hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
水圏汚染有機物質の酸化分解

本研究においては、空気、又は酸素のみを酸化剤として、熱・触媒電気あるいは光を利用して、排水中の汚染有機物質の効率よい酸化除去プロセスの確立をめざすもので、5つの分担課題により研究が行われた。1.触媒湿式酸化反応による難分解汚染物質の除去:難分解性物質の酸化コバルト触媒による酸化速度を解析し、総括の速度式を導いた。その速度と種々の物質の水素引き抜きの難易とが、よい対応を示すことを明らかにした。さらに、触媒充填における工学的課題についても検討を加え、装置内で効率よく反応を行わせるための触媒担持方式を明らかにした。2.湿式酸化反応による有機汚染物質の改質除去:湿式酸化処理による廃液の好気性生物処理実験を行い、湿式酸化によって、廃液の生物分解性が向上することを明らかにしたが、さらに生物処理の効率を高めるため、新たに開発した多孔質樹脂を利用した生物膜を用いた実験を行い、条件によっては可成りの効率の向上が認められた。3.電解酸化分解による廃液処理の高度化、過酸化水素生成条件および、分解に伴う廃液の酸化処理過程との効率よい結合をめざし、処理装置の設計と、その最適条件の検討が行われた。1段プロセスおよび2段プロセスの、両者の経済評価が行われた。4.高活性触媒を用いた廃液の常温処理:疎水性ポリマー担持白金触媒の調製法を改善し、高分散化をめざすことによって、アルコールの直接酸化活性を著しく向上することが出来た。さらに、二元金属化および分解促進機能を有する担体の利用が試みられた。5.光触媒を用いた廃液の常温処理、酸化チタンの光触媒作用、微量金属銅添加効果を明らかにし、トリハロメタン類の有機汚染物質の脱塩素分解反応を行わせ、その脱塩素速度、および分解速度の解析が行われ、光触媒が極めて優れた効果を与えることを見出した。
酸化還元酵素のハイスループット電極触媒機能評価

酵素電極反応に最適な細孔構造とモロフォロジーを有する酸化マグネシウム鋳型多孔質炭素を開発し,酸化還元酵素の電極触媒活性計測へ応用した.メソ孔は酵素担持量を増やし,個々の酵素電極活性を高め,マクロ孔は物質輸送効率を高める.多孔質炭素を修飾した電極は,酵素が少量であっても活性評価でき,酵素のスクリーニングへの応用が可能である.様々な電極触媒特性評価もできる.高性能・高耐久性酵素の開発のさらなる加速が期待される.平成27年度において,酸化還元酵素電極触媒ハイスループットスクリーニング系の構築にむけた以下の基礎検討を行った.1)多孔質炭素の構造設計:スクリーニングに最適な多孔質炭素材料として“酸化マグネシウム鋳型炭素"に注目した.メソ孔サイズが酵素サイズと同程度場合は高い安定性が得られ,細孔サイズが大きい場合は炭素粒子の内側のメソ孔まで利用できることで酵素担持量が増加し高い電流値が得られることがわかった.2)多孔質炭素の表面設計:キノンや酸化還元色素が酸化マグネシウム鋳型炭素の表面に安定に吸着すること,さらにメディエータとして機能することわかった.これにより,スクリーニングの対象となる酵素のバリエーションが増した.3)スクリーニング:酸化還元酵素と酸化還元ポリマーからなるハイドロゲル修飾電極における最適化条件のスクリーニングに応用し,応答電流値に及ぼす電解質の影響を調べた.電流生成効率に影響する酵素とレドックスポリマー間の相互作用,酵素とメディエータ間の相互作用を電解質の濃度及び種類の依存性を調べることで判別できることがわかった.得られた知見をもとに,ポリマーや酵素表面改質の設計指針を得ることができた.4)酵素を電極触媒として利用する場合,酵素-電極間電子移動メカニズムによって酸化還元メディエータを介した反応系(本研究ではレドックスハイドロゲル型修飾電極)と,それを用いない直接電子移動系に分類することができる.本研究では,いずれのタイプの酵素反応系にも適用できる適用範囲の広いスクリーニングシステムの構築を目指した.5)印刷電極のデザインおよび多孔質炭素インクの調整:多孔質炭素を印刷するためのインク調整方法や成分,条件の最適条件を見出した.また,メディエータを炭素インクに添加することで,均一かつ効率よく修飾することができ,印刷電極を調整した際にも,その活性は失わないことが分かった.本研究課題におけるキーマテリアルとなる多孔質炭素について粒子の構造およびメソ細孔構造,表面修飾方法を決定し,多様な酵素のスクリーニングに適用できることが明らかになった.また,印刷電極についても試作できており,当初の計画通り進行し,次年度の研究の準備は整っている.平成28年度では酸化還元酵素電極触媒ハイスループットスクリーニング系の構築にむけた以下の基礎検討を行った.1)多孔質炭素のさらなる改良:酵素が炭素の限られた空間しか利用できていないことが分かった.したがって本年度において,多孔質炭素微粒子の表面のみならず内部に形成された細孔も有効活用できるデザインの多孔質炭素をデザインし,その機能評価を行った.2)印刷電極への多孔質炭素の修飾:1)の成果により,適切な細孔を有する多孔質炭素を塗布した電極を用いることで,酵素吸着量が短時間で増加し,大きなシグナルを得ることに成功した.3)酵素活性のスクリーニング:酵素液に電極を一定時間浸漬し,酵素の電気化学活性をモニタリングすることで非常に薄い酵素液(10nm)においても十分な酵素活性を観測することができた.また酵素濃度の依存性を電気化学応答の強度により判別できた.4)酵素の電気化学活性プロファイルの調査(イオン種の影響):このシステムを応用することにより,酵素の電気化学的活性に及ぼす温度,塩濃度,pHなどの影響を調査することができた.一例として,ビリルビンオキシダーゼは,ある塩を共存させることによりその熱耐性が向上することが明らかになった.5)メディエータのスクリーニング:本システムは直接電子移動型酵素電極反応のみならずメディエータ型反応にも応用できることが分かった.従来の測定の100分の1程度の非常に少ない酵素量で様々な酸化還元分子(メディエータ)との反応性を調査することができた.酵素電極反応に最適な細孔構造とモロフォロジーを有する酸化マグネシウム鋳型多孔質炭素を開発し,酸化還元酵素の電極触媒活性計測へ応用した.メソ孔は酵素担持量を増やし,個々の酵素電極活性を高め,マクロ孔は物質輸送効率を高める.多孔質炭素を修飾した電極は,酵素が少量であっても活性評価でき,酵素のスクリーニングへの応用が可能である.様々な電極触媒特性評価もできる.高性能・高耐久性酵素の開発のさらなる加速が期待される.印刷電極上にメディエータも修飾した多孔質炭素材料を印刷(修飾)し,96穴プレートにおける試験を行う予定である.新規酵素のスクリーニングにメディエータを使用しない系にも,メディエータを必要とする酵素にも利用できることがわかったので,様々な系にて適用できるかどうかを調べる.また,試験するメディエータごとに,基質濃度,pHのみならず,電極触媒としても評価するためには電解質の濃度,種類も検討することが重要であることがわかり,ハイスループットスクリーニング系が有効に機能することを実証する予定である.生物電気化学試薬や酵素といった消耗品の供給先,使用量,価格を再検討することで研究のレベルを落とすことなく消耗品にかかる経費を節約できた.研究成果発表旅費や論文投稿にかかる経費(オープンアクセス)に有効活用する.具体的には第19回ISE Topical meeting(オークランド,ニュージーランド)やElecNano7(リール,フランス)などの国際会議で積極的に研究成果発表を推進する.
染色体機能におけるASF1の遺伝生化学的解析

ゲノムDNAは、細胞内ではヒストンなどの蛋白質と共に様々な高次クロマチン構造を形成することによって、染色体機能が維持される。ヒストンのシャペロン分子と知られるAsf1は新しく作られたヒストンH3-H4を複製されたDNA上に運ぶ重要な分子である。新規合成ヒストンH4はHat1というアセチル化酵素で高度にアセチル化されている。これら分子と相互作用する因子を共免疫沈降法で探索し、複合体成分の解析を行なった.その結果Hat1もしくはH4のLys-5,12のアセチル化が安定した細胞質ヒストンH3-H4複合体形成に寄与し、H3-H4複合体の形成はHat1とAsf1によって制御されていること明らかになった。ケノムDNAは、細胞内ではヒストンなとの蛋白質と共に様々な高次クロマチン構造を形成することによって、染色体機能が維持され、クロマチン構造を必要に応じて変化させることで様々なDNA代謝反応(転写、複製、修復、組換え)に寄与している。新規ヌクレオソームの形成と脱構築には種々のヒストンシャペロンとクロマチンリモデリング因子が関与しており、主にDNA複製後の娘DNA鎖上と転写領域で活発に行われる。新規ヒストンシャペロンとして、複製に共役したクロマチン形成を行うCAF-1と転写に共役したHIRAが知られている。さらにASF1はCAF-1とHIRAの、それぞれと協調して働くと考えられている。ニワトリのDT40細胞を用いて、HIRA欠損により種々の遺伝子発現の変化が起こるが、これが生存には必要ではないこと、3種のCAF-1サブユニットのconditional変異株の解析から、CAF-1欠損はS期の遅延、DNA合成能の低下、新規DNA合成鎖上へのすばやいヌクレオソーム形成能の低下を伴い、致死であるがことを明らかにし、本システムのヌクレオソーム形成粗過程及びこれに関連したクロマチン機能の研究にの有効性をすでに示している。本システムを用いてASF1 conditional変異株を作成し解析したところ、CAF-1変異株と比較すると弱いものの同様の表現型を示し、致死であった。したがって、動物細胞では確かに複製に共役したクロマチン形成はCAF-1とASF1に依存し、細胞増殖に必須であることがわかった。興味深いことに、ASF1 conditional変異株に種々の変異をもつASF1を導入したレスキュー法から、CAF-1とHIRAとの結合能を持たないASF1の変異はヌクレオソーム形成及び細胞増殖に影響せず、ヒストンH3と結合できない変異ASF1も生存可能であることが明らかになった。このことはCAF-1とHIRAを介さないASF1依存的クロマチン形成経路もしくはクロマチン形成とは異なるASF1の機能が生存に重要であることを示した。ゲノムDNAは、細胞内ではヒストンなどの蛋白質と共に様々な高次クロマチン構造を形成することによって、染色体機能が維持され、クロマチン構造を必要に応じて変化させることで様々なDNA代謝反応(転写、複製、修復、組換え)に寄与している。クロマチ構造の核となるヒストンの生合成はDNA複製と連動して厳密に調節されており、新規合成ヒストンの複製フォーク上への供給抑制や過剰なヒストンの蓄積は細胞に重篤な影響を及ぼす。すべての真核生物において、新規合成ヒストンH4のN末端5番と12番目のLysは高度にアセチル化されていることから、本アセチル化の新規ヌクレオソーム形成やヒストン代謝に及ぼす影響が示唆されているがその詳細は明らかでない。以前、我々はhistone acetyltransferase-1(Hat1)が新規ヒストンH4アセチル化の責任酵素であることをHAT1欠損ニワトリDT40細胞を作製して明らかにした。本欠損変異株は生育速度に若干の減少が認められるが、DNA複製能及び複製鎖上のヌクレオソーム形成反応には顕著な影響はない。一方でCPT,MMSなどの複製阻害剤に対する感受性が増加することから、Hat1を介するヒストン代謝機構の複製停止における損傷修復・応答への関与を示唆している。今年度、我々はタグ付きHat1発現細胞の細胞質画分からHat1と共免疫沈降する因子を調べところ、Hat1のsubunitであるRbAp48以外に、ヒストンH3/H4、さらにH3/H4シャペロンとして知られるAsf1が共沈することがわかった。DT40とHAT1欠損細胞の細胞質画分をショ糖密度勾配遠心法で分画して、谷因子の分布を調べたところ、HAT1欠損細胞ではH3-H4を含む画分(140kD)が低分子側にシフトし(70kD)、同様の変化がAsf1にも認められた。タグ付きのAsf1複合体をDT40とHAT1欠損細胞から部分精製し、ショ糖密度勾配遠心分画したところ同様の結果が得られた。

以上の結果は、Hat1もしくはH4のLys-5,12のアセチル化が安定したH3-H4複合体形成に寄与し、H3-H4複合体の一部はHat1とAsf1が担っていることを示唆している。
マイクロエレクトロニクス用微細配線におけるPbマイグレ-ションの研究

はんだ合金のマイグレ-ションを主に水環境中で検討した結果をまとめると以下のようである。試験はパワ-サプライを用いて一定電圧を印加する短絡時間測定試験と、ポテンシオスタットを用いて一定速度で電圧(電位)を上昇させ、電流急増電位、電流増加速度等を調べる特性試験を採用した。1.パワ-サプライを使用して短絡時間を測定した結果、電界電圧一定では、試料間隔が長いほど短絡時間は試料間隔に比例して長くなった。試料間隔一定では、電界電圧が大きくなるほど短絡時間は短くなったが、一定電圧を越えると短絡時間には差が見られなくほぼ一定となった。2.PbーSnはんだ合金組成に及ぼす短絡時間の効果を検討した結果、100Pbが最も短絡時間が短く、Snー9540Pb(mass%)、Pbー8095Sn(mass%)、100Snの順に短絡時間は長くなった。合金組成の短絡時間への影響は、共晶点を境に顕著であり、共晶組成(38.1Pbー61.9Sn)よりPb含有量が多くなると100Pbの短絡時間に類似してきて短くなり、Sn含有量が多くなるとSnの短絡時間に類似してきて短絡時間は長くなった。3.ポテンシオスタットを使用して短絡特性を測定した結果、Pb含有量が増加すると発生電圧は減少し、逆にマイグレ-ション発生電流は、Pb含有量が増加すると増加した。すなわち、短絡時間の結果と同様に、Pbによるマイグレ-ションが起こりやすかった。4.フラックスへの活性剤を添加した溶液では、マイグレ-ションを促進するものと遅らす効果を持つもの2種類があった。PbーSnはんだのマイグレ-ションによる生成物の主成分は主にPbで、Snは樹脂状生成物の枝の先端部や付け根のあたりに付着物の形で球状に析出していた。電子機器の高密度実装に伴い問題となってきた,はんだ付部に湿分環境下で電界がかかったときに生ずるPbマイグレ-ションを研究した結果は次のように要約される.(I)Pbマイグレ-ションの観察と試験条件の確立はんだ合金をセラミック基板上に一定距離(すき間)離して設置し,水滴を滴下して電圧を印加し,マイグレ-ション発生を観察した.水滴滴下条件,電圧印加条件とマイグレ-ション発生挙動の関係を検討し,ばらつきの少ない最適試験条件の確立を目指した.印加電圧が数十ボルトを超えると水の電気分解が起こりマイグレ-ション発生状況の顕微鏡観察が困難となることがわかった.使用水滴の電気抵抗,実験室の温度管理を十分に行う必要があることがわかった.当然印加電圧が高いほどマイグレ-ション寿命は短かった.(II)Pbマイグレ-ションに影響を及ぼす因子の検討滴下する水の種類について検討したところ水道水よりも蒸留水または脱イオン水を使用したほうがマイグレ-ション寿命のばらつきが少ないようであった.鋳造はんだよりもはんだ付した後のはんだの方がマイグレ-ション寿命が短く,残留フラックス成分あるいははんだへ銅の固溶が影響しているものと考えられた.ぬれ性を劣化させるような,はんだ中の不純物元素については明確な対応が取れなかったので,ほとんどの元素は影響がないといえよう.(III)Pbマイグレ-ションの自動計測化マイクロコンピュ-タを使用してマイグレ-ション過程の自動計測化を試みている.マイグレ-ションによる短絡電流の検出方法と自動計測可能性を検討中である.はんだ合金のマイグレ-ションをガラス板を用いて水環境中で検討した結果をまとめると以下のようである。

試験はパワ-サプライを用いて一定電圧を印加する短絡時間測定試験とポテンシオスタットを用いて一定速度で電圧(電位)を上昇させる特性試験を採用した。1.パワ-サプライを使用してPbーSnはんだ合金組成に及ぼす短絡時間の効果を検討した結果、100Pbが最も短絡時間が短く、Snー9540Pb(mass%)、Pbー8095Sn(masa%)、100Snの順に短絡時間は長くなった。合金組成の短絡時間への影響は、共晶点を境に顕著にみられ、共晶組成(38.1Pbー61.9Sn)よりPb含有量が多くなるとPbのマイグレ-ション挙動に近づいて短絡時間は短くなり、Sn含有量が多くなるとSnのマイグレ-ション挙動に近づいて短絡時間は長くなった。2.ポテンシオスタットを使用して晃絡特性すなわち電圧および電流ならびに電流増加度を測定した結果、Pb含有量が増加すると発生電圧は減少し、逆にマイグレ-ション発生電流は、Pb有量が増加すると増加した。すなわち、短絡時間の結果と同様にPbによるマイグレ-ションが起こりやすかった。3.活性剤添加溶液の効果は、リンゴ酸およびアシピン酸の酸性活性添加溶液ではマイグレ-ション発生を促進させる効果があり、モノエタノ-ルアミンおよびトリエタノ-ルアミンの塩基性活性剤添加溶液ではマイグレ-ション発生を防ぐまたは遅らす効果があった。4.PhーSnはんだのマイグレ-ションによる生成物の分析をしたところ、主成分は主にPbで、Snは樹脂状生成物の枝の先端部や付け根のあたりに付着物の形で球状に析出していた。
慢性低酸素性肺高血圧症の新規診断治療法の開発 -高地居住者の分子遺伝学的解析-

本研究はキルギス共和国の高地性肺高血圧症患者群よりキルギス国立心臓病内科センターとの共同研究で、現地にてビシュケク在住のコントロール群、高地在住の非肺高血圧群(高地コントロール群)、高地在住の肺高血圧群から各々血清、遺伝子用の血液サンプルを採取し、低酸素性肺高血圧の原因遺伝子である可能性のある遺伝子多型、また血中のNO活性や各種バイオマーカーの測定を行うことにより、低酸素性肺高血圧の分子遺伝的特徴を明らかとすることを目的とした。本年度は、キルギス共和国より搬送した血液サンプルの解析を主に行った。得られた患者群より、検体の破損などを除いた遺伝子解析が可能であったコントロール群36名、高地コントロール群41名、高地肺高血圧群33名からDNA遺伝子を抽出し、p53遺伝子多型とMDM2遺伝子多型の検討を行った。高地肺高血圧群で有意にp53 codon72 C alleleが多い結果となったが、p53遺伝子の制御因子であるMDM2 SNP309遺伝子多型には有意な差は認めらなかった。血清NOx値とET-1値は高地居住者群でコントロール群に比して有意に上昇していたが、肺高血圧の有無による差は認められなかった。またADMA値には三群間で優位な差は認められなかった。d-ROMsテストを用いた抗酸化ストレスの測定を行ったところ、コントロール群に比して血清d-ROMとBAP値の有意が上昇が高地コントロール群に認められたが、肺高血圧の有無による差は認められなかった。p53 codon 72C/G遺伝子多型により、低酸素性肺高血圧の発症が惹起される可能性が示唆され、低酸素由来の酸化ストレスがその誘因である可能性が示唆された。平成30年度が最終年度であるため、記入しない。本研究はキルギス共和国の高所性肺高血圧患者を対象として、低酸素性肺高血圧患者における循環血液中の一酸化窒素(NO)活性、疾患遺伝子特性を明らかにし、慢性呼吸器疾患の進行とともに生ずる慢性低酸素性肺高血圧の診断、治療応用へと展開するための研究基盤を確立することが目的である。具体的にはキルギス国立心臓病・内科センター、または同国の共同研究施設において高地性肺高血圧患者群とコントロール群を選択、同患者群から血液サンプルを採取し血管増殖因子やアポトーシスに関連する遺伝子多型や血球中細胞の遺伝子発現、血清中のエクソソーム中のマイクロRNAの発現を検討することを予定している。本年度は上記患者群の選定の状況であり、キルギス共和国において、肺高血圧患者、低地居住のコントロール群患者の血液、遺伝子サンプルの集積を行っている状況である。ただし、上記患者群での測定標的遺伝子の選定を行っており、低酸素暴露、またVEGF受容体拮抗剤投与後に低酸素に暴露した肺高血圧ラット(SuHx)モデルを作成し、同ラットにおける血球細胞、血清中のエクソソームを抽出しマイクロRNAの測定、また肺組織中のマイクロRNA遺伝子発現について検討した。まず、同肺高血圧ラットの血清より抽出したマイクロRNAをアレイを用いた各群での発現をクラスター解析を行い、標的遺伝子の検討を行った。その結果miR-30e、miR-664-1-5p、miR-874-3pの発現がコントロール群ラットに比して有意に変動しており、miR-30eがラット平均肺動脈圧との相関が最も良好であった。肺組織中での同遺伝子発現には有意は相関は無かったが、肺血管における発現を検討する必要があり、現在検討中である。キルギス国での倫理審査と本研究施設での倫理審査の承認に予想よりも時間が掛かってしまい、承認を受けた時期が9月になってしまったことより、天候の良好な夏期に行う予定であった山岳部位でのサンプル収集が実行困難となり、キルギス国の高地居住者の肺高血圧患者サンプル収集、解析が予想よりも遅れているため。本研究はキルギス共和国の患者群から血液を採取し、血中のNO活性、血球細胞/血中エクソソーム中の遺伝子、p53,ADMA関連遺伝子多型を測定し、低酸素性肺高血圧の原因遺伝子、病態解析、新規バイオマーカーの検索を行う。具体的にはキルギス国立心臓病・内科センター、または同国の共同研究施設において低地居住コントロール群、高地居住非肺高血圧患者群、高地居住肺高血圧患者群を選択、同患者群から血液サンプルを採取し血清ADMAやNO2/NO3値、血液細胞/エクソソーム中のp53,EPC関連遺伝子の発現、p53,ADMA関連遺伝子多型の解析を行い、高地居住者の低酸素刺激による肺循環遺伝子発現の影響や病態を明らかにする事を目的としてる。本年度は昨年度に行えなかった上記患者群をキルギス共和国にて選定を行った。その結果、50名の低地居住コントロール群、67名の高地居住コントロール群、47名の高地居住肺高血圧群、計214名の患者を選定し、高地への訪問が可能な夏期にそれぞれの現地へ赴き、現地スタッフの協力のもと血液サンプルを採取、現地キルギス共和国にて血清分離、血液DNA/RNA採血管処理を行い、サンプルの凍結処理を行った。凍結した血液サンプルはDNA/RNA処理や、遺伝子解析のため凍結状態で日本へ空輸し、現在DNA/RNAを抽出しPCR-RFLP法による遺伝子多型の検討、またRT-PCR法による血液細胞中のRNA、miRNAの検討を開始している。血清成分に関しても、ADMAやNOxの測定やエクソソームの抽出を来年度に行う予定である。昨年度に行う予定であった患者選定と血液サンプル採取が今年度に行う事となり、サンプルの採取と搬送の時期がおくれ、予定していたサンプルの解析が遅れているため。本研究はキルギス共和国の高地性肺高血圧症患者群より

キルギス国立心臓病内科センターとの共同研究で、現地にてビシュケク在住のコントロール群、高地在住の非肺高血圧群(高地コントロール群)、高地在住の肺高血圧群から各々血清、遺伝子用の血液サンプルを採取し、低酸素性肺高血圧の原因遺伝子である可能性のある遺伝子多型、また血中のNO活性や各種バイオマーカーの測定を行うことにより、低酸素性肺高血圧の分子遺伝的特徴を明らかとすることを目的とした。本年度は、キルギス共和国より搬送した血液サンプルの解析を主に行った。得られた患者群より、検体の破損などを除いた遺伝子解析が可能であったコントロール群36名、高地コントロール群41名、高地肺高血圧群33名からDNA遺伝子を抽出し、p53遺伝子多型とMDM2遺伝子多型の検討を行った。高地肺高血圧群で有意にp53 codon72 C alleleが多い結果となったが、p53遺伝子の制御因子であるMDM2 SNP309遺伝子多型には有意な差は認めらなかった。血清NOx値とET-1値は高地居住者群でコントロール群に比して有意に上昇していたが、肺高血圧の有無による差は認められなかった。またADMA値には三群間で優位な差は認められなかった。d-ROMsテストを用いた抗酸化ストレスの測定を行ったところ、コントロール群に比して血清d-ROMとBAP値の有意が上昇が高地コントロール群に認められたが、肺高血圧の有無による差は認められなかった。p53 codon 72C/G遺伝子多型により、低酸素性肺高血圧の発症が惹起される可能性が示唆され、低酸素由来の酸化ストレスがその誘因である可能性が示唆された。低酸素性肺高血圧モデルラットのマイクロRNAの発現の結果を基に、キルギス国居住の肺高血圧患者群を対象に、血清中、血球細胞よりの遺伝子発現、マイクロRNAの発現を検討し、肺循環マーカーとの相関を検討する予定である。また、ラットモデルにおけるマイクロRNAの発現分布を肺組織のISHや発現蛋白の免疫染色を行い、同遺伝子の肺血管リモデリングに関する機序についても検討する予定である。サンプル採取は予定していた十分な検体数を確保する事が出来たため、本年度はその検体処理と解析に注力していく。また低酸素による血清中の酸化ストレスマーカーについても検討する予定である。また、ラットモデルの解析の結果から得られたデータがヒト検体でも同様の傾向を示すかどうかの検証を行う予定である。平成30年度が最終年度であるため、記入しない。
脂肪組織由来幹細胞を用いた気管軟骨再生法に関する研究

脂肪組織由来幹細胞(ADSC)を分化させて軟骨細胞シートとし、回転培養により軟骨管状構造体を作製することを目的とした。家兎皮下脂肪組織からADSCを採取し、継続培養して細胞シートを形成後に回転培養を行った。当初は軟骨細胞への分化が不十分であったが、分化因子と培養条件の調整により軟骨細胞シートが形成された。しかし軟骨基質の産生が不足するためシートに十分な強度がなく回転培養による軟骨管状構造体の作製は困難であった。ADSCを軟骨細胞に分化させることは可能であるが、細胞シートのみで軟骨構造体を作製することは困難で、幹細胞からの気管再生では細胞外マトリックスなどの適切な足場が不可欠であると結論した。小児の気管軟骨の再生には多量の細胞源を必要とするが、本課題では実験動物及びヒトの脂肪組織由来幹細胞(ASC)を軟骨細胞に分化せしめ、in vitroで軟骨細胞シートを回転培養してASCから軟骨管状構造体を再生させることを目的とている。平成24年度には、家兎ACSの採取・同定を行いこれより軟骨細胞シートの作成を行った。実験動物にNew Zealand White Rabbitを用い、皮下脂肪組織を採取した。脂肪組織を洗浄後コラゲナーゼtype IIを用いて融解した。70μmナイロンメッシュで細胞分離し、10%FBS+DMEM中で37°C、5%CO2の条件下で接着細胞を選択的に培養した。p2で細胞を分離しASCとした。ASCは1×106/mlの濃度で-80°Cで凍結保存し、解凍後に培養および軟骨細胞への分化実験に用いた。結果:前年度には軟骨細胞の分化途上においてsphere形成ののち、細胞が不均一に重合していた。軟骨細胞シートを形成する以前に脱分化を生じていたものと考えられたため、培養溶液における添加物を調整することで、軟骨細胞への分化を継続させ、軟骨細胞シートが形成されるようになった。しかし、家兎耳介軟骨細胞を用いて作成した軟骨細胞シートに比較して強度が劣り、シリコンチューブ上で円筒の形状が維持できず、回転培養を継続するに至らなかった。軟骨基質の産生が不十分なためと考えられた。【目的】気管軟骨の再生には多くの細胞源を必要とする。本研究では実験動物の脂肪組織由来幹細胞(ASC)を軟骨細胞に分化させ、軟骨細胞シートとして回転培養により軟骨管状構造体を再生させることを目的とした。【方法】家兎ACSの採取・同定にはNew Zealand White Rabbitを用いた。皮下脂肪組織を採取してコラゲナーゼtypeIIを用いて融解し、細胞分離して10%FBS+DMEM中で接着細胞を選択的に培養した。p2で細胞を分離したASCは1×106/mlの濃度にて凍結保存し、解凍して培養後に細胞シート実験に用いた。ASCは融解増殖後、トリプシン処理して1.0×106/mlの細胞密度で播種して、細胞シートを形成すべく14週間培養を継続した。培養液には軟骨細胞分化用培養液(DMEM+5%FBS、transferrin、dexamethasone)を用いた。【結果】平成23年度における実験では、軟骨細胞の分化途上においてsphere形成ののち、細胞が不均一に重合した。重合した細胞は軟骨細胞シート形成以前にディッシュより剥脱した。軟骨細胞シート形成以前に脱分化を生じていたものと考えられた。次年度には、分化用培養液中にTGFβとinsulinを添加して軟骨細胞分化を継続させることで、軟骨細胞シートが形成されるようになったが、家兎耳介軟骨細胞による軟骨細胞シートに比較して強度が劣り、シリコンチューブ上では円筒形状が維持できなかった。軟骨基質の産生が不十分と考えられたため、培養液中にFGF-2、TGF-β2、TGF-β3などを添加して基質産生の増加を試みたが、シートの強度は不十分で回転培養を継続するには至らなかった。【結論】脂肪組織由来幹細胞を軟骨細胞に分化させて、足場を用いることなく軟骨管状構造体を再生させることは困難であった。幹細胞からの気管再生においては、適切な細胞外マトリックスによる足場の存在が必要と考えられた。小児の気管軟骨の再生には多量の細胞源を必要とする。本課題では実験動物及びヒトの脂肪組織由来幹細胞(ASC)を軟骨細胞に分化せしめ、研究代表者らが考案したin vitroで軟骨細胞シートを回転培養して管状軟骨構造体を再生させる方法を応用し、ASCから軟骨管状構造体を再生させることを目的とした。平成23年度は、家兎ACSの採取・保存と同定を行った。実験動物にNew Zealand White Rabbitを用い、頚部、腋窩および腹部から皮下脂肪組織を採取した。脂肪組織を洗浄の後コラゲナーゼtype IIを用いて融解した。

70μmナイロンメッシュで細胞を分離し、10%FBS+DMEM中で37°C、5%CO2の条件下で接着細胞を選択的に培養した。p2の代で細胞を分離し、フローサイトメトリーにてASCであることを確認した。また、ASCを1×106/mlの濃度で-80°Cで凍結保存し、解凍後にp3のASCとして培養可能であることを確認した。次に家兎ASCから軟骨細胞への分化実験を行った。上記ASCを増殖し、トリプシン処理して細胞を回収し、1.0×106/ml、2.0×105/ml、4.0×104/mlの細胞密度で培養器に播種して4週間継続培養して細胞シートを作製した。培養液として1)DMEM+10%FBSと、2)軟骨細胞分化用培養液(DMEM+1%FBS、TGF-β1、insulin、transferrin、dexamethasone)を用いた。また培養環境として5% O2の低酸素条件を用いた。結果:2)の培養液を用いても、軟骨細胞に分化途上のsphereの形成までは認められたが、細胞が均一に重合した軟骨細胞シートは形成されなかった。低酸素条件でも同様であった。ACSから軟骨細胞への分化が十分でないためと考えられ、今後培養液への添加物や培養条件を検討する必要があると考えられた。家兎ASCを分離・保存し、軟骨細胞シートを作成することは可能であったが、軟骨基質が不十分なためか、強度が不足しており、培養器から剥脱させると強度が維持できず、円筒状の細胞シートとして回転培養するに至らなかった。その理由として、ASCから軟骨細胞への分化条件が未だに不十分であり、基質の産生量が不足していることが挙げられる。シートの培養継続中に一部の細胞が繊維芽細胞に分化して混入していることも考えられる。今後、添加する蛋白を含め、細胞シート自体の培養条件にさらなる工夫を加えて検討する必要がある。家兎ASCを分離・確認し、p2で冷凍保存・復活できるところまでは達成できた。しかし、当初用いた培養液および培養条件では、軟骨細胞への分化途上と思われるsphereまでは形成されたが、均一な細胞シートを形成するには至らなかった。その理由として、ASCから軟骨細胞への分化条件が不十分であり、現時点では繊維芽細胞への分化の条件が勝ってしまっていると考えられる。今後、添加する蛋白や様々な細胞培養条件を検討する必要がある。培養液に添加する因子としてBMP-2、BMP-6、BMP-7、FGF-2、TGF-β2、TGF-β3などについて試み、さらにACSから軟骨細胞への分化促進因子として、低酸素濃度、温度条件、軟骨細胞や基質の添加などを行い、軟骨細胞が十分な強度を持った細胞シートになるよう条件を策定していく必要がある。十分な強度を有する細胞シートが形成されれば、回転培養を行い、当初の計画どおり、組織学的検討(HE染色、サフラニン-O染色、II型コラーゲンおよびI型コラーゲンの免疫組織化学染色)を行う。軟骨基質の組成についてはグリコサミノグリカン含有量を測定する。物性強度についてはレオメーターを用いて、圧縮強度およびヤング率を測定する。
微量添加物によるアスパラギン酸結晶の形状制御

結晶の形状は、各結晶面の成長速度の相対的差によって決まる。成長速度の遅い面が発達するのである。そこで、本研究では微量添加物によりアスパラギン酸結晶の特定な結晶面の成長を抑制して、形状を変えることを試みた。先ず、添加物の探索を試み、L-グルタミン、L-グルタミン酸およびL-アスパラギンを選んだ。次いで、これら添加物の成長速度に対する影響を調べた。いずれの添加物の場合も、結晶のC軸方向の成長速度が抑制された。抑制の強さは、L-グルタミン、L-グルタミンそしてL-アスパラギンの順であったが、前2者はほぼ同じ効果を示し、L-アスパラギンはそれらの半分の効果を示した。これらのデータを、我々の提案した理論を用いて解析した。理論では、結晶表面に吸着された添加物が結晶の成長ステップの前進を阻むことで成長を抑制すると仮定しているが、データ解析によれば、吸着活性点の間隔が添加物の種類に依存し、その結果成長速度が変化すると解釈された。この間隔の違いは、結晶構成物質のL-アスパラギン酸と添加物の間の構造化学的相互作用の差に起因すると考えられた。このようにして、結晶成長速度と添加物の化学的構造の関係が説明できた。以上のように、L-グルタミン、L-グルタミン酸およびL-アスパラギンの添加によりアスパラギン酸結晶のC軸方向の成長が抑制されることが明らかになったが、L-アスパラギン酸以外の結晶(硫酸カリウム、カリミョウバン結晶など)を対象とした添加物効果の実験も試み、理論的検討を行った。これらの添加物による成長の抑制効果が示され、形状の制御が可能性が示された。形状制御の実験的検証は、L-アスパラギン酸結晶ではなく、カリミョウバン結晶(添加物はビスマルクブラウンG)について試み、添加物による形状制御が可能であることが示された。現在、形状制御の実験は継続中であるが、今後も引き続き行って行く予定である。添加物によって特定の結晶面の成長速度が抑制され、その面が発達し結晶の形状が変わることがある。この現象を利用して、結晶の形状制御が試みられている。本研究では、アミノ酸の一種であるアスパラギン酸結晶を対象にした。添加物としては、L-グルタミン、L-グルタミン酸およびL-アスパラギンを選んだ。結晶成長速度としては、結晶のc軸方向先端の伸びる速度を測定した。3種類の添加物はいずれもアスパラギン酸の成長を著しく抑制した。結果は、Kubota and Mullinのモデルにより解析した。いずれの添加物もラングミュア型の吸着等温式に従って平衡吸着すると考えられた。また、抑制の度合いは不純物有効係数により評価した。L-グルタミンおよびL-グルタミン酸は、同程度の抑制効果を示したが、L-アスパラギンはそれらのほぼ2倍の効果を示した。この効果の違いを、添加物分子末端の官能基の大きさを考慮して、分子構造的な立場から理論的に説明した。すなわち、添加物分子は、I型とII型の2種類の配置で結晶に吸着される。添加物効果の高いL-グルタミンとL-グルタミン酸は、I型、II型いずれの配置で吸着されても添加物効果を示すが、効果の低いL-アスパラギン酸はI型配置の場合のみ効果を示すと解釈された。すなわち、同じ効果を得るためには2倍の吸着量が必要となる(効果が弱い)。

以上のように、成長抑制効果が定量的に説明できた。なお、添加物効果が過飽和度の増加に伴って減少する事実も、Kubota and Mullinモデルにより初めて説明できた。また、アスパラギン酸結晶に取り込まれた添加物を分析したところ、添加物は結晶に取り込まれる際に濃縮はされていないこと明らかになった。3種類の添加物、L-グルタミン、L-グルタミン酸およびL-アスパラギンはいずれもアスパラギン酸の成長を著しく抑制した。結果は、Kubota and Mu11inのモデルにより解析した。いずれの添加物もラングミュア型の吸着等温式に従って平衡吸着すると考えられた。また、抑制の度合いは不純物有効係数により評価した。L-グルタミンおよびL-グルタミン酸は、同程度の抑制効果を示したが、L-アスパラギンはそれらのほぼ2倍の効果を示した。この効果の違いを、添加物分子末端の官能基の大きさを考慮して、分子構造的な立場から理論的に説明した。すなわち、添加物分子は、I型とII型の2種類の配置で結晶に吸着される。添加物効果の高いL-グルタミンとL-グルタミン酸は、I型、II型いずれの配置で吸着されても添加物効果を示すが、効果の低いL-アスパラギン酸はI型配置の場合のみ効果を示すと解釈された。すなわち、同じ効果を得るためには2倍の吸着量が必要となる(効果が弱い)。L-アスパラギン酸以外の結晶(硫酸カリウム、カリミョウバン結晶など)を対象とした添加物効果の実験も試み、同様な理論的検討を行った。これらの添加物により形状の制御が可能であることは明らかになった。形状制御の実験的検証は、L-アスパラギン酸結晶ではなく、カリミョウバン結晶(添加物はビスマルクブラウンG)について試み、添加物による形状制御が可能であることが明らかになっている。現在、形状制御の実験は継続中であるが、今後引き続き行って行く予定である。
社会的交互作用事態における共栄状態への反応誘導性に関する実験心理学的研究

実験ゲーム研究における「因人のジレンマ」とよばれている心理学的事態は、いわゆる個人合理性と集団合理性に関する社会動機間の葛藤を示す典型的事態である。こ事態が何回も繰り返される場面では、この事態に参加するふたりのプレイヤーの選択は、しばしば最適解でない共貧状態に陥ってしまうことが多いが、この状態から共栄状態へ脱出するにはどうしたらよいかという問題がこの領域におけるひとつの主題になっている。本研究は、この主題を統制者が選択する反応系列によって相手側に協力反応を選択せざるを得ないようにする方略に関する視点と相手側に事態を規定している利得構造をいかに把握させるかという事態認知と情報統制とに関する視点に焦点をあてたものである。前者は「TITーFORーTAT」とよばれる方略,後者は申請者によって提起された「合成的分解型ゲーム」というパラダイムを基盤とする。本研究の目的は、これらのパラダイムが共栄状熊の実現に有効になり得るかということを実験的に検討することにある。本報告書は2部から成り、第1部はTIT-FOR-TAT方略に関する3系列の実験的研究,第2部は合成的分解型ゲームに関する2系列の実験的研究の成果を述べたものである。第1部における実験研究では、1)TIT-FOR-TAT方略には種々の型があり目的によって最適方略が異なること、2)利得和最大化のためには、可能ならば同時TIT-FOR-TAT方略が最適であること、3)利得差最大化にためには、当実験条件下では倍返しTIT-FOR-TATが最適であったこと、4)報復の遅延は効果を減ずること、などの結果が得られた。第2部における実験研究では、1)合成的分解型ゲームは理論的に標準的分解ゲームより効果があるにしても、そのままでは大きな効果を示さなかったこと、2)情報の統制効果は大で、相手に統制者の利得条件を示さない場合や相互の利得を示さない場合はとくに顕著であることなどの結果を得た。
細胞運動の秩序を担う細胞接着斑・細胞骨格・核の力学的協調作用の解析

本研究では、バイオメカニクス・メカノバイオロジー的観点から、血管などの組織内で生じている引張りや圧縮などの力に対し、細胞内の構成要素がどのような応答を見せるに注目している。特に、アクチン細胞骨格と非筋II型ミオシンを主体とする収縮性のアクチンストレスファイバと、細胞核のインタラクションの変化に着目し、細胞周囲の力学場の変化が細胞の運動・配列状態に与える影響を明らかにすることを目的とした。最終年度である平成26年度は,弾性膜上に培養した細胞に対し、血管壁などで生じている動的な繰返引張ひずみを負荷した際の変化を調査した。ひずみ波形の違い(台形波・三角波)によって、ストレスファイバや細胞核の配向が変化すること、さらに細胞間の接着の有無や、細胞の重層化によっても全く異なる配向特性を示す興味深い結果が得られてきている。すなわち、我々のこれまでの報告も含め、ストレスファイバは、基質の垂直ひずみが最小となる方向(引張も圧縮も生じない方向。弾性膜を引っ張った場合は、引張りに対して5070°傾いた方向)に優先的に再構築され、その方向に細胞も遊走し、細胞分裂も生じると考えられてきたが、1)細胞内のストレスファイバが圧縮される時間や、非筋II型ミオシンのリン酸化レベルに依存して、細胞配向が全く異なること、2)3次元的な細胞間接着の有無によって、引張や圧縮といった垂直ひずみだけでなく、せん断ひずみを避けるかのように細胞が形態・配向を変化させること、などが分かってきた。これらの知見は、本領域課題である細胞運動・組織形成の秩序原理の理解に繋がるだけでなく、力学場操作による組織形成技術といった応用展開へと繋がると言える。26年度が最終年度であるため、記入しない。研究初年度は,細胞接着斑,細胞骨格,核といった細胞内構成要素の空間配置を詳細に観察しながら,各要素間の力学的な相互作用や細胞内の張力分布を解析するための実験系を構築した.すなわち,現有するニポウ式リアルタイム共焦点スキャナに,本年度科研費にて新たに顕微鏡用のマルチ光源を設け,高速で多色蛍光観察ができるようにした.次に,細胞接着斑に生じる力の分布様態を把握するため,これまでに確立してきた弾性マイクロピラーによる接着斑での張力計測法を適用し,引張りや圧縮といった動的な力学環境下での細胞運動時の張力分布を詳細に解析できるようにした.これらの実験系を用いて,特に繰り返し引張ひずみやステップひずみを加えたときの細胞運動の変化を解析したところ,ひずみ負荷の回数によって,細胞の収縮運動と伸展・移動運動が切り替わっている可能性が得られた.また,微細加工技術で作成したマイクロ流路などを用いて,細胞の初期形態を制御したり,細胞の運動領域を制限する技術を確立し,そのような環境下での細胞接着斑・細胞骨格・核の空間分布や力学的相互作用を詳細に解析できる実験系を確立した.細胞形態が細長くなると,アクチン細胞骨格と細胞核との配向が均一化し,両者の力学的な結合が向上して細胞の運動性が低下する.逆に細胞が広がった状態では両者の配向の相関が低下し,かつ両者の力学的結合状態が緩み,細胞の運動性が高まるといった可能性が得られた.本研究では、バイオメカニクス・メカノバイオロジー的観点から、血管などの組織内で生じている引張りや圧縮などの力に対し、細胞内の構成要素がどのような応答を見せるに注目している。当初の計画通り,細胞接着斑,細胞骨格,核の3次元的な形態・配置の経時的な変化を詳細に把握するとともに,これらの力学的な相互作用を明らかにするための実験系が構築できた.さらに,単に静的な環境だけでなく,引張りや圧縮といった力学刺激を加えながら,細胞挙動とその張力分布をリアルタイムで観察できるように工夫が成された.

これらに加えて,微細加工技術で作成したマイクロ流路などを用いて,細胞の初期形態を制御したり,細胞の運動領域を制限する技術を確立した.そして,実際にそのような環境下での細胞内構造の変化を詳細解析することで,アクチン細胞骨格と細胞核との力学的相互作用の変化が細胞運動の秩序形成に大きく関与している可能性が得られた.以上の理由から,本研究が概ね順調に進展していると言える.前年度に確立した実験系を活用して,単一細胞レベルでの細胞内構成要素の力学的協調性が,どのようにして「細胞群」としての運動に影響を与え,細胞全体の協調性を生み出すのか見極める.特に基質の弾性率分布や基質表面の微細構造といった静的力学場や,引張りや圧縮,流体せん断といった動的力学場の変化が,細胞接着斑とアクチン細胞骨格との配向や細胞核との力学的結合状態にどのような影響を与えるのか,リアルタイム観察で明らかにしていく.そして,細胞内の個々の構造体の力学的な相互作用が,個々の細胞や細胞群・組織レベルの細胞運動にどのような影響を与えるのか明らかにしていく.
低階数擬似不偏推定法と悪条件逆問題への応用に関する研究

本研究では,悪条件の線形逆問題の新しい解法を目標とし,「低階数行列の中で最適な推定行列とは何か」を検討している.まず,本研究の準備として「最小分散不偏推定行列(BLUE : Best LinearUnbiased Estimator / Gauss-Markov estimator)」の考え方に倣い,「(一様)不偏推定行列」を最良近似する低階数行列「擬似不偏推定行列」を定義するとともに,全ての「擬似不偏推定行列」の中で「最小の分散値」を達成する「最小分散低階数擬似不偏推定行列」の一形式を導くことに成功している(ICASSP2006).次に`Trace Optimization'の分野で知られた定理を援用することにより,論文(ICASSP2006)の議論を再構築し,「最小分散低階数擬似不偏推定行列(MV-PURE : Minimum Variance Pseudo-Unbiased Reduced-Rank Estimator)」の見通し良い表現を導くことに成功している.また,「最小分散低階数擬似不偏推定行列」を線形制約条件の下で導くことにも成功している.さらに,「最小分散低階数擬似不偏推定行列」の考え方を確率ベクトルの推定に応用するアイディア(Stochastic MV-PURE :確率的最小分散低階数擬似不偏推定)と最適な階数設定法を提案し、実際にこれをMIMO通信システムの最適受信機に応用し、その有効性を確認している.その他にもこの問題の検討過程で明らかとなった多数の関連研究課題の解決に成功している.本研究では,悪条件の線形逆問題の新しい解法を目標とし,「低階数行列の中で最適な推定行列とは何か」を検討している.まず,本研究の準備として「最小分散不偏推定行列(BLUE : Best LinearUnbiased Estimator / Gauss-Markov estimator)」の考え方に倣い,「(一様)不偏推定行列」を最良近似する低階数行列「擬似不偏推定行列」を定義するとともに,全ての「擬似不偏推定行列」の中で「最小の分散値」を達成する「最小分散低階数擬似不偏推定行列」の一形式を導くことに成功している(ICASSP2006).次に`Trace Optimization'の分野で知られた定理を援用することにより,論文(ICASSP2006)の議論を再構築し,「最小分散低階数擬似不偏推定行列(MV-PURE : Minimum Variance Pseudo-Unbiased Reduced-Rank Estimator)」の見通し良い表現を導くことに成功している.また,「最小分散低階数擬似不偏推定行列」を線形制約条件の下で導くことにも成功している.さらに,「最小分散低階数擬似不偏推定行列」の考え方を確率ベクトルの推定に応用するアイディア(Stochastic MV-PURE :確率的最小分散低階数擬似不偏推定)と最適な階数設定法を提案し、実際にこれをMIMO通信システムの最適受信機に応用し、その有効性を確認している.その他にもこの問題の検討過程で明らかとなった多数の関連研究課題の解決に成功している.本研究では,[低階数行列の中で最適な推定行列とは何か」を検討している.まず,「最小分散不偏推定行列(BLUE: Best Linear Unbiased Estimator/Gauss-Markov estimator)」の考え方に倣い,「(一様)不偏推定行列」を最良近似する低階数行列「擬似不偏推定行列」を定義している.更に全ての「擬似不偏推定行列」の中で「最小の分散値」を達成する「最小分散低階数擬似不偏推定行列」をはじめて導いている(ICASSP2006).次にTrace Optimization'の分野で知られた定理を用いることにより,論文(ICASSP2006)の議論を再構成し,「最小分散低階数擬似不偏推定行列」のより簡潔な表現を導くことに成功している.また,「最小分散低階数擬似不偏推定行列」を線形制約条件の下で導くことに成功している.さらに,MIMO通信システムの最適受信機に「最小分散低階数擬似不偏推定行列」を応用するアイディアを提案し、検討を進めている.論文1では「不偏推定行列」の低階数最良近似行列の中で「最小の分散値」を達成する「最小分散低階数擬似不偏推定行列」を導くことに成功している.また,これを用いることにより悪条件の線形逆問題に対する優れた推定法が実現されることを明らかにしている.さらに,論文2ではMIMO通信システムの最適受信機に「最小分散低階数擬似不偏推定行列」を応用することにより,モデル誤差にロバストな受信機が実現できることを明らかにしている.その他、多くの関連研究の成果が得られている.
細胞を組み込んだ人工骨膜による顎骨の再生

インプラントや義歯の良好な維持には十分な厚みと高さを有する顎骨の存在が不可欠である.吸収された顎骨を再生させる方法として成長因子の投与,細胞の移植等が試みられているがいずれも形成される骨量はわずかしかでない.本研究では細胞と成長因子そして担体を組み合わせた人工骨膜を開発して,高齢者でも十分な量の顎骨を再生させることを目指し基礎研究を行った.まず顎骨再生のための人工骨膜が備えるべき条件を検討した.人工骨膜に組み込む細胞として骨髄から採取した骨髄幹細胞を用いた.骨髄細胞には骨芽細胞へ分化する能力がありデキサメサゾンといったホルモンにより分化が誘導されるがこのままでは臨床応用は難しい.近年コラーゲンに骨髄細胞を骨芽細胞へ分化させる能力のあることが明らかになったのでまずコラーゲンにより骨髄細胞が骨芽細胞へ分化することを検証した.骨芽細胞で特異的に発現しているオステオカルシン(OCN)や骨シアロ糖蛋白質(BSP)をマーカーとして調べたところ,コラーゲンゲル内に組み込まれた骨髄細胞OCNやBSP遺伝子を強く発現していることが認められた.以上からコラーゲンと骨髄細胞の組み合わせが高い骨形成能を有する人工骨膜作製にとって重要な要素であることが明らかになった.さらに人工骨膜に組み込む成長因子として骨芽細胞の機能に強い影響を与えるbFGFに着目した.高濃度のbFGFを複合させると細胞増殖は著明だが形質発現は抑制される傾向にあった.一方低濃度のbFGFは細胞のBSP遺伝子発現を促進した.しかしbFGFの細胞に対する効果は骨芽細胞の分化段階により変化することも明らかになったので今後は成長因子の最適な投与法を検討する予定である.インプラントや義歯の良好な維持には十分な厚みと高さを有する顎骨の存在が不可欠である.吸収された顎骨を再生させる方法として成長因子の投与,細胞の移植等が試みられているがいずれも形成される骨量はわずかしかでない.本研究では細胞と成長因子そして担体を組み合わせた人工骨膜を開発して,高齢者でも十分な量の顎骨を再生させることを目指し基礎研究を行った.まず顎骨再生のための人工骨膜が備えるべき条件を検討した.人工骨膜に組み込む細胞として骨髄から採取した骨髄幹細胞を用いた.骨髄細胞には骨芽細胞へ分化する能力がありデキサメサゾンといったホルモンにより分化が誘導されるがこのままでは臨床応用は難しい.近年コラーゲンに骨髄細胞を骨芽細胞へ分化させる能力のあることが明らかになったのでまずコラーゲンにより骨髄細胞が骨芽細胞へ分化することを検証した.骨芽細胞で特異的に発現しているオステオカルシン(OCN)や骨シアロ糖蛋白質(BSP)をマーカーとして調べたところ,コラーゲンゲル内に組み込まれた骨髄細胞OCNやBSP遺伝子を強く発現していることが認められた.以上からコラーゲンと骨髄細胞の組み合わせが高い骨形成能を有する人工骨膜作製にとって重要な要素であることが明らかになった.さらに人工骨膜に組み込む成長因子として骨芽細胞の機能に強い影響を与えるbFGFに着目した.高濃度のbFGFを複合させると細胞増殖は著明だが形質発現は抑制される傾向にあった.一方低濃度のbFGFは細胞のBSP遺伝子発現を促進した.しかしbFGFの細胞に対する効果は骨芽細胞の分化段階により変化することも明らかになったので今後は成長因子の最適な投与法を検討する予定である.本年度は顎骨再生のための人口骨膜が備えるべき条件を検討した.顎骨再生には人口骨膜に高い骨形成能を付与することが重要である.申請者は骨芽細胞として骨髄から採取した骨髄幹細胞を用いた.骨髄幹細胞はコラーゲンマトリックスとともに培養すると骨芽細胞へ分化するので,まず骨髄幹細胞を中性化コラーゲン溶液と混和しコラーゲン繊維膜上に添加した.そして37°Cで2時間放置してコラーゲンをゲル化させ細胞をコラーゲン膜上に固定し人口骨膜とした.このように細胞を組み込んだ人口骨膜の骨誘導能を骨芽細胞のマーカーであるOsteocalcin(OCN)やBone Sialoprotein(BSP)遺伝子量を測定することにより評価した.人口骨膜を4週間培養すると培養開始後3週目からOCN,BSP遺伝子発現が認められはじめ4週目では顕著なOCN,BSP遺伝子発現がみられた.このことは人口骨膜が高い骨形成能を有するようになったことを示すもので,申請者が目的としている人口骨膜による顎骨再生に一歩近づいたと考えている.また人口骨膜にさらに高い骨形成能を持たせるために成長因子を混合して骨形成能を調べた.成長因子の中でもbFGFが骨芽細胞の機能に強い影響を与えることが知られているので,まずbFGFから検討した.高濃度のbFGFでは細胞増殖が著明だが,形質発現は抑制される傾向にあった.一方低濃度のbFGFでは細胞増殖に与える影響は限られたものだが細胞のOCN,BSP遺伝子発現は促進された.そこで来年度はbFGFを初めとする成長因子を人口骨膜に混合し,人口骨膜による骨形成がどのような影響を受けるかを詳細に検討する予定である.インプラントや義歯の良好な維持には十分な厚みと高さを有する顎骨の存在が不可欠である.吸収された顎骨を再生させる方法として成長因子の投与,細胞の移植等が試みられているがいずれも形成される骨量はわずかしかでない.本研究では細胞と成長因子そして担体を組み合わせた人工骨膜を開発して,高齢者でも十分な量の顎骨を再生させることを目指し基礎研究を行った.まず顎骨再生のための人工骨膜が備えるべき条件を検討した.人工骨膜に組み込む細胞として骨髄から採取した骨髄幹細胞を用いた.

骨髄細胞には骨芽細胞へ分化する能力がありデキサメサゾンといったホルモンにより分化が誘導されるがこのままでは臨床応用は難しい.近年コラーゲンに骨髄細胞を骨芽細胞へ分化させる能力のあることが明らかになったのでまずコラーゲンにより骨髄細胞が骨芽細胞へ分化することを検証した.骨芽細胞で特異的に発現しているオステオカルシン(OCN)や骨シアロ糖蛋白質(BSP)をマーカーとして調べたところ,コラーゲンゲル内に組み込まれた骨髄細胞はOCNやBSP遺伝子を強く発現していることが認められた.以上からコラーゲンと骨髄細胞の組み合わせが高い骨形成能を有する人工骨膜作製にとって重要な要素であることが明らかになった.さらに人工骨膜に組み込む成長因子として骨芽細胞の機能に強い影響を与えるbFGFに着目した.高濃度のbFGFを複合させると細胞増殖は著明だが形質発現は抑制される傾向にあった.一方低濃度のbFGFは細胞のBSP遺伝子発現を促進した.しかしbFGFの細胞に対する効果は骨芽細胞の分化段階により変化することも明らかになったので,今後は成長因子の最適な投与法を検討する予定である.