hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
神経幹細胞の維持・分化制御に関わる転写機構の解析とその神経難病治療への応用

オリゴデンドロサイトは、神経幹細胞から産み出されるグリア細胞である。本研究では、オリゴデンドロサイトの発生に必須のOlig2転写因子と結合する新規分子をスクリーニングして同定したOBP1とOBP2について調べた。OBP2遺伝子をマウス胎児脳で強制発現すると、ミエリン関連遺伝子の発現が誘導された。また、OBP2遺伝子の中枢神経系特異的な遺伝子変異マウスを作成すると脳の発生異常が生じ、出生直後に致死となることが判明した。平成24年度は、Olig2転写因子に結合する因子をニワトリ胚に単独、あるいは、共発現することにより機能発現実験を行った。エレクトロポレーション法を用いてニワトリ胚に外来遺伝子を導入する際に、エレクトロポレーションの操作自体が胚の細胞にダメージを与えるので、遺伝子導入の条件の最適化を行い、細胞増殖や組織構築への影響のほとんどない至適条件を見出した。この条件を用いて、ニワトリ胚の脊髄における機能発現実験を行ったところ、1つの結合因子(OBP2)では、全長タンパクの発現でミエリン関連遺伝子発現の誘導が起こらないにもかかわらず、N末端を欠失したタンパクの発現ではミエリン関連遺伝子の誘導がおこることがわかった。この欠失タンパクはOlig2への結合能を有するので、Olig2とOBP2の相互作用がオリゴデンドロサイトの発生を制御していることが示唆される。Olig2転写因子はN末端でリン酸化を受けることが知られている。リン酸化Olig2に似せたリン酸化Olig2変異体と、非リン酸化Olig2変異体、および、野生型Olig2の発現ベクターを、ニワトリ胚に遺伝子導入して、オリゴデンドロサイト分化誘導能に違いがあるかどうかを検討している。平成25年度は、オリゴデンドロサイト分化を制御するbasic helix-loop-helix型転写因子であるOlig2に結合するOBP2遺伝子についての発現解析と遺伝子改変マウスの作製を行った。OBP2遺伝子は、オリゴデンドロサイト前駆細胞が産み出される領域に発現していることがわかった。また、遺伝子改変マウスの作製では、相同組換えをおこしたES細胞を作製し、キメラマウスの作製まで行った。リン酸化Olig2転写因子の解析では、リン酸化Olig2に似せたOlig2変異体と、リン酸化を受けないOlig2変異体のオリゴデンドロサイト分化誘導能に違いがあるかどうかをニワトリ胚のエレクトロポレーションにて確認した。両者には、ある条件下では若干の誘導能の差があることが観察された。平成23年度は、主に2つの実験を行った。1つ目は、Olig2のN末におけるリン酸化酵素を同定する目的で、in vitroリン酸化アッセイを行った。GST-野生型Olig2融合タンパクと、N末リン酸化部位に変異をいれたGST-非リン酸化Olig2融合タンパクを精製し、各種リン酸化酵素とin vitroでインキュベーションを行った。GST-野生型Olig2に、より多くのリン酸基を付加するリン酸化酵素を複数同定することができた。現在、N末リン酸化の生理学的意義を調べるために、ニワトリ胚におけるエレクトロポレーション法を用いた遺伝子導入実験を行っている。2つ目は、Olig2転写因子が働く分子メカニズムを明らかにするために、Olig2結合因子の解析を行っている。野生型Olig2あるいは非リン酸化型Olig2との免疫沈降実験により、野生型Olig2に強く結合するもの、非リン酸化型Olig2に強く結合するもの、両方に効率よく結合するものに分類できることがわかった。これらの因子との相互作用が細胞分化に果たす役割を解析している。また、一つのOlig2結合因子に着目し、その遺伝子のノックアウトマウスを作製したところ、進行性の神経症状を示すことが判明した。平成26年度は、オリゴデンドロサイト分化を制御するbasic helix-llop-helix型転写因子Olig2に結合するOBP2についての解析を行った。OBP2のマウス胎児脳における異所性発現を行うと、オリゴデンドロサイトマーカーであるミエリン関連遺伝子の発現が上昇することが明らかとなり、その長期的に分化オリゴデンドロサイトが維持されるかどうかについて調べた。また、OBP2遺伝子の変異アリールをもつ遺伝子改変マウスの作製を進めて、キメラマウスから変異アリールをもつマウスの作出に成功した。今後掛け合わせを進めて、遺伝子ノックアウトマウスの表現型解析を進める。平成27年度は、オリゴデンドロサイト分化を制御するbasic helix-loop-helix型転写因子Olig2に結合する因子として同定されたOBP2についての解析を引き続き行った。マウス胎児脳にOBP2をエレクトロポレーション法にて異所性発現すると、オリゴデンドロサイト関連遺伝子が発現上昇するのみならず、OBP2発現細胞の形態がオリゴデンドロサイト様に変化することがわかった。また、OBP2のfloxアリールの作成にも成功しており、中枢神経系特異的なコンディショナルノックアウトマウスの作成により、出生後致死になることが明らかとなった。グリア細胞分化に対する影響を含めて表現型解析を行い、現在論文にまとめている。

遺伝子変異マウスの作出に成功しているので、今後、本マウスを用いて、OBP2遺伝子のオリゴデンドロサイト分化における役割を解明できることが期待される。神経解剖学遺伝子改変マウス作成が予定よりも時間がかかったので、掛け合わせ実験を進めるために、本研究の研究期間の延長を行った。ニワトリ胚におけるエレクトロポレーション法の良い実験条件を見出して、機能発現実験を行ってきており、Olig2結合因子の機能解析は順調に進んでいると考えられる。遺伝子改変マウスの作製では、キメラマウスまで作製しているが、germ line transmissionが起こり遺伝子改変マウスの作製に成功するかかどうかは、今後の進展にかかっている。リン酸化酵素の同定、さらには、Olig2転写因子の同定と解析がおおむね順調に進展している。進行性の神経症状を示す新たな遺伝子改変マウスを作製できたので、その病態解析を行うことにより、研究の新たな展開が期待される。本研究計画は、遺伝子改変マウスを作成する計画であったが、作成に至るまでに予定より時間がかかった。平成25年度も継続して、ニワトリ胚を用いた機能発現実験を行う。さらに、Olig2転写因子の転写因子としての機能を定量的に調べるために、ルシフェラーゼアッセイを行う。OBP2に関しては、機能発現実験でその効果が確かめられれば、遺伝子改変マウスの作製を試みる。平成26年度も継続してニワトリ胚を用いた機能発現実験をおこなう。Olig2の転写因子としての機能を定量的に調べるために、ルシフェラーゼアッセイの実験系を立ち上げる。また、遺伝子改変マウスの作製を継続して行う。平成24年度は、ニワトリ胚におけるエレクトロポレーション法を用いた遺伝子導入により、Olig2転写因子のN末におけるリン酸化の生理学的意義を探る。また、Olig2とそれぞれのOlig2結合因子の相互作用が神経幹細胞からの分化制御にどのように関わっているかについて、解析を進める。進行性の神経症状を示すOlig2結合因子のノックアウトマウスについては、この神経症状が神経幹細胞の分化制御異常によるものかどうか、現在解析を進めている。遺伝子改変マウスの飼育・維持にかかる経費と、その表現型解析にかかる経費として使用する予定である。分子生物学、組織学の解析に必要な試薬の購入費用を計上している。また、マウスや鶏卵を購入する費用、および、マウス維持費用を計上している。本年度は、新潟大学の動物実験施設の改修工事のために、一時的にマウス飼育を縮小して研究室内の動物飼養施設で飼育する必要があった。動物実験が計画よりも遅れたため、来年度に研究費を使用する。分子生物学実験、組織学の解析に必要な試薬の購入経費を計上している。また、マウスや鶏卵を購入する費用、、および、マウス維持費用を計上している。組織学解析および分子生物学消耗品が主な使途である。その他としてマウス購入・飼育費用を計上した。さらに、学会発表のための旅費、および謝金を計上している。
超精密時空間マニピュレーションで定量解明する細胞力学の非線形非平衡性

本年度は、主として赤血球のオンチップ形状ゆらぎ解析の実験および、並行して次年度のための予備実験を実施した。従来の形状ゆらぎ解析は基板上に静置した赤血球について行うが、本研究ではオンチップ細胞マニピュレーション(Ito, 2017等)を用いてマイクロ流路を流れる赤血球を一時静止させて行う。このために、光学系と制御プログラムの最適化を行った。これにより一時静止状態の形状ゆらぎを解析した後に、同一の赤血球に狭窄変形を課して観察できるようになった。形状ゆらぎを連続体モデルで、狭窄変形を一般化粘弾性要素モデルで解析したところ、ゆらぎ解析で得られる赤血球膜の表面張力が一般化粘弾性要素の弾性係数の一つと正の相関を示し、また粘弾性緩和を担当する粘性係数が内部溶液(細胞質)の粘性と正の相関を示した。赤血球の粘性は細胞膜と細胞質に由来して2つの寄与があることが知られており、短時間変形では細胞膜粘性が支配的であると言われている。本研究の結果、長時間大変形の場合に支配的な粘性は細胞質粘性と相関をもつことが示唆されており、興味深い。また、赤血球のスペクトリン細胞骨格の可視化に向け、蛍光染色プロトコルの確立と予備的な変形実験を行った。ここでは、長い狭窄部を持つ薄さ2umのマイクロ流路に一定圧力で押し込むことで赤血球の長時間変形を実現し観察を行った。さらに、線維芽細胞(NIH3T3)についてもオンチップマニピュレーションを用いた長時間変形実験を行った。赤血球と同様に長時間変形後の粘弾性形状緩和が観察され、一般化粘弾性モデルによる定量化を行った。赤血球と比較して線維芽細胞は粘性係数が1桁ほど大きいこと、また、赤血球と同様の負荷時間に対する非線形応答性が確認された。細胞の長時間変形応答はタンパク質等の詳細に依らない、普遍的な性質であることが示唆される。以上の通り、当初予定に加え数多くの研究の芽が得られた。翌年度、交付申請を辞退するため、記入しない。
骨巨細胞腫の多核巨細胞形成及び骨破壊におけるサイトカインの役割

1、骨巨細胞腫培養細胞の産生するサイトカイン:手術時に採取した骨巨細胞腫(計7例)をcollagenaseを用いて分散し、10%FBS加RPMI1640培地にて培養した。初代培養細胞、継代培養細胞(2X10^5個/ml)の培養上清中のIL-1β、TNFα、M-CSFをELISA法により測定した。初代培養液中のIL-1βは62.5pg/ml、M-CSFは31.3pg/mlであった。現在、IL-4をELISA法で測定中である。2、骨巨細胞腫の骨破壊機序:骨巨細胞腫よりtotal RNAを抽出し、northern blottingによりMMP-1、MMP-2、MMP-3、MMP-9のmRNAの発現を検討したところ、破骨細胞と同じようにMMP-9のメッセージの発現を認め、骨破壊機序に関わっている可能性を示唆した。今後、western blotting及びsubstrate gel上での電気泳動によるzymographyを行う予定である。3、多核巨細胞の形成:ヒト末梢血単球を付着法により分離、IL-4(100u/ml)及びM-CSF(10000u/ml)を添加し、2日間培養することにより多数の多核巨細胞が形成された。一方、過去に報告されたIL-3とIFNγの系については、我々の条件下では多核巨細胞を形成することはできなかった。現在、骨巨細胞腫の培養上清を末梢血単球の培養系へ添加し、多核巨細胞の形成を観察中である。そしてその際のM-CSFの役割について中和抗体を用いて検討する予定である。
プラズマ支援ミスト内液相反応による金属ナノ粒子の均一・高速生成

塩化金酸水溶液や硝酸銀溶液に対して非平衡プラズマを照射することで、液中で金ナノ粒子や銀ナノ粒子などの金属ナノ粒子生成が可能である。本研究では、気液界面での反応の効率化、及び、粒子サイズ制御という観点から、プラズマ中のミストの利用に着目した。ミストを含むプラズマの生成手法について検討を行い、超音波霧化方式と直流グロー放電による放電リアクタ、及び、静電霧化方式とコロナ放電による放電リアクタを作成し、その特性を評価した。また、金ナノ粒子と銀ナノ粒子の生成を試み、これが実現可能であることを確認した。本研究はプラズマ中に導入したミスト内液相反応を反応場として利用することで、金属ナノ粒子の均一・高速生成を実現することを目的としている。そのためには、安定したミストの供給、安定したミスト含有プラズマの生成、ミストの挙動の正確な把握が必要である。よって、平成26年度前半で、ミスト生成部の作成、光散乱計測によるミスト計測システムの構築、平成26年度後半から平成27年度前半でプラズマ部の生成、ミスト含有プラズマの放電特性とミスト挙動の調査を行う計画とした。ミスト計測システムとして、供給されたミストに対し、散乱面に平行または垂直に偏光されたレーザー光を入射し、その散乱光の角度分布を計測するシステムを構築した。ミスト生成部については、超音波霧化式、及び、静電霧化方式による装置の2種類を検討しており、市販の超音波霧化装置を利用したミスト生成装置を試作した。ミー散乱による理論値と前述の散乱光計測結果の比較から粒径2μm程度のミストが生成されること、配管やミストを輸送するガス流量によって粒径やミスト濃度をある程度制御できることを確認した。ミスト含有プラズマの生成として、プラズマ内にミストを導入して強い相互作用を得るという観点より、ヘリウムガスを用いた誘電体バリア放電型プラズマジェットを試作し、この中にミストの導入を試みた。プラズマ内に直接にミストを導入する方式ではプラズマ生成が困難であったが、アフタグロー域に相当するジェット部へミストを導入した場合は安定したプラズマが維持された。ミスト内での金属ナノ粒子生成を見据え、プラズマ照射によるバルク液相内での金属ナノ粒子の生成条件、特に、磁性ナノ粒子生成の高速生成条件を見出した。本研究では、大気圧プラズマ中に分散したミストを反応場として用い、ミスト内部での金属ナノ粒子の均一・高速生成を実現することを目的としている。平成26年度での研究経過を踏まえ、平成27年度は1ミスト含有プラズマの安定生成とミスト挙動の解析、2ミスト内液相反応による金属ナノ粒子生成、の2点を中心に進める計画とした。1に関して、大気圧プラズマーミスト間で安定した相互作用を得るという観点より、いくつかの手法を試した上で、微細ヘリウム流に沿って生成される直流グロー放電の周囲に、超音波霧化式装置で生成したミストを含むガスをシールドガスとして流す方式を採用した。このとき、印加電圧やその極性、電極間距離、ヘリウム流やミスト流の流量などをパラメータとして最適条件を探索した。また、シート状に加工したレーザー光と高速ビデオカメラを用い、大気圧プラズマの存在下でのミストの動的な挙動解析を行った。静電霧化式のミスト供給についてはまだ着手できていない。2に関し、金属ナノ粒子生成の前段として、金属塩を溶かした水溶液をミストとして供給して大気圧直流グロー放電を生成し、分光によって発光を調べた。塩化ナトリウム水溶液にプラズマを接するとナトリウムの発光が容易に観測されることは知られているが、水溶液をミスト化することによって高感度でナトリウムの発光が観測された。同様にミスト化することで、カリウム、ストロンチウム、銅の発光も観測することができた。これは、プラズマとミストの強い相互作用を示すものである。当初の研究計画では、平成26年度から27年度前半にかけてプラズマ支援ミスト内液相反応に必要となる安定なプラズマの形成、及び、ミスト挙動の調査を予定していた。また、これらの結果を踏まえて、27年度後半に金属ナノ粒子生成を試みる予定であった。様々なプラズマ生成法を試した結果として、直流グロー放電、超音波霧化式装置で生成したミストを含むシールドガス流を用いることで安定したプラズマ生成を実現した。また、この時のミスト挙動を光散乱計測によって行い、プラズマとミストの特性を明らかにした。更に、金属塩を溶解した水溶液を用いたとき、プラズマからの発光に金属原子の発光が高感度で含まれることを確認することができた。一方で、現時点では金属ナノ粒子の生成を確認するには至っていない。また、静電霧化式装置からミストを供給する実験系のセットアップが遅れている。よって、3ヶ月ほどの遅れがある。本研究では、大気圧プラズマ中に分散したミストを反応場として位置付け、ミスト内部での金属ナノ粒子の均一・高速生成を実現することを目的とする。平成27年度までの経過を踏まえ、平成28年度は1直流グロー放電式のミスト含有プラズマによる金属ナノ粒子生成の実現、2静電霧化式のミストプラズマの挙動解析、の2点を中心に研究を進め、成果を総括する計画とした。1に関しては、直流グロー放電の周囲に、超音波霧化式装置で生成したミストを含むガスを流す方式を用いている。前年度にも実施したMie散乱光によるミスト挙動観測に加え、シュリーレン法による熱流動挙動解析を行い、ガス加熱とミスト挙動の相関を調査した。更に、ミストを生成する溶液として塩化金酸水溶液、硝酸銀水溶液をそれぞれ用い、金ナノ粒子や銀ナノ粒子の生成を試みた。透過型電子顕微鏡で観察した結果、塩化金酸水溶液を用いた場合は粒径10-20 nm、硝酸銀水溶液を用いた場合は粒径20-30 nmの粒子生成を確認した。

更に、エネルギー分散型X線分析により、生成された粒子は金ナノ粒子と銀ナノ粒子であることを確認した。よって、本手法により、金属ナノ粒子を生成可能であることを示した。2については、液体を供給するための注射針と平板電極の間への直流電圧印加による、静電霧化式のエレクトロスプレー型ミスト供給装置を試作した。この時、針電極側を負極とした場合は、安定したテイラーコーンが形成され、また、コーン先端にコロナ放電を伴うことが観測された。ミストの挙動を調査するために、シート状に加工したレーザー光を用いてMie散乱光の観測を行った。その結果、電気力線に沿って安定したミスト放出が行われていることを確認した。塩化金酸水溶液、硝酸銀水溶液等を用いた金属ナノ粒子生成には至っていないが、平板電極の表面を電子顕微鏡で観測した所、粒径が制御された微粒子の付着が観測された。塩化金酸水溶液や硝酸銀溶液に対して非平衡プラズマを照射することで、液中で金ナノ粒子や銀ナノ粒子などの金属ナノ粒子生成が可能である。本研究では、気液界面での反応の効率化、及び、粒子サイズ制御という観点から、プラズマ中のミストの利用に着目した。ミストを含むプラズマの生成手法について検討を行い、超音波霧化方式と直流グロー放電による放電リアクタ、及び、静電霧化方式とコロナ放電による放電リアクタを作成し、その特性を評価した。また、金ナノ粒子と銀ナノ粒子の生成を試み、これが実現可能であることを確認した。平成26年度前半でミスト生成部の作成、光散乱計測によるミスト計測システムの構築、平成26年度後半から平成27年度前半でプラズマ部の生成、ミスト含有プラズマの放電特性とミスト挙動の調査を行う計画としている。全体の研究計画を踏まえたとき、平成26年度に実施した研究で最も重要となるのは、ミスト生成部の作成とミスト計測システムの構築であり、これらについては概ね達成することができた。以降はこれらを使って計測を進めることで、データの蓄積が可能である。ミストを気化させて反応場へと供給するような研究は他にもあるが、ミストの内部を反応場として利用することが本研究で掲げた独自性であり、これを金属ナノ粒子生成という形で実現することが必要である。平成28年度は最終年度であり、これを最低限の達成目標としている。この実現のために、当初の研究計画に則り、2つのアプローチを行う。(1)超音波式霧化装置によるミストの利用:現時点でナノ粒子生成が確認できていないのは、ミストがプラズマからの熱によって蒸発していることが主因と考えている。したがって、ガス温度を下げる必要があり、これにはプラズマのパルス化で対応する。(2)静電霧化式装置によるミストの利用:静電霧化式装置の場合、負極性コロナ放電を利用する。コロナ放電の場合は電流が小さいために熱の影響は抑制できるものと考えている。一方で、安定してミストを供給するためには液体の粘性や導電率を制御する必要があり、添加する薬品の検討が必要である。
regenerative flap 開発

自家培養脂肪幹細胞を様々なモデルに移植して、移植床の最適条件を検証した。2008年度は、幹細胞を移植するモデルとしてマウスの背部に皮膚観察装置(skin chamber)の作成を行った。2009年度の研究ではラットから脂肪を採取し、脂肪幹細胞の培養の標準化を行った。次に培養し免疫染色を行った脂肪幹細胞を元の個体へ戻し、注入局所へ定着することを確認した。循環不全のモデルとして、背部全体の広さで、一本の動静脈を茎とした有茎皮弁を作成した。このモデルへ幹細胞移植を行ったマウスでは皮弁生着範囲が明らかに拡大した。脂肪幹細胞は皮弁の循環不全を改善し生着範囲を拡大させることが確認された。再生医療においては、幹細胞を組織内へ直接局所注射し、生着をはかるものが多いが、現在のところ移植する母床の研究はほとんど行われていない。再生医療において骨髄幹細胞が臨床応用される場合には、移植床は機能不全状態に陥っている場合が多く、細胞が生着する条件としては至適とはいえない。そこでH20年度の研究においては、幹細胞を移植する母床のモデルとしてマウスの背部にskinchamberの作成を試みた。具体的にはマウスの背部に筋膜上で薄層の皮弁を挙上し、皮弁に緊張をもたせるために周囲に枠組みを固定した。この際、皮弁内部への血流を妨げぬよう固定する点に留意した。このskin chamberは皮弁内を走行する血管を直接観察できる点が非常に有用であり、実体顕微鏡の倍率を上げて観察することで血流の方向まで確認が可能である。また、この皮弁に種々の幹細胞を移植することにより血管新生の相違や血流の評価などを可視化することが可能となる。また、皮弁の血流を一旦途絶させたのち、再開通させることにより、虚血再還流モデルとしても利用することが可能となる。さまざまな条件での虚血再還流モデルに対して骨髄細胞移植を行い、血管新生や血液還流の評価を行うことで、遊離皮弁を作成した際の幹細胞導入の至適条件検出のために有益であると考えられる。今後はこの皮弁を元に遊離皮弁への幹細胞導入の至適条件を検出する。そして、この条件に則して実際に遊離皮弁へ幹細胞導入を行い、機能させたい部位へ顕微鏡下に移植する方法を開発する予定である。再生医療においては、幹細胞を組織内へ直接局在注射し、生着を図るものが多いが、現在のところ移植する母床の研究はほとんど行われていない。組織への脂肪幹細胞移植が局在の血管新生を促し、血流を改善する可能性は以前より示唆されている。そのため、様々な循環不全のモデルを作成し、自家培養脂肪幹細胞を移植して、いかなる条件で最も効果的に作用するかを検証した。H20年度の研究においては、移植する母床のモデルとしてマウスの背部にskin chamberの作成を試みた。具体的にはマウスの背部に筋膜状の皮弁を挙上し、周囲に枠組みを固定した。このskin chamberは皮弁内を走行する血管を直接観察できる点で有用であり、皮弁に幹細胞を移植することにより血管新生の相違や血流の評価などを可視化することが可能となると考えられた。H21年度の研究においてはウィスターラットからの脂肪採取および脂肪幹細胞の抽出、ならびに幹細胞の培養の標準化を行った。ラットの両側鼡径部から脂肪組織の採取を行い、剪刀を用いて小片に裁断する。コラゲナーゼを約30分間反応させた後遠心分離を行い、沈殿成分より脂肪幹細胞を採取する。採取した、脂肪幹細胞はDMEM培地を用いて2週間培養を行うことにより300万500万この脂肪幹細胞を得る。次に培養した脂肪幹細胞を元の個体へ戻した際に、移植細胞が局所へとどまるかを確認するため、事前に免疫染色を行った脂肪幹細胞を背部へ注入し、1週間後に組織を採取して蛍光顕微鏡下に確認を行った。その結果、大部分の細胞が注入した局所へ定着していることが確認された。循環不全のモデルとしては、右腰部からの一本の皮下動静脈のみを茎とした有茎皮弁を背部全体の広さで挙上した。通常、このモデルでは茎より半径cm程度の葉にのみが生着するが、皮弁内へ脂肪幹細胞移植を行ったマウスでは皮弁生着範囲が明らかに拡大した。つまり脂肪幹細胞が循環不全を改善し皮弁生着範囲を拡大させることが確認された。
肺がん診断支援システムの高度化に関する研究

(1)3次元解剖学的モデルに基づく病巣,血管分離アルゴリズムの新規開発.FalsePositive Rate(以下FP)の発生原因別統計を取ったところ,肺内に存在する動脈・静脈陰影に起因する率が64%と最も多数であることが判明した.そこで,3次元解剖学的モデルとして血管陰影を取り上げて解析を行った.既に検出されている病巣候補領域(以下,関心領域)は,病巣単独で存在するケース,病巣と血管が複合して存在するケース,血管分岐部などを有する複数の血管が集合しているケース,に分けることが出来る.それぞれのケースに対して解剖学的に考え得るあらゆるモデルを自動生成させて関心領域と比較し,その中から確率的に最も妥当と見なせるモデルを特定することにより,関心領域が病巣を含む領域か,そうでないかを決定するアルゴリズムを完成させた.また,上記研究成果にヒントを得て,新たに肺野内の全領域から血管陰影を自動抽出するアルゴリズムを完成させ,この血管陰影上に存在する関心領域は血管の一部である確率が高いとして削除する論理を開発した.これによりFPの約60%を一挙に削減することに成功した.(2)病巣サイズにAdaptive対応する可変Quoit方式の開発.病巣候補となる関心領域の自動抽出法として,申請者らはQuoitフィルタと名付けた方式を開発したが,これは領域抽出のためのリングフィルタ半径が固定値であったため,病巣サイズの変化に対して柔軟に対応できなかった.そこで,新たにこのリングサイズを入力画像そのものから,場所ごとに適応的に抽出するアルゴリズムを完成させた.また,研究途上で新たに問題となった非常に淡い病巣陰影を正確に抽出するため,病巣陰影強調用の前処理アルゴリズムを完成させた.(3)リアルタイム,動的MIP方式の開発.医師が診断する場合の支援情報として,MIP法と呼ばれる2次元射影像をリアルタイム動画表示する方式を検討し,そのアルゴリズムを完成させた.(4)診断支援システムとしてのGUIシステムの試作(1)3次元解剖学的モデルに基づく病巣,血管分離アルゴリズムの新規開発.FalsePositive Rate(以下FP)の発生原因別統計を取ったところ,肺内に存在する動脈・静脈陰影に起因する率が64%と最も多数であることが判明した.そこで,3次元解剖学的モデルとして血管陰影を取り上げて解析を行った.既に検出されている病巣候補領域(以下,関心領域)は,病巣単独で存在するケース,病巣と血管が複合して存在するケース,血管分岐部などを有する複数の血管が集合しているケース,に分けることが出来る.それぞれのケースに対して解剖学的に考え得るあらゆるモデルを自動生成させて関心領域と比較し,その中から確率的に最も妥当と見なせるモデルを特定することにより,関心領域が病巣を含む領域か,そうでないかを決定するアルゴリズムを完成させた.また,上記研究成果にヒントを得て,新たに肺野内の全領域から血管陰影を自動抽出するアルゴリズムを完成させ,この血管陰影上に存在する関心領域は血管の一部である確率が高いとして削除する論理を開発した.これによりFPの約60%を一挙に削減することに成功した.(2)病巣サイズにAdaptive対応する可変Quoit方式の開発.病巣候補となる関心領域の自動抽出法として,申請者らはQuoitフィルタと名付けた方式を開発したが,これは領域抽出のためのリングフィルタ半径が固定値であったため,病巣サイズの変化に対して柔軟に対応できなかった.そこで,新たにこのリングサイズを入力画像そのものから,場所ごとに適応的に抽出するアルゴリズムを完成させた.また,研究途上で新たに問題となった非常に淡い病巣陰影を正確に抽出するため,病巣陰影強調用の前処理アルゴリズムを完成させた.(3)リアルタイム,動的MIP方式の開発.医師が診断する場合の支援情報として,MIP法と呼ばれる2次元射影像をリアルタイム動画表示する方式を検討し,そのアルゴリズムを完成させた.(4)診断支援システムとしてのGUIシステムの試作1. 3次元解剖学的モデルに基づく病巣,血管分離アルゴリズムの新規開発病巣検出範囲を5ミリ以上とレベルアップしたことに伴う新たなアルゴリズム開発課題として,3次元解剖学的モデルに基づく病巣,血管分離アルゴリズムの開発に着手した.本年は病巣,血管のモデル表現形式,ならびに両者を区別するためのベイズ規則に基づく統計的識別理論の定式化を行った.来年度はこれを具体的な症例に適用し,その効果を検証する予定である.2.病巣サイズにAdaptive対応する可変Quoit方式の開発従来のQuoit法ではフィルタのリングサイズが固定であったが,今回病巣サイズに応じて適応的に変化する可変Quoit方式を開発した.方式は本年度で固まったので,来年度はこれを用いた臨床評価テストに入る予定である.3.リアルタイム動的MIP方式の開発3次元画像を2次元に投影表示する有力な方式の一種であるMIP方式において,その最大の弱点である画像重なりを排除する目的で,観察視点をダイナミックに変更するリアルタイム動的MIP方式を開発した.これを少数の臨床例に適用したところ診断医から好評を得た.来年度はこの効果を多数の症例に適用し,評価を確定する予定である.(1)3次元解剖学的モデルに基づく病巣、血管分離アルゴリズムの開発3次元解剖学的モデルに基づく病巣、血管分離アルゴリズムの理論的定式化を行い、これを具体的な症例に適用しその効果を検証した。37患者のCT画像(1人約30枚)中から既開発の可変Quoit方式により3235個所(内病巣5個、血管等正常陰影3230個)の候補領域を抽出し、これに本アルゴリズムを適用した。

その結果、病巣5個を正しく認識し、かつ血管等を異常と見なしたFalse Positive(FP)数は96個であった。従って、1患者あたり医師が見るべき枚数は2.1枚に削減されることに相当し、効果が認められた。(2)病巣サイズにAdaptive対応する可変Quoit方式の臨床評価病巣サイズにAdaptive対応する可変Quoit方式を前述の症例に適用し、その効果は顕著であることが判明し、評価は確定した。(3)診断支援システムとしてのGUIシステムの試作医師が診断を行う場合に、病巣部分を特定する可変Quoit方式やリアルタイム動的MIP方式などの情報を如何に効率良く、かつ使い易い形で呈示するか、即ち診断支援のための優れたGUIシステムの整備が重要な課題の一つとなる。そこで本年度よりこのためのシステム開発に着手した。使用する計算機はワークステーションレベルとし、医師がその前に座って診断業務をできる体制を作った。本システムの臨床的評価は来年度に行う予定である。(1)3次元解剖学的モデルに基づく病巣,血管分離アルゴリズムの新規開発.FalsePositive Rate(以下FP)の発生原因別統計を取ったところ,肺内に存在する動脈・静脈陰影に起因する率が64%と最も多数であることが判明した.そこで,3次元解剖学的モデルとして血管陰影を取り上げて解析を行った.既に検出されている病巣候補領域(以下,関心領域)は,病巣単独で存在するケース,病巣と血管が複合して存在するケース,血管分岐部などを有する複数の血管が集合しているケース,に分けることが出来る.それぞれのケースに対して解剖学的に考え得るあらゆるモデルを自動生成させて関心領域と比較し,その中から確率的に最も妥当と見なせるモデルを特定することにより,関心領域が病巣を含む領域か,そうでないかを決定するアルゴリズムを完成させた.また,上記研究成果にヒントを得て,新たに肺野内の全領域から血管陰影を自動抽出するアルゴリズムを完成させ,この血管陰影上に存在する関心領域は血管の一部である確率が高いとして削除する論理を開発した.これによりFPの約60%を一挙に削減することに成功した.(2)病巣サイズにAdaptive対応する可変Quoit方式の開発.病巣候補となる関心領域の自動抽出法として,申請者らはQuoitフィルタと名付けた方式を開発したが,これは領域抽出のためのリングフィルタ半径が固定値であったため,病巣サイズの変化に対して柔軟に対応できなかった.そこで,新たにこのリングサイズを入力画像そのものから,場所ごとに適応的に抽出するアルゴリズムを完成させた.また,研究途上で新たに問題となった非常に淡い病巣陰影を正確に抽出するため,病巣陰影強調用の前処理アルゴリズムを完成させた.(3)リアルタイム,動的MIP方式の開発.医師が診断する場合の支援情報として,MIP法と呼ばれる2次元射影像をリアルタイム動画表示する方式を検討し,そのアルゴリズムを完成させた.(4)診断支援システムとしてのGUIシステムの試作
直交磁心形可変インダクタを用いた直列方式高速電圧調整器に関する研究

平成11年度においては,楔形ギャップ付き直交磁心可変インダクタの動作機構の解明を行うとともに,1kVA程度の線形可変インダクタの試作を行った。直交磁心は磁気特性の非線形性を利用した磁気デバイスであり,さらに,強い磁束分布を有する。このため,通常の磁気デバイス解析手法の適用は困難である。著者は,直交磁心をいくつかの要素に分割し,それぞれの要素を3次元的な非線形磁気抵抗で表す,いわゆるReluctance Network Analysisを考案した。ギャップ付直交磁心の解析に適用したところ,高い精度の特性計算が可能であることが明らかになった。これは最適ギャップ形状などの設計に対しても有用である。上記の成果に基づいて,1kVA程度の直交磁心形三相可変インダクタンスを製作し,制御特性や制御時の出力電流高調波を測定し,本研究で提案した可変インダクタが本質的に低歪み出力を有し,制御性も具備していることを実証した。さらに,直流側巻線の結線法によっては,出力電流高調波が発生することを指摘し,発生のメカニズムとその対策などを明らかにした。平成12年度は,前年度に得られた知見に基づき,直列方式高速電圧調整器の実現に必要な事項を明らかにするとともに,簡単な模擬システムにより実験を行った。すなわち可変インダクタを3相の電力系統に並列に接続する場合には,可変インダクタの二次側をデルタ結線すればよい。しかし,直列に挿入する場合にはこの方法が適用できない。本研究では,直交磁心の二次側には主巻線のほかに制御回路用電源のための巻線が施されていることに着目し,この巻線をデルタ結線して第3調波電流を還流させることにより,主巻線電流の第3調波成分の低減を試みた。簡単な仮定に基づく解析と実験を行い,本方式により実用上十分なレベルまで主巻線電流の高調波成分が低減されることを実証し,電力品質の極めて良好な直列方式電圧調整器が実現可能であることが明らかになった。以上より,本研究の目的はある程度達成されたものと考えている。これらの成果は電気学会,応用磁気学,IEEE国際会議および雑誌等で発表を行った。

これらの成果は電気学会,応用磁気学会の研究会等で発表すると伴に,本年4月トロントで開催される国際磁気学会において報告する予定である。以上より,直交磁心型線形可変インダクタを用いた直列補償方式の電圧調整器の設計・製作に必要な事項が明らかになり所期の成果が得られたものと考えている。次年度においては,本年度の成果をもとに直列補償器を試作し,実用化に必要な事項を明らかにする予定である。平成12年度は,前年度に得られた知見に基づき,直列方式高速電圧調整器の実現に必要な事項を明らかにするとともに,簡単な模擬システムにより実験を行った。直交磁心に楔形ギャップを施すことにより,可変インダクタとして動作させたときの出力電流高調波が著しく低減される。しかし原理的に第3調波電流はある程度残留する。可変インダクタを3相の電力系統に並列に接続する場合には,可変インダクタの二次側をデルタ結線すればよい。しかし,直列に挿入する場合にはこの方法が適用できない。本研究では,直交磁心の二次側には主巻線のほかに制御回路用電源のための巻線が施されていることに着目し,この巻線をデルタ結線して第3調波電流を還流させることにより,主巻線電流の第3調波成分の低減を試みた。簡単な仮定に基づく解析と実験を行い,本方式により実用上十分なレベルまで主巻線電流の高調波成分が低減されることを実証した。以上より,電力品質の極めて良好な直列方式電圧調整器が実現可能であることが明らかになった。本研究ではさらに,直列方式電圧調整器の新たな応用についても検討を行った。すなわち,系統のインピーダンスを調整すれば電力の流れを制御できることに着目し,直交磁心形可変インダクタと電力用コンデンサを並列に接続し,これを電力系統に直列に挿入する直列補償方式の潮流制御器を試作した。解析ならびに実験により本装置の動作を確認している。本装置は,直交磁心形可変インダクタを調整するというきわめて簡単な手段により,交流系統を流れる電力の大きさと方向を任意に制御できるため,フレキシブルな潮流制御が可能になる。さらに,直交磁心と複数の変圧器を組み合わせて潮流制御を行う,移相器への応用についても検討を行い,その基本的な回路構成について明らかにした。以上より,本研究の目的はある程度達成されたものと考えている。
がん由来エクソソームによる血液脳関門の破壊メカニズムの解明と診断治療への応用

申請者は、MDA-MB231-D3H2-LN(高転移株)を7週齢のscid/scidマウスへ移植し、脳転移モデルを作製した。こ今回、脳血管を構成する内皮細胞・ペリサイト・アストロサイトの三種の細胞を用いた、脳血液関門(BBB)を再現したin vitro modelによりエクソソームの作用解析を行った。上述のモデルを用いて、新たな脳転移メカニズムを解明し、Nature Communications(DOI: 10.1038/ncomms7716)に受理された。今回我々は、がん細胞が分泌するエクソソームによる脳転移機構を明らかにした。その結果、脳転移細胞株のエクソソームは、BBBを構成する密着結合及び接着結合の細胞膜局在を変化させることが明らかとなった。網羅的解析の結果、候補であるmiR-181cをBBB in vitroモデルに形質導入するとエクソソーム同様にBBBを破壊した。また、miR-181cは細胞内で、PDPK1と呼ばれるキナーゼを標的とし、PDPK1の下流にあるアクチン線維構造を破壊するコフィリンを活性化することが明らかとなった。さらに、脳転移細胞株分泌EVsは、脳に集積し血管の透過性を促進し且つ脳転移を促進することをマウスモデルで明らかにした。これらの事実から、エクソソームに含まれるmiR-181cは血管内皮細胞のPDPK1を抑制しコフィリンを活性化することで、アクチンダイナミクスを変化させた結果、BBB破壊を引き起こし、乳がんの脳転移に寄与していると考えられる。さらに、乳がん脳転移患者の血清中では、miR-181cの存在量が増加しており、早期診断マーカーとして応用できる可能性を証明した。27年度が最終年度であるため、記入しない。今回我々は、上述のモデルを用いて、がん細胞が分泌するエクソソームによる脳転移機構を明らかにした。さらに、乳がん脳転移患者の血清中では、miR-181cの存在量が増加しており、早期診断マーカーとして応用できる可能性がある。これらの結果はNature Communications(DOI: 10.1038/ncomms7716)に受理されている。本研究は、乳がんの脳転移メカニズムを明らかにするとともに、早期診断への応用を目指す研究である。

申請者は、エクソソームによる新規の脳転移メカニズムを明らかにし、Nature Communications(DOI: 10.1038/ncomms7716)に受理されている。さらに、包括同意の取れた乳がん患者血清で検討し、早期診断マーカーの可能性をも示唆している。このことから、当初の計画よりも進展していると言える。27年度が最終年度であるため、記入しない。エクソソームによる脳転移促進メカニズムが明らかになり、さらに申請者の観察により、エクソソームに脳血管に集積する指向性が存在することが明らかとなった。しかし、指向性を決める要因については不明なままである。これまで、行ったプロテオーム解析により、すでにその候補分子が決定している。そこで、エクソソームの脳血管指向性についてさらに検討を進め、脳転移メカニズムの理解を深めたい。加えて、早期診断マーカーとしての可能性についても、さらに多くの患者血清を用いて検討して行く必要がある。
エピジェネティック制御因子EedによるT細胞機能制御機構の解明

DNA配列の変化を伴わない遺伝子発現状態の安定的制御(エピジェネティックな制御)による免疫T細胞機能の制御について研究した。エピジェネティック制御の一つであるヒストンH3のメチル化に必要なEed遺伝子をT細胞特異的に欠損させたところ、腸管に存在するIELと呼ばれるT細胞の一部に特有なタンパク質群が、サイトカインであるTGFβの刺激によりCD4陽性T細胞において顕著に誘導されることが明らかとなった。また腸に付随するリンパ節のリンパ球数も増加した。これらのことからT細胞においてエピジェネティックな制御が、腸管免疫系の恒常性維持に関与することが示唆された。Eed欠損マウスではDPからSPステージへの分化障害が見られるが、OT-IおよびOT-IIトランスジーンにより分化障害がレスキューされるか調べた。OT-Iでは分化障害がレスキューされるのに対してOT-IIではレスキューされなかった。トランスジーン非存在下でEed欠損マウスでは胸腺において通常の正の選択を受けたαβT細胞と比較してIELの前駆細胞やTregの割合が有意に減少していたことから、Eed欠損によりアゴニスト選択がより強い障害を受けることが明らかとなった。Eed欠損マウスではCD8ααIELの減少が見られるが、それに関しては上述のように胸腺におけるアゴニスト選択の障害が原因の一つであることが強く示唆された。成熟T細胞におけるTCRシグナル伝達についても、CFSE標識した末梢のナイーブT細胞を用いて検討した。単離したナイーブCD4+ T細胞及びCD8+ T細胞を抗CD3/CD28抗体で刺激した場合、Eed欠損細胞では野生型と比較して増殖するものの割合が少なかったが、PMA/イオノマイシン刺激では逆に増殖の亢進が見られた。このことはEed欠損T細胞ではTCR近傍でのシグナル伝達に何らかの障害があることが示唆された。またPMA/イオノマイシン刺激したものでも、長時間の培養後はEed欠損T細胞の生存率は野生型と比較して低下していた。したがってEedはT細胞の生存維持にも関与していることが示唆された。またEed欠損ヘルパーT細胞のThサブセットへの分化能及びサイトカイン産生能についても検討した。Th1、Th2条件下ともIFNγ産生が野生型と比較して亢進していた。Th2条件下でのIL-4産生は低下した。Tregへの分化はほぼ正常であったが、Th17への分化は細胞が増殖せず結論が得られなかった。H3K27メチル化は遺伝子発現制御を介した細胞の自己同一性維持に重要であることから、本年度はH3K27のメチル化を触媒するPRC2複合体の必須サブユニットであるEedを欠損したヘルパーT細胞のサブセット分化に特に注目して解析した。ナイーブCD4陽性T細胞をTGFβ存在下で培養すると、野生型ではそのほとんどがFoxp3陽性となる。しかしEedを欠損した場合、Foxp3陽性かつCD8陽性の細胞へと分化する。この過程はIFNγの添加により促進されることから、iIEL分化の異常な脱抑制であることが示唆された。iIELへの分化にはRunx3の関与が報告されているためCbfb欠損によりRunx複合体の機能をさらに欠損させたが、CD8の発現上昇は部分的にしか抑制されなかった。またCFSE染色との解析から、この分化には細胞周期の進行は必須でないことも示された。これらの結果はTGFβ依存的な分化経路選択の制御にEedが重要であることを示唆している。またこれまでにEed欠損によりTCRシグナル伝達が障害され、およびその結果と思われる胸腺での正の選択およびアゴニスト選択を受けるnIEL, nTregの分化障害を見いだした。本年度はそれに加え、アゴニスト選択を受けるもう一つのT細胞系譜であるiNKTについても解析を行い、Eed欠損によりiNKT分化が強く障害されることを見いだした。また負の選択についても部分的に障害があることも明らかとなった。興味深いことに正の選択、負の選択と比較してアゴニスト選択がより強く障害されていた。また細胞質に優先的に局在するEed変異体を発現するマウスを作成し解析したところ、正の選択が亢進し、nIELおよびiNKTのアゴニスト選択も増強されるという予備的な結果を得た。ヒストン修飾の一つであるH3K27メチル化のT細胞分化および機能における役割について検討するため、T細胞特異的なEed欠損マウスの解析を引き続き行った。TGFβ存在下で刺激するとCD4+T細胞は主としてFoxp3+制御性T細胞へと分化するが、Eed欠損CD4+T細胞ではFoxp3と共にCD8の脱抑制も誘導される。EedとともにH3K27メチル化を触媒するPRC2複合体を構成するEzh2をノックアウトしても同様の表現型が得られた。また野生型CD4+ T細胞ではTGFβ添加によりEed遺伝子発現量が抑制されることから、Eed発現制御を介したH3K27メチル化の低下がTGFβ応答の調節に関与することが示唆された。TGFβはCD4+CD8αα+IEL(以下単にIEL)の分化も促進することが知られており、Eed欠損下で見られたCD8の脱抑制もIEL分化の異常亢進であると考えられた。IEL分化にはThPOKの発現低下、Runx3の発現亢進が重要であるため両転写因子の発現を検討した結果、Eed欠損T細胞ではTGFβ添加によりRunx3の高発現が誘導されることが明らかとなった。

Cbfbとの二重変異、あるいはドミナントネガティブ型T-betの強制発現によりCD8の脱抑制が抑えられた。両転写因子はIEL分化に必要であることが報告されており、上記の結果よりEed欠損CD4+T細胞でみられたCD8の脱抑制はIELへの分化経路が活性化されたことによるものと結論づけた。また野生型あるいはEed欠損OT-IIトランスジェニック由来のCD4+T細胞を養子移入し、固有抗原の経口投与によりin vivoでTreg誘導を行ったところ、Eed欠損OT-II+ T細胞ではCD8を共発現するものの割合が野生型と比較して増加していた。このことはEed欠損によるIELへの分化亢進は生理的条件下でも起こることを強く示唆した。DNA配列の変化を伴わない遺伝子発現状態の安定的制御(エピジェネティックな制御)による免疫T細胞機能の制御について研究した。エピジェネティック制御の一つであるヒストンH3のメチル化に必要なEed遺伝子をT細胞特異的に欠損させたところ、腸管に存在するIELと呼ばれるT細胞の一部に特有なタンパク質群が、サイトカインであるTGFβの刺激によりCD4陽性T細胞において顕著に誘導されることが明らかとなった。また腸に付随するリンパ節のリンパ球数も増加した。これらのことからT細胞においてエピジェネティックな制御が、腸管免疫系の恒常性維持に関与することが示唆された。本年度はT細胞特異的Eed欠損がヘルパーT細胞サブセット分化、とりわけ共にTGFβ依存するTregおよびIELへの分化調節を行っていることを強く示唆するデータを得た。PRC2複合体によるこのような役割はこれまで報告されておらず、免疫制御におけるPRC2複合体の新たな機能を明らかにしたものとして当初の研究目的に沿った成果と言える。また核質特異的Eed欠損のシステムを構築しその解析を始めたが、核質特異的Eed欠損細胞では核内のH3K27トリメチル化が減少していることが明らかとなった。さらに細胞質特異的Eedの発現はEedの単純欠損で見られる正の選択の部分障害をレスキューすることも示唆された。これらの結果は核質特異的Eed欠損システムが当初の計画通りに働いていることを支持しており、次年度でのさらなる解析に期待が持てるデータと言える。免疫学次年度ではEedによるTreg/IEL分化制御の生理的役割に焦点を当てて研究を進める予定である。まずEed欠損マウス内で実際にTreg/IEL間の運命分岐の異常が起きうるかを明らかにするため、経口免疫寛容誘導系でTreg分化を促進したときにEed欠損細胞で異常が見られるか検討する。具体的には野生型またはEed欠損OT-IIトランスジェニックCD4陽性T細胞を養子移入してOVAタンパクを経口投与後、腸間膜リンパ節及び粘膜固有層より移入細胞を回収し解析する。また分化異常の分子機構を明らかにするため、転写因子T-betの関与の有無についてドミナントネガティブ型T-betを用いて検討を行う。さらに野生型とEed欠損細胞の間で、TGFβ下流の転写因子であるSMADの結合の差異についてもクロマチン免疫沈降を用いて解析する。
森林生態系からのアミノ態窒素の流出が水田肥沃度に及ぼす影響

森林-水田の地目連鎖系では渓流水を通した塩基類の供給が知られているが、窒素供給は低いと考えられてきた。しかし、渓流水を介して水田へと移動する窒素には懸濁態、有機態成分も存在する。そこで、森林・水田土壌における窒素フラックスを推定するとともに、湛水条件下の水田土壌における窒素の無機化能を検証した。この結果、渓流水を介した遊離アミノ酸の供給量は小さいものの、水田土壌における平均滞留時間は数時間であり、即効性のある窒素供給源として働き得ることが示された。一方、渓流水を介した森林から水田への懸濁態物質の移行量、その無機化による窒素供給量は大きく、水田の地力窒素を高めていることが定量的に示された。本研究では森林・水田の地目連鎖系におけるアミノ態窒素フローの実態を解明し、水田微生物によるアミノ成分の無機化能力・イネによるアミノ成分の吸収能力を検証することで、森林からの懸濁態・有機態での窒素フローの実態と水田肥沃度に対する量的な重要性を解明する。森林から水田へのアミノ態成分を含む物質の移動量を定量評価するため、富山県上市町、京都府宮津市の森林・水田系において、土壌中の温度・水分、酸化還元電位の観測を開始するとともに、土壌水、渓流水、田面水の定期採取を開始した。渓流水中の硝酸イオン、溶存有機窒素ともに平水時は低濃度であったが、降雨イベントとともに高濃度の懸濁態物質が検出された。水田におけるアミノ態物質の利用可能性を調べるため、微生物によるアミノ酸、アミノ糖の生分解試験を実施した。放射性炭素(14C)を標識したグルタミン酸(アミノ酸代表物質)、グルコサミン(アミノ糖代表物質)、グルコース(単糖代表物質)を異なる濃度で土壌へ添加し、14CO2放出速度を測定した。この結果、水田土壌の微生物による無機化しやすさはアミノ酸>グルコース>アミノ糖の順であった。アミノ酸の無機化に伴い、アンモニウムイオンが土壌へ供給される。これまでに、森林から水田へ懸濁態物質を含む窒素成分が渓流水によって供給されること、冬季よりも雨の多い夏季にその量が大きいことを解明した。さらに、供給されたアミノ成分、特にアミノ酸は微生物によって速やかにアンモニウムイオンへと無機化されることを確認した。研究成果の一部は「森林・耕地土壌における窒素無機化速度の規定要因」として取りまとめ、日本土壌肥料学会において報告した。我が国の中山間地に多く存在する森林・水田の地目連鎖系では、森林は下流域へ養分を供給する機能を果たしてきた。特に塩基性陽イオンの供給は「地質学的施肥作用」として知られる一方で、窒素の供給機能は低いと考えられてきた。しかし、渓流水の窒素フローには無機態窒素だけでなく懸濁態・溶存有機態の窒素成分が重要な割合を占めるという報告もある。そこで、森林・水田土壌におけるアミノ態窒素フローの実態と湛水条件下の水田における窒素成分の無機化能を検証した。森林・水田における窒素成分の移動量を定量評価するため、富山県上市町、京都府宮津市(棚田)の森林-水田系において土壌水、渓流水、田面水を採取し、有機態N(アミノ酸)、NH4+、NO3-濃度を分析した。また、窒素の無機化特性を調べるため、アミノ酸、アミノ糖の分解試験を実施した。14C標識グルタミン酸(アミノ酸)、グルコサミン(アミノ糖)、尿素、グルコースを異なる濃度で土壌へ添加し、14CO2放出速度を測定した。渓流水、灌漑水中の無機態窒素は硝酸イオンが主体であるものの、降雨イベント後には高濃度の懸濁態物質が検出された。また、森林土壌の微生物代謝によって放出されやすいアルギニンなどのアミノ酸も低濃度で含まれており、有機態窒素もまた森林から水田へと移行することが示された。14Cトレーサーを用いた無機化速度は尿素>>アミノ酸>グルコース>アミノ糖の順であった。アミノ酸・アミノ糖の無機化速度は近接する森林・水田の間で違いは小さかったが、水田の尿素の分解速度は森林よりも有意に高かった。森林-水田連鎖系において、森林由来の有機体窒素成分が渓流水によって水田に供給されること、水田であっても土壌水中のアミノ酸・アミノ糖由来の炭素は速やかに無機化されることが示された。研究成果の一部は日本土壌肥料学会、カナダで開催された国際学会ISMOM2015において発表した。土壌水、渓流水、田面水中のアミノ酸濃度の分析を終えたことによって、森林から水田への窒素供給機能の全容が解明されつつある。研究成果は研究成果は、日本土壌肥料学会シンポジウム「土壌の物質循環機能を多角的にみるー最先端手法が切り拓く新たな姿」において発表した。また、成果の一部は著書『大地の五億年せめぎあう土と生き物たち』(山と渓谷社)においても情報発信し、日本経済新聞、毎日新聞、しんぶん赤旗の取材を受けた。森林-水田の地目連鎖系では渓流水を通した塩基類の供給が知られているが、窒素供給は一般に低いと考えられてきた。しかし、渓流水を介して移動する窒素には無機態だけでなく懸濁態、溶存有機態成分も存在する。本研究では森林・水田土壌における窒素フラックスを推定するとともに、湛水条件下の水田土壌における窒素の無機化能を検証した。富山県上市町、京都府宮津市(棚田)の森林-水田系において土壌溶液(遠心分離法1.5 MPa)、渓流水、田面水を採取し、有機態窒素、遊離アミノ酸、NH4+、NO3-濃度を測定した。