hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
大腸菌由来ヒトリコンビナント骨形成因子変種による骨誘導

2作製法では、CHO細胞などを用いる方法に比べ、非常に安価で容易に大量生産することが可能になり、臨床使用へ向け大きな前進を遂げることになる。本研究では、昨年度、CHO細胞由来rhBMP-2に劣らない活性を確認した大腸菌由来rhBMP-2に、種々の工夫を凝らした活性増強法を検定した。大腸菌に発現させたrhBMP-2を単離精製し、タイプIコラーゲン(徐放系となり得る担体)と混合、凍結乾燥した後、円板状に成形した。この円板をラット下腿部筋肉内に埋入し、3,7,14,21日後に屠殺することにより、生物検定(軟X線学的、組織学的、生化学的)を行った。担体として使用したタイプIコラーゲンについては、線維化アテロコラーゲンのみのものと10%熱変性アテロコラーゲンを混合したもので比較検討した。また、高圧酸素療法、低血流状態などの骨誘導活性への影響についても検討した。担体として、線維化アテロコラーゲンに10%熱変性アテロコラーゲンを混合したものは、細胞の侵人速度が早くなるためか、骨誘導も促進されたが、吸収も促進された。低血流状態の部位での骨誘導活性はもちろん低下するものの、40%程度にまで血流が減少した部位でさえ、骨誘導を確認することが出来た。これにより将来的に臨床で高頻度に適応されると予測される悪条件下でも、骨形成因子は使用可能であることが示唆された。また、この低血流状態は高圧酸素療法を施すことにより、骨誘導活性の回復が図れることがわかった。大腸歯を用いた骨形成因子作製精製法では、チャイニーズハムスター卵巣細胞などの哺乳動物の細胞を利用する方法に比べ、非常に安価で容易に大量生産することが可能である。前年度までに本研究では大腸菌由来骨形成因子に、種々の工夫を凝らした骨形成活性増強法を検定し、臨床応用の際により少量の骨形成因子で大量の骨形成を得る方法を検索した。今年度われわれは骨形成因子発現アデノウイルスベクターを利用することにより、有効性が高く、安価で、臨床使用に際し、有用な方法を検索した。免疫抑制剤を利用すれば、骨形成因子発現アデノウイルスベクターでの遺伝子導入法は蛋白質を直接使用する方法に比べ、有効性が高いことは明白である。しかし、アデノウイルスベクターの使用により生体内に骨を誘導するために、全身への免疫抑制剤投与を行うことには副作用が生ずる可能性があり、より全身への影響の少ない手法について検討した。前年度までに使用していたタイプコラーゲンをアデノウイルスベクターの担体として使用した場合、ベクターが徐放化され効果が持続するばかりか、免疫反応を抑えることが出来るのではないかと考えた。本年度のラットによる実験結果から、作用機序までは明確に出来なかったが、免疫抑制剤を使用しなくともコラーゲンを使用すれば、本ベクターによる骨誘導が可能であることが確認された。さらに、免疫抑制剤の使用方法について、副作用が少なく、現在臨床で最も一般的に使用されているFK506の全身投与、局所投与での骨誘導能について検索した。その結果、ウイスター系ラットへの短期全身投与および少量局所投与でも十分な骨誘導活性を示すことを確認した。本年度研究結果により、十分な有効性を示すアデノウイルスベクターを利用した骨形成因子遺伝子導入法による骨形成は臨床応用可能なことが示唆された。
映像化社会における機器を用いたデザイン教材の開発研究

本研究では、機器を用いた基礎的な映像技法であるルミノグラム(暗室で光の動いた軌跡をカメラで撮影する映像表現)をとりあげ、その作成方法を解明し、新しいデザインの教材としての有効性の考察を目的とした。ルミノグラムは光の美しさや動きの造形性を表現する。そのための研究方法として次の3項目に分類した。1.基の光源の形ー(1)点、(2)線、(3)面などの変化、組み合わせを実験した。2.動かし方ー(1)素早い動き、(2)ゆるやかな動き、(3)回転、(4)ズ-ム、(5)ランダムなどを行った。3.使用する機器ーカメラや発光装置は一般的なものを用い、フィルムは感度の異なるものも実験した。実験の結果としては、次のようなことが解明された。1.光源の形ー(1)点の大きさによって奥行き感やモアレなどの効果が得られた(2)楕円とその分割形の原図のパターンが最も視覚的効果があったと思われる。(3)面の原図は輝度が高いため動かし方に工夫が必要であった。2.動かし方ー結果的には、この動かし方は効果的ではないというものはなく、原図との相関によって、美しいパターンを形成することができた。3.機器ー超硬調のミニコピーフィルムでは、黒と白のコントラストの強いパターンが得られた。以上のような研究の結果、多彩なパターンを創作することができた。今回はモノクロ撮影での実験であったが、今後の研究として、色彩を用いることによって、より視覚的表現も拡大すると予想される。さらに教材の有効性としては、創作方法の開発における発想法、多くのパターンからどの様な観点で何を選択するかという審美的感覚の育成、そして映像表現の技術的習得に教育的意義があると考えられる。
ソフトスイッチング増幅器を用いたオンチップスイッチング電源の開発

オンチップのソフトスイッチング型DC-DCコンバータの試作を目指して、DE級増幅器を用いた同期整流型DC-DCコンバータをスイッチング周波数500MHzで設計し、1.2umCM0Sルール上でレイアウト設計した。更にオンチップインダクタの損失削減を目的としてMEMSによるインダクタレイアウトを作成し、MEMSインダクタを試作した。E級増幅器の動作について解析を進めより高周波動作に向けた設計式の導出を進めた。本年度は計画に基づいてMEMSによるマイクロな受動素子の試作を行った。MEMS設計用のCADソフト(MEMS Pro)を購入しレイアウト設計を行いファウンドリサービス(Metal MUMPS)に提出した。試作を終えて郵送されてきた受動素子MEMSをテスト基板に載せて測定を行った。一方,E級増幅器とDE級増幅器の高周波動作についてトランジスタの出力キャパシタンスの非線形性を考慮した精密な動作解析を進めた。これは計画している数百メガヘルツや数ギガヘルツでのスイッチング動作においては出力キャパシタンスの非線形性が動作波形に大きな影響を与えると考えられているためである。それらの解析結果をProceedings of lEEE International Symposium on Circuits and Systems(ISCAS2007)やProceedings of IEEE International Conference on Power Electronics and Drive Systems(PEDS),電気関係学会九州支部連合会大会講演論文集に発表した。また,より出力電力を大きくするためにE級増幅器の任意のデューティ比における設計式を導出しIEEE Transactions on Circuits and Systems,partIに発表した。オンチップのソフトスイッチング型DC-DCコンバータの試作を目指して、DE級増幅器を用いた同期整流型DC-DCコンバータをスイッチング周波数500MHzで設計し、1.2umCMOSルール上で、共振インダクタ、共振キャパシタを含むDC-DCコンバータ全体をレイアウト設計した。更にオンチップインダクタの損失削減を目的としてMEMSによる20nHのインダクタレイアウトを作成し、MEMSインダクタを試作した。E級増幅器が動作する周波数をデューティ比を変えることによって大きく変更できることをIEEE Transactions on Circuits and Systemsに発表した。トランジスタ個々の規格値(最大電流や最大電圧)を制約条件として最大出力電力を求める方法を示し、いくつかのトランジスタについてそのトランジスタを使って作ったE級増幅器において出力することができる最大の電力を求めた結果を国際会議で発表し、E級増幅器の動作周波数のデューティ比による変化について、E旧像茎のシャントキャパシタが非線形であるばあいについてどのような変化の仕方をするかを解析した結果を国際会議で発表した。これらの解析により、よりE級増幅器の特性を向上させる設計が可能となりより高周波での回路構成に向けての研究が進んだ。
臨床応用を想定した "自己体内再生型"結合組織代用血管バイオチューブの多角的展開

30年度は29年度に引き続き、自家移植実験を継続する一方で、適応拡大のためにShelf Ready Graftとしての異種・同種組織応用技術の開発を進めた。28年度より着手した脱細胞処理をさらに最適化し処理プロトコールを短縮、7時間程度で十分な脱細胞処理が行えるようになった。DNA定量・物理特性も問題なく、動物移植実験が現実的となった。その後、脱細胞処理した径2mmのビーグル犬由来バイオチューブをラット腹部大動脈に異種移植した。自家由来バイオチューブ同様に急速かつ良好な組織化と体循環環境下での強度を保持が確認できた。この研究については論文報告を行った。一方で異種移植は臨床応用には安全性確保のためのハードルが高く、実際の使用にはまだ時間を要すると考えられる。そこで同種移植応用技術開発も昨年度同様に継続した。ビーグルを用いた同種移植実験では早期に組織化が完成しており、自家移植よりもさらに迅速な治癒過程が示された。臨床応用の際に移植適応されると想定される、ハイリスク患者・高齢者・未熟児など組織再生能力が低下した患者への応用には、健常な成人由来の同種バイオチューブの応用も、より実現性の高い選択肢として可能であると示唆された。物理特性については、組織が乾燥すると特性が変化してしまうことから、新たな計測用水槽を設計し、湿潤環境でおこなえるシステムを考案・設計し実現した。また新たにデジタル化されたシステムを用いて、より高精度かつ高速に定量的評価がISO基準に準拠して行えるようになった。様々な処理を行った組織について、より多くのパラメーターについて計測が行えるようなった。物理特性評価を脱細胞処理方法にフィードバックし動物移植実験をおこなうことにより、更に理想的なグラフト開発が行えると考えられた。今後も研究を継続する予定である。平成30年度が最終年度であるため、記入しない。28年度は様々な形状の医療用シリコン基材を用いて、得られた組織が臨床使用にふさわしいかどうかを力学的・組織学的に検討した。またこれまで行った小動物およびビーグル犬と同様の手法を用いてブタを用いた自家動脈移植実験を行った。代用血管としての確実性・安全性を今後継続して検討する予定である。さらにShelf Ready Graftとしての異種組織応用技術の開発にも着手した。過去にビーグル犬由来のバイオチューブをグルタルアルデヒド処理したグラフトを用いた実験を行ったが、自家組織と比較して治癒が遅れる傾向が認められた。そこで本年度は脱細胞処理を試みた。ただし脱細胞処理により力学的強度がやや低下する可能性があるため、十分な脱細胞が行われておりかつ強度が十分に保たれている脱細胞条件を検討している。パイロットスタディーとして、脱細胞処理された径2mmのビーグル犬由来バイオチューブをラット腹部大動脈に移植した。2ヶ月間の植込みで自家由来バイオチューブ同様に良好な組織化を観察することが出来た。またこの間体循環(動脈)環境における十分な強度を保持し得た。また当初の計画通り同種移植の可能性についての検討も開始した。ブタを用いた脱細胞化同種組織の移植パイロットスタディーでは28年度内には最大6週までの結果を確認できたが、良好な結果が得られつつある。バイオチューブが適応されると想定される、ハイリスク患者・高齢者・未熟児などでは組織再生能力が低下しており、組織化の不確実性があると予測される。そこで、現在進めている自家移植用グラフトに開発にとどまらず、より確実に良好なグラフトを作成するために、健常な成人由来の同種バイオチューブの開発についても並行して行う必要があると考えられた。現時点では良好な結果が得られつつあるので今後引き続き本研究を継続してゆく予定である。当初の計画どおり順調に進展している。29年度はこれまでに引き続き自家動脈移植実験を継続した。代用血管としての確実性・安全性検証を今後継続する予定である。さらにShelf Ready Graftとしての異種組織応用技術の開発も同時並行で継続している。そこで28年度後半より脱細胞処理を開始している。脱細胞処理により力学的強度がやや低下する可能性があるため、十分な脱細胞が行われておりかつ強度が十分に保たれている脱細胞条件を検討している。自家由来バイオチューブ同様に良好な組織化を観察することが出来た。またこの間体循環(動脈)環境において十分な強度を保持し得た。ブタを用いた脱細胞化同種組織の移植パイロットスタディーでは良好な結果が得られた。更に経時的変化を観察するためにビーグル犬を用いた同種移植実験も開始し4週以内の早期に組織再生が誘導されることが明らかとなりつつある。物理的特性評価についても追加システムを構築して継続的に行っている。

現在良好な結果が得られつつあるので今後引き続き本研究を継続してゆく予定である。現在行っている動物実験について、29年度はおおむね順調にデータ収集が進んでおり、継続して実験を行う予定である。30年度中に予定通りの研究を終了できる見込みである。30年度は29年度に引き続き、自家移植実験を継続する一方で、適応拡大のためにShelf Ready Graftとしての異種・同種組織応用技術の開発を進めた。28年度より着手した脱細胞処理をさらに最適化し処理プロトコールを短縮、7時間程度で十分な脱細胞処理が行えるようになった。DNA定量・物理特性も問題なく、動物移植実験が現実的となった。その後、脱細胞処理した径2mmのビーグル犬由来バイオチューブをラット腹部大動脈に異種移植した。自家由来バイオチューブ同様に急速かつ良好な組織化と体循環環境下での強度を保持が確認できた。この研究については論文報告を行った。一方で異種移植は臨床応用には安全性確保のためのハードルが高く、実際の使用にはまだ時間を要すると考えられる。そこで同種移植応用技術開発も昨年度同様に継続した。ビーグルを用いた同種移植実験では早期に組織化が完成しており、自家移植よりもさらに迅速な治癒過程が示された。臨床応用の際に移植適応されると想定される、ハイリスク患者・高齢者・未熟児など組織再生能力が低下した患者への応用には、健常な成人由来の同種バイオチューブの応用も、より実現性の高い選択肢として可能であると示唆された。物理特性については、組織が乾燥すると特性が変化してしまうことから、新たな計測用水槽を設計し、湿潤環境でおこなえるシステムを考案・設計し実現した。また新たにデジタル化されたシステムを用いて、より高精度かつ高速に定量的評価がISO基準に準拠して行えるようになった。様々な処理を行った組織について、より多くのパラメーターについて計測が行えるようなった。物理特性評価を脱細胞処理方法にフィードバックし動物移植実験をおこなうことにより、更に理想的なグラフト開発が行えると考えられた。今後も研究を継続する予定である。本年度も計画通りの研究を推進する予定である。現在行っている上述の動物実験について、30年度にも引き続き経過観察を行いデーター収集を継続する。組織処理については形成された組織の耐久性・信頼性を高めるために、脱細胞処理に加えて様々な化学処理法についても検討する。力学的特性評価を動物移植前後の組織について行い、最適な条件について探求する。これらの実験と成果報告を行う予定である。平成30年度が最終年度であるため、記入しない。
現代アメリカにおける道徳教育のポリティクス:批判的教育研究から見た人格教育の諸相

アメリカ合衆国において近年注目されてきた人格教育と呼ばれる道徳教育の動向を文献及び実地調査によりその具体的な姿を明らかにし、これを批判的教育研究という観点から政治学的要因を踏まえて分析した。批判的教育研究の基礎理論や政治学的諸問題に関しては論文として発表し、人格教育の分析は学会発表により明らかにした。本年度は、主として次の4つの作業に従事した。(1)研究対象である米国の人格教育の背景をなすと考えられる政治・社会状況に関する理解を深めるために、リベラリズム理論を軸に、政治学・社会学理論を参照すること。(2)分析視角の精緻化のために、米国における批判的教育研究の理論的成果と課題を、文献研究に基づいて明らかにすること。(3)米国における人格教育に関する論争の要点を雑誌論文に基づいて整理すること。(4)米国のカリフォルニア州やウィスコンシン州における一般の小学校やミドルスクールでの実態を調査した。このうち、19年度に論文として成果を発表できたのは、(2)に関する研究のみである。そこでは、批判的教育研究の文脈において人格教育の動向をいち早く批判したヘンリー・ジルーの教育論を取り上げ、その批判性の意義と限界を明確化することに努めた。また、同国における批判的教育研究の代表的論客のもう一人マイケル・アップルの著作(邦訳)に関する比較的詳細な書評の中で、ジルーとは異なる批判的視点の可能性について若干の考察を加えた。人格教育がNCLB法の中で推進されている現状を、ネオコンサーヴァティズムとネオリベラリズムの結合関係として分析する作業や、人格教育と呼ばける道徳教育の教育現場における実践動向に関するより具体的な分析、及び多様な価値観の共存に向けたりベラルな道徳教育の可能性に関する考察に関しては、次年度の学会発表や報告書の中で進める予定である。これらによって、米国における道徳教育の政治社会学的文脈とともに、成熟社会(ポストモダン社会)におけるより現実的・実効的な道徳教育カリキュラムの可能性を明らかにしたい。(1)研究対象である米国の人格教育の背景をなすと考えられる政治・社会状況に関する理解を深めるための政治学的研究、(2)分析視角の精緻化のための、米国における批判的教育理論に関する文献研究、(3)米国における人格教育に関する論争の要点を的確に把握するための資料収集、(4)米国のカリフォルニア・ウィスコンシン・ノースカロライナ州における小学校やミドルスクール、ハイスクールでの実態調査、以上である。これらを通じて、米国における道徳教育の現状を批判的教育理論の観点から分析する可能性、及び、その方法論的視覚がより明確化でいるようになった。特に、人格教育がNCLB法の中で推進されている現状を、ネオコンサーヴァティズムとネオリベラリズムの結合関係として分析する作業や、人格教育と呼ばれる道徳教育の教育現場における実践動向に関するより具体的な分析に踏み込むことができるようになった。しかし、年度末に新資料が発掘されたので、この分析の発表は学会での口頭発表に留まっており、論文の執筆は21年度にずれこむことになった。また、多様な価値観の共存・多文化共生に向けたりベラルな道徳教育の可能性に関する考察に関しては、文献研究に時間がかかっており、これも論文としての発表は21年度になる。他方で、実地調査によって、米国での人格教育を考える場合、道徳教育思潮や理念の動向に関してのみならず、出版資本により編集されたマニュアル化された教材の普及という政治経済学的要因が無視できないことが明らかになった。しかし、この点も研究成果として発表するには、まだ多少時間がかかることになりそうである。
インターフェロン-γ遺伝子発現調節による口腔癌治療法の確立

近年、固形癌の治療成績は飛躍的に向上しつつあるが、浸潤、転移、再発による死亡率は依然として増加傾向にあり、新たな治療法の開発が制癌研究の重要な課題となっている。インターフェロン-γ(IFN-γ)は生体内で多彩な作用を示すサイトカインであるが、特に細胞増殖や分化において重要な役割を果たしていることが明らかとなっている。例えばIFN-γはある種の癌細胞に直接作用してその増殖を抑制する一方、マクロファージを活性化し、その抗腫瘍作用を誘導し、癌細胞に対する生体の防御機構において重要な役割を果たしていると考えられている。今回我々は、IFN-γを用いた口腔癌の治療法を開発するための基礎的研究として、IFN-γレセプター遺伝子欠失マウス(IFN-γR^<0/0>マウス)に、同系腫瘍であり高転移能を有するB16メラノーマ細胞を側尾静脈より移植し、3週間後にマウスを屠殺し肝臓、肺、脾臓を摘出し、組織学的および分子生物学的に転移状態を分析し、癌細胞の転移におよぼすIFN-γの作用を検討した。その結果、IFN-γR^<0/0>マウスの各臓器に比較して、野性型マウスより摘出した臓器に、より多数の転移巣を認めた。野性型、IFN-γR^<0/0>マウス間で血中IL-1α、IL-6、TNF-α、IL-18レベルに大きな差は認められなかった。また、マクロファージの抗腫瘍活性の作用物質とされる一酸化窒素の血中レベルも両マウス間で変化を認めなかった。しかし、RT-PCR法により各臓器のIL-12mRNAレベルを解析したところ、IFN-γR^<0/0>マウスのIL-12mRNAレベルは野性型のそれよりも有意に上昇していることが明らかとされた。以上より、IFN-γが作用しない条件下では、IL-12が生体の抗腫瘍免疫能を誘導している可能性が示唆された。例えば、IFN-γはある種の癌細胞に直接作用してその増殖を抑制する一方、マクロファージを活性化し、その抗腫瘍作用を誘導する。このよういIFN-γは癌細胞に対する生体の防御機構において重要な役割を果たしていると考えられている。これまで我々はIFN-γレセプターを先天欠失するマウスを用いて、生体防御機構におけるIFN-γの本質的な役割を検討してきた。今回我々は、IFN-γを用いた口腔癌の遺伝子治療を開発するための基礎的研究として、IFN-γレセプター遺伝子欠失マウス(IFN-γRo^</o>マウス)に同系腫瘍であり、高転移能を有するB16メラノーマ細胞を側尾静脈より移植し、移植3週間後にマウスを屠殺し、肝臓、膵臓、肺を摘出し、組織学的に転移の有無を検討した。その結果、野生型マウスの各臓器に比較して、IFN-γ^<o/o>マウスより摘出した臓器に、より多数の転移巣を認めた。野生型、IFN-γR^<o/o>

マウス間で血中IL1-α,IL-6,TNFレベルに大きな差は見られなかった。また活性化マクロファージの抗腫瘍効果の作用物質とされる一酸化窒素の血中レベルも野生型、IFN-γR^<o/o>マウス間で変化は見られなかった。以上より生体内で産生されるIFN-γは、癌細胞の転移制御において重要な役割を果たしていると示唆された。近年、固形癌の治療成績は飛躍的に向上しつつあるが、浸潤、転移、再発による死亡率は依然として増加傾向にあり、新たな治療法の開発が制癌研究の重要な課題となっている。インターフェロン-γ(IFN-γ)は生体内で多彩な作用を示すサイトカインであるが、特に細胞増殖や分化において重要な役割を果たしていることが明らかとなっている。例えばIFN-γはある種の癌細胞に直接作用してその増殖を抑制する一方、マクロファージを活性化し、その抗腫瘍作用を誘導する。このようにIFN-γは癌細胞に対する生体の防御機構において重要な役割を果たしていると考えられている。今回我々は、IFN-γを用いた口腔癌の治療法を開発するための基礎的研究として、IFN-γレセプター遺伝子欠失マウス(IFN-γR^<0/0>マウス)に、同系腫瘍である高転移能を有するB16メラノーマ細胞を側尾静脈より移植し、3週間後にマウスを屠殺し肝臓、肺、脾臓を摘出し、組織学的および分子生物学的に転移状態を分析し、癌細胞の転移におよぼすIFN-γの作用を検討した。その結果、IFN-γR^<0/0>マウスの各臓器に比較して、野生型マウスより摘出した臓器に、より多数の転移巣を認めた。野生型、IFN-γR^<0/0>マウス間で血中IL-1α、IL-6、TNF-α、IL-18レベルに大きな差は認められなかった。また、マクロファージの抗腫瘍活性の作用物質とされる一酸化窒素の血中レベルも両マウス間で変化を認めなかった。しかし、RT-PCR法により各臓器のIL-12mRNAレベルを解析したところ、IFN-γR^<0/0>マウスのIL-12mRNAレベルは野生型のそれよりも有意に上昇していることが明らかとされた。以上より、IFN-γが作用しない条件下では、IL-12が生体の抗腫瘍免疫能を誘導している可能性が示唆された。
統合生理学的手法による心臓拡張機能障害の病態解明と新規治療法の開発

心臓拡張機能障害による心不全は、心筋細胞レベルでの研究の進展が求められている。心筋細胞の長軸方向だけでなく短軸方向の力学的特性も心臓拡張機能に影響している可能性がある。本研究では原子間力顕微鏡を用いて単離心筋細胞の短軸方向の硬さを測定し、生理的単収縮において心筋細胞の硬さが減少することを見出し、筋原線維の構造変化の様式が短軸方向の力学的特性に大きく関与している可能性が示唆された。またジストロフィン欠損心筋細胞において、細胞短軸方向の力学的伝達の消失をもたらす細胞膜蛋白の局在異常を可視化し、高分子化合物による心筋細胞膜破綻の修復効果を検証した。心臓拡張機能障害による心不全は、詳細な病態や発症機序が不明な部分が多く、心筋細胞レベルでの基礎研究の進展が求められている状況である。申請者のこれまでの研究を含めて従来の心筋細胞の拡張機能の評価は、心筋細胞の長軸方向の力学的測定によりなされてきた。一方、心筋壁は心筋細胞が一定方向に配列して形成される細胞シートが層状に積み重なった構造を有していることから、心筋細胞の短軸方向の硬さも心臓拡張機能に影響する可能性があるが、如何にして、あるいは拡張期の何れの時相に影響するかは未だ定かではない。平成25年度は、心臓拡張機能障害の細胞レベルでの解析を目指して申請者がこれまでに改良を続けてきた単離心筋細胞の長軸方向の張力測定装置に加えて、新たに原子間力顕微鏡を駆使した短軸方向の硬さ測定法を開発した。まず基礎実験として、1)正常およびジストロフィン欠損(mdx)マウス心筋細胞の詳細な細胞膜表面形状の解析を行い、細胞単離条件の調節により、細胞膜表面の蛋白塊の局在の違いを見出した。ジストロフィン欠損による細胞膜表面蛋白の局在の変化は、ジストロフィン-サルコグリカン-ジストログリカンおよび細胞膜に連結した細胞外マトリックスの減少を反映していると考えられた。続いて、2)原子間力顕微鏡の押し込み力測定機能を用いて、正常心筋細胞の短軸方向の硬さを記録し、心筋細胞の単収縮において硬さが減弱することを見出し、国際学会(2013年11月米国心臓協会、および2014年3月日本循環器学会)にて報告した。心臓拡張機能障害による心不全は、詳細な病態や発症機序が不明な部分が多く、細胞レベルでの基礎研究の進展が求められている。心筋壁は心筋細胞シートが層状に積み重なった構造を有していることから、心筋細胞の短軸方向の硬さは心臓拡張機能に影響する可能性があるが、如何にして、あるいは拡張期の何れの時相に影響するかは未だ定かではない。平成25年度に開発した原子間力顕微鏡を駆使した短軸方向の硬さ測定法を用いて、平成26年度は、正常マウスとジストロフィン欠損(mdx)マウスの心筋細胞の短軸方向の力学的特性を比較した。mdxマウスの心筋細胞の短軸方向の硬さは正常対照と比較して有意な差を認めず、ジストロフィンの有無やジストロフィン関連蛋白の局在の変化は心筋細胞の短軸方向の硬さに影響を与えないことが示された。イソプロテレノール投与により静止状態の正常心筋細胞の硬さは有意に増加し、交感神経β受容体刺激の急性効果として心筋細胞の硬さが増加することが明らかとなった。また単収縮における心筋細胞の短軸方向の硬さを1秒間に約40回の力分光法で測定した。単収縮に伴い、硬さとしてのヤング率が低下した。イソプロテレノールにて有意に収縮ピーク時の硬さは低下した。すなわち、収縮に伴うサルコメアの構造がより過大に変化するとともに心筋細胞の硬さもより大きく低下した。これらの結果より、心筋細胞の短軸方向の弾性率を支配的に規定しているのは筋原線維であり、おそらくその他の細胞骨格が細胞全体の硬さに与える影響は相対的に小さいことが示唆される。また、クロスブリッジの早い運動による単収縮と、静止状態のクロスブリッジ運動の遅い緊張(pre-systole)とでは心筋細胞の短軸方向の硬さの変化が真逆であったことから、筋原線維の構造の変化の様式が短軸方向の力学的特性に大いに関与している可能性が示唆された。心臓拡張機能障害による心不全は、発症機序が不明な部分が多く、心筋細胞レベルでの研究の進展が求められている。従来の心筋細胞の拡張機能の評価は、心筋細胞の長軸方向の力学的測定によりなされてきた。一方、心筋壁は心筋細胞が一定方向に配列して形成される細胞シートが層状に積み重なった構造を有していることから、心筋細胞の短軸方向の硬さも心臓拡張機能に影響する可能性があるが、如何にして、あるいは拡張期の何れの時相に影響するかは不明である。平成26年度は正常およびジストロフィン欠損(mdx)マウス心筋細胞の短軸方向の力学的特性を比較し、短軸方向の弾性率を支配的に定義しているのは筋原線維であり、ジストロフィン欠損による心臓拡張機能障害はジストロフィン関連蛋白の細胞膜上の局在異常および細胞膜の破綻による細胞外からのCa流入によることが示唆された。平成27年度は、心筋細胞の長軸方向の発生張力と短軸方向の硬さの同時測定装置および細胞外から細胞内への力学的負荷を伝達するための細胞膜上蛋白に付着する抗体付きビーズを開発した。

また心筋細胞膜破綻に対する新規治療薬の候補を探るため3ブロック構造(親水基-疎水基-親水基)を有し各ブロックの分子量や親水基/疎水基の比率の異なるポロキサマーP124, P338, P407,およびP188を比較し、P188のみがジストロフィン欠損心筋細胞の受動的伸展における発生張力を低下させ、細胞膜修復効果を示した。また心筋の短軸方向に沿った心内膜側・中間層・心外膜側の3層において心筋細胞への力学的負荷が変化する可能性があり、イオンチャネルへの影響も予想されるため、基礎研究として3層におけるhERGチャネルの阻害が心筋活動電位に及ぼす影響をhERG発現細胞を用いたパッチクランプ測定と計算モデルにて解析した。中間層は他の2層と比較して活動電位の遅延の様式が異なっていた。心筋細胞の長軸方向の張力・短軸方向の硬さ測定装置と細胞膜蛋白に付着する抗体付きビーズを開発したが、さらに心筋細胞の長軸方向への力学的負荷を任意に変化させる際の指標とするサルコメア長および短軸方向への力学的負荷を変化させる際のビーズの挙動を解析する実験装置の開発に時間を要したため。心臓拡張機能障害による心不全は、発症機序が不明な部分が多く、心筋細胞レベルでの研究の進展が求められている。従来の心筋細胞の拡張機能の評価は、心筋細胞の長軸方向の力学的測定によりなされてきた。一方、心筋壁は心筋細胞が一定方向に配列して形成される細胞シートが層状に積み重なった構造を有していることから、心筋細胞の短軸方向の硬さも心臓拡張機能に影響する可能性があるが、如何にして、あるいは拡張期の何れの時相に影響するかは不明である。平成26年度は正常およびジストロフィン欠損(mdx)マウス心筋細胞の短軸方向の力学的特性を比較し、短軸方向の弾性率を支配的に定義しているのは筋原線維であり、ジストロフィン欠損による心臓拡張機能障害はジストロフィン関連蛋白の細胞膜上の局在異常および細胞膜の破綻による細胞外からのCa流入によることが示唆された。平成27年度は、心筋細胞の長軸方向の発生張力と短軸方向の硬さの同時測定装置および細胞外から細胞内への力学的負荷を伝達するための細胞膜上蛋白に付着する抗体付きビーズを開発した。また心筋細胞膜破綻に対する新規治療薬の候補を探るため、3ブロック構造を有し各ブロックの分子量や親水基/疎水基の比率の異なるポロキサマーによるジストロフィン欠損心筋細胞の受動的伸展における細胞膜の修復効果を比較した。平成28年度は、心筋細胞の長軸方向への力学的負荷を任意に変化させる際の指標とするサルコメア長の変化を高い時間・空間分解能で測定し、心筋細胞の長軸方向の張力・短軸方向の硬さ測定装置を改良した。また、心筋細胞の短軸方向への力学的負荷を変化させる際の抗体付きビーズの挙動を検出する際に細胞周囲の液体の流れの影響を受けるため、流体解析ソフトウエアによる補正を追加し測定精度を改良した。心臓拡張機能障害による心不全は、心筋細胞レベルでの研究の進展が求められている。心筋細胞の長軸方向だけでなく短軸方向の力学的特性も心臓拡張機能に影響している可能性がある。本研究では原子間力顕微鏡を用いて単離心筋細胞の短軸方向の硬さを測定し、生理的単収縮において心筋細胞の硬さが減少することを見出し、筋原線維の構造変化の様式が短軸方向の力学的特性に大きく関与している可能性が示唆された。またジストロフィン欠損心筋細胞において、細胞短軸方向の力学的伝達の消失をもたらす細胞膜蛋白の局在異常を可視化し、高分子化合物による心筋細胞膜破綻の修復効果を検証した。心筋細胞の長軸方向の張力と短軸方向の硬さを同時に測定できる実験装置の開発に時間を要する。また、光ピンセット法の実験装置の調整にも時間を要する。
ゲノム編集による遺伝子ネットワークのin vivo再構成技術を用いた進化発生研究

発生を制御する遺伝子ネットワークの進化プロセスについては未だ不明な点が多く,実験的な検証が可能なケースも限られている.本研究は,ゲノム編集技術の応用により遺伝子ネットワークを再構築する技術を確立することを目的とした.発生・再生研究のモデル昆虫,フタホシコオロギを使用し,CRISPR/Cas9システムによるゲノム編集を用いた遺伝子ノックアウトおよびノックインに成功した.さらに,標的遺伝子のエンハンサートラップにより遺伝子発現をモニターする系統を作出した.コオロギにおいて,シス転写調節領域の操作による遺伝子ネットワーク改変実験を可能とする技術基盤が確立された.コオロギのシス調節配列改変実験のために,人工ヌクレアーゼZFN, TALENに加えて,より簡便な系であるCRISPR/Casシステムを導入した。同じ遺伝子座(laccase2遺伝子)について生殖系列での変異導入効率を比較したところ,ZFN(47%), TALEN(17%)に対しCRISPR/Casでは77%と顕著に高く,他の遺伝子座でも同様に高効率であった。このため,CRISPR/Casシステムを用いてシス調節配列改変技術を確立を目指すことにした。1,標的配列の欠失: 2種類のガイドRNAを用いてそれらの標的部位間の配列の欠失を試み,標的部位近傍にマイクロホモロジーがあるようにガイドRNAを設定することで,目的の欠失を誘導可能であることが示された。2,外来配列のノックイン:相同組換えによるノックイン実験では結果が得られなかったため戦略を変え,非相同末端結合経路によるノックインを試みた。インジェクション当代において外来配列の標的部位への挿入を示す結果が得られた。現在次世代への伝搬効率を調べており,ノックイン系統を効率良く確立するための実験を進めている。昨年度中に、CRSPR/Casシステムを用いることで遺伝子ノックアウトがコオロギで高効率に行えること見出しており、本年度は同システムによるゲノム改変の技術開発を重点的に進めた。1.まず、CRSPR/Casシステムによる変異導入の実験条件の最適化を行った。ガイドRNAの導入量などを検討し、導入世代の体細胞への変異導入効率および次世代への変異伝搬効率の高い条件を明らかにした。2.さらに,遺伝子ノックアウト技術の確立を目指した。昨年度末までに、コオロギゲノムへの遺伝子ノックインを示唆するデータが得られていたが、ノックインベクターを改良するなどして、より効率良く、また、ノックインの検出が容易な系をデザインした。その結果、複数の標的遺伝子座へのGFPの発現カセットのノックインに成功し、次世代への伝搬を確認した。標的遺伝子のエンハンサーをトラップすることができており、今後シス領域の改変実験に使用することが可能と考えられる。昨年度までに、コオロギにおけるCRSPR/Casシステムによる遺伝子ノックイン技術の開発に成功しており、遺伝子ネットワーク改変実験への応用に向けてノックイン効率の向上のための実験条件最適化を行った。その結果、ドナーベクター無しのノックアウト実験の場合と異なる、ノックイン実験に適したガイドRNA、Cas9の導入量が明らかになった。その成果をもとに遺伝子発現をモニター可能な系統の作製を進めた。発生初期のパターン形成に関わるeven-skippedやhunchbackなどの遺伝子座を標的として蛍光マーカー遺伝子の発現カセットをノックインし、これらの遺伝子のエンハンサーをトラップすることを試みた。その結果、ノックインには成功したものの、マーカー遺伝子による蛍光発現は検出できなかった。Hox遺伝子座では同様の実験が成功しており、遺伝子座によってドナーベクターに使用するプロモーターの種類や、導入部位を検討する必要があると考えられる。一方で、ノックアウト変異体におけるin situhybridizationなどによる関連発現の発現変化についてデータを得ており、遺伝子ネットワークの変化の影響について論文執筆中である。発生を制御する遺伝子ネットワークの進化プロセスについては未だ不明な点が多く,実験的な検証が可能なケースも限られている.本研究は,ゲノム編集技術の応用により遺伝子ネットワークを再構築する技術を確立することを目的とした.発生・再生研究のモデル昆虫,フタホシコオロギを使用し,CRISPR/Cas9システムによるゲノム編集を用いた遺伝子ノックアウトおよびノックインに成功した.さらに,標的遺伝子のエンハンサートラップにより遺伝子発現をモニターする系統を作出した.コオロギにおいて,シス転写調節領域の操作による遺伝子ネットワーク改変実験を可能とする技術基盤が確立された.シス配列の改変には至らなかったが、ノックイン技術が確立され、発現レポーター系統を得ることができ、基盤技術開発で大きな進展があったため。発生生物学作製した発現レポーター系統を利用して、ゲノム編集によるシス候補領域の改変実験を行う。現有ノックイン技術は非相同末端結合に依存しており標的部位の改変の厳密さに限界があるため、相同組換えの導入などによる技術改良を並行して進め、随時利用する。体節パターン形成に関わる遺伝子ネットワークの再構成実験系の早期の確立を目指す。シス調節配列の操作には至らなかったものの,ゲノム編集技術による標的配列の除去および外来配列のノックインに成功し,シス改変の基盤となる技術開発が順調に進んでいるため。初年度の残額の一部を研究協力謝金として使用する計画であったが、その大部分を他の予算でまかなうことができたため、当初計画より小額の支出となり残額が生じた。CRISPR/Casシステムをベースとして開発した新規ゲノム改変技術をさらに改良,最適化し,シス調節配列を操作した個体を作製する系を早期に確立する。本実験系により,体節パターン形成に関わる遺伝子ネットワークの再構成を試みる。物品費として使用する計画である。トランスクリプトームを計画していたが,ゲノム改変技術の開発に集中することがその後の研究の展開において非常に重要と判断しこれを中止したため。

新たに開発したゲノム改変技術の改良とそれを用いた実験に使用する。多数のゲノム改変系統を維持する必要が生じるため,一部は研究協力謝金に使用する。
遺伝学とトランスクリプトームの統合による高脂血症の遺伝子ネットワークの解明

我々は、高脂血症関連遺伝子の発現量を調節するゲノム領域を発見し、その遺伝子ネットワークを描出した。まず、高脂血症に関わる脂質代謝の表現型がそれぞれ異なっているマウス組み換え近交系(BXD)を用いて、DNAマイクロアレイにより系統間の遺伝子発現量を測定した。次に、同一の遺伝子発現制御を受けていると考えられる遺伝子群を得るため、系統間の遺伝子発現プロファイルをクラスタリング(r^2>0.8,p-value<0.05)した。このなかから、脂質代謝関連遺伝子の発現クラスターを得た。この遺伝子群の発現制御を行っている遺伝子、つまり遺伝子ネットワークの上流に位置する遺伝子が存在するゲノム領域を予測するために、この遺伝子群の発現プロファイルの平均値を量的形質と見立てて、量的形質遺伝子座解析を行った。その結果、我々は、2つのゲノム領域(それぞれ、LOD:11.6,12.6,p-value:0.002,0.001)によって、遺伝子発現量が制御されていることを遺伝学的に示した。さらに、この2つの領域は、マウスの体重や血中の中性脂肪など高脂血症の表現型の量的形質遺伝子座であり、比較ゲノム解析により、ラットゲノム相同領域においても、糖尿病や高脂血症の量的形質遺伝子座として知られている領域と一致することを示した。この2つ領域には、脂質代謝関連遺伝子の発現を制御し、その結果、高脂血症の表現型を引き起こす遺伝子が存在すると考えられる。今後、この遺伝子が明らかにできれば、有力な高脂血症の創薬標的遺伝子となるだろう。
技能伝承を支援するための生体信号利用による触力覚インタフェースの開発

高度な技能を身につけるには遂行の早さと正確さが必要であり、経験や同じ手続きの繰り返しが求められる。しかし、再現性の高い訓練環境が整備されているとは言いがたい。そこで、技能訓練を支援するインタフェースの高度化を図る。微妙な調整が要求される作業では、感覚情報が重要な役割を担う。そのため、視覚や聴覚だけではなく、触覚の情報を提示し、これらが整合した体感的インタラクションを提供する。触力覚提示装置を利用することにより、触知インタラクションを提示するハプティック・システムを構築した。本研究の目的は、主観的な経験・体験に基づく知識としての体感的情報を再現する環境を構築することである。そこで、触力覚フィードバックによる触力覚情報を提示する触力覚インタフェースを開発する。そのために、手や腕の動作と力の入れ具合を計測し、その力に応じたフィードバックを与える仕組みを構築する。当該年度は、作業時における手及び指の動作による力の入れ具合を推定するため、腕の筋活動を計測するシステムを構築した。接触物体や接触環境など様々な条件で計測を行い、特徴を効果的に抽出できるか試みた。しかし、筋活動に付随する雑音が多く、適切に特徴抽出できないことがわかった。そこで、雑音に頑健な仕組みを構築するため、特徴抽出、パターン識別、学習の過程で構成されるシステムにおいて、特徴抽出を行う前に前処理を適宜行うと同時に、適応的に特徴を選択して候補の絞り込みを行うことにより推定することにした。触力覚デバイスを複数接続し、同時に協調動作させる方式と通信プロトコル、デバイスの特性に応じた反力提示の実装方法を検討した。その結果、通信遅延が及ぼす影響が小さくないこと及び反力情報と視覚情報の同期問題を低減する必要があることを認識した。インタラクション特性について、関連分野での学会等で研究発表を行うとともに、インタフェース研究の最新動向を調査した。その結果、触力覚インタフェースとして触力覚フィードバックを忠実に提示するだけではなく、人の触力覚特性に応じた提示を行う必要があることがわかった.本研究の目的は、主観的な経験・体験に基づく知識としての体感的情報を再現する環境を構築することである。そこで、触力覚フィードバックによる触力覚情報を提示する触力覚インタフェースを構築する。作業時における手腕の動作特性を筋活動の計測から分析し、力の入れ具合に整合した触力感覚の提示を考えていたが、前年度の結果から筋活動データに含まれる雑音の影響で動作特徴の抽出が困難であると予想されたため、仮想物体の接触具合に基づいて力情報を計算する仕組みでプロトタイプを設計した。当該年度は、力覚フィードバックを与える力覚デバイスを設計し、プロトタイプを実装した。3次元空間における仮想物体同士の衝突を2次元的に張力で表現した。力覚デバイスを構成する部品として汎用的なものを利用し、比較的容易に構築できるようにした。力の与え方は、仮想物体同士の干渉具合を算定し、その程度に応じて逐次力情報を出力する仕組みとした。これに伴い、3次元空間内の仮想物体の制御は、PCに付属のマウスで2次元的に操作できるようにした。自由度は制限されるが、特殊な装置を必要としなくて済む。力覚情報の視覚情報との連携によるマルチモーダルインタラクションを考察するため、分子構造を視覚的に提示し、それに整合した力覚を提示するシステムを設計した。接触物体の属性や接触条件をパラメータとして、さまざまな状況を再現する仕組みを検討した。力覚デバイスを複数接続し、同時に協調動作させる方式として、仮想物体の位置情報だけを送り、力情報は各端末で計算する構成を設計し、プロトタイプを実装した。前年度の結果から、筋活動の計測データに含まれる雑音の影響で、動作特徴に関する力の入れ具合の抽出が困難であると判断し、仮想物体の干渉に基づいて力を計算する仕組みでシステムを構築した。当該年度は、張力を使用して力を提示する手法を取り入れた力覚提示デバイスを、三次元空間での仮想物体同士の衝突を力覚フィードバックとして提示するシステムに実装した。力の提示は、三次元空間内の仮想物体同士の干渉具合を算出し、その程度に応じて高速に出力できる仕組みとした。位置センサとしてPC付属のマウスを利用しており、マウス・ポインタの位置取得とこれに伴う視覚情報の制御処理は力覚提示処理とは別に行う構成とした。力覚情報を視覚情報と連携させることにより、マルチモーダルインタラクションを実現した。力覚インタフェースの性能や視覚情報との整合性を評価するため、具体的な2つのテストプログラムを構築した。一つは、三次元物体のインタラクションを電気的特性と幾何学的特性との組み合わせによって制御するものである。幾何形状だけではなく、静電特性を加えることにより、物体同士の複雑なインタラクションを表現できるようになった。

もう一つは、現実世界の奥行き情報を取得し、これを三次元物体として力覚提示によって体感させるものである。見えてはいるが、実際に触ることができないような状況において応用の可能性があると考えている。前年度に筋活動データを測定したところ、雑音が動作特徴の抽出を難しくしており、力の入れ具合の推定を精度良く行うことが困難になると予想された。そこで、3次元空間内の物体の干渉具合に基づいて力覚フィードバックを与える仕組みを設計し、プロトタイプを実装することとした。24年度が最終年度であるため、記入しない。今後、実装した力覚デバイスについて、力覚フィードバックを与える性能を評価し、その改善を図る。また、複数の力覚デバイスによる協調動作を行う仕組みを高度化する。可視化機能との連携によるマルチモーダルインタフェースを構築し、学習コンテンツのプロトタイプを設計・実装する。教育・学習で利用されるためには、安価である必要がある。そのため、構築した力覚デバイスについて一つ一つの部品を精査し、安価な部品に代替え可能かどうか検討する予定である。
光操作法と神経路特異的破壊法を活用した新しい行動薬理学による負情動生成機構の解明

脳内分界条床核において、神経ペプチドであるCRFとNPYによる神経情報伝達が、痛みによる不快情動生成において相反的な役割を果たすことを明らかにした。また、これら神経ペプチドが分界条床核II型神経細胞に選択的に作用し、その活動をCRFは促進し、NPYは抑制することを示した。さらに、組織学的解析により、分界条床核II型神経細胞の活動亢進が、腹側被蓋野ドパミン神経の活動を抑制することにより不快情動を惹起する可能性を示し、痛みによる不快情動生成の神経機構を明らかにした。本研究では、1)痛覚受容からextended amygdalaに至る神経回路・神経情報伝達機構の解明、2)痛みによる不快情動生成に関わるextended amygdala内およびextended amygdalaと他脳領域間の神経回路・神経情報伝達機構の解明、3)Extended amygdalaからモノアミン神経核への神経投射の抑うつ・不安情動生成における役割の解明に関する研究を行う計画である。研究計画調書では3つの研究の遂行を便宜的に年度ごとに振り分けたが、研究の効率性を考慮し、3つの研究テーマを並行して行い、一定の研究成果が得られたテーマを優先的に推進していくこととした。平成23年度の研究では、痛み刺激により分界条床核においてCRF遊離が亢進することをマイクロダイアリシス法により明らかにするとともに、電気生理学的解析によりCRFが分界条床核内2型神経細胞の神経活動を亢進させることを示した。さらに、組織学的解析により、分界条床核から腹側被蓋野にGABA含有神経が投射していること、このGABA投射神経は腹側被蓋野内においてドパミン神経よりもむしろGABA介在神経にシナプスを形成していることが明らかとなった。これらの研究成果より、分界条床核において痛みにより遊離亢進したCRFは、分界条床核内2型神経細胞(GABA含有介在神経)を活性化し、分界条床核から腹側被蓋野に投射するGABA神経を抑制することで、腹側被蓋野内GABA介在神経を活性化し、最終的には腹側被蓋野内ドパミン神経を抑制して嫌悪情動あるいは抑うつ情動を生成させるものと考えられた。平成24年度には光操作法をもちいた行動薬理学的解析および電気生理学的解析により本仮説をさらに検証していく予定である。前年度までの研究により、分界条床核において痛みにより遊離亢進したCRFが、分界条床核内2型神経細胞(GABA含有介在神経)を活性化し、分界条床核から腹側被蓋野に投射するGABA神経を抑制することで、腹側被蓋野内GABA介在神経を活性化し、最終的には腹側被蓋野内ドパミン神経を抑制して嫌悪情動あるいは抑うつ情動を生成させる可能性が示された。さらに、ニューロペプチドY(NPY)の分界条床核内投与により痛みによる不快情動が抑制されること、NPY同時適用によりCRFの分界条床核2型神経細胞の活性化が抑制されることを明らかにした。これらの結果は、分界条床核内でCRFとNPYが相反的に働き、痛みによる不快情動を制御していることを示している。今年度の研究では、CRFによる分界条床核内2型神経細胞の活性化が、アデニル酸シクラーゼーcAMPーPKA系の活性化を介していることを種々の阻害薬・活性化薬を用いた電気生理学的解析により明らかにした。一方、本研究により示された分界条床核から腹側被蓋野に投射するGABA神経の役割を明らかにするために、オプトジェネティクスを用いた解析を開始していたが、これについては、今年度初頭に同様の研究が米国の2つのグループにより学術雑誌に報告されてしまった。我々が予想したとおり、分界条床核から腹側被蓋野に投射する神経は腹側被蓋野ドパミン神経の活動を調節するという報告であった。そこで、慢性疼痛が腹側被蓋野ドパミン神経活動に及ぼす影響を検討したところ、本来、報酬提示時に観察される腹側被蓋野ドパミン神経活動の亢進が、慢性疼痛モデル動物では観察されないことが明らかとなった。慢性疼痛時の抑うつ気分や慢性疼痛患者に見られる高いうつ病併発率に関連する可能性が考えられた。

研究計画調書では3つの研究の遂行を便宜的に年度ごとに振り分けたが、研究の効率性を考慮し、3つの研究を並行して行い、一定の研究成果が得られたテーマを優先的に推進していくこととした。平成23年度の研究成果より、分界条床核において痛みにより遊離亢進したCRFは、分界条床核内2型神経細胞(GABA含有介在神経)を活性化し、分界条床核から腹側被蓋野に投射するGABA神経を抑制することで、腹側被蓋野内GABA介在神経を活性化し、最終的には腹側被蓋野内ドパミン神経を抑制して嫌悪情動あるいは抑うつ情動を生成させる可能性が示された。今年度の研究では、ニューロペプチドY(NPY)の分界条床核内投与により痛みによる不快情動が抑制されること、NPY同時適用によりCRFの分界条床核2型神経細胞の活性化が抑制されることを明らかにした。これらの結果は、分界条床核内でCRFとNPYが相反的に働き、痛みによる不快情動を制御していることを示している。さらに、今年度は、光操作法を用いた解析のため、ウイルスベクターによるチャネルロドプシン遺伝子導入を行い、電気生理学的手法によりその機能的発現を検討した。ウイルス投与部位の神経細胞体では、十分量の発現を確認できたが、神経路特異的解析に必須である神経終末部での発現が微弱であった。今後、神経終末部での十分な発現を得るために、ウイルスタイター向上などの改善策を講じる。分界条床核において痛みにより遊離亢進したCRFが、分界条床核内2型神経細胞(GABA含有介在神経)を活性化し、分界条床核から腹側被蓋野に投射するGABA神経を抑制することで、腹側被蓋野内GABA介在神経を活性化し、最終的には腹側被蓋野内ドパミン神経を抑制して嫌悪情動あるいは抑うつ情動を生成させることを示唆する研究成果を得、負情動生成機構の一端を明らかにすることができた。神経活動の光操作法に必要なウイルスベクター構築が予定より遅れているため、平成24年度は光操作法の研究手法の確立に注力する。25年度が最終年度であるため、記入しない。今年度までの研究で、分界条床核内でCRFとNPYが相反的に働き、痛みによる不快情動を制御していることを明らかにした。これらの研究成果を報告した学術論文は「今週の注目論文」として当該学術雑誌で紹介されるなど国際的にも高い評価を得るとともに、毎日新聞や産経新聞での報道のほか、中日新聞や京都新聞など多数の新聞のWEB版にも掲載されるなど、国内でも注目された。一方、神経活動光操作法についは、神経細胞体部では光感受性チャネルの十分な発現を得ているが、神経路特異的解析に必須である神経終末部での発現が微弱であるため、平成25年度は光操作法の研究手法の確立に注力する。上述のように行動薬理学的解析、電気生理学的解析、組織学的解析においては新しい知見を得ることができたが、神経活動の光操作法に必要なウイルスベクター構築が予定より遅れている。平成24年度は光操作法の研究手法の確立に注力するとともに、本研究手法をで行動薬理学的手法や電気生理学的手法と組み合わせることで、研究をより強力に推進する。上述のように行動薬理学的解析および電気生理学的解析においては新しい知見を得ることができたが、神経路特異的解析に必須である神経終末部での光感受性チャネル発現については研究計画より遅れているため、平成25年度は光操作法の研究手法の確立に注力するとともに、本研究手法を行動薬理学的手法や電気生理学的手法と組み合わせることで、研究をより強力に推進する。