hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
死細胞が残した細胞間シグナルネットワークを介した創傷治癒制御

多細胞生物において組織の損傷によって細胞死を起こした細胞は、死にゆく一方で生き残った細胞にシグナルを発して損傷の修復や組織再生を促すことが示されつつある。しかしながら、組織の損傷修復・再生に関わる個々の生命現象の知見を集約するだけでは創傷治癒システムの制御基盤を理解することはできない。なぜなら、組織の損傷修復・再生過程では代償性増殖、組織リモデリングや細胞運命転換といった複数の生命現象が時間的・空間的に制御されており、これらが有機的に機能することで創傷治癒という複雑な生体応答を実現している。すなわち、創傷治癒システムの動作原理を解明するには、このような生存細胞集団の動的変化を制御・統括する死細胞のダイイングコードの分子実体とその制御メカニズムを理解する必要がある。本研究では、ショウジョウバエ上皮をモデルとして組織に物理的な損傷を誘導した際に生じた細胞死に応答して細胞内シグナル伝達活性が損傷部位から生存細胞間を伝播することによって組織の広範囲に広がることを見出し、その分子機構を明らかにした。さらに、このシグナル活性の細胞間伝播を抑制すると損傷組織の修復・再生異常が生じた。すなわち、死細胞が駆動するシグナル伝達活性の細胞間の伝播現象が死細胞のダイイングコードとして生存細胞の挙動を時空間的に制御し損傷の修復・再生を促していくことが分かった。この結果は、死細胞が制御する生体制御システムに新たな概念を提示するものといえる。平成30年度が最終年度であるため、記入しない。しかしながら、損傷組織の修復・再生は細胞増殖や細胞骨格の再編など複数の生命現象が時間的・空間的に制御されている複雑な生体制御システムであり、このメカニズムを解明するには組織内における細胞集団の動的変化を理解する必要がある。本研究では、ショウジョウバエ上皮をモデルとして損傷(細胞死)によって生じたJNKシグナル活性の細胞間伝播を死細胞の残したダイイングコードとして捉えて、その制御メカニズムと生理的役割を解析することで創傷治癒制御の動的制御を明らかにすることを目的とした。当該年度では、まずJNKシグナル活性の細胞間伝播メカニズムを解析した結果、Adamプロテアーゼによる腫瘍壊死因子(TNF)のシェディングによってJNK活性が損傷部位から組織の広範囲に広がることを見出した。実際にAdam活性阻害やTNF欠損させることでJNKシグナル活性の細胞間伝播を抑制したところ、損傷組織の修復・再生過程に破綻が生じて最終的に異常なサイズ・形態をもつ組織が形成された。さらに、JNKシグナルは細胞間を伝搬する過程で活性酸素種(ROS)の誘導を引き起こし、これが化学誘引物質として免疫細胞を損傷組織へとリクルートすることを見出した。これらの解析と並行して、生体内でJNKシグナル活性の細胞間伝播の動態を捉えるべくJNK活性を高感度に検出するJNK-FRETバイオセンサーを発現するトランスジェニックフライの作製に着手し、それに成功した。当初の研究計画通り生体レベルでJNKシグナル活性の細胞間伝播メカニズム及びその生理的役割の基盤となるデータを得ることができた。また、JNK-FRETバイオセンサーのトランスジェニックフライ系統の作製に成功した。これらの理由から当初の予定通り順調に進行しているといえる。今後は、JNKシグナル活性の細胞間伝播の生理的役割を遺伝学的解析により明らかにしていく。これと並行して、JNKシグナルの細胞間伝播をライブイメージングで捉えることで、その動態を解明していく予定である。
甲状腺中毒性周期性四肢麻痺における筋チャネル異常の同定と病態解明

甲状腺中毒性周期性四肢麻痺は甲状腺中毒症患者が低カリウム血症を伴った急性の四肢麻痺を繰り返すことを特徴とし、甲状腺機能が正常になるに伴い四肢麻痺発作は消失する。男性に圧倒的に多く、なおかつアジア人に多いことと、甲状腺ホルモン負荷試験では四肢麻痺を起こした男性にしか誘発できないことから特有の遺伝子異常の存在が示唆されている。また、電気生理学的検査のprolonged exercise test(PE test)において筋膜の興奮性の異常が認められ、筋チャネル異常との関連が示唆された。異常筋チャネルの候補として家族性低カリウム血症性周期性四肢麻痺の原因であるNaチャネル遺伝子SCN4AとCaチャネル遺伝子CACNA1Sの変異部位、家族性周期性四肢麻痺のKチャネル遺伝子KCNJ2とKCNE遺伝子の全蛋白コード領域、さらに電位依存性KチャネルKCNQファミリーのなかから骨格筋に発現してまだ疾患との関連が唯一不明なKCNQ5の全蛋白コード領域を変異検索の対象とした。末梢血から抽出したDNAを材料とし、各遺伝子のエクソンをPCRで増幅したのち、シークエンスで塩基配列の変異を調べた。対象は甲状腺中毒性周期性四肢麻痺の男性患者7名を患者群(TPP)とし、健康な成人275名を正常コントロール群(Control)とした。また、四肢麻痺を伴わない甲状線機能亢進症の患者17名(フィリピン人)を陽性コントロール群(HD)とした。アミノ酸置換を伴う変異はFisherの正確確率検定を用いてコントロール群との有意差を検定した。アミノ酸置換を伴う変異(2784T>A、H928Q)を1名のKCNQ5遺伝子に認めた。ヘテロなミスセンス変異で928番のヒスチジンがグルタミンに置換していた。変異の頻度は正常コントロール群および陽性コントロール群との間で有意差を認めなかった。アミノ酸置換を伴わない正常多型をKCNQ5、KCNJ2、KCNE3に1カ所ずつ認めた。SCN4AとCACNA1Sの変異部位は認めなかった。(1)検体、臨床データの収集本年度は臨床的に甲状腺中毒性周期性四肢麻痺(TPP)と診断され、臨床神経生理学的検査(prolonged exercise test)で異常が確認できた15症例のDNAサンプルと、周期性四肢麻痺を伴わない甲状腺機能亢進症の20症例のDNAサンプルを集めた。(2)原因遺伝子の特定と多型解析本年度は筋に高レベルで発現していることが明らかになり、かつ周期性四肢麻痺との関連が示唆されているKCNQ5についてTPP症例3例でこの変異の有無を検討したが、現在のところ疾患に関連すると考えられる変異は認められなかった。FPPでのmutationが知られているCACNA1SおよびSCN4Aについての、遺伝子多型分析は、検体が十分に集まり次第行なう予定である。(3)変異遺伝子導入によるパッチクランプ解析本邦における甲状腺中毒性周期性四肢麻痺症例で、原因の可能性のある筋イオンチャネル候補遺伝子の異常の有無を検討した。また、四肢麻痺を伴わない甲状線機能亢進症の患者17名を陽性コントロール群(HD)とした。異常筋チャネルの候補として家族性低カリウム血症性周期性四肢麻痺の原因であるNaチャネル遺伝子SCN4AとCaチャネル遺伝子CACNA1Sの変異部位、家族性周期性四肢麻痺のKチャネル遺伝子KCNJ2とKCNE遺伝子の全蛋白コード領域、さらに電位依存性KチャネルKCNQ

ファミリーのなかから骨格筋に発現してまだ疾患との関連が唯一不明なKCNQ5の全蛋白コード領域を変異検索の対象とした。末梢血から抽出したDNAを材料とし、各遺伝子のエクソンをPCRで増幅したのち、シークエンスで塩基配列の変異を調べた。アミノ酸置換を伴う変異はFisherの正確確率検定を用いてコントロール群との有意差を検定した。結果は次の通りであった。アミノ酸置換を伴う変異(2784T>A、H928Q)を1名のKCNQ5遺伝子に認めた。ヘテロなミスセンス変異で928番のヒスチジンがグルタミンに置換していた。しかし変異の頻度は正常コントロール群および陽性コントロール群との間で有意差を認めなかった。アミノ酸置換を伴わない正常多型をKCNQ5、KCNJ2、KCNE3に1カ所ずつ認めた。SCN4AとCACNA1Sの変異部位は認めなかった。今回の研究において甲状腺中毒性周期性四肢麻痺の候補遺伝子として検索した筋チャネルの5遺伝子、KCNQ5、KCNJ2、KCNE3、CACNA1S、SCN4Aには有意の変異は認めなかった。このことから甲状腺中毒性周期性四肢麻痺には家族性周期性四肢麻痺の遺伝子変異は関与していないことが確認できた。また、電位依存性Kチャネル遺伝子KCNQファミリーのなかで骨格筋に優位に発現しているKCNQ5もこの疾患の原因遺伝子ではないことが確認できた。今後、対象の筋チャネルの範囲を更に広げて検索する必要がある。
ミュージアムの特性を活かした「観光プログラム」の構築に関する研究

本研究では、積極的な事業展開により観光や経済の活性化などに取り組むミュージアムを調査対象に現地調査を中心とした実証的研究を進め、ミュージアムが展開する観光に関する事業にみられる共通のメカニズムとその波及効果について明らかにし、統合的に分析を加えることで、教育的観点や資料・資源の本来的価値を尊重するというミュージアムの特性を活かして観光振興に有効に機能する共有性・応用性のある「観光プログラム」を構築することを目的とする。また、「教育と観光の融合」や「地域貢献への新たな手法の提示」などの学際的な研究潮流に接合することも意図している。
糖タンパク質糖質のN-アセチルガラクトサミニル化機構の解析

極めて珍しいGalNAcβ1-4GlcNAc構造を含むAsn型糖鎖はウシ下垂体糖ペプチドホルモンで見いだされ、これはペプチド中のPro-X-Arg/Lys配列を認識するN-アセチルガラクトサミン転移酵素により合成されることが明らかとなった。我々はウシ乳腺上皮細胞由来の糖蛋白質Asn型糖鎖の構造を解析し、これらの糖蛋白質の多くがGalNAcβ1-4GlcNAc構造の糖鎖をもつことを見いだし、ウシ乳腺の転移酵素は下垂体とその基質特異性が異なるのではないかと考えた。今回、乳腺蛋白質でその全アミノ酸配列が決定されているbutyrophilinを精製し、格糖結合部位における糖鎖の構造を解析したところ、GalNAcβ1-4GlcNAc構造をもつ糖鎖には部位特異性が見られ、その近傍にPro-Cys-Arg配列が存在した。そこでウシ乳腺からDEAE-Sephacel,Affi-GelBlue,Hg-UDP-GalNAc-Speharoseのカラムを用いてN-アセチルガラクトサミン転移酵素を部分精製し、この糖転移酵素がペプチド特異性をもつかどうかを酵素学的に解析している。一方、ヒト乳腺上皮細胞由来の糖蛋白質Asn型糖鎖の構造を解析したところ、GalNAcβ1-4-GlcNAc構造はほとんど見いだされなかったが、ヒト乳癌より樹立したMRK-nu-1細胞では、細胞膜糖蛋白質糖鎖の約4%がこの二糖構造をもつ糖鎖であった。ヒト乳腺におけるこの二糖構造の発現は、細胞の癌化と相関する可能性が考えられ、ヒト乳癌の進行度とこの二糖構造の発現量の相関を調べている。
低酸素脳症および中毒性肝障害の組織・細胞応答メカニズムの解析

交通外傷や心血管障害等による脳障害ならびに中毒性肝障害は、救急診療において日常遭遇する重要症例である。本研究では、救急症例の中で、生体の主要な臓器である脳および肝臓の障害に着目し、これらの病態における組織・細胞レベルの応答メカニズム解明に向けた基礎科学的アプローチを行い、障害の軽減と回復の促進を目指した臨床応用の基盤研究とすることを目的としている。本年度は、中毒性肝障害についての実験を継続した。申請者等はこれまで、細胞内情報伝達に関わる酵素ジアシルグリセロールキナーゼ(DGK)ファミリーの生理機能を解析してきたことから、この分子のKOマウスを用いて四塩化炭素による中毒性肝障害モデルを作製した。肝障害後の肝星細胞活性化の指標としてα-SMAタンパクの発現を解析した。ウェスタンブロット解析の結果、DGKα-KOマウスにおいてα-SMAのタンパク発現が著しく亢進することが明らかとなった。6週間の連続の四塩化炭素投与による慢性線維化モデルにおいて、DGKα-KOマウスでは多くの肝細胞が腫大しており、野生型マウスよりも組織損傷が重度であったが、線維化の程度に明らかな差は認められなかった。α-SMAによる免疫組織化学やウェスタンブロット解析の結果、DGKα-KOマウスではα-SMA陽性細胞が増加し、タンパク発現が著しく亢進していることが明らかとなった。さらに、DGKα-KOマウスではPKCδのリン酸化レベルが亢進しており、PKCδによる肝星細胞の活性化が亢進している可能性が示唆された。以上より、肝星細胞の活性化には、DGKα-PKCδが関与すること、しかし肝線維化の進行には他のシグナル経路も関与する可能性が示唆された。今年度は、中毒性肝障害について、6週間連続の四塩化炭素投与による慢性線維化モデルの解析を行った。その結果、DGKα-KOマウスでは多くの肝細胞が腫大しているのが観察され、肝星細胞活性化の指標であるα-SMA陽性細胞が増加することを明らかにした。ウエスタンブロットの結果、ジアシルグリセロール(DG)により活性化されるPKCファミリーの中で、δ型PKCのリン酸化レベルが亢進しており、DG-PKCδ経路による肝星細胞の活性化亢進が示唆された。今年度の進展は、急性期モデルに加えて、慢性化モデルの解析を進めたことである。また、種々のPKCファミリーを解析した結果、δ型PKCの関与を明らかにしたことである。これまでの肝障害モデルの解析を進めるにあたり、DGKα-KOマウスを中心に実験を行って来たが、これに加えて他のDGK-KOマウスを用いた解析も検討したい。このことにより、DGKα以外のDGKファミリーが関与する可能性を精査し、複数のDG代謝経路がPKCδの活性化に関与するか否かの検討を行う。また、肝星細胞活性化において示唆されたDGKα-PKCδ経路の解析を、DGK阻害剤と培養細胞モデルを用いて検証を進める。また、PKCδの下流にある標的分子を追求し、肝線維化の促進に至るコラーゲン分子の発現増加を調節する転写制御シグナル経路を明らかにする。交通外傷や心血管障害、また放射線被曝等による身体各部の障害、ならびに中毒性肝障害は、救急診療において遭遇する可能性のある重要症例である。本研究では、救急症例の中で、生体の主要な臓器である脳および肝臓の障害に着目し、これらの病態における組織・細胞レベルの応答メカニズム解明に向けた基礎科学的アプローチを行い、障害の軽減と回復の促進を目指した基盤研究を企画した。申請者等はこれまで、細胞内シグナル伝達に関わる酵素ジアシルグリセロールキナーゼ(DGK)ファミリーの生理機能を解析してきた。そこで本年度は、ゼータ型DGK(DGKζ)とガン抑制遺伝タンパクであるp53との関わりを検討した。野生型マウスとDGKζノックアウト(KO)マウスにX線を照射してp53を活性化するモデルを用いて脾臓を調べたところ、DGKζ-KOマウスでは野生型に比べてp53の著しい誘導が観察された。また生存曲線を調べたところDGKζ-KOマウスでは8日目に死亡し、野生型よりも生存率が有意に低いことが明らかとなった。これらの結果から、DGKζはp53の上流に位置し、その発現を抑制している可能性が示唆された。また、申請者等は肝細胞にはDGKα、DGKζ、DGKεの発現が認められ、肝部分切除後の再生過程においてこれらの発現が増加することを報告してきた。そこで四塩化炭素を投与して肝線維症を発症させたモデルを用いて、上記マウスで検討を行った。野生型マウスとDGKαKOを比較検討したところα-SMAの発現およびプロテインキナーゼのリン酸化レベルが亢進していた。また、TGFβのシグナル分子であるsmad2のリン酸化レベルも増加していた。このことからDGKαはsmadやPKCを介して肝臓の繊維化に関与することが示唆された。野生型マウスとDGKζノックアウト(KO)マウスにX線を照射したp53誘導実験に関しては、「Advances in Biological Regulation 67 (2018) 93-100」に論文が掲載され、おおむね順調に進行していると思われる。今後、脳組織におよぼす影響を精査する予定でありまた、肝障害モデルに関する実験に関しては、追加実験を行っている。

交通外傷や心血管障害等による脳障害ならびに中毒性肝障害は、救急診療において日常遭遇する重要症例である。本研究では、救急症例の中で、生体の主要な臓器である脳および肝臓の障害に着目し、これらの病態における組織・細胞レベルの応答メカニズム解明に向けた基礎科学的アプローチを行い、障害の軽減と回復の促進を目指した臨床応用の基盤研究とすることを目的としている。本年度は、中毒性肝障害についての実験を継続した。申請者等はこれまで、細胞内情報伝達に関わる酵素ジアシルグリセロールキナーゼ(DGK)ファミリーの生理機能を解析してきたことから、この分子のKOマウスを用いて四塩化炭素による中毒性肝障害モデルを作製した。肝障害後の肝星細胞活性化の指標としてα-SMAタンパクの発現を解析した。ウェスタンブロット解析の結果、DGKα-KOマウスにおいてα-SMAのタンパク発現が著しく亢進することが明らかとなった。6週間の連続の四塩化炭素投与による慢性線維化モデルにおいて、DGKα-KOマウスでは多くの肝細胞が腫大しており、野生型マウスよりも組織損傷が重度であったが、線維化の程度に明らかな差は認められなかった。α-SMAによる免疫組織化学やウェスタンブロット解析の結果、DGKα-KOマウスではα-SMA陽性細胞が増加し、タンパク発現が著しく亢進していることが明らかとなった。さらに、DGKα-KOマウスではPKCδのリン酸化レベルが亢進しており、PKCδによる肝星細胞の活性化が亢進している可能性が示唆された。以上より、肝星細胞の活性化には、DGKα-PKCδが関与すること、しかし肝線維化の進行には他のシグナル経路も関与する可能性が示唆された。今年度は、中毒性肝障害について、6週間連続の四塩化炭素投与による慢性線維化モデルの解析を行った。その結果、DGKα-KOマウスでは多くの肝細胞が腫大しているのが観察され、肝星細胞活性化の指標であるα-SMA陽性細胞が増加することを明らかにした。ウエスタンブロットの結果、ジアシルグリセロール(DG)により活性化されるPKCファミリーの中で、δ型PKCのリン酸化レベルが亢進しており、DG-PKCδ経路による肝星細胞の活性化亢進が示唆された。今年度の進展は、急性期モデルに加えて、慢性化モデルの解析を進めたことである。また、種々のPKCファミリーを解析した結果、δ型PKCの関与を明らかにしたことである。これまでの実験はノックアウトマウスを飼育場所である山形大学を中心に行ってきた。今後は、福島県立医大での実験研究体制を整備し、さらに研究を推進する。また、福島県立医科大学では熱中症モデルの作製し、野生型マウスとDGKζ-KOマウスの比較検討をおこなう。これまでの肝障害モデルの解析を進めるにあたり、DGKα-KOマウスを中心に実験を行って来たが、これに加えて他のDGK-KOマウスを用いた解析も検討したい。このことにより、DGKα以外のDGKファミリーが関与する可能性を精査し、複数のDG代謝経路がPKCδの活性化に関与するか否かの検討を行う。また、肝星細胞活性化において示唆されたDGKα-PKCδ経路の解析を、DGK阻害剤と培養細胞モデルを用いて検証を進める。また、PKCδの下流にある標的分子を追求し、肝線維化の促進に至るコラーゲン分子の発現増加を調節する転写制御シグナル経路を明らかにする。前年度は山形大学での機材を使用したため、支出を少なく抑えて実験することができた。
低酸素下培養滑膜によるヒアルロン酸低分子化の機構と,その滑膜増殖に与える影響

関節症は,関節軟骨を中心とした軟骨および滑膜の退行性および増殖性病変である.我々はその病態と活性酸素との関連性について検討してきた.さらに関節症と局所における機械的ストレスが軟骨細胞に及ぼす影響をin vitroで検討してきた.ヒアルロン酸は軟骨基質の重要な構成要素で,関節液の粘稠性に重要な役割を果たしており,関節症となるとその関節液中ヒアルロン酸が変性して低分子化が生じるとの報告がある.また,軟骨組織基質においてもヒアルロン酸はアグリカンモノマーを結合し基質の機械特性の維持に極めて重要な巨大分子であると考えられている.本研究では活性酸素種の一つであるヒドロキシラジカルに注目し,ヒアルロン酸の低分子化への関与を検討した.まず合成高分子ヒアルロン酸にヒドロキシラジカルを添加すると,ヒアルロン酸は低分子化した.この現象は,ヒドロキシラジカル中和剤であるジメチルスルフォキシド,シトルリンによって抑制された.ついで三次元培養した牛足関節軟骨細胞より分泌されたヒアルロン酸についても同様の実験を行い,同じ結果が得られることを確認した.さらに単層培養した軟骨細胞に反復性の機械的伸展ストレスを加え,ヒドロキシラジカルが発生することを示した.さらに,このヒドロキシラジカルは,軟骨細胞より分泌されるヒアルロン酸を低分子化することを証明した.また,機械的ストレスを加えることによりヒアルロン酸合成酵素(HAS)の誘導が認められたが,高分子量ヒアルロン酸を合成するHAS2のみが誘導されていた.これらの所見より,機械的ストレスにより軟骨細胞が発生するヒドロキシラジカルは軟骨基質変性を介して関節症発症の因子となりうることが示唆された.また,低分子化したヒアルロン酸が滑膜細胞を刺激し滑膜の活性化・炎症を促す可能性が考えられた.関節症は,関節軟骨を中心とした軟骨および滑膜の退行性および増殖性病変である.我々はその病態と活性酸素との関連性について検討してきた.さらに関節症と局所における機械的ストレスが軟骨細胞に及ぼす影響をin vitroで検討してきた.ヒアルロン酸は軟骨基質の重要な構成要素で,関節液の粘稠性に重要な役割を果たしており,関節症となるとその関節液中ヒアルロン酸が変性して低分子化が生じるとの報告がある.また,軟骨組織基質においてもヒアルロン酸はアグリカンモノマーを結合し基質の機械特性の維持に極めて重要な巨大分子であると考えられている.本研究では活性酸素種の一つであるヒドロキシラジカルに注目し,ヒアルロン酸の低分子化への関与を検討した.まず合成高分子ヒアルロン酸にヒドロキシラジカルを添加すると,ヒアルロン酸は低分子化した.この現象は,ヒドロキシラジカル中和剤であるジメチルスルフォキシド,シトルリンによって抑制された.ついで三次元培養した牛足関節軟骨細胞より分泌されたヒアルロン酸についても同様の実験を行い,同じ結果が得られることを確認した.さらに単層培養した軟骨細胞に反復性の機械的伸展ストレスを加え,ヒドロキシラジカルが発生することを示した.さらに,このヒドロキシラジカルは,軟骨細胞より分泌されるヒアルロン酸を低分子化することを証明した.また,機械的ストレスを加えることによりヒアルロン酸合成酵素(HAS)の誘導が認められたが,高分子量ヒアルロン酸を合成するHAS2のみが誘導されていた.これらの所見より,機械的ストレスにより軟骨細胞が発生するヒドロキシラジカルは軟骨基質変性を介して関節症発症の因子となりうることが示唆された.また,低分子化したヒアルロン酸が滑膜細胞を刺激し滑膜の活性化・炎症を促す可能性が考えられた.変形性関節症(OA)や関節リウマチ(RA)の関節液中には低分子量のヒアルロン酸が検出されることが報告されている。これらの低分子量ヒアルロン酸はマクロファージを刺激し、関節炎の増悪に関与する可能性が指摘されている。しかし、関節液中で活性をもつヒアルロニダーゼが認められないことより、どのような機構でヒアルロン酸が低分子化するのかは明らかでない。本研究では酸化ストレス亢進状態にあるOAやRAの関節液中に放出されるreactive oxygen species(ROS)がヒアルロン酸の低分子化に重要な役割を果たすという仮説を立て、検証を試みた。まず、培養滑膜を低酸素下で培養し、再酸素化を行った。この再酸素化によりROSの発生を確認した。分子量1.8x10^6のヒアルロン酸を活性酸素、ヒドロキシラジカル、過酸化水素存在下で反応させると、ヒドロキシラジカルにより強いヒアルロン酸の低分子化を生じた。また、この低分子化はヒドロキシラジカル中和剤であるジメチルスルフォキシド、シトルリンによって抑制された。従って、滑膜組織の阻血再潅流はヒアルロン酸の低分子化をもたらす可能性がある。今後、低分子量ヒアルロン酸合成を行うとされているHAS3(hyaluronan syntase3)発現の変化による低分子ヒアルロン酸の産生亢進の有無、さらに、低分子ヒアルロン酸による、培養滑膜における種々の炎症性サイトカインの産生、ヒアルロン酸レセプターであるCD44の発現・cross-linking・シグナリング伝達に与える影響を検索する。活性酸素種の中でもヒドロキシラジカルがヒアルロン酸の低分子化に関与することを示してきた。そして、関節リウマチ患者関節液中のヒアルロン酸低分子化にヒドロキシラジカルが関与することが示唆された一方、軟骨細胞にに機械的ストレスが加わると活性酸素が発生することを既に報告している。

FX-3000を用いて培養軟骨細胞に繰り返し伸長の機械的ストレスを加えると活性酸素の発生を認め、活性酸素の発生は10Mpaまで強度依存性に増加した。また、発生した活性酸素は培養液中のヒアルロン酸を低分子化した。また、Superoxidedismutase(SOD)は機械的ストレスによる活性酸素種の発生を抑制し、ヒアルロン酸の低分子化を阻害した。シトルリンも同様に機械的ストレスによる活性酸素種の発生を抑制した。さらに、機械的ストレスによるSOD活性の変化(水溶性テトラゾリウムを用いて活性を測定)、RT-PCRによるヒアルロン酸合成酵素(HAS1,2,3)の誘導の状況、および培地中のヒアルロン酸の放出量の検討(サンドイッチ酵素結合アッセイで測定)では、SOD活性の上昇、HAS2の誘導が認められ、ヒアルロン酸の放出量の上昇が認められた。これらの結果より、機械的ストレスによる軟骨細胞における活性酸素種の発生は、関節液中のヒアルロン酸の低分子化を生じ、関節リウマチなどでみられる、関節液粘稠度の低下に関与する可能性が示唆された。関節液粘稠度の低下は関節軟骨の潤滑特注を劣化させる可能性があり、注目される結果が得られた。培養液中のヒアルロン酸分子量の差により牛培養軟骨が産生するフリーラジカル発生に差があるかどうかをみた.牛軟骨を単層培養とし,ヒアルロン酸無添加群,合成高分子ヒアルロン酸(分子量210万)添加群と合成低分子ヒアルロン酸(分子量60万)添加群に分け検討を行った.(1)IL-1β刺激によりフリーラジカルを強制発生させ,培養液中に産生されたフリーラジカル(SOはArgus50により、NOはNO2/NO3 Assay Kit-C2により、OH-はArgus50によりそれぞれ検討)を測定した結果,ヒアルロン酸無添加群に比較して,ヒアルロン酸添加群でのフリーラジカルの発生は抑制されたが,ヒアルロン酸分子量210万と60万での有意な差は認められなかった.(2)次に、培養液中の酸化物をFRAS4フリーラジカル分析システムによる測定したが,ヒアルロン酸無添加群に比較して,ヒアルロン酸添加群でのフリーラジカルの発生は抑制されたが,ヒアルロン酸分子量210万と60万での有意な差は認められなかった.(3)さらに、マンガンスーパーオキサイドディスムターゼ(Mn-SOD)の遺伝子発現状況を3群間でPCRを用いて比較検討したが,ヒアルロン酸添加群・無添加群で有意な差を認めなかった.今後,外因性に添加された合成ヒアルロン酸だけでなく,軟骨細胞自身から合成放出される内因性ヒアルロン酸に関して分子量による作用の違いを検討し,生理的な高分子量ヒアルロン酸のもつ軟骨保護作用としてのフリーラジカル消去を示したいと考える.
陸域有機物の海洋流入増大に備えたリグニン動態追跡用分子マーカーの樹立

H29年度には、リグニンの部分構造に作用するCα位酸化酵素、ヘミセルロース画分の分解に重要な役割を果たすフェノール酸エステラーゼの酵素化学的解析を進めた。また、大腸菌で組換え生産した酵素ならびにその酵素の由来となった菌株を天然バイオマスに作用させたときに生じる変化を液体クロマトグラフィー質量分析(LCMS)にて網羅的に解析した。H30年度にも引き続き同試験を行い、検出されたMSイオンを多変量解析を用いて精査した。フェノール酸エステラーゼとその由来となった菌株をイナワラ抽出物に作用させた場合には、共通のMSイオンが検出され、本菌株の代謝を特徴付ける酵素の一つがフェノール酸エステラーゼであることが示唆された。いずれの場合もフェノール酸2量体の生成は認められなかった。フェノール酸2量体はヘミセルロース鎖同士を連結する部分に存在することから、本酵素ならびに本菌株はヘミセルロースの遊離末端に結合したフェノール酸エステル結合の分解に寄与していることが示唆された。本菌株において、フェノール酸エステラーゼ活性の局在を調べたところ、本酵素は細胞外に分泌されておらず、細胞膜あるいは細胞質に存在すると判断されたことから、本菌株や酵素は何等かの別の作用で部分分解されたバイオマスに作用している可能性が高いと言える。本酵素ならびに本菌株によって生成される分子の構造を推定するためには、更に精密な質量分析が必要となったため、H31年度は、注目すべき分子をターゲットとした質量分析と詳細なフラグメント解析を進めることとした。海域より微生物を単離し、その代謝物の網羅的分析ならびに代謝を特徴付ける酵素の特定を行ってきたが、代謝物分子の構造推定のためには、更に精密な質量分析の追加が必要であることが判明した。環境中のリグニン由来物質の分析は、前述の試験で得られる情報が必要であることから、H30年度からH31年度に補助事業を延期して実施する。被検菌株ならびにその菌株が持つ酵素によって生成される分子の構造を推定するため、注目すべき特定の分子に焦点を絞った質量分析と、それらの詳細なフラグメント解析を進める。本解析で得られる情報を基に、環境中のリグニン由来物質の検出に繋げる。海洋に流入する陸域由来の有機炭素(Terrestrial Organic Carbon; TOC)の動態については、長年議論されているにも関わらず未だに未解明な部分が多い。リグニンは、地球でセルロースに次いで2番目に生産量の多い植物バイオマスであり、海洋流入TOCの主要成分である。近年、従来リグニン分解が起きないとされる海域においても微生物代謝による分解が起きていることが示唆されるようになり、様々な海洋生物に対して、海洋中リグニン挙動が与える長期的な影響を評価する手法の開発が必要となった。環境中に存在するリグニンを測定するこれまでの方法は、既に変成/不溶化した未知の堆積物「フミン質様不溶性物質」の分析に留まっており、「動的なリグニンそのもの」の挙動を充分に把握できていないのが現実である。本申請ではTOC流入の海洋環境へのインパクトに関する現状把握や予測に繋がる新しいリグニン動態追跡手法の開発を行うことを目的とする。2015年度には、これまでに我々が海域より収集してきたリグニン関連芳香族モノマーに対する代謝活性を持つ微生物から成るライブラリーの中から、様々な分類学的系統群に属する23株を被検株として選択した。これらを用いて、リグニンモデル化合物やリグニン由来低分子芳香族化合物を基質とした培養試験を行い、微生物培養に伴い生成された代謝物をLCMS分析を用いて網羅的に検出した。その結果、被検基質に対する加水分解、酸化、還元活性を見出すことができた。検出された各代謝物のMSフラグメント解析を実施し、代謝箇所の推定を行った。また、一部の菌株の培養物からは、多変量解析の手法を用いて、固有代謝物に由来するMSイオンを検出した。研究実施計画通り、リグニン関連物質を代謝する微生物ライブラリーを用いた各種芳香族化合物に対する代謝試験を行い、特徴的な代謝物を検出することができた。H27年度までに、種々の分類学的系統群に属するバクテリアを中心とする微生物23株を用いて、リグニンに関連する合成モデル低分子芳香族化合物を添加して培養した際に生成される代謝物を網羅的に調査してきた。H28年度には、これまでの合成モデル化合物での試験に加え、天然バイオマス成分として、植物から抽出したリグニン含有画分に対する代謝試験を実施した。本試験では、ユーカリ、スギ、タケ、イネの粉砕物から、ジオキサンを用いて抽出される成分を窒素雰囲気下で乾固し、これを粗リグニン画分として、微生物培養液に添加した。各粗リグニン画分から培養に伴い生成される代謝物をLCMSで分析、多変量解析を用いて、固有の代謝物の分子量情報の抽出を行った。その結果、用いた微生物の系統分類学的位置よりもむしろ、それぞれの微生物が持つ特徴的なバイオマス分解酵素活性に依存する一連の代謝物が見出された。さらに、これらの多様な代謝物の中には、被検基質の原料として使用した植物種が異なるにも関わらず、普遍的に生成される分子も見出され、リグニン動態追跡用マーカーの候補分子としての可能性が示唆された。候補となる分子の精密分子量情報から代謝物分子の組成式を計算し、天然リグニンの構造と照らし合わせて、その構造を予測した。研究実施計画通り、リグニンを含む天然バイオマス成分に対する種々の微生物代謝を実施し、各微生物が持つバイオマス分解酵素活性に依存した代謝物の多様性と普遍性を見出すことができた。

また本研究の目的であるリグニン動態追跡用マーカーの候補となる分子を見出すことができた。H28年度までに、リグニンを模した低分子合成モデル化合物ならびにリグニンを含有する植物からの抽出画分に対する代謝試験を実施した。各粗リグニン画分から培養に伴い生成される代謝物を解析した結果、それぞれの微生物が持つ特徴的なバイオマス分解酵素活性に依存する一連の代謝物を見出した。そこでH29年度には、リグニン主要結合特異的開裂を担うCα位酸化酵素活性、エーテラーゼ活性、ならびにバイオマスヘミセルロース画分分解に重要な役割を果たすフェノール酸エステラーゼ活性を持つ微生物のゲノム配列を解析し、その系統的位置付けや代謝の遺伝的ポテンシャルを調査した。バイオマス変換に重要と予測される酵素をコードすることが予測される塩基配列については、組換え酵素を作成し、その活性や酵素学的特徴を検査した。また、上記株がリグニン含有植物バイオマス粗画分を代謝した際に起こる低分子化合物の変化を、液体クロマトグラフィー質量分析(LCMS)で網羅的に解析した。その結果、草本と木材から得られた抽出物に共通する微生物代謝物分子を培地中に検出した。一方、海洋沈木に存在する微生物叢を16S、18S RNA配列のアンプリコンシーケンスによって調査し、陸域由来植物バイオマスの分解過程で特徴的に出現する微生物叢組成とそのキープレーヤーを推定した。H29年までに計画した、基準株の16S rDNAに基づく分類学的位置付を決定した。また、植物バイオマスを添加して培養した際に見いだされる特徴的な代謝物を検出することが出来た。H29年度には、リグニンの部分構造に作用するCα位酸化酵素、ヘミセルロース画分の分解に重要な役割を果たすフェノール酸エステラーゼの酵素化学的解析を進めた。また、大腸菌で組換え生産した酵素ならびにその酵素の由来となった菌株を天然バイオマスに作用させたときに生じる変化を液体クロマトグラフィー質量分析(LCMS)にて網羅的に解析した。H30年度にも引き続き同試験を行い、検出されたMSイオンを多変量解析を用いて精査した。フェノール酸エステラーゼとその由来となった菌株をイナワラ抽出物に作用させた場合には、共通のMSイオンが検出され、本菌株の代謝を特徴付ける酵素の一つがフェノール酸エステラーゼであることが示唆された。いずれの場合もフェノール酸2量体の生成は認められなかった。フェノール酸2量体はヘミセルロース鎖同士を連結する部分に存在することから、本酵素ならびに本菌株はヘミセルロースの遊離末端に結合したフェノール酸エステル結合の分解に寄与していることが示唆された。本菌株において、フェノール酸エステラーゼ活性の局在を調べたところ、本酵素は細胞外に分泌されておらず、細胞膜あるいは細胞質に存在すると判断されたことから、本菌株や酵素は何等かの別の作用で部分分解されたバイオマスに作用している可能性が高いと言える。本酵素ならびに本菌株によって生成される分子の構造を推定するためには、更に精密な質量分析が必要となったため、H31年度は、注目すべき分子をターゲットとした質量分析と詳細なフラグメント解析を進めることとした。
海産下等動物を利用したＨＩＶ増殖を抑制する新規宿主防御因子の同定

宿主はウイルス増殖を抑制する防御因子を持っている。しかしHIV-1はヒトにおいて効率よく増殖する。これはHIV-1がヒト防御因子から回避する能力を持っており、ヒト防御因子の単離は困難であることを示している。そこで、獲得免疫がなく発達した防御因子を持っていると考えられる海産下等動物からHIV-1増殖を抑制する宿主因子を単離し、抑制メカニズムを解明する。養殖が盛んで入手の容易なクルマエビを用いる。クルマエビ抗HIV-1因子のヒト、サル、マウスの相同体にもHIV-1増殖抑制活性があるかどうか観察し、その因子の進化と抗HIV-1活性との関連を考察する。
ヘチサン型トリカブトアルカロイドの汎用型合成ルートの確立

トリカブトは日本三大毒草の一つとして数えられるが、含有されるアルカロイド(aconite alkaloid)は古くから漢方で利用されてきた有用な医薬でもある。我々はケトン、アルデヒド、ニトロ基に対するパラジウム触媒α-アリール化反応を見出したのを契機にトリカブトアルカロイドの全合成研究を開始し、5種類ある代表的な骨格の内、唯一合成が達成されていなかったヘチサン骨格の(±)-Nominine全合成を世界に先駆け達成した。とはいえ、本合成は多段階を要し、多大な労力と熟練した合成技術を持ってせねば、これを再現することも困難である。そこで、合成経路を再検討し、工程数短縮を図り、また、光学活性体合成への手掛かりを得るべく検討した。合成経路改良の試み:中間体、2-フェネチルシクロヘキセノン誘導体への工程を改善すべくTaberらの方法により2-メトキシ安息香酸から一挙に2-アルキルエノンを得べく種々検討したが、β-ハロフェネチル体からスチレンへの脱離が優先し、所望のアルキル化は起きなかった。一方、出発原料2-ブロモ-5-メトキシフェネチルヨージドの大量調製法を確立した。光学活性中間体調製の試み:ニトロメタンの不斉付加は、文献記載条件では進行しない。条件を苛烈にし、進行したが不斉誘起は起こらなかった。また、dl-ニトロメタン付加体を酒石酸ジエステルのアセタール体とすると、4種ジアステレオマーをHPLC分離することに成功した。これにより理論上は光学分割、再生利用が可能となったが、同様な分離条件下オープンカラムでの分離は不可であった。以上の考察から、光学活性体を得るためには既存経路でdl体を合成後、たとえば二級水産基をベンゾイル化などしてキラルカラムによる分離を行なうことが最も現実的方法であると結論した。トリカブトは美しい青紫色の花と強力な毒性で有名である。その毒の本体は主として塊根部に含有される、トリカブトアルカロイドと呼ばれる複雑な構造を有する塩基性成分であり、5種基本骨格に分類される。これらの合成研究には40年を超える歴史があり、日、加、米などで幾つかが全合成された。しかし、上記5種母核のうち、最も複雑な骨格の一つである7環性ヘチサン骨格のみがその全合成はもとより、基本骨格の構築さえも報告されていなかった。我々は、既に報告した「Pd触媒による分子内ケトン基、ホルミル基、ニトロ基に対するα-アリール化反応」の応用の一環として、ヘチサン型トリカブトアルカロイド全合成に挑み、世界に先駆けて(±)-Nominineの全合成を完成し速報した。更に邦文総説にて合成の経過を詳述するとともに、詳報3編に亘ってその全容を記した。本合成は世界初とはいえ、40工程を要するうえラセミ体の全合成である。これを再検討し、より汎用性の高い合成経路へと改善すべく研究を継続した。上記合成経路ではシクロヘキサノンをA環として用い、5位相当部を3-メトキシフェネチルョージドにてアルキル化後、再度酸化、ホルミル基の導入を行なっていた。この工程を短縮すべくTaberらの方法により2-メトキシ安息香酸から一挙に2-アルキルエノンとすべく種々検討を行ったが、脱離基の変換や、塩基の添加などでもフェネチル体からスチレン型への脱離が優先し、所期のアルキル化は起きなかった。一方、前記フェネチルョージド合成法を改良し、大量調製に適う手法を確立した。

光学活性体合成に関してはニトロ中間体の4位ケトンを酒石酸エステルにてアセタール化することにより、ジアステレオマー混合物とすることができた。しかしながら、オープンカラムでの分離は困難であったため、他中間体でのアセタール化を検討する。また、ニトロメタンの不斉付加も併せて検討する。トリカブトは日本三大毒草の一つとして数えられるが、含有されるアルカロイド(aconite alkaloid)は古くから漢方で利用されてきた有用な医薬でもある。我々はケトン、アルデヒド、ニトロ基に対するパラジウム触媒α-アリール化反応を見出したのを契機にトリカブトアルカロイドの全合成研究を開始し、5種類ある代表的な骨格の内、唯一合成が達成されていなかったヘチサン骨格の(±)-Nominine全合成を世界に先駆け達成した。とはいえ、本合成は多段階を要し、多大な労力と熟練した合成技術を持ってせねば、これを再現することも困難である。そこで、合成経路を再検討し、工程数短縮を図り、また、光学活性体合成への手掛かりを得るべく検討した。合成経路改良の試み:中間体、2-フェネチルシクロヘキセノン誘導体への工程を改善すべくTaberらの方法により2-メトキシ安息香酸から一挙に2-アルキルエノンを得べく種々検討したが、β-ハロフェネチル体からスチレンへの脱離が優先し、所望のアルキル化は起きなかった。一方、出発原料2-ブロモ・5-メトキシフェネチルヨージドの大量調製法を確立した。光学活性中間体調製の試み:ニトロメタンの不斉付加は、文献記載条件では進行しない。条件を苛烈にし、進行したが不斉誘起は起こらなかった。また、dl-ニトロメタン付加体を酒石酸ジエステルのアセタール体とすると、4種ジアステレオマーをHPLC分離することに成功した。これにより理論上は光学分割、再生利用が可能となったが、同様な分離条件下オープンカラムでの分離は不可であった。以上の考察から、光学活性体を得るためには既存経路でdl体を合成後、たとえば二級水産基をベンゾイル化などしてキラルカラムによる分離を行なうことが最も現実的方法であると結論した。
生物活性を有する光学活性テルペン類の合成研究

大麦の発芽抑制物質であるソロキニアニンについては、d-カルボンより出発し、合成することに成功した。全17工程、4%の収率であった。また、本合成品の比旋光度は、符号を含めて天然物と良い一致を示したことで、天然物の絶対立体配置が、IR,4R,5S,6R,8S,13S,2′Rであることが明らかとなった。また、昆虫の成長及び摂食阻害物質であるアザジラクチンに関しては、高度に官能基化されたデカリン部分の構築の検討を行なった。その結果、分子内ディールス・アルダー反応と分子内ラジカル環化反応を用いることで最も合成が困難とされるB環部分の全置換基を望む立体化学で供えたデカリン骨格の構築に成功した。特にアザジラクチンの右側テトラシクロフラン部分に相当する大きな置換基を有した骨格の形成は世界で初めての例であり、本成果が、アザジラクチン全合成に向けての大きな進歩であるといえる。
損傷筋線維除去システムにおける酸化タンパク質の種類と役割

骨格筋の損傷に伴って,損傷筋線維中のタンパク質は酸化される.この酸化タンパク質の発生が筋再生に重要であると仮説を立てて研究を進めている.これまでに数種類の酸化タンパク質(ニトロシル化,カルボニル化タンパク質,酸化型SH基含有タンパク質,ならびにジチロシン等)がmdxマウスの損傷筋繊維に発現していることを明らかにした.平成30年度では,酸化タンパク質と内在性プロテアーゼの局在部位の確認を行い,酸化タンパク質の発現部位にカルパインならびにカテプシン類が発現していることが明確に示された.またそれら内在性プロテアーゼ活性は筋損傷の程度が高くなり,酸化タンパク質量が増えると増加することも明らかとなった.筋損傷時に発現する酸化タンパク質の種類については損傷のステージ(損傷初期,後期)によって発現種が異なることも明らかにすることができた.さらに,それらの酸化タンパク質を各種抗体を用いたwestern blottingで検出したところ,損傷筋試料においては複数種のバンドが確認できており,免疫組織化学染色結果と一致した.酸化タンパク質の多いmdxマウスの筋タンパク質はin vitroでのプロテオリシス処理でも分解されやすいことが示された.また,検討中であった酸化タンパク質の電子顕微鏡レベルでの局在観察に係る新手法の開発においては,酸化タンパク質の修飾と灌流固定を併用することで酸化タンパク質の保護と微細構造の保持の両者を一定レベルで両立することが可能となり,光学顕微鏡による予備的観察では極めて良好な結果が得られている.当該年度に予定していた内在性プロテアーゼと酸化タンパク質の局在観察,内在性プロテアーゼの活性,ならびに酸化タンパク質のin vitroプロテオリシス解析については,当初の計画通り順調に解析が進んでおり,損傷筋における酸化の種類やその程度と内在性プロテアーゼの関わりの理解が進んだ.特に損傷のステージにおいて酸化タンパク質の種類に差異があることが明確になったことは,酸化タンパク質に何らかの生理的意義があることを示唆していると考えられ,本研究課題の目的に即した結果が得られている.平成31年度では,これまでの知見を畜産業界に還元すること目的の1つにして研究を展開する.全世界のブロイラー業界で問題となっている異常硬化胸肉の発現は異常な筋肥大に伴う酸化ストレスが直接の原因であると仮説を立てている.異常硬化を発現する鶏の胸肉の酸化ストレスレベルを推定するために,酸化ストレスのマーカーであるリポフスチンの蓄積量やこれまでの知見で明らかになった酸化タンパク質種の発現について調査を進める.また,酸化タンパク質の電子顕微鏡レベルでの局在観察についても改良と検討を進め新規手法の開発に努める.骨格筋の損傷において損傷部位の正常な除去は,その後の筋再生(肥大)のために重要である.損傷部位が除去されない場合に繊維化などが生じる. mdxマウスでは,損傷筋線維中のタンパク質の特定アミノ酸残基が酸化されていることが報告された.同様に意図的な塩酸ブピバカインの筋肉注射により,損傷を受けた正常マウスの骨格筋線維においても酸化タンパク質が検出された.このことにより損傷筋においてタンパク質の酸化は普遍的な現象であることが示されている.しかしながら,損傷筋線維中でタンパク質が酸化される理由については理解が進んでいないことから,その理解を本研究課題の目的とした.平成29年度では,mdxマウスの大腿四頭筋,腓腹筋,ならびに前頸骨筋等を用いて,酸化タンパク質の種類とその組織内の局在について調査を行った.結果として,初年度に検出を予定していた酸化タンパク質種の全てが損傷筋線維中に存在することが確認され,さらに損傷した筋組織部位の除去に関係すると考えられるいくつかのプロテアーゼの活性が,酸化タンパク質量に依存して増加する傾向にあることが確認できた.また,平成29年度に設置した分光蛍光光度計を用いた酸化タンパク質の定量についても一定の成果が得られている.一方,新規な化学修飾法を用いて酸化タンパク質の局在を電子顕微鏡レベル明らかにする予定であったが,当初計画していた手法では,筋組織構造を電子顕微鏡レベルで維持することが難しいことが判明し,現在,その改良法の検討を進めている.初年度に予定していた電子顕微鏡レベルでの骨格筋組織構造における特定酸化タンパク質の局在観察では,当初の計画通り化学修飾法を用いて筋組織を処理した.その後,修飾領域の全てを連続的に超薄切片作製して観察したところ,全範囲で筋組織の化学固定レベルが低く,その修飾処理過程が原因と考えられる筋組織構造の崩壊が認められた.以上のことから,特定酸化タンパク質の筋組織中における電子顕微鏡レベルでの局在情報が得られていない.骨格筋の損傷に伴って,損傷筋線維中のタンパク質は酸化される.この酸化タンパク質の発生が筋再生に重要であると仮説を立てて研究を進めている.これまでに数種類の酸化タンパク質(ニトロシル化,カルボニル化タンパク質,酸化型SH基含有タンパク質,ならびにジチロシン等)がmdxマウスの損傷筋繊維に発現していることを明らかにした.平成30年度では,酸化タンパク質と内在性プロテアーゼの局在部位の確認を行い,酸化タンパク質の発現部位にカルパインならびにカテプシン類が発現していることが明確に示された.またそれら内在性プロテアーゼ活性は筋損傷の程度が高くなり,酸化タンパク質量が増えると増加することも明らかとなった.筋損傷時に発現する酸化タンパク質の種類については損傷のステージ(損傷初期,後期)によって発現種が異なることも明らかにすることができた.さらに,それらの酸化タンパク質を各種抗体を用いたwestern blottingで検出したところ,損傷筋試料においては複数種のバンドが確認できており,免疫組織化学染色結果と一致した.酸化タンパク質の多いmdxマウスの筋タンパク質はin vitroでのプロテオリシス処理でも分解されやすいことが示された.

また,検討中であった酸化タンパク質の電子顕微鏡レベルでの局在観察に係る新手法の開発においては,酸化タンパク質の修飾と灌流固定を併用することで酸化タンパク質の保護と微細構造の保持の両者を一定レベルで両立することが可能となり,光学顕微鏡による予備的観察では極めて良好な結果が得られている.当該年度に予定していた内在性プロテアーゼと酸化タンパク質の局在観察,内在性プロテアーゼの活性,ならびに酸化タンパク質のin vitroプロテオリシス解析については,当初の計画通り順調に解析が進んでおり,損傷筋における酸化の種類やその程度と内在性プロテアーゼの関わりの理解が進んだ.特に損傷のステージにおいて酸化タンパク質の種類に差異があることが明確になったことは,酸化タンパク質に何らかの生理的意義があることを示唆していると考えられ,本研究課題の目的に即した結果が得られている.平成30年度では,当初計画にある筋内在性プロテアーゼの組織内での局在観察を行い,平成29年度に明らかにした酸化タンパク質の組織内分布との関わりについて調査を進める.この他に,電子顕微鏡レベルでの特定酸化タンパク質の局在観察手法についての改良を進める.平成31年度では,これまでの知見を畜産業界に還元すること目的の1つにして研究を展開する.全世界のブロイラー業界で問題となっている異常硬化胸肉の発現は異常な筋肥大に伴う酸化ストレスが直接の原因であると仮説を立てている.異常硬化を発現する鶏の胸肉の酸化ストレスレベルを推定するために,酸化ストレスのマーカーであるリポフスチンの蓄積量やこれまでの知見で明らかになった酸化タンパク質種の発現について調査を進める.また,酸化タンパク質の電子顕微鏡レベルでの局在観察についても改良と検討を進め新規手法の開発に努める.電子顕微鏡レベルでの特定酸化タンパク質の局在観察手法の改良にはmdxマウスの個体が必要な場合があった.しかし,飼育していたmdxマウスの繁殖能力が低下したことから,個体を入手できずに実験を進めることができなかったことが次年度使用額が生じた理由である.次年度は使用マウスのつがいを購入して繁殖を進めることを予定している.遅延している実験については,次年度に繁殖できた個体を用いて行うことを予定しており,生じた次年度使用額はその実験に充当する.