hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
TLR4刺激抗体による自己免疫疾患抑制機序の解明と新規予防・治療法の分子基盤

本研究では、TLR4刺激抗体による1型糖尿病抑制機序の解明を通じて、新しい自己免疫疾患の発症予防・治療の基盤構築を目的にした。TLR4刺激抗体は、NODマウスの1型糖尿病の発症を予防するだけでなく、発症した1型糖尿病の自己免疫病態を寛解させることを明らかにした。TLR4刺激抗体の1型糖尿病抑制効果は、自己反応性T細胞の直接的抑制ではなく、樹状細胞への免疫寛容誘導や制御性T細胞、骨髄由来免疫抑制細胞の誘導を介した間接的作用機序であると考えられた。このような自然免疫を標的とした1型糖尿病の治療効果の発見は、既存の治療戦略とは異なる自己免疫疾患の新規治療法・治療薬開発につながる可能性がある。膵特異的自己免疫疾患である1型糖尿病の治療には、強化インスリン療法や膵島移植以外の有効な治療法がなく、その予防法や病態の進展阻止・寛解導入を誘導する新規治療法が望まれている。抗原提示細胞に発現するToll様受容体(TLR)は、病原体共通分子構造(PAMPs)を認識することでサイトカインやT細胞補助刺激分子の発現を増強し、獲得免疫を誘導する。TLR4はグラム陰性菌細胞壁のリポ多糖(LPS)を認識する。我々が作製したTLR4刺激抗体は、抗原との同時投与によってアジュバント効果を示す一方、刺激抗体単独投与では抗原特異的抗体産生を抑制する。LPSには免疫賦活化作用がある一方、エンドトキシントレランスに代表される免疫寛容を誘導することから、TLR4刺激抗体による免疫抑制効果が示唆される。NODマウスはヒトと同様の疾患感受性遺伝子MHC class IIの感受性ハプロタイプを有する1型糖尿病モデルマウスである。若齢NODマウスにフロイント完全アジュバント(CFA)を投与すると1型糖尿病が抑制されることが知られている。CFAはPAMPsを含むことに着目し、「TLR4刺激抗体による1型糖尿病予防効果」を着想した。本研究では、TLR4刺激抗体による1型糖尿病抑制機序の解明を通じて、新しい自己免疫疾患の発症予防・治療的寛解導入法の分子基盤を構築することを目的にした。本年度は、TLR4刺激抗体による1型糖尿病の予防効果、病態進展抑制・寛解導入効果について検討した。TLR4刺激抗体を3-4週齢のNODマウスに2週おきに3回腹腔内投与することにより、有意に糖尿病の発症を抑制できることを明らかにした。また、尿糖の出現が確認されたNODマウスにTLR4刺激抗体を1週間おきに2回投与することにより、糖尿病の発症が抑制された。一方、刺激活性を持たないTLR4コントロール抗体では、これら糖尿病の予防効果、治療効果とも認められなかった。昨年度に明らかにしたTLR4刺激抗体による1型糖尿病の予防効果と治療効果について、そのメカニズムを解析し、以下の成果を得た。TLR4刺激抗体による治療効果の見られたNODマウスでは、膵島炎が軽減し、浸潤リンパ球数が減少していた。TLR4刺激抗体の投与により、樹状細胞における共刺激分子CD80、CD86、CD40の発現低下と血清IL-2、IL-4、IL-33、IL-10濃度の上昇が認められた。また、CD11b+細胞や制御性T細胞数、特にFoxp3+Helios+Nrp1+制御性T細胞が増加していた。TLR4刺激抗体によりCD11c+樹状細胞を前処置すると、そのT細胞刺激活性は減弱した。一方、TLR4刺激抗体はCD3抗体クロスリンクによるCD4+T細胞の活性化を抑制することはできなかった。T細胞とB細胞を欠損したNOD-scidマウスに自己反応性NOD T細胞を養子移入すると1型糖尿病を発症するが、TLR4刺激抗体でNOD-scidマウスを前処置することで発症を遅延することができた。上記の結果から、TLR4刺激抗体は自己反応性T細胞を直接標的とせず、制御性T細胞等の免疫抑制細胞の誘導を介した間接的作用機序により、自己反応性T細胞を抑制し、1型糖尿病を予防、治療すると考えられた。シンシナティ大学Ridgway博士との情報交換を積極的に行い、TLR4刺激抗体による1型糖尿病の予防と治療効果のメカニズムの一端を明らかにすることができた。研究成果も論文発表でき、順調に成果は得られている。TLR4刺激抗体投与によってNODマウスの膵島へのリンパ球浸潤が軽減し、樹状細胞における副刺激分子の発現低下と血清IL-2、IL-4、IL-33、IL-10濃度の上昇が認められた。また、CD11b+細胞や制御性T細胞が増加していた。一方、TLR4刺激抗体はCD4+T細胞の活性化を直接的に抑制しなかった。NOD-scidマウスに自己反応性NOD T細胞を養子移入すると1型糖尿病を発症するが、TLR4刺激抗体の前処置はその発症を遅延した。

これらの結果から、TLR4刺激抗体は自己反応性T細胞を直接標的とせず、制御性T細胞等の免疫抑制細胞の誘導を介した間接的作用機序により、自己反応性T細胞を抑制し、1型糖尿病を予防、治療すると考えられた。これらの結果を受け、最終年度はTLR4刺激抗体による間接的T細胞抑制機序について解析し、以下の知見を得た。抗原特異的なT細胞抑制機序を解析するために、OVAに対するT細胞受容体を持つOT-IとOT-II組換マウスを用いた。OT-IとOT-IIマウス由来のCD8とCD4 T細胞をCFSE標識し、C57BL/6マウスに養子移植後、OVAに対する抗原特異的T細胞応答を解析した。その結果、TLR4刺激抗体を投与したマウスではOVA特異的なT細胞分裂が抑制していた。また、TLR4刺激抗体を投与すると骨髄由来免疫抑制細胞と同じ細胞表面マーカーを持つGr1+CD11b+細胞が増加することを明らかにした。このGr1+細胞とT細胞を共培養しCD3/CD28刺激したところ、T細胞の増殖とIL-4産生が有意に低下していた。この結果から、TLR4刺激抗体が骨髄由来免疫抑制細胞の誘導を介してT細胞を間接的に抑制していることが示唆された。本研究では、TLR4刺激抗体による1型糖尿病抑制機序の解明を通じて、新しい自己免疫疾患の発症予防・治療の基盤構築を目的にした。TLR4刺激抗体は、NODマウスの1型糖尿病の発症を予防するだけでなく、発症した1型糖尿病の自己免疫病態を寛解させることを明らかにした。TLR4刺激抗体の1型糖尿病抑制効果は、自己反応性T細胞の直接的抑制ではなく、樹状細胞への免疫寛容誘導や制御性T細胞、骨髄由来免疫抑制細胞の誘導を介した間接的作用機序であると考えられた。このような自然免疫を標的とした1型糖尿病の治療効果の発見は、既存の治療戦略とは異なる自己免疫疾患の新規治療法・治療薬開発につながる可能性がある。米国シンシナティ大学のRidgway博士との情報交換の成果もあり、初年度予定していたTLR4刺激抗体による1型糖尿病の予防効果、進展抑制・寛解導入効果について想定通りの結果が得られた。本研究の中核となる結果が得られたため、計画していたTLR4刺激抗体による自己免疫抑制機序について、自己反応性T細胞や抗原提示細胞等の機能的あるいは数的変化に関する細胞生物学的解析を進行中である。膵ランゲルハンス島の病理像については十分な解析に至っていないが、おおむね予定していた通りに研究は進んでいる。TLR4刺激抗体による1型糖尿病の予防・治療効果のメカニズムについて更に検討を進める。特に、TLR4刺激抗体による制御性T細胞の誘導が作用機序として強く示唆されるために、重点的に解析する。また、ミエロイド由来抑制細胞MDSCが治療メカニズムに関与する結果が示唆されているため、当初研究計画に加えて、本細胞の役割を解析する。免疫学TLR4刺激抗体の自己免疫抑制機序の細胞生物学的解析について解析を進める。当初の計画通りに、樹状細胞(DC)、マクロファージ(Mφ)、B細胞、CD4、CD8 T細胞、制御性T細胞のフローサイトメトリー解析による細胞数変化、DC、Mφ等の抗原提示細胞におけるサイトカイン分泌とT細胞刺激活性、膵島自己抗原に対するT細胞の反応性や血清自己抗体価について継続して検討する。また、膵島について、CD4、CD8 T細胞等の炎症性細胞の浸潤に関する病理解析を実施する。TLR4刺激抗体による自己免疫抑制機序の病因学的解析に着手する。
潜熱蓄熱微粒子スラリーを応用した高効率コンパクト熱交換器の開発

高効率のコンパクト熱交換器として,二重渦巻き型の熱交換器を開発した。先ず,この熱交換器に作動流体として温水と冷水を用い,互いに熱交換させて熱交換器の性能評価を行った。その結果,本熱交換器のもつ渦巻き流路に起因する二次流れの影響で,水平管型熱交換器と比べて高い熱交換性能を持つことを明らかにした。次いで,この熱交換器に蓄熱微粒子スラリーを適用し,潜熱吸収による交換熱量の更なる増大を図ると共に,熱交換器の積層化による伝熱面積の拡大の効果の一端も明らかにした。申請者は先ず,科学研究費補助金(課題番号17560657)において得た,潜熱蓄熱カプセルスラリーの熱媒体としての優位性を整理し,投稿論文として成果を報告した。さらに本年度は,上述の成果に基づき,蓄熱微粒子スラリーを利用した実用コンパクト熱交換器の開発とその伝熱特性の評価を行った。具体的には,実用コンパクト熱交換器の一例として二重スパイラル型の向流式熱交換器を試作し,蓄熱微粒子スラリーを利用することによる優位性を確認した。始めに,双方の流路に高温の水と低温の水を向流で流して熱交換実験を行った。その結果,二重スパイラル型の交流式熱交換器は,その構造の優位性から,直管型熱交換器よりも3位以上も伝熱能力が高いことが分かった。すなわち,微小かつ曲率の大きい流路を流体が流れる際の,二次流れの影響により,層流にもかかわらず高い熱伝達係数を示すことを明らかにした。次いで,この熱交換器の一方の流路に蓄熱微粒子スラリーを流し,もう一方の流路の高温の水からの熱回収実験を行った。その結果,蓄熱微粒子スラリーの濃度などの条件によっては,水の場合に比べて1.5倍近くの熱交換能力があることも分かった。今後は,異なる流路幅や曲率を有する二重スパイラル型熱交換器を設計し,その性能を把握するとともに蓄熱微粒子スラリーも適用した測定を行い,コンパクト熱交換器の実用化に寄与する。さらには,これらの熱交換器の積層を図り,交換熱量の増大を試みる。また,異なる温度の蓄熱微粒子スラリーを混合することで,蓄熱材の融解に伴う潜熱吸収温度範囲を拡大させた,いわゆる混合スラリーも熱交換器に適用し,その優位性を検討する。申請者は,蓄熱微粒子スラリーを利用した実用コンパクト熱交換器の開発とその伝熱特性の評価を行った。その成果は,国際会議(International Workshop on Process Intensification 2008)で報告した上で,投稿論文としてまとめた(現在投稿中)。また,前年度までに作製した熱交換器とは異なる流路幅や曲率を有する二重スパイラル型熱交換器を設計し,その性能を把握するとともに蓄熱微粒子スラリーも適用した測定を行った。さらには,これらの熱交換器の積層を図り,交換熱量の増大を試みた。また,異なる温度の蓄熱微粒子スラリーを混合することで,蓄熱材の融解に伴う潜熱吸収温度範囲を拡大させた,いわゆる混合スラリーも熱交換器に適用し,その優位性を検討した。以上の検討から,流路幅や曲率が異なる熱交換器でも,蓄熱微粒子スラリーによる熱交換性能の向上を確認した。また,熱交換器の積層化を試み,流路面積の拡大による高濃度スラリーの適用を実現した。蓄熱微粒子の混合による潜熱吸収温度域の拡大も試みたが,熱伝達促進に及ぼす温度域の拡大の影響は小さく,主に潜熱量自体が交換熱量の増大に寄与することを把握した。
幹細胞から成熟血液細胞への分化の全過程解析法

1個の胚性幹(ES)細胞をストロマ細胞株ST2上にまいて、移しかえるといった操作無しに破骨細胞誘導のすべての過程を1個のコロニーの中で継続的に観察できる(1段階培養法)。c-Kit、c-Fms、β2-integrin等の血液細胞表面マーカーで検討すると培養4日目にはc-Kil陽性細胞が出現し、6日目にはc-Fms、β2-integrin陽性細胞がコロニーの中心に出現し、次第に辺縁に移動する。そして8日目に辺縁にのみ破骨細胞のマーカーである酒石酸抵抗性酸フォスファターゼ陽性細胞が検出された。一方、血管内皮系譜の細胞はFlk-1、CD31は4日目には既に発現しその後放射線状にコロニーの成長に従いシート上に増大した。血液細胞は次第に辺縁部に集積し成熟破骨細胞へと分化した。この培養系を用いることで血液細胞系譜の分化過程を二次元的に理解できる。この培養法に加え、培養条件を途中で変化させることで血液細胞系譜までの分化、未熟血液細胞の増殖、その後の成熟過程を分離して観察できる(2及び3段階培養法)。3種の培養系を用いてtal-1、GATA-1、GATA-2、FOG遺伝子破壊ES細胞から破骨細胞誘導を行ったところ、GATA-1(-1-)、FOG(-1-)ES細胞は正常と同様に誘導が行えた。tal-1(-1-)ES細胞からは破骨細胞を含む如何なる血液細胞系譜も誘導できなかった。GATA-2(-1-)ES細胞からは頻度は激減していたが一旦、破骨細胞系譜にコミットした前駆細胞は正常と同じように増殖し分化した。このことはGATA-2がES細胞の血液細胞系譜への分化決定に関与していること、しかしながらその後の破骨細胞系譜の分化には関与していないことを示している。さらに抗M-CSF受容体阻害抗体、破骨細胞分化因子(ODF/OPGL)の阻害因子OCIFを培養に加えることでtal-1-->GATA-2-->M-CSF-->ODF/OPGLの順に破骨細胞分化に影響を与えることが明らかになった。
細胞膜外酵素BST-1、CD38による新しい自然免疫シグナル制御機構の解明

細胞膜外酵素BST-1 (CD157)は、CD38と共にADPリボシルシクラーゼ酵素のファミリーを形成している。しかし我々の身体の中でどのような働きをしているのかは分かっていない。我々はBST-1遺伝子欠損マウス(Bst1KO)の解析から、BST-1、CD38が大腸菌感染の際のB細胞やマクロファージの反応を制御している可能性があるという実験データを得た。本研究ではBST-1/CD38による新しい免疫制御機構を解明し、感染や炎症性疾患の発症にどのように関係するか、病気の治療や診断に使えるかについて調べていく。
軽量共通鍵暗号の解析と安全な構成方法とそのIoTへの応用に関する研究

Society5.0では,センサーから情報を取得,クラウド側で分析などを行い,適切な情報処理技術を行う.一般的にデータ収集に用いられるエッジデバイスは十分なハードウェアリソースを持っておらず,軽い演算で実装可能な軽量暗号技術が求められる.本研究では安全なSociety 5.0のため,1軽量共通鍵暗号の厳密な安全性評価手法の開発,2高い安全性と実装性能を有する軽量共通鍵暗号の構成方法の開発, 3軽量共通鍵暗号をベースとした軽量暗号ソリューションの開発を行う.最後に適切な暗号化モードの選択や軽量公開鍵暗号を適切に組み合わせることにより,IoT用途の軽量暗号技術のトータルソリューションを提供する.Society5.0では,センサーから情報を取得,クラウド側で分析などを行い,適切な情報処理技術を行う.一般的にデータ収集に用いられるエッジデバイスは十分なハードウェアリソースを持っておらず,軽い演算で実装可能な軽量暗号技術が求められる.本研究では安全なSociety 5.0のため,1軽量共通鍵暗号の厳密な安全性評価手法の開発,2高い安全性と実装性能を有する軽量共通鍵暗号の構成方法の開発, 3軽量共通鍵暗号をベースとした軽量暗号ソリューションの開発を行う.最後に適切な暗号化モードの選択や軽量公開鍵暗号を適切に組み合わせることにより,IoT用途の軽量暗号技術のトータルソリューションを提供する.
桜島沿岸における海洋生物の地理的分布に及ぼす火山活動の影響

鹿児島湾の中央に位置する桜島は毎年多くの観光客が訪れるが、近年噴火活動が著しく活発化しており、噴火によって生じる降灰は周辺住民への影響のみならず、海中でも堆積した火山灰によりサンゴが斃死している地点が確認されており、降灰による海洋生態系への影響が懸念される。沿岸生態系は多くの海洋生物にとって重要な再生産の場であるが、自然災害や任意的な影響を受けやすい生態系でもある。本研究では鹿児島湾のサンゴおよび魚類を長期的にモニタリングすることで火山灰が海洋生態系に与える影響について明らかにすることを目的とし、平成26年4月から隔月で桜島周辺に4ヶ所の調査地を設け調査を行った。環境パラメーター測定として各調査点における海水の水温、塩分濃度、溶存酸素量、pH、濁度、水中照度、降灰状況について測定した。また生態調査としてスポットチェックによる目視観察でサンゴの生息状況調査および降灰による影響が見られた場合にはその状況を記録し、魚類は沿岸から沖合に向けてライントランセクト法により出現魚類種および数を記録した。降灰の多い海域では造礁サンゴへの火山灰の堆積およびその影響によるとみられる部分的な斃死が見られたものの、多様な海洋生物を認めることができ独自の生態系を築いているとみとめられた。今回、環境パラメーターとこれら生息種を統合し長期的モニタリングを行うためのデータベースを作成した。
原発性胆汁性肝硬変におけるPDC-E2分子の胆管細胞表面への表出機序

本研究は、PBCの疾患特異的自己抗原と考えられるミトコンドリア内膜酵素であるPDC-E2の胆管細胞のミトコンドリアおよび小胞体への輸送動態を、シグナルペプチド分子、分子シャペロンおよびそれらの遺伝子レベルで解析した。患者さんに検体の一部を本研究に用いることを説明し承諾を得た後に採取した検体を用いて検討し以下の結果を得た。§タンパクのミトコンドリアへの膜輸送を規定する分子シャペロンHSP70、HSP60の解析PBC胆管細胞、正常胆管細胞間における、細胞質およびミトコンドリア分画のhsp70、ミトコンドリア分画のhsp60タンパクの発現、分子量の差異を免疫沈降法により解析したところ、PBCと健常人の間で有意な差異は認めなかった。しかしhsp70、hsp60遺伝子発現量は健常人に比しPBC症例で多く発現している傾向が認められた。§PDC-E2の小胞体における存在の解析PBC胆管細胞、正常胆管細胞それぞれの小胞体分画を分離し、PDC-E2の存在を免疫沈降法により解析したが、有意差は認めなかった。§タンパクのプロテアソームから小胞体膜TAPへの輸送を規定するシャペロンHSC73、小胞体内でTAPからMHC classIへの転送を規定する分子シャペロンgrp94の解析PBC胆管細胞、正常胆管細胞間における、細胞質HSC73、小胞体grp94の発現、分子量の差異を免疫沈降法により解析したところ、PBC症例では健常人に比して細胞質に発現するHSC73の分子量が異なることが明らかにされた。本研究は、原発性胆汁性肝硬変(PBC)の疾患特異的自己抗原と考えられるミトコンドリア内膜酵素であるPDC-E2の胆管細胞のミトコンドリアおよび小胞体への輸送動態を、シグナルペプチド分子、分子シャペロンおよびそれらの遺伝子レベルで解析した。患者さんに検体の一部を本研究に用いることを説明し承諾を得た後に採取した検体を用い、検討し以下の結果を得た。§胆管細胞膜、ミトコンドリア内膜、細胞質に存在するPDC-E2の分子量と活性の解析PBC症例の楔状肝生検、手術材料から得た胆管細胞の細胞膜、細胞内小器官、細胞質分画、ミトコンドリア内膜成分を材料に抗PDC-E2モノクローナル抗体を用いた免疫沈降を行い、各分画に存在するPDC-E2の分子量の差異を検討したところ、細胞膜、ミトコンドリア内膜成分には同じ分子量のPDC-E2が存在することが示された。しかし、他の分画にはPDC-E2は存在しなかった。さらにOnoらの方法に準じE2 Activity Assayを行い各分画のPDC-E2活性を測定したところ、ミトコンドリア内膜成分には活性が見られたが、膜成分には見られなかった。§正常胆管細胞とPBC胆管細胞のPDC-E2遺伝子多型性の差異の検討特異的プライマーを用いたRT-PCR法により正常胆管細胞とPBC胆管細胞のPDC-E2遺伝子を分離精製し、デイファレンシアル・デイスプレイ法により両者間で遺伝子多型性に差異があるか検討したが、差異を認めなかった。
上皮間葉系化生(EMT)と膵癌浸潤転移

膵癌の浸潤転移機構におけるEMTとその分子機構(特にTGFβシグナリング)に関して以下の知見を得た.1.膵癌細胞におけるEMT誘導:膵癌細胞株PANC-1にTGFβ1接触でEMTと遊走能・浸潤能の促進がみられ,EMTと膵癌細胞浸潤能亢進の相関が認められた.2.膵癌細胞のEMT誘導におけるRhoBの関与:PANC-1細胞をTGFβで刺激するとRhoB蛋白の経時的蓄積が見られた.変異RhoB遺伝子導入実験では,CARhoB株ではTGFβ刺激の有無に関わらずEMT形態変化がみられ,DNRhoB株ではTGFβ刺激でもEMT形熊変化が誘導されなかった.親株では上皮系マーカーはdown-regulateされ間葉系マーカーはup-regulateされたが,CARhoB株ではこれらのマーカー変化がTGFβ非存在下で観察され,DNRhoB株ではTGFβ刺激でも誘導されなかった.遊走浸潤能の検討では,CARhoB株はTGFβ刺激の有無に関わらず高い遊走浸潤能を示し,DNRhoB株ではTGFβ刺激でも完全な抑制が見られた.したがって,RhoBはTGFβによりup-regulateされ,EMTを誘導し遊走浸潤能を促進することが,明らかとなった.3.TGFβ/RhoBシグナルの下流経路:PANC-1細胞をTGFβで刺激しERK1/2蛋白発現変化を検討すると,515分をピークに活性が見られた.MEK阻害剤とp38MAPK阻害剤をTGFβと同時に作用させたところ,MEK阻害剤はTGFβ刺激とCARhOB株により誘導されたEMTを完全に抑制し,p38MAP阻害剤はEMTを増強したが,DNRhoB株では両阻害剤に全く変化を示さなかった.したがって,TGFβシグナル伝達系では,RtobBの下流にMAPKが位置し,EMT・遊走浸潤能に作用すると考えられ,p38MAPK経路は拮抗する経路と考えられた.膵癌の浸潤転移機構におけるEMTとその分子機構(特にTGFβシグナリング)に関して以下の知見を得た.1.膵癌細胞におけるEMT誘導:膵癌細胞株PANC-1にTGFβ1接触でEMTと遊走能・浸潤能の促進がみられ,EMTと膵癌細胞浸潤能亢進の相関が認められた.2.膵癌細胞のEMT誘導におけるRhoBの関与:PANC-1細胞をTGFβで刺激するとRhoB蛋白の経時的蓄積が見られた.変異RhoB遺伝子導入実験では,CARhoB株ではTGFβ刺激の有無に関わらずEMT形態変化がみられ,DNRhoB株ではTGFβ刺激でもEMT形熊変化が誘導されなかった.親株では上皮系マーカーはdown-regulateされ間葉系マーカーはup-regulateされたが,CARhoB株ではこれらのマーカー変化がTGFβ非存在下で観察され,DNRhoB株ではTGFβ刺激でも誘導されなかった.遊走浸潤能の検討では,CARhoB株はTGFβ刺激の有無に関わらず高い遊走浸潤能を示し,DNRhoB株ではTGFβ刺激でも完全な抑制が見られた.したがって,RhoBはTGFβによりup-regulateされ,EMTを誘導し遊走浸潤能を促進することが,明らかとなった.3.TGFβ/RhoBシグナルの下流経路:PANC-1細胞をTGFβで刺激しERK1/2蛋白発現変化を検討すると,515分をピークに活性が見られた.MEK阻害剤とp38MAPK阻害剤をTGFβと同時に作用させたところ,MEK阻害剤はTGFβ刺激とCARhOB株により誘導されたEMTを完全に抑制し,p38MAP阻害剤はEMTを増強したが,DNRhoB株では両阻害剤に全く変化を示さなかった.したがって,TGFβシグナル伝達系では,RtobBの下流にMAPKが位置し,EMT・遊走浸潤能に作用すると考えられ,p38MAPK経路は拮抗する経路と考えられた.
地域にあった半定量食物摂頻度調査票の妥当性および再現性の検討

食物摂取頻度調査法(Food Frequency Questionnaire:FFQ)は個人の長期の日常の食物摂取量を推定することができるため、食事と慢性疾患との関連等の疫学研究に有用である。わが国では過去20年間に数種のFFQが開発され、コホート研究に試行され始めているが、欧米に準ずる高い妥当性はこれまで確認されていない。食物摂取には地域性もあることから、我々は2003年に国立長寿医療センター研究所疫学部にて「地域にあった料理165品目の半定量食物摂取頻度調査票」を開発した。本FFQは短期検討ではあるが、既存のFFQ(各種栄養素等の相関係数の中央値0.43)を上回る、欧米(0.60)に近い高い妥当性(0.54)を有し、摂取量の絶対値においてもこれまでにない近似値を示した。今回、長期の妥当性・再現性の有無を確認するために、40歳以上の地域住民を対象として、秤量食事記録調査(DR)を各季節3日間ずつ年4回(12DR)と、FFQは3ヶ月ごとに計5回の調査を実施し、多くの栄養素等項目で長期にFFQの妥当性および再現性を繰り返し検討し、DRの季節変化も検討した。その結果、本FFQの妥当性は欧米の高いレベルまでは得られなかったものの、37の多くの栄養素等で長期に、摂取量の順位はもちろんのこと、他にない絶対値においても、これまでのFFQの中ではもっとも高い妥当性のレベルを有すること(各季の中央値0.45-0.52,1-5回の中央値0.50)が、再現性では計4回の季節変化を含む検討にて、欧米に匹敵する高い再現性(各季0.50-0.63,4回の中央値0.60)が確認された。わが国の食物摂取には季節変化があることも確認された。FFQの高い妥当性・再現性が長期に多くの栄養素等項目で確認されたことから、本FFQがDR調査を補完するツールとして、これからの大規模コホート研究に使用できると思われた。2003年に完成した地域にあった料理165品目の半定量食物摂取頻度調査票(FFQ)は、他に国内で開発された既存のFFQと比べても、多くの栄養素等・食品群において同程度または欧米に近い高い妥当性があることを確認している(2005年1月の日本疫学会で発表済み)。さらに、既存のFFQが4訂日本食品標準成分表で検討されたものであるのに対し、本FFQは現在用いられている5訂で検討を行っているのも特徴である。しかし、この妥当性の検討は国民健康・栄養調査の実施月の11月においてのみ検討したものであることから、四季があり食物摂取状況が変化する日本において使用するには無理がある。このことから、今年度は本FFQを用いて地域の中高年80-100名に、四季における調査を繰り返し実施し1年をとおしての妥当性・再現性の確認を行う事を計画し、秋季11-12月、冬季2-3月と年2回の実施を予定していたが、早くに地域の協力が得られたため6月末より開始し、9月、12月、3月と年4回の調査を終了した。食事調査は現在日本でゴールドスタンダードとされている3日間の秤量食事記録法(3DR)を比較とするため、FFQと3DRの両方法で実施した。

対象はすべて同意の得られた同一のボランティアであり、1回目から3回目は男性34名、女性42名の男女計76名、調査開始時の年齢は40-77歳(平均年齢60.7±7.6歳)であるが、4回目の調査参加者は海外単身赴任1名を除き男女計75名である。現在FFQは第3回までの結果を出したところであるが、3DRはグラム換算データ入力等継続して作業中であり、第2回までの結果が出たところである。これまでのところ、FFQ、3DRともに男女合計の栄養素等摂取量はエネルギー1900-2000kca1、たんぱく質70-80gであった。次年度は引き続き再現性の検討を行う必要があり、6月に実施予定である。わが国には1990年代に数種の食物摂取頻度調査法(FFQ/DHQ)が開発されている。しかし、2000年に5訂日本食品成分表が改定、2005年には修正を加味した5訂増補日本食品成分表がされており、成分表に準じたFFQが必要である。本研究での「地域にあった料理165品目の半定量食物摂取頻度調査票(FFQ)・2003年完成」は四季のあるわが国において11月(秋季)のみの検討ではあるが、5訂食品成分表を元にして上記既存のFFQと同程度、または欧米に近い高い妥当性があることを確認している。摂取量の絶対値においても既存のFFQにない近似値を示したことから、四季のあるわが国において真の妥当性・再現性の有無を確認するために、各季節の年間にわたる調査を実施し検討することを目的としている。今年度は6月にFFQの再現性の検討のための第5回調査を終了した。本FFQ食事調査は現在日本でゴールドスタンダードとされている3日間の秤量食事記録法(3DR)を比較とするため、FFQと3DRの両方法で春夏秋冬の4回の調査を実施し、さらに第5回のFFQを行った。対象はすべて同意の得られた愛知県T市の同一のボランティアであり、第1回調査から第3回調査は男性34名、女性42名の男女計76名、第4・5回調査は男性33名、女性42名である。現在3DRは4回の栄養計算を終え、2007年5月の日本栄養食糧学会にて「地域住民における食物および栄養素等の摂取量の季節変動」を発表した(投稿予定)。FFQも全5回の栄養計算を終え、平均では3DRと類似した結果を示している。現在3DRとFFQについて妥当性および再現性の検討、さらに各季節における妥当性の検討も加え解析中である。2007年度には日本疫学会に発表、国際学会誌に投稿の予定である。食事と疾病の関係をみるためには疫学的に有用な調査票が求められており、その食事調査法の中でも半定量食物摂取頻度調査票(FFQ)は有用とされるが、わが国には四季があり食物の摂取が変化すること、多様な食文化を受け入れており、地域や世代によっても食物摂取の内容が異なることなどから困難とされ、これまでに有用な調査票がなかなか開発されなかった。平成16年に国立長寿医療研究センターで開発した「地域にあった165項目のFFQ」は短期ではあるが高い妥当性・再現性を有することを確認している。本研究の目的は地域にあったFFQの長期の妥当性・再現性を確認することであり、18年度までに終えている四季(1年間)を通じて(1)3日間ずつ4回の食事記録調査(3DR×4,計12DR)結果と(2)同時期の年4回、さらに翌年春季の1回を加え計5回の5つのFFQの結果をもとに解析を行った。対象は全調査に参加した40歳以上の男女75名である。(1)妥当性の検討では先行研究にはほとんどない多種類の栄養素等(食事の重量、水分、エタノール等も加え)37項目について5回のFFQの栄養素等摂取量結果と12DRの平均栄養素等摂取量を比較検討した。いずれの比較においても各栄養素等において有意な関係が認められなかった栄養素は2-5項目と少なく、Pearsonの相関係数の中央値が0.45-0.50と高い相関関係が得られたが、ビタミンDのみ妥当性のある結果が得られなかった。
拍動血流と弾性血管壁の相互作用に関する体外模擬実験と数値解析

1.冠動脈や静脈の血管を生体外で模擬した柔軟な弾性ゴム管に外圧を印加した時、その断面が座屈し、大変形して行く過程を理論と実験の両面から解明するため、主に肉厚の異なる6種類のシリコンゴム管を対象に、管体積変化量測定法およびレーザーシート光による管断面可視化法と2次元および3次元数値計算法を用いて管内外差圧と断面形状との関係を求めた。その結果、管端に接続された円形剛管の影響が少ない箇所では2次元理論と実験は良く一致し、3次元理論と実験値は全域にわたってほぼ一致した。また、これらの座屈した管に水を定常的に流した時の管軸方向の圧力損失について、水力学平均直径を用いた1次元理論および2次元理論と実験を比較した結果、断面変形が大きくなると共に1次元理論と合わなくなるが、2次元理論とはほぼ合うこと、しかし両壁接触後は2次元理論とも合わなくなることが分かった。以上より、コラプシブルチューブの静的大変形および管内の定常流は3次元理論を用いれば全域にわたって正確に模擬できることが明らかになった。2.模擬赤血球として製作したアルギン酸ゲル製の平均直径9.6μmの柔軟弾性微粒子と水、生理食塩水およびデキストランとの体積濃度40%60%の高濃度分散液を作成し、レオスコープで粘度とレオロジー特性を測定したところ、実際の血液と同一粘度を持ち、かつ同じカッソン流体的特性を持つことが実証され、従来に無い高性能の模擬血液として使用出来ることが分かった。3.動脈内の狭窄部位における血流中の流れ場を模擬するために、内径6mmの柔軟弾性シリコンゴム管に高さ1mmの円環状狭窄を作り、上記の模擬血液を定常的に流し、LDVを用いて近傍の流速分布を測定し、血液のカッソン流体的性質と混相流体的性質の影響を調べた。その結果、狭窄の頂上では流速分布は矩形状であるが、水よりも分布の角が丸みを帯びていること、狭窄部下流の剥離領域の範囲が水よりも狭いことが分かった。1.模擬赤血球としてアルギン酸ゲルの柔軟弾性粒子、およびアラビアゴムとゼラチンでコーティングされたカプセル粒子の2種類を試作し、粒径、物性値の評価、およびそれらの高濃度懸濁液が模擬血液としての力学的特性を備えているか否かの評価を行なった結果、前者が模擬赤血球として適当との結論を得た。アルギン酸ゲル粒子は製作法を工夫することにより平均粒径13.6μm、密度1030kg/m^3とほぼ赤血球を模擬できた。水または生理食塩水を媒液としたこの粒子の高濃度分散液のずり応力τ一ずり速度dγ/dt曲線を体積濃度(ヘマトクリット)と液温度をパラメーターとしてコーンプレート型粘度計で精密測定したところ、血液と同じく降伏応力を持つCasson流体であること、血液とほぼ同じ粘性係数を持つこと、さらにずり速度約100/sec以下で血液が連銭を形成するのと同様にこの分散液も可逆的集合体を形成することがわかった。これにより、我々の模擬血液が実際の血液の持つ力学的特性の大部分を持っていることが明らかになった。2.静脈血管や冠動脈を模擬した柔軟な薄肉ゴム弾性管(コラプシブルチューブ)に外圧を印加して内部に流体を流した時に発生する自励振動のメカニズムを解明するため、まず外圧を受けて座屈していくチューブ断面の挙動について数値シミュレーションを行なったところ、最も重要なモード2の座屈(円形断面が8の字型につぶれるモード)を模擬することができた。

次にチューブ肉厚が管軸に沿って直線的に変化するような管を製作し、その中の流れの自励振動の特性を実験によって調べたところ、自励振動の発生領域が大幅に縮小した。この管を開心手術時の体外循環流路に用いれば、好ましくない自励振動の発生を抑えることも可能である。3.大動脈弓を模擬した分岐管付きテ-パ-U字剛曲管内の水拍動流中の瞬時・局所の速度場をレーザー誘起蛍光法による可視化法を用いて詳細に調べることができた。(1)動脈血管を生体外で模擬した弾性ゴム管(内径6mm、肉厚1mm)に、報告者らが開発し、実際の血液と同じレオロジー特性を持つことが実証されている模擬血液(模擬赤血球としてのアルギン酸ゲル製の柔軟弾性微粒子と水との体積濃度30%の高濃度分散液)を定常的に流し、LDVを用いて管断面内、とくに管壁近傍の流速分布を測定し、血液のカッソン流体的性質と混相流体的性質の影響を調べた。その結果、まず、模擬血管と同一内径の剛管内の発達流について、層流の場合は、ニュートン流体の放物線分布の中央部が押さえつけられたような流速分布を呈した。一方、乱流の場合はニュートン流体の1/7乗則よりも全体に丸みを帯びた分布を呈し、対数速度分布で見るとニュートン流体の場合よりも乱流コアにおける速度分布の傾きが大きくなり、すなわちカルマン定数が小さくなり、乱流が抑制されていると推測できた。次に、模擬血管内の発達流については上記の傾向がさらに強まり、乱流の抑制がさらに強くなっていると推測された。(2)拍動血流・弾性血管壁相互作用が血管全体にわたって現れた現象である大動脈内の脈波の伝播を、生体外で液体で満たされた薄肉ゴム弾性管(コラプシブルチューブ)内の単独波の伝播によって模擬し、補正した静的チューブ則と非定常粘性摩擦項を持つ一次元流れの微分方程式を連立させて数値シミュレーションを行い、実験結果と比較した。その結果、チューブの座屈点近傍におけるチューブ則の補正により実験結果と計算結果はよく一致し、また管を満たした液体の粘性が高い場合は非定常粘性摩擦項を考慮する必要があることが明らかになった。1.冠動脈血管や静脈血管を生体外で模擬した柔軟な弾性ゴム管に外圧を印加した時、その断面が座屈し、大変形して行く過程を理論と実験の両面から解明するため、主に肉厚の異なる6種類のシリコンゴム管を対象に、管体積変化量測定法およびレーザーシ一ト光による管断面可視化法と2次元および3次元数値計算法を用いて管内外差圧と断面形状との関係を求めた。その結果、管端に接続された円形剛管の影響が少ない箇所では2次元理論と実験は良く一致し、3次元理論と実験値は全域にわたってほぼ一致した。また、これらの座屈した管に水を定常的に流した時の管軸方向の圧力損失について、水力学平均直径を用いた1次元理論および2次元理論と実験を比較した結果、断面変形が大きくなると共に1次元理論と合わなくなるが、2次元理論とはほぼ合うこと、しかし両壁接触後は2次元理論とも合わなくなることが分かった。以上より、コラプシブルチューブの静的大変形および管内の定常流は3次元理論を用いれば全域にわたって正確に模擬できることが明らかになった。2.動脈内の狭窄部位における血流中の流れ場を模擬するために、内径6mmの柔軟弾性シリコンゴム管に高さ1mmの円環状狭窄を作り、報告者らが開発し、実際の血液と同じレオロジー特性を持つことが実証されている模擬血液(模擬赤血球としてのアルギン酸ゲル製の柔軟弾性微粒子と水との体積濃度50%の高濃度分散液)を定常的に流し、LDVを用いて近傍の流速分布を測定し、血液のカッソン流体的性質と混相流体的性質の影響を調べた。
母体の含硫アミノ酸代謝制御による哺乳類卵子老化の予防法の開発

加齢による卵子や受精卵の品質低下のメカニズムとその予防方法は、晩婚化の進んだ現代では重要な研究課題である。本研究では、遺伝的に卵子や受精卵の品質が高いC57BL/6Jマウスと、品質が低いDBA/2Jマウスの受精卵を用いて、アミノ酸代謝に関する比較と、それらの作動薬を用いた新しい培養技術の開発を行った。その結果、品質の低い受精卵でも効率良く胚盤胞まで発生させる培地の開発に成功した加齢による卵子や受精卵の品質低下のメカニズムとその予防方法は、晩婚化の進んだ現代では重要な研究課題である。その結果、品質の低い受精卵でも効率良く胚盤胞まで発生させる培地の開発に成功した卵子老化に代表される卵子や胚の品質の劣化は、晩婚化が進む現代において非常に重要な研究テーマの一つであるが、その原因となる因子や対策はあまり明らかになっていない。これまでに実施してきたマウス卵子の網羅的メタボロミクス解析などの結果から、遺伝的に卵子の品質が悪いDBA/2Jマウスの卵子や胚では、卵子品質が良いC57BL/6Jマウスの卵子や胚と比べて、(1)桑実胚から胚盤胞期でのミトコンドリア活性が低いこと、(2)ミトコンドリア機能に関連するタウリンなどの含硫アミノ酸が著しく低いことを明らかにしてきた。そこで、本研究計画では、タウリンなどの含硫アミノ酸代謝と卵子および胚品質劣化との関連を探り、その予防方法の開発につなげることを目的として、研究を行った。平成25年度は、当初実施計画に沿って、サブテーマ(1)C57BL/6およびDBA/2マウス卵巣における含硫アミノ酸代謝産物の測定と比較、サブテーマ(2)卵巣、卵子・胚中における含硫アミノ酸の生合成酵素群の発現プロファイルを実施し、C57BL/6Jマウス卵巣と、DBA/2Jマウス卵巣で、アミノ酸の含有量が顕著に異なることを明らかにした。予定していたサブテーマ(3)タウリントランスポーターレポーターマウスの導入とバッククロスおよびサブテーマ(4)含硫アミノ酸生合成系遺伝子ノックアウトマウスの導入については、交付決定額が予定より減額されたことからJackson研究所からの購入が困難になったため、RNAiおよび阻害剤実験、ウイルスベクターを用いた実験に切り替えて実施することとした。また平成26年度に実施予定であったサブテーマ(6)In VitroおよびIn VivoでのDBA/2マウス低品質卵子・胚のレスキュー実験を本年度に実施し、品質の悪いDBA/2Jマウス胚でも高率に胚盤胞形成をさせることができる新たな方法を開発し、特許出願した。卵子老化と呼ばれる加齢に伴う卵子・受精卵の品質低下は、晩婚化が進む現代社会において重要な研究テーマであるが、未だ未解明な点も多い。本研究では着床しやすく産子数も多いC57BL/6Jマウス受精卵と、着床しにくく産子数も少ないDBA/2Jマウス受精卵の代謝中間体を網羅的に解析・比較したところ、その中でタウリンなどの含硫アミノ酸の代謝経路に関わる中間体がDBA/2Jマウス受精卵で著しく少ないことを明らかにした。そこで、平成25年度に引き続き、平成26年度はサブテーマ(6)「In VitroおよびIn VivoでのDBA/2マウス低品質卵子・胚のレスキュー実験」を重点的に実施した。具体的には、卵子・受精卵の品質が低いDBA/2Jマウス受精卵で著しく少なかった代謝中間体群を、様々な濃度で添加し、DBA/2J受精卵の胚盤胞までの発生率が変化するかどうかをモニタリングするという実験で、メタボローム解析で候補としていた2つの代謝経路中間体のうち、1つの分子について、500μMから1mMの濃度域で顕著な発生率向上効果が得られることを明らかにした。また、候補分子のトランスポーターとレセプターの阻害剤、作動薬をそれぞれ添加した実験では、トランスポーターの阻害剤・作動薬では、発生率には何も影響を与えなかったのに対し、レセプターの阻害剤・作動薬では発生率が変化することを明らかにし、この分子のレセプターが卵子・受精卵の品質に重要であることを明らかにした。これらの結果を踏まえて、他の哺乳類であるウシ受精卵でも効果があるかどうかを検証するための実験を行った結果、ウシ低品質受精卵でも発生率向上効果があることを確認し、特許を国際出願した。これらのことから、本研究で明らかにした新たな受精卵品質に関わる因子の制御によって、卵子・受精卵品質を改善することが出来る可能性が示唆された。生殖工学当初計画で予定していたサブテーマ(1)およびサブテーマ(2)を滞りなく実施し、品質の良い卵子を産生するマウス卵巣と、品質の悪い卵子を産生するマウス卵巣で、アミノ酸の含有量が顕著に異なることを明らかにした。交付決定額が当初計画よりも減額されたため、予定していたレポーターマウスやノックアウトマウスの導入が困難になったものの、当初計画時から導入困難になった場合のリスクヘッジを折り込んでいたため、すぐにRNAiや阻害剤、ウイルスベクター実験へと変更して、影響を最小限に抑えた。

さらに平成26年度実施予定であったレスキュー実験を行い、胚盤胞達成率が悪いDBA/2Jマウス胚について、高率に胚盤胞に発生させる新たな方法を開発し特許出願した。これらのことから、「(2)おおむね順調に進展している」とした。平成25年度は当初計画の遂行により、品質の悪い卵子を産生するマウスと品質の良い卵子を産生するマウスの卵巣内では、含まれる遊離アミノ酸が大きく異なることを明らかにした。また、その知見を基に品質の悪い卵子・胚のレスキュー実験を行い、このような母胎から産生された卵子・胚でも、至適条件下では高率に胚盤胞に到達することを明らかにした。これらのことから、平成26年度には予定していたサブテーマ(5)含硫アミノ酸生合成系ノックアウトマウスの解析の代わりに、RNAiや阻害剤、ウイルスベクターを使った実験を進め、キーとなる遺伝子産物の絞り込みを行う予定である(平成25年度に、すでに阻害剤実験の一部を実施し、ある程度の予測はできている)。さらに平成25年度に一部実施したサブテーマ(6)In VitroおよびIn VivoでのDBA/2マウス低品質卵子・胚のレスキュー実験について、平成26年度は主にIn Vivoでのレスキュー実験を実施する予定である。交付決定額が当初計画予算よりも減額されたため、当初計画で予定していたレポーターマウスおよびノックアウトマウスの購入が困難となり、サブテーマ(3)、(4)および(5)について、RNAiや阻害剤実験、ウイルスベクターを用いた実験に切り替えた。そのため、平成25年度中の使用額が減少した。平成26年度は、平成25年度に一部実施したサブテーマ(6)In VitroおよびIn VivoでのDBA/2マウス低品質卵子・胚のレスキュー実験について、平成26年度については主にIn Vivoでの解析を行う予定としており、生体内へのRNAiや阻害剤、ウイルスベクターを導入するための費用として、使用する予定である。
c-Myc/Max 転写複合体による ES 細胞の未分化性維持の分子メカニズムの 解明

ES細胞は、体を構成するあらゆる種類の細胞へと変換できる潜在能力と、その潜在能力を維持したまま、培養細胞株として、無限に維持できることで特徴付けられる細胞である。今までに、c-Mycを含むMycファミリータンパク質も、Oct3/4タンパク質同様、それらのES細胞が持つ2つの特質を維持する上で必須であることが示唆されていたが、ジーンターゲティングの見地から、その点が確認されたことはなかったので、本研究課題では、Mycタンパク質が機能する上で必須であるMaxタンパク質をコードする遺伝子のホモ欠失ES細胞を樹立し、解析した。c-Myc転写因子は、Oct3/4転写因子と同様、ES細胞の未分化性維持において、必須な因子である。但し、c-Myc転写因子が、どのようにして、その生物学的機能を達成しているかに関しては全く明らかになっていない。c-Myc転写因子のES細胞における機能の分子メカニズムを探ることを目的に、c-Mycが機能する上で必須なパートナー因子であるMaxタンパク質をコードする遺伝子をホモでノックアウトすると同時に、ROSA26遺伝子座に、tet offシステムと伴にMax cDNAを導入した。そして、その細胞に、ドキシサイクリンを添加することにより、Max遺伝子の発現を完全に消失させたところ、ES細胞は、未分化性を失うとともに、激しい細胞死が躍起されることを明らかにした。また、阻害剤を用いた実験から、このMax-null ES細胞における細胞死は、Caspase-3依存的なアポトーシスであることが明らかになった。DNAマイクロアレーを用いた解析から、Max遺伝子の発現の消失に伴い、Myc moduleに属する遺伝子群の発現を抑え、また、興味深いことには、Oct3/4、Nanogといったpluripotencyタンパク質により規定されているCore module遺伝子群の発現は、Max遺伝子発現のレベルを低下させてた直後においては、その活性を高めていることが明らかになった。これは、c-Myc/Max転写複合体が機能できなくなった状態においても、未分化状態を保とうとするES細胞の代償的な応答である考えられる。但し、Max遺伝子発現を消失させた後、4日以上経過すると、Core module activityもMyc module activityの低下に引きずられる形で、負に転ずることが明らかになった。また、Gene Ontology解析から、Max-null ES細胞の細胞死の原因が、活性酸素を低下させる能力の低下によるのではないかという予備的なデータが得られた。ES細胞は、Oct-3/4、Sox2などのpluripotency遺伝子が中核をなすCore module転写サブネットワークのみでは、未分化性を維持することができず、そのCore moduleとはほぼ独立している、c-Mycを中心とした転写サブネットワーク(Myc module)も同様に必要であるとされていた。但し、私たちは、c-Mycタンパク質が機能する上で必須なパートナー因子をコードするMax遺伝子のホモ欠失ES細胞を用いた解析から、c-Mycタンパク質、及び、その支配下にあるMyc module遺伝子群は、Oct-3/4のように、ES細胞の未分化性維持において絶対に必要なものではないことを証明し、平成23年度の成果として発表することができた。具体的には、ES細胞の新しい培養法として開発されたグランドステート培養条件下にES細胞を曝すことなどにより、ES細胞は、c-Myc非依存的に、無限の自己増殖性、及び多分化能を維持することができることを証明した。すなわち、c-Mycは、Oct-3/4等とは違って、ES細胞の維持に必須な遺伝子ではなくて、細胞の培養条件を工夫することなどでその必要性が無くなる、いわゆるcontext dependentなES細胞の未分化性維持遺伝子であることを証明した。c-Mycは、癌原遺伝子であり、このような遺伝子に、ES細胞が、自身が有する特筆すべき性質である無限の自己増殖性と、神経、筋肉、肝臓細胞等、あらゆる種類の細胞へと変換する潜在能力である全能性を依存している故に、ES細胞は、細胞移植の為の供給源として利用するには危険すぎる細胞であるという概念が強くあった。但し、私たちの研究成果は、その固定概念を払拭するものであると考えている。ES細胞は、Oct-3/4、Nanogと言った転写因子を中心としたCoreモジュールとMycを中心としたMycモジュールと呼ばれる2つの転写サブネットワークの絶妙なバランスの上に成り立っている。但し、この概念は、マウスES細胞がLIFと血清という、古典的な培養条件で培養されているES細胞を用いて得られた研究結果から導き出された結論であり、培養条件を変えた場合でも、このことがES細胞についての普遍の真理であるか否かは今までに検討されたことがなかった。本研究では、その点を検討することを目的として研究を行った。本研究では、Maxタンパク質をコードする遺伝子をホモ欠失させたES細胞を用いて実験を行った。なお、このMaxホモ欠失ES細胞は、Max遺伝子座のホモ欠失に加え、ROSA26遺伝子座にtet offシステムと共にMax cDNAが導入されている。

従って、本ES細胞は、テトラサイクリン非存在下では、ROSA26遺伝子座からのMaxの発現が確保できるが、培地にテトラサイクリンを加えることで、Maxの発現が消失する。実際、この系を利用して、様々な培養条件下でのES細胞の未分化性維持にとってのc-Myc活性の必要性をMax遺伝子の発現をコントロールすることで検討した。その結果、予想とおり、LIFと血清を用いる古典的な培養条件下にあるES細胞は、Maxの発現を消失させると、ES細胞としての未分化性を維持することができず、細胞分化とアポトーシスを起こすことが明らかになった。但し、グランドステートというES細胞の新しい培養条件下にあるES細胞は、Max遺伝子の発現をうしなっても、ES細胞としての未分化性には全く影響を及ぼさないことがわかった。なお、Maxホモ欠失ES細胞が示すアポトーシスのフェノタイプは、Sirt1の活性を阻害することである程度緩和させることができることを明らかにした。グランドステート培養条件下にあるES細胞は、未分化性維持においてMycにそれほど大きく依存していなのではないかかという仮説を検討することが、本研究プロジェクトの最大の目的であり、その目的は達成することができた。かつ、得られた結果が、この条件では、c-Myc遺伝子が全く不必要であるというものであった故に、かなり大きなインパクトのある成果として発表することができた。但し、古典的な培養条件下で何故、ES細胞が未分化性維持においてc-Mycに大きく依存しているかという分子メカニズムに関しては全く解明できておらず、それ故、達成度として(2)を選択した。24年度が最終年度であるため、記入しない。いわゆるサイトカインであるLIFと血清を用いた古典的なES細胞培養条件下にあるES細胞において、c-Myc活性を奪うと、未分化性を失うと同時に、激しい細胞死を呈することを確認しているが、何故、そのようなフェノタイプが出現するか、分子メカニズムを解明することができていないので、それを平成24年度の目標に研究を進めていきたいと考えている。