hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
死細胞を中心とした炎症細胞社会の時空間的同定と炎症抑制機構の解析

本研究では、細胞社会における死細胞とその周囲の細胞の振る舞いを解析することで、炎症の惹起、遷延化、慢性化のメカニズムの解明と炎症の予防制御を目指している。非感染性の炎症である自然炎症は、死細胞、特に細胞膜が破綻したネクローシス細胞から放出される自己由来のリガンド(内因性リガンド)が原因となって引き起こされると考えられている。しかし、生体内(組織内)において死細胞からどのように炎症反応が惹起され、伝播し、遷延化していくのか、そのメカニズムはよくわかっていない。研究代表者のこれまでの研究で、生理的な環境下の生体内においても制御されたネクローシス型細胞死が誘導されていることを発見している。この細胞死は胚発生期の骨(特に骨表面)の形成に関与することが示唆され、この細胞死がオートファジー関連遺伝子Atg9aに依存する(ただしAtg5には依存しない)ことを同定した。これまでの考えと異なり、このAtg9a依存的ネクローシスの周囲には炎症を示す兆候は観察されなかった。このことから、自然炎症を惹起するネクローシスには、その実行メカニズムに依存した特異性があることが推察される。そこで、ネクローシスの種類によって炎症を惹起する能力に違いがあるのかを検証するために、研究代表者が同定した炎症を惹起しないネクローシス(Atg9a依存的ネクローシス)の実行メカニズムついて解析を行った。まず、in vitroでAtg9a依存的(Atg5非依存的)にネクローシスを誘導する化合物をスクリーニングし、この細胞死を制御する重要な経路を同定した。次に、炎症を惹起しないネクローシスが周囲に与える影響を明らかにするため、骨表面領域で観察されるネクローシスとその周囲をレーザーマイクロダイセクションにより切り出し、死細胞周囲での遺伝子発現の変化をマイクロアレイにより同定した。当初の予定では、炎症を惹起するネクローシス(病的な細胞死)と炎症を惹起しないネクローシス(生理的な細胞死)それぞれが細胞周囲に与える影響を比較する予定であったが、炎症を惹起しないネクローシスの分子メカニズムの解明が難航したため、炎症を惹起するネクローシスとの比較解析を行うことができなかった。今年度の解析で、炎症を惹起しないネクローシス(Atg9a依存的ネクローシス)の分子メカニズムをある程度明らかにすることができたため、来年度は、当初の予定であった炎症を惹起するネクローシスと炎症を惹起しないネクローシスの比較を行い、ネクローシス型の細胞死が周囲に伝える炎症シグナルをどのように制御しているのかについて解析を行う。
安全な輸血製剤の調製 : ボルナ病ウイルスに対するスクリーニング法の確立

精神疾患の原因は明らかにされていない。現在、精神分裂病やうつ病などの精神疾患の原因として遺伝因子と環境因子の両方が関わると考えられている。本研究では、精神疾患との関連性が示唆されているボルナ病ウイルス(BDV)に関する検討を行った。これまでのドイツを中心に行われた疫学調査から、BDVはウマ、ヒツジ、ウシ、ネコ、ダチョウに自然感染し、特に、BDVに感染したウマやヒツジではその一部に脳炎を引き起こすことが明らかにされている。私達は、日本においてもドイツとほぼ同じ状況でBDVがこれらの動物に蔓延していること、さらに末梢血単核球内にBDV RNAが検出しえることを報告してきた。また、同様の検出法により、精神分裂病に加え、慢性疲労症候群においてもBDVとの関連性を認めている。しかし、献血者血液においても、これらの疾患患者に比べ低率ながら、BDV血清抗体や末梢血単核球内のBDV RNA陽性例が存在することを報告した。そこで、本研究では安全な輸血用血液の供給を目的として研究を行い、以下の結果を得た。1)健常者由来末梢血単核球への精神分裂病患者剖検脳海馬由来BDV感染により、明らかなウイルス増殖の証拠は得られなかった。2)ヒトの血清抗体ではBDV p24に対する抗体が主に検出され、ヌクレオプロテインであるp40に対する抗体検出は稀である。同様に、ヒト由来末梢血単核球内のBDV RNA検出においても、p24 mRNAが主であり、p40 mRNAは稀である。この現象を検討するため、ラットおよびスナネズミ脳内へのBDV接種実験を行った。その結果、新生仔動物への接種ではp24抗体が主として産生され、成動物への接種ではp24とともにp40に対しても上昇することが判明した。一般に、ヒトの精神疾患とウイルス感染症との関連性については古くから検討されてきた課題である。しかし、いずれのウイルス感染症においても、明確な1:1の対応関係が得られていない状況にある。今回取り上げるボルナ病ウイルス(BDV)も、ヒト精神病との関連性がドイツの研究グループから指摘されているものである。しかし、今までにウマ、ヒツジ、ウシ、ネコ、ダチョウへの自然感染が証明されており、また鳥類からサルまで幅広く実験感染も可能であることから、今後BDVはzoonosisとしての認識を持ち、獣医学的立場、医学的立場から広く実際的な対応が迫られるもののひとつになると考えられる。本研究では、安全な輸血用血液の供給を目的として、動物由来のBDVとヒト患者由来BDVを区別し得る可能性、さらに後者のBDVのみを標的としたウイルス抗体(エライザ法)およびウイルス遺伝子(RT-PCR法)のスクリーニング法を試みた。1)今までは、ウマから分離されたBDVを用いて各動物およびヒトの疫学調査が進められてきたが、ヒトPBMC中のウイルスRNAのPCR産物の遺伝子配列は、ネコ、ウマ、ウシ、ヒツジに由来するBDV配列とは若干の違いが認められた。実際、ウシおよびヒツジ由来BDVの内、ウマ由来BDV配列を示したPCR産物の大腸菌発現産物を用いたウエスタンブロット法により、これらの動物には、ウマ由来BDV抗原とは反応しない新たなBDVの存在しいる可能性が示唆された。2)馬の産地である門別、静内での健常者の抗体保有率が有意に高いことが明らかになった。3)BDV p24、p40、およびgp18に対するマウスのモノクローナル抗体を作成した。これらを用いて、BDVの非特異反応を抑えた抗体および抗原検出用ELISA系を確立中である。4)nested RT-PCRの感度を検討した。

EZ rTth RT-PCR法が、通常の逆転写その後のPCRを行う方法により、約100倍感度が高いことが明らかになった。特にヒト由来末梢血内のBDV検索には極めて低いレベルのBDV RNAしか存在しないので、検出方法が重要と考えられた。また、PCR後のSouthern Hybridization法を、96穴マイクロプレートを用いる方法を開発した。一般に、ヒトの精神疾患とウイルス感染症との関連性についてはくから検討されてきた課題であるが、いずれのウイルス感染症についても明確な対応関係が得られていない。本研究課題で取り上げるボルナ病ウイルス(BDV)は、ウマやヒツジに自然感染し、感染した動物の一部に脳脊髄炎を引き起こす原因ウイルスとして分離されたものである。その後、ウマ脳由来BDVを用いた疫学的研究からウシ、ネコ、ダチョウなどにもBDVの感染が広がっていることが明らかにされている。1985年に、ドイツのRottらにより精神疾患患者に高率に抗BDV抗体が検出されることが報告され、BDVとヒト内因性精神疾患との関連性が初めて報告された。私たちは、これまでにわが国のウマ、ヒツジ、ウシ、ネコといった動物にBDVがかなりの割合で不顕性に感染していること、また精神疾患患者、慢性疲労症候群患者において、対照の献血者よりも高率にBDV抗体および末梢血単核球中BDVRNAが検出されることを見いだした。本研究では、安全な輸血用血液の供給を目的として研究を行い、以下の成果を得た。1)BDVのヒトに対する病原性に関する情報を得るために、精神分裂病患者剖検脳内からのBDV分離を試み、現在ヒトオリゴデンドロサイト細胞への持続感染を成立させた段階である。2)多検体を定量的に検索する目的でBDV抗原検出用ELISAを開発した。すなわち、BDVp40(ヌクレオプロテイン)とp24(リン酸化蛋白)を検出できる、マウス単クローン抗体とウサギポリクローナル抗体を用いたサンドイッチELISA法を開発した。3)ヒト献血血液中のBDV感染検出系をRT-PCR法により検討し、10^7以上のPBMCから抽出したRNAを用いることがBDVRNA検出には望ましいことを明らかにした。精神疾患の原因は明らかにされていない。現在、精神分裂病やうつ病などの精神疾患の原因として遺伝因子と環境因子の両方が関わると考えられている。本研究では、精神疾患との関連性が示唆されているボルナ病ウイルス(BDV)に関する検討を行った。これまでのドイツを中心に行われた疫学調査から、BDVはウマ、ヒツジ、ウシ、ネコ、ダチョウに自然感染し、特に、BDVに感染したウマやヒツジではその一部に脳炎を引き起こすことが明らかにされている。私達は、日本においてもドイツとほぼ同じ状況でBDVがこれらの動物に蔓延していること、さらに末梢血単核球内にBDV RNAが検出しえることを報告してきた。また、同様の検出法により、精神分裂病に加え、慢性疲労症候群においてもBDVとの関連性を認めている。しかし、献血者血液においても、これらの疾患患者に比べ低率ながら、BDV血清抗体や末梢血単核球内のBDV RNA陽性例が存在することを報告した。そこで、本研究では安全な輸血用血液の供給を目的として研究を行い、以下の結果を得た。1)健常者由来末梢血単核球への精神分裂病患者剖検脳海馬由来BDV感染により、明らかなウイルス増殖の証拠は得られなかった。
放射線治療における照射時間を加味した新たな生物学的線量評価システムの開発

細胞の亜致死損傷回復は放射線による損傷からの回復能力であり、放射線が細胞に照射された直後から起こり始め、細胞生存率に大きく影響を及ぼすことが知られている。申請者はこの点に着目して、放射線治療における照射時間と細胞生存率の関係を明らかにし、照射時間の延長が細胞致死効果を低下させることを報告してきた。現在、細胞の亜致死損傷回復などの生物現象を考慮した線量評価システムは未だ存在しない。本研究では、これまでの成果を発展させ、細胞レベルにおける照射時間と亜致死損傷回復の関係を用いることにより、放射線治療計画装置の物理学的線量に照射時間という新たな因子を加味した生物学的線量評価を実現する。
計算物質科分野・博士イノベーションリーダーの総合育成プログラムの開発と検証

計算物質科学分野(以下、CMS)教育とヒューマンスキル育成のプログラムを融合した短期総合育成プログラムのモデルケースとして、代表者が所属する計算物質科学人材育成コンソーシアム(PCoMS)で実施したPCoMS合宿セミナー2018の事後アンケートなどの解析を行い、プログラムの有効性を検証した。その結果、講義では、参加者が講義内容を難しすぎると感じた場合、参加者の満足度は下がるが、グループ課題討論などのアクティブラーニングでは、参加者が課題を難しいと感じても満足度が高いことを明らかにした。その他、参加者と講師が質疑応答を充分に行えなかった場合、参加者の講義に対する満足度と講師の感想が一致しないことも明らかになった。また、CMS博士人材の定量的な人数動向の調査研究が存在しなかったため、過去52年間(1965-2016)の国内理工系博士論文約14万報の解析を行い、CMS博士号取得者数の人数推移を推定した。その結果、理工系博士号取得者総数に対するCMS博士号取得者数の比率は増加し続けているが、未だ5-6%であることがわかった。さらに、1:主に人材育成や地域課題の解決に重点を置く55国立大学(以下、地方教育中心大学:博士論文約2万報)と、2:主に世界で卓越した教育研究や社会実装に重点を置く16国立大学(以下、研究中心大学:博士論文約11万報)の2つの大学群の解析結果を比較した。その結果、国内の理工系およびCMSの博士人材育成数やCMSの博士人材数の比率の全国動向を、研究中心大学が牽引していることが明らかとなった。また、地方教育中心大学でも博士後期課程の新設が相次いだ1990年代の大学院改革以降、地方教育中心大学における理工系博士号取得者数の人数推移は、数年遅れで研究中心大学と同様の傾向を示すが、CMS博士号取得者の人数推移の傾向はそれぞれの大学群で異なることなどを明らかにしつつある。本研究の対象となる計算物質科学分野(以下、CMS)の日本国内の博士人材の定量的な人数動向の調査研究が行われていなかったことから、当初予定していなかったが、初年度に、総合育成プログラムの個別の実習や課題の改善策などを検討する前に、育成プログラムの対象となる国内のCMS博士号取得者数の人数推移や動向を推定する必要が生じ、初年度の研究計画を修正した。その結果、総合プログラムを開発するために重要となるCMS博士号取得者数の人数推移についての知見を新たに得ることができたが、その知見に基づいた総合プログラムの個別の改善策の開発については、当初予定より、やや遅れている。しかしながら、初年度、代表者が所属するPCoMSで2018年8月に実施したPCoMS合宿セミナーなどの解析を行い、計算物質科学分野の教育とヒューマンスキル育成のプログラムを融合した短期総合育成プログラムに必要な要素などの検討については順調に進めている。2018年度に実施した国内のCMS博士号取得者数の人数推移の解析の結果、当初想定していなかった、研究中心大学と地方教育中心大学などそれ以外の大学群でのCMS博士取得者数の人数推移の傾向の違いが明らかになった。この結果は、この違いを踏まえた総合育成プログラムの開発が必要であることを示唆する。今後は、傾向の違いの原因などの解明を進め、その結果を踏まえて、まず、研究中心大学向けの教育プログラムを開発する。その後、それ以外の大学向けの博士人材の総合育成プログラムの開発につなげる。

本研究の対象となる計算物質科学分野(以下、CMS)の日本国内の博士人材の定量的な人数動向の調査研究が行われていなかったことから、当初予定していなかったが、初年度に、総合育成プログラムの個別の実習や課題の改善策などを検討する前に、育成プログラムの対象となる国内のCMS博士号取得者数の人数推移や動向を推定する必要が生じ、初年度の研究計画を修正した。その結果、総合プログラムを開発するために重要となるCMS博士号取得者数の人数推移についての知見を新たに得ることができたが、その知見に基づいた総合プログラムの個別の改善策の開発については、当初予定より、やや遅れている。しかしながら、初年度、代表者が所属するPCoMSで2018年8月に実施したPCoMS合宿セミナーなどの解析を行い、計算物質科学分野の教育とヒューマンスキル育成のプログラムを融合した短期総合育成プログラムに必要な要素などの検討については順調に進めている。2018年度に実施した国内のCMS博士号取得者数の人数推移の解析の結果、当初想定していなかった、研究中心大学と地方教育中心大学などそれ以外の大学群でのCMS博士取得者数の人数推移の傾向の違いが明らかになった。この結果は、この違いを踏まえた総合育成プログラムの開発が必要であることを示唆する。今後は、傾向の違いの原因などの解明を進め、その結果を踏まえて、まず、研究中心大学向けの教育プログラムを開発する。その後、それ以外の大学向けの博士人材の総合育成プログラムの開発につなげる。既に記載したとおり、本研究の対象となる計算物質科学分野(以下、CMS)の日本国内の博士人材の定量的な人数動向の調査研究が行われていなかったことから、初年度に、まず、国内のCMS博士号取得者数の人数推移を推定する必要が生じた。そのため、当初の研究計画を修正し、国内での博士論文数などの調査研究を進め、教材開発のためのサーバーやソフトウェアなどの購入を2019年度とした。また、当初、初年度から総合育成プログラムの実施を予定していたが、初年度は代表者が所属している計算物質科学人材育成コンソーシアム(PCoMS)が2018年8月に実施したPCoMS合宿セミナー2018をモデルケースとして解析を行うことを優先した。2018年度に実施したPCoMS合宿セミナー2018の解析とCMS博士号取得者数の人数動向の解析から得られた知見をもとに、今後、総合育成プログラムを開発し、2019年度以降に、開発した総合育成プログラムの実施と検証を行う。
表皮角化細胞の分裂・増殖に対するIL-33の機能解明

これまでにIL-33を正常ヒト表皮角化細胞(NHEKs)にてsiRNAを用いてノックダウン(KD)した際、細胞質分裂が不完全になり、2核の細胞が増え、細胞増殖能が落ちることを明らかにした。しかしながら、IL-33の分泌機構、特に核内から細胞質への移動と、その際にfull lengthのまま移動するのか、それとも核内で修飾を受けいわゆるトランケートフォームとして移動するのかは明らかにされていなかった。そこでIL-33のN末端及びC末端に蛍光タンパク質を融合させたIL-33をNHEKsに強制発現させ、様々なサイトカインや紫外線による刺激を行った。しかし、N末端、C末端にラベルしたIL-33のいずれも、刺激によって核内から移動する様子は観察されなかった。またこの時、IL-33過剰発現によって細胞増殖能に影響を与えることは無かった。乾癬モデルマウスについては野生型(WTマウス)とIL-33ノックアウトマウス(IL33KOマウス)についてイミキモドクリーム(IMQ)を連日7日間塗布することにより作成した。この時の耳介圧はWT並びにIL33KOマウスいずれも時間経過と共に厚くなっていったが、エンドポイントの7日目ではIL33KOマウスで有意に厚さが減少していた。この時、乾癬病態で重要なサイトカインの1つである血中IL-17Aの濃度を測定したところ、IMQ処理によりIL33KOマウスでは前日まではWTと同等の血中濃度を示すが、7日目ではコントロールと同等レベルまで減少することが解った。この時、IL-17Aの大きな産生細胞であると考えられている、Th17やILC3のマーカーの一つである転写因子RORγの発現量も血中IL-17Aと同様な挙動を示した。このことより、IL-33はTh17細胞の長期成熟に必要なサイトカインでは無いかと考えられた。ケラチノサイトにおいて、IL-33をノックダウン(KD)すると2核の細胞が増えることを見出した。この現象が、分裂が不完全になることにより起こるのか、別々の細胞が融合して起こるのか確認するために、IL-33 KD後の細胞の状態をタイムラプス観察した。その結果、コントロール細胞では問題なく分裂出来る細胞が、IL-33KD細胞では、染色体分裂を行い、2核になった後の細胞質分裂が出来ず、娘細胞同士が融合してしまうことが解った。また、撮影の回数から細胞分裂、細胞質分裂自体の時間も遅延していることが解った。また細胞分裂時に重要である、Ect2、RhoA、リン酸化Myosin Light Chain (MLC)の蛍光免疫染色を行った。その結果、蛍光顕微鏡の観察では、局在などに大きなさを見つけることはできなかった。一方、細胞収縮管の構成に重要であるアクチンの重合度の違いを、IL-33KD細胞とコントロール細胞で重合アクチン(F-actin)と遊離アクチン(G-actin)の量比をウエスタンブロット法によって比較を行った。その結果、G-actinの量に大きな違いは見られないが、F-actinの量がIL-33KD細胞において減少していることが見つけられた。このことにより、IL-33KD細胞では細胞収縮管の機能が低下していることが再度確認出来た。また、この結果を踏まえて、ボイデンチャンバー法を用いて細胞遊走能の比較を行った結果、F-actinの量が減少しているIL-33KD細胞では、コントロール細胞と比較して、細胞遊走能が落ちていることも明らかになった。平成28年度に計画した、細胞のタイムラプス観察、及びウエスタンブロット法によってIL-33KD細胞において、発現及び活性化の減少が観察されたRhoA、Ect2、リン酸化MLCの蛍光免疫染色を行った。タイムラプス観察においては、コントロール細胞を用いて、最適な撮影条件(細胞が光毒性によってアポトーシスを起こさない光源量、撮影時間、撮影間隔)を見出すことが出来た。このことにより、より細かい、細胞の分裂の様子を観察することが出来た。蛍光免疫染色についてはコントロール細胞及び、IL-33KD細胞いずれにおいても、今回行ったRhoA、Ect2、リン酸化MLCの発現パターンや局在について違いを見出すことは出来なかった。蛍光免疫染色についてアクチンの重合度に比較検討については、市販のキットによって、何度か細胞数や細胞を回収するタイミング等を検討しながら比較を行った結果、IL-33KD細胞において遊離したアクチン(F-actin)の量が減少していることを明らかにすることが出来た。同時に、ボイデンチャンバー法を用いて、細胞運動能の比較を行った結果、こちらも予想通りIL-33KDよって細胞運動能が低下していることが明らかとなった。以上の結果から蛍光免疫染色以外についてはほぼ予定位通りに実験を行い、結果を得ることが出来たと考えている。IL-33をノックダウンさせた場合、WB上ではアクチンタンパク質やコフィリンと言った、アクチンダイナミクスに関するタンパク質の減少やリン酸化の異常が観察されたが、細胞を蛍光免疫染色させてみた場合ではコントロールと比べて大きな違いを見ることは出来なかった。またIL-33の全長及び、各種スプライスバリアントとトランケートフォームのIL-33をケラチノサイトへトランスフェクションし、UVBに対して、抵抗性を持つか否か検討したが、いずれのフォームのIL-33もUVBに対する抵抗性は見られず、むしろIL-33を強発現することにより、UVBへの感受性が高くなっている様に感じられた。今後さらに詳しく検討する必要がある。乾癬モデルマウスに関しては、野生型マウス、IL-33ノックアウトマウス、ST2Tgマウスについて、イミキモドクリームを7日間連続塗布して作成した。

その結果、処理開始から全てのマウスで表皮肥厚が同じように進行していくことが解った。しかしIL-33ノックアウトマウスをST2Tgマウスに関しては処理最終日に野生型と比べて表皮肥厚が抑えられる蛍光が見られた。この時、表皮内のマスト細胞をトルイジンブルー染色により検討したところ、野生型に比べてIL-33ノックアウトマウス、及びST2Tgマウスにおいて、野生型と比べてマスト細胞の数が少なくなることが解った。マスト細胞は炎症を惹起し、表皮肥厚を増長させる原因の一因である。よってこのことにより、炎症が穏やかになることが示唆された。IL-33ノックダウン細胞については、免疫染色を試みたが、ウエスタンブロットで観察された違いは観察されなかった。染色によって機能的解析とともに、量的変化についても検討する必要があるため、引き続き、検討を行う予定である。またIL-33の各種スプライスバリアントのトランスフェクションについての検討であるが、代表的なバリアントによる評価を行うことが出来た。また推測した結果とは逆の結果となったが、想定内の結果であり、今後の検討課題が新たに出来たものの、一定の実験結果と成果を得られたと考えている。また乾癬モデルマウスについては、順調にn数を増やしているところであり、サンプルについても計画的に解析を随時行っている。これまでにIL-33を正常ヒト表皮角化細胞(NHEKs)にてsiRNAを用いてノックダウン(KD)した際、細胞質分裂が不完全になり、2核の細胞が増え、細胞増殖能が落ちることを明らかにした。しかしながら、IL-33の分泌機構、特に核内から細胞質への移動と、その際にfull lengthのまま移動するのか、それとも核内で修飾を受けいわゆるトランケートフォームとして移動するのかは明らかにされていなかった。そこでIL-33のN末端及びC末端に蛍光タンパク質を融合させたIL-33をNHEKsに強制発現させ、様々なサイトカインや紫外線による刺激を行った。しかし、N末端、C末端にラベルしたIL-33のいずれも、刺激によって核内から移動する様子は観察されなかった。またこの時、IL-33過剰発現によって細胞増殖能に影響を与えることは無かった。乾癬モデルマウスについては野生型(WTマウス)とIL-33ノックアウトマウス(IL33KOマウス)についてイミキモドクリーム(IMQ)を連日7日間塗布することにより作成した。この時の耳介圧はWT並びにIL33KOマウスいずれも時間経過と共に厚くなっていったが、エンドポイントの7日目ではIL33KOマウスで有意に厚さが減少していた。この時、乾癬病態で重要なサイトカインの1つである血中IL-17Aの濃度を測定したところ、IMQ処理によりIL33KOマウスでは前日まではWTと同等の血中濃度を示すが、7日目ではコントロールと同等レベルまで減少することが解った。この時、IL-17Aの大きな産生細胞であると考えられている、Th17やILC3のマーカーの一つである転写因子RORγの発現量も血中IL-17Aと同様な挙動を示した。
保健室経営計画の実践経験を学習に転換する健康課題解決力向上プログラムの開発

本研究の目的は、養護教諭の保健室経営計画に基づく実践経験を学びとして、協働的な健康課題解決力向上をめざしたプログラムを開発・実施し、有効性・妥当性を検証することである。平成30年度は、計画実施の成果と困難事例についてデータベース化するために、所属の校長の承認が得られた先駆的な実践をしている特別支援学校、小学校、中学校、高等学校4名の養護教諭にインタビュー調査を実施した。さらに、A地区養護教諭部会後に協力が得られた(6名予定)3名の養護教諭にグループフォーカスインタビューを実施した。また、地域と学校の連携の課題を知るために、児童相談所等の児童相談司3名にインタビュー調査を実施した。インタビュー調査をフィールドワークに切り替えてイギリスのFBA高等学校におけるABCBehavior(非営利団体)の学校における健康課題解決のための相談活動等を見学・調査した。イギリスのフィールドワークにより、学校外のコミュニティとの連携による協働的な健康課題解決の示唆を得たため、今後の課題解決力向上プログラム開発に取り入れたい。以上は、今後日本看護福祉学会等で発表予定である。また、課題解決力プログラムの試案を兼ねて、A県高等学校養護教諭研究会A支部の養護教諭を対象に「保健室におけるフィジカルアセスメントと危機管理」研修会の講師を務めた。実施後のアンケート調査から得られた課題をプログラム修正に役立てたい。さらに、平成30年度教員免許更新講習においても、科学研究費による研究で得られた知見を一部活用して『今、求められる学校保健の課題対応力』を企画して還元に努めた。児童相談所等において、児童福祉司にインタビュー調査を計画していたが、インタビュー予定時期に、児童の虐待死事件の発生による社会的な影響があった。このため、事前に了承を受けていた3名の児童福祉司以外は、多忙のために所属長の承諾を得るのが困難であった。そこで、地域との連携については、福祉の先進国であるイギリスのフィールドワークを実施した。これは、当初の予定以上の進展があった。令和元年は第一に、全国の小、中、高等学校、特別支援学校の養護教諭を対象に、保健室経営計画の困難事例及び課題解決能力に何するアンケート調査を実施する。また調査項目は、看護学の問題解決能力尺度、チーム援助のコーディネーション尺度を活用して、養護教諭用の保健室経営計画に基づく課題解決力評価指標を作成することを検討する予定である。第二に、ダブルループ学習のプログラムを開発するために、地域との連携について国内外におけるフィールドワーク調査を実施する。平成30年度の研究の課題は、学外の児童相談所等の児童福祉司等に対するインタビュー調査には困難性が伴ったことである。事前に承認が得られた対象者以外は、所属長の承認を得ることが難しい施設があった。そこで、国外のフィールドワーク調査に力を入れる予定である。特に、地域と学校の連携の知見を得るために、心の健康課題の解決にイギリスが導入しようとしているヘルスティーチャーの調査を継続する予定である。本研究の目的は、養護教諭の保健室経営計画に基づく実践経験を学びとして、協働的な健康課題解決力向上を目指したプログラムを開発・実施し、有効性・妥当性を検証することである。当初の計画においては、初年度は、情報収集を中心として、養護教諭に対するインタビュー調査や実態調査を予定していた。しかし、明らかになった新たな課題を踏まえて、養護教諭、学校長、地域の連携先である児童福祉司などに対するインタビュー調査内容やアンケート調査内容の修正を行う必要が生じた。このため、今年度はインタビューガイド及び調査票の再検討をして、倫理委員会の申請までを行った。情報収集の段階で、課題がより明確になったことは、今後の方向性を正しく見据える上でプラスであったと考える。これまでの研究を踏まえて調査研究するための情報収集やその分析、インタビューガイドの作成などについては、当初の予定通りを概ね行うことができた。しかし、先に述べたように10月の国際学会発表後、明らかになった課題に基づき内容を一部変更した。倫理審査は通ったため、倫理審査後のインタビュー調査及び全国実態調査については、次年度実施可能である。

児童相談所等において、児童福祉司にインタビュー調査を計画していたが、インタビュー予定時期に、児童の虐待死事件の発生による社会的な影響があった。このため、事前に了承を受けていた3名の児童福祉司以外は、多忙のために所属長の承諾を得るのが困難であった。そこで、地域との連携については、福祉の先進国であるイギリスのフィールドワークを実施した。これは、当初の予定以上の進展があった。今後は、今年度行った情報収集や実態分析及びインタビューガイドを基にして、分担者と協力して、児童福祉司、心理士、養護教諭などに実際にインタビュー調査・分析を行う。またすでに作成している調査票を基に実態調査・分析する。これらに基づいて、プログラム作成を進める予定である。令和元年は第一に、全国の小、中、高等学校、特別支援学校の養護教諭を対象に、保健室経営計画の困難事例及び課題解決能力に何するアンケート調査を実施する。また調査項目は、看護学の問題解決能力尺度、チーム援助のコーディネーション尺度を活用して、養護教諭用の保健室経営計画に基づく課題解決力評価指標を作成することを検討する予定である。第二に、ダブルループ学習のプログラムを開発するために、地域との連携について国内外におけるフィールドワーク調査を実施する。平成30年度の研究の課題は、学外の児童相談所等の児童福祉司等に対するインタビュー調査には困難性が伴ったことである。事前に承認が得られた対象者以外は、所属長の承認を得ることが難しい施設があった。そこで、国外のフィールドワーク調査に力を入れる予定である。特に、地域と学校の連携の知見を得るために、心の健康課題の解決にイギリスが導入しようとしているヘルスティーチャーの調査を継続する予定である。今年度、実態調査を行う予定であったが、国際学会で発表して得られた課題を踏まえて調査研究を実施するよう変更した。これを踏まえて倫理審査委員会に申請を行うと共に、実際の調査に必要な経費を次年度に繰り越すこととした。児童相談所等の児童福祉司に対するインタビュー調査が、虐待事件などの社会的影響で多忙のために、事前承認が得られていた施設以外インタビュー調査ができなかった。そのためその謝金とテープ起こしの金額が残り、次年度使用額となった。使用計画として、次年度は、学外の施設の情報収集に関しては、個別的にイギリスで新たな知見を得たヘルスティーチャーのフィールドワークおよび国内の養護教諭実践調査フィールドワークの費用に充てる。(予算を超える場合は、自費としたい。)
異種動物間の組織形成クロストーク解析に基づく皮膚付属器再生原理の解明

本研究課題は異種動物細胞を用いたハイブリッド皮膚組織形成システムを開発し、細胞間クロストークを解明することを目的としている。まずマウス・ニワトリそれぞれの胎児皮膚を用いたハイブリッド組織形成システムを開発し、in vivo/in vitro条件で毛嚢・羽毛の形成を誘導する上皮ー間葉クロストークを解明する。さらに純化したマウス・ニワトリ付属器幹細胞のハイブリッド皮膚組織内での分化能を指標に、付属器幹細胞とそのニッチ間のクロストークを検討する。
変形性膝関節症における前十字靭帯の網羅的な遺伝子発現解析と治療への応用

本研究は変形性膝関節症(膝OA)における前十字靭帯(ACL)変性の病態解明および膝OAの病態への関与を遺伝子およびタンパクレベルで明らかにすることを目的としている。平成30年度は平成29年度から引き続き、膝OAのACLにおける網羅的な遺伝子発現(mRNA、miRNA)をRNA-Seqを用いて遺伝子発現の解析を行う予定としていた。本研究では、ACLの肉眼的な変性度により3群(正常群:肉眼的に正常、軽度変性群:一部変性しているものの、連続性は保たれている、断裂群:変性が強く、連続性がない)に分けて、遺伝子発現差を検討する予定であるが、各群最低5検体での分析を検討している。平成30年度も検体採取を行い、軽度変性群および断裂群の検体を得ることができたが、検体を人工膝関節置換術症例から採取している為、多くの症例ではACLも変性しており、ACLが変性していない正常群が集まらず、RNA-Seqまで至らなかった。ただし、平成30年度は、採取した検体の肉眼的所見と病理組織学的な変性度が相関していることが、検体の病理組織学検査で確認できた。また、断裂群では検体量自体が少ないが、RNA-Seqおよびその後のRT-PCR等の検査も行えるだけの十分量のRNA採取が得られることが確認できた。また、平成30年度は軽度変性群と断裂群で遺伝子発現に差があるかをRT-PCRにて2群間で比較し、変性度により遺伝子発現に差があることが確認できた。そこで、次年度はこの結果に基づき、正常ごく軽度の変性群を集めていき、その中で正常に比較的近いものを5検体用いて、正常群に振り分け、RNA-Seqにて遺伝子解析を進めていく予定である。本研究では、変形性膝関節症における前十字靭帯の変性度を肉眼的に3群に分けているが、未だ正常群の検体数が足りていない。検体が末期の変形性膝関節症に対して行う人工膝関節置換術の際に採取している為、なかなか正常に近い前十字靭帯が残っている症例が少なく、検体数が目標数に届いていない。しかし、今年度は昨年度より人工膝関節置換術の症例が増えている為、正常群の検体数も得られる見込みである。本年度は正常群の検体数を集め、もし目標の5例に足りない場合でもRNAシーケンス、miRNAシーケンスを行う予定である。すでに、RNAシーケンスを外注する業者と検体が揃ってからのシーケンスまでの流れは確認できているため、検体数が揃い次第、シーケンスを開始する予定である。シーケンス結果はBioanalystと結果を解析する予定となっているため、検体数が揃えれば本年度中に研究結果を得ることができると考える。本研究は変形性膝関節症(膝OA)における前十字靭帯(ACL)変性の病態解明及び膝OAの病態への関与を遺伝子およびタンパクレベルで明らかにすることを目的としている。平成28年度は、膝OAのACLにおける網羅的な遺伝子発現(mRNA,miRNA)をRNA-Seqを用いて遺伝子発現の解析を行う予定としていた。RNA-Seqの結果をより信頼できるものにするためには、検体であるRNAが純度が高く、分解されていないものを組織から抽出する必要がある。組織からの良質なRNAを抽出するのは、組織によっては困難なため、まずはACL組織からRNA-Seqに用いるRNAを抽出できるプロトコールを検討した。RNA-Seqのサンプルに用いるRNAは純度が高く、分解されていないものでなければ、Sequencingのquality自体が下がってしまうためのプロトコールが本研究では非常に大事となる。過去に人工膝関節置換術(TKA)の際にACLを切除し、保存していた組織よりRNAを抽出し、純度、量ともに十分得られることが確認できた。また、本研究ではACLの肉眼的な変性度により3群(1正常群:肉眼的に正常、2軽度変性群:一部変性しているものの、連続性は保たれている、3断裂群:変性が強く、連続性がない)に分けて、遺伝子発現差を検討する予定だが、術中に肉眼的に判断できるか否かを確認し、肉眼所見で十分3群に分けられることが確認できた。本年度はこの結果に基づき、予定していた症例数(各群5例)のACL組織を集め、RNA-Seqにて遺伝子解析を進めていく予定である。平成28年度の実施計画では、RNA-Seqによる遺伝子解析までを行う予定であったが、RNA-Seqを行う上では材料となるRNAの純度、分解度が結果を大きく左右するため、十分なRNA抽出プロトコールを検討したため、計画よりは遅れたと考える。平成29年度は膝OAのACLにおける網羅的な遺伝子発現(mRNA、miRNA)をRNA-Seqを用いて遺伝子発現の解析を行う予定としていた。平成29年度は検体採取を行い、軽度変性群および断裂群の検体を得ることができたが、人工膝関節置換術を行う症例の為、正常群が集まらなかった為、RNA-Seqまで至らなかった。

ただし、本年度採取した検体の肉眼的所見と病理組織学的な変性度が相関していることが、検体の病理組織学検査で確認できた。また、断裂群では検体量自体が少ないが、RNA-Seqおよびその後のRT-PCR等の検査も行えるだけの十分量のRNA採取が得られることが確認できた。そこで、本年度はこの結果に基づき、正常ごく軽度の変性群を集めていき、その中で正常に比較的近いものを5検体用いて、正常群に振り分け、RNA-Seqにて遺伝子解析を進めていく予定である。平成29年度の実施計画では、RNA-Seqによる遺伝子解析までを行う予定であったが、RNA-Seqを行う上では材料が十分な検体数が収集できなかったため、遅れたと考える。本研究は変形性膝関節症(膝OA)における前十字靭帯(ACL)変性の病態解明および膝OAの病態への関与を遺伝子およびタンパクレベルで明らかにすることを目的としている。平成30年度は平成29年度から引き続き、膝OAのACLにおける網羅的な遺伝子発現(mRNA、miRNA)をRNA-Seqを用いて遺伝子発現の解析を行う予定としていた。本研究では、ACLの肉眼的な変性度により3群(正常群:肉眼的に正常、軽度変性群:一部変性しているものの、連続性は保たれている、断裂群:変性が強く、連続性がない)に分けて、遺伝子発現差を検討する予定であるが、各群最低5検体での分析を検討している。平成30年度も検体採取を行い、軽度変性群および断裂群の検体を得ることができたが、検体を人工膝関節置換術症例から採取している為、多くの症例ではACLも変性しており、ACLが変性していない正常群が集まらず、RNA-Seqまで至らなかった。ただし、平成30年度は、採取した検体の肉眼的所見と病理組織学的な変性度が相関していることが、検体の病理組織学検査で確認できた。また、平成30年度は軽度変性群と断裂群で遺伝子発現に差があるかをRT-PCRにて2群間で比較し、変性度により遺伝子発現に差があることが確認できた。そこで、次年度はこの結果に基づき、正常ごく軽度の変性群を集めていき、その中で正常に比較的近いものを5検体用いて、正常群に振り分け、RNA-Seqにて遺伝子解析を進めていく予定である。本研究では、変形性膝関節症における前十字靭帯の変性度を肉眼的に3群に分けているが、未だ正常群の検体数が足りていない。検体が末期の変形性膝関節症に対して行う人工膝関節置換術の際に採取している為、なかなか正常に近い前十字靭帯が残っている症例が少なく、検体数が目標数に届いていない。しかし、今年度は昨年度より人工膝関節置換術の症例が増えている為、正常群の検体数も得られる見込みである。今後はまずは予定している15例のサンプルを集め、RNA抽出からRNA-Seqまでを行う予定である。本学では毎月10例前後のTKAを行っているため、2-3ヶ月で目標のサンプル数が得られると考える。本学では毎月10例前後のTKAを行っているため、残り2-3ヶ月で目標のサンプル数が得られると考える。本年度は正常群の検体数を集め、もし目標の5例に足りない場合でもRNAシーケンス、miRNAシーケンスを行う予定である。
多機能分子触媒による水の活性化と触媒的水和反応の開発

酸塩基複合効果を基盤として発現する協奏機能を有するジアミン配位子をもつ16電子アミド(η^6-アレーン)ルテニウム錯体が、ブレンステッド塩基として機能することに着目して水との反応によるヒドロキソ(アミン)錯体の生成と、ヒドロキソ錯体の求核性を活用した触媒的水和反応への展開をめざして錯体化学的研究を行った。その結果、16電子アミドルテニウム錯体は、充分なブレンステッド塩基性を有することから容易に水分子と反応して水素-酸素結合の切断を伴って18電子アミン-ヒドロキソ錯体を与えることを見いだした。さらに合成単離した一連のヒドロキソ錯体は、塩基として作用し、酢酸や活性メチレン化合物と反応する一方、求核剤として、エステルと反応してエステルの加水分解生成物であるカルボキシレート錯体を与え、さらにアセトニトリルとの反応で対応する酸アミドを定量的に与えることを見いだした。これらの知見をもとに、ニトリルの触媒的水和反応を検討した結果、3級アミン配位子を有するヒドロキソ錯体が、基質/触媒比50、70°Cの条件下で、脂肪族および芳香族ニトリルの水和反応に対する触媒活性を示し対応する酸アミドを与えることを見いだした。アミン配位子の構造は触媒活性に大きく影響し、1級アミン配位子を有するヒドロキソ錯体はほとんど触媒活性を示さないものの、3級アミン錯体が中程度の触媒活性を示すことが分かった。1級アミンを有するアミダト錯体が水との反応によりヒドロキソ錯体に変換され難いのに対し、3級アミンを有するアミダト錯体は水と容易に反応してヒドロキシ錯体を再生できることが触媒活性発現の原動力と考えられる。本結果は、ジアミン配位子をもつりη^6-アレーンルテニウム錯体が協奏機能触媒として機能し、還元反応・炭素-炭素結合生成反応と同様に水分子の活性化をともなう水和反応に展開できるとともに、炭素-酸素結合生成を鍵反応とする新たな不斉触媒反応開発の可能性を示すものであり興味深い。
ヤドカリの「車体感覚」を成立させる知覚基盤の行動学的解明

本年度において国際動物行動学会(Behaviour2015)で行った研究発表は、オカヤドカリが貝殻の大きさを知覚するのに慣性モーメントを用いていることを明らかにした実験についてである。これは、無脊椎動物であるオカヤドカリが人間と同様に、「ダイナミックタッチ」を用いて身体の大きさを知覚していることを示唆するものである。以下、その意義についての説明である。これまでの研究により、ヤドカリが貝殻の大きさを知覚できることが明らかになった。これは人間における「車体感覚」に近いと考えられる。生態心理学においては自動車を用いた通過可能性[Shaw 1995]に関する実験が行われたが、申請者が行ったヤドカリの実験と直接に対応するだろう。車体感覚は日常経験からもわかるが、その知覚基盤は解明に至っていない。しかしながら、生態心理学のダイナミックタッチ[Turvey 1995]が有力な候補と考えられる。この概念は手に持った物体を振り、その振り方によらない普遍的な知覚情報として慣性テンソルを参照し、物体の形状を知覚するものである。そして、自動車の形状を広義のダイナミックタッチで知覚していることが考えられる。ヤドカリも貝殻を後脚で保持しており、歩行による振動を通してダイナミックタッチにより貝殻の形状を知覚しているといえる。本研究は、その可能性を実験的に示したものであり、動物行動学ならびに心理学において重要な成果といえる。27年度が最終年度であるため、記入しない。ヤドカリはその貝殻の大きさを知覚できることが研究代表者の先行研究から明らかになっている(Sonoda et al. 2012)。ここから、その知覚様式が一般的に知られている車両感覚と共通する可能性が考えられる。つまり、車両感覚と貝殻知覚がともにダイナミックタッチ(物体の慣性テンソルの知覚)を基盤としているならば、ヤドカリもヒトと同様に車両を操作することが可能となるはずである。言い換えると、車両感覚を伴う道具使用が可能であり、具体的には、車両の大きさを知覚して操作すること、を想定できる。ヤドカリは通過口を通過するときに、車両の大きさに応じた振る舞いを示すはずである。実験の主たる目的は、通過口における車両様物体にのったヤドカリの振る舞いについてみることで、そのような拡張的な道具使用が可能であるかを検証することである。車両様物体の使用は、車輪がついたアクリル板に貝殻を付着させることで実装していく予定である。第27回日本人工知能学会講演会にて、前年度から行っている予備実験の結果と考察について、報告と議論を行った(学会発表1)。特に、ヤドカリが車体様物体を操作可能であるかどうかが本研究テーマの最大の焦点であるが、この可能性を予備実験により明らかにしました。まだ、少数の個体でしか確認がとれていませんが、貝殻でない車輪付きの物体を忌避しないことが確かめられました。また、この車体を狭い通過口を衝突せずに通過できることも確認できました。日本動物行動学会第32回大会にて、25年度に行った実験の結果を合わせて、総合的な議論と報告をおこなった(学会発表2)。特に、本研究の要となる実験コースの問題点と車体の設計について、議論が行えた。また、本研究のテーマの1つである"ボディイメージ"に深く関連する"身体操作感"と"身体所有感"に関する議論と考察を学術論文の形で発表した(雑誌論文1)。本年度において、研究課題にのっとり、オカヤドカリが"慣性モーメント"(質量分布)を知覚できるかどうかを検証しました。オカヤドカリが貝殻の"重量"ではなく、"慣性モーメント"を知覚しているのかを明らかにすることは生態心理学の研究分野において非常に重要であると考えられます。また、動物行動学においても、比較認知科学的な観点から貴重な知見となることが予想されます。この研究発表に関して、H27年度においてオーストラリアでおこなわれる国際動物行動学会(Behavior2015)で口頭発表として受理されたことからも、研究の意義が認められると思われます。また、個別の研究実績としては、まず、前年度の成果を含め、日本動物行動学会第33回大会において発表いたしました。つぎに、本年度行った実験の報告として、第15回(社)計測自動制御学会システムインテグレーション部門講演会において口頭発表しました。さらに、研究対象であるオカヤドカリの生態と行動について、日本発達心理学会第26回大会ラウンドテーブルにて、広い幅のバックグラウンドをもつ聴衆にたいして、発表と議論を行いました。現在は、本年度の研究成果を原著論文として発表する作業にとりかかっています。

しかしながら、生態心理学のダイナミックタッチ[Turvey 1995]が有力な候補と考えられる。この概念は手に持った物体を振り、その振り方によらない普遍的な知覚情報として慣性テンソルを参照し、物体の形状を知覚するものである。そして、自動車の形状を広義のダイナミックタッチで知覚していることが考えられる。ヤドカリも貝殻を後脚で保持しており、歩行による振動を通してダイナミックタッチにより貝殻の形状を知覚しているといえる。本研究は、その可能性を実験的に示したものであり、動物行動学ならびに心理学において重要な成果といえる。本年度は、行動実験を行い、研究成果をえることができました。現在は、その研究成果をまとめ論文投稿する準備をすすめています。27年度が最終年度であるため、記入しない。今後の研究として、本年度の研究成果を踏まえ、次のオカヤドカリの行動実験を計画しています。研究計画にあるように、オカヤドカリの特殊な身体感覚を踏まえ、車輪がついて物体の道具使用=車体感覚を実証する予定です。すでに、本年度においても予備的検討を数回おこなっています。沖縄県西表島に渡り、平成27年度の6月、10月に次の実験を行なうべく、計画をおしすすめていきます。動物行動の実験に共通することではあるが、対象動物(ヤドカリ)の実験条件に対する反応をみながら、細かい条件(コース設計・試行回数・車体設計など)を調整しなければならないため。しかしながら、予備実験から重要な知見は得られており、実験条件はほぼ固まりつつある。25年度に行った一連の予備実験から得られた知見をもとにすでに実験装置を製作しているので、今後は本格的に行動実験をすすめていきたい。本研究課題は3つの実験テーマで構成されているが、26年度は準備が整ったので、このうち2つの実験テーマを完成させたい。
抗造血幹細胞抗体の検出による自己免疫性骨髄不全の診断法の確立

1.再生不良性貧血(再不貧)のうち、HLA-DR15を保有し末梢血中に微小なPNH形質の血球を有する例において、免疫抑制療法に対する反応性がみられた。再不貧患者の末梢血顆粒球のclonalityを検討したところ、主としてPNH血球陰性例にclonalityが確認された。2.PNH血球陽性の再不貧患者の血清中には、巨核芽球性白血病細胞株UT7の細胞質内蛋白に対する抗体が、間接蛍光抗体法とWestern blot法にて確認された。4.レコンビナントDRS-1蛋白を用いてELISAを行ったところ、PNH血球陽性の再不貧71例中27例(38.5%)に抗DRS-1抗体がみられたが、PNH血球陰性再不貧32例中では2例のみ(6.3%)にしか抗体がみられなかった。5.定量PCRを用いてDRS-1のmRNAの発現を検討したところ、成熟白血球では発現レベルが低かったが、UT-7やCD34陽性の骨髄造血細胞ではレベルが高かった。6.DR15上にDRS-1のアミノ酸配列上のCD4 epitope(同配列は、抗体の認識するhot spot 191-204と重なっていた)のペプチドを付加して、抗DRS-1抗体を持つ再不貧患者末梢血T細胞を刺激して得られた細胞障害性T細胞は、DRB1*1501を遺伝子導入されDRS-1を高発現しているL cell(マウス線維芽細胞)のみを選択的に障害した。(1)再生不良性貧血において、造血幹細胞に対する自己免疫反応を逃れて後天的にPIG-A遺伝子にmutationを持つPNH形質の血球が増加することを報告してきたが、今回骨髄異形成症候群の一部の例においても再生不良性貧血と同様にPNH形質の血球が増加していることを見いだした。このような例では、染色体異常の頻度が少なく、免疫抑制療法に反応しやすいことを報告した(論文として発表)。(2)PNH血球の増加した自己免疫性造血障害患者の血清中に、巨核芽球性白血病細胞株UT7に対する自己抗体のあることを、抗ヒト免疫グロブリン2次抗体を用いた蛍光抗体法によって確認した。(3)蛍光抗体法の結果より高い抗体価が予想された患者の血清を用いて、UT7のlysateに対するwestern blotを行った。その結果、lysate中の80kDaの蛋白に対して患者血清中の抗体が反応した。UT7 lysateを用いて多数例にてwestern blotを用いて検討したところ、この80kDaの蛋白に対する抗体は、HLA DR15を保有しPNH血球の増加がみられる自己免疫性造血障害患者にのみ見いだされた。この結果は、2002年アメリカ血液学会にて報告された。(4)次に、このUT7よりcDNA libraryを作成し大腸菌にて発現させて、lysateの80kDa蛋白に対する抗体をもつ患者血清を用いてスクリーニングした。複数のクローンが採取され、シークエンスして遺伝子を同定した。このうち、Ribosomal protein L14などいくつかについて、phage plate assayを用いて患者血清中の抗体が認識することを確認した(2002年アメリカ血液学会にて報告)。さらに、標識遺伝子との融合遺伝子を作成し、発現ベクターにて大量に発現させて精製し、患者血清中の抗体が精製された遺伝子産物を認識することを確認した。1,再生不良性貧血(再不貧)のうちHLA-DR15を保有し末梢血中に微小なPNH形質の血球を有する例において、免疫抑制療法に対する反応性から自己免疫性造血障害の存在を確認した。これらの症例の血清を用いて巨核芽球性白血病細胞株UT7を間接蛍光抗体法で検討したところ、細胞質や核に対する抗体がみられた。

2,次にUT7の細胞溶解液と患者血清を用いてWestern blotを行ったところ、対照の健康者やPNH血球陰性例では見られないBandがPNH陽性例で複数確認された。4,レコンビナントDRS-1蛋白を用いてELISAを行ったところ、PNH血球陽性の再不貧例でのみ高い抗体価が示された。5,定量PCRを用いてDRS-1のmRNAの発現を検討したところ、成熟白血球では発現レベルが低かったが、UT-7やCD34陽性の骨髄造血細胞では高かった。6.このDRS-1のアミノ酸配列のうち、HLA-DRB1*1501と親和性の高いペプチドと低いペプチドをソフトウエアTEPITOPEを用いて検索した。再不貧患者のTリンパ球を抗原提示細胞とこれらのペプチドで刺激したのちにペプチドに反応するT細胞をELISPOTアッセイにて定量したところ、PNH血球陽性例において高親和性ペプチドに特異的なT細胞を多く見いだした。