hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
小胞体とミトコンドリア間のオルガネラ連携を介した細胞機能制御機構の解明

真核生物における複雑な細胞機能は、オルガネラが正しく働くことにより維持されている。ところがオルガネラは、細胞が受けるストレスが原因となり機能低下を呈してしまう。そのため細胞には、オルガネラ機能低下を軽減・予防するためのさまざまな機構が備わっている。本課題は、異なるオルガネラの情報交換(オルガネラクロストーク)を介したオルガネラ品質管理機構の分子メカニズム、生理的意義を解明することを目的としている。得られた成果は下記の通りである。1小胞体膜上に局在するキナーゼが他オルガネラであるミトコンドリアで生じたストレスを受容し、品質管理に寄与した。2ミトコンドリアの品質管理に必要な小胞体局在キナーゼのリン酸化修飾部位を同定した。3同定した2のアミノ酸配列に対するリン酸化抗体を作製した。4小胞体局在キナーゼのリン酸化は褐色脂肪細胞の熱産生を制御した。これらの研究成果により、ミトコンドリア-小胞体クロストークを介した新規オルガネラ品質管理機構が存在し、それがリン酸化を介したシグナル伝達により制御されていることが考えられた。さらに褐色脂肪細胞の熱産生を制御している点から、この機構は全身のエネルギー代謝の調整に重要な役割を果たしている可能性が考えられた。このことから、ミトコンドリア-小胞体クロストークを介した新規オルガネラ品質管理機構の分子メカニズムを解析することで、代謝性疾患の病態メカニズムの解明に繋がることが期待できる。ミトコンドリア-小胞体クロストークを介した新規オルガネラ品質管理機構の存在を明らかにし、今後の解析に必要なリン酸化抗体を作製しており、本課題は順調に進展していると思われる。今後は、ミトコンドリア-小胞体クロストークを介した新規オルガネラ品質管理機構の分子メカニズム、特にリン酸化修飾、下流シグナルに焦点を当てて解析を実施する。また、現在作出している小胞体局在キナーゼのリン酸化修飾サイトに変異を挿入したノックインマウスの解析を進めていく予定である。
網膜投影型HMDを用いた直感的歯科インプラント手術ナビゲーションシステムの構築

近年,歯科医療において歯科インプラントは欠損歯の補綴治療においてきわめて有効な方法の一つとして確立され,それとともに骨量・骨質の不十分な症例や,審美的な要求の高い難症例が増加している.そのような症例に対して正確かつ安全な手術を実現するため,これまでに世界中で,術前シミュレーションソフトウェアにより,最適な埋入位置や角度,方向,適応サイズを検証し,サージカルガイドをCAD/CAM法で作製するシステムが開発されている.従来の歯科インプラント手術ナビゲーションシステムは,術部ではなくモニターを見ながら口腔内という狭い環境の中で器具の操作を行わなければならず,術者の不安が生じるという問題点があった.そこで,本研究では次世代ヘッドマウントディスプレイとして近年注目されている網膜投影型ヘッドマウントディスプレイと,AR技術を応用し,術前シミュレーション結果を術部に直接的にオーバーレイすることで,術部と術前シミュレーション像を同時に重ねて見ながら安心して手術が行えるナビゲーションシステムの開発を行った.近年,歯科医療において歯科インプラントは欠損歯の補綴治療においてきわめて有効な方法の一つとして確立され,それとともに骨量・骨質の不十分な症例や,審美的な要求の高い難症例が増加している.そのような症例に対して正確かつ安全な手術を実現するため,これまでに世界中で,術前シミュレーションソフトウェアにより,最適な埋入位置や角度,方向,適応サイズを検証し,サージカルガイドをCAD/CAM法で作製するシステムが開発されている.従来の歯科インプラント手術ナビゲーションシステムは,術部ではなくモニターを見ながら口腔内という狭い環境の中で器具の操作を行わなければならず,術者の不安が生じるという問題点があった.そこで,本研究では次世代ヘッドマウントディスプレイとして近年注目されている網膜投影型ヘッドマウントディスプレイと,AR技術を応用し,術前シミュレーション結果を術部に直接的にオーバーレイすることで,術部と術前シミュレーション像を同時に重ねて見ながら安心して手術が行えるナビゲーションシステムの開発を行った.近年,歯科医療において歯科インプラントは欠損歯の補綴治療においてきわめて有効な方法の一つとして確立され,それとともに骨量・骨質の不十分な症例や,審美的な要求の高い難症例が増加している.そのような症例に対して正確かつ安全な手術を実現するため,これまで世界中で術前シミュレーションソフトウェアにより,最適な埋入位置や角度,方向,適応サイズを検証し,サージカルガイドをCAD/CAM法で作製するシステムが開発されている.しかしながら,従来の歯科インプラント手術ナビゲーションシステムは,術部ではなくモニタを見ながら口腔内という狭い環境の中で器具の操作を行わなければならず,術者の不安が生じるという問題点があった.そこで,本研究では次世代ヘッドマウントディスプレイとして近年注目されている網膜投影型ヘッドマウントディスプレイとAR(Augmented Reality)技術を応用し,術前シミュレーション結果を術部に直接的にオーバーレイすることで,術部と術前シミュレーション像を同時に重ねて見ながら安心して手術が行えるナビゲーションシステムを構築した.平成21年度は基本システムの構築,および画像合成手順の提案と実装を達成した.USBカメラと光学透過型ヘッドマウントディスプレイを用いた検証実験により,640×480pixelに対して画像合成誤差がx軸方向に3.25%,y軸方向に2.83%であることを確認した.平成22年度は,実環境に適応したデュアルエクスポージャ機能と透視投影行列のサンプリング手法の開発を進め,画像合成精度とロバスト性の向上をはかる.本研究では.次世代ヘッドマウントディスプレイとして近年注目されている網膜投影型ヘッドマウントディスプレイとAR(Augmented Reality)技術をを応用し.術前シミュレーション結果を術部に直接的にオーバーレイすることで.術部と術前シミュレーション像を同時に重ねて見ながら安心して手術が行える歯科インプラント手術ナビゲーションシステムの構築を目的とした.平成21年度に,基本システムの構築と画像合成手順の提案,および検証実験を行い,その有効性を確認した.平成22年度は,実環境で利用するために解決すべき課題に取り組んだ.これまで使用してきた紙製の位置姿勢計測用マーカを,Rapid Prototyping装置の2色刷り機能を利用して紫外線硬化型の樹脂で製作することによりシステム全体の系統誤差を低減した.また1面だけでなく3面を立体的に配置することにより,計測範囲の拡張,隠れの問題を解決し,部分的無歯顎模型に取り付け,歯科用マネキン上で検証を行った.さらに,通常,白と黒の組み合わせで製作するマーカを灰色と黒の組み合わせにすることでコントラスト比を改善し.無影灯による頭部と患部の明度差が存在する環境における安定したマーカのトラッキングを実現した.最後に,画像合成に必要となる透視投影行列の算出法を古典的なDLT(Directr Linear Transformation)法からLMedS(Least Median Square)法に拡張することにより.サンプリング精度の低い例外値が含まれていた場合にこれらを効率的に除外し.ロバスト性の高い画像合成を実現した.
電磁スピニングシステムによるナノ流路駆動極小ポンプの開発

本研究は、極微小化が可能な遠隔力学操作方式である電磁スピニング(以下EMS)システムを用いて、マイクロ流路中において重要な機械構成部材となるマイクロポンプなどの要素部品を作り上げるための基盤技術を開発することを目的とした。研究では、球のトルクベクトルを3次元的に任意制御することにより微小球を任意の場所へ配送するシステムを構築した。また外部トルクによる転がり運動を精密に計測することにより、これまで物理的な定量測定が困難であった静止および動転がり摩擦の計測が可能になった。これらのシステムを用いて、転がり摩擦の変化から分子の吸着状態を精度よく検出するバイオセンサーの研究を展開した。申請者らはこれまで、電磁的な相互作用を用いて微小物体を遠隔で機械操作する要素技術の開発に取り組んできた。本研究は、極微小化が可能な遠隔力学操作方式である電磁スピニング(Electro-Magnetically Spinning、以下EMS)システムを用いて、マイクロ流路ひいてはナノ流路中において重要な機械構成部材となるマイクロポンプ、マイクロバルブ、コックといった要素部品を作り上げるための基盤技術を開発することを目的とする。本研究の最も大きな特徴は、マイクロマシンの基本駆動原理として、これまでにないまったく新しいEMSシステムを採用する点にある。この方式は構成が非常に簡便であるのに加えて、遠隔からの駆動エネルギー供給が可能であるという際立った特徴を有しており、これゆえ微小化が容易に行なえるというマイクロ・ナノ化学リアクターへの応用上きわめて優れた利点を持つ。本研究で開発する流体駆動のための微小機械要素は、今後バイオエンジニアリングや医療応用など様々な分野への応用が可能であり、その実現のインパクトは大きい。本年度はこれまでの微小球の自転運動に加えて、球のトルクベクトルを3次元的に任意制御し、スピンに加えて転がり自由度を持たせることにより微小球を任意の場所へ配送するシステムを構築した。これにより、例えば球にコーティングした材料などによる微細パターン形成などの可能性が拓かれる。これらのシステムを用いて、転がり摩擦の変化から分子の吸着状態を精度よく検出するバイオセンサーの研究に着手した。本年度はこれまで滑りなしと仮定していた球の転がりモードについて、ころがり摩擦と印加トルクの関係からその運動モードが変化しうることに着目し、これを積極的に球と基板との力学接触条件の高精度モニタリングに応用する試みを行った。これにより固体基板上に吸着したナノメートルスケールの吸着体が球の公転周期に影響を及ぼすことを見出した。これを応用すれば分子単体の吸着状態をモニタリングできる新たな界面観察手法を構築することができる。本年度は微小球へのEMSシステムの適用研究を行った。

これまでの技術では半径1mm程度の球に10-9Nm程度のトルクを印加することが限界であったが、これを磁場ならびにその回転数を増加させて100μm球までに適用した。駆動効率は磁場の大きさの2乗と磁場変動周波数に比例する。このため主に駆動トルクの向上は磁場生成周波数の高周波化により実現した。新たな磁気回路と電子回路の設計・製作と高周波電流アンプの導入、駆動電子回路の共振回路化により、従来の磁場の変調周波数50Hzを大幅に高周波化してkHz域まで拡張することに成功した。これにより低レイノルズ数駆動の確保や、機械摩擦の低減などの効果を確認した。当初の目標であった微小ポンプの実証に加え、任意場所への配送駆動など当初の計画にはなかった新たな知見による成果も生まれている。本年度に計画された2項目の研究項目について、それぞれおおむね順調に進捗している。以下にその概要と、自己評価の理由を記す。1.極小回転磁場生成技術の開発:本研究項目ではまず、微小領域におけるEMS駆動を実現するための要素技術開発を行った。現在のマイクロ流路の多くはそのチャンネルが平面内に二次元的に構成されており、このため流路の任意の場所にはごく薄い被膜を通して局所磁場を印加することが可能である。このため研究では、被膜を介して駆動部材に局所的な時間変動磁場を印加することのできるマイクロ磁場生成端子を開発した。さらに微小球を回転させるための局所的かつ強度の大きい磁場の生成を目指した。当初の数値的な目標は、磁場の回転数にして200Hz程度を想定していたが、これを高周波電流アンプの導入と駆動電子回路の共振回路化によりkHz域までの高周波化を達成することができた。これは当初の目標を上回る成果であり、本研究の目的達成に向けての大きなブレイクスルーとなった。2.微小流体駆動回路の作製と駆動能力の実験的検証:さらに作製した高周波EMSシステムを用いて、微小球の流体中における運動について検証した。このような系では、レイノルズ数が低く周囲の媒質の運動が層流領域にとどまるという点で、その設計思想は通常サイズのポンプなどの流体駆動部材のものとは大きく異なる。すなわち時間反転性の保存や部材表面での流体の速度ベクトルの連続性といった要因を考慮する必要があるが、この条件は流体力学の数値計算の問題としてはむしろ解法を容易にする。これを検証するため、流体力学シミュレーション計算と、実験結果を比較し、両者のきわめて良好な一致をを確認した。以上の通り、本研究においては計画は順調に進行しているが、上記の駆動系などは既存の設備を改良して使用したため、当初の計画通りのアンプ等を導入すれば更なる性能の向上が見込まれる。マイクロマシンの駆動機構としての要素技術に加え、高精度センサーとしての可能性も見いだされたため、これ以降はこの両者について特に実用化の可能性の観点から技術の評価を行う。
極座標ディラック方程式の経路積分とそのYukawa場の量子論への応用の研究

1.本研究課題の最終年度である。研究代表者一瀬が,初年度J.Math.Phys.(2005)誌で極座標Dirac方程式のGreen関数の経路積分表示を行った方法をEuclid2次元Yukawa場の量子論へ応用する研究である。目標は,G.A.BattleとL.RosenがJ.Stat.Phys.誌(1980)においてVekua-Bersの一般化された解析関数の理論を用いて証明したFKG不等式の経路積分法による別証明を与えることである。それはEuclid2次元Dirac方程式のGreen関数の積のトレースに関する不等式である。Euclid2次元Dirac方程式に対して,J.Math.Phys.(2005)の論文と同じ方法で,その動径成分のGreen関数表示を与える連続経路空間上の可算加法的2×2行列値測度が構成できることは昨年京都大学数理解析研究所講究録(2006)でスケッチした。目的の不等式を得るには,この測度の4つの各成分を詳細に調べる必要がある。それらはPoisson過程による再表示ができそうなことがその証明過程から見えている。Poisson過程との関わりが明らかにされれば問題解決に向かうと思われるが,他の関連する新たな問題の開拓に時間をとられ残念ながら研究期間内に完成しそうにないが,鋭意継続研究中である。2.尚,研究代表者は,いち早く経路積分、汎関数積分の研究を始めた旧ソ連の識者達から本研究に関する何かを学ぶべく,2007年4月にウクライナのオデッサで開催されたM.G.Krein生誕100年記念国際会議「Modern Analysisand Applications(MAA2007)」に出席し,経路積分に関係する講演を行い関連する問題について討議を行った。1.本年度は本研究の初年度である。研究代表者一瀬は,極く最近,本研究の第一歩のである,空間3次元Dirac方程式から得られるradial Dirac方程式に対して,経路の空間上の可算加法的測度を構成し,そのGreen関数の数学的厳密な経路積分表示を確立し,学術誌(J.Math.Phys.)にそれを書いた。radial Dirac方程式は係数にr=0で特異性を持つため,一瀬が以前,田村博志と共に,空間1次元のDirac方程式に対して経路の空間上の測度を構成した方法を用いるには困難があった。しかし,2002年5月ベルギーのAntwerpで開催されたThe 7-th International Conference : Path Integrals from Quarks to Galaxiesに出席した折,経路積分の物理サイドの専門家であるH.Kleinert教授(Berlin自由大学)とA.Inomata教授(New York州立大学)に会い彼等と討論し,彼等がCoulombポテンシャルを持つSchrodinger方程式等に用いた特異性を回避する方法を知り,それがうまく使えたのであった。3.この研究はまだ端緒についたばかりであるが,この先の研究を進める上で何かヒントを得るべく未完のこれまでの結果を2005年6月チェコのプラハで開催されたThe 8-th International Conference : Path Integrals. From Quantum Information to Cosmologyで講演した。また,2005年10月フランスのLuminy/MarseilleのC.I.R.M.で開催されたあるConferenceに出席した帰途,アイルランドのDublin Institute for Advanced Studiesから招待を受けセミナー講演を行った。もちろんこのやり方でうまく行くかという質問を受けた。問題は,1.で述べた,一瀬がGreen関数を表示するために構成した経路の空間上の可算加法的測度の中身をもっとよく調べる必要があり,少し時間がかかることのように思われる。目下鋭意検討中である。2.上述のJ.Math.Phys.でGreen関数を表示するために構成した経路の空間上の可算加法的2×2行列値測度の4つの成分の中身をもっとよく調べる必要があり,少し時間がかることのように思われる。3.尚,一瀬は,確率論関係の識者達から本研究について何かを学ぶべく,2006年6月にリトアニアで開催された第9回国際ヴィルニクス会議「確率論と数理統計」に出席し,昨年度J.Math.Phys.に発表した結果「極座標ディラック方程式のグリーン関数の可算加法的測度による経路積分表示」と本研究課題について講演を行った。

Poisson過程との関わりが明らかにされれば問題解決に向かうと思われるが,他の関連する新たな問題の開拓に時間をとられ残念ながら研究期間内に完成しそうにないが,鋭意継続研究中である。2.尚,研究代表者は,いち早く経路積分、汎関数積分の研究を始めた旧ソ連の識者達から本研究に関する何かを学ぶべく,2007年4月にウクライナのオデッサで開催されたM.G.Krein生誕100年記念国際会議「Modern Analysisand Applications(MAA2007)」に出席し,経路積分に関係する講演を行い関連する問題について討議を行った。
ゲノム編集技術応用によるシス制御因子駆動型進化メカニズムの実験検証

(1)Cas9によるlacZレポーター遺伝子のDlx3遺伝子への挿入実験を行い、約4kbの全長が正確に挿入された初代マウス個体を一匹得ることが出来た。しかしながらこのマウスから作製したF1マウスはいずれも致死となり系統化は実現できなかった。現在再度インジェクションを行っている。また、エンハンサーノックイン・アウトマウスとのヘテロコンパウンドマウス解析に用いるためのヘテロ接合Dlx3ノックアウトマウスの樹立に成功した。(2)ChIA-PET解析データから明らかになった複数のCTCF-cohesin結合領域(TAD25)に関するエンハンサー活性について、トランスジェニックマウス解析を詳細に行って発現のステージや発現領域の解析を行い、TAD3領域がE10.5前後に特異的な鰓弓エンハンサー関連領域であることを発見した。TAD2,TAD3領域についての欠失変異体の系統化に成功し解析を行った。(3)ゲノム編集技術によりDlx5-6遺伝子の鰓弓エンハンサーを修復鋳型とするDlx3-4クラスターTAD3 CTCFアンカー領域周辺への相同組換えノックイン実験を行い、その系統化に成功した。挿入ヘテロ、ホモマウスについて発現解析を行ったところ、Dlx3/4遺伝子の発現を変化させることに成功したことを確認した。これにより当初の目的であった、外部エンハンサーのノックインによるターゲット遺伝子発現変更を実現できた。RNA-seq解析データを取得し、形態学的解析も進行中である。近日中に論文として発表する予定である。(4)この他関連する研究として、ノックイン、ノックアウトの効率化プロトコールを確立し応用した研究として2報の論文(Ono et al、Niwa et al)を発表した。また、ES細胞を用いるノックインマウス作製効率化技術を確立し発表した(Sumiyama et al.)。平成29年度が最終年度であるため、記入しない。平成27年度は高効率ノックイン技術の開発検討と、非コード領域エンハンサー配列のゲノム編集技術によるノックアウト・ノックインによりツールキット遺伝子の発現改変をすることを目指して実験を行った。27年度初めに新しい研究室への引っ越しおよび新規マウス実験施設の立ち上げがあり、実際の実験が始められるまでに数ヶ月の遅れが生じたが、その後順調に実験を行える環境が整い実験を開始することができた。最初にコントロール実験として、非コード領域のエンハンサー配列に欠失変異を入れる実験をCRISPR/Cas9を用いて行い、50%の個体に目的の変異を得ることができた。また、ssODNを用いた配列改変では約20%の個体に目的変異を入れることができることを確認した。ただしこれらはいずれもモザイク個体であり初代の解析を行うことはできない。今後は効率を高め、初代での解析を可能にすることを目指していく。またツールキット遺伝子のエンハンサー配列の挿入・欠失による遺伝子発現の変化を追うため、塩基置換を導入したアリルを持つマウスをゲノム編集により作製した。今後はこのヘテロ接合マウスを利用し、種々の非コード領域の改変によりツールキット遺伝子の発現がどのように変化したかをRNA-seqにより解析していく予定である。さらに、外来のエンハンサー配列として利用するための各種エンハンサー配列を整備中であるが、その中で新たにDlx5-6遺伝子の非コード領域配列をクローニングし、その解析を行いこれが強力な鰓弓でのエンハンサー活性を持つことを確認した。今後はこれらのエンハンサー配列を用いてツールキット遺伝子の発現改変を行っていく予定である。平成27年4月より新規マウス施設の立ち上げが始まり、当初の試運転期間および立ち上げ時期の種々のトラブルシューティングのため、新施設で実際に動物実験が可能になったのは10月になってからであった。そのために全体の進行にやや遅れが出ているが、通常マウス実験開始後はほぼ順調に進んでおり、今後の実験に必要なマウスおよびDNA・RNA試料のリソース作りが進んでいることから、平成28年度内にはほぼ計画通りの進行に戻る見込みである。平成28年度は以下項目の実験を進めた。(1)ノックイン(KI)技術の改良とその応用によるシス因子の非コード領域への挿入実験および標的ツールキット遺伝子へのレポーター遺伝子挿入実験:KIの効率を高めるためTripleCRISPR法で開発した新しいsgRNAデザイン法を応用し、二重鎖DNA(プラスミド)を修復鋳型とするノックイン実験を行った。受精卵前核注入法によるlacZレポーター遺伝子のDlx3遺伝子への挿入実験では、約4kbの全長が正確に挿入された初代マウス個体を得ることが出来た。この個体の皮膚の一部を採取しlacZレポーター発現がDlx3の発現パターンを正確に反映していることが確認できた。現在系統化作業を行っている。その他、Dlx5-6遺伝子の鰓弓エンハンサーを修復鋳型とする、後述するDlx3-4クラスターCTCFアンカー領域周辺へのKI実験が進行中で、現在最初の産子が得られたところである。(2)ツールキット遺伝子としてDlx3、Dlx4遺伝子を選定し、ノックアウト(KO)表現型を確認するため、Triple CRISPR法によるKOマウスを作製した。Dlx3ホモKOマウスは胎盤の形成不全による致死性を示し過去の報告と一致した。現在今後の活用のためヘテロ接合KOマウスを作製中である。一方Dlx4遺伝子ホモKOマウスは明らかな異常表現型を示さず、今後の詳細な解析が必要である。

(3)DLX3-4クラスター非コード領域について、ChIA-PET解析データからDlx3遺伝子と相互作用がある3候補領域についてエンハンサー活性解析を行い、そのうちの一つからDlx3遺伝子の発現パターンと一致する非常に強い鰓弓活性が発見された。この領域をパラログDlx56鰓弓エンハンサー(Dlx3より時期的に早く、より広範囲の活性がある)の挿入サイトとして有力視して現在ノックイン実験を進めている。エンハンサーノックイン・ノックアウトを作製する実験に関して、ノックアウト実験には問題が無く進行しているが、ssODNを使用したエンハンサーモチーフノックイン実験について、最初の産子のジェノタイピングを行ったところ当初想定していたノックイン効率が得られず、系統化に適したマウスを得るため条件を変更しインジェクション数も増やした再実験を行うこととなり、結果として数ヶ月程度の遅れが生じた。現在はノックイン効率が向上しその後の実験は問題無く進行している。(1)Cas9によるlacZレポーター遺伝子のDlx3遺伝子への挿入実験を行い、約4kbの全長が正確に挿入された初代マウス個体を一匹得ることが出来た。しかしながらこのマウスから作製したF1マウスはいずれも致死となり系統化は実現できなかった。現在再度インジェクションを行っている。また、エンハンサーノックイン・アウトマウスとのヘテロコンパウンドマウス解析に用いるためのヘテロ接合Dlx3ノックアウトマウスの樹立に成功した。(2)ChIA-PET解析データから明らかになった複数のCTCF-cohesin結合領域(TAD25)に関するエンハンサー活性について、トランスジェニックマウス解析を詳細に行って発現のステージや発現領域の解析を行い、TAD3領域がE10.5前後に特異的な鰓弓エンハンサー関連領域であることを発見した。TAD2,TAD3領域についての欠失変異体の系統化に成功し解析を行った。(3)ゲノム編集技術によりDlx5-6遺伝子の鰓弓エンハンサーを修復鋳型とするDlx3-4クラスターTAD3 CTCFアンカー領域周辺への相同組換えノックイン実験を行い、その系統化に成功した。挿入ヘテロ、ホモマウスについて発現解析を行ったところ、Dlx3/4遺伝子の発現を変化させることに成功したことを確認した。これにより当初の目的であった、外部エンハンサーのノックインによるターゲット遺伝子発現変更を実現できた。RNA-seq解析データを取得し、形態学的解析も進行中である。近日中に論文として発表する予定である。(4)この他関連する研究として、ノックイン、ノックアウトの効率化プロトコールを確立し応用した研究として2報の論文(Ono et al、Niwa et al)を発表した。また、ES細胞を用いるノックインマウス作製効率化技術を確立し発表した(Sumiyama et al.)。平成27年度に引き続きノックイン実験技術の改良とゲノム変異マウス作製を行っていく予定である。マウス内在性toolkit
集中治療患者の持続血糖モニタリングと人工膵臓による血糖管理

本研究は、高度侵襲手術患者や集中治療成人患者における血糖管理に着目し、当該患者群で、1)持続血糖測定の安全性と信頼度を確認すること、2)持続血糖測定を用いた詳細な血糖測定を行うことで、血糖管理が予後に与えるメカニズムを検証すること、および3)安全な血糖管理法を持続血糖測定によって検証することを目的に行われた。本研究期間中、高度侵襲手術患者や集中治療成人患者で、24-72時間の持続血糖測定を行い、1)持続血糖測定の信頼度試験、2)心臓手術中の血糖値と術後臓器障害および酸化ストレスの関係の観察研究、3)パラチノースを使用した血糖降下療法の無作為化試験を施行した。各研究結果は、国内・国際学会で報告し、国際雑誌に投稿中である。現行の持続血糖測定機器では、新生児・小児での血糖測定は困難であるが、小型が進んだ際の研究を円滑にするために、小児患者の血糖管理に関しても、Pilot dataを集積した。この結果は、国際雑誌に投稿し採用され、2008年度日本集中治療医学会論文奨励賞を受賞した。18年度の研究目標は、集中治療患者に対する人工膵臓による持続血糖測定の信頼度を確認することであった。現在、人工膵臓を用いて2つの研究を続行中である。1;心臓手術における術中・術後における血糖値変化とその臨床的意義の検討本研究の目的は,「心臓術中・術後の高血糖の発生原因」及び「術中・術後血糖値管理とケミカルメディエーターと患者予後との関連性」を検討することである。人工膵臓により持続血糖測定を術中術後に施行し、その血糖値の変化と術後炎症マーカー、臨床的Outcomeと比較する。計30名を目標に患者登録をすすめており、現在18名の患者様に文書による同意を得たのち観察研究を施行した。2;高血糖を合併する食道癌患者での周術期血糖管理に対する糖質調節流動食と一般流動食の比較研究本研究の目的は、糖尿病患者の血糖管理を容易にするために開発されたパラチノースを主炭水化物とする糖質調整流動食が、一般的経腸栄養剤と比較して、高度侵襲手術である食道癌手術後患者において、血糖を低く保ちインスリン必要量を低下させるか否かを検討することである。研究方法は,無作為割付一2群間オープンラベル・クロスオーバー比較・検証的臨床試験である。人工膵臓により血糖値を連続モニタリングしながら、糖質調整流動食と一般的経腸栄養剤を24時間おきに投与し、それぞれの経腸栄養剤による血糖値の変動を観察する。16名の患者を目標に患者登録をすすめており、現在2名の患者様に文書による同意を得たのち研究を施行した。以上の研究を含め、現在47名の患者で、人工膵臓による血糖測定の信頼性を評価した。STG-22による持続血糖モニタリングの信頼度は、採血が良好である限り、血液ガス分析およびベッドサイド型血糖測定器での血糖測定に匹敵している事が確認された。19年度は、上記2つの臨床研究を終了させることを目標している。19年度の研究目標は、人工膵臓による持続血糖測定をOutcomeとした2つの研究を終了することにあった。両研究とも、患者集積は終了し、結果解析を行い発表・論文投稿の準備中である。1つ目は、「心臓術中・術後の高血糖の発生原因と術中・術後血糖値管理とケミカルメディエーターと患者予後との関連性」を検討する研究であった。現在、この研究は28名の心臓手術患者でのデータ集積を終え、結果解析を行っている。人工心肺を使用し、心停止液を使用した19名での検討を主に行い、持続測定血糖測定による平均血糖値は、従来の間歌的血統測定の平均と比較し、術後炎症反応・術後腎機能障害・および酸化ストレスと有意に強く相関していることが分かった。現在、ケミカルメディエーターおよび血糖制御ホルモンに関する解析も行っている。本研究内容は、2008年内に報告され、海外雑誌に投稿される予定である。2つ目の研究は、「高血糖を合併する食道癌患者での周術期血糖管理に対する糖質調節流動食と一般流動食の比較研究」である。本研究は、27名の患者をスクリーニングし、8名の患者をランダム化した時点で解析を行い、糖質調整流動食を用いることで低血糖のリスクなく血糖管理を良好にする作用があることがわかった。

本研究は終了し、研究内容は、2008年内に報告され、海外雑誌に投稿される予定である。18・19年度の研究成果を受け、20年度は、人工膵臓による持続血糖コントロールに関しての研究を行う予定である。20年度の研究目標は、人工膵臓による持続血糖測定をOutcomeとした2つの研究の解析と発表および論文執筆することにあった。また、今後の研究に向けて人工膵臓を用いた血糖管理を行う予定でもあった。「心臓術中・術後の高血糖の発生原因と術中・術後血糖値管理とケミカルメディエーターと患者予後との関連性」を検討する研究では、人工心肺を使用し、心停止液を使用した19名での検討を主に行い、持続測定血糖測定による平均血糖値は、従来の間歇的血統測定の平均と比較し、術後炎症反応・術後腎機能障害・および酸化ストレスと有意に強く相関していることが観察された。また、人工心肺使用中の平均血糖は術後酸化ストレスと正の相関関係にあることも観察された。本研究内容は、2008年内に日本麻酔科学会とアメリカ麻酔学会で報告した。近日中に海外雑誌に投稿する予定である。もう一つの研究は、「高血糖を合併する食道癌患者での周術期血糖管理に対する糖質調節流動食と一般流動食の比較研究」である。本研究は、29名の患者をスクリーニングし、8名の患者をランダム化した時点で解析を行い、糖質調整流動食を用いることで低血糖のリスクなく血糖管理を良好にする作用があることが観察された。本研究は終了し、研究内容は、日本集中治療医学会とアメリカ集中治療学会で報告された。現在、海外雑誌に投稿中である。人工膵臓を用いた血糖管理は8名の患者で施行し、危険なく血糖管理が行えた。
乳がん患者のサポートグループの効果を高めるプログラム構成と有効性に関する研究

本研究は、乳がん患者のサポートグループプログラムの構成内容と短期・長期的な効果を明らかにし、日本の乳がん患者の生活の質向上に効果的なプログラムの確立を目指すものである。2004年に研究者らが開発した乳がん患者のためのプログラム「ほっとカフェ」に参加した乳がん体験者と運営者を対象に、面接調査法と質問紙調査法を用いてプログラムに必要な内容や運営方法、プログラム参加から1年後までの効果の推移を明らかにした。本研究の目的は、研究者らが構築した乳がん体験者のサポートグループプログラム「乳がん手術体験者用サポートグループプログラム」の構成内容、および、短期・長期的な効果を明らかにし、乳がん患者の生活の質向上に効果的なサポートグループプログラムを確立することである。研究期間内に明示する内容は、以下の3点である(1)乳がん患者のサポートグループのプログラムの介入直後、および、介入後長期的な効果を、質的および量的な側面から明らかにする(2)乳がん患者の生活の質向上に効果的なサポートグループプログラムを再構築する(3)上記(1)(2)より、乳がん患者の生活の質向上に効果的なサポートグループのプログラム構成と有効性を明らかにする本研究は、乳がん患者のサポートグループプログラムの構成内容と短期・長期的な効果を明らかにし、日本の乳がん患者の生活の質向上に効果的なプログラムの確立を目指すものである。本年度は、研究者らが開発した4回のセッションから構成される乳がん患者用サポートグループプログラムを実践しながら、1.サポートグループに参加した乳がん患者の体験を明らかにし、効果的なプログラム構成を精練する、2.プログラムの効果を質的・量的な側面から明らかにする評価尺度を検討することを目的とし、以下の研究に取り組んだ。1.サポートグループに参加した乳がん患者の体験とプログラム構成の検討に関する研究(1)平成20年12月に、過去5年間に開催された「初発患者用サポートグループプログラム」の参加者を対象とする同窓会を開催した。同窓会参加者21名のうち研究同意が得られた12名に対して、半構造的質問紙に基づくインタビューを行った。対象者のサポートグループ参加時の年齢は平均50.8±9.2歳、術式は乳房温存術9名、乳房全摘術3名、サポートグループ参加時の術後経過期間は平均24.8±34.7ヵ月(中央値13、範囲5-127)であった。患者はサポートグループに参加したことで、同病者にしか語れない気持ちを共有できた、自分とは異なる問題をもつ患者が前向きに生きている姿を間近にし力を得た等の体験をしていた。現在分析を進め、プログラム構成を検討している。(2)平成21年13月に「初発患者用サポートグループプログラム」を実施し、参加者16名のうち8名の研究同意が得られた。プログラム終了1ヵ月後の平成21年4月にインタビューを予定している。2.サポートグループプログラムの評価方法の検討に関する研究研究協力者を含む研究者13名で計8回の検討会議を開催し、文献検討を行った。和文献180論文中27、洋文献198論文中19の論文についてレビューを深め、評価方法を精選している本年度は1.プログラム構成の検討、2.プログラム評価方法の検討を目的に以下の研究に取り組んだ。1.プログラム構成の検討に関する研究(1)初発乳がん患者用プログラム:平成21年4月に、「初発用プログラム(平成21年13月実施)」参加者16名のうち研究同意が得られた8名中7名に対してインタビューを行った。平成20年度に行った同インタビューと合わせ、「初発用プログラム」に参加した全19名のプログラム参加体験を分析し、プログラム構成を検討した。対象者は、平均年齢50.8±9.9歳、術後平均期間20.4ヶ月、乳房切除術7名・温存術13名(両術式1名含む)であった。分析の結果、体験に影響する4つのプログラム内容[(1)看護師による情報提供、(2)乳がん手術体験者同士の話し合い、(3)セッションを重ねるプログラム形態、(4)プログラムの運営方法]、および、プログラム内容に関連する31の体験[自分で病気に対処していけると実感する、家族にも言えない本音を話せる等]が明らかになった。情報提供と話合いを組み合わせた本プログラムは、参加者に肯定的な体験や変化をもたらす一方で、話合いでのグループ編成や患者固有の問題に対してプログラム内容をさらに工夫する必要性が示唆された。成果は学会で発表した。(2)再発患者用プログラム:「再発患者用プログラム」参加募集を開始したが、参加者が集まらない現状であった。理由を検討した結果、長期間にわたるプログラムではない再発患者用セルフヘルプグループが近隣で活性化し、再発乳がん患者のニーズが満たされつつあると考えられた。従って、今後はよりニーズの高い「初発患者用サポートグループプログラム」に焦点化することと決定した。2.プログラム評価方法の検討に関する研究前年度と同様、研究組織17名で計6回の研究会議を開催し検討した。次年度の評価実施に向けて、活用する尺度を数点に絞り、信頼性・妥当性等を確認する作業を行っている。本年度は、乳がん手術体験者のためのサポートグループプログラムの短期・長期的な効果の評価研究を以下の3つのステップを経て実施した。1.文献検討によるプログラム評価方法の選定

【調査1】プログラム参加者を対象とするアウトカム評価プログラムに参加した乳がん手術体験者への効果を明示することを目的に、短期評価:独自に作成した質問紙を用いて4つの各セッション直後に調査、長期評価:プログラムの目的に見合う既存の質問紙の設問を含む107116項目から構成される質問紙を用いてプログラム開始前から終了1年後までの5つの時期に評価する。【調査2】プログラム運営者を対象とするプロセス評価プログラムの運営スタッフの役割と機能を明示することを目的に、各セッション直後にインタビューガイドを用いたグループインタビューを行う。2.プログラム介入の質の担保に向けた準備プログラムの目的や具体的方法を記した手引きを作成して運営スタッフ26名に配布し、全スタッフがプログラムの内容を理解して同質のプログラムを提供できるようにした。また、プログラム参加者同士がグループで話合う際に機能するファシリテーターの質向上を目的に、乳がん患者に焦点化したロールプレイによるファシリテーター研修会を独自に考案し、研修を行った。3.プログラムの短期・長期的な効果の評価研究の実施【調査1】プログラムは、(1)平成22年9月、(2)平成23年2月の計2クール開催した。対象者は、プログラム申込者21名のうち研究参加に同意した17名、平均年齢47.5歳、術式は乳房切除術12名、乳房温存術5名、平均術後期間は1クール目:4.6ヶ月(med=3)、2クール目:30.1ヵ月(med=16)であった。データは、現在、量的および質的に分析中である。【調査2】上記2クールのプログラムの運営に関わったスタッフのうち、研究協力の得られた延べ63名を対象にグループインタビューを行った。現在、データは質的帰納的に分析している。本年度は、前年度同様に乳がん手術体験者のためのサポートグループプログラムを継続しながら、短期・長期的な効果の評価研究と英国フィールドリサーチを行った。【調査1】プログラム参加者を対象とするアウトカム評価プログラムは、(1)平成23年6月7月、(2)平成24年2月3月の計2クール開催した。対象者は、申込者19名のうち研究参加に同意した17名、平均50.4歳、術式は乳房切除術7名、乳房温存術10名、平均術後期間は1クール目14.8ヶ月(med=6)、2クール目10.8ヵ月(med=11)であった。短期評価は、4つの各セッション直後に自記式質問紙調査を行い、情報提供理解度および話し合い満足度を"とてもよくわかった・とても満足:5点"から"全くわからなかった・かなり不満足:1点"の5段階尺度で平均点を算出した。分析の結果、情報提供理解度平均4.2、話し合い満足度平均4.5であった。長期評価は、プログラム開始前から終了1年後までの5つの時期に質問紙調査および終了1年後のインタビューを行った。分析の結果、プログラム開始前と比較してプログラム終了直後では、がんに対する心理的適応尺度、外傷後成長尺度の平均得点の改善が認められ、終了3か月後には得点が弱まり、終了後6ヵ月に得点がやや改善した。【調査2】プログラム運営者を対象とするプロセス評価
三叉神経系神経因性疼痛モデル群の発症と治癒のメカニズムの解析

4種の三叉神経損傷モデルを作成して口髭部の機械刺激閾値を検証したところ、ほぼ例外なく閾値が低下するのは「眼窩下神経結紮モデル」のみであり、「下歯槽神経切断モデル」では約半数でのみ閾値低下が見られた。しかし「下歯槽神経切断モデル」のラットの解析では、神経細胞における神経損傷を示す遺伝子発現上昇にも、延髄におけるマイクログリアの活性化の程度にも分布にも、機械刺激閾値低下の有無との相関は見られなかった。神経損傷によって発症するアロディニアのメカニズム解明のため、三叉神経系を用いた神経因性疼痛モデルである「眼窩下神経結紮モデル」「眼窩下神経切断モデル」「下歯槽神経結紮モデル」「下歯槽神経切断モデル」の4種のモデルラットを作成し、それぞれモデルについて口髭部における機械刺激に対する逃避閾値を測定した。「眼窩下神経切断モデル」では閾値の低下はみられず、これは口髭部の支配神経である眼窩下神経そのものが切断されているためであると思われる。しかし「眼窩下神経結紮モデル」では発症時期に個体差はあるものの、ほとんどのラットで閾値の低下がみられた。一方下歯槽神経では逆に「結紮モデル」においては閾値の低下はみられなかったが、「切断モデル」では術後7日までに半数ほどのラットで閾値の低下がみられた。これまでにそれぞれのモデルラットについて術後7日目の三叉神経節及び延髄を摘出しており、「下歯槽神経切断モデル」では三叉神経節の下歯槽神経細胞体を含む領域で各種遺伝子の発現が変動しており、また延髄の下歯槽神経投射領域ではグリア細胞が活性化していることを確認している。他の3つのモデルについても比較のための同様の検討を行っており、さらに各モデルにおいて、同様の処置をしたにもかかわらずアロディニアを発症したラットと発症しなかったラットの比較も現在進めている。これにより神経節及び延髄における変化が、神経損傷の種類、アロディニア発症の有無などに関連があるのかどうか検討する予定としている。神経損傷によって発症するアロディニアのメカニズム解明のため、三叉神経系を用いた神経因性疼痛モデルである「眼窩下神経結紮モデル」「眼窩下神経切断モデル」「下歯槽神経結紮モデル」「下歯槽神経切断モデル」の4種のモデルラットを作成し、それぞれモデルについて口髭部における機械刺激に対する逃避閾値を測定したところ、「眼窩下神経結紮モデル」のほとんどのラット、「下歯槽神経切断モデル」の半数ほどのラットにおいて閾値の低下が見られたが、それ以外では見られなかった。これらのラットの延髄部におけるマイクログリアを免疫染色にて観察すると、下歯槽神経の損傷では延髄後角の再背側に、眼窩下神経の損傷では延髄後角の外側の広範囲に活性化したマイクログリアの集団が見られた。これは切断でも結紮でも、末梢神経が損傷するとその延髄への投射領域でマイクログリアが活性化することを示唆している。さらに、マイクログリアの活性化がそのまま機械刺激に対する逃避閾値の低下に繋がるわけではないことも表している。しかし今回の神経損傷によって活性化したマイクログリアは、延髄後角を中心として吻尾側方向のかなり広い範囲に分布している。確かに三叉神経から延髄への投射領域である三叉神経脊髄路核は吻尾側方向に広がるが、領域によって触覚、痛覚等、末梢から入力される感覚情報が異なることが知られており、それらと活性化マイクログリアの位置関係については今後の詳細な検討が必要であると考えられる。神経損傷によって発症するアロディニアのメカニズム解明のため、三叉神経系を用いた神経因性疼痛モデルである「眼窩下神経結紮モデル」「眼窩下神経切断モデル」「下歯槽神経結紮モデル」「下歯槽神経切断モデル」の4種のモデルラットを作成し、それぞれモデルについて口髭部における機械刺激に対する逃避閾値を測定したところ、「眼窩下神経結紮モデル」のほとんどのラット、「下歯槽神経切断モデル」の半数ほどのラットにおいて閾値の低下、すなわちアロディニアの発症が見られたが、同様の施術を行っているにもかかわらず残り半数のラットでは発症は見られなかった。これらのラットの延髄を摘出して免疫染色を行い、延髄後角におけるマイクログリアの活性化状態を観察したところ、下歯槽神経の損傷では延髄後角の再背側に、眼窩下神経の損傷では延髄後角の外側の広範囲に活性化マイクログリアが見られた。これをアロディニアを発症したラットと発症しなかったラットで比較すると、予想に反してこれらの間に差は見られなかった。さらに連続切片として観察して吻尾側方向の広がりも同様に比較したが、これについても差は見られなかった。この結果は、三叉神経系における神経損傷アロディニアモデルが、現在広く支持されている「マイクログリア仮説」のみでは説明できない現象であることを示している。

また、アロディニアを発症したラットと発症しなかったラットの感覚異常のテストのため、口髭部にカプサイシン、ヒスタミン、クロロキンといった刺激物質の投与を行い、そのごの行動を観察したところ、アロディニアを発症したラットでは痒み刺激に対する感受性も亢進していることを示唆する結果が得られた。4種も神経因性疼痛モデルラットの比較という点においては順調に進行している。しかし、方法がきちんと確立できなかった種類の行動テストについては、研究の進行を優先するために断念したものがあり、今後の進捗状況によっては再検証したい。24年度が最終年度であるため、記入しない。現在までに4種も神経因性疼痛モデルラットの延髄におけるマイクログリアの活性化は確認できているが、今後はそれらマイクログリアの細胞内部のシグナル分子の動態まで詳細に比較する必要がある。さらに、アストロサイトの状態にいても検討出来ればと考えている。また、予想よりも広範囲に及んだ活性化マイクログリアの分布と、三叉神経領域の触覚、痛覚、掻痒覚の延髄への投射領域との比較を行うことで、神経損傷、マイクログリアの活性化、感覚異常の発症という3つの事象の関連について新たな知見が得られるものと期待している。
悪性神経膠性漫潤能とhpoprotein receptor-related 蛋白

ヒト脳腫瘍組織片(良性神経膠腫、悪性神経膠腫および正常脳白質)を用いて、同一凍結材料から、病理組織標本用とmRNA抽出用の連続切片を作成し、まずヘマトキシリンエオジン染色で正常脳組織、および腫瘍の悪性度を確認した。次に連続切片から抽出したmRNAを用いてRT-PCRを行い、それぞれの組織でのLRPおよびuPA receptorのmRNAの発現を調べた。さらに同一材料からGAPDHのmRNAをコントロールとして検出して、uPA receptorおよびLRPの発現量を半定量的に検討した。また、RT-PCRに用いた組織片の連続切片を用いてLRPの免疫染色を行い、LRPの組織中での局在を検討した。悪性神経膠腫、特にglioblastomaではLAP mRNAが高頻度に発現されて、免疫染色法でもLRPは腫瘍細胞と腫瘍血管に陽性所見が得られた。正常脳組織中ではneuronに陽性所見がみられた。転移性および原発性肺腺癌ではその発現は殆どみられなかった。各種ヒトGlioma細胞株および腺癌細胞株においても同様にLRP mRNAの発現を検討し、Glioma細胞株ではLRPの発現がみられた。結論として、LRPは悪性神経膠腫の腫瘍細胞膜および腫瘍血管に発現され、uPA systemの代謝およびuPA receptorのリサイクルを促進することにより悪性神経膠腫の浸潤能および腫瘍組織内での血管新生に関与している可能性が示唆された。現在、悪性神経膠腫のcell lineを用いたin vitroでのtransfectionの実験を進めている。LRPのcDNAを、cDNA libraryから単離した。単離されたcDNAに特異的なprimerを用いてPCRで、細胞内部分および細胞外リガンド結合部位構造が欠落したtruncated cDNAを作成する段階である。これらのstable transfectantを単離し、In vitro invasion assay用のチャンバーを用いて、Matrigel in vitro invasion assayを行い、LRP cDNAをtransfectionしたcell lineおよびしていないcell lineの浸潤能の差を検討する予定である。
ロボットベースの組立てラインバランシングのシミュレータに関する研究

今日,生産ラインの設計において,シミュレータを用いて各設備仕様パラメータの値を決めることが多く,さらには現代の複雑化した生産ラインでは試行錯誤的調整が難しく,これらの設備仕様パラメータを最適化する手法の確立が求められている.2008年度では:その1:現在までに研究されている組立てラインバランシング(ALB)モデルについて,システム構築に必要不可欠な機能に関する分析等を行った.次に,ロボットの導入が進む現状に関して,ロボットベース組立てラインバランシング(rALB)モデルの技術や問題点など調査分析を行い,従来のALBとrALBでの相違点,ロボット導入によるシステム制御の複雑さや困難さを把握し,効果的なシステム開発と可視化シミュレータの研究開発に努める.その2:既存のソフトコンピューティング技術に対しての調査,分類,適用性の解析を行い,異なるアルゴリズムの中に生命システムをシミュレートしたルール,手順を概括し,ファジィ推論GAエンジンの研究開発した.本ファジィ推論GAエンジンは,パラメータ設定の複雑さ、高い計算負荷といった従来のGAの欠点を克服し,具体的な問題に対する有効性能を向上させるため,種々のソフトコンピューティング技法を組み合わせたハイブリッドアルゴリズム型シミュレータことである.その3:ロボットベース組立てラインシステムの信頼性を向上させながらサイクルタイムの削減ため、設備機械数や作業者数の最適化,製品のグループ化と資源割当に着目し,研究開発したファジィ推論GAエンジンを基に,多くのベンチマーク例題を用いた数値実験によるその性能評価を行った.また,必要に応じて事例研究テーマに関する開発技法の改善及び適用を行った.今日,生産ラインの設計において,シミュレータを用いて各設備仕様パラメータの値を決めることが多く,さらには現代の複雑化した生産ラインでは試行錯誤的調整が難しく,これらの設備仕様パラメータを最適化する手法の確立が求められている.2008年度では:その1:現在までに研究されている組立てラインバランシング(ALB)モデルについて,システム構築に必要不可欠な機能に関する分析等を行った.次に,ロボットの導入が進む現状に関して,ロボットベース組立てラインバランシング(rALB)モデルの技術や問題点など調査分析を行い,従来のALBとrALBでの相違点,ロボット導入によるシステム制御の複雑さや困難さを把握し,効果的なシステム開発と可視化シミュレータの研究開発に努める.その2:既存のソフトコンピューティング技術に対しての調査,分類,適用性の解析を行い,異なるアルゴリズムの中に生命システムをシミュレートしたルール,手順を概括し,ファジィ推論GAエンジンの研究開発した.本ファジィ推論GAエンジンは,パラメータ設定の複雑さ、高い計算負荷といった従来のGAの欠点を克服し,具体的な問題に対する有効性能を向上させるため,種々のソフトコンピューティング技法を組み合わせたハイブリッドアルゴリズム型シミュレータことである.その3:ロボットベース組立てラインシステムの信頼性を向上させながらサイクルタイムの削減ため、設備機械数や作業者数の最適化,製品のグループ化と資源割当に着目し,研究開発したファジィ推論GAエンジンを基に,多くのベンチマーク例題を用いた数値実験によるその性能評価を行った.また,必要に応じて事例研究テーマに関する開発技法の改善及び適用を行った.