hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
固体のポテンシャル問題に関連する数値・実験ハイブリッド型逆解析手法の確立

9.き裂による電流場,温度場の特異性解析を行い,温度場に基づく非破壊検査手法を検討した.工学,理学,医学の分野において,逆問題研究が注目を集めてきている。逆問題解析には分野を越えた共通点があるため,特定の問題に対する逆問題解析の発展が,逆問題研究全体の進展に繋がる。本研究では,材料力学の分野でも最も簡単で,最近いくつかの展開が得られている,ポテンシャル場の問題を主対象に,これに関連する逆問題を扱う数値・実験ハイブリッド型逆解析手法に関する検討を行い,以下の結論を得た。1.場の支配微分方程式を観測結果をもとに推定する方法の有効性を,誤差がある場合を含め,数値的に明らかにした。2.接触部の変位と力の分布を推定するためのいくつかの適切化法の有効性を調べた。また,境界値逆問題の不適切性に関する理論的検討を行った。3.直流電気ポテシャル法を用いて微小試験片中のき裂を測定する方法の有効性を実験的に確かめた。交流電気ポテンシャル法により応力拡大係数を計測する方法の3次元き裂への適用性を調べた。4.音響インピ-ダンスCT法の適用性について,数値的検討を行った。また,離散系の材料特性値を推定する方法の検討を行った。5.電流ベクトルポテンシャル法に基づく3次元渦電流解析を行い,これを用いた渦電流探傷の逆問題的アプロ-チを検討した。6.ガルバニック腐食による電流密度および電気ポテンシャル分布の推定の逆解析を行った。カソ-ド防食の最適設計問題に対する解析手法の有効性を明らかにした。7.波動方程式によって支配される分布定数系における外力の同定問題に対する逆解析手法について,数学的考察を行い,その適用性を数値的に明らかにした。8.非定常熱伝導問題における時間依存の未知境界値を推定する逆解析手法の有効性を数値的に検討した。9.き裂周辺の電流場,温度場の特異性の解析をもとに,温度場からき裂形状を推定するスキ-ムを提案し,その有効性の検証を行った。
LRRK2-Rab経路の理解に基づくパーキンソン病分子病態の解明

平成30年度は、LRRK2によるリン酸化の細胞内局在を検討した。前年度に確立した、家族性パーキンソン病変異型(Y1699C)3xFLAG-LRRK2とHA-Rab10を恒常発現するHEK293A細胞(クローン41-4)を用い、LRRK2特異的阻害剤であるMLi-2処理の有無でRab10リン酸化Thr73特異抗体と、FLAGタグ抗体、HAタグ抗体の三重染色を行った。その結果、MLi-2非処理時にはRab10は核近傍に集まって局在し、MLi-2処理によりこれが細胞質のreticularな局在に変化した。Rab10 Thr73のリン酸化は、核近傍に集まって局在するRab10に一致して見られ、MLi-2処理により消失した。Rab10の核近傍の局在は、リソソームマーカーであるLAMP1と大部分が共局在し、MLi-2処理時のreticularな局在は小胞体マーカーであるPDIと大部分が共局在した。この結果は、Rab10の局在がLRRK2によるリン酸化によって制御され、リン酸化時にはリソソームに、非リン酸化時には小胞体に局在することを示唆している。この細胞を用いて、LRRK2によるRab10のリン酸化を制御する遺伝子を網羅的にスクリーニングする実験系を立ち上げている。384ウェルプレートを用いて、41-4細胞にsiRNAを導入し、Rab10リン酸化Thr73特異抗体とHAタグ抗体で染色し、ハイコンテントイメージアナライザーで画像した。プレートのコーティングなどの条件検討を実施するとともに、新たに接着性の強いHeLa細胞を用いて同様の細胞株を作製している。家族性パーキンソン病変異(R1441G)をヘテロ接合に保有するパーキンソン病患者から皮膚線維芽細胞を取得した。この細胞では内因性LRRK2の発現が低かったが、弱いながらRab10リン酸化が検出できることを確認した。平成30年度は、R1441Gヘテロ変異ヒト皮膚線維芽細胞を取得し、内因性Rab10のリン酸化を検出した。これにより、平成29年度から持ち越された、当初計画の「ヒト由来サンプルにおけるRabリン酸化の検出」「PD患者由来サンプルおけるRabリン酸化の解析」を達成した。また、41-4細胞を用いた免疫細胞化学的解析から、Rab10が、LRRK2によるリン酸化依存的に、LAMP1陽性コンパートメントとPDI陽性コンパートメントを移動することを明らかにした。これにより、当初計画の「Rabリン酸化の小胞輸送に対する影響の解析」を部分的に達成した。さらに、当初計画の「LRRK2の活性制御因子の探索」について、LRRK2とRab10を共発現する細胞株を用いたゲノムワイドsiRNAスクリーニング系が確立されつつある。HEK293A由来のモノクローナル株である41-4細胞のみならず、HeLa細胞株も併用することで、クローン特異的な因子を排除することが可能であると考えられる。当初計画の「Rab結合タンパク質の探索」については、平成29年度にはAPEX2を用いた方法や、パラホルムアルデヒドによる架橋後に免疫沈降する方法を確立したが、BioID法がさらに改良されたTurboIDタグが報告された(Branon et al., Nature Biotechnology, 2018)ので、これについてもRab10、Rab29について試行した。APEX2タグが近傍のチロシンをビオチン化するのに対し、TurboIDタグは近傍のリシンをビオチン化する。APEX2とTurboIDを併用することで、より網羅性を高めることができたと考えている。Rab10がLRRK2によるリン酸化依存的に細胞内局在を変化させる分子メカニズムは不明である。今後は、Rab10の既知の活性制御因子(GAP、GEFなど)やエフェクタータンパク質をノックダウンすることで、Rab10の局在変化にどのような影響があるか解析する。また、APEX2やTurboIDを用い、Rab10の近傍タンパク質を網羅的に同定する。LRRK2によるリン酸化の有無で変化する近傍タンパク質を同定することができれば、局在変化の分子メカニズムに迫る手がかりになると期待される。このようにして同定された因子については、患者由来皮膚線維芽細胞においても同様の機能を有するか解析することで、病態形成への関与を明らかにすることができる。Rab29はLRRK2によりリン酸化されるが、一方でLRRK2を活性化することが明らかになっている。しかしながら、その分子メカニズムは不明である。また、Rab29の細胞内局在はtrans Golgi network(TGN)に限局しているが、そのメカニズムも明らかでない。そこで、Rab29についてもBioID法を適用することで、LRRK2活性化やTGN局在の分子メカニズムを明らかにする。最近の研究で、LRRK2はリソソーム恒常性の維持に重要な機能を有することが明らかになりつつある(Eguchi et al., PNAS, 2018)。本研究課題でも、Rab10がLRRK2によるリン酸化依存的にリソソームに局在することを明らかにした。リソソーム恒常性の破綻は、様々な点でパーキンソン病との関連が指摘されており、パーキンソン病の分子病態解明の緒となる期待が高い。今後は、LRRK2がリソソームの形態や機能などの恒常性に与える影響も解析していきたい。

平成29年度は、LRRK2によるRab10リン酸化の検出系を確立した。HEK293A細胞に野生型HA-Rab10とY1699C変異型3xFLAG-LRRK2を共発現させ、恒常発現細胞を取得した。生理的条件に近いRab10の局在を検出するため、発現量が比較的低いクローン41-4を選択した。Phos-tag SDS-PAGEを用いてリン酸化のstoichiometryを検討したところ、発現しているRab10の約50%がリン酸化されていた。このリン酸化は、LRRK2特異的阻害剤で細胞を処理することで消失した。また、免疫細胞化学的解析によりリン酸化Rab10の細胞内局在を解析するため、リン酸化Rab10特異抗体を作製した。今後、免疫細胞化学的にリン酸化Rab10の局在などを解析する。Rab10がリン酸化されたときに特異的に結合するタンパク質を探索するため、近傍に存在するタンパク質をビオチン化修飾するAPEX2タグを融合したRab10を発現する細胞を作製した。APEX2タグはbiotin phenolと過酸化水素が存在するとき、周囲40 nm程度に存在するチロシン側鎖をビオチン化する。作製した細胞のbiotin-phenolと過酸化水素で処理した後、固定してストレプトアビジン-Alexa488で染色したところ、両試薬存在時に特異的な染色が見られ、ビオチン化が生じたと考えられた。ビオチン化されたタンパク質を精製するため、ストレプトアビジンが結合した磁気ビーズを用いた。プルダウンされたタンパク質をストレプトアビジンHRPでイムノブロット解析し、ビオチン化タンパク質のプルダウンを確認した。今後、プルダウンされたタンパク質の質量分析による網羅的同定を試みる。また、LRRK2分解制御因子の探索に向けて、LRRK2を恒常発現するU2-OS細胞株を作製した。当初計画では、平成29年度には(1)Rabリン酸化の定量的検出系の確立、(2)LRRK2の分解制御因子の探索、(3)Rab結合タンパク質の探索、(4)小胞輸送アッセイの確立、(5)ヒト由来サンプルにおけるRabリン酸化の検出に向けた準備を進める予定だった。リン酸化Rab10特異抗体の完成により(1)(4)(5)の目処が立った。また、(2)LRRK2の分解制御因子の探索に用いるため、蛍光タンパク質を融合したLRRK2を恒常発現する細胞を作製し、LRRK2阻害剤処理時に分解を受けることを見出したことから、この点についてもスクリーニングに向けて順調に進展していると判断した。(3)Rab結合タンパク質の探索については、APEX-Rab10発現細胞を確立し、実際に近傍タンパク質のビオチン化が生じていること、ビオチン化されたタンパク質をプルダウンできることが確認できた。さらに、バックアップのための実験として、上記41-4細胞を用いて、パラホルムアルデヒドを用いて架橋した後にRab10を免疫沈降する実験系も確立した。このとき、Rab10を免疫沈降したのちにタグに対する抗体を用いてイムノブロット解析を行うと、Rab10がパラホルムアルデヒド処理依存的に高分子量側にスメア状に広がる様子が観察され、結合因子とのクロスリンクが生じていることが示唆された。
スパッタ法によるNa_2O-AL_2O_3系ハイブリッド固体電解質薄膜の作成と評価

次代のシステムやデバイスを担う新材料の開発は,素材の探索とともにそれらの複合集積化によって創り出される人工機能に大きく依存するようになろう.薄膜化技術は,こうした機能の設計に適しているだけでなく,新物質の合成手段としても興味深い.本課題においては,エネルギーおよびエレクトロニクス用デバイスとして注目されている代表的超イオン伝導体のNaβ-アルミナおよびNa_2O-Al_2O_3系化合物を薄膜状態で合成し,生成膜のイオン伝導を支配する(1)微細構造, (2)イオンパス,(3)異相間相互作用などの基礎的要因を解析することによって新しい複合機能をもつ高イオン伝導材料の基礎開発を行なうことを目的として研究を進めた.Na_2O-Al_2O_3系薄膜は, α-Al_2O_3単結晶基板上にスパッタ蒸着をしたアモルファス薄膜の熱処理によって合成し, SAW吸収実験は,圧電体上を伝搬する表面波の2つの性質,表面圧電電界と弾性ひずみ,を利用してSAW-伝導イオン間の圧電結合および局所歪結合をそれぞれ独立に分離して解析できるように工夫した. 2年間の研究で得られた主な成果は,1.高周波スパッタ法の採用によって,従来困難とされていた薄膜化に成功するとともに,薄膜の高イオン伝導をもたらす緻密な粒界組繊と結晶子の優先配向の効果を明らかにした.2.表面弾性波(SAW)を用いた新しいイオン運動解析法を開発し,その有効性を明らかにするとともに,伝導イオンと表面波の結合機構を解明した(3).3.表面波は,伝導イオンに対して,誘起圧電電界を介して強く結合するとともに, SAWが誘起する局所的な格子歪を介して結合することを検証し,伝導イオンー格子系における圧電結合を局所歪結合の存在を明らかにした.4.β-アルミナのイオン輸送は,対をなすNaイオンの協同的なイオンジャンプによって起こることを明らかにした.次代のシステムやデバイスを担う新材料の開発は,素材の探索とともにそれらの複合集積化によって創り出される人工機能に大きく依存するようになろう.薄膜化技術は,こうした機能の設計に適しているだけでなく,新物質の合成手段としても興味深い.本課題においては,エネルギーおよびエレクトロニクス用デバイスとして注目されている代表的超イオン伝導体のNaβ-アルミナおよびNa_2O-Al_2O_3系化合物を薄膜状態で合成し,生成膜のイオン伝導を支配する(1)微細構造, (2)イオンパス,(3)異相間相互作用などの基礎的要因を解析することによって新しい複合機能をもつ高イオン伝導材料の基礎開発を行なうことを目的として研究を進めた.Na_2O-Al_2O_3系薄膜は, α-Al_2O_3単結晶基板上にスパッタ蒸着をしたアモルファス薄膜の熱処理によって合成し, SAW吸収実験は,圧電体上を伝搬する表面波の2つの性質,表面圧電電界と弾性ひずみ,を利用してSAW-伝導イオン間の圧電結合および局所歪結合をそれぞれ独立に分離して解析できるように工夫した. 2年間の研究で得られた主な成果は,1.高周波スパッタ法の採用によって,従来困難とされていた薄膜化に成功するとともに,薄膜の高イオン伝導をもたらす緻密な粒界組繊と結晶子の優先配向の効果を明らかにした.2.表面弾性波(SAW)を用いた新しいイオン運動解析法を開発し,その有効性を明らかにするとともに,伝導イオンと表面波の結合機構を解明した(3).3.表面波は,伝導イオンに対して,誘起圧電電界を介して強く結合するとともに, SAWが誘起する局所的な格子歪を介して結合することを検証し,伝導イオンー格子系における圧電結合を局所歪結合の存在を明らかにした.4.β-アルミナのイオン輸送は,対をなすNaイオンの協同的なイオンジャンプによって起こることを明らかにした.固体中のイオン移動によって大きな電気伝導を示す物質(固体電解質)としてよく知られたβ-アルミナおよびその類縁化合物【Na_2】O・x【A1_2】【O_3】(5≦x≦11)を薄膜(0.52μm)状態で合成し、そのイオン伝導機構を弾性表面波を用いて動的に解析した。本年度の研究目的は、(1)伝導イオンと表面波の結合様式を明らかにすること、(2)超音波(表面波)吸収実験に基づきイオン伝導機構を明らかにすることである。【Na_2】O-【A1_2】【O_3】系薄膜は、α-【A1_2】【O_3】単結晶基板上にスパッタ蒸着をしたアモルファス薄膜の熱処理によって合成した。超音波吸収実験は、本年度の科学研究費補助金により購入した設備備品「超高速デイジタルストレージオシロスコープ」を用いて、圧電体を伝搬する弾性表面波の2つの性質(表面漏洩電界と弾性ひずみ)をそれぞれ分離し、それらと伝導イオンのカップリングを独立に解析できるように工夫した。これらの実験により、(1)膜内を通過する伝導イオンの運動様式の解明には、表面波の利用が有効であること、(2)伝導イオンは表面波と音響的に結合するだけでなく圧電電界と強く結合すること、(3)β-アルミナ中のイオン移動は対をなすNaイオンの協同的なイオンジャンプによって起こることが明らかになった。来年度は、【Na_2】O-【A1_2】【O_3】系の他の化合物(準安定λ相、アモルファス相)に上記の方法を適用し、それらの伝導機構をβ-アルミナと比較して解析する予定である。
各種メタラサイクルを含む有機金属ポリマーの合成と新規反応性高分子としての展開

高分子の機能化を行う上で反応性ポリマーは、非常に重要な位置付けにある。研究では新しい主鎖型反応性高分子としての展開を目的に、メタラサイクルを反応性の遷移金属-炭素結合として主鎖に有した有機金属ポリマーを設計、合成し、その反応性の評価を行なった。有機金属ポリマーの合成に関してはシクロブタジエンコバルト骨格をもつ二官能性モノマーの重縮合を検討したところ対応するポリマーが高収率で得られ、そのうち剛直な直鎖状になるように設計したポリマーには液晶相が観察された。類似のモノマーのカップリング重合ではリオトロピック液晶を示すポリマーが得られ、そのUVスペクトルからπ共役性が示唆された。コバルタシクロペンタジエン誘導体の反応性を用いた同骨格をもつポリマーの高分子主鎖の組み替え反応に関しては硫黄、セレンとの高分子反応を検討したところ、いずれの場合にもチオフェン、セレノフェン骨格へとほぼ定量的に変換されたポリマーが得られることが分かった。また、イソニトリルとの反応とこれに続くアルキル化(またはプロトン化)処理では高効率でコバルチセニウム骨格を含んだポリマーへと変換された。さらに、以上の結果をもとに、主鎖型反応性高分子材料としての有機金属ポリマーの有用性を示した。
マダニの自然免疫関連膜受容体を標的としたバベシア原虫媒介阻止ワクチンの開発

昨年度作出した人工吸血系を用いた新規のマダニーバベシア実験感染モデルにより、バベシア原虫がマダニ飽血後24時間以内にマダニ中腸内において、マダニ体内ステージへのステージシフトを起こしている可能性が強く示唆された。そこで実際にバベシア原虫のマダニ体内へのステージシフトを誘導することを試みた。人工飽血させたフタトゲチマダニ成ダニの中腸内容物を、in vitro培養系B. ovata感染赤血球に添加した後、静置培養を行い、ギムザ染色による原虫の形態観察を行った。その結果、通常のin vitro培養系と異なる形態の原虫が観察され、その形態変化は12時間以内に完了することが分かった。また、原虫細胞骨格蛋白質P29を標的とした間接蛍光抗体法で確認したところ、それらの多様な形態はすべてバベシア原虫そのものであった。以上の結果より、バベシア原虫はマダニ中腸内において飽血後24時間以内にステージシフトを起こしていることを明らかにした。ここで確立した実験感染モデルを用いて、実際に同定したフタトゲチマダニC型レクチン(HlCLec)とB. ovataの関連性の検証を行った。HlCLec遺伝子をノックダウンしたマダニ(KD群)にB. ovataを人工感染させ、B. ovata β-tubulin遺伝子を標的としたPCR評価系によりバベシア原虫のマダニ体内動態の変化について観察した。その結果、KD群においては、飽血後4日目においてもマダニ中腸内にB. ovata原虫遺伝子が検出されたが、その他の臓器では検出されなかった。従って、HlClecはマダニ中腸内におけるB. ovata原虫の伝播機構に関与している可能性が示唆された。これらの研究成果は、マダニベクター研究の発展に寄与するものであり、同定した膜受容体とともに新規のバベシア原虫伝播阻止ワクチンの開発へつながる重要な知見であると考えられる。28年度が最終年度であるため、記入しない。吸血性節足動物であるマダニは、さまざまな病原体を媒介しうることから、極めて優れた病原体媒介能を持つ。本研究ではマダニの自然免疫系の解明をはかり、それらを破綻させることに基づいた新規のマダニおよびマダニ媒介性疾病の防除法を模索する。レクチンは免疫や代謝など生体内で重要な機能を担う蛋白質である。近年、C型レクチンが病原体特有の多糖構造を認識しシグナルを発信するという多数の知見があり、Toll様受容体などとは異なる新たな自然免疫受容体ファミリーを形成すると考えられる。本年度は、フタトゲチマダニより新規のC型レクチン様蛋白質(HlCLec)を同定し、機能解析を実施した。HlCLecはN末端にシグナル配列、C末端に膜貫通領域を有していた。また、非常に興味深いことに、多くのC型レクチンが12個の糖認識ドメイン(CRD)を有しているのに対して、異なる3つのCRD(CRD1, CRD2, CRD3)を保存していることが明らかとなった。HlCLec遺伝子ノックダウン後に大腸菌または黄色ブドウ球菌を経皮接種した際のマダニの生存に及ぼす影響を調べた結果、大腸菌接種群において生存率が有意に減少した。HlCLec遺伝子はマダニの吸血に伴って上昇し、RNA干渉法による遺伝子ノックダウンでは対照群に比べて有意な飽血体重の減少をもたらし、産卵率および孵化率も減少した。また、個々で発現させたCRD13の組み換え蛋白質を用いて、細菌結合試験および細菌の増殖抑制試験を行い、すべてのCRDが大腸菌および黄色ブドウ球菌に結合しうるが、それらの増殖を抑制しないことが分かった。以上の結果より、HlCLecはマダニの生存、特にグラム陰性菌の感染防御において重要である可能性が示唆された。また、HlCLecは直接的な抗菌活性を示さない、自然免疫関連膜受容体である可能性が明らかとなった。昨年度はバベシア原虫媒介阻止ワクチン標的受容体としてフタトゲチマダニより新規のC型レクチンの同定および機能解析を行ったが、バベシア原虫に対する関与については未検証である。しかし、現状ではこのマダニの媒介原虫であるバベシア・オバタ(Bo)感染実験が容易にできないウシを宿主とし、フタトゲチマダニ体内におけるBoの知見については不明な点が多い。そこで本年度は、フタトゲチマダニ体内におけるBoの挙動を明らかにすることを試みた。本研究では人工吸血法を用いてBo感染マダニを作出し、Boβ-tubulin遺伝子を標的としてPCRまたqPCRによるマダニ体内のBo検出を行った。その結果、中腸においては飽血後0日目にはほぼすべてのサンプルにおいて原虫遺伝子断片が検出されたのに対して、飽血後4日目に向けて検出率が減少した。一方で、卵巣およびその他の臓器においては飽血後4日目に向けて検出率が増加した。検出されたBoを可視化するために、原虫細胞骨格蛋白質であるP29を標的に蛍光抗体法による検出を行った。BoP29ホモログのクローニングを行い、マウスを用いて特異的抗血清を得た。Bo感染マダニ組織切片を用いて蛍光抗体法を行ったところ、マダニ細胞の内外ともにBo特異的な蛍光を確認できた。

またBo感染マダニ卵の圧平塗抹を用いて同様に検出を行ったところ、Boと思われる細胞を確認することができた。以上の結果より、新規のBo人工感染マダニにおけるバベシア原虫感染率評価系を確立することができた。また本実験系を用いて、飽血後24時間以内に中腸を通過したバベシア原虫が、マダニベクターにおける経卵巣伝播の成立に寄与する可能性が明らかとなった。これらの成績は、バベシア原虫とマダニベクターとの相互関係を分子レベルで解析する上で重要な時間的指標となるものと考えられる。昨年同定した新規の膜受容体とバベシア原虫の関連性を探るために新規の評価系を作製し、今まで不明であったフタトゲチマダニ体内におけるBo動態の一端を明らかにした。本成果により、マダニ体内でのバベシア原虫研究において新たな研究展開が期待される。昨年度作出した人工吸血系を用いた新規のマダニーバベシア実験感染モデルにより、バベシア原虫がマダニ飽血後24時間以内にマダニ中腸内において、マダニ体内ステージへのステージシフトを起こしている可能性が強く示唆された。そこで実際にバベシア原虫のマダニ体内へのステージシフトを誘導することを試みた。人工飽血させたフタトゲチマダニ成ダニの中腸内容物を、in vitro培養系B. ovata感染赤血球に添加した後、静置培養を行い、ギムザ染色による原虫の形態観察を行った。その結果、通常のin vitro培養系と異なる形態の原虫が観察され、その形態変化は12時間以内に完了することが分かった。また、原虫細胞骨格蛋白質P29を標的とした間接蛍光抗体法で確認したところ、それらの多様な形態はすべてバベシア原虫そのものであった。以上の結果より、バベシア原虫はマダニ中腸内において飽血後24時間以内にステージシフトを起こしていることを明らかにした。ここで確立した実験感染モデルを用いて、実際に同定したフタトゲチマダニC型レクチン(HlCLec)とB. ovataの関連性の検証を行った。HlCLec遺伝子をノックダウンしたマダニ(KD群)にB. ovataを人工感染させ、B. ovata β-tubulin遺伝子を標的としたPCR評価系によりバベシア原虫のマダニ体内動態の変化について観察した。その結果、KD群においては、飽血後4日目においてもマダニ中腸内にB. ovata原虫遺伝子が検出されたが、その他の臓器では検出されなかった。従って、HlClecはマダニ中腸内におけるB. ovata原虫の伝播機構に関与している可能性が示唆された。これらの研究成果は、マダニベクター研究の発展に寄与するものであり、同定した膜受容体とともに新規のバベシア原虫伝播阻止ワクチンの開発へつながる重要な知見であると考えられる。今年度はフタトゲチマダニより新規のC型レクチン様蛋白質(HlCLec)を同定した。また、HlCLecの特性・機能解析を行い、マダニの生存およびグラム陰性菌に対する感染防御に重要であることを明らかにした。今後は当初の計画どおり、バベシア原虫などの病原体との関係を探っていく予定である。本年度の成果により、人工吸血法を利用したマダニーバベシア実験感染モデルを作製することができた。当初の計画では最終年度に犬を用いた感染実験を予定していたが、感染動物を用いず、より簡便で再現性のとりやすい本実験系を利用して、同定した膜受容体がバベシア原虫の伝播阻止ワクチン標的候補分子となりうるかを検証していく予定である。28年度が最終年度であるため、記入しない。
トラクション搬送される光学フィルムの損傷予測モデルの定式化とその応用

ウェブハンドリングプロセスは液晶ディスプレイ,太陽電池,燃料電池などをはじめとして多くのプリンティッド・エレクトロニクス分野で広く活用されている.ウェブの搬送工程で特に問題となるのはしわとスリップの発生である.他方,ウェブの巻き取りはハンドリングの最終工程にあたるので,これらのウェブの欠陥は大きな損失の原因となる.巻き取り時のしわとスリップの発生は巻き取りロール内部の応力状態に強く影響される.本研究では,ウェブハンドリングプロセスにおけるこれらウェブ欠陥の発生原因を理論と実験の両面から解明し,かつその有効な防止方法を提案して実験的に検証している.ウェブハンドリングプロセスは液晶ディスプレイ,太陽電池,燃料電池などをはじめとして多くのプリンティッド・エレクトロニクス分野で広く活用されている.ウェブの搬送工程で特に問題となるのはしわとスリップの発生である.他方,ウェブの巻き取りはハンドリングの最終工程にあたるので,これらのウェブの欠陥は大きな損失の原因となる.巻き取り時のしわとスリップの発生は巻き取りロール内部の応力状態に強く影響される.本研究では,ウェブハンドリングプロセスにおけるこれらウェブ欠陥の発生原因を理論と実験の両面から解明し,かつその有効な防止方法を提案して実験的に検証している.プラスチックフィルムや紙などの二次元的な広がりを有する連続柔軟媒体は,ウェブと総称され,新聞などの印刷物や写真,磁気テープなどの情報記憶媒体として,また液晶フィルムなどのディスプレイ用素材として極めて有用である.ウェブを搬送し,途中処理工程を経て最終的に巻き取る技術は"ウェブハンドリング技術"と呼ぼれ,フィルム,紙,金属薄膜などの製造分野をはじめとして広範囲の産業分野において導入されている重要基盤技術である.とりわけ昨今における機械の高効率化,高性能化のニーズの中で,製品精度を損なうことなくウェブを安定して走行させ,かつ適切な処理を行うことがキーテクノロジーの一つとなってきている.平成19年度は,ウェブハンドリング上の重要技術課題の1つであるフィルム巻き取り時のしわ,巻きずれなどのディフェクト予測モデルの構築とその実験的検証に取り組んだ.具体的にはフィルム巻き取り時における巻き取りロール内部の応力解析をフィルム素材の粘弾性や巻き込み空気層によるヤング率の低下などの影響を考慮して実施した.すなわちロールの弾性方程式とソフトEHL理論を組み合わせて数値解析をすることにより,半径方向,円周方向,軸方向の応力分布を求めた.その結果,例えば円周方向の応力が圧縮となる領域でウェブにしわが生じると予測されるので,これを実験的に検証した.さらに,このようなしわの発生を防止する手段として,巻き取り時の張力をロール半径方向に最適に変化させる方法を検討し,その効果を実験により確認した.プラスチックフィルムや紙などの連続柔軟媒体はウェブと総称され,新聞などの印刷物や写真,磁気テープなどの情報記憶媒体として,また液晶フィルムなどのディスプレイ用素材として極めて有用である.ウェブを搬送し,途中処理工程を経て最終的に巻き取る技術は“ウェブハンドリング技術"と呼ばれ,広範囲の産業分野において導入されている重要基盤技術である,とりわけ昨今における機械の高効率化,高性能化のニーズの中で,製品精度を損なうことなくウェブを安定して走行させ,かつ適切な処理を行うことがキーテクノロジーの一つとなってきている.平成20年度は,重要技術課題の1つであるフィルム巻き取り時のしわ,巻きずれなどのディフェクトの防止を目的とした巻き取り張力の最適化とその実験的検証に取り組んだ.フィルム素材の粘弾性や巻き込み空気層によるヤング率の低下などの影響を考慮したフィルム巻き取り時における巻き取りロール内部の応力解析手法と巻き取り時の張力をロール半径方向に自由に変化させる手法を組み合せた最適化手法を考案し,最適化計算を実施した.また同手法の有効性を実験的に検証するために,独自に設計製作した試験装置を用いて巻き取り内部応力の測定を実施した.実験に際しては,測定原理の異なる3つの巻き取り内部応力の測定法を開発し,それぞれについて応力測定を行った.その結果,理論予測値は実験値とよく一致することが確認され,最適化巻き取りロールの内部応力はその他従来の巻き取り手法による応力に比べて極めて良好な状態であることが確認された.さらに巻き取りロールに落下衝撃を加える衝撃試験により,巻きずれ防止効果を検証した.その他に極薄ウェブの低張力下における搬送時しわ発生メカニズムの解明とその防止法にも取り組み,極めて良好な結果を得ている.プラスチックフィルムや紙などの連続柔軟媒体はウェブと総称され,新聞などの印刷物や写真,磁気テープなどの情報記憶媒体として,また液晶フィルムなどのディスプレイ用素材として極めて有用である.ウェブを搬送し,途中処理工程を経て最終的に巻き取る技術は"ウェブハンドリング技術"と呼ばれ,広範囲の産業分野において導入されている重要基盤技術である.とりわけ昨今における機械の高効率化,高性能化のニーズの中で,製品精度を損なうことなくウェブを安定して走行させ,かつ適切な処理を行うことがキーテクノロジーの一つとなってきている.平成21年度は,フィルム巻取り後の継時変化や温度変化がしわや巻きずれなどのディフェクトに及ぼす影響について検討した.まずフィルムの粘弾性や熱応力を考慮した理論解析モデルを構築し,広範囲の条件下における実験によりその有効性を検証した.その際,2種類のフィルムに対して巻取りロールの半径方向および接線方向の線膨張係数を新たに測定し,理論計算に取り入れた.理論と実験を比較した結果両者は良く一致し,フィルムの違いによる特性の違いやそのメカニズムの解明など有用な知見が得られた.一方,フィルム搬送時におけるしわやスリップの防止についても実施した.近年,高機能フィルムは薄膜化が益々顕著になっているが,これに伴い搬送時におけるしわやスリップの発生が極めて深刻な問題となっている.

このような問題に対し,ロールの軸方向に緩やかなカーブをつけたコンケイブローラの表面に更にマイクログルーブを施してしわとスリップ防止に取り組んだところ極めて良好な結果が得られた.
in-situ加熱成形がCFRPの機械的特性に及ぼす影響

本課題では,FW法を用いたCFRPの成形において,in-situ加熱成形でのプロセス因子がCFRPの機械的特性に及ぼす影響を明らかにすることを目的とし,成形時に特に重要と思われる,繊維張力,積層速度および加熱温度がCFRP中の繊維の状態(配向度,残留応力)と強度に及ぼす影響を評価する.平成30年度は繊維層の変形および樹脂流動を考慮したFW成形モデルの構築と,in-situ加熱成形による円筒形状試験体の製作と,NOL引張試験による引張強度試験および微小切削による残留応力測定を行った.FW成形モデルについては,昨年度のモデルを改良し,樹脂流動現象を表すモデルを構築した.樹脂流動により繊維応力が減少し,その影響によって他の層が変形するモデルとして表現し,シミュレーションプログラムの作成を行った.作成したプログラムにより,従来行った実験でのパラメータを用いて繊維応力の計算を行った結果,樹脂流動を考慮しても巻き付け繊維張力による積層済み繊維の繊維方向の応力低下の幅は想定よりも小さくなり,繊維方向応力は負とならないことがわかった.また,繊維張力,積層温度および積層時間をパラメータとしてFWによる円筒形状試験体の製作を行った.製作した試験体を用いてNOL引張試験と微小切削による残留応力の測定実験を行った.NOL引張試験の結果より,積層温度に対する樹脂硬化時間と積層に要する時間の関係が強度発現率の向上に大きな影響を持つことが明らかとなった.また,微小切削による残留応力の測定実験については積層後加熱を行う従来のFW法による試験体において外周から積層CFRPを徐々に切削して応力を解放し,その際のライナひずみの変化を測定することにより残留応力の測定を試みた.その結果,これまでに明らかとなっている従来のFW法を用いた場合の残留応力と測定結果が定性的に一致することがわかった.平成30年度の計画としては,(1)「FW成形モデルに樹脂流動および硬化反応プロセスを導入し,シミュレーションプログラムの作成を行う.作成したプログラムを基に,成形時の樹脂の硬化度と発生する応力,ひずみの計算を行い,CFRP中の繊維の状態を推定する.成形時に特に重要と思われる,繊維張力,積層速度および加熱温度をパラメータとする.」(2)「in-situ加熱成形によるFW成形を行い,円筒形状の試験体を製作する.」(3)「製作した試験体を用い,切り込み法による残留応力の評価,断面の観察およびNOLリング引っ張り試験を行う.」という計画を立てていた.(1)のFW成形モデルの構築においては,樹脂流動による応力変化モデルの構築を行った.また,硬化反応プロセスのシミュレーションに関しては,関連文献を精査したところ,硬化反応プロセスで発生する応力は繊維張力による応力と比較して小さく,今回の条件においてはほぼ無視しうることが分かったため,今回のモデルからは除外した.(2)の試験体の製作においては,製造用ジグの製作を行い,試験体の製造が可能となった.(3)の試験体を用いた試験については,製造条件の異なる試験体によるNOL引張試験および残留応力測定実験を行い,製造パラメータが強度および残留応力に及ぼす影響の評価を行った.以上より,おおむね順調に推移している.FW法を用いたCFRPの成形において,in-situ加熱成形でのプロセス因子がCFRPの機械的特性に及ぼす影響を明らかにするため,平成31年度に計画している項目を実施予定である.H30年度に作成したプログラムを基に,成形時の応力,ひずみの計算を行い,CFRP中の繊維の状態を推定する.成形時の繊維張力,積層速度および加熱温度をパラメータとする.in-situ加熱成形によるFW成形を行い,円筒形状の試験体を製作する.製作した試験体を用い,微小切削による残留応力測定もしくは切り込み法による残留応力の評価,断面の観察およびNOLリング引っ張り試験を行う.これらの結果をFWモデルにフィードバックし,モデルの精度向上を図る.本課題では,FW法を用いたCFRPの成形において,in-situ加熱成形でのプロセス因子がCFRPの機械的特性に及ぼす影響を明らかにすることを目的とし,成形時に特に重要と思われる,繊維張力,積層速度および加熱温度がCFRP中の繊維の状態(配向度,残留応力)と強度に及ぼす影響を評価する.平成29年度は繊維層の変形を考慮したFW成形モデルの構築と,繊維層での樹脂の流動特性の測定を行った.FW成形モデルについては,まず樹脂流動と硬化反応を除いたモデルを構築した.巻き締めにより繊維層が固くなる現象を半径方向の繊維層弾性率が応力によって変化するモデルとして表現し,シミュレーションプログラムの作成を行った.作成したプログラムを用いて従来行った実験でのパラメータを用いて繊維応力の計算を行った結果,樹脂流動を考慮しない場合では巻き付け繊維張力による積層済み繊維の繊維方向の応力低下の幅は想定よりも小さくなり,このままでは実際の強度低下を説明できないことがわかった.また,繊維層での樹脂の流動測定においては,繊維に直角な方向への樹脂流動について,樹脂圧力と流速の関連を評価した.その結果,繊維層の密度の違いが樹脂流速に大きな影響を及ぼすことが明らかとなり,積層時の繊維幅の制御が重要であることがわかった.また,実際の積層においては,積層直後の樹脂流動が繊維束側方にも発生することから,これらの樹脂挙動についても測定を行い,成形パラメータとの関連を調べた.平成29年度の計画としては,(1)「樹脂マトリクスの流動および硬化反応と繊維層の変形を考慮したFW成形モデルの構築を行う」,(2)「繊維層の面外方向

弾性率および樹脂の流動特性の測定を行う」という計画を立てていたが,(1)のFW成形モデルの構築においては,モデルの基本的な構造は確立できたが,樹脂流動と硬化反応プロセスのモデル化に時間を要している.(2)の樹脂の流動特性の測定においては,(1)のFW成形モデルでの計算に必要な繊維中の初期樹脂量を推定するために積層直後の樹脂挙動を知る必要が出てきたため,これらを測定する実験を追加で実施し,積層パラメータとの関連性を調べた.これらのことから,研究計画に若干の遅れが生じている.本課題では,FW法を用いたCFRPの成形において,in-situ加熱成形でのプロセス因子がCFRPの機械的特性に及ぼす影響を明らかにすることを目的とし,成形時に特に重要と思われる,繊維張力,積層速度および加熱温度がCFRP中の繊維の状態(配向度,残留応力)と強度に及ぼす影響を評価する.平成30年度は繊維層の変形および樹脂流動を考慮したFW成形モデルの構築と,in-situ加熱成形による円筒形状試験体の製作と,NOL引張試験による引張強度試験および微小切削による残留応力測定を行った.FW成形モデルについては,昨年度のモデルを改良し,樹脂流動現象を表すモデルを構築した.樹脂流動により繊維応力が減少し,その影響によって他の層が変形するモデルとして表現し,シミュレーションプログラムの作成を行った.作成したプログラムにより,従来行った実験でのパラメータを用いて繊維応力の計算を行った結果,樹脂流動を考慮しても巻き付け繊維張力による積層済み繊維の繊維方向の応力低下の幅は想定よりも小さくなり,繊維方向応力は負とならないことがわかった.また,繊維張力,積層温度および積層時間をパラメータとしてFWによる円筒形状試験体の製作を行った.製作した試験体を用いてNOL引張試験と微小切削による残留応力の測定実験を行った.NOL引張試験の結果より,積層温度に対する樹脂硬化時間と積層に要する時間の関係が強度発現率の向上に大きな影響を持つことが明らかとなった.また,微小切削による残留応力の測定実験については積層後加熱を行う従来のFW法による試験体において外周から積層CFRPを徐々に切削して応力を解放し,その際のライナひずみの変化を測定することにより残留応力の測定を試みた.その結果,これまでに明らかとなっている従来のFW法を用いた場合の残留応力と測定結果が定性的に一致することがわかった.平成30年度の計画としては,(1)「FW成形モデルに樹脂流動および硬化反応プロセスを導入し,シミュレーションプログラムの作成を行う.作成したプログラムを基に,成形時の樹脂の硬化度と発生する応力,ひずみの計算を行い,CFRP中の繊維の状態を推定する.成形時に特に重要と思われる,繊維張力,積層速度および加熱温度をパラメータとする.」(2)「in-situ加熱成形によるFW成形を行い,円筒形状の試験体を製作する.」(3)「製作した試験体を用い,切り込み法による残留応力の評価,断面の観察およびNOLリング引っ張り試験を行う.」という計画を立てていた.(1)のFW成形モデルの構築においては,樹脂流動による応力変化モデルの構築を行った.
タンパク質の立体構造に基づく新規農薬候補化合物の合理的探索

昨年度までにナミキ商事のライブラリ(2019年4月時点で779万化合物)から農薬として適した物性値を持たない化合物(20%程度)を除外し、また塩の場合は対イオンを削除したうえで、実行速度の速いツールbayonを用いたクラスタリング結果を検討した。さらに分割した各クラスターから代表性が高いと考えられる分子を選択するアルゴリズムを考案した。固有ベクトル中心性の高い分子では必ずしも代表性が高いとは思われなかったため、各クラスタ内のサブクラスタ中最大のクラスタを用いて共通骨格を抜き出し、この共通骨格に最も近い分子を基のクラスタ中から選択することとした。代表構造を3次元の分子にする際、光学異性体についてキラル中心の数と幾何異性の数の合計をNをとすると2^N個の組み合わせについて3次元分子の作成をrdkitで試み、所定の回数以内で目的の組み合わせが実現できるかどうか、できた分子が歪んでいないかを判定するアルゴリズムを考案した。さらに幾何異性体への対応、光学異性に依存した光学異性への対応や、メソ異性体を判定して重複を避ける、などの課題を解決すべくアルゴリズムを改良した。開発の可能性、ドッキングシミュレーション結果の処理の点から異性体の数が9個を超える分子については計算対象としないこととした。なおキラル中心、幾何異性の数が多くても実際に可能な異性体は少数にとどまるケースがあるため、実際に異性体を発生させて確認する必要があるが、計算時間を考慮してキラル中心、幾何異性の数の合計が10を超える分子については計算を省いた。不斉軸、不斉面、アトロプ異性体、ヘリシティ、位相異性体についても現段階では考慮しないこととした。現在得られた3次元分子を用いてアセト乳酸合成酵素の立体構造を標的とするドッキングシミュレーションを検討中である。化合物の取扱いに用いているRDKitのバージョンアップによって、化合物の3次元化の判定が厳しく設定され、実際には可能な異性体が作成できなくなるという弊害が起き、その対応に時間がかかったため。使用するソフトウェアのバージョンを古いものに固定することとする。最新のナミキのライブラリー約650万化合物から構築した3次元分子のライブラリーに対してアセト乳酸合成酵素の野生型および薬剤抵抗性変異体についてドッキングシミュレーションを行い、候補化合物を購入、活性測定を行う。一般に利用できる化合物ライブラリはZINCが約2270万品目、ナミキ商事のSupplier在庫が515万品目などとなっており、農薬として適した物性値を持つ化合物を選抜する絞り込みが不可欠となる。そのためのパラメータとして医薬品に於いてはLipinskiのRule of 5等が用いられているが、農薬に於いてもTice(2001)、Hao(2011)、Avram(2014)などの提案がある。これらを参考にパラメータを検討し、ナミキ商事の515万品目に対して絞り込みを行うと、パラメータ設定により20%から4.4%の品目を除外できることが分かった。スクリーニング用途の化合物ライブラリではあらかじめ医薬品として適したものがある程度選抜されているが、重ねて農薬を念頭においた絞り込みを行うことでかなりの品目数が除外されることが分かった。また、分子の形が似ているものについては代表構造を取り出すクラスタリングにより品目数を減らすことが可能である。クラスタリングには様々な手法があるが、実行速度の速いRepeated Bisection法を採用したツールbayonをここでは用いた。クラスターサイズの分布、適宜抽出したクラスター中の化合物の目視による確認をして分割結果を参照しつつ実行パラメータを検討した結果、50万から150万品目程度のクラスターに分割するのが適当であることが分かった。現在50万程度の化合物セットに対し、ドッキングシミュレーションを実行する準備を進めている。申請時までのスクリーニングで得られたアセト乳酸合成酵素を阻害するリード化合物について、酵素との複合体の結晶を得た。また、自由エネルギー計算ソフトウェアHydeの利用を検討したがデモライセンスを用いて確認した結果、本ソフトウェアは多数の化合物の自由エネルギー計算を行う初期スクリーニングには適さないことがわかった。申請時には4月より研究を開始できる予定であったが、3月まで併任で着任していた研究企画調整室研究戦略チーム長の任期が5月まで延長となり、4月及び5月の予定を変更せざるを得なかった。また、515万品目のライブラリを用いた計算時間は当初の予定と大きくは変わらなかったものの、計算結果の解析に当初の想定よりも時間を要した。昨年度までに一般に利用できる化合物ライブラリ(ZINCが約2270万品目、ナミキ商事のSupplier在庫が515万品目など)から農薬として適した物性値を持たない化合物(パラメータ設定により20%から4.4%)のを除外したうえで、実行速度の速いツールbayonを用いたクラスタリング結果を検討し、ナミキ商事のライブラリの場合50万から150万品目程度のクラスターに分割するのが適当であることが分かった。今年度は分割した各クラスターから代表構造を取り出すのにあたり、当初は固有ベクトル中心性を用いることを想定していたが、実際に計算してみると必ずしも適当とは思われない分子が選ばれることも多いことが判明した。そこで固有ベクトル中心性を参考にしつつ、代表性が高いと考えられる分子を選択するアルゴリズムを考案した。プログラムにはpython-igraphを用いた。クラスタリングの結果と代表構造の選抜結果を各クラスターごとにhtml形式でわかりやすく表示するとともに、gml形式で出力して必要に応じて適宜参照・検討できるようにした。

次いで代表構造を3次元の分子にするため、まず光学異性体についてキラル中心の数をNとすると2N個の可能性があるが、そのすべてが存在できるとは限らないものの、あらかじめどの組み合わせが可能か知ることもできないので、すべての組み合わせについて3次元分子の作成をrdkitで試み、所定の回数以内で目的の組み合わせが実現できるかどうか、できた分子が歪んでいないかを判定するアルゴリズムを考案した。さらに、これらのライブラリ中には異性体の数が数万程度のものも存在することが判明したので、各化合物についてエネルギーの高い異性体の集団を除外することとし、分子数の1.5倍程度の異性体数となるように調整した。今後得られた3次元分子を用いてドッキングシミュレーションを実行する。クラスタリング結果からの代表構造の選抜に適当な既存の手法がないことは当初想定しておらず、アルゴリズムの考案、プログラミングに時間を要した。また、特に光学異性体について、複数のキラル中心があるものの、実際にはR/Sのいづれかしかとることができないキラル中心と両方可能なキラル中心が混在する化合物についても当初想定しておらず、その場合可能なすべての光学異性体を得ることが簡単にはできないことが判明した。これについてもプログラミングに時間を要したため、実際のドッキングシミュレーションにまでは至らなかった。昨年度までに商用化合物ライブラリ(ZINCが約2270万品目、ナミキ商事のSupplier在庫が515万品目など)から農薬として適した物性値を持たない化合物(パラメータ設定により20%から4.4%)を除外したうえで、実行速度の速いツールbayonを用いたクラスタリング結果を検討し、ナミキ商事のライブラリの場合50万から150万品目程度のクラスターに分割するのが適当であることが分かった。さらに分割した各クラスターから代表性が高いと考えられる分子を選択するアルゴリズムを考案した。固有ベクトル中心性の高い分子では必ずしも代表性が高いとは思われなかったため、共通骨格を判定して共通骨格に近い分子を選択することとした。代表構造を3次元の分子にする際、光学異性体についてキラル中心の数をNとすると2^N個の組み合わせについて3次元分子の作成をrdkitで試み、所定の回数以内で目的の組み合わせが実現できるかどうか、できた分子が歪んでいないかを判定するアルゴリズムを考案した。さらに幾何異性体への対応、光学異性に依存した光学異性への対応や、メソ異性体を判定して重複を避ける、などの課題を解決すべくアルゴリズムを改良した。また、開発の可能性、ドッキングシミュレーション結果の処理の点から異性体の数が8個を超える分子については計算対象としないこととした。不斉軸、不斉面、アトロプ異性体、ヘリシティ、位相異性体についても現段階では考慮しないこととした。光学異性体の処理のプログラミングに時間を要したため、実際のドッキングシミュレーションにまでは至らなかった。
開発政策における社会ネットワークデータの応用

本研究課題の目的は、途上国における開発政策に対して社会ネットワークの情報をどのように開発政策に活かすことができるかを理論的・実証的に明らかにすることである。しかしながら、これらの分析をするためのより基礎的な計量経済学的フレームワークが存在していないため、本年度は計量経済学的フレームワークの開発に従事した。具体的には、下記二つの研究に従事した。第一に、修士課程の時より進めてきた,多数のネットワークが観察される時のネットワーク形成モデルの相互安定均衡における構造推定に関する論文の発表、精査、投稿を行った。この研究は、相互安定均衡と呼ばれるネットワーク経済学の文脈では頻繁に使われる均衡概念のもとで効用関数のパラメータを推定する、初めてのフレームワークを与えた。しかしながら多くの応用、特に私が応用先として考えている途上国のデータでは、多数のネットワークが観察されるケースは少なく、一つのネットワークしか観察されない場合の構造推定のフレームワークの開発も必要とされた。そのため、第二の研究として、ノースウェスタン大学の渡辺安虎助教授との共同研究として、ネットワークが一つしか観察されない時のネットワークモデルの相互安定均衡の構造推定に関する研究を進めた。これらの研究は、これまで社会ネットワークの分析をするにあたって大きな障害となってきた計量経済学的フレームワークの非存在という問題に一定の解決方法を与えるものであり、本研究課題に対しても有意義なものであったと考えられる。
卵巣の冷蔵およびガラス化凍結による未成熟卵母細胞の保存

1.基礎保存液組成の検討:マウス桑実胚を0°Cに保存する場合、蔗糖(0.75M)の添加が有効であることが知られている。生存性の判定の容易なマウス2細胞期胚桑実胚を用いて,適する冷蔵保存液の組成を検討した結果、(1)蔗糖の適濃度は発育段階により異なる、(2)発育段階の初期の胚の方が保存可能期間が短い、(3)保存液のpHは中性弱アルカリ性が適している、(4)保存液の緩衡系は、リン酸塩(PB1液)、重炭酸塩(KRB液)に比べ、HEPES(M2)が適している、ことが明らかとなった。2.マウス卵巣の冷蔵保存:PMSG注射後48時間目のICR系雌マウスから卵巣を取り出し、0°CのM2液に保存したのち卵胞卵を採取して培養し、正常形態率およびMetaphaseIIへの成熟率をしらべた。その結果、(1)1時間保存しても生存性は低下せず、低温に対する感受性は認められなかった。(2)保存液への蔗糖の添加は、0.51.0M区で効果が認められた。(3)しかし、保存期間と共に生存率は低下し、48時間後の正常形態卵率は48%、MetaphaseII率は19%であった。3.家兎卵巣の冷蔵保存:FSH処理後12時間目の雌家兎から卵巣を取り出し、冷蔵保存したのち卵胞卵を培養した結果、保存液に蔗糖を添加しても、短期間で大部分の卵子が死滅した。これは、ムチン層の付着した家兎胚の冷蔵保存可能期間が極めて長いのとは対照的であった。4.卵巣および卵胞卵のガラス化保存:卵巣を、そのままあるいはスライスした後、EFS液(40%Ethylene glycol+18%Ficoll+0.3Mー蔗糖添加PB1)に浮遊させて-196°Cにガラス化保存した結果、融解後の卵巣からは、全く生存卵子は得られなかった。新鮮卵巣から卵胞卵を採取後ガラス化保存した結果、低率ながら生存卵子が回収された。以上の結果より、冷蔵状態では卵巣の保存が可能であるが、現段階では、ガラス化状態の保存は卵子を採取して保存することが必要である。
歯髄幹細胞の同種移植に向けた免疫原性コントロールの解明

歯髄幹細胞は、乳歯・永久歯から簡便に得られる細胞で、間葉系幹細胞の性質を有し、様々な全身疾患に治療効果を示すことが報告されている。今後、汎用性の高い医療として患者に提供するためには、同種移植の有用性を示すことが必要であると考えられる。そこで、同種移植の際に重要となる免疫機構について検討し、歯髄幹細胞を用いた同種移植治療の実現を目指す。
抗真菌薬の耐性機構の分子生物学的解析と新たな治療の試み

AIDS患者から分離されたCandida albicans菌株に関して、アゾール系抗真菌をはじめ各種抗真菌薬の薬剤感受性試験をNCCLS法に基ずく薬剤感受性試験法によって測定した。その結果、本邦の分離菌株(東京大学医科研究所および横浜市立大学医学部から分与)の中にもアゾール系抗真菌薬に高度耐性を認める菌株を5%に検出された。さらにオーストリアのAIDS患者の口腔内カンジダ症から分離された高度耐性株を用いて、その薬剤耐性機構が非特異的な薬剤排出に起因し、その排出能を蛍光色素であるローダミン6Gを用いて定量化することが可能となり、高度耐性株では細胞外のローダミン6Gの量が感受性株に比べて極めて低いことが証明された。また、この排出機構はATP依存症の分子生物学的機構に依存し、その発現を調整している遺伝子がCDR遺伝子とCaMDR遺伝子と推定され、前述のローダミン6Gを用いた検出系はCDR遺伝子発現株に限って検出されることが証明された。また、ATP依存症の薬剤排出ポンプの作用を特異的に抑制するとされる薬剤を用いて、薬剤感受性および細胞内の薬剤の取り込み量が回復するかを検討した。その結果、ヒト癌細胞で薬剤排出ポンプを競合抑制するFK506(tacrolimus)を添加することによって、耐性菌株の薬剤感受性が回復するとともに、RI標識したアゾール系抗真菌薬の細胞内取り込みが増強することが確認された。今後、さらに他の薬剤を検討し、また動物感染実験による治療効果を確認した。AIDS患者から分離されたCandida albicans菌株に関して、アゾール系抗真菌薬をはじめ各種抗真菌薬の薬剤感受性試験をNCCLS法に基ずく薬剤感受性試験法によって測定した。また、この排出機構はATP依存性の分子生物学的機構に依存し、その発現を調整している遺伝子がCDR遺伝子とCaMDR遺伝子と推定され、前述のローダミン6Gを用いた検出系はCDR遺伝子発現株に限って検出されることが証明された。また、ATP依存性の薬剤排出ポンプの作用を特異的に抑制するとされる薬剤を用いて、薬剤感受性および細胞内の薬剤の取り込み量が回復するかを検討した。今後、さらに他の薬剤を検討し、また動物感染実験による治療効果を確認し、アゾール耐性C.albicans感染症治療における有効な治療法を検討する。AlDS患者から分離されたCandida albicans菌株に関して、アゾール系抗真菌薬をはじめ各種抗真菌薬の薬剤感受性試験をNCCLS法に基ずく薬剤感受性試験法によって測定した。さらにオーストリアのAlDS患者の口腔内カンジダ症から分離された高度耐性株を用いて、その薬剤耐性機構が非特異的な薬剤排出に起因し、その排出能を蛍光色素であるローダミン6Gを用いて定量化することが可能となり、高度耐性株では細胞外のローダミン6Gの量が感受性株に比べて極めて低いことが証明された。