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抽象的危険に対する立法的対応-立法裁量の統制に関する基礎研究

伝統的な警察法理論の理解によれば、通常、具体的危険に対しては個別的措置で、抽象的危険に対しては法令で対処すると理解されている。しかし抽象的危険は、それが具体的危険ではないという理由からしばしば非危険とみなされ、「法令を通じた危険防御」に十分な注意が払われてきたとは言えなかった。本研究は、抽象的危険の概念内容を明らかにするとともに、裁量過程統制論を立法過程に適用することを通じて、実効的な危険防御の全体像を示した。本年度は、研究計画1年目の年ということもあり主に二つの検討を行った。一つは、警察法分野における公私協働の一例として注目されている「警察=民間安全パートナーシップ」の検討である。これは、私人(主として警備業者)が公私協働の一環として警察機能を担う場合の意義・問題点をドイツ法を素材にして明らかにしようとするものである。その成果は「私人による警察活動とその統制-ドイツ警察法における公私協働論を素材として-」(法律時報81巻13号)と題して公表した。もう一つは、抽象的危険概念の法実証化である。これは二段階に分けて検討を行った。一段階目は、これまでの裁判実務の中で抽象的危険概念(またこれに対比される具体的危険概念)がどのように理解され解釈適用されてきたのかを我が国の裁判例(最高裁・下級審を含む)を素材にして分析するというものである。その成果の一部は「『危険判断の論証モデル』の有効性とその限界(1)(2・完)-危険の存否が争点とされた裁判例の分析」(金沢法学52巻1号2号)と題して公表した。これを踏まえた上で二段階目として、ドイツ法の分析を通じて(具体的危険概念との異同に注意しながら)抽象的危険概念の法実証化を試みた。抽象的危険は、具体的危険のように「個別ケース」における損害発生の蓋然性に焦点を合わせて概念構成されるのではなく、行為、施設あるいは場所における「典型的な」損害発生、つまり危険の「実在様式」に焦点を合わせて概念構成されること、その理由、具体的法的効果等について明らかにした。もっとも当初予定していた[リスク」や「傾性的危険」といった抽象的危険類似の概念の解明までには至らなかった。これは次年度の課題である。本年度は、研究計画2年目ということで、前半は、前年行った抽象的危険概念の法実証化をさらに深めることを目的とした。具体的には、抽象的危険概念と異質の概念でありながらも、しばしば混同して議論されることの多かった「危険の疑い」「リスク」「傾性的危険」といった概念の法実証化に取り組んだ。この法実証化のために、さらにドイツの連邦イミシオン防止法などを素材にして、「確率論」「蓋然性概念」「実践理性」「物の傾性」などといった知見や「抽象/具体」「一般/個別」といった概念の法理論的意味の解明にも取り組んだ。これで、(行政)立法による抽象的危険の防御の前提となる「危険の種類」について一通り検討を終えたこととなる(なおこの検討の過程で、危険の存否が不明な場合に生じうる証明責任の問題について、一部、拙稿「取消訴訟における証明責任-訴訟の審理過程から」(法学教室360号)21頁以下で扱った)。本年度の後半は、行政立法と議会法律の異同について、法規の性質・立法制定権者の組織体・立法手続・立法裁量の広狭などの観点から明らかにする作業を行った。両者の異同については、これまで特に法規の性質に着目することが多かったが、行政組織内での立法制定過程を分析することで、議会・行政機関それぞれの立法作用の特徴がより明確になった。これらの検討結果を踏まえ、研究計画最終年度となる翌年、抽象的危険に対する立法的対応について論じることとなる。研究課題の最終年度となる本年度は、過去2年間の研究成果を踏まえ、抽象的危険に対する立法的対応の全体像の把握に取り組んだ。昨年度までの研究では、「抽象的危険」(同時に「危険の疑い」「リスク」「傾性的危険」の概念)の法実証化に取り組み(行政)立法が対応すべき危険の種類を明確にするとともに、さらに行政立法と議会法律の異同を、法規の性質・立法制定権者の組織体・立法手続・立法裁量の広狭などの観点から整理・分析した。本年度は、前年度までに示された分析結果を具体的に検証すべく、危険防御に係る行政立法権限の不行使の違法性を相次いで認めた筑豊炭鉱じん肺国家賠償訴訟(最判平成16年4月27日民集58巻4号1032頁)と熊本水俣病国家賠償訴訟(最判平成16年10月15日民集58巻7号1802頁)を素材にして、行政立法による危険防御の全体像を把握することを試みた。特に前者の判例は、省令制定権限の不行使と各種個別的監督権限の不行使を一連の行為として見なすものであり、個別的措置による危険防御から行政立法さらには法律による危険防御への一連の過程を解明する上でも、本研究の中心的分析対象となった。

なおその際、我が国の行政立法実務をより客観的に把握するため、その分析視座をドイツ警察法に求め、ドイツにおける警察命令(行政立法)権限の実態についても分析を行った。この比較法研究によって、我が国の行政立法による危険防御の全体像をその問題点とともに明確に示すことができたと考える。これら成果は、近く公表予定である。
IL-18による免疫監視機構の調節

IL-18のマウスへの吸入暴露による自然型気管支喘息の誘導IL-18はIL-2の存在下で抗原刺激なしにT細胞に作用してTh2サイトカイン産生を誘導する。既にIL-13が気道上皮細胞を刺激してエオタキシン産生を誘導することで肺組織への好酸球の遊走を促すことが知られている。また、IL-13は気管支平滑筋を直接刺激して気道過敏性を亢進(airway hyperresponsiveness, AHR)させることも既知のことである。我々はIL-18のIL-13産生誘導作用に着目し、野生型BALB/cマウスにIL-2+IL-18を4日間連日で経鼻投与した後、最終投与24時間後に肺を組織学的に検索すると共に肺気泡洗浄液中の湿潤細胞(好酸球、好中球、リンパ球)、さらにアセチルコリンの吸入曝露に対するAHRの上昇を測定した。IL-18投与群では、気道上皮でムチン産生亢進が認められ、さらに気管支周囲の好酸球浸潤とAHRの上昇など気管支喘息様症状が誘導されていた。一方、前もってCD4^+T細胞を除去したマウスにIL-2+IL-18を経鼻投与しても、全くこの様な病的変化は起こらなかった。おそらくIL-2+IL-18がCD4^+細胞を活性化して、Th2サイトカインを誘導したと考えられ。実際Stat6KOマウスにIL-2+IL-18を経鼻投与しても、気管支喘息様所見は認められなかった。一方、IL-4KOマウスにIL-2+IL-18を投与すると野生型マウス同様、著名なムチン産生が認められた。さらに、IL-2+IL-18を投与する際、IL-13活性を阻止する目的で可溶型IL-13Ra2を同時投与すると、気管支喘息の発症は完全に抑制された。異常の実験から、気管支喘息の誘導にIL-2+IL-18で刺激されたCD4^+T細胞由来のIL-13が密接に関与することか明らかとなった。次に、野生型とStat6KOマウスにIL-2+IL-18を投与後、肺組織内のIL-5とIL-13mRNAの発現、ならびにエオタキシンmRNA発現量をRT-PCRで測定したIL-2+IL-18投与は、野生型並びにStat6KOマウスの両群で同レベルのIL-5と1L-13mRNAの発現を誘導したが、エオタキシンmRNA誘導が認められたのは野生型のみであった。以上の結果から、IL-2+IL-18は肺組織内でCD4^+T細胞を活性化してIL-13産生を誘導することで、AHR、好酸球浸潤、そしてムチン産生を誘導することが明らかとなった。感染によって気管支喘息が発症・する。特にこの様な喘息では、特定のアレルゲンが同定されないことが多く、我々は"自然型喘息"と考えている。IL-18は気道上皮細胞に豊富に蓄えられ、病原微生物の成分で刺激を受けると産生されることから、感染によって発症・増悪する喘息にIL-18が関与する可能性が考えられた。1)IL-18によるTh1型気管支喘息の誘導とIL-18を標的とした気管支喘息の治療法の基礎を確立申請者は、OVA特異的メモリーTh1細胞を移入した正常マウス(メモリーTh1マウス)にOVA+IL-18を吸入するとTh1細胞からIFN-gとIL-13産生を誘導することでTh1型気管支喘息を誘導すること報告した(16年度)。マイコプラズマ肺炎あるいはRhinovirus感染が契機となって好中球を主体とするステロイド抵抗性の気管支喘息が発症することが知られている。そこで17年度は、OVA+IL-18を吸入代わりに、OVAと病原体成分をTh1メモリーマウスに吸入することで内因性IL-18を誘導し、気管支喘息を誘発できるか検討した。その結果、(1)気道上皮細胞をグラム陰性菌の菌体成分のリポポリサッカライド(LPS)で刺激すると、IL-18が産生誘導されることを確認した。次に(2)メモリーTh1マウスにOVAとIL-18を吸入する代わりにOVAとLPSを吸入させることで気管支喘息を発症した。(3)この喘息の発症にLPSによって気道上皮細胞から産生されたIL-18が関与することを明らかにする目的で、LPSと共に抗IL-18鎖抗体を投与すると気管支喘息の発症を抑制した。以上の研究から、感染を契機として発症するいわゆる"Th1型気管支喘息"に病原体成分によって誘導される内因性IL-18が関与していることが明らかになった(以上、内因性IL-18による気管支喘息誘導)。2)IL-18による腸管寄生線虫に対する感染防御作用腸管寄生線虫の排虫メカニズムの1つに、Th2サイトカイン(IL-3/IL-9)の作用で小腸粘膜に集積、活性化された粘膜型肥満細胞(mucosal mast cell : MMC)が放出するコンドロイチン硫酸が、虫体の粘膜への接着侵入を阻止する方法である。糞線虫の1つであるStrongyloides venezuelensis(Sv)の排虫はこの方法で行われる。本論文で我々は、(1)IL-18+IL-2の生体内投与はCD4^+T細胞からのIL-3/IL-9産生を誘導し、Sv排虫機能を有する活性化MMCを誘導すること、(2)Svに感染した野生型マウスは内因性IL-18

産生を誘導し、Th2非依存的に活性化MMCを誘導する結果、Sv感染防御作用に関与することを示した。本研究を通して、IL-18の全く新しい粘膜免疫作用が明らかになった。IL-18のマウスへの吸入暴露による自然型気管支喘息の誘導IL-18はIL-2の存在下で抗原刺激なしにT細胞に作用してTh2サイトカイン産生を誘導する。既にIL-13が気道上皮細胞を刺激してエオタキシン産生を誘導することで肺組織への好酸球の遊走を促すことが知られている。また、IL-13は気管支平滑筋を直接刺激して気道過敏性を亢進(airway hyperresponsiveness, AHR)させることも既知のことである。我々はIL-18のIL-13産生誘導作用に着目し、野生型BALB/cマウスにIL-2+IL-18を4日間連日で経鼻投与した後、最終投与24時間後に肺を組織学的に検索すると共に肺気泡洗浄液中の湿潤細胞(好酸球、好中球、リンパ球)、さらにアセチルコリンの吸入曝露に対するAHRの上昇を測定した。IL-18投与群では、気道上皮でムチン産生亢進が認められ、さらに気管支周囲の好酸球浸潤とAHRの上昇など気管支喘息様症状が誘導されていた。一方、前もってCD4^+T細胞を除去したマウスにIL-2+IL-18を経鼻投与しても、全くこの様な病的変化は起こらなかった。おそらくIL-2+IL-18がCD4^+細胞を活性化して、Th2サイトカインを誘導したと考えられ。実際Stat6KOマウスにIL-2+IL-18を経鼻投与しても、気管支喘息様所見は認められなかった。一方、IL-4KOマウスにIL-2+IL-18を投与すると野生型マウス同様、著名なムチン産生が認められた。さらに、IL-2+IL-18を投与する際、IL-13活性を阻止する目的で可溶型IL-13Ra2を同時投与すると、気管支喘息の発症は完全に抑制された。異常の実験から、気管支喘息の誘導にIL-2+IL-18で刺激されたCD4^+T細胞由来のIL-13が密接に関与することか明らかとなった。次に、野生型とStat6KOマウスにIL-2+IL-18を投与後、肺組織内のIL-5とIL-13mRNAの発現、ならびにエオタキシンmRNA発現量をRT-PCRで測定したIL-2+IL-18投与は、野生型並びにStat6KOマウスの両群で同レベルのIL-5と1L-13mRNAの発現を誘導したが、エオタキシンmRNA誘導が認められたのは野生型のみであった。以上の結果から、IL-2+IL-18は肺組織内でCD4^+T細胞を活性化してIL-13産生を誘導することで、AHR、好酸球浸潤、そしてムチン産生を誘導することが明らかとなった。感染によって気管支喘息が発症・する。特にこの様な喘息では、特定のアレルゲンが同定されないことが多く、我々は"自然型喘息"と考えている。IL-18は気道上皮細胞に豊富に蓄えられ、病原微生物の成分で刺激を受けると産生されることから、感染によって発症・増悪する喘息にIL-18が関与する可能性が考えられた。
トリチウム計測用質量分析計の開発

核融合燃料などの分析時に質量分析計を高濃度トリチウムに長期間接触させると,そのノイズが上昇し分析精度が低下する.本研究ではこの傷害をin-situに除去できるトリチウム計測用質量分析計(以後T用質量分析計と略記)を設計,製作し,その性能を評価した.製作したT用質量分析計に0.1Torr・sec(接触圧:1×10^<-6>Torr)のトリチウムを接触させた.その結果,ノイズレベルは1×10^<-9>A,ノイズ巾は5×10^<-11>Aに上昇し,測定上の傷害が生じた.但し,これらの値は標準型の質量分析計(ULVAC,MSQ-150A)で測定された傷害の約1/3の値である.これは真空容器及び質量分析計の表面に施した金コーティングの効果によるものと考えられる.光照射により,このノイズレベルは2×10^<-10>A,巾は1.5×10^<-11>Aまで減少した.これらの値は標準型の約1/15で,今回製作した質量分析計はin-situに吸着トリチウムを除去でき,ノイズを低減できることが知られた.しかしながら,完全なノイズ除去はできなかった.この原因は光照射により脱離したトリチウム水蒸気の光照射停止による二次電子増倍管表面などへの再吸着,あるいは紫外線ランプが低出力なために光照射が不均一になり,トリチウム脱離が不充分な部分ができるためである.これらの問題は水蒸気に対する排気速度の大きい真空ポンプを用いること,紫外線ランプの出力を上げその数を増やすこと,光照射時に影にある部分を最小限にすることにより解決できる.ちなみに二次電子増倍管のシールド円筒を茶筒タイプからメッシュタイプに変更したところ残留ノイズは半減した.即ち,本研究で開発したT用質量分析計は高濃度トリチウムに長期間接触させられた場合でもトリチウムの吸着量が少なく,さらにこれをin-situに除去でき,ノイズ傷害を克服できる.従って,核融合実験装置を初めとする様々な分野における高濃度トリチウムの測定に有効である.核融合燃料などの分析時に質量分析計を高濃度トリチウムに長期間接触させると,そのノイズが上昇し分析精度が低下する.本研究ではこの傷害をin-situに除去できるトリチウム計測用質量分析計(以後T用質量分析計と略記)を設計,製作し,その性能を評価した.製作したT用質量分析計に0.1Torr・sec(接触圧:1×10^<-6>Torr)のトリチウムを接触させた.その結果,ノイズレベルは1×10^<-9>A,ノイズ巾は5×10^<-11>Aに上昇し,測定上の傷害が生じた.但し,これらの値は標準型の質量分析計(ULVAC,MSQ-150A)で測定された傷害の約1/3の値である.これは真空容器及び質量分析計の表面に施した金コーティングの効果によるものと考えられる.光照射により,このノイズレベルは2×10^<-10>A,巾は1.5×10^<-11>Aまで減少した.これらの値は標準型の約1/15で,今回製作した質量分析計はin-situに吸着トリチウムを除去でき,ノイズを低減できることが知られた.しかしながら,完全なノイズ除去はできなかった.この原因は光照射により脱離したトリチウム水蒸気の光照射停止による二次電子増倍管表面などへの再吸着,あるいは紫外線ランプが低出力なために光照射が不均一になり,トリチウム脱離が不充分な部分ができるためである.これらの問題は水蒸気に対する排気速度の大きい真空ポンプを用いること,紫外線ランプの出力を上げその数を増やすこと,光照射時に影にある部分を最小限にすることにより解決できる.ちなみに二次電子増倍管のシールド円筒を茶筒タイプからメッシュタイプに変更したところ残留ノイズは半減した.即ち,本研究で開発したT用質量分析計は高濃度トリチウムに長期間接触させられた場合でもトリチウムの吸着量が少なく,さらにこれをin-situに除去でき,ノイズ傷害を克服できる.従って,核融合実験装置を初めとする様々な分野における高濃度トリチウムの測定に有効である.一度に5Ciのトリチウムを使用できる金属製超高真空装置ならびに光照射源を備えた四重極質量分析計(改造【I】型)を設計・製作した。なお、真空装置内壁及び質量分析計主要部にはトリチウム吸着を低減するために金メッキをほどこした。上記改造【I】型の特性を非放射性気体を用いて評価した。その結果改造【I】型は未改造の同機種器(MSQ-150A)とほぼ同等の特性を有することが知られた。次いでトリチウムの化学形と汚染の度合いとの関係を調べた。トリチウムガス(【T_2】)を約4×【10^(-5)】Torr・sec接触させた場合には、検出器(Cu-Beダイノード型二次電子増倍管)のノイズレベル及び幅は各々6×【10^(-11)】A及び3×【10^(-11)】Aとなり【10^(-11)】A領域での分圧測定時の著しい障害となった。更に、約1×【10^(-5)】Torr・secのトリチウム水蒸気に接触させると、ノイズレベル及び幅は各々3×【10^(-10)】A及び1×【10^(-10)】Aと増加した。即ち、同じ接触量ではトリチウム水蒸気の方が約10倍障害の程度が大きい。上記の汚染測定に次いで、光照射除染効果を調べた。

この際内部照射光源としてハロゲンランプを、外部照射光源として重水素ランプ(30W)を使用した。ハロゲンランプを300Wで使用した場合にはノイズレベル及び幅に対して約1×【10^(-4)】/secの一次除染速度定数が得られた。即ち2時間の照射でノイズは半減した。他方【D_2】ランプ照射の場合の速度定数は上記よりも約1桁小さい値となった。但し、光照射時のトリチウム水分圧は【D_2】ランプ照射の場合の方がハロゲンランプ照射の場合よりも数倍高かった。即ち紫外線照射により吸着トリチウム水は効率よく脱離しているが、外部からの局所照射であったため再吸着の影響が大きく、見かけ上除染効果が低くなっていることを示している。以上の結果により、更に大出力の内部照射型の紫外光源をとりつけることにより、トリチウム汚染の影響をin-situにかつ効率良く取り除ける見通しがついた。
注意欠陥/多動性障害モデルラットにおけるメチルフェニデートの作用

注意欠陥/多動性障害(attention-deficit/hyperactivity disorder ; AD/HD)の病態としてノルアドレナリン(NA)やドーパミンなどの神経伝達物質の働きの関与が報告されている。本研究ではAD/HDモデルラットとして広く繁用されている高血圧自然発症ラット(SHR)を用いて,AD/HD臨床薬Methylphenidate(MPH)の作用を検討した。SHR(雄性,生後34週齢,20-50g)からNA含有神経核である青斑核(LC)ニューロンを含む脳スライス標本(230μm)を作成し,whole cell patch clamp法によって神経活動を記録した。その結果,SHRのLCニューロンはWistar系ラットと比べて,静止膜電位が小さく(脱分極),自発性活動電位の発射頻度は低い傾向が認められた。保持電位(-60mV)において,MPH(10-100μM)灌流投与によりMPH誘起電流が記録されたが,外向き電流発生(34±6pA, n=8),内向き電流発生(21±4pA, n=6),変化なし(n=7)という結果を得た。このとき抑制性シナプス後電流(IPSC)は,MPHによって濃度依存的に振幅とタイムコースが増大されたが,高濃度MPH(100μM)ではIPSCsの振幅を抑制する例もみられた。興奮性シナプス後電流に対する作用は認められなかった。通常の(Wistar)ラットを用いた同様の実験では,ほとんどのLCニューロンにおいてMPHは膜コンダクタンスの上昇を伴う外向き電流を発生していたが,SHRではニューロンによってMPH誘起電流の性質が異なることが示唆された。このことはAD/HDモデルであるSHRのLCニューロンにおける神経伝達物質の代謝や感受性が正常ラットとは異なることを示唆しており,このような差がAD/HDの病態の一因ではないかと考えられる。
デバイス・ドライバの開発を支援するドメイン特化言語の設計と実現

昨年度までの研究により,デバイス・ドライバが守るべき暗黙の約束事には1)関数定義の義務,2)関数の呼び出し順序の指定,3)状況に依存した関数呼び出しの義務・禁止の3種類に大別できることがわかっている.昨年度は,これらの暗黙の約束事を形式的に記述できる一種のプログラミング言語の設計を行った.本年度は,この言語の有効性の検証を行うことを目標に,いくつかのテストケースとなるデバイス・ドライバを選択し,その記述を行った.具体的にはマウス用のデバイス・ドライバ,イーサネット・カード用のデバイス・ドライバを対象に暗黙の約束事の記述を試みた.しかし,実際にデバイス・ドライバの記述をすすめてみると,関数の呼び出し順序や,状況に応じた関数呼び出しの義務および禁止を十分に記述できないことが判明した.これは,デバイス・ドライバによっては制御の流れが想定以上に複雑になる場合があり,そのような場合に記述力が十分でないことが明らかになったためである.本研究の当初の目的は,暗黙の制約を満たしているかどうかを検証可能なデバイス・ドライバ記述用言語の設計を行うことであった.しかし,実際には検証可能なような記述法でありながら,実際のデバイス・ドライバの記述に耐えるだけの表現力をもつものを実現するのは難しかった.現時点では,やや限定された表現力しかない言語で妥協し,どのような拡張を行えばよいのか検証を進めている.現在,RAMディスク用のデバイス・ドライバ程度であれば,ほぼ記述できる程度の完成度となっている.本研究の目的は,デバイス・ドライバの開発を支援するドメイン特化言語(domain-specic language)を実現することにある.一般に,ある特定の問題領域(ドメイン)に特化したプログラミング言語のことをドメイン特化言語と呼ぶ.ドメイン特化言語は,対象とするドメインに特化した抽象化や記法を持ち,汎用的なプログラミング言語よりも高い記述性を持つ.また,プログラムの正当性の検証など,汎用的なプログラミング言語では難しい高度な解析が可能となり,通常では検出困難な誤りを静的に検出できる場合が多い.本研究では,デバイス・ドライバの開発に特化したドメイン特化言語を実現し,それによってデバイス・ドライバの開発効率を向上させ,その可搬性を高めることを目標とする.本年度は既存のデバイス・ドライバについて詳細に調査を行った.この調査は主にLinuxを対象として行った.その結果,すべてのデバイス・ドライバを対象とした汎用的な言語を設計することは現時点では困難であり,対象を限定して調査をすすめるべきであるとの結論に達した.研究進展のための足がかりを得るため,比較的に簡単なドライバであるマウス用のドライバを対象に現在は調査を行った.この結果,ドメイン特化言語に必要な機能がある程度明らかになった.この機能を用いて,他のドライバにもどの程度適用できるのかを調査する必要がある.本研究の目的は,デバイス・ドライバの開発を支援するドメイン特化言語(domain-specific language)を実現することにある.デバイス・ドライバは,OSカーネルと密接に連携して動作するプログラムであり,さまざまな暗黙の約束事を守ったプログラムを作成しなければならない.ここでいう暗黙の約束事とは,lock/unlockのようにペアとなる関数の呼び出しなどを指す.今年度は,これらの暗黙の約束事の調査を行い,それらの約束事を記述するための形式的な言語の設計を行った.具体的にはLinuxカーネルで用いられているデバイス・ドライバの調査を行い,こうした暗黙の約束ごとの抽出を行った.その結果,これらの約束事は,1)関数定義の義務,2)関数の呼び出し順序の指定,3)状況に依存した関数呼び出しの義務・禁止の3つに分類できることがわかった.この調査結果に基づき,デバイス・ドライバが守るべき約束事を記述するための一種の言語の設計を行った.この言語は,関す呼び出しの義務,関数の呼び出し順序の指定,状況に応じた関数呼び出しの義務・禁止を記述することができる.この言語の記述力を検証するため,Linux用のRAMディスクのデバイス・ドライバを対象に,そのドライバが守るべき約束事の定義を行った.800行のデバイス・ドライバに対し,約50行程度で約束事の記述ができた.今後,マウス・ドライバなどのより現実的なドライバに対して,記述力の検証を行う.また,デバイス・ドライバ記述専用の言語の設計を行い,その言語で記述したデバイス・ドライバが暗黙の約束事を守っているかどうかを検査できるようにしたい.昨年度までの研究により,デバイス・ドライバが守るべき暗黙の約束事には1)関数定義の義務,2)関数の呼び出し順序の指定,3)状況に依存した関数呼び出しの義務・禁止の3種類に大別できることがわかっている.昨年度は,これらの暗黙の約束事を形式的に記述できる一種のプログラミング言語の設計を行った.本年度は,この言語の有効性の検証を行うことを目標に,いくつかのテストケースとなるデバイス・ドライバを選択し,その記述を行った.具体的にはマウス用のデバイス・ドライバ,イーサネット・カード用のデバイス・ドライバを対象に暗黙の約束事の記述を試みた.しかし,実際にデバイス・ドライバの記述をすすめてみると,関数の呼び出し順序や,状況に応じた関数呼び出しの義務および禁止を十分に記述できないことが判明した.これは,デバイス・ドライバによっては制御の流れが想定以上に複雑になる場合があり,そのような場合に記述力が十分でないことが明らかになったためである.本研究の当初の目的は,暗黙の制約を満たしているかどうかを検証可能なデバイス・ドライバ記述用言語の設計を行うことであった.

しかし,実際には検証可能なような記述法でありながら,実際のデバイス・ドライバの記述に耐えるだけの表現力をもつものを実現するのは難しかった.現時点では,やや限定された表現力しかない言語で妥協し,どのような拡張を行えばよいのか検証を進めている.現在,RAMディスク用のデバイス・ドライバ程度であれば,ほぼ記述できる程度の完成度となっている.
医薬品および環境物質によるトランスポーターを介した肺障害発症機構の解明

肺サーファクタントは呼吸機能に必要不可欠な肺胞表面を覆う成分であり、主にPhosphatidylcholine(PC)から構成される。PC量の低下はARDSなどの肺障害機構と密接に関与する。そこで、PCはII型肺胞上皮細胞内でCholineより生合成されることに着目し、Cholineの細胞内取り込み機構について解析を行った。結果、Choline輸送にはCholine Transporter-Like Protein 1(CTL1)、およびCTL2が関わること、更にPC合成において生理的に重要な働きを担うGlucocorticoid ReceptorによってCTLsの遺伝子発現量、およびCholine輸送活性が調整されることを明らかとした。加えて、肺毒性を示す医薬品であるCPT-11やGefitinibはコリン輸送を著しく低下させた。すなわち、医薬品や環境物質が、CTLs遺伝子発現量の減少や、CTLsを介したCholine輸送阻害を促すことが、II型肺胞上皮細胞内のPC量低下による呼吸機能障害に関わる可能性を示唆するに至った。また、合成されたPCは、細胞内でラメラ体と呼ばれる小胞体に蓄積され、肺サーファクタントとして成熟した後にExocytosisによって肺胞腔中に分泌を受ける。ABCA3-KOマウスでは、ラメラ体へのPC蓄積が見られないことで、肺サーファクタントが形成されず出産後直ちに呼吸不全によって死に至ることから、このPC蓄積過程にABCA3が強く関与することが知られている。そこで、ABCA3のPC輸送と肺サーファクタント機能形成の関係に着目し、ABCA3のPC輸送に対する薬物の影響の検討を試みた。まず、ヒトII型肺胞上皮細胞株A549細胞に、ABCA3を過剰発現させることで、PCの細胞外分泌量が顕著に増加を示し、ABCA3活性が細胞外PC分泌と関係することが示された。続いて、ABCA3発現A549細胞の細胞外PC分泌対し、Minocycline, Gefitinib, CPT-11等、多くの肺毒性が報告されている薬物で細胞外PC分泌量が有意に低下した。しかしながら、このPC分泌量変化の現象が、直接にABCA3に対して薬物が影響を与えているかは明らかではない。この点について、今後の更なる検討が求められる。これら検討は、薬物が肺サーファクタント機能を阻害することで、肺毒性が発症する可能性を示唆する。
人腕の骨格モデルに基づいた多自由度電動義手の開発と臨床応用

本研究では、事故などで上肢の一部を失われた身体障がい者が物体とのインタラクションなど日常生活における殆どの作業を行うことができ、外観上にも本物の手と同様な多自由度電動義手の開発を目的とする。近年、申請者らはロボットハンドを製作し、筋肉の数式モデルを用いて粘弾性を制御することを提案している。このノウハウを応用し、人腕の骨格モデルに基づいた電動義手を製作し、機械学習を必要としない筋肉の数式モデルを用いて各アクチュエータの粘弾性を制御する電動義手の基盤技術の構築を行う。本研究によって身体障がい者向きの筋電電動義肢として人間のように巧みに操作できる。
可変型遺伝子トラップによる挿入突然変異マウス作製とそのカタログ化

我々は,単なる遺伝子破壊型の変異を作り出すだけではなく,トラップベクターのレポーター遺伝子を任意の遺伝子に置換できるようにするため,バクテリオファージP1由来のCre-loxシステムを応用し,組換え部位であるlox配列に変異を加えたものを用いることでES細胞でNDAを部位特異的に挿入させる方法を開発した。このCre-変異lox組換えシステムでは、lox配列の5'端3'端にそれぞれ変異を加えたlox71とlox66配列、中央部スペーサー領域に変異を加えたlox2272配列を組み合わせて用いる。このシステムをトラップベクターに用いることで、トラップされた遺伝子のプロモーターのコントロール下に別の遺伝子を発現させ、それをマウスで解析することができる。これら変異lox配列を用いた可変型遺伝子トラップベクターpU-17(intron-lox71-splice acceptor-betageo-loxP-pA-lox2272-pSP73-lox511)を構築し、TT2ES細胞にエレクトロポレーションにより導入、トラップクローンの単離を行なった。現在までに合計767クローンを単離した。これらのクローンについて、挿入パターンをPCRおよびサザンブロットにより解析した結果、約半数のクローンが1コピーの挿入でlox配列を保持していることがわかった。それらのクローンを用い、順次キメラマウスの作製し変異マウスの系統樹立も行なっている。キメラマウスは実体顕微鏡下で行なえるモルラ胚とのアグリゲーション法で作製しており、現在までに34系統の変異マウスラインを樹立した。また、トラップされた遺伝子の解析も5'RACE法により進めている。まだ解析数は10クローン程度であるが、その手法は確立し、確実にRACE産物が得られるようになった。
収縮時のヒト骨格筋および腱組織全体の形態計測

本研究では、ヒトの力発揮メカニズムを解明するために、収縮時の筋・腱組織全体の形態を計測することを目的として行われた。従来、骨格筋の測定に用いられている超音波Bモード法に加え、MR拡散テンソル画像法やTaggingsnapshot法(MRIの高速撮像法の一つで、画像上の一部分の移動を観測する方法)という新しい手法を骨格筋測定に応用した。主たる結果として、拡散テンソル画像法では、血流還流、筋線維組成、事前運動の量などの影響が誤差要因として無視できないことが明らかとなった。ヒト骨格筋力発揮時の筋束動態を定量することを目的とし、MR装置と超音波装置を併用し、拡散テンソル画像法を用いた筋線維追跡法の測定および超音波法による筋腱動態の実測を行い、得られた知見を統合した。ヒト骨格筋の力発揮時における水分子の拡散状態は、MR拡散強調画像から算出される拡散係数(ADC)で評価することができる。本研究では、健常成人男性7名に対し、MR装置内で使用できる非磁性体筋力測定装置を使用し、等尺性足背屈収縮時のADC値を求めた。強度20%MVC(Maximal Voluntary Contraction:随意最大収縮)時にはADC値は変化せず、強度50%MVC時にはADC値が有意に増加した。ADC値の増加には収縮熱の発生による影響もあるが、収縮に伴う筋束の羽状角(腱膜と筋束のなす角度)の変化にも対応していると考えられる。超音波法による収縮時の前脛骨筋の筋束動態の観測によって、力発揮強度の増加に伴い、筋束は短縮し羽状角が増大するとともに、腱膜の長軸方向へ筋束が移動することが分かっている。そこで、前脛骨筋の腱膜に対する平行方向と垂直方向に拡散係数を分けて計算したところ、水平方向に比べ垂直方向の拡散係数の変化が大きいことが明らかとなった。このことは、収縮に伴う筋束の移動方向と一致し、拡散画像から収縮時の筋束動態を定量出来る可能性を示唆している。一方で、血液流による影響も無視できないため、追加実験としてMR室外にて等尺性足背屈収縮時の近赤外分光法による運動前後の筋血流量を計測した。50%MVC時には筋内圧の上昇に伴う筋血流の減少が認められ、力発揮中の拡散係数に影響を及ぼさなかったと考えられる。ヒト骨格筋力発揮時の筋束動態の定量を行うため,拡散テンソル画像による筋線維追跡法の測定(研究1)および超音波法による筋腱動態の測定(研究2:実験計画3に該当)を行った。研究1:拡散テンソル画像による筋線維追跡法の測定精度の向上および妥当性の確認に関する実験を行った。拡散テンソル法で得られる拡散係数(ADC)には骨格筋の筋内水分量が影響する。そこで,まず,血液灌流の影響を除外するため,大腿部をカフで巻いて,200mmHgまで加圧して動脈を圧迫し阻血状態を保持した状態で,大腿部および下腿上部のADC値の測定を行った(被験者2名)。大腿部カフ締め時の拡散画像内では,動脈血管の信号値の低下が確認されたが,それに伴い筋内のADC値が低下した。次に,筋内に含まれる脂肪量の影響を考慮するため,プロトン磁気共鳴スペクトル法(1H-MRS法)により,筋内脂肪(IMCL)の定量を行った。筋内脂肪量は磁場と筋束のなす方向に影響されると言われているため,被験者5名に対し,足関節角度を変化させた際の下腿三頭筋のIMCLを計測した。その結果,足関節角度による影響は見られず,IMCL値はヒラメ筋>腓腹筋の順で,筋内脂肪の含有量に筋線維組成が影響する可能性が示唆された。最後に,加重負荷によるカーフレイズ課題前後のT2値変化(筋内水分量の指標)の測定を行った。その結果,運動課題直後にT2値が有意に増加した(ヒラメ筋13±5%,腓腹筋23±7%増加)。以上のことから,拡散テンソル画像によるFiberTracking法では,血流還流,筋線維組成,事前運動の量などを考慮する必要があることが分かった。研究2:足関節底背屈0度における安静時と等尺性足底屈発揮時の腓腹筋腱移行部ならびに筋束動態の計測を行った。FiberTracking法による筋線維方向の算出を行い,超音波法による羽状角の測定値との相関関係を確認した。研究計画13を通じて使用する予定であった非磁性体のMR装置内用の筋力計の試作品を製作し,実際に画像を撮像してみたが,荷重がかかる部分の強度が低く何度も紐が切れたり,動作が安定しなかったりした。また,関節の固定精度が悪く,MR装置内で使用する際にモーションアーチファクトによるノイズが多くて精密な測定には堪えなかった。さらに,発揮した張力をフィードバックする非磁性体のトランスデューサーの手配が遅れ,発揮張力のフィードバックをすることができなかった。

以上の点を改良するために,年度末に,類似した性能を持つ製品版の筋力計(価格800万円相当)を実際に使用している研究室(フランス,マルセイユ大学)を訪問し,使用しているところを見せてもらった。製品版では,機械の強度,固定器具の安定性は良かったが,実際に画像撮像した時のノイズは完全に消去できないことが分かった。しかしながら,機械に対しての具体的なイメージを得ることができたので,早急に筋力計を改良するために設計および機材手配を行う予定である。以上のことから,筋力計の設計・製作段階で大幅に遅れを生じ,本年度は実験計画1の一部と実験計画2に着手することができなかった。早急に筋力計の設計および改良を行い,非磁性体の筋力計を完成させる必要があるが,実験計画3は順調に進んでいるので,実験計画1,2の筋力計に依存しない部分については同時進行で実験を進めていく予定である。非磁性体のMR装置内用筋力計の試作機を改良し,等尺性で足関節筋力が測定できるようにする。筋力計が完成したのち,安静時に磁気共鳴スペクトル法(1H-MRS法)による筋内脂肪(IMCL)の定量ならびにT2値測定による筋内含水量の定量を行い,等尺性力発揮中に取得した拡散テンソル画像にそれらの結果ならびに収縮時のT2値変化を加味して,FiberTracking法により筋束角度の算出を行う。同時に超音波法を用いて部位ごとの筋束角度(羽状角)を求め,FiberTracking法の計測の妥当性を検証する。そののちに,収縮時の筋・腱組織全体の形状およびその変化を身体運動に近い状態で計測するために伸張・短縮性運動をMR装置内で実現できるような非磁性体の等負荷性伸張・短縮運動用の筋力計を製作する。製作した筋力計を用いてTagging Snapshot法による筋腱動態の計測を行う。なお,日本磁気共鳴医学会において2010年度より組織されたスタディーグループ"筋MRI&MRS研究会"に属している同様の研究をしている研究者ならびに海外の研究者(フランス,マルセイユ大学,David Bendahan氏)との連携を密にし、必要に応じて共同研究や意見交換を行う。MR室内で使用できるような非磁性体の筋力計を製作するための機材ならびに発揮した張力をフィードバックするためのトランスデューサの購入が必要である。足関節用の筋力計は,足関節の固定具とフットプレートに生じる回転トルクを測定する機器があれば十分であるが,非磁性体の資材で,それらの強度をある程度強く保つために補強が必要である。また,等尺性筋力計が完成したのちに,等負荷性伸張・短縮運動用の筋力計を製作する。その際に,油圧式モーターの導入を考えている。以上の機器・資材および工作費に研究費の多くを充当する予定である。また,筋力計の製品版を所有している研究者との実験協力やスタディーグループの打ち合わせなどが必要になる。国内外の研究者とは,主に,学会会場で打ち合わせを行わうため,学会参加のための旅費を計上する。実験計画13は筋力計が完成した後に本格的に行われるが,その際に実験協力の検者・被験者への謝金が必要となる。
プラスチドmRNAの翻訳機構に関する研究

本研究は、タバコのプラスチドより調製したin vitro翻訳系を用いて、以下のプラスチド翻訳の分子機構を明らかにした。(1)開始コドンの決定:ndhDmRNAは、AUG、GUGと後方のACGがRNAエディティングにより生じたAUGと3種の開始可能コドンが存在する。しかし、実際は第3のAUGからのみ翻訳開始することを示した。また、psbCmRNAのAUGとGUGのうち、後方のGUGのみが翻訳開始コドンと決定した。(2)開始コドンの効率:葉緑体でもAUG以外にGUGとUUGも開始コドンとなることを示したが、それらの効率とAUG>GUG>UUGと順に低下することを示した。(3)ジ・シストロニックmRNAの翻訳:psaC-ndhDmRNAは、シストロン間で切断されないと両方共翻訳しないことを見出した。一方、psbD-psbCmRNAは切断されなくとも翻訳できる。(4)Shine-Dalgarno(SD)配列の効果:各種mRNAで調べたところ、SD配列はAUGより512ヌクレオチド前方にある場合のみ効果あることを示した。(5)RNAエディティングと翻訳の関係:in vitroRNAエディティング系の開発に成功し、エディティングにより生じたAUGから翻訳開始することを実験的に証明した。本研究はタバコのプラスチドより調製したin vitro翻訳系を用いて、プラスチド翻訳の分子機構を解明することを目的とする。(1)開始コドンの決定タバコのプラスチドのndh DmRNAは、AUGとGUGの2ヶの開始コドンが存在する。その下流ACGがRNAエディティングにAUGになり、更に1ヶの開始コドンがRNAレベルで生成する。各種変異mRNAの翻訳をin vitro系で調べるとRNAエディティングの結果生じたAUGのみが実際に開始コドンとして働くことを明らかにした。(2)開始コドンAUGとGUGの効率psbCmRNAはGUGを持つが、in vitro系でこのGUGが開始コドンとして働くことを明らかにした。ついで、このGUGをAUGに変えたmRNAは、翻訳効率が10倍くらい上昇することを示したので、プラスチドに於いてもGUGに比べAUGが開始コドンとして効率が著しく良いことを明らかにした。(3)ジ・シストロニックmRNAの翻訳psaCとndhDはジ・シストロニックmRNAである。これがそのままでは、翻訳されず、シストロン間で切断されることにより始めて翻訳されることを明らかにした。(1) UUG開始コドンクロレラ葉緑体ゲノムのinfA mRNAの第1コドンはUUGである。これが開始コドンとして働くことをin vitro系で確認した。これは葉緑体mRNAで初めて見い出されたUUG開始コドンであるが、効率は極めて低い。(2) RNAエディティングの影響タバコrps 14 mRNAのコード領域内の2カ所のCがUに変換する。この変換が翻訳効率に影響するかどうかをかin vitro系で調べたが、変化ないことを示した。タバコ葉緑体のmRNAにはSD配列を含むものがあるが、この効果を変異mRNAとin vitro系で調べたところ、AUGより510ヌクレオチド前方にあれば著しい効果があることを示した。本研究はタバコのプラスチドより調製したin vitro翻訳系を用いて,プラスチド翻訳の分子機構を解明することを目的とする。(1)ジ・シストロニックmRNAの翻訳効率psbD mRNAは両端がオーバーラップしているジ・シストロニックmRNAである。psbD mRNAはAUGとGUGのコドンを持つが、後方のGUGのみが翻訳開始コドンであることを決定した。また、両シストロンを切り離したモノシストロニックmRNAの翻訳効率は大きな変化がないことを示した。(2)30種のtRNAの翻訳は可能かシスティンtRNA遺伝子の破壊を行った株を作製中である。(3)RNAエディティングと翻訳との関係単離タバコ葉緑体よりin vitro

エディティング系の開発に成功した。これを用いて、psbL mRNAのACGからAUGへの変換のシスとトランス因子を同定した。ついで、生成したAUGが翻訳開始コドンとなることを証明した。
中国における家庭内紛争の処理手続に関する基礎的研究

本共同研究は、中国における家庭内紛争の解決・処理のための組織・手続の基本的な枠組みと内容を明らかにすることを目的としていた。研究目的を達成するため、法制度の概要を法令により確認し、続いて主として裁判制度を対象に調査をおこなったが、司法改革の中、調停の組織・手続の整備が進んでいること等が明らかになった。次に、家庭内紛争の解決・処理における制度運用の基本的状況では、(1)和解・調停・訴訟という方式の多様化、(2)裁判所外の紛争処理方式(当事者間の和解と訴訟外の調停)に大きな比重、(3)調停(訴訟外および訴訟内)の高い効果、(4)今後は訴訟へ重心移動との予測、(5)訴訟における調停の重視、という結論が得られた。裁判所による調停について、日本の場合、人事訴訟手続法の改正によって家庭裁判所で離婚調停と離婚訴訟がおこなわれ、一見すると中国の場合と制度的に類似しているようだが、中国の場合には調停と訴訟が制度的に分立しているわけではない。また、中国では、家庭内紛争を処理するための特別の裁判手続・制度が用意されているわけではないが、今後、紛争の増大と多様化に対応するため、組織・手続が整備される可能性がある。また、紛争解決のための裁決規範については、裁判所内外で区別してはいない。制度上、一方では、裁判所外の紛争処理方式が主として人民調停委員会や司法所という裁判所の監督下にある公的組織によって担われていることにより、また他方では、裁判所の裁量の余地が大きく残されていることによる。立法においても、法律規定は原則的な内容に止めておき、これに裁判所が統一解釈を示すことによって裁決規範を形成する、というシステムが成立してきていることが確かめられた。なお、司法改革が進行中なので、家庭内紛争の処理手続が具体的にどのように変革・整備されるのか、については、今後の課題として残されている。本年度は、共同研究を開始するにあたり、中国における家庭内紛争処理の組織・手続の基本的な枠組みと内容を理論的、実証的に把握するためには、調査の範囲をどの程度まで拡げ、どのようなアプローチが効果的であるか、を検討することに費やされた。(1)國谷・南方・岡は、5月初旬に北京大学法学院へ行き、海外共同研究者である藩剣鋒教授および馬憶南助教授と打合せをおこない、研究計画と方法を綿密に検討し、課題設定と調査方法・分析方法等に関してレビューを受けた外、他の北京大学法学院教員からも情報を収集した。また、上海へ行って、当地の弁護士と面談し、情報収集をおこなった。(2)その結果、対象としている「家庭」が制度的に流動的であることが確認される一方、紛争の目的となるものが漸く法制度として樹立されつつあることが分かった。たとえば、2001年改正婚姻法は事実婚を認める方向へ一歩踏み出しており、家庭内紛争という場合の「家庭」の範囲を法的にどのように限定するのかが問題となること、夫婦財産制度についてその前提となる物権法の起草作業が最終局面にあり、家庭内の財産紛争の対象となる所有権や用益物権(農村土地請負権、居住権等々)が議論されていること、などである。(3)したがって、中国の家庭内紛争解決・処理の組織・手続に関する文献資料の調査と収集については、幅広くおこなうこととした。國谷は財産関係について、岡は婚姻関係と計画出産関係について、資料を調査中であり、その一部を翻訳公表した。(4)一方、分析視角・評価基準を仮設するための、日本における家庭内紛争の実態等については、南方が調査中であるが、國谷も新潟家庭裁判所7の統計や状況に関する調査をおこなった。

本年度は、家庭内紛争解決・処理の組織・手続に関する文献資料の調査・収集・整理をおこなう一方、研究の各論部分として対象範囲と分析視角をより具体的に仮設して研究を進めた。資料については、前年度から継続して家族に関する法令(司法解釈を含む)のリスト作成、裁判例(案例)の収集とリスト作成、論文の収集とリスト作成をおこなった。具体的な研究については、海外共同研究者からの意見を参考にしながら、離婚とりわけ裁判離婚の法定離婚原因に関する問題から分析を進めていくこととした。その成果は、平成17年12月12日の研究会「離婚に伴う諸問題-日本と中国における法的対応-」(於:新潟大学大学院実務法学研究科)で次のとおりに発表された。(1)馬憶南・北京大学法学院教授は、「中国法における裁判離婚の離婚原因の理論と実践」と題する報告をおこない、中国の離婚観・離婚法・離婚率の変遷、裁判離婚原因をめぐる論争、条文に例示された離婚原因と裁判実務とのくいちがい、について発表した。(2)南方暁は、「日本における離婚原因に関する論点について」と題する報告で、日本の離婚観・離婚率・離婚制度の特色、破綻主義離婚制度の意味、などについて発表した。(3)羅勝華・中国国家法官学院講師は、「法定離婚原因の変遷と国家強制-新中国における法定離婚原因の変遷を中心に-」と題する報告をおこない、中国法定離婚原因の変遷とその背景・理由について発表した。また、上記2人の海外共同研究者とともに、新潟家庭裁判所を参観し、離婚訴訟を傍聴した上で、判事等から事情を聴取し、日本の家庭内紛争についての実態、法意識・家族観、紛争処理に際しての留意点、組織的対応等を実務の面において調査した。そして調査を踏まえて海外共同研究者と意見交換をおこない、今後の研究を裁判所における紛争解決・処理の組織と実態に焦点を当てて進めていくこととした。本年度は、過去2年間実施してきた文献資料調査について必要な補足をおこない、中国における家庭内紛争処理手続の実態とモデルについて民事訴訟法を専門とする海外共同研究者から研究成果を聴取し、日本における家庭内紛争とその法的処理手続の概況と比較しながら、共同研究の成果のまとめをおこなった。まず、海外共同研究者の潘剣鋒北京大学法学院教授は、平成18年10月11日に「中国解決家事糾紛模式的初歩研究」と題する報告をおこない、中国の家庭内紛争解決方式の実態の分析結果を明らかにした。次に、南方は、家事調停に焦点を合わせて日本の紛争処理手続の分析を制度面および運用面でおこなった。一方、國谷は、中国の夫婦財産をめぐる紛争を対象として歴史的分析を加え、裁判手続と裁決規範の形成過程を明らかにし、現行制度における離婚時の処理手続と基準を示した。また、資料収集と整理の面では、岡が、中国家庭内紛争解決・処理の組織・手続に関する法令(司法解釈を含む)のリスト作成、裁判例のリスト作成、学術論文のリスト作成をおこなった。
手指の先天奇形(特に合指症)の成因に関する研究

種々の動物の手足の形成過程では、まず四肢の形成予定域に突起(肢芽)が形成され、肢芽の基部が細胞死によってくびれが生じ、手関節に相当する部ができる。さらに、発生が進むと手足の形成予定域には指の原器が形成され、グローブ状の形となる。その後、各指間の間充織がアポトーシスによる細胞死に陥り、指間間充織が除去され、各指が分離する。両生類では指間間充織に細胞死が起こらないために水かきを持つ手足が形成されるが、鳥類やほ乳類などでは指間間充織に細胞死が起こるため、水かきを持たない手足が形成される。鶏胚肢芽では7日鶏胚で指間間充織に細胞死が出現し、1日以内にほとんどの指間間充織が死んでしまう。そして、この部における細胞死への運命は61/3日から62/3日鶏胚で決定されると考えられているが、細胞死を誘導するメカニズムは明らかにされていない。一方、人の手の先天奇形は合指症や多指症など表現形が様々である。そのうち合指症は指間部の間充織が連続しており、外科手術を必要とする。その原因はいまだはっきりと解明されていないが、発生の段階でアボトーシスが正常に起こっていない可能性が考えられる。最近、BMP-2、BMP-4が指間間充織のアポトーシスのシグナルとなっている可能性が報告されている。本研究では、手の先天奇形の一つである合指症の原因を解明する目的で、鶏胚肢芽組織の細胞の分化とアポトーシスにおよぼすBMP-2の作用を解析する計画をすすめてきた。しかし、技術的な諸問題をクリアできず、研究目的を果たすことができなかった。設備機器および、試薬をはじめ各種消耗品を購入した。現在、6日目の有精卵から鶏胚の後肢の取り出し、6日鶏胚の後肢芽を0.5%トリプシン溶液で4°Cで20分間処理し、可及的に表皮を剥離し、その後、上皮下結合組織を0.1%トリプシン・0.1%コラゲナーゼ溶液で37°Cにて30分間処理し、細胞分散の課程である。今後さらに、これらの細胞を1.3x10_6細胞/cm2の濃度でLab Teck Charmberプレートに撒き、10%Fetal Bovine Serum(FBS)と抗生物質(ペニシリン;100U/ml、ストレプトマイシン;100ul/ml)を含むα-MEM培地で培養する。培養1日目に500ng/mlの濃度のrhBMP-2を添加し、さらに24日間培養後、アルカリフォスファターゼ(ALP)染色、アルシャンブルー染色を施し、軟骨細胞への分化を検討する。また、アポトーシスの同定はTUNEL法を用いて行う予定である。その後、指間間充織とそれ以外の組織に分離し、別々に培養する。上記と同様の処理の後、これらの細胞の分化とアポトーシスに及ぼすBMP-2あるいはBMP-4の作用を解析することによって、合指症の発生メカニズムの解明へとつなげる。6日目の鶏胚の後肢芽を0.5%トリプシン溶液で4°Cで20分間処理し、可及的に表皮を剥離した。その後、上皮下結合組織を0.1%トリプシン・0.1%コラゲナーゼ溶液で37°Cにて30分間処理し細胞を分散させた。これらの細胞を1.3×10^6細胞/cm^2の濃度でLabteck Chamberプレートに撒き、10%ウシ胎児血清と抗生物質(ペニシリン;100U/ml、ストレプトマイシン;100μl/ml)を含むα-MEM培地で培養した。

培養1日目に500ng/mlの濃度のrhBMP-2を添加し、さらに2-4日間培養後にアルカリフォスファターゼ染色、アルシアンブルー染色し、軟骨細胞への分化を検討した。アポトーシスの同定は、TUNEL法を用いた。BMP-2の添加群では軟骨用結節の染色性が非添加群よりも強く、またアルカリフォスファターゼ陽性細胞数も増加していた。さらに、BMP-2の添加により軟骨様結節間の細胞のアポトーシスも増加した。すなわち、BMP-2は6日鶏胚肢芽間充織細胞の軟骨細胞への分化促進作用とアポトーシスを促進することが示唆された。有精卵から鶏胚の後肢の指間組織とそれ以外の組織に分離した。0.5%トリプシン溶液で4°Cで20分間処理し、可及的に表皮を剥離し、その後、上皮結合組織を0.1%トリプシン・0.1%コラゲナーゼ溶液で37度で30分間処理し、細胞分散させた。これらの細胞を1.3×10_6細胞/cm2の濃度でLab Teck Chamberプレートに撒き、10%Fetal BOvineSerumと抗生物質(ペニシリン;100U/ml、ストレプトマイシン;100U/ml)を含むα-MEM培地で培養した。培養1日目に500ng/mlの法度のBMP-2を添加し、さらに24日培養後、アルカリフォスターゼ(ALP)染色、アルシャンブルー染色を施した。軟骨細胞への分化の観察し、またアポトーシスの同定にはTunne法を行い検討中である。