hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
薬剤耐性マラリアに有効な新規治療剤の創製研究

私は、薬剤耐性マラリアを克服できる新しいマラリア治療薬の開発を行い、マラリア制圧に寄与することを研究目的として本研究を進める。有機合成品である環状化酸化化合物、及び天然資源由来の常山アルカロイド誘導体を中心に最適の抗マラリア候補薬の選抜とこれら化合物の抗マラリア作用機序の解明を行う。本研究の研究成果を下記に示す。1.環状過酸化化合物の作用メカニズムの解析を網羅的に行った。マラリア原虫たんぱく質の2次元電気泳動分離条件をもとにN-251及びN-89の作用前後の相違のあるたんぱく質のパターンを比較し、MALDI-TOF/MSでたんぱく質を同定した。その結果、マラリア原虫の細胞骨格を形成するタンパク質、栄養源の獲得時に必要なタンパク質、及び原虫の生命維持に関わるタンパク質を同定した。また、環状過酸化化合物の標的と思われるタンパク質を1種類検出できた。2.環状過酸化化合物に耐性を有する熱帯熱マラリア原虫を獲得するために、薬剤プレッシャーとクローニング手法により1×10^<-7>Mでも培養できる耐性熱帯熱マラリア原虫株を得た。3.常山誘導体の合成研究を行い、10種類の誘導体の中から抗マラリア活性を示す化合物を1種類選抜した。4.メフロキン耐性熱帯熱マラリア原虫の薬剤耐性機構の解析のために、アフィメトリックス社のマラリア専用のGene Chip(Plasmodium/Anopheles DNA Micro Array)を用いて遺伝子解析を行ったところ、マラリア原虫のpfmdr-1遺伝子のみ増幅し、その他のpfcrt、およびpfmrpの増幅は見られなかった。また、メフロキン耐性の熱帯熱マラリア原虫に抗結核薬を併用するとメフロキンの感受性が60倍回復する結果を得た。上記の実験で得られたタンパク質が遺伝子の発現パターンと関連するかどうかを調べ、最終的にこれら環状過酸化化合物の標的分子を決定する。マラリアの制圧を考えるとき薬剤耐性を克服できる薬剤の開発は第一義的に重要である。私は薬剤耐性熱帯熱マラリア原虫に有効な新規抗マラリア薬を開発し、学術研究の面で国際貢献すると同時に、作用機序の明らかな抗マラリア薬をマラリア流行地に提供したい。下記に今年度の研究成果を記する。(1)1,2,4,5-テトラオキサシクロアルカン類化合物の誘導体の研究を行い、今年度に新たに20種類の誘導体を合成した。これら化合物の培養熱帯熱マラリア原虫、および培養動物細胞を用い、抗マラリア薬効と選択毒性を検討した結果、1×10^<-7>M以下で抗マラリア活性を示す化合物を3種類得た。これら化合物はいずれも1,2,4,5-テトラオキサシクロアルカンの骨格を有し、抗マラリア活性にこの構造は必須であることがわかった。(2)環状過酸化化合物の抗マラリア標的分子の探索のために、アフィニティカラムの条件検討を行った。環状過酸化化合物のアミノ基残基とアズルラクトン残基がアミド結合することを応用したアフィニティカラムを作成し、マラリア原虫粗抽出物より環状過酸化化合物特異的に結合するたんぱく質を見いだした。現在、これらたんぱく質の分離条件の改良研究を行っている。(3)環状過酸化化合物に耐性を有する熱帯熱マラリア原虫を獲得するために、薬剤プレッシャーとクローニング手法により1×10^<-7>Mでも培養できる耐性熱帯熱マラリア原虫株を得た。この原虫株はアルテミシニンに対しても薬剤耐性を示し、これら化合物の薬剤耐性、および交差耐性に関わる遺伝子の解析研究を開始した。

(4)常山誘導体の合成研究を行い、10種類の誘導体の中から抗マラリア活性を示す化合物を1種類選抜した。この化合物の抗マラリア活性は1×10^<-6>Mと弱い抗マラリア活性を示したが、細胞毒性の値が低く、常山アルカロイドが有する強い細胞毒性が生じる弱点を改善できるキー化合物になりえる知見を得た。現在細胞毒性をさらに軽減させるための誘導体を設計し、合成中である。(5)メフロキン耐性熱帯熱マラリア原虫の薬剤耐性機構の解析のために、アフィメトリックス社のマラリア専用のGene Chip(Plasmodium/Anopheles DNA Micro Array)を用いて遺伝子解析を行ったところ、マラリア原虫のpfmdr-1遺伝子のみ増幅し、その他のpfcrt、およびpfmrpの増幅は見られなかった。この結果より他の薬剤耐性に関わる遺伝子はメフロキン耐性には影響しないことがわかった。現在、遺伝子解析で相違があると認められた100種類の遺伝子について解析を行っている。また、メフロキン耐性の熱帯熱マラリア原虫に抗結核薬であるリファンピシンを併用するとメフロキンの感受性が60倍回復する結果を得た。マラリアは、現在でも熱帯地域全体に広く蔓延しているだけでなく、温帯の多くの地域でも発生しており、WHOの最新統計によると世界中で年間2億7,000万人の人々がマラリアに感染し、その内、100万人以上が死亡している(2000年WHOの報告)。近年、マラリアの特効薬であるクロロキンに耐性を示すマラリア原虫が出現し、それが全流行地に分布するに及び撲滅作戦は遂行不可能となり、現在に至っている。私は、薬剤耐性マラリアを克服できる新しいマラリア治療薬の開発を行い、マラリア制圧に寄与することを研究目的として本研究を進める。有機合成品である環状化酸化化合物、及び天然資源由来の常山アルカロイド誘導体を中心に最適の抗マラリア候補薬の選抜とこれら化合物の抗マラリア作用機序の解明を行う。平成17年度の研究成果を下記に示す。1.環状過酸化化合物の作用メカニズムの解析を網羅的に行った。昨年度に見いだしたマラリア原虫たんぱく質の2次元電気泳動分離条件をもとにN-251及びN-89の作用前後のたんぱく質のパターンを比較し、相違のあるバンドを切り出し、MALDI-TOF/MSでたんぱく質を同定した。2.N-251誘導体をリガンドとするアフィニティ法を用い、熱帯熱マラリア原虫のマラリア原虫粗抽出液から分子標的候補タンパク質を単離し、そのアミノ酸配列より遺伝子を特定した(両実験で得られた関連タンパク質は現在再現性の実験を行っているので、再現性を実験を行っている。3.マラリア原虫にN-251、N-89、およびアルテミシニン作用時の遺伝子の発現パターンをアフィメトリクス社のGeneChip^<【○!R】>(Plasmodium/Anopheles Genome Array)を用いて解析し、上記の実験で得られたタンパク質が遺伝子の発現パターンと関連するかどうかを調べ、最終的にこれら環状過酸化化合物の標的分子を決定する実験を行っている。
褐藻カヤモノリ目の分子系統学的研究

PCRのためのプライマーを新たに作成し,14種(ムラチドリ,モサクダフクロ,フクロノリ,ウスカワフクロノリ,ホソクビワタモ,ワタモ,カゴメノリ,カヤモノリ,カヤモドキ,ウスカヤモ,ヒラカヤモ,ホソバノセイヨウハバノリ,セイヨウハバノリ,ハバノリ)についてリポソーム遺伝子の大サブユニットの変異領域(D1D2領域,550bp),ITS1領域とrbcLおよびrbcS遺伝子のDNA塩基配列をPCRダイレクトシーケンス法により決定した。前年度に得られたITS2領域とrbcLとrbcS遺伝子の間にあるスペーサー領域のDNA塩基配列も用いて,最節約法と近隣接合法により系統樹を作成し評価を行った。ITSとrbcスペーサーでは,多数のギャップによりアラインメントがむずかしく,得られた系統樹においてもブートストラップ値の低い枝が多く有効な情報は少なかった。rbcLとSではギャップはみられず,リボソームの大サブユニットも2カ所でギャップがみられるのみであった。アラインメントが確かなこれらの塩基配列をもとに,カヤモノリ目に近縁とされているシオミドロを外群とし,系統推定を行った。最節約法と近隣接合法による系統樹はほぼ同様のもので,ムラチドリ科の独立性は疑わしいこととフクロノリ属,カヤモノリ属,セイヨウハバノリ属は多系統であることを示した。カヤモノリ目は異形世代交代を行い,その分類は大形の世代である配偶体の形態をもとに行われてきた。今回の結果は,それらの分類形質が系統を反映していないことを示している。一方,小さな世代である胞子体の形態は分類形質として用いられてこなかったが,その形態形質は今回の分子系統樹とよく一致していた。カヤモノリ目の科と属の分類体系は,胞子体の形態も分類形質として用いて大きく改訂する必要があることが明らかになった。本研究の成果は国際藻類学会誌(Phycologia)に投稿中である。1.DNAの抽出藻体からの前DNAの抽出には培養藻体を用いた.当初はPCRに用いることができるDNAは得られなかったが,藻体のつぶし方や用いる藻体の量を工夫し,UNSET法とGENECLEANIIによる精製を組み合わせることでPCRに用いることができるDNAを得ることができた.遊走細胞からのDNAの抽出にはベンジルクロライド法が有効であった.2.DNAの塩基配列の決定と系統解析PCRのためのプライマーについては,すでに発表されているものでは良い結果が得られなかったので新たにプライマーを作成し,14種(ムラチドリ,モサクダフクロ,フクロノリ,ウスカワフクロノリ,ホソクビワタモ,ワタモ,カゴメノリ,カヤモノリ,カヤモドキ,ウスカヤモ,ヒラカヤモ,ホソバノセイヨウハバノリ,セイヨウハバノリ,ハバノリ)についてリボソーム遺伝子のITS2領域とrbcLとrbcS遺伝子の間にあるスペーサー領域のDNA塩基配列をPCRダイレクトシークエンス法により決定した.最節約法と近隣接合法により系統樹を作成したが,ブートストラップ値の低い枝が多く,有効な情報は少なかった.rbcL遺伝子についてもPCRのためのプライマーを作成し,4種(カゴメノリ,カヤモノリ,ホソバノセイヨウハバノリ,セイヨウハバノリ)について塩基配列を決定した.PCRのためのプライマーを新たに作成し,14種(ムラチドリ,モサクダフクロ,フクロノリ,ウスカワフクロノリ,ホソクビワタモ,ワタモ,カゴメノリ,カヤモノリ,カヤモドキ,ウスカヤモ,ヒラカヤモ,ホソバノセイヨウハバノリ,セイヨウハバノリ,ハバノリ)についてリポソーム遺伝子の大サブユニットの変異領域(D1D2領域,550bp),ITS1領域とrbcLおよびrbcS遺伝子のDNA塩基配列をPCRダイレクトシーケンス法により決定した。
歴史的都市・村落の環境保全に関する調査研究

平成16年度は7月と10月に研究会を開催し、14年度と15年度に行った国外調査と国内調査の結果について意見交換を行った。7月の研究会では報告書の作成の方針について検討した。報告書の内容を1.問題の所在と課題2.現地調査報告3.まとめと提言に大別すること、その各々の小項目及びその執筆担当者と秋の研究会で研究分担者によるフリートーキングの座談の会を開き、その内容も報告書に収録することを決定した。国内の重要伝統的建造物群保存地区の図面を凡例を記載して報告書の添付資料とすることも決定した。10月の研究会では国外調査と国内調査の結果を踏まえてフリートーキングで意見交換を行い、この記録を座談会記事として報告書に収録した。研究テーマに関する問題の所在が多くの行政の制度と関連し、かつ今後取り組むべき課題も多岐にわたることが2年余の調査研究で明らかになってきたために問題の所在を洗い出し、課題を多角的に分析するために座談会形式のフリートーキングが有益であると考えられたためである。各研究分担者等によって作成された原稿は研究分担者の立命館大学歴史都市防災研究センター益田兼房教授と立命館大学歴史都市防災研究センター板谷直子ポスドク研究員がとりまとめ、研究代表者の中村が全体を見て部分的に必要な修正を執筆者と協議し、実施した。重要伝統的建造物群保存地区の図面については、保存地区の所在する市町村に文化庁文化財部建造物課から改めて提出を依頼し、江面主任文化財調査官と益田教授が数回にわたってこれを点検し、市町村にフィードバックしたうえで最終的な図面を確定した。図面の作成、修正等に関しては東京藝術大学大学院美術研究科文化財保存学専攻保存修復建造物研究室所属の大学院学生の方々の協力を得て行った。平成14年度の研究調査では、まず、6月21日の会議にて研究分担者が集まり、本年度の研究の目的等を確認し、国内調査、海外調査の計画を立案。国内調査としては、8月28日から3日間、岡山県、倉敷市、高梁市を調査研究。県の景観条例、倉敷市の美観地区景観条例等の説明を受けると共に、成羽町吹屋伝建地区、旧関谷学校、後楽園等の現地調査を実施した。また、11月21日,22日、函館市を調査研究。初日は、地区保存会の住民代表の聞き取り調査を行った後、都市デザイン課、文化財課から借上げ住宅を巡る経過と問題点について説明を受ける。2日目は現地調査と検討会を実施。海外調査は、まず、中村賢二郎学長が7月末、イギリス・ヨーク市、ドイツ・ヘルボルン市、パッサウ市での調査を実施した。篠藤教授は、12月末、ドイツ・ノルトライン・ヴェストファーレン州で取材、宮脇助教授は、3月、イタリア・フェッラーラ、アッシジ、パルマで調査研究。和田教授は、3月末、フランス・パリ、ディジョンを視察し研究した。本年度は、それぞれの国、都市で、環境保全に関連する施策等を取材すると共に関連資料の収集にも努めた。3月3日には、今年度研究の総括を行うため、文化庁において同文化財部建造課の江面主任調査官を交え、終日、検討会を行った。海外調査の報告はドイツのみであったが、国内調査の報告ともども、今年度の総括と来年度研究の課題が話し合われた。国外では7月下旬8月初旬、ドイツの調査を中村、篠藤と研究協力者の江面(文化庁建造物課主任文化財調査官)の3名で、ノルトライン・ウエストファーレン州記念物保護局及びモンシャウ市、ヘッセン州ヘルボルン市、バイエルン州ローテンブルク市の実地調査を行った。実地調査にはそれぞれの州の記念物保護担当官が市の担当官と共同して対応してくれた。また、8月下旬、中村、益田、江面の3名で韓国文化財庁と慶尚北道の安東河回村、安東民俗村、月城良洞村、済州道の城邑民俗村の実地調査を行った。各民俗村の実地調査にはそれぞれの道の文化財担当官が同行して対応してくれた。国内では9月上旬、中村、益田、上野、岸井、赤坂の5名と研究協力者の寺田(文化庁建造物課専門官)で沖縄県那覇市等の調査を行った。また、16年1月には中村、益田、上野、岸井、赤坂、和田、江面の7名で京都市及び美山町北重要伝統的建造物群保存地区の実地調査を行った。これらの実地調査に先立って府、県、市の担当官と意見交換を行うとともに現地調査にも同行していただいた。15年6月下旬第1回全体研究会を文部科学省会議室で開催。14年度に実施したイギリス、ドイツ(担当中村)、フランス(担当和田)、イタリア(担当宮脇)の海外調査の報告に基づいて意見交換を行った。16年3月には第2回全体研究会を文部科学省会議室で開催。15年度に実施したドイツ、韓国、沖縄、京都の調査結果の報告に基づいて意見交換を行い、16年度のとりまとめ方針について打合せを行った。

国内の重要伝統的建造物群保存地区の図面を凡例を記載して報告書の添付資料とすることも決定した。10月の研究会では国外調査と国内調査の結果を踏まえてフリートーキングで意見交換を行い、この記録を座談会記事として報告書に収録した。研究テーマに関する問題の所在が多くの行政の制度と関連し、かつ今後取り組むべき課題も多岐にわたることが2年余の調査研究で明らかになってきたために問題の所在を洗い出し、課題を多角的に分析するために座談会形式のフリートーキングが有益であると考えられたためである。各研究分担者等によって作成された原稿は研究分担者の立命館大学歴史都市防災研究センター益田兼房教授と立命館大学歴史都市防災研究センター板谷直子ポスドク研究員がとりまとめ、研究代表者の中村が全体を見て部分的に必要な修正を執筆者と協議し、実施した。重要伝統的建造物群保存地区の図面については、保存地区の所在する市町村に文化庁文化財部建造物課から改めて提出を依頼し、江面主任文化財調査官と益田教授が数回にわたってこれを点検し、市町村にフィードバックしたうえで最終的な図面を確定した。図面の作成、修正等に関しては東京藝術大学大学院美術研究科文化財保存学専攻保存修復建造物研究室所属の大学院学生の方々の協力を得て行った。
日和見リンパ腫の臨床免疫学的研究

伝染性単核球症(IM)症候群は通常宿主の免疫学的防御機構により、self-limitingに良好な経過をとるが、宿主に何らかの免疫不全状態がある場合にはEBvirus(EBV)起因性と考えられる日和見リンパ腫(opportunistic lymphoma)の発生をみることが最近注目されている。既往のリンパ網内系腫瘍におけるEBV関連抗体価推移の検索から、retrospectiveに少数例(7/135〓5%)ではあるが、Burkittリンパ腫以外のリンパ系腫瘍のなかにEBV関与の可能性を示唆する症例の存在が考えられた。これらはIM様症状、非特異性リンパ節炎像の先行、starry sky様組織球増生、節外病変など可成り特異的な臨床像を示すものであった。またprospectiveな検索の過程で、約1年半の慢性EBV感染症の経過後、EBNA、EBVgenome陽性のびまん性大細胞型、B細胞性リンパ腫に進展した62才男性の症例に遭遇した。本症例の経過中の免疫学的検討から、患者末梢リンパ球のNK活性およびmitogenによる芽球化反応は正常であったが、通常のIMと異なり、T8(+)、Ia(+)のT細胞の増加を認めず、T8(+)、Ia(-)細胞が増加し、抗体産生系においてもSuppressor T細胞の誘導がIgMクラスを除き認められず、またoutgrowth inhibition assayからEBV特異的cytotoxic T細胞活性は欠如していた。以上から本症例ではEBV特異的cytotoxic T細胞、suppressor T細胞の両者に障害があり、慢性EBV感染さらに悪性リンパ腫すなわちEBV起因性日和見リンパ腫への進展に至ったと推測された。なお本症例は一時期Interferon(α,β)によって腫瘍増殖の抑制がみられたことは、本症の発症機転と関連して興味深い。また本症は家族性に発症するx-linked recessive lymphoproliferative syndrome(XLP)とは免疫異常を異にし、後天性の成人例として貴重な症例と考えられた。現在、さらに他の免疫不全状態に続発したリンパ腫症例の蒐集と解析を計画し、Wiskatt-Aldrich症候群に続発したB細胞リンパ腫、common variable immunodeficiencyに続発したT細胞リンパ腫などを鋭意検討中である。
環境による性決定遺伝子の発現調節メカニズムの解明―甲殻類ミジンコをモデルとして―

生物の性決定の方法は、性染色体により性が決まる遺伝性決定と環境により決まる環境性決定に大きく分類される。以前に我々は、ミジンコを用いて世界で初めて環境性決定に必須の性決定遺伝子を同定した。興味深いことにこの遺伝子は、遺伝性決定を行う動物と同じ性決定遺伝子であることを発見し、性決定の普遍性を見いだした。本研究では、環境依存的に活性化されるミジンコの性決定遺伝子を制御する因子を明らかにすることを目的とした。RNA-Seq法による網羅的な遺伝子発現解析、また他の生物の性決定遺伝子の相同遺伝子の解析を行い、候補制御因子を複数見いだすことに成功した。生物の性決定の様式は、遺伝性決定と環境性決定に大きく分類される。私達は最近ミジンコの環境性決定の制御に、他の動物の遺伝性決定を制御する転写因子DSXのオーソログが機能していることを発見し、遺伝子レベルでの性決定の普遍性を見いだした。また、環境の悪化を感知した個体が体内の幼若ホルモンのレベルを上昇させdsx遺伝子の発現を誘導していることを示唆する結果も得た。本研究では、2つの仮説を立て幼若ホルモンによるdsx遺伝子の制御機構を解析する。1つ目の仮説(仮説1)は、幼若ホルモン受容体である転写因子METが直接dsx遺伝子の発現を誘導しているというものである。仮説1を証明するために、タグ配列を付加したMETのChIP解析を行う。本年度は、タグを付加したMETを発現するトランスジェニックミジンコを作製するために必要なゲノム編集技術の基盤を整備した。これまでにTALEN及びCrispr/Cas9を利用した標的配列の二本鎖切断技術を確立し、ノックイン技術の開発にも成功した。もう1つの仮説(仮説2)は、幼若ホルモンにdsx以外の遺伝子が最初に応答し、その遺伝子産物がdsx遺伝子を制御しているというものである。仮説2を証明するために、新学術領域研究「ゲノム支援」活動より支援をいただいて幼若ホルモン感受期からdsx遺伝子が発現する時期までの経時的な遺伝子発現変化のRNA-Seq解析を行い、性決定時期の幼若ホルモン応答遺伝子を探索する。本年度は、サンプル全てのシーケンスを終了し、データ解析を開始した。本研究では、幼若ホルモンによるDsx遺伝子の制御機構を解析し、動物種を越えて保存された性決定遺伝子Dsxの発現が、どのように環境変化に応答するのかを解明することを目的とし、2つの仮説を立て研究を進めた。1つ目の仮説は、幼若ホルモン受容体である転写因子METが直接Dsx遺伝子を制御しているというものである。この仮説をChIP解析により検証するために、タグ配列を付加したMETを発現するトランスジェニック個体を作出を試みた。前年度に引き続きミジンコのゲノム編集技術の開発を進め、相同組み換えによる遺伝子導入法を確立した。一方で、2Aペプチド配列を利用しタグ融合型MET遺伝子と蛍光タンパク質遺伝子をバイシストロニックに発現させる系を開発した。また、眼の色素遺伝子が形質転換のマーカーとなることも見出した。今後これらの技術をトランスジェニック個体の作製に応用できる。2つ目の仮説は、幼若ホルモンにより活性化した遺伝子が間接的にDsx遺伝子の発現を制御しているというものである。昨年度行った性決定時期のRNA-Seqの解析を行い、リファレンスゲノムへのTopHatによるマッピング、Cufflinks及びCuffmergeによるトランスクリプトのアセンブル、Cuffquant及びCuffdiffによる遺伝子発現解析、CummeRundによるデータの可視化を行った。その結果、2倍以上有意に発現が上昇、減少した遺伝子を複数見出した。一方で、遺伝的に性決定を行う生物で性決定、分化に働くことが知られているFTZ-F1遺伝子のオーソログをミジンコから単離、解析し、性特異的な遺伝子発現を示すことを明らかにした。ノックダウンによる表現型は胚性致死であったが、FTZ-F1がミジンコの環境性決定を制御していることが示唆された。「ゲノム支援」活動より援助をいただき、当初の研究計画を少し変更したが、概ね順調に進展している。環境分子生物学タグ配列を付加したMETを発現するトランスジェニックミジンコをゲノム編集技術を利用して作製し、dsx遺伝子に対してChIP解析を行う。RNA-Seqデータを解析し、性決定時期に発現が変動する幼若ホルモン応答遺伝子を抽出する。ノックダウンなどにより見出した幼若ホルモン応答遺伝子の遺伝子操作を行いdsx遺伝子の制御因子であるか否かを明らかにする。
言語知識を融合した学習ネットワークの構築法に関する研究

システム同定と制御において,ノイズの問題は不可避であり,ネットワーク手法で同定と制御を行うときに,ノイズの特徴を把握し,ノイズを含む信号がネットワークをどのように伝達して行くのかを調べる必要がある.また,色々な非線形変換関数を持つノードや色々な形態を持つネットワークがある中で,同定と制御の仕様にマッチするネットワークを構成するには,人間の知識や経験を生かした学習プロセスをコントロールできるネットワークの構成法が必要である.本研究では,学習ネットワークを用いたシステム同定と制御に向けて,次の各項について研究を行った:1)RBPネットワークとその構成法の開発RBFネットワークとパーセプトロンネットワークを結合して,二つの異なる種の隠れ層を持つネットワーク,RBP(Radial Basis Function-Perceptron)ネットワークとその構成法を提案した.RBPネットワークはパーセプトロンとRBFネットワークの両方の長所を兼ね備えており,学習速度が速く,汎化能力も良い.2)確率信号のネットワーク伝播特性の解析ネットワーク上のノイズを含む各信号の確率特性をその各次モーメントで表現し、各信号がネットワークを通過したとき、それらのモーメントのネットワーク伝播特性を調べ、各ノードにおける信号の各次モーメントの計算法を開発し、数値シミュレーションの検証を行った.3)雑音分散の推定法の発展ノイズに励起される自己回帰モデルを例題として,ノイズを量的に特徴付ける最も重要な指標として,ノイズの分散を推定することについて考え,ForwardとBackwardの補助統計量を導入することにより,数値的不安定性の問題を解決した.システム同定と制御において,ノイズの問題は不可避であり,ネットワーク手法で同定と制御を行うときに,ノイズの特徴を把握し,ノイズを含む信号がネットワークをどのように伝達して行くのかを調べる必要がある.また,色々な非線形変換関数を持つノードや色々な形態を持つネットワークがある中で,同定と制御の仕様にマッチするネットワークを構成するには,人間の知識や経験を生かした学習プロセスをコントロールできるネットワークの構成法が必要である.本研究では,学習ネットワークを用いたシステム同定と制御に向けて,次の各項について研究を行った:1)RBPネットワークとその構成法の開発RBFネットワークとパーセプトロンネットワークを結合して,二つの異なる種の隠れ層を持つネットワーク,RBP(Radial Basis Function-Perceptron)ネットワークとその構成法を提案した.RBPネットワークはパーセプトロンとRBFネットワークの両方の長所を兼ね備えており,学習速度が速く,汎化能力も良い.2)確率信号のネットワーク伝播特性の解析ネットワーク上のノイズを含む各信号の確率特性をその各次モーメントで表現し、各信号がネットワークを通過したとき、それらのモーメントのネットワーク伝播特性を調べ、各ノードにおける信号の各次モーメントの計算法を開発し、数値シミュレーションの検証を行った.3)雑音分散の推定法の発展ノイズに励起される自己回帰モデルを例題として,ノイズを量的に特徴付ける最も重要な指標として,ノイズの分散を推定することについて考え,ForwardとBackwardの補助統計量を導入することにより,数値的不安定性の問題を解決した.非線形システムにおいて、ノイズの特性を確率分布密度関数で表現したり、解析するのはとても困難である。本研究では、ネットワーク上のノイズを含む各信号の確率特性をその各次モーメントで表現し、各信号がネットワークを通過したとき、それらのモーメントのネットワーク伝播特性を調べ、各ノードにおける信号の各次モーメントの計算法を開発し、数値シミュレーションの検証を行った。さらに、ネットワークの出力ノードにおける信号を評価するコスト関数を設定し、このコスト関数の値が最適値になるような学習法を開発した。信号の各次モーメントの計算には2次以上の微分計算が必要になり、ネットワーク上で学習を実行するためには、さらに高次の微分演算が必要になってくる。本手法は高次微分の伝播を計算できるのが大きな特徴である従来の制御理論では非線形複雑系の同定と制御問題を取り扱うことが困難である。本研究は非線形複雑系の同定と制御において、ノイズに強く、自律的に学習プロセスをコントロールする学習ネットワークの構築法の開発を目的としている。昨年度はノイズの確率特性を各次モーメントで表現し、その伝播の規則を明らかにし、また、ノイズのモーメントを含む評価関数を考案し、それを最適化する学習法を開発した。今年度はさらに、パーセプトロンネットワークとRadial Basis Functionネットワークを合成したラジアル基底パーセプトロンネットワーク(RBPN)の構成法とその学習アルゴリズムを開発した。RBPNはパーセプトロンネットワークのパターン分類性の良さとRBFネットワークのグローバル最適化可能性という長所を兼ね備えており、また、単純なシグモイド関数ネットワークやRBFNよりも優れた汎可能力を持っている。このネットワーク手法をパターン認識問題や入札価格決定支援システム等に適用し、その有効性を立証した。
児童・生徒の動作分析とEMG計測および意識調査による学校用家具の検討

平成17年度は大学生8名を対象に,また,平成18年度は中学1年生の生徒10名を対象にして,学校用家具使用時の動作分析と筋活動の計測を行った。使用した机・椅子は,JIS規格の2号から6号までの号数で高さの調節が可能な木製机・椅子である。被験者の身長から割り出した適正号数の机・椅子の高さを基準とし,その高さから1号分高い高さと,1号分低い高さの机・椅子も使用し,この3段階に高さを変えて,体圧分布測定システムを用い,着座時の荷重値の変化,荷重分布重心の移動等を分析した。また,同時に,表面筋電計を用いて筋活動を調べるために,脊柱起立筋および僧帽筋に電極を取り付けて計測を行い,RMS法の分析手法で筋疲労について検討した。被験者には同じ号数の机・椅子で書き写し作業を行ってもらい,その後,机・椅子に関する意識アンケート調査を行った。この実験の結果,大学生対象の場合,脊柱起立筋では,適正号数よりも1号分高い机・椅子を使用したときに他の高さよりも疲労度が比較的小さくなったが,僧帽筋では顕著な差はみられなかった。また,中学生では,脊柱起立筋と僧帽筋では特に差はなかった。大学生の場合,適正号数の机・椅子を使用した場合に,身体の荷重分布重心の動きが抑えられ,1号分高い机・椅子を使用した場合に,座面の座骨結節点周辺部の体圧が大腿部の裏側へ移動し圧力が分散されることがわかった。中学生の場合は3段階の高さの違いによる荷重分布重心の移動距離の変化は特にみられなかった。また,アンケートによる意識調査から,大学生の場合は,適正号数の机・椅子を使用したときに適切な高さだと回答する人が多く,中学生の場合は1号分高い机・椅子が適切な高さだという回答が多かった。大学生と中学生ともに,1号だけ低い机・椅子を使用した場合に最も疲れ,大学生の場合は特に腰と右肩に,中学生の場合は右肩と手・腕に疲れを訴える回答が多くなった。平成17年度は,児童・生徒の学校用家具使用時の動作分析や筋活動の計測の予備実験として,大学生8名を対象にして実験を行った。計測に使用した机・椅子は,JIS規格の2号から6号までの号数で高さの調節が可能な木製机・椅子を使用した。被験者の身長から割り出した適正な机・椅子の高さを基準とし,その高さから1号だけ高い高さと,1号だけ低い高さの机・椅子も使用し,この3段階に高さを変えて,体圧分布測定システム(ニッタ株式会社,Clinseat)を用いて,着座時の荷重値の変化,荷重分布重心の移動等を分析した。また,同時に,表面筋電計(Thought Technology社,ProComp Infiniti)を用いて筋活動を調べるために,右脊柱起立筋および右僧帽筋に電極を取り付けて計測を行い,RMS法の分析手法で筋疲労について検討した。被験者は,同じ号数の机・椅子で20分間の書き写し作業を行い,その後,机・椅子に関する意識アンケート調査を行った。被験者には同じ号数で,この作業とアンケート回答を2回繰り返してもらった。なお,アンケートの内容は,高さの感じ方,姿勢の変化,背筋の曲がり具合等であり,疲れを感じた身体部位については図示して回答してもらった。

この予備実験の結果,適正な高さの机・椅子を使用した場合に,身体の荷重分布重心の動きが抑えられることがわかり,適切号数よりも1号だけ高い机・椅子を使用した場合に,座面の座骨周辺部の体圧が大腿の裏へ移動し圧力が分散されることがわかった。また,アンケートによる意識調査から,適切号数よりも1号だけ低い机・椅子を使用した場合,最も身体に負担がかかり,特に腰に与える影響が大きいことがわかった。さらに,筋活動の計測から,適正号数よりも1号だけ高い机・椅子を使用した場合に,脊柱起立筋の筋活動が小さくなることがわかった。平成18年度は,この予備調査の結果に基づき,小学校・中学校・高等学校の児童・生徒を対象に,適切な机・椅子の高さの検討を行う予定である。平成18年度は,中学1年生の生徒10名(男性5名,女性5名)を対象にして,学校用家具使用時の動作分析と筋活動の計測を行った。使用した机・椅子は,JIS規格の2号から6号までの号数で高さの調節が可能な木製机・椅子である。被験者の身長から割り出した適正な机・椅子の高さを基準とし,その高さから1号だけ高い高さと,1号だけ低い高さの机・椅子も使用し,この3段階に高さを変えて,体圧分布測定システムを用いて"着座時の荷重値の変化,荷重分布重心の移動等を分析した。また,同時に,表面筋電計を用いて筋活動を調べるために,右脊柱起立筋および右僧帽筋に電極を取り付けて計測を行い,RMS法の分析手法で筋疲労について検討した。被験者には同じ号数の机・椅子で15分間の書き写し作業を行ってもらい,その後,机・椅子に関する意識アンケート調査を行った。被験者には異なる高さの号数で,この作業とアンケート回答を繰り返してもらった。なお,アンケートの内容は,高さの感じ方,姿勢の変化,背筋の曲がり具合等であり,疲れを感じた身体部位については図示してもらった。この実験の結果,適切号数よりも1号だけ高い机・椅子を使用した場合に"座面の座骨周辺部の体圧が大腿の裏へ移動し圧力が分散されることがわかり,平成17年度に大学生8名を被験者として行った実験と同様な結果となった。また,大学生の場合は,適正な高さの机・椅子を使用した場合に,身体の荷重分布重心の動きが抑えられていたが,中学生の場合は,3段階の高さの違いによる荷重分布重心の移動距離の変化は特にみられなかった。また,筋活動の計測結果から,中学生の場合は高さの違いによる筋活動の変化は特にみられなかった。さらに,アンケートによる意識調査から,適正号数よりも1号だけ高い机・椅子がちょうどよい高さという回答が多く,一方で,1号だけ低い机・椅子を使用した場合に最も疲れ,特に肩の疲れを訴える回答が多くなった。
自閉症者における到達把持運動中の視覚運動変換とその発達過程の検討

自閉スペクトラム症(ASD)者の動作について,これまで「ぎこちない,不器用である」と指摘されてきたが,その詳細な運動学的特性については不明であった.そこで,本研究では,16歳20歳前半のASD者を対象に,日常的動作の1つである到達把持運動に着目して,運動中の見えによる把持調節,把持から持ち上げ動作への遷移過程について,同年齢の定型発達者と比較した.その結果,ASD者の把持調節は定型発達者と類似している一方,遷移過程については持ち上げ開始の遅れが認められ,動作間連結化の困難さが認められた.到達把持運動実行時における,視覚によるつかみ幅(親指・人差指間距離)の調節機能を検討するため,モーションキャプチャーシステムを用いて,自閉症スペクトラム(ASD)者および定型発達者の運動学的特性を検討した.本年度は,実験参加者の正面30cmに配置した木製円柱(直径4cmと6 cm)に対する到達把持運動実行中の見え(オンライン視覚)の影響を調べるため,液晶シャッターゴーグルを用いて,運動中常に視覚が利用可能な場合(視覚あり(Full Vision: FV)条件)と運動開始後(スタート位置のスイッチから手を離すと)見えが遮断される条件(視覚なし(No Vision: NV)条件)を比較した.視覚条件の提示方法として,1. FV条件とNV条件をブロック化する場合(同一ブロック内では常に同じ視覚条件で課題を実行する,ブロック化条件)と,2. FV条件とNV条件を交互に提示する場合(交互条件)の2種類設定した.定型発達者については,運動中に記録される,指間距離最大値(把持制御におけるオンライン視覚の影響の指標と考えられる)が,FV条件よりNV条件において大きかった.さらに,ブロック化条件の方が,交互条件に比べ,FV条件とNV条件間の指間距離最大値の差が大きかった.ASD者について,定型発達者と類似の結果を示す参加者がいる一方で,指間距離制御へのオンライン視覚の影響が小さい,あるいは,交互条件時にFV条件とNV条件間の指間距離最大値の差がほぼ0になるといった結果が認められた.方略の影響なのか,オンライン制御の影響か,今後さらに検討していく.モーションキャプチャーシステムを用いて,自閉スペクトラム症者(ASD)および定型発達者(TD)の到達把持運動時における運動学的特性を検討することが本研究の目的である.ASD群10名(女性1名,18.2 ±2.1歳,全て右利き)と年齢を統制したTD群10名(全て男性19.4 ±2.0歳,全て右利き)が実験に参加した.実験参加者の正面30 cmに配置した木製円柱(直径4・6 cm)に対する到達把持運動実行中の見えの影響を調べるため,液晶シャッターゴーグルを用いて,運動中常に視覚が利用可能な場合(視覚あり[Full Vision: FV]条件)と運動開始後(スタート位置のスイッチから手を離すと)見えが遮断される条件(視覚なし[No Vision: NV]条件)を設けた.そして,視覚条件の提示方法として,(1) FV条件とNV条件をブロック化する(1つの実験ブロックでは常に同じ視覚条件を提示する)場合と(2) FV条件とNV条件を交互に行う場合をテストした.把持調節の指標として,運動途中で現れる指間距離最大値を算出した.さらに,一連の動作を適切に連結できているかの指標として,動作間遷移時間(把持完了から持ち上げ開始までの時間)を分析した.上記の指間距離最大値,動作間遷移時間について,4要因の分散分析(参加者間:グループ[ASD, TD],参加者内:物体サイズ[4, 6 cm],視覚条件[FV, NV],提示文脈[ブロック化,交互])を行った.指間距離最大値について,TDと同様に,ASDにおいても,FV条件の方が,NV条件に比べて有意に小さいことが明らかになった.動作間遷移時間については,ASDが,TDに比べて有意に長くなった(ASD: 114 ±28 ms, TD: 36 ±21ms).本実験の結果より,ASDの到達把持運動制御における運動中の見えの利用について,TDと類似した運動パタンを示した一方で,動作間のスムーズな遷移(この場合,つかむ動作から持ち上げる動作への移行)が困難であることが示された(cf. Fabbri-Destro et al., 2009).自閉スペクトラム症(ASD)者の動作について,これまで「ぎこちない,不器用である」と指摘されてきたが,その詳細な運動学的特性については不明であった.そこで,本研究では,16歳20歳前半のASD者を対象に,日常的動作の1つである到達把持運動に着目して,運動中の見えによる把持調節,把持から持ち上げ動作への遷移過程について,同年齢の定型発達者と比較した.その結果,ASD者の把持調節は定型発達者と類似している一方,遷移過程については持ち上げ開始の遅れが認められ,動作間連結化の困難さが認められた.実験装置のセットアップに時間を要したが,その後,おおむね順調に実験を進めている.実験計画では,成人,児童(45歳児)を同時並行で,実験を実施する計画であったが,児童の集中力を考慮した場合,集中力を維持するための実験系への工夫が想定以上に必要であるため,方針を変更し,まず成人及び思春期児童を対象にした実験を行うこととした.27年度が最終年度であるため、記入しない。認知科学

現在行っている,成人,思春期児童に関する実験結果について,国際学会,国内学会などで発表し,論文執筆を行う.考察の過程で新たに浮かび上がる更なる仮説を検証する実験をすすめていく.児童(45歳児)を対象にした実験セットアップの構築を進める.ASD者の視覚-運動機能を研究している海外や国内の研究者とも,積極的にディスカッションする機会を探りたい.27年度が最終年度であるため、記入しない。
自律性と多様性を保証する学童保育施設の生活空間計画研究

学童保育施設の空間構成の原則を得るため、子ども一人一人を識別した観察調査と分析に継続して取り組み、子どもの過ごし方の差異のパターンと空間構成の対応関係についての知見を得た。教室転用施設、段階的空間構成を持つ民間住宅転用施設とプレファブ利用施設における屋内外の過ごし方調査、さらに少人数で過ごす領域を付加する実験前後の過ごし方調査を行い、[定型][不定型][一人]の行為と過ごし方パターンの存在を見出し、それをもとにした多種の領域を持つ空間構成原則を示した。本研究テーマに関連して蓄積していた学童保育施設における生活実態調査の詳細データについて、個々の子どもの過ごし方特性の分析手法を整理し、再分析を加えた結果、施設の空間構成と過ごし方の多様性の関係を明確に確認する方法を提示することができた。子どもの過ごし方には、他者との関わり方や距離の取り方の相違、集団行動、必要行動、任意行動に類型化される行為の傾向の相違、無為的な行為や移動などの行為の傾向による多様性があることが確認された。調査対象施設における「コーナー」設置などの工夫と過ごし方の多様性は対応しており、過ごし方の多様性と過ごす空間の選択との関係について事例研究レベルでの確認ができた。均質でない多様な場所を確保し、適切な定員と屋外での生活行為の保証することで屋内の適度な密度を保つことができれば、多様で自律的な過ごし方が一定程度可能になるという第一次の結論を得ることができた。この成果は、条件の異なる施設との比較研究へと展開することにより、学童保育施設において求められる空間的条件の提示に至る見込みである。次段階の研究展開のための事例状況確認調査として、新たに13箇所の学童保育施設の空間構成と面積の確認の調査を行った。調査年度は、学童保育について新しい法制度上の運用が行われようとする段階にあり、とくに面積の扱いについては保育所とは異なる面積基準の考え方が求められることが確認できた。概要調査を行った施設のうちの一施設については、空間構成の改変計画に関与し、新年度において空間構成の変化に伴う子どもの過ごし方の詳細調査を行うための条件整理を行うことができた。学童保育施設における子どもの過ごし方の実態調査の成果として、コーナーのある一室型施設の屋内における過ごし方の分析の取りまとめを行うことができた。行為の内容の多様性、人との関わり方の多様性を見出し、空間構成との対応関係を整理することにより、空間の分離と連続に関わる計画上の検討課題を見出すことができた。以上の研究成果については、建築学会計画系論文集に採択され2016年4月号に掲載された。さらに屋外空間の複数の領域を有する学童保育施設2箇所における過ごし方調査に着手した。屋外空間を大人数で動的に過ごせる広場型空間と、小さく区分された領域で少人数で過ごせる木陰型空間に区分し、それらの空間の使われ方について2015年度後半に二つの施設を対象とした調査を行った。10月12月に調査を実施した一つの施設については、いっしょに過ごす集団の規模による過ごし方の差異の大きさを確認するとともに、屋外の各領域の空間特性との関係を整理を一定程度行うことができた。この成果については、2016年度の日本建築学会大会で発表を行う予定である。3月に調査を実施した二つ目の施設に関わる成果については、データの基本的整理を終えるまでに至っており、2016年度に分析を進める予定である。以上の成果は、従来の学童保育施設に関わる建築計画学の成果に対して、個人の過ごし方の差異と多様性を念頭においた空間構成を求めるものであり、施設計画の理論に新たな視点を加えるものと考えている。コーナーのある一室型の学童保育施設における詳細なケーススタディの結果、子どもの過ごし方と空間構成の関係を一定程度整理することができ、学術論文として投稿、採択されるにいたった。その内容をもとにさらに多様な施設における過ごし方の観察調査に着手するための関係者との調整を行った。結果として二つの施設から調査実施に関わる承諾を得た。両施設ともに施設の改善あるいは新築移転という計画を有しており、研究成果を実践の場に反映するを前提として、継続的な調査と共同検討の場を構築することができている。平成27年度内に第一次調査を終え、一部を平成28年度の建築学会にて発表する予定である。平成27年度に行った観察調査データは個々の子どもの過ごし方の詳細の記録であり、子ども達の成長に伴う過ごし方の変化を把握するための第一段階のデータと考えることができるため、継続研究の可能性を広げることができた。既往の学童保育施設の計画研究における目標イメージは、活動に必要な機能の組み合わせ、あるいは単位空間の集積としての機能主義的な考え方が蓄積されている。これに対して、個々の子どもを識別した過ごし方調査を重ねることにより、一人一人の過ごし方の自律性と多様性を前提とした施設空間の目標像を再構築することが本研究の目的である。複数の施設空間を対象として、個々の子どもを識別した上で観察調査を重ねることにより、以下の知見を得るに至っている。学童保育での自由な時間の過ごし方は、行為の内容と集団との関わり方の組み合わせで理解される。その選び方には相当の個人差がある。主な過ごし方として、多人数の集団遊びと一人・少人数の座った遊びの両極が確認できるが、それ以外に二四人が小さな拠点をつくる行為や一人で集団から一定の距離をとって過ごす行為などのパターンを見出すことができる。

過ごし方の型と個人差を見出し、それに対応する空間を組み立てると、主要な活動空間とともに複数の領域がゆるやかに分離・連続する施設空間の目標像を描くことができる。2016年度はとくに、既往の空間に縁台やベンチなどを設置して空間の小改変を加えることにより、空間に対応した過ごし方の変化を確認し、また、空間の小改変により特に影響を受ける子どもの存在を確認することができた。引き続き既往空間に改変を加えた上での前後の状況の比較観察を行うことにより、空間と過ごし方の関係に関する分析を行うが、次段階は既存施設で見出した「きち」の要素を付加することにより、その意義を検証する予定である。個々の子どもを識別した学童保育施設における過ごし方調査は、子どもリストの作成と記録の識別に労力を要すると考えていたが、学童保育関係者の協力によりデータ整理の効率化が可能となったため、観察調査は当初の予定より多く、2015年度に2回、2016年度に2回実施することができた。また、調査対象施設において施設の新築や増設、改造等が行われる局面に関わることができたため、新施設へのフィードバックという意義を得て調査協力体制を組むことが可能となり、空間の小改変を行って前後の比較観察調査を行うという、当初の研究計画より進んだ形式の調査方式を実施することができた。一連の観察調査から個々の過ごし方のタイプを見出すことができているが、とりわけ少人数で過ごす傾向の強い子どもにとって、小さな拠点空間を設ける意義が明らかになりつつあることが、2016年度の成果の特徴である。この知見をさらに深めるために、研究機関を延長し追加調査を実施することとした。学童保育施設の空間構成について、子ども一人一人を識別した観察調査と分析に継続して取り組むことにより、子どもの過ごし方の差異と空間構成の対応関係についての知見を得ることができた。第一段階で実施した教室転用施設における屋内過ごし方調査においては、集団との関わり方の個人特性と空間構成(開かれた大空間とコーナー型の小空間の関係)の対応関係を見出した。第二段階では内外に小から大に至る段階的空間構成を持つ民間住宅転用施設二箇所における屋内外の過ごし方調査を行った。大人数での活発な遊び中心、一人での読書等の行為中心の二つのパターンを見出すとともに、中間的な存在として少人数での小さな領域を居場所とする過ごし方を見出した。第三段階は、民間住宅転用施設に小さな滞留空間としての家具を付加する実験を行い、そこで生じる変化を検証した。この調査の分析により、子どもの過ごし方の中に、遊び主導、仲間主導、一人行為の3種の流れがあることを見出した。遊び主導は機能に沿ったまとまった空間でほとんどの時間を過ごし、一人行為は小さな隠れた空間から大集団の周囲まで多様な隙間で過ごすのに対して、少人数の仲間主導の過ごし方をする子どもがとくに付加された小さな滞留空間を使用していることがわかった。第四段階では、単調なプレファブ型施設の空間に高低差をもたらす家具を実験的に製作し「一畳ロフト」と名付けて持ち込むことで起こる変化を検証した。過ごし方の中で形式の定まった過ごし方(定型)と形式とゆるやかで変化していく過ごし方(不定型)に区分した分類が有効であり、とくに不定型の過ごし方をする子ども達が「一畳ロフト」を使用することが明らかになった。
少数分子による自己組織化過程の生体機能シグナル可視化による解析

本研究は細胞性粘菌のcAMPに対する走化性の分子過程を可視化することで、細胞がゆらぎと同じレベルの濃度勾配の中で、その勾配の方向を的確に認識し、運動する方向を決定する仕組みを解明することを目的とした。その為に、タンパク質性Ca2+センサーであるカメレオンYC3.60のCa2+センシングドメインにアミノ酸変異を導入することで、これまで報告された如何なるCa2+センサーよりもCa2+に対して高い親和性(Kd=20nM)を持つ、つまり超高感度なCa2+センサーcameleon ZEROを開発した。驚いたことにこのセンサーを発現させた細胞性粘菌は野生型同様に分裂増殖することから内在のCa2+キレート効果による細胞毒性は無いと考えられた。この細胞株を用いて集合体形成時におけるカルシウム動態の観察を行ったところ、BZ(ベルーゾフ・ジャボチンスキー)反応様のスパイラルおよびターゲットパターンのみならず、時空間的にランダムに発火するカルシウム動態を観察することに成功した。本年度は走化性における複数の分子活性化や動態を同時に可視化するための顕微光学系開発を行った。特に、分子活性化を捕らえるための手法として蛍光共鳴エネルギー移動を利用した機能指示薬を用いるが、そのシグナル変化をスペクトルの変化ではなく"蛍光異方性の変化"で捉えることにより、観察波長域を狭小化し、複数種の生体分子機能の時空間ダイナミクスを取得可能することを目指した。蛍光異方性とは蛍光偏光度に関連した物理量で、FRET効率の増減により変化する量である。高感度に蛍光異方性変化を捉えるため、高開口対物レンズを通過することで解消する偏光状態を補償するためのフォトニック結晶性光学素子を考案し、対物レンズの後側焦点と共役な位置に挿入した。本光学系が予想通り機能するかどうかを確かめるために、細胞骨格タンパク質であるアクチンを黄色蛍光タンパク質とフュージョンして培養細胞に発現させ、観察を行った。その結果、アクチンが重合しているストレスファイバーにおいて高い異方性が、単量体アクチンが存在する細胞質では低い異方性が観察された。アクチンの重合化を阻害するラトランキュリンAによって細胞内のアクチンを全て単量体化すると、細胞全体に渡って、低い異方性が見られたことから、本顕微光学系により異方性の変化を捉えることが可能であることが確認された。本年度は細胞性粘菌が飢餓状態にさらされた時に起きる集合体形成過程での、細胞内カルシウム動態を効率良く検出するプローブの検討を行った。先ず、既に開発済みのタンパク質性カルシウムセンサーであるカメレオンYC3.60またはYC2.60を発現する細胞性粘菌を作成した。人為的なcAMP刺激によりカルシウム濃度の上昇が見られるかどうかを検討したところ、YC3.60よりもYC2.60の方が高いコントラストでカルシウム動態を観察できることが明らかとなった。YC2.60、YC3.60のカルシウムに対する解離定数はそれぞれ50nM,250nMであることから、細胞性粘菌内でのカルシウム濃度は哺乳類細胞よりも低く保たれていることが示唆された。次にYC2.60を発現する細胞性粘菌を用いて、集合体形成時におけるカルシウム動態の観察を行った。しかしながら、カルシウム濃度の変化は全く見られなかった。これは内在のcAMPによるカルシウム変動は予想以上に小さく、かつカルシウム濃度がYC2.60で捉えることができるレンジよりも低いためであると推測された。そこで、YC2.60よりもさらにカルシウムに対する親和性が高い(解離定数が小さい)カルシウムセンサーの開発を試み結果、15nMというこれまでに報告されているあらゆるカルシウムキレート剤よりも強力にカルシウムと結合する活性を有するカメレオン(YC1.60)を作成することに成功した。YC1.60を発現させた細胞性粘菌は野生型同様に分裂増殖することから内在のカルシウムキレート効果による細胞毒性は無いと考えられる。

走化性シグナルの時空間分布を明らかにするため, cAMP刺激に伴う細胞性粘菌の集合塊形成とその過程における細胞内カルシウム濃度の変化に注目した.多くの真核細胞同様,粘菌細胞のCa2+は静止期では50nM以下に保たれているが, cAMP刺激応答時には30秒以内に最大150nM程度まで上昇する.この微弱なカルシウム応答をイメージングにより検出するため,遺伝子にコードされたCa2+センサーであるcameleon(YC3. 60)に変異を導入し,超高感度Ca2+センサーを開発した. Ca2+イオンへの親和性が大幅に向上した指示薬を用いて,飢餓後6-7時間に同心円波の集合パターンを示す細胞集団のCa2+イメージングを行った.ペースメーカー領域から少なくとも15回以上にわたって安定な集合波が生じており,この間,周期と伝播速度はそれぞれ4.3分と約80μm/分に安定に保たれた.同様の結果は細胞内Ca2+濃度の変動パターンからも得られるが,興味深いことに同心円状の集合パターンとは一致しない一過的なカルシウム濃度の上昇が多数見いだされた.その形は直径が5-10細胞におよぶ真円形で,発火頻度は集合流あたり21±2.3plse/10minであった.この一過的なCa2+の上昇には1)時間的にも空間的にも分布はランダムで周期性は認められないこと, 2)集合流におけるカルシウム振動とは波形が異なる,という二つの特徴が見いだされた.また確率的なCa2+発火は明確な集合流が生じる前から見いだされ,その頻度は飢餓後3から6時間までは変化しなかったが, 7時間以後には1.4±0.3plse/10minにまでおおきく減少した.