hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
ヒトの精神活動に関わる遺伝子の進化と集団遺伝学

ヒトの疾病に関わる遺伝子のSNP(疾病SNP)の多くが他の霊長類で保存されている祖先型であることがあきらかになっている。これらのSNPがヒトの疾病と関わるようになったのは、ヒト特異的な環境変化がその引き金となり、ヒトで新たに疾病抵抗性SNPが出現したという仮説の元に、疾病(リスク型)SNPと疾病抵抗性(非リスク型)SNPの分岐年代や非リスク型SNPの正の自然選択の可能性等について解析している。本課題では、GWAS解析により明らかとされた統合失調症に関連する108のSNPsについて、非リスク型あるいはリスク型SNPに正の自然選択が働いた可能性を探している。昨年度開発したSFS (Site Frequency Spectrum)とLD (Linkage Disequilibrium:連鎖不平衡)を組み合わせた方法(Fc法)での解析を行った。しかし、Fc法では組み換えの効果の検出が甘く、またsoft sweepとhard sweepの区別もつきにくいことから、Fc法を発展させた2DMSFS(two dimetional site frequenccy spectrum)法を開発した。この方法は遺伝的組み換えの効果を明確に区別できる点、またsoft sweepとhard sweepを区別できる点においてFc法より優れている。現在は2DMSFS法を用いて108SNPsの解析を行っている。また、この結果と比較するために、ヒトゲノム中からイントロンに存在する100個ののSNPsをランダムに選び、新しい方法により自然選択の効果を調べた。その結果およそ96%のSNPsが中立変異であることが明らかとなり、108SNPsの結果との比較により、統合失調関連変異に自然選択が有意に働いているかの検討が期待できる。なお開発した方法については論文としてまとめ現在国際誌に投稿中である。平成30年度が最終年度であるため、記入しない。現生人類は20万年ほど前にアフリカ大陸で誕生後、およそ58万年前に全世界へとその生息域を広げた。これに伴い、洞窟の壁画、遺跡から発掘される装飾品や石器などに見られるように、ヒトは文化や技術の面で大きな発展を遂げた。この文化的・技術的な発展には、ヒトの脳機能の大きな亢進がともなっていることは想像に難くない。統合失調症は認知や思考の障害であり、その発症に関わる遺伝子は、そのようなヒトの脳機能の亢進に関わると考えられる。そこで本研究では、最近大規模関連解析で同定された統合失調症に関連する128個のSNPを対象に、SNP周辺領域の多型を調べることで、ヒトの脳機能の亢進に関与したと思われる遺伝子を検出し、その適応的役割を明らかにする。これらのSNPのリスク型について調べてみると、128個の内およそ半数の60個のSNPでリスク型が祖先型であることがわかった。このことは、統合失調症に対するリスクが、ヒト系統特異的である(人の文化の発展と相関している)ことを示しており、非リスク型は現在も正の自然選択の標的である可能性を示している。このようなSNPの中から、正の自然選択の標的となっているものを検出する必要があるが、正の自然選択の標的の検出には様々な方法が考案されており、大きく次の三つのカテゴリーに分類される。1)SFSに代表される頻度情報を利用する方法、2)EHHやROHに代表される連鎖不平衡を用いた解析法3)Fstに代表される集団間の分化の程度を指標にした方法である。この三つのカテゴリーそれぞれに含まれる代表的な方法を統合失調症との関連が指摘されているSTX(シアル酸転移酵素)遺伝子のプロモータ領域のSNPに適応し、SFSが正の自然選択のfirst screeningには適していることを明らかにした。今後は、SFS以外の方法(主にROH解析)との整合性も検討し、非リスク型に正の自然選択が働き始めて時間の推定などを行う。平成28年度は、自然選択の検出方法のパワーの比較を行い、平成29年度以降の解析の方針を決定した。平成29年度に新たに開発した統計量(Fc)を用いて以下の2つのプロジェクトを遂行した。1)ヒトシアル酸転移酵素(ST8SIA2)について、これまで統合失調症と関連すると指摘されている3つのSNPはST8SIA2のプロモター領域に存在する。この3SNPから構成される4種のプロモータイプ(TGT,TCT,CGC,CGT)がヒト集団ではmajor typeである。このうち、CGCタイプのみ統合失調症の非リスク型としてしられてきた。CGCタイプは特に東アジア集団でその頻度が高い。Fc統計量により、このCGCタイプに正の自然選択が働いていることを示した。また、このCGCタイプは、他の3種類のプロモータタイプと比較して、有意にプロモータ活性が低いことが示された。このプロモータ活性が自然選択のターゲットとなった生物学的意義かもしれない。また、この自然選択が働き始めたのは、今から23万年前と推定され、この選択は、最終氷期とともに人の集団の移動・交雑が起きたこととも関連していると思われる。(国際誌に結果を投稿中)2)大規模なGWAS(Genome-Wide Association Study)により統合失調症発症と関連するとされるSNPが108の遺伝子座で同定されている。これらのSNPの内、Fc統計量により32遺伝子座のSNPで自然選択を検出した。これらのSNPは、祖先型ー非リスク型、祖先型ーリスク型、派生型ー非リスク型、派生型ーリスク型の4つの分類群に分けられる。

当初は、祖先型、派生型を問わず、非リスク型が正の自然選択の標的となると予測したが、実際に正の自然選択の標的となったSNPを分類してみると、祖先型、派生型を問わずリスク型が正の自然選択の標的となった例が、複数見出された。また、東アジア、ヨーロッパ、アフリカのメタ集団では正の自然選択の標的になるSNPが異なっており、3つのメタ集団に共通な自然選択の標的になるSNPは一つしか、検出されなかった。本年度は、正の自然選択を効率よく検出する方法を開発し、その方法論を現在国際誌に投稿中である。この方法を用いて、統合失調症関連のST8SIA2遺伝子座のプロモーター領域における非リスク型SNPに正の自然選択が働いていることを示した。一方、大規模GWAS解析の結果、統合失調症の発症に関連すると推測される108遺伝子座のうち、32遺伝子座のSNPに自然選択の痕跡を見出した。ただ、これらのSNPの多くは、非リスク型であったが、複数、リスク型でありながら正の自然選択の標的であることを示すものも含まれており、これらのリスク型SNPが、どうのような生物学的意義を持つのか、またどのように集団中に維持されているのかを明らかにすることが今後必要となってくる。ヒトの疾病に関わる遺伝子のSNP(疾病SNP)の多くが他の霊長類で保存されている祖先型であることがあきらかになっている。これらのSNPがヒトの疾病と関わるようになったのは、ヒト特異的な環境変化がその引き金となり、ヒトで新たに疾病抵抗性SNPが出現したという仮説の元に、疾病(リスク型)SNPと疾病抵抗性(非リスク型)SNPの分岐年代や非リスク型SNPの正の自然選択の可能性等について解析している。本課題では、GWAS解析により明らかとされた統合失調症に関連する108のSNPsについて、非リスク型あるいはリスク型SNPに正の自然選択が働いた可能性を探している。昨年度開発したSFS (Site Frequency Spectrum)とLD (Linkage Disequilibrium:連鎖不平衡)を組み合わせた方法(Fc法)での解析を行った。しかし、Fc法では組み換えの効果の検出が甘く、またsoft sweepとhard sweepの区別もつきにくいことから、Fc法を発展させた2DMSFS(two dimetional site frequenccy spectrum)法を開発した。この方法は遺伝的組み換えの効果を明確に区別できる点、またsoft sweepとhard sweepを区別できる点においてFc法より優れている。現在は2DMSFS法を用いて108SNPsの解析を行っている。また、この結果と比較するために、ヒトゲノム中からイントロンに存在する100個ののSNPsをランダムに選び、新しい方法により自然選択の効果を調べた。その結果およそ96%のSNPsが中立変異であることが明らかとなり、108SNPsの結果との比較により、統合失調関連変異に自然選択が有意に働いているかの検討が期待できる。なお開発した方法については論文としてまとめ現在国際誌に投稿中である。128
運動と暑熱トレーニングが反射性循環調節に及ぼす影響

末梢血管抵抗の調節は,運動時や暑熱環境などの様々なストレス下における血圧や末梢血流量の調節に極めて重要である.本研究は,末梢血管抵抗が自発性に変動するという特性に着目し,末梢血管抵抗の変動が交感神経活動の増加や局所性調節によってどのように影響されるかを調べ,さらにこれらが,運動や暑熱トレーニングによってどのように変化するかを検討する。本年度では,以下の課題1,2について検討した.課題1,暑熱下運動トレーニングが末梢血管抵抗の自発性変動に及ぼす影響暑熱下運動トレーニングは末梢血管調節や自律神経活動に影響することが知られている.そこで,短期間(6日間)の暑熱下(気温37°C,湿度50%)での運動トレーニング(20分間の最大酸素摂取量の50%での自転車運動を10分間の休憩を挟んで4回繰り返す)が常温下安静時における上肢の末梢血管抵抗変動に及ぼす影響を検討した.暑熱下運動トレーニングによって,1)安静時心拍数の低下,体温上昇に対する皮膚の血管拡張反応の向上,および最大酸素摂取量の増加がみられたが,2)末梢血管変動には有意な変化はみられなかった.このことから,短期間の暑熱下運動トレーニングは末梢血管抵抗変動には影響しないことが示唆された.課題2.筋代謝受容器反射刺激時における動脈圧受容器反射機能変化が循環調節に及ぼす影響.心拍出量を連続的に測定可能な動物モデル(イヌ)を用いてbeat-to-beatの心拍出量調節を定量化する手法を開発し,これが,動的運動時および筋代謝受容器反射刺激時にどのように変化するかを検討した.その結果,1)運動強度の増加にともなって心拍数調節と心拍出量調節の反応性が低下すること,また2)筋代謝受容器刺激は心拍数調節の反応性を低下するが,心拍出量調節の反応性には影響しないことが明らかになった.このような変化は運動時の血圧調節メカニズムの一つであると考えられる.末梢血管抵抗の調節は,運動時や暑熱環境などの様々なストレス下における血圧や末梢血流量の調節に極めて重要である.しかし,これらの調節に対する反射性循環調節による作用や,その作用が運動や暑熱トレーニングによってどのように変化するかは明らかではない.本研究は,末梢血管抵抗が自発性に変動するという特性に着目し,末梢血管抵抗の変動が交感神経活動の増加や局所性調節によってどのように影響されるかを調べ,さらにこれらが,運動や暑熱トレーニングによってどのように変化するかを検討する。本年度では,実験課題1)末梢血管抵抗の自発性変動に関する基礎的データの収集および分析法の確立,実験課題2)交感神経活動亢進が末梢血管抵抗の自発性変動に及ぼす影響について研究を実施した.実験課題1.FFT法により安静時の大腿動脈血管抵抗変動を定量化することで,血管抵抗変動にはおよそ0.15Hz以下の低周波数成分と呼吸頻度と対応したおよそ0.20.35Hzの高周波数成分が多く含まれることを明らかした。さらに,周波数伝達関数を用いて血圧変化に対する末梢血管応答を検討し,約0.2Hz以下の周波数帯域において末梢血管抵抗はおよそ1.5秒遅れて血圧の変化を追従していることを明らかにした.実験課題2.交感神経活動が大きく増加する掌握運動後の前腕阻血時(筋代謝受容器刺激時)に大腿動脈血管抵抗の自発性変動がどのように変化するかについて検討した.その結果,筋代謝受容器刺激時には、安静状態と比較してi)末梢血流量および末梢血管抵抗の低周波数の変動が増加すること,またii)低周波数域において,血圧変化に対する末梢血管応答が増大することが明らかになった.このことから,筋代謝受容器が働き交感神経活動が亢進する高強度運動時などでは,上記メカニズムが血圧や末梢血流量調節に関与することが示唆された.末梢血管抵抗の調節は,運動時や暑熱環境などの様々なストレス下における血圧や末梢血流量の調節に極めて重要である.本研究は,末梢血管抵抗が自発性に変動するという特性に着目し,末梢血管抵抗の変動が交感神経活動の増加や局所性調節によってどのように影響されるかを調べ,さらにこれらが,運動や暑熱トレーニングによってどのように変化するかを検討する。本年度では,以下の課題1,2について検討した.課題1.交感神経活動亢進および局所性調節が末梢血管抵抗の自発性変動に及ぼす影響下半身陰圧負荷(LBNP)時には反射性の交感神経活動増加による全身性の末梢血管収縮が起る.これに加えて,下肢血管においては,血管経壁圧増加にともなう筋原生反応や,下肢静脈への血液プーリングにともなう動静脈反応などの局所性調節も血管収縮に関与すると考えられる.そこで,LBNP時の上肢と下肢での末梢血管抵抗の変動を比較することで交感神経活動増加と局所性調節の影響を検討した.その結果,LBNP時には,1)上肢と下肢のどちらにおいても低周波数域での末梢血流量および末梢血管抵抗の変動が増加し,また血圧変化に対する末梢血管応答が増大する,2)上肢と下肢では末梢血管抵抗変動の増加の程度には差はみられないことが明らかになった.このことから,LBNP時には全身性に末梢血管抵抗変動が増加し,これには交感神経活動の増加が関与することが示唆された.課題2.筋代謝受容器反射刺激時における動脈圧受容器反射機能の変化

動脈圧受容器反射機能が筋代謝受容器刺激時においてどのように変化するかについて,動的運動時に筋代謝受容器を選択的に刺激することが可能な動物モデル(イヌ)を用いて検討した。その結果,筋代謝受容器刺激により動脈圧受容器反射の心拍数調節の反応性が減弱することが明らかになった.このような動脈圧受容器反射機能の変化が血圧や末梢血管抵抗変動の変化に関与している可能性が考えられる.末梢血管抵抗の調節は,運動時や暑熱環境などの様々なストレス下における血圧や末梢血流量の調節に極めて重要である.本研究は,末梢血管抵抗が自発性に変動するという特性に着目し,末梢血管抵抗の変動が交感神経活動の増加や局所性調節によってどのように影響されるかを調べ,さらにこれらが,運動や暑熱トレーニングによってどのように変化するかを検討する。本年度では,以下の課題1,2について検討した.課題1,暑熱下運動トレーニングが末梢血管抵抗の自発性変動に及ぼす影響暑熱下運動トレーニングは末梢血管調節や自律神経活動に影響することが知られている.そこで,短期間(6日間)の暑熱下(気温37°C,湿度50%)での運動トレーニング(20分間の最大酸素摂取量の50%での自転車運動を10分間の休憩を挟んで4回繰り返す)が常温下安静時における上肢の末梢血管抵抗変動に及ぼす影響を検討した.暑熱下運動トレーニングによって,1)安静時心拍数の低下,体温上昇に対する皮膚の血管拡張反応の向上,および最大酸素摂取量の増加がみられたが,2)末梢血管変動には有意な変化はみられなかった.このことから,短期間の暑熱下運動トレーニングは末梢血管抵抗変動には影響しないことが示唆された.課題2.筋代謝受容器反射刺激時における動脈圧受容器反射機能変化が循環調節に及ぼす影響.心拍出量を連続的に測定可能な動物モデル(イヌ)を用いてbeat-to-beatの心拍出量調節を定量化する手法を開発し,これが,動的運動時および筋代謝受容器反射刺激時にどのように変化するかを検討した.その結果,1)運動強度の増加にともなって心拍数調節と心拍出量調節の反応性が低下すること,また2)筋代謝受容器刺激は心拍数調節の反応性を低下するが,心拍出量調節の反応性には影響しないことが明らかになった.このような変化は運動時の血圧調節メカニズムの一つであると考えられる.
粒子線照射による心臓の電気生理学的変化と不整脈治療への応用

まずコントロール群(非照射群のウサギ)において、心電図検査、心エコー図検査、そして全身麻酔を行った上で開胸を行いウサギの心臓の電気生理学検査が可能である事を確認した。照射群のウサギについては神戸大学動物実験施設から兵庫県立粒子線医療センターに搬送し、ウサギの心臓に粒子線照射(炭素線n=16 [25Gy照射n=8, 35Gy照射n=8],陽子線n=16 [25Gy照射n=8, 35Gy照射n=8])を行って、その後神戸大学に搬入し経過観察を行った。照射群のウサギは1か月、3カ月後に心電図、心エコー図検査を行い3ー6カ月後に全身麻酔下での開胸下で電気生理検査を行った。開胸し心臓を露出させ拍動下で伝導時間や電位波高などを測定しコントロール群を比較を行った。その後安楽死させて、心臓の組織学的変化を検討した。照射群においては、まず皮膚(前胸部)に照射による皮膚変化を認め、心エコー図検査では1-3カ月後に心嚢水貯留などの所見を認め、体表心電図では電位の低下を認めた。開胸下での電気生理検査では照射群において伝導時間の延長、伝導速度の低下、電位波高の減高を認め粒子線照射による影響と考えられた。現在、組織学的変化の解析を行っている。組織学的評価としては心筋のアポトーシスの変化、gap junctionへの影響(コネキシン43発現の変化)、心筋の線維化などを評価する。これらの結果は2019年7月に開催される第66回日本不整脈心電学会学術大会のシンポジウムで発表が決定している。粒子線照射を生体に行う場合に、その効果を最大限とし、かつ副作用を最低限とするために以下のような研究を行った。1.ウサギの粒子線の照射を今後行うために健常のウサギのCT画像データを粒子線医療センターへ送り、治療プランニングの作成の下地とした。CT画像では心臓、食道、肺、脊椎との解剖学的位置関係、皮膚からの距離などに関して詳細に検討を行った。2.近年心臓への放射線、粒子線照射による影響が基礎研究、臨床研究などから報告されており、これらを元に粒子線医療センターのスタッフと連携を取り各臓器への放射線線量の検討、副作用などについて検討を行った。3.粒子線照射の効果を確認する上でウサギを全身麻酔下で開胸し心外膜側にカテーテル電極を接触させ局所電位の波高、時相、伝導時間の解析を行う事が重要となる。ウサギの心臓は小さいため3次元の電気解剖学的マッピングシステムのカテーテルの種類や精度、画像解析法、解像度の設定などについて検討を行った。健常ウサギを兵庫県粒子線医療センターに搬送し心臓に照射を行う予定であるが、照射過多や照射範囲が広範囲となった場合にはウサギの早期死亡のリスクを伴う。このため照射前にウサギのCT画像で詳細な解剖を把握した上での照射を行う方針となった。ウサギの心臓は小さく、どのレベルまで照射を絞ることができるのかどうかは粒子線医療センターの専門知識を持つスタッフと連携を取る必要があり、照射プランニング作成まで時間を要する結果となった。上記のような理由で研究の進捗状況としては遅れているが、平成30年5-6月にはCT検査の画像を元にウサギの心臓への粒子線照射を予定している。照射1-2ヶ月後、または著明な心電図変化が起こった時点で電気生理学的変化の検討を行う予定である。全身麻酔下で開胸の準備も完了しており心外膜側にカテーテル電極を接触させ局所電位の波高、時相、伝導時間などを記録し、局所電位の減高/消失、伝導遅延/ブロックなどの評価を行う予定である。これらのデータは3次元の電気解剖学的マッピングシステムとしてコンピュータ上で視覚化する事が可能である。その後、ウサギを安楽死させ心臓、周辺臓器(肺、食道、気管、大動脈など)を摘出し肉眼的変化を観察する。

組織学的に心筋細胞の変化、線維化などを検討する予定である。心筋細胞のアポトーシスを確認するためTUNEL法を用いて評価を行う予定である。当該年度ではCT画像を元とした粒子線照射の治療プランニングの作成、検討に時間を要し研究進捗としては遅れた状況となった。平成30年度にはウサギの購入、飼育費、そして動物用人工呼吸器関連物品、薬品、ウサギの運搬費用、電極カテーテル購入などのために次年度使用額が生じる結果となった。
ヒト培養線維芽細胞よりのフィブロネクチン点眼剤連続作製システムの開発

難治性角膜上皮障害に対して、フィブロネクチン点眼剤が角膜上皮細胞の再被覆に有効である。しかしながら、フィブロネクチン点眼剤を作製する現在の方法では限られた施設でのみ臨床応用が可能であり、一般に用いる事は困難である。自動的にフィブロネクチン点眼剤を作製するシステムを開発する目的で59年度に引続き60年度は下記の研究を行なった。1.ヒト皮膚より線維芽細胞を培養し、炭酸ガスインキュベーター内でマイクロビーズの上で培養した。培養液中のフィブロネクチンを、昨年度開発したフィブロネクチン自動作製装置を用いて精製を試みた。しかしながら、培養液中のフィブロネクチンの含量は極めて少なく自動装置を用いて精製するには大量の培養液が必要である事が明らかとなった。2.フィブロネクチン自動作製装置を用いて効率良くフィブロネクチンを精製するには、細胞のフィブロネクチン合成能を亢進するか、あるいは培養条件を検討して一定の培養液あたりの細胞数を増加させる必要がある。角膜実質細胞の場合には表皮成長困子を添加することでフィブロネクチンの合成が促進されることより、現在線維芽細胞のフィブロネクチン合成を亢進する培養条件を検索中である。3.以上のように本研究の初期の目的である臨床に用いることのできるフィブロネクチン点眼剤を自動的に線維芽細胞から効率良く作製するためには、細胞の培養条件を再検討する必要があることが明らかとなった。
心筋細胞の介在板から入力するメカニカルシグナルの可視化

これまでの研究から、心筋細胞の『形や機能を変容しながらポンプ機能を維持する』性質は、心筋細胞のメカノセンサーを介したCa2+シグナルに支えられていることが明らかとなってきたが、未だに可視化されていない。本研究では、心筋細胞のメカノセンサーを介して入力するメカニカルシグナルを可視化し、心機能を支えるメカノトランスダクションのトリガーを明らかにしたいと考えている。我々は、メカノセンサー分子を対象としたノックアウトマウスモデルを保持しているので、この細胞を有効に使い研究を進める。本年度は、マウスの心筋細胞を用いて、メカニカルシグナルに依存したCa2+シグナルを解析した。正常マウスおよびメカノセンサー・ノックアウトマウスの心臓より、心筋細胞を単離し、メカニカルシグナルに依存して上昇する細胞内Ca2+をイメージングした。高速カメラで取得したイメージングデータを比較すること、また、局所的にメカニカルストレスを負荷することにより、メカニカルシグナルに依存したCa2+シグナルの入力場所を解析している最中である。また、メカノセンサー分子の結合分子解析から、機能未知の分子Xを同定した。興味深いことに、この分子Xは、メカノセンサー機能や局在依存的に細胞内局在を変えることが明らかとなった。これらの実験的事実をもとに、メカニカルストレスによって引き起こされるCa2+シグナルとそれによって引き起こされるメカニカルシグナル(細胞内イベント)を明らかにしていきたい。マウスの正常心筋細胞と、メカノセンサー欠損心筋細胞を用いて、メカニカルシグナルに依存したCa2+シグナルを高速カメラで比較した。また、メカノセンサー依存的に細胞内局在を変える転写因子を同定した。これらのことから、メカニカルストレスによって細胞局所でおこったCa2+シグナルが核内へ伝わることを考察できるようになったため。得られた実験結果をもとに、メカニカルストレスによって引き起こされるCa2+シグナルとそれによって引き起こされるメカニカルシグナル(細胞内イベント)を明らかにしていきたい。目的の抗体作成に時間がかかったために、一部の実験を次年度に計画しなおしたため。また、新しいマウスの掛け合わせに時間がかかり、一部の実験を次年度に計画しなおしたため。
中国「淪陥区」及び「国統区」の文芸に関する総合的研究

本年が総合研究の最終年度にあたるため、平成5年9月22日より23日にかけて、神戸商科大学淡水クラブならびに舞子ヴィラを会場として共同研究者による総括的なシンポジウムを開催、次のような題目で研究報告ならびに討論を行い3年間にわたる研究の成果をまとめた。(1)共同討論「総合研究の成果公開について」(2)下村作次郎「台湾文学百年史の構想」(3)白水紀子「中国・話劇運動の展開」(4)瀬戸宏「中国・話劇の民族化について」(5)岸陽子「中国当代文学の諸問題」また、指導助言者として神戸大学ならびに東京大学に外国人研究者として滞在中の陳平原氏(北京大学)及び〓叢林氏(吉林大学)を招聘、それぞれから「中国・国統区の文学運動」と「中国・淪陥区の文学運動」についての中国における研究動向に関する報告を受けるとともに研究上の指導・助言を依頼した。以上のような共同討論をふまえて、各自が研究成果を別記のような著書や論文にまとめたが、特に本年度は中国大陸の少数民族における文学ならびに日本統治時代の台湾文学に重点をおいた成果を公表した。過去3年間にわたる共同研究の内容については、できるだけ早い機会にまとめて公刊する予定で目下その準備作業を急いでいる。平成3年10月19日より21日にかけて、総合研究に従事するメンバ-27名全員が神戸市内に集まり、本研究の分担に関して綿密な打ち合せを行い、伊藤虎丸氏(東京女子大学教授)、劉春英女史(中国・東北師範大学副教授)、Mr.Jack Cain(Utlas International Canada)らを助言者としてシンポジウムを開催、メンバ-の一員である岡田英樹氏(立命館大学教授)ならびに岸陽子氏(早稲田大学教授)が中国・長春市で開催された「東北淪陥時期文学国際学術研討会」の参加報告を行うとともに、瀬戸宏氏(摂南大学助教授)、阪口直樹氏(同志社大学教授)を初め、研究分担者がそれぞれに研究報告を行った。また、同年11月19日には中国・東北師範大学教授(日本文学研究室主任)で中国日本文学会会長の呂元明氏ならびに愛知教育大学教授・谷口巌氏を講師として迎え、関西方面の研究分担者を中心とする研究会を大阪市内でもち、「十五年戦争期の満州文壇」についての検討を行った。以上のような研究活動をふまえ、旧来の文学史にはきわめて不十分にしか記述されてこなかった柳条湖事件より盧溝橋事件の勃発にいたる前期「満州国」時代と、日本の「華北分離工作」ないしは「華北政権特殊化」の方針によって、通州に設立された冀東防共自治政府(1935年11月、殷汝耕)及び北京の中華民国臨時政府(1937年12月、王克敏)統治下の文学・芸術に関する多くの事実を発掘したが、それらは既成の日本文学史と中国文学史の双方にわたる補充と訂正を要求する結果を生み出し、「研究発表」欄に記載したような個々の論文として公表した。本研究は今年度より引続き3年にわたって継続するので、最終年度には、今回の研究実績を盛り込んだ研究成果を一括して刊行する予定である。平成4年10月15日より17日にかけて、神奈川県平塚市において研究会を開催、北京大学教授厳沼塗〓氏ならびに東海大学教授辻康吾氏を助言者として抗戦期の文学ならびに台湾文学についての検討を行い、「抗戦期の程硯秋」に関する松浦恒雄氏(大阪市立大学)の報告、「台湾文学」に関する塚本照和氏(天理大学)の発表ならびに「第一回国際老舎学術討論会」についての杉本達夫氏(早稲田大学)の報告を中心として、総合研究参加者による討論を実施した。また、平成5年1月30日には神戸大学を会場とする研究会をもち、上海外国語学院副研究員の鄭福康氏を招いて「抗戦期の鄭振鐸」についての講演を依頼するとともに、秋吉久紀夫氏(九州大学)の台湾詩人に関する研究報告を主題とするシンポジウムを実施した。以上のような研究活動のなかで、中華民国維新政府や南京政府下での文芸活動ならびに日中全面戦争開始後の「満洲国」におけるそれら、及び日本統治下の台湾文芸について数多くの新しい知見を得ることができ、それらを本報告書に記載したような雑誌論文として公表した。

これらは既成の日本文学史と中国文学史の双方にわてった補充と訂正を必要とする性格の内容をもつものであり、今回の共同研究の大きな成果であった。本研究は来年度も引き続き継続するので、平成5年度に得られる成果をもとりこんで、3年間の共同研究による業績をまとめ、中国「淪陥区」及び「国統区」における文芸についての研究実績を近く一括して公刊できる準備を整えたいと考えている。本年が総合研究の最終年度にあたるため、平成5年9月22日より23日にかけて、神戸商科大学淡水クラブならびに舞子ヴィラを会場として共同研究者による総括的なシンポジウムを開催、次のような題目で研究報告ならびに討論を行い3年間にわたる研究の成果をまとめた。(1)共同討論「総合研究の成果公開について」(2)下村作次郎「台湾文学百年史の構想」(3)白水紀子「中国・話劇運動の展開」(4)瀬戸宏「中国・話劇の民族化について」(5)岸陽子「中国当代文学の諸問題」また、指導助言者として神戸大学ならびに東京大学に外国人研究者として滞在中の陳平源氏(北京大学)及び〓叢林氏(吉林大学)を招聘、それぞれから「中国・国統区の文学運動」と「中国・淪陥区の文学運動」についての中国における研究動向に関する報告を受けるとともに研究上の指導・助言を依頼した。以上のような共同討論をふまえて、各自が研究成果を別記のような著書や論文にまとめたが、特に本年度は中国大陸の小数民族における文学ならびに日本統治時代の台湾文学に重点をおいた成果を公表した。過去3年間にわたる共同研究の内容については、できるだけ早い機会にまとめて公刊する予定で目下その準備作業を急いでいる。
ラット繊維芽細胞3Y1の増殖制御におけるPKC分子種の役割

細胞内情報伝達系において重要なSer/Thrリン酸化酸素であるプロテインキナーゼC(PKC)は、多数の関連分子からなる遺伝子ファミリーを形成している。PKCは細胞の増殖や分化の制御に関わっていることが示唆されているが、その機能は分子種毎に異なっているらしい。しかし、一つの細胞には複数のPKC分子種が発現しており細胞毎にその種類や発現量が異なることから、PKCによる細胞増殖の制御機構を明らかにすることが困難になっている。そこで申請者は、transient発現系を用いて、増殖刺激依存的なDNA合成能に対するPKC高発現の効果を検討した。即ち、特定の分子種の発現ベクターをマーカー遺伝子と供に細胞に導入し静止期に同調する。これを血清等で刺激した後bromo-deoxyuridine (BrdU)によるパルスラベルを行う。マーカー及びBrdUに対する抗体を用いて二重染色し、PKCを高発現している細胞を特定しBrdUの取り込の有無を判定するものである。その結果、ラット繊維芽細胞3Y1にδ及びαを高発現させた場合、対照細胞に比べBrdU+の割合が有意に上昇し、εを高発現した場合は逆にBrdU+の減少が見られた。得に、ε高発現によるS期への移行時間が長くなる現象が見られた。各々のkinase knockout mutantを用いた場合にはこれらの効果が認められないことから、これらの現象は各々のキナーゼ活性に依存するものと考えられる。以上の結果は、3Y1細胞に発現している主たるPKC分子種であるα、δ、εが全てG0/G1期からS期へのDNA合成に至る経路に関与しているが、その作用は分子種により異なっていることを示している。
HIV-2ヌクレオキャプシド・タンパク質のRNA認識機構の解明

(1)RNAを認識する最少構造単位(NCp8-f1)の構造機能相関の解明我々の以前の研究で、NCp8-f1の機能発現に重要と考えられている部分(linker領域)の立体構造がAsn^<11>とlinker領域の主鎖の酸素核との水素結合によって安定化されていることがわかった。そこで、Asn^<11>をAlaに置換したNCp8-f1置換体(NCp8-f1/N11A)を立体構造と機能両面から野生型NCp8-f1(NCp8-f1wt)と比較した。その結果、NCp8-f1とNCp8-は、f1/N11Aでは、RNA結合様式が異なることがわかった。NMRによる立体構造解析の結果、NCp8-f1/N11Aでは、linker領域の構造がNCp8-f1とかなり違っていた。これらのことから、linker領域の立体構造は機能発現に重要であることがわかった。(2)NCp8-f2の立体構造解析NCp8-f2はC端側のzincfinger領域とそのN端側に位置するlinker領域を含む27残基のペプチドである。NCp7の同領域は,ウイルスRNAの認識能を持たない。これに対してNCp8-f2はウイルスRNAの認識能を持つ。NCp8-f2の立体構造解析の結果、zincfinger領域のC端側もループ様の構造を持っていることがわかった。このことはNCp7-f2では観測されていない。このC端側の構造要素がRNA認識に必要な構造要素の可能性がある。(3)安定同位体(^<15>N)標識NCp8の大量調製アミノ酸40殘基を超えるタンパク質のNMR測定では,水素核信号の重なりを避けるために安定同位体(^<15>Nおよび^<13>C)標識タンパク質を対象とした三次元NMR測定が必須である.そこで、^<15>N標識NCp8を大腸菌によって大量調製した。これによって、NCp8の立体構造はもとより、RNAとNCp8め複合体の立体構造解析も可能となった。当研究は,HIV-2のヌクレオキャプシド(NC)タンパク質(NCp8:zincfinger motif(ZFM)を2つ含む49アミノ酸残基のペプチド)の機能発現機構を解明し,機能制御をするための基礎データを提供することを目的としている.本年度の主な成果は以下の3点である.(1)C端側ZFMを含む部分ペプチド(NCp8-f2:27残基)の立体構造解析NCp8-f2の立体構造を高い精度で決定し,ZFMに加えてC末の6残基も安定した立体構造を形成していることを明らかにした.この構造をHIV-1のNCタンパク質(NCp7)およびマウス白血病ウイルスのNCタンパク質(NCp10)の相当領域の立体構造と比較した結果,今回我々の決定したC末の6残基の立体構造がRNA認識の補足的な構造要素であることを推定した.(2)N端側ZFMを含む部分ペプチド(NCp8-f1:29残基)のアミノ酸部分置換体(変異体)の立体構造解析昨年度の研究の結果,NCp8-f1中のAsn^<11>がRNAを認識するための構造形成に必要不可欠であることを推定した.

このことをさらに詳細に解析するために,Asn^<11>をAlaに置換した純度の高い変異体NCp8-f1を化学合成で約50mg調製した.(3)安定同位体(^<15>N)標識NCp8大量調製法の確立今後,NCp8およびRNAとNCp8の複合体の立体構造解析を行うためには,窒素核を安定同位体(^<15>N)標識したNCp8が大量に必要である.そのため本年度は,大腸菌を用いてNCp8を大量(10mg以上)調製する方法を確立した.当研究は,HIV-2のヌクレオキャプシド(NC)タンパク質(NCp8:zincfinger motif(ZFM)を2つ含む49アミノ酸残基のペプチド)の機能発現機構を解明し,機能制御をするための基礎データを提供することを目的としている.本年度の主な成果は以下の2点である.1.N端側ZFMを含む部分ペプチド(NCp8-f1:29残基)のアミノ酸部分置換体の立体構造解析昨年度の研究の結果,NCp8-f1中のAsn^<11>がRNAを認識するための構造形成に必要不可欠であることを推定した.このことをさらに詳細に解析するために,Asn^<11>をAlaに置換した試料NCp8-f1/N11Aの立体構造解析を行った.その結果,機能発現に重要なlinker領域の立体構造が変化していることがわかった.2.安定同位体(^<15>N)標識NCp8大量調製法の確立今後,NCp8およびRNAとNCp8の複合体の立体構造解析を行うためには,窒素核を安定同位体(^<15>N)標識したNCp8が大量に必要である.本年度はこの試料の調製を行った.7リットルの培養を3回行い,粗精製,HPLC精製をおこなった結果,純度95%以上の安定同位体標識した試料約5mgの調製に成功した.上記研究成果(1)および今後の構造機能相関解明のためには,NCp8とRNAの特異的な結合能を定量的に解析する必要がある.そのため,ゲルシフトアッセイおよびUVクロスリンキング法によるNCp8のRNA結合能解析の実験を開始した.HIVのヌクレオキャプシドタンパク質(NCタンパク質)は宿主細胞内でウイルスRNAに結合し、HIVの粒子形成を導く。量的に非常に多い宿主由来のRNAの中からウイルスRNAを特異的に認識し、結合するメカニズムは未だに不明な点が多い。当研究は、HIV-2のNCタンパク質(NCp8:zincfinger motif(ZFM)を2つ含む49アミノ酸残基のペプチド)の機能発現機構を解明し、HIV-1のNCタンパク質と比較して、NCタシパク質の機能を制御するための基礎データを提供することを目的としている。昨年までにNCp8と同等のRNA認識能をもつ部分ペプチド(NCp8-f1)およびその機能発現に重要な部位(linker領域)の立体構造形成に関与するアミノ酸を置換したNCp8-f1部分アミノ酸置換体(NCp8-f1m)の立体構造解析を終了した。しかし、NCp8のRNA結合能を調べることが出来ないため、機能発現メカニズム解明のための構造機能相関の研究が不可能であった。そこで、本年度はNCp8とRNAの結合能を調べるための方法を確立した。この方法は合成RNAの3'端をDIG(Digoxigenin)標識して、UVクロスリンキングを用いたゲルシフトアッセイ法によりRNA結合能を調べる方法である。RNAにはNCp8が特的に結合すると考えられているHIV-
原子層スタック型電界放射電子放出デバイス ― 放出機構解明と放出量増加への挑戦

原子層物質であるh-BNから顕著な電界放出が観察され、二次元物質を用いた電子放出デバイスの作製が期待されている。特にグラフェンとh-BNの層状構造にすることにより電子放出量が著しく増加することが報告されたが、その原因については未だ解明されていない。本研究では原子層物質からの電界放出メカニズムの解明および電子放出量の増加を目的として、本年度はグラフェン表面への分子吸着による電子放出量増加と電子放出スペクトル解析方法の確立を行った。(1)昨年度の研究成果により、h-BN/グラフェン積層物ではフェルミ準位近傍の電子密度増加が顕著な電子放出の原因と明らかになった。そのため、さらに放出量を増やすためには分子吸着によるドーピングによって電子密度を増加させればよいと考えた。これを確かめるため、グラフェン表面にH2Oを吸着させ、その価電子帯スペクトルを測定した。PEEMにおけるUPS測定では励起光源用の分光器などを備え付ける物理的なスペースがないため、He Iα共鳴線(21.22 eV)だけでなくHe Iβ(23.08 eV)やHe Iγ(23.74 eV)等の高エネルギー紫外線によるスペクトルも重畳される。この影響を取り除くため、フーリエ変換を用いたフィルタを作製し、分光器を備えていない装置でもフェルミ準位近傍の微細構造を明瞭に観察できるようになった。この結果から、H2O吸着によってフェルミ準位近傍の電子密度が増加することがわかった。(2)作製したフィルタの妥当性を確かめるため、高輝度放射光を用いた価電子帯スペクトルを測定した。実験室光源および放射光施設で測定した温度依存を比較した結果、両者は同じ傾向を示し、開発したフィルタの妥当性が示された。29年度が最終年度であるため、記入しない。本研究では原子層物質からの電界放出メカニズムの解明を目的として、本年は光電子顕微鏡による電子放出箇所のマッピング、および紫外線光電子分光による価電子帯スペクトル評価を行った。(1)物理的剥離法および熱CVD法により作製したh-BNの上にグラフェンを転写し、その試料の光電子顕微鏡による電子放出箇所マッピング観察を行った。物理剥離法h-BNは厚さが数μmあり、測定条件によってはチャージアップによる光電子スペクトルのシフトが観察された。その一方で熱CVD法により作製したh-BNは厚さが単原子層であり、チャージアップなく光電子顕微鏡像および光電子スペクトルが測定できた。光電子スペクトルの解析により、h-BNからグラフェンにチャージが移動し、フェルミ準位近傍の電子密度が増加することが顕著な電子放出の原因と推察された。(2)熱CVD法h-BNの上にグラフェンを転写し、さらにその上に物理的剥離法でh-BNを転写したh-BN/グラフェン/h-BNサンドイッチ構造を作製した。剥離途中にグラフェンの一部が破れてしまう等品質には改良の余地があるが、このようなサンドイッチ構造を用いることでさらなる高効率の電子放出が可能になると期待できる。本年度の計画通り、光電子顕微鏡および紫外線光電子分光を用いてグラフェン/h-BN膜からの電子放出メカニズムを解明できた。また、品質は不十分なものの、h-BNを複数重ねた試料の作製にも成功した。以上の点から当初の計画通りおおむね順調に研究が進展していると判断できる。平成29年度の目標を以下の通りに設定する。

(1)h-BN/グラフェン/h-BNサンドイッチ構造の品質向上:平成28年度に作製したものはプロセスの開発という点では目標を達成できたものの、中間層のグラフェンに破損があるなど、その品質には改良の余地が多大に残っている。高品質化に向けて、具体的には物理的剥離法で作製したh-BNを用いずにCVDで作製したh-BNをCu基板から剥離させたものを用いてみる。(2)グラフェン中間層の電気伝導度向上:電子放出効率増加のためにはグラフェンの電気伝導度向上も重要な課題である。グラフェンへの分子吸着によってグラフェンのキャリア密度を制御することができるため、水や炭酸ガス等の吸着によるグラフェン電気伝導度変化を明らかにし、その知見を活かして高効率原子層電子放出源の開発を進める。このような吸着物がグラフェン/h-BN複合体のバンド構造にどのような影響を与えるか、高輝度放射光および紫外光を用いた光電子制御により明らかにする。(3)電子放出量のグラフェン伝導度依存:平成28年度の研究により、グラフェンからの電子放出はh-BNからのチャージ移動であることが示唆された。したがって、グラフェンの伝導性の違い(p型かn型か)は電子放出特性に大きな影響を与えると予想される。そのため、グラフェン上への分子吸着を通じてグラフェンへのドーピングを行い、それが電子放出量にどのような影響を与えるのかを確かめる。29年度が最終年度であるため、記入しない。
中国における日本古典籍の所蔵状況とその伝来ルートに関する研究

当該研究期間においては、中国の北京、四川の成都、漸江の杭州などの図書館で調査を行い、各図書館に所蔵されている日本古典籍について重点的に調査を行った。一方、明治以後の日本から中国への古典籍の流出ルートについて、文献や実地調査を通して考察し、中国所蔵の日本古典籍の状況とその中国に伝わった歴史的背景の解明についても新たな知見を得ることができた。その成果として、研究代表者の陳捷が(1)「明治前期における日中間の民間往来について一岸田吟香を通して」(国際シンポジウム「近代日中関係人物史研究の新しい地平」、関西大学アジア文化交流センター、2006年6月2425日)(2)「日本入宋僧南浦紹明與宋僧詩集『一帆風』」(「宋代文化国際研討会」、中国・四川大学、2006年8月1518日)等の研究発表を行い、また「中国に伝わった百万塔陀羅尼一近代における中国人による百万塔陀羅尼の記録」等の論文を執筆した。研究分担者の山崎誠は論文「和刻本『劉子』考」、「性霊集注解題」などの成果を発表した。今年度は、中国国家図書館、北京大学図書館、中国科学院図書館、上海図書館において資料調査を行い、そこに所蔵されている日本古典籍の伝来の流通ルートについて、現存する書物と文献資料における記載との二つの面から検討した。日本国内においては、京都・大阪・長崎・神戸などにおいて文献資料を調査し、日本の古典籍が中国に渡るのに関わった日中両国の人物の足跡を追跡した。なお、メンバー間の意見交換と討論は随時行われ、それぞれの専門分野の観点から、中国に渡った日本書籍の内容、中国伝来の際の状況や、中国における移動状況などについて分析した。既に発表された論文のうち、陳捷「一位日本武士眼中的中国」は、明治初期に中国に渡った日本人の中国旅行記に関するものであり、また、同書における、当時の江南地域における日本に関する知識の記載は、日中文化交流に関する新資料の提示であり、本課題に密接に関係するものである。陳捷「岸田吟香的楽善堂在中国的図書出版和販売活動」は、岸田吟香の楽善堂の中国での活動に関するものであり、上海を根拠地として活動していた岸田吟香による日本書籍の中国への販売活動について、新発見の販売目録を使って、詳細な分析を行ったものである。平成18年度においては、引き続き中国各地の図書館における日本古典籍の所蔵状況について調査を行った。今年度は中国の北京、四川の成都、浙江の杭州などの図書館で調査を行い、とくに北京の国家図書館に所蔵されている日本古典籍について重点的に調査を行った。その成果として、研究代表者の陳捷が(1)「明治前期における日中間の民間往来について-岸田吟香を通して」(国際シンポジウム「近代日中関係人物史研究の新しい地平」、関西大学アジア文化交流センター、2006年6月2425日)(2)「日本入宋僧南浦紹明與宋僧詩集『一帆風』」(「宋代文化国際研討会」、中国・四川大学、2006年8月1518日)などの研究発表を行い、また「中国に伝わった百万塔陀羅尼一近代における中国人による百万塔陀羅尼の記録」などの論文を執筆した。
脳虚血にpH感知性受容体は機能しているか～受容体欠損マウスを用いた解析

虚血部位では酸性化が伴う。しかし、酸性pHに対する神経系細胞の応答とその機構は不明である。本研究では脳の機能制御におけるOGR1ファミリー受容体の役割を調べた。受容体欠損マウスの中大脳動脈閉塞再灌流による解析、また、ミクログリア、神経細胞のモデル系細胞としてN1E115細胞での酸性pH応答機構を解析した。その結果、TDAG8が脳虚血再灌流後の脳傷害に保護的に機能していること、その作用にミクログリアの関与が示唆された。また、神経細胞ではOGR1がnNOS/cGMP系にかかわっている可能性が示唆された。このように、OGR1受容体ファミリーは脳機能制御に受容な役割を担っている。虚血時には低酸素と酸性化(低pH)が伴う。これは酸素供給の低下とそれを反映した解糖系の亢進による乳酸産生の増加に基づく。最近、我々を含む国内外のグループによって、従来リゾ脂質性のG蛋白質共役受容体(GPCR)と報告されていたOGR1ファミリー(OGR1,GPR4,TDAG8)が細胞外のpH(プロトン)を感知して細胞内にシグナルを伝達するGPCRであることが判明した。私達はこのユニークなGPCRの生体での機能を知る目的で受容体欠損マウスを作成した。本研究では、脳虚血に曝された細胞が再灌流時のダメージとそれからの回復に対して、pH感知性受容体がどのように関わっているかについて、脳梗塞モデル実験、ミクログリア、神経細胞を用いた作用機構解析によって明らかにする。その結果、(1)中大脳動脈閉塞(約30分)再灌流後、5日後の線条体の梗塞部位と反対側線条体のTTC染色をおこない、神経細胞などのアポトーシスの状況を調べたところ、梗塞部位で明らかな神経細胞の細胞死を観察した。また、運動機能の測定でも、対象マウスと梗塞を行ったマウスであきらかな運動機能の違いが観察された。それをスコア化することで、運動機能の測定が可能であった。現在、これらの方法を用いて、野生型マウスとプロトン感知性受容体の一つであるTDAG8欠損マウスとの比較実験をおこなっている。(2)マウス胎児から採取したミクログリアではTDAG8が主要なプロトン感知性受容体である。酸性pHはLPSによる炎症性サイトカイン(IL-1b)産生を抑制する。この応答はTDAG8欠損マウス由来のマイクログリアでは有意に抑制された。cAMP誘導体(PKA特異的誘導体、Epac特異的誘導体)、PKA阻害薬の効果などを調べた実験から、pH低下がTDAG8/cAMP/PKAを介してLPS応答を抑制していることが判明した。本研究では、脳虚血に曝された細胞が再灌流時のダメージとそれからの回復に対して、我々を含む国内外のグループによって発見されたpH感知性受容体がどのように関わっているかについて、脳梗塞モデル実験、ミクログリア、神経細胞を用いた作用機構解析によって明らかにする。その結果、以下の知見が得られた。(1)脳梗塞実験:中大脳動脈の虚血再灌流による24時間後のTTC染色やニッスル染色、また、運動機能測定から梗塞で明らかなな傷害が観察される。本年度は傷害の程度に及ぼすTDAG8欠損の効果を調べた。その結果、TDAG8欠損で傷害が進行している傾向があった。今後、この点を確認したい。このことは、TDAG8が虚血再灌流後の傷害に対して保護的に機能していることが示唆している。(2)ミクログリア:MAPKを中心に解析した。阻害薬の実験から、LPSはNAkB,JNK,ERKが関与していること、その中で、酸性pHがJNK, ERKを抑制することが見いだされた。今後、酸性pHのMAPK活性制御がTDAG8を介しているかどうかを見極める必要がある。(3) N1E115神経細胞では酸性pHによって、カルシウム動員、Aktのリン酸化、nNOSリン酸化、cGMP産生が観察される。N1E115細胞ではOGR1とGPR4が発現している。そこで、本年度はOGR1に対するsiRNAを用い受容体のノックダウン細胞を作成して解析したところ、細胞外pHの低下はOGR1/Gq/ホスホリパーゼC/カルシウム/nNOSの活性化を介してcGMP酸性を促進していることが推定された。AktはnNOSのS1412をリン酸化してnNOSを活性化する可能性があるが、Akt/nNOSリン酸化

介した経路は細胞外pH低下によるcGMP産生制御にはあまり関与していないことが示唆された。生理化学当初は実験が比較的容易な総頸動脈閉塞モデルマウスで実験を行っていた。しかし、梗塞部位と非梗塞部位との比較のためには中大脳動脈閉塞のほうがベターであるとの判断から、方法を変えてみた。実験手技の取得にやや時間がかかり、やっと、プロトン感知性受容体欠損マウスの実験データが得られ始めた段階である。梗塞実験のデータは再現性よく得られているので、今後、多いに期待できる。ミクログリアの実験は当初の予定どおり、TDAG8のサイトカイン産生抑制機構に関してcAMP/PKAの関与を証明できた。このように、個体レベルの中大脳動脈閉塞実験では再現性よくTTC染色によるアポトーシスの比較、運動機能の測定ができるようになったので、これを継続して、プロトン感知性受容体の中でもTDAG8の関与を明らかにしたい。また、虚血再還流後の組織を採取して炎症性サイトカイン(TNF-a, IL-1b, IL-6, iNOS, COX-2など)のmRNAの測定などを行い、炎症反応の程度の違いを明らかにする。ミクログリアの実験ではcAMP/PKAがLPSのどのシグナル系を抑制しているかに関して、MAPKを指標にして解析する。さらに、神経細胞におけるプロトン感知性受容体の役割りに関しても、神経細胞のモデルとしてN1E115細胞のシグナル系と受容体の関係を明らかにする。計画はほぼ順調に遂行した。予定していた試薬の入手が年度をまたぐ危惧があったために若干の経費の繰り越しになった。この持ち越し経費は当初予定の経費と合わせ、ミクログリアにおけるcAMP/PKAのMAPK活性に対する影響の解析や神経細胞のモデルとしてのN1E115細胞のシグナル伝達系の解析に用いる。
劇症肝炎における原因ウイルスと細胞性免疫反応答の解明-米国肝移植例での検討

劇症肝炎は広範な肝細胞破壊による肝性脳症の出現を特徴とする急性肝障害であり、生存率30-40%と極めて予後不良な疾患である。我々は劇症肝炎に対する強力な人工肝補助療法と適切な原病対策により、約50%と高い生存率を達成している。しかし、亜急性に経過する症例で、原因ウイルスがC型あるいはB型キャリアからの劇症化例では肝細胞破壊の進展により著明な肝萎縮を来し、その結果再生不良による肝不全死に至ることが多い。劇症肝炎における救命率をさらに向上させるためには、急速かつ進行性の肝細胞破壊の機序の解明と、有効な対策が急務である。そこで今回我々は、劇症肝炎における宿主の細胞性免疫応答、特に炎症性サイトカインの動態を米国Pittsburgh大学A.W.Thomson教授との共同研究により検討した。その結果、IL-1β、TNF-αおよびIL-6は急性肝炎に比して高値であり肝細胞破壊の程度を反映し、特にIL-1βは発症早期・治療前においても劇症肝炎の予後を反映することが明らかになった。また、IL-1の活性を抑制するIL-1 receptor antagonist (IL-1Ra)は劇症肝炎生存例で死亡例に比して高値であり、発症早期における肝細胞破壊の進展を抑制し得る可能性も示唆された(Clin Exp lmmunol1994;98:71-77)。今後の課題として、劇症肝炎における肝細胞破壊の機序をさらに詳細に検討するために、リンパ球を用いた炎症性サイトカインのmRNAの測定や細胞障害性T細胞の変動および炎症細胞浸潤における重要な役割を有する、細胞接着分子の動態についても検討を行っている。米国ピッツバーグ大学ANGUS教授との共同研究により当院入院の急性肝点例、ウイルス性劇症肝点例、ピッツバーグ大学肝移植例において原因ウイルスの同定と細胞性免疫応答について検討している。特に細胞性免疫の指標としてインタロイキン(IL)-1beta,TNF-alpha,IL-6,IL-1raについては精力的に研究を進めており、劇症肝点におけるこれらサイトカインの動態はほぼ解明された。これらのサイトカインと肝再生についても新しい知見が得られつつあり、既に論文化も行っており、投稿予定である(Clin Exp Immunol).次年度は原因ウイルスとの関連について追究の予定である米国ピッツバーグ大学のA.W.Thomson教授との共同研究により、ウイルス性劇症肝炎の発症早期における細胞性免疫応答、特に各種炎症性サイトカイン(IL-1β,TNF-α,IL-6)とIL-1の活性を抑制するIL-1受容体拮抗物質(IL-1Ra)についてウイルス性急性肝炎と比較、検討した。その結果、発症早期・治療前においても各種炎症性サイトカインは急性肝炎に比して肝細胞破壊の進展を反映し、肝炎の重症度と相関した。特にIL-1βは発症早期・治療前においても既に劇症肝炎死亡例で生存例あるいは急性肝炎例に比して有意に高値であり、劇症肝炎の予後および予知の推定に有用となる可能性がある。また肝再生の指標としてAFPおよび肝再生促進因子(hHGF)との関連を検討した結果、劇症肝炎生存例におけるAFPは死亡例あるいは急性肝炎例に比して有意に高値であり、hHGFは炎症性サイトカイン(TNF-α,IL-6)と有意に相関することが判明し、発表(Clin Exp Immunol 1994;98:71-77)した。次年度は、炎症性サイトカインだけでなく、さらに局所の炎症の進展に密接に関わる細胞接着分子(ICAM-1)も加え、劇症肝炎の治療経過における動態を解析することで、劇症肝炎の発症および進展の機序を解明すると共に、治療への応用も検討する予定である。また、肝移植例における各種サイトカインや接着分子の動態と原因ウイルスあるいは基礎疾患との関連についても検討する予定である。