hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
仙台型紙の保存と仙台型染め文様を伝承するためのデジタルアーカイブス

文様の破損箇所については、汎用フォトレタッチソフトを用いて電子的に補修したが、折れ曲り箇所の補修や、細部欠損箇所の補完など、軽微な補修にとどめた。これらの電子保存型紙文様の一部を『仙台型染資料集XII』としてまとめた。また、電子保存した型紙文様を活用して、工芸染色技術の発展へと繋げるためのレーザー加工機による型紙文様の複製と、昇華転写型インクジェットプリンタによる染色も行った。後者については注染に用いられる綿布帛ではなく、ポリエステル布帛に染色する必要があるため、より効果が高い材料を選定する必要がある。一方で、常盤紺形染の調査については、本学所蔵藍型染古布から、常盤紺形染の特徴を有する資料について調査を行なった。しかし、文様の調査で止まっているため、資料寸法・布帛厚さ・糸密度等の詳細な調査を来年度に実施する。パソコン制御機器を用いた型紙文様の再生については、計画した方法での再生が概ね達成されるが、これまで用いられてきた型紙材料や布帛材料とは異なる材料を用いる必要があるため、細かい表現を再現するには至っていないため、今後デジタルデータの補正方法について検討したい。しかし、これまでとは違った新しい伝統文様の表現が可能となったことは評価できる。一方で、注染型紙の電子保存については、若干の遅れが生じた。これは、科研費が減額されて支給されたため、機材購入に予算の殆どを費やし、型紙調査の研究協力者を十分に確保できなかったためである。次年度は、型紙調査と電子保存を中心に研究を行うことで、遅れを取り戻す予定である。本研究では、かつて仙台地方において染色されたこの地方特有の型染めである常盤紺形染と注染染物(手拭・浴衣)についての調査と、それらの染色に用いられた型紙の電子保存を行なっている。本研究期間中に、注染型紙186枚の調査と電子保存を行うことができた。調査としては、1資料の状態記録、2資料計測、3文様等の型紙形態の分類を行なったところ、型紙寸法と文様から、本研究期間中に調査した型紙の98%が手拭を染色するために用いられた型紙であり、主に北海道の顧客から発注されたものであることが示された。型紙文様の電子保存には、パソコン制御の非接触式イメージスキャナを用いた。これらの電子保存型紙文様の一部を『仙台型染資料集XIII』としてまとめた。工芸染色技術の発展へと繋げるために、型紙文様の電子保存データを活用した型紙作成方法についても検討しており、レーザー加工機と小型カッティングプロッターのそれぞれの適正加工条件について検討し、代表的な型紙文様の一部を作成することができた。さらに、新たな常盤紺形染の調査の一環として、東北生活文化大学所蔵の藍型染め古布についての調査を行ったところ、常盤紺形染の特徴を有するものが19組見られた。他地域で生産されたものである可能性も考慮しながら、他地域で収集された藍型染め古布との比較調査を進めることが今後の課題である。一方で、公的機関所蔵の小紋染型紙745枚の二次資料による調査(文様の彫幅・送り計測、組型の抽出等)と型紙文様の電子保存を行うこともできた。また、仙台地方の伝統染色を題材とした教育プログラムについても検討し、大学の授業や、高校生対象の授業に展開することができた。今後も前年度に引き続き、常盤紺型および注染型紙の調査と電子保存を行う。すなわち、資料状態の記録と計測の他、注染型紙を4分割スキャンすることで型紙形態を電子的に保存し、汎用フォトレタッチソフトを用いて4分割画像の合成と電子的補修を試みる。
ＣｈＩＰ－ｏｎ－ｃｈｉｐ法による再生初期遺伝子群の同定とラット視神経再生への応用

中枢神経の再生可能なサカナの視神経切断モデルを使用し、再生初期に発現が上昇する遺伝子を同定し、細胞生存や神経突起伸長作用を確認し、これらを神経再生初期分子とした。この候補物質としてHSP70,レチノール結合蛋白プルプリンを同定した。これらに引き続いてレチノイン酸シグナル分子の発現が上昇した。これら再生分子を成熟ラット網膜に導入することにより、ラット視神経がin vivoで再生できた。ヒトと異なり魚類の視神経は損傷を受けても再生する。この再生のためには損傷後様々な遺伝子が網膜、特に神経節細胞で発現することが予想される。我々はこの遺伝子群を再生関連遺伝子群(RAGs)と呼ぶ。本研究ではゼブラフィッシュの視神経再生過程において最初期に発現上昇する遺伝子を見つけ、その機能や局在について研究し、ひいては再生が不可能なヒトの視神経再生に寄与すべく実験を計画した。その結果、Heat-shock protein70 (Hsp70)遺伝子が損傷後30分以内に網膜で発現上昇し、24時間でピーク(約2.5倍)となり72時間で対照群(コントロール)値に戻ることを見つけた。またこの局在はHsp70のmRNA、蛋白共に網膜神経節細胞であることが判明した。Hsp70の転写因子であるHsf-1遺伝子も損傷後2030分以内に有意に発現が上昇し、24時間でピーク(約2.6倍)となり、72時間でコントロール値に復していた。また、そのリン酸化抗体phospho-Hsf1蛋白の局在は神経節細胞の核内であった。次にHsp70の特異的阻害剤の眼球内投与により、Hsp70のmRNAおよび蛋白の発現が完全に抑制された。それに伴い細胞生存(Bc1-2の発現)、神経再生(GAP43の発現)が有意に抑制され、或いは遅延した。以上の結果より、Hsp70が神経再生過程の開始にあたり神経細胞の生存に重要な役割を果たすことが証明された。一方、ラットの視神経を損傷し、網膜でのHsp70の発現を調べたところ、損傷後24時間以内での有意な発現上昇が見られなかった。この魚とラットの違いを現在検討中である。これまでに熱ショック蛋白70(HSP70)の発現が、視神経損傷後速やかに、ゼブラフィッシュ網膜神経節細胞(RGCs)で上昇することを見つけた。その役割は、HSP70インヒビターの使用により、細胞死の抑制に効いていることを明らかにした。このことは、視神経再生が起きるためには、まず第一番に神経細胞の生存が維持されねばならないことを意味する。次いで、軸索再生の分子が動くことが予想される。そこで今年度は、視神経再生に重要なもう一つの要素、軸索伸長に関する研究を施行した。その結果、ゼブラフィッシュでは、視神経損傷後速やかにピストンのアセチル化(AcH3)がRGCsで誘導されることを、免疫発色法で発見した。一方、再生できない哺乳類では、AcH3が損傷後速やかにRGCsから減少することを見い出した。つまり、魚では視神経損傷後、何らかの理由で速やかにヒストン脱アセチル化酵素-2(HDAC-2)の抑制が起こり、AcH3が誘導され、必要な遺伝子の発現がエピジェネティックに誘導されることが明らかとなった。一方、再生のできない哺乳類では、視神経損傷後速やかにAcH3の減少が起こり、必要な再生分子の誘導ができないものと思われる。しかし、哺乳類においても、HDAC-2阻害剤でHDAC-2の活性を抑制することにより、AcH3が誘導され、軸索再生に必要な遺伝子、例えばレチノイン酸レセプターβ(RARβ)や軸索伸長マーカー分子、成長関連蛋白43(GAP43)の発現を誘導することを見つけた。現在、哺乳類網膜との比較を行ないながら、このエピジェネティックなクロマチンのリモデリング機構を精査し、新たな神経再生の糸口を探索している所である。魚の視神経は哺乳類と異なり、損傷を受けても再生できる。そこで、この魚の視神経再生初期に働く遺伝子・分子が同定できれば、将来、再生できないヒトを含めた哺乳類での再生への応用も可能と考え本研究課題に着手した。前年度までにHSP70の上昇やヒストンのアセチル化(AcH)の促進を見つけ、再生関連分子の誘導や、生存シグナルの増強について、明らかにしてきた。本年度は、実際に軸索再生を起こす分子について検索し、レチノイン酸シグナルの活性化に伴う神経突起の伸展について、研究を行った。レチノイン酸は、神経発生や再生に必要な各種遺伝子をプロモートすることが予想される。そこでNO誘導剤であるゲニピンで処理したところ、ヒストン脱アセチル化酵素-2(HDAC-2)のS-ニトロシル化が起こり、クロマチンのリモデリングを起こし、その結果、レチノイン酸レセプターRARβが有意に、成熟ラット網膜神経節細胞で誘導された。このRARβの誘導により、著しい神経突起の伸展をin vitro, in vivo両系で観察できた。

更に、S-ニトロシル化阻害剤,NOトラップ剤,RARβインヒビター,或いはRARβ特異的siRNAにより、この神経突起の伸長は完全に抑制された。また、ラット幼若網膜を使った培養でも、RARβの発現と神経突起の伸長との間で強い相関があることが分かった。以上の結果から、成熟ラット網膜には通常RARβの発現は見られないが、ゲニピン等により、HDAC-2を抑制し、ヒストンのアセチル化をRGCsで誘導できれば、再び発生時の様にRARβが出現し、視神経の再生も可能になると強く示唆された。上記の観察は、ゲニピン以外にも、一般的なHDACインヒビターとして知られているトリコスタチンAやバルプロ酸によっても見られ、我々の仮説が普遍化されることが分かった。視神経再生の可能な魚類のRGCsでの遺伝子発現をヒントに、視神経再生の不可能な哺乳類での再生を試みるというのが本実験の最終目標である。1年目の研究でHSP70が早期に発現誘導され、神経生存に大きく関わることを見い出し、本年度においては、魚では視神経損傷後速やかにヒストン脱アセチル化酵素-2(HDAC2)の抑制が起こり、ヒストンがアセチル化し、一方哺乳類では、アセチル化ピストンが損傷後速やかに減少することを見い出した。ピストンのアセチル化を切り口とした新しいエピジェネティックな研究が期待できる。25年度が最終年度であるため、記入しない。魚の中枢神経は哺乳類と異なり、損傷を受けても再生が可能である。このことは、魚では視神経損傷により、エピジェネティックにクロマチンの構造が変化し、種々の神経再生分子の転写が活性化することを意味する。HSP70分子の誘導を転機として、クロマチンのリモデリング機構による神経再生機構研究を想いついた。今後は特に軸索伸長作用を持つレチノイン酸レセプターβ(RARβ)の誘導を試み、ラットの視神経の再生をめざす。その際Nogoレセプターの阻害も同時に行い、目に見える形で視神経再生を実現したい。
環境デザインを基軸とした新たな都市再生に関する計画・デザイン論的研究

3年目は,次の3つのテーマで研究を進める予定であった。(1)現在スマートシティ構想を掲げている神戸市をとりあげ,風・温熱環境を指標として環境シミュレーションを行った成果を具体的な政策やデザインへの展開可能性を模索する。(2)地方都市である坂出市をとりあげ,日照条件等を指標として環境シミュレーションを行った成果を具体的な政策やデザインへの展開可能性を模索する。(3)海外先進事例(ドイツ等)におけるオープンスペースを対象として,基礎調査(オープンスペースの実態把握)の成果を踏まえ,都市政策(都市および地方都市)への適応可能性を模索する。しかし,申請者の一身上の都合により2017年1月7月まで休職したこと,10月以降同理由により退職したことで本研究目的を達成することができない状況であった。次の2つのテーマで研究を進めた。(1)国内の事例として,現在スマートシティ構想を掲げている神戸市をとりあげ,風・温熱環境を指標として環境シミュレーションを行った。具体的には,兵庫運河地区を対象として,4つのモデルを設定し,シミュレーションを行った。その結果,風環境解析については,1)兵庫運河があることで,風の道が形成されること,2)工場や倉庫などの立替え想定敷地を中層マンション化することで,線的な櫛状の風通しが発生し,兵庫運河の既存の風の道が促進されること,3)工場や倉庫などの建替想定敷地を緑化(樹林化)することで,面的な防風効果が発揮され,兵庫運河などの既存の風の道がより促進されること,が解明された。また,熱環境解析については,1)兵庫運河があることで,ある一定の冷却効果がみられること,2)建物緑化は近接範囲での点的な冷却作用があり,都市緑地は街区全体での面的な冷却作用が期待できること,が解明された。本研究成果は,季刊都市政策において報告書としてまとめられている。(2)温熱環境等を指標とした都市政策が既に展開されている海外先進事例として,ドイツを対象に,風の道計画を取り入れたシュツットガルト21および工場跡地をエコロジカルに再生したエムシャー・ランドシャフトパークの2つのプロジェクトに着目し,現地調査を行った。その結果,1)両者はエコロジーをツールとして用いながら都市再生を行っていること,2)両者の都市再生に対する合意形成のあり方が異なっていること,が解明された。本研究成果は,芸術工学において報告書としてまとめられている。以上2点を踏まえたうえで,計画論からみた環境デザイン政策の実態解明及び比較検討を行った。当初の計画であった1)国内の事例として,現在スマートシティ構想を掲げている神戸市をとりあげ,風・温熱環境を指標として環境シミュレーションを行うこと,2)風・温熱環境を指標とした都市政策が既に展開されている海外先進事例を対象として,その社会背景,計画意図,計画実態の調査を行う,といった内容は計画通りおおむね順調に進展している。これらの研究成果は,季刊都市政策,芸術工学において報告されている。(1)国内の事例として,地方都市である香川県をとりあげ,日照,水路,土壌等を指標として環境シミュレーションを行った。その結果,坂出市を対象として,金時みかん(215セル,17.8%),金時芋(118セル,9.8%),金時人参(55セル,4.0%)は土壌によって,水田(380セル,31.5%)は水路によって適正地が規定されていることが解明された。また,ソーラーシェアリング手法の可能性を日照条件(秋の9:0015:00に日影がないエリア)によって算出した結果,362セル,30.3%が適正地として抽出され,食糧・エネルギー自給率を向上させることが可能であることが示唆された。本研究成果は,建築学会梗概集2016においてまとめられている。(2)風・温熱環境等を指標とした都市政策が既に行われている海外先進事例を対象として,オープンスペースに関する基礎調査および研究協力体制の確立を行った。具体的には,ドイツ(ドルトムント,ハノーファー)および兵庫県(神戸市)を対象として,オープンスペース(O.S.)の実態把握とその類型化を行った。O.S.の実態把握の為,両都市における都市計画図,空中写真の収集,現地調査等の基礎調査を行った。本研究成果は,神戸芸術工科大学紀要「芸術工学」2017において報告書としてまとめられる予定である。以上2点を踏まえたうえで,計画論からみた環境デザイン事例の実態解明および比較検討を行った。当初の計画であった1)地方都市である坂出市を国内先進事例として,日照条件等を指標として環境シミュレーションを行い,その結果をもとに今後の地方都市の土地利用政策の方法論について検討する,2)風・温熱環境等を指標とした都市政策が既に行われている海外先進事例を対象として,オープンスペースに関する基礎調査および研究協力体制の確立を行う,といった内容は,申請者が体調不良で長期休職していたため計画当初よりやや遅れている。

しかし,申請者の一身上の都合により2017年1月7月まで休職したこと,10月以降同理由により退職したことで本研究目的を達成することができない状況であった。2年目は,次の2つのテーマで研究を進める。1国内の事例として,地方都市である坂出市を対象として,日照条件等を指標として環境シミュレーションを行い,その結果をもとに,今後の地方都市の土地利用政策のあり方について検討する。2風・温熱環境等を指標とした都市政策が既に行われている海外先進事例(ドイツを予定)を対象として,その社会背景,計画意図,計画実態の調査を行う。以上2点を踏まえたうえで,計画論からみた環境デザイン事例の実態解明および比較検討を行うこととする。3年目は,次の3つのテーマで研究を進める。(1)現在スマートシティ構想を掲げている神戸市をとりあげ,風・温熱環境を指標として環境シミュレーションを行った成果を具体的な政策やデザインへの展開可能性を模索する。(2)地方都市である坂出市をとりあげ,日照条件等を指標として環境シミュレーションを行った成果を具体的な政策やデザインへの展開可能性を模索する。(3)海外先進事例(ドイツ等)におけるオープンスペースを対象として,基礎調査(オープンスペースの実態把握)の成果を踏まえ,都市政策(都市および地方都市)への適応可能性を模索する。海外先進事例調査のための資料収集を行う予定であったが,十分な資料が集まらなかったため次年度繰越となった。1.調査・研究費:(1)海外先進事例調査のための出張費予算計画をたてていたが,別途学内共同研究費からの支出が決定したため科研費からの予算執行を行わなかった。(2)調査・研究旅費(東京・兵庫等)の予算計画をたてていたが,体調不良のため参加を見合わせたため科研費からの予算執行を行わなかった。2.設備備品費:(1)ノートパソコン・書類作成ソフト購入のための予算計画をたてていたが,前年度学内研究費からの支出が決定したため科研費からの予算執行を行わなかった。(2)画像処理ソフト購入のための予算計画をたてていたが,学内共通ライセンス使用が可能となったため科研費からの予算執行を行わなかった。(3)統計解析ソフト購入のための予算計画をたてていたが,前年度科研費から支出したため今年度の予算執行を行わなかった。海外先進事例調査のための資料収集に使用する予定である。研究を遂行する上での一通りの設備備品は揃ったため,研究協力者を増員するため,設備備品費に使用する予定である。
活性イオウ分子産生酵素の翻訳後修飾とその役割

シスタチオニンβ-シンターゼ(CBS)およびシスタチオニンγ-リアーゼ(CSE)は活性イオウ分子産生酵素として注目されているがそれ自身の翻訳後修飾に着目した研究はほぼない。本研究ではその翻訳後修飾に着目し研究を行った。CBSのあるセリン残基の置換体を作製し活性を測定したところその活性は認められなかった。よってこの残基のリン酸化修飾がCBS活性を制御するものであると考えられる。CSEはS-ニトリシル化修飾について検討したところ、NOドナー依存的な活性制御を確認した。加えてS-ポリチオール化修飾による制御を確認した。これらはCBS、CSEの翻訳後修飾による制御の可能性を示した新たな知見である。システインパースルフィドなどの活性イオウ分子は、生体内で様々な働きをすることが近年大きな話題となっている。シスタチオニンβ-シンターゼ(CBS)およびシスタチオニンγ-リアーゼ(CSE)は活性イオウ分子を産生する酵素として注目されているが、CBSおよびCSE自身の翻訳後修飾に着目した研究はほとんど行われていない。よって本研究はCBS、CSEの翻訳後修飾に着目し研究を行っている。CBSについて、平成27年度は、その活性に直接影響を与えるリン酸化修飾の発見を目指し研究を行った。CBSのある1つのセリン残基のアラニン置換体、およびアスパラギン酸置換体を作製しその活性を測定したところ、いずれもその活性は認められなかった。よってこのセリン残基はCBS活性に大きく影響を及ぼすことが判明し、このセリン残基のリン酸化修飾こそがCBS活性に直結するリン酸化修飾であると考えられる。したがって、CBSセリン残基リン酸化部位特異的抗体の作製を行った。また、このセリン残基を含むCBSペプチドを基質として、質量分析を用いたリン酸化修飾の検出を行った。CSEについて、平成27年度は、CSEのすべてのシステイン残基のそれぞれのバリン置換体のうち、活性が認められない2つの置換体に着目し検討を行った。2つの置換体について硫化水素検出プローブおよび活性イオウ分子検出プローブを用いその反応性を検討したところ、大変興味深いことに、1つのシステイン残基バリン置換体は両プローブで活性が認められないのに対し、もう一方の置換体は硫化水素検出プローブでは活性が認められないものの、活性イオウ分子検出プローブでは活性を確認することができるという知見が得られた。交付申請書等では全体の計画をステージ1からステージ3に分類した。すなわち、ステージ1「翻訳後修飾の検出」、ステージ2「翻訳後修飾の部位の同定」、ステージ3「翻訳後修飾の意義の解明」の3つである。CBSについてはその活性に重要なセリン残基を同定し、このセリン残基に着目し研究を行うとともに、このセリン残基リン酸化部位特異的抗体の作製を行った。この抗体は、今後本研究を遂行するにあたり、非常に有益なものである。CSEについては我々が作製した全てのシステイン残基バリン置換体の中で、その活性が認められない2つの置換体について検討を行った。硫化水素検出プローブおよび活性イオウ分子検出プローブそれぞれを用いて検出を試みた結果、1つのシステイン残基バリン置換体は両プローブで活性が認められないのに対し、もう一方の置換体は硫化水素検出プローブでは活性が認められないものの、活性イオウ分子検出プローブでは活性を確認できるということが判明した。この原因はまだ不明であるが、CSEの構造変化による、CSEの基質親和性もしくは基質選択性による、生成された活性イオウ分子によるCSEの自己修飾が関与する、等が考えられ、大変興味深い結果である。以上のことより、おおむね順調に進展していると言える。活性イオウ分子は生体内に豊富に存在し、タンパク質をS-ポリチオール化修飾することでその活性を制御するなど様々な働きをもつ。シスタチオニンβ-シンターゼ(CBS)及びシスタチオニンγ-リアーゼ(CSE)は活性イオウ分子産生酵素として注目されているが、それ自身の翻訳後修飾に着目した研究はほぼない。よってCBS、CSEの翻訳後修飾に着目し研究を行った。CBSはその活性に影響を与えるリン酸化修飾の探索を行った。CBSのあるセリン残基のアラニン及びアスパラギン酸置換体を作製しその活性を測定したところ活性は認められなかった。よってこのセリン残基はCBS活性に大きく影響を及ぼすことが判明し、この残基のリン酸化修飾がCBS活性を制御するものであると考えられる。よってCBSリン酸化部位特異的抗体の作製を行い、様々な刺激を加えた細胞をサンプルとし抗体の反応性を利用してCBSリン酸化修飾シグナルを探索している。CSEは作成した全てのシステイン残基のバリン置換体のうち2つに着目し検討を行った。これらの置換体について硫化水素検出プローブ及び活性イオウ分子検出プローブを用い検討したところ、1つの置換体は両プローブで活性が認められないのに対し、一方の置換体は硫化水素検出プローブでは活性が認められないが活性イオウ分子検出プローブでは活性が認められた。CSEの翻訳後修飾では、S-ニトリシル化修飾について検討したところ、NOドナー依存的な活性制御を確認した。S-ポリチオール化修飾について、プルダウン法により活性イオウ分子ドナー依存的な活性制御を確認した。合わせてCBS、CSEの恒常発現細胞を樹立しその影響について検討を行っている。これらの結果はCBS、CSEの翻訳後修飾による制御の可能性を具体的に示した新たな知見である。また解析に有能な方法及びツールを開発しており今後の展開が期待されるものである。シスタチオニン

β-シンターゼ(CBS)およびシスタチオニンγ-リアーゼ(CSE)は活性イオウ分子産生酵素として注目されているがそれ自身の翻訳後修飾に着目した研究はほぼない。本研究ではその翻訳後修飾に着目し研究を行った。CBSのあるセリン残基の置換体を作製し活性を測定したところその活性は認められなかった。よってこの残基のリン酸化修飾がCBS活性を制御するものであると考えられる。CSEはS-ニトリシル化修飾について検討したところ、NOドナー依存的な活性制御を確認した。加えてS-ポリチオール化修飾による制御を確認した。これらはCBS、CSEの翻訳後修飾による制御の可能性を示した新たな知見である。平成28年度はステージ1「翻訳後修飾の検出」、ステージ2「翻訳後修飾の部位の同定」の継続実施から、ステージ3「翻訳後修飾の意義の解明」の実施に向けて研究を遂行する。CBSについては、平成27年度に明らかにした、活性に直結するセリン残基に起こるリン酸化修飾に着目し研究を行う。すなわち、このセリン残基をリン酸化修飾するリン酸化酵素の同定、およびこのリン酸化修飾が起こるシグナルの解明である。また平成27年度に作製したCBSセリン残基リン酸化部位特異的抗体を用いた免疫染色を行うことで、その体内動態や細胞内局在を明らかにしたいと考えている。加えて著しい酸化ストレスを生じる一過性脳虚血モデルなどの病態組織の免疫染色を行うことで、CBSリン酸化修飾の生体内での働きの解明を行う予定である。CSEについては、その活性が認められない2つの置換体について引き続き検討を行う。この活性喪失およびプローブ反応性の違いを明らかにすること、加えて我々が作製した全てのCSEシステイン残基バリン置換体の解析を引き続き行うことで、CSEの翻訳後修飾による制御の一端が解明できると考えている。医歯薬学
トマト日持ち性関連遺伝子の転写制御機構の解明

トマト果実の日持ち性は品質向上に寄与する重要な特性である。生産地域によって人口分布は偏るため、貿易による食料の地域間移動が不可欠である。日持ちが良い農産物の作出は、収穫後の流通・消費の各段階において損失を著しく減少させる。トマト果実の成熟にはエチレン生合成遺伝子群が深く関わることが知られているが、本研究では、トマト果実の日持ち性向上に関与することが示唆された遺伝子であるNOR機能解析を通じてエチレン生合成の転写制御機構の解明に貢献でき、トマトの重要農業形質の一つである日持ち性を向上させることで、将来的に食糧の安定的かつ持続的な確保につながると確信している。本研究では、申請者はトマトの重要形質である果実の日持ち性の遺伝子制御機構を解明し、ポストバーベスト管理に適した品種の開発するによって安定した食料供給を目指す。エチレン生合成関連遺伝子は日持ち性にかかわる重要な因子として知られ、果実成熟が抑制されたトマト変異系統NORの遺伝子機能を解析し、miRNAによるNOR転写後調節機構の有無を検証する。更に、先行研究においてトマトのモデル品種マイクロトムの大規模変異集団から選抜されたNOR変異系統を用い、NORと他のエチレン生合成関連遺伝子との交互作用について解析する。本年度は、以下の結果が得られた。果実成熟制御因子NORの遺伝子発現解析を行った。トマトデル品種マイクロトム果実の各成長段階(花、未熟果実、緑熟期、催色期、桃熟期、完熟期)のサンプルを用いてQ-PCRした結果NORの発現レベルは催色期に最大値に達することが分かった。更に、野生品種におけるエチレン合成量、色、果肉かたさの変化を測定した。更に、他のエチレン生合成関連遺伝子への影響を調べるためにTILLING技術用いて選抜されたNOR変異系統の成長は顕著に遅れ、赤熟にならない変異系統を用いて解析する。そのためにNOR変異体の遺伝子ホモ化及び世代促進を進めた。miRNAによるNORの転写後制御機構の有無について探索した。本年度はIn silicoでのmiRNA候補及び、NOR領域における標的部位の推定を行た。公共データベースのsmall RNAリードを解析した結果、想定した配列を持つsiRNAのリード数は少なく、NORの転写領域にマッピングされなかったが、プロモーター領域にsiRNAと交互作用する可能性がある。NORの形質転換体の作成による遺伝子機能解析を行った。35Sプロモーターで誘導するNOR過剰発現系統及び、CRESーT法とRNAi法による発現抑制形質転換体の作成するためのベクターを構築できた。トマト果実の成熟にはエチレン生合成遺伝子群が深く関わることが知られているが、これらの発現調節を行う転写因子の機能解析は明らかにされていない点が多い。そこで本研究では、トマト果実の日持ち性向上に関与することが示唆された遺伝子であるNORとその下流遺伝子の転写調節機構を解明するため、以下の研究を行った。先行研究から、トマト日持ち性に関与する転写因子NORは新規のマイクロRNA (miRNA)による転写調節を受けることが示唆された。新規miRNAによるNORの転写後制御の検証を試みた。公共データベースのsmall RNAリードを用いてin slicoスクリーニング行ったが、NORの転写領域に相同性高いmiRNAリードは僅かしかマッピングされなかった。Modified5'RACE法を用いてmiRNAによるNOR mRNA切断を検証した結果、切断が見られなかった。昨年に引き続き形質転換体の作成と世代促進を行う。35Sプロモーターで誘導するNOR過剰発現系統が作成でき、T2世代まで進むことができた。RNAi法による発現抑制形質転換体が作成できた。T0世代で日持ち性が向上すると確認でき、現在世代促進中。CRES-T法による発現抑制形質転換体の作製を試みたが、感染効率が低く、RNAi系統と共に現在再作中。本年度は3つの子課題に取り組み、それぞれ以下の進捗状況であったことから、上記の判断を行った。1.日持ち性制御遺伝子NORの発現解析:野生株におけるNORの発現解析し、発現パタンを確認できた。他のエチレン生合成関連遺伝子の情報を集め、nor欠損変異体を用いた遺伝子発現解析を準備した。2.NORに制御するmiRNA候補の探索:In silicoでのmiRNA候補及び、NOR領域における標的部位の推定を行った。想定した配列を持つmiRNA稀であり、予想したターゲットサイトに相補的な配列はあまりかった。しかし、新たにNORのプロモーター領域にsiRNAと交互作用する可能性がある4か所発見した。3.NORの形質転換体の作成:形質転換体作成に必要なベクターが構築できた。

アグロバクテリウムに感染による形質転換体作成は予定よりもやや遅れている。27年度が最終年度であるため、記入しない。分子遺伝学トマト果実の日持ち性を制御する転写因子NORの発現解析をし続け、特にnor欠損変異体を用いて他の遺伝子への発現制御関係を明らかにする。また、トマト果実内のNOR発現に対する局在性解析を行い、受粉効率や、角質形成への影響について検討し、NORの追熟過程における機能を明らかにする。今年度中にNORノックダウン変異系統を用いて遺伝子発現解析を行う。先行研究にトマトのモデル品種マイクロトムのTILLING技術を用いたNOR変異系統を選抜した結果、終止コドンを生じ、赤熟にならない系統を発見した。この変異系統を利用してエチレン生合成関連遺伝子の発現パタンを確認し、野生株との違いを検証する。miRNAによるNOR遺伝子の転写後制御の有無を引き続き検討する。前年度にin slicoスクリーニング行ったが、NORの転写領域にマッピングず、候補miRNA配列と相同性高いリードは僅かしかなかった。今年度中にModified 5'RACE法を用いてmiRNAによるNOR mRNA切断を検証する。更に、野生株に乾燥ストレスを与えてNOR mRNA切断の有無を検証する。二年間のデータ解析から総合的にmiRNAの関与を判断する。NORの形質転換体の作成による遺伝子機能解析を行う。今年度中に引き続き形質転換体の作成と世代促進を行う。CRES-T法とRNAi法による発現抑制形質転換体の表現型とTILLING法で選抜された変異系統の表現型を比べることでNORの機能を明らかにする。特に、NOR発現量が比較的に高い果実の追熟期における機能を検討する。
次世代電力変換回路に適したSAWフィルタを用いたゲート駆動回路の提案

次世代電力変換回路に適した,表面弾性波(SAW)を用いたゲート駆動回路を提案した.本提案法は,SAWフィルタを用いることで高温動作と信号多重化が可能となるため,次世代ワイドギャップ半導体素子の高温動作利用と,信号多重化によるマルチレベルインバータへの適用できる.得られた研究成果は次の通りである.まず,提案システム用の送・受信器の設計を行った.次に,提案法に適したSAWフィルタを設計・作製し,低い遅延時間と耐電圧特性との両立を図れた.さらに,作製した4chのSAWフィルタを用いてゲート信号伝送を行い,単相3レベルインバータの動作を確認した.以上の結果より,本提案法の有効性を実証した.本研究の目的は,次世代の電力変換回路として期待されているマルチレベルインバータを対象として,パワーデバイス多接続時における高信頼動作を実現させるための新たなゲート駆動回路の提案である.本研究では表面弾性波(SAW)デバイスを用いることで,マルチレベルインバータのゲート駆動回路に必要となる(1)電気的絶縁,(2)多チャンネル接続を可能とする.本研究は新規提案であるため,まず提案法の実現可能性を図るべく,基礎的な特性把握・設計手法についての検討を行う.H26年度においては,提案法の実現可能性を実証するため,1送信機構成の確立,2SAWデバイスの作製,3インバータの試作に関しての研究を行った.まず,1の送信機については,Direct Digital Synthesizer (DDS)を用いることで多チャンネル化および1GHz以上の周波数まで対応可能なシステムが構築できることを示し,実際に動作を確認できた.次に,2のSAWデバイスを作製した.通常のSAWデバイスよりも伝搬路の長いデバイスを作製し,伝送特性や伝搬遅延時間などに関する検討を行った.上記の結果を踏まえ,実際に3のインバータ装置への組み込みを行い,動作することを確認し,提案法がパワーデバイスの制御に用いることができることを明らかにした.H27年度以降は,SAWデバイスの最適設計および作製,さらなる多チャンネル化などについて研究を行う予定である.本研究の目的は,次世代電力変換回路として期待されるマルチレベルインバータを対象として,パワーデバイスの多接続時における高信頼性動作および配線数の大幅低減を実現させるための新たなゲート駆動回路の提案である.本研究では弾性表面波(SAW)デバイスを用いることで,マルチレベルインバータのゲート駆動回路に必要となる(1)電気的絶縁,(2)多チャンネル接続を可能とする.本研究は新規提案であるため,まず提案法の実現可能性を図るべく,基礎的な特性把握および設計手法についての検討を行う.H27年度においては,H26年度で得られた成果をもとにし,1SAWデバイスの最適設計および作製,2インバータ回路試作,3電気的絶縁性能評価に関しての研究を行った.まず1のSAWデバイス設計に関しては,伝播遅延時間の低減および均一化,エネルギー損失の低減を図るため,本研究に適したSAWデバイスの櫛型電極構造を検討し,実際に試作を行った.一つの圧電基板上に12チャネル分の通過周波数が異なるフィルタを設計し,伝播遅延時間に影響する伝搬路長は一定とした.2に関して実際に4チャネルのインバータ回路を作製し,動作させた結果,正常動作の確認と伝搬遅延時間の目標値を満たす事が示された.次に3の電気的絶縁特性に関して調査実験を行った.SAWデバイスの入出力間に直流電圧を印加する実験を行った結果,空気中での放電により絶縁破壊が生じることを確認でき,空気の絶縁破壊電解強度を超えなければ使用可能であろうことを示した.H28年度は,インバータのさらなる多チャンネル化に関する研究を行う予定である.H27年度の目標だった課題II(SAWフィルタの最適設計)および課題IV(インバータ回路の試作)に関し,研究実績の概要に記載した通り概ね予定通りに研究が進んだため,順調に進展していると判断した.本研究の目的は,次世代電力変換回路として期待されるマルチレベルインバータへの適応を目指し,スイッチングデバイスの多接続時における高信頼性動作および配線数低減を実現するための新たなゲート駆動回路の提案である.本研究では弾性表面波(SAW)デバイスを用いる事で,マルチレベルインバータのゲート駆動回路に求められる電気的絶縁と多チャンネル接続を可能とする.H28年度は,H2627年度で得られた研究成果を基に,1専用設計したSAWフィルタ,2インバータ回路の試作,に関しての研究を行った.まず,1の専用設計したSAWフィルタに関し,リチウムナイオベート基板上に作製したSAWフィルタの各種特性を詳細に測定・評価した.絶縁破壊電圧は,民生用途を念頭に安全係数2を掛けた600Vを想定し,SAWフィルタの入出力間距離を0.2mmと設計したが,絶縁破壊試験により想定の2倍近い1,100V以上の絶縁性能を得た.したがって,SAWフィルタをパッケージングする際の封止条件を最適化することで,入出力間距離をさらに低減し,伝搬遅延時間を半減させる余地のある事が明らかになった.次に,2のインバータ回路の試作実験を行った.目標としているマルチレベルインバータへの適用を考慮し,4チャンネルのスイッチングデバイスが必要とされる単相3レベルインバータの動作検証を行った.上述した専用設計の周波数帯域別SAWフィルタを4つ用い,4チャンネル分のゲート駆動波形をRF信号の周波数多重化により同軸線1本で伝送した.実験結果より,単相3レベルインバータは正常に動作し,伝搬遅延時間も当初の想定を大きく下回わる事が示された.立ち上がり・下がり合計での伝搬遅延時間はおよそ1us程度で収まっており,本提案法の有用性と多チャンネル化への実現可能性を示す事が出来た.

次世代電力変換回路に適した,表面弾性波(SAW)を用いたゲート駆動回路を提案した.本提案法は,SAWフィルタを用いることで高温動作と信号多重化が可能となるため,次世代ワイドギャップ半導体素子の高温動作利用と,信号多重化によるマルチレベルインバータへの適用できる.得られた研究成果は次の通りである.まず,提案システム用の送・受信器の設計を行った.次に,提案法に適したSAWフィルタを設計・作製し,低い遅延時間と耐電圧特性との両立を図れた.さらに,作製した4chのSAWフィルタを用いてゲート信号伝送を行い,単相3レベルインバータの動作を確認した.以上の結果より,本提案法の有効性を実証した.H26年度の目標であった,課題I(送信機構成の確立)および課題II(SAWフィルタの最適設計)に関し,概ね予定通りに研究が進んでいる.加えて,平成27年度以降に予定していた課題IV(インバータ回路の試作)に関しも前倒しして動作確認ができたことから,順調に進展していると判断した.当初予定しているH28年度以降の研究計画を基に研究を進めていく.引き続き課題III(受信・検波回路の構築)および課題IV(インバータ回路の試作)に関してさらに発展させた内容を目指して研究を行う予定である.精密周波数応用当初予定しているH27年度以降の研究計画を基に研究を進めていく.引き続き課題II(SAWフィルタの最適設計)に関して,またH27年度以降に予定していた,課題III(受信・検波回路の構築)および課題IV(インバータ回路の試作)に関してもさらに発展させた内容を目指して研究を行う計画である.旅費の支出が予定よりも少なかったこと,また論文掲載(掲載決定1件)がH28年度の出版となったため.[課題I]送信機構成の確立に関して,当初購入予定だったD/A変換ボードを,より安価な方法で対応できたため.また,[課題II] SAWフィルタの最適設計に関して,SAWフィルタを設計・作製するために必要となる費用をH27年度へ繰り越す必要があったため.研究成果公表のための学会発表を活発に,加えて論文掲載料の支出を行う予定である.[課題I]送信機構成の確立に関して,さらなる多チャンネル化を図るためにDDS送信機,およびケーブル等の消耗品を購入する.(300千円)[課題II]SAWフィルタの最適設計に関して,SAWフィルタを設計・作製するために必要となる,マスクパターン作製,基板ウェハおよび実験消耗品を購入する.(401千円)
イネ葉鞘における塩排除能の分子機構の解明と耐塩性強化法の提案

平成29年度は、イネ葉鞘における塩排除機能を発現する組織を同定するため、イネ葉鞘における軸方向の塩分布を調べた。その結果、塩ストレス条件下でのナトリウムイオン、塩化物イオンの軸方向の分布は異なり、ナトリウムイオンは特に葉鞘の基部において多く蓄積し、塩化物イオンは葉鞘の中央部から先端部において多く蓄積した。カリウムイオンは塩化物イオンと同様であり、塩ストレスを与えると葉鞘の基部において顕著に減少した。一方、塩ストレスを与えていない場合は、ナトリウムイオンの蓄積はカリウムや塩化物イオンと同様であった。これらのことは、塩ストレス下ではナトリウムイオンの排除能を司るタンパク質またコード遺伝子は特に葉鞘基部において発現し、一方塩化物イオンの排除能を司るタンパク質またコード遺伝子は葉鞘中央部または先端部で発現することが示唆された。またナトリウムイオンと塩化物イオンではその排除能の発現部位が異なることが分かった。さらに、葉鞘と葉身の間で塩輸送量が減少することから、葉鞘と葉身間にあるラミナジョイントの関与が考えられた。しかしラミナジョイントが欠損したイネ突然変異体においても野生株と同程度の葉鞘における塩排除活性が見られたことから、ラミナジョイントにおける組織がナトリウムや塩化物イオンの逆方向への輸送を司るのではなく、葉鞘の基部や中央部、先端部においてこれらのイオンが道管からその周辺柔細胞に取り込まれることが示唆された。葉鞘における塩排除活性の品種間差に関与する一塩基多型(SNP)を同定するため、323品種のイネを用いたGWAS解析を行った。この結果、葉鞘におけるナトリウムイオンの排除量に関わるSNPを第5染色体上に、および塩化物イオンの排除量に関わるSNPを第3,4染色体以外の染色体上に見出した。昨年度の懸念であった、GWAS解析における表現型の解析について、数千というサンプルがあったたが、効率的な測定方法を開発することによって、予定していた表現型解析が予定通りに終了し、有意なSNPを得ることができた。また、葉鞘におけるナトリウムイオンと塩化物イオンの動態を追跡し、軸方向ではナトリウムイオンは葉鞘基部、塩化物イオンは基部以外が重要であり、放射方向ではいずれも中央部柔細胞が重要であることを明らかにすることができ、予定していたところまで終了することができた。これまでの研究において、葉鞘の軸方向、放射方向において、塩排除活性が高い組織を見出した。今後の研究の方針方策としてこれらの組織を用いて、ナトリウムイオンおよび塩化物イオンの輸送に関わるとされる輸送体タンパク質をコードする遺伝子群およびイオン輸送に関わる遺伝子群(プロトンポンプなど)の発現様式を調べる。平成28年度は、イネ葉鞘における塩分布の定性・定量分析法の確立をおこなった。耐塩性程度の対照的なイネ2品種(IR29およびFL478)を水耕栽培し、水耕液に塩化ナトリウムを添加することによって塩処理を施した。その後葉鞘および葉身の基部、中央部、および先端部を鋭利なカミソリによって切り出し、生のままエネルギー分散型X線分析装置を付属した低真空走査型電子顕微鏡を用いて断面の塩分布を観察した。複数の方法を検討した結果、カミソリで切片を作成後凍結組織切片作製用包埋剤を用いて試料台に載せ、液体窒素で凍結した後クールステージを搭載した低真空走査型電子顕微鏡で検鏡すると、試料の崩壊がやや遅くなることがわかった。また、葉鞘および葉身基部の中央に位置する中央部柔組織において特にK、Cl、Naが多く蓄積することが明らかになった。一方、葉鞘の周縁部における葉緑体の発達した光合成組織および柔組織にはこれらの塩の蓄積は小さかった。したがって周辺部維管束から蒸散流により運ばれた塩は、周縁部に運ばれるのではなく、導管から木部柔細胞に取り込まれ、その後木部柔細胞に隣接した中央部柔組織に輸送されることが予想された。また、GWASによる葉鞘による塩排除能の品種間差異をもたらす原因遺伝子の同定のため、323品種のイネを水耕栽培し、対照区および塩処理区を設けた。収穫後、地上部から齢の異なる葉を葉鞘および葉身に分けて、乾燥させた。研究実施計画当初は、平成28年度ではレーザーマイクロダイセクション法による葉鞘での塩の動態に関わる遺伝子群のトランスクリプトーム解析も行う予定をしていた。このため葉鞘から特に塩の隔離蓄積に関わる組織を選抜する必要があったが、この組織の選抜に計画以上の時間を有した。さらに、GWAS法のためのイネ多品種を用いた栽培は平成30年度実施予定であったが、こちらも計画以上の時間がかかることが分かったため、計画を繰り上げて平成28年度から計画を実施することとなった。以上の理由により、計画よりやや遅れているという区分を選択した。

またナトリウムイオンと塩化物イオンではその排除能の発現部位が異なることが分かった。さらに、葉鞘と葉身の間で塩輸送量が減少することから、葉鞘と葉身間にあるラミナジョイントの関与が考えられた。しかしラミナジョイントが欠損したイネ突然変異体においても野生株と同程度の葉鞘における塩排除活性が見られたことから、ラミナジョイントにおける組織がナトリウムや塩化物イオンの逆方向への輸送を司るのではなく、葉鞘の基部や中央部、先端部においてこれらのイオンが道管からその周辺柔細胞に取り込まれることが示唆された。葉鞘における塩排除活性の品種間差に関与する一塩基多型(SNP)を同定するため、323品種のイネを用いたGWAS解析を行った。この結果、葉鞘におけるナトリウムイオンの排除量に関わるSNPを第5染色体上に、および塩化物イオンの排除量に関わるSNPを第3,4染色体以外の染色体上に見出した。昨年度の懸念であった、GWAS解析における表現型の解析について、数千というサンプルがあったたが、効率的な測定方法を開発することによって、予定していた表現型解析が予定通りに終了し、有意なSNPを得ることができた。また、葉鞘におけるナトリウムイオンと塩化物イオンの動態を追跡し、軸方向ではナトリウムイオンは葉鞘基部、塩化物イオンは基部以外が重要であり、放射方向ではいずれも中央部柔細胞が重要であることを明らかにすることができ、予定していたところまで終了することができた。平成29年度では、前年度に引き続きGWASによる葉鞘による塩排除能の品種間差異をもたらす原因遺伝子の同定を行う。前年度収穫したイネ地上部の各部位における塩(Na,K,Cl)イオン濃度を測定するのだが、数千ー1万程度のサンプル数があるため、希釈の不要な抽出法や測定法など、方法の最適化を試みる。また前年度進捗の遅れた、塩の動態に関わる葉鞘内組織からのRNA抽出、およびトランスクリプトーム解析を進める予定である。RNAを抽出する際、葉鞘の中央部柔組織は非常に高濃度の糖、デンプン、塩を蓄積し、これらが抽出を阻害する可能性がある。そのため、SDS-フェノール法やグアニジンを用いた方法など、複数のRNA抽出法を試みる。これまでの研究において、葉鞘の軸方向、放射方向において、塩排除活性が高い組織を見出した。今後の研究の方針方策としてこれらの組織を用いて、ナトリウムイオンおよび塩化物イオンの輸送に関わるとされる輸送体タンパク質をコードする遺伝子群およびイオン輸送に関わる遺伝子群(プロトンポンプなど)の発現様式を調べる。前年度、イネ葉鞘による塩排除能に関するゲノムワイドアソシエーション解析を早期に開始する必要があることが判明し、研究計画に先んじてゲノムワイドアソシエーション解析用試料作製を行った。そのため前倒し支払い請求を行った。前年度にはゲノムワイドアソシエーション解析用植物の生育、塩の処理および試料の作製まで終了したが、それまでの工程はすでに保有していた試薬類で行うことができた。試料の解析を行うためには新しく試薬を購入することが必要であるが、そこまで実験が進まなかったため、次年度使用額が生じた。29年度はGWAS解析における表現型の解析を終了させることを第1目標とした。
モルモット卵形嚢支持細胞におけるカルシウム輸送経路と耳石形成

1.細胞内小器官の三次元構築の観察内耳器官培養系を用いた実験結果よりモルモット卵形嚢支持細胞内のカルシウム輸送経路を、小胞体、分泌顆粒、自家貧食胞、二次ライソゾームを経て細胞外へ放出されると推測している。透過型電子顕微鏡による観察では、小胞体と分泌顆粒、ゴルジ装置と分泌顆粒との関連を示唆する所見が得られている。現在、モルモット卵形嚢の凍結割断試料を作製し、走査型電子顕微鏡で支持細胞内の小器官の関連を三次元的に観察しているところである。2.インターフェロンによる蝸牛、前庭器障害モデルの作製有色モルモットを用い、インターフェロンによる蝸牛及び前庭器の障害モデルを作製している。インターフェロン投与前後で、平衡機能検査(オープンフィールド内での行動観察、急速立ち直り反射及び背地走行)及びABRによる聴力検査(クリック刺激及びトーンバースト刺激)を行ない、インターフェロン投与終了後に蝸牛及び前庭器を走査型電子顕微鏡で観察し、蝸牛内外有毛細胞の変化、卵形嚢及び半器官膨大部の感覚細胞の変化を検討した。インターフェロン投与量は個体当たり5万単位、10万単位、100万単位、1000万単位とし、コントロールとしてタチオン10mMを投与した。投与方法は腹腔内投与とし、投与期間は14日間連続投与した。今回の検討では、各系列間に有意な差がみられなかったため、投与量、投与方法及び投与期間について再検討を行ない、試料観察方法として、透過型電子顕微鏡による感覚細胞内小器官の変化の観察を検討している。
COX2、LOX、EGFRに対する分子標的剤感受性の解析と新規肺癌治療法の開発

本研究では、難治癌の代表である肺癌の治療成績向上を目指し、従来の化学療法剤とは機序を異にした新しいアプローチとして、アラキドン酸代謝のシグナル伝達経路の触媒酵素であるリポキシゲナーゼ(LOX)に対する選択的阻害剤の感受性及び従来の抗癌剤との併用効果について検討すると共に、最近臨床導入された上皮成長因子受容体(EGFR)阻害剤ゲフィチニブを用いた、より有効な肺癌治療法の開発を目的としてゲフィチニブ感受性を規定する因子について検討した。全リポキシゲナーゼ阻害剤であるNDGAによる肺癌細胞に対する増殖抑制効果は、肺癌細胞の増殖を濃度依存的に抑制し、一方12-リポキシゲナーゼ特異的阻害剤baicaleinも濃度依存的に増殖を抑制し抑制機序としてアポトーシスの関与が示唆された。また、肺癌の治療薬剤であるSN-38、アムルビシン、ビノレルビン、シスプラチン、エトポシドとの併用で、効果増強作用が観察された。一方、EGFR遺伝子変異とEGFR受容体阻害剤ゲフィチニブの治療効果との関連性について非小細胞肺癌症例30例を用いて検討した結果、EGFR遺伝子のexon19の欠失変異が7例、exon21のミスセンス変異が5例認められ、ゲフィチニブ感受性はEGFR遺伝子変異の認められた12例中10例で奏効が認められたが、EGFR遺伝子変異の認められない18例では1例(腺癌では12例中1例)にのみ奏効が認められ、EGFR遺伝子変異とゲフィチニフ感受性との間に強い関連性が示唆された。本研究より、肺癌に対してリポキシゲナーゼ阻害剤、EGFR阻害剤、COX2阻害剤を組み合わせ、また遺伝子変異情報も加味することにより、肺癌に対する有効な治療戦略が構築できるものと期待される。上皮成長因子受容体(EGFR)阻害剤であるゲフィチニブはその有用性が高く評価されているが、感受性を規定する因子については不明である。本年度は、ゲフィチニブの肺癌細胞に対する効果について、EGFRファミリーの発現レベルやras遺伝子変異との関連性について検討した。肺癌細胞株19株を用い、EGFRファミリーであるEGFR、Her2、Her3、Her4及び、EGFRの活性型であるリン酸化formの発現レベルについてはWestern blot法により、ゲフィチニブ感受性についてはMTTアッセイ法を用いて検討した。また、EGFRのシグナル伝達経路の下流に存在するK-ras遺伝子の変異についてはdirect sequence法にて検出し、ゲフィチニプ感受性との関連性について検討した。その結果、EGFRの発現レベルは、扁平上皮癌で一番高く、次いで腺癌と大細胞癌の順で、小細胞癌では発現が低くWestern blot法にては検出不可であった。ゲフィチニブの肺癌細胞に対する増殖抑制効果の検討では、ゲフィチニブにより用量依存性の増殖抑制効果が認められ、IC50値が臨床的到達可能濃度である1μM以下である細胞株は19株中5株であり、EGFR発現量とゲフィチニブ感受性の間に明らかな関連性は認められなかった。また、EGFRの活性型であるリン酸化formやHer2、Her3、Her4の発現とゲフィチニブ感受性との間にも有意な関連性は見出せなかった。肺癌の主要な組織型である腺癌、扁平上皮癌、大細胞癌、小細胞癌とゲフィチニブ感受性との関連性は、小細胞癌で感受性が低い傾向が認められたが、組織型とゲフィチニブ感受性の間に関連性は明らかではなかった。

K-ras遺伝子の変異は、腺癌細胞株6株中4株、大細胞癌細胞株3株中2株、扁平上皮癌細胞株6株中1株、小細胞癌細胞株4株では変異なしの結果が得られたが、K-ras変異とゲフィチニブ感受性との間にも明らかな、関連性は認められなかった。本研究の結果から、肺癌細胞のゲフィチニブに対する感受性に関して、EGFRファミリーであるEGFR、Her2、Her3、Her4の発現量やk-ras変異からはゲフィチニブ感受性の予測は困難との結果が得られ、今後、遺伝子解析によるゲフィチニブ感受性因子の同定が重要課題と考えられた。全リポキシゲナーゼ阻害剤(5-,12-,15-リポキシゲナーゼ阻害)であるNordihydroguaiaretic acid(NDGA)による肺癌細胞に対する増殖抑制効果は、検討に用いた肺癌細胞株6株すべての増殖を濃度依存的に抑制し、一方12-リポキシゲナーゼ特異的阻害剤baicaleinも濃度依存的に増殖を抑制し抑制機序としてアポトーシスの関与が示唆された。増殖抑制効果はNDGAと比べて低い傾向にあったが、肺癌の治療薬剤であるSN-38、アムルビシン、ビノレルビン、シスプラチン、エトポシドとの併用で、その効果増強作用が観察され、特にSN-38との併用ではIC50値を1/3以下に低下し、その併用における有用性が示唆された。リポキシゲナーゼ阻害剤の作用点は、副作用の多い抗癌剤とは異なり癌細胞で高発現しているリポキシゲナーゼを分子標的としており、今後急増が予想される高齢者肺癌の治療におけるクオリティーオブライフを念頭においた治療、従来の抗癌剤との併用療法等、新しい肺癌の治療への応用が期待された。一方、EGFR遺伝子変異とEGFR受容体阻害剤ゲフィチニブの治療効果との関連性について非小細胞肺がん症例30例を用いて検討した結果、EGFR遺伝子のexon19の欠失変異が7例、exon21のミスセンス変異が5例認められ、ゲフィチニブ感受性はEGFR遺伝子変異の認められた12例中10例で奏効が認められたが、EGFR遺伝子変異の認められない18例では1例(腺癌では12例中1例)にのみ奏効が認められ、EGFR遺伝子変異とゲフィチニブ感受性との間に強い関連性が示唆された。本研究より、肺癌に対してリポキシゲナーゼ阻害剤、EGFR阻害剤、COX-2阻害剤を組み合わせ、また遺伝子変異情報も加味することにより、肺癌に対する有効な治療戦略が構築できるものと期待された。