hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
歯周病による動脈硬化促進メカニズムの解明-炎症性歯槽骨吸収が及ぼす影響-

歯周病患とアテローム性の動脈硬化の関連メカニズムを明らかにするために、炎症性骨吸収が動脈硬化に与える影響を検討した。その結果、動脈硬化を起こしやすいマウスに歯槽骨吸収を惹起すると動脈硬化が促進した。動脈硬化組織には破骨細胞形成に必須の破骨細胞分化因子(RANKL)の存在が免疫組織学的に明らかとなった。また動脈硬化の主体をなす泡沫化細胞の形成をin vitroでRANKLが促進することが確認できた。歯周病と動脈効果の関連が指摘されているが、その詳細なメカニズムは不明なままである。歯周病で認められる現象の中でも、炎症性の骨吸収がアテローム性動脈硬化の促進に関連しているのではないかと考え研究を計画した。今年度は以下の研究を行いそれぞれ記載した結果を得ることができた。1,動脈硬化で見られるT細胞は主にIFNgを産生するTh1であると言われている。また炎症性骨吸収部位では多くのIFNgや破骨細胞分化因子であるRANKLの産生が確認されていることより、foam cell形成におけるRANKLとIFNgの影響を検討した。その結果、IFNgはマクロファージにおけるoxLDLの取り込みを有意に抑制した。しかしRANKLはIFNgによるoxLDLの取り込みの抑制を減少させた。(ア) ApoE KOマウス歯肉にE.coli LPSを13回注入して歯槽骨の吸収を惹起させた。このマウスと未処置あるいは背部皮下へLPSを注入した対照群と比較することで炎症性骨吸収の動脈硬化への影響をin vivoで検討した。評価法として大動脈弁部位を組織学的に評価した。その結果、実験群では対照群と比較して広範囲にわたるアテロームの形成が確認できた。また予備実験により、アテローム組織において免疫染色によりRANKL陽性細胞が検出できた(イ)上記3群のマウス脾細胞がfoam cell形成に与える影響を検討した。その結果、実験群では対照群と比較して有意にfoam cell形成の増加が確認できた。以上より、LPSによる炎症性骨吸収はアテローム性動脈硬化の形成を促進することが示唆された。またこの促進にはRANKLの関与が考えられた。これらの結果は二つの学会において報告した。今後はさらに詳細なメカニズムを検討していく予定である。炎症性骨吸収が全身に及ぼす影響を検討するために、マウス歯周組織へのLPS注入により歯槽骨吸収が見られる時の全身的影響を検討した。その結果、T細胞の発現するCD40 ligandが破骨細胞形成に促進的に関与することを明らかにした。これは炎症組織でT細胞が発現するCD40 ligandが骨吸収に重要であることを示した初めての研究で、この成果はJournal of Periodontal researchに投稿し、アクセプトされた。またアテローム性動脈硬化において重要な働きをするTh1細胞の産生する代表的なサイトカインであるインターフェロンγの破骨細胞形成への影響も検討した。その結果、このサイトカインはこれまで破骨細胞形成を抑制すると言われてきていることに反し、LPS存在下では条件により破骨細胞形成ならびに骨吸収を促進することを示した。この成果もJournal of Periodontal researchに投稿し、アクセプトされた。ApoEノックアウトマウスを用いた実験においては、アテローム病変局所で免疫組織学的に破骨細胞形成に最も重要であると言われているRANKLの発現を検出でき、骨吸収とアテローム性動脈硬化の関連を示唆する結果が得られた。歯周病によるアテローム性動脈硬化促進の関連を検討するために、これまで炎症性骨吸収メカニズムを検討してきた。その結果、動脈硬化組織で多く棟出される炎症性サイトカインIFN-γやCD40Lが炎症性歯槽骨吸収促進に関連することを示してきた。さらに破骨細胞形成において必須であるRANKLがマウスアテローム性動脈硬化組織において発現されることを示した。これらの研究では炎症性骨吸収惹起にLPSを用いてきたが、口腔内感染ではグラム陽性細菌の影響も大きい。今年度はこのグラム陽性細菌の重要な構成因子であるペプチドグリカンの骨吸収に与える影響を検討した。その結果、LPS同様にペプチドグリカンもRANKL存在下で破骨細胞形成ならびに骨吸収を促進することが確認できた。さらに、ペプチドグリカンがLPSと協調して破骨細胞形成を促進することも確認した。またLPSならびにペプチドグリカンによる骨吸収にはどちらもRANKLとTNF-αが重要な役割を果たしていることが示唆された。これらの所見はJ Periodontal Resに投稿し、アクセプトされている。我々はRANKLが泡沫化細胞形成を促進することを学会報告しており、歯周炎における炎症性骨吸収がアテローム性動脈硬化を促進するに関連する可能性を示すことができた。
昼夜逆転環境の妊娠へ及ぼす影響の実験動物モデルでの解析

女性の活発な社会進出が目立つ今日,昼夜交替勤務や経線通過飛行などの変速的な作業-生活時間環境が女性の生殖生理機構へ及ぼす影響を把握する意義は大きい.そこで,本研究は,実験動物モデルを用いて,非24時間日周期が妊娠の成立,その経過,及び胎仔(中期胚および満期胚)へ及ぼす影響を検討した.成熟ICRマウスを,交配の少なくとも2週間前から, 22時間(11:11時間明暗周期), 24時間(12:12)あるいは26時間(13:13)の日周期ま人工証明下で飼育した.明期2時間交配によって得た妊娠マウスを,交配から278時間目(妊娠120日)あるいは408時間(17.5日)に開腹し,胎仔数,胎仔体重,肢芽の分化状態(指放線間隙数)および形態異常の有無について観察した.交配率を見ると, 22時間および26時間の非24時間日周期群で, 40-50%と著しく低下した.また,妊娠12.0日の観察では,胎仔の発育や肢芽の分化に遅れが認められ,とくに26時間日周期群で着床数の減少や吸収・死亡胎仔数の増加がみられた.妊娠17.5日においても,胎仔体重が24時間日周期群の平均1.04gと比較して, 22時間群で0.95gと低下していた.しかし,奇形の出現頻度の増加は見られなかった.なお,妊娠機関中のみ非24時間日周期環境で飼育した場合にも,吸収・死亡胎仔数の増加する傾向がみられた.以上のことから,妊娠前および妊娠中の日周期の変化が体内リズムの乱れをひきおこし,妊娠の成立や胎仔の発育に悪影響を与えることが示唆された.今後は,さらに早期胚を用いて,非24時間日周期環境の排卵と受精のtimingなどへの影響について検討する予定である.女性の活発な社会進出が目立つ今日,昼夜交替勤務や経線通過飛行などの変速的な作業-生活時間環境が女性の生殖生理機構へ及ぼす影響を把握する意義は大きい.そこで,本研究は,実験動物モデルを用いて,非24時間日周期が妊娠の成立,その経過,及び胎仔(中期胚および満期胚)へ及ぼす影響を検討した.成熟ICRマウスを,交配の少なくとも2週間前から, 22時間(11:11時間明暗周期), 24時間(12:12)あるいは26時間(13:13)の日周期ま人工証明下で飼育した.明期2時間交配によって得た妊娠マウスを,交配から278時間目(妊娠120日)あるいは408時間(17.5日)に開腹し,胎仔数,胎仔体重,肢芽の分化状態(指放線間隙数)および形態異常の有無について観察した.交配率を見ると, 22時間および26時間の非24時間日周期群で, 40-50%と著しく低下した.また,妊娠12.0日の観察では,胎仔の発育や肢芽の分化に遅れが認められ,とくに26時間日周期群で着床数の減少や吸収・死亡胎仔数の増加がみられた.妊娠17.5日においても,胎仔体重が24時間日周期群の平均1.04gと比較して, 22時間群で0.95gと低下していた.しかし,奇形の出現頻度の増加は見られなかった.なお,妊娠機関中のみ非24時間日周期環境で飼育した場合にも,吸収・死亡胎仔数の増加する傾向がみられた.以上のことから,妊娠前および妊娠中の日周期の変化が体内リズムの乱れをひきおこし,妊娠の成立や胎仔の発育に悪影響を与えることが示唆された.今後は,さらに早期胚を用いて,非24時間日周期環境の排卵と受精のtimingなどへの影響について検討する予定である.
急性呼吸促迫症候群におけるヒストンメチル化酵素Setdb2の役割と臨床的意義

急性呼吸促迫症候群(Acute Respiratory Distress Syndrome:ARDS)は致死率の高い、予後不良の急性炎症性疾患のひとつであるが、その分子病態は十分にはメカニズムは理解されていない。近年、急性炎症もエピジェネティクスが関与していることがわかり、ARDSモデルマウスの肺では転写抑制に機能するヒストンメチル化酵素Setdb2の発現が上昇していることも判明し、急性炎症に対するSetdb2の関与が示唆されつつある。申請者は、マクロファージ特異的Setdb2欠損マウスを確立しており、それらでARDSモデルを作製した。ARDS作製にあたって、リポ多糖(Lipopolysaccharide:LPS)を直接気管内投与することによる直接型ARDSが、LPSの腹腔内投与などによる間接型ARDSよりも、よりLPSへの反応が顕著であり実験系を確立しやすいことが判明した。野生型マウスと比較し、1肺の形態学的変化の違い、2気管支肺胞洗浄(Bronchoalveolar lavage:BAL)で肺胞内の好中球やマクロファージの出現の違い、3RT-PCRを用いた炎症性サイトカイン発現の違い、を中心に研究してきた。その中で、RT-PCR,組織所見を総合するとマクロファージ特異的Setdb2欠損マウスでは野生型に比して、炎症反応が増悪していることまで判明してきた。LPS刺激したSetdb2欠損マクロファージにおけるサイトカインや活性酸素の産生を定量的評価するために各種炎症性サイトカインに対してELISAを行ったが、有意差を認めるには至っていない。また、BALについては、好中球に比してマクロファージの出現がマクロファージ特異的Setdb2欠損マウスにおいてやや増加している傾向にあることがわかっている。マクロファージ特異的Setdb2欠損マウスではARDSモデルの病態が悪化することが、組織学的にはHE染色により判明した。またRT-PCRを用いて各種炎症性サイトカインの定量測定を行い、分子レベルでもマクロファージ特異的Setdb2欠損マウスでは炎症が増悪することが判明してきた。しかし、実際に炎症性サイトカインの定量評価をELISA法により測定しても有意差は認めず、その原因について現在究明中である。今後は、まず骨髄由来マクロファージをLPS刺激し、発現変動する遺伝子群の違いをDNAマイクロアレイによって網羅的に解析した結果を待つ。その後、Setdb2の制御因子、マクロファージの機能に与える影響を検討し、Setdb2の標的遺伝子の解析と、それら標的遺伝子のARDS重症度との関連を調べることにより、予後予測・診断マーカーとして確立させることを目指す。具体的には、変動した遺伝子が直接の標的遺伝子であるかをSetdb2ならびにH3K9メチル化に対する抗体を用いてChIP法(クロマチン免疫沈降法)により検討する。標的遺伝子の機能はsiRNAによる発現抑制をマクロファージ細胞株で行い、遺伝子発現や機能に与える影響を解析する。Setdb2の役割を究明するために、マクロファージ特異的Setdb2欠損マウスを用いているが、その他の細胞に対してSetdb2をノックアウトしたマウスも今後は研究対象としていく予定である。急性呼吸促迫症候群(Acute Respiratory Distress Syndrome:ARDS)は致死率の高い、予後不良の急性炎症性疾患のひとつであるが、その分子病態メカニズムは十分には理解されていない。野生型マウスと比較し、1肺の形態学的変化の違い、2気管支肺胞洗浄で肺胞内の好中球やマクロファージの出現の違い、3RT-PCRを用いた炎症性サイトカイン発現の違い、を中心に研究してきた。その中で、マクロファージ特異的Setdb2欠損マウスでは野生型に比して、炎症反応が増悪していることまで判明してきた。LPS刺激したSetdb2欠損マクロファージにおけるサイトカインや活性酸素の産生を定量的評価するためにPCR、ELISAを用いることを検討している。

野生型マウスと比較し、1肺の形態学的変化の違い、2気管支肺胞洗浄(Bronchoalveolar lavage:BAL)で肺胞内の好中球やマクロファージの出現の違い、3RT-PCRを用いた炎症性サイトカイン発現の違い、を中心に研究してきた。その中で、RT-PCR,組織所見を総合するとマクロファージ特異的Setdb2欠損マウスでは野生型に比して、炎症反応が増悪していることまで判明してきた。LPS刺激したSetdb2欠損マクロファージにおけるサイトカインや活性酸素の産生を定量的評価するために各種炎症性サイトカインに対してELISAを行ったが、有意差を認めるには至っていない。また、BALについては、好中球に比してマクロファージの出現がマクロファージ特異的Setdb2欠損マウスにおいてやや増加している傾向にあることがわかっている。マクロファージ特異的Setdb2欠損マウスではARDSモデルの病態が悪化することが、組織学的にはHE染色により判明した。またRT-PCRを用いて各種炎症性サイトカインの定量測定を行い、分子レベルでもマクロファージ特異的Setdb2欠損マウスでは炎症が増悪することが判明してきた。しかし、実際に炎症性サイトカインの定量評価をELISA法により測定しても有意差は認めず、その原因について現在究明中である。今後は、Setdb2の制御因子、マクロファージの機能に与える影響を検討し、Setdb2の標的遺伝子の解析と、それら標的遺伝子のARDS重症度との関連を調べることにより、予後予測・診断マーカーとして確立させることを目指す。具体的にはマクロファージ特異的Setdb2欠損と野生型マウスの骨髄由来マクロファージをLPS刺激し、発現変動する遺伝子群の違いをDNAマイクロアレイによって網羅的に解析する。変動した遺伝子が直接の標的遺伝子であるかをSetdb2ならびにH3K9メチル化に対する抗体を用いてChIP法(クロマチン免疫沈降法)により検討する。標的遺伝子の機能はsiRNAによる発現抑制をマクロファージ細胞株で行い、遺伝子発現や機能に与える影響を解析する。今後は、まず骨髄由来マクロファージをLPS刺激し、発現変動する遺伝子群の違いをDNAマイクロアレイによって網羅的に解析した結果を待つ。その後、Setdb2の制御因子、マクロファージの機能に与える影響を検討し、Setdb2の標的遺伝子の解析と、それら標的遺伝子のARDS重症度との関連を調べることにより、予後予測・診断マーカーとして確立させることを目指す。具体的には、変動した遺伝子が直接の標的遺伝子であるかをSetdb2ならびにH3K9メチル化に対する抗体を用いてChIP法(クロマチン免疫沈降法)により検討する。
環境美学研究-ロマン主義にもとづくあたらしい自然哲学の企て-

今年度の研究は以下のような成果をあげた。3年間にわたる研究の総括として研究論文をまとめるために、研究計画にそって、人間と自然との関係を最も直接的に反映している現代の環境芸術に関する考察をもとにして、自然哲学思想と芸術論をめぐるロマン主義思想の再検討をおこなった。また、実際の作品を自分の目で見ることや作品制作の現場に立ち会う機会をできるだけ多く持ち、環境美学の構想を具体的な面で検証していくことにも意を注いだ。さらに、最近とりわけドイツで盛んになってきた「自然についての美学」、「生態学的美学」といった、自然について考察すろ美学や哲学の文献に接することで、自らの構想である環境美学の論理との異同を確認することもおこなった。これまでに得られた研究の成果を、「自然哲学としての環境美学の試み-環境芸術からのアプローチ-」と題した論文にまとめ、日本シェリング協会編の雑誌「シェリング年報'01第9号」に発表した。将来の人間と自然の関係を考えるためのモデルとしての環境美学を打ち出すことを目標とした論文の概要は以下の通りである。「自然とはなにか?」という自然哲学の根本的な問いを生態学的危機の状況の中で再び真剣に考えなければならない現代において、人間と自然との関係を尖鋭的に示す環境芸術は、さまざまな具体的な方策を作品の中で示し始めている。環境問題を引き起こすことになったさまざまな問題点を切り取り明らかにするものだけではなく、壊れてしまつた環境を実際に治癒するものまで、多種にわたる現代の環境芸術作品はわたしたちの向かうべき未来をあざやかに指し示しているのである。将来の人間と自然との関係を考えるためのモデルとしての環境美学を打ち出すために、研究計画にそって、人間と自然との関係を最も直接的に反映している現代の環境芸術に関する考察をもとにして、自然哲学思想と芸術論をめぐるロマン主義思想の再検討をおこなった。また、実際の作品を自分の目で見ることや作品制作の現場に立ち会う機会をできるだけ多くもち、環境美学の構想を具体的な面で検証していくことにも意を注いだ。さらに、最近とりわけドイツで盛んになってきた「自然についての美学」、「生態学的美学」といった、自然について考察する美学や哲学の文献に接することで、自らの構想である環境美学の論理との異同を確認することもおこなった。概要は以下のとおりである。「自然とはなにか?」という自然哲学の根本的な問いは、今日では環境問題によって動機づけられている。人間自身が自然であり、自然のうちで自然とともに生きなければならないことに気づかされている現代、これまでの人間の自然との関係の修正をはかるような自然哲学が必要となる。環境美学もまたその一部として、危機的な状況の診断や治療にかかわってゆく。自然科学的なものの見方の有効な部分を生かしつつ自然との共生を得るために、自然と人間の媒介者となる芸術という、自然・哲学・芸術が一体になったロマン主義の美学思想を基礎として、感情の問題を切り捨てることなく、自然とどのように向き合い、自然環境の劣化にどう対処してゆくべきかを、ひとりひとりが自ら思索するための素地となる思考の枠組みを環境美学は提示するのである。昨年度に引き続き将来の人間と自然との関係を考えるためのモデルとしての環境美学を打ち出すために、研究計画にそって、人間と自然との関係を最も直接的に反映している現代の環境芸術に関する考察をもとにして、自然哲学思想と芸術論をめぐるロマン主義思想の再検討をおこなった。これまでに得られた研究の成果を、とりわけ自然哲学にかかわる研究が近年盛んに行われている、日本シェリング協会の第9回研究発表大会において「自然哲学としての環境美学の試み-環境芸術からのアプローチ-」と題した発表を行った。発表の概要は以下の通りである。環境問題を引き起こすことになったさまざまな問題点を切り取り明らかにするものだけではなく、壊れてしまった環境を実際に治癒するものまで、多種にわたる現代の環境芸術作品はわたしたちの向かうべき未来をあざやかに指し示しているめである。

これまでに得られた研究の成果を、「自然哲学としての環境美学の試み-環境芸術からのアプローチ-」と題した論文にまとめ、日本シェリング協会編の雑誌「シェリング年報'01第9号」に発表した。将来の人間と自然の関係を考えるためのモデルとしての環境美学を打ち出すことを目標とした論文の概要は以下の通りである。「自然とはなにか?」という自然哲学の根本的な問いを生態学的危機の状況の中で再び真剣に考えなければならない現代において、人間と自然との関係を尖鋭的に示す環境芸術は、さまざまな具体的な方策を作品の中で示し始めている。環境問題を引き起こすことになったさまざまな問題点を切り取り明らかにするものだけではなく、壊れてしまつた環境を実際に治癒するものまで、多種にわたる現代の環境芸術作品はわたしたちの向かうべき未来をあざやかに指し示しているのである。
ナノ・メゾ組織制御による高強度粒子分散強化合金の創製と強化機構の実験的解明

水素を雰囲気としたメカニカルアロイング(MA)処理と第3元素としてのジルコニウム(Zr)の添加を適用して、ナノ・メゾ組織制御による粒子分散強化(PDS)合金の創製に成功した。アルミニウム(Al)添加PDS合金へのZr添加は、ナノ酸化物粒子のサイズを小さくするとともに、粒界析出物の数密度を高めることが判明した。一方、MA雰囲気として使用した水素ガスは、マトリックス粒子内、あるいは旧粉末粒界(PPB)上の分散質粒子のサイズを減少させ、さらに合金組織を均質化することが可能である。このように、優れた高温延性を有するAl-Zr添加PDS合金の強化には、上記の強化因子が寄与することが実験的に示された。合金設計や粉末プロセス環境条件を改善することにより、Al添加鉄基粒子分散強化合金の高強度化を図ることを目標とした。先ず、機械的合金化(Mechanical Alloying: MA)処理中に合金粉末に混入する過剰酸素(Excess Oxygen: Ex.O)とN2が強度に及ぼす影響を調査するため、O, N量を制御したArガス雰囲気下でMA処理後、1150°Cで熱間押出により固化成形し、Ex.O量やN量の異なる2種の合金を製造した。成分は16Cr-4Al-0.1Ti-0.3Y2O3で、Ex.O量はそれぞれ、Low Ex.O材が0.15wt%、High Ex.O材が0.46wt%である。シャルピー衝撃試験を行った結果、Low Ex.O材の衝撃特性は、High Ex.O材に比べ、向上することが判明した。すなわち、固化体中に含有するEx.O, N量が少なくなると、合金内に形成される酸化物や窒化物などの析出量やサイズが減少し、衝撃特性が向上している。次に、種々のMA雰囲気ガスや第三元素の添加が延性に及ぼす影響を調べるため、ArおよびH2ガス雰囲気下でMA処理後、1150°Cで真空加圧焼結により固化成形し、MA雰囲気ガスの異なる2種の合金を製造した。成分は15Cr-2W-4Al-0.8Zr-0.35Y2O3である。ここでは、第三元素としてZrを添加した。室温および700°Cで引張試験を行ったところ、いずれの試験温度でも、H2ガス雰囲気下MA処理材の引張変形伸びは、Arガス雰囲気下MA処理材に比べ、約2倍に増大することを明らかにした。すなわち、H2ガスを雰囲気としたMAプロセスは、合金粉末中へのArの取り込みを完全に防ぐことができ、かつ還元性雰囲気であるため、固化成形時に合金内の旧粉末粒界での酸化を抑制し、その結果、粗大な酸化物などの介在物形成が抑えられるため、引張延性が増大すると考えられる。初年度は、合金設計や粉末プロセス環境条件を改善することにより、Al添加鉄基粒子分散強化合金の高強度化を図ることを目標とした。N2ガスを雰囲気としたMA処理プロセスの包括的な実験調査を目的として、MA雰囲気ガス中のO, N量を制御した合金を製造し、固化体中に含有するEx.O, N量を低減させることで、衝撃特性の向上を図ることができた。これは、これまでの知見と一致しており、ナノ・メゾ組織制御による強化機構を実験的に解明するための重要な指針が得られた。さらに新たな合金設計の基本方針として、第三元素にAlよりも酸素親和性が高く、Y2O3酸化物の凝集を妨げる元素であるZrを選定した。また、H2ガスを雰囲気としたMAプロセスを施して製造した合金の室温および700°Cにおける引張延性を評価した結果、従来のArガスを雰囲気としたMAプロセスを施して製造した合金に比べ、強度特性の優れた高性能の粒子分散強化合金の創製に成功している。平成28年度は、Al添加鉄基粒子分散強化合金のナノ・メゾスケールでの微細組織観察と構造解析に重点を置いた。先ず、O, N量を制御したArガス雰囲気下で機械的合金化(Mechanical Alloying: MA)処理後、1150°Cの熱間押出により製造した過剰酸素(Excess Oxygen: Ex.O)量やN量の異なる2種の合金に対し、初年度と同様のシャルピー衝撃試験を行い、これらの破断面を電界放出形オージェ電子分光(FE-AES)分析装置により解析し、Ex.O量が増大した際の酸化物粒子の析出形態が衝撃特性に及ぼす影響を明らかにした。16Cr-4Al-0.1Ti-0.35Y2O3の合金成分においては、低Ex.O材(Ex.O = 0.08wt%)は高Ex.O材(Ex.O = 0.39wt%)よりも、合金中に析出したメゾスケールAl2O3粒子の数密度が大きく低下している。次に、上記の合金成分をベースに、第三元素としてZrを添加した低Ex.O合金を製造し、高分解能透過型電子顕微鏡(HR-TEM)観察を行ったところ、粒界上の析出粒子の数が増大していることが判明した。Zr添加材中の酸化物粒子径(約3-5nm)は、Zr無添加材中のそれ(約7nm)に比べて小さく、数密度は約5倍高くなっている。

また、ArおよびH2ガス雰囲気下でMA処理後、1150°Cの真空加圧焼結により製造したMA雰囲気ガスの異なる2種の合金(15Cr-2W-4Al-0.8Zr-0.35Y2O3)のナノ・メゾ組織を評価した結果、Arガスを雰囲気としたMAプロセスを経た場合のみ、合金中にArバブルの形成が観察された。一方、H2ガス雰囲気下MA処理材の結晶粒径はArガス雰囲気下MA処理材に比べ、微細且つ均一化している。すなわち、これらのナノ構造のみならず、メゾ構造を複合的に組織制御させることにより、引張延性が増大したと言える。高強度粒子分散強化合金の創製の鍵となる技術開発として、ナノ・メゾ組織制御に向けたMA雰囲気影響の実験的評価や第三元素の添加を試みた結果、Al添加材において、H2ガスを雰囲気としたMAプロセスの適用およびZrの添加により、衝撃特性や引張延性が顕著に改善されることが判明した。すなわち、酸化物粒子の微細化(ナノ組織制御)のみならず、酸化物粒子の粒界析出および結晶粒径の均一化(メゾ組織制御)などを図ることで、クリープ強度の向上が期待できることを確認した。最終年度は、Al-Zr添加鉄基粒子分散強化合金の強度の温度依存性を明らかにすることに重点を置いた。前年度と同様の15Cr-2W-4Al-0.8Zr-0.35Y2O3を合金成分として、ArおよびH2ガス雰囲気下で機械的合金化(Mechanical Alloying: MA)処理を行い、得られたMA粉末を1150°Cで真空加圧焼結を施して2種の合金を製造した。これらに対して、室温から700°Cまでの引張試験を行ったところ、いずれの温度範囲においても引張強度に有意差はほとんど認められないことが確認された。一方、H2ガス雰囲気下MA処理材の全伸びは、Arガス雰囲気下MA処理材のそれよりも2倍程度大きく、いずれの試験温度でも同様の結果を示すことが判明した。本研究は、合金設計や粉末プロセス環境条件を改善することにより、高強度粒子分散強化合金を創製するとともに、その強化機構の解明を目指したものである。平成27年度は、MA雰囲気ガス中のO, N量を制御したAl添加鉄基粒子分散強化合金を製造し、固化体中に含有するEx.O, N量を低減させることで、合金内に形成される酸化物や窒化物などの析出量やサイズが減少し、衝撃特性が向上することを示した。この指針に基づいて、第三元素としてのZr添加およびH2ガスを雰囲気としたMAプロセスを適用することにより、従来のArガス雰囲気下MA処理材を凌駕する引張変形伸びを持つ、Al-Zr添加鉄基粒子分散強化合金が得られることを示した。平成28年度は、上記合金のナノ・メゾスケールでの微細組織観察と構造解析を行うことにより、Zr添加が合金中のナノ酸化物の微細化および高密度化を図り、さらにH2ガスを雰囲気としたMAプロセスを施すことで、鋼中のメゾバブル形成が抑制され、粒子分散強化合金の強度向上が図られることが実験的に示された。水素を雰囲気としたメカニカルアロイング(MA)処理と第3元素としてのジルコニウム(Zr)の添加を適用して、ナノ・メゾ組織制御による粒子分散強化(PDS)合金の創製に成功した。アルミニウム(Al)添加PDS合金へのZr添加は、ナノ酸化物粒子のサイズを小さくするとともに、粒界析出物の数密度を高めることが判明した。一方、MA雰囲気として使用した水素ガスは、マトリックス粒子内、あるいは旧粉末粒界(PPB)上の分散質粒子のサイズを減少させ、さらに合金組織を均質化することが可能である。このように、優れた高温延性を有するAl-Zr添加PDS合金の強化には、上記の強化因子が寄与することが実験的に示された。今年度の成果で特に重要な点は、H2ガスを雰囲気としたMAプロセスを施すことで、室温および700°Cにおける引張延性が大幅に増大した点である。これは、固化体中にArバブルが存在しないことだけでなく、H2が合金内での介在物形成の抑制に作用することを示唆しており、一層のクリープ強度向上が期待される。
唾液腺特異的傷害モデルマウスの作出とEGFR2/MUC1経路による修復機構の解明

唾液腺組織の傷害と修復機構をin vitroで検討するために、TRECK法を用いて唾液腺組織特異的傷害モデルマウスを作出した。唾液腺特異的に発現するアミラーゼ遺伝子(AMY1C)およびMUC7遺伝子のプロモーター配列をTA-クローニングし、ヒト-ジフテリアトキシン(DT)受容体が組み込まれたTRECKベクター(AMY1C-TRECKおよびMUC7-TRECK)を作製した。野生型マウスはDTに対して非感受性であるためDTを投与しても組織に影響はないが、細胞特異的にDT受容体を発現する遺伝子改変マウスにDTを投与すると、DT受容体を発現した細胞のみが傷害される。この遺伝子を受精卵へマイクロインジェクションし、遺伝子改変マウスを作出した。トランスジーンの発現が確認されたF0マウスは、AMY1C遺伝子のプロモーター配列を組み込んだ系統は48系統が得られ、そのうち16系統の顎下腺にヒトDT受容体の発現を確認したが、複数の臓器に発現が見られたため、顎下腺に発現が強い1系統を維持している。本系統の顎下腺を摘出し培養液にDTを添加して臓器スライス培養を行ったところ、DT添加群では培養組織に広範な壊死が生じ、顎下腺の組織傷害モデルとして利用できると考えられた。また唾液腺の上皮細胞を特異的に初代培養する方法を確立したため、上記の遺伝子改変マウスに由来する唾液腺上皮細胞を用いたin vitroの実験に応用が可能となった。一方、MUC-7のプロモーター配列を組み込んだ系統は99系統が得られ、そのうち1匹に顎下腺特異的なヒトDT受容体の発現を確認し、当初の目的であった唾液腺組織特異的傷害モデルマウスの樹立が達成された。初年度に唾液腺組織で発現の高いAMY1C(アミラーゼ)のプロモーター配列を用いて唾液腺組織特異的傷害モデルマウス作出を進めていたが、脳や心臓などの重要臓器でトランスジーン発現が確認されたため、受精卵へのマイクロインジェクションを繰り返したが、唾液腺に発現が強い1系統が得られ、臓器スライス培養を応用した唾液腺傷害モデルの実験系を確立した。また本年度までに前述のMUC7-TRECKベクターを組み込んだ遺伝子改変マウスの作出を進めたところ、99系統のF0マウスが獲られたのでトランスジーン発現の確認に時間を要したが、唾液腺特異的にトランスジーンを発現する遺伝子改変マウスが1系統得られた。今後、唾液腺組織に発現しているEGFR2の活性化がミトコンドリアに局在するMUC-1を経て細胞死(apoptosis)を抑制する可能性について詳細を検討する。前述のように、唾液腺組織特異的にトランスジーンを発現している遺伝子改変マウス(MUC7-TRECK系統)が得られたため、本系統を用いてマウス生体ならびに唾液腺上皮初代培養細胞におけるheregulin-EGFR2-MUC-1経路によるapoptosis抑制について検討を進める。唾液腺組織特異的傷害モデルマウス作出のためTRECK法を用いた。アミラーゼ遺伝子(AMY1C)のエンハンサー・プロモーター配列をTA-クローニングし、ヒトジフテリアトキシン(DT)受容体が組み込まれたTRECKベクター(AMY1C-TRECK)を作製した。トランスジーンの発現が確認されたF0マウスと野生型マウスを交配させ、F1世代ヘテロ型マウスの各種臓器におけるヒトDT受容体の発現を検討した。48系統のうち16系統の顎下腺にヒトDT受容体の発現を確認したが、複数の臓器に発現が見られたため、顎下腺に発現が強い1系統を維持している。本系統の顎下腺を摘出し培養液にDTを添加して臓器スライス培養を行った。DT添加群では培養組織に広範な壊死が生じ、顎下腺の組織傷害モデルとして利用できると考えられた。今後、EGFR2-MUC-1経路によるapoptosis抑制について検討する。また唾液腺特異的に発現するMUC-7のプロモーター配列をTRECKベクターに組み込み、受精卵へマイクロインジェクションし、顎下腺特異的にDT受容体を発現する遺伝子改変マウスの作出を進めている。現在までにF0世代99匹のうち26匹にヒトDT受容体の発現を確認し、野生型マウスとの交配を進めている。F1世代のヘテロマウスで各種臓器におけるヒトDT受容体発現を検討し、唾液腺組織特異的傷害モデルマウスの樹立を目指している。これまでに唾液腺組織で発現の高いAMY1C(アミラーゼ)のプロモーター配列を用いて唾液腺組織特異的傷害モデルマウス作出を進めていたが、脳や心臓などの重要臓器でトランスジーン発現が確認されたため、受精卵へのマイクロインジェクションを繰り返したため、実験計画に遅れが生じた。しかし、顎下腺に発現が強い1系統が得られ、臓器スライス培養を応用した唾液腺傷害モデルの実験系を確立した。また前述のMUC7-TRECK遺伝子改変マウスの作出が進んでいる。

唾液腺特異的に発現するアミラーゼ遺伝子(AMY1C)およびMUC7遺伝子のプロモーター配列をTA-クローニングし、ヒト-ジフテリアトキシン(DT)受容体が組み込まれたTRECKベクター(AMY1C-TRECKおよびMUC7-TRECK)を作製した。野生型マウスはDTに対して非感受性であるためDTを投与しても組織に影響はないが、細胞特異的にDT受容体を発現する遺伝子改変マウスにDTを投与すると、DT受容体を発現した細胞のみが傷害される。この遺伝子を受精卵へマイクロインジェクションし、遺伝子改変マウスを作出した。トランスジーンの発現が確認されたF0マウスは、AMY1C遺伝子のプロモーター配列を組み込んだ系統は48系統が得られ、そのうち16系統の顎下腺にヒトDT受容体の発現を確認したが、複数の臓器に発現が見られたため、顎下腺に発現が強い1系統を維持している。本系統の顎下腺を摘出し培養液にDTを添加して臓器スライス培養を行ったところ、DT添加群では培養組織に広範な壊死が生じ、顎下腺の組織傷害モデルとして利用できると考えられた。また唾液腺の上皮細胞を特異的に初代培養する方法を確立したため、上記の遺伝子改変マウスに由来する唾液腺上皮細胞を用いたin vitroの実験に応用が可能となった。一方、MUC-7のプロモーター配列を組み込んだ系統は99系統が得られ、そのうち1匹に顎下腺特異的なヒトDT受容体の発現を確認し、当初の目的であった唾液腺組織特異的傷害モデルマウスの樹立が達成された。初年度に唾液腺組織で発現の高いAMY1C(アミラーゼ)のプロモーター配列を用いて唾液腺組織特異的傷害モデルマウス作出を進めていたが、脳や心臓などの重要臓器でトランスジーン発現が確認されたため、受精卵へのマイクロインジェクションを繰り返したが、唾液腺に発現が強い1系統が得られ、臓器スライス培養を応用した唾液腺傷害モデルの実験系を確立した。また本年度までに前述のMUC7-TRECKベクターを組み込んだ遺伝子改変マウスの作出を進めたところ、99系統のF0マウスが獲られたのでトランスジーン発現の確認に時間を要したが、唾液腺特異的にトランスジーンを発現する遺伝子改変マウスが1系統得られた。今後、唾液腺組織に発現しているEGFR2の活性化がミトコンドリアに局在するMUC-1を経て細胞死(apoptosis)を抑制する可能性について詳細を検討する。前述のように、唾液腺組織特異的にトランスジーンを発現している系統が得られなかった。しかし本研究で確立した遺伝子改変マウス(AMY1-TRECK系統)の唾液腺スライス培養の実験系を応用し、heregulin-EGFR2-MUC-1経路によるapoptosis抑制について検討を進める。マウス生体におけるheregulin-EGFR2-MUC-1経路による唾液腺apoptosis抑制は本研究で重要な位置を占めるため、プロモーター領域をMUC-7に代えたTRECKベクター(MUC7-TRECK)を作製し、唾液腺組織特異的傷害モデルマウスの樹立を目指している。前述のように、唾液腺組織特異的にトランスジーンを発現している遺伝子改変マウス(MUC7-TRECK系統)が得られたため、本系統を用いてマウス生体ならびに唾液腺上皮初代培養細胞におけるheregulin-EGFR2-MUC-1経路によるapoptosis抑制について検討を進める。前述のように、唾液腺組織特異的にトランスジーンを発現している系統が得られず、実験の進捗が遅れたため繰越金が生じた。前述のスライス培養によるEGFR-2/MUC-
ストレス負荷による皮膚肥満細胞脱顆粒現象の病態の解明

そこで、フットショックによって皮膚肥満細胞の脱顆粒(肥満細胞活性化)が増強することに対してSPがどのように関与しているのかを検討するため、活性化肥満細胞数、皮膚に分布するSP陽性神経線維数の変化を検討した。またELISAにて、SPの蛋白量を測定した。さらに、SPの前駆体であるpreprotachykinin A(PPTA)のmRNAの発現について、real time RT-PCR法を試みた。その結果、SP陽性神経線維数、SP蛋白量は、フットショックストレス群がコントロール群に比し減少する傾向を認めた。このことは、SPは組織中に放出されると、ただちにNEPやACEといった蛋白分解酵素によって分解されるため、ストレスによりSPが放出されるほど、その組織中の蛋白量は減少することが示唆された。mRNAの発現については、双方に有意差は認めなかった。このことは、今回、ストレス負荷直後の検体を使用しており、mRNAの発現までには至らなかった可能性も考えられ、今後慢性的にストレスを負荷し、皮膚局所でmRNAの発現が見られるかどうか検討する予定である。その結果、SP陽性神経線維数は、フットショックストレス群、コントロール群に有意差は認められなかった。しかし、SP蛋白量は、フットショックストレス群の方が減少する傾向を認めた。
ルーメン細菌の亜硝酸還元能の増強

1)ルーメン微生物混合系における硝酸・亜硝酸還元に及ぼすプロトゾアの影響混合バクテリア区分に混合プロトゾア区分を添加したところ硝酸還元が速くなり、それ以上に亜硝酸還元が速くなった結果、亜硝酸の蓄積が減少した。これはプロトゾアによるH_2と乳酸の生成によるものであり、プロトゾアは易発酵性基質を一旦貯蔵し緩徐に分解するため、特に亜硝酸が蓄積する時期に硝酸・亜硝酸還元菌にH_2と乳酸(電子供与体)を供給する点が重要であると考えられた。主要硝酸・亜硝酸還元菌、S.ruminantiumの硝酸還元の速度は菌体あたりの硝酸還元酵素(NaR)の量よって左右されると考えられた。また、菌体あたりのNaR含量は増殖速度とは逆の関係にあった。硝酸還元速度(NaR含量)と菌体内のATP濃度およびNADH/NAD比の間に相関関係があったことから、NaRの合成はエネルギーと電子の供給に応じて調節されていると考えられた。更に、NaRの合成は硝酸により高められた。3)競合PCR法によるルーメン内の硝酸還元菌数の測定4)硝酸還元ルーメン菌の硝酸・亜硝酸還元能、並びにメタン生成に及ぼす硝酸還元菌の影響上記の3種の硝酸還元菌は硝酸および(または)亜硝酸の還元と共役した電子伝達リン酸化によるATP獲得機構を持ち、しかも亜硝酸の毒性に対する耐性が高いことが明らかとなった。従って、これらの菌は硝酸含量の高い飼料の給与により他のルーメンバクテリアよりも有利に増殖すると考えられた。一方、メタン生成菌は他菌よりも亜硝酸に弱いことが判明したので、ルーメン内における硝酸還元菌の数を増加させれば、発酵を阻害しない程度の亜硝酸の作用と硝酸・亜硝酸還元による電子の消費により、メタン生成を抑制できると考えられた。1)ルーメン微生物混合系における硝酸・亜硝酸還元に及ぼすプロトゾアの影響ルーメンにおいてプロトゾアがどのように硝酸・亜硝酸還元に関与するかを調べた。プロトゾアを除いたバクテリア区と比べ、プロトゾアとバクテリアの共存区では硝酸還元が速くなり、それ以上に亜硝酸還元が速くなった。その結果、亜硝酸の蓄積濃度が低下し、蓄積時間が顕著に短縮された。このようなプロトゾアの影響は、プロトゾアによるH_2と乳酸の生成によるものと考えられた。プロトゾアは易発酵性糖質を一旦貯蔵し、バクテリアよりも緩徐に分解するため、特に亜硝酸が蓄積する時期に硝酸・亜硝酸還元菌にH_2と乳酸を供給する点が重要であると考えられた。プロトゾアの生存や発酵は2mM以上の亜硝酸で著しく阻害されたので、プロトゾアはこれ以下の濃度の時に大きな影響を及ぼすと考えられる。主要な硝酸・亜硝酸還元ルーメン菌であるS.ruminantiumの硝酸還元速度および硝酸還元酵素(NaR)の合成を左右する要因について調べた。硝酸還元速度と菌体あたりのNaR含量の間に平行関係が見られたことから、本菌の硝酸還元速度はNaRの量によって左右されると考えられた。増殖速度と菌体内のATP濃度との間には正の関係があり、またADPおよびAMP濃度との間には逆の関係があった。NADH/NAD比も硝酸還元速度および菌体あたりのNaR含量と正に相関した。これらの結果から、NaRの合成はエネルギーと電子の供給状態に応じて調節されていると考えられた。この場合、アデニンヌクレオチドとピリジンヌクレオチドが調節因子の一つとして働くと思われる。

NaR含量は硝酸の存在下で増加したので、NaRの合成は硝酸により促進されると考えられる。1.競合PCR法によって見積もったルーメン内における硝酸還元菌の存在数主要なルーメン菌の中で硝酸・亜硝酸還元能をもつことが知られているSelenomonas ruminantium、Veillonella parvula、およびWolinella succinogenesがヤギのルーメン内にどれ位の数で存在するかを調べた。これらの3菌の中でS.ruminantiumが最も多数存在し、V.parvula、およびW.succinogenesの数は非常に少なかった。しかし、後者の2菌の数は高濃厚飼料(低硝酸含量)を給与した場合よりも、高粗飼料(高硝酸含量)を給与した場合の方が多い傾向があった。そこで、高濃厚飼料に硝酸塩を添加したところ、両菌の数は明らかに増加した。従って、これら2菌の数は硝酸の増加によって増加すると考えられた。2.硝酸還元ルーメン菌の硝酸・亜硝酸還元能、並びにメタン生成に及ぼす硝酸還元菌の影響上記の3種の硝酸還元ルーメン菌は硝酸および(または)亜硝酸の還元と共役した電子伝達リン酸化によるATP獲得機構を持ち、しかも亜硝酸の毒性に対する耐性が高いことが明らかとなった。従って、硝酸の存在下では他のルーメンバクテリアよりも有利に増殖すると考えられた。それ故、硝酸含量の高い飼料の給与により、これらの硝酸還元菌、特にW.succinogenesの数が増加すると考えられた。一方、メタン生成反応はバクテリア全般の増殖を阻害しないような低濃度の亜硝酸によっても阻害された。つまり、亜硝酸はメタン生成を特異的に阻害することが判明した。従って、ルーメン内における硝酸還元菌の数を増加させれば、発酵を阻害しない程度の亜硝酸の作用と硝酸・亜硝酸還元による電子の消費により、H_2を蓄積させることなくメタン生成を抑制することができると考えられる。
共添加による価数制御法を用いたEu:SrI2シンチレータの発光量世界記録更新

高い発光量とエネルギー分解能を有する次世代のシンチレータ単結晶としてEu:SrI2が着目されている。しかし、当該結晶中には結晶育成中に生成したヨウ素欠陥が存在していることが予想されるため、その欠陥を生成しないようにすることでより高特性化が可能になる。本研究では3価の不純物元素を添加してヨウ素欠陥の生成抑制を試みた。La, Gd, Luを共添加したEu:SrI2の単結晶を作製し、最も多く添加されたLa共添加結晶に関してシンチレーション特性の評価を行った。共添加の結果、発光量が低下してしまったが、これは500 nm付近の発光の影響で本来必要な435 nmにおける発光量が減少したことが示唆される。高価数元素の共添加により次世代サーベイメータに搭載が期待されているEu:SrI2シンチレータ結晶の発光量を改善する。独自に開発したハロゲン化物単結晶育成用の改良型マイクロ引き下げ法を用いて、Eu:SrI2シンチレータ結晶への高価数元素共添加および陰イオン制御を行うことでEu:SrI2結晶内のEuイオンの価数制御を行う。結晶内Euイオンの中でEu3+イオンとなっているものを共添加による電気的中性条件によりEu2+イオンに変えることで、シンチレータ発光量の改善を目指した。安定して結晶育成を行えるようにするため、合成条件の最適化を行った。様々な温度勾配、育成速度、育成前処理条件を試した結果、温度勾配は2030°C/mm、育成速度は0.010.1 mm/min,育成前処理条件は10-4Pa、300°Cにおけるベーキングの際に最も安定して結晶作製に成功した。発光量の向上をめざして、SrI2:Eu結晶に発光中心であるEuの以外にGd、La等の高価数元素を共添加した結晶の育成を行った。これは、通常Euの価数は2価と3価が共存するが、放射線検出器に利用可能な発光に寄与する2価の割合を増やして、それを阻害する3価を抑えることを目的としている。その結果、いずれも結晶化に成功し、今後の開発につながるような知見を得ることができた。単結晶の切断・研磨技術の確立に関しては、ハロゲン化物が難溶である合成油を用いてグローブボックス内で切断・研磨を行う技術を開発した。次世代のガンマ線用シンチレータとして期待されているEu:SrI2シンチレータ結晶において、高価数元素の共添加によりさらなる高発光量化の達成を実現するべく、本研究課題では、A.改良型μ-PD法による高価数元素共添加Eu:SrI2単結晶作製、B.共添加Eu:SrI2単結晶の切断・研磨技術の確立、C.共添加Eu:SrI2単結晶の結晶性評価・組成分析、D.共添加Eu:SrI2単結晶のシンチレーション特性評価の4項目を実施した。改良型μ-PD法によって結晶作製した共添加なし、La,GdおよびLu1を%共添加したEu7.5%:SrI2単結晶を作製した。作製した結晶は、すべて無色透明を示した。これらの結晶は、新たに確立した切断・研磨技術によって加工を行った。特に当該材料は吸湿性が高く大気中での切断・研磨が困難であるため、水分濃度・酸素濃度を1ppm以下に制御したグローブボックス内で切断・研磨を行った。さらに、研磨で使用する溶媒には100%の合成油を使用することで研磨中に潮解が生じないようにした。ICP-OESによる組成分析結果から、Euはほぼ仕込組成通りの添加量が結晶中に含まれていることが分かった。一方、共添加したLa、GdまたLuは仕込組成(1mol%)に対して、非常に少ない量しか結晶中には添加されておらず、それぞれ0.04%、0.01%、0.01%の置換量となった。共添加元素の中でLaが最も多く結晶中に添加できたのはイオン半径の違いによると考えられる。137Cs放射線源からのガンマ線励起下における波高分布スペクトルの結果から、Laを共添加した結晶は、共添加なしの結晶に比べて、発光量・エネルギー分解能の値が悪くなっていることが分かった。これはフォトルミネッセンス測定とX線励起ラジオルミネッセンス測定にて観測された約500 nm付近の発光の影響で本来必要な435 nmにおける発光量が減少したことが示唆される。結晶科学初年度の目標であった改良型μ-PD法による高価数元素共添加Eu:SrI2単結晶作製、および共添加Eu:SrI

2単結晶の切断・研磨技術の確立が順調に進展したことで、当初の予定通りに研究が進んでいると考えている。今年度は、目的とする共添加Eu:SrI2単結晶の育成に成功した。さらに、高品質なハロゲン化物単結晶を作製する手法の確立を行うことができた。今後は作製したそれらの単結晶の評価手法を確立して、結晶性評価・組成分析、光学特性評価および放射線応答評価を進めていく。また、光学評価・放射線応答評価の際に必要となる切断・研磨技術の確立も同時に進める。
セロトニン含有化学受容細胞の機能解析と病態生理学的意義

細胞膜電位固定法を用いて、ニワトリ大動脈に存在するニュートラルレッド(NR)陽性、セロトニン(5-HT)含有化学受容細胞の性質を調べた。(1)この細胞は電位依存性Na^+チャネル、L型とN型の電位依存性Ca^<2+>チャネル、電位依存性K^+チャネル、酸素感受性K^+チャネル、α-bungarotoxin(α-BTX)感受性と非感受性の神経型ニコチン様ACh受容体が機能していることを示した。(2)モルモットとラット腸管粘膜から分離したNR陽性細胞(5-HT含有細胞)の電流反応を記録した結果、一定の反応を得ることができず、5-HT含有細胞群を分離同定できなかった。(3)高濃度KCl、veratridine、ACh、nicotine、DMPPは胸部大動脈から5-HT遊離を引き起こし、前2者の反応はCa^<2+>チャネル遮断薬で、後3者の反応はα-BTXにより部分的に抑制された。(4)アンフェタミン誘導体p-chloroamphetamine(PCA)は時間依存性、濃度依存性に5-HT遊離を起こした。5-HT再取込阻害薬fluvoxamine、fluoxetine及びclomipramine(CLM)は濃度依存性、外液Ca非依存性に5-HT分泌を起こした。外液Na^+濃度の減少はCLMによる分泌反応を消失させたが、PCAの反応を抑制しなかった。(5)ラット脳底動脈では、5-HTは律動的な収縮と細胞内Ca^<2+>濃度変化を起こしたが、分離平滑筋では、5-HTは僅かの細胞でしかCa^<2+>増加を起こさなかった。(6)PC12細胞において、分泌小胞アミン取込阻害薬reserpineは分泌小胞のATP量を変えることなくdopamine量を低下させた。(7)副腎髄質細胞では、オピオイド受容体はG蛋白質を介してCa^<2+>チャネル電流を抑制すること、またmuscarineとcaffeineによる空間的細胞内Ca^<2+>濃度上昇は異なることを示した。ニワトリ大動脈を酵素処理して分離した細胞の中からセロトニン(5-HT)を含む化学受容細胞を生きた状態で同定する方法を見いだし、以下の成績を得た。(1)ホールセルボルテージクランプ法を用いて脱分極パルスにより誘発される内向き電流を観察し、この細胞にはテトロドトキシン(TTX)により抑制される電位依存性Na^+チャネルとCoCl_2により抑制されるL型とN型の電位依存性Ca^<2+>チャネルが存在することが示された。(2)KCl電極を用いると外向き電流が観察され、この細胞にはテトラエチルアンモニウム感受性の電位依存性K^+チャネルが存在し、その一部は低酸素で抑制される酸素感受性K^+チャネルであることが示された。(3)高濃度KClとべラトリジンは大動脈から5-HT放出を引き起こし、前者はCa^<2+>チャネル遮断薬で、後者はCa^<2+>チャネル遮断薬もしくTTXで抑制された。(4)ニコチン、アセチルコリン(ACh)、ジメチルフェニルピペラジニウム(DMPP)により内向き電流が誘発され、この反応はヘキサメソニウムで抑制されたことから、この細胞には神経型ニコチン様ACh受容体が存在することが示された。

(5)この細胞のニコチン様ACh受容体を介する内向き電流反応にはα-バンガロトキシン(α-BTX)感受性と非感受性の部分があることが示された。α-BTX感受性電流はニコチン様ACh受容体のα7サブユニットの阻害薬であるメチルリカコニチンにより抑制された。(6)ニコチン、ACh、DMPPはいずれも胸部大動脈から5-HT放出を引き起こし、これらの分泌もα-BTXにより部分的に抑制された。(7)モルモットとラット腸管粘膜細胞のニュートラルレッドで赤染した細胞をホールセルボルージクランプし、脱分極と過分極パルスを与えた結果、多くの細胞は電位依存性反応を示さなかった。一部の細胞でのみ内向き電流が観察され、赤染した細胞は均一ではないことが示された。(8)脳血管に対する5-HTの作用を調べた結果、バゾプレシンと同様、5-HTは脳底動脈に律動的な収縮を引き起こした。(1)セロトニン(5-HT)含有細胞を含むニワトリ胸部大動脈において、アンフェタミン誘導体のp-chloroamphetamine(PCA)は時間依存性、濃度依存性に5-HT遊離を起こした。PCAはmethamphetamineよりも5-HT遊離の力価が強かった。(2)5-HT再取込阻害薬fluoxetine、fluvoxamineとclomipramine(CLM)はいずれも濃度依存性に5-HT分泌を起こした。これら薬物による5-HT放出は外液Ca^<2+>非依存性であった。(3)PCAとCLMは温度依存性に5-HT遊離を起こした。また、CLMによる5-HT遊離は外液Na^+を下げることにより消失したが、PCAの反応はこの処置では影響受けなかった。(4)5-HT再取込阻害薬をニワトリに静注すると、濃度依存性に20%二酸化炭素+酸素下における呼吸数低下を改善した。(5)ラット脳底動脈に対する5-HTの作用を調べた結果、vasopressinと同様、低濃度の5-HTは律動的な収縮と細胞内Ca^<2+>濃度増加を起こした。分離脳底動脈平滑筋において、UTPは全ての分離細胞で細胞内Ca^<2+>を増加させたが、5-HTは僅かの細胞でしかCa^<2+>増加反応を起こさなかった。(6)PC12細胞において、分泌小胞アミン取込阻害薬reserpineは分泌小胞のATP含量を変えることなくdopamine含量を低下させたが、小胞ATPase阻害薬bafilomycine A1は両者を低下させた。(7)副腎髄質細胞には、オピオイド受容体が発現し、この受容体の刺激はG蛋白質を介してCa^<2+>チャネル電流の抑制することが示された。また、muscarineとcaffeineによるCa^<2+>活性化K^+電流反応と細胞内Ca^<2+>増加反応との相関には差が認められ、アミン含有細胞の空間的細胞内Ca^<2+>濃度上昇は不均一であることが示された。