hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
高誘電率絶縁膜-シリコン界面における界面反応層の形成・消失過程の解明

本研究では,高誘電率酸化膜(High-k膜)とSiの界面としてHfO_2/SiとY_2O_3/Siの2つの系を比較しながら,界面反応機構と反応経路の検討を進めてきた。前者は界面でSiの酸化が見られ,後者はシリケート化反応が見られる例である。平成16年度はHfO_2/Si界面反応のモデル化を進めたが,今年度はまず,このモデルを発展させてY_2O_3/Si界面反応の定量的な説明を試みた。予め界面にSiO_2層を挟んだY_2O_3/SiO_2/SiスタックをN_2中で加熱したところ,600°C付近からシリケート化反応によってSiO_2層が減少し始め,900°C以上となると減少が顕著となる。ところがそれ以上温度を上げてもSiO_2層は消失せずに逆に上昇に転じてしまう。これは残留酸素による酸化とシリケート化反応の競合である。HfO_2/Siでの界面反応モデルと同様に,界面層中を原子状の酸素が失活しながら通過して界面に到達するモデルを適用したところ,界面層が減少して薄くなると急速に原子状酸素の失活率が低下して酸化速度が増大することによって定量的に説明できた。次に,基板をGeに変えた場合の界面反応の解析へと展開した。近年,高チャネル移動度を有するGe上にトランジスタを作製する試みが急速に注目されているためである。その結果,HfO_2/Ge,Y_2O_3/Ge,どちらの場合もN_2アニールによって界面層が消失し,Ge上であれば界面層を持たない界面を容易に形成できた。これは主に界面酸化により形成されるGeO_2が不安定で,多量にHigh-k膜中へ拡散,さらに気相へと脱離するためと考えられる。SIMS測定の結果,絶縁膜中に拡散したGeが検出されたが,特にY_2O_3/Geの場合に顕著であり,YとGeを含む複合酸化物が界面に形成され得ることを示唆する。即ち,Geの界面反応の制御においても,ますますHigh-k材料の選択が重要となる。本研究では,高誘電率酸化膜とSiの界面としてHfO_2/SiとY_2O_3/Siの2つの系を比較しながら,界面反応機構と反応経路の検討を進めている。本年度は2つの系の界面反応の定量化を試みた。HfO_2/Si系について酸素雰囲気中で熱処理し,界面酸化により成長するSiO_2層の厚さを調べたところ,初期酸化は急速だが,その後緩やかに進行する飽和型の挙動を示すことが明らかになった。またO^<18>同位体ガス中でのアニール後の同位体プロファイルからHfO_2層中の酸素の移動過程は極めて迅速であり律速過程とはならないこと,さらにSiの面方位を変えても酸化速度が等しいことが分かった。これらの実験事実を基に,気相中の酸素分子がHfO_2中では分子から原子状に変化して界面に到達して急速な酸化をもたらす一方,SiO_2層が界面に成長すると共にSiO_2層中での原子状酸素の失活が起こって界面に到達しなくなるために酸化が緩やかになるというモデルを構築した。このことはHfO_2層が2nm以下の極薄領域では,Si表面酸化の挙動と類似してくることと矛盾しない。一方,Y_2O_3/Si系で同様の実験を行ったところ,シリケート化反応に加えて界面酸化反応が同時進行することが明らかとなった。このことは,O^<18>同位体ガスによって予めSi表面を酸化しておき,この上にY_2O_3を堆積して1000°C熱処理した後の同位体プロファイルを調べると,O^<18>はY_2O_3中へ均一に拡散する一方で下地に残ったSiO_2中にO^<16>が多量に含まれることからも示唆された。この界面酸化の反応量については,HfO_2/Si系の場合を発展させ,原子状酸素が失活する層としてシリケートとSiO_2の双方を考慮したモデルを仮定すると定量的に説明できる。次年度はさらに反応経路を明確化する予定である。

HfO_2/Siでの界面反応モデルと同様に,界面層中を原子状の酸素が失活しながら通過して界面に到達するモデルを適用したところ,界面層が減少して薄くなると急速に原子状酸素の失活率が低下して酸化速度が増大することによって定量的に説明できた。次に,基板をGeに変えた場合の界面反応の解析へと展開した。近年,高チャネル移動度を有するGe上にトランジスタを作製する試みが急速に注目されているためである。その結果,HfO_2/Ge,Y_2O_3/Ge,どちらの場合もN_2アニールによって界面層が消失し,Ge上であれば界面層を持たない界面を容易に形成できた。これは主に界面酸化により形成されるGeO_2が不安定で,多量にHigh-k膜中へ拡散,さらに気相へと脱離するためと考えられる。SIMS測定の結果,絶縁膜中に拡散したGeが検出されたが,特にY_2O_3/Geの場合に顕著であり,YとGeを含む複合酸化物が界面に形成され得ることを示唆する。即ち,Geの界面反応の制御においても,ますますHigh-k材料の選択が重要となる。
鉛による赤芽球系細胞の核酸代謝障害に関する研究

鉛の生体作用としてのポルフィリン代謝障害の他に,近年,赤血球中のPyrimidinー5'ーnucleotidase(P5N)活性が鉛暴露により阻害される事が明らかになり,この鉛によるP5N活性阻害の生体内意義と,これの鉛暴露指標としての有用性を検討した。平成元年度に行った雄性家兎を用いた実験成績を詳細に検討し,本年度は更に実験例数の追加すべく,雌性家兎14羽を3群に分ち,鉛量として0(対照群,n=4),0.4mg/kg(n=5),2.0mg/kg(n=5)を週2回6週間に亘り靜注投与した。投与期間中,採血,採尿を毎週行ない,採取試料について各種の鉛暴露指標を測定,各指標の変動を血中鉛量と対比検討し,量一反応関係を求めた。また前年度の雄性家兎の成績と比較して,性差による各指標変動の差異を詳細に検討した。この結果,各指標中で性差が認められるものは,FEP(♂<♀),P5N活性(♂<♀),Hb(♂>♀)のみで,その他の諸指標(Ht,FeS,PbーB,ALAD,GOT,GPT,ALAーU,CPーU,)には性差はみられず,これら性差を認めないパラメ-タ-の成績は雌雄一活して論じてよいことが判明した。問題のP5N活性は鉛投与開始より最初に血中鉛が4060μg/dlになった時期で一度明らかに活性は低下するが,その後の血中鉛量の上昇に伴なう活性の低下は,血中鉛と明確な量反応関係を示さず,逆に血中鉛の上昇に伴ってP5N活性が上昇することもみられ,指標としてはALAーDやFEPに比し実用性に劣ることが判明した。P5N活性低下による赤芽球系細胞の核酸代謝障害に伴なって畜積する代謝物質の分離同定には,HーNMRは不適当で,HPLCによろざるを得ず,このためには,かなり大量の鉛中毒家兎を要する。また,P5N活性変動と血中鉛との量一反応関係を今一度精査する必要があるので,現在,さらに家兎による追加実験を実施中である。我々は、鉛の生体影響に関心を持ち研究をおこなってきたが、近年、遺伝的溶血性貧血患者の赤血球中にPyrimidine-5'-nucleotidase(P5N)の欠乏がみられ、またP5N活性が鉛暴露により阻害されることを知った。そこで、P5N活性阻害について生体内意義や、鉛暴露指標としての有用性について検討を試みた。まず、日本白色性雄性家兎へ鉛として0(対照群、n=4)、0.4mg/kg(n=5)、2mg/kg(n=5)を週2回静注した。食餌は、鉛の2mg/kg群の食餌量を他群へ与え制限食餌をおこなった。投与期間中、採血、採尿を週1回おこなった。鉛投与の5週目の影響をみると、Ht(対照群:39.0±1.7%、pb2mg/kg群:31.1±3.0%)、血清鉄(対照群:308±22.7μg/dl、pb2mg/kg群:249.9±50.4μg/dl)および血清GOT(対照群:22.5±9.9unit、pb2mg/kg14.0±3.5unit)は、pb2mg/kg群で低下しており、鉛の生体影響を窺うことができた。また、全血ALA-D(対照群:2.15±0.18μmolesPBG/mlーpcv/h、pb0.4mg/kg群:0.52±0.14、pb2mg/kg群:0.30±0.06)およびFEP(対照群:59.6±8.0μg/dl・pcv、pb0.4mg/kg群:192.1±53.3μg/dl・pcv、pb2mg/kg群:486.6±64.4μg/dl・pcv)は用量-作用関係を示しており、鉛暴露指標として有効性が再確認された。一方、P5N活性(対照群:372±39nmol uridine/gーHb/h、pb0.4mg/kg群:239±38、pb2mg/kg群:245±27)は鉛投与群で低下したが用量-作用関係は明らかでなく鉛暴露の実用的生体指標としてはALA-DやFEPに劣ることがわかった。次に鉛による赤芽球系細胞の核酸代謝障害を窺うため鉛投与家兎血液についてH-NMRをみたところ対照群に比べ微細なピ-クがNMRクロマトグラム上にみられたが、詳細な同定は困難であり、血液中核酸代謝物質の蓄積変化をみるにはHPLCによる分離同定が今後検討されねばならない。さらに鉛によるP5N活性阻害の生体内意義を調べるには、P5Nの精製をおこない、in vitroでの鉛のP5Nへの作用を検討することも今後の課題の一として必要である。

平成元年度に行った雄性家兎を用いた実験成績を詳細に検討し,本年度は更に実験例数の追加すべく,雌性家兎14羽を3群に分ち,鉛量として0(対照群,n=4),0.4mg/kg(n=5),2.0mg/kg(n=5)を週2回6週間に亘り靜注投与した。投与期間中,採血,採尿を毎週行ない,採取試料について各種の鉛暴露指標を測定,各指標の変動を血中鉛量と対比検討し,量一反応関係を求めた。また前年度の雄性家兎の成績と比較して,性差による各指標変動の差異を詳細に検討した。この結果,各指標中で性差が認められるものは,FEP(♂<♀),P5N活性(♂<♀),Hb(♂>♀)のみで,その他の諸指標(Ht,FeS,PbーB,ALAD,GOT,GPT,ALAーU,CPーU,)には性差はみられず,これら性差を認めないパラメ-タ-の成績は雌雄一活して論じてよいことが判明した。問題のP5N活性は鉛投与開始より最初に血中鉛が4060μg/dlになった時期で一度明らかに活性は低下するが,その後の血中鉛量の上昇に伴なう活性の低下は,血中鉛と明確な量反応関係を示さず,逆に血中鉛の上昇に伴ってP5N活性が上昇することもみられ,指標としてはALAーDやFEPに比し実用性に劣ることが判明した。P5N活性低下による赤芽球系細胞の核酸代謝障害に伴なって畜積する代謝物質の分離同定には,HーNMRは不適当で,HPLCによろざるを得ず,このためには,かなり大量の鉛中毒家兎を要する。また,P5N活性変動と血中鉛との量一反応関係を今一度精査する必要があるので,現在,さらに家兎による追加実験を実施中である。
高エネルギー宇宙線絶対流束の精密測定

宇宙線反陽子の精密測定で実績を挙げている気球搭載型超伝導スペクトロメータ(BESS)の運動量分解能を向上させ、一次宇宙線絶対流束を数百GeVまで精密測定する実験を行ってきた。このエネルギー領域の宇宙線流束は精度の高い観測結果が存在せず、宇宙線の起源、伝播を知る上で極めて重要である。また一次宇宙線は大気でできるニュートリノの親であるため、大気ニュートリノ振動の研究を進めていく上でも不可欠である。平成13年度は測定器開発フェーズとして、改良の中心となる新型飛跡検出器(ドリフトチェンバ)の開発を行い、平成14年度にはこの測定器を用いてカナダ北部において気球観測を行った。平成15年度は、収集した実験データの解析作業を行った。飛跡検出器が新しくなったため、そのキャリブレーションを行う解析システムを、オブジェクト指向をとりいれて新たに開発し、実験中測定器が設計通りの性能を発揮したことを確認した。運動量分解能は、MDR(Maximum Detectable Rigidity)で1400GVという、MDRが200GVであった従来のBESS測定器を含めた過去の一次宇宙線観測装置の中で郡を抜く最高の性能であった。この成果は平成14年5月にイタリアで行われた測定器に関する国際学会で発表するとともに、雑誌Nucl. Instr. and Meth. Aに論文を発表した。実験結果として、1-540GeV、及び1-250GeV/nという過去に例の無い広いエネルギー範囲での陽子、及びヘリウムの宇宙線絶対流束が得られた。この成果は、昨年8月に行われた宇宙線国際学会、および今年2月に行われた「Neutrino Oscillations and their Origin」国際ワークショップにおいて発表するとともに、現在、雑誌Physics Letters Bへの論文投稿準備を進めている。また、3月末に開かれる物理学会年次大会でも報告する予定である。宇宙線反陽子などの精密測定で実績の高い気球搭載型超伝導スペクトロメータ(BESS)の運動量分解能を向上させ、陽子、ヘリウムなどの一次宇宙線絶対流束を100GeV1TeV近くまで精密測定する実験を行ってきた。このエネルギー領域の宇宙線データは、現在のところスペクトロメータなどを用いた精度の良い結果が存在せす、宇宙線の起源、加速、および伝播などを知る上で重要である。また、大気中でできる数10100GeVのニュートリノの親でもあるため、大気ニュートリノ振動の研究を進めていく上で、その絶対流束の計算の為に必要不可欠なデータでもある。平成13年度は測定器開発フェーズとして、BESS測定器改良の中心となる新型飛跡検出器(ドリフトチェンバー)の開発、製作と、ビームを用いた性能評価を行ってきた。14年度にこれらをインストールし、BESS測定器全体での調整とテストを繰り返した後、8月にカナダ北部のリンレークにて高度37km(1/200気圧)での気球実験を行った。実験は約1日間行われ、実測定時間で11時間分のデータを収集した。
細胞内および血清中抗酸化生体防御機構の胎生期、小児期での発達と疾患における意識

ウシ脳ホモジネート脂質自動酸化能(AOA)は新生児期から乳児期に増加して学童期以降は加齢とともに低下した。AOAおよびラジカル消去能総括性(TRAP)は、インスリン依存型糖尿病患児とストレプトゾトシン糖尿病ラットの両方で低下しており、抗酸化機構の異常が糖尿病合併症としての組織傷害に関与する可能性がある。慢性腎不全ではAOAが低下していて、動脈硬化促進などに関与していることが示唆される。細胞内GPXの免疫金粒子ラベル酵素電顕法による検討を、ラット肝および肺胞上皮で行った。肺胞組織では細胞内GPXは肺胞マクロファージに最も多く、次いでII型肺胞細胞に多く、他の細胞種では少なかった。細胞内分布は、肝細胞でも肺胞細胞でも同様で、ミトコンドリアに最も多く、細胞質内と同等量が核内にも分布し、他の細胞内小器官にも依存していた。GPXは二つの細胞内SOD(CuZnSODおよびMnSOD)に一つで対応する分布を示した。組織切片をFITC蛍光染色して、画像解析法で定量化した。細胞内GPXとSODは胎児ラット組織において、在胎15日以降では日齢が進むに従って、酵素も段階的に増加し、相互に協調した生理的変動であった。FPLCを導入して、ラット血漿中GPXを精製した。純品比活性は250単位/mg、精製度は1470倍、収率は19%であった。家兎に免疫して3000倍で組織化学染色とイムノブロットに用いられるポリクローナル抗体を作成した。血漿GPXは23kDaのサブユニットの4量体で、細胞内GPXの22kDaよりは分子量がやや大きく、等電点もやや酸性であり、比活性は大きく異なっていた。細胞内GPXのポリクローナル抗体と血漿GPXとは交差反応性がなかった。血漿GPXは組織化学染色では糸球体にはなく、腎尿細管とヘンレ係蹄に集積していた。血漿GPX値をEIAキットで測定したところ、インスリン投与で血糖コントロールされている患児においては、血漿GPX抗原量は対照児と比較して有意に増加していなかった。ウシ脳ホモジネート脂質自動酸化能(AOA)を用いて、新生児期から老人に至るまでの血清中抗酸化能について検討し、AOAは新生児期から乳児期に増加して学童期にピークとなり、加齢に伴って低下した。AOAおよびラジカル消去能総括性(TRAP)は、インスリン依存型糖尿病患児とストレプトゾトシン糖尿病ラットの両方で、いずれも低下傾向になることか判明し、糖尿病合併症としての組織傷害に抗酸化の低下が関与する可能性が示唆される。細胞内GPXの酵素電顕法による検討を、ラット肝および肺胞上皮について行った。従来の報告では本酵素が細胞質のみに限局して存在するとされていたが、今回の検討で、ミトコンドリアに最も多く、細胞質内と同等量が核内にも分布し、他の細胞内小器官にも存在することが判明した。すなわちGPXは二つの細胞内SOD(CuZnSODおよびMnSOD)の両方に一つで対応する分布を示した。組織切片をFITC蛍光染色して、IBAS-2000による画像解析で定量化した。細胞内GPXと二つのSODの胎児ラット組織における発達を検討したが、在胎15日以降では日齢の進行とともに、いずれの酵素も段階的に増加し、相互に協調した生理的変動と考えられた。慢性腎不全ではAOAが低下していて、慢性臓器障害としての動脈硬化促進などに関与していることが示唆される知見が得られた。血清GPXは当初考えたより不安定で、純品はまだ得られていないが、現時点で比活性150単位/mg程度(純度50%程度)の産物が得られており、次年度にFPlCなどの導入によって完成することが期待できる。アスコルビン酸の測定はHPLCに電気化学的検出器を接続して測定が可能であるが、デヒドロアスコルビン酸との同時定量に課題が残されている。血清中TRAP活性の大きな部分を尿酸が占めており、抗酸化物質としての生理的役割とこの物質の一般的な臨床的評価との間に解離がみられる点が理論的問題点としてあげられるが、次年度の研究課題の一つである。

純品比活性は250単位/mg、精製度は1470倍、収率は19%であった。家兎に免疫して3000倍で組織化学染色とイムノブロットに用いられるポリクローナル抗体を作成した。血漿GPXは23kDaのサブユニットの4量体で、細胞内GPXの22kDaよりは分子量がやや大きく、等電点もやや酸性であり、比活性は大きく異なっていた。細胞内GPXのポリクローナル抗体と血漿GPXとは交差反応性がなかった。血漿GPXは組織化学染色では糸球体にはなく、腎尿細管とヘンレ係蹄に集積していた。血漿GPX値をEIAキットで測定したところ、インスリン投与で血糖コントロールされている患児においては、血漿GPX抗原量は対照児と比較して有意に増加していなかった。
電磁波エネルギーがもたらす磁気再結合過程の研究

磁気再結合は太陽フレア、地球磁気圏、トカマク装置などで幅広く観測され、プラズマが関与した普遍的な現象の一つとして知られている。これまでにも多くの実験・計測とモデルの提唱が行われてきているがその物理機構については今だ解き明かされていない点が数多くある。小型トーラスプラズマ実験装置LATEにおいて電子サイクロトロン共鳴でトーラスプラズマを発生させ、弱い垂直磁場を印加するとトロイダル方向にプラズマ電流が流れ始める。低ガス圧下で入射マイクロ波電力が大きい時垂直磁場などの外部制御パラメータを一定にしていてもプラズマ電流の急激な増加(「電流ジャンプ」)が起こり、自発的な閉じた磁気面を作るという新しいタイプの磁気再結合現象が観測された。2.45GHzと5GHzの2つの周波数のマイクロ波を用い、入射電力も1130kWまで変えて実験を行い、785Gというひろい垂直磁場強度において「電流ジャンプ」現象が起こることを確認した。磁気解析、CdTe検出器を用いた硬X線波高分析、軟X線カメラによる軟X線発光像のCT再生を行った結果、電子バーンスタイン波加熟と速度空間での磁力線方向に非対称な電子の閉じ込め特性とによりトロイダル電流が急激に増加し、磁気再結合を引き起こして開いた磁力線構造から閉じた磁力線構造へのトポロジー変化が生じたと考えられる。また、この時トロイダル平衡状態もプラズマ圧力のバルーニングカが主となる領域からプラズマ電流のフープカが主となる領域に遷移していると考えられる。磁力線に沿って流れてくるプラズマを計測するためにLATE装置の上部ポートに可動式の1ch静電イオン検出器/静電プローブを取り付けた。このプローブの位置をショット毎に変えてイオン飽和電流の空間分布の時間発展を調べた。電流ジャンプが起こっている時間帯だけ局所的に数倍のイオン飽和電流が観測され、磁気再結合時に磁力線に沿って加速されたプラズマの流れによるものと考えられる。低ガス圧下で入射マイクロ波電力が大きい時垂直磁場などの外部制御パラメータを一定にしていてもプラズマ電流の急激な増加が起こり、自発的な閉じた磁気面を作るという新しいタイプの磁気再結合現象が観測された。2.45GHzと5GHzの2つの周波数のマイクロ波を用い、入射電力も1130kWまで変えて実験を行い、785Gというひろい垂直磁場強度でこのような現象が起こることを確認した。磁気解析、CdTe検出器を用いた硬X線波高分析、2台の軟X線カメラによる軟X線発光像のCT再生を行った結果、速度空間での磁力線方向に非対称な電子の閉じ込め特性と電子バーンスタイン波加熱とによりトロイダル電流が急激に増加し、磁気再結合を引き起こして開いた磁力線構造から閉じた磁力線構造へのトポロジー変化が起こると考えられる。また、この時トロイダル平衡状態もプラズマ圧力のバルーニング力が主となる領域からプラズマ電流のフープ力が主となる領域に遷移していると考えられる。また、磁気解析から得られた磁場分布とプローブ計測から得られる静電ポテンシャル分布中を運動するイオンの軌道を計算するコードを開発した。

そしてその計算結果に基づいて静電イオン検出器を試作し、LATE装置の上部ポートに取り付けた。現在動作試験を行っているところである。磁気再結合は太陽フレア、地球磁気圏、トカマク装置などで幅広く観測され、プラズマが関与した普遍的な現象の一つとして知られている。これまでにも多くの実験・計測とモデルの提唱が行われてきているがその物理機構については今だ解き明かされていない点が数多くある。小型トーラスプラズマ実験装置LATEにおいて電子サイクロトロン共鳴でトーラスプラズマを発生させ、弱い垂直磁場を印加するとトロイダル方向にプラズマ電流が流れ始める。低ガス圧下で入射マイクロ波電力が大きい時垂直磁場などの外部制御パラメータを一定にしていてもプラズマ電流の急激な増加(「電流ジャンプ」)が起こり、自発的な閉じた磁気面を作るという新しいタイプの磁気再結合現象が観測された。2.45GHzと5GHzの2つの周波数のマイクロ波を用い、入射電力も1130kWまで変えて実験を行い、785Gというひろい垂直磁場強度で「電流ジャンプ」が起こることを確認した。磁気解析、CdTe検出器を用いた硬X線波高分析、2台の軟X線カメラによる軟X線発光像のCT再生を行った結果、速度空間での磁力線方向に非対称な電子の閉じ込め特性と電子バーンスタイン波加熱とによりトロイダル電流が急激に増加し、磁気再結合を引き起こして開いた磁力線構造から閉じた磁力線構造へのトポロジー変化が起こると考えられる。また、この時トロイダル平衡状態もプラズマ圧力のバルーニングカが主となる領域からプラズマ電流のフープカが主となる領域に遷移していると考えられる。磁力線に沿って流れてくるプラズマを計測するためにLATE装置の上部ポートに可動式の1ch静電イオン検出器/静電プローブを取り付けた。このプローブの位置をショット毎に変えてイオン飽和電流の空間分布の時間発展を調べた。電流ジャンプが起こっている時間帯だけ局所的に数倍のイオン飽和電流が観測され、磁気再結合時に磁力線に沿って加速されたプラズマの流れによるものと考えられる。
戦前－戦後移行期における都市計画の再評価と計画システムの連続性の検証

2019年に日本の都市計画法の生誕百周年を迎えるが、従来の都市計画通史では、特別都市計画法による戦災復興を除けば、戦前ー戦後移行期における都市計画は、停滞期として位置づけている。戦時下に日本の都市計画の原型が確立し、戦災復興から高度経済成長期にかけて試行錯誤も含めて多面的な都市計画が展開されたという見通しから、本研究では戦前ー戦後移行期における都市計画について当時の最重要課題であった1広域計画、2地域開発、3都市不燃化の観点から再評価し、計画システム(I.計画理論、II.計画技術、III.計画体制、IV.事業化)の連続性を検証することで、日本の都市計画に通底する特質を探るとともに通史の再構築を目指す。
漸近双曲性とYoccoz's puzzleを用いたPalis予想解決への挑戦

力学系の不変集合やパラメータ空間をパズルピースと呼ばれる小部分に分解し、それらの間の関係の記述に基づき大域的な構造を捉える。与えられた力学系をパズルピースに分解するためには、力学系の一様双曲性が破綻する「力学系的臨界点」を明示し、それを用いて全体の統制を行う必要がある。最初から一般の力学系を考察することは困難が大きいので、まず具体例の考察から開始する。Henon写像については、研究代表者がすでに漸近双曲性を持つパラメータの存在を示し、力学系的臨界点も明示した[H. Takahasi, arXiv:1308.4199]。これらのパラメータでパズルピースの構成を試みる。
小児ステロイド抵抗性ネフローゼの疾患遺伝子パネル構築と免疫因子検査体制の整備

背景:ネフローゼ症候群(NS)は、腎糸球体濾過障壁構造の破綻により、高度蛋白尿、低アルブミン血症および全身性浮腫を主徴とするで、小児NS有病率は12-16/100,000人である。小児特発性NS(INS)の約90%はステロイド治療で寛解し予後良好であるが、約10%はステロイド抵抗性(SRNS)で、巣状分節性糸球体硬化症(FSGS)の病理像を示し、免疫抑制療法で反応不良の場合、約40%が末期腎不全へと進行する。目的:小児SRNSは約30%が糸球体上皮細胞の遺伝子変異が主因とされ、また、INSの発症には、糸球体透過性亢進因子、サイトカイン、自己抗体など多くの病態と相関性を示す液性因子が報告されてきている。このように小児SRNS発症には、遺伝学的機序と免疫学的機序の二つの機序が関与していることから、本研究は、全国レベルで小児特発性SRNSの遺伝子解析と発症に関与する液性因子の解析、およびその作用機序の解明を行い、発症機序に基づく、検査体制の整備を目指すことを目的とする。方法:1)倫理委員会による研究計画承認後、全国医療機関から先天性・乳児NS、およびSRNS症例の臨床検体を収集し、臨床データベースの構築を行う。2)既知SRNS・FSGS責任遺伝子(43-49遺伝子)のエクソンおよびエクソン-イントロン境界領域を対象とした疾患パネルの作製と、次世代シークエンサーを用いたターゲットリシークエンスを行う。結果:2018年度までには219症例を解析し、67症例で責任遺伝子を同定した。2016-2018年度において、NPHS2遺伝子の変異症例はなく、欧州・米国との人種差を示唆する遺伝子であることを裏打ちする結果となっている。また、2017年度以降は、寛解導入を一度でも認めた症例は解析から除外した結果、同定率は30%以上で推移している(2016年度26%)。背景:ネフローゼ症候群(NS)は、腎糸球体濾過構造の破綻により、高度蛋白尿、低アルブミン血症および全身性浮腫を主徴とする疾患で、小児NS有病率は12-16/100,000人である。目的:小児SRNSは約30%が糸球体上皮細胞の遺伝子変異が主因とされ、また、INS発症には、糸球体透過性亢進因子、サイトカイン、自己抗体など多くの病態と相関性を示す液成因子が報告されてきている。このように小児SRNS発症には、遺伝学的機序と免疫学的機序の二つの機序が関与していることから、本研究は、全国レベルで小児特発性SRNSの遺伝子解析と発症に関与する液性因子の解析、およびその作用機序の解明を行い、発症機序に基づく検査体制の整備を目指すことを目的とする。結果:本年度は、62症例(発症年齢平均7歳、中央値4歳)を収集し、16症例で責任遺伝子を同定した(同定率26%)。欧州・米国の報告と同様、生後6ヶ月未満ではNPHS1(1症例)、LAMB2(3症例)、WT1(2症例)を同定したが(同定率100%)、本邦ではNPHS2はみられず民族差が存在することが示唆された。また、生後6ヶ月以上では同定率が18%に低下し、原因不明のままである。小児腎臓病学会学術集会など、全国医療機関の小児医療従事者が参加する研究発表の場において、研究協力者とともに本研究の目的・意義を紹介し、周知活動を行ってきたことから、症例の収集状況を良くしていると考察する。方法:1)倫理委員会による研究計画

承認後、全国医療機関から先天性・乳児NS、およびSRNS症例の臨床検体を収集し、臨床データベースの構築を行う。2)既知SRNS・FSGS責任遺伝子(43-49遺伝子)のエクソンおよびエクソン-イントロン境界領域を対象とした疾患パネルの作製と、次世代シークエンサーを用いたターゲットリシークエンスを行う。結果:平成29年度までに146症例(平成28年度までは62症例)を解析し、46症例で責任遺伝子を同定した(同定率32%)。平成29年度においても、NPHS2遺伝子の変異症例はなく、欧州・米国との人種差を示唆する遺伝子であることを裏打ちする結果となっている。また平成29年度は、寛解導入を一度でも認めた症例は解析から除外したため、同定率の上昇が見られた(平成28年度は26%)。平成28年度の62症例に加え、平成29年度は84症例を収集することができ、平成29年度までの収集症例数は合計で146症例となり、変異と付随する臨床データと合わせた統計学的解析も可能となりつつある。これは平成28年度同様、平成29年度も小児腎臓病学会学術集会など、全国医療機関の小児医療従事者が参加する研究発表の場において、研究協力者とともに本研究の目的・意義を紹介し、周知活動を行ってきたことが、症例収集状況が安定していきていると考えられる。背景:ネフローゼ症候群(NS)は、腎糸球体濾過障壁構造の破綻により、高度蛋白尿、低アルブミン血症および全身性浮腫を主徴とするで、小児NS有病率は12-16/100,000人である。小児特発性NS(INS)の約90%はステロイド治療で寛解し予後良好であるが、約10%はステロイド抵抗性(SRNS)で、巣状分節性糸球体硬化症(FSGS)の病理像を示し、免疫抑制療法で反応不良の場合、約40%が末期腎不全へと進行する。目的:小児SRNSは約30%が糸球体上皮細胞の遺伝子変異が主因とされ、また、INSの発症には、糸球体透過性亢進因子、サイトカイン、自己抗体など多くの病態と相関性を示す液性因子が報告されてきている。このように小児SRNS発症には、遺伝学的機序と免疫学的機序の二つの機序が関与していることから、本研究は、全国レベルで小児特発性SRNSの遺伝子解析と発症に関与する液性因子の解析、およびその作用機序の解明を行い、発症機序に基づく、検査体制の整備を目指すことを目的とする。方法:1)倫理委員会による研究計画承認後、全国医療機関から先天性・乳児NS、およびSRNS症例の臨床検体を収集し、臨床データベースの構築を行う。結果:2018年度までには219症例を解析し、67症例で責任遺伝子を同定した。2016-2018年度において、NPHS2遺伝子の変異症例はなく、欧州・米国との人種差を示唆する遺伝子であることを裏打ちする結果となっている。また、2017年度以降は、寛解導入を一度でも認めた症例は解析から除外した結果、同定率は30%以上で推移している(2016年度26%)。今後、1)さらに解析症例数を増やした本邦における責任遺伝子の統計学的調査、2)遺伝子変異と、臨床経過および患者病態との相関解析、3)液性因子の発現解析、などを順次実施していく予定である。責任遺伝子を同定できなかった症例については、臨床経過調査書、およびフォローアップデータを蓄積し、研究協力者とともに全ゲノム解析などの手法を用い、新規責任遺伝子探査研究に備える予定である。責任遺伝子およびその変異については、これまで疾患症例報告の多い欧州・米国と比較し、アジアの民族特性にも着目して統計解析を行っていく。
生体機能分子の設計・合成

本研究は、脳における情報処理や神経伝達機構などの、生物の持つ優れた機能を持ち、且つ工学的に応用可能な全く新しい「生体機能分子」の「設計・合成」を行うことを目的とする。生体機能分子を設計・合成するために、有機合成化学的アプローチと蛋白質化学的アプローチの2つの方針をとる。平成8年度までの段階で、有機合成的アプローチのモレキュラーインプリンティング法では、新規の分子認識機能を持った合成高分子が得られ、更にその分子認識機能の改良とセンサーへの応用の可能性が示された。蛋白質工学的アプローチにおいては、蛋白質を化学修飾しその電子伝達機能の改変を行った。更に同じく化学修飾を行うことにより、有機溶媒中で触媒機能をもつ酵素の作製にも成功している。平成9年度は、具体的に以下の2つを研究目的とした。1.これまでに開発した生体機能分子の創製方法をまとめ、将来的な実用化の可能性を検討する。2.コンピューター上の進化を利用して生体機能分子の設計を行う全く新しい手法「バーチャルエボルーション」の開発とこの手法を用いた新規生体機能分子の設計合成を試みる。これらの目的に対して以下の成果が得られた。1.モレキュラーインプリンティング法により分子認識ポリマーを合成する方法及びその分子認識機能を向上させる方法を確立した。またそのセンサーへの応用の可能性も確認した。更に蛋白質と合成高分子や電子メディエーターをハイブリッドさせて電子伝達機能を改変することが出来た。2.新規な生体機能分子の創製法である「バーチャルエボルーション」という手法の可能性を確認できた。
骨軟骨移植術症例のリハビリテーションに関する研究

膝関節骨軟骨疾患に対する骨軟骨移植術後の超音波治療効果を検討することを目的として研究を実施した。膝関節骨軟骨疾患に対する骨軟骨移植術後のリハビリテーションでは通常は運動療法のみを実施する。そこで骨軟骨移植術後に運動療法と超音波治療を併用した運動療法・超音波治療併用グループ(Ultrasound群、U群、3症例)と、通常の運動療法のみのグループ(Routine群、R群、18症例)との膝機能を比較検討した。骨軟骨移植術後のリハビリテーションは、術後2日目より開始した。荷重時期は術後58週で全荷重とし、筋力強化運動は骨軟骨移植部位に留意して行った。U群に対する超音波治療は10分間とし、術後3週目から8週目まで週3回、その後は週2回の頻度で実施した。膝機能の測定は術前、術後2週、4、8および12週の計5回を行った。膝機能の測定項目は膝伸展筋力、屈曲可動域、疼痛(NRS)およびJKOMとした。両群における、各測定値の比較は2元配置の分散分析を用いて検討した(有意水準:p<0.05)。その結果、膝伸展筋力と膝屈曲可動域は、U群、R群ともに術後8週では術前値以上に回復した。U群とR群との間にはすべての時期で有意差を認めなかった。U群の症例数が少ないので、現在もなお測定を継続中である。
摂食促進ホルモン・グレリンによる自律神経機能の体温・血圧調節メカニズムの解明

本研究は,摂食促進ホルモンのグレリンについて,自律神経機能の調節メカニズム(体温および血圧調節)を明らかにすることを目的とし,グレリン遺伝子欠損マウスの循環動態(血圧・心拍数)の経時的な変動および日内リズムの異常の有無をテレメトリー自動計測システムにて解析した。本研究により,胃から分泌されたグレリンは,摂食促進作用以外に中枢レベルで自律神経の機能を調節して体温・血圧・心拍などのトーンバランスを制御することが明らかとなった。これまでに研究代表者らは,グレリン遺伝子欠損マウスでは血圧・心拍数の日内リズムに異常が認められ,交感・副交感神経活動のリズムが消失していることを明らかにし,自律神経系による血圧調節機構にグレリンが関与している可能性が示唆された。しかし,このような自律神経活動のリズムの消失が血圧・心拍数の日内リズム以外の自律神経活動にどのように関与しているのかは不明であった。そこで本研究課題は,摂食促進ホルモンのグレリンについて.自律神経機能の調節メカニズム(体温および血圧調節)を明らかにすることを目的とし,本年度は,一般的に自律神経活動の生体内リズムが生じるパラメータとして広く知られている体温の日内リズムについて,グレリン遺伝子欠損(KO)マウスの体温リズムの異常の有無や変動をテレメトリー自動計測システムにて解析し,48時間絶食下.GHRP-6(グレリン受容体のアゴニスト)を浸透圧ミニポンプにて連続投与後のグレリンKOマウス,ならびに迷走神経切除後の野生型(WT)マウスなどの体温の日内リズムおよび行動量の変化を比較検討した。(1)グレリンKOマウスでは体温の日内リズムが不安定であり,明期における平均体温が高かった。(2)48時間絶食下において,WTマウスではtorporと呼ばれる著しい体温の低下が見られたが,グレリンKOマウスでは観察されなかった。さらに,グレリンKOマウスにGHRP-6を連続投与するとtorporが誘導された。(3)迷走神経切除後のWTマウスでは,体温の日内リズムが消失し,(4)48時間絶食下におけるWTマウスとグレリンKOマウスの行動量に差がなかったことから,グレリンは自律性体温調節に関与すると考えられた。以上から,胃から分泌されたグレリンは,中枢レベルで自律神経の機能を調節して体温を制御する。これまでに申請者らは,グレリンKOマウスでは血圧・心拍数の日内リズムに異常が認められ,交感・副交感神経活動のリズムが消失していることを明らかにし,自律神経系による血圧調節機構にグレリンが関与している可能性が示峻された。そこで本研究は,摂食促進ホルモンのグレリンについて,自律神経機能の調節メカニズム(体温および血圧調節)を明らかにすることを目的とし,本年度(平成23年度)はグレリンKOマウス(KOマウス)に認められる血圧・心拍数の日内リズムの異常が,視床下部-SCNの体内時計の異常によるのか,それとも中枢性と末梢性摂食リズムとのトーンバランスの不調和の一つとして生じているのかを調べた。(1)KOマウスに認められた血圧・心拍数の日内リズムの異常(血圧・心拍波形のVariability解析から,KOマウスのLF/HF比が明・暗期を通し高いレベルのまま推移しており,明・暗期共に交感神経活動が優位になっていた。)は,長期恒常暗(21日間)条件下では,明暗周期と無関係な不安定な血圧・心拍数変動として観察され,KOマウスにはサーカディアンリズムに同調した血圧・心舶数リズムの異常が存在することが明らかとなった。82)絶食時や制限給餌時の血中グレリン濃度の上昇と共に,野生型マウスでは血圧・心拍数の上昇が認められ,血圧・心拍数,空腹時グレリン濃度は有意な正の相関が存在したが,KOマウスにはそのような変動は観察されなかった。以上の結果から,KOマウスに認められた血圧・心拍数の日内リズムの消失は,明期における自律神経活動の異常によることが考えられ,中枢性と末梢性摂食リズムとのトーンバランスの不調和の一つとして生じていることが示唆された。これまでに申請者らは、グレリン遺伝子欠損(GKO)マウスでは血圧・心拍数の日内リズムに異常が認められ、交感・副交感神経活動のリズムが消失していることを明らかにし、自律神経系による血圧調節機構にグレリンが関与している可能性が示唆された。しかし、このような自律神経活動のリズムの消失が血圧・心拍数の日内リズム以外の自律神経活動にどのように関与しているのかは不明であった。そこで本研究は、摂食促進ホルモンのグレリンについて、自律神経機能の調節メカニズム(体温および血圧調節)を明らかにすることを目的とし、平成24年度は、アドレナリン作動性薬物やアドレナリン作働性効果遮断薬投与後のKOマウスの血圧調節機構の変化を詳細に検討し、グレリンの自律神経活動を調べた。

1グレリンの交感神経を介した血圧調節機構の解析:野生型(WT)マウスにおけるノルアドレナリン投与後の血圧・心拍数の上昇は、GKOマウスでは軽度であり、合成グレリンを持続投与したGKOマウスでは無処置のGKOマウスに比べ大きかったが、WTに比べ小さかった。また、ノルアドレナリン投与後の血圧・心拍数の上昇は、α、β遮断薬にて抑制され、グレリンが交感神経に抑制的に作用する可能性が示唆された。2グレリンの副交感神経を介した血圧調節機構の解析:;一般に胃内のグレリン分泌は、迷走神経胃枝を介して摂食中枢に作用することから、迷走神経切除後のWTマウスでは、GKOマウスと同様の血圧・心拍数のリズムの消失が認められ、GKOマウスにおける血圧・心拍数の日内リズムの異常は、迷走神経を介したグレリンにより生じる可能性が示唆された。本研究から、胃から分泌されたグレリンは、中枢レベルで自律神経機能を調節して血圧・心拍数のトーンバランスを制御することが明らかとなった。1)グレリンによる体温日内リズム調節機構における自律神経活動について,平成22年度の研究計画にて明確にすることができ,2)グレリンによる自律神経機能を介した血圧調節機構に関しては,平成23年度研究計画にて一部明確になり,平成24年度(最終研究実施年度)の研究実施項目の基礎データとなった。24年度が最終年度であるため、記入しない。本研究課題にて自律神経機能の調節メカニズム(体温および血圧調節)におけるグレリンの役割が明らかになったが,体温および血圧調節以外の自律神経活動へのグレリン関与については不明な点も存在する。今後は,グレリンによる自律神経機能の解析の一つとして記憶学習実験,弁別学習実験,空間認知実験などの行動解析が必要と考えられる。また,自律神経失調症を代表とする自律神経機能の異常が認められる様々な神経疾患におけるグレリンの病態生理学的意義を明確にする必要がある。
光機能化チタンを応用した新規遺伝子導入法の開発

臨床において酸化チタンは生物学的安定性の高さのため、歯科用インプラントや整形外科領域では人工股関節に使用されている。歯科臨床、整形外科領域でインプラントとして使用されている酸化チタンに固相による遺伝子導入技術が付加されれば、インプラント上の骨分化促進等の細胞挙動を制御できると応募者は考えた。本研究では、酸化チタンの表面形状と光機能化チタンの性質を応用して、酸化チタン表面上に導入遺伝子を付与することにより、ウイルスを用いない新規遺伝子導入方法の開発を目的とした。直径20mm厚さ1mmのディスクを120°Cの67%硫酸で75秒処理を行い凹凸を付与した。酸処理後、暗室で4週間保管したチタンディスク(OLD群)と、4週間保管後に紫外線を48時間照射したチタンディスク(UV群)を用意した。表面形状の観察には走査型電子顕微鏡(SEM)を使用した。チタン版表面が作成されてから時間経過により表面性状の変化は認められなかった。また紫外線照射を行なっても表面性状は変化しなかった。10μlの蒸留水をチタンディスク上に滴らした表面濡れ試験ではOLD群では接触角60度以上の疎水性を示したのに対し、紫外線照射したチタン表面では超親水性を示した。次に、紫外線照射したチタンディスクにpAcGFP1-C1 vectorをコーティングし、その後、MC3T3E1、MG-63、Hela細胞を播種し遺伝子導入を試みた。培養液にベクターを添加し、ポリスチレンディッシュで細胞培養したものを対照群とした。GFPの定量はCell Biolabs社のGFP Quantification Kitを用いた。培養24時間後にGFPを計測したところ、チタンディスク上にベクターをコーティングし培養した群では、すべての細胞でGFPの発現が確認できた。動物実験を行う予定であるが、実験のセットアップに時間がかかっている。プレ実験が済み次第データを取る予定である。また、細胞内GFPを共焦点レーザー顕微鏡による確認を行っているが、バックグラウンドのシグナルが認められ、十分なコントラストを得られていない。前処理の方法を含め、最適濃度の再検討を行う必要がある。動物実験のセットアップができ次第、動物実験を行う予定である。具体的には、ラット実験モデルを利用する。円柱状純チタン(チタンワイヤーより製作)のインプラント体を各種酸溶液にて酸処理する。ラット大腿骨にGFP遺伝子をコーティングしたインプラント体を埋入する。埋入後にインプラント体を含む大腿骨を摘出し、インプラント周囲組織におけるGFPの発現を確認する。手法としては、蛍光顕微鏡によるGFPシグナルの確認、組織切片で抗GFPモノクローナル抗体を用いて免疫組織化学的解析を行う。動物実験の計画に遅れが生じているため、その費用部分で次年度使用額が生じた。今後、動物実験を組み立てていく中で使用する予定である。
Ｐｈｄ遺伝子欠損マウスを用いた低酸素・高所トレーニングの効果・リスクの検討

昨年度までの研究により、全身性Phd2欠損マウスに4週間の持久性トレーニングを行わせると、1.コントロールマウスと比較して高いトレーニング効果が得られること、2.トレーニング効果の向上にはPhd2欠損だけではなくトレーニングによる骨格筋適応が不可欠であること、の大きく二つが明らかになった。これを受け、本年度は低酸素トレーニングにおける骨格筋適応の重要性をより詳細に明らかにするために、骨格筋特異的Phd2欠損マウスの使用を検討した。骨格筋特異的Phd2欠損マウスの作出には、Cre-loxPシステムを用いた。昨年度中に既に正常にマウスが誕生することを確認しており、骨格筋におけるPhd2遺伝子欠損率や骨格筋以外での欠損の有無を検証したところ、狙い通り骨格筋でのみPhd2を欠損し、全身性Phd2欠損マウスで観察された顕著な赤血球数増多は見られないことが明らかになった。一方、骨格筋における毛細血管数は増加傾向にあり、血管新生を誘導するVEGFタンパク質の発現も増加していた。より詳細な血管観察を行うために、小動物用CTを用いた血管の三次元解析を行ったところ、末端の毛細血管は造影されなかったものの、観察可能であった太い血管の形態は正常であることが示唆された。また、同マウスに小動物用トレッドミルを用いた持久性運動能力テストを実施したところ、トレーニングを行わない時点での運動能力はコントロールマウスと同程度であることが明らかになりつつあり、トレーナビリティを比較するための条件が揃ったといえる。本年度の検証によって、ヘマトクリット値上昇の影響を排除した上で、低酸素応答やトレーニングにより引き起こされる骨格筋適応に焦点を当てた解析を行うことが可能になり、より効果的かつより安全なトレーニングプログラムの作成に貢献することが期待される。28年度が最終年度であるため、記入しない。申請者のこれまでの研究では、低酸素応答によるヘマトクリット値・ヘモグロビン濃度の上昇が持久性トレーニングの効果に影響を与える確証は得られていなかったが、トレーニングプロトコルを改良し、より最大運動能力を高めることに特化した長期間のトレーニングをPhd2遺伝子欠損マウスに行わせたところ、コントロールマウスに比べて有意に高いトレーニング効果が得られることが明らかとなった。これらの結果から、低酸素応答によるトレーニング効果への影響は、トレーニングの内容により左右される可能性があり、特に持久性トレーニングに効果的であることが示唆された。Phd2遺伝子欠損マウスでは、高確率で脾腫が発生することが確認されており免疫システムにもなんらかの異常が起こっていることが予想された。しかし、フローサイトメトリーを用い、肥大が見られた脾臓から採取した免疫細胞の網羅的解析を行ったところ、脾腫の原因は赤芽球増多であることが明らかになり、特筆すべき免疫異常は確認されなかった。Phd2遺伝子を欠損したマウスは、ヘマトクリット値が70%以上にまで上昇するものがほとんどであった。過度な血液粘度上昇が血栓形成や血流不良を引き起こすことが予想されたが、寿命についてはコントロールマウスと比較しても短命ではなく、運動遂行についても問題はなかった。これには、血管新生が血流を促す一因になっている可能性が高く、Phd2欠損により新たに形成が誘導された血管が形態的にも機能的にも正常であることを確認することが求められる。現在毛細血管の三次元イメージングを準備中であり、新たな血管がどのような形態でどのような場所に分布しているかを明らかにする予定である。昨年度までの研究により、Phd2遺伝子欠損(Phd2 cKO)マウスに4週間の持久性トレーニングを行わせると、コントロールマウスに比べて有意に高いトレーニング効果が得られることが明らかになっており、Phd2遺伝子欠損によるHIF経路の活性化が持久性トレーニング効果向上に効果的であることが示唆された。しかし、トレーニング効果の主因は明らかではなかったため、Phd2 cKOマウスにおける持久性トレーニング実施時の骨格筋の適応について更に詳細な検証を行った。その結果、Phd2 cKOマウスの腓腹筋では、運動負荷のない状態で毛細血管密度の上昇が見られる一方で筋線維サイズが低下し、筋線維タイプが変化している可能性が示唆された。そこで免疫染色による筋線維タイプ同定分析を行ったところ、Phd2 cKOマウスでは遅筋線維(タイプ1)の数の増加が見られた。このことから酸素利用能力も向上していることが考えられたため、酸化系代謝能力の指標としてSDH染色を行ったところ、Phd2 cKOマウスの運動群ではSDH陽性筋線維が腓腹筋外縁部まで広がるように増加していたのに対し、非運動群ではSDH陽性筋線維の増加は見られなかった。このことから、Phd2遺伝子欠損により増加した遅筋線維は酵素活性を伴わないが、持久性トレーニングを行うことで酸化系酵素活性が得られ、酸素利用能力が向上した可能性が示唆された。本年度の研究により、持久性トレーニング効果の向上には、Phd2遺伝子の欠損だけではなく、持久性トレーニングとの組み合わせが重要であることが示唆されたが、更に詳細な検証を進めるため骨格筋特異的Phd2遺伝子欠損マウスを用いた検証を行う予定であり、既に正常にマウスが誕生することを確認済みである。

Phd2遺伝子欠損による持久性トレーニング効果上昇の主因を突き止めるにあたり、ヘマトクリット値の上昇や、血管新生による酸素運搬能力の向上がトレーニング効果向上を誘導することが推測されたが、Phd2遺伝子欠損マウス非運動群では持久性走運動能力の上昇は見られなかったことから、Phd2遺伝子欠損マウスの運動群・非運動群間では、骨格筋の適応に違いがあるのではないかと考え、当初予定していた毛細血管の三次元ジメージングに先立ち、骨格筋の網羅的検討を行うこととした。その結果、Phd2 cKOマウスにおける持久性トレーニング効果向上には、トレーニングによる酸素利用能力の向上も不可欠であることが明らかとなり、トレーニング効果の主因を明らかにする目的を達成する大きなステップとなった。これに加え、当初の計画であったイメージング解析も既に着手しており、これによりPhd2遺伝子欠損によるHIF経路の安定化がもたらす血管新生が酸素運搬能力向上に寄与する正常な血管であるか明らかにする予定である。更に骨格筋特異的なPhd2遺伝子欠損マウスの交配にも成功していることから、計画以上の進展があったものと考える。昨年度までの研究により、全身性Phd2欠損マウスに4週間の持久性トレーニングを行わせると、1.コントロールマウスと比較して高いトレーニング効果が得られること、2.トレーニング効果の向上にはPhd2欠損だけではなくトレーニングによる骨格筋適応が不可欠であること、の大きく二つが明らかになった。これを受け、本年度は低酸素トレーニングにおける骨格筋適応の重要性をより詳細に明らかにするために、骨格筋特異的Phd2欠損マウスの使用を検討した。骨格筋特異的Phd2欠損マウスの作出には、Cre-loxPシステムを用いた。昨年度中に既に正常にマウスが誕生することを確認しており、骨格筋におけるPhd2遺伝子欠損率や骨格筋以外での欠損の有無を検証したところ、狙い通り骨格筋でのみPhd2を欠損し、全身性Phd2欠損マウスで観察された顕著な赤血球数増多は見られないことが明らかになった。一方、骨格筋における毛細血管数は増加傾向にあり、血管新生を誘導するVEGFタンパク質の発現も増加していた。より詳細な血管観察を行うために、小動物用CTを用いた血管の三次元解析を行ったところ、末端の毛細血管は造影されなかったものの、観察可能であった太い血管の形態は正常であることが示唆された。また、同マウスに小動物用トレッドミルを用いた持久性運動能力テストを実施したところ、トレーニングを行わない時点での運動能力はコントロールマウスと同程度であることが明らかになりつつあり、トレーナビリティを比較するための条件が揃ったといえる。本年度の検証によって、ヘマトクリット値上昇の影響を排除した上で、低酸素応答やトレーニングにより引き起こされる骨格筋適応に焦点を当てた解析を行うことが可能になり、より効果的かつより安全なトレーニングプログラムの作成に貢献することが期待される。進行中の研究のプロトコルを全面的に見直すことで、新たな知見を得ることができ、今後の研究展開の方向を位置づける大きな助けとなった。また、低酸素応答に伴う生体の危険性を探索するアプローチの一つとして、Phd2遺伝子欠損マウスの肥大した脾臓から得られた細胞のフローサイトメトリー解析を行い免疫異常の有無を確認したが、脾腫の原因は赤芽球増多であり免疫異常を示唆する所見は得られなかった。この点で、二年目に予定していた、低酸素暴露時に起きる免疫システムと炎症の状態の解析については目的がおおむね達成されたものと考える。