hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
スピン偏極を取り入れた非束縛核分光法の開発

原子核物理において有用な実験手法である陽子共鳴弾性散乱の手法は近年の低エネルギーRIビーム(不安定核2次ビーム)の発達により不安定核にまで適用されるようになった。我々は、従来のRIビーム実験での陽子標的を偏極陽子標的に置き換えた「逆運動学偏極陽子共鳴散乱法」の実現を目指している。新手法の最初の適用対象として炭素9の陽子共鳴散乱が考えられる。本研究では、将来のスピン偏極陽子共鳴散乱実験に向けて、反跳陽子検出器と低エネルギー炭素9二次ビームの開発を行った。また、炭素9の非偏極陽子共鳴散乱のテスト測定を行った。本研究では、不安定核陽子共鳴弾性散乱の厚い標的測定法に偏極陽子標的を取り入れた新しい「逆運動学偏極陽子共鳴弾性散乱法」を開発し、不安定核構造研究のための非束縛核分光法の高度化を目指している。本手法を適用する最初の実験として、偏極陽子標的を用いた9C+p (10N)共鳴散乱の測定を想定している。本年度は予備実験として、9C+p共鳴散乱の測定を非偏極陽子標的(ポリエチレン標的)を用いて行った。実験は理化学研究所のRIPSビームラインで行い12Cの入射核破砕反応により9C二次ビームを生成した。9Cビームエネルギーはエネルギー減衰板により核子あたり4.2 MeV/uにまで落とした。エネルギー減衰させる際に、多重散乱効果により、ビームの一部がビームライン中で失われてしまうという問題がある。エネルギー減衰板の材質を従来のAlから原子番号が小さい原子(CおよびH)を含むポリエチレンにかえることにより、ビーム減少率を約半分に軽減することに成功した。ビームラインの最終焦点でのビーム強度は10k個/s程度であり、将来の本実験にも使用できそうである。本テスト実験で得られた非偏極9C+p共鳴散乱のデータ自身も過去に測定例が少ないため、重要性が高く、10N共鳴状態に関する情報を引き出すべく現在解析を行っている。次に九州大学で最近更新したタンデム加速器を本研究のテスト実験(反跳粒子検出器系および標的結晶のテスト)に使用するため、ガスの導入が可能なタンデム加速器用負イオン源を設置した。このイオン源とタンデム加速器によりpおよびdビームを加速することに成功した。今後、Heビームの加速テストも行い、各種ビームを用いたテスト実験に使用する。理化学研究所における9Cビームの生成および9C+p共鳴散乱のテスト測定は予定通り実施された。一方、九州大学においては、タンデム加速器のビーム開発がほぼ終わったところであり、予定していた検出器系・標的テスト実験はこれからである。本研究では、不安定核陽子共鳴弾性散乱の熱い標的法に偏極陽子標的を取り入れた新しい「逆運動学偏極陽子共鳴弾性散乱法」を開発し、不安定核構造研究のための非束縛核分光法の高度化を目指している。今年度は、昨年度理化学研究所にて行った9C+p共鳴散乱の非偏極陽子標的を用いたテスト測定の解析を進め、共鳴散乱の励起関数の予備的結果を得ることができた。得られた励起関数には10N共鳴によると思われる構造が見えていることが分かった。今後、R行列を用いた計算によるフィッティングを行い、共鳴パラメーターの決定を行う予定である。平行して、九州大学のタンデム加速器を用いて、共鳴散乱実験に関係する、以下に示す3つのサポート実験を行った。1)昨年度の9C+p共鳴散乱テスト実験で実際に使用したポリエチレンおよび炭素標的に、エネルギーの定まった陽子線を照射し、エネルギー損失の実測データを取得した。これにより、共鳴散乱の解析に役立てた。2)共鳴散乱実験用dE-E型シリコン半導体検出器テレスコープにエネルギーの定まった陽子、重陽子線を照射し、エネルギー分解能、粒子識別能力を評価し、将来の本実験で要求される性能を十分満たすことが確認できた。3)シリコン半導体検出器より安価な反跳陽子検出器の候補としてCsI(Tl)シンチレーターのテストを行い、シンチレーション光検出器MPPCの信号波形分析により、陽子の粒子識別が少なくとも5 MeV以上で可能なことがわかった。タンデム加速器を用いた実験では、反跳陽子検出器の開発・テストを行うことができたが、マシンのトラブルもあり実施に時間がかかった。そのため、他に予定している安定核のビームを用いた逆運動学共鳴散乱のテスト実験、反跳陽子偏極度計に関するテスト実験、偏極陽子標的用結晶のビームによる評価等がまだ実現していない。本研究では偏極陽子標的を用いた不安定核の非束縛核分光法の開発を行っている。本年度は安定核のビームと非偏極標的を用いて、逆運動学陽子共鳴散乱のための測定系の開発と、SiPM(シリコン光電子増倍器)とCsI(Tl)結晶による反跳陽子用シンチレーション検出器の開発を行った。九州大学タンデム加速器において核子あたり2.33 MeVの炭素12ビームを陽子標的(ポリエチレン)に照射し、逆運動学陽子共鳴散乱により、窒素13の既知の共鳴励起状態を観測し、実験・解析手法の検証をおこなった。共鳴エネルギーの解析結果と既知の値の比較から、今回のような低エネルギー領域ではビーム粒子の標的中のエネルギー損失の評価をSRIMのような計算コードだけにたよる場合、その誤差が系統誤差の主要因になることがわかった。将来の不安定核ビームによる実験の際には、エネルギー損失の実測により計算コードの補正をすることが望ましい。

次に、逆運動学共鳴散乱における反跳陽子の検出において通常用いられるシリコン半導体検出器の代替として、CsI(Tl)結晶にSiPMを取り付けた検出器のプロトタイプを製作し性能評価を行った。CsI(Tl)シンチレーターは比較的安価に製作でき、信号波形分析により検出器単体で粒子識別が可能であるという利点がある。さらに、近年になって利用可能になったSiPMは従来のフォトダイオードに比べ、出力信号が大きく電気的ノイズによる分解能の悪化がほとんど問題にならないという利点がある。今回、タンデム加速器による312 MeVの陽子および重陽子の弱いビームを検出器に照射し、性能評価を行った。その結果、本研究が想定する、幅が広い共鳴を観測する実験には、十分なエネルギー分解能と粒子識別能力が得られることが確認できた。原子核物理において有用な実験手法である陽子共鳴弾性散乱の手法は近年の低エネルギーRIビーム(不安定核2次ビーム)の発達により不安定核にまで適用されるようになった。我々は、従来のRIビーム実験での陽子標的を偏極陽子標的に置き換えた「逆運動学偏極陽子共鳴散乱法」の実現を目指している。新手法の最初の適用対象として炭素9の陽子共鳴散乱が考えられる。本研究では、将来のスピン偏極陽子共鳴散乱実験に向けて、反跳陽子検出器と低エネルギー炭素9二次ビームの開発を行った。また、炭素9の非偏極陽子共鳴散乱のテスト測定を行った。すでに実施した9C+p共鳴散乱のテスト測定のデータ解析を進めつつ、タンデム加速器を用いたテスト実験を行う。9C+p共鳴散乱テスト実験の解析結果のまとめを行いつつ、タンデム加速器のビーム(4He, 6Li, 7Li, 12C等)を用いて、逆運動学の陽子共鳴散乱のテストを行う。昨年度実施したCsI(Tl)シンチレーターのテスト実験で明かになった信号波形分析による粒子識別能力について、追加データを取得すると将来の本実験用検出器の開発に有用であるので、この追加実験にもやや重点を置くことも検討中である。未実施の反跳陽子偏極度計に関するテスト実験や偏極陽子標的用結晶のビームによる評価は、まず具体的な実験計画を立てる。その上で、全体の優先順位を考えながら、可能な部分について実現をめざす。原子核物理(実験)本年度はタンデム加速器を使用したテスト実験を実施する予定であったが、ビーム開発の段階で年度が終わってしまい、実験用部品等の購入を保留したため。タンデム加速器を使用した実験の進捗が遅れており、実験用物品等の購入を保留したため。次年度に、タンデム加速器を使用したテスト実験を実施するため、実験用部品等の購入に充当する。タンデム加速器を使用した実験のための物品購入および研究打ち合わせや成果発表のための旅費に充当する。
筋組織ミトコンドリアDNAの欠失・変異を利用した年齢推定

筋組織の中で心筋及び胸筋について,そのミトコンドリア(mt)DNAにみられる,特定領域4,977bpの欠失と年齢との関係を検索した.材料は当教室の法医剖検例のうち,死因に心臓突然死を含まない症例で,生後1ヶ月から91歳で各年齢層に広く分布している47例の心筋及び胸筋組織50100mgを材料とした.DNAは定法に従いプロテイナーゼK/フェノール・クロロホルム法で抽出した.初めにmtDNAの欠失の有無を検索した.PCR法によってATPase8とND5間の4,977bpの欠失の存在について,242bpの増幅産物が得られるように欠失領域を挟むPrimer pairを設定した.一方,欠失領域を含まない272bpをターゲットとしたPrimer pairでPositive controlの増幅とした.Positive controlの増幅が認められることを確認し,引き続き欠失領域の増幅の有無によって欠失の有無を判定した.この際,アガロースゲル電気泳動/エチジウム・ブロマイド染色で増幅バンドが観察されたものを「欠失が存在する」と判定した.欠失存在の最低年齢は心筋では29歳,胸筋では16歳であった.欠失非存在の最高年齢は心筋,胸筋共に47歳であった.年齢との関係では,心筋,胸筋何れも欠失存在群が欠失非存在群に比して,年齢が有意に高かった.次にmtDNAの欠失量を定量した.47例中ランダムに15例を選択し,Competitive PCR法で定量した.年齢との相関については,欠失量は年齢に依らず幅広く分布していたが,例数が少ないために結論を導くためにはさらに追加の実験が必要とされた.以上の結果より,mtDNAの欠失の存在や欠失量に対応する年齢層は広い分布を示しており,法医実務で応用するにはさらに検討を加える必要があった.筋組織の中で特に心筋について,そのミトコンドリア(mt)DNAにみられる,特定領域4,977bpの欠失と年齢との関係を検索した.材料は当教室の法医剖検例のうち,死因に心臓突然死を含まない症例で,生後2ヶ月から91歳で各年齢層に広く分布している46例の心筋組織50100mgを材料とした.DNAは定法に従いプロティナ-ザK/フェノール・クロロホルム法で抽出した.まず,心筋mtDNAの欠失の有無を検索した.PCR法によってATPase8とND5間の4,977bpの欠失の存在について,242bpの増幅産物が得られるように欠失領域を挟むプライマー・ペア(L828及びH1349)を設定した.一方,欠失領域を含まない272bpをターゲットとしたプライマー・ペア(L62及びH85)でPositive controlの増幅とした.Positive controlの増幅が認められることを確認し,引き続き欠失領域の増幅の有無によって欠失の有無を判定した.この際,アガロースゲル電気泳動/エチジウム・ブロマイド染色で増幅バンドが観察されたものを「欠失が存在する」と判定した.さらに心筋mtDNAの欠失量の検索を行った.前記の欠失検索用あるいはPositive control用の増幅産物に対して,塩基配列の同じプライマー・ペアで増幅され,約20%サイズの大きいDNA competitorを作製しCompetitive PCRを行った.これまでで,年齢と心筋mtDNA欠失の存在については,欠失存在群が欠失非存在群に比して,年齢が有意に高いことが認められた.一方,年齢と心筋mtDNAの欠失量については,欠失量が極めて少ないものの中にCompetitive PCRで増幅産物が検出できなくなるなど定量する上でいくつかの問題点があり,検量線は作製できていない.筋組織の中で心筋及び胸筋について,そのミトコンドリア(mt)DNAにみられる,特定領域4,977bpの欠失と年齢との関係を検索した.材料は当教室の法医剖検例のうち,死因に心臓突然死を含まない症例で,生後1ヶ月から91歳で各年齢層に広く分布している47例の心筋及び胸筋組織50100mgを材料とした.DNAは定法に従いプロテイナーゼK/フェノール・クロロホルム法で抽出した.初めにmtDNAの欠失の有無を検索した.PCR法によってATPase8とND5間の4,977bpの欠失の存在について,242bpの増幅産物が得られるように欠失領域を挟むPrimer pairを設定した.一方,欠失領域を含まない272bpをターゲットとしたPrimer pairでPositive controlの増幅とした.Positive controlの増幅が認められることを確認し,引き続き欠失領域の増幅の有無によって欠失の有無を判定した.この際,アガロースゲル電気泳動/エチジウム・ブロマイド染色で増幅バンドが観察されたものを「欠失が存在する」と判定した.欠失存在の最低年齢は心筋では29歳,胸筋では16歳であった.欠失非存在の最高年齢は心筋,胸筋共に47歳であった.年齢との関係では,心筋,胸筋何れも欠失存在群が欠失非存在群に比して,年齢が有意に高かった.

次にmtDNAの欠失量を定量した.47例中ランダムに15例を選択し,Competitive PCR法で定量した.年齢との相関については,欠失量は年齢に依らず幅広く分布していたが,例数が少ないために結論を導くためにはさらに追加の実験が必要とされた.以上の結果より,mtDNAの欠失の存在や欠失量に対応する年齢層は広い分布を示しており,法医実務で応用するにはさらに検討を加える必要があった.
脂質メディエーターのヒアルロン酸合成促進作用の機序解明と細胞老化についての検討

我々は、環状ホスファチジン酸(cPA)が皮膚繊維芽細胞や滑膜細胞に対しヒアルロン酸産生を促進する作用を持つことを見出していた。本研究課題では、皮膚線維芽細胞を用いて、cPAがLPA受容体を活性化し、ヒアルロン酸合成酵素2の発現を上昇させ、ヒアルロン酸合成量を上昇させていることを明らかにした。また、様々な年齢ドナー由来の細胞を使用し、ヒアルロン酸合成調節に関与している遺伝子の発現を網羅的な解析を行った。その結果、老化した細胞においてもヒアルロン酸合成酵素の発現は減少していないことが明らかになった。環状ホスファチジン酸(cPA)が皮膚繊維芽細胞や軟骨細胞に対しヒアルロン酸産生を促進する作用を持つことを発見した。本研究課題ではその作用機序を明らかにするために、cPAの受容体(GPCR)活性化により誘導されるヒアルロン酸合成に関与する細胞内情報伝達経路の全貌を明らかにすることを目指した。その結果、cPAに構造が似ているLPAにもヒアルロン酸合成促進作用があることが示された。また、cPA、LPA刺激によって合成されるヒアルロン酸の分子量は1 ×10^6 Daよりも大きく、cPA、LPAがヒアルロン酸合成酵素HAS2 (Hyaluronan synthase2)の発現を上昇させることが示された。次にcPAやLPAのヒアルロン酸合成促進の作用機序について検討を行った。NB1RGBにはLPA1が強く発現していたことから、LPA1の阻害剤(Ki16425)を用いてヒアルロン酸合成への影響について調べた。その結果、Ki16425でcPA、LPAのヒアルロン酸の合成が有意に抑制され、このことからLPA1の関与が示唆された。さらに下流のシグナル伝達系についても各種阻害剤を用いて解析を行った。その結果、cPA、LPAはLPA1-Gi/o、PI3K、ERK、CREBを活性化することで、HAS2 mRNAの発現を上昇させていることが示唆された。次に、皮膚線維芽細胞が合成するヒアルロン酸の長さは老化に伴い変化するのか否かを検討するために、本年度は、ヒアルロン酸の長さを測定する実験系をの立ち上げを行った。SEC-MALS(サイズ排除クロマトグラフィー-多角度光散乱検出器)を用いて、ヒアルロン酸の長さを測定を試みた。現在、ヒアルロン酸の標準物質から検量線を作成することに成功し、細胞上清に含まれるヒアルロン酸の長さを測定するための条件の検討を進めている。また、皮膚線維芽細胞はコンフルエント状態にまで培養すると、特定の渦状の形を形成する。その渦の形状は培養皿の基質により大きく影響を受けることが示された。渦状の形状は細胞の動きが影響すると推察されており、現在老化に伴い渦状の形状にどのような影響があるのか、についても解析を行っている。本研究課題の最終目的は加齢がヒアルロン酸合成調節に与える変化の解明をあげている。最も難しいと考えられる実験は実際に細胞が合成するヒアルロン酸の長さを測定することであり、平成28年度は各年代のドナーから採取された皮膚線維芽細胞が合成するヒアルロン酸の長さを測定することが主になると考えられる。その実験系については今年度に目途がついているため。我々は環状ホスファチジン酸が皮膚線維芽細胞や軟骨細胞に対し、ヒアルロン酸産生を促進する作用を持つことを発見した。本研究課題では、その作用機序を明らかにすることと、老化によりどのようにヒアルロン酸合成調節が変化しているのかを解析することを目的とした。1年目の研究成果として、環状ホスファチジン酸がLPA受容体を介してヒアルロン酸合成酵素の発現を増加させていることを報告している。そこで、本年度は、様々な年齢のドナーから採取された皮膚線維芽細胞の培養細胞を用いて、老化により皮膚線維芽細胞でヒアルロン酸合成がどのように変化しているのかを調べた。その結果、皮膚のヒアルロン酸量は老化に伴い減少することが知られていたが、培養皮膚線維芽細胞においては、ヒアルロン酸合成酵素の発現量やヒアルロン酸産生量は老化に伴い増加していることが示された。これは、繊維芽細胞が持つヒアルロン酸合成能は老化により失われないことを示す。また、ヒアルロン酸分解酵素の発現についても調べた結果、分解酵素の発現量は老化に伴い変化しないことが示された。これらの結果から、老化に伴い皮膚で減少するヒアルロン酸の量は、皮膚線維芽細胞自体の変化ではなく、周囲の環境の変化に伴って引き起こされると考えられた。次に、環状ホスファチジン酸は、皮膚線維芽細胞のヒアルロン酸合成を促進することがわかっているが、その作用は老化した細胞においても効果があるかどうかについて上記の実験で用いた皮膚線維芽細胞を用いて検証を行った。その結果、環状ホスファチジン酸は老化した皮膚線維芽細胞に対してもヒアルロン酸合成酵素の発現を促進させ、ヒアルロン酸量を増加させることがわかった。一時的に研究の中断があったため。環状ホスファチジン酸は皮膚線維芽細胞や滑膜細胞に対し、ヒアルロン酸産生を促進する作用を持つことを発見した。その結果、下記のことを明らかにした。1皮膚線維

芽細胞において、環状ホスファチジン酸はリゾホスファチジン酸(LPA)受容体を介してヒアルロン酸合成酵素の発現を増加させる。2様々な年齢のドナーから採取された皮膚線維芽細胞の培養細胞を用いて、老化により皮膚線維芽細胞でヒアルロン酸合成がどのように変化しているのかを調べた。その結果、皮膚のヒアルロン酸量は老化に伴い減少することが知られていたが、培養皮膚線維芽細胞においては、ヒアルロン酸合成酵素の発現量やヒアルロン酸産生量は老化に伴い増加していることが示された。これは線維芽細胞が持つヒアルロン酸合成能は老化に伴い失われていないことを示す。皮膚組織において、老化に伴うヒアルロン酸量の現象については、ヒアルロン酸分子の長さや分解されやすさなどが影響していると考えられ、ヒアルロン酸分子の長さの測定は今後の検討課題である。3環状ホスファチジン酸の様々な年齢のドナー由来の皮膚線維芽細胞に対してもヒアルロン酸合成を促進するのかを調べた。その結果、老化した細胞においても環状ホスファチジン酸はヒアルロン酸合成酵素の発現を促進させ、ヒアルロン酸量を増加させることがわかった。我々は、環状ホスファチジン酸(cPA)が皮膚繊維芽細胞や滑膜細胞に対しヒアルロン酸産生を促進する作用を持つことを見出していた。本研究課題では、皮膚線維芽細胞を用いて、cPAがLPA受容体を活性化し、ヒアルロン酸合成酵素2の発現を上昇させ、ヒアルロン酸合成量を上昇させていることを明らかにした。また、様々な年齢ドナー由来の細胞を使用し、ヒアルロン酸合成調節に関与している遺伝子の発現を網羅的な解析を行った。その結果、老化した細胞においてもヒアルロン酸合成酵素の発現は減少していないことが明らかになった。本研究課題の目的のひとつに環状ホスファチジン酸(cPA)が皮膚繊維芽細胞や軟骨細胞に対しヒアルロン酸産生を促進する作用機序の解明をあげていた。1年目に、cPAの受容体(GPCR)活性化により誘導されるヒアルロン酸合成に関与する細胞内情報伝達経路の全貌を明らかにし、その成果を論文、学会で発表した。したがって、おおむね順調に実験が進行している。本研究課題の最終的な目的は、27年間の加齢に伴う細胞の老化をエピジェネティックに記憶している同一の成人男性から採取された4種類の細胞株を使用して、老化によりどのようにヒアルロン酸合成調節が変化しているのか解析することである。現在、それらの細胞を培養し、ヒアルロン酸合成量の変化について測定を行っており、計画に変更はない。研究計画書に準じて、遅れた分の実験を遂行する。脂質生化学、細胞生物学本研究課題の最終的な目的は、27年間の加齢に伴う細胞の老化をエピジェネティックに記憶している同一の成人男性から採取された4種類の細胞株(採取時の年齢: 36, 47, 56, 62歳)を使用して、老化によりどのようにヒアルロン酸合成調節が変化しているのか解析することである。現在それらの細胞を培養し、ヒアルロン酸合成量の変化について測定を行っており、計画に変更はない。研究を一時中断したため。研究計画書に準じて研究を進める。
微生物を活用する複合糖質の特異的生合成と分解並びに応用に関する研究

1.パン酵母の乾燥菌体を用いて、糖ヌクレオチドの生産条件及びエネルギー共役の特性を解析した。2.糸状菌のガラクトースオキシダーゼを用いてUDP-N-アセチルガラクトサミン(UDP-GalNAc)を酸化し、生成物UDP-N-アセチルガラクトサミンジアルドースを単離同定した。本物質はトリチウム標識のUDP-GalNAcに容易に変換されるので、有用な試薬である。さらにUDP-Gal-NAcの特異的酵素定量法を開発する一方、合成の鍵酵素の1つであるUDP-N-アセチルグルコサミン(UDP-GIcNAc)4-エピメラーゼをB.subtilisから単一タンパク質に精製して基本的性質を明らかにした。3.Penicillium oxalicumの培養濾液からβ-N-アセチルヘキソサミニダーゼを単一タンパク質として精製した。本酵素は高いβ-N-アセチルガラクトサミニダーゼ活性を示す点、新しい複合糖質試薬として注目される。4.活性汚泥の塩酸分解物を培地として特異的に生育するFusarium oxysporumの培養濾液(一次生育培養液)からα-L-フコシダーゼを単一に精製するとともに、触媒特性を明らかにした。さらに本酵素の簡便調製法(菌体二次誘導法)を開発した。すなわちグルコース生育菌体をL-フコース含有誘導培地に懸濁し、24時間酵素合成を行なう。得られる誘導培養濾液から僅か3段階で単一タンパクに精製できる方法である。5.Mucorfragilisは、未利用バイオマス牛血粉存在下で培養すると2種のβ-N-アセチルヘキソサミニダーゼE【I】,E【II】を産生し、N-アセチルガラクトサミン添加培地では低分子性E【II】酵素を特異的に生成した。このE【II】を単一に精製して諸性質を明らかにした。6.本研究で調製されたグリコシダーゼを用いて、複合糖質糖鎖の分解機構を研究した。前述のヘキソサミニダーゼはアセチルキトビ(トリ)オース及びFetuinのグリコペプチドを分解した。フコシダーゼは豚ムチンからフコースを遊離した。
分布北限域の絞め殺しイチジク集団は送粉共生を維持しているか

アコウはコバチとの送粉共生を維持するため、年間のどの時期にもいずれかの個体が結実する周年結実を実現する必要がある。しかし分布北限域の四国南部では、遺伝的多様性の低下や冬期の低温のために周年結実ができていない可能性がある。そこで足摺・室戸のアコウ個体群について、結実行動を観察し遺伝的多様性を比較した。足摺・室戸ともに周年結実は維持されていたが、結実個体の少ない秋冬期に規則的に結実する個体は認められなかった。周年結実がより安定していると示された足摺のほうが遺伝的多様性は高かった。北限域においても周年結実は維持されているが、その安定性は遺伝的多様性に支えられている可能性が示された。室戸・足摺の両地域において、それぞれおよそ80個体のアコウを対象にした結実・展葉スケジュールのモニタリングを継続した。これまでに3週間ごとの観察を2年弱にわたって継続し、それぞれ32回の観察をおこなうことができた。平均20.6±3.0日間隔で観察をおこなったことになる。いまのところ両地域ともにいずれの時期においても結実個体が認められ、果嚢数が0になることはなかった。また正常な発芽能力をもった種子がいずれかの季節には生産されており、それぞれの地域内でコバチとの送粉共生は維持されていると考えられた。しかしながら、室戸地域では冬期に結実する個体が足摺地域に比べて少なく、コバチの個体群を維持する上では制限要因になり得ることが示唆された。室戸・足摺地域を含め国内のアコウ生育地から広くサンプルを収集した17集団について、各集団の遺伝的特徴を16座のマイクロサテライトを使って解析した。足摺集団では遺伝的多様性が九州地域の集団と同程度であったが、室戸集団ではそれよりも低かった。主座標分析の結果、室戸および足摺集団は九州・琉球地域の多くの集団と同様の特徴をもっていると示唆され、室戸・足摺集団は物理的な位置関係と同じく遺伝的にも九州・琉球地域の辺縁部に位置すると考えられた。さらにSTRUCTURE解析の結果から、足摺集団の遺伝構造は九州・琉球地域から連続的に変化したものといえるが、足摺と室戸の集団間では遺伝的組成が異なることが示唆された。以上のことから室戸集団は足摺集団とは移住や定着の歴史的・時間的背景が異なり、遺伝的に偏った個体によって創始された集団であること、あるいは他集団との遺伝子流動が少ないために遺伝的浮動(genetic drift)により他集団とは遺伝的に若干異なる特徴をもつ集団であることが推察された。室戸・足摺の両地域とも天然記念物や国立公園の規制がかかっているため、年度当初には関係諸機関から調査許可を得るのに時間がかかってしまったが、6月以降、予定どおりに両地域での調査を開始することができた。両地域に生育するそれぞれ80個体強について、3週間ごとに結実と展葉の状況を観察した。その結果、物理的・遺伝的に個体群がより隔離されていると予想される室戸岬では冬期に結実する個体が足摺岬に比べて少ないとともに、室戸岬では夏期において成熟途中の果嚢が落ちてしまうことが頻繁に観察された。未成熟果嚢の落果はコバチによる花粉の媒介および受粉がおこなわれなかったためによるアボーションであると考えられた。これまでにアコウの個体数が十分にある屋久島でおこなった事例では、冬期に大量に結実しコバチを養うことのできるアコウ個体の存在が、アコウとコバチの送粉共生を支えるために重要であると示唆されている。室戸岬で観察された現象により、冬期にコバチの個体数が大きく減少し、その後の送粉が十分におこなわれていないと予想される。観察対象個体からは葉サンプルを採取しDNAを抽出した。現在、マイクロサテライトマーカーを使って遺伝子型の解析をすすめている。また、観察対象個体が成熟果嚢をつけている場合には数個を採取し、果嚢あたりの種子と虫こぶを数え、取り出した種子を使って発芽試験をおこなった。残念ながらいまだ報告に足るだけのサンプル数は得られていない。今後、室戸・足摺での観察の継続、四国・九州内のアコウ個体群の遺伝構造の解析、種子生産数・発芽率といった繁殖効率の評価をおこなうことによって、分布の辺縁地域において植物集団の遺伝的多様性が低下し送粉共生が維持されない場合があることを、遺伝的な解析と生態現象の観察から実証したいと考えている。アコウの分布北限域にあたる室戸岬および足摺岬において、およそ80個体ずつの結実フェノロジー観察を2年半にわたり実施した。それぞれの地域で49回のセンサスをおこなうことができた。

室戸・足摺ともに4-5月に結実する個体が多く、9-10月に少ないという変動がみられたものの結実個体が0になることはなく、両地域ともに周年結実は維持されていた。しかし結実個体割合の変動係数は室戸60.5に対して足摺44.1となり、室戸の方が変動が大きく個体ごとの結実時期がより集中しているといえる。ただし、年間を通じて採取した成熟果嚢で発芽試験をおこなったところ、両地域ともに平均80%前後の高い発芽率を示し、年間を通じ発芽可能な種子を生産していた。17座の核マイクロサテライトマーカーで室戸・足摺集団の遺伝的多様性を評価したところ、いずれの指標でも室戸の方が低くヘテロ接合度(期待値)は海洋隔離された南大東島と同等の低さであった。集団の遺伝構造を評価するSTRUCTURE解析の結果、足摺では九州地域と遺伝的組成が類似していたが、室戸では地理的距離の近い足摺とは遺伝的組成が異なっていた。これらのことから、室戸では個体群が定着してからの時間が足摺に比べて短く、遺伝的に偏った集団であると推察された。STRUCTURE解析によって評価された個体ごとの遺伝的組成と観察によって記録された個体ごとの結実パターンには対応関係がみられなかった。室戸・足摺ともアコウの周年結実、すなわちコバチとの送粉共生は維持されていたが、遺伝的多様性の低い室戸の方が周年結実の安定性は低いことが示唆された。森林生態学全体として研究計画書のとおりにすすんでいると認識している。当初の予定よりも頻度を多くして結実を観察できており、より細かな解析が可能となっている一方、DNAの抽出作業はやや滞っているものの、全体の進捗を遅らせているわけではない。室戸岬では未成熟果嚢の落果(アボーション)が非常に多いという、当初には予想していなかったこともあったが、研究そのものは順調にすすんでいると考えている。室戸・足摺ともにさまざまな規制がかかっているために関係諸機関から調査許可を得るのにやや時間を要したが、それも次年度以降は問題にならない。全体として順調と判断できる。結実のモニタリングを2年間続けたところ、室戸では冬期に大量結実する個体、すなわち花粉媒介者であるコバチを十分に越冬させることができていないことが示唆された。また足摺でも越冬結実タイプの個体が年ごとに違っており、環境要因などの影響で冬期結実ができない場合があると考えられた。そのため、冬期に結実することのできる個体の数が個体群として送粉共生系の安定にとっては重要と推察される。今後は現在の研究計画を継続するとともに、分布を北方へと広げる上で重要な耐冷性と個体の遺伝型との関係についても探っていきたい。おおむね予定どおりの研究進展であるので、次年度以降も当初の計画どおりにすすめていきたい。室戸・足摺での観察の継続、四国・九州内の各アコウ個体群のサンプリングおよび遺伝型決定、および発芽率など繁殖効率の評価をつづけていく。ただし、当初は想定していなかったアボーションが頻繁に起こることがわかってきたので、コバチの個体数の年間変動、コバチの飛翔距離の評価についてデータを得られるように準備をすすめておきたい。DNA抽出・分析作業について予定のサンプル数をこなすことができなかったため、経費を繰り越した。単純に年度の切れ目をまたいでしまったため、手続き上、繰り越しとした。昨年度におこなう予定であったものを今年度に順次おこなっていくことによって、十分に予定のサンプル数を分析することができる。該当なし
近代日本の伝統音楽における演奏の場についての実証的研究：箏曲演奏会を中心に

本研究は、近代における日本の伝統音楽の、演奏会を始めとする「演奏の場」の変遷を実証的に明らかにすることを目的とした。1921年から44年まで発行された邦楽雑誌『三曲』の演奏会情報を主要な史料として研究を行い、東京の三曲演奏者のネットワーク、戦争期の大日本三曲協会の活動、外地の演奏会の特色、を検討した。最終的に、演奏会を目的別に分類して考察し、1920年代から44年までの演奏会を4期に分け、邦楽演奏会の変遷を明らかにした。また、研究成果の一環として「『三曲』演奏会データベース」を作成し、公開した。本研究は、近代における日本の伝統音楽の、演奏会を始めとする「演奏の場」の変遷を実証的に明らかにし、それにもとづいて、伝統音楽が、文化的・社会的に大きく変動した時代においてどのように伝承を継続し、活動を展開させたのかという経緯について考察することを目的とする。実証的な邦楽演奏会研究の端緒として、本研究では、箏曲を中心として基礎データを収集し、近代的家元制度の確立、「演奏の場」の西洋化、太平洋戦争のための芸術活動の規制、現代の「演奏の場」への道筋、の4点について考察を行う。2年目となる今年度は、初年度に引き続き、演奏会データの入力作業を継続した。そのデータに基づき、東京における家元の演奏活動および、「外地」における日本人の演奏活動を考察し、都道府県別のデータ分析を行った。演奏会データに関しては、大正後期から昭和前期にかけての箏曲に関する重要文献である邦楽雑誌『三曲』(1921年創刊-1944年終刊)の全号を主要な資料とし、掲載されている演奏会プログラムおよび予告と報告記事から、演奏会名・開催日時・場所の基本情報を抽出し、統計ソフトで管理した。多量のデータ入力に予想外の時間がかかったが、入力項目を絞ることで『三曲』全号25年間の演奏会データ全件、すなわち約1万件の基本情報の入力が完了した。データに基づく考察を通して、次の各点が明らかになった。(1)『三曲』は東京で刊行された雑誌であるが、データは沖縄を除く全国、そのほか朝鮮・満州などの「外地」、米国の演奏会が含まれていた。(2)東京の演奏会を家元の活動を通して考察した結果、演奏会の大規模化の過程が導かれた。(3)朝鮮・満州などの演奏会データ約700件を分析した結果、戦前の「外地」における日本人の音楽活動は「内地」を指向したものであった。(4)戦前の邦楽の「演奏の場」について、東京の演奏会を中心に分類を試みた。本研究は、近代における日本の伝統音楽の、演奏会を始めとする「演奏の場」の変遷を実証的に明らかにし、それにもとづいて、伝統音楽が文化的・社会的に大きく変動した時代における、伝承の継続と活動の展開の経緯について考察することを目的とする。実証的な邦楽演奏会研究の端緒として、箏曲を中心として演奏会情報の基礎データを収集し、近代的家元制度の確立、「演奏の場」の西洋化、太平洋戦争のための芸術活動の規制、現代の「演奏の場」への道筋、の4点について考察を行う。3年目となる今年度は、演奏会データ24年分約1万件の整備を行い、データを基に十五年戦争期(1931-1945)の邦楽演奏会について考察を深めた。データに関しては、箏曲に関する重要文献である邦楽雑誌『三曲』(1921年創刊-1944年終刊)の全号に掲載されている、演奏会プログラムおよび予告と報告記事から、演奏会名・開催日時・会場等の基本情報の入力作業を2年かけて行った。今年度は、そのデータの確認作業と並行して、出演者と流派、演奏会の趣旨、入場料、曲数、演奏者数等の各種情報の入力、会場名の整理、『三曲』本文の演奏会関連記事の抽出を進めた。データに基づく考察は、十五年戦争期に着目して行った。本データは、戦争期の情報が比較的豊富である。考察の結果、次の各点が明らかになった。(1)この時期の演奏会の種類として、慰問と献金の演奏会が特色であった。これには、1920年代の慈善・慰安演奏会との連続性が認められた。(2)慰問・献金演奏会は、戦況の激化の中で貴重な演奏の場であり、情勢に応じて実施数が変化し、地域による特色もみとめられた。(3)『三曲』の記事から、三曲家に影響した戦争に伴う芸能統制の全容をつかむことができた。(4)統制は演奏会や楽器にとどまらず、奉仕活動や貯蓄動員等の統制が年を追うごとに増加し、音楽活動を圧迫していった。

本研究は、近代における日本の伝統音楽の、演奏会を始めとする「演奏の場」の変遷を実証的に明らかにし、それにもとづいて、伝統音楽が、文化的・社会的に大きく変動した時代においてどのように伝承を継続し、活動を展開させたのかという経緯について考察することを目的とする。実証的な邦楽演奏会研究の端緒として、本研究では、箏曲を中心として演奏会情報の基礎データを収集し、近代的家元制度の確立、「演奏の場」の西洋化、太平洋戦争のための芸術活動の規制、現代の「演奏の場」への道筋、の4点について考察を行う。初年度は、前半に統計ソフトの設定やデータ入力手順について検討し、後半に入力作業と考察を行い、近代的家元制度の確立について家元と会員の演奏活動を中心に考察した。データに関しては、大正後期から昭和前期にかけての箏曲に関する重要文献である邦楽雑誌『三曲』(1921年創刊-1944年終刊)のうち前半の10年分を主要な資料とし、掲載されている演奏会プログラムおよび演奏会予告と演奏会報告からすべての演奏会情報を抽出した。演奏会情報は、重複を省き、演奏会名・開催日時・場所の基本情報のほか、音楽ジャンル・流派・料金・演奏者数なども含めて統計ソフトで管理し、現在までに、1921年から1931年の演奏会データ約5,000件の入力がほぼ完了した。データに基づく考察により、初年度は次の点が明らかになった。(1)1920年代末から件数が大幅に増加した。(2)東京で刊行された雑誌であるが、東京に次いで大阪の件数が多く、そのほか北海道から九州、満州・朝鮮、米国の演奏会も掲載されていた。(3)1923年の関東大震災の影響で一時休刊しており、その前後で演奏会に変化がみられた。(4)特定の会派に注目して考察したところ、戦前の「演奏の場」の変遷が読み取れると同時に、家元の多様な演奏活動が会派の維持と発展に貢献していた。本研究は、近代における日本の伝統音楽の、演奏会を始めとする「演奏の場」の変遷を実証的に明らかにし、それにもとづいて伝統音楽が、文化的・社会的に大きく変動した時代においてどのように伝承を継続し、活動を展開させたのかという経緯について考察することを目的とした。実証的な邦楽演奏会研究の端緒として、本研究では、箏曲を中心に演奏会記録を収集し、近代的家元制度の確立、「演奏の場」の西洋化、太平洋戦争のための芸術活動の規制、現代の「演奏の場」への道筋、の4点について考察を行った。本研究は、1921年から44年まで発行された、邦楽雑誌『三曲』掲載の演奏会情報を主な資料とした。主だった三曲(箏曲・地歌・尺八)の師匠が購読・寄稿し、演奏活動の情報を寄せており、購読者が全国に渡っていた。本研究では、『三曲』掲載の演奏会情報をすべて抽出して「『三曲』演奏会データベース」を作成した。演奏会が行われた地域は沖縄を除く全国、および満州、朝鮮等の旧外地が含まれており、総数は1万件にのぼった。データに基づき、前年度までに、東京での演奏家のネットワーク、旧外地での演奏状況、戦時中の演奏の場など、要点をしぼって考察を行った。最終年度には、抽出した情報を演奏会の目的別に分類し、その変遷をたどった。考察の結果、研究対象とした1920年代から40年代にかけての三曲演奏会の動向は、4期に分類された。その一方で、この年代全体としては、明治期に萌芽がみられた近代的な演奏の場が定着し、演奏団体組織の充実と新音楽の台頭による多様な演奏会の広がり、社会情勢に応じた新たな演奏の場という特色をもつ、公開演奏会が発展した時期と結論づけられた。この成果に関して、学会での口頭発表および学会誌への論文投稿を行い、ホームページを開設してデータベースを公開した。音楽学研究は計画に沿って進めているが、一部に遅れが生じている。詳細について、1.データ入力と2.考察に分けて記述する。
非平衡系を操る精密超分子重合

本研究は、超分子ポリマーの精密重合法を確立しすることを目的とする。高分子化学で実証されているように、ポリマーの分子量(長さ)は、ポリマーの物性や機能を決定づける根本的な構造因子である。2年間の研究によって、(1)2次元的に成長する超分子ポリマーの面積を制御することに成功した、(2)光照射で制御可能な精密超分子重合を確立した。こうして精密合成された超分子ポリマーの物性や機能に関して研究を進めることによって、超分子ポリマーの新たな側面を照らし出すことができるだろう。平成27年度はアゾベンゼン誘導体の合成とその超分子ポリマー化について検討した。6種類のアゾベンゼン誘導体を合成し、そのうち2つが1次元の超分子ポリマーを形成することを明らかにした。また、シス体へと光異性化すると超分子ポリマーを与えないこともわかった。超分子ポリマーの成長に関して、Meijerらによって提案されているCooperativeモデルに加え、van't Hoffプロットから熱力学パラメータを決定した。また、光異性化については、Arrheniusプロットから活性化エネルギーを求めた。これらの値をもとに、光異性化と超分子ポリマー化がカップルされたエネルギーランドスケープを描くことができた。超分子ポリマーに対して超音波照射することによって超分子ポリマーを分断することができ、これを種(開始剤)として用いて、リビング超分子重合を試みた。種とアゾベンゼンのシス体を混合し、ここに可視光を照射することによって、シス=>トランス異性化を行ったところ、トランス体となったアゾベンゼンは、種に会合し、その結果として超分子ポリマーが成長した。すなわち、超分子ポリマーの光連鎖重合に成功した。また、以前から研究しているポルフィリン誘導体についても新しい展開があった。超分子集合体が示す時間発展現象とエネルギーランドスケープの相関を明らかにするために、さらに多くのポルフィリン誘導体を合成し、その自己集合プロセスを精査した。具体的にはポルフィリン分子に修飾したアルキル鎖の長さを、ブチル基からヘプチル基まで変え、その超分子集合体形成をスペクトルおよび顕微鏡観察によって評価した。今後は、これらの分子の自己集合プロセスに関するメカニズムの解明に取り組む。本研究の目的は、我々が以前に報告したリビング超分子重合メカニズムのエッセンスを抽出し、超分子ポリマーのリビング重合系をさらに2例以上提示することによって、精密超分子重合の分野を大きく前進させることである。平成27年度に、アゾベンゼンを用いることによってもリビング超分子重合が可能であることを示すことができた。本手法は我々の従来のコンセプトの一般性を示すだけでなく、時空間的なリビング超分子重合を可能とする新しい方法論となると期待される。平成28年度は、アゾベンゼン誘導体を用いた光制御リビング超分子重合に成功した(J. Am. Chem. Soc. 2016, 138, 14347)。アゾベンゼンの光異性化と、超分子ポリマー化を組み合わせることで、速度論的に超分子ポリマーの成長を制御できることを実証した。この時、超分子ポリマーの成長速度は、光異性化に用いる可視光の波長や強度によって調節できる。したがって、本手法は、リビング超分子重合の新しい手法として興味深いだけでなく、超分子ポリマー化を時空間的にコントロールする手法としても展開できると期待される。また、以前から研究を進めているポルフィリン誘導体については、平成27年度に発見した『分化現象』のメカニズムを解明した。非常に興味深いことに、1次元および2次元の自己集合は異なるメカニズムで進行するため、それぞれ独立に制御する事が可能であった。2014年に報告したリビング超分子重合の手法を用いる事によって、本系に対しても1次元および2次元の両方でリビング超分子重合を達成した(Nature Chem. 2017, in press)。ポルフィリン誘導体の側鎖を変えることによって、自己集合における核形成の速度定数を調節できる事を明らかとした。これは核形成過程のエントロピーに影響を受けていた。核形成速度がことなる誘導体は、異なるサイズの集合体を与えた。リビング超分子重合とは異なる方法で超分子集合体のサイズを制御できる手法として興味深い(Polymer, in press)。研究実績の概要に述べた『1次元および2次元のリビング超分子重合』は、当初全く予期していなかった成果であり、世界的にも我々のグループのみがなし得た実績である。この点から、本研究が当初の計画以上に進展していると判断した。ポルフィリン誘導体の超分子ポリマーについて、2種類以上のモノマー分子が共存した場合にどのような超分子ポリマーが得られるかを調べた。本研究によって、ブロック超分子ポリマーの合成が非常に難しいことが明らかとなったが、一方で、わずかに分子構造の異なるモノマー分子が共存するだけで、超分子ポリマーのモルフォロジーが大きく影響を受けることが明らかとなった。ブロック超分子ポリマーの合成のために、水素結合部位を増やしたポルフィリン誘導体を設計・合成した。このモノマー分子は強固な水素結合によって超分子ポリマーを形成した。上記の通り、われわれのグループではブロック超分子ポリマーの合成に成功していなかったが、水素結合部位を増やしたポルフィリン誘導体の場合には、亜鉛錯体と銅錯体のポルフィリン分子からなるブロック超分子ポリマーを合成できることがわかった。これは、亜鉛ポルフィリンと銅ポルフィリンの接合部位が強固な水素結合によって安定化されるためと考察される。現在、得られたブロック超分子ポリマーの物性と機能について研究を展開している。これまでの研究から、ポルフィリン誘導体の側鎖の構造のわずかな違いが超分子ポリマーの安定性に影響することがわかっている。

今年度に新たにフルオロアルキル鎖を有するポルフィリン誘導体を合成し、その自己集合挙動を調べた。非常に興味深いことに、このポルフィリン分子の超分子ポリマーは、らせん状の成長することがわかっている。この成長メカニズムを種々の測定によって明らかにして行く予定である。本研究は、超分子ポリマーの精密重合法を確立しすることを目的とする。高分子化学で実証されているように、ポリマーの分子量(長さ)は、ポリマーの物性や機能を決定づける根本的な構造因子である。2年間の研究によって、(1)2次元的に成長する超分子ポリマーの面積を制御することに成功した、(2)光照射で制御可能な精密超分子重合を確立した。こうして精密合成された超分子ポリマーの物性や機能に関して研究を進めることによって、超分子ポリマーの新たな側面を照らし出すことができるだろう。我々のリビング超分子重合の初報では、ポルフィリン分子を用いた。このポルフィリン分子がリビング超分子重合できるメカニズムは既に明らかになっている。しかしながら、分子構造とメカニズムの相関は明らかになっていない。重合メカニズムのエッセンスを抽出するためには、この相関を明らかにする必要がある。そこで、今後は、ポルフィリン誘導体を複数さらに合成し、そのリビング超分子重合を試みる。また、平成27年度に着手したアゾベンゼン分子の光リビング超分子重合については、さらに研究を展開し、その一般性を示す。本研究を遂行する中で得られた予想外の成果である2次元のリビング超分子重合は、非常に興味深い。2次元には、(1次元にはない)形という特徴がある。今後は、この形を制御できる2次元リビング超分子重合を目指す。また、28年度の研究でアゾベンゼンの光異性化を超分子重合とカップルさせたように、ポルフィリンの亜鉛金属への配位結合を超分子重合とカップルさせたシステムを構築する。これによって、リビング超分子重合を実現するためのアプローチの汎用性を実証する。29年度が最終年度であるため、記入しない。高分子化学29年度が最終年度であるため、記入しない。
糖尿病網膜症に対する網膜イメージングと網膜電図による病態解析

糖尿病網膜症患者において画像解析や電気生理学的手法を用いた機能解析を行い、糖尿病網膜症増悪に関する予後因子の同定を目指す。予後不良因子が判明すれば糖尿病網膜症患者の適切なフォローアップにつながり、これまでであれば失明していた患者の視機能を救い、また我が国の増加の一途をたどる医療費の削減の一助にもなると考えられる。具体的には網膜光干渉計や補償光学眼底カメラなどによる構造解析や網膜電図を用いた機能解析を行う。
直接醗酵のためのキシラナ-ゼ改変

M13mp18ーxynAまたはM13mp19ーxynAを化学変異剤処理し、逆転写酵素処理、生限酵素切断後、pKP1500に変異xymA領域を連結し、大腸菌KP3998のアンピシリン耐性形質転換体として回収した。60,000個についてβーキシロシダ-ゼ活性を持つかどうかを調べたが候補はなかった。大部分がキシロビオ-スであるオリゴ95を単一炭素源としてβーキシロシダ-ゼ活性を持つxynAを選択する方法を見いだした。候補を検索したい。xynAとxynBが隣接するpUC19ーxynAxynBを構築し、PvuIIとIIpalの間を除いた。この欠失によりキシラナ-ゼの195番目のアミノ酸残基(酵素のC末端5残基が欠失する)とβーキシロシダ-ゼのN末端の間にアスパラギンを含む連結酵素がLacプロモ-タ-の制御下におかれることが期待されたがβーキシロシダ-ゼ活性のみしか示さなかった。耐熱性キシラナ-ゼを生産するかどうかを調べたところ、4株の候補(N56,N102,N104,F1)を得た。酵素をカラムクロマトグラフィ-によって精製した。SDSーポリアクリルアミドゲル電気泳動のあと純度検定したところ、N56,N102,N104,F1,野生株でそれぞれ99%、99%、99%以上、97%、99%以上であった。55°C20分間の熱処理による残存活性を調べたところ、野性型酵素が1%以下であるのに対し、N104で100%、N56で35%、N102で10%、F1で5%であった。変異部位を調べるために塩基配列を調べた。パラギン酸に、126番めのスレオニンがセリンに変化していると考えられた。N102株では38番目のグリシンがアスパラギン酸に、N104では38番目のグリシンがセリンに、48番目のアルギニンがリジンに、F1株では12番めのセリンがシステインに変化していると考えられた。キシラナ-ゼの立体構造および熱耐性の度合いから、分子表面のβーシ-ト上にある38番目のグリシンの位置が熱安定性に重要であることが強く示唆される。候補を検索したい。
ヒト成熟NK細胞を長期間維持できるヒト化マウスを用いた生体内細胞傷害検証系の開発

本研究課題は、ヒトNK細胞を長期間維持できるNOG-human IL-15トランスジェニック(NOG-hIL-15 Tg)マウスの特性を生かし、ヒトNK細胞を介した分子標的抗体の抗体依存性細胞傷害(ADCC)活性をマウス生体内で測定し得るin vivo ADCCモデルを作出することである。NOG-hIL-15 TgマウスにヒトNK細胞・ヒトがん細胞・がん抗原に対する分子標的抗体を用い、in vivo ADCCモデルを作製に成功し、結果をまとめてScientific Reports誌にて公表した。一方で、NOG-hIL-15 Tgマウスの検証中に、NOGマウスに残存する貪食細胞(単球/マクロファージなど)は抗体依存性細胞貪食(ADCP)活性を保持しており、in vivo ADCCモデルのヒトNK細胞を介したADCC反応の検出感度の低下に関与している可能性が示唆された。従って、マウスADCP活性を欠失させるために、マウス抗体受容体を欠損させたNOG-IL-15 Tgマウスを新たに樹立し、マウス免疫系の特性解析を行った。その結果、新旧系統で、ヒトIL-15の産生量に差異は認められなかった。また、ヒトがん細胞と分子標的抗体を用いた結果、抗体受容体の欠損によってマウス貪食細胞のADCP活性を欠失させることが確認された。さらに、ヒトNK細胞・ヒトがん細胞・分子標的抗体を用いてin vivo ADCCモデルの作出を試みた結果、新規系統でマウスADCP活性は消失し、ヒトNK細胞を介したADCC反応の検出感度が向上したことが確認できた。これらの結果をまとめ、日本免疫学会および米国がん学会(AACR)にて発表を行った。申請者らは、ヒトNK細胞の分化・増幅に必須であるヒトインターロイキン-15(IL-15)遺伝子を導入した免疫不全NOG-IL-15トランスジェニック(Tg)マウスを樹立した。NOG-IL-15 Tgマウスはヒト末梢血由来成熟NK細胞を長期間維持することが可能であることが見出われたことから、この特徴を生かし、抗体医薬の抗体依存性細胞傷害活性(ADCC)を生体内で評価できる動物モデルの開発を進めている。本研究の目的は、ヒトNK細胞の活性化等に必要なヒト遺伝子を加えた複合型遺伝子改変マウスの作製・特性解析や、動物モデルに使用する材料や手法の検証を行い、動物モデルの改良を行う事である。平成28年度では、既存のNOG-IL-15 TgマウスとNOG-IL-2 Tgマウスを自然交配することでNOG-IL-2/IL-15 double Tgマウスを作製し、ヒト末梢血由来成熟NK細胞の生着能およびヒト腫瘍細胞に対する細胞傷害活性が、NOG-IL-15 Tgマウスに比べて亢進するかを評価した。移植NK細胞の中に混入した微量のヒトT細胞は、IL-2存在下では爆発的に増幅するため、実験結果に著しく影響を及ぼす。ヒトT細胞増幅防止のための条件検討を行った後、NOG-IL-15 TgマウスとNOG-IL-2/IL-15 doubleTgマウスとの比較実験を行った。この結果、本実験系においては、ヒトIL-2はヒトNK細胞の活性化レベルに大きく影響しなかった。また、ヒトNK細胞活性化因子の一つであるIL-12およびIL-18の有用性を検討するため、初期検討として、ヒトNK細胞を移植したNOG-IL-15 Tgマウスに投与することでヒトNK細胞への影響を検証したが、有意義な結果は得られなかった。1) NOG-IL-2/IL-15 double Tgマウスを作製し、ヒト末梢血由来成熟NK細胞の生着能およびヒト腫瘍細胞に対する細胞傷害活性がNOG-IL-15 Tgマウスに比べて亢進するかを評価した。医療用抗体を転用することで、移植NK細胞中に混入している微量ヒトT細胞の除去方法を確立した。このヒトT細胞増幅防止措置を加えた手法で、NOG-IL-15 TgマウスとNOG-IL-2/IL-15 doubleTgマウスとの比較検証を行った。ヒトNK細胞を移植後、ヒト腫瘍細胞株K562を移植して検証した結果、本実験系においては、ヒトIL-2はヒトNK細胞の細胞数は微増するが、活性化には殆ど影響しなかった。2)ヒトNK細胞活性化因子であるヒトIL-12およびIL-18の有用性を検討した。初期検討として、ヒトNK細胞を移植したNOG-IL-15 Tgマウスに、IL-12/IL-18タンパク質を投与することでヒトNK細胞への影響を検証したが、有効性は認められなかった。また、ヒト腫瘍株を併用し、抗腫瘍活性を測定したが、変化は認められなかった。3)これまでのNOG-IL-15 Tgマウスの結果をまとめ、論文を投稿した(Scientific reports)。一方で、NOG-hIL-15 Tgマウスの検証中に、NOGマウスに残存する貪食細胞(単球/マクロファージなど)は

抗体依存性細胞貪食(ADCP)活性を保持しており、in vivo ADCCモデルのヒトNK細胞を介したADCC反応の検出感度の低下に関与している可能性が示唆された。従って、マウスADCP活性を欠失させるために、マウス抗体受容体を欠損させたNOG-IL-15 Tgマウスを新たに樹立し、マウス免疫系の特性解析を行った。その結果、新旧系統で、ヒトIL-15の産生量に差異は認められなかった。また、ヒトがん細胞と分子標的抗体を用いた結果、抗体受容体の欠損によってマウス貪食細胞のADCP活性を欠失させることが確認された。さらに、ヒトNK細胞・ヒトがん細胞・分子標的抗体を用いてin vivo ADCCモデルの作出を試みた結果、新規系統でマウスADCP活性は消失し、ヒトNK細胞を介したADCC反応の検出感度が向上したことが確認できた。これらの結果をまとめ、日本免疫学会および米国がん学会(AACR)にて発表を行った。1)NOGマウスに、ヒトNK細胞やADCCモデル作製に有効と考えられるヒトサイトカイン遺伝子をさらに追加導入した複合型遺伝子改変NOGマウスの開発を進める。2)in vitroで増幅した培養ヒトNK細胞を移植細胞として用い、さらにヒト腫瘍および医療用抗体を併用することで、ADCCモデルへの有用性を検証する。3)ヒトIL-12/IL-18の投与方法を変更して、再度検証実験を行い、IL-12/IL-18の有効性が認められるか検証する。抗体(抗体医薬・検査用抗体など)や移植用細胞など、高額製品の購入金額の増加が見込まれ、資金の使用を一部見合わせたため。次年度の物品費と併せて、高額試薬類を購入する。