hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
軽度認知障害から認知症への進行予測を可能にするコンピュータ支援診断システムの開発

本研究では、mild ADとMCIを対象にデータベースに蓄積されたMRIとADAS-Jcogを使用し、mild ADとMCIの早期診断について検討した。対象はmild AD192名とMCI138名の計330名である。本研究の結果、VOI内萎縮度、全脳萎縮領域の割合、VOI内萎縮領域の割合、萎縮比の全てにおいて有意な差が認められた。また、ADAS-Jcogの下位項目のうち10項目で有意な差が認められた。さらに、判別分析の結果、全脳萎縮領域の割合、見当識、単語再生、再生能力、物品呼称で判別率80.9%を得た。よって、この5項目はmild ADとMCIの診断に有用な指標であった。本年度は、これまでにデータベースに蓄積された認知機能検査データの時系列解析をするとともに、生活活習慣病データとの関係から、認知機能の低下と生活習慣病との関係について明らかにした。対象は、クリニックを受診して認知機能データベースにデータ登録され、6か月ごとのMMSE検査を4年以上に渡って実施することのできた211名である。なお、すべての対象者はNINCDS-ADRDA基準でprobable ADと診断されているが、本研究では糖尿病、高血圧、脳梗塞を合併しているかどうかによって対象者を分類した。ただし、複数を合併している場合には対象者から除外することにした。MMSEは十分にトレーニングを受けた同一の者が実施し、検査者によるバイアスがかからないように配慮した。アルツハイマー型認知症群、糖尿病合併群、高血圧合併群、脳梗塞合併群の全てにおいてMMSEは年々低下していた。また、1年間あたりのMMSE低下得点は、糖尿病合併群で1.31点と最も高く、次いでアルツハイマー型認知症群で0.78点,脳梗塞合併群で0.77点,高血圧合併群で0.64点であった。次に、VSRADについて糖尿病合併群は年間で17.7%増加し、次いでアルツハイマー型認知症群は年間で10.8%,脳梗塞合併群は年間11.2%,高血圧合併群は13.5%増加した。VSARDが増加しているということは、内側側頭部である海馬傍回付近が年々萎縮していることを示している。これらのことから、糖尿病はアルツハイマー型認知症の発症リスクを高めるだけでなく、認知機能の低下や脳の委縮のリスクを高めるものと考えられ、認知症の進行を遅らせるためには糖尿病管理が重要であると示唆された。本年度は、これまでに認知機能データベースに蓄積されたCDR、VSRAD、ADAS-Jcogのデータを解析し、認知症の早期発見項目の抽出を行った。対象は、平成27年1月から12月までの1年間に物忘れを主訴としてクリニックを受診して認知機能データベースに登録された1,362名のうち、CDR、ADAS-Jcog、MRI撮影の全てを実施することのできた348名である.なお、CDRは半年に1度、VSRADおよびADAS-Jcogは1年に1度検査を実施した。ADAS-Jcogは十分にトレーニングを受けた者が実施し、CDRは神経内科専門医が判断した。また、MRI装置はSiemens社製のMagnetom(1.5T)を使用し、MRI画像はVSRAD撮像推奨条件(3DT1強調水平断画像)により撮影した。認知症重症度が高くなるにつれ、Zスコアは大きな値となり、脳萎縮の割合は大きくなった。さらに、認知症重症度が高くなるにつれ、ADAS-Jcog合計点は高い値となった。Zスコア、脳萎縮の割合、ADAS-Jcogの11の下位検査項目についてステップワイズ法による判別分析を行った結果、CDR0.5、1、2の3群を判別するのに投入された項目は、Zスコア、自発語の換語困難、見当識、単語再認の4項目であった。この4項目はアルツハイマー型認知症の早期発見に有効な項目であると考えられ、定期的にフォローアップする必要があると考えられた。今年度は昨年度に引き続き、データ収集作業とデータ解析作業を中心に研究を実施した。特に、1)これまでに収集されたMRI画像や認知機能検査などの臨床データをデータベースに保管し、収集される臨床データをスムーズに登録できるようにデータベースを整備した。2)データベースに保管されている臨床経過や認知機能検査結果、MRI画像から形態的変化を数値化したデータについてデータ解析を行い、アルツハイマー型認知症の危険因子を抽出した。3)研究代表者および研究分担者の解析結果や開発結果を情報共有することが可能なプラットホームを構築した。4)軽度認知障害者のデータの臨床データを収集し、データベースに登録した。5)アルツハイマー型認知症の早期発見することが可能な因子を抽出した。今後、軽度認知障害から認知症への進行を予測することが可能な因子を抽出し、医師、看護師や介護職員などの医療従事者、さらには患者とその家族に対して客観的に説明することが可能なシステムを開発する。物忘れを主訴としてクリニックを受診、認知機能データベースに登録された軽度アルツハイマー型認知症患者192名、軽度認知障害患者138名の計330名を対象に、VSRADから得られるVOI内萎縮度、全脳萎縮領域の割合、VOI内萎縮領域の割合、萎縮比の4つの指標,ADAS-Jcogの11の下位検査項目について検討した。

軽度認知障害および軽度アルツハイマー型認知症におけるVSRADから得られたVOI内萎縮度、全脳萎縮領域の割合、VOI内萎縮領域の割合、萎縮比の結果より、VOI内萎縮度、全脳萎縮領域の割合、VOI内萎縮領域の割合、萎縮比の全てにおいて軽度認知障害と軽度アルツハイマー型認知症の間で有意な差が認められた。また、ADAS-Jcog合計点は軽度認知障害は9.16点、軽度アルツハイマー型認知症は20.25点であり、統計的に有意な差が認められたADAS-Jcog合計点とVOI内萎縮度、全脳萎縮領域の割合、VOI内萎縮領域の割合、萎縮比それぞれの相関係数を求めたところ、全てにおいて有意な相関が認められた。ADAS-Jcogの11の下位検査項目のうち、構成行為のみ有意な差は認められなかったが、それ以外の10項目については軽度認知障害と軽度アルツハイマー型認知症との間で有意な差が認められた。さらに、軽度認知障害と軽度アルツハイマー型認知症の間で有意な差が認められた14項目についてステップワイズ法による判別分析を行った結果、軽度認知障害と軽度アルツハイマー型認知症を判別するのに投入された項目はVSRADから得られた全脳萎縮領域の割合、ADAS-Jcogの下位項目である見当識、単語再生、再生能力、物品呼称の4項目の計5項目であった。これらのことから、5項目は軽度認知障害と軽度アルツハイマー型認知症を鑑別するのに有効な項目であると考えられ、定期的にフォローアップすることが必要考えられた。昨年度に引き続き、データ解析作業を中心に研究を実施してきた。特に、頭部MRI画像による脳萎縮の変化、脳形状変化の特徴や認知機能検査のサブ項目などのデータ解析結果から、軽度認知障害および軽度アルツハイマー型認知症の診断に有用な項目の抽出作業を行うことができた。また、軽度認知障害からアルツハイマー型認知症への進行を予測することが可能な検査項目の抽出も行うことができた。さらに、軽度認知障害およびアルツハイマー型認知症の診断に有用な客観的かつ定量的な情報を医師に提供し、軽度認知障害に対して適切な診断を促すことを支援するシステムの開発に着手した。今後、開発しているシステムの有用性について検証するとともに、軽度認知障害からアルツハイマー型認知症、レビー小体型認知症などへの進行予測、および認知症状の予後予測について、医師、看護師や介護職員などの医療従事者、さらには患者とその家族に対して客観的に説明することが可能なシステムの開発を行う予定である。軽度認知障害患者を対象として5年間追跡調査し、軽度認知障害からアルツハイマー型認知症への移行等について調査した。対象は物忘れを主訴として医療機関を受診し、Petersenらのamnestic MCIの診断基準を満たし、5年の経過観察を終えることのできた31名である。5年の経過により、31名中19名(61.3%)が軽度認知障害からアルツハイマー型認知症に移行し、2名(6.5%)がレビー小体型認知症に移行した。8名(25.8%)は軽度認知障害のまま推移し、2名が健常高齢者にリバートした。リバート率は6.5%であった。また、アルツハイマー型認知症へ移行した患者の海馬領域は早期から委縮しており、レビー小体型認知症患者のMMSEは急激に低下した。これらのことから、海馬領域の萎縮は軽度認知障害からアルツハイマー型認知症への進行予測因子となることが示唆された。また、アルツハイマー型認知症および軽度認知障害を対象としてこれまでにデータベースに蓄積されたVSRAD、ADAS-Jcog、MMSEの解析も行った。
高温反応ガスなどからの高効率熱伝達

本研究班では,熱エネルギーの高効率利用に関連する種々の問題の中でも(1)燃焼によって効率よく高温ガス(高温熱源)をつくり出す方法, (2)高温ガスの利用における新技術,(3)高温熱源からの熱の取り出し(熱移動)の高効率化の3テーマに焦点を絞り,さらに前期3年の期間内にまとまった成果を挙げる目途が立てられること,しかしテーマとして新規性があること,などを勘案してテーマを選定しグループを組織した.本年度は次の7課題についてそれぞれ実験・数値解析などを行い成果を挙げた.(i)強い乱流場による伝熱面近傍における燃料反応の維持に関する研究, (ii)超臨界雰囲気下における液体燃料の蒸発と燃料に関する研究, (iii)ふく射変換体による反応熱の効果的変換に関する研究, (iv)流動層を用いた高温ガスからの高効率熱交換に関する研究, (v)電場による沸騰熱伝達の促進に関する研究, (vi)混合媒体による高効率沸騰熱伝達に関する研究, (vii)直接接触による高効率蒸発伝熱に関する研究.本研究班では,熱エネルギーの高効率利用に関連する種々の問題の中でも(1)燃焼によって効率よく高温ガス(高温熱源)をつくり出す方法, (2)高温ガスの利用における新技術,(3)高温熱源からの熱の取り出し(熱移動)の高効率化の3テーマに焦点を絞り,さらに前期3年の期間内にまとまった成果を挙げる目途が立てられること,しかしテーマとして新規性があること,などを勘案してテーマを選定しグループを組織した.本年度は次の7課題についてそれぞれ実験・数値解析などを行い成果を挙げた.(i)強い乱流場による伝熱面近傍における燃料反応の維持に関する研究, (ii)超臨界雰囲気下における液体燃料の蒸発と燃料に関する研究, (iii)ふく射変換体による反応熱の効果的変換に関する研究, (iv)流動層を用いた高温ガスからの高効率熱交換に関する研究, (v)電場による沸騰熱伝達の促進に関する研究, (vi)混合媒体による高効率沸騰熱伝達に関する研究, (vii)直接接触による高効率蒸発伝熱に関する研究.
ドイツ語オペラ確立への軌跡：ドイツ語諸都市の上演状況比較から辿る自国語オペラ

本研究は、1719世紀初頭までほぼイタリア・オペラに支配されていたドイツにおける、ドイツ語オペラ確立の軌跡を、作品史ではなく上演史から読み解くことを目的としている。そのために、18世紀にはドイツにおける一大オペラ上演地であり、19世紀のドイツ語オペラ先進地であったドレスデンのオペラ上演を、その初期である1600年代から1800年代半ばまでのオペラ上演の変遷を辿ることを主眼とする。本年度は、イタリア・オペラからドイツ語オペラへの転換がおこなわれた主要な時期のドレスデンでのオペラ上演のデータをまとめ、東京芸術大学音楽学部附属音楽高等学校『研究紀要』において、「ハッセとヴェーバーの間:1765年から1830年までのドレスデンにおけるオペラ上演に関する予備的考察」と題する論文を発表した。ザクセン宮廷の財政逼迫によって中断されていたオペラ上演が再開された1765年からの65年間は、従来おこなわれていたイタリア・オペラに加えて、ドイツ語、フランス語のオペラの上演もおこなわれるようになり、そこには翻訳オペラの存在が不可分であることが判明した。また、2018年8月末から9月初旬にかけて、ヴィーン・ベルリン・ドレスデンの図書館にて基礎資料の収集にあたった。この内容に関しては、2019年度に学会発表する予定である。さらに、1718世紀のドレスデンとベルリンにおけるオペラとバレエの上演史を扱う上での問題点をまとめ、バレエ史研究会において「18世紀ドイツにおけるオペラとバレエの上演実態調査の問題点:ドレスデンとベルリンを例に」、発生期バレエ研究会において「1718世紀ドイツにおけるバレ:ドレスデンを例に」と題する口頭発表をおこなった。ドレスデン・ベルリン・ヴィーンの上演記録のデータ入力作業が進行中である。どの都市も情報が散在している状況で、2年目におこなう予定のメディア調査によって情報の追加・削除・修正をおこなうことも十分予測できるので、次年度も引き続き調査と入力を継続することは想定内である。ドレスデンを中心に、上演情報の調査と入力を継続しつつ、当時の新聞・雑誌といったメディアでの調査をおこなう予定である。その際、上演記録やその受容について調査に加え、1年目に浮かび上がってきた「ドイツ語翻訳オペラ」の存在にも注視し、同様の傾向をもつベルリンおよびヴィーンとの比較を通して考察していきたい。物品費のうち、関連図書代に充てる予定だった5万円が使用できなかった。次年度に関連書籍代として使用する予定。
可溶不可溶逆セルラ-ゼを用いた沈降分離型反応器によりセルロ-スの連続同時糖化酸酵

セルロ-スを生物燃料へ変換するプロセスにおいて糖化工程は最大の律速段階であり、セルラ-ゼの利用効率を高める必要がある。そこで、可溶状態で立体障害なくセルロ-スに効率よく作用した後、pHをわずかに変えることによって不溶化し回収再利用できる可溶・不溶可逆セルラ-ゼの調製およびその繰り返し利用について検討した。得られた成果は以下のようにまとめられる。1.pHに応答して溶解性が変化する3種類の高分子にそれぞれセルラ-ゼを水溶性カルボジイミドを用いて固定化することにより、可溶・不溶可逆セルラ-ゼを調製できた。2.固定化酵素の調製条件としてpH,固定化時間、酵素と高分子の重量比、酵素添加量について検討し、最適な固定化条件を決定した。3.調製した固定化酵素の沈降特性を検討した結果、pH3.8において約10分間静置することにより、大部分の固定化酵素は沈澱として回収でき、再利用できた。4.この固定化酵素は水に溶けている状態で効率よくゼルロ-スを加水分解し、反応終了後にpHを変えることによって不溶化し、反応生成物である糖液と分離ができた。また、可溶・不溶可逆セルラ-ゼは水不溶性担体に固定化したセルラ-ゼに比べて結晶セルロ-スに対する活性が著しく向上した。5.不溶化時に沈降する可溶・不溶可逆セルラ-ゼを繰り返し用いるために、円錐形の底部を有する沈降分離型反応装置を作製した。この装置内で可溶・不溶可逆セルラ-ゼを繰り返し用いて結晶セルロ-スおよび脱リグニンした稲わらを可水分解できた。
食生活リズムと肥満の関連性

遺伝的肥満モデルマウスであるob/obマウスを用いて、肥満と行動リズム及び食事摂取リズムの関連について検討した。その結果、正常体重のコントロールマウスと比較してob/obマウスでは一日の運動量が低下しているとともに24時間の行動リズムが変化していた。またob/obマウスを用いた食餌時間の調節による検討では、明期のみ食餌を摂取させた明期群は、暗期のみ摂取させた暗期群と比較して明期と暗期の行動量の差が小さく、また24時間の合計行動量が少ない傾向であった。食餌時間の調節による行動パターン及び行動量の変化は、ob/obマウスの内分泌系の異常に影響している可能性があり、今後の解析が必要である。本研究ではレプチンを欠損している遺伝的肥満モデルマウスであるob/obマウスを用いて、肥満がマウスの概日リズムに及ぼす影響について、行動リズムおよび飲水行動を指標として検討を行った。実験にはC57BL/6J-Lepobマウス(ob/obマウス)およびC57BL/6Jマウス(コントロールマウス)を用いた。13週齢、27週齢の2時点で24時間の経時的な行動リズム及び飲水行動を測定した。行動リズム及び飲水行動の測定には運動量測定システム(CompACT AMS Ver.3)を用い、12時間毎の明暗サイクルの環境下(午前7時午後7時/午後7時午前7時)で測定を行った。その結果、ob/obマウスの体重はコントロールマウスと比較して13週齢で有意に高値であり、27週齢ではさらに著しい体重の増加が認められた。明期及び暗期別の合計運動量は、13週齢、27週齢ともにob/obマウスはコントロールマウスと比較して有意に減少しており、特に暗期において著しい低下がみられた。またob/obマウスでは運動量が減少するだけでなく行動リズムの位相と振幅が変化しており、13週齢と比較して27週齢ではより顕著な影響が認められた。一方飲水行動においては両群に差は認められなかった。このことから、ob/obマウスでは運動量の低下とともに24時間の行動リズムが変化することが示された。また肥満の進行により、行動リズムの変化がより強まることが示唆された。さらに、本年度導入したマウス用摂餌量測定装置を用いて、ob/obマウスにおける食餌摂取リズムと肥満との関連について検討中である。体内時計遺伝子の異常が、肥満や生活習慣病に関与していることが動物モデルを用いた研究により報告されている。「食事」は体内時計を正常に作動させる外的因子の一つであることも示されているが、食生活リズムと肥満との関連について実験的な知見は少ない。そこで本研究では、ob/obマウスの食餌摂取時間帯を調節し、肥満との関連性を明らかにすることを目的とした。本研究では、マウス用摂餌量測定装置を用いた。この装置は、餌の摂取量及び行動量を24時間連続で計測できる。この装置を用いてob/obマウスに暗期のみ餌を摂取させる群(暗期群)、及び明期のみ餌を摂取させる群(明期群)を設定した。通常の飼育ケージにおいて自由摂取させる群(自由摂取群)を対象群とし、7ヶ月間飼育した。その後、解剖を行い、血液を採取した。血液から血糖値を測定した。さらに脾臓、胸腺、肝臓、腸管膜脂肪を採取し、重量を測定した。体重は、食餌時間調節後2か月間は低値傾向を示したが、最終体重は3群間で有意な変化は認められなかった。血糖値及び臓器重量においても有意な差は認められなかった。一方行動量においては、明期群では、暗期群と比較して明期と暗期の行動量の差が小さく、また24時間の合計行動量が少ない傾向であった。食事時間の調節による行動パターン及び行動量の変化は、ob/obマウスの内分泌系の異常に影響している可能性があり、今後の解析が必要である。
浪曲三味線の「手」の史的形成過程に関する研究

本研究は、明治期に誕生し、楽譜を介在させることなしに伝承が行なわれてきている浪曲の三味線演奏をめぐり、現時点で伝承され、また使用されている諸旋律型を整理した上で、史的変遷をふまえて演奏のありかたの展開を明らかにすることを目的とした。研究の結果、第一に、現在伝承されている浪曲三味線の旋律型の種別は、浪曲の二大様式、すなわち「関東節」と「関西節」では異なっていること、第二に、20世紀初頭の録音にも見られる演奏様式の特徴を受け継ぎながら、時代の推移とともに、現在伝承されている諸旋律型が形成されたと考えられることが、導き出された。(1)博士論文「浪曲三味線の研究」を執筆、博士号(学術)を授与された(2013年3月、お茶の水女子大学)。浪曲三味線の「手」について、規範と逸脱という観点から音楽学的な分析を行い、現在伝承されている「手」は浪曲の誕生期から存在していたわけではなく、時代の推移の中でつくられてきたものである、との見方を提示した内容の当該論文は、1楽譜を使わずに伝承されてきている浪曲三味線の「手」について、大阪と東京での伝承内容を五線譜で提示して考察を行った点、2実演された浪曲の音盤における三味線の「手」について、伝承されている「手」との比較に基づいた音楽学的分析を行い、「手」は逸脱を前提とした規範であるとの見方を打ち出した点、3浪曲三味線の「手」の史的形成過程について、一部を明らかにした点で意義をもつ。(2)大阪教育大学紀要(第I部門人文科学)第61巻第1号に「浪花亭綾太郎《壷坂霊験記》の二種の録音の分析」(2012年9月)、同第2号に「浪曲三味線の口頭伝承」(2013年2月)を発表し、この2本の論文は大学リポジトリにてweb上で公開された。前者は20世紀半ばの特定の演題をめぐり、浪曲の「語り」と三味線部分、両方の可変性について検証した内容、後者は、現在どのように新しい三味線の「手」が生成されているかの事例研究を提示した内容であり、いずれも、浪曲三味線の「手」の史的形成過程を探る手がかりの一端としての意義をもつ。(3)浪曲三味線奏者として、毎月、木馬亭浪曲定席の舞台に立ち、演奏ならびに楽屋でのフィールドワークを実施した。その成果の一部は既に各論文に反映されており、また、今後の研究に反映されてゆくものであるが、浪曲共同体に入り込んでの参与観察を継続的に行っていることは、文化研究のありかたの可能性の一つを体現している点で意義をもつ。最終年度である平成25年度には、複数の浪曲師・曲師の方を対象にしたインフォーマルなインタビューを継続させ、また、浪曲以外の三味線音楽研究者との相互交流をはかった。それらから、浪曲三味線の現在の「手」(旋律型)は、過去からずっと変化せずに在るわけではなく、時代とともに変化している、という見方の妥当性が得られたと考え、この見方を、前年度までに行ってきた「手」の音楽学的分析に改めて反映させて、理論形成をおこなった。研究成果は小冊子の形にまとめた。本研究は、明治期に誕生し、口頭で伝承されてきている浪曲の三味線演奏について、現在使用されている諸旋律型を整理した上で、史的変遷をふまえて演奏のありかたの展開を明らかにすることを目的とした。研究期間全体を通じた結果として、第一に、現在伝承されている浪曲三味線の旋律型の種別は、浪曲の二大様式、すなわち「関東節」と「関西節」では異なっていること、第二に、20世紀初頭の録音にも見られる演奏様式の特徴を受け継ぎながら、時代の推移とともに、現在伝承されている諸旋律型が徐々に形成されたと考えられることが、導き出された。浪曲三味線の音楽学的研究は、本研究以前にはほとんど手つかずの状態にあったことから、本研究は、今後の浪曲研究者のためのたたき台を、また他の三味線音楽との比較を可能にする最低限の土俵を、つくった点で意義をもつ。今年度行った研究内容および、そこから導出された知見は以下の通りである。1.1930年代までに録音された浪曲の音盤を収集し、それらについて、三味線の「手」(旋律型)の聴きとりによる分析と、一部は採譜による分析を行い、現在伝承されている「手」との比較を行った。

その結果、浪曲の二大様式のうち「関東節」では、1930年代までに、現在伝承されている「手」と相同の旋律型、すなわち「狭義の関東節」の「手」が形成されていると考えられるのに対して、「関西節」では1930年代までにはまだ、現在伝承されている「手」、すなわち「ウレイ節」「浮かれ節」といった各種の「節」に対応する三味線の旋律型が確立されていない可能性があることが浮かび上がった。2.楽屋裏を含めた複数の場で、複数の浪曲師および曲師の方に、浪曲三味線の「手」についての教授をお願いし、得られた情報を整理した。その結果、一点目に、個々の曲師によって、同一種類の「節」に対応する「手」にちがいがあること、二点目に、当該曲師が誰に三味線の「手」を教わったかという、いわば教授の個人ルートによって「手」が異なると考えられること(既存の三味線音楽を引用するという、定型性が強く働くはずの「手」に関しても、そうした例が見られたことは特に重要である)、三点目に、どのように「手」を変形させてよいかという程度と内容、また口演のたびに異なる「手」を弾くことに対する認容度が、個々の浪曲師によって異なると考えられること、が浮かびあがった。実演者としても活動することによって、浪曲師ならびに曲師へのインフォーマルなインタビューを継続的に行うことができ、成果の一部として、3本の論文(うち一本は博士論文)を執筆できた。「浪曲三味線の【手】が史的展開過程においてがどのように形成され、変容しているのかを探る」という研究目的に関して、今年度の計画として掲げた(1)1930年代までの録音資料の分析、(2)楽屋裏を含めたフィールドワーク、の二種の作業を実施し、浪曲三味線の「手」が、当初から、現在伝承されているような「手」であったわけではないとの知見が今後の研究方向への手がかりとして得られたことから、今年度の研究は順調に進展していると判断できる。(1)大阪と東京以外の地方都市での浪曲受容のありかたとその変遷をめぐるフィールドワークに着手し、研究の展開へとつなげる。(2)東京での浪曲共同体におけるフィールドワークに加え、大阪での浪曲共同体に関する参与観察に着手し、研究の展開へとつなげる。(3)本研究課題の成果となる報告書を執筆・印刷する。浪曲三味線の「手」が、当初から、現在伝承されている「手」と相同であったわけではない、という知見は今年度得られたが、ではいつごろ、どのように、という問題を、今後、1930年代以降の録音物の分析から導き出してゆくとともに、他方で、現在の演者と奏者の価値意識をフィールドワークからさらに描き出し、浪曲三味線の変容過程とそこに働いた力を探ってゆく方向ですすめる。(1)フィールドワーク(実演の場での楽屋フィールドワーク、浪曲師と曲師へのインフォーマルなインタビュー)のための旅費(2)研究成果の一部である博士論文の製本(3)報告書の作成、印刷1930年代以降第二次世界大戦後あたりまでの録音物の収集、フィールドワーク旅費、ならびにフィールドワークに必要な消耗品に使用する。
紫外線による皮膚発癌、皮膚炎症、白内障及び乾癬におけるホスホリパーゼＣεの役割

ホスホリパーゼCε(PLCε)を皮膚角化細胞特異的に強発現するトランスジェニックマウス(K5-PLCε-TGマウス)を作成したところ、同マウスの皮膚には鱗屑、表皮肥厚、不全角化、好中球の表皮内浸潤など尋常性乾癬に類似した臨床的・組織学的変化が生じ、皮膚浸潤細胞におけるサイトカイン発現などの免疫学的側面もほぼヒトの尋常性乾癬に合致することを見いだした。K5-PLCε-TGマウス皮膚に紫外線Bを照射すると野生型マウスに比べ、びらんや潰瘍形成が起こりにくかった。また、K5-PLCε-TGマウス皮膚では創傷治癒能が亢進していることが明らかとなった。ホスホリパーゼCε(PLCε)を皮膚keratinocyte特異的に強発現するトランスジェニックマウス(K5-PLCε-TGマウス)を作成したところ、同マウスの皮膚には生後9日後より鱗屑、表皮肥厚、不全角化、好中球の表皮内浸潤など尋常性乾癬に類似した臨床的・組織学的変化が生じ、皮膚浸潤細胞におけるサイトカイン発現などの免疫学的側面もほぼヒトの尋常性乾癬に合致することを見いだした。また、ヒトの尋常性乾癬でみられる活性化STAT3発現もこのマウスの皮膚で起こっていることが確認された。K5-PLCε-TGマウス皮膚に紫外線を照射すると野生型マウスに比べ著明な好中球浸潤と表皮肥厚がみられた。さらに、K5-PLCε-TGマウスの眼では白内障が自然発症していることが明らかとなった。一方、PLCεのノックアウトマウス(PLCε-KOマウス)では、紫外線による皮膚への好中球浸潤と表皮肥厚が野生型マウスに比べて著明に減少していることを確認した。PLCε-KOマウス皮膚では、紫外線による好中球遊走性ケモカインCXCL1誘導が野生型マウスに比べて低下していることが、PLCε-KOマウス皮膚で紫外線による好中球浸潤が野生型マウスに比べて軽度である理由と考えた。また、PLCε-KOマウスでは紫外線による角膜炎症と白内障が、野生型マウスに比べて起こりにくいことを観察した。さらに、PLCε-KOマウスでは野生型マウスに比べて紫外線による皮膚発癌が亢進していることを見出した。その機序としてPLCε-KOマウスでは紫外線による皮膚角化細胞のアポトーシスが起こりにくく、そのため遺伝子変異を起こした細胞が生き残りやすくなるためであると想定した。細胞膜情報変換酵素ホスホリパーゼ(PL)は大きくPLA、PLB、PLC、PLDの4種に分類される。PLCε(ε:イプシロン)はPLCに属する分子で、種々の刺激により活性化されて様々な細胞応答を引き起こす。PLCεを角化細胞特異的に強発現するトランスジェニックマウス(K5-PLCε-TGマウス)を作成し、同マウスの皮膚を臨床的および病理組織学的に解析した。臨床的にK5-PLCε-TGマウスは皮膚に多数の鱗屑を付着するが、野生型マウスでは皮膚のどの部位においても鱗屑はみられなかった。病理組織学的にK5-PLCε-TGマウス皮膚では表皮肥厚、表皮内好中球浸潤が起こっており、角化細胞ではSTAT3活性化が起こっていることが明らかとなった。以上の結果よりK5-PLCε-TGマウスは尋常性乾癬に類似した臨床的・組織学的変化を自然発症すると思われ、PLCεが乾癬発症に関与する可能性が考えられた。また、K5-PLCε-TGマウスの耳介に貫通創を作ったところ、野生型のマウスではこの創は半永久的に大きさが変わらず残るのに対し、K5-PLCε-TGマウスでは速やか(約2週間)に閉鎖することを見出し、K5-PLCε-TGマウスでは創傷治癒能が亢進していることが明らかとなった。K5-PLCε-TGマウス皮膚の紫外線Bに対する反応をみたところ、野生型マウス皮膚は紫外線Bを長期間照射するとびらんや潰瘍を生じるのに対し、K5-PLCε-TGマウス皮膚は紫外線Bの長期間照射を受けてもびらんや潰瘍を生じないことを見出した。

我々は、(PLCe)ノックアウト(KO)マウスを用いて紫外線(ultraviolet B: UVB)皮膚発癌を行い、UVB皮膚発癌は、PLCεKOマウスのほうが野生型マウスに比して促進され、その原因の一つとしてPLCεKOマウスの皮膚細胞ではUVBによるアポトーシスが抑制されることが考えられることを想定したが、UVBによる皮膚発癌は、(1)イニシエーション時のcyclobutane pyrimidine dimmer (CPD)生成、(2)プロモーション時の炎症反応(3) IL-10・IL-12などの皮膚免疫に影響を与えるサイトカイン発現などによっても影響を受ける。これらの事象がPLCεKOマウスにおける紫外線皮膚発癌亢進の原因となっている可能性を検討したところ、野生型マウス皮膚とPLCεKOマウス皮膚との間ではUVBによるCPD生成とIL-10・IL-12産生能には差がみられなかった。一方、UVBによる皮膚炎症は野生型マウス皮膚に比べPLCεKOマウス皮膚では著明に減弱していた。この結果は、通常炎症反応は発癌にプラスに働くとされている考えと矛盾するが、上記で述べたように、PLCεKOマウスの皮膚細胞ではUVBによるアポトーシスが抑制されるため、遺伝子損傷を受けた細胞が多く生残り、これが発癌亢進に働き、発癌における炎症反応の影響の少なさをカバーし、結果としてPLCεKOマウスでのUVB皮膚発癌につながったと考えた。当初の計画通り、紫外線皮膚炎症と紫外線白内障におけるPLCεの役割解析をほぼ終了したため。当初の平成23年度における研究目的事項である<紫外線皮膚発癌におけるPLCεの役割の検討>、および、<紫外線による皮膚炎症におけるPLCεの役割の検討>はほ、ともに検討がぼ達成されたため、研究は順調に進展していると考える。1)紫外線皮膚発癌におけるPLCεの役割の解明2)乾癬におけるPLCεの関与の解明我々が作成したK5-PLCε-TGマウスは乾癬様皮疹を自然発症するが、ヒトの乾癬におけるPLCεの関与は未だ検討されていない。本研究では、ヒトの皮膚サンプルを用いて、ヒトの乾癬におけるPLCεの関与の有無を明らかにする。当初の予定通り、平成24年度は<乾癬におけるPLCεの関与の検討>、<紫外線白内障におけるPLCεの役割解析>、<PLCεの下流シグナルの解明>を目的として研究を行う。ヒトの皮膚サンプルを用いて、ヒトの乾癬におけるPLCεの関与の有無を明らかにするためのPLCεに関する抗体や、PLCεの下流シグナルの検討のために必要な各種シグナル伝達関連分子に対する抗体を含めた免疫学的試薬に40万円使用する。マウス皮膚に種々の刺激を加えたあと、各種サイトカイン、ケモカインの発現量をRT-PCRで解析するための生化学的試薬18万円使用する。マウス皮膚から角化細胞を培養するための細胞培養関連試薬として15万円使用する。研究成果を外国語論文として発表するので、外国語論文の校閲費、研究成果投稿料ならびに論文別冊費を計上した。当初の予定通り、消耗品費として750000円、国内旅費として100000円、外国旅費として250000円、謝金等に50000円、その他(研究成果投稿料、実験動物の飼育管理費など)に50000円を使用する予定である。
植物型オートファゴソームのホスファチジル３リン酸分子イメージングと局在解析

細胞がストレスを受けると細胞内微細構造がダイナミックに変化する。自食(オートファジー)はその一つであり、酵母や動物細胞を使った研究が盛んに行われている。一方、植物細胞ではストレスを受けた際に見られる微細構造の変化に関する情報は十分ではない。本研究では、緑藻クラミドモナス(Chlamydomonas reinhardtii)や生態毒性試験のモデル生物であるムレミカヅキモ(Raphidocelis subcapitata)を材料とし、自食にかかわるメッセンジャー物質であるホスファチジルイノシトール3リン酸(PI3P)の細胞内局在を明らかにする目的で研究を進めている。2017年度後半から2018年度初めにおいて、PI3Pを特異的に認識するphoxドメインタンパク質(p40phox)を精製し、PIPストリップアッセイによって、PI3P分子を特異的に認識することを確認した。さらに、p40phoxに付加したGSTタグを間接蛍光抗体法により検出し、蛍光顕微鏡法あるいはフローサイトメトリーにより可視化する方法を確立した。また、フリーズフラクチャー免疫電顕による金コロイドの可視化条件の検討をおこなった。さらに、人工小胞膜アッセイにより、p40phoxタンパク質がPI3Pを濃度依存的に検出できているのかを確かめた。本研究ではストレス付与条件としてラパマイシンのほか、銅や亜鉛などの重金属イオンによるストレスについても調べ、特定の重金属イオンがPI3P分子の蓄積を誘導することを見出した。今後は、2018年度に条件検討した金コロイド免疫電顕法をもとに、フリーズフラクチャー法により作製した試料におけるPI3P分子の局在を明らかにする。本研究課題の最重要ステップであるp40phoxを用いた藻類細胞のPI3P分子を可視化するための間接蛍光抗体法のプロトコルを確立できた。加えて、様々なストレス付与条件を検討し、本研究で扱っている緑藻クラミドモナスやムレミカヅキモのPI3P分子の細胞内動態について、種間比較をおこなった。既知のゲノム情報と照らし合わせて、実験的に明らかになった結果がゲノム情報と矛盾なく説明できることがわかった。間接蛍光抗体法およびフローサイトメトリーによる解析結果は、2019年3月に日本藻類学会で報告した。2018年度に確立した実験プロトコルをもとにフリーズフラクチャー免疫電顕をおこない、ストレスを付与した細胞でPI3P分布の動態を微細構造レベルで観察する予定である。フローサイトメトリーを利用することで、比較的容易にPI3P分子の動態を追うことができ、様々なストレス源による自食の誘導を網羅的かつ定量的に調べることが可能になった。今後は緑藻の複数種の比較により、オートファゴソーム形成がストレスの耐性にどのように影響を及ぼすのかを明らかにしたい。また、既知のゲノム情報を用いることで、本課題で得られた実験結果の整合性を確認するとともに、緑藻における自食の進化についても明らかにする予定である。本課題の達成目標は、植物型オートファゴソームのホスファチジルイノシトール3リン酸(PI3P)分子の局在をナノレベルで明らかにすることである。本研究ではフリーズフラクチャー法と免疫電顕法を組み合わせて、オートファゴソームの膜面におけるPI3P分子の局在を可視化することを試みている。本研究で得られたデータは先行研究の酵母や哺乳類細胞と比較し、植物型オートファジーに関する特徴を見出す予定である。初年度は、実験に使用する藻類株の選定を行った。本課題ではゲノムがすでに解読されている緑藻クラミドモナス(Chlamydomonas reinhardtii)および生態毒に鋭敏に応答する緑藻類であるムレミカズキモ(Pseudokirchneriella subcapitata)を用いることにした。いずれの株も国立環境研究所微生物系統保存施設より入手し、継代培養をしている。また、細胞がストレスを受けたときに生じる酸性コンパートメントの出現時期についてモノダンシルカダベリン等の蛍光試薬を用い、フローサイトメトリー、マイクロプレートリーダーおよび蛍光顕微鏡を用いたアッセイを行った。窒素飢餓、ラパマイシン曝露、重金属曝露等をストレス源として酸性コンパートメントの出現の有無を調査した。また、実際に上記2種の藻類細胞に対してフリーズフラクチャーを行い、固定の条件検討を行った。フリーズフラクチャー法で得られたレプリカ膜は、2.5 %ニクロム酸ナトリウム/50 %硫酸による細胞消化のほか、免疫電顕法で使用するためにドデシル硫酸ナトリウム溶液による細胞消化法も試している。さらに、先行研究に基づきPI3P分子を認識するPXドメイン(Phox相同性)をもつリコンビナントタンパク質を精製し、PIP stripsアッセイにより精製タンパク質のPI3P分子に対する特異性について調べた。ホスファチジルイノシトール3リン酸分子を認識するタンパク質に関しては、先行研究に基づき、PI3P分子を認識するリコンビナントタンパク質を精製し、PIP stripsアッセイによりタンパク質のPI3P分子に対する特異性を調べるところまで到達できた。また、フリーズフラクチャー法に関しては、藻類細胞の固定および観察の段階に到達できた。研究の進捗はおおむね計画通りである。

本研究では、緑藻クラミドモナス(Chlamydomonas reinhardtii)や生態毒性試験のモデル生物であるムレミカヅキモ(Raphidocelis subcapitata)を材料とし、自食にかかわるメッセンジャー物質であるホスファチジルイノシトール3リン酸(PI3P)の細胞内局在を明らかにする目的で研究を進めている。2017年度後半から2018年度初めにおいて、PI3Pを特異的に認識するphoxドメインタンパク質(p40phox)を精製し、PIPストリップアッセイによって、PI3P分子を特異的に認識することを確認した。さらに、p40phoxに付加したGSTタグを間接蛍光抗体法により検出し、蛍光顕微鏡法あるいはフローサイトメトリーにより可視化する方法を確立した。また、フリーズフラクチャー免疫電顕による金コロイドの可視化条件の検討をおこなった。さらに、人工小胞膜アッセイにより、p40phoxタンパク質がPI3Pを濃度依存的に検出できているのかを確かめた。本研究ではストレス付与条件としてラパマイシンのほか、銅や亜鉛などの重金属イオンによるストレスについても調べ、特定の重金属イオンがPI3P分子の蓄積を誘導することを見出した。今後は、2018年度に条件検討した金コロイド免疫電顕法をもとに、フリーズフラクチャー法により作製した試料におけるPI3P分子の局在を明らかにする。本研究課題の最重要ステップであるp40phoxを用いた藻類細胞のPI3P分子を可視化するための間接蛍光抗体法のプロトコルを確立できた。加えて、様々なストレス付与条件を検討し、本研究で扱っている緑藻クラミドモナスやムレミカヅキモのPI3P分子の細胞内動態について、種間比較をおこなった。既知のゲノム情報と照らし合わせて、実験的に明らかになった結果がゲノム情報と矛盾なく説明できることがわかった。間接蛍光抗体法およびフローサイトメトリーによる解析結果は、2019年3月に日本藻類学会で報告した。初年度に引き続き、フローサイトメトリー等を用いて藻類細胞における酸性コンパートメント出現時期を正確に把握する実験に取り組む。ストレス源として栄養塩飢餓や重金属曝露条件を検討する。フリーズフラクチャー電顕に関しては、通常の細胞消化法による観察を行うとともに、免疫電顕法で観察するための条件検討と実際の観察を行う予定である。フリーズフラクチャーレプリカにより捕捉されたPI3P分子を標識・可視化する系が確立できたら、電顕観察を継続し、定量的なデータ取得に努める。2018年度に確立した実験プロトコルをもとにフリーズフラクチャー免疫電顕をおこない、ストレスを付与した細胞でPI3P分布の動態を微細構造レベルで観察する予定である。フローサイトメトリーを利用することで、比較的容易にPI3P分子の動態を追うことができ、様々なストレス源による自食の誘導を網羅的かつ定量的に調べることが可能になった。今後は緑藻の複数種の比較により、オートファゴソーム形成がストレスの耐性にどのように影響を及ぼすのかを明らかにしたい。また、既知のゲノム情報を用いることで、本課題で得られた実験結果の整合性を確認するとともに、緑藻における自食の進化についても明らかにする予定である。
卵の発育・成熟過程におけるアンドロゲン作用の基礎的検討

卵発育・成熟過程には多くの関連分子が存在するが、我々は以前より男性生殖器におけるアンドロゲンの役割について研究をしてきたが、アンドロゲンは男性性腺以外に女性の卵巣での発現し、卵の発育・成熟、卵胞の閉鎖、閉経の過程に関与していることが報告されているが、まだその詳細な機能について多くのことが明らかではない。平成22年度はまず、ヒト卵巣顆粒膜細胞株KGN細胞におけるアンドロゲン作用の検討をおこなった。すでに報告されているアンドロゲンの標的分子のkitligandとBMP7のgel shift assayによりアンドロゲンの作用部位の同定試みた。その結果、5'上流1.5kb1.0kbの断片に偏移する領域を同定した。抗アンドロゲン抗体でさらに偏移することを明らかにした。これらに領域をレポーター遺伝子の上流に組み込み現在Luciferase解析を実施した。一方でBMP7の上流3kbの範囲で同様のgel shift assayを実施した。明らか偏移する領域を同定することができなかった。次にアンドロゲンにて誘導される分子の同定を行うために、幼若雌マウスにDHTを投与した場合、抗アンドロゲンレセプター作用のflutamideを投与した場合とコントロールとしてcornoilを投与した場合で卵巣を摘出して、mRNAを抽出する。それらを用いてマイクロアレイを実施して、コントロールに比べて変化のある遺伝子を検索同定を行い、シグナル伝達、血管新生因子等に関する遺伝子に焦点を当てて現在その発現様式を検討中である。これらの解析が進めば、アンドロゲンによる卵巣での卵の発育、成熟過程における作用が明らかになることが期待される。
電解重合法による機能性薄膜被覆電極の創製と機能発現機構

本研究では電解重合法による機能性薄膜の創製、機能付与、機能発現機構の解析を行った。従来より導電性かつ電気化学的活性高分子について研究がなされてきた当分野において新規な着眼点としてポリピロール重合成膜時に絶縁不活性化反応を並行して進行させることで均一薄膜の作製を可能とした。その膜生成時には重合と同時に求核性物質によるπ共役系破壊反応が進行することを示し、求核的攻撃の制御より薄膜特性の制御を可能とした。また電場下における絶縁膜の導電率安定性について知見を得た。また高分子アニオンと電気化学的活性なp型高分子の複合膜の酸化還元時にはアニオンの代わりに、カチオンによる電荷補償が起こることを明らかにした。この事から分子レベルでの複合による機能付加が示された。さらに高分子固体電解質/電気化学的活性高分子界面の電気化学的挙動についても検討を加え、固体系における特異性として物質移動過程が反応全体を支配することが示され、この全固体系における有機電気化学反応の取扱いに対し知見を得た。さらに固体高分子電解質と有機液体電解質の中間に位置するゲル電解質/高分子膜の組み合わせを試み、その電荷移動反応、物質移動過程が液体電解質と同等であることを明らかにした。さらに、リチウム二次電池正極を一つの応用例として、電気化学的活性高分子について総合的な評価を行い、電解重合膜の機能化およびその機能制御、機能発現機構について総合的に評価を行った。また以上の研究において薄膜電極の電気化学的評価および物質移動の評価における測定法についての検討より各測定法の選択、有用性、限界について指針を得た。
3次元積層技術による超高帯域幅ベクトルプロセッサ設計に関する研究

本研究では,近未来に起こる3次元集積化実装時代に対応した高性能マイクロプロセッサアーキテクチャ設計制約条件,及びその制約下での最適アーキテクチャ設計方式を明らかにすることを目的としている.平成20年度には, 3次元積層の要素技術,および3次元積層技術を用いた新たなアーキテクチャ設計に関する研究動向の調査・検討を行った.これにより, 3次元積層技術により利用可能となるチップ内のトランジスタ数は飛躍的な増加し, 3次元方向に積層される各シリコン層を結合するThrough Silicon Via(TSV)によりチップ上の配線長,および配線遅延時間の短縮が可能であることを確認した.また,近年入出力ピンの実装技術の限界により,メモリバンド幅の低下が懸念されているベクトルプロセッサに着目し,前述の三次元積層技術がもたらす利点を最大限に活かすことが可能な3次元積層技術を用いた大容量オンチップメモリを搭載する3次元ベクトルプロセッサを提案した.提案した3次元ベクトルプロセッサは,プロセッサ層と複数のメモリ層から構成され,メモリ層を増加させることオンチップメモリの容量を容易に増加させることが可能であり,オフチップメモリへのアクセス数を削減することで,オフチップメモリアクセスに伴う消費電力を抑制しつつ,メモリアクセスレイテンシを効果的に隠蔽する.評価の結果,提案するメモリ積層型3次元ベクトルプロセッサは既存の2次元実装のベクトルプロセッサと比較して,消費エネルギを最大14%,実行サイクルを最大63%削減出来ることを示した.本研究では,近未来に起こる3次元集積化実装時代に対応した高性能マイクロプロセッサアーキテクチャ設計制約条件,及びその制約下での最適アーキテクチャ設計方式を明らかにすることを目的としている.平成20年度には, 3次元積層の要素技術,および3次元積層技術を用いた新たなアーキテクチャ設計に関する研究動向の調査・検討を行った.これにより, 3次元積層技術により利用可能となるチップ内のトランジスタ数は飛躍的な増加し, 3次元方向に積層される各シリコン層を結合するThrough Silicon Via(TSV)によりチップ上の配線長,および配線遅延時間の短縮が可能であることを確認した.また,近年入出力ピンの実装技術の限界により,メモリバンド幅の低下が懸念されているベクトルプロセッサに着目し,前述の三次元積層技術がもたらす利点を最大限に活かすことが可能な3次元積層技術を用いた大容量オンチップメモリを搭載する3次元ベクトルプロセッサを提案した.提案した3次元ベクトルプロセッサは,プロセッサ層と複数のメモリ層から構成され,メモリ層を増加させることオンチップメモリの容量を容易に増加させることが可能であり,オフチップメモリへのアクセス数を削減することで,オフチップメモリアクセスに伴う消費電力を抑制しつつ,メモリアクセスレイテンシを効果的に隠蔽する.評価の結果,提案するメモリ積層型3次元ベクトルプロセッサは既存の2次元実装のベクトルプロセッサと比較して,消費エネルギを最大14%,実行サイクルを最大63%削減出来ることを示した.
ウイルス感知レセプターの自然免疫力を活用する新規癌療法の確立

今回、IFN-β刺激によるRIG-Iタンパクの発現誘導が、ヒトメラノーマ由来培養細胞において確認された。また、24時間のIFN-β刺激により培養ヒトメラノーマ細胞の増殖能は有意に抑制された。その他のサイトカイン、IFN-γ、TNF-α、TGF-β刺激では、メラノーマ細胞によるRIG-I発現増強効果はみられなかった。合成核酸アナログであるpoly-(I:C)刺激では、ヒトメラノーマ細胞におけるRIG-I発現増強効果は認めなかった。1.合成核酸による培養細胞のRIG-I、STING、IFN-βの発現誘導:正常ヒト表皮細胞、正常ヒト線維芽細胞、ヒトメラノーマ細胞、ヒト慢性骨髄性白血病細胞株K562細胞をそれぞれ最適な培地を用い培養し、合成核酸であるpoly-(I:C)、5'-リン酸RNA、DNAを添加しRIG-IおよびSTING発現の経時性および濃度依存性をRT-PCR、Western blot法により確認した。RIG-I、STING発現に伴うIFN-β発現誘導を、RT-PCR、ELISAを用い確認した。2.合成核酸による培養メラノーマ細胞の増殖に与える影響:培養ヒトメラノーマ細胞に合成核酸を添加、増殖能への影響を、細胞増殖測定キット(MTSキット)を用い測定したところ、非刺激群に比べ増殖能低下がみられた。3.RIG-I、STING強制発現が培養メラノーマ細胞に与える影響:培養ヒトメラノーマ細胞のmRNAより、RT-PCRにて完全長RIG-IおよびSTINGのcDNAを増幅、回収した。発現ベクターに挿入後、培養ヒトメラノーマ細胞に形質導入しWestern blot法、ELISAにてRIG-I、IFN-β発現を確認。培養ヒトメラノーマ細胞の増殖抑制効果を、細胞増殖測定キットで確認したところ、増殖能低下を認めた。(1)ヒト表皮細胞のRIG-I発現:ヒト表皮細胞であるHaCaT細胞を各種サイトカインで刺激、RIG-I発現の増減をRT-PCRにて確認したところ、TNF-α、IFN-γ添加でRIG-I発現が有意に上昇していた。また、合成核酸であるpoly-(I:C)刺激によるRIG-I発現を経時的に確認したところ、RNA、タンパクレベルで発現増強を確認できた。(2)メラノーマ細胞のRIG-I発現:ヒトメラノーマ細胞である501mel細胞を各種サイトカインで刺激したところ、IFN-β刺激でRIG-I発現増強を確認した。また、合成核酸であるpoly-(I:C)刺激によるRIG-I発現を様々な培養ヒトメラノーマ細胞で経時的に確認したが、タンパクレベルではRIG-I発現増強はみられなかった。(3)メラノーマ細胞の増殖抑制:ヒトメラノーマ細胞である501mel細胞にRIG-I誘導能をもつIFN-βを加えたところ、501mel細胞の増殖能は有意に低下した。RIG-Iが腫瘍細胞の増殖抑制効果を有すると推測される。本研究は、RIG-I・STING誘導性免疫賦活効果とそれに伴うメラノーマ細胞の増殖抑制作用、NK細胞の活性化を以下の実験でその詳細なメカニズムを解明する目的で行われる。1)合成RNA、DNAによるRIG-I、STING発現の確認、2)培養メラノーマ細胞の増殖能への影響の評価、3)NK細胞の受容体NKG2Dに対するリガンド発現の確認、4)in vivoにおける自然免疫賦活効果の確立と腫瘍抑制機序の解明。現時点での研究成果は下記の通りである。1.合成核酸による培養細胞のRIG-I、STING、IFN-βの発現誘導(1)正常ヒト表皮細胞、正常ヒト線維芽細胞、ヒトメラノーマ細胞、ヒト慢性骨髄性白血病細胞株K562細胞をそれぞれ最適な培地を用い培養し、合成核酸であるpoly-(I:C)、5'-リン酸RNA、DNAを添加しRIG-IおよびSTING発現の経時性および濃度依存性をRT-PCR、Western blot法により確認したところ、ヒトメラノーマ細胞以外ではRIG-I、STINGの発現がみられた。(2) RIG-I、STING発現がみられた培養細胞では、IFN-β発現誘導をRT-PCR、ELISAにて確認した。2.合成核酸による培養メラノーマ細胞の増殖に与える影響(1)培養ヒトメラノーマ細胞に合成核酸を添加、増殖能への影響を、細胞増殖測定キット(MTSキット, Promega)を用い測定したところ、今のところ明らかな増殖抑制効果は認めない。本研究では、RIG-I・STING誘導性免疫賦活効果とそれに伴うメラノーマ細胞の増殖抑制作用、NK細胞の活性化の詳細なメカニズムを解明することを目標に行われている。下記に示すような結果が得られ、比較的に当初の計画通り研究は進んでいると思う。

1)合成RNA、DNAによるRIG-I、STING発現の確認:申請者は、すでに培養表皮細胞の合成RNAであるpoly-(I:C)、5'-リン酸RNA、合成DNAによるRIG-I、STING発現、RIG-Iのフィードバック効果を確認しているが、さらに皮膚真皮内に存在する線維芽細胞、リンパ球におけるRIG-I・STINGの発現誘導によるIFN-βの産生をRT-PCR、ELISAで確認した。3)NK細胞の受容体NKG2Dに対するリガンド発現の確認:NK細胞が非自己と判断し攻撃を加える際、NKG2Dリガンドを所有しているかが重要である。ヒト培養メラノーマ細胞がNKG2Dリガンドを発現していることをRT-PCR、ウエスタンブロットで確認した。1.合成核酸であるpoly-(I:C)、5'-リン酸RNA、DNAによる培養細胞のRIG-I、STINGの発現誘導を、ヒトメラノーマ細胞以外で確認できた。2.RIG-I、STING発現がみられた培養細胞では、IFN-β発現誘導をRT-PCR、ELISAにて確認できた。RIG-I、STING活性化による自然免疫力促進を抗腫瘍効果として臨床応用するために、本研究計画は以下の研究項目を明らかにした。: 1.表皮細胞、線維芽細胞、メラノーマ細胞における合成核酸刺激によるRIG-I、STING発現誘導、それに伴うI型IFN産生促進を確認した。: 2.RIG-I、STING、I型IFNによる細胞増殖能への影響を調べ、非刺激群に比べ増殖能低下を確認した。今後はさらに自然免疫力促進を抗腫瘍効果として臨床応用するために、以下の研究項目を予定している。: 3.NK細胞受容体NKG2Dに対応するリガンドがメラノーマ細胞で発現しているか、更にその発現量がRIG-I、STING、I型IFNにより増強するかを解析する。:4.RIG-I、STING過剰発現による1I型IFNの直接作用、2I型IFNによって活性化したNK細胞による細胞傷害作用、によりメラノーマを抑制できる条件を見出す。1.RIG-I、STING強制発現が培養メラノーマ細胞に与える影響(1)培養ヒトメラノーマ細胞のmRNAより、RT-PCRにて完全長RIG-IおよびSTINGのcDNAを増幅、回収。(2)発現ベクターに挿入後、培養ヒトメラノーマ細胞に形質導入しWestern blot法、ELISAにてRIG-I、IFN-β発現を確認。2.培養ヒトメラノーマ細胞におけるNK細胞受容体NKG2Dに対応するリガンドの発現およびI型IFNによるその発現増強促進効果「該当なし」遺伝子工学用酵素類・キット,ガラス・プラスチック器具,細胞培養用試薬,一般試薬などの消耗品や情報収集のための学会参加旅費、実験補助の技術員への謝金にあてる。