hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
新しい概念「テロメアノット」形成に基づいたテロメラーゼ阻害剤の開発

癌細胞で活性化されているテロメラーゼは、遺伝子の複製により短くなるテロメア領域を伸長する酵素であり、テロメア配列(ヒトではd(TTAGGG))に相補的なRNA配列r(CCCTAA)をもつリボヌコレオプロテインである。テロメアが短くなるとアポトーシスにより細胞か死滅するため、テロメラーゼ阻害による癌細胞選択的な治療効果が期待されている。従来のテロメラーゼ伸長阻害を目指して開発されてきた分子は、そのすべてがテロメアの一本鎖領域が形成すると考えられている「グアニン四重鎖」を安定化しようとする発想に基づいているが、ヒトテロメア一本鎖領域がグアニン四重鎖を核内で形成していることを示す確たる証拠はいまだ得られていない。G-Gミスマッチ認識分子「ナフチリジンダイマー」とヒトテロメア配列5'-TTAGG-3'との結合を、コールドスプレーイオン化質量分析法を用いて詳細に解析した。その結果、TTAGGG一単位にナフチリジンダイマー1分子が結合していることを明らかにし、TTAGGGの繰り返し配列がヘアピン構造を形成し、そこに生じたG-Gミスマッチにナフチリジンダイマーが結合した「テロメアノット」構造を形成することが支持された。この結果に基づいて、新たなテロメア結合物質「ナフチリジンテトラマー」を分子設計し、ナフチリジンダイマーをリンカーで結合することにより合成した。コールドスプレーイオン化質量分析法を用いたナフチリジンテトラマーとヒトテロメア配列の結合解析から、TTAGGG2単位につきナフチリジンテトラマー1分子が結合していることが示された。また、ヘアピン構造のナフチリジンテトラマーによる安定化をUV-融解曲線から求めたところ、連続するG-Gミスマッチにナフチリジンテトラマーが結合していることが確認された。ナフチリジンテトラマーを用いてヒトテロメア配列の伸長阻害をTRAPアッセイにより評価したところ、ナフチリジンダイマーに比べてより低濃度でテロメラーゼによるテロメア配列の伸長を阻害することが明らかとなった。
加熱面上の旋風再現と発生リスク評価

火災旋風の模型実験は、アルコールを用いた小規模の火源を配列して行った。火源の炎と炎の間に間隔を設け、その間に気流が流入し、炎による上昇気流と交ることで旋回が発生した。解明できた点は、(1)横風が強いと旋風は発生しない、(2)まとまった熱源が2つ以上あり、それぞれの熱源に間隔があると火災旋風が発生しやすいことであった。解析は、L字に配列した火源パターンについて行い、実験と同様な旋風の発生が確認できた。地震時の火災などで起きる大火によって火災旋風が避難場所で発生する可能性に対して、本研究では、このような大規模火災時の被害拡大を防ぐことを目的として、火災旋風の発生メカニズムを調べ、その対策を考えることを目的としている。火災旋風再現実験では、比較的小規模の火災実験と、FDS(Fire Dynamics Simulator)を用いたシミュレーション解析を行う。火災実験はキャンプ用アルコール、発煙管、可視化装置を使用する。アルコールを直径60mmのステンレス容器(写真1)に入れ、それを9個L字に配置し、点火、発煙、記録の順序で実験を行い、電動ポンプによる発煙管を用いた可視化によって、旋風の発生を確かめる。L字に配置した容器を周囲からの風に対して回転させて、横風の影響を受けてどのような位置で火災旋風が起こるかを可視化により調べた。火災旋風の発生のための装置は、最初に火源にガスを用いたが、火炎の上昇が強すぎるなどのため火災旋風を再現できなかったため、アルコールを火源とする方法に切り替えた。熱源をL字に配置した場合に、火災旋風とみなせる旋風が発生した。実験から旋風は、定常的に形成されることはなく、形成されても消滅し、再び形成される非定常的な挙動を持つことがわかった。実験において熱源の後流に旋風が形成される場所は、シミュレーションでも同じであることが確認できた。また、実験では旋風が形成されなかった熱源パターンであってもシミュレーションでは形成されることがあり、実験方法に問題を残すこともわかった。火災旋風の摸型実験では、アルコールを用いて小規模の火源を配列させて、火災旋風を発生させることを試みた。模型実験では、アルコール、アルコール容器(鉄製60mmφ)、発煙管、ビデオカメラ、風速計を使用する。アルコール容器を容易に移動できるように水槽用の砂を敷き詰めた設置台を作成した。設置台の周囲からの気流の影響(換気扇による風の流れなど)を減らすために三方の周囲に高さ70cmの金属網を置いた。さらにこれをアルミホイルで覆う(横風を遮る)場合と覆わない場合を行った。ビデオ撮影側の面は寒冷紗を伸ばしてビデオまでを含めるように覆った。火源は、設置台のほぼ中央位置に5×5の整形配列パターンで配置した。実験は、火源とする配置パターンの容器にのみ20ccずつアルコールを入れて、点火し、発煙開始、ビデオカメラ撮影し、燃焼終了(5分程度)まで行う。アルコール容器同士の間隔(1cm間隔で変更)や、アルコールを入れる箇所を変更させて、様々な熱源の状態(以下燃焼パターンと称す)の実験を行う。住宅街などの配列を考慮し燃焼パターンを手探りで調べていった。燃焼パターンから、複数の炎が寄り添い合う集合火炎になる。さらに炎と炎の間に間隔を設けることで、その間隔に気流が流入し、炎による上昇気流との交ることで炎の旋回が発生した。そのとき火災旋風が発生した火源に向かって周囲の火源の炎が旋回方向にたなびいた。火災旋風について解明できた点を簡単にまとめると、(1)横風が強いと旋風は発生しない、(2)まとまった熱源が2つ以上あり、それぞれの熱源に間隔があると火災旋風が発生しやすいことであった。火災旋風の模型実験では、ろうそくを用いて小規模の火源を配列させて、旋風を発生させることを試みた。模型実験では、ろうそく、発煙管、ビデオカメラ、風速計を使用する。実験には水槽用の砂を敷き詰めた設置台を用いて、設置台の周囲からの気流の影響(換気扇による風の流れなど)を減らすために三方の周囲に高さ70cmの金属網を置いた。今年度の実験で使用したパターンは、金沢の密集市街地を対象として、ろうそくで住宅の配置パターンを模擬した。実験はすべて水平の状態で行った。

配置パターンは主に道路形状や平面上の配置が類似したものに着目し、その外周を道路に沿うように建物が立ち並んでいると想定し、建物から道路幅8m(モデルでは2cm)の幅を開け周囲を約5m(1.2cm)の高さに相当する壁で囲った。ほぼ全てのパターンで程度の違いはあるが旋風の発生を確認することができた。旋風が確認できた配置パターンは、炎と炎のあいだにある程度の空間があり、旋風の多くは建物で囲まれている箇所ではなく側面(道路側、又は広い空間のある箇所)に発生した。部分的に燃焼させた実験でも外側、道路側の開けた空間に強い旋風の種となりそうな旋風が発生した。また、米国NISTによって開発された火災現象のためのシミュレータFDSを用いて、L字型の建物配置のパターンで火源の位置や数を変更したシミュレーションを行った。燃焼させた建物の側面に気流の旋回ができることが確認できた。気流の旋回を確認できる場所は建物ごとの決まった位置であり、建物と建物の間に空気の通り道となる空間が存在し、広い空間が存在する方向で旋風が発生した。火災旋風の発生場所が、わずかな横風によっても影響を受けるため、その調整に時間を費やしたため。24年度が最終年度であるため、記入しない。火災旋風発生パターンは5×5の火源設定によっても、ある程度観察されており、シンプルな発生パターンから先に進めて、市街地の木造家屋密集市街地を想定した火源パターンをモデル化して、火災旋風の発生状態を観察する。横風の影響などが問題であったが、寒冷紗などの防風シートを配置して、横風の影響を制御する。
葉内CO2濃度をターゲットにした節水灌漑

従来,潅水の量やタイミングは,土壌中の水分状態に基づいて決定されてきた.しかし,灌漑水の不足がちな島嶼地域では,節水灌漑の概念が必要である.作物の水ストレスに対する応答は種,品種,環境条件で著しく異なる.特に,葉の気孔開度や光合成速度は土壌水分ストレスに対して敏感に応答する.また,同等の土壌水分状態であっても光合成型によって応答は様々であり,土壌から葉の光合成器官へ至る水ポテンシャルの変化と植物生理学的パラメーターの関係性を明らかにする必要がある.本研究では,葉内CO2濃度(Ci)を実測し,その情報と気象データ,土壌水分状態に基づいて潅水のタイミングを決定し,作物の水利用効率の最適化を試みる.従来,潅水の量やタイミングは,土壌中の水分状態に基づいて決定されてきた.しかし,灌漑水の不足がちな島嶼地域では,節水灌漑の概念が必要である.作物の水ストレスに対する応答は種,品種,環境条件で著しく異なる.特に,葉の気孔開度や光合成速度は土壌水分ストレスに対して敏感に応答する.また,同等の土壌水分状態であっても光合成型によって応答は様々であり,土壌から葉の光合成器官へ至る水ポテンシャルの変化と植物生理学的パラメーターの関係性を明らかにする必要がある.本研究では,葉内CO2濃度(Ci)を実測し,その情報と気象データ,土壌水分状態に基づいて潅水のタイミングを決定し,作物の水利用効率の最適化を試みる.
胎児性白血病の発症・進展・自然治癒と造血微小環境の関連に関する研究

ダウン症候群新生児にみられる一過性白血病は、胎児期の主たる造血臓器である肝臓で生じ、生後に自然治癒する独特な胎児性白血病である。その病態発生には胎児の造血微小環境が深く関わると考えられる。胎児肝臓の造血微小環境を構成する肝芽細胞が一過性白血病細胞に及ぼす影響を、両者の共培養を主とする実験にて解析した。肝芽細胞は幹細胞因子等の造血因子を産生し、一過性白血病細胞の増殖を促進するとともに、巨核球への成熟も誘導した。一過性白血病の発症と進展には、胎児肝臓の造血微小環境から産生される造血因子が重要な役割を果たすことが明らかにされた。胎児性白血病細胞と造血微小環境との関係について、以下の2通りの研究を開始した。TLの白血病細胞と造血微小環境との関係を病理学的に検討するためには、組織切片におけるTL細胞を正確に同定する必要があるが、TL芽球は分化能を有するため、組織中の成熟した細胞がTL由来の腫瘍細胞か否かを決定することが難しい。とくにTLは新生児の疾患であり、新生児期の組織中に生理的に存在する髄外造血細胞との形態学的な鑑別が困難である。これを克服するためには、TL細胞のGATA1遺伝子変異を組織切片上でPCR法を用いて検出する方法(in situ PCR法)が最も確実な解決策である。本年度はこのin situ PCR法の確立を試みた。第一段階として、既知のGATA1遺伝子変異を有する症例の凍結保存TL細胞と対照細胞を用い、プライマーの作製に工夫を加えることで、変異特異的PCR法が可能であることを確認した。第二のステップとして、TL症例の組織切片および培養TL細胞のサイトスピン標本を用いたin situ PCR法を試行中である。内因性peroxidase活性の問題は回避できたが、非特異的な陽性反応への対処法を現在検討中である。2. MLL遺伝子関連白血病に関して:TLとともに胎児性白血病の代表疾患であるMLL遺伝子関連白血病細胞と胎児造血微小環境構成細胞との相互作用を調べるため、この両者の共培養実験を予定しており、我が国の小児がん研究グループに白血病細胞保存材料の供与を依頼中である。また剖検症例の病理標本を用いた組織形態的解析のため、日本病理学会剖検輯報から解析に適した症例の検索を学会に依頼し、その結果をすでに得ている。これらの症例の剖検標本を解析する予定である。研究実績の概要の1に述べたin situ PCR法は、多くの用途に利用できる優れた解析方法であるが、その実験技術の確立や結果の評価方法は必ずしも容易なものではなく、多くの条件設定や対照実験を必要とする時間を要する方法である。さらに現在、この方法を用いた研究を行っている研究室は世界的にも少ないため、この解析方法を用いている技術者から直接指導をいただくことは困難であり、文献の記載に頼りながら独自に技術を確立しなくてはならない。解析技術に関する種々の問題の解決に多くの時間を要した。このため、2に関する研究は、時間的制約の問題が主たる理由にて、研究材料の収集の段階にとどまっている。ダウン症候群の患児にみられる一過性造血異常症transient abnormal myelopoiesis (TAM)は、新生児期に自然治癒する特殊な胎児性白血病であり、胎児期の主たる造血臓器である肝臓にて生じると考えられている。肝臓の造血微小環境は、肝実質に相当する肝細胞と血管周囲細胞や血管内皮細胞などの間質細胞から構成される。本年度は胎児期の肝細胞(肝芽細胞)がTAMの芽球の増殖と分化に与える影響について、in vitroの実験にてその機能を解析した。肝芽細胞として2種のヒト由来細胞株(HUH-9、HepG2)およびマウス細胞株FHC-4D2を用いた。肝芽細胞(壁付着細胞)とTAM芽球(浮遊細胞)を、Transwellの多孔膜を介した分離共培養を行い、TAMの芽球の増殖と分化に及ぼす肝芽細胞の影響を解析した。TAMの芽球増殖に対し、HepG2は有意な作用を示さなかったが、HUH-9とFHC-4D2は、胎児肝間質細胞に比して弱いながら、一定の増殖刺激作用を示した。またHUH-9はTAM芽球の巨核球への分化を促進する作用も示した。肝芽細胞株の培養液上清をELISA法にて解析した結果、HUH-9とFHC-4D2細胞の培養上清中には、TAM芽球の増殖刺激作用を有するstem cell factorが高濃度で含まれ、さらにHUH-9細胞培養液上清には巨核球系の造血因子thrombopoietinも含まれることが示された。以上の結果から、TAMの芽球の増殖と分化には胎児肝の間質細胞とともに、肝芽細胞も関与することが判明した。TAMの芽球は巨核芽球の性格を有するが、これには肝芽細胞が産生するTPOが関与している可能性がある。胎児性白血病の発症と進展には、胎児期の肝臓の造血微小環境が重要な役割を果たすものと考えられる。初年度はTAMの芽球ならびにその分化した成熟球を、症例特異的なGATA1遺伝子変異を指標として、組織学的にこれを同定するためのin situ PCR法の開発に取り組んだ。しかし本研究に使用する予定のTAMの剖検組織を用いた解析では、材料のホルマリン固定時間等の影響と考えられるが、PCR法による遺伝子増幅が不十分で、明確な結果を得ることが出来ず、当初の計画どおりに研究が進展しなかった。

本年度は肝芽細胞株を用いたin vitroの培養実験を主体として、胎児肝臓の微小環境の役割を解析する研究を開始し、研究実績の概要に記載したごとく、一定の成果が得られた。したがって、初年度は遅滞したものの、それ以降の研究はおおむね計画どおりに進捗していると考える。ダウン症候群患児の新生児期にみられる一過性白血病transient leukemia (TL)は,胎児期の肝臓にて生じ、生後自然に治癒する特殊な胎児性白血病である。本研究はTLの病態と胎児期の造血微小環境との関わりを基礎的実験にて解析することを目的とする。胎児肝の造血微小環境を構成する主要な細胞の一つである肝芽細胞に由来する細胞株(HUH-9, HepG2, FHL-4D2)がTL細胞に及ぼす影響を、多孔膜を介した両者の分離共培養にて解析した。肝芽細胞はTL細胞に対して弱いながら増殖刺激作用と巨核球への分化促進作用を示した。肝芽細胞の培養上清からELISA法にて、stem cell factor (SCF)、thrombopoietin、insulin-like growth factor 2などの造血因子が検出された。肝芽細胞株の培養上清に対してSCF中和抗体が大きな抑制作用を示したことから、肝芽細胞の産生する造血因子の中でSCFがTL細胞の増殖に重要であると考えられた。TL患者はしばしば重篤な合併症である肝線維症を起こす。この機序として、TL細胞が胎児肝で産生するtransforming growthfactor b (TGFb)が関与すると考えられている。筆者らは、肝臓の星細胞がTGFb刺激にてmonocyte chemoattractant protein-1 (MCP-1)の産生を介して肝臓に線維化を起こすこともin vitroとex vivoの実験にて示した。これらの結果から、胎児期の肝臓において、肝芽細胞はSCF等の造血因子産生を介してTL細胞の増殖・分化に関わること、TLの合併症である肝臓の線維化にはMCP-1等のサイトカインが関与することが示され、TLの病態形成に胎児肝の造血微小環境構成細胞が産生する液性因子が深く関与することが明らかにされた。ダウン症候群新生児にみられる一過性白血病は、胎児期の主たる造血臓器である肝臓で生じ、生後に自然治癒する独特な胎児性白血病である。その病態発生には胎児の造血微小環境が深く関わると考えられる。胎児肝臓の造血微小環境を構成する肝芽細胞が一過性白血病細胞に及ぼす影響を、両者の共培養を主とする実験にて解析した。肝芽細胞は幹細胞因子等の造血因子を産生し、一過性白血病細胞の増殖を促進するとともに、巨核球への成熟も誘導した。一過性白血病の発症と進展には、胎児肝臓の造血微小環境から産生される造血因子が重要な役割を果たすことが明らかにされた。概要1に述べたin situ PCR法を平成28年度中には確立する予定である。この方法が利用可能となれば、胎児TL剖検症例を用いて、胎児期の造血臓器におけるTL細胞の存在を組織学的に確実に証明し、胎児臓器とTL細胞の増殖・分化の関連を明らかにする予定である。またin situ PCR法が技術的に十分な確立ができない場合には、その代替方法としてGATA1蛋白のN端およびC端に対する特異抗体を用いて、胎児組織中に浸潤するTL細胞が上記GATA1抗体のいずれに反応するかを解析する。TL細胞はGATA
複合アニオン化表面による機能創発

晶癖・晶相を制御してフラックス育成した目的組成の電極活物質結晶粒子表面を複合アニオン化し,結晶表面の表面自由エネルギー変化による晶癖発達面制御や,電解液分子の吸着配向,さらに電解液の酸化分解反応@正極表面または還元分解反応@負極表面をともなって生成するSEI層の構造に及ぼす効果を明らかにし,高効率かつ安全なLi+伝導界面反応場(人工SEI層)形成の道筋をつける。
鳥インフルエンザウイルスのヒトへの病原性獲得および伝播の分子機構解明

1997年以来、高病原性鳥インフルエンザ(H5N1)ウイルスは東南アジアを中心に発生し続けている。160人を超える人々がこのウイルスによって感染・死亡しているが、人間同士の感染の発生は稀である。この事実は、新型ウイルス発生・世界流行の可能性に関与する基本的な問題を提起している。鳥由来のH5N1ウイルスは、鳥型のウイルスレセプターを欠くと思われる人間に、なぜ、効率的に感染・増殖が可能なのであろうか?また、人間同士での感染を制限する分子学上の障壁は何であろうか?私達は、前年度に、高病原性鳥インフルエンザウイルス感染患者から分離された1つのウイルス株が、鳥型・人型の両方のシアル酸(インフルエンザウイルスレセプター)を認識する性質を有することを報告すると同時に、宿主側要因として、人間の呼吸器組織に分布するシアル酸の性状を報告した。本年度、更に、1918年に流行したインフルエンザウイルス(スペイン風邪)の生物学的性状の特徴づけを行い、病原性の獲得機構を解明した。また、ウイルスRNA合成酵素(RNAポリメラーゼ)における点変異の、ヒト細胞での増殖における生物学的意義、同変異に感受性を示す哺乳動物を用いた生物学的意義付けを行った。つまり、この変異はヒトを含む感受性細胞においてウイルスポリメラーゼ活性を上昇させ、ウイルスポリメラーゼ活性の上昇は感染個体内での一次増殖部位におけるウイルス粒子生産量を増加させる。一次増殖部位におけるウイルス粒子生産量の増加は他の感受性組織への二次的な播種の効率を増加させることが判明した。私達の研究成果はいずれも、今後の鳥インフルエンザウイルスの病理発生機序解明の主軸となる結果を提示している。100人を超える人々がこのウイルスによって感染し、高い死亡率を示しているが、人間同士の感染の発生は稀である。鳥由来のH5N1ウイルスは、鳥型のウイルスレセプターを欠くと思われる人間に、なぜ、効率的に感染・増殖が可能なのであろうか?また、人間同士での感染を制限する分子学上の障壁は何であろうか?私たちは、2003年に発生した、H5N1ウイルスの人への感染の際に、患者から分離された1つのウイルス株(A/Hong Kong/213/03)を用いて、その生物学的特徴づけと病原性解析を行った。その過程で、同ウイルスが鳥型・人型の両方のシアル酸(インフルエンザウイルスレセプター)を認識する性質を有することを報告した。また、宿主側要因として、人間の呼吸器組織に分布するシアル酸の性状を報告した。人間の上部の呼吸器官中の上皮細胞が、人由来のインフルエンザウイルスのレセプターとされる、SAα2、6Gal、を多く含有し、反対に、呼吸の細気管支および肺胞には、鳥由来のウイルスによって優先的に認識されるSAα2、3Galを多く含有することを報告した。これらの事実は、これまでH5N1ウイルスの感染がめったに人間同士で起こらなかったが、下部呼吸器においては効率的に増殖する傾向があった事実に対するひとつの理由付けとなる。私達のデータは、効率的な人同士の感染を起こす能力を獲得するためには、高病原性鳥インフルエンザウイルスは、人型のレセプター認識能を含む多数の変異を経なくてはならないことを示している。
黒毛和種牛の出血性素因遺伝子の除去法に関する検討

われわれは、1982年以来、南九州で300頭以上の出血性疾患に罹患した和牛を調査研究し、本疾患がChediak-Higashi症候群(C-HS)、血友病様疾患、第XIII因子欠乏症の3つの遺伝性出血性疾患に起因することを報告した.本研究ではこれらの疾患の牛群からの除去法について検討した.1)これらの疾患の遺伝様式を確定するために、血統書、発症状況をもとに血統分析、分離比分析、遺伝子頻度による集団遺伝学的解析を行い、3疾患がいずれも、常染色体性劣性に遺伝することを確認した.2)診断が確定していなかった血友病様疾患はvon Willebrand因子の活性測定及びマルチマ-解析の結果から、ヒトの分類上、von Willebrand病(vWd)typeIIIに相当することが明らかとなった.3)3疾患とも、常染色体性劣性に遺伝することから、本疾患の牛群からの除去には保因牛の摘発が必要であるが、第XIII因子欠乏症以外では、保因牛のスクリーニングに有効な検査法は見出せなかった.4)第XIII因子欠乏症では、保因牛の第XIII因子活性は中等度の低下を示した.また、第XIII遺伝子サブユニットa遺伝子のクローニングによって、本疾患と連鎖した変位部位が発明され、PCR-RFLPsによる発症牛、保因牛の診断が可能となった.遺伝子診断の結果は臨床診断と一致し、調査した種雄牛の中で、約10%が保因牛であることが判明した.今後、C-HS、vWdにおいても、第XIII因子欠乏症と同様に、遺伝子診断による保因牛摘発法の開発が必要である.われわれは、1982年以来、南九州で300頭以上の出血性疾患に罹患した和牛を調査研究し、本疾患がChediak-Higashi症候群(C-HS)、血友病様疾患、第XIII因子欠乏症の3つの遺伝性出血性疾患に起因することを報告した.本研究ではこれらの疾患の牛群からの除去法について検討した.1)これらの疾患の遺伝様式を確定するために、血統書、発症状況をもとに血統分析、分離比分析、遺伝子頻度による集団遺伝学的解析を行い、3疾患がいずれも、常染色体性劣性に遺伝することを確認した.2)診断が確定していなかった血友病様疾患はvon Willebrand因子の活性測定及びマルチマ-解析の結果から、ヒトの分類上、von Willebrand病(vWd)typeIIIに相当することが明らかとなった.3)3疾患とも、常染色体性劣性に遺伝することから、本疾患の牛群からの除去には保因牛の摘発が必要であるが、第XIII因子欠乏症以外では、保因牛のスクリーニングに有効な検査法は見出せなかった.4)第XIII因子欠乏症では、保因牛の第XIII因子活性は中等度の低下を示した.また、第XIII遺伝子サブユニットa遺伝子のクローニングによって、本疾患と連鎖した変位部位が発明され、PCR-RFLPsによる発症牛、保因牛の診断が可能となった.遺伝子診断の結果は臨床診断と一致し、調査した種雄牛の中で、約10%が保因牛であることが判明した.今後、C-HS、vWdにおいても、第XIII因子欠乏症と同様に、遺伝子診断による保因牛摘発法の開発が必要である.1982年以来調査を続けてきた遺伝性出血性疾患、すなわち、Chediak-Higashi症候群(C-HS)、第VIII因子低下症及び第XIII因子欠乏症の3疾患について継続的に調査研究を行い、保因牛摘発の可能性について検討した。1)自然発症牛とその血縁牛の継続的収集調査本年収集した出血牛は26頭で、依然発症は続いているが、C-HS、第VIII因子低下症は減少し、第XIII因子欠乏症が主体となった.この中で、従来第VIII因子低下症と診断してきた症例について検討した結果、第VIII因子の低下、出血時間の延長、常染色体性劣性の遺伝様式などから、von Willebrand病,type IIIの可能性が高いことが明らかとなった.2)地域を特定し、3疾患発症牛の血統調査を行い、統計学的に解析した結果、C-HS、第VIII因子低下症、第XIII因子欠乏症のいずれも常染色体性劣性の遺伝様式を示し、従来の推測が裏付けられた.3)止血学的検査による保因牛摘発が可能かどうかを知るため、C-HSでは血小板凝集能、血小板成分、第VIII因子低下症では第VIII因子活性、第XIII因子欠乏症では第XIII因子活性を測定したところ、保因牛と考えられる発症牛の母牛で異常値を示したのは、第XIII因子低下症のみであった.4)遺伝子診断法の予備段階として、第XIII因子欠乏症について予備的検討を開始した。.今後の課題として、第VIII因子低下症では診断の確定、第XIII因子低下症では、保因牛の第XIII因子活性の定量、さらに各疾患の遺伝子診断法の検討がある.和牛の遺伝性出血性疾患、すなわち、Chediak-Higashi症候群(C-HS)、血友病様疾患及び第XIII因子欠乏症の3疾患について継続的に調査研究を行い、保因牛摘発の可能性について検討した。1)自然発症牛とその血縁牛の継続的収集調査本年収集した出血牛は昨年度とほぼ同数の29頭で、C-HS、血友病様疾患は少なく、第XIII因子欠乏症が主体であった.

この中で、従来第XIII因子低下症と診断してきた症例は第XIII因子の低下、出血時間の延長、常染色体性劣性の遺伝様式、抗ヒトvon Willebrannd抗体を用いたマルチマ-解析、疾患牛の血漿によるヒト血小板凝集能などから、von Willebrand病,typeIIIであることが明らかとなった.2)第XIII因子の測法を検討した結果、モノダンシルカダベリン法によって定量が可能であることが判明し、疾患牛の父牛、母牛ともに第XIII因子活性の低下が認められた.3)東京大学との共同研究の結果、疾患牛との比較から第XIII因子のcDNAに点突然変異が認められ、PCR-RFLPによって検出された変異アリルは症状、第XIII因子活性とよく一致することが確認された.この結果、第XIII因子の定量とPCR-RFLPにより、同種接合体(疾患牛)および保因牛の検出が可能となった.今後の課題として、血友病様疾患では診断の確定、C-HSおよび血友病様疾患の遺伝子診断法の検討がある.和牛の遺伝性出血性疾患について継続的に調査研究を行い、保因牛摘発の可能性について検討した。1)自然発症牛とその血縁牛の継続的収集調査:本年収集した出血牛は71頭で、その内訳はChediak-Higashi症候群(C-HS)30頭、von Willebrand病0頭、第XIII因子欠乏症9頭で、さらに、これらの疾患とは症状や検査所見が異なる症例が32頭あり、新たな出血性疾患の存在が疑われた.2)C-HS:モデル動物であるベ-ジュマウスでC-HS遺伝子がクローニングされたため、牛でもクローニングを開始した.3)von Willebrandb病:現在までに収集した29頭の血漿の解析から、本疾患がヒトの分類に当てはめるとtype IIIであることが確認されたが、本年は発症が認められなかった.4)第XIII因子欠乏症:症例と種雄牛の検査から第XIII因子の定量とPCR-RFLPにより、同種接合体(疾患牛)および保因牛が確実に検出できること、調査した種雄牛の約10%が保因牛であることが明らかとなった.今後の課題として、C-HSおよびvon Willebrand病type IIIの遺伝子診断法の確立、そして、新たな出血性疾患の解明がある.
染色体に転移した外来性薬剤耐性遺伝子の薬剤耐性菌の世界的拡散におけるリスク評価

薬剤耐性遺伝子を含む環状DNA(薬剤耐性プラスミド)の菌から菌への伝達は、抗菌薬へ耐性を示す薬剤耐性菌出現の主な要因とされている。基質特異性拡張型βラクタマーゼ(ESBL)産生菌は、臨床における出現が問題とされている薬剤耐性菌の一つである。近年、insertion sequence (IS)により、プラスミドから染色体へ転移した薬剤耐性遺伝子(染色体性薬剤耐性遺伝子)を保有するESBL産生菌が、市中及び院内に高頻度に検出された。本研究は、染色体性薬剤耐性遺伝子の、薬剤耐性菌の拡散への役割を明らかにすることを目的としている。初年度にCTX-M型ESBL産生菌をモデルとしてISの一つであるISEcp1によるプラスミドから染色体へのblaCTX-Mの転移が高頻度であることを確認した(0.51%、SD=0.37)。ISEcp1はInverted repeat right(IRR)領域を有するが、さらに下流のランダムな配列(IRR関連領域)の認識がblaCTX-Mの転移に関わっている事が知られている。本年度はISEcp1により転移したblaCTX-Mとその周辺領域を解析した。その結果、1ISEcp1によるblaCTX-Mの転移の際には、特定のIRR関連配列が高頻度に関与しており、2そのIRR関連領域の配列はISEcp1本来のIRR領域と類似していることが確認された。以上の結果より、ISEcp1によるIRR配列認識の曖昧さは、blaCTX-Mのプラスミドから染色体への高頻度な転移に寄与する一因であることが考えられた。これらの研究成果は、市中及び院内における染色体性薬剤耐性遺伝子を保有する薬剤耐性菌の高い検出率の原因の一端を示すものであると考えられる。CTX-M型ESBL産生菌をモデルとして、Insertion sequenceによる薬剤耐性遺伝子のプラスミドから染色体性への転移が及ぼす薬剤耐性菌の出現への役割の一端を明らかにした。得られた研究成果を2019年4月に開催される日本細菌学会、及び2019年6月に開催される米国細菌学会において発表することが決定している。現在これらの実験データをまとめ、査読付き国際学術誌に投稿中である。一方で、一部の研究計画については実験手法の特性から修正を加えつつ研究を遂行したものの目的を達成するには至っていない。以上のことから、ある程度の進展はあったが、研究計画の一部に支障が生じている点を踏まえ、研究の進捗はやや遅れていると結論した。近年、カルバペネム系抗菌薬及びコリスチンに対して耐性を示すグラム陰性腸内産生菌による難治性の重篤な感染症も報告されており、コリスチン耐性遺伝子mcr-1保有細菌の動向にも注目が集まっている。ISの一つであるISApl1はmcr-1のプラスミドー染色体間の転移に関与することが報告されている。次年度はこれまでに作出した実験モデル株、及び確立したプロトコルをもとに、ISApl1によるmcr-1の転移頻度を決定し、近年報告されている染色体に転移したmcr-1を保有するコリスチン耐性細菌出現の原因の一端を明らかにすることを目的とする。CTX-M型基質特異性拡張型βラクタマーゼ(ESBL)産生菌は様々な抗菌薬に対して耐性を示す薬剤耐性菌の一つである。近年、院内及び市中においてプラスミドから染色体に転移したblaCTX-M(染色体性blaCTX-M)を保有する細菌が高頻度に報告された。本研究では、CTX-M型ESBL産生菌をモデルとし、Insertion sequence (IS)によるプラスミドから染色体への薬剤耐性遺伝子の転移が薬剤耐性菌の出現に果たす役割の一端を明らかにすることを目的とした。本年度は1ISによりプラスミドから染色体に転移したCTX-M型ESBL遺伝子の発現量の確認、及び2CTX-M型ESBL遺伝子発現ユニットの転移の頻度と、影響する因子の解明の二点を目的とした。上記1については実験手法上の問題から実験計画の変更を余儀なくされた。その為、blaCTX-M及びその上流のISを蛍光タンパク質に置き換えたモデルE. coli株を作製した。作製したモデルE. coli株の蛍光強度の違いを観察することで、blaCTX-M及びその上流のISの発現量を確認できる事が期待される。上記2についてはISによるプラスミドから染色体へのblaCTX-Mの転移頻度を決定する為のモデルE. coli株を作製した。作製したモデル株を一定条件で培養することにより、プラスミドから染色体へ転移したblaCTX-Mを保有するE. coliのみを効率的に選択培養することが可能なスクリーニング法を樹立した。樹立したスクリーニング法と分子生物学的テクニックを用いてblaCTX-Mのプラスミドから染色体への転移頻度(0.51%)を決定した。決定したblaCTX-Mのプラスミドから染色体への転移頻度は、染色体性blaCTX-Mを保有する細菌の市中、及び院内における高頻度な出現に寄与する因子である可能性を示唆した。本年度は1Insertion sequenceによりプラスミドから染色体に転移したCTX-M型ESBL遺伝子の発現量の確認、及び2CTX-M型ESBL遺伝子発現ユニットの転移の頻度と、影響する因子の解明の二点を目的として研究を行った。上記1については、遺伝子の発現量を確認する為のリアルタイムPCRを行う上で、DNAポリメラーゼに混入するE. coliゲノムが障壁となった。そのため現在は遺伝子の発現を蛍光強度として検出することが可能となるような遺伝子組み換え大腸菌を作製することで、当初の研究計画に支障がないように研究を進めている。

上記2については、当初の研究計画に沿ってCTX-M型ESBL遺伝子発現ユニットの転移の頻度を決定することができた。その研究成果について、2018年3月に開催された日本細菌学会にてポスター発表をおこなった。また更なる実験によって得られた詳細なデータを含めた研究成果は、2018年6月に開催される米国細菌学会においてポスター発表を通した情報発信が予定されている。現在これらの研究成果をまとめ、薬剤耐性菌分野で重要な海外学術誌であるAntimicrobial Agents and Chemotherapy誌へ投稿中である。本年度に行ったこれらの学会発表や論文投稿から研究が良好に進展していると評価する事ができる。薬剤耐性遺伝子を含む環状DNA(薬剤耐性プラスミド)の菌から菌への伝達は、抗菌薬へ耐性を示す薬剤耐性菌出現の主な要因とされている。基質特異性拡張型βラクタマーゼ(ESBL)産生菌は、臨床における出現が問題とされている薬剤耐性菌の一つである。近年、insertion sequence (IS)により、プラスミドから染色体へ転移した薬剤耐性遺伝子(染色体性薬剤耐性遺伝子)を保有するESBL産生菌が、市中及び院内に高頻度に検出された。本研究は、染色体性薬剤耐性遺伝子の、薬剤耐性菌の拡散への役割を明らかにすることを目的としている。初年度にCTX-M型ESBL産生菌をモデルとしてISの一つであるISEcp1によるプラスミドから染色体へのblaCTX-Mの転移が高頻度であることを確認した(0.51%、SD=0.37)。ISEcp1はInverted repeat right(IRR)領域を有するが、さらに下流のランダムな配列(IRR関連領域)の認識がblaCTX-Mの転移に関わっている事が知られている。本年度はISEcp1により転移したblaCTX-Mとその周辺領域を解析した。その結果、1ISEcp1によるblaCTX-Mの転移の際には、特定のIRR関連配列が高頻度に関与しており、2そのIRR関連領域の配列はISEcp1本来のIRR領域と類似していることが確認された。以上の結果より、ISEcp1によるIRR配列認識の曖昧さは、blaCTX-Mのプラスミドから染色体への高頻度な転移に寄与する一因であることが考えられた。これらの研究成果は、市中及び院内における染色体性薬剤耐性遺伝子を保有する薬剤耐性菌の高い検出率の原因の一端を示すものであると考えられる。CTX-M型ESBL産生菌をモデルとして、Insertion sequenceによる薬剤耐性遺伝子のプラスミドから染色体性への転移が及ぼす薬剤耐性菌の出現への役割の一端を明らかにした。得られた研究成果を2019年4月に開催される日本細菌学会、及び2019年6月に開催される米国細菌学会において発表することが決定している。現在これらの実験データをまとめ、査読付き国際学術誌に投稿中である。一方で、一部の研究計画については実験手法の特性から修正を加えつつ研究を遂行したものの目的を達成するには至っていない。
残存言語脳機能イメージングによる失語症の回復支援研究

本研究では、光トポグラフィ等の脳機能イメージング法によって言語課題遂行時の失語症患者の脳活動のパターンから残存言語脳機能を検証した。失語症患者の残存脳機能探索に有望と見られる2つの課題として、呼称課題と語流暢課題を検討した結果、前者が比較的重度の失語症患者にも遂行可能である頑健な課題であることが分かった。失語症患者の残存脳機能探索に有望と見られた呼称課題について、光トポグラフィを用い、失語症35名の亜急性期患者に対して検討をおこなった結果、左ウェルニケ野の賦活が顕著であった。この賦活パターンは、ブローカ野損傷の機能代償を表す賦活パターンとしては妥当なものと考えられた。本研究の目的は、脳幾能イメージング去を用いて失語症患者に残存する言語目断幾能を検索し、その結果に基づいて言語回復のリハビリテーションメニューを設計支援する、新たなテーラーメード脳機能画像診断法を創出することである。近年、失語症患者の言語機能の回復は、言語処理に関係しない部位の新たな機能獲得ではなく、残存する言語脳機能の活用によるという説が有力になりつつある。そこで、本研究では、MEG、fMRI、光トポグラフィを組み合わせたマルチモーダルな脳機能イメージング法によって言語課題遂行時の失語症患者の脳活動のパターンから残存言語脳機能を最大限に活用するための、患者の状態に即した最適なリハビリテーションメニューの設計支援を行なう。これらを統合して、失語症の回復を支援するための、テーラーメード脳機能画像診断システムの基礎を構築する。初年度の探索的研究において、失語症患者の残存脳機能探索に有望と見られる2つの課題が見いだされてきた。第一の呼称課題は、比較的重度の失語症患者にも遂行可能である頑健な課題であることが分かった。第二の語流暢課題は、遂行が可能な場合には、振幅の大きなシグナルが得られ、時間応答特性が多様であるという点で、情報量の多い課題であることが分かった。また、光トポグラフィによる計測が失語症患者の残存脳機能探索には極めて有望であることが実証されつつある。従来の解析法は100msという光トポグラフィの時間分解能を活用したものではなかったが、計測タイムポイント全点の情報を有効に活用する一般線形モデルの導入、及び、これに用いる基底関数を動的に変動させる新規解析法を開発が有望であるという可能性が浮上しつつある。この新手法によって、計測データから得られる情報が飛躍的に増大するため、今後の検討をさらに進めていくことが有望と考える。これまでの研究において失語症患者の残存脳機能探索に有望と見られた呼称課題について、光トポグラフィを用い、失語症35名(脳出血9、脳梗塞26)の亜急性期患者に対して検討をおこなった。解析方法としては、発話に伴うノイズに頑健と考えられる脳血流動態基底関数への回帰に基づく一般線型モデルを用いた。この結果、左前頭前野背外側部、左ウェルニケ領域、右側頭葉と頭頂葉の一部を含む領域に有意な賦活が見いだされた。特に、左ウェルニケ野の賦活は顕著で、この賦活パターンは、ブローカ野損傷の機能代償を表す賦活パターンとしては妥当なものと考えられた。しかし、他の領域の賦活が妥当なものであるかどうか、ノイズ混入によるアーティファクトの可能性を考慮しつつ、より詳細な解析を行う。本研究は過去に類例のない研究であり、失語症患者への影響も考慮等、その成果が担う責務は重大である。このため、成果発表に際しては細心の注意を払う必要があると考えられる。

近年、失語症患者の言語機能の回復は、言語処理に関係しない部位の新たな機能獲得ではなく、残存する言語脳機能の活用によるという説が有力になりつつある。そこで、本研究では、MEG、fMRI、光トポグラフィを組み合わせたマルチモーダルな脳機能イメージング法によって言語課題遂行時の失語症患者の脳活動のパターンから残存言語脳機能を最大限に活用するための、患者の状態に即した最適なリハビリテーションメニューの設計支援を行なう。これらを統合して、失語症の回復を支援するための、テーラーメード脳機能画像診断システムの基礎を構築する。初年度の探索的研究において見いだされた失語症患者の残存脳機能探索に有望と見られる言語課題について、光トポグラフィを用い、語流暢課題を中心に詳細な検討を行なった。語流暢課題としては語頭音課題とカテゴリー課題が挙げられる。このうち、カテゴリー課題については、左右の言語関連領野(下前頭回、中心前回、中心後回、上中側頭回)に局在した左優位の脳活動が観察された。一方、語頭音課題では左右の言語関連領野に加え、左周辺領野(縁上回、中前頭回)及び右周辺領野(縁上回、角回、中前頭回)の活動が見られた。印欧語では右縁上回、角回の賦活は報告されていない。日本語語頭音課題は他言語の語頭音課題と課題特性が異なるため、日本語に特徴的な脳賦活パターンが存在することが見いだされた。すなわち、音韻検索、音韻生成要素が強く、該当語数が少ないため課題難易度が高いという特徴があり、左右言語周辺領野(縁上回、角回、中前頭回)の賦活により、音韻的な機能補助が行われている可能性が考えられる。当初の計画に比べ、MEGによる言語関連脳機能計測については適切な課題が見いだせていないが、光トポグラフィについては、適切な言語課題を見いだせたとともに、予想外の方法論的発展がなされた。また、これに伴う論文発表も順調に進行している。全体的には、概ね順調な進行状況と考えられる25年度が最終年度であるため、記入しない。当初の計画と比較し、マルチモーダルな言語関連脳機能計測という点では、MEGによる解析に技術的な課題があるが、光トポグラフィについては、当初の予定より重厚な解析が実現している。特に、日本語に特有の脳活動パターンが見いだされたことにより、言語課題におけるローカライゼーションの必要性が示された点は重要である。すなわち、印欧語の課題における脳活動パターンは参考としつつも、日本語の課題における脳活動パターンを詳細に検討する必要であるという重要な知見が得られた。また、研究進展に伴い、論文発表も順調に進行している。全体的には、概ね順調な進行状況と考えられる平成24年度は、亜急性期の30名程度の重症失語症患者に対して、呼称課題による脳機能解析を実施する。亜急性期の失語症患者の脳機能イメージング研究は技術的困難を伴うため、これまで、数例程度の報告しかなされていないが、本研究で行う計測は、最大規模のものとなる。統計的にもグループ解析に耐えうる規模の計測例であり、臨床医学的にも極めて有用なデータが得られると期待される。一方、語流暢課題遂行に伴う脳の時間応答から有用な情報を抽出するため、一般線形モデル(GLM)による解析系を探索する。具体的には、従来用いられてきた単一の脳血流動態応答関数(HRF)による解析ではなく、課題の時間特性に合わせて、探索的にHRFを変化させる新手法の適用を試みる。
ワモンゴキブリの体液性レクチンの肢の再生に於ける機能解析と構造決定

研究代表者らはこれまでに、ワモンゴキブリの体液から共通抗原性を示す3種類のC型レクチンを精製し、その内regenectin、26kDa lectinと命名したレクチンが肢の再生芽に一過的に出現することを見いだしている。Regenectinが再生芽の筋細胞の周囲に局在するのに対し、26kDa lectinは上皮組織の外側に局在する。従って、ワモンゴキブリの肢の再生芽形成過程では、これらのレクチンが異なる組織の細胞接着分子として働くことにより、再生芽の空間的な秩序の形成に働くものと推察される。更に、regenectinは正常な発生過程には発現しないことから、再生筋細胞の接着に特異的に働く分子であると考えられる。今年度は、regenectinの肢の筋細胞における局在を、組織切片の染色と蛍光抗体法を組み合わせることにより詳細に解析した結果、このレクチンは筋細胞の基底膜か細胞膜の部分と、筋細胞に接する上皮細胞の内側の表面にも局在することを見いだした。このことから、regenectinは再生芽の筋細胞同士の接着に働くばかりでなく、上皮組織と筋組織という異なる組織の細胞の選別にも関与する可能性を新たに指摘できた。更に、regenectinと26kDa lectinの部分アミノ酸配列を決定した結果、これらのレクチンの一次構造は、既に我々の研究室で同じワモンゴキブリの成虫体液から精製し、cDNAクロ-ニングによって一次構造が明らかとなっているLPS結合蛋白(LPSの糖鎖部分を認識するC型レクチンの一種)の一次構造と高い類似性を示すことを見いだした。従って、これらのレクチンは、実際に一次構造の類似したファミリ-を構成していることが示された。次年度は、これらのレクチンの再生における役割を解析するとともに、cDNAクロ-ニングによるレクチンの構造解析を行い、再生芽におけるレクチンmRNAの発現を解析することを目的として研究を推進する。
金属-非金属転移流体のダイナミクス-ゆらぎを切り口とした相転移記述の試み-

金属-非金属転位に伴う液体のダイナミクスの変化を観測し、転移に伴う「ゆらぎ」との関連を議論した。大型放射光施設SPring-8を用いた非弾性X線散乱、X線小角散乱手法により、転移を起こす代表例であるセレン-テルル混合系、また議論の標準材料として、気体-液体相転移に伴う「ゆらぎ」が顕著になる超臨界流体水について測定を行った。密度ゆらぎの増大、「速い音速」と呼ばれる現象、など共通した現象を観測し、議論を進めた。近年になり、金属-非金属転移を起こす流体(液体)系では、その転移領域で特徴的なスローダイナミクスを呈することが実験的に明らかとなってきた。本研究では、このようなダイナミクスを「動的ゆらぎ」として捉え、ゆらぎの観点から金属-非金属転移の相転移としての位置づけを行うことを試みる。今年度は、最終的に包括的な議論を行う上で重要となる、以下2つの参照系を対象として、大型放射光施設SPring-8での測定を行った。1.セレンーテルル混合液体系の金属-非金属転移領域における静的ゆらぎこのようなゆらぎは既に25年以上前に予想され、これまでいくつかのグループが観測を試みていたが、信頼の置けるデータは得られていなかった。今回セレン50-テルル50混合系について広い温度(<1000°C)圧力(<1800気圧)範囲でのX線小角散乱測定を行い、転移に伴うメゾスケールの静的密度ゆらぎの変化の直接観測に初めて成功した。今回得られた密度ゆらぎの大きさは、超音波速度の変化から間接的に見積もられていたものよりはるかに小さく、このようなゆらぎは「静的」と「動的」で大きく異なる側面を持つことが明らかとなった。2.超臨界水のダイナミクス非弾性X線散乱測定を行い、超臨界水の高周波数ダイナミクスを調べた。気体-液体臨界点に近づくにつれ、本測定から得られる「高周波数音速」と(超音波測定から得られる)マクロな音速との相違(=「正の分散」)が次第に大きくなることが確認され、この「正の分散」が臨界ゆらぎを特徴づける一つのパラメータと成りうることが分かった。本研究は、流体系の金属-非金属転移について、ゆらぎの直接観測を行い、ゆらぎの観点から相転移の位置づけを試みる。今年度はセレンーテルル混合糸について、組成比50:50および70:30の試料について、それぞれSPring-8を利用した透過率、小角散乱、非弾性散乱測定を行った(50:50組成の小角散乱測定については、前年度の実験の再現性確認)。X線透過率測定の結果から、温度上昇と共に試料が低密度相から高密度相へと連続的に転移していくことが観測できた。転移領域のちょうど中間当たりでは、小角散乱強度が極大を示し、転移に伴い密度ゆらぎが増大することを改めて観測できた。また非弾性X線散乱測定から見積もった(高周波数)音波速度は、超音波測定の(低周波数)音速に比較して著しく速く、所謂「速い音速」状態となっていることが分かった。特にこの「速い音速」度合いは、転移領域に向かって増大するという、小角散乱強度と似た温度変化を示した。このような結果から、この「速い音速」度合いは、ゆらぎの良い指標であるということが示せた。組成依存性については、(以前行った純粋テルルの結果も含め)セレンの割合を増加させるにつれ、それぞれの温度変化曲線は高温側へとシフトしていった。これは過去行われた超音波や電気伝導度など、物性変化ともコンシステントなものであった。近年になり、金属-非金属転移を起こす流体(液体)系では、その転移領域で「速い音速」などの特徴的なダイナミクスを呈することが実験的に明らかとなってきた。今年度も引き続き、転移を起こす典型例である液体セレン-テルル混合系を対象として実験を行った。液体テルルのX線小角散乱測定では、測定温度範囲(450-900°C)で転移に伴う有意な散乱強度の変化を得ることができなかった。ただこれは真の転移温度が深い過冷却域に有り(300°C)、ゆらぎの影響が測定限界以下に小さいためであったと現時点では考えている。組成比70:30、50:50に対する非弾性X線散乱測定では、転移領域で「速い音速」状態となっているという、前年度までの測定結果の再現性を確認すると共に、測定点を増やし、議論の材料を増強することが出来た。また実験と平行して、転移による「ゆらぎ」とダイナミクスとの関係について議論を行った。その結果、このような「ゆらぎ」の概念は金属-非金属転位に限らず一般の液体-液体構造相転移にも適用可能であることが示唆された。
機能性ナノコンポジット形成に基づく次世代型特定保健食品の開発

酵素処理技術の発展により、難水溶性食品中有効成分に糖を付加させ、可溶化して吸収性が向上された機能性添加剤が特定保健用食品として販売されている。これらの機能性添加剤の可溶化現象が添加剤自身のナノ集合体形成によるものであることを解明した。また、水中で形成されるナノ集合体の疎水的ユニットと難水溶性の食品中有効成分を相互作用させ、数ナノメートルの有機ナノコンポジットを構築させることに成功した。有機ナノコンポジット形成により、難水溶性有効成分の見かけの溶解度を顕著に向上させ、吸収性向上にも成功した。また、難水溶性有効成分の光安定性向上も示唆された。本研究は、食品中に含まれるものの、これまでに利用することが困難であった難水溶性の有効成分を、機能性添加剤のナノ集合体形成現象を有効に活用して、水中で「見かけ上溶けている状態」を作り出して、体内への吸収性を高めることを目的とするものである。そこで、種々の機能性添加剤を用いて、水中で難水溶性の食品中有効成分とナノサイズの複合体の形成の有無について検討した。本年度は機能性添加剤として新たに糖転移ルチンを使用し、数十種類の難水溶性化合物を対象として、溶解度上昇現象が認められるかについて検討した。糖転移ルチンを用いて見かけの溶解度上昇が起こるかを検討したところ、化合物間で見かけの溶解度上昇に関して挙動が大きく異なることが判明した。これらの基礎データの集積により、本研究の最終目的であるデータベース構築に大きく貢献する成果が得られたものと考えている。なお、本年度の成果として、Quercetinの抗酸化作用向上のための固体分散体の調製の可能性や、糖転移化合物が難水溶性薬物Ipriflavoneの溶解性に与える現象について新規知見が得られ、Ipriflavoneに対しては溶解度の向上の寄与度は糖転移ルチン>糖転移ヘスペリジン>糖転移ステビアの順であることが判明し、対象となる薬物とのナノ構造体形成には、添加剤の選択が大いに関与することを明らかとした。また、糖転移ヘスペリジンが水中で構築するナノ構造についても、千葉大学との共同研究により精査し、新たな考察が得られた。本研究のデータベース作成に関しては、これまでに糖転移ヘスペリジン(Hsp-G)、糖転移ステビア(Stevia-G)を主に使用して、難水溶性の化合物の溶解性の改善挙動してきた。昨年度に引き続き、本年のメインのテーマは糖転移ルチン(Rutin-G)に関して、難水溶性の化合物の溶解性の改善挙動を精査しデータベース化すること、及び糖転移ルチンによってもたらされる溶解度改善挙動のメカニズム、吸収改善効果の検証などであった。なお、次年度には新たな酵素処理物として、糖転移ナリンジンに関する検討を立ち上げてデータベース作りを行う予定である。まずは、糖転移ルチンによってquercetinの溶解性が大幅に改善されることを報告し、その溶解度改善効果がRutin-G >Hsp-G > Stevia-Gであることを明らかとした。糖転移化合物による難水溶性化合物の溶解度改善効果の大きさは、対象化合物によって大きく異なることを報告した。また、tranilastのRutin-Gによる溶解度改善効果、ナノ構造体のTEMによる解析、及び吸収性改善効果について精査し、Rutin-Gとの噴霧乾燥処理によってtranilastの吸収性が大幅に改善されることを報告した。本研究の目的は、糖転移させた機能性食品添加剤が形成する、数ナノメートルのナノ集合体構造中に難水溶性化合物を組み込んだ「ナノコンポジット」を形成させて、難水溶性の食品有効成分の溶解性及び吸収性を改善させることにある。最終年度では、糖転移へスぺリジン、糖転移ステビア、糖転移ルチン、糖転移ナリンジンを基盤としたデータベースライブラリー作成も順調に進み、粉末化最適処方を速やかに探索できる環境がおおよそ整った。そこで、次世代型の機能性食品開発を目指して、難水溶性フラボンを糖転移ルチン存在下で固体分散化させたところ、難水溶性フラボンの溶解性や吸収性を大幅に向上することに成功した(Food. Chem., 190, 1050-1055 (2016))。ナノコンポジット構造解析を基にした発展研究として、新たなタイプの高次複合体を水中で形成させることにも挑戦し、その結果、クルクミン/糖転移へスぺリジン/水溶性高分子の複合体構造を形成できることを発見した。クルクミン/糖転移へスぺリジン/水溶性高分子の複合体形成によって、クルクミンの溶解度を1000倍以上に上昇させたまま、複合体構造を水中で安定に存在させることにも成功した(Adv. Powder Tech., 27, 442-447 (2016))。一方で、糖転移ルチンの粉砕助剤としての能力についても見出すことができ、葉酸を糖転移ルチン存在下で粉砕すると100 nmよりも小さな粒子まで粉砕可能であること、及び葉酸の光分解を糖転移ルチンが抑制することを見出した(J. Agr. Food. Chem., 64, 3062-3069 (2016))。以上の成果から、糖転移させた機能性食品添加剤を用いて、複数の調製手法を用いて、難水溶性の食品中有効成分を効率的に利用可能な、新規の機能性食品の開発手法を提案することに成功した。