hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
小学児童の夏・冬の閾値温度の地域比較研究

札幌・東京・熊本の小学校教室で夏と冬に温熱的不快に達する閾値温度を解明する実測調査を行ない、ロジスティック解析により以下のことがわかった。1)夏に「暑くて授業に集中できない」児童が過半数(60%)になる外気温は札幌で30.5°C、熊本で32.5°C、実際室温は札幌で29°C、熊本で35.5°Cだった。その時の児童の想像温度は札幌で27.5°C、熊本で32.5°Cで、教室にエアコンが設置されている東京では外気温が28.5°Cのときだった。2)冬に「寒くて授業に集中できない」児童が40%のときの児童の想像温度は、札幌:9°C、東京:7°C、熊本:2°Cだった。以上から、児童の夏と冬の閾値温度には地域差があった。平成23年度に続き、小学児童を対象に「温熱的不快」と「想像温度」の関係を解明する研究を行なった。平成24年度は、これまでの札幌と熊本に加えて、教室にエアコン(冷房・暖房)が設置されている東京も対象地にして、夏から秋期、厳冬期にそれぞれ調査を行なった。夏から秋期は9月初旬と10月初旬の2回に分けて調査した。その結果、熊本(通風)は「暑くて不快」の児童の割合が24%から13%に、札幌(通風)は52%から42%に減少した。それに対して、東京(通風もしくは冷房)は16%から27%に増加した。東京では、児童の生理・心理が冷房室の温熱環境の影響を受けている可能性があり、初秋でも通風だけでは暑さをしのぐのが困難な状態にあることが示唆された。厳冬期の1、2月に行なった調査の結果、札幌では、教室の室温が暖房によって20°C以上でも「暑くて不快」の児童が表れ、そのときの児童の想像温度は実際室温と同じか、高かった。それに対して「寒くて不快」の児童は実際室温よりも5°Cほど低い温度を想像していた。一方、東京では、児童の想像温度は実際室温と相関がなかった。東京は、札幌・熊本に比べて実際室温の幅が日によって15°C以上になることがあったが、教室の温熱環境の変化に対して、エアコンの発停が追随できなかったので実際室温と想像温度が乖離したと考えられる。冬季において、児童の想像温度に対する温熱的不快の発生率をロジスティック回帰分析によって明らかにした。札幌は室温が20°C以上にも関わらず、児童の想像温度が20°C以下の場合が表れ、想像温度が下がるに連れて温熱的不快の発生率は急激に増すことがわかった。札幌と同様の傾向は東京では見られたが、熊本ではほとんど見られなかった。これは、児童の寒冷環境下での生理・心理の順応(寒冷馴化)の地域性が表れていると考えられる。【最終年度の研究成果】平成23、24年度に引き続き、小学生を対象に温熱的不快が発生するときの想像温度と教室の温熱環境調査および解析を行なった。これまでの夏における札幌・熊本・東京(平成24年度のみ)の調査結果を使って、温熱的不快の発生率に関するロジスティック回帰分析を行なった。熊本の児童は、札幌よりも暑熱不快に達する閾値となる室温やグローブ温度が35°C程度高かった。東京では、冷房運転によって児童が「寒さ」を感じているケースがあり、寒冷不快が30%のとき、実際室温やグローブ温度は26.5°C前後であったのに対して児童の想像温度は19°C前後であった。これは、夏から秋にかけての教室での冷房に対して児童が敏感に「寒さ」を感じているものと考えられた。【研究期間全体の研究成果】小学生を対象に「温熱的不快」と「想像温度」の関係を解明する研究を札幌・東京・熊本で実施した。1)夏、熊本では発汗感と通風感があれば温熱的不快にはならず、冬は室温が13°Cを下回ると温熱的不快の発生率が80%になる。2)東京ではエアコン稼働の影響を受け初秋でも通風だけで一時的な暑さを凌ぐのが困難で、冬は実際室温と想像温度が乖離している児童が多い。3)札幌では暖房で室温20°C以上でも温熱的不快が現れた。夏と冬において、各地域の実際室温や児童の想像温度に対する温熱的不快の発生率をロジスティック回帰分析によってモデル化した。今後は本研究で明らかにしたロジスティックモデルを、地域別の温熱環境教育(住育)プログラムの作成・実践に活用する予定である。

札幌・熊本の夏、冬の小学校教室の温熱環境を対象に、児童にとって温熱的不快でない条件が地域性やライフスタイルによって異なるか否かを明らかにする実測調査を行なった。外気温、実際室温および児童の「想像温度」と温熱的不快の発生率の関係について以下のことが確認できた。1)夏、外気温と実際室温が同じとき、熊本は札幌よりも温熱的不快の申告率は低かった。冬、札幌の室温は熊本よりも8°Cほど高いにも関わらず、札幌と熊本とで温熱的不快の申告率は同じだった。2)夏、熊本の児童は発汗感と通風感があれば温熱的不快にはならない傾向にあった。3)夏、札幌、熊本ともに1日の歩数が多い児童ほど発汗感は増すが、温熱的不快の申告率は札幌の方が熊本より高い傾向にあった。4)夏、冬に関係なく、札幌、熊本ともに温熱的不快を申告した児童は不快でなかった児童よりも想像温度が高く、両者の差は2°Cほどだった。5)夏の温熱的不快の想像温度は札幌よりも熊本の方が高かった。また、夏について児童の授業への「集中度」、「百マス計算」、「楽しかった時限数」と想像温度について以下の関係性が確認できた。6)「暑くて不快」と感じることがあっても、児童は授業に集中できる可能性が示唆された。7)授業に集中できるか否かが現れる温度幅は札幌、熊本ともに34°Cで、札幌と熊本の地域差として56°Cの差があることがわかった。これは児童の想像温度の地域差と一致した。8)札幌では「集中度」と想像温度に相関があり、熊本では、「百マス計算」の得点比と想像温度に相関がみられた。9)熊本では、「楽しかった時限数」は「授業への集中度合い」と「温熱的不快でない」に相関があった。「人体エクセルギー収支モデル」に調査データを代入することによって、人体エクセルギー収支による地域性の違いを明らかにする研究がやや遅れているが、それ以外の基礎的なデータの収集、および数値解析は概ね順調に進展している。最終年度の研究成果によって当初の研究目標が達成される見込みである。札幌、熊本での小学校における調査を順調に進められたので評価区分は(2)とした。平成25年度は、これまでの調査データに基づいて、札幌・東京・熊本の小学児童の温熱的不快と想像温度の地域性に関する傾向をさらに整理する予定である。具体的には、以下のことを実施する。1)教室の相対湿度や放射温度との対応関係をこれまで得られたデータに基づいて明らかにする。2)夏季と冬季において、児童の想像温度と実際温度、外気温度に対して、児童の温熱的不快の発生率をロジスティック回帰分析によって明らかにする。3)「人体エクセルギー収支モデル」に調査データを代入することによって、人体エクセルギー収支の地域性の違いを明らかにする。寒冷地の札幌と温暖地の熊本に加えて、普通教室に冷房が導入されている東京都も調査対象地に加えて、児童の温熱感、想像温度の地域差や、ライフスタイルに基づく個人差を明らかにする。また平成23年度に引き続き、温熱的不快の発生率を、外気温や室温、想像温度を説明変数とするロジスティック回帰分析によって予測する。以上の結果に総合して、持続可能な教室の温熱環境とは何かを明らかにする。研究分担者(宿谷昌則)の研究費の執行が昨年度内に完了しなかった理由は、調査データを「人体エクセルギー収支モデル」に適用する研究を最終年度に延長したことによるもので、平成25年度中に当該内容について実施する予定である。平成24年度は、以下のことを行なう予定である。1)東京都下の小学校を調査対象に加える。2)温熱的不快の発生率を、外気温や室温、想像温度を説明変数とするロジスティック回帰分析によって予測する。
リンパ球によるアセチルコリン合成と合成酵素の遺伝子解析

1)コリンアセチルトランスフェラーゼ(ChAT)mRNAを発現する血球細胞種の特定最もACh合成能が高いMOLT-3より調製したpoly(A)^+RNA用いて、ChAT mRNA発現量およびサイズをノーザンブロット解析した。^<32>p放射ラベルしたChAT特異的cDNAプローブをハイブリダイズさせ、オートラジオグラムをとった。しかしながら、ChAT mRNAは検出できなかった。ChAT mRNA発現量が脳と比較して非常に少ないことが考えられる。予備実験で半定量的-PCRを行い、リンパ球では脳と比較して少くとも1000分の1以下のChAT mRNA発現量であることを確認した。このことは、リンパ球のChAT活性が、脳で最もChAT活性の高い線条体の1000分の1程度であることに一致する。3)ChAT全塩基配列の解析脳ChATの塩基配列より作製したPCRプライマーを用いて、T細胞中のChAT mRNAを増幅した。しかしながら、発現量はが低いためクローニングに十分なcDNAを得られず、本年度中の全塩基配列決定は実現できなかった。引き続きPCR条件などのクローニング戦略を再検討した上で実施予定である。
マイクロエンジニアリングのための人工的量子状態の生成と制御

1年目での成果にもとづいて、計画2年目の今年度は量子空洞共振器を対象とした具体的なフィードバック制御系を想定し、そこから発生する様々の問題を理論的に解析した。まず制御のための操作を陽に含む量子系の時間発展を確率微分方程式を用いて記述し、その近似解の表現を導き、その性質を調べた。同じ手法を量子化された光の場にも適用し、簡単な解の公式をもとめた。その中で特筆すべき成果として不確定性原理の制御論的な意味づけを見出したことである。この成果は量子状態の実部と虚部を同時に安定化するフィードバック制御器は存在しない、ということである。これにもとづき、スクイーズド制御を上述の空洞共振器とハーフミラーを含むシステムに適用し、制御の限界を定量的にもとめた。本研究はこのように量子制御の基本的な問題を解明し、今後の発展の基礎を築いたと考えられる。特に、制御理論と量子力学の間の橋わたしを行い、マイクロ工学とマクロ工学の接面を切り開いた。これらの成果は現在2編にわたる論文としてIEEEのTransaction on Automatic Controlに投稿中である。量子系は,量子論的測定過程をシステムが含むか否かによって系の数学的記述が全く異なるので、制御対象を記述する方法が古典系とは著しく異なる.本年度はこの特徴に留意し,Entanglementの概念にもとづいて量子論的測定過程を含む場合と含まない場合についてフィードバックの概念を導入した.前者は「自然な」フィードバック,後者は「外付けの」フィードバックにそれぞれ対応する.制御理論においてはこれまで量子系におけるフィードバック制御の研究はなされておらず,一方物理学においては物理的な直観に基づくフィードバックの研究が進められてきたが,制御と言う観点からきわめて不十分であった.今年度得られた結果はその意味で概念的にこれまでにない完全性をもつフィードバック制御の枠組みが量子系に対して得られたと考えられる.本研究によって制御理論の視点から,量子フィードバック系の解析,設計が可能となった.さらに本研究の応用例として,スクイーズド状態を生成するシステムの設計について考察した.スクイーズド状態は1970年代に発見され,その興味深い性質と量子力学における主原理,ハイゼンベルグの不確定性関係と深くかかわることから,理論的にも多くの研究がなされてきたが,その状態を実験的に生成することは今なお困難な問題とされている.我々が導入したフィードバックの手法によって,スクイーズド状態を生成するシステムの設計を外乱除去問題として位置づけることが可能となり,制御理論において開発されてきた有用な手法,特に,Jロスレス分解とそれに基づくH^∞制御でのコントローラの設計手法が適用可能となった.1年目での成果にもとづいて、計画2年目の今年度は量子空洞共振器を対象とした具体的なフィードバック制御系を想定し、そこから発生する様々の問題を理論的に解析した。
塞栓性虚血・血栓溶解再灌流後の血流動態と組織損傷

一過性脳虚血と再灌流による脳病変の性状について臨床の脳梗塞に近いモデルとして開発された塞栓性脳虚血・再潅流モデルおよび頸動脈一過性結紮モデルについて検討した。塞栓性脳虚血の実験にはC57B1/6Jマウスを用いの右外頚動脈より動脈圧の持続的モニターを行った。血栓注入により虚血を作成、開始30分後より血栓溶解剤を頚動脈内に注入し血栓を溶解した。虚血前、再潅流6時間後、24時間後の神経脱落症状、自発運動量および歩行障害度の計測をした。脳を凍結しumbelliferone法による組織ATP量、3H leucineおよびオートラジオグラムによるタンパク質合成能及び脳血流量の画像化、TUNEL陽性細胞分布域マップの作成を行った。頸動脈一過性結紮モデルにはスナネズミを用い一側或いは両側艘頸動脈を5-20分間閉塞、虚血症状陽性の動物を選び、神経脱落症状の評価を虚血後最長4週間迄行った。以上の検討により以下の結果を得た。血栓注入後に病巣脳血流量は虚血前値の19.8±11%に低下し血栓溶解後に徐々に回復した。神経脱落症状のスコアーは再潅流6,24時間後では徐々に増悪した。他の症状も同様の傾向であった。タンパク質合成能低下域(%対側半球比)は6時間後に28.7±11.5,ATP量低下域は8.7±5.4であり再潅流24時間後は38.5±20.6,38.4±22であった。再潅流24時間後のTUNEL陽性細胞の分布域はタンパク質合成能低下域と良く一致した。ATP量低下域の大きさと神経症状には弱い相関を認めた。以上の結果を頸動脈一過性結紮モデルの結果と比較検討した結果、塞栓性脳虚血・再潅流モデルは臨床例の脳虚血に病態が近い適切な動物モデルと考えられた。一過性脳虚血の病態についてマウスやスナネズミ、ラットをもちいて研究をおこなった。実験にはマウスではてフィブリン塞栓による脳血管閉塞・血栓溶解剤による再潅流モデル,スナネズミでは一側頚動脈の反復閉塞モデル,ラットでは一側中大脳動脈閉塞モデルをもちいて検討を行っている。本年は虚血後の神経脱落症状の変化、血流動態の特徴、MRI拡散係数画像状の変化、超微細構造の変化、などについての検討を行った。マウスフィブリン塞栓による脳血管閉塞・血栓溶解剤による再潅流モデルは現在進行中であり、その成果の一部を来年度はじめの日本神経病理学会やヨーロッパ神経病理学会で発表の予定である。スナネズミ一側頚動脈の反復閉塞モデルでは虚血後の神経症状の経時的な変化の検討を行い、神経脱落症状が虚血後1週間の経過で徐々に増悪する様子を報告した。更にこの現象が虚血体制を誘導した動物では有意に軽減することを見出した。また現在MRI拡散係数画像法を用いて虚血性脳浮腫の進展とその検出法の特徴についても検討を行っている。さらに病変の遅小進行の各時期における超微細構造の変化を検討し、特にアストログリア細胞の変化を報告し、その役割についての推定を行った。

一方ラット一側中大脳動脈閉塞モデルを用いた実験では虚血の病巣とともに虚血時に血流の低下の生じない周辺域に見られる神経細胞死について注目し、黒質に見られる神経細胞死を対象に、その画像上の特徴や超微細構造上の特徴について検討し成果を報告した。一過性脳虚血と再灌流による脳病変の性状について臨床の脳梗塞に近いモデルとして開発された塞栓性脳虚血・再潅流モデルおよび頸動脈一過性結紮モデルについて検討した。塞栓性脳虚血の実験にはC57B1/6Jマウスを用いの右外頚動脈より動脈圧の持続的モニターを行った。血栓注入により虚血を作成、開始30分後より血栓溶解剤を頚動脈内に注入し血栓を溶解した。虚血前、再潅流6時間後、24時間後の神経脱落症状、自発運動量および歩行障害度の計測をした。脳を凍結しumbelliferone法による組織ATP量、3H leucineおよびオートラジオグラムによるタンパク質合成能及び脳血流量の画像化、TUNEL陽性細胞分布域マップの作成を行った。頸動脈一過性結紮モデルにはスナネズミを用い一側或いは両側艘頸動脈を5-20分間閉塞、虚血症状陽性の動物を選び、神経脱落症状の評価を虚血後最長4週間迄行った。本年度は主に生化学的な指標と組織像および神経症状との対比を中心に検討した。神経脱落症状のスコアーは再潅流6,24時間後では徐々に増悪した。他の症状も同様の傾向であった。タンパク質合成能低下域(%対側半球比)は6時間後に28.7±11.5,ATP量低下域は8.7±5.4であり再潅流24時間後は38.5±20.6,38.4±22であった。再潅流24時間後のTUNEL陽性細胞の分布域はタンパク質合成能低下域と良く一致した。ATP量低下域の大きさと神経症状には弱い相関を認めた。以上の結果を局所脳血流量のデータと対比し、さらに頸動脈一過性結紮モデルの結果と比較検討した結果、塞栓性脳虚血・再潅流モデルは臨床例の脳虚血に病態が近い適切な動物モデルと考えられた。
免疫寛容によるAnti-Drug Antibodies産生を抑制する基盤的研究

本研究はニワトリリゾチームを多量体(混合物)化してそれを実験動物(ラット)に投与し、その約1週間後にニワトリリゾチームの単量体を投与してもニワトリリゾチームに特異的な免疫応答(一般にニワトリリゾチームはラットに対しては異種蛋白質であり免疫応答反応が起こる)が生じない現象(再現性あり)を梃子に実験を計画している。免疫寛容が誘導されているラットにリゾチームとは異なる蛋白質(オボアルブミン)を投与した場合は、オボアルブミンに対して免疫応答が生じていることから、抗原(リゾチーム)特異的な免疫寛容と判断している。2018年度では、この結果をとりまとめ昨年度中に論文を投稿したがまだ採択にはいたっていない。申請計画に記載しているように、我々の研究室で調製済みのヒト型Fabを用いて多量体化を二価性架橋試薬にて架橋を試みた。反応条件設定が難しく、反応時間、試薬の濃度等、種々の実験条件を検討した。その結果、SDS-PAGEで3量体以上のヒト型Fabが生成していることを確認し、ゲルクロマトグラフィーにて3量体以上の画分を得ることに成功した。一方、抗体医薬品を構成するCH2ドメインの多量体を用いて免疫実験を行うため、酵母(Pichia pastoris)を用いて、CH2ドメインの発現を行った。CH2ドメインはN型糖鎖付加配列(Asn-Ser-Thr)を持つので、その部位に糖鎖が付加したものも併せて入手できた。CH2ドメインは不安定であることが知られており、凝集性が高い。既報の条件で精製した場合、凝集体が生じ回収率が非常に低下した。そこで凝集体を形成しない精製方法を検討した。その結果、凝集体を含まないCH2ドメインの精製方法を確立した。また、糖鎖が付加したヒト型CH2ドメインの大量発現方法は、これまで報告されていなかったので、当初の計画にはなかったが論文としてとりまとめ現在投稿中である。申請計画ではニワトリリゾチームと異なる蛋白質の多量体化を実施し、それを用いて抗原特異的に免疫寛容が誘導されるかどうかを検討することとなっている。ヒト型Fabについては、我々の研究室ですでに調製済みであるが、多量体化の条件検討が予想以上に時間がかかったので、現段階では、当初の計画よりやや遅れている。ただ、申請計画に記載している内容については、2019年度中に終了できる見込みである。多量体化したヒト型Fab、ヒト型CH2ドメインなどの蛋白質を多量体化し、それらを実験動物に投与したのちに、それぞれの単量体蛋白質を実験動物に投与し免疫応答を解析する。その結果を踏まえて、多量体化による免疫寛容応答の誘導はニワトリリゾチームに特異的なものか否かを判定する。広く蛋白質に利用できる場合は、抗体医薬品(当面、入手可能なリツキシマブを使用)に応用する。また、リゾチーム特異的なものであれば、蛋白質の分子量、電荷等に着目して、どのような仕組みでリゾチーム特異的な免疫寛容現象が生じているのかを解析する。

ただ、申請計画に記載している内容については、2019年度中に終了できる見込みである。多量体化したヒト型Fab、ヒト型CH2ドメインなどの蛋白質を多量体化し、それらを実験動物に投与したのちに、それぞれの単量体蛋白質を実験動物に投与し免疫応答を解析する。その結果を踏まえて、多量体化による免疫寛容応答の誘導はニワトリリゾチームに特異的なものか否かを判定する。広く蛋白質に利用できる場合は、抗体医薬品(当面、入手可能なリツキシマブを使用)に応用する。また、リゾチーム特異的なものであれば、蛋白質の分子量、電荷等に着目して、どのような仕組みでリゾチーム特異的な免疫寛容現象が生じているのかを解析する。平成30年度に取りまとめた研究成果を現在論文に投稿中である。この論文掲載料を確保しておく必要があったため平成30年度末まで一部の金額を未使用としていた。次年度(令和元年度)では、この経費は、論文掲載料に使用する予定である。しかしながら、現在投稿中の雑誌は、科研費の趣旨に沿ったオープンジャーナルであり、掲載料が20万円程度必要である。もし、この雑誌に不採択になった場合は、一般の国際誌に投稿するため、この金額は研究を多角的に推進するための物件費(実験動物と実験試薬)に用いる。
陸上競技における局面学習に関する研究－マック理論の展開－

スプリント技術を身につけるための基本的なドリルとして2つのドリルがある。そのドリルはAドリルとBドリルと呼ばれており、マックドリルとして知られている。本研究では、スプリント技術を身につけるためのAドリルとBドリルをキネマティクス的に比較検討した。そして、スプリント技術に関連する動作について解析を行った。特に腿上げ動作に着目してスプリント技術を分析した。また、エリート選手はよりよいスプリント技術を示すことができるため、被験者は日常的にマックドリルを行っているイギリスのエリートレベルの短距離選手とした。Gerald Mach氏のトレーニング理論を実践している英国のエリートレベルの短距離選手を対象として、平成24年度は疾走動作中のスウィング脚に着目して2次元分析を行った(腿上げ動作:鉛直線と大腿のなす最大角度67.04deg、腿上げ速度711.39deg/s、引きつけ動作:膝関節の最小角度29.27deg、最大屈曲速度786.05deg/s、振り出し動作:鉛直線と大転子から踵を結んだ線の最大角度34.84deg、膝関節の最大伸展速度1122.37deg/s、振り戻し動作:大転子と踝を結んだ線のなす最大角速度423.54 deg/s)。そして、平成25年度はその結果とA Drill、B Drillの関係を検討するために2つのドリルの画像解析を通して、Mach Drillsの意図するポイントが実際の疾走動作のどの部分にどのように貢献しているのかを検討するために解析中である。また、初心者指導のなかで疾走動作を習得するための手段としての可能性を探るために、2つのドリル(A Drill、B Drill)練習を体育授業のなかで5月7月にかけておよそ8週間にわたり1回20分ずつ実施した。ドリル練習の実施前と実施後には、疾走動作を被験者の側方40mに設置したDVカメラで撮影した。撮影した映像データは現在パソコンに取り込んで解析中である。得られた分析結果は、A Drill、B Drillとの関係について検討するとともに初心者指導から競技力向上までの指導への適用を考えていく。8月の学会で発表を予定している。1960年から1970年代にかけて欧米において世界レベルの選手を数多く輩出し、世界的にも著名な短距離コーチであるゲラルド・マック(Gerard Mach)氏の理論を動きの局面に着目して精査し、走運動における学習指導に反映させるために平成24年度は以下の項目を実施した。・Mach Drillsで行われるSkip AとSkip Bについて、それぞれ強調する箇所として前者では「大腿部を引き上げた際に膝関節を閉めること(closure)」、後者では「接地前に膝関節が伸展して身体の真下に戻すこと(ground preparation)」などが挙げられた。・Mach Drillsを実践している英国トップレベルの選手の疾走動作を、スイング脚に着目して画像解析した。その結果、疾走中の腿上げ角度(67.04deg)と腿上げ速度(711.39deg/s)は、日本、外国のトップ選手に比べ低い値であった。また、引き付け時の膝関節角度(29.27deg)は比較的小さく、振り出し動作では、鉛直線と大転子から踵を結んだラインの角度が34.84degで、その膝関節伸展速度は1122deg/sとやや高めであった。・Mach Drillsの意図するポイントが実際の疾走動作のどの部分にどのように貢献しているのかを、さらに分析項目を増やして検討する必要がある。Mach DrillsにおけるA DrillとB Drillについて特に腿上げ動作に着目して解析を行った。その結果、腿上げ角度はスプリント動作(67.05deg)よりも2つのドリル(A:96.42deg, B:121.28deg)の方が大きく、特にBドリルは大幅に大きな値を示した。引きつけ角度はAドリルが小さい値(25.61deg)を示し、振り出し角度はBドリルが大きい値(49.78deg)であった。また、最大関節角速度においては、膝関節の屈曲と伸展の関係がスプリント動作とドリルでは逆の傾向を示した。このことは、疾走速度と相関のある脚の後方スイングをドリルの中で獲得するためには、引き付け動作からワンアクションでの一連の動きを作りだすためであると考えられる。また、Aドリルは腿上げ速度は低いものの膝関節は高い屈曲速度で引き付けられており、その後膝関節は積極的に伸展されて接地している。つまり、ドリル中の腿上げはそれ自体が目的ではなく、大腿の後方スイングを高めるための予備動作と言える。そして、Bドリルはスプリントに劣らない腿上げ速度と高い屈曲速度で膝関節は引きつけられて高い位置まで引き上げられている。また、伸展速度は小さいものの振り戻し動作は積極的に行われている。

つまり、下腿の振り出し動作は、接地直前の最大角速度を得るための予備動作であり、この動作は降り出すのではなく、振り戻される時に受動的に膝を伸展させるものである。今回のMach Drillsにおける腿上げ動作に焦点をあてた分析結果は、スプリントフォームの指導方法として今後の学習指導における有用性が高いと考えられる。健康・スポーツ科学モデル選手のデータ映像の収集や体育授業を通した実験は終えているが、データの処理や解析にかなりの時間を要している。モデル選手の疾走動作の解析は完了している。しかし、A drillとB Drillのモデル解析、及び体育の授業を通して実施した2つのドリル練習前後の解析については被験者数が多いためにその解析が遅れている。データの処理や解析に時間を要したため、平成25年度に行う予備実験に関する準備が遅れている。諸般の事情を整えて平成26年度に本実験を遂行し論文投稿ができるように基礎的な予備実験などを行う。本研究では、今後、以下の項目を明らかにする。体育授業で実践した2つのドリル学習の効果を明らかにする。Skip AとSkip Bの初心者指導への適用を検討する。分析結果をまとめて本年度は学会発表を行う。Skip AとSkip Bの指導方法を検討する。Skip AとSkip Bが疾走動作に及ぼす影響を分析し、疾走速度との関係を明らかにするとともに、学習指導への可能性を検討する。実験の工夫により調達予定物品などの経費が当初計画より節約できたため。研究の伸展に伴い必要となった物品および、共同研究者との打ち合わせ回数を増やすための旅費として使用予定。該当なし
酸化ストレスが創傷治癒、肥厚性瘢痕形成に与える影響について

炎症時には酸化ストレスが増大し、活性酸素種(ROS)が細胞機能を傷害する。一方ROSは細胞内において精密に制御されたシグナル伝達の担い手でもある。TRPチャネルは様々な環境因子を感応するチャネルであり、なかでもTRPCは酸化ストレスに反応する。ROSによりTRPCは開口状態で安定し細胞内Ca濃度を上昇させる。Caは細胞内シグナルの重要なセカンドメッセンジャーであり、その細胞内濃度の上昇は様々な反応を引き起こす。本研究ではTRPC3,5過剰発現線維芽細胞を作成し、その機能を解析した。TRPC3過剰発現細胞を用いたコラーゲンゲルは酸化ストレス下で強い収縮を示した。酸化ストレスは、様々な活性酸素種(ROS:Reactive Oxygen Species)によって生体の酸化作用と抗酸化作用のバランスが崩れ、前者に傾いた状態のことである。炎症時には酸化ストレスが増大し、ROSが細胞機能を傷害する。一方ROSは生体内でも産生され細胞内において精密に制御されたシグナル伝達の担い手でもある。TRPチャネルは様々な環境因子を感応するチャネルであり、なかでもTRPC5は酸化ストレスに反応するチャネルである。ROSにより、TRPC5は開口状態で安定し細胞内Ca濃度を上昇させる。Caは細胞内シグナルの重要なセカンドメッセンジャーであり、その細胞内濃度の上昇は様々な反応を引き起こす可能性がある。(研究実績の概要)1).マウスTRPC5過剰発現線維芽細胞の作成;マウスTRPC5遺伝子をベクター(pMXs-IRES-GFP)に組み込んだ後、パッケージング細胞としてPlat E細胞にtransfectionしレトロウィルス液を作成、マウス皮膚線維芽細胞(NIH3T3)に感染させ、マウスTRPC5過剰発現線維芽細胞を作成した。過剰発現したTRPC5の機能についてはCa imagingにて確認した。2).TRPC5過剰発現細胞を用いてROS添加時の細胞反応の観察;酸化ストレスへの応答性を観察するためROSとしてH2O2を用いて観察した。0.1-10mMH2O2をTRPC5過剰発現細胞とコントロール細胞に添加し、24時間の培養の後、創傷治癒・肥厚性瘢痕形成に関わる遺伝子発現をReal Time PCRを行い観察した。同じ濃度のH2O2を添加しても細胞毒性がassay毎に異なるため条件検討を要した。3).抗酸化剤(還元剤)によって上記2).がどのように変化するかの観察;上記ROS添加実験での条件検討がまだ不十分なため、本実験についても条件検討中である。炎症時には酸化ストレスが増大し、ROSが脂質やタンパク質、核酸などを酸化変性させ細胞機能を傷害することが知られている。一方ROSは生体に非特異的損傷を与える毒性因子であるのみならず生体内でも産生され細胞内において精密に制御されたシグナル伝達の担い手であることも明らかになっている。皮膚創傷治癒過程や肥厚性瘢痕形成過程は炎症が強く関わるにも関わらず酸化ストレスがどのような影響を与えているのかは未だ不明な点が多い。TRPチャネルは様々な環境因子を感応するチャネルであり、TRPC5チャネルは様々な外的刺激のうち酸化ストレスに反応するチャネルでもあることがわかっている。すなわち、NO(一酸化窒素)などのROSにより、TRPC5は開口状態で安定し細胞内Ca濃度を上昇させるというものである。Caは細胞内シグナルの重要なセカンドメッセンジャーであり、その細胞内濃度の上昇はコラーゲンの発現上昇といった様々な反応を引き起こす可能性がある。以上より「創部の細胞のTRPC5の発現量もしくは活性の違いにより、創部に存在するROSに対する反応性が異なり創傷治癒遅延や肥厚性瘢痕形成が起こるのではないか」と考えられる。TRPC5の機能を解析するためStableなTRPC5過剰発現細胞の作成を試みた。具体的にはTRPC5遺伝子をベクター(pMXs-IRES-GFP)に組み込んだ後、パッケージング細胞としてPlat E細胞にtransfectionしレトロウィルス液を作成、目的とする細胞に感染させ、TRPC5遺伝子を細胞に組み込んだ。強制発現されたTRPC5の機能はCa imagingにて確認した。1).マウスTRPC5過剰発現線維芽細胞の作成;現在までにマウスTRPC5遺伝子をベクター(pMXs-IRES-GFP)に組み込んだ後、パッケージング細胞としてPlat E細胞にtransfectionしレトロウィルス液を作成、マウス皮膚線維芽細胞(NIH3T3)に感染させ、マウスTRPC5過剰発現線維芽細胞を作成した。過剰発現したTRPC5の機能についてはCa imagingにて確認している。2). TRPC5過剰発現細胞を用いてROS添加時の細胞反応の観察;TRPC5過剰発現細胞の酸化ストレスへの応答性を観察するためROSとしてH2O2を用いた際の応答性を観察した。

0.1-10mMH2O2をTRPC5過剰発現細胞とコントロール細胞に添加し、24時間の培養の後、創傷治癒・肥厚性瘢痕形成に関わる遺伝子発現をReal Time PCRを行い観察している。同じ濃度のH2O2を添加しても細胞毒性がassay毎に異なる(Mediumの参加度合いなど)ため条件検討を要した。3).抗酸化剤(還元剤)によって上記2).がどのように変化するかの観察;上記ROS添加実験での条件検討がまだ不十分なため、本実験はまだ行っていない。1).抗酸化剤(還元剤)によってTRPC5過剰発現細胞のROSへの応答性がどのように変化するかの観察;ROSを添加した際のTRPC5過剰発現細胞の創傷治癒関連遺伝子発現の応答性を観察することで創傷治癒過程における酸化ストレスとTRPC5の関係を明らかにし、ROSの至適濃度を明らかにする。その結果を基に抗酸化剤を添加した際に応答性がどのように変化するかを観察する。2). TRPC5過剰発現細胞をマウス創部へ移植したうえで創部の酸化ストレスマーカーの測定;TRPC5過剰発現細胞およびコントロール細胞をマウス背部左右の皮膚・皮下へ一方ずつ移植する。1週間から2週間後移植部背部左右に1箇所ずつ肉様膜まで含めた全層欠損を径5mmのバイオプシーパンチを用いて作成する。創部の状態を経時的に観察し、組織を採取する。創部の酸化ストレスマーカーとしては創部組織ホモジェナイズからDNAを抽出し、8-OHdGを計測する。TRPC5過剰発現細胞移植組織の酸化ストレス応答性がコントロール細胞移植組織と比べてどのように変化しているか計測し、同時に様々な炎症性サイトカインや創傷治癒関連サイトカイ、コラーゲンなどの発現を免疫染色法にて観察する。3). TRPC5遺伝子のsiRNAを用いたノックダウン実験;上記1).の実験と逆にsiRNAを用いてTRPC5の発現をノックダウンしてその際、ROSに対し細胞がどのように反応するか観察する。上記研究を遂行するため、試薬や実験消耗品、実験動物などを当研究費にて購入する予定である。
ハイパースペクトラルイメージング技術による多癌種診断システムの実用化とその応用

本研究では、ハイパースペクトラルイメージング技術の臨床での実用化に向けた検討として、小型化のための検討と、化粧品の定量的な評価指標の開発を実施した。ハイパースペクトラルイメージャーはシステム全体のコストが高くなる傾向がある。研究費の効率的な活用を実現するため、極力既存装置から部品を流用することで、安価に試作を実現できることが判明した。化粧品の評価システムの開発では、健常ボランティアによる実験を実施し、化粧品の主観評価とスペクトルの変化の相関関係やファンデーションなどの化粧品の塗布状況の劣化の定量化に取り組んだ結果、化粧品の定量評価の実現に大きく前進した。本年度はハイパースペクトラルイメージャの白色人種における臨床性能を評価するため、スウェーデン・ルンド大学に当該装置を設置し、臨床での計測を開始した。日本人に比べメラノーマの有病率が高い白色人種では、メラノーマに対する認識が日本人のそれとは大きく異なり、極めて身近な病気であることが分かった。メラノーマ患者を家族に持つ場合、多くは年に1回以上の皮膚科専門医による診察を受けており、メラノーマが発生したとしても、かなり早期の段階で発見され、完治することが多い。日本での計測では、メラノーマの発生がかなりレアであり、進行した状態で見つかることが多い。そのため、これまで開発した指標値が直接使用できない可能性が示唆されつつある。白色人種においては早期かつ微小な病変を診断することがほとんどであり、そのため良性病変との鑑別は日本人の場合よりもはるかに困難になる。既に我々のメラノーマ鑑別指標は微小病変に対しても対応できるよう改良を施していたが、更なる改良が求められることが判明しつつある。今後はこれまで開発したメラノーマ鑑別指標の改良を進める一方、新たな視点からハイパースペクトラルデータを解析する手法の新規開発を目指す。本年度はハイパースペクトラルイメージング技術の臨床での実用化に向けた検討として、特に小型化のための検討を実施した。ハイパースペクトラルイメージャーは原理的にシステムが大型化する特性があり、システム全体のコストが高くなる傾向がある。そこで、機能を一部制限することで、大幅な小型化とコストダウンが実現することが分かった。具体的にはスキャン機構とオートフォーカス機構を廃し、空間情報を一次元に制約する。空間的な広がりが知りたい場合は、操作者が装置自体を移動させることでその情報を得ることができる。本年度はその基礎的検討として、従来装置で得られたハイパースペクトラルデータを疑似的に一次元化することで、メラノーマの鑑別能力がどの程度悪化するかを検討した。一次元化のための仮定として、操作者は最も色の多様性が高い部分を狙って計測するとした。その結果、空間情報を一次元に縮約しても、メラノーマ鑑別能力はほとんど変化しないことが判明した。この成果をもとに、来年度以降、より小型で低コストなシステムの試作に取り掛かる予定である。また、本システムの応用として、化粧品の評価システムの構築に向けた検討を推進。基礎的実験から、化粧品使用者の嗜好と相関の高い指標が取れうる可能性が高いことが判明したことから、来年度以降より大規模な実験を実施する予定である。本年度、研究機関を移動したことから、新たな共同研究先の模索などが必要となったが、これまでの共同研究先から十分な試料が得られたことから、大きな問題とはならなかった。メラノーマの患者データは十分なペースで集積しており、今後は実用化に向けたステップに移ることとなろう。化粧品の感性評価とハイパースペクトラルイメージャーの相関に関する研究においては、まだ準備段階ではあるが、基礎的検討から有用である可能性が十分に得られており、研究はおおむね順調に進展していると評価できよう。本年度はハイパースペクトラルイメージング技術の臨床での実用化に向けた検討として、小型化のための検討と、化粧品の定量的な評価指標の開発を実施した。そこで、機能を一部制限することで、大幅な小型化とコストダウンが実現する。昨年度の成果をもとに、新規装置の概念設計を開始した。具体的にはCCDカメラ、分光器、光源等を流用することができることがわかった。ハイパースペクトラルデータの位置情報を一次元にすることで、スキャン機構は不要となることから、制御基板、電源、外装などのみの整備で試作可能であることが分かった。次年度以降、外部研究資金などを活用し、実際の装置試作に取り組む予定である。化粧品の評価システムの構築に向けた検討も併せて推進。昨年度までの成果をもとに、今年度は健常ボランティアによる実験を実施。主に化粧品の主観評価とスペクトルの変化の相関関係並びに、ファンデーションなどの化粧品の塗布状況の劣化の定量化に取り組んだ。複数名の解析結果をまとめたところ、基礎検討とほぼ同様の傾向が得られたことから、ハイパースペクトラルイメージャーを用いた化粧品の定量評価の実現に大きく前進した。

化粧品の評価システムの開発では、健常ボランティアによる実験を実施し、化粧品の主観評価とスペクトルの変化の相関関係やファンデーションなどの化粧品の塗布状況の劣化の定量化に取り組んだ結果、化粧品の定量評価の実現に大きく前進した。本年度は装置の海外展開、更なる分野への応用を検討していた。白色人種ではメラノーマの有病率が高いことは事前に想定していたが、実際に装置をスウェーデンに設置し、臨床計測を開始すると、我々の想定以上に計測患者数が増加した。これは白色人種におけるメラノーマへの意識の高さが反映しているものと推測される。同時に課題もみつかりつつあり、次年度以降その解決を目指す。メラノーマ以外の分野への応用に関しては、化粧品分野での応用に向けた準備が整いつつあり、次年度以降実際の被験者を用いた計測の開始を計画している。メラノーマ診断に関しては、今後実用化に向けた小型化を推進するとともに、鑑別指標の性能向上を図る。特に微小な早期メラノーマの高感度検出に向けた検討を進める。小型ハイパースペクトラルイメージャーに関しては、来年度中の試作を検討している。完成後は検証実験の後、臨床研究機関等に設置を依頼し、実際の使い勝手を確認していただく予定である。化粧品評価に関しては大規模実験を実施し、指標値と感性評価の相関性を検証する予定である。生体分光計測引き続きスウェーデンでの臨床計測を実施するとともに、国内においても計測施設の増加を図る。既に国立がん研究センターへの装置移設が終了しており、本邦でのがん研究の最前線での臨床計測を開始することによって、これまで以上に症例数が増加することが期待できる。白色人種の計測によって明らかになりつつある、小さいメラノーマ病変への対応として、現在までに開発してきたSpectral AngleとEntropyを組み合わせた指標において、基準スペクトルの変更や、病変の領域抽出による患部領域の明瞭化を試みるとともに、新機軸、たとえば主成分分析の導入などによって、新たな視点からのハイパースペクトラルデータの解析にも挑む。化粧品分野へのハイパースペクトラルイメージャの応用として、次年度以降皮膚の経時変化や日照との関係など、まず基礎的なデータの収集から開始する予定である。今年度は主に外部共同研究機関との打ち合わせ出張が多く、予算としても十分に積算していたが、想定以上に出張が増えたため、消耗品等の購入を抑制した結果、20万円程度の残額が発生した。ほぼ計画通り執行したが、当初予定より安価に取得できた物品等があり、僅かに次年度使用額として繰り越した。来年度は装置の試作を検討していることから、当初予算より費用の支出が増額することを予想しており、これに今年度節約できた分を充てる。当初予定通りの使用計画で執行する予定である。次年度使用額に関しては物品調達の際に適宜調整される予定である。
健康及び歯周疾患罹患歯肉中におけるメルケル細胞の局在と機能について

目的:1.メルケル細胞の局在;歯肉を頬側と舌側に分け、年齢層・性別・歯周病の進行度別にメルケル細胞数、多形性(多形性は機能の異なるサブタイプを反映する可能性が高い)および部位(歯肉上皮基底層にあることは判明しているが、3次元的な位置を知る)を調査する.2.メルケル細胞の機能;神経成長因子によって誘導する機能を発現しているのかどうか、メルケル細胞-神経細胞複合体を形成して感覚受容器として機能しているのか、免疫反応に関与しているかを検討する.メルケル細胞と末梢神経の結合に関しては、(1)複合体を形成する割合(2)複合体の部位的な頻度の差異についても検討する.材料と方法:松本歯科大学病院歯周病君外来患者のうち臨床的健康歯周組織を持つメインテナンス患者の中で試料採取に同意した者から歯肉を採取した.また、炎症歯肉は当科外来患者の中で歯周炎と診断され試料採取に同意した者の歯肉を採取した.採取部位は頬側および舌側歯肉の歯肉辺縁からとした。採取した試料は歯肉頂縁から外縁上皮と内縁上皮に分け、固定、凍結ののち-80°Cにて保存した。結果:メルケル細胞の位置的な関係について、共焦点レーザ走査顕微鏡(CLSM)の使用の可能性を検討した.その結果、連続断層像が得られることや、画像上においてCLSMの測定機能を用いて種々の計測を行なうことができることから、メルケル細胞の3次元的な位置、あるいは細胞間の距離や面積を検討する上で有効であると思われた.CLSMの詳細についてはすでに報告を行なっている.研究発表:第481回大阪歯科学会例会平成13年12月共焦点レーザ走査顕微鏡(CLSM)による低Ca食飼育ラット切歯ラペリング像の観察,大阪歯科学会例会抄録集:1-2,2001.目的:1.メルケル細胞の局在:歯肉を頬側と舌側に分け、年齢層・性別・歯周病の進行度別にメルケル細胞数、多形性(多形性は機能の異なるサブタイプを反映する可能性が高い)および部位(歯肉上皮基底層にあることは判明しているが、3次元的な位置を知る)を調査する。2.メルケル細胞の機能;神経成長因子によって誘導する機能を発現しているのかどうか、メルケル細胞-神経細胞複合体を形成して感覚受容器として機能しているのか、免疫反応に関与しているかを検討する.メルケル細胞と末梢神経の結合に関しては、(1)複合体を形成する割合(2)複合体の部位的な頻度の差異についても検討する。材料と方法:松本歯科大学病院歯周病科外来患者のうち臨床的健康歯周組織を持つメインテナンス患者の中で試料採取に同意した者から歯肉を採取した。また、炎症歯肉は当科外来患者の中で歯周炎と診断され試料採取に同意した者の歯肉を採取した。さらに、本研究遂行の一環として、CPITNによる歯周疾患実態調査を行ない、検診の結果歯周治療が必要と判断された受診者の中から当科に来院可能な患者の歯肉も同様に採取した.採取部位は頬側および舌側歯肉の歯肉辺縁からとした。結果:CPITNを導入した歯科検珍を行なうことにより木曽地区における歯周治療の必要性が把握でき,受診勧告等により研究試料確保にも繁がった。研究発表:第42回秋季日本歯周病学会学術大会平成11年10月CPITNによる木曽地区の歯周疾患調査.日歯周誌,41。(秋季特別号):166,1999.目的:1.メルケル細胞の局在;歯肉を頬側と舌側に分け、年齢層・性別・歯周病の進行度別にメルケル細胞数、多形性(多形性は機能の異なるサブタイプを反映する可能性が高い)および部位(歯肉上皮基底層にあることは判明しているが、3次元的な位置を知る)を調査する。2.メルケル細胞の機能;神経成長因子によって誘導する機能を発現しているのかどうか、メルケル細胞-神経細胞複合体を形成して感覚受容器として機能しているのか、免疫反応に関与しているかを検討する。メルケル細胞と末梢神経の結合に関しては、(1)複合体を形成する割合(2)複合体の部位的な頻度の差異についても検討する。なお、歯周病の診断には当教室において開発した病態診断システム(コンピュータに自動歯周組織測定器を接続し、X線像および口腔内写真の画像上に歯周病の各臨床所見をコンピュータチャーティングするシステム)を使用した。採取部位は頬側および舌側歯肉の歯肉辺縁からとした。結果:コンピュータによる病態診断システムは、歯周病の診断を簡単に、早く、しかも正確に行なうことができるため、歯周病の進行度別メルケル細胞の局在を検討するにあたり大変有用であると思われた。研究発表:第19回日本歯科医学会総会・第22回アジア太平洋歯科大会

平成12年5月歯周病の総合診断システムの研究.日歯医師会誌,52(11):1398,2000.目的:1.メルケル細胞の局在;歯肉を頬側と舌側に分け、年齢層・性別・歯周病の進行度別にメルケル細胞数、多形性(多形性は機能の異なるサブタイプを反映する可能性が高い)および部位(歯肉上皮基底層にあることは判明しているが、3次元的な位置を知る)を調査する.2.メルケル細胞の機能;神経成長因子によって誘導する機能を発現しているのかどうか、メルケル細胞-神経細胞複合体を形成して感覚受容器として機能しているのか、免疫反応に関与しているかを検討する.メルケル細胞と末梢神経の結合に関しては、(1)複合体を形成する割合(2)複合体の部位的な頻度の差異についても検討する.材料と方法:松本歯科大学病院歯周病君外来患者のうち臨床的健康歯周組織を持つメインテナンス患者の中で試料採取に同意した者から歯肉を採取した.また、炎症歯肉は当科外来患者の中で歯周炎と診断され試料採取に同意した者の歯肉を採取した.採取部位は頬側および舌側歯肉の歯肉辺縁からとした。採取した試料は歯肉頂縁から外縁上皮と内縁上皮に分け、固定、凍結ののち-80°Cにて保存した。結果:メルケル細胞の位置的な関係について、共焦点レーザ走査顕微鏡(CLSM)の使用の可能性を検討した.その結果、連続断層像が得られることや、画像上においてCLSMの測定機能を用いて種々の計測を行なうことができることから、メルケル細胞の3次元的な位置、あるいは細胞間の距離や面積を検討する上で有効であると思われた.CLSMの詳細についてはすでに報告を行なっている.研究発表:第481回大阪歯科学会例会平成13年12月共焦点レーザ走査顕微鏡(CLSM)による低Ca食飼育ラット切歯ラペリング像の観察,大阪歯科学会例会抄録集:1-2,2001.
比較的大きな分子サイズの基質を認識する輸送但体を介したドラッグデリバリーシステム

比較的大きな分子サイズの基質を認識する輸送担体として、ペプチド輸送担体を取り上げた.ヒトの結腸ガン細胞由来の培養細胞であるCaco-2にはペプチド輸送担体としてPEPTIが発現している.この輸送担体は多様なアミノ酸配列のペプチドを効率よく取り込むための広い基質認識性を有している.そこで、細胞内での加水分解されにくいこと及び修飾に容易な反応基をもつという点を考慮し、Val-Lys-Sarを基本ペプチドとすることにした.細胞への取り込みの測定の容易さを考え、蛍光色素FITC(fluorescein isocyanate)およびcoumarin-3-carboxylic asidを上記のLysに付加することにした.この蛍光レポーター付きPEPTI基質のCaco-2細胞への取り込みを測定した.取り込み初速の濃度依存性を調べたところ、濃度に比例していた.PEPTIはH^+とのシンポーターであるので、脱共役剤であるCCCPによって取り込みは抑制される.実際、Lys-Sarは抑制が見られた.一方、本研究で合成した蛍光基質は、不思議なことに取り込み量が23倍に増大した.文献ではCaco-2細胞には多剤排出輸送体が発現しているとの報告があるので、この排出輸送体によって排出されると考えた.この排出輸送体の基質であると考えられている薬物であるメトキサレートを共存下で蛍光基質の取り込み速度は有意に低下した.この発見を発展させれば、抗ガン剤の排出を止めることのできる薬物を合成できると考えられる.比較的大きな分子サイズの基質を認識する輸送担体として、ペプチド輸送担体を取り上げた.ヒトの結腸ガン細胞由来の培養細胞であるCaco-2にはペプチド輸送担体としてPEPTIが発現している.この輸送担体は多様なアミノ酸配列のペプチドを効率よく取り込むための広い基質認識性を有している.そこで、細胞内での加水分解されにくいこと及び修飾に容易な反応基をもつという点を考慮し、Val-Lys-Sarを基本ペプチドとすることにした.細胞への取り込みの測定の容易さを考え、蛍光色素FITC(fluorescein isocyanate)およびcoumarin-3-carboxylic asidを上記のLysに付加することにした.この蛍光レポーター付きPEPTI基質のCaco-2細胞への取り込みを測定した.取り込み初速の濃度依存性を調べたところ、濃度に比例していた.PEPTIはH^+とのシンポーターであるので、脱共役剤であるCCCPによって取り込みは抑制される.実際、Lys-Sarは抑制が見られた.一方、本研究で合成した蛍光基質は、不思議なことに取り込み量が23倍に増大した.文献ではCaco-2細胞には多剤排出輸送体が発現しているとの報告があるので、この排出輸送体によって排出されると考えた.この排出輸送体の基質であると考えられている薬物であるメトキサレートを共存下で蛍光基質の取り込み速度は有意に低下した.この発見を発展させれば、抗ガン剤の排出を止めることのできる薬物を合成できると考えられる.細胞の「輸送機能を利用して」組織移行率を上げようとするドラッグデリバリーシステムの開発がされているが、現状では十分とはいえない.リ-ド物質として比較的大きな分子を選べば,生体の輸送タンパクは本来の基質と見分けられないでそれを輸送するので,組織移行率が上昇するであろうとのアイデアで本研究を行なった.リゾリン脂質に種々の蛍光色素を結合させた物質を合成した.これらを合成した目的は,蛍光色素分子を投与したい薬物と見做し,かつ,蛍光を利用して動態を研究するためである.また,蛍光色素の荷電を中性(pyrene),プラス(rhodamine123),マイナス(fluorescein)とした.ラット腸管evert sackを用いて,これらの薬物の腸管吸収実験を行なった.プラスの荷電を持っているものがやや大きな透過性を示すようなデータが得られている.生体膜が負の荷電を持っているので,静電的相互作用が若干あるのではないかと推察された.しかし,細胞内に取り込まれた蛍光リゾ脂質がすべて,脂質輸送体を介したものかどうかを検討する必要があり(下記を参照),平成8年度はpharamaco-kineticsの検討を行なう必要がある.生体膜そのものを使用する実験と平行して,平面脂質二分子膜のl-V曲線の解析から,種々の薬物の透過速度を解析した.これは受動輸送の速度を測定していることになる.このデータと腸管吸収のデータを比較検討し,輸送機能を介した取り込みの割合を推定する手段とする.腸管におけるペプチドのトランスポーターを介して,アミノ-β-ラクタム抗生物質、モノカルボン酸型β-ラクタム抗生物質,ジカルボン酸型β-ラクタム抗生物質,甲状腺刺激ホルモン分泌ホルモン,レニン阻害薬,アンジオテンシン変換酵素阻害薬,ニューキノロン系抗菌薬等の種々の薬物が体内に取り込まれることが明らかになっている.これらの化合物はペプチドボンド以外に,比較的大きな構造をもつグループを含んでいる.したがって,ペプチド・トランスポーターを介するドラッグ・デリバリーは本研究に適していると考えられた.上記化合物の構造を検討した結果,Val-Lys, Val-Orn, Val-Tyr, Val-Cys, Val-Glyのダイペプタイドを基本構造(vehicle)とし,これに薬物を付加することとした.検出の容易さを考え,蛍光色素(FITC)を疑似薬物とした.細胞はモノレイヤーになったCaco2細胞,Sw620細胞を用いた.これらのダイペプチドにFITCを付加したものを合成した.これらの疑似薬物を含んだ化合物は,ザルコシンの透過を拮抗阻害した.その阻害定数はすべて10乃至30μMであり,強くトランスポータに認識されることが示された.

しかし,残念なことに,これらの化合物,それ自信は透過しなかった.原因として,疑似薬物であるFITCが大きすぎることが考えられる.そこで,もう少し小さな蛍光色素(例えばNBD-CI)に変えた化合物を合成中である.比較的大きな分子サイズの基質を認識する輸送担体として、ペプチド輸送担体を取り上げた.ヒトの結腸ガン細胞由来の培養細胞であるCaco-2にはペプチド輸送担体としてPEPT1が発現している.この輸送体は多様なアミノ酸配列のペプチドを効率よく取り込むための広い基質認識性を有している.そこで、細胞内での加水分解されにくいこと及び修飾に容易な反応基をもつという点を考慮し、Val-Lys及びLys-Sarを基本ペプチドとすることにした.細胞への取り込みの測定の容易さを考え、蛍光色素FITC(fluorescein isocyanate)およびcoumarin-3-carboxylic acidを上記のLysに付加することにした.この蛍光レポーター付きPEPT1基質のCaco-2細胞への取り込みを測定した.取り込み初速の濃度依存性を調べたところ、濃度に比例していた.PEPT1はH^+とのシンポーターであるので、脱共役剤であるCCCPによって取り込みは抑制される.実際、Lys-Sarは抑制が見られた.一方、本研究で合成した蛍光基質は、不思議なことに取り込み量が23倍に増大した.文献ではCaco-2細胞には多剤排出輸送体が発現しているとの報告があるので、この排出輸送体によって排出されると考えた.この排出輸送体の基質であると考えられている薬物であるメトキサレートを共存下で蛍光基質の取り込み速度は有意に低下した.この発現を発展させれば、抗ガン剤の排出を止めることのできる薬物を合成できると考えられる.