hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
神経再生機能分子LOTUSによるALS の治療法開発

現在のところ、ほぼ仮説通りの運動機能を呈しているが、今後さらに例数を増やし週齡を追っていきたい。LOTUS遺伝子改変マウスとALSモデルマウスの交配が順調にすすみ、運動機能解析でも、ほぼ仮説通りの結果が期待できそうなデータを得つつある。LOTUS遺伝子改変マウスとALSモデルマウスの交配を進め、運動解析を継続する。さらに、これらの脊髄運動ニューロンにおける病理変化、病変における活性化ミクログリア、炎症性物質の産生、Tリンパ球の浸潤について評価を行う。また、LOTUSの軸索伸長促進作用が変異SOD1(G93A)マウスのニューロンにおいても機能することを確認する。我々はこれまでに、野生型マウスの初代培養ニューロンにおいて、培養液中にリコンビナントLOTUSを添加することで、軸索伸長阻害分子であるNogoの存在下であっても軸索伸長が促進されることを確認している。そこで、ALSの確立された動物モデルである変異SOD1(G93A)マウスの初代培養ニューロン、変異型(G93A)SOD1を導入した運動ニューロン系細胞のNSC34を用い、培養液中にリコンビナントNogoまたはリコンビナントLOTUS、またはその両方を添加し形態・生存率を病理学的手法・生化学的手法を用いて解析する。病態関連サイトカイン・炎症性物質(iNOS, NOなど)の動態をmRNA及びタンパクの発現で解析する。一方で、siRNAによるLOTUSのノックダウンも行い、その影響を検討する。これにより、ALSの炎症病態とNogo-NgR1シグナルとの関連、LOTUSによる異常炎症の制御効果を明らかにする。また、これら、ミクログリア、ニューロン単独の解析に加え、変異SOD1(G93A)マウスのミクログリア/ニューロン共培養系でも、上記と同様の解析を加えるとともに、ニューロンの形態・生存率を解析し、「神経変性」、「神経炎症」という二つの病態を同時に制御しうるLOTUSによる治療効果をex vivoで明らかにする。今年度は、マウスの交配と運動機能解析を先行して行ったため、細胞培養系のex vivoの解析で予定したいた各種試薬の使用量がそれほど多くなかったため、次年度使用額が発生した。次年度は、これらを使用し、マウスの病理学的解析、生化学的解析に加え、細胞培養系実験を行っていく。
中国の家電・パソコン・自動車産業におけるトップ企業の成長戦略に関する研究

本研究は「世界の工場」になりつつある中国の製造業を取り上げ、企業戦略論の枠組を適用しつつ、最も代表格にあげられる自動車産業と家電産業に参入して大量生産の確立を目指す中国上位メーカーの競争力蓄積の成果と問題を比較し検討した。あわせて、WTOの加盟にともない、中国製造業のダイナミックな変化、およびグローバル化を踏まえた企業行動の行方を分析した。中国の自動車メーカーと家電メーカーはともに1950年代中期に現れたが、70年代の中期まで国際比較から見れば、自動車メーカーの生産規模や技術水準は家電メーカーよりかなり上であった。その後、1970年代末の改革開放から今日までの20数年間の発展を経て、ともに政府の産業保護、政策支援を受けながら、両産業の競争力は逆転し大きな格差が現れてきた。以上の認識のもと、本研究の問題関心は次のとおりである。すなわち、WTO加盟にしたがって中国の自動車と家電メーカーの間で、顕在化しつつある競争力の格差は、どのように生じたのか、その要因はなにかである。具体的に、いままでの政府による産業政策などといった外部環境要因とともに、それぞれ産業における内部競争の度合いおよび各自上位メーカーの戦略構築過程とどのような関係があるかなどである。結論として、両産業それぞれの外部環境要因、業界内部の競争の度合いおよび各上位メーカーの戦略構築過程の差異は、それぞれ上位メーカー間に行動重心の政策適応から市場適応へ修正する時間差を発生させ、競争力の格差を形成させたことを明らかにした。まず、中国の自動車メーカーにおける競争力の蓄積は、政府の一貫した競争排除政策、とくに需要がトラックから乗用車へ移行しはじめた80年代の後半に採られた中央政府の厳しい参入制限と競争排除政策によって強く制約された。これに対して、家電メーカーに対する政府政策の直接介入は80年代の後半になると、多数の新規参入と大量生産能力の導入によって、家電製品の生産が売り手市場から買い手市場へ転換したため、ほぼ不可能になった。また、大手国有自動車メーカーは、業界の中核的な地位を占めながら、終始政府政策や計画投資の依存から抜けられないので、市場環境の変化に備える競争力の構築は大きく立ち遅れた。これに対して、80年代に後発した非国有企業を中心とする家電メーカーは、初めから政府の計画投資などに期待せず、市場ニーズに応え、厳しい国内市場競争でしのぎを削ってたたかい、市場経済の波に乗って業界の上位に上り、競争力を着々と伸ばして強くなっていた。本年度の研究は中国のWTO加盟と市場の本格解放にともない、最も衝撃にさらされる製造業分野といわれる中国の自動車産業を取り上げ、経営戦略論の枠組を適用しつつ、この産業に参入して大量生産の確立を目指す上位企業の戦略構築や競争力蓄積の成果と問題を検討した。あわせて、当該産業の最近のダイナミックな変化、およびこれからのグローバル化を踏まえた企業行動の行方を分析した。中国の自動車産業は1950年代に形成され、すでに半世紀の発展を経たにもかかわらず、政府による産業政策の厚い保護を受けたまま、未だに「幼稚産業」といわれるように小さくて弱い。

こうした現実にかんがみ、本研究の問題関心は、中国の自動車企業の競争能力はいかに蓄積されてきたのか、またはこなかったのか、それはこれからの中国自動車産業の成長とグローバル化過程にどのような影響を与えるか、といった点である。本研究の結論は次のとおりである。まず中国の自動車産業における競争力の蓄積は、政府の競争排除政策、とくに需要がトラックから乗用車へ移行しはじめた自動車産業成長期(80年代半ばから90年代前期まで)にとられた中央政府の厳しい参入制限と競争排除政策によって強く制約された。また90年代後半までの「五カ年計画」という政府投資の枠組みや「大ロット」の建設方針は、一汽と東風の成長を大いに遅れさせた。さらに自動車のアーキテクチャの視点から見れば、中国のメーカーは乗用車などのインテグラル型製品に対しまだ弱い。ただし、乗用車の分野と違って、小型トラック、軽自動車、農用車、オートバイなどやモジュラー寄りの製品分野では、中国企業は競争力を高めている。近年の中国自動車産業の動向をまとめ、中国で展開している主な多国籍自動車企業の中国戦略や中国自動車産業のこれまでの設計思想も分析してきた。また、続いて中国における自動車企業の戦略構築や能力蓄積の成果と問題を検討していった。まず、一汽や東風のような大手国有自動車企業は、50年代から今日までずっと業界の中核的な地位を占めながら、従来の計画投資の枠組から抜けられないので、市場ニーズの変化に対して速やかに対応できなかった。これに関連して、後発の地方企業や軍需企業の場合、投資決定にいたる時間差を利用して積極的に参入・拡張し、相次いで波状に的に成長していったものの、中央政府の投資政策の制約の下で、得られた資金を少しずつ規模拡大に投入し、雪だるま式で成長せざるを得なかったので、規模の優位性や強い競争力はなかなか形成できなかった。さらに中国の自動車企業における競争力の蓄積は、政府の一貫した競争排除政策、とくに軍需がトラックから乗用車へ移行しはじめた自動車産業成長期にとられた中央政府の厳しい参入制限と競争排除政策によって強く制約された。アーキテクチャの視点から見れば、中国の自動車メーカーは乗用車などのインテグラル型製品に対し未だに弱いため、中国経済のグローバル化とともに、さらなる競争を通じて、中国の自動車メーカーは、自国の巨大かつ多様な市場に対し、健全な産業基盤や豊富な熟練労働者を活用し、優れた外資系企業と提携しながら、競争的に進化していくことも可能であろう。「世界の工場」になりつつある中国の製造業を取り上げ、企業戦略論の枠組を適用しつつ、もっとも代表格にあげられる自動車産業と家電産業に参入して大量生産の確立を目指す中国上位メーカーの戦略構築や競争力蓄積の成果と問題を比較的に検討した。あわせて、WTOの加盟にともない、中国製造業のダイナミックな変化、およびグローバル化を踏まえた企業行動のゆくえを分析した。中国の自動車メーカーは1950年代に大量生産方式を導入し形成され、すでに半世紀の発展を経たにもかかわらず、政府による産業政策の保護を受けたまま、未だに「幼稚産業」といわれるように小さくて弱い。中国の上位自動車メーカー、特に乗用車メーカーは、外資系企業との直接的な競争を回避し、むしろパートナーとして外資系企業に新たな協力を求めている。
小胞体ストレス応答因子ATF6βによる生体機能制御とその破綻による疾患発症の解明

生体は、小胞体でのタンパク質の折り畳み障害(小胞体ストレス)に適応する小胞体ストレス応答を持ち、ATF6はその応答の中心的役割を果たしている。ATF6には染色体上の異なる遺伝子座にATF6αとATF6βがあり、ATF6βでなくATF6αがタンパク質の折り畳みに重要であるとこれまでに報告されている。本研究では、ATF6βノックアウトマウスを用いた解析からATF6βが軟骨分化や大腸炎発症などに関与することを見出した。このことから、小胞体タンパク質の品質管理には直接的には関連しない代謝、免疫といった生体機能を制御する非古典的な小胞体ストレス応答が存在すると考えられる。平成25年度は、以下の2項目について検討を行った。1. ATF6αKOとATF6βKOマウスを用いた軟骨細胞分化における生理的な意義を骨形成異常の形態学的解析、軟骨組織の組織学的解析、軟骨組織の遺伝子発現解析、培養細胞を用いた機能解析を行い検討した。2. ATF6αKOとATF6βKOマウスを用いたDSS大腸炎発症における病的意義をDSS腸炎の臨床重症度判定、大腸組織の組織学的解析、大腸組織の遺伝子発現解析、培養細胞を用いた機能解析を行い、検討した。前度に得られた結果を基にして、マイクロアレイを用いた網羅的解析によるATF6βによる遺伝子発現制御機構の解明を以下の点で行った。1. ATF6βで制御されるmRNAとmiRNAの同定: ATF6β特有の生理的・病的表現型を示したサンプルからRNAを抽出してマイクロアレイを用いた網羅的遺伝子発現解析を行い、ATF6βKOをWTとATF6αKOマウスを比較することで、ATF6βで制御されるmRNAとmiRNAを同定し、定量的RT-PCRで確認を行った。2. ATF6βで制御されるmiRNAとその標的mRNAの同定:哺乳類のmiRNAは翻訳抑制よりも主としてmRNA分解により制御されることが明らかになってきた(Nature (2010) 466: 835-840)ため、TargetScanを用いてATF6βで制御されるmiRNAの標的mRNAを予測し、実際にATF6βで制御されたmRNAの中から標的mRNAの絞り込みを行った。さらに同定したmiRNAを過剰発現あるいはデコイにより機能阻害で標的遺伝子の発現が制御されるかを、定量的RT-PCRで確認した。3. ATF6βで制御されるmiRNAとmRNAによる機能制御の解析:ATF6βで制御されるmRNAをGO解析することでATF6βにより制御される遺伝子発現の意味とさらにその中でmiRNAを介した制御の割合と意味についての仮説を立てた。前年度で行った機能解析の実験系において、仮説の検証を行った。ATF6には相同性の高いATF6αとATF6βがあるが、ATF6βでなくATF6αが小胞体タンパク質の品質管理に必要な遺伝子誘導に必須であることがすでに知られていた。ところがATF6βノックアウトマウスの解析から、ATF6βは小胞体タンパク質の品質管理に必要な遺伝子誘導には必須でないのにも関わらず、ATF6αKOマウスよりもATF6βKOマウスは軟骨細胞分化が遅延したり、DSS誘導性の大腸炎が重篤化することを見出すことができた。ATF6αKOとATF6βKOマウスを用いた軟骨細胞分化におけるATF6βの生理的な意義の解析やDSS誘導性大腸炎におけるATF6βの病的意義の解析は順調にできた。しかしながら、細胞機能解析に使用していた密度勾配分析分取装置に不具合が生じ、何度か修理を試みながら解析を続けたが必要とする分離性能を得ることができなくなった。そのため急遽、代替機の購入が必要となったが納期に時間を要し、以降の計画に係る研究について遅れが生じている。平成27年度中に細胞機能解析に使用してた密度勾配分析分取装置に不具合が生じ、細胞機能解析に必要とする分離性能を得ることができなくなったため、代替機の購入手配を行ったが、機器の納期に時間を要し、以降の計画に係る研究について遅れが生じて、1年間の補助事業期間の延長を行った。本年度は、前年度に遅れが生じていたATF6βノックアウトマウスを用いた軟骨細胞分化における生理的な意義の検討を行った。具体的には、軟骨細胞へと分化することができるATDC5細胞あるいは初代マウス線維芽細胞にATF6αとATF6βを過剰発現あるいはノックダウンして、軟骨細胞への分化への影響をそれぞれ解析し、ATF6βの軟骨分化への関与を明らかにした。現在、研究成果を論文発表するためまとめている。ノックアウトマウスを用いた網羅的な遺伝子発現解析は順調に進んでいる。しかしながら前年度からのノックアウスマウスの繁殖率の悪さが、ATF6βの生理的意義の個体レベルでの機能解析に遅れて生じている。

ATF6βが機能制御に働く軟骨組織や腸管には様々な種類の細胞があり、それらを密度勾配で分取して細胞機能の違いを解析する必要がある。密度勾配分析分取装置の故障のために解析が頓挫しているが、新たに密度勾配分析分取装置を購入して、解析を進める28年度が最終年度であるため、記入しない。医歯薬学本研究では、小胞体ストレス応答を制御する転写因子であるATF6βに焦点を絞り、非古典的小胞体ストレス応答での生体機能制御とその破綻による疾患発症を解明して、先端医療開発の基盤形成を目的としている。今年度に得られた解析結果を基に、前年度に引き続きATF6αとATF6βノックアウトマウスの比較解析を行い、ATF6βによる遺伝子発現ネットワークの全容とその制御の分子機構の解明を目指す。体長の短さは軟骨細胞の増殖・分化に起因することが多く、ATF6βKO由来の線維芽細胞は軟骨細胞への分化が障害されていることを見出しており(未発表)、軟骨細胞分化の検討によりATF6βの生理的意義の解明が強く期待できる。しかしながら、ノックアウトマウスの繁殖が予定どおりに進まず、解析にやや遅れを生じている。細胞機能解析に使用していた密度勾配分析分取装置に不具合が生じ、何度か修理を試みながら解析を続けたが必要とする分離性能を得ることができなくなった。そのため当初計画していた実験の遂行に影響が出た。28年度が最終年度であるため、記入しない。予定のATF6βノックアウトマウスの産出率が芳しくなく、計画していた計画の実施に遅れが生じて使用額より下回ったため。主な予算を新たな機器および解析に使用する試薬に充て、細胞機能解析を行う予定である。本研究では、小胞体ストレス応答を制御する転写因子であるATF6βに焦点を絞り、非古典的小胞体ストレス応答での生体機能制御とその破綻による疾患発症を解明して、先端医療開発の基盤形成を目的としている。今年度に得られた解析結果を基に、前年度に引き継ぎATF6αとATF6βKO(ノックアウト)マウスの比較解析を行い、ATF6βによる遺伝子発現ネットワークの全容とその制御の分子機構の解明を目指す。解析の使用する試薬に充てる。当初、ATF6βマウスの交配を雄雌ともにホモ同士の交配を計画していたが、産出率が悪く予定していた匹数が得られなかった。そのため、今年度は細胞培養を優先したため、当初予定していた使用額が変更になった。現在は、マウスの交配をヘテロマウスを使用するように計画を変更したため、遺伝子解析を行う業務が増えた。そのため、次年度はマウスの遺伝子解析の業務を行う技術補佐員の人件費に充てる。
離床意欲を高める脳血管障害者用立ち上がり動作訓練用ロボットの開発

本年度は、立ち上がり動作練習用ロボットの1次試作モデル(本モデル)を製作した。本モデルの基本的なメカニズムは、長下肢装具の膝関節部に伸展ユニット、足関節部に底屈制動ユニットを空気圧で制御するプログラムから成り立っている。外部力源は、工業用のエアコンプレッサを利用し0.02.0MPaの範囲で出力を調整することで、立ち上がり動作の補助量を段階的に調整することが可能となった。また、立ち上がり動作を誘導するスイッチは自動制御とセラピスト側の判断による半自動制御の2種類を開発した。本ロボットの開発目的は、脳血管障害により片麻痺を呈しベッド上で臥位を余儀なくされている超急性期の時期から早期離床を積極的に促進することにある。セラピストは、臥位の患者を座位へ誘導する。次に身体の重心位置を坐骨部から前方へ移動させながら健側下肢への荷重を促すとともに、体幹、下肢の随意的な筋収縮を促し着座姿勢から立位へ誘導する。この時、超急性期では麻痺側下肢の随意的な筋収縮が期待できないため健側下肢の筋収縮により立位保持を促すが、半身が麻痺しているこの時期に立位保持を誘導することは患者側の負担とともにセラピスト側の身体的負担も高く、繰り返して行える回数には限界がある。ニューロリハビリテーションの観点に立てばリスク管理がされた環境で立ち上がり動作練習が繰り返し可能であれば、脳神経の再構築に促進的に作用することが考えられる。本ロボットを装着した健常成人の印象として、立ち上がり動作の容易さが挙げられ、セラピストからは身体的負担感の軽減とともに安全性への配慮が高まるなどの肯定的な意見が挙げられた。本年度の成果は、本モデルの製作と複数の健常者を対象とした装着感とセラピストの印象の聴取に留まっている。現在、この印象で得られた内容を定量的に測定する方法を検討しており、来年度はその結果に基づき2次試作モデルの開発を行う。立ち上がり動作練習用ロボットの開発という本研究のメインテーマである装置の1次試作モデル(本モデル)を作製することができた。本モデルの計画時には、膝伸展を補助する外部動力のみを設計していたが、測定を繰り返す中で足関節の底屈制動を同期させることにより着座姿勢から立位動作までを円滑に補助することができることを発見した。このことにより設計を見直し本モデルの作製を実現できた。ロボットの開発という観点では当初の計画以上に進展していると考えるが、本モデルを装着した状態での運動学的分析に関しては、分析方法の計画および実施が遅れていると言わざるを得ない。このことにより、自己点検は(2)概ね順調に進展している、という段階に留まっていると考える。平成28年度は、第1に立ち上がり動作練習用ロボットの1次試作モデル(本モデル)を用いた運動学分析を実施する。対象は健常成人50名、本モデルを左下肢(麻痺側想定)に装着した状態で立ち上がり動作の3次元動作解析を行い、右下肢(健側想定)の床反力、膝関節モーメント、足関節モーメントを計測する。分析は、左下肢(麻痺側想定)に装着した本モデルの膝伸展力を段階的に変化させた場合の右下肢(健側想定)の運動学的変化に着目する。第2に臨床評価を行う。対象は、在宅生活を営んでいる運動制限のない脳血管障害者で下肢の緊緊張が弛緩型とする。医師立ち合いのもとで立ち上がり練習を繰り返し行った際の主観的評価と運動学分析を行う。第3に上記の研究の結果から2次試作モデルを開発する予定である。本学に設置している3次元動作解析装置、筋電図測定装置の修理とともに健常者を対象とした運動学的分析を実施する。繰り越した助成金は、被験者謝金、測定に必要な消耗品などの購入で適正に使用する予定である。

本年度の成果は、本モデルの製作と複数の健常者を対象とした装着感とセラピストの印象の聴取に留まっている。現在、この印象で得られた内容を定量的に測定する方法を検討しており、来年度はその結果に基づき2次試作モデルの開発を行う。立ち上がり動作練習用ロボットの開発という本研究のメインテーマである装置の1次試作モデル(本モデル)を作製することができた。本モデルの計画時には、膝伸展を補助する外部動力のみを設計していたが、測定を繰り返す中で足関節の底屈制動を同期させることにより着座姿勢から立位動作までを円滑に補助することができることを発見した。このことにより設計を見直し本モデルの作製を実現できた。ロボットの開発という観点では当初の計画以上に進展していると考えるが、本モデルを装着した状態での運動学的分析に関しては、分析方法の計画および実施が遅れていると言わざるを得ない。このことにより、自己点検は(2)概ね順調に進展している、という段階に留まっていると考える。平成28年度は、第1に立ち上がり動作練習用ロボットの1次試作モデル(本モデル)を用いた運動学分析を実施する。対象は健常成人50名、本モデルを左下肢(麻痺側想定)に装着した状態で立ち上がり動作の3次元動作解析を行い、右下肢(健側想定)の床反力、膝関節モーメント、足関節モーメントを計測する。分析は、左下肢(麻痺側想定)に装着した本モデルの膝伸展力を段階的に変化させた場合の右下肢(健側想定)の運動学的変化に着目する。第2に臨床評価を行う。対象は、在宅生活を営んでいる運動制限のない脳血管障害者で下肢の緊緊張が弛緩型とする。医師立ち合いのもとで立ち上がり練習を繰り返し行った際の主観的評価と運動学分析を行う。第3に上記の研究の結果から2次試作モデルを開発する予定である。立ち上がり動作練習用ロボットの1次試作モデルの製作に関する備品費は予算通り使用した。しかし、本学に設置している3次元動作解析装置、筋電図測定装置の故障のため健常者を対象とした運動学的分析を実施することができなかった。この理由により人件費、謝金などの予算を使用することができなかった。本学に設置している3次元動作解析装置、筋電図測定装置の修理とともに健常者を対象とした運動学的分析を実施する。繰り越した助成金は、被験者謝金、測定に必要な消耗品などの購入で適正に使用する予定である。
世代間コミュニケーションの社会学的研究

本年度は、基礎的な資料の収集と、その読み込みを行った。本年度、収集資料にあたって対象としたのは、中・上流家庭の幼稚園児童の母親向けの教育雑誌である。時代区分的には、大正時代から敗戦直後までを中心としている。資料の収集の方法としては、学内に所蔵されていない古書を購入する、手元におきたい基本文献を図書館から借りてコピーを取る、近辺の図書館には所蔵していない資料を国会図書館で閲覧する、といった順序で行った。1年間という限られた期間で得られた研究成果はまだまだ少ないが、日本の教育雑誌のはしりである『育児雑誌』『幼児の教育』を読み込むことができたのは大きな収穫であった。当時の社会の通念では、どのような世代間コミュニケイションが望ましいとされたか、という観点に着目しながら読み込みを行った。そのさい、[(1)乳幼児観(2)望ましい母親像(3)望ましいこどもの徳性]をとくにキーワードとして抽出に心掛けた。今後は、新聞の読者投稿欄や自伝、歌謡曲の歌詞・乳幼児向けの絵本やテレビ番組・映画や絵画・ライフコースの聞き取り調査などによって、踏査する資料・情報の内容と時間幅をさらに広げ、得られた知見をもとに、時系列のデータへとまとめてゆきたいと考えている。
深屈曲型人工膝関節の海外向け仕様としてのモジュラーシステムの構築

研究代表者の死去によって終了となったため,研究を実施できた期間が短く,ほぼ準備のみで終了し,発表できた成果は少なかった. 1年目の目標であった対象人工膝関節の選定・設計や,対象動作の検定については実施できたが,具体的な成果として発表できた内容は少なかった.(1)モジュラー化した人工膝関節の製作についてモジュラー化の方法や,関節接触面の形状に関する可変パラメータについて検討していた段階であり,また,対象人工関節を解析するためのモデル作成ソフトウェアや,実験に用いるモデルを作製する工作機械についても,必要な仕様を検討し,調達する段階であった.そのため,具体的な成果としての発表はできておらず,実験・解析の準備中で終了した.ただし,人工膝関節のモジュラー化設計,国際的テーラーメードによる開発手法については国際会議にて1件発表した.(2)文化圏ごとに特徴的な動作の解析について日本向けの人工膝関節の開発については,従来から継続していた研究であったため,正座姿勢での膝関節まわりのキネティクスを算出し,口演発表までを行った.他文化圏における特徴的な動作については,動作・姿勢を選定し,現有の動作解析装置によって予備的な動作測定実験を行っていたが,具体的な成果として発表するには至らなかった.(3)実験および解析について実験に用いる膝関節シミュレータについては,構造や測定に関する部分が完成し,筋力制御の最適化を行いつつある状態である.ここまでは他課題(課題番号24300201)の成果であるが,前述したように本課題の実験・解析を行う準備は整わないまま終了となり,具体的な成果は出なかった.研究代表者の死去によって終了となったため,研究を実施できた期間が短く,ほぼ準備のみで終了し,発表できた成果は少なかった. 1年目の目標であった対象人工膝関節の選定・設計や,対象動作の検定については実施できたが,具体的な成果として発表できた内容は少なかった.(1)モジュラー化した人工膝関節の製作についてモジュラー化の方法や,関節接触面の形状に関する可変パラメータについて検討していた段階であり,また,対象人工関節を解析するためのモデル作成ソフトウェアや,実験に用いるモデルを作製する工作機械についても,必要な仕様を検討し,調達する段階であった.そのため,具体的な成果としての発表はできておらず,実験・解析の準備中で終了した.ただし,人工膝関節のモジュラー化設計,国際的テーラーメードによる開発手法については国際会議にて1件発表した.(2)文化圏ごとに特徴的な動作の解析について日本向けの人工膝関節の開発については,従来から継続していた研究であったため,正座姿勢での膝関節まわりのキネティクスを算出し,口演発表までを行った.他文化圏における特徴的な動作については,動作・姿勢を選定し,現有の動作解析装置によって予備的な動作測定実験を行っていたが,具体的な成果として発表するには至らなかった.(3)実験および解析について実験に用いる膝関節シミュレータについては,構造や測定に関する部分が完成し,筋力制御の最適化を行いつつある状態である.ここまでは他課題(課題番号24300201)の成果であるが,前述したように本課題の実験・解析を行う準備は整わないまま終了となり,具体的な成果は出なかった.
作物におけるミトコンドリアから核ゲノムへの遺伝子転移の解析

植物ミトコンドリアのリボソームタンパク質遺伝子は、植物種間で比較的変異が大きいことが知られている。リボソームタンパク質S2遺伝子(rps2)は、単子葉植物イネ、コムギ、トウモロコシではミトコンドリアゲノムに存在することがこれまで明らかにされているが、多くの双子葉植物では遺伝子がミトコンドリアゲノムから消失している。イネ、コムギ、トウモロコシのrps2遺伝子は、下等植物ゼニゴケのそれと比べてC末端側をコードする領域が大きく拡張していることが知られ、このC末端拡張領域の配列はイネ、コムギ、トウモロコシの三者で全く異なっている。そこで、このC末端拡張領域の由来を知るため、コムギやオオムギ、ライムギ等を含むコムギ族に関して、rps2遺伝子の構造を解析した。植物種間で保存されている領域をプローブに用いてオオムギからrps2遺伝子を単離した。オオムギrps2遺伝子のC末端拡張領域は、イネ、コムギ、トウモロコシのいずれとも全く異なっていたが、栽培オオムギを含むオオムギ属の中では遺伝子構造がよく保存されていることが明らかになった。次に、コムギ族に含まれる約20種類の植物について調査したところ、オオムギと相同性のあるC末端領域を持つrps2遺伝子が10種あることが明らかになった。一方、コムギと相同性のあるC末端領域を持つrps2遺伝子は、調査に用いた全てのコムギ族植物に認められた。以上のことから、異なるC末端拡張領域を持つ2種類のrps2遺伝子型がコムギ族に異なって分布し、植物種によっては2種類のrps2遺伝子が混在することがわかった。DNAデータベースに対して相同性検索を行った結果、rps2遺伝子はシロイヌナズナやマメ科植物などでは核ゲノムに存在し、これらの核のrps2はミトコンドリアゲノム上のそれとは異なり、C末端に拡張領域を持たないことが推察された。本年度は、ミトコンドリアゲノム上に存在する遺伝子の構造、及び、ミトコンドリアゲノムから核ゲノムへ転移した遺伝子の同定を行った。ミトコンドリアゲノムに存在するrps2遺伝子の構造を植物間で比較した。オオムギのミトコンドリアゲノムよりrps2遺伝子を単離してその構造を解析したところ、下等植物ゼニゴケのrps2遺伝子と比較して遺伝子の3'末端側が拡張していた。この拡張領域は、イネ、コムギ、オオムギの三者で全く異なっていた。このことから、これらの領域は三者で独自に獲得されたと推察された。興味深いことに、イネ科等の単子葉植物ではrps2遺伝子はミトコシドリアゲノムに存在していたが、エンドウやシロイヌナズナ等の双子葉植物ではミトコンドリアゲノムから消失していることが明らかになった。また、最近報告されたイネミトコンドリアゲノムの全塩基配列によって、rpl6遺伝子が完全に消失していることが明らかになった。そこで、ゼニゴケrpl6遺伝子の配列を用いてDNAデータベースに登録されている塩基配列に対して検索を行なったところ、rpl6遺伝子はイネ核ゲノムに転移していることが明らかとなった。イネrpl6遺伝子は、異なる染色体上に2コピー存在してした。2つのrpl6遺伝子の構造を比較したところ、核ゲノムへの転移後に遺伝子の重複が起こったことが推察された。cDNAライブラリーのスクリーニング及びイネ完全長cDNAデータベースの検索から、両遺伝子とも転写されていることが明らかとなったが、両者のrpl6遺伝子にはいずれもミトコンドリアへの輸送に必要なシグナル配列が認められず、この遺伝子がどのように機能しているのかさらなる解析が必要である。本年度は、これまでに単離したミトコンドリアゲノム上に存在する遺伝子、及び、ミトコンドリアゲノムから核ゲノムへ転移した遺伝子の構造の解析を行った。オオムギミトコンドリアのrps2遺伝子は、下等植物ゼニゴケの遺伝子と比較して遺伝子の3'-末端側が拡張しており、この拡張領域はイネ、コムギ、オオムギ、トウモロコシの四者で全く異なっていたが、これら以外の植物種でのrps2遺伝子の構造は全く知られていない。そこで、rps2遺伝子の構造をムギ類野生種で比較した。コムギ族に属する19属の野生種(オオムギ、コムギ、ライムギ等の作物を含む)について、オオムギのrps2遺伝子の3'-末端と類似の構造を持つもの(オオムギ型)と、コムギのrps2遺伝子の3'-末端と類似の構造を持つもの(コムギ型)の分布を調査した。その結果、オオムギ型のrps2遺伝子は、オオムギ以外にも8つの属に存在することが明らかになった。一方、コムギ型のrps2遺伝子は、調査に用いた19種の属全てに存在することが明らかになった。このことから、種によっては、オオムギ型とコムギ型両方のrps2遺伝子を併せ持っていることが明らかになった。オオムギ型rps2遺伝子の分布は、コムギ族の系統樹において比較的散在して存在していたため、コムギ族の進化の過程でオオムギ型rps2遺伝子のランダムな消失が起こったことが推察された。また、核に存在する電子伝達系の遺伝子の一種、coxVb遺伝子をエンドウより単離した。coxVb遺伝子は、エンドウの核ゲノムに単一コピー存在し、mRNAとして転写されていることが明らかになった。

既に報告されているイネ及びシロイヌナズナの対応する遺伝子と比較したところ、イントロンの挿入箇所が植物種間でよく保存されていることが明らかになった。しかしながら、イントロンの長さについては、大きな差異が認められた。植物ミトコンドリアのリボソームタンパク質遺伝子は、植物種間で比較的変異が大きいことが知られている。リボソームタンパク質S2遺伝子(rps2)は、単子葉植物イネ、コムギ、トウモロコシではミトコンドリアゲノムに存在することがこれまで明らかにされているが、多くの双子葉植物では遺伝子がミトコンドリアゲノムから消失している。イネ、コムギ、トウモロコシのrps2遺伝子は、下等植物ゼニゴケのそれと比べてC末端側をコードする領域が大きく拡張していることが知られ、このC末端拡張領域の配列はイネ、コムギ、トウモロコシの三者で全く異なっている。そこで、このC末端拡張領域の由来を知るため、コムギやオオムギ、ライムギ等を含むコムギ族に関して、rps2遺伝子の構造を解析した。植物種間で保存されている領域をプローブに用いてオオムギからrps2遺伝子を単離した。オオムギrps2遺伝子のC末端拡張領域は、イネ、コムギ、トウモロコシのいずれとも全く異なっていたが、栽培オオムギを含むオオムギ属の中では遺伝子構造がよく保存されていることが明らかになった。次に、コムギ族に含まれる約20種類の植物について調査したところ、オオムギと相同性のあるC末端領域を持つrps2遺伝子が10種あることが明らかになった。一方、コムギと相同性のあるC末端領域を持つrps2遺伝子は、調査に用いた全てのコムギ族植物に認められた。以上のことから、異なるC末端拡張領域を持つ2種類のrps2遺伝子型がコムギ族に異なって分布し、植物種によっては2種類のrps2遺伝子が混在することがわかった。DNAデータベースに対して相同性検索を行った結果、rps2遺伝子はシロイヌナズナやマメ科植物などでは核ゲノムに存在し、これらの核のrps2はミトコンドリアゲノム上のそれとは異なり、C末端に拡張領域を持たないことが推察された。
調音構造の多角的分析による北奥・南奥方言の音声対立とその動態に関する新研究

北奥・南奥方言の音声対立(いわゆるジージー弁・ズーズー弁)は、これまで、主には狭母音音節(/-i/ /-u/)の中舌化を指標に論じられることが多かった。しかし音響分析によればさらに低母音化の度合いが、口形分析によれば非円唇化の度合いが、対立の空き間を埋める重要な要素となりうることがうかがえる。本研究では、そうした観点に立ちつつ、当該事象を舌調音の側面(前後・高低)と口唇の側面(円唇・非円唇)とが連動する構造体として捉え直し、新視点からの多角的な分析により、両方言の音声対立を再考することを目的とする。本年度は、これまでの予備的調査から関係性が予測できる上記の二側面のうち、まずは「舌調音」のバリエーションを把握すべく、北奥代表地点としての秋田県(秋田市・潟上市・五城目町)をケーススタディとして、実地調査とPraatによる音響分析を行った。対象は6080歳代の男女性。質問調査により、/-i/ /-u/のミニマルペアを中心に複数回の発音を求め、そのすべてをICレコーダーに(一部をビデオレコーダーに)デジタル記録した。これにより明らかになったことは次の点である。1当方言(6080歳代)の/-i/と/-u/の実相には現在、いくつかのバリエーションが見られる。2そのうちもっとも多いのが/-i/と/-u/が/-i/に合一化して現れるもの、次いで多いのが非合一化して現れるものである。3ただし後者の場合、いずれも著しい低母音化の傾向を示し、その点では前者とさほど調音位置(高低関係)が変わらない。4これらからすると、当方言では元来の/-i/に合一化する状況が根強く保持される一方、「舌調音」上の区別に関しては、前後の関係が高低の関係に先行して推移しつつあることがうかがえる。北奥・南奥方言の/-i/と/-u/(いわゆるジージー弁・ズーズー弁)の対立は、理論上はそのどちらに音韻論的空き間が生じているかで説明されうるが、実際には/-i/的なのか、/-u/的なのか、あるいはその中間的位置にあるのかで実相の判断がつきにくい。加えて最近では、聴覚的な聞こえのうえでは区別が明瞭ながら、音響ないし口唇特徴の面で見ると、舌の高低や円唇性の有無等において、性格の異なる段階的な諸相がみとめられることも少なくない。当方言の音声対立を再考しようとする本研究にとっては、すなわち、上記するような諸相を多地点・多人数にわたって捉え、現状の把握と今後の分析の指針を得ることが基礎的に重要である。今年度は4年計画の研究の1年目ということもあり、上記のことを見据えた実地調査(その中でも既に予備的調査でおおよその傾向がつかめている北奥[秋田]方言調査)の面に重点を置いた。また地の利を生かし、複数話者を対象とする多人数調査に加え、同一話者に関する日時を違えての複数回調査も行った。これにより、予備的調査でつかめていた知見を検証的に見直せた面があると同時に、実相の揺れ幅やそれと知覚面との相関などについても新しい知見を得ることができた。なお舌調音の面に限った分析ではあるが、音響分析から高低・前後の位置関係を相対化し、現状に生じている変化の序列も推察した(この一部は『秋田大学教育文化学部研究紀要』74に報告した)。これらから、これまで仮説的に捉えていたことの確認はもとより、分析の対象や視点の置き方など、加味すべき事柄への気づきもあり、今後の取り組みを有効に見通せたということがいえる。以上から、現在までの達成度はおおむね順調であると判断される。前年度は、特に「舌調音」のバリエーションを把握することを念頭に、秋田方言をケーススタディとして、実地調査と収集したデータの音響分析に重点を置いた。上記の究明点にも触れたが、その「舌調音」においては、前後の関係で方言色を失いつつある一方、高低の関係では未だ方言色が根強いこと、そしてその過程に段階的な諸相があることがみとめられた。本年度はそのバリエーションをさらに吟味するとともに、もうひとつの観点である口形分析を進め、上記する「舌調音」の諸相と口形(円唇性の有無や度合い)との相関を構造的に捉えていきたいと考えている。一方、本研究のテーマの中核である“北奥・南奥方言の音声対立"についても、探りを入れるための実地調査を可能な限り展開する。先述のとおり、昨年度の調査から「分析対象や視点の置き方など、加味すべき事柄への気づき」があったことにより、基本的には北奥方言地域を対象とした補充ないし発展的調査が中心になると思われるが、併せて岩手・青森県境をはじめとする南部方言(南奥方言)にも調査の対象を広げていくことを予定している。なお、ここでいう「加味すべき事柄」であるが、具体的には音節・音環境別に時折見られる実相上のずれに関する吟味、一部に誇張的に(見方によっては疑似的に)現れる方言音(それの調音および口唇上の特質)に関する吟味などがそれに当たる。特に後者に関しては、伝統的な方言音声を保持している高齢者よりも、その本来的性質を落としつつある層の話者に現れがちであること、またこれらの実相は先に現状の特質であると指摘した低母音化(高低関係)ではなく、前後関係の方において誇張が見られることがうかがえる。今年度は、そうした面にも注意を向け、考察を深めていきたいと考えている。

北奥・南奥方言の音声対立(いわゆるジージー弁・ズーズー弁)は、これまで、主には狭母音音節(/-i/ /-u/)の中舌化を指標に論じられることが多かった。しかし音響分析によればさらに低母音化の度合いが、口形分析によれば非円唇化の度合いが、対立の空き間を埋める重要な要素となりうることがうかがえる。本研究では、そうした観点に立ちつつ、当該事象を舌調音の側面(前後・高低)と口唇の側面(円唇・非円唇)とが連動する構造体として捉え直し、新視点からの多角的な分析により、両方言の音声対立を再考することを目的とする。本年度は、これまでの予備的調査から関係性が予測できる上記の二側面のうち、まずは「舌調音」のバリエーションを把握すべく、北奥代表地点としての秋田県(秋田市・潟上市・五城目町)をケーススタディとして、実地調査とPraatによる音響分析を行った。対象は6080歳代の男女性。質問調査により、/-i/ /-u/のミニマルペアを中心に複数回の発音を求め、そのすべてをICレコーダーに(一部をビデオレコーダーに)デジタル記録した。これにより明らかになったことは次の点である。1当方言(6080歳代)の/-i/と/-u/の実相には現在、いくつかのバリエーションが見られる。2そのうちもっとも多いのが/-i/と/-u/が/-i/に合一化して現れるもの、次いで多いのが非合一化して現れるものである。3ただし後者の場合、いずれも著しい低母音化の傾向を示し、その点では前者とさほど調音位置(高低関係)が変わらない。4これらからすると、当方言では元来の/-i/に合一化する状況が根強く保持される一方、「舌調音」上の区別に関しては、前後の関係が高低の関係に先行して推移しつつあることがうかがえる。北奥・南奥方言の/-i/と/-u/(いわゆるジージー弁・ズーズー弁)の対立は、理論上はそのどちらに音韻論的空き間が生じているかで説明されうるが、実際には/-i/的なのか、/-u/的なのか、あるいはその中間的位置にあるのかで実相の判断がつきにくい。加えて最近では、聴覚的な聞こえのうえでは区別が明瞭ながら、音響ないし口唇特徴の面で見ると、舌の高低や円唇性の有無等において、性格の異なる段階的な諸相がみとめられることも少なくない。当方言の音声対立を再考しようとする本研究にとっては、すなわち、上記するような諸相を多地点・多人数にわたって捉え、現状の把握と今後の分析の指針を得ることが基礎的に重要である。今年度は4年計画の研究の1年目ということもあり、上記のことを見据えた実地調査(その中でも既に予備的調査でおおよその傾向がつかめている北奥[秋田]方言調査)の面に重点を置いた。また地の利を生かし、複数話者を対象とする多人数調査に加え、同一話者に関する日時を違えての複数回調査も行った。これにより、予備的調査でつかめていた知見を検証的に見直せた面があると同時に、実相の揺れ幅やそれと知覚面との相関などについても新しい知見を得ることができた。なお舌調音の面に限った分析ではあるが、音響分析から高低・前後の位置関係を相対化し、現状に生じている変化の序列も推察した(この一部は『秋田大学教育文化学部研究紀要』74に報告した)。これらから、これまで仮説的に捉えていたことの確認はもとより、分析の対象や視点の置き方など、加味すべき事柄への気づきもあり、今後の取り組みを有効に見通せたということがいえる。以上から、現在までの達成度はおおむね順調であると判断される。前年度は、特に「舌調音」のバリエーションを把握することを念頭に、秋田方言をケーススタディとして、実地調査と収集したデータの音響分析に重点を置いた。
ヒ素発癌に関わる多様なヒ素活性種と発癌組織特異性との関連

課題1:肺発癌におけるジメチルヒ素活性種の生成と組織特異性を明らかにするため、動物に対して発癌性を有するジメチルアルシン酸に由来するヒ素活性種(ヒ素ラジカルやヒ素過酸化ラジカル)の生体内生成機構とその肺発癌特異性との関連を明らかにした。課題2:ジメチルヒ素活性種のマウス肺発癌モデルの開発ヒ素肺発癌実験モデルの開発を目指し、ヒ素と相互作用を示す鉄とジメチルヒ素の肺発癌作用における影響を検討した結果、ジメチルアルシン酸と鉄の同時投与によりマウス肺腫瘍、特にその悪性度が増大することを明らかにした。課題1:肺ならびに皮膚発癌におけるジメチルヒ素活性種の生成と組織特異性肺ならびに皮膚発癌におけるイニシエーターとしてジメチルアルシンを介して生ずるジメチルアルシンラジカル、ジメチルアルシン過酸化ラジカルを明らかにしてきたが、これらラジカルのこれら組織に対して何故特異性を示すのかが不明である。この点を明らかにするために、酸素分圧の高い組織における発癌組織特異性はジメチルアルシンが赤血球内で代謝生成し、ヘモグロビンと結合することでジメチルアルシンが安定的に肺や皮膚組織まで運搬され、酸素分子と反応することでヒ素ラジカルが生成するものと考え、ジメチルアルシンをはじめとするヒ素活性種の赤血球内での生成を確認するとともに、現在、赤血球ヘモグロビンに対する親和性などの物理化学的性質を把握するとともに、肺、皮膚に対する発癌特異性の可能性を確認している。課題2:ジメチルヒ素活性種の肺発癌における鉄の影響ヒ素発癌の中で、膀胱に対する究極代謝活性体として含硫ジメチルヒ素が推定されてはいるが、未だ不明である。そこで、ヒ素汚染井戸水において、ヒ素のみならず鉄も多く含まれることが報告されており、異なる活性種の生成に伴う発癌影響も相互作用を受けることが予想される。そこで、ジメチルヒ素の肺発癌プロモーション作用における鉄の影響を検討した。その結果、ジメチルヒ素飲水投与によるマウス肺発がんプロモーション作用を鉄の同時投与により顕著に増大することを明らかにした。これは、ジメチルヒ素ならびに鉄の代謝過程で生ずる活性種の相互作用によるものと推定された。現在、さらに発がん実験動物モデルの改良を試みている。課題1:肺発癌におけるジメチルヒ素活性種の生成と組織特異性動物に対して発癌性を有するジメチルアルシン酸に由来するヒ素活性種の生体内生成と肺に対する発癌特異性を明らかにすることを目的とした。その結果、血球内にわずかに取り込まれたジメチルアルシン酸はジメチルアルシンに容易に変換されること、酸素を導入するとこの血球は溶血することなどから、ヒ素ラジカルやヒ素過酸化ラジカルが生成することが推定された。また、ヒ素ラジカルやヒ素過酸化ラジカルが非酵素的に生体内生成することも明らかにし、これには還元型グルタチオンが必須であることも示した。本研究成果から、ヒ素発癌機構を解明する上で重要な提案がなされたと考えられ、今後、本研究分野の進展に大きく貢献できると思われる。課題2:ジメチルヒ素活性種のマウス肺発癌モデルの開発前年度から予備検討をしてきたヒ素肺発癌実験モデルの開発を目指し、ヒ素と相互作用を示す鉄とジメチルヒ素の肺発癌作用における影響を検討した。飼育50週間の検討から、ジメチルアルシン酸と鉄の同時投与によりマウス肺腫瘍、特にその悪性度が増大することを明らかにした。ヒ素汚染井戸水において、ヒ素のみならず鉄も多く含まれることが報告されており、異なる活性種の生成に伴う発癌影響も相互作用を受けることが予想される。したがって、ヒトのヒ素発癌のリスク評価を行う上でも、ヒ素発癌に影響する重要な環境化学要因を提示したことは、新規発癌モデルの開発にとどまらず、本研究分野への貢献は大きいと思われる。
新麻痺性貝毒生産渦鞭毛藻に関する研究

麻痺性貝中毒は渦鞭毛藻の毒を蓄積した二枚貝の摂食によって起き死亡率の高い食中毒である。近年、古くから知られているAlexandrium属に加えてGymnodinium catenatumによる被害が世界各地で発生し、食品衛生および産業上大きな問題となっている。本研究は毒化海域に位置し、最適の研究環境にあるオ-ストラリア、タスマニア島においてこの鞭毛藻の生活史および毒生産能を調査するとともに、本種の生産する特異な麻痺性貝毒群の構造と毒性を解明して対策立案のための基礎資料を得ることを目的として実施した。以下に研究結果を要約する。(1)渦鞭毛藻の生活史同種の生産する毒をHPLCで分析した結果、C1ーC4等Nーsulfocarbamoyl毒群を主成分とし、渦鞭毛藻では珍しいdecarbamoyltoxin群を含む特異な麻痺性貝毒組成を有していた。また、新規の麻痺性貝毒を生産することを発見し、同成分を毒化二枚貝から単離して構造解析を行った結果、13ーdeoxydecarbamoylsaxitoxinであることを明らかにした。異なる温度、塩濃度、栄養塩濃度で培養したG.catenatumの毒を分析した結果、毒含量に変動はみられるものの各成分の相対比に変化はみられないことから、毒組成は安定した生化学的特性であり、同種系群判別の指標となりうることが明らかになった。(4)主要毒の毒性及び安定性C3、C4の比毒性を初めて測定し、18,57MU/umoleと低いことを示した。Nーsulfocarbamoyl基を有するC1ーC4は酸性溶液中で加熱すると硫酸基が脱離して強毒のcarbamate毒群に変換することは知られていたが、今回、中性付近で加熱するとエステル結合が加水分解を受け、decarbamoyl毒群が生成する新しい反応を発見した。このことはNーsulfocarbamoyl毒群を多量に含むG.catenatum毒化二枚貝のような場合は調理によって毒性が上昇する可能性があり、食品衛生上問題があることを指摘した。(5)オ-ストラリア産Alexandrium属の毒組成アデレ-ドで出現したA.minutumの麻痺性貝毒生産を初めて明らかにした。また、ヴィクトリア州で分離したA.tamarenseが北半球の典型的な同種と良く似た組成を示すことを明らかにした。
1.ヒト精子核DNAにおけるsingle strand break (SSB)観察の基礎的検討として、単一細胞のDNA fiberをできるだけ伸展する、fiber中のnickを検出する方法を検討した。新たにヨーイングモーション電気泳動法を開発し、DNA fiberを0.5-1.0mm程度に伸展させることができた。さらに位相を180度回または120度3回ずらして泳動することにより多くのfiberを原点から引き出すことができた。2.前年度に開発した酸素パージ可能な培養ボトルを用いて精子swim up、媒精、受精卵培養を低酸素環境(酸素濃度2.0%)で行った。精子swim upを酸素濃度2.0%またはCO_2-air中で行い、DINA2重鎖切断精子(DSB精子)比率をSPCFGEにより比較した結果、低酸素によりDSB誘起抑制が可能であることが示された。さらに非非働化血清存在下では、さらにDSB陽性精子比率を低下し得ることを認めた。本法による体外受精・胚移植を12例に施行し、4例に妊娠が成立した。例数が少なく統計的有意性は今後の検討課題であるが、胚形態所見は良好であった。3.HIV感染者は抗ウィルス薬(核酸アナログ製剤)を服用しており、造精過程において精子DNA損傷誘起の可能性がある。HIV感染男性(夫)の精液からウィルスを除去して非感染女性(妻)に体外受精を施行するのに際し、ウィルス排除と同時にDSB陽性精子排除を行う必要がある。密度勾配遠心、沈降速度差遠心、精子運動性に基づくswim upにより精液を分画した。最終的にDSB陽性精子比率は2%以下となり、さらに超高感度PCR(検出限界HIV 2copy/ml)により残存ウィルスが0であることが確認された。4.精漿内DNA断片から酸分解により選択的にアデニンを遊離させ、それをHPLC法で測定した。精漿中にはDNA断片が存在するが、血漿中では検出限界以下であることを確認した。精漿内DNA量は一般精液所見とは相関せず、クラインフェルター患者で異常高値を示すことを観察した。新たにヨーイングモーション電気泳動法を開発し、位相を120度づつずらして3回泳動することにより各DNA fiberを0.5-1.0mm程度伸展させることができた。DNAポリメラーゼ-FITC-dArPを用いるnick translation変法によりDNA fiber中のnick部位を検出できた。大腸菌(DNA base数:約430万base)をマーカーとして、伸展ヒト精子DNA鎖長を推定したところ、最長のもので1000万base程度の連続したDNA fiberが得られた。2.精子を低酸素環境で取り扱うため、酸素パージ可能な培養ボトルの開発を行った。すなわち、培養液に懸濁した精子は密閉可能なプラスチックボトルに収納し、酸素センサーを用いて酸素濃度が2.0%を維持した。3.活性酸素の影響を観察するため、過酸化水素を培養液中に添加すると濃度依存性に2重鎖の切断が観察された。
4.一般的にDNAはアルカリ条件に安定であるとされてきたが、本研究で取り扱う1000万baseレベルのDNAは酸、アルカリに脆弱であり、その取り扱いに関しては、pH、活性酸素等に充分な注意が必要であることが明らかになった。5.洗浄して精漿を除去した精子を抗酸化系因子を含まない培養液に懸濁して、空気中に放置するとSSBが増加する可能性が示唆された。この件に関しては次年度に精査して、精子をin vitroにおける精子取り扱いに関してどのように環境因子を整備すればDNAの物理的損傷を最低限とできるかを検討する。2.前年度に開発した酸素パージ可能な培養ボトルを用いて精子swim up、媒精、受精卵培養を低酸素環境(酸素濃度2.0%)で行った。精子swim upを酸素濃度2.0%またはCO_2-air中で行い、DNA2重鎖切断精子(DSB精子)比率をSPCFGEにより比較した結果、低酸素によりDSB誘起抑制が可能であることが示された。さらに非働化血清存在下では、さらにDSB陽性精子比率を低下し得ることを認めた。本法による体外受精・胚移植を12例に施行し、4例に妊娠が成立した。例数が少なく統計的有意性は今後の検討課題であるが、胚形態所見は良好であった。3.HIV感染者は抗ウィルス薬(核酸アナログ製剤)を服用しており、造精過程において精子DNA損傷誘起の可能性がある。HIV感染男性(夫)の精液からウィルスを除去して非感染女性(妻)に体外受精を施行するのに際し、ウィルス排除と同時にDSB陽性精子排除を行う必要がある。密度勾配遠心、沈降速度差遠心、精子運動性に基づくswim upにより精液を分画した。最終的にDSB陽性精子比率は2%以下となり、さらに超高感度PCR(検出限界HIV 2copy/ml)により残存ウイルスが0であることが確認された。4.精漿を酸分解して、DNA fiberから遊離したd-アデノシンに由来するアデニンを測定した結果、精漿中にはDNA断片が存在するが、血漿中では検出限界以下であることを確認した。精漿内DNA量は一般精液所見とは相関せず、クラインフェルター患者で異常高値を示すことを観察した。