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コロニアルな視線の順応化―ロマン派期英国アイルランド小説再評価

3年目にあたる今年度は、Austenの_Emma_(1815)と_Persuasion_(1817)_の読み直しを中心に進めた。今年度は比較対象のEdgeworthの生誕250周年に当たり、国際的にEdgeworth研究への注目も高まる機運の中、同時代のAustenらロマン派期の小説を俯瞰した国内外の国際学会で成果の一部を発表し、専門家らとの意見交換や最新の研究の動向の把握を積極的に行うことができた。特に、7月と12月にそれぞれ口頭発表した国際学会は、開催地がそれぞれオランダ共和国、アイルランド共和国ということで、英文学をヨーロッパ文学の広い文脈で捉える視座での基調講演やディスカッションが闊達で今後の研究に貴重な示唆を得た。_Emma_と_Persuasion_の読み直しは、各作品でヒロインが家庭空間の内外で注ぐ視線に潜むリアリズムとロマンスの作用を重点的に分析することを中心に進めた。また、歴史的文脈で「コロニアルな視線」への理解を深めるため、イギリス帝国のネットワークを行き来したAustenとEdgeworthの親族・知人(海軍将校であった親族を中心に)に関する一次資料・二次資料の検証に取り組んだ。夏季に資料調査を集中的に行った大英図書館では、キャプテン・クックを再評価する展示が開催されており、植民地の開拓や航海にまつわる視覚表象の調査も行うことができた。Austenの受容に関する研究も継続し、Austenの家庭小説の受容を夏目漱石の文学理論に検証する英語論文を1編まとめた。これまでの研究成果の一部を、国内外で開催された国際学会で口頭発表し(招待講演1回を含む)、論文1編にまとめたため。国際学会では、最新の研究動向を再確認しながら国内外の専門家と意見交換を行い建設的なフィードバックを得ることができた。2019年度は、エッジワースの手稿コレクションの試験的なデジタルアーカイブ・プロジェクトが立ち上がったオックスフォード大学を拠点として、オースティン研究の主要拠点の一つであるチョートン・ハウス図書館や大英図書館などで資料調査を継続し、現地の研究者と意見交換を定期的に行いながら、成果をまとめる。本研究の目的は、基盤研究C(課題番号25370276)の成果に基づき、再評価が進むロマン派期英国・アイルランド小説の体系化を補い、文学史を修正することである。ロマン派期の文学史修正は着手されているものの包括的とは言い難く、特に、ジェイン・オースティンの位置付けに関して議論が続行している。オースティンの作品はロマン派期小説の正典として再定義される一方、基幹サブジャンルである国民小説との間テクスト性の検証には議論の余地がある。本研究は、オースティンのイングランドの家庭を舞台の中心とした小説が、「ケルト辺境」でリアリズムとロマンスを混在させる国民小説のコロニアルな視線を順応化することで、帝国の拡大に伴い理想的国民像の再定義を必要とする時代の要請に巧みに応えていること、さらには、その特徴が作品の正典化につながっていることを独自に示す。初年度に当たる平成28年度は、予定通り、コロニアルな視線に関する理論的理解を深め、Northanger Abbey (1817)とSense and Sensibility(1811)を読み直した。コロニアルな視線に関しては、特に、19世紀後半の在インド英国女性の著したテクスト、および在インドの英国女性の表象を扱うSusmita Roye and Rajeshwar Mittapalli編の論文集に集められた方法論と知見に注目し、本研究に応用する際の方法論的修正を検討した。また、Northanger AbbeyとSense and Sensibilityの読み直しに関しては、近年のAusten批評の動向を再確認しつつ、ヒロインの視線に潜むリアリズムとロマンスの作用を分析することを重視した。研究成果の一部を、雑誌論文1編、共箸1点、口頭発表2件で発表した。校務多忙のため海外資料調査を平成29年度に延期することにしたが、国内で入手した資料の分析からでも方法論的な理解を一定度深めることができ、一次資料の再読でも新たな観点を得ることができたため。また、研究成果の一部を複数の機会で公表し、全国主要図書館のレファレンス係を対象とした講演も含んだため、広く社会へ発信することができたと考えられるため。2年目に当たる平成29年度は、Jane AustenのPride and Prejudice (1813)とMansfield Park (1814)の読み直しを中心に進めた。Austen没後200周年に当たる年度であったことから、数々の参考文献や資料が公刊され、それらを把握することで、現代も続行するAustenの作品の正典化の検証も行った。Pride and PrejudiceとMansfield Parkの読み直しは、昨年度のNorthanger AbbeyとSense and Sensibilityの読み直しに引き続き、ヒロインの視線に潜むリアリズムとロマンスの作用を重点的に分析しながら展開した。同時代に「ケルト辺境」から発信されたMaria EdgeworthのThe Absentee (1809), Patronage (1814), Sydney OwensonのO'Donnel (1814)等と比較を行ったが、特に、西インド諸島の農園を舞台にしたEdgeworthの'The Grateful Negro' (1809)を重点的に扱った。英米の奴隷表象に関する研究の動向も確認しながら、西インド諸島の農園の奴隷に注がれるコロニアルな視線とその順応化を分析した。成果の一部を、平成30年度7月に開催される国際学会の研究発表用にまとめて投稿し、発表が確定している。また、平成30年度11月に開催される国際学会のシンポジウムへも招待され、準備を開始した。

平成28年度より延期されていた海外資料調査を遂行した。また、平成30年度に国内外で開催される2つの国際学会に向けて準備・投稿を行い、招待講演1件、研究発表(査読付き)1件が決定したため。3年目にあたる今年度は、Austenの_Emma_(1815)と_Persuasion_(1817)_の読み直しを中心に進めた。今年度は比較対象のEdgeworthの生誕250周年に当たり、国際的にEdgeworth研究への注目も高まる機運の中、同時代のAustenらロマン派期の小説を俯瞰した国内外の国際学会で成果の一部を発表し、専門家らとの意見交換や最新の研究の動向の把握を積極的に行うことができた。特に、7月と12月にそれぞれ口頭発表した国際学会は、開催地がそれぞれオランダ共和国、アイルランド共和国ということで、英文学をヨーロッパ文学の広い文脈で捉える視座での基調講演やディスカッションが闊達で今後の研究に貴重な示唆を得た。_Emma_と_Persuasion_の読み直しは、各作品でヒロインが家庭空間の内外で注ぐ視線に潜むリアリズムとロマンスの作用を重点的に分析することを中心に進めた。また、歴史的文脈で「コロニアルな視線」への理解を深めるため、イギリス帝国のネットワークを行き来したAustenとEdgeworthの親族・知人(海軍将校であった親族を中心に)に関する一次資料・二次資料の検証に取り組んだ。夏季に資料調査を集中的に行った大英図書館では、キャプテン・クックを再評価する展示が開催されており、植民地の開拓や航海にまつわる視覚表象の調査も行うことができた。Austenの受容に関する研究も継続し、Austenの家庭小説の受容を夏目漱石の文学理論に検証する英語論文を1編まとめた。これまでの研究成果の一部を、国内外で開催された国際学会で口頭発表し(招待講演1回を含む)、論文1編にまとめたため。国際学会では、最新の研究動向を再確認しながら国内外の専門家と意見交換を行い建設的なフィードバックを得ることができた。平成29年度は、海外資料調査を冬期に実施する。また、主な研究対象作品としては、Pride and Prejudice (1813)とMansfield Park (1814)を扱う。平成30年度はEmma (1815)とPersuasion(1817)の読み直しを行い、平成31年度に研究の総括を行う。研究成果は随時国内外の口頭発表や論考にまとめ投稿を行う。平成30年度は、主要対象作品のEmma (1815)とPersuasion (1817)の読み直しを行う。また、国際学会で講演・発表を行う際、フィードバックの積極的な収集を行う。平成31年度は、研究の総括を行う。2019年度は、エッジワースの手稿コレクションの試験的なデジタルアーカイブ・プロジェクトが立ち上がったオックスフォード大学を拠点として、オースティン研究の主要拠点の一つであるチョートン・ハウス図書館や大英図書館などで資料調査を継続し、現地の研究者と意見交換を定期的に行いながら、成果をまとめる。
相対論的シュレディンガー作用素の一般固有関数と擬微分作用素論に関連する諸問題

空間3次元の場合に、自由相対論的シュレディンガー作用素のレゾルベント核が特異性の強いリース・ポテンシャルとマイナス・ラプラシアンのレゾルベント核、および性質の良い積分核の3つから成り立っていることを示した。道具立てとして必要な、リース・ポテンシャルに関する新しい不等式を導くことに成功した。極限吸収原理に基づいて導入される関数が相対論的シュレディンガー作用素の一般固有関数になっていることを証明した。その際に避けて通れない問題であるところの、マイナス・ラプラシアンの平方根の超関数への作用を3次元のみならず、一般の空間次元で解明することに成功した。相対論的シュレディンガー作用素の一般固有関数が平面波からどの程度ずれているかを表す関数に対して、ゾンマーフェルドの放射条件が成り立つことについても一般次元で確認した。相対論的シュレディンガー作用素の一般固有関数の無限遠方での漸近挙動の解析には、空間の次元が奇数であるか、偶数であるかにより、技術的な難しさに大きな違いがあることを解明した。この知見に基づき、空間2次元の場合に、ポテンシャル項のない相対論的シュレディンガー作用素のレゾルベント核を具体的に求めた。その結果、空間3次元の場合と異なり、空間2次元の自由相対論的シュレディンガー作用素のレゾルベント核はリース・ポテンシャルのみならず、ベッセル関数、ノイマン関数、スツルッベ関数を含み、複雑な形をしていることを見出した。上記の成果と、すでに得られている極限吸収原理の結果を組み合わせた計算により、空間2次元相対論的シュレディンガー作用素の一般固有関数が有界な関数であることの証明に成功した。この結果と上記の結果を再度用いれば、相対論的シュレディンガー作用素の一般固有関数の無限遠方での漸近挙動が平面波と球面波の重ね合わせになっていることの証明が可能となった。さらに、相対論的シュレディンガー作用素の一般固有関数の全体が完全であること、すなわち、相対論的シュレディンガー作用素に対する絶対連続部分空間を張ることの証明も可能となった。空間3次元で質量パラメータがゼロの場合に、相対論的シュレディンガー作用素の一般固有関数の無限遠方での漸近挙動をポテンシャルの減衰の速さに応じる形で精密に解明した。そのために、まず、空間3次元の相対論的シュレディンガー作用素で、ポテンシャル項がない場合に、レゾルベント核を精密に計算した。このレゾルベント核は特異性の強いリース・ポテンシャルとマイナス・ラプラシアンのレゾルベント核、および性質の良い積分核の3つから成り立っていることを解明した。相対論的シュレディンガー作用素の一般固有関数の無限遠方での漸近挙動を解析するための道具立てとして、リース・ポテンシャルの定義する関数が有界関数になるための条件と、それに付随する不等式を証明した。極限吸収原理に基づいて導入される関数が相対論的シュレディンガー作用素の一般固有関数になっていることを確認する上で避けて通れない問題であるところの、マイナス・ラプラシアンの平方根の超関数への作用を、特に、重み付きソボレフ空間に属する関数に対して解明した。相対論的シュレディンガー作用素の一般固有関数の、平面波からのズレを表す関数は、ゾンマーフェルドの放射条件を満たすことを示した。また、相対論的シュレディンガー作用素の一般固有関数は空間全体で連続な関数であることも示した。さらに、一般固有関数の、平面波からのズレを表す関数の無限遠方における漸近挙動もポテンシャルの減衰の速さに応じる形で精密に解明した。

一般の空間次元で、質量パラメータがゼロの場合に、相対論的シュレディンガー作用素の一般固有関数の無限遠方での漸近挙動をポテンシャルの減衰の速さと次元の大きさに応じて精密に解明するためにさまざまな計算を行った。奇数次元と偶数次元で、技術的な難しさに違いがあることを解明した。まず、奇数次元の場合に、ポテンシャル項のない相対論的シュレディンガー作用素のレゾルベント核を具体的に求めるための計算を進めた。その結果、空間3次元の場合と同様に、一般奇数次元の場合にも、ポテンシャル項のない相対論的シュレディンガー作用素のレゾルベント核は特異性の強いリース・ポテンシャルとマイナス・ラプラシアンのレゾルベント核、および性質の良い積分核の3つからなりたっていると予想されることがわかった。道具立てとして必要な、リース・ポテンシャルに関する不等式を新たに導くことに成功した。極限吸収原理に基づいて導入される関数が相対論的シュレディンガー作用素の一般固有関数になっていることを証明するうえで、避けて通れない問題であるところの、マイナス・ラプラシアンの平方根の超関数への作用を、奇数次元のみならず、一般の空間次元で解明することに成功した。相対論的シュレディンガー作用素の一般固有関数が平面波からどの程度ずれているかを表す関数に対して、ゾンマーフェルドの放射条件が成り立つことを一般次元で確認した。また、偶数次元における解析の困難が、如何なる種類のものであるかについても解明することができた。この困難は、波動方程式の解の性質の解明が奇数次元と偶数次元で異なっており、偶数次元の方がより困難である事情と類似のものであることが明らかにされた。一般次元において、ポテンシャル項のない相対論的シュレディンガー作用素のレゾルベント核は特異性の強いリース・ポテンシャルとマイナス・ラプラシアンのレゾルベント核、および性質の良い積分核の3つからなりたっていることが確認された。その結果、相対論的シュレディンガー作用素の一般固有関数の遠方での詳しい挙動を調べる上で、特異性の強いリース・ポテンシャルの関数への作用を各点的に調べる必要が生じることが確認された。リース・ポテンシャルを含む特異積分作用素は伝統的に関数空間における作用を調べる研究(特異積分作用素に対する不等式の研究)が多く、本研究で必要とされる、各点的評価はほとんど研究がない。そこで、この困難を克服するために、表象に特異性をもつ擬微分作用素の各点的評価、さらには、漸近展開の研究を行った。手始めに、ヒルベルト変換、および、表象がヒルベルト変換と同等の特異性をもつ擬微分作用素に対する漸近展開を導いた。次に、リース・ポテンシャル、および、表象がリース・ポテンシャルと同等の特異性をもつ擬微分作用素に対する漸近展開を導いた。これらは、共役変数の空間の1点にのみ特異性をもつ場合である。このような場合、作用を受けた関数のフェイズ、および漸近展開の係数は表象の特異性に位置によって決定されることが示された。本研究では、さらに踏み込んで、表象の特異性が位相空間における多様体上にある場合にも、考察を広げた。特異性の乗っている多様体の次元が位相空間の次元の半分の場合には、擬微分作用素の作用を受けた関数の漸近展開が完全に求められた。
貧血合併心不全における分子機構解明と新規治療への応用

貧血、特に鉄欠乏性貧血が心機能に及ぼす分子機構について、ノックアウトマウスを用いた基礎研究より検討した。エリスロポエチン(EPO)受容体ノックアウトマウスを用いた検討より、鉄欠乏による貧血合併心において心臓の内在性EPO-EPO受容体を介したシグナル伝達系が心保護に作用していることが示された。一方、アンジオテンシンII受容体(1a型;AT1aR)ノックアウトマウスを用いた検討では、鉄欠乏による貧血合併心において腎臓AT1aRを介したEPOが心保護に作用していることが示唆された。以上より、貧血合併心不全において腎臓AT1aR-EPO-心臓EPO受容体を介した経路が心保護に作用していることが示された。心臓病は我が国の死因第2位で、心不全はあらゆる心臓病の終末像である。心不全は貧血を合併することが多いが、その成因は解明されていない。本研究では、その成因を明らかにし、心不全患者さんの生命予後及びQuality of Lifeの改善を目指す。本研究では、私が発見した貧血合併心不全の分子機構において、心臓における内在性エリスロポエチン-エリスロポエチン受容体を介したシグナル伝達系が、心保護に作用するのか、をエリスロポエチン受容体ノックアウトマウスを用いて検討した。そして、貧血合併心不全においては、内在性エリスロポエチン-エリスロポエチン受容体を介したシグナル伝達系が心保護的に作用していることをつきとめた。これまで、エリスロポエチン受容体ノックアウトマウスを用いた心不全における貧血の分子機序を検討した報告は国内外において全くない。心臓におけるエリスロポエチン-エリスロポエチン受容体を介したシグナル伝達系を標的とした治療が、貧血合併心不全発症・予防につながると考えられる。これは新規の研究分野であり、得られた結果の重要性は非常に高いと考えられる。心不全患者は、貧血を高率に合併する。一方、貧血が心不全の発症・増悪因子になりうることはよく知られている。しかし、心不全患者における貧血の成因について、その分子機構は解明されていない。我々は、貧血と心不全が互いに増悪しあうという観点から、貧血、特に鉄欠乏性貧血が心機能に及ぼす分子機構を明らかにした(Naito Y et al. Am J Physiol Heart Circ Physiol. 2009)。この検討から、鉄欠乏性貧血による心機能低下に対し造血ホルモンであるエリスロポエチン(EPO)が心保護的に作用し、長期間貧血が続くと心臓におけるEPO受容体発現の亢進も認められ、心臓における内在性EPO-EPO受容体を介したシグナル伝達系が貧血合併心に重要な役割を果たしていることが示唆された。一方、アンジオテンシンIIによる内因性EPO生成促進作用が報告され、心不全治療に不可欠なレニン・アンジオテンシン系抑制薬(RAS抑制薬)によるEPO生成抑制が懸念される。本研究は、我々が発見した貧血合併心不全の分子機構において、心臓における内在性EPO-EPO受容体を介したシグナル伝達系が心保護に作用するのか、心不全治療に不可欠なRAS抑制薬であるアンジオテンシンII受容体拮抗薬が心不全合併貧血の憎悪因子なのか、などの問題をノックアウトマウスを用いた実験より検討し、患者さんに貢献するための研究基盤の確立を目指す。EPO受容体ノックアウトマウスを用いた検討よりご鉄欠乏による貧血合併心において心臓の内在性EPO-EPO受容体を介したシグナル伝達系が心保護に作用していることが示された。一方、アンジオテンシンII受容体(la型;ATlaR)ノックアウトマウスを用いた検討では、鉄欠乏による貧血合併心において腎臓ATlaRを介したEPOが心保護に作用していることが示唆された。以上より、心不全・貧血連関ネットワークにおいて腎臓ATlaR-EPO-心臓EPO受容体を介した経路が心保護に作用していることが示された。
プライバシーを考慮した認証方式の研究

メッセ一ジ認証やユーザ認証に匿名性を持たせる方法として匿名性を有する証明書を利用することが挙げられる。しかし、証明書自体を利用する方式は必ずしも計算量的な効率が良くないため、署名権の委任の仕方を改良したものとして委任署名が提案されている。委任署名は匿名証明書が埋め込まれた秘密を用いて署名を作成する方式であり、署名検証に署名者の公開鍵を必要としないため、匿名性を提供する。昨年度までに、委任署名に閾値法を適用して拡張した方式における匿名性の問題について考察した。具体的には、既存の方式の匿名性に関する問題点を指摘して、新たな閾値委任署名方式を構成した。本年度はこの結果をまとめて、外部発表をおこなった。委任署名は検証者が署名者を特定できないため匿名性を有するが、昨年度までに検討していた方式では同一の署名者の複数の署名が同一の署名者により作成されたことが容易に判明し、この関連付けがなされてはいけない状況では利用できなかった。署名者グループ内での署名者の匿名性を提供する署名としてグループ署名が、また、署名者に匿名性を持たせる署名としてブラインド署名が存在する。そこで、グループ署名やブラインド署名の技術などを参考にして署名権の委任の仕方を変更することにより、より高い匿名性を有する閾値委任署名方式を構成し、その安全性解析を行なった。また、署名者が署名依頼者の意に反した行動をとることがありえるので、署名依頼者は必要に応じて署名者の匿名性を剥奪し、署名者を特定できなくてはいけない。この機能についても考察を行なった。認証技術にはパスワード認証のような利用者を認証するものと、メッセージの正当性や作成者名を認証するものがあるが、今回は後者の電子署名に関してプライバシーを考慮した方法を検討した。プライバシーを考慮した電子署名の実現には、正当性を検証できるが、どの利用者宛に発行されたか特定できない証明書を作成することが考えられ、署名者の公開鍵情報が署名検証に必要とならない委任署名の技術が応用できる。そこで、委任署名での証明書発行の技術に基づき、委任署名に閾値法を適用し、委任方式を拡張することを試みた。得られた結果は以下のような事項である。1.まず、既存の2つの方式が次の様な特徴を持つことを考察した。Liらによる閾値多重署名が、署名検証の際に署名者の公開情報を利用するために、署名者の匿名性を必ずしも保っていないことを指摘した。また、Kimらの閾値委任署名が、グループ中の閾値数以上の署名者が署名を作成した後に、署名検証者のみならず署名依頼者も署名者を特定する手段がないことを指摘した。そして、これらの両方の方式の匿名性に係わる欠点を解決する方式として、新たな閾値委任署名方式を構成し、その安全性について考察した。2.現在までに幾つかの委任署名の手法が離散対数問題を利用して提案されていたが、その他にどのような手法が可能であるか必ずしも明らかでなかったため、既存の方式とは異なる形式で内示的な証明書を発行する手法を考案し、その安全性について考察した。
覚醒を作り出すメゾ回路機能の操作による機能解析

睡眠障害のひとつである、ナルコレプシーは思春期頃に視床下部のオレキシン産生神経が特異的脱落することによって発症する。このことは、オレキシン神経細胞が睡眠覚醒調節において、特に覚醒の維持に重要な役割を担っていることを示している。そこで、マウスにおいて、オレキシン神経だけを時期特異的に脱落させて、ヒトのナルコレプシーに近いナルコレプシーモデルマウスを作成した。このマウスを用いて残存するオレキシン神経細胞の数を制御して、発現症状との関係を明らかにした。ほとんどの高次脳機能は、脳が覚醒しているときにのみ発揮される。そのため覚醒を導く神経機構は重要であるものの、覚醒が無数の神経活動の結果生じる極めて複雑で高度な現象のため、未だにその仕組みの解明に至っていない。近年の研究により、視床下部に存在するオレキシンを産生する神経(オレキシン神経)が特異的に脱落すると、覚醒を維持できずに何をしていても眠ってしまうナルコレプシーという睡眠障害になることから、オレキシン神経細胞が覚醒に極めて重要な役割を担っていることが判明した。そこで、本研究ではオレキシン神経を中心とした解析によって脳が覚醒する神経機構の解明を試みている。今年度は研究に必要な遺伝子改変マウスの作成を行った。組織化学的に正しく発現が認められることと、正しく発現遺伝子が機能することを同定した。これによって、オレキシン神経細胞特異的かつ時期特異的な運命制御が可能となり、新しいナルコレプシーモデルマウスとして使用できることが明らかとなった。このマウスでは、テトラサイクリン遺伝子発現誘導システムを用いて、ドキシサイクリンの有無によって遺伝子発現を制御することが可能である。今後はこのマウスを使用して、当初の研究予定である、オレキシン神経特異的脱落とナルコレプシー症状発現との相関および、脱落後の神経回路の自己書き換えについても検討していく。それに向けて現在睡眠解析と行動解析および、摂食量・体重などの代謝測定を開始しており、w神経の生理的な役割について、統合的な解析の予備実験を行った。神経ペプチド「オレキシン」を産生する神経細胞は、視床下部に存在し、そこから脳内のほとんどの領域に軸索を投射している。オレキシン神経の特異的脱落によって、睡眠障害のひとつであるナルコレプシーを発症することから、オレキシンが睡眠覚醒調節において重要な役割を担っている事が示唆されている。本研究では、オレキシン神経細胞特異的に様々な外来遺伝子を発現する遺伝子改変マウスを作成し、その活動を光遺伝学を用いて操作または、運命制御することを試みた。神経活動操作のために、チャネルロドプシン2、アーキロドプシンをオレキシン神経特異的に発現するマウスを作成した。オレキシン神経特異的な活性化によって、覚醒が生じること、またオレキシン神経特異的な抑制によって、覚醒から睡眠に移行することを見いだした。しかしながら、オレキシン神経活動の抑制によって、睡眠覚醒の断片化は見られたものの、脱力発作などのナルコレプシーの症状は認められなかった。そこで、オレキシン神経特異的にジフテリアトキシンA断片を時期特異的に発現する遺伝子改変マウスを作成し、オレキシン神経の運命を制御した。このマウスを用いてオレキシン神経を脱落させると、約85%のオレキシン神経細胞が脱落すると、睡眠覚醒の分断化が生じ、95%のオレキシン神経細胞が脱落すると脱力発作が生じることが分かった。これらのことから、睡眠覚醒の調節においてオレキシン神経細胞がどのように機能して覚醒を維持しているのかが明らかになった。しかし、覚醒が無数の神経活動の結果生じる極めて複雑で高度な現象のため、未だにその仕組みの解明に至っていない。視床下部に存在するオレキシン神経が脱落すると、覚醒を維持できないナルコレプシーという病気になることから、オレキシン神経細胞が覚醒に重要な役割を担っていることが判明している。そこで本研究では、丸ごとの個体を用いてオレキシン神経に対して光で神経活動を操作可能なオプトジェネティクスを適用し、オレキシン神経活動を操作し、睡眠覚醒を調節する神経回路の動作原理を解明することを試みた。また、任意の時期にオレキシン神経を特異的に脱落可能なナルコレプシーモデルマウスを作成し、オレキシン神経脱落の前後において睡眠覚醒状態がどのように変化するのかについて明らかにした。約85%のオレキシン神経が脱落することによって、睡眠覚醒調節の異常が認められた。さらに約95%のオレキシン神経が脱落することによってナルコレプシーで認められる脱力発作が観察された。オレキシン神経脱落の程度とナルコレプシー症状発現との相関が明らかになった。さらに残存するオレキシン神経数を制御することも可能であることを示した。この遺伝子改変マウスは、ヒトのナルコレプシーにより近いモデルマウスであり、今後のナルコレプシー治療薬や症状を改善する薬物の開発および評価において有用であることを示した。

<1.Orexin-tTAマウスの作成>オレキシン神経特異的にtTAを発現する遺伝子改変マウスorexin-tTAマウスを作成した。<2.Orexin-tTA; TetODTAマウスの作成><1.>において確立したorexin-tTAマウスラインとTetO DTA(ジフテリアトキシンA断片)マウスとの交配によって、orexin-tTA; TetODTAマウスを作成した。オレキシン神経数は、DOX含有餌で飼育しているときには全く減少していないものの、DOX不含餌に代えてから2日後から減少を始め、1週間後には85%、2週間後には95%のオレキシン神経が脱落することを確認した。<3.睡眠覚醒調節に関わるメゾ回路の抽出とその機能・運命操作>Orexin/tTAマウスを、以下のTet-Oマウスと交配させバイジェニックマウスを作成した。TetO ChR2(C128S):青色光で活性化される非選択的陽イオンチャネルであり、膜電位を脱分極させる。第二世代のChR2であり、橙色光で活性化が停止する。TetO Arch:橙色光で活性化されるプロトンポンプであり強力且つ持続的に膜電位を過分極させる。免疫組織学的解析の結果、オレキシン神経特異的に目的の遺伝子が発現されていることを確認した。<4.視覚情報処理の基盤となる視覚野神経回路の抽出>神経活動に依存して蛍光蛋白Venusを発現する遺伝子改変マウスを用いて、提示した視覚刺激に反応した視覚野細胞を蛍光標識した。この視覚野から切片標本を作製し、蛍光蛋白発現を指標として、同じ視覚刺激に反応したと考えられる細胞群を同定した。それらが微小神経回路網を形成しているかについて、同時ホールセル記録法とケージドグルタミン酸による光刺激法を用いて検証した。オレキシン神経活動の操作と運命操作を可能とするマウスの作成と機能確認が終了し、計画通りの実験に進むことができる。26年度が最終年度であるため、記入しない。チャネルロドプシン2変異体であるChR2(C128S)は、ステップファンクション型であり、長時間神経活動の活性化が出来るものの、活動電位の発生頻度を正確に規程することが出来なかった。その短所を補填するために、高頻度刺激に適する変異体であるChR2(E123T/T159C)を発現誘導する新たなTetOマウスTetO ChR2(E123T/T159C)マウスを作成した。今後はTetO ChR2(C128S)だけでなく、TetO ChR2(E123T/T159C)を用いた活性化も並行して試みる。神経生理学26年度が最終年度であるため、記入しない。当初計画していた遺伝子改変マウスの作成が順調に進んでいるため。光遺伝学を用いてオレキシン神経細胞の活動を活性化と抑制のどちらにも操作可能な遺伝子改変マウスの作成に成功し、その活動操作と行動解析によって、睡眠覚醒における役割について明らかにすることができた。さらに、光遺伝学では、長時間の抑制が難しいことから、神経細胞死を誘導する分子をオレキシン神経細胞特異的に発現させることで運命制御を可能にするマウスを作成した。
電子密度のグラデーションと擬似吸着能を活かした新しい有機複合吸着剤の創製

スチレン系有機複合吸着剤(PA316TAS)と12種類の模擬放射性核種(SRs = Mn, Co, Sr, Y, Ru, Rh, Sb, Te, Cs, Ba, Eu, I(IとIO3を含む))との間の疑似的吸着能と電子密度のグラデーション効果に関する研究を最終年度まで取り組んだ。河川水と海水中におけるSRsの化学構造が明らかとなり、PA316TASに対するSRsの吸着構造もうまく推測することができた。疑似的吸着能とは、水溶液中において中性の電荷を持つTeもしくはSbとPA316TASとの間で観測できる特異的な吸着現象である。具体的には、金属原子と酸素原子との間の電荷が局在化した単結合とPA316TASとの間の静電的相互作用を経由する吸着機構のことである。一方、電子密度のグラデーション効果とは、パラホルムアルデヒド(PFA)を用いて加水分解したタンニン酸(TAS)と陰イオン交換樹脂(PA316)を架橋することにより発現する吸着機構である。つまり、ある程度規則正しく架橋したタンニン酸の電荷は非局在化しているが、そこへPA316が短い距離で複合されると、PFA架橋前後における各化学結合の電荷バランスが局所的に変化する。電荷分布の変化量は僅かと考えられるが、様々な値を取り得る。それゆえに、PA316TASは多種多様なSRsと選択的に吸着できると結論付けた。加えて、PA316TASは吸着したSRsを長期間保持した後、塩酸水溶液によるSRsの溶離回収も可能である。放射性CsとSrを用いた吸着分離実験でも同様の現象を確認できた。さらには、焼却処理によるPA316TASの減容化も可能であった。以上のことから、シビアアクシデント対応型高度浄水システム構築に向けた新しい複合吸着剤の開発に成功した。今後は得られた成果に関する論文発表等や新しい浄水システムのシナリオの情報発信を行う予定である。アクリル系弱塩基性、スチレン系弱塩基性、スチレン系強塩基性、ベンゾイミダゾール系、及びピリジン系有機複合吸着剤の合成法を確立した。これらの複合吸着剤を用いて模擬放射性核種(Mn, Co, Sr, Y, Ru, Rh, Sb, Te, Cs, Ba, Eu, I, IO3)を含む河川水の除染実験を行った。その結果、スチレン系有機複合吸着剤を用いた場合、全ての核種に対して分配係数が100以上となることがわかった。一方、この河川水に陰イオン交換樹脂とタンニン酸を複合吸着剤と同重量比で添加した除染実験では、単体のみの結果と比較して、分配係数が急激に減少することがわかった。これは陰イオン交換樹脂と僅かに溶存したタンニン酸との間の陰イオン交換反応に起因する。つまり、架橋剤による安定化によってタンニン酸の溶出をうまく抑えることができた。さらに、複合吸着剤の混合比最適化を検討した。結果として、最適比は陰イオン交換樹脂とタンニン酸が2:1であった。また、タンニン酸の混合比の減少に伴い、Mn, Co, Sr, Cs, Baの分配係数が急激に低下することから、これらの元素はタンニン酸と選択的に吸着することがわかった。また、分配係数の緩やかな低下からY, Ru, Rh, Sb, Te, Euに対してはタンニン酸と陰イオン交換樹脂の双方に吸着能を持っていることがわかった。つまり、これら6元素は溶液中に陽イオンと陰イオンが混在した状態で存在する。従って、これを確かめるために温度依存性実験を行った。主とする吸着化学種が一つのMn、Co、Sr、Cs、Ba、Iは1/Tプロットが直線となり、主とする吸着化学種(Y, Ru, Rh, Sb, Te, Eu)が二つの場合、1/Tプロットが山型となることがわかった。スチレン系有機複合吸着剤を用いると検討元素の吸着脱離を温度変化のみで制御できる現象を見出した。本年度では、タンニン酸型有機複合吸着剤の合成を行った後、12種類の模擬放射性核種(SRs)に対する吸着脱離挙動を評価した。複合吸着剤の組み合わせの選定や混合比最適化も完了した。合成法の改良も継続的に行い、最終的には収率が90%以上を超えた。混合比が異なる複合吸着剤を準備し、SRsの吸着実験を行い、どの吸着点にどのSRsが吸着するのかを明らかにできた。これによって、紫外・可視分光光度計と解析ソフトウェアを併用した河川水中の模擬放射性核種、第一族元素、及び第二族元素と無機陰イオンとの間の配位数や錯形成定数等の算出作業の大部分を短縮できた。困難とされた河川水中のY, Ru, Rh, Sb, Te, Euの構造解析も本年度中に何とか終えることができた。pH = 4 - 8の領域で、複合吸着剤は安定した高い吸着能を維持できることがわかった。また、複合吸着剤は5倍濃縮の河川水中のSRsさえも除染できた。さらに、SRsの吸着挙動に対する温度依存性実験を行ったところ、非常に興味深いことに、Mn、Co、Sr、Cs、Ba、Iのvan't Hoffプロットは直線となり、Y, Ru, Rh, Sb, Te, Euは山型となることがわかった。つまり、前者の吸着機構は1種類、後者は2種類と予想でき、この推測は分光学的解析法から得られた結果と一致した。加えて、スチレン系有機複合吸着剤を用いると検討元素の吸着脱離を温度変化のみで制御できる現象を見出せた。

この成果は全く予想しなかったものである。開発したタンニン酸型有機複合吸着剤は温度環境変化を認識し応答する高機能性高分子となりうる可能性がある。つまり、溶離剤を使わずしてSRsとの相互作用を変化させ分離選択性を自由に制御する新しい分離剤が開発できるかもしれない。以上により、当初の計画以上に成果が得られたことから、本年度の達成度としては区分(1)と判断した。昨年度、スチレン系有機複合吸着剤(PA316TAS)を用いるとオゾン酸化前後に拘らず河川水中の模擬放射性核種(SRs = Mn, Co, Sr, Y, Ru, Rh, Sb, Te, Cs, Ba, Eu, I(IとIO3を含む)のほぼ完全な吸着分離が可能となり、その吸着脱離挙動を温度変化のみで制御できる興味深い現象が確認された。今年度は、このメカニズムを理解するため、PA316TASとSRsとの間の吸着脱離反応に関する温度依存性実験を行った。その結果、例えば、CsとSr等のΔH, ΔSは、オゾン酸化前後においても一定値となったが、RuやTe等に対してはオゾン酸化後の方が、高いΔH, ΔS値を示すことが明らかとなった。これはオゾン酸化によりRuやTeがRuO4-とH2TeO4に変化し、さらに親水性が増したことを意味する。河川水のpH、希釈率、濃縮率、SRsの価数変化に対しても高い吸着能力を保持した。クロマトグラフィー実験を行った結果、Cs, Sr, I(IとIO3を含む)の単位重量当たりの吸着量(mol/g)は、それぞれ2.1×10-4, 8.8×10-5,及び4.5×10-2であった。特に、Iに対して特異な吸着挙動を示したので、PA316TAS等のDV-Xα分子軌道計算を行った。その結果、陰イオン交換樹脂(PA316)、硫酸処理させたPA316、PA316TASの順でIO3-の分配係数とLUMOが直線関係となり、化学的な複合によりLUMOの低下が確認された。河川水中では十分に高い吸着能力を持つPA316TASであるが、幸いにも、海水中でもその吸着能力を維持できた。比較のため、スルホン基を持つスチレン・ジビニルベンゼン共重合体やベンゾクラウンエーテル樹脂等を合成し、海水、陸水中のSRsの吸着挙動を調べ、PA316TASの方がより優れた吸着能力を持つことを確認した。スチレン系有機複合吸着剤(PA316TAS)を用いて、様々な河川水や海水中の模擬放射性核種(SRs = Mn, Co, Sr, Y, Ru, Rh, Sb, Te, Cs, Ba, Eu, I(IとIO3を含む))の吸着脱離挙動を調べ、検討した全ての条件下において、十分な吸着能力を持つことが確認できた。また、水溶液中へのPA316TASの溶出も見受けられなかった。加えて、河川水のみならず海水中におけるPA316TASとSRsとの間の吸着脱離機構の多くも明らかとなった。前年度のSRsの吸着脱離平衡反応に対する温度依存性実験では、Mn、Co、Sr、Cs、Baのvan't Hoffプロットは直線となり、Y, Ru, Rh, Sb, Te, Eu, I(IもしくはIO3を含む場合)は山型となったが、本年度に実施した海水系の場合は、van't Hoffプロットが全て直線となった。より詳細な分光学的研究から河川水と海水成分でのSRsの化学構造の違いによるものと判断した。オゾン有無による大きな違いは、オゾン酸化により河川水中のMn, Co, Y, Euが沈殿したことである。海水中のSRsの溶解挙動に関しては現在調査中である。
樹脂切片-イオンエッチング-走査電顕法による骨組織三次元微細構造の解明

エポキシ樹脂切片をガスイオンでエッチングし、これを走査電顕下に観察するという新しい手法、ならびに高圧エネルギーフィルター透過電顕による電子線トモグラフィーを用いて、ラット上腕骨、歯槽骨、歯根膜などの三次元構造を形態学的に解析した。またイオンエッチング-走査電顕法の応用による免疫走査電顕の可能性を、ラット唾液腺で検討した。さらには骨組織の多様性を分子レベルで解析する糸口をつかむため、骨髄培養細胞における幹細胞因子についても検討した。樹脂切片-イオンエッチング-走査電顕法による観察では、上腕骨の基礎層板とババース管周辺部、および歯槽骨で、それぞれ骨の組織構築が異なることが明らかとなった。上腕骨内基礎層板では、骨細胞の配列方向はさまざまで、膠原細線維の走行方向が異なる層板が1μm10μm間隔で規則正しく並んでいた。一方ババース管の周辺部では骨細胞の配列方向も膠原細線維の走行方向もほぼ骨の長軸に沿ったものであった。歯槽骨では骨細胞の配列も膠原細線維の走行も不規則であった。電子線トモグラフによる検索では、本法が骨基質や歯根膜の膠原細線維の三次元構造の解析に有用であることが示された。耳下腺、エブネル腺におけるアミラーゼの局在をイオンエッチング-免疫走査電顕法で検索した。耳下腺では、分泌終末部の顆粒が陽性、介在部の顆粒が弱陽性、線条部の顆粒は陰性であった。一方エブネル腺では、分泌終末部の顆粒が弱陽性であった。培養骨髄細胞に、TGFβ1、bFGF、TNFα、IL-4、LIF、ならびにこれらの組合せを作用して、幹細胞因子(SCF)バリアントの発現変化をみた。SCF1の発現はSCF2の10倍以上あり、その発現量は、各種サイトカインの刺激で大きく変動した。2年計画の1年目の研究として、長管骨の三次元構造を樹脂切片-イオンエッチング-走査電顕法を応用した三次元再構築法により検索するとともに、歯周組織、特に歯根膜主線維の三次元構造を高圧電顕とオンライン三次元トモグラフシステムを用いて検索した。また、骨細胞ネットワークの情報網を検索する手だてとして、骨髄間質細胞や骨芽細胞に発現する幹細胞因子(SCF)の発現動態に着目し、さまざまなサイトカインの作用によりSCFの発現動態がどのように変化するかを調べた。ラット上腕骨の三次元構造の検索では、内基礎層板部とハバース管周辺部で、骨細胞の配列方向や膠原細線維の走行方向に顕著な差異が認められた。ハバース管周辺部では層板構造が不明瞭で、紡錘形ないし楕円形の骨細胞は骨の長軸とほぼ平行に配列し、膠原細線維もほぼ骨の長軸と平行に配列していた。一方内基礎層板部では、イオンエッチングを施した樹脂切片の走査電顕像で、明暗の縞をなす明瞭な層板構造が認められ、膠原細線維が横断された領域が明るく、縦断された領域は暗く認められた。骨細胞の配列方向も一定でなく、骨の長軸に並行なもの、直行するもの、斜走するものなど、さまざまであった。厚い切片(0.30.5μm)を三次元トモグラフシステムを用いて解析することにより歯根膜主線維の三次元を検索し、歯根中央部のややセメント質寄りの領域に、細かな膠原線維の網状配列を確認した。SCFの発現動態関する研究では、TGFβ1は遊離型および膜結合型の両方のmRNA発現を抑制するが、細胞膜上のSCFは逆に増加することなどを明らかにした。

平成17年度の研究として、ラットの歯根および歯周組織をイオンエッチング-走査電顕法で観察し、歯根象牙質のほか、歯槽骨、セメント質、歯根膜の三次元微細構造を検索した。歯槽骨の検索では、骨細胞の配列や層板構造、さらには層板を構成する膠原細線維の走行方向などが、長管骨の基礎層板やハバース層板に見られるような整然としたものではなく、多様で不規則なものである可能性が強く示唆された。また歯牙の観察では、イオンエッチング-走査電顕像でも象牙質と象牙前質が二次電子像の濃淡から明瞭に識別できること、象牙細管の側枝が歯冠象牙質より歯根象牙質で多く観察される傾向があること、象牙質とセメント質の識別は、低倍率のイオンエッチング-走査電顕像ではやや困難であるが、中等度以上の倍率では歯根膜線維の進入(シャーピー線維の存在)により象牙質と明瞭に識別できることなどが明らかとなった。歯根膜については歯根膜主線維の走行方向と線維芽細胞の配列方向の間に密接な関連があることが示唆された。また連続切片からの歯周組織血管網の三次元再構築像から、歯根膜の血管が歯根の長軸に平行に配列する多数の微小血管ループで構成され、隣接するループ間にはほとんど吻合が存在しないこと、これらのループのほとんどが歯槽骨側に偏在し、歯根側に毛細血管ループが見られることはごく稀であること、さらには歯槽中隔および根間中隔をなす歯槽骨中には隣接する歯根膜の血管を繋ぐ血管が頻繁に認められることなどが明らかとなった。また平成17年度までに得た骨組織の三次元構造、舌血管網の三次元構造、ならびにイオンエッチング-走査電顕法を応用した新しい免疫走査電顕法に関するデータを3編の論文にまとめ、国内外の専門誌に発表した。
細菌内毒素による免疫系細胞にたいするアポトーシスの誘導機序

我々は今年度、細菌内毒素によるアポトーシス誘導作用を用いて、生体防御機構に関わる様々な情報を得ることに成功した。マウスに大量の細菌内毒素を投与した場合、胸腺細胞に大量のアポトーシスが誘導された。これは腫瘍壊死因子(TNF-α)とグルココルチコイドの共同作用によるアポトーシスであることが明らかとなった。(Kato, Y., Morikawa, A., et al. 1995FEMS Immunol. Med. Microbiol. 12, 195-204)。また、D-ガラクトサミンと細菌内毒素を投与することによって、肝細胞に広範にアポトーシスが誘導された。これは、TNF-α単独作用によるものである(Morikawa, A. Sugiyama, T. et al. 1996 Infect. Immun. 64, in press)。このほか、細菌内毒素を用いたシュワルツマン反応の実験モデルでは、マウス血管内細胞にアポトーシスが認められた。このアポトーシスの発生機序については現在検討中である。
核融合炉における高ベータ化と境界プラズマ自己構造形成に関する研究

本研究では、トカマク型核融合炉においてプラズマ周辺部に形成される輸送障壁によって閉じ込めが改善される高閉じ込めモード(Hモード)を対象として、炉心プラズマの高プラズマ圧力化で起こる磁気軸シフトが周辺プラズマ構造に及ぼす影響とプラズマ断面形状の関係を理解することを目的としている。特に、周辺ペデスタル構造は炉心プラズマ全体の閉じ込めや核融合炉の出力に対する境界条件となるため適切な予測とその制御が求められる。近年、炉心プラズマの高プラズマ圧力化で起こる磁気軸シフトが周辺プラズマ部のMHD不安定性を抑制することが示され、周辺プラズマはプラズマ境界近傍で局所的な特性を持つものではなく、プラズマ全体との大域的な相互作用の下でその性質が決定されることが分かってきた。そこで、本研究では、量子科学技術研究開発機構JT-60SAにおいて、高閉じ込めモードのプラズマ周辺部をより安定化させる高三角度化したプラズマ形状を維持し、高ベータ時の周辺部安定化効果を検証するための基盤となる放電立ち上げシナリオを作成した。本研究により、高ベータ化と境界プラズマ自己構造形成との関係を明らかにするための基盤を確立する成果を得た。本研究成果は、2018年12月に大阪で開催されたプラズマ・核融合学会年会において発表した。また、国際熱核融合実験炉における非放射化フェーズでは、軽水素による放電が実施されるため周辺プラズマ構造に対する水素同位体効果に関する解析を実施した。本課題におけるプラズマ断面形状によるプラズマ性能への影響評価に関連して、量子科学技術研究開発機構JT-60SAにおけるプラズマ位置形状制御開発を進めているが、複雑な制御ロジックの検討と開発に時間を要しているため遅れが生じた。一方で、進捗状況に関しては研究成果をまとめ、学会発表を行った。令和元年は、平成30年度に引き続き量子科学技術研究開発機構JT-60SAにおけるプラズマ位置形状制御開発を進めながら、周辺プラズマの高性能化に向けたプラズマ断面形状による周辺プラズマへの影響に関して解析を行う。また、国際熱核融合実験炉における非放射化フェーズでは軽水素による放電が実施されるため、周辺プラズマ構造に対する水素同位体効果に関する解析を進めていく。(理由)補助事業の目的を精緻に達成するためにプラズマ位置形状の制御の開発に従事したが、当初計画していた英国カラム核融合研究センターへの訪問及び実験参加を令和2年度以降に持ち越す形となった。(使用計画)当該年度における研究成果を令和元年度中に学会発表及び論文投稿する予定である。また、英国カラム核融合研究センターへの訪問及び実験参加を行う予定である。これらの目的とそのために必要なデータ解析機器のために令和2年度使用額を用いる計画である。
重金属吸着ドメインの真核微生物細胞表層へのターゲッティング

工業廃水・メッキ廃液などから有害重金属除去および有価金属の回収を行うため、微生物菌体に重金属を吸着させてバイオソルベントとして利用することを目的として、金属結合蛋白質の金属吸着ドメインを細胞表層に発現させることによって微生物に重金属結合能を付与する分子育種を試みている。主たる宿主として、古くから産業的に重要であったため、安全性が確認され大量培養などの取り扱い技術が進歩している麹菌(Aspergillus oryzae)を用いた。細胞表層へターゲティングする効率のよい重金属吸着ドメインとして、酵母(S.cerevisiae)から金属結合蛋白質メタロチオネインをコードするCUP1遺伝子をクローン化した。CUP1遺伝子に制限酵素サイトを含むリンカーをつけて、細胞表層に発現させる金属吸着ドメインとして供することとした。麹菌において異種蛋白質含む融合蛋白質の細胞外発現システムを構築するため、分泌蛋白質であるグルコアミラーゼ(GlaA)の触媒ドメインに蛍光蛋白質GFPを結合した融合遺伝子を作製し、麹菌における分泌発現を確認した。これを元にグルコアミラーゼ遺伝子(glaA)をベースとして、金属吸着ドメインなどを組み込むための制限酵素サイトを導入したアッセイ用ベクターを構築した。次に、糸状菌の細胞表層へのターゲティングを目的として糸状菌の表層に大量に存在するハイドロフォービンをコードする遺伝子(rodA)をAspergillus nidulansからクローニングし塩基配列を確認した。さらに、麹菌A.oryzaeのハイドロフォービンをコードする遺伝子の一部をクローン化することに成功し、A.nldulans rodA遺伝子と58%の相同性を有していることを見いだした。また、A.nidulansのESTデータベースを検索することにより、糸状菌細胞中で細胞表層へのGPIアンカーとして機能しうるFlo1,a1cwp,Exp2のそれぞれの相同遺伝子のC末端領域をクローン化した。以上より重金属吸着蛋白質を糸状菌の細胞表層に発現させるための融合蛋白質を作製する材料となる遺伝子の収集がほぼ完了し、融合蛋白質の発現量・局在性を評価するアッセイ用ベクターの構築も行った。
Notchシグナルによる血管平滑筋細胞分化調節機構の解明

研究計画調書提出時に、Notchシグナルが平滑筋分化マーカー(SM-MHC,SM22a,etc)の発現を誘導することを述べた。本研究では、その分子機序について検討し以下の結果を得た。1、平滑筋分化マーカー(SM-MHC,SM22a)のプロモーターを用いたレポーター遺伝子アッセイで、活性化Notch1はそれらの転写活性を著明に上昇した。いずれのプロモーター上にもNotchのメディエーターであるRBP-Jk結合部位があり、この部位に変異を加えると、活性化Notch1により転写活性は消失した。2、ゲルシフトアッセイで、SM-MHC上のRBP-Jk結合部位にRBP-Jk蛋白が結合した。この現象はchromatinimmunoprecipitation assayでも確認された。3、多分化能をもつマウス線維芽細胞10T1/2に活性化Notch1を強制発現すると、複数の平滑筋分化マーカーを誘導したが、乳腺上皮細胞、ヒト臍帯静脈内皮細胞やヒト表皮細胞を用いて同様の処置をしても平滑筋分化マーカーは誘導されなかった。このことから、Notchによる平滑筋分化誘導には細胞特異性があることがわかった。4、血管に多く発現するNotchリガンドはJagged1とD114である。この二つのリガンドを用いて10T1/2を刺激すると、Jagged1は平滑筋分化マーカーを誘導したがD114は誘導しなかった(リガンド特異性)。5、myocardinは強力な平滑筋分化誘導因子である。このmyocardinと活性化Notch1を共発現すると、平滑筋分化マーカーの遺伝子発現が相乗的に上昇した。この現象はレポーター遺伝子アッセイでも同様であった。この相乗効果にはプロモーター上のRBP-Jk結合部位とmyocardinパートナーであるSRFの結合部位が必須であることが明らかとなった。研究計画調書提出時に、Notchシグナルが平滑筋分化マーカー(SM-MHC, SM22a, etc)の発現を誘導することを述べた。1、平滑筋分化マーカー(SM-MHC, SM22a)のプロモーターを用いたレポーター遺伝子アッセイで、活性化Notch1はそれらの転写活性を著明に上昇した。この現象はchromatin immunoprecipitation assayでも確認された。この二つのリガンドを用いて10T1/2を刺激すると、Jagged1は平滑筋分化マーカーを誘導したがD114誘導しなかった(リガンド特異性)。

研究計画調書提出時に、Notchシグナルが平滑筋分化マーカー(SM-MHC,SM22a,etc)の発現を誘導することを述べた。本研究では、その分子機序について検討し以下の結果を得た。1、平滑筋分化マーカー(SM-MHC,SM22a)のプロモーターを用いたレポーター遺伝子アッセイで、活性化Notch1はそれらの転写活性を著明に上昇した。いずれのプロモーター上にもNotchのメディエーターであるRBP-Jk結合部位があり、この部位に変異を加えると、活性化Notch1により転写活性は消失した。2、ゲルシフトアッセイで、SM-MHC上のRBP-Jk結合部位にRBP-Jk蛋白が結合した。この現象はchromatinimmunoprecipitation assayでも確認された。3、多分化能をもつマウス線維芽細胞10T1/2に活性化Notch1を強制発現すると、複数の平滑筋分化マーカーを誘導したが、乳腺上皮細胞、ヒト膀帯静脈内皮細胞やヒト表皮細胞を用いて同様の処置をしても平滑筋分化マーカーは誘導されなかった。このことから、Notchによる平滑筋分化誘導には細胞特異性があることがわかった。4、血管に多く発現するNotchリガンドはJagged1とD114である。この二つのリガンドを用いて10T1/2を刺激すると、Jagged1は平滑筋分化マーカーを誘導したがD114は誘導しなかった(リガンド特異性)。5、myocardinは強力な平滑筋分化誘導因子である。このmyocardinと活性化Notch1を共発現すると、平滑筋分化マーカーの遺伝子発現が相乗的に上昇した。この現象はレポーター遺伝子アッセイでも同様であった。この相乗効果にはプロモーター上のRBP-Jk結合部位とmyocardinパートナーであるSRFの結合部位が必須であることが明らかとなった