hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
DNA脱メチル化異常を介した染色体不安定性のメカニズムの解明

年齢と共に増加する発癌リスクの要因としてゲノム損傷の蓄積が考えられます。その契機は遺伝子複製の際の染色体分配です。正常な染色体分配には染色体のセントロメア領域のメチル化が必須です。セントロメア領域は反復配列であるSatelliteα配列より構成され、そこから転写されるnon-cording RNAであるSatelliteαtranscript(SatA)により染色体の均等分配が司られます。我々は、セントロメア領域のメチル化異常によりSatAが過剰発現し、特定の染色体を標的として数的異常が生じる事を明らかにしました。「研究の目的」我々はこれまで、遺伝子複製時のメチル基修飾エラーが加齢とともに蓄積される事でゲノム全域のメチル化シトシンの含有量が低下(DNA脱メチル化異常)する事を示しました。さらにDNA脱メチル化異常は染色体欠失等の染色体不安定性と相関する事を示し、DNA脱メチル化異常を介する発癌経路を提唱しました。本研究は、加齢に伴うセントロメア領域のDNA脱メチル化異常に着目し、それをセントロメア領域のnon-cording RNA、satelliteαtranscriptsが誘発する染色体不安定性と関連づける独創的な試みです。この発癌過程は、従来の遺伝子異常の蓄積による古典的なものとは異なり、新たな発癌経路の発見の糸口になると考えられます。「研究実施計画」1,大腸癌、胃癌の古典的癌化経路で見られる遺伝子異常p53、KRASを免疫組織染色法を用いて検出しました。その結果、satelliteαtranscriptsが亢進した大腸癌では、低いものに比べ、p53の変異は低く、KRAS変異は変わりませんでした。2、CGHアレイを行い、satelliteαtranscriptsの亢進した癌に染色体欠失等、遺伝子不安定性がどのような頻度で、どの部位に多いか、そして古典的癌化経路で見られる遺伝子異常の関連遺伝子が存在しないかを検討しました。satelliteαtranscriptsの亢進した癌の染色体の変化として、7、12、13番染色体で全域にわたりgainが認められ、16番染色体では長椀にgainが認められました。一方、14、15、18番染色体では全域にわたりlossが認められ、標的染色体と不安定性の特徴が明らかになりました。現在、その染色体上にある遺伝子を検索しています。我々はこれまで、セントロメア領域のメチル化異常によりSatAが過剰発現し、特定の染色体を標的として数的異常が生じる事を明らかにしました。大腸癌患者の臨床検体を用いてCGHアレイでDNAコピー数の変化を捉えたところ、DNAコピー数の変化は特定の染色体に集中して認められる事が分かりました。Satelliteαtranscriptが亢進している症例では、7,8,20番染色体で増幅が、14,15,18番染色体で欠失が高頻度に認められる一方で、Satelliteαtranscriptの発現亢進がない症例では、染色体数の変化はほとんど認められませんでした。また、レンチウイルスを用いてSatelliteαtranscriptを乳腺上皮細胞のゲノムにインテグレイトさせたところ、8,20番染色体の長椀に増幅が認められました。8,20番染色体の長椀の染色体不安定性は、胃癌、大腸癌、乳癌など多くの癌でその異常が認められ、染色体の構造的な変化を来しやすい部位であることが推測できます。8番染色体長椀には、癌遺伝子C-mycがコードされており、Satelliteαtranscriptを介する発がんのイニシエーションにかかわっていると考え検討を進めています。腫瘍外科25年度の研究計画として予定された古典経路で認められ遺伝子異常との比較は、P53、KRAS変異検索が終了し古典経路と若干異なる事が示され、おおむね計画通りである。また、染色体不安定性の標的染色体の同定がなされ、不安定性の特徴を捉える事ができたのは大きな成果である。染色体不安定性に関わる遺伝子の発現変化を発現アレイで検証します。消耗品の価格変動のため次年度消耗品に繰り越しする
中部地方における更新世以降のヒノキ林の成立とその変遷に関する研究

この研究はわが国の中部地方における更新世以降のヒノキ林の成立とその変遷を明らかにし,将来におけるヒノキ林の造成や森林環境の保全,自然保護の重要な問題の解決に有益な基礎資料をうることを目的としたものである。研究試料は,12か所からボ-リングによってえた湿原堆積物である。研究試料には,すベて花粉分析法を適用した。研究結果の大要は次のとおりである。2.ヒノキ林の成立期を検討した結果,次のような3つの型のあることを明らかにした。すなわち,1)長野県南木曽町田立湿原堆積物の分析結果から,この周辺においてヒノキ天然林は約7,000年B.P.から成立していたことを明らかにした。2)長野県北安曇郡唐花見湿原堆積物の分析結果から,この周辺においてヒノキ天然林は最終氷期最成期(約25,000年B.P.)に成立していたことを明らかにした。3)長野県上伊那郡大阿原湿原堆積物の分析結果から,この周辺においてヒノキ天然林は最終氷期最盛期以降も認められなかった。4)富山県下縄ケ池,白木峰,池の平,上ノ小平,弥陀ケ原などの湿原の分析結果はら,ヒノキ天然林は後氷期以降も認みられなかった。以上で明らかなように,ヒノキ林の成立とその変遷は単一でなく,地域によって特徴づけられるようである。この研究は中部地方における更新世以降のヒノキ林の成立とその変遷を明らかにし、将来におけるヒノキ林の合理的な造成や森林環境の保全、自然保護の重要な問題の解決に有益な基礎資料を得ることを目的として現在継続中である。昭和63年度にはヒノキ科樹木花粉の形態の詳細な検討と、長野県下田立湿原堆積物の花粉分析の結果を検討した。研究結果を摘記すれば、次のとおりである。1.ヒノキ科に属するChamaecyparis,Thuja,Thujopsis,Juniperus4種属の花粉壁の表面構造を明らかにするため、レプリカ法と走査電子顕微鏡を用いて研究し、各種属花粉壁の表面はUbische bodyでおおわれていることを確認し、さらに今日まで明らかにされていなかった発芽装置の形態についても明らかにした。また、超薄切片法によって花粉壁の層状構造を明らかにした、一連の研究結果から、化石花粉の同定には光学顕微鏡を用い、ヒノキ科として記録し、種属の判定には走査電子顕微鏡を用いると有効であると考察した。2.長野県南木曽田立湿原堆積物の分析結果から、次のことが明らかになった。すなわち、この湿原周辺の7000年B.P.から現在まで、Lepidobalanus・Betula時代,Lepidobalanus・Chamaecyjparis時代,Chamaecyparis・Lepidobaranus時代と3つの森林型を認めた。森林の主要な構成樹種は、ミズナラ・ダケカンバ・シラカンバなどから、ミズナラ・ヒノキへと移行し、そしてヒノキ・ミズナラ・アカマツ林へと変遷したようである。現在みられるようなヒノキの天然林は、約3500年B.P.に成立したものと推定した。なお、上記の結果は現在とりまとめ中であり、平成元年度に発表の予定である。この研究は中部地方における更新世以降のヒノキ林の成立とその変遷を明らかにし、将来同地方でヒノキ林の合理的な造成や森林環境と保全、自然保護の重要存問題の解決に有益な基礎資料を得ることを目的として現在継続中である。1.ヒノキ科に属するChamaecypris、Thuja、Thujopsis、Juniperusなど4種属の花粉壁の表面構造と属状構造を明らかにした。一方長野県南木曽町田立湿原の花粉分析を行い、かなり優勢なヒノキの天然林は約7,000坪B.P.から成立していたことを明らかにした。これらの結果はいずれも公表した。2.長野県北西部唐花見湿原の花粉分析の結果、約25,000年

B.P.から現在まで、4回にわたる森林型の変化が認められ、ヒノキ科の分布はとくに25,00017,000年B.P.と11,000現在の2つの時代に認められた。前者はThjujaとThujopsisを主とするもの、一方後者は現在のChamaecyparisに由来するものと推定された。3.長野県東部大阿原湿原の花粉分析結果によると、約26,000年B.P.から現在まで、5回にわたる森林型の変化が認められた。この湿原周辺は泥岸属形成当初から冷温帯上部ないし亜寒帯下部に属しており、ヒノキ科の樹木は花粉の飛来する範囲にわずかに分布していたようである。4.関連地域として、新潟県南部小松原湿原の花粉分析を行った。その結果、森林型は約2000年の間に3回変化したことが明らかとなった。この泥岸属形成初期にのみわずかに認められた。上記大阿原湿原の場合と同様、ヒノキ科樹木の侵入を許さない環境にあったようである。24までの結果は現在詳細な検討と、とりまとめ中であり、他日公表の予定である。この研究は中部地方における更新世以降のヒノキ林の成立とその変遷を明らかにし,将来同地方でヒノキ林の合理的な造成や森林環境と保全,自然保護の重要な問題の解決に有益な基礎資料を得ることを目的として現在継続中である。研究結果を摘記すれば,次のとおりである。1.長野県北安曇郡唐花見湿原の花粉分析を行い,最終氷期最盛期にヒノキ林は定着していたが,一時衰微した後,後氷期から再び出現して現在に至っていることを明らかにした。また,長野県上伊那郡大阿原湿原の花粉分析結果では,最終氷期最盛期以降ヒノキ科種属の分布はほとんど認められなかった。これらの結果は,いずれも公表した。2.富山県西部縄ケ池,白木峰,池の平湿原の花粉分析を行い,縄ケ池湿原では約2,500年B.P.から,白木峰湿原では約4,000年B.P.から,池の平湿原では約3,000年B.Pから現在までの森林変遷をそれぞれ明らかにした。ヒノキ科花粉の出現率は,縄ケ池湿原では112%,白木峰湿原では16%,池の平湿原では14%であり,これらの湿原周辺では優勢なヒノキ林は認められなかった。3.富山県東部上ノ小平湿原で2か所,弥陀ケ原湿原で1カ所,計3カ所で採取した堆積物の花粉分析を行った。上ノ小平湿原では約1,500年B.P.と15,000年B.P.から,また弥陀ケ原湿原では約19,000年B.P.から現在までの森林変遷をそれぞれ明らかにした。ヒノキ科花粉の出現率は上ノ小平,弥陀ケ原両湿原とも極めて低かった。このように富山県下5か所の湿原周辺では,サワラ,クロベ,アスナロなどが分布していたが,森林を形成するまでには至らなかったようであり,1.で述べた長野県下の結果とは著しく異なることを明らかにした。4.その他福井県を主とした関連地域の花粉分析結果についても現在検討中である。
遠方Ia型超新星による宇宙膨張の測定

本研究ではIa型超新星を使った宇宙膨張測定によりダークエネルギーに制限をつけることを目標としている。すばる望遠鏡に搭載されたHyper Suprime-Cam (HSC)による超新星サーベイ観測が2016年から2017年にかけての6か月間実行され、そのデータをもとに研究を進めている。2018年度は、このデータからの超新星サンプルの選定および超新星のタイプ分類、母銀河の赤方偏移の取得を行った。6か月間のHSCによる観測で、超新星は1824個が検出され、多色光度曲線を使ったタイプ分類により、433個がIa型超新星の可能性が高いことが分かった。このうち、129個に精度の高い赤方偏移情報があり、58個はダークエネルギーの時間変化を制限するのに有効な赤方偏移1以上の遠方に存在する。ハッブル宇宙望遠鏡が過去10年間に実施した各種サーベイ観測で発見された同様に遠方のIa型超新星の数が50個程度あることを考えるとHSCによる超新星探査がいかに効率的であるかが分かる。一方、多くの超新星については、精度の高い赤方偏移情報が不足しており、それらを主にオーストラリアのAnglo-Australian Telescopeに搭載された多天体分光器で観測することで487個について新たな赤方偏移を得ることができた。さらに、HSC観測による測光精度の向上、一部のサンプルについてハッブル宇宙望遠鏡で取得した赤外線データの解析などを同時に進めている。最終的な結果に至るために必要な手順は確認できており、必要な観測データもほぼ取得できている。サンプル数が大きいため必要な情報、特に、赤方偏移がすべてのサンプルについて得られない可能性があるが、本研究に重要となる赤方偏移1以上の遠方のサンプルについては国際協力で主要な大型望遠鏡を使った追観測を実施しており、大きな影響はないと考えている。一方、2018年度に実施を予定してた、別の領域での超新星探査観測が、すばる望遠鏡の立地するハワイ島での火山の噴火に伴う地震の影響や望遠鏡のトラブルなどにより2019年度に延期になっているので、研究期間内にすべての解析を終えられるかどうかは不明である。現在すでにあるデータについては、測光ゼロ点も含めたHSCによる測光精度の向上、宇宙論的解析に向けたより厳しいIa型超新星の選択基準の策定、赤方偏移を含む母銀河の性質の抽出、ハッブル宇宙望遠鏡による赤外線追観測データの処理などを進めていく必要があると認識している。これらについては、国際協力による共同研究も前提にして研究を推進していく予定である。また、2019年9月から別の領域での超新星探査観測を計画している。超新星検出のための解析処理は前回の観測で使ったものを流用する予定であるが、偽天体のふるい落としなどのために機械学習なども取り入れて、より高速化を図る予定である。
乳酸脱水素酵素にみられる酵素学的多様性とその機能構造の蛋白質工学的解析

(D-乳酸脱水素酵素の構造と機能)Lactobacillusplantarum D-乳酸脱水素酵素において、この酵素の属する脱水素酵素ファミリー酵素間で保存性の高い二残基のHis残基を、部位指定変異により他のアミノ酸に置換した変異型酵素を作製した。そしてそれらの触媒上の性質を検討した結果、本酵素のHis296がL-乳酸脱水素酵素におけるHis195に相当する役割を持つ、事実上の触媒残基であることが明らかになった。またこの酵素ファミリーの酵素間で保存されている唯一のArg残基であるArg235を他の残基に置換し検討したところ、この残基がL-乳酸脱水素酵素におけるArg171と相同な役割をもち、この残基のグアニジノ基が、基質の結合とその活性中心での正確な配向に重要な役割を持っていることが明らかになった。以上の結果よりD-型乳酸だ水素酵素はL-型酵素と一次構造上の相同性はなく、進化的に隔たった酵素であるにも関わらず、その基質結合と触媒の機構は極めて類似したものであることが示された。(L-乳酸脱水素酵素のアロステリック特性)非アロステリック型酵素であるL.plantarumの酵素はアロステリック型であるL.casei酵素と高い一次構造上の相同性を示すが、活性化因子フルクトース二リン酸(FBP)結合に重要なHis188がAspに置換されている。そこでL.casei酵素のHis188をAspに置換した変異型酵素を作製し検討した。この変異型酵素はFBPに非感受性を示したが、マンガンに対する感受性を残していた。また野生型酵素と異なり、FBP非存在下でも微弱な活性を示したが、L.plantarum酵素のような完全な活性型ではなかった。この結果はL.plantarum酵素のHis188変異酵素の結果とあわせて、His188はFBPの結合には重要であるが、それを通じての活性制御には他の部位が関与していることを示している。現在おもに両者のキメラ酵素の作製を通じてこの部位の検討を行いつつある。
相互作用する多様な砂地形集団の非線形動力学

地球上にある砂地形の代表的なものに砂丘がある。砂丘は多様な形態をとる事が知られており、その形態は風の複雑さ(方向や強さ)と砂量で大きく分類することができる。そこで、環境条件によって変化する砂丘形態の時間発展や変形過程を明らかにするために数値計算を用いて砂丘形状を定量的に調べた。時々刻々と変化する砂丘地形の動的形状を定量的に議論するために砂丘重心から砂丘表面までの距離を全角度方向にわたって計測した。次に、植生による飛砂抑制効果と植生の成長、枯死を考慮した植生砂丘数理模型を用いて放物線型砂丘、植生を含んだ横列砂丘を再現した。砂地形に代表される砂丘に注目し、風の複雑性の指標と場にある砂量を変化させたときの砂丘地形の変化を数値計算で調べた。風の複雑性としては風のベクトル和とスカラー和の比をとる値を用いている。砂丘模型としては最初saltation(飛砂)とavalanche(雪崩)の堆積過程だけを考慮した数理模型を用いた。数値計算の結果、多様な砂丘形態を再現できることがわかったので、次に、環境条件を大きく変化させた(風の複雑性を変化させる)ときの砂丘が変形する過程を詳細に調べ、それらを野外観測で得られた画像と比較した。さらに、時々刻々と変化する砂丘地形の動的形状を定量的に議論するために砂丘重心から砂丘表面までの距離を全角度方向にわたって計測することで形状変化を取り扱う手法を昨年度より改良しおこなった。最後に、砂漠の境界領域での複雑な地形や海岸地形への応用を目指し、砂丘表面上の植生を考慮した数理模型を構築した。植生模型では従来の堆積過程に加えて、"植生によsaltationの抑制効果"と"植生の成長、枯死"を考慮した。数値計算の結果、植生なしでは角の向きが風下方向を向く三日月型砂丘が、植生存在下では角が風上方向を向くという観測事実の再現に成功している。ほかにも植生の成長速度を変化させることによって、植生をともなった横列砂丘が現れることがわかった。これらの振る舞いは過去の野外観測で報告されていたものと類似している。砂丘の動態は砂漠化の拡大だけでなく砂丘移動による街の破壊など環境問題とも深く関わっている。このことから、逆問題として砂丘形態の観測から環境条件を推測できる可能性がある。砂丘は地球上だけでなく火星や他惑星にも存在しており、砂丘形態と環境の関係を解き明かす事は重要な課題となっている。そこで、本研究では従来から研究されてきた単純な風方向だけでなく風の強さの比率を複合的に変化させることで、様々な砂丘形態を計算機の中で再現することにしその形態的特徴を調べたことにした。ここで使用した数理模型は飛砂(サルテーション)となだれ(アバランチ)を素過程とした格子模型で、計算コストを大幅に削減することができ、複雑な地形形状を容易に計算機上で再現することが可能な模型である。この模型は過去の研究から実験や野外観測で得られた砂丘形態を良く再現することが分かっている。また、砂丘は単独で存在するより集団で存在することが知られていたので、単独の砂丘だけでなく、複数の砂丘を配置したときに働く砂丘間の相互作用によって形成される砂丘形態と環境条件を変化させたときのの形態変化も調べた。その結果、貧砂環境での縦状砂丘の相互作用により連結砂丘が現れることを明らかにした。砂丘は風と砂によって形成される地形であり、風の複雑性と場にある砂量の変化によって様々な形態をとることが知られている。このことは、砂丘の形態を観測することで、その場の環境条件を推測できることを意味している。環境条件と砂丘形態の相関を見ることで、火星や他の天体での環境条件を推測することができる。しかし、自然界には理想的で定常な砂丘形態ばかりでなく、未発達な砂丘や他の砂丘との衝突によって変形した形態も多く存在している。砂丘模型としては、saltation(飛砂)とavalanche(雪崩)の堆積過程だけを考慮した数理模型を用いた。また、風の複雑性としては風のベクトル和とスカラー和の比をとった指標を用いた。この模型を用いて環境条件を変化させた(風の複雑性と砂量を変化させた)ときの形状変化を数値的に評価し、それぞれの砂丘の安定性を明らかにした。次に、植生によるsaltation抑制効果と植生の成長、枯死を考慮した植生砂丘数理模型を用いて、環境条件を変化させたときの砂丘形状を植生のある場合とない場合について調べた。最後に、海岸で観測される砂地形の砂州についての数理模型を構築した。砂州形成では、特定の場所からの砂供給と波によって運搬される砂を考慮して数理模型を構築した。この数値計算の結果、野外観測でみられる砂州形状が再現することができた。風と砂で形成される砂丘は利用可能な砂量と風向の複雑性(風向場のベクトル場とスカラー場の1年間平均比)によって様々な形態をとることが知られている。

このことは、環境条件によって地形が変化するというだけでなく、地形形状から環境条件を読み取ることができることを示唆している。この環境条件の変化に対応する砂丘地形変化を計算機シミュレーションで調べるためにsaltation(飛砂)とavalanche(なだれ)を考慮した砂丘の数理模型を構築し、その変化を調べた。前年度までにおこなっていた特別な砂丘形状だけでなく変形途中の砂丘形状など、より複雑で多様な形状に応じた砂丘周りの砂の流量を測定できる手法を開発し、計算機シミュレーションを用いて調べた。その結果、縦状砂丘、横列砂丘など特徴的な砂丘だけでなく、砂丘変形過程の流砂量が風向複雑性に応じてどのように変化するかを明らかにした。また、風方向毎の高さに依存した砂量を考慮した流砂量の理論を構築し、同様に風向の複雑性への依存性を調べたところ、計算機シミュレーションと一致することがわかった。次に、この数理模型の応用として海岸域での砂丘、砂州形状を計算機シミュレーションで調べるとともに野外観測をおこなった。観測では海岸植生地域に砂丘が覆い被さる地域を調べたところ、その侵食域では植物の枯死状態が見られた。また、海岸域では2重の砂州が観測され、その形成条件を計算機シミュレーションで調べた。論文の執筆がやや遅れているが、複雑な風向場での砂丘形状の流砂量を計算機シミュレーション及び理論により記述できるようになったことから研究自体は研究計画に沿って進んでいるといえる。砂丘は風と砂で形成され、現地で利用可能な砂量と1年間で卓越する風向の複雑性などの環境条件によって多様な形態(三日月型、横列、縦列、星型、涙型など)をとる。これらの形態は環境条件によって変化するため、その形態から逆に環境条件を読み取ることができる。砂丘は砂漠だけでなく海岸などでも観測され、その一部には植生が存在する地域もある。この植生の生育条件や植生分布によって砂の動きは影響を受け、そのことが砂丘の形状に大きな影響を与える。この現象を調べるために砂丘地形変化と植生成長を数理模型で記述し計算機シミュレーションを用いて調べた。シミュレーショでは砂の動きを表す為にsaltation(飛砂)とavalanche(なだれ)を考慮し、植生には植物の成長と枯死及び植生によるsaltationの抑制効果を考慮した。また、初期条件として海岸線を模した一様な砂の供給状態をとった。シミュレーションの結果、砂の供給量が少ない場合にはparabolic dune(放物線型砂丘)とよばれる風下側に角を向けた特徴的な砂丘が出現した。また、砂量を増やしていくと植生とないときと同様に横列砂丘が発達してきた。さらに、砂量を増やした時には大きな分断された砂丘群がところどころに出現した。出現した砂丘群はお互いに相互作用することが少なく、それぞれが孤立した状態で移動していた。これらは植生の成長によるsaltationの抑制効果によることが推測される。また、特殊な初期条件として孤立した砂丘を準備し、その形態変化の時間発展を調べたところ風と垂直方向に大きく伸びていくことがわかった。地球上にある砂地形の代表的なものに砂丘がある。砂丘は多様な形態をとる事が知られており、その形態は風の複雑さ(方向や強さ)と砂量で大きく分類することができる。そこで、環境条件によって変化する砂丘形態の時間発展や変形過程を明らかにするために数値計算を用いて砂丘形状を定量的に調べた。時々刻々と変化する砂丘地形の動的形状を定量的に議論するために砂丘重心から砂丘表面までの距離を全角度方向にわたって計測した。
四季成り性を消失した変異株を用いたイチゴ季性遺伝子の解析

一季成り性や四季成り性といった「季性」は、適応度や繁殖戦略と密接に関わり、農業上も極めて重要な形質である。栽培イチゴにも四季成り性が知られているが、栽培イチゴは8倍体であるためゲノム解析が難しく、どのような遺伝子により支配されているのかは明らかになっていない。申請者らは、近年、四季成り性遺伝子周辺に構造変異が生じたために一季成り状態になったと考えられる栽培イチゴの変異株を発見した。本研究では、四季成り性遺伝子周辺以外は同じバックグラウンドをもつと推定される正常株と変異株の交雑F2集団を材料として、正常株だけがもつ塩基配列を特定することで、季性というダイナミックな生活史の変化をもたらしている遺伝子を明らかにすることを目的としている。本年は、実施計画に基づき、正常株と変異株の交配により得たF1個体について、自然日長下での季性判定を行うとともに、これまでに開発した四季成り性連鎖マーカーを用いて、四季成り性遺伝子型を明らかにした。正常株と変異株を交配すると、四季成り性遺伝子座について4つの遺伝子型が出現するが、上記の分析結果に基づき、F2集団を育成するための交配母本として、四季成り性遺伝子型がex(正常四季成り性遺伝子と変異遺伝子のヘテロ型)およびej(正常四季成り性遺伝子と正常一季成り性遺伝子のヘテロ型)を示すF1個体を選定した。それぞれの個体について自家交配を行い、自殖種子を得た。得られた種子を播き、F2集団を育成した。当初の計画どおり、表現型および四季成り性連鎖DNAマーカー分析に基づいてF1個体の季性判定および四季成り性遺伝子型判定を実施し、その結果に基づく交配母本の選定、ならびに自殖種子の採種、播種、F2集団の育成を進めた。F2個体の季性を自然日長下で判定する。F2個体、親のF1個体、F1の両親2個体を含む個体について、次世代シーケンサーを用いて塩基配列を取得し、季性データを用いたQTL解析を行う。次年度使用額433円は、研究費を効率的に使用して発生した残額であり、次年度の研究費と合わせて、研究計画遂行のために使用する。
ベトナム南部における食中毒原因菌の薬剤耐性化に関する調査研究

本研究では、ベトナムの食品から、食中毒原因菌であるカンピロバクター、サルモネラ、リステリアを分離し、薬剤耐性能を明らかにすることにより、ヒトに感染した場合のリスクを評価する。また、ESBL産生及びコリスチン耐性大腸菌を分離し、薬剤耐性遺伝子がコードされているプラスミドを比較解析し、食品を介しての薬剤耐性プラスミドの拡散頻度と伝播様式を明らかにすることを研究目的としている。そのために、H30年12月に日本側メンバーによる国内ミーティングを行い、日本側メンバーの顔合わせを行うと同時に研究概要の説明を行い、さらに本研究で標的としている薬剤耐性大腸菌及び食中毒原因菌について分離手法に関する意見交換を行った。H31年2月下旬に、ベトナム側研究機関であるホーチミン公衆衛生研究所及びカントー大学水産学部に訪問し、日越両メンバーの顔合わせをすると同時に研究概要の説明を行った。また、ベトナム側研究機関の研究施設を視察するとともに、現地研究員と意見交換を行い、現地研究機関における技術レベルの把握を行った。その後、ベトナム側研究機関の現状把握を踏まえた上で、日本側で分離法の再検討を行った。再検討後、ベトナム側研究機関から同意を得たのち、カンピロバクター、サルモネラ、リステリアに関して分離法を決定した。薬剤耐性大腸菌、アエロモナスに関しては選択培地によって抗生物質に影響が有ることが判明しために、現在、追加の予備実験を行い、培地の検討を行っている所である。日本の研究機関とベトナムの研究機関では保有している機器や微生物の取り扱い技術に差があるために、日本で行う研究方法をベトナムで行うことはできない。よって現地に適した分離法を決める必要がある。H31年2月の最初の渡航では、顔合わせ及び研究概要を説明するのと同時に、現地での研究機器の有無や研究員の食中毒原因菌の取り扱い経験等のベトナム側研究機関及び研究員の現状を把握することを目的としていたために、それらは予定通り行えており、計画は順調に進展していると考えている。本年度は、実際に現地にて、食品から薬剤耐性菌及び食中毒原因菌の分離を行う予定である。現在予定では、本年4月から5月中旬までに薬剤耐性大腸菌及びアエロモナスの分離方法を確定させる。その後、本年5月下旬にカントー大学へ行き、カントー市の市場から水産食品10検体から薬剤耐性サルモネラ、大腸菌、アエロモナスを分離する予定ある。また、本年8月にはホーチミン市において、鶏肉及び野菜50検体を目標にカンピロバクター、リステリア、薬剤耐性サルモネラ、大腸菌を分離する予定であり、これらの渡航においては、現在、ベトナム側研究機関と綿密な打ち合わせを行っている最中である。加えて、本年度冬にカントー大学に訪問して、水産食品10検体を調査する予定であるのと同時に、ホーチミン公衆衛生研究所にも訪問し、8月に分離した菌について解析を進める予定である。

加えて、本年度冬にカントー大学に訪問して、水産食品10検体を調査する予定であるのと同時に、ホーチミン公衆衛生研究所にも訪問し、8月に分離した菌について解析を進める予定である。2月下旬に、ベトナム側研究機関へ渡航したが、その際、日本側メンバーの1人が忌引きにより、渡航をキャンセルした。また、渡航の際、現地において借り上げ車両を使用した際の領収書を現地の会社が用意していなかったために、旅費精算の手続きが遅れ、次年度決済に旅費精算が行われることになった。これら2つの理由により次年度使用額が生じた。
薬用植物資源の確保と活用に関するデータベースの体成

現在,日本の国公立大学薬学部には薬用植物園の設置が義務づけられ,それぞれに多数の薬用植物を保有して教育研究に利用しているが,それらが相互に,或は外部より利用易い形にまとめられていない.本研究は,わが国の国公立大学薬用植物園施設に裁培されている教育研究用植物を共通のデータベース上に記録し,教育研究上一層活用し易い様に情報の整理を行うとともに,それらを生産利用や新しい薬物開発に役立たせることを目的として,国公立大学薬用植物園園長会議の要請に基き,本年度に発足し,全国公立大学薬用植物園が参加して行われたものである.本研究では,まず,全国公立薬用植物園について保有植物目録を整備完成させ,それに基いて,植物学名,和名,科名,薬用資源としての価値,の4項目についてデータベース化を行った.これらについては各大学所有のパーソナルコンピュータによって処理可能となり,各大学所有の葉用植物を一度に比較検討することができる様になった.この間,数度の体葉委員会及び全体会議を開催して見解の統一を計るとともに,新たな情報のデータベース化にともなう問題点について検討討議した.新たな情報としての個体識別(別名,由来),植物学的事項(裁培特,遺伝子源としての利用),教育利用項目(成分,葉理,用途,文献)等については,未だフォーマットに関する統一見解がえられず今後の検討課題として残されており,それにともなう大型コンピュータ使用の問題も次年度以降の課題となっている.本研究は本年発足したばかりであり,まだまだ検討すべき課題は多い.今後機会をとらえ,当初の目的であるより充実したデータベースの完成をはかりたい.なお,本年度の研究成果ならびに現段階のデータベースについては4月末に刊行の予定である.現在,日本の国公立大学薬学部には薬用植物園の設置が義務づけられ,それぞれに多数の薬用植物を保有して教育研究に利用しているが,それらが相互に,或は外部より利用易い形にまとめられていない.本研究は,わが国の国公立大学薬用植物園施設に裁培されている教育研究用植物を共通のデータベース上に記録し,教育研究上一層活用し易い様に情報の整理を行うとともに,それらを生産利用や新しい薬物開発に役立たせることを目的として,国公立大学薬用植物園園長会議の要請に基き,本年度に発足し,全国公立大学薬用植物園が参加して行われたものである.本研究では,まず,全国公立薬用植物園について保有植物目録を整備完成させ,それに基いて,植物学名,和名,科名,薬用資源としての価値,の4項目についてデータベース化を行った.これらについては各大学所有のパーソナルコンピュータによって処理可能となり,各大学所有の葉用植物を一度に比較検討することができる様になった.この間,数度の体葉委員会及び全体会議を開催して見解の統一を計るとともに,新たな情報のデータベース化にともなう問題点について検討討議した.新たな情報としての個体識別(別名,由来),植物学的事項(裁培特,遺伝子源としての利用),教育利用項目(成分,葉理,用途,文献)等については,未だフォーマットに関する統一見解がえられず今後の検討課題として残されており,それにともなう大型コンピュータ使用の問題も次年度以降の課題となっている.本研究は本年発足したばかりであり,まだまだ検討すべき課題は多い.今後機会をとらえ,当初の目的であるより充実したデータベースの完成をはかりたい.なお,本年度の研究成果ならびに現段階のデータベースについては4月末に刊行の予定である.
網羅的なT細胞受容体解析技術を用いた抗原特異的T細胞の機能的階層性の検討

ヒト免疫応答システムにおいて抗原特異的T細胞レパトワがどのように基準にもとづいて構成されているかを明らかにするために、次世代シークエンサー(NGS)とシングルセルソーティング技術を用いて、サイトメガロウイルス(CMV)既感染者の末梢血に存在するCMV特異的TCRの網羅的・定量的解析と特異性・機能解析を行った。CMV特異的T細胞レパトワは各クロノタイプの定量性とそれらが保有するTCRの抗原ペプチドとの結合力、個人間の共有性には正の相関性があり、特にstem cell memory T細胞サブセットにおいて、複数の個人間での共有性の高いTCRを保有するクロノタイプが多く存在することが確認された。ヒトの獲得免疫応答の主役を担うT細胞はT細胞受容体(TCR)の遺伝子再構成により膨大なる多様性を獲得し病原体や腫瘍の発生および進展に対する抑制的な機能を発揮している。本研究では、次世代シークエンサー(NGS)を用いたハイスループット解析技術によりウイルおよび腫瘍抗原を認識するTCR遺伝子配列の網羅的・定量的解析と特異性・機能解析を同時に行い、TCR遺伝子導入T細胞を用いた養子免疫T細胞療法を開発するための基礎的知見を得ることを目的とする。本年度は、健常者の検体を用いて末梢血中に循環しているウイルス・腫瘍抗原を特異的に認識するT細胞の検出とそれらに発現している抗原を特異的に認識するT細胞レセプター(TCR)のレパトワ解析を行った。まず、ウイルス抗原特異的T細胞の解析をするためにサイトメガロウイルス(CMV)、Epstein-Barrウイルス(EBV)既感染者から採取したリンパ球をCMVpp65抗原由来のペプチド(NLV, QYD)、EBV BRLF1抗原由来のペプチド(TYP)を用いて試験管内で感作させ反応したリンパ球を、それぞれの抗原に対するMHC/ペプチド四量体を用いて染色し、フローサイトメトリーを用いて検出および分離しTCR遺伝子配列をもとにそのレパトワ解析を行い、さらに単一細胞分離技術により個々のT細胞のTCRα鎖とβ鎖のペア遺伝子配列の同定し、TCR欠損T細胞株に遺伝子を導入することによりTCRと抗原ペプチドとの結合能の検証を行った。これらのウイルス抗原を特異的に認識するT細胞のレパトワは偏在傾向を示しており、特にCMVpp65-NLV抗原に反応するT細胞においてはそのT細胞レパトワの偏在性はTCR-ペプチド間の結合力に強い相関性を認めており、これは抗原刺激によるT細胞クローンの選択的増幅にはTCRと抗原ペプチドとの結合能が重要であることが示していると考えられる。健常者5人の末梢血検体を用いてウイルス抗原(CMVpp65、EBV BRLF1)を特異的に認識するTリンパ球集団を同定し、それらに発現しているTCRのα鎖β鎖ペア遺伝子配列を同定し、TCRレパトワ解析およびそれらの抗原特異性の検証を行った。本研究では、次世代シークエンサー(NGS)とシングルソーティング技術を用いてウイルスおよび腫瘍抗原を特異的認識するTCRの網羅的・定量的解析と特異性・機能解析を行った。健常者の末梢血に存在するウイルス抗原(サイトメガロウイスル[CMV]、EBウイルス[EBV])、腫瘍抗原(W-11、MART-1)特異的T細胞群を試験内で各抗原ペプチドで感作増幅させ、テトラマーを用いて検出し、シングルセルソーティング技術を用いて個々のT細胞が有するTCRα鎖とβ鎖のペア遺伝子配列の同定を行い、全108種のTCRαβペア遺伝子配列(CMV:51種, EBV: 27種, WT-1: 12種, MART-1:18種)を同定した。さらにCMVpp65 NLVを特異的に認識する各TCRのNLVペプチドとの結合力を検証したころ、感作増幅させたT細胞における各クロノタイプの存在頻度とそれらが保有するTCRの結合力には正の相関性を認めた。また増幅性が高く定量的に存在頻度の高い上位のクロノタイプほど、異なる個人間で共有性の高いTCR(shared TCR)を有する傾向認めた。T細胞サブセットごとにshared TCRを有するクロノタイプの頻度を解析したところ、自己複製能と多分化能を有するStem cell memory T細胞サブセットにおいて特にshared TCRを有するT細胞クロノタイプが多く存在することが確認された。これらの結果は、CMV抗原を特異的に認識するT細胞群には、TCRの機能性および共有性に基づいた階層性が存在することを示唆するものと思われる。

次に腫瘍抗原を特異的に認識するTCRの解析を行うためにウイルス抗原特異的TCRの解析法と同様に、NY-ESO-1、WT-1、MART-1などの腫瘍抗原由来のペプチドを用いてリンパ球を感作増幅させ、それらに反応したT細胞をMHC/四量体ペプチド染色とフローソーティング技術を用いて分離しTCR遺伝子配列の取得およびその機能解析を行う。抗原ペプチドを特異的に認識し、その結合力が高いTCRに関しては臨床応用に用いることができる可能性があるため、ヒト末梢血T細胞にそれらTCR遺伝子を導入し、抗原特異性、増殖性、細胞傷害活性を発揮できるかの検証を行う。免疫学本研究における検体量の測定のために高感度測定を可能とする超微量分光光度の購入を検討していたが本機に関しては学内の共同使用機を利用することにより購入を断念し、消耗品となる実験試薬および器具の購入のみとなっため次年度使用額が生じた。次年度使用額の使用計画は消耗品となる実験試薬の購入、国内旅費(国内学会研究成果発表)、外国旅費(国際学会研究成果発表)、論文英文校正・投稿費用を計上した。
レトロトランスポゾンを介した新しい宿主-RNAウイルス間相互作用の探索と解析

ボルナ病ウイルス(BDV)の配列は逆転写され、宿主ゲノムに取り込まれる。この反応には、BDVと宿主レトロトランスポゾンであるLINEとの相互作用が関与すると考えられている。しかし、その生理的意義やLINE自身の生理機能については不明であった。本研究では、ウイルスとLINEとの相互作用と、その相互作用の結果生じたゲノム中のウイルス由来配列の生理的意義を解明した。その結果、BDV感染がLINE活性に影響すること、ゲノム中のBDV由来配列からはpiRNAが発現し、BDV mRNAを抑制することを見出した。以上より、LINEはウイルス配列の取り込みを促進し、宿主にウイルス抵抗性を賦与すると考えられた。最近、我々は、RNAウイルスであるボルナ病ウイルス(BDV)の配列が、レトロトランスポゾンであるLINEによって逆転写され、宿主ゲノムにインテグレーションされることを明らかにした。さらに、LINEは、BDV以外のRNAウイルスの配列も逆転写することが報告されてきている。これらは、LINEとRNAウイルスとの間に相互作用が存在する証左である。我々は現在までに、LINE転移活性の高い細胞では、BDV感染に対する抵抗性が生じていることを見出している。本研究では、このLINEによるBDV感染抵抗性賦与メカニズムを明らかにする。本年度の研究においては、LINEにより挿入された配列がウイルス感染を制御する方法について解析し、レトロトランスポゾン-RNAウイルス間相互作用について以下の結果を得た。1)ヒトゲノムに存在する内在性ボルナウイルス配列(endogenous bornavirus-like nucleoprotein: EBLN)がヒト組織において、RNAとして発現していることを見出した。2)ボルナウイルスのインテグレーションにより、周囲の遺伝子の発現が変化した可能性を見出した。特に、ヒトEBLN-1は近傍の遺伝子COMMD3の発現を制御し、宿主の自然免疫活性をあげる可能性が考えられた。3)ボルナウイルスのインテグレーションが、宿主ゲノムのpiRNAクラスター(低分子RNAであるpiRNAを産生するゲノム領域)近傍に起こったことを見出した。ここから産生されたpiRNAは、ボルナウイルスの配列に対しアンチセンス側であり、ウイルスを制御する可能性が考えられた。このように本年度は、レトロトランスポゾン-RNAウイルス間相互作用について当初の計画以上の成果をあげることができた。平成27年度の研究計画では、2つの小課題を提案していた。1つは、各種LINE変異体の作成である。すでに、LINEのプロモーター領域のみ、ORF1のみ、ORF2のみをコードする変異体を作出済みである。本小課題は計画通り進展していると考えられた。もう一つは、LINE活性制御方法の開発である。この小課題については、活性変化をもたらす化合物スクリーニングを行ったが、まだヒット化合物は得られていない。一方、LINEタンパク質と相互作用する分子の候補をいくつか単離した。今後、その結合を検証する予定である。以上のことより、本小課題についてもおおむね順調に進展していると判断した。さらに、本年度はLINEより生じた内在性RNAウイルス配列の解析から、LINEが賦与する抗ウイルス活性の実態が明らかになりつつある。このことは、今後展開する予定のLINE-ウイルス間相互作用の解析において研究の最終的な目標の候補を示す知見であり、重要である。つまり、本年度得られた情報は、本研究の方向性をある程度指し示す成果であると言える。全体として、当初の計画より若干の変更点はあるが、大きな追加データがあり、本研究の目的達成に向けて当初の計画以上に進展していると考えられる。最近、我々はRNAウイルスであるボルナ病ウイルス(BDV)の配列が、レトロトランスポゾンであるLINEによって逆転写され、宿主ゲノムにインテグレーションされることを明らかにした。これは、LINEとRNAウイルスとの間に相互作用が存在する証左である。本研究では、このLINEによるウイルス感染抵抗性賦与メカニズムを明らかにする。本年度の研究において、LINEにより挿入された配列がウイルス感染を制御する方法について解析した。また、レトロトランスポゾン-ウイルス間相互作用を解析する上で有用な、病原性の明らかなウイルス感染モデルの構築を行った。(1)平成27年度に見出した内在性ボルナウイルス配列(endogenous bornavirus-like elementfrom N gene: EBLN)からのpiRNA産生の意義を検討した。piRNAなどの低分子RNAの機能として、それらがウイルスRNAをダウンレギュレーションするという可能性がある。これを検証するために、microRNAを発現するBDVを作成した。しかし、BDV由来microRNAは、BDV RNAと相補的ではあるが、BDV RNAをダウンレギュレーションしなかった。(2)BDVのヒトへの病原性ははっきりしない。これを明らかにするプラットフォームとして、信頼性の高い血清中抗体の評価方法を確立し、BDV抗体陽性の小児自閉症症例を見出した。(3)病原性が明らかなウイルスとして、がんウイルスであるB型肝炎ウイルス(HBV)がある。HBV慢性感染の間に、HBV遺伝子とLINEとのキメラ遺伝子が生じる。このキメラ遺伝子はレトロトランスポゾン-ウイルス間相互作用のよい例であると考え、その意義について研究を開始した。平成28年度の研究計画では、2つの小課題を提案していた。しかし、平成28年度は大阪大学への異動により、新しい研究の立ち上げに時間を要した。そのため、若干の研究計画の変更を余儀なくされた。

最も大きな変更として、ヒトへの病原性を強く意識し、BDVの病原性の再評価と病原性のはっきりしたHBVの研究立ち上げを行った点である。その結果、レトロトランスポゾン-ウイルス間相互作用についてより表現型に基づく解析が行える環境が整ったと考えられる。(1)前年度の延長として、低分子RNAが実際にウイルスゲノムRNAを制御できるか検証した。その結果、少なくとも低分子RNAが直接ウイルスゲノムRNAを切断したりする可能性が低いことが明らかとなった。このことは、今後の解析の焦点を他の可能性に集中させることにつながり、重要な成果であると考えられる。以上のことより、本小課題についてはおおむね順調に進展していると判断した。(2)LINE活性制御方法の開発については引き続き化合物スクリーニングを行っている。しかし、まだヒット化合物は得られていない。今後、別の化合物ライブラリーを用いてスクリーニングする予定である。(3)HBV研究の立ち上げについては順調に進んでいる。各種遺伝子発現プラスミドや、抗体の整備、HBV-LINEキメラ遺伝子発現プラスミドの構築などが終了している。今後、それらを用いた解析を進めていく予定である。全体として、変更点もあるが、本研究の目的達成に向けて、概ね順調に進展していると考えられる。最近、我々は、RNAウイルスであるボルナ病ウイルス(BDV)の配列が、レトロトランスポゾンであるLINEによって逆転写され、宿主ゲノムにインテグレーションされることを明らかにした。これらは、LINEとRNAウイルスとの間に相互作用が存在する証左である。本研究では、LINEとウイルスとの相互作用を明らかにする。本年度の研究において、LINE関連ウイルス配列がウイルス感染を制御することを以下の通り明らかにした。(2)BDV配列のゲノムへの取り込みを考える上で、BDVが発現するRNAの種類を正確に把握することは重要である。本年度、BDVが発現する新しいRNA (leader RNA)を発見し、報告した。しかし、このleader RNAはcap-polyA構造を持たないと考えられ、宿主ゲノムにはmRNAタイプが主に取り込まれることから、leader RNAがゲノムに取り込まれる可能性は低いと考えられた。(3)病原性が明らかなウイルスとして、がんウイルスであるB型肝炎ウイルス(HBV)がある。HBV慢性感染の間に、HBV遺伝子とLINEとのキメラ遺伝子が生じる。HBV-LINEキメラ遺伝子は、EBLN同様、HBV複製を制御する可能性が見出された。ボルナ病ウイルス(BDV)の配列は逆転写され、宿主ゲノムに取り込まれる。
活動銀河核からの超高エネルギーガンマ線の探索

1.活動銀河核の観測:CANGAR00-II 10メートル望遠鏡で、PKS2155-304、PKS2005-489、PKS0548-322、Mrk421の4つのHBLをそれぞれ観測した。このうちPKS0548-322は天候の関係で十分な観測が行えなかった。また、Mrk421を除いては低活動状態であった。(1)PKS2155-304:平成12年8月及び12月のX線天文衛星RXTEとの同時観測を含め、オンソーススキャン36時間、オフソーススキャン35時間観測した。有意な信号は得られず、2σのフラックス上限値として1.2×10^<-11>cm^<-2>sec^<-1>(>400GeV)を得た。平成13年度にはさらに11時間観測しており、目下解析中である。(2)PKS2005-489:平成12年8月にRXTEとの同時観測を、9月にはRXTEを含む多波長同時観測を行った。それを含め、オンソーススキャン33時間、オフソーススキャン31時間の観測で、有意な超過事象は観測されず、6.4×10^<-12>cm^<-2>sec^<-1>(>450GeV)という上限値を得た。(3)Mrk421:活動期のMrk421を大天頂角度法で観測し35TeVまでエネルギースペクトルが伸びていることを確認した。予想される赤外吸収によるカットオフが見られず、活動期にはエネルギーが高エネルギー側に相当伸びていることが示唆される。2.パターントリガーモジュールの開発:計算機シミュレーションにより、エネルギー閾値を下げるためのトリガー条件の最適化を行った。その結果、クラスタリングトリガーの有効性を確認した。ロジック判定の心臓部に、ロジックの変更が容易なCPLDを採用し、シミュレーションと評価版ボードによるテストの結果、トリガー信号の出力までに要する時間が30nsec以下で、チャンネル毎のばらつきが15nsec以下のチップとしてアルテラ社のEPF10K130EQC240-1を選んだ。CPLD搭載のトリガーモジュール基板を開発し、実験室でのテストの後、来月現地での評価テストを計画している。CANGAROO-II望遠鏡は、この1年間でDAQ用CPU/OSの変更による処理速度の向上等を行い、エネルギー閾値を350GeV(preliminary)まで下げることに成功した。観測目標とした活動銀河核はPKS0548-322、PKS2005-489、PKS2155-304、Mrk421の4つのHBLである。このうち、PKS2005-489については、8月にRXTEとの同時観測を、9月にはRXTEを含む多波長同時観測を、PKS2155-304とPKS0548-322については、8月と12月にそれぞれRXTEとの同時観測を行った。これらの観測期間中は、各天体は低活動状態にあった。

Mrk421に関しては、1月から現在にいたるまで高活動状態に入っており、10TeV領域という超高エネルギー領域での観測を行い、目下鋭意解析中である。PKS2005-489とPKS2155-304は解析が順調に進んでおり、3月末より国際会議や学会での発表を予定している。現在の予備的な結果では、いずれの活動銀河核からも統計的に有意な信号は得られていない。PKS2005-489についてはオンソーススキャン33時間、オフソーススキャン31時間の観測で2σのフラックス上限値7.0×10^<-12>cm^<-2>sec^<-1>(>350GeV)を得ている。また、PKS2155-304については、オンソーススキャン36時間、オフソーススキャン35時間の観測で2σのフラックス上限値6.9×10^<-12>cm^<-2>sec^<-1>(>350GeV)を得ている。これらの上限値はいずれもStecker et al(1996)の予言値とほぼ同レベルであるが、彼らは銀河間赤外吸収を過大評価しているため、実際にはここで得られた上限値はSSCモデルにかなりの制限をつけることができるはずである。来年度は、7m鏡のデータも加えさらに解析を進めるとともに、RXTEなど他波長の観測結果を入手し、超高エネルギーガンマ線の観測結果と合わせてSSCモデルについて検討する。1活動銀河PKS2155-489及びPKS2005-304の観測及び解析:CANGAROO-II 10メートル望遠鏡で、PKS2155-304とPKS2005-489をそれぞれ観測した。解析に用いたオンソースの有効観測時間はそれぞれ18時間と17時間で、いずれも有意な超過事象は観測されず、1.2×10^<-11>cm^<-2>sec^<-1>(>400GeV)と6.4×10^<-12>cm^<-2>sec^<-1>(>450GeV)という上限値を得た。また、X線天文衛星RXTEを中心とする多波長観測キャンペーンにも延べ20日間参加した。2001年度には、PKS2155-304をさらに11時間観測しており、目下解析中である。2活動銀河Mrk421の観測と解析:活動期のMrk421を大天頂角度法で観測し35TeVまでエネルギースペクトルが伸びていることを確認した。予想される赤外吸収によるカットオフが見られず、活動期にはエネルギーが高エネルギー側に相当伸びていることが示唆される。3超高エネルギーガンマ線の光学的深さの計算:現在得られている赤外背景放射密度の観測から得られたリミットを用いて、上記の活動銀河核までの超高エネルギーガンマ線の光学的深さを計算した。これらを用いて観測で得られたフラックス上限値から、ソースでのエネルギースペクトルの上限値を求めた。4パターントリガーモジュールの開発:計算機シミュレーションにより、エネルギー閾値を下げるためのクラスタリングトリガーの有効性が確認できたので、それを実現するトリガーモジュール基板の開発に力を入れた。、ロジックの変更が容易なCPLDを採用し、シミュレーションと評価版ボードによるテストの結果、トリガー信号の出力までに要する時間が30nsec以下で、チャンネル毎のばらつきが15nsec以下のチップとしてアルテラ社のEPF10K130EQC240-1を選んだ。現在実装されたボードのテスト中である。
IP3 受容体type2 の細胞内局在に関する分子メカニズムの解明

I型IP3RはPKAによってリン酸化され、Ca2+放出能が増強される。しかしIRAG/PKG Iβが共存すると、これらと複合体を形成し、PKAによるリン酸化とそれによるCa2+放出能の増強は消失する。一方II型IP3RはIRAG/PKG Iβと複合体を形成してもPKAによりリン酸化され、Ca2+放出能が増強される。IP3RとIRAGの結合領域は、I型ではPKAによってリン酸化されるセリン残基とは近接していたが、II型では離れていた。よって、I型IP3Rでは複合体の形成がPKAによるリン酸化にとって立体障害となることが示唆された。唾液腺細胞内でイノシトール1,4,5三リン酸受容体(IP_3R)は管腔側に局在し、これを介した細胞内カルシウムイオン(Ca^<2+>)プールからのCa^<2+>動員は唾液分泌において必須である。しかし現在の所、「なぜIP_3Rが特異な細胞内局在を示すのか」という根本的な疑問に対する研究にまでは至っていない。我々はこれまでにIP_3R type 2(IP_3R2)がDT40細胞内のある局所に集中局在することを発見した。そこで今回、我々は研究課題名を「IP_3R2の細胞内局在に関する分子メカニズムの解明」とし、DT40細胞をモデル系として、IP_3R2が小胞体に組み込まれた後、ある別の分子がIP_3R2特異的に結合し、IP_3R2をある特定の小胞体部位に集中局在させているとの仮説をたて、この分子の同定を試みた。そこでまず今年度は、野生型IP_3R2を発現しているDT40細胞にのみ認められたIRAGの集中局在が、IRAGとIP_3R2との特異的結合によるものであることをより確実にするために、IP_3R2分子内におけるIRAG結合領域の同定を試みた。IP_3R2分子を構成する5つのサブユニット構造をmycタグ融合型分子としてクローニングし、GFP融合型IRAGとともにCOS-7細胞に共発現させ、抗GFP抗体を用いた免疫沈降法にてIRAGと特異的に結合するサブユニット構造の同定を試みた。その結果、IRAG分子はIP_3R2分子内のN末端から3番目のサブユニット分子と免疫沈降されてきた。さらに、同定したサブユニット分子のC末端側より段階的に欠失させたさまざまな欠失変異体をクローニングし、同様の免疫沈降法を用いて、より小さな結合領域の探索を試みた。その結果、IP_3R2分子内の1542番目のアラニンから1561番目のロイシンに挟まれた領域がIRAG分子との結合に重要である事が示唆された。我々はこれまでにIP_3R type2(IP_3R2)がDT40細胞内のある局所に集中局在することを発見した。まず、野生型IP_3R2を発現しているDT40細胞にのみ認められたIRAGの集中局在が、IRAGとIP_3R2との特異的結合によるものであることをより確実にするために、IP_3R2分子内におけるIRAG結合領域の同定を試みた。前年度と今年度の実験から、IRAG分子はIP_3R2分子内のN末端から3番目のサブユニット分子と結合すること、さらに、同定したサブユニット分子のC末端側より段階的に欠失させたさまざまな欠失変異体をクローニングし、同様の免疫沈降法を用いて、より小さな結合領域の探索を試みた結果、IP_3R2分子内の1541番目のバリンから1580番目のアルギニンに挟まれた40アミノ酸残基がIRAG分子との結合に重要である事が判明した。そこでこの領域を欠損させた変異型IP_3R2をクローニングし、変異型IP_3R2、IRAG、PKG1βをCOS-7細胞に共発現させ、変異型IP_3R2がIRAG/PKG1β複合体と複合体を形成しない事を確かめた。