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明治期における国民道徳運動の実証的研究

民間の動きとしては、明六社・洋々社・慶応義塾そして西村茂樹が組織した日本弘道会などがある。それらについては個々に検討が加えられてきたが、なおその全体像は明らかではない。本研究は西村茂樹と日本弘道会を主たる対象とする。西村の主要著作は、三巻本の旧全集に収められ、その事績は活澣な2冊本伝記にまとめられている。しかし彼の活動はこれに尽きるものではなく、国会図書館はじめ全国各地の図書館・文書館・資料館・個人宅にはなお厖大な史料が収蔵されている。本年度は国会図書館以下・東大・慶大また愛知県・和歌山県・京都府・長野県・新潟県などで調査を行い、新史料を発掘・収集した。それらは『増補改訂西村茂樹全集』第4巻に収蔵した。
将来債権の差押えの許容性について―第三債務者の保護のあり方の再検討を通じての考察

将来債権の差押えの許容性に関しては、学説からは差押債権者と第三債務者との間の利益衡量から考察するという一般論が提示されてきたが、その具体的な内容は十分に明らかにされているとはいえない状況にある。また、将来預金の差押えの許容性が問題となった最高裁判決においては、いわゆる支店順位方式と同様の枠組み(金融機関のシステムの整備状況に依存した枠組み)によって議論が展開されており、第三債務者に与えられるべき保護の程度や手段について、より柔軟な解釈論が望まれるところである。そこで、本研究においては、第三債務者に与えられるべき保護の程度とその保護の手段を詳細に検討することによって、差押債権者と第三債務者との間の利益衡量の内容の精緻化を図り、これを通じて、将来債権の差押えの新たな事案類型(特に将来預金の差押え)に関して、これを許容するために必要となる解釈論や制度設計について具体的な考察をすることとしている。昨年度は、債権執行における第三債務者の保護に関して、ドイツ法の議論の歴史及びその展開を調査して、ドイツ法の理論的な到達点を分析したところであるが、これに引き続いて、今年度は、すでに将来債権の差押えに関する規定を有するドイツ法において、近年将来預金の差押えを許容する旨の規定が立法化されたことから、この点に関する議論の展開及び問題意識を参考にしつつ、将来債権の差押えを許容するために考察すべきものと考えられる問題点を整理した。研究計画において今年度に実施するものとしていたドイツ法の検討作業が概ね予定通り進行している。次年度は、ドイツ法の検討作業から得られた示唆を基に、わが国における将来債権の差押えの許容性について、第三債務者に与えられるべき保護の程度やその方法について考察したうえで、一定の判断枠組みを提示することを目指す。それを前提として、わが国の実務状況を踏まえながら、将来債権の差押えに関する解釈上および立法上の制度設計について検討していくこととする。将来債権の差押えの許容性に関しては、差押債権者と第三債務者との間の利益衡量から考察するという一般論が提示されてきたが、その具体的な内容は十分に明らかにされているとはいえない。また、近年最高裁において問題となった将来預金の差押えの許容性についても、金融機関のシステムの整備状況に依存した議論が展開されており、第三債務者に与えられるべき保護の程度や手段について、より柔軟な解釈論が望まれるところである。本研究は、将来債権の差押えにおいて、第三債務者に与えられるべき保護の程度とその保護の手段を詳細に理論的に検討することによって、第三債務者との間の利益衡量の内容の精緻化を図り、このことを通じて、将来債権の差押えの新たな事案類型(特に将来預金の差押え)に関して、これを許容するために必要となる解釈論や制度設計について具体的な検討をすることを目的とするものである。初年度の平成29年度は、本研究の第一ステップとして、第三債務者の保護の観点から債権差押えに関連する問題について議論をしてきた蓄積が多く認められるドイツ法の議論の歴史および展開を参考にしながら、債権執行一般における第三債務者の保護のあり方を検討した。本研究の目的との関係においては、ドイツ法における第三債務者の保護に関する思考水準を明らかにすることが重要となるため、債権執行における第三債務者の保護に関するドイツ法の議論の歴史及びその展開を初期に遡って検討することによって、債権執行における第三債務者の保護に関するドイツ法の理論的な到達点を分析した。研究計画において初年度に行うものとしていた、本研究の出発点として必要となる作業が概ね予定通り進行している。次年度は、将来債権の差押えに関する規定(ZPO832条や833条)を有しており、かつ、近年将来預金の差押えを許容する旨の規定(ZPO833a条)が立法化されているドイツ法の議論の歴史やその展開及び現状における問題意識を参考にしつつ、将来債権の差押えを許容するために検討すべき問題点や必要となる制度設計について検討することとする。

次年度は、ドイツ法の検討作業から得られた示唆を基に、わが国における将来債権の差押えの許容性について、第三債務者に与えられるべき保護の程度やその方法について考察したうえで、一定の判断枠組みを提示することを目指す。それを前提として、わが国の実務状況を踏まえながら、将来債権の差押えに関する解釈上および立法上の制度設計について検討していくこととする。ほぼ計画通り使用したが、年度末から年度始めにかけて出張した旅費の支給が平成30年度にずれ込んだため、残額が生じた。この残額は、上記の旅費として速やかに予算を執行する。
本年度はまず,断層の活動履歴に関する情報の多い日本国内を対象として,本手法を適用する断層を文献調査および現地調査に基づいて選定した.文献情報や気候環境データ等に基づき,西南日本や北海道を対象にいくつかの内陸活断層を選定し,地形と地質の状況を地理情報システムと現地調査によって確認した.特に西南日本では近畿周辺や中国出雲地方を対象に渓流堆砂を採集し,宇宙線生成核種分析に着手した.複数種の鉱物中の宇宙線生成核種の分析手順についても,試料処理の高効率化を検討し,既存手法の改良を試みた.実験器具の工夫や改良を試み,炭酸塩鉱物のルーチン分析に向けて整備を進めている.ケイ酸塩鉱物についても,石英以外の新たな鉱物種や鉱物表面への吸着核種について,抽出や単離の手法を検討した.また,研究対象候補地の空間情報解析を通じて,侵食基準面変化と削剥速度変遷の履歴が,河川や流域の地形に残されていること,また,その定量的モデリングの方法について気付きを得た.宇宙線生成核種により削剥速度と地形量の対応がキャリブレートされていれば,地形の分析に基づいて任意の場所で,断層活動度を推し量ることができるようになる.よって断層周辺の地形の発達過程についても,河川縦断形の時間変化や斜面の侵食速度の変化などをシミュレートするモデルの開発にも着手した.局所的な断層運動に支配されたテクトニクスをもつ場を選定し,テストケースでの研究を進めた.計画通り試料中の同位体分析と地形解析が進捗しているため.今後は,西南日本内帯に位置する中国・九州地方の内陸活断層および,西南日本外帯に位置する九州・四国地方の非活動性断層において,試料の採取を行う.ボーリングの掘削およびコアの採取については,当初計画通り,簡易パーカッションボーリングマシンによるトライアルを行うが,選定地の地盤が硬質で掘削が困難である場合等は,随時専門業者に外部委託して研究に遅滞の生じないよう工夫する.得られた試料は,計画通り京都大学,東京大学,筑波大学の実験室で物理化学処理を施し,東京大学および筑波大学での加速器質量分析によって宇宙線生成核種を測定する.断層周辺の地形の発達過程についても,河道遷急点の遡上や斜面崩壊頻度などに注目したシミュレーションを行うなどして検討を進める.具体的な場として六甲山地や近畿地方南部丘陵,木曽山地での地形発達を検討する.断層運動が無いが活発な隆起の生じている場としては,四国山地や紀伊山地の地形を対象に検討を行う.計算に必要なパラメータを得るため,地形を構成している岩石および風化生成物の物性測定も行う方針である.得られた結果は,順次学会発表や論文出版により公表する.本年度はまず,断層の活動履歴に関する情報の多い日本国内を対象として,本手法を適用する断層を文献調査および現地調査に基づいて選定した.文献情報や気候環境データ等に基づき,西南日本や北海道を対象にいくつかの内陸活断層を選定し,地形と地質の状況を地理情報システムと現地調査によって確認した.特に西南日本では近畿周辺や中国出雲地方を対象に渓流堆砂を採集し,宇宙線生成核種分析に着手した.複数種の鉱物中の宇宙線生成核種の分析手順についても,試料処理の高効率化を検討し,既存手法の改良を試みた.実験器具の工夫や改良を試み,炭酸塩鉱物のルーチン分析に向けて整備を進めている.ケイ酸塩鉱物についても,石英以外の新たな鉱物種や鉱物表面への吸着核種について,抽出や単離の手法を検討した.また,研究対象候補地の空間情報解析を通じて,侵食基準面変化と削剥速度変遷の履歴が,河川や流域の地形に残されていること,また,その定量的モデリングの方法について気付きを得た.宇宙線生成核種により削剥速度と地形量の対応がキャリブレートされていれば,地形の分析に基づいて任意の場所で,断層活動度を推し量ることができるようになる.よって断層周辺の地形の発達過程についても,河川縦断形の時間変化や斜面の侵食速度の変化などをシミュレートするモデルの開発にも着手した.局所的な断層運動に支配されたテクトニクスをもつ場を選定し,テストケースでの研究を進めた.計画通り試料中の同位体分析と地形解析が進捗しているため.今後は,西南日本内帯に位置する中国・九州地方の内陸活断層および,西南日本外帯に位置する九州・四国地方の非活動性断層において,試料の採取を行う.ボーリングの掘削およびコアの採取については,当初計画通り,簡易パーカッションボーリングマシンによるトライアルを行うが,選定地の地盤が硬質で掘削が困難である場合等は,随時専門業者に外部委託して研究に遅滞の生じないよう工夫する.得られた試料は,計画通り京都大学,東京大学,筑波大学の実験室で物理化学処理を施し,東京大学および筑波大学での加速器質量分析によって宇宙線生成核種を測定する.断層周辺の地形の発達過程についても,河道遷急点の遡上や斜面崩壊頻度などに注目したシミュレーションを行うなどして検討を進める.具体的な場として六甲山地や近畿地方南部丘陵,木曽山地での地形発達を検討する.断層運動が無いが活発な隆起の生じている場としては,四国山地や紀伊山地の地形を対象に検討を行う.計算に必要なパラメータを得るため,地形を構成している岩石および風化生成物の物性測定も行う方針である.得られた結果は,順次学会発表や論文出版により公表する.
前立腺癌周辺に於けるリンパ管の分布様式・形態変化およびリンパ管浸潤の解明

1.研究方法前立腺全摘術にて得た、ヒト前立腺癌新鮮凍結標本を用いて、デコモブラチンにて毛細リンパ管を、PSAにて癌細胞を染め二重染色酵素抗体法を行ない、担癌組織での毛細リンパ管**や毛細リンパ管浸潤を検討する。2.実績現在は、2重染色の**条件*の検討を行なっている状態である。3.展望更に実験を重ねる必要がある。
演劇における東西交流の歴史と新たな創造の可能性 日本とフランスの関係を通じて

2007年度は、本研究代表者は、カナダで開かれた国際学会で日本現代演劇に関して仏語で発表するとともに、フランス語現代演劇およびフランス文化政策に関する論文を2本発表した。2006年度の日仏現代演劇交流に関する学会発表も、報告集に掲載され、フランスで出版された。日仏演劇協会の有志とともに、近年にフランスで出版された重要な演劇理論書『演劇とは何か』(クリスティアン・ビェ、クリストフ・トリオー共著、「あとがき」エマニュエル・ヴァロン)の翻訳(2009年3月出版予定)の準備を編訳者として進めた。同時に、早稲田大学演劇博物館グローバルCOE「演劇・映像の国際的教育研究拠点」の事業推進担当者としても、芸術文化環境研究コースのコース事業を統括するとともに、西洋演劇研究コースのフランス語圏舞台芸術研究プロジェクトの責任者を務め、日仏間の演劇研究交流の拡大と深化に努めた。具体的には、同グローバルCOE事業と連携して、12月にフランス国立科学研究所の研究員であるマリ=マドレーヌ・メルヴァン=ルー教授、3月にパリ第10大学よりエマニュエル・ヴァロン教授、パリ第7大学よリクリストフ・トリオー准教授を日本に招聘し、研究者・大学院生・一般向けに講演会および研究会を企画運営した。また、早稲田大学、フランス国立科学研究所、パリ第7大学、パリ第10大学とが連携して、日仏演劇交流の歴史に関する学術書の出版を目指し、その準備段階として国際研究集会を2009年にパリで開催することを確認している。そのほか、ジゼル・ヴィエンヌ、アルノー・ムニエ、ヤン・アレグレら、来日したフランスの演出家との交流・協力関係を深め、ムニエとアレグレが参加する2つの演劇交流プロジェクトのために、フランス語戯曲も2本翻訳した。とくにアレグレの戯曲翻訳については、フランスにおいて日仏二言語による出版が2008年5月に予定されている。2006年度は、研究代表者は夏期休業期間を利用して渡仏し、資料と文献の収集にあたるとともに、とりわけ日本の舞台芸術との交流が大きな中心の一つであったアヴィニヨン演劇祭を訪ね、現在における日仏演劇交流の一大成果を確認することができた。本年度はフランス現代演劇に関する論文を2本、フランス文化政策に関する論文を1本発表し、演劇研究の基本書となるべき『演劇学のキーワーズ』の共編著者として出版に関与した。また、フランス劇作家作曲家協会(SACD)の機関誌Entr'actesに、「日本におけるフランス演劇」という評論をフランス語(および英語翻訳)で発表してもいる。また、2006年2月にストラスブール大学で仏語でおこなった、現代演劇における日仏演劇交流に関する学会発表が論文として発表される予定である。さらに、その一方で、早稲田大学演劇博物館21世紀COE事業とも連携して、6月にフランス国立科学研究所の主任研究員であるベアトリス・ピコン=ヴァラン教授を日本に招聘し、3回の講演会を企画運営するとともに、20世紀初頭にヨーロッパ演劇に大きな影響を与えた女優貞奴の今後の共同研究の枠組みを議論した。11月にはパリ第10大学のクリスティアン・ビエ教授およびパリ第7大学のクリストフ・トリオー助教授を招聘し、3回の講演会・セミナーを企画運営し、トリオー助教授とは、日仏演劇の交流の歴史に関して、フランス語による学術書の出版を共同して進めていくことを確認した。その他、モイーズ・トゥーレ、アルノー・ムニエ、ヤン・アレグレ、ピエール・アスカリッドら、来日したフランスの演劇人と随時連絡をとり、面会し、研究の準備を進めた。
統計科学のための情報幾何的方法の深化と発展

確率密度関数の集合を多様体と見なし、統計的推論の構造を微分幾何学の方法により論じることから始まった情報幾何学は、これまで情報理論・最適化・機械学習などの関連諸分野にも影響を及ぼしながら発展してきたが、起源である統計学においてはいくつかの限られた成果はあるものの、あまり大きな進展は得られていない。しかしながら、まだいくつもの未解決問題が残っており、統計的推論や手法を幾何学の観点から理解し、発展させる可能性は十分にある。そこで本研究では、これまで行ってきた研究を踏まえながら、諸問題の解決や解決すべき問題の発掘なども行うことで、情報幾何学の統計科学における役割をさらに促進させることを目指す。
血管新生抑制因子TSPー1の発現制御分子の探索

Thrombospondin-1(TSP-1)は血管新生抑制分子として知られている。すでにある種の抗がん剤がTSP-1を誘導すること見いだした。抗原剤より低い毒性の分子によって人為的にTSP-1を誘導あるいは抑制することができれば、がんや血管性の疾患の治療に役立つ可能性が高い。今回、海洋天然物の抽出物の特定の分画に毒性のない濃度でTSP-1の発現を誘導できる活性の存在を確認できた。更に、数種の海洋生物から細胞障害性を指標とした探索を合わせて行い、10種の新規化合物を含め、興味深い化合物を単離した。代表者の岩川は本研究の計画遂行のために海洋からの材料収集をおこなった。そこで得られた海綿Agelas nakamurai(15.1kg)の分画と精製を主に細胞障害性を指標に進行した。MeOHで抽出物に細胞障害性を確認した、(Hex層,90%M/W層,n-BuOH層,H_2O層90%M/W層の4つの画分後の90%M/W層(50g)の一部1D画分をバキュームカラムクロマトグラフィーにかけ、得られたフラクションのうち1Dno.12,1Dno.13,1Dno.24についてはいずれもKB細胞と輸送体蛋白質MRP1発現細胞KB/MRP1細胞に対しIC_<50>値で1-3μg/ml程度の細胞障害性を有している。NMRの結果と活性試験の結果より、1D13をさらに精製した。得られた画分で1D13-2は、強い細胞毒性を示し、さらにカラムクロマトグラフィーで精製して、得られた画分の1D13-2-10はIC_<50>値1.5μg/ml程度の活性を示した。1D13-5、1D13-11は、IC_<50>値1μg/mlの活性を示した。各画分は保存し、安定なアッセイ系の構築後に速やかに再検可能である。古川はTSP-1のルシフェラーゼアッセイについて条件を再度検討中であり、安定したアッセイ可能な系の構築のために新たなプラスミドを作成している。具体的には現在用いているプラスミドが含むTSP-1のプロモーターDNA部分のうち最も重要なEGR-1の結合部位を残して重要でない部分を削除した。さらに、動物細胞で選択可能なマーカー遺伝子を挿入する操作を行っている。この遺伝子が組み込まれたKM12C細胞を作製することを目指している。1)海洋天然物からの抽出液画分について、TSP-1の発現を誘導する分子の同定をおこなった。1.昨年度作製した、海洋天然物からの抽出液画分から、TSP-1の発現を誘導する活性を有する画分を探索した。実際にはTSP-1遺伝子の5'転写制御領域を蛍ルシフェラーゼ発現遺伝子につないだプラスミド遺伝子と一定の発現が起こるウミシイタケのルシフェラーゼの発現プラスミドの2つのプラスミドを、KM12C大腸ガン細胞に同時に一過性に遺伝子導入して、海洋天然物からの粗抽出液の3,10,30マイクログラムの濃度存在下で作用させて、TSP-1遺伝子の発現誘導をルシフェラーゼの発現変化をその発光活性によって測定した。これまでに良好な活性化を観察できる分画の同定に到っていない。(岩川、古川)2)海洋天然物である沖縄産のジャノメアメフラシ(Aplysia.dactylomela)のMeOH抽出部のCH_2Cl_2可溶部は、KB細胞に強い増殖阻害活性(IC_<50>1.30±0.12μg)が認められた。分画と精製によってえられたHPLCのピークから8種単離し、7種の構造決定を終えた。このうち四種は新規の化合物であった。(岩川)1)海洋天然物からの抽出液画分について、TSP-1の発現を誘導する分子の同定をおこなった。2)ジャノメアメフラシ(Aplysia.dactylomela)のMeOH抽出部から、KB細胞に強い増殖阻害活性物質を含め7種単離し、構造を再度検討した結果そのいくつかの構造を訂正した。(岩川)ルシフェラーゼアッセイに天然物抽出物を加えた時のアッセイ条件が難しく再現性のよい結果がえられていない。24年度が最終年度であるため、記入しない。アッセイの再現債をためけるためにKM12CへのTSP-1遺伝子の5'転写領域をルシフェラーゼ発現遺伝子につないだプラスミを導入し、パーマネントな遺伝子導入細胞の単離を行い、この細胞を用いてアッセイを行う。
頬脂肪由来幹細胞を用いた立体培養コンストラクトによる抜歯窩骨再生の試み

体性幹細胞の利用は倫理的問題の抜本的解決に繋がることから、再生医療の実現に向けて大きな期待がある。そこで採取が簡便な細胞を用いて、目的の細胞へ直接の分化誘導が可能となれば、今後の再生医療に大きく貢献すると考えられるため、これらの手法・手技を研究したい。脂肪組織由来幹細胞(ASCs)の数は、骨髄に含まれるそれの1000倍となる報告もある。そこで、採取が簡便な頬脂肪から幹細胞を分離し、頬脂肪由来幹細胞の骨芽細胞分化方法の確立を目的とする。また動物実験による骨再生促進を評価して臨床応用を考察する。ヒトの頬脂肪組織よりASCsを分離し、骨芽細胞に分化誘導することが目標であるが、先ずマウスの脂肪組織よりASCsを分離して、骨芽細胞分化誘導を行った。すでに当研究室にあるヒトBMP-2プラスミドを大量精製し、アデノウィルスに組み替えた。マウス皮下脂肪組織由来幹細胞に対する遺伝子導入、あるいは骨芽細胞分化誘導培地における細胞培養によって、骨芽細胞への分化誘導を確認した。そして、ASCsでは、特にCD90膜抗原を持つ細胞において、強い骨芽細胞分化を示した。また、ASCsは、骨髄由来細胞に比較して有意な骨芽細胞分化能を持っていることが明らかとなった。さらに、CD105膜抗原を持つ分画細胞においては、強い増殖能を示した。ここまでの結果から、ASCsの増殖能および骨芽細胞分化能が示された。ヒトBMP2遺伝子導入に関してはもともとプラスミドベクターに組み込まれているものを使用したため、すでにアデノウィルスコンストラクトを作製とASCsへの遺伝子導入に成功し、骨芽細胞分化誘導を行った。立体コンストラクトの作製に関しては、細胞浸潤あるいは溶解性によってアテロコラーゲンやゼラチンの濃度を決定することになるが、条件の設定が難しくその部分が進んでいない。動物実験への準備として、生体材料(アテロコラーゲンゲル等)を用いた立体培養を考えている。また、動物モデルとしては研究計画で予定しているマウス下顎切歯抜歯窩を考えているが、大腿骨、頭蓋骨における骨欠損モデルを併せて検討する。H29年度の目的は、ヒトの頬脂肪組織よりASCsを分離し、骨芽細胞に分化誘導することであった。一方で、他の遺伝子導入に関してはヒト由来の細胞からの遺伝子を抽出が必要であるため、ヒトからの脂肪摘出が必要である。そこで東京医科歯科大学の倫理委員会からの承認を得るための準備に時間がかかっている。今後の状況をみながら、遺伝子導入に関してはBMP2に限った実験に切り替えることも検討している。

さらに、CD105膜抗原を持つ分画細胞においては、強い増殖能を示した。ここまでの結果から、ASCsの増殖能および骨芽細胞分化能が示された。ヒトBMP2遺伝子導入に関してはもともとプラスミドベクターに組み込まれているものを使用したため、すでにアデノウィルスコンストラクトを作製とASCsへの遺伝子導入に成功し、骨芽細胞分化誘導を行った。立体コンストラクトの作製に関しては、細胞浸潤あるいは溶解性によってアテロコラーゲンやゼラチンの濃度を決定することになるが、条件の設定が難しくその部分が進んでいない。動物実験への準備として、生体材料(アテロコラーゲンゲル等)を用いた立体培養を考えている。また、動物モデルとしては研究計画で予定しているマウス下顎切歯抜歯窩を考えているが、大腿骨、頭蓋骨における骨欠損モデルを併せて検討する。当該年度の実験内容が予定よりも進まなかったことで、物品費が抑えられた。次年度では、当該年度で行う予定であった研究内容を実施し、動物実験の準備を開始していく予定である。さらに、学術大会等における発表をしていく予定である。
脳、神経細胞内、電気・化学ナノスケール解析プローブアレイデバイスの開発

本研究課題では、脳・生体組織内のナノスケール局所領域電気的・化学(薬学)的解析ツールを目指した、集積化ナノプローブアレイデバイスを開発した。製作したデバイスの応用として生体組織の深部細胞内への薬液投与を提案し、これをナノプローブアレイを用いたナノ粒子の電気的吸着と擬似生体サンプルへのナノ粒子注入により実証した。更に、ナノプローブアレイによる細胞へのDNA導入を提案し、これまでに、培養したHEK293細胞に対し改変YFP(yellow fluorescent protein)を滴下、ナノ先鋭化プローブを細胞に対し刺入を行うことでDNAの局所的導入に成功している。本研究で開発したナノプローブデバイスはこれらの応用以外にも、電気的細胞内プローブとしての応用もあり、脳・神経科学の分野での今後の貢献が期待できる。本研究課題は、先端直径"10nm50nm"の細胞内用ナノプローブアレイ集積化デバイスを新しく提案し、そのデバイス製作及び電気的(記録/刺激)、化学的(薬液投与)な脳組織内、神経細胞内のナノスケール計測・解析を目指すものである。このような脳組織内部のナノ計測技術はこれまでに確立されておらず、成果としては脳・神経科学の基礎研究を進める強力なデバイスの実現が期待できる。このような研究課題を達成するため、今年度は下記項目を実施した。ナノプローブ集積化プロセスの確立:ナノプローブ集積化プロセスを確立した。Si基板上IC、MEMSプロセス後に、選択的にマイクロプローブを選択VLS成長で製作し、その後、フォトレジスト・スプレ-法によるプローブ全体保護、先端を酸素ガスエッチングで露出、プローブ先端Siエッチングによりナノプローブ化を実現した。ナノプローブ先端形状制御細胞内刺入用プローブとして先端ナノプローブの先鋭化角度制御を実施した。先鋭化には溶液(HF+HNO_3)を用いたSi等方性エッチングを用いており、その溶液混合比をパラメータとすることで、プローブ先端角度(11°38°)が制御できることを明らかにした。先端局率半径は最小で40nmを実現した。この局率半径は、追加のSi熱酸化とSiエッチングにより更に減少できる値である。ナノプローブ細胞刺入試験:擬似サンプル(Gelatin)を用いたナノプローブ刺入試験をとおして、ナノプローブの刺入が可能であることを確認した。加えて、プローブ刺入を有限要素法で解析し、先鋭化ナノプローブの細胞刺入の優位性(圧力集中、局所性)も定量的に評価した。集積回路、MEMSシステム集積化:ナノプローブチップ搭載用集積回路を検討した。電気的記録・刺激用として、ナノプローブと同一基板に集積化可能なSi-(100)MOSFETプロセスを提案した。選択VLSプローブ成長にはSi(111)基板を必要とするため、Si(100)/Box/Si(111)構造のSOI基板を用いた。Siプローブ形成後のMOSFET/(100)の動作も確認した。ナノプローブ機能化:ナノプローブの電気的機能化を実現した。ナノプローブ側壁には絶縁膜(酸化膜、Parylene)を形成、先端は、細胞適合性・細胞内電極を考慮した金属電極を形成した(白金、金)。プローブの電気的特性は、溶液中Dielectrophoresis法によるpolystyreneナノ粒子の吸着で評価した。刺入試験:Gelatinを用いたナノプローブの刺入試験を実施した。先のpolystyreneナノ粒子をプローブ先端に吸着させた後、ナノプローブアレイをGelatinに刺入したところ、ナノプローブの長さと同等のGelatinの深さ位置(2.0μm)にナノ粒子が注入できていることを共焦点顕微鏡で確認できた。また、Gelatin中に注入されたナノ粒子はプローブアレイと同等の間隔(100μm)を示した。脳切片サンプル内細胞刺入:上記の培養細胞サンプルに加えて、高アスペクト比のプローブ形状の特徴を生かし、深さを有する脳切片サンプルに対しても深部細胞内へのDNA導入を実施し、その可能性を示した。集積回路、MEMSシステム集積化:電気的記録・刺激、化学的薬液搬送用の機能化ナノプローブ用として、各種回路・システム(増幅器)を同一Siチップ上に集積化した。チューブ用配線の集積化も実現した。
DNA2重鎖切断の修復に関わる蛋白質の機能検査法の開発

「患者のリンパ細胞のDNA-PK(DNA依存性プロテインキナーゼ)活性と染色体不安定」染色体不安定性の存在は、様々な臓器の発癌において重要な役目を担っている。DNAの2重鎖切断の修復系は、染色体異常の発生を抑制することにより、遺伝的安定性の保持に関わっている。DNA-PKはDNAの2重鎖切断の修復に主要な役割を果たしている。そこで、本研究では、癌患者(乳癌、頭頚部癌、子宮癌、食道癌、悪性リンパ腫)と健常者でDNA-PK活性に差が見られるかどうか、またDNA-PK活性と染色体不安定性に関係がみられるかどうかを検討した。健常者の末梢血中のリンパ細胞のDNA-PK活性値は、15.84±4.87pmolで、癌患者のDNA-PK活性値は、12.28±5.10pmolで、有意差(p=0.012)をもって、癌患者が低値であった。年齢や喫煙歴は、DNA-PK活性と相関がみられなかった。Western blotで解析したが、DNA-PK活性値とDNA-PKの構成サブユニットであるDNA-PKcs、ku70、ku86の発現に相関はみられなかった。DNA-PK活性値と染色体異常の自然発生頻度は、相関がみられた。二動原体(dicentric)は、DNA-PK活性値が16.32pmol以上では発生がみられなかった。excessfragmentの発生頻度は、DNA-PK活性値と逆相関がみられた。以上よりDNA-PK活性値は、染色体不安定性と相関がみられると結論できる。末梢血中のリンパ細胞のDNA-PK活性の低値は、様々な癌のリスクと関連がみられ、よって末梢血中のリンパ細胞のDNA-PK活性の低値は、腫瘍マーカーや癌罹患性の指標として、使用可能であると思われる。「患者のリンパ細胞のDNA-PK(DNA依存性プロテインキナーゼ)活性の測定」DNA-PKはX線照射によるDNAの2重鎖切断の修復に主要な役割を果たしており、また、培養癌細胞の結果では、DNA-PK活性とその細胞の放射線感受性が相関する事が報告されている。よって、DNA-PK活性により、癌組織に対する放射線治療効果や正常組織の放射線障害の程度が予測できないか検討した。DNA-PK活性を測定する細胞としては、癌組織や照射される部位の正常組織の細胞のDNA-PK活性を測るのが理想であるが、DNA-PK活性測定に必要な組織量を得るのは非常に困難であるため、採取が容易なリンパ細胞を用いて、研究を施行した。両側耳下腺を含めた照射野で外部照射が施行され、4ヶ月以上前に放射線治療が終了した20歳以上の患者を対象とした。照射による唾液分泌量の減少の程度を患者の放射線治療に対する耐容能力の指標として、本研究を施行した。1唾液分泌検査安静時唾液分泌量及びビタミンC錠服用による刺激時唾液量測定を施行した。2リンパ細胞のDNA-PK活性の測定患者の血液20mlを採取し、Lymphoprepに重層して、リンパ細胞を遠心分離し、DNA-PK活性を測定した。36名から唾液量を測定し、また、リンパ細胞のDNA-PK活性を測定した。安静時唾液量においても、刺激時唾液量においても、リンパ細胞のDNA-PKとの相関はみられなかった。この原因としては、1唾液腺への放射線量や放射線治療終了からの期間がバラバラであったこと、2唾液腺の放射線感受性と末梢血リンパ球のDNA-PKには関係が無いことが考えられる。平成15年度は、血中のリンパ細胞ではなく、手術標本などの癌組織におけるDNA-PK活性を測定し、放射線感受性との関係を検討する予定である。「患者のリンパ細胞のDNA-PK(DNA依存性プロテインキナーゼ)

活性と染色体不安定性」染色体不安定性の存在は、様々な臓器の発癌において重要な役目を担っている。DNAの2重鎖切断の修復系は、染色体異常の発生を抑制することにより、遺伝的安定性の保持に関わっている。DNA-PKはDNAの2重鎖切断の修復に主要な役割を果たしている。そこで、本研究では、癌患者(乳癌、頭頚部癌、子宮癌、食道癌、悪性リンパ腫)と健常者でDNA-PK活性に差がみられるかどうか、また、DNA-PK活性と染色体不安定性に関係がみられるかどうかを検討した。健常者の末梢血中のリンパ細胞のDNA-PK活性値は、15.84+4.87pmolで、癌患者のDNA-PK活性値は、12.28+5.10pmolで、有意差(p=0.012)をもって、癌患者が低値であった。年齢や喫煙歴は、DNA-PK活性と相関がみられなかった。Western blotで解析したが、DNA-PK活性値とDNA-PKの構成サブユニットであるDNA-PKcs、ku70、ku86の発現に相関はみられなかった。以上よりDNA-PK活性値は、染色体不安定性と相関がみられると結論できる。末梢血中のリンパ細胞のDNA-PK活性の低値は、様々な癌のリスクと関連がみられ、よって、末梢血中のリンパ細胞のDNA-PK活性の低値は、腫瘍マーカーや癌罹患性の指標として、使用可能であると思われる。
ゼオライトを結晶化基板材料として用いた汎用的タンパク質結晶化方法の確立

タンパク質X線結晶構造解析においてボトルネックである結晶化問題を解決するために,タンパク質結晶化促進剤として見出した合成ゼオライトのモレキュラーシーブを結晶化基板材料として用い,汎用的タンパク質結晶化方法の確立を試みた.モレキュラーシーブ,およびその類似化合物を用いてタンパク質結晶化を行った結果,様々なタンパク質の結晶化が促進された.その結晶化基板材料はマイクロ孔,結晶性,および金属イオンを有する物質が適していることが示唆された.タンパク質X線結晶構造解析においてボトルネックである結晶化問題を解決するために,タンパク質結晶化促進剤として見出した合成ゼオライトのモレキュラーシーブを結晶化基板材料として用い,汎用的タンパク質結晶化方法の確立を試みた.モレキュラーシーブ,およびその類似化合物を用いてタンパク質結晶化を行った結果,様々なタンパク質の結晶化が促進された.その結晶化基板材料はマイクロ孔,結晶性,および金属イオンを有する物質が適していることが示唆された.合成ゼオライトのモレキュラーシーブを結晶化基板材料として用いた汎用的タンパク質結晶化方法の確立に向けて、以下の3研究を行った。1、モレキュラーシーブを用いたタンパク質結晶化機構の解明に向け、平成22年度ではモレキュラーシーブのタンパク質結晶化における広範囲な汎用性を確認した。28種類の異なるタンパク質(7.0-57.6kDa、pI4.4-11.4)を用いて結晶化を行った結果、23種類のタンパク質でモレキュラーシーブ表面から結晶が析出し、その汎用性が確認できた。それら結晶化に成功したタンパク質のサイズ、および等電点に特異性はなく、それら幅広い範囲でのタンパク質の結晶化を確認した。得られた結晶を用いて構造解析を行った結果、ヘテロエピタキシャル結晶成長特有の層状構造が確認できた。2、モレキュラーシーブを用いた効率的タンパク質結晶化技術の開発では、モレキュラーシーブをマウントした結晶化プレートを開発した。従来のモレキュラーシーブを用いた結晶化方法は、細孔径が異なる4種類のモレキュラーシーブをそれぞれ結晶化プレートヘマウントしていたため、その結晶化作業は時関と手間がかかった。そこで、より効率の良い結晶化を行うために、4種類のモレキュラーシーブ混合物を結晶化プレートウェルにマウントした結晶化スクリーニング用結晶化プレートを開発した。本プレートを用いることで、難結晶性タンパク質3サンプルの結晶化に成功し、それら結晶構造を決定した。3、新規タンパク質結晶化基板材料の開発を行った。モレキュラーシーブでは結晶化しないタンパク質の結晶化に向けて、モレキュラーシーブと同様にマイクロ孔を有し、また種類が豊富な有機低分子結晶をタンパク質結晶化基板材料として用いた。その結果、汎用性を有するタンパク質結晶化基板材料として、2種類の有機低分子結晶を見出した。合成ゼオライトのモレキュラーシーブを結晶化基板材料として用いた汎用的タンパク質結晶化方法の確立に向けて、以下の3研究を行った。1、モレキュラーシーブを用いたタンパク質結晶化機構の解明。平成23年度では、回折実験に適した良質単結晶を得るのが困難なタンパク質として、膜タンパク質、70sリボソームを含む様々な生物種由来タンパク質を10種類準備した。現在、モレキュラーシーブを用いてそれらタンパク質結晶化実験を進めており、本手法の実用性評価を行っている。2、モレキュラーシーブを用いた効率的タンパク質結晶化技術の開発では、本手法に適した結晶化試薬の調査を行った。本手法により行った40種類のタンパク質の結晶化スクリーニングから得られたデータをもとに、結晶化成功率の高い試薬を調製し、初期スクリーニング用結晶化試薬キットを作製した。今後、本試薬キットを用いることで、効率の良いタンパク質結晶化実験を進める。加えて、本手法に最適な結晶化方法を調査するために、オイルマイクロバッチ法、およびハンギング・シッティングドロップ蒸気拡散法との比較を行った。結果として、最も多く良質単結晶を析出したのはオイルマイクロバッチ法であった。3、新規タンパク質結晶化基板材料の開発においては、新たにタンパク質結晶化を促進する物質を見出した。その材料の特徴として、モレキュラーシーブと同様に、金属、および細孔を有しており、それらはタンパク質の結晶化を促進する材料の重要な要素と思われる。現在、平成22年度に見出した2種類の結晶化促進物質を含む各材料を用いて、様々なタンパク質との結晶化を進めている。合成ゼオライトのモレキュラーシーブを結晶化基板材料として用いた汎用的タンパク質結晶化方法の確立に向けて,最終年度では以下の研究を行った.最初に,本手法によるタンパク質結晶化の実用性を評価するため,回折実験に適した良質単結晶を得るのが困難な膜タンパク質の結晶化を行った.その結果,回折分解能の向上は見られなかったが,本手法により微小結晶のみが析出しやすい膜タンパク質の大幅な結晶サイズの改善に成功した.次に,本手法による結晶化において,タンパク質の無駄なロスをなくすための効率的なタンパク質結晶化を試みた.これまでの結晶化結果から,細孔サイズ,および含有しているイオンが異なる4種の各モレキュラーシーブがどのようなタンパク質の結晶化に効果があるのかは不明であった.そこで,モレキュラーシーブと相互作用するタンパク質の簡易検出方法を調査した.しかしながら,使用するタンパク質量を考慮すると,それら4種の混合物を用いて小規模結晶化スクリーニングを行い,本手法の効果を確認するのがより効率的であった.

最後に,タンパク質-基盤材料の両結晶間における接触面での格子整合を調査するため,ゼオライト単結晶を用いてタンパク質結晶化を試みたが,良質タンパク質結晶の獲得は困難であった.しかしながら,新たに見出したタンパク質結晶化を促進する細孔性金属含有結晶を用いてタンパク質結晶化を行った結果,得られたタンパク質結晶の格子定数は,使用する物質に依存して変化しており,格子整合の重要性が示唆された.したがって,汎用的にタンパク質結晶化を促進する基板材料は,細孔,金属を有する結晶性物質が適していると思われる.本研究は研究計画にしたがって、おおむね順調に進展している。加えて平成23年度では、本手法により得られるタンパク質結晶の回折実験のための結晶マウント法に関する論文が受理された。また、合成ゼオライトを用いたタンパク質結晶化方法を含む特許を出願した。24年度が最終年度であるため、記入しない。平成23年度では、タンパク質結晶化を促進する材料を新たに見出した。今後、モレキュラーシーブでは結晶化が困難なタンパク質に対して、新規結晶化促進材料による結晶化を試みる。それら異なる材料を用いたタンパク質の結晶化、およびその回折実験データを活用して本結晶化方法を改良し、汎用的タンパク質結晶化方法を確立したい。
Dock関連分子による緑内障と視神経炎の治療研究

本研究ではバルプロ酸(VPA)が、緑内障でみられる網膜神経節細胞死を抑制する可能性について検討を行った。神経細胞死を引き起こす高濃度のグルタミン酸をマウス眼球に投与して、網膜神経節細胞死を誘導したところ、VPAを投与したマウスでは網膜における神経細胞死が抑制されることが明らかとなった。また、神経保護作用をもつDock3の発現を調べたが、VPAによる発現誘導は確認されなかった。一方、Dock8による視神経炎症への影響について検討したところ、Dock8欠損マウスでは病態が著しく軽減することを見出しており、今後はDock分子を活用した炎症制御による新たな治療法開発に期待がもたれる。本研究では中枢神経系に特異的に発現するguanine nucleotide exchange factor (GEF)の1つであるDock3の機能に注目し、神経保護と軸索再生療法の可能性を検討する。特に網膜神経節細胞(RGC)に対する保護効果のメカニズムを解明し、さらに緑内障や視神経損傷モデル動物における治療効果をin vivoで解析する。一方Dock3はオリゴデンドロサイトにも発現することから、視神経脱髄を発症する疾患モデル動物を作製し、ミエリンの保護や再髄鞘化に与える影響を検討する。Dock3過剰発現マウスにCuprizoneを投与して脱髄疾患のモデル動物を作成したところ、野生型マウスに比べてミエリンが保たれ、視機能も維持することがわかった。また正常眼圧緑内障モデル動物に対してバルプロ酸を毎日投与したところ、治療開始から2週間後には網膜神経節細胞死の抑制が観察され、視機能障害の進行も予防できることがわかった。一方、高濃度のグルタミン酸をマウスの眼球に投与すると網膜神経節細胞死が観察されるが、この時にバルプロ酸を投与したマウスでは網膜変性が抑制され、網膜機能も保たれていた。バルプロ酸は網膜のグリア細胞に発現する神経栄養因子(BDNF)の発現量を上昇させる。そこでBDNFの受容体であるTrkBが網膜神経節細胞から欠損するマウスで同様の毒性実験を行った。その結果バルプロ酸の神経保護効果が大きく減少したことから、バルプロ酸による神経保護作用にはBDNF-TrkB経路が関与することが明らかとなった。以上から既存薬であるバルプロ酸の神経保護作用が緑内障治療にも有用な可能性が示唆された。バルプロ酸は抗てんかん薬として世界中で広く使用されており,近年では神経保護効果をもつ可能性が指摘されている。そこでバルプロ酸が網膜神経節細胞の保護薬として有効か検討した。バルプロ酸は網膜のグリア細胞における神経栄養因子(BDNF)の発現量を上昇させることから、BDNFの受容体であるTrkBが網膜神経節細胞から欠損するマウスで同様の毒性実験を行った。その結果、バルプロ酸の神経保護効果が大きく減少したことから、バルプロ酸による神経保護作用にはBDNFーTrkB経路が関与することが明らかとなった。(Kimura et al., Am J Pathol, 2015)。次に正常眼圧緑内障モデル動物に対してバルプロ酸を毎日投与したところ、治療開始から2週後には網膜神経節細胞死の抑制が観察され、視機能障害の進行も予防できることが分かった(Kimura et al., Neurosci Lett, 2015)。一方、Dock8欠損マウスを用いた解析から視神経炎症における視機能障害の重症化にはDock8が大きく寄与していることを見出している。Dock8は免疫系細胞で強く発現するが神経細胞ではその発現がほとんど認められない。したがって、Dock8欠損マウスにおける視機能障害の軽症化は、免疫抑制を介した間接的な神経保護効果であると考えられる。Dock3によるミエリン保護効果に加えて、バルプロ酸による神経保護効果について、合計3報の論文発表を行った。視覚病態プロジェクト神経薬理学引き続きDock3による神経保護効果と、視神経炎に対する治療効果を検討する。消耗品費の節約などにより、支出の抑制に成功した。学会出張、論文出版費なども含めて、消耗品などを中心に使用予定である。
現代英国における多文化主義論争と共同性の行方

本研究は、メディアと空間を主たる分析対象としながら、現代英国における多文化主義論争と共同性の行方について考察するものである。本年度は、昨年度収集した多文化主義、人種、公共圏をめぐる先駆的な文献を読み解き、また海外研究者による理論的な著作の翻訳に取り組むとともに、過去二年間の論文、及び発表等を通してさらに深化、発展させる必要があると感じた点について理論的な考察を深め、実証的な調査を進めていった。とくに今年度は、アニメをはじめとしたメディア表象の分析およびメディア機関へのインタビューをふまえた上で、グローバル化とともに他者との共生の(不)可能性について理論的な考察を深めた。とりわけ米国を中心に浸透している多文化主義的寛容と政治的公正の陥穽がグローバルなレベルでどのように展開しているのかという点に光を当てながら考察した。また前年度の課題として残っていた、変容する都市空間と監視の問題については、監視研究の第一人者でもあるカナダの研究者ディヴィッド・ライアンの著書『9.11以後の監視』の翻訳にとりくみ出版することで、この問題を自分の研究テーマに結びつけながら展開していくことができた。研究成果は、共著および雑誌論文の執筆のみでなく、文化研究に関する国際学会及びシンポジウムの発表に重点を置いて行った。日本コミュニケーション学会シンポジウム(6月)、文化研究に関する国際シンポジウム(7月)、および香港で行われた国際比較文学会(8月)での発表、そして台湾から招聘された文化表現をめぐる特別シンポジウム(12月)での発表をはじめ、数々の場で研究発表を行い、国内のみならず国際的な場で多くの領域を横断する研究者と議論し問題を共有していくことになった。いずれも本研究テーマを遂行する上できわめて貴重な機会であった。以上の点をふまえて、今後、この三年間の成果を結実し、さらに展開していきたい。本研究は、文学、テレビドラマ、映画、写真、建築等を分析対象としながら、現代英国における多文化主義論争と批評理論の展開を検証し、多文化主義と現代英国の共同性について考察するものである。本年度は、多文化主義、文化論争、公共圏をめぐる基本的な文献、データを収集し、かつ英国において各種メディア機関、および街頭インタビュー調査を試みた。研究成果の一部は、5月に北星学園大学で行われた日本英文学会で報告し、また論文「帝国の記憶と<英国性>の変容」に発表した。今年度調査したロンドンを中心とした各種インタビューおよび一次資料については、現在まとめている最中である。メデイア表象分析、メディア機関とのインタビューについては、グローバル化ととちに大きく変容している都市空間の問題とあわせて考察している。かつてサッチャー政権がとりくんだ都市再開発計画には、グローバルな資本が投下され、そして多くの失業者を生み出した。また今日、ブレア政権においても、多文化主義的な傾向を売りにしながら、実際にはブランケット内相によって英国への移住希望者に英語の試験を義務づけるといった新たな移民政策が提起されている。こうした動きは、一つの都市のなかに第一世界と第三世界が混淆するグローバルな都市空間がどのように再地図化されているのか、という問題と密接に結びついている。報告者は、以上の点をふまえて1970年代以降急激に高まったコミュニティ・アーキテクチュア、80年代以降、街でくり広げられたアート・プロジェクト、また2000年のテイトモダン誕生にいたるグローバルな資本と労働の動きをおさえながら、都市空間と公共性について考察している。その成果は来年度の日本英文学会シンポジウム(5月)、文化研究に関する国際シンポジウム(6月)、および香港で行われる国際比較文学会(8月)、また大塚英文学会(4月)において研究発表を行うことがすでに決定している。本研究は、現代英国における多文化主義論争と共同性の行方について考察するものである。文学、テレビドラマ、映画、写真、建築等を主たる分析対象としている。本年度は、昨年度収集した多文化主義、文化論争、公共圏をめぐる基本的な文献を読み解き、かつ英国で実施した各種メディア機関、及び街頭でのインタビュー調査等を通して得た一次資料の分析・考察を進めた。今年度の研究成果の一部として、別紙に記載した通り、各種雑誌を中心に7本の論文を執筆した。同時に文化研究に関する国際学会及び日本英文学会シンポジウムをはじめとし、4回にわたる研究発表を行った。また、今年度の論文、及び発表等を通してさらに深化、発展させる必要があると感じた点については理論的にも実証的にも現在調査を進めている最中である。とくに今年度は、ポピュラー・カルチャーをはじめとしたメディア表象分析、メディア機関とのインタビューをふまえ上で、グローバル化とともに大きく変容する都市空間の問題とあわせて本研究テーマの考察を進めてきたが、9.11以降の現状を鑑みると、監視という視点からさらなる丹念な調査が必要と思われる。報告者は、以上の点をふまえて、来年度、この三年間の成果が凝縮できるようさらなる研究を遂行している最中である。その成果は来年度の日本コミュニケーション学会シンポジウム(6月)、文化研究に関する国際シンポジウム(7月)、および香港で行われる国際比較文学会(8月)をはじめ、多数の場で研究発表を行うことがすでに決定している。

本年度は、昨年度収集した多文化主義、人種、公共圏をめぐる先駆的な文献を読み解き、また海外研究者による理論的な著作の翻訳に取り組むとともに、過去二年間の論文、及び発表等を通してさらに深化、発展させる必要があると感じた点について理論的な考察を深め、実証的な調査を進めていった。とくに今年度は、アニメをはじめとしたメディア表象の分析およびメディア機関へのインタビューをふまえた上で、グローバル化とともに他者との共生の(不)可能性について理論的な考察を深めた。とりわけ米国を中心に浸透している多文化主義的寛容と政治的公正の陥穽がグローバルなレベルでどのように展開しているのかという点に光を当てながら考察した。また前年度の課題として残っていた、変容する都市空間と監視の問題については、監視研究の第一人者でもあるカナダの研究者ディヴィッド・ライアンの著書『9.11以後の監視』の翻訳にとりくみ出版することで、この問題を自分の研究テーマに結びつけながら展開していくことができた。研究成果は、共著および雑誌論文の執筆のみでなく、文化研究に関する国際学会及びシンポジウムの発表に重点を置いて行った。日本コミュニケーション学会シンポジウム(6月)、文化研究に関する国際シンポジウム(7月)、および香港で行われた国際比較文学会(8月)での発表、そして台湾から招聘された文化表現をめぐる特別シンポジウム(12月)での発表をはじめ、数々の場で研究発表を行い、国内のみならず国際的な場で多くの領域を横断する研究者と議論し問題を共有していくことになった。いずれも本研究テーマを遂行する上できわめて貴重な機会であった。以上の点をふまえて、今後、この三年間の成果を結実し、さらに展開していきたい。
転写因子AFF4をターゲットとしたFGF21抵抗性の分子基盤の解明

AFF4は、絶食時の視床下部弓状核において、摂食促進作用を持つニューロペプチドであるNPYやAgRP陽性のニューロンに発現していた。また、AFF4へテロ欠損マウスの視床下部ではNPYやAgRPの遺伝子発現が減少していた。これらの結果より、AFF4は、絶食時の視床下部において、NPYやAgRPの発現を制御している可能性が示唆された。また、野生型マウスにFGF21を投与し、AFF4の発現変化を検討した。視床下部や肝、脂肪においてFGF21によるAFF4の発現誘導は認められなかった。AFF4へテロ欠損マウスにおいて、熱産生量の増加や絶食時の体温低下の抑制、及び絶食時の行動量の減少が認められた。AFF4へテロ欠損マウスは絶食後の再摂食量が野生型と比較して低下するため、視床下部における摂食関連分子の発現を検討した。摂食促進作用を持つニューロペプチドY(NPY)やアグーチ関連蛋白(AgRP)の遺伝子発現は、野生型マウスの視床下部において絶食により増加するが、AFF4へテロ欠損マウスの視床下部ではそれらの増加量が減少していた。プロオピオメラノコルチンやコカイン・アンフェタミン調節転写産物などの摂食抑制に作用する遺伝子の発現は、野生型マウスとAFF4へテロ欠損マウスの視床下部において絶食により同様に減少していた。また、AFF4は絶食時の視床下部弓状核においてNPYやAgRPを発現しているニューロンに発現していた。以上のことより、AFF4は、絶食時の視床下部において、NPY/AgRP陽性ニューロンに作用し、NPYやAgRPの発現を制御している可能性が示唆された。また、AFF4へテロ欠損マウスは絶食時の体温低下が起こりにくく、その原因として褐色脂肪における熱産生抑制が考えられるため、AFF4へテロ欠損マウスの褐色脂肪における熱産生関連分子の発現について検討した。野生型マウスを絶食すると、熱産生を促進する分子である脱共役蛋白(UCP)-1やペルオキシソーム増殖因子活性化受容体コアクチベーター(PGC)-1の発現が褐色脂肪において減少するが、AFF4へテロ欠損マウスを絶食してもUCP-1の遺伝子発現に変化は認められず、PGC-1の発現は増加していた。これらの結果より、AFF4へテロ欠損マウスの褐色脂肪では、絶食時におけるUCP-1やPGC-1の発現が保持され、それによって熱産生を保っている可能性が示唆された。また、絶食時の褐色脂肪におけるAFF4の発現を検討したところ、その発現が増加したことより、AFF4は、直接褐色脂肪に作用して熱産生関連遺伝子の発現を制御している可能性が示唆された。AFF4の糖・脂質代謝における影響を検討するために、野生型とAFF4へテロ欠損マウスに高脂肪食を給餌し、その表現型を解析した。AFF4へテロ欠損マウスに高脂肪食を給餌しても、野生型マウスと比較して体重の増加率に差は認められなかった。また、普通食、及び高脂肪食給餌下においてAFF4へテロ欠損マウスの血糖値や血清インスリン値を測定したところ、野生型マウスとAFF4へテロ欠損マウスとの間で、血糖値に差は認められなかったが、血清インスリン濃度はAFF4へテロ欠損マウスで上昇しており、インスリン抵抗性が示唆された。そこで、腹腔内糖負荷試験とインスリン負荷試験を行ったところ、AFF4へテロ欠損マウスは、野生型マウスと比較して、強いインスリン抵抗性を示した。さらに、血清脂質濃度を測定したが、総コレステロール、中性脂肪、及び遊離脂肪酸濃度に有意な差はみられなかった。昨年度、FGF21によるAFF4の発現誘導の検討を行ったが、AFF4はFGF21によって発現が誘導されなかった。そこで、本年度は、ヒスチジンタグのついていないFGF21を投与することで、再度FGF21によるAFF4の発現誘導の検討を試みたが、肝臓や脂肪組織など代謝性疾患に関与する諸臓器において、FGF21によるAFF4の発現誘導は認められなかった。研究実績の概要に記載したように、本年度の研究は研究実施計画に基づきおおむね遂行できたが、FGF21によるAFF4の発現誘導の解析については予想どおりの結果が得られなかったため、実験計画を一部変更し、次年度に実施する予定である。一方で、本年度の研究結果より、AFF4が糖代謝と関連している可能性が示唆され、FGF21の糖・脂質代謝への作用におけるAFF4の役割の解明をめざす本研究にとって、非常に有用な情報であると考えられる。このように、本年度の研究は、おおむね順調に進展していると考えている。