hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
移行上皮細胞膜の細胞膜と細胞骨格の免疫組織細胞化学的研究

膀胱移行上皮は、特異な形態の腔側形質膜、それと同じ形態の限界膜を有する紡錘形空胞および多量のフィラメントを持つことを特徴とする。本研究はこの様なフィラメントの性状、種類、分布状態および腔側形質膜との関係を明らかにするため、急速凍結ディープエッチング法、免疫組織細胞化学的方法を用いた。結果は次の通りである。1.移行上皮細胞中のフィラメントは、ケラチンフィラメント、アクチンフィラメントが存在した。2.ビメンチ、デスミンの抗体に反応するフィラメントは存在しない。3.アクチンフィラメントは、表層細胞では腔側形質膜直下で網工を作り、腔側形質膜に附着していた。また一部は紡錘形空胞、ミトコンドリア等にも附着していた。中間細胞、基低細胞中では、ほぼ細胞質中に均等に分布するが、形質膜附近にやや多く分布する。4.ケラチンフィラメントは、アクチンフィラメントに比べ太く、移行上皮細胞質中に束状にいろいろな方向に伸び、分布していた。移行上皮細胞質中に最も多く存在するフィラメントはこの種のものである。5.アクチンフィラメントは、尿の充満度に応じ膀胱移行上皮の形態が変化する際、腔側形質膜の折りたたみ、腔側形質膜の移動等に関与し、ケラチンフィラメントは移行上皮細胞の形態保持に関与するものと思われる。6.酵素細胞化学的研究では、腔側形質膜には5′ヌクレオチダーゼが存在し、アクチンフィラメントの重合に関与するものと示唆される。7.移行上皮細胞中にはACPaseとTMPaseの両酵素で標識されるライソゾームが存在し、TMPase標識ライソゾームは少数で、大部分のライソゾームはACPaseで標識された。共に傷害された腔側形質膜の処理に関与するものと思われるが、今後さらにこれらの点に関し検討する必要がある。尿路の管腔を縁取る移行上皮の表層細胞の腔側細胞膜は、外葉が6nm、内葉3nm、計12nmの非対称性単位膜よりなり、この細胞膜は六角形の膜内粒子が規則正しく六角格子状に配列していることを以前に明らかにした(Seguchi,H.et al.Acta Histochem.Cytochem.13,660,1980)。またこの表層細胞の細胞質中には多数のフィラメントが存在しているが、従来トノフィラメントといわれた。しかし、フィラメントには直径が5nm以下、10nm以上、15nm以上の3種のものが存在している。このうち直径約5nmのフィラメントはアクチン、直径約10nmのものはミオシンと考えられる。我々はCa-ATPaseの活性の局在はこれら2種のフィラメントの存在部位に一致していることを証明した。これらのフィラメントにより、尿路が空虚な時には立方状ないし円柱状をなし、充満時には扁平状を呈する上皮細胞の形態変化に関与していると考えられる。しかし現在までこれらの直接的証明はなく、また、これらのフィラメントと特異な構造をなす非対称性細胞膜との関係は明らかにされていない。抗アクチン、抗ミオシン、抗ケラチン、抗デスミン、抗ビメンチンの各種の抗体を用い、ペルオキシダーゼまたはFITCを標識として、免疫組織細胞化学的に検索した。直径約10nmの、いわゆる中間径フィラメントには、抗デスミン、抗ビメンチン共に陽性であった。

抗ミオシンに反応するフィラメントは、細胞質に極く少量のみ在存し、特に細胞質直下の抗アクチン陽性の直径5nm以下のフィラメントの多い所に一致している。抗ケラチン陽性フィラメントは細胞質中に多数在存する直径約15nmのフィラメントの束状存在部に一致した。現在の所、これらの所見は光顕レベルのみで、現在プロテインゴールドを標識として電顕レベルで検索中である。また特異な構造をなす細胞膜とフィラメントの関係は急速凍結法を用い、凍結置換法またはディープエッチング法などにより検索している。移行上皮は腎臓の腎杯に始まり,腎盤,尿管,膀胱の管腔を縁取る上皮である.この上皮の腔側細胞膜は非対称性単位膜よりなることは,従来すでに明らかにされている.上皮細胞中には多数のフィラメンドが存在し,その径により,直径が15nm以上のもの,約10nmのいわゆる中間径のもの, 5nm以下のものと, 3種のフィラメントに分けられ,直径5nmのフィラメントと直径15nmのものは収縮性タンパクよりなりCaーATPase活性の存在することを明らかにした(Sequchi,H.et al.Acta Histochem.Cytochem.15.76.1982).今回,主として抗ケラチン,抗デスミン,抗ビメンチンの各種の抗体を用いて,ペルオキシダーゼまたはFITCを標識とした間接法で,免疫組織化学的に光顕レベルで検索した結果,細胞質内にこれら3種とも存在することが観察された.フェリチンまたは金で標識した間接法を用い,電顕レベルで検索した結果,これら3種の抗体で標識されるものは,直径15nmおよび中間径のフィラメントであることが判明した.また抗アクチンおよび抗ミオシンを用いて,上記と同様に光顕および電顕レベルで免疫組織化学的に検索した結果は,共に主として細胞膜直下の直径5nmのフィラメントの多い細胞質に陽性で,ここに存在する直径5nmのフィラメントおよび直径15nm以上のフィラメントは共に収縮性タンパクであることが判明した.現在急速凍結固定法を行った後,凍結置換法および割断後のディープエッチングなどを行い,これらのフィラメントと非対称性の特異な細胞膜との関係を検索中であり,最終的結論には致っていないが, Stachin et al.(J.Cell Biol.53.73.1972)の想定している様なαーアクチンないしはスペクトリン様のアンカリングタンパクが介在し,これらが主としてその直下に存在する上記の収縮性タンパクよりなるフィラメントを結合していることを確信してきている.尿路の管腔を縁取る移行上皮は、表層細胞、中間細胞、基底細胞より成り、表層細胞の腔側形質膜は、六角形格子状に並ぶ膜内粒子を持つ持異な形態を示す非対称性単位膜よりなり、細胞質に腔側形質膜と同じ構造の限界を有する紡鐘形空胞と、多量のフィラメントが存在する。今年度はこれらの腔側形質膜とフィラメントの関係、およびフィラメントの走行、種類を主として急速凍結ディープエッチング法によりレプリカ膜を作製し、電子顕微鏡で観察、解析した。またこれまでの研究の結果と綜合し、検討した。レプリカ像では、腔側形質膜のES面に六角形格子状配列をなす膜内粒子が斑状部に着明に認められた。PS面にはこの様な配列をなす膜内粒子が認められないが、径約11nmのフィラメントが附着している。このフィラメントは腔側形質膜直下に豊富に存在し、複雑な3次元的網工をなしている。このフィラメントはあまり長い走行を示さないが、その径はほぼその全長で一定で、その表面は顆粒状を呈する。ミトコンドリア等の細胞小器官にもこのフィラメントは附着している。
東南アジアにおける出土銭貨の考古学的研究

本研究は、東南アジアの中世から近世にかけての銭貨流通を解明するための考古学研究である。3年間にわたり、インドネシアおよびラオスにて出土銭調査を実施した。その結果、インドネシアの東部ジャワでは13世紀以降中国の銭貨が大量に流入したことが明らかとなった。またラオスでも17世紀以降に方孔円銭が一定程度流入していたことを突き止めた。これらは東南アジアにおける銭貨流通の様相を解明する上で重要な成果と位置づけられる。平成25年度は、銭貨流通に関する新しい情報を収集するため、台湾とラオスにて出土銭の調査を行った。台湾では淇武蘭遺跡から出土した銭貨538枚を見学することができた。その結果、近世の台湾では中国の明・清の銭貨が流通の主体をなしていたことが明らかとなった。また出土銭の中に日本の寛永通寳や長崎貿易銭の元豊通寳、ベトナムの銭貨なども含まれていることが分かり、当時の東アジアの広範囲にわたる銭貨流通の一端が把握できた。また清朝の銭貨の鋳造地を確認したところ、北京で作られた戸部寳泉局・工部寳源局のものと並んで雲南寳局製造のものが多く見られ、むしろ台湾に近い浙江・江蘇の銭貨はそれほど多くはなかった。これが流入ルートを示すものか、あるいは当時の長江以南の流通銭貨の組成を反映しているものか、現時点では明確ではない。今後の調査により、明らかにしていきたい。ラオスの調査では、ビエンチャン、ルアンパバーン、シェンクワーンにて調査を実施した。ビエンチャンではラオス大学の発掘調査にて出土した銭貨を見学した。またルアンパバーンでは出土銭の情報を求めて聞き取り調査を行った結果、一括出土銭が発見されたとの情報を得た。残念ながら実物資料の見学には至らなかったが、今後も情報収集を行うことで、出土銭資料が発見される可能性は高い。シェンクワーンではクーン郡イアン村に所在するプー・タット寺院の基壇から、金銀の仏像とともに壺に入れられて出土した銭貨を調査することができた。銭貨は51枚あり、ベトナム銭の景興通宝、景興巨宝、中国北宋銭の皇宋通宝、元豊通宝、熙寧元宝、清銭の康熙通宝、順治通宝、乾隆通宝などを確認できた。清銭には北京鋳造のものも存在したが、雲南鋳造のものも存在した。来年度に再度訪問し、計測や拓本を採るなど精密なデータ化が望まれる。この地域はさらなる成果が期待できる。本年度は、東南アジアにおける銭貨流通の実態を考古学的に解明するという、当該研究の目的達成のため、インドネシアのジャワ島東部より発見された一括出土銭の調査を行った。調査はインドネシア考古学センターと共同で行い、調査した資料はジャワ島南東部のプジョン地域から発見され、東部ジャワ文化財管理事務所が管理している2点の一括出土銭である。調査は考古学の基礎的な資料化の作業であり、銭種の同定と枚数の集計、写真撮影、拓本などである。また出土地点の地理的・文化的情報を入手するため、プジョン地区にて現地調査も行った。その結果、東部ジャワの中世の銭貨流通の状況を復元するための、具体的な情報を得ることができた。調査した一括出土銭はすべて中国の銅銭であった。それぞれ最新銭が南宋・咸淳元寳(13世紀末)と明・永楽通寳(15世紀初め)であり、中世の時期に中国からもたらされたものと推測される。それらの銭種組成は、中国・日本・ベトナムなどで発見されている一括出土銭と非常に類似することが明らかとなった。このことから、中世に日本やベトナムへ中国銭が流出したのと同じ時期に、ジャワ島へも同じ銭種組成の中国銭がもたらされたものと考えられる。その状況は、14,15世紀のジャワでは銅銭が使用されているとの文献の記載とも一致しており、それを裏付けるものと言える。また南宋末の銭貨を最新銭とする資料が存在することから、流入の契機にはモンゴルのジャワへの侵攻と、その後に活性化する貿易活動などが重要な役割を果たしたと推測される。この調査成果は、読売新聞2013年3月27日(水)朝刊文化欄で報道され、社会への調査成果の還元も行われた。本年度は研究成果の共有を図るため研究会を開催し、また今後の研究継続の可能性を確認するため、ラオスにて調査を行った。研究会は2014年12月に淑徳大学東京キャンパスにて行った。連携研究者・研究協力者および海外の研究者を招聘し、これまでの調査研究の成果を報告し、今後の研究展望を示した。報告は中国南部・台湾・ベトナム・ラオス・インドネシアなど、広範な地域の出土銭の状況が報告され、それらの地域で使用された銭貨の具体的状況が、考古資料から明らかとなった。

その結果、中世・近世の東南アジアにおいて、中国の銭貨だけでなく日本やベトナムなど様々な国・地域で作られた銭貨が、広範囲に流通していることが確認でき、その歴史的背景も東アジアに共通するものと地域独自の様相とが相互に影響していることが示された。これら本研究課題の成果を内外の研究者と共有することができ、また各地域の今後の研究課題も具体的に明らかとなったことで、今後も研究を継続する必要性とその方向性も共有できた。昨年度の予備的な調査を経て、2015年2月にラオスにおいて出土銭の調査を実施した。ラオス北東部シェンクワン県のプー・タット寺院にて発見された銭貨を調査し、資料化を行った。その結果、ベトナムの銭貨と雲南で作られた中国銭が主体となっていることが分かった。前科研の研究成果であるベトナムの一括出土銭との比較から、これらの銭貨の種類がベトナム北部の状況と類似していることが明らかとなり、歴史的背景と合わせ、当該資料は隣接するベトナムよりもたらされたと推測される。合わせてシェンクワン県での聞き取り調査を行い、多くの一括出土銭の情報を得た。今後も調査を継続することで、より詳細な様相が明らかになると期待できる。これらの研究成果は、香港中文大学にて「東亜出土銭幣的考古研究」と題する研究発表を中国語にて行い、中国の研究者に対しても周知を図っている。考古学平成24年度はインドネシアのジャワ島にて、一括出土銭の調査を行うことができ、大きな成果を得ることができた。平成25年度は当初ベトナムにおいて調査を行う予定であったが、諸般の事情で実施が困難となったため、新しい情報の収集を行うこととし、台湾とラオスで調査を行った。その結果、これまで出土銭の情報がほとんどなかった地域において、あるていど情報を得ることができ、新しい研究課題も見えてきた。その点から、当初予定とは違う地域での調査となったが、研究はおおむね順調に進展していると評価できる。現在のところ、研究の達成度はほぼ予定通りであり、部分的に計画を上回る成果を上げていると評価できる。申請時の調査予定ではバリ島の一括出土銭の調査を行う予定であったが、昨年度まで採択されていた科研費(基盤研究(C)課題番号21520774)により、当初の目的をほぼ達成する成果をあげることができたため、継続して調査を行う必要がなくなった。これを受け、今年度の調査では新たにジャワ島において行うこととし、インドネシア考古学センターと協議した結果、東部ジャワ文化財管理事務所が管理している一括出土銭を調査することになった。調査は滞りなく進み、調査成果も上記概要で記した通り、新たなデータの蓄積が行われ、着実に進展している。平成26年度は、前年度に続きラオスでの調査と、まとめのシンポジウムを行いたい。ラオスでは、特にシェンクワーンにて調査を継続し、前年度に概要のみを把握したプー・タット寺院の基壇出土の銭貨を詳細に調査し、資料化を行う。あわせて、新しい出土銭の情報収集も行いたい。また次年度は本研究課題の最終年度にあたる。これまで調査の概要をまとめ、研究成果を周知するため、シンポジウムを行いたい。報告者はこれまで調査に参加した日本の研究者を中心にするが、一部国外の研究者も招聘することとしたい。その際に資料集の形で研究成果をまとめ、刊行する予定である。次年度は、これまでの調査成果を踏まえ、東南アジアの銭貨流通の状況を解明すべく、さらに詳細なデータを収集する調査を行う予定である。次年度である平成25年度は、ベトナムにて調査を計画している。
植物細胞壁合成酵素および分解酵素を用いた細胞外情報処理空間の動的可視化

植物の細胞壁は多様な高分子物質が互いに作用しあった複雑な構造を有しており、詳細は明らかになっていない。細胞壁を構成するそれぞれの成分は細胞の酵素によって合成された後、自己組織化によって複合化することで細胞外に複雑な細胞壁構造を構築する。一方、細胞壁を栄養源として生育するきのこ等の生物は自身が生産する分解酵素により細胞壁の複雑な構造を分解することで、栄養を獲得している。そこで本研究ではこれらの生物が有する酵素と細胞壁を構成する成分の組織化との関係性を顕微鏡技術や生化学技術によって明らかにし、複雑な植物細胞壁の理解、利用に向けた知見を得た。1:結晶性セルロースの分解性が高い子嚢菌Trichodermareesei由来Cel7A(TrCel7A)に変異導入をして蛍光色素をラベルするとともに一分子観察を行い,結晶性セルロースに対する吸着定数konおよび脱理定数koffを算出した。本結果はLangmuirに受理された。2:蛍光顕微鏡と高速原子間力顕微鏡で同じ視野を観察する手法の開発に取り組み,蛍光色素でラベルしたTrCel7Aの蛍光ー高速原子間力顕微鏡同時一分子観察に成功した。本結果はRev. Sci. Instr.に投稿予定である。3:セルロース分子の自己凝集を可視化するために,セロデキストリン加リン酸分解酵素のリアルタイム観察を高速原子間力顕微鏡によって行った。4:セルロース合成過程を可視化するために,メタノール資化性酵母Pichia pastorisを用いた組換えセルロース合成酵素の発現系構築を試みた。平成25年度は,平成24年度に引き続き植物細胞壁の生合成および生分解に関わる酵素の取得および可視化に力点を置いた。酢酸菌Gluconacetobacterxylinus由来のセルロース合成酵素の異宿主発現に成功し、発現した組換えGxCeSABの活性を測定する為、細胞破砕液を用いたin vitroセルロース合成試験を実施した。また合成試験により得られた産物を、蛍光標識セルロース結合タンパク質(RFP-CBM1)による染色、電子顕微鏡観察およびセルラーゼによる分解によって確認した。以上の結果は、Pichia酵母を用いたセルロース合成酵素の生産に成功し、さらにin vitroでのセルロース合成に成功したことを示しており、投稿に向けて準備中である。さらに,植物細胞壁の生分解に関わる酵素の動的可視化を行うために、高速原子間力顕微鏡(HS-AFM)と全反射蛍光顕微鏡(TIRFM)観察が同時に可能となる実験機器を作製し、それを用いてin vitroでの植物細胞壁分解酵素の観察に成功し、科学機器総説(Rev. Sci. Insr.)に公表された。また、連続的(プロセッシブ)な加水分解速度が異なると考えられる3つのセロビオヒドロラーゼ(TrCel7A、PcCel7C、PcCel7D)の加水分解速度と解離定数の関係を明らかにするために、高速原子間力顕微鏡によって三つの酵素の挙動を明らかにした。その結果加水分解速度と表面からの解離にはトレードオフの関係が成り立つことが分かった。本結果は米国化学会誌(J. Amer. Chem. Soc.)に受理された。植物細胞壁の主成分である結晶性セルロースが,セルラーゼによってどのように分解されるのかを明らかにするために,高速原子間力顕微鏡(HS-AFM)および全反射蛍光顕微鏡(TIRFM)を用いて観察を行った。これら一分子観察によって植物細胞壁のような固体表面で分解酵素はどのように振る舞うのかを明らかにし,植物細胞壁と分解酵素を動的に可視化することに成功した。結晶性セルロース表面に吸着した酵素の滞在時間を測定し,その頻度分布のヒストグラムを解析したところ,二重指数関数で近似されることが明らかとなった。本結果は米国生化学会誌(J. Biol. Chem.)に受理された。また,連続的(プロセッシブ)な加水分解速度が異なると考えられる3つのセロビオヒドロラーゼ(TrCel7A,PcCel7C,PcCel7D)の加水分解速度と解離定数の関係を明らかにするために,高速原子間力顕微鏡によって三つの酵素の挙動を明らかにした。さらに、セルロース生合成酵素(GxCeSAB)の異宿主発現系の構築を試み,メタノール資化性酵母を用いた発現系の構築に成功した。GxCeSABによるin vitroセルロース合成反応の結果,白色の水不溶性物質の生成が確認された。生成物をTricoderma reesei由来のセルラーゼ(TrCel7A)によって分解した結果,白色の水不溶性物質は完全に無くなり,分解物としてグルコースとセロビオースが生じることを確認した。以上の結果は,Pichia酵母を用いたセルロース合成酵素の生産に成功し,さらにin vitroでのセルロース合成に成功したことを示しており,投稿に向けて準備中である。平成27年度も、これまでの研究に引き続き植物細胞壁の生合成および生分解に関わる酵素の取得および可視化に力点を置いた。特にセルロースやヘミセルロースなどの合成酵素の多くは,膜タンパク質であることが知られており、メタノール資化性酵母Pichia patorisなどを用いた異宿主発現系を構築すること自体がチャレンジングな実験であったため、本年度はBrevibacillus choshinensisを用いた発現系に挑戦した。1)植物由来タンパク質の異宿主発現

本年度は植物細胞壁の生合成過程で重要な役割を担っていると考えられるエクスパンシンやキシログルカンエンドトランスグルコシダーゼ/トランスフェラーゼ(XTH)など、これまでにあまり異宿主発現の例が無いタンパク質に関して、Pichia pastorisおよびBrevibacillus choshinensisを用いた発現系の構築にチャレンジした。その結果AtEXPA17に関してはP. pastorisからB. choshinensisに発現系を変えることで組換えタンパク質の生産に成功した。また、GxCeSAB、AtCeSA1、PpXTH32、AtXTH3、OsCEBiPに関してはP. pastorisで、OsPMT10およびOsPMT16に関してはB. choshinensisによる発現に成功した。それらに関しては論文や学会などでの発表を行っていく予定である。2)植物細胞壁生分解酵素の可視化26年度から取り組んでいたPcCel45Aの中性子構造解析に成功し、その成果をScience Advancesに公表するとともに、プレスリリースを行った。さらに本成果の一部がギネス世界記録に登録された。現在バクテリアが生産するセルラーゼの挙動解析に関しても、結果を取りまとめている。研究開始当初は酵素分子の動態解析に利用できる技術が高速原子間力顕微鏡だけであると考えていたが、蛍光顕微鏡を用いた一分子観察や、中性子構造解析によるプロトンリレーのダイナミズムを可視化できたことは、計画以上の成果であったと言える。これらの技術を組み合わせて、研究を遂行していく。1植物細胞壁成分の自己組織化平成28年度ではこれまでの研究に引き続き、植物細胞壁の生合成過程で重要な役割を担っていると考えられるエクスパンシンやキシログルカンエンドトランスグルコシダーゼ/トランスフェラーゼ(XTH)などのタンパク質に関して、共同研究を含めた発現系の構築を試みた。その結果、いくつかの発現系において組換えタンパク質の生産に成功し、特に東北大学との共同で行ったシロイヌナズナ由来XTH3の研究ではXTHによるセルロース-セルロース間、およびセルロース-キシログルカン間のつなぎ替え活性の発見など新規の細胞壁モデルの構築につながる成果が得られ、Scientific Report誌に公表した。一方、本研究においては様々な植物細胞壁由来のタンパク質に対して組換え発現系の構築を試みたが、多くは発現量などの点に問題があり、効率的な発現系の構築に向けては何らかのブレイクスルーが必要である事が示唆された。2植物細胞壁分解酵素の基質認識を利用した細胞壁の動的可視化平成28年度は、高速原子間力顕微鏡(HS-AFM)を用いてタマリンド種子由来キシログルカンの動態が観察可能であることを明らかにし、キシログルカンが単純なコイル状構造以外の形態をとることを明らかにした。さらに周波数変調原子間力顕微鏡(FM-AFM)を用いた結晶性セルロースの可視化し、グルコースの水酸基の原子像を得ることにも成功した。また、メタノール資化性酵母Pichia pastorisを用いたランダム変異導入法の開発にも成功し、Biotechnology for Biofuel誌に成果を公表した。
リバースジェネティックスによる遺伝性神経疾患の原因遺伝子の解明

ヒトX染色体q28に遺伝子座の存生が知られている神経疾患(Adreno-leukodystrophy(ALD),Emery-Dreifuss muscular dystrophyなど)の原因遺伝子をポジショナルクローニングの手法を用いて同定することを目的として、ヒト染色体Xq24-qterのみをヒト染色体として有する雑種細胞X3000-11.1よりコスミドゲノムライブラリーを作成し1,784個のコスミドクローンを単離した。このうちNotI制限酵素認識部位を含むコスミドクローン400個をリンキングクローンとして同定し,これらを雑種細胞のパネルを用いてマッピングし,目的のXq28領域に19個の独立したclusterを同定した。さらにcross-species homologyを利用して,従来ウイルムス腫瘍由来細胞株での発現低下が知られていたQM遺伝子の遺伝子座がXq28であることを明らかにし,そのゲノム構造を詳細に解析した。ALD24例におけるサザン解析ではQM遺伝子の大きな欠失,組換えは認められなかった。また染色体の特定の部位(Xq28)から機能遺伝子を効率よく単離するために以下の方法を用いて解析を行った。まず雑種細胞X3000-11.1よりスプライシングを受ける前のheterogeneousnuclear RNA-complementary cDNA(hn cDNA)に含まれるヒト特異的な反復配列を利用して,Xq24-qter由来の新たなcDNAを11個単離した。この手法はすベての組織で発現しているhouse-keeping geneにのみ有効と考えられていたが,実際に単離されたhn cDNAクローンについてNorthern解析を行った所,脳でのみ発現しているような組織特異的遺伝子も含まれており,本法は大変有用であることが示された。さらにクローン化されたコスミドゲノムDNAとヒト脳cDNAライブラリーとのハイブリダイゼーションを行うことで,組織特異的かつ染色体特異的なcDNA単離を試みた。結果としてXq28遺伝子座を有し,主に脳と筋肉に発現している新たなcDNAクローンが1個単離同定された。このcDNAは比輔的組織特異的な発現様式を呈しており,このストラテジーが組織特異的な機能遺伝子の同定に有効であることが明らかとなった。ヒトX染色体Xg28に遺伝子座の存在が知られている神経疾患(Adrenoleukoーdystrophy,EmeryーDreifuss muscular dystrophy,Xーlinked hydrocephalusなど)の原因遺伝子をリバ-スジェネティックスの手法を用いて同定することを目的として,まずヒトXg24ーgterのみをヒト染色体として含む雑積細胞(X3000ー11,1)からコスミドゲノムライブラリ-を作製しヒトに特異的な反復配列をプロ-ブとして1784個のコスミドクロ-ンを単離した。さにこれらのコスミドクロ-ンの中で物理地図の作製に有用なNotI認識部位を含むクロ-ンとして400個同定し,これらについて互いのハイブリダイゼ-ションのリ-グ戦を行いXg28領域において19個の独立したcontigを作製できた。

また,コスミドクロ-ンの中でヒトーrodent間で保存された配列を有するものを同定し,このコスミドクロ-ンをプロ-ブとしてNorthernブロットでメッセンジャ-RNAの存在を確認しさらに,cDNAを1種類単離することができた。X3000ー11.1からヒト遺伝子由来のスプライシング前のRNA(heterogenous nucl ear RNA)の多くがイントロン内にヒトに特異的な反復配列を有していることを利用してヒトに特異的なheterogeneous nucledr RNAーcomplementary DNA(hncDNA)のクロ-ニング技術の開発を行い,特にreterse transcriptaseの反応温度条件を詳細に検討することにより,ヒト反復配列に対するプライマ-の特異性を高めることに成功した。現在までにヒトXg28由来のhncDNAクロ-ンを6個単離している。この手法はすべての組識で発現しているhouseーKeeping geneにのみ有効と考えられたが,実際に単離されたhncDNAクロ-ンについてNorthern解析を行ってみると,中には脳のみで発現しているような組識特異的遺伝子も含まれていることが判明しhncDNAクロ-ニングが大変有用な方法であることが判明した。ヒトX染色体q28に遺伝子座の存在が知られている神経疾患(Adreno-leukodystrophy(ALD),Emery-Dreifuss muscular dystrophyなど)の原因遺伝子をポジショナルクローニングの手法を用いて同定することを目的として,ヒト染色体Xq24-qterのみをヒト染色体として有する雑種細飽X3000-11.1よりコスミドゲノムライブラリーを作成し1,784個のコスミドクローンを単離した。このうちNotI制限酵素認識部位を含むコスミドクローン400個をリンキングローンとして同定し,これらを雑種細飽のパネルを用いてマッピングし,目的のXq28領域に19個の独立したclusterを同定した。さらにcross-species homologyを利用して,従来ウイルムス腫瘍由来細飽株での発現低下が知られていたQM遺伝子の遺伝子座がXq28であることを明らかにし,そのゲノム構造を詳細に解析した。ALD24例におけるサザン解析ではQM遺伝子の大きな欠失,組換えは認められなかった。また染色体の特定の部位(Xq28)から機能遺伝子を効率よく単離するために以下の方法を用いて解析を行った。まず雑種細飽X3000-11.1よりスプライジングを受ける前のheterogeneousnuclear RNA-complementary cDNA(hn cDNA)に含まれるヒト特異的な反復配列を利用して、Xq24-qter由来の新たなcDNAを11個単離した。この手法はすベての組織で発現しているhouse-keeping geneにのみ有効と考えられていたが、実際に単離されたhn cDNAクローンについてNorthern解析を行った所,脳でのみ発現しているような組織特異的遺伝子も含まれており,本法は大変有用であることが示された。さらにクローン化されたコスミドゲノムDNAとヒト脳cDNAライブラリーとのハイブリダイゼーションを行うことで,組織特異的かつ染色体特異的なcDNA単離を試みた。
歯周病による心疾患発症メカニズムとEpac1の治療標的としての可能性

【方法】雄マウス(C57BL6/J, 8週齢)を用いてPBS投与群(コントロール群)とPG菌由来のLPS投与群(PG-LPS投与群; 4mg/kg/day i.p.)を作成した。投与期間中と投与4週後、心エコーによる心機能測定後に心臓を摘出し、マッソントリクローム染色による線維化面積とTUNEL染色によりアポトーシス陽性細胞の割合の評価を行い、ウエスタンブロッティングによる関連シグナルの解析を行った。【結論】CaMKIIならびにmTORは歯周病を合併する心疾患の有用な治療標的になる。PG菌由来のLPSによる心不全発症にベータアドレナリン受容体シグナルが重要な役割をはたしている予備実験結果を2018年度は生化学的所見で得ることができた。2019年度以降はPG菌由来のLPSによる心機能低下がβ遮断薬の併用投与により抑制されるかについて検討していく予定である。2019年度は心エコーのみの心機能評価であったが、心筋スキンド標本を用いてミオフィラメントのリン酸化、カルシウム感受性、ATPase消費、tension costに及ぼす影響、経食道心房頻回刺激による心房細動誘発率や心房細動持続率に与える影響を調べる。また今回用いているPG-LPS投与による歯周病モデルの血清中のサイトカイン濃度測定、Toll-lile receptor 4の阻害剤(TAK-242)により心機能抑制に及ぼす影響も調べる予定である。2018年度行う予定の実験がマウスの準備状況で2019年度に行うことになったため。
Protein Kinase Cの構造と機能、並びに細胞増殖の調節

細胞増殖、分化に果たすプロテインキナーゼCの機能解明は今日、医学生理学のメインテーマの一つであるが、分子遺伝学的解析により本酵素は構造の類似する極めて多数の分子集合体であることが判明した。本研究ではプロテインキナーゼ各分子種の機能を解明するため、構造と機能の相関、酵素化学的性質及び組織特異性について検討を行い以下の成果をおさめた。当初分離されていた4種の分子種α、βI、βII、γはC_1領域にraf発癌遺伝子との相同性が認められるcystein-rich repeatを有している。機能ドメインの解析を行うためこの部分のdeletion mutantを作製し大腸菌中で発現を行った結果、C_1領域にcystein-rich sequenceが少なくとも一回存在すればphorbol ester結合能が発現される事が明らかとなった。また本酵素はカルパインにより限定分解を受け活性化される事が知られているが、α、β、γ各分子種はすべてカルパインのターゲットとなりV_3領域のそれぞれ異なる部位で限定分解を受ける事を明らかにした。また各分子種特異的活性調節物質の検索を行った結果、phosphatidylethanolが生理的Ca^<2+>イオン存在下でγ種のみを活性化する事を明らかにした。一方この4種以外にも少なくとも3種δ、ξ、ζ種の存在が明らかとなっている。これら分子種にはC_2領域が存在せず、先の4種とはactivatorの依存性において活性化機構が異なっており別のグループを形成していると考えられた。次に各分子種に対する特異抗体を用いた組織化学、生化学的解析により、α、βI、βII、γ種についてはぞぞれ特有の分布を示す事が明らかとなった。即ち、α種はほとんどすべての組織、細胞に共通して認められた。βI、βII種は組織により、発現が異なり、γ種は中枢神経組織でのみ発現が認められた。δ、ξ、ζ種についてもRNAブロットにより組織特異的分布を認めた。以上より本年度の目的は達成された。
アクティブ・ラーニングを支援するＣＳＣＬの構築

「科学教育研究」に採録決定となった論文「総括リフレクションを取り入れた授業観察実習プログラムの開発と評価教育実習生による授業観察の事例を通して」では、授業観察においてedulogを用いることで、それぞれの観察者がお互いの観察を比較検討しながら、自身の観察を振り返ることができることが明らかとなった。また、臨床教科教育学会誌に採録決定となった「粘土を用いた工作における相互鑑賞記録の閲覧が,学習者の表現に与える効果に関する事例的研究」では、小学校の図工の学習においてedutabを用いることで、お互いの作品と鑑賞記録を相互に閲覧可能となる効果が明らかとなった。40分間程度で実施される相互閲覧型学習における学習方略には、時系列的な変遷を考慮すると、216パターンの方略が存在する可能性が示唆された。また、限られた観測データから、216パターンの方略から授業目標達成度を推定する人工知能を構築した。さらに、全パターンの方略を人工知能に入力し、目標達成度を推定させ、これを可視化させた。これにより、学習者が選択可能なあらゆる方略について、そのうちどれが目標達成に結びつきやすいのか、視覚的に考察可能な環境を構築した。本研究の目的は,タブレット型端末に実装可能な同期型CSCL「edutab」によって,個別に展開する学習の発話データや交流過程に関するをデータ化し,授業者にフィードバックすることで,効果的にアクティブ・ラーニングを実践するための支援ツールを開発することである。上記の目的を遂行するため、今年度は、小学校国語科のディベート学習において、タブレット型端末を利用した同期型CSCLを用いて、学習者の思考を可視化する研究を行った。その結果、ディベートにおいては、低迷しがちとされる聞き手の学習意欲を高めることが明らかになった。この研究成果については、以下の論文として採録され、現在印刷中である。・榊原範久・松澤健彦・水落芳明・八代一浩・水越一貴:タブレット型端末を利用した同期型CSCLによる思考の可視化がディベートに参加する聞き手の学習意欲に与える効果に関する研究,科学教育研究,41(2),日本科学教育学会,印刷中また、小学校算数科「小数」単元の学習において、edutab,iPadを用いた同期型CSCLの実践を行い,「数学教育における創造性に関する態度」並びに,「自他認識テスト」に対する効果について検証した。この結果は、以下の国際学会で口頭発表した。CSCLを用いることによって学習者の学習状況や思考の状態を可視化することの効果等について検証することができた。具体的には、アクティブ・ラーニングの例としてあげられているディベートにおいて、話し手だけではなく、聞き手の学習者についても、開発したCSCLによってそれぞれの学習者の学習状況を可視化し、学習意欲を向上させることができることを明らかにし、日本科学教育学会の論文誌に採録が決定した。科学教育研究(日本科学教育学会)に掲載された「アクティブ・ラーニングを協働的に可視化・共有化する授業観察ツールの開発」では、CSCLシステムを学習者用として用いるだけでなく、アクティブ・ラーニングを観察するツールとして活用する可能性を実証的に検証した。これにより、大勢の学習者がそれぞれ多様に展開するアクティブ・ラーニングを複数の観察者が観察し、観察した情報をシェアすることの可能性が示唆された。また、科学教育研究(日本科学教育学会)に掲載された「タブレット型端末を利用した同期型CSCLによる思考の可視化がディベートに参加する聞き手の学習意欲に与える効果に関する研究」では、アクティブ・ラーニングとして例示されるディベートにおいて、CSCLを用いて、聞き手の意識を可視化することの効果について実証的に検証した。これにより、CSCLによって可視化される情報が学習者の学習意欲に効果的に作用する可能性が示唆された。本研究の目的は、アクティブ・ラーニングを支援するCSCLシステムを構築することである。これまでに、学習者がアクティブ・ラーニングにおいて対話するパートナーを人工知能によって探究する方法の検討を始めている。今後は、事例的な検討を重ね、システムをブラッシュアップしていく予定である。今年度は、アクティブ・ラーニングにおいて、学習者がそれぞれ個別に展開する他者との交流をデータ化するシステムの開発と効果の検証を中心に行う予定であり、現在、開発中である。学習者がアクティブ・ラーニングにおいて、対話するパートナーを人工知能によって探究する際、人工知能に学習させる条件をどのように決定していくのか、事例的な検討を重ね、学習効果の検討と合わせてシステムをブラッシュアップしていく。

参加を予定していた国際学会が他の予定の日程が重なったため、参加人数を縮小したため。今後は、CSCLの新しいバージョンを開発し、実践調査を充実させるために使用する。
高等植物の雄性配偶子形成を制御するCSL1の機能解明にむけた細胞形態学的研究

私は、雄性配偶体形成のメカニズムを理解することを目的にした。高等植物の雄性配偶体形成異常の突然変異体を用いて、配偶体自身のもつ遺伝子の異常による変異、及び配偶体をとりまくジプロイド細胞の異常による変異の、両面からの解析を進めている。以前に、光形態形成に関連するCIP7遺伝子ホモログのCSL1遺伝子にT-DNAタグが挿入されたシロイヌナズナ変異体(csl1)において、雄性配偶体形成が特異的に阻害されること、またそれは特に液胞膜への異常によることを見いだした。また、緑化の早い変異体として単離されたhayamidori(ham)という過剰発現型変異体において、やはりcsl1と同様の液胞膜の崩壊から異常が誘発されることを見つけた。今年度私は、新しい変異体として、メバロン酸経路のキーエンザイムといわれる、HMG-CoAレダクターゼ遺伝子のシロイヌナズナにおける破壊株の解析を中心に、研究を進めた。シロイヌナズナのHMG-CoAレダクターゼ遺伝子は、HMG1とHMG2の2つがあり、それぞれに対する変異体hmg1とhmg2が単離されている。hmg1は雄性不稔の形質を示し、それは、ハプロイドの配偶子をとりまくジプロイド細胞によって引き起こされていた。詳細な解析の結果、hmg1では、メバロン酸経路の下流にあるステロールの減少によって、タペータム細胞内のタペトソームの著しい収縮がおこり、その結果、タペトソームからPollen coatへ供給されるステロール類が減少し、花粉の発芽・伸長を抑制したことが明らかとなった。またhmg1とhmg2の二重変異体の解析から、ハプロイドの雄性配偶体では、HMG1とHMG2のどちらかの発現が必須であり、両者とも破壊されると、その雄性配偶体は致死になることが示された。高等植物の雄性配偶子形成異常の突然変異体において、その原因遺伝子が特定された例は少ない。私は、雄性配偶子形成のメカニズムを理解することを目的に、配偶子自身のもつ遺伝子の異常による変異体、及び配偶子をとりまくジプロイド細胞の異常による変異体の、両面からの解析を進めている。以前に光形態形成に関連するCIP7遺伝子ホモログのCSL1遺伝子にT-DNAタグが挿入されたシロイヌナズナ変異体(csl1)において、雄性配偶子形成が特異的に阻害されることを見いだした。その後の詳細な顕微鏡観察によって、csl1では花粉第一分裂直前の液胞が増大する時期に、液胞膜が崩壊することで異常が引き起こされることを見つけた。また最近、緑化の早い変異体として単離されたhayamidori (ham)という過剰発現型変異体において、やはりcsl1と同様の液胞膜の崩壊から異常が誘発されることを見つけた。これらのことは、雄性配偶子形成において色素体の形成と液胞の形成になんらかの関係があることを感じさせる。さらに私は、ハプロイドの配偶子をとりまくジプロイド細胞によって雄性配偶子形成異常が引き起こされるものとして、メバロン酸経路のキーエンザイムといわれる、HMG-CoAレダクターゼ遺伝子のシロイタナズナにおける破壊株(hmg1)の解析も進めた。hmg1は雄性不稔の形質を示し、それはメバロン酸経路の下流にある、ステロールの減少によって引き起こされることを見つけた。in situハイブリダイゼーション解析の結果、HMG1は葯のタペータム細胞で強く発現していることが確かめられた。hmg1の葯を電子顕微鏡観察したところ、タペータム細胞内のエライオプラストとタペトソームの著しい収縮がみられた。これらのオルガネラから花粉へ供給されるステロール類が、花粉の発芽・伸長において何らかの機能を果たしていることを予感させる。

またhmg1とhmg2の二重変異体の解析から、ハプロイドの雄性配偶体では、HMG1とHMG2のどちらかの発現が必須であり、両者とも破壊されると、その雄性配偶体は致死になることが示された。
燃焼解析のためのCARS法の研究

これまで燃焼ガス中の温度および成分濃度の分布をCARSを用いて測定する方法について、実用上どのような問題点が存在するかを検討し、その解決法を求めてきた。その結果、現在の時点で燃焼解析のためのCARS法は、基本的な点ではほぼ確立されたと考えてよい。しかし、スペクトルシミュレーションを中心とする従来の方法は、実験測定上も解析手続きの点でも甚だ大がかりなものとなっており、実用的見地からは計測度を本質的に損なうことなく方法を簡易化することが望ましい。このような見地から、温度測定のためにスペクトルバンド全体を記録、解析する代りに、2つの異なるレーザー波長でのCARS測定を同時に行なうことにより全バンド波形の温度変化をとらえる、いわゆる二色CARS法の開発を本年度において試みた。この方法では、通常用いられる広帯域色素レーザーに代って2つの単色色素レーザーを用いる一方、信号光検知には高価な光多チャンネル解析器の代りに2本の光電子増倍管を使用するため、装置的に大幅に簡単化する上、結果の解析手続きも甚だ少ない労力で済む利点がある。この方法を種々の温度の空気中窒素に対し試みた結果、温度測定の手段として十分用い得るものであることがほぼ確認された。なお、これはCARS温度計測の簡易化というだけではなく、従来の方法に比べレーザーエネルギー利用効率が著しく高まる結果、燃焼測定に強く求められる単一レーザーパルスによる測定を容易にする点でより大きな意味があると言える。なお、これに関連して、エキシマーレーザーをCARSによる燃焼計測に利用するための種々の実験的検討を行なった。また一方で、光散乱法による火炎中の電子温度、電子密度の測定を実施し、これにもとづいて燃焼反応の非平衡性を明らかにすると同時に、そのノッキング等への関連を検討した。
冠動脈狭窄部位初期血栓形成に関する基礎的研究(血小板糖蛋白GPIb・von Willebrand因子相互作用の制御機構の解析)

血小板膜蛋白GP Ibα鎖とvon Willbrand因子(以下vWF)との反応は一次止血のトリガーとなることが知られており、冠動脈狭窄部位での初期血栓形成においてはGP IbとVWFとの相互作用を三次元構造を保持した新たなアッセイ法で解明した.GPIbα鎖のN末端フラグメントtagを付けたmutantGP Ibα鎖を固層化してもちいた。Mutantはアラニンスキャニングにより全VWF結合領域を網羅した。平成12年度にすべてのmutagenesisを完了し、翌年度にかけて評価した結果、128,172,175,217,218:ristocetin、botrocetin双方をモジュレーターとしたときのVWF bindingが特異的に低下した。これらの残基は実際にGPIbに結合しVWF bindingを阻害する各種モノクローナル抗体のエピトープになっており、6Dl(ristocetin、botrocetin双方をモジュレーターとしたときのVWF bindingを抑制する):125、HPL7(VWF bindingに全く影響を与えない):121であった。我々はオーストラリアの著明なGPIb研究者Michael Berndt博士が所有するGpIbのVWF結合ドメインの結晶構造モデルを用いてVWF結合部位の候補となる残基と抗体のエピトープの空間座標解析を共同で行うことにした。このモデルによると128,172,175の相互関係は非常に近接しており協調してVWF biding siteを形成する可能性が示唆された。一方、6D1は125に結合することによって近接した位置にある128におけるVWF bindingを阻害するであろうこと、これに対してHPL7はエピトープである121がbinding siteと空間的に遠く離れているため影響を与えないのだろうと考えられた。現在我々は,上記の研究課題に対し以下の如く解析を進めている。従来のGPIbのvWF結合部位同定法の問題点は,申請書の如くGPIbα鎖の複雑な高次構造領域に関する検討が不十分なことにある。従って我々はこの問題を解決するべくGPIbα鎖の第301アミノ酸のC末端側にtagとストップコドンを導入した合成GPIbα鎖発現ベクター,及び同様の基本構造ながら同領域内に存在する向電アミノ酸をアラニンに置換した41種のクラスター変異型GPIbα鎖発現ベクターを作成し,細胞感染後上清中に分泌された野生型及び変異型GPIbα鎖を作成し,これを用いて結合部位を解析している。合成GPIbα鎖のvWFに対する結合性は,tagとその抗体を用いて野生型及び変異型合成GPIbα鎖を固相化したプレートと125IでラベルしたvWFを用いたRIAシステムを用いた。GPIb-vWF結合は,結合誘導因子であるリストセチンとボトロセチンを用いて施行した。この結果,ロイシンリッチリピート内の変異体であるE128A及び(172-175)2Aでは何れの結合誘導因子による結合とも低下した。また,リストセチン依存型結合のみの単独低下は(12-14)2A,D106K,(149-152)3Aの3変異で,ボトロセチン依存型結合のみの単独低下は(217-218)2A,(285-287)2A,K301Aの3変異で認められた。以上の結果から,これらの7種類の変異体に含まれるアミノ酸残基がvWF結合に中心的役割を演じている可能性が示唆された。しかしながらこの中には、vWFに対する結合性の低下が結合中心部に存在するアミノ酸残基の置換によるものと、蛋白のマクロな立体構造変化によるものが含まれると考えられた。従ってマクロ立体構造変化によりvWFに対する結合性低下を呈した変異群を除外するために立体構造感受型抗GPIbα鎖モノクローナル抗体を用いた検討を進めている。

変異型GP Ibα鎖のvWF結合性を、新たなAssay systemを用いて評価した結果、以下のアミノ酸残基のmutantがpick upされた。128,172,175,217,218:ristocetin、botrocetin双方をモジュレーターとしたときのVWF bindingが特異的に低下した。12,14:ristocetinをモジュレーターとしたときのVWF bindingが特異的に低下したが、botrocetinによるVWF bindingは正常であった。217,218 285,287,301:botrocetinをモジュレーターとしたときのVWF bindingが特異的に低下したが、ristocetinによるVWF bindingは正常であった。これらの残基は実際にGPIbに結合しVWF bindingを阻害する各種モノクローナル抗体のエピトープになっている可能性が高いと判断し、直ちに結合性を検討した。我々はオーストラリアの著明なGPIb研究者Michael Berndt博士が所有するGPIbのVWF結合ドメインの結晶構造モデルを用いてVWF結合部位の候補となる残基と抗体のエピトープの空間座標解析を共同で行うことにした。このモデルによると128,172,175の相互関係は非常に近接しており協調してVWF binding siteを形成する可能性が示唆された。一方、6D1は125に結合することによって近接した位置にある128におけるVWF bindingを阻害するであろうこと、これに対してHPL7はエピトープである121がbinding siteと空間的に遠く離れているため影響を与えないのだろうと考えられた。
複合的環境要因に応じた植物個体レベルの物質分配調節メカニズムの探索

植物個体レベルの葉/根比(L/R)、葉の厚さ(LMA)や葉面積あたりのN濃度(Narea)などの炭素(C)・窒素(N)分配パターンは、光環境に応じた葉のN需要および土壌からのN供給に応じて、相対成長速度(RGR)を最大化させるように調節されていることが示唆されている(Sugiura & Tateno 2011)。本研究では、このような環境変化に応じたCN分配パターンを制御するメカニズムについて、植物ホルモンの役割に焦点を当て、(実験1)外生植物ホルモンの添加実験、(実験2)環境変化に応じた内生植物ホルモンの定量的解析、を行なった。(実験1)において、外生植物ホルモンとして、ジベレリン(G,GA3)、サイトカイニン(B,ベンジルアデニン)、ジベレリン合成阻害剤(U,ウニコナゾール)を用い、これらを単体、または組み合わせて植物体全体に添加する実験を行った。これらの植物ホルモン処理によって、個体レベルでの葉面積あたりの葉の重さ(LMA,gm-2)やL/Rが大きく変化した。また、このような形態的特性の変化と連動して葉のNareaが変化し、光合成速度や純生産速度といった生理的特性が変化した。個体全体のRGRは主に形態的特性の変化で説明されたことから、環境変化に応じたこれらの植物ホルモンによる形態的特性の制御によって、RGRが決定されていることが示唆された。(実験2)では、イタドリを、コントロール群は3段階のN条件(HN、MN、LN)で生育させたのち、HNはさらに摘葉(Def)、低N(LowN)、弱光(LowL)処理をし、1週間生育させた。これらのグループごとに、葉位ごとの、生理的形質、CN含量、バイオマス分配、内生の植物ホルモン量(GAs:ジベレリン、CKs=サイトカイニン、IAA:オーキシン)の測定を行った。コントロール群では、N条件が高いほど葉/根比が大きく、GAs量も高かった。処理群では、Def、LowL、LowNの順に、葉へのバイオマス分配比が大きいほど、GAs重も高かった。これらの結果からも、植物体はN条件や光条件の変化に対して、内生植物ホルモンの量を変化させることで葉根比を調節している可能性が示唆された.草本植物イタドリを用いて、外生植物ホルモンの添加実験と、内生植物ホルモンの定量実験を行なった。その結果、ジベレリンが植物個体レベルの光合成産物の分配を調節する重要な因子である可能性を示すことができた。今後は、モデル植物のタバコを用い、ジベレリン合成経路に関する組換え体を用いることで、ジベレリンと光合成産物の分配調節に関する生理学的研究を行う。個葉ごとに蒸散速度や光合成速度を調節可能なチャンバーシステムを構築し、安定同位体を用いたラベリング実験を行い、より詳細な光合成産物の動態を明らかにする。1.不均一な光環境におけるカジカエデの資源分配パターンと成長プロセスの解析Y字型に2分枝したカジカエデを用いて、不均一な光環境に対して樹木がどのような資源分配を通じて成長していくかを解析した。その結果、(1)不均一な光環境下では、強光環境下の枝へ窒素が集中的に分配され、弱光環境下の枝への窒素分配が抑制的となること、(2)均一な光環境下では各枝への窒素分配が均等に行われること、(3)各枝の成長量は、葉面積と葉の窒素濃度、光合成特性、光強度や気温などの気象条件で十分に説明できること、などが明らかとなった。2植物ホルモンに着目した個体レベルでの物質分配を決定するメカニズムの解明光環境および土壌窒素可用性に応じた成長速度を最大化させる最適な葉/根比を解析的に求め、どのようなメカニズムがあれば可塑的に物質分配を調節できるかを検討した。その結果、植物体は葉面積レベルの同化速度と窒素吸収速度の比を認識することで、物質分配を最適化可能であることが予測された。これらのシグナル伝達物質として植物ホルモンの効果を評価したところ、ジベレリンとサイトカイニンは葉/根比を増加させること、ジベレリン合成阻害剤は葉/根比を減少させること、葉の厚さや葉の窒素含量も大きく変化することが明らかとなった。

個体全体のRGRは主に形態的特性の変化で説明されたことから、環境変化に応じたこれらの植物ホルモンによる形態的特性の制御によって、RGRが決定されていることが示唆された。(実験2)では、イタドリを、コントロール群は3段階のN条件(HN、MN、LN)で生育させたのち、HNはさらに摘葉(Def)、低N(LowN)、弱光(LowL)処理をし、1週間生育させた。これらのグループごとに、葉位ごとの、生理的形質、CN含量、バイオマス分配、内生の植物ホルモン量(GAs:ジベレリン、CKs=サイトカイニン、IAA:オーキシン)の測定を行った。コントロール群では、N条件が高いほど葉/根比が大きく、GAs量も高かった。処理群では、Def、LowL、LowNの順に、葉へのバイオマス分配比が大きいほど、GAs重も高かった。これらの結果からも、植物体はN条件や光条件の変化に対して、内生植物ホルモンの量を変化させることで葉根比を調節している可能性が示唆された.物質分配を調節するメカニズムを動的成長モデルで再現することができた。このモデルを構成する仮定のいくつかを、実際の植物体を用いた操作実験によって検証することができた。草本植物イタドリを用いて、外生植物ホルモンの添加実験と、内生植物ホルモンの定量実験を行なった。その結果、ジベレリンが植物個体レベルの光合成産物の分配を調節する重要な因子である可能性を示すことができた。植物体を用いた操作実験をより詳細なスケールで行うことで、メカニズムの解明に取り組む。現在、植物ホルモンの添加実験を、種類、添加部位、濃度等を変化させて行っている。また、個々の器官の環境を制御する装置系を構築し、それぞれの器官での植物ホルモンの発現量や、光合成産物や窒素の分配パターンを解析する予定である。今後は、モデル植物のタバコを用い、ジベレリン合成経路に関する組換え体を用いることで、ジベレリンと光合成産物の分配調節に関する生理学的研究を行う。個葉ごとに蒸散速度や光合成速度を調節可能なチャンバーシステムを構築し、安定同位体を用いたラベリング実験を行い、より詳細な光合成産物の動態を明らかにする。