hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
初到達時間に基づく境界摂動の理論構築

今年度は、前年度までの研究結果を整理し直し、種々の境界摂動実験と比較することにより、境界摂動に対する応答に共通してみられる、摂動の詳細に依存しない性質を明らかにした。第一に、半導体微粒子を混合した系での光の照射に対する電流の応答、触媒上での化学反応における容器の圧力変化に対する反応速度の応答、溶液の境界温度変化に対する熱流の応答、といった種々の境界摂動実験を比較し共通の性質を調べた。その結果、これらの境界摂動実験は、粒子の流入、移動、流出という三つの本質的な過程を共通して含んでおり、これまで我々が用いてきた粒子の流入・流出に基づくモデルが境界摂動実験の一般的な性質を調べる道具として適当であることを確認した。第二に、粒子の移動が量子力学に従う場合に加えて、運動が古典力学や確率分布の時間発展で記述される場合についても解析を進めることにより、境界摂動に対する応答と到達時間分布の関係が、種々の系において普遍的に成り立つことを明らかにした。過去に川崎らによって解析された粒子の移動がランダムウォークに従うモデルでは、境界摂動、及び、吸着壁がない状態での初到達時間分布が境界摂動に対する応答関数であるという結果が得られていた。一般的なモデルに基づいてこの結果を再検討することにより、川崎らの結果は特殊な状況でのみ成立し、一般の設定では、これまでの量子系の研究で明らかにしてきた関係式と同様に、吸着壁の性質に依存するように定義した到達時間分布が、境界摂動に対する応答関数になることを示した。本研究では、アモルファス合金や半導体微粒子の混合系など、構造が不規則な系の輸送能力を特徴づける際に力を発揮する、境界摂動実験の論理的な解析を目指している。通常の実験手法では注目する系の全体に摂動を加えることが多いが、境界摂動実験では、系の一端のみに時間変化する摂動を加え、それに対する応答を反対の端で観測するのが特徴である。我々は、境界摂動実験の設定から、摂動情報の一端から他端への到達と摂動に対する応答との繋がりに着目している。特に、摂動が粒子の系への流入として与えられる場合に集中して、粒子の運動が量子力学に従うモデル系を対象に研究を進めた。このモデル系では、粒子の系からの流出を現象論的な複素ポテンシャルで記述することにより、観測可能な量として粒子の端から端への到達時間を定義することができる。解析計算により、このように定義した到達時間の分布が摂動に対する応答関数になることを明らかにし、到達時間分布と応答との関係式を導出した。さらに、乱れた系における到達時間分布を数値的に計算することにより、乱れを強くすることで応答に現れる特徴と、到達時間分布の広がりとの関係を明らかにした。また、より現実的な系への適用を見据え、構造が時間的に揺らぐ系で、粒子の到達時間を数値的に計算した。揺らぎの基礎的な効果を調べるため、最も単純なモデルとして、周期的に時間変化する不純領域により二つに分断された系を対象に選んだ。計算で得られた到達時間から、揺らぎの振動数が特定の値を取る場合に、端への到達が極端に遅くなる現象を見出した。この現象は、特殊な状況で不純領域を通過する時間スケールが遅くなることを意味している。この点に着目し、不純領域を摂動として扱う特異摂動法で解析計算を行い、分断された一方の領域に局在しているモードの固有エネルギー分布と、到達が遅くなる振動数との関係式を明らかにした。前年度までの抽象的なモデルの解析から得られた知見を基礎として、今年度は具体的な実験と比較することを念頭に、二種類の理論モデルを解析した。第一に、Vanmaekelberghらによって提案されている、半導体微粒子の混合系での電子輸送に関する境界摂動実験のモデルを考察した。まず、彼らのモデルから、基本的な要素を抽出することにより、その本質をとらえた、より単純なモデルを構築した。次いで、そのモデルを解析し、境界摂動に対する線形応答の範囲内では、定常状態における電子の端から端への到達時間分布が応答関数になっていることを明らかにした。この対応関係は、これまでの抽象的なモデルから得た予想と整合しており、到達時間分布に基づく境界摂動実験の理解が有用であることを示唆している。第二に、DNA分子を介した電子移動反応に対して、境界摂動型実験の適用可能性を考察した。これまでに、DNA分子の両端に色素を結合し、光子の照射で電子が励起するように工夫することで、励起した電子がDNAを介して他端に移動する反応(電子移動反応)を観測する実験が多数、行われている。この実験を境界摂動型に発展させることを目標に、Okadaらが提案している密度行列の時間発展に基づくDNAを介した電子移動反応のモデルを考察した。その結果、モデルを拡張することによって、照射光の強度を摂動とする境界摂動実験が表現できることを明らかにした。

その結果、これらの境界摂動実験は、粒子の流入、移動、流出という三つの本質的な過程を共通して含んでおり、これまで我々が用いてきた粒子の流入・流出に基づくモデルが境界摂動実験の一般的な性質を調べる道具として適当であることを確認した。第二に、粒子の移動が量子力学に従う場合に加えて、運動が古典力学や確率分布の時間発展で記述される場合についても解析を進めることにより、境界摂動に対する応答と到達時間分布の関係が、種々の系において普遍的に成り立つことを明らかにした。過去に川崎らによって解析された粒子の移動がランダムウォークに従うモデルでは、境界摂動、及び、吸着壁がない状態での初到達時間分布が境界摂動に対する応答関数であるという結果が得られていた。一般的なモデルに基づいてこの結果を再検討することにより、川崎らの結果は特殊な状況でのみ成立し、一般の設定では、これまでの量子系の研究で明らかにしてきた関係式と同様に、吸着壁の性質に依存するように定義した到達時間分布が、境界摂動に対する応答関数になることを示した。
構造物の動的空力応答に対するJetを利用したファジィアクティブ制御

昨年度は,本研究に関連した研究成果として,静止した三次元角柱に作用する空気力をジェットによって制御することが可能であることを風洞実験的に確認した.本年度は,その成果に基づき,ジェットによって三次元角柱の風に起因する振動を制御する方法に関する風洞実験的な研究を行った.静止模型の後流に発生する周期的な渦は,模型上流側隅角部から交互に発生させたジェットによって同期し,変動空気力を増大させる風速領域が存在する.このことは,構造物の振動を抑制することを目的とする振動制御問題においては好ましい現象ではない.そこで,本研究では,構造物の変位応答をフィードバック量として検出し,振動変位に対する相対的時間遅れを発生させジェットの噴出タイミングに関する制御効果を調べた.その結果,変位からπ/2程度遅れた時点でジェットを噴出させるとき制御効果の大きいことがわかった.この結果は,昨年度の研究結果からも予想されたことであり,若干時間遅れが存在するがジェット噴出側に流体力の発生することに対応しており,速度と逆位相で力が作用するとき振動を制御する。また,制御効果の大きくなるジェットの噴出位置を調べるため,ジェットを定常的に噴出させて応答特性を調べた.定常的なジェットの噴出に対しては,接近流の風速分布特性に応じて最適な噴出位置の存在することがわかった.このことに関連して,変位応答をフィードバックしてアクティブに切り替えてジェットを噴出する場合においても最適な噴出位置の存在することと,噴出位置によって最適な噴出タイミングが変化するという結果が得られた.昨年度は,本研究に関連した研究成果として,静止した三次元角柱に作用する空気力をジェットによって制御することが可能であることを風洞実験的に確認した.本年度は,その成果に基づき,ジェットによって三次元角柱の風に起因する振動を制御する方法に関する風洞実験的な研究を行った.静止模型の後流に発生する周期的な渦は,模型上流側隅角部から交互に発生させたジェットによって同期し,変動空気力を増大させる風速領域が存在する.このことは,構造物の振動を抑制することを目的とする振動制御問題においては好ましい現象ではない.そこで,本研究では,構造物の変位応答をフィードバック量として検出し,振動変位に対する相対的時間遅れを発生させジェットの噴出タイミングに関する制御効果を調べた.その結果,変位からπ/2程度遅れた時点でジェットを噴出させるとき制御効果の大きいことがわかった.この結果は,昨年度の研究結果からも予想されたことであり,若干時間遅れが存在するがジェット噴出側に流体力の発生することに対応しており,速度と逆位相で力が作用するとき振動を制御する。また,制御効果の大きくなるジェットの噴出位置を調べるため,ジェットを定常的に噴出させて応答特性を調べた.定常的なジェットの噴出に対しては,接近流の風速分布特性に応じて最適な噴出位置の存在することがわかった.このことに関連して,変位応答をフィードバックしてアクティブに切り替えてジェットを噴出する場合においても最適な噴出位置の存在することと,噴出位置によって最適な噴出タイミングが変化するという結果が得られた.
Dlk1-Dio3インプリント制御領域の機能解析

申請者は本提案によりIG-DMRの解析を中心としたPlk1-Pio3インプリンティング領域の遺伝子発現制御、DNAメチル化の確立、DNAメチル化維持の分子メカニズムを解明することにより生殖細胞の正常な分化に必須の領域であるIG-DMRの機能を同定し、将来の再生医学、再生医療への応用のための分子基盤を築いていきたいと考えている。今年度は昨年度までに同定したIG-DMR内の進化上保存された配列とIG-DMR内の特異的リピート配列に対する結合タンパク質の精製とその同定を行った。DNA配列をビーズに結合し、胎生13.5日の核タンパク質をプルダウンすることにより結合タンパク質を精製、その後DSD-PAGEと銀染色によりタンパク質を可視化、質量分析によりタンパク質を同定する手法を用いた。その結果、IG-DMR内の特異的リピート配列に結合する因子の一つとして、ピストンのメチルトランスフェラーゼの一種であるSmyd2が同定された。まだ質量分析による同定までには至っていないが、進化上保存された配列に特異的に結合するタンパク質も銀染色により確認できている。また、今までにこのリピートに結合する因子の候補として酵母One hybrid法でZbtb22を同定している。Zbtb22ノックアウトマウスの作製と掛け合わせを行ったが、Zbtb22ノックアウトマウスは妊性のある正常な個体であった。Zbtb22ノックアウトマウスでのDlk1とGt12の発現解析をreal-time RT-PCRにより行ったが、Zbtb22がインプリンティングの確立や維持には影響がないという結果を得た。現在メチル化解析を行っているところである。IG-DMRは約8kbあるので、その制御メカニズムを分子レベルで解明するには大きすぎるため、平成23年度はまずIG-DMR内の制御候補領域の絞り込みを行った。進化上の保存性を元に、IG-DMRのDlk1側に2カ所、Gtl2側に1カ所高度に保存されている領域を同定した。また既存のIG-DMRの中央付近に存在するヒト、ヒツジ、マウスで保存されている繰り返し配列を含め、4カ所を制御候補領域とした。4カ所を制御候補領域の機能する際の分子メカニズムの解明のため、それらの領域に結合するタンパク質の同定を試みた。そのため、4カ所を制御候補領域とネガティブコントロールの配列をアガロースビーズに結合したカラムを作製し、核タンパク質のプルダウン実験を行い、繰り返し配列に特異的な66kDaのタンパク質を精製したので、平成24年度質量分析によりそのタンパク質を同定する。また、他の3カ所に対する配列特異的タンパク質の精製は来年度も引き続き行う。また、DNaseI hypersensitivity siteの検出実験も行ったが、こちらからは制御候補領域を検出できていない。酵母one-hybrid法により検出した上記繰り返し配列に結合する可能性のある因子であるZbtb22に関してはノックアウトアレルを持ったマウスを掛け合わせ、ホモ欠損マウスを作製した。現在のところ野生型との表現型の違いは観察されていないが、今後メチル化解析とインプリント遺伝子の発現解析を行う必要がある。セカンダリーなインプリントメチル化の分子メカニズムの解明に向けた実験がマウスの導入に時間がかかったためにできていないため。IG-DMR結合タンパク質の同定を早急に行い、ノックアウトマウスによる解析を実行する。セカンダリーなインプリントメチル化の分子メカニズムの解明に向けた実験も行っていく。
生体高分子の分子構造解析のための溶液Ｘ線散乱クロマトグラフィー法の評価・開発研究

溶媒や処理条件に依存した生体高分子の多様な構造体を、分離と同時に構造評価する手法の開発が望まれている。本研究では、生体高分子をクロマトグラフィーで分離しオンライン接続した溶液X線散乱測定装置により、溶出分子のサイズ、分子量および分子構造を同時計測する溶液X線散乱クロマトグラフィー法について、生体高分子の分離直後の溶液構造物性評価における有効性の提示に焦点を絞り、食品加工や食品開発など生体高分子関連分野への普及展開を見据えた基盤研究を行った。本研究では、生体高分子をクロマトグラフィーで分離しオンライン接続した溶液X線散乱測定装置により、溶出分子のサイズ、分子量および分子構造を同時計測する溶液X線散乱クロマトグラフィー法について、生体高分子の分離直後の分子構造解析における新たな有効性の検証に焦点を絞り、食品加工や食品開発など生体高分子関連製造現場への普及展開を見据えた基盤研究を行う。本年度は、食品に係る生体高分子の機能や加工特性の制御などの有効利用に役立てるため、結晶化やNMR構造解析が困難な食品関連タンパク質の溶液中の変性特性を散乱法により明らかにした。具体的には、分子量数万のアレルゲン性タンパク質であるウシ血清アルブミンの熱処理条件で混在するモノマーと可溶性高分子量会合体のクロマトグラフィー分離条件における溶液X線散乱クロマトグラフィー法による可溶性会合体の分子構造変化を明らかにする実験によりウシ血清アルブミンの熱変性可溶性分子の溶液X線散乱データを評価し、生理的条件での天然状態単量体とは異なる散乱曲線を示すことを明らかにした。本結果は、食品タンパク質の熱処理加工時のゲル化の初期過程の解析と関連するので、今後のこの分野での散乱手法の有効利用が期待できる。また、大腸菌外膜に低分子の通過孔を形成する内在性生体膜タンパク質OmpFについて、界面活性剤ドデシル硫酸ナトリウムによる可溶化条件下で、分子サイズが約4nmの天然3量体と変性単量体について溶液X線散乱実験データを評価中である。さらに、本手法において未開拓のイオン交換クロマトグラフィーモードについての評価研究の準備を開始した。本研究では、結晶化およびNMR解析の成功していない生体高分子やその集合体あるいは異種分子との複合体などについて、溶液X線散乱クロマトグラフィー法による分離直後の分子構造解析に焦点をしぼり本手法の特性を明らかにする。本年度は食品に係る生体高分子の機能や加工特性の制御などの有効利用に役立てるため、結晶化やNMR構造解析が困難な食品関連糖タンパク質の溶液構造物性について検討した。具体的には、溶液X線散乱クロマトグラフィー法により、結晶化およびNMR解析の成功していない軟骨プロテオグリカンの天然条件における分離直後の分子構造を評価した。その結果、排除体積を持ったほどけた構造で、高分子鎖の堅さの指標である持続長は13-16 nmであることを明らかにした。高分子量プロテオグリカンに免疫賦活機能が示唆されているので、本解析はその生理機能解明に重要な意味がある。また、同法によりムチンの超分子会合体の形状およびタンパク質変性作用のある界面活性剤・ドデシル硫酸ナトリウムSDS共存下での分子構造を評価し、両者の構造は異なることを示唆するデータを得たので解析を進めていて、溶液構造物性評価における本手法の有効性が提示できると考えている。また、本条件でのムチンへのSDSの結合量は単純タンパク質より少なく、ムチンのゲル電気泳動法の適用は慎重に検討する必要があることが示唆される。さらに、分子量数万のアレルゲン性タンパク質であるウシ血清アルブミンや鶏卵白アルブミンの熱処理条件で混在するモノマーと可溶性高分子量会合体のクロマトグラフィー分離条件における同法による可溶性会合体の分子構造変化を明らかにする実験を開始した。本研究では、生体高分子をクロマトグラフィーで分離しオンライン接続した溶液X線散乱測定装置により、溶出分子のサイズ、分子量および分子構造を同時計測する溶液X線散乱クロマトグラフィー法について、生体高分子の分離直後の分子構造解析における新たな有効性の検証に焦点を絞り、食品加工や食品開発など生体高分子関連製造現場への普及展開を見据えた基盤研究を行った。本年度は、前年度に準備を開始したイオン交換クロマトグラフィーモードの溶液X線散乱クロマトグラフィー法への適用について評価した。具体的には、試料として水溶性食品タンパク質である卵白リゾチームを使用し、イオン交換クロマトグラフィーの溶出分子のサイズと分子量を評価することが可能かを検討した。その結果、溶液散乱データの取得は充分に可能であることを見いだした。しかしながら、サイズ評価の予備的知見を得ることができたものの、その詳細を精査する必要があることがわかった。つまり、散乱角度ゼロ外挿強度値の評価からの分子量計算における溶出試料濃度の定量性などを再検討する必要があることがわかった。さらに、未開拓であった連続測定システムの構築の可能性の有無を検討した。

これまで主として使用していた放射光散乱測定装置の測定システムの変更にともない、より高性能な散乱検出器の利用が可能となることになり、これまで使用してきた一次元検出器で見いだしてきた知見から、新測定システムに適応した自動測定システムの開発が重要であることが明らかとなった。これまでの成果から、溶液X線散乱クロマトグラフィー法の分離直後の分子構造解析における有効性を示すことができ、本手法の他分野への技術普及が十分に期待できる。食品タンパク質溶液学平成25年度の研究実施計画の内容に概ね則した研究実験を行った。平成24年度の研究実施計画の内容に概ね則した研究実験を行った。前年度に開始したイオン交換クロマトグラフィーモードについて評価研究を継続する。具体的には、試料は水溶性タンパク質である卵白リゾチームを対象とし同手法を適用し、イオン交換クロマトグラフィーの溶出分子のサイズ、分子量および分子構造を同時計測することが可能かを検証する。さらに、オートサンプラーの本測定システムへの組み込みを計画し、未開拓であった連続測定システムの構築の可能性を精査する。これらの成果により、放射光溶液X線散乱測定の未経験者においても、本手法の利用が容易となり、他分野への技術普及が十分に期待できる。以上の実験から、溶液X線散乱クロマトグラフィー法について、分離直後の分子構造解析についての本手法の新規な有効性の評価・実証を行い、本手法の他分野への技術普及に資する知見を整理する。ムチンおよびアルブミンの可溶性熱処理会合体の分子構造解析の一部については前年度からの継続研究を行う。また、大腸菌外膜に低分子の通過孔を形成する内在性生体膜タンパク質・OmpFについて、界面活性剤ドデシル硫酸ナトリウムによる可溶化条件下で、分子サイズが約4nmの「天然3量体(分子量11万)」と「変性単量体(分子量3.7万)」が再現性良く維持できることを見いだしているので、この2状態について、溶液X線散乱クロマトグラフィー法により、分子構造の違いから溶出成分が識別可能かを検討する。さらに、本手法において未開拓のイオン交換クロマトグラフィーモードについての評価研究の準備を開始する。該当なし
放射性廃棄物地層処分における粘土緩衝材の潜在的バリア性能に関する研究

高レベル放射性廃棄物の地層処分では、粘土緩衝材(Na型ベントナイト)中でオーバーパック(炭素鋼)が徐々に腐食し、鉄腐食生成物(主としてFe^<2+>イオン)が粘土緩衝材中に放出される。このため、Fe^<2+>イオンが、Na^+やCa^<2+>イオンのようなベントナイトの元々の交換性陽イオンと置換されることで、Fe(II)型ベントナイトが生成し、その結果粘土緩衝材の性能が変わる可能性がある。ベントナイトの変質による膨潤能の低下は、緩衝材の性能を劣化させる負の効果の一つである。一方、ベントナイトの変質は、緩衝材の性能を向上させる、正の効果をもたらす可能性がある。例えば、Fe(II)型ベントナイトを含有する変質ベントナイトは、ある種の放射性核種を収着・固定化し、その結果それら核種を遅延させ得る。そこで、本研究では、Fe型化したベントナイトの調製およびその特性評価を行った。Fe型試料は、不活性ガス雰囲気のグローブボックス内でNa型ベントナイトをFeCl_2溶液に接触させる、従来型のイオン交換法によって調製した。一方、本研究では、ニトリロ三酢酸の鉄(II)錯体(Fe^<2+>-NTA)溶液を用いる新しい調製方法を開発した。調製した試料および同試料を大気中で酸化させた試料に対し、SEM-EDX観察、FT-IR分析、メスバウアー分光、マイクロPIXE分析、湿式化学分析等による特性評価を行った。これらの試料の特性評価の結果、ベントナイト中に交換性陽イオンとして存在するFe^<2+>イオンは比較的安定な状態にあることが示唆された。また、Fe^<2+>-NTA溶液を用いた新しい調製方法は、不活性ガス雰囲気のグローブボックスを用いずにFe(II)型ベントナイトを調製でき、Cl^-イオンのような不都合なイオン種に対して試料を接触させなくても良いという点で優れた調製方法であることがわかった。高レベル放射性廃棄物の地層処分では、緩衝材として用いられる圧縮ベントナイトに、超長期間にわたって高いバリア性能が求められる。しかし、圧縮ベントナイトは処分下で必ずしも安定ではなく、例えば廃棄物の処分後に炭素鋼製オーバーパックが腐食することにより、ベントナイトはそこからの鉄腐食生成物によって鉄型化することなどが考えられる。こうしたベントナイトの変質は、膨潤能などの機能を低下させる可能性がある一方で、特定の核種に対する収着能の向上など、従来の評価以上のバリア性能(「潜在的バリア性能」)を発現させる可能性もある。そこで、本研究では、このベントナイト緩衝材に期待される潜在的バリア性能に関する実験・研究を行い、地層処分の安全評価に及ぼす影響を検討することとした。研究初年度の平成16年度は、メスバウアー分光装置のセットアップを進めるとともに、酸素濃度1ppm以下の雰囲気制御グローブボックス内で調製したFe型ベントナイト試料および大気中で酸化させた同試料に対して、SEM-EDX観察ならびにFT-IRによる赤外分光分析を行った。また、透過拡散法によるベントナイト中の鉄(II)イオンの拡散実験を行った。鉄型試料の赤外分光では、Na型試料がFe型化する際およびFe型試料が酸化する際に、シート構造中のFeの酸化還元状態が変化する可能性が示された。一方、鉄(II)イオンの拡散実験では、研究期間内に破過曲線は得られず、精度の良いデータを求めることは出来なかったが、ベントナイト試料への鉄(II)イオンの累積

浸入量の経時変化から、Fe(II)イオンのベントナイト中の実効拡散係数が10^<-12>[m^2s^<-1>]程度、また収着容量が10^4[-]程度である可能性が示された。高レベル放射性廃棄物の地層処分では、処分後、粘土(Na型ベントナイト)緩衝材中の炭素鋼製容器(オーバーパック)が徐々に腐食し、そこから溶出したFe^<2+>イオンがベントナイトの主たる構成鉱物であるモンモリロナイトをNa型からFe型に変質させる可能性がある。このようなFe型への変質反応は、膨潤能などの緩衝材性能を劣化させると懸念される一方で、Fe型化したモンモリロナイトあるいは鉄腐食生成物が特定の放射性核種を固定化して、移行を遅延させる性能向上の効果も期待される。そこで、本研究では、粘土中の鉄の腐食および鉄腐食生成物の化学的挙動の解明を目的として、Fe型化したベントナイトの調製およびその特性評価に関連した研究を行った。研究2年目の平成17年度は、FeCl_2溶液を用いたイオン交換法で調製したFe型モンモリロナイトのμ-PlXE分析を行い、調製した試料中にCI^-イオンが残存することを確認した。このため、FeCl_2溶液を用いない調製方法として、L-アスコルビン酸を添加したニトリロ三酢酸の鉄(II)錯体(Fe^<2+>-NTA)溶液を用いる方法を考案した。この方法は、大気中で容易に酸化するFe^<2+>イオンを、準安定なキレート錯体にしてモンモリロナイトと接触させるものであり、幅広いpH領域で鉄の析出・沈殿を避けてイオン交換反応を進めることができる。また、イオン交換後のキレート剤をイオン交換水で容易に洗い出すことが出来、その際のモンモリロナイト中のFe^<2+>イオンの酸化を最小にすることができ、さらに雰囲気制御グローブボックスのような装置が不要となる利点がある。調製した試料の特性評価の結果、この方法で得られた試料の交換性陽イオンの大部分はFe^<2+>に置換されており、モンモリロナイトのシート構造にも変化がないことが確認された。そこで、本研究では、Fe型化したベントナイトの調製およびその特性評価に関連した研究を行った。Fe型試料の調製は、酸素濃度1ppm以下の雰囲気制御グローブボックス内でのFeCl_2溶液を用いた従来型のイオン交換法の他、本研究において新たに考案したニトリロ三酢酸の鉄(II)錯体(Fe^<2+>-NTA)溶液を用いる方法により実施した。調製した試料および同試料を酸化させて得た試料に対し、SEM-EDX観察、FT-IR分析、メスバウアー分光、マイクロPIXE分析、湿式化学分析等を行い、従来法では調製試料に塩化物イオンの残留があるのに対して、Fe^<2+>-NTA溶液を用いる方法ではより簡便に純度の高い試料が得られることを明らかにした。また、モンモリロナイト層間に侵入したFe^<2+>イオンは安定化し、その酸化反応は遅延することを見出した。
高感度シングルセル解析を用いたヒト造血幹細胞分画の層別化

前年度までにCD34+38-CD90+のヒト造血幹細胞分画中にCD35を発現する亜分画が存在することを明らかにしていた。CD35が補体系の制御因子であることから、本年度は補体系に関する機能解析を進めた。ヒト血清の添加培養系において、CD35+HSCはCD35-HSCより細胞表面へのC3b沈着が有意に少ないことが確認された。この特徴はCD35阻害抗体や可溶性CD35を加える事でキャンセルされた。次いでin vivoでの機能解析として、CD35陽性/陰性HSCを補体活性が失われている免疫不全マウス(NSG)と維持されている免疫不全マウス(BRGS)に異種移植し、ヒト造血の再構築能を解析した。NSGマウスにおいてはCD35陽性/陰性HSCは同等のヒト造血を再構築したが、BRGSマウスへの移植ではCD35+HSCのみが生着可能であった。放射線による前処置後の異種移植系においては、CD35+HSCは活性化した補体系から逃避し、生存・増殖優位性を示すことが明らかとなった。化学療法後の患者サンプルにおいても、治療後の早期相においてHSC分画中のCD35陽性細胞の比率が高いことが確認され、stress hematopoiesisにおいてはCD35+HSCが重要な役割の担っている可能性が示唆された。HSC層別化分子(CD35)の同定に成功し、FACSで前向きに純化して、その機能的意義まで明らかにすることができた。本年度までに得られた結果を基に、論文作成予定。またCD35発現制御メカニズムの解明や特定のニッチ構成細胞との連関がないかなど研究を進めていく予定としている。健常骨髄・臍帯血よりマルチカラーFACSでソーティングした造血幹細胞(HSC)分画を用いて、細胞表面抗原の網羅的発現解析を行った。HSCとそのすぐ下流に存在する多能性前駆細胞分画(MPP)を比較して、高発現(FACS蛍光強度2倍以上)している分子を検索したところ4分子に絞られた。このうち高発現が再現性を持って確認され、遺伝子発現解析でも同様の結果が得られたCD35分子に着目した。CD35はHSC分画の15-40%程度に発現が見られ、MPP→CMP→GMPでは発現していなかった。一方で赤芽球/巨核球系前駆細胞(MEP)分画の50-80%程度にCD35が発現していることから、当初CD35+HSCはHSC分画内に存在する最も未分化なMEP集団と想定したが、in vitroでの解析ではCD35-HSCと同様に全細胞系統への分化能が示された。シングルセル遺伝子発現解析でも、CD35+HSCはCD35-HSCと同様に系統特異的遺伝子の発現は極めて低レベルに留まっており、MEPとは明らかに異なる遺伝子発現パターンを有していた。さらにin vivoでの解析(異種移植・継代移植)やcell cycle assayなどの結果から、CD35+HSCはCD35-HSCに比して、dormantな状態を保持しながら必要時には高い造血再構築能を有するという「幹細胞性」の特徴をより強く有する細胞分画であることが確認された。平成29年度目標であったHSCの層別化候補分子の同定に成功し、その機能解析(in vivo/in vitro)まで当該年度に完了している。研究は予定どおりに進捗しており、このままCD35+HSCの機能解析を進めヒト造血分化モデルにおける位置づけを明らかにしていく。CD35が補体制御蛋白であることから、HSC分画におけるCD35発現の意義に関しても検討を加える予定としている。
ゲノミクスと計算科学の手法に基づくワクチン抵抗性のA群ロタウイルスのゲノム解析

A群ロタウイルス(RVA)感染症は、乳幼児に重篤な下痢症を引き起こす。日本では、年間25万人の乳幼児がRVA感染症に罹患し、3万人が入院している。2011年以降、希望児を対象にワクチンの任意接種が開始され、2014年のワクチン接種率は60%にまで上昇した。これにより、RVA感染症の患者数はワクチン導入前の40%程度に減少した。しかしその後、患者数は大きく変動せず、依然として多くの患者が毎年発生している。このことから、現在流行しているRVAはワクチンへの耐性を有している可能性が考えられる。そこで本研究では、ワクチン導入後に検出されたRVAを対象に解析を行い、RVAの性質の変化を明らかにする。本年度では、当研究所(地方独立行政法人大阪健康安全基盤研究所)に保管されている検体に関する情報の収集および解析、さらに検体からのA群ロタウイルス(RVA)の解析法の検討を行った。感染症発生動向調査事業に基づき、医療機関から当研究所に搬入された感染性胃腸炎疑いの患者検体のうち、RVA遺伝子が検出されRVA感染症であると当研究所で確定された検体は167件であった。RVAワクチンが認可された2012年から2018年にかけて、患者数の明確な減少は確認できなかった。しかし、検査の過程で明らかになっている検体に含まれるVP7遺伝子は、2009年から2013年まではG1遺伝子型が多数を占めていたのに対し、2014年以降はG2遺伝子型またはG3遺伝子型が多数を占めていた。このことから、ワクチン認可の前後では異なるRVAが流行していると考えられた。検体に付随する情報を確認したところ、2014年以降の一部の検体においてRVAワクチンの接種歴(RotaTeqの接種歴あり、Rotarixの接種歴あり、いずれかのワクチンの接種歴あり、あるいは接種歴無し)が確認できた。一方、RVAの解析法の検討は2018年に当研究所に搬入された2検体を用いて行った。患者糞便からのRNA抽出、逆転写反応、PCR、ならびにダイレクトシーケンスの条件検討を行った。これらの検討により、RNA抽出においてキットに付属するキャリアRNAを用いず行うこと、逆転写反応においてDenatureを95°Cで行うこと等を決定した。以上の条件において、ダイレクトシーケンス法にてVP4、VP6、VP7、ならびにNSP4遺伝子の塩基配列を決定できることが確認できた。VP4、VP6、VP7及びNSP4遺伝子の解析について、条件検討に用いた2検体のうち、含有RNA量が少ない検体の解析が難航した。RNA抽出、逆転写反応、ならびにPCRの反応を最適化したものの、電気泳動で確認できるバンドは非常に薄く、ダイレクトシーケンスを行っても解読領域はごく短かった。そこで、GenomiPhi DNA Amplification KitというDNAを非特異的に増幅する試薬を検討した。逆転写反応で得られたcDNAを鋳型とし、GenomiPhi DNA Amplification Kitの反応によってDNA量を増加させ、これをテンプレートとしてPCRを行った。しかし、PCR後の反応産物を電気泳動してみると、多数のバンドが確認され、PCRの反応産物として予想されるサイズのバンドは確認できなかった。つまり、GenomiPhi DNA Amplification Kitを用いても、微量のウイルスRNAを解析することができなかった。原因として、糞便からのRNA抽出ではウイルスRNA以外にも多様なRNAが回収されるため、GenomiPhi DNA Amplification Kitを用いることにより様々なDNAが増幅されて夾雑物となり、PCR反応を行っても非特異的な反応しか起こらなかったことが考えられる。現状、微量のウイルスRNAをシーケンスする手段が無いため、ウイルス量が少ない検体については後回しし、充分なウイルスRNAを含む検体から解析する。後回しにした検体については、逆転写反応のプライマーを解析したい遺伝子に特異的なプライマーに変更する、またはNested PCR用のプライマーを設計する等、条件検討を続けていく必要がある。今後は、RVAワクチンの接種歴が確認できた2014年以降の検体を優先してダイレクトシーケンス法にて解析する。具体的には、RotaTeq接種済みの患者由来の4検体、Rotarix接種済み患者由来の5検体、種類について記載無しのRVAワクチン接種済みの患者由来の2検体、ならびにワクチン未接種の患者由来の6検体、以上計17検体を優先して解析する。同時に、次世代シーケンサーでの解析に関する条件検討を行う。得られたRVAの配列情報を基に、VP4、VP6、VP7およびNSP4遺伝子それぞれの近縁系統樹解析、時間系統樹解析、population dynamicss解析、計算額的手法を用いた多様性解析、タンパク質の立体構造解析遺伝学的解析、ならびにタンパク質の立体構造解析を包括的に行う。以上の解析の結果より、注目すべきRVAの遺伝子型を選定する。2013年以前の検体についても、選定した遺伝子型のRVAが含まれる検体を中心に解析を行い、2009年から2018年の10年間、大阪で流行しているRVAの性質がどのように経時的に変化していくのかを明らかにする。

これにより、RVA感染症の患者数はワクチン導入前の40%程度に減少した。しかしその後、患者数は大きく変動せず、依然として多くの患者が毎年発生している。このことから、現在流行しているRVAはワクチンへの耐性を有している可能性が考えられる。そこで本研究では、ワクチン導入後に検出されたRVAを対象に解析を行い、RVAの性質の変化を明らかにする。本年度では、当研究所(地方独立行政法人大阪健康安全基盤研究所)に保管されている検体に関する情報の収集および解析、さらに検体からのA群ロタウイルス(RVA)の解析法の検討を行った。感染症発生動向調査事業に基づき、医療機関から当研究所に搬入された感染性胃腸炎疑いの患者検体のうち、RVA遺伝子が検出されRVA感染症であると当研究所で確定された検体は167件であった。RVAワクチンが認可された2012年から2018年にかけて、患者数の明確な減少は確認できなかった。しかし、検査の過程で明らかになっている検体に含まれるVP7遺伝子は、2009年から2013年まではG1遺伝子型が多数を占めていたのに対し、2014年以降はG2遺伝子型またはG3遺伝子型が多数を占めていた。このことから、ワクチン認可の前後では異なるRVAが流行していると考えられた。検体に付随する情報を確認したところ、2014年以降の一部の検体においてRVAワクチンの接種歴(RotaTeqの接種歴あり、Rotarixの接種歴あり、いずれかのワクチンの接種歴あり、あるいは接種歴無し)が確認できた。一方、RVAの解析法の検討は2018年に当研究所に搬入された2検体を用いて行った。患者糞便からのRNA抽出、逆転写反応、PCR、ならびにダイレクトシーケンスの条件検討を行った。これらの検討により、RNA抽出においてキットに付属するキャリアRNAを用いず行うこと、逆転写反応においてDenatureを95°Cで行うこと等を決定した。以上の条件において、ダイレクトシーケンス法にてVP4、VP6、VP7、ならびにNSP4遺伝子の塩基配列を決定できることが確認できた。VP4、VP6、VP7及びNSP4遺伝子の解析について、条件検討に用いた2検体のうち、含有RNA量が少ない検体の解析が難航した。RNA抽出、逆転写反応、ならびにPCRの反応を最適化したものの、電気泳動で確認できるバンドは非常に薄く、ダイレクトシーケンスを行っても解読領域はごく短かった。そこで、GenomiPhi DNA Amplification KitというDNAを非特異的に増幅する試薬を検討した。逆転写反応で得られたcDNAを鋳型とし、GenomiPhi DNA Amplification Kitの反応によってDNA量を増加させ、これをテンプレートとしてPCRを行った。しかし、PCR後の反応産物を電気泳動してみると、多数のバンドが確認され、PCRの反応産物として予想されるサイズのバンドは確認できなかった。つまり、GenomiPhi DNA Amplification Kitを用いても、微量のウイルスRNAを解析することができなかった。
ショウジョウバエ高分子量機能性RNAの網羅的検索

近年の研究から、哺乳類をはじめとした生物のゲノムには、予想をはるかに超える数のmRNA-like non-coding RNA遺伝子が存在することが強く示唆されている。これらRNAのほとんどが新規の分子であり、ゲノムの包括的理解のためにはその機能を明らかにすることが急務であると考えられる。本研究課題ではショウジョウバエをモデル系とし、1)ショウジョウバエゲノム中にいくつのmRNA-like non-coding RNA遺伝子が存在するのか、2)これらnon-coding RNA遺伝子の生体内の機能は何かを明らかにすることを目標とした。1)全長の塩基配列が明らかにされている10,165のショウジョウバエcDNAを対象にin silicoスクリーニングを行い、287個の非翻訳RNA候補を見い出した。これらのうち、既知のタンパク質遺伝子の相同性が低く、かつ直近に遺伝子が存在しないものを選別し、136個のmRNA-like ncRNAを得た。これらncRNAを近縁種のゲノム配列と比較したところ、mRNA-like ncRNAの進化速度が非常に速いことが示唆された。2)in situハイブリダイゼーション法により、136個のmRNA-like ncRNAのうち、126個について発現解析を行った。これらnon-coding RNAの約5分の1(32個)が胚発生期に発現しており、特に神経系において特異的に発現するものが多く見られた(18個)。これらの組織特異的なnon-coding RNAについて、RNAiによる機能阻害を行ったところ、2個について特定の表現型が得られた。これら遺伝子の表現型の詳細については現在解析を進めているところである。近年の研究から、生物のゲノムには予想をはるかに超える数のmRNA-like no-coding RNA遺伝子が存在することが強く示唆されている。本研究課題ではショウジョウバエをモデル系とし、1)ショウジョウバエゲノム中にいくつのmRNA-like non-coding RNA遺伝子が存在するのか、2)これらnon-coding RNA遺伝子の生体内の機能は何かを明らかにすることを目標とする。現在までの成果について以下に述べる。1)全長の塩基配列が明らかにされている10,165のショウジョウバエcDNAを対象にin silicoスクリーニングを行い、219個のmRNA-like non-coding RNA遺伝子候補を見い出した。このうちアンチセンスRNA遺伝子は79個、イントロン中に存在するものが25個あり、他の遺伝子と重複しない形で存在するもの(non-overlapping non-coding RNA)か115個であった。ほとんどの候補遺伝子が比較的短いORF(100アミノ酸以下)を持ち、スクリーニングが有効に働いていることが示唆された。2)in situハイブリダイゼーション法により、115個のnon-overlapping non-coding RNAのうち、78個について発現解析を行った。これらnon-codingRNAの約半分(38個)が胚発生期に発現しており、特に神経系において特異的に発現するものが多く見られた(12個)。これらの組織特異的なnon-coding RNAについては、さらにRNAiによる機能阻害を行う予定である。
言語態分析による近代日本の考察-戦争期の言説をめぐる差別と文学

本研究は、言語態分析を行うことにより、差別という事象を通して言語の文学性について検討し、言葉と差別の問題にアプローチするとともに、近代日本のありようについて新たな視座から考察することを目的としている。今年度は、台湾大学に赴き、戦争期の出版物に関連する資料調査を行った。さらに、収集した資料のデータベース化を進めた。また、昨年度に引き続き、第一次世界大戦期や第二次世界大戦期の日本語一次資料を収集する作業を継続的に行った。文学的言語、新聞・雑誌等のメディア言語、法的言語、学問的言語(人類学・民族学・民俗学・歴史学・教育学等)、衛生学・医学的言語、外交文書など、さまざまな言語態に属する資料を、国内の図書館等の機関を利用して集め、分析作業を進めるのと並行して、それらの資料をデータベース化につとめた。昨年度までに収集した日清・日露戦争期から第一次世界大戦期にかけての一次資料に基づいて、論文「香らせる肌の虚構-広告メディアの女性表象と管野須賀子」や「『春は馬車に乗つて』-病と女性身体の表象」を執筆した。また、差別研究に関する理論的文献の購入・収集・整理を行い、ジェンダーやセクシュアリティをめぐる問題系と人種や病の表象の関係を軸に、論文「裏返しの曖昧-鹿島田真希『白バラ四姉妹殺人事件』」、「輪転する眠り-『変身のためのオピウム』」「ほころびる秘密-角田光代『空中庭園』の世界」「殴る女たちの祈り-阿部和重『グランド・フィナーレ』」を執筆した。本年度は、とくに日清戦争、日露戦争期の、日本語一次資料を収集することを主な作業として、文学的言語、新聞・雑誌等のメディア言語、法的言語、学問的言語(人類学・民族学・民俗学・歴史学・教育学等)、衛生学・医学的言語、外交文書など、さまざまな言語態に属する資料を、国内の図書館等の機関を利用して集め、分析作業を進めていった。とりわけ北海道立図書館では明治期の北方関連資料を収集することができ、また、大阪市立大学附属図書館ではとくに朝鮮半島関連の資料を得ることができた。11月に赴いた韓国では、国立国会図書館や延世大学附属図書館、安義士紀念館などで1890年代から1910年代の報道言説に関する資料を集めることができたので、それらを整理しつつ、同時期に日本において活字化された言説資料と比較、検討するための下地を調えることにつとめた。こうした成果に基づいて、かつて学会発表した内容に大幅に加筆するかたちで、論文「王妃の行方-暗殺事件前後の閔妃をめぐる表象」をまとめるとともに、さらに数本の論文を準備中である。また、差別研究に関する理論的文献の購入・収集・整理を行い、ジェンダー・セクシュアリティをめぐる問題系と病の表象の関係を軸に、論文「献血する女の憂鬱-高木芙羽『フラワービジネス』」、「母胎の爪-三原世司奈『不妊クラス』」「恋愛感触と小説と-『本格小説』論」を執筆した。本年度は、1月にアメリカ合衆国スタンフォード大学で行われたシンポジウム「文学とアクティヴィズム」に出席して、昨年度の研究成果として「日本語文学と天皇制(Literature in Japanese and the Emperor System)」という題目で研究発表を行った。同時に、関連する会議・研究打ち合わせに出席し、アクティヴィズムとアカデミズムの関わりの可能性に関して討議を行い、現段階での差別研究における理論的課題について整理することができた。また、昨年度に引き続き、とくに日露戦争期や第一次世界大戦期の日本語一次資料を収集することを主な作業として、文学的言語、新聞・雑誌等のメディア言語、法的言語、学問的言語(人類学・民族学・民俗学・歴史学・教育学等)、衛生学・医学的言語、外交文書など、さまざまな言語態に属する資料を、国内の図書館等の機関を利用して集め、分析作業を進めていった。昨年度収集した日清・日露戦争期の一次資料に基づいて、論文「王妃の行方-暗殺事件前後における閔妃をめぐる表象」、「奪われた皇太子の未来-日清・日露戦争と「朝鮮」の表象」をまとめた。こうした論文を集めた著作『物語と暗殺-閔妃事件から大逆事件を貫く近代の背理』を準備している。また、差別研究に関する理論的文献の購入・収集・整理を行い、ジェンダーやセクシュアリティをめぐる問題系と人種や病の表象の関係を軸に、論文「うつし身の恋人形-茂田眞理子『スキンディープ』」、「喋らない口-村田沙耶香『母乳』」を執筆した。

文学的言語、新聞・雑誌等のメディア言語、法的言語、学問的言語(人類学・民族学・民俗学・歴史学・教育学等)、衛生学・医学的言語、外交文書など、さまざまな言語態に属する資料を、国内の図書館等の機関を利用して集め、分析作業を進めるのと並行して、それらの資料をデータベース化につとめた。昨年度までに収集した日清・日露戦争期から第一次世界大戦期にかけての一次資料に基づいて、論文「香らせる肌の虚構-広告メディアの女性表象と管野須賀子」や「『春は馬車に乗つて』-病と女性身体の表象」を執筆した。また、差別研究に関する理論的文献の購入・収集・整理を行い、ジェンダーやセクシュアリティをめぐる問題系と人種や病の表象の関係を軸に、論文「裏返しの曖昧-鹿島田真希『白バラ四姉妹殺人事件』」、「輪転する眠り-『変身のためのオピウム』」「ほころびる秘密-角田光代『空中庭園』の世界」「殴る女たちの祈り-阿部和重『グランド・フィナーレ』」を執筆した。
水圏における溶存態及び懸濁態タンパク質の起源と動態に関する研究

水圏中に存在する懸濁態及び溶存態有機物中には、生物の体内ではなく非生物として存在する特定のタンパク質分子が濃縮して存在していることが、世界で始めてわかった。その中で、海洋の溶存有機物中からは、グラム陰性細菌(Pseudomonas aeruginosa)由来のチャネルタンパク質であるポリンが溶存態タンパク質として普遍的に存在することが明らかにされた。琵琶湖・湖水中からも溶存態タンパク質分子が検出された。検出したタンパク質分子のうちの一つは、そのN末端アミノ酸配列から、グラム陰性細菌(Bordetella pertussis)の外膜に存在するチャネルタンパク質であるポリンに極めて近いタンパク質であることがわかった。環境が大きく異なる琵琶湖及び海洋において、同様な現象が認められることは、水圏に生息する特定の細菌中の特定のタンパク質が、溶存態タンパク質として選択的に蓄積するメカニズムが存在することを示している。しかし、このメカニズムについては、現在謎である。海洋表層懸濁態タンパク質は、その中に生物も含むために多数のタンパク質を含み、従来から用いている一次元電気泳動法では、個々のタンパク質を分離する事は不可能であった。このようなタンパク質群にたいして、二次元電気泳動法を適用した。その結果、十数個の主要懸濁態タンパク質を相互に分離することができた。N末端アミノ酸配列から、その内の一つは、真核生物の植物プランクトンのクロロプラストに存在するタンパク質であることがわかった。このことは、溶存態タンパク質の起源が原核生物である細菌である事と大きく異なっている。以上の結果は、諸外国でも報告例が無く、新しく発見された現象であり、その海洋溶存有機物の起源や動態、ひいては地球表層の炭素循環を理解する上で、極めて重要な知見と考えられる。琵琶湖・湖水中から生物の体内ではなく、非生物として存在する溶存態タンパク質分子を検出した。淡水環境中からこのようなタンパク質を検出した例はなく、世界で初めてである。海洋環境中からは、やはりグラム陰性細菌(Pseudomonas aeruginosa)由来のポリンが溶存態タンパク質として存在する事が、本研究代表者により明らかにされている。現在、水圏に生息する特定の細菌中の特定のタンパク質が、溶存態タンパク質として選択的に蓄積するメカニズムは謎のままである。環境が大きく異なる琵琶湖及び海洋において、同様な現象が認められることは、この謎を解く大きな手がかりになるものと期待される。このようなタンパク質群に対して、本研究費で購入した二次元電気泳動法を適用した。懸濁態タンパク質に二次元電気泳動法を適用し、主要タンパク質の起源を明らかにした例は無く、本研究が世界で初めてである。以上、本研究課題による初年度の今年度において、研究は極めて順諷に進み、世界で初めての結果が二つ得られた。水圏中に存在する懸濁態及び溶存態有機物には、特定のタンパク質分子が濃縮して存在していることが明らかになりつつある。その中で、溶存態タンパク質の一つについては、そのアミノ酸配列からバクテリアの膜タンパク質であるポリンP同族体と同定された。

今年は、溶存タンパク質について、魚病細菌が有するポリンタンパク質の抗体を用い、抗原-抗体反応を利用した結果、このようなタンパク質が海洋中に存在する事を明らかにした。即ち、海洋中には、ポリンP同族体以外にもポリン族のタンパク質が存在する事がわかった。更に、沿岸域の海水試料について、溶存タンパク質を検出したところ、外洋域と比較して他種類のタンパク質が存在する事が分かった。そして、沿岸域の海水試料にも、ポリンP同族体及び魚病細菌由来のポリンタンパク質が存在する事が分かった。即ち、沿岸及び外洋域を問わず、海水中にはバクテリアの膜タンパク質に由来するポリンタンパク質が存在する事が分かった。懸濁態タンパク質について、二次元電気泳動法を適用した結果、十数個の特定タンパク質を分離することができた。そのうちの一つのタンパク質について、アミノ酸配列が決定され、このタンパク質は植物のクロロプラストの存在するタンパク質に由来する事が分かった。このタンパク質について、そのアミノ酸配列からペプチドを合成し、そのペプチドを抗原とする抗体を作成した。現在、抗原-抗体反応を利用してこのような特定タンパク質の海洋における普遍的存在について検討中である。水圏中に存在する懸濁態及び溶存態有機物中には、生物の体内ではなく非生物として存在する特定のタンパク質分子が濃縮して存在していることが、世界で始めてわかった。その中で、海洋の溶存有機物中からは、ダラム陰性細菌(Pseudomonas aeruginosa)由来のチャネルタンパク質であるポリンが溶存態タンパク質として普遍的に存在することが明らかにされた。琵琶湖・湖水中からも溶存態タンパク質分子が検出された。検出したタンパク質分子のうちの一つは、そのN末端アミノ酸配列から、ダラム陰性細菌(Bordetella pertussis)の外膜に存在するチャネルタンパク質であるポリンに極めて近いタンパク質であることがわかった。環境が大きく異なる琵琶湖及び海洋において、同様な現象が認められることは、水圏に生息する特定の細菌中の特定のタンパク質が、溶存態タンパク質として選択的に蓄積するメカニズムが存在することを示している。しかし、このメカニズムについては、現在謎である。海洋表層懸濁態タンパク質は、その中に生物も含むために多数のタンパク質を含み、従来から用いている一次元電気泳動法では、個々のタンパク質を分離する事は不可能であった。このようなタンパク質群にたいして、二次元電気泳動法を適用した。その結果、十数個の主要懸濁態タンパク質を相互に分離することができた。N末端アミノ酸配列から、その内の一つは、真核生物の植物プランクトンのクロロプラストに存在するタンパク質であることがわかった。このことは、溶存態タンパク質の起源が原核生物である細菌である事と大きく異なっている。
蛋白質の可視化とプロテオーム解析による複製後修復の分子メカニズムの解明

ゲノム上に生じた一部の損傷は修復しきれずに複製期まで残り、DNA複製の進行を頻繁に阻害する。進行が阻害された複製フォークは細胞死を誘発するのみならず、DNAの二本鎖切断等の二次的損傷を引き起こし、ゲノム不安定性や発ガンの原因となる。この時損傷の除去を伴わず複製を再開させる機構が複製後修復(損傷トレランス)で、複製後修復は複数の損傷乗り越えポリメラーゼによってなされる損傷乗り越え複製と、メカニズムはほとんどわかっていないが新生鎖を鋳型にするテンプレートスイッチングの二つの経路からなる。RAD18は複製後修復で中心的な役割を果たし、この二つの経路の制御に関わっていると考えられているが、その詳しいメカニズムはわかっていない。この重要な問題を明らかにする為に、RAD18とテンプレートスイッチングの経路でユビキチン転移酵素(E2)として働くUbc13/Mms2複合体のプロテオーム解析を試みた。免疫沈降によりそれそれの蛋白質の結合蛋白質を精製し、nanoLC-MS/MSにより蛋白質を同定した結果、RAD18は特異的にHSP70と結合する事がわかり、IUD18とHSP70の結合の複製後修復における役割を、in situ解析やin vitroでの機能解析により解析を行った。またUbc13とMms2の免疫沈降で精製した蛋白質からは、複数のユビキチン結合酵素(E3)を含む、今までUbc13とMms2に結合する事が知られていない蛋白質を同定され、これらの蛋白質が複製後修復で栗たす役割を解析した。また、共同研究によって明らかにした機能的な相互作用より、ワーナー症候群の原因遺伝子であるWRNとRAD18が直接相互作用する事を発見し、この結合の細胞内での意義を解析した。(731字)ゲノム上に生じた一部の損傷は修復しきれずに複製期まで残り、DNA複製の進行を頻繁に阻害する。(731字)
筋萎縮性側索硬化症(ALS)の治療開発:ALSモデル動物(Wobblerマウス)を用いたSuperoxide dismutase療法の検討

方法Wobblerマウスの発病直後(生後3-4週間)にPC-SOD、U-SOD(それぞれ10^4、10^5U/kg)と対照液を盲検法により連日4週間、腹腔内投与した。薬物投与は生後7-8週間で終了し、各実験群はn=10で施行した。実験開始時から毎週、forelimb deformityとgrip strenghtを観察した。薬物投与終了後に右上腕二頭筋の湿重量を測定し、筋線維平均直径を求めた。また、灌流固定後に頸髄C5-6レベルを摘出し、ホルマリン固定後に20μm以上の大型脊髄運動神経細胞の数を測定した。結果PC-SOD投与によりforelimb deformityの進行が遅延し、grip strengthの低下についても軽減できた。一方、両評価ともにU-SOD投与群と対照群との間に有意差はなかった。PC-SOD投与群における上腕二頭筋の重量は、対照群に比べて約20-30%の増加が認められた。筋線維平均直径についてもPC-SOD投与群は、対照群に比べて有意な増加を認めた。U-SOD投与群に関しては筋重量、筋線維平均直径ともに対照群との間に有意差はなかった。PC-SOD投与群における脊髄運動神経細胞の数は、対照群に比べて有意に増加していた。しかし、U-SOD投与群と対照群との間に有意差はなかった。