hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
ATLの発症、進展におけるDNA修復阻害因子hnRNP B1の作用と治療への応用

(1)ATL細胞におけるDNA修復阻害因子hnRNPB1の過剰発現とその意義肺がんの早期から過剰発現することを見出したhnRNPB1タンパク質は、細胞内でDNA依存性キナーゼ複合体に結合することを見出している。hnRNPB1はATLの70%以上の症例において過剰発現していた。その発現は慢性期から増加し、急性期、リンパ腫型においては約8割の症例において発現亢進することが明らかになった。ATL細胞を用いた解析ではhnRNPB1はDNA依存性キナーゼに結合しその酵素活性を阻害すること、hnRNP B1の量と非相同末端修復(NHEJ)の活性は逆相関の傾向にあることを明らかにした。(2)新規抗がん剤SMS-06によるATL細胞に対する抗腫瘍効果の解析SMS-06はIC_<50>として50-100nMの濃度で種々のATL細胞の増殖を抑制した。その機序としてG2/M停止とその後のアポトーシスの誘導によることを明らかにした。またSMS-06はトポイソメラーゼIIの阻害作用に加えてhnRNP B1の存在下において放射線照射によるDNA修復を阻害する作用を持つことを新たに見出した。さらにSCIDマウスへのATL細胞の移植系において腫瘍の増殖を抑制作用を確認した。複数の分子標的を有するSMS-06はATLの治療薬剤開発のためのリード化合物として臨床応用への検討を進めている。背景・目的:成人T細胞性白血病・リンパ腫(ATL)は種々の遺伝子変異とエピジェネティックな変化の蓄積によりキャリアから多段階発がん過程を経て発症すると考えられている。また治療早期から多剤耐性となりやすいため極めて予後不良な疾患である。本研究の目的は(1)ATLの発症・進展における遺伝子変異の蓄積にhnRNPB1がどのように関与するか細胞およびマウスを用いた固体レベルで明らかにする。(2)hnRNPB1を標的とする新規抗癌剤がATLの新規治療薬として有望か前臨床試験において確認することを目的とする。成果:(1)ATL細胞におけるDNA修復阻害因子hnRNPB1の過剰発現とその意義我々が肺がんにおいて過剰発現することを見出したhnRNPB1タンパク質は、ATLの70%以上の症例において過剰発現していた。その発現は慢性期から見出され、ATLにおいても発がん過程の早期から発現亢進することが明らかになった。ATL細胞を用いた解析ではhnRNPB1はDNA依存性キナーゼに結合しその酵素活性を阻害すること、hnRNP B1の量と非相同末端修復(NHE J)の活性は逆相関の傾向にあるこどを明らかにした。(論文投稿中)(2)新規抗がん剤SMS-06によるATL細胞に対する抗腫瘍効果の解析SMS-06はIC_<50>として50-100nMの濃度で種々のATL細胞の増殖を抑制した。またSCIDマウスへのATL細胞(MT1)の移植系においてSMS-06の腹腔内投与は移植腫瘍の増殖を抑制した。現在、MTDや副作用についても解析中である。(論文準備中)目的:成人T細胞性白血病・リンパ腫(ATL)は治療早期から多剤耐性となりやすいため極めて予後不良な疾患である。(2)hnRNPB1を標的とする新規抗癌剤がATLの親規治療薬として有望か前臨床試験において確認することを目的とする.成果:(1)ATL細胞におけるDNA修復阻害因子hnRNPB1の過剰発現とその意義:昨年度はhnRNPB1タンパク質が、ATLの70%以上の症例において過剰発現し、ATL細胞を用いた解析ではhnRNP

B1はDNA依存性キナーゼに結合しその酵素活性を阻害すること、hnRNP B1の量と非相同末端修復(NHEJ)の活性は逆相関の傾向にあることを明らかにした。今年度はhnRNPB1トランスジェニックマウスにおいて放射線照射によりリンパ腫の発生が増加するかを検討した。放射線照射により胸腺の腫大と肺へのリンパ球の浸潤傾向が認められた。(データ解析中)(2)新規抗がん剤SMS-06によるATL細胞に対する抗腫瘍効果の解析SMS-06はIC_<50>として50-100nMの濃度で種々のATL細胞の増殖を抑制した、その機序としてG2/M停止とその後のアポトーシスの誘導によることを明らかにした。細胞内標的分子としてSMS-06はトポイソメラーゼIIとPI-3キナーゼ経路を阻害する作用があることを明らかにした。現在直接の標的分子の同定を行っている。またSCIDマウスへのATL細胞(MT1)の移植系においてSMS-06の腹腔内投与は移植腫瘍の増殖を抑制した。副作用については、一過性の骨髄抑制以外には明らかなものは認められなかった。(論文準備中)
地域における高齢者のうつ状態の予防とケアに関する研究

山形県長井市において、在宅の高齢者2,056名を対象にうつ状態の疫学的な調査を行った。一次調査で、高齢者用の抑うつ性尺度であるGDS短縮版の日本語版を施行し、6点以上の者をうつ状態の疑いがあると考え、訪問による二次調査を施行した。5点以下の者から無作為抽出した対照群にも二次調査を実施した。臨床的なうつ状態の者(抑うつ群A)とGDSは6点以上だが臨床的なうつ状態でなかった者(抑うつ群B)およびGDS 5点以下で臨床的なうつ状態でなかった者(対照群)について、日常生活動作、ライフ・イベント、ソーシャル・サポート、自覚症状を比較した。その結果、抑うつ群Aは、他の群と比べて、家庭内の問題の発生や病気の悪化がライフ・イベントとして多く、身体症状の自覚が多く、病気になったときのソーシャル・サポートが乏しいことが明らかになった。追跡調査の結果では、臨床的なうつ状態の半数以上が軽快しているが、一部は痴呆が顕在化していた。GDS得点が低くうつ状態でなかった者からも11%がGDS高得点に移行し、その背景にADLの悪化や病気の悪化、友人の死などの要因が関与していることなどが明らかになった。以上の結果から、高齢者の抑うつ状態には、身体状況、日常生活動作、喪失体験、家庭内の葛藤、社会的なサポートなどが関与していることが示唆された。山形県長井市在住の高齢者に、自己評価式抑うつ尺度GDSと構造化診断面接SCIDを施行し、それらの結果を参考にしてうつ状態の診断をおこない、本人と家族から、生活状況や身体的な健康状況などを聴取した。具体的には、短縮版のGDS得点で6点以上の者206名とGDS得点5点以下の者から無作為に抽出された117名に対して、家庭を訪問して面接を施行した。痴呆をともなった者や寝たきりの者は、対象から除外した。GDS得点6点以上の206名のうち、臨床的なうつ状態(大うつ病、気分変調症、抑うつ気分を伴う適応障害など)と判断された者は38名であった。この38名(A群)と臨床的にはうつ状態でなかったがGDS得点6点以上の者144名(B群)、うつ状態ではない精神的に健康な者107名(C群)の3群について、心理社会的な要因や身体的な要因に差があるかどうかを検討した。その結果、うつ状態のA群は、精神的に健康なC群に比べて、日常生活動作の能力が低く、高次活動能力も低く、家庭内の葛藤を抱えている者が多く、社会的なサポートも少ないという傾向が明らかになった。また、GDSが高得点だが臨床的なうつ状態ではないと判断されたB群は、C群に比べて、高次活動能力が低く、社会的なサポートも少なく、地域活動に参加していない傾向があることが明らかになった。以上の結果から、臨床的なうつ状態に陥る要因として、身体的な能力の低下に加えて、家庭内の葛藤や社会的なサポートの不足が関与していることが示された。また、GDS得点が高いことは、明らかなうつ状態ではなくとも、うつ状態に陥る危険性が高いことを示すものと考えられた。山形県長井市在住の高齢者2056名に、留置法よる自己評価式抑うつ尺度GDSと訪問調査による構造化診断面接SCIDを施行し、うつ状態の分布を調査した。留置法の調査で有効回答は、1343名であった。このうち、GDS得点6点以上の者206名とGDS得点5点以下の者から無作為抽出された117名について、訪問調査を施行できた。GDS点6点以上の206名のうち、臨床的なうつ状態と診断された者は38名であった。GDS得点5点以下の者でも5名が臨床的なうつ状態と診断された。臨床的なうつ状態の群(A群)と臨床的なうつ状態ではないがGDS得点の高い群(B群)と、GDS得点の低い群(C群)について、日常生活動作、ライフイベント等を比較した。

その結果、A群は、他群に比べて、日常生活動作の能力が低く、高次活動能力も低く、家庭内葛藤を抱えているものが多く、社会的なサポートも少ないという傾向が認められた。初回調査の1年後にA群を訪問調査し、C群については、留置法により調査を行った。A群43名のうち、うつ状態であった者は10名で、軽快15名、痴呆状態4名、死亡2名、入院5名、不在2名、調査拒否5名であった。また、C群99名のうち、1年後にGDS得点が6点以上になったものは、11名であった。GDS得点点が高まったことに関連する要因を分析すると、病気の悪化、友人の死、日常生活動作の低下、地域活動への不参加が関連していることが明らかになった。以上の結果より、高齢者のうつ状態には、身体的な状況、日常生活動作、喪失体験、社会的サポートなどの要因が関与していることが示唆された。
マクロファージの分化に依存するレセプター機能発現の分子機構

マクロファージのFcレセプターの機能発現における糖鎖の役割、およびその機構について、以下のように研究を進めた。先ず、マクロファージ細胞株P388DIを用いて、細胞表面糖鎖の修飾による貪食能の誘導を検討した。その結果、Asn結合型糖鎖のプロセッシング阻害剤(スワインソニン、カスタノスペルミン)や生合成阻害剤(ツニカマイシン)の存在下で培養したり、細胞をシアリダーゼで消化することにより、Fcレセプター介在性貪食能を誘導することが出来ることを示した。したがって、シアル酸含有複合型糖鎖が貪食機能の発現を抑制しており、このような糖鎖の減少あるいは構造修飾によって貪食能が誘導されるものと考えられた。このように糖鎖構造修飾に寄って誘導される貪食は、トリプシン感受性やサブクラスの異なるIgGによる阻害実験からFcγ2bレセプター介在性であることが判明した。貪食能の誘導前後で、リガンドのFcレセプターへの結合には違いが認められないことから、タンパク質のリン酸化を調べた。その結果、貪食能を誘導した細胞にのみ、リガンドの結合に依存してリン酸化される数種のタンパク質が検出され、この中にはFcレセプターが含まれることがわかった。リン酸化されるアミノ酸はセリンと同定された。又、アデニル酸シクラーゼの活性化剤であるフオルスコリンを貪食能誘導前の細胞の培養液に添加したところ、タンパク質リン酸化の昂進を伴って貪食能を誘導することが観察された。したがって、糖鎖を修飾した細胞では、レセプターへのリガンドの結合がタンパク質のリン酸化を昂進することによって貪食作用の発現に導くのに対し、糖鎖修飾前の細胞ではリガンドの結合がタンパク質のリン酸化に連動しないために、貪食作用を示さないものと考えられた。
IPMN由来浸潤癌に対する新規治療標的遺伝子の検証とペプチドワクチン療法の開発

IPMN由来浸潤癌に対する新規がんペプチドワクチン療法の開発を目的とし、浸潤性膵管癌の新規治療標的遺伝子として期待されているMUC16/mesothelinをtargetとして臨床病理学的検討および分子生物学的検討を行った。当科で切除したIPMN症例223例を対象にMUC16およびmesothelin蛋白発現解析を行うと、lowhigh grade dysplasia症例では発現を認めず、IPMN由来浸潤癌となって初めて発現することが分かったが、MUC16/mesothelin高発現は独立した予後不良因子とはならなかった。摘出標本より細胞培養を行い、蛋白発現解析、共発現解析を行った。予後因子解析において、MUC16, mesothelin高発現は生命予後との相関を認めなかった。この理由としては、IPMN由来浸潤癌の予後は膵癌と比較すると良好であることが挙げられた。in vitro研究として和歌山医大第二外科で切除した3症例のIPMN由来浸潤癌切除標本より組織片を採取し、酵素処理後に3次元培養を行った。得られた培養細胞をPCR、Western blotting法、免疫染色でそれぞれMUC16、mesothelin蛋白発現を解析したところ、いづれもMUC16、meshothelinを発現することが分かった。しかし、IPMN由来浸潤癌細胞株の入手あるいは作成は非常に困難で、当初予定していたMUC16/mesothelin機能解析を行うには至らなかった。膵臓外科学現時点で、ほぼ当初予定していた研究計画通りに推進できていると考えられる。今後はin vitro、in vivo、さらには結果の解析作業等を並立して行う必要があるが、これらの手法はこれまでに経験してきているものばかりであり、十分に推進可能であると考えられる。また、これまで当教室で行ってきたペプチドワクチン療法を応用し、MUC16/mesothelinをtargetとしたIPMN由来浸潤癌新規治療へと発展させるべく、計画通りに研究を遂行していく所存である。
骨格筋の損傷治癒メカニズムは遅発性筋痛にどのように影響するのか

遅発性筋痛発生時および治癒過程において、筋内に発生する物質の動態には不明な点が多い。本研究では,骨格筋損傷発生および治癒過程において筋内で発生する発痛関連物質を観察し,それらの物質動態と遅発性筋痛との関連性の解明を試みた。その結果、筋損傷および治癒に関連が深い一酸化窒素(NO)と発痛関連物質の動態に関連性が観察された。NOは損傷細胞の炎症と修復に関与することから、NO発生の遅延が筋痛の遅れを生み出しているものと考えられた。損傷筋内に発生する発痛物質を経時的に観察した.損傷骨格筋における発痛物質の定量化はSDSポリアクリルアミド・ゲル電気泳動(SDS-PAGE)およびケミルミネセンス法を用い,一酸化窒素(NO)Bradykinin B2受容体(BKB2R),Prostaglandin E2受容体,Serotonin(5-HT2A),COX-2,とした.また,電気刺激のみと全く処置をしないコントロール群を作成し,モデル群との比較に使用した.筋損傷後の各物質の変化は,COX-2,PGE2,PGE2R,5-HT2Aが損傷後3日目にピークを示しNOと同期した.BKB2Rは損傷後1日目にピークを示し,7日目にはコントロールレベルまで低下した.NOとスーパーオキシド(02-)の結合によって合成されるペルオキシナイトライト(ONOO-)は,炎症細胞においてCOX活性化の重要なメディエーターとして関与していると示唆されている.また,リポ蛋白によって実験的に炎症性サイトカインの分泌を促進させる先行研究により,02-はアラキドン酸の放出とCOX-2によるPGE2合成に関与している事が示唆されている.今回の実験結果と先行研究により,損傷した筋は損傷1日後から3日後にNOと02-の結合によって合成されたONOO-の作用によりCOX-2が活性化した結果,アラキドン酸からPGE2が合成され痛覚過敏が強く発現している事が考えられる.しかし,損傷受傷から発痛時まで,タイムラグが存在している事から,今後はDOMSを含めた痛みのメカニズムおよびNO抑制についての生理学的,分子生物学的に詳細な研究が必要と考えられる.高強度運動時の損傷筋内に発生する一酸化窒素(Nitric Oxide : NO)が非定常状態である3Gの過重力環境時にどのような変化を示すのかを検討した.実験には雄ラットを用い過重力負荷として遠心機により3.0-Gを8分間負荷した.筋損傷の指標となるβ-グルクロニダーゼ,TNFα,iNOS遺伝子およびNOは,腓腹筋,前脛骨筋および長指伸筋において,コントロール群に比べて,過重力負荷群の方が有意に高い値を示した.一方,IL-6には過重力負荷群とコントロール群の間に有意な差を認めなかった.ヒラメ筋においては,明らかな生化学的変化を認めなかった.短時間の過重力負荷では,すべての筋で1L-6に変化を認めなかった。さらにヒラメ筋ではそれらのすべての変化を認めなかった.これらの結果より,8分間の3.0-G過重力負荷は,腓腹筋,前脛骨筋および長指伸筋において筋損傷の指標物質を有意に増加させたものの,筋損傷の指標物質の一つであり筋へのグルコースの取込にも関与するIL-6は,いずれの筋においても増加しなかった.さらに遅筋であるヒラメ筋においては他の筋とは異なりすべての指標において,過重力負荷による影響を認めなかった.これらの結果から,短時間の過重力負荷により引き起こされる骨格筋内の炎症性反応は1G環境下とは異なり,さらに筋特性による応答性の差異が生じている可能性が示唆された.今回の実験結果と先行研究により,NOの生成は骨格筋損傷という現象をトリガーとして増加するが,重力環境の違いによりその生成機序も異なることが考えられる.これは,骨格筋損傷を考察する上で非常に重要な示唆であり,筋痛の発生にも大きく関与するものと思われ,本研究の今後の進展に大きな意味をもつものと思われる.伸張性収縮運動によって引き起こされる筋損傷時には、誘導性一酸化窒素合成酵素(iNOS)によって一酸化窒素(NO)が生成される。筋損傷時の炎症によって引き起こされたNOが、遅発性筋痛のコントロールを行っているのではないかという考えのもと研究を進めてきた。プロスタグランジンE2(PGE2)は、アラキドン酸からシクロオキシゲナーゼ(cyclooxygenase:COX)により合成される。PEE2の合成関連酵素であるCOXにはCOX-1とC0X-2の存在が知られており、COX-1は生体内の大部分に恒常的に存在している。またCOX-2は炎症性刺激によりマクロファージなどから合成され、NO生成に関与するiN0Sとの関連も大きい。そこで、筋損傷によるPGE2の変化はこのCOX-2を通じて影響を受けていると考えた。PGE2にはR1R4の4つの受容体が存在し、R2は痛覚過敏に関係する受容体であるため、その動態を観察した。

一方、セロトニン(Serotonin:5-HT)は消化管、血小板、中枢神経系に存在し炎症時において重要な役割を演じ、痛みを増強することが知られている。セロトニンの数多くある受容体のうち2Aは痛覚制御に関連している。筋損傷3日後にNOタンパクの筋内発現がピークを迎えるが、COX-2、PGE2、PGE2R2、5-HT2AもNO同様に3日後にピークを迎え、NOと何らかの関連があると示唆された。しかし、PGE2R2、5-HT2Aは共に受容体であり、発痛物質産生への直接の関係を立証するには至らなかったが、受容体の発現が起こっていることから痛みや痛覚過敏へのトリガーとなることは十分に考えられる。しかし、本研究においてNOとCOX-2に関係について言及することは出来なかった。今後も、遅発性筋痛のメカニズムを、生理学的・分子生物学的にとらえた詳細な研究が必要と考えられる。
1,2-プロパンジオール生成乳酸菌によるサイレージの好気的変敗防止とその機能解析

L.buchneriの好気的変敗防止機能とその作用機序を調べるとともに,乳牛を用いた泌乳試験を行ってその栄養特性を明らかにした.まず,トウモロコシ,イネ科牧草,TMR(完全混合飼料)を材料としてL.buchneriの添加試験を行い,1,2-プロパンジオール生成量や好気的安定性に関わる要因について解析を行った.同時に,L.buchneriの使用にあたって危惧されることが多いポリアミン生成の有無を確認し,サイレージ用スターターとしての健全性および安全性の評価を行った.さらに,有望株を選抜して実規模調製と乳牛への給与試験を行うとともに,飼料イネホールクロップサイレージの発酵制御にも応用を試みた.得られた結果は以下のとおりである.1.L.buchneriを添加すると,トウモロコシおよびイネ科牧草サイレージでは,開封後1週間以上好気的変敗が起こらなかった.酵母は検出限界以下となり,乳酸が減少して酢酸と1,2-プロパンジオールが増加した.予乾はL buchneriの効果を減弱させたが,予乾サイレージでも好気的変敗は抑制された.一方,TMRサイレージはL.buchneriを添加しなくても変敗せず,酵母が高レベルで生残しても温度上昇はまったく見られなかった.2.研究代表者らが保有するL.buchneriは,スクリーニング培地で培養してもポリアミンを生成しなかった.トウモロコシ,フェストロリウムおよびTMRサイレージでもこの特性は裏付けられ,スクリーニングで陰性となったL.buchneriは,サイレージ用スターターとして安全に使用できると考えられた.3.平成15および16年度にそれぞれ1回ずつ泌乳試験を行い,L.buchneriの有用性を実規模レベルで評価した.L.buchneriによる発酵特性の変化はいずれの実験でも認められたが,小規模サイロに比べると実規模サイロにおける効果は小さかった.L.buchneri添加サイレージを0.400.50の割合で含むTMRを乳牛に給与したところ,採食量,乳量,乳成分およびルーメン液性状は対照飼料と差がなかった.4.飼料イネサイレージにL.buchneriを添加すると,エタノールと2,3-ブタンジオールの生成が強く抑制された.また,貯蔵12ヶ月後でもL.buchneriは優占菌として生残した.L.buchneriの好気的変敗防止機能とその作用機序を調べるとともに,乳牛を用いた泌乳試験を行ってその栄養特性を明らかにした.まず,トウモロコシ,イネ科牧草,TMR(完全混合飼料)を材料としてL.buchneriの添加試験を行い,1,2-プロパンジオール生成量や好気的安定性に関わる要因について解析を行った.同時に,L.buchneriの使用にあたって危惧されることが多いポリアミン生成の有無を確認し,サイレージ用スターターとしての健全性および安全性の評価を行った.さらに,有望株を選抜して実規模調製と乳牛への給与試験を行うとともに,飼料イネホールクロップサイレージの発酵制御にも応用を試みた.得られた結果は以下のとおりである.1.L.buchneriを添加すると,トウモロコシおよびイネ科牧草サイレージでは,開封後1週間以上好気的変敗が起こらなかった.酵母は検出限界以下となり,乳酸が減少して酢酸と1,2-プロパンジオールが増加した.予乾はL buchneriの効果を減弱させたが,予乾サイレージでも好気的変敗は抑制された.一方,TMRサイレージはL.buchneriを添加しなくても変敗せず,酵母が高レベルで生残しても温度上昇はまったく見られなかった.2.研究代表者らが保有するL.buchneriは,スクリーニング培地で培養してもポリアミンを生成しなかった.トウモロコシ,フェストロリウムおよびTMRサイレージでもこの特性は裏付けられ,スクリーニングで陰性となったL.buchneriは,サイレージ用スターターとして安全に使用できると考えられた.3.平成15および16年度にそれぞれ1回ずつ泌乳試験を行い,L.buchneriの有用性を実規模レベルで評価した.L.buchneriによる発酵特性の変化はいずれの実験でも認められたが,小規模サイロに比べると実規模サイロにおける効果は小さかった.L.buchneri添加サイレージを0.400.50の割合で含むTMRを乳牛に給与したところ,採食量,乳量,乳成分およびルーメン液性状は対照飼料と差がなかった.4.飼料イネサイレージにL.buchneriを添加すると,エタノールと2,3-ブタンジオールの生成が強く抑制された.また,貯蔵12ヶ月後でもL.buchneriは優占菌として生残した.1.1,2-プロパンジオール生成乳酸菌L.buchneriの生体アミン生成能研究代表者らは有望株としてL.buchneri NK01およびNK02を保有しているが,これらの生体アミン生成能は確認していない.高濃度の生体アミンは採食量や嗜好性を低下させる因子と考えられており,サイレージ中の生成量とその変動要因を明らかにすることは重要である.本実験では,液体培地を用いて生体アミン生成能を確認するとともに,数種サイレージにL.buchneri NK01およびNK02を添加して実際の生成量を測定した.材料は黄熟期のトウモロコシ,出穂初期のフェストロリウムおよびビール粕を主体とするTMRとし,これにL.casei, L.buchneri NK01およびL.buchneri NK02を添加してパウチ式サイレージを調製した.60日後に開封して微生物叢,発酵特性,好気的安定性および生体アミン生成量を調べた.

液体培地を用いたスクリーニングにより,L.buchneri NK01にチラミン生成能が認められた.ヒスタミン,カダベリンおよびプトレシン生成能はいずれの乳酸菌からも認められず,L.caseiおよびL.buchneriNK02はチラミン生成能も示さなかった.L.buchneriの好気的変敗防止機能はすべてのサイレージで認められ,酢酸の増加による酵母数の減少がそれらに関与すると考えられた.生体アミン生成量は無添加サイレージが最も多く,L.casei添加サイレージが最も少なかった.L.buchneri NK01およびNK02添加による違いはほとんどなく,液体培地で確認されたチラミン生成能は実際のサイレージには反映しなかった.これらのことから,L.buchneri NK01とNK02がいずれも安全な微生物製剤となりうることが示されるとともに,生体アミン生成能が変敗防止機能と関係ないことが明らかとなった.1,2-プロパンジオールは通常のサイレージには含まれない物質であり,L.buchneriの生産面での機能を評価するには大動物での飼養試験が必須である.本実験では,L.buchneri NK02を黄熟期のトウモロコシに添加してサイレージを調製し,これを含むTMRを平均乳量35kg/dの高泌乳牛に給与して,採食量,乳量,乳成分およびルーメン液性状の変化を調べた.L.buchneriの添加により,サイレージ中に13.6g/kgDMの1,2-プロパンジオールが生成した.これを含むTMRを給与しても高泌乳牛の採食量,乳量,乳成分およびルーメン液性状は有意な変化を示さず,L.buchneriは実用的にも有効かつ安全な微生物製剤と考えられた.前年度の試験でアミン生成能がないことを確認したL.buchneri NK02株を用いて,実規模調製と泌乳試験を行った.黄熟期のトウモロコシホールクロップ(DM35%)を材料とし,L.buchneri凍結乾燥粉末を蒸留水に溶かして10^<10>cfu/tレベルで添加した.対照には蒸留水のみを添加し,2トン容のFRPサイロに2基ずつ詰め込んだ.約8ヶ月間貯蔵後,泌乳中期のホルスタイン種初産牛4頭を用い,反転法による採食試験を行った.給与飼料はL.buchneri添加あるいは無添加サイレージを50%含むTMRとし,予備期および本期はいずれも10日間とした.また,サイレージ単独あるいはTMR混合後の温度変化を記録して,好気的安定性を調べた.得られた結果は以下の通りである.1)対照サイレージは典型的な良質サイレージであり,pHが3.6で乳酸が5.6%DMと優占していた.エタノールや酢酸も1.0%DM程度であったが,開封時にはサイレージ上面に少量のカビが見受けられた.2)L.buchneriを添加すると,乳酸が4.5%DMに低下して酢酸が1.6%DMに増加した.1,2-プロパンジオールは0.4%DMであり,前年度の実規模調製試験に比べ生成量は3分の1程度であった.好気的変敗抑制機能は試料の採取部位による変動があったが,単独およびTMRのいずれでも確認された.通常TMRとすると好気的変敗は促進されるので,TMRでも温度上昇を遅延させたことは大きな成果である.また,サイレージ上面のカビはほとんどなかった.
巡回セールスマン問題の多項式時間で解けるクラスへの計算幾何学からの取り組み

巡回セールスマン問題(以下、TSP)とは与えられた複数の都市をすべて1回ずつ通り、出発点に戻ってくるような最短経路を見つける問題である。この問題はNP困難のクラスに属し、都市数が増えたとき実用的な時間(多項式時間)で最短経路(最適解)を求めるのは不可能と予想される代表例になっている。そこで、実社会での応用の観点から、実用的は時間で最適解に近い解を求める近似解法の研究がさかんに行われてきた。TSPの近似解法を考える際、木は重要な概念の1つである。この木は、グラフ理論においてもさまざまな研究がなされている。例えば、与えられたグラフG_1,...,G_k,Hに対し、HがG_1,...,G_kを辺素に含むことができるかどうかを判定する問題はNP完全に属しており、一般にその判定は難しい。そこで、さまざまなグラフのクラスに関する十分条件について研究されてきた。この問題に対し、特にHを平面グラフにした場合どのようなグラフを辺素に含むことができるかに興味を持っている。今年度は2つの木の平面グラフへの埋め込みに関する研究を行った。Garciaら(2002)は、2つのスターでない木はある平面グラフに辺素に埋め込むことができると予想した。同じ論文で、Garciaらは、スターでない木とパスはある平面グラフに辺素に埋め込めることを示している。予想の解決を目標に、より広い木のクラスについて考えた。まず、スターのいくつかの辺を1回細分して得られるグラフとスターでない木に、2つのキャタピラ、について榎本,太田,神田,枡井とともに示した。また、直径5以下のキャタピラとスターでない木に関して構成的に証明し、最終的にスターでないキャタピラとスターでない木について太田とともに示した。この証明方法が予想の解決の糸口にならないかを考察することが今後の課題である。巡回セールスマン問題(以下TSP)はNP困難のクラスに属し、都市数が増えたとき実用的な時間(多項式時間)で最短経路(最適解)を求めるのは不可能と予想される組合せ最適化問題の代表例になっている。そこで、実社会での応用の観点から、実用的な時間で近似解を求める研究がさかんに行われてきた。その一方、理論的な観点からは、どのような性質があればTSPの最適解が多項式時間で得られるかについて研究されてきた。本研究では代表者がこれまでTSPとは独立に取り組んできたボロノイ図やデローネ三角形分割などのようにユークリッド距離を考慮した性質を持つ計算幾何学の観点からTSPの多項式時間で解けるクラスについて考える。まず、今年度、Monge propertyとよばれる性質を緩和した条件を仮定することにより、TSPが多項式時間で解けることを示すことができた。この結果については3月にイギリスで開催された国際会議CO2004にて発表を行った。さらに、論文としてまとめ、国際雑誌に投稿中である。この条件の幾何的性質についてはあまりよくわかっていないが、対称性があることからこの性質について考察することは興味深いと考えられる。また、計算幾何学の分野では、ボロノイ図に関する成果を得た。平面上に配置された母点に対するボロノイ図を描画するとき、広範囲の領域ではなく、注目すべき部分領域のみ得られればよいことが少なくない。昨年度までに指定した長方形領域に母点が1点あるいは2点の場合、その領域に正確なボロノイ図を描画するのに考慮すべき母点の最適な領域が煩雑な証明により決定できていた。今年度はこの別証を考えることにより、この一般化として、指定領域内に母点がn点の場合の最適な領域についても決定することができた。このような計算幾何学の性質を具体的にTSPの多項式時間で解けるクラスに適用する手法については今後の課題である。ハミルトン閉路の交差数解消については、交差する2辺の他の2辺への変換(フリップ)によって、自己交差のないハミルトン閉路を生成するための変換の最小回数の上限と下限を得た。また、ある制限をつけたいくつかのハミルトン閉路に対して、変換の最小回数の正確な値を決定することができた。この交差数解消にフリップとよばれる操作を導入しているが、これは巡回セールスマン問題の近似解法の1つである2-OPTの1ステップに類似している。また、計算幾何学については、ボロノイ図の指定領域とその探索領域について次の研究を行った。平面上の指定領域が長方形で指定領域内の母点数が1の場合はKuhnにより、2の場合は岡本-小田-坂上-早川により、面積が最小となる最善の探累領域(以下、最適探索領域)が決定できていたが、一般の(3以上の)場合の最適探索領域が複数の円の和領域で表せることを示した。さらに長方形領域だけでなく、指定した領域が凸多角形の場合も同様の性質が成り立つことがわかった。しかし、計算機を用いて計算・描画を行う場合、このような複雑な和領域に含まれる母点を抽出するのは計算効率のよい方法とは言えない。そこで、実用性を考慮し、計算機を用いて抽出しやすいような最適探索領域を包含するいくつかの領域(以下、近似探索領域)を導いた。特に上述の最適探索領域にMBR(Minimum Boundary Rectangle)を組み合わせることで高速に指定領域内のボロノイ図の計算が行えることを計算機実験により確認した。この近似アルゴリズムは、例えば、必要としている部分領域のみをディスプレイ上に描画する際高速に計算できるといった応用例があげられる。

また、指定領域が凹多角形の場合や空間を平面ではなくn次元に拡張した場合についても同様の議論が成り立つのではないかと考えている。巡回セールスマン問題(以下、TSP)とは与えられた複数の都市をすべて1回ずつ通り、出発点に戻ってくるような最短経路を見つける問題である。この問題はNP困難のクラスに属し、都市数が増えたとき実用的な時間(多項式時間)で最短経路(最適解)を求めるのは不可能と予想される代表例になっている。そこで、実社会での応用の観点から、実用的は時間で最適解に近い解を求める近似解法の研究がさかんに行われてきた。TSPの近似解法を考える際、木は重要な概念の1つである。この木は、グラフ理論においてもさまざまな研究がなされている。例えば、与えられたグラフG_1,...,G_k,Hに対し、HがG_1,...,G_kを辺素に含むことができるかどうかを判定する問題はNP完全に属しており、一般にその判定は難しい。そこで、さまざまなグラフのクラスに関する十分条件について研究されてきた。この問題に対し、特にHを平面グラフにした場合どのようなグラフを辺素に含むことができるかに興味を持っている。今年度は2つの木の平面グラフへの埋め込みに関する研究を行った。Garciaら(2002)は、2つのスターでない木はある平面グラフに辺素に埋め込むことができると予想した。同じ論文で、Garciaらは、スターでない木とパスはある平面グラフに辺素に埋め込めることを示している。予想の解決を目標に、より広い木のクラスについて考えた。まず、スターのいくつかの辺を1回細分して得られるグラフとスターでない木に、2つのキャタピラ、について榎本,太田,神田,枡井とともに示した。また、直径5以下のキャタピラとスターでない木に関して構成的に証明し、最終的にスターでないキャタピラとスターでない木について太田とともに示した。この証明方法が予想の解決の糸口にならないかを考察することが今後の課題である。
DNA結合蛋白質を利用したナノドット・分子素子の自由配列と量子細線の形成

本年度の成果は以下のとおりである。1)光活性分子素子とジンクフィンガーの融合・DNAとの結合:まず、従来の配列を変えN端側にルテニウム(オスミウム)トリスバイピリジン錯体部を移した。この配列換えによりケミカルライゲーション法の適用が可能になり、自由にフィンガー側の配列を選べるようになる。改めてTbp^<Ru(Os)>-ZFの合成法を検討し、まず、ライゲーションの原料になるTbp^<Ru(Os)>-GTGEKPYGチオエステルの大量合成法確立に努めた。その結果、TAMPAL resinから固相法により伸長し、直接チオエステルを切り出す方法が有効であることを見出した。この方法でTbp^<Ru>-GTGEKPYG-F1F2とTbp^<Os>-GTGEKPYG-F2F1(F1、F2は何れも単鎖のジンクフィンガー)の合成を試み、前者については単離・精製に成功し、更に、50bp DNA上に5個直列配列させることに成功した。後者についても、Tbp^<Os>-GTGEKPYG-F2の合成に成功している。2)ドットとの結合能を有する新規ジンクフィンガー融合蛋白質の合成:前年度における検討から、金のドットと1:1で反応し、安定にハンドリングすることが可能なペプチドとして、メタロチオネイン(MTIIのαドメイン)とジンクフィンガーの融合蛋白質の合成を企図した。様々な検討の結果、固相合成後液相でのフラグメント縮合によりこの融合蛋白質の単離・生成に成功した。現在、金ドットの導入を検討中である。DNA認識部位)の増産を行った。ペプチドの合成は配列がシステインを含むことを利用して、nativechemical ligation法を固相法と組み合わせて行った。同時にフィンガー部のアミノ酸配列をF1F1に変え、オスミウムを導入した化合物の合成も行ったが、余り再現性の良い結果は得られなかった。3)一方、ZFのN-端にシステインパッチを結合させたF3F1-C10の合成を当初の計画に従って試みたが、システインパッチは極めて酸化されやすく、この計画は途中で断念せざるを得なかった。そこで新たにシステインパッチの変わりに、より空気中で扱いやすいと予想される重金属結合蛋白質メタロチオネイン(MT)を用いることにした。MTの合成は固相法により行い、切り出し後の精製には分取HPLCを用いた。同定はESI-TOFマス使用した。4)MTとドットとの1:1結合を実現する条件を探索した。ドットとしてCdS、Auを選び、それぞれ約2-3nmのサイズのものを合成したが、ともにMT部位がないとZF構造を破壊することがわかり、最終的に極微小ドットである水溶性Au55の使用を選択した。現在MT-Au55系の形成を検討中である。
D-セリン合成阻害による網膜神経変性抑制効果の解析

中途失明の主な原因として、糖尿病網膜症、緑内障、加齢黄斑変性等の疾患がある。それらの病態にはN-メチルD-アスパラギン酸(NMDA)受容体の過剰な活性化を原因とする神経変性が関与している。本研究では網膜変性疾患に対する治療法の選択肢として、D-セリン合成酵素であるセリンラセマーゼ(SRR)の酵素活性を阻害する薬剤を糖尿病モデルマウスへ投与し、D-セリン合成の長期的な抑制を試みる。眼内D-セリンの濃度との相関関係と、SRR阻害剤の網膜障害に対する抑制効果を検討する。本研究で網膜変性疾患の増悪に関与すると思われる眼内D-セリンの制御方法が明らかになれば、臨床応用への基礎データを提供できる。
Helicobacter Pylori感染胃粘膜における胃粘膜萎縮・発癌機構に関する研究二酸分泌抑制剤の影響

目的:Hpは高いウレアーゼ活性を有し、高濃度のアンモニアを産生する。本研究では、酸分泌抑制剤の使用により惹起される胃内腔pHの上昇が、アンモニアによる胃粘膜防御機構の破綻作用、及び胃粘膜上皮細胞apoptosis誘導作用に及ぼす影響を検討した。方法:1.In vitro胃粘膜実験系:(1)マウス由来胃粘膜上皮細胞に対して、アンモニアを投与し、胃粘膜上皮細胞(GSM06)のapoptosisについて検討した。(2)モルモットintactsheet胃底腺粘膜をUssing chamberにmountし、NH4Cl投与による粘膜の変化を電気生理学的、形態学的に検討した。2.In vivoマウスにおける検討:C57/BL6マウスにHpを感染させた後、酸分泌抑制剤(H2-blocer,PPI)を一年間連日投与し、胃炎の程度、胃粘膜細胞回転、アポトーシスの出現、萎縮の進展の程度について検討した。成績:1.In vitroにおける検討:アンモニアは胃内pHの高い環境下で、(1)GSM06細胞におけるapoptosisを増大させ、(2)モルモット胃粘膜の電気学的指標を低下させ、上皮細胞に空胞化を惹起した。2.In vivoにおける検討:Hp感染によるマウス胃粘膜萎縮の進展は、酸分泌抑制剤投与群において著明であった。酸分泌抑制剤の使用は、アポトーシスによる被蓋上皮細胞の脱落を促進し、頚細胞の増殖能を増大させ、被蓋上皮細胞への分化を促進し、線細胞への分化を抑制した。結論:Hp感染胃粘膜において、長期的な胃酸分泌抑制剤の使用は、胃内腔のpHを上昇させ、アンモニアをイオン型のNH4+からガス型のNH3に変換させることにより、アンモニアによる胃粘膜傷害、上皮細胞のapootosis誘導作用を増悪し、胃粘膜萎縮を進展させる可能性が示唆された。Helicobacter pylori(Hp)による胃粘膜萎縮のメカニズムに関する検討目的: Hpは高いウレアーゼ活性を有し、高濃度のアンモニアを産生ずるが、アンモニアの胃粘膜傷害はpHの高い環境下で増強される。本研究では、アンモニアの胃体部粘膜に及ぼす影響について異なる胃内pH環境下で検討した。方法:1.胃粘膜実験系:(A)モルモットintactshect胃底腺粘膜:固有筋層より剥離したnativeな胃底腺粘膜を用いた。(B)モルモット遊離胃腺:モルモット胃粘膜をco11agenase処理して得られた遊離胃腺細胞を用いた。2.実験プロトコール:(A)上記の胃粘膜をUssing chamberにmountし、粘膜側pH5.0と8.0の条件下で粘膜側にNH4Clを投与し、電気生理学的、形態学的に検討した。(B)モルモット遊離胃腺細胞をNH4Cl存在下、pH5.08.0にて培養した後、propidium iodide,ancxin Vによる二重染色を行い、flow cytometryにてapoptosisの出現率を評価した。成績: (A)モルモットintactsheet胃底腺粘膜において、粘膜側pH5,0よりもpH8.0において、NH4Cl投与後のPD,Rの低下、及び胃底線細胞における空胞化が著明に認められた。(B)モルモット遊離胃腺細胞において、培養液のpHが高くなるほど、apoptosisの出現率が増大した。詰盈:アンモニアは、胃内pHの高い環境下において、胃粘膜防御能を低下させ、胃底腺細胞のapoptosisを促進した。以上より、Hp感染者に対する長期間の酸分泌抑制治療は胃粘膜萎縮を進展させる可能性が示唆された。1.In vitroにおける検討

-アンモニア、及びフリーラジカルによる胃粘膜傷害機序の検討-目的:Hpは高濃度のアンモニアを産生すると共に、粘膜内白血球浸潤を誘導し、大量のフリーラジカルを産生する。我々は、酸分泌抑制下において、これらの物質が胃粘膜細胞に及ぼす影響について検討した。方法:胃粘膜実験系:(A)マウス由来胃粘膜上皮細胞に対して、アンモニアと次亜塩素酸(フリーラジカル産生物質)を投与し、胃粘膜上皮細胞のapoptosisについて検討した。成績:胃内pHの高い環境下で、アンモニア、次亜塩素酸によるapoptosisが増大した。結論:Hp感染胃粘膜において、アンモニアは、特に胃酸分泌抑制時に、白血球由来のフリーラジカルと反応して、胃粘膜萎縮を進展させる可能性が示唆された。2.In vivoにおける検討-酸分泌抑制剤の長期投与がHp感染胃粘膜の萎縮進展に及ぼす影響-方法:マウスHpを感染させた後、酸分泌抑制剤(H2-blocer,PPI)を一年間連日投与し、萎縮の進展について薬剤非投与群と比較した。成績:Hpによる胃粘膜萎縮の進展は、酸分泌抑制剤投与群において著名であった。結論:酸分泌抑制剤の長期投与はHp感染胃粘膜の萎縮進展を加速すると考えられた。1.In vitroにおける検討-アンモニアによる胃粘膜上皮細胞アポトーシスの機序に関する研究目的:Hp感染胃粘膜にみられる萎縮の機序として、Hpが産生するアンモニアが関与するか否かについて、および酸分泌抑制剤の投与がアンモニアの作用に及ぼす影響について検討した。方法:胃粘膜実験系:(A)マウス由来胃粘膜上皮細胞(GSM06)に対して、培養液のpH5.0-7.0の条件下でアンモニアを投与し、胃粘膜上皮細胞のアポトーシスの出現を検討した。成績:アンモニアはミトコンドリアよりチトクロームCを遊離し、カスパーゼ3を活性化してアポトーシスを誘導した。アンモニアによるアポトーシスは、胃内pHの高い環境下で著明であった。結論:Hp感染胃粘膜において、酸分泌抑制剤の使用は胃内pHを上昇させることにより、胃粘膜上皮細胞のアポトーシスを促進することが示唆された。2.In vivoにおける検討-酸分泌抑制剤の長期投与がHp感染胃粘膜の萎縮進展に及ぼす影響-目的:酸分泌抑制剤の長期使用が胃粘膜萎縮の進展を加速するか否かについてin vivoの実験系を用いて検討した。方法:マウスにHpを感染させた後、酸分泌抑制剤(H2-blocer,PPI)を一年間連日投与し、Hp菌量の変化、胃炎の程度、胃粘膜細胞回転、アポトーシスの出現、萎縮の程度について検討した。成績:Hpによる胃粘膜萎縮の進展は、酸分泌抑制剤投与群において著明であった。酸分泌抑制剤の使用は、アポトーシスによる被蓋上皮細胞の脱落を促進し、頚細胞の増殖能を増大させ、被蓋上皮細胞への分化を促進したが、逆に腺細胞への分化は抑制した。結論:酸分泌抑制剤の長期投与はHpの産生するアンモニアが、胃内pH上昇の結果上皮細胞に侵入しやすくなり、頚細胞から腺細胞への分化を抑制することにより萎縮の進展を加速することが示唆された。
新規カンナビノイド受容体GPR55とその内在性リガンドの生理的意義の解明

GPR55は、マリファナの受容体として知られるカンナビノイド受容体の新しいサブタイプではないかと報告された受容体で、その内在性リガンドは、リゾホスファチジルイノシトール(LPI)である。今回の研究で、LPIがGPR55を介して細胞骨格系の制御やストレス応答等において何らかの役割を担っていることが明らかとなった。また、GPR55と約30%のホモロジーを有するGPR35のリガンドを探索したところ、2-アシル型のリゾホスファチジン酸(LPA)がGPR35の内在性リガンドとして機能している可能性が示唆された。GPR55は、ヒトでは319個のアミノ酸からなるクラスA(ロドプシン様)Gタンパク質共役型受容体である。我々は、ヒトGPR55を発現させたHEK293細胞を用いてリガンドの探索を行い、リゾリン脂質の一種であるリゾホスファチジルイノシトール(LPI)が、GPR55を介して、ERK(p42/44MAPキナーゼ)のリン酸化や細胞内カルシウム応答を引き起こすこと、種々のLPI分子種のうち、グリセロール骨格の2位にアラキドン酸が結合した2-アラキドノイルLPIが最も強い活性を示すことなどを報告してきた。しかし、GPR55とその内在性リガンドであるLPIの生理的な意義はまだよく分かっていない。ところで、GPR55はG_<12/13>と共役していることが報告されている。そこで今回の研究では、G_<12/13>を介した作用に注目して実験を行った。まず、G_<12/13>の下流にあるRhoAに及ぼす影響を調べたところ、LPIは、GPR55を介してRhoAを強く活性化することが分かった。次に、RhoAを介して引き起こされる作用について調べた。その結果、LPIは、GPR55及びRhoAを介して細胞のrounding及びストレスファイバーの形成を引き起こすことが分かった。また、LPIはGPR55を発現させたHEK293細胞のp38 MAPキナーゼ及びその下流の転写因子であるATF-2(Activating transcription factor 2)のリン酸化を起こすことも明らかとなった。一方、GPR55の発現をRT-PCRにより調べたところ、GPR55は脳の他、脾臓や胸腺といった免疫系の組織に比較的多量に発現していることが確認された。このことから、LPIはこれらの組織でG_<12/13>及びRhoAを介して細胞骨格系の制御やストレス応答等において何らかの役割を担っていると考えられる。研究代表者は、これまでの研究で、新規カンナビノイド受容体として報告されたGタンパク質共役型受容体GPR55の内在性リガンドが、リゾリン脂質の一種であるリゾホスファチジルイノシトール(LPI)であることを明らかにした。また、最近、GPR55がマリファナの主要活性成分であるΔ^9-テトラヒドロカンナビノール(Δ^9-THC)に反応することを見出した。更に、GPR55との間に30%のホモロジーがあるGPR35もΔ^9-THCに反応することも分かった。興味深いことに、GPR35遺伝子とGPR55遺伝子は同一染色体上の比較的近い場所に位置している。これらの事実も、GPR35の内在性リガンドとGPR55の内在性リガンドとの間に、何らかの構造上の関連がある可能性を示唆するものである。今回の研究では、この点に注目し、脂質関連化合物の中からGPR35の内在性リガンドの候補を探索した。その結果、GPR35を発現しているHEK293細胞にリゾリン脂質の一種である2-アシル型のリゾホスファチジン酸(LPA)を加えると、細胞内カルシウム応答やERKのリン酸化が著しく増大することが明らかとなった。2-アシル型LPAは、受容体分子の細胞内への取り込みも促進した。同様の効果は、他のリゾリン脂質を加えた場合には観察されなかった。これらの結果は、2-アシル型LPAがGPR35の内在性リガンドとして機能している可能性を強く示唆するものである。一方、GPR35は小腸などの消化器系や脾臓に比較的多量に発現していることが確認された。GPR35の生理的役割はまだよく分かっていないが、欠損すると精神遅滞や骨異形成を引き起こす可能性が指摘されている。このほか、GPR35は胃がんや2型糖尿病、痛覚の調節、ある種の心疾患に関与しているのではないかとの報告もある。2-アシルLPAはGPR35リガンドとして、細胞の正常な分化・増殖等に、あるいは様々な疾病の成立に深く関与している可能性が高い。
チャネル蛋白質の構造変化に連携した自己組織化動態：チャネル新規機能発現機構の解明

膜蛋白質は膜平面上で制限された拡散運動を行い、同種蛋白質間で集合・離散を行うものがある。しかし膜蛋白質の中でもイオンチャネルは、細胞膜上でごく少数のチャネルで細胞機能を担うものもあり、自己組織化によってチャネル機能の発現にどのような関連があるのか十分に検討されてこなかった。私達は原子間力顕微鏡(AFM)によってチャネル蛋白質の新しい動的秩序構造を発見した。チャネルはゲート開閉構造変化に連動して膜状で可逆的な自己組織化を行うのである。一方、チャネルと膜脂質の相互作用がチャネル蛋白質の新しい構造モチーフ(センサーへリックス)を介して行われており、しかもセンサーへリックスがゲート構造変化を制御することも発見した。この2つの発見から導かれることは、チャネル機能発現においてチャネル蛋白質の構造変化が膜脂質との相互作用を変化させ、チャネルの膜内での孤立状態と自己組織化状態の遷移を引き起こしている、というシナリオである。生体膜と異なり、脂質2重膜に精製したチャネルを再構成するにはチャネルの向きを揃えることが不可欠であるが、これまでに方法が確立していなかった。この方法の確立のために多くの実験を行った。またチャネル集合離散状態によってチャネル機能の差を捉えるためには原子間力顕微鏡で捉えられる事象でなければならず、様々な方法を試みてきた。その中で隣り合うチャネル機能に差があるという結果を得つつある。チャネルが膜とどう相互作用するかという点を明らかにする上で膜リン脂質の組成はきわめて重要である。私達は様々なリン脂質を使ってリポソームを形成し、膜上での集合離散状態を蛍光色素で測定した。その結果、リン脂質の組成だけではなく、膜の相分離・厚さなど膜の物理的特性によって集合離散状態が大きく変化することを明らかにした。これらの実験と並行して、複数の共同研究を開始し、新しい結果を得た。27年度が最終年度であるため、記入しない。最近私達は原子間力顕微鏡(AFM)によってチャネル蛋白質の新しい動的秩序構造を発見した。チャネルはゲート開閉構造変化に連動して膜上で可逆的な自己組織化を行うのである。一方、チャネルと膜脂質の相互作用がチャネル蛋白質の新しい構造モチーフ(センサーヘリックス)を介して行われており、しかもセンサーヘリックスがゲート構造変化を制御することも発見した。本研究の目的は、分子内構造変化から超分子集合体形成にいたるチャネルの新しい動的機能発現様式の分子機構を明らかにすることである。チャネル機能測定に対する新しい方法を確立し、電流と蛍光の同時測定が可能になった。またAFMは高い空間・時間分解能の測定を目指し実験を進めつつある。さらにチャネル分子動態を明らかにするために分子動力学法を適用し、イオンの新しい透過様式を発見した。これらの実験と平行して、複数の協同研究を開始し、実験を進めつつある。チャネルの膜上での振舞いを明らかにするための新しい方法を開発し、論文として発表した。この方法は膜の曲率などを変化させることができ、集合・離散への影響を検討することができる。

またチャネルの膜上のオリエンテーションを制御する方法を開発しつつあり、これを原子間力顕微鏡(AFM)で高分解能で観察している。一方、集合離散をより高い時間分解能で観察するために、高速AFMの観察を協同研究として進めている。27年度が最終年度であるため、記入しない。AFMの測定が高分解能になるにしたがって、さまざまな実験上の困難が現れてきた。しかしこの課題を解決することが本プロジェクトのブレークスルーにつながるはずであり、集中して実験を進める。これらの問題は基本的なリポソーム作成法や脂質平面膜法、さらにチャネル蛋白への変異導入などの基本的技術を組み合わせることによって解決の糸口をたどりつつある。本年度は平行して進めている技術的課題を克服し、新しい結果を得ることである。これによって来年度の統合的過程に進めることができる。新しく開発した脂質平面膜法が共同研究者の課題解決に有用であることがわかり、さらに共同研究を推進する。