hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
外的リソースを導入した教授・学習方法の構築と教師教育への適用

本研究の目的は、児童生徒が関わる様々な外的リソースが科学的な概念の形成に有効に働いていくのかを明らかにし、その上で、科学的な概念の形成を図るための理科の教授・学習方法を構築し、教師教育へ提供していくことである。12の事例研究を行った結果からは、物や人といった外的資源を用意することで問題の解決に必要な制約が顕在化され、科学的な概念形成に有効に機能することを示すことができた。こうした成果を公開し、教師教育への適用を図った。本研究は、理科授業の中で(1)児童生徒が関わる様々な外的リソースが、思考活動にどのように作用し科学的な概念の形成に有効に働いていくのか、(2)児童生徒の外的リソースの利用に問題はないのかを明らかにする。その結果を踏まえ、外的リソースに基づく科学的な思考力や概念形成を促すための理論的なフレームワークをつくる。その上で、科学的な思考力や科学的な概念の形成を図るための理科の教授・学習方法を構築する。さらに、構築した教授・学習方法をインターネットや研修会の機会を活用しながら広く社会に提供していくことを目的としている。国内外の先行研究を総括した結果からは、外的資源には、認知負荷の軽減をするという効果があり、A解決のプロセスを減らすことができる、内部と外部の双方向の視点からの検討ができる、顕在化や操作可能性を持つ、問題が分散することで課題が変化するなどの効果があることの成果をみることができることが分かった。外的資源があることで、頭の中だけで考えるよりも多くの解決方法を検討できること、目的とする情報を得るまでの必要なアプローチを減らすことができる効果があるということである。そこで、研究者と小中学校の教師により教授・学習方法の構築を図り、外的資源のもつ顕在化及び操作可能性ということに着目した2つの検証授業を行った。顕在化の効果を調べた慣性の法則の授業では、外的資源として発泡スチロール球を水の上に入れて観察させることが、科学的な見方や考え方につながる気づきに大きな影響を与えることが指摘できた。また、操作可能性について検討した葉の付き方の学習では、モデル化する際の茎の素材により概念形成に影響を及ぼすことを見て取ることができた。本研究は,理科授業の中で児童生徒が関わる様々な外的リソースが思考活動にどのように作用し科学的な概念の形成に有効に働いていくのか,児童生徒の外的リソースの利用に問題はないのかを明らかにしながら,科学的な概念形成を図るための理科の教授・学習方法を構築し,構築した教授・学習方法を広く社会に提供していくことを目的としている。平成21年度の研究は,1.人間の認知活動に外的リソースがどのように働くかを明らかにする,2.外的リソースを活用した教授・学習方法の構築を行うとともに,構築した教授・学習方法により授業の効果を検証する,ということに重点をおいて進めた。その結果,1.については,これまでの認知科学研究の成果をまとめてみると,外的資源は問題表象を構築する際に必要な知識や問題構造,ルールといった内的制約を外に顕在化する機能や,問題内の対象の物理的な操作,特性,効果の理解を容易にさせる機能があるといえることが明らかにすることができた。2.については,1の結果を踏まえ外的資源のもつ顕在性及び操作可能性ということに着目し実験授業を行ってみた。顕在性に着目して実施した実験授業からは,外的資源の持つ顕在性の機能は学習者に観察すべき視点を明確に促し,科学的な概念の形成に有効に働くことが示唆された。また,Beveridge&Parkins(1987)の研究に基づき顕在性の要因×操作可能性要因を設定した実験授業からは,理科授業における問題解決においても外的資源は必要な制約が顕在化され,操作可能となることで初めて問題解決に効果的に機能する様子を示すことができた。加えて,科学的な概念の形成に有効であることも示唆された。近年の認知科学研究からは、人間の思考活動は外の事物との相互作用として成立するものであり,道具といった外的資源は人間の行動を誘発する情報を持つとされ,物理的環境,人工物,他者,社会等といった外界の情報を無秩序な異物と見なすのではなく,我々の認知が依存し,認知課題を実行する際に利用し得る資源として捉え直すようになった。しかし、外的リソースをいかに活用したら人間の認知や問題解決に有効に機能するのかについては研究されていないのが現状である。そこで、本年度は、(1)人間の認知活動に外的リソースがどのように働くかを明らかにする。(2)外的リソースを導入した実験的な授業からその効果を検証する。(3)外的リソースを活用した教授・学習方法の構築を行う。(4)教師教育への適用方法を開発するという手順で研究を進めた。

こうした研究の意義は、児童生徒が関わる様々な外的リソースが、思考活動にどのように作用し科学的な概念の形成に有効に働いていくのか、児童生徒の外的リソースの利用に問題はないのかを明らかにし、外的リソースに基づく科学的な概念形成を図るための理科の教授・学習方法を構築したことにある。研究結果からは,物や人といった外的資源は問題解決を促し,科学的な概念形成を図ることに有効に機能することを示すことができた。その大きな理由としては,外的資源があることで問題の解が可視化可能になるということであることが示唆された。外的資源が操作可能であったり,多様な考えを明示することで,解決に必要な制約が顕在化され,科学的な概念の形成を促すと考えることができた。こうした研究成果は、12の事例研究を載せた研究報告書として作成し教師や学生が活用可能な資料として提供することができた。
ヒトiPS細胞由来膵島の形成メカニズム解析と高効率誘導系の開発

本研究では当研究室で樹立したヒトiPS細胞からの膵島形成培養系をベースとし、ヒト膵島前駆細胞から膵島様構造物形成に至るまでのメカニズムを解析すること、および得られた知見を応用して生体外で大量に膵島を作製する系を確立することを目的に研究を行なった。その結果、分化誘導系において内分泌前駆細胞は,自己凝集することで膵島様構造を形成することを見出した。この結果をもとに膵島形成培養系を改良したところ,膵島形成効率を向上させることに成功した本研究では、当研究室で確立したヒトiPS細胞からの三次元膵島形成系において、1膵島前駆細胞から膵島様構造形成に至るまでのメカニズムを理解し、得られた知見を元にした系の再構築2ヒト膵島前駆細胞を無尽蔵に増やす系の開発を行い、in vitroでのヒトiPS膵島形成効率を劇的に向上させることを目的として研究を行っている。当研究室の系では、iPS細胞から内分泌前駆細胞まで膵臓発生ステージを模倣した分化誘導を行う。この細胞を分散させたのちに分化支持細胞シート上に撒き直す。このことで機能的な膵島様構造が形成されることを確認している。しかし、この培養系でなぜ機能的な膵島形成ができるのか不明である。以上の事から、本誘導系における膵島形成過程を詳細に解析することで、in vitroにおける膵島の形成メカニズムを理解することを目的として研究を行ってきた。平成26年度はヒトiPS細胞由来の内分泌細胞が膵島系細胞に分化する過程の観察を行った。内分泌前駆細胞マーカー、内分泌細胞マーカー発現ベクターを組み込んだヒトiPS細胞を用いて実験を行った。本細胞を分化誘導することで内分泌前駆細胞を80%以上含む内分泌前駆細胞塊を作成することに成功した。内分泌前駆細胞塊が膵島系細胞に分化する過程をインキュベーター共焦点顕微鏡にて確認したところ、複数の内分泌前駆細胞が細胞塊内部で集合、凝集する様子が観察できた。この知見を元に、現在、本細胞塊を分散させ、細胞シート上に撒き直すことで膵島を形成する過程を観察する実験を行っている。また、分化フィーダー細胞中の膵島形成を支持する細胞種の同定を行うために、分化フィーダー細胞のシングルセルクローニングを行った。その結果、増殖能を維持する細胞が複数得られ、さらに本フィーダーを用いることで機能的な内分泌細胞を含む細胞塊が得られることがわかった。本研究では、これまでに樹立したヒトiPS細胞からの膵島様構造物を分化誘導する培養系の、劇的な膵島形成効率向上を最終目的として研究を行っている。本研究の具体的な目標としては、1ヒトiPS由来膵島前駆細胞からの膵島様構造形成メカニズム解析を行い、詳細を明らかにすること, 2膵島の元となる膵島前駆細胞、および膵島様構造物の大量培養方の開発をおこなうことがある。これまでに1の実験において、内分泌前駆細胞から膵島様構造物が形成される過程で、細胞間の相互作用が重要であるということを示す結果を得ている。昨年度までに得られた知見をもとに、現在の分化誘導系から分離した膵島前駆細胞から、膵島様構造物を効率的に作成可能な系を構築している。また、膵島様構造物を成熟分化する過程において、特定の細胞と共培養することで分化を促進させられることを示す結果を得ている。これら膵島支持細胞を単離培養し、至適な条件で膵臓系前駆細胞と共培養することでより効率的に膵島様構造物を作成可能できるかについても検討を進めている。また、2膵島様構造物の大量培養法の確立に向けて、膵内分泌前駆細胞を分離し、遺伝子導入などの方法を用いてこれを株化,無尽蔵に増幅する系の樹立を試みている。さらに、従来単層培養系であった膵島様構造物の分化誘導系を、浮遊培養系に変更することに成功しており、これらの方法を最適化することによって、大量培養への道筋をつけられると考えているiPS細胞からの分化誘導において一時期分化効率が不安定になり、実験に必要な内分泌前駆細胞の収集に支障をきたした。そこで分化誘導系の見直し、サイトカイン類のメーカー変更などにともなう追加の実験が必要になったため、当初の計画よりもやや遅れることとなった。現在は安定的な系が得られており、今後の進捗には影響がないものと考えられる。本研究では、当研究室で樹立した三次元膵島形成系において、ヒト膵島前駆細胞から膵島様構造形成に至るまでのメカニズムを理解し、これを応用して生体外で高効率、かつ大量に膵島を作製する系を確立することを目的して研究を行ってきた。具体的には1ヒトiPS細胞由来膵島前駆細胞からの膵島様構造形成メカニズム解析と系の最適化2膵島種細胞の大量培養法の開発を行なった。内分泌前駆細胞マーカー(NGN3等)と、内分泌細胞マーカー(インスリン、グルカゴン等)の発現を検出可能な発現ベクターを組み込んだヒトiPS細胞を内分泌前駆細胞ステージまで誘導した後,細胞をセルソーターで純化した。純化した内分泌前駆細胞がどのように膵島を形成するかを追跡、観察した結果,複数の内分泌前駆細胞が集合して細胞塊を形成し,成熟分化に至ることを示唆する結果を得た。この知見を元に,純化内分泌細胞から効率的に膵島を形成可能である細胞播種密度、培養形態等を検討した。その結果,純化内分泌細胞単独で膵島様構造物を作成可能な系の樹立に成功した。本方法で作成した膵島様構造物は,従来法と同様に各種内分泌細胞で構成され,インスリン分泌能を有していた。

また,純化内分泌前駆細胞を維持培養する方法についても検討した。その結果,純化内分泌前駆細胞は緩やかに増殖するものの,分化マーカーは徐々に発現減少するという結果を得た。現在不死化遺伝子などの導入による株化を検討している。本研究では当研究室で樹立したヒトiPS細胞からの膵島形成培養系をベースとし、ヒト膵島前駆細胞から膵島様構造物形成に至るまでのメカニズムを解析すること、および得られた知見を応用して生体外で大量に膵島を作製する系を確立することを目的に研究を行なった。その結果、分化誘導系において内分泌前駆細胞は,自己凝集することで膵島様構造を形成することを見出した。この結果をもとに膵島形成培養系を改良したところ,膵島形成効率を向上させることに成功した膵島形成過程のメカニズム解析に関連する実験がやや遅れているものの、分化支持細胞の特定に関連する実験は順調に推移している。iPS細胞は株間で分化誘導効率が大きく異なることがよく知られているが、本実験においてマーカー導入iPS細胞を効率的に分化するために系の最適化を図ったことがメカニズム解析の進行に影響を与えた。現在は解決している。当初の目的である内分泌前駆細胞から膵島様構造物を効率的に作成する系の作成に関してはある程度の目処がついたと考えている。今後は内分泌前駆細胞の効率的な分離増殖と、膵島大量培養系の樹立に注力する予定である。再生医療本研究課題の計画書通りに進行する予定である当初予定していた遺伝子解析実験(外注予定)が分化誘導系の変更に伴い延期となったため分化誘導系の改良により分化に使用する試薬類に変更が生じ、新規購入が必要となったため分化誘導実施に必要な消耗品購入と、遺伝子発現実験に充当する予定である試薬類(低分子化合物、サイトカイン類)に使用する
内生アブサイシン酸含量およびショ糖合成酵素活性からみた米粒のシンク活性の遺伝変異

本研究では,米粒のシンク活性の制御要因の候補として発育粒中の内生ABA含量とショ糖合成酵素(SS)活性を取り上げたが,これらはいずれも,出穂後の粒発育に伴う変化パターンが粒の発育状態と密接な平行関係にあることが明らかとなった.このことから,これら2要因が米粒発育過程自体の制御に対して何らかの役割をはたしていることが強く示唆された.一方,本研究結果は,これら要因のうち内生ABA含量の遺伝変異は粒発育過程あるいは粒のシンク活性の遺伝変異と相関関係にないこと,またSS活性の変異は粒当たりで表現した場合にのみ粒重増加速度等と正の相関を示すが,これは見かけ上のものであり,むしろ増加速度,最終粒重の変異の結果として生じていることを明らかにした.従って,内生ABA含量もSS活性もともに粒のシンク活性の遺伝変異の直接の原因である可能性は低いことが推察された.このことから,収量性育種の一戦略としてのシンク能力の遺伝的改良は,一般的にいえばシンク活性よりはシンク容量の改良を通じてなされる方がより有効であると推察される.しかし,本研究で得られた一般的な傾向を破るような突然変異体,即ち,高く持続的なSS活性を示し,これに起因する高いシンク活性をもつようなもの,を探索あるいは誘発してこれを育種的に利用することは今後の課題として重要であると思われる.また本研究では,イネの一次枝梗上粒(強勢頴果)と二次枝梗上粒(弱勢頴果)の間の粒重増加速度,最終粒重に関する差異は,内生ABA含量ではなく,SS活性の差によることが示唆された.このことから,イネの穂全体の登熟性を向上させる一手段として,発育中の二次枝梗上粒のSS活性がより高いような遺伝子型の探索,もしくはこの粒着生位置のSS活性を増大させるような栽培方法の開発が考えられる.1.イネ発育粒中のショ糖合成酵素活性に関する質的な遺伝変異を探索することを目的とし、品種金南風に由来するShrunken突然変異系統3系統を用いて原品種の金南風とともに出穂後20日目の胚乳のショ糖代謝関連酵素の活性を調べた。その結果、どの系統もショ糖合成酵素は酸性および中性インベルターゼよりも高い活性を示すこと、UDPGピロフォスフォリラーゼは他酵素に比べて著しく高い活性を示すことが判った。従って胚乳中に転流されたショ糖は、インベルターゼではなくショ糖合成酵素によってUDPグルコースへと変換される経路で代謝されることが確認された。一方、原品種と突然変異系統との間には、ショ糖合成酵素活性に関する有意な差は認められなかった。この結果は、本実験のサンプリング時期が不適切であったことによる可能性がある。今後の実験では、種々の発育時期の胚乳を供試し、突然変異系統がショ糖合成酵素活性に関して質的な違いを示すのか否かを検討する必要がある。2.上記のショ糖合成酵素活性に関する量的な遺伝変異、特に粒重増加速度との関係を探ることを目的として、粒大等が異なるイネ4品種を用いて、出穂後の胚乳中におけるショ糖合成酵素活性の推移を検討した。また、粒を一次枝梗上もしくは二次枝梗上に着生するものに分別し、両者の比較も行った。ショ糖合成酵素活性を一粒当りで表わすと、活性はどの品種も出穂後20日目までは増加し、その後低下した。また大粒品種は小粒品種に比べ、一次枝梗上粒は二次枝梗上粒に比べて高い活性を示した。一方、活性を単位たん白量当り(比活性)で表わすと、どの品種も出穂後1520日目で極大値を示したが、この極大値は品種間でも一次枝梗上粒、二次枝梗上粒間でも大差がなかった。従って、ショ糖合成酵素活性は粒の発育の基本的な制御に大きな役割を果たしているが、一胚乳細胞当りの活性に関する遺伝変異は小さいことが推察された。本研究では,米粒のシンク活性の制御要因の候補として発育粒中の内生ABA含量とショ糖合成酵素(SS)活性を取り上げたが,これらはいずれも,出穂後の粒発育に伴う変化パターンが粒の発育状態と密接な平行関係にあることが明らかとなった.このことから,これら2要因が米粒発育過程自体の制御に対して何らかの役割をはたしていることが強く示唆された.一方,本研究結果は,これら要因のうち内生ABA含量の遺伝変異は粒発育過程あるいは粒のシンク活性の遺伝変異と相関関係にないこと,またSS活性の変異は粒当たりで表現した場合にのみ粒重増加速度等と正の相関を示すが,これは見かけ上のものであり,むしろ増加速度,最終粒重の変異の結果として生じていることを明らかにした.従って,内生ABA含量もSS活性もともに粒のシンク活性の遺伝変異の直接の原因である可能性は低いことが推察された.

このことから,収量性育種の一戦略としてのシンク能力の遺伝的改良は,一般的にいえばシンク活性よりはシンク容量の改良を通じてなされる方がより有効であると推察される.しかし,本研究で得られた一般的な傾向を破るような突然変異体,即ち,高く持続的なSS活性を示し,これに起因する高いシンク活性をもつようなもの,を探索あるいは誘発してこれを育種的に利用することは今後の課題として重要であると思われる.また本研究では,イネの一次枝梗上粒(強勢頴果)と二次枝梗上粒(弱勢頴果)の間の粒重増加速度,最終粒重に関する差異は,内生ABA含量ではなく,SS活性の差によることが示唆された.このことから,イネの穂全体の登熟性を向上させる一手段として,発育中の二次枝梗上粒のSS活性がより高いような遺伝子型の探索,もしくはこの粒着生位置のSS活性を増大させるような栽培方法の開発が考えられる.米粒の発育に伴う内生ABA含量の変化を粒大等が異なるイネ2品種を用いて観察した.その結果,両品種ともに粒当たりおよび生体重当たり内生ABA含量は出穂後増加し,粒の発育が最も活発になる時期に最大値に達した後に減少に転じ,粒発育の停止時期以降は出穂期ごろの低いレベルのまま推移することが分かった.また,同一穂内の一次枝梗上粒,二次枝梗上粒の各々において上記と同様に内生ABA含量の出穂後の変化を検討したが,変化のパターンは両着生位置とも同様であった.このような結果から,発育粒中の内生ABA含量は,品種,粒着生位置を問わず粒の発育,シンク活性の制御に何らかの役割を果たしていることが強く示唆された.また,内生ABA含量の最大値は,粒当たり含量では大粒品種の方が高くなったが生体重当たり含量では両品種に差は認められなかった.一次枝梗上粒と二次枝梗上粒の間でも内生ABA含量の最大値についての差はなかった.このような内生ABA含量と昨年度の実験でやはりシンク活性の制御に役割を果たすと考えられたSS活性,両者の遺伝変異,およびそれらと粒重増加速度や最終粒重の遺伝変異との関係を,イネ11品種を用いて検討した.出穂後15日目の粒における内生ABA含量とSS活性,および粒重増加速度,最終粒重を測定し品種間差異と相関をみたところ,粒当たりSS活性と粒当たりおよび生体重当たりABA含量に有意な品種間差異がみられた.またこれら形質のうち,粒重増加速度,最終粒重と有意な正の相関を示したのは粒当たりSS活性のみであったが,この相関は偏相関分析から増加速度と粒重の間の相関によって結果的に生じたと考えられた.従って,内生ABA含量もSS活性もシンク活性の遺伝変異の原因である可能性は低いことが推察された.
ニューセラミックス系超微粒子高性能充填剤の開発

現在、ニューセラミック微粒子はこれを加熱・成形して工業製品化する原材料として、組成、粒子径とも多種多様のものが生産されている。一方、これらニューセラミックス系微粒子はクロマトグラフィーの立場から眺めると、その粒子径の微少さの故に高い理論段を与え得る可能性を秘め、また分離特性に関してもほとんど未知の新素材と言える。そこで、本研究においてはクロマトグラフィー用担体としての可能性を探るため、現在広範に利用されている高速液体クロマトグラフィー(HPLC)用充填剤基材としての評価を、シェイクフラスコ法を用いて行った。即ち、ヘキサン-イソプロパノール(9:1、V/V)中に種々のニューセラミックス微粒子を懸濁し、パラヒドロキシ安息香酸の吸着挙動の3種の吸着等温式(Henry式、Langmuir式、Freundrich式)により解析した。その結果、シリカゲル、アルミナ、二酸化チタニウム(12μm)、二酸化ジルコニウム(3μm)、窒化ジルコニウム(1.35μm)、炭化ジルコニウム(0.97μm)、珪酸ジルコニウム、オキシリン酸ジルコニウムなどの吸着は、Freundrich式でよく表されることが判明し、同式中の吸着キャパシティーを示すパラメーター(K)から、二酸化ジルコニウムなどが高い吸着活性を有することが示された。このようにして選別した新素材をカラムに詰め、実際にHPLCを行って種々の化合物の分離挙動を調べたところ、シリカゲルなどでは分離が困難なニトロアニリンのオルト、メタ、パラ異性体がジルコニアで容易に分離されるなど、新素材は従来の吸着剤には見られない分離特性を有することが明らかとなった。また、これら新素材の多くは、現在のHPLC用充填剤基材の大半を占めるシリカゲルがアルカリ性で溶解するのに対して、極めて高い耐アルカリ性を示すことが判明した。
光線力学療法を高度利用した活性酸素殺菌法の開発

光線力学療法を応用した殺菌技術により非常に効果的に黄色ブドウ球菌を殺菌できることを実証した。さらに光線力学療法において生成される一重項酸素の定量法を確立し、一重項酸素生成量と殺菌作用の強さの相関性を検証した。一重項酸素測定には環状アミンを用いた電子スピン共鳴法の応用が適していることを実証し、光照射時間や光感受性物資の濃度に依存して一重項酸素が生成されることを示した。平成21年度においては,発光ダイオード(LED)を用いて,光線力学療法により発生する活性酸素種の測定およびその殺菌効果の検証実験を行った.光感受性物質として用いた物質は,がん治療薬として用いられているタラポルフィンナトリウム,口腔なプラーク染色液として用いられているエリスロシン,およびがん診断などで用いられているトルイジンブルー0を用いた,それぞれの光感受性物質の吸光波長を計測したうえで,光の波長が405nm,530nm,670nmのLEDを実験に用いた.活性酸素種の測定:電子スピン共鳴装置を用いたスピントラップ法により,活性酸素種の定性分析を行った.スピントラップ剤として,一重項酸素をトラップすることができるとされているTMPDとヒドロキシルラジカルやスーパーオキシドをトラップすることができるDMPOを用いた.その結果,一重項酸素の生成はタラポルフィンナトリウムに670nmの光照射を行った場合とエリスロシンに530nmの光照射を行った場合に認められた.一方,トルイジンブルー0に670nmの光照射を行った場合には,ヒドロキシルラジカルの生成が認められた。これらの結果より,光感受性物質によって生成される活性酸素種が異なることが示唆された.今後,より詳細に活性酸素種の同定およびその発生メカニズムに関して調べていく予定である.殺菌試験:殺菌試験には黄色ブドウ球菌を対象細菌として用いた.細菌懸濁液を各光感受性物質と混和後,光照射を行い,生存する細菌数を評価した.いずれの光感受性物質も100μMの場合には1mL当たり一億個の細菌を含む細菌懸濁液の菌数を15分以内にすべて死滅させることが分かった.また,10μMに光感受性物質を薄めて各光感受性物質の殺菌能を比較したところ,エリスロシンがもっとも強い殺菌効果を有することが分かった.まとめ:光線力学療法によって,短時間に効率的に殺菌できることがわかり,歯科治療など殺菌を必要とする治療に応用できる可能性が示唆された.光線力学殺菌療法(PACT)において殺菌作用の主体を担う一重項酸素の定量分析は非常に重要であるが、これまでのところPACTによって生成される一重項酸素の定量分析法は確立されていなかった。そこで、H22年度の研究では、一重項酸素生成のための光感受性物質としてローズベンガルを用いて、最適な一重項酸素測定法の検証を行った。ローズベンガルは歯垢染め出し液としても利用されている物質であり、口腔内で用いることができる光感受性物質の一つである。このローズベンガルに対して、励起波長である532nmのレーザーを照射することで生成される一重項酸素を測定の対象とした。測定法としては、環状アミンを用いた電子スピン共鳴(ESR)法、1,3-diphenylisobenzofuran(DPIBF)の比色分析法、および蛍光プローブ(Singlet Oxygen Sensor Green,SOSG)法を用いて比較を行った。各測定用試薬の濃度、ローズベンガルの濃度、およびレーザー照射時間と測定値の変化の関係性を調べた結果、それらのパラメーターの増加に伴った一重項酸素生成の増加が認められた。測定感度としてはDPIBF<ESR<SOSGの順であった。しかしながらSOSGは、蛍光測定を行うということからローズベンガル濃度が非常に低い場合(<1μM)しか用いることができなかった。ESR法とDPIBF法ではローズベンガル濃度が20μm程度まで一重項酸素生成量が増加することが確認されたが、DPIBFは405nmのレーザーを照射した場合に吸光スペクトルが著しく変化した。以上の結果より、SOSGを用いた方法ではPACTで用いるような濃度の光感受性物質の測定を行うことができず、またDPIBF法では、400nmの光で励起されるヘマトポルフィリンなどを光感受性物質として用いた測定には不適であることが示唆された。一方、環状アミンを用いたESR法の測定感度はPACTで生成される一重項酸素測定に適していることが示唆された。今後、本研究の結果を応用してPACTで生成される一重項酸素量と殺菌効果を比較することで、新しい歯科殺菌療法を構築することができると考えられる。
癌抑制遺伝子LATS2キナーゼのM期チェックポイントにおける役割の研究

申請者は、分裂(M)期チェックポイント制御におけるLats2キナーゼの機能解析を行ってきた。その過程においてLats2が微小管重合阻害剤ノコダゾールで処理した際に特異的なリン酸化制御を受けていることを見つけ、このリン酸化を制御するプロテインキナーゼの一つとして中心体キナーゼであるAurora-Aを同定した。さらに、Aurora-AがLats2の83番目のセリン残基(S83)をリン酸化することを見出した。S83は間期(Interphase)では核内と中心体の両方でリン酸化され、核膜崩壊後は、中心体でのみリン酸化された。特に、そのリン酸化シグナルはProphaseとMetaphaseで強く観察され、このパターンはAurora-Aと酷似している。また、非常に興味深いことに、CytokinesisのときのS83のリン酸化シグナルは中心体から消失し、その代わりにMidbodyにおいて強く観察された。S83が中心体でリン酸化されていたことから、申請者はS83のリン酸化がLats2の中心体局在に影響を及ぼしているのではないかと考え、Lats2の野生型と2つのS83変異体S83C、S83EをHeLa細胞に導入し、その中心体局在を観察した。その結果、S83Cを発現させた細胞では、Lats2の中心体局在率が顕著に低下した(印刷中)。このことは、Aurora-AによるS83のリン酸化がLats2の中心体局在に重要な役割を果たしていることを示唆している。Lats2は中心体に局在することで他の中心体構成蛋白質を効率よくリン酸化して中心体の成熟あるいはスピンドルの形成を厳密に制御していると考えられる。実際、申請者は、S83を含むLats2のN末端領域がもう一つのLatsファミリーで中心体などの分裂装置上に局在することが報告されているLats1のC末端領域と結合することを見つけている。(投稿準備中)。申請者は、新規癌抑制遺伝子として単離したLats2キナーゼの機能解析を行ってきた。その過程でLats2が細胞周期依存的、特に微小管重合阻害剤ノコダゾールで処理したときに特異的なリン酸化制御を受けていることを見出だした。これはLats2が細胞周期(チェックポイント)制御に関与している可能性を示唆する。そこで、このリン酸化を制御するプロテインキナーゼを同定するために候補となるキナーゼ蛋白質をいくつか精製しin vitro kinase assayを行った。その結果、Lats2蛋白質が中心体キナーゼの一つであるAurora-Aにより特異的にリン酸化されることを発見した。線維芽細胞におけるAurora-Aの過剰発現は中心体の異常増幅および染色体不安定性を引き起こし、細胞をトランスフォームすることが報告されている。Aurora-Aによるリン酸化部位を決定するためにLats2のアミノ酸置換変異体を作製してkinase assayを行い、少なくともそのうちの一つが83番目のセリン残基(S83)であることを明らかにした。さらに、この部位に対する抗リン酸化モノクローナル抗体を作製し、この部位がin vivoにおいてリン酸化されていることも確認した。これらの成果により、今まで不明だったLats2のリン酸化シグナルカスケードの端を明らかにできた(投稿中)。現在、Aurora-AによるS83のリン酸化の生理的意義を明らかにするための実験を進めている。また、LATS2ノックアウト(KO)マウスの作製も順調に進行している。現在キメラマウスの作製が終了し、ヘテロ欠損マウスができつつあるのでホモ欠損マウスの誕生まであと少しのところである。さらに、LATS1のKOマウスの作製も同時に行っているので、両者が作製できた後にはLATS1・LATS2のダブルKOマウスを作製し解析を行う予定でいる。

実際、申請者は、S83を含むLats2のN末端領域がもう一つのLatsファミリーで中心体などの分裂装置上に局在することが報告されているLats1のC末端領域と結合することを見つけている。(投稿準備中)。
ナノ・マニュファクチャリング・ワールドの構築

現在、工学の発展によってサブミクロンオーダの精度で磁気ヘッドや半導体が作成され、物理学の発展によってオングストロームオーダの精度で原子が操作されるようになった。しかし、両者の精度の中間である1100nmのオーダでは新たな加工・作業の方法が期待されているにもかかわらず、未だ静態的に観察するという段階に留まっている。本研究では、人間の大きさからこの中間領域の微小部分に観察しながら近づき、いじり、動かし、測るという動態的で工学的な要望を満足させる手法を追求した。この手法を微小世界に具現化したシステムが「ナノ・マニュファクチャリング・ワールド」である。まず、数μmの微小物を微細に切削・組立・分析するマイクロ工具、数nmと微細にエッチングできる高速原子線、回転を含め16自由度を有するナノマニピュレータ、多面視の走査形電子顕微鏡、人間による遠隔作業を臨場感に支援するシステム、人間と微小物との世界をそれぞれ支配する表面力や視野などの要因を変換するソフトウェア、の6要素を新たに試作・検討し、次にこれらを真空環境へ拡張して、そこで統合したシステムを実現した。具体的に、形状作成・作業・準備の3つの真空室を配したテーブルトップサイズの工場を作り、そこでパレット上に固定された微小物をロボットで配送し、高速原子線やマイクロ工具によって人間が観察しながら作業した。その後、実際の微小作業に試用して、磁気ヘッド用サスペンション、マイクロレンズ列、微細ドットメモリ、量子効果素子、などを試作し、本システムの基本コンセプトが妥当であることを確認した。立体的でナノメータオーダの精度を持つ微小構造体を、主にメカニカルな手法によって作製する生産システム、すなわちナノ・マニュファクチャリング・ワールドの構築を目指した。まず、その基本的な機能、構成、機構要素、などを考察し、次に上記の考察に基づいて、いくつかのメカニカルな手法を試み、さらにこれらを用いて立体微小物を実際に作製し、これらの概念が正しいことを確認した。上記の手法として、1)直進するビーム、たとえば高速原子線や紫外線レーザ、と回転する被加工物とを組み合わせて、ビームが成す回転直線母線の包絡面を被加工物上に生成する、多面ビーム加工による3次元形状生成、2)回転運動成分を有する組立・分析・観察用の工具が、被組立物の回りに配されているため、工具や被加工物を回転させてもオペレータは常時視野内で作業することができる、集動マニピュレータによる3次元組立、3)振動を付加させながら微小切削するマイクロ工具と上記マニピュレータとを用いて、従来の機械加工のように被加工物の外形を切除する、マイクロメカニカル工具による3次元形状生成、などを試みた。さらにこれらを用いて、大きさが約100μmのマイクロな鳥居、こけし、五重塔、などを、立体的な微小構造体の例として作製・建立し、その結果、上記の3次元加工という概念通りに、微小構造体が加工可能であることを確認した。平成5年度に引き続き、当該研究として、1)マイクロ工具、2)ナノマニピュレータ、3)臨場感支援システム、4)支配要因変換ソフトウェア、などの開発を主に行ったが、平成6年度の成果は次の通りである。1)マイクロ工具の開発全体の大きさが数10μmの立体的な微小構造体を真空中で自由に着脱できる静電気工具や、上述の微小構造体を加工できる振動切削工具を、従来の機械工学の知識を応用して開発した。さらに、その立体的な微小構造体を0.1μmオーダと精密に加工するため、高速原子線を照射するマイクロエッチングを行った。ここでも機械加工の知識を応用し、工作機械のように被加工物を3次元的に回転させて、立体的な微小構造を加工した。2)ナノマニピュレータの開発既存の並進精密運動機構(12自由度)に、円弧ガイドによる回転運動機構(8自由度)を加えた真空用「集動マニピュレータ」を設計・製作した。これは各軸の回転中心と被加工物と焦点領域とが3者同じ場所に配されるものである。

これと上記のマイクロ工具とを用いると、微小な3次元作業が容易にできる。3)臨場感支援システムの開発力覚支援のためにμNオーダの微小力を検知できる力センサと、視覚支援のために多面視顕微鏡とを開発し、作業者に音・力・立体画像などを通して、微小作業時の臨場感を与えるシステムを試みた。4)支配要因変換ソフトウェア上記の力センサによって、微小世界と通常世界との作業力のちがいを定量的に把握し、そのちがいが作業者に苦痛を与えないような、ファイルセーフソフトウェアを試作した。最終年度である平成7年度では、まず、既に開発した機構である、マイクロ工具、ナノマニピュレータ、臨場感支援システム、支配要因変換ソフトウェア、などを統合し、これらを真空環境へ拡張した。次に、そこでこの統合システムを用いて微小構造体を実際に試作し、最後に、その結果から基本コンセプトの妥当性を確認した。1)真空環境へのシステムの拡張高速原子線によるエッチングによる形状作成と、SEM観察下の作業(組立・検査・分析など)と、を機構的に結合する真空環境を作成した。振動振幅を能動的に制御して1nm以下と微小に小さくできる1.6mm×0.9mmのテーブル上に、形状作成室と作業室とロードロック室の、3つの真空室を配した。この間を、真空環境用の配送ロボットによって、配送専用パレットに固定された微細試料が移送される。また、作業空間に多くのモータや軸受けなどの機械要素を配したにもかかわらず、高速原子線やSEMの機能に支障が生じない10^<-4>Paオーダの真空度が達成できた。2)個別分野への適用によるナノ・マニュファクチャリング・ワールドの総合確認被加工物として供したマイクロマシンや情報素子などを、真空中の本ワールドで実際に観察しながら加工して、その結果から本ワールドの基本コンセプトの妥当性を確認した。まず、高速原子線で微細にエッチングして、量子効果素子用の幅30nmの溝、小形CCD用のマルチレンズ、磁気ヘッド用の高さ30nmの角形凹凸、などを形状作成し、また、作業用の16自由度を有するナノマニピュレータや、2つのSEM鏡筒から得られる上からと横からの画像情報によって微細作業の臨場感を増強した臨場感支援システムを用いて、内視鏡用の接合レンズ、全長0.4mmの紙飛行機、などを組み立てた。これらの試みを通して、本ワールドが微細な作業を実現する一つの総合システムとして完成したこと、当初の基本コンセプト通り、通常の世界に住む人間が微小な世界に入ったかのごとく運転できること、などを確認した。
少数の3次元計測位置からのヒューマンフィギュア動作制御ライブラリの開発とその応用

平成16年度の研究実施計画に基づき研究を遂行し,以下の研究成果を得ることができた.1.画像認識によるリアルタイム身体姿勢推定の高精度化既に開発した身体姿勢推定アルゴリズムを前年度にひきつづき改良し,アルゴリズムの高精度化を行った.人体動作の動画像系列をデータベース化し,今後の継続研究の開発に役立てることが可能なよう整理した.2.ヒューマンフィギュアの動作制御手法の開発より人間に近い動作を自動制御可能にするために、仮想物体両手操作時・片手操作時の自動化機能を追加した.これより,仮想空間上で頻繁に行う手指の詳細な動作の再現に伴う不自然さがある程度解消されたことを確認した.3.動作制御ライブラリの実装本研究で開発したライブラリはlinuxOS上で利用可能なものであったが,汎用性を考えwindowOS上で動作可能なライブラリへと移植を行った.一方,CGキャラクタ当てはめの汎用性が充分に実現できていないため将来的には本動作制御ライブラリへ組み込むことを考える必要がある.4.ヒューマンフィギュアの生成動作に関するリアリティの評価実世界から獲得される身体情報とそれを用いて仮想空間において再現されるリアリティ情報の質を検証するために,ネットワークで接続した遠隔地へ動作情報を送信し,どのような動作を表現しているものか被験者に確認を行ってもらい,典型的な動作に関しては充分再現されていることが検証できた.今後,無意識に行う人間の動作に関してその再現性の検証を進める必要があることも確認した.平成15年度の研究実施計画に基づき研究を遂行し,以下の研究成果を得ることができた.1.画像認識によるリアルタイム身体姿勢推定の高精度化既に開発した身体姿勢推定アルゴリズムを改良し,アルゴリズムの高精度化を行った.具体的には,人体動作の動画像系列を収集し身体姿勢をより人間らしく生成するためのパラメータの獲得実験を行い,良好な結果を得た.実データを元に推定したパラメータを用いることでより実データに近い生成が可能になった.2.ヒユーマンフィギュアの動作制御手法の開発面像認識で得られる動作データ(モーションキャプチャデータ)を元に,より人間らしい動作を仮想空間上で再現するための仕組みを開発中である.具体的には,仮想空間上でのヒューマンフィギュアにシーンの制約を考え,より現実らしく見せるための増強を自動的に行う仕組みである.これより,少数のモーションデータからある程度現実感のあるヒューマンフィギュア(アバター等)の動作を制御することが可能となる.いくつかの仮想物体操作タスクについてこの仕組みを適用し実験・評価を行った.現在,より多くの仮想空間操作タスクについて実現できるよう開発を続けている.既に本ライブラリをいくつかの応用システムに適用し,その有効性の評価を始めている,具体的な応用としては,ヒューマンフィギュアをアバターとして表示した仮想空間での利用であり,今後はネットワークを介した遠隔地間コミュニケーション支援のツールとして利用することを想定している.3.動作制御ライブラリの実装本研究で開発した動作制御手法及び画像認識手法を応用システム(プロトタイプシステム)から切り離しモジュール化を行った.現在,本ライブラリを様々な応用システムから利用できるようインタフェースの抽象化を行っている.平成16年度の研究実施計画に基づき研究を遂行し,以下の研究成果を得ることができた.1.画像認識によるリアルタイム身体姿勢推定の高精度化既に開発した身体姿勢推定アルゴリズムを前年度にひきつづき改良し,アルゴリズムの高精度化を行った.人体動作の動画像系列をデータベース化し,今後の継続研究の開発に役立てることが可能なよう整理した.2.ヒューマンフィギュアの動作制御手法の開発より人間に近い動作を自動制御可能にするために、仮想物体両手操作時・片手操作時の自動化機能を追加した.これより,仮想空間上で頻繁に行う手指の詳細な動作の再現に伴う不自然さがある程度解消されたことを確認した.3.動作制御ライブラリの実装本研究で開発したライブラリはlinuxOS上で利用可能なものであったが,汎用性を考えwindowOS上で動作可能なライブラリへと移植を行った.一方,CGキャラクタ当てはめの汎用性が充分に実現できていないため将来的には本動作制御ライブラリへ組み込むことを考える必要がある.4.ヒューマンフィギュアの生成動作に関するリアリティの評価実世界から獲得される身体情報とそれを用いて仮想空間において再現されるリアリティ情報の質を検証するために,ネットワークで接続した遠隔地へ動作情報を送信し,どのような動作を表現しているものか被験者に確認を行ってもらい,典型的な動作に関しては充分再現されていることが検証できた.今後,無意識に行う人間の動作に関してその再現性の検証を進める必要があることも確認した.
混住化農村における社会空間の構造と過程に関する地理学的研究

本研究では,混住化農村におけるパーソナルネットワークの空間的範域とコミュニティの階級構造や住民のライフサイクルとの関連,その局地的コミュニティの意義づけなどについて,長崎市北郊長与町を事例地域として,おもに住民に対するアンケート調査(回答数485,回収率54.2%)から実証的に明らかにした。その結果は,以下の諸点に要約される。(1)日常行動に関しては,就業・購買・レジャーのいずれの活動も町内には完結せず,とくに長崎市がその目的地として優位を占めた(ホワイトカラー・専門職の長崎市通勤66%)。(2)社会的活動や交友関係では,42%はかなり頻繁に社会組織・団体の活動に参加し,スポーツ活動や趣味の会,ボランティア組織に参加する人も多く(48%),それらの組織は30%が長崎市に本拠をおいていた。多くは町内に親しい友人や親戚がおり(66%,とくに近隣44%),75%がここ数カ月の間に友人を私的に訪問し合っていたが,多くは町内に住む友人・同僚・親戚(60%)であった(長崎市居住者28%)。(3)空間的行動や社会関係から明らかにされる長与町の顕著なベッドタウン的性格は,町内の施設利用や行事参加にも反映されており,例えば,図書館や公民館に関しては約半数が利用したことがなく,20%近くが場所すら知らなかった。こうして「身近に感じる地域」は,長崎市を含む長崎都市圏(42%)と自宅の周りや近隣などの町内小地区(36%)とに分裂する傾向にあった。(4)住民の政治参加に関しては2/3がその必要性を唱え,その回路として1/3が自治会に関連した項目をあげているが,具体的な利益項目としては,ホワイトカラー=自然保護・景観保全・文化教育施設など,旧住民とくに農民・自営業者=農業振興・雇用対策といった社会・地域分化的状況が指摘でき,自治会以外の地域横断的な住民組織化が期待できない現状では,住民参加の政治的装置をどう設定するかが大きな課題である。
可溶性エリスロポエチン受容体を用いた食品等からの造血因子の探索

1.可溶性エリスロポエチン受容体(_sEPO-R)をビオチン化し、6残基のランダムなペプチドを粒子表面に持つファージライブラリー液と混合後、ストレプトアビジンでコートしたプレート上にパニングして、_sEPO-Rに特異的に結合するものをスクリーニングしようとしたが、特異的に結合するファージは得られなかった。一方、_sEPO-Rを抗原として得られたモノクローナル抗体1G3をコートしたプレート上で同様にファージライブラリー液をパニングしたところ、特異的に結合するファージが濃縮されてきた。現在、このファージを精製し、_sEPO-Rのどの配列を有しているかを検討することにより、1G3の認識する配列を決定している。2.エリスロポエチン(EPO)は赤血球系に特異的に作用すると考えられてきたが、神経系にも作用することを明らかにした。先ずコリン作動性ニューロン株SN6や副腎髄質由来クロム親和性細胞PC12上にEPO受容体が存在することを発見した。そして、EPO添加によりPC12細胞内のカルシウム濃度の一過的上昇や、モノアミン含量の上昇を検出した。PC12細胞は神経成長因子を添加すると神経突起を伸展するが、EPO添加では変化せず、増殖も促進されなかった。これらの結果からEPOは神経系では栄養因子として作用すると考えられた。また、マウスの胎児発生過程の神経系の形成にEPOが作用するするのではないかと考えて、RT-PCR法または免疫組織化学的手法でEPOとEPO受容体の胚および胎児における発現について検討した。その結果、胎生7日目の原始線条、胎生8日目の神経褶にEPOおよびEPO受容体の存在が認められた。さらに胎生10日目になると神経上皮の辺縁側および脊髄の原基にEPOの存在が認められた。以上の結果は、胎児の神経系形成にEPOがオートクリンまたはパラクリン様式で作用することを示唆しており、現在EPOの神経系での生物学的機能についてさらに検討している。
遅延型皮膚反応の発現機序およびアネルギー機序の解明

PPDと水痘抗原を用いて行った遅延型皮膚反応(DTH)とleukocyte procoagulant activity(LPCA)との間には相関が認められLPCAがin vitroにおけるDTHの評価に有用であること、またこれらの抗原によるLPCAの発現については異なる径路が働いていること、さらに臨床におけるDTHとLPCAの検討等は昨年報告した如くである。今年は川崎病を中心に研究を行った。川崎病に関しては、急性期BCG接種部位に紅斑がみられることや回復期にかけて各種の抗原に対してDTHが陰性を示すことが知られており、何らかの免疫機序の関与が推測されている。今回の検討でPPDによるLPCAは低下しており、川崎病の急性期ではLPCAに関与するT細胞あるいは単球の機能障害が推測された。また川崎病急性期の単球機能を化学発光を用いて検討したが対照と比較し有意な変化は認められなかった。一方、好中球機能を化学発光を用いて検討した結果、川崎病の急性期においては対照である健常小児に比較し有意な化学発光の増強がみられた。また川崎病の急性期について冠動脈病変形成群と非形成群との化学発光の比較をみると形成群は非形成群に比較し有意な化学発光の高値が認められた。さらに冠動脈病変形成群では化学発光の高値が持続した。こうした化学発行の高値は心断層エコーにより冠動脈病変が明らかになる以前の現象であり川崎病の病態に好中球の産生する活性酵素の関与が推測された。川崎病にみられるDTHの陰性化に関しては炎症反応がひきおこす二次反応のように考えられる。こうした機序については好中球の産生物質とサプレッサーT細胞の誘導など、好中球,T細胞,単球の相互反応の観点からさらに検討を加えていきたい。
膵関連自己抗体の早期検出法の開発と食・生活パターン解析による生活指導法の構築

目的;1型糖尿病やSPIDDMを高精度かつ早期に検出するために、高感度のGAD抗体やインスリン自己抗体検およびIA-2抗体検出法を開発し、これら抗体検出法を組み合わせ、膵島関連自己抗体を同時に検出する新規の高感度マルチ抗体検出法を開発する。さらに、自動検出機の試作や、これに組み込むためのキット化も平行して行う。一方、この検出法の有効性については、現在進行中の非介入型前向きコホート研究の試料を用い実証をおこなう。さらに、このコホート研究において抗体出現(膵障害)と食生活のパターンを解析し、膵障害リスクの軽減・改善のための有効な生活指導法を開発することを目的とした。方法;研究者らが開発した超高感度抗体検出法を応用し、3種の高感度抗体検出法を開発し、保険適用になっている2種の抗体(GAD抗体およびIA-2抗体)の高感度マルチ抗体検出法を開発した。ついで、糖尿病患者血清(28検体)を用い同時検出法の有効性を検証した。さらに、前向きコホート試料中のGAD抗体を測定し、食生活のパターンとの関連について解析した。結果・結論;従来ELISAの100-1,000倍高感度のGAD抗体やインスリン自己抗体検およびIA-2抗体検出法を開発し、2種の抗体(GAD抗体およびIA-2抗体)の高感度マルチ抗体検出法を開発した。1型糖尿病患者血清では、実測値/予想値比が48162%、的中率は28/28(100%)であった。いずれかの検体が陽性または2種の抗体が陽性の検体は、1回の同時検出法により陽性と判定することができた。また、高感度自動検出機が完成し、上市化ができ、高感度抗体検出法のキット化も2019年度中には上市化の見通しである。一方、コホート研究試料における抗体陽性者と食生活パターン解析においては、特筆すべき結果は見当たらなかった。1型糖尿病やSPIDDMを高精度かつ早期に検出するために、膵島関連自己抗体を同時に検出する新規の高感度マルチ抗体(インスリン自己抗体、GAD抗体、IA-2抗体)検出法を開発する。そして、1型糖尿病患者(IDDMおよびSPIDDM)およびコホート検体を用い、その有用性を検証する。28年度は、すでに開発しているGAD抗体およびインスリン自己抗体の高感度検出法に加え、IA-2抗体の高感度検出法の開発を行った。その結果、主要自己抗体3種類の測定法が出来上がった。そこで、これらの検出法の有用性を1型糖尿病患者(IDDMおよびSPIDDM)の試料を用い確認したところ、GAD抗体検出率(69.7%)、IA-2抗体検出率(26.0%)及びIAA抗体検出率(41.6%)であった。しかし、この中には、それぞれの抗体が重複しない個々に単独で検出された検体がGAD抗体では27.3%、IA-2抗体体では1.3%及びIAA抗体では19.5%もあり、これらの抗体の単独検出系では、自己抗体陽性検体を見逃す危険性がある。一方、3種の抗体いずれかを検出した場合の検出率は81.8%に向上する。そこで、確実に陽性検体を捕捉するため、これら3種の抗体を同時に検出するGAD・IA-2・インスリン抗体の同時検出法の開発に着手している。また、コホート集団で検証したところ、従来のELISAキットと同様のシグナルでは、理解できない検体が見られ、特異的抗体の量およびその質(アフィニティー)を検証する必要性が示された。そこで、特異的抗体の量およびその質を数値化すべく、測定系の改良を行なっている。研究の概要にも記載しているが、GAD抗体、インスリン抗体およびIA-2抗体の高感度検出法が出来上がったので、これらの抗体検出法の有用性を、まず1型糖尿病患者(IDDMおよびSPIDDM)の試料を用い確認した。その結果、それぞれの抗体の単独検出系では、糖尿病関連自己抗体陽性検体を見落とす例が20%以上あることが示された。しかし、これらの抗体のいずれかを検出した場合の検出率は82%に向上する。そこで、これらの3種の抗体を同時に検出するGAD抗体・インスリン抗体・IA-2抗体同時検出法の開発に着手しており、ほぼ順調に進行している。一方、コホート集団で検証したところ、従来のELISAキットと同様のシグナルでは、理解できない検体が見られ、特異的抗体の量およびその質(アフィニティー)を検証する必要性が示された。そこで、特異的抗体の量およびその質を数値化すべく、測定系の改良が必要であることが示されため、コンンジュゲート濃度および阻害抗原量について検討している。29年度は、28年度に1型糖尿病患者を対象に実施した3種の抗体測定に加え、新たに76名の1型糖尿病患者に対し、高感度GAD自己抗体、インスリン自己抗体及びIA-2自己抗体検出法の感度の検証を行った。その結果、3種抗体のうち1つでも陽性であった比率は81.6%(62/76名)、全てが陰性であった比率は18.4%(14/76名)であった。

それぞれの抗体では、IAA陽性61.8%(47/76名)、GADA陽性51.3%(39/76名)、IA-2A陽性10.5%(8/76名)であった。内訳は、IAAのみ陽性24.7%(19/76名)、GADAのみ陽性16.9%(13/76名)、IA-2Aのみ陽性1.3%(1/76名)、IAA陽性かつGADA陽性28.6%(22/76名)、IAA陽性かつIA-2A陽性3.9%(3/76名)、GADA陽性かつIA-2A陽性1.3%(1/76名)、3種の抗体全て陽性3.9%(3/76名)となった。個別にみると、IAA、GADAが多くの検体から検出されたが、IA-2A単独で検出された例もあることから、3種抗体を測定する必要性が示された。また、この新規の高感度測定法を搭載した高感度自動化装置(HI-1000)をシスメック社と共同で開発し、平成30年春に上市するとともに、これに搭載するGAD抗体やIA-2抗体検出キットについては、開発を進めている。さらに、これらの開発と並行して、5年間の前向きコホート研究試料を用い、GAD抗体を測定し、超高感度法の有用性の検証を行っている。研究の概要にも記載しているが、GAD抗体、インスリン抗体およびIA-2抗体の高感度検出法が出来上がったので、これらの抗体検出法の有用性を、まず1型糖尿病患者試料を用い確認した。その結果、IAA、GADAが多くの検体から検出されたが、IA-2A単独で検出された例もあり、それぞれの抗体の単独検出系では、糖尿病関連自己抗体陽性検体を見落とす例危険性があることが示された。そこで、これらの3種の抗体を同時に検出するGAD抗体・インスリン抗体・IA-2抗体同時検出法の開発に着手しており、ほぼ順調に進行している。さらに、これらの高感度検出法の自動化測定装置も完成しており、上市とともにこの機器に搭載する膵島関連自己抗体測定キットの開発も順調に進んでいる。これらの機器とキットを用い、コホート検体の測定に取り掛かっている。目的;1型糖尿病やSPIDDMを高精度かつ早期に検出するために、高感度のGAD抗体やインスリン自己抗体検およびIA-2抗体検出法を開発し、これら抗体検出法を組み合わせ、膵島関連自己抗体を同時に検出する新規の高感度マルチ抗体検出法を開発する。さらに、自動検出機の試作や、これに組み込むためのキット化も平行して行う。一方、この検出法の有効性については、現在進行中の非介入型前向きコホート研究の試料を用い実証をおこなう。さらに、このコホート研究において抗体出現(膵障害)と食生活のパターンを解析し、膵障害リスクの軽減・改善のための有効な生活指導法を開発することを目的とした。方法;研究者らが開発した超高感度抗体検出法を応用し、3種の高感度抗体検出法を開発し、保険適用になっている2種の抗体(GAD抗体およびIA-2抗体)の高感度マルチ抗体検出法を開発した。ついで、糖尿病患者血清(28検体)を用い同時検出法の有効性を検証した。さらに、前向きコホート試料中のGAD抗体を測定し、食生活のパターンとの関連について解析した。結果・結論;従来ELISAの100-1,000倍高感度のGAD抗体やインスリン自己抗体検およびIA-2抗体検出法を開発し、2種の抗体(GAD抗体およびIA-2抗体)の高感度マルチ抗体検出法を開発した。1型糖尿病患者血清では、実測値/予想値比が48162%、的中率は28/28(100%)であった。いずれかの検体が陽性または2種の抗体が陽性の検体は、1回の同時検出法により陽性と判定することができた。