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酸化ストレスと寿命及びNrf2の新規ユビキチンリガーゼSiah2の働き

大腸菌で発現したヒトSiah2の可溶化がうまくいかず、Siah2特異抗体は作成できたものの、抗体価が低く、低い発現量の細胞では検出できなかった。線虫のSiahは可溶化できそうであり、現在可溶化を検討中である。ヒトSiah2とかなり相同性があるので、うまく抗体ができれば、使用できる可能性が高い。一方、線虫の遺伝子変異体を用いた、酸化ストレスが寿命に与える影響の検討であるが、申請者らにとっては初めての経験であり、連携研究者であり専門家の西脇教授に様々な助言をもらいながら進めているが、思いのほか時間がかかっている。1.Nrf2発現制御因子と発現制御機構の解明ヒトNrf2及び新しいNrf2制御因子と考えられるWDR23, SKN-1cDNAを単離して、大腸菌での発現・精製を試み、抗体の作成を行った。Nrf2の抗体に関しては、これまでより、性能の良い抗体が作成できwestern blottingにおける非特異バンドが消失し、免疫沈降も可能となった。Hela細胞を用いたWDR23(isoform 1と2の存在を確認した)の過剰発現においては通常状態ではNrf2の発現量に変化がなかったが、tBHQ処理してKeap1を不活化した状態ではNrf2の発現量低下が見られた。一方、WDRの局在は核内で見られたことから、WDR23は核内でNrf2の発現調節に関わっている可能性が示唆された。2.Nrf2発現制御化合物としてのビスフェノールA(BPA)およびクロロゲン酸(CGA)の作用機序の解明BPAについては細胞内でCa2+の濃度を上昇させることで、一酸化窒素(NO)合成酵素を活性化することで、NOがKeap1を不活化してNrf2の発現量を上昇させること、さらにラットの実験でも同様のことが起こっている可能性を明らかにし、論文に報告した。現在BPAのターゲット因子を探索中であるが、これまで可能性が示唆されているTRPチャンネル、細胞膜に存在するエストロゲン受容体ではないとの結果は得ている。3.酸化ストレスが線虫の寿命に与える影響の検討これまでの検討で、様々な因子欠損線虫を用いることにより、BPAはskn-1発現に依存的に作用していること、CGAはskn-1, daf-16発現に依存的に作用していることが明らかとなった。BPA, CGAは共にskn-1下流因子で抗酸化因子であるgcs-1 mRNAを増加させ、gcs-1欠損体ではその影響が消失することが明らかとなった。ほぼ予定通りに進行した。哺乳動物におけるBPAによるNrf2発現量増加のメカニズムは解明し現在論文作成中である。線虫の変異体を用いた寿命検討では、線虫の操作に慣れていないせいで少し手間取っている。線虫SKN-1の大腸菌における発現精製には成功し、抗体を作成した。線虫のストック培養に不慣れなせいで、またskn-1ノックアウト、過剰発現の個体が十分得られておらず、これから抗体の性能を確認する予定である。また、線虫の因子に関しては、哺乳動物のようにその抗体が市販されておらず、当研究室では様々な因子の抗体作成法を確立しているので、western blottingや免疫沈降が可能な抗体を作成していく予定である。1.Siahの特異抗体作成と発現制御機構解明引き続き、大腸菌で発現した線虫Siahの可溶化の検討さらには抗体作成を行う。ヒト
重い電子系薄膜の界面設計による新奇超伝導相の創成

本研究は、独自の重い電子系超伝導体薄膜の作製技術を用い、ヘテロ構造による界面設計や超格子作製を行うことで、人工的に特異な超伝導物質の開発や新奇超伝導現象の探索を行うことを目的とする。前年度にトリコロール(三色)超格子における空間反転対称性の破れた超伝導状態の実現とその人工制御、および反強磁性体と超伝導体を交互積層したハイブリッド超格子における磁気揺らぎの注入による超強結合超伝導の実現に成功し、それぞれ今年度中にPhys. Rev. BおよびPhys. Rev. Lett.への掲載が決定した。さらに京都大学・石田教授のグループとの共同研究により、重い電子系超格子のNMR測定を行うことで,微視的な電子・磁気状態の解明に関する研究を行った。その結果、ハイブリッド超格子と磁性層を含まない超格子との比較から、隣接する反強磁性体CeRhIn5からCeCoIn5へと磁気ゆらぎが注入されていることを微視的に捉えた。今年度からトポロジカル超伝導のエッジ状態の観測を目指し、我々が開発したMBE-STM複合装置を用いた重い電子系薄膜のその場電子状態観測の研究を開始した。非磁性不純物のZnをドープしたCeCoIn5において、常伝導状態および超伝導状態における局所電子状態を調べた結果、不純物周辺で磁性や束縛状態が誘起されず、重い電子状態もほとんど変化しないことが明らかとなった。これは銅酸化物高温超伝導体とは大きく異なるものであり、遍歴性の強い重い電子系の性質を反映したものであると考えられる。この成果はJ. Phys. Soc. Jpn.に掲載された。さらに反強磁性体CeRhIn5のMBE-STM測定を行い、反強磁性状態における重い電子状態形成の証拠を得た。これは数十年来にわたる未解決問題を明らかにする上で極めて重要な知見であり、これまで提出されてた理論に大きな制約を与えるものである。29年度が最終年度であるため、記入しない。本研究は、我々のグループが世界で初めて成功した重い電子系超伝導体薄膜の界面設計により、トポロジカル超伝導を含めた新奇超伝導相の創成とその制御を行う。応募者らにノウハウが蓄積された技術を戦略的に展開することで、トポロジカル超伝導の物理を切り拓き、界面設計による新しい超伝導現象探索・超伝導物質開発の学理の基礎を築くことを目的とする。このような目的のもと、平成27年度には(1)重い電子系人工超格子における量子臨界性の解明、(2)重い電子系ハイブリッド超格子における超伝導特性の解明、(3)重い電子系トリコロール超格子における超伝導特性の解明に関する研究を行った。(1)重い電子系反強磁性体と通常金属の超格子を作製することにより、重い電子系反強磁性の2次元閉じ込めに成功し、2次元化による量子臨界状態の実現に成功した。また、磁場に対する量子臨界性の異方性がバルクとは逆になることが明らかとなった。(2)(1)をもとに、重い電子系反強磁性体と超伝導体による重い電子系ハイブリッド超格子を作製した。(1)から期待されるように、量子臨界状態と超伝導が共存することが明らかとなった。このような物質系は実現例がなく、新奇な超伝導状態が示唆される。(3)グローバルな空間反転対称性を破る超伝導物質を超格子作製によって開発することに成功した。従来の化学的物質開発では困難であった、空間反転対称性の破れの人工制御が可能であることを実証した。空間反転対称性に伴うスピンパリティの混成をも人工制御可能であることが示唆される。種々の重い電子系人工超格子作製の成功により、従来のバルク物質では実現不可能な物質系の作製が可能となっただけでなく、その超伝導状態がバルク物質とは大きく異なることが明らかとなってきた。したがって、本研究の最低限の到達目標となる界面設計による超伝導物質開発については、大きな進展があったと考えられる。ハイブリッド超格子の作製に成功し、当初予期していなかったような新しい超伝導状態することが明らかとなってきた。そのため、次年度以降にその超伝導状態を明らかにする研究も進める。また、トポロジカル超伝導のエッジ状態を観測するための走査型トンネル顕微鏡システムの準備が完了し、直ちに研究を進める体制が整った。当初の予定通りに次年度からエッジ状態観測のための研究を推進する。このような目的のもと、平成28年度には(1)重い電子系トリコロール超格子における超伝導特性の解明、(2)重い電子系ハイブリッド超格子における超伝導特性の解明、に関する研究を行った。(3)3種の異なる物質を交互積層した超格子作製を開発することに成功し、グローバルな空間反転対称性を破る超伝導物質を人工的に作製することに成功した。

また、面内磁場を印加した際に、上部臨界磁場に異常なふるまいが観測され、バルク物質では観測されて来なかった特異な高磁場超伝導相、ヘリカル超伝導相が出現している可能性が示唆された。(2)重い電子系反強磁性体と超伝導体交互積層した、重い電子系ハイブリッド超格子を作製した。層数制御によって量子臨界状態と超伝導が共存することが明らかとなった。このような物質系は実現例がなく、新奇な超伝導状態が示唆される。また、この物質に圧力を印加することによって、量子臨界状態を精密に制御できることが明らかとなった。量子臨界点近傍において上部臨界磁場の増大することが分かり、隣接する磁性層の量子臨界揺らぎが超伝導に大きな影響をおよぼすだけでなく、つい形成を強めることが明らかとなった。種々の重い電子系人工超格子作製の成功により、従来のバルク物質では実現不可能な物質系の作製が可能となっただけでなく、その超伝導状態がバルク物質とは大きく異なることが明らかとなってきた。したがって、本研究の最低限の到達目標となる界面設計による超伝導物質開発については、大きな進展があったと考えられる。ハイブリッド超格子の作製に成功し、当初予期していなかったような新しい超伝導状態することが明らかとなってきた。そのため、次年度以降にその超伝導状態を明らかにする研究も進める。また、トポロジカル超伝導のエッジ状態を観測するための走査型トンネル顕微鏡システムの準備が完了し、直ちに研究を進める体制が整った。当初の予定通りに次年度からエッジ状態観測のための研究を推進する。本研究は、独自の重い電子系超伝導体薄膜の作製技術を用い、ヘテロ構造による界面設計や超格子作製を行うことで、人工的に特異な超伝導物質の開発や新奇超伝導現象の探索を行うことを目的とする。前年度にトリコロール(三色)超格子における空間反転対称性の破れた超伝導状態の実現とその人工制御、および反強磁性体と超伝導体を交互積層したハイブリッド超格子における磁気揺らぎの注入による超強結合超伝導の実現に成功し、それぞれ今年度中にPhys. Rev. BおよびPhys. Rev. Lett.への掲載が決定した。さらに京都大学・石田教授のグループとの共同研究により、重い電子系超格子のNMR測定を行うことで,微視的な電子・磁気状態の解明に関する研究を行った。その結果、ハイブリッド超格子と磁性層を含まない超格子との比較から、隣接する反強磁性体CeRhIn5からCeCoIn5へと磁気ゆらぎが注入されていることを微視的に捉えた。今年度からトポロジカル超伝導のエッジ状態の観測を目指し、我々が開発したMBE-STM複合装置を用いた重い電子系薄膜のその場電子状態観測の研究を開始した。非磁性不純物のZnをドープしたCeCoIn5において、常伝導状態および超伝導状態における局所電子状態を調べた結果、不純物周辺で磁性や束縛状態が誘起されず、重い電子状態もほとんど変化しないことが明らかとなった。これは銅酸化物高温超伝導体とは大きく異なるものであり、遍歴性の強い重い電子系の性質を反映したものであると考えられる。この成果はJ. Phys. Soc. Jpn.に掲載された。さらに反強磁性体CeRhIn5のMBE-STM測定を行い、反強磁性状態における重い電子状態形成の証拠を得た。これは数十年来にわたる未解決問題を明らかにする上で極めて重要な知見であり、これまで提出されてた理論に大きな制約を与えるものである。
サブカルチャーと演劇-ベルリン・フォルクスビューネとプレンツラウアーベルク地区を例に

本年度は三年間の研究期間の成果をまとめ、学会誌・紀要で発表した。(2)「ベルリンをめぐる二人の劇作家-平田オリザと川村毅」<第四回シアターアーツ賞受賞論文(佳作)国際演劇評論家協会[AICT]日本センター主催>In:シアターアーツ(国際演劇評論家協会[AICT]日本センター編集委員会編集、晩成書房発行2000年7月)第12号136-143項。論文(1)で萌芽的に論じたベルリンと東京という二つの都市の比較演劇研究を、日本の若手演劇人の戯曲ではベルリンがどのように描かれているかという観点から、発展的に論じた。(3)「新しいシャウビューネの出発」In:「東京商船大学研究報告(人文科学)」(2000年12月)第51号27-38項。ベルリンの代表的公共劇場であるシャウビューネの芸術スタッフが入れ替わり、これまでサブカルチャーで活躍してきた若手演出家・俳優・振付家・ダンサーが登用された。この背景をサブカルチャーと劇場をめぐる文化的布置の変化と捉え、劇場の新しいあり方を模索する動きとして分析した。本研究はベルリンを研究対象とするものであったが、研究の進展と共にベルリンと東京の文化状況の比較研究へと研究範囲が広がりつつある。都市論・メディア論・演劇論という複数のジャンルにまたがる本研究は現時点では完結せず、さらなる継続的な展開が期待される。本年度はベルリン・フォルクスビューネへ依頼して上演作品のビデオテープを郵送してもらい、その分析を行った。また、演劇学関係の基礎文献を多量に購入した。さらにベルリンのサブカルチャー・シーンを扱う小説、情報誌、パンフレット(以上ドイツ語)及び関連する翻訳本を購入し、「サブカルチャーと演劇」の関係を分析するための基礎資料の整備に努めた。関連する資料を所蔵する国内大学図書館で資料収集を行なったのもその一環である。今後は、収集した資料をもとに国内外の学会、シンポジウムで発表を行ない、分析の成果を公表する。本年度は、昨年度に引き続いて演劇学関係の基礎資料、メディア社会学関係の基礎文献、および芸術学の文献を引き続き購入するとともに、昨年度購入した文献資料および収集したビデオ資料を分析し、学会等で論文発表を行った。本年度の研究の中心は、フォルクスビューネの演出家フランク・カストルフの演出傾向の特徴の分析である。その成果は、7月のシドニーでのシンポジウム「A Decade of German Literature,1989-1999」で発表した「Frank Castorfs Inszenierungen - Theatralische Herausforderung oderzuruck zur alten DDR-Identitat」に結実している。そこでは、カストルフの演出の特徴を浮遊する記号の暴力的切断と定義し、ここにカストルフのポストモダニズム批判が顕著に現れれるという結論を論じた。また、本研究から派生する演劇の東西比較研究では、8月に日本独文学会主催アジア地区ゲルマニスト会議で研究発表を行なった。そこでは、ドイツの劇作家ハイナー・ミュラーの「ハムレット・マシーン」を日本の演出家岡本章が演出したヴァージョンを分析し、アメリカの演出家ロバート・ウィルソンの演出を比較分析して発表した。
体内ロボットを用いる診断・治療システムの開発

(1)粘液を利用して体内で生体組織と直接接触することなく医療機器を推進させる機構を開発した.斜め方向にリブを加工した円筒をマイクロモーターで回転させて流体力学的に推進力を発生させることが出来た.数値解析と実験によりインペラーとリブの最適形状を決定することができ,また推進力の大きさと限界を明らかにすることができた.(2)生体管を模擬したビニール管内で機器を推進させて推進力と抵抗力の関係を明らかにした.さらに管の曲がりと分岐部での推進特性を調べた.(3)インペラーを超弾性ワイヤに取りつけてイヌの消化管内で推進させる実験を行った.口腔から順行性い推進した場合には十二指腸まで,肛門から逆行性の推進をした場合には上行結腸まで消化管を傷つけることなく容易に誘導することが出来た.(4)医療用マイクロロボットを製作し,透明な管の内部で移動させて推進力と速度を計測した.また推進に及ぼす屈曲,分岐,内径変化の影響を明らかにした.(5)粘液が不足する場合には人工粘液として麦芽糖,オリゴ糖,蜂蜜などの水溶液を供給することによって必要な推進力を維持することが出来た.(6)機器と生体組織のすきまを粘性流体で満たして振動を与えることにより摩擦を減少させる機構を明らかにした.これを利用して機器の挿入抵抗を減少させることができた.また,振動と往復運動を組み合わせて機器を自力で推進させることに成功した.(7)能動内視鏡や能動カテーテルではスペースの関係で先端部の動きが1自由度にとどまるが,磁力を外部から加えることを試みた.電磁石の電流量を制御することにより,屈曲部や分岐部で体外から機器を誘導する技術を開発した.(1)粘液を利用して体内で生体組織と直接接触することなく医療機器を推進させる機構を開発した.斜め方向にリブを加工した円筒をマイクロモーターで回転させて流体力学的に推進力を発生させることが出来た.数値解析と実験によりインペラーとリブの最適形状を決定することができ,また推進力の大きさと限界を明らかにすることができた.(2)生体管を模擬したビニール管内で機器を推進させて推進力と抵抗力の関係を明らかにした.さらに管の曲がりと分岐部での推進特性を調べた.(3)インペラーを超弾性ワイヤに取りつけてイヌの消化管内で推進させる実験を行った.口腔から順行性い推進した場合には十二指腸まで,肛門から逆行性の推進をした場合には上行結腸まで消化管を傷つけることなく容易に誘導することが出来た.(4)医療用マイクロロボットを製作し,透明な管の内部で移動させて推進力と速度を計測した.また推進に及ぼす屈曲,分岐,内径変化の影響を明らかにした.(5)粘液が不足する場合には人工粘液として麦芽糖,オリゴ糖,蜂蜜などの水溶液を供給することによって必要な推進力を維持することが出来た.(6)機器と生体組織のすきまを粘性流体で満たして振動を与えることにより摩擦を減少させる機構を明らかにした.これを利用して機器の挿入抵抗を減少させることができた.また,振動と往復運動を組み合わせて機器を自力で推進させることに成功した.(7)能動内視鏡や能動カテーテルではスペースの関係で先端部の動きが1自由度にとどまるが,磁力を外部から加えることを試みた.電磁石の電流量を制御することにより,屈曲部や分岐部で体外から機器を誘導する技術を開発した.診断,手術,薬剤送達を目的とするマイクロロボットを生体内で移動させるために、粘液を利用して生体組織と接触することなく推進させる技術に関する研究を行い,斜め方向にリブを配置したインペラ-を回転させることによって推進する機構について研究した.まず流体潤滑に基づく理論解析によって推進力を最大にする最適設計条件を与えた.次いで拡大モデルを用いて粘液の流動を調べるとともに,発生する推力と移動速度を計測した.その結果,実験値はほぼ理論的予測と一致したが,リブのスパンが大きい場合には推力が理論値より低く,また1N以上の推力を得ることは困難であった.透明なインペラ-を用いる可視化実験により,前者の原因はリブの間の二次流れ(渦)による損失であり,後者の原因は気液界面の不安定化による粘液への空気の混入であることを解明した.マイクロモータを用いる小型モデルを製作して透明な管の内部で移動させる実験を行った.推力と移動速度を計測した結果から,斜め方向にリブを加工したインペラ-を回転させることによってマイクロロボットを管内で確実に移動させうることを確認した.超弾性ワイヤによって後部からインペラ-を回転させる方法についても実験を行った.この場合には既存の内視鏡のチャンネルにワイヤを通して後部を回転させることによって,内視鏡を挿入することも可能である.超弾性ワイヤの先端部にインペラ-を装着した機器およびそれを内視鏡のチャンネルに装着した場合について,麻酔したイヌの体内で移動試験を行った.その結果,経口による順行性挿入の場合には十二指腸まで,経肛門の逆行性挿入の場合には上行結腸まで容易に到着させることができた.1.スパイラルリブを用い,粘液を利用して体内を移動する回転式推進機構における推カの限界がキャビテーションを伴う粘液膜の崩壊現象によるものであることを解明した。さらに,その対策には十分な粘液を供給し,回転速度をある値以下に保たなければならないことを明らかにした。2.軟式内視鏡をビニールチューブ内で誘導させ,内径,曲率,傾斜の推進力に及ぼす影響を調べた。3.ビーグル犬の消化

管内でスパイラルリブ付きインペラーを移動させ,またそれを利用して内視鏡を誘導させた。いずれの場合にも消化管への侵襲はほとんどみられず,経口による順行性の場合には十二指腸まで到達し,経肛門の逆行性の場合には上向結腸における回盲弁の近傍まで容易に到達した。4,粘液の不足を補うために供給する人工粘液の条件としては生体適合性が良いだけでなく,高せん断においても粘度降下があってはならない。そこで数多くの高粘度水溶液の特性を調査した結果,消化管に対する人工粘液としては麦芽糖,オリゴ糖,蜂蜜に適量の水を加えたものが最適であることを発見した。5.消化管内を移動するマイクロロボットを製作し,減速歯車付き超小型モータで駆動してビニールチューブ内を移動させた。チューブの内径,曲率及び粘液量の推進特性に及ぼす影響を調べた。その結果,曲がった部分を通過するためには,ロボットの外径だけでなく,その長さにも上限があることがわかった。その対策として自由に曲がることができる柔軟なロボットを開発することとした。6.生体組織と人工材料の間の摩擦力を制御して推進する往復動推進機構の研究を進めた。摩擦の制御に粘液の流体くさび作用,温度変化,振動を利用することを試み,いずれの場合にも推進のために有効である大幅な摩擦変化を実現させることができた。1.粘液を利用して内視鏡やカテーテルを生体組織と接触させることなく推進させる機器を開発した.ニッケルチタン製の超弾性ワイヤーの先端にスパイラルリブ付きインペラーを固定して後部から電磁モーターで回転させた.人口粘液としてチューブの内部にシリコン油またはオリゴ糖を供給し,透明なチューブの直線部,屈曲部,分岐部においてインペラーの回転によって発生する推進力を計測した.2.麻酔したビーグル犬の消化管の内部でこの機器を推進させた.経口による場合には噴門部の通過がやや困難であったが,それ以外は食道から胃を経て十二指腸まで容易に到達した.一方,逆行性の場合には肛門から上行結腸まで到達したが,大腸内ではインペラーがヒダのそこにはまり込む傾向があり,推進は困難であった.3.この機器のワイヤーを内視鏡の操作チャンネルに挿入してリブ付きインペラーによる内視鏡の誘導を試みた.挿入して内視鏡の抵抗が高くなったときにインペラーを回転させると抵抗が低くなって内視鏡がが容易に推進した.4.減速機付のマイクロモータにリブ付きインペラーを装着したマイクロロボットを製作してシリコンチューブ内を推進させ,その速度を計測した.5.生体組織と固体面を粘液を介して接触させて加振しつつ摩擦を測定した.振動させることによって摩擦を3分の1程度に減少させることが出来た.6.体外から電磁石によって血管カテーテルを誘導させる機構を開発した.計算機シミュレーションによって磁束密度と吸引力の3次元分布を調べ,実験によって血管の屈曲部と分岐部で任意の方向にカテーテルの先端を誘導出来ることを明らかにした.
初期胚細胞動態のインシリコ再構成技術と数理モデルの構築

本研究では、哺乳類着床前胚の4Dイメージデータを対象として、細胞核の位置を99%の精度で自動同定する画像解析アルゴリズムと1%のエラーを補正するGUIを開発した。これらを用いて得られるエラーフリーの細胞位置情報をもとに、細胞移動と細胞分裂に関わる最適化問題を解くことによって細胞集団のトラッキングを実装し、複数の胚でその発生動態をin silcoで再構成した。再構成した細胞系譜に様々な発生の情報をマップすることにより、発生を定量的かつ詳細に解析することが可能となった。また初期胚以外にも活用できる様々なバイオイメージ解析技術、データ解析技術、そして発生にかかわる個別現象の数理モデル構築を行った。発生過程の3D細胞配置を再構築可能な画像解析法のドラフト作成を行った。データとしては、共同研究を行った計画班がH21年度はじめにおいて取得済みであったマウスの初期胚データ、およびH21年度後半に取得した高解像度データを対象とした。計画に基づき、核の2D形状に関して細胞の位置を同定する手法を3Dに改良することを進めたが、3Dデータにおいて深さ方向の解像度の低さが大きな障害になることが判明した。この問題に対し、複数の画像解析アルゴリズムを開発しその有効性を検証するとともに、共同研究の計画班から新たな高解像度データの提供(H21.11月)を得て、より高画質のデータに適したアルゴリズムの検討とその性能限界の評価を行った。また3D空間内での細胞動態追跡に関しては、予備的な解析から各時間点での細胞位置の同定精度に結果が予想以上に大きく依存することがわかったので、今年度は核の位置同定精度の向上に重点を置いた。本年度に開発した画像解析の有効性を確かめるため、目視で確認し誤認識を手動で補正するためのGUIプログラムを医療画像解析用に開発されたソフトウェアPlutoを活用し構築した。また、これを用いて、開発したプログラムの精度評価に必要な正解データの作成も行った。以上の内容をまとめた論文を現在バイオインフォマティクス系の論文誌へ投稿準備中である。また数件対外発表を行った。数理モデルの基礎開発に関しては、画像データからの多細胞位置情報の取得に予想外に時間がかかることが想定されたことから、極性形成・細胞接触・分泌因子などの発生の基本過程を対象とした数理モデル構築をすすめた。より具体的には、細胞内での分化制御機構を対象とした簡略化モデルを用い、細胞の増殖に伴い、分泌因子による細胞間相互作用によって細胞の分化状態がどのように固定化されるかのシミュレーションを行った。また細胞の分裂軸に関わる極性形成に関する基本的なモデルも構築した。細胞膜形状の定量化は、細胞核の同定による細胞位置の定量化と同じく重要である。空間3D時間1Dの細胞膜の解析手法開発のプロトタイプとして、ショウジョウバエの細胞内極性形成データを用いて空間2D+時間1Dにおける細胞膜追跡の画像解析方法を構築した。具体的には、各種空間フィルタリング・モーフォロジー処理などを時間的に個別の画像に適用し、大まかな細胞膜の形状を推定した。タイムラプス画像のS/Nの低さから自動推定された結果は多くのエラーを含む。手動によるエラー訂正を自動の画像解析に組み合わせる方法を開発し、全体として高い精度を実現した。膜の解析法開発と並行して、細胞運動追跡を行う手法の蘭発を細胞同定が容易なチック胚発生のデータを用いて行った。空間2D時間1Dのデータを空間3Dの画像であるとみなして連結領域を追跡することにより、細胞の形状の変化も考慮したトラッキング手法を検討した。細胞接触などが頻繁に起こらない場合には非常に良い結果が得られたが、接触が頻繁に起こる場合、接触細胞のIDを客観的に決定することが難しくさらなる拡張が必要であることが明らかになった。細胞や細胞内分子などの粒子が示す空間的な運動を扱う空間統計的なデータ解析手法を開発した。非常にランダムに振る舞う細胞内極性形成に関わる小胞の移動方向と移動距離の統計的パターンを解析し、非対称局在をする分子に関わる小胞の移動方向に偏りがあることが示唆された。さらに野生型と変異型の差異の有意性を解析するための方法として、リサンプリングによる解析を行いその有効性を検討した。また、3次元空間内での分子・細胞の配置やその確率的ダイナミクスをデータ解析するための手法として、KL距離による確率的ダイナミクスの定量化とPCAを組み合わせた手法の開発も行った。開発を進めてきた核位置の3D同定手法を発展させ、比較的広い範囲の初期胚発生段階(232細胞)細胞核の位置を同定する手法を開発した。前年度までに導入したGUIなどを用いて核認識精度を評価するための正解データを構築し、90%弱の精度で同定ができていることを定量的に示した。その内容を各種学会で報告し論文として取りまとめPlos Oneに採択された。

核同定の結果を用いて核追跡アルゴリズムの検討を行った結果、時間的トラッキングを安定に行うためには90%の精度では不十分であり、核数が一定(2,4,8細胞)の場合を除き核同定の精度を更に高める必要があることが定量的にわかた。また、トラッキング結果を評価する正解データを作成したが、現時点のGUIでは時間的に異なる核を手動で対応させる作業には不十分でありヒューマンエラーが無視できないことがわかった。そのため新たな画像処理系ソフトの検討を行いAmiraを導入した。核同定精度のさらなる向上のため、時間的に隣接する画像からの同定結果を再帰的に活用する形にPlos Oneの結果を改良し、精度向上の検討を行った。並行して、他グループから発表されたグラフに基づく新しい核同定手法の予備的検討と解析をすすめ、その結果をIEEE EMBC'13に投稿した。さらに解析に用いるデータセットの変更による同定精度の向上の可能性についても共同研究者とともに検討をすすめた。数理モデルに関しては、前年度からの検討をしていた細胞分化状態の確率的運命決定の理論に関して解析を進め国内外の会議で発表をした。また、これまでの解析を細胞集団における運命決定問題に拡張した結果をFrontiers in Physiologyに投稿し、論文が採択された。本研究および画像解析などに基づく定量的なイメージデータの活用に関して、生化学会大会および日本顕微鏡学会などで招待講演を行った。これまでに構築した画像解析手法・手動補正GUIを用い、1632細胞期までの細胞核位置のエラフリーデータを5つの胚について作成した。また、短いタイムインターバル(10min)を持つデータについても同手法を適用し、3胚の解析を行った。短いタイムインターバルのデータは16細胞期以降の画像解析エラーが大きいため、前年度から用いてきた15minインターバルの5胚についてさらなる解析を進めた。前年度に問題となった細胞増殖時のトラッキング問題に対し、時間前方向・逆方向でのトラッキングの整合性を用いる方法や、細胞分裂時の娘細胞の動きの傾向などを考慮する方法などを検討し、分裂時に娘細胞が対称な方向に移動しやすい情報を用いて対応付けを最適化問題として定式化することにより、高い精度でトラッキングができることを確認した。この手法を用いて、5胚についての完全なトラッキングデータを作成した。この結果を用いて発生過程の細胞分裂系譜図を作成し、その系譜の上に細胞位置だけではなく他の様々なパラメータをマッピングするシステムも構築した。このシステムを用いて検討をした結果、核イメージの体積と表面積比で定義されるゆがみ度と細胞分裂のタイミングが強く相関しており、ゆがみ度を核同定やトラッキングにおける潜在的な誤りの検出に利用できることが分かった。更に細胞増殖系の系譜解析のための数理モデル研究を進め、経路積分表示に基づく細胞動態の記述を活用することにより、増殖からくる影響と細胞状態の確率的遷移からくる影響とを定量的に評価する手法を構築した。前年度までに構築した細胞核位置を99%で同定するアルゴリズムについてはPlos Oneに論文を投稿し、細胞系譜の統計検定法についてはPlos Biologyに採択された。
網膜解毒機構としての網膜関門排出輸送担体の同定と生理的役割

血液網膜関門(BRB)は、網膜内の神経活動で産生される神経伝達物質やホルモンの代謝物である有機アニオンおよび網膜内に移行した薬物を排出する解毒機構を有すると考えられるが、その機構は今のところ不明である。本研究は、BRBにおける有機アニオン排出輸送機構を解明し、その輸送担体を同定することを目的とした。モデル有機アニオンとして、estradiol 17-βglucuronide([3H]E17βG)及びρ-[3H]amino-hippuric acid([3H]PAH)とbulk flowマーカーとして、[14C]D-mannitolとを同時に硝子体内に投与し、マイクロダイアリシス法を用いて硝子体における[3H]標識薬物と[14C]D-mannitolの濃度推移を測定し、[3H]E17βG及び[3H]PAHのBRBを介した排出輸送を評価した。内側血液網膜関門(iBRB)のmRNA発現量は、磁気ビーズ標識抗CD31抗体を用いてiBRBの実体である網膜毛細血管内皮細胞を単離し、リアルタイム定量PCRを用いて解析した。[3H]E17βG及び[3H]PAHの硝子体からの消失速度定数は[14C]D-mannitolの消失速度定数よりも約2倍高いことが示され、E17βG及びPAHの硝子体からの消失は眼房水等からのbulk flowだけでなくBRBを介して排出されていることが示唆された。さらに、[3H]E17βGの排出はorganic anion tra-nsporter(oat)の基質や阻害剤及び[3H]PAHの排出は、有機アニオントランスポーター(OAT)の基質や阻害剤において有意に阻害された。以上の結果から、[3H]E17βG及び[3H]PAHのBRBを介した排出にはそれぞれoatpやOATが関与していることが示唆された。Oatp及びOAT発現解析からoatp2及びOAT3がmRNA及びタンパクレベルで網膜血管内皮細胞において発現していることが示された。さらに、二重免疫染色解析法からrOAT3は網膜毛細血管内皮細胞のabluminal側に局在していることが示唆された。以上の結果から、E17βG及びPAHは硝子体から血液側へBRBの輸送担体を介して排出輸送されており、その排出には少なくともoatpやOAT3が関与していることが示唆された。モデル有機アニオンとして、p-[^3H]aminohippuric acid([^3H]PAH)とbulk flow

マーカーとして、[^<14>C]D-mannitolとを同時に硝子体内に投与し、マイクロダイアリシス法を用いて硝子体における[^3H]標識薬物と[^<14>C]D-mannitolの濃度推移を測定し、[^3H]PAHのBRBを介した排出輸送を評価した。内側血液網膜関門(iBRB)のmRNA発現量は、磁気ビーズ標識抗CD31抗体を用いてiBRBの実体である網膜毛細血管内皮細胞を単離し、リアルタイム定量PCRを用いて解析した。[^3H]PAHの硝子体からの消失速度定数は[^<14>C]D-mannitolの消失速度定数よりも約2倍高いことが示され、PAHの硝子体からの消失は眼房水等からのbulk flowだけでなくBRBを介して排出されていることが示唆された。さらに、有機アニオントランスポーター(OAT)の基質や阻害剤であるPAH、benzylpenicilin、probenecidおよびsulfobromophthalein存在下において、[^3H]PAHの排出は有意に阻害された。以上の結果から、[^3H]PAHのBRBを介した排出にはOATが関与していることが示唆された。OAT発現解析からOAT3がmRNAおよびタンパクレベルで網膜血管内皮細胞において発現していることが示された。さらに、二重免疫染色解析法からrOAT3は網膜毛細血管内皮細胞のabluminal側に局在していることが示唆された。以上の結果から、PAHは硝子体から血液側へBRBの輸送担体を介して排出輸送されており、その排出には少なくともOAT3が関与していることが示唆された。
篩管内での情報伝達機構の解明

植物は外界からの刺激に反応し、その情報を他の部位に伝えるが、このような各器官間の情報の長距離輸送は主として篩管を通じて行われると考えられている。現在まで、植物ホルモンなどのような低分子化合物によるもの、ペプチドによるもの、さらには、電気的なシグナルによるものが考えられており、その幾つかについては、詳細な研究が進められている。篩管の中での、何らかのセカンドメッセンジャーの変動やプロテインキナーゼの存在を明らかにすることができれば、どのような情報伝達の仕組みが存在するのかを明らかにすることができる筈である。これまで我々の研究グループは、篩管内でタンパク質のリン酸化反応が起こっていることを世界に先駆けて発見しており、この反応と情報伝達の係わりの解明が待たれていた。本年度は,1)篩管内に存在するタンパク質の同定とと遺伝子のクローニング,および2)情報伝達に関与すると考えられるキナーゼの同定の性質を明らかにすることを目的としていた。イネ篩管液1ml中のタンパク質を精製し,二次元電気泳動により分離した後,特に多く存在するタンパク質のスポットを気相シークエンサーにかけ,その一次配列を決定した。得られた配列よりオリゴヌクレオチドを合成し,cDNAライブラリーをスクリーニングし,篩管液タンパク質のうち最も多く存在するものの一次構造を明らかにした。相同性検索の結果,このタンパク質はチオレドキシンと高い相同性を持つことが明らかになった。篩管内にチオレドキシンが多く存在することは,植物の防御機構を考えるうえで新たな知見を与えるものと考える。また,篩管内に存在するキナーゼの性質も明らかにした。試験管内の実験によれば,篩管に存在するキナーゼはカルシウムイオンのみにより活性化され,カルシウムとの結合能を備えていた。イネ篩管内に存在するキン-ゼは,分子量約7万であり,植物に特徴的に存在するカルシウム依存性タンパク質リン酸酵素であると決定した。本年度の研究成果は,植物における情報の長距離輸送を考えるうえで新たな考え方を導入する契機になると考えている。
ウイルス移行タンパク質と相互作用する植物因子KELPによる感染抑制作用の研究

植物ウイルスに対する抵抗性植物の開発には、植物が本来もつウイルス抵抗性遺伝子の作用機序を分子レベルで明らかにする必要がある。本研究では、ウイルスの感染拡大を抑制する作用をもつ植物遺伝子KELPの機能解析を進めた。その結果、多くの植物に保存されているKELPは、少なくとも2種のウイルス因子(移行タンパク質)と細胞内で相互作用して、その因子の本来の機能を阻害することにより、ウイルスの感染を抑制していることが示唆された。ToMV MPと相互作用する植物因子KELPによる感染抑制作用を明らかにするため以下の3つのテーマについて実験を行った。(テーマ1)一過性過剰発現系におけるKELPのウイルス移行阻害機構の解析を目的とし、以下の3つの実験を行った。(1) bimolecular fluorescence complementation法に用いるプラスミドの作製およびMPとKELPの相互作用について検証した。(2) MPとGFPの融合タンパク質をコードするToMV感染性クローンを含む遺伝子導入用プラスミドを作製した。ウイルス感染時において、KELP過剰発現がMPの細胞内局在を変化させることを示唆するデータを得た。(3) KELPの配列に核排出シグナルを付加し、核に局在できないKELPの遺伝子発現プラスミドの構築を試みた。そのプラスミドを用いて実験を行ったが、KELPを完全に核から排除できなかった。(テーマ2)シロイヌナズナを用いたKELPの機能解析および遺伝子発現解析を行うため、KELP遺伝子の過剰発現体および欠損変異体の系統を選抜し、ホモ系統を確立した。ToMV粒子を接種し、ウエスタンブロット解析(外被タンパク質の検出)を経時的に行い、欠損変異体ではウイルスの感染初期において増殖が高まっていることを示唆するデータを得た。(テーマ3)KLEPホモログのウイルス感染抑制機能の検証を目的として、トマト(Lycopersicon esculentum)、イネ(Oryza sativa)、タバコ(Nicotiana tabacum)やN.benthamianaからのKELPホモログのクローニングを行い、遺伝子発現ベクターに導入した。以上の成果は、KELPがウイルス感染抑制因子として働くことを示すと同時に、今後の更なる機能解明に貢献するものである。トマトモザイクウイルス(ToMV)あるいはキュウリモザイクウイルス(CMV)のMP(移行タンパク質)と結合する能力を有する植物因子KELP (Arabidopsis thaliana由来)が植物ウイルスの移行をどのように抑制するのか、特にMPの機能にどのように作用しているのかという点に関して分子レベルでの解析をさらに進めた。(1) bimolecular fluorescence complementation法を利用し、KELPとMPのin vivoでの相互作用を確認することができた。(2) MPとGFPの融合タンパク質をコードするToMV感染性クローンを含む遺伝子導入用プラスミドを利用し、ウイルス感染時における、KELPの一過的過剰発現によるMPの細胞内局在の経時的な変化を調べた。その結果、MP-GFP融合タンパク質を発現するウイルスは、自身の細胞間移行が著しく抑制されると同時に、MP-GFPの細胞内局在も大きく変化することが分かった。(1)と(2)から、KELPはウイルス感染時にMPと相互作用し、MPの機能を阻害することでウイルスの移行を抑制しているというモデルが考えられた。(3)ブラシカ植物(Brassica campestris)、トマト(Lycopersicon esculentum)、イネ(Oryza sativa)、タバコ(Nicotiana tabacum)に由来するKELPホモログのcDNAを利用し、ウイルスの細胞間移行における抑制効果を調べた。その結果、これらのホモログは全て、一過的過剰発現下で、ToMVの細胞間移行を抑制することが分かった。また、CMVMPをコードする組換えToMV感染性クローンに対するKELPの移行抑制効果を検証したところ、この組換えウイルスの移行も抑制できることが分かった。本研究から、KELPは多くの植物に保存された、異種ウイルスの細胞間移行を抑制することのできる有用な遺伝子である可能性が示され、効果的なウイルス抵抗性植物の作出に向けて重要なデータを得ることができた。
2次元運動機能を持つ物性測定器による、咀嚼運動とテクスチャー感知との関連性の解明

研究目的咀嚼運動によって感知されるテクスチャーという視点から、人間の咀嚼運動に近づけた「咀嚼ロボットによる物性評価研究」によって2次元運動機能を持つ物性測定器の開発が完成した。本研究は開発した測定器をテクスチャー測定機器としての実用化につなげることを目的とした。研究成果一般食品より均質で安定性のある試料を検討し、破断力や破断ひずみを任意に設定できるものとして、寒天ゲル(以下A)、カラギーナンゲル(以下K)、ゼラチンゲル(以下Z)を用いた9種類の試料を設定した。テクスチャーアナライザーを用いて、硬さを測定し、低強度(15N)のゲルとしてA2.5%濃度、K8.5%濃度、Z7.5%濃度を採用した。中程度(30N)の強度はA4.5%、K12.5%、Z11%、高強度(45N)はA6.5%、K17.5%、Z16%を採用した。試料の破断ひずみはゼラチンが最も大きく、ついでカラギーナン、寒天となり、破断力・破断ひずみがそれぞれ異なる試料を得た。2次元圧縮測定器による測定方法は、従来の1次元圧縮とは異なり、側方運動を負荷するため、プランジャーは底面1mm幅、30mm長さの刃型とした。各試料破断点に達するまでの側方運動距離を今回0,3,6,9mmに設定し、側方運動距離すなわち、すり切る距離によって破断力がどのように変化するかを検討した。圧縮速度は10・40・80mm/secと3段階に変化させ、破断力を測定した。その結果、側方距離の増加により、破断力は3種類のゲル化剤でともに低下した。側方距離における破断力の変化は、ひずみの最も大きいゼラチンで顕著で、次いでカラギーナン,寒天の順であった。また、圧縮速度の増加における変化では、寒天は速度が増すほど硬さの程度に関わらずわずかながら破断力が増加し、カラギーナンは速度の増加に伴い破断力の低下がみられ、ゼラチンは速度が増すほど著しく破断力が増加した。最も変化が大きかったのは、ひずみの大きいゼラチンであった。これより、物性の破断に要する力は圧縮速度やすり切り方法等によって変化することが示された。義歯装着での咀嚼の大きな特徴は、側方運動量の低下にある。そのような場合、ひずみの大きな食品で噛みきりにくさが生じやすく、口腔内での咀嚼運動の変化によってテクスチャー認知が変化することが示唆された。本機器を用いることで義歯装着に伴うテクスチャー認知の変化を、客観的に評価することが期待でき、今後は日常食品を使用しての研究展開をしていく。

本機器を用いることで義歯装着に伴うテクスチャー認知の変化を、客観的に評価することが期待でき、今後は日常食品を使用しての研究展開をしていく。研究目的咀嚼運動によって感知されるテクスチャーという視点で咀嚼運動に近づけた「咀嚼ロボットによる物性評価研究」により2次元運動機能を持つ物性測定器の開発が完成した。本研究は開発した測定器をテクスチャー測定機器としての実用化につなげることを目的とした。研究成果一般食品より均質で安定性のある試料を検討し、破断力や破断ひずみを任意に設定できるものとして、寒天ゲル(以下A)、カラギーナンゲル(以下K)、ゼラチンゲル(以下Z)を用いた9種類の試料の設定を行った。テクスチャーアナライザーを用いて、直径10mmの円柱プランジャー、圧縮速度10mm/sec、90%圧縮で測定し、低強度(1.5kg)のゲルとしてA2.5%濃度、K8.5%濃度、Z7.5%濃度を採用した。中程度(3.0kg)の強度はA4.5%、K12.5%、Z11%、高強度(4.5kg)はA6.5%、K17.5%、Z16%を採用することができた。ゲルの調整は20mm×20mm×10mmサイズに型入れし、10°Cで18時間冷却した。試料の破断ひずみはゼラチンが最も大きく、ついでカラギーナン、寒天となり、破断力・破断ひずみがそれぞれ異なる試料を得た。これらの試料を2次元運動測定器を用いて破断力の変化を検討した。従来の1次元圧縮とは異なり、側方運動を負荷するため、プランジャーは底面1mm幅、30mm長さの刃型とした。各試料破断点に達するまでの側方運動距離を今回0,3,6,9mmに設定し、側方運動距離すなわちすり切る距離によって破断力がどのように変化するかを検討した。測定速度は10mm/secとした。測定の結果いずれの試料も、側方運動距離が大きくなるほど破断力が小さくなることが示され、9mmでは側方運動を負荷しない0mmでの測定結果の60-70%程度の破断力に低下した。低下の程度は試料の硬さよりひずみの影響を受け、破断力がもっとも低下したのは、ひずみが大きいゼラチンであった。義歯装着での咀嚼の大きな特徴は、側方運動量の低下にある。そのような場合、ひずみの大きな食品で噛みきりにくさが生じやすいことが示唆された。次年度はより咀嚼運動に近づけた状態での測定を行い、咀嚼によって感知されるテクスチャーの客観測定方法の実現に近づけたい。研究目的咀嚼運動によって感知されるテクスチャーという視点で咀嚼運動に近づけた。「咀嚼ロボットによる物性評価研究」により2次元運動機能を持つ物性測定器の開発が完成した。研究成果一般食品より均質で安定感のある試料を検討し、破断力や破断ひずみを任意に設定できるものとして、寒天ゲル(以下A)、カラギーナンゲル(以下K)、ゼラチンゲル(以下Z)を用いた9種類の試料の設定を行った。テクスチャーアナライザーを用いて、硬さを測定し、低強度(15N)のゲルとしてA2.5%濃度、K8.5%濃度、Z7.5%濃度を採用した。中程度(30N)の強度はA4.5%、K12.5%、Z11%、高強度(45N)はA6.5%、K17.5%、Z16%を採用した。2次元圧縮測定器による測定方法は、上下による圧縮程度は破断点より1-2mm多く圧縮し、側方運動距離を、0.3.6.9mmの4段階に変化させた。また圧縮速度は10・40・80mm/secと3段階に変化させ、破断力を測定した。その結果、側方距離の増加により、破断力は3種類のゲル化剤でともに低下した。側方距離における破断力の変化は、ひずみの最も大きいゼラチンで顕著で、次いでカラギーナン、寒天の順であった。
神経栄養因子とその受容体の遺伝子発現よりみた虚血性脳創傷修復機構の解析

これまで2年間の本研究班公募研究で、虚血性損傷や外傷性損傷にともなうFGFおよびFGF受容体の遺伝子発現をin situ hybridizationを中心に研究してきた。本年度は神経細胞に抑制的に作用する成長制御因子(GIF)について重点的に検討した。その結果、虚血性損傷、外傷性損傷とも損傷1日後には損傷周囲皮質でGIFの発現は低下し、4日後に一過性に損傷側皮質全般に発現が亢進した。これは損傷に伴う神経細胞の初期修復反応として理解できる。その後2週間して損傷部近辺に限局性のGIF発現亢進部位がみられ、アストロサイトによるものと判断できるがその意義については明らかではない。GIFと神経細胞機能の関係をみるため、顔面神経損傷後の顔面神経核でのGIFの発現を検討すると、損傷3日後に神経核でのGIFの発現低下がみられるが、これは軸索損傷後の神経細胞の突起進展に相応したGIFの発現抑制と判断できる。また、顔面神経の損傷条件を圧挫、切断後再接着、切断のみと変えると機能回復までの期間はこの順に長くなるが、これに一致してGIFの発現抑制期間が長くなる。このことからGIFの発現と神経機能がよく相関することが示された。次に虚血耐性現象を解析するため、培養神経細胞を用いた低酸素耐性モデルを開発し、この低酸素耐性への線維芽細胞成長因子(FGF)の関与を検討した。その結果、軽度の低酸素負荷によりFGFのmRNAと蛋白が発現し、これがその後の致死的な低酸素負荷に対して耐性を獲得することと関連するものと判断できる。また未知の耐性関連遺伝子を探索するため、differential display法で現在解析中であるが、これまでにその候補となる3つの遺伝子をつり上げ、その全構造解析と役割について検討中である。
プリオンタンパクの小胞輸送に関与するRAB11およびSGSMファミリーの機能解析

SGSM(Small G protein Signaling Modulator)ファミリータンパクは、プリオンタンパクの小胞輸送に関与するRAB11タンパクと相互作用し、ヒトの遺伝性プリオン病の発症機序に関与することが考えられる。本研究では、様々な分子生物学的手法を用いて、SGSMファミリーとRABファミリーとの相互作用を解析したところ、SGSM2タンパクがRAB11タンパクと相互作用することが明らかとなった。また、SGSM2と相互作用するRAPタンパクの機能について解析したところ、RAPタンパクの活性化型がリサイクリングエンドソームからゴルジ装置までの細胞内逆行性輸送を制御することが分かった。SGSMファミリータンパク(SGSM1/2/3)は、RUNドメイン、TBCドメインを併せ持ち、RAPを介した細胞内シグナル伝達経路およびRABを介した小胞輸送システムを統合的に制御し、プリオンタンパクの小胞輸送に関与することが考えられる。H23年度の実験結果に基づいて、小胞輸送におけるSGSM2の機能をさらに解析した。細胞免疫染色により、SGSM2はプリオンタンパク輸送に関与するRAB11と共局在するが、RAB6/9とは共局在しないことが分かった。Mammalian Two-Hybrid Systemおよびin vitroアッセイでSGSM2と相互作用を示したRAB3/4/5/7/8/24/27/31/32/33Bについて、細胞免疫染色により、SGSM2と共局在しないことが分かった。また、コレラ毒素(CTxB)を用いてエンドサイトーシスアッセイを行ったところ、SGSM2を強制発現させた細胞では、CTxBのエンドソームからゴルジ装置への輸送が阻害された。一方、RUNドメインを欠失したSGSM2の部分欠失変異体を強制発現させたところ、CTxBのゴルジ装置への輸送が阻害された。これらの結果から、SGSM2のTBCドメインは、エンドソームからゴルジ装置までの細胞内小胞輸送系に必須であることが示唆された。RAPタンパクの活性型変異体および不活性化型変異体を作成し、強制発現させ、エンドサイトーシスアッセイを行ったところ、活性型変異体がCTxBのエンドソームからゴルジ装置への輸送を阻害することが分かった。また、RAPタンパクの活性型変異体を強制発現させた細胞においてSGSM2の発現をノックダウンしたところ、CTxBがゴルジ装置まで輸送されたことから、RAPタンパクがSGSM2を介して細胞内逆行性輸送に関与することが分かった。SGSM(Small G protein Signaling Modulator)ファミリーは、RABファミリーおよびRAPファミリーと相互作用し、シグナル伝達および小胞輸送に関与することが報告された。SGSMファミリーはRABファミリーを介して、プリオンタンパクの小胞輸送を制御し、ヒトの遺伝性プリオン病の発症機序に関与することが考えられる。ヒトプリオン遺伝子cDNAの全長ORF(Open Reading Frame)をクローニングし、p3XFLAG-CMV-7.1ベクターに挿入した。FLAGタグ付加したプリオンタンパクを強制発現させ、抗FLAG抗体を用いた免疫沈降を行った後、数種の抗RABタンパク抗体を用いて、Western Blotの手法でプリオンタンパクと相互作用するRABタンパクを確認した。また、作製したウサギ抗SGSM2抗体、市販のマウス抗プリオンタンパク抗体および様々な細胞小器官マーカー抗体を用いて、内在性のSGSM2およびプリオンの細胞内局在を確認した。抗SGSM2抗体、抗プリオンタンパク抗体および様々な輸送小胞のマーカー抗体を用いた共免疫染色を行い、SGSM2およびプリオンと輸送小胞との相互作用を確認した。また抗SGSM2抗体と数種の抗RABタンパク抗体を用いた共免疫染色を行い、SGSM2タンパクがRABタンパクと部分的に共局在することは確認された。ヒトSGSM遺伝子(SGSM1/2/3)cDNAのORFをそれぞれpACTベクターに、ヒトRAB遺伝子cDNA(RAB2A/3A/4A/5A/6A/7A/8A/9A/10/11A/23/24/27A/31A/39B)のORFをそれぞれpBINDベクターに組み込み、Check-Mate Mammalian Two-Hybrid Systemを用いて、SGSMタンパクとRABタンパクとの相互作用を確認した。ヒトプリオン遺伝子cDNAをクローニングし、免疫沈降の手法でプリオンタンパクと相互作用するRABタンパクを確認した。また、共免疫染色の手法を用いて、SGSM2タンパク、プリオンタンパクおよび輸送小胞の細胞内局在および相互作用を確認した。ヒトSGSMファミリー遺伝子および数種のRAB遺伝子をクローニングし、Mammalian 2-hybrid systemを構築して、SGSMタンパクとRABタンパクとの相互作用を確認した。H23年度構築したMammalian 2-hybrid実験系を利用し、残る代表的なRABファミリーメンバーを全部クローニングし、SGSMファミリータンパクとの相互作用を測定する。

SGSMタンパクがプリオンタンパクの輸送に関与すると予想されたため、RNAi法を用いて、SGSMタンパクおよびRABタンパクに対する機能阻害実験を行い、プリオンタンパクおよび関連する神経伝達物質の輸送の制御機序を解析する。本研究用の試薬およびプラスチック器具の購入に120万円、成果発表の旅費に30万円を使用する予定である。