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超短パルスレーザー励起ナノ構造生成のアト秒ダイナミクスとその応用

フェムト秒レーザーパルス照射によって誘電体,半導体,金属の表面に形成されるナノ周期構造の成長過程を超高時間分解追跡し,周期構造が表面プラズモン・ポラリトン(SPP)の励起で形成されることを実証した。構造形成の物理モデルを構築し,SPP励起過程を制御して大気中でナノ格子を能動的に創製できる新規のアブレーション手法の開発に成功した。また,同手法を基に短波長のレーザーを用いてナノ周期構造が微細化できることを検証した。以上により,レーザーを用いて,回折限界を超えるサイズのナノ格子を製作できる新規ナノプロセッシングの基礎を確立した。本研究の目的は,超短パルスレーザー照射による固体表面でのSPPの成長と緩和過程をアト秒時間分解能で追跡し,ナノ周期構造形成過程に関する独自モデルを実験的に検証することにより,レーザーによる初めてのナノプロセッシング手法を開拓することである。当該年度には,以下の研究を行った。fs秒レーザーを用いたポンプ・プローブ計測装置を開発し,半導体を主な標的とし,ポンプパルス照射に伴う表面の反射率の変化を超高時間分解測定することによって,周期ナノ構造形成の物理過程,及びその緩和過程を解明するための研究を行った。その結果,比較的融点の低い半導体表面の周期ナノ構造形成には,低フルーエンスでの多重パルス照射が必須であり,表面層の構造転移と界面で過渡的に励起される表面プラズモンポラリトン(SPP)によって構造形成が進展することを検証した。異なるフルーエンス,及び異なる照射環境下(大気中,水中)でポンプ・プローブ実験を行い,周期構造形成の緩和過程に関する初めての知見を得た。結果を応用して周期ナノ構造形成過程を制御する方法を実験的に検討し,誘電体(DLC,GaN)表面にほぼ完全なナノ格子構造を大気中で創製する手法の開発に成功し,ナノプロセッシング手法の開発指針を得た。一方,搬送波包絡線位相(CEP)安定化fsレーザー出力をポンプパルス,同レーザーを基本波として発生させる高次高調波をプローブパルスとするポンプ・プローブ計測装置の開発を進めた。高次高調波スペクトルを高速で観測できる計測装置を完成したが,5fsレーザー装置の動作不良により計画が大幅に遅れ,当該年度内に計画していた計測装置は完成しなかった。なお,海外の研究者(独)とモデル比較のための共同研究を継続した。本研究の目的は,超短パルスレーザー照射による固体表面での表面プラズモン・ポラリトン(SPP)の成長と緩和過程をアト秒時間分解能で追跡・解明し,固体表面でのナノ周期構造形成に関する物理モデルを構築することによって,世界初のレーザーナノプロセッシング法の基礎を開拓することである。H25年度には,従来のポンプ・プローブ法による測定を基に,ナノ周期構造形成・制御に関する以下の研究を行った。[1]誘電体や半導体と光学特性・物性が大きく異なる金属(SUS, Ti)をターゲットとして,ナノ周期構造成長過程の解明とその制御によるナノ格子創製の研究を行った。金属においても,レーザー波長以下の微細なナノ周期構造は,SPPの周期近接場によって形成されること検証すると共に,SPPとの競合過程を抑制するため,干渉ビームを用いる新しいナノ格子形成手法を開発した。[2]前年度までに開発した2ステップアブレーション法を基に,ナノ構造形成過程を検証すると共に,周期間隔dの100 nm以下への微細化を実現するため,Ti:sapphireレーザーの第3高調波(λ267 nm)を用いてGaN表面でのナノ格子形成の実験を行った。この励起レーザー波長の短波長化によって,λ800 nmでd = 180 - 230 nmであった間隔をd = 50 - 60 nmへ微細化できた。独自モデルによる理論計算の結果,SPP定在波モードの近接場周期とdは大変良く一致し,物理過程を解明することに成功した。[3]搬送波包絡線位相(CEP)を安定化した5 fsレーザーパルス(1 kHz)を用いてアト秒パルス発生の実験を行い,CEPに依存するアト秒パルス発生の特性と物理過程を明らかにした。以上により,ナノ周期構造形成過程の解明・制御,独自モデルの構築・検証,それらを基にしたナノ格子形成・制御手法の開発を実現し,レーザーによる世界初のナノプロセッシング手法の基礎を確立した。本研究の目的は,超短パルスレーザー照射による固体表面でのSPPの成長と緩和過程をアト秒時間分解能で追跡し,ナノ周期構造形成過程に関する独自モデルを実験的に検証することによって,レーザーによる初めてのナノプロセッシング手法を開拓することである。H24年度には以下の研究を行った。回折測定装置を開発し,サブミクロン間隔の格子を付与した金属と半導体表面を標的として反射率と回折特性変化を測定した。

ポンプパルスとして基本波(800 nm)及び第三高調波( 267 nm)を用いて,レーザーフルーエンスを変化させて,反射率と回折特性の角度分布を測定し,金とSi表面においてプラズモン・ポラリトンが励起されることを確認した。また,fs秒レーザーポンプ・プローブ実験装置を用いて,これまで未解明であった低フルーエンスの複数fsレーザーパルス照射の効果を解明した。ナノ周期構造形成過程のモデルを基に,相互作用過程を制御して固体表面に均一なナノ格子構造を創製するための2段階アブレーション手法を開発した。同手法を大気中のGaN結晶に適用し,均一な周期間隔を備えたナノ格子の創製に成功した。実験結果から,fsレーザーで単一モードのSPP定在波が励起され,周期的な近接場によってアブレーションが誘起されたことを検証した。以上により, SPP励起を制御して均一なナノ格子が形成できることを実証した。本成果を基に,任意の周期ナノ構造を形成するためのレーザープロセッシング手法の開発に向けた指針を明確化した。当初の目標をほぼ達成し,半導体標的について周期ナノ構造形成の主な物理過程を解明すると共に,非熱的な構造形成過程の条件を突き止めた。また,大気中でほぼ完全なナノ格子構造を加工する新手法を開発することに成功した。なお,SPP励起過程の簡易計測手法の開発は期待通りには実現できなかった。5fsレーザー装置の動作不良により,アト秒計測装置開発が遅れたが全体計画に大きな支障はない。25年度が最終年度であるため、記入しない。当初の目標をほぼ達成し,金属と半導体標的について周期ナノ構造形成の主な物理過程を解明すると共に,非熱的な構造形成過程の条件を解明した。2ステップのアブレーションによってSPP励起過程を制御することにより,大気中,マスクレスで固体表面に均一なナノ格子を直接創製する手法を開発した。なお,過渡回折によるSPP励起過程の時間分解測定の研究を継続すると共に,アト秒計測装置をほぼ完成させた。5fsレーザーと高次高調波発生によるコヒーレントEUVパルスを用いたポンプ・プローブ計測装置を完成し,SPP励起・緩和過程を直接的に時間分解計測する。結果と構築モデルを基に,周期ナノ構造形成過程の制御とそれを利用した完全ナノ格子加工手法を,半導体や金属,並びに他の誘電体に適用する。結果を基に,任意物質について周期間隔200nm以下のナノ格子・ナノドットを設計・加工できるレーザープロセッシング手法の開発研究を行う。5 fsレーザーで発生させたコヒーレントEUVパルスを用いて,SPP励起・緩和過程の時間分解計測を行う。結果を用いて,周期ナノ構造形成過程の制御とそれを利用した完全ナノ格子加工手法の基礎を確立し,周期間隔200 nm以下のナノ格子・ナノドットを設計・加工できるレーザープロセッシング手法の開発研究を行う。
マウスモデルを用いた消化器がん転移の研究

マウスの大腸がん細胞を脾注肝播種により転移させる移植系では、宿主骨髄系の細胞により二相反応が起き、前者の主要な細胞は好中球であり、後者ではFibrocytesであった。MMP9とMMP2双方がそれぞれの細胞により産生され、浸潤転移に必須の役割を果たす。Notchシグナル伝達により大腸がん細胞に誘導され、転移を促進する遺伝子の一つはDAB1で、このタンパクはABLキナーゼによりチロシンリン酸化され、逆にABLの自己リン酸化による活性化を促進する。その結果GEFタンパクTRIOのY2681残基がリン酸化され、患者の予後の悪さと有意に相関し、新規の予後予測マーカーとなる。本プロジェクトでは二つの中心課題を据えている。すなわち、1。大腸がんの浸潤、転移におけるケモカインCCL15と受容体CCR1の役割、及び2。Notchシグナル伝達経路による大腸がん浸潤、転移促進機構の研究である。1。については、1-1として、マウスで確立した上記メカニズムが実際にヒトでも作用していることを確認するために、ヒトの大腸がん培養細胞を用いた分子機構の解析と手術標本を用いた検索を行い、このことを確認した。(Itatani et al., Gastroenterol. 145: 1064-75, 2013).また、1-2として、ヒトCCR1遺伝子の発現制御域の上流をBacterial Aartificial Chromosomeより分離し、下流にmCherry蛍光タンパク発現ベクターを繋いでtransgenic (Tg) miceを作出し、このTg-miceを用いてCCR1発現細胞をFACSにて分離し、詳細な解析を行い、結果を原稿にまとめている(投稿準備中)。1-3として、Aesの発現制御に付いても、解析を進め、現在論文原稿を準備中である。2。については、Notchシグナル伝達の下流で誘導される遺伝子を同定し、さらにその下流で浸潤、転移に直接関わるタンパクを数種同定した。その結果、これらのうち一つの修飾が300例を超える大腸がん患者の手術標本の検索で予後と極めて強い相関をしめした(P < 0.01)。これに基づき、このタンパク修飾(ここではMarkerXとする)を診断マーカーとして特許を申請し、PCT出願による国際特許出願に関しても、JSTによる資金援助を頂くことが決まり、現在PCTの作業中である。また、学術的結果についても、論文を準備、投稿中である。即ち、1)大腸がんの浸潤、転移におけるケモカインCCL15と受容体CCR1の役割、及び、2)Notchシグナル伝達経路による大腸がん浸潤、転移促進機構の研究である。以下の10.で詳述するが、概要としては以下に要約される。2.については、我々が発見した大腸がん転移抑制遺伝子Aesの作用機構の解明を進め、Notchシグナル伝達により、下流では、Notch-Dab1-Abl-Trio-Rhoの流れで活性化が起きること、TiroのY2681チロシン残基のリン酸化(pY2681)が,がん患者の生存率に大きな影響を及ぼし、診断に使える事や、Abl阻害薬による、補助化学療法による転移予防治療の可能性が大きく示唆された(Sonoshita et al. Cancer Discovery 5:198-211, 2015)。消化器がんは、がんの中でも最も死亡率が高い。死因の殆どは遠隔転移によるため、その機序の解明と予防・治療法の確立が急務である。本研究では、我々がこれまでにマウスモデルを駆使して得た知見を更に発展させ、大腸がんの転移を抑制するための新たな治療標的を目標とする。具体的には、以下の2項目を研究した。1、大腸がん浸潤・転移におけるCCL15ケモカインの役割:先に発表した結果では、ヒトの大腸がん肝転移巣においてもマウスと同様なCCR1受容体を発現する骨髄由来細胞の存在を確認したが、さらにこれらの細胞を免疫染色による解析を行い、CCR1を発現しCCL15に応答する細胞の実体を詳しく解析した。SMAD4変異の大腸がんではそれらは骨髄由来抑制細胞(MDSC)であることを見いだした。(In press.)。さらに、マウスゲノムのCcr1遺伝子プロモーターの下流に膜繋留蛍光タンパクを発現するトランスジェニックマウスを作出し、初期の転移巣に出現するCCR1発現細胞がMMP9陽性の好中球であり、その後にMMP2陽性のフィブロサイトが集簇することを見いだした(Clin. Exp. Metastasis 2014)。2、Notchシグナル伝達経路による大腸がん浸潤・転移促進機構:大腸がん浸潤を支配する分子機構を同定し最近発表した(Cancer Discovery 2015)。この発見の臨床意義を深めるため、加えて胃がん肺がんなどにおける役割を発見すると同時に、治療的介入により大腸がん転移の患者の予後改善を試みる治療戦略の開発研究を行った。またTrio(pY2681)に対するポリクローナル抗体をモノクローナル化し、力価特異性とも大幅に改善した。治療薬評価のためモデルマウスを再構築(ApcD716→ApcFlox)中である。さらに、転移抑制遺伝子Aesの発現を支配する機構を調べ、論文を投稿した。

Notchシグナル伝達により大腸がん細胞に誘導され、転移を促進する遺伝子の一つはDAB1で、このタンパクはABLキナーゼによりチロシンリン酸化され、逆にABLの自己リン酸化による活性化を促進する。その結果GEFタンパクTRIOのY2681残基がリン酸化され、患者の予後の悪さと有意に相関し、新規の予後予測マーカーとなる。2.については、Notchシグナル伝達による転写で産生される転移に重要な分子はDab1であること、このDab1のチロシン残基はAblキナーゼにより燐酸化され、リン酸化Dab1は逆にアダプターとしてAblの自己燐酸化と活性化を促進する事を解明した。さらにAblの標的として大腸がん浸潤・転移に重要なのはGEFタンパクであるTrioであり、Y2681チロシン残基のリン酸化(pY2681)がRho-GEFを活性化することを証明した。そこで、京大病院で腫瘍の摘出手術を受けた337例のを解析したところ、pY2681陽性患者は陰性患者にくらべて著しく予後が悪いことが判明した(p<0.001)。この検査を利用すれば患者の予後を判定でき、更にAbl阻害薬による化学療法で転移予防治療が可能になろう(Sonoshita et al. Cancer Discovery 5:198-211, 2015)。27年度が最終年度であるため、記入しない。実験病理学1.のCCR1受容体とCCL15 (CCL9)リガンドの役割について、マウスとヒトでは受容体の発現細胞や組織が微妙に異なる事を見いだしたので、その差異を踏まえつつ、臨床応用に持って行くための、研究を更に進める。すなわち、マウスモデルと手術標本の双方を並行して解析し、マウスから得られた結果を臨床例で確認しながら、臨床応用の可能性を探求する。2.については、Trio(pY2681)の臨床診断への応用性が確立したので、これらの知見を深めるために、大腸がんについては、京大病院だけでなく、複数の他施設の手術例について検索を行い、また胃がん、肺がんでのデータも症例増やして多角的検討を行う。上記のように、本プロジェクトは予定していた項目に付いて着実に成果がでており、それらを論文としてまとめて居り、一部は既発表、一部は投稿中、更に一部は投稿準備中である。また、結果が臨床応用として重要な診断法に繋がるため、特許も申請し、PCTによる国際出願も進行中である。現在進行中の成果をまとめ、論文として発表することに加え、特許申請で確保された権利を有効利用するため、この診断法の事業化を考慮中で、そのためには別途の開発資金が必要になると思われる。未発表の成果であるが、この診断マーカーは大腸がんだけでなく、胃がん、肺がんなど他のタイプのがんでもそれぞれ200例、300例を越す手術標本での検索を終了しており、有用な予後マーカーとなるデータを得ている。従って、この基礎研究の成果を臨床研究に結び付ける方向を計画している。
レドックス制御機構としてのメチル化ダイナミクスーがん細胞転移の分子機序の解明ー

前年度の研究成果をもとに、本年度ではヒト単球系細胞株(THP-1細胞)およびヒト乳がん細胞株(MDA-MB-231細胞およびMCF7細胞)におけるsuperoxide dismutase 3(SOD3)発現制御機構としてのエピジェネティクスの関与を詳細に解析した。前年度では転写因子FOXO1のノックダウンにより、ホルボールエステル(TPA)誘導性SOD3発現増大が抑制されることを見出したため、今年度は、FOXO1の過剰発現プラスミドを作成し、FOXO1過剰発現細胞におけるSOD3発現を解析した。その結果、当初の期待通りにSOD3発現のさらなる亢進が認められた。また、ChIP法によりSOD3遺伝子プロモーター領域におけるFOXO1の結合を解析したところ、TPA処理細胞においてその結合度の増大が認められた。また、本傾向はヒト乳がん細胞株を用いた実験系においても認められた。以上より、FOXO1はSOD3の直接的な転写因子として機能し、その発現を正に制御していると考えられた。一方、FOXO1のメチル化をIP法にて解析したが、有意なメチル化レベルの増大は認められなかった。次に、ヒト乳がん細胞株におけるSOD3発現へのエピジェネティクスの関与を解析した。前年度では、低酸素環境下のMDA-MB-231細胞におけるSOD3遺伝子のDNAメチル化の変化を検出することができなかったため、DNAメチル化に必要となる鉄イオン添加の影響を解析した。しかし、鉄イオンの存在下においてもDNAメチル化レベルに有意な変化は認められなかった。また、SOD3発現レベルに応じた細胞遊走能を評価するために必要となる遊走実験の適正化を行った。その結果、MDA-MB-231細胞およびMCF7細胞それぞれの遊走性を適正に評価できる実験系を構築することができた。平成29年度および平成30年度の成果より、SOD3発現制御機構におけるFOXO1の関与は概ね実証できたと考える。現在、本成果をまとめた論文を執筆中である。また、SOD3発現レベルに応じたがん細胞遊走性を評価する実験系を適正に構築できた。このことから次年度以降、SOD3のノックダウン細胞におおける遊走実験に効率よく着手できるものと考える。一方で、低酸素環境下におけるSOD3発現変動に及ぼすDNAメチル化の関与を見いだすことができなかった。これは、低酸素環境下におけるSOD3発現変動が有意ではあるものの劇的な変化ではないことが理由であると考えられたが、その他にヒストンアセチル化あるいはメチル化などの他のエピジェネティクス要因の寄与が大きい可能性が示唆された。以上、一部期待した成果は得られなかったものの、論文の作成ならびに次年度以降の研究の遂行に向けての実験基盤は確立できたものと考える。前年度までの成果をもとに、SOD3発現レベルに応じた細胞遊走能の違いを検証する。また、SOD3発現制御に及ぼすヒストンメチル化(H3K27me3)ならびにその責任タンパク(JMJD3)の関与を詳細に解析する。細胞の遊走性に関しては、SOD3遺伝子のノックダウンプロトコールならびに遊走実験のプロトコールは確立しているため、早急に着手し、SOD3発現レベルに応じた細胞遊走性を評価する。SOD3発現に及ぼすJMJD3/H3K27me3の関与に関しては、前年度までにその関与を概ね実証できているため、JMJD3ノックダウン細胞株を樹立し、その影響を解析する。低酸素環境下におけるSOD3発現変動に関しては、これまでにSOD3発現への関与を見出しているヒストンアセチル化に焦点を絞り解析する。本研究では、酸化ストレス防御酵素の一種であるsuperoxide dismutase 3(SOD3)発現制御機構としてのエピジェネティクス、特に、DNA/ヒストンメチル化ならびに非ヒストンメチル化の関与の解明を最終目標とする。そこで、平成29年度では、ヒト乳がん細胞株、ヒト前立腺細胞株およびがん微小環境間質細胞となるヒト単球系細胞株を用いてその関与を検討した。転移度の異なる2種類のヒト乳がん細胞株(MDA-MB-231細胞およびMCF7細胞)を用いて、SOD3発現に及ぼすDNAメチル化の関与を解析したところ、当初の仮説通りSOD3発現とDNAメチル化との間に負の相関が認められた。また、本傾向はヒト前立腺細胞株(PC3細胞およびLNCaP細胞)においても認められた。ヒト単球系細胞株(THP-1細胞)におけるSOD3発現に及ぼすDNAメチル化の関与はすでに報告しているため、ホルボールエステル(TPA)誘導性のSOD3発現増大に及ぼすヒストンメチル化の関与を検討した。THP-1細胞をTPAで処理することにより、転写抑制マーカーであるH3K27me3レベルの低下ならびに転写促進マーカーであるH4R3me2レベルの増大が認められた。また同様の傾向がSOD3プロモーター領域においても認められた。次に、TPA誘導性のSOD3発現増大に対する非ヒストンメチル化の関与を転写因子FOXO1に着目し検討した。FOXO1をノックダウンしたところ、TPA誘導性のSOD3発現増大はmRNAおよびタンパクレベルで抑制された。以上、平成29年度の研究成果より、本研究を遂行する上での基盤となる実験系を確立することができたと考える。平成29年度では、実験系の確立とともに今後着目すべきヒストン修飾および制御因子を選定することができた。特に、TPA誘導性のSOD3発現増大に及ぼすFOXO1の関与は決定的であり、SOD3発現制御機構における非ヒストンタンパクの関与を解析する上での基盤を構築できたものと考える。一方で、低酸素状態下におけるSOD3遺伝子のDNAメチル化については期待通りの結果が得ることができなかった。

これは各がん細胞が有する低酸素応答性の違いに由来すると考えられたが、TETを介したDNA脱メチル化には酸素とともに鉄イオンならびに2-オキソグルタル酸の存在が必要であるため、来年度以降の検討では両因子を添加するなどの実験系を改良する必要があると考えられる。以上より、一部期待した成果は得られなかったが、次年度に向けての基盤の構築は概ね達成できたものと考える。前年度の研究成果をもとに、本年度ではヒト単球系細胞株(THP-1細胞)およびヒト乳がん細胞株(MDA-MB-231細胞およびMCF7細胞)におけるsuperoxide dismutase 3(SOD3)発現制御機構としてのエピジェネティクスの関与を詳細に解析した。前年度では転写因子FOXO1のノックダウンにより、ホルボールエステル(TPA)誘導性SOD3発現増大が抑制されることを見出したため、今年度は、FOXO1の過剰発現プラスミドを作成し、FOXO1過剰発現細胞におけるSOD3発現を解析した。その結果、当初の期待通りにSOD3発現のさらなる亢進が認められた。また、ChIP法によりSOD3遺伝子プロモーター領域におけるFOXO1の結合を解析したところ、TPA処理細胞においてその結合度の増大が認められた。また、本傾向はヒト乳がん細胞株を用いた実験系においても認められた。以上より、FOXO1はSOD3の直接的な転写因子として機能し、その発現を正に制御していると考えられた。一方、FOXO1のメチル化をIP法にて解析したが、有意なメチル化レベルの増大は認められなかった。次に、ヒト乳がん細胞株におけるSOD3発現へのエピジェネティクスの関与を解析した。前年度では、低酸素環境下のMDA-MB-231細胞におけるSOD3遺伝子のDNAメチル化の変化を検出することができなかったため、DNAメチル化に必要となる鉄イオン添加の影響を解析した。しかし、鉄イオンの存在下においてもDNAメチル化レベルに有意な変化は認められなかった。また、SOD3発現レベルに応じた細胞遊走能を評価するために必要となる遊走実験の適正化を行った。その結果、MDA-MB-231細胞およびMCF7細胞それぞれの遊走性を適正に評価できる実験系を構築することができた。平成29年度および平成30年度の成果より、SOD3発現制御機構におけるFOXO1の関与は概ね実証できたと考える。現在、本成果をまとめた論文を執筆中である。また、SOD3発現レベルに応じたがん細胞遊走性を評価する実験系を適正に構築できた。このことから次年度以降、SOD3のノックダウン細胞におおける遊走実験に効率よく着手できるものと考える。一方で、低酸素環境下におけるSOD3発現変動に及ぼすDNAメチル化の関与を見いだすことができなかった。
液体中における微粒子よごれの付着制御に関する研究

液体中における微粒子の付着制御を目的として,水/エタノ-ル混合液中での高分子板への粒子の付着現象をべ,粒子と基質の界面動電位,および,基質と液体の表面自由エネルギ-が付着現象とどのように関わるかを検討した。粒子として直径的5μmのナイロン12粒子と約4μmのポリエチレン粒子,基質として繊維を溶融して作成した平板(ポリエステル,ポリエチレン,ナイロン6,ポリ塩化ビニリデン,ポリフッ化ビニリデン)を用いた。粒子分散液に板を浸漬して引き上げ,付着粒子数を光学顕微鏡にとりつけたテレビカメラでビデオ録画して計数した。基質と粒子の界面動電位は流動電位法と電気泳動法でそれぞれ測定した。表面自由エネルギ-はwilhelmy法でwetting force測定して算出した。付着粒子数は3060分でほぼ一定となる傾向が認められたので,60分後の値をみかけの平衡付着粒子数nとした。水中ではナイロン粒子よりポリエチレン粒子のほうがnが大きく,いずれの粒子でもポリ塩化ビニリデンに最も多く付着した。粒子と基質のどの組合せにおいても,エタノ-ルの混合比率を増すとnは減少した。ナイロン粒子の場合,エタノ-ル混合比率が40%まで,ポリエチレン粒子では60%まで増加させると粒子はどの基質にも付着しなくなることがわかった。上記の結果は、誘導電率や界面動電位の変化を考慮したヘテロ凝集理論を用いて説明することはできなかった。そこでwetting fovce測定から基質の表面自由エネルギ-を求めて検討した。基質の表面自由エネルギ-の極性成分γ^P_Sと液体の表面自由エネルギ-の極性成分γ^P_Lとnの関係から,γ^P_S_=6mJ/m^2でnは極大値を与えること,および,γ^P_Lが小さくなるとnは減少し,n=0となるγ^P_Lの値は,ナイロン粒子の場合13.6mJ/m^2,ポリエチレン粒子では10.4mJ/m^2であることがわかった。
観測情報の拡充による全球大気予測の高度化に関する研究

本研究の目的は、データ同化の高度化によって、飛躍的に多くの観測情報の同化を可能にし、数値天気予測の精度を大幅に改善することである。H30年度の研究計画に沿って研究を遂行し、以下の成果を得た。はじめに、計画初年度(H29)に構築したすべての観測及び背景場の誤差共分散行列を最適化した同化システムを拡張し、随伴予測モデルをアンサンブル予報に置換したシステム(アンサンブル4D-Var)を構築した。同システムは、数100メンバ程度のアンサンブル予報の生成と決定論的な解析を単一の変分法同化システムで行うことができ、従来よりも高精度な流れ依存した背景誤差共分散行列の生成が可能である。また、観測演算子の精度も向上する。これと最適化された観測誤差共分散行列を組み合わせることで、飛躍的に多くの観測情報の同化が可能となった。次に、同システムによる1か月間の解析、予報サイクル実験を行った。その結果、5日程度先までの予測精度が全球的に顕著に改善することがわかった。とくに衛星観測が重要となる南半球や、背景誤差共分散行列の精度向上が顕著な熱帯域での改善が大きいことがわかった(根平均2乗誤差で9%以上の改善)。現実大気を対象とする高精度な数値予報システムで、全観測を対象とした観測誤差共分散行列の高精度推定と、変分法によるアンサンブル生成及び背景誤差共分散行列の高精度推定を同時に行い、これらの同化システムへの導入による予測精度の顕著な改善を示したのは、本研究が初めてであり、科学的に重要な成果である。また、本研究の成果は、これまで経験的チューニングによっていた背景及び観測誤差共分散行列の推定にかかるコストを大幅に軽減するため、今後の数値天気予報研究に大きく貢献することが期待できる。H30年度の研究計画に沿って研究を遂行し、期待した以上の研究成果が得られており、昨年度の研究成果の一部は査読論文として出版されたが、今年度成果の論文出版が次年度以降となる等、論文化作業がやや遅れたことを考慮し、"概ね順調に進展している"とした。令和1年度から2年度は当初の研究計画に沿って以下を行う。H30年度までに開発した同化システムを拡張して、アンサンブル同化により非線形性の強い観測データの同化や、観測誤差の時空間相関の導入を図り、観測情報をさらに拡充する。これらについて、1か月程度の期間の解析・予報サイクル実験を行い、予報精度や各観測情報のインパクと評価等を行う。本研究の目的は、データ同化の高度化によって飛躍的に多くの観測情報の同化を可能にし、数値天気予測の精度を大幅に改善することである。H29年度の研究計画に沿って研究を遂行し、以下の成果を得た。はじめに複数の推定手法を用いて観測誤差共分散行列(R)の推定を行った。観測と予測、解析値の差分情報を用いた推定手法(Desroziers et al. 2005)によって推定された観測誤差標準偏差は、現行値と比較してほとんどの観測種別で小さく、特に衛星観測では現行値の25%程度であった。水平相関距離の推定結果は現行の25倍程度の高密度同化が可能であることを示している。水蒸気に感度のある衛星輝度温度観測では強いチャンネル間誤差相関がみられた。以上の結果は他の推定手法による結果と概ね整合的であった。次に推定したRを同化システムに導入し、1か月間の解析、予報サイクル実験を行った。その結果、全球的に5日程度先までの予測精度が顕著に改善した。最も効果が大きいのは衛星観測が重要となる南半球であり、例えば予報時間2日程度までの高度場の予測の根平均2乗誤差(RMSE)は10%程度減少した。Rの推定を再帰的に行った場合は、推定結果の変動が見られたが、これは推定手法の推定精度の範囲内と考えられる。また、夏期間で推定したRを冬期間で使用した場合でも精度は改善した。以上から、推定で得られたRは、季節変化や推定回数に強く依存しないロバストなものである。現実大気を対象とする高精度な数値予報システムで、全観測を対象としたRの高精度推定とその導入による予測精度の顕著な改善を示したのは、本研究が初めてであり、科学的に重要な成果である。また、本研究の成果は、これまで経験的チューニングによっていたRの推定にかかるコストを大幅に軽減するため、今後の数値天気予報研究に大きく貢献することが期待できる。H29年度の研究計画に沿って研究を遂行し、期待した以上の研究成果が得られているが、論文化作業がやや遅れたため、出版は次年度以降となったことを考慮し、"概ね順調に進展している"とした。

次に、同システムによる1か月間の解析、予報サイクル実験を行った。その結果、5日程度先までの予測精度が全球的に顕著に改善することがわかった。とくに衛星観測が重要となる南半球や、背景誤差共分散行列の精度向上が顕著な熱帯域での改善が大きいことがわかった(根平均2乗誤差で9%以上の改善)。現実大気を対象とする高精度な数値予報システムで、全観測を対象とした観測誤差共分散行列の高精度推定と、変分法によるアンサンブル生成及び背景誤差共分散行列の高精度推定を同時に行い、これらの同化システムへの導入による予測精度の顕著な改善を示したのは、本研究が初めてであり、科学的に重要な成果である。また、本研究の成果は、これまで経験的チューニングによっていた背景及び観測誤差共分散行列の推定にかかるコストを大幅に軽減するため、今後の数値天気予報研究に大きく貢献することが期待できる。H30年度の研究計画に沿って研究を遂行し、期待した以上の研究成果が得られており、昨年度の研究成果の一部は査読論文として出版されたが、今年度成果の論文出版が次年度以降となる等、論文化作業がやや遅れたことを考慮し、"概ね順調に進展している"とした。H30年度は当初の研究計画に沿って以下を行う。初年度に開発した同化システムについて、随伴予測モデルをアンサンブル予報に置換したシステム(アンサンブル4D-Var)を構築する。アンサンブルメンバは100メンバ程度として、アンサンブル生成もアンサンブル4D-Varで行う。精度を1か月程度の実験で評価する。観測情報の拡充の程度により、随伴モデルを使用した通常の4D-Varとアンサンブル4D-Varの精度がどのように変化するかを解析する。令和1年度から2年度は当初の研究計画に沿って以下を行う。H30年度までに開発した同化システムを拡張して、アンサンブル同化により非線形性の強い観測データの同化や、観測誤差の時空間相関の導入を図り、観測情報をさらに拡充する。これらについて、1か月程度の期間の解析・予報サイクル実験を行い、予報精度や各観測情報のインパクと評価等を行う。当初計画していたデータ保存用の大型ストレージについては、所属機関の電力事情から導入を見送り、既存ストレージの利用、効率的なデータハンドリングで代替することとした。一方で当初計画より多くの研究成果が得られているため、同大型ストレージ予算及び海外発表のための旅費を論文掲載やオープンアクセス費用にあてることとした。掲載は次年度以降になるため、次年度使用額が生じている。研究成果の論文掲載は次年度以降になるものがあるため、次年度使用額が生じている。
非自明超伝導体のギャップ構造決定の実験的手法の確立を目指す理論的研究

非自明超伝導体の代表的な物質であるSr2RuO4と(U,Th)Be13の対関数の同定を行った。それぞれの超伝導体についてのギャップ構造を具体的な実験手段のデザインを含めて、実験グループとの共同作業の中で遂行した。Sr2RuO4については角度分解比熱測定を行った。この実験手段は今まで我々が培ってきたギャップ構造同定の有力な実験であることが立証されてきた。この方法を今回はSr2RuO4に適用し、この物質のギャップ構造を明らかにした。従来縦ノードが有力視されてきたが、ab面に水平に配置するラインノードが存在することを明らかにした。この結論を理論サイドからサポートするために微視的な計算をEilenberger方程式に基づいて詳細に検討した。その際、マルチバンドの効果、パウリ常磁性効果等を取り入れたモデルを設定した。また、バンド構造の3次元性は従来しばしば無視されることが多かったが、今回の計算にはこれも考慮して角度分解比熱を算出した。その結果角度振動が磁場と温度の空間全体で一定の振動パターンを示す実験事実は水平ラインノードを想定することによって説明できることを明らかにした。これは縦ノードに伴って起きる振動パターンの逆転現象とは対比的であり、水平ノードの時のみに見られることである。興味深いことにHc2の直下に符号反転振動がごく狭い温度ー磁場領域に見られることが実験的に判明した。この系の準2次元性や強いパウリ常磁性効果、並びに結晶がクリーンであること等を考えるとFFLO相がこの領域で出現していることの兆候とみなすことができる。現在継続的にこの可能性を追求していて、理論とそれを検証できる実験のデザインを行っている。(UTh)Be13についても研究を進め超伝導二段転移の理解を行った。ここではspin triplet対称性の中で立方晶の群論的な分類を行い二次元表現に属する対関数を考えた。上述したように、Sr2RuO4と(UTh)Be13という強相関物質に発現する超伝導体についての研究を実験グループとの共同研究の下に遂行した。実験グループの強力な支援もあって概ね当初計画は確実に前進したと評価している。とりわけSr2RuO4については最近になって筆者の主張してきた水平ラインノードを持つスピンシングレット説を支持する有力な実験が現れ始めた。最大のサポートはナイトシフト実験の再検証が行われ、従来の結果が覆ったことである。この系のカイラルtriplet説の有力な実験的基盤が失われた。その意味では意外なところから決定的な実験が出たということである。従って、我々の計画をこの方向で前進させることが最大の今後実行することである。Sr2RuO4の超伝導対称性の研究を更に推進する。スピンシングレット対であることはこれまでの研究で明らかとなった。この先であるがパウリ常磁性効果が強いことも同時に示すことができているので、FFLO状態が当然のことながら期待できる。これは(1)系がクリーンであること。(2)低次元性があること。(3)パウリ効果が強いこと。これらの条件を満たす超伝導体では実現するものとかが得られている。一方で今までのところ明確にFFLOであるという物質はない。Sr2RuO4はこの3つの条件を満たしているのでそこでFFLOが見つかる可能性は十分にある。この目標に向かって研究を推進する所存である。今までのところで幾つかの前駆的な現象は見つかっているので、それを基礎として積極的に実験をデザインする。一方で理論的な考察を進め、実験と理論の共同作業の中でFFLOの同定を図る。UBe13は高ドーピング域で2段転移が消失し、単一の超伝導相になるこの相については現在までほとんど実験がなされていない。上述の我々の理論に従えばこの相はUBe13と同一の超伝導相とみなすことができる。次年度においてはこの仮設の実験的、理論的な検証を行いたい。最近共同研究者がこのドーピング領域の単結晶の育成に成功したので精密実験の進展が期待できる。それに呼応した理論的な考察を進める所存である。当該年度においては主として非自明超伝導体の典型例として(UTh)Be13とSr2RuO4についての研究を実験グループと共同で行った。(UTh)Be13は超伝導の転移点が2つに分裂することが80年代から知られた重い電子系超伝導体である。この転移点の分裂の原因は不明のまま現在に至っている。最近共同研究者が単結晶作成に成功し、磁場方位を結晶軸に対して制御した実験を行うことが可能になった。今年度においては角度分解比熱測定と磁化実験が行われた。これらの実験の結果によるとこの二段転移は超伝導ー超伝導転移であって、以前筆者が考えていた超伝導ー反強磁性転移等でないことが明らかになった。更には低温における超伝導相のギャップ構造はフルギャップであることも明確になった。これらの結果を踏まえて可能な超伝導対の対称性の分類とその物理的な性質について理論的な考察を行った。立方結晶対称の下で可能なスピン3重項対のうちでサイクリックp波と呼ばれるクーパー対状態が最近の実験並びに過去から蓄積されたデータと最も整合性が良いことが判明した。この状態は(111)方向に点状ノードを有するがバンド計算の結果によるとその方向にはフェルミ面が存在せず、実質的にフルギャップとなる。さらには高温相の同定も行った。

当該の2次元表現状態の一つの成分、即ちプラナー状態が高温相として実現している可能性を指摘した。同時に残りの成分、ネマティック状態はThをドープしていないUBe13で実現していることも明らかにした。Sr2RuO4についても実験グループとの共同作業の中で取り組んだ。当該年においては角度分解比熱実験の理論解析に従事した。主として準古典Eilenberger方程式を用いて実験データを解析した。この系のギャップ構造は面平行な線形ラインノードであるという結論を得た。概ね順調に計画した研究課題は進行していると考える。(UTh)Be13については初期的な実験、理論の考察は終了した。異なるTh-dopingについての単結晶作成とそれを用いた実験の進行をにらみつつ、理論的な考察をさらに先に進める。特にUBe13についての新たな理論的な結論に基づいて従来の実験結果の再検討を行う。Sr2RuO4については水平ラインノードの結論を踏まえて新たな実験のデザインを考えている。当該課題の目標である超伝導体のノード決定のための理論創成を実現するために、以上の物質以外の系の探索を行う。非自明超伝導体の代表的な物質であるSr2RuO4と(U,Th)Be13の対関数の同定を行った。それぞれの超伝導体についてのギャップ構造を具体的な実験手段のデザインを含めて、実験グループとの共同作業の中で遂行した。Sr2RuO4については角度分解比熱測定を行った。この実験手段は今まで我々が培ってきたギャップ構造同定の有力な実験であることが立証されてきた。この方法を今回はSr2RuO4に適用し、この物質のギャップ構造を明らかにした。従来縦ノードが有力視されてきたが、ab面に水平に配置するラインノードが存在することを明らかにした。この結論を理論サイドからサポートするために微視的な計算をEilenberger方程式に基づいて詳細に検討した。その際、マルチバンドの効果、パウリ常磁性効果等を取り入れたモデルを設定した。また、バンド構造の3次元性は従来しばしば無視されることが多かったが、今回の計算にはこれも考慮して角度分解比熱を算出した。その結果角度振動が磁場と温度の空間全体で一定の振動パターンを示す実験事実は水平ラインノードを想定することによって説明できることを明らかにした。これは縦ノードに伴って起きる振動パターンの逆転現象とは対比的であり、水平ノードの時のみに見られることである。興味深いことにHc2の直下に符号反転振動がごく狭い温度ー磁場領域に見られることが実験的に判明した。この系の準2次元性や強いパウリ常磁性効果、並びに結晶がクリーンであること等を考えるとFFLO相がこの領域で出現していることの兆候とみなすことができる。現在継続的にこの可能性を追求していて、理論とそれを検証できる実験のデザインを行っている。(UTh)Be13についても研究を進め超伝導二段転移の理解を行った。ここではspin triplet対称性の中で立方晶の群論的な分類を行い二次元表現に属する対関数を考えた。上述したように、Sr2RuO4と(UTh)Be13という強相関物質に発現する超伝導体についての研究を実験グループとの共同研究の下に遂行した。
全ての転写産物を網羅したゲノム刷り込み領域の多元的解析

本申請では神経細胞特異的に刷り込みを受けるゲノム領域の特定を試みるため、in vitroでマウスES細胞を神経細胞へ分化させ、その過程でのRNA-seqによるトランスクリプトーム解析を行い、非コードRNAを含め新規のゲノム刷り込みされた転写産物を同定した。同時にiPS細胞でも同様の実験を行い、パイロット的に小規模のRNA-seqを行いES細胞のデータとの相違点を同定した。H3K36トリメチルマークのChIP-seqとTSS-seqとの結果とも合わせ、長鎖非コードRNA転写領域の転写の様相を解析した。ゲノム刷り込みは母親と父親由来のどちらか片方のみの対立遺伝子が発現する現象である。哺乳動物において両親のゲノムがそろっていないとうまく発生しない原因であるとされている。本申請ではゲノム刷り込みの中でも、神経細胞特異的に刷り込みを受けるゲノム領域の特定を試みる。その際、非コードRNAや内在性アンチセンス転写も含めた包括的なトランスクリプトーム解析を行い、エピゲノム情報との相関も解析する。我々が既に所有している次世代シーケンサー(RNA-seq)データのインフォマティクス解析から始めた。今年度研究開始時点で所有していたのはES細胞から成熟した神経細胞へin vitroにおいて分化させた4タイムポイントのRNA-seqデータである。ES細胞の種類はMSM/Ms(母親)とC57BL/6(父親)のF1胚盤胞から作製した亜種間雑種ES細胞(MB-ES細胞)と、母親と父親の組み合わせを逆にした亜種間雑種ES細胞(BM-ES細胞)の2種類である。また、上記の配列解析と共にMB、及びBM F1個体由来のiPS細胞の作製を開始した。非コードRNAと予想される長鎖アンチセンスRNAは転写単位が通常の遺伝子のようにきっちりと同定できない。このような非コードRNAのより正確な転写単位同定を試みるため、当初の計画を前倒ししてRNAポリメラーゼII(PolII)のChIP-seqの準備及び、転写開始点解析(TSS-seq)を次世代シーケンサーにて行った。ゲノム刷り込みは母親と父親由来のどちらか片方のみの対立遺伝子が発現する現象(モノアレル発現)である。本申請では神経細胞特異的に刷り込みを受けるゲノム領域の特定を試みるため、in vitroでES細胞を神経細胞へ分化させ、その過程でのトランスクリプトーム解析を行う。母親由来と父親由来の染色体を区別する為にMSM/Ms(MSM)とC57BL/6(B6)間の亜種間雑種ES細胞を用いる。ES細胞はMSM(母親)とB6(父親)のF1胚盤胞から作製したES細胞(MB-ES細胞)と、母親と父親の組み合わせを逆にした亜種間雑種ES細胞(BM-ES細胞)の2種類である。配列解析に際しては、非コードRNAや内在性アンチセンス転写も含めた包括的なトランスクリプトーム解析を行い、エピゲノム情報との相関も解析する。MB-ES細胞とBM-ES細胞のin vitro分化系のサンプルから得られたRNA-seqの配列解析を行い、分化段階特異的なゲノム刷り込み遺伝子を同定した。同時に親由来の染色体によらなく、亜種特異的なタイプのモノアレル発現がゲノム刷り込みタイプのモノアレル発現より一桁多く同定された。RNA-seqは通常のポリA鎖を有するRNA(通常のmRNA)と共にポリA鎖を持たない全RNAでも行い、配列解析にあたっては両者のRNA-seqデータを用いて行った。通常のmRNAのRNA-seqのみでは同定されない転写単位も同定された。非コードRNAと予想される長鎖アンチセンスRNAはポリA鎖を有しないRNA-seqで顕著に検出されたり、また転写単位が通常の遺伝子のようにきっちりと同定できない場合も多い。このような非コードRNAのより正確な転写単位同定を試みるため、転写開始点解析(TSS-seq)及び、転写されているユニットのエピジェネティックなマーカーであるH3K36me3のChIP-seqを行った。現在、RNA-seqのデータを合わせて解析中である。MB-ES細胞及びBM-ES細胞をin vitroで神経細胞へ分化させた4タイムポイントのRNA-seqデータ解析はほぼ終了しており、神経細胞特異的なゲノム刷り込みが見られる遺伝子座、ポリA鎖を有しない非コードRNAが優位な遺伝子座、アンチセンスRNAによる発現制御の可能性がある遺伝子座などを同定した。iPS細胞作製はBM/MBの組み合わせ共に数株を樹立し、現在、神経分化系の調整をしているところである。PolIIのChIP条件検討は終了し、更にH3K36のChIPも終了しNGS解析をするのみとなっている。TSS-seq自体も終了し情報科学的解析中である。上記のようにおおむね、予定より早く進行しており順調である。本申請では神経細胞特異的に刷り込みを受けるゲノム領域の特定を試みるため、in vitroでES細胞を神経細胞へ分化させ、その過程でのRNA-seqによるトランスクリプトーム解析を行った。母親由来と父親由来の染色体を区別する為にMSM/Ms(MSM)とC57BL/6(B6)間の亜種間雑種ES細胞を用いた。

更にはMSMとB6間のF1個体の繊維芽細胞からiPS細胞(母親がMSMのものがMB-iPS細胞、母親がB6のものがBM-iPS細胞)を作製し、同様にin vitroで神経細胞へ分化させ、パイロット的に小規模のRNA-seqを行った。配列解析に際しては、非コードRNAや内在性アンチセンス転写も含めた包括的なトランスクリプトーム解析を行った。非コードRNAと予想される長鎖アンチセンスRNAは転写単位が通常の遺伝子のようにきっちりと同定できない。Ube3a遺伝子座アンチセンスRNAのような非コードRNAのより正確な転写単位同定を試みるために昨年度得たH3K36トリメチル(発現している遺伝子領域全体のマーク)のChlP- seqのデータをゲノム上にマップし、得た転写開始点解析(TSS-seq)と共に、Ube3a遺伝子座近傍の長鎖非コードアンチセンスRNAの転写開始点やH3K36トリメチルマークの解析を行った。作製したiPS細胞を用いてin vitro神経分化系を行ったサンプルで行った予備実験の解析を行ったところ、ES細胞で行った場合と違う転写様式が見られたため、更にRNA-seqを行った。本申請では神経細胞特異的に刷り込みを受けるゲノム領域の特定を試みるため、in vitroでマウスES細胞を神経細胞へ分化させ、その過程でのRNA-seqによるトランスクリプトーム解析を行い、非コードRNAを含め新規のゲノム刷り込みされた転写産物を同定した。同時にiPS細胞でも同様の実験を行い、パイロット的に小規模のRNA-seqを行いES細胞のデータとの相違点を同定した。H3K36トリメチルマークのChIP-seqとTSS-seqとの結果とも合わせ、長鎖非コードRNA転写領域の転写の様相を解析した。MB-ES細胞及びBM-ES細胞をin vitroで神経細胞へ分化させた4タイムポイントのRNA-seqデータ解析はほぼ終了しており、神経細胞特異的なゲノム刷り込みが見られる遺伝子座、ポリA鎖を有しない非コードRNAが優位な遺伝子座、アンチセンスRNAによる発現制御の可能性がある遺伝子座などを同定した。iPS細胞作製はBM/MBの組み合わせ共に数株を樹立し、現在、神経分化系の調整をしているところである。PolIIのChIP条件検討は終了し、更にH3K36のChIPも終了しNGS解析をするのみとなっている。TSS-seq自体も終了し情報科学的解析中である。上記のようにおおむね、予定より早く進行しており順調である。in vitro分化系のRNA-seqデータとTSS解析データ、及びChIP-seqのデータを統合的に解析することにより、神経細胞特異的なゲノム刷り込みの様相とエピジェネティックなマークとの関連、及び非コード/アンチセンスRNA発現の係わりとの関連の解析を試みる。また、樹立したiPS細胞でin vitroで神経細胞を(ES細胞で行ったのと同様の方法で)作製し、アレルの区別、センス鎖・アンチセンス鎖発現の区別、ポリA鎖を有しないRNAを含めた総合的な転写、エピジェネティックなマークなども含め、包括的にES細胞由来の神経細胞と比較し、ES細胞/iPS細胞の同等性の検証を試みる。28年度が最終年度であるため、記入しない。分子遺伝学in vitro
ストレッチ刺激が培養皮膚に及ぼす影響の解析～オーダーメイド皮膚の作成を目指して～

我々は、世界初の3次元全層培養皮膚の伸展培養が可能なシステムを開発しており、今回このシステムを用いて伸展刺激が3次元全層培養皮膚に及ぼす影響の解析を行った。伸展刺激を加えた群で表皮層の厚みが増し、表皮分化マーカーであるinvolucrinの発現が増加しており、伸展刺激が表皮細胞の分化・増殖を促進することが示唆された。さらに基底膜構成タンパクであるLaminin 5, Collagen IV/ VIIの合成および基底層への沈着が増加し、基底膜におけるLamina densaの長さとヘミデスモゾームの数も有意に増加しており、伸展刺激により、より発達した基底膜を形成することが分かった。今年度は、まず専用のシリコンチャンバーを作成し、その内にヒト皮膚線維芽細胞を混和したI型コラーゲンゲルを注入し真皮層を作成した。3日後、その表面にヒト表皮角化細胞を播種し、更に3日後、表面を空気に暴露させ角化させることで、ヒト全層培養皮膚(Human Skin Equivalents: HSEs)を作成した。このチャンバーを伸展装置に装着し、伸展させることで3次元全層培養皮膚のストレッチシステムを完成させることに成功した。伸展期間は5/7/10日、伸展率は5/10/20%で行う予定であったが、7日間以上伸展した場合、HSEsがチャンバーから脱落してしまう確立が高かったため、伸展期間は5日間とした。また、伸展率20%では、チャンバーが高率に破損してしまったため、伸展率は10%に設定し実験を継続した。その結果、このシステムを用いてストレッチ刺激を加えた(ST)群と加えていない(NST)群に分け、切片を作成しHE染色を行ったところ、有意にST群で表皮角化層の厚みが増している所見が認められた。また、基底層における単位長さあたりの基底細胞の数も有意に増加しており、HSEsに伸展刺激を加える事で、表皮層の層化、角化を促進されることが示唆された。このシステムを用いることで、従来の皮膚線維芽細胞、表皮角化細胞単独での伸展培養では不可能であった、伸展刺激が表皮角化細胞の重層化、角化に及ぼす影響を観察することが可能となった。我々は、前年度の研究で3次元全層培養皮膚のストレッチシステムを構築することに世界で初めて成功した。今年度、これを用いて伸展刺激を加えた培養皮膚を解析したところ、伸展刺激を加えなかった皮膚に比べ、表皮層の厚みが増し、基底膜タンパクであるLaminin 5、Collagen IV/VIIの合成及び基底層への沈着が増加している所見が得られた。また、電子顕微鏡による解析では基底層におけるヘミデスモゾーム及びLamina densaが増加していた。これらの結果より、3次元全層培養皮膚に伸展刺激を加えることで、まず真皮層上層に接着している表皮角化細胞に刺激が伝わり、接着能が上昇するとともに細胞増殖及びタンパク合成が促進され、同時に皮膚線維芽細胞にも刺激が伝達され、タンパク合成及びプロテアーゼ阻害物質の分泌が促進されたのではないかと推測される。その結果、基底層におけるLaminin 5, Collagen IV, Collagen VIIの沈着が増加し、基底膜構造がより発達することで、更に表皮角化細胞の分化増殖が促進され、表皮角化層の厚みが増加したのではないかと考えられた。当初の予定通り、基底膜タンパクの解析及び基底膜構造の解析を行うことができているため。今年度は昨年度に引き続き、我々が開発した3次元全層培養皮膚ストレッチシステムを使用して伸展刺激を加えたヒト3次元全層培養皮膚の表皮分化に関して解析を行った。表皮基底細胞の基底層単位長さあたりの密度を計測したところ、伸展刺激を加えた群で有意に基底細胞の密度が増加していた。また、表皮分化マーカーであるK-10、K-14、involucrinに関して蛍光免疫染色を行い比較したところ、伸展刺激を加えた群でinvolucrinの発現が明らかに増加している所見が得られた。一方、K-10、K-14に関しははっきりした違いは認められなかった。表皮細胞の角化マーカーであるinvolucrinが増加していることから、3次元全層培養皮膚に伸展刺激を加えることで、皮膚線維芽細胞をコラーゲンゲル内に包埋培養した真皮層を介して、真皮上面に接着した基底細胞にも伸展刺激が伝達され、基底細胞の分化が促進され、表皮角質層の厚みが増加したと考えられた。さらに、透過型電子顕微鏡で撮影した基底膜構造をより詳細に解析した結果、基底膜におけるヘミデスモゾームの数及び、Lamina densaの長さが伸展刺激を加えた群では約1.5倍と有意に増加していた。Immunoblottingを用いて3次元全層培養皮膚に含まれる基底膜構成蛋白であるLaminin5、Collagen IV/VIIの定量解析も行ったところ、培養皮膚1枚あたりに含まれる蛋白量は有意に増加している所見が得られた。