hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
１型糖尿病遺伝子解析による免疫制御機構の解明と発症予防への展開

1型糖尿病は膵β細胞が免疫機序により破壊される臓器特異的自己免疫疾患であり、免疫調節機能を明らかにすることが治療につながる。1型糖尿病における免疫調節機能を解明するため、新規1型糖尿病感受性遺伝子の同定を行うとともに、複数の異なる臓器における自己免疫疾患の関連について解析を行い、遺伝子間の関連を明らかにした。新規1型糖尿病感受性遺伝子Mafa遺伝子では、1型のノックアウトマウスを作成し解析をしたところ、Mafa遺伝子が糖尿病発症と膵島炎に関わる遺伝子であることが明らかとなった。自己免疫性甲状腺疾患(AITD)患者のHLAクラスII領域とクラスI領域のタイピングを行い、日本人において、両領域がAITD感受性に及ぼす影響を検討した。クラスII領域ではDRB1*08:03(14.4% vs 7.6%, Pc<0.01)とDRB1*08:03-DQB1*06:01(14.2% vs 7.3%, Pc<0.01)が、クラスI領域ではB*35:01(13.2% vs 6.8%, Pc=0.04),C*03:03(17.4% vs 8.1%, Pc<0.01),B*35:01-C*03:03(11.9% vs 4.7%, Pc<0.0001)がAITD疾患感受性を有することが示された。また、クラスII領域のDRB1*01:01(2.3% vs 8.8%, Pc<0.0001)とDRB1*01:01-DQB1*05:01(2.3% vs 8.8%, Pc<0.0001)、クラスI領域のB*07:02(1.6% vs 6.8%, Pc<0.01)とB*07:02-C*07:02(1.6% vs 6.6%, Pc=0.02)が疾患抵抗性を有することが示された。この結果は、1型糖尿病に関連するHLAクラスII領域とクラスI領域遺伝子が、自己免疫性甲状腺疾患にも関連することを示し、自己免疫疾患の臓器特異性に関する情報を得た。β細胞特異性に関連する遺伝子であるMAFA遺伝子において、国内国外との多施設共同研究を行ない、アミノ酸変異を伴うMAFAGly346Cys多型が日本人において有意な関連を示すことを証明した(1.6% vs 6.6%, P=0.02)。欧米人においては有意な関連を認めなかった。インスリン遺伝子と相互作用を示すことも証明したことから、MAFA遺伝子が臓器特異性に関与することが示された。円形脱毛症患者において、自己免疫性甲状腺疾患と自己免疫性1型糖尿病の合併頻度を調査し、さらに各種自己抗体およびHLAクラスII領域のタイピングを行い、解析を行った。円形脱毛症患者において、自己免疫性甲状腺疾患合併は10%、自己免疫性1型糖尿病合併は0%であった。円形脱毛症患者における自己免疫性甲状腺疾患の自己抗体は、TRAb、TPOAbいずれにおいても対照群と比較して高値を示した(TRAb: 42.7% vs 1.2%, P=1.6×10-46, TPO Ab: 29.1% vs 11.6%, P=1.7×10-6)。一方、円形脱毛症患者における膵島自己抗体については、対照群と比較して差を認めなかった。自己免疫性1型糖尿病に疾患抵抗性を示すHLAクラスIIハプロタイプであるDRB1*15:01-DQB1*06:02の保有率は、TRAb陽性の円形脱毛症患者に対照群と比較して高率であり、自己免疫性1型糖尿病に疾患感受性を示すHLAクラスIIハプロタイプであるDRB1*04:05-DQB1*04:01は円形脱毛症患者において自己免疫性1型糖尿病患者と比較して低率であった。この結果は、1型糖尿病に関連するHLAクラスII領域が、円形脱毛症と自己免疫性甲状腺疾患にも関連することを示しており、自己免疫疾患の臓器特異性に関する情報を得ることができた。MaFa遺伝子のノックアウトマウスを1型糖尿病モデルマウスのNODマウスにスピードコンジュニックの手法を用いて置換したMafa-/-マウスを作出した。雌のMafa-/-マウスの糖尿病発症率は、NODマウスと比較して有意に抑制された(5.6% vs 95.6%, P<0.0001)。しかし膵島炎の進行は有意に促進された。この結果は、1型糖尿病の候補遺伝子であるMaFa遺伝子の役割をin vivoにおいて確認したものであり、同遺伝子の役割が明確となった。MaFa遺伝子については、ヒトの遺伝子解析にて1型糖尿病に関連していること、ならびに動物モデルでMaFa遺伝子をノックアウトすることで1型糖尿病発症に加え、組織・免疫学的解析を行ってきたが、新たにMaFa遺伝子を過剰発現するトランスジェニックマウスを1型糖尿病モデルマウスのNODマウスに戻し交配を行い、2系統での戻し交配が終了した。現在、糖尿病累積発症率の観察研究を行っているが、本研究を行うことで、MaFa遺伝子の知見を深めることができると考えらえる。新たな1型糖尿病の候補

遺伝子同定をすべく、同一家系内で1型糖尿病発症が集積発症している全6名の対象者のDNAを収集し、タンパク質のコーディング領域である全てのエクソン領域である約4000万塩基をシークエンスする網羅的な全エクソーム解析を行った。検出された全ての変異情報から、アミノ酸置換またはスプライシングに影響するものを抽出しマイナーアリル頻度が低いものに絞りこむとともに想定した遺伝様式に合致しているレアバリアントを同定した(Immunology of Diabetes Society, 14th International Congress, Munich, Germany, 2015.4.13)。全ゲノム連鎖解析も加えておこない、この家系の1型糖尿病発症と連鎖する染色体領域を解析し、さらに絞り込みを行い責任遺伝子の同定を進めている。1型糖尿病は膵β細胞が免疫機序により破壊される臓器特異的自己免疫疾患であり、免疫調節機能を明らかにすることが治療につながる。1型糖尿病における免疫調節機能を解明するため、新規1型糖尿病感受性遺伝子の同定を行うとともに、複数の異なる臓器における自己免疫疾患の関連について解析を行い、遺伝子間の関連を明らかにした。新規1型糖尿病感受性遺伝子Mafa遺伝子では、1型のノックアウトマウスを作成し解析をしたところ、Mafa遺伝子が糖尿病発症と膵島炎に関わる遺伝子であることが明らかとなった。平成25年度に、新たな1型糖尿病疾患感受性遺伝子の同定を研究計画していたが、MAFA遺伝子において、国内国外との多施設共同研究を行ない、アミノ酸変異を伴うMAFAGly346Cys多型が日本人において有意な関連を示すことを証明した。MAFA遺伝子とインスリン遺伝子との相互作用も示されたことから、MAFA遺伝子が1型糖尿病の臓器特異性に関与することが示された。平成26年度には、1型糖尿病および他の自己免疫疾患(円形脱毛症、自己免疫性甲状腺疾患)の関連を詳細に解析することで、HLAクラスIIと各自己免疫疾患の関わりがより明確となった。1型糖尿病と他の臓器特異的自己免疫疾患についての関わりが明確になったことが、1型糖尿病疾患感受性遺伝子における免疫調節機能の解明につながると考えられる。また、予定していたコンジェニックマウスを用いた解析も完了し、1型糖尿病の候補遺伝子であるMaFa遺伝子の役割をin vivoにおいて確認したものであり、同遺伝子の役割が明確になった。総合的にはおおむね順調に進展していると評価している。糖尿病日本人の1型糖尿病患者において有意な関連を確認できたMaFa遺伝子については、コンジェニックマウスにおけるin vivoでの解析が完了した。今後はヒトにおける解析を勧めていくことになり、健常者・1型糖尿病患者・他の自己免疫疾患患者の末梢血サンプルを用いて、メタボローム解析・免疫機能解析・1型糖尿病のバイオマーカーの探索を行い、解析をすすめていく。今回の研究でMaFa遺伝子が1型糖尿病疾患感受性遺伝子と同定されたが、さらに、新たな1型糖尿病疾患感受性遺伝子についての同定をすすめる。現在進行中の日本人GWAS(genome-wide association study)解析(当教室が解析チームリーダー)で関連が示唆されている遺伝子群と欧米のGWASで関連の証明された遺伝子群について、候補遺伝子とし解析を進める。
ガラス包有物からみた火山噴火におけるマグマ中の揮発性物質の挙動

1.火山岩斑晶中のガラス包有物はその火山岩を噴出したマグマの急冷凍結物とみなすことができるので、マグマ中の水および二酸化炭素濃度はガラス包有物の分析から得ることが出来る。ガラス包有物の分析に必要な高真空抽出系ー四重極質量分析計から成る分析システムは前年度の科学研究費補助金等により既設である。本研究では本システムによるガラス包有物の分析条件の最適化を検討した。2.極微量の水および二酸化炭素の分析ではバックグラウンドの極少化が必須である。バックグラウンド値の変動の原因を究明するために、ガス抽出系にリ-クディテクタ-を設置し、リ-ク対策を施した。また分析装置部品をより高温・長時間のベ-キングに耐えるものに変更し、装置自体に起因するバックグラウンドを極少化した。3.直径50100μm程度のガラス包有物を選択的に溶融するために用いられているレ-ザ-ビ-ムの出力を、レ-ザ-発振器コントロ-ルユニットを設置することにより制御した。最適出力条件は、励起ランプ電流を17Aに固定した時、パルス周波数は10kHz、照射時間は550msecであった。4.薄片状にしたガラス包有物をレ-ザ-ビ-ムで撃ち抜くことにより正確な溶融体積を測定することができ、本システムによるガス量の分析結果と合わせてガラス包有物中の揮発性物質濃度の定量が可能になった。5.岩石学的情報のそろっている浅間山火山の溶岩等を採取し、輝石、斜長石などの斑晶を分離した。現在、これらに含まれるガラス包有物中の水および二酸化炭素濃度の定量中である。またガラス包有物の塩素、硫黄濃度および主成分化学組成を既設の設備であるEPMAにより合わせて分析中である。
密閉燃焼室内伝播火災の局所的燃焼速度と乱流特性のレーザによる同時計測

火災に対する未燃焼混合気の相対的流入速度,すなわち燃焼速度は予混合燃焼を記述する上での重要なパラメータの一つである。本研究では,燃焼室内予混合気中の非定常伝播火災について,圧力および局所的乱流特性と,その乱流によって影響される局所的火災の乱流燃焼速度,さらに未燃焼混合気の温度変化を同時に測定し,相互の関係を明らかにしうる方法を確立することを目的としている。1.火災伝播速度と未燃焼混合気流速との差として,局所的燃焼速度を直接測定するとともに,その場所でLDAにて測定した未燃焼混合気流速を,デジタルフィルタにて計算処理することにより,平均流速と乱れ成分に分離して,乱流特性を求める方法について検討した。2.乱流のカットオフ周波数をfcとして,Δt=1/(2fc)の時間区間データを,両方向バタワースデジタルフィルタ法により処理した。このようにすることにより,スペクトルの大きく異なる2種類の乱流火災の燃焼速度と乱流特性の関係を統一的に説明することができた。3.密閉燃焼室では,火災の伝播にしたがって未燃焼混合気の圧力,温度が上昇する。このような未燃焼混合気の状態変化を,レーザ干渉法により計測した。この方法は,機械的振動に対して非常に敏感であるが,ここでは,偏波面保存光ファイバおよびケスタプリズムで構成したマッハツェンダ光学系により,干渉計測を可能にした。また測定結果から,未燃焼混合気温度はポリトロープ変化を仮定してもほぼ推定できることを明らかとした。4.定常乱流火災や層流火災では,燃焼速度と熱発生速度は比例するが,密閉燃焼室内で非定常に伝播する乱流火災では,両者は比例せず,熱発生率は,燃焼素面の大きさにより決まることなどが明らかになった。密閉燃焼室内を伝播する火炎の燃焼速度(すなわち火炎に対する未燃焼混合気の相対的流入速度)は予混合燃焼を記述する上での重要なパラメ-タの一つである.本研究では,燃焼室内の圧力および局所的乱流特性(乱れ強さ,スケ-ル,パワ-スペクトルなど)と,その乱流によって影響される局所火炎の乱流燃焼速度,さらに未燃焼混合気の温度変化を同時に測定し,相互の関係を明らかにしうる方法を確立することを目的としている.火炎伝播方向に対して垂直に通された2本のレ-ザビ-ムが,火炎面によって屈折する時期を検出して,火炎伝播速度を測定し,LDAにて測定した未燃焼混合気流速との差として燃焼速度を求めた.層流火炎に対しても乱流火炎に対しても同様の方法にて測定した.結果は,圧力変化から求めた全体の燃焼率および火炎形状の測定結果から求めた値とよく一致するものとなった.層流火炎に比べて乱流火炎の場合には,燃焼速度の測定値のばらつきが大きく,乱流火炎の一つの特徴が示された.LDAから得られる流速デ-タから乱流特性値を求めるためには,非定常な短い時間の流速デ-タを解析する必要がある.その方法として,デジタルフィルタについて検討した.バタワ-スデジタルフィルタを,両方向フィルタ法で位相変化の影響を除去するようにして使用することが可能であることがわかった.未燃焼混合気温度については,レ-ザ干渉法により,初期温度からの変化を求めた.その結果,未燃焼混合気はほぼ断熱的に変化することがわかった.火災に対する未燃焼混合気の相対的流入速度,すなわち燃焼速度は予混合燃焼を記述する上での重要なパラメータの一つである。火炎に対する未燃焼混合気の相対的流入速度,すなわち燃焼速度は予混合燃焼を記述する上での重要なパラメータの一つである.本研究では,燃焼室内予混合気中の非定常伝播火炎について,圧力および局所的乱流特性と,その乱流によって影響される局所的火炎の乱流燃焼速度,さらに未燃焼混合気の温度変化を同時に測定し,相互の関係を明ららかにしうる方法を確立することを目的としている.

1.前年度の研究成果に基づいて,火炎伝播速度と未燃焼混合気流速との差として,燃焼速度を直接測定するとともに,LDAにて測定した未燃焼混合気流速を,デジタルフィルタにて計算処理することにより,平均流速と乱れ成分に分離して,乱流特性を求める方法について検討した.2.乱流のカットオフ周波数をfcとして,〓t=1/(2fc)の時間区間データを,両方向バタワースデジタルフィルタ法により処理した.このようにすることにより,スペクトルの異なる2種類の乱流火炎の燃焼速度と乱流特性の関係を統一的に説明することができた.3.密閉燃焼室では,火炎の伝播にしたがって未燃焼混合気の圧力,温度が上昇する.このような未燃焼混合気の状態変化を,レーザ干渉法により計測した.この方法は,機械的振動に対して非常に敏感であるが,ここでは,偏波面保存光ファイバおよびケスタプリズムで構成したマッハツェンダ光学系により,干渉計測を可能にした.測定結果から,未燃焼混合気温度はポリトロープ変化を仮定してもほぼ推定できることが明らかとなった.4.定常乱流火炎や層流火炎では,燃焼速度と熱発生速度は比例するが,密閉燃焼室内で非定常に伝播する乱流火炎では,両者は比例せず,熱発生率は,燃焼素面の大きさにより決まることなどが明らかになった.
高い三次の非線形光学効果を示す高屈折率ガラスの開発

三次の非線形光学効果は入射光強度によって屈折率が変化するため、全光系情報処理システムの光スイッチや光メモリーへの応用が期待されている。我々は、従来溶融急冷法で作られる一般的な多くのガラス組成で、この大きさを測定し、高屈折率ガラスで大きい三次の非線形光感受率(χ^<(3)>)が得られることを明らかにしてきた。そこで本研究では、TiO_2,PbO,Nb_2O_5等、屈折率を大きくする成分を多量に含むか、又はそれらのみから成る非晶質固体を溶融法ばかりでなく、液相合成法であるゾル-ゲル法等を用いて作製し、そのχ^<(3)>値を調べた。その結果TiO_2を主成分とし、Bi_2O_3やNb_2O_5,PbO等を添加した二成分透明非晶質が10^<-12>(esu)オーダーで酸化物非晶質中で極めて大きなχ^<(3)>を示すことが分かった。我々は、更に各成分のχ^<(3)>に対する寄与そ求め、それに基づいてより高いχ^<(3)>を持つガラスを設計するためにそれぞれのχ^<(3)>への寄与に当たる超分極率(α^<(3)>)を求めることを試みた。高いχ^<(3)>を示すガラスは、成分と構造ユニットが複雑なため、より単純な構造を持つ組成のガラスを用いた。一つは、アルカリゲルマン酸塩系ガラスで、このガラスは"ゲルマン酸塩異常"と呼ばれるアルカリ含有量に依存するGe^<4+>の配位数の変化が起こることが知られている。そこで、アルカリ含有量を変化させたガラスでχ^<(3)>を測定し、Ge^<4+>の4配位と6配位状態でのα^<(3)>を調べた。その結果、高配位状態のGe^<4+>のα^<(3)>の大きいことが分かった。一方、架橋酸素、非架橋酸素、アルカリイオンのα^<(3)>は、アルカリ珪酸塩ガラスとアルカリアルミノ珪酸塩ガラスのχ^<(3)>より求めた。結果から、架橋より非架橋が、又、酸素よりアルカリのα^<(3)>が大きいことが分かった。更に、アルカリイオンはそのイオン半径が大きいほどα^<(3)>は大きい値を示した。これらの基礎研究を基にアルカリイオンと非架橋イオンを含み、配位数の高いBi_2O_3を主成分とするガラスを作製し、そのガラス化範囲を決定した後、種々の添加物を加えたガラスでχ^<(3)>を調べた。その結果1x10^<-11>(esu)に近い極めて大きなχ^<(3)>を示すガラスを得ることに成功した。
植物の低リン耐性に関わる排出型トランスポーターの単離

低リン条件下では、有機酸、酸性ホスファターゼの分泌による難利用性リンの可給化や、二次代謝産物の分泌による菌根菌や根圏細菌などリン吸収と深い関係のある微生物との相互作用に影響している。本研究は、これらの低リン条件下で根から分泌される物質の輸送を担うトランスポーターを単離することを目標として実施した。昨年度、排出型トランスポーターの候補として選抜した遺伝子についての機能解析を進めた結果、以下のような結果を得た。At1g73220,At3g47420の発現は極めてリン欠乏根に特異的で、変異株の生育は-P区で顕著に抑制された。これらのトランスポーターは排出型ではなく、リン欠乏条件下で認められる脂質の再編に関与する可能性が考えられた。At4g21680もリン欠乏根で特異的に発現し、変異株の生育が-P区で顕著に抑制された。ペプチド輸送を担うことが予想され、未知のリン欠乏応答に関与する可能性が考えられた。Al活性化型リンゴ酸トランスポーターALMT1のシロイヌナズナホモログの一つである、AtALMT-PI1とリン欠乏条件下でのリンゴ酸分泌の関係について解析を実施した。シロイヌナズナは低リン条件下でリンゴ酸を多く分泌し、クエン酸の分泌量は多くなかった。AtALMT-PI1のmRNAはリン欠乏条件の根において標準リン条件と比較して約4倍に発現量が増加した。AtALMT-PI1のpromoter解析を行った結果、特に根伸長域において強く発現している一方で、根端付近や成熟した根ではあまり発現しないことが示された。また、発現は主根および側根の表皮細胞と根毛に多く見受けられた。変異株でリンゴ酸の分泌量の低下が認められたものの、電気生理試験ではリンゴ酸の輸送活性がこれまでに検出されていないことから、AtALMT-PI1はリンゴ酸分泌に関わるものの、輸送を活性化する他の因子が存在することが考えられる。資源の涸渇に瀕しているリン酸質肥料の有効利用を図るためには、植物の低リン耐性を理解し、その機能を利用することが必要である。低リン条件に適応する植物は、根から有機酸、酵素、二次代謝産物(ストリゴラクトン類やフラボノイド類)などの物質を分泌することによって自ら根圏環境を改善する能力を有するが、その物質分泌の能力とこれを担う排出型のトランスポーターはあまり同定が進んでいない。そこで本研究は、低リン耐性に関わる未解明の排出型トランスポーターを単離し、この分子が担う分泌物質と低リン耐性における機能を解明することを目的としている。これまでに、低リン条件下で栽培した3種類の植物の根部を試料としたマイクロアレイ解析を実施した。その結果より、低リン条件下で発現が増加した機能未知の膜タンパク質候補を選抜した。この候補遺伝子について、シロイヌナズナの根部においてリン欠乏条件で顕著に発現が誘導されていることを確認した。また、T-DNAタグラインを入手し、ホモ系統の株の育成を実施した。解析対象とする形質は、1)難溶性リン酸塩を形成する金属イオンをキレート化し、リン酸を放出する「有機酸」、2)有機態リンを分解し、無機リン酸を放出する「酸性ホスファターゼ」、3)菌根菌との共生に重要な役割を担う「ストリゴラクトン」、4)根圏細菌との共生に関わる可能性が指摘される「フラボノイド類」とした。以上の形質をシンプルに観察するため、シロイヌナズナおよびミヤコグサを用い、難溶性リン酸培地または低リン培地を用いたスクリーニング系を確立した。難溶性リン酸培地を用いて変異株の栽培試験を実施し、難溶性リン酸利用性の低い株を見いだした。

変異株でリンゴ酸の分泌量の低下が認められたものの、電気生理試験ではリンゴ酸の輸送活性がこれまでに検出されていないことから、AtALMT-PI1はリンゴ酸分泌に関わるものの、輸送を活性化する他の因子が存在することが考えられる。
水痘帯状疱疹ウイルス次世代ワクチン開発の基礎研究

水痘-帯状疱疹ウイルスのORF39遺伝子はウイルスの増殖に必須うであり、存在位置もORF65とORF66遺伝子間にあるAvrII部位への再導入させた結果、ウイルスの増殖を見ることはできなかった。この結果は、ORF39はORF38およびORF40に囲まれた状態でないとウイルスの生存に何らかの影響があることが示唆された。組織培養下でウイルスの複製および増殖に関する役割が不明な遺伝子ORF39について、その遺伝子の機能を以下の方法にて検討した。組換え操作の容易化のため、プラスミドベクターにサブクローニングした。プロモーターの範囲、両隣に位置との関係を顧慮した上で、目的遺伝子を欠損させた。欠損遺伝子の範囲をPCR,シークエンスにて確認後、ターゲット遺伝子がコードされているコスミベクターに同部位に組み込みこんだ。今回用いたコスミドベクターはStanford大学の研究グループにより作成されたFsp4, Spe5, Pmee19およびSpe21で、それぞれのコスミドは水痘帯状疱疹ウイルス遺伝子(岡株)の1-33211, 21875-40134, 53877-96188および94208-124884をSupercos vector制限酵素AscI部位に組み込んだものである。細胞への遺伝子導入効果を上げるため、リポフェクション法にてターゲット遺伝子を組替えたコスミドベクターをMW-115細胞に導入した。遺伝子導入を行ったMW-115細胞は細胞変性効果が認められるまで継代したが細胞変性効果が認められたため、欠損させた遺伝子を再度、Spe21のORF65とORF66の遺伝子間に存在するユニークな制限酵素部位であるAvrII部位に組込み、必須で遺伝子の有無を再度、検討する。co-ransfectionで欠損遺伝子の再現が不可能な場合は、ターゲット遺伝子を持続的に発現する細胞株をMW-115細胞用いて作成し、同様にco-ransfectionを行うことでウイルス増殖の必須遺伝子であることを証明する。組織培養下でウイルスの複製および増殖に関する役割が不明な水痘-帯状疱疹ウイルス遺伝子ORF39について、その遺伝子の機能を以下の方法にて検討した。まず、目的遺伝子であるORF39をこの領域をコードするヴクター内で欠損させ、ターゲット遺伝子がコードされているコスミベクターに同部位に組み込みこんだ。今回用いたコスミドベクターはStanford大学の研究グループにより作成されたFsp4,Spe5,Pme19およびSpe21で、それぞれのコスミドは水痘帯状疱疹ウイルス遺伝子(岡株)の1-33211,21875-40134,53877-96188および94208-124884をSupercos vector制限酵素AscI部位に組み込んだものである。遺伝子導入を行ったMW-115細胞は細胞変性効果が認められるまで継代したが細胞変性効果が認められたため、欠損させた遺伝子を再度、Spe21のORF65とORF66の遺伝子間に存在するユニークな制限酵素部位であるAvrII部位に組込み、必須で遺伝子の有無を再度、検討した。また、ORF39をAvrII部位への再導入し正常な3つのコスミドベクターとco^-ransfectionでさせた結果、細胞変性は認められず、ウイルスを得ることができなかった。このことを証明するために、今後、ターゲット遺伝子を持続的に発現する細胞株をMW-115細胞用いて作成し、同様にco^-ransfectionを行うことでウイルス増殖の必須遺伝子であることを証明し、ORF39は水痘-帯状疱疹ウイルスにとって必須な遺伝子であることを証明する。
骨形成性毛細血管からみた内軟骨性骨化の新しい概念

1.耳小骨で見出した「内軟骨性骨芽細胞」を「超石灰化骨芽細胞」と命名し、詳細な解析を進め、放射光施設SPring-8も活用した。この骨芽細胞は、耳小骨だけでなく内耳骨の形成にも寄与していることが分かった。ツチ骨短突起に加えて、鼓膜に接する「ツチ骨柄」についても内軟骨性骨化過程を細胞レベルで観察した。ツチ骨柄は聴覚機能を担う部位であり、機能と直結した形態形成の場としての意義がある。さらに、頭蓋底の底後頭骨(斜台)の骨化後の変化を解析し、破骨細胞と骨芽細胞が、皮質骨の裏と表で、それぞれ骨吸収と骨形成を行う現象を解析し、「トランス・カップリング」と命名して論文発表した(Edamoto et al)。また、成長板依存的な内軟骨性骨化を起こす骨として、マウス脛骨と腓骨を詳細に解析した。脛骨の骨端部に神経の侵入を認めたので形態学的に解析し、論文発表した(Matsuo et al)。さらに、生後のマウス腓骨でも、頭蓋底と同様な「トランス・カップリング」が起こっていることを見出し、国内学会で発表した。2.国際学会での高い評価:米国骨代謝学会で本研究の「超石灰化骨芽細胞」に関する発表要旨が高い評価を受け、口頭発表(トップ12%程度)に選ばれ注目された。3.国際共同研究の成立:ウイーンのボルツマン骨学研究所との共同研究がスタートし、マウスの耳小骨と大腿骨を比較しながら骨密度分布を計測する態勢が整った。これにより、耳小骨の内軟骨性骨化でできる骨基質と、長管骨の成長板依存的な内軟骨性骨化によってできる骨基質との差が客観的に判明すると思われる。内軟骨性骨化という、多様な骨で基盤となる骨形成過程の細胞メカニズムを研究対象としているため、様々な発生時期の様々な骨を観察することになり、本来の研究目的の進展に加えて、新しい形態学的知見や概念に到達した。長管骨の内軟骨性骨化を担う成長板は、無血管・無神経の軟骨細胞から構成されており、その両側の骨幹端と骨端には豊富な血管・神経が到達している。マウスの脛骨の骨端側の神経は、膝関節に面した特徴的な骨孔から侵入していたが、文献的な記述がほとんどなされていなかったので、マイクロCTと組織学的解析データを基に論文化された(Matsuo et al., 2019)。さらに、内軟骨性骨化で形成される底後頭骨では、「超石灰化骨芽細胞」の存在は明確でなかったものの、皮質骨を挟んて脳側には破骨細胞が、咽頭側に骨芽細胞が分布しており、脳幹の成長に伴い、頭蓋内の体積の拡大に寄与しているものと考えられた。この特徴的な破骨細胞と骨芽細胞の分布は、脳からの力学的負荷によるものである可能性を示し、「トランス・カップリング」と命名して論文発表を行った(Edamoto et al, 2019)。この概念は、長管骨の皮質骨でも成立していることを見出した。「超石灰化骨芽細胞」も国内外の学会で注目されており、どのようにして石灰化度が高まるのか、その細胞系譜はどのようなものかなど、解明すべきポイントが明確になってきた。「超石灰化骨芽細胞」の存在は明確になってきた。今後はメカニズムの解明を行う。まず、従来の骨芽細胞の細胞系譜との違いを明確に示す必要がある。シングルセル解析に進む準備をしており、軟骨細胞や従来の骨芽細胞とは異なる、新たな細胞集団であることを示したい。次に、石灰化度の高い骨になるメカニズムの解明である。2型コラーゲンを産生するなど、従来の骨芽細胞とは異なるタンパク質を産生していることが分かっている。「超石灰化骨芽細胞」に特異的なタンパク質が、石灰化度を高めるメカニズムを担っているかどうかを解析する。石灰化度の解析には、工学的な手法を必要とするため、専門性の高い研究グループとの共同研究を強力に推進する。1.内軟骨性骨化によって骨になる耳小骨や長管骨の解析から、内軟骨性骨化過程で働く新たな「内軟骨性骨芽細胞」の実体を明らかにしようと実験を進めた。その結果、耳小骨で見出された「内軟骨性骨芽細胞」と類似した細胞が、(成長板直下の軟骨・骨移行部ではなく)上腕骨遠位部の骨膜下などの、骨密度が特別に高い部分に存在することがわかった。意義:研究対象の細胞を、予測される機能に基づき「超石灰化骨芽細胞(hypermineralizing osteoblasts)」と呼ぶこととし、実体の解明が進んだ。2.I型コラーゲンの発現細胞を可視化できるCol1a1-GFPマウスを用いた解析から、耳小骨の「超石灰化骨芽細胞」はI型コラーゲンの発現が低く、II型コラーゲンの発現が高いことが分かった。骨芽細胞マーカーであるオステオカルシンに陽性、Col1a1-GFPマウスでGFP陰性、かつ骨標識剤アリザリンでラベルされる骨形成部位に局在するという指標を用いて同定できることがわかった。意義:本来骨基質のタンパク質の9割程度を占めるI型コラーゲンだけでなく、軟骨に含まれるII型コラーゲンも産生する骨芽細胞が存在することが初めて明らかになった。

3.放射光施設SPring-8におけるX線位相顕微鏡を用いたマイクロCT解析により、腓骨における通常の骨芽細胞と、耳小骨における「超石灰化骨芽細胞」の両方を、細胞レベルで可視化できた。意義:内軟骨性骨化の過程を細胞レベルで空間的に把握することができるようになった。骨芽細胞と毛細血管の空間的な位置関係の情報が得られた。4.耳小骨以外のマウスの骨格全体で、「超石灰化骨芽細胞」の主な存在部位が明らかになった。「長管骨の成長板直下の軟骨・骨移行部では、通常の骨芽細胞とは異なる「内軟骨性骨芽細胞」が、骨形成性毛細血管を構成して、軟骨基質上に骨基質を添加する」という当初の作業仮説を追究した結果、耳小骨で内軟骨性骨化を担う骨芽細胞に似た骨芽細胞が、マウス骨格の成長板以外の部位に見出された。これは予期しない知見であったものの、新たに見出された「超石灰化骨芽細胞」が耳小骨の骨化に限られた特殊なものではなく、石灰化度の高い様々な部位に存在する普遍的な骨芽細胞である可能性が示され、「超石灰化骨芽細胞」が通常の骨芽細胞とは異なることが明確になってきたから。1.耳小骨で見出した「内軟骨性骨芽細胞」を「超石灰化骨芽細胞」と命名し、詳細な解析を進め、放射光施設SPring-8も活用した。この骨芽細胞は、耳小骨だけでなく内耳骨の形成にも寄与していることが分かった。ツチ骨短突起に加えて、鼓膜に接する「ツチ骨柄」についても内軟骨性骨化過程を細胞レベルで観察した。ツチ骨柄は聴覚機能を担う部位であり、機能と直結した形態形成の場としての意義がある。さらに、頭蓋底の底後頭骨(斜台)の骨化後の変化を解析し、破骨細胞と骨芽細胞が、皮質骨の裏と表で、それぞれ骨吸収と骨形成を行う現象を解析し、「トランス・カップリング」と命名して論文発表した(Edamoto et al)。また、成長板依存的な内軟骨性骨化を起こす骨として、マウス脛骨と腓骨を詳細に解析した。脛骨の骨端部に神経の侵入を認めたので形態学的に解析し、論文発表した(Matsuo et al)。さらに、生後のマウス腓骨でも、頭蓋底と同様な「トランス・カップリング」が起こっていることを見出し、国内学会で発表した。2.国際学会での高い評価:米国骨代謝学会で本研究の「超石灰化骨芽細胞」に関する発表要旨が高い評価を受け、口頭発表(トップ12%程度)に選ばれ注目された。3.国際共同研究の成立:ウイーンのボルツマン骨学研究所との共同研究がスタートし、マウスの耳小骨と大腿骨を比較しながら骨密度分布を計測する態勢が整った。これにより、耳小骨の内軟骨性骨化でできる骨基質と、長管骨の成長板依存的な内軟骨性骨化によってできる骨基質との差が客観的に判明すると思われる。内軟骨性骨化という、多様な骨で基盤となる骨形成過程の細胞メカニズムを研究対象としているため、様々な発生時期の様々な骨を観察することになり、本来の研究目的の進展に加えて、新しい形態学的知見や概念に到達した。長管骨の内軟骨性骨化を担う成長板は、無血管・無神経の軟骨細胞から構成されており、その両側の骨幹端と骨端には豊富な血管・神経が到達している。マウスの脛骨の骨端側の神経は、膝関節に面した特徴的な骨孔から侵入していたが、文献的な記述がほとんどなされていなかったので、マイクロCTと組織学的解析データを基に論文化された(Matsuo et al., 2019)。さらに、内軟骨性骨化で形成される底後頭骨では、「超石灰化骨芽細胞」の存在は明確でなかったものの、皮質骨を挟んて脳側には破骨細胞が、咽頭側に骨芽細胞が分布しており、脳幹の成長に伴い、頭蓋内の体積の拡大に寄与しているものと考えられた。この特徴的な破骨細胞と骨芽細胞の分布は、脳からの力学的負荷によるものである可能性を示し、「トランス・カップリング」と命名して論文発表を行った(Edamoto et al, 2019)。
時間と否定の概念を加えたソート階層上の意味表現

これまでの論理学の否定とは一種類の連結子(〓)であったが,本研究では,暗黙に否定の意味が内在するソートを含んだソート階層と知識ベースとの結合を強化した推論機構を提案した.ここでは,異なる否定間での推論を実現するために,否定間の関係をソート階層で互いに関係づけ,肯定表現と排他性および全域性などを明確にし,その結果,拡張したソート表現に関する導出処理を提供することができた.また,時間の論理の組み込みを行った.テンスの概念を抽象化した時相論理(temporal logic)は様相論理の一発展形として盛んに研究されているが,アスペクトの概念を様相として論理を構築した研究例は少ない.本研究での目標の一つはアスペクト論理の完成であるが,その途上として,本年は現在のアスペクト分類を実際に自然言語のテキストに応用して時間的描写の精度を向上させるシステムを開発した.この研究では通常のアスペクト分類を拡張し,さまざまな完了の概念を導入することで視覚的にわかりやすいウェブ形式によるタイムマップを生成することに成功した.時間と否定の論理を組み込んだソート階層が実用に供する可能性のある知識ベースとして働くために,次のような現実上の問題を考慮した.まず第一に,知識ベースはそもそも分散して存在するために,どの知識ベースからどの知識ベースがアクセスできるかの制限がある.これはそのまま可能世界のアクセス関係として考えることができるために,われわれはソート論理を組み込んだ様相論理を提案し,その枠組みの中でオントロジーに関する理論を構築した.第二に,こうした分散知識ベースにおいては,同一概念が異なる名前で呼ばれている可能性がある.われわれは概念の同一性を検証するために各概念に固有の同一性条件(identity condition)なる関数に着目し,それら関数が同一の値を取ることで概念の同一性を発見するメカニズムを提案した.これまでの論理学の否定とは一種類の連結子(〓)であったが,本研究では,暗黙に否定の意味が内在するソートを含んだソート階層と知識ベースとの結合を強化した推論機構を提案した.ここでは,異なる否定間での推論を実現するために,否定間の関係をソート階層で互いに関係づけ,肯定表現と排他性および全域性などを明確にし,その結果,拡張したソート表現に関する導出処理を提供することができた.また,時間の論理の組み込みを行った.テンスの概念を抽象化した時相論理(temporal logic)は様相論理の一発展形として盛んに研究されているが,アスペクトの概念を様相として論理を構築した研究例は少ない.本研究での目標の一つはアスペクト論理の完成であるが,その途上として,本年は現在のアスペクト分類を実際に自然言語のテキストに応用して時間的描写の精度を向上させるシステムを開発した.この研究では通常のアスペクト分類を拡張し,さまざまな完了の概念を導入することで視覚的にわかりやすいウェブ形式によるタイムマップを生成することに成功した.時間と否定の論理を組み込んだソート階層が実用に供する可能性のある知識ベースとして働くために,次のような現実上の問題を考慮した.まず第一に,知識ベースはそもそも分散して存在するために,どの知識ベースからどの知識ベースがアクセスできるかの制限がある.これはそのまま可能世界のアクセス関係として考えることができるために,われわれはソート論理を組み込んだ様相論理を提案し,その枠組みの中でオントロジーに関する理論を構築した.第二に,こうした分散知識ベースにおいては,同一概念が異なる名前で呼ばれている可能性がある.われわれは概念の同一性を検証するために各概念に固有の同一性条件(identity condition)なる関数に着目し,それら関数が同一の値を取ることで概念の同一性を発見するメカニズムを提案した.本年度研究の成果としては,暗黙に否定の意味が内在するソートを含んだソート階層と知識ベースとの結合を強化した推論機構を提案した.従来の知識ベースでは,ソート階層に含まれているような否定的要素を内在するソートに対して,その否定による情報を推論に反映できなかった.しかし,否定要素を含むソートの階層関係を形式化することによってその問題に対処する.否定的要素を含むソートは,自然言語では語彙項目の否定と呼ばれ,(i)接辞による否定と(ii)ある他の概念と対立するために否定的意味が内在する語彙との2種類があり,否定辞(not, no)とは異なった特性を持つ.本研究では,否定が内在するソートを語彙項目の否定から考察することで,(i)に対して強い否定の概念に基づいた否定演算子を導入し,語彙そのものが統語論的に否定の要素すらもたない(ii)を,ソート階層で反意語と排他性を持つソートとして捉える.そのうえで,異なる否定間での推論を実現するために,否定間の関係をソート階層で互いに関係づけ,肯定表現と排他性および全域性などを明確にし,その結果,拡張したソート表現に関する導出処理を提供することができた.また,時間と否定の論理を組み込むにあたっては,それらの概念が実世界でのインタラクションにどのように左右するかを観察する必要がある.今年度は本研究の一環として実世界に埋め込まれたエージェントの信念の論理を考察するため,(i)belife revisionの研究においてエージェントが新たな情報を全面的に信頼しない枠組みでのrevisionのしくみを提案した.さらに,(ii)このような信念の論理を時間の論理と組み合わせて,時間と信念のモダルオペレータを持つエージェントの論理を構成した.アスペクトとは自然言語の動詞の活用の上で進行形や完了形などの概念であり,動詞で述べられる動作がどのような局面にあるかを述べるものである.アスペクトは未来や過去を表すテンスとともに,言語上の時間的性質を述べるものである.

テンスの概念を抽象化した時相論理(temporal logic)は様相論理の一発展形として盛んに研究されているが,アスペクトの概念を様相として論理を構築した研究例は少ない.本研究での目標の一つはアスペクト論理の完成であるが,その途上として,本年は現在のアスペクト分類を実際に自然言語のテキストに応用して時間的描写の精度を向上させるシステムを開発した.本研究では料理のレシピ文をターゲットとした.レシピ文は複数動作の同時進行や各動作の起点・終点を正確に伝える必要がある.したがってレシピ文のテキストを入力とし,各々の動作の時間関係を描写するタイムマップを作成することは,文章の正しい理解度を測る上で有意義である.この研究では通常のアスペクト分類を拡張し,さまざまな完了の概念を導入することで視覚的にわかりやすいウェブ形式によるタイムマップを生成することに成功した.来年度以降は,このアスペクトのシステムを様相論理として形式化する予定である.さらに,複数のエージェントがそれぞれの知識を有し,時間の推移にしたがって知識も変化するような体系で,あるエージェントがある時点である命題を知識として持っているかどうかを判別するための証明手続きを完成した.その他,前年度より手がけていた複数の否定(強い否定,古典的否定,対立概念)を含むオーダーソート論理を完成し,論文発表を行った.来年・再来年においてはこのオーダーソート論理に上記アスペクト論理を組み込むことを研究の目標とする.本研究課題は言語のセマンティクスに対して、論理を拡張することによってその記述性を高めることである。本年度は下記のように研究を行ったので、その概要を報告する。・まず、言語セマンティクスにとって時制とアスペクトの表現は最重要課題の一つである。従来の一階述語論理は静的な状態表現には適した表現であるが、時間軸上瞬間的に起こり時間に沿っで性質を変えるイベントの表現に対しては不充分である。本研究では当初よりOccurrence Logic、すなわちイベント(event, occurrence)を記述する論理を考案してきたが、本年はこのテーマで次の二点の成果を公表した。(i)ひとつは時間軸上に起こったイベントの言語表現に対して、その表現が未来と過去に遺伝性のあるものであるかをそれぞれ定義した右方遺伝性・左方遺伝性、およびより広い時間区間とより狭い時間での成立を定義した上方遺伝性・下方遺伝性を用いてそれらの性質を議論したことである。これにより、時間軸上のイベント列の依存関係を明示できるタイムマップを提示することができた。(ii)もうひとつの成果は同一イベントが状況の変化によって呼称を変える場合を扱う論理である。イベントの呼称はイベント間にも上位・下位の階層関係を定義しておくことで、より一般的な名称で述べられる場合を扱うことができるが、この階層関係は時間の推移によって変化する可能性があるので、時間の推移を様相論理として定義したTemporal Logicを用い、階層関係の時間依存性を表現する枠組みを実現した。・人間の信念の表現は、時間の問題とともに重要課題の一つである。
わが国古代の稲作農耕研究における生物考古学的手法の開発

1遺跡から出土する生物遺体のうち、イネ科植物に存在するプラントオパール分析を、各地遺跡出土のものを対象として、縄文、弥生、古墳時代のものを広範におこない、年代判定など考古学的な検討をも加えた。2各地遺跡出土の種子類のSEM分析およびDNA分析を、各年代の試料について集中的におこない、一部はプラント・オパール分析にも供した。3出土炭化米からDNAを抽出することに成功し、それらがすべてジャポニカ種であることが確かめられた。良好な炭化種子であれば、DNA抽出が可能で、品種の判定に大いに役立つ見通しがついた成果は大きく、今後さらに成果の上ることを期待したい。4分析用に収集した植物遺体について、考古学的な視点から、その時代性等に関して検討を加え、できる限り網羅的に試料収集をおこない、考古資料から、まず古代農耕様式の変遷をたどることに努めた。5以上の分析結果を総合的に検討してみると、分析方法などでまだ細部に改良点や工夫を要するとことがあるものの、遺跡出土の植物遺体から古代の稲作農耕様式を復元し得る生物考古学的な手法というものが確立できる見通しはついたと言える。特に出土遺体から、DNAが抽出できる可能性を得たことは、今後この研究を進めるうえで、大きな威力となることであろう。1遺跡から出土する植物遺体は、古代の稲作農耕の様式やその変遷に関して多くの情報を秘めている。その情報を効率よく取り出し、各種の検討を加えることにより古代農耕の復原をおこなう手法を確立することを目的に出発した。このため、各地の発掘現場で採集された植物遺体ーとりわけイネ科植物・稲粒・炭化米等のサンプルの収集を、九州から東北地方にわたっておこなった。2植物遺体のうち、特にイネ科植物に含まれるプラントオパールを分析することによって,その大きさや形態差を比較することにより、稲の品種同定や成育度を推定する手法がほぼ可能であることがわかってきた。これによれば、従来は単にイネと同定するにとどまって分類が、インディカ種、ジャポニカ種、さらに最近注目を浴びているジャバニカ種の判別が確実となり、古代稲作の系統が追求できることになり、大きな成果をあげることになる。3各地から収集した植物遺体から、遺伝情報の本体であるDNA(デオキシリボ)を取り出して、その植物の生物種や系統名を推定することをおこなった。原生種と違い出土品は組織自体が破壊してしまっているものが多いため、DNAを取り出すことが困難を極める。その手法にはまだまだ改良の余地がある。違体の保存には超低温フリーザー(設備備品)が有効であった。特にイネでは品種間の微細構造を明らかにすることにより、ジャポニカでも、熱帯型と温帯型を分けることも可能となる。これまで、米粒の態差で分類していたイネ研究が大いに飛躍することになろう。さらにプラントオパールそのものから、DNAを抽出する手法も試みる予定である。九州から東北地方までに至る各時代の遺跡から出土した植物遺体のうち、特にイネ科植物について試料収集をおこない、昨年以来おこなっている、それらからのDNA分析(遺伝子抽出作業)とその同定作業を実施した。また、木本類のサンプルからもDNA抽出の見通しがつけられるようになり、広い意味での栽培植物の追求が可能となりつつある。各地からの遺跡出土の植物遺体(イネ科植物を中心とした)の収集は従来どおり、工楽・黒崎が継続しておこなっている。わが国のイネのルーツを考える際に、どうしても見ておかなければならない試料に中国のイネがある。分担者の1人である藤原は、江蘇省草鞋山遺跡出土の新石器文化である馬家浜中期ころのイネ機動細胞プラント・オパールを、パターンアナライザ(本年購入器機)により計測・解析した。このイネは温帯ジャポニカに属する可能性が高い。また、プラント・オパールからもDNAを検出できる技術がほぼ確立できるようになった。1.遺跡から出土する生物遺体のうち、イネ科植物に存在するプラント・オパール分析を各地の遺跡出土のものを広範に対象としておこなった。2.さらに出土種子類のSEM分析およびDNA分析を昨年度に不足していた年代のものや不足地域のものに限って集中的におこなった。3.分析用に収集した植物遺体について、考古学的な観点から、その時代性等を検討した。

4.以上の各分析結果を総合的に検討してみると、分析法など、まだ細部では改良点や工夫を要するところがあるものの、植物遺体から古代の稲作農耕様式を復原し得る生物考古学的な手法というものが、確立できる見通しはついたと言える。特に出土遺体から、DNAが抽出できる可能性を得たことは、この研究を進めるうえで今後大きな威力となるであろう。
腎内ミネラロコルチコイド受容体活性化による腎障害メカニズムの解明

本研究では、アルドステロン依存性高血圧ラット、食塩感受性高血圧ラット、アンジオテンシンII依存性高血圧マウスなどにおいて検討を行い、ミネラロコルチコイド受容体(MR)MRが腎老化や酸化ストレスを生じて腎障害に関わることを証明した。さらに、培養ラットメサンギウム細胞、マウスポドサイト、ヒト近位尿細管細胞、ラット血管平滑筋細胞を使用した実験によって、詳細な分子生物学的メカニズムも明らかにした。これらの研究結果の一部は、9報の英文雑誌に掲載され、学会でも発表された。また、本研究に関連して、申請者は日本腎臓学会大島賞を受賞した。尚、交付された助成金はすべて消耗品に使用された。本研究の最終的な目的は、腎障害メカニズムにおけるミネラロコルチコイド受容体の役割について、その全容を解明することである。平成24年度は初年度平成23年度に引き続き、ミネラロコルチコイド受容体活性化による近位尿細管細胞の障害が、炎症を介する尿細管間質障害によって引き起こされるか否かについて検討を続けた。全身GFP発現マウスに対してストレプトゾトシンを投与して糖尿病性腎症を生じ、あるいは5/6腎摘をおこない、テレメトリーシステムを利用して24時間血圧・心拍数を連続測定した。その後イナクチンで麻酔下に多光子レーザー顕微鏡によって近位尿細管部位の間質における白血球と血小板の動態を観察し、炎症の状態を可視化した。その結果、糖尿病の発症とともに近位尿細管を中心として自己蛍光発色を強く生じていることが観察された。また、赤血球の流れが障害されてマクロファージが集積しているなどの、微小循環障害にともなう炎症を生じていることが明らかとなった。組織学的検討でもSAβ-Gal染色による老化が生じており、腎組織中のp21, p53, sirt1, sirt2などの遺伝子・蛋白発現が増加していた。これと並行して培養ヒト近位尿細管細胞において、ミネラロコルチコイド受容体の活性化が酸化ストレスを介して老化を生じており、TNF-α分泌が重要な役割を果たしていることが示唆された。これらの研究結果の一部は、平成24年度にClin Exp Pharmacol Physiol誌やPLoS ONE誌に発表され、日本腎臓学会総会、日本臨床分子医学会、日本臨床高血圧フォーラムにて発表された。また、本研究に関連して、日本腎臓学会総会では大島賞を受賞した。尚、交付された助成金はすべて消耗品に対して使用された。本研究の最終的な目的は、腎障害におけるミネラロコルチコイド受容体(MR)の関与について解明することである。まず、ダール食塩感受性高血圧ラットやストレプトゾトシン投与糖尿病マウスにおいて検討を行った結果、これらの病態で生じる尿細管間質の炎症や線維化は近位尿細管を中心とした腎組織の老化を伴っていることを見出した(SA-βGal染色によって評価)。さらに、腎組織中のp21, p53, sirt1, sirt2などの老化関連遺伝子の発現が増加していた。これらすべては、MR拮抗薬の投与によって抑制されたことから、MR活性化による近位尿細管細胞の老化が、尿細管間質の障害に関与していることが示唆された。一方、アンジオテンシンII依存性高血圧ラットによって生じる腎臓の老化には、MRが関与していないことも明らかとなった。一方、マウスに対してストレプトゾトシンを投与して糖尿病性腎症を発症させたモデルにおいて、抗酸化剤であるテンポールの効果について検討したが、実験条件が整わず、一定の見解を得る事ができなかった。同時に、予定していたヒト腎生検サンプルを使用した実験も、実行に必要なレーザーキャプチャーが故障しているため、実行できなかった。これに対して、培養ヒト近位尿細管細胞での実験においては、MRの活性化が、酸化ストレスを介して老化を生じていることが明らかとなった。このようなMR活性化による近位尿細管細胞の老化は、おもに酸化ストレスとp21を介して生じていることも証明した。これらを含める一連のレニン・アンジオテンシン・アルドステロン系の研究結果は、多くの国内外の学会にて発表され、数編の英文誌に掲載された。尚、交付された助成金はすべて消耗品(動物、培養細胞、ディスポーザル器具、遺伝子発現測定キット、蛋白発現測定キットなど)に対して使用された。本研究の最終的な目的は、腎障害におけるミネラロコルチコイド受容体の役割について、その全容を解明することである。初年度はミネラロコルチコイド受容体活性化による近位尿細管細胞の障害が、炎症を介する尿細管間質障害の根本であることを証明するため、全身GFP発現マウスに対してストレプトゾトシンを投与して糖尿病性腎症を生じ、イナクチン麻酔下に多光子レーザー顕微鏡によって近位尿細管部位の間質における白血球と血小板の動態を観察し、炎症の状態を可視化することを目的としていた。

これに際して、まず多光子レーザー顕微鏡にて腎臓を評価する手技を確立した。しかし、全身GFP発現マウス搬入時の遺伝子動物関連手続きに時間を要したため、まだ十分な結果が出ていない。そのため、正常ブラックマウスにストレプトゾトシンを投与して上記検討を行った。その結果、糖尿病の発症とともに近位尿細管を中心として、SA-beta-Gal染色による老化が生じており、腎組織中のp21, p53, sirt1, sirt2などの遺伝子発現が増加していることを明らかとした。これと並行して培養マウス糸球体上皮細胞とヒト近位尿細管細胞において、ミネラロコルチコイド受容体の活性化が酸化ストレスを介して老化を生じていることを見出した。興味深いことに、酸化ストレスが亢進している状態では、アルドステロンのみならず、グルココルチコイドもミネラロコルチコイド受容体を活性化し、細胞の老化を生じることを明らかとした。これらの研究結果の一部は、Am J Hypertens.に発表され、平成24年度日本高血圧学会総会とHigh Blood Pressure Councilにて発表される予定である。また、交付された助成金はすべて消耗品に対して使用された。すべてのデータが論文化されているわけではないが、動物実験も培養細胞実験もほぼ予定どおり実行され、十分な結果を得ることができた。また、平成24年度では一部のデータがClin Exp Pharmacol Physiol誌やPLoSONE誌に発表され、日本腎臓学会総会、日本臨床分子医学会、日本臨床高血圧フォーラムにて発表された。さらに、本研究の業績が認められ、日本腎臓学会総会では大島賞を受賞することができた。このように、本研究はおおむね順調に進展していると思われる。全身GFP発現マウスを使用した実験については、搬入に際に必要な遺伝子動物の関連手続きに時間を要したため、まだ十分な結果が出ていないが、正常ブラックマウスにて十分な結果が出ている。また、培養細胞を使用した実験は、予定通りに進んでおり、これらの研究結果の一部は、Am J Hypertens.に発表され、平成24年度に開催される日本高血圧学会総会とHigh Blood Pressure Councilにて発表できる予定である。平成25年度は平成24年度までで行った全身GFP発現マウスを用いた病態モデル動物を使用した腎老化メカニズムについて、引き続き検討をおこなう予定である。まず、テレメトリーシステムを利用して24時間血圧・心拍数を連続測定し、その後イナクチンで麻酔下に多光子レーザー顕微鏡によって近位尿細管部位の間質における白血球と血小板の動態を観察して炎症の状態を可視化し、前年度までに得られた病態の変化に加え、その他にも新しい病態が観察されないか否かについて検討する。さらに、培養ヒト近位尿細管細胞における実験により、ミネラロコルチコイド受容体活性化による細胞老化作用において、TNF-αによる経路を中心とした老化作用の詳細な分子生物学的メカニズムを検討する。平成25年度はこれに並行して、腎障害の進展と血圧のDippingパターンの変化について、ミネラロコルチコイド受容体の役割について動物モデルで検討する。
時間分解磁気光学顕微鏡を用いた磁区ダイナミクスとスピン起電力発生の同時観測

スピン起電力は、磁性体におけるスピンの空間的・時間的変化によってつくられる実効的電磁場による起電力で、スピン自由度を介したエネルギー変換の一つとして注目されている。本研究では、高分解能の磁気光学顕微鏡を用いて磁化ベクトルの運動を時間・空間分解観察すると同時に、スピン起電力の発生を電気的に検出し、その関係を直接的に評価することを試みる。これにより、大きなスピン起電力の発生が期待される複雑な磁区構造を持つ系における実験的研究を可能にする。