hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
地域在住高齢者における歯周病と認知機能障害発生のリスクとの関連

自立高齢者を対象に実施した2012年・2013年健診と5年次追跡健診のデータを用いて、歯周病の血清抗体価と認知機能障害との関連について、性別・年齢・ヘリコバクターピロリ菌の血清抗体価・内科疾患(高血圧・脂質異常症・がん・糖尿病・心筋梗塞・脳卒中)を調整変数とした多変量解析を行った結果、歯周病の血清抗体価は認知機能障害に対して関連性は否定はできないが統計学的に有意ではなかった。有意差が出なかった理由として、5年次追跡健診の参加者は平均81歳で、継続して疫学調査に参加した方において認知症領域に該当する人がほとんどいなかったためと考える。歯の喪失と栄養状態との関連性についても検証した。男性1591名(中央値71.0歳)、女性1543名(中央値71.0歳)を本研究の分析対象者とした。咀嚼能力の客観的指標として最大咬合力を測定した。主観的指標として剪断に必要な硬さで群分けした5つの食品群(第1群:バナナ等0.53kg、第2群:蒸した米等1.22kg、第3群:干しブドウ等2.93kg、第4群:生ニンジン等4.38kg、第5群:ビーフジャーキー6.56kg)を咀嚼できるか否かの質問紙調査を行った。栄養指標として血清アルブミンとBody Mass Indexのデータを使用した。ロジスティック回帰分析で性・年齢・飲酒・喫煙・握力・内科疾患の有無を調整した後でも、最大咬合力100N以上300N未満(OR 1.45; 95%CI, 1.09-1.92)と100N未満(OR 1.42; 95%CI, 1.00-2.02)は血清アルブミン4.4g/dl未満に対して有意な関連を示した。5段階の硬さの食品すべて咀嚼可能であることはBMI21.0kg/m2未満に対して有意な関連を示した(OR 0.66; 95%CI, 0.53-0.83)。本研究は、地域在住高齢者を対象とした前向きコホート研究で、歯周病と認知機能障害との関連を検証するものである。2015年度の研究目的は、認知症関連遺伝子アポリポタンパクE遺伝子の一遺伝子多型であるapoE4の影響を調整した後でも、歯の残存本数が少ないと認知機能障害(軽度認知障害および認知症領域)の発生リスクが上昇するかについて検証することであった。2015年度に、2012年に採血し凍結保存していたDNAを使ってapoE4のSNP解析を実施した。データ解析の対象者は2007年のベースライン健診で認知機能障害がなく、遺伝子解析研究に同意した2373名であった。5年後の2012年の追跡健診で381名(16.1%)が軽度認知障害あるいは認知症領域と判定された。多変量解析にて性、年齢、ベースライン時の認知機能検査の成績、教育年数、抑うつの有無、高血圧・糖尿病・脳血管疾患・脂質異常症・心筋梗塞の既往の有無、飲酒習慣、喫煙習慣、apoE4の影響を調整した後の歯25-32本に対する歯17-24本のオッズ比は1.45 (95%CI: 1.08-1.95, P=0.014)、歯9-16本のオッズ比は1.20 (95%CI: 0.81-1.76, P=0.362)、歯0-8本のオッズ比は1.42 (95% CI: 1.02-1.99, P= 0.040)で、歯17-24本と歯0-8本において有意な関連がみられた。本研究の結果は、歯の残存本数が少ないことは認知機能障害の危険因子であることを示唆するものである。全対象者のapoE4のSNP解析を終了させた。また、2012年に採血し凍結保存していた血清を使ってヘリコバクターピロリ菌の抗体価も測定し終えた(n=2969)。1.2012年と2013年の疫学調査(藤原京スタディ)のボランティア協力者(健診参加時点で平均年齢78歳)から採取した凍結保存血液を用いて、アポリポタンパクE遺伝子(apoE, rs429358)のSNP解析を実施した。遺伝子型T/Tは2410名、C/Tは452名、C/Cは37名であり、アルツハイマー病の危険因子であるapoE4の保有割合は、16.9%(489/2899)であった。2.2012年の協力者129名の凍結保存血液を使って、4種類の歯周病原菌(A.actinomycetemcomitans, P.gingivalis, P.intermedia, E.corrodens)、ヘリコバクターピロリ菌(H.pylori)、サイトメガロウイルス(CMV)、クラミジアニューモニエ(Chlamydia pneumoniae)、単純ヘルペスウイルス(HSV)の血清抗体値を測定した。3.2012年と2013年の協力者2957名の凍結保存血液を使って、ヘリコバクターピロリ菌(H.pylori)の血清抗体値を測定した。

4.2012年の協力者のうち追跡可能の3191名(大和郡山市の住民と死亡、県外転居、施設入所、入院、拒否を除外した)に健診の案内を発送すると、1578名から参加申し込みがあった。この1578名のうち、2017年2月22日3月18日の間の17日間に804名の健診を終了させた。調査内容は以下の通りであった。1)Mini-Mental State Examination(MMSE)、ADAS-Jcog.単語再生テスト、主観的物2)抑うつ状態のスクリーニングのGeriatric Depression Scale短縮版(GDS15)3)歯科健診による残存歯数・機能歯数の評価、歯周ポケット深さの測定4)血圧測定、身長・体重・腹囲計測5)High sensitivity C-reactive protein(高感度CRP)、糖尿病・脂質異常症に関する血液検査6)病歴(がん・脳血管疾患・心筋梗塞・糖尿病・高血圧・脂質異常症など)の聞き取り7)日常生活動作能力の自立度、身体活動量、生活習慣(飲酒・喫煙・外出頻度・身体活動量・睡眠など)、社会参加の有無2016年度に10年次追跡健診を実施したため。教育歴と高齢期における認知機能障害の新規発生との関連について検証した。対象者は2007年のベースライン時の認知機能検査で健常範囲と判定された2373名の地域在住高齢者(平均71歳)であった。2012年に5年次追跡健診を実施し、Mini-Mental State Examination(MMSE)で軽度認知機能障害と認知症領域を判定した。追跡5年目の検査で軽度認知機能障害または認知症領域と判定された者は381名であった。ロジスティック回帰分析にてベースライン時のMMSE score、脳血管疾患・心筋梗塞・高血圧・糖尿病・脂質異常症の有病状況、apolipoprotein E (APOE) ε4 alleleの影響を調整すると、軽度認知機能障害または認知症領域に対する中学卒業以下のオッズ比は1.33 (95%CI, 1.02-1.73, P= 0.035 )で有意な関連がみられた(基準:高卒以上)。自立高齢者の歯の本数および最大咬合力と、咀嚼可能食品群数と血清アルブミンとの関連を検討した。藤原京スタディの2007年収集のベースラインデータを使用した。採血と歯科健診および剪断に必要な硬さで群分けした食品群(1バナナ等0.53kg・2ご飯等1.22kg・3油揚げ等2.93kg・4豚肉ももゆで等4.38kg・5さきイカ等6.56kg)を咀嚼できるか否かの聞き取りを行った。男性1682名と女性1692名を本研究の分析対象者(平均71.0歳)とした。5つの食品群のうち一つでもかみ切れない食品群がある者の割合は歯20本以上群、10-19本群、1-9本群、0本群の順に、5.7%、34.1%、43.2%、45.7%と有意に増加し、血清アルブミン4.0g/dl未満の者の割合は1.8%、2.1%、5.1%、4.0%と有意に増加した。女性においても同様の傾向がみられた。本研究課題では、歯周病の評価指標として歯周病原細菌の血清抗体価を測定する計画である。国内唯一の民間検査機関であったサンスターが歯周病原細菌の血清抗体価検査の事業から撤退したため、他に検査機関を探す必要性が生じたから。自立高齢者を対象に実施した2012年・2013年健診と5年次追跡健診のデータを用いて、歯周病の血清抗体価と認知機能障害との関連について、性別・年齢・ヘリコバクターピロリ菌の血清抗体価・内科疾患(高血圧・脂質異常症・がん・糖尿病・心筋梗塞・脳卒中)を調整変数とした多変量解析を行った結果、歯周病の血清抗体価は認知機能障害に対して関連性は否定はできないが統計学的に有意ではなかった。有意差が出なかった理由として、5年次追跡健診の参加者は平均81歳で、継続して疫学調査に参加した方において認知症領域に該当する人がほとんどいなかったためと考える。歯の喪失と栄養状態との関連性についても検証した。男性1591名(中央値71.0歳)、女性1543名(中央値71.0歳)を本研究の分析対象者とした。咀嚼能力の客観的指標として最大咬合力を測定した。
キューバの対外政策決定要因に関する研究

2018年6月開催の日本ラテンアメリカ学会のパネル「カリブ地域の政治と国際関係」においてカリブ諸国の「医療外交」をテーマとする発表に対して、討論者として報告を行った。その際、本研究の成果の一部を援用して、キューバの対アフリカ、対ラテンアメリカ外交、および国内政治経済要因を指摘した。2018年8月、2019年1月、3月の計3回にわたって、日本貿易振興機構アジア経済研究所図書館にて、1960年代から近年までのキューバ外交に関する現地での報道資料や論文等の資料集を進めた。研究の成果を11月の日本国際政治学会にて「キューバとOAS」とのタイトルで報告する準備を行った(後述する事情により報告はキャンセルせざるを得なくなった)。2019年3月には京都大学稲盛財団記念会館にて開催された研究会(アジアとラテンアメリカにおける競争的権威主義体制)にも参加した。2018年度は種々の事情により予定していた海外調査を次年度に延期した。その代わり、研究テーマに関係する重要な欧文献30冊を購入し、最近の研究動向整理を中心に進めた。こうした研究成果は2019年4月に開催された「愛知県立大学国際セミナー」において講演「ポスト・カストロ時代のキューバおよぼラテンアメリカ」として報告した。また、メキシコ国立自治大学政治社会学部ウスカンガ教授(Carlos Uscanga)が2017年に執筆したメキシコ外交に関する論文「友好から敵対へ」の翻訳を行なうことで、20世紀の米国・メキシコ・キューバ関係の分析を進めることができた。2018年8月に家族が進行性の病気であることが判明し、治療・入院・手術を継続中であり、9月に予定していたキューバ、メキシコでの現地調査を中止せざるを得なかった。この影響により、発表エントリーしていた11月の日本国際政治学会での発表もキャンセルとなった。国内における文献調査(二次資料)も、9月12月の間はあまり進めることができなかった。家族の病気療養の推移にもよるが、2019年5月下旬の時点では安定しており、最も適切なタイミングとして8月下旬から9月上旬の間で2週間以内の海外調査を実施できそうである。現在、在京キューバ大使館やメキシコの研究者に連絡する調査計画書を作成している。2019年末を目途に大学紀要には中間報告的な論文をまとめる予定。年度途中に家族の進行性の病気が発覚したため、年度内(9月)に予定していた海外調査計画をキャンセルしたことが主な理由である。次年度(2019年度)においては比較的短期での海外調査を複数回実施する計画である。
Non cording RNAを用いた大腸癌の新規診断法とミサイル療法の開発

本研究の目的は、大腸癌のアンチセンスRNAの発現パターンを解析し大腸癌の層別化を行うことである。アンチセンスRNAが一部の癌抑制遺伝子をエピジェネティックに制御してタンパク質の発現を抑制することが報告された(Yu W et al, Nature 2008)。癌の研究においてもアンチセンスRNAがますます重要性を帯びてきたが、現在までのところ、ヒト癌に関してアンチセンスRNAの網羅的解析の報告は無い。そこで我々は、平成20年度にin situ hybridization(ISH)と共通のプローブ領域をもつセンス/アンチセンスRNAプローブを新たに設計し、そのプローブを搭載した44Kのカスタムマイクロアレイを作成した。センス/アンチセンスRNAの網羅的解析が可能なマイクロアレイは他に類を見ないものである。筑波大学病院で行われた大腸癌手術症例で得られた検体から癌部および非癌部組織を採取し、RNAを抽出、カスクムマイクロアレイを用いて、網羅的解析を行っている。これまでに約70症例の解析を行い、ヒト大腸癌組織と非癌部組織においてセンス/アンチセンスRNAが癌特異的に増加または減少していることを確認した。この結果はヒト癌のセンス/アンチセンスRNAを網羅的に解析した世界初の報告になる。このマイクロアレイの結果を、患者の臨床病期などを加味して多変量解析を行い新しい大腸癌診断法のバイオマーカーとなり得る候補遺伝子を抽出した。抽出した候補遺伝子に関してRT-PCRで発現量の裏付けを行った。これまでの結果から、アンチセンスRNAは大腸癌の新規バイオマーカーとして非常に有用となり得ると考えられた。アンチセンスRNAが一部の癌抑制遺伝子をエピジェネティックに制御してタンパク質の発現を掬制することがカ報告された(Yu W et,Nature 2008)。癌の研究においてもアンチセンスRNAがますます重要性を帯びてきたが、現在までのところ、ヒト癌に関してアンチセンスRNAの綱羅的解析の報告は無い。そこで我々は、平成20年度にin situ hybridization(ISH)と共通のプローブ領域をもつセンス/アンチセンズRNAプローブを新たに設計し、そのプローブを搭載した44Kのカスタムマイクロアレイを作成した。センス/アンチセンスRNAの網羅的解析が可能なマイクrロアレイは他に類を見ないものである。筑波大学病院で行われた大腸癌手術症例で得られた検体から大腸癌および非癌部組織を採取し、RNAを抽出、カスタムマイクロアレイを用いて、網羅的解析を行っている。これまでに約50症例の解析を行い、ヒト大腸癌組織と非癌部組織においてセンス/アンチセンスRNAが癌特異的に増加または減少していることを確認した。このマイクロアレイの結果を、患者の臨床病期などを加味して多変量解析を行い新しい大腸癌診断法のバイオマーカーとなり得る候補遺伝子を抽出しているところである。抽出した候補遺伝子に関して今後RT-PCRで発現量を、ISHで発現部位を、またWestern blotで標的タンパク質の発現量の変化を解析していく予定である。
導波型第二高調波発生デバイスを用いた情報処理用集積化短波長光源の試作

本試験研究は、導波型第二高調波発生デバイスを中心素子として、光情報処理への応用に適した小型で短波長の集積化コヒーレント光源を実現することを目的とした。2年間の研究で得られた成果を以下に要約する。1.LiNbO_3導波路型疑似位相整合光第二高調波発生(QPM-SHG)デバイスおよびそれと半導体レーザを集積化した系の理論解析により種々のデバイス例について理論性能と作製精度要求を明らかにし、データを蓄積した。2.高効率QPM-SHGデバイス用周期的分極反転構造形成の最も有効な方法となると期待される新しい電圧印加法について実験的に検討した。波板状の新規な周期電極と反転電流モニタ/電圧パルス自動制御回路を用いて理想に近い反転構造を再現性よく形成する技術を確立した。3.半導体レーザ励起青色光発生用導波路型QPM-SHGデバイスを設計・試作した。実験で特性を評価し、これまでの最高記録である150%/Wの規格化効率と5mW以上の出力を達成した。4.SHGデバイスの入出力端にミラーを設けて入力基本波を導波路内で巡回共振させるに共振型導波路QPM-SHGデバイスについて理論解析を行い、変換効率を増倍できることを示した。また実際にデバイスを試作して実験を行い、進行波型デバイスに比較して約8倍のSHG変換効率の増倍を達成した。5.さらに高効率化を図るために相互作用長の拡大について検討を行い、10mmまでの長尺の分極反転構造の作製技術や導波路作製技術などの要素技術を確立し、1000%/Wの規格化効率達成の見通しを得た。6.高調波出力の短波長化の検討を行い、実際に周期約2μmの分極反転構造を有する紫外光発生デバイスを試作し、波長383nmまでの紫外光の発生、70%/Wの規格化効率、1mW以上の出力を達成した。本試験研究は、導波型第二高調波発生デバイスを中心素子として、光情報処理への応用に適した小型で短波長の集積化コヒーレント光源を実現することを目的としている。本年度に得られた成果を以下に要約する。1.LiNbO_3導波路型疑似位相整合光第二高調波発生(QPM-SHG)デバイスの理論解析により種々の具体的デバイス設計例について理論性能と作製制度要求を明らかにし、試作のためのデータを蓄積した。2.導波路QPM-SHGデバスと半導体レーザを集積した系の動作特性を理論解析してシステムとしての効率・出力・安定性に関するデータを得た。3.高効率QPM-SHGデバイス用周期的分極反転構造形成の最も有効な方法となると期待される新しい電圧印加法について実験的に検討した。4.電圧パルス印加法による分極反転構造を用いて、Nd:YAGレーザ励起緑色光発生用導波路型QPM-SHGデバイスおよびSHG半導体レーザ励起青色光発生用導波路型QPM-SHGデバイスを設計・試作した。実験で特性を評価し、両デバイスにつきこれまでの最高記録である100%W以上の規格化効率ち1mW以上の出力を達成した。5.SHGデバイスの入出力端にミラーを設けて入力基本波を導波路内で巡回共振させるに共振型導波路QPM-SHGデバイスについて理論解析を行い、変換効率を増倍できることを示した。

6.プロトタイプの共振型導波路QPM-SHGデバイスを設計・試作し、Ti:Al_2O_3レーザを励起光源として用いた実験により2倍程度の変換効率増倍を達成した。平成7年度は前年度に引続いて光第2高調波発生部の性能改善を行うとともに、さらに高度な機能を持つ集積化光源の実現のため理論的・実験的検討を行い、以下のような成果を得た。(1)平成6年度の成果である分極反転構造の電圧パルス印加法による形成技術に関して改善を加え、半導体レーザを一次光源として光第2高調波発生を行う集積化光源(SHG部の相互作用長3mm)を試作した。特性評価の実験を行い、150%/Wの規格化効率を達成した。(2)さらに高効率化を図るために相互作用長の拡大について検討を行い、10mmまでの長尺の分極反転構造の作製技術や導波路作製技術などの要素技術を確立し、1000%/Wの規格化効率達成の見通しを得た。(3)進行波型デバイスの導波路両端面に誘電体多層膜からなる反射器を付加することにより、共振器型のデバイスを作製し、その第二高調波発生特性を波長可変半導体レーザを一次光源として用いた実験で評価した。その結果、進行波型デバイスに比較して約8倍のSHG変換効率の増倍を達成した。(4)光源の導波路に周期電極を付加して共振条件を電気光学効果で制御して出力光強度を変調できるようにした集積化光源を設計・試作し、その特性を評価する基礎実験を行った。高調波出力の短波長化の検討を行い、実際に周期約2μmの分極反転構造を有する紫外光発生デバイスを試作し、波長383nmまでの紫外光の発生、70%/Wの規格化効率、1mW以上の出力を達成した。(6)応用領域の調査研究を行うとともに、集積化短波長光ディスクピックアップなど、より高度な集積化デバイスへの発展可能性について検討を行った。
海洋天然物アプリロニンＡが誘導する新しいタンパク質間相互作用

本研究で私は、抗腫瘍性物質アプリロニンAの標的タンパク質との結合様式の解明を目指した。アプリロニンAはアクチン複合体としてチューブリンに作用することが知られているが、分子レベルでの結合位置はまだ明らかになっていない。そこで私は新しいタイプの分子プローブを用いる手法を提案した。反応性官能基をリガンド(アプリロニンA)に導入したアミドピレンプローブである。まずこのプローブと標的タンパク質を反応させ、リガンド結合位置近傍のアミノ酸残基をアミドピレンでラベル化する。得られた複合体を酵素消化した後、紫外線レーザーを用いた質量分析(LA-LDI MS)で解析することで、ラベル化されたペプチド断片が選択的に検出され、結合位置が決定されると期待される。本研究では反応性官能基としてN-ヒドロキシスクシンイミドエステル構造を導入したアプリロニンAのアミドピレンプローブを用いることで、標的タンパク質のアクチンを定量的にラベル化し、その結合位置をLA-LDI MS法で決定した。すなわち、従来法で必要なラベル化ペプチドの精製過程を除くことができたため、より少ない操作で結合位置を解析することができた。しかしLA-LDI MSの測定において、プローブのリンカー部分でのフラグメント化が観測され、目的のラベル化ペプチドの検出感度が著しく低下した。この問題はLA-LDI MSで開裂しないプローブを設計することで克服できると期待される。このアミドピレンプローブの構造最適化により、さらなる高効率・短時間の結合位置解析が可能になると考えられる。また本手法は様々な生物活性リガンドにも適応できるため、アミドピレンプローブの最適化は創薬研究に大きく貢献できると期待される。そして本手法を用いて、アプリロニンAとチューブリンの結合位置を明らかにし、アプリロニンAの創薬研究を発展させたいと考えている。27年度が最終年度であるため、記入しない。私はこれまでに海洋天然物アプリロニンAが細胞骨格タンパク質のアクチンとチューブリンのタンパク質間相互作用を誘導することを明らかにした。当該年度はその一般性の確認と、その結合様式の解明のための新規プローブの開発に着手した。まずアプリロニンA以外のアクチン脱重合剤としてラトランクリンA、サイトカラシンD、ミカロライド類に着目し、それぞれにおいて、細胞分裂の際にチューブリンが構成する紡錘体に対する効果を調べた結果、ミカロライドCが異常な紡錘体形成を誘導した。しかし精製したタンパク質を用いたin vitroの試験でミカロライド類はチューブリンに作用しなかったため、この化合物の標的はチューブリン以外の紡錘体形成に重要なタンパク質であると考えた。そのタンパク質探索のため、ビオチンプローブを合成し、生細胞から標的タンパク質を探索した結果、HSP90が精製された。現在HSP90と紡錘体形成異常との関係について調べている。またアプリロニンAーアクチンーチューブリン三元複合体の結合様式の解明に着手した。まずX線解析のための結晶化を試みた。しかし200種類の結晶化バッファーを検討したが、結晶を得ることはできなかった。そこで、分子プローブを用いる方法に着目した。この方法はタンパク質内のリガンド結合位置近傍のペプチド構造を検出できる。しかしそのペプチド断片を精製する必要があり、回収量が低下してしまう。実際、共同研究者がこの解析を行っているが、まだ達成できていない。そこで私は精製しない方法の確立を目指し、ラベル化したペプチドを質量分析で選択的に検出できる機能性官能基の開発を行っている。5回の分子設計から、アミドピレン構造が解析に有用であることを見出した。今後はまず、その分子を用いて、結合位置が既知のアクチンとの解析を行い、その結果の妥当性を評価する。その後チューブリンとの結合位置を解明する予定である。

そして本手法を用いて、アプリロニンAとチューブリンの結合位置を明らかにし、アプリロニンAの創薬研究を発展させたいと考えている。アプリロニンAが誘導する新規のタンパク質間作用の特異性の確認は実行できた。当初の予定通り、代表的なアクチン結合分子であるラトランクリンA、サイトカラシンD、ミカロライド類いずれもアクチンーチューブリンのタンパク質間相互作用を誘導しなかった。しかしそれに伴い、ミカロライドCが新たなタンパク質間相互作用を誘導する可能性が示唆されており、分子生物学的に興味深い知見を得ることができたと感じている。アプリロニンAーアクチンーチューブリンの三元複合体の解析において、複合体の結晶化の見込みが全くなかったことは予想外であった。しかし現在その代替案として分子プローブを用いた手法を試みており、その中で、既存の方法で問題がある精製過程を省略できる新しい手法の開発を行っている。現在までにアミドピレン基を検出基として導入することで結合位置解析に有効と思われるプローブを合成できているため、三元複合体の結合位置解析も遠からず達成できると考えられる。当初の予定では上記の方法で明らかにした結合様式を元に、アプリロニンAの構造を簡略化した分子を設計する予定で、合成容易なアクチンーチューブリンのタンパク質間相互作用誘導分子を合成するはずだったが、まだ行えていない。そのため全体的な計画から考えると現在の進行状況はやや遅れていると考えている。しかし共同研究者が既に部分的な合成を始めているため、結合様式を解明できれば、類縁体合成には多くの時間はかからないと考えており、後1年で、予定通り新規のタンパク質間相互作用を誘導するリガンドを創出できると期待できる。27年度が最終年度であるため、記入しない。今後はこれまでに合成した結合位置解析に特化したアプリロニンAの分子プローブに対して、まずその機能製を評価するためにアクチンとの結合位置を解析する。両者の結合位置は既にX線結晶構造解析で明らかになっている。そのため、その2つの結果を比較することで今回開発したピレンプローブの有用性を評価できる。その後はピレンプローブを用いてチューブリンとの結合位置を明らかにする。そしてその結果をもとにドッキングシミュレーションなどの計算科学的手法で詳細な結合位置を明らかにする。この結合様式の情報はアプリロニンAの構造最適化を可能にするため、簡略化した構造を持つアプリロニンA人口類縁体を合成する。その類縁体に対して当初の予定通り、アクチン、チューブリンに対する解離定数をアプリロニンAと比較する。これにはBiacoreを用いる。これは表面プラズモン共鳴の変化を観測することで解離定数を算出できる。Biacoreは相互作用を調べる一方を専用のセンサーチップに固定する必要があるが、アプリロニンAにおいては所属する研究室で合成したアプリロニンAビオチン誘導体を用いることができると考えている。
カロリー制限食の摂取に伴うマイクロRNAを介した免疫増強メカニズムの解明

適切なカロリー制限は、様々な疾病を予防するなどの健康効果をもたらすことが知られている。本研究では、カロリー制限によって著しく変化する血中miRNAに着目し、miRNAを介した免疫制御に関するメカニズムを明らかにすることを目的とし、実験を行った。マウスを用いて、カロリー制限を行ったところ、カロリー制限食の摂取によって脾臓中のナイーブT細胞が増加し、血清中で発現が増加するmiRNAを同定した。今後は、選抜したmiRNAのターゲット分子を同定し、miRNAによる免疫機能制御メカニズムの詳細を明らかにしたいと考えている。通常の食事のカロリーを30%制限することにより、肥満や糖尿病の発症を抑えるだけではなく、免疫機能が高まることが知られているが、免疫機能の制御に関わる遺伝子とその発現の制御に関わる因子は未解明である。そこで本研究では、カロリー制限によって著しく変化するマイクロRNA(miRNA)に着目し、その免疫機能に与える影響について分子レベルで明らかにすることを目的とする。そこでまず、カロリー制限によって免疫機能が変化する実験条件を確立するために、マウスに通常飼料、カロリー制限した飼料、高カロリー(高脂肪含有)飼料を4週間摂取させ、マウス脾臓細胞のPopulation解析と免疫応答の変化を解析した。その結果、カロリー制限をしたマウス脾臓のヘルパーT細胞とキラーT細胞の割合は、通常飼料摂取群に比べて有意に高い値を示した。また、カロリー制限をした場合、ヘルパーT細胞のうちのナイーブT細胞(抗原刺激を受けていない細胞)の割合が高くなることを見出した。免疫応答を解析した結果、カロリー制限の影響は見られなかったが、高カロリー飼料を摂取したマウスの脾臓細胞は、LPSの刺激に対してサイトカインを高産生した。以上より、摂取カロリーの違いによって免疫機能が変化する条件を見つけ出し、カロリー制限によって著しく変化するmiRNAを同定するためのマウス実験モデルを確立することができた。次に、カロリー制限によって変化する免疫機能を制御するmiRNAを探索するために、カロリー制限飼料、あるいは高カロリー飼料を摂取させたマウスより血清を採取し、血中miRNAのマイクロアレイ解析を行った。その結果、カロリー制限によって著しく発現増加するmiRNAと発現低下するmiRNAを選抜することができた。今後は、選抜したmiRNAがどのように免疫機能を制御しているかを詳細に解析する予定である。マウスに通常飼料、カロリー制限した飼料、高カロリー(高脂肪含有)飼料を4週間摂取させ、マウス脾臓細胞のPopulation解析と免疫応答の変化を解析した。また、カロリー制限をした場合、ヘルパーT細胞のうちのナイーブT細胞(抗原刺激を受けていない細胞)の割合が増加することを見出した。次に、カロリー制限下で免疫機能を制御するmiRNAを探索するために、カロリー制限飼料、あるいは高カロリー飼料を摂取させたマウスより血清を採取し、血中miRNAのマイクロアレイ解析を行った。さらに、カロリー制限で発現増加したmiRNAの機能を解析するために、候補miRNAのミミック分子をマウス脾臓細胞にトランスフェクトし、ヘルパーT細胞の表現型を解析したところ、ナイーブT細胞、あるいはメモリーT細胞の割合が変動する傾向にあった。平成26年度においては、カロリー制限あるいは高脂肪食を摂取させたマウスにおいて免疫機能の変化が起こる実験系を確立し、血中miRNAのマイクロアレイ解析を行った。その結果、カロリー制限によって著しく発現増加するmiRNAと発現低下するmiRNAを選抜することができたことから、おおむね計画通り研究が進んでいると評価できる。免疫学今後は、マイクロアレイで選抜されたmiRNAについて、カロリー制限させたマウスの血中、5大臓器(心臓、肝臓、脾臓、腎臓、肺)、各種リンパ組織、免疫担当細胞での発現をリアルタイムPCRで解析することにより、カロリー制限で変化するmiRNAを同定する。また、同定したmiRNAが免疫担当細胞に対して機能変化を及ぼすかどうかを検証するために、人工的に作成したmiRNA模倣分子を各種免疫担当細胞(T細胞、NK細胞、樹状細胞)添加し、サイトカイン産生や細胞表面分子の発現解析を行う。さらに、miRNAで発現変化する標的遺伝子を同定し、miRNAによる免疫機能制御メカニズムを明らかにする。
記憶固定における海馬から大脳皮質への情報のリレー機構

記憶の固定化の神経回路メカニズムの詳細は不明であるが、一つ、動物が静止状態や睡眠中にあるときに観察されるreplay現象が関与すると考えられている。本研究では、固定化先として有力候補である大脳皮質領域の前帯状皮質(ACC)のどの細胞種に記憶が固定化されていくかを、メゾスケールからシナプスレベルまでの範囲で明らかにしていく。固定化に関連したACCのシナプスを同定するために、抑制性回避学習をマウスに行わせ、30分後と35日後それぞれ別のマウスから脳スライスを摘出し、パッチクランプ法によりACCの2/3層領域の興奮性神経細胞の活動を記録した。学習後すぐにはAMPA/NMDA比は変化しなかったが、35日以降ではAMPA電流が大きくなった。一方、海馬では学習後すぐにAMPA電流は大きくなることから、記憶の固定化先としてACCに転送されている可能性が高い。次に、興奮性細胞特異的にカルシウム感受性蛍光蛋白質G-CaMP7を発現するCaMKIIα-tTA x TRE-G-CaMP7マウスを用い、ACCの第2/3層の興奮性神経細胞の活動をカルシウムイメージングにより記録した。学習初期では場所細胞様活動は見られないが、数日後に場所特異的な活動やcontext依存的に活動する細胞が現れ、安定していくことがわかった。一方、海馬では、場所細胞はすぐに形成されるがわかった。今後、海馬で見られないcontext依存的な活動を示す細胞が海馬から直接入力が入るのか、また、どこへ出力していくか明らかにしていく。てんかん治療のため海馬を切除されたHM氏は新しいことを思い出すことは全くできなかったが、少年の頃の事は思い出すことができた。この症例からもわかる通り、記憶の中でも陳述記憶は初め海馬でコードされるが、時間が経つにつれ、海馬以外の脳領域に移行していくと考えられている。これを記憶固定化と呼ぶ。本研究では、どの大脳皮質領域のどの細胞種に記憶が固定化されていくかを、メゾスケールからシナプスレベルまでの範囲で明らかにしていく。固定化を起こした大脳皮質細胞とシナプスの同定するために、抑制性回避学習をマウスに行わせ、30分後と35日後それぞれ別のマウスから脳スライスを摘出し、パッチクランプ法により前帯状皮質(ACC)の2/3層領域の興奮性神経細胞の活動を記録した。学習直後にはAMPA/NMDA比は変化しないが、35日以降でAMPA電流が大きくなった。一方、海馬では学習後すぐに大きくなることから、記憶の固定化により記憶はACCに転送されている可能性が高い。学習初期では場所細胞様活動は見られないが、数日後に場所特異的な活動やcontext依存的に活動する細胞が現れることを発見した。一方、海馬では、場所細胞はすぐに形成されることがわかった。本年度は、電気生理学的手法とカルシウムイメージングにより、記憶の固定化による海馬からの投射先は、前帯状皮質が有力であり、その第2/3層の錐体細胞が主に反応していた。また、海馬とは異なり、長期記憶として転送されることで前帯状皮質の反応が強くなったことから、記憶の固定化による反応であることが考えられる。したがって、本研究は、申請した研究計画通りに進んでいる。カルシウムイメージングで前帯状回皮質の細胞の活動を記録すると同時に、海馬で局所場電位をreplayを判断するripple波を記録する。海馬でripple波に伴うメゾスケールの神経活動が前帯状皮質で観察されると期待される。

記憶の固定化に伴い大脳皮質でLTPが起こっているかの解析には連携研究者の林らが以前開発したAMPA受容体の電気生理学的taggingを用いる。AMPA受容体サブユニットGluA1を過剰発現すると、整流特性が内在受容体と異なるホモ四量体を形成する。これを用い海馬LTP誘導や体性感覚入力により体性感覚野でAMPA受容体のシナプスへの挿入が起こっていることを実証した(Hayashi, 2000, Takahashi, 2003)。GluA1を発現する細胞を全細胞記録し局所電気刺激あるいはCre依存的に発現したChR2やケージ化グルタミン酸を用い特定のシナプス前細胞を刺激することで、記憶固定化に伴いどのシナプスでLTPが起こったかを検討する。今年度で購入した領収書が次年度に繰り越された。また、得られた大規模解析や局所場電位記録などによるデータ取得における物品費や人件費、学会等での成果発表や情報収集など多額の助成金を次年度に参上した。
脳腫瘍微小環境の修飾による根治的ウイルス療法の開発研究

単純ヘルペスウイルスI型(HSV-1)のゲノムを遺伝子工学的に改変して、腫瘍細胞で選択的に複製するがん治療用ウイルスを作製できる。本研究は、悪性脳腫瘍の根治を可能にする革新的ウイルス療法の基礎開発を目的とした。幹細胞性を阻害するTGF-β阻害因子またはBMP4を発現する脳腫瘍幹細胞標的型HSV-1を作製した。更に、がん幹細胞が豊富な腫瘍や良性腫瘍でも高い複製能を呈する腫瘍特異的プロモータ制御型HSV-1を作製した。脳腫瘍微小環境の修飾を企図して作製した抗VEGF抗体発現型HSV-1は、ウイルス投与直後に生じる腫瘍の腫脹を抑制しながら抗腫瘍効果を発揮し、脳腫瘍治療での有用性が示された。単純ヘルペスウイルスI型(HSV-1)のゲノムを遺伝子工学的に改変して、腫瘍細胞で選択的に複製するがん治療用遺伝子組換えHSV-1を作製できる。研究代表者らは治療域の広い第三世代がん治療用HSV-1を開発し、我が国初のウイルス療法の臨床展開を行っている。本研究は、悪性脳腫瘍の根治的な治療開発を目指して、脳腫瘍微小環境の修飾を介した革新的ウイルス療法の開発研究を行うことを目的とする。臨床研究データやヒト膠芽腫由来がん幹細胞の特性解析、更にはがん細胞におけるウイルス複製等の最新知見に基づいた研究を行った。特に平成26年度は、目的の外来遺伝子を確実に挿入し、且つ複数のHSV-1を並行して短期間で作製することが可能な、G47Δを基本骨格とするBACシステム(T-BAC)を活用して、脳腫瘍幹細胞標的型HSV-1として、脳腫瘍幹細胞の幹細胞性維持やsphere形成能を阻害する抗TGF-β蛋白またはBMP4を発現する新規HSV-1を作製した。また、抗VEGF機能を有するHSV-1を複数作製して、主にマウス皮下腫瘍モデルを用いて有効性評価を行った。さらにマイクロRNA(miRNA)のうち数種は、マウス細胞株においてHSV-1複製を阻害するとされることから、miRNA阻害によるウイルス療法の治療効果修飾を調査した。世界でウイルス療法開発が激化する中、膠芽腫の根治をも可能にする、日本独自の、革新的かつ実用的な脳腫瘍治療の開発研究を推進する。臨床研究データやヒト膠芽腫由来がん幹細胞の特性解析、更にはがん細胞におけるウイルス複製等の最新知見に基づいた研究を行っている。目的の外来遺伝子を確実に挿入し、且つ複数のHSV-1を並行して短期間で作製することが可能な、G47Δを基本骨格とするBACシステムを活用して、脳腫瘍幹細胞標的型HSV-1として、脳腫瘍幹細胞の幹細胞性維持やsphere形成能を阻害するTGF-β阻害因子またはBMP4を発現する新規HSV-1を作製した。平成27年度は特に、悪性脳腫瘍由来のがん幹細胞や、がん幹細胞様の特性を有するSAS細胞株を用いたマウス腫瘍モデルを用いてin vivo評価を進め、TGF-β阻害因子発現型ウイルスやBMP4発現型ウイルスの高い有効性を明らかにした。更に、がん幹細胞が豊富な悪性脳腫瘍や良性脳腫瘍でも高いウイルス複製が得られるHSV-1を作製するため、G47Δで欠失したICP6を腫瘍特異的プロモータで制御したICP6遺伝子で置換した新規HSV-1を作製した。腫瘍特異的プロモータ活用型ウイルスは、特にゆっくりと増えるがん幹細胞において高い複製能を示した。更に、抗VEGF抗体を発現するHSV-1を新規に作製した。平成27年度は以下の成果を達成した。1.脳腫瘍幹細胞標的型HSV-1の作製i)目的の外来遺伝子を確実に挿入し、且つ複数のHSV-1を並行して短期間で作製することが可能な、G47Δを基本骨格とするBACシステム(T-BAC)を活用して、脳腫瘍幹細胞の幹細胞性維持やsphere形成能を阻害する抗TGF-β蛋白またはBMP4を発現する新規HSV-1を作製した。悪性脳腫瘍由来のがん幹細胞や、がん幹細胞様の特性を有するSAS細胞株を用いたマウス腫瘍モデルを用いてin vivo評価を進め、TGF-β阻害因子発現型ウイルスやBMP4発現型ウイルスの高い有効性を明らかにした。ii)がん幹細胞が豊富な悪性脳腫瘍や、良性脳腫瘍でも高いウイルス複製が得られるHSV-1を作製するため、G47Δで欠失したICP6を腫瘍特異的プロモータで制御したICP6遺伝子で置換した新規HSV-1を作製した。2.抗VEGF分子発現型HSV-1の作製

平成26年度に作製した抗VEGF機能を有する複数のHSV-1に加え、抗VEGF抗体を発現するHSV-1を新規に作製した。単純ヘルペスウイルスI型(HSV-1)のゲノムを遺伝子工学的に改変して、腫瘍細胞で選択的に複製するがん治療用遺伝子組換えHSV-1を作製できる。研究代表者らは治療域の広い第三世代がん治療用HSV-1を開発し、我が国初のウイルス療法の臨床展開を行っている。本研究は、悪性脳腫瘍の根治的な治療開発を目指して、脳腫瘍微小環境の修飾を介した革新的ウイルス療法の開発研究を行うことを目的とする。臨床研究データやヒト膠芽腫由来がん幹細胞の特性解析、更にはがん細胞におけるウイルス複製等の最新知見に基づいた研究を行っている。目的の外来遺伝子を確実に挿入し、且つ複数のHSV-1を並行して短期間で作製することが可能な、G47Δを基本骨格とするBACシステムを活用して、脳腫瘍幹細胞標的型HSV-1として、脳腫瘍幹細胞の幹細胞性維持やsphere形成能を阻害するTGF-β阻害因子またはBMP4を発現する新規HSV-1を作製した。更に、がん幹細胞が豊富な悪性脳腫瘍や良性脳腫瘍でも高いウイルス複製が得られるHSV-1を作製するため、G47Δで欠失したICP6を腫瘍特異的プロモータで制御したICP6遺伝子で置換した新規HSV-1を作製した。平成28年度以降は、抗血管新生因子を発現するHSV-1を新規に作製し、悪性脳腫瘍由来のがん幹細胞を用いたマウス脳腫瘍モデルを用いてin vivo評価を進めた。このうち特に、抗VEGFモノクローナル抗体を発現するHSV-1は、ウイルス投与後に通常発生する一過性の腫瘍の腫脹を抑制しながら抗腫瘍効果を発揮することが示され、脳腫瘍治療には特に有用であることが判明した。世界でウイルス療法開発が激化する中、膠芽腫の根治をも可能にする、日本独自の、革新的かつ実用的な脳腫瘍治療の開発研究を推進した。単純ヘルペスウイルスI型(HSV-1)のゲノムを遺伝子工学的に改変して、腫瘍細胞で選択的に複製するがん治療用ウイルスを作製できる。本研究は、悪性脳腫瘍の根治を可能にする革新的ウイルス療法の基礎開発を目的とした。幹細胞性を阻害するTGF-β阻害因子またはBMP4を発現する脳腫瘍幹細胞標的型HSV-1を作製した。更に、がん幹細胞が豊富な腫瘍や良性腫瘍でも高い複製能を呈する腫瘍特異的プロモータ制御型HSV-1を作製した。脳腫瘍微小環境の修飾を企図して作製した抗VEGF抗体発現型HSV-1は、ウイルス投与直後に生じる腫瘍の腫脹を抑制しながら抗腫瘍効果を発揮し、脳腫瘍治療での有用性が示された。平成26年度は以下の成果を達成した。1.脳腫瘍幹細胞標的型HSV-1の作製:目的の外来遺伝子を確実に挿入し、且つ複数のHSV-1を並行して短期間で作製することが可能な、G47Δを基本骨格とするBACシステム(T-BAC)を活用して、脳腫瘍幹細胞の幹細胞性維持やsphere形成能を阻害する抗TGF-β蛋白またはBMP4を発現する新規HSV-1を作製した。また、がん幹細胞が豊富な悪性脳腫瘍や、良性脳腫瘍でも高いウイルス複製が得られるHSV-1を作製するため、G47Δで欠失したICP6を腫瘍特異的プロモータで制御したICP6遺伝子で置換した新規HSV-1を作製した。
福岡県における占領期の保育―保育先進県の戦後保育構築に関する実証的研究

県は昭和26年度に11のモデル保育所を指定し、公開保育と研究会を行ない、保育の質を向上させる取り組みがなされた。それ以前に、戦後の混乱から子どもを守り、保育を進めようとする動きがあった。昭和21年に福岡県保育連盟が発足し、機関紙『育てつつ』が発行され、地区ごとの研究会が開催され、昭和20年代の半ばまでは、保育所、幼稚園両方の保育者を対象としていた。保育所への補助に関しては、共同募金からの補助が福岡県では特に多かったことが明らかになった。戦後すでに70年近くが経過していることもあり、得られた資料は限られていたが、占領期を中心にした昭和20年代の福岡県の保育状況の一端を明らかにできた。本年度は前年度に引き続き、昭和25年度までに設立されていた保育所への訪問、資料収集を行った。そのなかで、福岡県では昭和20年代には、保育所と幼稚園が一緒に組織を設立し、研究を進めていたことが、わかってきた。このことは、「九州保育新聞」の分析からも明らかになったので、保育所と同様、昭和25年までに設立されていた幼稚園を対象に、訪問、資料収集を始めた。また、福岡県では共同募金から保育所への補助が多かったと思われるので、その資料の収集・分析を行っている。保育所に関しては、訪問、資料収集を行い、平成23年度に対象としたところに加えて、合計14ヵ所の資料が収集できた。幼稚園は、『福岡県社会福祉事業史別冊』(福岡県社会福祉協議会編・発行、昭和57年)のような資料がないため、『福岡県私立学校総覧』(県政タイムス社編、福岡県私立学校総覧刊行会、昭和33年)や『30年のあゆみ』(北九州私立幼稚園連盟30年のあゆみ編集委員会編、北九州私立幼稚園連盟、昭和51年)等から、設立年を探り、資料の有無を問い合わせ、訪問を始めた。また、福岡県私立幼稚園振興協会の加盟園名簿をいただき、対象とする幼稚園の確認をしている。平成23年度及び24年度に収集した保育所(資料収集・聞き取り調査6ヵ所、資料収集8ヵ所)の資料から、「保育者・資格」「施設・設備」「保育内容(行事を含む)」に分けて、分析を進めている。その結果に関しては、日本教育学会第72回大会で発表予定である。平成24年度には、「九州保育新聞」の内容の分析を中心に、福岡県保育連盟の機関紙「育てつつ」の記事内容の検討も行い、『愛知県立大学教育福祉学部論集』にまとめた。平成25年度には、収集した資料の分析を進めるとともに、福岡県では、特に昭和20年代の半ばまでは、保育所と幼稚園が一緒に組織を作り活動していたこともあるので、幼稚園での聞き取り調査及び資料収集を続けて行った。また、国立国会図書館のプランゲ文庫に収蔵されている新聞から、保育、幼児教育、子どもの福祉等に関する記事を探し出した。8月には日本教育学会第72回大会で、「福岡県における戦後保育構築に関する実証的研究(2)」として、共同募金からの補助や福岡県の保育所の状況を中心に分析し、発表した。これをもとにしながら、『愛知県立大学教育福祉学部論集』第62号に論文を執筆した。博多港が引揚港であり、戦後の混乱期にはその影響が大きかったと思われるので、その概況について述べた後、福岡県では共同募金からの保育所への補助が大きかったことを明らかにし、保育所の施設・設備、保育者と子どもの人数、保育時間、行事、保育内容・方法等について、聞き取り調査と資料収集からまとめた。保育所普及の先進県の一つである福岡県における昭和20年代の保育所の状況を明らかにすることを通して、子どを守る上で保育所が果たした役割を検証した。保育所、幼稚園の昭和20年代の状況を個別にまとめたものも加えて、「福岡県における占領期の保育ー保育先進県における戦後保育構築に関する実証的研究ー」の報告書を作成した。この報告書を、ご協力くださった保育所、幼稚園、個人、及び福岡県立図書館、福岡市総合図書館、北九州市立中央図書館にも送付した。『福岡県社会福祉事業史別巻』の各保育所紹介を手掛かりに、昭和25年度までに設立され、現在も存続していると思われる保育所に、資料があるかどうか、当時を知っている人がいるかどうかを尋ねるアンケート調査を行った。「調査研究へのご協力のお願い」を作成し、回答用葉書と「福岡県における戦後のモデル保育所に関する実証的研究」の概要を同封して、10月末日を締め切りとした。回答がなかったところへは、再度お願いを送付した。その結果、「資料がある」「知っている人がいる」に該当する保育所は16ヵ所であった。「知っている人がいる」

保育所は7ヵ所であったが、そのうちの1ヵ所は、アンケートへの回答後、知っている人が亡くなり、聞き取り調査ができたのは、6ヵ所であった。写真が一部あるかもしれないという保育所は、20年代のものではなかったということであった。聞き取り調査、資料収集は二人一組で行い、11月末から3月にかけて、6回に分けて14ヵ所を訪問した。この時に合わせて、福岡県立図書館、福岡市立中央図書館、北九州市立中央図書館をはじめとして、柳川図書館、三潴図書館等を尋ね、郷土史資料を中心に、保育関係の記事を探した。また、西南女学院大学の図書館でも、先行研究の検索をはじめ、資料を探した。聞き取り調査に関しては、各保育所ごとに、沿革、在籍児数、受け入れ対象年齢、保育時間、保育料、施設、保育者数と資格、保育内容等について、一時的なまとめを行った。また、国立国会図書館プランゲ文庫にある、「九州保育新聞」(「学業院新聞」から改題)をはじめ、県内各地域で出されていた新聞から、保育に関連する記事を探し出すことを行った。これに関しては、膨大な資料から探し出さなければならないため、まだ途中である。戦後60年が経過していることから、資料の入手はかなり困難である。しかし、写真・アルバム以外の資料も、多くはないが収集できた。また、当時のことを知る方からの聞き取り調査を行い、貴重な話を聞くことができた。施設開設(保育の開始)と認可の年は必ずしも同じではなく、保育所、幼稚園の統計資料だけでは分かりにくいこともあり、昭和25年までに開設された保育所、幼稚園で現存するところをすべて明らかにすることが、まだできていない。また、保育所から幼稚園に変わったところ、およびその逆の場合は、認可年だけではいつ開設されたかが分からないため、市町村の統計資料等からも探ることに着手した。計画の「(1)保育所へのアンケート調査」「(2)資料が残されている保育所への訪問」は、順調に進んだ。『福岡県社会福祉事業史別巻』をもとに、各保育所のホームページ等を検索して、現在も存続していると思われる113ヵ所に発送した。返事がなかった63ヵ所へは、再度お願いを行った。その結果、55ヵ所から回答があった。統廃合等で5ヵ所は、宛先不明で返送された。(その後のこの5ヵ所の動向は判明したので、幼稚園の調査に合わせてアンケートを送りなおす予定である。)当時のことを知っている人がいる保育所から聞き取り調査を始め、さらに資料がありそうな1ヵ所を除いて、資料収集も終わった。「(3)福岡県保育連盟と『育てつつ』にかかわる資料収集」では、「育てつつ」は早緑子供の園、西南女学院大学にも残されていなかったため、入手できていない。福岡県保育連盟の副会長であった大野柔忍は、善隣保育園園長であったと思われるが、廃園になっている。もう一人の副会長の岡田栄資は、都府楼保育所所長であったが、この保育所も現存しない。「(4)『九州保育新聞』と九州保育研究所にかかわる資料収集」では、「九州保育新聞」の国立国会図書館プランゲ文庫にある分はコピーをして、その内容の分析を始めた。「(5)収集した資料の整理」に関しては、まず、聞き取り調査の整理をした。各地の新聞や郷土史関係の整理を始めた。昭和25年までに開設され、現存する保育所・幼稚園を、さまざまな資料にあたりながら、早急に明らかにする。そのうえで、前半には、研究協力者の協力のもと、資料収集・聞き取り調査を終了するように、分担しながら進める。
LESによる乱流解析技術の確立

本研究では乱流解析を実用化するために、LESを用いて30分以内の計算時間で所用の精度を満たす解析技術を確立することを目標としている。そのために、当初は4つのサブテーマに分けて、研究を開始したが、研究の進展に連れて関連の問題を扱う研究者が増加し、研究班に加入することが望ましいグループを加えたため本年は7研究者4グループで実施した。主な成果は以下の通りである。イ)壁乱流におけるLES技術の確立...単純流路におけるLES解析は世界最大の規模で実施し、計算スキームの工夫と時間短縮の工夫を加えて最も高い精度の解析が可能となった。ロ)巨大空間を対象にしたLES技術の開発...巨大空間での問題は複雑な個体境界近傍でのSGSモデルの高精度化と個体境界のみならず自由境界における非周期的な適切な境界条件の設定法の確立である。巨大空間の問題では壁近傍の現象よりも大規模構造の方がより重要であることを考え、SGSモデルよりも境界条件の研究に重点をおいた。このために、多様な境界条件を考案した。ハ)乱流数値解析における数値技術の開発...乱流は本質的に非定常現象であり、これに対する誤差評価は研究のために、一つは直交可変格子系を用いたレーレー流れの乱流遷移を扱った。いずれも独創的なスキームで、世界的に高い評価を得ているばかりでなく、十分発達した乱流うずに至るまでの遷移過程について重要な知見が得られた。ニ)乱流拡散問題におけるLES技術の確立...乱流拡散問題として平面混合層を解析して来た。これに対して境界条件、計算領域の大きさなどが敏感に影響する。これらを三次元グラフィック表示を用いて結果を検討しながら解析技術の改良を進めて来たが、平均量については少なくとも独自に行っている実験結果と極めて高精度に一致すること、得られた現象が妥当な物理的説明を与えることなどから、解析技術の確立について当初の目標にほぼ到達した。
微小培養環境設計による幹細胞の分化制御技術の確立

本研究では、ES細胞・iPS細胞胚様体(EB)の大量形成を実現する新しいEB形成チップ技術を開発するとともに、形成されたEBの微小培養環境を制御することによって効率的な分化制御手法を確立する。当該年度は、昨年度までに確立したマルチマイクロウェルチップを基本技術として、初期導入細胞数、EB粒径、EB間距離の違いがEBの分化特性(内胚葉、中胚葉、外胚葉への分化傾向)に及ぼす影響を評価した。得られた結果を以下に示す。1.初期導入細胞数、EB粒径の影響ウェル内への初期導入細胞数(100 cells/well、1000cells/well、10000cells/well)が少ないほど形成するEBは小さいが、細胞の増殖率は大きく、培養経過に伴いいずれも同等のサイズに制御された。さらに、100 cells/wellの場合には中胚葉(血球・血管系)に、1000 cells/wellの場合には中・内胚葉(心筋系・肝臓系)への分化傾向に特徴が見られ、増殖率が高いほど分化が速く進行した。2.EB間距離の影響初期細胞数、EB数を一定(1000 cells/well、195 wells/chip)として、ウェル間距離の異なるチップ上で培養したところ、ウェル間距離が大きいほど細胞増殖してB粒径は大きくなり、分化が進行した。本チップ技術は、工学的発想から微小培養環境を厳密制御して分化を制御するシンプルなアプローチであるが、これまでにあまり報告例はない。総じて、細胞の増殖速度を巧くコントロールすることが重要であると思われる。本技術の確立によって、既存の技術では困難であったEBサイズの任意制御と簡便な大量形成・回収を実現しており、幹細胞培養及び分化誘導のための新しいプラットフォームとなり得ることが期待できる。当該年度は、ES細胞やiPS細胞に適合した培養基板形状、表面修飾分子の最適化を行い、均質なEBを大量形成できる独自のチップ技術を開発した。具体的には、円柱状のマイクロウェル(直径2001000μmの範囲)を多数有するチップ基板を開発するとともに細胞非接着表面の形成(PEG修飾)することによって、均一な大きさのEBを大量形成できることを実証した。チップ上でのEBの基本的な性質(増殖や分化の方向性)を既存技術(ハンギングドロップ法及びU字プレート培養法)と比較すると、細胞増殖が制限されて分化の速度が遅いことが判った。また、初期導入細胞数やチップ上のEB数、EB間距離、EB粒径の違いがEBの分化特性(内胚葉、中胚葉、外胚葉への分化傾向)に影響を与えることが明らかになってきており、今後は更なる検討を予定している。