hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
気圧変動および模擬無重力環境下での歯髄細胞の痛覚受容体発現に関する研究

歯髄が気圧変動から受ける影響を明らかにするため、ラット歯髄細胞由来細胞株RPC-C2Aが減圧条件下で示す細胞状態の変化や痛覚受容体関連遺伝子の発現変化を検索した。その結果、減圧(0.5気圧)下でも増殖速度には大きな影響がなかった。マイクロアレイ分析では、歯髄の痛覚機構に関連する温度受容体や慢性疼痛ATP受容体の発現量は減圧下でほとんど変化しなかった。さらに0.1気圧の条件下では、多くの遺伝子発現に変化がみられたが、痛覚受容体関連の遺伝子の発現変化は少なかった。すなわち、気圧変化が歯髄の痛覚発症メカニズムを直接的に変化させるとは考えにくいと推察された。培養歯髄細胞としてラット歯髄細胞由来細胞株RPC-C2Aを用い、気圧変化の影響を調べる実験を開始した。まず、本年度購入した真空インキュベーターを用い、減圧下での細胞培養の予備実験を行った。気圧変化に伴い空気の排出・流入があるため、培地のpH緩衝にはHEPESを用いた。その結果、減圧(0.5気圧)下でも大気圧(1.0気圧)中と同様に細胞培養を継続出来ること、増殖速度には大きな影響がないことが明らかになった。減圧下で生じる遺伝子の発現変化を網羅的に調べるため、気圧の異なる条件下で培養した細胞からそれぞれRNAを抽出し、マイクロアレイ分析によって各種遺伝子の発現量を比較した。その結果、0.5気圧下で6時間24時間培養した細胞と、1.0気圧下の細胞との比較では、発現量が著明に異なる遺伝子は見つからなかった。さらに8日間培養を継続しても、0.5気圧下と1.0気圧下で発現量に著明な相違がある遺伝子はなかった。マイクロアレイで解析された遺伝子の中には、温度受容体TRPA1, TRPM3, TRPM8, TRPV3, TRPV4や慢性疼痛ATP受容体P2X3, P2Y6が含まれていた。すなわち、これらの遺伝子は気圧変化だけで発現量が変化するわけではないと考えられた。歯髄が気圧変動から受ける影響を明らかにするため、ラット歯髄細胞由来細胞株RPC-C2Aを用い、減圧条件下で細胞増殖・遺伝子発現に現れる変化を検索した。まず、減圧インキュベーターを用いて細胞培養を行い、減圧が細胞増殖へおよぼす影響を調べた。気圧変化に伴い空気の排出・流入があるため、pH緩衝にHEPESを用いた10%FBS含有α-MEM培地を用い、最長18日間培養した。次に、減圧下で生じる遺伝子の発現変化を網羅的に調べるため、気圧の異なる条件下で培養した細胞からそれぞれRNAを抽出し、マイクロアレイ分析をおこなった。さらに8日間培養を継続しても、0.5気圧下と1.0気圧下で発現量に著明な相違がある遺伝子は少なかった。とくに、歯髄の痛覚機構に関連する可能性がある温度受容体TRPA1, TRPM3, TRPM8, TRPV3, TRPV4や慢性疼痛ATP受容体P2X3, P2Y6も、0.5気圧の変化だけでは発現量の変動は大きくなかった。そこで、減圧インキュベーターを改造して0.1気圧の条件下でも実験した。この条件下では多くの遺伝子の発現変化が観察されたが、温度受容体や慢性疼痛ATP受容体の遺伝子の発現変化はやはり少なかった。以上の結果から、気圧変化が歯髄細胞の痛覚発症メカニズム自体を直接的に変化させるとは考えにくいと推察された。今後、硬組織に囲まれた歯髄組織に、気圧変化によって生じるメカニカルな刺激の影響を検討する必要があるだろう。歯内治療学、歯周治療学本研究は気圧変化や模擬無重力が細胞に及ぼす影響を調べることが目的であるが、そのための標準的な実験系は未だ確立されていない。今回購入した真空インキュベーターは、チャンバー内が設定した気圧・温度に厳密に維持されるよう作られている。これを用いることで、一定の減圧下での細胞の動態が初めて解析可能となった。すなわち、3Dクリノスタットと合わせて、気圧変化と模擬無重力環境下での実験を行う環境が整ったことから、当初の目標の一つが達成されたと考えている。培養歯髄細胞の痛覚受容体を調べる実験では、目的遺伝子を含め、より広く網羅的に遺伝子発現の変動を検索した。その結果、多くの遺伝子の発現変化についての知見を得た。

当初は受容体個別に遺伝子レベル、蛋白レベルで検索する予定だったが、先に網羅的に検索をすることで、当初の予定とは進め方が変わったものの、研究自体は順調に進展していると考えている。今後は当初の予定通り、各痛覚受容体およびサイトカイン分子の発現の関連性、内毒素(LPS)刺激による発現の変動に対して、気圧変化・模擬無重力環境の影響を調べる予定である。予備実験に用いた減圧条件(0.5気圧)では遺伝子発現の変動が少なかったことから、気圧条件に関してはさらに異なる条件についても確認する予定である。また、歯髄細胞株としてRPC-C2Aを用いてきたが、異なる細胞株、もしくは初代培養細胞系を使った実験も計画している。当初、個々の標的分子に対してそれぞれ個別のPCRプライマー、特異抗体を購入する予定だったため、その費用を予算計上していた。しかし、先にマイクロアレイ解析を行うことで網羅的に遺伝子発現を検索し、変動の見られた標的分子のみを取り上げることにしたため、プライマー費用、抗体費用を大きく削減することが出来た。今後も必要に応じて予め網羅的検索を行うことで、研究をより効率的・効果的に遂行できると考えられる。しかし、マイクロアレイ解析には1サンプル510万円かかるため、本年度削減できた費用をこれに当てる予定である。
細胞間コミュニケーションにおけるコンタクトアクティベーション機構の解析

ギャップジャンクション構成タンパク質であるコネキシン群の網羅的解析の過程で、マウスES細胞ではCx30.3が隣接する細胞の細胞間接触部位のみに速やかに発現することを発見した。本研究は、Cx30.3の遺伝子およびタンパク質レベルでの発現機構解析を目的として実施し、以下の点を明らかにした。細胞接触応答解析:データベースを元にES細胞からプロモーター領域と予想されるゲノムDNAを抽出して解析した結果、プロモーター活性を有する部位を決定することができた。細胞接触によってCx30.3のプロモーターを活性化する細胞内シグナリングについて解析した結果、LIFシグナルの関与だけではなく、E-カドヘリンーβ-カテニンシグナル伝達系が大きな役割を担っていることを明らかにした。また、Cx30.3の発現は、異種細胞であるHeLa細胞あるいはメラノーマ細胞と接触させた場合では、mRNAの発現増加は認められず、細胞接触応答に特異性があることがわかった。Cx30.3タンパク質の細胞接触に伴う空間的発現解析:Cx30.3とEGFPの融合タンパク質発現ES細胞を用い、単一の細胞同士をマニピュレーターを用いて接触させたところ、接触部位から離れて発現していたCx30.3が、速やかに接触点に向かって移動することが確認された。接触後に細胞を離すと、Cx30.3は速やかに接触部位から遠ざかった。この応答はHeLa細胞との接触では観察されなかったことから、Cx30.3は同種の細胞接触を認識しているのではないかと考えられた。Cx30.3の新機能解析:ES細胞にCx30.3を過剰に発現させた細胞の増殖能を解析したところ、野生型の細胞と比較して有意に細胞増殖活性が上昇することがわかった。このことから、Cx30.3は細胞周期にも関与する新たな機能の発見につながる結果が得られた。マウスES細胞において、ギャップジャンクション構成タンパク質であるコネキシン群の網羅的解析により、Cx30.3が隣接する細胞間接触部位のみに速やかに発現することを見いだしており、Cx30.3はコンタクトアクティベーションの機能を有する分子であると考えられている。本研究は、このCx30.3タンパク質の新機能を明らかにすることにより、多細胞生物の多様な細胞間コミュニケーションの分子機構を解明することを目的としている。本年度は、Cx30.3のES細胞内発現動態の解析を行なうために、以下の2点を行った。1.Cx30.3遺伝子のプロモーター領域の解析データベースを元にES細胞からプロモーター領域と予想されるゲノムDNAを抽出し、EGFPをレポーターとするベクターを数種類作製した。それらのベクターをES細胞にトランスフェクションし定量PCR法によりEGFPのmRNA発現量を解析した。その結果、プロモーター活性を有する部位を決定することができた。2.Cx30.3タンパク質の細胞接触に伴う空間的発現解析Cx30.3とEGFPの融合タンパク質発現ベクターをES細胞へトランスフェクションし、Cx30.3-EGFP発現ES細胞を作製した。2個のCx30.3-EGFP発現ES細胞同士をマニピュレーターを用いて接触させたところ、速やかに接触点に向かって移動するEGFPの蛍光スポットが確認された。2個のCx30.3-EGFP発現ES細胞を一旦接触させたのち、細胞を強制的に離したところ、細胞接触面から速やかに遠ざかるEGFPの蛍光スポットが確認された。一方、Cx30.3-EGFP発現ES細胞と異種細胞であるHeLa細胞を接触させた場合は、それに伴う蛍光スポットの移動は全く観察されなかった。これらのことから、Cx30.3は同種のES細胞接触を認識しているのではないかと考えられた。初年度である本年度の目的はCx30.3遺伝子のプロモーター領域の解析である。データベースを元に設計したDNAにEGFPをレポーターとするベクターを数種類作製した。ES細胞にトランスフェクションした細胞のEGFPのmRNA発現量の定量PCR解析により、プロモーター活性を有する部位を決定することができた。今後解析予定の転写因子の探索のためには、プロモーターの最小領域の決定が必要であるため、現在解析を進めている。また、平成30年度に実施予定である、Cx30.3タンパク質の時空間的発現解析の予備実験として、Cx30.3タンパク質の細胞接触に伴う空間的発現解析を行い、Cx30.3タンパク質の新たな機能を有する可能性を見いだすことができた。本研究は、コンタクトアクティベーションの機能を有するCx30.3の発現特性を明らかにすることを目的としている。本年度は、以下の2点を行った。1.細胞接触応答の特異性の解析ES細胞の細胞懸濁液を培養ディッシュの蓋にhanging dropを形成したものと、十分なピペッティングによりsingle cell化してディッシュに播種したものを培養し、一定時間後に細胞を回収してCx30.3の発現を解析したところ、hanging dropを形成したものは、通常培養時のコロニー状態の細胞よりも発現が上昇していた。一方、single cellの場合は通常培養時の細胞に近づくようにCx30.3の発現量は増加していった。また、異種細胞であるHeLa細胞あるいはメラノーマ細胞とES細胞の細胞懸濁液を用いてhanging dropを形成した場合、Cx30.3の発現上昇は認められなかった。これらのことから、Cx30.3は同種のES細胞接触により発現増加することがわかった。2.Cx30.3発現増加におけるカドヘリンの関与

Cx30.3の発現変化は細胞接触に関わるカドヘリンが関与している可能性があるため、カドヘリンの細胞接着を阻害する抗体を培養液中に添加し、hanging drop及びsingle cellの形成から一定時間後のCx30.3の発現を解析した。その結果、hanging drop、single cellともに抗体を添加していない場合とは異なり、通常培養時に対してCx30.3は低い発現量を示した。これらのことから細胞接着の阻害がCx30.3の発現に影響を与えた可能性が示唆された。コンタクトアクティベーション機能を明らかにするためには、単に細胞を培養してコロニーを形成させた場合ではなく、細胞を接触させてCx30.3の発現増加が観察できることを確かめる必要がある。そこで、強制的に接触させる方法として培養ディッシュの蓋にhanging dropを形成させたところ、通常培養時のコロニー状態の細胞よりもCx30.3の発現が上昇していることを確認することができた。また、この発現増加はES細胞同士で起こることも確認することができた。また、細胞接触に関与することが知られているカドヘリンの関与も解析することができ、Cx30.3の発現はカドヘリンシグナルの下流にあることが示唆された。既にLIFシグナルの下流にあることを明らかにしており、新たな細胞内シグナル伝達経路が存在する可能性を見いだすことができた。ギャップジャンクション構成タンパク質であるコネキシン群の網羅的解析の過程で、マウスES細胞ではCx30.3が隣接する細胞の細胞間接触部位のみに速やかに発現することを発見した。本研究は、Cx30.3の遺伝子およびタンパク質レベルでの発現機構解析を目的として実施し、以下の点を明らかにした。細胞接触応答解析:データベースを元にES細胞からプロモーター領域と予想されるゲノムDNAを抽出して解析した結果、プロモーター活性を有する部位を決定することができた。細胞接触によってCx30.3のプロモーターを活性化する細胞内シグナリングについて解析した結果、LIFシグナルの関与だけではなく、E-カドヘリンーβ-カテニンシグナル伝達系が大きな役割を担っていることを明らかにした。また、Cx30.3の発現は、異種細胞であるHeLa細胞あるいはメラノーマ細胞と接触させた場合では、mRNAの発現増加は認められず、細胞接触応答に特異性があることがわかった。Cx30.3タンパク質の細胞接触に伴う空間的発現解析:Cx30.3とEGFPの融合タンパク質発現ES細胞を用い、単一の細胞同士をマニピュレーターを用いて接触させたところ、接触部位から離れて発現していたCx30.3が、速やかに接触点に向かって移動することが確認された。接触後に細胞を離すと、Cx30.3は速やかに接触部位から遠ざかった。この応答はHeLa細胞との接触では観察されなかったことから、Cx30.3は同種の細胞接触を認識しているのではないかと考えられた。Cx30.3の新機能
イネにおけるアルミニウム耐性転写因子ＡＲＴ１活性化機構

イネアルミニウム耐性転写因子ART1の活性化機構を明らかにするために、前年度ART1プロモーター制御下でATR1ーFlagタグつきの形質転換植物を作成したが、ART1タンパク質は検出できなかった。そのため、今年度はユビキチンプロモーター制御下で、Flagを三つ直立したコンストラクトを作成して、art1変異体に形質転換した。T0植物を使ってアルミニウム耐性を調べた結果、形質転換植物のアルミニウム耐性は野生型並に回復した。根から抽出した核タンパク質を用いてWesternを行った結果、ART1抗体では検出できたが、Flag抗体では検出できなかった。この原因については不明である。酵母ツーハイブリッドで得たART1と相互作用するタンパク質IBBI3-2遺伝子は主に根で発現し、アルミニウムによって誘導される。そのの細胞内局在を調べるために、GFPとの融合遺伝子を作成し、タマネギの表皮細胞に一過的に発現させた。その結果、IBBI3-2は核ではなく、細胞質に局在していた。またCRISPR/Cas9を用いて、RBBI3-1, RBBI3-2とRBBI3-3の3重破壊株を作出した。配列を調べた結果、幾つかの変異体を得た。現在ホモラインを取得しているところで、種子を得次第、アルミニウム耐性などを調べる予定です。そのほかにイネの根の伸長を制御する遺伝子OsCCC1を単離し、その機能はK-Cl共輸送体としてこれらのイオンを細胞内に輸送して細胞の伸長に必要な浸透圧の維持に働いていることを明らかにした。27年度が最終年度であるため、記入しない。イネのアルミニウム耐性転写因子ARTIの活性化機構を明らかにするために、ART1と相互作用するタンパク質の探索を行い、本年度は以下のような結果を得た。1. ART1にFlag及びHAタグをつけて、コムギ胚無細胞系でFlag-HA-ARTIの合成を試みた。HA及びFlagの抗体を用いて精製したあと、ART1の抗体でwesternを行った結果、予想したサイズ(50kD)とは異なるが、単一なバンドが見られ、目的のタンパク質の合成ができたと考えられる。2.このタンパク質を用いて、アルミニウム処理有無の根から核タンパク質を抽出し、免疫沈降を行った。電気泳動の結果、タグされているART1タンパク質以外に、25kDのタンパク質が検出された。しかも、アルミニウム処理の根と比べ、無処理のほうの量が多かった。このことはこのタンパク質は負のレギュレーターとして機能している可能性があり、今後更なる解析が必要である。3.一方、同じコンストラクトFlag-HA-ART1をART1のプロモーター制御下でart1変異体に形質転換した。形質転換値物でART1が発現していることを確認した。しかし、アルミニウム耐性を調べた結果、artl変異体と同程度で、相補しなかった。抗体染色でART1の局在を観察した結果、本来局在すべき核での局在が少なく、タグの影響が考えられる。今後、C末端にタグをつけて試みる予定である。4.その他、ART1下流にある遺伝子OsMGT1について更なる解析を行った。OsMGT1はマグネシウム輸送体をコードしているが、その破壊株では、アルミニウム耐性だけではなく、耐塩性も顕著に低下することが分かった。破壊株の地上部のNa濃度が野生型と比べ、増加した。このことはOsMGT1がイネの耐塩性にも関与していることを示唆している。イネアルミニウム耐性転写因子ART1の活性化機構を明らかにするために、前年度はART1のN末端にFlag-Hisタグを付けて、art1変異体に導入した。しかし、アルミニウム耐性が相補できなかったため、今年度はART1のC端に同じタグを付けて、art1変異体に形質転換した。その結果、art1変異体のアルミニウム耐性が回復した。しかし、形質転換植物からART1を抽出してFlagとHisの抗体による免疫沈降を行った結果、ART1タンパク質が検出できなかった。現在、複数タグをつけたコンストラクトを構築していて、art1に導入する予定である。一方、根と基部節から構築したcDNAライブリーを用いて、酵母ツウハイブリッド法により、ART1と相互作用するタンパク質のスクリーニングを行った。その結果、11種類のタンパク質候補を得たが、そのうちの5種類はBowman-Birk proteinaseinhibitor (RBBI)ファミリーに属していた。RT-PCRでそれらの遺伝子の発現を調べた結果、RBBI2-1, RBBI2-2は根での発現がなく、RBBI3-1, RBBI3-2とRBBI3-3の発現はアルミニウムによって誘導された。しかも、art1変異体でこれらの遺伝子の発現が高かった。ART1とRBB3-1- RBBI3-3との相互作用を確認するために。RBBI3-1, RBBI3-2 ,RBBI3-3のC末端にGFPを付けて、無細胞系でタンパク質を合成させた。Flagタグ付けのART1とpull-downアッセイした結果、3種類のタンパク質ともART1と共溶出された。現在RBBI3-1, RBBI3-2 ,RBBI3-3の破壊株を作出して、アルミニウム耐性における役割を調べるところである。

そのため、今年度はユビキチンプロモーター制御下で、Flagを三つ直立したコンストラクトを作成して、art1変異体に形質転換した。T0植物を使ってアルミニウム耐性を調べた結果、形質転換植物のアルミニウム耐性は野生型並に回復した。根から抽出した核タンパク質を用いてWesternを行った結果、ART1抗体では検出できたが、Flag抗体では検出できなかった。この原因については不明である。酵母ツーハイブリッドで得たART1と相互作用するタンパク質IBBI3-2遺伝子は主に根で発現し、アルミニウムによって誘導される。そのの細胞内局在を調べるために、GFPとの融合遺伝子を作成し、タマネギの表皮細胞に一過的に発現させた。その結果、IBBI3-2は核ではなく、細胞質に局在していた。またCRISPR/Cas9を用いて、RBBI3-1, RBBI3-2とRBBI3-3の3重破壊株を作出した。配列を調べた結果、幾つかの変異体を得た。現在ホモラインを取得しているところで、種子を得次第、アルミニウム耐性などを調べる予定です。そのほかにイネの根の伸長を制御する遺伝子OsCCC1を単離し、その機能はK-Cl共輸送体としてこれらのイオンを細胞内に輸送して細胞の伸長に必要な浸透圧の維持に働いていることを明らかにした。計画した実験はほぼ順調に進展した。27年度が最終年度であるため、記入しない。得られたART1と相互作用する候補の破壊株を作成して、アルミニウム耐性における役割を調べる。計画した実験はほぼ順調に進展した27年度が最終年度であるため、記入しない。前年度の結果に基づいて、新たなコンストラクトを作成して、形質転換を行い、引き続きART1と相互作用するタンパク質を同定していきたい。
北方林の3次元構造と多様性維持機構の解明

北海道大学苫小牧演習林において、森林生態系における生物多様性の維持機構を4年間にわたって調べた。この期間に演習林を舞台に我々が出版した学術論文は36編にのぼる(別冊報告書参照)。専門分野の異なる分担者が協力してプロジェクトを行ったため、研究材料は、樹木、昆虫、魚類、哺乳類、土壌動物、鳥類など非常に多岐にわたる。これらの材料を用いてこれまでの日本の生態学では考えられなかったほどの大規模な野外実験や、精細な長期観察によって、動植物の相互作用、攪乱の効果、森林の垂直構造が昆虫の群集配列に及ぼす影響、生態系境界面での物質の移動に伴う生物の資源利用などが明らかされた。これらの研究成果は日本の生態学に寄与するもっとも重要なもののひとつとなるであろう。1.北方生態系における攪乱地の代表樹種であるヤナギとその葉にゴールを作るハコブハバチの相互作用について調査し、次のことから明らかになった。(1)本種はヤナギの種、樹齢、クローンに対して強い産卵選好性がある。(2)植物要因による死亡は、クローンに依存する。(3)寄生者による死亡は高密度では密度逆依存性を示す。2.土壌生物、アリ類、鱗翅目昆虫同し亜目昆虫などを材料として、種間相互作用に関する研究を進めるとともに、とくに北海道産アリ類の分類学的整理を行っている。とくに北大苫小牧地方演習林に生息するカドフシアリについで女王型と中間カースト型を発見したが、両型の遺伝子交流は雄のみによっている可能性があり、その進化に関する研究が注目を集めつつある。3.ショウジョウバエ群集の多様性と森林の3次元構造との対応性を評価するために、北大の中川、雨龍両演習林のシラカンバ林において、葉群分布の定量化とショウジョウバエ類の垂直分布を調査し、異なる林分間で比較した。亜高木性樹木(アオダモ、ハクウンボク)の結実率や性表現に及ぼす至近要因を調べ、階層構造の発達によって周辺個体との光資源をめぐる競合が重要であることが明らかになった。5.二次林内にエンクロージャーを設けて森林性鳥類の種類を変えることにより、シジュウカラとゴジュウカラ昆虫群集組成に与える影響を定量化した。6.森林の階層別にウィンドウトラップを設けることにより、階層ごとに出現する飛翔性昆虫群集が異なることがわかった。7.発達した森林内に18×15×15mの森林観測足場を作設し、樹木の3次元構造とその維持機構を明らかにするための準備を行った。1,亜寒帯と冷温帯のシラカバ林で、樹形、森林構造、ショウジョウバエ群集の多様性の関係を比較した。複数の昆虫食鳥類の森林生態系における役割の違いを明らかにするために、大規模な林冠エンクロージャー実験を行った。2,ヤナギとそれに利用する昆虫の産卵選好性と生存率の関係を複数の生態機能群で比較した。その結果、相互作用の様式が大きく異なることが明らかになった。これは相互作用の進化を考えるうえで大変興味深いものである。3,過去5年間のミズナラ堅果(ドングリ)の豊凶とエゾアカネズミの個体数の変化を調査した結果、前年のドングリの豊凶と次年春のエゾアカネズミの生き残りの数に有意な相関が認められた。4,草食動物(北海道和種馬)による林床植生の選択的な採食が林床の種多様性に与える影響を評価した。イネ科、カヤツリグサ科の草本植物やカエデ類の低い葉が選択的に採食され、シダ類はまったく食害を受けなかったが、踏圧によるダメ-ジがきわめて大きい。5,亜高木と低木4種について結実率に及ぼす影響を実験的に明らかにした結果、いずれも当年の資源制限と花粉制限はみられず、貯蔵養分に依存していると推察された。6,森林観測ジャングルジムを用いて葉群の3次元分布を実測し、樹種特性や階層性を明らかにするとともに、従来の葉群分布推定法の精度を定量的に評価した。1.成熟した落葉広葉樹林1ヘクタール内のすべての林冠木と亜高木30種にデンドロメータを取り付け、4週間ごとに直径成長の季節変化を追跡した。成長パタンは資源要求の高い高木、要求の高くない高木、亜高木に類別された。2.苫小牧の河畔林の林木種多様性・現存量・同回転速度・潜在林冠高のデータを、東アジアのさまざまな森林での同様のデータと比較し、多様性が現存量などの生態系指標の積としてうまく説明できることを見いだした。3.ヤナギを利用する各種の昆虫の産卵選好性と適応度の関係を比較したところ、食性に関するfunction groupで大きな違いが見られた。このことから、植食性昆虫の資源利用様式の進化と生活史戦略の関係を明らかにするための重要な示唆が得られた。

4.ネズミ類の個体数と気温、積雪などの気候およびミズナラ堅果(ドングリ)の落下量との関係を、9年間のデータから調べた結果、ドングリ落下量とその次年度秋のヒメネズミとヤチネズミの個体数に有意な正の相関が認められた。5.魚類、植食性水生昆虫および藻類の三者が基本構成要素となる河川の生物群集を対象に、生物間相互作用と多様性の関係を明らかにするための操作実験を行い以下の結果を得た。(1)魚類の捕食圧は植食性昆虫の採餌活性を低下させ、ギルド内における競争の緩和を通じて多種共存を可能にする。(2)捕食性魚類の存在は、植植性昆虫の分散率を高め、間接的に藻類の資源量の決定因子となる。(3)これら三者間のトロフイックカスケード作用の強度は、系外資源である陸上性昆虫の供給量に依存する。林床低木ミツバウツギの繁殖成功度は、ミツバウツギ各個体の上層を覆う林冠樹種のフェノロジーとマルハナバチによる隣家受粉の頻度に依存していることを明らかにした。虫媒樹木約20種の開花フェノロジーと開花量を明らかにした。オオマルハナバチとコマルハナバチの個体群サイズは高木類の開花量の年変動によって強く規定され、間接的に林床植物の結実率にも影響を及ぼすことが示唆された。樹体内貯蔵養分量の季節変動パタンは開花結実がまったく見られなかったにもかかわらず、アオダモとハクウンボクでは大きく異なり、開葉フェノロジーによっても影響されることが明らかとなった。二次林に設定していた40ヵ所、8年間の毎木調査区のデータから、樹木種類の多い林分ほど生産性が高く、階層構造がよく発達していることが明らかとなった。また、階層構造が発達している林分ほど土壌の炭素/窒素比が大きく、光資源と土壌養分のトレードオフ関係が働いていることが分かった。樹種・個体ごとの詳細な光資源分割の解析により、高木類は亜高木に比べてサイズの小さい段階では光利用効率は低いが、サイズが大きくなるにつれ逆転することが明らかとなった。これは階層の異なる樹種が光資源を効率よく分割していることとも対応する。
酵母液胞型プロトン輸送性ATP分解酵素サブユニットの機能と分子多様性に関する研究

酵母液胞膜V-ATPaseの17-kDaサブユニット(Vma3p)は、プロトンの輸送に直接機能していると考えられているが、このサブユニットには、遺伝子レベルで同定された相同的な分子VmallpとPpalpが存在する。平成6年度はVma3pとVmallpについて解析した。1.17-kDaサブユニットおよびその相同分子の抗体による検出系の構築互いに相同的な遺伝子産物を特異的に検出する系を構築する目的で、Vma3pのC末端領域に抗c-myc抗体のエピトープを含む10アミノ酸を融合した産物を発現する組換え体を構築した。この株は、野生株を同じレベルの液胞膜V-ATPase活性を有した。また、抗c-myc抗体に反応し、予想される分子量のポリペプチドが融合遺伝子の発現に特異的に認められた。この系をVmallpやPpalpに応用することで、これらの遺伝子産物の特異的検出系を構築できると考える。2.Vmallpの保存性グルタミン酸残基の変異株の解析Vma3pでプロトンの輸送に機能すると考えられているグルタミン酸残基がVmallpの配列中にも保存されている。Vmallpの保存性グルタミン酸残基をロイシンに置換した変異株では、液胞膜上に野生型酵素と同じサブユニット構成の複合体が形成されていたが、V-ATPase活性は失われていた。この結果から、Vmallpは、液胞膜V-ATPaseの分子集合形成などに間接的に機能しているのではなく、サブユニットとして機能していると考える。また、野生株では、液胞膜に結合したサブユニットの一部が部分複合体として存在していると考えられているが、この変異株では、ほとんどがホロ酵素複合体様の構造を取っていた。液胞内酸性化が起きない変異株でより多くの酵素複合体が検出されたことから、液胞内酸性化の度合いに応じて、液胞膜への酵素結合量が変化し、酸性化の調節が行われている可能性が示唆された。
内耳血管条上皮細胞の頂部小胞の微細構造と動態

モルモット内耳血管条の辺縁細胞の内リンパ液代謝に働く役割について、カチオン化フェリチン(CF)の取り込みと組織化学的方法により検討した。蝸牛管基底回転に開けた小窓より連続的に人工内リンパ液に溶解したCFを注入し、経時的に辺縁細胞によるCFの取り込み過程を観察した。辺縁細胞の自由表面には多量のCFが附着し、これらは被覆小胞により活発に取り込まれた。次いで、CFは種々の形態を示すエンドゾームに集められた。CF注入後1時間ではCFは内腔に小型の小胞を持つ大型のエンドゾーム、いわゆる多胞小体に大量に取り込まれ、更に2時間後には内部に顆粒状物質や膜の遺残物を密に持つエンドゾームに集積され、細胞基底部に送られる様子がみられた。この過程において、細胞頂部に多数みられる頂部小胞には一部にCFの取り込みがみられ、被覆小胞に取り込まれたCFは、多胞小体を含むエンドゾームに集積され、一部は頂部小胞に、一部はライソゾームに送られるものと思われる。CFを2時間取り込ませた血管条の酸性ホスファターゼ(ACPase)とトリメタホスファターゼ(TMPase)活性の局在を検討した。その結果、CFを取り込んでいるすべてのエンドゾームはTMPaseの強い活性を示した。しかし、ライソゾームの代表的な標識酵素であるACPase活性はCFを取り込んだ構造には全く検出されなかった。更にACPase活性を示す構造にはCF粒子は全くみられなかった。また、エンドゾームとライソゾームの融合を阻害するブレフェルデインAの投与によってもCFの取り込みとエンドゾームへの輸送の過程は阻害されなかった。これらの結果より、辺縁細胞はCFを取り込み、すばやくエンドゾーム系へ送るが、ライソゾーム系での処理は比較的ゆっくりと行われるものと考えられる。モルモット内耳での各種の酵素活性の局在を組織化学的に検討した。その結果、CaーATPase,MgーATPase,NaーKーATPaseの酵素活性の局在が血管条上皮細胞にみられ,内リンパ液の代謝に重要な役割を担うと考えられる結果を得た。NaーKーATPase活性は血管条辺縁細胞の基底側細胞膜に,CaーATPase活性は辺縁細胞の腔側細胞膜と多胞空胞に高い活性の局在を示した。MgーATPase活性は側底面側細胞膜に局在してみられた。辺縁細胞にある特異な頂部小胞,被覆小胞,多胞空胞の,内リンパ液代謝における役割の解明を試みるために,モルモットの中耳胞を開放し,蝸牛官基底回転に開けた小孔より,人工内リンパ液に溶解したカチオン化フェリチンを内リンパ腔に連続的に注入した。辺縁細胞はリンパ腔に面する細胞膜に大量のフェリチン粒子を附着させ,複覆小胞による活発な取り込みを示した。注入後5分ではフェリチン粒子は細胞膜にみられ,15分では被覆小胞と多胞空胞に取り込まれていた。60分後には多胞空胞に大量の粒子がみられた。一方,カチオン化されていないフェリチン粒子は細胞膜への附着はみられず,取り込みは不活発であった。3060分間の注入で,少量のフェリチン粒子が被覆小胞に取り込まれた。これにより辺縁細胞は細胞膜の糖衣層に結合した内リンパ腔の物質を活発に取り込む。同時に内リンパ液を取り込み,内リンパ液の代謝を行っていることを示すことができた。

しかし,これらの過程において,頂部小胞はカチオン化フェリチン粒子で標識されることは殆どなく,内リンパ液の取り込みに関与していない可能性があり,この頂部小胞の機能について,さらに異った角度より検討していく必要がある。モルモット内耳血管条での各種の酸素活性の局在を組織化学的に検討すると共に、カチオン化フェリチン(CF)を標識として、内リンパ液の取り込み過程を検討し、血管条上皮細胞の内リンパ液代謝における役割を検討した。Na^+-K^+-ATPase活性は細胞基底部の基底陥入の細胞膜に局在してみられ、Ca^<2+>-ATPase活性は自由表面の細胞膜と大型のエンドゾームに局在し、Mg^<2+>-ATPase活性は辺縁細胞の側面細胞膜に局在してみられた。蝸牛管に注入したCFの辺縁細胞による取り込みは被覆小胞によってすみやかに行なわれ、CF注入後5分では被覆小胞に、15分後には大型の空胞状エンドゾームに取り込まれた。CF注入後、60分では被覆小胞、管状小胞、大型の空胞状エンドゾーム、内部に多数の小胞を持つ大型の多胞小体が多量のCFによって標識された。それぞれの構造物では、CFは限界膜に附着してみられるかあるいは凝集して集塊を形成していた。2時間後では小型の小胞および被覆小胞の数は減少し、大型の多胞小体と内容物が濃縮され、顆粒状物質や小胞を多量に持つ密な多胞小体にCFが蓄績された。CFを2時間取り込ませた血管条でライリゾームの標識酸素であるACPaseとTMPase活性の検出を行なった。ACPase活性は上記構造すベてに陰性の反応を示し、CFを取り込まないいわゆるライリゾーム構造に強い陽性を示した。TMPaseは、逆に、CFで標識された管状小胞、大型空胞、多胞小体すベてに強い陽性を示し、CF粒子とTMPaseの反応産物の共存がみられた。これらの実験において、CFで標識されない頂部小胞は、各種の酵素活性をも持たなかった。これらよりいわゆる頂部小胞のあるものはCFの取り込みに直接関与している可能性が考えられるが、更に詳細に検討を要する。
Bachファミリーによる細胞の増殖と死の制御

Bach1およびBach2はMafファミリーとヘテロ二量体を形成し、転写抑制因子として作用する。本研究では、Bach1ならびにBach2がAP-1系の抑制因子として担う生理機能を明らかにすること、そしてその異常が癌化に関わる可能性を検討した。まず、Bach1ならびにBach2が細胞増殖等におよぼす影響を、レトロウィルスを用いた過剰発現系にて検討した。その結果、Bach2はジエチルマレイン酸などの酸化ストレス刺激に応答して核へ集積し、アポトーシスを誘導することを見いだした。したがって、Bach2はストレス応答の経路でpro-apoptotic geneとして作用すると考えられる。一方、Bach1はBach2と同様の機能モチーフを持つにも関わらず、細胞死の誘導活性は認めらなかった。Bachは癌関連因子で見い出されるBTB/POZドメインを有することが特徴であるが、このドメインはBach2の細胞死誘導活性に必須であった。そこでBach2のBTB領域と結合する因子を検索したところ、新規BTB-Znフィンガー型転写因子MAZRを発見した。MAZRはEwing sarcomaでEWSと相互転座をしている例が報告されたことから、癌化への直接的な関与が示唆された。
初期近代ブリテンにおける「帝国」論の研究

平成14年度においては、初期近代ブリテンにおける人文主義者を中心とした「帝国」論の受容と展開を追跡した。とくに、MachiavelliのDiscorsi、Giovanni BoteroのRagione di Stato、Grandezza delle cittaに代表される大陸の人文主義者の議論においては、ローマ型の拡大国家とスパルタ・ヴェネチア型の現状維持国家という2つの歴史的モデルが存在していたこと。また、16世紀のイングランドでは前者の系としての「国家理性」論が受容されていたこと、後者の拡大国家論は、古代ローマを原型とする点などにおいて、プロテスタントや新プラトン主義者による他の「帝国」論のモデルとは異なること明らかとなった。また、一方で1603年のイングランド・スコットランド統合問題を契機として、たとえばFrancis BaconのEssaysに見られるように、「偉大さ(greatness)」を希求した拡大国家論/帝国論が新たに展開されたこと。そして、拡大の議論は、17世紀中葉におけるJames HarringtonのOceanaにもそれが継受されたことが判明した。この「帝国」と「統合」の問題は、1707年の政治統合を経てもなお、多元性君主国家「ブリテン」における政治的、思想的な中心課題であり続けた。このことは、たとえばスコットランドのAndrew Fletcherから提示された、イングランド中心の統合・拡大に対する異論に端的に表れている。さらに、このFletcherと、BaconやHarringtonを比較することによって、初期近代政治思想史研究におけるパラダィムである「リパブリカニズム」と、「帝国」論との関係を再検討することの必要性が新たに確認された。
デジタル高度情報を用いた衛星搭載降雨レーダ地表面エコーの上端位置決定に関する研究

温暖化などのグローバルな気候変動の解明には宇宙からの降雨観測が必要で、特に衛星搭載降雨レーダによる観測は降雨の3次元構造を定量的に精度よく測定することから重要である。ところで、現在運用中の熱帯降雨観測(TRMM)衛星搭載降雨レーダでは、チベットやアンデスなどの山岳地域で、非常に小さな発生確率ではあるが地表面エコーを降雨エコーと誤判定することがあり、レーダ工学上の一つの問題となっている。本研究の最終目的は、衛星搭載降雨レーダの観測で地表面エコーと降雨エコーとを高精度で分離することであるが、このためには正確なデジタル高度情報が必要である。このため、TRMM衛星搭載降雨レーダのデータを用いた地表面高度情報(標高マップ)の作成を行った。初年度の平成14年度に各種のグリッド間隔での標高データ作成の検討を行い2km×2kmのマップ作成が望ましいとの結論に至り、初年度と次年度(平成15年度)において1998年2月及び1998年9月の2km×2kmグリッドの地表面デジタル高度情報(標高マップ)を作成した。1ヶ月弱のデータがあれば観測領域の全体がカバーされることがわかった。最終年度の平成16年度は、このようにして求めた標高マップと、既存のデジタル高度情報としては最も精度が良いとされているSRTM(Shuttle Radar Topography Mission)の30秒角の全球データであるSRTM30(水平方向分解能1km)とのより詳しい比較を行った。エベレストを含む領域で細かく調べると、SRTM30には山頂の値に近い8000mを超える標高が格納されており、標高の変動が激しい。これに対し、TRMM衛星搭載降雨レーダで求めた標高マップはSRTM30の裾野をなぞるなだらかな形となっていることが判明した。この結果は、山岳地域におけるSRTM30の標高値は1kmグリッドでの平均値ではなく最大値を格納してしることを示唆している。衛星搭載降雨レーダ観測における地表面エコーと降雨エコーとの分離には、地表面エコーのピーク位置の決定と、地表面エコーの上端位置の決定の2段階が必要となる。地表面エコーのピーク位置の決定にはTRMM衛星搭載降雨レーダで求めた標高マップの使用が有益である。他方、地表面エコーの上端位置の決定には1km分解能での標高の変動が必要で、この目的にはSRTM30の使用が適していると結論できる。ただし、SRTM30のデータを10km×10km程度の範囲で使用し、メディアンを使用するのが有効との見通しも得ることができた。本研究の成果を現行の衛星搭載降雨レーダの標準アルゴリズムに反映させることは、今後の課題である。グローバルな気侯変動の解明に必要な宇宙からの降雨観測は、衛星搭載降雨レーダによって最も定量的で信頼のおけるデータが得られると考えられている。

しかし、熱帯降雨観測(TRMM)衛星搭載降雨レーダの観測結果からわかるように、特にチベットやアンデスなどの山岳地帯では、非常に小さな発生確率ではあるが地表面エコーを降雨エコーと誤判定することがあり、レーダ工学上重要な問題となっている。現状のTRMM衛星搭載降雨レーダで地表面エコーを降雨エコーと誤判定する一番の理由は、レーダエコーデータから地表面高度を決定する際に使用している1km水平分解能のデジタル高度情報に大きな誤差が含まれる場合があるためということが判明している。本研究の最終目標は、衛星搭載降雨レーダの観測で地表面エコーと降雨エコーとを高精度で分離し、降雨エコーの下端位置、すなわち地表面エコーの上端位置を決定する手法を開発することであるが、そのためには正確なデジタル高度情報を求める必要がある。幸いなことにTRMM衛星搭載降雨レーダ自体が地表面高度計であり、そのデータを用いて現用のデジタル高度情報に補正をかけてより正確なデジタル高度情報を求めることが可能である。平成14年度は、この正確なデジタル高度情報を求めるための準備として、データ処理環境の整備、データの入手とバックアップの作成、データ処理アルゴリズムの検討と設計を行った。データベースとして、最小でも、地表面高度データ、分散、個数のペアを各グリッドで求める必要があり、水平分解能の大きさにもよるが、全球データのときそれぞれの項目で約1GBという大きな記録領域が必要で、このような大量の処理統計データを如何に効率よく(複数の)データファイルに格納し、今後の解析の読み書きに使用するかという点も研究課題の一つである。グローバルな気候変動の解明に必要な宇宙からの降雨観測は、衛星搭載降雨レーダによって最も定量的で信頼のおけるデータが得られると考えられている。本研究の最終目標は、衛星搭載降雨レーダの観測で地表面エコーと降雨エコーとを高精度で分離し、降雨エコーの下端位置、すなわち地表面エコーの上端位置を決定する手法を開発することであるが、そのためには正確なデジタル高度情報を用いる必要がある。幸いなことにTRMM衛星搭載降雨レーダ自体が地表面高度計であり、そのデータを用いて既存のデジタル高度情報に補正をかけてより正確なものを求めることが可能である。平成15年度は、TRMM衛星搭載降雨レーダの一ヶ月間のデータを用いて水平方向分解能が2kmのデジタル高度マップを作成し、既存のデジタル高度情報としては最も高精度であるといわれているスペースシャトル・エンデバーのミッションで作成したSRTM (Shuttle Radar Topography Mission)の30秒角の全球データであるSRTM30(水平方向分解能1km)と比較した。この比較の結果、精度が良いといわれているSRTM30にもチベットやアンデスなどにおいて大きな誤差が含まれていることが判明した。本研究の最終目標である衛星搭載降雨レーダの観測における地表面エコーと降雨エコーとの高精度での分離のためには、TRMMの後継機として計画されているGPM(全球降水観測)衛星搭載
医薬品探索を指向した触媒的不斉Ｃ－Ｈカップリングの開発と応用

近年、安定な化学結合を切断し、新たなヘテロ原子を導入する分子結合活性化反応が次世代の精密有機合成化学反応として注目されている。結合開裂の触媒となるのは主に遷移金属であり、様々な化学結合を切断しうる触媒と、それらを用いた反応開発が盛んに行われている。中でも炭素-炭素結合(C-C結合)は有機分子の主骨格を構成しすべての有機化合物がC-C結合を有している。従って、C-C結合開裂を伴う分子変換法の開発は、複雑有機化合物の新しい合成法につながるため、世界中の合成化学者の研究対象となっている。シクロプロパンは環歪みに起因する高い反応性を有する。一方で、安定で取り扱いやすく容易に合成可能であるため、合成化学の有用なビルディングブロックとして利用されている。C-C結合活性化研究において、シクロプロパンは環歪み解消エネルギーを反応の駆動力とすることから数多く用いられ、その開環を伴った様々な形式の反応が報告されている。しかし容易に合成でき安価で入手可能な一置換シクロプロパン(活性化されていないシクロプロパン)がC-C結合活性化反応に用いられる例は少ない。今回、直截的なアミノシクロプロパンのヒドロシリル化反応を見出した。ロジウム触媒存在下、アシル化アミノシクロプロパンとヒドロシランを反応させると、シクロプロパン環のproximal結合の選択的開裂を伴ったヒドロシリル化体を与える。基質のアシル基の配向作用によりproximal結合が選択的に活性化されたと示唆される。また、用いるモノホスフィン配位子によりシリル基が付加する位置選択性を制御することに成功した。本反応はα-アミノシラン類の新たな合成法でありシランジオール前駆体の合成が可能である。28年度が最終年度であるため、記入しない。近年、医薬品探索において「Escape from flatland」という化合物誘導化アプローチが注目されている。医薬分子にはビアリール骨格をもつ芳香族化合物が多く含まれる。一方で、その平面性や自由回転性のため生物活性や標的タンパク質への選択性の向上が困難である例が増加している。そのため、オルト位に置換基を有し平面構造をとれない三次元骨格をもつ嵩高いビアリール化合物が次世代医薬リード化合物として期待されている。また、嵩高いビアリール化合物は軸回転が制御されるため軸不斉が生じる。標的タンパク質は不斉情報を正確に認識するため、軸不斉ビアリール化合物はより副作用の少ない標的タンパク質選択的な医薬分子になる可能性を秘めている。効率的なビアリール骨格構築法であるC-Hカップリングは官能基化を伴わず直接芳香環同士を繋げることが可能であるため世界中で精力的に研究されている。しかし、嵩高い芳香族化合物のC-Hカップリングを実現する分子触媒はほとんど報告されていない。これまでの研究によって、様々なヘテロ芳香環と嵩高いアリールボロン酸のC-Hカップリングを実現するPd(OAc)2/sulfoxide-oxazoline(sox配位子)触媒の開発に成功した。Pdに併せ用いる配位子が極めて重要であり、触媒の反応性を著しく向上させる。また、不斉点を有するsox配位子を用いることで報告例がほとんどない触媒的不斉C-Hカップリング反応へ応用し、軸不斉を発現させることに成功した。本年度は不斉収率の向上を指向し、本反応の反応機構および不斉発現の機構解明研究に取り組んだ。不斉発現における配位子の置換基効果を実験化学により調査すると同時に、共同研究を行い、量子化学計算を用いて反応機構と不斉発現に関する配位子効果を明らかにした。本申請者が見出したPd触媒を用いた不斉C-Hカップリングの反応機構と配位子効果を実験化学および計算化学を駆使して明らかにすることができた。そして、計算化学により得られた知見から、新たな配位子設計の指針を得ることが出来た。このことから、申請者の今年度の研究進歩状況は当初の計画以上に進展があったことは明らかである。

基質のアシル基の配向作用によりproximal結合が選択的に活性化されたと示唆される。また、用いるモノホスフィン配位子によりシリル基が付加する位置選択性を制御することに成功した。本反応はα-アミノシラン類の新たな合成法でありシランジオール前駆体の合成が可能である。不斉収率の向上を目指し、引き続きよりよい触媒の開発を行う。これと並行して、医薬品に最もよく含まれる芳香環であるベンゼン環に適用可能なC-Hカップリング反応の触媒開発を行う。不活性なベンゼン環を反応させるため、配位子検討が重要となる。はじめにヘテロ芳香環に対して有効であったスルホキシド-オキサゾリン配位子をもとに配位子のチューニングを綿密に行う予定である。28年度が最終年度であるため、記入しない。
遺伝子不安定性ならびにメチル化異常による消化器癌の発生とその分子標的治療

DNAミスマッチ修復遺伝子の異常によるマイクロサテライト不安定性(microsatellite instability : MSI)は、家族性非ポリポーシス大腸癌(HNPCC)のみならず、散発性の大腸癌や胃癌の発癌に関与する。本研究では、MSIや異常メチル化により不活化される癌関連遺伝子を同定し、消化器癌の発生と進展における役割を明らかにする。異常メチル化はエピジェネティックな変化であり、メチル化阻害剤により遺伝子発現の回復が可能である。メチル化されている遺伝子を分子標的とした消化器癌治療へ向けた基礎的検討を合わせて行う。大腸癌および胃癌における遺伝子不安定性、特にマイクロサテライト不安定性とメチル化による遺伝子サイレンシングの関連について解析を行った。その結果、散発性大腸癌でマイクロサテライト不安定性を有する癌の約80%がゲノムワイドなDNAメチル化の異常、CpG island methylator phenotype(CIMP)によるhMLH1の異常メチル化が原因であることを明らかにした。CIMP陽性マイクロサテライト不安定性陽性の大腸癌は、p16遺伝子のメチル化頻度やBRAFの遺伝子点突然変異の頻度が高く、p53変異の頻度が低いなど、異常を認める遺伝子に特徴を有し、CIMPを介した発癌経路はHNPCC型の大腸癌とは異なるパスウェイで発癌すると考えられた。異常メチル化によりWNTの制御遺伝子SFRPやRasの制御遺伝子、RASSF2などが不活化され、WNTやRas経路の活性化に重要な役割を果たしていると考えられた。また、メチル化阻害剤により、アポトーシス関連遺伝子の発現を回復させることにより、腫瘍細胞にアポトーシスが誘導出来た。これらの結果から、異常メチル化を標的とした消化器癌治療の可能性が示唆された。これまで我々は、MSI陽性腫瘍においてBax等のアポトーシス関連遺伝子のフレームシフト変異を見い出し、さらに、メチル化の異常が癌化に伴う二次的な現象でなく、癌の発生に重要な役割を果していること、特に細胞周期に関連する重要な14-3-3シグマ遺伝子のメチル化による不活化を見い出し、報告してきた。また、最近、我々は、MSI陽性腫瘍においてβ2-マイクログロブリンのフレームシフト変異を見い出し、このことが発癌と連動する可能性を論じた。また、メチル化の異常が大腸腺腫や肝硬変など癌化の早期の段階でおこることについて知見を蓄積しつつある。そこで、本研究においては、遺伝子不安定性ならびにメチル化異常による消化器癌発生の分子機助序を明確にし、その成果の上に、分子標的治療を案出しようとした。本年度は、メチル化により不活化されている遺伝子を明らかにするため、申請者らが開発したMCA (methylated CpG island amplification)法を用いて、メチル化のターゲット遺伝子をクローニングし、前癌病変における関連遺伝子の同定を試みた。得られた遺伝子のうち、既知の遺伝子に関しては遺伝子不活化におけるメチル化の検討、臨床例における遺伝子発現低下と、腫瘍の臨床病理学的性格との関係を検討しつつある。Combined bisulfite restriction analysis(COBRA)法や、bisulfite-SSCP法などによる定量的PCR法によるメチル化異常の解析システムを構築し、微量の検体を用いて定量的にメチル化のレベルを測定出来るよう条件設定を行った。これまで我々は、MSI陽性腫瘍において、Bax等のアポトーシス関連遺伝子のフレームシフト変異を見い出し、さらに、メチル化の異常が癌化に伴う二次的な現象でなく、癌の発生に重要な役割を果していること、特に細胞周期に関連する重要な14-3-3シグマ遺伝子のメチル化による不活化を見い出し、報告してきた。また、最近、我々は、MSI陽性腫瘍においてβ2-マイクログロブリンのフレームシフト変異を見い出し、このことが発癌と運動する可能性を論じた。

そこで、本研究においては、遺伝子不安定性ならびにメチル化異常による消化器癌発生の分子機序を明確にし、その成果の上に、分子標的治療を案出しようとした。本年度は、メチル化により不活化されている遺伝子を明らかにするため、申請者らが開発したMCA(methylated CpG island amplification)法を用いて、メチル化のターゲット遺伝子をクローニングし、前癌病変における関連遺伝子の固定を試みた。得られた遺伝子のうち、既知の遺伝子に関しては遺伝子不活化におけるメチル化の検討、臨床例における遺伝子発現低下と、腫瘍の臨床病理学的性格との関係を検討しつつある。また、DNAアレイ法を応用して、メチル化遺伝子アレイを設定し、新規にいくつかの遺伝子を見い出した。さらに、細胞周期に関係するCHFR遺伝子のメチル化が消化器癌に高頻度に出現することを見い出した。これまで我々は、MSI陽性腫瘍において、Bax等のアポトーシス関連遺伝子のフレームシフト変異を見い出し、さらに、メチル化の異常が癌化に伴う二次的な現象でなく、癌の発生に重要な役割を果していること、特に細胞周期に関連する重要な14-3-3シグマ遺伝子のメチル化による不活化を見い出し、報告してきた。また、最近、我々は、MSI陽性腫瘍においてβ_2-マイクログロブリンのフレームシフト変異を見い出し、このことが発癌と運動する可能性を論じた。また、メチル化の異常が大腸腺腫や肝硬変など癌化の早期の段階でおこることについて知見を蓄積しつつある。本年度は、これまでに引き続き、メチル化により不活化されている遺伝子を明らかにするため、申請者らが開発したMCA(methylated CpG island amplification)法を用いて、メチル化のターゲット遺伝子をクローニングし、前癌病変における関連遺伝子の同定を試みた。さらに、新しくCABIN 1 betaと名付ける遺伝子が胃癌で高頻度にメチル化することが判明した。大腸癌および胃癌における遺伝子不安定性、特にマイクロサテライト不安定性とメチル化による遺伝子サイレンシングの関連について解析を行った。その結果、散発性大腸癌でマイクロサテライト不安定性を有する癌の約80%がゲノムワイドなDNAメチル化の異常、CpG island methylator phenotype(CIMP)によるhMLH1の異常メチル化が原因であることを明らかにした。