hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
授業記録の読解方略に基づく授業記録改訂(授業過程可視化)の方法の開発

授業記録の読みは,授業研究の重要な要素である.教師と教師志望学生の授業記録の読解方略の調査を行い,「主質問,相互作用,教材・教具,分節等」の因子を抽出・解釈した.とくに,「主質問,相互作用,教材・教具」は,「授業記録読解スキーマ」と考えられる.学生の授業記録読解は,「テキストベース」で,教師の読解は既有知識・スキーマを手がかりとした「状況モデル」構築処理である.この教師の読みをモデルに授業記録改訂方法を開発した.授業記録の読みは,授業研究の重要な要素である.教師と教師志望学生の授業記録の読解方略の調査を行い,「主質問,相互作用,教材・教具,分節等」の因子を抽出・解釈した.とくに,「主質問,相互作用,教材・教具」は,「授業記録読解スキーマ」と考えられる.学生の授業記録読解は,「テキストベース」で,教師の読解は既有知識・スキーマを手がかりとした「状況モデル」構築処理である.この教師の読みをモデルに授業記録改訂方法を開発した.授業は、教師・子どもの対面による教材内容を主題とする談話による理解の漸進的促進過程で、授業記録はこの談話記録で、欠落部分も多く結束性(意味的関連)が弱く、読者の読み(伝達)を想定しない、情報伝達機能も極めて低い等の特徴がある。教師・学生の授業記録の読解を促進する知識の体系化と、読解を促進・支援する授業記録改訂(授業過程可視・状況モデル化)方法の開発を行った。(1)授業記録読解過程・読解方略・スキーマに関する質問紙調査について、国語・算数等の教科の授業論から検討し汎用化質問紙項目を開発・策定した。さらに、授業記録読解活動等を行った学生を対象としてこの質問紙に調査を行い、分析を進めている。併せて小・中学校教師についても質問紙調査を行い、調査数を増やしている。(2)授業(授業ビデオ)観察に基づく授業研究と授業文字記録読解に基づく授業研究の双方を行い、授業研究(授業方略・学習活動等の特徴検討)の内容等質的差異の検討と授業観察・文字記録読解の両者から得られる情報・読解等の関連について検討している。(3)認知的道具としての「授業過程可視化」手続き仮説に基づき授業記録読解(「授業過程可視化・改訂」)を試行し、その「可視化・改訂」活動成果を集成し資料集を作成した。この活動成果(資料集)と活動の内省等から手続きの妥当性等を検討した。(4)研究会を開催し前記の研究等について検討した。授業研究は,授業記録を定式化された手続きにより対象化することからはじまり,授業記録の読みは授業研究の重要な要素である.1.教師と教師をめざす学生の授業記録の読みについて調査し、次の知見を得た。・教師をめざす学生の授業記録の読みは、「教科書,子ども,主発問、ねらい,マーキング(印付け)等」の授業の目標を実現する具体的内容,観察可能な顕在的・個別的知識による教材研究活動的読みである。・教師の授業記録の読みは、「授業構造,学習目標,分節,教材・教具等」を手がかりとし、実践経験を通して獲得・蓄積した「授業構造、分節」は重要な手がかりとして読んでいる。2.授業記録読解(「授業過程可視化・改訂」)手続き前記の知見に基づき、教師をめざす学生に、「教材研究的活動」と「授業構造、分節等」の読みの手続きを提案し、授業記録読解(「授業過程可視化・改訂」)と併せて授業の特徴抽出(授業研究)を試行し、提案手続きに一定の効果があることが分かった。3.授業記録読解手続きの授業研究への適用と成果・知見の適用・実用化、公表等前記の知見に基づく授業観察、授業記録等に基づく授業研究(授業方略・学習活動等の特徴検討)について、教員免許更新講習、教員免許認定講習および「地域連携教育フォーラム」等の教員研修企画・実施し研究を公表・評価した。授業研究は,授業改善,授業力量形成,授業についての学問的研究を目的に行われ,実践としての授業を観察・記録し,その授業記録を定式化された手続きにより対象化することからはじまることから,授業記録の読みは授業研究の重要な要素である.(1)教師と教師志望学生の授業記録の読みの調査授業記録を読む手がかりについて,教師と教師志望学生(以下学生)を対象に質問紙調査に基づき因子分析を行い,「1主質問,2相互作用,3教材・教具,4学習者,5キーワード,6体験,7分節,8立ち止まり,9ヒント」の9因子を抽出・解釈した.また,「1主質問,2相互作用,3教材・教具」の3因子は,授業記録読解の重要因子であり「授業スキーマ」の構成要素と考えられる.さらに,学生の授業記録

読解は、「7分節,8立ち止まり」を手がかりとした「テキストベース」であり,教師の読解は「1主質問,2相互作用,3教材・教具,4学習者,6経験」の既有知識・スキーマを手がかりとした「状況モデル」構築処理と捉えられる.さらに,教師に限定した結果,「1授業構造,2学習目標,3分節,4教材・教具,5注目語,6模倣,7吟味,8学習活動,9自己体験,10補完」の10因子を抽出・解釈した.とりわけ,「1授業構造(主質問、相互作用等)」の寄与率は極めて高い.さらに,教職経験年数5年以下経験教師は「6模倣」,6年以上経験教師は「1授業構造,3分節」をそれぞれ主要な手がかりとして読みを進めるという知見を得た(2)授業記録読解(「授業過程可視化・改訂」)手続き前記知見に基づき、教師志望学生の授業記録読解に際し「教材研究活動」と「主質問、相互作用、分節等」の視点を提案し、「授業過程可視化・改訂による授業研究」を試行し、効果を検証した。教師と教師をめざす学生の授業記録の読みについて調査し、次の知見を得た。・授業記録の読みについて、教師は「授業構造、分節」、学生は、「教科書,子ども,主発問等」教材研究活動的読みという特徴という知見が得られた(当初の予想・仮説に近いものと検証)。24年度が最終年度であるため、記入しない。(1)授業記録読解(「授業過程可視化・改訂」)手続きは、当初の予想・仮説に近いものであることが分かったが、教員養成学生・新任教師に適用するための汎用化等の検討が必要である(2)教師・学生の授業記録の読みについて、教育実践経験による特徴についての検討が必要である。
発生分化を制御するDECODE回路の解明

発生過程の細胞の運命決定において重要な役割を担っているTGF-βおよびWntシグナルに注目し、特にこれらのシグナルクロストークに関わるNLKシグナルが関与する発生制御機構の解明を目指した。NLKシグナル因子と相互作用するリン酸化酵素、ユビキチン関連酵素、転写因子等を単離し、培養細胞系やモデル生物であるXenopusを用いた機能解析を進め、主に頭部形成制御に関与することを示した。高血圧症は遺伝的素因と環境因子が複雑に絡み合って発症するが、中には単一遺伝子が原因の遺伝性高血圧症もある。我々は、WNK1の機能を明らかにする目的で、WNK1をbaitとした酵母two-hybridスクリーニングおよびエピトープタグと質量分析を用いた相互作用解析を行い、WNK1結合因子としてSTE20様プロテインキナーゼSPAKを同定した。特異的抗体を用いた共沈実験により、内在性のSPAKおよびSPAKとキナーゼドメインが90%以上の相同性をもつOSR1は、293細胞ならびにMDCK細胞内でWNK1と結合していることが認められた。また、WNK1はSPAKおよびOSR1のキナーゼドメインのC末側に存在する進化的に保存されたセリン残基(ラットSPAKのSer380およびマウスOSR1のSer-325)をリン酸化した。しかも、このセリン残基をアスパラギン酸に置換したOSR1変異体は野生型に比較してキナーゼ活性が上昇していた。これらのことから、WNK→SPAK/OSR1というキナーゼカスケードの存在が示唆された。PHAII患者の治療にはサイアザイド系利尿薬が有効であり、このサイアザイドの標的は腎臓遠位尿細管に存在するNa^+-Cl^-共輸送体(NCC)であることが知られている。そこで我々は、SPAKならびにOSR1の標的分子としてNCCに着目した。NCCは、12回膜貫通型の構造をもつNa^+-(K^+)-Cl^-共輸送体ファミリーに属する分子であり、全身に存在するNKCC1や腎臓ヘンレループに存在するNKCC2などもこのファミリーに含まれる。NKCC1の活性調節は、N末端側細胞内領域のリン酸化/脱リン酸化により行われていることが知られていたが、このリン酸化部位を含む領域はNKCC2やNCCのN末領域と非常に高い相同性を示していた。培養細胞およびin vitroの実験から、SPAK/OSR1がNKCC1,NKCC2およびNCCのN末制御領域を直接リン酸化することを明らかにした。これらの知見は、生体内においてWNK1→SPAK/OSR1→共輸送体というシグナル伝達経路が存在し、この経路の制御異常がPHAII発症の一因である可能性を示唆していると思われる。NLKはMAPキナーゼファミリーと考えられている。我々はNLKがTCF/LEFを直接リン酸化することでTCF/LEFとβ-カテニンの複合体形成を阻害し、Wntシグナル伝達を抑制することを報告してきた。今回、NLKと会合する分子群の検索を酵母two hybrid法を用いて実施した結果、N末端側にRINGフィンガー領域を有する分子NARFを単離した。次にNARFと会合する分子の同定を試みたところ、ユビキチン結合酵素E2-25Kを検出した。多くのRINGフィンガータンパクがE3ユビキチンリガーゼとして機能することから、NARFがユビキンリガーゼ活性を発揮するのか検討した。NARFとE2-25Kを用いてin vitroユビキン化アッセイを行ったところ、NARFが自己ユビキン化されることが確認され、NARFがユビキチンリガーゼ活性を有していることが明らかとなった。in vitroユビキン化を指標にNARFの標的分子の検索を行ったところ、Wntシグナル下流の転写因子TCF/LEFがNARFによってユビキン化されることが判明した。このTCF/LEFのユビキン化は、NLKのキナーゼ活性に依存して促進された。siRNAを用いて内在性NARFを消失させるとTCF4の蓄積が確認された。これらの結果はNARFがユビキチン化を介してTCF4のタンパク量を制御していることを示している。また、Wnt3a刺激により誘導されるWntシグナルの標的遺伝子DKK1とaxin2遺伝子の転写がsiRNAを用いた内在性のNARFタンパクの消失により、更に増強された。以上の結果から、NLKによるWntシグナル伝達の抑制機序には、NLKがTCF/LEFをリン酸化修飾することに加えて、NARFによるTCF/LEFのユビキチン化とそれに伴うタンパク分解が関与するが明らかとなった。Nemo-like kinase (NLK)は、MAPキナーゼファミリーと類縁のセリン/スレオニンキナーゼであり、転写因子TCF/LEFをリン酸化することによりWntシグナルを負に制御し、またTGF-βシグナルの下流でSTAT3の機能制御に関与し、中胚葉誘導を担っている。一方、初期胚においてNLKは前頭部の神経領域において強く発現し、神経系を誘導することが明らかとなっている。

NLKの機能に関与する新たな関連因子を得ることを目的として、293細胞に強制発現させたNLKを免疫沈降し、共沈タンパク質群をマススペクトロメーターにより解析した。その結果、初期胚において体節および神経系で発現し、MyoD等の標的遺伝子プロモーターのAT-rich配列に結合し、活性化する転写因子であるmyocyteenhancer factor 2A (MEF2A)をNLK結合因子として同定した。実際、293細胞にNLKとMEF2Aを共発現させ、免疫沈降およびウエスタンブロット法により、細胞内でNLKとMEF2Aが複合体を形成していることを確認した。次に、発生過程におけるNLK-MEF2A複合体の機能を明らかにするため、アフリカツメガエルを用いて解析を進めた。アフリカツメガエル初期胚へmorpholino-antisense oligonucleotide (Mo)を微量注入し、内在のNLKあるいはMEF2Aをノックダウンしたところ、いずれの胚においても頭部形成が不完全となった。Moを微量注入した胚における各種マーカー遺伝子の発現をRT-PCR法により調べた結果、いずれの遺伝子ノックダウンによっても、前方マーカー遺伝子の発現量が低下していることが明らかとなった。以上のことより、NLK-MEF2Aの前頭部形成制御に関与している可能性が示唆された。Nemo-like kinase (NLK)は、MAPキナーゼファミリーと類縁のセリン/スレオニンキナーゼであり、転写因子TCF/LEFをリン酸化することによりWntシグナルを負に制御し、またTGF-βシグナルの下流でSTAT3の機能制御に関与し、中胚葉誘導を担っている。一方、初期胚においてNLKは前頭部の神経領域において強く発現し、神経系を誘導することが明らかとなっている。その結果、MPAキナーゼであるp38をNLK結合因子として同定した。実際、293細胞にNLKとp38を共発現させ、免疫沈降およびウエスタンブロット法により、細胞内でNLKとp38が複合体を形成していること、p38がNLKをリン酸化できることを確認した。次に、発生過程におけるNLK-p38複合体の機能を明らかにするため、アフリカツメガエルを用いて解析を進めた。アフリカツメガエル初期胚へmorpholino-antisense oligonucleotide(Mo)を微量注入し、内在のNLKあるいはp38をノックダウンしたところ、いずれの胚においても頭部形成が不完全となった。以上のことより、NLK-p38の前頭部形成制御に関与している可能性が示唆された。NLKは、Drosophilaの複眼の細胞極性、翅の形態形成、表皮のパターニングを担うNemoの相同遺伝子として単離されたMAPキナーゼ様セリン・スレオニンキナーゼである。
タイ東北部における移動労働者の形成するネットワーク

本研究では、移動労働を「人々が生活のために、村共同体のネットワークを拡張していく行動」と捉え、以下の仮説を立て、農村部の生活状態や生活設計の調査を行った。(1)人々は経済・社会の変化と新たな情報から従来と違う生活設計を描いて都会や海外へ誘発されており、収入拡大だけを目的にしているのではない。(2)タイ政府による移動労働抑制のための所得拡大は、生活のニーズに合致しないため効果が少ない。しかし、平成14年度までにタイ東北部コンケーン県内の三農村とバンコクで行った基礎調査(インタビューと資料収集)の結果、仮説に疑問が生まれた。調査地において移動労働は、地縁よりも仲介業者や親族のあいまいな情報と資金を元に行われる。また、移動先での村出身者の協同行為や村での残留者の協力は、狭い範囲でしか起きていない。結果、移動労働は、共同体全体の発展よりも内部格差の拡大に繋がっている。そこで、本年度は調査計画を修正し、分析単位を共同体から家族と個人に変えて生活史調査を行い、人生の中での選択、移動を含めた生計維持を、地域や世代差によって比較検討した。また、個人の行動に影響を与える要因として、仲介業者や政府の労働者輸出政策、農村金融政策などを分析した。結果、人々は家族の状態、本人と周囲の希望、人脈などから職業や居住地を選択しており、海外労働もその一部分であった。また、女性の場合は60年代うまれを境に、交通と情報網の改善、年長者からの規範の変化によって、進学や職業選択の自由が大幅に拡大していた。さらに、移動経験のない人は周囲の変化をあたかも自分とは無関係な出来事のように認識しており、移動の可能な人/不可能な人の格差は、物理的な差に留まらないことを推論できる。これらの結果は、慶應義塾大学の21世紀COE研究「日本・アジアにおける総合政策研究拠点」ワーキングペーパーシリーズの一部としてまとめ、現在刊行準備を行っている。今年度は、02年7月9月(第1回)、02年12月03年1月(第2回)にわたってコンケーン県内3ヶ所の農村でインタビュー調査を行った。第1回調査においては、海外労働のある世帯、国内労働のみある世帯、移動労働のない世帯について、家族構成、家計状況、移動のプロセスを聞き取りした。三村(A、B、C)のうち、村AとBは比較的早く(60年代)から現金収入や支出があった地域で、農業やその他の雇用も比較的安定している。一方、C村では、70年代以降に新しく開拓され、農業生産の不安定さから住民達の生活には国内季節労働が必須だった。こうした環境の違いから、80年代以降に活発になった海外労働に対する反応に差があるように見受けられる。村AとBでは概して具体的な目標(購入物や教育費、投資など)が掲げられるが、Cの場合は農閑期に「何もしない」ことを嫌って(つまり季節労働と同じ理由で)多額の借金をして海外に出て行くケースが多い。この調査結果から、三村の移動に対する態度の違いとその理由について、あらたな分析対象を加えることにした。一つは、村と家族の歴史である。約1世紀の歴史のある村AとBに対し、20年前に集団移住によって形成された村Cでは、生活基盤や外の世界(都市や外国)に関する知識、関心が大きく異なると思われる。二点めは、土地保有(制度と実質)の違いである。所有面積や法的権利の差は、特に若い人にとって、農業経営に対する期待の差となって現れることが予想される。第2回調査は、前回と同じインフォーマントを対象に上記二点の調査を行った。人口の流出入は村AとCが盛んで村Bは少ないほか、Cでは土地面積が少なく所有権も得ていないといった違いが明らかになったが、移動労働との関連については、現在分析中である。

さらに、移動経験のない人は周囲の変化をあたかも自分とは無関係な出来事のように認識しており、移動の可能な人/不可能な人の格差は、物理的な差に留まらないことを推論できる。これらの結果は、慶應義塾大学の21世紀COE研究「日本・アジアにおける総合政策研究拠点」ワーキングペーパーシリーズの一部としてまとめ、現在刊行準備を行っている。
建築とのインタラクションを考慮した数理計画手法による空調システムの運転最適化

空調システムの省エネルギーを達成する手法の一つとして,シミュレーションによる運転最適化が注目を集めている.しかし,既往研究の多くは空調一次側システムのみを対象とした最適化であり,建物側とのインタラクションが生じる空調二次側システムまで含めた最適化ではない.一次側と二次側は独立しておらず互いに影響を与えるため,真に最適化をするためには,建物側と二次側を含めたシステム全体で解く必要がある.そこで,建物とのインタラクションを考慮した運転最適化手法に関する研究の初期検討として,システムシミュレーションを用いて,一次側のみを対象とした最適化と二次側まで含めた最適化で,最適解やエネルギー消費量,室内温熱環境にどの程度の違いが生じるかを明らかにした.まず,検討に用いるシステムシミュレーションを開発した.対象建物は日本建築学会オフィス用標準問題の建物モデルを基に作成した中規模オフィスビルであり,建築設備設計基準(平成18年度版)を基に機器選定を行った.室熱収支モデル,空調機器モデル,制御ロジックモデルをそれぞれ開発し,これらを組み合わせてシステムシミュレーションを開発した.シミュレーションの開発には行列演算用ソフトMATLAB/Simulinkを用いた.開発したシステムシミュレーションを用いて最適化に関するケーススタディを行い,「空調一次側システムのみを対象とした最適化」と「二次側システムまで含めた最適化」にどの程度の差があるのかを比較検討した.検討の結果,空調一次側システムのみを対象とした最適化では熱源送水温度が高くなるため室内湿度に悪影響を与える可能性があることが判った.また,二次側まで含めて最適化することにより,熱源が固定速ターボ冷凍機のシステムでは約3%,可変速ターボ冷凍機のシステムでは約13%のエネルギー消費量を更に削減可能であることを明らかにした.空調システムの省エネルギーを達成する手法の一つとして,シミュレーションによる運転最適化が注目を集めている.しかし,既往研究の多くは空調一次側システムのみを対象とした最適化であり,建物側とのインタラクションが生じる空調二次側システムまで含めた最適化ではない.一次側と二次側は独立しておらず互いに影響を与えるため,真に最適化をするためには,建物側と二次側を含めたシステム全体で解く必要がある.そこで,建物とのインタラクションを考慮した運転最適化手法に関する研究の初期検討として,システムシミュレーションを用いて,一次側のみを対象とした最適化と二次側まで含めた最適化で,最適解やエネルギー消費量,室内温熱環境にどの程度の違いが生じるかを明らかにした.まず,検討に用いるシステムシミュレーションを開発した.対象建物は日本建築学会オフィス用標準問題の建物モデルを基に作成した中規模オフィスビルであり,建築設備設計基準(平成18年度版)を基に機器選定を行った.室熱収支モデル,空調機器モデル,制御ロジックモデルをそれぞれ開発し,これらを組み合わせてシステムシミュレーションを開発した.シミュレーションの開発には行列演算用ソフトMATLAB/Simulinkを用いた.開発したシステムシミュレーションを用いて最適化に関するケーススタディを行い,「空調一次側システムのみを対象とした最適化」と「二次側システムまで含めた最適化」にどの程度の差があるのかを比較検討した.検討の結果,空調一次側システムのみを対象とした最適化では熱源送水温度が高くなるため室内湿度に悪影響を与える可能性があることが判った.また,二次側まで含めて最適化することにより,熱源が固定速ターボ冷凍機のシステムでは約3%,可変速ターボ冷凍機のシステムでは約13%のエネルギー消費量を更に削減可能であることを明らかにした.
日中韓における知的アクターの社会的機能と影響に関する比較的研究

本年度は平成18年度に引き続き、各国内における社会エリートとしての知的アクターの在り方と影響力を、理論および事例から検討し、知的エリートの知識生産の国際及びトランスナショナルなレベルへの波及、並びに知的エリートを媒介とした、国内と国際そしてトランスナショナルな共振関係を探った。本年度は、特にこれまでナショナルな枠の中でのみ考えられがちであった、日・中・韓の北東アジア諸国の社会運動と民主主義を、知的エリートアクターによって効果的にモビリゼーションが起こされたり、媒介されたりするものと捉えて、そのダイナミズムのナショナルな境界を越えた「外部性」に焦点を当てて検討を行った。この社会エリートによる、民主主義的メカニズムにおける知識・制度・手続き上の、社会運動と市民社会の参加的統合に関しては、理論・実践のレベルにおいて北欧の先進事例から得られたものをプロトタイプとし、そこから北東アジア社会を照射するという方法を用い、そのパースペクティブの一部を「世界政治における先進民主主義とカウンター・エリートの「外部性」の政治社会学」『メディア・コミュニケーション研究』論文(2007年)で、学術的議論を問うものとなった。北東アジアは中国という民主主義体制をとらない国を抱え、日本や韓国と若干の事情の違いはあるものの、全体として地域的に進む公的機能の情報化・商業化・民営化の内外に、知的アクターによる権力の監視・情報公開または議論の惹起・世論の活性化などの事例が多く確認された。しかし、欧米に比較した場合に、いまだグローバルな諸アジェンダに対する地域的な広がりを持つ、トランスナショナルな社会的意思の統合と発信、行動実践の実体化は弱く、今後はこれまでの成果を活かし、さらにこの論点の分析を深めたい。国内における非政府の知的アクターおよびエリートの理論研究、及び事例研究から以下のことが明らかとなった。まず、知的アクターを当初、官僚・シンクタンク・大学・マスメディアの4分類としていたが、この4分類のうち北東アジアの官僚および商業ベースのシンクタンクは、政府や各国の財界と強い結びつきを持ち、既存の政治経済秩序の中で政策や変化を考えること。これは、従来の狭義のトップ・ダウン型エリートと類型される。この従来型エリートに対して、知的アクターとして台頭してきているのが市民・社会セクターのNGOやNPOを初めとした市民組織・団体、それに労働組合や学生運動組織・女性運動組織などの社会運動組織などであり、これらは知的センターであると同時に、既存の政治経済の体制の外側から政治や社会を考え変革を目指すという意味において、ボトムアップ型のカウンター・エリートとして類型される。そして、大学およびマスメディアの持つ知的能力と社会的影響力は、あるときにはエリート的機能を果たし、またあるときは、カウンター・エリートとしての機能を果たすことが確認される。ここから、官僚・シンクタンク・大学・マスメディアの4つは、NGO・NPO、労働組合、多様な社会運動組織などと加えた、エリートの3類型、すなわち、エリート、カウンター・エリート、中間エリートという新たな広がりを見せた分析枠組みの中で議論を検討される必要性が認識される。また、北東アジアの国際関係において歴史上、中国や日本の民間や市民組織に見られるように、文化大革命、冷戦などの公式の交流がない、動乱の危機的情勢において、非政府の組織や団体が実質的なチャンネルとなって世界と北東アジア各国をつなぎ、この地域の国際関係にインパクトを与えていることが確認された。ここから、市民組織が外交に直接参加する北欧モデルとの比較も有効であることが視野に入ってきた。
新規希少糖ガムの作製とその口腔内常在性菌に対する作用の研究

大量生産可能な希少糖の内、水に易溶解性、甘味度が60%以上の糖を選択し、口腔内細菌を減少させる効果のある糖を探索し、D-タガトースが最も適していることを発見した。In vitroにおいて、D-タガトースを培養液中に添加したところGS5などのミュータンス菌に対する増殖、酸および不溶性グルカン産生を著明に抑制し、バイオフィルム形成を阻害し、グルコシルトランスフェラーゼ活性を阻害した。D-タガトースガムの製造に成功し、In vivo(臨床試験)により4週間使用した。被験者に副作用は全く認めず、口腔内細菌、特にミュータンス菌数を減少させた。この結果は、In vitroの結果と一致した。平成25年度の研究内容A希少糖ガムの作成:平成24年度までのin vitroの実験にて、D-プシコース、L-プシコースおよびL-タガトースには口腔内細菌のS. mutansに対する効果が弱いことが判明した。したがって、実験をD-タガトースに集中することにした。ガムの作成を松谷化学工業に依頼し、1D-タガトースガムと、対象として2マルチトースと3キシリトールのガムも作成した。さらに、平成24年度までのin vitroによる実験にてD-タガトースとキシリトールの併用がS. mutansに対する抑制効果が高いことが判明したため、4D-タガトースとキシリトールの混合ガムも作成した。14の4種のガムを各800g準備した。B D-タガトースガム使用前後の口腔内細菌の検査:4種のガムの比較実験を開始している。事前に口腔内診査および唾液緩衝能テストを行い、う蝕活動性の高い者を被検者としている。被検者をランダムに4つのグループに分け、(a)D-タガトースガム、(b)キシリトールガム、(c)マルチトースガム、(d) D-タガトース+キシリトールの混合ガムをそれぞれ3日間使用し、ガムの使用前後で、被検者の口腔内より細菌を採取した。ガムの使用量を限定しているため、使用期間を短縮した初期実験として1回3g(2個)を1日3回毎食後30分以内、1回10分間、3日間連続使用することにした。平成26年1月までに各ガム3人分(計12人分)の検体採取を終了している。採取した細菌を用い、デントカルトSMキットおよびLBキット、BHI培地、MSB培地、PCRを用いた口腔内細菌の変化を検索している。A希少糖ガムの作成:in vitroの実験にて、D-プシコース、L-プシコースおよびL-タガトースには口腔内細菌のS. mutansに対する効果が弱いことが判明した。試験用ガムは1D-タガトースガム、対照として2マルチトースと3キシリトールのガムを作成した。さらに、in vitroの実験にて、D-タガトースとキシリトールの併用が、S. mutansに対する抑制効果が高いことが判明したため、4D-タガトースとキシリトールの混合ガムも作成した。B D-タガトースガム使用前後の口腔内細菌の検査:S. mutansの評価において、in vitroとin vivoのそれぞれの実験の整合性をもたせるために、両者をバイオアッセイによるバイオフィルムの形成量を評価した。in vitroにて、S. mutans株のGS5を用い、スクロース、D-グルコース、キシリトールまたはD-タガトースの各培地で、バイオフィルムの生産を、バイオアッセイによって測定し、比較した。D-タガトース培地において、バイオフィルム産生の有意な減少を認めた。バイオフィルム形成阻害は、対象のキシリトールと比較し用量依存性を示した。in vivoにて、ボランティアの被験者に、上記Aで作成した14のガムを用い、1回2gを1日3回食後、1回5分間、3日間使用した。使用の前後で口腔内細菌を、各ガム約10人分(計40人分)の検体を採取した。in vitroと同様に、バイオフィルムの生産を、バイオアッセイによって測定し、比較した。D-タガトースガムの使用にて、バイオフィルム産生の減少を認めたが、in vitroの結果と比し、著明な変化ではなかった。バイオフィルムのほかに、デントカルトMSキットおよびLBキット、BHI培地、MSB培地、PCRを用いた口腔内細菌の変化も検索したA希少糖ガムの作成:in vitroの実験にて、D-プシコース、L-プシコースおよびL-タガトースには口腔内細菌のStreptococcus mutansに対する効果が弱いことが判明した。試験用ガムは1D-タガトースガム、対象として2マルチトースと3キシリトールのガムを作成した。B D-タガトースガム使用前後の口腔内細菌の検査:S. mutansの評価において、in vitroとin vivoのそれぞれの実験の整合性をもたせるために、両者をバイオアッセイによるバイオフィルムの量の測定をにて評価した。

バイオフィルム形成阻害は、対象のキシリトールと比較し用量依存性を示した。in vivoにて、ボランティアの被験者に、上記Aで作成した14のガムを用い、1回2gを1日3回食後、1回5分間、3日間使用し、使用の前中後で口腔内細菌を採取した。in vitroと同様に、バイオフィルムの生産を、バイオアッセイによって測定し、比較した。D-タガトースガムの使用にて、バイオフィルム産生の減少を認めたが、in vitroの結果と比し、著明な変化ではなかった。バイオフィルムの測定のほかに、デントカルトMSキットおよびLBキット、BHI培地、MSB培地、PCRを用いた口腔内細菌の変化も検索した。希少糖ガムの作成、生産、使用に成功した。ボランティアの被験者に、作成した希少糖ガムを3日間使用し、その使用前後で口腔内細菌のサンプルを、各ガム約10人分(計40人分)採取し測定を行った。測定結果の解析を行ったが、1D-タガトースガム、3キシリトールガムおよび4D-タガトースとキシリトールの混合ガムにより、細菌数が低下した被験者もあったが、解析を行ってみると有意差が無かった。そこでガムの試用期間を1か月間とし、一昨年の3日間の実験と同様に、口腔内細菌の変化を測定した。すると、4D-タガトースとキシリトールの混合ガムが唾液中のS. mutansの数を減少させていることがわかった。In vitroにおいて、口腔内細菌を減少させる効果のある糖の探索を開始したところ、D-タガトースが最も適していることがわかった。D-タガトースを培養液中に添加したところGS5など特定のミュータンス菌に対する増殖、酸および不溶性グルカン産生を著明に抑制した。GS5のバイオフィルム形成を阻害し、グルコシルトランスフェラーゼ活性を阻害した。D-タガトースとキシリトールの併用投与はミュータンス菌に対する抑制効果を強く認めた。In vivoにおいて、D-タガトースガムとキシリトールガム、D-タガトースとキシリトールの混合ガムを独自に開発し、4週間使用した。19人に対して使用し、副作用は全く認めず、口腔内細菌のうちミュータンス菌を減少させた。特に、D-タガトースとキシリトールの混合ガムは唾液中のミュータンス菌を著明に減少した。上記のIn vitroとIn vivoの試験結果が一致し、D-タガトースはキシリトールとは異なる作用を有し、両糖を併用することで、新たなう蝕予防または歯周病予防となる可能性が示唆された。大量生産可能な希少糖の内、水に易溶解性、甘味度が60%以上の糖を選択し、口腔内細菌を減少させる効果のある糖を探索し、D-タガトースが最も適していることを発見した。In vitroにおいて、D-タガトースを培養液中に添加したところGS5などのミュータンス菌に対する増殖、酸および不溶性グルカン産生を著明に抑制し、バイオフィルム形成を阻害し、グルコシルトランスフェラーゼ活性を阻害した。D-タガトースガムの製造に成功し、In vivo(臨床試験)により4週間使用した。被験者に副作用は全く認めず、口腔内細菌、特にミュータンス菌数を減少させた。この結果は、In vitroの結果と一致した。
レジン強化型グラスアイオノマーセメントの汎用プライマーに関する研究

本研究は、レジン強化型グラスアイオノマーセメント専用の汎用プライマーを開発するための資料を蒐集する目的で行われた。修復材として3種のレジン強化型グラスアイオノマーセメント(Fuji II LC、Vitremer、Fuji Lute)および従来型グラスアイオノマーセメントFuji IXを使用した。象牙質処理材としては、Reactmer Bond(以後RM)、One-up Bond F(以後OF)、AQ Bond(以後AQ)の3種の市販ワンステップボンディングシステムおよびそれぞれの製造者指示の表面処理材としてCavity conditioner、Vitremer primerと本研究のために試作された汎用プライマー(以後EP)について、プライマー組成と接着性の検討および、口腔環境を想定した温度および湿度ストレスを付加するハザード試験やサーマルサイクル試験によって口腔環境を擬似想定した環境下での接着耐久性の観点から検討した。その結果、エナメル質および象牙質接着界面の特徴ある形態を示した。象牙質ではその界面にハイブリッド様のセメントマトリックス層を形成し,接着材と修復材料との組み合わせでは、メーカーが指示する方法で接着強さの高い成績を示した。口腔環境をシュミレートしたサーマルストレス負荷による接着耐久性への検討では、用いられたFuji II LC Vitremer、Fuji Luteとエナメル質および象牙質との間に厚い層を形成するEP、RM、OFで著しく歯質接着強さを低下しサーマルストレスの影響を強く受ける結果となった。一方、製造者指示条件で製作されたエナメル質および象牙質接着強さは、24時間後の成績に比較して、有意には低下しなかった。また、接着試験後の破壊形式は、エナメル質および象牙質接着試片製作24時間後で界面破壊が多く観察されたが、経時的に接着材層内での凝集破壊が多く認められるように変化したことから、汎用プライマーを用いたレジン強化型グラスアイオノマーセメントのエナメル質および象牙質接着強さは、接着界面に形成されるはその接着材層に影響される結果となった。すなわち、その汎用プライマーによる接着強さは、接着界面に形成されるハイブリッド様のセメントマトリックス層の性状と接着材層の物性、厚さに依存することを示唆する多くの資料が蒐集できた。レジン強化型グラスアイオノマーセメント(以後,RMGIC)の象牙質に対する接着強さを向上させることを目的として汎用プライマー(EP)を試作し,その有効性を象牙質接着性試験,破壊形式および接着界面の走査電子顕微鏡(以後,SEM)観察を行い検討した。供試したRMGICは,2種の光硬化型グラスアイオノマーセメント,従来型グラスアイオノマーセメイト,合着用グラスアイオノマーセメントおよびフッ素徐放性を有する光重合型レジンである。象牙質面処理は,試作の汎用プライマーおよび市販のReactmer Bond,One-up Bond F,AQ Bondの3種のワンステップシステムである。ウシの下顎前歯を用い接着試験およびSEM観察を行った。接着強さ測定は,インストロン万能試験機(Type 4204,Insoton)を用いてクロスヘッドスピード1.0mm/mimの条件で測定した。SEM観察は,象牙質処理面およびSEM試片を歯牙の長軸方向に縦切断後接合界面の観察を金蒸着後,SEM(JSM-5400,JEOL)で行った。RMGICとEPとの組み合わせによる象牙質接着強さは、光レジンと比較し同程度の接着強さを示し優れていることが判明した。

象牙質処理面のSEM観察では,象牙質研削面に観察されたスミヤー層は除去され,象牙細管内のスミヤープラグは除去されているのが観察された。試作汎用プライマーと象牙質との接合界面には,1μm程度のハイブリッド様層が形成されているのが観察された。接着試験後の破壊形式は,化学硬化型RMGICとの組み合わせではその大部分が界面破壊であったが,光硬化型RMGICの一部のセメント内での凝集破壊が認められた。しかし,レジン成分を含まない従来型のF9との接着試験後の破断状態は,すべてが界面破壊であった。本実験の結果,試作汎用プライマーとセメントとの接合状態は緊密であり,象牙質接着性に大きく影響していることが示唆された。本実験の成果は,第36回日本歯科理工学会(平成12年,岡山)で報告された。レジン強化型グラスアイオノマーセメント(以後,RMGIC)は歯質や金属との接着し,フッ素を徐放し,歯髄為害性が少ないことなどの特徴を生かして合着用,裏層用,修復用およびシーラント用の製品が開発され臨床応用されている。このRMGICの歯質に対する接着強さを向上させることを目的として有効カルボン酸系モノマーを使用したワンステップシステムの汎用グラスアイオノマー系プライマーを試作した。汎用プライマーの効果についての資料を蓄積する目的で口腔環境をシミュレートした温度負荷(サーマルサイクルテスト)および保管環境をシミュレートした温度負荷(ハザードテスト)によるエナメル質および象牙質に対する光セメントの接着耐久性を接着強さ試験,接着試験後の試片の破壊形式,接合界面の走査型電子顕微鏡観察などを通じて検討した。検討した内容について第37回日本歯科理工学会学術講演会および第38回日本歯科理工学会学術講演会で発表した。その内容をまとめると以下のようである。1.試作された汎用プライマーは,エナメル質および象牙質に対する接着強さを向上させた。2.エナメル質および象牙質に対する接着強さは,サーマルサイクルの負荷回数が増加するに伴い,すべての試片で低下する傾向を示した。対象として用いた市販接着システムも同様の傾向を示した。3.エナメル質および象牙質に対する接着強さは,ハザードボックス内での保管期間が増加するに伴い,すべての試片で低下する傾向を示した。4.試作セルフエッチングプライマーを使用した接着試片の歯質接合界面には明らかな約1ミクロン程度の耐酸性層の生成を認めた。しかし,接着耐久性との関係については明らかにできなかった。今後,試料数を増加しRMGICの接着強さを向上させる安定性のあるプライマーを検討する。修復材として3種のレジン強化型グラスアイオノマーセメント(Fuji II LC、Vitremer、Fuji Lute)および従来型グラスアイオノマーセメントFujiIXを使用した。
薬物治療をサポートするフラボノイドの臨床応用

アントラサイクリン系抗がん薬の代謝に寄与するCBR1・AKR1A1、CBR1の類縁酵素CBR3の大腸菌発現系・精製系を確立し、CBR1に対する強力な阻害活性を示す果物・野菜抽出液を見出した。また、CBR1とAKR1A1に対する阻害を検討できる細胞系を確立し、上記と同様の結果を得た。さらに、食品添加物の一種がCBR1の転写制御に関与することを見出し、その制御には転写因子Nrf2が関与することを明らかにした。CBR1の基質であるイサチンが腎障害を悪化させることを明らかにし、CBR1の機能制御が新規薬物標的となることを示した。Short-chain dehydrogenase/reductase (SDR) superfamilyに属するCBR1は、NADPHを補酵素として、生体内外の物質を還元する酸化・還元酵素である。その基質のひとつにアントラサイクリン系抗癌薬が挙けられる。本薬剤は、CBR1によってアルコール体へと代謝される。この代謝産物は、本薬剤が引き起こす重篤な副作用である心筋障害の原因物質であると考えられている。本年は、CBR1に高い類似性を示す新規酸化・還元酵素CBR3とCBR1のヒトオルソログ蛋白質の大腸菌を用いた大量調製系を確立した。カルボニル還元活性に対する複種類のテスト基質に対して、CBR3とCBR1の酵素活桂を測定したところ、CBR3はCBR1に比べ100倍程度低い活性しか示さなかった。Harr plot解析により、CBR1とCBR3のアミノ酸配列を比較したところ、触媒アミノ酸に近接する19a.a.の領域と、基質結合ループ領域と一致する14a.a.の領域を、保存性が低い領域といて同定した。この2つの領域に焦点を当ててCBR1とCBR3のキメラ酵素を構築し、その酵素科学的解析を行なっだ結果、CBR1とCBR3のそれぞれに特徴的な酵素科学的性質は、基質結合ループ領域に依存して発揮されていることが明らかとなった。本領域をターゲットとする阻害薬は、互いに類似するCBR1とCBR3に対して、特異的に働くことが示唆される。アントラサイクリン系抗癌薬は、広い抗癌スペクトルを持つ有用な抗癌薬であるが、一方、生涯累積投与量依存的に重篤な心筋障害・心不全を引き起こす。この心不全の原因の一つとして、アントラサイクリン系抗癌薬のアルコール体代謝産物の心臓組織への蓄積が有望視されている。この代謝に関与する酵素として、CBR1(Carbonyl reductase 1)が知られている。最近になって、ヒトAKR1A1(Aldo-keto reductase 1A1)も同様に生理的な代謝酵素として働きうることが明らかにされた。本年度は、AKR1A1およびラットのオルソログであるAKR1A3の酵素蛋白質精製系・酵素活性測定系の確立、これらの酵素を安定に発現させた細胞株の樹立を目指した。AKR酵素群は、タグの付加により酵素活性が低下することが知られるため、タグのon-column cleavageが可能なeXactタグの融合蛋白質として大腸菌内に発現させ、その後on-column cleavageによってtag freeな酵素をワンステップで精製した。本方法で得られた酵素蛋白質はSDS-PAGE上で均一かつ十分量であり、その後の酵素活性測定に使用可能であった。また、FLAGタグを付加した上記の酵素のpolyclonalな安定発現細胞群を樹立した。次年度以降はこれらを用い、上記酵素の阻害活性を持つ物質を探索する予定である。本年度は、ドキソルビシンを基質とした酵素反応の生成物検出や、昨年度までに樹立した上記代謝酵素群の大腸菌発現系・精製系により得られたタンパク質を用いて、フラボノイド含有フルーツの抽出液やジュース類を酵素阻害剤含有食品候補として、スクリーニングを行った。20種類程度の酵素阻害剤含有食品候補0.001%(v/v)-1%(v/v)に対して、human CBR1によるドキソルビシンを基質とした酵素反応についてスクリーニングを行ったところ、いくつかのものはIC50が0.03%(v/v)という極めて強力な阻害作用を検出した。これらはhuman CBR1に対して極めて強力な阻害活性を有する物質を含んでいると考えられる。

今後は、これらの候補物質の他の酵素群に対する阻害活性を検討する必要がある。アントラサイクリン系抗癌薬は、広い抗癌スペクトルを持つ有用な抗癌薬であるが、一方、生涯累積投与量依存的に重篤な心筋障害・心不全を引き起こす。この心不全の原因の一つとして、アントラサイクリン系抗癌薬のアルコール体代謝産物の心臓組織への蓄積が有望視されている。この代謝に関与する酵素として、CBR1(Carbonyl reductase 1)が知られている。本年度は、CBR1の転写制御に食品中の物質が関与するのかを検討するとともに、CBR1と病態への関与について検討した。CBR1遺伝子上流域-2062 bpを用いたルシフェラーゼアッセイの結果、酸化防止剤として使用されることがあるBHAがCBR1の転写活性を促進させることを見出した。BHAは転写因子Nrf2を活性化させる作用があるためNrf2のCBR1遺伝子制御への関与を検討したところ、Nrf2のDNA結合配列であるARE(antioxidant-responsive element)を3つ、当該領域に見出した。変異導入解析の結果、そのうちもっとも転写開始点に近いARE1が、BHAによるCBR1転写活性化に寄与していることを明らかにした。また、これらの結果はEMSA(Electrophoretic mobility shift assay)により支持された。CBR1の病態への関与について、ラット腎虚血再灌流モデルにおいてCBR1の基質の一つであるイサチンに注目し解析を行った。イサチンは生体内に存在する物質でありMAO(monoamine oxidase)を阻害する活性を有する。イサチンの投与により、腎虚血再灌流による腎障害がさらに悪化した。CBR1の機能制御が腎障害への治療標的になりうると考えられる。ラット腎虚血再灌流モデルに関する実験は、研究協力者として筒居秀伸(大阪大谷大)が関わった。ほぼ想定通りの研究を展開できており、予定通りに進展している。24年度が最終年度であるため、記入しない。今後は、これまでに得られた知見を基に研究計画通りに本研究課題を展開する予定である。
消化管粘膜再生機構における細胞分化と関与する遺伝子群の研究

【目的ならびに方法】外科的に切除された炎症性腸疾患(IBD)症例の消化管粘膜再生過程について,再生医療への応用をも見据えた有用な基礎的情報を得る目的で病理組織学的に細胞増殖・分化の面から解析した.18年度はクローン病(CD)20例(小腸15例,大腸5例),19年度は潰瘍性大腸炎(UC)12例を対象に,ホルマリン固定パラフィン包埋された各症例の代表的な病理組織切片を用い,胃型(MUC5AC,MUC6,HGM,HIK1083抗体)ならびに腸型(MUC2,villin抗体)の細胞分化マーカー,腸への分化誘導に関わる転写因子Cdx-2に対する抗体を用いた免疫組織化学的染色を施行し粘膜における形質発現を検討した.【結果ならびに考察】1.CDでは胃型形質発現は小腸14/15例(93%),大腸5/5例(100%)に認めた.腺窩上皮への分化は小腸11/15例(73%),大腸5/5例(100%),幽門腺への分化は小腸14/15例(93%),大腸2/5例(40%)であった.2.UCでは8/12例(75%)で明らかな腺窩上皮への分化を認めた。幽門腺細胞への分化(偽幽門腺化生)は1例(8.3%)のみであった.3.CD,UCともに腸型形質発現ならびにCdx-2発現はすべての症例で保たれていた.4.消化管の細胞分化に関わる他の転写因子[Sox2,Sonic hedgehog(SHH),Musashi-1]に関しても免疫組織化学的検索を試みたが,染色至適条件が見つからず現在までのところ有意な結果が得られていない.5.IBDの種類を問わず小腸は幽門腺分化を,大腸は腺窩上皮分化を示す傾向がみられた.この差は正常粘膜での腺管形態の差に起因すると思われる.また粘膜破壊に伴う細胞分化異常が生じても形態に関する情報は保持されていることを示しており,器官の基本的形態はより上位の遺伝子支配を受けている可能性が示唆された。本年度は以下の実績を得た.1.外科的に切除された20例(小腸15例,大腸5例)のクローン病症例を対象に,ホルマリン固定パラフィン包埋された各症例の代表的な病理組織切片を用いて,胃型(MUC5AC, MUC6,HGM, HIK1083抗体)ならびに腸型(MUC2,villin抗体)の細胞分化マーカー,腸への分化誘導に関わる転写因子Cdx-2に対する抗体を用いた免疫組織化学的染色を施行し,粘膜における形質発現を検討した.2.胃型形質発現は,小腸では14/15例(93%)に,大腸では5/5例(100%)に認めた.胃型のうち,腺窩上皮への分化を示したものは小腸11/15例(73%)[HGM陽性12例,MUC5AC陽性11例],大腸5/5例(100%)[HGM陽性5例,MUC5AC陽性4例],幽門腺への分化を示したものは小腸14/15例(93%)

[MUC6陽性14例,HIK1083陽性12例],大腸2/4例(40%)[MUC6陽性2例,HIKIO83陽性0例]であった.HGMとMUC5AC, MUC6とHIK1083の染色性は各々よく相関していたが,HGM, MUC6がより強い染色性を示した.3.腸型形質発現ならびにCdx-2発現は,小腸,大腸ともすべての症例で保たれていた.4.胃型,腸型形質発現と炎症の程度,肉芽腫形成とは相関を認めなかった.5.消化管粘膜再生過程において,小腸,大腸のいずれにおいても胃型形質発現が確認された.小腸は幽門腺への分化を,大腸は腺窩上皮への分化を示しやすい傾向がみられた.これは,正常粘膜における腺管形態の差に起因する可能性が示唆された.本年度は以下の実績を得た.1.外科的に切除された12例の潰瘍性大腸炎(UC)症例について,ホルマリン固定パラフィン組織切片を用いてHE染色により病理組織像を確認し,胃型上皮(腺窩上皮,幽門腺細胞)への分化を検討した.さらに,腸への分化誘導に関わる転写因子Cdx-2の発現を免疫組織化学的に検索し,形質発現との関係を調べた.2.12例中8例(75%)で明らかな腺窩上皮への分化を認めた.幽門腺細胞への分化(偽幽門腺化生)は1例(8.3%)のみであった.現在,胃型(MUC5AC, MUC6, HGM, HIK1083抗体)ならびに腸型(MUC2, villin抗体)の細胞分化マーカーを用いて確認中である.パネート細胞への分化は8例(75%)で認めた.3.腸型形質発現ならびにCdx-2発現は,すべての症例で保たれていた.消化管の細胞分化に関わる他の転写因子[Sox2, Sonic hedgehog(SHH), Musashi-1]に関しても免疫組織化学的検索を試みたが,有意な結果が得られなかった.4.潰瘍性大腸炎実験モデルマウス(2%デキストラン硫酸ナトリウム(DSS)投与マウス,10匹)を用いた検索では,DSS投与中止後20日目の粘膜には高度の慢性炎症と再生性変化を認めたが,明らかな胃型上皮の出現はみられなかった(HE染色のみでの検索).5.ヒトUC症例では,上皮の再生過程に加えて過形成性変化を伴う症例で,より強い胃型形質の発現が観察された.6.以上の結果より,大腸粘膜における胃型形質発現のような異分化(化生性変化)は,炎症の程度と逆相関があると思われた.このことから,粘膜の炎症が消腿して再生上皮の出現をみた後に,ある程度の時間的経過を経てから分化の方向が定まってくると考えられた.7.幽門腺への分化をほとんど認めなかった理由として,正常粘膜における腺管形態に起因する可能性が示唆された.
“自己複製"と“寿命・老化"制御における分子基盤の共通性

造血幹細胞の自己複製制御機構を解析するため、老化制御に関与すると考えられる分子を取り上げ、造血幹細胞に対する作用を検討した。今年度は、ヒトでその変異によって早期老化症を呈することが知られているATM(Ataxia Telangiectasia Mutated)について検討した。ATM欠失によって造血前駆細胞の頻度やその分化能力にはほとんど異常は認められなかったものの、長期骨髄再構築能といった幹細胞の能力の著しい低下を認めた。この幹細胞活性の異常は、胎生期における造血幹細胞にはほとんど認められず、成体になり出現した。さらに、加齢とともに幹細胞の異常が原因と考えられる骨髄不全状態となることから、加齢や老化との深い関与が示唆された。幹細胞機能の低下の原因を探索したところ、活性酸素の上昇であったことが判明した。すなわち、Atm欠損マウスでは、幹細胞において活性酸素が上昇していること、抗酸化剤を投与することによって、幹細胞の骨髄再構築能の低下を防ぐことを確認した。さらに抗酸化剤の投与によって、加齢に伴う骨髄不全も防ぐことから、活性酸素の上昇が造血幹細胞のプールの枯渇の原因になっていたことが明らかになった。さらに、活性酸素の上昇によって、細胞周期制御因子であるp16INK4a/Rb経路の活性化が自己複製を抑制していることが判明した。活性酸素は、個体や細胞の老化に重要な役割を担う因子であることが示唆されているため、幹細胞の自己複製と老化・寿命が共通の因子で制御されているのではないかという仮説を支持する結果であった。本研究では、造血幹細胞の未分化性の維持機構が、寿命・老化制御と共通ではないかという仮説に基づき、寿命・老化制御因子の幹細胞における役割を明らかにする。まず、我々は、骨髄において細胞周期から逸脱したG0期にある造血幹細胞は、骨髄の皮質骨表面において、骨芽細胞と接着しており、ここが造血幹細胞のニッチとよばれる場所であることを明らかにした。ニッチにおいて、幹細胞はストレスに抵抗性を示し、いわば冬眠状態で長期間過ごしている。細胞周期を停止させ、幹細胞のテロメアを長く保ち、Hayflick限界に近づくことのないようにして、いかに長く命を保つかに最大の努力を払っている。我々は、いくつかの候補遺伝子を強制発現系、ノックアウトマウス、siRNA法によるノックダウン法によって、造血幹細胞における役割を解析している。まず、酵母で寿命を制御していることが知られている脱アセチル化酵素Sir2が造血幹細胞に発現が強いことが明らかとなった。そこで、野生型およびドミナントネガティブ型のトランスジェニックマウスを作製し、現在、幹細胞を移植し、未分化性維持能を長期にわたって検討中である。つぎに、ヒトでその欠損が早老症を呈するATM (Ataxia Teleangiectasia Mutated)の解析をしたところ、ATMが造血幹細胞の再生能に重要な役割を果たしていることが明らかとなった。一方、前駆細胞では、分化および増殖能に異常を認めなかったため、ATMの機能は幹細胞に特異的であると考えられた。このATMによる幹細胞制御の分子機構を詳細に解析することによって、幹細胞の未分化性維持機構あるいは寿命制御を明らかにする予定である。