化炭素分圧モニターを用いて測定し、母体の二酸化炭素レベルに関与する因子を多数例の分娩から検討することが本研究の目的である。昨年度は研究計画のはじめとして、経皮二酸化炭素分圧センサーtcPCO2 electrodesを購入した。現在は分娩中の輸液量および脱水の程度と母体の経皮二酸化炭素分圧との関連を継続して検討中である。また、平成27年には胎児の脳血流や脳内酸素飽和度を測定する機器が静岡大学および浜松医科大学によって開発され第33回周産期学シンポジウム(2015年1月23,24)にて発表された。当学会に参加し実際に検討を行ったが、本機器は、母体二酸化炭素分圧と出生時の胎児脳血流および脳内酸素飽和度を直接検討できる画期的な機器と考えられ、当機器を用いた母体二酸化炭素分圧と胎児脳血流および脳内酸素飽和度の関係についても検討を開始した。当機器を(医療機器認証番号:227ADBZX00009000)を購入した。経皮二酸化炭素分圧センサーによる娩出直前の母体の測定に加えて、胎児脳酸素飽和度を測定し、分娩監視装置としての意義を検討を開始している。胎児の脳血流や脳内酸素飽和度を測定する機器し、それと母体二酸化炭素分圧との関連を検討することになり、再度学内倫理員会の承認を得る必要があった。また、妊婦に対しての承諾をもう一度とる必要があったためやや研究の振興がやや遅れることとなった。最終年度の目的としては、胎児脳酸素飽和度を直接測定しさらなる分娩管理の向上につなげることである。昨年度は研究計画の最終年度として、静岡大学および浜松医科大学によって開発され第33回周産期学シンポジウム(2015年1月23,24)にて発表された診察指装着型オキシメータ(医療機器認証番号:227ADBZX00009000)を購入した。当機器を用いることで、出生時の胎児脳血流および脳内酸素飽和度を直接検討できることが画期的と考えられ、当機器を用いて胎児脳血流および脳内酸素飽和度の関係についても検討を行った。少数例の検討ではあるが、その意義を検討中である。

胎児低酸素血症の同定を目的とする胎児心拍数モニタリングを用いた現在の分娩管理によっても脳性麻痺の頻度は減少していない。胎児二酸化炭素分圧は母体の二酸化炭素分圧と強い関連を示す。我々は、胎児脳組織酸素化に影響を与えることが示されている胎児二酸化炭素分圧に着目し、診察指装着型オキシメーターを用いて、胎児脳組織酸素化との関連を検討した。その結果、臍帯静脈血二酸化炭素分圧と胎児脳組織酸素化とで相関傾向が認められた。少数例での検討ではあるが、胎児低二酸化炭素血症を防ぐという新しい観点からの最適な分娩管理方法について一定の意義が見いだせたと考える本年度は研究の本格的な至らず、基礎研究および研究の準備に多くの時間を費やした。理由として主任研究者の年度中の転勤があげられる。本年は本格的な研究を開始する予定である。経皮二酸化炭素分圧センサーによる娩出直前の母体の測定に加えて、胎児脳酸素飽和度を測定し、分娩監視装置としての意義を検討を開始している。今後は症例を重ねて検討を加える予定である。産婦人科学本年度は出生時に臍帯動静脈の酸素分圧・二酸化炭素分圧・pHなどを測定し、胎児二酸化炭素分圧に関連する因子を多数例の分娩から検討することに加えて、前述の胎児の脳血流や脳内酸素飽和度を測定する機器(指に装着可能)を用いて直接胎児脳血流および脳内酸素飽和度との関係を検討する。次年度に研究結果をまとめるため、物品費、および校正等に余力を残した。残金が少額のため次年度に繰り越す。試薬等物品費、校正及び学会参加費に充当。物品費に充当。
音楽による気分誘導と絵画の要素的・全体的評価

本研究の中心的研究として、音楽の聴取による気分誘導が、被験者の絵画の印象評定において、誘導された気分と同質の方向に評価が特定的に偏向するという仮説をたて、その検証を行った。そのために、聴取音楽の有無を被験者間要因として、気分誘導を行わない統制群と、音楽を聴取することで気分を誘導する実験群を設定して実験を行った。音楽の選出にあたっては、特定の感情価のみ高いものを選び、誘導される気分が特定されるよう留意した。実験に先立って、絵画の感情的側面に関する絵画評定尺度を作成し、絵画の印象評定に用いた。絵画刺激としては、被験者の感情的な側面を刺激しやすいものであること、絵の解釈について一定の標準化がなされていることなどの理由から、TAT図版を用いた。気分誘導の成否の検討として、気分誘導×感情状態の分散分析を行った結果、感情状態の主効果と気分誘導×感情状態の交互作用が得られた。下位検定によって、抑鬱・不安、活動的快、集中における気分誘導の単純主効果がそれぞれ有意であり、特定の気分のみ誘導するという目的がほぼ達成された。絵画評定への影響の検討として、気分誘導×評定項目の分散分析を行った結果、評定項目の主効果と気分誘導×評定項目の交互作用が得られた。下位検定を行ったところ、たとえば、抑鬱群は統制群に比べて、抑鬱に関する項目の得点が高く、高場を表す項目の得点が低いなど、絵画の印象をより抑鬱的に評価しているが、親和に関する項目を除く他の項目では気分誘導による差がないことなどが明らかになった。以上の結果から、絵画全体に対する評価は、誘導された気分と同質の方向に特定的に偏向することが明らかとなった。絵画の要素と全体での気分の効果の違いについては、明快な結果は得られなかった。
高速液体クロマトグラフィーによる先天性代謝異常症の病態解析

先天性代謝異常症の副腎皮質過形成症,胆道閉塞症,有機酸代謝異常症などは早期発見,早期治療が望ましい.副腎皮質過形成症のマススクリーニング法として酵素免疫測定法を開発し,すでに実施の段階に達しているが,陽性検体について二次検査による精密診断が必要とされている.本研究ではこれらの先天性代謝異常症の病態解析,精密診断に適した高速液体クロマトグラフィー法の開発を目的とした.これらの代謝異常症に関連のある生体成分-コルチコステロイド,胆汁酸,有機酸を対照としUV,蛍光または化学発光法を検出システムとする高感度なHPLC法を開発した.1.3α-ヒドロキシステロイドデヒドロゲナーゼの固定化酵素リアクターを用いHPLC分離されたコルチコステロイドの代謝物(テトラヒドロ体)及び胆汁酸にNADを反応させ,生成するNADHを蛍光法により検出する方法を確立した.また,フェナジンメトサルフェートとイソルミノールによるNADHの化学発光法を開発し胆汁酸の化学発光HPLC法を確立した.開発した蛍光・化学発光HPLC法により患者尿中のテトラヒドロコルチコステロイドの測定を行った.2.ルシゲニンによる還元性化合物の化学発光反応を検討し, α-ヒドロキシカルボニル基により強く発光することを見出し,ルシゲニンをポストカラム試薬とする化学発光HPLC法を開発した.テトラヒドロコルチコステロイド類やフェナシルエステル化した胆汁酸の分析に応用した.3.フェナシル誘導体をプレラベル化試薬とする有機酸のUV検出HPLC法を検討し,血液中の遊離脂肪酸の分離分析法を確立した.本法はルシゲニンをポストロカラム試薬として反応させることにより高感度な化学発光HPLC法とすることが出来る.先天性代謝異常症の副腎皮質過形成症,胆道閉塞症,有機酸代謝異常症などは早期発見,早期治療が望ましい.副腎皮質過形成症のマススクリーニング法として酵素免疫測定法を開発し,すでに実施の段階に達しているが,陽性検体について二次検査による精密診断が必要とされている.本研究ではこれらの先天性代謝異常症の病態解析,精密診断に適した高速液体クロマトグラフィー法の開発を目的とした.これらの代謝異常症に関連のある生体成分-コルチコステロイド,胆汁酸,有機酸を対照としUV,蛍光または化学発光法を検出システムとする高感度なHPLC法を開発した.1.3α-ヒドロキシステロイドデヒドロゲナーゼの固定化酵素リアクターを用いHPLC分離されたコルチコステロイドの代謝物(テトラヒドロ体)及び胆汁酸にNADを反応させ,生成するNADHを蛍光法により検出する方法を確立した.また,フェナジンメトサルフェートとイソルミノールによるNADHの化学発光法を開発し胆汁酸の化学発光HPLC法を確立した.開発した蛍光・化学発光HPLC法により患者尿中のテトラヒドロコルチコステロイドの測定を行った.2.ルシゲニンによる還元性化合物の化学発光反応を検討し, α-ヒドロキシカルボニル基により強く発光することを見出し,ルシゲニンをポストカラム試薬とする化学発光HPLC法を開発した.テトラヒドロコルチコステロイド類やフェナシルエステル化した胆汁酸の分析に応用した.3.フェナシル誘導体をプレラベル化試薬とする有機酸のUV検出HPLC法を検討し,血液中の遊離脂肪酸の分離分析法を確立した.本法はルシゲニンをポストロカラム試薬として反応させることにより高感度な化学発光HPLC法とすることが出来る.先天性代謝異常症の副腎皮質過形成症,胆道閉塞症,胆汁酸代謝異常証の診断、病態の解明にはそれぞれ多種類のステロイド,胆汁酸,有機酸を一斉同時に分析することが必要とされている。又、本研究では対象患者が新生児や未熟児であることから検体量に制約があり、より高感度な方法が望ましい。本研究では酵素リアクターを用いての胆汁酸類の蛍光HPLC法及びノーブロムアセチルピレンを誘導体化剤とする胆汁酸の硫酸エステル類のHPLCを確立し、それぞれ、J.Biomedical Chromatography,及び分析化学に掲載された。これらの経験を基礎とし、更に高感度化の目的で、検出方法を蛍光法から化学発光法にかえて以下の検討を行った。1.ルシゲニンを用いる化学発光HPLC法による尿中テトラヒドロコルチコステロイド類の定量:血中及び尿中の副腎皮質ステロイド類は肝で水溶性抱合体となり主としてテトロヒドロ体となり排出されるので、当研究室で開発したルシゲニンによる化学発光反応を用いてこれらテトラヒドロコルチコイドを化学発光検出HPLCで分析する方法の検討。(一部International SymposiumAdvance in Chromatography,Chiba 1986 10月に発表)2, 3α-ヒドロキシステロイドデヒドロゲナーゼを固定化し、生成するNADHを化学発光HPLCで検出する方法の検討:当研究室で開発したフェナジンメトサルフェート及びイソルミノールを用いるNADHの化学発光法をHPLCの検出系への適用の検討(一部International Symposium Advance in Chromatography Chiba,1986,10月に発表)
各種疾患におけるカチオン化ゼラチンを用いた経カテーテル治療法の開発

本研究で、急性心筋梗塞、肝硬変、肝細胞癌や放射線肺臓炎などの治りにくい疾患に対してカテーテル(動脈内に挿入し、目的とする臓器に薬を投与する管)を用いた新たな治療法の開発を行った。具体的には、動物実験モデルを用いてそれぞれの疾患を作成し、カテーテル内に疾患の治癒を誘導するような細胞を投与し、新たな治療法となる可能性を見出した。この研究により、それぞれの治りにくい疾患への実際の診療現場で応用されることが期待される。本研究の目的は、原発性肺高血圧症、肝細胞癌、肝硬変症、脳梗塞症や急性心筋梗塞症などの様々な難治性疾患に対する新たなカテーテル治療法を開発することである。そのためにまず、血管内皮前駆細胞や骨髄幹細胞の分離同定を行い、遺伝子導入を行うためのカチオン化ゼラチンを作成し、各種動物疾患モデルを作成した。具体的にはモノクロタリンを用いた原発性肺高血圧症モデルを作成し、全身麻酔下で体表から超音波装置を用いることによりモデルの作成状況を確認した。従来、我々はモデルラットを犠死させモデルの確認を行っていたが、生存させたままでもモデルの作成を確認することができた。また、肝硬変症、肝細胞癌モデルも各種血液検査だけではなく、肺高血圧症モデルと同様に体表から超音波検査を行うことにより肝硬変症や肝細胞癌が生じていることを確認することが可能であった。肝硬変症モデルに関しては、組織化学的な肝細胞癌モデルに関しては、明らかな腫瘍の形成だけではなく免疫組織化学的染色より前癌病変の状態もうまく描出することができた。脳梗塞症に関しては、ヌードラットを用い、現在モデル作成中であるが、急性心筋梗塞症モデルにおいても体表からの超音波検査により心筋梗塞の作成に成功したことが確認されて、現在組織学的検索を行っている。以上のように本年度の検討により、各種疾患モデルが問題なく作成されることが明らかとなり、次年度に行う予定である治療効果の検討が期待される。我々が開発した遺伝子導入技術を応用し、難治性疾患に対する新たな治療を開発するのがこの研究の目的である。そこで本年度は、昨年度に引き続き主に、肝硬変症、肝細胞癌および急性心筋梗塞症における検討を行った。肝硬変症に関しては、コリン欠乏食およびジエチルニトロソアミンを用いて作成した肝硬変モデルラットを用いて研究を行い、肝硬変症発症前に肝動脈内に遺伝子導入骨髄幹細胞を投与する事により、肝硬変症が抑制されることを血液検査所見(ALT値)上および病理組織学的所見(H.E染色、アザン染色)を用いて示した。また、肝細胞癌に関しては、ジエチルニトロソアミンを用いて作成した肝細胞癌モデルラットを用い、肝動脈内に遺伝子導入ゼラチン粒子を注入する事により、遺伝子が肝組織内で発現し、肝細胞癌縮小効果があることを、超音波所見および病理組織学的(H.E染色、GST-P染色)を用いて示した。急性心筋梗塞症に関しては、急性心筋梗塞症モデルラットを用い冠動脈内に遺伝子導入血管内皮前駆細胞を投与することが心筋梗塞症における病態を改善することを超音波検査および病理組織的(H.E染色、アザン染色)に改善することを明らかにした。以上の結果は、次年度引き続き追試験を行い確認する予定である。本研究は、我々が開発した遺伝子導入技術を応用し、難治性疾患に対する新たなカテーテル治療を開発することが目的である。そのため、本年度はラット肝細胞癌モデル、ラット脳梗塞モデル及び、ラット急性心筋梗塞症モデルを用いて検討を行った。1.肝細胞癌における検討疾患モデルの作製は、アメリカのベスラ社より輸入したコリン欠乏食を与えるモデルおよび、ジエチルニトロソアミンを腹腔内に投与したモデルを利用した。上記動物実験モデルでは、薬剤投与後16週までに全例で、肝細胞癌が発現することが経時変化的に行った超音波検査で確認できた。開腹し、経肝動脈的にゼラチン粒子を投与することにより、肝細胞癌の発育は抑制されることが、超音波検査所見上確認できた。また、AFP(α・fetoprotein)染色やGST-P染色を行うことにより、免疫組織化学的にも腫瘍の発育が抑制することが確認できた。現在、その有効性のメカニズムを検討中である2.脳梗塞および急性心筋梗塞における検討脳梗塞症モデルの作成は、ヌードラット(6週齢、♂)を利用し、右総頚動脈と右中大脳動脈を永久結紮するモデルを利用した。急性心筋梗塞症モデルはの作成はヌードラット(6週齢、♂)を用い、冠動脈前下行枝を永久結紮するモデルを利用した。いずれのモデルにおいても、経カテーテル的に幹細胞を投与することにより、組織学的に治療効果が認められることが明らかになった。本研究により、経カテーテル的にゼラチン粒子や幹細胞を投与することにより、肝細胞癌、脳梗塞症や急性心筋梗塞症などの難治性疾患の治療として有効であることの基礎的な検討が終了し、今後の臨床応用に繋がる有意義な検討となった。
自然科学的調査手法を用いた黄檗様彫刻の国内受容と変容に関する総合的研究

本研究は、近世彫刻における黄檗様彫刻を対象にその特徴が国内で伝播する過程で、具体的な様相を明らかにした上で、黄檗様彫刻の影響を評価する研究である。本研究では、長崎・京都での明人仏工による彫刻作品、以後の黄檗様彫刻を制作した七条仏師康祐、彼の子息(康傳、友学)の彫刻作品を研究対象とする時間軸を設定し、個々の作品を対象に目視観察等の調査による造形的特徴の把握と並行して透過X線撮影による構造技法の分析、樹種同定・年輪年代測定、赤茶色系下地や盛上輪郭線など下地・加飾の材料分析、色彩・色材調査の自然科学的手法による調査を行い、各作品の基礎的情報を得た上で黄檗様彫刻の伝播とその影響について明らかにする。