hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
緑藻の生物時計の分子基盤

ヒトからシアノバクテリアまで、地球上のほとんどの生物は概日時計を持っています。本研究では、池などに住む緑藻の一種であるクラミドモナスを用いて、概日時計の分子メカニズムの研究を行いました。その結果、光がクラミドモナスの概日時計をリセットするメカニズムや、陸上植物の概日時計との共通点や相違点が明らかになりました。クラミドモナスは極めて単純な単細胞性の緑藻である。分子遺伝学・細胞生物学・生化学の実験に適しており、光合成や鞭毛の研究で強力なモデル系としてよく用いられる。申請者らは、これまでに行った一連の研究で、クラミドモナスの時計遺伝子群を網羅的に同定し、クラミドモナスを生物時計研究の新たな、そして最も単純な真核生物モデルとして確立することに成功した(Matsuo et al., Genes Dev, 2008, 22:918-30; Matsuo et al., Mol Cell Biol, 2006, 26:863-70;松尾ら,蛋白質核酸酵素, 2008, 53:1873-80)。本研究では、クラミドモナスの時計遺伝子とその産物(時計タンパク質)の解析をさらに進めることで、真核生物の生物時計の分子基盤の理解を進めると共に、光合成生物がもつ生物時計の共通性と多様性の理解を深めることを目的とする。今年度は、クラミドモナスの時計タンパク質のひとつであるRHYTHM OF CHLOROPLAST 15 (ROC15)の解析を中心に進めた。クラミドモナスが外界から光を浴びると、ROC15が急速に分解される。この現象を詳細に解析した結果、この分解はユビキチンープロテアソーム系を介したタンパク質分解で、時計タンパク質ROC114が関わっていることを明らかにした。また、ROC15の分解を引き起こす光の波長は、クラミドモナスの概日時計の位相リセットを引き起こす光の波長とよく似ていることを明らかにした。さらに、ROC15の変異株においては、概日時計の位相リセットが上手く機能しないことを明らかにした。これらの結果から、光によるROC15の分解が、概日時計の位相リセットを引き起こす重要なステップであることが強く示唆された。クラミドモナスは単細胞性の緑藻である。我々は、これまでに行った一連の研究で、クラミドモナスの時計遺伝子群を網羅的に同定し、クラミドモナスを生物時計研究の新たな、そして最も単純な真核生物モデルとして確立することに成功した(Matsuo et al., Genes Dev, 2008, 22:918-30; Matsuo et al., Mol Cell Biol, 2006, 26:863-70;松尾ら,蛋白質核酸酵素, 2008, 53:1873-80)。26年度はクラミドモナスの時計タンパク質ROC15の光誘導性の分解機構に関わる遺伝子の同定に成功した。具体的には、ROC15とルシフェラーゼの融合タンパク質を生物発光レポーターとして発現するレポーター株を使い、ルシフェラーゼ発光を指標としてROC15の分解を測定する系を確立した。これを用いて、ROC15の分解に異常を来す変異体を10株分離することに成功した。さらに、これらの変異体のうちの5つの変異体に関して、原因遺伝子を同定した。同定した遺伝子のうちの3つは新規遺伝子であった。今後、これらの遺伝子の解析をさらに進めることで、未知の光受容伝達機構の解明につながると期待される。また、時計タンパク質ROC75に関しても解析を進め、ROC75はクラミドモナスの生物時計の位相が主観的昼に移行するために重要な因子であることを明らかにした。クラミドモナスは単細胞生の真核緑藻である。分子遺伝学や生化学の手法による研究に非常に適しており、光合成や鞭毛運動の研究において有用なモデル生物として用いられている。我々は、これまでに行った一連の研究で、クラミドモナスの時計遺伝子群を網羅的に同定し、クラミドモナスを時計遺伝子研究の新しい真核細胞モデル系として確立した(Matsuo et al. Genes. Dev, 2008, 22:918-30; Matsuo et al. Mol Cell Biol, 2006, 26:863-70;松尾ら、蛋白質核酸酵素、2008、53:1873-80)。本研究では、クラミドモナスの時計遺伝子とその産物(時計タンパク質)の解析をさらに進めることで、真核生物の生物時計の分子基盤の理解を進めると共に、光合成生物が持つ生物時計の共通性と多様性の理解を深めることを目的とする。27年度は、26年度に同定した新規遺伝子B16(仮名)の解析を中心に進めた。B16は時計タンパク質ROC15の光誘導性の分解に関わる因子として同定した。この遺伝子はほぼ全長がロイシンリッチリピートからなる蛋白質で、恒常的に細胞質に発現することを明らかにした。

また、この遺伝子の変異体においては赤色光に対するROC15の分解誘導はほぼ完全に消失しているが、青色光に対する応答は正常であることを突き止めた。これらの結果から、B16はクラミドモナスにおいてこれまでほとんど知られていない赤色光受容伝達経路に関わることが示唆された。全体的に順調に研究を進めることが出来た。特に新たに同定したB16遺伝子の変異体においては、クラミドモナスにおいてはほとんど知られていない赤色光受容伝達経路に関わることが示唆され、さらに詳細な解析を行うことで、重要な知見が得られると期待できる。クラミドモナスは極めて単純な単細胞性の緑藻である。分子遺伝学・細胞生物学・生化学の実験に適しており、光合成や鞭毛の研究で強力なモデル系としてよく用いられる。我々は、これまでに行った一連の研究で、クラミドモナスの時計遺伝子群を網羅的に同定し、クラミドモナスを生物時計研究の新たな、そして最も単純な真核生物モデルとして確立することに成功した(Matsuo et al., Genes Dev, 2008, 22:918-30; Matsuo et al., Mol Cell Biol, 2006, 26:863-70;松尾ら,蛋白質核酸酵素, 2008, 53:1873-80)。本研究では、クラミドモナスの時計遺伝子とその産物(時計タンパク質)の解析をさらに進めることで、真核生物の生物時計の分子基盤の理解を進めると共に、光合成生物がもつ生物時計の共通性と多様性の理解を深めることを目的とする。研究の進捗に伴い、当初計画にあった研究テーマのひとつである「ROC15タンパク質と概日時計の光リセット」に関して、想定以上の進展があり、興味深い変異体の分離に成功した。そこで、本研究の目的をより精緻に達成するために、助成事業期間を一年間延長して研究を行った。今年度は、csl変異体に関して、概日時計およびROC15の紫色光応答、赤色光に対する遺伝子発現の応答を解析した。それらの結果を追加して、論文を発表した。ヒトからシアノバクテリアまで、地球上のほとんどの生物は概日時計を持っています。本研究では、池などに住む緑藻の一種であるクラミドモナスを用いて、概日時計の分子メカニズムの研究を行いました。その結果、光がクラミドモナスの概日時計をリセットするメカニズムや、陸上植物の概日時計との共通点や相違点が明らかになりました。ROC15の光誘導性分解に関わる遺伝子を多数同定できたことは、当初の予定を遙かに上回る成果であった。同定した遺伝子の中にはそのモチーフ構成から非常に興味深いタンパク質をコードするものも見つかっており、今後の展開に非常に大きな期待を持てる。B16の詳細な解析を進める。波長特性、概日時計のリセット機構との関連、ROC15のリン酸化との関連等を進めることで、クラミドモナスにおいて未知の赤色光受容伝達経路の解明につながると期待される。時間生物学当初の予定を進めるとともに、同定したROC15分解に関連する遺伝子の解析を進める。今年度は、ROC15の解析において予想を上回る成果を上げることが出来た。具体的には、当初の計画の概日時計の位相リセットの生理学的解析に加えて、光照射時のROC15リン酸化、細胞内局在、タンパク質間相互作用など、分子生物学的知見も多く得ることが出来た。研究の進捗に伴い、当初計画にあった研究テーマの一つである「ROC15蛋白質と概日時計の光リセット」に関して、想定以上の進展が有り、興味深い変異体の分離に成功した。
シャペロン介在性オートファジーによるCOPD病態の制御

慢性閉塞性肺疾患(COPD)は喫煙を原因とし,酸化ストレス増加に関連した細胞老化や細胞死の亢進が重要な役割を果たす.これまでシャペロン介在性オートファジー(CMA)の呼吸器病態への関与は明らかではなく、COPD病態におけるCMAの蛋白質恒常性維持機構としての役割解明を目的として以下の検討を行った.3,CMA活性と喫煙刺激が細胞運命に与える影響を検討した.LAMP2Aをノックダウンし, CMAを阻害したBeas 2B細胞にCSE刺激を行い, LDHアッセイ及びMTTアッセイで細胞死の評価を行ったところ、細胞死が更に増加した.次に,カスパーゼ阻害剤であるZ-VAD-FMKを喫煙刺激前に加えたBeas 2B細胞でAnnexin V-PI染色を行ったところ細胞死が減少し, CMA活性低下で増加する細胞死がアポトーシスである可能性が示唆された.CMA低下の結果,気道上皮細胞における細胞死が増加することがin vitroで示されているが,その細胞死がアポトーシスで良いか確立していない.また,アポトーシスと仮定し,その機序として小胞体ストレス応答の関与を考えているが,こちらも種々の小胞体ストレス応答のsignaling pathwayを検討している段階であり,やや遅れていると判断している.(2)CMA基質タンパク質の同定:培養気道上皮細胞を用いて, CSE刺激の有無での検討を行う.LAMP2Aをノックダウンした上で,二次元電気泳動法と液体クロマトグラフィー質量分析法を用いる.同定されたタンパク質発現の変化はwestern blotting法により,マクロオートファジーやプロテアソームの影響を受けずCMAにより選択的に分解されることを確認する.(3)CMAによる細胞傷害及び細胞運命の制御:CMA機能低下が喫煙刺激による細胞傷害や表現型に与える影響を培養気道上皮細胞で検討する.LAMP2AノックダウンによりCMAを阻害した上で,CSE刺激を加え細胞死,小胞体ストレス応答について評価する.次に(1)で同定されたCMA基質タンパク質をノックダウンや過剰発現した上でCSE刺激を行い,細胞運命に与える影響,ROS産生,ミトコンドリア形態・機能,ライソソーム機能,小胞体ストレス応答について評価する.更にLAMP2A又はATG5をノックダウンし, CMA又はマクロオートファジーを阻害した上で,各々の活性を評価する.(4)COPD肺組織でのCMA活性:手術検体由来の肺組織を用いてホモジネートのWestern blotting法や免疫組織学的にCMA活性の検討を行い,喫煙歴・呼吸機能検査等の臨床所見との関連性を比較検討する.(5)6-10週齢マウス(C57BL/6)を30週に渡って喫煙暴露することでCOPDマウスモデルを作成し,肺の摘出を行う.肺組織の免疫組織染色,及び肺ホモジネートによりCMA,及びマクロオートファジー活性を評価する.慢性閉塞性肺疾患(COPD)は喫煙を原因とし,酸化ストレスの増加やミトコンドリア傷害に関連した細胞老化や細胞死の亢進が病態で重要な役割を果たす.しかし,蛋白質恒常性維持機構として重要であるシャペロン介在性オートファジー(CMA)の呼吸器病態への関与は明らかではなく、COPD病態におけるCMAの役割解明を目的とし以下の検討を行った.これらの機序として活性酸素種(ROS)の関与を考えた.LAMP2Aをノックダウンし, CSE刺激を行ったHBECでROS産生(細胞内総ROSとミトコンドリア由来ROS)を評価検討したところ,LAMP2AノックダウンでROS産生は亢進し,CSE刺激により更に亢進した.以上より,CMA活性低下による細胞老化亢進の原因として,ROS産生亢進の関与が示唆された.CMAの特徴として,基質選択的なタンパク質分解が挙げられる.我々はCMAの活性の低下に伴い蓄積する基質が,細胞運命へ大きく影響を与えうるものと考えており,その基質として,当初はミトコンドリア恒常性維持や酸化ストレスに対し保護的な役割を果たしていることが既に報告されているPARK7(DJ-1)が特にCOPD病態の進展上重要ではないかと仮説を立てていた.しかしながら,上述のCOPDを擬したin vitroモデルでは, CSE刺激, LAMP2Aのノックアウト共にPARK7の動態に一貫した傾向が認められず,着目する基質として適さないと考えている.このため,やや遅れていると判断している.一方, CMA活性が気道上皮細胞で低下することで細胞老化が亢進し,その機序としてROS産生,特にミトコンドリア由来のROS産生が増加している可能性が示唆されており,更なる検討の必要がある.慢性閉塞性肺疾患(COPD)は喫煙を原因とし,酸化ストレス増加に関連した細胞老化や細胞死の亢進が重要な役割を果たす.これまでシャペロン介在性オートファジー(CMA)の呼吸器病態への関与は明らかではなく、COPD病態におけるCMAの蛋白質恒常性維持機構としての役割解明を目的として以下の検討を行った.3,CMA活性と喫煙刺激が細胞運命に与える影響を検討した.LAMP2Aをノックダウンし, CMAを阻害したBeas 2B細胞にCSE刺激を行い, LDHアッセイ及びMTTアッセイで細胞死の評価を行ったところ、細胞死が更に増加した.次に,カスパーゼ阻害剤であるZ-VAD-FMKを喫煙刺激前に加えたBeas 2B細胞でAnnexin V-PI染色を行ったところ細胞死が減少し, CMA活性低下で増加する細胞死がアポトーシスである可能性が示唆された.

CMA低下の結果,気道上皮細胞における細胞死が増加することがin vitroで示されているが,その細胞死がアポトーシスで良いか確立していない.また,アポトーシスと仮定し,その機序として小胞体ストレス応答の関与を考えているが,こちらも種々の小胞体ストレス応答のsignaling pathwayを検討している段階であり,やや遅れていると判断している.(1)呼吸器細胞におけるCMAの基質タンパク質の同定:培養気道上皮細胞を用いて,タバコ抽出液(CSE)刺激の有無での検討を行う. CMAを特異的に阻害することで発現が増加するタンパク質を同定するために, LAMP2Aをノックダウンした上で,二次元電気泳動法と液体クロマトグラフィー質量分析法を用いる.同定されたタンパク質発現の変化はwestern blotting法により,マクロオートファジーやプロテアソームの影響を受けずCMA選択的に分解されることを確認する.(2)CMAによる細胞傷害及び細胞運命(細胞死と細胞老化)の制御:CMA機能の低下が喫煙刺激による細胞傷害と細胞表現型に与える影響を培養気道上皮細胞で検討する.LAMP2AのノックダウンによりCMAを阻害し, CSE刺激を加えミトコンドリアの形態・機能,ライソソーム機能について評価する.次に, (1)で新たに同定されたCMA基質タンパク質が細胞運命に与える影響を,ノックダウンや過剰発現したうえでCSE刺激を行い,細胞運命に与える影響, ROS産生の評価,ミトコンドリアの形態・機能,ライソソーム機能について同様に評価する.更に, LAMP2A又はATG5をノックダウンし, CMA,又はマクロオートファジーを阻害し,各活性に及ぼす影響を評価する.(3)COPD肺組織でのCMA活性:肺組織を用いてホモジネートのWestern blotting法や免疫組織学的にCMA活性の検討を行い,喫煙歴・呼吸機能検査等の臨床所見との関連性を比較検討する.(4)6-10週齢マウス(C57BL/6)を30週に渡って喫煙暴露することでCOPDマウスモデルを作成し,肺の摘出を行う.肺組織の免疫組織染色,及び肺ホモジネートによりCMA,及びマクロオートファジー活性を評価する.(2)CMA基質タンパク質の同定:培養気道上皮細胞を用いて, CSE刺激の有無での検討を行う.LAMP2Aをノックダウンした上で,二次元電気泳動法と液体クロマトグラフィー質量分析法を用いる.同定されたタンパク質発現の変化はwestern blotting法により,マクロオートファジーやプロテアソームの影響を受けずCMAにより選択的に分解されることを確認する.(3)CMAによる細胞傷害及び細胞運命の制御:CMA機能低下が喫煙刺激による細胞傷害や表現型に与える影響を培養気道上皮細胞で検討する.LAMP2AノックダウンによりCMAを阻害した上で,CSE刺激を加え細胞死,小胞体ストレス応答について評価する.次に(1)で同定されたCMA基質タンパク質をノックダウンや過剰発現した上でCSE刺激を行い,細胞運命に与える影響,ROS産生,ミトコンドリア形態・機能,ライソソーム機能,小胞体ストレス応答について評価する.更にLAMP2A又はATG5をノックダウンし, CMA又はマクロオートファジーを阻害した上で,各々の活性を評価する.(4)COPD
炎症とミトコンドリア機能障害のクロストークに着目した急性脳症の包括的病態解明

急性脳症の病態は炎症性サイトカイン過剰とミトコントコンドリア機能障害に代表される代謝異常の関与が想定されるが、サイトカインとミトコンドリア機能障害マーカーの動態や、両者の相互作用も不明である。本研究では急性脳症の臨床経過に対応したサイトカイン・ミトコンドリア機能障害マーカーの急性期の変動や相互関係を解明することを目的とし、サイトカインの網羅的測定、ミトコンドリア機能障害マーカーであるATP・GDF15測定を行い、臨床経過を分単位で記録したデータベースと照合して解析を行う。本研究により急性脳症の病態の包括的理解を可能とし、さらに病態に応じた最適な治療法選択と至適治療時期の決定に貢献できる。
非アルコール性脂肪性肝疾患の病態進展に及ぼす骨格筋組織連関の解析

【目的】骨格筋脂肪化の評価として腹部CTで腰椎背側の多裂筋と皮下脂肪とのCT値比を骨格筋脂肪化の指標とし、慢性肝疾患の病態と骨格筋脂肪化の関係を検討した。【結論】非アルコール性脂肪肝炎の肝病理学的進展度と骨格筋脂肪化は相関していた。非代償性肝硬変では、骨格筋脂肪化が進展しており、分岐鎖アミノ酸製剤の投与によって血清アルブミンが上昇した群では、骨格筋脂肪化の改善を伴った症例も観察された。【背景】我々は非アルコール性脂肪性肝疾患(NAFLD)の病態には全身の代謝異常が関連すると想定し骨格筋脂肪化に注目してきた。つまり筋脂肪化は加齢に強く相関し,NAFIDでは正常に比べ筋は脂肪化し非アルコール性脂肪肝炎(NASH)の進展と脂肪化の進展が関連すること,さらにNAFLDに対する前食事運動療法で肝脂肪化の改善と共に筋脂肪化が改善することを報告している。【目的】さらに筋脂肪化とNASHの連関を検証するために血清フェリチン,インスリン,IV型コラーゲン7SからなるNAFICscore(Sumida et al. J Gastroenterol,2010)や海外報告の非侵襲的肝線維化予測モデルと筋脂肪化との関連,各予測モデルを構成するパラメータとの関係を検討した。【結果】NAFLD130例(女性57例)を検討した。SS/NASHはそれぞれ21/109例。NAFICscoreの上昇によりIMACは有意に進行し(p<0.01),IV型コラーゲン7Sと相関を示した(p<0.01)。また線維化進展への寄与因子としてIMACとNAFIC scoreとが独立因子であることが判明した。【意義】NAFLDの病態に密接な肝と筋の臓器連関があり,NASHにおける線維化進展には骨格筋脂肪化を来す全身代謝異常及び加齢の影響が示唆された。平成23年度は単純性脂肪肝,NASHを含むNAFLDや肝硬変症例に対して前向きに精密なプロトコールによる食事運動療法を実施しその介入前後での骨格筋脂肪化の変化と長期経過による変化の有無を含め解析した。結果1)非アルコール性脂肪性肝疾患や肝硬変症に対して、食事・運動療法を実施し,内臓脂肪蓄積の改善ならびにインスリン抵抗性,脂質異常症,高血圧症,高尿酸血症の変化と「多裂筋組織CT値による筋年齢」の関連を評価した。さらに,運動量の評価に関しては厚生労働省が示した「健康作りのためのガイドライン2006」を用いて運動量の単位である「エクササイズ」を求め,ガイドラインに則り,運動療法の目標を設定し,個々の症例での身体活動およ「び運動量の達成度を聞き取り調査・運動日記から推定し,実際の運動量と「多裂筋組織CT値による筋年齢」の改善を検討したところ、運動療法が実施できた症例においては有意な筋組織の脂肪化の改善を認めた。結果2)当院を受診した肝硬変症症例に対して各症例における身体活動・運動量を求め,肝予備能を考慮した36ヶ月間の運動療法を行い,低アルブミン血症を合併する症例には,36ヶ月間の運動療法に加え分岐鎖アミノ酸製剤を投与し,血清アルブミン値などの肝予備能の改善と「多裂筋CT値による筋年齢」の変化について検討を行ったところ、骨格筋の脂肪化の軽減が見られた症例においては、アルブミンの改善も観察され、肝不全の栄養に骨格筋が関連していることが明らかとなった。【背景と目的】非アルコール性脂肪性肝疾患(NAFLD)や非アルコール性脂肪肝炎(NASH)の病態には全身の代謝異常が関連する。骨格筋脂肪化の評価として腹部CTでの腰椎背側の多裂筋と皮下脂肪とのCT値比から骨格筋脂肪化を測定し慢性肝疾患の病態の進展との関係を明らかにする。【検討1】肝生検で診断されたNASHで病理学的な活動性および進展度と骨格筋の脂肪化の関連を検討。【結果1】NAFLD群では正常群に比べ筋脂肪化が進行し,食事運動療法により肝脂肪化の改善と共に筋脂肪化は改善した。NASHにおいて病理学的線維化の進展により骨格筋脂肪化は進行していた(p<0.01)。多変量解析ではNASH進展が骨格筋脂肪化に影響を及ぼす独立した因子であった(odds ratio = 2.21, p<0.05)。【検討2】非代償性肝硬変に分岐鎖アミノ酸(BCAA)顆粒製剤を投与し血清アルブミン値や糖代謝とIMACの関連を検討。【結果2】登録された19例のうち12例でIMACの改善が認められた。IMAC改善群では血清アルブミン値の上昇(P<0.05)、腹部CTスキャンでの臍周囲の皮下および内臓脂肪面積の減少(P<0.05)、インスリン抵抗性の改善を認めた。多変量解析では血清アルブミン値の改善へ寄与する因子としてIMACは独立因子であった(OR = 65.3, p<0.05)。【結論】

NAFLDなどのメタボリックシンドロームでは、骨格筋の脂肪化が存在することが明らかになった。さらにNASHでは線維化の進展とともに骨格筋の脂肪化が進展する。またNASHの病態の改善とともに骨格筋の脂肪化は改善する。さらに、非代償性肝硬変において骨格筋は脂肪化しているが、BCAA顆粒製剤は骨格筋の質の改善することにより血清アルブミン値や糖代謝の改善をもたらしている可能性が示唆された。臨床データに関しては、観察研究、介入研究のいずれも予定通り進行している。学会発表についても達成できている。24年度が最終年度であるため、記入しない。介入試験において予定症例数の評価を行い、最終的な解析を開始する。論文執筆を行う。
枯草菌細胞表層蛋白質の安定性及び局在性における分泌プロテアーゼの影響

枯草菌における細胞表層蛋白質には、プロテアーゼや細胞壁溶解酵素を含む約20の蛋白質が存在する。7種類の分泌プロテアーゼ多重欠損株を用いた細胞表層蛋白質のプロテオーム解析により、主要な細胞表層蛋白質であるWapAのプロセッシングがEprによりなされていることを明らかにした。また栄養増殖期の細胞壁溶解酵素について3xFLAGエピトープtagを融合させ、免疫蛍光顕微鏡観察を行った結果、D, L-endopeptidaseであるLytF及びLytEは分裂面及び分裂後の極に局在し、細胞分裂の最終段階である細胞分離に機能している可能性が推測された。一方amidaseであるLytCは細胞表層にほぼ均一に分布していた。次に分泌プロテアーゼによる細胞表層蛋白質の分解を検出するために、3xFLAG融合蛋白質こついてWestern blot解析及びzymographyを行った。その結果、LytF及びLytEは表層プロテアーゼWprA及びEprにより分解を受けるのに対し、LytCはほとんど分解を受けないことが解った。さらにこの3xFLAGシステムを用いて、網羅的な細胞表層蛋白質の局在性並びに分泌プロテアーゼによる分解の有無を調べた。その結果、LytCのmodifierであるLytB、及びglucosaminidaseであるLytDはLytCと同様に細胞表層にほぼ均一に分布することが明らかになった。またD, L-endopcptidaseであるYojL、及び機能未知蛋白質であるYoeBは分裂面及び分裂後の極に局在し、同様に機能未知蛋白質であるYqgAは分裂面のみに局在することが解った。さらにWestern blot解析の結果、LytBはWprA及びEprによりほとんど分解を受けなかったのに対し、LytD、YojL、YoeB、及びYqgAは両プロテアーゼにより分解を受けることが明らかになった。また細胞表層蛋白質の安定性に影響を及ぼすことが明らかになった細胞表層プロテアーゼであるWprAに関してその局在部位を観察したところ、培地中の塩濃度が低い(NaCl濃度0.5%以下)場合には細胞の両極に局在し、塩濃度が高い(NaCl濃度1%以上)場合には細胞表層にほとんど局在できず培地中に遊離してしまうことが解った。さらに分裂面及び分裂後の両極に見られるLytFの局在性は、細胞壁の構成成分であるpeptidoglycanを特異的に認識することによりなされている可能性が示唆された。細胞表層及び分泌蛋白質のマッピング及びこれらの蛋白質群に対する分泌プロテアーゼの影響について論文報告した。7種類の分泌プロテアーゼ多重欠損株を用いた結果、WapAのプロセッシングは主にEprによりなされていることが明らかになった。しかしながらCwlEやCwlF,CwlG等の細胞壁溶解酵素のスポットは検出できなかった。そこでこれらの細胞壁溶解酵素についてエピトープtagを融合させることにより、それらの局在部位並びにプロテアーゼによる分解の有無を明らかにすることを試みた。まずCwlE,CwlF,CwlBに標識ペプチドとしてGFP,T7,FLAG,3xFLAG,c-Myc,6×Histidineの6種類のエピトープtagを融合させた株を構築し、蛍光顕微鏡を用いた観察を行った。(ここで作成したGFP融合プロスミドは本研究の目的には使用できなかったが、別の胞子内蛋白質の観察に応用した。論文参照。)その結果、唯一3xFLAGエピトープtagを用いた場合にのみ蛍光が観察された。D,L-endopeptidaseであるCwlE及びCwlFは分裂面及び分裂後の極に局在し、細胞分裂の最終段階である細胞分離に機能している可能性が推測された。一方amidaseであるCwlBは細胞表層にほぼ均一に分布していた。次に分泌プロテアーゼによる細胞表層蛋白質の分解を検出するためにWestern blotによる3xFLAG融合蛋白質の検出を試みた。その結果、3xFLAG融合蛋白質を高感度で定量的に検出可能であることが解った。そこで上記細胞壁溶解酵素の3xFLAG融合蛋白質についてWestern blot解析及びzymographyを行った結果、CwlE及びCwlFは表層プロテアーゼWprA及びEprにより分解を受けるのに対し、CwlBはほとんど分解を受けないことが解った。この結果はwprA epr二重欠損株を用いた蛍光顕微鏡観察でも確認され、主に分裂後の細胞の極に残ったCwlE,CwlFを分解していることが明らかになった(現在投稿準備中)。このように細胞壁溶解酵素が細胞表層の異なる部位で機能していることは非常に興味深い発見である。さらに表層プロテアーゼとの相互関係についての知見も得られたことは、細胞分裂の全体像を把握する上でも意義深いものであると考えられる。細胞表層及び分泌蛋白質のマッピングを行うと共に、これらの蛋白質群に対する分泌プロテアーゼの影響について解析を進めた。7種類の分泌プロテアーゼ多重欠損株を用いた結果、WapAのプロセッシングは主にEprによりなされていることが明らかになった(2番目の論文参照)。しかしながらLytFやLytE,LytD等の細胞壁溶解酵素のスポットは検出できなかった。そこでこれらの細胞壁溶解酵素の末端にエピトープtagとして3xFLAG配列を融合させることにより、それらの局在部位並びにプロテアーゼによる分解の有無を明らかにすることを試みた。まずLytF,LytE,LytCに3xFLAGを翻訳融合させた株を構築し、蛍光顕微鏡を用いた観察を行った。

その結果、D,L-endopeptidaseであるLytF及びLytEは分裂面及び分裂後の極に局在し、細胞分裂の最終段階である細胞分離に機能していることが明らかになった。一方amidaseであるLytCは細胞表層にほぼ均一に分布していた。次に細胞表層及び分泌プロテアーゼによる分解の有無を検出するために、これら3種類の細胞壁溶解酵素と3xFLAG融合蛋白質についてWestern blot解析及びzymographyを行った。その結果、これらの融合蛋白質は細胞表層に正常に分泌され、3xFLAGエピトープタグは安定に保持されていることが明らかになった。またLytF-3xFLAG及びLytE-3xFLAGは表層プロテアーゼWprA及び分泌プロテアーゼEprにより分解を受けるのに対し、LytC-3xFLAGはほとんど分解を受けないことが判明した。この結果はwprA epr二重欠損株を用いた蛍光顕微鏡観察でも確認された。以上の結果から、細胞表層プロテアーゼであるWprA並びに分泌プロテアーゼであるEprは、分裂後の細胞の極に残ったLytE,LytEを特異的に分解していることが明らかになった(1番目の論文参照)。このように細胞壁溶解酵素が細胞表層の異なる部位で機能していることは非常に興味深い発見である。さらに表層プロテアーゼとの相互関係についての知見も得られたことは、細胞分裂・細胞分離の全体像をより詳細に理解する上でも意義深いものであると考えられる。枯草菌における細胞表層蛋白質には、プロテアーゼや細胞壁溶解酵素を含む約20の蛋白質が存在する。7種類の分泌プロテアーゼ多重欠損株を用いた細胞表層蛋白質のプロテオーム解析により、主要な細胞表層蛋白質であるWapAのプロセッシングがEprによりなされていることを明らかにした。また栄養増殖期の細胞壁溶解酵素について3xFLAGエピトープtagを融合させ、免疫蛍光顕微鏡観察を行った結果、D, L-endopeptidaseであるLytF及びLytEは分裂面及び分裂後の極に局在し、細胞分裂の最終段階である細胞分離に機能している可能性が推測された。次に分泌プロテアーゼによる細胞表層蛋白質の分解を検出するために、3xFLAG融合蛋白質こついてWestern blot解析及びzymographyを行った。その結果、LytF及びLytEは表層プロテアーゼWprA及びEprにより分解を受けるのに対し、LytCはほとんど分解を受けないことが解った。さらにこの3xFLAGシステムを用いて、網羅的な細胞表層蛋白質の局在性並びに分泌プロテアーゼによる分解の有無を調べた。その結果、LytCのmodifierであるLytB、及びglucosaminidaseであるLytDはLytCと同様に細胞表層にほぼ均一に分布することが明らかになった。またD, L-endopcptidaseであるYojL、及び機能未知蛋白質であるYoeBは分裂面及び分裂後の極に局在し、同様に機能未知蛋白質であるYqgAは分裂面のみに局在することが解った。
言語による主観的な情報の動作への作用とその発達的変容

学習者が主観的な運動の感覚を獲得するためには,客観的な運動の情報の伝達だけでは不十分であり,言語を媒介とすることによる表象の共有が不可欠である.そして,言語のもつあいまいさは,言語と運動との結びつきを普遍的なものでなく,多様なものにしている.本研究では,運動の調節を表現する感覚的なことばを用いて,客観的な運動情報(視覚的映像)から形成される運動表象がどのように分節化されているのかを明らかにした.さらに,視覚的映像に基づいて再生された動作を分析し,運動情報の伝達可能性について発達的視点から検討した.実験Iでは,大学生40名に,異なる大きさ(空間的要素)と速さ(時間的要素)の組み合わせから構成された9つの動作をモデル呈示し,運動の調節を表現する18のことばがどの程度あてはまるかを評定させた.因子分析を行ったところ,「速さ」「大きさ」「円滑さ」の3つの因子が抽出され,「速さ」と「円滑さ」を構成することばは,動作の時間的要素を分節化し,「大きさ」を構成することばは,動作の空間的要素を分節化していた.なお,「速さ」を構成することばには,一部空間的要素も分節化することばも存在し,ことばのあいまいさが認められた.実験IIでは,中学生および大学生各30名に対し,実験Iで用いた9つの動作を再現するよう求めた.被験者の膝関節,および足関節にゴニオメータを装着して各関節の「角度の変化」と「動作時間」を測定し,それぞれについてモデルとの誤差を求めた.分析の結果,「角度の変化」は動作の空間的要素を,「動作時間」は時間的要素を明確に分節化していることが示された.また,角度の変化では,小さい動作はより大きく,大きい動作はより小さく再生された.動作時間はモデルよりも長く,速い動作になるほどより長くなった.これらの傾向はいずれも大学生により強く認められ,発達差の存在が示唆された.客観的に提示される情報と学習者が主観的に享受する情報は,必ずしも整合性のあるものではない.学習者が主観的な運動の感覚を獲得するためには,客観的な運動の情報の伝達だけでは不十分であり,言語を媒介とすることによる表象の共有が不可欠である.しかしながら,言語による伝達は,主観的であり,あいまいさが存在する.そこで,言語情報の受容における発達差を明らかにするため,横断的な分析を行った.1315歳,1618歳,19歳以上の3つの年齢群を調査の対象とした.予備調査の結果にもとづき,運動の空間的調節(スペーシング),時間的調節(タイミング),力動的調節(グレーディング)を示すことばを各11選択,55の組み合わせを作成し,一対比較を行った.判定の一貫性を検討するため,各対象者ごとに一致性係数を求め,年齢別に比較した.その結果,いずれの運動調節を示すことばにおいても,有意な差が認められ,年齢が高くなるにしたがって,一貫性が高くなることが明らかになった.特に,1315歳は,その他の年齢に比べ,力動的調節を示すことばで一貫性が低いことが示された.また,空間的調節を示すことばにおける判定の一貫性は,他のことばに比べ高いことが明らかになった.さらに,各年齢内での判定の一致性を検討したところ,年齢が高くなるにしたがって,一致性も高くなることが明らかとなった.また,各年齢別に心理学的尺度値を求めたところ,各年齢で尺度値が必ずしも同様の傾向を示すわけではなく,年齢が高くなると,尺度値の散らばりが大きくなり,ことばの区別が明確になることが明らかとなった.次年度は,調査対象者の年齢を拡大し,運動調節に関わる言語がどのように作用するのかをkinematicな側面から分析するための実験を行う.学習者が主観的な運動の感覚を獲得するためには,客観的な運動の情報の伝達だけでは不十分であり,言語を媒介とすることによる表象の共有が不可欠である.そして,言語のもつあいまいさは,言語と運動との結びつきを普遍的なものでなく,多様なものにしている.本研究では,運動の調節を表現する感覚的なことばを用いて,客観的な運動情報(視覚的映像)から形成される運動表象がどのように分節化されているのかを明らかにした.さらに,視覚的映像に基づいて再生された動作を分析し,運動情報の伝達可能性について発達的視点から検討した.実験Iでは,大学生40名に,異なる大きさ(空間的要素)と速さ(時間的要素)の組み合わせから構成された9つの動作をモデル呈示し,運動の調節を表現する18のことばがどの程度あてはまるかを評定させた.因子分析を行ったところ,「速さ」「大きさ」「円滑さ」の3つの因子が抽出され,「速さ」と「円滑さ」を構成することばは,動作の時間的要素を分節化し,「大きさ」を構成することばは,動作の空間的要素を分節化していた.なお,「速さ」を構成することばには,一部空間的要素も分節化することばも存在し,ことばのあいまいさが認められた.実験IIでは,中学生および大学生各30名に対し,実験Iで用いた9つの動作を再現するよう求めた.被験者の膝関節,および足関節にゴニオメータを装着して各関節の「角度の変化」と「動作時間」を測定し,それぞれについてモデルとの誤差を求めた.分析の結果,「角度の変化」は動作の空間的要素を,「動作時間」は時間的要素を明確に分節化していることが示された.

また,角度の変化では,小さい動作はより大きく,大きい動作はより小さく再生された.動作時間はモデルよりも長く,速い動作になるほどより長くなった.これらの傾向はいずれも大学生により強く認められ,発達差の存在が示唆された.
蛋白質生産菌とその分泌生産ベクターを用いる有用蛋白質の高効率生産

蛋白質生産菌バチルスブレビスは,蛋白質を高効率出大量に分泌生産する細菌として見出され,培養液中に大量に蓄積する蛋白質は本菌の細胞表層蛋白質に由来することが判明した.この表層蛋白質遺伝子の有する高効率発現・分泌能を支配しているDNA領域をベクター・プラスミドにのせ,その下流に有用蛋白質の遺伝子を連結して分泌生産を行った.1.ヒト・インターロイキン2(IL2)の生産.クローン化されていたIL2遺伝子を切り出し,バチルスブレビスにおける高発現・分泌ベクターであるbNU200へ挿入した.pNU200はバチルスブレビスの主要菌体外蛋白質(細胞表層蛋白質と同じ)遺伝子のプロモーター, SD配列,シグナル配列等の領域を有するので,そのシグナルペプチド切断部位の下流にIL2遺伝子を直結した.このプラスミドをバチルスブレビス47菌へ導入した結果, 12mg/lのIL2が菌体外に生産されたが,培養時間を延長するとIL2の分解が認められた.そこで同プラスミドを用いて,菌体外にプロテアーゼ活性が検出されないバチルスブレビスHPD31株の形質転換を行った. IL2に対するモノクローン抗体を用いる分析により,転換株中から安定にIL2を生産する菌株を得た.培養条件を詳細に検討することによって, HPD31株を宿主として約2030mg/lのIL2の蓄積が得られ分解が認められなかった.2.細菌β-アミラーゼの生産.バチルスポリミキサ菌のβ-アミラーゼ遺伝子を〓NU200の高発現領域,シグナル配列の下流に連結した.このプラスミドをバチルスブレビス47菌へ導入した後,種々の培養条件を検討した結果約0.5g/lのβアミラーゼの大量蓄積が得られた.本遺伝子の下流領域を欠失させても活性のあるβアミラーゼが得られ,活性発現に必要な領域を明らかにした.蛋白質生産菌バチルスブレビスは,蛋白質を高効率出大量に分泌生産する細菌として見出され,培養液中に大量に蓄積する蛋白質は本菌の細胞表層蛋白質に由来することが判明した.この表層蛋白質遺伝子の有する高効率発現・分泌能を支配しているDNA領域をベクター・プラスミドにのせ,その下流に有用蛋白質の遺伝子を連結して分泌生産を行った.1.ヒト・インターロイキン2(IL2)の生産.クローン化されていたIL2遺伝子を切り出し,バチルスブレビスにおける高発現・分泌ベクターであるbNU200へ挿入した.pNU200はバチルスブレビスの主要菌体外蛋白質(細胞表層蛋白質と同じ)遺伝子のプロモーター, SD配列,シグナル配列等の領域を有するので,そのシグナルペプチド切断部位の下流にIL2遺伝子を直結した.このプラスミドをバチルスブレビス47菌へ導入した結果, 12mg/lのIL2が菌体外に生産されたが,培養時間を延長するとIL2の分解が認められた.そこで同プラスミドを用いて,菌体外にプロテアーゼ活性が検出されないバチルスブレビスHPD31株の形質転換を行った. IL2に対するモノクローン抗体を用いる分析により,転換株中から安定にIL2を生産する菌株を得た.培養条件を詳細に検討することによって, HPD31株を宿主として約2030mg/lのIL2の蓄積が得られ分解が認められなかった.2.細菌β-アミラーゼの生産.バチルスポリミキサ菌のβ-アミラーゼ遺伝子を〓NU200の高発現領域,シグナル配列の下流に連結した.このプラスミドをバチルスブレビス47菌へ導入した後,種々の培養条件を検討した結果約0.5g/lのβアミラーゼの大量蓄積が得られた.本遺伝子の下流領域を欠失させても活性のあるβアミラーゼが得られ,活性発現に必要な領域を明らかにした.蛋白質を菌体外に大量分泌する性質を有するBacillus brevis(蛋白質生産菌)を宿主とし、本菌の細胞内に安定に保持されるプラスミドをベクターとして用い、各種の有用蛋白質を高効率で生産する目的で研究を行った。大量生産される菌体外蛋白質の遺伝子から、その効率よい発現と分泌能を支配していると考えられるDNA領域をベクター・プラスミド上に連結し、その下流に有用蛋白質の構造遺伝子を連結することによって蛋白質の高効率生産を行える発現分泌ベクター、PNU200を調製した。このような宿主・ベクター系を用いて、高等生物の遺伝子産物としてヒト・インターロイキン2を、原核生物のものとして細菌のβ-アミラーゼの分泌生産を検討した。1.すでにクローン化されているヒト・インターロイキン2の遺伝子をPNU200のシグナル配列下流に翻訳フレームを合せて連結した。この連結にはプラスミドとインターロイキンDNAとを種々の制限酵素で切断したり、リンカーDNAを用いる複雑な手順が必要であった。また、組換えDNAをB.brevisへ導入することが非常に困難であった。これはB.brevisの形質転換効率が低いためではなくて、導入された遺伝子によってインターロイキン2が生産されると宿主菌に致死的に働くためではないかと考察した。少数ではあるが、目的のプラスミドを保有すると考えられる形質転換株を得ることに成功した。その1株について種々の条件で培養し、インターロイキンの生産量を分析した。培養細胞に対する活性で測定した場合には約1mg/lであり、インターロイキン抗体と反応する蛋白質としては1020mg/l、培養液中に蓄積していた。2.β-アミラーゼ遺伝子をPNU200のシグナル

配列下流に連結した後、B.brevisへ導入した。この場合も翻訳フレームを合せるため、多数の過程について遺伝子操作を行った。目的の形質転換株は予想通りβ-アミラーゼを効率よく分泌生産することが明らかとなった。
肝虚血再灌流障害時におけるビタミンＥ誘導体ＥＴＳ―ＧＳ投与の改善効果の検討

今回の研究でわれわれは新規抗酸化物質であるETS-GSの肝虚血再還流傷害軽減効果を検討した。使用したラットはWistar系雄性ラットの全身麻酔下肝虚血再灌流傷害モデルであった。軽減効果はETS-GSによる強力な抗酸化作用効果が関連していることが解明され、血液学的にASTやALT、LDHなどのトランスアミナーゼ値の低下および顕微鏡的な組織形態維持として、肝保護効果を新たに確認することができた。本研究の実験目的は、当教室にて従来より検討を重ね優れた抗炎症効果や抗酸化機能を有したことを証明できている新規ビタミンE誘導体であるETSーGSの効果を肝虚血再灌流障害モデルにおいて確認し臨床での使用を最終目標とすることである。そのために、本年度にまず行うべきこととして、肝虚血再灌流モデルの確立を行うこととした。今回、使用するモデルとして我々が選んだのはラットである。ラットを選択した理由としては、まず比較的大きく操作が容易である点、解析方法が確立しており各種解析が容易であることが考えられる点、入手が容易である点から選択した。まず、ラットに対して全身麻酔薬であるセボフレンを使用し全身麻酔を行い、腹部正中切開から肝門部の血管系の同定を行った上で肝門部の血管を血管用クリップにて把持し虚血状態を作成した。その後の肝組織の変色を確認のうえ1時間後にクリップを取り除くことで虚血再灌流状態を作成した。この24時間後に肝組織ならびに血液を採取し、AST等の肝逸脱酵素の上昇と肝組織の傷害を確認できた。ETS-GSの有効性を確認するため、ETS-GSをラットに投与し、肝虚血再灌流傷害時の有効性を確認するために以下の実験を計画した。まず、ETS-GSを皮下に注射後、肝虚血再灌流モデルを作成。24時間後の時点における有効性を肝組織像並びに肝逸脱酵素にて評価した。その結果、ETS-GSの投与により有意に肝逸脱酵素の低下並びに肝組織像の改善効果を認めた。本研究の実験目的は、当教室にて従来より検討を重ね優れた抗圓生効果や抗酸化機能を有したことを証明できている新規ビタミンE誘導体であるETS-GSの効果を、肝虚血再灌流傷害モデルで確認し、臨床での使用を最終目標とすることである。今回のETS-GS投与における肝虚血再灌流傷害改善効果の検討では、1血清中のASTおよびALT値の測定、2血清中のNOx、サイトカイン量の測定をELISA Kit等を使用して解析、3肝組織中のROS測定を酸化ストレスマーカー用いて検討することであった。さらに肝組織からのリン酸化アッセイでは、リン酸化タンパク質抽出キット(バイオラッド社)を用いて抽出、精製。さらにその後は、バイオラッド社製Bio-Plexを用いて網羅的に肝組織中のリン酸化タンパク質の変化を検討することであった。使用するモデルとして確立できたのはラットであり、安定した実験研究を遂行できた。ラットは比較的大きく操作が容易であり、解析方法が確立しており各種解析が容易で、比較的入が容易であった。肝虚血再灌流傷害モデルでは全身麻酔薬であるセボフルランを使用し全身麻酔を行い、腹部正中切開から肝門部の血管系の同定を行ったうえで肝門部の血管を血管様クリップにて把持し虚血状態を作成した。その後、肝組織の変色を確認のうえ1時間後にクリップを取り除くことで虚血再灌流状態を作成した。この24時間後に肝組織ならびに血液を採取し、上記測定項目の検討を行った。このモデルを用いることにより、肝虚血再灌流傷害モデル、肝虚血再灌流傷害モデル+ETS-GS投与モデルを安定的に作成でき、検討項目解析に大きな進歩を遂げた。そして本ラットモデルにおける各検討項目において、肝虚血再灌流傷害のETS-GSによる改善効果を認めた。まず、肝虚血再灌流障害モデルにおいて、ビタミンE誘導体の一つであるETS-GSが有効であるか否かについて検討。次に、より臨床での使用状況に近づけるために、虚血再灌流後の後投与でのETSーGSの効果を検討した。さらに肝虚血再灌流後の肝機能改善効果についてはETS-GS投与によりもたらされたものか否かを検証するために、Bio-Plex(バイオラッド社)を用いて虚血再灌流障害後の肝組織において、リン酸化タンパク質の変化について確認を計画。1)肝虚血再灌流障害時におけるビタミンE誘導体ETS-GS投与の改善効果の検討ではビタミンE誘導体の投与の有無による影響を解析するために(1)血清中のAST,ALT値の測定、(2)血清中のNOx、サイトカイン量の測定をELISA Kit等を使用して解析。(3)肝組織中のROS測定を酸化ストレスマーカーを用いて検討した。2)正常肝組織ならびに虚血再灌流後の組織からのリン酸化アッセイでは、正常肝組織並びに虚血再灌流後、さらにはビタミンE誘導体であるETS-GSを肝虚血再灌流後の組織においてリン酸化タンパク質抽出キット(バイオラッド社)を用いて抽出、精製。その後、バイオラッド社製Bio-

Plexを用いて網羅的に肝組織中のリン酸化タンパク質の変化を検討。3)肝虚血再灌流障害後におけるビタミンE誘導体ETS-GS投与の改善効果の検討では、ビタミンE誘導体の投与の有無による影響を解析するため(1)血清中のAST,ALT値の測定(2)血清中のNOx、サイトカイン量の測定をELISA Kit等を使用して解析、(3)肝組織中のROS測定を酸化ストレスマーカーを用いて検討した。まず今回の肝虚血再灌流傷害モデルにおいては、セボフレンを使用した全身麻酔を行い、腹部正中切開から肝門部の血管系の同定を行った上での肝門部の血管クリップによる虚血状態の作成、およびクリップ解除後の再灌流状態でそのラットモデルは成功した。このモデルを用いた肝虚血再灌流後の血液中のAST、ALTの肝逸脱酵素の測定により、ETS-GS投与は有意に肝臓機能ならびに肝組織像の改善効果を認めることがわかった。肝虚血再灌流障害モデルにおいて、ビタミンE誘導体の一つであるETS-GSが有効であるか否かについて検討については、この実験モデルにおける1)肝虚血再灌流障害時におけるビタミンE誘導体ETS-GS投与の改善効果としての、ビタミンE誘導体の投与(障害前投与)の有無による影響として、(1)血清中のAST,ALT値の測定。(2)血清中のNOx、サイトカイン量の測定をELISA Kit等を使用して解析。(3)肝組織中のROS測定を酸化ストレスマーカーを検討。を終了し、その効果を図ると共に、ETS-GSの効果・有用性を一部確認済みである。その次項目に関しては実際測定、測定数値集計段階で、実験計画確立の困難から現在実施進行中に留まる。次年度においては、ETS-GSの効果を多方面から確認するため、サイトカイン等様々なパラメーターを測定し最終目標につなげる予定である。追加項目として、血清中のNOx、サイトカイン量の測定をELISA Kit等を使用して解析を行い、肝組織中のROS測定を酸化ストレスマーカーを用いて検討する予定である。これらの結果によりラット肝虚血再灌傷障害モデルにおけるETS-GSの効果を確かにできれば、次はETS-GSの再灌流後投与法による効果を検討し、より臨床に即した投与方法モデルでの薬剤効果を解析していく方針である。初期計画に追従し予定通り実施進める方針。最終的にETS-GSが本肝虚血再灌流障害モデルにおいて無効である場合が想定される。我々は本物質の基本特許を保持しており、同様な作用を持つ化合物を複数保持しているので、開発者チームと協議の上代替化合物を選定する。その際、当大学内にてすでに稼動している薬品を合成できる施設をフルに稼動させ、異なるビタミンE誘導体を合成し、有効性の再確認を行う。該当なし。これまでと同様、必要物品(消耗品)、実験動物を中心に、実験計画を進めるための必要最低限の研究費を使用していく予定である。
西太平洋沿岸諸国に発生する赤潮及び有毒プランクトンに関する研究

東南アジア諸国の沿岸では近年次第に富栄養化が進行しつつあり、それに伴って有毒プランクトン赤潮の発生が食品衛生や水産業における重大な問題となり、特にまひ性貝毒の出現により、この10年間に1,000名以上の人命が失われていることが報告されている。そこで本研究では、タイ、ブルネイダルサラムおよびフィリピンにおいて、生物環境学的調査を行い、赤潮発生や貝類毒化の防止のための基礎資料を得ることを目的とした。5月23日から同30日にかけて、ブルネイダルサラムの首都であるバンダルベリセガワン沿岸の赤潮発生状況調査と有毒プランクトンであるPyrodinium bahamenseのシスト調査を行った。ブルネイダルサラムでは1976年3月に5平方マイルにわたる赤潮が発生し、イワシなどの魚類や貝類が5723POMU/100gまで毒化したとの資料を得ると共に、P.bahamenseのシスト調査を行った。すでに発芽した殻の存在は認めたが、特にシスト分布の中心がどこにあるかは確定できなかった。ついで、9月3日から9日までの間、マニラ湾及びルソン島中西部のザンバレス沿岸で、フィリピン水産局のMr.ゴンザレスやフィリピン大学海洋研究所と共同で調査を行った。マニラ湾で10点、ザンバレス地方のマシンロック湾で8点、サンタクルス湾で4点、スビック湾で4点の海水、底泥の採取を行い、またP.bahamenseの出現状況を調査した。水温はおおむね2830°C、塩分は2834〓であった。P.bahamenseの遊泳体は認められなかったが、底泥1g当たり約100細胞を発見することができた。1989年は6月下旬に出現し、7月上旬に赤潮になっており、シストはこの赤潮時に形成されたものと思われる。タイ湾の調査は、11月6日より25日までに実施した。6回にわたりチャオプラヤ川及び河口域の水質、底質及びプランクトンを採取して分類及び分析を行った。その結果、Dinophypis candata、Pyrodinium bahamensevar.compressum、Alexandrium corhorticula、Chattonella sp.cf.marinaを分離、培養し、その形態的特徴を明らかにした。また、Noctiluca scintillansについてはその寄生性藻類の形状を調べ、円相当径で3.5μmin1.9max5.1μの値を得た。本寄生性藻類はPedinomonas mictilucaで、その培養も試み、培地組成についてある程度の見通しを得た。タイ湾のN.scintillansは緑色を呈するが、日本のN.scintillansと同様に260及び320nmに吸収を有する物質の存在を認めた。チャオプラヤ川のバンコクの中心付近の川水中の栄養塩は、NH_4ーN0.34(mg/l以下同じ)NO_2ーN0.067、NO_3ーN1.5、PO_4ーP0.11であった。河口から数km沖合ではNH_4ーN0.150.18、NO_2ーN0.01、NO_3ーN0.771.11、PO_4ーP0.05と低下しているが、かなり沿岸域が富栄養化していると考えられる。しかし、沈降物や堆積物の窒素やリンの分析結果から、チャオプラヤ川によって運ばれるこれらの物質は河口域で沈降し、海水中で著しく濃度を低下するが、堆積物の悪化の進行が心配される。なお、バンコク東方100kmのアンシラ付近ではNH_4^+0.007、NO_2^<-N>0.277、PO_4ーPは0.02程度であった。平成2年度以降においては、フィリピン沿岸でのPyrodinium赤潮について十分な調査を行うと共に、インドネシア沿岸の富栄養化の進行状況を調べたいと考える。

P.bahamenseの遊泳体は認められなかったが、底泥1g当たり約100細胞を発見することができた。1989年は6月下旬に出現し、7月上旬に赤潮になっており、シストはこの赤潮時に形成されたものと思われる。タイ湾の調査は、11月6日より25日までに実施した。6回にわたりチャオプラヤ川及び河口域の水質、底質及びプランクトンを採取して分類及び分析を行った。その結果、Dinophypis candata、Pyrodinium bahamensevar.compressum、Alexandrium corhorticula、Chattonella sp.cf.marinaを分離、培養し、その形態的特徴を明らかにした。また、Noctiluca scintillansについてはその寄生性藻類の形状を調べ、円相当径で3.5μmin1.9max5.1μの値を得た。本寄生性藻類はPedinomonas mictilucaで、その培養も試み、培地組成についてある程度の見通しを得た。タイ湾のN.scintillansは緑色を呈するが、日本のN.scintillansと同様に260及び320nmに吸収を有する物質の存在を認めた。チャオプラヤ川のバンコクの中心付近の川水中の栄養塩は、NH_4ーN0.34(mg/l以下同じ)NO_2ーN0.067、NO_3ーN1.5、PO_4ーP0.11であった。河口から数km沖合ではNH_4ーN0.150.18、NO_2ーN0.01、NO_3ーN0.771.11、PO_4ーP0.05と低下しているが、かなり沿岸域が富栄養化していると考えられる。しかし、沈降物や堆積物の窒素やリンの分析結果から、チャオプラヤ川によって運ばれるこれらの物質は河口域で沈降し、海水中で著しく濃度を低下するが、堆積物の悪化の進行が心配される。なお、バンコク東方100kmのアンシラ付近ではNH_4^+0.007、NO_2^<-N>0.277、PO_4ーPは0.02程度であった。平成2年度以降においては、フィリピン沿岸でのPyrodinium赤潮について十分な調査を行うと共に、インドネシア沿岸の富栄養化の進行状況を調べたいと考える。