hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
強磁場中電気泳動堆積法を用いた配向積層セラミックスにおける亀裂進展制御技術の確立

スラリー中の水の含有量が40vol%以上になると配向性が劣化することが明らかなった。電場と磁場の印可方向のなす角が0度となる0度層と90度層を交互に堆積させた場合には、90度層では引張りの残留応力となるために、亀裂がこの層に入るときには界面に垂直に進展するが、0度層では圧縮残留応力となり、この層に亀裂が入るときには界面に対して角度を持って進展することが分かった。また、圧縮残留応力層から引張残留応力層へ亀裂進展したときには、その逆よりも亀裂偏向の角度が大きくなった。亀裂偏向には圧縮応力層よりも引張応力層の寄与が大きく、引張応力が大きくなるように層厚を調節することで偏向角が大きくなることが明らかになった。層厚と配向方位の制御により残留応力の大きさを変えることで、亀裂の偏向角が制御可能であることを実証した。
RhoAによる細胞分化機構を応用した歯根膜細胞移植治療のための基礎的研究

歯根膜細胞の硬組織形成細胞への分化過程は、RhoA-ROCKシグナルが制御する細胞骨格の性状に依存的であり、その細胞骨格はBMP-4やWnt3aおよびWnt5aなどの硬組織分化に関与する遺伝子発現を制御すると考えられる。一方、RhoAおよびROCKを過剰発現した歯根膜細胞は著しい細胞増殖能の低下を示したことから、歯根膜細胞の分化は、細胞骨格の性状に加えて、種々の増殖因子や細胞外基質の協調制御が重要であると考えられる。歯根膜細胞の分化は,種々の増殖因子や細胞外基質が及ぼす細胞内シグナルに加えて,細胞骨格の性状によっても制御を受けると考えられる。そこで申請者らは,細胞骨格のマスター遺伝子であるRho-Rhokinases (ROCK)シグナルによる歯根膜細胞の分化機構に着目し,本年度は1,硬組織形成細胞へ分化誘導した歯根膜細胞におけるRho-ROCKの発現パターンを調べ2,Rho-ROCKを過剰発現するベクターのクローニングおよび遺伝子導入の条件設定を行った。1,Rho-ROCKシグナルの活性化を,アクチン線維の重合量,およびリン酸化ミオシン軽鎖の産生量について,免疫蛍光染色法にて調べた。歯根膜細胞を石灰化誘導培地で培養すると,アルカリフォスファターゼ活性およびカルシウム沈着量の増加を示す硬組織形成細胞へ分化した。この分化過程に伴って,歯根膜細胞はアクチン線維の重合促進およびミオシン軽鎖のリン酸化を亢進を示した。アクチン-ミオシン相互作用によるストレスファイバーの形成は細胞の張力を発生することから,歯根膜細胞の細胞骨格の変化は,硬組織形成細胞への分化に関与すると考えられる。2,RhoAの活性型(RhoA-V14),およびROCKの活性型(〓3)のcDNA(Dev Cell 2004,Pennsylvania大学Dr.Chenの供与)をネオマイシン耐性配列とGFP配列を含む発現ベクター(pEGFP-C3)にクローニングした。これらの発現ベクターをラット腎臓細胞(NRK-52E細胞)にエレクトロポレーション法にて遺伝子導入を行い,選択培地での培養後,導入効率をGFP発現にて確認した。以上の結果から,Rho-ROCKシグナルは歯根膜細胞の細胞骨格分子の調節を介して硬組織形成細胞への分化を促進する可能性が示唆された。今後,Rho-ROCKを過剰発現する歯根膜細胞株を樹立することによって,歯根膜細胞の分化メカニズムの解明に応用する。昨年度の研究結果から,歯根膜細胞の分化過程において,細胞骨格の性状およびRhoA-Rho kinases(ROCK)シグナルが変化することが分かった。そこで申請者らは,RhoA-ROCKによる歯根膜細胞の分化制御機構を調べることを目的に1,歯根膜組織からの伸展増殖過程におけるROCK阻害剤の影響2,歯根膜細胞から硬組織形成細胞への分化過程におけるROCK阻害剤の影響3,歯根膜細胞におけるRhoA過剰発現の影響について本年度調べた。1,歯根膜組織のsingle-cell suspensionにROCK阻害剤(Y-27632)を添加し,伸展増殖した細胞の未分化度をアルカリフォスファターゼ染色によって調べた。伸展増殖した細胞はコロニーを形成し,Y-27632によってアルカリフォスファターゼ陽性コロニーの比率が増加する傾向を確認した。すなわち,ROCKの抑制は歯根膜幹細胞の未分化増殖を促進する可能性がある。2,上記コロニーを継代して得た歯根膜細胞にY-27632を添加し,アクチン線維の重合量,アルカリフォスファターゼ活性,およびカルシウム沈着量を調べた。Y-27632は濃度依存的にアクチン線維の重合を阻害し,これに伴って,硬組織形成細胞への分化マーカーも減少した。3,継代培養した歯根膜細胞に,昨年度作製したRhoAの活性型(RhoA-V14)配列を含む発現ベクターをエレクトロポレーション法にて遺伝子導入した。選択培地での培養後,アクチン線維の著しい増加と形態学的変化を伴う歯根膜細胞を確認した。今後,RHoAおよびROCKを発現調節した歯根膜細胞株の性状の解析を行うことによって,歯根膜細胞移植の可能性を探索する。昨年度の研究から,RhoA-ROCKシグナルは歯根膜細胞の細胞骨格分子の調節を介して硬組織形成細胞への分化を促進する可能性が示唆された。本年度は,1.歯根膜細胞の細胞骨格による分化制御メカニズムを調べ,2.RhoAおよびROCKを過剰発現した歯根膜細胞株の性状解析を行うことによって歯根膜細胞移植の可能性を探索した。2,上記遺伝子発現のうち,ROCK特異的阻害剤(Y-27632)の添加によって,BMP-4およびWnt3a/5aの進伝子発現量が著に変動した。

すなわち,歯根膜細胞の細胞骨格による分化制御メカニズムは,BMPとWntのシグナリング間の協調制御が重要な役割を果たしている可能性がある。3,歯根膜細胞にRhoAおよびROCK過剰発現ベクターをエレクトロポレーション法にて遺伝子導入後,選択培養を行うことによって,アクチン線維の著しい増加と形態変化を伴う歯根膜細胞株を分離したが,この細胞株は著しい増殖能の低に伴って細胞死を示した。以上の結果から,RhoA-ROCKシグナルは歯根膜細胞の細胞骨格分子の調節を介して,硬組織形成細胞への分化に関与る遺伝子発現を制御し,分化過程を促進することが分かった。さらに,歯根膜細胞は細胞骨格分子と増殖因子等との調作用によって分化・成熟する可能性が示唆された。
個人識別用STRローカスのアレル頻度分布における日本人集団内の地域差に関する研究

日本国内の4地域(秋田、名古屋、大分、沖縄)において収集された各198、200、196、175名のDNA試料より、AmpF1STR Identifiler kit及びOhtakiらが考案したマルチプレックス(6-Plex)システムを用いて、計21ローカスの常染色体STRのアレル頻度を算出し、ハーディ・ワインベルグ平衡(HWE)の検定をlikelihood ratio、homgzygosity test、exact testを用いて行ったところ、3つのテスト全てで乖離がみられたものはなかった。また、統計学的解析から、名古屋-沖縄、秋田-沖縄、大分-沖縄間では各11、9、8ローカスにおいて有意な差(P<0.05)が認められたが、秋田-名古屋、私田-大分、名古屋-大分では3ローカスのみであった。さらにY染色体上のSTRについても、秋田、名古屋、大分、沖縄にて収集された121名、207名、90名、87名の男性DNA試料より、2つのマルチプレックスタイピングキットを用いて、14ローカスのY-STR(DYS19、DYS385、DYS389I、DYS389II、DYS390、DYS391、DYS392、DYS393、DYS435、DYS437、DYS438、DYS439、DYS460、Y-GATA-H4)の解析を行った。各ローカスのアレル頻度分布について集団間の有意差を検定したところ、秋田-沖縄間では6ローカス、名古屋-沖縄間では5ローカスにおいて有意差(P<0.05)が認められたが、その他の集団間では有意な差を示したローカスはなかった。また、これらのハプロタイプを解析したところ、秋田で112種類、名古屋で190種類、大分で89種類、沖縄で80種類、4地域全体では総計505名中441種類のハプロタイプが観察され、そのうち、4地域すべてに共通のハプロタイプはわずか2種類であった。本年度は、名古屋200名、秋田199名、沖縄196名のDNA試料からAmpFlSTRIdentifiler kitを用いて常染色体上の15STRローカスのタイピングを行い、各ローカスのアレル頻度を算出した。また、これらの頻度について、Hardy-Weinberg平衡(HWE)からの乖離を、homozygosity test、likelihood ratio test exact testにより検定したところ、全てのローカスにおいて、少なくともexact testで乖離は認められなかった。また、アメリカ合衆国NISTが開発した10ローカス(DYS436、DYS439、DYS435、DYS19、DYS460、YGATAH4、DYS391、DYS392、DYS438、DYS437)のY-STRをマルチプレックス法により型判定できるシステムにおいて、非常に情報量が少ないDYS436をMinimal Databaseに含まれるDYS389Iに入れ換えた改良型の10-plexシステムを作製し、このシステムと、市販のY-PLEX6キット(DYS393、DYS19、DYS389、DYS390、DYS391、DYS385)を用いて、名古屋207名、秋田122名、沖縄87名の男性DNA試料から、共通な2ローカスを除く14ローカスのハプロタイプ解析を行った。また、同様に、大分で採取された135名のDNA試料についても現在解析中である。

今後、少なくとも全ての集団で200サンプル以上収集し、できれば、他の地域から収集したDNA試料や我々が開発したマルチプレックスに含まれるローカスをダイピングした後、各ローカスの地域差について、GenepopやStructure programなどのソフトを使って検討したいと考えている。今年度は、大分で採取された175名のDNA試料についてAmpFlSTRIdentifiler kitを用いて15ローカスの常染色体上STRのタイピングを行った。さらに名古屋、秋田、沖縄を含めた4地域について、我々が考案したマルチプレックスシステムを用いて新たに6ローカス(D20S480、D6S2439、D6S1056、D9S1118、D4S2639、D17S1290)のタイピングを実施し、計21ローカスについて統計学的に集団間の有意差を検定した。その結果、名古屋-沖縄、秋田-沖縄、大分-沖縄間で21ローカス中それぞれ11、9、8ローカスにおいて有意な差(P<0.05)が認められたが、秋田-名古屋、秋田-大分、名古屋-大分では3ローカスのみであった。さらにY染色体上のSTRについても、大分にて収集された90名の男性DNA試料について、2つのマルチプレックスタイピングキットを用いて、14ローカスのY-STR(DYS19、DYS385、DYS389I、DYS389II、DYS390、DYS391、DYS392、DYS393、DYS435、DYS437、DYS438、DYS439、DYS460、Y-GATA-H4)の解析を行った。各ローカスのアレル頻度分布について集団間の有意差を検定したところ、秋田-沖縄間では6ローカス、名古屋-沖縄間では5ローカスにおいて有意差(P<0.05)が認められたが、その他の集団間では有意な差を示したローカスはなかった。また、これらのハプロタイプを解析したところ、秋田で112種類、名古屋で190種類、大分で89種類、沖縄で80種類のハプロタイプが観察され、4地域全体では総計505名中441種類のハプロタイプが観察され、そのうち、4地域すべてに共通のハプロタイプはわずかに2種類のみであった。
網膜色素上皮細胞における促通拡散型糖輸送担体の免疫組織学的解析

1:ラット網膜色素上皮細胞における促通拡散型糖輸送体担体(GLUT1-5)を免疫組織学的手法で解析した。GLUT1は以前の報告どうり網膜色素上皮細胞の頂面と基底側面に局在したが他のものは検出されなかった。2:ストレプトゾトシンにより糖尿病状態にしたラット網膜色素上皮細胞の促通拡散型糖輸送担体の局在を明らかにし、糖尿病性網膜症に促通拡散型糖輸送担体がどのように関与するかを明らかにしようとしたが、GLUT1は定量的に変化せず、他のものは検出されなかった。3:今回網膜色素上皮細胞でCLUT1の局在は解明されたものの、CLUT2-4の局在は解明できず、染色法や固定法の改良が必要であると考えられた。また糖尿病状態における促通拡散型糖輸送担体の定量もGLUT1しか解明できず、染色体や固定法改良だけでなく、糖尿病の罹患期間の考慮も必要であると考えられた。
遊走細胞における微小管の配向制御機構の解明

本研究では、伸長する微小管の先端に濃縮する+TIPs(CLIP-170やEBsなど)による微小管の配向を制御する分子機構の解明を目指した。今年度、抗リン酸化CLIP-170抗体を作製し、Plk1によるCLIP-170リン酸化の時空間的な制御機構を解析した。細胞周期を同調させた培養細胞を用いて検討したところ、CLIP-170のリン酸化レベルが細胞分裂中期に高いことが明らかになった。このCLIP-170リン酸化レベルの上昇は、Plk1阻害剤やPlk1遺伝子発現抑制で減少したことから、CLIP-170は細胞分裂中期にPlk1によりリン酸化されることが示唆された。また、培養細胞を用いた実験やcell-free実験において、CLIP-170のPlk1によるリン酸化はCLASP2への結合能を減弱させた。細胞分裂中期には紡錘糸の微小管が染色体に付着し、染色体が赤道面に整列する。CLIP-170の遺伝子発現を抑制すると、この染色体の整列が乱れることを見出した。さらに、レスキュー実験によりCLIP-170のリン酸化が染色体の整列に必須であることを見出した。以上の結果から、CLIP-170は分裂中期にPlk1によってリン酸化されることで、CLASP2と協調し、染色体の整列に重要な役割を果たしていると考えられた。一方、EB結合蛋白質として同定した蛋白質を培養細胞内に発現させ、その挙動を観察することで複数の新規+TIPsを同定することに成功した。Ce11-free実験において、それら候補蛋白質はEB依存的に微小管先端に濃縮することを見出した。詳細な解析は継続中だが、EBをコアとした蛋白質問相互作用ネットワークが微小管配向決定を担っていることが強く示唆された。細胞の遊走は、発生過程や生体の維持にとって極めて重要な現象である。遊走細胞は進行方向に対して前後軸を決定し、それに沿って細胞骨格や形態をダイナミックに変化させることで方向性を持って運動する。細胞骨格の一つである微小管は、特定の細胞表層で捕捉されることによって非対称に配向し、前後軸の決定及び維持に必須の役割を果たしている。しかしながら、細胞膜近傍で微小管がどのように捕捉されるのかは未だ判然としていない。微小管の伸長端に特異的に濃縮するPlus-end trackingproteins (+TIPs)は、微小管のダイナミクスや配向決定に関与すると考えられているが、その分子機構は明らかになっていない。本年度は、1)細胞膜近傍での微小管の捕捉機構を評価するcell-free実験系の確立、2)+TIPsの一つであるCHP-170のリン酸化による制御機構の解明を目的とした。1)の実験系の立ち上げに当たり、+TIPsとしてCLIP-170を、cortical factorとしてIQGAP1を用いた。微小チャンバーの側壁にビオチン化したIQGAP1を固相化することで細胞表層を模し、さらにチャンバー内で+TIPsとtubulinを加えて微小管を重合させ、側壁に衝突した際の微小管及び+TIPsの挙動を観察する事に成功した。今後詳細な解析を進め、CLIP-170とIQGAP1が微小管の捕捉にどのようにして寄与しているのか検証するとともに、その他の+TIPsとcortical factorの相互作用についても、この実験系を用いて評価する。2)については、AMPKによるCLIP-170のリン酸化の意義をin vitroでの再構成実験系を用いて検討した。その結果、in vitroでリン酸化型CLIP-170は微小管の伸長端への濃縮が減少することが分かった。CLIP-170の微小管末端への濃縮にはEB1が必要である事が知られているが、tubulin、EB1、CLIP170の三者のみの存在下では、CLIP-170のリン酸化による微小管ダイナミクスの変化は見られなかった。しかし、EB1、CLIP-170両方の結合タンパク質であり、+TIPsの一つであるCLASP2を加えた条件下においては、CLIP-170のリン酸化によって微小管の伸長速度が上昇することを見出した。今後、in vitroでの結果をふまえて、細胞内でのCHP-170リン酸化の意義について検討する。遊走細胞は進行方向に対して前後軸を形成し、これに沿って細胞骨格の分布や細胞形態は非対称性を示す。リン酸化によるCLIP-170の活性制御機構の解析を行い、CLIP-170がリン酸化されると、微小管構成成分であるチューブリンや他の+TIPsであるCLASP2との結合が減弱することを見出した。in vitro実験計において、リン酸化型CLIP-170は、コントロールに比べ微小管をより不安定な方向にダイナミクスを変化させた。このことは、細胞内でCLIP-170のリン酸化状態が調節され、CLIP-170の活性が制御されていることを示唆している。一方、CLIP-170のダイナミクスやそのリン酸化状態に影響を与える分子をスクリーニングし、新たにPlk1を同定した。

in vitroでPlk1がCLIP-170を直接リン酸化すること、CLIP-170のリン酸化が細胞分裂時に上昇し、この一過的なリン酸化型CLIP-170の上昇がPlk1阻害剤やPlk1siRNAで減少することから、分裂細胞内でPlk1がCLIP-170をリン酸化し、CLIP-170の活性を制御していることが明らかになった。また、+TIPsの主要制御因子EBs(EB1とEB3)のアフィニティーカラムクロマトグラフィーを行い、LC-MS/MSによって結合蛋白質を網羅的に同定した。いくつかの候補蛋白質の細胞内局在を検討したところ、数個は伸長する微小管先端に特異的に濃縮することが明らかになった。詳細な性状解析は進行中だが、EBsはこれまで同定されている以外の+TIPsも微小管先端にリクルートし、微小管ダイナミクスやその配向を決定していると考えられる。本研究では、伸長する微小管の先端に濃縮する+TIPs(CLIP-170やEBsなど)による微小管の配向を制御する分子機構の解明を目指した。今年度、抗リン酸化CLIP-170抗体を作製し、Plk1によるCLIP-170リン酸化の時空間的な制御機構を解析した。細胞周期を同調させた培養細胞を用いて検討したところ、CLIP-170のリン酸化レベルが細胞分裂中期に高いことが明らかになった。このCLIP-170リン酸化レベルの上昇は、Plk1阻害剤やPlk1遺伝子発現抑制で減少したことから、CLIP-170は細胞分裂中期にPlk1によりリン酸化されることが示唆された。また、培養細胞を用いた実験やcell-free実験において、CLIP-170のPlk1によるリン酸化はCLASP2への結合能を減弱させた。細胞分裂中期には紡錘糸の微小管が染色体に付着し、染色体が赤道面に整列する。CLIP-170の遺伝子発現を抑制すると、この染色体の整列が乱れることを見出した。さらに、レスキュー実験によりCLIP-170のリン酸化が染色体の整列に必須であることを見出した。以上の結果から、CLIP-170は分裂中期にPlk1によってリン酸化されることで、CLASP2と協調し、染色体の整列に重要な役割を果たしていると考えられた。一方、EB結合蛋白質として同定した蛋白質を培養細胞内に発現させ、その挙動を観察することで複数の新規+TIPsを同定することに成功した。Ce11-free実験において、それら候補蛋白質はEB依存的に微小管先端に濃縮することを見出した。詳細な解析は継続中だが、EBをコアとした蛋白質問相互作用ネットワークが微小管配向決定を担っていることが強く示唆された。当初の計画通り、スクリーニング実験(RNAi、阻害剤、アフィニティーカラムクロマトグラフィー)で微小管の配向を制御する候補分子を同定し、cell-free実験系で性状解析を進捗させている。また、細胞内での解析も予定通り進んでおり、微小管ダイナミクスや配向を制御する分子機構を解明しつつある。EBs新規結合蛋白質に関しては、現在詳細な性状解析を細胞内とin vitro実験系で遂行しており、これを完遂させる。Plk1によるCLIP-170のリン酸化が細胞分裂に必須であるという予備的な知見を得ており、これを完遂させることでリン酸化によるCLIP-170の活性制御機構を解明する。in vitroでの微小管捕捉機構の解析は、使用するチャンバーの品質が不安定なため、製作工程を見直し品質を向上、均一化することで解析を完遂する。
扁桃体神経回路制御の可視化とその生理的意義

痛みなどの無条件刺激と条件刺激との連合学習である恐怖条件付けには、扁桃体基底外側核が責任領域とされてきたが、近年、扁桃体中心核も情動記憶形成に積極的に関与することが示されている。しかしながら、これらアプローチは分子生物学・行動学的手法が中心であり、電気生理学的解析は大きく遅れていた。一方、情動を担う扁桃体への痛み伝達経路として、橋の腕傍核から視床・皮質を経ずに中心核へ直接入力する直接路が示されていた。我々は従来の研究成果により、強い恐怖記憶形成後、直接路に顕著なシナプス増強を見出した。さらに、直接路の光遺伝学的刺激により「痛み」刺激無しで人工的な恐怖記憶を作ることにも成功した。以上の結果は直接路の情動記憶への関与を示唆するが、扁桃体神経核における経路特異的な生理的意義やそのシナプス増強の分子機構に関しては不明な点が多い。そこで本研究では、シナプス増強の分子機構を明らかにし、個体において光遺伝学的に可塑性を操作することで、情動学習制御における痛み神経回路可塑性の意義を、分子から個体レベルまで一貫して解明することを目的として研究を行った。本年度の研究実績として、細胞種特異的な神経回路の可視化とその操作手法を確立した。さらに可塑性制御の分子メカニズムを明らかにしつつある。これらの知見を応用してより生理的状態を反映する刺激プロトコールを確立するとともに、個体レベルでの行動変化を検討することで、痛み情動経路可塑性の制御機構とその生理的意義を分子レベルから個体まで一貫して明らかにすることを目指す。扁桃体の神経回路を細胞種特異的に操作介入する手法を確立し、可塑性制御の分子メカニズムに関しても知見を得ており、研究はおおむね順調に進展している。今後の研究の推進方策としては、光遺伝学的手法を用いて細胞種特異的なシナプス伝達特性の詳細な解析を行うと共に、生理的状態を反映するようなシナプス刺激プロトコールを確立する。さらに、個体レベルでの行動変化を検討することで、痛み情動経路可塑性の制御機構とその生理的意義を分子レベルから個体まで一貫して明らかにすることを目指す。痛みなどの無条件刺激(US)と条件刺激(CS)との連合学習である恐怖条件付けには、扁桃体基底外側核(BLA)が責任領域とされてきたが、近年、扁桃体中心核も情動記憶形成に積極的に関与することが示されている。しかしながら、これらアプローチは分子生物学・行動学的手法が中心であり、電気生理学的解析は大きく遅れている。近年、情動を担う扁桃体への痛み伝達経路として、橋の腕傍核(lPB)から視床・皮質を経ずに中心核へ直接入力する直接路が示されたが、我々は強い恐怖記憶形成後、直接路に顕著なシナプス増強を見出した。以上の結果は直接路の情動記憶への関与を示唆するが、直接路シナプス増強の生理的意義はいまだ不明である。そこで本研究では、シナプス増強の分子機構を明らかにし、個体において光遺伝学的に可塑性を操作することで、情動学習制御における痛み神経回路可塑性の意義を、分子から個体レベルまで一貫して解明する。本年度の成果として、直接経路の可塑性を可視化する実験系を確立した。今後は光遺伝学的手法を用いてより生理的状態を反映する刺激プロトコールを確立するとともに、個体レベルでの行動変化を検討することで、痛み情動経路可塑性の制御機構とその生理的意義を分子レベルから個体まで一貫して明らかにすることを目指す。扁桃体神経回路の可視化については当初の目的どおりに進んでいるが、それぞれの神経回路に関しては、当初の計画になかったCGRPをマーカーとする新たな発見があったため、その生理的意義を現在解析中である。このため、修飾物質の探求の項目で計画した、電気生理学的解析がやや遅れている。一方、情動を担う扁桃体への痛み伝達経路として、橋の腕傍核(lPB)から視床・皮質を経ずに中心核へ直接入力する直接路が示されていた。我々は強い恐怖記憶形成後、直接路に顕著なシナプス増強を見出した。本年度の研究実績の概要として、直接間接経路をシナプスレベルで可視化する実験系を確立した。今後は光遺伝学的手法を用いて、より生理的状態を反映する刺激プロトコールを確立するとともに、個体レベルでの行動変化を検討することで、痛み情動経路可塑性の制御機構とその生理的意義を分子レベルから個体まで一貫して明らかにすることを目指す。

平成29年度は新たに研究室を立ち上げたため当初の研究進捗はやや遅れていた。しかしながらその後電気生理学的解析システムおよび行動学的解析システムのセットアップも完了し、新たな行動学的実験パラダイムも確立できた。さらに神経回路をシナプスレベルで可視化する実験系も確立している。これらの実績から全体としての研究は計画通りおおむね順調に進展しているといえる。痛みなどの無条件刺激と条件刺激との連合学習である恐怖条件付けには、扁桃体基底外側核が責任領域とされてきたが、近年、扁桃体中心核も情動記憶形成に積極的に関与することが示されている。しかしながら、これらアプローチは分子生物学・行動学的手法が中心であり、電気生理学的解析は大きく遅れていた。一方、情動を担う扁桃体への痛み伝達経路として、橋の腕傍核から視床・皮質を経ずに中心核へ直接入力する直接路が示されていた。我々は従来の研究成果により、強い恐怖記憶形成後、直接路に顕著なシナプス増強を見出した。さらに、直接路の光遺伝学的刺激により「痛み」刺激無しで人工的な恐怖記憶を作ることにも成功した。以上の結果は直接路の情動記憶への関与を示唆するが、扁桃体神経核における経路特異的な生理的意義やそのシナプス増強の分子機構に関しては不明な点が多い。そこで本研究では、シナプス増強の分子機構を明らかにし、個体において光遺伝学的に可塑性を操作することで、情動学習制御における痛み神経回路可塑性の意義を、分子から個体レベルまで一貫して解明することを目的として研究を行った。本年度の研究実績として、細胞種特異的な神経回路の可視化とその操作手法を確立した。さらに可塑性制御の分子メカニズムを明らかにしつつある。これらの知見を応用してより生理的状態を反映する刺激プロトコールを確立するとともに、個体レベルでの行動変化を検討することで、痛み情動経路可塑性の制御機構とその生理的意義を分子レベルから個体まで一貫して明らかにすることを目指す。扁桃体の神経回路を細胞種特異的に操作介入する手法を確立し、可塑性制御の分子メカニズムに関しても知見を得ており、研究はおおむね順調に進展している。今後は、可塑性制御における修飾物質の探索を進めると同時に、個体において長期可塑性を誘導し、その行動レベルの変化を詳細に解析することを目指す。今後の研究の推進方策としては、光遺伝学的手法を用いてより生理的状態を反映するようなシナプス刺激プロトコールを確立する。さらに、個体レベルでの行動変化を検討することで、痛み情動経路可塑性の制御機構とその生理的意義を分子レベルから個体まで一貫して明らかにすることを目指す。今後の研究の推進方策としては、光遺伝学的手法を用いて細胞種特異的なシナプス伝達特性の詳細な解析を行うと共に、生理的状態を反映するようなシナプス刺激プロトコールを確立する。扁桃体の神経回路可視化において、CGRP陽性細胞と陰性細胞の混在とその役割の違いという、当初予想していなかった興味深い結果を得た。このため、当初予定していた修飾物質の探求にやや遅れが生じており、次年度使用額が発生した。消耗品費として計上した光カニューレをリサイクルしたため、再利用可能となった。次年度では新たな座標のカニューレを作製し、回路解析を進める予定である。
新しい分子標的治療薬の開発を目指した生物活性天然物の合成研究

優れたp21^<ras>ファルネシルトランスフェラーゼ阻害剤(抗がん活性物質)であるTAN-1813のデカリン環部および上部構造であるスクシンイミド部の合成を達成した。また,ヒストン脱アセチル化酵素(HDAC)阻害剤(分子標的型の抗がん活性物質)スピルコスタチン類の新しい類縁物質であるスピルコスタチンCおよびDを合成し,それらの生物活性評価を行ったところ,優れた抗がん剤になる可能性が示唆された。1) p21^<ras>ファルネシルトランスフェラーゼ阻害剤TAN-1813の全合成に関する研究TAN-1813は2000年、武田薬品の研究グループにより、真菌類であるphoma sp.FL-41510の培養液から単離・構造決定された天然物であり、優れたRasファルネシルトランスフェラーゼ阻害作用(IC_<50>=2.3μM)を有し、新規抗癌剤として期待されている。このTAN-1813は、核間位(4a位)およびその隣接位(5位)の立体化学および絶対配置が未決定であるが、熱力学的安定性を考慮した推定構造(4aR,5S)で合成し、完全化学合成を達成すると共に天然物の絶対配置を決定することを目的として行った。申請者らは、TAM-1813の上部構造であるマレイミドセグメントの立体選択的な合成を検討した。すなわち、市販のtrans-2-オクテンにEvansの不斉補助基を導入後、不斉Michael反応によりアリル基を立体選択的に導入し、数工程を経て上部構造であるマレイミドセグメントを合成した。さらに、下部構造であるデカリン環との結合を考慮し、プロモマレイミドおよびスクシンイミド構造を有する上部構造部位の合成も達成した。2)ヒストン脱アセチル化酵素(HDAC)阻害剤FK228の類縁体合成に関する研究FK228は、優れたピストン脱アセチル化酵素(HDAC)阻害作用を示し、新しい分子標的抗癌剤のリードとして注目されている。すでに申請者らは、マクロラクトン化反応を機軸としたFK228の全合成を達成している。本年度は、この合成法を基軸としてFK228の2位にメチル基(アラニンユニット)を有する両エナンチオマーを合成を行った。その結果、この2位のメチル基は合成段階、特に鍵反応である椎名マクロラクトン化反応によりエピメリ化しやすいこと示唆される結果が得られた。そこで、マクロ環化反応を光延条件に適用可能な基質の合成をおこない環化前駆体の合成を達成した。1)ヒストン脱アセチル化酵素(HDAC)阻害剤FK228の類縁体合成に関する研究FK228は、優れたピストン脱アセチル化酵素(HDAC)阻害作用を示し、新しい分子標的抗癌剤のリードとして注目されている。すでに申請者らは、マクロラクトン化反応を機軸としたFK228の合成法を確立している。本年度は、この合成法を基軸としてFK228の類縁体であるスピルコスタチンDの全合成を達成した。さらに、スピルコスタチンCに関しては、鍵化合物であるカップリング反応前駆体まで合成を終えている。現在は、この合成を進めると共に、スピルコスタチンDのHDAC阻害活性や細胞毒性などの生物活性評価を行い、より副作用(心毒性)の少ない抗がん剤の開発を目指し研究を行っている。2) p21^<ras>ファルネシルトランスフェラーゼ阻害剤TAN-1813の全合成に関する研究TAN-1813は2000年、武田薬品の研究グループにより、真菌類であるphoma sp.FL-41510の培養液から単離・構造決定された天然物であり、優れたRasファルネシルトランスフェラーゼ阻害作用(IC_50=2.3μM)を有し、新規抗がん剤として期待されている。このTAN-1813は、核間位(4a位)およびその隣接位(5位)の立体化学および絶対配置が未決定であるが、熱力学的安定性を考慮した推定構造(4aR, 5S)で合成し、完全化学合成を達成すると共に天然物の絶対配置を決定することを目的として行った。本年度は、TAM-1813の上部構造であるマレイミドセグメント並びに、すべての不斉炭素を制御した下部構造であるデカリン環セグメントをそれぞれ合成し、カップリング反応を検討したが、効率的に目的物を得ることができなかった。そこで、このカップリングの反応性を見る目的で、モデル化合物を合成しカップリング反応を検討している。1)ヒストン脱アセチル化酵素(HDAC)阻害剤FK228の類縁体合成に関する研究FK228(ロミデプシン)は、優れたヒストン脱アセチル化酵素(HDAC)阻害作用を示し、新しい分子標的抗がん剤のリード化合物として注目されている。すでに申請者らは、光延型マクロラクトン化反応を機軸としたFK228の合成法を確立している。本年度は、この合成法を基軸としてFK228の類縁体であるスピルコスタチンCおよびDの全合成を達成した。さらに、

スピルコスタチンCおよびDに加え、新たに4種類のFK228類縁体を合成し、HDAC阻害活性ならびに種々のヒト癌細胞増殖抑制活性に関する評価を行った。その結果、スピルコスタチンDが、FK228(ロミデプシン)より優れたHDAC阻害活性を有することが判明した。現在、これらの生物活性評価を基にした構造活性相関研究を行っており、より優れたHDAC阻害活性およびアイソフォーム選択性を有する分子標的抗がん剤の開発を目指し研究を行っている。2)p21rasファルネシルトランスフェラーゼ阻害剤TAN-1813の全合成に関する研究TAN-1813は2000年、武田薬品の研究グループにより、真菌類であるphoma sp.FL-41510の培養液から単離・構造決定された天然物であり、優れたRasファルネシルトランスフェラーゼ阻害作用(IC50=2.3μM)を有し、新規抗がん剤として期待されている。このT姻-1813は、核間位(4a位)およびその隣接位(5位)の立体化学および絶対配置が未決定であるが、熱力学的安定性を考慮した推定構造(4aR,5S)で合成し、完全化学合成を達成すると共に天然物の絶対配置を決定することを目的として行った。本年度は、TAN-1813の上部構造であるマレイミドセグメントと下部構造に相当するアルデヒドとのモデルカップリング反応を検討した。その結果、上部構造部位として無水コハク酸、無水マレイン酸、マレイミド、およびN-アルキルマレイミドを用いた種々のカップリング反応(Morita-Baylis-Hillman反応など)を行い、N-アルキルマレイミドを用いたときに、カップリングする可能性があることを見出した。現在、この結果を基に反応条件の最適化を行っている。
高密度実装半導体の超水浸超音波映像検査システムの開発

平成15年度は1.超水浸超音波伝達理論の構築、2.半導体パッケージ検査アルゴリズムの開発、3.超水浸超音波映像検査システムの開発に取組み、それぞれ以下のような研究実績を得た。1.超水浸超音波伝達理論の構築音響液体と被検査物(半導体デバイス)との間に固体薄層を介した超音波伝達系において、受信強度を算出する理論モデルを構築した。音響液体としての水と半導体デバイスとの間に固体薄層を挿入した場合に超水浸超音波伝達(固体薄層の挿入により超音波共鳴が生じ、受信強度が従来水浸時を上回る)が実現される固体薄層の物性を理論モデルより算出するとともに、上記物性を有するいくつかの高分子薄層を特定した。厚さ9μmのポリ塩化ビニリデン層を介したシリコンへの超音波伝達を実施し、超水浸超音波伝達を実現した。2.半導体パッケージ検査アルゴリズムの開発多層構造化された半導体パッケージからの信号重畳を解決するため、(1)固体薄層を用いた周波数フィルタ設計、(2)ウェーブレット解析を利用した検査アルゴリズム開発に取組んだ。(1)では1.で構築した理論モデルより超水浸超音波伝達で実現される信号増幅に加えて、空間分解能を向上させる高周波数変調を実現する固体薄層を設計、実験により設計した周波数フィルタの有効性を確認した。さらに(2)では、多層構造半導体パッケージからの信号に様々なマザーウェーブレットを用いたウェーブレット解析を行い、信号重畳解決に最適なマザーウェーブレットを特定した。3.超水浸超音波映像検査システムの開発1.で構築した超水浸超音波伝達と2.で開発した検査アルゴリズムとを統合した超音波映像検査システムの開発に着手し、現在までに固体薄層の装脱着機構給排水機構、半導体デバイス昇降機構等の機構部を完成させた。
二次粒子の成長に対する有機化合物の影響に関する研究

大気中では硫酸-水の2成分均質核生成、硫酸-アンモニア-水の3成分均質核生成、イオン核生成など複数の機構により二次粒子生成が起きているといわれているが、生成した粒子の成長過程は核生成の機構とは必ずしも同じではなく、様々な有機化合物が微粒子の成長には重要な役割を果していると考えられるようになってきた。本研究では、硫酸ナノ粒子に対して様々な有機化合物を作用させて、大気ナノ粒子の成長の初期過程に対する有機化合物の影響を実験的に検証することを目的としている。昨年度はSO_2/H_20/Air混合ガスの放射線電離による微粒子発生システムと、帯電粒子捕集器、DMAから構成される実験システムを昨年度構築して予備的な実験を行ったが、放射線による電離では微粒子の生成効率が十分ではなかった。そこで今年度は電離方法として放射線ではなく新たに負極性コロナ放電を用いることにより効率的な硫酸ナノ粒子の生成を可能にした。このような方法で生成した硫酸ナノ粒子の粒径は水蒸気濃度およびSO_2濃度とともに増大することを確認した。また非帯電の硫酸ナノ粒子だけを取り出して有機化合物としてトルエンとギ酸を作用させたところ、トルエンの場合は粒径分布に変化が見られなかったが、ギ酸には硫酸ナノ粒子を成長させる効果が認められた。しかしながら、ギ酸による影響は実験する度に変動が大きく、その正確な評価には測定回数をさらに増やして実験を重ねる必要がある。SO_2/H_2O/Air混合ガスの放射線電離によって非帯電硫酸ナノ粒子を発生させ、有機化合物と反応させてその粒子数密度および粒径分布の変化を測定するための実験システムを構築した。実験システムは、混合ガス供給部、微粒子生成・反応部、および測定部から構成される。混合ガス供給部では、高純度空気を乾燥カラムおよび加湿器に通し、それぞれの流量をマスフローコントローラで調整することにより水蒸気量を制御する。これに濃度が既知のSO_2およびNH_3をマスフローコントローラで調整して加えられるようにした。これまでの研究から、SO_2/H_2O/Air混合ガスの放射線電離によってイオン誘発核生成と均質核生成が同時に起こることがわかっている。したがって、イオン誘発核生成による帯電粒子と均質核生成による非帯電粒子が発生する。本研究では電荷を持たない非帯電硫酸ナノ粒子を実験に用いるため、イオナイザーで発生した微粒子を帯電粒子捕集器に導入して帯電粒子を取り除くことにした。捕集器を通過した非帯電粒子は反応チャンバーに導入され、ここで様々な有機化合物と混合される。有機化合物を入れた場合と入れない場合で、粒子数および粒径分布に生じる変化をそれぞれ凝縮核型粒子計(UCNC)および微分型静電分級器(DMA)によって測定する。SO_2/H_2O/Air混合ガスの放射線電離によって生成する微粒子を帯電粒子捕集器を使って調べてみると、実際はほとんどが非帯電粒子であることがわかった。しかしDMAで計測するために荷電するとその一部分だけしか電荷を持たないため、荷電用Amによる非帯電微粒子のわずかな生成もその影響が無視できない。この問題点を回避するために荷電用Amによって生成する微粒子の粒径分布をあらかじめ測定しておき、その分を差し引くことによって非帯電粒子の粒径分布が測定可能であることを確認した。
光架橋した高分子混合系のメゾスコピック秩序化現象とモルフォロジーの新規制御法

二成分高分子混合系Poly(2-chlorostyerne)/Poly(vinyl methyle ther)(PSCS/PVME)の一相領域において、紫外光照射によりPSCSを架橋した。反応はPSCS鎖上に化学的に修飾した感光団アントラセンの光二重化反応を利用した。架橋反応の進行と共に、PSCSのネットワークが形成され、不安定領域が拡大し、混合系は相分離する。また、PSCSおよびPVMEの分子量はそれぞれ26万と9万であった。光源は500WのXe-Hgランプであり、強度3mW/cm^2、波長365nmの光を用いた。共存曲線とガラス転移温度に囲まれた一相領域でPSCS鎖を架橋した場合、架橋反応と相分離の競合によって次の4つの場合に分類することができた。領域(I):ガラス転移温度(Tg)近傍でPSCS鎖を架橋するとTgが上昇する。ある程度反応が速く進行すると、相分離が起こる前に実験温度はガラス温度内に入り、ブレンドは相溶するまま凍結され、擬相溶のsemi-IPNがられる。温度を上昇されると、相分離は起こるが、架橋されるため、相分離構造が百Å程度に限定されることは小角X線散乱によって観測された。領域(II):共存曲線近傍で架橋した場合、不安定領域が拡大し、実験温度に達すると相分離が起こり、構造は成長するが、架橋のため、スピノール構造が後期まで成長する前に架橋によって凍結された。この過程は、障害物のある場合の相分離動力学について最近、提案されたGlotzer-Di Marzio-Muthukumar(GMD)スケーリング則によく表わすことができた。領域(III):上述した領域(I)と(II)の間、またPSCSの高濃度の領域である。低温において核生成と成長を伴ったスピノール分解過程が観測され、より高温では同心円のターゲットパターンが得られた。温度をさらに昇させる場合、スピノ-ダル分解と核生成.成長が共存する領域が発見された。一方、PSCSの組成が小さい場合、相分離の誘発がおそく、架橋反応の収率が大きい。そのため、長時間を照射するとネットワークの形成によって生成した弾性ひずみが濃度と結合して、モルフォロジーの等方性から異方性へ転移が起こり、秩序性の高い構造が観測された。上述した光架橋反応によって誘発された相分離構造は一般にModulated Phaseと呼ばれ、反応と相分離の競合尺度を変化させれば、ナノメータからミクロメータまでの広い範囲にわたって設計できる。
O/W型エマルジョンの革新的解乳化プロセスの開発

O/Wエマルジョンは、分散相(油滴)間の距離が遠く、引力が働きにくい、分散相(油滴)の誘電率が小さく、静電的な分極が起こりにくく強引力が発生しにくいなど、解乳化が起こりにくい。解乳化させるには、分散相間の距離が短くなればよく、合一に至らなくても、交流電場を印可すれば解乳化が可能になる(実証済、特許6214025号)。そこで、分散相の濃縮としてクリーミングが起こることを目指した。クリーミングとは、エマルジョンの分散相が凝集することにより、分散相の濃度が高い相(クリーム状)と希薄な相(透明な液)である。O/Wエマルジョン(トルエン10vol%, span40 5mM)を交流電場印可(1000kV/m, 100Hz、約180秒)の処理を行い、見かけの変化がないエマルジョンを、直径約20mmの円筒形、高さ200mmのポリプロピレン製(表面疎水性)の容器に静置した。約1日で液体上部にクリーミング層が発生し、下部には半透明な液層が現れた。わずかに振動を与えると簡単に入り交じり、相分離が完全でないことも確認した。クリーミング層を分離し、カールフィッシャー法で確認するとトルエンの体積分率は81vol%まで濃縮されていた。また、顕微鏡で観察すると分散相(トルエン相)は、ほぼ六角形に近い形状でくっつき合っていることもわかった。このクリーミング相に交流電場印可(同上)を行うと、透明なトルエンが体積比52vol%で回収することができた。このことより、O/Wエマルジョンのクリーミングに交流電場印可の効果があり、クリーミングにより分散相間の距離が短くなることによる静電的相互作用の増加し、再度の交流電場の印可によりこれまでほとんど報告例のなかったO/Wエマルジョンの解乳化に成功した。なお、なぜ交流電場をエマルジョンに与えるとなぜクリーミングするのか、そのメカニズムの解明が今後の研究課題である。平成30年度が最終年度であるため、記入しない。電場印加法によりO/W型エマルジョンを解乳化させた。水相は純水に0ー3.0重量%のドデシル硫酸ナトリウム(SDS)を溶解させ、油相には市販のトルエン(特級)をそのまま用いた。両相を所定の有機溶媒分率で混合し、ホモジナイザーを使って24000rpm、1分間、攪拌しエマルジョンを調製した。各エマルジョンがO/W型エマルジョンであることを、拡散法により確認した。エマルジョンを内径1.0 mm、外径3.0mm、長さ760mmのフッ素ゴムチューブを管の上下に、銅電極ではさみ電極間に1000 kV/m、周波数100 Hz、矩形変化する交流電場を、フッ素チューブ管内を流れるエマルジョンに照射した。フッ素ゴムチューブ管から排出した液体をすべてメスシリンダーに受けとり、液体の上部に分離した透明なトルエンの体積Vを測定した。全体の液の体積に対する解乳化して分離されたトルエンの体積分率Φとエマルジョンの調製のために使用したトルエンの体積分率Φ0の比を100分率として表した解乳化率E=(Φ/Φ0)で定義する。電場の照射時間が増すにつれて、Eは増大した。電場の照射時間[秒]における電場照射「なし」および「あり」の解乳化率Eは、(50秒、3%、8%)、(100秒、8%、12%)、(150秒、12%、12%)、(200秒、18%、21%)、(550秒、18%、18%)であった。解乳化率が10%以下の低い時は電場の解乳化の促進の効果が顕著であった。しかし、解乳化が10%以上では、電場の効果が小さくなった。エマルジョンの分散相の直径は、解乳化が進行するにつれて、10マイクロメートルから30マイクロメートル程度の大きくなっており、分散相の合一が促進されていることを確認した。フッ素ゴムの壁に分散相(油相)が多く不着していることが観察されたので、不着した油相の合一を促進させることが重要であろうと判断した。本年度の予定としては、エマルジョンが流れるフッ素ゴムチューブの上下から、チューブ全体を一様に覆う2枚の銅板電極で挟み、この電極板間に交流電場を印加させる方針で実験を行う予定であった。この電極条件では、装置内を流れるエマルジョンは均一な交流電場を照射される。水ーp-キシレン系エマルジョン(界面活性剤;LAS)において、印加する電場強度(0-1000 kV/m)、電場を印加する時間(0-300s)、交流電場の周波数(0-500Hz)、エマルジョンの分散相(油相)の体積分率の影響が解乳化におよぼす影響を実験により明らかにした。当初の予定どおり、上記に示すようにO/Wエマルジョンの解乳化の可能性を見出した。電場の作用により分散相の油滴が合一し、大きくなった油滴がフッ素ゴムの壁に一部不着していることから、この油滴を効率よく回収することが解乳化に効果があることを示唆している。新たに発生した課題としては、解乳化率が20%程度より大きくならない点である。

解乳化の向上については、次年度に開発する予定になっている新規に考案する電場の強度を不均一にする電極の開発においても考慮する。O/Wエマルジョンは、分散相(油滴)間の距離が遠く、引力が働きにくい、分散相(油滴)の誘電率が小さく、静電的な分極が起こりにくく強引力が発生しにくいなど、解乳化が起こりにくい。解乳化させるには、分散相間の距離が短くなればよく、合一に至らなくても、交流電場を印可すれば解乳化が可能になる(実証済、特許6214025号)。そこで、分散相の濃縮としてクリーミングが起こることを目指した。クリーミングとは、エマルジョンの分散相が凝集することにより、分散相の濃度が高い相(クリーム状)と希薄な相(透明な液)である。O/Wエマルジョン(トルエン10vol%, span40 5mM)を交流電場印可(1000kV/m, 100Hz、約180秒)の処理を行い、見かけの変化がないエマルジョンを、直径約20mmの円筒形、高さ200mmのポリプロピレン製(表面疎水性)の容器に静置した。約1日で液体上部にクリーミング層が発生し、下部には半透明な液層が現れた。わずかに振動を与えると簡単に入り交じり、相分離が完全でないことも確認した。クリーミング層を分離し、カールフィッシャー法で確認するとトルエンの体積分率は81vol%まで濃縮されていた。また、顕微鏡で観察すると分散相(トルエン相)は、ほぼ六角形に近い形状でくっつき合っていることもわかった。このクリーミング相に交流電場印可(同上)を行うと、透明なトルエンが体積比52vol%で回収することができた。このことより、O/Wエマルジョンのクリーミングに交流電場印可の効果があり、クリーミングにより分散相間の距離が短くなることによる静電的相互作用の増加し、再度の交流電場の印可によりこれまでほとんど報告例のなかったO/Wエマルジョンの解乳化に成功した。なお、なぜ交流電場をエマルジョンに与えるとなぜクリーミングするのか、そのメカニズムの解明が今後の研究課題である。照射する交流電場の条件の影響を明らかにすることを目的に電場の影響,および電極の配置を換えて不均一電場を与えた。また,O/Wエマルジョンと有機溶媒あるいは水を交互流接触させることにより解乳化を試みたが,顕著な解乳化を確認することはできなかった。そこで,電場の照射により解乳化できるO/Wエマルジョンを精緻に探索することにした。(2)解乳化手法の開発と解乳化のメカニズムの解明種々のO/Wエマルジョンについて調べたところ,交流電場による解乳化は非イオン性界面活性剤を用いて調製したO/Wエマルジョンに有効であることが明らかになった。電場印加によるO/W型エマルジョンの解乳化は,油相分率が高い場合(50vol%)の場合,分散相(油相)径が大きいほど起こりやすかった。特に,分散相20μm以上の径で解乳化が起こりやすかった。また,油相分率が低い場合(10vol%)の場合, 100 Hz, 1000 kV/mの矩形波交流電場を約180秒与えたが,解乳化を確認することができなかった。しかし,その後,24時間静置することにより水相とクリーム状で粘度が高いエマルジョン層に分離した。このクリーム状に濃縮したエマルジョンの水分率をカールフィッシャー水分計用いて測定し,油相体積分率を算出したところ,油相分率が81.3 vol%まで増加したことが明らかになった。この濃縮したエマルジョンをさらに本研究で開発した電場印加装置による電界強度1000 kV/mの電場を印加したところ,濃縮液基準で52.0%のトルエンを分離することができた。これまでにほとんど報告例がなかったO/Wエマルジョンの解乳化は,交流電媒印加と24時間程度の静置による相分離,さらに,濃縮されたエマルジョンの再度の電場印加による解乳化で50%以上の溶媒回収が可能であることがわかった。
顎骨形成術における骨および神経組織変化に関する実験的研究

顎変形症患者に行われる下顎枝矢状分割術と骨延長術における神経組織および神経生理学的変化を調べる目的で家兎を用い実験を行った。すなわち4群に分けた実験系でそれぞれ骨形成関連細胞の局在および骨誘導タンパクの発現等を確認・観察する免疫組織化学的評価について検討を行った。その結果、下顎枝矢状分割術と骨延長術のいずれにおいても対照群の組織学的所見になるまでの時間に相違はあるものの良好な回復が認められた。実際の下顎骨骨切り術施行患者のComputed tomography (CT)画像情報を用い骨切り部位、骨切り範囲の数値化を行うにことにより統計学的に三叉神経感覚誘発電位の分析結果と合わせて解析したところ、神経走行と骨切り部位の大きさ、位置が術後の知覚神経麻痺に関与していることがわかってきた。骨内にも下歯槽神経の分枝が存在しており、その修復回復が骨新生とともに生じるのではないかと考えられる。実験的研究においては、下顎骨骨切り手術を行っていない家兎において、オトガイ部に刺激電極を設置、オトガイ部知覚領域の脳座標に従って、電極を刺入し、対照としての誘発電位を計測することから試みた。刺激波形、刺激強度、解析時間など過去の報告も参考にしながら三叉神経体性感覚誘発電位(TSEP)の正常波形が再現性をもって計測可能はどうか検証した。非常に微弱な電位であるが、波形を加算することで、潜時、振幅が記録できることを確認した。次に、家兎、下顎臼歯と前歯の間で骨切りし、下歯槽神経血管束に損傷をできるだけ与えないようにした。短縮群では3mmの骨幅を削除し、伸長群では3mm間隙を開けプレートとスクリューでできるだけ強固に固定した。術後3日目、2週、4週、8週、112週においてそれぞれTSEPの測定を行った。個々の家兎についてTSEP波形解析を行っている。また確実にTSEP波形の解析が可能であったものに関して、随時屠殺し、組織学的な検索を行っている。TSEP波形解析結果と組織学的解析結果の関連性は非常に重要であり、実際の組織学的回復状況がTSEP波形にどのように反映するかを現在、分析している。実験動物の電気刺激による下歯槽神経の活動電位波形では、術後、一期的骨片移動を行うことで、潜時の延長と振幅の減少がある傾向があった。組織変化では、軸索、神経鞘の変化と骨再生修復過程の関連性も検討中である。下顎骨に対する顎矯正手術のうち世界的にもっと頻用されている術式は下顎枝部で骨切りする下顎枝矢状分割術(SSRO)である。この術式はオトガイ領域の知覚神経麻痺は発生頻度が高いことと、回復までの期間が予側できないことなどの問題がある。一方では近年、顎顔面領域において骨延長法の応用が広まりつつある。しかしながら、骨延長術がSSROによる一期的な骨移動を行う時と神経組織および神経生理学的変化においてどのように異なっているのかは解明されていない。そこで動物実験により2種類の違った方法による骨切り後の骨移動が神経組織あるいは周期の軟組織、骨組織に与える影響を明らかにすることが目的である。21年度は一期的に骨変移動を行った際には神経周囲の骨形成が十分行われるか不明であることから、十分な骨形成を可能にするためのスペースを設け周囲軟組織の侵入を防ぎ,骨形成を促進した状態と、単に、骨切り後、伸長し閉鎖縫合のみ行った群との比較を行うため以下の実験系に進んだ。平成20年度の実験と同様の方法で、術前、術直後、2週、4週、12週、24週経過時に電気刺激による神経生理学的観察を行い、2週、4週、12週、24週経過時屠殺、標本作製した。標本数は各週ごと4羽とした。各群において形態的・X線学的・組織学的ならびに免疫組織学的に再生骨の変化および神経組織変化について精査している。下歯槽神経そのものの組織変化のみならず、周囲の新生骨組織内への神経分枝の新生過程を観察できれば、より効果的な骨新生部位での末梢神経組織の再生のメカニズムが明らかにでき、それが生理学的に機能するためには、どのような組織変化が必要であるかも解明できると考え実験を進めている。顎変形症患者に行われる下顎矢状分割術(SSRO)と骨延長術における神経組織および神経生理学的変化を調べる目的で家兎を使った実験を行ってきた。今年度は4群に分けた実験系でそれぞれ解析ソフトを用い軸索、骨量の面積などを数値化して各群間で客観的に比較検討するため組織学的評価、神経周囲の骨形成細胞に対してPCNA(Proliferating Cell Nuclear Antigen:細胞増殖核抗原)およびBMP(Bone Morphogenetic Proteins:骨誘導タンパク)に対する免疫組織化学的染色をLSAB(labelled streptavidin biotin)法に基づいて行った。各材料、各時期における骨形成関連細胞の局在およびBMPの発現等を確認・観察する免疫組織化学的評価について検討を行い、現在最終的な取りまとめを行っている。