hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
放線菌の生産するコレステロ-ル転換酵素系の遺伝生化学的究明とその応用

成熟タンパク質は、504コのアミノ酸をコ-ドし、分子量54,913と推定された。コンピュ-タ-グラフィクにより、FAD結合サイトや、コレステロ-ル結合サイト等、を解析した。本酵素遺伝子の上流に、チトクロ-ムP450類似遺伝子の存在を発見した。チトクロ-ムP450は、コレステロ-ルの胆汁酸への異化初期反応に関与するほか、ステロイドの水酸化等の多種多様なオキシダ-ゼ反応を触媒することが知られている。この遺伝子とコレステロ-ル酸化酵素遺伝子が、オペロンを形成していること、および少なくとも3つの転写産物がある事を証明した。さらに、コレステロ-ル転換系の一連の遺伝子を、guided genomic walking法を独自に開発し、約30kbのDNAをクロ-ニングした。さらに、上記のクロ-ン化遺伝子を利用して、コレステロ-ル酸化酵素を大量に分泌発現させる事に成功した。この事により、下の生産菌より70倍の生産性の向上を見た。
イネ育種のための貯蔵タンパク質遺伝子の構造解析および発現制御

遺伝子操作による植物育種を実現させるためのモデルタンパク質としてイネ貯蔵タンパク質のイネ・プロラミン,イネ・グルテリン遺伝子を選んだ。1:登熟期イネ胚乳細胞で発現するmRNAに対するcDNAライブラリーの作成とイネプロラミン、イネグルテリンcDNAの同定。プロラミン,グルテリン遺伝子を同時に発現する"金南風"胚乳よりOligodTカラムを用いpoly A RNA画分を得た。このRNA画分を用いcDNAライブラリーを作成した。このライブラリー中よりイネ・プロラミン,イネ・グルテリン抗ウサギ抗体と反応するタンパク質を生産する大腸菌を分離した。グルテリンを生産すると思われる大腸菌の一つには挿入配列3kbpのプラスミドが存在した。このプラスミドはウサギ網状赤血球ライゼートを用いるグルテリン合成を特異的に阻害し、グルテリンcDNAの配列をもつことを示した。このcDNA配列は制限酵素Pst1で5ヶの断片に分かれることが明らかになり、各断片について塩基配列決定を行った。2:突然変異イネ胚乳の貯蔵タンパク質分析。金南風の受精卵に対するN-メチルニトロソウレア処理によって得られる突然変異株の中にプロラミン型(CM:1834),グルテリン型(CM:21)の変異体を見い出した。これらは貯蔵タンパク質の発現制御部位に変化があるはずてあり、その塩基配列の解明による植物タンパク質の発現制御機構理解のための貴重な材料が得られた。
日常世界と看護をつなぐ方法論としての漢方看護論の創出

看護は、人々が健康上の課題を持ちつつも日常生活をよりよく過ごすことができることを助ける活動である。しかし現在大多数の看護師は病院に所属し、日常生活とはかけ離れた環境で、医療事故を起こさないことを最善の価値として、できるだけ早く退院することをゴールに看護実践を展開している。患者からは「対話力が落ちた」と看護師に対する批判もあり、患者を真の意味で支える看護の実践力を上げる必要がある。そこで本研究では漢方医学の哲学とアプローチを看護師が学ぶことによって、患者に耳を傾け、望む生活に戻ることを支援する看護実践力を身につけることができると考え、「漢方看護論の教育プログラム」を作ることに取り組むこととした。
異種ゲノムの重複がもたらす植物の表現型可塑性を担う発生システムの構成的理解

外部環境の変化を受けて形態・生理学的形質を適切に制御することは、生物の生存において必須の生命現象である。植物は環境の大きな変化に対して移動により逃れることができないため、ダイナミックな形態変化により環境に適応する。そのため、環境に応答した遺伝子発現と発生システムの変化を明らかにすることは、植物の生存戦略を理解する上で重要な課題である。二種類の両親種の融合により誕生した異質倍数体種には両親種より幅広い環境に生育する例が見られるが、具体的にどのような形質の変化が適応に関与するかについての研究例は少ない。本研究は、異質倍数体植物がどのような発生メカニズムで環境に応じた表現型の可塑性を示すのか、どのようなゲノム構造や遺伝子発現を示す個体が高い適応度を示すことで選抜された次世代を残すのかを明らかにすることを目的としている。そのために、特に、植物の通気組織である気孔の発生に注目して解析を行っている。異質倍数体種Cardamine flexuosaのRNAseqによる発現解析から、細胞壁合成関係の遺伝子などが両親種由来の染色体から異なる割合で発現していることがわかった。この現象が実験室環境で生育させた植物だけでなく野外で自生している植物でも起こっているかを確かめるため、自生地においてサンプリングと表現型の観察をおこなった。RNAseqによる発現解析より、実験室環境と野外とでそれぞれ特徴的に発現変動する遺伝子が明らかになりつつある。また、植物の栄養組織の環境応答性をさぐるため、Arabidopsis halleriの葉を一年を通じて定期的にサンプリングし、気孔の発生を調べている。その結果、この植物は気温の変化に対して頑強性を示す一方、生育地の光環境が気孔密度に大きく影響することが明らかになった。Cardamine flexuosaのRNAseq解析を実験室環境・野外環境で比較することより、それぞれの環境で特異的に発現変動する遺伝子と、共通して変動する遺伝子があることが明らかになりつつある。これらの解析より環境応答に関わるメカニズムが明らかになると期待される。Arabidopsishalleriの通年観察により、気孔に関わる形質が気温の年変動に影響を受けにくい、頑強性のある形質だと分かった。一方、日照量については発生形質に影響する閾値があることも分かった。Cardamine flexuosaのRNAseq解析を実験室環境・野外環境で比較することより得られた、環境応答に関わる遺伝子の候補について、ノックアウトや強制発現により遺伝子の機能を探る。Arabidopsis halleriの気孔の発生における環境の影響について、実験室でも野外を模倣した環境を設定し、環境応答と発生形質とをつなぐ遺伝的メカニズムの解明に取り組む。外部環境の変化を受けて形態・生理的形質を適切に制御することは、生物の生存において必須の生命現象である。2種類の両親種の融合により誕生した異質倍数体種には、両親種より幅広い環境に生育する例が見られるが、具体的にどのような形質の変化が適応に関与するかについての研究例は少ない。本研究は、異質倍数体植物はどのような発生メカニズムで環境に応じた表現型の可塑性を示すのか、どのようなゲノム構造や遺伝子発現を示す個体が高い適応度を示すことで選抜されて次世代を残すのかを明らかにすることを目的としている。そのために、特に気孔の発生に注目して解析を行った。異質倍数体種Cardamine flexuosaのRNA-seqにより得られたreadを、両親種であるC. amara、C. hirsuta由来のSNPを指標に分類し、両ホメオログごとの発現比を求めた。さらにGene Ontology解析により、発現が変動する遺伝子の特徴付けをおこなった。その結果、細胞壁合成関係の遺伝子などが大きく変動していることが分かった。また、実験室環境だけでなく、野外の自生植物においても同様の遺伝子発現の変化が見られるか調べるため、自生地においてサンプリングを行った。現在植物の表現型を解析しているところである。Gene Ontology解析により、発現が変動する遺伝子がどのような特徴をもつかが明らかになった。この成果は今後遺伝子の機能解析や植物の表現型解析を進めるにあたり参考になる。さらに、今年度サンプリングした野外自生個体と研究室環境の個体との比較をすることにより、環境応答に関わる普遍的なメカニズムが明らかになると期待される。植物は環境の大きな変化に対して異動により逃れることができないため、ダイナミックな形態変化により環境に適応する。そのために、特に、植物の通気組織である気孔の発生に注目して解析を行った。

異質倍数体種Cardamine flexuosaのRNA-seqによる発現解析から、細胞壁合成関係の遺伝子などが両親種由来の染色体から異なる割合で発現していることがわかった。この現象が実験室環境で生育させた植物だけでなく野外で自生している植物でも起こっているかを確かめるため、自生地においてサンプリングと表現型の観察をおこなった。現在、RNA-seqによる発現解析をすすめている。また、植物の栄養組織の環境応答性をさぐるため、Arabidopsis halleriの葉を一年を通じて定期的にサンプリングし、気孔の発生を調べている。Cardamine flexuosaのRNA-seq解析を実験室環境・野外環境で比較することより、環境応答に関わる普遍的なメカニズムが明らかになると期待される。Arabidopsishalleriの通年観察により、気孔に関わる形質が気温や日照量の年変動に影響を受けにくい、頑強性のある形質だと分かった。外部環境の変化を受けて形態・生理学的形質を適切に制御することは、生物の生存において必須の生命現象である。植物は環境の大きな変化に対して移動により逃れることができないため、ダイナミックな形態変化により環境に適応する。そのため、環境に応答した遺伝子発現と発生システムの変化を明らかにすることは、植物の生存戦略を理解する上で重要な課題である。二種類の両親種の融合により誕生した異質倍数体種には両親種より幅広い環境に生育する例が見られるが、具体的にどのような形質の変化が適応に関与するかについての研究例は少ない。本研究は、異質倍数体植物がどのような発生メカニズムで環境に応じた表現型の可塑性を示すのか、どのようなゲノム構造や遺伝子発現を示す個体が高い適応度を示すことで選抜された次世代を残すのかを明らかにすることを目的としている。そのために、特に、植物の通気組織である気孔の発生に注目して解析を行っている。異質倍数体種Cardamine flexuosaのRNAseqによる発現解析から、細胞壁合成関係の遺伝子などが両親種由来の染色体から異なる割合で発現していることがわかった。RNAseqによる発現解析より、実験室環境と野外とでそれぞれ特徴的に発現変動する遺伝子が明らかになりつつある。その結果、この植物は気温の変化に対して頑強性を示す一方、生育地の光環境が気孔密度に大きく影響することが明らかになった。Cardamine flexuosaのRNAseq解析を実験室環境・野外環境で比較することより、それぞれの環境で特異的に発現変動する遺伝子と、共通して変動する遺伝子があることが明らかになりつつある。これらの解析より環境応答に関わるメカニズムが明らかになると期待される。
自己抗体も誘導する歯周組織由来抗原の性状と役割

平成9年度において,1)インスリン依存性糖尿病(IDDM)患者の血清中に歯周組織構成線維芽細胞(歯肉線維芽細胞,歯根膜線維芽細胞)由来抗原に反応する自己抗体が存在すること,2)歯周組織構成線維芽細胞由来抗原は市販のGAD(グルタミン酸脱炭酸酵素)65を認識する抗GAD抗体と反応することを示した。GAD65は膵β細胞に発現し,GAD65に対する抗GAD抗体はIDDMの発症前からIDDM患者で高頻度に検出され,膵β細胞の破壊やIDDM診断のマーカーとして近年非常に重要視されている。また抗GAD抗体はIDDMやある種の全身疾患を有する患者にのみ検出されることが知られている。平成10年度においては,歯周病が抗GAD65抗体の産生にどのように関わっているかを調べるため1)培養歯肉および歯根膜線維芽細胞におけるGAD65の発現をRT-PCR法で調べた。2)増幅cDNAとGAD65の相同性を増幅cDNAの塩基配列から調べた。3)歯周病患者63人,IDDM17人,そして全身疾患を有さない63人の血中抗GAD抗体価をRIA法で測定した。結果は1)RT-PCRによって683bpのGAD65と考えられるmRNAを歯肉および歯根膜線維芽細胞が発現していた。2)RT-PCRにより増幅されたcDNAはGAD65と99.8%の相同性を有していた。3)2人(3.2%)の歯周病患者と11人(64.7%)のIDDM患者で抗GAD抗体を検出した。以上より歯周組織構成線維芽細胞はGAD65を産生し,歯周病患者において抗GAD抗体を検出する事実は,歯周病が抗GAD抗体産生に関わっている可能性と,IDDMの診断や発症予知に影響を与える可能性を示唆すると考える。歯周病は歯肉溝への細菌感染によって惹起される感染症である。しかしながら疾患の進行には多くの宿主要因が複雑に関与するため,患者個々で一様でない。申請者らはかねてから歯周病の発症と進行に歯周組織構成成分に対する自己免疫反応が関与する可能性があると報告してきた。本年度は代表的な自己免疫疾患であり,更にその合併症の一つとして歯周病を併発するインスリン依存性糖尿病(IDDM)に注目し,IDDM患者の血清中に歯周組織構成成分に反応する抗原があるかどうか,またあるとすればそれは度のような抗原であるかを検討した。その結果多くのIDDM患者の血清中に歯周組織構成細胞(歯肉線維芽細胞,歯根膜線維芽細胞)由来抗原に反応する自己抗体を検出した。その分子量は64kDaと38kDaのものであった。この64kDaの歯周組織構成抗原は市販の抗GAD(グルタミン酸脱炭酸酵素)抗体と反応した。GADは,抑制性神経伝達物質であるγ-アミノ絡酸(GABA)をグルタミン酸より合成する酵素で,主に脳のGABA作動性ニューロン神経終末に高濃度に局在する。しかし膵ラ氏島細胞(中でもβ細胞)にも存在しており,IDDMにおける代表的な自己抗原であるとともにIDDMの発症に関与するものと考えられている。GAD抗体の陽性率は発症早期IDDM患者で3876%とされている。今回のこの結果はIDDM患者において産生されるGAD抗体が歯周病によって破壊・遊離された歯周組織由来の細胞成分と交差反応し,その結果歯周病による組織破壊をさらに進行・悪化させる可能性を示唆しているものと考察される。
災害復興に挑む過疎地域の高齢者の主体的な生の全うを支援する生活環境モデルの構築

本研究は、被災高齢者を支援した住民・保健医療福祉専門職・行政職の被災経験を通して、住み慣れた過疎地域で高齢者が生を全うするための生活環境条件を解明することを目的とした。豪雨・豪雪・地震により甚大な被害を受けた国内3カ所の過疎地域で、支援者を対象とした面接調査を実施した結果、以下の6項目の生活環境条件を抽出した。1自立期間の延長、認知症予防の重要性2経済面での備え3小さい頃から自分は自分で守る意識醸成の防災教育4身近な医療と介護保険サービスの有効活用5自治会の後継者の育成6住民主体の地域完結型暮らしの検討。これらの実現に向けて、高齢者と支援者による中長期戦略を検討する必要性が示唆された。本研究は,災害被災地である高齢化が深刻な過疎地域住民の住み慣れた地域での生の全うをめざす災害復興支援生活環境モデルの提言を行うものである。対象地域は,平成23年9月の豪雨災害被災地である紀伊半島南部であり、モデル地域は、京都府中丹地域の豪雨や豪雪災害被災地にある福祉施設周辺部である。平成25年度は、対象地域およびモデル地域の住民代表、自治会長、過疎地域保健・医療・福祉に従事する医師、看護師、保健師、社会福祉士、社会福祉関係施設管理者を対象にインタビュー調査を行った。インタビュー項目は、災害が住民の健康や生活に及ぼした影響や防災・減災への思い、高齢化の進展と集落機能の維持に関する思い等であり、半構成的面接法を用いた。分析は質的データ分析法を用いてカテゴリー分類し、概念化を図った。現在分析中であるが、26年度開催の日本公衆衛生学会および日本看護科学学会において研究発表の予定である。また、モデル地域で開催された地域ぐるみの交流イベントにおいて参加観察を行った。現在までに、対象地域の自治会長、住民代表、医療・福祉関係者7人のインタビュー調査の分析およびコミュニティ・アズ・パートナーモデルを用いた地域診断の結果から、『災害復興支援者がとらえる過疎地域の高齢者が主体的に生を全うするための生活環境条件』として、以下の5つを抽出した。1)災害時の減災に向けた整備:自分のことは自分で守るという意識の醸成、情報管理2)住民の交流を深め、コミュニティ内の関係性を高める3)認知症予防と認知症に関する理解を高める教育4)病診連携・看看連携の強化5)過疎地域住民が持つ価値観・観念を理解し、生活を支援する専門職の質の向上を図るこれらの条件整備には、過疎地域の特性を理解した支援活動が求められ、さらに住民の意向を調査しながら、課題解決に向けた地域力を高める方策について検討したいと考える。本研究は,災害被災地である高齢化が深刻な過疎地域住民の住み慣れた地域での生の全うをめざす災害復興支援生活環境モデルの提言を行うものであり、対象地域は,平成23年9月の豪雨災害被災地である紀伊半島南部である。まず文献・資料収集とアクションリサーチ研究の枠組み検討を研究代表者・分担研究者・研究協力者間で行い、その後下記研究活動を実施するとともに進捗管理を行った。(打ち合わせ・進捗管理会議6回)1.対象地域ヒアリング調査:対象地域の自治体・保健所の保健師及び豪雨災害支援担当職員に当時の状況、その後の高齢者を中心とする住民の生活環境の変化についてヒアリングを行った。また、高齢者の生活を民間の視点で支援するNPO法人理事長やスタッフにも同様の聞き取りを行った。2.モデル地域支援者へのヒアリング調査:モデル地域社会福祉施設施設長に対して、過去の災害からの復興や高齢化・過疎化進展の中での地域づくりの戦略・進捗状況・今後の課題についてヒアリングを行った。その中で24時間安心サポートシステムを過疎化の進む中でのコミュニティ再生の軸にしている取組みについて紹介を受けた。3.対象地域住民代表へのインタビュー調査:自治会長、民生委員に災害時の状況、災害後の高齢者の生活、復興に向けた住民の思いについてインタビューを行った。また、被災地市町村主催の支援者研修会において、「支援者の心のケア」について講演を行った。4.24年度調査結果については現在詳細を分析中であるが、検討会議において住民の生活満足度、地域づくりに関する住民の意識の実態についても把握する必要性を見出した。24年度の研究活動のまとめについては、25年10月に開催される日本公衆衛生学会に発表予定である。本研究は,災害被災地である高齢化が深刻な過疎地域住民の住み慣れた地域での主体的な生の全うをめざす災害復興支援生活環境モデルの提言を行うものである。対象地域は,平成23年9月の豪雨災害被災地である紀伊半島南部であり、モデル地域は、京都府中丹地域(福知山市・綾部市)の台風による豪雨や豪雪災害被災地である過疎地域である。

さらに26年度は、東日本大震災被災地である人口流出の激しい地域(宮城県気仙沼市)を調査地域に加えた。追加した調査地域は、研究代表である野呂が、基盤研究C課題番号23593204の研究分担者として研究活動を行ってきた地域であり、本研究の他の地域とともに災害復興に挑む中で、高齢化のさらなる進展と乏しい保健医療福祉資源の活用・生活環境の整備について喫緊に取り組む必要があった。最終年度である26年度は、2年間の調査活動をまとめ、それに基づくモデル地域での専門職によるディスカッションの実施および国内外での学会発表(7題)を中心に行った。1京都府福知山市では、過疎地域を中心に活動する福祉施設で開催された「ケア24」会議に定期的に出席し、高齢者の直面する生活環境の課題と専門職が捉えた「地域で生を全う」するための方策について活動分析としてまとめた。(城・野呂)2京都府福知山市および宮城県気仙沼市において、住民リーダー・ボランティア・保健医療福祉従事者・行政の復興担当として高齢者の生活環境整備を支援する関係者と、災害時の状況・健康への影響、復興の状況と課題について主体的な高齢者の「生の全う」を支援する視点でディスカッションを行った。(野呂・城・研究協力者:及川)。3年間の研究成果をもとに、資源の枯渇する過疎地域における高齢者の「主体的な生の全う」を支援する生活環境整備のあり方について、今後さらに追究していく予定である。公衆衛生看護学25年度は、京都府中丹地域で選定した2カ所のモデル地域での研究活動を本格的に開始し、対象地域である紀伊半島南部の活動とあわせて、災害復興とともに高齢者を支援する立場にある住民代表および保健・医療・福祉関係者にインタビュー調査を実施することができた。また、モデル地域での地域の活性化をめざした自治会と福祉施設が合同で開催しているイベントに参加し、高齢化の進展する地域の次世代に向けた取組みを参加観察することができた。これらの結果の分析も順調に進んでいる。研究の報告は、25年度中に4題学会発表を終えている。当初は、住民への意識調査も予定していたが、研究者間のディスカッションの結果、災害等により住み慣れた地域から離れることを余議なくされる高齢者をいかに支援するか、関係者のそれぞれの取組みに焦点をあて、質的分析によりベストプラクティスを選定し、生活環境モデルの提言に向けて活動展開するよう研究方針を明確にした。当初の計画では、モデル地域を過去に災害に遭った過疎地域4か所を選定していたが、分担研究者と検討の結果、研究活動に費やす時間等との関連からモデル地域を当初設定した条件を満たす物理的に近い環境にある自治体に変更した。24年度は、新たに設定した災害復興の取り組みを行ってきた過疎地域自治体において研究活動を行った。対象地域に関しては、行政関係者に研究依頼を行い、快諾を得た。また、その後のヒアリングにおいても協力を得て情報収集を行い、住民代表のインタビュー調査も実施できている。研究目的に対して、効果的な研究方法を研究者間で協議し、進捗管理の中で評価と改善を繰り返し、研究が成果あるものになるよう努力しているところである。26年度は、本研究の最終年度である。
微生物由来リポタンパク質およびリポペプチドの腫瘍増殖に及ぼす影響

微生物由来物質と腫瘍抗原と一緒に免疫してマウスに腫瘍を接種すると、腫瘍の増殖が著しく抑制され、生存率も著しく伸びた。しかしながら、微生物由来物質を単独、FSL-1を単独で免疫した場合は、腫瘍の増殖が著しく増強され、生存率も著しく低下した。この相反する活性の原因を細胞レベルで明らかにした。1、FSL-1+QRsP(UV)免疫で腫瘍細胞の増殖が抑制される理由腫瘍抗原にFSL-1を加えたことによりアジュバント活性が惹起され、自然免疫系が活性化され、続いて獲得免疫が誘導されたためではないかと推測し、以下の結果を得た。(1)CpG+QRsP免疫を行ったものに比べると、弱いながらも腫瘍特異的なCTLが誘導された。(2)免疫終了後、マウスより採取した血清をQRsPと混合し、マウスの脾臓からMACSによって分離したNK細胞と共培養した結果、FSL-1+QRsP免疫を行ったものでは、細胞傷害活性が強く誘導された。(抗体依存性細胞傷害活性:ADCC)(3)マウスより脾臓細胞採取し、MACSを用いて免疫応答を抑制する制御性T細胞(Treg)およびeffector T細胞(Th細胞)を分離し、Tregの抑制活性を測定した結果、Tregの抑制活性は、FSL-1を加えることによって解除されることもわかった。2、FSL-1単独免疫で腫瘍細胞の増殖が促進した理由FSL-1単独で免疫を行った場合、末梢およびリンパ器官でのTregの割合が増加し、そこに腫瘍細胞を投与することで、腫瘍に対する免疫応答が抑制されてしまったのではないかと推測し、以下の結果を得た。(1)FSL-1単独免疫後、所属リンパ節においてCD4^+CD25^+Foxp3^+細胞の割合が優位に高いことがわかった。(2)マウスの脾臓よりMACSでTregを分離し、FSL-1、CpGおよびLPSで刺激すると、FSL-1でのみ増殖反応が見られた。(3)マウスにFSL-1免疫を行う際、anti-CD25抗体を投与した後にQRsPを接種すると、腫瘍の増殖は抑制された。CD4^+CD25^+Foxp3^+制御性T細胞(Treg)は、胸腺に由来し、ヒトやマウスでは末梢CD4^+T細胞の約510%を占め、自己反応性T細胞の活性化を抑制したり、過剰な免疫応答を抑制することで免疫系における恒常性を維持している。また、腫瘍の微小環境において、Tregは腫瘍に対する免疫応答を抑制し、腫瘍の増殖に有利な環境をつくっていることが報告されている。最近、自然免疫系で微生物の侵入を感知するTbn-like receptor(TLR)のいくつかがTregにも発現しており、特にTLR2はTregの機能の制御にかかわっていることが報告された。そこで、本研究ではTLR2のリガンドであるリポペプチドFSL-1がin vivoにおいて腫瘍増殖に対してどのように影響するかを調べ、腫瘍免疫アジュバントとして知られているTLR9のリガンドであるCpGと比較した。FSL-1もしくはCpGをマウスの皮下に腫瘍接種前に1週間隔で4回免疫した後、C57BL/6由来線維肉腫(QRsP)を接種し、経時的に体積の測定および生存率を測定した。FSL-1を免疫した場合は、腫瘍の増殖が著しく促進され、また生存率も著しく低下した。しかしながら、CpGを免疫した場合、そのような現象は見られなかった。このことから、FSL-1を投与することによって、Tregが活性化され、抗腫瘍免疫応答を抑制したために腫瘍の増殖が促進されたのではないかと推測した。実際、FSL-1を免疫した後、所属リンパ節中のCD4^+CD25^+細胞におけるFoxp3陽性細胞の割合が優位に高いことがわかった。また、マウスの脾臓よりMACSを用いてTregを分離し、FSL-1、CpGおよびE. coliLPS(TLR4リガンド)で刺激したところ、FSL-1刺激でのみTregの増殖が見られた。さらに、腫瘍を接種する3日ならびに1日前に抗CD25抗体を腹腔に投与したところ、FSL-1投与による腫瘍の増殖促進はみられなかった。また、TLR2ノックアウトマウスを用いた実験でも、FSL-1投与による腫瘍の増殖促進はみられなかった。以上のことから、FSL-1投与による腫瘍の増殖促進は、FSL-1刺激でTregの増殖促進がTLR2依存的に誘導され、その結果として免疫抑制状態が増強されたために腫瘍の増殖が促進されたものと推測された。
木質系バイオマス資源の有効利用に関する基礎的研究-遺伝子工学的手法を用いるリグニン分解酵素の大量生産-

本研究は、リグニン分解性担子菌Pleurotus ostreatusが生産するリグニン分解酵素、マンガン依存性ペルオキシダーゼ(MnP)を研究対象として行い、以下に述べる知見を得た。1.本酵素の生産条件について検討を行ない、本酵素がMN^<2+>により誘導生産されることを明らかとした。2.本酵素を均一状態に精製し、精製酵素を用いてMnPの蛋白化学的、酵素化学的諸性質を種々明らかとした。3.本酵素遺伝子およびcDNAをクローニングし、それらの全塩基配列を決定した。解折の結果、本遺伝子は29アミノ酸残基から成るシグナルペプチドと332アミノ酸残基から成る成熟MnPをコードしていることが明らかとなった。また、本遺伝子には、GT-AGの一般則に従う15個のイントロンが存在した。本遺伝子の5'-非コード領域には、真核生物の遺伝子に特徴的なTATAボックスおよびCAATボックスと推測される配列が各々2箇所存在することが明らかとなった。また、3'-非コード領域には、ポリAシクナルと推測される領域か存在した。さらに、本酵素にはペルオキシダーゼに特徴的な活性部位(disatal-His、distal-Arg、proxomal-His)の存在が認められることや、N-グリコシレーションサイトが一箇所存在することなどが判明した。4.MnPcDNAを発現ベクターに挿入して得られた組換えベクターを、Saccharomyces cerevisiaeあるいはAspergillus oryzaeに導入したが、活性のあるMnPを生産する形質転換体は得られなかった。しかし、A.oryzaeにおいては、染色体に挿入されたMnPcDNA(サザンブロット解折により確認)がベクター由来のプロモーターの支配下で転写され、MnPmRNAが生産されていることがノーザンプロット解折から判明した。本年度では、主として担子菌Pleurotus ostreatus(ヒラタケ)が生産するリグニン分解酵素であるマンガン依存性ペルオキシダーゼ(MnP)について、その生産性、精製方法、諸性質、リグニンモデル化合物の分解反応について検討を行なった。P.ostreatusを木粉培地で培養すると、各種リグニン分解酵素のうち特異的にMnPが高生産されることが明らかとなり、本酵素のリグニン分解における重要性が示唆された。また、P.osteratusの液体培養系においては、本酵素は培地に添加したマンガンイオンによって誘導生産されることが明らかとなった。本酵素を各種クロマトグラフィーにより、電気泳動的に均一状態にまで精製した。収率は約2%であり、比活性は約30倍に上昇した。精製酵素を用いて、本酵素の諸性質について検討したところ、本酵素は分子量約43、000のモノマー酵素であり、反応の最適pHは6.0、最適温度は50°Cであった。また、本酵素は40°Cまで、およびpH6.0付近で安定であった。本酵素は各種基質の酸化活性に二価のマンガンイオンを必須とし、二価のマンガンイオンの三価への酸化反応を触媒した。従って、本酵素の触媒機能は二価のマンガンイオンの酸化反応にあり、生成した三価のマンガンイオンがリグニンなどの基質を酸化するものであると考えられた。本酵素による各種低分子リグニンサブストラクチャーモデル化合物の分解反応について検討を行なったところ、本酵素はフェノール性β-O-4リグニンモデデル化合物である、シリンギルグリセロール-β-グアイアシルエーテルのアルキル-アリール開裂、およびα位の酸化反応を触媒することが示唆された。

さらに本酵素のアミノ酸配列をN末端より30残基まで決定し、この知見は次年度に予定しているMnP遺伝子、cDNAのクローニングに際して必須となるものである。本年度では、担子菌Pleurotus ostreatus(ヒラタケ)が生産するリグニン分解酵素であるマンガン依存性ペルオキシダーゼ(MnP)の遺伝子およびcDNAの構造解析、並びにMnPcDNAの異種宿主における発現について検討した。まず、本酵素遺伝子およびcDNAをクローニングし、それらの全塩基配列を決定した。解析の結果、本遺伝子はメチオニンで始まる29アミノ酸残基から成るシグナルペプチドとアラニンで始まる332アミノ酸残基から成る成熟MnPをコードしていることが明らかとなった。この結果は、本酵素が菌体外酵素であることと一致した。また、本遺伝子には、15個のイントロンが存在したが、このイントロンの多さは本遺伝子の特徴を示すものであると考えられる。イントロンはすべてそれらのスプライシング部位において、GT-AGの一般則に従っていることが判明した。本遺伝子の5'-非コード領域には、真核生物の遺伝子に特徴的なTATAボックスおよびCAATボックスと推測される配列が各々2箇所存在することが明らかとなった。また、3'-非コード領域には、ポリAシグナルと推測される領域が存在した。本酵素遺伝子およびcDNAの塩基配列の結果から推測された本酵素のアミノ酸配列の解析から、本酵素にはペルオキシダーゼに特徴的な活性部位の存在が認められることや、N-グリコシレーションサイトが一箇所存在することなどが判明した。次いで、MnPcDNAを発現ベクターに挿入して得られた組換えベクターを、Saccharomyces cerevisiaeあるいはAspergillus oryzaeに導入したが、活性のあるMnPを生産する形質転換体は得られなかった。しかし、A.oryzaeにおいては、染色体に挿入されたMnPcDNA(サザンブロット解析により確認)がベクター由来のプロモーターの支配下で転写され、MnPmRNAが生産されていることがノーザンブロット解析から判明した。これらの結果から、A.oryzaeにおいてMnPcDNAの転写は起こるがその後の翻訳過程、あるいはタンパク質プロセシングの過程に問題があるために、活性のあるMnPが生産されなかったことが予想された。
留学生のメンタルヘルスに関する包括的な研究

<研究1:受け入れ留学生のメンタルヘルスに関する多施設共同後ろ向きコホート研究>研究計画通り、京都大学・大阪大学・名古屋大学における多施設共同後ろ向きコホート研究を行った。受け入れ留学生のうち、学校医により、精神疾患の診断名がついたケースについて、統計学的解析を行った。最初に、メンタル不調を呈した群の、疫学的特徴を記述的に明らかにした。次に、重症群のリスク因子について解析を行った。その結果、非アジア地域、非正規生、日本語初級レベルが、リスク因子として抽出された。さらに、思春期群(25歳以下)と青年期群(26歳以上)との2群間の比較研究を行った。症状の程度や出身地域に差違は認められなかったが、発病に影響を及ぼした主なストレッサー、援助希求行動の特徴に有意な差違が認められた。加えて、メンタル不調のため、途中帰国をした予後不良群について、統計解析を行った。ICD10でF2に分類される群は有意に予後不良であった。また、アフリカ地域や中南米地域など、地理的・文化的距離の遠い地域に予後不良群が多い傾向が認められた。重症群のうち、F2群以外では、F3・F4に分類された、ひきこもり群が特徴的であった。<研究2:派遣留学生の留学前後における健康と精神的発達に関する疫学研究>派遣留学生における留学前後の全般的健康度と精神的発達に関する疫学研究を行った。留学前は留学後に比し、有意に全般的健康度が不良であった。大学における留学出発時期は、概ね、夏休みと春休みであるが、その前には試験やレポート提出が集中しており、出発前に睡眠不足である傾向が著しかった。留学後のストレス対処方法の変化に関しては、二極化している傾向が認められた。未熟な反応を示すいわゆる退行群と、認知的再解釈を強化し成熟度が増したと解釈できる群がそれぞれ有意に増加していた。平成27年度の計画は、留学生のメンタルヘルスに関する、全国規模の横断研究について、調査を行うことであった。当初計画は、G30に選定された13大学に限定して考えていたが、国立大学留学生指導研究協議会に加盟しかつ、全国大学保健管理協会に加盟している、全国の主な国立大学法人を概ね網羅することとした。まず、国立大学留学生指導研究協議会に協力を要請し、現在倫理規定ななどにつき、協議中である。また、全国大学保健管理協会においても、幹事大学に対して、研究意義を説明し、研究協力を依頼中である。さらに、本研究においては、ウェッブ調査を行う予定である。最終的なコンテンツは、両協議会とすり合わせが必要であるものの、平成27年度中に、ウェッブシステムの概略は完了している。また、これと平行して、本研究のパイロット調査として、本学における過去4年間の留学生のメンタル不調者の解析および過去5年間の留学生のメンタル不調者のうち予後不良者の解析を行い、第112回精神神経学会学術総会でも口頭発表を行った。また後者は、平成28年3月の留学生担当教員連絡会で報告をおこない、現在国際学術誌に投稿中である。本研究のコアである全国データについては、28年度以降の解析となっているため、結果が得られ次第、学会や専門部会で報告し、国際誌に投稿していく予定である。27年度は、本研究の初年度であったが、ウェッブ調査における、システム構築の概略が完成した。また、全国調査において、協力を得るべき機関にも要請を行い、現在詳細を調整中である。さらに、本研究を遂行するにあたって必要な、パイロット研究2件についても、平成27年度中に解析を終了し、現在は、国際誌に投稿準備中である。以上より、本研究は、おおむね順調に進展していると考える。また、本パイロット研究に基づき、京都大学留学支援ネットワーク・ワークショップにて、グループB「異文化適応」の分科会にて、派遣留学生の異文化適応とメンタルヘルスについて、発表を行った。さらに、本研究に関連する調査として、留学生の健康意識、中でも、メンタル関連疾患に関するスティグマ調査を、秋学期に入学する京都大学の全留学生を対象にウェブ調査を行った。本研究については、「有効なアンチスティグマ活動を展開するために過去の文献レヴューと自験例における予備解析結果から」のタイトルで精神神経学会の学術誌に投稿済みであり、平成28年度末の時点で査読中である(平成29年4月に採択のご連絡をいただいた)。研究1に関しては、全国の国立大学に協力要請を行うために調整を進めていたが、文部科学省が推進中である、SGU (Super Global University)構想に採択された、全国の主要大学に調査対象を変更した。これに伴い、協力要請機関の変更を余儀なくされたため、その分の遅延が生じている。研究2については、京都大学の留学生の調査分については着手しており、計画通りである。1)本研究で得られたデータを用いて、留学生のメンタル不調のうち、予後不良群の特徴を解析し、検討を加えた。予後が不良であった群に関しては、概ね二群に大別できた。一つは急性精神病群、もう一つは、ひきこもりなどを伴う抑うつ症状群であった。前者は、渡日後、早期に発病する傾向があり、出身国が日本から観て、地理的・文化的に遠方である傾向が認められた。一方、うつ病関連疾患群に関しては、渡日後、半年以上経過してから発病する傾向があった。出身国に明らかな特徴は認められなかったが、そもそも母国での学校生活への適応に問題がある傾向が認められた。解析では、性別や年齢には、有意な関連性は認められなかった。

2)本研究で得られたデータを用いて、留学生のメンタルヘルスに関する援助希求能力と予後との関連性を解析し、検討を加えた。初診時のGAFの得点が低く、精神医学的な重症度が高いほど、予後は不良であった。また、自力での援助希求行動が取れなかった群ほど、予後は不良であった。さらに、疾患群間での比較では、ICD-10によるF3群よりもF2群の方が初診時のGAFが不良であり、援助希求行動も取ることができていなかった。3)本研究で得られたデータを用いて、留学生のメンタル不調と日本語能力に関して解析し、検討を加えた。統合失調症関連疾患群においては、日本語能力に関して中等度群に発病が集中しており、日本語が不完全に理解できることと発病との関連性が示唆された。また、うつ病関連疾患群においては、日本語能力との明らかな関連性は認められなかった。研究計画におけるデータ取得も概ね終了している。既に十分なデータが得られており、現在、データ解析と複数の論文を執筆中である。研究は順調に進捗している。<研究1:受け入れ留学生のメンタルヘルスに関する多施設共同後ろ向きコホート研究>研究計画通り、京都大学・大阪大学・名古屋大学における多施設共同後ろ向きコホート研究を行った。受け入れ留学生のうち、学校医により、精神疾患の診断名がついたケースについて、統計学的解析を行った。最初に、メンタル不調を呈した群の、疫学的特徴を記述的に明らかにした。次に、重症群のリスク因子について解析を行った。その結果、非アジア地域、非正規生、日本語初級レベルが、リスク因子として抽出された。さらに、思春期群(25歳以下)と青年期群(26歳以上)との2群間の比較研究を行った。症状の程度や出身地域に差違は認められなかったが、発病に影響を及ぼした主なストレッサー、援助希求行動の特徴に有意な差違が認められた。加えて、メンタル不調のため、途中帰国をした予後不良群について、統計解析を行った。ICD10でF2に分類される群は有意に予後不良であった。また、アフリカ地域や中南米地域など、地理的・文化的距離の遠い地域に予後不良群が多い傾向が認められた。重症群のうち、F2群以外では、F3・F4に分類された、ひきこもり群が特徴的であった。<研究2:派遣留学生の留学前後における健康と精神的発達に関する疫学研究>派遣留学生における留学前後の全般的健康度と精神的発達に関する疫学研究を行った。留学前は留学後に比し、有意に全般的健康度が不良であった。大学における留学出発時期は、概ね、夏休みと春休みであるが、その前には試験やレポート提出が集中しており、出発前に睡眠不足である傾向が著しかった。留学後のストレス対処方法の変化に関しては、二極化している傾向が認められた。未熟な反応を示すいわゆる退行群と、認知的再解釈を強化し成熟度が増したと解釈できる群がそれぞれ有意に増加していた。本研究のうち、全国調査においては、平成28年度中にデータの収集とデータクリーニングを完成する予定である。また、平成29年度中には、国際誌への投稿を目指す予定である。さらに、前向きコホート研究についても、計画通り、平成28年度より開始する予定である。
D-乳酸脱水素酵素の構造と機能に関する研究

おもにアミノ酸残基置換による解析から、Lactobacillus plantarum D-乳酸脱水素酵素(D-LDH)においては、His-296が酸塩基触媒として作用し、Arg-235が基質の結合に重要であることが示された。すなわちこれらの残基は、L-LDHのHis-195とArg-171にそれぞれ対応し、両LDHは、進化的には大きく隔たる酵素でありながら、きわめて類似した基質結合と触媒の機構を備えていることを示している。さらにL-LDHにおいてはHis-195と対をなすAsp-168の負電荷が、基質ピルビン酸との結合及び触媒上の遷位状態の構造を安定化していると考えられているが、そこでこれに対応する残基をD-LDHにおいて検索した。D-型酵素ファミリーにおいて保存されている、193、200、240位のAsp、264位のGlu残基のカルボキシル基を、それぞれ部位指定変異によりアミド基に置換したところ、Glu-264をGlnに置換した場合にのみ大きな活性低下が見られた。既にL.bulgaricus D-LDHにおいて、Glu-264をGlyに置換した変異型酵素が報告されている。この場合には酵素活性は大きく低下せずに、そのpH依存性が大きく酸性側にシフトしたことから、Glu-264は触媒活性に必須ではなく、触媒His残基の近傍に位置することにより、酵素のpH依存性を中性付近に調節している残基と考えられている。しかしながら、L.plantarum D-LDHにおいてGlu-264を同様に負電荷を消失させるGlnに置換した場合には、顕著なpH依存性のシフトは認められず、並異型酵素は、大幅に増大したKm値と減少したkcat値を示した。この結果はL-LDHにおいてAsp-168をAsnに置換した結果によく対応し、本残基がL-LDHにおけるAsp-168のそれと相同な機能を持つことを強く示唆している。本結果はL.bulgaricus酵素の結果と異なるが、もし両D-LDHにおいてGlu-264の機能に相違が無ければ、L.bulgaricus酵素の場合は、残基を側鎖の無いGlyに置換したために、酵素の構造にさらに大きな変化が引き起こされた結果とも考えられる。
高高度気球を用いた微小重力実験装置の開発

数十秒間の微小重力環境を中程度のコストで実現する手段として、高高度気球から微小重力実験装置を落下させ、自由落下中に微小重力実験を実施するシステムを開発した。飛翔実験にて10^<-4>G以下の微小重力環境を約35秒間実現し、今後の定常的運用に目処を立てた。平成16年度は、微小重力実験システムの概念設計と主要要素技術の開発を開始し、これに基づいて平成18年度までの研究計画(特に飛翔実験計画)の詳細化を行った。まず、大重量観測器用高高度気球の開発に必須である多層膜型気球の設計、試作を行った。この方式は、単一のフィルムで製作する場合と比較して、気球尾部のフィルム厚みを薄くすることができるため、気球の軽量化、高高度化が可能となる。気球製作用ヒートシーラを設計、製作し、これを用いて気球の頭部を試作し、平成16年10月に三陸大気球観測所にて地上試験を行った。試験の結果、気球は十分な強度を発揮し設計が問題ないことが実証された。落下機体については、機体の空力、構造、熱設計を開始した。各技術の専門家に研究協力者として適宜参画してもらい、概略設計、数値解析などを行っている。また平成17年度に実施する風洞試験のための準備を行っている。微小重力実験部については、2重殻ドラッグフリー機構を設計し、計算機シミュレーションによって所期の性能が達成できる見通しを得た。これを受けて、レーザ変位センサを購入し、内殻外殻の3次元相対距離が計測できることを実験的に確かめた。また、1号機、2号機に搭載する微小重力実験項目の検討を行い、画像伝送、データ伝送のインターフェイス(特に無線伝送部)の設計を行った。ガスジェット推進装置については、制御シミュレーション結果に基づいて配置を決定し、製作を開始した。特にスラスタバルブについては、航空宇宙用の製品は高価であるため、民生用の製品を購入し、その特性測定装置を開発し、制御に使用するためのパラメータ取得を行った。その他の機体搭載機器については、性能、重量、消費電力、コストなどを比較検討し、搭載計算機、姿勢センサ、加速度計、データ記録装置、モニタカメラ、通信機器などの設計・選定を終えた。一部機器は、既に購入している。平成17年夏期に1号機の飛翔試験を行う予定であるので、気球との機械的・電気的インターフェイスの調整、飛翔させるときの機体保持方法の検討、温度試験などの耐環境試験の準備を行っている。本研究では、高高度気球からドラッグフリー技術を使用した微小重力環境部を落下させ、ここで各種微小重力実験を行うことを目的としたシステムを開発している。平成16年度の基礎設計に基づき、平成17年度は、9月に40km高度からの落下試験を行うべく、微小重力部を載せた機体(1号機)の詳細設計、製作、地上にての動作確認試験、各種環境試験を行った。1号機では、微小重力実験の試験ケースとして流体物理実験を計画し、実験装置の製作、機体側とのインターフェイス試験などを行った。三陸気球実験場にて飛翔準備まで終了したが、風向きが実験に適さなかったため、飛翔は平成18年5月に延期された。以後、1号機の信頼性、運用性などの向上を行うために、いくつかの改良、試験を行い、次回の飛翔に向けて準備をしている。並行して、長秒時微小重力実験を行う2号機(平成18年8月飛翔予定)の設計、製作を始めた。2号機は超音速落下となるため、計算流体力学と風洞試験を併用して翼の設計を行い、翼を可動するための制御則の研究などを行っている。また超音速からの減速手段として、超音速パラシュートの研究を研究協力者と連携しながら始めた。2号機では燃焼物理の微小重力実験を計画しており、平成17年度は燃焼チャンバーおよび計測制御装置の設計・製作と、航空機を用いた短時間無重力環境でその予備実験を行った。3号機(平成19年度飛翔予定)では、さらに長秒時の微小重力環境を実現するため、空気取り込み式推進装置(エアーブリージングエンジン)を取り付け、大きな空気抵抗にうち勝つように下向きに加速を行う。エンジンの開発は別途行われているが、当該研究グループと密接に連携しながら、3号機の機体設計(特に空力設計)を開始した。平成16年度の基礎設計、平成17年度の1号機の設計、製作、試験につづき、平成l8年5月には三陸大気球実験場から1号機を飛翔させ、無重力落下機体システムの動作確認試験を行った。システムは高度42kmまでの飛翔中全て正常に動作し、熱設計、通信回線設計等の確認が行えた。気球ゴンドラからの分離後、約7秒間の微小重力環境が実現でき、この間に、流体物理実験(異なる表面張力をもつ2液相間での気泡の挙動の観察)を行うことができた。実験装置の動作、機体側とのインターフェイス、実験画像伝送、画像記録など全て正常に行われた。落下開始20秒後にはパラシュートを開傘し、機体は海上に緩降下、浮遊し、これを回収船とヘリコプターにより回収した。

回収された機体の損傷はほとんどなく、構造設計、水密設計の妥当性が確認された。つづいて、2号機の設計、製作を行い、平成18年9月に三陸大気球実験場から飛翔させる予定であったが、放球直前に気球が損傷したため、今期の飛翔は断念し、平成19年5月に実験を行う予定である。2号機は実際に30秒以上の微小重力環境を実現させるため、超音速落下となる。このため、計算流体力学と風洞試験を併用して翼の設計を行い、尾翼を装備した。また超音速からの減速手段として、超音速パラシュートの研究を研究協力者と連携しながら行った。2号機では燃焼物理の微小重力実験を行うため、燃焼チャンバーの設計、製作を行い、飛翔前のインターフェイス試験は正常に行われている。気球は破損したため再製作したが、機体は損傷無かったので、平成19年度実験にそのまま使用する。3号機(平成20年度飛翔予定)では、さらに長秒時の微小重力環境を実現するため、空気取り込み式推進装置(エアーブリージングエンジン)を取り付け、大きな空気抵抗にうち勝つように下向きに加速を行う。エンジンの開発は別途行われているが、当該研究グループと密接に連携しながら、3号機の機体設計(特に空力設計)を行っている。本研究では、高高度気球からドラッグフリー技術を使用した微小重力環境部を落下させ、ここで各種微小重力実験を行うことを目的としたシステムを開発している。平成16年度の基礎設計、平成17年度の1号機の設計、製作、試験、平成18年度の1号機の飛翔と2号機の設計、製作、飛翔準備に引き続き、平成19年5月には2号機を飛翔させ、4号機の製作、試験および飛翔準備を行った。2号機は高度41.4kmまでの飛翔中全て正常に動作し、気球ゴンドラからの分離後、約30秒間の微小重力環境が実現でき、この間に、燃焼実験(線香花火の燃焼挙動の観察)を行うことができた。落下開始35秒後には超音速パラシュートを開傘し、機体は海上に緩降下、浮遊し、これを回収船とヘリコプターにより回収した。これにより、気球落下式微小重力実験システムの成立性が確認できた。回収された機体の損傷はほとんどなく、ほぼそのまま4号機の機体へと使用された。つづいて、4号機の設計、製作を行い、平成19年9月に三陸大気球実験場から飛翔させる予定であったが、風向きが飛翔に適さず、今期の飛翔は断念し、平成20年度以降に実験を行う予定である。4号機は、実用的な微小重力実験システムの実現を目指し、微小重力実験ユーザは当研究グループ外の研究者とし、東京大学理学部の重力波アンテナの動作試験と東京理科大学の流体の濡れ性観察の2種類について実験装置の開発を行った。実験装置の完成度の観点から、重力波アンテナを搭載し、4号機の飛翔実験に臨んだが、前期のように飛翔させることができなかった。なお重力波アンテナ実験装置は、その後航空機実験に供する機会があり、数秒ではあるが微小重力状態での動作を確認することができた。平成20年度は、実験場の北海道大樹町への移転があり、5月はユーザの実験を実施しないことから、9月期に4号機の実験を実施予定である。これにより、当初平成20年度に実施予定だった3号機の実験が実施できないため、予算の平成21年度への一部繰り越しを希望する。3号機では、さらに長秒時の微小重力環境を実現するため、空気取り込み式推進装置(エアーブリージングエンジン)を取り付け、大きな空気抵抗にうち勝つように下向きに加速を行う。
エリスロポエチンの組織特異的(脳・肝臓・腎臓)遺伝子発現機構の解明

エリスロポエチン(EPO)は、赤血球系前駆細胞の赤血球への分化・増殖に必須の糖タンパク質であり、胎児では肝臓、成体では肝臓で生産される。申請者は神経細胞に対してもEPOは作用することを示し、中枢神経系ではアストロサイトがEPOを生産し、ニューロンにEPO受容体を介して作用することを明らかにした。これによりEPOは脳・肝臓・腎臓において組織特異的発現をしていることが判明した。本研究はEPOの脳・肝臓・腎臓特異的に発現するために必須の領域を決定し、そこに結合する転写因子を同定することによりEPOの組織特異的発現調節機構を解明することを目的として研究を行った。EPO遺伝子の組織特異的発現に必要な転写調節領域の決定するために、様々な領域のヒトEPO構造遺伝子の上流および下流領域をルシフェラーゼ遺伝子の両端に接続した。これをEPOを生産する初代培養アストロサイト細胞、肝ガン細胞Hep3Bに導入し、トランジエントのルシフェラーゼ活性を指標として、脳・肝臓におけるEPO産生に必要な領域の決定を試みた。その結果、肝臓での発現にはEPOの上流0.2Kbおよび下流の酸素応答配列が存在すればよいことがわかった。いっぽう脳での発現は、上流3.5Kbと下流の酸素応答配列をルシフェラーゼに接続したものでは、酸素応答配列だけを接続したものに比べて転写の活性化が見られた。しかし上流8.5Kbを接続すると転写は抑制された。従ってこの領域は脳での特異的発現に関する部分ではないと推察された。この知見から脳での特異的発現には、されに上流あるいは下流の配列が必要であることが明らかとなった。脳でのEPO受容体の発現部位を明らかにするために、18日目のラットの免疫組織化学的染色を行い、海馬および大脳皮質に陽性のニューロンが存在することを明らかにした。