hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
癌抑制遺伝子ＦＨＩＴのＰＫＣ制御による膵癌の浸潤・転移抑制効果の研究

Ezrinは癌の転移を促進するが、PKCにより制御されている。PKCI(PKC関連タンパク)と相同性がある癌抑制遺伝子FHITは膵癌でも異常が報告されているが、アデノウイルスベクターを用いてFHITを膵癌細胞S2-VP10に過剰発現させることで、FhitがPKCとEzrinの結合を阻害することによりEzrinのスレオニン基のリン酸化を抑制し、EzrinとActinの結合抑制されることを証明した。結果としてEzrinによる細胞の遊走性が抑制された。以上より、癌抑制遺伝子FHITの過剰発現はEzrinを制御することで膵癌の転移を抑制する可能性が示唆された。23年度に行った実験の続きとして、EZRINの発現量が最も多く、細胞増殖能および浸潤能も強いS2-VP10を用い、in vitroの実験を行った。FHIT発現アデノウイルスベクター(Ad-FHIT)、コントロールしてPBS、LacZ発現アデノウイルスベクター(Ad-LacZ)をS2-VP10に1000MOIで感染させ48時間にinvasion assayを行い、Ad-FHIT感染細胞のみ浸潤能の減少を確認した。また同様に48時間後の細胞質成分を用い、抗EZRIN抗体により免疫沈降(IP)を行い、抗リン酸化チロシン抗体、抗リン酸化スレオニン抗体でIBを行い、EZRINのリン酸基の変化をWestern blot(WB)法で検討した。EZRINのチロシン基のリン酸化はコントロール群、Ad-FHIT感染細胞で共に変化なかったが、スレオニン基のリン酸化はコントロール群では変化なく、Ad-FHIT感染細胞のみ100%阻害されていた。また同時に抗Actin抗体でWBを行うとAd-FHIT感染細胞でのみFHITとActinの結合が阻害されている結果が得られた。抗Actin抗体でIPを行い、抗EZRIN抗体でWBを行った結果も同様に、Ad-FHIT感染細胞のみActinとEZRINの結合が阻害されていることが証明された。このことと前年度の結果より、FHIT過剰発現によりFHITとPKCが結合し、PKCによるEZRINのスレオニン基のリン酸化が阻害され、FHITとActinの結合も詐害されることにより、S2-VP10細胞の浸潤能が阻害されている可能性が強く示唆された。現在S2-VP10細胞を用い、肺転移モデルを作成中である。24年度に行ったFHIT発現アデノウイルスベクター(Ad-FHIT)を用いた実験をより生理的な条件で再現するため、カチオニックリポソームであるDOTAPコレステロールを用いプラスミドでの遺伝子導入実験を行った。膵癌細胞株S2-VP10にFHITを導入したが、EZRINスレオニン基のリン酸化抑制は認められなかった。原因としてS2-VP10への遺伝子導入効率が低いことが考えられたため、免疫蛍光染色で形態の変化を観察した。コントロール細胞ではアクチンフィラメントの重合とそれに一致したEZRINの局在が確認されたが、FHIT発現プラスミドが導入された細胞ではアクチンフィラメントの重合阻害とEZRINのびまん性発現が認められ、EZRINとACTINとの結合阻害が示唆された。上記の結果より強発現系のAd-FHITを用い膵癌細胞の転移能を検討する実験を行った。治療群はAd-FHIT、コントロール群はPBS、および、LacZ発現アデノウイルスベクター(Ad-LacZ)をS2-VP10に1000MOIで感染し、36時間、48時間、72時間後の細胞増殖能をXTTを用い定量した。36時間、48時間ではAd-FHIT感染細胞とコントロール群は同等の増殖能を有したが、72時間ではでは細胞増殖能が減弱した。次に24ウェル細胞浸潤アッセイキットを用い細胞浸潤能の検討を行った。Ad-FHIT感染(1000MOI)36時間後にメンブレンにS2-VP10を敷き、その12時間後にメンブレンを通過してチャンバーに到達した細胞を固定、DAPI染色の蛍光吸光度で定量した。Ad-FHIT感染細胞はコントロール群に比し有意に細胞浸潤能の減弱が認められた(P<0.01)。以上よりFHIT遺伝子治療はPKCを制御することによりEZRINとACTINの結合を阻害し細胞の浸潤能を減弱することで膵癌の転移を抑制する可能性が示唆された。FHIT遺伝子を欠損している膵癌細胞株SUIT-2、S2-CP9、S2-VP10においてEZRIN, ACTINの発現をウェスタン・ブロッティング(IB)により確認した結果、いずれの細胞株でも両者の発現を認めた。EZRINの発現量が最も多く、細胞増殖能および浸潤能も強いS2-VP10を以後の実験系に使用した。

FHIT発現アデノウイルスベクター(Ad-FHIT)、コントロールしてPBS、LacZ発現アデノウイルスベクター(Ad-LacZ)をS2-VP10に1000MOIで感染させ48時間後のcell viabilityをXTT assayにて差がないことを確認した。同時にGFP発現アデノウイルスベクター(Ad-GFP)1000MOI48時間でGFP発現効率が95%以上であることを確認し、遺伝子導入が確実に行われていることを実証した。S2-VP10にAd-FHITを感染48時間後の細胞質成分を用い抗PKC抗体により免疫沈降(IP)を行い、抗FHIT抗体でIBを行い、PKCとFHITが結合していることを証明した。同時に抗EZRIN抗体でIBを行ったが、コントロール群ではPKCとEZRINの結合を認めたが、Ad-FHIT感染細胞ではPKCとEZRINの結合を認めなかった。このことにより、FHITタンパクがPKCと結合することにより、PKCとEZRINの結合を阻害している可能性が強く示唆された。S2-VP10細胞はアデノウイルスでも1000MOIと比較的高いウイルス濃度でなければ感染効率を上げることができない細胞であったため、アデノウイルスと平行でin Vitro実験を行う予定であったプラスミドの導入効率が期待していたほど上がらず、現在導入方法の改善をおこなっている最中である。アデノウイルスを用いた研究はin Vivo実験を残すのみとなり、やや遅れているが次年度には達成できる見込みである。膵癌細胞株S2-VP10が3種類の細胞株の中で、細胞増殖能・浸潤能も強く、EZRIN強発現であったため、今回の実験系に最も適していることは比較的早期に判断できたが、cell viabilityに影響を与えず、かつ、95%以上の遺伝子導入を達成する至適条件を設定するまでに時間を要した。結果的にAd-FHITを1000MOIで感染48時間後でcell viabilityがコントロール群と変わらず、Ad-GFPを用いた同条件の感染効率が95%以上であることを確認し、以後のin vitro実験を開始した。今回の実験系では細胞質内タンパクの相互作用を解明するため、細胞膜成分、細胞質成分、細胞核成分と分画することが必要で、数種類の分画法を試し、最も確実に分画し、かつ、細胞質成分を量的に損なわない方法の選択・確立に時間を要した。以上により、研究計画はやや遅延しているが研究成果は着実に上がっている。すでにアデノウイルスを用いたin Vivo実験に移行しており、S2-VP10細胞を用いた肺転移モデルが確立し次第治療研究を行い、FHIT遺伝子治療が転移を抑制するかどうかを検証する。また、生理的条件に近いプラスミドを用いた実験も続ける予定である。23年度に予定していたアデノウイルスベクターを用いた強発現系でのin vitro実験の続きを速やかに行い、FHIT、PKC、EZRINの相互作用を証明する。次いで24年度に計画していたプラスミドを用いたより生理的に近い条件で同様のタンパクの相互作用が生じるかを確認する。in vivo実験でS2-VP10が転移モデルとして使用できるか検討し、転移モデルを確立する。次いで治療研究を行い、FHIT遺伝子治療が転移を抑制するかどうかを検証する。以上24年度に予定されている研究を遂行する。次年度の研究材料は計画通りであり、研究費の使用計画に変更はない。23年度に予定していた研究材料はそろっており、研究費の使用計画に変更はない。
極低温 Rydberg 原子を用いた低周波帯単一光子源の開発

本研究では、THzサブGHz領域の低周波帯において動作する準波長可変単一光子源の可能性を追求することを目的とする。これを遂行するための独自の戦略として、磁気光学トラップ(MOT)中に蓄えた極低温Rydbergガスに特徴的に出現するダイポールブロケード効果を利用する方法を目論む。これを目指し、ダイポールブロケード創出のためのレーザーシステムの開発及びMOTの改良を行い、それに成功した。同時に、低温或いは常温Rydberg原子ガス超放射を利用した低周波光の生成実験を行い、Rydbergガスが低周波光源として利用できることを実証した。その他Rydberg原子の新しい生成法を開発した。本研究の最終目的はTHz-サブGHz領域の低周波帯において動作する準波長可変単一光子源の実現である。そのための独自な手法として磁気光学トラップ中に生成された冷却Rb原子を高励起Rydbberg状態に励起し、その結果出現するダイポールブロケイド効果を利用することを計画した。本年度では、まず準備的な実験研究として、真空中に生成した原子ビーム、及び原子分光セルを利用し、パルス色素レーザーを用いて原子を共鳴的にRydberg状態へ励起し、原子密度などの条件を最適化することで隣接するRydberg準位間に遷移が起こることを観測することを行った。始状態となるRydberg準位の励起を選択的に行うことでそこから放射される低周波光子の波長をおおよそ選択できると考えられ、この実験は本研究の最終目的である準波長可変単一光子源実現のために重要である。実験の結果、真空中の原子ビームに超放射による遷移が起こること、条件によっては複数の波長を伴う遷移が同時に誘起されることなどを確認した。この実験結果を踏まえ、Rydberg原子から単一の波長のみを取り出すためのマイクロ波THz共振器を作成した。一方、分光セルを用いた実験では超放射を確認することができず、今後の更なる追求が求められる結果となった。これらの予備的実験と同時に、Rbの磁気光学トラップに冷却Rydberg原子を生成し、冷却Rydberg原子の超放射現象の観測を試みた。本実験では、しかしポジティブデータを得ることが出来ず、その磁気光学トラップのトラップ用レーザーの改良が必要であることが明らかにされた。その他、低周波源として利用するための雑音となる、室温黒体輻射場の冷却Rydberg原子への影響や、周囲の原子と冷却Rydberg原子の衝突の影響などについて、幾つかの知見を得た。本研究は、THzサブGHz領域の低周波帯において動作する準波長可変単一光子源の可能性を追求することを目的としている。これを遂行するための独自の手法として、磁気光学トラップ(MOT)中に蓄えた極低温Rb原子を高励起Rydberg状態へと励起し、その結果そこに出現するダイポールブロケード効果を利用する方法を用いることを計画した。本年度は引き続き、昨年度から行っている準備的実験である、原子分光セルを利用したRydberg原子超放射による低周波電磁波の観測を行った。その結果、昨年度には観測出来なかったRydberg原子からの低周波光放射現象を、異なる手法(EOサンプリング法)を適用することにより観測することに成功した。この結果は原子分光セルに閉じ込められたRydberg原子を用いた高感度低周波電磁波の検出を行う可能性を示唆すると同時に、本研究の開始当初では考えていなかった、Rydberg原子を用いたシングル低周波パルス波形診断法の開発のためのポジティブデータとなり得ると考えられ、今後の展開が期待される。また、極低温Rydberg原子を生成するためのMOTに挿入する、Kバンドで動作するファブリーペロー共振器(Q値数1000)の設計を終了し、本年度早々これをMOTに導入し、極低温Rydberg原子の放射崩壊現象を検出する準備を終了した。同時に低温Rb Rydberg原子にダイポールブロケード効果を誘起するために必要な480nmシングルモードレーザーシステムの開発を行った。更に、極低温Rydberg原子にマイクロ波を、ファブリーペロー共振器ではなくマイクロ波ホーンをもちいて照射する予備実験を行い、低温Rydberg原子とマイクロ波の相互作用に関する知見を得た。昨年度に生じた排気系の不具合による実験の遅延が、引き続き本年度にも無視出来ない影響を及ぼしたことが第一の理由である。その他、本実験の心臓部分であるKバンドのファブリーペローマイクロ波共振器の作成を依頼するための適当な業者がなかなか見つからず、その選定に想定外の時間がかかった。更には、480nmシングルモードレーザーシステムの開発中に、テーパアンプなどの光学部品の不具合などが多々生じ、ここでも予想外の時間がかかった。また、実験室の室温や空調、湿度などを制御しなければ480nmシングルモードレーザーがなかなか安定しないことが判明し、ところがこれら設備関連のことは本学では研究室レベルでは解決できない問題であるため、その対応に時間を費やさざるを得なかったことなども遅延の理由としてあげられる。本研究はTHzサブGHz領域の低周波帯において動作する準波長可変単一光子源の可能性を追求することを目的として行われた。これを実現する中心的プレイグラウンドとして磁気光学トラップ(MOT)中に生成・捕獲された極低温ルビジウム(Rb)Rydberg原子を据え、そこに特徴的に出現するとされるダイポールブロケード効果を利用することで単一励起原子を生成し、単一発光を誘起することを計画した。本年度ではまず、極低温Rydberg原子にブロケード効果を誘発するために必要な480 nm発振シングルモードレーザーシステムの開発を終了した。

具体的には、外部共振器型960 nm発振ダイオードレーザーを作成し、その性能試験を行うと同時に、960 nmシングルモード出力を、我々が設計・作成したボウタイ型共振器に導入することで、高出力のシングルモード480 nm光の発振を確認することを行った。同時にMOT中に挿入するファブリーペローマイクロ波共振器とMOTトラップ及びリポンプ用レーザー光との幾何学的配置に関する最適化を、光学システムの改良により遂行した。さらに、補助的なものとして、原子の高励起Rydberg状態の励起のための新しい方法を考案し、それを実証する実験を行った。また、Rb原子が関与する非線形光学現象の観測実験及び観測結果の数値的考察を行い、a新しい光源として利用する可能性が示唆された。その他、Rydberg状態にある高密度Rbガスに低周波光が透過する場合に起こり得る幾つかの非線形光学現象についての考察も行った。本研究では、THzサブGHz領域の低周波帯において動作する準波長可変単一光子源の可能性を追求することを目的とする。これを遂行するための独自の戦略として、磁気光学トラップ(MOT)中に蓄えた極低温Rydbergガスに特徴的に出現するダイポールブロケード効果を利用する方法を目論む。これを目指し、ダイポールブロケード創出のためのレーザーシステムの開発及びMOTの改良を行い、それに成功した。同時に、低温或いは常温Rydberg原子ガス超放射を利用した低周波光の生成実験を行い、Rydbergガスが低周波光源として利用できることを実証した。その他Rydberg原子の新しい生成法を開発した。高温Rydberg原子が超放射を起こす場合、ドップラー効果がその競合過程となって超放射現象を阻害するとされる。一方、冷却Rydberg原子ではドップラー効果が無視出来るため、より容易に超放射が出現すると考えられる。そこで、冷却Rydberg原子から放出される低周波を超放射光として直接観測することを目的とした実験を最初に試みた。しかし実験ではポジティブデータを得ることができず、上記のシナリオが必ずしも成り立たないことが判明した。その原因として、本実験で生成した冷却Rydberg原子サンプルのディメンジョンが波長かそれ以下程度の大きさしか持たないことに起因する、超放射のモードマッチング問題が予測される。サンプルのディメンジョンは磁気光学トラップのための冷却レーザービームの径によって規定されており、ビーム径を大きくすること等々で解決されると考えられる。このことを行うためには新たに光学素子を購入する必要があり、本年度はそこまで到達できなかった。更に、本実験で使用している冷却原子生成のための磁気光学トラップには真空引きにターボ分子ポンプ及びイオンポンプを使用しているが、ターボ分子ポンプに不具合が生じ、そのオーバーホールが必要となったこと、及び研究室の空調設備に不具合が生じ、その修理が必要になったことが、実験の遅延に繋がった。本年度では、MOT中に導入したファブリーペローマイクロ波共振器の動作を確認することから実験を行う。
ラム波モーダル解析によるクロスプライCFRPの衝撃損傷の発生・伝播の検出と解明

ラム波のモーダル解析によって、円筒フランジで周辺固定されたクロスプライCFRP積層板(2-6mm厚さ)に直径7mmの鋼球が衝突(4-40m/s)するときの鋼球速度と衝撃力、衝撃力持続時間、内部損傷発生限界速度の関係を定量化した。衝撃力の正確な測定は、薄い積層板が自励振動するとともに、大規模な層間剥離が発生するため極めて難しい問題であるが、ラム波Soと初動Aoモードに対して実験一括応答関数を用いるシンプレックス援用波形シミュレーションによって正しく推定する方法を開発した。すなわち、シャープペンシルの芯の圧折によって励起されるラム波を圧折の原波形(0.9μsの立上がり時間と開放力6Nをもつステップ状関数)でガウスザイデル時間領域逆畳込み積分して一括応答関数を求める。次に、11次のフーリエ級数で近似した非対称逆山形衝撃力を仮定し、この原波形と一括応答関数の畳込み積分で得られる波形を実測ラム波形と一致させるための繰返し計算を行う。このとき、非対称山形波形の形状は、計算と実測波形が一致するように、フーリエ級数をシンプレックス法を用いて変化させることによって求めた。この方法によって、衝撃力とその時間履歴(モーメンタム)を求めることが可能になった。推定衝撃力履歴は、マス・スプリングモデルによるそれと、最大衝撃力はエネルギー・バランスモデル(衝撃点における板の最大たわみから計算)によるそれとを比較したが、マス・スプリングモデルではヘルツの接触力を測定するためラム波形シミュレーションによる値の40倍以上も大きな値を示す。一方、エネルギー・バランスモデルから推定される衝撃力は、低速鋼球範囲ではラム波から求めたそれらとほぼ一致するが、高速になると大きな層間剥離(衝撃裏面の繊維方向に沿うラグビーボール状の剥離)が発生するため一致しなくなることを明らかにした。すなわち、色々な方法の中でも、ラム波形シミュレーション法は、最も正確に衝撃力と持続時間を推定できることが示された。また、線及び点状レーザの断熱膨張を破壊源としてラム波を発生し、ウエーブレット係数等高線図の類似度を調べることによって、繊維破断、トランスバースクラック、マトリックスクラック(スプリッティング)、デラミネーションなどの内部損傷を分類する方法を提唱した。本研究によって、測定の難しかった衝撃力履歴や、損傷の分類と進展挙動を明らかにすることが可能になった。クロスプライCFRPの衝撃損傷を検出・解明するための基礎研究を行うと共に、コンフォカル・ファブリペロー干渉計を作成した。基礎研究としては、鋼球衝突を受けるPMMA薄板(円筒フランジ固定)のラム波の逆解析のよる衝撃力の定量化,および損傷を発生させる鋼球速度(13-20m/s)におけるラム波を分離する方法を確立した。前者は、鉛筆の芯の圧接を原波形とする一括応答関数の逆畳み込み積分でもとめこの方法は積層CFRPでも有効であることを調べた。また、顕著な異方性を示す積層CFRPの衝撃点(音源)位置評定を行う4チャンネルモニタリング装置と速度分散を考慮した位置評定スキームを開発し、500mm□板では2mmの誤差範囲での位置評定を可能にした。また、130μm厚さの圧電フルム(PVDF)を用いて衝撃力や破壊発生時間を直接測定する方法を開発し、衝撃持続時間と損傷発生時間の関係を明らかにした。一方、衝撃による大振幅のラム波から、破壊による小振幅のラム波を抽出する方法として、時間シフトサブトラクション法の有効性を確認した。抽出された破壊によるラム波は、PZT素子で模擬した人工破壊源によるラム波と良い一致を示し、破壊の大きさと生成速度が推定できることを明らかにした。また、円周固定されたクロスプライCFRPに準静的な圧縮負荷負荷を与えた時に発生する繊維破断,デラミネーション、トランスバースクラックなどの発生順をラム波のモーダル解析から分類し、その有効性を線状あるいは点状パルスYAGレーザを音源として励起したラム波との類似性から検証した。CFRPの衝撃試験は、試験片作成に相当の予算を必要とするため現在十分な結果は得られていないが、開発した基礎的ツールを使うことによって可能なことを低速度粒子衝突について確認している。コンフォカル・ファブリペロ干渉計はほぼ構築済みで、高出力化したグリーンレーザを用いてその性能を検定中である。

この方法によって、衝撃力とその時間履歴(モーメンタム)を求めることが可能になった。推定衝撃力履歴は、マス・スプリングモデルによるそれと、最大衝撃力はエネルギー・バランスモデル(衝撃点における板の最大たわみから計算)によるそれとを比較したが、マス・スプリングモデルではヘルツの接触力を測定するためラム波形シミュレーションによる値の40倍以上も大きな値を示す。一方、エネルギー・バランスモデルから推定される衝撃力は、低速鋼球範囲ではラム波から求めたそれらとほぼ一致するが、高速になると大きな層間剥離(衝撃裏面の繊維方向に沿うラグビーボール状の剥離)が発生するため一致しなくなることを明らかにした。すなわち、色々な方法の中でも、ラム波形シミュレーション法は、最も正確に衝撃力と持続時間を推定できることが示された。また、線及び点状レーザの断熱膨張を破壊源としてラム波を発生し、ウエーブレット係数等高線図の類似度を調べることによって、繊維破断、トランスバースクラック、マトリックスクラック(スプリッティング)、デラミネーションなどの内部損傷を分類する方法を提唱した。本研究によって、測定の難しかった衝撃力履歴や、損傷の分類と進展挙動を明らかにすることが可能になった。
損傷応答によるゲノム安定性の制御

本申請では、ゲノムに誘発される変異を「次世代シークエンサ(NGS)」を用い解析する研究を提案している。培養細胞に加え、体組織レベルでの「ゲノム解析」を行うのが特徴である。試験管内細胞系では見えてこない組織構造特有の損傷応答を、in vivo体組織解析系の構築により明らかにできると考えている。本年度は、DNA損傷応答遺伝子発現誘導のモニター系の作を開始した。BACクローンを利用したRecombineering法により、組織幹細胞特異的発現の制御領域の単離系を確立する事ができた。27年度が最終年度であるため、記入しない。
磁気神経刺激法を用いた小児脊髄・骨盤神経機能検査法の確立とその臨床的意義の研究

平成8-9年の基礎的並びに臨床的検討により以下の研究成果を得た。《基礎的検討》(実験方法:筋電図・誘発電位記録法)(1)研究細目、家兎を用いた適切な磁気刺激部位・条件の検討磁気刺激装置:磁気刺激装置SMN-100、8の字型磁気コイルYM-111B(日本光電製)筋電図記録:誘発電位・筋電型MEM4202(日本光電製)結果:体重3kg前後の家兎15匹を用い磁気刺激による外肛門括約筋筋電図を試みた。頭部では、明瞭な反応が得られなかったが、胸椎以下の脊髄レベルでは明瞭な筋電図が再現性をもって記録できた。また、胸椎・腰椎部では単相性反応であったが、仙骨部では多相性反応と変化し、馬尾神経レベルでは闘値の異なる神経群により支配されているものと考えられた。《臨床的検討》(実験方法:筋電図・誘発電位記録法)(1)研究細目.磁気刺激を用いた小児外科疾患における陰部神経機能の検討結果:正常小児15例における検討では、腰椎以下の磁気刺激において再現性のある筋電図の導出が可能で、ヒトでは家兎より磁気刺激がかかりにくく、中枢神経の陰部神経への関与が異なるものと考えられた。また、潜時の測定には刺激ノイズの少ない腰椎刺激が適していた。小児外科疾患における検討では、(1)鎖肛術前4症例において術前外肛門括約筋筋電図が記録が可能で、術前の評価だけでなく、従来不可能であった陰部神経や括約筋への手術侵襲の評価にも有用であった。また、術後12例において、従来より施行している経直腸壁陰部神経刺激法による外括筋筋電図との比較検討より、陰部神経障害部位の同定や術後評価に有用であった。(2)脊髄浸潤を示す悪性腫瘍2例と良性腫瘍1例では、脊髄磁気刺激による胸壁筋電図の導出も施工し、術前神経障害の評価と術後の回復過程を明らかにできた。(2)研究細目.小児外科疾患の直腸肛門機能並びに骨盤・体性感覚神経機能研究結果:H6年よりの継続課題の成果として、ヒルシュスプルング病や直腸肛門奇形症例の仙骨神経機能異常と術後排便機能障害との関連を研究し、陰部神経機能異常例では術後排便機能が不良であることを明らかにした。また、胆道閉鎖商術後胆汁排泄不良例では、ヒダミンE欠乏を伴わない体性感覚神経異常が出現し、肝移植により改善されうることを明らかにした。平成8年の基礎的並びに臨床的検討により以下の研究成果を得た。《基礎的検討》(実験方法:筋電図・誘発電位記録法)研究細目:家兎を用いた適切な磁気刺激部位・条件の検討磁気刺激装置:磁気刺激装置SMN-100、8の字型磁気コイルYM-111B(日本光電製)

筋電図記録:誘発電位・筋電型MEM4204(日本光電製)結果:体重3kg前後の4匹の家兎を用い、経静脈的ネンブタール麻酔下に外肛門括約筋筋電図(外括筋EMG)を記録した。仙骨部刺激磁気刺激では、明瞭な2相性反応が記録され、その平均潜時は2.45±0.84msecで、S3レベルで最も振幅が大きかった。胸椎・腰椎刺激でも明瞭なEMGが記録されたが単相性で、潜時は腰椎、胸椎部でそれぞれ6.8±1.1、9.7±1.6msecであった。一方、頚部では再現性はなるものの振幅が著明に低下し、頭部刺激ではEMG記録が困難であった。磁気刺激により胸椎以下では明瞭な反応が得られるものの、従来より施行している経直腸壁陰部神経電気的刺激による外括筋EMG(発生潜時;1.48±0.32msec)と比較した場合、磁気刺激法では標準偏差が比較的大きく、刺激の有効性に個体差があるものと考えられた。しかし、磁気刺激法は非侵襲的で脊髄神経機能検査法として有用であり、外括筋は刺激閾値の異なる神経線維群より構成されていることが明らかとなった。《臨床的検討》研究細目.磁気刺激を用いた小児外科疾患における陰部神経機能の検討結果:現在まで、正常小児12例の検討を行ったが、磁気刺激は家兎よりも有効でなく、明瞭な反応が認められるのは、腰椎より以下のレベルであった。直腸肛門奇形症例8例での検討では、経直腸壁陰部神経刺激にて外括筋EMGの認められなかった高位型3例において、仙骨部磁気刺激により外括筋EMGが記録でき、従来の経直腸壁陰部神経刺激法と精髄磁気刺激法との組み合わせにより、詳細な陰部神経機能検索が可能であった。また、脊髄磁気刺激法を用いることにより術前に外括筋EMG記録が可能となり、術後の排便機能障害を評価する上で有用であった。現在、ヒルシュスプルング病や慢性便秘などにおいても検討を進めている。平成8-9年の基礎的並びに臨床的検討により以下の研究成果を得た。《基礎的検討》(実験方法:筋電図・誘発電位記録法)(1)研究細目.家兎を用いた適切な磁気刺激部位・条件の検討磁気刺激装置:磁気刺激装置SMN-100、8の字型磁気コイルYM-111B(日本光電製)筋電図記録:誘発電位・筋電型MEM4204(日本光電製)結果:体重3kg前後の家兎15匹を用い磁気刺激による外肛門括約筋筋電図を試みた。頭部では、明瞭な反応が得られなかったが、胸椎以下の脊髄レベルでは明瞭な筋電図が再現性をもって記録できた。また、胸椎・腰椎部では単相性反応であったが、仙骨部では多相性反応と変化し、馬尾神経レベルでは閾値の異なる神経群により支配されているものと考えられた。《臨床的検討》(実験方法:筋電図・誘発電位記録法)(1)研究細目.磁気刺激を用いた小児外科疾患における陰部神経機能の検討結果:正常小児15例における検討では、腰椎以下の磁気刺激において再現性のある筋電図の導出が可能で、ヒトでは家兎より磁気刺激がかかりにくく、中枢神経の陰部神経への関与が異なるものと考えられた。また、潜時の測定には刺激ノイズの少ない腰椎刺激が適していた。小児外科疾患における検討では、(1)鎖肛術前4症例において術前外肛門括約筋筋電図が記録が可能で、術前の評価だけでなく、従来不可能であった陰部神経や括約筋への手術侵襲の評価にも有用であった。また、術後12例において、従来より施行している経直腸壁陰部神経刺激法による外括筋筋電図との比較検討より、陰部神経障害部位の同定や術後評価に有用であった。(2)脊髄浸潤を示す悪性腫瘍2例と良性腫瘍1例では、脊髄磁気刺激による胸壁筋電図の導出も施行し、術前神経障害の評価と術後の回復過程を明らかにできた。(2)研究細目.小児外科疾患の直腸肛門機能並びに骨盤・体性感覚神経機能研究
心不全発症におけるGSK-3βを介した心肥大抑制メカニズムの役割の解明

GSK3βは心臓の生理と病理において中心的役割を果たしている。本研究では、GSK3βヘテロ接合体ノックアウト突然変異(GSK3β+/- KO)と同時に家族性DCMの遺伝的原因の一つである心筋トロポニンT (cTnT) ΔK210ノックイン(KI)突然変異を導入したマウスを作成した。GSK3β+/- KOは、DCMマウスにおいて、心不全を伴う左心室収縮機能の低下を抑えるとともに、心拡大、心筋線維化および心筋細胞アポトーシス等の心臓リモデリングを抑えた。本研究の結果は、ΔK210 cTnT突然変異による家族性DCMにおいてGSK3β阻害が心臓保護的であることを示唆している。GSK-3βは心肥大を調節する重要な細胞内シグナリング分子であり、その恒常的活性化によって心肥大を抑制することができることが知られている。一方、がん治療の研究から、非ステロイド性抗炎症薬(NSAIDs)であるセレコキシブとその誘導体がその上流にあってGSK-3βの活性を抑制しているAkt(protein kinase B)の活性を阻害することで抗腫瘍作用を持つことが明らかにされている。本研究では、進行性のうっ血性心不全を発症する拡張型心筋症(DCM)モデルマウス(BALB/c遺伝的背景心筋トロポニンTΔK210突然変異ノックインマウス)に対するセレコキシブとその誘導体で抗炎症作用を持たないメチルセレコキシブの効果を比較検討することによって、GSK-3βを介した心肥大抑制メカニズムの心不全発症における役割を解明し、それをターゲットにした画期的な心不全治療薬の開発につなげることを目的とする。本年度は、投薬前DCMマウスの病態進行に伴うGSK3βを介する心肥大抑制メカニズムの変化を検討した。Aktセリン473リン酸化レベル(活性化レベル)は重度の心不全症状を示す8週令においては軽度の心不全症状を呈する4週令に比べて顕著に増加していた。しかし、その下流にあってAktによってリン酸化され不活性化されるGSK-3βのセリン9リン酸化レベル(不活性化レベル)は予想に反して低下していた。それにもかかわらず、活性化GSK3βによって分解されるβcateninの量はむしろ増加していたことから、従来の肥大抑制シグナル経路のみでは説明不可能であり次年度も引きつづき慎重に検討する必要がある。セレコキシブはCOX2選択的阻害作用を持ち血栓形成を促進する可能性があるため、心不全の予後を悪化させるリスクが危惧されている。それに対して、ジメチルセレコキシブはセレコキシブと同様にAktを阻害することでGSK3β活性を高めるがCOX2阻害作用をもたないため心血管イベントの発生リスクを高めることなく心肥大を抑制し心不全の予後を改善することが期待されている。そこで、本年度は心筋トロポニンTΔK210突然変異による拡張型心筋症ノックインマウスモデルを用いて、末期心不全に対するセレコキシブとジメチルセレコキシブの治療効果を比較検討した。セレコキシブとジメチルセレコキシブの経口摂取は予想に反してどちらもこの末期心不全モデルの予後を有意に改善せずむしろ悪化させる傾向がみられた。また、心不全におけるGSK3βの役割を明らかにするため心筋トロポニンTΔK210突然変異による拡張型心筋症ノックインマウスモデルとGSK3βノックアウトマウスを交配することで、心不全に対するGSK3βノックダウンの影響を検討した。こちらも予想に反してGSK3βノックダウンは心筋層間質線維化とともに心機能低下を抑制した。以上の結果は、GSK3β活性化による心肥大抑制は心不全に対して必ずしも有益ではなく、むしろその抑制による心肥大促進が有益である可能性を示唆している。GSK-3βは平常時には活性化されており、心肥大を促進する遺伝子群の転写因子であるβカテニンをリン酸化しユビキチンプロテアソームシステムによる分解を促進することによって心筋細胞の肥大を抑制している。しかし、心不全時には、GSK-3βは活性化されたAktによってリン酸化され不活性化されるため心肥大が促進される。我々は、これまでにセレコキシブとジメチルセレコキシブがAktを阻害しGSK-3βの活性化することで心肥大反応を抑制することを明らかにし、これらの薬物によって心不全の進行を抑えることができる可能性を示した。セレコキシブはCOX2選択的阻害作用をもつため血栓形成を促進し心不全をむしろ悪化させる可能性が危惧されるが、ジメチルセレコキシブはCOX2阻害作用を持たないため心不全治療に特に有益である可能性がある。この可能性を証明するため、心筋トロポニンTΔK210突然変異による拡張型心筋症ノックインマウスをもちいて末期心不全に対する両薬物の治療効果を比較検討したところ、予想に反してどちらも心不全をむしろ悪化させるという結果が得られた。さらに、心筋トロポニンTΔK210突然変異による拡張型心筋症ノックインマウスとGSK-3βノックアウトマウスを交配し、心不全に対するGSK-3βノックダウンの効果を調べたところ、その効果は心臓保護的であることが明らかになった。本研究で得られた結果は、少なくともこの家族性拡張型心筋症においては、GSK-3β活性化による心肥大抑制は有害であり、むしろGSK-3β阻害による心肥大促進が有益であることを示唆している。

本研究では、GSK3βヘテロ接合体ノックアウト突然変異(GSK3β+/- KO)と同時に家族性DCMの遺伝的原因の一つである心筋トロポニンT (cTnT) ΔK210ノックイン(KI)突然変異を導入したマウスを作成した。GSK3β+/- KOは、DCMマウスにおいて、心不全を伴う左心室収縮機能の低下を抑えるとともに、心拡大、心筋線維化および心筋細胞アポトーシス等の心臓リモデリングを抑えた。本研究の結果は、ΔK210 cTnT突然変異による家族性DCMにおいてGSK3β阻害が心臓保護的であることを示唆している。当初の予想とは異なる結果が得られているが、本研究の目的である心不全発症におけるGSK3βの役割が明らかになりつつある。心臓生理学セレコキシブとメチルセレコキシブ投与実験および拡張型心筋症ノックインマウスにおけるGSK3βノックダウンにおける検体数をさらに増やして本年度得られた結果を検証するための信頼性の高いデータを収集する。。本年度に計画した薬物投与前の心不全進行に伴う心肥大抑制メカニズムの発現レベルに関してひきつづき慎重な検討を要するものの一定の結果を得ることができた。年度末に使用する予定であったものが年度をまたいでしまった。引き続き、投薬前における心肥大抑制メカニズムをNFAT3cリン酸化も含めて詳細に検討するとともにセレコキシブとメチルセレコキシブの投薬を行い、その効果を比較検討していく。さらにGSK3βノックアウトマウスも利用することによって、GSK-3βを介した心肥大抑制メカニズムの心不全発症における役割の解明を強力に進める。次年度すぐに使用する予定である研究進行状況に応じて適正に使用した結果、多少の次年度使用額が生じた。翌年分助成金と合わせて本研究計画を着実に遂行するために適正に使用する。
麻酔薬の心筋感作作用におけるカリウムチャネルの役割

麻酔薬の心筋感作作用においてK^+チャネルの果たす役割について検討した。まずラットを用いてエピネフリン不整脈閾値測定の実験系を確立した。ラットをハロセンで麻酔し、気管内挿管ののち人口呼吸器にて正常換気を行い、心電図と直接動脈圧をモニターした。不整脈は15秒間に4発以上の心室性期外収縮の発生とし、不整脈を誘発する最小投与量をもって不整脈閾値とした。エピネフリン投与量は指数的に変化させ、一回の注入時間は3分間とし、10分以上の間隔で繰り返した。不整脈発生時点で、血液を採取し血漿エピネフリン濃度を測定した。3種類のK^+チャネル開口薬を用いて、ハロセン-エピネフリン不整脈への影響を調べた。ハロセン麻酔下のエピネフリン不整脈誘発投与量は生食水投与中(コントロール)で、5.21±2.08μg/kg/min(mean±SD;N=7)であった。KRN2397の投与中は用量依存症に上昇し、25μg/kg/minの投与により、エピネフリン不整脈誘発投与量は7.55±1.92μg/kg/min(N=8)に増加した。同様に、ニコランジル80μg/kg/min投与中は6.67±2.64(N=7)に、Y26763の5μg/kg/min投与中は7.33±1.14(N=7)にそれぞれ増加した。以上の結果はハロセン-エピネフリン不整脈に対してK^+チャネル開口薬は抑制的に作用することを示している。作用機序として、心筋細胞の過分極に伴う興奮性抑制、Ca^<++>流入の抑制、心筋細胞保護効果等が考えられる。、またハロセン心筋感作作用の機序としてK^+チャネルの開口は可能性が低いことが示唆される。
過活動膀胱における膀胱粘膜下微小循環の変化と KIT 陽性間質細胞の役割

消化管平滑筋においては、カハールの間質細胞(ICC)が自発興奮の発生伝達に重要な役割をしていることが明らかになっている。ICCの存在が膀胱で報告され、特に平滑筋の自動運動や粘膜下層におけるC線維を介したシグナル伝達に関与し、過活動膀胱(OAB)の発症に中心的役割を担っている可能性が示唆されている。ICCは、KITを発現しているが、最近の研究では、KITはICCのマーカーのみならず、KITそのものが膀胱機能の調節に重要な役割を担っていることが示唆されている。従ってICCおよびKITの機能を明らかにすることが、OABの病態を明らかにすることにつながる。本研究では、ICCおよびKITの膀胱における発現機能およびOABとの関係、さらに将来の治療ターゲットとしての可能性を検討した。さらに、KITのリガンドであるStem cell factorのOABの客観的診断治療マーカーとしての可能性について考察した。1.モルモット正常膀胱におけるKitおよびStem Cell Factor(SCF)の発現:モルモットの膀胱において、Kit陽性間質細胞は、膀胱粘膜下層を中心に膀胱全層に発現していた。またSCFは尿路上皮を中心に発現しており、下部尿路閉塞モデルモルモットの膀胱では発現が増加していた。2.膀胱間質細胞の超微細構造からみた過活動膀胱の発症機序の検討:正常膀胱には、紡錘形をした間質細胞の細胞質にはミトコンドリアや粗面小胞体が豊富に存在し、細胞同士が互いに連絡しあい、神経・平滑筋とも密接している像を観察した。過活動膀胱モデルの膀胱においては間質細胞が一部変形しており、これらの微細構造の変化が過活動膀胱の発症に関与すると推察された。3.c-kit遺伝子変異動物を用いた膀胱Kit陽性間質細胞の検討:形態学的には本変異ラット膀胱の間質細胞は異常を認めなかった。また膀胱内圧測定の結果も野生型と比べて優位な差は認めなかった。しかし本変異ラットにサイクロフォスファミドを投与したところ、野生型に比べて、排尿間間隔の減少やnon-voiding contractionの頻度増加の程度が軽微であった。以上からKITは病的状態下において膀胱機能特に膀胱知覚の役割を担い、蓄尿障害時にKITシグナル伝達系の異常が関与していることが示唆された。4.過活動膀胱モデル動物に対するKit抑制因子(グリベック)およびSCFの作用機序:グリベックは、Kitを抑制することにより、カハールの間質細胞由来の消化管間葉系腫瘍に対しても効果が確認されている。過活動膀胱モデル動物にグリベックを投与したところ、排尿圧を変化させることなく、non-voiding contractionを抑制し、排尿間隔を延長させることが判った。この結果からKitが間質細胞を介して過活動膀胱の発症機序に関与している可能性が示唆された。膀胱における自発活動に関与すると考えられている間質細胞は、c-kit遺伝子によりコードされるレセプター型チロシンキナーゼ活性をもつことから、その活性を抑制すれば自発収縮が亢進した過活動膀胱の治療につながると思われる。最近の研究から、膀胱の平滑筋層に存在する間質細胞は、消化管神経叢の間質細胞のようにペースメーカー細胞として働いている可能性は低く、むしろ細胞間情報伝達の経路としてか、神経筋伝達の介在細胞として働いている可能性が大きいと考えられる。また最近私たちは膀胱粘膜下層に存在する間質細胞は、粘膜上皮からの情報伝達物質からの情報を知覚神経へ伝達する可能性も示した。前立腺肥大症など下部尿路閉塞により膀胱の粘膜下微小循環の障害が起こり、尿意切迫感などの症状が生じる可能性もあり、間質細胞と虚血・過活動膀胱との関係は非常に意義深いものと考えられる。過活動膀胱では、膀胱平滑筋細胞間の電気的連絡の亢進により自発興奮が広範囲に伝播し、膀胱内圧上昇を引き起こして尿失禁につながると考えられている。私達は、過活動膀胱患者ではこの間質細胞の数が増加する傾向にあることを報告しており、その背景に細胞間情報伝達系としての間質細胞の機能異常が存在する可能性があると考えている。私たちはこれまでにモルモット尿流出路閉塞モデルの膀胱において、頻尿になるとともにKit陽性間質細胞が増加することも報告してきた。したがって膀胱における間質細胞の機能の解明は過活動膀胱の病理を解明する上で重要かつ不可欠な問題であると考える。下部尿路閉塞モデル動物では膀胱粘膜下微小循環の障害により、過活動膀胱が生じていることから、間質細胞との関係に着目し、さらに研究を継続している。臨床業務を行いながら研究を継続できる環境を作ってもらい、実験助手さんらに手伝ってもらいながら時間を有効利用できているため。効率的に研究を進めるために、研究方法毎に研究者を分担して効率的に進めることにした。

実際に患者の同意を得て行う検査に関しては、主に外来診察を担当する窪田・早瀬が担当する。動物を用いた実験に関しては、大学院生を中心に各種モデル動物の作成を行い、組織採取の際は必ず2人以上で手際よく行う。組織解剖学的微細構造の研究においては電子顕微鏡の知識・操作に卓越した当院共同研究室に在籍する研究者との共同研究として行うことにした。また、教授・講師の指導的立場の医師が研究をコントロールしつつ、助手、研究員、大学院生がそれぞれの研究を個別に行いつつ、月に1度の定期的な研究報告会を行うことにより、研究の共有化をはかることとする。ヒト正常および、過活動膀胱患者の膀胱における粘膜下微小循環と間質細胞被膜下前立腺摘除術の時に得られる膀胱組織および診断を兼ねた膀胱生検を行う際に得られた膀胱組織を用いて、患者にインフォームドコンセントを行い同意が得られたら、粘膜下層におけるKit陽性間質細胞、SCF陽性細胞の局在・染色性につき免疫抗体法により検討する。そして定量的RT-PCR、Western blotting法等により発現量を検討する。さらに、治療前の臨床所見とKitおよびSCFの発現量の関係につき検討する。また透過型電子顕微鏡を用いて、粘膜下に存在する間質細胞を超微細構造学的に検討する。上記研究を行うため、消耗品費(実験動物および試薬類)、国内旅費、外国旅費、研究助手への謝金等の他、実験動物の飼育費および論文発表のための英文校閲料、投稿料が必要である。
過渡的な生体分子構造の急速凍結とESR研究

生体分子の構造研究は、生物科学や物性科学など幅広い分野で欠かすことのできない研究課題となっており、特に生体機能を示す常温での構造とダイナミクスを明らかにすることは、特に重要となってきている。本研究の目的は、1)常温での生体分子の構造、および生体機能の発現過程で時々刻々と変化する中間構造を、その状態を保持したまま急速に凍結する手法を確立し、2)それによって捕捉・凍結された生体超分子の過渡的構造を電子スピン共鳴(ESR)法によって分子レベルで明らかにすることである。昨年度に引き続き、構造変化を示す生体膜イオンチャンネルを対象とした実験を継続した。急速凍結システムならびに凍結後サンプル処理方法の改良を行った結果、より精度の高い時間分解能を得ることが可能となり、リガンドとの反応に伴う構造変化の時定数を決定した。また、ESRによる構造変化観測のおいて不可欠な距離測定法の理論的改良も進めてきた。具体的には、生体系に広く含まれる高スピン鉄イオンを含む化合物を対象に、これまであまり考慮されてこなかった「高磁場近似の破綻」について、実験と理論の両面から考察し、新たな解析方法を確立した。一方で、生体系で構造ダイナミクスを示す典型例として、リボスイッチを対象とした実験も行ってきた。リボスイッチは、遺伝子発現において低分子化合物が特異的に結合することで構造変化を示し、影響を受けるメッセンジャーRNAである。ウェットプロセスで、かつ高効率に、電子スピンをRNA内の特異なサイトにラベル化する手法を確立し、構造変化前後の距離測定に成功した。ESR法によって、RNAの構造変化を観測した例は、これまでなかった。安定した急速凍結システムの改良が進んだ。また、構造変化の観測に不可欠なESRによる距離測定について、理論と実験の改良を行うことができ、様々な生体系に適用できた。今後も現在の研究を継続していく。一方で、得られた実験結果と、実際に生体内で起こっている構造ダイナミクスを伴う反応について、どのように統一的解釈を図っていくか、理論的考察も併せて行っていく。本研究では、噴霧ノズル直前で溶液を混合し、それを液体窒素で冷却した金属プレートに噴霧し、急速に凍結するシステムを構築した。噴霧速度やノズルと冷却済み金属プレートとの距離など噴霧条件をコントロールすることで、凍結時間の制御を行った。構築した急速凍結システムの凍結時間を校正するため、ミオグロビンへのアジド結合反応を用いた。この反応では、高スピン状態の鉄イオンが低スピンの鉄イオンへと変化し、そのスペクトルが非常に大きいため、容易に反応の追跡をすることが可能となった。また、数十マイクロ秒以下の速い速度定数を与えるため、幅広い凍結時間の校正を行った。凍結時間は噴霧溶液の温度にも依存するため、反応速度の温度依存性も詳細に調べた。構築した急速凍結システムのデモンストレーションを行うため、モデル系としてサブミリ秒の時間領域で構造変化を示す生体膜イオンチャンネルを対象として、リガンドとの反応に伴う構造変化をESR法によって追跡することに成功した。当初予定していた急速凍結システムを順調に構築でき、モデル化合物の測定にも成功した。

より精度の高い時間分解能を得るよう装置の改良を行うとともに、対象とする系を拡大する。今後も現在の研究を継続していく。一方で、得られた実験結果と、実際に生体内で起こっている構造ダイナミクスを伴う反応について、どのように統一的解釈を図っていくか、理論的考察も併せて行っていく。購入予定の試薬が受注生産のため納期が遅れ、執行を次年度に繰り越した。ESR装置の主要部であるマイクロ波ブリッジ、共振器、ならびに磁場用電源が故障し、購入予定部品の選定に変更が生じたため。
活性化されたシリルスタンナンと遷移金属錯体の反応

本研究を遂行するために、下記に示した2つのテーマについて検討を行った。(1)ヒドロシリルスタンナン(HR_2SiSnR_3)の構造と高い反応性の関連性の解明:結晶性のヒドロシリルスタンナン(1:HMe_2SiSnPh_3;収率:51%;mp90-91°C)及びシリルスタンナン(2:Me_3SiSnPh_3;収率:56%;mp130-131°C)の合成を行い、X線結晶構造解析を用いて、Si-Sn結合長の比較を試みた。いずれの化合物もX線を吸収して分解したので、目的とするデータを得ることはできなかった。他のシリルス夕ンナン類を合成したが、結晶性はなかった(HMes_2SiSnMe_3;収率:41%;bp60-90°C/1.0mmHg;MeMes_2SiSnMe_3;収率:50%;bp60-150°C/1.2mmHg;Mes=2,4,6-トリメチルフェニル基)。(2)有機ハロゲン化物や不飽和化合物との反応性の検討及び有機合成中間体としての応用性の探索(a)ハロゲン化物のシリル化反応及び還元反応:パラジウム触媒(PdCl_2(PPh_3)_2)存在下のヒドロシリルスタンナンと有機ハロゲン化物の反応ではベンゼン溶媒のときはシリル化反応が良好に進行し、一方、DMSO溶媒を用いたときは還元反応が優先的に進行した。シリル化反応の条件:ベンゼン溶媒中80°Cの条件下、2-6時間で反応が進行した。適用範囲:芳香族ヨウ化物(収率:5-100%)、ビニルヨウ化物(収率:30-60%)、ビニル臭化物(収率:30-40%)アセチレンヨウ化物(収率:30-40%)、環状ビニルヨウ化物(収率:22-63%)。還元反応の条件:DMSO溶媒中80°Cの条件下、2-6時間で反応が進行した。適用範囲:芳香族ヨウ化物(収率:40-100%)、ビニルヨウ化物(収率:90%)、環状ビニルヨウ化物(収率:40%)。(b)共役ジエン化合物のシリルスタンニル化反応:パラジウム触媒(PdCl_2(PPh_3)_2)存在下、室温で頭一頭2量化シリルスタンニル化反応が進行した。適用範囲:イソプレンとHMe_2SiSnBu_3の付加体(収率:35%)、イソプレンとHMePhSiSnMe_3の付加体(収率:47%)、ブタジエンとHMe_2SiSnBu_3の付加体(収率:36%)、ブタジエンとHPh_2SiSnMe_3の付加体(収率:40%)。(c)ハロゲン化物のスズ化反応:ヒドロシリルスタンナンはt-BuLiよって対応するスズリチウム化合物へ良好に変化し、種々の有機ハロゲン化物と反応した(有機スズ化合物の収率:40-90%)。(b)共役ジエン化合物のシリルスタンニル化

反応:パラジウム触媒(PdCl_2(PPh_3)_2)存在下、室温で頭一頭2量化シリルスタンニル化反応が進行した。適用範囲:イソプレンとHMe_2SiSnBu_3の付加体(収率:35%)、イソプレンとHMePhSiSnMe_3の付加体(収率:47%)、ブタジエンとHMe_2SiSnBu_3の付加体(収率:36%)、ブタジエンとHPh_2SiSnMe_3の付加体(収率:40%)。(c)ハロゲン化物のスズ化反応:ヒドロシリルスタンナンはt-BuLiよって対応するスズリチウム化合物へ良好に変化し、種々の有機ハロゲン化物と反応した(有機スズ化合物の収率:40-90%)。