hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
レビー小体型痴呆の診断治療に関する総合的研究

発症年齢についてはAD群が73.8±9.0歳、DLB群が73.0土9.8と統計学的な有意差はなく、発症から入所までの期間も4.8±3.6年と3.8±3.4年で有意な差を認めなかった。しかしながら、改長谷川式簡易知能評価スケールの得点はAD群が43±3.8点で、DLB群が10.3±7.1と有意に高く(p=0.02)、MMSEも同様(6.2±6.1Vs13.0±5.0、P=0.02)であった。また、入所時の症状や運動機能などの評価では、DLB群で幻覚などが多く、自発性や覚醒度が低く、着衣などの運動機能が低いことが示された。今回の検討は、AD、DLBともに剖検によって診断が確定した患者のみを検討対象にしており信頼性が高いと思われる。在宅介護が破綻して施設入所に至る時点において、DLB患者はAD患者と比較して、認知機能においては保たれているものの、幻覚等の症状が多く、運動機能の障害が強く日常生活機能が低下していることが示された。従って同じ認知症を呈する両疾患の経過が大きく異なり、施設入所の原因も異なるものと思われる。こうした事実をもとに、DLB患者とその介護者が在宅介護の継続を希望される場合には、認知機能だけでなく運動機能や幻覚などの症状に対する治療や対応が求められると考えられる。L-ドーパの平均投与量は62.8mgであった。投与前と1、3ケ月目までの評価では、有意な改善を示した認知機能検査はなかった。Molleyらは、2006年にNeurology誌に、認知症を伴うパーキンソン病、認知症を伴わないパーキンソン病とDLB患者にL-ドーパを投与した際の認知機能に対する急性効果を報告しているが、それによれば、前例で自覚的な覚醒度の改善効果があったものの、意識レベルの変動が大きくなり、全体として認知機能に有意な変化を認めなかったとされている。また、平均のL-ドーパの投与量は95-137mgと我々の検討よりも多かった。この報告を参考に、今回の検討で認知機能検査に有意な改善が認められなかった理由を考察すると、1)L-ドーパの投与量が少なかったこと、2)L-ドーパによって意識レベルの変動が大きくなったために、改善の検出が難しくなったことの2つがあげられる。
小規模企業における職域健康増進が企業業績に及ぼす影響に関する実証的研究

従業員数10-50人程度の小規模製造業における就労者の心身の健康状態、および企業による職域健康増進への取組実態と生産性・収益性など企業業績との関連を明らかにするため、平成22年2月に大阪地域の小規模製造業970社にアンケート調査を行った。107社の回答を分析した結果、企業が職域健康増進に積極的に取り組むことで、従業員の健康状態のみならず、企業業績(納期、クレーム数、余力工数、機械故障時間、材料の歩留まり)も改善される可能性が示された。研究期間3ヵ年の初年度にあたる平成20年度は、主として文献・資料の収集・分析、職域健康増進の先進的取り組みを行っている身体障害者多数雇用事業所でのインタビュー調査、および研究組織メンバーおよび産業医、保健師等の研究協力者が参加する研究会での議論等を通して、平成21年度に実施する、大阪地域の従業員50人未満の小規模製造業1000社とその従業員を対象とした、企業による職域健康増進への取り組みと企業業績、従業員の主観的健康度についての大規模アンケート調査の調査票の設計に取り組んだ。その過程で、本研究の狙いと学術的・実践的・社会的意義について、平成20年11月に福岡で開催された日本公衆衛生学会ポスターセッションで報告し、参加者から研究上極めて有意義な示唆を多数得ることができた。また、本研究の実証分析枠組みに関する理論的考察を英文論文としてまとめ、平成21年1月に刊行された日本情報経営学会誌第29巻2号で発表した。なお、本年度は経済環境の急激な悪化により、年度当初に予定していた数の小規模製造業へのインタビュー調査が困難になったため、平成22年度に検討する予定の、小規模製造業で利用可能な職域健康増進プログラムのあり方を探ることを目的として、主として文献・資料の収集・分析、生鮮食材生産地での生産者へのインタビュー調査、研究組織メンバーおよび流通・農業研究者等の硬究協力者が参加する研究会での議論等を通して、わが国の高度成長期以降の食文化・慣行の変化と、現代の食文化・慣行が就労者の健康に及ぼしている影響、および就労者への食育・栄養指導を通じた職域健康増進の可能性を検討した。その成果の一部は、平成21年3月に中国・北京理工大学およびドイツ・ケムニッツ工科大学で開催された国際学会およびワークショップで報告し、研究上有意義な示唆を得た。3ヵ年の研究期間の2年目にあたる平成21年度は、主に研究分担者と岡山大学医歯薬総合研究科疫学教室の産業医、大阪市健康福祉局の保健師、中小企業経営者等の研究協力者による研究会と文献・資料の分析等を通して、従業員50人未満の小規模製造業とその従業員を対象とした、小規模企業による職域健康増進への取り組みと企業業績、従業員の主観的健康度に関するアンケート調査の調査票改訂および実施準備に取り組み、平成22年2月に大阪商工会議所の協力を得て、同会議所会員の従業員50人未満製造業970社に調査票を配布し、企業107社、従業員1128名から回答を得た。大阪商工会議所が実施してきた同規模企業向けアンケートと比較すると回収率は高く、本研究への期待が確認されたといえる。本年度は併せて、小規模企業の職域健康増進における保健医療機関・専門職の役割を探るため、フランス電力公社中央研究所の協力を得て、日本とフランスの電力会社へのインタビュー調査を実施した。また、本研究の概要を日本産業衛生学会(平成21年5月)と日本公衆衛生学会(同10月)で報告し、産業衛生・公衆衛生の専門家から積極的な評価と多数の有益な示唆を得た。さらに平成22年度に検討する、小規模企業向け職域健康増進プログラムの有望な構成要素として、成人の食育を通じた新たな食文化の創造手法を探るため、高度成長期以降の日本の食の変化に関する文献調査、わが国を代表する大手食品メーカー、給食業者、NHK料理番組ディレクター、大阪の小売市場関係者へのインタビュー調査、高度成長期以前の日本の食慣行・食材流通の特徴を一部保持している韓国の食材流通の現地調査を実施し、その成果の一一部を国際アート・文化マネジメント学会(平成21年6月米国)、欧州組織学会(同7月スペイン)などで発表した。最終年度にあたる平成22年度は、平成22年2月に実施した小規模製造業・従業員へのアンケート調査結果の集計・統計分析とヒアリング・文献調査等の追加調査を行い、その成果を踏まえて、就労者向け食育・栄養指導を中心に、小規模企業の業績改善に貢献する職域健康増進プログラムを検討した。平成22年4-7月には研究協力者(大学院生)に委嘱して企業アンケート調査データの単純集計を行い、8-12月にはNPO法人e-ヘルスプロモーション・アット・ワーク関西および岡山大学の研究協力者と共同で、集計結果の統計分析と文献・ヒアリング調査を実施した結果、職域健康増進に積極的に取り組んでいる小規模製造業では企業業績も良好であるという示唆が得られた。

この間、9月にはイタリアで開催された欧州科学技術研究学会(EASST)で本研究の理論枠組みを報告した。並行して4-12月には、現代日本の食文化が就労者の健康に及ぼしている影響を中心に、小規模製造業における職域健康増進プログラムの核となる食育・栄養指導のあり方について文献・ヒアリング調査を行い、7月にはポルトガルで開催された欧州組織学会(EGOS)でその成果の一部を報告した。平成23年1-3月には研究成果報告書素案の執筆と平成23年5月の日本産業衛生学会での報告準備を行った。これまでの研究で、小規模企業における職域健康増進を促進するには、営利企業の収益追求の原理と、就業者の心身の健康を増進するケアの原理を統合した、新たなマネジメントモデルが必要であることが明らかになった。そこで平成23年3月には、医療・福祉ケア組織のマネジメント研究の世界的権威であるオランダ・人文学大学のH.レティーシュ教授を訪問し、医療・福祉ケアの倫理とケア組織のマネジメントに関する近年の国際的研究動向と同教授の研究のヒアリングを行い、同国の高齢者ケア施設の調査を行った。
高速AFMで明らかにする真正細菌型イオンポンプロドプシンの多量体構造と機能動態

1.イオンポンプロドプシンの多量体構造の決定:様々な微生物型ロドプシンを高速AFM法と円二色性(CD)分光法により網羅的に解析し、脂質膜に再構成された状態での多量体構造を決定した。高速AFM観察により、GR、KR2、FR、KrActR、QsActR等の真性細菌で見出された微生物型ロドプシンはリング状の5量体を形成しており、GPRは5量体と6量体が共存していることがわかった。また、センサリーロドプシンであるSRII、ハロロドプシンNpHRなどの古細菌型ロドプシンは三量体であることがわかった。一方、内向きH+ポンプであるPoXeRやセンサリーロドプシンASRは真性細菌で発見された微生物型ロドプシンであるが、アミノ酸残基の相同性からは古細菌型に分類され、実際多量体構造は三量体であった。また、CD分光で観察される三量体と五量体に特徴的なスペクトルは多量体構造に依存したレチナールの配向で説明できることもわかった。これらの結果から、微生物型プロドプシンの多量体構造は進化系統樹と深く関わっている一方、イオンポンプのイオン種や向きと相関がないことがわかった。2.KR2の光誘起構造変化の観察の観察:外向きNa+ポンプであるKR2の光誘起による構造変化の観察に向けて、KR2五量体の観察面の決定およい高解像観察に適した試料の調製を行った。野生型に比べて光サイクルが100以上遅いN112A変異体を高解像観察しながら、周期的な光照射を照射したが明瞭な構造変化は観察できなかった。このことから、BRとは異なり、KR2の光サイクル中には大規模な構造変化は起きていない可能性が示唆された。29年度が最終年度であるため、記入しない。A.イオンポンプロドプシンの多量体構造の決定微生物型イオンポンプロドプシン(KR2・FR・GR・ASR・PoXeR)を高速AFMにより網羅的に観察し、多量体構造を決定した。高解像な高速AFM観察のために、脂質ナノディスクに使われる膜骨格タンパク質(MSP)と脂質の混合比を最適化して調整することで、脂質平面膜に分子が高密度に再構成し、高解像AFM観察に適した試料を調整する方法を開発した。これにより、プロトンポンプGR、ナトリウムイオンポンプKR2、クロライドイオンポンプFRは全て5量体を形成しており、一方、センサリーロドプシンASRや内向きプロトンポンプPoXeRはバクテリオロドプシンと同様の3量体を形成していることがわかった。これらのことから、微生物型プロドプシンの多量体構造は進化系統樹と相関があることが示唆された。2. KR2の光誘起構造変化の観察に向けた検討ナトリウムポンプであるKR2の光誘起による構造変化を観察するためには、5量体中のプロトマーを細胞質側から高解像で可視化する必要がある。KR2にはHis-tagが付与されていることから、5量体にHis-tag抗体が結合する様子を観察することで、高速AFMにより観察されるKR2-5量体の向きを決定した。また、His-tagが5量体の中心でより合わさって突起構造を形成し、高解像観察を阻害していることが判明した。His-tagを切断した試料を調整することで、KR2細胞質側から5量体中のプロトマーを分解して可視化ができるようになった。微生物型ロドプシンの多量体を高解像に高速AFM観察するための試料調整方法を確立でき、いくつかのイオンポンプロドプシンの多量体構造を決定することができた。さらに、イオンポンプロドプシンの進化と多量体構造に相関があることを見出すことができた。また、KR2の光誘起構造変化に向けた、試料検討も順調に進んでいるため。2.KR2の光誘起構造変化の観察の観察:外向きNa+ポンプであるKR2の光誘起による構造変化の観察に向けて、KR2五量体の観察面の決定およい

高解像観察に適した試料の調製を行った。野生型に比べて光サイクルが100以上遅いN112A変異体を高解像観察しながら、周期的な光照射を照射したが明瞭な構造変化は観察できなかった。このことから、BRとは異なり、KR2の光サイクル中には大規模な構造変化は起きていない可能性が示唆された。KR2の光誘起構造変化の観察については、高速AFMの時間分解能で観察できる程度にフォトサイクルが遅い変異体を準備している。試料の調整が出来次第、構造変化の観察に取りかかる。また、KR2は多量体を形成しない変異体で、イオンポンプ活性が低下する現象が生化学的に見出されている。この変異体について多量体解析を行い、多量体構造と機能との相関を明らかにする。KR2を発現するK. eikastusはKR1と呼ばれるプロテオロドプシンに属するロドプシンを発現することが知られている。細胞膜上でKR1とKR2が別々のクラスターで存在するのか、あるいは混在して存在するのかを明らかにするために、細菌表層に分布した状態の高速AFM観察を行う。ロドプシンは細胞内膜に存在するので、外膜をリゾチームで溶解、除去したスフェロプラスト状態を作り観察する。KR1とKR2の両者を区別して観察できれば、それらの局在と多量体構造、さらには光刺激による構造変化の観察も試みる。29年度が最終年度であるため、記入しない。
ヒトゲノム多型によるCYP薬物代謝活性変化の網羅的解析

本研究ではヒトの薬物代謝に関わる酵素の中でも主要な位置にあるシトクロムP450(CYP)を対象とし、ヒトゲノムの一塩基多型(SNP)情報を基礎とする各種変異体の薬物結合性と薬物代謝活性の網羅的・迅速測定を通して、ゲノム情報に基づいたオーダーメード医療を可能にする薬物投与設計の分子論的指針を確立する。この目的のために、SNP情報に基づき作成したCYP1A2、CYP2C9、CYP2C19、CYP2D6、CYP3A4変異体とこれら薬物との結合性を網羅的に測定する。また、SNPの影響を受ける分子構造的要因を探るた最大反応速度定数Vmaxは、薬物結合によってヘム鉄から配位水がはずれる割合と直線的に相関することがわかった。Vmax/Kmは薬物のクリアランスと関連づけられるため、酵素活性を測らなくても静的なKdと水配位率を測定するのみでクリアランスを推定できることが明らかとなった。一方タンパク質の安定化を促進する薬剤の添加、及び界面活性剤の工夫により、これまで大量発現が遅れていたCYP3A4及びCYP2D6の大量発現系を構築することに成功した。これらを用いることにより、ヒトCYPによる薬物代謝を包括的に検討することが可能となった。また、SNPの影響を受ける分子構造的要因を探るため、共鳴ラマン法によりヘム鉄軸配位子である水に関する構造情報を得る。さらに、CYPの基質となりうる結合親和性を示した薬物について、代謝活性をHPLCにて分析するとともに代謝産物の化学構造をLC-MSにより決定する。本年度においては、まず、これまでに知られているCYPのSNP変異体を新たに調製し、それらの大量発現を行った。CYP2C9、2C19、1A2を中心に大量調製し、微量透析法とHPLCを用いた薬物結合性の迅速測定を行った。また、ラマン分光計を用いて薬物結合型CYPの共鳴ラマンスペクトルを測定し、基質結合部位の構造評価を行った。その結果、CYP2C9及び2C19は基質フリーの状態でヘム鉄に水が配位した6配位型ヘムを含むが、薬物の結合により配位水がはずれて一部5配位型に変化することがわかった。しかしながら、CYP1A2は基質非存在下においても5配位型を示し、薬物が結合してもスペクトルに変化は認められなかった。さらに、良好な親和性を示した薬物について代謝活性を測定し、Km、Vmaxを決定した。さらに、CYPの基質となる薬物の結合様式を解明するため、X線結晶構造解析による検討を行うとともに代謝活性の網羅的測定を行う。本年度においては、まず、昨年度に調製したCYPのSNP変異体を用いて薬物代謝活性の網羅的測定を継続して行った。その結果、薬物結合親和性の指標であるKdが、すべての薬物とSNP変異体にてミカエリス定数Kmと直線的に相関することがわかった。また、最大反応速度定数Vmaxは、薬物結合によってヘム鉄から配位水がはずれる割合と直線的に相関することがわかった。

Vmax/Kmは薬物のクリアランスと関連づけられるため、酵素活性を測らなくても静的なKdと水配位率を測定するのみでクリアランスを推定できることが明らかとなった。一方、タンパク質の安定化を促進する薬剤の添加、及び界面活性剤の工夫により、これまで大量発現が遅れていたCYP3A4及びCYP2D6の大量発現系を構築することに成功した。これらを用いることにより、ヒトCYPによる薬物代謝を包括的に検討することが可能となった。
融合遺伝子を標的とした肉腫治療のための基礎研究

2018年度は、前年度施行した孤立性線維性腫瘍150例に関する融合遺伝子解析結果と臨床病理学的および病理組織学的データを解析し、発生部位による融合遺伝子のパターンの偏りがあることを明らかにした一方、融合遺伝子が孤立性線維性腫瘍の生物学的特徴を左右するのではなく、発生部位によって融合遺伝子のパターンに偏りがあるだけであることを示唆する結果を得、これらの内容を論文化し、現在投稿中の状態である。また、上記の内容を基礎として、孤立性線維性腫瘍の悪性化機構についての研究を新たに開始した。孤立性線維性腫瘍150例を組織学的に分類したところ、発生部位により組織学的パターンに偏りがあり、悪性化の頻度が異なることが明らかとなった。また、融合遺伝子のパターンとも関連が見られたが、こちらも発生部位と融合遺伝子のパターンに偏りがあるだけで、直接的な関与でない可能性を示唆する結果が得られた。昨年までの融合遺伝子のデータに加え、胞巣状軟部肉腫50例、粘液性脂肪肉腫100例についても融合遺伝子のデータが収集され、利用可能となった。新規の融合遺伝子解析として、近年新たに報告されたグロムス腫瘍の融合遺伝子であるMIR143-NOTCHの遺伝子解析をグロムス腫瘍80例に対して施行した。同融合遺伝子は当教室の解析系では5例のみ検出されており、臨床病理学的あるいは組織病理学的なデータとの解析には不十分と思われたため、現在解析系を見直し再度遺伝子解析を施行する予定である。同様に、血管肉腫に対しても融合遺伝子解析系の構築を進めている。前年度までに予定した骨軟部腫瘍の融合遺伝子解析は当初の対象腫瘍よりも広い範囲で展開されているため、収集されているデータは予定を上回っている状態である。具体的には、隆起性皮膚線維肉腫100例、炎症性筋線維芽細胞性腫瘍40例、滑膜肉腫100例、線維形成性小円形細胞腫瘍15例、間葉性軟骨肉腫10例、類上皮血管内皮腫10例、分類不能/未分化小円形細胞肉腫20例については大部分の症例で遺伝子解析のデータが利用可能な状態であり、さらに今年度新たに胞巣状軟部肉腫50例や粘液性脂肪肉腫100例についても利用可能な状態となっている。昨年度までに収集された情報を利用し、孤立性線維性腫瘍の論文を執筆し投稿中の状態であり、新たに孤立性線維性腫瘍の悪性化に関する研究を開始し、こちらも論文作成の予定である。その他の腫瘍に関しても統計解析を実施して新たな知見を蓄積しており、今後論文化の予定である。今後は、融合遺伝子に関連した免疫組織化学的マーカーを検索する方針であり、診断学的意義あるいは治療ターゲットとしての意義を明らかにする方針である。上記の内容を踏まえ、研究の進捗はおおむね順調と考える。現在対象として展開されている腫瘍は、孤立性線維性腫瘍、隆起性皮膚線維肉腫、炎症性筋線維芽細胞性腫瘍、胞巣型横紋筋肉腫、胞巣型軟部肉腫、類上皮血管内皮腫、血管肉腫、滑膜肉腫、骨外粘液性軟骨肉腫、線維形成性小円形細胞腫瘍、Ewing肉腫、未分化小円形細胞肉腫、軟部血管線維腫、リン酸塩尿性間葉系腫瘍、低悪性度線維粘液性肉腫、腱鞘巨細胞腫、胞巣状軟部肉腫、血管周囲類上皮細胞腫瘍、結節性筋膜炎、脂肪芽腫であり、昨年度までと同様に、新たな融合遺伝子が発見され次第、新たにこれに加えて解析を行っていく方針である。骨軟部腫瘍のデータは整理されており、融合遺伝子のデータを得次第利用可能な状態であるため、最新の知見を利用してそれらの意義について臨床的あるいは病理組織学的な知見から解析を行うことが可能である。治療標的としての意義が明らかな融合遺伝子を発見することが目標の一つであるため、より多くの腫瘍を対象とすることが重要と考える。また、骨軟部腫瘍においてもPD-L1といった癌免疫療法の適用が拡大されており、融合遺伝子の有無とPD-L1の発現の有無についても関連性が言われている。今後の骨軟部腫瘍治療方法の拡大のために重要な情報であると考えられるため、融合遺伝子の有無とPD-L1発現の有無についても解析を進める必要がある。2017年度は、孤立性線維性腫瘍150例、線維形成性小円形細胞腫瘍15例、間葉性軟骨肉腫10例、類上皮血管内皮腫10例、血管肉腫10例、分類不能/未分化小円形細胞肉腫20例、リン酸塩尿性間葉系腫瘍10例に対し、融合遺伝子解析を施行した。リン酸塩尿性間葉系腫瘍に関しては、その多様な臨床的経過及び組織学的特徴とをFISH法およびRT-PCR法を利用した遺伝子解析結果と併せて解析し、融合遺伝子解析が診断に一定の意義を有するほか、組織学的な特徴との関連性や治療標的としての可能が考えられたため、同内容を論文化して報告した。また、Ewing肉腫に類似した組織像を呈する腫瘍として分類不能/未分化小円形細胞肉腫の一群を抽出し、抽出された症例がいずれもCIC-DUX4あるいはBCOR-CCNB3融合遺伝子を有する点から遺伝学的にEwing肉腫と異なる腫瘍であると確定した上、これらの遺伝学的に確定された症例が臨床的あるいは組織学的にEwing肉腫とは異なる特徴を有することについて詳細にまとめて論文報告した。

論文化されていないものとして、線維形成性小円形細胞腫瘍に関してはほとんどの症例にEWSR1-WT1融合遺伝子が確認されており、間葉性軟骨肉腫、類上皮血管内皮腫に関しても、過去の文献をおおむね合致する割合で融合遺伝子の存在が確認された。孤立性線維性腫瘍についてもほぼ全例で遺伝子解析を終了済みの状態である。上記のように、これまでに発表された文献をもとに骨軟部腫瘍の融合遺伝子解析を施行し、それらを検出する系について複数の腫瘍で確立することができた。残症例についても継続して遺伝子解析を実施中の状態である。初年度に予定した骨軟部腫瘍の融合遺伝子解析は当初予定されていた対象腫瘍12種類よりも広い範囲の骨軟部腫瘍で遺伝子解析が展開されており、20種類に上る。研究開始時点で既に遺伝子解析の大部分が終了していた腫瘍と併せ、予定を上回る症例数での遺伝子解析が終了している状態である。具体的には、隆起性皮膚線維肉腫100例、炎症性筋線維芽細胞性腫瘍40例、滑膜肉腫100例、線維形成性小円形細胞腫瘍15例、間葉性軟骨肉腫10例、類上皮血管内皮腫10例、分類不能/未分化小円形細胞肉腫20例については大部分の症例で遺伝子解析のデータが利用可能な状態であり、加えて2017年度に実施した遺伝子解析により、当初の予定とは異なるものの、おおむね同数種類の腫瘍での解析が終了した状態である。加えて、孤立性線維性腫瘍、隆起性皮膚線維肉腫、炎症性筋線維芽細胞性腫瘍、滑膜肉腫、Ewing肉腫に関しては臨床情報の調査も大部分が終了した状態であり、孤立性線維性腫瘍においては融合遺伝子の情報と臨床情報および組織学的所見との関係について統計解析を実施し、論文執筆中の状態である。その他の腫瘍に関しても統計解析を実施しており、新たな知見に関しては論文報告の予定である。また、融合遺伝子に関連した免疫組織化学的マーカーに着目し免疫染色を施行する予定であり、これらと併せて治療ターゲットとしての意義や診断学的ツールとしての意義を明らかにする方針である。以上から、研究の進捗はおおむね順調と考える。2018年度は、前年度施行した孤立性線維性腫瘍150例に関する融合遺伝子解析結果と臨床病理学的および病理組織学的データを解析し、発生部位による融合遺伝子のパターンの偏りがあることを明らかにした一方、融合遺伝子が孤立性線維性腫瘍の生物学的特徴を左右するのではなく、発生部位によって融合遺伝子のパターンに偏りがあるだけであることを示唆する結果を得、これらの内容を論文化し、現在投稿中の状態である。また、上記の内容を基礎として、孤立性線維性腫瘍の悪性化機構についての研究を新たに開始した。孤立性線維性腫瘍150例を組織学的に分類したところ、発生部位により組織学的パターンに偏りがあり、悪性化の頻度が異なることが明らかとなった。また、融合遺伝子のパターンとも関連が見られたが、こちらも発生部位と融合遺伝子のパターンに偏りがあるだけで、直接的な関与でない可能性を示唆する結果が得られた。昨年までの融合遺伝子のデータに加え、胞巣状軟部肉腫50例、粘液性脂肪肉腫100例についても融合遺伝子のデータが収集され、利用可能となった。新規の融合遺伝子解析として、近年新たに報告されたグロムス腫瘍の融合遺伝子であるMIR143-NOTCHの遺伝子解析をグロムス腫瘍80例に対して施行した。同融合遺伝子は当教室の解析系では5例のみ検出されており、臨床病理学的あるいは組織病理学的なデータとの解析には不十分と思われたため、現在解析系を見直し再度遺伝子解析を施行する予定である。同様に、血管肉腫に対しても融合遺伝子解析系の構築を進めている。
心筋内細胞移植後の細胞増殖・分化機序の解明および移植最適細胞の開発に関する研究

方法:細胞培養:Lewisラットの大動脈および子宮・卵管より大動脈(ASMC)および子宮平滑筋細胞(USMC)を採取,第3世代まで継代培養後,移植細胞生着確認のため,BrdUで平滑筋細胞を標識.細胞移植:凍結傷害モデル作成3週後,ASMC, USMを瘢痕組織内中央に移植.心機能評価:細胞移植5週後,Langendorff潅流.細胞外マトリックス評価:ASMC群においてelatica van Gieson染色を行い,NIHイメージプログラムを用いて,エラスティンおよび総コラーゲン領域を算出.血管増殖因子定量:slot blotting解析で,瘢痕組織内のVEGFを定量.結果:血管増殖因子定量:瘢痕組織内VEGF定量ではASMC群,USMC群は共にコントロール群に比して高値.組織学的評価:ASMC群およびUSMC群共に移植5週後の瘢痕組織内でBrdU陽性細胞を多数認め,BrdU陽性内皮細胞あるいは平滑筋細胞が瘢痕組織内微少血管に認められた.細胞移植部位においてASMC群,USMC群は共にコントロール群より有意に多くのcapillary densityを認めた.左室リモデリングの評価:瘢痕組織の壁厚はASMC群,USMC群は共にコントロール群より有意に厚く,瘢痕組織左室面積比はASMC群,USMC群は共にコントロール群より有意に小さかった.細胞外マトリックス評価:エラスティン,総コラーゲン領域はASMC群がコントロール群より有意に大きかった.結論:1.平滑筋細胞移植により,瘢痕組織内において血管増殖因子を分泌,angiogenesisを促進,さらに心収縮機能の改善を認めた.2.移植平滑筋細胞は,少なくとも移植後5週間,瘢痕組織内で生存,失着.また,移植細胞が新たな血管形成に利用された可能性が示唆された.3.移植平滑筋細胞は瘢痕組織の菲薄化及び拡張を予防.血管平滑筋細胞は瘢痕組織内にて細胞外マトリックスを発現し,瘢痕組織のリモデリングへの関与が示唆された.方法:細胞培養:Lewisラットの大動脈および子宮・卵管より大動脈(ASMC)および子宮平滑筋細胞(USMC)を採取,第3世代まで継代培養後,移植細胞生着確認のため,BrdUで平滑筋細胞を標識.細胞移植:凍結傷害モデル作成3週後,ASMC, USMを瘢痕組織内中央に移植.心機能評価:細胞移植5週後,Langendorff潅流.細胞外マトリックス評価:ASMC群においてelatica van Gieson染色を行い,NIHイメージプログラムを用いて,エラスティンおよび総コラーゲン領域を算出.血管増殖因子定量:slot blotting解析で,瘢痕組織内のVEGFを定量.結果:血管増殖因子定量:瘢痕組織内VEGF定量ではASMC群,USMC群は共にコントロール群に比して高値.組織学的評価:ASMC群およびUSMC群共に移植5週後の瘢痕組織内でBrdU陽性細胞を多数認め,BrdU陽性内皮細胞あるいは平滑筋細胞が瘢痕組織内微少血管に認められた.細胞移植部位においてASMC群,USMC群は共にコントロール群より有意に多くのcapillary densityを認めた.左室リモデリングの評価:瘢痕組織の壁厚はASMC群,USMC群は共にコントロール群より有意に厚く,瘢痕組織左室面積比はASMC群,USMC群は共にコントロール群より有意に小さかった.細胞外マトリックス評価:エラスティン,総コラーゲン領域はASMC群がコントロール群より有意に大きかった.結論:1.平滑筋細胞移植により,瘢痕組織内において血管増殖因子を分泌,angiogenesisを促進,さらに心収縮機能の改善を認めた.2.移植平滑筋細胞は,少なくとも移植後5週間,瘢痕組織内で生存,失着.また,移植細胞が新たな血管形成に利用された可能性が示唆された.3.移植平滑筋細胞は瘢痕組織の菲薄化及び拡張を予防.血管平滑筋細胞は瘢痕組織内にて細胞外マトリックスを発現し,瘢痕組織のリモデリングへの関与が示唆された.平成12年度では1.成人ラットの心筋細胞培養2.心筋細胞の確認3.左心室瘢痕形成4.心筋細胞移植5.移植心筋細胞の特質の検討を行うことを申請時に計画していた。1.成人ラットの心筋細胞培養に関して・・・培養技術は問題無く、培養細胞の継代も問題無く実施できた。2.心筋細胞の確認に関して・・・培養細胞の収縮蛋白(ミオシン重鎖,トロポニンI)の免疫染色を行い、培養細胞が心筋細胞であることの確認を行った。3.左心室瘢痕形成に関して・・・左冠動脈結紮による心筋梗塞モデルを作成した。心筋梗塞モデルの瘢痕範囲の評価は心エコー図を用いて行った。梗塞作成4週間での心エコー検査では、左室は有意に拡大し、また梗塞部の壁運動は認められなかった。また梗塞部の組織学的評価も合わせて行った。4.心筋細胞移植に関して・・・左心室瘢痕作成後4週目に、同系ラットの左室瘢痕部へBrDUでラベリングした培養心筋細胞の移植を行った。移植後1週、4週、3カ月に移植部位の組織検査を行い、心筋細胞の生着を確認した。

5.移植心筋細胞の特質の検討に関して・・・移植心筋細胞の増殖を形態学的に観察した。瘢痕部に移植した心筋細胞を採取し再び細胞培養を行った。繊維芽細胞等より心筋細胞を分離培養し、移植細胞の収縮蛋白の免疫染色を行った。その結果、収縮蛋白は染色され、増殖細胞が心筋細胞由来のものであることを確認した。一般に成人心筋細胞は増殖はしないとされており、我々の研究では増殖の可能性を示唆する結果を得ており今後の検討を要する。6.追加検討項目・・・心筋細胞移植後1週、4週、3カ月後に断層心エコー検査にて心機能評価を行った。その結果、移植前には壁運動が認められなかった瘢痕部は移植後4週目には軽度の左室壁運動を認めるようになった。3カ月後では4週目と比し有意な壁運動の改善は認められなかったが、心筋細胞移植を行わなかった群に比し、左室の拡大は抑制された。以上、実験はほぼ計画通りに実施できており、現在、実験分担者である松林をカナダ・トロント大学に派遣しており,最新の知見ならびに技術を修得させている。今後、骨髄間質系幹細胞から心筋細胞への分化を認めた細胞に発現する各種転写因子を培養成人心筋細胞へ転写し、正常心筋細胞への分化能を獲得するか否かを検討し、成人心筋細胞の増殖・分化能の検討を行う予定である。免疫的同系ラットを使用して,大動脈及び子宮より採取した平滑筋細胞を凍結心筋傷害モデルに移植し,血管新生の誘発,血管増殖因子の分泌,さらに心筋能改善について評価を行った.方法:Lewis雌性ラットの胸部大動脈および子宮・卵管よりそれぞれ大動脈平滑筋細胞(ASMC)および子宮平滑筋細胞(USMC)を採取し,第2世代まで継代培養後,液体窒素内で凍結保存を行った.同系Lewisラットを用いて,液体窒素にて冷却した金属プローブにて貫壁性心筋傷害モデルを作成した.心筋傷害3週後に,ASMC,USMを瘢痕組織内中央に移植し,コントロールとして培養液を注入した.細胞移植5週後に心臓を摘出し,Langendorff灌流で心機能を測定した.その後,3mm厚に心臓をスライスしデジタル画像化し,computerized planimetry法により左室容積,左室、瘢痕組織の壁厚と面積を測定した.Factor VIII免疫染色,H&E染色を行い,瘢痕組織内・境界部位のcapillary density(CP)を光学顕微鏡下で計測した。ASMC群においてはelatica van Gieson(evG)染色を行い,瘢痕組織部位をデジタル画像化し,NIHイメージプログラムを用いて,エラスティン・総コラーゲン領域を算出した.細胞移植5週後に心臓を摘出しmicrospheresを冠動脈内に灌流し,瘢痕組織内のDisintegrations per minute(DPM)をneutron activation technologyを用いて測定した固定組織標本より,任意に瘢痕組織部位を摘出し,slot blotting解析にて,瘢痕組織内のVEGFおよびbFG)蛋白を定量した.結果:瘢痕組織内VEGF定量ではASMC群,USMC群は共にコントロール群(C群)に比して高値を示した.しかし,bFGFは有意差を認めなかった.ASMC群およびUSMC群共に移植5週後の瘢痕組織内でBrdU陽性細胞を多数認めた.また,瘢痕組織内および境界部位において,ASMC群,USMC群は共にコントロール群より有意に多くのCPを認めた.瘢痕組織内のDPMおよび局所血流係数は,ASMC群では有意にUSMC群とコントロール群より高かった.
卓状実験と分子運動アニメーションを連動させた熱力学バーチャルラボラトリーの開発

1.研究目的本研究は、卓上実験(マクロな視点)と分子運動のアニメーション(ミクロな視点)を連動させてリアルタイム表示できるバーチャルラボラトリーを開発することを目的とする。2.研究方法(1)気体の状態変化実験装置の作成200mlの注射器内に高度計測センサーを取り付け、気体の温度と圧力を測定できるようにした。またセンサーのコードは注射器の先端から取り出せるようにし、電子計測装置と接続した。(2)バーチャルラボラトリーの作成(1)の卓上実験装置から得られる圧力データと温度データとを電子計測装置を用いてデジタル化し、実験用ノートPCに取り込んだ。実験データから分子の運動をリアルタイムに表示できるシミュレーションプログラム(バーチャルラボラトリー)を作成した。(3)授業実践と評価今後、これまで行ってきた卓上実験と分子運動のアニメーションを別々に用いる授業と、二つをリアルタイムに連動させて表示するバーチャルラボラトリーを用いる授業を行う予定である。そして作成したバーチャルラボラトリーの有効性を評価し、その結果に基づいたバーチャルラボラトリーの改良を検討する。3.研究成果本研究によって、シリンダー中の気体というマクロな視点と、分子運動というミクロな視点をつなぎ、気体の圧力・温度・体積の関係などの熱力学的理解を促進できる教育システムを開発することができた。本教育システムを活用することは、生徒が熱力学現象に興味を持ち、エネルギー概念を身につけるという教育的意義を有するものである。
生活環境の差異による微量元素の毒性及び必須性の変動に関する実験的研究

〈研究目的〉微量元素の毒性、必須性を変動させる要因として、これまで生体の属性、栄養条件等についての研究がなされてきたが、環境条件、特に物理的環境条件の相違による変動についての研究は少ない。本研究では、微量元素(セレン)の毒性が、環境条件(環境温)によってどのように変動するかを動物実験により検討し、生活環境の異なるヒト個体群間における微量元素の毒性の変動についての基礎情報を提供することを目的とした。〈主要な知見〉1.亜セレン酸ナトリウム(SS)を、マウスに投与すると一過性・環境温依存性の体温低下を誘発した。また、環境温の高い場合ーこの場合、体温低下も認められないーにSSの急性致死毒性が増強されることを見いだした。環境温による毒性の修飾は、動物を予め高温馴化させた場合にも見られた。さらに、短時間の環境温の変化が長期にわたる毒性発現に影響しうることを認めた。これらの結果は、環境温がセレンの毒性を評価する上で、特に産業衛生学的に、重要な意義を持つ可能性をしめす。2.SSの他の生体影響を環境温あるいは体温低下との関連から検討した。死亡・体重変化を指標とするgross tpxicity、および、摂食昂進作用は環境温に依存した。これに対し、SSによるメタロチオネインの誘導は環境温に依存せず、また無機水銀の毒性軽減は体温低下とは直接には関係しないとの結果を得た。このように、環境温による毒性の修飾が体温の低下を介しているという可能性を別にすれば、亜セレン酸による体温低下の中毒学的意義は明確ではなかった。なお、SSによる体温低下誘導の起こる詳細な機序は不明であり、特異性の問題を含め、今後検討していく予定である。以上の結果以外に、微量元素の必須性の変動、ならびに、環境条件としての酸素分圧についても、検討の予定である。本年度実施した、マウスを用いた実験の内容及び知見は以下のとおりである。1.微量元素過剰食での飼育条件の検討:Zn,Srの各過剰食で雄を2週間飼育の後、体内分布の定量を行なった。Sr過剰では骨中Srの著明な増加を認めたのに対し、Zn過剰では通常の10倍のZn摂取であったにもかかわらず臓器中Znの変化は軽微であった。2.微量元素による生体影響の生理・生化・行動学的指標の検討:(1)致死量に満たないSeを一回投与した後に、体温低下酸素消費量の減少、摂食行動の誘発(いずれも一過性)が起きることを観察した。(2)Hg,Cr,Mn,Al,Mg,Caの一回投与によっても、Se同様の一過性の体温低下を生じた。Cu,Pb,Sn,Feについては明確な体温変化を認めなかった。Hgについては摂食行動の誘発をも確認したが、他の元素については未検討である。(3)Cr一回投与後、赤血球中グルタチオンレダクターゼ活性の低下を認めた。3.環境条件を変えて飼育するたの基礎的条件の検討:(1)温度条件の変化;1.間歇的に寒冷ばくろ(10°C)を行ない。食塩水と蒸溜水とを選択摂取させたころ、寒冷ばくろ期に食塩水の摂取が増加した。2.Se一回投与時の生体影響(2.(1)に記した)が環境温によって修飾されること、及びSe毒性(死亡率、体重変化によって評価)が環境温によって著しく変わることを認めた。(2)個体群飼育における生体影響指標として重要な繁殖力に対しSe及び有機Hgの及ぼす影響を、個別飼育条件下で検討した。特に妊娠前のばくろに注目した。

すなわち、有機Hgは一回投与の後、2週間連続でキレート剤を与え、その後交配して妊娠させ、繁殖能を検討し、Seは飲水に添加して1020日間与えた後、交配、妊娠させ、出産直前におけるSeの母体・胎盤・胎仔への分布を定量した。(3)低酸素条件での飼育装置(酸素消費量測定装置も兼ねる)を製作し、短期の試験を実施した。これまでに,セレン(Na_2SeO_3)をマウスに一回投与した場合に投与量に依存しておこる一過性の体温低下が環境温の高い場合にはみられないこと,更に高温下で飼育したマウスではセレンの致死毒性が高いことを明らかにし,セレン毒性と体温低下の関連についての研究を進めてきた.今年度得られた新しい知見は以下のとおりである.1.水銀(HgCl_2)の一回投与により,投与量に依存して一過性の体温低下がおこる.また,セレンと水銀を同時投与した場合にも体温低下がみられ,その低下の程度はそれぞれを単独投与した場合の低下を加算したものではなく,セレン単独投与の場合と同程度であった.2.水銀あるいはセレン単独投与による体温低下の程度は投与経路(静脈内,腹腔内,皮下)により差のあることが明らかとなった.水銀投与の場合,静脈内投与ではその投与量にかかわらず体温低下が認められなかった.3.水銀・静脈内投与の場合を除き,水銀またはセレン投与によって誘導された体温低下の程度と,投与5分後の血中水銀またはセレン濃度との間には高い関連性がみられた.このことより,投与直後に血中に存在する水銀またはセレンが体温低下の引金となり,更に体温低下の程度を決定することが示唆された.4.セレン単独投与によっておこる一過性の摂食昴進は,水銀単独投与あるいは水銀・セレン同時投与ではみられず,摂食昴進が体温低下により生じる二次的な反応ではないことが示唆された. 5.還元型グルタチオン(GSH)を投与した場合,血漿中GSH濃度は20分後にピークを示し2時間後には元のレベルにもどった.セレンの投与が血漿中GSH濃度の上昇中になされた場合その致死毒性が高まった.なお,体温低下もGSH投与によって強まった.6.セレン単独投与により,肝臓において量依存的にメタロチオネインの誘導が認められた.一方,環境温は肝臓のメタロチオネイン誘導に有意な影響を示さなかった.1.これまでの研究で、亜セレン酸投与によりマウスに誘発される一過性の体温低下、摂食昂進が高温下では誘発されないことがわかった。本年度は体温低下の程度と投与直後の血しょう中、赤血球中セレンとの間の関連性について、投与経路を変えた場合、及び異なった環境温下においた場合の経時的変化を調べ、以下の知見を得た。1-1.セレン投与2分から30分後までの経時的な血漿、赤血球中濃度を投与経路別(静脈血、腹腔内、頚部皮下、腹部皮下)に調べたところ、静脈内投与では他投与経路よりセレン濃度のピークがより早く現れた。(2分後)また、調べた投与量及び時間の範囲内でのセレン濃度は、静脈内・腹腔内からの場合赤血球>血しょうであり、これに対し皮下投与の場合、赤血球<血しょうとなって差がみられた。但し、これら投与経路によるセレン濃度の時間推移および血球・血しょう比の差と体温低下の程度の差との関連は明確ではなかった。1-2.投与後の短時間に高温環境においたマウスの血漿および赤血球中セレン濃度は、最大30分までの間では、常温においた場合とは差がみられなかった。
直接的芳香族カップリングを基盤とする高度パイ共役分子の集積合成

本課題では、新規なアリール置換芳香族およびヘテロ芳香族誘導体の創成にむけて、我々がこれまで手がけてきた配位性官能基をもつ芳香族基質の炭素ー水素結合切断を含む触媒的直接置換反応を基盤として、パイ共役系が拡張した芳香環連結化合物を簡便に構築する集積合成法の開発を行うことを目的としている。本年度は、これまでの成果を踏まえ、銅塩を促進剤として用いた含窒素複素環の酸化的直接アリール化反応の展開を中心に検討した。まず、種々の官能基を持つベンゼン誘導体とベンゾオキサゾールを基質に用い、酢酸銅存在下、オルトキシレンを溶媒に用いて条件検討を行った。その結果、8-アミノキノリンをアミン源とした安息香酸アミドが、130-140 °C程度の加熱条件で効率よくカップリングを受けることが分かった。この反応では、安息香酸アミドおよびアゾールのベンゼン環に電子吸引基および電子供与基が置換しても反応は円滑に進行した。生成物のさらなる誘導体化に有用なハロゲン置換基も共存可能であった。安息香酸の代わりにフランやチオフェンのような複素環のカルボン酸のアミド用いた場合や、オキサゾールの代わりにイミダゾールやチアゾールを用いた場合も反応は効率よく進行した。生成物中のアミノキノリン基は、エトキシ基に変換できた。さらに、反応機構について知見を得る目的で重水素ラベル実験を行った。(i)2位に重水素をもつベンゾオキサゾールは反応条件で容易にH-D交換を受けた。(ii)一方、反応条件でd5-安息香酸上の重水素はほとんどH-D交換をうけなかった。(iii)安息香酸上に重水素をもつ基質(d5)ともたない基質(H5)の反応速度比から、速度論的同位体効果KH/KDの値は2.0と見積もられた。これらの事実をもとに、C-H結合切断を律速段階に含む反応機構を提案した。25年度が最終年度であるため、記入しない。本年度は、これまでの成果を踏まえ、銅を促進剤として用いた含窒素複素環の酸化的直接アリール化反応を中心に検討した。まず、1-(2-ピリミジル)インドールとベンゾオキサゾールを基質に用い、酢酸銅存在下、オルトキシレンを溶媒に用いて条件検討を行った。その結果、150 °C程度の加熱条件で過剰量の酢酸銅を用いると、窒素下で効率よく反応が進行した。また、適量の酢酸を添加すると収率の向上がみられた。一方で、銅の触媒化検討において、空気化で反応を行うと、20 mol%程度にまで酢酸銅を減らしても反応が進行することが分かった。この反応では、インドールおよびアゾールのベンゼン環に電子吸引基および電子供与基が置換しても反応は円滑に進行した。インドールの3位にシアノ基のような電子吸引基が存在すると特に高い収率で生成物が得られた。また、ピロール誘導体上でもカップリングはうまく進行した。生成物中の2-ピリミジル基は塩基処理により容易に脱離可能であった。

反応機構について知見を得る目的で重水素ラベル実験を行った。(i)2位に重水素をもつベンゾオキサゾールは反応条件で容易にH-D交換が起こった。(ii)一方、2位に重水素をもつ1-(2-ピリミジル)インドールのH-D交換は遅いが、ベンゾオキサゾールが存在するとH-D交換が加速された。これらの事実をもとに、C-H結合切断を律速段階に含む反応機構を提案した。上記のように、銅を触媒あるいは促進剤として用いる集積的パイ共役分子の合成法の開発に成功した。一方で、ロジウムやルテニウムを用いる、新しいタイプのパイ共役拡張反応についても検討し、位置選択的ビニル化反応や縮環を伴う新規触媒反応系を見出し、1年間の当初計画以上の成果が得られた。次年度は、これらの反応のさらなる高度集積化を検討する予定である。酸化的クロスカップリング反応は、反応基質に前もってハロゲン化やメタル化を施す必要がなく、結合形成法として極めて有用である。特に本年度の中心的研究対象とした反応では、着脱可能な配向基を利用して反応を行えることが特徴である。今後、種々の金属触媒を組み合わせ、多様な基質を用いてパイ共役分子の合成研究を展開する。また、開発した反応を基盤とした新規機能材料の創成を目指す。25年度が最終年度であるため、記入しない。
自己抗体に着目した新規腹部大動脈瘤発症機転の検討

Angiotensin II持続投与により、高齢マウスでは若齢マウスに比べ、AAA形成を来しやすいことを確認した。高齢、若齢マウス、それぞれの血清から得られた抗体を若齢マウスに投与後、Angiotensin IIの持続投与を行った結果、高齢マウス抗体投与群においてのみ、AAA形成が惹起された。また、高齢マウスのIgGを酵素的に断片化すると、AAAを惹起しないこと、補体のC3を欠損したマウスにおいては、高齢マウス抗体はAAA形成を惹起しないことを示した。これらから、加齢により、抗体がAAA形成の惹起作用を持つこと、またその作用には補体の活性化を必要とすることが示唆された。野生型マウスとしてC57/BL6Jを用いた。高齢野生型マウス(1年齢1.5年齢)、若齢野生型マウス(8-10週齢)のそれぞれに浸透圧ポンプを用いてAngiotensin IIの持続皮下投与を28日間行った。超音波検査で経時的に観察した結果、高齢マウスでは腹部大動脈瘤を形成しやすいことを確認した。高齢野生型マウス(1年齢1.5年齢)、若齢野生型マウス(8-10週齢)、それぞれの血清から、protein Gカラムを用いてIgG抗体を精製し、SDS-PAGE、CBB染色を行い、純度に問題がないことを確認した。その後、若齢野生型マウス(8-10週齢)に対し、高齢、又は若齢マウス由来の抗体を投与後、浸透圧ポンプを用いてAngiotensinIIの持続投与を28日間行った。超音波検査で腹部大動脈を経時的に観察した結果、高齢マウス抗体投与群においては、腹部大動脈瘤形成が惹起された。抗体以外による作用の可能性を排除するため、高齢マウスの血清から抽出したIgGを酵素的に断片化したF(ab)'2を同様に若齢野生型マウスに投与し、Angiotensin IIの持続投与を行ったところ、動脈瘤形成を惹起しないことを示した。また、作用機序の解明を目的として、補体のC3を欠損したマウスに対して、高齢マウスの血清由来の抗体を投与後にAngiotensin IIの持続投与を行っても腹部大動脈瘤形成を惹起しないことを示した。本研究における、重要な表現型については結果を得られたと考えている。腹部大動脈瘤(AAA)は罹患率、致死率共に高い疾患で有り、病態理解には今なお不明な点が多い。ヒトのAAAの組織では、リンパ球や単球の浸潤が見られ、また抗体や補体の沈着が認められている。また、マウスでは、好中球の除去や補体の除去によって、AAA形成が抑制されることが報告されている(Eliason, Circulation, 2005)(Pagano, Circulation,2010)。これらから、免疫機構がAAAの病態に関わることが示唆されてきた。加齢はAAAの危険因子であるが(Singh, Am. J. Epidemiol, 2001)、その機序については不明な点が多い。一方、ヒト、マウスの双方で加齢とともに自己抗体が増えることが知られているが(Nagele, PLoS ONE, 2013)(Hayashi,Clin.exp.Immunol.,1989)、その機能については不明である。本計画では、加齢にともない、変容した抗体がAAA発症に関わるとの仮説の元に行った。野生型マウスとしてとしてC57/BL6Jを用いた。Angiotensin II持続投与下において、高齢マウスでは若齢マウスに比べ、AAAを形成しやすいことを確認した。高齢、若齢マウス、それぞれの血清からIgG抗体を精製し、若齢マウスに対し、高齢、又は若齢マウスの抗体を投与後、AngiotensinIIの持続投与を行った。その結果、高齢マウス抗体投与群においてのみ、AAA形成が惹起された。また、高齢マウスのIgGを酵素的に断片化したF(ab)'2では、AAAを惹起しないこと、補体のC3を欠損したマウスにおいては、高齢マウス抗体はAAA形成を惹起しないことを示した。抗体機能の解析について、高齢、若齢マウス、それぞれのIgGの動脈組織への結合能に関して、マウス動脈組織切片を用いた、ex vivo免疫染色にて、またマウス動脈組織由来の蛋白を用いたwestern blottingにて評価する。動脈瘤形成に関わる分子である、MMP-2,9、MCP-1、TNF-α、IL-6の発現について、免疫染色とRT-PCRを用いて解析を行う。また、MMP-2,9の活性評価として、Zymographyを行う加齢医学
心筋梗塞壊死進展における動脈硬化病変の意義-レニン・アンジオテンシン系と一酸化窒素との連関-

実験的心筋梗塞モデルの梗塞量を縮小する薬剤が必ずしも臨床症例においてその有効性を発揮することができない。その理由の一つは、臨床例における再潅流障害には、冠動脈硬化病変が基盤に存在することである。アンジオテンシン変換酵素(ACE)阻害薬は動脈硬化進展を抑制しうること、動物モデルでの心筋梗塞の壊死進展を抑止することがすでに報告されている。ACE阻害薬はキニナーゼの阻害をも行い、ブラジキニンの上昇、NO産生の亢進をもたらすことから、動脈硬化モデルにACE阻害薬を投与することにより冠動脈硬化を抑制しNO産生を保持すると、心筋梗塞の壊死進展抑制効果が期待できる。本研究においては、日本家兎を1%コレステロール食で10週間飼育することにより、高コレステロール血症モデルを作成した。高コレステロール負荷家兎においては、正常食ウサギに比し著明な心筋梗塞巣の拡大を認めた。高コレステロール食ウサギにおいては、虚血領域におけるミエロペルオキシダーゼ活性、ロイコトリエンB4産生が増大しており、冠微小循環における白血球活性化が心筋障害に関与していることが示唆される。高コレステロール負荷ウサギにおいては内皮依存性弛緩反応が減弱し、外因性のNO供与体を投与すると心筋梗塞巣の拡大が抑制されることより、血管内皮由来NO産生低下が白血球活性化をもたすことが考えられる。一方、高コレステロールウサギにおいては、血管壁ACE活性、血中アンジオテンシンIIレベルが上昇した。ACE阻害薬を投与すると、両者の低下とともに、動脈硬化巣の縮小を認めた。これらの結果は、動脈硬化病変を基盤に持つ虚血性心疾患において心血管組織におけるレニン-アンジオテンシン系の活性化がNO産生を抑制し、冠微小循環の白血球活性化を介した心筋梗塞巣の拡大をもたらすこと、ACE阻害薬がかかる病態の抑制に有用である可能性を示唆する。[目的]アンジオテンシン変換酵素(ACE)阻害薬は動物モデルにおいて動脈硬化の進展を抑制し、この作用機作としてアンジオンテンシン(Ang)IIによる細胞増殖作用の関与が報告されている。しかし、動脈硬化進展における経時的な血管組織レニン・アンジオテンシン系(RAS)の変化は明らかではない。今回、動物モデルを用いて、ACE阻害薬慢性投与時の動脈硬化初期と成立期における血管系と血中のRASを対比すると共に、Angによる血圧昇圧反応の変化を検討した。[方法]家兎を正常食あるいは、1%高コレステロール(Chol)食で4週(n=20)、10週(n=36)飼育し、各群の半数にエナラプリル(E,3mg/kg/d)を投与した。血中、大動脈組織中のACE活性を測定し、Ang I,II(3ng/kg)による昇圧反応を観血的に計測した。[結果]1.血中Chol値はE投与の有無で差を認めなかった。血中ACE活性は、Chol負荷による差は認めなかったが、E投与により有意に低下した。大動脈ACE活性はChol負荷により上昇し、E投与による抑制率は著明に減弱していた。2.Chol負荷10週群でAng Iによる昇圧反応は有意に上昇し、Eによる抑制効果も低下していた。[総括]Chol負荷により大動脈ACE活性は上昇し、EによるACE活性抑制率は血中より大動脈組織の方がより軽度であった。Ang Iに対する昇圧反応は動脈硬化成立期(10週)で亢進しており、動脈硬化進展におけるRASの関与が示唆される。ACE阻害薬は動脈硬化の進展度によりその効果発現が異なると考えられる。その理由の一つは、臨床例における再潅流

障害には、冠動脈硬化病変が基盤に存在することである。アンジオテンシン変換酵素(ACE)阻害薬は動脈硬化進展を抑制しうること、動物モデルでの心筋梗塞の壊死進展を抑止することがすでに報告されている。ACE阻害薬はキニナーゼの阻害をも行い、ブラジキニンの上昇、NO産生の亢進をもたらすことから、動脈硬化モデルにACE阻害薬を投与することにより冠動脈硬化を抑制しNO産生を保持すると、心筋梗塞の壊死進展抑制硬化が期待できる。本研究においては、日本家兎を1%コレステロール食で10週間飼育することにより、高コレステロール血症モデルを作成した。高コレステロール負荷家兎においては、正常食ウサギに比し著明な心筋梗塞巣の拡大を認めた。高コレステロール食ウサギにおいては、虚血領域におけるミエロペルオキシダーゼ活性、ロイコトリエンB4産生が増大しており、冠微小循環における白血球活性化が心筋障害に関与していることが示唆される。高コレステロール負荷ウサギにおいては内皮依存性弛緩反応が減弱し、外因性のNO供与体を投与すると心筋梗塞巣の拡大が抑制されることより、血管内皮由来NO産生低下が白血球活性化をもたすことが考えられる。一方、高コレステロールウサギにおいては、血管壁ACE活性、血中アンジオテンシンIIレベルが上昇した。ACE阻害薬を投与すると、両者の低下とともに、動脈硬化巣の縮小を認めた。これらの結果は、動脈硬化病変を基盤に持つ虚血性心疾患において、心血管組織におけるレニン-アンジオテンシン系の活性化がNO産生を抑制し、冠微小循環の白血球活性化を介した心筋梗塞巣の拡大をもたらすこと、ACE阻害薬がかかる病態の抑制に有用である可能性を示唆する。