hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
核酸アプタマーを利用した対象タンパク質の“超”選択的蛍光ラベル化

対象タンパク質を選択的に蛍光ラベル化することのできる革新的なプローブ分子の創出を目指して研究を行った。当初計画において、「対象タンパク質を特異的に認識する核酸アプタマー」と「近接したタンパク質と選択的に結合を形成する発蛍光性反応基」とをリンカーで連結させたプローブ分子を設計していた。まず、計画通り肝細胞増殖因子受容体c-Metを対象とした核酸アプタマーについて合成を行い、これを達成した。続いて、発蛍光性反応基については種々精査を行い、対象タンパク質を選択的に発蛍光ラベル化するのに適した反応基を見出すことに成功した。以上、対象タンパク質の“超"選択的蛍光ラベル化に資する研究成果を得た。1つの細胞には、数万種を超えるタンパク質が存在する。その中で、研究対象のタンパク質だけを選択的に蛍光ラベル化することができれば、そのタンパク質が織りなす様々な細胞内イベントをリアルタイムで観察できるようになる。本研究課題では、対象タンパク質を選択的に蛍光ラベル化できる革新的なプローブ分子の創出を目指している。当初計画において、「対象タンパク質を特異的に認識する核酸アプタマー」と「近接したタンパク質のみを選択的に蛍光ラベル化することのできる反応性標識基」をリンカーでつないだ連結分子をプローブ分子として設計している。本年度は、研究計画に従って、〔1〕がん細胞で過剰発現する肝細胞増殖因子受容体(c-Met)を対象タンパク質とした核酸アプタマーの合成に着手した。また、〔2〕近接したタンパク質を選択的に蛍光ラベル化するのに適した反応性を有する反応性標識基の探索を開始した。その結果、以下の研究成果を得ることができた。〔1〕対象タンパク質c-Metの認識に適した全長40-merの核酸アプタマー(trCLN3)の合成に成功した。また、trCLN3の5'-末端にアルキン修飾を施すことにより、反応性標識基との連結に適した核酸アプタマーを得ることに成功した。〔2〕反応性標識基に関して、緩衝液中での安定性・反応性・蛍光性を検討すべく、種々の化合物を設計・合成し、新たにエステル加水分解酵素による機能評価を加え、近接したタンパク質のみを選択的に蛍光ラベル化するのに適した反応性をもつ反応性標識基を見出した。本研究課題では、対象タンパク質を選択的に蛍光ラベル化することのできる革新的なプローブ分子の創出を目指している。当初研究計画において、「対象タンパク質を特異的に認識する核酸アプタマー」と「近接したタンパク質を選択的に蛍光ラベル化することのできる反応性標識基」をリンカーでつないだ連結分子をプローブ分子として設計している。昨年度は、肝細胞増殖因子受容体(c-Met)を対象とした核酸アプタマーと当初研究計画で設計した反応性標識基について、それぞれ合成を達成した。本年度は、当初研究計画の通り、核酸アプタマーと反応性標識基を連結し、肝細胞増殖因子受容体のラベル化実験を行う予定であった。まず、研究計画の通り核酸アプタマーと反応性標識基の連結実験を実施した。しかし、予想に反して目的の連結分子を純度良く得ることは困難であった。これは、反応性標識基の化学的な不安定性のためであると考えた。そこで、安定性が高いと予想される反応性標識基を再度設計し合成を行った。合成した反応性標識基について、望みのタンパク質を選択的に蛍光ラベル化するのに適した反応性をもつか、緩衝液中で安定であるか等、まずは低分子リガンドに連結して評価を行った。その結果、新たに設計した反応性標識基は優れた反応性と安定性を有することが明らかになった。今後、本反応性標識基と核酸アプタマーを連結し、対象タンパク質の“超"選択的蛍光ラベル化を実現したいと考えている。本年度は、核酸分子、蛍光分子、タンパク質ラベル化に関する成果について、論文発表および学会発表を行った。反応性標識基の探索が一つの鍵になると考えていたが、緩衝液中で優れた安定性を有し、かつ、近接したタンパク質を選択的に蛍光ラベル化するのに適した反応性を有する反応性標識基を見出すことができた。核酸アプタマーに関しても、対象タンパク質c-Metを蛍光ラベル化するのに十分な量を確保することができた。c-Met蛍光ラベル化に関する検討は遅れているが、反応性標識基の探索結果は当初計画以上のものであり、概ね計画通りに研究が進展していると考えている。生体関連化学核酸アプタマーtrCLN3と反応性標識基を連結させたプローブ分子を合成し、細胞系で対象タンパク質c-Metの選択的な蛍光ラベル化を試みる。ラベル化の選択性については、細胞溶解物を二次元電気泳動で分離した後、ゲル蛍光イメージャーで評価する。

連結リンカーの長さや剛直性、さらには反応性標識基の導入位置について種々検討を行い、c-Met選択的蛍光ラベル化に適したプローブ分子の創出を目指す。c-Metの選択的蛍光ラベル化が達成できたら、c-Met過剰発現細胞(基本的にはがん細胞)とc-Met非発現細胞の細胞識別化について評価を行う。研究開始前に、研究代表者の所属が変わった(大阪大学大学院薬学研究科から東京大学分子細胞生物学研究所へ異動した)ことにより、当初研究計画に挙げていた二次元電気泳動装置購入(約200万円)の必要がなくなった。そのため、当該年度の支出額が減少した。一方で、異動にともない当初計画以上に合成試薬の購入が必要となったため、標記の支出額となった。今後も合成試薬の購入額が大きくなると予想している。さらに、細胞培養関連でも当初計画以上の支出が予想される(バイオ関連汎用試薬、プラスチック類、蛍光顕微鏡使用費など、計画以上の支出が予想される)。したがって、これら実験関連の費用として使用していくことを計画している。
要介護高齢者の嚥下障害と服薬方法に関する研究

目的:服薬困難は内服治療の効果判定を不正確にし、服薬アドヒアランスを損なう。高齢者の服薬困難の実態を調査し、その課題を検討した。方法:服薬困難の定義は、薬の嚥下困難感やむせ、3回以上のみ込む動作、水で流し込む、口腔・咽頭・食道内残薬または残留感、薬の喀出とした。摂食嚥下障害専門職により服薬困難と判断された65歳以上の230名(29施設)を対象とした。結果:服薬困難患者の49%で口腔や咽頭内に残薬が、どの剤形でも認められた。服薬自立は29%、平素の食事が普通食は30%、嚥下スクリーニングテストは17%が正常であった。結論:服薬管理を担う医療スタッフの臨床的観察と連携が必要である。目的:本研究では、医療職の観察により、服薬状況の実態データを収集して解析し、臨床における服薬の問題点を抽出することを目的とした。方法:対象は22施設の服薬困難のある高齢者130名。服薬状況を調査した症例カードを回収して分析した。調査項目は服薬困難の状況、服薬困難であった薬剤、患者背景、嚥下障害の評価(反復唾液のみテスト、水飲みテスト、フードテスト、平素の食形態)、内服薬の剤形、服薬方法である。結果:服薬困難患者の年齢は70-80歳台が多く、男女比はM/F 59/69、基礎疾患は、脳血管障害54名、神経筋疾患19名、認知症17名、呼吸器疾患13名、頭頚部疾患3名であった。ただし重度の認知症は除外した。スクリーニングテストの水飲みテスト(water swallowing test)が異常なものは71名、反復唾液のみテスト(repetitive swallowing test)の異常は97名であった。服薬の自立は17名、全介助52名、半介助53名、服薬困難だが食事は普通食を食べているものは38名であった。一度に飲む薬剤数は1剤3剤91名、4剤6剤22名であった。服薬困難の薬剤は、剤形の大きさや剤形の種類に依存しなかった。服薬困難の状況としては、嚥下困難感(薬の飲み込みにくさ)、3回以上飲み込む動作、水やゼリーで何度も流し込む、むせ、口腔内残薬、咽頭残留感、服用後に口腔周辺などで薬が見つかるとの項目が多かった。現時点でのまとめ:服薬困難患者は、脳血管障害や神経筋疾患に多くみられ、スクリーニングテストで異常がみられていた。特にRSSTは服薬困難を予測するひとつの指標となる可能性があり、患者の服薬状況の注意深い観察が必要である。日本神経学会総会(英語セッション)・日本ハビリテーション医学会総会にて発表予定の中間報告は以下の通りである。<目的>要介護高齢者の服薬困難は、治療効果判定を不正確にし、服薬のアドヒアランスに影響を与える。本研究は、医療職の観察による服薬状況のデータから、臨床における服薬の問題点を抽出することを目的とした。<方法>対象は服薬困難のある高齢者(31施設223名)。医療職により報告された服薬状況の症例カードを分析した。調査項目は患者背景、服薬困難の状況、剤形、服薬方法、嚥下障害の評価、平素の食形態である。<結果>服薬困難患者の基礎疾患は、脳血管障害78名、神経筋疾患57名、認知症32名、呼吸器疾患20名、頭頚部疾患6名であった。(重度の認知症は除外対象)嚥下スクリーニングのMWST、RSSTは124名・74名で正常であった。服薬困難として多いのは、薬の飲み込みにくさ、3回以上飲み込む動作、何度も流し込むなどの主観的困難感によるもの、むせ、口腔内残薬、咽頭残薬、服用後に口腔周辺などで薬が見つかるなどの客観的な所見であった。薬剤効果に影響する口腔内残薬・咽頭残薬がある117名で、介護度はほぼ自立31名、部分介助34名、全介助33名で、服薬は自立17名、全介助52名半介助53名、平素は普通食を食べているものは、38名であった。<結論>服薬困難は神経内科疾患で多く、平素の食形態や介護度とは一定の関連が見られなかった。反復唾液のみテストは2/3の異常がみられ、特に口腔・咽頭の残薬との特異度が高く、服薬困難の予測因子となる可能性がある。研究協力者のミーティングを行い、学会発表は平成27年3月のDysphagia Reaserch Societyにおいても発表した。現在現場にて参照できる冊子を作成中である。目的:服薬困難は内服治療の効果判定を不正確にし、また服薬アドヒアランスを損なう。本研究では服薬困難のある患者の実態を調査し、その課題を検討した。方法:服薬困難の定義は、薬の嚥下困難感やむせ、3回以上飲み込む動作、水やゼリーで流し込む、口腔・咽頭・食道内残薬または残留感、薬の喀出のいずれかがある場合とした。摂食嚥下障害専門の医療職により服薬困難と判断された65歳以上の患者230名(29施設)を対象とした。

結果:服薬困難患者の基礎疾患は、脳血管障害79、神経筋疾患57、認知症19、呼吸器疾患18、頭頚部疾患6、その他であった。服薬困難の内訳は、薬の飲み込みにくさ158、3回以上飲み込む動作100、何度も流し込む117、むせ85、口腔内残薬82、咽頭内残薬と残留感59、服用後に口腔周辺で薬が見つかる42などであった(複数回答)。服薬困難患者の半数以上で口腔や咽頭内に残薬がみられ、残薬はどの剤形でも認められた。服薬は1/4が自立、平素の食事は1/3が普通食を食べており、嚥下スクリーニングテストは1/3が正常であった。水平なアートアセテートフィルム板に置いたOD錠・糖衣錠・フィルムコート錠・裸錠の4種類の剤形への水0.3cc滴下後の付着性実験では、糖衣錠は付着性が極めて少なかったが、口腔内崩壊錠(OD錠)・フィルムコート錠・裸錠では付着性が強く見られた。同効のジェネリックOD錠7種類の同様の付着性試験では、付着性と崩壊性に顕著な差が見られた。結論:服薬困難は剤形、服薬の自立度、平素の食事形態によらずおこり得ると考えられ、服薬管理を担う医療スタッフの臨床的観察と連携が必要である。目的:服薬困難は内服治療の効果判定を不正確にし、服薬アドヒアランスを損なう。高齢者の服薬困難の実態を調査し、その課題を検討した。方法:服薬困難の定義は、薬の嚥下困難感やむせ、3回以上のみ込む動作、水で流し込む、口腔・咽頭・食道内残薬または残留感、薬の喀出とした。摂食嚥下障害専門職により服薬困難と判断された65歳以上の230名(29施設)を対象とした。結果:服薬困難患者の49%で口腔や咽頭内に残薬が、どの剤形でも認められた。服薬自立は29%、平素の食事が普通食は30%、嚥下スクリーニングテストは17%が正常であった。結論:服薬管理を担う医療スタッフの臨床的観察と連携が必要である。予定通り症例を集積し、研究協力者によるミーティングを行い、データを分析した。現在その結果をもとに、医療介護現場への啓蒙のための冊子(パンフレット)を作成中である。神経内科学(神経難病)パンフレットを研究協力施設に配布し、現場の服薬困難に関する現状と認識調査(無記名アンケート)を行う予定である。また、啓蒙活動に活用するため、口腔・咽頭残薬写真を集積予定であり、特に課題となった口腔内崩壊錠については、服薬時の薬剤の動きについても、内視鏡ビデオの動画として記録予定である。メールによるデータ依頼、定期的な情報交換が有効であったと思われる。次年度に服薬困難に関する冊子(パンフレット)を作成し、研究協力者に配布し、それについてのアンケートを実施予定としている。それらの必要経費を次年度使用としたため、未使用額が生じた。平成26年度は継続して症例カードを回収するとともに、56名の研究協力者とのミーティングを予定している。服薬困難について、多くの問題点や注意喚起点が見出されたので、今後の啓蒙活動に向けて、手引書作成に向けて意見交換の予定である。また、評価の同意が得られた症例については、詳細な嚥下機能検査や呼吸と嚥下の同期性検査に向けて、関係者と準備を勧める予定である。平成27年度(最終年度)は、服薬困難に関する冊子(パンフレット)を作成し、研究協力者に配布し、それについてのアンケートを実施する予定である。パンフレット印刷代、郵送代などの費用、並びに研究分担者を新たに2名追加し、研究を発展させるための必要経費に充当する予定である。本研究は多施設共同研究であり、広く研究内容を周知して研究参加を呼び掛けたため、研究協力者確定に一定の時間を必要とした。56名の研究協力者が現在データ収集に当たっている。また、各研究協力者所属機関における倫理審査委員会の承認を得る必要があった。そのため、第1回の症例カードの記入が9月、送付が10月となり、その後、第2回が1月締め切り、第3回が4月締め切りというスケジュールで経過している。現在は第2回のデータ
精密温度制御を目指した磁性温熱療法の技術開発

磁気温熱療法用の熱源であるマグネタイトナノ粒子(MNPs)を熱分解法により作製した。MNPsの合成温度を200°Cから250°Cへと増加させたところ、平均粒子径(D_<av>)は6.6 nmから12.5 nmへと増大した。MNPsの発熱量はD_<av>が12.5 nmの試料では22.5 W/gに達した一方、D_<av>が6.6 nmの試料では有意な発熱は見られなかった。合成したMNPsを両親媒性高分子で被覆することで、水やバッファ溶液に対して分散安定性を付与できた。最初にマグネタイトナノ粒子(MNPs)の細胞中での発熱特性を評価した。水溶液中で作製したMNPsを貪食能を有するマクロファージ細胞の共存下でインキュベートしたところ、顕微鏡観察から細胞が黒く染色できていることが確認できた。次にMNPsを内包した細胞の培養液に600kHzの交流磁場を30分印加したところ、MNPsの濃度が1.5mg/mL以上で8°C以上の温度上昇が確認できた。一方、ガン細胞の一種であるメラノーマ細胞の場合、貪食細胞と同様の手順ではマグネタイトナノ粒子はほとんど取り込まれなかった。In vitroの実験と並行して、発熱効率の高いMNPsの合成方法についても検討した。不飽和脂肪酸であるオレイン酸とオレイルアミンの混合溶媒中で合成したMNPsは、水溶液中で作製した試料よりも高い発熱効率を示すこと、また、動的光散乱法と電子顕微鏡観察から、この試料はトルエン中では分散状態を維持できることがわかった。一方、肝臓などの臓器を模擬した媒体であるポリビニルアルコールハイドロゲルに対しては分散性を維持的できず容易に沈降した。純水とリン酸緩衝液に対しても同様の結果が得られた。以上のことから、粒子合成後の後処理で親水性を向上する方針に切り替えた。このため、本研究室に所属している前期博士課程の学生1名をドイツ・ボーフム大学生物無機化学研究室へ派遣し、抗体の模擬物質として選定したペプチドをリンカー分子を介してMNPsと結合する手法について検討した。この結果、長鎖のアミン分子やポリエチレングリコールメチルエーテル(PEGME)をマグネタイトナノ粒子の表面に付加することで、水系溶媒への分散に成功した。PEG修飾はMNPsを貪食細胞に捕食されにくくすることが知られており、PEG誘導体であるPEGMEでも同様の効果が期待できる。磁気温熱療法で熱源として用いられる磁性ナノ粒子は、交流磁場を印加することで磁気モーメントの緩和に由来する発熱を示す。ヒト体内に磁性ナノ粒子を導入して磁気温熱療法を適応する場合、磁性ナノ粒子は(1)高い発熱効率、(2)血液中での分散性、(3)ガン細胞への特異的吸着能、の3点を有することが必要である。熱源に用いられるマグネタイトナノ粒子(MNPs)の発熱効率は、その直径が12.5nmのときに極大となる。しかし従来の水系合成ではMNPsの粒度分布が広くなり,発熱効率が低下する問題があった。そこで申請者は粒子サイズを精密に制御できる熱分解法によるMNPsの合成に取り組んだ。この結果、平均粒子径12.5±1.4nmという均一なサイズのMNPsを得ることに成功した。また、交流磁場照射試験の結果から、この試料の発熱効率は22.5W/gと算出された。一方、溶媒として用いたオレイン酸とオレイルアミンがMNPs表面を覆っているため、合成後のMNPsは水などの極性溶媒にはほとんど分散しない。この問題を解決するため、合成後のMNPsを両親媒性高分子(ACP)で被覆した。この結果、ACP被覆後のMNPsは水やバッファ溶液に安定に分散することが明らかになった。ACPはマクロファージなどによるMNPsの貪食を抑制するとともに、ガン抗原を認識、結合する抗体の結合サイトとしても働く期待がある。そこで、モデル反応としてクロスリンカー分子(CLM)を介してACP被覆MNPsとウシ血清アルブミン(BSA)との結合を試みた。MNPsに対するCLMの導入量を増やすとBSAの吸着量が減少した一方、CLMを含まない試料ではCLMを導入した試料よりもBSAをよく吸着した。MNPs表面に存在するオレイン酸イオンがBSAと優先的に結合し、CLMの導入量増大に伴ってオレイン酸イオンとBSAとの結合が阻害されたものと推察される。
持続可能な開発のための教育を推進させるマイクロスケール実験教材の開発と改良

通常実験の規模を縮小させたマイクロスケール実験には,実践操作が容易,安価,安全,迅速,環境に優しい等,多くの長所がある.これまで数多くのマイクロスケール実験に関する研究が行われてきた.しかし,持続可能な開発のための教育の視点からは,ほとんど検討されていない.本研究では,持続可能な開発のための教育を推進させるためのマイクロスケール実験教材の開発や改良を試みた.さらに,児童・生徒を対象とした授業実践も行った.1学会・研究会における情報検索・収集:第15回近畿地区化学教育研究発表会,日本環境教育学会第24回大会,日本理科教育学会第63回全国大会,平成25年度化学系学協会東北大会,平成25年度日本理科教育学会近畿支部大会,日本化学会第94春季年会等に参加して,マイクロスケール実験(MSE)や持続可能な開発のための教育(ESD)に関する情報収集を行った.また,化学と教育,理科の教育,School Science Review, Journal of Chemical Education等の学術雑誌にも目を通し,情報収集に努めた.2 MSEに関する普及・啓発活動:研究代表者の勤務校におけるサイエンス体験(高校生を対象に実施する実験講座)やスーパーサイエンスハイスクール(SSH)で,授業実践を行った.また,理科教育法や物理学実習の授業で,MSEを紹介した.3化学分野のMSE教材の開発・改良:昨年度より着手した溶液の希釈に伴う体積の非加成性に関して検討を加え,各種水溶液に応用して教材としての有効性を確認した.また,平衡移動に関するマイクロスケール実験で使用する指示薬の濃度の適正化に関しても検討した.さらに,昨年度作成した「マイクロスケール実験シート」を,授業実践や学会で高校生や教育研究者に配布し,残部が僅少となったため増刷した.4科研費通信の発行・送信:本研究の研究協力者(大学・高校教員)に学会の案内や研究成果を周知するため,適宜科研費通信を発行して送信した.5研究成果の公表:研究成果を,第15回近畿地区化学教育研究発表会,日本環境教育学会第24回大会,日本理科教育学会第63回全国大会,平成25年度化学系学協会東北大会,平成25年度日本理科教育学会近畿支部大会,日本化学会第94春季年会で口頭発表した.さらに検討を加え,成果の一部を,神戸女学院大学論集に誌上発表した.1研究組織の編成:マイクロスケール実験(MSE)や持続可能な開発のための教育(ESD)に興味・関心を持つ理科教員に呼びかけ,本研究を実施するのに必要な研究組織を編成した.3 MSEに関する普及・啓発活動:オープンキャンパスや高大連携授業等により,高校生を対象とした授業実践を行った.また,理科教育法や物理学実習の授業で,MSEを紹介した.4化学分野のMSE教材の開発・改良:液体の混合や溶液の希釈に伴う体積の非加成性に関して,教材開発・改良を行った.また,12穴セルプレートの蓋を加工し,電池や電気分解のMSE教材を開発した.さらに,MSEの授業実践で使用した実験シートをまとめ,「マイクロスケール実験シート」を作成した.5研究成果の公表:研究成果を,日本理科教育学会第62回全国大会や日本化学会第93春季年会,22nd International Conference on Chemistry Education,日本理科教育学会近畿支部大会等で口頭発表した.さらに検討を加え,神戸女学院大学論集やLa Chimica nellaScuola(教育化学,イタリア化学会編)等の学術雑誌に発表した.1国際会議・学会・研究会における情報検索・収集:第17回近畿地区化学教育研究発表会,23rd International Conference on Chemistry Education,日本物理教育学会第31回物理教育研究発表大会,日本理科教育学会第64回全国大会,マイクロスケールケミストリー第3回シンポジウム,日本教材学会第26回研究発表大会,日本化学会第95春季年会等に参加して,マイクロスケール実験(MSE)や持続可能な開発のための教育(ESD)に関する情報収集を行った.また,化学と教育,理科の教育,School Science Review等の学術雑誌にも目を通し,関連情報の収集に努めた.2 MSEに関する普及・啓発活動:研究代表者の勤務校におけるオープンキャンパス模擬授業や子どもサイエンス体験講座,スーパーサイエンスハイスクール(SSH)等で,授業実践を行った.3化学分野のMSE教材の開発・改良:昨年の研究内容を継続・発展させ,溶液の希釈に伴う体積の非加成性について検討し,主として無機塩の水溶液に応用して有用性を確認した.マイクロスケール実験における酸塩基指示薬の濃度適性化やマイクロスケール電池教材に関しても検討を進め,有用性を確認した.4生物学分野のESD教材の開発:研究協力者の大西氏の協力を得て,生態学分野のESD教材の改良・改良と授業実践に取り組んだ.5研究成果の公表:研究成果を,第17回近畿地区化学教育研究発表会,23rd International Conference on Chemistry Education,日本物理教育学会第31回物理教育研究発表大会等で発表した.さらに検討を加えて,教材学研究や神戸女学院大学論集に誌上発表した.2 MSEに関する普及・啓発活動:研究代表者の勤務校におけるサイエンス体験講座・オープンスクール模擬授業,青少年のための科学の祭典(神戸会場大会),高校への出前授業等で授業実践を行い,MSEの普及・啓発活動に努めた.3化学分野のMSE教材の開発・改良:溶液の混合に伴う体積の非加成性について再検討した.また,アントシアニンを酸塩基指示薬として使用したマイクロスケール実験教材を開発し,有用性を確認した.

4生物分野のMSE教材の開発:研究協力者である宮田氏の協力を得て,酵素反応に関するマイクロスケール実験教材の開発と授業実践を行い,有用性を確認した.5研究成果の発表:第17回近畿地区化学教育研究発表会,日本理科教育学会第65回全国大会,日本物理教育学会第32回物理教育研究大会,日本教材学会第27回研究発表大会,6th Network for Inter-Asian Chemistry Educator, International Chemical Congress of Pacific Basin Societies,日本化学会第96春季年会で口頭発表した.さらに,神戸女学院論集にも誌上発表した.研究開始時点から現在に至るまで,概ね「研究実施計画」通りに進展している.これまでに開発・改良したマイクロスケール実験教材を用いて,サイエンス体験やオープンキャンパス模擬授業,高校への出前授業,青少年のための科学の祭典等で,児童・生徒を対象に授業実践を実施し,教材の有用性を確認した.これは,MSEの普及・啓発活動の観点から高く評価できる.研究成果の学会発表や誌上発表にも,研究代表者以外に,研究協力者も貢献している.これより,研究体制が充実し,共同研究により研究が推進したことは明確である.1学会・研究会における情報検索・収集:第18回近畿地区化学教育研究発表会,日本理科教育学会第66回全国大会,日本理科教育学会近畿支部大会等に参加して,マイクロスケール実験(MSE)や持続可能な開発のための教育(ESD)に関する情報収集を行った.また,化学と教育,地学教育,物理教育等の学術雑誌にも目を通し,関連情報の収集に努めた.2 MSEに関する普及・啓発活動:研究代表者の勤務校におけるオープンキャンパス模擬授業,青少年のための科学の祭典(神戸会場大会),高校への出前授業等で授業実践を行い,MSEの普及・啓発活動に努めた.3化学分野のMSE教材の開発・改良:ダニエル電池に関する教材開発・改良や,電池教材の発展的な内容としてネルンストの式を用いた電池の起電力の指導法に関して検討した.ダニエル電池や電気分解用の蓋も加工して作製した.加えて,研究協力者の宮澤氏の協力を得て,マイクロスケール実験の手法を用いたダニエル電池および鉛蓄電池の授業実践を行い,有用性を確認した.4物理分野・地学分野のMSE教材の改良:研究協力者の内田氏の協力を得て,液体の密度測定に関するマイクロスケール実験の授業実践を行い,有用性を確認した.研究協力者の平井氏・笹部氏の協力を得て,岩石・鉱物の密度測定の関するマイクロスケール実験教材の開発・改良と授業実践を行い,有用性を確認した.5研究成果の発表:第18回近畿地区化学教育研究発表会,日本理科教育学会第66回全国大会,日本理科教育学会近畿支部大会等で口頭発表した.6
巨大DNAクロ-ニングによるヒトHLA抗原遺伝子の構造解析

ヒトHLA遺伝子領域に位置する疾患感受性遺伝子の同定、遺伝的多型性の生成の機序の解析、ヒトの遺伝子構成の解明などを目的として、我々はHLA全領域のクロ-ニングを目指している。我々のグル-プはすでに全3.500Kb中1.450Kbをコスシドベクタ-にクロ-ニングしていたが、今年度はコスシドに加えてYACベクタ-によるクロ-ニングの系を確立し新たにクラスI抗原領域を中心に800Kbをクロ-ニングした。YACクロ-ンのインサ-トサイズは160Kb70OKbであり、HLAーB及びーC遺伝子周辺に数多くのCpGislandが存在することが明らかとなり、これらの遺伝子とクラスI抗原と相関する多くの疾患(ベ-チュット病、尋常性乾癬、強直性脊椎炎など)の原因遺伝子との関係を追及するために、現在cDNAクロ-ンの分離、解析を行っている。またクラスIII遺伝子よりクラスII遺伝子に向けてコスシドウオ-キングをおこない、150Kbの領域をクロ-ニングした。この領域はGcrich→ATrich領域の変化する興味ある部位であるが、コスシドクロ-ンの解析によりこの変化が連続的ではなく、不連続的であることが示唆された。またこの解析の過程で21ーOHハイドロキシラ-ゼ遺伝子より約100Kbセントロメア側にテネイシン様の遺伝子が塩基配列の決定によりみいだされた。すなわち、N未端から中心球状部、7反復部、EGF様繰り返し配列、フィブロネクチンIII型繰り返し配列、フィブリノ-ゲン様配列が続く典型的なテネイシン様構造をもつことが明らかとなった。なお興味あることに、このテネイシン様遺伝子と21ーOHハイドロキシラ-ゼB遺伝子の3'未端は互いにオ-バ-ラップしていた。この遺伝子とクラスII抗原と相関する疾患との関係は今後の課題である。ヒトの主要組織適合複合体(MHC)であるHLA抗原は免疫応答の制御やさまざまな疾患の発症に関与し、HLA遺伝子群は3500Kb以上からなる長大な多重遺伝子族を形成している。我々はこれまでに約900KbのHLA遺伝子コスミドクロ-ンを分離したが、全領域をクロ-ニングするには至っていない。本研究はこれら未知の領域を酵母pYACベクタ-及び大腸菌F因子ベクタ-を用いて巨大DNAクロ-ニングを行い、HLA遺伝子全領域の遺伝子構成を明らかにすることを目的とする。今年度はHLAホモ接合体B細胞株AKIBAより巨大DNAライブラリ-の作成を試みた。大腸菌ミニF因子をベクタ-として用いる系では細胞より凍結破砕法を用いてDNAを抽出し、50300Kbの断片が生じるようにEcoRIで部分切断した。このDNA断片をミニFpMF7のEcoRI切断部位に挿入し、大腸菌HB101に形質転換した。その結果、50Kb前後の挿入断片を持つAmp耐性形質転換菌(1×10^4/μgDNA)が得られた。一方、酵母のpYAC4ベクタ-を用いる系ではアガロ-スビ-ズ法によりビ-ズ内に細胞を封入し、ビ-ズ内の高分子DNAをEcoRIで部分切断後、pYAC4のEcoRI切断部位に挿入し酵母AB1380に形質転換した。1×10^3/μgDNAの頻度で形質転換コロニ-が得られ、挿入DNA断片の長さは大部分が100150Kb前後であり、200400Kbの長さの挿入断片を持つ形質転換体も約10%みられた。

この方法により現在までに2000個余りのUra^+,Trp^+の形質転換体の分離と保存を行った。以上の結果より、大腸菌ミニFベクタ-を用いた系では100Kb以上の挿入断片を持つ形質転換体は分離できず、pYAC4ベクタ-を用いた系では100Kb以上の挿入断片を持つ形質転換体が得られたことから、現在pYAC4ベクタ-を用いた系でライブラリ-の作成を進めている。今後、電気泳動法とショ糖密度勾配遠心法によって200Kb以上の長いDNA断片を分画し、より長い挿入断片を持つライブラリ-の作成を試みる予定である。ヒトHLA遺伝子領域に位置する疾患感受性遺伝子の同定,遺伝的多型性の生成の機序の解析、ヒトの遺伝子構成の解明などを目的として、HLA全領域のクロ-ニングをすすめているが、本年度はYACライブラリ-よりHLA領域を含むクロ-ニを分離、解析するとともに、コスミドによるクロ-ニングをおこない、新しく400kbの領域について構造解析をすすめることにより新しい遺伝子9個を同定した。すなわち、YAC及びコスミドによるジ-ンウォ-キング,パルスフィ-ルド電気泳動による物理的地図の作成とCpG islandの同定,マウスHー2領域にマップされる遺伝子プロ-ブなどをもちいて新しく400kbをクロ-ニングし、それらの領域についてノザンブロッティングやcDNAクロ-ンの分離と塩基配列の決定などの方法により発現遺伝子の同定をおこなった。その結果,DNAーDOB間に新しい遺伝子NATを同定し、cDNAクロ-ンの解析によりATP依存輸送蛋白様の産物をコ-ドする遺伝子であることが判明した。さらにHLAーDP遺伝子亜領域よりテロメア側コラ-ゲンα2サブユニット遺伝子をはじめ6つの発現遺伝子、クラスIIIークラスII遺伝子間にフィブロネクチン様の遺伝子、クラスIIIークラスI遺伝子間に精細胞特異的熱ショック蛋白70様遺伝子を新しくみいだした。このようにHLA領域には多くのnonーHLA遺伝子が座位していることが明らかとなり、これらの遺伝子が疾患の発症を規定している可能性が考えられ将来重要な課題と考えられる。発現遺伝子が高密度に分布しているHLA領域はヒト遺伝子構成を知る格好のモデルを提供するであろう。現在,YACライブラリ-のスクリ-ニングを中心にHLA全領域のクロ-ニングをすすめている。ヒトHLA遺伝子領域に位置する疾患感受性遺伝子の同定、遺伝的多型性の生成の機序の解析、ヒトの遺伝子構成の解明などを目的として、我々はHLA全領域のクロ-ニングを目指している。我々のグル-プはすでに全3.500kb中1.450kbをコスミドベクタ-にクロ-ニングしていたが、今年度はコスミドに加えてYACベクタ-によるクロ-ニングの系を確立し新たにクラスI抗原領域を中心に800kbをクロ-ニングした。YACクロ-ンのインサ-トサイズは160kb700kbであり、HLAーB及びC遺伝子周辺に数多くのCpGislandが存在することが明らかとなり、これらの遺伝子とクラスI抗原と相関する多くの疾患(ベ-チェット病、尋常性乾癖、強直性脊椎炎など)の原因遺伝子との関係を追及するために、現在CDNAクロ-ンの分離、解析を行っている。またクラスIII遺伝子よりクラスII遺伝子に向けてコスミドウォ-キングをおこない、150kbの領域をクロ-ニングした。この領域はGCrich→ATrich領域の変化する興味ある部位であるが、コスミドクロ-ンの解析によりこの変化が連続的ではなく、不連続的であることが示唆された。またこの解析の過程で21ーOHハイドロキシラ-ゼ遺伝子より約100kbセントロメア側にテネイシン様の遺伝子が塩基配列の決定によりみいだされた。
マクロファージを制し根治を目指す！新型電子顕微鏡での肥厚性瘢痕、ケロイドの研究

肥厚性瘢痕(HS)とケロイドを電子顕微鏡FIB/SEMを用いて解析し三次元的な組織構築の違いをから両者の鑑別が可能か検討した。1正常皮膚、2成熟瘢痕、3肥厚性瘢痕および4ケロイドの4組織型から得た試料を用いて、線維芽細胞(Fb)とマクロファージ(Mφ)両細胞間の接触の有無、接触様式を解析し4組織型の有意差の有無を統計解析した。接触の有無については、123と4の間に有意差があり、接触形態は12と3の間に有意差があった。したがって、肥厚性瘢痕とケロイドには電子顕微鏡で明確な組織構築の違いがあり、この手法を用いて両者の鑑別が可能と考えられた。肥厚性瘢痕とケロイドは、ともに創傷治癒過程でコラーゲン線維が過剰に生産された状態であるが、未だにその発生機序や診断に関しては不明なことが多く、組織学的に両者を鑑別することが困難な疾患である。肥厚性瘢痕とケロイドの発生には、コラーゲン線維産生を行っている線維芽細胞と近年炎症や免疫反応に重要な役割を担っていることが明らかになってきたマクロファージが何らかの役割を担っていると考えられるが、これまでの2次元切片の観察での解析は不可能であった。そこで、2010年に久留米大学に導入された電子顕微鏡はFIB/SEM(focused ion beam/scanning electron microscope)を用いて、細胞・組織の三次元微細構造解析を行うことで、新たな知見を得る試みを行っている。1正常皮膚、肥厚性瘢痕とケロイドの組織採取と組織サンプルの電子顕微鏡観察:形成外科手術によって採取された正常皮膚、肥厚性瘢痕、ケロイド及び成熟瘢痕の組織を各々n=5ずつ採取し、随時重金属en bloc染色を行い、FIB/SEM観察を行っている。観察範囲は70μm角で、画像の3D再構築と解析では、a)組織内のコラーゲン線維の3D配置や走向、b)線維芽細胞やマクロファージの分布及び両者の接点に着目して微細構造解析を行っている。特にb)では、各組織間に明らかな相違点が見られており、定量解析による評価を試みている。2正常皮膚、肥厚性瘢痕とケロイドの光学顕微鏡レベルでの解析:1の手法で取得できる画像の大きさは、直径70μmのごく狭い範囲であるため、得られた所見が組織全体でも観察できるかどうかを検討する必要がある。そこで、FIB/SEMの解析と平行して、線維芽細胞のマーカーであるHSP47とマクロファージのマーカーであるIba-1の免疫二重染色にて組織を観察し、定量解析を試みている。H27年度の予定であった正常皮膚、肥厚性瘢痕とケロイド組織内でのコラーゲン線維や細胞間の接触形態についての解析は、必要なサンプル数の取得も予定通りに行え、すでに試料は必要十分な数に達している。試料の作成及び組織の観察についても概ねスムーズに進行している。観察対象が、遺伝的多様性を持つヒトの試料であるので、より正確な観察結果を得る目的で1試料あたり複数箇所の観察を行う必要がある。従って、電子顕微鏡解析には、予定よりやや時間がかかる見込みである。これまで肥厚性瘢痕とケロイドの違いについて集束イオンビーム観察装置付走査型電子顕微鏡(focused ion beam/scanning electron microscope:以下FIB/SEM)を用いて、それぞれの立体構造を解析し、細胞構築の違いを三次元的に明らかにすることで両者の鑑別を行ってきた。現在までに、正常皮膚5例、成熟瘢痕5例、肥厚性瘢痕5例およびケロイド5例に対して解析を行ってきた。1例につきそれぞれ3カ所の部位をFIB/SEMにて観察したため、観察部位の数は1組織につき3×5=15カ所で、総計60カ所であった。そして、線維芽細胞とマクロファージとの接触の有無、接触の程度(面状か点状か)について観察し、Fisher正確検定を用いて4種類の組織間に有意差があるかないかを検討した。正常皮膚では、15カ所全ての観察部位で線維芽細胞とマクロファージの接触がみられ、全て面状(100%)であった。成熟瘢痕では、接触有りが15カ所中13カ所(87%)で、その内面状が12カ所(80%)と点状が1カ所(7%)であり、接触無しは2カ所(13%)であった。肥厚性瘢痕では、接触有りが15カ所中12カ所(80%)で、その内面状が3カ所(20%)と点状が9カ所(60%)であり、接触無しは2カ所(20%)であった。ケロイドでは接触有りが15カ所中2カ所(15%)で、その内面状が1カ所(7.5%)と点状が1カ所(7.5%)であり、接触無しは13カ所(85%)であった。接触の有無については、正常皮膚と成熟瘢痕および肥厚性瘢痕の間に有意差は認められず、それら3つの組織とケロイドの間には有意差が認められた。接触有りと判定されたそれら3つの組織における接触の程度(面状、点状)については、正常皮膚と成熟瘢痕の間に有意差は認められず、それら2つの組織と肥厚性瘢痕の間には有意差が認められた。

解析を行うそれぞれの組織の数を、より正確性を期すためにより多くの数を集めていたため、さらにそれぞれの組織間全てにおいて電子顕微鏡での観察や解析を行うには、全てPCの操作を人で行うしかなく、必要とするため考慮、人手と時間を要するため。鑑別が困難な、肥厚性瘢痕とケロイドをfocused ionbeam/scanning electron microscope(FIB/SEM)を用いて、組織構築を解析し、細胞間接触様式の違いを三次元的に明らかにすることで両者の鑑別か可能か検証を行った。解析は、1正常皮膚(5例)、2成熟瘢痕(5例)、3肥厚性瘢痕(5例)および4ケロイド(5例)、の4組織型を用いた。各症例の組織サンプルから電顕試料を作成し、観察部位はコラーゲン線維の増生が著明な真皮網状層とし、観察箇所は1例から無作為に3箇所を選び、1組織型(例えば1)では15カ所、4組織型では総数は60カ所のFIB/SEM解析を行った。正常口腔粘膜において、線維芽細胞とマクロファージ同士が接着しているとの報告に着目し、4組織型における、この2種類の細胞数および両細胞間の接触の有無、接触様式(面状か点状か)について解析し、Fisher検定にて4組織型の有意差の有無を検討した。観察部位や組織型における細胞数の偏りは見られなかった。1では、全ての観察部位において、2種類の細胞同士の接触がみられ、全て面状(100%)の接触様式であった。2では、接触を持つものが87%で、うち面状の接触様式が80%と点状が7%であり、接触無しは13%のみであった。3では、接触ありが80%で、うち面状が20%と点状が60%であり、接触が無かったのは20%であった。4は、接触ありが15%のみで、面状が7.5%と点状が7.5%、接触を持たないものは85%であった。接触の頻度は、1と2および3の間に有意差は認められず、これら3つと4の間は有意差があった(p<0.05)。2つのの細胞間接触があった、これら3つの組織における接触様式の違い(面状or点状)については、1と2の間に有意差は認められず、これら2つの組織と3の間には有意差が認められた。肥厚性瘢痕(HS)とケロイドを電子顕微鏡FIB/SEMを用いて解析し三次元的な組織構築の違いをから両者の鑑別が可能か検討した。1正常皮膚、2成熟瘢痕、3肥厚性瘢痕および4ケロイドの4組織型から得た試料を用いて、線維芽細胞(Fb)とマクロファージ(Mφ)両細胞間の接触の有無、接触様式を解析し4組織型の有意差の有無を統計解析した。接触の有無については、123と4の間に有意差があり、接触形態は12と3の間に有意差があった。したがって、肥厚性瘢痕とケロイドには電子顕微鏡で明確な組織構築の違いがあり、この手法を用いて両者の鑑別が可能と考えられた。現在までに解析を行って得られた所見から、今後の方針として、次の2点を明らかにする予定である。1)ケロイドでは周囲の健常皮膚に水平方向へ伸展・増殖していく傾向が見られるが、このような特異的なケロイド増大のメカニズムを解明することである。創にかかる緊張、これについては力学計算を応用した応力を工学的手法によって解明しようとする試みが進められつつあるが、この応力の方向と線維芽細胞の向きや細胞の配列とに何らかの関係性がみられるか検討を加える予定である。また、2)細胞間接触に関わる分子機構の解明についても検討を加える予定である。既に候補となり得る分子機構についてはpick up作業が終了しており、当初の計画に加えて上述の2項目についても研究を進める。今までの研究結果から、FIB/SEM解析において、正常皮膚と成熟瘢痕と比較して、肥厚性瘢痕やケロイドでは、線維芽細胞とマクロファージの形態的相違点が存在することが明らかになった。
作物のアンチエイジングを指向した老化機構に関する研究

ダイズは開花結実後、急激な個体老化を起こす(一回結実性老化)。申請者らは老化物質アブシジン酸の活性を増強させるシナージスト(ジャスモン酸と12-ヒドロキシジャスモン酸)を単離した。ダイズの生長に伴う両シナージストの変動を調べた結果、後者はダイズの老化開始時期に一過的に増加し、前者の量は生育期間を通じて変動しなかった。よって、12-ヒドロキシジャスモン酸がダイズの老化開始のシグナルである可能性が示された。このシナジー効果はダイズ植物体へ散布実験においても確認することができた。申請者らは従前の研究からこの老化には老化ホルモンとして有名なアブシジン酸とその活性を増強させる未同定のシナージストが重要であることを明らかにした。本年度はクロロフィル保持試験を指標とした独自のシナジー活性試験法を用いて、ダイズ莢に含まれるシナージストの精製を行った。具体的にはシリカゲル、ゲルろ過等のクロマトグラフィーにより粗精製を施した後、逆相HPLCにより精製を行い、目的のシナージストとしてジャスモン酸を単離・同定した。ジャスモン酸がシナジー効果を示すという報告は今までに無く、本研究が初めて報告例である。次にダイズ植物体を用いた散布実験を行い、ジャスモン酸のシナジー効果を確認したところ、1μmol/Lの低濃度でアブシジン酸の老化促進活性を増強させることを確認できた。この結果はダイズ植物体内でアブシジン酸とジャスモン酸の協働効果により一回結実性老化が起きていることを強く示唆する結果である。ジャスモン酸は傷害ホルモンなどとして知られる植物ホルモンの1つであり、多彩な生理活性が報告されている。しかし、その活性部位は各活性で異なることから植物中には多彩なジャスモン酸受容体が存在していると思われる。本年度は予定通り、シナージストの同定を完了させることができたので、来年度以降、その分子メカニズムを明らかにするため、シナジー効果のみを有するジャスモン酸誘導体の調製を有機化学的手法により行いたい。申請者らは従前の研究からこの老化には老化ホルモンとして有名なアブシジン酸とその活性を増強させる2種のシナージストが関与していることを明らかにし、18年度の研究により、その1つをジャスモン酸であると同定した。本年度はクロロフィル保持試験を指標とした独自のシナジー活性試験法を用いて、ダイズ莢に含まれる2つ目のシナージストの精製を行った。具体的にはシリカゲル、ゲルろ過等のクロマトグラフィーにより粗精製を施した後、逆相HPLCにより精製を行い、目的のシナージストとしてヒドロキシジャスモン酸を単離・同定した。現在ダイズ植物体への散布実験により、その活性を確認中である。ジャスモン酸類は老化活性をはじめとした多彩な生物活性を有することが報告されているが、今回同定したヒドロキシジャスモン酸の植物体内における役割は知られておらず、本成果は初めての報告例となる。さらに、我々は構造活性相関研究を行ない、老化活性とシナジー活性の構造活性相関が明らかに異なることも示した。この結果は植物中にその活性に応じた多彩なジャスモン酸類受容体が存在していることを強く示唆するとともに、多彩な生物活性を有するジャスモン酸類が植物中でどのようにしてその使い分けをしているかを知る手がかりとなるかもしれない。来年度は本成果に基づき、シナジー効果のみを有するジャスモン酸誘導体の調製を有機化学的手法により行うとともに、ヒドロキシジャスモン酸生合成阻害によるアンチエイジング手法の開発研究に挑みたい。申請者らは昨年度までの研究からこの老化には老化ホルモンとして有名なアブシジン酸とその活性を増強させる2種のシナージスト(ジャスモン酸、12-ヒドロキシジャスモン酸)を同定した。本年度はダイズの生長に伴う両シナージストの変動を調べた。その結果、12-ヒドロキシジャスモン酸はダイズの老化開始時期に一過的に増加し、その量は10μmol/Lと植物体内で老化増強活性を示すに十分な量であった。一方、ジャスモン酸量は生育期間を通じて、その量は0.1μmol/L程度と少なく、また変動も小さかった。以上の結果、12-ヒドロキシジャスモン酸の一過的な増加がダイズの老化開始のシグナルである可能性が示された。一方、ジャスモン酸もシナジー活性を示すことを示しているが、ジャスモン酸は12-ヒドロキシジャスモン酸の生合成前駆体であることを考えると、生体内で後者へ変換されたための活性であり、実際の老化制御への貢献は小さいと判断した。この仮説を証明するために、ジャスモン酸と水酸化酵素阻害剤の混合投与による活性試験を行なう必要がある。

さらなる研究を進めるためにはキラルなジャスモン酸誘導体の調製が必要であった。そこで、清田らの方法を参考に市販のジャスモン酸メチルから酵素反応を利用した光学分割を行い、キラルなジャスモン酸を得た。現在、これを出発原料に受容体特定のための合成研究を進めている。
モデルマウスを用いた睡眠・覚醒リズム障害の遺伝要因の解析と疾患メカニズムの解明

我々は従来から概日リズムに異常を持つ突然変異マウスのスクリーニングを進めているが、これまでに、周期が24時間より長くリズムsplittingを起こすCSマウス(野生型は周期が24時間より短い)、野生キャスタネウスマウス集団から分離した無周期マウス、明暗周期下で明期に活動する昼行性マウス(野生型は夜行性)、さらに、既存系統の交配過程で偶然発見した8時間周期を示すマウスなどを見いだしてきた。これらのマウスのうち、CSマウスと無周期マウスについてQTL解析により原因遺伝子を複数マッピングした。本研究では、これらのマウスを用いて、睡眠・リズム障害の発症に関する原因遺伝子を明らかにするとともに、病態を分子レベルで解明する。1.2001年度の研究の当初計画(1)CS及び無周期マウスの脳波・リズム異常の原因遺伝子を同定する。(2)CS及び無周期マウスのSCN単一細胞におけるリズム特性を明らかにする。(3)上記以外のリズム異常マウスについてリズム特性の把握とQTL解析を進める。2.2001年度の成果CS、無周期マウスのリズム異常及び概日光感受性異常の原因遺伝子をQTL解析によりマッピングした。その結果、複数の遺伝子がリズム異常に関与していることが明らかとなった。このうち、CSマウスのリズム異常の候補遺伝子に関してノックアウトマウスを検討したが、リズム異常は認められなかった。現在、複数の遺伝子のノックアウトマウスについて検討している。mPer1-GFPトランスジェニックマウスをリズム異常マウスと交配し、生きた脳切片上で視交叉上核の一つ一つの時計細胞の振動をモニターできるシステムを構築した。現在、CSマウスの視交差上核細胞のリズムを検討している。
骨髄球系抑制細胞の産生機構とインターロイキン17の関与の解明

骨髄球系抑制細胞(myeloid derived suppressor cells : MDSCs)の産生調節機構について検討した。インターロイキン17(IL-17)受容体のシグナルはMDSCsの誘導に必須であるが、二つの主要なリガンドであるIL-17AまたはIL-17FのいずれのノックアウトマウスでもMDSCsの誘導に異常は認められなかった。これらはMDSCsの誘導に関して機能的に重複していることが示唆された。腫瘍細胞が誘導するCD11b陽性Gr-1陽性の骨髄球系血液細胞は宿主の免疫に対して抑制的に作用すると考えられ、Myeloid Derived Suppressor Cells(MDSCs)と呼ばれている。この細胞は癌の免疫監視回避機構のひとつとして最近注目されており、癌治療における新たな標的となる可能性がある。本研究はMDSCの骨髄での産生機構や産生誘導に関わる液性因子に明らかにすることを目的とする。マウス腫瘍細胞株B16またはEL4を皮下に接種した後に経時的に骨髄および脾細胞を採取し、フローサイトメトリーを用いて成熟MDSCへの分化段階の推移を検討している。今後細胞をセルソーターで分離して免疫系を抑制する機能的な成熟過程についても検討する予定である。さらに骨髄球系造血を刺激するインターロイキン17(IL-17)に着目し、MDSCの誘導および機能に及ぼすIL-17の作用について検討している。IL-17には数種のファミリーが知られているが、その中でもIL-17AとIL-17Fが骨髄球系の細胞の炎症部位への動因に関っていることが知られている。IL-17AノックアウトマウスおよびIL-17Fノックアウトマウスに腫瘍細胞を接種し腫瘍のサイズおよびMDSCの誘導について野生型と比較したが、三群間で有意な差は認められなかった。IL-17AおよびIL-17Fに機能的重複がある可能性もあり、腫瘍細胞株での過剰発現系を検討する予定である。近年、骨髄由来と考えられる骨髄球系の細胞が癌の転移や浸潤などの進展に関わっているという報告が相次いでいる。CD11b陽性Gr-1陽性のMyeloid Derived Suppressor Cells(MDSCs)もその一つであり、癌に伴い誘導されて宿主の免疫能を抑制すると考えられている。マウス腫瘍細胞株B16またはEL4を皮下に接種した後に経時的に骨髄および脾細胞を採取し、フローサイトメトリーを用いて成熟MDSCへの分化段階の推移を検討したところ、約3週間の観察で骨髄での造血幹細胞および顆粒球・マクロファージ前駆細胞が増加する傾向が認められたが、その差はわずかであった。MDSCを誘導する条件の再検討や細胞をセルソーターで分離して免疫系を抑制する機能的な成熟過程についても検討する予定である。IL-17には数種のファミリーが知られているが、その中でもIL-17AとI-17Fが骨髄球系の細胞の炎症部位への動員に関っていることが知られている。IL-17AおよびIL-17Fに機能的重複がある可能性もあり、腫瘍細胞株での過剰発現系を検討するために安定発現細胞株を作成中である。骨髄球由来抑制細胞(Myeloid Derived Suppressor Cells:MDSCs)は担癌状態で誘導される骨髄、脾臓、腫瘍中、末梢血中のCD11b+Gr-1+細胞であり、単球系の細胞と顆粒球系の細胞が混在した不均一な細胞集団である。MDSCはCD4およびCD8陽性T細胞の他、NK細胞の活性化を抑制することによって免疫システムの監視網を撹乱している(Marigo I.et al.Immunological Reviews 2008)。本研究は骨髄内での産生調節機構に注目し、a)造血幹細胞からの分化のメカニズムと、b)その誘導にかかわる可能性の高い液性因子としてインターロイキン17(IL-17)に注目してその関与を解明することを目的とした。腫瘍のモデルとしてはマウス悪性黒色腫の細胞株であるB16細胞をC57BL6マウスに接種するという系を用いた。細胞株摂取後21日目には脾臓でCDIlb+Gr.1+細胞が6%から14%へと増加し、mSCが誘導されていることが示された。この状況でマウスの造血幹細胞および骨髄球系の前駆細胞の頻度について検討した。Lin-c-kit+Sca-1+の造血幹細胞の頻度はMDSCの誘導に際して変化を認めなかった。

骨髄球系細胞前駆細胞(lin-c-kit+Sca-1-CD16/32low CD34+)はlin-c-kit+細胞中22%から26%へと増加し、顆粒球マクロファージは前駆細胞(lin-c-kit+Sca-1-CD16/32high CD34+)はlin-c-kit+細胞中19%から14%と減少したが、いずれの変化も統計学的に有意ではなく、軽微なものであった。IL-17が癌の病態においてどのような働きをしているかについてはまだ議論の余地のあるところである。本研究実施期間中にIL-17受容体からのシグナルがMDSCの誘導に重要であるという報告が学術誌に掲載された(He D etal.Journal of Immunology,2010)。Il-17受容体の主要なリガンドとしてはIL-17AとIL-17Fが知られているため、それぞれのノックアウトを用いてMDSCの誘導に関して野生型マウスとの間で比較検討した。B16細胞株接種により野生型マウスでは脾臓中のCD11b+Gr-1+細胞が1.9±0.56%から12.9±4.5%へと増加した。同じ条件でIL-17Aノックアウトマウスでは3.3±1.3%から9.7±5.4%、IL-17Fノックアウトマウスでは5.9±0.16%から14.1±9.17%への増加となり、三群間で統計学的に有意なさは認められなかった。このことはIL-17AとIL-17FはMDSCの誘導に関して機能的な重複を有していることを示唆していると考えられた。以上よりMDSCの誘導において骨髄中の造血の変化は微細なものであること、IL-17重要なはMDSCの誘導において重要な役割を担い、主要なリガンドであるIL-17AとIL-17Fは機能的に重複していると考えられた。今後IL-17を標的としてMDSCの誘導を制御するという新たな治療の可能性が示唆された。