hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
中国仮還後の香港の金融システムに関する研究

本年度の研究は、1997年に始まるアジア通貨金融危機の香港への影響についての分析と、その中から明らかになってきているアジアの金融システムと欧米の金融システムの相違について分析を進めた。前者に関しては、1997年10月及び1998年8月の投機攻撃に対する香港金融管理局の政策を具体的に究明した。この過程で、香港金融管理局は外貨準備を用いて株式市場に介入して株価を買い支えることによって通貨投機を撃退した。これは、香港がカレンシーボードシステムによる固定相場制を採用しているために、金融政策を有効に利用できないための緊急の措置であった。しかし、このことは従来から自由放任あるいは積極的不介入主義を政策上の理念としてきた香港にとって、政策の大きな転換を意味するかもしれない。90年代に入って香港は介入主義的傾向を強めてきており、その中で設立された香港金管理局が積極的な政策を展開するのは、いわば当然のこととも言える。後者に関しては、欧米の金融システムがarm's length systemを基本にするのに対してアジアの金融システムがrelationship-basedsystemをとっているという主張から、ここに危機の原因を求める考え方が出てきている。欧米流のシステムがcommon law概念を基礎にしたシステムであることからすると、香港は長らくイギリスの統治下にあり、その意味で欧米流のarm's length systemが根付いているようにも思われる。しかしながら、香港の金融システムは急速に中国本土のシステムに同化しつつあり、上で見たように介入主義的あるいは裁量主義的な傾向を強めてきていると言ってよい。その意味で、香港の金融システムに関しては上で挙げたアジアの金融システムの二分法は必ずしも適合的な分析用具にはならないと考えられる。本年度の研究では香港金融市場のおいて圧倒的なシェアを占めていた邦銀の動向を分析した。1980年代以降香港金融市場においては、日本の銀行(邦銀)が資産規模でみて過半のシェアをもっており、1990年代前半には地方銀行の支店設置ラッシュが続いた。こうした動きは、90年代における邦銀の国際業務からの撤退とは対立する動きのように見える。しかし、90年代前半の香港への邦銀の進出は主に地方銀行によって行われており、その進出が香港での業務の拡大をもたらしているというよりは、地元製造業の進出にともなってとりあえず進出するというものであった。そのため、1997年以降のジャパンプレミアムの発生や不良債権問題の中で急速に撤退に追い込まれ、邦銀数は2年間で半減した。結局、1980年代以降都市銀行を中心とした日本の大手銀行が邦銀の香港業務を担っていたが、その大手邦銀にしても1978年以降に進出した銀行に適用される"one building condition"、すなわちATMを含めて複数の店舗開設を認めないという規制の結果、リテール業務には進出できなかった。そのため、邦銀は日本を対象とした対外取引を主たる業務とせざるを得なかった。すなわち、日本からインターバンク資金を取り入れ、それを日本の顧客に貸し付けるという債権債務両建てでの業務を拡大していったのである。この動きは日本の規制を回避する迂回融資として従来強調されてきており、それが90年代半ばまで拡大し続けたと理解されてきた。
異業種共配による小ロット末梢流通体系の成立要件の解明

本研究は、流通末梢部を「人口減少や過疎化に伴い、輸送サービスが不十分である農山村・過疎地域」と定義し、貨客混載などに代表される異業種や地域自治体との共同実施の在り方から、本来非効率とされる過疎地域の運送事業の存続維持と異業種間共配による小ロット輸送の経済的要件を解明することを目的としている。本研究の課題は、農山村の輸送において、経済効率性に目を向けた従来の研究とは異なる、1過疎地域の輸送における異業種間の共同化と成功要因の解明、2地域社会へ与える異業種間の共同化による効果検証の視点からの分析、研究を目指すものである。
実技教科授業の日韓比較研究-実技教科の子どもの「学び」の経験とは何か-

本研究は,音楽科,図画工作科,家庭科,体育科の「実技教科授業」について,日韓比較調査研究を通して,子どもたちの「学び」経験について明らかにすることを目的として行った。結果,日韓の子どもたちの教科観は,実技各教科で授業経験構造から多くの共通点が存在している。しかし,授業実践比較による子どもたちの授業評価から学習経験としての「学び」には相違が見られ,特に韓国の子どもたちには性差がみられることや教師の満足度との関係も日本と韓国で異なることが明らかになった。本研究は、音楽科、図画工作科、家庭科、体育科の実技教科の教科相対的、教科横断的視野から日韓の比較調査研究において、実技教科の学習経験や「学び」の形成を学習者の視点から明らかにすることを目的としている。平成21年度は、日韓での実技教科授業を実践する前段階として、(1)実技教科における日韓の共通点や特徴を日本の学習指導要領や韓国の教育課程から把握した。音楽科では、ともに表現や鑑賞から豊かな情操(情緒)を養うこと。図画工作では、美術の表現や鑑賞から創造活動の基礎を養うこと。家庭科では、日常生活、家庭生活の知識、技能をみにつけること。体育科では、身体活動を通して、明るい活気にみちた生活を送ることなど各教科における目標等において多くの共通部分があることが確認できた。また、(2)日韓で行う実技授業の授業分析、学習者の「学び」を解明するための授業で使用する調査票を作成するための調査を韓国の小学生約1500名(各教科約400名)を対象に実施した。教科別に主因子法によるバリマックス回転の因子分析を実施し、固有値1.0以上の因子について命名を行い、音楽科は6因子、図画工作科は7因子、家庭科は8因子、体育科は6因子が抽出、命名された。この結果を基に、韓国で実施する実技教科授業の分析のための授業調査票を各教科10項目で作成した。本研究は、音楽科、図画工作科、家庭科、体育科のいわゆる「実技教科」において、教科相対的ならびに教科横断的な視野から、日韓の比較調査研究において、(1)学校における「実技教科」授業において、学習者は実際に何を「経験」し、どのような「学び」を実際に形成しているのかを、学習者のもつ教科観から明らかにする。さらに、(2)その「実技教科」において形成された「学び」や「経験」について、実技教科カリキュラムの「効果」について明らかにすることを目的としている。H22年度は、初年度(H21年度)後半に韓国の小学校5,6年生約1,500名を対象とした実技授業に係る調査を詳細に分析した。韓国小学生の実技教科授業への学びの経験を把握し(課題1)、日韓比較授業実践で使用する日本と同様の手法で授業評価票(案)の作成を試みた。成果として、1.韓国小学生への調査を教科ごとに因子分析を行い、音楽科6因子(53項目)、美術科7因子(52項目)、実科(日本の家庭科にあたる)8因子(50項目)、体育科6因子(52項目)が抽出された。また抽出された因子の中で実技4教科に共通する因子が4因子あることが明らかになった。2.実技各教科で抽出された各因子は、「よい授業である」「教師の指導性」とすべての因子で有意な関係が認められた。また「よい授業である」「共生の指導性」への各因子の影響度は教科で異なることも明らかになった。3.実技各教科の因子分析の結果から、毎時間の授業実践で有効に活用するために各因子から12項目ずつ選択し、実技各教科の授業評価票(案)の作成を行った。作成した韓国の実技教科授業評価票(案)は日本韓国の実技教科授業を分析する一つの基準となり、現場実践研究において日韓授業比較や研究者間、教師間の研究討議に有効に活用される調査票になると考えている。本研究は、音楽科、図画工作科、家庭科、体育科のいわゆる「実技教科」において、教科相対的ならびに教科横断的な視野から、日韓の比較調査研究において、学校における「実技教科」授業において、子どもたちはどのような「学び」を実際に形成しているのかを、学習者の持つ教科観から明らかにすることを目的としている。H23年度は、研究最終年にあたり、初年度、次年度に実施した韓国小学生の実技教科授業の学び経験構造(課題1)と日本の小学生を対象にした実技教科授業経験構造を基に作成した韓国と日本の実技教科授業評価票(音楽、図画工作、家庭、体育)を用いて、日韓の実技教科授業を1単元授業実施し、子どもの学びの経験比較分析(課題2)を行った。子どもたちの教科観には実技各教科で授業経験構造から多くの共通点が存在しているが、学習経験としての学びは、各実技教科授業の子どもたちの授業評価から相違が見られることを明らかした。

また日韓実技教科授業実践の結果分析について、日韓の研究者によるシンポジウム(「日韓国際シンポジウム」2012.02.03)を開催し、日韓実技教科授業の特徴や実技教科の関連性、個別性などについて討議を行った。さらに韓国・春川教育大学を訪問し、近年の韓国の教育事情について情報収集を行った。これまでの日韓教育比較研究についての活動や成果についてウェブページを日本語と韓国語で作成し、公表している。(www.nikkankyokakyofku.info)ウェブページを日本語、韓国語で開設することにより、日韓実技教科授業に関する活動や成果を日韓で共有することができ、今後のさらなる日韓教科授業実践の交流に役立つ資料となるものと考えている。
原発被災市町村復興の担い手となる壮年期男性への生活と健康に関する支援方法の構築

本年度は、原発災害により被災し長期の避難生活を送る壮年期男性(以下、被災群)と被災していない壮年期男性(以下、非被災群)の睡眠とストレスを比較することを目的に、非被災群10名の睡眠とストレスに関するデータ収集を行い、その結果を分析した。今回収集した非被災群のデータを、以前に収集した被災群のデータ(仮設住宅居住時及び復興住宅居住時)と比較するためにMann-WhitneyのU検定を用いて分析した(p<0.05)。その結果、非被災群と復興住宅居住時の被災群では、睡眠とストレスに有意差は認められなかった。一方で、非被災群と仮設住宅居住時の被災群では、PSQI総得点(p=0.039)及びPSQI下位尺度睡眠時間(p=0.006)及びSleep Latency(p=0.034)において有意差が認められた。これらのことから、原発災害により長期の避難生活を送る壮年期男性の仮設住宅居住時の睡眠は被災し避難していない一般の壮年期男性と比較して、有意に悪いことが明らかになった。研究計画に沿って調査を実施した。対照群としての一般壮年期男性の睡眠とストレスのデータを収集し、被災者群と比較することができた。復興住宅での避難生活の長期化に伴って対象者の睡眠とストレスにどのような変化がみられるのか、またそれらに影響を及ぼす要因を明らかにするために、引き続き睡眠とストレスに関するデータ収集を行っていく。次年度使用額が生じた理由は唾液ストレスバイオマーカー受託分析費が前年度より値上がりし今年度予算では不足したため次年度に予定することにしたからである。次年度の使用計画は、旅費(研究成果発表、データ収集のための現地訪問)、人件費(謝金、翻訳費)、その他(唾液ストレスバイオマーカー受託分析費、脳波解析受託費、研究成果発表、通信費)に使用する予定である。
高配位有機リン化合物の合成と反応

トリス(2.6-ジメトキシフェニル)ホスフィンオキシド(2.6)_3PO[(2.6)=2.6-(MeO)_2C_6H_3]は二塩化ジメチルスズMe_2SnCl_2と1:1錯体しか形成しない。X-線結晶解析の結果、Me_2SnCl_2の錯体には珍しい5配位(三角両錐)構造をしており、MeO基酸素のスズへの配位はないことが分った。Sn-O距離[2.205A]はこれまでに報告のある他の錯体のSn-L(O-donor)距離[2.27-2.56A]よりかなり短く、(2.6)_3POの配位が強いことが分る。P=O結合距離は1.513Aであった。(2.6)_3とトルエンからも一水和物として結晶化する。この無水物はPh_3PSには見られない高い求核性を有し、塩化ブチルとも容易に反応してアルキルチオホスホニウム塩[(2.6)_3P-SBu]Clを生成する。また、Ph_3PSがMe_2SnCl_2と錯体を形成しないのに対し、(2.6)_3PSは1:1錯体を形成する。X一線結晶解析の結果、(2.6)_3PS.H_2OのP=S距離[1.971A]はこれまでの解析例中でも最も長いことが分った。また、P-C距離[1.845,1.842,1.833A]もPh_3PSのそれ[平均1.817A]よりかなり長い。結晶水の酸素原子は(2.6)_3PSのイオウ原子の近傍に存在し[S---O距離3.365A]、両分子が水素結合をしている可能性が高い。[(2.6)_3P-OH]ClO_4は各種のアミンと1:1付加体として共晶する。この付加体のX一線結晶解析を行ったところ、P-O-H-N結合のO---N距離が2.65(2)Aとかなり短いことが分った。また、いずれも6つのMeO基酸素とリンとの原子間距離がvan der Waals'半径の和[3.3A]よりも短く、MeO基酸素がリン原子へ配位していると考えられる。この結果、P=O酸素原子やP=Sイオウ原子上の電子密度が増加し、これらのルイス塩基性を高めていると考えられる。
尿路の機械受容体はTRPイオンチヤネルと上皮型ナトリウムチヤネルのいずれか?

1)ヒト尿路性器組織における自律神経受容体を介した遠心性および求心性神経伝達機構のなかで交感神経α1受容体、バニロイド受容体、一酸化窒素に関するものおよび細胞内伝達機構のうちの脱感作機構についていくつかの知見を得て、公表した。2)ラット膀胱上皮に発現するENaCが、伸展刺激による膀胱上皮からのATP放出をコントロールすることにより膀胱求心性情報伝達に関与している可能性を証明した(Du et al.,投稿中)。またヒト膀胱上皮におけるENaCの発現をはじめて証明し、過活動膀胱を伴う閉塞膀胱(前立腺肥大症)において上皮のENaCがup-regulateされることから、過活動膀胱発生メカニズメムに対するENaCの関与を示唆する報告を行い(Araki et al,2004)、特許を取得した。3)ヒト膀胱での大コンダクタンスCa^<2+>感受性K^+チャネル(BKチャネル)BKチャネルサブユニットの発現形式、膀胱出口部閉塞(BOO)に関連する変化について、下部尿路閉塞(以下BOO)のない非閉塞膀胱と前立腺肥大症による閉塞(BOO)膀胱を用いて、RT-PCR法を用いて、BKチャネルサブユニット(α、β1,2,3,4)の遺伝子発現と、BKチャネル蛋白の局在と発現を調べた。その結果、膀胱粘膜、筋層ともにα、β1サブユニット遺伝子の存在を認め、筋層により多く発現した(α:p=0.005,β1:p=0.0001)。BOO群では粘膜、筋層どちらも発現レベルが有意に低下していた(粘膜α:p:0.03,β1=p=0.02、筋層α:p=0.0003,β1:p=0.0003)。免疫組織化学的検索ではBKα、BKβ蛋白が粘膜下層と筋層に観察され、BOO群の筋層での発現が少ない傾向がみられた。以上から、BOOによって起こる過活動膀胱にはBKチャネル量の減少が関与していることが示唆された。現在、ASIC, TRPV1,TRPM8,TRPA1などの膀胱における発現および機能的役割についての予備的実験が進行中であり、すでに一定の成果を得ている。対象および方法:1)ヒトにおける検討:非閉塞状態のヒト膀胱上皮とOAB症状を呈するヒト前立腺肥大症患者の膀胱上皮を用いた。ENaCのサブユニットに対する抗体を用いた免疫組織学的検討によるタンパク質発現と、定量的RT/PCR法によるmRNA発現を調べた。2)ラットにおける検討(in vitro):非閉塞状態の雌ラット膀胱上皮と下部尿路不完全閉塞を作成した雌ラット膀胱上皮を用いだ。結果:1)ヒトにおける検討:ヒト膀胱におけるENaCのサブユニット(α、β、γ)のたんぱく質の発現を認めた。閉塞膀胱では非閉塞状態のヒト膀胱上皮と比較して、ENaCのサブユニットのmRNAの発現が著明に亢進していた(Urology,64:1255-1260,2004)。2)ラットにおける検討(in vitro):ラット膀胱におけるENaCのサブユニット(α、β、γ)のたんぱく質の発現を認めたが、閉塞膀胱と非閉塞状態のラット膀胱上皮とでは、ENaCのサブユニットのmRNAの発現に差がなかった。
スピン転移による電界発光消失の機構解明

Chlorophyll aを発光分子とする有機電界発光素子に、スピンクロスオーバー錯体である[Fe(dpp)2](BF4)2を導入すると、低温でのスピン転移に伴い電界発光が消失する。この新規現象について、複数の発光分子の利用やキャリアブロック層を導入した素子を作製することで、電界発光の消失が、スピン転移による分子軌道準位の変化が発光分子への電子注入を阻害することによって引き起こされるものであることを明らかにした。この新規現象の機構解明のため、ITOと活性層の間に電子ブロック層として働くことが期待できるPVK(poly-(N-vinylcarbazole))を導入したITO/PVK/[Fe(dpp)2](BF4)2:Chl a/Al構造の素子、Chl aの代わりにNile Redを発光分子として導入した素子などの複数の素子を作製し、電界発光特性の温度依存性測定を行った。結果として、ITO/[Fe(dpp)2](BF4)2:Chla/Al構造の素子におけるスピン転移に伴う電界発光の消失は、スピン転移による分子軌道準位の変化が発光分子への電子注入を阻害することによって引き起こされるものであることを明らかにした。このような機構による有機薄膜素子の特性変調は他に報告がない。分子軌道エネルギーの変化や、キャリア輸送特性の変化を利用した有機薄膜素子の特性制御はまったく未知の現象であり、その機構解明は化学・応用物理学的に意義が高い。本研究成果を基に新たな素子特性変調機構が確立されれば、基礎科学・応用科学の両面においてのブレークスルーとなり得るだろう。スピンクロスオーバー化合物の素子利用という点についても新しい観点を提供する研究成果が得られたと言える。最近、Chlorophyll aを発光分子とする有機電界発光素子に、スピンクロスオーバー錯体である[Fe(dpp)2](BF4)2を導入すると、低温でのスピン転移に伴い電界発光が消失するという他に例のない現象を見出した。同構造の薄膜における蛍光測定においてはChlorophyll aの発光は低温でも消失しないことから、電界発光の消失にはキャリア注入効率や輸送特性の変化が関わっていると考えられるがその詳細は明らかになっていない。本研究では、異なる構造の素子作製と、他のスピンクロスオーバー錯体や発光分子の利用、電気・磁気物性評価と分子軌道の考察という、デバイス作製の工夫と素子特性評価に多方面からアプローチすることによって、スピン転移による電界発光消失という新奇現象の発現機構解明を目指している。低温で[Fe(dpp)2](BF4)2が低スピン状態になりChlorophyll aの電界発光が消失した状態においては、Chlorophyll aの励起状態自体が形成されていないことを既に実験から確認しており、これは活性層に注入されたキャリアがChlorophyll aに入らず活性層を通り抜けていることを示唆する。そこで、キャリアブロック層を導入したところ、電子ブロック層を導入した際にChlorophyll aの発光が低温でも維持されることを見いだした。これは、活性層において電子がChlorophyll aに注入されない状況が電界発光の消失を引き起こしていることを意味する。他の発光材料として、電子輸送性材料を用いた場合には低温でのスピン転移後も電界発光が消失しない結果も得ており、上記のモデルを支持する。他の発光分子の利用、キャリアブロック層の導入についてはおおよそ当初予定通りに進んでいるが、スピンクロスオーバー錯体[Fe(dpp)2](BF4)2のスピン転移前後での分子軌道エネルギー変化についての考察が進んでいない。身近な手法としてサイクリックボルタメトリからの算出に取り組んだが、[Fe(dpp)2](BF4)2の酸化還元電位を観測することが難しく、エネルギー変化についての知見が得られていない。Chlorophyll aと類似構造を持つ、TetrabenzoporphyrineのMg錯体やPhthalocyanineのMg錯体を用いた素子作製を行う。いずれの発光材料もホール輸送性であるが、分子軌道レベルは大きく異なる。[Fe(dpp)2](BF4)2の電荷注入レベルとの相対的な位置が変われば、[Fe(dpp)2](BF4)2のスピン転移前後での発光の消失が観られなくなる可能性があり、[Fe(dpp)2](BF4)2のレベルについての知見が得られる。また、新たなスピンクロスオーバー錯体自身の設計を行い、スピン転移と電界発光の相関と新規現象についての探索を行う。研究費の大半は、材料購入費、電極材料購入費、合成器具購入費など消耗品の購入で消化する予定である。なお、今年度購入を予定していた透明電極が、取引業者の更生法適用により適わなかったため次年度使用額が発生している。素子作製には不可欠なものであるので、今年度執行する。
セリンプロテアーゼを介した酸化ストレス制御を標的としたCKD新規治療戦略の構築

我が国では、慢性腎臓病(CKD)の進展阻止による医療費の抑制が重要な医療課題となっている。申請者は、CKDモデルラットにおいてセリンプロテアーゼ阻害薬の一つであるカモスタット(CM)が抗酸化作用を発揮し、腎障害進展を抑制することを報告している。更に、最近得られた知見から、“CMのセリンプロテアーゼを介した酸化ストレス制御がCKDの腎障害進展を抑制したのでは"という考えに至った。本年度も引き続き培養細胞を用いた検討から酸化ストレス制御に関連するセリンプロテアーゼについて同定を試みた。まず、セリンプロテアーゼの一つであるFXaの阻害剤であるエドキサバンおよびFXaが活性化するPAR2の阻害剤であるFSLLRY-NH2を用いて、FXaによって誘導された酸化ストレスに対する細胞内抗酸化活性を評価した。その結果、エドキサバンおよびFSLLRY-NH2の両薬剤で、FXa誘導性の細胞内ROS産生が有意に減少し、FXa-PAR2経路が酸化ストレス産生に関与していることが示唆された。また、CMおよびセリンプロテアーゼの典型的な阻害剤であるアプロチニンを用いて、腎障害時に酸化ストレスとの関連が示されているインドキシル硫酸よって誘導された酸化ストレスに対する細胞内抗酸化活性を評価した。その結果、CMおよびアプロチニンの両薬剤で、IS誘導性の細胞内ROS産生の有意な減少が確認された。次年度は、CMとアプロチニンの酸化ストレスに対する作用の違いを比較し、酸化ストレス制御に関連するセリンプロテアーゼについて同定を進めていく。エドキサバンおよびFSLLRY-NH2を用いた検討から、FXa-PAR2経路が酸化ストレス産生に関与していることを明らかにすることができ、おおむね順調に進展していると感じている。FXa-PAR2経路が酸化ストレス産生に関与していることを明らかにすることができたが、様々なセリンプロテアーゼが存在するため、細胞実験及び動物実験の両側面から酸化ストレス産生に関与するその他のセリンプロテアーゼについて引き続き同定を進めていく。申請者は、CKDモデルラットにおいてセリンプロテアーゼ阻害薬の1つであるカモスタット(CM)が抗酸化作用を発揮し、腎障害進展を抑制することを報告している。本年度は、「CKDモデル動物へのCMの投与により、腎組織で発現量変化が生じるセリンプロテアーゼを同定する」ことを目的に検討を行った。CKDモデル動物としてアデニン誘発慢性腎不全モデルラットを用いて、1control群、2CKD群、3CKD+CM (200mg/kg)群の3群に分け、5週間の薬物投与を行った後、摘出した腎組織中で発現量変化が生じているセリンプロテアーゼの同定を試みた。しかしながら、CMによる腎障害の進展抑制効果は確認されたものの、腎組織中で発現量変化が生じているセリンプロテアーゼの同定には至っていない。一方、CM以外の同効薬であるガベキサートメシル酸およびナファモスタットメシル酸が抗酸化作用を有しているのか確認したところ、ガベキサートメシル酸はラジカルスカベンジャー様の直接的な作用を有しないものの、培養細胞を用いた検討で酸化ストレスを抑制することが確認された。このことからも、セリンプロテアーゼを介し酸化ストレスが制御されている可能性が考えられ、次年度以降も酸化ストレス制御に関連するセリンプロテアーゼについて同定を試みていく。腎組織中で発現量変化が生じるセリンプロテアーゼの同定を試みたものの、変化が生じているセリンプロテアーゼの同定には至らなかった。しかしながら、CM以外の同効薬において、ラジカルスカベンジャー様の直接的な作用を有しないものの、培養細胞を用いた検討で酸化ストレスを抑制することが確認された。

エドキサバンおよびFSLLRY-NH2を用いた検討から、FXa-PAR2経路が酸化ストレス産生に関与していることを明らかにすることができ、おおむね順調に進展していると感じている。当初の解析方法では、腎組織中で発現量変化が生じるセリンプロテアーゼの同定ができていないことから、Zymography法とLC-MS/MSを組み合わせた解析方法などに切り替え、同定を試みる。また、同定したいセリンプロテアーゼが微量な可能性を考慮し解析するサンプルの増量、また、血中のセリンプロテアーゼである可能性を考慮し血清に関しても解析していく予定である。FXa-PAR2経路が酸化ストレス産生に関与していることを明らかにすることができたが、様々なセリンプロテアーゼが存在するため、細胞実験及び動物実験の両側面から酸化ストレス産生に関与するその他のセリンプロテアーゼについて引き続き同定を進めていく。
古いtRNAの分解と修飾ヌクレオチドの代謝

本研究では、寿命の長いRNAであるtRNAを取り上げ、タンパク質に見られるような傷害分子の非対称細胞分裂に従った非対称分配が見られるのか、分解の際に修飾ヌクレオチドがどう処理されるのか、の解析系を、出芽酵母を用いて構築した。この中で、分裂寿命の進んだ細胞を濃縮してtRNAの細胞内分布を調べたが、若い細胞との大きな差は見られなかった。他方、一過的なtRNA分解亢進状態を作り出して修飾ヌクレオチドの動態を調べるための温度感受性tRNA変異を単離した。また、傷害tRNAを含めたtRNAの核内輸送機構の解析から、酵母細胞質Hsp70の一つSsa2pが、tRNAの核内輸送担体であることを突き止めた。本年度は、出芽酵母の分裂の非対称性に着目した傷害tRNAの品質管理の違いの有無を解析するためのシステム構築を主眼とした。単細胞の出芽酵母においても分裂寿命が存在するが、いわゆる年老いた細胞(分裂能を失いつつある細胞)と若い細胞(母細胞から分裂したての細胞)とを比較する際、通常の増殖状態では前者の割合は極めて小さい。そこで、老いた細胞を濃縮する条件をまず検討した。このために、(1)酵母細胞の表面に細胞分裂後に残される出芽痕という構造がキチン質(GlcNAcポリマー)に富むことから、GlcNAc特異的レクチンであるWGA-Sepharoseにより出芽痕の多い細胞を分離する、(2)一度形成された酵母細胞壁は更新されないことを利用し、表層をビオチン化した細胞を一定時間増殖させたのち後にstreptavidin-beadsで回収する、の二つの方法を試みた。その結果、後者で多数回の分裂を経た酵母細胞を回収出来るめどがたった。ただし、tRNAの生化学的分析が可能であるほどの酵母を回収するには、より高効率の手法を採る必要も明らかとなった。一方、傷害tRNAを人為的に蓄積し、かつ、それを簡便に検出するために、8-oxoguanosine(8-oxo-G)という核酸の酸化傷害修飾に着目した。過酸化水素で酵母に酸化ストレスを与えた時、8-oxo-Gを持つtRNAが蓄積するかを抗8-oxo-G抗体を用いたNorthwestern blottingでの検出を試みたところ、時間依存に8-oxo-Gを含むtRNAが増えることが判った。この際、低分子rRNAである5S rRNAや5.8S rRNAには、通常の生育状態でも多くの8-oxo-Gが含まれることも判った。今後はtRNAに加え、これら低分子rRNAについても傷害RNAの酵母内での品質管理を解析してゆく予定である。出芽酵母の様な非対称分裂を行う真核生物では、タンパク質やオルガネラがその機能状態に応じて選別され、傷害を受けたものが若い細胞に分配されない仕組みが近年明らかにされてきた。しかし、傷害RNAに関してはそのような非対称分配・処分があるかは、誰も検討してこなかった。この可能性を検討するため、酵母細胞表面のビオチン化を利用して分裂寿命が進んだ「老いた」酵母細胞を濃縮し、老いた酵母におけるtRNAの細胞内分布や構造特性の検討を試みた。表面ビオチン化酵母の固定化アビジンによる回収効率に関してかなり詳細な条件検討を行い、全体で0.1%程度しか存在しない10回以上分裂を経た母細胞を10%以上まで濃縮することができたものの、それ以上の濃縮は出来なかった。また、娘細胞特異的に転写誘導されるHOプロモーターを用いた母細胞濃縮酵母株(Lindstorm & Gottschling, 2009)を用いた検討も行ったが、tRNAのFISH観察に適した培養条件では報告されている娘細胞特異的な細胞死誘導効率が得られなかった。これらに加え、必要なビオチン化試薬や固定化アビジンの費用面からも、異常修飾等のtRNAの化学的構造に関する生化学的な分析は断念せざるを得なかった。他方、表面ビオチン化法によって回収した酵母についてのFISH解析では、出芽痕の数によって明らかに分裂寿命の進んだ酵母をより分けて観察することが可能であった。tRNA-Proの分布比較では、こうした細胞と分裂直後の細胞が多数を占める通常の培養状態と大きな違いは見られなかった。現時点では、分裂寿命の若い細胞と寿命の進んだ細胞でははっきりと違いが検出できなかったが、後者の細胞が明らかに肥大していることなどから、翻訳に弱いストレスをかけ続けて分裂寿命を進めた場合などでtRNA分布に違いが見られるか検討する必要があると考えられる。老いた細胞の効率のよい回収システムの構築に時間がかかったため、進捗には多少の遅れがある。しかし、下記に触れる新たな手法の導入を含め、本問題は解決の方向が見えている。

分子生物学・細胞生物学出芽時の母細胞のみを選択的に生存させる酵母変異株を開発したグループがある事から、H27年度ではこうした菌株を入手する事でより効率の良い解析系を構築し、研究計画のスピードアップを図る予定である。また、先にも述べたように、tRNAに加えて低分子rRNAで顕著な酸化傷害が発生するという結果も得られた。非対称分裂を行う際の母細胞と娘細胞の間での傷害tRNAの品質管理の違いとの比較対象としても、rRNAの状態を引き続き解析してゆく予定である。一部の執行額の端数分を除けば、研究進捗状況に示した通り、進捗に若干の遅れがあり、それに対応する形で一部消耗品関連の経費の執行を翌年度に延ばさざるを得なかったために生じた残額である。H27年度では、予定の研究計画の全体を遂行すべく、H26年度の積み残し実験を含めて研究の実施を急ぐ予定である。研究費についても、昨年度積み残しの計画分としてH27年度に合わせて執行する予定である。
パインアップル果実の糖・有機酸合成に関する研究

生食用パインアップル果実の品質を栽培環境の改善を通じて向上させることを目的として、平成56年度にかけて、季節によって大きく変動する品質の実体を、糖類、有機酸類、タンパク質、及び消化酵素ブロメラインに着目し比較検討した。また、貯蔵温度が品質に及ぼす影響に関しても調べ、ポストハーベストの問題点を明らかにした。さらに、代表的な沖縄の6品種に関しても上述の要素を調べ、良質パインアップルの条件を決定した。供試材料は、Ananas comosus(L.)Merr.であった。品種間比較ではSmooth caynneのN67-10、Cayenne×Queenのボゴール、Brancoのジュピ-及びペローラペルナンブコ、メイピア群のクリームの6種類を用いた。季節変動及びポストハーベストの実験にはN67-10を用いた。果実を上部、下部、芯部に3分割し、各部からの搾汁液を取り、HPLCを用いて糖及び有機酸類の測定を行った。Brix、滴定酸度、タンパク質、及びブロメライン活性も測定した。結果:品質の季節変動に関しては、Brix、滴定酸度、糖酸比、糖類、有機酸において両年とも同様の結果が得られた。また、果実上部と下部は同様な季節変化を示した。ブロメライン活性は、夏季に低く、冬期に高くなる傾向を示した。全タンパク質は、夏季に高く、冬期に低下する傾向を示した。品種間比較では、良質のパインアップルとして評判のN67-10が、ブロメライン活性もタンパク質も低かった。比活性でみても他の品種に比べ低い値を示した。以上より、良質パインアップルの条件として、生重1g当り100mg以上の糖と5mg程度の有機酸を含み、甘味と酸味のバランスがとれ、さらに、ブロメライン活性の低いものといえる。収穫後の貯蔵温度の違いが品質に及ぼす影響を調べたところ、4°C保存では糖類はやや増加し、全有機酸は大きな変化を示さなかった。しかし、中でもリンゴ酸が顕著に増加し、低温による影響のひとつとして示された。その他、15°C保存、室温保存の場合、全糖及び有機酸において貯蔵期間中糖酸比が低下する方向に大きく変化した。従って、パインアップルの貯蔵適温は低温ほど品質の変化が少なく、かつ後熟(追熟)タイプの果実ではないことが示され、収穫後はできるだけ早い機会に食べるほうが良いと言える。輸入品は長期低温にさらされ品質の低下を免れないが、沖縄のパインアップル産業はその点を強調すれば生き残りは可能であると考えられる。生食用パインアップル果実の品質を栽培条件の改善を通じて向上させることを目的として、まず季節によって大きく変動する品質の実体を、糖類及び有機酸類に着目し比較検討した。供試材料はAnanascomosus(L.)Merr.cv.Smooth caynne、系統N67-10を用いた。

サンプルは、まず縦に4等分し、相対する果実切片の一対から各々の上部と下部の約2cmを切り、果肉部分の搾汁液を取り、島津製HPLCを用いて糖及び有機酸類の測定を行った。また同時に、Brix及び滴定酸度も測定した。また、収穫後の貯蔵温度が果実の品質に及ぼす影響についても同様に検討した。結果:Brixは5月から7月まで上昇し、その後10月頃まで一定の傾向を示した。滴定酸度は、5月頃高く、その後低下し7月下旬頃最小値を示し、再び上昇に転じた。従って、糖酸比は7月下旬にピークがあり、春期及び秋期には低下する傾向を示した。果実の上部及び下部では同様の変化を示したが、Brix及び糖酸比の絶対値は果実下部の方が高く、滴定酸度は上下部でほぼ同じ値を示した。糖類の季節変化をみると、シュークロースは、5月に上昇し、その後一定の傾向を示したが、10月に下部で一時的に上昇する傾向が認められた。フラクトース及びガラクトースは5月下旬ごろピークに達し、7月下旬ごろ最小値に、その後再び上昇する傾向を示した。全糖は、5月下旬にピークに達し、7月下旬ごろ低下し、秋に再び上昇する傾向を示した。果実下部と上部とでは傾向は似ているものの絶対値は著しく異なった。従って、本系統の果実は、部位によっても糖含量は均一でないことが伺える。有機酸は、果実上部と下部とでほぼ同様な季節変化を示し、また絶対値においても大きな差は認められなかった。7月下旬頃に最小値を示すV字形変化を示した。全糖と全有機酸の比を前述の糖酸比とを比較すると、両者はほぼ同様な傾向を示した。これらの比には、糖類よりも有機酸特にクエン酸が大きく関与していることが示された。収穫後の貯蔵温度の違いが品質に及ぼす影響を調べたところ、4°C保存ではグルコース及びフラクトースが6日目頃から上昇したが、シュークロースは15°C、エチレン+室温及び4°C保存では8日まで大きな変化は認められなかった。しかし、室温保存は全糖で明かのように、2日目以降急激に低下しているのがわかる。有機酸は、15°C及び4°C保存で貯蔵期間中大きな変化は示さず、24°C及びエチレン区で急激な低下が観察された。従って、パインアップルの貯蔵適温は低温ほど品質の変化が少なく、かつ後熟(追熟)タイプの果実ではないことが示され、収穫後はできるだけ早い機会に食べる方が良いと考えられた。生食用パインアップル果実の品質を栽培条件の改善を通じて向上させることを目的として、昨年と同様、季節によって大きく変動する品質の実体を、糖類、有機酸類、タンパク質、及び消化酵素ブロメラインに着目し比較検討した。また、貯蔵温度が品質に及ぼす影響に関しても調べ、ポストハーベストの問題点を明らかにした。さらに、代表的な沖縄の6品種に関しても上述の要素を調べ、良質パインアップルの条件を決定した。供試材料は、Ananas comosus (L.)Merr.であった。品種間比較の実験ではSmooth caynneのN67-10、Cayenne×Queenのボゴール、Brancoジュピ-及びペローラペルナンブコ、メイピア群のクリームの6種類を用いた。季節変動及びポストハーベストの実験ではN67-10を用いた。果実を上部、下部、芯部に3分割し、各部からの搾汁液を取り、HPLCを用いて糖及び有機酸類の測定を行った。
準弾性散乱による高励起高運動量状態での集団運動および有効相互作用の研究

準弾性散乱領域のスピン・アイソスピン・モードの励起について、核構造、核反応の両面から理論的解析を行った。LAMPF,Copenhagenの実験グループと協力し、実験の解析を行った。I)構造面:アイソベクトル・縦および横スピン応答関数を直交条件付き連続RPA法で計算した。単純殻模型、核相関をTamm-Dancoff近似、Ring近似で取り入れた場合、Δ粒子励起を取り入れた場合を比較し、それぞれの影響を調べた。新たに考慮したのは以下の点である。a)相互作用を規定するLandau-Migdal parameterに対するuniversalityの仮定(g'_<NN>=g'_<NΔ>=g'_<ΔΔ>)を用いず解析した。b)核ポテンシャルの非局所性を有効質量の方法で取り入れた。c)粒子空孔状態に対する分散幅の効果を取り入れた。d)ρメソンの質量の核内変化の影響を調べた。e)和則を用いてRPA以上の相関の影響を評価した。II)反応面:^<12>C,^<40Ca>(p^^-,n^^-),(e,e')反応を歪曲波インパルス近似(DWIA)で解析した。従来より進んだのは以下の点である。a)universalityの仮定を用いない応答関数による反応計算を可能とした。b)核子・核子散乱t行列の全ての項の干渉が取り入れられた。c)入射粒子を複合粒子とする反応C(d^^-,2p)をグラウバ-近似で解析した。これら解析の結果、(e,e')散乱より評価される横スピン応答函数は、交換電流やRPA以上の相関が入ればある程度理論的に再現されるが、(p^^-,n^^-)反応の解析で得られるものは、実験値が理論値より2倍も大きいという困難に直面した。縦スピン応答関数は、(p^^-,n^^-)反応のみから抽出されるが、大きさはある程度再現された。準弾性散乱領域のスピン・アイソスピン・モードの励起について、次のような理論的解析を行った。a)スピン・アイソスピン・モードに対する応答関数が、Δ粒子励起によってどの様な変更を受けるか、それがNh-Δh間相互作用にどの様に依存するか調べた。これらのg′を独立に変えて計算を行い、応答函数のエネルギースペクトルが、準弾性散乱領域においても、Δの自由度の導入により大きな影響を受ける事、g′_<NN>だけでなくg′_<NΔ>にも強く依存している事、したがって、定量的解析には、g′_<NΔ>の値が極めて重要である事を示した。また、ρメソンの質量依存性も調べた。その結果を、(e,e′)散乱で得られたアイソベクトルスピン横波応答函数と比較した。b)一方、(p,n)のようなハドロン反応の解析には、これまで歪曲波インパルス近似(DWIA)計算を、universality ansatzの下でのOCRPAと併せて行ってきた。今年度は、従来取り扱えなかった、核子-核子散乱t-行列のスピンスカラー項とスピン軌道項を含め、他の項との干渉のまで入れて計算できるようにした。その結果、今まで出来なかったAnalyzing Powerの信頼性ある計算が佳能となり、LAMPFやRCNPのデータも再現できた。偏極移行量から求められる縦波/横波応答の比は、核内相互作用によって大きく変わり、その決定に有用である。しかしながら、断面積のエネルギー

スペクトルは、改善されたものの依然として過小評価をしており、この改善にはuniversality ansatzを用いない計算が望まれ、次年度の目標となる。準弾性散乱領域のスピン・アイソスピン・モードの励起について、次のような解析を行った。a)スピン・アイソスピン・モードに対する原子核の応答関数が、核相関のない単純な殻模型で計算した場合、核相関をTamm-Dancoff近似で取り入れた場合、RPAの近似であるRing近似で取り入れた場合、△粒子励起の効果を取り入れた場合に、それぞれどの様な影響を受けるかを分析した。さらに、和則を用いてRing近似以上の相関を取り入れた場合とも比較した。一般にRing近似以上の相関が重要であること、縦スピン応答関数のenhancementには△粒子の影響が顕著であることなどが明らかになった。また、この結果が核子、空孔有効相互作用、核子、空孔-△・空孔遷移有効相互作用にどの様に依存するも調べた。その際、よく用いられるLandau-Migdal parameterに対するg′_<NN>=g′_<N△>=g′_<△△>という「universalityの仮定」は用いず解析した。b)(p,n)反応のような核子反応の解析に、これまで歪曲波インパルス近似(DWIA)計算を、universalityの仮定の下での直交条件つき連続RPA法と併せて行ってきたが、今年度はuniversalityの仮定を用いずに計算できるようにプログラムを改良した。c)これらの発展を踏まえて、^<12>C,^<40>Ca(p^^→,n^^→),(e,e′)の解析を行った。(e,e′)散乱よ評価されるアイソベクトル・スピン横応答函数は、交換電流やRPA以上の相関が入っていないことを考慮すると、ある程度理論的に再現されたといえるが、(p^^→,n^^→)反応の解析で得られるものは、実験値が理論値より2倍も大きいという困難に直面した。一方、アイソベクトル・スピン縦応答関数は(p^^→,n^^→)反応のみから抽出されるが、大きさはある程度再現できた。(p^^→,n^^→)反応で得られるスピン横応答函数が異常に大きい理由を明らかにすることが今後の大きな課題である。準弾性散乱領域のスピン・アイソスピン・モードの励起について、核構造、核反応の両面から理論的解析を行った。LAMPF,Copenhagenの実験グループと協力し、実験の解析を行った。I)構造面:アイソベクトル・縦および横スピン応答関数を直交条件付き連続RPA法で計算した。単純穀模型、核相関をTamm-Dancoff近似、Ring近似で取り入れた場合、Δ粒子励起を取り入れた場合を比較し、それぞれの影響を調べた。以下の天を新たに考慮した。a)相互作用を規定するLandau-Migdal parameterに対するg′_<NN>=g′_<NΔ>=g′_<ΔΔ>という「universalityの仮定」を用いず解析した。b)核ポテンシャルの非局所性を有効質量の方法で取り入れた。c)粒子空港状態に対する分散幅の効果を取り入れた。d)pメソンの核内変化を調べた。e)和則を用いてRing近似以上の相関の影響を評価した。II)反応面:^<12>
膠原病患者に対するセルフマネジメントプログラムの開発とその効果に関する研究

1)膠原病友の会・佐賀県支部の会員のうち承諾が得られた患者に対して、患者の保健行動・自己管理に関するニーズを把握するために、アンケート調査を行った。その結果、うつやストレスの管理、運動について、栄養についてなどスタンフォード大学で開発された内容とほとんど同じ結果であった。また、膠原病は病因も明らかではなく長い間病気と共に生きていく必要があるため、自己管理に関する患者のニーズは高かった。2)米国で開発され、世界10ヶ国以上で導入されているセルフマネジメントプログラムを行うためには、マスタートレーナーの資格を取得する必要があったため、平成17年8月8日8月13日米国スタンフォード大学にて5.5日間の研修を受講し資格を取得した。研修は、世界各国から30名の受講者が参加し、リーダー2名による講義と受講者同士のディスカッションで進められた。また、決められたことを一方的に指導するのではなく、受講者が自分に必要なことを自分で理解し、学べるよう、リラックスした開放的な雰囲気のなかで行われた。プログラムは、マニュアルがあり、原則としてマニュアル通りに行うよう指導され、国の文化などによりマニュアルの改訂が必要な場合は、スタンフォード大学に許可を得る必要があることが明らかになった。さらに、2005年3月、日本国内の患者会、製薬企業団体などが任意で集まりセルフマネジメントプログラム導入プロジェクトが発足し、現在NPO法人となっている。3)リーダー2名でセルフマネジメントプログラムを行う必要があるため膠原病友の会・佐賀県支部の患者1名を上記NPO法人で開催されたリーダー研修に参加し、リーダーの資格を取得してもらった。今後膠原病患者に対してプログラムに沿った介入を行い、介入前・中・後に痛み、抑うつ、Self-efficacy、疾患活動性、合併症、検査データなどを比較し、その効果を検討する予定である。
船底防汚塗料候補物質含ハロゲン化合物の酵素反応による合成

含ハロゲン化合物であるローレンシンを生産するウラソゾから、その生合成酵素の一つとして環化と臭素化を触媒するバナジウム依存型ブロモペルオキシダーゼのクローニングに成功し、組換え酵素を用いてその臭素化活性を明らかにした。含ハロゲンセスキテルペノイドであるローリンテロールを生産するミツデソゾから、バナジウム依存型ブロモペルオキシダーゼのクローニングに成功し、その性状を明らかにした。さらに、含ハロゲントリテルペノイドを生産するマギレソゾから、同酵素のクローニングに成功し、その性状を明らかにした。ブロモアレンを有するC15化合物であるオマエザレンの構造を報告すると共に、その全合成に成功した。船底防汚塗料開発の有力な候補物質として紅藻ソゾ由来の含ハロゲン化合物を選抜し、その中でも特に非テルペノイドC15化合物のローレンシンに着目し、その臭素化酵素を解明することを試みた。ウラソゾ由来バナジウム依存型プロモペルオキシダーゼ組換えタンパク質を大腸菌発現系により作製した。得られた組換えタンパク質をDE52陰イオン交換カラムクロマトグラフィーにより精製した。まず、ハロペルオキシダーゼの汎用的基質であるモノクロロジメドンを用いて性状を調べたところ、臭素付加活1生は、他の海藻のプロモペルオキシダーゼと同程度の強さであった。また、至適pHおよび温度耐性もほぼ同様であった。次に、ローレンシンの前駆体と推定されるローレジオールを天然ローレンシンの分解により調製し、それを基質としてウラソゾ由来バナジウム依存型プロモペルオキシダーゼの活性を調べた。その結果、LC/MSにより、ローレジオールに臭素付加し、環化反応が進んで得られるデアセチルローレンシンが酵素反応生成物として検出された。このことにより、組換えタンパク質として作製したウラソゾ由来バナジウム依存型プロモペルオキシダーゼが、ローレンシンの生合成において臭素化と環化を司る重要な酵素であることと認められた。以上の結果は、平成25年6月のマリンバイオテクノロジー学会大会で発表予定である。また、セスキテルペノイドであるローリンテロールを生産するミツデソゾからプロモペルオキシダーゼのクローニングに成功した。船底防汚塗料開発の有力な候補物質として選抜された紅藻ソゾ由来の含臭素非テルペノイドC15化合物のローレンシンの生合成に関わる臭素化酵素の解明に引き続き取り組んだ。天然藻体から酵素タンパク質の精製を試みたところ、MS/MS解析により、フィコエリスリンの混入がみられるものの、クローニングされた遺伝子から推定されるアミノ酸配列に一致するタンパク質が得られた。また、汎用基質であるMCDを使って反応を行ったところ、活性があることも確かめられた。これらの結果に加えて、天然の推定基質であるローレジオールに関する反応や推定立体構造などの検討を進めて、論文発表した。また、異なるC15化合物を生産するウラソゾ2株のバナジウム依存型ブロモペルオキシダーゼのクローニングにも成功し、その全長配列を決定した。セスキテルペノイドであるローリンテロールを生産するミツデソゾのブロモペルオキシダーゼの組み換えタンパク質を作製し、その酵素反応を調べた。その結果は学会発表した。紅藻ソゾ由来の含臭素化合物から船底防汚塗料開発候補としてオマエザレンを選抜し、生合成酵素研究を見据えて、全合成研究を行った。D-グルコースから合成した既知のアルデヒドから、E-オレフィンのブロモエーテル化反応による臭素原子を含む2連続不斉中心の立体選択的構築を鍵反応に、18段階でオマエザレンの全合成に成功した。その結果、オマエザレンの絶対立体配置を決定することができた。構造決定、付着阻害活性、生態毒性のデータと共にAngewandte Chemie International Editionに発表した。トリテルペノイドであるチルシフェロールを生産するマギレソゾからゲノムDNAを抽出し、インバースPCRによりマギレソゾのバナジウム依存型ブロモペルオキシダーゼ(LsVBPO)を取得した。C15化合物を生産するウラソゾやミツデソゾ由来のVBPOとの同一性は65%であり、バナジウム活性中心を校正するアミノ酸残基は良好に保存されていたものの、配列の差異が大きいことがわかった。ゲノムDNAからクローニングされたLsVBPOは、藻体で発現していることが確認された。そのPCR産物はゲノムDNA由来のLsVBPO全長配列に対して97%の同一性を示し、イントロンを含まないことが示された。大腸菌発現系でLsVBPO組み換えタンパク質を調製し、酵素の性状を調べた。臭素付加活性はウラソゾに比べて低く、至適pHや温度体制にも若干の差がみられた。また、透析・濃縮により失活するなど、ウラソゾのVBPOに比べて不安定であった。ハチジョウジマレンは、八丈島産未同定ソゾから単離されたブロモアレンを有する化合物である。タテジマフジツボに対する付着阻害活性はEC50が150 ng/mLと非常に強い。ハチジョウジマレンの構造についてデータを精査した上で、学会発表を行った。さらに、ハチジョウジマレンの全合成を目指してDーグルコースを出発物質としてヘミアセタールを合成し、1,3ージケトンとのカップリング反応を鍵反応とする合成計画をたて、カップリング反応の反応物の調製、モデル化合物による鍵反応の条件検討などを行った。トリテルペノイドであるチルシフェロールを生産するマギレソゾLaurencia saitoiの次世代シークエンサー(NGS)によるRNAseq解析から、網羅的に遺伝子配列を取得した。

これまで得られている別種のソゾの遺伝子配列情報との比較から、特有の生合成酵素を見いだすという試みは、混在する微細紅藻由来の遺伝子などにより非常に困難であった。しかしながら、前年度得られたバナジウム依存性ブロモペルオキシダーゼの配列に加えて、別の同酵素の配列が得られた。これは、既に報告しているウラソゾ由来LnVBPOに類似していた。ウラソゾとマギレソゾでは配列の差が大きい酵素が存在しているのではなく、どちらも配列の差が大きい2組の酵素が存在することが判明した。前年度に作製した組換えLsVBPOの精製条件を検討し、モノクロロジメドンによる臭素化活性試験において、より活性の高いタンパク質の精製に成功した。それでも、ウラソゾの酵素に比べると活性は低い。また、他の海藻由来のVBPOがpH 67で最大活性を示すのに対して、LsVBPOはpH 8で最大活性を示した。合成されたスクワレンエポキシドの供与を受け、ミツデソゾ、ウラソゾ、マギレソゾVBPO組み換えタンパク質を用いて反応させた。その結果、3種の酵素で反応性の違いが示唆され、種間や立体配置における反応性の違いを精査する必要があると考えられた。ハチジョウジマレンの全合成を目指して、13工程を経てβ-ヒドロキシケトンを合成し、その後ハチジョウジマレン骨格を合成するための反応を検討した。含ハロゲン化合物であるローレンシンを生産するウラソゾから、その生合成酵素の一つとして環化と臭素化を触媒するバナジウム依存型ブロモペルオキシダーゼのクローニングに成功し、組換え酵素を用いてその臭素化活性を明らかにした。含ハロゲンセスキテルペノイドであるローリンテロールを生産するミツデソゾから、バナジウム依存型ブロモペルオキシダーゼのクローニングに成功し、その性状を明らかにした。さらに、含ハロゲントリテルペノイドを生産するマギレソゾから、同酵素のクローニングに成功し、その性状を明らかにした。ブロモアレンを有するC15化合物であるオマエザレンの構造を報告すると共に、その全合成に成功した。当初予定通りトリテルペノイドを生産するマギレソゾのブロモペルオキシダーゼについて解析を進めることができた。また、ハチジョウジマレンの全合成研究も順調である。27年度が最終年度であるため、記入しない。海洋天然物化学次世代シークエンサーのデータも活用して生合成酵素研究をさらに加速させる。ローレンシンの臭素化と環化を制御するプロモペルオキシダーゼの組換えタンパク質により性状解析が順調に進み、平成25年6月に学会発表する予定であり、論文も現在執筆中である。ほぼ計画通りに進行している。ローレンシンを生産するウラソゾのブロモペルオキシダーゼは、本研究課題の最大の研究テーマであったが、まずはクローニングから酵素反応の解析までを終了して論文としてまとめることができた。また、他のソゾのブロモペルオキシダーゼの解析も順調に進んでいる。さらに、新たな研究ターゲットとしてオマエザレンをとりあげ、構造決定、活性評価、全合成を論文発表することができた。