hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
腎系球体上皮細胞足突起間のスリット膜の構造、機能の解析

糸球体係蹄壁の透過性を制御する腎糸球体上皮細胞足突起間のスリット膜の構造、機能の解析を目的として、研究を進めてきた。スリット膜の構成蛋白として報告されているのは、私たちのグループが報告したp51とZO-1の2種のみである。免疫電顕を用いた検討で、p51は細胞外にZO-1はその基部に存在することを報告している.本研究では、p51と結合能を持つ抗体により誘導される蛋白尿出現時のp51とZO-1の動態を検討した結果、蛋白尿がピークとなる抗体静注5日目では、p51のみならずZO-1もスリット膜から消失していることを証明した。これらの蛋白が消失しているにも関わらず通常の電子顕微鏡を用いた検討では、足突起の融合などの形態学的変化を見い出すことはできず、スリット膜構造の分子レベルでの微小な変化が係蹄壁のバリアー機能の破綻を招いたと考えられた。p51,ZO-1の局在変化のメカニズムを解析するため、単離糸球体を用いたin vitroの系を確立し、この両分子の動態を指標として各種阻害剤に対する感受性試験を行った。検討の結果、抗体がその対応抗原であるp51と結合すると、Ca^<++>依存性のcalmodulin-cytoskeletonの系を介したtubuline非依存性、actin依存性の機序によりp51,ZO-1がスリット膜から遊離し、その結果引き起こされる機能低下により病的蛋白尿がもたらされたと考えられた。これらの観察結果は、98年度第31回米国腎臓学会総会において報告した((J Am Soc Nephrol 9,499,1998 abstract)。また後腎原基培養の系vitroにおいてもp51が発現することを確認した.現在この系でのスリット膜構造形成機序の解析、p51合成期の後腎器官培養材料から作製したcDNA libraryを用いたp51のクローニングをボストン大学と共同で行っている。免疫電顕を用いた検討で、p51は細胞外にZO-1はその基部に存在することを報告している。本研究では、p51と結合能を持つ抗体により誘導される蛋白尿出現時のp51とZO-1の動態を検討した結果、蛋白尿がピークとなる抗体静注5日目では、p51のみならずZO-1もスリット膜から消失していることを証明した。

また後腎原基培養の系vitroにおいてもp51が発現することを確認した。現在この系でのスリット膜構造形成機序の解析、p51合成期の後腎器官培養材料から作製したcDNA libraryを用いたp51のクローニングをボストン大学と共同で行っている。
動的システム再構成に基づくディペンダブルな並列ボランティア計算基盤

インターネットに接続されるパソコンなどの計算資源(ノード)を用いるボランティアコンピューティング(VC)において,ノード間で通信を伴う並列計算を実行可能にするディペンダブルな並列VCの実現方式に関する研究を行った.その実現には,新たな課題となる「計算ジョブを投入するノード群の選択」と「通信相手ノードの離脱への対応」を解決しなければならない.本研究では,VCで不可欠な冗長計算に着目し,これを応用して動的にシステム(計算ノード群)を再構成する方式により,両課題の同時解決を図った.本方式を用いた並列VCのプロトタイプを開発し,ディペンダブルな並列VCが実行可能であることを実証した.ディペンダブルな並列ボランティアコンピューティング(VC)の実現に向けて,ノード(クライアント)の離脱に対処するノード群選択手法を考案し,プロトタイプシステムの開発およびアプリケーションプログラムの並列化を行った.1.ディペンダビリティ要求を満たすノード群の選択手法の開発:各ノードの信頼度と離脱率を考慮しながらジョブの完了確率を推定するアプローチにより,要求を満たすノード群を選択可能にする手法を考案した.本手法を用いることで,ノードの離脱が発生した場合でもジョブの再実行を抑制でき,VC全体の完了時間を約60%削減可能なことを明らかにした.2.並列VCシステムのプロトタイプの開発:VCの実行に必要なVCサーバとクライアントプログラムの開発を行った.VCサーバは,内部の処理の待ち時間を削減するために,各処理をマルチスレッドで並行化する構成とした.本サーバを用いることで,VCの基本的な処理が実行できることを確認した.また,クライアントプログラムには,離脱の発生に対処するために,ノード群の間で冗長な通信グループを形成し,動的に再構成を行う機能を導入した.これにより,ノード間の通信環境を維持できることを確認した.これは,ノードの離脱が発生する不安定な環境において,通信を伴う並列処理を実行可能にするものである.3.アプリケーションプログラムの並列化:VCの実アプリケーションとして三次元形状復元処理を対象に,並列化手法を提案した.本手法は,計算処理におけるデータアクセスパターンの偏りに着目して,データ分割を行う.クラスタ計算機を用いた性能評価により,単純な並列化手法と比較して,通信時間と使用メモリ量を大幅に削減可能なことを明らかにした.今年度の目標は,ノード群の選択手法の開発とアプリケーションプログラムの並列化であり,これらは上記で報告した通り,概ね順調に展開しているものと考える.ただし,後者においては,VCで実行させるための並列ジョブの生成方法を検討する必要があり,次年度で引き続いて行う予定である.ディペンダブルな並列ボランティアコンピューティング(VC)の実現に向けて,ノード(クライアントPC)群の動的再構成手法の性能評価,WebベースのVCシステムの開発,アプリケーションプログラムの実行支援環境の開発を行った.1.ノード群の動的再構成手法の性能評価:ノードの離脱に対処するための動的再構成手法を標準的なソケットライブラリを用いてプログラム実装し,性能評価を行った.本手法は,ノードが離脱した際に,ノード群を再構成することにより,他のノードが通信を代行するためのものである.ノード群の再構成が正しく動作することを確認し,ノード群の数と再構成に要する時間の関係を明らかにした.また,ノード群の選択については,過去の参加・離脱の履歴をもとに予測される離脱率を用いて選択することにより,ノード群の可用性が向上可能なことを明らかにした.2.WebベースのVCシステムの開発:Webで用いられているHTTPプロトコルで通信を行うVCサーバとクライアント環境の開発を行った.VCサーバは,現在広く用いられているWEBサーバソフトウェアであるApacheに,VCで必要になる機能をモジュールとして組み込む方法で開発した.また,クライアント側では,Webブラウザ上でプログラムコードを実行できるPNaClを用いたWebアプリケーションとして開発した.3.アプリケーションプログラムの実行支援環境の開発:VCの実アプリケーションとして三次元形状復元処理を対象に,VC向きの並列化手法を検討した.並列計算環境を持たないノードにおいても処理の実行を可能にするために,ノード間の通信をサーバ経由の通信に代替するサーバ支援型の通信を実現するソフトウェアを開発した.今年度の目標は,動的再構成手法の実機上での動作確認と性能評価,および,実アプリケーションのVCへの実装方法の検討であり,これらは上記の1と3で報告した通り,概ね順調に展開しているものと考える.ただし,後者については,代替可能な通信関数が現状では限られているため,より多くの通信関数に対応させるように,拡張する必要がある.これらに加えて,信頼性と利便性を兼ね備えたVCシステムを実現するために,WebベースのVCシステムの開発を行った.ディペンダブルな並列ボランティアコンピューティング(VC)の実現に向けて,通信相手ノード(クライアントPC)の動的切り替えに基づく並列VC基盤の開発,Android端末向けのVCクライアントの開発,セキュリティ攻撃の検知モジュールの開発を行った.1.ノードの動的切り替えに基づく並列VC基盤の開発:前年度に開発した動的再構成手法をもとに,通信相手ノードが切り替わった場合でも,並列計算の継続性を保証するVC基盤を開発した.本手法では,通信データのログを保存しておくことにより,あるノードが他のノードの通信を代行する場合に,リクエストされた適切なデータを送信可能にしている.本機能を実装した通信ライブラリを用いて並列VCの評価実験を行い,ノードの切り替えが発生した場合でも,並列計算を正しく実行可能であることを確認した.2.VCクライアントの開発:年々台数が増加しているスマートフォンによるVCの参加を目的に,Android端末向けのVCクライアントを開発した.

本クライアントは,VCサーバとの通信や計算ジョブの実行,CPU使用率の制御などの機能を持つAndroidアプリケーションとして開発した.前年度に開発したWebベースのVCサーバを用いてVCの動作検証を行い,スマートフォン上でVCが動作可能であることを確認した.3.セキュリティ攻撃の検知モジュールの開発:インターネットなどのようなオープンな環境でディペンダビリティの向上を図るには,各ノードへのセキュリティ攻撃を考慮することも必要になる.このため,システムで標準的に使用される時刻同期サービスに着目し,被攻撃時に時刻同期の調整量にずれが生じることを利用した攻撃検知手法を開発した.また,本手法を用いた軽量な攻撃検知モジュールを開発し,各ノードにおいて高精度な攻撃検知が可能であることを実証した.インターネットに接続されるパソコンなどの計算資源(ノード)を用いるボランティアコンピューティング(VC)において,ノード間で通信を伴う並列計算を実行可能にするディペンダブルな並列VCの実現方式に関する研究を行った.その実現には,新たな課題となる「計算ジョブを投入するノード群の選択」と「通信相手ノードの離脱への対応」を解決しなければならない.本研究では,VCで不可欠な冗長計算に着目し,これを応用して動的にシステム(計算ノード群)を再構成する方式により,両課題の同時解決を図った.本方式を用いた並列VCのプロトタイプを開発し,ディペンダブルな並列VCが実行可能であることを実証した.提案しているノード群選択手法を並列VCのプロトタイプシステムに組み入れ,実性能の評価と改善を行う.本システムで実現する動的再構成機能について,ノード数に対する再構成時間や可用性など,詳細な性能評価を行う.さらに,本システムを組織内のネットワーク上に展開し,アプリケーションプログラムを用いたVCの実性能を明らかにする.提案しているサーバ支援型の実行支援環境の機能拡充を行い,より多様な並列計算プログラムの実行を可能にし,既存の通信ライブラリを用いた並列計算との性能比較を行う.また,この環境を用いて,実アプリケーションを用いたVCシステムの評価を行い,性能と改善点を明らかにする.並列分散システム次年度使用額が生じた理由は,主に,開発・評価用機器の変更による.次年度(平成28年度)では,通信データの計測・収集のために計算機を1台購入する予定である.また,国内外の学会での成果発表のために旅費を使用し,通信データの計測・解析のために謝金を使用する.前年度の未使用額は,研究打ち合わせのための旅費として活用し,研究を推進する予定である.
難分解性有機塩素化合物の酸化分解促進を目的とした腐植酸の高機能化

鉄-ポルフィリン触媒は、木材腐朽菌(キノコ類に含まれる)が生産する酸化酵素の活性中心を模倣した触媒として知られている。これは、穏和な条件で安価かつ易分解性の酸化剤であるオクソン(KHSO5)共存下で、クロロフェノール(CPs)など有害な有機塩素化合物を穏和な条件にて酸化分解出来ることが報告されており、CPsで汚染された土壌・水圏環境の浄化剤として応用が期待できる。しかし、酸化剤共存下で、触媒自身が自己分解し不活性化する問題点がある。本研究では、鉄-ポルフィリン触媒を天然高分子である腐植酸へ共有結合することにより、自己分解の抑制とCPsに対する酸化分解率の向上を達成した。鉄-ポルフィリン触媒を腐植物質のモデル化合物であるシクロデキストリンを包接させた超分子触媒を調製し、その安定性の評価を行った。その結果、鉄-ポルフィリン触媒の自己分解は、ヒドロキシプロピル-β-シクロデキストリンとの包接錯体の形成により、pH4-6の範囲で大幅に抑制出来ることがわかった。この超分子触媒を、ペンタクロロフェノール(PCP)汚染土壌へ適用したところ、85%以上のPCPを除去することができ、25%程度のPCPが二酸化炭素にまで完全無機化した。ゆえに、超分子の生成は、触媒の安定化に寄与するだけではなく、触媒活性の大きな向上にも繋がることを明らかにした。また、ストップドフロー分光法により、腐植物質のような有色色素共存下での鉄-ポルフィリン触媒の安定性評価法を確立した。さらに、腐植物質中のカルボキシル基へ、アミノ基を導入した鉄-ポルフィリン触媒をアミド結合にて導入する方法を確立した。しかし、アミド結合は安定ではなく過酸化物共存下で容易に加水分解してしまうため、鉄-ポルフィリン触媒を安定化するには至らなかった。そこで、腐植物質中のフェノール性水酸基の部位にハロゲン化アルキルを導入した鉄-ポルフィリン触媒をエーテル結合にて共有結合させる新たな方法を開発した。現在は、3種類のヒドロキシフェニルポルフィリン-鉄錯体について2種類のアルキル鎖を介して腐植物質へのエーテル結合を行った。さらに、エーテル結合部位となる腐植物質中のフェノール性水酸基の量を増加させるため、腐植物質の酸化前処理によるヒドロキシル化、および、試薬由来のフェノール性水酸基のアルドール縮合による付加を試みた。鉄-ポルフィリン触媒の自己分解の抑制とクロロフェノール(CPs)のような有機基質の酸化活性の向上を目的として、この触媒の共有結合による腐植酸への導入に関して検討を行った。鉄-ヒドロキシフェニルポルフィリン触媒を腐植酸へ共有結合で導入する手段として、アルカリ触媒共存下でホルムアルデヒドを用いた架橋反応が有用であることを見出した。この反応では、触媒中のヒドロキシフェニル基と腐植酸中のフェノール部位が架橋する。まず、ヒドロキシフェニル基を1つだけ有する触媒を合成し、腐植酸へ架橋させた。さらに、ヒドロキシフェニル基を4つ有する触媒に関しても、腐植酸へ導入した。これら触媒を比較すると、ヒドロキシフェニル基が多い方が触媒の自己分解に対する抑制効果が大きく現れ、CPsに対する分解率の向上にも有効であることが明らかになった。これは、ヒドロキシフェニル基4つの触媒の方が安定であり、その自己分解が抑制されることから失活し難くなることに起因する。特に、ヒドロキシフェニル基4点で架橋した触媒は、元の鉄-ポルフィリン触媒に比べCO2への無機化率が12-13%も向上し大きな効果が見られた。また、鉄-ヒドロキシフェニルポルフィリン触媒をアルキル鎖でエーテル結合を介して腐植酸と共有結合させることについても検討を行った。その結果、腐植酸のカルボキシル基の酸解離をエステル化によりマスクすれば、触媒をエーテル結合で腐植酸へ導入できることを明らかにした。鉄-ヒドロキシフェニルポルフィリン触媒(FeTPP(OH)_4)の自己分解の抑制とペンタクロロフェノール(PCP)など難分解性有機塩素化合物の酸化分解に対する触媒活性の向上を目的として、この触媒の共有結合による腐植酸への導入に関してさらなる検討を行った。昨年度、FeTPP(OH)_4を腐植酸ヘホルムアルデヒド縮重合反応で導入したが(この触媒をResolとする)、ResolのようにCH2基のみの架橋だけではなく、アミノ基(Urea-Resol)、エーテルそしてフェニル基による架橋も試みた。まず、アミノ基による架橋を行うため、ホルムアルデヒド縮重合反応において、尿素を添加した。その結果、自己分解速度も2倍程度の遅延効果を示し、PCPに対する分解率も10%程度向上した。次に、FeTPP(OH)_4を腐植酸ヘエーテル結合で導入する際に反応を阻害するカルボキシル基をメチルエステル化によりマスクし、アルキル鎖を介してFeTPP(OH)_4と腐植酸をエーテル架橋できた。

自己分解の遅延やPCP分解率の向上はResolやUrea-Resolに比べ大きくなかったが、アルキル鎖の長さが長いほど触媒活性が高くなるとの知見を得、触媒と基質との相互作用が触媒活性向上の一因子であることを見出した。また、腐植酸をヒドロキノンで修飾しホルムアルデヒド縮重合反応によりFeTPP(OH)4を導入した(この触媒をHQ-HA-Feとする)。自己分解の遅延効果およびPCP酸化分解に対する触媒活性は、これまで合成してきた触媒の中ではこのHQ-HA-Feが最も高かった(自己分解速度はFeTPP(OH)_4だけに比べ、13-15倍遅延し、PCP分解率は90-100%を達成した)。しかし、PCPのCO_2までの完全分解は困難であった。
ポテンシャル問題の数値解析と関連事項

1.研究代表者を中心として得られた知見(1)スチェクロフ作用素を用いた透過境界条件の設定とその数値的取り扱いラプラス方程式とポアッソン方程式の数値解法におけるスチェクロフ作用素の取扱いについて考察を深めた。スチェクロフ作用素を用いることによって、無限領域問題および角のある有界領域等の特異性のある領域での有限要素近似計算法を確立して、その数学解析と数値計算を実施した。完全流体における一様流の中の物体まわり流れの精密計算法を考察した。本研究は研究分担者小山大介と共同して実施した。(2)移流拡散非定常問題の差分近似問題の安定性と誤差評価数値流体力学における基本問題である移流拡散問題の差分近似問題の安定性と誤差評価を研究した。空間一次元問題における等間隔五点差分公式を対象とした。2.分担者が著しい成果を収めた研究課題(分担者名)(1)遅れをもつ線形微分方程式の線形作用素の半群の理論による取り扱い(内藤敏機)。(2)構造と音場の連成系の振動スペクトルとその有限要素法による近似理論(加古孝)。(3)狭い間隔をもつ同軸円筒管流のテイラー・クエット渦の数理解析と有限要素数値計算(海津聡)。(4)均質化理論による多孔質媒質における非線形固有値問題の取り扱い(海津聡)。(5)遅延微分方程式のルンゲ・クッタ法による数値解法とその代数的安定性の有効性の確立(小藤俊幸)。(6)グラフの全域木を列挙する効率的方法の開発(田村明久)。(7)組み合わせ最適化問題における実行可能多面体のフェイス構造(田村明久)。(8)交互境界条件法による領域分割計算法(竹田辰興、福原誠)。3.電気通信大学数値解析研究会の継続開催本年度15回にわたっておおむね金曜午前に実施し、2月9日には、応隆安北京大教授を囲む特別研究会、3月1日には一日研究会「陽春謳歌の会社」をそれぞれ開催した。
泌尿器癌における癌・間質細胞相互作用-Stromal Therapyをめざして

膀胱がん細胞株5637にHGFを添加の有無で、マイクロアレイを行い、遺伝子の変化を検討し、2-fold以上の変化を認めた26分子(3down-regulation、23up-regulation)のうちToll like receptor 4(TLR4)とその下流にあると考えられるMatrix metalloproteases(MMP-1、MMP-10)に着目し検討したところ、HGFによる作用がTLR4-NFκBの経路を介して、MMPの活性を増強させ、浸潤能の増強を誘導している可能性が示唆された。1.膀胱がん細胞株5637にHGFを添加した培養液で培養すると、浸潤能が増強することをすでに示しているが、HGFをさまざまな濃度(0ng/ml、25ng/ml、50ng/ml、100ng/ml)で培養液中に添加し、それらの培養液で培養した膀胱がん細胞5637から採取したcDNAを用い、マイクロアレイを行った。添加濃度での遺伝子発現の差を検討したところ、50ng/mlでほぼデータはプラトーになり、50ng/mlと100ng/mlではほとんど差を認めなかった。0ng/mlに対して50ng/mlにおいて、2-fold up-regulateした分子は28,869分子中23分子で、2-fold down-regulateした分子は28,869分子中3分子であった。2-fbld以上の発現の差を認める分子の中から浸潤に関与している可能性のある分子について、リアルタイムPCRとウエスタンブロット法で再度発現の確認を行い、免疫染色にて局在の変化を検討し、その他の機能解析中である。間質細胞から分泌されるHepatocyto growthfactor (HGF)が膀胱がん細胞表面のc-Metに作用し、浸潤能が亢進されることをすでに報告しており、HGFによる膀胱がん浸潤能、増殖能亢進に関わる分子を検討するためにマイクロアレイを行った。膀胱がん細胞5637にrecombinant HGFの添加の有無でマイクロアレイを行い、比較検討した。コントロール群と比べ、HGF添加群で2-fold以上の変化を認めた26分子のうちtoll like receptor 4 (TLR4)に着目した。まずリアルタイムPCRを用いて、マイクロアレイの結果の再検証を行い、同様の結果が得られた。次に各膀胱がん細胞株において、正常の膀胱細胞株と比べ、TLR4は高発現を認め、ウエスタンブロットにおいても同様の結果が得られた。免疫組織染色において、正常膀胱組織と比べ、膀胱腫瘍組織において、血管内皮細胞および細胞質でよく濃染されていた。次にTLR4が高発現していたJ82細胞株をTLR4のsiRNAを用い、ノックダウンすることでHGFの膀胱がん浸潤能、増殖能亢におけるTLR4の関与の有無を検証した。TLR4のノックダウンを行うと浸潤能はさらに亢進し、増殖能は抑制された。TLR4は浸潤能に関しては抑制する方向に、増殖能に関しては増強する方向に働いている可能性が示唆された。TLR4をノックダウンしたものにHGFを添加したものでは、コントロールにHGFを添加したものと浸潤能はほとんど差を認めなかったが、増殖能は有意に抑制されたことから、HGFの浸潤能亢進にTLR4が関与していない可能性、増殖能亢進にTLR4が関与している可能性が示唆された。間質細胞から分泌されるHepatocyto growthfactor (HGF)が膀胱がん細胞表面のc-Metに、作用し、浸潤能が亢進されることをすでに報告しており、HGFによる膀胱がん浸潤能、増殖能亢進に関わる分子を検討するためにマイクロアレイを行った。膀胱がん細胞株5637にHGFの添加の有無でマイクロアレイにて比較検討を行い、コントロール群と比べ、HGF添加群で2-fold以上の変化を認めた26分子のうち、toll like receptor 4 (TLR4)とその下流にあると考えられる、Matrix metalloproteases (MMP-1、MMP-10)に着目した。次にウエスタンブロットにて、HGFの添加により、TLR4とNFκBの発現が増強すること、TLR4のノックダウンでNFκBの発現が抑制され、HGFでの増強効果も抑制された。MMPに関しては、MMP活性測定キットを用いて、HGFの添加により、MMP-1、MMP-10の活性の増強が認められ、TLR4のノックダウンでMMP-1、MMP-10の活性は抑制され、MMP-1ではHGFでの増強効果も有意に抑制された。Matrigel invasion assayにて、TLR4、MMP-1,MMP-10のノックダウンにて、浸潤能は抑制され、またHGFでの浸潤能増強効果も抑制された。HGFによる作用が、TLR4-NFκBの経路を介して、MMPの活性を増強させ、浸潤能の増強を誘導している可能性が示唆された。
困難を抱える子どもを包摂する多重感覚発達支援環境の実証的研究：日英米の環境比較

本研究では、英国、米国における多重感覚発達支援環境の調査事例を踏まえ、地域の学校園や発達支援事業所に在籍する困難を抱える子どもたちを包摂する多重感覚発達支援環境の実証的研究を行う。子どもたち本人による所感を踏まえ、国内でも実践可能で有効性がある多重感覚発達支援環境を提案し、地域の子どもたちや保護者のエンパワメントを目指すものである。
ウメボシイソギンチャクにおけるサルコシンの代謝に関する研究

本研究は、ウメボシイソギンチャク(Actina equina)の細胞内浸透圧調節におけるサルコシン(Sar)の役割とその代謝を明らかにすることを目的とするもので、以下の成果を得た。1.上記動物は25200%海水の広い塩分濃度範囲に耐え、しかもその体液は飼育海水とほぼ等浸透であることから、広塩性浸透順応型と判断された。2.上記動物から80%メタノールエキスを調製し、遊離アミノ酸(FAA)とベタイン類(BET)を分析したところ、主成分としてTau、Sar、ホマリン(Hom)が認められた。SarとHomは、Magnum9-SCXなどを用いるHPLCで分離後、各種スペクトル、HPLCの保持時間、TLCのRf値などを標品のそれと比較することにより同定した。3.FAAとBET含量に及ぼす飼育海水濃度の影響を調べたところ、上記3成分が海水濃度の変化に応じて変動した。ことに、Sarの変動は顕著で、主要な細胞内浸透圧調節物質であることが判明した。4.100%海水から75%海水へ移して48時間飼育し、経時的に80%メタノールエキス中のFAAと結合アミノ酸(CAA)を調べたところ、移行後速かにFAAとCAAの減少ならびにアンモニアの増加が認められた。とくにSarの減少が著しいことから、低張海水移行時にはSarの分解が促進されるものと思われる。5.100%海水から125%海水へ移して前項と同様の実験を行ったところ、移行6時間後にSarの顕著な増加を認めるとともに、Glyの減少が観察され、GlyのN__ー-メチル化によるSarの生成が示唆された。なお、CAA中にSarが認められないことから、Sarはペプチド由来ではないと判断された。
直流刺激と行動分析の統合リハビリによる日常生活動作の再獲得：その基礎と臨床応用

頭蓋の外から1mA程度の微弱な直流電流を与える経頭蓋直流電気刺激法(Transcranial Direct Current Stimulation: tDCS)は、簡便な神経修飾法としてリハビリテーション分野で研究が進んでいる。しかしながら、運動麻痺などの機能障害に対するtDCS研究が広く行われている一方で、着衣動作などの日常生活動作をtDCSのターゲットとする研究は萌芽的段階にある。本研究の目的は、tDCSによって日常生活動作の獲得を促進するために有効な訓練プロトコルを開発することである。障害後の日常生活動作の遂行には、障害を生じる以前にはなかった行動連鎖を新たに獲得しなければならない。すなわち、日常生活動作の獲得には、機能障害の回復とともに新たな行動連鎖を学習することが必要なのである。そこで本研究では、tDCSと行動分析の手法を組み合わせた新しいリハビリテーションを提案する。本年度は、(1)tDCSに関する基礎研究を論文化も含めて継続した。物体をつまむなどの上肢日常生活動作に対して、脳卒中患者を対象にtDCS効果の検証を行った研究の論文をまとめた(Moriya et al., 2018)。その結果、対象者間で効果のばらつきがあるものの、介入から1週間後には、グループレベルの解析では有意に成績が改善することが示された。(2)tDCS効果の個人差を生じる要因として、ターゲット領域における電界のばらつきが寄与している可能性を健常者を対象とした研究で示し、論文化した(Laakso et al., 2018)。(3)トイレ動作という日常生活動作の訓練において、脳卒中患者を対象に応用行動分析の手法を用いて課題分析を行い、行動要素ごとの難易度を明らかにし論文化した(Kawanabe et al., 2018)。tDCSに関する研究に関しては計画通りに進み、論文化をすることができた(Moriya et al., 2018)。行動分析に関しても、脳卒中患者のトイレ動作に関する研究を実行し、こちらも論文化することができた(Kawanabe et al., 2018)。引き続き、tDCS効果の個人差に対する検討を進めていく。また、行動分析では、分担研究者と協力し患者を対象とした研究を遂行していく。両介入を統合した研究を進めていく。頭蓋の外から1mA程度の微弱な直流電流を与える経頭蓋直流電気刺激法(Transcranial Direct Current Stimulation: tDCS)は、外科手術を行わずヒトの脳活動を修飾できる装置としてリハビリテーション分野で研究が進んでいる。しかしながら、運動麻痺などの機能障害に対するtDCS研究が広く行われている一方で、着衣動作などの日常生活動作をtDCSのターゲットとする研究は世界的にみてもまだ少なく萌芽的段階にある。本年度は、(1)tDCSの作用機序に関する基礎研究を実施した。MRI画像を用いた脳内電場シミュレーションにより、標準脳におけるtDCSの脳内電場分布を明らかにし、また電場分布の個人差も明らかにした(Laakso Tanaka et al., 2016 NeuroImage)。今後はシミュレーションの結果を実データと照合し、更なる検討を行う。(2)機能的MRI実験の研究環境を整えた。共同研究を実施する医療機関において機能的MRIを実施するための最適パラメータを探索し、また視覚刺激呈示を計測できる環境を構築した。DCSの作用に関する研究、MRI実験の環境構築に関しては計画通りに進んだ。行動分析に関しては、主に担当する分担研究者の一時的離脱があり当初の計画よりはやや遅れたが、次年度より復帰する。本年度は、(1)tDCSに関する基礎研究を継続した。筋力という日常生活動作の遂行に欠かせない基本単位に関してtDCSの効果を検証したが、複数日における連続介入では有意な効果は認められなかった(Maeda et al., 2017)。一方、昨年度開発したMRI画像を用いた脳内電場シミュレーション(Laakso et al., 2016NeuroImage)により、刺激領域を同定しtDCSを実施することで、感覚機能に対し一時的な促進効果を認めた(Fujimto et al., 2017)。このことは、シミュレーションと実験の融合が有効な方法であることを示唆している。

また(2)トイレ動作に関して一連の動作を各行動要素に分解し、脳卒中患者にとってどのような行動要素が実施困難であるかを検討開始した。tDCSに関する研究に関しては計画通りに進んだ。行動分析に関しては、分担研究者の鈴木が復帰し、脳卒中患者のトイレ動作に関する研究を推進し、こちらも研究が計画通りに進んだ。頭蓋の外から1mA程度の微弱な直流電流を与える経頭蓋直流電気刺激法(Transcranial Direct Current Stimulation: tDCS)は、簡便な神経修飾法としてリハビリテーション分野で研究が進んでいる。しかしながら、運動麻痺などの機能障害に対するtDCS研究が広く行われている一方で、着衣動作などの日常生活動作をtDCSのターゲットとする研究は萌芽的段階にある。本研究の目的は、tDCSによって日常生活動作の獲得を促進するために有効な訓練プロトコルを開発することである。障害後の日常生活動作の遂行には、障害を生じる以前にはなかった行動連鎖を新たに獲得しなければならない。すなわち、日常生活動作の獲得には、機能障害の回復とともに新たな行動連鎖を学習することが必要なのである。そこで本研究では、tDCSと行動分析の手法を組み合わせた新しいリハビリテーションを提案する。本年度は、(1)tDCSに関する基礎研究を論文化も含めて継続した。物体をつまむなどの上肢日常生活動作に対して、脳卒中患者を対象にtDCS効果の検証を行った研究の論文をまとめた(Moriya et al., 2018)。その結果、対象者間で効果のばらつきがあるものの、介入から1週間後には、グループレベルの解析では有意に成績が改善することが示された。(2)tDCS効果の個人差を生じる要因として、ターゲット領域における電界のばらつきが寄与している可能性を健常者を対象とした研究で示し、論文化した(Laakso et al., 2018)。(3)トイレ動作という日常生活動作の訓練において、脳卒中患者を対象に応用行動分析の手法を用いて課題分析を行い、行動要素ごとの難易度を明らかにし論文化した(Kawanabe et al., 2018)。tDCSに関する研究に関しては計画通りに進み、論文化をすることができた(Moriya et al., 2018)。行動分析に関しても、脳卒中患者のトイレ動作に関する研究を実行し、こちらも論文化することができた(Kawanabe et al., 2018)。DCSの研究を着実に進めていく。特にシミュレーションと実験との融合を重視する。機能的MRIに関しては運動反応を信頼性高く計測できる環境を整える。特に被験者の頭部の動き対策を検討する。行動分析のパートについては、エキスパートである分担研究者と検討を重ねる。tDCS効果の個人差に対する検討を進めていく。また、行動分析では、分担研究者と協力し患者を対象とした研究を遂行していく。引き続き、tDCS効果の個人差に対する検討を進めていく。
PACAPは魚類においてどんな機能を担っているのか?

【背景と目的】下垂体アデニル酸シクラーゼ活性化ポリペプチド(Pituitary adenylate cyclase-activating polypeptide、PACAP)は、哺乳類において多機能ペプチドであると考えられている。一方、魚類においてPACAPがどんな機能を担っているのか、詳細についてはほとんど判っていない。本研究は、魚類におけるPACAPの生理的意義を探ることを目的とした。【研究成果】(1)PACAP微量測定系により体内各組織中PACAP量を、定量的RT-PCR法により各組織中PACAPmRNA発現量とPACAP受容体mRNA発現量をそれぞれ測定して、含有量や発現量の変動を探ったところ、成長過程や性差および季節によって発現量が変動する可能性が示唆された。(2)PACAP含有ニューロンと各種腺性下垂体ホルモン産生細胞との分布相関を免疫組織化学的に調べ、また、単離した下垂体細胞のホルモン分泌に及ぼすPACAPの影響をCellプロットアッセイ法により解析したところ、PACAPは、ソマトラクチンやプロラクチンの合成と分泌を共に制御する可能性が見出された。(3)中枢神経系におけるPACAPの機能、特に摂食行動に及ぼす影響を脳室内投与実験により探ったところ、顕著な食欲調節機能を有することが判った。これらの研究課題は現在進行中であるが、本研究により、神経ペプチドPACAPの機能は魚類において多様であることが判明しつつある.これらの成果は、国際専門誌に12編の原著論文として公表(掲載決定を含む)した。また、現在、投稿論文1編が審査中である。下垂体アデニル酸シクラーゼ活性化ポリペプチド(Pituitary adenylate cyclase-activating polypeptide、PACAP)は、哺乳類において多機能性ペプチドであると考えられている。従って、本研究は硬骨魚類におけるPACAPの生理機能を解明することを目前とする。平成16年度の研究成果(1)ミシマオコゼ脳におけるPACAP及びPACAP受容体の分布動態の解明硬骨魚類ミシマオコゼ科のミシマオコゼ(Uranoscopus japonicus)を研究材料として用い、脳内PACAPの分布動態をミシマオコゼPACAPに特異的な抗体を用いて免疫組織化学法によって観察した。また、ビオチン標識したミシマオコゼPACAPを用いてPACAP受容体の分布を組織化学的に観察した。これらの成果は論文として公表した(Matsuda et al.,2004)。(2)ミシマオコゼ脳におけるPACAPの発現量の解析ミシマオコゼ脳におけるPACAP含有量を酵素免疫測定法により測定した。また、脳中PACAP含有量と体重および生殖腺重量との関係を調べた。これらの成果は論文として公表した(Matsuda et al.,2005a,2005b)(3)ミシマオコゼPACAP含有神経線維と各種下垂体ホルモン産生細胞の分布相関(4)ミシマオコゼ下垂体細胞のホルモン分泌におよぼすPACAPの影響解析下垂体細胞細胞のホルモン分泌におよぼすPACAPの影響をCellブロットアッセイ法によって探った。この成果については学会発表済みであり、論文投稿準備中である。PACAPの硬骨魚類脳内の分布より摂食調節への関与が推察された。そこでキンギョ脳内へPACAPを投与して摂食行動を抑制性に調節することを明らかにした。これらの成果は論文として公表した(Matsuda et al.,2005c)。【研究成果】

(1)PACAP微量測定系により体内各組織中PACAP量を、定量的RT-PCR法により各組織中PACAP mRNA発現量とPACAP受容体mRNA発現量をそれぞれ測定して、含有量や発現量の変動を探ったところ、成長過程や性差および季節によって発現量が変動する可能性が示唆された。(2)PACAP含有ニューロンと各種腺性下垂体ホルモン産生細胞との分布相関を免疫組織化学的に調べ、また、単離した下垂体細胞のホルモン分泌に及ぼすPACAPの影響をCellブロットアッセイ法により解析したところ、PACAPは、ソマトラクチンやプロラクチンの合成と分泌を共に制御する可能性が見出された。(3)中枢神経系におけるPACAPの機能、特に摂食行動に及ぼす影響を脳室内投与実験により探ったところ、顕著な食欲調節機能を有することが判った。これらの研究課題は現在進行中であるが、本研究により、神経ペプチドPACAPの機能は魚類において多様であることが判明しつつある。これらの成果は、国際専門誌に12編の原著論文として公表(掲載決定を含む)した。また、現在、投稿論文1編が審査中である。
輪作採用度要因の解明による持続的土地利用確立に関する研究

本研究は、畑作経営の実態調査により輪作採用要因を解明し、持続的土地利用の確立条件を検討したものである。調査対象地域は、北海道十勝地域を中心に、比較対象として3作物の輪作が行われている網走地域、小規模で野菜導入の進んでいる後志地域を選定した。畑作経営が農業所得の獲得を目指して行われる以上、相対的に有利な価格条件を持つ作物が選択される。しかし、連作障害回避、地力維持といった観点から複数作物が選択され、土地利用は年次作付交替を行う輪作が実施されている。十勝地域は、その自然条件から主にてん菜、馬鈴薯、豆類、小麦という4作物の輪作が実施されている。これら4作物の作付比率の均衡が望まれるが、作物選択は価格だけではなく単位あたり労働時間および組作業体系といった労働組織に規定されていた。この労働組織は機械体系に規定され、雇用労働力の排除を可能にする機械導入が進展していた。しかしながら、新規農業機械は高価であり、機械導入を図り作付均衡を図る行動が採用されるためには、それぞれの作物が長期にわたり一定面積作付可能であることが必要であった。輸入等で供給過剰が指摘される状況では、価格の影響が強まり特定作物への作付集中が危惧された。こうした状況下にあっても、地力維持増進効果が期待される緑肥休閑の実施がみられた。実施農家は数年に一度実施する農家と毎年実施する農家とに大別され、前者は規模拡大による農作業調整の性格が強く、後者は一定額の農業所得を確保できる相対的な大規模経営に多いことが明らかとなった。以上のことから、持続的土地利用の確立には機械開発のほか、安定的な作付を担保すること、投資を可能にする農家経済確立条件が必要であることが明らかになった。研究初年目である平成14年は、主要研究対象地の農業動向の整理と農家の作物選択要因の把握を行った。本研究の主要対象地は北海道十勝地域と網走地域であり、2000年における両地域の地域区分と1970年以降の作付動向を整理し、あわせて主成分分析による集落類型区分を行った。十勝地域は沿海部の「畜産」地帯、山麓部の「混同・畑作4品」地帯、中央部の「畑専・畑作4品」および「畑専・いもなし3品」地帯に区分できる。また、網走地域は北部の「畜産」地帯、山麓部の「混同・畑野菜・豆なし3品」地帯、北見周辺の「畑作・畑野菜・豆なし3品」地帯、美幌周辺の「畑作・畑野菜・4品」地帯、沿海部の「畑作・畑専・豆なし3品」地帯に区分できることを明らかにした。集落類型では十勝は「畑作3品」型の集落が最も多く、「畑作4品」型の集落が減少している。網走は「畑作3品」型とともに「酪農」型集落が多く、「酪農」型集落が増加している特徴が見られた。また、農家の作物選択と輪作採用行動には、各作物の価格水準にくわえて、排水等の土地条件、団地的な農地保有条件、さらには農家の個人的な輪作への関心度がおおきな影響を与えることが示唆された。さらに、この農家行動に関しては、農家の規模拡大条件の相違による経営耕地規模、家族労働力保有と農作業機械の能率などが影響を与えていると考えられた。この点は、地域性を考慮しながら実態把握の蓄積が必要であるという課題も明らかにしており、次年度以降の農家実態調査の成果が期待される。研究2年目である平成15年は、主に畑作専業・畑作4品生産地帯である北海道十勝地域での農家実態調査を行った。調査対象地域は、十勝地域の中でも経営耕地面積規模が大きい更別村である。

調査のポイントは畑作物作付実態と作付面積の多寡を左右する条件の把握、ならびに休閑緑肥作の導入実態とその要因などである。更別村は大規模な用排水事業と農用地造成事業、さらに高率な離農の発生により、十勝地域でもトップクラスの経営耕地面積となった。作付は畑作物4品生産が主体であり、輪作の実態を把握しやすい町村である。農家実態調査からは、農家の作物選択と輪作採用行動には、各作物の価格水準にくわえて、排水等の土地条件、団地的な農地保有条件、さらには農家の個人的な輪作への関心度がおおきな影響を与えることが示唆された。さらに、この農家行動に関しては、農家の規模拡大条件の相違、家族労働力保有と農作業機械の能率などが影響を与えていると考えられた。また、休閑緑肥作導入は、農家割合で10%、面積割合では5%以下の実態であり、しかも作付順序に組み込んでいる農家は極めて少ないことがわかった。休閑緑肥の導入は過作問題への対処と考えられているが、そうした要因から規模拡大にともなう農作業と土地利用の調整という要因を強めていることが示唆された。最終年度に向けて、さらに詳細な検討を進める計画である。この他、畑作3品生産地域である網走地域において豆類減少の要因調査も行った。豆類生産の自然的条件不利性が豆類作付減少の要因と考えられているが、これに加えて農協等関係機関が農業所得の向上と安定性を目指し、意図的に豆類作付減少の営農指導を行っていた知見もえた。研究最終年である平成16年度は、おもに畑作・4品目生産を基幹とする十勝地域・芽室町、野菜や食用ばれいしょを中心とし政府管掌畑作物生産の少ない後志地域・真狩村の農家実態調査をおこなった。調査のポイントは、経営耕地の拡大条件の差異と土地利用・作物選択の関連である。芽室町は土地条件のよい中央地域では規模拡大が相対的に進まず野菜の定着が見られ、相対的に土地条件の劣る山沿い地域では離農を背景にした経営耕地の拡大が進展し、昨年度調査対象地域更別村同様の大規模畑作経営が出現していた。芽室町も食用・加工ばれいしょの主産地であるが、近年の価格や需要低迷により作付が停滞し、てん菜・豆類作付けの停滞とあいまって、作付が増加しているのは多収を実現していた小麦作であった。農産物価格とともにその需要を反映した作付指標や契約面積の存在が作付構成を左右していた。規模階層別には10ha未満の小規模層と60ha超の大規模層で小麦過作、3品輪作といった作付が見られ、労働力、後継者の有無による機械投資の是非が作付に影響を与えていた。真狩村は平均14ha弱の畑作が行われており、野菜作の作付が1/3を占め、それにばれいしょを加えると、過半数を超える作付けが行われている。沢によって農地が分断される地形条件にあって、離農も規模拡大につながらないあるいは遠隔飛び地を発生させる問題を抱えている。農家の中には拡大意向をもつ農家も多いが、畑作物4品の輪作ではなく、野菜作を安定化させるための土つくり(作付間隔確保、禾本科である小麦導入、緑肥休閑の定着など)が意識されている。いわゆる集約作物である野菜定着を念頭においた土地利用の模索が行われているのである。
心臓の発生と奇形形成における細胞死関連抗原Fasの発現の解析

マウスの心臓発生過程におけるプログラム細胞死の関与を明らかにする目的で、アポトーシスを媒介する細胞表面蛋白質であるFas抗原の発現を解析した。結果は、11.5dpcで、円錐動脈幹、心内膜床外側の心筋細胞層に強い染色が認められた。12.5-14.5dpcでは、心室筋、肉柱、心房筋全体に強い染色が認められた。14.5dpcは、心室筋緻密層での発現が減弱し、16.5dpc以降は、Fas抗原の発現は認められなかった。弁護脹、弁腹基は染色されなかった。心室、肉柱でのfas抗原の一過性の発現は、同部位での活発な細胞死を示すもので、緻密層のFas抗原発現の減弱は細胞分化の終了と共に細胞死の役割も終了することを意味するものと考えられた。弁形成においては細胞死が重要な役割を果たすと考えられているが、Fas抗原との関連は否定的であった。以上のように、Fas抗原は、主に心室筋において、時間、空間特異的な発現様式を示しており、マウス胎仔の心臓の発生過程において、Fas抗原を介したプログラム細胞死が関与することを確認できた。我々は、P19EC細胞のレチノイン酸による心筋細胞分化過程で、Fasが発現し、in vitroでRAが濃度依存性にFasリガンド発現を誘導することを確認し、また、マウス心臓におけるCRABP・RARの発現の解析から、RNAβをFas抗原の発現様式の時間的近似性を確認した。Fas抗原の発現と以上の結果と併せて、心臓発生過程における細胞死現象にはFasが関与し、その発現はレチノイン酸によるリガンド発現の制御によることが推察された。
真に深層にできるグラフ深層学習への挑戦

グラフ深層学習は,画像等の整列したデータではなく,神経網・交通網などのネットワーク上のデータ,あるいは点群データなどの不均一に分布するデータに対する特徴抽出・分類・認識などに用いられている,深層学習の新しいパラダイムである.本研究では,真に深層とできるグラフ深層学習の実現のため,全スペクトル領域グラフ畳み込みニューラルネットワークを提案することを目標とする.グラフ深層学習は,画像等の整列したデータではなく,神経網・交通網などのネットワーク上のデータ,あるいは点群データなどの不均一に分布するデータに対する特徴抽出・分類・認識などに用いられている,深層学習の新しいパラダイムである.本研究では,真に深層とできるグラフ深層学習の実現のため,全スペクトル領域グラフ畳み込みニューラルネットワークを提案することを目標とする.
成長因子固相化軟骨細胞シート・同種骨複合体による広範囲骨軟骨欠損修復法の確立

【目的】離断性骨軟骨炎の重症例や外傷による広範囲骨軟骨欠損に対しては、土台となる骨欠損が問題となるため、膝関節骨軟骨組織や肋骨肋軟骨による自己組織を使用した軟骨再生に頼らざるを得ない。本申請研究では深い骨欠損を伴う軟骨欠損の修復を目指し、家兎骨軟骨欠損モデルに対する骨軟骨修復法の確立を目的とした。【方法】日本白色家兎雄を使用した。ドナー家兎の膝関節から滑膜組織と円柱状の骨組織を採取した。骨組織は-30°Cで保存し、滑膜組織はトリプシン処理後、滑膜間葉系細胞を2週間平面培養した。レシピエント家兎の両側大腿骨顆部関節軟骨に直径5mm、深さ10mmの円柱状の骨軟骨欠損を作成し、一方の骨軟骨欠損部には同種骨移植のみを行い(以下、B群)、もう一方の骨軟骨欠損部には同種骨移植と滑膜間葉系細胞を移植した(以下、BS群)。移植後、12週間で、大腿骨顆部を採取し移植部を評価した。肉眼的評価、microCTによる骨組織の評価後、パラフィン包埋した組織の薄切切片を作成し、HE染色およびサフラニンO染色にて移植部を評価した。【結果】肉眼的評価ではB群、BS群ともに移植後12週間で表面はほぼ修復され、micro CT評価では移植した同種骨組織は骨癒合していた。組織学的、組織化学的評価では、移植後12週において、BS群はB群の組織と比較し、良好な軟骨組織で修復されていた。【考察】過去の報告では、直径5mm、深さ3mmの家兎骨軟骨欠損モデルに対する滑膜間葉系細胞移植の良好な成績が報告されている。申請者は直径5mm、深さ10mmのより深い骨軟骨欠損モデルに対して、同種骨移植と滑膜間葉系細胞移植の併用した骨軟骨修復を試みた結果、移植した同種骨の上にサフラニン染色性が良好な軟骨組織の再生が認められた。今後、本法を応用し成長因子固相化軟骨細胞シート・同種骨複合体による広範囲骨軟骨欠損修復法の確立を目指す方針である。当初、広範囲家兎骨軟骨欠損モデルに対して、同種骨移植移植に高密度軟骨細胞移植を併用した骨軟骨修復実験を行っていたが、移植後12週の時点では、同種骨移植のみを行った群(B群)と同種骨移植に高密度軟骨細胞移植を行った群(BC群)で軟骨修復に差が認められなかった。そこで、過去の報告を参考に、同種骨移植に、滑膜間葉系細胞移植を併用した群(BS群)を作成し、軟骨修復を行った。その結果、BS群では、B群やBC群と比較して、組織学的は、サフラニン染色良好な軟骨組織で修復された。当初の計画通りに進行しなかったため、研究の進行がやや遅れている。、2018年度の研究で成果が得られた、家兎骨軟骨欠損モデルに、同種骨移植と滑膜間葉系細胞を移植する修復方法をさらに発展させる。現在は12週間までの評価を行っているが、16週間までの時系列的評価を行う。評価は、軟骨修復の肉眼的評価、μCTによる骨癒合と骨密度評価、組織学的、組織化学的評価を行う方針である。その評価を行った上で、成長因子固相化同種骨を移植した家兎骨軟骨欠損欠損モデルの軟骨修復過程への効果、影響などについて、研究を進める方針である。【研究の目的】同種骨組織を移植した上に体外で増殖させた滑膜幹細胞や自家培養軟骨細胞を損傷部位に移植することで、大きな骨欠損を伴う骨軟骨欠損部の関節軟骨修復を目標とした治療法の確立を目指している。【方法】あらかじめウサギ大腿骨顆部から円柱状の骨組織と滑膜を採取し、円柱状の骨組織は-30°Cで保存しておき、移植前に80°C、10分間の加温滅菌処理を行った。採取した滑膜組織より酵素処理で滑膜幹細胞を採取し、血清を含む培養液で2週間培養した。ウサギ大腿骨顆部の関節軟骨部に径4.5mm、深さ10mmの骨軟骨欠損部を作製後、処理した同種骨を移植し、その上に滑膜幹細胞〔1×10(6) cells〕を移植した。移植後、2週間および4週間後の肉眼所見、micro CT像、組織学的評価(Hematoxylin-Eosin染色)、組織化学的評価(サフラニンO染色)を行い評価した。【結果】肉眼所見では、移植部は周囲の組織と比較して凹面となっているが、2週および4週間ともに軟部組織で覆われており、同種骨の露出は見られなかった。micro CTによる移植部の評価では、移植した同種骨は4週間の時点で骨癒合が確認できた。組織学的、組織化学的評価では、移植した同種組織は4週の時点で骨癒合を認め、その上に生着した滑膜幹細胞は一部軟骨組織への分化を認めた。【まとめ】これまでに本研究で得られた結果は、自家培養軟骨移植のみでは修復が困難であった、大きな骨欠損をともなう骨軟骨損傷の治療の発展、臨床応用に大きく貢献するものと思われる。しかし、移植後の4週の時点における肉眼的な表面の段差や軟骨細胞への分化が一部にとどまっているため、今後さらに研究を進める必要がある。進捗状況がやや遅れている原因として、当初、ウサギ膝関節より採取した軟骨細胞を血清含有培養液で培養したが、得られる細胞数が少なく、移植に十分な量の軟骨細胞が得られなかったことが挙げられる。このため、滑膜幹細胞を使用した関節軟骨修復を試みた。

滑膜組織を採取し、酵素処理により採取した滑膜幹細胞を血清含有培養液で培養したところ移植に十分な量の滑膜幹細胞を得ることができた。今後、軟骨組織採取方法や培養方法を再検討し、軟骨細胞移植による軟骨修復の実験も行う予定である。【目的】離断性骨軟骨炎の重症例や外傷による広範囲骨軟骨欠損に対しては、土台となる骨欠損が問題となるため、膝関節骨軟骨組織や肋骨肋軟骨による自己組織を使用した軟骨再生に頼らざるを得ない。本申請研究では深い骨欠損を伴う軟骨欠損の修復を目指し、家兎骨軟骨欠損モデルに対する骨軟骨修復法の確立を目的とした。【方法】日本白色家兎雄を使用した。ドナー家兎の膝関節から滑膜組織と円柱状の骨組織を採取した。骨組織は-30°Cで保存し、滑膜組織はトリプシン処理後、滑膜間葉系細胞を2週間平面培養した。レシピエント家兎の両側大腿骨顆部関節軟骨に直径5mm、深さ10mmの円柱状の骨軟骨欠損を作成し、一方の骨軟骨欠損部には同種骨移植のみを行い(以下、B群)、もう一方の骨軟骨欠損部には同種骨移植と滑膜間葉系細胞を移植した(以下、BS群)。移植後、12週間で、大腿骨顆部を採取し移植部を評価した。肉眼的評価、microCTによる骨組織の評価後、パラフィン包埋した組織の薄切切片を作成し、HE染色およびサフラニンO染色にて移植部を評価した。【結果】肉眼的評価ではB群、BS群ともに移植後12週間で表面はほぼ修復され、micro CT評価では移植した同種骨組織は骨癒合していた。組織学的、組織化学的評価では、移植後12週において、BS群はB群の組織と比較し、良好な軟骨組織で修復されていた。【考察】過去の報告では、直径5mm、深さ3mmの家兎骨軟骨欠損モデルに対する滑膜間葉系細胞移植の良好な成績が報告されている。申請者は直径5mm、深さ10mmのより深い骨軟骨欠損モデルに対して、同種骨移植と滑膜間葉系細胞移植の併用した骨軟骨修復を試みた結果、移植した同種骨の上にサフラニン染色性が良好な軟骨組織の再生が認められた。今後、本法を応用し成長因子固相化軟骨細胞シート・同種骨複合体による広範囲骨軟骨欠損修復法の確立を目指す方針である。当初、広範囲家兎骨軟骨欠損モデルに対して、同種骨移植移植に高密度軟骨細胞移植を併用した骨軟骨修復実験を行っていたが、移植後12週の時点では、同種骨移植のみを行った群(B群)と同種骨移植に高密度軟骨細胞移植を行った群(BC群)で軟骨修復に差が認められなかった。そこで、過去の報告を参考に、同種骨移植に、滑膜間葉系細胞移植を併用した群(BS群)を作成し、軟骨修復を行った。その結果、BS群では、B群やBC群と比較して、組織学的は、サフラニン染色良好な軟骨組織で修復された。当初の計画通りに進行しなかったため、研究の進行がやや遅れている。、これまでの研究成果では、移植後、長期間(8週12週)の結果が得られていないこと、現段階では肉眼的に移植部の段差が存在すること、移植した滑膜幹細胞の軟骨細胞への分化が不十分であること、などの改善すべき点があり、さらに良好な軟骨修復を目指し、研究を遂行する必要がある。今後の計画を以下に列挙する。1滑膜幹細胞の細胞密度の条件検討:移植した滑膜幹細胞の数は過去の報告に基づき、1×10(6)cellsとしたが、さらに高密度の滑膜幹細胞を移植することにより、良好な軟骨組織の修復を期待できる。