hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
酵母発現ＨＢＶ粒子を用いた細胞表面結合蛋白質の探索

組換え酵母由来のB型肝炎ウイルス(HBV)粒子を用い、この粒子が結合する細胞と結合しない細胞を見いだした。SILAC法を用いて、この細胞間で発現レベルの異なる細胞表面蛋白質を同定し、これらのsiRNAをウイルス粒子が結合する細胞に導入し、ウイルス粒子の結合を減弱させる遺伝子としてScavenger receptor class B member 1 (SRB1)を同定した。しかしながらHBV感染感受性細胞においてSRB1をノックダウンあるいはノックアウトさせても、HBVの感染抑制効果は認められなかった。従ってSRB1は、HBVの感染初期過程には関与していないと考えられた。組換え酵母を用いてB型肝炎ウイルス(HBV)のL蛋白質を発現させ、組換えHBV粒子を精製した。様々な細胞株について、酵母発現組換えHBV粒子の結合能をフローサイトメーターを用いて定量的に解析し、ウイルス粒子が最も良く結合する細胞とほとんど結合しないヒト由来細胞株を見いだした。その中でウイルスが最も良く結合する細胞をトリプシン処理すると、ウイルス粒子の結合能が低下した事から、蛋白質を介したウイルス粒子の結合が示唆された。そこでウイルス粒子が最も良く結合する細胞とほとんど結合しない細胞を異なる安定同位体標識アミノ酸含有培地で培養した後に、細胞表面蛋白質をビオチン標識し、精製を行った。さらに質量分析法を用い、発現レベルの異なる蛋白質を多数同定した。同定された蛋白質に対するsiRNAを、ウイルス粒子が結合する細胞に導入し、ウイルス粒子の結合を減弱させる遺伝子を同定した。また、この蛋白質を発現していない細胞に強制的に発現させると、組換えHBV粒子が結合した。組換え酵母を用いてB型肝炎ウイルス(HBV)のL蛋白質を発現させ、組換えHBV粒子を精製したHepG2細胞、Huh7細胞、FLC4細胞、FLC5細胞、Alexander細胞等のヒト肝臓由来細胞やマウス肝臓由来細胞、さらにヒトの肝臓以外の組織由来の細胞株等について、酵母発現組換えHBV粒子の結合能をフローサイトメーターを用いて定量的に解析した。そこでウイルスが最も良く結合する細胞とほとんど結合を示さない細胞について、異なる安定同位体標識アミノ酸含有培地で培養した後に、細胞表面蛋白質をビオチン標識し、精製を行った。これを質量分析法を用いて発現レベルの異なる蛋白質を同定した。様々な細胞株について、この粒子の結合をフローサイトメーターを用いて定量的に解析し、ウイルス粒子が最も良く結合する細胞とほとんど結合しないヒト由来細胞株を見いだした。次にウイルス粒子が結合する細胞と結合しない細胞を、異なる安定同位体標識アミノ酸含有培地で培養した後に細胞表面蛋白質をビオチン標識し、精製を行った。さらに質量分析法を用い、発現レベルの異なる細胞表面蛋白質を同定した。同定した蛋白質をほとんど発現していない細胞に、この蛋白質を発現させると、組換えHBV粒子が結合した。さらにヒトHBVキャリアの血清より精製したHBs粒子の細胞表面への結合も、同定した分子を介している事を示唆するデータが得られた。同定された分子のHBV感染過程への関与を明らかにするため、Sodium taurocholate cotransporting polypeptide (NTCP)発現HepG2細胞の同定分子をノックダウンさせたが、HBVの感染抑制は認められなかった。このウイルス粒子が最も良く結合する細胞とほとんど結合しないヒト由来細胞株を見いだし、それぞれ異なる安定同位体標識アミノ酸含有培地で培養した後に細胞表面蛋白質をビオチン標識し、精製を行った。さらに質量分析法を用い、発現レベルの異なる細胞表面蛋白質を同定し、各蛋白質に対するsiRNAをウイルス粒子が結合する細胞に導入し、ウイルス粒子の結合を減弱させる遺伝子を同定した。同定した蛋白質を粒子が結合しない細胞に発現させると、組換えHBV粒子が結合した。同定された分子のHBV感染過程への関与を明らかにするため、Sodium taurocholate cotransporting polypeptide (NTCP)発現HepG2細胞において同定分子をノックダウンさせたが、HBVの感染抑制は認められなかった。ノックダウンレベルが不十分であるために感染阻害効果が認められなかった可能性を考え、さらにCRISPR-Cas9システムを用いて同定分子のノックアウト細胞を樹立したが、ノックダウンと同様に、HBVの感染抑制効果は認められなかった。そのため同定分子がウイルス感染以外に関与している可能性についてさらに検討した。HBV粒子がマクロファージのTLRシグナル伝達を阻害するという報告がある事から、THP1細胞を用いて評価したが、ウイルス粒子の添加によるTLRシグナル伝達の阻害は認められなかった。

SILAC法を用いて、この細胞間で発現レベルの異なる細胞表面蛋白質を同定し、これらのsiRNAをウイルス粒子が結合する細胞に導入し、ウイルス粒子の結合を減弱させる遺伝子としてScavenger receptor class B member 1 (SRB1)を同定した。しかしながらHBV感染感受性細胞においてSRB1をノックダウンあるいはノックアウトさせても、HBVの感染抑制効果は認められなかった。従ってSRB1は、HBVの感染初期過程には関与していないと考えられた。今年度はウイルス粒子の結合に関わる宿主因子の同定に成功した。結合は、酵母由来の組換え粒子だけでなく、ヒト血清由来のHBs粒子においても認められた。しかしながら、この分子のHBV生活環における役割は、未だ明らかにできていない。ウイルス学HBs粒子の細胞表面への結合に関与すると考えられる宿主因子の同定に成功した事から、今後はこの分子のウイルス感染、その他のHBV生活環への関与を明らかにする。具体的には、HBV感染感受性培養細胞を用い、同定分子のノックアウト細胞を樹立し、感染実験を行う。また、マクロファージ等の免疫細胞にHBs粒子が影響するという報告がある事から、それらの細胞を用いた解析についても検討を行う。今年度はウイルス粒子が良く結合する細胞とほとんど結合を示さない細胞において発現レベルの異なる多数の蛋白質の中から、ウイルス粒子の結合に関わる宿主因子の同定に成功した。今年度は組換え酵母発現HBV粒子を発現、精製し、その粒子を用いて培養細胞表面への結合を定量的に解析するアッセイ系を確立し、良く結合する細胞とほとんど結合を示さない細胞の存在を明らかにする事が出来た。さらにそれらの細胞表面上の発現レベルの異なる蛋白質を多数同定した。年度末納品等にかかる支払いが平成27年4月1日以降となったため、当該支出分については次年度の実支出額に計上予定。平成26年度分についてはほぼ使用済みである。また研究の進展にともない、当初同定した宿主因子のウイルス生活環への関わりを、siRNAによるノックダウン法で検証したが、十分なノックダウン効果が得られず、それ以降の解析が行う事が出来なかった為。酵母由来組換えHBV粒子の細胞表面への結合に関与すると考えられる宿主因子の同定に成功した事から、今後はその結合責任領域を明らかにする為に、様々な欠損変異体発現プラスミドを構築し、解析を行なう。また培養細胞を用いたHBV感染実験系において、同定された分子のウイルス感染への関与を明らかにする。さらにはHBV subviral particleの細胞表面への結合への関与についても検討を行う。今後は同定された分子のsiRNAをHBV粒子が結合する細胞へ導入し、HBV粒子の結合に及ぼす影響を解析し、結合に重要な宿主因子を同定する。また一方で、上記の方法ではウイルス粒子結合蛋白質の同定が困難な場合に備え、別の方法を用いて研究を推進する。HBV粒子が最も良く結合する培養細胞よりmRNAを抽出し、レトロウイルスベースのcDNAライブラリーを構築する。
多端子ジョセフソン接合の多次元位相空間における動的なトポロジカル物性

研究計画は多端子ジョセフソン接合における(i)トポロジカル電荷の動的性質、(ii)人工トポロジカル物質としてのバルクエッジ対応とトポロジカル相発現条件、(iii)異方的超伝導体接合、の3つのサブトピックスで構成されている。本年度は主に(ii)について解析計算と実空間構造を考慮可能な数値計算で進めた。ジョセフソン電流の定式として古崎-塚田公式があるが、これを多端子系への拡張し、解析的な表式を得た。解析計算の議論はまだ進捗途上で、具体的な物理描像を理解するまでには至っていない。数値計算の結果と対応させることで理解を深めたい。数値計算では十字型の4端子系を想定し、ワイル特異点が現れる際の準粒子波動関数やジョセフソン電流との相関、特異点の発現条件を調べた。不純物のない非常にクリーンな接合の場合、実空間と超伝導体の位相差の双方で反転対称性がある点で特異点が得られる。不純物があると実空間上の反転対称性が破れるために、位相差の空間における特異点が対称な位置からずれる。その際でも、不純物による電子散乱が弱い場合にはワイル特異点が得られる。つまり、常伝導体に電子伝導が良い材料を用いることで、実験的にトポロジカルなワイル特異点を得ることができる。また、数値計算において多端子ジョセフソン接合に形成される準粒子波動関数を調べた。2端子系の場合、超伝導体間の位相差に対して波動関数の空間構造はあまり変化しない。一方、4端子系の場合、波動関数が位相差に対して敏感に変化する。位相差を変調すると、波動関数が十字構造の腕に局在して他の腕とは結合しない振る舞いを示す。これら波動関数の形状は多端子間での各超伝導電流と相関すると予想され、現在その解析を進めている。位相差によって局在する準粒子を操作することができることが分かったので、パラメータの動的制御による特異的な物性の議論が期待される。現在、研究代表者が所属している研究室では主に光物性を研究している。その光物性の研究テーマについても革新的な研究テーマに基づきて進めており、エフォートの割合を上手く調節できなかったために、申請時に想定していた進捗状況よりも遅れている。現在の研究状況についての課題、特に直流ジョセフソン電流と準粒子波動関数の空間構造との相関関係に関する考察を進める。2端子系では端子間のジョセフソン電流は1つだが、多端子系の場合はN*(N-1)/2個の電流が定義される。これらを1種のベクトル量と捉えることで視覚化した解析・考察を行う。また、本年度の研究では、ゼロエネルギー点であるワイル特異点に特有の波動関数を得ることはできなかった。これは当初の期待とは異なる。しかし、数値計算では真に特異点位置を数値計算で得ることは難しく、数値誤差が含まれる。ワイル特異点の線型分散性から、特異点の微小な近傍でジョセフソン電流ベクトルは急峻に変化するため、特異点そのもので議論することは数値計算からは難しいと考えている。そこで、特異点を内包する領域でのジョセフソン電流ベクトルの構造などを考察することで、トポロジカル相と多端子系でのジョセフソン効果の関係性にアプローチする。以上をまとめて論文執筆に取り掛かる。さらに、(i)の課題に取り組む。また、米国物理学会において多端子ジョセフソン接合の実験を進めているグループと直接の連絡を取った。その際に本計画の拡張による数値計算を打診されているので、共同研究に発展させたい。

位相差によって局在する準粒子を操作することができることが分かったので、パラメータの動的制御による特異的な物性の議論が期待される。現在、研究代表者が所属している研究室では主に光物性を研究している。その光物性の研究テーマについても革新的な研究テーマに基づきて進めており、エフォートの割合を上手く調節できなかったために、申請時に想定していた進捗状況よりも遅れている。現在の研究状況についての課題、特に直流ジョセフソン電流と準粒子波動関数の空間構造との相関関係に関する考察を進める。2端子系では端子間のジョセフソン電流は1つだが、多端子系の場合はN*(N-1)/2個の電流が定義される。これらを1種のベクトル量と捉えることで視覚化した解析・考察を行う。また、本年度の研究では、ゼロエネルギー点であるワイル特異点に特有の波動関数を得ることはできなかった。これは当初の期待とは異なる。しかし、数値計算では真に特異点位置を数値計算で得ることは難しく、数値誤差が含まれる。ワイル特異点の線型分散性から、特異点の微小な近傍でジョセフソン電流ベクトルは急峻に変化するため、特異点そのもので議論することは数値計算からは難しいと考えている。そこで、特異点を内包する領域でのジョセフソン電流ベクトルの構造などを考察することで、トポロジカル相と多端子系でのジョセフソン効果の関係性にアプローチする。以上をまとめて論文執筆に取り掛かる。さらに、(i)の課題に取り組む。また、米国物理学会において多端子ジョセフソン接合の実験を進めているグループと直接の連絡を取った。その際に本計画の拡張による数値計算を打診されているので、共同研究に発展させたい。成果の進捗状況を考慮し、次年度以降により積極的に成果発表をすべきだと判断し、学会参加費としては不十分で荒れるが無理に使用することなく次年度予算に繰り越す判断をしました。
外国語読解力構成技能の発達的変化

読解力は複雑な認知能力であり様々な構成技能に支えられている。過去の研究で様々な第二言語読解力の構成技能が発見されてきた。しかしその相対的重要性や発達的変化の理解は、さらに深められる必要がある。本研究課題はこの問題意識のもとに3つの研究(大学生対象、中高生対象、メタ分析)を遂行した。これらを通して、言語知識(語彙・文法)の影響力が大きく安定していること、理解力(第一言語読解力・第二言語聴解力)や言語処理効率(語彙や語彙より下位レベルの処理・文処理)の影響力は相対的に小さくかつ不安定であることが示唆された。第二言語読解力の個人差を説明する構成技能を発達的に特定し読みの習得理論と教育への示唆を得ることを目的とした本研究課題の初年度は、予定通り2つの研究対象に対する研究を並行して行った。その1つである、大学生データの再分析では、まずテスト得点をRasch分析によりlogit scoreに変換し、それを使って、L2言語能力、聴解力、L1読解力をL2読解力の説明変数としたモデルを構造方程式モデリング(SEM)により検証し、構成要素間の相対的重みづけを調べた。また大学生を対象に新たに集めた少人数のデータから、L2言語能力、単語認知力、音読のプロソディの関係について相関に基づいた分析を行った。いずれも、本研究の目的に照らして、データ収集法、分析法を検討し、研究の実行可能性も踏まえて、最終的に扱う読解力の構成素を決定するための基礎的研究となるが、これらの結果を本年度中に学会で発表することができた。次に、中高生を対象にする部分では、学術論文、教科書の調査、専門家からの示唆より、中3・高1・高2の連続する3学年に原則同じテストを実施するという研究デザインを取ることを決定した。読解力の構成素は、語彙力、文法力、聴解力、単語認知力に絞ることとし、単語認知力は反応時間を使う実験的タスクを用いることとした。このうち語彙テストについては、使用予定のものを予備調査として中1高2を対象に行い、発達を示すよい感触をえた。その他のテストの候補として、レベル分けがされていて、問題数が多く、かつ協力に対して好意的であるG-TELPの使用を検討中であり、担当者と第一回の会談をもった。今後は、テスト問題、実験項目を具体化すること、協力校へ正式な依頼書を提出するため、テスト実施の詳細なスケジュールを作成し、本調査実施への準備を進めることが2年目以降の課題となる。第二言語読解力の個人差を説明する構成技能を発達的に特定し読みの習得理論と教育への示唆を得ることを目的とした本研究課題の2年目は、まず前年度に行った大学生対象の量的研究の分析をやり直し2つの国際学会(EuroSLA,AAAL)で発表した。この研究では、L2言語知識、聴解力、L1読解力をL2読解力の説明変数としたモデルを構造方程式モデリング(SEM)により検証し、構成要素の相対的重みづけを調べている。結果はL2言語知識とL2聴解力はL2読解力への貢献が大きいが、L1読解力は相対的に貢献が小さいというものであった。その他、大学生を対象にした部分では、昨年度行ったL2言語知識、単語認知力、音読のプロソディの関係について調べた予備調査の結果を出版できた。次に、中高生を対象にする部分では、昨年度に続いてさらに5回の予備調査を行い、語彙・読解・聴解・文法の4つのテスト、単語認知力測定のための言語刺激についてデータ収集をした。テストについてはRasch分析に基づいて項目の適切性を検討した。加えて文法テストでは、7人の経験ある英語教師の判断による内容分析も行った。単語認知力については、サイトワード、音韻処理、正書法処理を測ることにし、先行研究から項目を選んで紙ベースでテストを行った。それにより正答率を確認し、最終的に使う正答率の高い項目をプールすることができた。以上のような作業の結果、本年度中に読解力、聴解力のテストを作成できたが、その他のテストと単語認知測定用の言語刺激、およびアンケートについては、次年度前半に完成を目指すこととなった。また弱い変数であることは予測できるものの、国際学会等への参加を通して、L1読解力を変数として加えることも検討を飴めた。今後はできるだけ早くすべてのテストを完成し、協力校へ正式な研究依頼書を提出し本調査を開始することが課題である。第二言語読解力の個人差を説明する構成技能を発達的に調査し、読みの習得理論と教育への示唆を得ることを目的とした本研究課題の最終年となる4年目は、昨年度から引き続いて取り組んできた論文(大学生を対象とした多変量解析に基づく研究成果)の投稿を完了し、2014年4月現在審査の最終段階まできている。

次に、中高生を対象にする部分では、2013年3月の第一回目のデータ収集後、この研究を縦断的研究に発展させる承諾を協力校から得ることができた。つまり、本研究課題は中3高2までの3学年を横断的に調査するものであるが、昨年参加した中3に対して継続して高1、高2の時点でテストし、縦断的研究に発展させるというものである。そのため、2013年3月は同じテストを3学年すべてに実施したが、2014年3月は、中3の生徒と、2013年に中3で2014年に高1になった生徒に、異なるテストを実施するデザインを追加した。中3用のテストはTest Battery 1 (TB1)、高1用のテストはTB2と呼ぶ。この発展的変更のため、2014年度はまずTB2を新たに作成した。継続研究であるため、同じ種類のテストをTB1作成と同様に予備調査を繰り返して作成した。ただ、中3時と高1時の様々なコンポーネントの力を比較する必要があるため、係留項目を残してTB1とTB2の関連付けをつけられるようにした。また、生徒への負担を少しでも軽減するため、2013年3月の300名を超える生徒から収集したテストデータに基づき、いくつかのテストで項目を削減した(TB1_2)。このようにして準備したTB1_2とTB2を、2014年3月に2週間かけて実施した。対象となったのは、中3の80名と高1の120名である。データ収集は計画通り進み、2014年度内にテストの採点、入力作業の一部を終了し、残りの分析作業と本格的な縦断的研究は、新しい科学研究費補助金を受けた研究課題に受け継がれる形で、本研究課題を終了した。第二言語読解力の個人差を説明する構成技能を発達的に観察読みの習得理論と教育への示唆を得ることを目的とした本研究課題の3年目は、大学生を対象とする部分では、日本語を母語とする大学生の英語読解力と単語認知の3つの構成要素の関係を調べた研究成果を論文にし、審査の結果受理された(2013年4月出版)。また(大学生に限ったわけではないが)第二言語の読解力と10の構成要素の関係を調べたメタ分析の結果を論文にまとめて投稿した。2013年4月現在審査の最終段階まできている。次に、中高生を対象にする部分では、昨年度から検討課題であった日本語の読解力を変数に含めることを決め、データ収集についても、協力校の国語の時間に実施してもらえることが決まった。昨年度に続いてさらに8回の予備調査を行い、英語の語彙・読解・聴解・文法、日本語の読解の5つのテスト、学習背景を知るためのアンケート、単語認知力測定のための言語刺激とそれを提示し反応時間を記録するプログラム(HSP使用)など、この研究課題に含むすべての変数を測定するテストバッテリーを完成させた。協力校へ正式な研究依頼書を提出して受理され、2013年3月に2週間かけて本調査を行った。対象となったのは予定通り、協力校の中3・高1・高2の3学年合計約310名である(学年ごとの人数は、最大数にしておよそ80, 120, 120)。英語聴解力テストとコンピュータを使った単語認知課題は協力校のコンピュータラボを使用して調査者とその補助者が行い、その他の紙のテストは協力校の教師が期末試験後の授業時間に適時組み込む形で行った。マークシートと記述式の解答方法を採用したが、マークシートの機械による読み込み採点の初期段階は、本年度中に終わらせることができた交付申請書に書いた通り、大学生データについては分析を終え、研究協力者塩津敏彦先生との連名で2回の国際学会で発表した。
テチス獣類の歯のテクスチャーと安定同位体から見た水中索餌という環境適応戦略

アフリカ大陸北部に位置するモロッコのウル・アブドゥーヌ盆地東縁のダゥイ地方の暁新統(約6000万年前)から産出する長鼻類の基幹種について,炭素と酸素の同位体分析を行なって,彼らの生息地と食性の推定を試みた.その結果,長鼻類の基幹種は,水棲生態系の食物を摂っていたことが示唆された.また,彼らは海水の影響が大きい環境に生息していたことも強く暗示された.これらの結果から,長鼻類は進化の最初期には水生生物を一次生産者とする食物網に属する動物で,その生息地も海岸であったことが強く暗示された。したがって、テチス獣類は全体として最初は海棲哺乳類として進化し,後に再陸棲化したことが強く示唆される結果となった。本研究は,アフリカ大陸に起源を持つアフリカ獣類の中でもアフリカ大陸北部(古地中海周辺)で進化したとされるテチス獣類(長鼻類や海牛類の仲間)の基幹種として注目されているモロッコの暁新世(約6000万年前)からのエリテリウム類について,頬歯の歯冠咬合面の微細表面形態(テクスチャー)を指標としてテチス獣類が初期進化においてどのような索餌行動をとっていたのかを推定し,炭素・酸素の安定同位体比およびストロンチウム等の微量元素の同位体比・重量比の分析に基づいて食性と生息地を復元して,テチス獣類の初期進化における索餌適応戦略及び環境適応戦略の観点から水中で索餌を行なうことの進化戦略的意味を解明することを目的としている.本研究の初年度は,国立科学博物館(以下科博)に所蔵されているエリテリウム8点とフォスファテリウム2点の頬歯を伴った顎骨の実物標本を用いて,科博に設置されている走査型共焦点デジタルレーザー顕微鏡(VK-8510)により各歯種の歯冠咬合面に見られるテクスチャー(微細摩耗面)をデジタル3D化し,併せて索餌様式と索餌対象が既知の現生哺乳類(初年度は偶蹄類)の比較資料を化石と同様の方法によりデジタル3D化した.安定同位体比分析のための試料採取にあたっては,対象となる資料が極めて数少ない上に試料採取可能部分が限られる(厚さ1m以下の歯冠エナメル)ことから,各歯種の精密な印象模型を作成した後に,研究協力者と共に炭素と酸素の安定同位体比分析用の微量試料を採取した.これらの試料に対して,科博に設置されている炭酸塩分解装置(Kiel)と熱分解元素分析計(TC/EA)を備えた安定同位体比質量分析計(MAT253)を用いて,炭素と酸素の安定同位体比の測定を行なった.これらの成果の一部は,日本古生物学会2015年年会(茨城県つくば市)ならびに米国古脊椎動物学会第75回記念大会(テキサス州ダラス)にて発表した.本研究課題においては,成果の要となるモロッコ産の祖先的テチス獣類エリテリウムと祖先的長鼻類フォスファテリウムの実物標本を複数個体得ることができ,標本の剖出作業(母岩から化石を取り出す過程)を含む資料の調整もほぼ完了している.また,多くの標本については,すでに精密な印象模型の作成も完了している.同時に,歯冠エナメル表面のテクスチャー分析のために必要なデジタル3D化も,比較対象のための現生哺乳類も含めて順調に進められている.したがって,本研究課題はおおむね順調に進捗していると判断できる.本研究は,アフリカ大陸に起源を持つアフリカ獣類のうち,アフリカ大陸北部(古地中海周辺)で進化したとされるテチス獣類(長鼻類や海牛類の仲間)の基幹種として知られていて,これまでのところモロッコの暁新世後期(約6000万5800万年前)の海成層だけから化石が知られているエリテリウム類について,頬歯歯冠の咬合面の微細表面形態(テクスチャ)の構造を指標に用いて,テチス獣類が初期進化においてどのような索餌行動を取っていたのかを推定すると共に,歯冠エナメルに固定されている炭素と酸素の安定同位体比分析に基づいて彼らの食性と生息地を考察し,テチス獣類の初期進化における索餌適応戦略および環境適応戦略の実体を詳らかにする事を目的としている.3カ年計画の本研究の2年度(2年目)は,国立科学博物館(以下科博)に所蔵されているエリテリウム8点とフォスファテリウム3点の上顎および下顎頬歯の実物標本を用いて,科博に設置されている走査型共焦点デジタルレーザー顕微鏡(VK-8510)により異なる歯種の歯冠咬合面に見られるテクスチャを観察し,歯種ごとにテクスチャのパターンの差異があるかどうかの検証を行なった.その結果,各歯種のテクスチャ間に有意な相違は認められず,テクスチャ解析を行なうにあたって,どの歯種を用いたとしても歯種間差がない事を確認した.本研究に使用する標本は極めて希少な化石である事から,今後は単離した歯であっても,歯種の別なく標本集団に含めて扱ってよい事が確かめられた.また,新たに追加したエリテリウム2点とフォスファテリウム2点から同位体比分析用試料を採取し,科博に設置されている安定同位体質量分析計(MAT253)を用いて炭素と酸素の安定同位体比の測定を行なった.この測定により,それぞれのタクサの安定同位体比情報はすべて3個体以上となり,標準偏差など基本的な統計量を求める事が可能となった.

本研究課題においては,成果の要となるモロッコ産の基幹的テチス獣類であるエリテリウムと基幹的長鼻類であるフォスファテリウム(共にテチス獣類)の極めて貴重な実物標本を複数個体分析用に追加する事ができ,平均値や標準偏差など統計学的に必要な3個体以上からの測定結果をすでに確保できている.これらの標本はすでに計測と写真撮影,現状保存のための精密な印象模型の作成を終えており,歯冠エナメル表面のテクスチャ分析のために必要なデジタル3D化も順調に進められている.また,コントロールデータとなる同一産地から採集された陸上食(雑食)の絶滅哺乳類オセペイア(初期の有蹄類)からの同位体分析用試料の採取も完了しており,最終年度にこれらの同位体比分析を行なうと共にテチス獣類の標本点数をさらに追加して同位体分析の結果をより統計学的に優意に扱えるようにすることで,当所の目的を果たす事が充分に可能と考えている.本研究は,アフリカ大陸に起源を持つアフリカ獣類のうち,アフリカ大陸北部(古地中海周辺)で進化したとされるテチス獣類(長鼻類や海牛類の仲間)の基幹種として知られていて,これまでのところモロッコの暁新世後期(約6000万5800万年前)の海成層だけから化石が知られているエリテリウム類およびフォスファテリウム類について,頬歯歯冠の咬合面の微細表面形態(テクスチャ)の構造を指標に用いて,テチス獣類が初期進化においてどのような索餌行動を取っていたのかを推定すると共に,歯冠エナメルに固定されている炭素と酸素の安定同位体比分析に基づいて彼らの食性と生息地を考察し,テチス獣類の初期進化における索餌適応戦略および環境適応戦略の実体を詳らかにする事を目的としている.3カ年計画の本研究の最終年度(3年目)は,国立科学博物館が所蔵する,フォスファテリウムと同一層準から共産した初期のテチス獣類オセペイアの上顎および下顎頬歯の実物標本を対象として,科博に設置されている安定同位体質量分析計を用いて炭素と酸素の安定同位体比の測定を行なった.その結果、本研究により上記の3種すべてについて3個体以上の個体から同位体比情報が得られ,彼らの古生態を「統計学的」に議論できる必要最小限の資料が整えられた.エリテリウムとフォスファテリウムおよび陸棲哺乳類と考えられてきたオセペイアの炭素の安定同位体比は,それぞれすべて水棲哺乳類の値を示し,驚くべきことにエリテリウムは酸素の同位体比から海水の影響下で生息していたことが強く示唆された.これらの結果から,長鼻類は進化の最初期には海辺で索餌をする海棲哺乳類であったことが明らかとなった.したがって、テチス獣類は全体としてアフリカ獣類の中で水棲適応した後に海棲棲適応し,これらの中で長鼻類だけ3次的に淡水棲から陸棲生活に戻った系統群であったことが強く示唆される結果となった。アフリカ大陸北部に位置するモロッコのウル・アブドゥーヌ盆地東縁のダゥイ地方の暁新統(約6000万年前)から産出する長鼻類の基幹種について,炭素と酸素の同位体分析を行なって,彼らの生息地と食性の推定を試みた.その結果,長鼻類の基幹種は,水棲生態系の食物を摂っていたことが示唆された.また,彼らは海水の影響が大きい環境に生息していたことも強く暗示された.これらの結果から,長鼻類は進化の最初期には水生生物を一次生産者とする食物網に属する動物で,その生息地も海岸であったことが強く暗示された。したがって、テチス獣類は全体として最初は海棲哺乳類として進化し,後に再陸棲化したことが強く示唆される結果となった。
高分子電解質膜中でのプロトンダイナミックスと水輸送機構の解明

固体高分子型燃料電池の構成要素である、電解質膜中でのフロトン伝導機構及ひ水輸送過程の詳を分子シミュレーションによりらかにした。従来用いられてきたプロトン伝導のモデルでは、電気浸透係数のような物理量がうまく説明できなかった。電気浸透係数が大きいと燃料電池の性能が低下するため、この物理量の本質を理解することが燃料電池の性能の向上のため重要である。我々がシミュレーションから得たプロトン伝導メカニズムは従来のモデルと異なり、高分子電解質膜中でのプロトンの拡散計数、水の拡散計数及びプロトンとカップリングした水輸送(電気浸透係数)の含水率依存性をうまく説明することができ、これらの現象の背景にある物理と化学の本質を理解するさいに役に立つと思われる。また、現在注目されている炭価水素系高子電解質膜の計算を行い、特にこの系で問題となっている低元水率でのプロトン伝導度の低下の原因を明らかにした。我々のシミュレーションの結果、高分子の主鎖に含まれている親水性の官能基が、水の水素結合ネットワークを壊しグロータス機構でプロトンが伝導される可能性を低くさせていることが分かった。また、高分子電解質膜の末端についているスルフォン酸の酸性度の影響をしらべ、プロトン伝導に及ぼす影響が文献などで報告されているよりも大きくないことを確認した。このような一連の分子シミュレーションの結果から新しい高分子電解質膜をテザインするさいに、どのような官能基を選択すれは優れたプロトン伝導特性を得られるのかを提案することができた。代表的な高分子電解質膜であるナフィオンおよび、炭化水素の電解質膜の特性を計算機シミュレーションの技術を用いて解析した。本年度はベンチマーク的な電解質膜であるナフィオン中でのプロトン伝導機構および水輸送の分子レベルでの詳細、また水輸送と関連した電気浸透係数の解析を行った。また現在産業界で実用化のために開発が進められている代表高な炭化水素系電笏質膜である、Sulfonated polyether sulfone(SPES)を量子化学計算及び第一原理分子動力学シミュレーションを用いて解析しナフィオンとの性能の違いの詳細を分子レベルで検討した。我々のシミュレーションの結果、従来のプロトン伝導機構では説明が難しかった含水率と電気浸透係数との関係を明らかにすることができた。また、従来の高分子電解質膜中でのプロトン伝導機構の分子レベルでの詳細が、極端に単純化されたモデルであることを明らかにした。SPESに関するシミュレーションの解析結果、SPESではナフィオンと違いスルフォン酸基の水和が低含水率では不十分であり、これにより低含水率ではSPESの性能がナフィオンに比べ劣ってしまうのではないかとの見解を得ることができた。また、量子化学計算の結果からSPES、ナフィオン共にプロトンの解離に必要な水分子は四つであることが分かった。従来の実験グループにより提案されているように、ナフィオンの方がプロトンを解離しやすいことも計算により明らかにした。しかしプロトンの解離のしやすさにより、両電解質膜のプロトン伝導度の違いがでるのではなく、むしろスルフォン酸周辺の水和構造の違いにより、プロトン伝導度の違いがでるとの結果が示唆された。
レーザーアシステッド電子衝撃イオン化による電子軌道選択的な光ドレスト効果の解明

本研究課題では、電子雲の変形という観点で捉えられてきた光ドレスト効果の研究をさらに進め、強い光によって引き起こされる様々な現象の初期過程の理解を深めるために重要な、電子雲を構成する各電子軌道についての光ドレスト効果を観測し、その効果を定量的に明らかにすることを目的とする。そのために、既報の装置と比較して桁違いに高い捕集効率・エネルギー分解能を持つ装置を自作し、得られた微分散乱断面積を再現できる理論の定式化及び計算を行う。
SPring-8のマイクロCTを利用した福井洞窟出土縄文草創期焼骨群の種同定

1)本研究では大型放射光施設SPring-8のCT装置を利用する。科研費によるSPring-8の利用申請について年2回の募集期間が設定されているが、本科研費の採択通知が届いたのが2018年度の利用申請募集締め切りを過ぎていたので、2019年度の利用申請に応募し、2019年度A期(2019年4月7月)の利用研究課題として採択された。したがって、2018年度はSPring-8を利用した分析を開始できなかったので、長崎県佐世保市教育委員会を訪問し、研究材料である福井洞穴出土資料から試料の選定を実施し、50点のSPring-8分析試料を得た。これら試料を、2019年6月にSPring-8のCTで撮影する予定である。2)本研究と関連し、日本列島主要4島(北海道、本州、四国、九州)の人類考古遺跡から出土した更新世動物資料の総説を執筆し、タイトル「旧石器時代の動物考古学をめぐる諸問題」としてまとめた。本論考は、書籍『東北日本の旧石器研究』(東北日本の旧石器文化を語る会編、六一書房、2018年刊行)に掲載された。要約は以下の通り:日本列島主要4島において動物骨が出土した後期更新世人類遺跡(人類遺跡の可能性のあるものを含む)を集成した。該当する遺跡はごく少なく、長崎県福井洞窟、広島県帝釈馬渡岩陰、神奈川県吉岡遺跡群C地区、長野県野尻湖立が鼻遺跡、岩手県花泉遺跡、青森県尻労安部洞窟、北海道柏台1遺跡の7遺跡を数えたのみであった。このうち、旧石器など確実な人工遺物が動物骨と同じ層から出土した遺跡は福井洞窟、吉岡遺跡群C地区、尻労安部洞窟、柏台1遺跡の4遺跡であったが、これらの遺跡から出土した動物骨の主体は小・中型哺乳類であり、ゾウなど大型哺乳類を狩猟していたとする従来の旧石器時代狩猟イメージを見直す必要が考えられた。本研究では大型放射光施設SPring-8のCT装置を利用する。科研費によるSPring-8の利用申請について年2回の募集期間が設定されているが、本科研費の採択通知が届いたのが2018年度の利用申請募集締め切りを過ぎていたので、2018年度はSPring-8を利用した分析を開始できなかった。SPring-8のCT装置を使用する実験について、2019年度A期(2019年4月7月)の利用研究課題として採択されたので、当初予定より半年遅れで研究計画を遂行する予定である。研究内容は当初計画と変更なし。本研究は大型放射光施設SPring-8のCT装置の利用を前提としている。SPring-8では科研費による利用申請として年2回の募集期間が設定されているが、本科研費の採択通知が届いたのが遅く、2018年度の利用申請募集締め切りを過ぎていたので、2018年度はSPring-8を利用した分析を開始できなかった。

したがって、2018年度はSPring-8の実験費用を使用しなかったため、次年度使用額が発生した。SPring-8のCT装置を使用する実験について、2019年度A期(2019年4月7月)の利用研究課題として採択されたので、当初予定より半年遅れで研究計画を進めている予定である。次年度使用額は2019年度A期のSPring-8実験費用にあてる。研究内容は当初計画と変更なし。
ホヤを用いた化学物質高感度検出系の開発と海洋汚染化学物質のリスク評価

海洋環境汚染物質として有機スズに着目した。有機スズ(TBT)は船底の生物の付着を防ぎ船舶の燃費改善を目的に船底塗料として近年使用されてきた。しかし環境ホルモン様作用があることが明らかになって現在日本では使用が禁止されている。しかし近隣諸国ではいまだに使用されているため日本近海の汚染は依然として深刻である。健全な海域環境を維持することは海洋に囲まれた日本においては非常に重要な事項である。そこで生物の遺伝子発現プロファイルを確認することで海洋の有機スズ汚染をモニタリングすることを模索した。海産動物ホヤ類は脊策動物に分類され、無脊椎動物から脊椎動物への進化の過程上に存在する生物と考えられている。それゆえホヤの研究を通して脊椎動物における原始的かつ共通な生物学的システムの存在を明らかにできると予想される。また定着生物であることから遺伝子プロファイルにその海域の汚染状況を反映することが期待できる。現在、海産生物で大規模なマイクロアレイが開発されているのはカタユウレイボヤのみであることからカタユウレイボヤを用いた海洋汚染検出システムの構築を試みた。前年度までにTBT被曝により特異的に発現が亢進すると思われる遺伝子14個と抑制される遺伝子28個を確認した。それらの遺伝子がTBTの濃度及び被曝時間に関連してどのような発現変動が見られるかをRT-PCR法を用いて確認した。またそれらの遺伝子の組織特異性をWhole Mount in situ Hybridaization法を用いて確認した。さらに海水中の有機スズ濃度が高い韓国沿岸のホヤと日本沿岸のホヤの体内に残留する有機スズ濃度を比較してみたところ韓国産のホヤで明らかに高く、またそれに相関して発現が亢進しているとみられる遺伝子1個と抑制されている遺伝子1個を確認した。結果、これらの遺伝子を使用しての海洋の有機スズ汚染の検出の可能性が示唆された。まず、TBT被曝によりホヤの遺伝子発現がどのように変化するのかを調べることを目的に、カタユウレイボヤを2群に分け1群を100nM TBTにて24時間、もう1群をTBTの溶媒であるエタノールにて24時間被曝した。その後、両群のRNAを抽出しエタノール被曝群をコントロールとした2色法マイクロアレイにて遺伝子発現プロファイルの確認を行った。通算3回の実験で共通して発現が2倍以上もしくは0.5倍以下に変動した遺伝子に注目し遺伝子プロファイルの解析を行ったところ、TBT被曝により特異的に発現が亢進すると思われる遺伝子14個と抑制される遺伝子28個を確認した。
RFHR電気泳動法の開発と核酸結合タン白質の包括的分析

研究課題にもとずき以下の研究を行った。1.RFHR電気泳動法の開発-多数の核酸結合タン白の分離分析をつみ重ねながら、冷却方式、泳動条件等数点に亘る改良を行った。その結果RFHR法は塩基性タン白に対して最高の分離能をもつに至っている。現在、実用化に関してメーカーと検討中である。2、核酸結合タン白の包括的分析-典型的な核酸結合タン白であるリボソームタン白を前核細胞43種、真核細胞9種から調製しRFHR法で分析した。その結果RFHR法の2次元スポットパターンが生物種夫々に固有のものであり、種の固定法としてきわめて決定性の高い方法であること、又、系統進化的関係を研究する方法としても有効であることが明らかになった。3.大腸菌の不溶性画分に存在する数百種の核酸結合性タン白フラグメントの成因を研究し、これらフラグメントが全てプロテアーゼVIIによって生成されることを明らかにした。さらに可溶性画分に存在するリボソームの構成タン白であるL31が我々が発見したCタン白からプロテアーゼVIIによって人為的に形成されることを証明した。L31は生きた細胞中には存在しない。存在するのはCタン白であり、Cタン白こそが真のリボソームタン白である。我々はCタン白をL31と呼称することを提案している。4、リボソームタン白以外にも核酸と相互作用するRNAポリメラーゼおよびQβファージのタン白成分をRFHR法で分析し、細胞の増殖段階移行に伴う構造変化およびQβレプリカーゼのホストファクターについて研究した。本研究の目的は塩基性タン白に対して高い分離能をもつ「ラジカルフリー高還元性2次元ゲル電気泳動法(RFHR法)」を開発実用化することと、RFHR法による核酸結合タン白の包括的分析を行うことである。この目的に沿って以下の研究を行った。1.RFHR法を実用化するため民間の研究機関の協力を得て、操作の各段階の検討を行っている。そのうち冷却方式について風冷から水冷への切換えを試み、1次元の電圧を100Vから500Vに上げ、時間短縮に成功した。2.植物(ホウレンソウ,オオムギ、ユーグレナ)のリボソームタン白をRFHR法で分析し、数種の新しいタン白成分を発見した。このうちホウレンソウのSCS23の性質構造解析をFEBS Lettersに発表した。3.ラットのリボソームタン白の分析で行った結果、2次元ゲル上に10個以上の未固定のスポットを見出し、現在構造解析中である。又ヒト細胞のリボソームでもラットに類似したスポットパターンが得られたことから哺乳動物のリボソームタン白の定義が未完成であることが示唆され、それと完成させるためにRFHR法が有効であることが示された。4.大腸菌の細胞残渣から得られる核酸結合タン白にはリボソームタン白などのフラグメントが多数含まれるが、これらがプロテアーゼVIIによって生じることを明らかにした。同時にリボソームタン白L31もこのプロテアーゼVIIによって前駆体からつくられることがわかり、プロテアーゼVIIの核酸結合タン白の構成に対する役割が今後の課題となった。5.購入したデンシトメーター(PD110)によるデンシトメトリー操作を確立した。これによってRFHR法の2次元ゲル上でのタン白の定量がきわめて容易かつ迅速に行えるようになった。今年度の研究実施計画にもとずいて以下の研究成果を得た。1.リボソームタン白の分離同定典型的な核酸結合タン白であり、かつその大部分が塩基性タン白でもあるリボソーム白の分離同定を多数の生物種に対して行った。腸内細菌、土じょう細菌、海洋細菌、ラン藻など前核細胞43種、および酵母、植物、ラット、ヒトなど真核細胞9種がそれである。この結果RFHR

電気泳動法の二次元ゲル上のリボソームタン白のスポットパターンが、種の同定法としてきわめて決定性が高いこと、又系統進化的関係の解明にも有効であることが明らかになった。2.核酸結合性タン白フラグメントの研究不溶性画分(cell debris)中に存在する核酸結合性タン白フラグメントの成因について研究し、このフラグメント化が専らトリプシンタイプのプロテアーゼVIIによって形戒することを明らかにした。さらに可溶性画分に存在するリボソームタン白L31も同じプロテーゼVIIによって生成することがわかった。これは、我々が発見したCタン白が細胞破砕時にプロテアーゼVIIと遭遇し切断された結果生成するフラグメントがL31に他ならない。したがってL31は人為的生産物であり、生きな細胞中には存在しないものである。我々は従来のL31(実はCタン白のフラグメント)に代ってCタン白そのものをL31と呼称することを提唱中である。
抗マラリア活性を示す新規な環状過酸化低分子化合物の抗ウイルス作用メカニズムの解明

新規抗HCV化合物(N-89とN-251)の抗HCV作用機序の解明を目的とした。まず、N-89やN-251に抵抗性を示す細胞株の樹立を行った。得られた抵抗性細胞と元の感受性細胞を用いて、当該化合物の作用機序の解析を行い、当該化合物への抵抗性獲得には、ウイルス側と宿主側の両方の因子が同程度に関与している事を明らかにした。抵抗性細胞由来のHCVの遺伝子解析から、抵抗性獲得に関与する可能性のあるアミノ酸置換を検出した。マイクロアレイ解析により抵抗性獲得に寄与する可能性のある遺伝子候補を特定した。また、当該化合物が日本脳炎ウイルス、B型およびE型肝炎ウイルスにも増殖抑制効果があることを明らかにした。独自に開発したC型肝炎ウイルス(HCV)アッセイ系を用いて見出した新規抗HCV化合物である環状過酸化低分子化合物(N-89とその誘導体N-251)の抗HCV作用のメカニズム解明とHCV以外のウイルス(B型肝炎ウイルス(HBV)やHCVに近縁なフラビウイルスなど)に対する抗ウイルス作用の評価を目的として以下の2項目について研究を行った。(1)抗HCV作用メカニズムの解明まず、解析手段を得るために、N-89やN-251に感受性を示すHCV RNA複製細胞にN-89やN-251を長期(約2ヶ月)に渡って投与し(Step-wise法とHigh-dose法を用いた)N-89やN-251に耐性を示すHCV RNA複製細胞株の樹立を試みた。その結果、Step-wise法によりN-89やN-251の50%阻害濃度が10倍程度高くなった耐性細胞株を得ることに成功した。N-89とN-251に対する耐性度に違いはないことからN-89とN-251の標的は同じであることが示唆された。(2) HBVをはじめ他のヒトウイルスに対するN-89やN-251の活性評価本研究開始前にN-89やN-251が抗HBV活性を示す予備的実験結果を得ていた。この結果を検証するために、HBV受容体であるNTCP分子を発現させたヒト肝癌細胞HepG2を作成し、HepG2.2.15細胞から産生された感染性HBV粒子を感染させ一過性にHBVを増殖させるアッセイ系を構築した。このアッセイ系を用いて解析した結果、N-89やN-251の抗HBV活性は当初の予想より弱く、HCVでのRNA複製阻害とは異なり、HBVでは感染阻害であることが判明した。また、サブゲノムレプリコン細胞を用いた解析ではデング熱ウイルスには効果がなく日本脳炎ウイルスに対して弱い効果があることが分かった。本研究の柱とした2項目のうち、項目(1)については、N-89やN-251に耐性を示すHCV RNA複製細胞を作成できたことから、当初の計画どおり順調に進展している。ただ、現在の耐性度は10倍程度なので、さらに耐性度の高い細胞を得ることができれば、N-89やN-251の抗HCV作用メカニズムの解明に迫ることができると考えられるので現在、その努力をしている。項目(2)については、研究計画当初予想していたより抗HBV活性が弱いことが判明したが、HCV近縁のフラビウイルスでも抗ウイルス活性を示す場合と示さない場合があることから、この作用機構を探る上でも非常に興味深い結果を得ることができた。全体としての進捗状況は、概ね良好で予想していた範囲内にあり、最終年度の研究成果が期待できる。独自に開発したC型肝炎ウイルス(HCV)アッセイ系を用いて見出した新規抗HCV化合物である環状過酸化低分子化合物(N-89とその誘導体N-251)の抗HCV作用機序の解明を目的として研究を行った。なお、HCV以外の近縁ウイルスに対する抗ウイルス作用活性は、当初予想していたより活性が弱いか或いは活性がないことが前年度の研究で分かったことから、N-89などの抗HCV作用機序の解明には有用ではないと判断し、当該年度は、前年度得られたN-89やN-251に抵抗性を示すHCV-RNA複製細胞を用いて解析を行った。得られた成果を以下に示す。(1) N-89やN-251に抵抗性を示すHCV-RNA複製細胞においても、各種DAA(直接作用型抗HCV薬)は強い抗HCV活性を示したことから、N-89やN-251の作用機序はこれらのDAAとは異なるものと考えられた。(2) 2種類のHCV-RNA複製細胞(親細胞)とそれらの親細胞から得られたN-89やN-251に抵抗性を示す2種類の細胞(抵抗性細胞)由来のHCV-RNAを入れ替えた計8種類のHCV-RNA複製細胞を作成した。これらの8種類の細胞のN-89やN-251感受性を評価した結果、N-89やN-251への抵抗性の獲得には、ウイルス側と宿主側の両方の因子が同程度に関与していることが明らかになった。(3)N-89やN-251に抵抗性を示す細胞由来のHCVの遺伝子解析から、これらの抵抗性獲得に関与する可能性のあるアミノ酸置換を10カ所検出した。(4)親細胞と抵抗性細胞を用いたcDNAマイクロアレイ解析により抵抗性の獲得に寄与する可能性のある遺伝子候補(抵抗性細胞において発現上昇する22種類と低下する17種類)を特定した。

新規抗HCV化合物(N-89とN-251)の抗HCV作用機序の解明を目的とした。まず、N-89やN-251に抵抗性を示す細胞株の樹立を行った。得られた抵抗性細胞と元の感受性細胞を用いて、当該化合物の作用機序の解析を行い、当該化合物への抵抗性獲得には、ウイルス側と宿主側の両方の因子が同程度に関与している事を明らかにした。抵抗性細胞由来のHCVの遺伝子解析から、抵抗性獲得に関与する可能性のあるアミノ酸置換を検出した。マイクロアレイ解析により抵抗性獲得に寄与する可能性のある遺伝子候補を特定した。また、当該化合物が日本脳炎ウイルス、B型およびE型肝炎ウイルスにも増殖抑制効果があることを明らかにした。本研究は当初の研究計画に沿って概ね進展しているため、推進方策の大きな変更はない。従って、次年度も2つの項目について、研究を進めて行く予定である。項目(1)については、ウイルス側因子の解析として得られた耐性細胞と親細胞におけるHCVの遺伝子解析を行い、耐性獲得に伴い出現したと考えられるHCV変異の有無を明らかにする。候補となる変異が見つかった場合には、その変異をHCV遺伝子に導入して耐性獲得に関与しているかどうかの機能解析を行う。宿主側因子の解析は、耐性細胞と親細胞を用いて、cDNAおよびmiRNAマイクロアレイやリン酸化アレイの比較解析などを行う。項目(2)については、弱いながらも活性が確認できたデング熱ウイルスに関して、HCVに対する作用メカニズムと対比しながら、その作用メカニズムの解析を行う。N-89やN-251がHCVに対して強い抗ウイルス作用を示す理由を明らかにする。ウイルス学、細胞生物学、分子生物学、肝臓学効率良く且つ節約しながら研究を進めることができたことが大きな要因である。最終年度のゴールに向けて。費用のかかるマイクロアレイ解析等に研究費を充てる。
レクチンによる単サブユニットグルタミン酸受容体の糖鎖の修飾作用に関する研究

米国のハイネマンよりAMPA/カイニン酸型グルタミン酸受容体サブユニット遺伝子GluR1、GluR3を含むプラスミドを、また、独のシ-バーグよりGliR4を含むプラスミドを譲り受けた。プラスミドからグルタミン酸受容体のRNAをin vitro合成し、アフリカツメガエル卵母細胞に遺伝子導入することにより単一サブユニットタンパクのみから構成されるAMPA/カイニン酸型のグルタミン酸受容体チャネルを発現させた。GluR2のみからなる受容体チャネルは、電気生理学的応答を示さないので実験を行わなかった。そして、二電極膜電位固定を行い、タチナタマメレクチンであるコンカナバリンA(ConA10muM)によりグルタミン酸応答、カイニン酸応答、及びAMPA応答が増強されるかどうか調べた。ConAは、GluR1のみからなる受容体、GluR3のみからなる受容体、GluR4のみからなる受容体のいずれに対しても、また、グルダミン酸(100muM)、カイニン酸(100muM)、AMPA(20muM)のいずれに対するアゴニスト感受性電流応答をも増強した。しかし、増強の程度は、サブユニットの種類により、また、アゴニストの種類により大きく異なった。最も増強効果の強かったのはGluR1受容体のグルタミン酸応答でConAにより6.9倍に増強されたが、最も増強効果の弱かったGluR3受容体のカイニン酸応答は1.1倍にしか増強されなかった。グルタミン酸受容体の脱感作を抑制することにより応答を増強することが知られているアニラセタム(1mM)は、ConAによって増強させられたアゴニスト感受性電流応答を更に増強し、最も強い増強効果の見られたGluR4受容体のグルタミン酸応答は、ConAとアニラセタムの相互作用により元の63.8倍にまで大きくなった。