hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
種内および近縁種間における花の匂い特性の多様性形成とそれに伴う種分化に関する研究

また、北アメリカ東部に分布するヒメタイサンボクは北方系と南方系で花の匂いやDNAが異なることを報告したが、葉の精油成分でも違いがないかを調べた。エーテル抽出した精油成分を薄層クロマトグラフィーで分析したところ、スポットのパターンにおいて違いがあるように見えるが、個体差が大きく、また、当該物質の同定に至っておらず、さらなる解析が必要である。花の匂いの捕集や訪花昆虫の観察を行うためには対象となる植物の生きた状態の花が必要だが、対象種の開花期がどうしても春から夏にかけて重なってしまうため、十分な調査ができないことがあるが、複数年継続することでカバーできている。前年度に引き続き、アケビ属のアケビとミツバアケビ、およびその雑種とされるゴヨウアケビの花の匂いの捕集、訪花昆虫の観察、およびDNA解析を行った。その結果、極微量ではあるが、両親種(アケビ、ゴヨウアケビ)の匂い物質としては検出されていない物質が、ゴヨウアケビから新たに検出された。すでに一部のゴヨウアケビでのみ見られた匂い物質については模造花をもちいた昆虫の誘引試験を行った。アケビ属はつる性で樹木に絡みついて比較的高い位置まで伸びていくので、今年度はそれを模して日当たりの良い林縁において地上1m付近と地上3m付近で訪花昆虫の違いを検討した。地上3m付近のほうが個体数としては1m付近より比較的多くの昆虫が訪花していた。また、試験の際の匂い物質の量については実際の花から検出された量と同程度に調整した場合はほとんど昆虫が誘引されず、量を増やすと昆虫が誘引された。また、ショウブ属についても新たな集団においてこれまで同様に匂いの捕集やDNA解析、訪花昆虫の観察を行った。匂いに関してはこれまでと同様の結果が得られた。訪花昆虫についてはセキショウではほとんど訪花昆虫が観察されなかった。実際、観察した個体の自然状態での結実率は低かった。ただし、集団内にはそれなりの果実の発達が見られる個体もあったので、観察範囲を広げる必要がある。開花期の違うセキショウ集団間の人工交配を試みたが、現時点で成功していない。また、すでに採集した北アメリカ産ヒメタイサンボクの葉の精油成分については個体差が大きく、交雑個体の特徴を特定するに至っていないので、さらなる解析を進めている。近縁種間およびそれらの雑種個体における花の匂いの化学的特性の違いと生殖的隔離との関係を調べるために,アケビ属,サツマイモ属,ヒメタイサンボク,セキショウなどを対象に匂い特性を調べた。アケビとミツバアケビの交雑個体であるゴヨウアケビにおいては両親とは異なる匂い物質を放つ個体があり,野外で誘引試験した場合は両親種ではあまり見られない甲虫類の訪花が見られた。ハリアサガオとヨルガオの匂い特性は異なっており,両種の雑種個体の作成を試みたが,現時点まで成功していない。ヒメタイサンボクは川を挟んで異なる種内分類群がみられ,葉の化学成分を指標に種内多型を評価した。ハリアサガオ、ヨルガオについては順調に進展しているが、予想されたとおりの結果が出るかどうかは次年度以降にならないと分からないので、今年度に関してはほぼ順調である.また、セイヨウヒルガオについても野外で調査を行う予定にしていたが、開花期がハリアサガオ、ヨルガオとほぼ重なってしまい、ハリアサガオとヨルガオの研究を優先しているので、セイヨウヒルガオに関しては、まだ十分な量の材料を得ることができていない.前年度に引き続き、データ収集を行う.最終年度なので、野外調査よりも栽培個体の解析に力を入れ、データの補強を行う.最終年度なので、データの取りまとめを視野に、不足するデータの補強などを行う。植物系統分類学前年度に引き続き計画に沿って行う.
安定な対象物操作を可能にする上肢インピーダンスの制御と最適化

インピーダンス制御と内部モデル制御の統合的学習モデル従来の学習モデルでは、インピーダンス制御と内部モデル制御を同時に獲得することは不可能であった。そこで、本プロジェクトでは、生理学的データに基づく3つの法則から、新たな学習モデルを提案し、それを実験的に検証すると同時に計算機シュミレーションを実施した。その計算機シュミレーション部分が英語論文として掲載された。さらに実験部分に関する論文を投稿し現在修正中である。タスクの拘束とインピーダンス制御正確さが要求されるとき、前もってインピーダンスを上昇させるという考え方に対して、最適フィードバック則に則りオンラインで軌道修正を行っている考え方が最近提案されている。そこで本プロジェクトでは、到達運動において運動の中央部分に通過目標点を設定し、筋電図信号を測定することで、精度の要求に対してインピーダンス制御で対応しているのか最適フィードバック制御で対応しているのかを調べた。その結果、インピーダンス制御をしている可能性の方が高まった。結果は2本の日本語論文として掲載された。インピーダンス制御の神経機構の解明内部モデル制御に関わる神経機構については徐々に明らかになっているが、インピーダンス制御に関わる神経機構については研究されていない。主な理由は、今まで機能的磁気共鳴画像装置(fMRI)内で被験者にインピーダンス制御を実現させることのできる装置が無かったことである。そこで本プロジェクトでは、新たに開発した1自由度fMRI対応マニピュランダムで被験者の手首に2Hzの正弦波で振動する力を加えた結果、被験者に様々なレベルのインピーダンスを実現させることが可能となった。現在、実験を終了し、論文を準備中である。現在結果をまとめているところである。結果を神経科学学会で発表し、まとめているところである。現在、予備実験を終了し、結果を解析中である。
高効率の褐色化を示す新規脂肪組織の分子解剖

白色脂肪組織(WAT)は、摂取した余剰なエネルギーを貯蔵する臓器であり、エネルギー異化が必要な際に脂肪分解を介して全身にエネルギーを供給する。また、一部のWATは寒冷曝露時に褐色化し、熱産生能の獲得を介して体温調節に寄与する。生体では様々な部位に特性の異なる脂肪組織が存在するが、研究代表者らは、寒冷曝露時に高効率に褐色化する新規のWAT(inducible BAT, iBAT)を発見し、形態変化と遺伝子発現を解析した。その結果、iBATでは他の組織で末梢組織の幹細胞マーカーとして知られる遺伝子Xの発現が顕著に誘導されることを見いだした。iBATでは寒冷曝露により非震え熱産生に重要なUCP1の発現が強力に誘導されることから、iBATにおける褐色化機構の解明は肥満や糖尿病などの代謝疾患に対する新規治療法の確立につながる可能性がある。そこで、国際共同研究加速基金の支援を受けて、褐色脂肪細胞の分化研究の世界的権威である英国のCambridge大学のVidal-Puig博士との共同研究を開始した。平成30年8月に渡英後、線維芽細胞株から白色脂肪細胞への分化および褐色脂肪細胞への分化実験を行った。遺伝子発現を定量解析したところ、褐色脂肪細胞への分化時には遺伝子Xの発現が誘導されるものの、WATへの分化時には遺伝子Xの発現誘導は見られなかった。すなわち、遺伝子Xは褐色脂肪細胞の分化誘導あるいは白色脂肪細胞の褐色化に関連する分子である可能性が考えられている。また、研究代表者は共同研究先で種々の実験を受けるための教育訓練と、資格試験を受けてきた。ようやく英国で動物実験を行うためのライセンスを取得でき、これから動物実験を開始する。具体的にはまず、マウスから単離したiBATのex vivo分化実験を行い、高効率の褐色化を示す分子機構を解析する計画である。研究代表者の李は、平成29年度に国際共同研究加速基金に採択され、Cambridge大学でのVidal-Puig博士との共同研究の準備に着手した。渡英に際して必要なビザの取得や大学での受け入れ承認などの手続きに予想以上の時間がかかったものの、共同研究先機関のスタッフの尽力もあり、平成30年8月29日に渡英して英国での研究を開始した。渡英までの期間を用いて、日本でマウスの寒冷曝露実験とその際の遺伝子発現解析を進めることができた。その結果、申請時に既に発見していた高効率に褐色化を示す新規の脂肪組織の遺伝子発現を解析し、寒冷曝露時にこの脂肪組織に発現誘導される遺伝子群を網羅的に解析し、発現が変化している遺伝子群のパスウェイを絞り込むことができた。平成30年8月29日に渡英してから約半年で、in vitroでの白色脂肪細胞や褐色脂肪細胞の分化実験を行い、褐色化の過程でin vivoの実験と同様な遺伝子Xの一過性発現誘導を確認できており、研究はおおむね順調に進展していると考えている。上記の通り、繊維芽細胞からの褐色脂肪細胞への分化実験では遺伝子Xの発現が確認できた。一方、繊維芽細胞からの白色脂肪細胞への分化実験では発現は見られず、遺伝子Xが褐色脂肪細胞の分化に重要な役割を果たしていると考えられた。そこで、より初期の分化段階であるiPS細胞からの褐色脂肪細胞への分化実験系で遺伝子Xの発現を解析する予定である。遺伝子Xには2つのアイソフォーム(遺伝子Y、遺伝子Z)が存在することが知られているので、繊維芽細胞からの褐色脂肪細胞への分化実験で遺伝子Y、遺伝子Zの遺伝子発現も解析する。もし、iPS細胞からの褐色脂肪細胞分化でも遺伝子Xの遺伝子発現が誘導されるのであれば、遺伝子Xの分化過程における生理的役割を解明する目的で、CRiSPR/Cas9系を用いて遺伝子Xを遺伝子破壊し、細胞分化を解析する。また、英国での動物実験のライセンスを取得したので、マウスのiBATから調整した間質血管分画(SVF)の脂肪細胞分化を試み、分化過程での遺伝子X/Y/Zの発現変化を解析する。さらにsiRNAを用いて遺伝子Xをノックダウンし、分化過程を解析する。遺伝子X欠損マウスはバイオバンクからの入手が可能である。しかしながら、共同研究先の動物実験施設の状況から、現時点では英国での遺伝子X欠損マウス実験の実施は困難である。従って、遺伝子X欠損マウスの実験は研究代表者の日本の所属機関である千葉大学に搬入し、日本と英国で並行して実験を進める予定である。これらの解析を通じて、褐色脂肪細胞の分化における遺伝子Xの役割の解明をめざす。遺伝子Xの機能制御により白色脂肪細胞の褐色化を誘導できれば、肥満症や糖尿病などの代謝疾患の新規治療法となる可能性もあるため、遺伝子Xの転写制御についても解析を進める予定である。内定年度:2017白色脂肪組織(WAT)は、摂取した余剰なエネルギーを貯蔵する臓器であり、エネルギー異化が必要な際に脂肪分解を介して全身にエネルギーを供給する。

iBATでは寒冷曝露により非震え熱産生に重要なUCP1の発現が強力に誘導されることから、iBATにおける褐色化機構の解明は肥満や糖尿病などの代謝疾患に対する新規治療法の確立につながる可能性がある。そこで、国際共同研究加速基金の支援を受けて、褐色脂肪細胞の分化研究の世界的権威である英国のCambridge大学のVidal-Puig博士との共同研究を開始した。平成30年8月に渡英後、線維芽細胞株から白色脂肪細胞への分化および褐色脂肪細胞への分化実験を行った。遺伝子発現を定量解析したところ、褐色脂肪細胞への分化時には遺伝子Xの発現が誘導されるものの、WATへの分化時には遺伝子Xの発現誘導は見られなかった。すなわち、遺伝子Xは褐色脂肪細胞の分化誘導あるいは白色脂肪細胞の褐色化に関連する分子である可能性が考えられている。また、研究代表者は共同研究先で種々の実験を受けるための教育訓練と、資格試験を受けてきた。ようやく英国で動物実験を行うためのライセンスを取得でき、これから動物実験を開始する。具体的にはまず、マウスから単離したiBATのex vivo分化実験を行い、高効率の褐色化を示す分子機構を解析する計画である。研究代表者の李は、平成29年度に国際共同研究加速基金に採択され、Cambridge大学でのVidal-Puig博士との共同研究の準備に着手した。渡英に際して必要なビザの取得や大学での受け入れ承認などの手続きに予想以上の時間がかかったものの、共同研究先機関のスタッフの尽力もあり、平成30年8月29日に渡英して英国での研究を開始した。渡英までの期間を用いて、日本でマウスの寒冷曝露実験とその際の遺伝子発現解析を進めることができた。その結果、申請時に既に発見していた高効率に褐色化を示す新規の脂肪組織の遺伝子発現を解析し、寒冷曝露時にこの脂肪組織に発現誘導される遺伝子群を網羅的に解析し、発現が変化している遺伝子群のパスウェイを絞り込むことができた。平成30年8月29日に渡英してから約半年で、in vitroでの白色脂肪細胞や褐色脂肪細胞の分化実験を行い、褐色化の過程でin vivoの実験と同様な遺伝子Xの一過性発現誘導を確認できており、研究はおおむね順調に進展していると考えている。上記の通り、繊維芽細胞からの褐色脂肪細胞への分化実験では遺伝子Xの発現が確認できた。一方、繊維芽細胞からの白色脂肪細胞への分化実験では発現は見られず、遺伝子Xが褐色脂肪細胞の分化に重要な役割を果たしていると考えられた。そこで、より初期の分化段階であるiPS細胞からの褐色脂肪細胞への分化実験系で遺伝子Xの発現を解析する予定である。遺伝子Xには2つのアイソフォーム(遺伝子Y、遺伝子Z)が存在することが知られているので、繊維芽細胞からの褐色脂肪細胞への分化実験で遺伝子Y、遺伝子Zの遺伝子発現も解析する。もし、iPS細胞からの褐色脂肪細胞分化でも遺伝子Xの遺伝子発現が誘導されるのであれば、遺伝子Xの分化過程における生理的役割を解明する目的で、CRiSPR/Cas9系を用いて遺伝子Xを遺伝子破壊し、細胞分化を解析する。また、英国での動物実験のライセンスを取得したので、マウスのiBATから調整した間質血管分画(SVF)の脂肪細胞分化を試み、分化過程での遺伝子X/Y/Zの発現変化を解析する。さらにsiRNAを用いて遺伝子Xをノックダウンし、分化過程を解析する。遺伝子X欠損マウスはバイオバンクからの入手が可能である。
延髄内のデュアルリズムジェネレーターによる呼吸の基本周期決定の神経機構

延髄呼吸中枢には,少なくとも2種類の呼吸性リズムジェネレーターが存在する:プレベッチンガーコンプレックス(pre-BotC)と傍顔面呼吸ニューロングループ(pFRG)である.本研究ではこれらのニューロングループ間での相互作用による呼吸の基本リズムの決定の仕組みを調べた.その結果,pFRGが少なくとも生後直後では、呼吸リズムの基本周期を決定し,中枢化学受容器(特にCO2の受容)としても重要な機能を有していること,このために、生後の生存に不可欠な役割を果たしていることが分かってきた.延髄呼吸中枢には,少なくとも2種類の呼吸性リズムジェネレーターが存在する:プレベッチンガーコンプレックス(pre-BotC)と傍顔面呼吸ニューロングループ(pFRG)である.本研究ではこれらのニューロングループ間での相互作用による呼吸の基本リズムの決定の仕組みを調べた.その結果,pFRGが少なくとも生後直後では、呼吸リズムの基本周期を決定し,中枢化学受容器(特にCO2の受容)としても重要な機能を有していること,このために、生後の生存に不可欠な役割を果たしていることが分かってきた.延髄呼吸中枢には,少なくとも2種類の呼吸性リズムジェネレーターが存在する:プレベッチンガーコンプレックス(PBC)と最近申請者らが発見した傍顔面呼吸ニューロングループ(pFRG)である.PBCおよびpFRGは,ある条件下ではそれぞれ独立にリズムを形成しうるが,延髄全体としては,これらのニューロングループ問での相互作用により呼吸の基本リズムが形成されると考えられている.本研究の目的は,これらのリズムジェネレーターが実際にどのような条件下で,どのような相互作用を行うことで,呼吸の基本リズムを決定するのかを明らかにすることにある.6.2(mM)K+,2.4Ca2+,1.3Mgt+を含む溶液いおいて、延髄一脊髄標本の呼吸リズム頻度(C4吸息性活動の頻度)は、延髄吻側部顔面神経核領域での切断レベルが尾側へと下がるに伴って減少した。特に延髄最吻側部(顔面神経核領域の吻側1/3)を取り除くと、pFRG-Pre-1ニューロンの活動に吸息性活動が1:1に対応しなくなり、結果としてC4吸息性活動の頻度が減少した。いわゆる量子的呼吸リズム抑制が引き起こされた。この結果は、延髄最吻側部pFRG-Pre-1ニューロンが、呼吸の基本周期を決定するpFRG全体の活動レベルを増強する役割を持つことを示唆する。実際、延髄最吻側レベルの腹外側部(顔面神経核と腹側表面の問の狭い領域)に、Pre-1ニューロンが密集して存在することを見出した。pFRGのおよそ80%を取り除く切断レベルでは、C4吸息性活動は、ほとんど停止した。ただし、このような条件下でも、外液のK+濃度を増やすか、興奮性アミノ酸(NMDA)を投与すると、C4吸息性リズムは再び見られるようになった。このときのリズム形成がpFRGからの制御を外れているかどうかは、まだ明らかではない。延髄呼吸中枢には,少なくとも2種類の呼吸性リズムジェネレーターが存在する:プレベッチンガーコンプレックス(PBC)と最近申請者らが発見した傍顔面呼吸ニューロングループ(pFRG)である.PBCおよびpFRGは,ある条件下ではそれぞれ独立にリズムを形成しうるが,延髄全体としては,これらのニューロングループ間での相互作用により呼吸の基本リズムが形成されると考えられている.本研究の目的は,これらのリズムジェネレーターが実際にどのような条件下で,どのような相互作用を行うことで,呼吸の基本リズムを決定するのかを明らかにすることにある.すでに我々は延髄最吻側レベルの腹外側部(顔面神経核と腹側表面の間の狭い領域)に、Pre-Iニューロンが密集して存在することを明らかにした。この延髄最吻側部pFRG-Pre-Iニューロンは、呼吸の基本周期を決定する機構において、pFRG全体の活動レベルを増強する役割を持つことを示唆する結果を得ていた。平成20年度の研究では、これらのpFRG-Pre-Iニューロンが、TTX存在下で、外液のCO2濃度を上げた時に脱分極の膜電位応答(つまり内因性CO2反応性)を示すことを明らかにした。さらに、これらのニューロンは転写因子であるPhox2b遺伝子を発現していることを、免疫組織化学的に確認した。Phox2b遺伝子は、延髄中枢化学受容器細胞が特異的に発現する遺伝子として最近注目されている。これらの結果は、pFRG-Pre-Iニューロンは、少なくとも生後直後では、呼吸リズムジェネレーターとして働くと同時に、中枢化学受容器としても重要な機能を有していること、このために、生後の生存に不可欠な役割を果たしていることを示唆する。これまで、pFRGの神経生理学的性質はPBCのそれに比べ、不明の点が多いとされてきたが、今回の結果はこうした疑問に答える重要な発見である。延髄呼吸中枢には,少なくとも2種類の呼吸性リズムジェネレーターが存在する:プレベッチンガーコンプレソクス(PBC)と最近申請者らが発見した傍顔面呼吸ニューロングループ(pFRG)である.PBCおよびpFRGは,ある条件下ではそれぞれ独立にリズムを形成しうるが,延髄全体としては,これらのニューロングループ間での相互作用により呼吸の基本リズムが形成されると考えられている.21年度の研究では,pFRG-Pre-Iニューロンの詳しい細胞生物学的性質を明らかにすることが急務と考え,CO2に対する反応,免疫組織化学的特徴,延髄内分布の詳細を調べた.その結果,尾側pFRGエリアにおいては性質の異なるPre-Iニューロン(CO2に反応し,Phox2b陽性でグルタミン酸ニューロン,CO2に反応せずPhox2b陰性でGABA

ニューロンなど)が存在することがわかった.一方,吻側pFRGは,そのほとんどがCO2応答性(脱分極)でPhox2b陽性(及びグルタミン酸ニューロン)のPre-Iニューロンから構成されていた.特に延髄最吻側に局在するPhox2b陽性ニューロンのクラスターは延髄断面からのアプローチが極めて容易で,今後詳しいCO2受容機構などを調べて行く上で,重要なターゲットになることが示された.膜電位感受性色素あるいは細胞内カルシウムインジケーターを用いた神経活動のイメージング法を適用し,このエリアのPre-Iニューロン活動を捉えることに成功した.これまでの結果より,pFRG-Pre-Iニューロンは,少なくとも生後直後では、呼吸リズムの基本周期を決定し,中枢化学受容器としても重要な機能を有していること,このために、生後の生存に不可欠な役割を果たしていることなどが分かってきた.
高機能ナノ自由加工を目指すマルチ集束イオンビーム開発

Siマイクロマシニングにより作製したエミッタアレイによりイオン液体電界放出型イオン源アレイを適用してSiエッチング特性を把握し、イオン液体イオン源によるSiエッチングメカニズム解明を行った。Siエッチング面表面のXPS分析およびエッチング雰囲気の質量分析により、イオン液体のFフラクションがエッチングに大きく関与しておりSiFxという気体となってエッチングされることが判明した。電界シミュレーションによりエミッタアレイおよびターゲット近傍の電界計算を行い、エミッタ保持部などもイオンの集束化に影響を与えることを明らかにした。エミッタ保持部の影響を受けないようなイオンエミッタ構成を考案し、実実験によりその効果を明らかにした。レンズ系で最も困難な課題は、球面収差と色収差である。色収差は従来のGa集束イオンビームに比べ種々のイオン種が存在することから増大の可能性があるが、その他の収差はGa集束イオンビームと比べ、エミッタ先端半径、アパチャー半径、光源、レンズ・光源間距離などいずれも二桁以上小さく高精度に作製することにより、収差を抑圧できる可能性があるのでシミュレーションおよび昨年度試作したイオンエネルギー分布測定装置により検討を進めた。イオンエミッタの構成法として昨年度はout-of-plane型について検討したが、本年はin-plane型を新たに発案し試作してその機能を確認した。イオン液体のエミッタ先端への供給が確実に行われることと、その供給量が制御できることを実験的に明らかにした。当初の計画の通り以下の検討項目を実施した。(1) Si基板エッチングメカニズムについて明らかにした。(2)イオン液体を用いた集束イオンビームについて電界シミュレーションおよび実験により基礎特性を把握した。(3) Siマイクロマシニングにより作製した電界放出型イオン源アレイの構成として従来のout-of-plane型に加えて新たにin-plane型を考案し、イオン液体供給制御の優位性について明らかにした。Siマイクロマシニングにより製作したマルチ集束イオンビーム源によりエッチング、表面修飾、イオン注入などの各種加工に対し特に、Siとイオン液体中の各種元素、特にF, Cl, Cなどに着目して多種・多様な加工法が可能であることを明らかにする。エッチングではF成分の多いイオン液体を用いる。最初にイオン液体としてEMI-BF4を用いたイオン液体イオン源と簡便な減速系レンズによりSi基板をエッチングし、エッチング中の質量分析と粟得てエッチング面のAFM観察およびXPS観察を行う。この過程において化学反応の効果を明らかにし、さらなるスパッタ率増大可能性を追究する。イオンビーム構成原子、分子の同定およびエッチングメカニズムの解明のためにイオンビームそのものの解析を進める。このため、ビーム中のイオン種および中性分子種の同定を進めるとともにそれぞれのエネルギー分布の測定を進める。マイクロマシニングを用いたイオン源の作製
有機分子アリル化剤の開発を基軸とする革新的不斉有機分子触媒反応の開拓

近年、環境調和性の高い分子変換プロセスの確立が求められている。不斉有機触媒反応は、光学活性物質を効率的に供給するひとつの方法論として広く認識されるようになってきたが、その適用可能反応はいまだに限定されている。本研究では、金属アリル化剤の代替となり得る有機分子アリル化剤の設計・開発を基盤として不斉転位反応の開発を試みた。その結果、これまでに報告例のないホモアリルアミンの1,3ーアルキル移動反応およびN-クロチルホモアリルアルドイミンの1,3ー転位反応を見出した。本研究で見出した2つの転位反応は、オレフィン末端に2つの置換基を有するホモアリルアミンの簡便な合成反応として、その有用性が期待される。本年は、昨年度に設計した金属アリル化剤に代替する有機分子アリル化剤を用いて位置特異的アリル化反応を試行し反応の有用性を確立するとともに、反応機構解明ならびに不斉合成反応の開発に向けて、種々、検討を行った。・2,4ー置換ホモアリルアミン合成を目的とするアルドイミンの1,3ー転位反応昨年度に見出した新規1,3ー転位反応の反応機構解明に向けて、交差反応実験ならびにキラルな反応基質の合成と不斉転写反応を行った。交差反応実験では、正常転位体と交差転位体の両方が得られ、1,3ー転位反応が段階的に進行していることを示唆する実験結果を得た。不斉転写反応の検討では、キラルな反応基質を合成し不斉転写反応を行い、それぞれの幾何異性体に対して不斉転写されたと考えられる解析結果を得た。また、触媒的不斉反応への展開を目指し、検討を行った。不斉分子触媒として光学活性ビナフトールから誘導したキラルジチオリン酸を、サリチルアルデヒドから誘導したアルドイミンを用いて用いて反応を行った。その結果、わずかではあるが、不斉誘導がみられた。・1,4ー置換ホモアリルアミン合成を目的とする1,2,2ー置換アミノブテンの1,3ーアルキル移動反応昨年度の知見をもとに、反応の適用範囲について検討を行った。その結果、1位および2位の置換基は、アルキル基ならびに芳香族置換基のどちらも適用可能であり、高収率で目的とする1,4ー置換ホモアリルアミンが得られた。また、反応機構の解明に向けて、交差反応実験ならびにキラルな反応基質の合成と不斉転写反応を行った。交差反応実験では、正常生成物と交差生成物の両方が得られた。また、不斉転写反応では、90%程度の不斉転写立で生成物が得られた。これらの実験結果から、本反応は、ブレンステッド酸存在下での逆エン反応によるイミニウム中間体の形成を伴って進行したと考えられる。本年は、昨年度までに得られた知見をもとに、種々、検討を行った。・2,4ー置換ホモアリルアミン合成を目的とするアルドイミンの1,3ー転位反応:本年度は、昨年度に見出した新規1,3ー転位反応の反応機構解明に向けて、光学活性な反応基質の合成と不斉転写反応ならびに交差反応実験を行った。不斉転写反応では、オレフィンの幾何異性がE体とZ体の反応基質を合成して検討を行った。その結果、絶対配置がRでE体の反応基質の場合、反応は70度48時間で円滑に進行し、完全な不斉転写率で絶対配置S、E体の生成物を与えた。Z体の反応基質の場合、反応はE体に比べて極めて遅く5日間の反応を行った。其の結果、低収率ではあったが良好な不斉転写率で転位生成物が得られ絶対配置R、E体の生成物を与えた。また、交差反応実験として、はじめに反応基質のイミンを用いた交差実験を行った。その結果、予想に反し、正常転位体と交差転位体の両方が得られることが分かった。この結果をもとに、転位後の正常転位体のみを用いて交差実験を行った。その結果、反応は正常転位体と交差転位体の両方を与えた。以上の不斉転写反応ならびに交差反応の実験結果から、本反応は、結合開裂と結合生成が協奏的に進行したと考えられるが、反応完了後に結合開裂と再結合を繰り返しても極端な不斉転写率の低下を伴わない極めて特異な反応であることが分かった。・1,4ー置換ホモアリルアミン合成を目的とする1,2,2ー置換アミノブテンの1,3ーアルキル移動反応:昨年度の知見をもとに本年度は、不斉転写反応の適用範囲について検討を行った。その結果、1位がアリール置換基の場合は概ね良好な不斉転写率を与えた。引き続き、不斉転写反応の適用範囲の拡充に向け検討を進める予定である。

本研究で見出した2つの転位反応は、オレフィン末端に2つの置換基を有するホモアリルアミンの簡便な合成反応として、その有用性が期待される。光学活性物質の効率的供給は、科学全体の発展のために必要不可欠な最重要課題のひとつである。近年、この課題に対し工業化も視野に入れた環境調和性の高い分子変換プロセスの確立が求められている。現在、不斉有機触媒反応は、光学活性物質を効率的に供給するひとつの方法論として広く認識されるようになってきたが、一方で、その適用可能反応はいまだに限定されている。本研究では、金属アリル化剤の代替となり得る有機分子アリル化剤を設計・開発を基盤として、アリル化反応のみならず不斉有機分子触媒反応の限界を打破する革新的不斉有機分子触媒反応の開拓を試みている。本年は特に、金属アリル化剤に代替する有機分子アリル化剤の設計ならびに位置特異的アリル化反応の開発を行なった。β位にジアルキル基を有するクロチルホモアリルアミンと芳香族アルデヒドからアルドイミンを調整して、反応出発基質として用いた。触媒量のカンファスルホン酸存在下、1,2ージクロロエタン溶媒中、マイクロ波照射下100150°Cで反応を行なったところ、1,3ー転位反応が円滑に進行し、加水分解の後、2ーモノメチルー4,4ージアルキルホモアリルアミンが高収率で得られた。一方、α位にアリール基、β位にジアルキル基を有するホモアリルアミンを出発反応基質として用いた場合は、アルジミンへと変換することなく、トリフルオロ酢酸存在下、1,2ージクロロエタン溶媒中、マイクロ波照射下100150°Cで反応を行なうだけで、1ーモノアリールー4,4ージアルキルホモアリルアミンが高収率で得られた。本申請研究の最終課題は位置選択的な光学活性多置換ホモアリルアミンの合成にある。現在までの研究により、最終課題の基盤となる位置選択的な三置換ホモアリルアミンの合成法を確立し、その反応機構に関して知見を得ることができた。具体的には、設計した転位反応により、ブレンステッド酸存在下、1ーモノアリールー4,4ージアルキルホモアリルアミンと2ーモノアルキルー4,4ージアルキルホモアリルアミンが高収率で得られた。本研究で合成が可能となったホモアリルアミンは、金属アリル化剤を用いるイミン類へのアリル化反応などの従来法では合成することが困難であったオレフィン末端に二つの置換基を有するホモアリルアミノ化合物である。得られたオレフィン末端に二つの置換基を有するホモアリルアミノ化合物の不斉合成については、キラルジチオリン酸による触媒的不斉反応の検討において、わずかではあるが不斉誘起がみられている。また、反応機構解明に関する検討を行うなかで、当初から検討を計画していた触媒的不斉合成とともに、不斉転写によるアプローチも可能であることが明らかとなった。本研究は、今後、キラルジチオリン酸を用いる触媒的不斉反応、ならびに、不斉転写反応の検討により光学活性ホモアリルアミン合成への展開が十分に期待できる。現在までの研究により、最終課題の基盤となる位置選択的な三置換ホモアリルアミンの合成法を確立することができた。本研究で合成が可能となったホモアリルアミンは、金属アリル化剤を用いるイミン類へのアリル化反応などの従来法では合成することが困難であったオレフィン末端に二つの置換基を有するホモアリルアミンである。
経皮免疫法を用いたがんペプチドワクチンの基礎的研究

マウスモデルを用いてケミカルピーリング経皮がんペプチドワクチンの開発を行っている。乳酸を用いたピーリング液でケミカルピーリング後にCTLエピトープペプチド(OVA257-264)、アジュバント(イミキモドクリーム)、HMGB1阻害剤(グリチルリチン)を混合したワクチンを塗布する方法で、ペプチド抗原に特異的なT細胞受容体を発現する細胞の増殖、及び、抗原特異的細胞傷害性T細胞の誘導と抗腫瘍(腫瘍縮小)効果の誘導が前年度の研究で確認された。今年度は、上記の抗原特異的免疫応答の誘導と抗腫瘍効果を高める条件を見出すことが課題であった。アジュバント(イミキモドクリーム)とペプチド・HMGB1阻害剤混合液に分けて、ワクチン投与条件の至適化を行った。2時間のアジュバント(イミキモドクリーム)の塗布をケミカルピーリング+ペプチド・HMGB1阻害剤混合ワクチンの前後で投与する方法を比較したところ、アジュバント(イミキモド)をピーリング+ペプチド・HMGB1阻害剤混合ワクチン後に2時間塗布することで、アジュバント・ペプチド・HMGB1阻害剤混合溶液のワクチン投与に比べて、抗原特異的反応の誘導を飛躍的に高められることがCFSSE増殖アッセイやインターフェロンガンマエリスポットアッセイで確認された。現在、in vivoでの抗腫瘍効果を確認するための実験を行っているが、HMGB1阻害剤の効果がアジュバントの効果に比べて低い傾向がみられることもあるので、改善の必要がある。申請計画書に挙げた項目のうち、半分ほどの項目の進み具合なので(4)遅れているを選択した。本研究課題において計画申請書を基に進めていく予定であり、研究計画の大幅な変更は現時点ではない。乳酸を用いたピーリング液でケミカルピーリング後にCTLエピトープペプチド(OVA257-264)溶液を塗布すると、抗原ペプチドは皮膚を浸透し、ペプチド抗原に特異的なT細胞受容体を発現する細胞を刺激し、増殖を誘導することがCFSE増殖アッセイで確認された。また、カーボポールを基剤としてワクチンの至適化を行い、アジュバント(イミキモド)とHMGB1阻害剤(グリチルリチン)を併用することにより、ペプチド(30ug)のみの皮下投与と同等の増殖を誘導することもCFSE増殖アッセイで確認された。ケミカルピーリング経皮ワクチン(OVAペプチド+イミキモド+グリチルリチン)を23回投与したマウスの脾臓細胞を用いてインターフェロンガンマ産生のCD8T細胞をエリスポットアッセイで検出・確認し、OVAを発現する腫瘍細胞を皮下移植したマウスにケミカルピーリング経皮ワクチンを23回投与した治療系実験を行った場合、無処置群と比較し、腫瘍細胞の増殖抑制効果に違いが見られた。これらのことは、ケミカルピーリングによる経皮ペプチドワクチンが抗原特異的免疫反応を誘導することができることを示唆している。抗腫瘍免疫において直接的に腫瘍細胞を攻撃する細胞傷害性T細胞の誘導と抗腫瘍(腫瘍縮小)効果の誘導が確認されたが、それらの効果を高める条件を決定し改善することが今後の課題となっている。申請計画書における当該年度の予定において、3項目目の「ケミカルピーリング経皮ワクチンにおけるCTLの腫瘍局所への動員の検討」が実施されていない為。その代わりに、翌年度計画の2項目目の「ケミカルピーリング経皮ワクチンに適した免疫増強剤の開発・検討」を経皮ワクチンの至適化と並行して行っている。まだ、CTL誘導能の検討と抗腫瘍効果の検討も改善すべき段階であるので、「やや遅れている」を選択した。本研究課題において計画申請書を基に進めていく予定であり、研究計画の変更は現時点ではない。研究遂行における今後の課題として、CTL誘導能と抗腫瘍効果を高める為の改善が必須となる。一つは、アッセイの精度を高める。その為、CD8T細胞を分離してのエリスポットアッセイもしくは他の細胞傷害アッセイを実施する。二つ目に、ワクチン投与回数を増やす。

投与回数を増やすと皮膚への負担が高くなるのは必須なので、それを軽減するためにケミカルピーリングやアジュバントの微調整を行う。本研究課題において計画申請書を基に進めていく予定であり、研究計画の大幅な変更は現時点ではない。
シグナル伝達データベースとオミックス解析による先天奇形症候群の病因解明

本研究者らは2005年にHRASの生殖細胞系列での変異を先天奇形症候群であるCostello症候群で同定した(Nature Genetics,2005)。また2006年にcardio-facio-cutaneous(CFC)症候群の原因がKRAS,BRAFの遺伝子変異が原因であることを報告した(Nature Genetics,2006)。申請者らの発見が契機となり、RAS/MAPKに異常を持つ先天異常症という新しい疾患概念が確立した。本研究の目的は、これまでの細胞ベース・マウスベースとは異なる、ヒト発生異常の表現型の臓器別・stage別の詳細な情報と遺伝子の機能・シグナル伝達マップを包括的に網羅するヒト発生異常のデータベースを構築し、データベースに基づいたプロテオーム解析(遺伝子発現タンパクの網羅的解析)をおこなうことによってMCA/MRの原因遺伝子を革新的な探索法を開発することにある。本年度は、患者で同定された変異が遺伝子特異的あるいは変異特異的にシグナル伝達経路を活性化させるかどうかを検証するために、HRASの野生型とコステロ症候群で同定された変異9種類を、レトロウイルスベクターを用いてヒト線維芽細胞に導入し、RAFへの結合活性とその下流のシグナルであるELK,c-jun転写活性を解析した。その結果、A146T変異ではRAF結合活性が他の変異より低かった。K117R,A146T変異ではc-junの転写活性の上昇は有意には観察されなかった。さらに、これまでにがん遺伝子変異をヒト2倍体線維芽細胞に導入すると細胞老化が起こることが明らかになっていることから、これらの9種類の変異が細胞老化にどのような影響を及ぼすかを調べたところ、コドン12,13の変異より少し活性が弱いとされたK117R,A146T変異においても、細胞老化の表現型と細胞老化に関与する下流の分子の活性化がみられた。以上より、コステロ症候群で同定された変異は、活性の弱い変異であっても細胞老化をおこす能力があり、細胞老化がコステロ症候群の症状である低身長や骨粗繧症に関与している可能性が示された。同様にBRAF,KRAS,PTPN11変異を持つベクターも作成し、遺伝子特異的なシグナル伝達活性化の有無を解析している。本研究の目的は、複数の先天奇形と精神遅滞を合併する各種症候群の原因遺伝子を究明するための新しい遺伝子探索法を開発し、その検証を行なうことにある。具体的には、本研究者らが疾患概念を確立した細胞内のRAS/MAPKシグナル伝達系に異常を持つ先天異常症と(RAS/MAPK症候群)を対象に検討を行った。本年度は、RAS/MAPK症候群の原因遺伝子としてあらたにRAF1およびSHOC2が同定されたため、急遽、その遺伝子変異解析と変異蛋白の機能解析を実施した。まず、ヌーナン症候群の患者18人で見出したRAF1遺伝子変異について、臨床症状との相関と変異蛋白の機能解析をおこなった。RAF1遺伝子変異を持つ場合、PTPN11やSOS1などの他の遺伝子異常に比べて肥大型心筋症と低身長の合併頻度が有意に高かった。変異RAF1蛋白の機能解析では、抑制性のS259部位のリン酸化が低下しており、そのためにRAF1活性抑制に重要な14-3-3蛋白との結合が低下し、非刺激時にも下流のERKを活性化していることが明らかとなった。一方、SHOC2遺伝子変異を有している患者は11人同定され、詳細な解析を実施中である。つぎに、網羅的な解析を進めるため、マイクロアレイと次世代シークエンサーによる解析について検討をおこなった。さらに、遺伝子変異と表現型・シグナル伝達での役割を包括的に記したデータベースを構築中で、順次その成果をホームページで公開している。

以上より、コステロ症候群で同定された変異は、活性の弱い変異であっても細胞老化をおこす能力があり、細胞老化がコステロ症候群の症状である低身長や骨粗繧症に関与している可能性が示された。同様にBRAF,KRAS,PTPN11変異を持つベクターも作成し、遺伝子特異的なシグナル伝達活性化の有無を解析している。
複数の雄形質に基づく雌の配偶者選択と,それに適応した産仔調節機能の解明

本研究は,沖縄産野生化グッピーを用いて複数の雄形質に対する雌の選好性及び産仔調節を明らかにし,雌の配偶者選択の利益やコストとそれに応じた産仔調節機能という繁殖戦略の新たな研究分野を開拓することを目的とし,以下のような研究成果を得た。1.雄のオレンジ色のスポットだけを操作したデジタル画像を用いた厳密な実験システムを開発し,雌がオレンジ色の鮮やかな雄を好んでいることを確認した。また,野外調査及び室内実験により,オレンジスポットの鮮やかな雄は藻類採餌能力が高いことを明らかにした。さらに,雄の藻類採餌能力は子へと遺伝すること,藻類採餌能力の高い雄はオレンジスポットや体サイズなど雌に好まれる形質をより発達させることを解明した。これらの結果から,雌はオレンジスポットの鮮やかな雄を配偶相手として選ぶことにより,藻類採餌能力の高い子をつくることができ,それらの子は繁殖効率が高いという配偶者選択の間接的利益を得ていることが示された。2.本種の雄には尾鰭を伸長させて全長を大きくする個体が見られる。雌は全長の大きな雄を配偶相手として好むことが知られているが,全長が等しい2個体の雄と雌を直接接触させる実験によって,雌は尾鰭の長い雄よりも短い雄を好むことを明らかにした。また,尾鰭の短い雄と配偶させた雌に比べ,尾鰭の長い雄と配偶した雌の娘は成長が遅く繁殖効率が低いというコストがあることが判明した。さらに,尾鰭の長い雄と配偶した雌は子の性比を息子に偏らせ,尾鰭の長い雄と配偶するコストを小さくしていることを示した。一方,雄の長い尾鰭は遊泳能力を減少させ,野外では流れの緩やかな環境に生息範囲が制限されていることが判明した。これらの研究成果により,配偶者選択の基準とする雄形質の違いにより雌が得ている利益やコストが異なること,さらに雌は産仔調節によりそれらのコストを抑制していることが示唆された。本研究の目的は,雌の配偶者選択の利益と産仔調節機能を統括した新たな繁殖戦略の研究モデルを提唱するため,沖縄産野生化グッピーを対象に,複数の雄形質に対する雌の配偶者選好性および配偶した雄による雌の産仔調節機能を解明することである。この目的遂行のため,平成16年度は以下の調査を行った。1.研究に使用している沖縄・比地川の個体群における雌の配偶者選択をさらに明確にするため,雄と直接に接触できる条件で尾鰭長の異なる雄への選好性を調査したところ,雌は初期の視覚だけによる接触時には雄の尾鰭長を識別していないが,交尾に至るまでの接触の過程で尾鰭の長い雄への選好性が低くなることが判明した。さらに,そのような雌選好性に対応して,尾鰭の長さの異なる雄は代替繁殖戦術の頻度など雌への配偶行動が異なることが明らかになった。これらの結果をまとめた論文は,Behaviour誌に受理され,現在印刷中である。2.特定の雄形質に対する雌の配偶者選好性の強さを明らかにするため,同一雄のデジタル動画像を加工して,ターゲットとする形質だけが異なる雄の2つの画像を雌に提示し,雌の選好性がどの程度異なるかを定量化する実験手法を構築した。その際他個体群における先行研究例を参照するとともに,入念な予備実験を行い,本研究個体群での最適な実験条件を明らかにした。

3.配偶相手が雌の選好性に合致しているかどうかによって,雌が体内で配偶者選択を行い,産仔調節をしている可能性を検討するため,両親が同じ2個体の雌に対し,それぞれ全長が等しく尾鰭長が異なる雄と配偶させ,産まれてきた子の数や成長などを比較した。その結果,雌が好む尾鰭の短い雄と配偶した雌と比較して,好みでない尾鰭の長い雄と配偶した雌は,産仔数が少なく,また子の成長の程度なども低い傾向が見られた。これらについては,現在さらに実験例を増やして詳しく検証中である。本研究では,複数の雄形質に対する雌の配偶者選好性と,その利益やコストの違いに対応した雌の産仔調節機能を統括した新たな繁殖戦略研究モデルを構築することを目的として,平成17年度は以下のような研究成果を得た。1.研究対象の沖縄・比地川産グッピーの雌は,全長の大きな雄を配偶相手として好んでいるが,雄の尾鰭の長さを配偶者選択の指標とはしていない(Karino & Kobayashi 2005,Behaviour)。そこで,雄の長い尾鰭は全長を大きく見せて雌に選んでもらうための騙し戦略ではないかという仮説を検証するため,尾鰭の長い雄と配偶した雌のコストを検証した。その結果,尾鰭の長い雄の娘は,尾鰭の短い雄の娘よりも体サイズが小さく,また産仔数が少ないなど繁殖効率も低いことから,尾鰭の長い雄と配偶することは雌にとってコストとなることが明らかになった(Karino et al. 2006,Behaviour)。また,尾鰭の長い雄と配偶した雌は,尾鰭の短い雄と配偶した雌よりも産仔数が少なかったが,これは尾鰭の長い雄と配偶したコストを低減し,次回の繁殖により大きな投資をするための雌の産仔調節による繁殖戦略であることが示唆された。2.本種の雌は,オレンジ色のスポットの鮮やかな雄を好むが,雄のオレンジ体色はカロテノイド依存形質であり,グッピーでは河川の藻類を摂取することでオレンジ体色が鮮やかになる。したがって,雌はオレンジ体色の鮮やかな雄を選ぶことで採餌能力の高い子をつくれるという利益を得ていると考えられているが,この仮説を検証した。その結果,親の藻類採餌能力は子へと有意に遺伝することが実証され,雌はオレンジ体色の鮮やかな雄と配偶することで採餌能力の高い子を得ていることが明らかになった(Karino et al. 2005,Behavioral Ecology and Sociobiology)。現在,このような利益をもたらすオレンジ体色の鮮やかな雄と配偶することで,雌がどのような産仔調節を行っているか検証中である。本研究は,沖縄産野生化グッピーを材料に複数の雄形質に対する雌の選好性及び産仔調節を明らかにし,雌の配偶者選択の利益とそれに応じた産仔調節機能という新たな繁殖戦略研究分野を開拓することを目的とし,平成18年度は以下のような成果を得た。1.これまでの研究から,グッピーの雌は全長の大きな雄を好むが雄は尾鰭を伸ばすことで全長を大きく見せており,尾鰭が長い雄と配偶した雌は娘が小さく繁殖効率も低いというコストがあることが明らかになった。そこで,雄の尾鰭の長さと子の性比を調べたところ,尾鰭の長い雄と配偶した雌は雄偏りの性比で出産しており,尾鰭の長い雄との配偶コストを低減させていることが明らかになった(Karino et al. 2006, Ethology)。また,長い尾鰭は雄の遊泳能力を減少させており,尾鰭の長い雄は流れの緩やかな環境に生息範囲が制限されていることが判明した(Karino et al. 2006, Zoological Science)。2.本種の雄におけるオレンジ色のスポットはカロテノイド依存形質であり,オレンジ色の鮮やかさは河川での藻類採餌能力を示すと示唆されていた。
高齢者の習慣性顎関節脱臼の臨床病態学的調査と低侵襲手術法の確立に向けた開発

本症に対する治療実態の現況が不明のなか、当教室で独自に開発した2種の低侵襲手術法すなわち内視鏡下顎関節脱臼手術および局所麻酔下での関節切開による関節結節形成術を適応して、その有用性と適応症、偶発症について明らかとすることを目的とした結果、手術前後の詳細な症状推移、偶発症、画像所見推移の記録、手術法の詳細より、上記の両手術法は合併症なく実行でき、概ね良好に経過したことが判明した。習慣性顎関節脱臼の病因は明らかにされておらず、また高齢患者の治療において基礎疾患の存在などから全身麻酔たよる手術は禁忌となる傾向があり、現在の治療実態は謎である。そこで当教室で独自に開発した2種の低侵襲手術法すなわち内視鏡下顎関節脱臼手術および局所麻酔下での関節切開による関節結節形成術を適応して、その有用性と適応症、偶発症について明らかとすることを目的とした。外科治療の適応:脱臼症状を頻回に繰返して生活の質に著しい低下をきたしている患者に対して、全身麻酔可能または禁忌の判断で局所麻酔の適応を判断し、内視鏡下脱臼手術(2例4関節)ならびに局所麻酔下の低侵襲開放手術による関節結節形成術(3例5関節)を施行した。これらの詳細は、すでに欧文誌あるいは本年度の国際学会で発表しており、十分な質疑考察が行われたものである。手術遂行に際しては、患者自身、家族への充分なインフォームドコンセントを確立のうえ遂行した。手術前後の詳細な症状推移、偶発症、画像所見推移を記録し手術法の詳細により、上記の両手術法は合併症なく実行でき、再発なく良好に経過したことから、各手術手技の優劣よりも、手術法の選択基準として患者の全身状態や全麻適応、本人や家族の意向などにより判断するべきものと考えられた。平成20年度以降は、患者の症状および画像、咀嚼嚥下機能の追跡を行い、併せて高齢者の顎関節脱臼病因としての全身(神経疾患の有無あるいは悪習癖の有無)および局所因子(MRIまたはCT画像における骨形態や関節結節の膨隆度の定量的評価)の究明を行うべきと考えられる。習慣性顎関節脱臼の病因は明らかにされておらず、また高齢患者では基礎疾患の存在などから全身麻酔による手術は禁忌となる可能性が高いことなどあり、現在の治療実態の詳細は不明である。外科治療の適応:脱臼症状を頻回に繰返して生活の質に著しい低下をきたしている患者に対して、全身麻酔可能または禁忌の判断で局所麻酔の適応を判断し、内視鏡下脱臼手術(16例20関節)ならびに局所麻酔下の低侵襲開放手術による関節結節形成術(20例35関節)を施行した。これらの詳細は、すでに発表しており十分な質疑考察が行われたものである。さらに本年度は、局麻下に下顎頭切除術を施行可能であることを確認した(2例4関節)。手術前後の詳細な症状推移、偶発症、画像所見推移を記録し手術法の詳細により、上記の両手術法は合併症なく実行でき、概ね良好に経過した。
皮膚の恒常性維持機能における末梢血間葉系細胞の役割解明とその制御法開発

平成29年度までの研究により、組織壊死由来核タンパクHMGB1の血中濃度上昇によって骨髄から血中へと動員される間葉系血液細胞が神経堤由来であることが示唆された。そこで、平成30年度は、GFPマウスと野生型マウスの末梢循環を共有するパラビオーシスマウスを作成し、その野生型マウス背部に皮膚移植を実施して、移植皮膚片生着過程におけるHMGB1誘導性末梢血間葉系細胞の役割を、1細胞レベルでのトランスクリプトーム解析により検討した。その結果、HMGB1誘導性末梢血間葉系細胞は、移植皮膚片内で表皮細胞および真皮間葉系細胞として組織再生過程に寄与していることが明らかとなった。また、移植皮膚片の1細胞レベルでのエピゲノム解析(ATACseq)では、植皮片の表皮基底細胞層で、HMGB1投与により特異的に誘導されるクロマチン構造変化が存在し、特に表皮幹細胞を制御する転写因子結合クロマチン領域が特異的にオープン構造を持つことが示された。また、HMGB1投与により表皮内ランゲルハンス細胞、真皮内Bリンパ球がコントロールと比較して減少していたことから、HMGB1誘導性末梢血間葉系細胞の集積により、組織再生過程の移植皮膚片で免疫・炎症反応が抑制的に制御されている可能性が示された。一方、HMGB1応答性骨髄間葉系細胞を同定する目的で、HMGB1投与前後のマウスより骨髄細胞を採取し、1細胞レベルでの遺伝子発現変化を網羅的に解析した。その結果、これまで報告されていない特異的なHMGB1応答性間葉系細胞集団が同定されたことから、これらの骨髄内間葉系細胞亜集団が壊死性組織損傷に応答して活性化し、末梢血中に間葉系細胞を供給している可能性が明らかとなった。平成30年度が最終年度であるため、記入しない。平成28年度の研究において、HMGB1ペプチド投与により皮膚損傷部に骨髄由来末梢血間葉系細胞(mesenchymal blood cell, MBC)の集積が誘導される結果、皮膚末梢神経の再生が促進される可能性が示された。具体的には、マウス背部皮膚に全層皮膚欠損を作成した皮膚潰瘍モデルに対して、HMGB1ペプチド投与により誘導される組織学的変化を検討した。その結果、HMGB1ペプチド非投与群ではシュワン細胞による髄鞘を持った異常な有髄神経が再生皮膚に形成されること、シュワン細胞からTGF-βが産生される結果、異常有髄神経周囲に線維化が生じ、瘢痕治癒が誘導されること、一方HMGB1ペプチド投与群では異常有髄神経形成が抑制される結果、正常皮膚組織と同様の無髄神経再生が誘導され、その結果瘢痕形成が抑制的に制御されることが明らかとなった。さらに、表皮内のメルケル細胞が形成する知覚受容装置タッチドーム(touch dome)の形成が瘢痕部は著明に減少することが明らかとなり、HMGB1ペプチド投与により非瘢痕性皮膚再生を誘導することによりタッチドームの喪失が抑制的に制御され、潰瘍部皮膚の知覚再生を促進し得ると予想する。すなわち、HMGB1ペプチドにより末梢血中に増加するMBCの潰瘍部皮膚集積により正常神経再生が誘導され、非瘢痕性機能的組織再生促進が可能となる。HMGB1ペプチド投与により骨髄由来末梢血間葉系細胞MBCが増加することが、マウス基礎研究のみならず、ヒトにおいても確認された(医師主導治験および臨床研究)ことから、本研究によるMBCの皮膚恒常性維持機構解明研究の重要性がさらに高まりつつある。今年度の研究によりMBCが皮膚の非瘢痕性機能的再生に寄与することが明白となり、特に表皮と同じ外胚葉性組織である神経再生もMBC動員により促進されることが明らかとなりつつあることから、研究の進捗はおおむね順調と自己評価する。これまでの研究において、マウス全層皮膚欠損モデルにおける皮膚再生プロセスで、血小板増殖因子受容体(platelet-derived growthfactor receptor-alpha: PDGFRα)陽性間葉系細胞による末梢神経再生メカニズムが存在すること、この末梢神経再生プロセスは骨髄間葉系幹細胞血中動員活性を持つ核内クロマチン結合蛋白HMGB1の投与により促進されることを明らかにした。平成29年度は、末梢循環性間葉系細胞(mesenchymal blood cell, MBC)の皮膚再生プロセスをより詳細に解明することを目的として、特定の細胞でPDGFRαが一度でも発現すれば、それ以降はPDGFRαの発現が消失しても緑や赤の蛍光を発する細胞から成るマウス(PDGFRα-Cre::flox-stop-tdTomatoマウス:Pα-Tomatoマウス)と野生型マウスの末梢循環を共有させた共生マウス(parabiosisマウス)を作成し、その野生型マウス背部皮膚に、皮膚基底膜接着分子VII型コラーゲンの機能不全により表皮剥離を繰り返す栄養障害型表皮水疱症モデルマウスの新生仔皮膚を移植し、その皮膚再生プロセスにおけるMBCの寄与を検討した。その結果、MBCは移植皮膚片内で間葉組織のみならず、表皮、毛包、末梢神経の再生に寄与していることが明らかとなった。さらに、MBCの遺伝子発現を、次世代シークエンスを用いて網羅的に解析した結果、神経堤由来間葉系幹細胞と類似の遺伝子発現パターンを示すことが明らかとなった。即ち、生体内組織損傷時には、末梢循環を介した神経堤由来間葉系幹細胞の損傷組織への集積による組織再生誘導メカニズムが存在することが初めて明らかとなった。