hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
クラスリン・アダプター様タンパク質の細胞内タンパク質輸送における役割

クラスリン被覆小胞は,トランスゴルジネットワーク(TGN)からリソソームへのタンパク質輸送や,細胞膜からの受容体分子のエンドサイトーシスなどに関与する。TGN膜や細胞膜へのクラスリンの結合は,アダプタータンパク質複合体により仲介される。TGNでのクラスリン被覆小胞の形成にはAP-1複合体が、細胞膜ではAP-2複合体が関与する。これらは,2つのlarge鎖、1つのmedium鎖,1つのsmall鎖で構成される。また最近,TGNやエンドソームで機能する新たなアダプター様複合体AP-3やAP-4も,我々や他の研究グループにより同定された。また我々は,AP-1複合体のlarge鎖のひとつγ-アダプチンのC末端に存在するイアー・ドメインと相同性を有する3種類の新奇のタンパク質(GGA1-GGA3)を同定し,TGNで機能することを示した。本研究ではこれらのアダプタータンパク質に関して以下のことを明らかにした。1.AP-1複合体のlarge鎖のひとつγ-アダプチンやGGAが,C末端のイアー・ドメインを介して,TGNで機能するタンパク質γ-シナージンや小胞の融合に働くラバプチン5と結合することを示した。さらには,γ-アダプチンのイアー・ドメインのX線結晶構造解析を行い,γ-シナージンやラバプチン5との結合様式を明らかにした。2.GGAのN末端にあるVHSドメインが,TGNから輸送される積み荷タンパク質であるマンノース6リン酸受容体やソーティリンの酸性アミノ酸クラスター・ジロイシン(ACLL)モチーフに結合することを明らかにした。さらには,GGAのVHSドメインとACLLペプチドの複合体のX線結晶構造解析を行い,その結合様式の詳細を明らかにした。クラスリン被覆小胞は、トランスゴルジネットワークからリソソームへのタンパク質輸送や、細胞膜からのエンドサイトーシスに関与する。クラスリン被覆小胞の形成は、輸送されるべき積み荷タンパク質の細胞質領域に存在する輸送シグナル(チロシン・シグナルなど)を認識してアダプタータンパク質(AP)複合体が結合し、そこにクラスワンを呼び寄せることにより始まる。AP複合体はこれまでに3種類(AP-1、AP-2、AP-3)知られており、それぞれ4つのサブユニット(AP-1、γ,β1,μ1,σ1:AP-2、α,β2,μ2,σ2:AP-3、δ,β3,μ3,σ3)で構成されている。これらのうち、μサブユニットは直接チロシン・シグナルに結合する。本研究では以下のことを明かにした。1. γおよびσ1と高い相同性を示す新奇のアダプター様サブユニットγ2およびσ1Bを同定した。γ2サブユニットは、γとは異なりエンドソーム様の構造に局在していた。また、酵母two-hybridシステムを用いて既知のAPサブユニットとの相互作用を調べた結果、これらの新奇のアダプター様サブユニットは、新たなAP複合体を形成する可能性を示した。2. μ2サブユニットの遺伝子を解析し、この遺伝子が12のエクソンから成ること、エクソン5の選択的スプライシングにより2種類のμ2 mRNAが生じることを明かにした。3.酵母two-hybridシステムを用いてμ1、μ2、μ3の各サブユニットとチロシン・シグナルの相互作用を調べることにより、これらがチロシン残基近傍のアミノ酸配列を区別して認識し、異なるタンパク質の輸送に関与する可能性を示した。クラスリン被覆小胞は、トランスゴルジネットワーク(TGN)からリソソームへのタンパク質輸送や、細胞膜からの受容体分子のエンドサイトーシスなどに関与する。TGN膜や細胞膜へのクラスリンの結合は、アダプタータンパク質複合体により仲介される。TGNでのクラスリン被覆小胞の形成にはAP-

1複合体が、細胞膜ではAP-2複合体が関与する。これらは,2つのlarge鎖、1つのmedium鎖,1つのsmall鎖で構成される。また最近,エンドソームで機能する新たなアダプター様複合体AP-3も同定された。しかし、TGNと細胞膜との間の小胞輸送は複雑で、これら以外にも別のアダプターが存在する可能性が考えられる。申請者らはこれまでに、large鎖のホモログを3種類、medium鎖のホモログを3種類,small鎖のホモログを2種類発見し、これらのcDNAの全構造を決定した。本研究では、これらのアダプター複合体に関して以下のことを明らかにした。1.新奇のアダプター様複合体AP-4が、ε、β4、μ4、σ4の4つのサブユニットで構成されること、およびこれらのサブユニット間の相互作用の様式を明らかにした。また、AP-4複合体はTGNとエンドソームの間で機能する可能性を示した。2.新奇のmedium鎖μ1Bが、これまでに知られていたAP-1複合体のサブユニットγ、β1、σ1とともに別の複合体AP-1Bを形成すること、および上皮細胞特異的に発現してTGNから基底側膜側への選択的な小胞輸送に関与することを明らかにした。クラスリン被覆小胞は、トランスゴルジネットワーク(TGN)からリソソームへのタンパク質輸送や、細胞膜からの受容体分子のエンドサイトーシスなどに関与する。TGN膜や細胞膜へのクラスリンの結合は、アダプタータンパク質複合体により仲介される。TGNでのクラスリン被覆小胞の形成にはAP-1複合体が、細胞膜ではAP-2複合体が関与する。また最近,TGNやエンドソームで機能する新たなアダプター様複合体AP-3やAP-4も,申請者らや他の研究グループにより同定された。本研究では新奇のアダプター様タンパク質に関して以下のことを明らかにした。1.AP-1複合体のlarge鎖のひとつγ-アダプチンのC末端に存在するイアー・ドメインと相同性を有する3種類の新奇のタンパク質(GGA1-GGA3)を同定した。2.GGAはいずれも,N末端側からVHSドメイン,GGAHドメイン,プロリン・リッチ領域,γ-アダプチンのイアー・ドメインと相同なドメイン(AGEHドメイン)を有していた。3.GGAはいずれもTGNに局在し,クラスリン/AP-1コート小胞の出芽を調節する可能性を示した。4.GGAHドメインには低分子量GTP結合タンパク質ARFが,AGEHドメインにはラバプチン5やg-シナージンが結合することを明らかにした。クラスリン被覆小胞は,トランスゴルジネットワーク(TGN)からリソソームへのタンパク質輸送や,細胞膜からの受容体分子のエンドサイトーシスなどに関与する。TGN膜や細胞膜へのクラスリンの結合は,アダプタータンパク質複合体により仲介される。
サンゴ－海草混合群落の形成に関与する活性物質の解明

沖縄県備瀬海岸のサンゴ礁池で観測されるエダコモンサンゴとリュウキュウスガモの混合群落の形成に関与する化合物を探索するため、リュウキュウスガモ抽出物がエダコモンサンゴ幼生に対してどのような影響を与えるのか検討した。また、コントロール実験として、コユビミドリイシの隠蔽種Acropora sp. 1幼生を用いた。その結果、リュウキュウスガモ抽出物からエダコモンサンゴ幼生に対して毒性を示すカフェ酸を単離した。また、カフェ酸は0.0018 mg/ml0.18 mg/mlの濃度ではエダコモンサンゴ幼生に対して影響を示さないが、Acropora sp. 1幼生の形態を変化させることが明らかとなった。昨年度の研究から、リュウキュウスガモ抽出物にはサンゴ幼生に対して毒性を示す化合物が含まれることが明らかとなり、各種クロマトグラフィーを用いて分離、精製を進めた結果、毒性物質としてカフェ酸を単離した。リュウキュウスガモから単離したカフェ酸は0.4 mg/mlでエダコモンサンゴ幼生に対して致死活性を示し、それより低い濃度ではエダコモンサンゴ幼生に影響を示さないことが明らかとなった。また、Acropora sp. 1幼生を用いて同様の実験を行ったところ、カフェ酸は0.0018 mg/ml0.18 mg/mlの濃度でA. sp. 1幼生の形態を変化させることが明らかとなった。カフェ酸はエダコモンサンゴ幼生に対して、0.4 mg/ml以下の濃度でサンゴ幼生に対して影響を示さないのに対し、A. sp. 1幼生に対しては、その形態を変化させる作用を示すことから、異なる種のサンゴ幼生に対するカフェ酸の作用が顕著に異なることが明らかとなった。今回用いたエダコモンサンゴ幼生は褐虫藻を有し、A. sp. 1幼生は褐虫藻を持たないことから、カフェ酸の幼生に対する作用の違いは褐虫藻の有無に関係している可能性があるため、今後はさらに多くのサンゴ幼生に対してカフェ酸の影響を調べる予定である。また、リュウキュウスガモに含まれるカフェ酸の定量を行った。備瀬海岸で定期的にリュウキュウスガモを採集し、カフェ酸を定量したところ、サンゴの産卵期である5月から9月の間はカフェ酸の含有量が少ないことが明らかとなった。さらに、カフェ酸の含有量が最も多い月と少ない月では約200倍の差があることが明らかとなった。今後は、カフェ酸がサンゴ幼生、又は他の付着生物に対してどのような影響を与えているか詳細に検討する予定である。リュウキュウスガモから単離したカフェ酸を用いてコユビミドリイシの隠蔽種Acropora sp.1幼生に対する作用を詳細に検討したところ、濃度0.005 MでA. sp.1幼生の外胚葉が剥離し、外胚葉と内胚葉が分離することが明らかとなった。サンゴを含む刺胞動物は二胚葉性で、外胚葉と内胚葉の2層からなり、これらの間には中膠と呼ばれる細胞外マトリックスが存在する。中膠は膠原繊維で構成されており、外胚葉と内胚葉を連結している。今回の実験で外胚葉と内胚葉が分離したことから、中膠が消失した可能性が示唆された。また実際に中膠は観察されなかった。また市販されているカフェ酸を用いてエダコモンサンゴ幼生とコユビミドリイシ幼生に対する作用を検討したところ、濃度0.005 Mでコユビミドリイシ幼生の外胚葉が剥離したが、形が崩れる幼生が多く、外胚葉がきれいに剥離したA. sp.1幼生の場合と異なる結果となった。さらにエダコモンサンゴ幼生の外胚葉は剥離しないことが明らかになったことから、異なる種のサンゴ幼生に対するカフェ酸の作用が顕著に異なることが明らかになった。同時性雌雄同体種であるエダコモンサンゴは胃腔内で親から褐虫藻が感染した卵と精子が形成され、それらが体外へ放出され受精、発生してプラヌラ幼生となる。プラヌラ幼生は数日から数か月間浮遊幼生期を過ごし、着底、変態を経て成体になる。成体サンゴは移動することが出来ないため、備瀬海岸で観察されるリュウキュウスガモとエダコモンサンゴの混合群落の形成には、エダコモンサンゴの浮遊幼生が深く関わっていると考えられる。そこでリュウキュウスガモ抽出物がエダコモンサンゴ幼生に対してどのような影響を与えるのか検討した。2011年6月7日に備瀬海岸よりエダコモンサンゴを採集し、瀬底研究施設屋内にある海水オーバー・フロー水槽で飼育した。6月15日午後7時半、16日午後8時にエダコモンサンゴが産卵したため、当日中に受精卵をプラスチック容器に移した。

また受精卵飼育容器の飼育海水は毎日90%以上入れ替え飼育した。受精してから48時間飼育したエダコモンサンゴ幼生を用いて活性試験を行った。ガラスシャーレにリュウキュウスガモ抽出物、及びリュウキュウスガモ抽出物を細かく分画した画分を添加し、溶媒が蒸発するのを待って、そこに人口海水と浮遊幼生を入れた。その後2728°Cで2週間飼育し、24時間ごとにサンゴ幼生を観察した。サンゴ幼生の密度は1匹/ml、抽出物の濃度は0.1 mg/mL1 ug/mLに調整し活性試験を行った。その結果、サンゴ幼生の着底、変態などは観察されず、リュウキュウスガモ抽出物にサンゴ幼生に対して毒性を示す化合物が含まれていることが明らかになった。サンゴ幼生とリュウキュウスガモの生物間相互作用に関与する化学物質を解明するためにはサンゴ幼生の確保が重要な課題となる。本年度の実験では、成体サンゴ飼育施設を琉球大学熱帯生物圏研究センター瀬底研究施設とし、その特徴を活かした飼育方法を考案することで、エダコモンサンゴ幼生と、A. sp. 1幼生を大量に確保する事に成功した。また、得られたサンゴ幼生に対するリュウキュウスガモ抽出物の作用を調べたところ、リュウキュウスガモ抽出物にはサンゴ幼生に対する毒性物質が含まれることが明らかとなり、各種クロマトグラフィーを用いて分離、精製を進めたところ、エダコモンサンゴ幼生に対する毒性物質としてカフェ酸を単離した。カフェ酸はサンゴ幼生に対して低濃度で毒性を示すことから付着生物の付着阻害物質として機能している可能性がある。また、リュウキュウスガモが生産するカフェ酸は季節により大きく異なることが明らかとなり、サンゴの産卵期である5月から9月の間はカフェ酸の含有量が少ないという興味深い結果が得られた。今後はカフェ酸がエダコモンサンゴ幼生、A. sp. 1幼生以外のサンゴ幼生や他の付着生物の幼生に対してどのような影響があるのか調べることで、リュウキュウスガモとエダコモンサンゴ幼生の混合群落の形成について新しい知見を得る事が出来ると考えられる。本年度の実験では、成体サンゴ飼育施設を琉球大学熱帯生物圏研究センター瀬底研究施設とし、その特徴を活かした飼育方法を考案することでサンゴ幼生を大量に確保することに成功した。活性試験用の成体サンゴは、長時間水槽内で飼育すると、環境の変化により産卵しない可能性もあるため、活性試験用の成体サンゴは、エダコモンサンゴの産卵期に沖縄県備瀬海岸付近で採集し、瀬底研究施設屋内にある海水オーバー・フロー水槽で飼育した。また水槽内のサンゴ成体は、水深1020 cmに調整した台に一定の間隔で配置した。以上の条件でエダコモンサンゴに大きなストレスをかけることなく飼育できたと考えられる。成体サンゴを水槽で飼育して約1週間後エダコモンサンゴは産卵し、大量の受精卵を確保することが出来た。得られた受精卵は受精卵飼育シャーレに移し、飼育海水を毎日90%以上入れ替えた。受精してから48時間飼育したエダコモンサンゴ幼生を用いて活性試験を行ったところ、リュウキュウスガモ抽出物にエダコモン幼生に対して致死活性を示す化合物が含まれていることが明らかとなった。この化合物はリュウキュウスガモが付着生物から身を守るために役立っていると考えられる。今後はこの化合物の単離、構造決定、またサンゴ幼生以外の付着
自身の膜上発現密度に依存して性質の変化するイオンチャネルポアの解析

イオンチャネル型のATP受容体P2Xは、時間依存的にイオン選択性が変化することや、記録ごとにうち向き整流性の強度がばらつくなどの特徴あるポアの性質を持つことが知られている。本研究課題において昨年度我々は、P2X2受容体の膜上発現密度とチャネルの性質の相関を解析し、「膜上に存在する「開状態」のチャネルの密度に依存してP2X2受容体はポアの性質やリガンド感受性が変わる。」という結果を得た(Journal of Physiology(2004))。上述したチャネルの膜上発現密度は、細胞膜上のチャネルタンパク量と膜リン脂質量のバランスと言い換えることが出来る。本年度はこの点に着目し細胞膜リン脂質量とチャネルの性質の相関を電気生理学的手法、薬理学的手法及び、タンパク質生化学的手法を用いて解析した。実験結果より「開状態のP2X2受容体の細胞内領域膜近傍に細胞膜リン脂質が静電気的に直接結合することにより開状態の安定を引き起こす。リン脂質とP2X2受容体の結合が減弱しポアの安定性が失われた際にイオン選択性が変化し、その後P2X2受容体は脱感作する。」という結論を導いた。細胞膜リン脂質が直接チャネルのゲート開閉に関わるという知見は新しいものである(現在投稿中)。このリン脂質による修飾が発現密度によるポアの性質の修飾機構に直接的に何らかの関わりを持つ可能性があると考えて、現在さらなる統合的な解析を遂行中である。我々は、アフリカツメガエル卵母細胞にP2X2を発現させ2本刺し膜電位固定下でATP投与後の電流を記録した結果、内向き整流性のばらつきが発現密度に相関することを見いだした。これを手がかりとして、受容体の種々の性質を発現レベルとの関連において解析し以下の知見が得られた。(1)P_<K+/PNa+>の発現密度に依存した変化は観察されなかったが、P_<NMDG+/PNa+>は発現密度と負の相関を示した。(2)内向き整流性の強弱は発現密度と負の相関を示した。脱分極パルス直後に観察される外向き電流(I_<initial>)は、経時的に減衰し定常レベルに(I_<steady>)に達した。I_<initial>およびI_<steady>の、内向き電流の大きさに対する割合はどちらもチャネルを高発現にすることによって増加した。(3)高濃度のATP(100μM)により弱い内向き整流性電流を呈する発現密度の高い細胞に、低濃度ATP(3μM)を投与するとその内向き整流性は増強した。(4)[ATP]-応答関係のKdの値は発現密度と負の相関を示した。Hill係数は発現密度に相関なく一定値2であった。(5)ポア上部の点変異I328Cにより上記の発現密度に依存したポアの性質の変化がほぼ消失した。以上の結果から「膜上に存在する「開状態」のチャネルの密度に依存してP2X_2受容体はそのポア上部においてなんらかの構造変化を引き起こし、ポアの性質やリガンド感受性が変わる。」という結論に至った。
軌道縮退電子系における揺らぎと相転移の動力学的理論

・軌道揺らぎを取り入れた理論の定式化まず我々は,既存の平均場理論をそのまま用いるのではなく,これを揺らぎの効果を取り入れることができるように拡張した。本理論は空間次元が無限大の極限で厳密になる。本研究で定式化した理論は,古典スピン系のspherical model近似を量子スピン系に拡張したものであり,フェルミ粒子系を局在させた理論よりも精度のよいものである。・軌道縮退電子系CeB_6及びCe_<0.75>La_<0.25>B_6の奇妙な秩序の解明CeB_6のIII相に見られる奇妙な磁気秩序を,次隣接サイト間の擬双極子相互作用の存在を仮定して説明した。また,Ce_<0.75>La_<0.25>B_6において新しく発見されたIV相が八極子秩序である可能性を議論した。今までに観測されている相の他に,エネルギー的に近い相があることを見出した。これは,一軸性圧力などの外場で実現する可能性がある。この議論のために,Ginzburg-Landau展開を微視的に行うことのできる新しい汎関数積分法を開発した。・軌道縮退電子系における軌道・スピン波励起複雑な軌道・スピン秩序状態からの素励起の分散関係を導出した。秩序状態の単位胞が16個のCe原子を含むため,素励起のプランチは48本ある。これをすべて求め,スペクトルと多極子相互作用には特徴的な関連があることを見出した。・1次元軌道縮退系の厳密な動力学以上は,3次元系を対象にした研究である。一方,低次元系では揺らぎの役割が格段に増加する。その様相を最も明快な形で見るために,我々は1次元の厳密に解けるモデルを研究した。このモデルは軌道とスピンの縮退をSU(4)に単純化し,交換相互作用が距離の2乗に反比例(1/r^2)している。我々は,厳密な動的相関関数を実際に厳密に求めることに成功した。軌道自由度の果たす役割を異なる角度から研究した。第1の方向は,近藤効果が軌道縮退によってどのように影響するかを繰込みの手法で研究するものである。このために,まず高次の繰込みを体系的に行なう摂動的方法を定式化した。この方法を用いて,Ce_xLa_<1-x>B_6を想定したモデルの詳細な解析を行なった。四重縮退した結晶場基底状態のf電子が伝導電子と相互作用する際には,従来仮定されてきた単一の結合定数では不十分で,時間反転対称性の違いを考慮して少なくとも2つの結合定数を取る必要があることを示した。この相互作用定数が著しく異なっている場合には,軌道近藤効果のエネルギー尺度がスピン近藤効果のそれとずれ,中間温度領域で非フェルミ液体的挙動が現れることを示した。第2の方向は,我々の開発した無限次元で厳密になる理論的方法で,サイト間の相互作用による揺らぎ効果を研究するものである。本年度の研究では,揺らぎを静的に扱うために,まだ近藤効果は考慮できない。しかし,軌道縮退系の秩序が揺らぎで強く影響される効果を有限磁場の下で理解することができる。磁場に誘起された異方性の効果で軌道の揺らぎが抑えられ,この度合いが揺らぎの成分数が大きい場合に特に著しいことを示した。

また,転移点以上の温度での比熱を計算し,揺らぎによる特徴的なピークが現れることを示した。本年度の研究の主な結果を以下に記す。1.軌道縮退系Ce_xLa_<1-x>B_6において,x0.75で現れる奇妙な相(IV相)の秩序パラメータはまだ同定されていない。我々は,これを八重極の秩序とする仮説を立て,実験的に観測されている顕著な弾性異常を説明した。すなわち,八重極の秩序があると,四重極揺らぎと反強磁性の揺らぎが混合し,弾性率のソフト化の原因は,後者の揺らぎが温度の降下と共に育つことにある,と議論した。.2.揺らぎの効果を予断なく考慮するために,軌道縮退をSU(4)対称性に単純化したモデルを取った。高温展開法により,1次元系から3次元系にわたってこのモデルの熱力学的諸量を導出した。1次元におけるエントロピーは外挿法を工夫することにより,全温度領域で正確に求められた。多次元系においては,比熱のピークを与える有限の温度が存在することを示した。3.f^2状態においては局在した単重項状態が可能であり,混成の増加により遍歴した状態に連続的に変化すると考えられる。我々は,結晶場単重項基底状態と三重項励起状態が存在する場合には,軌道縮退と近藤効果の競合により,電子対が形成されるとする新機構を提案した。この電子対の波動関数は,軌道の交換に対して対称,スピンについては反対称である。逆に結晶場三重項が基底状態の場合には,スピン三重項の電子対が形成される。本年度の主な研究成果を以下に記す。・軌道縮退電子系CeB_6及びCe_<0.75>La_<0.25>B_6の奇妙な秩序の解明CeB_6のIII相に見られる奇妙な磁気秩序を,次隣接サイト間の擬双極子相互作用の存在を仮定して説明した。また,Ce_<0.75>La_<0.25>B_6において新しく発見されたIV相が八極子秩序である可能性を議論した。今までに観測されている相の他に,エネルギー的に近い相があることを見出した。これは,一軸性圧力などの外場で実現する可能性がある。この議論のために,Ginzburg-Landau展開を微視的に行うことのできる新しい汎関数積分法を開発した。・軌道縮退電子系における軌道・スピン波励起複雑な軌道・スピン秩序状態からの素励起の分散関係を導出した。秩序状態の単位胞が16個のCe原子を含むため,素励起のブランチは多数ある。これをすべて求め,スペクトルと多極子相互作用には特徴的な関連があることを見出した。特に,ほとんど分散のない波数方向があるので,中性子散乱などで検出できる可能性がる。・弾性定数に対する歪みの2次の効果軌道縮退系の磁場下の弾性定数においては,2次の歪みが重要であることを指摘し,CeB_6系の弾性定数の温度,磁場依存性を導出した。磁場中の弾性定数は古くから議論されているが,研究者によってまちまちな結論が得られていた。本研究はこれを正し,CeB_6で従来謎であった奇妙な振る舞いを説明した。
ツメガエル四肢の再生能に関する研究

有尾両生類の四肢の再生は古くから研究されてきた発生生物学のテーマである。四肢の切断後、再生芽が形成され、最終的にもとと同じ構造を持った四肢が形成される過程は、器官再生機構の解析だけでなく、パターン形成機構の解析にも大きく貢献してきた。さらに再生医療の最も典型的な例として、ヒトの失われた四肢を再生することの基礎研究が多くの研究者によって始められている。しかしヒトを含めて哺乳類の四肢は指先を除いてほとんど再生しない。鳥類、爬虫類も同様である。このように完全な四肢再生が可能な有尾両生類と、四肢再生がほとんど不可能な哺乳類等を結ぶものとして、無尾両生類がある。多くの無尾両生類では、変態初期に幼生で形成される肢芽を切断しても完全な四肢を再生するが、変態が進み軟骨パターンが形成されるとともに、四肢再生能は急速に失われ、変態した子ガエルでは再生は全く起こらないか、1本の軟骨が形成できるだけになる。この軟骨には分岐も分節も見られない。このような再生能の変化は無尾両生類においてのみみられるもので、再生能の解析に有益な材料と考えられる。本研究では、ツメガエルの幼生、子ガエルを用いて、四肢再生の分子機構を解析し、その結果をもとに失われた再生能を復活させることを試みた。その結果、幼生の肢芽の発生に伴う再生能の低下は、肢芽間充織の変化に伴うもので、特にFGF-10の発現が重要であることが分かった。さらにFGF-10タンパクを外から加えることによって、再生脳を回復させることができた。また肢芽の発生に伴って背腹軸形成機構にも変化が起こり、表皮からの背方化シグナルが失われることが再生能の低下と関係していることが示唆された。さらに子ガエルの四肢で起こるスパイク形成は再生の一部であり、シグナル分子の添加でスパイク構造に分岐分節を起こせることが明らかになった。ツメガエルの後肢芽を、変態前期のstage52で切断すると、5本の指を持つ完全な後肢が再生されるが、指が明瞭となるstage56で切断した場合は、再生体の指の数は1-2本に減少し、全体の長さも極めて短い。このような無尾両生類の再生能の変態に伴う変化は、完全な四肢再生能を持つ有尾両生類と四肢再生能をほとんど持たない哺乳類を結びつけるもので、哺乳類の四肢再生能を回復させる方法を見いだすのに重要と考えられる。本研究では、この四肢再生能の消失はどの組織、に依存しているのか、またどのような分子の消失が関係しているを明らかにし、再生能を回復させる事を目指した。再生能が高いstage52の間充織を再生能が低下したstage56肢芽の切断した部分に移植し、間充織が宿主表皮に覆われ、再構成肢芽ができた後、切断、再生させると、正常な四肢が再生したのに対し、stage56の間充織をstage52肢芽に移植し、切断した場合は、再生はほとんど起こらなかった。この結果は、stage56での再生能の低下は間充織の変化によることを示している。肢芽の発生を担うシグナル分子として、先端部上皮AERから分泌されるFGF-8、先端部間充織が分泌するFGF-10が知られている。ツメガエルfgf-8遺伝子、fgf-10遺伝子ともにstage 56肢芽では発現が減少していた。再構成肢芽を切断した場合は、stage 52間充織を用いた場合のみ、強い発現が見られた。

これらの結果は、ツメガエル肢芽の再生能は間充織の発生段階、特に間充織から分泌されて、先端部外胚葉に作用するFGF-10によって制御されていることを示唆している。そこで、ヒトのリコンピナントFGF-10をstage56の肢芽の切断面に添加したところ、fgf-8の発現がみられ、間充織から外胚葉へのFGF-10による制御が確認できた、さらに再生された指の数の増加が見られた。今後このシステムの改良により、成体での四肢の再生が可能と考えられる。ツメガエル幼生の後肢芽は発生の進行と共に再生能を失い、これは間充織の性質の変化、特に間充織でのFGF-10の発現の減少に依存する事をすでに明らかにしている。さらに再生能の落ちたstage56の肢芽を切断して得た再生芽にFGF-10をビーズに染み込ませて投与することによって、四肢の再生を誘導した。本年度はまずFGF-10投与で形成された再生芽での遺伝子発現を調べた。その結果、fgf-8、fgf-10、Msx-1、Hoxa-13、shhの発現が見られた。対照のPBSビーズを投与したものでは発現は見られなかった。これはFGF-10による再生誘導が、正常な再生と類似の機構で行われていることを示している。次に成体の四肢を切断して作った再生芽で再生を試みた。成体の四肢では切断によって再生芽が形成され、最終的には1本の軟骨突起であるスパイクが形成される。この再生芽ではshhの発現が見られなかった。そこで前腕部の切断後にFGF-10に加えて、SHHをビーズに染み込ませて投与した。その結果、一部の個体で、分岐、分節した軟骨が形成された。これらの結果は、四肢再生能の有無の接点であるツメガエル成体四肢で再生が誘導されたことを示しており、哺乳類などより高等な動物の四肢再生への道をつけるものと考えられる。ツメガエル幼生の後肢芽は発生の進行と共に再生能を失い、これは間充織の性質の変化、特に間充織でのFGFー10の発現の減少に依存する事が既に明らかになっている。本年度はまず四肢パターン再生に必須な背腹軸に着目して研究を行った。四肢の背側中胚葉で発現するLmx-1は、変態初期の再生能がある肢芽では、表皮からのシグナルに応じて発現するが、再生能を失った肢芽では表皮からのシグナルが失われ、背腹形成ができなくなることが示された。また成体四肢再生芽ではLmx-1の発現は見られなかった。これらの結果は、ツメガエル四肢再生能の低下は背腹軸形成と密接に関係していることを示している。またツメガエル成体の四肢を切断して作った再生芽で再生を試みた。この再生芽にSonic HedgehogタンパクやPDGFを染み込ませたビーズを投与し、分岐、分節した四肢軟骨パターンの形成を得た。さらにDMSO処理によって、四肢パターンの原型を得た。これらの結果は、四肢再生能の有無の接点であるツメガエル成体四肢で、不充分ながらも軟骨パターンの再生が誘導されることを示しており、哺乳類などのより高等な動物の四肢再生への道をつけるものと考えられる。
CキナーゼとDGキナーゼの脂質性シグナルによる標的認識機構の解明

プロテインキナーゼC(PKC)及びジアシルグリセロールキナーゼ(DGK)の脂質性シグナルによるサブタイプ特異的標的認識(ターゲティング)機構を解明する目的で、εPKC及びDGKγの変異体とGFPとの融合蛋白質を作製し、脂質性シグナルによる動態をコンフォーカルレーザー顕微鏡で観察した。その結果、1,C1Bドメインを変異(欠損または点変異)させたεPKCは、アラキドン酸(AA)及びセラミドによるゴルジ体へのターゲティングが消失したことから、これらの脂質性シグナルによるターゲティングにはC1Bドメインが関与していることが明らかになった。2,δPKCは、セラミドによりゴルジ体へターゲティングされるが、AAには応答しない。そこで、εPKCのC1BドメインをδPKCのC1Bに入れ替えたキメラを作製したところ、AAに応答しなくなった。反対に、εPKCのC1BドメインをもつキメラδPKCは、AAに応答するようになった。これらのことから、εPKCとδPKCのAAに対する応答能の違いは、それぞれのC1Bが決定づけていることが明らかになった。3,DGKγはAA及びTPAにより細胞質膜へターゲティングされる。C1Bドメインを欠損させるとAAによるターゲティングは消失したが、C1Aドメインを欠損させてもAAによるターゲティング能は有していた。一方、C1Aドメインを欠損させるとAAに対する応答能は保持していたが、TPAには応答しなくなった。このことから、DGKγのAA応答にはC1Bドメインが、TPA応答にはC1Aドメインが重要でり、TPAとAAに応答するモチーフはそれぞれ独立していることが明らかになった。2,C1BとC1Aをともに欠損させたεPKC変異体は、TPAによる細胞質膜へのターゲティング能が消失した。しかし、C1BあるいはC1Aのどちらかが欠損した変異体は、ターゲティング能を有していた。このことは、TPAによる細胞質膜へのターゲティングにはC1AかC1Bのどちらかのドメインが必要であることを示していた。3,δPKCは、セラミドによりゴルジ体ヘターゲティングされるが、AAには応答しない。4,DGKγはAA及びTPAにより細胞質膜へターゲティングされる。C1Bドメインを欠損させるとAAによるターゲティングは消失したが、TPAによる細胞質へのターゲティング能は保持していた。このことから、TPAとAAに応答するモチーフはそれぞれ独立して、C1AとC1Bドメインに存在していると推定された。
フォトニッククリスタル非線形光学材料による空間光制御デバイスに関する研究

フォノトニッククリスタルとは光の波長程度の周期で誘電率を変調させた材料で、モードの効果的な変調制御が可能なものである。本研究では、フォトニッククリスタルによる光波モードの究極的な閉じ込め制御により高効率へ線形現象を確認し、これを用いたデバイス化への基礎研究を行うことを目的にした。具体的には、電解印可による透過バンド位置の変化を利用した透過強度の変調デバイスの開発を目的にしている。フォトニッククリスタルに導入する有機非線形材料は電場配向ポリマーであり、この材料は、色素をドープしたポリマーに高電圧を印可して色素のダーポールモーメントの向きを揃えるものである。このとき通常緩和がおこり、非線形光学特性は数時間で消滅してしまう。本研究では、高いガラス転移温度を有するポリマーの探査と、このポリマーに色素を側鎖として導入した新しい材料を設計し試作した。この結果、数千時間経過後も緩和の現象がみられない安定な材料を開発できた。また、非線形光学定数も極めて大きい材料が開発された。しかし光変調材料として、この電場配向ポリマーを用いる場合でも、高い変調電圧が必要である。例えば、DRI(Disperse Red 1)をPMMAにドープした厚さ100μmの材料を用いる場合には、光の位相をπ変調するためには、500V/μm程度の高電圧を印可しなければならない。この電圧は通常の絶縁破壊電圧を超えてしまう。低電圧で駆動可能にするためには、上記のフォトニッククリスタル構造が利用できる。フォトニッククリスタル構造で、不純物として中央層に電場配向された有機非線形材料を使った場合、この材料に電圧を印可すると透明ピーク位置が変化する。層数が増加すると、より低電圧で光制御できるようになり、31層のフォトニッククリスタルを使用した場合では印可電界10V/μmコントラスト100:1が得られた。また、10HMz程度の応答スピードが得られた。フォトニッククリスタルとは,光の波長程度の周期で誘電率を変調させた材料で,光波モードの効率的な制御が可能なものである.これは,通常の結晶内の周期的ポテンシャルで,電子のバンド構造が決定されるのと類似の効果であり,電子を光子に代えた結晶という意味から,このように呼ばれている.光波モードの制御により,光の自然放出の制御が可能であり,超低しきい値のレーザーの実現が期待されるほか,特定の位置に強く局在する光波モードを利用した非線形光学効果の著しい増強効果が期待される.本研究では,このフォトニッククリスタルによる光波モードの究極的閉じこめ制御により,高効率非線形光学現象の発現を確認し,この材料のデバイス化のための基礎的実証研究を行う.具体的には,メガヘルツ程度の動作速度を有する電界印可による位相変化を利用した空間光変調デバイスの開発を目的として,試作するフォトニッククリスタルと平坦化集積回路のボンディングによる新しいデバイスの設計・試作・評価を行うことが目的である.本年度は、以下の実験評価を行い,デバイス化の基礎的事項を検討した.1)一次元フォトニッククリスタル中の光波伝搬特性測定のため,白色光マイケルソン干渉計及び変調特性評価のための偏光解析装置を作製した.2)誘電体多層膜により,一次元完全格子フォトニッククリスタルを作製し、また,その完全格子に有機非線形光学材料(電場配向ポリマー例えば,DR1/PMMA,DR19/PMMAなど)の欠陥層を導入して,一次元不完全格子フォトニッククリスタルを作製した.3)上記の結果をもとに,一次元格子状電極をとりつけたデバイスの基本構成の検討を行なった.変調度,屈折率変化,応答速度等の測定評価に基づきデバイスを試作した.

4)フォトニッククリスタルの加工装置を試作し,平坦化集積回路との接合法を検討した.フォトニッククリスタルとは光の波長程度の周期で誘電率を変調させた材料で、モードの効果的な変調制御が可能なものである。本研究では、フォトニッククリスタルによる光波モードの究極的な閉じ込め制御により高効率へ線形現象を確認し、これを用いたデバイス化への基礎研究を行うことを目的にした。具体的には、電解印可による透過バンド位置の変化を利用した透過強度の変調デバイスの開発を目的にしている。フォトニッククリスタルに導入する有機非線形材料は電場配向ポリマーであり、この材料は、色素をドープしたポリマーに高電圧を印可して色素のダイポールモーメントの向きを揃えるものである。このとき通常緩和がおこり、非線形光学特性は数時間で消滅してしまう。本研究では、高いガラス転移温度を有するポリマーの探査と、このポリマーに色素を側鎖として導入した新しい材料を設計し試作した。この結果、数千時間経過後も緩和の現象がみられない安定な材料を開発できた。また、非線形光学定数も極めて大きい材料が開発された。しかし光変調材料として、この電場配向ポリマーを用いる場合でも、高い変調電圧が必要である。例えば、DR1(Disperse Red 1)をPMMAにドープした厚さ100 μmの材料を用いる場合には、光の位相をπ変調するためには、500V/μm程度の高電圧を印可しなければならない。この電圧は通常の絶縁破壊電圧を超えてしまう。低電圧で駆動可能にするためには、上記のフォトニッククリスタル構造が利用できる。フォトニッククリスタル構造で、不純物として中央層に電場配向された有機非線形材料を使った場合、この材料に電圧を印可すると透明ピーク位置が変化する。層数が増加すると、より低電圧で光制御できるようになり、31層のフォトニッククリスタルを使用した場合では印加電界10V/μmでコントラスト100:1が得られた。また、10MHz程度の応答スピードが得られた。
部門文化の多様性を活用した組織の活性化および革新プロセスの解明

H30年度は,1組織の多様性と創造性発揮の関係性について他領域における研究成果を企業文化研究へ応用する可能性を検討すること,2量的研究と質的研究をつなぐ研究方法について具体的な研究デザイン・モデルを検討すること,3アンケート票設計ための予備的聞き取り調査を実施すること,4具体的なアンケートの設問項目を検討すること,5アンケート調査を実施すること,6調査から得られた量的・質的データを分析・考察することを課題とした。12の理論研究については,過年度の研究成果をより精緻化することに努めた。また,実証研究の部分では,12での理論的考察や3の予備調査を踏まえたアンケートを設計し,本調査を実施した。アンケートの設問は,部門内の方針やリーダーの特性等を問う「職能部門の特性」,部門内のコミュニケーションのあり方を問う「部門を超えたコミュニケーションや活動」,部門内のモラールや組織学習の状況を問う「職能部門の状況」,「部門文化間の相互作用と全社文化の存在」の4項目,約30問(自由記述式回答を含む)で構成した。調査の対象は,これまで得たデータと関連させる目的で国内製造業とし,これらの企業で研究・開発業務,生産業務,販売業務(売り場担当業務は除く),間接(人事,経理,財務,会計,総務)業務に従事する主に正社員に対して,彼らの在籍企業と所属職能部門に関するアンケートを依頼し,412名から回答を得た(うち有効回答は406件)。なお,アンケートの回答依頼から回収までの作業は,株式会社マクロミルに業務を委託し,同社のwebアンケート・システムを用いて調査を実施した。本調査の結果(選択式回答)は,「「部門文化の多様性と組織の活性化」に関する調査」として『千葉大学経済研究』第34巻第1・2号にまとめた。H28年度は,1基本的分析枠組みの確認,2組織の多様性と創造性発揮に関する他領域における研究成果の検討,32の企業文化研究への応用可能性の検討,4量的研究と質的研究をつなぐ研究方法の検討,5具体的な研究デザイン・モデルの検討,6既存調査データの整理・検討,7アンケート票設計のための予備的調査を実施した。1に関しては,研究者と実務家に対して分析枠組みの妥当性を問い,全社文化と部門文化の関係性について若干の修正を施した。2と3に関しては,経済社会学や心理学領域等,他領域における多様性と創造性発揮の関係性にふれた文献を渉猟した結果,企業文化の概念は本研究における定義から経営諸要因に広く及ぶことため,これらの知見は企業文化研究においても十分応用可能であることを理論的に確認した。4に関しては,混合研究法を中心に量的研究と質的研究の実施タイミング,ウェイト付け,混合方法を考慮し,本研究と諸研究デザインとの適合性を検討した。同研究法以外でも,田村(2006)等で量的研究と質的研究を相互補完的に用いる研究方法の基本的な考え方を確認した。6に関しては,国内製造業の経営に関する全般傾向の把握や本研究の調査対象企業を選定する目的で,当初は戦略経営研究グループによる2001年度調査からのデータを使用する予定であったが,同グループより19952000年度の調査データを新たに提供されたことから,約20年間に及ぶ調査データの整理を行った。このことにより,国内製造業のより長期的な全般傾向の把握のみならず,約20年間のアンケート回答企業や個別企業の時系列データの推移も把握することが可能となった。7に関しては,国内の大企業2社に対して予備的インタビュー調査を行い,異部門間の連携内容,連携による相互作用,具体的な成果等について,より詳細なプロセスを把握することができ,今後の研究展開において大いに意義があった。理論研究に関しては,本研究の基本的分析枠組みについて研究会や予備的インタビュー調査等の機会で研究者と実務家と議論を行うことによって再検討を行い精緻化できたこと,また文献研究によって他領域での知見を企業文化研究へ応用できる可能性を確認できたことから,予定どおり順調に進んでいる。量的研究と質的研究をつなぐ研究デザインに関しては,実証研究を実施するための具体的なモデルを決定するには至らなかったものの,混合研究法をはじめとする研究手法を参考に量的研究と質的研究をつなぐ研究デザイン・モデル案を複数検討することができたため,概ね順調に進んでいる。しかしながら,当初予定していなかった過去データを利用することが可能になったことで,時系列データの整理と検討に予想以上の作業量,時間,費用を要したため,部門文化の相互作用に関するアンケート調査を実施することができなかった。また,量的研究と質的研究をつなぐ具体的な研究デザイン・モデルを決定できなかったこともこのことに起因する。H29年度は,1組織の多様性と創造性発揮の関係性について他領域における研究成果を企業文化研究へ応用する可能性を検討すること,2量的研究と質的研究をつなぐ研究方法について具体的な研究デザイン・モデルを検討すること,3アンケート票設計ための予備的聞き取り調査を実施すること,4具体的なアンケートの設問項目を検討すること,5予備的アンケート調査を実施すること,6調査から得られた量的データを分析・考察すること,7研究デザインにもとづく質的研究の対象企業の検討することが課題であった。1に関しては,引き続き他領域における多様性と創造性発揮の関係性について扱った先行研究を文献調査した結果,特に社会心理学領域での研究成果が本研究における課題を解決する糸口になることが確認できた。2に関しては,混合研究法を中心に量的研究と質的研究の実施タイミング,ウェイト付け,混合方法を考慮し,本研究と諸研究デザインとの適合性を再検討した。

当初はこれまで蓄積してきた量的データも活用する目的で,説明的モデルを中心に検討を行っていたが,当研究課題により適合した設問項目を用いたアンケート調査によって新たな量的データを入手できる可能性がより高まったことから,埋め込みモデルの適用も考慮するに至った。34に関しては,国内製造業に対して予備的な聞き取り調査を行い,異部門間の連携内容,連携による相互作用,具体的な成果等についてより詳細なプロセスを把握し,これらを反映させた質問項目の設計に役立てることができた。57に関しては,国内製造業に対してwebによる予備的アンケート調査を実施し,ここから得られた量的データを分析・考察することで部門文化の多様性を活用することで組織学習の活性化と組織の創造性発揮に関する組織プロセスの一般的な傾向を把握し,質的研究の対象企業を検討する状況まで到達した。理論研究に関しては,前年度に引き続き文献研究によって他領域での知見を企業文化研究へ応用できる可能性についてより具体的な研究領域や研究成果を確認できたこと,研究会や予備的インタビュー調査等の場で行った議論によって理論枠組みや研究仮説を再考できたことから,予定どおり順調に進んでいる。量的研究と質的研究をつなぐ研究デザインの構築に関しては,混合研究法にさらに検討を加えることによって説明的モデルや埋め込みモデルそれぞれの派生モデルまで複数検討することができたため,概ね順調に進んでいる。しかしながら,実証研究に関しては,webによる予備的アンケート調査を実施したが,当初期待していた回答数を収集できるまでに予想以上の時間を要したことから,H29年度中に設問項目を確定するには至らず本調査を行うことが出来なかった。また,研究手順の関係(量的研究と質的研究を行うタイミング)で質的研究の対象企業を検討する状況まで到達したものの具体的な企業を選定することができなかった。以上の状況を総合的に判断し,やや遅れているとした。H30年度は,1組織の多様性と創造性発揮の関係性について他領域における研究成果を企業文化研究へ応用する可能性を検討すること,2量的研究と質的研究をつなぐ研究方法について具体的な研究デザイン・モデルを検討すること,3アンケート票設計ための予備的聞き取り調査を実施すること,4具体的なアンケートの設問項目を検討すること,5アンケート調査を実施すること,6調査から得られた量的・質的データを分析・考察することを課題とした。12の理論研究については,過年度の研究成果をより精緻化することに努めた。また,実証研究の部分では,12での理論的考察や3の予備調査を踏まえたアンケートを設計し,本調査を実施した。アンケートの設問は,部門内の方針やリーダーの特性等を問う「職能部門の特性」,部門内のコミュニケーションのあり方を問う「部門を超えたコミュニケーションや活動」,部門内のモラールや組織学習の状況を問う「職能部門の状況」,「部門文化間の相互作用と全社文化の存在」の4項目,約30問(自由記述式回答を含む)で構成した。調査の対象は,これまで得たデータと関連させる目的で国内製造業とし,これらの企業で研究・開発業務,生産業務,販売業務(売り場担当業務は除く),間接(人事,経理,財務,会計,総務)
マイクロチップテクノロジーを利用した生化学分析システムの構築

本研究で開発した生化学分析システムとして、環境分析では、巻貝中のステロイドホルモン分析、河川中の亜硫酸イオン、亜硝酸イオンの分析システムを作製した。また、生物活性物質分析では、サイトカイン類のイムノアッセイチップ、細胞保持型のバイオアッセイチップを作製した。具体的には、ラットマスト細胞から放出されるヒスタミンの分析、マウスマクロファージから放出されるTNF-αの分析チップを作製した。マイクロチップ作製法としては、高粘性フォトレジストを用いたフォトリソグラフィーにより、スライドグラスのマイクロ簡易加工法を開発した。この方法により作製したスライドグラスを鋳型とし、ポリジメチルシロキサン(PDMS)マイクロチップを作製した。また、高感度分析を行う検出器としてマイクロチップ分析に特化した落射型蛍光ユニットの開発も行った。また、培養細胞をマイクロチップ上に保持し、培養を行う技術、さらに、マイクロ流路の造形により、試薬の濃度勾配を得られるチップの作製も行った。作製した分析システムにより、ステロイドホルモン分析では、従来のELISA法より一桁以上感度が上がり、分析時間を1/3に短縮することができた。また、本システムにより、海産巻貝類であるイボニシの卵巣中に含まれるステロイドホルモンを個体別に定量することが可能となった。同様に、TNF-αの分析でも従来の分析時間を1/3に短縮することができた。ヒスタミン遊離試験では、必要細胞数を従来の1/100程度に低減することに成功し、連続送液を行うことで、細胞からのヒスタミン遊離を連続的にモニタリングすることが可能になった。抗ガン剤感受性試験用マイクロチップは、抗ガン剤溶液と培養液の混合時に形成される濃度勾配を利用して、あらかじめ培養されていた胃ガン細胞を生死細胞染色し、その生存率を調べることにより抗ガン剤の至適濃度範囲を調べることができた。本年度の研究実績として、まず、マイクロチップ作製技術を開発した。マイクロチップ基板として、ポリジメチルシロキサン(PDMS)を用いた。ポリマーの成型用に鋳型が必要となるが、フォトリソグラフを応用し、ガラス鋳型を簡易に作製する方法を開発した。特に、高粘性フォトレジストを使用し、レジスト膜厚を調節することで、金属薄膜を使用しないガラス基板のウエットエッチング法を可能とした。生化学的応用事例として、マィクロチップ上における免疫細胞への刺激によって放出されるヒスタミンの検出システムを開発した。ヒスタミンはアレルギー誘発物質として注目され、.細胞への刺激による遊離挙動を調べることは生理学的に重要である。ヒスタミンはo-フタルアルデヒドで蛍光誘導体化させた。上記方浩によって微小流路を構築したPDMSマイクロチップを用い、ラット由来の肥満細胞および各試薬を導入してヒスタミンの蛍光誘導体化反応を行った。今回導入した波長可変蛍光顕微検出システム等を用いることで、細胞由来ヒスタミンのチップ上での検出が可能となった。また、マイクロチップ上で、ELISAシステムによる海産巻貝類中のステロイドホルモンの定量を行った。極めて高い質量感度が要求されるこの実験では、検出機器に熱レンズ顕微鏡(TLM)を用い、ガラス製マイクロチップ内の微小領域において、競合的な抗原抗体反応や酵素反応を行った。マイクロチップ上に堰構造を設け、あらかじめ抗体を吸着させたポリスチレンビーズを保持した。抗体ビーズをチップ内へ導入した後、ホルモンと酵素標識ホルモンによる競合的抗原抗体反応を行った。続いて酵素反応を行い、そこで生成する発色物質をTLMで検出し、検量線を作成した。得られた検量線の定量限界は1pg/mLであり、従来のELISA法より一桁以上感度が上がり、かつ分析時間は1/3に短縮することができた。

本年度の研究実績として、免疫分析および細胞を用いた生物活性物質分析のためのマイクロチップ作製を行い、それらの評価と分析を行った。免疫分析用ガラスチップには、抗体を吸着させたビーズを保持するため、フォトリソグラフィ-ウエットエッチング法を駆使して、マイクロチップ上に堰構造を作製した。昨年度に作製した堰構造を改良し、送液した溶液の淀みが少ない構造とし、熱レンズ顕微鏡(TLM)を用いた分析に適した構造とした。この免疫分析用マイクロチップおよびTLMを利用し、実試料、特に環境中の内分泌攪乱化学物質である有機スズの標的生物の海産巻貝類におけるステロイドホルモン類の分析について、オンチップELISA法を用いて行った。従来の測定方法では、巻貝などの小さな個体を測定するためには感度が足りず、数個から数十個の個体を合わせて測定していたが、本研究で作製した分析システムで得た検量線では、海産巻貝類であるイボニシの卵巣中におけるステロイドホルモンを各個体ごとに定量することが可能となった。細胞保持型チップとしては、主にPDMSを素材として利用した。PDMSチップを多層構造とし、細胞保持用のフィルターを挟み込むことで細胞チャンバーを作製した。このPDMSチップにはラット由来の腹腔肥満細胞を導入、保持し、化学物質により刺激を与え、ヒスタミンを放出させた。遊離したヒスタミンは下層のチップ上にて蛍光誘導体化して、蛍光顕微鏡を利用して蛍光分析した。酸素透過性であるPDMSは細胞利用型のチップ素材に適しており、細胞への酸素供給は良好であった。検討の結果、導入細胞数を従来よりも2桁程度低減することができ、必要試薬、必要細胞数の低減、作業量、作業時間の短縮などを実現した。また、細胞利用型ガラスチップの作製も検討し、マクロファージを導入し、保持することを可能とした。本年度の研究実績として、まず、堰構造を構築したガラス製マイクロチップにポリスチレンビーズを導入し、そのビーズ表面において抗原抗体反応を行うイムノアッセイチップの作製および評価を行った。本チップでは昨年までの研究において、熱レンズ顕微鏡による高感度検出方法と組み合わせることで、巻貝一個体中のステロイドホルモン分析などを行ってきた。本年度は、用いる基質の変重や抗体の蛍光標識を行うことで、化学発光や蛍光検出といった他の高感度検出系を導入した。これらの導入により、検出物質の多様化だけでなく装置の小型化、反応選択性の向上などの効果が確認された。次いで、PDMSマイクロチップ上に導入した細胞を利用した生物活性物質検出システムの構築を行った。昨年までに構築した濾過膜利用型細胞保持システムを利用し、マイクロチップ上での物質検出を行った。特に、ここでは、ラット由来マスト細胞を用いたヒスタミン検出系の構築と、マウス由来マクロファージを利用したTNF-α検出系の構築を検討した。前者は昨年までに細胞刺激応答をマイクロチップ上で確認できており、本年度はより応用的なヒスタミン遊離/遊離抑制試験系の構築を行った。
低分子量G蛋白質RasおよびRhoと関連蛋白質の構造と機能の解析

本研究では、低分子量G蛋白質Rhoとその関連蛋白質の構造と機能について検討した。私共の研究室では、すでにRhoの活性制御蛋白質Rho GDIを見い出している。本年度、私共はこのRho GDIのホモログを出芽酵母より精製し、そのcDNAをクローニングして一次構造を決定した。さらに、このRho GDIの機能を明らかにする目的で、Rho GDI遺伝子の破壊変異株を作成してその表現型を解析したが、明らかな変化は認められなかった。そこで、現在、Rho GDI要求性の変異株を新たに樹立してその変異遺伝子をクローニング中である。一方、私共は、出芽酵母においてRhoがアクチンと共に出芽部位に局在して、出芽による細胞膜の増殖を制御していることを明らかにした。さらに、Rhoは出芽酵母では増殖に必須であることから、Rhoの温度感受性変異株を樹立し、その復帰変異株を取得して解析したところ、Rho以外の遺伝子に変異が生じていることが明らかとなった。この復帰変異株では増殖がRhoに非依存性になることから、変異が生じている遺伝子はRhoの標的蛋白質をコードしている可能性が高いと考えられる。現在、この遺伝子を分離してクローニング中である。また、Rhoの優性活性型変異株と優性不活性型変異株はその増殖能が低下するが、この2種の変異株において多発現させることで増殖能の低下を抑圧する遺伝子を多数分離した。これらの遺伝子もRhoの関連蛋白質をコードする遺伝子である可能性が高い。以上、Rhoおよびその関連蛋白質の構造と機能がかなり明らかになり、当初の研究目的はほぼ達成することができたと考えられる。