hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
活性酸素によるDNA損傷の定量化とその防御機構の解析

まずDNA鎖切断は、パルスフィールドゲル電気泳動で測定し、過酸化水素処理により細胞内DNA鎖切断が誘発されることを証明した。しかしこの方法は、感度・定量性に問題があると考えられた。80HdGは、細胞から抽出したDNAを酵素的に切断し、高速液体クロマトグラフィーで、切り出されたヌクレオシドを分離し、電気化学検出器で測定した。細胞を過酸化水素処理することにより、細胞内DNAに80HdGが、過酸化水素濃度に依存して増加することを証明した。また、遺伝性高発がん疾患でしかも活性酸素に高感受性であるファンコニ貧血症患者由来細胞は、高濃度過酸化水素処理により、正常者由来細胞より2-3倍多くの80HdGを生成した。ファンコニ貧血症患者由来細胞では、過酸化水素を分解するカタラーゼ活性が有意に低下しており、これが80HdG生成量増加の原因と考えられた。また、カタラーゼ阻害剤で細胞を処理することにより、過酸化水素処理による80HdG生成量が著明に増加した。以上のことから、活性酸素がヒト由来細胞内DNAに酸化的損傷を誘発すること、損傷防御にカタラーゼが重要な因子であることが証明された。老化及び成人病の発症と深く関わっている活性酸素による細胞障害を、酸化的DNA損傷の代表的な指標でしかも変異を誘発する8ヒドロキシデオキシグアノシン(8OHdG)を指標に、定量評価し、その損傷誘発機構を解析した。好中球あるいはマクロファージに分化し得るヒト前骨髄球性白血病細胞(HL60)を用い、実験を行った。好中球様に分化したHL60に、オプソニン化したアスベストを添加することにより活性酸素(O2-)の発生をESRで確認した。しかし、この系では、8OHdGはほとんど誘発されなかった。一方、マクロファージ様に分化したHL60に、アスベストを添加すると、活性酸素の産生増加は認められなかったが、細胞はアスベストを貪食し、8OHdGの増加が認められた。このアスベストによる8OHdGの増加は、カタラーゼやSOD(活性酸素を除去するに十分量の)では抑制されず、貪食抑制剤のサイトカラシンBで抑制された。アスベストは活性酸素の1つであり生体内(細胞内)で常に産生されている過酸化水素をより活性の高いOHラジカルに変換することが報告されている。これらの結果から、活性酸素が発生すれば必ず酸化的DNA損傷が生じるのではなく、活性酸素の発生する場所もDNA損傷誘発に重要な要因であることが解った。すなわち、アスベストが貪食により核の近傍に取り込まれ、そこでより活性の高い活性酸素を産生することにより、8OHdGが誘発されると考えられる。それ故、8OHdG誘発を防御するには、DNA近傍の活性酸素を効率よく除去する必要があることが解った。ヒト細胞における酸化的DNA損傷を把握する目的で、健常者集団におけるヒト末梢血白血球中の8OHdGを定量した。活性酸素産生能の高い好中球は、単核球とほぼ同量の8OHdGを有していた。また、白血球調整時に赤血球が残存すると、DNA抽出過程で8OHdGが人工的に生成することが解った。年齢やライフスタイル要因である喫煙・飲酒と8OHdG値の間に相関は認められなかったが、これは8OHdG値の分布の幅が8OHdG測定誤差に比べ小さいためと考えられた。年齢幅の広い集団・個人間のライフスタイルが大きく異なる集団での解析が必要である。
モンタージュ写真の構成が、犯人識別の正確さを妨げるのはなぜか

第一に、本研究では、これまでの目撃記憶の研究を評論した。目撃記憶の研究を予防的研究、診断的研究、回復的研究の3つのタイプに分けて考察した。さらに、これらの研究を展望することにより、予防的研究と診断的研究は多く行われているが、回復的研究が少ないことを考察した。特に、モンタージュ法や似顔絵法が、回復的研究の手法のひとつと考えられることを示唆した。第二に、幼児と大人を対象に顔認識の実験を行った。この研究の目的は、似顔絵を描くことが顔の再認にどのような影響を及ぼすのかを発達的に検討した。そこで、被験者にはビデオでターゲットの登場人物を呈示した。ターゲットの記銘は、偶発記憶課題であった。被験者がビデオを視聴した後で、半分に被験者である似顔絵呈示群には、実験者が顔を描いて、先程見たターゲットの顔を思い出すように促した。残り半分の被験者である統制群には、家の絵を描いて、家を思い出すように促した。その後で、数枚の顔写真を見せ、その中からビデオの人物がどれであるのかを再認させた。その結果、幼児では、統制群よりも似顔絵呈示群で、再認成績が有意に優れた。他方、大学生では似顔絵呈示群よりも統制群で、再認成績が優れた。この結果は、幼児と大学生で似顔絵が顔記憶に及ぼす効果が異なることを示している。幼児では、似顔絵を呈示することによって、ターゲットについて視覚的リハーサルが促されたのであろうと仮定された。他方、大学生はターゲットについて自発的に視覚的リハーサルを行っているが、似顔絵を呈示することによって妨害されたのではないかと仮定された。このことは、事件を目撃した後で、犯人についての似顔絵を描くことが、大人にとっては負の効果があるが、幼児には促進的効果があることを示唆している。
分子の動的挙動に基づく食品安全性指標の構築

近年,加工食品や保存食品が開発されるようになり,加えて,食品流通システムの変化の影響もあり,食の安全の重要性が再認識されるようになった。食品の安全性を科学的・系統的に理解し,予測するためには,内部の分子運動と保存性との関係を定量的に把握することが重要と思われるが,そうしたアプローチはあまり見られない。本研究では,近年,食品科学で着目されているガラス転移を理論的基盤として,分子の運動性の変化と保存性の関係について解明することを目的とした.初年度は,DSCにより小麦粉グルテン,マルトデキストリンなどのガラス転移点T_gの測定を行った.次年度は,水が食品の重要な可塑剤であることから食品の水分収着特性の測定および解析を行い,溶液熱力学により求められる固体側の自由エネルギー変化によって水の可塑化効果が評価しうることが確認された.また,水分収着速度が極小となる水分活件が存在することが見出された.最終年度は,パルスNMRを用いて,FID(自由誘導減衰)スペクトルの測定を行い,分子の運動性を反映するスピン-スピン緩和時間T_2および動きにくいプロトンの挙動を反映する二次モーメントM_2を算出し,ガラス状態とラバー状態における分子の運動性の変化について検討した.また,小麦粉グルテンとマルトデキストリンに関して,粉体食品の保存において重要な固結現象について検討を行った.結果として,小麦粉グルテンおよびマルトデキストリンに関しては,含水率の増加に伴ってT_2は増加してM_2は減少して分子の運動性が増加することが確認された.また,水分収着速度が極小となる含水率付近からM_2の値も減少し,動きにくいプロトンの運動性が増加するに伴い,水分収着速度が上昇することがうかがわれた.固結に関しては,吸湿や昇温によってラバー化した後に降温してガラス化することによって固結が進行することが確認された.近年,加工食品や保存食品が開発されるようになり,加えて,食品流通システムの変化の影響もあり,食の安全の重要性が再認識されるようになった。本研究では,近年,食品科学で着目されているガラス転移を理論的基盤として,分子の運動性の変化と保存性の関係について解明することを目的とした.初年度は,DSCにより小麦粉グルテン,マルトデキストリンなどのガラス転移点T_gの測定を行った.次年度は,水が食品の重要な可塑剤であることから食品の水分収着特性の測定および解析を行い,溶液熱力学により求められる固体側の自由エネルギー変化によって水の可塑化効果が評価しうることが確認された.また,水分収着速度が極小となる水分活件が存在することが見出された.最終年度は,パルスNMRを用いて,FID(自由誘導減衰)スペクトルの測定を行い,分子の運動性を反映するスピン-スピン緩和時間T_2および動きにくいプロトンの挙動を反映する二次モーメントM_2を算出し,ガラス状態とラバー状態における分子の運動性の変化について検討した.また,小麦粉グルテンとマルトデキストリンに関して,粉体食品の保存において重要な固結現象について検討を行った.結果として,小麦粉グルテンおよびマルトデキストリンに関しては,含水率の増加に伴ってT_2は増加してM_2は減少して分子の運動性が増加することが確認された.また,水分収着速度が極小となる含水率付近からM_2の値も減少し,動きにくいプロトンの運動性が増加するに伴い,水分収着速度が上昇することがうかがわれた.固結に関しては,吸湿や昇温によってラバー化した後に降温してガラス化することによって固結が進行することが確認された.近年,女性の社会進出,高齢化など生活様式の変化から様々な加工食品や保存食品が開発されるようになった。加えて,食品流通システムの変化の影響もあり,食の安全の重要性が再認識されるようになった。本研究では,近年,食品科学で着目されているガラス転移を理論的基盤として,分子の運動性の変化と保存性の関係について解明することを目的とする.ガラスとは非晶質の固体のことで,食品の場合,パスタ類,クッキー,各種粉体がガラスに分類される。ガラスを昇温させるとある温度Tgでラバーに変化し,この温度をガラス転移点またはガラス転移温度という。Tg以下では,分子のミクロブラウン運動が凍結され,そのため反応速度がひじょうに低くなると言われている。よって,食品の保存性の面からTgは基本的なパラメータである.また,食品の場合,水が可塑剤として作用し,Tgを下げることもよく知られている。本年度は,示差走査熱量測定(DSC)によるガラス転移点の測定を行った.試料は,粉体食品である小麦粉グルテン,マルトデキストリン,コーヒー,脱脂粉乳などを用いた。試料を飽和塩の入った密閉容器中で加湿し,主に昇温速度10°C/minで測定を行い,比熱変化のオンセット,オフセットを求め,その中点をガラス転移点Tgとした。結果は,含水率の増加と共に試料のTgの値は低下し,水の可塑化効果が観測された.

昇温速度の影響についても検討したところ,1°C/min程度まで昇温速度を低下させてもTgの測定値の差は数°C程度だった。また,オンセットとオフセットの差は,試料によって異なるが,最大数十°C程度あり,ガラス転移が広い温度範囲で起こる現象であることが確認された。近年、女性の社会進出、高齢化など生活様式の変化から様々な加工食品や保存食品が開発されるようになった。加えて、食品流通システムの変化の影響もあり、食の安全の重要性が再認識されるようになった。食品の安全性を科学的・系統的に理解し、予測するためには、内部の分子運動と保存性との関係を定量的に把握することが重要と思われるが、そうしたアプローチはあまり見られない。本研究では、近年、食品科学で着目されているガラス転移を理論的基盤として、分子の運動性の変化と保存性の関係について解明することを目的とする。ガラスとは非晶質の固体のことで、食品の場合、パスタ類、クッキー、各種粉体がガラスに分類される。ガラスを昇温させるとある温度T_gでラバーに変化し、この温度をガラス転移点またはガラス転移温度という。T_g以下では、分子のミクロブラウン運動が凍結され、そのため反応速度がひじょうに低くなると言われている。よって、食品の保存性の面からT_gは基本的なパラメータである。また、食品の場合、水が可塑剤として作用し、T_gを下げることもよく知られている。昨年度は、示差走査熱量測定(DSC)により小麦粉グルテン、マルトデキストリン、コーヒー、脱脂粉乳などのガラス転移点T_gの測定を行った結果、ガラス転移が広い温度範囲で起こる現象であることが確認され、各食品に関してT_gの含水率依存性が求められた。本年度は、水が食品の重要な可塑剤であることから食品の水分収着特性の測定および解析を行った。水分収着等温線の測定を行ったところ、食品の含水率は、ガラスからラバーに変化すると急激に増加することが確認された。また、溶液熱力学により求められる固体側の自由エネルギー変化によって水の可塑化効果が定量的に評価しうることが確認された。水分収着速度に関しては、相対湿度(水分活性)において水分収着速度が極小となることが見出された。近年,加工食品や保存食品が開発されるようになり,加えて,食品流通システムの変化の影響もあり,食の安全の重要性が再認識されるようになった。食品の安全性を科学的・系統的に理解し,予測するためには,内部の分子運動と保存性との関係を定量的に把握することが重要と思われるが,そうしたアプローチはあまり見られない。本研究では,近年,食品科学で着目されているガラス転移を理論的基盤として,分子の運動性の変化と保存性の関係について解明することを目的とする。初年度は,DSCにより小麦粉グルテン、マルトデキストリンなどのガラス転移点T_gの測定を行った。次年度は,水が食品の重要な可塑剤であることから食品の水分収着特性の測定および解析を行い,溶液熱力学により求められる固体側の自由エネルギー変化によって水の可塑化効果が評価しうることが確認された。また、水分収着速度が極小となる水分活性が存在することが見出された。本年度は、パルスNMRを用いて、FID(自由誘導減衰)スペクトルの測定を行い、分子の運動性を反映するスピン-スピン緩和時間T_2および動きにくいプロトンの挙動を反映する二次モーメントM_2を算出し、ガラス状態とラバー状態における分子の運動性の変化について検討した。
洞庭湖周辺における日本住血吸虫症の免疫病理学および疫学的解析と撲滅に関する研究

本共同研究事業は、1987年度に始まり、1988年度より本格的に実施するに至ったもので、洞庭湖周辺における日本住血吸虫症の疫学的研究、中間宿主貝のコントロ-ルに関する研究および同症の免疫病理学的研究が実施されている。現在までの調査研究、とくに1989年度の成果の概要は以下のようである。1.パイロット地区の再選定と疫学的研究:前年度調査したパイロット地区は、本研究の目的に必ずしも合わないと考えられ、再びその選定を含め、調査が進められた。今年度新たに本症流行状況の異る3地区として選定されたのは、(1)流行最盛地区である益陽県明朗山村(A地区)、(2)低流行地として益陽県黒湖州(B地区)および(3)流行終息途上地区として岳陽県東風湖郷(C地区)である。A地区は本症の極めて濃厚な感染地で、住民の感染率は現在でも65.4%である。洞庭湖中にある島で、中間宿主貝の感染率は1.2%1.4%であるが、貝の棲息密度が極めて高く、住民の治療を実施しても、再感染のためにヒトの感染率は低下しないのが現状である。B地区は住民の感染率が12.118.3%の中等度感染地区であり、中間宿主貝の感染率は0.160.21%である。かっては貝の棲息密度が高かったが、撲滅効果により現在では低密度となり、住民の感染も低下傾向にある。C地区は洞庭湖岸にある漁村で、1959年以来の本格的な撲滅事業により、1988年には血清の検査(COPTおよびIHA)で6.5%という低率の陽性者が現われるのみとなり、中間宿主貝もほとんど発見されない状況である。各地区の虫卵陽性者には、Praziquantelによる治療を実施した。治療グル-プについては、治療前後の血清の検査を実施しているが、そのうち30名をとくに選び、ELISA法による治療効果判定を試みた。現在までに虫体および虫卵抗原を使用し、治療後6カ月の抗体価検査が行なわれたが、治療後はいずれの抗原に対する抗体価も明らかに低下すること、とくに虫卵抗原に対する抗体価の低下が著明であることがわかった。このことにより、ELISA法による血清検査が治療効果判定に効果的であると考えられた。2.中間宿主貝のコントロ-ルの研究:中間宿主貝に対する3種薬剤(Cartap,ChlorothalonylおよびTribromosalan)の殺貝効果を実験室内および野外で検討中である。この3種薬剤が我が国の中間宿主貝(Oncomelania nosophora)に対し、有効であることはすでに証明されている。室内試験成績については一部今後の検討を要するものの、おおむね中国における中間宿主(O.hupensis)に対してもほぼ同様の効果が期待されている。野外における試験では、Cartapが注目すべき高い効果を示したので、その実用性に関しさらに追究中である。同貝の生物学的コントロ-ルを目指し、貝寄生性原虫の検索を行なっている。現在までにMicrosporeaの胞子と考えられる一種が検出され、その生物学的特性と貝に対する病原性などについて検討中である。3.免疫病理学的研究:本症既往者の抗イデオタイプTリンパ球の反応誘導性を指標として感染濃度、感染後の経過および臨床症状などの分析のため、患者血清を虫卵抗原特異的Tリンパ球に添加培養し、その増殖反応を試験した、その結果、少数例ではあるが、本症の慢性経過中に急性症を再発した特殊な患者の例で、ELISA法により虫卵抗原に対し著しく高い抗体価を示し、しかもそのイデオタイプTリンパ球反応誘導活性があることがわかった。これに対し他の慢性患者で肝硬変併発例では、その活性はみられなかった、このことにより、本試験法は本症の免疫病理学的解析に好適であることが示唆された。前年度に引き続き、原発性肝癌の発生病理に関連する本症とB型肝炎との関係について調査した。これまで肝癌の成因には、本症とB型肝炎の両因子が関係すると指摘されてきたが、今回の多数例についての検討により、中国の本症流行地における肝癌の発生病理には、本症がB型肝炎より強い関連を有することが示唆された。我が国の本症流行地においても、肝細胞癌と本症およびHB_s抗原との関連について再検討し、肝細胞癌の成因に本症が有意に関与すること、またHB_s抗原との関連では、中国の本症流行地におけるそれと同様の傾向であることなどが示唆された。

A地区は本症の極めて濃厚な感染地で、住民の感染率は現在でも65.4%である。洞庭湖中にある島で、中間宿主貝の感染率は1.2%1.4%であるが、貝の棲息密度が極めて高く、住民の治療を実施しても、再感染のためにヒトの感染率は低下しないのが現状である。B地区は住民の感染率が12.118.3%の中等度感染地区であり、中間宿主貝の感染率は0.160.21%である。かっては貝の棲息密度が高かったが、撲滅効果により現在では低密度となり、住民の感染も低下傾向にある。C地区は洞庭湖岸にある漁村で、1959年以来の本格的な撲滅事業により、1988年には血清の検査(COPTおよびIHA)で6.5%という低率の陽性者が現われるのみとなり、中間宿主貝もほとんど発見されない状況である。各地区の虫卵陽性者には、Praziquantelによる治療を実施した。治療グル-プについては、治療前後の血清の検査を実施しているが、そのうち30名をとくに選び、ELISA法による治療効果判定を試みた。現在までに虫体および虫卵抗原を使用し、治療後6カ月の抗体価検査が行なわれたが、治療後はいずれの抗原に対する抗体価も明らかに低下すること、とくに虫卵抗原に対する抗体価の低下が著明であることがわかった。このことにより、ELISA法による血清検査が治療効果判定に効果的であると考えられた。2.中間宿主貝のコントロ-ルの研究:中間宿主貝に対する3種薬剤(Cartap,ChlorothalonylおよびTribromosalan)の殺貝効果を実験室内および野外で検討中である。この3種薬剤が我が国の中間宿主貝(Oncomelania nosophora)に対し、有効であることはすでに証明されている。室内試験成績については一部今後の検討を要するものの、おおむね中国における中間宿主(O.hupensis)に対してもほぼ同様の効果が期待されている。野外における試験では、Cartapが注目すべき高い効果を示したので、その実用性に関しさらに追究中である。同貝の生物学的コントロ-ルを目指し、貝寄生性原虫の検索を行なっている。現在までにMicrosporeaの胞子と考えられる一種が検出され、その生物学的特性と貝に対する病原性などについて検討中である。3.免疫病理学的研究:本症既往者の抗イデオタイプTリンパ球の反応誘導性を指標として感染濃度、感染後の経過および臨床症状などの分析のため、患者血清を虫卵抗原特異的Tリンパ球に添加培養し、その増殖反応を試験した、その結果、少数例ではあるが、本症の慢性経過中に急性症を再発した特殊な患者の例で、ELISA法により虫卵抗原に対し著しく高い抗体価を示し、しかもそのイデオタイプTリンパ球反応誘導活性があることがわかった。これに対し他の慢性患者で肝硬変併発例では、その活性はみられなかった、このことにより、本試験法は本症の免疫病理学的解析に好適であることが示唆された。前年度に引き続き、原発性肝癌の発生病理に関連する本症とB型肝炎との関係について調査した。これまで肝癌の成因には、本症とB型肝炎の両因子が関係すると指摘されてきたが、今回の多数例についての検討により、中国の本症流行地における肝癌の発生病理には、本症がB型肝炎より強い関連を有することが示唆された。我が国の本症流行地においても、肝細胞癌と本症およびHB_s抗原との関連について再検討し、肝細胞癌の成因に本症が有意に関与すること、またHB_s抗原との関連では、中国の本症流行地におけるそれと同様の傾向であることなどが示唆された。
IL-8産生とIL-8によるサイトメガロウイルス複製に関する分子制御機構の解析

これまでに、IL-8によりサイトメガロウイルス(CMV)の複製及びDNA合成能が促進される事を報告してきた。一方、今回の研究プロジェクトのうち"IL-8産生に関わるCMV遺伝子の解析"に関する研究計画において、IL-8産生及び遺伝子発現にCMV遺伝子のどの部位が関与しているかについて検討し、IL-8とCMVの相互の関係を明らかにした。CMV前初期遺伝子(IE1,IE2)領域を含む種々ベクターを構築し、遺伝子導入による一時発現系及びIE1,IE2を発現するパーマネント細胞系を作成し実験に供した。まず一時発現系による実験で、IL-8遺伝子上流域の各種転写部位を有するルシフェラーゼ発現ベクターと同時に遺伝子導入し検討したところ、IE1導入細胞の方がIL-8遺伝子発現に関係しており、特にNF-kBとAP-1転写部位を特異的に活性化する事が示唆された。さらに培養液中のIL-8タンパク量を測定したところ、IE1導入細胞が最大であった。これらの成績は、IE1,IE2をパーマネントに発現する細胞を用いた場合でも同様であった。また免疫二重染色による観察から、同一細胞がIE1抗原とIL-8抗原を同時に発現しているのが見い出された。この事は、CMVのIE1遺伝子発現細胞がNF-kBとAP-1の活性化を介して、IL-8を産生することを示したことになる。更にゲルシフトアッセイ法による解析から、NF-kBと特異的に結合する核内タンパクは、IE2産生株と比較してIE1産生株の方がより多く移行している事が見い出された。以上の事からIL-8産生に関与するCMV遺伝子は、少なくともIE1部位の関与が明らかであり、その機序としてNF-kBとAP-1両転写部位の活性化を介していることが考えられた。今後、これらの機序の詳細を明確にしその全体像を明らかにするために、IE1遺伝子欠損CMV株を作成し検討していく予定である。今年度の研究実績は、研究実施計画のうちの特に"IL-8産生に関わるCMV遺伝子の解析"に関する研究において、IL-8産生および遺伝子発現にCMV遺伝子のどの部位が関与しているかについて検討し以下の成績が得られた。CMVの前初期遺伝子(IE-1,IE-2)領域を含むベクターを構築し、IL-8遺伝子上流域(-546-+44)を有するルシフェラーゼ発現ベクターと同時にTHP-1細胞へ遺伝子導入し、一時発現系によりルシフェラーゼ活性の誘導を標的にし検討したところ、IL-8遺伝子発現に関与するCMV前初期遺伝子は、IE1部位である事が示唆された。さらに、CMV前初期遺伝子導入されたTHP-1細胞でのIL-8mRNAの発現検索および培養上清中のIL-8産生タンパクの検索からも、同様に主要なCMV遺伝子はIE1部位である事が確認された。IL-1やTNF産生には、むしろIE2部位の関与が報告されており、この相違点は興味深い。これらの知見は、第12回ヘルペスウイルス研究会(三島)、第45回日本ウイルス学会総会(京都)およびSymposium oninterferons and cytokines:Basic science and clinicalaspects(Riyadh,Saudi Arabia)において発表された。今後の研究の展開としては、IL-8産生および遺伝子発現にCMV遺伝子のどの部位が関与しているかをさらに明確にするために、IE-1,IE-2領域を含むパ-マネント細胞系を作製し検討していく予定である。

今年度は、昨年度に継続して"IL-8産生に関わるCMV遺伝子の解析"に関する研究を行った。これまでの一時発現系を利用した遺伝子導入実験による解析から、IL-8遺伝子発現およびタンパク産生に関与するCMV遺伝子は、少なくともその一部は前初期遺伝子(IEl,IE2)領域のIEl部位である可能性を報告してきた。今年度の研究ではこのことを更に明確にする為に、IEl,IE2遺伝子鎖域を含む種々のパーマネント細胞系を樹立し検討した結果、以下の成績が得られた。CMVのIEl,IE2遺伝子領域をpSV2-neoベクターに構築したものを、Astrocytoma由来のCMV弱許容細胞(U373MG)に遺伝子導入し、G418Sulfateを含む選択培地を用い各種パーマネント細胞株を得た。これらの細胞培養液中のIL-8タンパク量を測定したところ、IEl導入細胞株が最大であった。また、IL-8遺伝子上流域の各種転写部位を有するルシフェラーゼ発現ベクターをこれらの細胞へ遺伝子導入し、ルシフェラーゼ活性の誘導を標的に比較検討したところ、IEl導入パーマネント細胞株がIL-8遺伝子発現に関与しており、特にNF-kBとAP-1転写活性部位を特異的に活性化することが示唆された。さらにImmunostainingによる二重染色による観察から、同じ細胞にIEl抗原とIL-8抗原を同時に発現しているのが見い出された。この事は、CMVのIEl遺伝子発現細胞がNF-kBとAP-1の活性化を介して、IL-8をも産生することを示したことになる。これらの事から、一時発現系を利用した昨年の結果と同様にIL-8産生に関与するCMV遺伝子は、少なくともIEl部位であることが再確認された。以上の知見は、第13回ヘルペスウイルス研究会(富山)、第35回日本細菌学会中部支部総会(名古屋)および第46回日本ウイルス学会総会(東京)において発表された。本年度の研究実績は、これまでに樹立したサイトメガロウイルス(CMV)の前初期遺伝子産物(IE1,IE2)をパーマネントに発現するAstrocytoma由来U373MG細胞株を用い、IL-8産生に関与するCMV遺伝子に関する研究を行った。これまでの検討から、各細胞株のIL-8蛋白産生性はIE1細胞株が最大であった。この株のIE1発現細胞とIL-8産生細胞が同一細胞である事を免疫染色により明らかにし、さらにはIL-8遺伝子上流域の各種転写部位を有するルシフェラーゼ発現ベクターをこれらの細胞へ遺伝子導入し比較検討したところ、IE1細胞株がIL-8遺伝子発現に関与しており、特にNF-kBとAP-1転写活性部位を特異的に活性化することが示された。今回、ウエスターンブロット法による解析から、IE1細胞株においてNF-kBーp65抗体と反応する蛋白は、細胞質画分では僅であるが核内画分において増加しているのが明らかとされた。また、ゲルシフトアッセイにより、NF-kBと特異的に結合する核内蛋白は、IE2細胞株と比較してIE1細胞株の方が強いことが見い出された。以上の事から、IL-8産生に関与するCMV遺伝子のうち、少なくともIE1部位の関与が明らかであり、その機序としてNF-kBとAP-1転写部位の活性化によることが考えられた。
次世代シークエンシング技術を利用したマメガキおよびカキの雌雄性制御機構の解明

古くより,高次倍数性のカキ(Diospyros kaki)の雌雄混株性に関する研究が行われてきたが,その雌雄の制御機構に関してはほとんど知見が得られていなかった.本研究では次世代シークエンス解析を活用することにより,雌雄異株性の二倍体種マメガキ(D. lotus)の雌雄異株性は,小分子RNA遺伝子(OGI)による転写因子MeGIの発現抑制を通じて行われていることを明らかにした.引き続いて栽培ガキのゲノムと発現解析を行い,栽培ガキではOGI上流への転移因子の挿入によるOGI発現の不安定化とMeGIのエピジェネティックな制御による可塑性のある性制御へと進化していることを明らかにした.本研究では,従来の研究手法のみの利用では,さらなる研究の進展に限界があり,研究の発展が阻まれているマメガキの雌雄性研究に,近年,急速な進歩を遂げた次世代シークエンシング技術を導入することでブレークスルーをはかり,マメガキ(Diospyros lotus)の雌雄性決定因子を同定し,その結果を栽培カキ(D. kaki)の雌雄性研究に応用しようとするものである.本年度は以下の実験結果を得た.12004年にマメガキの雌株と雄株を交配して得た64個体の開花が全てみられ,開花調査が終了した.また2011年に同じ交雑を行い得た約200個体の一部が開花したため,その調査を開始した.これらの個体は,マメガキにおける性染色体の構造解析に用いる予定である.2マメガキとカキの花成を比較調査した結果,両者は同様の花成の過程を経て,開花に至ることが明らかになった.またマメガキではカキよりも花成の開始時期が若干早いことも明らかになった.3マメガキの雌雄性が判明しているF1個体およびその両親のゲノムDNAにタグをつけてIllumina HiSeq2500を用いたショートリード塩基配列解析を行い,また花芽分化期の混合芽のmRNA-Seq解析も併用して,マメガキの雌雄異株性決定機構,OGI/MeGIシステムを明らかにした.このシステムが,栽培ガキの複合的かつ可塑性に富む性決定機構の中で,どのように機能しているか解明するために,栽培ガキのOGIおよびMeGIの調査を開始した.本研究では,従来の研究手法のみの利用では,さらなる研究の進展に限界があり,研究の発展が阻まれているマメガキの雌雄性研究に,近年,急速な進歩を遂げた次世代シークエンシング技術を導入することでブレークスルーをはかり,マメガキ(Diospyros lotus)の雌雄性決定因子を同定し,その結果を栽培カキ(D. kaki)の雌雄性研究に応用しようとするものである.昨年度までの研究で,マメガキの雌雄決定機構が明確になったので,研究2年目にあたる本年は栽培ガキの研究を進め,以下の実験結果を得た.1マメガキの雄性決定遺伝子であるOGI遺伝子が,栽培器の雌雄性と関連性があるかどうか,マメガキのOGI配列を参考にPCR増幅用のプライマーを作製し調査した.2栽培ガキのOGI配列とMeGI配列をクローニングして,マメガキの配列と比較した.マメガキの性決定領域が予想より小さかったことや次世代シークエンシング技術が予想以上にうまく機能したことから,既にマメガキにおける雌雄異株性の決定機構の解明に成功しており,栽培ガキの解析も順調に進んでいる.本研究では,従来の研究手法のみの利用では,さらなる研究の進展に限界があり,研究の発展が阻まれているマメガキの雌雄性研究に,近年,急速な進歩を遂げた次世代シークエンシング技術を導入することでブレークスルーをはかり,マメガキ(Diospyros lotus)の雌雄性決定因子を同定し,その結果を栽培カキ(D. kaki)の雌雄性研究に応用しようとするものである.研究初年度の研究でマメガキの雌雄決定機構が明確になったので,研究2年目以降は栽培ガキの研究を進めた.最終年度にあたる本年度も引き続き栽培ガキの雌雄性制御に関する研究を進め,以下の結果を得た.1マメガキの雄性決定遺伝子であるOGI遺伝子の相同遺伝子が栽培ガキのゲノム中に存在するが,雄花を着生する栽培ガキには必ずこのOGI遺伝子が存在することを明らかにした.またOGI遺伝子がゲノム中に存在しない栽培ガキは雌花のみを着生することも明らかとなりOGIの存在が栽培ガキの雄花着生の必要条件であることを示した.2栽培ガキの栽培ガキのOGIの発現解析を行ったところ,栽培ガキではOGIの発現はほとんど見られないことが明らかになった.しかしながらMeGI由来のsmall RNAが雄花を着生する芽で多く産出されていた.3栽培ガキのOGIにはSINE様の配列が挿入されており,このことによりOGI遺伝子がメチル化され,OGIの発現が抑制されていることが明らかになった.4以上の結果に基づいて,栽培ガキにおける不安定な性表現の制御機構の作業仮説を構築し,論文発表した.古くより,高次倍数性のカキ(Diospyros kaki)の雌雄混株性に関する研究が行われてきたが,その雌雄の制御機構に関してはほとんど知見が得られていなかった.

本研究では次世代シークエンス解析を活用することにより,雌雄異株性の二倍体種マメガキ(D. lotus)の雌雄異株性は,小分子RNA遺伝子(OGI)による転写因子MeGIの発現抑制を通じて行われていることを明らかにした.引き続いて栽培ガキのゲノムと発現解析を行い,栽培ガキではOGI上流への転移因子の挿入によるOGI発現の不安定化とMeGIのエピジェネティックな制御による可塑性のある性制御へと進化していることを明らかにした.マメガキの性決定領域が予想より小さかったことや次世代シークエンシング技術が予想以上にうまく機能したことから,既にマメガキにおける雌雄異株性の決定機構の解明に成功している.当初の計画以上の研究進展をみており,栽培ガキの雌雄性の制御機構の解明にも予定より早く着手できている.今後,栽培ガキの雌雄性の制御機構の解明に鋭意取り組む予定である.果樹園芸学当初の計画以上の研究進展をみており,今後,栽培ガキの雌雄性の制御機構の解明に鋭意取り組む予定である.実験計画の一部が,当初の予定より効率的に行うことが可能であったため,次年度使用額が生じた.実験計画の一部が,当初の予定より効率的に行うことが可能であったため,次年度使用額が生じた.さらに研究の進展を早めるために,研究3年度目に予定していた研究をさらに充実させるために使用する.さらに研究の進展を早めるために,研究2年度目に予定していた研究をさらに充実させるために使用する.
NMDA受容体刺激で誘導されるシナプスに局在する高分子の検索

中枢神経系シナプスにおける神経伝達は、興奮性アミノ酸のグルタミン酸に主に依存しているが、中でもNMDA型グルタミン酸受容体を介するものは、長期増強(LTP)に代表される伝達効率の変化、並びに発達期のシナプスの再構成や安定化に重要な役割を果たしていると考えられている。本研究では、視覚野皮質神経細胞においてNMDA受容体の特異的な刺激で誘導されるシナプス蛋白、もしくはその遺伝子(mRNA)を複数同定しその機能を知ることにより、NMDA受容体がどの様な分子を通してシナプスの再構成や安定化に寄与しているか探る計画である。我々は、培養した初代神経細胞を用い、テトロドトキシン存在下でNMDA受容体特異的刺激を実現した。また同時にNMDA受容体刺激を慢性的にAP-5で阻害した群からもRNAを調整した。それらRNAは差分提示PCR法により分析し、NMDA受容体刺激でのみ誘導されるかもしくはAP-5処理で低下する分子を64クローン同定した。このうち5クローンは既知のものと同一であった。他のクローンをRNAブロッテイング法により脳での発現とin vivoのケイレンでの誘導性をもとにとりあえず4クローンに絞りこんだ。そのうちクローン♯55はノザンブットテイグによる推定全長2800塩基のうち2628塩基のシークエンスを終えたところで、この蛋白はセルサイクル蛋白と高い相同性を有し、その発現は脳特異的でNMDAで上昇するので、神経活動依存的な神経分化に関与するのではないかと予想される。一方クローン♯4は推定全長6500塩基のうち4200塩基を終了していて、このタンパクはジンクフィンガーモチーフを複数有していて典型的な転写因子の構造をとっていることが判明している。クローン♯4遺伝子の発現は成長した動物に高いので、NMDA受容体を介したシナプスの可塑性関連遺伝子の発現を調節している可能性が推察される。その他にも自発的発火によるNMDA受容体刺激をAP-5で阻害した群からも5つのクローンがとれているが、時間の問題でその解析は後になっている。このように計画通りクローン複数が取れてきているので、これらの一連の解析によりNMDA受容体を介したシナプスの可塑性の調節機構が明らかになると期待される。
口腔癌における細胞外基質-細胞膜受容体クロストークの多様性

ヒト口腔癌由来細胞ACC3、ZK-1ほかの産生するファイブロネクチン(FN)の分子量が血清ならびに線維芽細胞FNに比べて大型であることから、その分子解析をしたところ、選択的スプライシングによってED-B/ED-A/IIICS領域が組み込まれた蛋白質であること、さらにN-およびO-結合型オリゴ糖鎖付加が大きくまたシアル酸添加もあるためということが判明した。この口腔癌型FNに対して、これらの口腔癌細胞は血清FNにくらべてより高い接着性をしめした。そこで、FNに対する細胞膜受容体であるインテグリン(INT)についても検討したところ、少なくともN-結合型オリゴ糖鎖の添加量が大きいことが判明した。したがって、口腔癌細胞は自ら産生する細胞外基質により強力に接着する細胞生活環境を整えて増殖性を制御していることが示唆された。さらに、ヒトHSPGコア蛋白質遺伝子の全領域をカバーするプライマーを設計して、ACC3細胞ほかについてRT-PCR増幅をおこない、選択的スプライシング領域を検出するためにスクリーニングをおこなった。多数の候補遺伝子断片がスクリーニングされたが、現在までのところ確定的な領域を決定できておらず、なお検討中である。つぎに、各口腔腫瘍におけるHSPGならびにFN遺伝子の特定領域の発現を組織学的に検索したところ、HSPGおよびFNは腫瘍実質細胞のみならず間質線維芽細胞にも広範に発現していることが判明した。扁平上皮癌と腺様嚢胞癌では、とくにFNのED-B領域は実質細胞に、ED-A領域は間質線維芽細胞にそれぞれ特異的に発現しており、実質間質の役割分担があることが示唆された。腺様嚢胞癌の実質胞巣では小型導管様構造構成細胞にHSPGならびにFNのED-B領域の発現が顕著で大型偽嚢胞構成細胞では減弱しており、偽嚢胞の起源と発育経過が解明された。また、過誤腫では、HSPGおよびFNの局在パタンから真の腫瘍と鑑別できること、炎症性病変では、間質あるいは肉芽組織線維芽細胞とともに再生実質細胞によるHSPGの発現が顕著であった。以上の結果から、腫瘍実質の成長とこれにともなって誘導される間質の双方にHSPGおよびFNの発現が重要であること、とくに実質胞巣の形態形成に主導的役割をはたしていること、腫瘍細胞の浸潤性性格にこれらの分子の発現が伴っていることなどが明らかで、これらの分子を介した細胞間クロストーク様式が腫瘍の生物学的性格を規定している可能性さらに肉芽組織形成に大きな役割を果たしていることが示唆された。腫瘍実質細胞のつくる腫瘍性間質と腫瘍細胞自身との関わりを軸に癌の増殖浸潤転移機構を理解したいと考え、口腔癌細胞系の産生するヘパラン硫酸プロテオグリカン(HSPG)およびファイブロネクチン(FN)とそれぞれに対応する膜受容体インテグリン(INT)各鎖の分子多様性を解析し、それらについてがん抑制遺伝子p53をはじめとするがん関連遺伝子構造を解析し、細胞種あるいはがん組織型に特異的な変異様式とECM分子クロストークの多様性との関わりについて検討した。ヒト唾液腺癌

由来細胞ACC3、ACC-M、舌扁平上皮癌由来細胞MK-1、ZK-1と正常口腔線維芽細胞の各初代培養細胞について、免疫沈降法によってHSPGおよびFNをえた。FNについてはED-A、ED-B、IIICS領域の選択的スプライシング様式解析したところ、ACC3細胞には高度に挿入がみあられたが、そのほかの癌細胞では挿入頻度が低かった。また、糖鎖についてはACC3にもっとも多量のN-結合型およびO-結合型糖鎖の修飾がみられた。したがって、ACC3細胞の産生するFN高分子量であることが分子レベルで説明できた。HSPGについては、オリゴ糖鎖付加がACC3細胞で高度であり、この細胞では、N-結合型複合型糖鎖の付加が分泌に必須であるがヘパラン硫酸鎖の付加は必須ではないことが判明した。HSPGのスプライシング領域は検索中である。またMK-1およびZK-1細胞では、前者の転移能がより高いとされているが、インテグリン(INT)α2鎖について検索したところ、ZK-1でより高度なN-結合型糖鎖修飾を確認した。これらの腫瘍についてp53遺伝子の変異を検索したところ、腫瘍種特異的な突然変異がみいだされ、細胞外基質合成パタンとの関連も示唆された。また、口腔領域の過誤腫では、HSPGおよびFNの産生が高度なものがあり、その局在パタンから真の腫瘍と鑑別できることが示唆された。今後、とくにHSPGのスプライシング領域を確定し、腫瘍種による様式の異同を明かにし、細胞の浸潤・転移能に関する生物学的性格との関連を究明したい。前年度までに、ヒト口腔癌由来細胞の産生するヘパラン硫酸プロテオグリカン(HSPG)およびファイブロネクチン(FN)およびインテグリン(INT)の選択的スプライシングならびに糖鎖付加様式が核細胞に特有で、それらの細胞の生物学的特性に反映している可能性を示唆した。そこで、本年度は、各口腔腫瘍におけるHSPGならびにFN遺伝子の特定領域の発現を組織学的に検索し、実質細胞と間質細胞のあいだでどのような相違があるかを検討した。すなわち、口腔粘膜扁平上皮癌、唾液腺腺様嚢胞癌、唾液腺多形性腺腫、歯冠周囲過誤腫、さらに対照として唾液腺炎、顎骨嚢胞の各外科材料のフォルマリン固定パラフィン連続切片を作製し、In-situハイブリダイゼーション(ISH)をおこなった。また、外科摘出新鮮材料よりRNAを抽出して、HSPG遺伝子発現を検定した。さらに、ヒトHSPGコア蛋白質遺伝子の全領域をカバーするプライマーを設計して、ACC3細胞についてRT-PCR増幅をおこない、選択的スプライシング領域を検出するためにスクリーニングをおこなった。この結果、HSPGおよびFNは腫瘍実質細胞のみならず間質線維芽細胞にも広範に発現していることが判明した。扁平上皮癌と腺様嚢胞癌では、とくにFNのED-B領域は実質細胞に、ED-A領域は間質線維芽細胞にそれぞれ特異的に発現していた。腺様嚢胞癌の実質胞巣では小型導管様構造構成細胞にHSPGならびにFNのED-B領域の発現が顕著で大型偽嚢胞構成細胞では減弱していた。また、浸潤性増殖をしめす小型索状胞巣は例外なくHSPG発現が高度であった。口腔領域の過誤種では、HSPGおよびFNの局在パタンから真の腫瘍と鑑別できることが示唆された。
クラウド型電子書籍統合学習システムによる情報ネットワーク教育の質の向上

情報通信ネットワークの研究開発用シミュレータであるNS2(The Network Simulator 2)をWebブラウザ上で操作できるWebインターフェイスとWeb実行ツールを開発し,ネットワーク工学初学者にもネットワークのしくみやその動作を学習することができるシステムの環境構築を行った.さらに,これらWebインターフェイス等を,近年普及が進んでいる携帯情報端末等のスマートデバイスで利用できる電子書籍に組み込むことにより,クラウド型統合学習システムとして開発した.本システムを授業・演習等で活用することでより高い教育効果が得られ,情報通信ネットワーク教育の質の向上を達成することができた.そこで,今年度はまず,ネットワークシミュレーションのためのWebインターフェイスの開発を行った.システム開発のため,ネットワーク,Webアプリケーション技術やコンテンツ技術について研究会やセミナーに参加する等調査を行った上で,シミュレーションを実行するための専用サーバを構築し,サーバ上にNS2をインストール・稼働させ,NS2の実行コマンドや結果表示を処理するWeb APIをJSON(JavaScript Object Notation)により開発した.さらに,最近のWeb技術であるHTML5を用いて,GUIでNS2を操作・実行するための実行ツールを作成した.これは,ネットワークを設計するためのシナリオ定義GUIエディタ,シミュレーション解析ツール,シミュレーション結果アニメーションツールからなっている.このようにして,ネットワーク初学者においてもWebブラウザからNS2を操作し,ネットワークの基本的学習を行える環境「NSviaWeb」を構築した.さらに,ネットワーク工学を学習するための電子書籍を,開発環境であるiBooks Authorを用いて試行的に作成し,NSviaWebを組み込むことによって,タブレット端末からも視覚的に学習できるシステムとして開発した.以上のように,本研究の目的を達成するためのシステム開発を中心に研究を遂行することができた.本研究は,情報通信ネットワークの研究や教育ツールとして使用できる代表的なネットワークシミュレータであるNS2(Network Simulator version.2)をWebブラウザ上でネットワーク初学者でも簡単に利用を可能とするWebアプリケーションを開発し,それを電子書籍などに組み込み,情報通信ネットワーク工学教育に活用することで,この分野における教育の質の向上を目指すことを目的としている.今年度は前年度までに開発したWebアプリケーションを利用して,システムを電子書籍に組み込むためのシステム改善と基本的なユーザビリティの検証を行った.電子書籍として活用するには,PCのみならずタブレット端末等の携帯情報端末での良好なユーザビリティが必要となるが,従来までのシステムにおいては,そのような環境での機能が一部不十分であったため,これら機能の改善を行った.また,ネットワーク初学者には,システム利用の基本的なチュートリアルが必要であるため,これの開発も行った.今年度開発したシステムをチュートリアルとともにPCおよび携帯情報端末上でユーザに使用してもらい,ユーザビリティ評価を行ったところ,我々が学習者として想定をしている高専高学年の学生において,システムの利活用についておおむね好評価を得た,特に前年度までのシステムにおいてユーザアンケートから明らかになっていた問題点について大幅に改善されたことがわかった.ところで,これまでの開発している情報通信ネットワーク教育用電子書籍は現在は試験的なコンテンツにとどまっているため,次年度からはこれを拡充すること,また,近年注目されているウェアラブル端末での通知機能の検討などを行っていく予定である.本研究は,情報通信ネットワーク研究によく用いられるネットワークシミュレータであるNS2(Network Simulator 2)を,ネットワーク初学者でもWebブラウザを使って簡単に利用を可能とするWebアプリケーションを開発し,さらにこれを電子書籍に組み込んで,情報通信ネットワーク教育用教材として活用することで,この分野における教育の質の向上を目指すことを目的としている.今年度は,前年度までに開発したWebアプリケーションを試験的に組み込んだ,情報通信ネットワーク教育教材用の電子書籍のコンテンツを拡充し,実際の授業や演習で利用するための内容となるよう開発を継続した.開発した電子書籍においては,もととなるWebアプリケーションの想定していた開発仕様と異なる部分があり,システムの組み込みと電子書籍の表示に一部スマートでない部分が生じた.このシステム改善には大幅な仕様の変更が必要であることが分かったため,今年度は一時的にこの問題を回避するため,当初予定していたWebアプリケーションの完全埋め込みではなく,電子書籍からシステムをWebで呼び出し,擬似的にWebブラウザで利用するように対処した.ただしユーザにはシステムが切り替わることを意識しないような設計としている.また,電子書籍のユーザビリティ評価も改めて実施し,概ね問題ないことを確認している.次年度は,Webアプリケーションの仕様を変更し,今年度問題となった部分のシステム改善を行うこととしている.また,私が行っている講義,演習に利用を行い,教育効果の確認を実施する予定である.当初予定していた,NS2を電子書籍から利用して情報通信ネットワーク技術を実践的に学ぶことができるシステムの構築は概ね達成できている.また,ユーザビリティ評価においても想定している水準以上となっており,計画通りのシステムとなっていると考えている.ただし,研究概要でも述べたように,Webアプリケーションの完全埋め込みについては一部不具合が生じている.現状ではユーザがそれを意識しないように擬似的な方法で対処しているが,これを改善することが今後必要である.情報通信ネットワークの研究開発用シミュレータであるNS2(The Network Simulator 2)を,Webブラウザ上で操作できるWebインターフェイスとWeb実行ツールを開発し,初学者でもネットワークのしくみや動作を学習することができるシステムの環境整備を行った.さらに,これらWebインターフェイスおよび実行ツールを,近年普及が進んでいるタブレット端末などのスマートデバイスで利用できる電子書籍に組み込むことにより,クラウド型統合学習システムとして開発した.なお,ネットワーク工学を学習するためのオリジナルなテキスト教材についても電子書籍として作成し,学習者がこのテキストを読みながら,同時にクラウド上のシミュレーションサービスを通してインタラクティブに学習できるようなシステムとしている.次に開発したシステムを実際に授業・演習等の一部において活用した.

研究代表者が所属する高専学生によるユーザビリティ評価を回顧法を用いて行い,より使いやすい(学習しやすい)システムにするための改善を行った.システム改善により,より高いユーザビリティ評価を得ることができている.最終年度においては,本システムを使用した場合の教育効果を確認するための検証を行った.授業・演習においての達成度を定期試験により評価するとともに,システムを活用したユーザを対象にアンケート評価を実施した.すべての学習者はシラバスに記載した目標達成度を達成することができたと同時に,アンケート結果より,視覚的に情報通信ネットワークの挙動を理解することに役立ったという評価を得ることができた.以上より,本研究で開発したシステムは,高専生などのネットワーク初学者に対して,ネットワーク工学の学習の質向上に貢献できたと考えられる.情報通信ネットワークの研究開発用シミュレータであるNS2(The Network Simulator 2)をWebブラウザ上で操作できるWebインターフェイスとWeb実行ツールを開発し,ネットワーク工学初学者にもネットワークのしくみやその動作を学習することができるシステムの環境構築を行った.さらに,これらWebインターフェイス等を,近年普及が進んでいる携帯情報端末等のスマートデバイスで利用できる電子書籍に組み込むことにより,クラウド型統合学習システムとして開発した.本システムを授業・演習等で活用することでより高い教育効果が得られ,情報通信ネットワーク教育の質の向上を達成することができた.携帯情報端末での利用を想定したWebアプリケーションの開発は今年度のシステム改善とユーザビリティ評価を行うことでほぼ達成できており,おおむね予定した進捗状態となっている.シミュレーション機能を組み込んだ電子書籍教材のコンテンツ拡充はやや遅れているが,これの開発には多くの時間は要しないと考えており,大きな問題とはならない.
ヒト血漿中に存在する細胞結合性免疫グロブリンMの研究

正常ヒト血しょうをエラスチン-セファロースカラムにかけ,吸着タンパク質を調べたところ,主に免疫グロブリンMであった。この免疫グロブリンMは,肝がん細胞にグルタミンアナローグとともに加えると,細胞を殺傷した。しかし標品によって性質が一定せず,研究を進めるのが困難であった。一方,ヒト血しょうをラクトース-セファロースカラムを用いたアフィニティークロマトグラフィーにかけると,β-ガラクトシドと特異的に結合する免疫グロブリンGを得た。特異性を検討した結果,従来知られていた抗α-ガラクトシド抗体や抗T抗体と異なる新しい自然抗体であることがわかった。生体内にあって,この抗体に反応する抗原を検索した。まず,β-ガラクトシド構造を持つ20種類のグリコリピドとの結合を調べたが,どのグリコリピドとも結合しなかった。また,メラノーマB16の細胞溶解物中の糖タンパク質について,この抗体と結合するものを検索したところ,分子量80Kのバンドが検出された。しかし量が少なく,このタンパク質の構造研究を進めることはできなかった。ラクトース構造をもつネオグリコタンパク質を合成し,これを抗原として抗β-ガラクトシド免疫グロブリンG量を測定するELISA系を確立した。正常なヒトの血液約50例について測定したところ,平均83.2+67.0μg/mlであった。ABO血液型とは無関係であり,また抗α-ガラクトシド抗体量との間にも,相関はみられなかった。がん患者7例の血液についても調べた。抗β-ガラクトシド抗体量の著しく高いもの(560μg/ml)が1例発見された。細胞のがん化に伴い,β-ガラクトシド基が発現することが報告されているので,この抗体は生体をがんから守る防御システムの一つなのかもしれない。正常ヒト血漿をエラスチンーCHセファロ-スカラムにかけ,吸着タンパク貭をしらべたところ,主に免疫グロブリンMであった。この免疫グロブリンは,ヒト肝がんの培養細胞にグルタミンのアナロ-グ(6ージアゾー5ーオキソーLーノルロイシン)と共に加えると,細胞を殺傷した。この免疫グロブリンMはCHーセファロ-スカラムを用いても得られたので,疎水性基につよく結合する性貭をもつ特別な免疫グロブリンMと思われる。しかし,標品によって性貭が一定でなく,治性が認められない場合もあり,これ以上の研究が進んでいない。一方,正常ヒト血漿をラクト-スヌはメリビオ-スを結合させたセファロ-スのカラムにかけ,糖結合性の免疫グロブリンをえた。すなわち,ラクト-スセファロ-スに吸着させ,メリビオ-ス溶液で洗浄後ラクト-ス溶液で溶出を行い,βーガラクトシル基に結合する免疫グロブリンGをえた。また,メリビオ-ス・セファロ-スのカラムに吸着させ,ラクト-ス溶液で洗浄した後メリビオ-ス溶液で溶出させ,αガラクトシル基に結合する免疫グロブリンGをえた。βーガラクトシル基給合性の免疫グロプリンG自然抗体は未だ報告がなく,新しい発見と思われる。αーガラクトシル結合性の免疫グロブリンG自然抗体については報告があるが,本研究の調製法の方が,より特異的なものを単離できたと考えられる。細胞のがん化に伴い,正常細胞にはないαーガラクトシル基やβーガラクトシル基が発現することが報告されているので,ここでえられた免疫グロブリンは,がん細胞に特異的に結合することが期待される。研究を続行中である。