hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
肺癌手術検体よりの初代培養細胞による同所性移植SCIDマウスモデルの作成

肺癌でリンパ行性または血行性転移の有無の把握は、治療効果や予後の予測に重要である。私達はMa44-3肺癌細胞株をSCIDマウスの肺に同所性に移植し、高率にリンパ節転移を生じるモデルを作成した。更にMa44-3細胞株にGreen Fluorescent Protein発現遺伝子を導入し、同所性にSCIDマウスに移植した。これにより、肺内に移植した癌細胞が増殖し肺門を経て縦隔へリンパ行性に転移していく様子が蛍光発色した病変部位として確認され、臨床での肺癌の転移様式と酷似していた。また、細胞株(Ma2、Ma10、Ma25、Ma44-3、A549)を変えることで、この同所性移植モデルは細胞それぞれの転移能を反映し、リンパ行性転移のみならず血行性転移も生じた。すなわち、この同所性移植モデルにより癌細胞それぞれの転移能の評価が可能である。転移メカニズムの解明は現在もその途中段階にあり、私達の同所性移植実験モデルは転移メカニズムの解明の手助けとなりうる。ヒト肺癌細胞株3種(Ma2、Ma25、A549)及びヒト肺癌切除検体初代培養細胞2種(FM205、FT821)でマウスの移植部腫瘍のRNAと移植前の細胞RNAをセットにし、DNAマイクロアレイで57種(薬物代謝,薬剤耐性,DNA修復蛋白等)の遺伝子発現の違いを検討した。それぞれの細胞株と移植後の肺腫瘍のmRNAは、Pearsonの相関係数0.88830.9533で、両者は有意に相関していた。これより、移植前の腫瘍細胞はSCIDマウス肺に移植後も遺伝子的変化はほとんどなく、移植後の肺腫瘍は移植前の細胞の特性を保持していると考えられた。個々の癌細胞はそれぞれ転移様式、転移速度、更には抗癌剤の感受性などに違いがある。不均一な細胞の集まりであるヒト肺癌の転移能や薬剤感受性を検討するためには臨床で得られた肺癌組織を対象として研究する必要がある。今回私達は、臨床の肺癌切除材料5例より初代培養癌細胞2種を作成し、これを用い同所性移植モデルの作成に成功した。成功した2種の細胞において病理学的にこのモデルの腫瘍と臨床の標本は類似していた。更に転移形式においても、臨床では縦隔にリンパ節転移を認めており私たちのモデルでも縦隔に転移をきたしており、類似していた。現在、臨床の肺癌切除材料より高率に初代培養癌細胞を作成し、同所性移植モデルにより転移能や抗癌剤の抗腫瘍効果と転移抑制効果を同定するというシステムを確立すべく研究を行っている。我々の研究室では、肺癌細胞株をSCIDマウスに同所性に移植し、縦隔リンパ節転移を生じるモデルを作成した。今回、肺癌手術検体5例より初代培養を行い、2例は癌細胞を線維芽細胞より分離できた。

残り3例は培養途中で、真菌感染1例および線芽細胞の優位な増生2例の為分離できなかった。分離できた2肺癌細胞(FT821細胞:大細胞癌,pT3N2M1とFM205細胞:低分化腺癌,pT4N2MO)をSCIDマウスに同所性移植した。FT821細胞(n=15)は4週目以降には15/15匹(100%)が移植部(左肺内)に腫瘍を形成し、さらに14/15匹(93.3)が縦隔リンパ節に転移していた。顕微鏡的に移植の後4週までに縦隔転移を認め、6週までに肉眼的に転移を認めた。FM205細胞(n=9)は4週目以降には9/9匹(100%)が移植部に腫瘍を形成し、さらに8/9匹(88.9%)が縦隔リンパ節に転移していた。移植後4週までの顕微鏡的に縦隔転移を認め、16週には肉眼的に転移を認めた。SCIDマウスの肺の中の腫瘍の病理学的発見は、患者の外科的に切除された癌と非常に類似しており、いずれの切除材料でも、縦隔リンパ節転移を認めており、我々のモデルでもマウスの縦隔リンパ節転移を認めた。肺に移植された腫瘍サイズは、時間経過により大きくなり、縦隔リンパ節転移の数とそのサイズは増加していった。これらの初代培養細胞のリンパ行性の転移能は、臨床腫瘍のそれと類似していた。平成15年度、私達は人肺癌細胞株(Ma2、Ma10、Ma25、Ma44-3、A549)5種及び人肺癌切除検体初代培養細胞2種を用い肺癌同所移植モデルを作成。経時的に転移様式を病理学的に検討した。結果は(リンパ行転移のみ:3種、血行性転移のみ:1種、リンパ行性転移と血行性転移の両方:2種、転移なし1種)であった。この同所性移植モデルは、リンパ行性転移のみならず血行性転移も生じた。我々のモデルは、肺癌細胞の違いにより、移植部肺での増殖能、転移能及び転移様式に違いを認め、癌細胞そのものの転移ポテンシャルを反映するものと思われる。更に、このモデルを用い、ヒト肺癌細胞株3種(Ma2、Ma25、A549)及びヒト肺癌切除検体初代培養細胞2種(FM205、FT821)でマウスの移植部腫瘍のRNAと移植前の細胞RNAをセットにし、DNAマイクロアレイで57種(薬物代謝,薬剤耐性,DNA修復蛋白等)の遺伝子発現の違いを検討した。それぞれの細胞株と移植後の肺腫瘍のmRNAは、Pearsonの相関係数(R)はMa2:R=0.9533、Ma25:R=0.9259、A549:R=0.9070、FM205:R=08883、FT821:R=0.9335)で、マウスの移植部腫瘍のRNAと移植前の細胞RNAは有意に相関していた。これより、移植前の腫瘍細胞はSCIDマウス肺に移植後も遺伝子的変化はほとんどなく、移植後の肺腫瘍は移植前の細胞の特性を保持していると考えられた。現在、臨床の肺癌切除材料より高率に初代培養癌細胞を作成し、そして、同所性移植モデルにより転移能や抗癌剤の抗腫瘍効果と転移抑制効果を同定するというシステムを確立すべく研究を行っている。これにより臨床での原発癌の転移能の評価や有効な抗癌剤の選択が可能になり、患者個別の治療に有用である。
インスリン様成長因子－１（ＩＧＦ－１）による神経保護再生作用の研究

当該年度は、IGF-1単独投与効果を検討するに当たり、現実的な観点(薬剤(IGF-1、IGFBP-2)投与量、動物飼育場所と数)から、再度マウスによる脳虚血侵襲動物モデルの作成と脳梗塞範囲の検討を行わざるをえなくなった。動物はC57BL/6Jを使用。Isofluraneによる全身麻酔下(ISO濃度0.7-2.0%, Room Air、自発呼吸)に、総頸動脈からの糸上げ法(5-0ナイロン3cm、シリコンゴムコーティング、総頸動脈分岐部より18mm挿入)により90分間左中大脳動脈を閉塞、その後threadを抜去し、総頸動脈を結紮して覚醒させた。7日後麻痺の有無を調べた後、脳を摘出し凍結切片を作成し、Cresyl Violet染色を行い、脳梗塞体積を計測した。結果は、生存率約60%、7日目の片麻痺率は約50%、脳梗塞体積はコントロール群と比較して30%前後であった。この条件下に、梗塞作成後1日目で片麻痺を後遺した動物にIGF-1を20ug IP one shotで投与して、同様に評価した。しかし、生存率・片麻痺率・脳梗塞体積、ともに薬剤非投与群と差がない結果となり、投与条件の再検討が必要である。しかしながら、平成26年度は、研究代表者が当研究施設退職することになり、当該研究を継続することが困難となった。最近当研究に類似した論文が発表され(BMC Neurosci. 2013; 14: 158.)、in vitroでOGDにより神経細胞・グリア細胞ともにIGFBP2の発現が亢進し、マウスのMCAOモデルで、虚血再灌流72時間後に、虚血コア・ペナンブラ・虚血側嗅球におけるIGF-1とIGFBP2の発現が有意に亢進していることが報告された。その他、IGFBP-2のIGF-1促進効果やIGF-1非依存性作用の報告も散見されるようになり、当研究の妥当性が図らずも他の研究によって先に証明されつつある。将来可能であれば、IGF-1とIGFBP-2投与の研究を再開したいと考えている。インスリン様成長因子-1(以下、IGF-1)は、神経保護及び神経再生作用を有する生体活性物質の一つである。このポリペプチドは、成長ホルモン(GH)の刺激で主に肝臓で分泌され、低酸素ー虚血を代表とする様々な侵襲による神経細胞死を減弱させると言われている。一方、IGFに結合する蛋白(以下IGFBP)は6型報告されており、中枢神経系でIGF-1との作用で重要なのはIGFBP-2と言われ、神経保護・再生・増殖に関与していることが報告されている。IGF-1、IGFBP-2個別には、それぞれ膨大な研究成果がある。しかし、我々の研究は、より臨床的実践的なIGF-1投与法の検討、そのIGF-1投与法による神経再生の程度とその詳細、IGF-1/IGFBP-2の同時投与による上乗せ効果を検討するものであり、ここで得られる結果は全てnovelなものとなる。当該年度は、薬剤投与効果判定の前段階として、脳虚血侵襲動物モデルの作成と脳梗塞範囲の検討を行った。動物はLong Evans Ratを使用。

Chenらのモデルを採用し(Chen et al. Stroke. 17: 738-743, 1986)、isofluraneによる全身麻酔下に、片側中大脳動脈と総頸動脈を永久閉塞し、対側総頸動脈60分遮断を行った。2日後に脳を摘出し、TTC染色を行った。結果はコントロール群と比較して脳体積で40%の梗塞が認められた。生存率は100%であった。当初の予定では、平成24年度中に行う事項として以下の項目が挙げられる;(1)虚血侵襲手術:全脳虚血あるいは局所脳虚血(2)IGF-1投与:腹腔内ワンショット(3)虚血脳侵襲保護効果・神経再生効果の評価:生理学的検査(筋力テスト、Rotarod test)、脳梗塞巣の体積測定、BrdU陽性新生細胞数計測、発現タンパク量(IGF-1、IGFBP-2、IGFBP-3、IGF-1 receptor)定量、新生神経細胞マーカーによる免疫染色。しかし、実際には、局所脳虚血モデルの作成までにとどまったことにより、目的の達成度は遅延している。その理由は、1全脳虚血モデルでは、生存率が低いため、より生存率の高い、局所脳虚血モデルに変更せざるをえなかったこと。2局所脳虚血モデルの条件設定に難渋した。(a)脳梗塞体積のばらつき(b)脳虚血による麻痺症状の有無(c)生存率のばらつき。などが考えられた。しかし、最終的に前述の結果で示した条件設定により、安定した局所脳虚血モデル作成が可能となった。平成25年度中に行う事項として、昨年度(平成24年度)行う予定であった以下の項目について、引き続き検討していく方針である。即ち、(1)虚血侵襲手術:局所脳虚血モデル作成(2)IGF-1投与:腹腔内ワンショット(3)評価:生理学的検査、脳梗塞巣の測定、BrdU新生細胞数計測、発現蛋白量、免疫染色、である。同時に、IGF-1/IGFBP-2の併用実験の前に、IGFBP-2単独投与実験を先行する方針である。主として、動物(ラット、マウス)購入ならびに飼育・処理、破損した手術器具、試薬・抗体・麻酔薬などの消耗品に研究費を使用することになる。該当なし
光触媒による新規複合型レドックス反応の開発

紫外線照射下の酸化チタン光触媒によるアセトフェノン誘導体などの芳香族ケトンの還元的水素化反応において、対応する芳香族2級アルコールが高収率(約100%)で得られた。この反応は、酸化チタン表面で起こるエタノールの酸化反応との共役複合レドックス反応に伴って効率よく進行することが証明された。一方、タンタル酸化物光触媒(NaTaO_3とTa_2O_5)を使うと、二酸化炭素の還元反応によるギ酸生成とエタノールの酸化反応による酢酸生成の複合型レドックス反応が同時複合的に進行することが明らかとなった。光触媒表面では、光励起により正孔と励起電子の活性種が生成し、特異なレドックス反応を引き起こすことができる。本研究ではこの可能性に着目し、平成21年度において、研究(1):新規な連続複合型レドックス有機化学反応系の開発と、研究(2):複合型レドックス反応によるCO_2固定化反応の開発、および、研究(3):複合型レドックス反応による高効率還元反応系の開発、の3つを柱として研究を推進した。まず研究(1)では、代表者(甲谷)と分担者(宮部)が学内研究生を動員し、酸化チタン光触媒を使って、ピルビン酸メチル(αケトエステル)とアセチルアセトン(βケトエステル)の分子間で起こる連続複合型レドックス反応を検討した。しかし、この反応は予想に反して、全く進行しないことが明らかとなった。次に研究(2)では、代表者(甲谷)が研究支援者(趙)を動員して、硫化亜鉛光触媒によるアルキルカルバミン酸塩の還元と1級アミンの酸化を組み合わせた複合レドックス反応により、α-アミノ酸が生成するかを検討した。しかし、反応溶媒の選択がうまくいかず、アルキルカルバミン酸塩と1級アミンが分離してしまうという問題点が明らかとなった。また、GC-MSによる反応追跡手法に問題があることも判明した。最後に研究(3)では、代表者(甲谷)と分担者(吉岡)が、酸化チタンの作用でアセトフェノン等の芳香族カルボニル化合物がほぼ100%の収率でアルコール体へと還元できることを明らかにした。このように、酸化チタン光触媒は、温和な条件下で芳香族カルボニル化合物を2級アルコールに還元するのに優れた光触媒であることが分かった。さらに、二環系及び三環系芳香族カルボニル化合物を基質とした場合、反応の進行が途中で停止してしまうという触媒化学的に興味深い現象も発見することができた。本研究ではこの可能性に着目し、平成22年度において、研究(1):複合型レドックス反応によるCO_2固定化反応の開発と、研究(2):複合型レドックス反応による高効率還元反応系の開発、の二つの研究テーマを推進した。まず研究(1)において、代表者(甲谷)と分担者(宮部)は、励起電子によるCO_2還元と正孔によるエタノールの酸化を組み合わせた複合レドックス反応が、常圧下で進行し、乳酸へと効率よく合成できるかを検討した。光触媒には、タンタル酸系光触媒のうち、特徴的な表面ステップ構造をもつランタンドープ型のタンタル酸ナトリウム光触媒(La : NaTaO_3)を利用し、銀微粒子を助触媒として、上記反応を検討した。その結果、乳酸への合成には至らないが、CO_2還元によるギ酸の生成が認められた。また、ギ酸、乳酸、および酢酸の生成を効率よく分離して、高感度で分析できる蛍光ラベルHPLC法の確立に成功した。研究(2)では、代表者(甲谷)と分担者(吉岡)が、酸化チタンによるアセトフェノンの2級アルコールへの還元について、アセトフェノンのメチル基をフッ素化することによる速度論的効果を詳細に検討した。その結果、アセトフェノンを基質とした場合、ラングミュアーヒンシェルウッド速度論モデルでうまく解析できることが明らかとなった。一方、2,2,2-トリフルオロアセトフェノン(TFA)の場合、1次反応速度則で解析できることが分かった。両者の速度論的挙動の違いは、反応の律速段階の違いにあると考察できる。アセトフェノンでは、光量律速ひいてはTiO_2上での表面反応が律速になっており、TFAでは、TiO_2上への基質の吸着過程が反応速度を支配する吸着律速になっていることが判明した。本研究ではこの特性に着目し、研究(1):複合型レドックス反応によるCO_2固定化反応の開発と、研究(2):複合型レドックス反応による高効率還元反応系の開発、の二つの研究テーマを推進した。

研究(1)では、高い酸化還元能力を有するタンタル系酸化物光触媒(Ta_2O_5,NaTaO_3など)を用いて、エタノールとCO_2から乳酸を合成する反応を検討した。今のところ目的とする乳酸合成には成功していないが、数多くのタンタル系酸化物光触媒からCO_2の還元でギ酸が生成することを確認した。本研究成果より、多孔性細孔をもつチタン系光触媒あるいはCO_2を強力に還元できるタンタル原子で構成される多孔質光触媒が有効であることが示唆され、今後の研究の方向性が明確となった。研究(2)では、TiO_2表面おけるアセトフェノン誘導体の光還元機構を明らかにするために、紫外光照射によりあらかじめTiO_2表面のバンドギャップ内にある電子捕捉準位に反応性電子を蓄積させたのち、過剰量の基質を注入してTiO_2から基質への電子移動を誘起し、生成物の同定・定量およびその時間変化を追跡した。その結果、TiO_2からアセトフェノン誘導体への電子移動は、全てTiO_2表面の電子捕捉準位を介して起こることが明らかとなった。また、電子移動量とアセトフェノン誘導体の還元電位との間に強い相関関係がみられたことから、TiO_2表面上での光還元反応は、TiO_2表面の電子捕捉準位からアセトフェノン誘導体への電子移動過程が全反応速度を支配していることが明らかとなった。
扁桃病巣感染症の病態における抗コラーゲン抗体の意義に関する研究

1.扁桃病巣感染症の代表的二次疾患である掌蹠膿疱症(以下PPP)患者血清の検索にて以下の知見が得られた.(1)扁桃摘出術前後におけるPPP患者血清中の抗コラーゲン抗体価のIgGはタイプI・III・VそしてVIにおいてコントロール群よりも有意に高い値を示した.IgMはタイプIIにおいてPPP群で有意に高値を示した.(2)血清中の免疫複合体量はPPP群では対照群に比し有意に高値を示した.また,PPP群において扁摘後免疫複合体量は皮疹の改善と共に有意に低下した.(3)血清中の抗細菌抗体価は抗pyogenes T4のIgG,抗MitisのIgGにおいてPPP群で有意に高値を示した.他の菌腫でもおおむねPPP群で高値を示す傾向にあった.また,Sanguis Iに対するIgG抗体価は扁摘後有意に低下した.(4)扁摘後皮疹改善群と非改善群に分けて,各パラメーターの相関を調べた.抗細菌抗体価と免疫複合体量との間には有意な相関はなかったが,抗細菌抗体価と抗コラーゲン抗体価との間には有意な相関を示すものがあった.扁桃組織内にもコラーゲンが存在しており,連鎖球菌のアジュバント作用の可能性も含め今後の課題として検討していきたい.2.PPP患者の扁桃リンパ球における抗コラーゲン抗体(タイプIVI)産生細胞数をELISPOT法により検索し,以下の知見を得た.(1)コントロール,反復性扁桃炎,掌蹠膿疱症のいずれの群においてもタイプIII,VIに対する抗体産生細胞の数が多い傾向を認めた.(2)3群間での各サブクラスにおける抗コラーゲン抗体産生細胞数に有意差は認められなかった.患者群での血清抗コラーゲン抗体高値がどのような機序で生じたか,末梢血リンパ球の検索を含め今後研究したい.1.扁桃病巣感染症の代表的二次疾患である掌蹠膿疱症(以下PPP)患者血清の検索にて以下の知見が得られた.(1)扁桃摘出術前後におけるPPP患者血清中の抗コラーゲン抗体価のIgGはタイプI・III・VそしてVIにおいてコントロール群よりも有意に高い値を示した.IgMはタイプIIにおいてPPP群で有意に高値を示した.(2)血清中の免疫複合体量はPPP群では対照群に比し有意に高値を示した.また,PPP群において扁摘後免疫複合体量は皮疹の改善と共に有意に低下した.(3)血清中の抗細菌抗体価は抗pyogenes T4のIgG,抗MitisのIgGにおいてPPP群で有意に高値を示した.他の菌腫でもおおむねPPP群で高値を示す傾向にあった.また,Sanguis Iに対するIgG抗体価は扁摘後有意に低下した.(4)扁摘後皮疹改善群と非改善群に分けて,各パラメーターの相関を調べた.抗細菌抗体価と免疫複合体量との間には有意な相関はなかったが,抗細菌抗体価と抗コラーゲン抗体価との間には有意な相関を示すものがあった.扁桃組織内にもコラーゲンが存在しており,連鎖球菌のアジュバント作用の可能性も含め今後の課題として検討していきたい.2.PPP患者の扁桃リンパ球における抗コラーゲン抗体(タイプIVI)産生細胞数をELISPOT法により検索し,以下の知見を得た.(1)コントロール,反復性扁桃炎,掌蹠膿疱症のいずれの群においてもタイプIII,VIに対する抗体産生細胞の数が多い傾向を認めた.(2)3群間での各サブクラスにおける抗コラーゲン抗体産生細胞数に有意差は認められなかった.患者群での血清抗コラーゲン抗体高値がどのような機序で生じたか,末梢血リンパ球の検索を含め今後研究したい.
伝導性・磁性の両方から興味が持たれる新規ドナー分子の開発

上記の課題名で1年間研究を進めてきた結果、その目標の条件を満たした新規ドナー分子が合成された。この分子は遷移金属や希土類元素などの常磁性金属イオンを中心金属とする錯体であり、その特徴は、有機伝導体の歴史の中でも最も興味ある物性データを提供し続けてきたBEDT-TTF分子と二つのシアノ基を配位子に持ったアニオンだということである。分子全体の大きさや形状はBEDT-TTFそのものとさほど変わらないため、固体(結晶)中でBEDT-TTF側はこれまでのように自己集積し、高密度の硫黄原子同士の多次元ネットワークを組むことが期待される。これは分子軌道計算の結果からも支持される予想である。つまりBEDT-TTFを配位子とすることにより、まず高い伝導性を確保しようとした。次にこの錯イオン全体は負の電荷を持つため、正の電荷を持つイオンをカウンターイオンとして結晶化する。このときシアノ基が二つあることにより、金属イオンが共存すれば配位結合を形成して積極的に結晶中に金属イオンを取り込むことが期待される。つまりシアノ基は、中心金属とカウンターイオンの金属とを架橋して結ぶ役割を期待されている。もしこれら二種の金属イオンのスピンが異なれば、この両者の磁気的相互作用のいかんに関わらず固体全体としては強磁性を示すことが期待される。こうして有機分子性物質としては初の金属的導電性とバルク強磁性を兼ね備えた固体をめざしている。また、本研究によって開発された新規ドナー分子は、その分子構造上の特徴により、多数の、これまでにドナーにない優れた特質を実現している。例えば、溶解度が高く、それもカウンターイオンによって変えられる点、酸化電位がBEDT-TTFよりもはるかに低い点、BEDT-TTFと金属イオン上のスピンとの相互作用を確保している点、二種類の金属イオンを導入でき、それらの間の相互作用の確保している点などである。
自然滞積粘土の原位置有効応力を解放しない特殊な3軸試験装置及び試験方法の開発

原位置有効応力保存式三軸試験装置に再圧密装置を付加し不撹乱粘土試料に対する実験の適用範囲を拡大することを目的として研究を行なった。上記の特殊な装置を用いて九谷粘土を対象とした一連の実験をとり行ない特にせん断中に発生するすべり線の発達が原位置有効応力状態の保存の程度とどのように関係しているかを調べた。その結果通常の1軸試験装置や3軸試験装置を用いて実験した場合に較べてすべり線の発生がきわめて一様になり、細かなすべり線がアミ目のように発達することが判った。またすべり面は通常考えられているような一枚の平面ではなくほぼ軸対称的に試料表面に分布しており、試料内部に向って数ミリの深さをもっていることが観察された。このことは一般に使われている安定解析法の基本的な前堤であるすべり線が実のところ想定されているほど単純ではなく将来再構築されるべきものであることを示しているといえよう。再圧密装置自体は単純なものであるため特に問題なく実験をとり行なうことができたが、各種の不撹乱粘土に対する実験結果をつみ積ねることにより、たとえばKo値等の力学定数についての知見が畜積されてゆくものと考えられる。これまでに本研究で測定されたKo値や土の応力-ひずみ-強度関係は九谷粘土に限られているため原位置有効応力状態の各種力学特性への影響については今後の実験のつみ重ねが必要であろう。また再圧密装置や原位置有効応力保存式3軸試験装置自体の改良点など、より簡便な実験方法の確立を目的とした研究の必要性はあるが、原理的には特に問題点もみつからなかったため、本研究の所期の目的は達成されたといえよう。
脊椎動物頭部進化の比較分子発生学的解析

哺乳類(マウス、ウサギ、ブタ、スンクス)、爬虫類(ゲッコー、スッポン)、鳥類(ニワトリ)、両棲類(カエル)、総鰭類(シーラカンス)、腕鰭類(ポリプテルス)、真骨魚類(ゼブラフィッシュ、メダカ、フグ)、軟骨魚類(エイ)、無顎類(ヤツメウナギ)を比較発生及び比較ゲノム解析することによって、胚体外ヘッドオーガナイザー組織の相同的起源、ヘッドオーガナイザーOtx2遺伝子カスケードの肉鰭類での成立、条鰭類と肉鰭類で異なる神経外胚葉形成機構、皮質層構造形成の起源などを明らかにした。現在なお、脊椎動物の起源、門レベルの進化を解明する道筋はない。しかし、各脊椎動物での分子発生学的解析の進捗とゲノム情報の進捗によって、綱レベルでの脊椎動物の体造りの変化を解明する時点に達した。脊椎動物の頭部は脳と神経堤細胞のつくる頭蓋によって特徴づけられ、これに比する構造は原索動物には存在しない。脊椎動物にのみ特有な頭部はまた脊椎動物進化の過程で最も劇的に変遷した構造で、生物体最高の所産であるヒト新皮質を生み出した。本研究は頭部形成の各段階で主要な役割を果たす頭部ギャップ遺伝子について、各発現を制御するシスエレメントを中核に、上流因子、協働因子、下流因子を含めた遺伝子カスケードの変化として脊椎動物の頭部進化を明らかにする。(i)ほ乳動物に特有なエピブラスト、臓側内胚葉でのOtx2遺伝子カスケードの成立機序ヒトOtx2エピブラスト(EP)エンハンサー相当領域にはEPでの発現活性がなく、EPでのOtx2発現は齧歯類に特徴的なことが示唆され、ブタ、イヌでの解析をすすめた。マウス臓側内胚葉(VE)エンハンサー及びカエルの相当領域がカエル原腸胚深部内胚葉で活性を持っことを確定し、ともに上流でFoxa2の支配を受けていること、ともに下流でdickkopfを制御することを明らかにした。(ii)真骨魚と四足動物で異なる吻側神経外胚葉形成、Otx2/Otx1機能の成立機序マウス吻側神経外胚葉でOtx2の下流で働くshisaについて生化学的機能解析を進めた。真骨魚ではFMエンハンサーがAN活性を獲得することによって、四足動物のANエンハンサー相当領域を失ったが、真骨魚でのFMエンハンサーのAN活性獲得はSox siteの一つをSix siteに変え、X領域(仮称)の配列を変えることによって起こったことを明らかにした。四足動物ANでもSix3は発現するが、そのAN enhancerはSix3の支配を受けていない。X領域の解析を進め、またシーラカンス、エイのエンハンサー構成を明らかにし、エイ胚Otx cognatesの発現解析を行ったさらにポリプテルス、ヤツメ胚でのOtx cognatesの発現解析。ゲノムの解析を進めた。(iii)前脳の初期領域化機構、新皮質の成立機序各段階の吻側神経外胚葉でのEmx2,Pax6発現を制御するエンハンサーを確定し、その詳細解析を進めた。Emx2/Pax2重変異マウスなどを用い吻側前脳領域形成、終脳形成、皮質形成のの候補遺伝子を抽出した。また、皮質で最初に移動する嗅索道細胞の線条体境界での停止はSemaphorin 3Fの反発作用に寄ることを明らかにした。加えてEmx1/Emx2二重変異体皮質での引き続く細胞移動の異常の解析を進めた。(iv)Otx2陽性頭部内中胚葉、神経堤細胞の起源Otx2はゼブラフィッシュ、ポリプテルス、エイの吻側内中胚葉及び頭部神経堤細胞でも発現するが、四足動物でこれらの発現を制御するエンハンサー領域は、これらの動物では保存されておらず全く別の制御機構によっていることが明らかとなった。ほ乳動物に特有なエピブラスト、臓側内胚葉でのOtx2遺伝子カスケードの成立機序比較発現解析と比較ゲノム解析から、エピブラストでのOtx2発現はげっ歯類に特異的であることを明らかにした。マウス臓側内胚葉、胚体吻側内中胚葉で、Otx2を後方化因子の抑制に用いる分子カスケードは、四足動物の祖先ヘッドオーガナイザーで成立したことを明らかにした。その前後軸形成のための軸回転への利用は虫類/乳類段階と想定される。真骨魚と四足動物で異なる吻側神経外胚葉形成、Otx2/Otx1機能の成立機序ポリプテルス、フグ、エイ、ヤツメウナギ胚でOtx2,Otx1,Otx5発現を比較解析し、whole genome duplicationに先立ち、祖先条鰭類で四足動物に至る系譜と吻側神経外胚葉でのOtxパラログの利用法は分岐したことが示唆された。これを確認するため、これら動物でのゲノム解析を進めた。前脳の初期領域化機構、新皮質の成立

機序Emx1/Emx2の下流で、皮質層構造の形成に働く因子として、microRNA-9の解析を進め、microRNA-9はFoxg1.mRNAに働きその蛋白発現を制御することによってCajal-Retzius細胞の産生調節に働き、ひいては皮質層構造の形成を制御することを明らかにした。microRNA-9によるFoxg1制御は四足動物Foxg1に共通であるが、真骨魚ではこの制御機構は存在しない。嚢胚形成機構ゼブラフィッシュ、カエルでの中胚葉形成は上皮形態を維持した伸張と収斂運動によるが、羊膜類でのそれは上皮間充織転換による細胞移動による。上皮間充織転換に際しE-cadherinを介する細胞間接着の消失と、integrinを介する細胞-ECM接着の亢進をpost-translationalに調節する因子としてEPB4.1L5を明らかにした。胚体外内胚葉の進化的起源ポリプテルス、ナメクジウオでの解析より、祖先脊椎動物で植物局側の割球は胚体外で、内胚葉・中胚葉は赤道軸上の周辺領域より生じることを明らかにした。羊膜類ならびに真骨魚で体軸形成に重要な働きをする胚体外内胚葉はこれより生じた相同な構造で、両生類で2次的に胚体深部内胚葉に組み込まれ胚体外組織としては失われたと考えられる。この結果は両生類型が祖先型で胚体外組織は真骨魚と羊膜類でそれぞれ独自に進化したとの従来の考えを覆すものである。3胚葉、軸形成に関わるEMTEPB41L5がposttranslationalに制御する上皮、間充織転換の分子機構解明を進展させた。臓側内胚葉でのOtx2遺伝子カースケードの成立機序マウス胚臓側内胚葉で軸形成、頭部誘導に必須の役割を果たすOtx2遺伝子カスケードは祖先四足動物で成立したことを明らかにしたが、鳥類での変化が予想され、デイスク型ほ乳動物胚、は虫類胚での検討を進めた。吻側神経外胚葉形成機能の成立機序有顎類の吻側神経外胚葉形成には共通にANエンハンサー下でのOtx2発現が必須であるが、これを制御する上流因子を同定した。Emx2が関わる脳形成機構マウス胚でEmx2はE8尾側前脳原基、E9-10終脳背側部、E11.5-皮質未分化細胞層で発現するが、これらの発現は同一のエンハンサーと上流因子により制御されていることが明らかになった。この遺伝子カスケードは四足動物で保存されているが真骨魚での変化が想定された。microRNAが制御する新皮質形成miR9が皮質層構造形成に働くことを明らかにした。そのターゲットは層構造を形成しない脊椎動物でも保存されており、これらの動物での機能解析を進めた。昨年度の研究は、祖先脊椎動物は現世のポリプテルス,ヤツメウナギのようにその植物割球を卵黄割球とし、内胚葉は赤道軸割球より生じたこと,真骨魚および羊膜類に至る両系譜で、卵黄性植物割球は融合し、卵黄割球を生じたのに対し、両生類は卵黄性植物割球を内胚葉に2次的に組み込んだ特殊な動物達であることを示唆した。本年の研究は、祖先硬骨魚が真骨魚に至る系譜と四足動物に至る系譜に分岐した後、祖先総鰭動物の植物割球の一部に、Otx2を後方化因子の抑制に用いるためのエンハンサーと遺伝子カスケードが成立し、両生類ではこれが頭部オーガナイザー活性を持つ深部内胚葉に組み込まれたことを示唆した。他方でこの植物局割球は羊膜類のハイポブラストをへて、哺乳類の臓側内胚葉(AVE)へと受け継がれ、マウスAVEとカエル深部内胚葉は相同な構造であることが示唆された。
蛋白質の膜透過の力を測る

本研究の目的は、基本的な生命現象の一つである蛋白質の膜透過の力を高速原子間力顕微鏡(高速AFM)で測ることである。原核生物の膜透過反応は蛋白質膜透過チャネルであるSecYEG複合体を介して起こり、SecA ATPaseが基質蛋白質と相互作用しながら、ATP加水分解を伴う構造変化をすることで駆動される。膜透過反応の力学的特性を評価するために、ナノディスク(ND)とSecY-SecA融合蛋白質を用いてSecYAEG-NDを構築した。SecYの細胞外側をビオチン標識し、測定基板にストレプトアビジン(STV)を用いることで、SecYAEG-NDの膜表面が測定基板に対して水平となり、SecAが上部に位置する向きでの固定が可能となった。前年度は測定基板としてSTV二次元結晶を用いていたが、結晶の調製が煩雑であることなどの問題があったので改めて基板を検討した。検討の過程で、マイカ基板ではSecYAEG-NDの膜表面が基板に対して垂直となり、SecYAEG-NDが横たわった状態で固定できることを発見した。これにより、膜蛋白質を二方向から高速AFM観察することが可能となり、新たな手法として査読付き学術誌に報告した。一方、問題点は基板をビオチン-OSuで修飾し、STVを介してSecYAEG-NDを基板に固定することで改善された。次に、カンチレバーに結合可能な基質蛋白質(proOmpA)の調製に取り組んだ。アミノシラン処理したカンチレバーを、グルタルアルデヒドを介してproOmpAと架橋するために、リジンから成るポリペプチド鎖を持つGFPを付加したproOmpAの発現系を構築した。proOmpAをunfoldした紐状の状態で得るために尿素存在下で精製したところ、高純度の精製産物を得た。今後は、精製したproOmpAと修飾したカンチレバーを架橋したものを用いて、膜透過の力を測定する予定である。本研究は、すべての生物に保存された基本的な生命現象である蛋白質の膜透過の分子メカニズムの解明を目指し、高速原子間力顕微鏡(HS-AFM)を用いた解析を行う。原核生物では、モーター蛋白質であるSecA ATPaseが基質蛋白質と相互作用しながら、ATP加水分解エネルギーを利用した反復運動を繰り返すことで、膜透過チャネルであるSecYEG複合体を介した基質の膜透過を駆動する。この反応は、SecYEG、SecA、基質蛋白質、膜構造が存在すればin vitroで再現できる。蛋白質の膜透過の詳細な解析を行うためには、生体膜と同様な脂質二重膜構造を維持することやSecAとSecYEGが1:1で機能する1ユニット(反応最小ユニット)を構築することが必要である。そこで初めに、脂質二重膜構造を維持できるナノディスク(ND)とSecY-SecAの融合蛋白質を用いて、安定な1ユニットであるSecA-SecYEG-NDを精製した。精製したSecA-SecYEG-NDとSecYEG-NDをHS-AFMで比較したところ、SecA-SecYEG-NDではSecAとSecYEGが1:1で相互作用していることを確認できた。次に、SecYを標識したビオチンを介して、SecA-SecYEG-NDをストレプトアビジン二次元結晶上に結合させた。HS-AFM画像はSecAのドメイン構造を示し、SecAが上向きになるように基板に固定されていることを確認できた。また、このドメイン構造は膜透過反応に伴うSecAの構造変化を可視化するのに十分な分解能を示した。1ユニットで制御された系(SecA-SecYEG-ND)とそれを基板に固定する系を確立できたので、蛋白質の膜透過における力学的特性などの詳細を明らかにするためにHS-AFMを用いたsingle molecule force spectroscopyへと展開させる。ナノディスク(ND)にSecY-SecAの融合蛋白質を含むSecA-SecYEGを再構成して、安定な1ユニット(SecA-SecYEG-ND)を構築した。高速原子間力顕微鏡(HS-AFM)の観察結果から、精製したSecA-SecYEG-NDは均一な粒子であり、それは溶液中で基板に固定した状態でも安定であることを示した。また、SecAとSecYEGは1:1で相互作用しており、SecAはSecYEGに強く結合していた。この系を用いて、蛋白質の膜透過反応を再現する準備が整った。蛋白質の膜透過の力をHS-AFMで測定するには、SecAが上向きで基板上に固定される必要があるので、SecYを標識したビオチンを介してSecA-SecYEG-NDをストレプトアビジン二次元結晶上に固定した。SecA-SecYEG-NDのHS-AFM画像は、SecAが基板表面から離れているにも関わらず、高分解能のSecAのドメイン構造を示した。また、複数のSecA構造が観察され、蛋白質の膜透過反応中に起こるSecAのドメインの動きを追跡できる可能性を示した。これらの結果は、ナノディスクとSecY-SecAの融合蛋白質を用いて安定な1ユニットを構築し、ビオチン標識を介して二次元結晶上に固定する方法を確立できたことを示している。この方法により、SecAとSecYEGのオリゴマー状態と基板への固定を厳密に制御でき、蛋白質の膜透過反応を再現させたうえで、HS-AFMを用いたsingle molecule force spectroscopyによって蛋白質の膜透過の力を測定することが可能となる。原核

生物の膜透過反応は蛋白質膜透過チャネルであるSecYEG複合体を介して起こり、SecA ATPaseが基質蛋白質と相互作用しながら、ATP加水分解を伴う構造変化をすることで駆動される。膜透過反応の力学的特性を評価するために、ナノディスク(ND)とSecY-SecA融合蛋白質を用いてSecYAEG-NDを構築した。SecYの細胞外側をビオチン標識し、測定基板にストレプトアビジン(STV)を用いることで、SecYAEG-NDの膜表面が測定基板に対して水平となり、SecAが上部に位置する向きでの固定が可能となった。前年度は測定基板としてSTV二次元結晶を用いていたが、結晶の調製が煩雑であることなどの問題があったので改めて基板を検討した。検討の過程で、マイカ基板ではSecYAEG-NDの膜表面が基板に対して垂直となり、SecYAEG-NDが横たわった状態で固定できることを発見した。これにより、膜蛋白質を二方向から高速AFM観察することが可能となり、新たな手法として査読付き学術誌に報告した。一方、問題点は基板をビオチン-OSuで修飾し、STVを介してSecYAEG-NDを基板に固定することで改善された。次に、カンチレバーに結合可能な基質蛋白質(proOmpA)の調製に取り組んだ。アミノシラン処理したカンチレバーを、グルタルアルデヒドを介してproOmpAと架橋するために、リジンから成るポリペプチド鎖を持つGFPを付加したproOmpAの発現系を構築した。proOmpAをunfoldした紐状の状態で得るために尿素存在下で精製したところ、高純度の精製産物を得た。今後は、精製したproOmpAと修飾したカンチレバーを架橋したものを用いて、膜透過の力を測定する予定である。次年度は、まず初めに基質である外膜蛋白質OmpAの前駆体(proOmpA)の調製とビオチン標識を行う。proOmpAは大腸菌内で封入体として発現させ、尿素存在下で変性状態を保ったまま精製する。変性状態のproOmpAはアンフォールド状態の紐状のポリペプチド鎖になっており、膜透過反応の基質となる。次に、カンチレバーの探針にproOmpAを固定する条件を検討する。カンチレバーをビオチン結合BSAとインキュベートすることで探針を修飾し、ストレプトアビジンを介してビオチン標識した紐状のproOmpAをカンチレバーに固定する。このカンチレバーと1ユニットで制御された系(SecA-SecYEG-ND)を用いて、蛋白質の膜透過における力学的特性を高速原子間力顕微鏡(HS-AFM)で測定する。カンチレバーに固定された基質であるproOmpAがSecA-SecYEG-NDのSecAと相互作用もしくはSecYに膜透過されることで張力がかかってカンチレバーがたわむ。このカンチレバーのたわみをフォトダイオードで検出し、探針・試料間距離とカンチレバーに働く力(たわみ量)との関係をプロットすることでフォースカーブを得ることができる。さらにヌクレオチド条件や濃度を変えた測定あるいはproOmpA変異体を用いた測定を行い、データを収集する。これにより、蛋白質の膜透過に実際にどの程度の力が必要であるのか、また基質の配列依存性があるのかなど、これまで不明だった蛋白質の膜透過の詳細を明らかにできる。
半構造テキストデータの一般構造を推論する高度情報抽出アルゴリズムの構築

XMLを中心とする半構造データの登場により,情報抽出は次の新しい局面を迎えている.本研究の目的は,半構造データからの情報抽出問題を木構造へ一般化し,複雑な抽出を効率的に行うための枠組みを提案することである.これまでの枠組みでは半構造データからデータの場所を推論してテキストのみを取り出していた.これに対して本研究では『構造化テキスト』すなわち半構造データの部分木に相当する部分を学習によって抽出する.学習アルゴリズムの目標は与えられたデータから一般構造を取り出してラッパー(抽出規則)を構築することであり,抽出アルゴリズムはラッパーと未知のデータをマッチングさせて適切なデータを取り出す.これらのアルゴリズムを実現するために研究計画として以下の3つの課題を設けているが,最終年度はそのうち3.について成果をあげた.1.多様な論理構造を持つデータを表現できる木構造ラッパーを定式化する.一般の文字列は変数や関数記号を導入することでより一般的な表現になる.この考えを応用して正規表現の概念を木構造へ導入する.2.半構造データを一般化する手続きを確立し,木構造ラッパーを学習するアルゴリズムを構築する.この枠組みでは複数の木構造を同時に一般化するため,ダイナミックプログラミングを応用してメモリーを圧迫しない学習アルゴリズムの実現を目指す.3.高速な抽出アルゴリズムを実装し,実験によって有効性を示す.素朴な手法によって抽出アルゴリズムを実装する場合,未知のデータを一度構文解析する必要があり,このままでは高速化は難しい.そこで従来の文字列照合問題を木構造データのマッチングへ拡張し,構文解析を必要としない手法を確立する.本研究における一般化によって,データの構造を学習し複雑な抽出を行うことができる.XMLを中心とする半構造データの登場により,情報抽出は次の新しい局面を迎えている.本研究の目的は,半構造データからの情報抽出問題を木構造へ一般化し,複雑な抽出を効率的に行うための枠組みを提案することである.これまでの枠組みでは半構造データからデータの場所を推論してテキストのみを取り出していた.これに対して本研究では『構造化テキスト』すなわち半構造データの部分木に相当する部分を学習によって抽出する.学習アルゴリズムの目標は与えられたデータから一般構造を取り出してラッパー(抽出規則)を構築することであり,抽出アルゴリズムはラッパーと未知のデータをマッチングさせて適切なデータを取り出す.これらのアルゴリズムを実現するために研究計画として以下の3つの課題を設けているが,初年度はそのうち(1)と(2)について成果をあげた.(1)多様な論理構造を持っデータを表現できる木構造ラッパーを定式化する.一般の文字列は変数や関数記号を導入することでより一般的な表現になる.この考えを応用して正規表現の概念を木構造へ導入する.(2)半構造データを一般化する手続きを確立し,木構造ラッパーを学習するアルゴリズムを構築する.この枠組みでは複数の木構造を同時に一般化するため,ダイナミックプログラミングを応用してメモリーを圧迫しない学習アルゴリズムの実現を目指す.(3)高速な抽出アルゴリズムを実装し,実験によって有効性を示す.素朴な手法によって抽出アルゴリズムを実装する場合,未知のデータを一度構文解析する必要があり,このままでは高速化は難しい.そこで従来の文字列照合問題を木構造テータのマッチングへ拡張し,構文解析を必要としない手法を確立する.従来の枠組みでは簡単な抽出しか行うことができなかったが,本研究では一般化によってデータの構造を学習し,複雑な抽出を行うことができる.またデータから部分木を一部加工して抽出することもできるようになる.最終年度は、これらの結果をふまえて,総合的なシステムの実現を目指す.XMLを中心とする半構造データの登場により,情報抽出は次の新しい局面を迎えている.本研究の目的は,半構造データからの情報抽出問題を木構造へ一般化し,複雑な抽出を効率的に行うための枠組みを提案することである.これまでの枠組みでは半構造データからデータの場所を推論してテキストのみを取り出していた.これに対して本研究では『構造化テキスト』すなわち半構造データの部分木に相当する部分を学習によって抽出する.学習アルゴリズムの目標は与えられたデータから一般構造を取り出してラッパー(抽出規則)を構築することであり,抽出アルゴリズムはラッパーと未知のデータをマッチングさせて適切なデータを取り出す.これらのアルゴリズムを実現するために研究計画として以下の3つの課題を設けているが,最終年度はそのうち3.について成果をあげた.1.多様な論理構造を持つデータを表現できる木構造ラッパーを定式化する.一般の文字列は変数や関数記号を導入することでより一般的な表現になる.この考えを応用して正規表現の概念を木構造へ導入する.2.半構造データを一般化する手続きを確立し,木構造ラッパーを学習するアルゴリズムを構築する.この枠組みでは複数の木構造を同時に一般化するため,ダイナミックプログラミングを応用してメモリーを圧迫しない学習アルゴリズムの実現を目指す.3.高速な抽出アルゴリズムを実装し,実験によって有効性を示す.素朴な手法によって抽出アルゴリズムを実装する場合,未知のデータを一度構文解析する必要があり,このままでは高速化は難しい.そこで従来の文字列照合問題を木構造データのマッチングへ拡張し,構文解析を必要としない手法を確立する.本研究における一般化によって,データの構造を学習し複雑な抽出を行うことができる.
ポリマー・無機ナノ粒子ハイブリッドの形成機構

本研究は、ホットプレスにより成型した高分子の板上に金を少量蒸着し熱処理した際の、高分子中への金微粒子の拡散現象に関する研究である。金と高分子間の相互作用は小さいと考えられるが、それにもかかわらず特定の条件下において金微粒子を拡散させることができる。この条件および金微粒子の拡散機構解明を目的として研究を行った。まず、高分子中に酸素原子や窒素原子等を含む極性基が存在する場合、より拡散し易いことがこれまでの研究で分かった。このことから金微粒子と極性基間には相互作用が働いているものと考えられた。これは極性基の有無と金の蒸着量との関係、さらには高分子中の極性基の量と金微粒子の拡散状態の観察結果からも確認された。この熱処理時の金微粒子の拡散距離について、ストークス・アインシュタインの式から得られる値との比較を行ったところ、極性基を持つ高分子中ではより大きな拡散距離をとることが分かった。そこでこの相互作用の大きさを見積もるため、原子間力顕微鏡を用いて、表面に金を蒸着した探針と各種高分子間に働く力の大きさをそのフォースカーブから見積もることを試みたが、高分子の種類による力の大きさの差はわずかであった。さらに非経験的分子軌道計算プログラムGaussian98を用いて、有機物近傍から金原子を無限遠に移動させるのに要するエネルギーを計算させた結果、数kcal/mol程度であることが分かった。これは200°Cにおける熱運動エネルギー(0.9kcal/mol)に比べて十分に大きい値であり、拡散に際して有意な値であると考えられる。以上のように本研究により、金と高分子中の極性基間に相互作用があり、これによって拡散距離が大きくなることを見出し、またこの相互作用の大きさを見積もることが出来た。本研究では、高分子中への金の拡散現象に関する研究である。高分子上に金を蒸着し、さらに蒸着面を高分子ではさんだサンドイッチ状の試料において、これを熱処理すると金微粒子が高分子中に拡散する。この現象について、その条件を調べ金微粒子の拡散機構を解明することを目的としている。まず、金の蒸着量と拡散しやすさとの関係について調べたところ、高分子上が金蒸着膜で覆われてしまった状態ではほとんど拡散は起きず、直径数nm程度の金微粒子が高分子上に均一に分散するように蒸着したものでは拡散することが分かった。金属間相互作用は、高分子-金属間相互作用に比べて遥かに大きく、一旦凝集した金属を引き離すことは容易ではない。また、たとえ熱処理前に金が薄膜状になっていない場合であっても、微粒子間距離が近い場合には熱処理によって容易に凝集が生じ、拡散しにくくなる。したがって、熱処理前には金微粒子がある程度の距離を保って離れた状態にあることが必要である。次に、高分子側の条件(分子量、化学構造など)を変えた場合の影響について調べた。その結果、金微粒子の拡散には高分子の自己拡散が大きいこと、また金と高分子間にある程度の相互作用が働いている必要があることなどが明らかとなった。また、この相互作用が小さいと金微粒子は互いに凝集しサイズが大きくなり、その結果微粒子の拡散距離は短くなる。相互作用が大きい場合の拡散に対する効果については現在検討中であるが、高分子が金微粒子どうしの凝集を妨げ、これによって遠くまで拡散することが可能になっているものと考えられる。
人工細胞膜と膜タンパク質から構成される神経インタフェースデバイスの研究開発

提案する神経インタフェースデバイスは,人工細胞膜と膜タンパク質から構成される人工のギャップジャンクションを用いて細胞内刺激を実現するものである.膜の安定化の目的でボール形状のゲル物質周りに脂質二重膜を構成し、ギャップ結合の構成要素であるconnexin43を膜タンパク質として配置する要素技術の開発を行う必要がある.本年度は,1)粒径が数十μm以上のジャイアントリポソームの作製,2)平板上への脂質二重膜(黒膜)形成の高効率化,3)ナノポア支持型脂質二重膜(nano black lipid membranes; nano-BLMs)の各種評価,について研究を実施した.ジャイアントリポソームの作製には静置水和法を用いた.従来は静置水和法を用いると作製効率が低い問題があったが,温度を変えることでジャイアントリポソームの作製効率が向上することを明らかにした.次に,黒膜形成についてはポリジメチルシロキサン(PDMS)における有機溶媒の吸収特性を利用した脂質二重膜の形成方法に着目した.PDMSフィルムの厚さで有機溶媒の吸収量を制御することにより,脂質二重膜の形成成功率を従来よりも向上できた.nano-BLMsについては従来のペインティング法に代わって自発展開法を採用することで作成効率を向上させて,簡便な手順で大面積の膜を生成できることを明らかにした.またポアサイズ50 nmの小孔を有するメンブレンフィルタ上にも膜を自発展開できることを示し, FRAP法(fluorescence recovery after photobleaching)やAFM (Atomic Force Microscope)を用いて評価したところ,確かに脂質二重膜が形成されていることを確認した.本年度の成果はボール形状のゲル物質周りに脂質二重膜を配置した構造物の開発につながるものと考えている.ジャイアントリポソームを効率的に生成できるようになったため,これにハイドロゲルなどのコア材料を封入して,所望の構造物を作製する次の段階へと進むことができる.またAFMを用いた脂質二重膜の評価系について知見が深まったので,今後実施する電気特性評価と合わせて,多角的に形成された脂質二重膜を評価する実験系の構築へとつなげる.また,未発表ではあるが,無細胞タンパク質合成系を用いたコネキシン作製実験で,コネキシンタンパク質(CX43)の合成に無細胞タンパク質合成試薬を利用して,CX43と思われるタンパク質を合成することができた.ただし脂質二重膜に埋め込みコネクソンを形成することはできていないため,今後さらに検討し,問題の解決を試みる.今後もおおむね当初の計画通りに,1)無細胞タンパク質合成系を用いたコネキシン作製と人工脂質二重膜への導入、2)パッチクランプ法を用いたデバイスの電気特性評価と改良、3)作製したデバイスと生体組織との結合とその電気特性評価、4)ゲルボールへの高効率な脂質二重膜コーティング法の開発,を目指して研究を推進する.デバイスの電気特性評価についてはAFMの評価系と比較しながら実験系の構築を目指す.またゲルボールへの脂質二重膜コーティングについては,ジャイアントリポソームを利用するなどして,脂質二重膜中に封入されたハイドロゲルコアからなるリポビーズを電極の先端に接着し,リポビーズの脂質二重膜部分に管状膜タンパク質を導入した電極の開発を目指す。提案する神経インタフェースデバイスは,人工細胞膜と膜タンパク質から構成される人工のギャップジャンクションを用いて細胞内刺激を実現するものである.膜の安定化の目的でボール形状のゲル物質周りに脂質二重膜を構成し、ギャップ結合の構成要素であるconnexin43を膜タンパク質として配置する要素技術の開発を行う必要がある.本年度は,1)粒径が数十μm以上のジャイアントリポソームの作製,2)平板上への脂質二重膜(黒膜)形成の高効率化,3)ナノポア支持型脂質二重膜(nano black lipid membranes; nano-BLMs)の各種評価,について研究を実施した.ジャイアントリポソームの作製には静置水和法を用いた.従来は静置水和法を用いると作製効率が低い問題があったが,温度を変えることでジャイアントリポソームの作製効率が向上することを明らかにした.次に,黒膜形成についてはポリジメチルシロキサン(PDMS)における有機溶媒の吸収特性を利用した脂質二重膜の形成方法に着目した.PDMSフィルムの厚さで有機溶媒の吸収量を制御することにより,脂質二重膜の形成成功率を従来よりも向上できた.nano-BLMsについては従来のペインティング法に代わって自発展開法を採用することで作成効率を向上させて,簡便な手順で大面積の膜を生成できることを明らかにした.またポアサイズ50 nmの小孔を有するメンブレンフィルタ上にも膜を自発展開できることを示し, FRAP法(fluorescence recovery after photobleaching)やAFM (Atomic Force Microscope)を用いて評価したところ,確かに脂質二重膜が形成されていることを確認した.本年度の成果はボール形状のゲル物質周りに脂質二重膜を配置した構造物の開発につながるものと考えている.

ジャイアントリポソームを効率的に生成できるようになったため,これにハイドロゲルなどのコア材料を封入して,所望の構造物を作製する次の段階へと進むことができる.またAFMを用いた脂質二重膜の評価系について知見が深まったので,今後実施する電気特性評価と合わせて,多角的に形成された脂質二重膜を評価する実験系の構築へとつなげる.また,未発表ではあるが,無細胞タンパク質合成系を用いたコネキシン作製実験で,コネキシンタンパク質(CX43)の合成に無細胞タンパク質合成試薬を利用して,CX43と思われるタンパク質を合成することができた.ただし脂質二重膜に埋め込みコネクソンを形成することはできていないため,今後さらに検討し,問題の解決を試みる.今後もおおむね当初の計画通りに,1)無細胞タンパク質合成系を用いたコネキシン作製と人工脂質二重膜への導入、2)パッチクランプ法を用いたデバイスの電気特性評価と改良、3)作製したデバイスと生体組織との結合とその電気特性評価、4)ゲルボールへの高効率な脂質二重膜コーティング法の開発,を目指して研究を推進する.デバイスの電気特性評価についてはAFMの評価系と比較しながら実験系の構築を目指す.またゲルボールへの脂質二重膜コーティングについては,ジャイアントリポソームを利用するなどして,脂質二重膜中に封入されたハイドロゲルコアからなるリポビーズを電極の先端に接着し,リポビーズの脂質二重膜部分に管状膜タンパク質を導入した電極の開発を目指す。