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円口類ヘモグロビン、ミオグロビン分子の構造・機能・進化

進化的に単量体ヘモグロビンと四量体ヘモグロビンをつなぐ位置にある円口類ヘモグロビン、およびそれのミオグロビンの構造と機能を明らかにするため、新潟産と北海道産のカワヤツメウナギの血液から溶血液とヘモグロビンを、筋肉からミオグロビンをそれぞれ調製して下記の実験結果を得た。1.ヘモグロビン、ミオグロビンの成分と構造の解析(1)溶血液には5つのアイソフォーム(Hb IHb V)が存在し、初めの2つがメジャー成分であった。(2)精製したHb Iのアミノ酸配列はウミヤツメのHb Vのそれと97%の相同性を示した。ヒトのHIのα鎖、β鎖に比べると相同性は低く、N末端が8残基長く、C末端付近に9残基分の欠損がみられた。(3)Hb IIのアミノ酸配列はHb Iのそれと同一であった。(4)ミオグロビンは単一成分で、しかも、それのアミノ酸配列はHb Iのそれと同一であった。2.酸素結合特性(1)Hbの機能は、種々の点において脊椎動物Hbのそれに比べて原始的である(弱い協同作用、Bohr効果、CO_2の効果の存在と有機リン酸塩効果の欠如)。(2)Hb IとHb IIの間には若干の機能的差異がみられた。(3)ミオグロビンの機能はHb Iのそれに類似していた。3.電子常磁性共鳴(EPR)、フーリエ変換赤外線吸収(FT-IR)(1)酸化型と還元NO型のEPR、CO型のFT-IRのデータは、ヤツメウナギHbのヘム鉄配位構造が、近位、遠位残基がHisである脊椎動物Hbのそれに類似していることを示していが、若干の相違もみられる。4.まとめ(1)Hb IIはHb Iが何らかの人工的あるいは翻訳後修飾によって生成した可能性がある。(2)ヤツメウナギでは、MbはHbと同一蛋白である可能性がある。そうだとすると、この動物、あるいは円口類一般では、Hbのポリペプチド鎖をそのままMbとして"流用"していることになり、進化論的に興味深い。単量体ヘモグロビンと四量体ヘモグロビンをつなぐ位置にある円口類ヘモグロビンの構造と機能を明らかにするため、北海道と新潟県の河川で捕獲したヤツメウナギの血液を採取して、イオン交換樹脂カラムによって2つのヘモグロビン成分(Hb I、Hb II)を分離し、所定の実験を行なって、下記の結果を得た。1.ヘモグロビン成分の一次構造(アミノ酸配列)の決定:Hb Iの一次構造を決定した。それは従来報告されている海で捕獲したヤツメウナギのヘモグロビンの一次構造と同一であった。Hb IIの一次構造決定は目下進行中。2.赤血球の酸素平衡特性:弱いBohr効果(Bohr係数=-0.12)と弱い協同作用(Hill係数=1.5)がみられた。3.溶血液の酸素平衡特性:酸素親和性は赤血球のそれと類似していた。一定の強さのBohr効果(Bohr係数=-0.27)がみられた他、協同作用のpH依存性(pH6.2でHill係数=1.40、pH9.0でHill係数=1.02)がみられた。蛋白濃度を8μMから1mMまで変えると、酸素親和性は約2倍だけ低下し、Hill係数は1.02から1.22まで増加した。各種アロステリック因子の効果をみると、ATP, IHP, DPGはそれぞれ単独では有意な効果を示さなかったが、CO_2はDPG存在下でわずかに酸素親和性を低下させた。4.電子常磁性共鳴スペクトル:還元型NO誘導体の極低温(35K,77K)でのスペクトルは、ミオグロビンまたはヘモグロビンβ鎖のNO誘導体でみられる典型的な六配位型の特徴を示した。酸化型の極低温(5Kまで)でのスペクトルのg=6付近のシグナルは軸対称性と異方性の2つの成分の混ざりであり、pH変化と共にそれらの割合が変化した。今後、分離した個々のヘモグロビン成分について同様の実験を行い、成分間の特性の差異とその意味について検討する予定である。

(3)ミオグロビンの機能はHb Iのそれに類似していた。3.電子常磁性共鳴(EPR)、フーリエ変換赤外線吸収(FT-IR)(1)酸化型と還元NO型のEPR、CO型のFT-IRのデータは、ヤツメウナギHbのヘム鉄配位構造が、近位、遠位残基がHisである脊椎動物Hbのそれに類似していることを示していが、若干の相違もみられる。4.まとめ(1)Hb IIはHb Iが何らかの人工的あるいは翻訳後修飾によって生成した可能性がある。(2)ヤツメウナギでは、MbはHbと同一蛋白である可能性がある。そうだとすると、この動物、あるいは円口類一般では、Hbのポリペプチド鎖をそのままMbとして"流用"していることになり、進化論的に興味深い。進化的に、単量体ヘモグロビンと四量体ヘモグロビンをつなぐ位置にある円口類ヘモグロビンの構造と機能を明らかにするため、北海道と新潟県の河川で捕獲したヤツメウナギの血液を採取して、イオン交換樹脂カラムによって2つのヘモグロビン成分(Hb I、Hb II)を分離し、所定の実験を行って、下記の結果を得た。1.精製ヘモグロビン成分の酸素結合特性(1)酸素親和性:溶血液の親和性に比べて、Hb Iは等しいが、Hb IIはわずかに高い。(3)ATPの効果:両成分ともになし。(4)蛋白濃度の効果:両成分ともに蛋白濃度が増加すると、酸素親和性が低下し、協同作用が現れる。しかし、その程度はHb Iの方が顕著である。2.電子常磁性共鳴スペクトル(1)酸化型:g=6付近のシグナルが軸対称性のものと異方性のものの2つの高スピン種が存在し、pHの増大とともに前者が減少し、後者が増大する。pH9では低スピン型に移行することから、遠位配位子は水分子と思われる。1μM100μMのヘモグロビン濃度ではスペクトルの有意な差はみられない。(2)還元型NO誘導体:ヒスチジンを近位配位子とする六配位型の特徴を示し、pH6ではg異方性が増大する。蛋白濃度に対する依存性はみられない。還元型一酸化炭素誘導体の吸収スペクトルに、1968cm-1(major band)と1928cm-1(minor band)の特微的な吸収帯がみられ、前者はさらに2つの吸収帯に分解できる。COの伸縮振動からみて、CO結合状態には少なくとも3種類のコンフォーマーがあること、ヘムポケットの遠位側に負電荷をもつアミノ酸残基が存在することが示唆される。進化的に単量体ヘモグロビンと四量体ヘモグロビンをつなぐ位置にある円口類ヘモグロビン、およびそれのミオグロビンの構造と機能を明らかにするため、北海道産カワヤツメウナギ(Lampetra japonica)の血液からヘモグロビンを、筋肉からミオグロビンをそれぞれ調製して下記の実験結果を得た。1.ヘモグロビンの成分と構造の解析(1)溶血液には5つのアイソフォーム(Hb IHb V)が存在し、含有率はそれぞれ78.1%,17.9%,0.2%,2.6%,0.6%であった。(2)精製したHb Iは149個のアミノ酸残基から成り、その配列はウミヤツメのHb Vのそれと97%の相同性を示した。ヒトのHbのα鎖、β鎖に比べると相同性は低く、N末端が8残基長く、C末端付近に9残基分の欠損がみられた。(3)もう1つの主要成分であるHb IIのアミノ酸配列はHb Iのそれと同一であった。2.ミオグロビンの成分と構造の解析(1)単一成分で、しかも、それのアミノ酸配列はHb Iのそれと同一であった。
呉・越・徐・舒と楚―特に秦末漢初の騒乱における役割から―

1.各国から越研究者が参加した中国柯橋・越国文化高峰論壇にて「越都琅〓新考:兼論越在淮北地区的発展」を口頭発表、改訂稿「越〓都琅〓新考」を『中国柯橋・越国文化高峰論壇文集』に掲載した。本論文は越研究において長年の懸案である越の琅〓遷都および准北進出について、近年の考古調査に基づきながら新説を提示したものであり、以下の事を明らかにした。(1)従来『史記』は越の准北進出を否定しており、越の琅〓遷都を伝える『越絶書』等の記述とは矛盾すると考えられてきたが、実際には『史記』は越の淮北進出を否定してはおらず、『越絶書』等の記述とも矛盾しない(2)越の准北進出は考古学的証拠からも裏付けられる(3)ただし琅〓遷都自体は虚構である可能性が高く、少なくとも従来最も有力視されてきた山東省〓南市の琅〓山一帯に遷都したという説は、考古学的証拠より否定される(4)張志立氏らの考古調査により、准北における越に拠点は江蘇省連雲港市錦屏山九龍口古城にあった可能性が最も高い(5)准北に進出したあとの越は、無彊死後も淮北に存在し続け、最終的には戦国後期、考烈王期の楚に併呑される。2.指導委託により上海・復旦大学歴史地理研究中心の李暁傑教授に師事し、歴史地理学を学ぶと同時に、独自に各地でおもに楚・越にかんする史料調査を行なった。調査した博物館・遺跡・研究機関は以下のとおり。湖南省博物館・馬王堆漢墓三号墓坑・長沙簡牘博物館・湖北省博物館・武漢博物館・武漢大学・随州博物館・曾公乙墓遺址・襄樊市博物館・荊州博物館・楚紀南故城・荊門市博物館・宜昌博物館・南京博物院・上海博物館・蘇州博物館・蘇州科技学院・印山越王陵・越国文化博物館・紹興博物館越王城分館・良渚博物館・浙江省博物館1論文「鄂君啓節からみた楚の東漸」を『東洋史研究』第68巻第2号に発表した。本論文では、鄂君啓節に示された免税区域をもとに、文献の記述を詳細に検討し、戦国中期における楚の勢力範囲を明らかにすることによって、東方においては、下蔡・居巣・樅陽までが、前322年の段階における楚にとっての安全圏であったこと、それ以東の地域には、なお越や淮夷の勢力が存在していたこと、を確認した。また、それに基づき、のちの秦末漢初の騒乱(反秦戦争)や呉楚七国の乱の舞台となる長江・淮河下流地域に対計する楚の進出が、戦国後期に降ることを明らかにした。以上により、淮夷や越の存在に留意せず、戦国中計期にはすでに楚が江淮の間ならびに江東を支配していたとする従来の観点を正し、中国古代史上における二大反乱に地域的特質を見いだしうる可能性を指摘した。2指導委託により、上海・復旦大学において、歴史地理学研究中心の李暁傑教授に師事し、歴史地理学を学ぶと同時に、同大学文物与博物館学系の呂静副教授ひきいる江蘇省鎮・揚・常三市文物遺址考察小組にも参加、さらには自身でも独自に各地の博物館・遺跡をめぐり、楚・呉・越・徐・舒に関する史料を収集、各博物館の研究員の方々からも、未公表情報を含め、貴重なご意見をいただいた。これらは今後の研究にとって必要不可欠なものであり、いずれ研究成果として発表する予定である。なお、本年度には、鎮江博物館・揚州博物館・漢広陵王墓・常州博物館・春秋淹城遺址・武進博物館・上海博物館・印山越王陵・越国文化博物館・紹興県博物館・紹興越国文化博物館・紹興博物館・河姆渡遺跡博物館・寧波博物館・淮安市博物館・安徽省博物館を調査した。

2.指導委託により上海・復旦大学歴史地理研究中心の李暁傑教授に師事し、歴史地理学を学ぶと同時に、独自に各地でおもに楚・越にかんする史料調査を行なった。調査した博物館・遺跡・研究機関は以下のとおり。湖南省博物館・馬王堆漢墓三号墓坑・長沙簡牘博物館・湖北省博物館・武漢博物館・武漢大学・随州博物館・曾公乙墓遺址・襄樊市博物館・荊州博物館・楚紀南故城・荊門市博物館・宜昌博物館・南京博物院・上海博物館・蘇州博物館・蘇州科技学院・印山越王陵・越国文化博物館・紹興博物館越王城分館・良渚博物館・浙江省博物館
明治期における明清楽および沖縄民謡の歴史情報化をめざす研究

1.民謡「金毘羅船々」が清楽曲「中山流水」のほぼ替え歌であることを突き止めた。前者は明治13(1880)年にはほぼ現在の曲・歌詞をもつ日本民謡として定着した。「中山流水」を日本に紹介した曲集は『聲光詞譜』(1872年)であるが,これが数年間で定着したのはこの曲がこの時期日本民衆の感性を捉えたことを意味している。なお「中山流水」の原曲は中国江浙地域で歌われてきた「挑担号子」と推定される。後者は作業歌として仕事を促進するための歌で,高揚した気分を「中山流水」が曲の中で継承していると判断される。2.八重山古謡とされてきた「鷲の鳥ユンタ」は,その音階・メロディーなどから分析すると清楽の影響を強く受けていることが明らかである。本研究では,その原曲または最も強く影響を与えた曲が「鮮花調」または「茉莉花」であると推定し得ることを,根拠を挙げて論じた。両者が清楽的長調の曲である点は注目に価する。さらに問題はこのような清楽の影響が明治中期以後,八重山地方で全く語られなくなる点である。本研究ではその理由が,明治12(1879)年の「琉球処分」にあたり日本政府が宮古・八重山の清国へ割譲するという分島問題を推進したことにあるとした。その際の八重山地域の住民の動向についての記録がほとんどないが,私は本研究を通じ,当時の八重山民謡の動向を調べることにより,歴史事実を浮かび上がらせることができるという見解に達した。明治15(1882)年に大浜用能が『八重山工工四』を作成し,八重山民謡の曲調の一元化を図ったことは,まさにこの動きに対応しようとする努力を示すものであると判断される。1.明清楽曲「中山流水」は,明かに民謡「金比羅船々」の原曲であるが,その譜面(工尺譜)は1872(明治5)年に出版された平井連山・永原梅園「明清楽譜」に初出するものであり,ほぼこの時期に日本に導入されたものと判断される。この曲と「金比羅船々」の歌詞とがどの時期に結合したのかの決め手となる資料はまだ入手できなかったが,1894(明治27)年にはすでに両者が一体となって流行していたことが確認される。2.上の事実は従来の,明清楽曲の中で日本民謡に取り入れられた曲の代表が「九連環」であり「梅が枝節」などとなって流行したとする説に一定の修正をせまるものである。「梅が枝節」等が愛好された範囲・規模はかなり限定されていたと思われるのに対し,「金比羅船々」は1894年当時,東京で大流行したという証拠があり,むしろ「中山流水」こそこの時期の日本人に最も広く愛好されたと考えられる。すなわち,明清楽曲の中で日本人の音楽的感性に訴える力が最も大きかった曲こそは,「中山流水」であったと言うべきであろう。3.この事実は明治中期までの日本人の感性のあり様に関する歴史情報を提供していると見なければならない。すなわちこの時期の大衆は,「中山流水」のように長音階で軽快な曲想を持ち,清新な印象を与え,同時に東洋的な気分を喚起する曲を強く求めていたと考えられるのである。それ以前の邦楽的民謡曲は,たとえ陽音階として発足したものでも,流行を重ねるうちにほぼ例外なく陰音階に転じたとされているが,明治期の民衆はこの伝統を離れて明るく調子のよい雰囲気を求めるようになったと言うべきであろう。4.明清楽曲が日本民謡に転じたのはこれだけでなく,もっと多くの事例が見つかるはずである。

すでにデータはかなり集積されているので,早急に分析に入ることを予定している。1.清楽曲「中山流水」は,明かに民謡「金比羅船々」の原曲であるが、さらにその原曲と思われるものが、中国・江蘇省蘇州の作業歌「挑担号子」であると推定できるほぼ確実な資料を入手した。その結果、「中山流水」の旋律は本来、進取性と持続性を確保するという目的があったことが明かになった。また、それが日本民謡「金比羅船々」にもある程度継承されていることを推定させる資料として、新聞記事と1887年に流行した替え歌「民権張れ々々」を発見することができた。これは、民謡の歴史情報化の有力な手掛かりとなるものである。2.沖縄民謡に関しては、その典型とされる八重山民謡に関する調査を行い、次のような成果をあげた。(1)明清楽との関係では、八重山民謡にこれが直接流入したと判断されるケースは発見できないが、首里政府の宮廷音楽(古典芸能)の中に明清楽ないしは中国原産の曲が影響を及ぼしたことはよく知られている。その古典芸能は原則として門外不出とされていたが、八重山が政治犯の流刑地とされていたこととあいまって、秘技に属する太鼓の段もの、古典音楽の作曲および伴奏つけの技法、舞踊に関する虎の巻などが八重山に持ち込まれ首里城での音楽的蓄積が八重山民謡の作助に適用されることによって、独特の美しさと力強さをもった民謡が作られ流布されるようになったという経路を浮かび上がらせることができるようになった。(2)八重山民謡の重要な特徴は、喜舎場永恂『八重山民謡誌』(初版1924年)が指摘したように、作曲者をその末裔の伝承に差り特定することができ、かつその家族の「家譜」をしらべることにより、作曲年代を特定できることである。沖縄県立図書館八重山分館・石垣市立図書館所蔵の楽譜と家譜を調査し、民謡の成立に関する年代記を作成することが可能で、その時代の歴史事実とを突き合わすことで民謡に凝縮された歴史情報の復元も不可能でないことが感得された。
オキシトシン受容体を用いたヒト早産の遺伝的背景解析に関する研究

我々は前年期で、オキシトシン受容体N-末端の糖鎖修飾部位に点突然変異を導入し、糖鎖がつかない様にした分子を作成し、これがリガンド結合能において野生型と同じであることを証明した。オキシトシンは分娩のみでなくその後の授乳においても重要な役割を果たしている。従来、解剖学的、生理学的知見から、オキシトシン受容体は乳腺の筋上皮細胞上に存在し、これがオキシトシンに反応して収縮し射乳がおこる、と考えられていた。今回我々はヒト乳腺組織(非授乳期、授乳期)を用いてオキシトシン受容体の極在、発現量を検討してみた。そのmRNA量では非授乳期、授乳期の間にほとんど差が見られず、またウエスタンプロット法にて授乳期乳腺におけるオキシトシン受容体蛋白量は子宮筋に比べ極めて少量であることを示した。一方免疫組織化学法にて、オキシトシン受容体は筋上皮よりむしろ腺上皮、乳管上皮に多く発現していることが明らかになった。早産後の母乳栄養の確立は母児相互関係の樹立のためも重要であり、乳腺におけるオキシトシンの作用の、今後更なる検討が必要である。また、子宮筋におけるオキシトシン受容体の誘導は正期症のみならず早産でも見られているが、この誘導時にオキシトシン受容体遺伝子5'領域に結合する蛋白質をクローニングした。この蛋白はプロトオンコジーンMafファミリーに属し、分子量18KD、アミノ酸164個よりなる。しかし残念ながらこの蛋白は直接のオキシトシン受容体転写活性化を行うことは出来なかった。又、この蛋白の結合領域に関係する多型性や転写に関する真の意義付けは今後研究課題と考える。早産の背景には、オキシトシン受容体の早期発現の存在、受容体分子構造の変化によるオキシトシン過敏症、細胞内シグナル伝達系の異常によるオキシトシン過敏症等の存在を仮定することができる。今年度我々は先づオキシトシン受容体の構造変化がオキシトシン過敏症や過剰発現につながるかを検討するため、同受容体N末端の糖鎖修傷部位に人工的に点突然変異を導入しその変化をみた。すると、点突然変異体を発現させても、野生型の場合と同じmRNA量、蛋白量、オキシトシン結合量および、オキシトシンに対する親和性を示し、この部分の変異はヒト早産の遺伝的背景となりえないことがわかった。また、ヒト培養子宮筋細胞を用いて、オキシトシンの培養液の添加に際する脱感作現象の機構を解析したが、一次培養に用いた個人間の差がなく1224時間で脱感作が成立し、更に遺伝子発現レベルもこれに一致して低下していた。したがって早期産において脱感作ができないことによるオキシトシン過敏症の存在の可能性も低いと考えられた。これらの知見を通じて更に臨床検体での早産例の遺伝的背景の解析をすすめていく計画である。そのmRNA量では非授乳期、授乳期の間にほとんど差が見られず、またウエスタンブロット法にて授乳期乳腺におけるオキシトシン受容体蛋白量は子宮筋に比べ極めて少量であることを示した。

早産後の母乳栄養の確立は母児相互関係の樹立のためも重要であり、乳腺におけるオキシトシンの作用の、今後更なる検討が必要である。また、子宮筋におけるオキシトシン受容体の誘導は正期症のみならず早産でも見られているが、この誘導時にオキシトシン受容体遺伝子5′領域に結合する蛋白質をクローニングした。この蛋白はプロトオンコジーンMafファミリーに属し、分子量18KD、アミノ酸164個よりなる。しかし残念ながらこの蛋白は直接のオキシトシン受容体転写活性化を行うことは出来なかった。又、この蛋白の結合領域に関係する多型性や転写に関する真の意義付けは今後研究課題と考える。
甲殻類心臓における特異的な筋制御機構:インパルスを介さない神経筋伝達の解析

神経細胞間のシナプスや神経筋接合部における情報伝達は,全か無かの神経インパルスによって行われるが,最近になってインパルスを介さない段階的なシナプス伝達が,感覚系や中枢神経系における神経情報伝達に重要な役割を担っている事が明らかされてきた。そこでは,前ニューロンの膜電位変化に対応して放出された伝達物質が,後ニューロンに段階的なシナプス電位を生じる。一方,神経筋接合部における運動ニューロンの前末端も,膜電位変化に依存して伝達物質を放出する性質のあることが実験的に示されてきた。しかし生体内においては,運動ニューロンと筋は距離的にも離れていることから,筋の制御は運動ニューロンのインパルスによって行われており,神経筋接合部における機能的な段階的シナプス伝達は知られていない。多くの甲殻類の心臓は,心臓内にある心臓神経節がペースメーカーとなる神経原性心臓であるが,等脚類のフナムシでは心筋にも自動興奮性があり,心臓神経節の自発活動が神経筋シナプス電位を介して心筋の活動リズムを神経節の活動リズムに制御している。フナムシの心臓神経節は6個の運動ニューロンによって構成されており,それらのニューロンは電気的結合を介して同期して活動する。神経節で生じた周期的な神経インパルス群は,神経筋接合部電位を介して心筋の活動電位を誘発する事によって,心筋の活動リズムを神経節の活動リズムに制御する。本研究において,心臓神経節と心筋間の神経筋伝達を,電気生理学的および薬理学的手法を用いてさらに詳しく解析した結果,心臓神経節ニューロンは神経インパルスを介したシナプス伝達のみならず,ニューロンに局所的に生じる膜電位変化を介した段階的シナプス伝達を介して心筋を制御していることを明らかにした。これらの成果は,運動ニューロンによる筋の新たな制御機構の発見の論文として専門誌に掲載された。また心臓制御機構に関するいくつかの新たな成果も得られ,論文として発表した。一般にシナプスにおける情報伝達は,全か無かの神経インパルスによって行われるが,最近になってインパルスを介さないシナプス伝達が感覚系や中枢神経系で重要な役割を担っている事が明らかにされてきた。そこでは,前ニューロンの膜電位変化に対応して段階的に放出された伝達物質が,後ニューロンに段階的なシナプス電位を生じる。神経筋接合部における運動ニューロンの前末端も同様な性質を持つことが実験的に示されてきたが,生体の神経による筋の制御は,一般には運動ニューロンのインパルスによる神経筋伝達によって行われており,神経筋接合部における機能的な段階的シナプス伝達は知られていない。多くの甲殻類の心臓は,心臓内にある自動興奮性をもった心臓神経節が心筋を駆動することによって拍動する神経原性心臓であるとされてきた。しかし等脚類のフナムシの心臓では,心筋も自動興奮性をもっており,心臓神経節の自発活動が神経筋シナプス電位を介して心筋の活動リズムを神経節の活動リズムに制御していることを示した。フナムシの心臓神経節は,6個の自発興奮性をもったグルタメイトを伝達物質とする運動ニューロンによって構成されており,それらのニューロンは電気的結合を介して同期して活動する。心臓神経節で引き起こされた周期的な神経インパルス群は,神経筋接合部電位を介して心筋の活動電位を誘発する事によって心筋の活動リズムを神経節活動リズムに制御する。これらの結果は,ニューロンによる筋の新たな制御機構の発見の論文として,現在専門誌に印刷中である。

これらの成果は,運動ニューロンによる筋の新たな制御機構の発見の論文として専門誌に掲載された。また心臓制御機構に関するいくつかの新たな成果も得られ,論文として発表した。神経細胞間のシナプスや神経筋接合部における情報伝達は,全か無かの神経インパルスによって行われるが,最近になってインパルスを介さない段階的なシナプス伝達が,感覚系や中枢神経系における神経情報伝達に重要な役割を担っている事が明らかされてきた。そこでは,前ニューロンの膜電位変化に対応して放出された伝達物質が,後ニューロンに段階的なシナプス電位を生じる。一方,神経筋接合部における運動ニューロンの前末端も,膜電位変化に依存して伝達物質を放出する性質のあることが実験的に示されてきた。しかし生体内においては,運動ニューロンと筋は距離的にも離れていることから,筋の制御は運動ニューロンのインパルスによって行われており,神経筋接合部における機能的な段階的シナプス伝達は知られていない。多くの甲殻類の心臓は,心臓内にある心臓神経節がペースメーカーとなる神経原性心臓であるが,等脚類のフナムシでは心筋にも自動興奮性があり,心臓神経節の自発活動が神経筋シナプス電位を介して心筋の活動リズムを神経節の活動リズムに制御している。フナムシの心臓神経節は6個の運動ニューロンによって構成されており,それらのニューロンは電気的結合を介して同期して活動する。神経節で生じた周期的な神経インパルス群は,神経筋接合部電位を介して心筋の活動電位を誘発する事によって,心筋の活動リズムを神経節の活動リズムに制御する。本研究において,心臓神経節と心筋間の神経筋伝達を,電気生理学的および薬理学的手法を用いてさらに詳しく解析した結果,心臓神経節ニューロンは神経インパルスを介したシナプス伝達のみならず,ニューロンに局所的に生じる膜電位変化を介した段階的シナプス伝達を介して心筋を制御していることを明らかにした。
機能性色素の高秩序集積化によるp-nヘテロ接合の構築

電子ドナー性色素がアクセプター性色素に共有結合で連結した新規ダイアド分子群を設計・合成した.得られたダイアド分子は溶媒や温度に応答して自発的に積層し,ドナー及びアクセプター成分を高秩序集積させることに成功した.さらに得られた自己組織体を光電変換層とした有機薄膜太陽電池を作製・評価したところ,光電流が観測された.この結果より,ダイアド分子の自己組織体が両成分間での電荷分離と電荷移動を可能とするp-nヘテロ接合を提供し得ることが明らかとなった.電子ドナー及びアクセプター成分からなる分子は有機薄膜太陽電池の基本要素を分子内に備えており,ホール及び電子の移動パスを構築できれば,原理的には単一成分で光電変換層とすることが可能である.本研究では,高効率な電荷分離と電荷移動の実現に資する有機電子材料の開発に向けて,卓越した光吸収能と凝集性を示す機能性色素をドナー及びアクセプター成分に持つ分子を設計・合成し,それらの自己組織体の創製に取り組む.本年度はスクアリリウム色素(SQ)とナフタレンジイミド(NDI)からなるダイアド分子の合成と特性解析を行った.遠赤色光から近赤外光領域に吸収を示すSQ前駆体とハロゲン化NDIのパラジウム触媒クロスカップリングにより,SQやリンカーの構造が異なる9種類のダイアド分子の合成に成功した.得られた化合物の中でエチニレン基を連結成分に持つダイアドは,各成分に由来した吸収に加えて,近赤外領域にブロードな吸収帯が見られた.分子軌道計算から長波長領域の吸収帯はSQからNDIへの分子内電荷移動であることが示され,2成分連結が光学特性に及ぼす効果を確認した.また,ダイアド分子の電気化学特性をサイクリックボルタンメトリーで評価したところ,SQの酸化及びNDIの還元に由来するピークがともに観測された.得られたダイアド分子を用いて電界効果トランジスタを試作したところ,p型半導体特性(ホール移動度10ー410ー6 cm2Vー1sー1)を示すことを明らかにした.電子ドナー及びアクセプター成分からなる分子は有機薄膜太陽電池の基本要素を分子内に備えており,ホール及び電子の移動パスを構築できれば,原理的には単一成分で光電変換層とすることが可能である.本研究では,高効率な電荷分離と電荷移動の実現に資する有機電子材料の開発に向けて,卓越した光吸収能と凝集性を示す機能性色素をドナー及びアクセプター成分に持つ分子を設計・合成し,それらの自己組織体の創製に取り組んだ.H27年度はダイアド分子の構成成分であるスクアリリウム色素(SQ)の設計・合成及びナフタレンジイミド(NDI)との結合様式について検討を行い,ダイアド分子の自己組織体形成を目指した.SQ色素の構成成分としてベンゾ[c,d]インドレニン,BODIPY誘導体,トリアルコキシベンゼン誘導体を設計・合成し,遠赤色から近赤外光領域に強い吸収を示すSQを設計・合成した.前項で得られたカルボキシ基を有するSQとイミド置換基として2-アミノエチレンジイル基を持つNDIとのアミド化によってダイアド分子を合成した.トリドデシルオキシベンゼン誘導体をSQ成分に持つダイアド分子はクロロホルムーアセトニトリル混合溶媒中でJ会合体を形成することが吸収スペクトルより示された.また,トルエンーメチルシクロヘキサン中ではH会合体を形成することが明らかとなった.AFM等を用いて会合体を直接観察したところ,J会合体は球状の形態,H会合体はファイバー状の形態を採っていることが示され,溶媒の選択によって会合状態を制御できるダイアド分子の合成に成功した.このダイアド分子を光電変換層として有機薄膜太陽電池を試作・評価したところ,光電流が観測され,単一成分での光電変換に成功した.電子ドナー性色素がアクセプター性色素に共有結合で連結した新規ダイアド分子群を設計・合成した.得られたダイアド分子は溶媒や温度に応答して自発的に積層し,ドナー及びアクセプター成分を高秩序集積させることに成功した.さらに得られた自己組織体を光電変換層とした有機薄膜太陽電池を作製・評価したところ,光電流が観測された.この結果より,ダイアド分子の自己組織体が両成分間での電荷分離と電荷移動を可能とするp-nヘテロ接合を提供し得ることが明らかとなった.本研究課題は,1ドナー性色素の合成,2アクセプター性色素へのドナー性色素の配置とリンカーの設計,3自己組織化挙動の評価,4有機電界トランジスタによる電荷移動度の評価,5有機薄膜太陽電池の試作,の5項目に関して検討する計画である.本年度では1及び2の検討を通して,所望のダイアド分子の合成に成功しており,4に挙げている電荷移動度の評価まで完了していることから,おおむね順調に進展している.機能性色素化学次年度では,当初の研究計画に従って3自己組織化挙動の評価,に着手する.具体的には,本年度に得た知見を基に長鎖アルキル基を有する対称性D-A-Dダイアドを合成し,疎溶媒効果等によって自己組織体の合成を目指す.また,光誘起電子移動や自己組織化挙動は分光学的手法とTEM観察等により評価する.さらに,4有機電界トランジスタによる電荷移動度の評価,5有機薄膜太陽電池の試作,にも着手し,自己組織化とデバイス特性の相関を明らかにする計画である.
2次元ラマン及び赤外分光法における振動モード結合の解析プログラムの開発

本研究は、非線形に熱浴と相互作用したブラン運動モデルや量子回転子モデル等、統計力学的なさまざまなモデルを用いて、凝縮相中の分子のプロトン移動反応や電子移動反応等の量子動力学的ふるまいを調べることおとび、そのような効果が2次元分光スペクトルに及ぼす効果について調べることを目的とした。多次元相関関数の計算は、新たに導出した量子フォッカープランク方程式や経路積分の新しい定式化を用いて行った。非線形の熱浴相互作用に関しては、5次の2次元ラマン分光信号と、3次の2次元赤外分光信号(それぞれ2次の赤外分光過程と7次のラマン分光過程に対応)に関係した座標の3体と4体の相関関数について、ガウスマルコフ型非線形量子フォッカー・プランク方程式を数値積分することにより計算し、分子の振動子がノイズの相関関数の長さに応じて不均一から均一広がり分布変化する徳井なふるまいを、2次元分光信号の変化としてとらえられることを示した。また、2次元回転系の2次元分光についても、経路積分を用いて解析に求めた標識を使い、さまざまな条件下で詳細な解析を行った。回転系の1次元スペクトルでは、緩和をいれるとピークが大きく広がり量子的効果を観測することが困難であるが、2次元分光を用いると異なる準位に対する量子的遷移が、緩和が大きな場合も明瞭に観測され、量子効果を調べるのに有効な手段であることがわかった。近年の実験技術の進歩により、二次元分光の実験が盛んに行われるようになったが、それを解析する理論はまだまだ未整備である。実験と理論を結びつける基礎理論を構築する事が本研究の主な目的である。本年度は、相関関数から位相整合条件下での信号を導出するアルゴリズムの開発を行った。理論で通常計算される量は、双極子か分極率の相関関数なのに対し、実際に実験で測られる量は、レーザーの照射角度で特定の信号を検出する位相整合条件が加味されたものである。ポンプ・プローブやフォトン・エコー等さまざまな信号が測られているが、通常の理論はレーザーのシークエンスのみを考慮しており、位相整合条件による差異や、パルスの有限性による効果を考慮していない。そこで、それらを簡単に取り入れるアルゴリズムを開発した。これにより、これまでの理論で求められた相関関数にこのアルゴリズムを通すだけで、5次や7次のラマン、又は3次のIRによる様々な位相整合条件下での信号を、一度に計算出来るようになった。特に重要なのは、パルスが短くなると実際の実験では位相整合によるシグナルの分離が悪くなるのだが、これらの効果もこのアルゴリズムは再現しており、実験手法を思考実験するでも非常に有用にものと考えられる。結果は既に論文にまとめており、現在CPLに投稿中である。また、本年度はこれ以外に回転粒子系の2次元分光の基礎方程式も導出する事に成功している。現在、この解析的式をもとに数値計算を行い、結果を解析中であるが、振動回転相互作用等も2次元分光で解析する事を可能とする重要な結果である。本年度は、昨年度開発した汎用プログラムを用いて、非線形の熱浴との相互作用により2次元分光の信号がどのように変化するか詳細な解析を行った。これらの解析は1モードに対してであるが、プログラムをさらに2モードに拡張し、計算を行った。拡張すると計算時間が数十倍となり、計算時間がかかりすぎる問題があり、それを克服するためのさまざまな近似的手法を試した。2次元分光法は近似に非常に鋭敏なため、大きな近似をすると全く非物理的な結果を得かねない。そこで、リファレンスとするために、時間がかかるがまず近似抜きの計算を行っている。近年、パーソナルコンピューターの価格性能比が大幅に向上し、これらの計算も最新のパソコンを並列化することにより可能である。現在、プログラムの並列化を勢力的に行っている。

回転系の1次元スペクトルでは緩和をいれるとピークが大きく広がり量子的効果を観測することが困難であるが、2次元分光を用いると異なる準位に対する量子的遷移が、緩和が大きな場合も明瞭に観測され、量子効果を調べるのに有効な手段であることがわかった。強緩和の場合について解析を特に詳細に行い、2次元回転系での1次元スペクトルで観測される低振動数のピークと、ガラス等のラマン分光等で観測されるボゾンピークとの関係について議論し、もしこれがボゾンピークと関係しているなら2次元分光スペクトルを測定すれば、より明確に判断できることを示した。また、研究対象を双極子液体に拡張するために、2準位双極子系をイジングモデルでモデル化して、そのダイナミックスを調べるための基本方程式の導出し、その数値計算のために必要な乱数のプログラムの開発を行った。昨年、完全版ともいえる2次元ラマン分光の実験、分子動力学シミュレーションが成功し、2次元分光は新たな展開を迎えた。我々の研究目標は2次元分光のインフラとなる理論を開発することであるが、これら新しい実験やシミュレーションの結果は、我々がそれの結果が得られるより4年ほど前に発表した解析的な結果により説明されており、我々のアプローチの有用性を示すよい例になったと感じいる。本年度は、ガウスマルコフ的量子フォッカー・プランク方程式を用いて熱浴との非線形の相互作用が2次元分光に及ぼす効果の研究、経路積分を実行することにより回転系の2次元分光の厳密解を求め、その特徴について議論した。また、レッドフ理論を用いてトンネル過程が重要となるような化学反応系の2次元信号、モンテカルロ法を用いて極性ガラス系の2次元分光の信号を新たに計算し、このような系についても2次元分光法が有用なことを示した。理論的な計算を行うにあたっては、ファインマンダイアグラムを用いるやり方や、アルブレヒトダイアグラムを用いるやり方が知られているが、この両者の関係についても検討を行った。また、2次元分光の理論的枠組みとして、座標系を用いるかエネルギー準位系を用いるかの2通りあるのだが、両者の関係について詳細な検討を加え、エネルギー準位表示を用いるマスター方程式のやり方では、緩和の入れ方を注意しないと、現実の信号と全く違う結果になることを示した。このことを特にレッドフィールド理論とブロッホ方程式の2つの方程式を用いて示した。以上の結果は6報の投稿論文として纏められアクセプトされた。本研究のサイテーションの高さは目経産業新聞でも紹介されている。
多孔質体中の無機態窒素の移動・分解に関する研究

水分環境の制御により窒素循環を制御することを目的に,畑地と水田という全く水環境が異なる二つの農業的土地利用形態における窒素の循環機構について研究した.代表的な畑地土壌であるクロボク土と砂丘土について,硝化反応を中心に検討を進め,間隙構造が発達したクロボク土は砂丘土に比べて硝酸の生成が著しいことを明らかにするとともに,その反応と移動過程の定式化ならびにパラメータ決定を行った.そして数値シミュレーションにより,肥料流亡と降雨・潅水との関連についての検討を行った.畜産や酪農においては畜舎から排出される屎尿に含まれている窒素が環境汚染の原因としてその対策について注目が集まっているが,草地へ還元して窒素の循環系を作り上げる試みについて,米国における調査をもとに,窒素の循環の数値モデルを作成し,窒素循環の状況を分析するとともにその対策について検討を行った.水田では,田面は湛水により嫌気的環境が形成されているが、傾斜地水田の法面では大気との複雑なガス交換が起こるために,空間的,時間的に複雑な酸化・還元環境が形成されていることを明らかにして,窒素循環に法面がきわめて重要な役割を果たしていることを,地下水流動解析,水質分析,分子微生物生態学手法により明らかにした.多孔質体の間隙中に形成される複雑な環境に対応する微生物活動を詳しく検討するために、脱窒バイオリアクタを作成し,脱窒菌の活動状況を分析するとともに,このリアクタが脱窒装置としても十分実用できることを明らかにした.PCRとDGGEを活用した分子微生物生態系分析手法は,多孔質体中に形成される微生物のコンソーシアを分析する上で有効であることを確認し,今後この種の現象の分析手法として活用できることを明らかにした.研究は,フィールド調査,土壌カラム室内実験,バイオリアクター実験に分けて実施した。以下それぞれについて本年度の研究結果を報告す。フィールド調査:当初畑及び暗渠による地下排水改良工事が行われた水田を対象に非灌漑期に実施する予定であったが,地下水位変動の激しい傾斜地水田に調査対象を変えた。水収支調査,地下水位調査と併せて無機態窒素の動態を調べたが,きわめて大きな変化が生じていることを確認した。次年度以降はさらに新しく窒素動態を調べる予定である。土壌カラム実験:典型的な畑地土壌である砂丘砂と火山性クロボク土を採取し,室内に現地土壌を模したカラムを作成し,現地の施肥と水分管理を想定して,窒素がどのような挙動をするかを調べた。その結果,砂丘砂ではNH_4-Nの形で,クロボク土ではNO_3-Nの形で窒素が土壌水分の状態に応じて形態を変え,移動することが明らかになった。次年度以降はさらに詳しく窒素の動態を調べ,数理シミュレーションが可能になるところまで研究を進めたい。バイオリアクター実験:実際の農業集落排水処理場から排水される処理水を,固定化担体を利用したバイオリアクターを用いてさらに硝酸性窒素の高次処理を行った。その結果,処理が困難と言われる濃度の薄い窒素が効率よく除去できることを確認した。さらに固定化担体中でどのような微生物がどの部位で活動しているかを調べた。まず18SrRNA分析により,リアクターの運転状況によってきわめてダイナミックに微生物生態系が変化していることを確認した。つぎにタンパク質の染色によって,担体中での微生物活動部位が特定できる可能性のあることを確認した。本年度は予備実験を中心としたが,次年度以降は詳しい実験を行う予定である。水分環境の制御により窒素循環を制御することを目的に,畑地と水田という全く水環境が異なる二つの農業的土地利用形態における窒素の循環機構について研究した.代表的な畑地土壌であるクロボク土と砂丘土について,硝化反応を中心に検討を進め,間隙構造が発達したクロボク土は砂丘土に比べて硝酸の生成が著しいことを明らかにするとともに,その反応と移動過程の定式化ならびにパラメータ決定を行った.そして数値シミュレーションにより,肥料流亡と降雨・潅水との関連についての検討を行った.畜産や酪農においては畜舎から排出される屎尿に含まれている窒素が環境汚染の原因としてその対策について注目が集まっているが,草地へ還元して窒素の循環系を作り上げる試みについて,米国における調査をもとに,窒素の循環の数値モデルを作成し,窒素循環の状況を分析するとともにその対策について検討を行った.水田では,田面は湛水により嫌気的環境が形成されているが、傾斜地水田の法面では大気との複雑なガス交換が起こるために,空間的,時間的に複雑な酸化・還元環境が形成されていることを明らかにして,窒素循環に法面がきわめて重要な役割を果たしていることを,地下水流動解析,水質分析,分子微生物生態学手法により明らかにした.多孔質体の間隙中に形成される複雑な環境に対応する微生物活動を詳しく検討するために、脱窒バイオリアクタを作成し,脱窒菌の活動状況を分析するとともに,このリアクタが脱窒装置としても十分実用できることを明らかにした.PCRとDGGEを活用した分子微生物生態系分析手法は,多孔質体中に形成される微生物のコンソーシアを分析する上で有効であることを確認し,今後この種の現象の分析手法として活用できることを明らかにした.咋年度に引き続き,フィールド調査,土壌カラム室内実験,バイオリアクター実験に分けて実施した.以下ではそれぞれについての本年度の研究結果を報告する.(1)フィールド調査:本年度は,硝酸性窒素による河川水質汚濁の進んでいる鹿児島県薩摩半島池田湖集水域における汚濁の実態調査と対策法について調査を行った.

その結果きわめて高濃度の硝酸が河川に流出している実態が明らかになり,水質浄化が必要であること,浄化法としてはすでに昨年から本研究で実施しているバイオリアクターがきわめて有効であることが明らかとなった.本年は実験用のプラントの性能試験と効果の追跡調査を鹿児島県と連携して実施した.性能試験を冬季に実施したために,期待した脱窒効果が得られなかった.装置に若干の改良を施した上で,最終年度にさらに実験を行う予定である.(2)土壌カラムを用いた硝化作用の実験を昨年度に引き続いて実施,本年度は硝化作用と連動して生じる他のイオン類の相互作用の解析へと研究の展開を図っている.結果の再現性を最終年度に確認したい.(3)バイオリアクターの実験については,昨年度に引き続きリアクター内の分子微生物生態学的手法を用いて,リアクター内の環境により脱窒菌の生態系の変化,ならびに多孔性物体中の還元的環境の状況の分析を行った.引き続き分析を実施中であり,今のところ明快な結論が得られるまでには至らなかった.次年度の課題としたい.研究成果の概要は以下の通りである.(1)既に試作した20リットル脱窒リアクターに加えて,実用プラントに近い5,000リットルのリアクターを作成し,現地への適用実験を行った.いくつかの技術的改良を加えることにより,年間を通して安定に硝酸性窒素を除去できることを確認するとともに,リアクターの設計や運転に必要な諸元を得ることができた.(2)20リットルリアクターによる実験を引き続き行い,固定化担体中の微生物のコンソーシアの特徴的な変化をDNA分析手法を適用して確認した.(3)典型的な畑作土壌である火山性クロボクと砂丘砂を用いたカラム実験により,両土壌では硝化作用が大きく異なることを明らかにし,その現象を数値的にシミュレートするモデルを完成させた.また,そのモデルを用いて,施肥操作の数値実験を行って硝酸排出の負荷の少ない施肥法について検討した.(4)物質循環を具体的の応用した技術として,畜産・酪農分野では実用化が進んでいるが,酪農分野における採草畑の土壌中での窒素の挙動について,米国カリフォルニア州における実験圃場での観測結果をもとに分析と検討を行った.(5)傾斜地水田の法面部は,地下水の変動により激しく酸化還元状況が変化するが,この法面を含めて,傾斜地水田で特有の窒素の移動・分解が生じていることを,地下水変動解析と遺伝子解析手法を適用して明らかにした.(6)以上は,主な研究成果であるが,その他,硝化・脱窒に関する実験や現地レベルの多くの研究成果をあげた.それらの成果を体系的に整理し,一連の研究成果を総合的なとりまとめを行い,今後のこの課題への新たな展開の基礎を築くことができた.
極微小電場を利用した微粉砥石による超精密研削加工の研究

本研究においては、極微小電場において金属表面の最表層が活性化される現象を利用して、微粉CBNメタルボンド砥石による超精密研削加工技術を確立することを目的とする。まず、CBN砥粒を用いて、極微小電場で過渡的切削を行い、砥粒と被削材との接触開始点近傍の諸現象、単粒研削溝、切りくずを詳細に解析することによって極微小電場における切りくず生成機構を解明する。また、微粉CBNメタルボンド砥石と金属被削材との間に微小電圧を負荷した条件下での研削過程を検討し、研削加工面の創成過程を解明するとともに、研削加工面に結晶内の歪みによって生成される残留応力を定量的に評価することによって、極微小電場における研削加工変質層の生成機構を解明する。研削加工における砥粒の切込み深さは、零から次第に増加し、ある点で最大値をとったのち再び零まで減少する。一方、微小電場内の金属材料の表層部は活性化され、電場における活性化層深さは、負荷電圧すなわち電場深さによって変化する。そこで本研究においては以上のことを明確にする目的で、(1)研削加工における加工変質層の定量的な解明(2)仕上面の摩耗特性などを精力的に検討し、次ページの成果を報告した。
アポスポリー植物におけるＡＳＧＲ染色体の分子細胞学的解析

近年、アポミクシス(無性生殖)を制御する染色体特異的領域(ASGR)が発見された。本研究はギニアグラスで得られたアポミクシス候補遺伝子がASGRに座乗するか、アポミクシス植物間のASGRに相似性があるかについて解析した。その結果、候補遺伝子はASGRに座乗しておらず責任遺伝子ではないことが示唆され、ギニアグラスとチカラシバ属植物のASGRは相似性を示し、“ASGRの獲得によってアポミクシスが伝搬する"という仮説が支持された。1)Yamada-Akiyama, H. et al. (2009)によって得られたアポスポリー特異的ESTのP0165を含むBACクローン4個(EST-pmBAC100103:昨年度スクリーニング)からプローブを作製し、ギニアグラス・アポミクシス品種・ナツカゼについてFISH解析を行った。全てのBACは、ギニアグラス・ナツカゼの全ゲノム領域にハイブリダイゼーションし、特異的なシグナルは検出されなかった。さらに、ギニアグラス・ナツカゼから作製したCot-100ブロッキングDNAを使用した場合も同様の結果となり、EST-pmBAC100103にはギニアグラスのゲノム中に散在している反復配列を含むことが明らかとなった。2)Ebina et al. (2005)によって報告されているギニアグラス・アポミクシス植物に特異的なマーカー(A3-355, D5-139, E2-300, G4-228, B4-124, C6-261, D4-82,またはC8-293)を含むASGR-pmBACクローン8個を用いて、Pennisetum massaicumについてFISH解析を行った。8個のASGR-pmBACクローンのうち7クローンは、P. massaicumのゲノム上に特異的なシグナルが検出されなかった。一方、C8-293を含むASGR-pmBACクローンについては、特異的な強いシグナルがP. massaicumのASGR上に検出された。アポミクシス(無性生殖)の育種利用は長らく望まれているが、主要作物における利用成功例はない。近年、アポミクシスの一様式であるアポスポリーにおいては、性を制御する性染色体のように、アポスポリーを制御する特異的染色体(ASGR染色体)が発見され、この染色体の解析がアポミクシス研究において重要と考えられている。本研究はギニアグラスのASGR染色体について、3つのアポスポリー特異的Expressed sequence tag(EST)のマッピング、および他のアポスポリー植物におけるASGR染色体との比較解析を行うことを目的とした。1,ギニアグラスのバクテリア人工染色体(BAC)ライブラリーから、3つアポスポリー特異的ESTを含むBACをスクリーニングし、単離されたBACをプローブに用いて蛍光in situハイブリダイゼーション(FISH)解析を行った。その結果、1つのアポスポリー特異的ESTは反復配列のためにマッピング不可能だったが、2つはASGR以外に座乗しており、アポスポリーを引き起こす遺伝子ではないことが示された。2,FISH解析によって、ギニアグラス由来のASGR特異的BACはPennisetum属のアポスポリー植物のASGRに座乗し、また、Pennisetum属由来のASGR特異的BACはギニアグラスのASGRに座乗していることが明らかとなった。さらに、Pennisetum属のASGR特異的マーカーであるASGR-BBMLがギニアグラスのアポスポリー系統で検出された。これらの結果は、ギニアグラスとチカラシバ属植物のASGRの相似性を示し、“ASGRの獲得によってアポスポリーが伝搬する"という仮説を支持する。よって、主要作物におけるアポミクシスの育種活用を実現するために、ASGRの解明と利用が重要であることが示唆された。1)Yamada-Akiyama, H. et al. (2009)によって得られた3つのアポスポリー特異的EST(P0165, P0195またはP2574)をプライマーに用いて、46,080個の平均サイズ120 kbpのギニアグラス・BACクローンライブラリーについてPCRスクリーニングを行った。その結果、アポスポリー特異的EST P0165を含むBACが4クローン、P195が2クローン、P2574が5クローン得られた。これらのBACクローンをFISHのプローブに利用することによって、ESTの物理的マッピングが可能となった。2)ギニアグラス・アポスポリー品種ナツカゼ、ナツユタカおよび有性生殖系統のGR297のゲノムDNAを抽出し、Pennisetum属アポミクシス植物のASGR-BBMを検出するプライマー(BBM-like p779:TATGTCACGACAAGAATATG、BBM-like p780:TGTAACCATAACTCTCAGCT)を用いてPCRを行った。得られたPCR産物のクローニング行った。

その結果、Pennisetum属アポスポリー植物と同サイズのASGR-BBMのPCR産物が、ギニアグラス・アポスポリー品種ナツカゼ、ナツユタカで得られた。一方、有性生殖系統のGR297においてはPCR産物が得られなかった。これらの結果は、ギニアグラスとPennisetum属のASGRの相似性を示唆している。予定通り、一種類のアポミクシス特異的ESTを含む4つのEST-pmBACクローンに関するFISH解析を完了した。ASGRの相似性については、ASGR-pmBACを用いたP. massaicumへのFISH解析により、ASGRとギニアグラスの相同性について明らかにすることができた。P. squamulatumにおけるASGR-pmBACクローンの物理的マッピングは現在進行中である。予定通り、ESTを含むBACのスクリーニングが完了した。ASGRの相似性については、ASGR-BBMによって明らかにすることが出来た。また、ギニアグラスBACクローンの物理的マッピングは現在進行中である。1)アポスポリー特異的EST(P0195およびP2574)を含むBACクローンをプローブに用いてFISH解析を行い、アポスポリー特異的ESTがギニアグラスのASGR染色体に座乗するかどうか明らかにする。2)Pennisetum属アポミクシス植物のASGRにマッピングされるP. squamlatum由来BACクローンを用いて、ギニアグラスのASGR染色体に座乗するかどうかFISH解析を行い、Pennisetum属とギニアグラスのASGRの相同性について、より詳細に解析する。1)得られたアポスポリー特異的ESTを含むBACクローンをプローブに用いてFISH解析を行い、アポスポリー特異的ESTがギニアグラスのASGR染色体に座乗するかどうか明らかにする。2)ギニアグラスのASGR-BBMのシークエンスを行い、Pennisetum属のアポスポリー植物におけるASGR-BBMとの比較解析を行う。3)Ebina et al. (2005)によって得られた分子マーカーを含むギニアグラスのアポスポリー特異的BACクローンのうち、FISH解析によってギニアグラスのASGR染色体にマッピングされたASGR-BACクローンをプローブとして、Pennisetum属植物にFISHを行う。本研究課題の推進のため、次年度の研究費は、交付申請時の計画どおり、物品費・旅費に使用する。なお、未使用額については、研究費を効率的に使用して発生した残額であり、次年度に請求する研究費と合わせて研究計画遂行のために使用する。なお、次年度使用額194,944円は、研究費を効率的に使用して発生した残額であり、次年度に請求する研究費と合わせて研究計画遂行のために使用する。