hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
腸管局在性IL22産生細胞の誘導メカニズムの解明

本課題では腸内感染症に対する抵抗性を高めるはたらきを持つとされているIL22産生細胞に着目し、腸管におけるその誘導機構について研究を行った。まず、マウスの様々な臓器におけるIL22産生細胞数を測定した結果、腸管、特に小腸に豊富に集積していた。その誘導に腸内常在菌の関与が考えられたため、無菌マウスを解析したところ、IL22産生細胞が顕著に減少していたことから、腸内常在菌がその誘導に寄与していることが分かった。さらに、III型リンパ球がIL22のメインソースであること、またその誘導にはグラム陽性の腸内常在菌によるMyD依存的経路を介して刺激が必要であることが明らかとなった。平成26年度は下記の2項目について実験を実施した。[1] IL22産生細胞の誘導に対する腸内常在菌の必要性検証IL22産生細胞の誘導に及ぼす腸内常在菌の必要性を、無菌マウスの腸管IL22産生細胞を解析することで検証した。その結果、正常な腸内細菌が存在するSPFマウスにくらべ、無菌マウスではIL22産生細胞数が減少していた。この結果から、IL22産生細胞は腸内常在菌依存的に誘導されることが示唆された。また、誘導に特定の細菌分画が影響しているのかを異なるスペクトラムを持つ抗生剤を投与する事で検討した。具体的には、グラム陽性菌に対して抗菌作用を持つバンコマイシン、グラム陰性菌に対して抗菌作用を持つポリミキシンを投与した。その結果、バンコマイシン投与マウスではIL22産生細胞数の減少が見られたのに対し、ポリミキシン投与マウスでは変化が見られなかった。この結果から、腸内常在菌のうちグラム陽性細菌がIL22産生細胞の誘導に主たる役割を担っていることが示唆された。[2]細菌由来の誘導責任成分の探索細菌の構成成分または代謝産物の認識レセプターを欠損したマウスにおけるIL22産生細胞数を調べた。Toll-like、NOD-like、Dectin1レセプターシグナル(MyD88, RIP2、CARD9)、短鎖脂肪酸を認識するGPCR(Gタンパク質共役受容体)、AhR(芳香族炭化水素受容体)などの欠損マウスを解析した。その結果、MyD88欠損マウスでIL22産生細胞の減少が認められた。一方、RIP2、CARD9、GPR84欠損マウスで細胞数に変化が見られたなかった。AhR欠損マウスでは、IL22産生細胞の前駆細胞そのものが減少していた。この結果は既報論文とconsistentである。以上から、IL22産生細胞はMyd88シグナル依存的な経路を介して誘導されることが示唆された。インターロイキン(Interleukin; IL)22産生細胞の誘導する腸内細菌の同定: IL22産生細胞を誘導する腸内細菌を同定する。具体的には、様々な種類の細菌を別々の無菌マウスに投与し、IL22産生細胞数を解析した。マウス由来Th17誘導セグメント細菌およびそれが欠如したジャクソンラボラトリー社SPFマウス便、さらにヒト由来菌として、Treg誘導17菌株、Th17誘導20菌株などの効果を検証した。また、マウス腸管病原性大腸菌であるCitrobacter rodentiumの投与による影響も調べた。その結果、無菌マウスと比べてどの細菌の投与においてもIL22産生細胞数が増加した。これらの結果から、IL22産生細胞はあらゆる腸内細菌の刺激により誘導されることが明らかとなった。IL22産生細胞のキャラクタライズ: IL22産生細胞の特徴を検討した。具体的には表面マーカーや転写因子などをフローサイトメトリーにて調べた。その結果、IL22産生細胞はThy1陽性でCD3陰性かつ転写因子RorγtおよびT-bet両陽性であった。このことから、IL22産生細胞はいわゆるIII型自然免疫リンパ球(ILC3)であることが分かった。またその一部はNKp46を発現していたことから、ILC3のうち少なくとも2種類以上の亜集団がIL22産生を担っていることが分かった。IL22産生細胞の誘導メカニズムの探索: IL22産生の集積を誘導するシグナル伝達を検証した。先行論文ではIL22の産生にはIL23の重要性が示唆されている。そこで、IL22-Venusレポーターマウスを新規に作製し、IL23欠損マウスとのダブルミュータントマウスを作製・解析した。その結果、in vivoでの発現細胞はIL23欠損で減少していたが、in vitroでリコンビナントIL-23を補充・刺激すると正常なIL22産生が観察できた。このことから、IL23はIL22産生のトリガーとなるが、その産生能力を持つ細胞の集積には関与しないことが分かった。

さらに、III型リンパ球がIL22のメインソースであること、またその誘導にはグラム陽性の腸内常在菌によるMyD依存的経路を介して刺激が必要であることが明らかとなった。平成26年度の交付申請書に記載した研究実施計画のうち、おおむねの実験が遂行できた。また、当初解析を予定していた以外の遺伝子欠損マウスについても解析を行うことが出来た。また、平成27年度に実施予定の実験内容についても予備実験を行うことが出来た。一方、研究方策を部分的に変更したため、実施計画に記載した項目の中で未達成の内容があった。しかしながら、平成26年度に実施した研究内容で論文にまとめ、既にsubmitを完了しており(現在リバイス実験中)、平成27年度中にはacceptを目指す。以上をふまえ総合的におおむね順調に進展していると評価した。27年度が最終年度であるため、記入しない。免疫学、微生物学平成27年度ではIL22産生細胞を誘導する腸内常在細菌の同定し、その誘導メカニズムの解明を試みる。1.IL22産生細胞の誘導する腸内細菌の同定: IL22産生細胞を誘導する腸内細菌を同定する。具体的には、様々な種類の細菌を別々の無菌マウスに投与し(ノトバイオートマウスを作製)、IL22産生細胞数をフローサイトメトリーにて解析する。投与する細菌として、マウスおよびヒト由来の腸内常在菌(Clostridia、セグメント細菌など)を予定している。無菌マウスと比べてIL22産生細胞数が増加した細菌を誘導細菌とする。2.IL22産生細胞のキャラクタライズ(表面マーカー・他のサイトカイン) :同定細菌によって誘導されるIL22産生細胞の特徴を検討する。具体的には細胞が発現している表面マーカーや転写因子などをフローサイトメトリーにて調べる(NKp46, CCR6, Tbet, Gata3)。その発現パターンから、既存に報告されている細胞サブセットと比較し、細胞機能を予測する。また、細胞のRNAシーケンスを行い、転写因子の網羅的解析も行う予定である。3.IL22産生細胞の誘導メカニズムの探索:IL22産生細胞の誘導機構を検討する。一つは関連するシグナル伝達を検証する。これまでにIL1およびIL23レセプターシグナルの重要性を示唆する論文が報告されている事から、IL1RおよびIL23ノックアウトマウスにおけるIL22産生細胞数を検討する。さらには、食餌成分の影響を調べる予定である。マウスに成分含量が異なる様々な種類の餌を投与し、そのIL22産生細胞を解析する事で、誘導に必要な食餌成分についても考察を行う。
食品成分による糖尿病合併症の制御

糖尿病合併症の発症におけるフリーラジカルの関与について分子レベルでの解明と防御を目的として研究を進め、次のような研究実績を得ることができた。(1)生体内メーラード反応最終生成物、Advanced Gly-cation EndProducts(AGE)と呼ばれる糖化タンパク質のバイオマーカーについても構造未知の物質が多く存在している。特に、申請者らは、アルギニンとシステイン、グリコースとの反応の結果生じる新しい糖尿病合併症のバイオマーカー、MRXの存在を見出すことができた。このMRXは、ヒトのみならずウサギや羊の赤血球とグリコースとの反応でも生成する全く新しいAGEと推定されたので、モデル反応で大量に調製し、各種クロマトグラフィーにより分離・精製を行い、純品でえることができた。そこで、二次元NMRをはじめ機器分析を行い、構造を明らかにすることができた。また、新しい生体内メーラード反応生成物の検索を行い、メチルグリオキザ-ルとタンパク質の縮合物をエピトープとする新しいポリクローナル抗体の作成にも成功することができた。(2)個体レベルとして、糖尿病誘導剤のストレプトゾトシン(STZ)投与のラットを用いてフリーラジカル傷害の解析を行うと共に、遺伝症糖尿病ラットのモデルとして注目を集めているOLET-Fを最近導入することができたので、この系を用いて腎不全の原因としての腎細胞のフリーラジカル傷害が推定され、糖尿病発症の際に血液中や尿中に排出されるフリーラジカル傷害バイオマーカーの8-ヒドロキシデオキシグアノシン(8-OH-dG)のモノノクローナル抗体利用のELISA法での定量・評価を行った結果、OLET-Fの尿中に大量の8-OH-dGと共にMRXが排泄されることを明らかにすることができた。(3)これらの糖尿病合併症の発症の過程で起こるフリーラジカル傷害に対する防御メカニズムの解明を目的に、ゴマ種子や米、豆種子をはじめ各種香辛料中の新規なフリーラジカル捕捉因子、特に最近研究を進めつつあるレモンの抗酸化成分を対象に、糖尿病発症で最も問題とされる合併症予防の可能性についてSTZ投与の糖尿病モデルラットに対する予防効果の検討を行った。その結果、レモンの抗酸化成分、エリオシトリンに強い抗酸化的な防御効果を明らかにすることができた。本年度は、糖尿病合併症の食品成分による制御の研究を目的に、まず、個体レベルの実験系として、糖尿病誘導剤のSTZ投与のラットを用いてフリーラジカル傷害の解析を行うと共に、遺伝症糖尿病ラットのモデルとして注目を集めているOLET-Fを最近導入することができたので、この系を用いて腎不全の原因としての腎細胞のフリーラジカル傷害、また、糖尿病発症の際に血液中や尿中に排出されるフリーラジカル傷害バイオマーカーの8-ヒドロキシデオキシグアノシン(8-OHdG)のモノクローナル抗体利用のELISA法での定量・評価をおこなった。その結果、STZ投与の系では、糖尿病の進行と共に酸化ストレスが昂進し、血液や尿中で脂質過酸化反応が促進され、8-OHdGが排出されると共に腎臓ではグルタチオンが減少し、グルタチオンペルオキシダーゼやグルタチオン-S-トランスフェラーゼが誘導された。これらの結果は、糖尿病の合併症の発現には酸化ストレスが誘導されたことを強く示唆する結果であり、現在、自然発症糖尿病のモデルであるOLET-Fを用いた解析が進行中であるので、詳細は次年度に報告する。

一方、糖尿病の発症と共に尿中に同様に排出されると推定されている酸化傷害マーカーのカルボキシメチルリジン(CML)についてもポリクローナル抗体の作成に成功し、糖尿病の際に尿中に排出されることを明らかにすると共に、悪玉コレステロールと言われている低密度リポタンパク質(LDL)の過酸化反応でも生成するという新しい知見を得ることができた。糖尿病の合併症としての動脈硬化症も最近注目されてきており、今後、さらに検討を進めて行きたい。さらに、ペントシジンやクロスリンと呼ばれる生体内メーラード反応最終生成物:Advanced Glycation End Products (AGE)と呼ばれる糖化タンパク質のバイオマーカーについても構造未知の物質が多く存在している。特に、申請者らは、MRXと命名した新しい糖尿病バイオマーカーの構造を明らかにすることができたので、まず、各種食品中の抗酸化ポリフェノールを用いた抑制実験の検討をすすめて行きたい。糖尿病合併症の発症におけるフリーラジカルの関与について分子レベルでの解明と防御を目的として研究を進め、次のような研究実績を得ることができた。(1)生体内メーラード反応最終生成物、Advanced Gly-cation EndProducts (AGE)と呼ばれる糖化タンパク質のバイオマーカーについても構造未知の物質が多く存在している。特に、申請者らは、アルギニンとシステイン、グルコースとの反応の結果生じる新しい糖尿病合併症のバイオマーカー、MRXの存在を見出すことができた。このMRXは、ヒトのみならずウサギや羊の赤血球とグルコースとの反応でも生成する全く新しいAGEと推定されたので、モデル反応で大量に調製し、各種クロマトグラフィーにより分離・精製を行い、純品でえることができた。そこで、二次元NMRをはじめ機器分析を行い、構造を明らかにすることができた。また、新しい生体内メーラード反応生成物の検索を行い、メチルグリオキザ-ルとタンパク質の縮合物をエピトープとする新しいポリクローナル抗体の作製にも成功することができた(2)個体レベルとして、糖尿病誘導剤ののストレプトゾトシン(STZ)投与のラットを用いてフリーラジカル侵害の解析を行うと共に、遺伝症糖尿病ラットのモデルとして注目を集めている。OLET-Fを最近導入することができたので、この系を用いて腎不全の原因としての腎細胞のフリーラジカル傷害が推定され、糖尿病発症の際に血液中や尿中に排出されるフリーラジカル傷害マイオマーカーの8-ヒドロキシデオキシグアノシン(8-OH-dG)のモノクローナル抗体利用のELISA法での定量・評価を行った結果、OLET-Fの尿中に大量の8-OH-dGとともにMRXが排泄されることを明らかにすることができた。(3)これらの糖尿病合併症の発症の過程で起こるフリーラジカル傷害に対する防御メカニズムの解明を目的に、ゴマ種子や米、豆種子をはじめ各種香辛料中の新規なフリーラジカル促進捕捉因子、特に最近研究を進めつつあるレモンの抗酸化成分を対象に、糖尿病発症で問題とされる合併症予防の可能性についてSTZ投与の糖尿病モデルラットに対する予防効果の検討を行った。
ヒトMHC領域と相同性をしめす第9染色体領域のゲノム解析によるMHC進化の解明

ヒトの第6染色体6p21.3領域に位置するHLA領域と相同性を有する遺伝子が多数みいだされるヒト第9染色体9q33-34領域、第1染色体1q21-25領域のゲノム構造をHLA領域と比較、解析することにより、MHCの進化の起源と進化の過程を解明することを目的として、まずHLA領域のなかで塩基配列が未決定のクラスI全領域(1.8Mb)の塩基配列を決定し、新遺伝子の同定を試みた。その結果、この領域に16個の発現新規遺伝子、22個のESTと一致する領域、3個の発現可能な塩基配列などの計124個の遺伝子あるいは遺伝子候補領域を見い出した。さらに5対の領域について倍化によると考えられる遺伝子重複が見られた。第9染色体9q33-34領域と第1染色体1q22-23については、相同遺伝子の配列順序を明らかにするためにこれらの領域を含むと考えられるYACクローンを用いて、この領域に座位する遺伝子とSTSマーカーのPCR解析を行った。その結果、9q33-34領域については、セントロメア側からHXB-C5-GRP78の順序にHLA領域と相同性を有する遺伝子が位置することが明らかになった。1q22-23領域については、CDl遺伝子を含む1.8Mbの領域のYACとPAC,BACコンティグを作成した。このコンティグには、セントロメア側からCD1D-CD1A-CDIC-CD1B-CD1E-SPTA1-MNDA-IFI-16-FY1-FCERIA-KRTC7-CRP-CRPP1-APCS-KIAAO120の順序に15遺伝子が位置することが明らかになった。さらにYACクロ-ンを用いたPCR解析から、KIAA0120遺伝子のテロメア側には、PBXl,RXRG,POU2F1などのHLA領域に相同性遺伝子の存在が認められる遺伝子が座位していること、並びにこの領域にはSPTA1,FY1,IFI-16,FCERIA,APCS,LYAM,CD48,LY9,SCM,CD3Z,ATAC,ELAM1,LNHR,FASLのような免疫反応に重要な遺伝子が数多く位置することが明らかになった。ヒトの第6染色体6p21.3領域に位置するHLA領域と相同性を有する遺伝子が多数みいだされるヒト第9染色体9q33-34領域、第1染色体1q21-25領域のゲノム構造をHLA領域と比較、解析することにより、MHCの進化の起源と進化の過程を解明することを目的として、まずHLA領域のなかで塩基配列が未決定のHLAクラスI領域の1.3Mbについて、ショットガン法により大量シークエンシングを行い、新遺伝子の同定を試みた。その結果、この領域に16個の既知遺伝子、23個の新発現遺伝子、6個の新偽遺伝子の合計45個の遺伝子が同定され、現在これら新遺伝子の機能を解析している。代9染色体9q33-34領域と第1染色体1q22-23については、相同遺伝子の配列順序を明らかにするためにこれらの領域を含むと考えられるYACクローンを用いて、この領域に座位する遺伝子とSTSマーカーのPCR解析を行った。

その結果、9q33-34領域については、セントロメア側からHXB-C5-GRP78の順序に各遺伝子が位置することが明らかになった。1q22-23領域については、非古典的MHC遺伝子として知られているCD1遺伝子を含む1.4Mbの領域のYACとPACコンティグを作成した。PACクローンの末端シークエンスとPCR解析からこのコンティグには、セントロメア側からCD1D-CD1A-CD1C-CD1B-CD1E-SPTA1-FY-IFI-16-FCERIAの順序に9遺伝子が位置することが明らかになった。さらにこのコンティグは、PACクローンを用いたFiber-FISH法によっても確認された。また、FCERIA遺伝子のテロメア側の領域を含むと考えられるYACクローンを用いたPCR解析から、セントロメア側からFCERIA-PBX1-ALDH9-RXRG-POU2F1-CD3Z-ATAC-FV-FMO1-FASLの順序で遺伝子が位置していた。以上の解析から、1q22-23領域にはSPTA1,FY,IFI-16,FCERIA,CD3Zのような免疫反応に重要な遺伝子が数多く位置することが明らかになった。ヒトの第6染色体6p21.3領域に位置するHLA領域と相同性を有する遺伝子が多数みいだされるヒト第9染色体9q33-34領域、第1染色体1q21-25領域のゲノム構造をHLA領域と比較、解析することにより、MHCの進化の起源と進化の過程を解明することを目的として、前年度に引き続き、HLAクラス1領域の塩基配列が未決定部分の塩基配列決定を試み、クラスl全領域(合計1.8Mb)の塩基配列を決定した。さらにこの領域の新遺伝子の同定を試みたところ、16個の発現新規遺伝子、22個のESTと一致する領域、3個の発現可能な塩基配列などの計124個の遺伝子あるいは遺伝子候補領域を見い出した。さらに5対の領域について倍化によると考えられる遺伝子重複が見られた。第1染色体1q22-23については、相同遺伝子の配列順序を明らかにするためにこの領域を含むと考えられるYACクローンを用いて、この領域に座位する遺伝子とSTSマーカーのPCR解析を行った。その結果、1q22-23gi域について、5個のCDl遺伝子を含む1.8Mbの領域のYACとPAC,BACコンティグを作成した。CD1E遺伝子のテロメア側には、SPTAl-MNDA-IFl-16-FY1-FCERIA-KRTC7-CRP-CRPPl-APCS-KIAA0120の順序に10遺伝子が位置することが明らかになった。またKIAA0120遺伝子のテロメア側の領域を含むと考えられる
近代大学における社会科学の制度化に関する実証的研究ー日欧の比較ー

19世紀後半から20世紀初頭にかけて西欧の諸大学に社会・人文諸科学が制度化されたことは、「近代大学」成立の重要な一契機である。英・独・仏三カ国の社会学の制度化を例にとると、制度的正統性と学問的正統性の二要件を備えることがその制度化にとって必須であった。前者は国家的要請によって、後者は哲学を筆頭とする古典学中心の学問的承認によって保障される点で各国は共通していたが、二つの正統性は歴史的に必ずしも相即しなかったこと、各国での制度化はそれぞれの国の市民社会の成熟度によって異なる特徴を示し、それがそれぞれの国の代表的社会学者の理論に特徴的に表われることが確認できる。しかし、各国とも社会学が双方の正統性を一般的に獲得するのは、実に第二次大戦後のことになる。(1)19世紀に大学のもっとも充実していたドイツでは哲学部の解体、法学部の拡張、分化という形で、国家的要請の強い社会科学(例えば経済学、社会政策学など)の制度化を中心に進むが、学問の自律性と国家要請との関係が新たな緊張関係をもたらし、社会学の制度化はむしろマイナ-な地位におかれる。(2)フランスでは第三共和制の名の下に強い国家主導の形で大学改革が行われ、社会学はその一翼を担う形で制度化されるが、逆に学問的正統性を獲得するのに長い時間を要する。(3)イギリスでは大学改革が遅々として進まなかったが、諸科学の制度化にはやはり新大学の創設(ロンドン大学ほか)と国家の介入を必要とした。ここでも、社会学の制度化はとくに学問的正統性の承認で遅れた。三カ国とも社会諸科学の導入は高等教育改革を必然のものとしたが、その成果を輸入した日本では、社会学はむしろ当初から制度的正統性によって学問的正統性が保障される形をとり、同じく西欧諸大学の影響を受けたアメリカの場合とも異なった特徴を示す。主として近代大学における社会学講座の制度化に焦点をおいて研究を進めてきたので、その点を中心に概括しておきたい。(1)1983年にフランスでR.ウォルムスが国際社会学会を、1903年にJ.ブライスがイギリス社会学会を、1909年にテンニエス、M.ウェ-バ-、ゾンバルト、ジンメルがドイツ社会学会を興す。各国とも社会学は講座として大学にはまだ定着しておらず、社会学は学際的な学問としてマ-ジナルな地位にあり、上記の各国社会学の設立の動き、その主要な担い手、研究活動の内容などには非常に大きな差異がある。(2)イギリスではL.T.ホブハウスが1907年にロンドン大学のマ-チン・ホワイト講座で社会学を講義するが、当初は社会哲学の講義であった。彼自身によって社会学の輪郭が明確化されるのはもっと後であり、彼を取り巻く諸学者、たとえばウェッブ夫妻、G.ウォラスらとの交流が社会学の制度化に大きな影響を与えた。(3)スランスでは、ウォルムスらの国際社会学派が社会哲学的傾向を強めたのに対して、デュルケムはボルド-大学の「社会科学」講座と『社会学年報』を拠りどころに、社会学の大学知識としての制度化を志す。そのため文学部と法学部、文学部内部の諸学問との交流・論争ーとりわけ哲学・心理学とのーが社会学を練り上げていく主要な要因となる。また、雑誌の定期刊行と学派の形成という点でも、フランス的な特徴を示す。(4)ドイツでは、社会学の制度化は1910年代に入っても十分に進まず、テンニエスがキ-ル大学で社会学の講座で講義をするのは1921年(名誉教授として)からである。ハイデルベルクのウェ-バ-、シュトラスブルクでのジンメルは、いずれも大学での制度化に問題を投げかけている。以上のように、社会学の制度化は各国によって多様な形態と実質を持つことの一端が明らかになった。

三カ国とも社会諸科学の導入は高等教育改革を必然のものとしたが、その成果を輸入した日本では、社会学はむしろ当初から制度的正統性によって学問的正統性が保障される形をとり、同じく西欧諸大学の影響を受けたアメリカの場合とも異なった特徴を示す。
紫外線発光ダイオードを用いた多機能光センシングシステムに関する研究

本年度では、下記に示した内容について実施を行った。・真空蒸着法により蛍光色素膜をコーナーキューブプリズム表面に成膜し,これをセンサヘッドとし,蛍光色素膜の励起光源としてUV-LEDを用いて蛍光強度変化の違いから有機ガス及び酸塩基性ガスの検出を行った。`・アクリジンオレンジ蛍光色素膜付きコーナーキューブプリズムをセンサヘッドとして用いて種々の有機ガスの検出を行った結果,メタノールに対して応答速度が速く,アセトンに対して遅い傾向が見られた。また,メタノールとエタノールの場合についてのみ蛍光強度が減少するという傾向が見られた。・ローダミンBを用いて種々の有機ガスの検出を行った結果,トルエンよりもクロロホルムに対する応答速度が最も早いということが見られたが,ベンゼンにおいて蛍光強度の変化はほとんど見られなかった。また,膜厚依存性については,膜厚が60nm前後において蛍光強度の変化量;が最も大きいことが得られた。・クマリン6蛍光色素膜付きコーナーキューブプリズムのセンサヘッドを用いたときのベンゼンの検出を行った結果,波長570770nm付近で,ベンゼンによりクマリン6色素膜の蛍光強度の減少が見られた。トルエンでは,波長580680nmにおいて蛍光強度の減少,また,クロロホルムでは波長570700nmにおいて蛍光強度の減少が見られた。・本実験での測定システムにより各種蛍光色素膜に対して蛍光スペクトル強度の変化を光学的にリアルタイムで検出することができ,検出ガスの種類により蛍光スペクトル強度の変化量の違いがあるのが見られた。そのため,それぞれの検出ガスの選別が可能であるであることが見出された。特にクマリン6蛍光色素膜が有用であることが確認された。本研究を総括し,研究成果の取りまとめを行った。1、種々の蛍光色素を真空蒸着法によりガラス基板に成膜し、蛍光色素膜の吸収スペクトル及び励起光源に紫外線発光ダイオード(UV-LED)を用いたときの蛍光スペクトルについて測定を行った。2、種々の微量有機ガスに対する蛍光色素膜の基礎光学特性について測定を行った結果、有機ガスの種類によって蛍光強度変化が異なることが見られた。3、光源とするUV-LED、伝送路とする光ファイバ、センサヘッド部とする全反射面を3面もつコーナーキューブプリズム、光検出器とするアバランシェフォトダイオードを用いて、微量有機ガス検出の光センシングシステムの構成を行った。また、本システムにおける光利用率や光損失の測定を行った。4、本研究で提案した光センシングシステムを用いて、実時間上での微量有機ガスの検出を行うことが可能となり、種々の有機ガスによる応答特性の解析結果から種類の特定の可能性を見出した。5、以上の研究結果を取りまとめ、問題点や改善すべき点の検討を行い、光センシングシステムの一時評価を行った。
ショウジョウバエゲノムの遺伝子機能の体系的解明

ゲノム配列が決定されたことにより、表現型から原因遺伝子にたどり着くまでの道のりは、以前に比べると容易なものになったが、機能破壊によって明らかな表現型を示すものは約3分の1に過ぎないと推定されている。これらは、機能的に重複する遺伝子や表現型の異常が軽微で検出できないと考えられている。組織特異的な強制発現法は、ゲノムの遺伝子の機能を効率的にアノテートするのに適した方法である。本研究では、P-エレメントの内部にUASとhsp70由来のコアプロモーターを外向きに配置したGene Search(GS)ベクターをゲノムに挿入して強制発現変異体を作製できるGene Searchシステムを用いて、遺伝子機能情報を体系的に取得することを目的とした。具体的には,1)多機能をもつGene Search(GS)ベクターの開発とベクター挿入系統の大規模作製、2)GSベクター挿入サイトのマッピングと挿入特性の解析、3)GSベクター挿入系統の情報データベースの構築、4)GS系統を用いた網羅的な表現型情報の収集と分類、および5)表現型スクリーニングによって同定した新規遺伝子の機能解析、の5項目について研究を行なった。5種類の異なるGSベクターを用いて、合計1万6千系統を作製し、挿入サイトに隣接するゲノム配列を決定した。マッピング情報をはじめとして、個々のGSベクター挿入系統に関する大規模なデータを効率的に抽出、表示、利用するためのデータベースGSDBを構築した(http://gsdb.biol.metro-u.ac.jp/%7Edclust/)。GS系統を利用した表現型スクリーニングによって、発生、細胞死、自然免疫、行動、ストレス感受性、寿命など、様々な機能に関する新規遺伝子を多数見出し、その性状を明らかにした。ショウジョウバエは真核多細胞生物における遺伝子機能解析系として重要なモデル生物である.全ゲノムの配列が決定された現在,ゲノム規模での遺伝子機能の解明にむけたアプローチが必要である.本研究では,ショウジョウバエゲノムの遺伝子機能を体系的に解明することを目的として,Gene Search(GS)強制発現ベクター挿入系統(計画代表・相垣),およびGAL4エンハンサートラップ系統(計画分担・林)の大規模解析を開始した.ゲノムの機能情報を取得するには,突然変異体の作製が不可欠である.トランスポゾン挿入変異体では原因遺伝子を特定するには有利であるが,従来の機能喪失変異体の探索を目的にしたベクターでは検出できる表現型に限界がある.また,Pエレメントによるバックグラウンド突然変異があるため,ホモ接合体の表現型は必ずしもベクター挿入の結果ではないこともある.これらの欠点を克服するものとして,本研究では酵母由来GAL4転写活性化因子の標的配列であるUASエンハンサーをPエレメントに組み込んだGene Searchベクターを用いて,大規模な挿入系統の作製を進めた.具体的には,UASエンハンサーをP末端両側に組み込んだもの(GSv1),片側のみに組み込んだものを(GSv2,GSv3),およびGSv1の片側UASの下流にGFPを導入して発現レポーターとしたもの(GSv6)の4種類を用いて,合計5,000のGSベクター挿入系統を樹立した.また,ゲノム上の挿入サイトをマップするために,各ベクターごとにInverse-PCRの最適化を行った.GSv6ベクターは表現型の誘発頻度はGSv1の1/2であるが,エンハンサートラップの機能があるため,最も効率的にゲノムの情報を取得できる.ゲノム配列が決定されたことにより、表現型から原因遺伝子にたどり着くまでの道のりは、以前に比べると容易なものになったが、機能破壊によって明らかな表現型を示すものは約3分の1に過ぎないと推定されている。1.研究の目的と進め方ショウジョウバエゲノムの遺伝子機能を体系的に解明することを目的として、強制発現を誘導できるGene Search(GS)ベクター挿入系統を大規模に作製し、ゲノム地図上での挿入位置情報、及び表現型情報を統合するデータベースを構築する。2. 2001年度の研究の当初計画新たに2,000系統のGSベクター挿入系統を作成し、各系統からゲノムDNAを抽出して、inverse-PCRによりベクター挿入部位のゲノム配列を決定する。GS系統にGAL4系統を交配して、F1個体における表現型の解析を行う。個体寿命測定の自動化条件の設定を行う。3. 2001年度の成果

GS6ベクターをショウジョウバエのゲノムにランダムに挿入した系統を新規に6,000系統作成した。GAL4依存的に強制発現を誘導し、酸化ストレス条件下での個体寿命を自動的に測定する方法を確立した。挿入サイトをマッピングするために、Inverse-PCRの条件を最適化し、挿入サイトの情報を取得した(分担者、林との共同作業)。マップ情報を表現型情報と統合するデータベース(GSDB)を構築した。4.国内外での成果の位置づけ年度当初に予定した2,000系統/年をはるかに上回る速度で系統を作成することができた。現在保有するGS系統は合計約10,000系統に達し、マッピング情報が付加されたコレクションとしては世界的に類をみない大規模なものである。5.達成できなかったこと、予想外の困難、その理由表現型情報の網羅的取得に時間を要している。その理由としては、今年度は新規の表現型として個体寿命の自動測定法を確立することを優先したためである。GSベクターのPエレメント内側にloxPサイトを導入した新規ベクター(GS7)を構築し、Cre導入遺伝子との組み合わせにより、内部構造を反転できることを確認した。この新規ベクターを挿入した系統を約1000株作成した。ベクター挿入サイトのマッピングの精度をあげるために、LM-PCR法を適用することにした。現在保有するGS系統は合計約17,000系統に達し、マッピング情報が付加されたコレクションとしては世界的に類をみない大規模なものである。新規ベクターは同一座位でベクター内部構造を反転することができるため、1ヶ所にしか挿入されていないベクターを利用して、より広くゲノムをカバーすることが可能になった。このようなベクターはこれまでに開発されておらず、今後の研究を大きく発展させるものと期待される。酸化ストレス条件下の寿命の表現型、神経特異的強制発現による表現型の記述も予定どおり進行している。表現型情報の網羅的取得に時間を要しているが、GS系統を利用している共同研究者からのデータを一括してアップロードする方法を確立した。これにより、データベースが充実する。樹立した多数の系統をどのように維持し、取捨選択していくかかが重要になってきた。作成したGS系統の見直しを行い、ミニマムキット作成にむけて検討を開始する。今年度から用いる新規ベクター挿入系統は、挿入位置において内部配列を反転させることができるため、実質的に2倍の系統数に匹敵する。最も有用性の高い新規系統の大規模作成とマッピングに力を入れる。ショウジョウバエゲノムの遺伝子機能を体系的に解明することを目的として、強制発現を誘導できるGene Search (GS)ベクター挿入系統を大規模に作製し、ゲノム地図上での挿入位置情報、及び表現型情報を統合するデータベースを構築した。より、具体的には以下の通りである。
摂食障害のスクリーニング機能ならびに発病予測機能を兼備した心理テストの開発

1.既存スクリーニング・テストの妥当性(1)EAT-26:新入生を対象としてEAT-26で15点以上、あるいは月経異常(無月経・三ヶ月以上の無月経既往・未潮)に該当するものを呼出した。女子障害学生(ED)はAN群29人(AN:n=23、AN既往:n=2、EDNOS-1:n=4)、BN群8人(BN:n=7、EDNOS-3:n=1)、BE 9人であり、EAT-26よりは月経異常での抽出率が高かった。病型別EAT-26得点はAN群・BN群・BEの順にそれぞれ10.7、24.1、15.9あった。(2)SCOFF(BMJ 319:1467-1468,1999):女子在学生を対象として質問紙形式でSCOFFを実施し、2問以上に「ハイ」と回答した学生を呼出した。EDは26人でAN群7人(全例EDNOS-1)、BN群9人、BE群10人であった。これらED中に季節性感情障害(SAD)とSAD疑い例がそれぞれ7人ずついた。SCOFFの抽出率はEAT-26と比較して高かったが、AN抽出には月経異常の設問が有用なこと、過食症状を伴うEDにはSAD合併例が多いことが示唆された。2.発病予測テストとしてのUPIとSDSの妥当性在学中にEDを発病した学生を対象として、入学時と発病後のUPIとSDSの得点、および各因子得点とを比較した。入学後にAN(n=20)、BN(n=17)、BE(n=4)を発病した学生の入学時得点は、対照群と比較して有意差は認められなかった。しかし、発病後には得点が増加して、有意差が認められた。以上から、両テストでは摂食障害の発病予測は困難であること、EDで認められる内気・強迫・依存・衝動といわれる性格傾向や低い自己評価はstate dependentであることが示唆された。今後は蓄積中の他検査データも含めて解析し、発病に及ぼす要因を明らかにしていく予定である。【目的・方法】摂食障害発病予測テストとしてのUPIとSDSの信頼性と妥当性を検討する目的で、(1)探索的因子分析によりUPIとSDSの因子構造を解明し、(2)構成尺度の診断に対する有用性を検証する目的で、在学中に発病した学生(男子が少数であるため女子のみ対象とした:障害群)の入学時におけるUPIとSDSの各尺度得点を対照群と比較した。さらに、障害群のstateあるいはtrait dependentな性格特性を解明する目的で、(3)障害群の発病後のUPI・SDS得点を対照群と比較し、また障害群の入学時得点とも比較した。【結果】(1)UPIおよびSDSの探索的因子分析により、それぞれ7個(回避・強迫、依存、自己愛、易刺激、抑うつ、心気、対人緊張)と3個(感情、認知、身体)の因子を抽出した。(2)入学後に神経性無食欲症(AN;n=20)、神経性大食症(BN;n=17)、無茶喰い障害(BE;n=4)を発症した学生、および対照群の入学時UPI総得点、UPI各因子得点、SDS総得点、SDS各因子得点には有意差は認められなかった。

しかし、(3)発病後には4群間のUPI抑うつ因子得点、SDS総得点、SDSの感情および身体因子得点に有意差が認められ、対照群と比較してそれぞれBN、ANとBN、BN、BEが有意に高値であった。また発病によってANではUPI総得点と易刺激、抑うつ、心気の因子得点、SDS総得点が有意に増加した。BNではUPIの依存、抑うつの因子得点、SDS総得点と総ての因子得点が有意に増加し、UPIの自己愛因子得点が低下した。BEではUPI総得点と回避・強迫因子得点、SDS総得点が有意に低下した。【考察】以上から、(1)UPIおよびSDSによっては、摂食障害の発病予測は困難であることが示唆された。(2)一般にANやBNで認められる内気、強迫的、依存的、衝動的といわれる性格傾向や低い自己評価は、state dependentな性格特性であることが示唆された。【目的・方法】スクリーニング・テストとしてのEAT-26の妥当性を検討した。対象は平成8年13年度大学新入生で、ID・EAT-26・月経異常調査の3項目からなる調査書に記入を求めた。現在無月経・三ヶ月以上に渡る無月経の既往・未潮の何れかに該当するものを「月経異常」とした。EAT-26で15点以上、あるいは月経異常に該当するものを要精査学生として呼出し、DSM-IVの基準に従って診断面接を行った。【結果】調査書提出学生(対照群)は11,659人で、要精査430人、要精査呼応358人(女266人、男92人)であった。女子障害学生は計46人で、神経性無食欲症(AN)群29人(AN23人、AN既往2人、月経があることを除きAN診断基準を満たす者4人)、神経性大食症(BN)群8人(BN7人、症状持続期間を除きBN診断基準を満たす者1人)、無茶喰い障害(BE)9人。その内EAT-26と月経異常で抽出されたAN群・BN群・BEは、それぞれ順に10・7・6人と、25・6・5人であった。男子障害学生は計7人で、順に3・1・3人。女子と男子の病型別EAT-26得点は、AN群・BN群・BE・要精査正常群・対照群の順にそれぞれ10.7・24.1・15.9・12.7・4点と16.7・15・21.7・3.2点であった。男女共に何れの病型得点も、対照群と比較し有意に高値であった。さらに、女子BN群得点はAN群・要精査正常群と比較して有意に高値であったが、男子では各病型と要精査正常群とには有意差は認められなかった。各病型を併せた障害群と要精査正常群の得点には、男女共に有意差は認められなかった。【考察】女子ではEAT-26よりは月経異常調査で、より多くの障害学生が抽出できた。しかし、要精査正常群と障害群のEAT-26因子得点に相違が報告されていることから、妥当性検討にはさらに因子得点別比較が必要である。【目的・方法】Morganらによって作成された全5問からなる口問口答形式の摂食障害スクリーニング・テスト「SCOFF Questionnaire ; SCOFF(BMJ 319:1467-1468,1999)」の有用性、ならびに摂食障害に占める季節性感情障害(SAD)合併例の割合を検討した。対象は某大学女子在学生の一部(2565名)で、SCOFFを質問紙法により実施した。【結果】回答学生1035名(有効回答数1031名)のうち、2問以上に「ハイ」と回答した学生169名を要精査として呼出し、SCIDによる構造化面接を行った。一次要精査に108名が応じ、62名が摂食障害ではないと診断された。二次要精査に残り46名中37名が応じDSM-IVに従って診断した結果は、月経があることを除きAN-R型の診断基準を満たす者7名(3,1)、BN-P型4名(1,0)、BN-NP型5名(1,1)、BE7名(1,4)、無茶喰い期間が6ヶ月を満たさないことを除きBEの診断基準を満たす者2名(1,0)、BE疑い1名(0,1)であった。
薩摩藩の財政と「宝暦の治水」に関する研究

「宝暦の治水」とは、宝暦3(1753)年12月幕府からお手伝い普請を命ぜられた薩摩藩が、翌4年から5年にかけて行った木曽川等の治水工事を言う。本研究の目的は次の点にあった。1「宝暦の治水」に関する薩摩藩側関係史料の存在状況を確認収集し今後の研究の基礎を作ること,2工事に予定以上の出費を強いられる理由と藩財政への影響,3工事参加者(薩摩藩武士)が多数切腹する遠因となる人格形成を薩摩藩の子弟教育にみることである。研究の結果は次の通りである。1,薩摩藩側の史料は「薩藩旧記雑録」に収録される以上のものはなく、在地史料として期待された山崎・伊作・蒲生三郷の「御仮屋文書」にも直接関係する史料はないことを確認の上、名古屋大学図書館所蔵および岐阜県立歴史史料館所蔵史料を収集した。2,支出増加の原因の一つとして、「五拾箇年御普請明細帳」により在地百姓が常に河川などの定式・臨時普請による利益に注目しなければならないことを示した。3,藩財政への影響は、借財増加のきっかけとはなるが、返済のための改革は行われず、以後の財政悪化の原因は重豪期の放漫財政に求めるべきである。4,人格形成の教育としての武士子弟の郷中教育は、「定説」化されている人材養成として優れた教育ではなく、他者排除、身贔屓を強め、集団行動に適する人物が養成されたことを明らかにし、このような性格が犠牲者を増加させることなった。収集した史料による上記目的の研究は継続中であり、特に藩財政への影響では、幕末期の鋳銭までを含めた長期的視野で藩財政を明らかにする必要がある。本研究の目的は、従来、伝承などにより薩摩「義士」として美化することに意が注がれていた宝暦3年5年の木曽川等の御手伝普請の実態を、厳密な史資料の検討により明らかにすることにより、藩財政の実態および多数の死者を出す背景となっている薩摩藩の教育・士風と関連づけて明らかにすることにある。研究の初年度としての本年度は、次年度以降の研究を発展させるための基礎作りを、以下の通り行った。1.マイクロフイルム撮影機および簡易製本機の購入携帯用マイクロフイルム撮影機(ヒラカワ-35)は、多量の史料収集には必須のものであり、これを購入することにより、本年度から原史料の収集が可能となり、次年度以降も史料収集に威力を発揮することが期待できる。また、撮影したフイルム焼付の整理、コピー類の整理に簡易製本機(とじた君M型)を有効に使用しており、研究推進の環境が整った。2.史資料の収集の状況岐阜県立歴史資料館所蔵の笠松陣屋文書の収集を行ない、基本史料をフイルムに収めた。主要な史料は、「元禄元年より五十ケ年御普請明細取調一件」・「御手伝御普請御用留」・「御用留」等であり、これらは焼付などにより利用できる状態にある。但し、岐阜県立歴史資料館所蔵の関係史料の収集は、今年度末終了のため、次年度も継続して収集にあたる。また、鹿児島では利用することが困難であった「木曽川用水史」・「木曽三川の治水史を語る」・「海津町史」・「大垣市史」等の宝暦治水関係の基本図書も収集した。1.平成5年度に引き続き,「宝暦治水」に直接関係する資料と薩摩藩の財政経済に関する基本資料の収集と整理に当たった。以下,簡単に報告する。(1)岐阜県歴史資料館「御手伝御普請雑」・「国役普請」・「大榑川口洗締切一件」などの史料の収集をおこなった。(2)三重県桑名市海蔵寺その他の調査

宝暦治水の犠牲者を葬る諸寺,および岐阜県海津郡海津町の治山神社・千本松原・大榑川洗堰などの現地調査を行った。海蔵寺所蔵「薩摩義士古証文」2巻を写真に収めた。(3)旧山崎郷御仮屋文書・旧伊作郷御仮屋文書中の財政経済史料の収集(4)鹿児島県歴史資料センター黎明館および鹿児島県立図書館所蔵の本研究に関係する史料の悉皆調査黎明館主査徳永和喜氏の協力を得て,黎明館・県立図書館に所蔵される「宝暦治水」関係資料の調査を行った。リストアップされた資料目録の点検整理が済めば,鹿児島県側の史料の残存状況を明確にした上での研究が可能になり,以後の研究に大きく寄与するものと考えている。2.来年度研究との関わりについて2年にわたり史料の所在調査,史料収集に努めてきたことによりほぼ全体像が見えてきた。史料分析はまだ緒についたばかりであるので今年度までは研究成果の発表はない。史料収集の成果および分析結果については,来年度以降発表する予定である。平成5年度から行ってきた岐阜県立歴史資料館への史料収集は、今年度の2回にわたる補充調査により宝暦治水関係の基本的史料の収集は一応終わり、今後の研究のための基礎資料を入手することができた。宝暦治水関係の資料は、岐阜県立歴史資料館所蔵文書の外、名古屋大学古川総合研究資料館所蔵の高木家文書も重要なものである。この史料については、伊藤忠士・伊藤孝幸の両氏が史料紹介を続けているが、翻刻された史料はまだ限定されており、今後この史料の収集を急がなければならないと考えている。資史料収集に力を注いだために、収集した資史料の分析・発表は遅れているが、今年度は、薩摩藩の宝暦治水研究の前史に該当する部分についての史料翻刻に向けて作業を行っている。宝暦治水に至るまでの該地域の農民の治水への関わりを明確にすることにより、初めて宝暦治水の時の農民の幕府への要求・薩摩藩お手伝い衆等への態度などの意味を理解しうると考える。紀要などへの発表は平成8年度になるが、本研究の報告書には、原稿の形態で示す予定である。薩摩藩側の史料は、出水市の史料を調査したが、本研究に資する史料はないことが明確になった。しかし、吹上町中央公民館所蔵の伊作御仮屋文書・宮之城町山崎郷御仮屋文書・蒲生町の蒲生郷御仮屋文書などの史料に断片的に見られる関係文書の整理も進行中である。
遠赤外(C II)スペクトル線による銀河構造の研究

本研究の目的は、中性星間ガラスの最大の冷却源である遠赤外[CII]スペクトル線(波長158μm)をプローブとして、銀河面サーベイ観測を行い、銀河系の構造を新しい観点から明らかにすることにある。観測には、[CII]サーベイ専用に開発した気球搭載観測機BICE(Balloon-bome InfraredCarbon Explorer)を用いている。平成3年度には、米国テキサス州から、このBICEを用いた本観測を行い、銀経-10度75度の銀河面、Cyg-X領域、ρ-Oph暗黒星雲など、広範囲でかつ多種多様にわたる天体を観測することができた。この成果を受け、平成4年度には、オーストラリア・アリススプリングス気球基地から気球者翔を行い、南天の天体の観測を目指した。実験の途中では、気球自身の打ち上げ事故にも何回かみまわれ観測の実行が危ぶまれたが、最後には観測に成功し、良質のデータを大量に取得することができた。観測範囲は、南天銀河面の主要部分のほとんど(銀経250度355度)と、大マゼラン雲全域を含む。これらの観測により、内部銀河系の広い領域にわたる[CII]強度マップ、すなわち、銀河系の構造解明に関する貴重なデータベースが得られたわけである。さらに、我々の観測では、[CII]スペクトル線の持つ速度情報を不完全ながらも、得ることができた。強度マップと速度情報とを組み合わせることにより、銀河系の三次元構造を明らかにできるはずである。平成5年度には、銀河面サーベイをより完全にするために、北半球からのBICE気球飛翔観測実験を予定している。さらに、これらのデータの解析を進め、銀河系の構造を、[CII]という新しいプローブにより、明らかにしていく予定である。本研究の目的は、中性星間ガスをトレ-スする新しいプロ-ブである遠赤外[CII]スペクトル線(波長158μm)を用いて、銀河面サ-ベイ観測をい、銀河系の構造を新しい観点から明らかにすることにある。遠赤外[CII]スペクトル線は、地球大気吸収のために、地上からは観測することができない。そこで、我々は、地球大気の影響を逃れるために、気球により高度約40kmにまで観測器を持ち上げ、そこから[CII]スペクトル線を観測することを計画した。そのために、[CII]サ-ベイ専用の気球搭載観測機BICE(Balloonーborne Infrared Carbon Explorer)を開発してきた。平成3年度には、このBICEを用いた観測実験を行った。今回の様な広域サ-ベイ観測の場合、同一観測器による複数回の気球飛翔観測が必要である。したがって、観測器の地上回収が保証されている気球基地からの観測が必要不可欠である。このため、平成3年度の観測実験は、米国アリゾナ大学との協同のもと、米国テキサス州パレスティンのNSBF(National Scientific Balloon Facility)から行った。二回の気球飛翔を行い、共に観測に成功し、良質のデ-タを大量に取得することができた。今回の観測は、従来行われてきた[CII]広域サ-ベイを、空間分解能で35倍、感度で1桁、それぞれ向上させたものである。今回の観測範囲は、銀経ー10度75度の銀河面、CygーX領域、ρーOph暗黒星雲など、広範囲でかつ多種多様にわたる。この観測により、個々のHII領域に付随しない広がった[CII]領域や発見や、暗黒星雲からの強い[CII]放射の検出など、数多くの興味深い結果が得られた。観測結果は、現在解析中であり、近日中にデ-タをまとめ、論文発表を行う予定である。この成果を受けて、平成4年度には、南半球からの観測を行う予定である。
培養骨膜幹細胞移植による顎骨再生に関する研究

われわれは、この基盤研究で骨膜に存在する骨軟骨形成細胞に着目し、これらを用いた骨組織再生医療のための基礎研究を行った。この研究では岡山大学附属病院倫理委員会承認のもと、ラットの頸骨骨膜から採取した骨膜細胞を用い、これらを三次元構造コラーゲン複合体存在下にDMEM培養液を用いて培養を行い、骨膜細胞コラーゲン複合体を作成した。これらの移植体を免疫抑制を行ったラットの頭蓋骨に作製した骨欠損部に移植した。移植後14、21、35日目に摘出し、骨形成過程を組織学的・X線学的に観察した。この結果、骨欠損部において移植後35日目までに骨形成は観察されるものの骨欠損部をすべて満たすに足る新生骨は観察されなかった。しかし、この手法の新規性は骨形成細胞採取・培養が、きわめて簡便で確実な臨床応用可能な術式である事を証明した。さらにこれら移植細胞の骨形成を効率化させるために骨形成因子BMP-4のエレクトロポレーション法による遺伝子導入療法を行った。BMP-4遺伝子を導入された骨膜細胞は骨形成マーカーであるPCNA,VEGF,CD44,Sox9陽性細胞が優位に増加した。現在までに骨膜細胞の骨形成能をin vivoにて証明した報告は少なく。この研究結果は将来の臨床再生医療への基礎実験としての成果が確認された。そしてこれらの細胞からの骨形成はBMP-4の遺伝子導入により血管形成因子や細胞増殖マーカーの有意な上昇をみた。こうした遺伝子療法は骨形成能の低下した高齢患者や代謝疾患患者にも適応が期待される有効な治療法となりうる。これらの研究結果を第26回欧州顎顔面外科学会(フランス、トウール)、第4回アジア口腔外科学会(千葉)にてシンポジウム口演を行い報告した。またこの研究の一部を国際雑誌Annals of Plastic Surgery,などに報告した。骨膜は骨を覆う線維性結合組織で骨折や成長過程での骨形成に重要な役割を果たす。この骨膜には骨組織や筋肉組織を形成する組織幹細胞が豊富に存在することが知られている。本研究では、ラット頸骨から採取した骨膜由来細胞をDMEM(10%FBS)液で14日間培養し、増殖させた後に2%トリプシン処理後に細胞を剥離し、再度アテロコラーゲンDish上で7日間培養し、骨膜細胞コラーゲン複合体を作成した。これをネンブタール麻酔下の7週齢SDラットの頭蓋骨に人工的に作成したCritical Sized骨欠損部にXenogenic Graftを行った。移植後は免疫抑制剤FK5061.0mg/kg/dayを筋肉内投与して、移植後、7,14,21日目に摘出し、軟X線写真、組織形態学的観察を行い骨膜の組織幹細胞の骨形成能の検討を行った。その結果、移植後7日目には移植ヒト骨髄培養細胞はPCNA陽性の増殖像を示した。さらにこれらの増殖細胞は骨形成因子BMP-4を発現し移植後14日目までに一部は軟骨芽細胞に分化した。これら軟骨細胞は2型コラーゲンおよびアルシアンブルー産生が観察された。軟骨には移植後14から21日目にかけて血管内皮細胞誘導因子VEGFの発現が観察され、軟骨への血管侵入から軟骨内骨化様式にて骨形成が組織形態学的に確認された。同時に軟X線写真では欠損の中心部から石灰化像が観察され、この石灰化は経時的に拡大した。これらの所見からラット培養骨膜細胞は移植組織内で骨形成能を持つことが証明され、培養骨膜細胞移植による骨再生術は臨床的にきわめて侵襲の少ない有効な手法となりうる可能性が強く示唆された。

今後は、この骨形成幹細胞を骨膜細胞の中から選択的に培養を行う超選択的培養法や、骨形成因子BMP-4の遺伝子導入などを用いての効率的な骨再生術式の確立に発展させる予定である。われわれは、この基盤研究で骨膜に存する骨軟骨形成細胞に着目し、これらを用いた骨組織再生医療のための基礎研究を行った。この研究では岡山大学附属病院倫理委員会承認のもと、ラットの頸骨骨膜から採取した骨膜細胞を用い、これらを三次元構造コラーゲン複合体存在下にDMEM培養液を用いて培養を行い、骨膜細胞コラーゲン複合体を作成した。これらの移植体を免疫抑制を行ったラットの頭蓋骨に作製した骨欠損部に移植した。移植後14、21、35日目に摘出し、骨形成過程を組織学的・X線学的に観察した。この結果、骨欠損部において移植後35日目までに骨形成は観察されるものの骨欠損部をすべて満たすに足る新生骨は観察されなかった。しかし、この手法の新規性は骨形成細胞採取・培養が、きわめて簡便で確実な臨床応用可能な術式である事を証明した。さらにこれら移植細胞の骨形成を効率化させるために骨形成因子BMP-4のエレクトロポレーション法による遺伝子導入療法を行った。BMP-4遺伝子を導入された骨膜細胞は骨形成マーカーであるPCNA, VEGF, CD44,Sox9陽性細胞が優位に増加した。現在までに骨膜細胞の骨形成能をin vivoにて証明した報告は少なく。この研究結果は将来の臨床再生医療への基礎実験としての成果が確認された。そしてこれらの細胞からの骨形成はBMP-4の遺伝子導入により血管形成因子や細胞増殖マーカーの有意な上昇をみた。こうした遺伝子療法は骨形成能の低下した高齢患者や代謝疾患患者にも適応が期待される有効な治療法となりうる。これらの研究結果を第26回欧州顎顔面外科学会(フランス、トウール)、第4回アジア口腔外科学会(千葉)にてシンポジウム口演を行い報告した。またこの研究の一部を国際雑誌Annals of Plastic Surgery,などに報告した。