hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
ウェーブレット変換を用いた歯元応力からの歯車歯形誤差評価

歯車は互いの歯面が滑り・転がり接触して動力を伝達しているが,歯面にピッチング,スポーリング等の損傷が起こり,歯形が劣化することにより,歯車動荷重が変化し,装置の振動,騒音が非定常に変化するようになる.このように歯面損傷の予知を行うことは歯車装置の故障診断にとって重要であると考えられる.本研究では,歯面損傷を行う際の検出信号に対するウェーブレッド変換の有用性を工学的観点から明らかにすることが本研究の目的である.そこで,歯車運転疲れ試験中の歯元ひずみ,歯車箱振動加速度を所定の繰返し数ごとに測定し,それらの信号をウエーブレッド変換を用いて,時間・周波数分析を行った.その結果,単独の歯に歯面揖傷が起こる場合には,歯面損傷が発生した歯を特定することができた.しかし,連続した複数の歯に歯面損傷が現れた場合には,大まかには損傷した歯を特定できるが,正確には特定できなかった.また,従来より行われている高速フーリエ変換による故障診断では,どの歯が損傷したかまでは検出できなかったことから,歯車故障診断におけるウェーブレッド変換の有用性を示すことができた.歯元ひずみに含まれる高周波成分の強度の時間的変化は,わずかな歯形の変化により異なった.また,歯車の荷重分担に大きく影響される歯元ひずみの低周波成分の強度は,わずかな歯形の変化にはあまり影響されなかった・すなわち・歯元ひずみをウェーブレッド変換することにより,歯面の微少な歯形変化を検知できる可能性を示した.以上のように,歯面損傷を行う際の検出信号に対するウェーブレット変換の有用性を工学的観点から明らかにすることができた.歯車は互いの歯面が滑り・転がり接触して動力を伝達しているが,歯面にピッチング,スポーリング等の損傷が起こり,歯形が劣化することにより,歯車動荷重が変化し,装置の振動,騒音が非定常に変化するようになる.このように,歯面損傷の予知を行うことは歯車装置の故障診断にとって重要であると考えられる.本研究では,歯面損傷を行う際の検出信号に対するウェーブレット変換の有用性を工学的観点から明らかにすることが本研究の目的である.そこで,歯車運転疲れ試験中の歯元ひずみ,歯車箱振動加速度を所定の繰返し数ごとに測定し,それらの信号をウェーブレット変換を用いて,時間・周波数分析を行った.その結果,単独の歯に歯面損傷が起こる場合には,歯面損傷が発生した歯を特定することができた.しかし,連続した複数の歯に歯面損傷が現れた場合には,大まかには損傷した歯を特定できるが,正確には特定できなかった.また,従来より行われている高速フーリエ変換による故障診断では,どの歯が損傷したかまでは検出できなかった.したがって,歯車故障診断におけるウェーブレット変換の有用性を示すことができた.歯元ひずみに含まれる高周波成分の強度の時間的変化は,わずかな歯形の変化により異なった.また,歯車の荷重分担に大きく影響される歯元ひずみの低周波成分の強度は,わずかな歯形の変化にはあまり影響されなかった.すなわち,歯元ひずみをウエーブレット変換することにより,歯面の微少な歯形変化を検知できる可能性を示した.以上のように,歯面損傷を行う際の検出信号に対するウェーブレット変換の有用性を工学的観点から明らかにすることができた.歯車は互いの歯面が滑り・転がり接触して動力を伝達しているが,歯面にピッチング,スポーリング等の損傷が起こり,歯形が劣化することにより,歯車動荷重が変化し,装置の振動,騒音が非定常に変化するようになる.このように歯面損傷の予知を行うことは歯車装置の故障診断にとって重要であると考えられる.本研究では,歯面損傷を行う際の検出信号に対するウェーブレッド変換の有用性を工学的観点から明らかにすることが本研究の目的である.そこで,歯車運転疲れ試験中の歯元ひずみ,歯車箱振動加速度を所定の繰返し数ごとに測定し,それらの信号をウエーブレッド変換を用いて,時間・周波数分析を行った.その結果,単独の歯に歯面揖傷が起こる場合には,歯面損傷が発生した歯を特定することができた.しかし,連続した複数の歯に歯面損傷が現れた場合には,大まかには損傷した歯を特定できるが,正確には特定できなかった.また,従来より行われている高速フーリエ変換による故障診断では,どの歯が損傷したかまでは検出できなかったことから,歯車故障診断におけるウェーブレッド変換の有用性を示すことができた.歯元ひずみに含まれる高周波成分の強度の時間的変化は,わずかな歯形の変化により異なった.また,歯車の荷重分担に大きく影響される歯元ひずみの低周波成分の強度は,わずかな歯形の変化にはあまり影響されなかった・すなわち・歯元ひずみをウェーブレッド変換することにより,歯面の微少な歯形変化を検知できる可能性を示した.以上のように,歯面損傷を行う際の検出信号に対するウェーブレット変換の有用性を工学的観点から明らかにすることができた.
盗葉緑体性渦鞭毛藻の細胞内共生に必要な宿主・共生体の内的変化と外的環境要因の解明

細胞内共生は宿主と共生体だけではなく、宿主、共生体、細胞外環境が密接に関連しあって成立する現象である。本研究では、共生の成立と維持に求められる宿主と共生体の生理的要因と細胞外の環境要因を特定することを目的とする。そのために、本研究では盗葉緑体現象を対象とし、宿主渦鞭毛藻と共生クリプト藻双方に起こる生理的変化、及び細胞外環境が共生関係に及ぼす影響を理解する。平成30年度は、Nusuttodinium aeruginosumの一時的な共生関係における宿主と共生体双方の生理的変化を明らかにするため、宿主渦鞭毛藻及びクリプト藻の明暗に応じたトランスクリプトーム変動解析を行った。また、共生藻であるクリプト藻の生理的変化を明らかにするため、共生前での明暗に応じたトランスクリプトーム変動解析を行い、共生後の変動との比較を行った。共生藻の変化に着目して解析を行った結果、共生条件では葉緑体に標的されるタンパク質をコードした遺伝子群の多くが、自由生活条件に比べて有意に発現上昇することが明らかとなった。これらの葉緑体関連遺伝子群の発現上昇が葉緑体の著しい拡大に寄与していると示唆された。上記の解析と並行して、宿主側の生理的変化を明らかにするためするため、宿主渦鞭毛藻の明暗に応じたトランスクリプトーム変動解析を行った。宿主渦鞭毛藻では、無機窒素の取り込みに関する遺伝子群が明条件で発現上昇することが示された。このことから、N. aeruginosumは、共生藻の光合成が起こる明期に、細胞外から硝酸を取り込んで共生藻に供給していると考えられる。重要だと思われる遺伝子については、そのタンパク質の抗体を作成し、解析を進行させている。平成30年度に予定していたトランスクリプトーム解析を終了させ、共生関係の維持に重要な遺伝子群を見出し、その抗体を用いた局在解析も行うことができたため。また、トランスクリプトーム解析や種々の培養実験によって、共生関係に重要だと思われる細胞外環境要因の特定につながる知見を得ることができたため。平成30年度に作成した抗体の他に、トランスクリプトーム解析で重要だと推測されたタンパク質に対して抗体を作成し、局在と発現パターンを解析する。さらに、これらのタンパク質の活性を確かめるため、Cyanidioschyzon merolaeの形質転換系を用いて相補実験を行う。また、栄養塩を変動させた培養実験を行い、形態観察と遺伝子発現解析から共生関係に起こる変化を特定する。
イノシト-ルリン脂質代謝物の分別定量法の培養細胞系への適用に関する研究

イノシト-ルリン脂質(InsP)代謝物質の動態を追求するのに適した培養細胞実験系の1つと考えたヒト前骨髄性白血病細胞(HL-60)を用いて、腫瘍壊死因子(TNF)と受容体の結合がInsP代謝物にどのような変化を与えるかについて検討した。InsP代謝物の分別にはイオン交換カラムクロマトグラフィを用い溶出分画中InsP検出には,予定した高感度リン定量系の確立が未完成なため,放射活性を利用することとした。すなわち、培養細胞HL-60をmyo[^3H]inositolで標識し、TNFを添加したあとクロロホルム・メタノ-ルで水溶性分画を抽出した。イオン交換カラムクロマトグラフィでInsP代謝物を分別溶出し、それぞれの放射活性を測定した。TNF添加直後よりInsP代謝物が有意に増加することが確認され、InsP代謝回転の亢進がみられることが明らかとなった。細胞内cyclicAMP濃度を上昇させうる物質の共存下ではTNFの生理活性が相乗的に上昇すること、TNFの高親和性受容体蛋白と考えられる膜蛋白(分子量約78kDa)を同定できたことから、TNFによるHL-60の分化誘導時にはTNFと78kDa受容体蛋白との結合を介し、細胞内情報伝達機構にInsP代謝が関与することが考えられる。陰イオン交換樹脂(Mono Q,HR5/5)を支持体とした高速液体クロマトグラフィによってイノシトールリン脂質(Insp)代謝物質、InsP_1、InsP_2、InsP_3の分別分離ができることを確かめた。分別採取した分画中のこれら物質の定量には、検出感度の改良がのこされているが、InsP代謝物質中リン酵素的定量が可能である。ヒト骨髄性白血病細胞HL-60がInsP代謝系の動態を追究するのに適切な実験系になることを示す結果が得られた。骨髄性白血病の分化誘導因子を白血病細胞膜上の因子受容体との結合という面から検討を加えるなかで、白血病細胞が分化誘導因子の1つであるTNF(腫瘍壊死因子)に対して高親和性及び低親和性受容体を保有し、高親和性受容体との結合が分子誘導因子の活性を発現させ、低親和性受容体との結合が活性を喪失させるという事実が見出された。すなわちTNF高親和性受容体を介する生理活性が低親和性受容体による負の調節うけることが示唆される。この培養細胞系において異なった親和性をもつ受容体へのTNFの結合が細胞内情報伝達に関係するInsP代謝物にどのような変化を与えるかをみることが重点課題となる。細胞内情報伝達に係る酵素のひとつプロテインキナーゼCの活性は、平板電気泳動法およびオートラジオグラフィを用いて測定する方法が確立された。
韓国人のβサラセミア変異

1.経緯この研究の目的は,韓国人のサラセミアおよび異常ヘモグロビンについて調査し,この方面に関する世界地図上の空白を満たすことである.最初は,ソウル大学病院を中心に韓国の医療施設で見いだされた疑わしい症例の血液が山口大学医学部に受け入れられ,そこで臨床病理学的診断,さらに変異遺伝子DNAの分析,あるいは異常ヘモグロビンの蛋白化学的分析が行われた.次いでDNA分析技術が山口大学医からソウル大学に移転移転され,その結果ソウル大学医学部臨床病理学教室が韓国におけるサラセミアおよび異常ヘモグロビン研究のためのセンター機能を果たし得るようになった.2.韓国におけるサラセミア症スクリーニング(1)サラセミア症および異常ヘモグロビン症とはどんな病気か.これらの病気が韓国人にも存在することについて広く医師の注意を喚起されることにより,疑わしい症例の報告と血液検査を促進した.(2)ソウル大学病院における過去の末梢血液検査データ15万例(約5万患者)を洗いなおした.(3)日常血球検査データの中から,ヘモグロビン濃度>9g/dL,平均赤血球体積<70fLまたは平均赤血球ヘモグロビン<24pgの両条件を満たす症例を常時選び出すシステムにより,サラセミア疑診例を拾い上げた.このような努力により,韓国におけるβサラセミア保因者の頻度はおよそ0l010.1%と推定された.3.韓国人から同定されたサラセミア変異韓国では従来「優性型」サラセミア(コドン32-34の3塩基欠失:Hb korea)の1症例報告がみられたのみであったが,日韓共同研究開始以来さらに13症例について,βグロブリン遺伝子変異が決定された.その内訳は翻訳開始コドン変異(5例):コドン17終止変異(4),121終止変異(1),IVS-I-130スプライス変異(2種,各1例),コドン41-42の4塩基欠失(1)である.これらの仕事は初期には山口大学医学部で遂行されたが,その後の技術移転により,大部分ソウル大学医学部で完遂されるようになった.4.韓国人から同定された異常ヘモグロビン蛋白化学的方法による異常ヘモグロビンの同定や,その諸性質の測定は韓国では行われず,これらの仕事は大部分山口大学医学部で実施された.5.ヘモグロビン遺伝子変異からみた日本人と韓国人ヘモグロビン遺伝子変異は韓国でも日本と同様に多種類低頻度であることが示唆された.この点南アジアとは対照的である.両国とも低頻度ながら東南アジア系変異(コドン41-42の4塩基欠失など)を有するが,北アジア系(Hb G-Coushattaなど)あるいは独自の変異のほうがむしろ多い.ATAボックス変異(-31Cap)やコドン90終止変異,その他多数の日本人に多い,あるいは日本人独自の変異の多くが,未だ韓国人には見いだされていない.日本人と韓国人の共通点と相違点をさらに明確にするためには韓国人に関するもっと多数のデータが必要である.1.経緯この研究の目的は,韓国人のサラセミアおよび異常ヘモグロビンについて調査し,この方面に関する世界地図上の空白を満たすことである.最初は,ソウル大学病院を中心に韓国の医療施設で見いだされた疑わしい症例の血液が山口大学医学部に受け入れられ,そこで臨床病理学的診断,さらに変異遺伝子DNAの分析,あるいは異常ヘモグロビンの蛋白化学的分析が行われた.次いでDNA分析技術が山口大学医からソウル大学に移転移転され,その結果ソウル大学医学部臨床病理学教室が韓国におけるサラセミアおよび異常ヘモグロビン研究のためのセンター機能を果たし得るようになった.2.韓国におけるサラセミア症スクリーニング(1)サラセミア症および異常ヘモグロビン症とはどんな病気か.これらの病気が韓国人にも存在することについて広く医師の注意を喚起されることにより,疑わしい症例の報告と血液検査を促進した.(2)ソウル大学病院における過去の末梢血液検査データ15万例(約5万患者)を洗いなおした.(3)日常血球検査データの中から,ヘモグロビン濃度>9g/dL,平均赤血球体積<70fLまたは平均赤血球ヘモグロビン<24pgの両条件を満たす症例を常時選び出すシステムにより,サラセミア疑診例を拾い上げた.このような努力により,韓国におけるβサラセミア保因者の頻度はおよそ0l010.1%と推定された.3.韓国人から同定されたサラセミア変異韓国では従来「優性型」サラセミア(コドン32-34の3塩基欠失:Hb korea)の1症例報告がみられたのみであったが,日韓共同研究開始以来さらに13症例について,βグロブリン遺伝子変異が決定された.その内訳は翻訳開始コドン変異(5例):コドン17終止変異(4),121終止変異(1),IVS-I-130スプライス変異(2種,各1例),コドン41-42の4塩基欠失(1)である.これらの仕事は初期には山口大学医学部で遂行されたが,その後の技術移転により,大部分ソウル大学医学部で完遂されるようになった.4.韓国人から同定された異常ヘモグロビン蛋白化学的方法による異常ヘモグロビンの同定や,その諸性質の測定は韓国では行われず,これらの仕事は大部分山口大学医学部で実施された.5.ヘモグロビン遺伝子変異からみた日本人と韓国人ヘモグロビン遺伝子変異は韓国でも日本と同様に多種類低頻度であることが示唆された.この点南アジアとは対照的である.

両国とも低頻度ながら東南アジア系変異(コドン41-42の4塩基欠失など)を有するが,北アジア系(Hb G-Coushattaなど)あるいは独自の変異のほうがむしろ多い.ATAボックス変異(-31Cap)やコドン90終止変異,その他多数の日本人に多い,あるいは日本人独自の変異の多くが,未だ韓国人には見いだされていない.日本人と韓国人の共通点と相違点をさらに明確にするためには韓国人に関するもっと多数のデータが必要である.
外国法適用の観点からみた渉外事件の処理プロセス-日伊比較研究-

今年度は、最終年度として、従来の研究の成果をまとめることに専念した。すなわち、代表者(奥田)は、公序および反致に関する判例のまとめを行い、分担者(早川)は、外国法の審理方法に関する判例のまとめを行った。その成果は、次のとおりである。第一に、日本をはじめ多くの国においては、いわゆる「外国法の適用」については法律の明文の規定がなく、その解決は判例に委ねられている。これに対して、イタリア新国際私法(1995年)は、この問題に関する明文の規定を置いており(14条および15条)、この点が同法のひとつの特色になっている。そこで、これらの条文の起草過程およびこれらの条文に関する裁判例を中心に、抵触法の適用および準拠外国法の適用をめぐって、裁判所と訴訟当事者との間において、どのように権限・義務が分配されるかを総合的に検討し、あわせて、同じ問題に関する他国(日本、英国、フランス等)の取扱との比較をおこなった。その結果、イタリアにおける「外国法の適用」に関する実態および特色を明らかにすることができた。第二に、イタリアの裁判所は、従来から公序を積極的に発動する傾向にあり、1995年の国際私法改正後も、この傾向は変わらない。その対象となった外国法は、東欧・中近東・北アフリカ・南米などのほか、とりわけイギリスなどのEU域内の法律も含まれている。ただし、公序違反が否定された例も多く、慎重な外国法の認定を基礎としていることが伺われる。この点は、日本の裁判所における公序の発動にとって、大いに参考になる点であろう。これに対して、反致は、1995年改正以降に初めて認められたためか、判例はほとんど見当たらなかった。本研究は、日本とイタリアの裁判所における外国法の適用例を収集することから始めるが、初年度は、代表者(奥田)が公序の発動例を収集し、分担者(早川)が外国法の職権適用などが問題とされた例を収集した。対象としたのは、最近10年間の判例である。全体的にみると、日本の渉外判例は最近増えてきたとはいえ、本研究のテーマに直接関わるものが少ないのに対して、イタリアの判例は、そもそも外国法の適用が問題となるものがかなりの数にのぼり、本研究のテーマに関係するものを相当数収集することができた。そこで、われわれの分析は、主にイタリアの判例に集中して行われた。まず公序違反については、分野別では、家族法だけでなく、財産法(とくに労働契約)においても多数の該当例が見られ、また対象となった外国法も、いわゆる発展途上国法だけでなく先進国法もかなり含まれていた。とくに財産法の分野では、外国法の適用排除という意味での消極的公序ではなく、むしろイタリア法の強行規定の適用を確保するという意味での積極的公序の発動例が多かった。一方、家族法の分野において、消極的公序が問題となる場合も、外国法の適用を排除した後は、ストレートにイタリア法を適用する傾向が見受けられた。一方、外国法の職権適用については、むしろ訴訟当事者の証明責任が問題となった例が多数見られ、外国法の内容の調査・証明のあり方なども議論となっていた。今年度は、引き続き、代表者(奥田)が反致における外国国際私法の適用を研究し、分担者(早川)が外国法の内容不明および適用違背の処理を研究した。まず反致については、イタリア国際私法が伝統的に反致を全面的に否定しており、1995年の改正法により初めて反致を認める規定(13条)を置いたため、イタリアの判例を十分に調査することはできなかった。ただし、1995年の改正法については、1989年・1991年・1993年の草案までは従来の反致否定主義を維持していたのに対し、最終段階において急遽、かなり広い範囲で反致を認める規定を置いた点が注目される。とりわけ本研究との関連では、外国国際私法の適用により渉外事件の処理プロセスがどのように変化するのかという観点から、立法資料を収集・分析した。一方、わが国では、中国人の相続について、中華人民共和国の国際私法が不動産所在地法である日本法を指定しているとして反致を認めた最高裁判決(平成6年3月8日)があるが、中国国際私法の調査・適用に多数の問題があることが明らかとなった。つぎに外国法の内容不明については、最近の日伊両国の判例とも、問題となったケースは少ない。これは、外国法の調査方法が進歩したためである。とりわけイタリアは、1995年改正法に外国法の調査方法に関する規定を置き(14条1項後段)、また外国法情報の交換に関するヨーロッパ条約に加盟している。そこで改正法の立法趣旨や条約の実施状況を調べることにより、イタリアにおける外国法の調査プロセスを明らかにすることができた。また外国法の適用違背については、日伊両国とも、これを上告理由とすることがほぼ確立しているが、イタリアでは最高裁(破棄院)判決が多数出ており、そこから上告審における外国法の適用違背に関する処理の実態を明らかにすることができた。

これに対して、イタリア新国際私法(1995年)は、この問題に関する明文の規定を置いており(14条および15条)、この点が同法のひとつの特色になっている。そこで、これらの条文の起草過程およびこれらの条文に関する裁判例を中心に、抵触法の適用および準拠外国法の適用をめぐって、裁判所と訴訟当事者との間において、どのように権限・義務が分配されるかを総合的に検討し、あわせて、同じ問題に関する他国(日本、英国、フランス等)の取扱との比較をおこなった。その結果、イタリアにおける「外国法の適用」に関する実態および特色を明らかにすることができた。第二に、イタリアの裁判所は、従来から公序を積極的に発動する傾向にあり、1995年の国際私法改正後も、この傾向は変わらない。その対象となった外国法は、東欧・中近東・北アフリカ・南米などのほか、とりわけイギリスなどのEU域内の法律も含まれている。ただし、公序違反が否定された例も多く、慎重な外国法の認定を基礎としていることが伺われる。この点は、日本の裁判所における公序の発動にとって、大いに参考になる点であろう。これに対して、反致は、1995年改正以降に初めて認められたためか、判例はほとんど見当たらなかった。
植物資源をめぐる共生者と寄生者の共存機構

本研究は、有性生殖型と無性生殖型を含むヒヨドリバナとそれに感染するウイルスの間の相互作用を野外調査と実験によって解析し、生物種間相互作用における病原体の役割を明らかにすることを一つの目的としている。3年間にわたる個体群統計学的調査の結果、無性生殖集団ではウイルスの感染は3年間という短い期間で集団全体にひろがること、ウイルスの感染は無性生殖植物の適応度を、生存、成長、繁殖というすべての側面において低下させること、したがって、ウイルスの感染を受けた無性生殖集団では短期間に個体数が減少することが明らかになった。ウイルス集団にどの程度変異があるかを調べるために、複製酵素をコードする遺伝子の一部をPCRによって増幅し、PCR産物をクローニングして配列を比較した。その結果、アミノ酸配列で20%ほど異なるウイルスが同じヒヨドリバナ個体に同時に感染していることが明らかになった。この事実はウイルスがきわめて早い速度でホストに適応する可能性を示唆する。以上の研究のほか、共生者と共生関係に依存して寄生する者との相互作用を理論的に調べ、共生依存的寄生者が群集の安定や種の多様性の増大に寄与することを示唆する結果を得た。このような関係の一例として、イチジク・イチジクコバチ共生系において、花粉を運ばないコバチがおり、この居候コバチの種多様性が高いという現象があげられる。この現象についてさらに研究をすすめるために、イチジクの花の開花期間の効果を考えたモデルを作った。花粉を運ぶイチジクコバチの個体数に応じて、イチジクの開花戦略がどのように変化するかを調べ、一斉開花が有利な場合や、漸次開花が良い場合があることを示した。このようなイチジクの開花習性のちがいによって、花のう内の居候コバチの多様度が決まってくると考えられる。
宿主のMHCタイプからみた糞線虫症の病態,免疫に関する研究

これまでに,沖縄の多数の糞線虫感染者および非感染者について,PCR-SSO法により白血病のHLAタイピングをおこなった。検討を行なったのは、そのうちで多様性の最も高いclass II MHCのひとつであるDRB1である。各アレルの出現頻度は、糞線虫非感染者で1501,1503,0409,0802の頻度が高く,これに対して,糞線虫陽性者では1503,1501の出現頻度が高いという結果を得た。各アレルの出現頻度を糞線虫非感染者と感染者で比較した結果,1501,0490,0802,1406などが非感染者において感染者よりも高率に認められ,逆に1503,0302,0404,1302,1406の各アレルが糞線虫感染者において非感染者よりも高率に認められた。しかし,その差は統計的に有意の差ではなく,今回の検討では特定のHLAタイプに糞線虫の感染が集積しているといった結果を得ることはできなかった。また,糞便中に排泄される幼虫の数からみた感染状態と,酵素標識抗体法で測定した血清抗体値についても,特定のHLAタイプとの間に関連を認めなかった。他方,沖縄では糞線虫感染者においてヒトTリンパ球向性ウイルス(HTLV-1)の重複感染が高率に認められることが既に知られているが,これらが糞線虫の治療効果に及ぼす影響や特に血清中のIgE特異抗体価に及ぼす影響についてもその後検討した。その結果,糞線虫とHTLV-1の重複感染者の治癒率は,糞線虫のみの感染者に比べて有意に低く,HTLV-1重複感染者では概して難治性傾向にあることが確認された。また,血清中の糞線虫特異的IgE抗体価は重複感染者の抗体価が糞線虫のみのものに比べて低下しており,さらに治療抵抗性を示すグループで低かった。今回の検討から,糞線虫感染が中間の住民の間で長年にわたって維持されてきた背景として,住民の遺伝的背景よりも,HTLV-1の高率な重複感染が重要な要因であると判断された。これまでに90名にのぼる糞線虫感染者および非感染者140名の血液からDNAを抽出し、PCR-SSO法によりHLAのタイピングを行なった。このDNAを用い、今回はclassIIMHCのひとつであるDRB1について検討を行い、各アレルの出現頻度を比較した。その結果、糞線虫非感染者については1501、1503、0409、0802の各アレルが比較的高頻度に認められた。これに対し、糞線虫陽性者では1503が最も頻度が高く、次いで1501が高頻度に認められた。各アレルの出現頻度を糞線虫保有者と非保有者の間で比較した結果、1501、0490、0802、1406などが非感染者におい感染者よりも高率に認められ、逆に1503、0302、0404、1302、1406の各アレルが糞線虫感染者において非感染者よりも高率に認められた。しかし、その差は統計的に有意の差ではなく、今回の検討では特定のHLAタイプに糞線虫の感染が集積しているといった結果を得ることは出来なかった。

また、今回検討したHLAタイプと糞便内幼虫数からみた感染状態との間、また血清抗体レベルとHLAタイプとの間にも有意の関連を認めることができなかった。現在さらにclassIBタイピングを行い、同様の比較検討を進めつつある。また、今後は同じDNAサンプルをもとにclassIIDP、DQのタイピングについて、同様に検討を進める予定である。前年度,多数の糞線虫感染者と非感染者について,そのHLAタイプとの関連を検討した。その結果,最も多様性に富み,抗体産生において重要な遺伝的背景と考えられるclass II MHCのひとつであるDRB1について検討を行なったが,特定のHLAタイプでの糞線虫の感染集積を認めることは出来なかった。また,幼虫排泄数からみた感染状態や血清抗体価に及ぼすHLAタイプとの関連についても明らかな結果を得ることができなかった。他方,沖縄では糞線虫の感染にHTLV-1(ヒトT細胞向性ウイルス)の重複感染が重要な影響を及ぼしていることが知られており,今回検討した感染者について,さらに治療効果や血清中の糞線虫特異的IgE抗体価の比較検討を行なった。その結果,糞線虫とHTLV-1の重複感染者の治癒率は,糞線虫のみ感染の者に比べて有意に低く(P<0.05),これまでの報告と同様の結果を得た。また,糞線虫特異的IgE抗体価を測定した結果では,重複感染者の抗体価は糞線虫のみ単独感染の者に比べて著明に低かった(P<0.001)。さらに治癒群と治療抵抗群の間で比較した抗体価は治療抵抗群で低かった(P<0.05)。これらのことより,沖縄における糞線虫の長期にわたる持続感染に及ぼす背景として,住民の遺伝的背景よりもむしろ,HLTV-1の重複感染が重要な要因として介在していると判断された。HLAのタイプが糞線虫の感染,病態,免疫にどのように影響しているかについては,さらのHTLV-1の重複感染の影響を除外した研究条件でさらに検討を進める必要がある。
SLEモデルマウスにおけるYaa遺伝子異常によるマージナルゾーンB細胞の分化異常

全身性エリテマトーデス(SLE)の特徴を持つ自己免疫疾患を自然発症するBXSBマウスは、Yaa遺伝子がその病態形成に重要な役割を果たしている。このYaa遺伝子の異常はB細胞に発現されており、また脾臓においてYaa遺伝子の存在下ではマージナルゾーン(MZ)B細胞が著明に減少していることが知られている。我々は、Yaa遺伝子に伴うMZ B細胞の減少とB細胞抗原レセプター(BCR)及びそれに関わる分子との関わりについて、2種類の遺伝子改変マウスを用いて検討した。結果、BCRシグナル強度による違いがMZB細胞の構成に影響を与えていると考えられた。東京大学医科学研究所の三宅健介教授の研究室で作製された、RP105欠損マウスとBXSBマウス由来のYaa遺伝子を野生型であるC57BL/6マウスに導入することで作製したC57BL/6 Yaaマウス(B6 Yaaマウス)と交配させることで、RP105-/-Yaaマウスを作製した。QMマウスは、カルフォルニア大学サンフランシスコ校のWabl博士のグループが作製したマウスで、今回我々は、東京医科歯科大学の鍔田武志教授のグループとの共同研究でこのマウスとB6 YaaマウスのF1マウスを作製し、更にF2マウスを作製することでNP反応性を持つQM Yaaマウスを作製することができた。順天堂大学病理学の広瀬幸子准教授との共同研究でBXSB YaaマウスのFcレセプター共通ガンマ鎖の欠損マウスであるBXSB Yaa FcR・-/-マウスを提供頂き、月齢の若い段階と古い段階のマウスで脾臓のマージナルゾーンB細胞をフローサイトメトリーで解析した。また、BXSB YaaマウスにB6マウス由来のFcRIIbを導入したマウス(BXSB Yaa IIb^<B6/B6>)も同様に解析を行ったところ、どちらのFcレセプター変異マウスも脾臓のマージナルゾーンB細胞はB6マウスとほぼ同様のレベルまで増加していた。今後、これらのマウスを用いて、in vitroあるいはin vivoで抗原刺激を行い、B6マウスと比較した際のYaaマウスのマージナルゾーンB細胞の免疫応答を解析していく予定である。作製したRP105欠損Yaaマウス、RP105欠損マウス、B6マウスそしてB6 yaaマウスのマージナルゾーン(MZ)B細胞の構成をフローサイトメトリーで解析比較したところ、RP105欠損マウスは、B6マウスよりもMZB細胞は増加していたものの、RP105欠損yaaマウスはB6 yaaマウスと同様であった。QMYaaマウスの解析QMマウスは、カルフォルニア大学サンフランシスコ校のWab1博士のグループが作製したマウスで、今回我々は、東京医科歯科大学の鍔田武志教授のグループとの共同研究でこのマウスとB6 YaaマウスのF1マウスを作製し、更にF2マウスを作製することでNP反応性を持つQMYaaマウスを作製することができた。QMyaaマウスの作製した後、MZ B細胞の構成をフローサイトメトリーで解析したところ、CD21high CD23int B220+のMZB細胞はB6マウスと同様のレベルまで回復していた。B6yaaマウスにR837を投与した際には、MZ B細胞は、著明に減少したが、QM yaaマウスにNP-BSAおよびR837を投与したところ、特にMZ B細胞の構成に変化は認めなかった。しかし、QMマウスにNF-BSAを投与したところ、著明にMZ B細胞は減少していた。上記の結果より、BCRシグナル強度による違いがMZB細胞の構成に影響をあたえていると考えられた。今後、更に上記マウスについてin vivoで抗原刺激を行い、MZ B細胞の構成と自己抗体産生についての解析・実験をおこなっていく。
胃粘液糖鎖構築の変化とヘリコバクターピロリ胃粘膜結合との関連性

H. pyloriは、菌体側の定着因子と宿主側の受容体との結合性を介して胃粘膜ゲル層および表層粘膜に定着している。その受容体の多くは糖蛋白や糖脂質であることが知られている。本研究の目的は薬物により影響を受けた胃粘液糖鎖構造の変化が、H. pyloriの結合に影響を及ぼすか否かを検討することである。1.胃粘液糖鎖構造をレクチン組織化学およびELISA法を用いて胃粘液ゲル層、表層粘膜、深層粘膜に分類した。H. pylori受容体糖鎖構造の一部として取られるシアル酸は粘液ゲル層において、フコースは粘液ゲル層および胃粘膜表層において観察された(日本薬学会第116年会発表予定、投稿準備中)。2.胃粘膜直接刺激性のあるアスピリンあるいはカプサイシン経口投与で胃粘液分泌性が増加し、表層粘膜におけるシアロムチンの増加と胃粘液ゲル層におけるシアル酸の増加を認めた(アメリカ消化器病学会発表予定)。3.上記薬物処置により得られた胃粘液を精製し、H. pylori分画抗原を固相化したELISAプレート(HM-CAP)に対する結合性を検討した。アスピリン処置により得られた粘液ゲル層ムチンは正常マウスに比べてHM-CAPに対する高い結合性が認められた。以上のことから、H. pylori受容体に関与する糖鎖は胃粘液ゲル層および粘膜表層において認められ、これら糖鎖との結合性にアスピリンが影響する可能性が示唆された。
LincRNAome解析を通じた新しい疼痛治療学の基盤確立

2018年度は遷延性術後痛の新しいモデルであるSMIRモデルの開発とラットDRGニューロンのFACSによる分離技術の開発を目指した.前者は分担者の城戸により,Buvanendranの開胸術後痛モデル(Anesth Analg 2004;99:1453)を参考に下肢でモデルを作成した.疼痛刺激は熱刺激と機械刺激を用いた.安定したデータが獲得されつつあり,2019年11月の北米日本神経科学会でデータを発表予定である.また後者の研究は分担者の杉野が担当した.杉野はコラゲナーゼDとトリプシンの使用により,多くのDRGニューロンを単離することに成功した.さらにNeuN抗体で免疫染色した後,FACSでNeuN陽性の細胞を取り出すことを現在,検討している.細胞懸濁液には分離不十分な組織の混入やdebrisも多くみられ酵素の濃度や遠心分離の条件などさらなるプロトコルの最適化が必要だと考えられる.しかしながら現時点でもラット1匹の片側のDRG3つ(L4-L6)の単離で,50万個/mL以上の単離片を獲得できており,NeuN抗体の染色でもdebrisは染まらず,自家蛍光もわずかであることを確認ずみである.FACSでの分別成功も近いと予想される.われわれの研究計画では2018年度の終盤にSMIRモデルラットからDRGを採取して,DRGニューロンを単離した後,FACSで集めて総量RNA溶液を抽出する予定であったが,間に合わなかった.だがこの遅延は技術的困難さが原因ではなく,実験時間確保が不十分であったためである.2019年度はプロジェクトを加速する必要がある.われわれの研究計画では2018年度の終盤にSMIRモデルラットからDRGを採取して,DRGニューロンを単離した後,FACSで集めて総量RNA溶液を抽出する予定であったが,間に合わなかった.だがこの遅延は技術的困難さが原因ではなく,実験時間確保が不十分であったためである.2019年度はプロジェクトを加速する必要がある.2019年度の早い時期に2018年度に達成予定であった遷延性術後痛の新しいモデルであるSMIRモデルとラットDRGニューロンのFACSによる分離技術との融合を目指す.われわれは初年度は慢性痛のなかでも近年,大きなトピックスとなっている遷延性術後痛に着目することにした.遷延性術後痛はこれまであまり重要視されていなかったが,予想以上に有病率が高いことが判ってきている(Br J Anaesth 2010;本邦では数万人規模とされるが疫学調査がないので詳細不明).実際,麻酔科医として術前に診察を行う際,手術歴がある患者は過去の手術創が「季節によっては痛い」「時々疼く」などと訴えていることをしばしば経験する.一方,このような遷延性術後痛の診断や治療的介入については,本邦ではあまり研究されておらず,未だ解決されていない課題である.なにより遷延性術後痛の発症や増悪の機序に関して詳細が不明であり,術後患者の生活の質を改善することができる研究成果が待望されている.術後痛の基礎研究による機序解明はBrennanらによる動物モデルの確立で飛躍的に進歩した(Pain 1996).このモデルは動物の後肢の足底を切開して縫合するものであるが,切開部の軽度の炎症を惹起するが,後根神経節の遺伝子発現プロファイルはほとんど影響を受けない(Anesthesiology 2012).したがって理想的な遷延性術後痛の動物モデルとはBrennanのモデルより創部の組織損傷が著しく強くかつ長時間炎症が継続し,後根神経節レベルや脊髄後根レベルで遺伝子やタンパクの発現変化が生じ,ニューロンの機能特性が変化するものであるはずである.遷延性術後痛は皮膚切開と筋肉組織の損傷とそれらに随伴する軽度の炎症が病理学的な機序だと推測されている.近年では皮膚切開に加え,開創器で皮膚と筋肉を一定時間牽引した,より臨床像に近い動物モデル(SMIRモデル:skin/muscle incision and retraction)が報告されている(Pain 2008).われわれはまずこのラット下肢でのSMIRモデルを作成することを試みた.足底SMIRモデルの作成はすでに開始しており、すでに予備的研究データを取得している。2週間持続する機械刺激に対する知覚過敏を再現できている。2018年度は遷延性術後痛の新しいモデルであるSMIRモデルの開発とラットDRGニューロンのFACSによる分離技術の開発を目指した.前者は分担者の城戸により,Buvanendranの開胸術後痛モデル(Anesth Analg 2004;99:1453)を参考に下肢でモデルを作成した.疼痛刺激は熱刺激と機械刺激を用いた.安定したデータが獲得されつつあり,2019年11月の北米日本神経科学会でデータを発表予定である.また後者の研究は分担者の杉野が担当した.杉野はコラゲナーゼDとトリプシンの使用により,多くのDRGニューロンを単離することに成功した.さらにNeuN抗体で免疫染色した後,FACSでNeuN陽性の細胞を取り出すことを現在,検討している.細胞懸濁液には分離不十分な組織の混入やdebrisも多くみられ酵素の濃度や遠心分離の条件などさらなるプロトコルの最適化が必要だと考えられる.しかしながら現時点でもラット1匹の片側のDRG3つ(L4-L6)の単離で,50万個/mL以上の単離片を獲得できており,NeuN抗体の染色でもdebrisは染まらず,自家蛍光もわずかであることを確認ずみである.

FACSでの分別成功も近いと予想される.われわれの研究計画では2018年度の終盤にSMIRモデルラットからDRGを採取して,DRGニューロンを単離した後,FACSで集めて総量RNA溶液を抽出する予定であったが,間に合わなかった.だがこの遅延は技術的困難さが原因ではなく,実験時間確保が不十分であったためである.2019年度はプロジェクトを加速する必要がある.われわれの研究計画では2018年度の終盤にSMIRモデルラットからDRGを採取して,DRGニューロンを単離した後,FACSで集めて総量RNA溶液を抽出する予定であったが,間に合わなかった.だがこの遅延は技術的困難さが原因ではなく,実験時間確保が不十分であったためである.2019年度はプロジェクトを加速する必要がある.足底SMIRモデルの確立と疼痛関連行動実験は分担研究者の施設で継続することにする.同時に研究代表者の施設ではラットDRGを採取して,酵素で細胞を単離してNeuN抗体で免疫染色した後にFACSで分離する技術を確立する.2019年度の早い時期に2018年度に達成予定であった遷延性術後痛の新しいモデルであるSMIRモデルとラットDRGニューロンのFACSによる分離技術との融合を目指す.
二置換ポリアセチレン膜の気体混合物分離機構に関する研究

1.製膜後約3ヶ月間真空中に保持して、気体透過性の経時変化がほぼ認められなくなったポリ[1-'(トリメチルシリル)-1-プロピン][P(TMSP)]膜への、二酸化炭素、イソブタン、アセトンを成分とする二元混合物の透過挙動を30°Cで測定した結果、単独透過において透過係数が正の力依存性を示す成分気体は、混合物透過において相手成分気体の透過係数を、その単独透過の時の値よりも大きくすることが明らかになった。また混合透過における二酸化炭素、あるいはイソブタン、に関する透過係数の圧力依存性は、膜への溶解度が高いアセトンに関する透過係数の圧力依存性に近いことがわかった。2.上述の測定結果は、P(TMSP)膜が30°Cにおいてガラス状態にあるにもかかわらず、気体-ガラス状高分子系の透過挙動を説明するために提出された二元輸送モデルの予測とは全く異なり、気体-ゴム状高分子系の挙動を説明するために提出された自由体積モデルに近いものであることが明らかになった。3.P(TMSP)と同じく置換基中にトリメチルシリル基をもつポリ[o-(トリメチルシリル)フェニルアセチレン][P(TMSP)]膜への酸素、窒素などの気体の透過挙動を調べ、P(TMSP)膜についての結果と比較検討した。イソブタンのように大きい分子を除いて、透過係数は1/2ないし1/3であるが、理想的分離係数は数倍大きいことがわかった。また、P(TPA)膜は、気体透過係数の経時変化をほとんど示さなかった。4.両試料膜の^<13>C及び^<29>Si固体高分解能NMR測定を行って、上記の諸結果は、トリメチルシリル基の高い運動性により、膜中で気体分子の移動経路となる主鎖間の局所的環境が、ゴム状高分子膜中のそれとほぼ変わらないものになっているために得られたことを明らかにすることができた。5.以上を総合して、高気体透過性のP(TMSP)及びP(TPA)膜の気体混合物分離機構は、ポヂメチルシロキサンのようなゴム状高分子膜のそれとほぼ変わらないものと結論される。1.二置換ポリアセチレンであり、高い気体透過性を示すポリ〔1ー(トリメチルシリル)ー1ープロピン〕(PTMSP)膜への、二酸化炭素/アセトン混合物の透過挙動を30°Cで測定した結果、アセトンの透過挙動には膜への溶解度の低い二酸化炭素共存の影響が現れないが、二酸化炭素の透過挙動には溶解度の高いアセトンの共存効果が若干あることがわかった。2.PTMSP膜へのイソブタン/アセトン混合物の透過挙動を30°Cで測定した結果、共に膜への溶解度が高い両成分気体が、それぞれ相手の成分気体の透過挙動に影響を与え、混合物透過における各成分気体に関する透過係数は、単独に透過する場合の値よりも大きくなることが明らかになった。また、各成分気体に関する透過係数の気体の圧力への依存性は、膜への溶解度がより高いアセトンに関する透過係数の圧力依存性に近いことがわかった。3.1、2に示した測定結果は、PTMSP膜が30°Cにおいてガラス状態にあるにもかかわらず、気体ーガラス状高分子系の透過挙動を説明するために提出された二元輸送モデルの予測とは全く合わないで、気体ーゴム状高分子系の挙動を説明するために提出された自由体積モデルの予測に一致するものである。

しかし、自由体積モデルにより計算した結果は、透過係数の圧力依存性については測定結果と一致したが、係数の値は測定結果より若干低いものであった。ポリ酢酸ビニルへの二酸化炭素/アセトン混合物の30°Cにおける透過挙動についても、この結果と全く同様な傾向があることを確かめた。4.PTMSP膜のNMR測定を行い、かさ高いトリメチルシリル基の分子運動性が高いこと、また膜全体としてはガラス状態にあるにもかかわらず、低分子移動の素過程が関与する局所的な環境はゴム状態に近いものであることが明らかになった。1.ベンゼン溶液から溶媒蒸発法により作製した、二置換ポリアセチレンであるボリ[1ー(トリメチルシリル)ー1ープロピン](PTMSP)膜を試料として、前年度に続きさらに詳細に、^<13>C及び^<29>Si固体高分解能NMR測定を行った。magic angle spining(MAS)を行ったときと行わないときの^<13>CNMRスペクトル測定結果より、主鎖とメチル基の結合のランダム運動はかなり拘束されているが、主鎖とSiの結合は等方的運動をしていることが明らかになった。また、^<29>SiNMRスペクトルの同様な測定より、主鎖とSiとの結合がかなり振幅の大きい運動をしており、この運動がSiとメチル基のCとの結合の運動を促進していることがわかった。さらに、Siを結合している主鎖のCの方が、メチル基を結合している主鎖のCよりもKHz域の運動性が高いことが明らかになり、昨年度に気体混合物の透過測定を行った結果から推察した、PTMSP膜の気体混合物の分離機構に対する実験的証拠を得ることができた。2.PTMSP同様、大きくて運動性に富むトリメチルシリル基をもつ置換ポリアセチレンであるポリ[0ー(トリメチルシリル)フェニルアセチレン(PTPA)膜へのO_2、N_2等5種類の気体の透過挙動を調べた。PTPA膜の理想的気体分離係数は、PTMSP膜に比べて数倍大きいが、一方各気体の透過性はPTMSP膜の1/2ないし1/3であることがわかった。また、PTPA膜は、PTMSP膜について見られた長期間にわたる気体透過性の経時変化をほとんど示さないことが明らかになった。これらの結果は、PTPAではトリメチルシリル基と主鎖の間にベンゼン環が介在するため、トリメチルシリル基の高い運動性の主鎖への影響がPTMSPほど著しくなく、また主鎖間の平均距離はPTDAの方が若干短いことによると、両置換ポリアセチレンの局所的な構造と分子運動に基づいて解釈した。
周波数領域蛍光偏光法によるアクトミオシン動作中の水和層粘性変化の反応速度論的解析

タンパク質周囲の水和水は,タンパク質の構造の安定性やダイナミクスに大きく影響することでその動作メカニズムに寄与している.本研究では,タンパク質周囲の水和水の性質を解析する手法を開発し,筋タンパク質であるアクチンの水和水の解析を行った.柔軟なリンカーを介して蛍光色素をアクチンに結合することで蛍光色素を水和層中に係留し,LN光変調器を使って開発した高精度周波数領域蛍光装置で時間分解蛍光偏光測定を行った.ここで得られた蛍光色素の回転ブラウン運動の解析値から,アクチン周囲の水和層の流体特性についての情報が得られた.本研究で開発した手法は,タンパク質に対する水和の役割の研究を進めるのに有用である.本研究の主たる目的は,タンパク質分子周囲の水和層の局所粘性の経時変化を計測する手法の確立である.タンパク質水和層の局所粘性の情報は,時間分解蛍光偏光法によるタンパク質に係留させた蛍光プローブ回転運動性測定によって得る.今年度は,時間分解蛍光異方性測定の高精度化,リンカー長の異なるチオール反応性蛍光色素群の合成,そしてモデル物質に係留した蛍光色素における時間分解蛍光異方性測定を実施した.前年度に構築した周波数領域蛍光偏光測定システムを改変することにより,変調蛍光異方性の測定精度の改善を図った.前年度に構築した蛍光測定システムの励起光光学系において,励起光の平均強度と強度変調をモニターする機構を導入し,励起光の情報を基にして試料の蛍光シグナルに補正を行うことによって,各種のドリフトを相殺することができるようになった.さらに,試料の温度調節機構の導入の併用によって,定常蛍光異方性および変調蛍光異方性の測定において,0.001以下の高い精度を実現した.時間分解蛍光異方性測定のモデル物質として,蛍光色素Rhodamine 6G (R6G)で標識したαシクロデキストリンを合成した.本研究の測定システムを用いて,水中のR6G標識αデキストリンについての測定を20°Cで行った.本研究で開発した解析プログラムにより,時間分解蛍光異方性は,2つの減衰成分で記述でき,速い成分および遅い成分の時定数はそれぞれ,0.3ナノ秒と1.3ナノ秒であった.速い成分はR6G自体の回転,そして遅い成分は蛍光性αデキストリン全体の回転と予想される.今年度の研究成果により,時間分解蛍光異方性を高精度に測定することが可能な周波数領域蛍光測定システムの構築を達成した.さらに,この測定システムおよび解析プログラムを用いることにより,時間分解蛍光異方性減衰が多成分となる実験系における回転相関時間の成分解析を可能にした.本研究は,タンパク質の動作や酵素反応に伴って起こるタンパク質周囲の水和層の変化を局所粘性の経時変化として計測する手法の確立を目的とする.タンパク質の水和層の局所粘性変化は,タンパク質に係留させた蛍光プローブ回転運動性から検出できる.蛍光プローブの回転運動性の経時変化は,周波数領域蛍光偏光測定法を用いることで測定できると期待される.そこで,本年度は,水溶液中で自由な回転ブラウン運動を行う蛍光プローブの回転相関時間測定が可能な測定系の構築を行った.本年度構築した周波数領域蛍光偏光測定系では,CWレーザー光を光導波路型LN光変調器で変調した光を励起光として用い,蛍光試料から発生した変調蛍光を光電子増倍管で検出し,その出力をロックインアンプに掛けて位相検波検出を行い,変調蛍光の振幅と位相を読み出した.この測定系により,200 MHzまでの変調周波数で周波数領域蛍光測定が可能になった.測定系の性能評価のため,Cy3, Rhodamine 6G(R6G)を蛍光試料として測定を行った.水中のCy3, R6Gの蛍光寿命はそれぞれ0.251±0.005,3.91±0.01nsecとして測定され,回転相関時間は,0.444±0.032,0.223±0.004 nsecと測定された(20°C).さらに,1100 mPa・sの粘性範囲において,プローブの回転相関時間の溶媒粘性に対する比例性も確認できた.このように,蛍光プローブのサブナノ秒の蛍光寿命と回転相関時間を再現性良く測定することに成功した.今後,本測定システムを経時変化計測できるように拡張し,蛍光プローブの蛍光寿命や回転相関時間の経時変化測定に展開する予定である.また,本研究で開発したシンプルな測定装置の構成でサブナノ秒の蛍光寿命と回転相関時間測定を達成できたことは,時間分解蛍光法の生物分子科学への応用という点でも重要である.本研究の目的は,タンパク質分子周囲の水和層の局所粘性を経時変化計測する手法の開発を通して,水和のタンパク質機能における役割を調べることである.タンパク質水和層の局所粘性の情報は,タンパク質に係留させた蛍光プローブの回転拡散のデータから得る.蛍光プローブの回転拡散は,本研究で開発した周波数領域蛍光偏光法で測定する.今年度は,本研究で開発した周波数領域蛍光偏光測定装置を用いて,アクチンタンパク質に係留した蛍光プローブの時間分解蛍光異方性測定を行った.さらに,それらのデータを基に,アクチンに係留した蛍光プローブの回転運動成分解析と,回転運動モードの帰属に着手した.アクチン/Rhodamine 6G(R6G)間の距離の異なる3種類のR6G標識アクチンを調製し,周波数領域蛍光偏光測定を行い,その回転拡散を解析した.モノマー状態であるG-

アクチンにおけるアクチンに係留されたR6Gの周波数領域蛍光偏光測定データより,R6Gの時間分解蛍光異方性は時定数の異なる2つのモードの回転拡散の重なりで記述された. R6G/アクチン間の距離の異なる3種類のR6G標識アクチンのデータを解析したところ,数十ナノ秒の時定数を持つ遅い回転拡散モードはアクチンモノマーの回転ブラウン運動に帰属され,1ナノ秒以下の時定数を持つ速い回転拡散モードはR6Gの局所的な回転ブラウン運動に帰属されることが示された.また,G-アクチンが重合してフィラメント化したF-アクチンの形成に伴うR6Gの時間分解蛍光異方性変化を調べたところ,速い回転拡散モードの時定数はG-アクチンからの変化はなかったが,遅いモードの時定数はG-アクチンに対して数倍遅くなった.以上の結果より,速い回転拡散モードからはタンパク質周囲の局所粘性の情報が得られ,遅い回転拡散モードからはタンパク質自体の大きさやドメイン運動の情報が得られることが示された.今年度は,アクチンに係留された蛍光色素Rhodamine 6G (R6G)の周波数領域蛍光偏光測定データの解析をwobbling-in-coneモデルを使って行い,R6Gの回転拡散運動についての情報抽出を行った.この解析により,アクチンに係留されたR6Gの局所回転運動速度(回転拡散係数)と回転運動可能な角度範囲,そしてG-アクチンの分子回転の回転拡散係数を算出することができた.アクチン・R6G間リンカー長が異なる3種類のR6G標識アクチン(R6G-アクチン)の解析結果から,R6Gの回転拡散係数はアクチン近傍の局所粘度を反映することが明らかになった.さらに,R6G-アクチン/水/グリセリンの3元溶液系(グリセリン濃度,8-24 wt%)を用いてアクチン周囲の水和層に摂動を加えて周波数領域蛍光偏光測定を行ったデータの解析から,バルク溶媒とアクチン近傍の水和層では,グリセリン添加による粘性変化は異なる挙動を示すことが明らかになった.本研究課題の実施を通して得られた主たる成果は以下の通りである:(1)LN光変調器を使った新規的な方式による周波数領域蛍光偏光測定技術の開発によって,時間分解蛍光異方性の精密測定を実現した.(2)周波数領域蛍光偏光測定データの解析にwobbling-in-coneモデルを適用することにより,蛋白質周囲の水和層の流体的性質の情報抽出を行う手法を確立した.(3)蛋白質・蛍光色素間リンカー長の異なるいくつかの蛍光標識蛋白質を併せて測定することで蛍光色素の回転拡散運動情報を高い信頼性で得る手法を確立した.(4)アクチン周囲の溶媒層と,バルク溶媒が異なる流体的性質を示す溶媒和の効果を実験的に明らかにした.本研究で確立した手法は,モーター蛋白質等が動作するときに,蛋白質周囲の場が,どのように変化し,どのように動作メカニズムに寄与するかを今後研究する上で有用である.タンパク質周囲の水和水は,タンパク質の構造の安定性やダイナミクスに大きく影響することでその動作メカニズムに寄与している.本研究では,タンパク質周囲の水和水の性質を解析する手法を開発し,筋タンパク質であるアクチンの水和水の解析を行った.柔軟なリンカーを介して蛍光色素をアクチンに結合することで蛍光色素を水和層中に係留し,LN光変調器を使って開発した高精度周波数領域蛍光装置で時間分解蛍光偏光測定を行った.ここで得られた蛍光色素の回転ブラウン運動の解析値から,アクチン周囲の水和層の流体特性についての情報が得られた.