hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
外国籍住民を対象とする社会教育のシステム化に関する比較研究

本年度は主に、(1)アメリカ・カナダ・スウェーデンにおける外国籍住民に対する成人教育および学国籍児童・生徒の学校外活動のシステム化に関する資料・文献を収集、三ヶ国に共通する施策の特徴と各国の最近の動向を把握しつつ、(2)日本における地方自治体社会教育行政への適用の可能性を探る予備的な調査研究を行った。(1)においては、三ヶ国とも、国あるいは連邦政府レベルで外国籍住民の教育に関する法の整備が進み、主に言語習得を中心に充実した施策が展開されているものの、移民の更なる増加および地方分権化の潮流の中で、従来の多文化主義に基づく施策が困難になりつつあることがわかった。(2)については、外国籍住民の急増への対応を生涯学習の現代的な課題として位置づけ、生涯学習振興計画等に反映させつつある一地方自治体を選定し、その政策動向を欧米のそれと比較しつつ、日本における新しい社会教育システム開発の可能性を検討した。(1)については、アメリカにおける移民を対象とする成人教育の内容・方法論に学びつつ、言語習得(日本語習得)のあり方について考察した論稿を発表した。今後はカナダ・スウェーデンの現地調査を踏まえた上で、三ヶ国の多文化主義に基づく成人教育の特徴について明らかにし、さらに研究成果を発表する予定である。また、(2)については、当該地方自治体の協力を得ながら、外国籍の住民の生活の課題に関する調査や日本語教室等の調査を目下すすめており、近く、その成果をもとに、総合的な社会教育システム化の可能性に関する論稿を発表する予定である。
究極の遺伝子治療法確立に必要なWASPの特性解明および移植造血幹細胞の制御法開発

平成30年度までに、WASP完全欠損iPS(WAS-iPS)細胞について2患者由来の複数クローン、およびXLT-typeのWASP変異を有するiPS細胞についての複数クローンストックの整備を完了した。完全欠損型iPS細胞についてはCRISPR/Cas9システムを用いたゲノム編集を試み、患者特異的遺伝子変異配列の修復に成功しており、WASP変異患者における病態再現研究を可能にする基盤について構築を終了している。遺伝子治療モデル化については、WASP完全欠損iPS細胞にレンチウイルスベクターを用いて遺伝子付加を行い、WASP発現のモニタリングに供した。遺伝子導入株についてはシングルセルクローニングを行い、新たに開発したdigital droplet PCR法を用いた正確なベクターコピー数評価によって、ゲノム挿入されたプロウイルスコピー数の異なる治療細胞クローンのパネルを獲得した。ウイルスベクターには、2種類の異なるプロモーター(現在進行中の臨床遺伝子治療で使用されている1.6 Kb WASP遺伝子由来人工プロモーターおよびEF1-alfa恒常的発現プロモーター)が搭載されたものを使用することで、本研究の目的達成に必要となる、治療遺伝子(タンパク)の発現レベル、発現調節様式を多様に再現する系の構築に成功した。さらに治療効果判定の評価系の至適化にも取り組み、巨核球/血小板系における血小板数低下に加え、マクロファージにおける食細胞機能異常の病態を再現する結果を得ている。また、WASPタンパクの発現評価に関しての精度向上のため、細胞内染色によるフローサイトメトリー法全般において、細胞固定化処理、細胞膜透過化処理について複数の方法を試みている。翌年度、交付申請を辞退するため、記入しない。平成29年度には、重症型WAS患者骨髓細胞より樹立したWASP完全欠損iPS(WAS-iPS)細胞に対してCRISPR/Cas9システムを用いたゲノム編集を試み、患者特異的遺伝子変異配列の修復に成功した。さらにWAS-iPS細胞に2種類のレンチウイルスベクターを用いた遺伝子付加的処置を施し樹立したバルク細胞株について、シングルセルクローニングを行い、相当数の遺伝子治療モデルWAS-iPSクローンを獲得した。これらについて、digital droplet PCR法により正確なベクターコピー数評価を行い、異なるベクター構造(臨床遺伝子治療で使用されている1.6Kb WASP遺伝子人工プロモーターと恒常的発現プロモーター)、異なるコピー数をゲノム上に有するクローンからなる、遺伝子治療細胞パネルを構築した。現在、これら被験細胞について、iPS細胞から種々の造血細胞への分化誘導を行い、WASP蛋白の発現比較を開始している。さらに、遺伝子治療後の細胞における客観的な機能回復の評価を可能にする分化培養系、機能アッセイ系の構築にも取り組んだ。結果、造血前駆細胞段階におけるサイトカイン反応性、コロニー形成能、巨核球・血小板系における産生不全の評価系に加えて、単球・マクロファージ系における機能異常を見出し、評価系のさらなる整備、機能修復の定量的評価、比較を試みている。これらの成果の一部は、第38回日本炎症・再生医学会、第23回日本遺伝子細胞治療学会、および第46回日本免疫学会学術集会にて報告した。本研究課題の目的は、究極の遺伝子治療法の確立に寄与することである。「究極」の実現には、より高い安全性とより高い有効性を同時に担保することが重要である。現行の遺伝子治療における治療の実態は、ウイルスベクターを用いた「遺伝子付加」を行うことであり、その中で究極を目指すときに、ベクター構造、コピー数と、蛋白発現、目的細胞における機能修復との関係を可能な限り精緻に検討する実験系の構築が欠かせない。得られた遺伝子治療をモデル化するiPS細胞パネルは、その目的を達成するための重要な研究材料であり、初年度においてこれを構築できたことの意義を考慮し、研究が順調に進捗しているものと評価する。まずは確立したiPS細胞パネルを用いてベクター構造、コピー数と、蛋白発現、目的細胞における機能修復との関係を明らかにする。得られる結論によって理想の遺伝子治療に必要な要件を見出し、個々の課題解決を図る。

WASはX染色体遺伝子におけるloss-of-function疾患であること、WASPの発現が造血細胞に限局していることから、究極の遺伝子治療は、造血幹細胞における遺伝子修復である。ゲノム編集技術の進捗にも留意しながら、遺伝子付加法を極める方向性の妥当性についても考慮しつつ、新たな人工プロモーター開発、部位特異的ベクター組み込み等、適宜取捨選択を行い研究を進める。翌年度、交付申請を辞退するため、記入しない。
髄液ProSAAS測定によるアルツハイマー病早期診断法の開発

私たちはピック病の剖検脳に認められるピック小体にproSAASのN末断片が蓄積していることを見出し(Kikuchi et al., BBRC,2003)、またアルツハイマー病剖検脳に見られるタウ封入体がproSAASのN末断片に対するラット抗血清により免疫染色されることを報告した(Wada et al., Neurosci Lett,2004)。この結果から、proSAASのN末断片がタウ封入体に蓄積し、髄液中のproSAASのN末断片が減少していることが予想される。髄液中のproSAASのN末断片を測定し、その減少が明らかになればアルツハイマー病の診断に役立てることができるものと考えられる。平成16年度はヒトproSAASのN末断片にたいするポリクローナル抗体を作成した。ヒトproSAAS 42-59、91-102、179-189アミノ酸部位を免疫して得られた抗体(それぞれM01、Ab-1、Ab-2とする)はヒト脳組織抽出液をサンプルとしたウエスタンブロットにおいて単一バンドとして確認された。平成17年度は得られた抗体(M01、Ab.1、Ab-2)を用い、その特異性について免疫組織化学的に検討した。病理学的にアルツハイマー病と診断された剖検脳の側頭葉を用い検討した。脱パラフィン後、切片はクエン酸バッファーにより処理し、前述の抗体(M01、Ab-1、Ab-2)と反応させた。一次抗体と反応させた後、ビオチン化された二次抗体と反応させ、その後はABC法により免疫染色を行った。検討したいずれの抗体においても、ラット抗血清において認められたタウ封入体への免疫反応は認められなかった。ヒトproSAASのN末断片に対するポリクローナル抗体を作成したが、アルツハイマー病に認められるタウ封入体を認識する抗体は作成できなかった。私たちはピック病の剖検脳に認められるピック小体にproSAASのN末断片が蓄積していることを見出し(Kikuchi et al.,BBRC,2003)、またアルツハイマー病剖検脳に見られるタウ封入体がproSAASのN末断片に対するラット抗血清により免疫染色されることを報告した(Wada et al.,Neurosci Lett,2004)。今回、ヒトproSAASのN末断片に対するポリクローナル抗体の作成を行った。1)抗体の作製proSAAS 42-59、91-101、179-189、210-222アミノ酸部位を合成し、それぞれウサギに免疫して抗血清を採取した。ウサギに免疫して得られた抗血清の一部はprotein AカラムにてIgGに精製した。このIgGとproSAAS合成ペプチドの反応性は免疫源を固相したELISA測定系で確認した。2)脳組織抽出液をサンプルとしたウエスタンブロット脳組織抽出液200μlを透析後、10μlのサンプルを電気泳動しPVDF膜に転写した。その後、上述の抗血清(proSAASアミノ酸部位42-59免疫抗体をM01、91-101免疫抗体をAb-1、179-189免疫抗体をAb-2、210-222免疫抗体をAb-3とする)とそれぞれ反応させ、ウエスタンブロットを施行した。その結果、M01、Ab-1及びAb-2では21kDaに単一のバンドとして確認された。一方、Ab-3を用いたウエスタンブロットでは免疫反応を確認できなかった。このことから、M01、Ab-1及びAb-2は生体内のproSAASとの反応性を持つものと考えられた。今後、この抗体を用い、免疫組織化学的検討および髄液proSAAS測定系を検討する予定である。ヒトproSAASのN末
ヒトリンパ球の発生分化におけるRAGとホメオボックス遺伝子の発現と機能

(1)ヒト組み換え活性化遺伝子(RAG)発現誘導に関する研究(1)ヒトRAG-1mRNA発現の微量測定法の確立:RT-PCR法によるヒトRAG-1 mRNAの高感度かつ特異的検出法を確立した。この系を用いて、正常細胞・血液系細胞株におけるRAG-1 mRNAの発現を検討したところ、胸腺・骨髄細胞・pre-B株(Nalm-6)・T細胞株(CEM)などの未熟細胞にRAG-1が発現していることが明らかになった。また、我々の樹立した胎児肝由来リンパ球様細胞株(FL)においてはその発現は見られず、FLがRAGを発現する以前の前駆細胞であることが確認された。(2)FL細胞(未熟リンパ球株)のRAG発現誘導:マウス骨髄由来のストローマ細胞株(PA6)、ヒト骨髄由来ストローマ細胞株(RASV-5)をFL細胞を共培養することで、FLにRAG-1 mRNAの発現が誘導された。この発現誘導には、ストローマ細胞との直接接触が必要であること、またある種のサイトカインがこの誘導を増幅することを明らかにした。サイトカインとしては、IL-3,IL-6,IL-7が重要であることを明らかにした。(2)ホメオボックス蛋白の特異的DNA結合配列の決定ホメオボックス遺伝子(HB24)cDNAを用いて、in vitro translation kitでHB24蛋白を合成し、可能性ある全degenerativeオリゴヌクレオチドに対してゲルシフトアッセイを行った。ゲルから結合断片を回収し、PCRにより増幅するという行程を3回繰り返し、シークエンス特異的に結合すると考えられるヌクレオチドプールを得た。これをブルースクリプトベクターを用いてサブクローニングし、大腸菌にトランスフォームして得られたプラスミド(31種類)の塩基配列を決定した。その結果、24種のプラスミドDNAが同一のコンセンサス配列(7塩基配列)を含むことを明らかにした。得られた7塩基配列が特異的結合配列であることは、変異ヌクレオチドを用いたゲルシフトアッセイにて確認した。
レーザーコンプトン準単色硬Ｘ線による低侵襲高精細医用イメージング技術の研究

X線を用いた非破壊イメージング技術は産業や医療分野で広く利用されているが、現場の技術者や医師・被験者は常にX線被曝のリスクを負っている。本研究では、高い安全性と機能を有する単色X線イメージング技術の地域の病院や研究施設への普及を目指し、小型電子加速器と高出力レーザーを駆使したレーザーコンプトン準単色硬X線の高収量発生のための技術開発とその医用イメージングへの適用手法の研究を行った。具体的には、レーザーコンプトン準単色X線をマルチパルス化する技術開発を進めるとともに、X線吸収端を利用した血管造影及びタルボ干渉による生体軟組織の高精細イメージングの可能性に対する実験的検証を行った。本研究は、小型電子加速器と高出力レーザーを駆使したレーザーコンプトン準単色硬X線(LCS-X線)の高収量発生技術とその医用イメージングへの適用手法の研究を目的とする。本年度はLCS-X線のマルチパルス化(マルチパルスLCS法)によりX線を高収量化するため、コンプトン散乱用高出力レーザーパルス列を発生させる再生増幅型レーザー共振器技術を構築した。そこでは共振器へ供給するシードレーザー及び再生増幅システムの最適構成を決定し、再生増幅器内で数mJ程度のレーザー蓄積に成功した。その際、オフナー型パルスストレッチャーで、種光パルス幅をfsから10psまで制御できることを確認するとともに、プリアンプを4パスから6パス増幅に変更することで、種光パルスを10^4倍以上増強することに成功した。再生増幅器の共振器長を3.8mにした場合のビルドアップ増幅実験において、種光パルス1本の導入では約20ns間隔の歯抜け増幅となるが、強度変調した2本の種光パルス導入では、強度変動の少ない約10ns間隔のレーザー蓄積が実現できることが確認できた。コンプトン衝突させる電子ピームは約10ns間隔であるため、高効率のマルチパルスLCSが可能となる。再生増幅型レーザー共振器内はペリスコープ型拡大縮小光学系となっており、集光点前後の2枚の凹面鏡曲率半径は3倍異なる。これに因る往路衝突と復路衝突におけるLCS-X線の分布の相違を検証するため、計算機3次元シミュレーションを実施し、生成X線の分布にはほとんど差がないことを確認した。このようなLCS-X線光源開発と並行して、放射光や病院設置型X線源を用いた微小血管造影のための実験が、他機関の分担研究者によって進められた。次年度以降は、共振器内のレーザー蓄積エネルギーを数Jまで増強し、LCS-X線マルチパルスを生成するとともに、これを光源とする微小血管造影やタルポ干渉による高精細医用イメージング実現のための研究を行っていく。本研究では、Sバンド小型リニアックで加速した高輝度電子ビームと高出力レーザーを衝突させLCS準単色硬X線を発生させること、更に発生した準単色硬X線を、K殻吸収端を利用した微小血管造影やタルボ干渉による生体軟組織の高精細イメージング等に適用するための技術開発を行うことを目指している。本年度は、42MeVに加速した電子ビームに800nmのレーザーパルスを衝突させてLCS-X線を発生させ、これを人体頭部ファントムの頸部へ照射して透過像を測定した。その際、準単色X線と造影剤によるコントラスト増強の効果を、モンテカルロシミュレーションによって検証した。ファントム内部には、頸動脈を模擬した造影剤封入疑似血管を導入し、造影剤には硫酸バリウム(バリウムのK殻吸収端は37.4keV)を使用した。LCS-X線の光子エネルギーはビーム中心と周囲の部分で異なることを利用し、照射するX線ビームの中心を、頸動脈より3.5ミリラジアンずらすことにより、照射するX線エネルギー範囲を37.439.1keVへ微調整した。本手法を用いると照射X線エネルギーを高い精度で微調整可能となり、血管造影に有用であることを確認した。またタルボ干渉は2枚の透過型X線格子を用いてX線の位相変化を検出する手法で、X線の空間コヒーレンス長が格子ピッチに対してある程度長ければ、吸収格子後方にモアレ縞が観察され、被写体によるX線の屈折によるモアレ縞の変形から、吸収測定ではコントラストが付きにくい軟組織の構造も鮮明に撮影できるものと期待される。産総研LCS-X線源を用いた実験配置では、光源から十分な距離を取ることができないことからタルボ・ロー干渉計を用いる方が最適であることが分かり、今後の生体イメージング実験への目途を立てることができた。本研究は、小型電子加速器と高出力レーザーを駆使したレーザーコンプトン散乱準単色硬X線(LCS-X線)の高収量発生技術とその医用イメージングへの適用手法の研究を目的とする。

本年度は、再生増幅器型レーザー共振器を完成させ、LCS-X線マルチパルスを安定生成するため、レーザー発振器の安定化を行った。同時に、レーザーコンプトン散乱X線により人体等価材料(ポリウレタン・エポキシ樹脂)で作製された人体頭部ファントムを用いた血管造影実験を行った。ファントム内部には硫酸バリウム(K殼吸収端約37.4keV)を造影剤とした血管が模擬されており、最大約38keVにチューニングした準単色X線を照射することでファントム首部の頚動脈撮像に成功した。これにより人体とほぼ同じ材質・厚みの物質であっても準単色性を生かした低侵襲・高コントラスト撮像が可能であることが示された。当所におけるLCS-X線の発生とその医用イメージングへの適用実験と並行して、回転セリウム陽極微小血管造影法を用いた心筋貫通枝および脳穿通枝の描出の研究が、他機関の分担研究者によって進められた。今後は、さらなるイメージングのコントラスト増強のため、タルボ干渉法による高精細医用イメージング実現を目指しいく。再生増幅型レーザー共振器内のレーザー蓄積エネルギーはまだ数mJと目標値まで到達していないが、手法は確立できており、小型電子加速器で発生させたマルチバンチ電子ビームとの衝突も可能な技術レベルに達している。全体としては、おおむね順調に進展していると考えている。25年度が最終年度であるため、記入しない。発振器として用いているモードロックTi:Saレーザーの故障(PZTとSESAMの剥離)のため、発振器を含めたシステムの再設計・再構築を余儀なくされ、当初予定していた再生増幅器型レーザー共振器への蓄積エネルギーの増強による高収量のマルチパルスX線発生には至らなかった。ただし、従来の構成によるLCS-X線を用いて、硫酸バリウム(K殼吸収端約37.4keV)を造影剤とする人体頭部ファントムを用いて血管造影実験を行い、最大約38keVにチューニングした準単色X線を用いてファントム首部の頚動脈撮像が可能であることが実証される等の付加的な成果が得られた。当面の課題は、再生増幅型レーザー共振器内のレーザー蓄積エネルギーの増強であるが、励起エネルギーを増強していく過程で、共振器の光学系を含め、偏光ビームスプリッタやミラーがダメージ閾値を超えてしまう恐れがあるため、ビーム径の最適化は必須である。次年度は、約5Jの蓄積エネルギーを目指すとともに、共振器の電子加速器ビームラインへのインストールを行い、マルチバンチ電子ビームとの衝突によりLCS-X線をより高収量で生成する。同時に、最終年度に向け、タルボ干渉計や高精細医用イメージングの準備を進めていく。次年度は、昨年度進める予定であった再生増幅器型レーザー共振器の蓄積エネルギー増強を目指すとともに、共振器の電子加速器ビームラインへのインストールを行い、マルチバンチ電子ビームとの衝突によってマルチパルスLCS-X線を生成する。同時にマルチパルスLCS-X線の高精細微小血管造影への適応研究や、さらなる高コントラスト撮像を目指したタルボ干渉法によるイメージングの可能性の検証を行っていく。
中性子・イオン照射した徴小試験片の高温変形・破壊挙動

照射後の試料の強度特性を知る為の試験片としてRTNSーII照射用に作られた極徴小試験片(全長12mm,平行部巾1.2mm,平行部長5mm)が原子炉照射(JMTR,常陽,FFTF/MOTA)およびイオン照射(p,α照射)にも広く使われている。しかし、この試験片は平行部断面積が小さい(厚さ100μmの時、0.12mm^2)ため、変形荷重は非常に小さく、その為、現在、国内には放射化した極徴小試験片用の高温真空引張試験装置がない。本研究では、極徴小試験片用の高温真空引張試験装置を作製し、合わせて、イオン照射した極徴小試験片の変形・破壊挙動を調べる目的で実験を行なった。高温真空引張試験装置の作製に当たり,(1)性能;イ)荷重測定の正確さ(ロードセル周辺の温度管理, (ロ)装置の剛性, (ハ)試験片の温度制御,(2)操作性,(3)保守管理性(修理のしやすさ)の三点に留意し,以下の仕様のものを作製した.(1)用いる引張試験機は東北大学・金属材料研究所・大洗研究施設ホットラボ内の島津オートグラフ(DCSー500)とした.(2)加熱温度;最高900°C,到達真空度;3×10^<-6>torr,最大荷重;100Kg,最大変位(最大ストローク);20mm.また,高温度ヘリウム注入後の低放射化鉄鋼材料(CrーMn合金として, Feー12%Crー15%Mn合金及びFeー12%Crー30%Mn合金を選定)の変形・破壊挙動について調べた.高温度ヘリウム注入は東京大学・原子核研究所のSFサイクロトロン・30MeVα線照射によった.15%Mn合金, 30%Mn合金のいずれにおいても室温破壊挙動は基本的には粒内延性破壊を示した.これは,従来, 50ppnHe程度の注入においても316系ステンレス鋼,あるいはVーTo合金において高温では粒界脆性破壊を示すと報告されていることとは著しく異なる.今後,高He注入材の高温変形・破壊挙動を本年度作成した装置で系統的に調べる予定である.照射後の試料の強度特性を知る為の試験片としてRTNSーII照射用に作られた極徴小試験片(全長12mm,平行部巾1.2mm,平行部長5mm)が原子炉照射(JMTR,常陽,FFTF/MOTA)およびイオン照射(p,α照射)にも広く使われている。高温真空引張試験装置の作製に当たり,(1)性能;イ)荷重測定の正確さ(ロードセル周辺の温度管理, (ロ)装置の剛性, (ハ)試験片の温度制御,(2)操作性,(3)保守管理性(修理のしやすさ)の三点に留意し,以下の仕様のものを作製した.(1)用いる引張試験機は東北大学・金属材料研究所・大洗研究施設ホットラボ内の島津オートグラフ(DCSー500)とした.(2)加熱温度;最高900°C,到達真空度;3×10^<-6>torr,最大荷重;100Kg,最大変位(最大ストローク);20mm.また,高温度ヘリウム注入後の低放射化鉄鋼材料(CrーMn合金として, Feー12%Crー15%Mn合金及びFeー12%Crー30%Mn合金を選定)の変形・破壊挙動について調べた.高温度ヘリウム注入は東京大学・原子核研究所のSFサイクロトロン・30MeVα線照射によった.15%Mn合金, 30%Mn合金のいずれにおいても室温破壊挙動は基本的には粒内延性破壊を示した.これは,従来, 50ppnHe程度の注入においても316系ステンレス鋼,あるいはVーTo合金において高温では粒界脆性破壊を示すと報告されていることとは著しく異なる.今後,高He注入材の高温変形・破壊挙動を本年度作成した装置で系統的に調べる予定である.
精神的ストレス解消のための新しいリハビリテーション：神経難病に対する効果の検討

現在のリハビリテーションは運動機能の評価し、悪化する機能を強化するのが原則である。したがって、この方法は、急性疾患患者には非常に有効である。しかし、徐々に進行性の神経変性疾患に対するそのようなリハビリテーション戦略の効果は、かなりあいまいである。特に、精神的ストレスがその症状に濃厚に影響するパーキンソン病で十分な効果が得られていない。この研究において、我々は新しいリハビリテーション戦略の概略を提供して、パーキンソン病患者のために、精神機能の評価に基いたリハビリテーションを導入した。我々はリハビリテーションの影響を検討し、パーキンソン病患者で、有意な効果を運動・精神機能において認めた。リハビリテーション医療は、現在、多くの専門部門からなる多職種のスタッフが参画するチームアプローチとして、日常的に広く行われている。現在のリハビリテーションの進め方は,Dsability-oriented rehabiritationということができる。すなわち、基本的には運動機能を評価することからスタートし、その劣った機能を集中的に強化することを重視するものであり、急性に発症する疾患に対しては非常に有効である。しかし、緩徐進行性の神経変性疾患においては,十分な効果の検討はなされていない。とりわけ、精神的ストレスの影響が強いパーキンソン病においては効果は限定的といえる。本研究は,我々がパーキンソン病のために独自に作成したリハビリ専用のプログラム(Mentality-oriented rehabilitation)の、種々の神経難病に対する効果を様々な角度から検討する。国立病院機構徳島病院においては、パーキンソン病を対象として平成21年5月より専門的リハビリテーションがスタートしている。パーキンソン病に対しては、このリハビリテーションは運動症状・非運動症状ともに著明な改善が得られている。本研究ではさらに他のパーキンソン病関連疾患や多系統萎縮症の患者に対しても行い、その効果がどの程度あるのかを様々な評価スケールを用いて検定する。また、このリハビリテーションがそれぞれの疾患に対してどの程度効果があるのか、さらには効果がある場合にはいつまで持続するかを検討する。コントロールとしては、外来通院で従来の方法でリハビリを受けている同じ疾患の患者を同様のスケールで評価する。これまでにパーキンソン病ならびにパーキンソン病関連疾患にについてリハビリテーションを行い、以下に述べるように、運動機能ならびに精神機能の改善が得られている。国立病院機構徳島病院において、パーキンソン病を対象として平成21年5月より専門的リハビリテーションがスタートしている。コントロールとしては、外来通院で従来の方法でリハビリを受けている同じ疾患の患者を同様のスケールで評価した。

コントロールとしては、外来通院で従来の方法でリハビリを受けている同じ疾患の患者を同様のスケールで評価する。最終的には、このリハビリテーションを行うことで病状の進行を抑制しうるか否かを、長期間の観察で明らかにする。以下に述べるように、本研究成果から多くの新たな知見が得られている。平成23年度は主として孤発性パーキンソン病の患者を対象にして、リハビリテーションを実施した。パーキンソン病患者に関しては、入院時に伴う非運動症状の評価、服用している抗パーキンソン病薬の副作用の有無についても評価する。またレボドーパを内服している患者については、必要に応じて、血中のレボドーパ濃度の測定を行い、必要最小限の抗パーキンソン病薬を内服するよう調整を試みた。平成24年度にはパーキンソン病とともに進行性核上性麻痺、大脳皮質基底核変性症や、多系統萎縮症の患者について、同様のリハビリテーションを行い、その効果を検証する。コントロールには外来通院および在宅で通常のリハビリ(Disability-orientated Rehabilitation)を実施している同様の神経疾患の患者を用いる。コントロールにもリハビリの開始6ヶ月間は薬物療法に変更がなされていない患者を対象とした。リハビリテーションの効果を1年間にわたり追跡し、これらの患者について、神経内科専門医、理学療法士(PT)、作業療法士(OT)および言語聴覚士(ST)がそれぞれ次のスケールを用いて実施した。神経内科医: UPDRS part1-4理学療法士(PT) 1歩行:スピード、歩幅、歩数2筋力:大腿四頭筋(左右)作業療法士(OT)1握力(左右)2STEF3SDS 4IADL 5ADL(BI)言語聴覚士(ST) 1FAB 2MMSE 3口唇運動:開口「あ」、横引「い」、突出「う」4舌運動:突出、右、左5咬合力6両唇閉鎖力7嚥下:反復唾液飲みテスト、改定水飲みテスト8発声持続「あー」、早口「ぱ」、「た」、「か」、「ぱたか」これらの評価は入院前、入院後4週間、退院後1ヶ月、3ヶ月、6ヶ月、1年の時点で行った。
網膜接着分子導入による網膜剥離の新しい治療法の開発研究

視細胞外マトリックスの新たな分子として、SPACRCANの同定に成功した(lnoue, et. al.,J Biol Chem.2006)。この分子は、SPACRとホモロジーの高いアミノ酸配列を持つが、最も異なる点は、SPACRが糖蛋白であるのに対してSPACRCANがコンドロイチン硫酸プロテオグリカンであること、そして、SPACRCANが視細胞外マトリックス空間に生前にのみ一過性に発現するのに対して、SPACRは生後より発現しはじめ、加齢とともに増加していくことである。これらは、神経網膜と網膜色素上皮の接着機序を網膜の分化と加齢という視点で考察するのに、非常に興味深い分子である。最後に、FiVerHyの中心的分子であるversicanが、太陽光線により分解し、ヒアルロン酸結合能を失うことを皮膚の系を使って示した(Hasegawa, et. al.,J Invest Dermatol.2007)。この現象は、例えば、加齢により起こるとされる後部硝子体剥離が、実は太陽光線により硝子体のビアルロン酸分解を促進させ、結果的に後部硝子体剥離を助長するとも解釈され、非常に興味深い。研究の目的である「網膜剥離に対する新しい治療方法」の確立に至っておらず、この夢の実現のためには、さらに眼内組織における分子の基礎的な背景をしっかりと把握する必要がある。眼におけるグリコサミノグリカンの役割について総合的に網羅する過程で(Zako and Yoneda, EISEVIER BV, in Press)、昨年度の研究結果もふまえ、網膜および視細胞外マトリックス内でのビアルロン酸の発現について、以下の事を学んだ。内網状層のヒアルロン酸発現は、網膜分化に伴い、コンドロイチン硫酸プロテオグリカンであるversicanの発現と時を同じくして、一過性の増加減少を示すが、ビアルロン酸の分子サイズは、時間とともに低分子化する。versicanには、ヒアルロン酸結合活能があり、内網状層のヒアルロン酸はversicanと共存している事を示唆する興味深い結果であった。一方、視細胞外マトリックスでのヒアルロン酸発現は、生涯を通じて、量的に変化しないが、その分子サイズは、網膜分化時に一旦は低分子化するものの、生後は、継続して高分子状態で存在する事が判明した。これらは、現在、投稿準備中である。視細胞外マトリックスにあるSPACRCANの特徴についても、既にpubulishされ(Inoue et al., J Biol Chem, 2006)、現在は、報告されたシーケンスを用いて、mammalian cellを用いて蛋白を発現しつつ抗体を作製し、SPACRも含めて、より網膜接着力発生機序の研究のための準備を整えている。また、網膜分化で重要な役割を果たすヒアルロン酸結合性マトリックス分子であるversicanが、光分解によりヒアルロン酸結合性を失う事を皮膚組織を用いた研究で報告した(Hasegawa et al., J Invest Dermatol, 2007)。眼のversican、さらにSPACRやSPACRCANについても、同様の加齢性変化がないか現在検討中である。視細胞外マトリックスの新たな分子として、SPACRCANの同定に成功した(Inoue eta1., J Biol Chem.2006)。最後に、FiVerHyの中心的分子であるversicanが、太陽光線により分解し、ヒアルロン酸結合能を失うことを皮膚の系を使って示した(Hasegawa eta1., J Invest Dermatol.2007)。この現象は、例えば、加齢により起こるとされる後部硝子体剥離が、実は太陽光線により硝子体のヒアルロン酸分解を促進させ、結果的に後部硝子体剥離を助長するとも解釈され、非常に興味深い。

研究の目的である「網膜剥離に対する新しい治療方法」の確立に至っておらず、この夢の実現のためには、さらに眼内組織における分子の基礎的な背景をしっかりと把握する必要がある。
水田に施用された稲ワラに生育するメタン生成菌、メタン酸化菌の系統分類学的研究

本研究では、土壌や土壌に施用された稲ワラに生息するメタン生成菌群集、メタン酸化菌群集の系統分類学的特徴やその季節変化を解明するとともに、両細菌群集の関係を明らかにすることにより、微生物生態学および地球温暖化の抑制のための基礎的知見を得ることを目的とした。平成16年度は、水田土壌中に生息するメタン酸化菌群集の系統分類学的特徴やその季節変動を愛知県安城農業技術センター内水田圃場を対象に一年間に渡って調査した。土壌からDNAを抽出後メタンモノオキシダーゼとアンモニアモノオキシダーゼに特異的なプライマーでメタン酸化菌のDNAをPCR増幅し、変性剤濃度勾配ゲル電気泳動(DGGE)のバンドパターンからメタン酸化菌の群集構造を解析した。その結果、水田土壌中のメタン酸化菌群集は、年間を通してほとんど変化しないことが明らかとなった。
消化器がんにおける糖鎖のフコシル化異常のメカニズム解明

フコシル化とは、糖タンパクもしくは糖脂質にフコースという糖が付加されることである。古くから、癌に伴って細胞および血清中のタンパク質のフコシル化が増加することが注目されてきた。そのフコースの糖転移に関与するフコシルトランスフェラーゼの1つFut8は、コアフコースという肝癌特異的な腫瘍マーカーであるAFP-L3分画に関与する糖鎖構造の合成を行う。約10年前に申請者らはFut8のタンパク精製に成功した(JBC 271,27810-17,1996)。またそのドナー基質であるGDP-fucoseのアッセイ系を確立し、肝癌におけるフコシル化にはドナー基質の合成系の方が重要であることがわかった(Cancer Res 63,282-9,2003)。以後、このフコースと癌の研究を続けてきたが、本研究費によってさらに以下の実績を出すことができた。まずFut8とのドナー基質であるGDP-fucoseの定量法を用いて、LAD-IIという遺伝性の糖鎖異常症の患者では、細胞内のGDP-fucoseが低下し、コアフコースが最も影響を受けたことをイタリアのグループとの共同研究で発見した(Glycobiology 15,924-34,2005)。また今日、難治性の癌の1つとして知られる膵臓癌の血清中にフコシル化ハプトグロビンが特異的に増加し、新しい膵癌の腫瘍マーカーになる可能性を示すとともに、その詳細な糖鎖構造を決定した(Int.J.Cancer 118,2803-8)。通常、ハプトグロビンは肝臓で産生されるが、Fut8やGDP-fucoseの少ない肝臓で何故フコシル化が進むのか、今後の検討が待たれる。また数年前に、グライコミクスの手法を用いて、フコシル化の修飾を受けやすい表面タンパクとしてインテグリンを同定したが、同じ方法によって様々な糖転移酵素の標的分子を同定し、糖鎖の変化に伴う機能の違いを検討してきた。一方、Fut8のKOマウスでは著しい成長障害と肺気腫様の病理変化を認め、EGFのシグナルとTGF betaのシグナルからそれらの病態に関わる分子機構を解析した(PNAS 102 15791-6,2005;JBC 281,2572-7,2005)。発がんに伴い、糖鎖構造が変化することは、古くから知られてきた。中でもコアフコースの付加は、肝癌の腫瘍マーカーとして知られるAFP(alpha-fetoprotein)のL3分画として、臨床応用されている。研究代表者は、そのフコースを転移するα1-6フコース転移酵素(FUT8)の遺伝子クローニングに成功した。しかしFUT8の遺伝子を用いた検討では、FUT8の発現は肝癌のみならず周囲の肝硬変組織でも発現上昇が見られた。次にフコシル化のドナー基質であるGDP-フコースの定量法を開発し、ヒト肝癌組織で検討したところ、慢性肝疾患組織に較べて肝癌で有意に増加していることがわかった。その原因としては、GDP-fucose合成酵素であるFXの遺伝子発現が増加していることも判明した。

FXの過剰発現により、細胞内のGDP-fucose量が増加し、細胞全体としてのフコシル化も増強された。このGDP-fucoseは細胞内の量であり、実際にゴルジ内で基質として利用されるためには、ゴルジのトランスポーターによって運搬される必要がある。そこでGDP-fucoseトランスポーターの遺伝子をクローニンして、ヒト肝癌組織でその発現を検討したところ、肝癌組織において有意に増加していた。以上の検討から、肝癌細胞のフコシル化を規定する因子としては、FUT8、GDP-fucose量、GDP-fucoseトランスポーターの3者が考えられ、それらのバランスによってフコシル化が制御されていると考えられる。次に、肝癌以外の例として、膵癌症例で検討したところFUT8に加えて、もう一つのGDP-fucose合成酵素であるGMDの発現がフコシル化に重要な因子であることがわかった。現在、これらの過剰発現株やノックダウン細胞を用いて、フコシル化が塵加する生物学的意義を解析中である。フコシル化とは、糖タンパクもしくは糖脂質にフコースという糖が付加されることである。古くから、癌に伴って細胞および血清中のタンパク質のフコシル化が増加することが注目されてきた。そのフコースの糖転移に関与するフコシルトランスフェラーゼの1つFut8は、コアフコースという肝癌特異的な腫瘍マーカーであるAFP-L3分画に関与する糖鎖構造の合成を行う。約10年前に申請者らはFut8のタンパク精製に成功した(JBC 271, 27810-17, 1996)。またそのドナー基質であるGDP-fucoseのアッセイ系を確立し、肝癌におけるフコシル化にはドナー基質の合成系の方が重要であることがわかった(Cancer Res 63, 282-9, 2003)。以後、このフコースと癌の研究を続けてきたが、本研究費によってさらに以下の実績を出すことができた。まずFut8とのドナー基質であるGDP-fucoseの定量法を用いて、LAD-IIという遺伝性の糖鎖異常症の患者では、細胞内のGDP-fucoseが低下し、コアフコースが最も影響を受けたことをイタリアのグループとの共同研究で発見した(Glycobiology 15, 924-34, 2005)。また今日、難治性の癌の1つとして知られる膵臓癌の血清中にフコシル化ハプトグロビンが特異的に増加し、新しい膵癌の腫瘍マーカーになる可能性を示すとともに、その詳細な糖鎖構造を決定した(Int.J.Cancer in press)。通常、ハプトグロビンは肝臓で産生されるが、Fut8やGDP-fucoseの少ない肝臓で何故フコシル化が進むのか、今後の検討が待たれる。また数年前に、グライコミクスの手法を用いて、フコシル化の修飾を受けやすい表面タンパクとしてインテグリンを同定したが、同じ方法によって様々な糖転移酵素の標的分子を同定し、糖鎖の変化に伴う機能の違いを検討してきた(論文多数)。一方、Fut8のKOマウスでは著しい成長障害と肺気腫様の病理変化を認め、EGFのシグナルとTGF betaのシグナルからそれらの病態に関わる分子機構を解析した(PNAS 102 15791-6, 2005 ; JBC 281, 2572-7, 2005)。
DNA架橋化試薬の開発と、その応用に関する研究

DNAの向かい合った2つの塩基を糖部より取り除き、新たに生成する2つのアルデヒド基同士を2価の架橋化試薬によって連結する反応を開発した。本架橋化反応では、芳香環を有する架橋化試薬が高い架橋化効率を示し、さらに隣接塩基間とスタッキングを維持することで高度にDNAを安定化させることを見出した。本研究では、架橋化DNAを用いて酵素を基盤表面に固定化し、酵素反応用の安定な足場を架橋化DNAで作製可能であることも証明した。今年度は、2本鎖DNA間を架橋し、かつ安定化する新規な化学試薬の合成と、その活性評価を行った。1.架橋化試薬の合成架橋化試薬は、架橋後にも塩基部と効率的にスタッキングするため、芳香族基に2つの反応性基を有するデザインとした。この架橋化反応では2本鎖DNAの向かい合った2つの塩基を脱塩基処理した後に糖部に生成する2つのアルデヒド基を連結させる目的から、アルデヒド基と高効率で反応し、還元反応を必要としないアミノオキシ基を反応性基に選択し、架橋化試薬【アミノオキシ基-linker-芳香族基-linker-アミノオキシ基】を合成した。また、DNAの架橋化反応は水溶液中で行うため、合成された試薬の疎水性が高くなり過ぎないことに配慮し、芳香族基にはナフータレン基を選択した。また、芳香族基の重要性を評価するために、芳香族部分を直鎖のプロピル基で置換した試薬も併せて合成した。2.活性評価DNA中の脱塩基部は、デオキシウリジン(以下dU)にウラシルDNAグリコシラーゼ(以下UDG)を作用させ、その加水分解触媒反応からDNA中に生成させた。dUを中心の向かい合った部位に有する相補的な2本鎖DNAを合成し、この2本鎖の一方の5'末端には、ゲル電気泳動の解析に利用するために蛍光色素を導入した。合成した2本鎖DNAを会合させた後にUDGで処理し、次いで試薬を添加して架橋化反応を行い、変性ポリアクリルアミド電気泳動(PAGE)によって生成物を分析した。その結果、架橋されたDNA2本鎖が試薬の存在によって生成していることを確認できた。反応の効率は、ナフタレン基を分子内に有する試薬の方が、アルキル鎖を有する試薬よりも格段に高かったことから、芳香族基と塩基対間のスタッキングが架橋反応には重要であることが明らかになった。1.架橋構造の同定昨年度までに開発したDNA架橋化試薬によって架橋化DNA中に形成される架橋部位の構造を決定する実験を初めに行った。架橋化DNAを作製後、2種類の核酸分解酵素(Nuclease P1,snake venom phosphodiesterase)によって完全分解し、逆相HPLCによって分析したところ、架橋化試薬が結合したピークが溶出された。この核酸以外の未知ピークを解析した結果、2分子のデオキシリボースが1分子の架橋化試薬に結合した構造であることを明らかにした。また、この架橋部位には試薬と糖との共有結合の様式に応じて3種類の幾何異性体が存在することを見出した。この結果は、2つのアミノオキシ基を有する架橋化試薬が、2本鎖DNA中の2つの脱塩基部位と期待した通りの結合を形成していることを示している。加えて、架橋化部位の構造はcis,transのいずれかが優先的にDNA中で形成されず、両方の構造が形成されることを示している。またこの架橋部位は還元によって1種類の構造に変換できることも見出した。2.架橋化DNAの安定性の評価架橋化DNAの化学的安定性を調べるため、pH4,pH7,pH9の緩衝溶液中で架橋化DNAを加温した。その結果、中性条件下では90°Cでも架橋化DNAは安定であったが、pH4とpH9で90°Cに加熱した場合には架橋部位においてDNA鎖の切断が見られることが明らかになった。3.新規架橋化試薬の合成架橋部位を還元して1種類の構造に収束するには、酸性条件や高濃度の還元剤などの過酷な反応条件が必要であった。そこで、より緩和な条件によって還元することを目的に、アミノオキシにメチル基を付加した新たな架橋化試薬を合成した。この新しい架橋化試薬によってDNAの架橋化反応を行ったところ、メチル基を付加することで架橋化効率が著しく低下することが明らかになった。しかしながら、架橋部位の還元反応は、より高いpHでも進行することも確認した。1.2本鎖RNAの架橋化反応2本鎖DNAの相補的な部位に生成させた脱塩基部位を架橋する反応に関し、H23年度では2本鎖RNAに対して同架橋化反応が適用可能であるかどうかを調べた。2本鎖DNAと同様に、デオキシウリジン(dU)を相補的な2本鎖RNA鎖の向かい合った部位に有するRNAを化学合成し、ウラシルDNAグリコシラーゼ(UDG)の処理に続いて架橋化試薬を添加することで2本鎖間の架橋化を調べた。

その結果、UDGによってRNA鎖中にも脱塩基部位が生じ、それらが架橋化試薬によって連結されて架橋化2本鎖RNAが生成することを確認した。これにより、当該架橋化反応はRNAにも有効であることが証明され、安定な2本鎖RNAの構築に役立つ技術になり得ると考えられる。2.複数のDNA鎖の架橋と応用DNAは金表面など種々の固相上に固定化可能なため、DNAに酵素を結合させることで酵素反応の足場としてDNAを用いることができる。そこで、酵素反応を架橋化2本鎖DNAと通常の非架橋の2本鎖DNA上のそれぞれで行い、酵素反応の進行度合いを比較した。DNAに結合させる酵素には、HRP-ストレプトアビジン融合タンパク質と、ALP-抗フルオレセイン抗体を選択し、ビオチンとフルオレセインそれぞれを導入した2本鎖DNAを合成した。1種類の酵素を固定化する2本鎖DNAと、2種類の酵素を同一DNA分子上に配置する3本鎖からなる架橋化DNAを構築した。各2本鎖DNAを金基板上に固定化した後、酵素をDNAに結合させて酵素反応を行い、反応の進行を走査型電気化学顕微鏡によって評価した。反応の結果、通常の2本鎖DNAは1本鎖に解離して酵素の固定化量が低下したため、酵素による生成物量は架橋化DNA上よりも大きく低下した。本結果によって、同架橋化試薬によって構築される架橋化DNAは、酵素反応の安定な足場として有効であることが証明された。
コグニティブスペクトロスコピーによる自動樹種判別システムの構築

可視(電子励起)・近赤外(振動励起)スペクトルの形状そのものを情報源として活用し、コグニティブ(認識)スペクトロスコピーとも呼ぶべき新たな分析手法を構築し樹種判別を正確・迅速・簡便に行う。木材の可視・近赤外分光情報を包含したシームレスなハイパースペクトラルデータを利用して、樹種判別を自動で行えるプロトコル構築を目指す。
カラ-コンピュ-タを用いた口腔癌および前癌病変の早期診断に関する基礎的臨床的研究

マイクロカラ-コンピュ-タを用いて、口腔病変の測色方法および診断について検討した。測色開始時間については、測定値が安定する電源入力20分後以降とした。色彩表示は、視感比色法との対応を考えマンセル表色系に従った。測色時の被検部と光検知部との位置関係については、被検部を圧迫するとそこに貧血を生じて色相が変化し、被検部と離すと色相がばらつき明度が落ちるため、フェザ-タッチでの測定が良い事が判明した。マイクロカラ-コンピュ-タと視感比色法とにより皮膚、粘膜の同一部位を測色し比較検討したところ、色相および明度については差がみられなかったが、彩度はマイクロカラ-コンピュ-タの方がおよそ1.52.0低値を示した。そこで彩度については視感比色法を併用して測色を行うこととした。正常口腔粘膜の色彩を舌、歯肉、頬粘膜で測定したところ、三者の色相および明度については明らかな差はみられず、歯肉の彩度が舌、頬粘膜に比べやや低値を示す傾向がみられた。白板症の色彩は、色相5RP5YR、明度38、彩度110の範囲に分布していた。単純な白板症では、高明度低彩度の白い色が多かったのに対し、上皮性異形成のある白板症では白斑部の明度は低く、低明度高彩度の鮮やかな紅斑部を伴うものが多く、色彩と悪性潜在能との関連を示唆する結果であった。口腔癌の色彩分布は、色相10RP5Y、明度38、彩度112と広範囲にわたり、赤色についてみると、白板症の紅斑部が鮮やかな赤色を呈していたのに対し、くすんだ暗赤色をしていた。以上、カラ-コンピュ-タによる口腔病変の色彩診断の可能性を示唆する結果が得られたが、現状では本器では、色彩の全ての要素を測定するにはいたらず、新たな測色機器の開発、測色方法の改良が今後の課題と考えられた。ヒトの口腔癌および前癌病変とされている白板症の色彩を視感比色法により記録し、病理組織所見と対比させた。その結果、口腔癌の色彩は色相10RP5Y、明度38、彩度112の範囲に分布しており、白板症の色彩は色相10P5Y、明度39、彩度110の範囲に分布していた。さらに白板症の色彩は明度5以上彩度2以下の白斑部色彩群と明度5未満彩度4以上の紅斑部色彩群とに大別された。白板症の色彩と病理組織学的所見との関連では、上皮の厚さが厚いものほど、また上皮表面の凹凸のつよいものほど、白斑部の明度は高く、間質乳頭部上皮の菲薄化、びらん形成、および上皮下結合組織中に血管の拡張・増生を認める症例では、高彩度色が出現していた。また上皮性異形成の軽度な症例では白斑部の明度は高く、紅斑部は認めないか、認めてもその彩度はあまり高くなかったのに対し、異形成中等度高度な症例では、白斑部の明度は低く、全例に紅斑を認めた。以上のように白板症のうちでも病理組織学的な悪性潜在能の差異により、その色彩に変化のあることが判明した。

カラーコンピュータを用いた測色データにおいても同様の傾向が認められるものの、視感比色法と比べるとまだ測定条件にもとずく測定値のバラツキが大きい。口腔癌、前癌病変とも表面が粗造で凹凸不整なため測色時の外光の影響がでやすく、しかも口腔内では常に唾液がこれらの病変の表面をおおっているため測色時に影響を与えるものと考えられる。カラーコンピュータを用いた測色データをさらに蓄積したうえで、適切な補正法の確立が今後必要とされる。さらにハムスターを用いての発癌実験を行ない、その色彩所見をカラーコンピュータを用いて経時的に計測し、前癌病変および早期癌の色彩学的差異、悪性化の色彩学的特徴を探究していく予定であるが、現在はその予備実験を行なっている段階である。マイクロカラ-コンピュ-タSM-5-FCH(計測部:SM-5型、光学部:FCH型)により測定を行った。測定方法は被検部を乾燥後、センサ-をフェザ-タッチで接触させ測定を行った。測定回数は10回とし、その平均値を示した。16名の被験者について手の甲、頬部、下唇部を測定し、色彩表示はマンセル表色系にて行った。手の甲の色相分布は1.5Y5.8YR、明度分布は4.05.3、彩度分布は0.61.8であった。頬部の色相分布は0.4Y0.1GY、明度分布は4.65.3、彩度分布は0.71.5であった。下唇の色相分布は5.3R0.1GY、明度分布は3.75.4、彩度分布は0.92.3であった。これらは視感比色法の結果とほぼ一致していた。カラ-コンピュ-タによる測定上の問題点としては(1)センサ-を被検部に押しつけることにより被検部が虚血し、僅かなタッチの差が測定値を変動させること、(2)唾液の存在による測定誤差およびセンサ-部の汚染が考えられた。(1)は外光を遮断するために、センサ-を被検部に密接させねばならず、被検部に圧を加える結果となる。種々のタッチで同部位を測定したところ、指先において標準偏差は、色相0.48、明度0.07、彩度0.06、下唇で色相1.64、明度0.06、彩度0.12であり、明度、彩度はタッチ圧の強さにはあまり左右されない。またタッチを強くすることによって色相はY傾向が増加し、明度、彩度は減少する傾向にあった。(2)については被検部を水で濡らした状態にして測定したところ、(1)におけるバラツキの範囲内に入り、エア-等により被検部を乾燥すれば、測定上ほとんど問題にならないと思われた。唾液による汚染の問題は、薄いセロファン紙でセンサ-の先端を覆うこととし、標準合わせ時に、セロファン紙を介することによって補正を行った。現在、センサ-先端に装着する、特殊キャップを試作中である。マイクロカラ-コンピュ-タを用いて、測色に適応する時間の計測を行ったところ、電源入力後約20分で安定に入り、測色は電源入力20分後以降とした。測色はマンセルの表色系に従った。測色時の被測色部と光検知部との位置的関係と測色精度を検討した。被検部を圧迫すると粘膜あるいは皮膚が貧血を生じて、色相が変化し、青みが増してしまうため、また被検部と離すと色相がばらつき、明度が落ちるため、フェザ-タッチでの測定が良い事が判明した。なお、マイクロカラ-コンピュ-タの皮膚、粘膜部分の測定精度を検討するため、視感比色法とマイクロカラ-コンピュ-タとにより同一部位を測色し、比較検討したところ、色相および明度については差がみられなかったが、彩度はマイクロカラ-コンピュ-タの方が視感比色法よりもおよそ1.52.0低値を示した。このことより、色相、明度はマイクロカラ-コンピュ-タによったが、彩度については視感比色法を併用して測色した。正常口腔粘膜の色相に関しては舌では2.5R10Rに、歯肉及び頬粘膜では5R5YRに、明度については舌では3.55に、頬粘膜、歯肉では45、5に分布していた。彩度については舌、頬粘膜、歯肉とも35に分布していた。白板症の色相については5RP5YRに、明度では38に分布し、彩度は白斑単独では12に分布し、紅斑を伴ったところでは510の鮮やかな赤い色が多かった。
放線菌S. virginiae信号伝達物質リセプターの機能解析

1.放射菌S. virginiae由来のVB特異的リセプタータンパク質BarAに関して、まずBarAタンパク質のVB結合領域を大まかに決定するために、完全長のbarA遺伝子を持つ発現ベクターpAR509を使用し、PCR法によってC末端側から各49、96アミノ酸残基、及びN末端側から47アミノ酸残基を除去した変異型rBarAの調製を試みた。しかし、C末端側を部分除去したものについてはinclusion bodyを形成し、N末端側を部分除去したものについては、可溶性で存在するものの高分子量のaggregateを形成し、全くVB結合活性は見られなかった。チオレドキシンとの融合タンパク質として発現させた場合にも全く同様の現象が見られ、従って、BarAタンパク質のN末端及びC末端及びC末端側の数10アミノ酸残基は、本タンパク質の構造維持に関与していると結論される。rBarAの特定のアミノ酸残基を化学修飾し、その修飾BarAタンパク質の諸性質を測定することで、種々の必須アミノ酸残基の同定を試みた。本BarAタンパク質は、Cys残基を2個しか持たないため、まず5,5'-dithio-bis-(2-nitrobenzoic acid)(DTNB)によるCys残基の修飾を行った。1.8mol/molBarAの修飾によっても、本BarAタンパク質はVB結合活性をほぼ100%保持し、またその高次構造にも変化が見られないため、Cys残基はリガンド結合にも又構造維持にも関与しないと結論される。その他、Lys残基特異的修飾試薬や色素増感光修飾などを行ったが、いずれもリガンド結合活性の低下が見られる場合には、本来Dimerであるべき本BarAタンパク質が可溶性の高分子重合体に変化していることが見出され、これら化学修飾によって修飾されるアミノ酸残基は構造維持に関与している可能性が示された。1.放線菌S.virginiaeよりクローン化したVirginiae Butanolide (VB)リセプタータンパク質遺伝子(barA)について塩基配列を決定し、翻訳開始コドン部分にNcoIサイトを導入した変異型barA遺伝子を構築した。この変異型barA遺伝子よりNcoI-BamHI断片を回収後、大腸菌用発現ベクターpET-3dのNcoI-BamHIサイトに導入した。本ベクターを大腸菌BL21(DE3)/pLysSに形質転換し、IPTG誘導により、組み換え型VBリセプターの大量発現に成功した。更に、培養菌体より、超音波破砕、DEAE-Sephacelイオン交換クロマトグラフィーの2段階の精製操作で、SDS-PAGE上単一バンドを示すVBリセプターを調整する手法を確立した。2.精製VBリセプターについて、[^3H]VB-C_7をリガンドとするScatchard解析を行い、VBに対してK_d=30nM,B_<max>=1.01を持つことを明らかにした。3.N-末端側1/10,1/5を除去した変異型VBリセプター、並びにC末端側1/5を除去した変異型VBリセプターを調整した。各々についてVB結合活性を測定したが、いづれもVB結合活性を喪失していた。4.上記変異型VBリセプターの各々に対して、VB存在下及び不在下でのゲル濾過クロマトグラフィーを行った結果、いづれも2量体として存在する事が判明した。1.放線菌S.virginiae由来のVB特異的リセプタータンパク質