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水稲葉身の老化過程におけるサイトカイニンおよび窒素による光合成活性の維持機構の解析-光合成炭酸固定酵素の合成,遺伝子発現制御に着目して-

作物の葉は老化に伴い光合成速度は減少し,葉の老化は乾物生産,収量に大きな影響を及ぼす.作物の老化を抑制し葉の光合成速度を高く維持するための生理的機構を明らかにし,多収性品種を育成するために備えるべき生理的,遺伝的性質を明らかにするため,水稲の葉の老化程度の異なる品種を用いて,今年度は葉の老化過程の光合成速度,炭酸固定酵素量とその発現量の低下程度か品種間で異なるかどうか,また葉の窒素含量,サイトカイニン量,根から運ばれるサイトカイニン量,および窒素の吸収量,分配,葉からの転流とどのような関係があるか検討した.その結果,老化のおそい品種ははやい品種に比べて老化過程で葉の窒素含量が高く維持され,このことが炭酸固定酵素Rubiscoの含量を高く維持し,光合成速度を高く維持することと関係が認められ,登熟初期の窒素追肥により老化の遅い品種では光合成速度およびRubisco含量の維持程度が著しく大きくなり,葉の窒素含量の維持が光合成活性の維持と関係があることがわかった.しかしながら,同じ窒素含量でも老化の遅い品種ははやり品種よりRubisco含量が高く,Rubisco含量の維持,発現に窒素以外にサイトカイニンが関係することが示唆された.老化の遅い品種の窒素吸収量ははやい品種に比べて出穂前および登熟期を通じてた高く,窒素の分配は茎が少なくより葉への分配割合が多いことがわかった.これらのことから,根から葉に送られる窒素およびサイトカイニン量が大きいことが作物の葉の光合成活性を高く維持し,多収となる上で重要な性質であることが明らかとなった.作物の葉の老化に伴い光合成速度は減少し,葉の老化は作物の乾物生産,収量に大きな影響を及ぼす.作物の老化を抑制し葉の光合成速度を高く維持するための生理的機構を明らかにし,多収性品種を育成するために備えるべき生理的,遺伝的性質を明らかにするため,水稲の葉の老化程度の異なる品種を用いて,窒素吸収量および登熟期に根から地上部に運ばれ,老化抑制効果があることでしられているサイトカイニンおよび窒素量の変化と光合成炭酸固定酵素Rubisco量との関係について検討した.その結果,老化のおそく多収性の品種は登熟期の窒素吸収量が多く,地上部に運ばれるサイトカイニン量および無機態窒素量が多く,出液中サイトカイニン活性と葉のRubisco含量との間により密接な正の相関関係が認められた.HPLC-ELISA法で定量した葉のゼアチンおよびゼアチンリボシド含量は葉の老化が遅い品種が早い品種に比べて大きく,葉の内生サイトカイニン量とRubisco含量との間に正の相関関係があった.葉の老化の過程のRubiscoの合成,遺伝子発現量に品種間で相違があるかどうか検討するため,Rubiscoの大サブユニットと小サブユニットのタンパク量,mRNAの量の定量法を検討し,比較を行った.その結果,葉の老化が遅く葉のサイトカイニン量が多い品種はRubiscoのmRNAの発現量が多い傾向があり、登熟期の老化の過程でRubiscoの合成量が高く維持されている可能性が示唆された.次年度は,葉のサイトカイニンおよび窒素とRubiscoの発現との関係を解析し,老化葉の光合成活性を高く維持する機構を検討する予定である.作物の葉は老化に伴い光合成速度は減少し,葉の老化は乾物生産,収量に大きな影響を及ぼす.作物の老化を抑制し葉の光合成速度を高く維持するための生理的機構を明らかにし,多収性品種を育成するために備えるべき生理的,遺伝的性質を明らかにするため,水稲の葉の老化程度の異なる品種を用いて,今年度は葉の老化過程の光合成速度,炭酸固定酵素量とその発現量の低下程度か品種間で異なるかどうか,また葉の窒素含量,サイトカイニン量,根から運ばれるサイトカイニン量,および窒素の吸収量,分配,葉からの転流とどのような関係があるか検討した.その結果,老化のおそい品種ははやい品種に比べて老化過程で葉の窒素含量が高く維持され,このことが炭酸固定酵素Rubiscoの含量を高く維持し,光合成速度を高く維持することと関係が認められ,登熟初期の窒素追肥により老化の遅い品種では光合成速度およびRubisco含量の維持程度が著しく大きくなり,葉の窒素含量の維持が光合成活性の維持と関係があることがわかった.しかしながら,同じ窒素含量でも老化の遅い品種ははやり品種よりRubisco含量が高く,Rubisco含量の維持,発現に窒素以外にサイトカイニンが関係することが示唆された.老化の遅い品種の窒素吸収量ははやい品種に比べて出穂前および登熟期を通じてた高く,窒素の分配は茎が少なくより葉への分配割合が多いことがわかった.これらのことから,根から葉に送られる窒素およびサイトカイニン量が大きいことが作物の葉の光合成活性を高く維持し,多収となる上で重要な性質であることが明らかとなった.
高励起領域における中性子過剰核の分子的構造の研究

前年度まで、α+^6He、^6He+^6He系に関して、それぞれの^6Heが励起する自由度を含めたチャンネル結合の計算を行ってきたが、両原子核間の中性子移行の効果と、反対称化の問題をより正確に取り扱う必要性があるため、今年度より、その両方の効果を取り入れた新しい模型『一般化2中心クラスター模型』の開発を行ってきた。この模型は、Beアイソトープ系などのα+α+n+n...(nは過剰中性子)からなる系を取り扱えるもので以下の様なものである。まず調和振動子ポテンシャル内の(Os)^4で記述した2つのα粒子を、適当な空間距離Sを持って配置し、次にどちらかのα粒子を指定しその周りに過剰中性子を配置する。この時、過剰中性子の量子状態は、指定したα粒子と共通の中心を持つ調和振動子のOp状態の方向(x、y、zのいずれか)と核子スピンにより指定する。この様に構成された波動関数に対し、反対称化とパリティ、角運動量射影を正確に行ったものを多体系の基底関数とし、それらの混合係数は、各距離S毎にハミルトニアンを対角化することにより決定する。我々は、α+α+n+n(=^<10>Be)系に対しこの手法を適用し、各S毎のエネルギー固有値を計算し、その内部構造の変化を調べた。その結果、α-αの距離が近い場合には、過剰中性子は2つのα粒子の周りに広がって、『分子軌道状態』を形成し、またそれらが離れた領域では、過剰中性子が片方あるいは両方に局在化した^5He+^5He、α+^6Heという『原子軌道状態』を作ることを明らかにした。ここでいう、原子軌道状態とは、^6He及び^5Heが明白な内部スピンをもち、相対角運動量で結合したいわゆる『チャンネル波動関数』を正確に表現している。また、距離Sを生成座標として取り扱うことにより、系全体のエネルギー固有値の計算も行い、実験データとの比較をおこなった。その結果、J^π=1^-の励起状態には、非常に発達したα+^6Heのクラスター構造が発現することが明らかになり、これまでの理論分析では得られなかった分子軌道状態の形成とクラスター構造の発現を同時に取り扱うことが可能となった。それらの成果の一部は、既に2編の学術雑誌に発表しているが、今後引き続き、Beアイソトープに関した分析を進める予定である。また同時に^<12>C+^<12>C反応に観測された多クラスター共鳴に関しても分析を進め、その成果を2編の学術雑誌に発表した。
22q11.2欠失症候群における硬組織形成異常発症機序の解析

22q11.2欠失症候群は22番染色体長腕の微細欠失により起こる重篤な先天的発生異常を示す。疾患の特徴として、先天性心疾患、免疫不全症、低カルシウム血症等に加えてエナメル質形成不全を認める。本疾患の原因候補遺伝子としてTbx1等が同定され、TBX1の発現の変化がエナメル質形成不全に影響を与えることが報告されている。しかし、本疾患における歯牙石灰化の程度が患者によって異なることや逆に象牙質石灰化亢進が見られる症例が見出されていることなどから、Tbx1以外にも歯の硬組織形成異常の発症を制御する遺伝子の存在が考えられる。本研究より、Slc25a1、Dgcr2などにその可能性を見出した。22q11.2欠失症候群は22番染色体長腕の微細欠失により確認される症候群であり、疾患の特徴として、先天性心疾患、免疫不全症、低カルシウム血症、鼻咽腔閉鎖不全、学習障害、エナメル質形成不全などが挙げられる。22q11.2欠失症候群の候補遺伝子としてTBX1が同定されている。エナメル質は増殖した内エナメル上皮から分化したエナメル芽細胞が分泌する基質が成熟することでつくられていく。TBX1はこれらの増殖、分化、成熟を制御しており、エナメル質形成不全にもTBX1の変異が関与するといわれている。しかし、本疾患における歯牙石灰化の程度が様々であることや逆に象牙質石灰化亢進が見られる症例が見出されていることなどからTBX1以外にもエナメル質形成不全の発症を制御する遺伝子があると考えられる。それらの遺伝子の同定、発現解析、および歯の発生・成熟における機能解析を本研究の目的とした。22q11.2欠失症候群における歯の硬組織形成異常を制御する可能性のある遺伝子をヒトゲノムのデータベースを用い、22q11.2欠失症候群の患者で高い頻度で同様の欠失が見られるヒト染色体22q11.2領域中の1922Mb間の約3Mbにおいて網羅的に検索を行った。次に、生後2日齢マウス歯胚から調整したtotal RNAを逆転写したcDNAを用いてPCRによる発現解析を順次行った。その結果、slc25a1,Cdc45など複数の遺伝子で発現を認めた。22q11.2欠失症候群の患者で高い頻度で同様の欠失が見られるヒト染色体22 q11.2領域中の1922Mb間の約3Mbに歯の硬組織形成異常を制御する可能性のある遺伝子が複数認められたため。22q11.2欠失症候群は22番染色体長腕の微細欠失により起こる重篤な先天的発生異常を示す疾患である。疾患の特徴として、先天性心疾患、免疫不全症に加えてエナメル質形成不全などが挙げられる。22q11.2欠失症候群の原因候補遺伝子としてTBX1やCRKLが同定され、特にTBX1の発現の低下・増加いずれにおいてもエナメル質形成不全に影響を与えることが報告された。しかし、本疾患における歯牙石灰化の程度が患者によって様々であることや逆に象牙質石灰化亢進が見られる症例が見出されていることなどから、TBX1以外にも歯の硬組織形成異常の発症を制御する遺伝子の存在が考えられる。前年度には22q11.2欠失症候群の患者で高い頻度で同様に欠失が見られるヒト染色体22q11.2領域中の1922Mb間の約3Mb Common 22q11.2deletion領域内で歯の硬組織形成異常を制御する可能性のある遺伝子が複数認められた。今年度はそれら複数の遺伝子から作製したプローブならびにマウス下顎切片を用いてin situ hybridizationを行った。その結果、Dgcr2,Slc25a1の発現がマウス歯胚のエナメル芽細胞で確認された。歯胚培養を用いた機能解析も試みたが、結果が伴わず今後に課題を残すこととなった。当初の目的であったTBX1以外の歯の硬組織形成異常の発症を制御する遺伝子の同定、発現解析、および歯の発生・成熟における機能解析までは至らなかったが、TBX1以外にも歯胚を構成する細胞の分化段階特異的に発現する因子がCommon 22q11.2deletion領域内に存在することは本研究により示された。さらにヒト染色体22 q11.2領域中の1922Mb間の約3Mbで歯の硬組織形成異常を制御する可能性のある遺伝子を確認し、それらの遺伝子の成熟歯牙組織ならびに歯胚における発現解析を行う。発現が確認された遺伝子に関して機能解析を行っていく。28年度が最終年度であるため、記入しない。
精神障害診断分類体系DSMのグローバル規模の影響の実態と歴史的経過の解明

1980年に米国精神医学会が発表した精神障害診断分類体系DSM-IIIによる精神医学の「革命」が、その後、30年間にグローバル規模で医学、生命科学、医療等に与えた影響の実態と歴史的経緯を明らかにするために、文献調査とインタビュー調査によって以下の点を検証した:(1)DSM-IIIの操作的診断基準採用における診断の信頼性(一致率)の優先、(2)我が国における伝統的ドイツ精神医学のフレーム内でのDSMの受容、(3)DSM-5の章構造(生涯発達モデルと2因子モデル)の解明とその背景、(4)精神科診断の妥当性と有用性をめぐる論争と心理的本質主義、(5)DSMのグローバル化がもたらしたシニシズム本研究は、1980年に米国に登場した精神障害診断分類体系DSMによる精神医学の「革命」が、その後、30年間にグローバル規模で医学、生命科学、医療等に与えた影響の実態と歴史的経緯を明らかにすることにより、「新たな科学パラダイムは、各国固有の伝統的なパラダイムの素地の上に受容され、浸透してゆく」という仮説を論証する。それにより、今日、米国の学界に席巻されている我が国を含む諸外国の生命科学や医療の在り方を批判的に検証し、適切な科学情報リテラシーの啓発に寄与することを目的としている。初年度の研究として、DSM-III開発の背景にあった195060年代に確立した計量心理学が精神疾患の診断学に与えた影響について文献的調査と分析を行った。その結果、DSM-IIIの開発が着手される以前の1960年代より心理尺度を用いた評価結果に基づく精神疾患の分類が試みられたが、DSM-IIIの開発者はまず診断の信頼性の向上を第一の目標に置いたことを明らかにした。DSM-IIIは表面上は伝統的なヨーロッパ精神医学のカテゴリー的分類を採用し、妥当性の検証を課題として残された。しかし、DSM-III発表後に展開された地域住民という大規模集団を対象とした疫学研究は、従来の精神医学のカテゴリー的分類の妥当性を揺るがす数々の知見を提供したため、DSM-IVを経て、DSM-5に至る段階において、その妥当性が問われるようになり、精神疾患のディメンジョン的分類への転換が主張されるようになったと理解される。こうした観点に立ち、DSM-5における計量心理学のアプローチについて専門雑誌である「精神科治療学」にシリーズの連載を行った。本研究は、1980年に米国精神医学会が発表した精神障害診断分類体系DSMによる精神医学の「革命」が、その後、30年案にグローバル規模で医学、生命科学、医療等に与えた影響の実態と歴史的経緯を明らかにすることにより、「新たな科学パラダイムは、各国固有の伝統的なパラダイムの素地の上に受容され、浸透してゆく」という仮説を論証する。それにより、今日、米国の学界に席巻されている我が国および諸外国の生命科学や医療の在り方を批判的に検証し、適切な科学情報リテラシーの啓発に寄与することを目的としている。初年度の研究として、DSM-III開発の背景にあった計量心理学の発展が精神科診断学に与えた影響について文献的調査と分析を行い、診断の信頼性(一致率)の向上を優先すべく操作的診断基準の開発がなされたことを明らかにした。2年目の研究では、我が国におけるDSM-III以降のグローバル・スタンダードたる国際的診断基準の普及が精神医学の教育、研究、および臨床に与えた影響について、文献調査およびインタビュー調査を行い、第二次大戦後も戦前のドイツ精神医学を堅持した我が国の精神医学教育の特殊性を明らかにし、その結果、1990年代前半までDSMも旧来のドイツ精神医学のフレームの範囲内で受容された事実を示した。さらに、2013年発表のDSM-5において、精神科診断の妥当性と有用性をめぐる論争が生じたことから、その意義と「疾患分類」をめぐる心理的本質主義の在り方を論じた。この間、DSM-5の邦訳作業に関わるとともに、同改訂版に関する解説書および論考を発表した。本研究は、1980年に米国精神医学会が発表した精神障害診断分類体系DSMによる精神医学の「革命」が、その後、30年間にグローバル規模で医学、生命科学、医療等に与えた影響の実態と歴史的経緯を明らかにすることを目的としている。2年目の研究では、我が国におけるDSM-III以降のグローバル・スタンダードたる国際的診断基準の普及が精神医学の教育、研究、および臨床に与えた影響について文献調査およびインビューッ調査を行い、第二大戦後も生前のドイツ精神医学を堅持した我が国の精神医学教育の特殊性を明らかにし、その結果、1990年代前半までDSMも旧来のドイツ精神医学のフレームの範囲内で受容された事実を示した。さらに、2013年発表のDSM-5において、精神科診断の妥当性と有用性をめぐる論争を生じたことから、その意義と「疾病分類」をめぐる心理的本質主義のあり方を論じた。この間、DSM-5の邦訳作業に関わるとともに、同改訂版に関する多数の解説書、および論考を発表した。最終年度の研究では、DSMが、今日の巨大化した生物学的精神医学と同様、日常臨床における診断の感覚との解離から精神医学にシニシズムをもたらした経緯と背景を考察した。

1980年に米国精神医学会が発表した精神障害診断分類体系DSM-IIIによる精神医学の「革命」が、その後、30年間にグローバル規模で医学、生命科学、医療等に与えた影響の実態と歴史的経緯を明らかにするために、文献調査とインタビュー調査によって以下の点を検証した:(1)DSM-IIIの操作的診断基準採用における診断の信頼性(一致率)の優先、(2)我が国における伝統的ドイツ精神医学のフレーム内でのDSMの受容、(3)DSM-5の章構造(生涯発達モデルと2因子モデル)の解明とその背景、(4)精神科診断の妥当性と有用性をめぐる論争と心理的本質主義、(5)DSMのグローバル化がもたらしたシニシズム本研究の遂行に極めて優秀な研究協力者による支援により研究は順調に進展し、および精神科診断学セミナー受講により、専門家のレビューを受けたところ、本研究の趣旨が概ね適切であると考えられた。臨床精神医学最終年度は、研究成果のまとめとして、一連の研究成果報告を網羅したモノグラフの出版を計画しており、現在、出版社の協力を得て、原稿をとりまとめている段階である。また、国際誌に共著論文を投稿する準備も進めている。本研究の遂行に極めて有意義な研究協力者の参加により、研究計画の立案段階では想定しなかったほど、計量心理学がDSM-III開発の背景に与えた影響について明らかにすることができた。また、専門雑誌へのシリーズ連載も大きな成果であった。今年度の研究計画は予定通り実施し、ほぼ計画通りの成果に達した段階で、旅費および人件費・謝金等の支出が少なかったため、なお次年度使用額を生じたものである。研究協力者のアドヴァイズに従い、DSM-III開発からDSM-IVからDSM-5に至る約30年間の計量心理学の発展の歴史を明らかにし、それの各国における歴史的状況について検討したい。また、DSM-III紹介時のわが国の精神医学の指導者たちに対するインタビュー調査も実施する計画である。翌年度は、研究成果を報告するために精神医学専門書の出版社よりモノグラフの出版を予定しているが、出版にかかる諸費用に翌年度の交付予定額(200,000円)では達しないため、次年度使用額も併せて支出することを計画している。
送粉動物の空間移動様式の変化が植物の花粉分散におよぼす影響

電動人工花を用いた室内実験により、マルハナバチの採餌におけるルート巡回は空間学習にもとづくこと、競争に強い採餌戦略であることを発見した。また、送粉動物が探索型から巡回型へと空間移動様式を変えるにつれ、交配距離や交配相手の多様性が増すだけでなく、新しいタイプの自家受粉(出戻り受粉と命名)が減ることを理論的に明らかにした。さらに、キバナアキギリにおけるマイクロサテライト遺伝マーカーを開発した。まず栃木県内の野生集団(6カ所)からキバナアキギリを採集し、本学キャンパス内の林床に鉢植え集団を作成し、栽培条件を決める予備実験をおこなった。また、これらのキバナアキギリの葉から抽出・精製したDNA試料から、trnL-Fを含む領域をPCR法により増幅して配列決定した。このデータを用いて既知の同属種との類縁関係を推定すると、キバナアキギリはサルビア属の中にある3つの分岐群のうち、アジア産種を含む第三分岐群に属することがわかった。よって本研究の目的であるキバナアキギリの父親判定に用いる遺伝マーカーの開発には、同属の近縁種における既知のDNA配列情報を利用できる可能性が示唆された。一方、マルハナバチと人工花を用いた室内実験と野外観察により、ハチ個体の空間移動様式にはルート巡回と地域集中探索という2つのモードが見られること、ルート巡回は株の位置を学習した個体によってのみ行われることを証明した(学術論文1・2)。また、個体間の競争が激しい場所ほど探索型から巡回型への切り替えが適応的になるという先行研究の理論的予測を確認するための室内実験をおこなった。その結果、競争の激しさによらず、個体は探索型から巡回型へと学習にともなって行動を切り替える傾向があること、巡回型は探索型よりも競争採餌において高い成績をおさめることを証明することができた(学会発表1)。まず前年度にひきつづき、キバナアキギリの父親判定に用いる遺伝マーカーの開発をおこなった。6つの野外集団に由来する株から抽出・精製したDNA試料を用いて既知のサルビア属種との類縁関係を推定したところ、キバナアキギリはアジア産種を含む第三分岐群に属することがわかった。そこで中国産の近縁種Salvia miltiorrhiza(丹参)のDNA配列情報の中から、100bpを越えるマイクロサテライト配列を含む領域を計20箇所ピックアップし、各領域をPCRで増幅するためのプライマーを設計・合成した。これにより、父性解析に必要十分な多型を含むマイクロサテライト遺伝子座を探索する手がかりを得た。一方、マルハナバチと人工花を用いた室内実験により、餌をめぐる競争が激しいときほど探索型から巡回型への切り替えが適応的になるという先行研究の理論的予測を検証した。その結果、巡回型は探索型よりも競争時に高い採餌成績をおさめること、個体は経験にともない探索型から巡回型へと行動を切り替えるものの、その学習過程は競争者の存在により著しく妨げられることを見いだした(学術論文1, 2 ;学会発表2, 3, 4)。また、送粉動物のルート巡回行動に関する自身の研究成果を総括し、この行動が植物の繁殖や花の進化におよぼす影響について新たな仮説を提出した(学会発表2 ;投稿中)。さらにシミュレーション・モデルを用いた解析により、植物集団を訪れる送粉動物の空間移動様式が探索型から巡回型へと変化するとき、集団内の花粉分散が「交配距離」「交配相手の多様性」「他家受粉」の3つの面のいずれにおいても大幅に改善されることを初めて明らかにした(投稿中)。前年度までの成果で、キバナアキギリはアジア産種を含む第三分岐群に属することがわかっている。そこで、中国産の近縁種Salvia miltiorrhiza(丹参)のDNA配列情報を用いて、100bpを越えるマイクロサテライト配列を含む領域をPCRで増幅するためのプライマーを20セット設計・合成した。6つのキバナアキギリ野外集団から集めたDNA試料を用いてこれらのプライマーを試したところ、19セットについてはマイクロサテライト領域をPCR増幅できること、そしてこれらの領域には集団間で多型が見られることを確認できた。以上により、キバナアキギリにおける父性解析や集団間の遺伝解析に利用できるマイクロサテライト遺伝マーカーの開発を完了した。一方、送粉動物のルート巡回行動に関する自身の研究成果を総括し、この行動が植物の繁殖や花の進化におよぼす影響について新たな仮説を提出した(学術論文1)。また、シミュレーション・モデルを用いた解析により、植物集団を訪れる送粉動物の空間移動様式が探索型から巡回型へと変化するとき、集団内の花粉分散が「交配距離の増加」「交配相手の多様性の増加」「出戻り受粉(自家受粉)の軽減」という3つの利益をもたらすことを明らかにした(学術論文1)。さらに、RFID式人工花システムを開発し、複数個体のマルハナバチを用いた実験を可能にした(学術論文2)。そしてこのシステムを用いた室内実験により、餌をめぐる競争が激しい状況では、情報を利用して頻繁にルートを改変する個体よりも、ルートに固執する個体ほど高い採餌成績をおさめるという理論の予測が正しいことを初めて示した(投稿準備中)。
微小試料の段差・歪み量を並列測定する光周波数走査顕微干渉システムの開発

周波数走査を広範囲に行える面発光型半導体レーザを2個同時に使用する顕微干渉システムを構築した。その特色は2つのレーザを同時かつ互いに逆方向に周波数走査することで被検物体の幾何的サイズ・歪み量を同時に測定できる点にある。検証試験を行ったところ、200μm立方の金属試料の形状を測定でき、かつ温度膨張量の検出も行えることが示された。面発光型半導体レーザ(VCSEL)光源を構成するために、初めに注入電流変調駆動回路を設計・製作し、次いでペルチエ素子による動作温度安定化装置を設計、製作した。使用したVCSELの発振波長帯は780nm帯である。光源の動作試験を実施したところ、高精度の温度・電流同時制御が可能であることを確認した。本装置を使用して電流変調を施しながらVCSELの発振波長を光スペクトラムアナライザでモニタしたところ、光周波数に換算すると約1THzの広範囲で周波数変調が可能であることが判った。この変調幅から見積もられる合成波長は約300μmとなり、干渉縞位相を1/100の精度で読み取ればミクロンレベルの測長精度は十分に期待できる。次いで光波長(周波数)マーカーとして利用するルビジウム(Rb)のD2吸収線を得るべく封入吸収セルにVCS肌出力光を入射したところ、線形吸収スペクトルは明瞭に観測できたが、より精密な飽和吸収スペクトルについては十分な明瞭度は得られなかった。その理由としてVCSELの発振スペクトル幅が飽和吸収線幅より広い点が上げられる。以上の状況より本研究では当面のところ線形吸収スペクトルをマーカーとして使用することとした。また走査幅検知用のマーカーを得るべくブロックゲージ(10mm)を使用して基準干渉計を構築した。周波数を走査して干渉縞信号を取得し、フーリエ変換法で位相解析を行ったところ、走査幅検知マーカーとして十分に利用できることがわかった。以上の結果を元に、次年度予定している同時周波数走査干渉測長計の構築を進めていく予定である。平成21年度では、はじめに昨年度の波長走査性能を確認した面発光型半導体レーザ(VCSEL)を2個使用し、それぞれの発振周波数を逆方向に同時走査させる機能を持つ電流駆動回路を設計・製作した。光路揺らぎの影響を除去して長さを安定に測定するにはそれぞれの周波数走査量を合致させる必要があり、昨年度製作したブロックゲージによる基準干渉計を使用した。すなわち本干渉計から出力される干渉縞位相のシフト量が一致するように各電流走査量を調節する。この状態でピエゾ素子を光路中に組み込んだ干渉計(被験長さ10mmを含む)からの2つの干渉縞位相シフト量の平均演算を行ったところ、ピエゾ素子で与えた光路揺らぎの影響が大幅に低減し、安定に長さを測定できることが実証された。これと同時に、両位相シフト量間の差分を取ったところピエゾ素子による光路変動の時間波形が検出され、本研究の目的の一つである物体変形量の検出が基本的には可能であることがわかった。次に手動で行っていた周波数走査幅調節を自動制御で行うことを目的に、位相同期ループ(PLL)技術を応用した電流自動調整回路(1回路)を設計・製作した。本回路の動作試験を行ったところ、基準干渉計の干渉縞位相が外部基準クロックに位相同期されており、良好に動作していることが確認された。本システムによれば干渉縞位相の勾配が時間的に一定になるため、最小自乗フィッティングで求めた勾配値から測定長さを精密に決定できる。この方法を拡張して原子吸収線マーカー波長における干渉次数を推定することにより、測長精度をナノメートルレベルにまで引き上げることが可能となった。この成果については2件の学会講演会にて発表講演を行っている。平成22年度では、前年度までに製作した周波数走査干渉システムをベースとして2個の逆方向周波数走査を施した面発光型半導体レーザ(VCSEL)を使用する顕微干渉計を構築した。本顕微干渉計は被験物体を搭載するステージを有しており、2枚のレンズで構成される顕微光学系でステージ上の対象エリア(約1mm四方)を6倍の像倍率で拡大観測する。物体表面からの反射光波面と参照波面との重なりで生じる干渉縞はCCDセンサーにより画像データとして2次元的に取得される。両VCSELの出射光は両者の波面を精密に一致させるために1本の偏波面保存ファイバに直交偏光として同軸入射させた後に干渉計に入射させている。被験サンプルとして1cm四方の銅ブロック表面上にマイクロマシニング加工により精密作製された微細柱状構造(底面200ミクロン四方、高さ200ミクロン、20ミクロンの2種類)を用いて試験を実施した。この構造のサイズは金属単結晶と同程度である。周波数走査中の基準干渉縞およびCCD画像はコンピュータ上に連続記録され、被験試料表面を100×100点に区画分割された試料表面上の各座標における干渉光路差を算出して3次元構造をコンピュータ内で再生する。

ペルチエ素子を用いてサンプル温度を室温から26°Cの幅で上昇・下降させ柱状部分の熱膨張量の検出試験を実施したところ、試料高さとともに1nm程度の膨張、伸縮が2次元的に同時計測されており、銅の熱膨張係数から予測される膨張量を捉えていることがわかった。このように開発したシステムによれば金属単結晶レベルでの熱膨張を検出できることが十分可能であることから、本研究の目標は十分に達成できたものと考えられる。
パーキンソン症状を自然発症するTUBG2欠損マウスの解析

TUBG2欠損マウスは、パーキンソン様症状を呈する神経変性疾患自然発症マウスである。このマウスの解析を行ったところ、TUBG2欠損の培養線条体神経細胞では野生型よりミトコンドリア機能が低く、細胞内のATPも少なく、細胞内のATP依存的カルシウムチャンネルの活性が落ちており、その結果神経伝達物質の放出が低くなっていることが分かった。TUBG2欠損マウスは線条体から黒質へのGABA性の抑制回路が正常に働かないことで、運動失調を来していることがわかった。本年度は、パーキンソン病の発症と深い関係があると考えられているTUBG2蛋白質と神経細胞の細胞質で複合体を形成している蛋白質の分離同定をおこなった。最初にTUBG2蛋白質を特異的に認識するモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマをヌードマウスの腹腔内に接種し、腹水中に大量に分泌されるモノクローナル抗体を回収した。次に、その抗体をプロテインAビーズに共有結合させて抗体ビーズを作成し、マウス新鮮脳から得た細胞質分画から免疫沈降法によってTUBG2を含む複合体を単離した。単離できた複合体は、SDSPAGEで分離し、トリプシン消化したのち、質量分析法によって同定を行った。その結果TUBG2と共沈する5種類の蛋白質を同定することができた。そのうち2つはgamma-tubulinと複合体を形成する事がすでに知られている中心体構成蛋白質のGCP2とGCP3であった。新たに同定された3種類の蛋白質のうち、蛋白質Aは神経終末においてシナプス小胞のリサイクリングにかかわる蛋白質として知られているものであった。また、蛋白質Bはミトコンドリア外膜の分裂にかかわっているものである。蛋白質Cは抑制性神経伝達物質の受容体の裏打ち蛋白質と知られているものだった。Gamma-tubulinの神経における機能は今までまったく報告がなく不明であったが、今回の結果により、シナプス伝達やミトコンドリアの分裂に関与する可能性が示唆された。来年度に、さらに詳しい機能解析を行うことで、パーキンソン病の発症機構の一端を明らかにすることが出来ると考えている。TUBG2欠損マウスは、組織学的にも行動学的にもパーキンソン様症状を呈するユニークな神経変性疾患自然発症マウスである。このTUBG2欠損マウスを解析することで、今まで不明であったパーキンソン症状の発症機構の解明を行った。まず、神経細胞の細胞質でTUBG2蛋白質と複合体を形成している物質を分離同定した。同定できたTUBG2複合体構成蛋白質のうち、今までγ-tubulinの結合蛋白質として報告のなかった蛋白質Aに注目した。蛋白質Aはミトコンドリアの外膜の分裂に必要な蛋白質であり、GTPase活性を持つものである。H20年度はこの蛋白質Aの神経細胞内での機能に注目し、TUBG2欠損により、運動失調に至る過程を明らかにすることを試みた。蛋白質Aの関与するミトコンドリアの分裂に着目し、TUBG2欠損マウスと野生型マウス由来の培養線条体神経細胞及び、ミトコンドリア膜電位依存性蛍光色素を用い、電子伝達系の活性の指標であるミトコンドリア膜ポテンシャルの測定を行ったところ、TUBG2欠損マウスは野生型マウスのそれに比べて有意に値が小さかった。酸化的リン酸化の結果生じるATPの濃度に関してもTUBG2欠損の培養線条体神経細胞で野生型より少なかった。神経細胞は細胞内のATP濃度に依存して、伝達物質の放出を調節するカルシウムチャンネルの活性が変化するが、TUBG2欠損マウス由来の培養神経細胞では、細胞内ATP依存的にカルシウムチャンネルの活性が落ちており、その影響で神経伝達物質の放出が低くなっていることが分かった。運動を調節する線条黒質路は、線条体から黒質へのGABA性回路と黒質から線条体へのドーパミン性回路が存在する。TUBG2欠損マウスでは線条体から黒質へのGABA性の抑制回路が正常に働かず、その結果運動失調を来している、つまり多系統萎縮症様の運動失調モデルであることがわかった。
レーザ干渉露光法による光誘起分極反転制御に関する研究

今年度は、昨年度に引き続き、本研究で使用する非線形光学結晶LiNbO_3(LN)の分極反転特性に関する評価を行った結果、以下の研究結果が得られた。LiNbO_3(LN)結晶を用いた2μm以下の微小周期分極反転形成を目的として新しい円電極法を提案し、実験により円電極法の実証を行った。理論解析を行った結果、結晶に点接触する円形電極形状が分極反転制御に有効であることが示唆された。円電極法を実証するために二光束レーザ干渉露光により2μm周期の円形電極を作製し、分極反転実験を行った。その結果、厚さ500μmのLN結晶において、高アスペクト比(870)を有する周期分極反転の作製および150nmの極微小分極反転構造の作製に成功し、干渉露光法により作製した円電極の有効性を実証することができた。また、本年度は、結晶の抵抗率と分極反転特性との相関関係について詳細に検討するため、抵抗率制御LN結晶を用いた分極反転特性の評価を行った。具体的には従来のLN結晶の抵抗率を4桁低下させたLN結晶を用いて分極反転実験を行った結果、分極反転閾値Vthは抵抗値の平方根に比例することを見いだした。そして、ドット状およびライン状周期マイクロ電極を作製して、100Vの電圧印加を行った結果、周期分極反転パターンを均一に作製することができた。以上結果から、LN結晶の抵抗率を制御することにより、従来と比較し十分低い印加電圧で微小周期分極反転構造を形成できることを明らかにした。今年度は以下のような研究結果が得られた。1)備品の分光特性評価:LiNbO_3結晶の分光特性を紫外可視分光光度計を用いて評価した。吸収端は310nm近傍であり、本研究で用いたHe-Cdレーザ光の波長325nmではバンド間達移による大きな吸収のあることが分かった。2)結晶の抵抗率測定:結晶に対してレーザ光を垂直方向から照射した状態で、結晶に電圧を印加し電圧-電流測定を行った。その結果、325nmレーザ光照射では、印加電圧の増加とともに、電流量が直線的に増加した。この直線の傾きから求めた抵抗率は、レーザ光照射前の値に比べて5桁程度低下することが明らかになった。3)光照射分極反転の実験的検討:上記の結果を踏まえ光照射下における分極反転実験を行った。325nmレーザ光照射下で電圧を徐々に印加していくと,3.6kVで分極反転電流が流れた。この分極反転電圧は光照射なしでの反転閥値電圧10.7kVの約1/3の倍まで低下することが分かった。4)微小分極反転構造の形成:分極反転後のサンプルをエッチング処理し、反転形状の観察をレーザ顕微鏡を用いて行った。その結果、幅200nmライン、直径1.0μmΦの微小分極反転構造を観察することができた。以上の結果から、結晶に対して強い吸収をもつレーザ光の照射により、従来より十分低い印加電圧で極微小分極反転構造を形成できる可能性が示唆された。今年度は、本研究で使用する非線形光学結晶の分極反転特性に関する評価を行った結果、以下の研究結果が得られた。1)新規分極反転制御法の提案と実証:LiNbO_3(LN)結晶を用いた2μm以下の微小周期分極反転形成を目的として新しい円電極法を提案し、実験により円電極法の実証を行った。円電極法を実証するために2μm周期の円形電極を二光束干渉露光により作製し、電界印加分極反転実験を行った。その結果、厚さ500μmのLN結晶において、2μm周期の分極反転の作製に成功した。また、一部分ではあるが、0.15μmの極微小分極反転の作製に初めて成功し、提案した円電極法の有効性が実証された。2)結晶の抵抗率と分極反転特性との関係:本研究の目的である微小周期分極反転技術の確立を目指し、抵抗率を制御したLN結晶を用いて分極反転特性を調べた。具体的には従来のLN結晶の抵抗率を4桁低下させたLN結晶を用いて分極反転実験を行った結果、分極反転閾値Vthは100V程度であることを見いだした。また、ドット状周期電極を作製して、電圧100Vを印加した結果、周期ドットパターンを均一に作製することができた。この結果から、結晶の抵抗率を制御することにより、従来と比較し十分低い印加電圧で微小周期反転構造を形成できる可能性が示唆された。

その結果、厚さ500μmのLN結晶において、高アスペクト比(870)を有する周期分極反転の作製および150nmの極微小分極反転構造の作製に成功し、干渉露光法により作製した円電極の有効性を実証することができた。また、本年度は、結晶の抵抗率と分極反転特性との相関関係について詳細に検討するため、抵抗率制御LN結晶を用いた分極反転特性の評価を行った。具体的には従来のLN結晶の抵抗率を4桁低下させたLN結晶を用いて分極反転実験を行った結果、分極反転閾値Vthは抵抗値の平方根に比例することを見いだした。そして、ドット状およびライン状周期マイクロ電極を作製して、100Vの電圧印加を行った結果、周期分極反転パターンを均一に作製することができた。以上結果から、LN結晶の抵抗率を制御することにより、従来と比較し十分低い印加電圧で微小周期分極反転構造を形成できることを明らかにした。
血液微小循環による物質輸送の多重スケール解析

毛細血管内を変形しながら移動する赤血球やドラッグデリバリ用マイクロカプセルなどの分散体では,毛細血管内での力学的特性と膜を介しての分子レベルの物質輸送が密接に関連している.生体内におけるこれらの要素の影響を定量的に評価するためには,生体膜を介して細胞内に取り込まれる分子レベルの物質輸送から連続体レベルでの血流・分散体の流体・構造連成までマルチスケール性を考慮した解析が必要である.本研究では,これらの複雑な因子を合理的かつ精度良く解析するためのツールの開発を行なうために,生体膜の基本要素である脂質二分子膜に関して,分子レベルでの情報を取り入れながら連続体スケールで利用可能である膜モデルを構築することを目的としている.研究分担者のWilson博士はこれまで,脂質2分子膜からなるリポソームに関して,分子論的なアプローチから連続体モデルへとつながる膜モデルの構築に関して数種類の手法を試みた.初期のモデルとして,膜面上の脂質2分子膜を粗視化するための方法としてボロノイ分割のアイデアを用いて,多数の脂質分子を1つの粒子で近似し,脂質間の相互作用をボロノイ分割の分割面で表現する手法に関して研究を行なった.この手法では,脂質二分子膜において特に重要となる親水基と疎水基の役割を適切にモデリングすることに多くの困難を伴ったため,その後,粗視化分子動力学法や散逸粒子動力学法の概念を取り入れた新たな手法の構築を行った,すなわち,複数の原子のかたまりを1つの粒子として近似し,脂質分子を数個の粒子として表現する概念を取り入れながら,場を離散的な粒子ではなくスカラー量として表現する手法の開発を行なった.粒子間に働く力として,分子の運動エネルギー由来のエントロピー項と分子間相互作用力由来の自由エネルギー項をモデル化し,簡単な粒子モデルで脂質二分子膜が構成されることを示した.本研究は,ドラッグデリバリーシステム(DDS)の薬剤封入用カプセルなどに用いられるリポソームや,赤血球などのジャイアントベシクルに関して,それらの膜の分子構造を考慮にいれた膜モデルの構築を行なうことを主な目的としている.本研究一年目となる本年度は,脂質2分子膜からなるリポソームに関して,分子論的なアプローチから連続体モデルへとつながる膜モデルの構築に関していくつかの手法を試みた.本年度前半では,膜面上の脂質2分子膜を粗視化するための方法としてボロノイ分割のアイデアを用いて,多数の脂質分子を1つの粒子で表し,脂質間の相互作用をボロノイ分割の分割面で表現する手法に関して研究を行なった.結果としては,脂質二分子膜において特に重要となる親水基と疎水基の役割を適切にモデリングすることに多くの困難を伴い,ボロノイ分割によるアプローチを諦めることとなった.現在は,粗視化分子動力学法や散逸粒子動力学法に近い概念を導入し,複数の原子のかたまりを1つの粒子として近似し,脂質分子を数個の粒子として表現するようなアイデアを導入しながら,場を離散的な粒子ではなくスカラー量として表現するような手法の開発を行なっている段階である.毛細血管内を変形しながら移動する赤血球やドラッグデリバリ用マイクロカプセルなどの分散体では,毛細血管内での力学的特性と膜を介しての分子レベルの物質輸送が密接に関連している.生体内におけるこれらの要素の影響を定量的に評価するためには,生体膜を介して細胞内に取り込まれる分子レベルの物質輸送から連続体レベルでの血流・分散体の流体・構造連成までマルチスケール性を考慮した解析が必要である.本研究では,これらの複雑な因子を合理的かつ精度良く解析するためのツールの開発を行なうために,生体膜の基本要素である脂質二分子膜に関して,分子レベルでの情報を取り入れながら連続体スケールで利用可能である膜モデルを構築することを目的としている.研究分担者のWilson博士はこれまで,脂質2分子膜からなるリポソームに関して,分子論的なアプローチから連続体モデルへとつながる膜モデルの構築に関して数種類の手法を試みた.初期のモデルとして,膜面上の脂質2分子膜を粗視化するための方法としてボロノイ分割のアイデアを用いて,多数の脂質分子を1つの粒子で近似し,脂質間の相互作用をボロノイ分割の分割面で表現する手法に関して研究を行なった.この手法では,脂質二分子膜において特に重要となる親水基と疎水基の役割を適切にモデリングすることに多くの困難を伴ったため,その後,粗視化分子動力学法や散逸粒子動力学法の概念を取り入れた新たな手法の構築を行った,すなわち,複数の原子のかたまりを1つの粒子として近似し,脂質分子を数個の粒子として表現する概念を取り入れながら,場を離散的な粒子ではなくスカラー量として表現する手法の開発を行なった.粒子間に働く力として,分子の運動エネルギー由来のエントロピー項と分子間相互作用力由来の自由エネルギー項をモデル化し,簡単な粒子モデルで脂質二分子膜が構成されることを示した.
梗塞心におけるACEの遺伝子発現調節機構とレドックス情報伝達系の意義の検討

我々は心筋梗塞患者の部検心においてアンジオテンシン変換酵素(ACE)の発現が亢進していることを報告している。この発現亢進は繊維芽細胞のみならず心筋細胞自身からの分泌亢進であり、組織内レニン-アンジオテンシン系の重要性を示唆している。しかしながら、このACEの発現機構については不明な点が数多くあり、最近ではフリーラジカルの関与が示唆されている。我々はこの発現のメカニズムについてのin vitroの実験系に取り組んでいる。我々はラット心室筋を用いた培養心筋細胞系を確立した。この系は、心筋および非心筋を分離して採取、培養する方法であり、その純度は現在、国際的に高い評価を得ている。これまで培養ラット心筋モデルにおいては、ACEの発現は確認されていなかったが、今回RT-PCRを用いてラット心筋純培養系においてもACE遺伝子が発現していることを確認した。我々はこれまでラット心室筋を用いて、肥大過程におけるナトリウム利尿ペプチド(ANP、BNP)が著明に発現することを確認している。よって、ANP、BNPを用いることで最も適したpositive controlが得られる。本研究の予備的実験としてTNF-α,IL-1βがANP,BNPの発現を急激に増加させることを新たに見出した。TNF-α,IL-1βは、ラジカルを介する酵素反応系を刺激し、ANP、BNPを発現させている可能性がる。このラジカル反応を阻害するためPDTC,NACを使用してANP、BNPおよびACEの発現の変化を見ていると、予備実験ながらこれらの発現の程度が変化する可能性を見出した。つまり、この研究の方向の妥当性が明らかとなった。今後、この実験系を基にさらに発展させ、培養系におけるACEの発現とラジカル反応系とのかかわり、さらにはその他の心筋から分泌される神経液性因子の情報伝達系が飛躍的に明らかになっていくものと思われる。
家蚕の食性に関する研究

アルデヒド猛基、カルボキシル基および各種アルキルエステルを置換基として持つ19種のHydroxybenzoate化合物を1ppm1%の濃度で20%の桑粉末を含む人工飼料に添加して蟻蚕に給与し、24時間後の摂食量を調査し以下の結果を得た。以下のhydroxybenzoateをHBと略す。1.摂食性への影響はアルデヒド基とカルボキシル基では異なり、オルト位ではHB酸が、常にHBアルテヒドを上まわり、メタ位及びパラ位では1100ppmではHB酸が0.11%ではHBアルデヒドが各々摂食刺激効果を示した。2.HBパラアルキルエステルについて調べたところ、炭素数の少ないもの(メチル、エチル)で摂食量が増し、炭素数の増加に従い(ヘキシル、ヘプチル)、低濃度でも摂食阻害作用を示す傾向を得た。3.置換基の位置により摂食量は異なり、パラ位は比較的高濃度での摂食阻害が少ない。それに対してオルト位は低濃度で摂食刺激効果を示す傾向がみられた。4.100ppmのような低濃度でも摂食阻害効果を示した9種の化合物について、桑葉粉末を40%含む人工飼料に添加して調査したところ、そのうちO-HBアルデヒド、O-HBAメチルエステル及び0-HBAエチルエステルの3種のみで摂食刺激効果が認められた。一方、m-HBAエチルエステル、P-HBAエチルエステル、P-HBAヘキシルエステルおよびP-HBAヘプチルエステルの4種は摂食阻害作用を示した。また、これらのHB化合物は1ppm、10ppmの低濃度でも、摂食刺激作用を認めることはできなかった。
パラジウム触媒反応を利用するインドールの新しい合成法

研究実施計画に基づき研究を遂行した結果,次の諸点を明らかにすることができた.1)既に得られている知見に基づき,エチル2-ブロモカルバニラートにパラジウム触媒下モノ置換アセチレンを反応させ,次いで塩基で閉環することにより, 2-置換インドールを合成することができた.しかしながら,上記の反応は,官能基を持つ置換アセチレンでは進行し難いことが判明した.そこで,アミノ基の保護基としてメチルスルホニル基を用いたところ,炭素官能基を持つモノ置換アセチレンで,反応が円滑に進行し,種々の2-置換インドールを合成することができた.なお,本反応では,エチニル基の導入と共に閉環も同時に進行し,保護基の脱離は認められず,また基質としては,ブロモ体よりもヨード体がより好結果を与えた.2)2-ヨードアセトアニリドと2-エトキシアクリル酸エステルとの反応を利用すると,インドールカルボン酸エステルが生成することが判明した.なお,アミノ基を保護せずに本反応を行なうと, 3-エトキシキノリンが生成する.研究実施計画に基づき研究を遂行した結果,次の諸点を明らかにすることができた.1)既に得られている知見に基づき,エチル2-ブロモカルバニラートにパラジウム触媒下モノ置換アセチレンを反応させ,次いで塩基で閉環することにより, 2-置換インドールを合成することができた.しかしながら,上記の反応は,官能基を持つ置換アセチレンでは進行し難いことが判明した.そこで,アミノ基の保護基としてメチルスルホニル基を用いたところ,炭素官能基を持つモノ置換アセチレンで,反応が円滑に進行し,種々の2-置換インドールを合成することができた.なお,本反応では,エチニル基の導入と共に閉環も同時に進行し,保護基の脱離は認められず,また基質としては,ブロモ体よりもヨード体がより好結果を与えた.2)2-ヨードアセトアニリドと2-エトキシアクリル酸エステルとの反応を利用すると,インドールカルボン酸エステルが生成することが判明した.なお,アミノ基を保護せずに本反応を行なうと, 3-エトキシキノリンが生成する.
高齢期の認知機能に関連する認知負荷の高い活動に関するライフコース研究

日本では,長寿化の影響により,私たちは生き方の変化を迫られている.寿命が延伸したことにより,どのようにライフコースを形成するのか,ライフコースの違いが高齢期の心身にどのような影響をもたらすのか,関心が高まっている.本研究では,青年期から高齢期における認知負荷の高い活動を定量化する方法を作成し,それらと高齢期の認知機能との関連を包括的に検討する.本研究の実施により,性別を問わず,青年期から高齢期までの認知負荷の高い活動量を継時的に把握することができ,これから高齢期を迎える幅広い世代がライフコースを形成するための知見を提供することが期待できる.日本では,長寿化の影響により,私たちは生き方の変化を迫られている.寿命が延伸したことにより,どのようにライフコースを形成するのか,ライフコースの違いが高齢期の心身にどのような影響をもたらすのか,関心が高まっている.本研究では,青年期から高齢期における認知負荷の高い活動を定量化する方法を作成し,それらと高齢期の認知機能との関連を包括的に検討する.本研究の実施により,性別を問わず,青年期から高齢期までの認知負荷の高い活動量を継時的に把握することができ,これから高齢期を迎える幅広い世代がライフコースを形成するための知見を提供することが期待できる.
タンパク質相互作用モチーフBRCTドメインのDNA損傷応答における役割

生物の遺伝情報が収められているゲノムDNAは電離放射線や様々な環境ストレスでDNA損傷を受けている。いったんDNA損傷が細胞に発生すると、その損傷は即座に検知されるとともに細胞周期チェックポイント機構で細胞増殖をとめるとともに、損傷に適したDNA修復機構で損傷DNAを修復して、生物はゲノムDNAの安定性を維持している、このような一連のDNA損傷応答機構で近年BRCTドメインというタンパク質部分構造を持つタンパク質群が役割を果たすことが報告されてきたことから、本研究ではBRCTドメインをもつタンパク質と物理的相互作用するタンパク質をプロテオミクス解析で同定し、同定したタンパク質のDNA損傷応答における機能を明らかにすることを目的とした。その結果、我々はBRCTドメインタンパク質NBS1がBRCT/FHAドメインを介して、H2AXとインターラクションをし、DSB(DNA二重鎖切断)損傷部位にNBS1/MRE11/RAD50複合体が集結すること重要であることを明らかにした。また、このドメインは相同組換え修復の制御に必要であった。同様に、BRCTドメインを持つTopBP1については、NBS1とDSB損傷依存的に結合し、相同組換え修復で重要な機能を持つことを示した。さらに、NBS1のBRCTドメインを介して相互作用するH2AXがさらにnucleolinと結合することをプロテオミクス解析で明らかにしたが、nucleolinはNBS1,RPAの相同組換え因子とも結合して、相同組換え修復に機能することも示した。これらの結果から、BRCTドメインを介してのタンパク質の相互作用はDNA損傷応答、特に相同組換え修復に重要であることが示唆される。近年、DNA損傷に対する細胞の応答機構は、細胞の癌化の障壁として重要であることが示唆されており、このようなBRCTドメインを介したDNA損傷応答機構はDNA修復の制御を介して癌化防御に機能していると考えられることから、今後さらなる詳細な解析が重要であると考えられる。生物の以前情報が収められているゲノムDNAは電離放射線や様々な環境ストレスでDNA損傷を受けている。いったんDNA損傷が細胞に発生すると、その損傷は即座に検知されるとともに細胞周期チェックポイント機構で細胞増殖をとめるとともに、損傷に適したDNA修復機構で損傷DNAを修復して、生物はゲノムDNAの安定性を維持している、このような一連のDNA損傷応答機構で近年BRCTドメインというタンパク質部分構造を持つタンパク質群が役割を果たすことが報告されてきたことから、本研究ではBRCTドメインをもつタンパク質について、変異型タンパク質のドミナントネガティブ効果を利用して、DNA損傷応答への影響を明らかにするとともに、大腸菌合成BRCTドメインを用いたPull-down法でBRCTドメインと結合するタンパク質を細胞から分離するとともに、プロテオミクス解析で分離したタンパク質の同定を18年度では試みた.我々はDNA損傷応答との関係が示唆されるBRCTドメインドメインを含むタンパク質のうち、NBS1,BRCA1,BRCA2,53BP1,MDC1のBRCTドメイン欠損の変異タンパク質の発現ベクターを作製し、哺乳類培養細胞に導入して、ドミナントネガティブ効果によるこれらの内在性遺伝子の不活性化によるDNA損傷応答への影響を検討した.BRCTドメインに変異のあるNBS1を導入すると、正常細胞ではDNA二重鎖切断(DSBs)部位で見られる損傷応答タンパク質のフォーカス形成が抑制されるとともに、DSBs修復の主要機構の一つ、相同組み換え(HR)修復も抑制されていた。また、BRCTドメイン変異型BRCA1の導入でもフォーカス形成の抑制効果とともにHR修復への影響も見られた.以上の結果から、これらの因子はDSB損傷応答に機能することが示唆された。また、これらの因子の機能の分子機構を明らかにする為にBRCTドメインのみの合成タンパク質を用いて、すごさ用タンパク質を分離すると、BRCTドメインと結合する可能性がある候補タンパク質を複数同定することができた.