hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
マラリア原虫の媒介蚊唾液腺侵入過程を標的とした感染阻止法の開発

マラリア原虫は、蚊の吸血を介してヒトからヒトへと伝播される。マラリアを根絶するためには、蚊による媒介を阻止する有効な方策の創出が急務である。本研究はこの課題を、1.媒介蚊への原虫の感染を阻止する分子の開発、2.昆虫ウイルスベクターを用いた媒介蚊での外来遺伝子発現法の開発によって実現することを目的とする。すなわち申請者が新たに発見した原虫の唾液腺侵入に必須である蛋白分解酵素"スポロパイン"(スポロゾイトの唾液腺基底膜通過に必要と考えられる)に対するインヒビターを作出する。また新たな媒介蚊特異的ウイルスを探索し、このウイルスをベクターとして用い、開発したインヒビターを媒介蚊に発現させることで感受性蚊を非感受性蚊に変える手法を確立する。この手法を用いれば非感受性蚊はウイルス自体が自然伝播することで広がり、現実的な感染阻止法になると期待できる。蚊での外来遺伝子発現ベクターとして使用するため、野生の蚊からの昆虫ウイルスの分離を試みた。その結果、新種のフラビウイルスの分離に成功した。このウイルスは蚊に潜在感染し、また伝播能力も極めて高いためベクターとして理想的である(投稿準備中)。現在感染性cDNAを構築し、外来遺伝子発現のための改良を行っている。またスポロパインを小麦胚芽を用いたin vitro translation法により可溶性蛋白として発現することに成功した。現在この蛋白を用いスポロパインの生化学的特性を明らかにするとともに、インヒビターの開発を行っている。唾液腺侵入前のスポロゾイトに特異的に発現するプロテアーゼ(スポロラーゼと命名)を発見した(投稿中)。スポロラーゼ遺伝子を破壊したスポロゾイトは唾液腺への感染性を完全に失い、マウスに感染できなくなった。以上の結果よりこの分子がマラリア感染阻止の標的分子となりうることを明らかにした。蚊の唾液腺は基底膜に被われており、このプロテアーゼはスポロゾイトが唾液腺の基底膜を破って内部に侵入するさいに、使われるのではないかと推測した。このことを証明するために、スポロラーゼの遺伝子を人工合成し、大腸菌で組み替え体蛋白を発現させた。また、昆虫の基底膜の主要な構成成分である、コラーゲンの遺伝子をハマダラ蚊からクローニングし、組み替え体蛋白を発現させた。以上の組み替え蛋白を用いることで、実際にコラーゲンがスポロラーゼの基質であることを証明することができるとともに、スポロラーゼのインヒビターを作出するためのアッセイ系を確立することができる。また昆虫ウイルスを遺伝子導入のベクターとし媒介蚊のコントロールに応用するという目的のもとに、野生の蚊に不顕性感染している昆虫ウイルスの分離を試みた。その結果、複数のウイルスを分離することに成功した。またこれらのウイルスの構造をすでに一部あきらかにした。その結果、これらのウイルスはすべて、これまで報告されていない新しいものであることがわかった。今後これらのウイルスのほ乳類への感染性を調べ、安全な遺伝子導入のベクターの確立を試みる.マラリア原虫は、蚊の吸血を介してヒトからヒトへと伝播される。
マイクロサテライト、単塩基多型を用いた慢性関節リウマチの遺伝要因の研究

慢性関節リウマチ(RA)の発症には複数の遺伝子が関与していると考えられているが未だ解明されておらず又、病態と遺伝要因の関連も明らかではない。本研究の目的は全染色体についてスクリーニングする事でRAの遺伝要因を明らかにする事である。本年度の研究実績の具体的内容は以下の如くである。1.兄弟発症のRA家系の登録:10名のリウマチ専門医の協力を得、兄弟発症を含むRA家系60家系を登録した。2.RA家系サンプルからのDNA採取:50家系よりDNAを採取しDNAリストを作成した。3.RA患者のデータベースの作成:家族歴、臨床データを中心にデータベースを作成した。4.正常コントロールDNAの採取:正常人集団100名からDNAを採取した。5.RA家系サンプルのマイクロサテライト多型のスクリーニング:全染色体について、1020cM間隔で分析するマイクロサテライトの多型をDNAシークエンサーで検出を開始した。スクリーニングは順調に進行している。6.正常コントロールサンプルのマイクロサテライト多型のスクリーニング:正常コントロールのマイクコサテライト多型を検出し、その各多型の頻度を調べる事を開始した。7.解析ソフトウニアの検討:多型データーより、疾患感受性遺伝子(領域)を推定する際に用いるソフトウエアを検討し、MAPMAKER/SIBを用いる事とした。同ソフトウエアのダウンロードは終了し、ワークしている。8.HLA-DRについてのsib pair分析:HLA-DRの多型を利用してsib pair分析を行なった。LOD値は0.6と比較的低い値となった。家族性因子の強い症例のHLA-DRデーターとして相関分析も行った。家系例の発端者におけるshared epitopeの陽性率は69.8%(p=0.001)で家族歴のないRAの60.0%(p=0.01)と有意な差はなかったが、やや高い傾向があった。慢性関節リウマチ(RA)の遺伝要因を、マイクロサテライト(MS)を用いて分析し明らかにする事を本研究は目的とする。本年度は交付申請書の実施計画に基づき、以下の研究を行なった。前年度に引き続いてRA家系サンプルを収集し、分析可能な52家系を得、更に家系数を増やす予定である。家族歴、リウマチ因子などの臨床データを中心にデーターべ一スを作成した。更にサンプルのHLA-DR分析を得ないそのデーターを中心にデーターべ一スを作成した。更にサンプルのHLA、DR分析を得ないそのデーターを加えた。前年度から引き続いて正常コントロールのMS多型を分析し、一次スクリーニングを完了した。これにより漸定的ではあるが日本人のMS多型頻度を得た。白人で、heterozygosity(HZ)0.7以上のMSマーカーを用いたが、約20%のMSでHZは0.7以下であった。又白人と多型パターンに差がみられた。日本人の多型頻度については、今後データーの見直し、再検をすすめて最終的に決定していく予定である。前年度に引き続いてRA家系サンプルのMS多型のスクリーニングを行なった。スクリーニングの途中であるが、前述の漸定的多型頻度を用いてMAPMAKER/SIBで、sib pair分析を行い、疾患感受性遺伝子領域の推定を試みた。中間データーであり、今後のデーターの追加、再検により変わる可能性はあるが、Lod値1.5以上の漸定的な候補領域としてTIRA1-5の領域を得た。各々D3S1278(Lod=1.8)、D11S904(Lod=1.85)、D17S802(Lod=2.1)、D18S452(Lod=2.25)、DXS1226(Lod=1.5)近傍に相当する。家系サンプル分析を今後ともすすめながら、その都度中間結果として候補領域を推定していく予定である。諸外国のデーターと合わせていくつかの候補領域が得られたので、その領域内の遺伝子を相関分析するため、ランダムなRAサンプルの収集を開始した。今後平成15年までの間に200検体を収集する予定である。
2型リアノジン受容体の組織特異的スプライシングバリアントの存在意義の解明

リアノジン受容体(RyR)は小胞体内から細胞質へのCa2+の放出を担うCa2+チャネルであり,膵β細胞ではインスリン生合成機構に関与している。3種類のアイソフォームのうちの主に心筋細胞に発現する2型RyR(RyR2)には組織特異的スプライシングバリアントが存在し,心筋型RyR2はexon 75を含むのに対し,膵β細胞型RyR2ではexon 75が欠失している。本研究では,ゲノム編集技術を用いて培養細胞内のRyR2の発現型(スプライシング型)を改変させ,未改変細胞との機能の差異を確かめることで,RyR2の組織特異的スプライシングバリアントの役割を解明する。
心筋由来分泌蛋白を標的とした虚血性心疾患の病態解明

心筋由来分泌蛋白であるフォリスタティン関連蛋白の虚血性心疾患に対する作用を解析した結果、フォリスタティン関連蛋白は心筋虚血再灌流障害に防御的に作用することが明らかとなった。マウスに対するフォリスタティン関連蛋白投与は心筋虚血再灌流後の心筋梗塞サイズを縮小させ、心筋組織での炎症反応とアポトーシスの抑制を伴っていた。フォリスタティン関連蛋白の心筋保護機序は、心筋細胞におけるAMPキナーゼ活性化とBone morphogenetic protein-4シグナル阻害による炎症抑制とアポトーシス抑制を介していることが明らかとなった。本研究では、虚血性心疾患に対するフォリスタティン関連蛋白の意義を明らかにするため、現時点で以下のような実験の結果を得ている。1.フォリスタティン関連蛋白欠損マウスと対照マウスに対して心筋虚血再灌流モデルを作製するとフォリスタティン関連蛋白欠損マウスでは心筋虚血再灌流後の心筋梗塞サイズが有意に増大していた。2.フォリスタティン関連蛋白を野生型マウスに全身投与すると虚血再灌流後の心筋梗塞サイズが有意に減少していた。3.フォリスタティン関連蛋白を心筋細胞に添加すると低酸素再酸素化刺激によるアポトーシス反応を有意に抑制した。4.フォリスタティン関連蛋白を心筋細胞に添加するとAMPキナーゼが活性化した。5.虚血性心疾患における、血中フォリスタティン関連蛋白の臨床的意義については、フォリスタティン関連蛋白の血中濃度測定と解析を継続している。急性心筋梗塞をはじめとする虚血性心疾患の病態解明と有効な治療法の確立は急務を要する。本研究は心筋由来分泌蛋白であるフォリスタティン関連蛋白の虚血性心疾患の制御機構とその機序を個体レベルと細胞レベルにて詳細に解析し明らかにすることを目的としている。遺伝子改変マウスを用いた検討ではフォリスタティン関連蛋白は心筋虚血再灌流後の心筋傷害に対して防御的に作用することが明らかとなった。そして、フォリスタティン関連蛋白の全身投与は心筋虚血再灌流モデルにおいて心筋梗塞サイズを縮小させ、虚血心筋における炎症反応やアポトーシスを抑制していた。さらに、フォリスタティン関連蛋白は心筋虚血再灌流後の心機能低下を改善した。培養系での検討においても、フォリスタティン関連蛋白は低酸素再酸素化刺激あるいはBMP4添加による心筋細胞のアポトーシス反応を抑制した。また、フォリスタティン関連蛋白は心筋細胞においてLPS添加あるいはBMP4添加による炎症性サイトカインの発現増加を抑制していた。さらに、マクロファージにフォリスタティン関連蛋白を前処理するとLPS添加あるいはBMP4添加による炎症反応が抑制された。フォリスタティン関連蛋白によるアポトーシス抑制作用と炎症反応抑制作用にはAMPキナーゼの活性化とBMP-4シグナルの阻害が関与していた。従って、フォリスタティン関連蛋白は虚血性心疾患の病態生理解明や治療法開発に対する新しい標的分子になる可能性が示唆された。2.フォリスタティン関連蛋白を野生型マウスに全身投与すると虚血再灌流後の心筋梗塞サイズが有意に減少し、心エコーで評価した心機能の低下も有意に回復していた。これらのフォリスタティン関連蛋白による心筋障害保護効果は虚血心筋組織でのアポトーシスの抑制(TUNEL染色で評価)と炎症性サイトカイン(TNF,IL-6)の発現抑制(定量的PCR法)を伴っていた。また、フォリスタティン関連蛋白は心筋細胞においてLPS添加による炎症性サイトカイン(TNF,IL-6)の発現増加を有意に抑制していた。フォリスタティン関連蛋白による心筋細胞のアポトーシス抑制と炎症性サイトカイン抑制作用にはAMPキナーゼの活性化が関与していた。現時点では、遺伝子改変マウスを用いたマウスレベルにおいて内因性フォリスタティン関連蛋白が急性心筋障害に対して保護的に作用し、フォリスタティン関連蛋白投与が急性心筋障害を抑制するという結果が得られている。また、フォリスタティン関連蛋白は心筋細胞のアポトーシスを抑制し、AMPキナーゼの活性化するという結果が得られている。血中フォリスタティン関連蛋白の測定は継続している。従って、フォリスタティン関連蛋白の虚血性心疾患における役割は細胞レベルと個体レベルで明らかになりつつある。

これらの達成度は当初の研究計画の予定を考えると順調であると考えられる。25年度が最終年度であるため、記入しない。現時点では、遺伝子改変マウスを用いたマウスレベルにおいて内因性フォリスタティン関連蛋白が急性心筋障害に対して保護的に作用し、フォリスタティン関連蛋白投与が急性心筋障害を抑制するという結果が得られている。また、フォリスタティン関連蛋白は心筋細胞のアポトーシスや炎症反応を抑制し、このフォリスタティン関連蛋白による心筋細胞保護効果には少なくともAMPキナーゼの活性化を介しているという結果が得られている。さらに、血中フォリスタティン関連蛋白の測定を継続している。従って、フォリスタティン関連蛋白の虚血性心疾患における役割は細胞レベルと個体レベルで明らかになりつつある。虚血性心疾患に対するフォリスタティン関連蛋白の意義を明らかにするため、前年度までの研究成果を踏まえて、以下の解析を行う。1.前年度までに、フォリスタティン関連蛋白欠損マウスは対照マウスに比して心筋虚血障害が悪化していることが明らかとなった。また、フォリスタティン関連蛋白は心筋虚血障害を抑制していた。今後は、心筋虚血モデルの作成を継続し、マウスレベルでのフォリスタティン関連蛋白による心筋保護作用の作用機序とそのシグナル伝達機構を解明する。2.前年度までに、フォリスタティン関連蛋白は培養心筋細胞に対して保護作用を有し、AMPキナーゼを活性化することを明らかにした。今後は、培養心筋細胞を用いて、フォリスタティン関連蛋白のシグナル伝達機序とさらなる機能を解明する。3.血中フォリスタティン関連蛋白の測定を継続し、虚血性心疾患における、血中フォリスタティン関連蛋白の臨床的意義をさらに検討する。1.前年度までに、フォリスタティン関連蛋白欠損マウスは対照マウスに比して心筋虚血障害が悪化していること、フォリスタティン関連蛋白過剰発現マウスでは心筋虚血障害が改善していることが明らかとなった。また、フォリスタティン関連蛋白はアポトーシスや炎症反応を抑制していた。今後は、心筋虚血モデルの作成を継続し、vivoでのフォリスタティン関連蛋白による心筋保護作用のさらなる作用機序とそのシグナル伝達機構を解明する。2.前年度までに、vitroにおいてもフォリスタティン関連蛋白は心筋細胞保護作用を有し、AMPキナーゼが関与する可能性を明らかにした。今後は、培養心筋細胞を用いて、そのさらなるシグナル伝達機序と機能を解明する。
葉緑体ゲノム改変レタスによる希少カロテノイド生産システムの構築

カロテノイドは代表的な天然色素群であり、種々の酸化ストレスから生体を守る機能を担っている。本研究では、その化学構造から機能性食品素材として期待されるが、自然界には希少にしか存在せず、かつ化学合成も困難であるカロテノイド色素として、4-ケトカプサンチンやノストキサンチン等に着目し、これらの色素の葉緑体での生合成用プラスミドを作製し、葉緑体ゲノム改変(CGM)レタスの構築を行い、各々について色素分析等を実施した。なお、先行して作出していたアスタキサンチンやフリチエラキサンチン(希少カロテノイド)を産生するCGMレタスについても多量栽培し、植物生理学研究用、及び食品としての安全性試験用に提供した。予定通り、3種類の目的とする希少カロテノイド色素(4-KC、2,2'-DA、及びNosto)を生産させるためのレタス葉緑体導入用プラスミド3種類の作製を完了した。さらに、これらのプラスミドのレタス・バークレーへの導入実験を繰り返し、各々のプラスミド内の目的とする外来遺伝子群が葉緑体ゲノムに組み込まれた葉緑体形質転換レタスを得ることに成功した。現在、spectinomycinによる選抜(葉から不定芽誘導し幼植物まで3回繰り返す)を行っているところである。4-ケトカプサンチン、2,2'-ジヒドロキシアスタキサンチン、及びノストキサンチン産生用プラスミドが葉緑体に導入された形質転換レタス(バークレー品種)の各々について、目的の外来遺伝子が葉緑体ゲノムの予想部位に導入されていることをPCRで確認した。その葉をspectinomycinの入った再分化用培地に置床して培養し、不定芽形成を経て幼植物体を得た。この操作を計5回繰り返し、ほとんどの葉緑体ゲノムが組換えゲノムに置き換わったことをPCRで確認した。この結果は、目的の葉緑体ゲノム改変(CGM)レタスが取得できたことを意味している。3種類のCGMレタスの葉を用いて、全カロテノイドの効率的抽出法を決定し、HPLC-PDA分析(色素分析)を開始した。4-ケトカプサンチン、2,2'-ジヒドロキシアスタキサンチン、及びノストキサンチン生合成遺伝子群が葉緑体に導入された葉緑体ゲノム改変(CGM)レタスの作出を、昨年度報告した。本年度は、これらCGMレタス(in vitro幼植物体)を特定網室(組換え温室)に移して土で栽培し、T1種子を取得し始めた。種子が揃い次第、これら種子を栽培して、展開葉の色素分析により、予想されるカロテノイドが生成されているかどうかを確認する。おおむね当初の研究計画通り、3種類のCGMレタスを作出し、T1種子を形成させることができた。種子は当初、なかなか形成されなかったので、T2種子の取得までは至らなかった。各CGMレタスにおける非天然型のカロテノイドが植物体の成長を若干阻害している可能性がある。初年度(H25年度)には、取り扱いが容易なレタス葉緑体形質転換用ベクターを作製し、これをベースに4-ケトカプサンチン(crtWとCCS遺伝子の導入)、2,2'-ジヒドロキシアスタキサンチン(crtW、crtZとcrtG遺伝子の導入)、及びノストキサンチン(crtZとcrtG遺伝子の導入)産生用プラスミド構築した。これら3種のプラスミドを用いて、レタス(バークレー品種)の形質転換を行い、目的の外来遺伝子が葉緑体ゲノムの予想部位に導入されたことをPCRで確認できたものを取得した(H2526年度)。次に、選択薬剤入りの再分化培地での葉の置床→不定芽形成を5回以上繰り返し、ほとんどの葉緑体ゲノムが組換えゲノムに置き換わった葉緑体ゲノム改変(CGM)レタスを数系統ずつ取得し、種子を得た(H2627年度)。レタス葉から全カロテノイドの効率的抽出法を決定し、これら3種類のCGMレタス葉のHPLC-PDAやHRMS等を用いた色素分析を行った。crtW、CCS導入CGMレタスは4-ケトカプサンチンを生産できなかったが、残りの2種類のCGMレタスは目的とするカロテノイドを生産していた(H27年度)。また、crtW、crtZ、crtG導入CGMレタスは、有望な機能性が期待されるフリチエラキサンチン(4-ケトルテイン)を含んでいたので、このCGMレタス、またはcrtW、crtZ導入CGMレタス(先行して作出されていた)を多量栽培し、その葉から本色素を100 mg以上精製した(H28年度)。なお、crtW、crtZ導入CGMレタスは植物生理学研究用にも提供された。さらに比較のため、crtWとcrtZ遺伝子の染色体への導入用プラスミドを作製し、レタス以外の機能性カロテノイド産生農作物の作出にも貢献した。以上の成果等により、H28年のGordon Research Conference on CarotenoidsではDiscussion Leaderとして招待された。

なお、先行して作出していたアスタキサンチンやフリチエラキサンチン(希少カロテノイド)を産生するCGMレタスについても多量栽培し、植物生理学研究用、及び食品としての安全性試験用に提供した。おおむね当初の研究計画通り、3種類のCGMレタスを構築し、色素分析を開始した。3種類のCGMレタスを各T1種子から栽培する。展開葉のHPLC-PDA分析(色素分析)を行い、非天然型のカロテノイドが生成されているかどうかを確認する。さらに、各CGMレタスにより生産された主要カロテノイドを、各種クロマトグラフィーにより単一成分まで精製し、NMR、HRMS分析により構造を決定する。さらに、精製した主要カロテノイドについて、in vitro抗酸化試験を実施する。合成生物学3種類のCGMレタスを特定網室(組換え温室)で栽培し、各々から十分量のT1種子を取得する。さらに、T1種子を発芽させ、特定網室で栽培し、T1の葉を取得する。T2種子も取得する。得られた3種類のCGMレタスT1の葉からカロテノイドを抽出し、HPLC-PDA分析を行う。さらに、生産された主要カロテノイドを各種クロマトグラフィーにより単一成分まで精製した後、NMR、HRMS分析により構造を決定する。さらに、生産された主要カロテノイドについてin vitroでの抗酸化試験を実施する。計画では、spectinomycinによる選抜(葉から不定芽誘導し幼植物まで3回繰り返す)を平成27年3月までに終了する予定であり、このまま順調に実験が進むと数か月、前倒しで計画が終了する見込みである。平成26年度物品費の実支出額に37円という少額の残金が生じたためspectinomycinによる選抜(葉から不定芽誘導し幼植物まで3回繰り返す)を終了した葉緑体形質転換レタス3種類の幼植物体を得た後、葉緑体ゲノムが組換え体に完全に置き換わっていることを確認する。さらに、確認した幼植物の葉のカロテノイド色素分析を行うと共に、組換え温室でこれらの栽培を行い、T1種子を取得する。平成27年度物品費の中で使用する。
腎臓の発生と再生における新規遺伝子GZF1の役割に関する研究

GDNF/GFRα1/RETシグナル伝達系はこの3者のいずれをノックアウトしても腎臓の無形成あるいは著しい低形成が認められるため、腎臓発生において非常に重要な系であることが明らかになっている。我々は平成15年にGDNF刺激によって誘導される新規遺伝子GZF1を報告した。GZF1のアンチセンスオリゴを添加することによりマウスの後腎器官培養での尿管芽の発育が障害されたためGZF1は腎臓発生においてGDNF/RETシグナル伝達系の下流で機能する重要な遺伝子である可能性があると考えられた。今回の研究の目的はGZF1の機能を解析して、腎臓発生における役割を明確にすることである。GZF1はC末端に10個のzinc finger motiを有するため、この部位でDNAと結合し転写にかかわる可能性が示唆されている。無作為な26塩基のDNA配列からGZF1蛋白と特異的に結合する共通配列を抽出するためにCASTing法(Cyclic Amplification and Selection of Targets)を行ったところGZF1と親和性の高い12塩基のDNA共通配列(TGCGCGTCTATA)を同定した。ゲノムデータベースで検索したところヒト及びマウスのホメオボックス遺伝子(Hoxa10)の上流にこの12塩基のDNA共通配列が認められた。このホメオボックス遺伝子の転写調節領域とGZF1蛋白はEMSAでDNA蛋白複合体を形成し、クロマチン免疫沈降法(ChIP assay)でホメオボックス遺伝子上流との結合が検出された。さらに遺伝子調節領域を用いたルシフェラーゼアッセイにおいてDNA結合配列特異的な転写抑制を認めた。ホメオボックス遺伝子群は様々な器官発生に必須であることが明らかにされており、GZF1によるホメオボックス遺伝子の転写抑制が腎臓発生過程で重要である可能性が示唆された。GDNF/GFRα1/RETシグナル伝達系はこの三者のいずれをノックアウトしても腎臓の無形成あるいは著しい低形成が認められるため、腎臓発生において非常に重要な系であることが明らかとなっている。GZF1はC末端に10個のZincFingermotifを有するため、この部位でDNAと結合し転写に関わる可能性が示唆されている。無作為な26塩基のDNA配列からGZF1蛋白と特異的に結合する共通配列を抽出するためにCASTing法(Cyclic Amplification and Selection of Targets)を行ったところGZF1と親和性の高い12塩基のDNA共通配列を同定した。ゲノムデーターベースで検索したところヒトおよびマウスのホメオボックス遺伝子の一つの上流にこの12塩基のDNA共通配列が認められた。このホメオボックス遺伝子の転写調節領域とGZF1蛋白はEMSAでDNA蛋白複合体を形成し、クロマチン免疫沈降法でホメオボックス遺伝子上流との結合が検出された。さらに遺伝子転写調節領域を用いたルシフェラーゼアッセイにおいてDNA結合配列特異的な転写抑制を認めた。
妊婦のエンパワメント尺度の臨床適用と検証

本研究は、妊娠・出産・育児に向けた妊婦の主体的行動を支援するために妊婦のエンパワメントを把握し、出産前教育の評価指標となる尺度を開発することである。臨床での尺度の有用性を確認し、修正した尺度の信頼性・妥当性を検討した。調査の結果、エンパワメント尺度を用いてクラスに参加した妊婦のエンパワメントの変化が把握できること、また、エンパワメントの高さは妊婦の主体的行動に影響することが示された。よって、エンパワメントに介入する意義、出産前教育の評価指標としての有用性が示された。また、尺度の修正版を作成し、妥当性と信頼性を確認した。今後、更に尺度を洗練させ、効果的な出産前教育を検討することが課題である。【研究の目的】妊婦のエンパワメント尺度修正版を作成し尺度を洗練・発展させる。また、修正版尺度を用いて出産前教育の評価や妊婦ケアに活用し、臨床での適用範囲を検証する。今年度は、文献検討から尺度の構成概念について検討した。【今年度の研究成果】データベースは医学中央雑誌、CINHALを用いた。妊婦のエンパワメント尺度(2008 ; Virsion1)発表前後の2007-2009年を検索対象とし、エンパワメントに関する国内外の文献レビューを行った。中でも注目したのは、Centering Pregnancy Modelとして妊婦健診のあり方を変革している米国から報告されたPregnancy-Related Empowerment Scale(以下、PRES)であった。PRESの構成概念はProvider Connectedness, Skillful Decision-making, Peer Connectedness, Gaining Voiceであり,エンパワメントを成果ととらえた尺度と考えられた。我々が作成した妊婦のエンパワメント尺度は、妊婦の主体的な行動変容へとつながるモチベーショナルな心理的側面(self-efficacy, future image, self-esteem, supportand assurancefrom others, and joy of addition to thefamily)を測定するものであり、パワーレスな心理状態の妊婦のスクリーニングや目的が多様化している出産前教育の評価をねらいとしている。日米間の文化的背景や提供される産科医療・助産ケアの相違を踏まえ、より本邦の臨床現場に適用できる尺度としての修正課題を確認した。本研究の目的は、妊婦のエンパワメント尺度(Version.1)を洗練・発展させ、臨床適用について検証することである。本年度は、平成21年度に行った妊婦のエンパワメントに関する文献検討を踏まえ、修正版尺度を作成することを目的としていた。しかし、連携研究者との討議により、妊婦のエンパワメント尺度を用いて出産前教育を縦断的に評価した調査結果を分析し、尺度の臨床適用への可能性を探ること、および尺度修正への示唆を得ることに研究計画を変更した。調査概要と分析計画:I県の4施設で行われている出産前クラスに参加した妊婦を対象に、クラス参加前、クラス終了直後、クラス後1か月の3時点において、妊婦のエンパワメント・属性・行動遂行状況等を調査して得られた125名のデータを分析対象とした。本年度は、出産前クラスに関する基礎情報(クラスの目的、内容、運営体制等)の整理、および分析データの整理を行っている段階である。分析計画として、以下の3点を挙げた。(1)出産前クラスの評価ツールとしての有用性の観点から、クラスの目的とエンパワメントとの関係性、クラス前後におけるエンパワメント変化等について検討する。(2)パワーレスな妊婦の特徴を探求するために、妊婦の属性要因とエンパワメントとの関係性を分析し、臨床への活用について検討する。(3)クラス後1か月までのエンパワメントの推移、エンパワメントの高さと行動遂行との関係性を明らかにすることにより、エンパワメントの測定意義を追求する。次年度はこれらの分析を進めて成果発表する。妊婦のエンパワメント尺度の臨床への適用と妊婦のエンパワメント支援への示唆を得るために、出産前クラスの評価ツールとしての有用性、妊婦のエンパワメントの関連要因について検討した。I県の4つの産科施設で行われている出産前クラスに参加した妊婦125名を対象にクラス前、クラス直後、クラス後1か月の3時点で妊婦のエンパワメント(以下、エンパワメント)、クラス評価、属性、1か月後の行動遂行状況等について調査したデータを分析した。なお、クラス後1か月時点まで回答が得られたのは61名であった。

エンパワメント得点は、クラス直後の方がクラス前よりも有意に得点が高かったが(p<.05)、クラス直後に得点が低下した妊婦は14名(11.2%)、得点が変わらなかった妊婦は10名(8.0%)であった。これらより、エンパワメントは介入によって操作可能であり、介入次第ではエンパワメントを上下させることが示され、本尺度はクラスの評価ツールとして利用できることが示唆された。関連要因の検討では、クラスに参加して「気持ちが楽になった」という感覚がエンパワメントの変化に影響していた(β=.26)。また、エンパワメントとの関連が示唆された属性は「出産歴」、「妊娠経過」、「合併症の有無」、「妊娠を希望していたか否か」であり、経産の方が初産より、妊娠経過が順調な妊婦の方がそうでない妊婦より、合併症のない方がある妊婦より、妊娠を希望していた方がそうでない妊婦よりエンパワメントが高い傾向にあったが、クラス前後の変化量は属性によって有意な差はなかった。また、エンパワメントと行動変容との間には正相関をみとめ、さらにクラス直後のエンパワメントは1か月後の妊婦行動に影響することが示された。以上より、エンパワメント支援の意義と介入の視点が示唆された。平成23年度までの研究結果から、出産クラスの評価指標として活用できること、エンパワメントへの介入の方向性について示唆が得られた。最終年度は妊婦のエンパワメント尺度をさらに洗練・発展させることを目的に、国内外の研究者から届けられた意見等を踏まえ、研究者間で構成概念を検討し、修正版尺度を作成した。修正版尺度は5因子から6因子構造とし、項目数は27項目から36項目とした。信頼性・妥当性の検討のために、北陸地方の産科施設に通う妊婦を対象に研究協力に同意を得てアンケート調査を実施し、211名のデータを分析対象とした(有効回答率98.6%)。天井効果・フロアー効果、項目分析から9項目を削除対象とした。探索的因子分析の結果、尺度項目は計27項目、因子構造は第1因子「家族が増える楽しみ」、第2因子「自己効力感」、第3因子「自己肯定感」、第4因子「周囲からの支持・保証」、第5因子「将来のイメージ」、第6因子「医療者との関係性」の6因子が抽出され、寄与率46.6%であり修正版尺度の構成概念を確認できた。基準関連妥当性については、Locus of Control尺度との相関係数は0.49を示した。また、クロンバックのα係数は0.88であった。以上より、修正版尺度の妥当性と信頼性は支持されたと考える。今後、臨床においてエンパワメント尺度をクラス評価や妊婦健診時のパワーレス状態の把握等に活用しながら、妊婦のエンパワメントへの介入研究への発展を課題と考える。データ分析の途中であり、予定していた結果公表は準備段階であるため。25年度が最終年度であるため、記入しない。調査対象施設の臨床スタッフに連携研究者として協力を依頼する。研究プロジェクトを組み、調査データの収集・分析・考察等を共同で行う。
低酸素環境下のがん幹細胞をターゲットとした放射線増感研究

平成30年度は以下の2点を中心に研究を行った。Sulfasalazine放射線増感作用を3種類のヒト由来腫瘍細胞U251、HSC-2およびHT1080を用いてin vitroで検討した。U251およびHSC-2はCD44vを発現し、HT1080は発現していない。放射線増感効果はコロニー形成法を用いて算定した。低酸素状態は酸素濃度は0.5%、照射前4時間および照射中低酸素状態とした。この条件での酸素濃度約0.5%であり、酸素増感比はU251細胞に対して1.8であった。1 mM sulfasalazine 24時間暴露によりU251細胞はわずかに増殖抑制が認められた。低酸素細胞に対して増感比1.4と放射線増感効果を認めたが、一方、常酸素細胞に対しては増感比0.91と増感効果を認めなかった。次にHSC-2およびHT1080細胞について同様の検討を行ったが、明らかな増感効果は認められなかった。SulfasalazineによるxCTの抑制により低酸素状態のU251細胞に対して増感効果を認めたが、常酸素状態U251細胞、低酸素状態のHT1080およびHSC-2 cellsに関して効果を認めなかった。前年度から引き続きHsp90阻害剤17-DMAGの低酸素増感効果に関しても追加研究を行った。HeLa、HT1080およびHSC-2を用いた。低酸素状態は上記研究と同様に行った。100 nM 17-DMAG24時間暴露により常酸素状態では放射線増感効果は認められなかったが、HeLaおよびHT1080では低酸素状態で高い増感効果を認めた。17-DMAGは細胞周期には影響せず、Hsp90を有意に抑制していた。HT1080細胞ではHIF-1aを抑制したが、一方、増感効果を示さなかったHSC-2細胞ではHIF-1a発現を亢進させた。Hsp90は低酸素増感剤の新しい標的になる可能性が示された。コロニー法を用いた放射線増感効果に関する研究は順調に推移し、SulfasalazineおよびHsp90阻害剤17-DMAGの低酸素増感効果が明らかに示された。また、その効果は細胞依存性であることも判明した。上記薬剤の作用機序および細胞依存性の分子メカニズムが重要である。本検討を行う予定の研究協力者が体調不良で、ウエスタンブロット法を中心とする研究が遅れている。最近、体調が改善しつつあり、次年度の研究が期待される。ウエスタンブロット法を中心とした放射線増感効果のメカニズムを中心に担当する研究協力者の体調が回復し、現在Sulfasalazineの作用メカニズム、17-DMAG作用の細胞間差異に関して研究中である。なお、17-DMAGに関しては論文投稿中、Sulfasalazineに関しては国際学会でのポスター発表が採用され、発表予定である。これまでの研究でHeLa細胞およびHT1080細胞については、DMAGは常酸素細胞に対して放射線増感効果は低く、一方、低酸素細胞に対しては増感比1.3-1.7の高い増感効果を示すことを明らかにしてきた。HSC-2を用いてコロニー法で放射線増感効果を求めたが、常酸素細胞および低酸素細胞では増感比それぞれ1.0、1.1と放射線増感効果をほとんど認めなかった。また酸素増感比も1.6と他の細胞から有意に低値を示した。Hela細胞およびHT1080細胞では100 nM DMAG24時間暴露でHIF-1アルファの有意な発現低下を認めた。現在、HSC-2細胞でHIF-1アルファの発現を検討中である。HSC-2ではCD44バリアントが発現しており、細胞外からシステインを取り込むため放射線抵抗性である可能性が示唆され、今後、検討していく予定である。CD44バリアントの発現状態が異なる4種類の細胞、即ちHSC-2、HSC-3、HSC-4、およびOSC 19を新規に細胞バンクから購入した。平成28年度は放射線増感比を計測するため重要なコロニー法について、これらの細胞で実験の可否について検討した。このため研究計画28年度と29年度を入れ替え、Hsp90阻害剤を用いて低酸素環境におけるがん幹細胞様細胞に対する放射線増感効果を中心に行った。この研究で最も成果が期待できるCD44バリアントを発現しているHSC-2ではコロニー法で研究が可能であることが明らかになった。また成果でも示したが、HSC-2細胞には他の細胞にはない放射線感受性の特徴があり、Sulfasalazineを用いた研究に期待が持てる。HeLa細胞、HT1080細胞、HSC-2細胞では常酸素状態でのコロニー法で求めた増感効果は増感比1.0-1.2とほとんど認めなかったが、低酸素状態ではHeLa細胞、HT1080細胞についてはDMAG100-400nM以上で増感比1.5以上の増感効果を認めた。一方、HSC-2では増感効果は認めなかった。HT1080細胞を対象としDMAGへの暴露時間による差異をみた場合、4時間の暴露でも有意な増感効果を示した。タンパク発現ではDMAGの処理によりHsp90阻害の指標であるHsp70の発現増加を認めた。HIF1αはDMAGの処理により低酸素状態で増感効果を認めたHT1080細胞では抑制されたが、認めなかったHSC-2細胞では変化しなかった。

次にSulfasalazineの低酸素細胞への放射線増感効果を同様にして求めた。薬剤単独での細胞毒性は極めて低く、1mMでもわずかな増殖抑制効果を認めたのみであった。また、コロニー法で求めた細胞生存率は、対象に比較して差を認めなかった。放射線増感効果に関しては、HT1080細胞、HSC-2細胞では増感効果は全く認めなかった。ヒト由来脳腫瘍細胞U-251MG細胞では1mMで常酸素状態ではむしろ防護的に作用したが、低酸素状態では有意な放射線増感効果を認めた。Sulfasalazineによる放射線増感効果が、初期にテストした細胞で全く認められなかった。この原因を探索するため時間を要したが、研究実績の概要で示したように新たに細胞種を増やしてテストした結果、増感作用が明確となったため現在は順調に進行している。平成30年度は以下の2点を中心に研究を行った。Sulfasalazine放射線増感作用を3種類のヒト由来腫瘍細胞U251、HSC-2およびHT1080を用いてin vitroで検討した。U251およびHSC-2はCD44vを発現し、HT1080は発現していない。放射線増感効果はコロニー形成法を用いて算定した。低酸素状態は酸素濃度は0.5%、照射前4時間および照射中低酸素状態とした。この条件での酸素濃度約0.5%であり、酸素増感比はU251細胞に対して1.8であった。1 mM sulfasalazine 24時間暴露によりU251細胞はわずかに増殖抑制が認められた。低酸素細胞に対して増感比1.4と放射線増感効果を認めたが、一方、常酸素細胞に対しては増感比0.91と増感効果を認めなかった。次にHSC-2およびHT1080細胞について同様の検討を行ったが、明らかな増感効果は認められなかった。SulfasalazineによるxCTの抑制により低酸素状態のU251細胞に対して増感効果を認めたが、常酸素状態U251細胞、低酸素状態のHT1080およびHSC-2 cellsに関して効果を認めなかった。前年度から引き続きHsp90阻害剤17-DMAGの低酸素増感効果に関しても追加研究を行った。HeLa、HT1080およびHSC-2を用いた。低酸素状態は上記研究と同様に行った。100 nM 17-DMAG24時間暴露により常酸素状態では放射線増感効果は認められなかったが、HeLaおよびHT1080では低酸素状態で高い増感効果を認めた。17-DMAGは細胞周期には影響せず、Hsp90を有意に抑制していた。HT1080細胞ではHIF-1aを抑制したが、一方、増感効果を示さなかったHSC-2細胞ではHIF-1a発現を亢進させた。Hsp90は低酸素増感剤の新しい標的になる可能性が示された。コロニー法を用いた放射線増感効果に関する研究は順調に推移し、SulfasalazineおよびHsp90阻害剤17-DMAGの低酸素増感効果が明らかに示された。また、その効果は細胞依存性であることも判明した。上記薬剤の作用機序および細胞依存性の分子メカニズムが重要である。本検討を行う予定の研究協力者が体調不良で、ウエスタンブロット法を中心とする研究が遅れている。最近、体調が改善しつつあり、次年度の研究が期待される。平成29年度予定であったHSP90阻害剤による放射線増感効果の研究はほぼ完成したので、論文作成に入る。
腎細胞におけるSystemAのストレス応答

腎細胞、腹膜細胞を用い、浸透圧ストレス応答について研究を行った。1)腹膜透析では腹膜細胞の傷害による腹膜機能の低下、硬化性腹膜炎が問題となっており、透析液の高浸透圧がその要因の一つと考えられている。本研究では高浸透圧負荷によるsystemAの誘導を明らかにし、新たな浸透圧制御の知見を得た。培養腹膜細胞では中性アミノ酸輸送系であるSystemAの輸送活性は高浸透圧負荷4時間後には36倍に増加し、細胞内アミノ酸含量は高浸透圧により12時間後には306より757nmol/mg proteinと2倍以上に増加した。増加したアミノ酸の81%は中性アミノ酸であった。SystemAの輸送カイネティクスの解析ではKmは0.16mM/lであり高浸透圧によりVmaxの増加を認めた。これより中性アミノ酸とSystemA輸送系が高浸透圧制御に重要な役割を持つことが明らかとなった。2)腎由来培養細胞(MDCK)を用いて高浸透圧による細胞傷害にアポトーシスが関与すること、オスモライト添加が細胞保護効果を持つことを示した。高浸透圧(700mOsm)負荷24時間後にはcaspase-3活性は20倍以上に増加し、caspase-8、caspase-9活性化も認められ、caspase依存性のアポトーシスが誘導されることを示した。またベタイン、中性アミノ酸などSystemAの基質であるオスモライトを細胞外に添加することにより、高浸透圧による細胞傷害が抑制されることを示し、特にベタイン添加は、高浸透圧依存性アポトーシスを抑制することを明らかにした。NDCK細胞を用い、高浸透圧、アミノ酸欠乏、インスリン投与によるSystem Aの誘導のtime course、浸透圧ならびにインスリン投与量の依存性を明らかにした。MeAIBの細胞内取り込みで評価すると高浸透圧ではsystem Aの誘導は4時間後の最も早期に認められ、インスリンは8時間後、アミノ酸欠乏では24時間後にsystem Aの活性増加が認められ、誘導のtime courseの相違が明らかとなった。インスリン投与24時間後に高浸透圧負荷を加えるとSystem Aの誘導は相加的に認められ、インスリン投与と高浸透圧ストレスによるSystem A誘導機構が異なることが示された。MDCK細胞の細胞傷害をMTTassay、培養メディウム中へのLDHrelease、apoptosisの有無をDNAの電気泳動によるラダーの検出とTUNEL法によるDNA断片化により評価した。500mOsm48h負荷群ではメディウム中のLDH活性が増加し、MTTassay値はコントロール(300mOsm)の23±4%と高浸透圧による細胞傷害を認めた。1mMのベタイン、タウリン、プロリン、トレオニンの添加によりMTTassay値はそれぞれコントロールの87±2、46±2、44±4、41±2%と回復し、オスモライト添加による細胞傷害の有意な抑制を認めた。600、700mOsm24時間負荷によりDNAのラダーおよびTUNEL法陽性細胞が認められ、apoptosisが高浸透圧による細胞障害に関与していることが明らかとなった。TUNEL法陽性の細胞数は1mMベタイン添加により抑制され、オスモライト蓄積が障害の軽減に有用であることが示唆された。腎尿細管上皮由来MDCK細胞を用い、高浸透圧による細胞障害にアポトーシスが関与するかを検討した。また高浸透圧環境下で細胞内に蓄積し細胞内外の浸透圧バランスを保つと考えられているオスモライト(ベタイン、中性アミノ酸など)添加の効果も検討した。細胞障害はMTT assay、浮遊細胞の割合により評価した。MTT assay値は500、600、700mOsm48h負荷群はそれぞれコントロ-ルの30±5、10±3、3±0%であり、浸透圧依存性の細胞障害を認めた。1mMのベタイン、タウリン、中性アミノ酸添加により障害抑制効果が認められ、ベタインの効果が最も顕著であった。

TUNEL染色は700mOsm24h負荷群の付着細胞において陽性であり、アガロースゲル電気泳動においてもアポトーシスに特徴的なDNA断片化によるラダーが認められた。TUNEL陽性細胞の比率はコントロ-ルが1%以下であるのに対し、700mOsm24h負荷群は12%と有意な増加を認め、これはベタインにより有意に抑制された。アポト-シスに関与するとされるCaspase3活性は700mOsm24時間後にはコントロ-ルの20倍以上の活性を示し、これはベタイン添加により約50%抑制された。Caspase8、caspase9の活性は24時間後にコントロ-ルの3.4倍、7.5倍と増加した。ミトコンドリア膜電位は700mOsm4h後には有意に低下し、ミトコンドリア障害が高浸透圧負荷後の早期に起こると示唆された。これよりMDCK細胞では高浸透圧ストレスによりミトコンドリア障害、caspase familyの活性化をきたし、アポト-シスが誘導されると考えられた。
イオン伝導性高分子超薄膜の作製と分子素子の開発

イオン伝導性高分子超薄膜の作製をラングミュアー・ブロジェット法(LB法)により試み、その膜構造解析とイオン伝導性等の電気特性について検討し、次の結果を得た。ポリ(エチレングリコール)/長鎖脂肪酸混合LB膜の作製と物性(1)重量平均分子量約1万のポリ(エチレングリコール)とステアリン酸とをモル比1:1から10:1の割合で混合したLB膜の作製が可能であった。(2)ポリ(エチレングリコール)組成が増加すると膜の親水性が強まり、Y型から比較的安定なZ型の積層膜が得られた。(3)膜構造をX線回析、反射吸収赤外分光法、偏向可視紫外分光法により解析した。膜中のステアリン酸分子は、膜面に対し80°の角度を持ちほぼ垂直に配向し、ポリ(エチレングリコール)組成が増大するとその配向性は低下した。(4)イオン伝導性をこのLB膜に持たせるために、水槽にアルカリ金属塩を加えて積層すると室温で約10^<-6>S/cmのイオン伝導性を示した。また、積層後に再度アルカリ金属塩を含む有機溶媒中でイオンドープすることが可能であった。膜面方向と膜厚方向のイオン伝導性を比較すると膜面方向の導電率は1000倍程度高く、この膜が異方導電性を有していることがわかった。2.ポリ(エチレングリコール)/導電性高分子/長鎖脂肪酸LB膜の作製と物性(1)上記同様、ポリ(3_-ヘキシルチオフェン)とステアリン酸によるLB膜に、ポリ(エチレングリコール)を混合することが可能であった。(2)イオン伝導性挙動等は、上記の系とほぼ同様であった。(3)ポリ(3_-ヘキシルチオフェン)をドープして電子伝導性薄膜にすると、ポリ(エチレングリコール)への水分、アルカリ金属イオンの吸着により、その電子伝導性が変化することがわかった。現在、この性質を利用したセンサーの研究を進めている。
タイプA行動および失感情傾向とストレス性疾患との関連性の研究

タイプA行動パターンは冠動脈疾患の発症に関わる心理・行動的因子として注目されている。このような行動パターンは広くストレス性疾患全般の発症原因となるものと考えられる。またタイプA行動パターンはストレス性疾患患者にしばしば観察される失感情、過剰適応といった行動特徴を含むことが推察される。そこで本研究ではストレス性疾患を持つ患者群と健常被験者群を用いてタイプA行動パターンと失感情傾向が各群にどのように観察されるかを検討し、また患者群では視床下部・下垂体系のドーパミン作動系機能を手がかりとしてその特徴の比較を行った。これらの被験者に当研究者が新たに構成したタイプAの測定法に基づく質問紙とミネソタ多面的人格目録(MMPI)、エゴグラムを施行した。これらの質問紙の統計的検討によりエゴグラムではドーパミン作動系機能が影響を及ぼす尺度は見いだされなかった。しかしMMPIではストレス性疾患患者の中でドーパミン作動系機能が正常反応である群のほうが無反応である群よりも抑うつ性尺度の得点が高い傾向が窺われた。このことはドーパミン作動系機能が無反応である群の方が、抑うつ尺度に反映される抑うつ感、無気力、身体的愁訴、心配や緊張などの心理的な問題を表現しにくいことを示している。さらに多次元尺度構成法によって新たに作成した質問紙を分析したところ、健常者群とストレス性疾患患者群の判別、またストレス性疾患患者のドーパミン作動系機能の無反応群と正常反応群の判別が可能であることが示唆された。この分析結果から、健常者群に比べてストレス性疾患患者群のほうがストレスを認知しやすいことが窺われ、さらにドーパミン作動系機能の無反応群は正常反応群に比べて過剰適用傾向を持ちながら、日常生活におけるストレスをあまり認知していないことが示された。今年度の研究の主目的は、ストレス性疾患の心理・行動特徴として、しばしば取り上げられる過剰適応、失感情傾向について心身症患者を対象として検討することであった。本研究ではこのような心理・行動特徴を視床下部・下垂体系のドーパミン作動系機能との関連で検討することを試みた。これらの心理・行動特徴を検討するために、一般的によく使われている心理検査として、MMPIとエゴグラムを用いた。また本研究では当研究者が前研究に基づいて構成した新しい心理検査を用いて、本来被験者自身が自覚しにくく、自記式質問紙では測定困難であると考えられてきた心理・行動特徴を測定することを試みた。MMPIとエゴグラムの尺度についての分析では、MMPIの抑鬱性尺度のみに有意傾向が見られたのみでその他の尺度では有意差が見られなかった。またMMIの項目の中から構成された失感情尺度についても検討を行ったが、この尺度についても両群で有意差は見られなかった。新しく構成した質問紙については、健常者群と心身症患者のうち視床下部・下垂体系のドーパミン作動系機能に歪みのある群、また歪みのない群についてカテゴリカル・データに対する多次元尺度構成法による分析を行った。この結果2つの尺度が抽出された。第1の尺度では健常者群と心身症患者群とを判別することができ、第2の尺度では心身症患者群のうち視床下部・下垂体系のドーパミン作動系機能に歪みのある群と、この機能が正常な群とを判別することが可能であった。この質問紙についての信頼性、妥当性については今後検討を行って行く必要があるが、本研究によって視床下部・下垂体系のドーパミン作動系機能と関連した心理・行動特徴を測定するための手がかりを得ることが出来たと考えられる。

今年度の研究の主目的は、ストレス性疾患の心理・行動特徴として、しばしば取り上げられる過剰適応、失感情傾向について新たに作成した質問紙によって健常者のデータを得ること、またこの研究と平行して心身症患者を対象としてリラクセーション訓練とイメージ面接を行い、質問紙の実際的妥当性を確認し、臨床面からタイプAの失感情的特徴を確認することであった。本年度の実績として、本研究者が構成した新しい質問紙を100名の健常被験者に施行し、心身症患者のデータと比較できる対照群データを獲得することが出来た。このデータと前年度に蓄積した心身症患者のデータ、また今年度追加した心身症患者のデータに対してカテゴリカル・データに対する多次元尺度構成法による分析を行った。この結果前年度と類似した分析結果を得ることが出来た。すなわちこの質問紙によって健常者群と心身症患者群との判別が可能であり、さらに心身症患者群のうち視床下部・下垂体系のドーパミン作動系機能に歪みのある群と、この機能が正常な群とを判別することが可能であった。このことから新しい質問紙の妥当性を確認できたと考えられる。また本年度は調査対象とした患者群の一部にリラクセーション訓練として自律訓練を施行し、その成績を自記式質問紙によって報告させた。この結果タイプA的な特徴を持つ被験者はリラクセーションが困難で、リラックス時の自分の身体感覚が乏しく、想起されるイメージも乏しいことが明らかとなった。本年度の研究では、前年度までの研究によって明らかにしてきたタイプA行動パターンとストレス性疾患との関連についてさらに検討するために、前年度までに蓄積したデータに臨床データを追加して再分析を行った。すなわち、当研究者が新たに構成したタイプAの測定法に基づく質問紙とミネソタ多面的人格目録(MMPI)、エゴグラムをストレス性疾患患者に施行し統計的検討を行った。エゴグラムではドーパミン作動系機能が影響を及ぼす尺度は見いだされなかった。しかしMMPIではストレス性疾患患者の中でドーパミン作動系機能が正常反応である群のほうが無反応である群よりも抑うつ性尺度の得点が高い傾向が窺われた。このことはドーパミン作動系機能が無反応である群の方が、抑うつ尺度に反映される抑うつ感、無気力、身体的愁訴、心配や緊張などの心理的な問題を表現しにくいことを示している。さらに多次元尺度構成法によって新たに構成した質問紙を分析したところ、健常者群とストレス性疾患患者群の判別、またストレス性疾患患者のドーパミン作動系機能の無反応群と正常反応群の判別が可能であることが示された。この分析結果から、健常者群に比べてストレス性疾患患者群のほうがストレスを認知しやすいことが窺われ、らにドーパミン作動系機能の無反応群は正常反応群に比べて過剰適応傾向を持ちながら、日常生活におけるストレスをあまり認知していないことが再度示された。また当研究者は視床下部、下垂体系のドーパミン作動系機能の歪みのある患者はこの機能の正常な患者と比較して失感情的であるという見解から、MMPIの失感情尺度とドーパミン作動系機能との関連の検討を行った。しかし両者の関連については明確は結論が得られなかった、これは最近提出されているMMPI失感情尺度に対する妥当性の問題をさらに検討すべきであるとの意見を支持する結果であった。