hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
痛みの分かる材料・構造の為の光相関領域法による光ファイバ神経網技術の機能進化

光周波数の変調で干渉特性を制御し、光ファイバの散乱等を分布測定する独自技術「光相関領域法」の機能進化を果たした。本「光ファイバ神経網」を橋や航空機等に巡らせ、歪や温度を分布測定し「痛みの分かる材料・構造」を実現する。他手法を凌ぐ、mm分解能、kHz測定速度、ランダムアクセス等を実現してきた。本研究では、ブリルアン散乱による、歪と温度の同時測定、分布情報全体の高速測定、ランダムアクセスの高速化等の機能進化を果たし、空間分解能、測定レンジ、雑音特性等も向上させた。光ファイバグレーティングによる短尺分布型センサの多重化技術も提案・実証した。航空機の健全性診断等の応用研究も進め、適用性を確認した。「BOCDA法の機能進化:温度と歪の高精度・同時・分布センシング機能」では、偏波維持光ファイバのブリルアン散乱と複屈折の2量から10cmの空間分解能で温度と歪を同時測定することに成功した。2個必要であった光源を1個にしても上記2量が測定できる新システムも構築し、測定安定性の向上を果たした。「BOCDA法の機能進化:分布量全体のダイナミックセンシング機能」では、測定速度の制限要因であったマイクロ波スイーパの使用法を工夫した新システムを構築し、光ファイバに沿う歪分布の全体を数Hzの速度で測定することを可能にした。「ブリルアン散乱歪センシングのシステム構成の進化:BOCDR法の高性能化」では、測定系を記述する基本理論式の導出に成功した。また、光源の周波数変調波形を工夫して測定レンジを延伸法する新技術を提案・実証し、偏波スクランブル技術を導入して偏波変動雑音を除去し、高非線形なテルライト光ファイバにより空間分解能を従来の約2倍の6mmにまで向上させた。「ブリルアン散乱歪センシングのシステム構成の進化:簡素化BOCDA法」では、ポンプ光とプローブ光を時分割発生させる際の波形発生精度を向上させた。また、計測器メーカとの共同研究として、可搬型に向けた装置試作も進んでいる。「長尺FBG歪センシングシステムの機能進化」では、複数の長尺FBGを光ファイバに沿って配置して多領域・限定分布型FBGセンシング機能を実現する系のシミュレーション法を確立し、これによって設計したシステムでの機能実証に成功した。空間分解能を向上させる新たな光源周波数変調技術も提案し、約4mm(従来の約2倍)を実現した。「痛みの分かる材料・構造の機能進化の実証」では、航空機ヘルスモニタリングにBOCDA法ならびに簡素化BOCDA法を適用する研究を関連企業と実施し、また、製鉄分野での応用への協同研究も進めている。「BOCDA法の機能進化:温度と歪の高精度・同時・分布センシング機能」では、偏波維持光ファイバのブリルアン散乱と複屈折の2量を独自の相関領域法で分布測定する技術において、2個必要であった光源を1個にするシステムを提案・実証し、測定レンジと空間分解能を向上する手法も新たに考案・導入して、500mの測定レンジで約15cmの空間分解能にて温度と歪の同時・分布測定を実現した。「BOCDA法の機能進化:分布量全体のダイナミックセンシング機能」では、相関ピーク(測定位置)が移動し続ける技術を創案して、100mのレンジと80cmの分解能で、毎秒20回の分布測定を実現した。「ブリルアン散乱歪センシングのシステム構成の進化:BOCDR法の高性能化」では、光源周波数変調に加えて強度変調も施す新技術を提案し、不要雑音スペクトルの低減に成功した。「ブリルアン散乱歪センシングのシステム構成の進化:簡素化BOCDA法」では、測定位置へのランダムアクセス機能を保持しつつ測定速度を向上させるシステム構成を発案して、200サンプル/秒の速度を達成した。温度と歪の同時・分布計測を可能とする簡素化システム構成も考案・実験している。「長尺FBG歪センシングシステムの機能進化」では、長尺FBG分布型センサを光ファイバに沿って多点で配置したシステムにおいて、相関ピーク以外からの雑音を激減させる新たなアポダイゼーション技術を提案・実証して、FBG間クロストークを低減した。測定レンジを拡大させる複数の技術も提案・実証できた。「痛みの分かる材料・構造の機能進化の実証」では、航空機ヘルスモニタリングにBOCDA法に基づく温度と歪の同時・分布計測法を導入する研究を関連企業と実施し、CFRP材料のボルト周りの劣化をBOCDA法で検出する技術、BOCDA法のプラントでの応用、ガラス光導波路の性能評価への応用等の研究も進めた。

「BOCDA法の機能進化:温度と歪の高精度・同時・分布センシング機能」では、偏波維持光ファイバのブリルアン散乱特性と複屈折特性を独自相関領域法で測定して温度と歪を同時・分布計測する技術において、測定レンジ延伸法を提案・実証し、空間分解能の制限要因を突き止めてその向上技術も提案し、約5倍の分解能向上を実証した。「BOCDA法の機能進化:分布量全体のダイナミックセンシング機能」では、相関ピーク(測定)位置を光ファイバ長手方向に自動掃引する技術とロックイン検波なしでも雑音低減可能な技術を提案して、全分布情報を毎秒20回測定することに成功した。「ブリルアン散乱歪センシングのシステム構成の進化:BOCDR法の高性能化」では、提案した光源の周波数変調と強度変調を併用する新技術についてシミュレーション手法を確立して実験結果との比較検討で良い一致を示し、1cmの空間分解能と6000μεの高歪測定を両立させた。「ブリルアン散乱歪センシングのシステム構成の進化:簡素化BOCDA法」では、提案した温度と歪の同時・分布計測を可能とする簡素化システムを構築して、分離計測機能を実証した他、ポンプ光とプローブ光の時分割発生法の精度向上も果した。「長尺FBG歪センシングシステムの機能進化」では、提案した長尺FBG分布型センサの多点配置システムにおいて、光源のコヒーレンス長を超えた遠方でも機能する技術、光ファイバに沿って複数存在する相関ピークから一つだけを分離検出する技術、相関ピークを位相変調で掃引する技術等を提案・実証した。「痛みの分かる材料・構造の機能進化の実証」では、関連企業との共同研究にて航空機ヘルスモニタリング用にBOCDAに基づく温度と歪の同時・分布計測機を試作し、BOCDA法によるガラス光導波路の特性評価にも成功し、BOCPA法のプラント診断への応用も検討している。[温度と歪の高精度・同時・分布センシング機能]では、偏波維持光ファイバにおける誘導ブリルアン散乱と同時発生する音響波ダイナミックグレーティング特性を測定して,温度と歪を同時・分離・分布測定する独自技術に関し、強度変調による空間分解能向上手法を提案・実証し、発表した。[分布量全体のダイナミックセンシング機能]では、BOCDA法のポンプ・プローブ光周波数差を固定して測定点を掃引し、本周波数差を変化させて本掃引を繰り返すことで全スペクトル分布を高速測定する技術を提案し、12回/秒の高速分布測定に成功した。[BOCDR法の高性能化]では、被測定光ファイバからの自然ブリルアン散乱を分布測定する本技術において、信号光を位相変調した場合としない場合とで取得したスペクトルの差を取ることで、空間分解能と歪レンジを同時に向上できる新たな方法を提案・実証した。[簡素化BOCDA法]では、ポンプ光とプローブ光を時分割発生させるS-BOCDA系において、従来速度を2.5倍凌ぐ500サンプル/秒のランダムアクセスを達成した。S-BOCDA法による温度と歪の同時・分布測定技術では、単一半導体レーザからポンプ光、プローブ光、読み取り光を時分割発生させ、これらによりダイナミックグレーティングからのブラッグ反射を検出することにも成功した。「長尺FBG歪センシングシステムの機能進化」では、コヒーレンス特性を合成する光源FM波形と相似な位相変調を参照光に加えることで測定位置を掃引する独自技術において、掃引線形性の向上に成功した。「痛みの分かる材料・構造の機能進化の実証」では、BOCDA法に基づく温度と歪の同時・分離・分布測定系のプロトタイプモデルを企業と共同開発し、ビジネスジェット機体に光ファイバ神経網を設置して航空機構造ヘルスモニタリングの飛行実証試験を行って、温度と歪の同時・分離・高速測定に成功した。
植物のイオンチャネル制御に関与する膜タンパク質の生物有機化学

マメ科植物アメリカネムノキの就眠物質であるジャスモン酸グリコシド(JAG)を基に、Click Chemistry型プローブを合成し、標的タンパク質MTJGの段階的タギング実験を行った。また、運動細胞プロトプラストを用いた実験により、天然型JAGの添加で運動細胞の体積収縮が起こることが確認された。さらに、JAGは植物のストレス応答反応、ジャスモン酸応答性遺伝子発現誘導、エクオリン導入ダイズ細胞でのカルシウム応答を引き起こさないことを明らかにし、JAGはジャスモン酸類と全く異なる分子機構で働くことを示した。マメ科植物アメリカネムノキの就眠物質を基に、Click Chemistry型プローブの合成を行った。D-糖、およびL-糖を含む完全な鏡像体型アジ化プゴーブ並びに、エピトープペプチドであるFLAGユニットを含む8員環型アルキンユニットの合成により、標的タンパク質(Membrane target protein of hydroxyjasmonate ; MTPHJ)精製のための段階的タギング実験の準備が完了した。また、運動細胞プロトプラストを用いた実験により、就眠物質の添加で運動細胞の体積収縮が起こることが確認された。収縮は鏡像体では起こらないことから、リガンドの立体化学を認識するMTPHJが、細胞体積収縮に重要な役割をはたしていることを確認した。さらに、就眠物質は植物のストレス応答反応であるharvibor放出を誘導しないこと、エクオリン導入ダイズ細胞にカルシウム応答を引き起こさないことを明らかにし、就眠物質とジャスモン酸類が全く異なる分子機構で働くことを示した。また、植物毒素コロナチンをexo-選択的Diels-Alder反応を鍵反応として合成することに成功した。コロナファシン酸ならびにコロナナミン酸の両鏡像体から、可能な4種の立体異性体を合成し、その気孔開口誘導活性を検討した。天然型のみが顕著な活性を示すことから、コロナチン標的探索にも、エナンチオディファレンシャル法が有効であることを示した。(601文宇)微生物由来の植物毒素コロナチンは、ジャスモン酸様の強力な活性を持つ化合物である。本年度は、その両鏡像体を、exo選択的Diels-Alder反応を利用した合成経路で合成し、その気孔開口活性について検討した。予想通り、活性は天然型の立体化学を持つものにしか認められず、エナンチオディファレンシャル法による標的探索が有効であることを示すことができた。また、これとは対照的に、ジャスモン酸の配糖体には、ジャスモン酸活性が全く認められないことも明らかにした(論文未発表)。これは、標的部位の違いによるものと推定され、次年度は、両化合物の活性の差異についてさらに詳細な検討を行うため、生化学的な手法とともに、モデル植物シロイヌナズナのCOI1変異株を用いた遺伝学的手法も併用して、標的タンパク質の同定を行う。また、生理活性天然有機化合物の標的探索研究に関して、分子タグを効率的に導入しうる、Stepwise Tagging法を開発、報告した。これを用いることで、エビスグサの葉を開かせる活性物質であるイソレスペデジン酸カリウムの標的探索を行い、細胞質タンパク質MetEを標的として同定した。MetEはメチル化酵素であり、標的同定は、運動制御の分子機構に重要な示唆を与える発見であると考えられる。今後、本方法論をジャスモン酸配糖体やコロナチン等の系に適用して、これらの標的探索研究の推進を目指す。本研究では、東北大学大学院工学研究科、マックスプランク研究所との共同研究により、植物運動細胞がジャスモン酸配糖体LCFに対して立体化学特異的な応答を示し、細胞体積収縮を誘導することを明らかにした。アメリカネムノキ葉枕より調整したプロトプラストのうち、葉の上面側にあたるextensor運動細胞のみが、(+)-LCFにより立体化学特異的に収縮した。この細胞レベルでの応答に加え、アメリカネムノキ個体レベルでの応答(就眠運動の誘導、volatile生成)、遺伝子レベルでの応答(ジャスモン酸特異的応答遺伝子)、なども詳しく解析した結果、この応答機構は、ジャスモン酸の受容体であるCOI1タンパク質が関与しない全く新規なものであった。分子プローブを用いた研究から発見されたMTJGは、運動細胞膜上に存在し、(+)-LCFを立体化学特異的に認識することから、その推定膜受容体と考えられる。これを精製するために、剛直なリンカー構造をもつ高性能BArL(Biaryl-linked)型分子プローブを開発した。一方、ジャスモン酸ミミックであるコロナチンは、LCFとは逆に気孔孔辺細胞を膨潤させる。この作用機構解明のため、clickchemistryにより、多様なプローブに誘導可能なアジ化コロナチンを開発し、coi1突然変異株を用いた生物検定とプロテインノックダウン法を組み合わせた作用機構研究を試みた。
環東シナ海貿易圏における琉球・対馬・朝鮮間交流史の研究

1対馬宗氏の朝鮮外交交渉、貿易取引等に関する史料の収集を行った。対馬歴史民族資料館において宗家史料の写真撮影を行い、さらに幕府の対馬藩朝鮮外交の監査と実務担当の立場で、京都五山から派遣された以酊庵輪番僧の記録の一部として、健仁寺両足院所蔵文書のマイクロフィルム化を行った。これは、(1)朝鮮信使来聘に関する事前準備、先例調査、外交上の契約、経費の積算等に関する記録、(2)対馬から朝鮮への送使船往環記録、封進物記録、(3)「遣朝鮮国歳条書契」等の公式文書、「朝鮮往復書翰留」「先行出訴願書」等の交渉記録、(4)「以酊庵御役筋」「以酊庵輪住勤行簿」「対州卸在番中日記」等の勤務記録等である。輪番僧は、直接外交折衡を行う立場にはなく、朝鮮側との交渉は、釜山倭館の東向寺に派遣された対馬府中の臨済宗系寺庵の僧が「館守」や特命の交渉責任者「裁判」を補佐し文書の立案・審査を行い、「両国往復書騰」に収録される。これら両記録の照合を必要とした。2対馬藩が朝鮮から輸入した人参は、対馬国売りのほか博多・長崎・大阪・京都・江戸等で販売され、特に江戸に人参座を設けて販売の適正化を図る。対馬藩の要望により、幕府は補助金を与え、また、人参代往古銀を鋳造して輸出銀の品質を維持した。対馬藩は、輸入生糸、絹織物を直接大阪まで廻航し、京都藩邸から朝鮮問屋に卸し、西陣の分糸・巻物仲買に提供する。仲買は、糸代先納銀を対馬側に前渡し、相互の利益を図る。これは、中国・オランダ船の長崎輸入の生糸等の京都仲買も兼ね、さらに琉球-薩摩藩から廻船によって京の定問屋に直送の生糸等も取引し、ここに三ルート商品の統合をみる。その他唐物は、長崎会所から大阪幕府荷受問屋に、琉球-薩摩藩領内商人扱いの物資も大阪問屋に移送される。対馬大阪藩邸では、これらの問屋から朝鮮輸出用唐物を購入して対馬に送る。以上、当初の予算項目別配分類について史料収集方法上の理由から、若干の調整を行っている。
Bcr-Abl下流のrasGAP結合蛋白質Dok及びDok-2と慢性骨髄性白血病

Dokは、チロシンキナーゼ活性を持つ癌遺伝子産物の基質であり、PH、PTBドメインを持つドッキング蛋白質である。また、Dokとその類縁蛋白質Dok-2はヒト慢性骨髄性白血病(CML)の血液幹細胞中で強くチロシンリン酸化される。前年度の研究から、我々はDokがB細胞の増殖とMAPキナーゼに抑制性のシグナル分子であることを発見し、それがCML発症にも抑制的に機能していると予想した。本年度は、CMLのモデル系を適用するために、Dok/Dok-2のノックアウトマウスを樹立するとともに、Srcによるトランスフォーメーションを指標に、Dokによる癌化抑制の機序を検討した。1.Dok-2及びDok/Dok-2二重ノックアウトマウスは、生後6ヶ月までは見かけ上異常なく成長した。両者とも、8週齢での血液細胞の構成にも異常は認められなかったが、6ヶ月齢ノックアウトマウスにはリンパ組織の過形成が多く認められた。現在、この過形成の成因について解析を進めるとともに、CMLのモデルマウスであるbcr-ablトランスジェニックマウスとの交配を進めている。2.DokはSrcによる細胞のトランスフォーメーションを抑制するが、カルボキシ端から364番目までの欠失変異体(Dok-363)はその抑制能を保持していた。しかし、さらに27アミノ酸欠失したDok-336はその抑制能を失った。この27アミノ酸にはrasGAP SH2の標的配列があり、実際、Dok-363はrasGAPと会合し、Dok-336は会合しなかった。また、Srcによるチロシンリン酸化を受けないような点変異体はその抑制能もrasGAPとの会合能も失った。以上の知見から、Dokはチロシンリン酸化されることでrasGAPをリクルートし、Ras/MAPキナーゼを阻害することでトランスフォーメーションを抑制するのではないかと考え、解析を続けている。
批判的思考力を育む日本語教育－学習方略研究の知見に基づいた授業の設計と実践、評価

最終年である今年は1過去2年間の研究成果を学会誌等で発表する、2追跡調査等により研究結果の更なる検証を行う、3研究成果を教育現場に還元するの3つを目標とした。1については、最初の2年間に行った中上級学習者対象の本調査1・2の成果を実践報告論文としてまとめ、日本語教育学会に投稿。2018年4月発行の『日本語教育』169号に掲載された。また、初級者対象の本調査1についても香港日本語教育研究会に投稿し、採択された(本年8月刊行の『日本学刊』22号に掲載予定)。さらに、教育心理学の分野で同じ質問研究をされている他大学の教員たちと共著で質問の理論と実践に関する本を出版することになり(本年9月刊行予定)、本研究の成果の一部を報告した(本年9月には日本教育心理学会でシンポジウムも開催予定)。2については、まず2018年6月に日本人学生対象の追跡調査を行い、その結果を2019年3月の沖縄県日本語教育研究会で発表した。次に、過去2年間の研究から導き出した「学習者の批判的思考を促す日本語授業のデザイン原則」の妥当性を検証し汎用性を高めるために、その原則に沿ってデザインした実践を3つ行った。1つは日本人学生対象の集中講義、2つ目は夏季短期研修における地域理解をテーマにした日本語授業、3つ目は台湾の高校生を対象とした日本語・日本文化の授業である。この3つは今年度新たに獲得した科研への繋ぎとなるもので、収集したデータは現在分析中である。3については、2018年12月に一般市民を対象としたセミナー「問いを活用したコンテントベースの日本語授業」を開催するとともに、海外でも11月に中国広州で「第12回中国大学日本語教師研修会」(主催:高等教育出版社・北京日本文化センター)、本年2月に台北と台中「2018年度第3回日本語教育研修会」(主催:日本台湾交流協会)に招待され、現地の教員向けに講演を行った。【平成28年度前期】申請時の研究計画書に示したとおり、前期は前年度(平成27年度)後期に日本語日本文化研修コースの16期生(上級者:母語は様々)を対象に行った上級者対象の予備調査のデータを分析し、初期の学習モデルの問題点について考察した。その上で、学習方略研究と第二言語習得研究の知見に基づき、学習モデルの再構築を行った。【中期】8月上旬に香港中文大学専業進修学院(CUSCS)において「日本留学体験講座」という5日間の集中セミナーを開催し、初級者対象の予備調査を行った。主な研究課題は以下の3点である。1中上級者対象の授業で用いた「質問作成」という批判的思考力の育成法が初級者対象の授業でも有効なのかを検証すること、2再構築した新たな学習モデルが想定通り機能するかを検証すること[上級者対象の本調査1に向けた予備調査を兼ねる]、3これまで未着手だった課題(CBIは日本語の習得を促すのか)について検証すること[上級者対象の本調査1に向けた予備調査を兼ねる]【後期】香港での初級者対象の予備調査で(受講者は少なかったものの)ほぼ想定どおりの結果が得られたことから、日本文化研修コース生17期生を対象に上級者対象の本調査1を行った。また、山口県立大学の集中講義で補足データの収集も行った。【研究成果の発表】香港で行った初級者対象の予備調査については11月に香港公開大学で行われた第11回国際日本語教育・日本研究シンポシウムにて発表を行い、その内容をまとめた論文をProceedingsに投稿した(現在審査中)。また、後期に山口県立大学で行なった調査の結果については本年3月に沖縄県日本語教育研究会で発表を行い、上級者対象の本調査1の結果についても平成29年度の日本語教育学会春季全国大会にて発表予定(確定済み)である。中上級者対象の本調査については、平成28年度の実践で想定していた以上の結果が得られ、当初の計画以上に進展していると言える。一方、初級者対象の実践については、初年度ということもあって広報活動があまりうまくいかず、受講者が極めて少なかったが、平成29年度以降の本調査に向けた予備調査としては(被験者が少なくデータの信頼性は低いものの)期待通りの結果は得られており、概ね順調に進展していると言える。申請時に提出した計画書どおり、秋学期に勤務校において批判的思考力の育成を目指した日本語の研究授業を行い、合わせて6月にも香港の日本語教育期間で5日間の研究授業を行った。また、近県の大学においても日本人学生対象の集中講義を行い、比較データの収集を行った。本研究の主たる研究課題は「中上級学習者対象の日本語の授業(歴史を題材としたCBI)で、どのような環境・条件を整え、どのような指導を行えば、学生たちの思考を刺激し、深く思考された高次の質問を引き出すことができるのか」であった。この課題を解決するために「講義後の質問作成を意識させることで学生たちの講義を聞く態度を変えさせ、より高次の質問を引き出す」という学習モデルを立て、これまで実践を繰り返してきた。しかし、(比較対象の)日本人学生対象の授業では想定どおりの成果が得られたものの、留学生対象の授業では、講義を聞く態度に変化が見られないまま、質問の質だけが中位の具体的・分析的質問のレベルまで高まるという逆転現象が生じていた。

この問題を解決するために、学習方略研究の知見に基づいた学習モデルの再構築を行い、香港と筆者の勤務校で前述の2つの調査を行なったところ、留学生対象の授業でも日本人学生と同様に、批判的に講義を聞く態度に明らかな変化が見られ、質問の質も高次の「応用的質問」まで高めることができた。これを受けて、日本語教育学会春季全国大会で研究成果の発表を行うとともに、学会誌『日本語教育』にも論文投稿を行い、採択された(平成30年4月末掲載予定)。また、本研究で得た知見を教育心理学分野の研究者との共著『質問の理論と実践』(ひつじ書房)で発表することになり(2018年夏出版予定)、日本語教育関係者向けにも留学生対象の批判的思考教育の実践に関する書籍を出版することになった(2019年春出版予定)。本研究の成果を発表できるのは3年目の平成30年度と考えていたが、平成28年度後期の授業で行なった学習モデルの再構築が期待以上の効果を発揮し、平成29年度中に主な研究成果を学会誌と全国大会で発表することができたため。最終年である今年は1過去2年間の研究成果を学会誌等で発表する、2追跡調査等により研究結果の更なる検証を行う、3研究成果を教育現場に還元するの3つを目標とした。1については、最初の2年間に行った中上級学習者対象の本調査1・2の成果を実践報告論文としてまとめ、日本語教育学会に投稿。2018年4月発行の『日本語教育』169号に掲載された。また、初級者対象の本調査1についても香港日本語教育研究会に投稿し、採択された(本年8月刊行の『日本学刊』22号に掲載予定)。さらに、教育心理学の分野で同じ質問研究をされている他大学の教員たちと共著で質問の理論と実践に関する本を出版することになり(本年9月刊行予定)、本研究の成果の一部を報告した(本年9月には日本教育心理学会でシンポジウムも開催予定)。2については、まず2018年6月に日本人学生対象の追跡調査を行い、その結果を2019年3月の沖縄県日本語教育研究会で発表した。次に、過去2年間の研究から導き出した「学習者の批判的思考を促す日本語授業のデザイン原則」の妥当性を検証し汎用性を高めるために、その原則に沿ってデザインした実践を3つ行った。1つは日本人学生対象の集中講義、2つ目は夏季短期研修における地域理解をテーマにした日本語授業、3つ目は台湾の高校生を対象とした日本語・日本文化の授業である。この3つは今年度新たに獲得した科研への繋ぎとなるもので、収集したデータは現在分析中である。3については、2018年12月に一般市民を対象としたセミナー「問いを活用したコンテントベースの日本語授業」を開催するとともに、海外でも11月に中国広州で「第12回中国大学日本語教師研修会」(主催:高等教育出版社・北京日本文化センター)、本年2月に台北と台中「2018年度第3回日本語教育研修会」(主催:日本台湾交流協会)に招待され、現地の教員向けに講演を行った。研究計画書に掲げた5つの研究課題のうち、「1どうすれば、質問の質を応用的質問のレベルまで高められるか」については、今年度後期に行った上級者対象の本調査1でほぼ解決することができた。また、「5CBIは明示的な指導なしに日本語の習得を促すのか(日本語の習得促進)」についても具体的な提言ができるところまで来ている。よって、次年度は残された3つの研究課題について調査を行う。【残された3つの研究課題】2質問作成のアプローチは初級者にも有効か、3よい質問が書ける学習者と書けない学習者の違いは何か(個人差要因)、4質問を考えやすいテーマと考えにくいテーマがあるのか(課題要因)
好塩基球特異的ペルオキシダーゼの遺伝子クローニングとその機能の解明

本研究の目的は好塩基球に存在するペルオキシダーゼの性状を検索し、その機能を明らかにすることである。多能性幹細胞株であるKU812はIL3添加で好塩基球に分化する。この系を用いて次の点が明らかになった。1)光学顕微鏡でペルオキシダーゼ陽性である。2)RT-PCRで検索するとMPO(myeloperoxidase)は陰性であるが、EPO (eosinophil peroxidase)は陽性である。3)蛍光顕微鏡で検索するとEPOが陽性であるが、MPOは陰性である。4)電子顕微鏡でペルオキダーゼ陽性顆粒は好塩基球類似顆粒である。5)EPOとMPOの共通塩基組成をもとに新たなperoxidaseが存在するかどうか探索したが、現時点ではみつかっていない。好塩基球ペルオキシダーゼは好酸球のペルオキシダーゼと抗原性を同一にしていることが明らかになった。今後さらに研究を進める。
成長ホルモン放出因子分泌動態からみた各種間脳下垂体疾患の病因と病態

ヒトGHRH-(1-44)-N【H_2】のC端特異抗体(自家製)を用いて高感度(1.pg/tube)のRIA系を確立し、ヒト各種組織,脳脊髄液および血漿中の成長ホルモン放出因子様免疫活性GHRH-LIを測定した。組織中GHRH-LIは視床下部正中隆起に最も高濃度に存在したが、胃,膵臓,腸管にも低濃度ながら明らかに検出された。末梢血中GHRH-LI値は、正常者にインスリン低血糖刺激やL-dopa負荷をする時、血漿GHの上昇にほぼ一致して増加したが、視床下部に器質的障害があり視床下部のGHRHの分泌不全の存在する患者ではこれらの刺激後に血漿GHRH-LI値は増加しなかった。これらの成績よりインスリン低血糖やL-dopaによるGH分泌亢進の機序の少くとも一部には視床下部からのGHRH放出が関与していること、更にこの視床下部GHRH放出は末梢血中の濃度変化として観察されうることが明らかとなった。また脳脊髄液中GHRH-LIの起源は視床下部弓状核が主要なものであり、この部位の破壊,障害は脳脊髄液中GHRH-LI濃度の低下をもたらすことも明らかとなった。特発性下垂体性小人症では、約40%の患者でL-dopaやインスリン低血糖刺激後の血漿GHRH-LI増加反応が消失し脳脊髄液中GHRH-LI濃度は低値を示したが、残りの約60%の患者では脳脊髄液中GHRH-LI濃度はやや低いもののL-dopa等による刺激後の血漿GHRH-LI値の増加は観察された。病因として前者は視床下部GHRH分泌不全が考えられるが後者の場合には視床下部GHRH分泌不全はむしろ軽微で下垂体自体の障害の可能性が高いと考えられた。先端巨大症患者において未治療の活動性例の大半で脳脊髄液中GHRH-LI値は正常乃至高く、L-dopa投与後末梢血中のGHRH-LI値は増加した。しかし放射線療法を過去に受けた患者では脳脊髄液中GHRH-LI値は低くL-dopa負荷後の血中GHRH値の増加も見られず、血中GH値も低く安定していた。従って視床下部GHRHは先端巨大症の活動性を高める増悪因子として作用する可能性が考えられる。
大腸がんの治療効果・予後予測システムの開発

本研究は、進行再発大腸がんの予後を改善するため、進行再発大腸がんの予後を予測する方法を開発することを目的としている。網羅的遺伝子変異解析の結果、大腸がんは2つの遺伝子群によってそれぞれ2つ、計4つのサブタイプに分類されることが示された。それぞれのサブタイプで臨床病理学的背景因子や、抗癌剤の治療効果が異なることが示された。このサブタイプ分類は臨床的に有用であると考えられ、2012年3月に特許申請を行った。進行再発大腸がんの予後を改善するため、進行再発大腸がんの予後を予測する方法を開発することを目的とする。具体的には、マイクロアレイを利用した網羅的遺伝子発現解析を行い、1.進行再発大腸がんの予後を予測可能な遺伝子発現プロファイルを作成する2.進行再発大腸がんの各標準的化学療法レジメンについて、治療効果を予測する遺伝子発現プロファイルを作成する3.上記予測法の臨床応用を目指し、Multiplex RT-PCR法を用いたより簡便で安価な診断方法を開発する2010年度末までに、進行再発大腸がん症例90例より同意を取得し、48例についてマイクロアレイを行った。症例背景、病理学的因子、化学療法に対する臨床効果、無増悪生存期間、全生存期間等の臨床データの収集を行った。また、大腸がん関連遺伝子(KRAS、TP53、BRAF等)について遺伝子変異解析を行った。遺伝子発現プロファイルについては、教師なしクラスタリングを行い、大腸がんにおける遺伝子発現プロファイルからのサブグループ分類について検討を行った。またこのサブグループと病理学的因子、大腸がん関連遺伝子変異の有無、臨床データの相関についての検討を行った。サブグループ間で予後が異なることを示唆するデータがえられた。また、大腸がんの標準治療である、オキザリプラチンベースレジメン、イリノテカンベースレジメン、EGFR抗体薬、それぞれに対する治療効果を予測する遺伝子群を同定するための統計解析も合わせて行った。より精度の高い遺伝子発現プロファイルを同定するため、さらに多くの症例のマイクロアレイデータが必要であり、現在、症例収集、発現解析を進めている。具体的には、マイクロアレイを利用した網羅的遺伝子発現解析を行い、1.進行再発大腸がんの予後を予測可能な遺伝子発現プロファイルを作成する2.進行再発大腸がんの各標準的化学療法レジメンについて、治療効果を予測する遺伝子発現プロファイルを作成する3.上記予測法の臨床応用を目指し、Multiplex RT-PCR法を用いたより簡便で安価な診断方法を開発する2011年度末までに、計100例の進行再発大腸がん検体を収集し、網羅的遺伝子発現解析を行った。教師なし階層的クラスタリング解析および主成分分析の結果、大腸がんは2つの遺伝子群によってそれぞれ2つに分類することが可能であり、計4つのサブタイプに分類されることが示された。一つ目の遺伝子群で分類すると、大腸がんの標準治療薬の一つである抗EGFR抗体薬の治療効果が異なることが示された。また二つ目の遺伝子群で分類すると、FOLFOX療法やFOLFIRI療法などの古典的殺細胞性抗癌剤の治療効果が異なることが示された。また、既存のバイオマーカーであるKRAS遺伝子変異の割合がサブタイプ間で異なることが示された。これらの結果から、抗癌剤治療の治療効果を予測可能な新規バイオマーカーとして2012年3月10日付けで特許申請を行った(特願2012-053883)。また、研究成果について現在英文論文として投稿中である。現在、前向き臨床試験(臨床第II相、臨床第III相)の付随研究として、本研究成果を検証する研究を準備している所である。
貧困層による市場を通じた土地へのアクセス拡大のための条件の解明:ウガンダの事例

本研究の目的は、ウガンダ共和国の事例研究を通じて、どのような取引相手・契約方法が貧困層による市場参加と土地へのアクセス拡大を可能とさせているのか、を明らかにすることを目指した。まず、既存データと昨年度本調査の分析により、以下のことが明らかになった。1.従来土地の売り手と買い手と証人の三者が署名する非公式な覚書に比べ、その三者間で取り交わす覚書にさらに村レベルの行政委員会が裏書をするケースが近年増加傾向にあることが確認された。2.1.の増加傾向は民族や土着の慣習法が未だ強く影響を及ぼし共同体的な営みを行っていると考えられている地域により顕著に現れていた。これは、既存文献において見られる、口頭のみの契約や非公式な覚書のみの契約は本来契約不履行のリスクが高いと思われるため、通常この低い履行力を共同体的な地縁・血縁・慣習をもって補完できるような地域により多く見られるとの仮定と食い違うものである。更に本年度のフォローアップ調査により以下が確認された。3.共同体的関係の強い地域においては、証人の数が圧倒的に多く、村長は地元名士の一人として相対的に位置づけられ、村長に支払う手数料は他の証人とあまり変わらない場合が多い。他方で、血縁・地縁関係が比較的薄いと思われる地域や家計では、周囲も認めるリーダーは村長のみであるため、他の証人とは別の手数料を一定額支払って行政のお墨付きを得る傾向が認められた。共同体的な関係の薄い地域や家計において、取引の当事者が対価を払って行政の承認を得ようとする自発的行動は、行政や司法制度の脆弱なアフリカにおける土地権利の保障と地方分権に重要な示唆を与えると思われる。しかし、(3)の後者(地縁・血縁関係の薄い地域)の場合、村行政に裏書を頼む際の費用が嵩むため、負担能力のない貧困層は完全に非公式な契約方法に頼らざるを得ない可能性があることには注意を払うべきと考える。本研究では、土地市場に関する実証研究が特に少ないサハラ以南アフリカの国の一つであるウガンダ共和国の事例研究を通じて、貧困層による市場参加と土地へのアクセス拡大に果たす土地市場の役割の解明を図る。本年度は本研究実施期間の初年度ということで、分析に必要な文献やデータ収集・加工に費やした。まず4月から6月までフィールド調査を行い、文献・データ収集を行った。帰国後、過去本学がウガンダにて行った家計調査と統合するべく、データ入力・加工を始めた。しかし、同じ農家に関する情報が、本学が過去に調査し得たものと、今回の調査で得たものとで食い違いが多く見られたため、まずはどこが食い違っているかの確認作業に思いのほか時間を要した。洗い出しの結果、1.一部地域で使われている土着の測量単位の換算方法が調査時点ごとに異なる可能性2.担当地域別調査員グループ間の質問表に対する理解度に差がある可能性3.その他、過去の調査で農家が所有していると記録された土地が、今回の調査時に存在を否定されたなど調査員・農家間の理解度や農家自身の記憶のあいまいさによるものと思われるケースなどが浮上し、これらの原因解明と対応のため、3月末に2週間ほど補足調査を行った。その結果、1および3に関しては、修正可能な場合は修正し、不可能な場合には換算方法が分析に影響しないように比率を用いるなど必要な配慮をすることとした。また、そのほかの点でデータの食い違いが見られる場合、最新の調査データを重視しながら、現在データ加工・分析を行っているところである。以上のような理由から計画に遅れが出たものの、来年度は研究成果のとりまとめと発表に専念する予定である。
カーボンナノチューブ暴露により胸膜中皮及び肺胞上皮細胞が被る遺伝子損傷の評価

カーボンナノチューブの生体影響を、ヒト由来胸膜中皮細胞を用いて評価した。本研究では,癌化が懸念される標的組織であるヒト胸膜中皮に由来する細胞であるMeT-5Aに対し,高度に精製されたCNTを曝露することで,その細胞毒性について調べ,次いでコメットアッセイにより遺伝毒性の評価を行った。また,核内に蓄積する8-OHdG量の変化を定量すると共に,新たな試みとして,酸化DNA除去修復酵素の発現変動についても解析することで, CNT曝露による酸化的DNA損傷の可能性について検証した。その結果,高純度の単層及び多層カーボンナノチューブの曝露では、8-OHdGの蓄積やカルボニルタンパク質の生成といったような、酸化的な細胞障害は観察されなかった。しかし、高純度のCNTを用いた場合にも,有意な細胞増殖の抑制と変異原性が認められたことから、誘発される胸膜中皮細胞のDNA損傷は,ゲノムDNAあるいはヌクレオチドプールの単純な酸化によってのみ起こるものではないことが示唆された。今後、アスベストとは異なる機序によるカーボンナノチューブによるDNA損傷作用の機序について更なる解析が望まれる。本年度は、まずこれまで行われたアスベストを用いた研究の追試を行い、その過程でクリソタイルや発がん性の強いクロシドライトの肺胞上皮由来A549細胞への曝露により、細胞内グルコース-6-リン酸デヒドロゲナーゼ(G6PDH)が、酸化的修飾(カルボニル化)を受け、失活することを明らかにした。そこで、カーボンナノチューブが低分子SH化合物及び蛋白質に与える酸化的傷害について検討を行った。今回の検討では、単層カーボンナノチューブ(SWCNT)の分散法を検討し、肺胞上皮由来の癌細胞であるA549とヒト胸膜中皮由来MeT-5AにSWCNTを曝露し、細胞内のSH濃度変化とSHタンパク質の失活及びカルボニル化などについて調べた。細胞に対しSWCNTを37°C、5%CO_2、24-72時間処理した後、細胞抽出液中の低分子SH量をDTNB法、GSHをHPLC法、G6PDH活性を常法に従って測定した。また、タンパク質カルボニルをウエスタンブロット法で検出した。分散の状態は、水浴型ソニケーター使用時と、超音波発振子使用時で違いが認められた。SCNT曝露において、A549細胞では、細胞内低分子SH量に減少傾向が見られたが、G6PDHの失活は認められなかった。これに対しMeT-5Aにおいては、G6PDH活性の有意な低下が認められた。即ち、中皮細胞において、SWCNTが、レドックス系の中枢を担う酵素に影響を与えることが示唆された。今後このG6PDHの変化がタンパク質レベルの変化であるのか、あるいは、アスベストとは異なり、遺伝子レベルでの変化によるものか否かを、解析すると共に、DNAの酸化的損傷について、コメットアッセイなどを用い評価していく予定である。これまでの研究において、アスベスト暴露によるヒト肺胞II型上皮由来細胞(A549)に対する酸化的傷害が検討した。A549にアスベストを暴露する事で細胞内GSH濃度の低下が認められた。さらに細胞膜に酸化傷害が起こり、膜脂質が過酸化され、その脂質過酸化二次生成物(TBARS)との反応によりG6PDHの活性部位がカルボニル化され、G6PDHの活性が低下することを見出した。さらに本年度は、以上の事を踏まえ、アスベスト感受性細胞であるヒト胸膜中皮細胞MeT-5Aを用い、CNT曝露による細胞毒性について調べ、次いでコメットアッセイにより遺伝毒性の評価を行った。また、ゲノムDNA由来の8-OHdGの変化を定量すると共に、塩基除去修復酵素の発現変動についても解析することで、CNT曝露による酸化的DNA損傷の可能性について検討した。その結果、CNT暴露によりヒト胸膜中皮由来細胞において増殖阻害、及びDNA損傷が生じる事が明らかとなった。そのメカニズムとして、従来アスベストを用いた実験で考えられている様な酸化的な損傷である事を示唆するデータは得られなかった。したがって、今後の課題として、変異スペクトル解析などにより変異の確認やそのパターンを詳細化し、酸化的損傷修復以外のDNA修復系の解析など、更なる検討を進める事が望まれる。

本年度は、カーボンナノチューブをアルブミン、グルコース及びジパルミトイルフォスファチジンリン酸等から構成した擬似肺胞内液でコーティング後分散して細胞に添加する方法を採択した。その分散媒を変えたMWCNTおよびSWCNTを用いて、あらためてコメットアッセイを行ない、DNA in tail(%)を求めたところ、SWCNTにおいて有意なDNA損傷を検出した。更に、塩基除去修復酵素の発現変動についても再解析することで、CNT曝露による酸化的DNA損傷の可能性について検討した。その結果、従来指摘されたような塩基除去修復酵素グリコシラーゼ等の変化は見出されなかった。しかし、核内に蓄積した間接証拠として、細胞より抽出したCNTにヒストンが特異的に吸着している事がウエスタンブロット法により明らかとなった。従って、カーボンナノチューブは、核内に入り込み、酸化的損傷に依存しない遺伝毒性を有する事が示唆された。
バイオテンプレートプロセスによる電磁波応答材料の開発

バイオテンプレートプロセスは微生物の形を利用した人工的な微細加工技術では困難な3次元構造材料の作製法である。リソグラフィー技術は、平面上に精度よく造形できる一方、3次元構造作製には不向きであり、自然界の機能的かつ階層的なナノ・マイクロ構造などは既存法では到底作製できない。例えば、珪藻は、シリカからなる被殻にさまざまな胞紋パターンを形成する。本研究では、微細藻類をバイオテンプレートとした微小金属構造体の新しい作製法の開発を検討した。その結果、無電解めっきを介し、微細藻類のもつ階層構造に追従する金属被覆プロセスを確立できた。その全体構造や内部構造を利用した構造特異的な電磁波応答特性を評価できた。本研究は、自然界の周期的マイクロ構造をバイオテンプレートとする高周波帯域電磁波応答材料の作製を目的とし、電磁波応答に適した構造をもつ藻類・バクテリア・植物組織の探索、2.電気伝導体への転写(バイオテンプレート)プロセスの確立、3.電気伝導性マイクロ構造体の配向制御、4.電磁波応答特性の測定とサンプル形態の確立の4項目を通じて、生物・植物が自らつくりだす特異なマイクロ構造を電磁波応答材料として活用し、これまでのように人工的構造形成にエネルギーを傾注する研究手法から脱却した材料作製プロセスを提案する。平成25年度は、電磁波応答に適したミクロ構造をもった藻類の選定を行った。電磁波の透過・吸収特性は、主に表面周期構造、誘電率、構成金属の表面プラズモン・ポラリトン特性に依存する。そこで、藻類のミクロ構造における秩序性に着目した。また、鋳型となる微生物の培養環境における構造制御性の検討も合わせて行った。マクロメートル領域において特異的な周期構造、幾何学構造をもつ藍藻類、円石藻、珪藻類、計7種類の株から培養を試みた。その結果、珪藻類キクロテラ、エオリムナ、コアミケイソウの3種において、人工培養下の良好な増殖がみられ、培養環境による被殻厚の制御が可能であることがわかった。これらの珪藻は、1.5ミクロン程度の胞紋パターンをもち、さらにその胞紋には、師板とよばれる、200 nm程度の孔が幾何学的に配列しているホールアレイシートを有することが特徴である。FDTD計算において、この階層的ホールアレイを金属被覆した際に得られる透過率を求めたところ、波長5ミクロン程度まで表面プラズモン・ポラリトンに起因した以上透過現象がみられた。本研究は、自然界の周期的マイクロ構造をバイオテンプレートとする高周波帯域電磁波応答材料の作製を目的とし、1.電磁波応答に適した構造をもつ藻類・バクテリア・植物組織の探索、2.電気伝導体への転写(バイオテンプレート)プロセスの確立、3.電気伝導性マイクロ構造体の配向制御、4.電磁波応答特性の測定とサンプル形態の確立の4項目を通じて、生物・植物が自らつくりだす特異なマイクロ構造を電磁波応答材料として活用し、これまでのように人工的構造形成にエネルギーを傾注する研究手法から脱却した材料作製プロセスを提案するものである。平成26年度は、前年度までに選定した電磁波応答に適したミクロ構造をもつ藻類コアミケイソウおよびタラシオシラを対象に微小金属構造体の作製プロセスの開発を主に行った。始めに、鋳型となるこれら珪藻の純粋培養条件の探索と量産性の検討を行ったところ、別種珪藻スケレトネマとの共生により非常に良好な増殖が見られることを明らかにした。鋳型珪藻へのテンプレートプロセスはこれまで実績のある無電解めっきを用い、検討を行った。洗浄後の珪藻被殻は、清浄なシリカから構成されるため、めっき核であるパラジウム微粒子の吸着が困難である問題点があった。そこで、電荷付与のアルカリ前処理を施したところ、被覆率80 %程度の金属被覆を達成することができた。得られた珪藻を鋳型とした微小金属構造体の光学特性評価を目指し、顕微分光測定装置をあらたに立ち上げた。微小金属構造体の珪藻胞紋由来の直径1ミクロン程度の一つのホールの透過率・反射率測定を行ったところ、一般的な金属ホールアレイにみられる光の異常透過現象に類似のスペクトルパターンが得られた。今年度行った金属ホールアレイとしての光学特性評価を今後より詳細に検討し、あたらしい光学材料としての可能性を検討する予定である。平成27年度は、階層的なホールアレイ構造を被殻に有するコアミケイソウおよびタラシオシラをバイオテンプレートとする微小金属構造体粒子を作製した。バイオテンプレートへの金属被覆には、従来から検討している無電解めっきに加え、ドライプロセスである金スパッタリングを用いる手法を確立した。清浄なシリカ被殻の水分散液をガラス基板上に滴下し、乾燥したサンプルに金スパッタを施すことにより、膜厚200 nm程度の金ホールアレイチップを作製することができた。ガラス基板上に凝集することなく配置された各粒子の発色を光学顕微鏡により、また同視野を電子顕微鏡で観察し、内部構造であるホールアレイの形状・配置と光学特性の相関関係を検討した。

今後は、得られた光学特性が一般的な金薄膜ホールアレイにみられる光の異常透過と帰属できるかを検討する必要がある。最終年度である平成27年度に研究代表者の異動があったため、珪藻培養設備、光学顕微鏡および分光装置の移設・立ち上げを行った。本研究は自然界の周期的マイクロ構造をバイオテンプレートとする高周波帯域電磁波応答材料の作製を目的とし、1.電磁波応答に適した構造をもつ藻類・バクテリア・植物組織の探索、2.電気伝導体への転写プロセスの確立、3.電気伝導性マイクロ構造体の配向制御、4.電磁波応答特性の測定とサンプル形態の確立の4項目を通じて、生物・植物が自らつくりだす特異なマイクロ構造を電磁波応答材料として活用し、これまでのように人工的構造形成にエネルギーを傾注する研究手法から脱却した材料作製プロセスを提案するものである。これまで、選定した電磁波応答に適したミクロ構造をもつ藍藻や珪藻を対象に微小金属構造体の作製プロセスの開発を主に行った。はじめに、選定藻類の純粋培養条件の探索と量産性の検討を行った。特に、コアミケイソウおよびタラシオシラなどの珪藻については、繁殖力の高い別種珪藻スケレトネマとの共生により非常に良好な増殖がみられることを明らかにした。鋳型藻類へのテンプレートプロセスはこれまで実績のある無電解めっきを用い、検討を行った。培養中の各種藻類は、その表面が細胞外膜やゼラチン質の保護膜に覆われているため、めっき核であるパラジウム微粒子の吸着が困難である問題点があった。そこで、グルタルアルデヒドを用いた細胞固定、次いで電荷付与のアルカリ前処理を施したところ、被覆率80 %程度の金属被覆層の作製に成功した。得られた藻類を鋳型とした微小金属構造体の光学特性評価を目指し、顕微分光測定装置を新たに導入した。特に微細な内部構造を有する珪藻から得られた微小金属構造体については、珪藻胞紋由来の直径1ミクロン程度の1つのホールの透過率・反射率測定を行い、一般的な金属ホールアレイにみられる光の異常透過現象に類似のスペクトルパターンを得るに至り、新しい光学材料としての展開が期待できる結果となった。バイオテンプレートプロセスは微生物の形を利用した人工的な微細加工技術では困難な3次元構造材料の作製法である。リソグラフィー技術は、平面上に精度よく造形できる一方、3次元構造作製には不向きであり、自然界の機能的かつ階層的なナノ・マイクロ構造などは既存法では到底作製できない。例えば、珪藻は、シリカからなる被殻にさまざまな胞紋パターンを形成する。本研究では、微細藻類をバイオテンプレートとした微小金属構造体の新しい作製法の開発を検討した。その結果、無電解めっきを介し、微細藻類のもつ階層構造に追従する金属被覆プロセスを確立できた。その全体構造や内部構造を利用した構造特異的な電磁波応答特性を評価できた。本研究の申請時に予定した、平成26年度の研究実施計画を概ね完了できた。具体的には、本研究に適した微生物(バイオテンプレート)の大量培養と無電解めっきを介した金属被覆構造の作製に成功した。さらに顕微分光法による表面プラズモン・ポラリトン特性の実測を行うことができた。珪藻被殻のバイオテンプレートの作製は、概ね完了し、次年度には光学特性評価に注力する予定である。
ヒト胸T細胞ネガテイブセレクションにおけるシグナル伝達

昨年度までの研究により、我々はヒト胸腺DP cellにおける抗CD3抗体及び抗CD28抗体を用いたin vitro negative selection modelを確立し、この系を用いてAnnexinV陽性細胞の出現、Caspase3活性化等のアポトーシス解析を行った。この際、同時にミトコンドリアの膜電位の低下が観察され、胸腺T細胞、negative selectionにおけるアポトーシスシグナル伝達にミトコンドリアが関与していることが推測された。ミトコンドリアはアポトーシスにおいて種々のシグナルが収束するゲートウェイとして非常に重要視されている細胞内小器官である。本年度はnegative selection時のアポトーシスに対するミトコンドリアの関与についてさらに詳細な解析を進めた。以上の結果より、胸腺T細胞negative selectionにおけるアポトーシスシグナル伝達にミトコンドリアが関与することが証明された。.昨年度までの研究により、我々はヒト胸腺DP cellにおける抗CD3抗体及び抗CD28抗体を用いたin vitro negative selection modelを確立し、この系を用いてAnnexinV陽性細胞の出現、Caspase3活性化等のアポトーシス解析を行った。.(a)DP cellsをmagnet beads法を用い、sortingして以下の刺激を加えた。(4)etoposide(50ug)によるp53依存性アポトーシス刺激上記の刺激したT細胞のアポトーシスの解析をミトコンドリアの膜電位の低下、AnnexinVの発現、caspase3の活性をフローサイトメトリーにて解析し、kineticsを解明した。(c)p53リン酸化のkiinetic解析以上の結果よりp53リン酸化およびアポトーシスのkiineticを解析した。この際、同時にミトコンドリアの膜電位の低下が観察され、胸腺T細胞negative selectionにおけるアポトーシスシグナル伝達にミトコンドリアが関与していることが推測された。