hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
GTP結合蛋白活性測定法の改良およびホルモン受容機構異常症スクリ-ニング法の開発

今後、この精製Gs分画を用い、GsのRIA法を確立するなどの発展が望めた。上記の研究成果は、第62回日本内分泌学会総会(6月1日)、第36回日本臨床病理学会総会(10月6日)、第7回生物学と医学における情報伝達国際会議(10月9日)、第62回日本内分泌学会秋季学術大会(10月21日)において発表した。ホルモン受容機構異常症のスクリ-ニングに向けて,われわれは従来煩雑な操法であり,研究室レベルのものであったGTP結合蛋白質(Gs)の活性測定を簡便なものとして,偽性副甲状腺機能低下症I型の患者について検討を行いGs活性値の低下と病態との関連で新たな知見を得た(平成元年度)。本測定法は測定サンプル膜分画をコ-ル酸で可溶化し,GTPγSと30°Cで2時間incubationを行い,Gsを活性化する。これを人血小板膜分画に加え,0°Cで20分再構成を行う,これをadenylate cyclase活性測定系に加え,30°Cで10分間incubationを行い生成したcAMPをRIAにて測定するものである。本年度はこの方法に検体少量化,測定時間の短縮化などの改良を加え,スクリ-ニング法として十分使用可能とした。本測定系を用いて各種疾患についてスクリ-ニングを行ったところ,アルコ-ル中毒患者においてアデニルシクラ-ゼ活性の低下が見られた。詳細を培養細胞におけるアルコ-ル投与実験により検討した結果,急性期におけるアデニルシクラ-ゼ活性の上昇と慢性期におけるアデニルシクラ-ゼの活性低下が証明できた。また本測定法により,従来有効な鑑別法の無かったアルコ-ル中毒患者の鑑別診断が行えることがわかった。今後さらに本測定法を用いて,各種疾患のスクリ-ニングや病態解明への応用を行う予定である。ホルモン受容機構異常症のスクリ-ニングに向けて,われわれは従来煩雑な操作法であり,研究室レベルのものであったGTP結合蛋白質(Gs)の活性測定を簡便なものとし,偽性副甲状腺機能低下症I型の患者について検討を行いGs活性値の低下と病態との関連で新たな知見を得た(平成元年度)。このGs活性測定法に,検体少量化,測定時間の短縮化などの改良を加え,スクリ-ニング法として充分使用可能とした。このスクリ-ニング法を用いて各種疾患についてスクリ-ニングを行ったところアルコ-ル中毒患者においてGs活性の低下がみられた(平成二年度)。本年度もこのスクリ-ニング法を用いて,ホルモン受容機構異常症スクリ-ニングを行った。さらに偽性副甲状腺機能低下症でGsの低下している患者のGsのmRNAを測定したところ,Gs mRNAの低下しているものとしていないものがみられた。すなわち,Gs活性の低下は,Gs遺伝子,mRNA,タンパクなどのさまざまな段階での異常によりもたらされる可能性が考えられた。つまりはGs活性とmRNAの双方を測定することにより,病気の本態の解明ができると考えられた。上記の研究成果は,第64回日本内分泌学会総会(6月13日),第31回日本臨床化学会年会(9月28日),第5回アジア太平洋臨床生化学会(9月30日),第64回日本内分泌学会秋季学術大会(11年14日)において発表した。
地域住民ニーズに応える家庭内看護・介護・健康づくり教材とその提供システムの開発

本研究は、地域住民の日常的なニーズに応える健康情報マルチメディア教材の開発・提供・評価を実施し、住民がそれぞれの目的に応じた健康情報を手軽に得られる内容と形態はどうあるべきかを、実践的に明らかにしていくことを目的とした。1.教材開発:教材は、地域住民の二ーズ把握の結果と本研究に従事した研究員の専門性を生かし、(1)家庭内看護・介護教材『心とからだにやさしい排泄の介護オムツ編』及び(2)健康運動教材『すこやかデイリーエクササイズ』を開発した。教材は一テーマ5分間を基準とした映像中心の視聴覚教材とした。コンテンツの構成についてはストーリー型あるいは素材集の形式をとった。また、一トピック一ユニットを原則とし、複数の関連するユニットをまとめてひとつのコースとすることで、必要なものだけを選択して視聴することも、コース全体を視聴して体系的な知識を身に付けることもできるように考慮した。2.教材提供:各教材は住民自身の自己学習・自己啓発教材として構想したものであるが、講習会などの集団学習環境の提示教材としても利用可能である。教材提供は、住民が家庭や職場で「必要なときに必要な情報を」得られる提供方法を実証的に検討するために、放送系メディアとしてケーブルテレビ、パッケージメディアではVHSビデオテープとパソコン用CD-ROM、オンデマンド・メディアとしてインターネット上のビデオ・オン・デマンドの4種類とした。3.教材評価:教材内容・提供に関する評価は、地域住民及び学生を対象とした質問紙調査により実施、検討した。教材内容に関しては、家庭内看護・介護教材では計137名、健康運動教材におけるケーブルテレビ視聴者では計139名、ビデオ版/CD-ROM版教材視聴者では計288名から回答を得た。教材提供に関しては、家庭内看護・介護教材視聴者137名と健康運動教材視聴者381名の計518名及び学生46名から回答を得た。その結果、開発した教材内容(テーマ、構成、時間枠等)については肯定的評価が得られた。しかし、教材提供については環境面での制約から十分な評価を行う段階には至らなかった。特に、作成した教材をインターネット上で検索・視聴した場合の効果を、組織的・経済的課題も含めて更に検討していく必要があると考えられるが、住民がそれぞれの目的に応じた健康情報,を手軽に得られるシステムには多くの可能性が示唆された。本研究は、地域住民の日常的なニーズに応える健康情報マルチメディア教材(家庭内看護・介護方法、健康づくりプログラムなど)をシリーズで試作し、種々のメディアを通じて地域住民に試供し、フィードバックを得ることで、住民がそれぞれの目的に応じた健康情報を手軽に得られるシステムはどうあるべきか、またそのようなシステムを通じて提供される情報の内容と形態はどうあるべきかを、実践的に明らかにしていくことを目的とする。平成11年度は、主として教材試作に関する研究活動を実施した。まず、教材トピックを選定した。住民の健康づくりのための運動プログラム及び排泄介助等の家庭内介護技術をテーマとした教材を選定した。運動プログラムにおいては、転倒予防に役立つ主要な筋力・柔軟性・神経機能を保持するためのトレーニング中心の内容とした。また家庭内介護技術に関しては、家庭内で介護している家族にどのような介護技術指導を実施しているかを県内の訪問看護婦から情報を得た。

家族の介護技術習得において継続的に関わる必要性の高い技術、介護ニーズの高い技術は何かを検討し、オムツ交換を中心とする排泄介助に焦点を当てた内容とした。これらのテーマを基に教材構成を企画し、各トピック数分程度のビデオ教材として作成した。次年度はこれらの教材を提供するメディアとシステムの検討を行い、併せて、教材を試供する場合に必要な補助教材の作成を実施する予定である。本研究は、地域住民の日常的なニーズに応える健康情報マルチメディア教材(家庭内看護・介護方法、健康づくりプログラムなど)をシリーズで試作し、種々のメディアを通じて地域住民に試供し、フィードバックを得ることで、住民がそれぞれの目的に応じた健康情報を手軽に得られるシステムはどうあるべきか、またそのようなシステムを通じて提供される情報の内容と形態はどうあるべきかを、実践的に明らかにしていくことを目的として活動している。平成12年度は、主として教材試作及び教材試供、住民の反応調査に関する研究活動を実施した。教材試作においては、住民の健康づくりのための運動プログラム「すこやかデイリーエクササイズ」及び排泄介助等の家庭内介護技術「身体とこころにやさしい排泄の援助オムツ編」をテーマとした教材を作成した。運動プログラムにおいては、M県I町をモデル地域としてCATVによる試供を行い、住民の反応を調査した。次年度は、家庭内介護技術の住民への試供及び反応調査、各教材のライブラリ化に向けての検討を実施する予定である。1.研究目的地域住民の日常的なニーズに応える健康情報マルチメディア教材を開発し、種々のメディアを通じて住民に提供し、評価を得ることで、住民がそれぞれの目的に応じた健康情報を手軽に得られるシステムはどうあるべきか、またそのようなシステムを通じて提供される情報の内容と形態はどうあるべきかを、実践的に明らかにしていくことを目的とした。2.研究の経過と成果(1)地域住民のニーズ把握及び教材開発研究代表者・分担者が過去に実施した三重県内市町村との共同研究を通して、家庭で参照できる介護情報提供、家庭で実行できる健康づくりプログラムへの要望が高いという結果が得られた。そこで、家庭内介護で最も身体的・精神的負担の高い介護技術の一つである排泄援助方法の教材及び運動プログラムを内容の中心とした健康づくり教材を開発した。(2)教材提供のためのメディアとシステムに関して提供形態としては、(1)地域住民に実際に視聴してもらうことができる方法として、ビデオテープ及びCD-ROM貸し出し(各家庭ないし公民館等での視聴)、地域町営CATVによる放映、(2)将来の提供形態を模索するためのネットワーク上でのオンデマンド・サービスの2種類を検討した。(3)教材内容・提供形態等の評価教材内容・提供形態それぞれに関して、アンケート調査を実施し、その結果を考察した。評価内容は、対象の属性、各教材の内容と提供方法についての5段階尺度評価、教材に対する感想や希望(自由記述)等とした。
ブナ科の殻斗の形態発生過程の比較研究

ブナ科の殻斗の形態学的起源について, 2つの説が対立している.即ち,それぞれの花の下の小花柄の盛り上りに起源するという説と,二出集散花序の一つ高次の枝に起源するという説である.前者は,現生のすべての属の完成した形態の比較研究に基づき主張されている.一方,これまでの形態発生の研究者はすべて後者の説を支持している.たしかに,観察された種では,殻斗片の分裂組織の位置や形態は,高次の花の原基と区別が困難である.しかし,この立場から,ブナ科の殻斗のすべての形態を説明するのは困難である.例えば,二出集散花序のそれぞれの花が,それぞれの殻斗に包まれるマテバシイ属で,二次の花の殻斗は三次の枝から導かれるとしても,中心(一次)の花を包む殻斗はいかにして生じえたのだろうか.2つの説のどちらが支持されるべきかを判定するために,マテバシイ属とクリ属の殻斗の発生過程を比較した.その結果,マテバシイ属の中心の花の周辺(特に向軸部)に,殻斗の発生に先行して,特徴的な細胞分裂が起ることが明らかになった.そこでは,接線方向に細長い表皮細胞が規則正しく密に配列し,放射方向に急速にその数が増大する.これは,この部分で,著しい介存生長が起っていることを示している. (このような現象はこれまで観察されていなかったし,今回のクリでも見られなかった. )一方,マテバシイの二次の花の側方には,三次の枝の原基があらわれ,その部分の殻斗形成に中心的役割をはたす.つまり,これまでの2説はいずれも不完全で,どちらの要素も殻斗形成に関与しているということが明らかになった.以上の成果をふまえ,ブナ科における殻斗の進化過程をより詳細に描きあげることが今後の課題となる.ブナ科の殻斗の形態学的起源について, 2つの説が対立している.即ち,それぞれの花の下の小花柄の盛り上りに起源するという説と,二出集散花序の一つ高次の枝に起源するという説である.前者は,現生のすべての属の完成した形態の比較研究に基づき主張されている.一方,これまでの形態発生の研究者はすべて後者の説を支持している.たしかに,観察された種では,殻斗片の分裂組織の位置や形態は,高次の花の原基と区別が困難である.しかし,この立場から,ブナ科の殻斗のすべての形態を説明するのは困難である.例えば,二出集散花序のそれぞれの花が,それぞれの殻斗に包まれるマテバシイ属で,二次の花の殻斗は三次の枝から導かれるとしても,中心(一次)の花を包む殻斗はいかにして生じえたのだろうか.2つの説のどちらが支持されるべきかを判定するために,マテバシイ属とクリ属の殻斗の発生過程を比較した.その結果,マテバシイ属の中心の花の周辺(特に向軸部)に,殻斗の発生に先行して,特徴的な細胞分裂が起ることが明らかになった.そこでは,接線方向に細長い表皮細胞が規則正しく密に配列し,放射方向に急速にその数が増大する.これは,この部分で,著しい介存生長が起っていることを示している. (このような現象はこれまで観察されていなかったし,今回のクリでも見られなかった. )一方,マテバシイの二次の花の側方には,三次の枝の原基があらわれ,その部分の殻斗形成に中心的役割をはたす.つまり,これまでの2説はいずれも不完全で,どちらの要素も殻斗形成に関与しているということが明らかになった.以上の成果をふまえ,ブナ科における殻斗の進化過程をより詳細に描きあげることが今後の課題となる.
モノクロナール抗体を用いての血小板膜糖蛋白の電顕的解析

血小板表面に存在する膜糖蛋白(GP)は,種々の刺激に対する血小板の受容体として考えられている.中でもGPIbにはリストセチン存在下でのvon Willebrand因子(vWF)およびトロンビンの受容体があり, GPIIb/IIIaにはフィブリノゲンの結合部位があるとされる.そこで当研究部で作成したGPに対するモノクロナール抗体などを用いる免疫電顕法により,血小板刺激時におけるGPの変化を観察し,その意義を検討した.洗浄ヒト血小板の静止時,リストセチン, ADP,トロンビン刺激時のGPならびにフィブリノゲン分布を, GPに関してはフェリチン標識,フィブリノゲンに関しては金粒子標識で観察した.その結果GDIb, IIb/IIIa分布を透過電顕下にフェリチン粒子の接着像としてとらえた.GPIbは間隔100nm前後, IIb/IIIaはこれよりやや広い間隔でほぼ均等に分布していた.走査電顕下,表面が金属粒子で被覆されることから,フェリチン粒子塊は大きくみえるが,その中心間距離は透過電顕像の場合とほぼ同様であった. GPIbの数は血小板あたり約4000個で,従来言われているvWF結合数の1/4が形態的に確認可能であった. IIb/IIIaはこれよりやや少なく,血小板無力症患者の血小板では認められなかった.GPIb分布はvWF,トロンビン刺激によりクラスター化し,受容体機能を示唆する形態的変化が生じることが推察された.フィブリノゲンについては,静止血小板ではこれを添加しても表面膜への結合はみられず, α顆粒内のみに局在していたが, ADP刺激により表面膜への結合,凝集血小板膜面間の存在が明らかにみられ,従来のフィブリノゲン架橋説を形態学的にはじめて立証した.一方トロンビン凝集での血小板膜面間のフィブリノゲンの存在は局所的であり,他の粘着性蛋白による機構が推察され, GPの機能とともにその重要性が考えられた.血小板表面に存在する膜糖蛋白(GP)は,種々の刺激に対する血小板の受容体として考えられている.中でもGPIbにはリストセチン存在下でのvon Willebrand因子(vWF)およびトロンビンの受容体があり, GPIIb/IIIaにはフィブリノゲンの結合部位があるとされる.そこで当研究部で作成したGPに対するモノクロナール抗体などを用いる免疫電顕法により,血小板刺激時におけるGPの変化を観察し,その意義を検討した.洗浄ヒト血小板の静止時,リストセチン, ADP,トロンビン刺激時のGPならびにフィブリノゲン分布を, GPに関してはフェリチン標識,フィブリノゲンに関しては金粒子標識で観察した.その結果GDIb, IIb/IIIa分布を透過電顕下にフェリチン粒子の接着像としてとらえた.GPIbは間隔100nm前後, IIb/IIIaはこれよりやや広い間隔でほぼ均等に分布していた.走査電顕下,表面が金属粒子で被覆されることから,フェリチン粒子塊は大きくみえるが,その中心間距離は透過電顕像の場合とほぼ同様であった. GPIbの数は血小板あたり約4000個で,従来言われているvWF結合数の1/4が形態的に確認可能であった. IIb/IIIaはこれよりやや少なく,血小板無力症患者の血小板では認められなかった.GPIb分布はvWF,トロンビン刺激によりクラスター化し,受容体機能を示唆する形態的変化が生じることが推察された.フィブリノゲンについては,静止血小板ではこれを添加しても表面膜への結合はみられず, α顆粒内のみに局在していたが, ADP刺激により表面膜への結合,凝集血小板膜面間の存在が明らかにみられ,従来のフィブリノゲン架橋説を形態学的にはじめて立証した.一方トロンビン凝集での血小板膜面間のフィブリノゲンの存在は局所的であり,他の粘着性蛋白による機構が推察され, GPの機能とともにその重要性が考えられた.血小板表面に存在する膜糖蛋白(Glycoprotein,GP)は種々の刺激に対する血小板の受容体として考えられている。中でもGPIbにはリストセチン存在下でのvon Willebrand因子(vWF)およびトロンビンの受容体があり、GP【II】b/【III】aにはフイブリノゲンの結合部位があるとされる。最近結合特異性のあるモノクロナール抗体を利用することにより、血小板膜構成成分の形態的観察の可能性が期待されており、当研究室でも上記GPに対するモノクロナール抗体をマウスを用いて作成したので、これを用い免疫電顕法によりGP【I】b、【II】b/【III】aの分布様式と、血小板刺激による変化を観察し、その意義を検討した。洗浄健康人血小板浮遊液を用い、グルタールアルデヒド前固定後、各GPに対するモノクロナール坑体30μg/mlを加え37°C、30分間孵置後、ビオチン-抗マウスIgG、ついでアビジン-フエリチンを加え、室温にて各2時間孵置、水洗後オスミウム酸後固定し検体を得た。また前固定せずに同様処理を行ったもの、さらにリストセチンとVWF、またはトロンビンを加えた標本についても観察した。その結果GP【I】b、【II】b/【III】の分布を透過電顕下にフエリチン粒子の接着像としてとらえた。GP【I】bは間隔100nm前後、【II】b/【III】aはこれよりやや広い間隔でほぼ均等に分布していた。

走査電顕下、表面が金属粒子で被覆されること、走査電顕解像力からフエリチン粒子塊は大きくみえるが、その中心間距離は透過電顕像の場合とほぼ同様であった。GP【I】bの数は血小板あたり約8000個で、従来いわれているvWF結合数の4分の1が形態的に認識可能であった。【II】b/【III】aはこれよりやや少なく、また血小板無力症血小板では認められなかった。GP【I】b分布はvWF、トロンビン刺激によりクラスター化し、受容体機能を示唆する形態的変化が生じることが推察された。
非侵襲生体イメージング法による生体内修復機構の解明：次世代DSBセンサーマウス

放射線により誘発されたDNA二本鎖切断(DSB)は生体にとって最も重篤なDNA損傷である。培養細胞の解析から、DSBは主に、非相同末端結合(NHEJ)と相同組換え(HR)の2つの機構かによって修復するとされている。一方、生体内では複雑な調節を受けていると予測されるが、損傷直後から始まる修復過程を生体内で検出する方法は未開発である。最近、私達はNHEJ機構を生体皮膚で検出し、トレースするためのDSBセンサーマウスの開発に成功した。本研究では新たな次世代DSB修復センサーマウスを開発し、生体内で損傷直後から始まるDNA修復の分子機構を非侵襲的にリアルタイムに解析することを通じて、DNA修復に関わる未解明な生理的意義を提示したいと考えている。本年度は、マウス小腸におけるDSB修復蛋白質の発現解析を行うために、培養細胞等を用いて検出条件の検索と抗体の特異性の検討を開始した。また、GFP標識したDNA修復蛋白質をリポフェクション法で遺伝子導入した培養細胞を材料に、DSB誘導とDSBへの検出条件の検索を開始した。実験に使用する予定のマウスの繁殖能力が落ちたこと(原因は不明)で必要とするマウスを得られなかったこと、さらに、所属する研究所の実験動物施設において使用する予定の購入マウスから規制対象とされる細菌が検出されたためにマウスを淘汰した。そのために必要とする組換えマウスを年度内に得られなくなったことに加えて、年度後半に研究代表者が受傷しマウスの飼育管理ができなくなったことから、やや遅れている。まず、マウスを飼育管理する体制を整えてから、昨年度行う予定であった遅れている実験を推進する。(理由)所属する研究所の実験動物施設において使用する予定の購入マウスから規制対象とされる細菌が検出されたためにマウスを淘汰した。そのために必要とする組換えマウスを年度内に得られなくなったことに加えて、年度後半に研究代表者が受傷しマウスの飼育管理ができなくなったことから、次年度使用が生じた。(使用計画)繰り越した研究費は、遅れているマウスを用いた研究を実施するために使用する予定である。
ストレステンソル密度とスピントルクによる量子遷移の理論的研究

二重スリット現象は、ファインマンが言うところの量子力学の「ミステリー」であり、それを時々刻々予言することはできないとされてきました。本研究成果として、量子力学ではなく場の量子論である量子電磁力学を用いることで時々刻々の予言が可能であることがわかりました。そのカギは「双対コーシー問題」(場の演算子と波動関数両方の時間発展)を解くことにあり、そのアルゴリズムが「アルファ振動子」(素粒子代数の数学的下部構造を構成するもの)理論により与えられることを発見しました。本研究は、研究代表者により定式化された電子のストレステンソル密度・スピントルク密度・ツェータ力密度を用いて量子遷移現象の理論的研究を推進するものである。理論構築部分においては、超重力理論に基づくスピン渦理論における具体例の計算が行われた。また、ブロッホ関数で表される電子状態の電子ストレステンソル密度において、平面波部分から液体的なふるまいが現れることを解析的に示した。相対論計算部分においては、光子場の時間発展およびくりこみの有効な方法を検討する必要があったが、これらについて遅延ポテンシャル計算に必要な分子積分公式を導出し、電子質量の時間依存くりこみ方法の提案を行った。また、これらを実装した数値計算コードを作成した。今後これらを用いて計算を行うことで、より正確に場の量子論に基づいた時間発展の数値的な計算が実行可能となる。非相対論計算においては、相互作用を記述する光子場の時間発展についての系統的な計算コードを開発した。その結果として、場の量子論に基づいて正しく記述される光子状態を得るthermalizationの過程が、非常に重要であることを示した。電流と電磁場が矛盾なく得られるためには適切なthermalization過程が必要であることが分かった。電子の電気双極子モーメントがある場合のスピントルクの定式化を行った。Volkov解に対する振る舞いを調べ、スピントルク、ツェータ力と直交した成分を持つことを示した。YbF分子を例にとりあげ、電磁場中でのこの新たなトルクの分布を示した。本研究は、研究代表者により定式化された電子ストレステンソル密度・スピントルク密度・ツェータ力密度の理論を用いて量子遷移現象の理論的研究を推進するものである。また、場の量子論(特に量子電磁力学)に基づく系の時間発展シミュレーション方法の研究開発を行う。理論構築部分においては、量子ストレステンソル理論および量子スピン渦理論について、従来は準古典的な作用に基づく作用原理から導かれていた結果を単純超対称性のもと拡張して定式化し、量子的な作用に基づくものへと拡張した。また、量子スピン渦理論における重力波の量子効果を示した。物性分野への応用として、量子スピン渦理論とスピンホール効果の関連について研究を行った。時間発展シミュレーション方法の研究開発については、遅延ポテンシャル項の積分についていくつかの数値積分法を検討し、積分値のクロスチェックをするとともに、二重指数関数型公式(double exponential formula, DE公式)によるものが有効(いまのところ唯一実用的)であることを見出した。光子場のthemalization計算については電流・電磁場がMaxwell方程式と無矛盾となるように光子場を計算するコード開発を行って、その結果を報告した。スピントルク密度に関しては、YbF分子内部の電気双極子モーメント(EDM)によるスピントルクの研究を行った。相対論的拡張の下では、EDMにより誘起されるスピントルクは電場だけでなく磁場によっても誘起され、そのそれぞれの分布を計算した。分子全体へのトルクとしては電場によるものの方が強く作用することを示した。また、場の量子論(特に量子電磁力学(QED))に基づく系の時間発展シミュレーション方法の研究開発を行う。理論構築部分においては、場の量子論であるQEDの時間発展が場の演算子の時間発展とケットベクトルの時間発展との二元的(いずれの時間発展をも知る必要がある)であり、QEDハミルトニアンが時間に依存することに伴う定式化を行った。また、漸近場によらない定式化を与えるために、素粒子(場の素励起;粒子描像を具現)代数の数学的下部構造を構成する「アルファ振動子代数」を発見し、(i)無限遠方で場がゼロと仮定する必要が無い、(ii)アルファ振動子のthermalizationとrenormalizationとは独立に定義されるので時々刻々定義されるparticle描像と矛盾しない、(iii)繰り込み定数は時々刻々q-numberとして表現される、ことを見出した。時間発展シミュレーション方法の研究開発については、遅延ポテンシャル項の積分について二重指数関数型公式(double exponential formula, DE公式)による効率的な方法の実装を行った。また、演算子の時間発展に加えて波動関数の時間発展を行う部分のコード開発を行った。具体的にポジトロニウムの時間発展を取り扱い、量子状態が状態ベクトルを設定する時刻に依存することを示した。スピントルク密度に関しては、ツェータ力を作り出すポテンシャルであるツェータポテンシャルは、分子全体のものよりも1つの軌道だけが作るものの方が大きく、その互いの相殺によって小さなツェータポテンシャルが得られていたことを示した。電子の電気双極子モーメントに関わる有効電場は分子内部のスピンの非対称分布によって作り出されていることを示した。

本研究成果として、量子力学ではなく場の量子論である量子電磁力学を用いることで時々刻々の予言が可能であることがわかりました。そのカギは「双対コーシー問題」(場の演算子と波動関数両方の時間発展)を解くことにあり、そのアルゴリズムが「アルファ振動子」(素粒子代数の数学的下部構造を構成するもの)理論により与えられることを発見しました。理論構築部分においては、理論の拡張が行われ、物性現象への新たな適用が見出された。シミュレーション方法の研究開発については定式化およびコード開発が順調に発展している。遅延ポテンシャル部分の計算のための有効なアルゴリズムが見出され、コードが実装された。理論化学遅延ポテンシャル部分の積分については、従来は計算されてこなかった量であるため、数値計算結果の検証をしつつ、時間発展コードに取り入れていく。演算子の時間発展を解くに当たって、現状では演算子を行列で表現しているが、今後精度を上げるためには行列の次元を上げる必要が生じ、行列のデータ表現方法にも工夫が必要である。疎行列を扱うパッケージの利用を検討する。QED(量子電磁力学)に基づいて非摂動的に量子遷移過程を計算する計算コードが順調に発展している。相対論計算部分においては光子場の遅延ポテンシャル部分の計算のための分子積分計算を行うことができるようになった。また、定常一様外部電磁場存在下での時間発展のための定式化が行われた。非相対論計算部分においては、遅延効果を含む相互作用光子場を系統的に計算するコード開発を行い完成した。Thermalizationの方法についての情報が集まり、今後の指針を決定した。科研費申請時には予定していなかった予算が確保できたため、計算機使用料、旅費について他の予算から支出することができ、当該年度の支出を抑えることができた。次年度に開催される国際会議の状況などを踏まえて、次年度に研究費を多く使用する方がより効果的に予算を活用できると判断した。相対論計算部分においては光子場の遅延ポテンシャル部分の計算のための効率的な数値積分アルゴリズムおよびデータ格納方法を実装する。数値積分についてはDE(二重指数関数型)公式を検討する予定である。くりこみについては電子質量以外のパラメターである電子電荷や場の演算子の規格化について考察する。非相対論計算部分においては、改良したThermalizationの方法について計算コードの開発を進める。テスト計算による結果を見ながら修正してバランスを調整する。くりこみについては、保存量を利用してくりこまれる量の再定義を行う方針を採用しているが、これまで粒子電荷保存に基づいたものだけが導入されている。静止質量を利用した質量くりこみについての導入を進める。申請時には限られた予算の範囲で断念していた、書籍の購入や会議への参加費、旅費として活用する。
対話システムにおける対話を通じたドメイン知識の獲得

本研究課題は,「話すほど自律的に賢くなる対話システム」の実現を目指している.具体的には,ユーザとの対話中に現れる未知語に関する知識を,ユーザとの自然な対話を通じて取得する.この一環として,昨年度に暗黙的確認というプロセスを提案した.これは単純に「○○って何ですか?」のような明示的確認要求を繰り返してユーザの対話継続意欲を削ぐことなく,知識の獲得やその正誤の検証を行うものである.これは,1未知語のクラス推定,2暗黙的確認要求,3ユーザの応答に基づく暗黙的確認要求に含めた内容の正誤推定,からなる.本年度は,次の2点においてこの暗黙的確認を拡張した.まず上記3の正誤推定において,単純な肯定否定表現に加えて,その中で使われるクラスの有無や,前後の発話との関係,応答の表層的表現などを素性として扱い,機械学習により正誤を予測する手法を提案した.これにより,正しいクラスを予測するF値が0.308向上した.2点目として複数のユーザからの応答を利用した.暗黙的確認要求に対する単一のユーザの応答のみを使った場合の推定精度は7割程度であったが,複数のユーザに対する暗黙的確認の結果を利用することにより精度をさらに向上させた.ここでは単一のユーザとの対話で得られる確率値を素性として機械学習を行った.音声を入力とした場合の未知語獲得についても検討を進めた.辞書にない語を単語単位で正しく音声認識するのは不可能であるため,音素レベルでのモデル化を行い,ノンパラメトリックベイズの枠組みで未知語の音素列や単語境界を得ることを試みた.さらに,獲得した知識を保持するために,単純な関係データベース以外の知識表現を用いる検討も行った.昨年度提案した暗黙的確認の枠組みをより高精度化するために,上述した2点の拡張を行った.これに際して,クラウドソーシングにより対話データを収集し,このデータを使って提案手法の性能を評価した.この結果をまとめたものが対話に関する第一の国際会議SIGDIALに採択され,口頭発表を行った.また昨年度の成果について取りまとめを行い,人工知能学会論文誌に採録された.さらには本年度の成果を中心に,所属研究機関の定例記者会見で発表を行い,確認した範囲で,国内で全国紙朝刊を含む5件,海外で14件の記事が報道された.明示的確認要求が煩わしいという前提を確認するためのデータを,本年度終盤にクラウドソーシングにより収集した.これを用いて暗黙的確認要求の印象評定を進める.これとあわせて本年度の成果の取りまとめを行い,ジャーナルとして投稿する.また,音声を入力とした場合の未知語の認識や,獲得した知識を保持する知識表現についても検討を進める.これにより,音声入力で候補となった語彙の対話を通じた検証や,獲得した知識を含めた知識の汎化に基づく推論といった新たな展開を検討する.本研究課題では「話すほど賢くなる対話システム」の実現を目指している.具体的には,ユーザとの対話中に現れる未知語に関する知識を,ユーザとの自然な対話を通じて取得する.本年度は,料理に関する非タスク指向型対話において,未知の料理名のクラスを題材として研究を開始した.知識を獲得する際に単純に「○○って何ですか?」のような明示的確認要求を繰り返すのは,ユーザにとって煩わしく,対話を継続する意欲を削ぐと考えられる.このため,暗黙的な確認要求,つまり話題を継続させつつ確認したい内容を含める発話をシステムが行い,それに対するユーザの応答を見ることで知識を獲得する枠組みを新たに提案した.この枠組みの中で,まず未知語の表記からその所属クラスを機械学習により推定した.この際の推定を最下位クラスと中間クラスとの2つのレベルで行い,その結果に基づき暗黙的な確認要求を生成することで,対話を継続させつつ知識を獲得することを狙った.この際,推定結果の正誤を判定するための確信度に対するしきい値は,データをもとに決定した.次に,この暗黙的確認要求に対するユーザの応答からその内容が正しいかどうかを推定する手法を開発した.まず確認要求に対するユーザの応答を,クラウドソーシングにより収集した.このデータを用いて,ユーザの応答から確認要求に含めたクラス名の正誤を推定する手法を開発し,その検証を行った.さらに,同じ確認要求に対する複数の抽出結果を用いてより確実に知識を獲得する手法について検討を進めた.まず全体像となる枠組みを提案したうえで,その中の要素技術についての研究を順に進めている.次年度に利用するデータの収集を終えており,また次に実施する被験者実験の設計に関する検討も進んでいる.本年度はまず国際ワークショップで全体像を含む発表を行った.次年度は引き続いて国際会議などで成果をアピールしていく.本研究課題は,「話すほど自律的に賢くなる対話システム」の実現を目指している.具体的には,ユーザとの対話中に現れる未知語に関する知識を,ユーザとの自然な対話を通じて取得する.この一環として,昨年度に暗黙的確認というプロセスを提案した.これは単純に「○○って何ですか?」のような明示的確認要求を繰り返してユーザの対話継続意欲を削ぐことなく,知識の獲得やその正誤の検証を行うものである.

これは,1未知語のクラス推定,2暗黙的確認要求,3ユーザの応答に基づく暗黙的確認要求に含めた内容の正誤推定,からなる.本年度は,次の2点においてこの暗黙的確認を拡張した.まず上記3の正誤推定において,単純な肯定否定表現に加えて,その中で使われるクラスの有無や,前後の発話との関係,応答の表層的表現などを素性として扱い,機械学習により正誤を予測する手法を提案した.これにより,正しいクラスを予測するF値が0.308向上した.2点目として複数のユーザからの応答を利用した.暗黙的確認要求に対する単一のユーザの応答のみを使った場合の推定精度は7割程度であったが,複数のユーザに対する暗黙的確認の結果を利用することにより精度をさらに向上させた.ここでは単一のユーザとの対話で得られる確率値を素性として機械学習を行った.音声を入力とした場合の未知語獲得についても検討を進めた.辞書にない語を単語単位で正しく音声認識するのは不可能であるため,音素レベルでのモデル化を行い,ノンパラメトリックベイズの枠組みで未知語の音素列や単語境界を得ることを試みた.さらに,獲得した知識を保持するために,単純な関係データベース以外の知識表現を用いる検討も行った.昨年度提案した暗黙的確認の枠組みをより高精度化するために,上述した2点の拡張を行った.これに際して,クラウドソーシングにより対話データを収集し,このデータを使って提案手法の性能を評価した.この結果をまとめたものが対話に関する第一の国際会議SIGDIALに採択され,口頭発表を行った.また昨年度の成果について取りまとめを行い,人工知能学会論文誌に採録された.さらには本年度の成果を中心に,所属研究機関の定例記者会見で発表を行い,確認した範囲で,国内で全国紙朝刊を含む5件,海外で14件の記事が報道された.本年度収集したデータを用いて引き続き要素技術の開発を進めるとともに,新たに設計した被験者実験も実施する.また本研究課題で開発している技術を,非タスク指向型システムに組み込み公開することも検討する.現在この非タスク指向型システムの開発が想定よりも遅れているが,統合できれば,被験者実験ではなく実際の対話の中で提案手法の有効性を検証できる.さらには,現在テキスト入力を前提として研究を進めているが,これを音声入力に展開する研究についてもさらに検討を進める.明示的確認要求が煩わしいという前提を確認するためのデータを,本年度終盤にクラウドソーシングにより収集した.これを用いて暗黙的確認要求の印象評定を進める.これとあわせて本年度の成果の取りまとめを行い,ジャーナルとして投稿する.また,音声を入力とした場合の未知語の認識や,獲得した知識を保持する知識表現についても検討を進める.これにより,音声入力で候補となった語彙の対話を通じた検証や,獲得した知識を含めた知識の汎化に基づく推論といった新たな展開を検討する.
近現代日本の農業発展と土地制度－農地政策と土地改良の史的分析－

2013年度は研究課題のうち、(1)農地改革に関する研究、(2)戦前から戦後の土地改良事業に関する研究の2点を進めた。また、(3)戦前日本の都市家計に関する研究成果を公表した。(1)まず、新潟県農地委員会会議録を用いて、1買収対価の基準として慣行小作権の価格を承認するまでの県・市町村の調整過程、2県の委員会において3.4haを上限とする経営面積上限の設定の困難さを明らかにすることができた。続いて、西蒲原郡中野小屋村を事例に、1慣行小作権は農民たちの土地諸経費が耕作権として価格化したものであったこと、2経営面積上限については調整の結果、3.4haを基準とした自作農創設を行っていたことを明らかにした。日本の農地改革は、農家間の平準化作用だけではなく、土地改良促進効果があった。(2)戦前は地主の反対によって土地改良事業実施が滞っていた。戦時下では県と農民が請願を行い、事業を農地開発営団事業に指定することに成功した。しかし、戦時下の労働力不足と資材不足により、事業が着手されることはなかった。戦後、木材などの限られた資材によって用排水機施設が設置され、地域の耕地条件は湿田から乾田へと転換することが出来た。(3)1919年に実施された東京市小学校教員生計調査の家計簿を利用して、夫婦世帯の1年間の家計データ分析を加瀬和俊氏とともに行った。第1に新中間層の代表的な職業階層と考えられた教員層は、1919年の半ばには食糧費支出が安定化し、都市生活が再生産される見通しがたった。第2に919年の後半の物価変動が激しく、家計は収入と支出において対応に迫られていた。第3に1919年末には教員に対する各種手当が充実するようになり、文化費支出を増加させていった。事例の世帯は、時代状況を反映して、「大正期教養主義」ともいえる生活スタイルを体現した家計特性を示していると位置づけた。(抄録なし)2011年度は、研究課題のうち、(1)戦時期の自作農創設維持事業、(2)戦後の農地改革といった農地政策に関する研究を中心に進めた。(3)新潟市役所歴史文化課、西蒲原土地改良区、新潟県立文書館、新潟県立図書館所蔵の史料調査を継続すると共に、新潟県庁所蔵の史料調査に着手した。(4)また、研究受入者である加瀬和俊教授の下で行ってきた、戦前の新聞産業に関する共同研究の成果を取りまとめ、公表した。(1)については、2011年6月に学会報告を行い(日本農業史学会)、その内容を学術論文として公表した(『農業史研究』第46号)。自作農創設維持事業が財政によって制約されていた側面、地主の置かれていた社会状況、農民が自作農創設維持事業を通じて積極的に土地購入に向かう条件(土地価格、土地条件)を実証的に解明した。(2)については、修士論文の内容をベースに、新潟県立文書館、新潟県立図書館、新潟県庁所蔵の史料調査から得た情報を加えて、2011年10月に学会報告を行った(政治経済学・経済史学会2011年度秋季学術大会)。農民の投下資本を「慣行小作権」として補償し、優良な農家経営に対しては経営規模を維持させる措置をとった事例を紹介し、日本の農地改革:と農家経営の発展との具体的な関係を事例に即して明らかにした。(3)については、農地政策に関する史料の収集は完了した。また、もう一つの研究課題である土地改良事業に関する史料については、西蒲原土地改良区での史料収集の他に、新潟県庁農地計画課が所蔵・管理する史料の調査を開始した。(4)については、共同研究者の一人として、192030年代の新聞社の経営上、重要な収入源であった新聞広告に関するサーベイ論文を執筆した。新聞広告を商品広告と案内広告とに分類して、新聞広告史研究の到達点と論点を示した。また、新聞広告の担い手として中小商工業者が地域末端の広告代理店機能を担っていた可能性を指摘し、中小商工業史の視点から新聞広告史を研究していく方法を提示した.2012年度は、研究課題のうち、(1)戦後の農地改革に関する研究・史料調査、(2)戦前から戦後の土地改良区に関する研究・史料調査、(3)1950年代の農業・農村政策に関する研究・史料調査の3点を進めた。また、(4)研究受入者である加瀬和俊教授の下で、戦前日本の家計消費に関する研究に着手した。(1)については、農地改革の買収売渡対象となる農家経営の土地と家族労働力に関するミクロデータを構築し、改革の影響を個別農家レベルで把握した。改革実施前に3-4ha以上を有していた農家80戸のうち、すべての農家が一定の農地買収が実施された。その結果、3.4ha以上有する農家は40戸と半減し、その多くが3-44haの範囲に収まった。すなわち、改革実施過程で容認された超過売渡は0.5ha未満であり、3.4ha前後を基準とした平準化が行われたことを明らかにした。(2)については、2011年度から引き続き、新潟県庁、新潟県立図書館・文書館、新潟市役所歴史文化課、西蒲原土地改良区が所蔵する史料に対する調査を実施した。これによって戦後直後の土地改良計画、事業の経過、事業結果について詳細なデータが得られた。(3)については、農地改革直後から農業・農村政策として展開した短期農業生産計画に関する史料調査を中心に行った。

東京大学社会科学研究所、新潟市役所歴史文化課が所蔵する短期農業生産計画に関する報告書、農業委員会会議録、事業計画書の収集を行った。(4)については共同研究者の一人として、住居費に関する研究にとりかかった。2012年度は住居費に関連する都市経済、住宅政策、建設産業史などの先行研究のサーベイと戦前の国勢調査や厚生省の住宅調査などの官庁統計を把握した。また、19171919年に高野岩三郎によって実施された東京市および隣接郡部の小学校教員生計調査の家計簿を利用して、夫婦世帯の1年間の家計簿データをデータベース化し、月次・日次レベルの家計分析を行った。そこから教員世帯の家計の変動性を把握することができた。2013年度は研究課題のうち、(1)農地改革に関する研究、(2)戦前から戦後の土地改良事業に関する研究の2点を進めた。また、(3)戦前日本の都市家計に関する研究成果を公表した。(1)まず、新潟県農地委員会会議録を用いて、1買収対価の基準として慣行小作権の価格を承認するまでの県・市町村の調整過程、2県の委員会において3.4haを上限とする経営面積上限の設定の困難さを明らかにすることができた。続いて、西蒲原郡中野小屋村を事例に、1慣行小作権は農民たちの土地諸経費が耕作権として価格化したものであったこと、2経営面積上限については調整の結果、3.4haを基準とした自作農創設を行っていたことを明らかにした。日本の農地改革は、農家間の平準化作用だけではなく、土地改良促進効果があった。(2)戦前は地主の反対によって土地改良事業実施が滞っていた。戦時下では県と農民が請願を行い、事業を農地開発営団事業に指定することに成功した。しかし、戦時下の労働力不足と資材不足により、事業が着手されることはなかった。戦後、木材などの限られた資材によって用排水機施設が設置され、地域の耕地条件は湿田から乾田へと転換することが出来た。(3)1919年に実施された東京市小学校教員生計調査の家計簿を利用して、夫婦世帯の1年間の家計データ分析を加瀬和俊氏とともに行った。第1に新中間層の代表的な職業階層と考えられた教員層は、1919年の半ばには食糧費支出が安定化し、都市生活が再生産される見通しがたった。第2に919年の後半の物価変動が激しく、家計は収入と支出において対応に迫られていた。第3に1919年末には教員に対する各種手当が充実するようになり、文化費支出を増加させていった。事例の世帯は、時代状況を反映して、「大正期教養主義」ともいえる生活スタイルを体現した家計特性を示していると位置づけた。学会報告および公刊による研究成果の公表が順調に進展している。史料調査が当初の予定通りに進展していることに加え、新出史料の発掘・利用が可能になった。自らの専門分野以外の研究成果を公表することができた。2012年度に予定していた、(1)農地改革に関する研究成果を学術雑誌に掲載のうえ公表する予定が遅延している。(2)土地改良に関する研究成果を学会報告等を通じて公表する予定が遅延している。以上の(1)と(2)が遅延した要因は、研究過程で史料調査不足が判明し、補足の史料調査を行ったためである。また、(3)1950年代の農業・農村計画に関する研究に関しては、おおむね順調に資料調査・研究史整理を進めた。以上、三つの研究進捗状況から総合すると、「研究の目的」の達成度は(4)の「遅れている」が妥当な評価だと思われる。農地改革に関する研究成果を査読付雑誌に投稿する。
環境変動への葉緑体の応答の多光子レーザ走査蛍光顕微鏡による4次元観察

共焦点レーザ走査蛍光顕微鏡(以下、CLSM)などの蛍光顕微鏡によるクロロプラストの観察では、蛍光プローブの励起光が光合成を刺激し、観察行為自体が観察対象を変えてしまうのに対し、赤外域の励起光を用いる多光子レーザ走査蛍光顕微鏡(以下、MPLSM)では、励起光が光合成有効放射ではなく、また、波長800nm以上の赤外放射では、フィトクロムへの作用もないことから、非破壊観察が可能であろう、との予想から本研究は始まった。しかし、立ちはだかる困難は予想をはるかに超えたものであった。一番の問題は、MPLSMにより植物観察事例がほとんどないことである。いままでCLSMに使われていた蛍光プローブ自体がMPLSMに使用可能かどうかもわからなかった。そのため、多くの時間をMPLSMによる観察法の確立に割かざるをえず、当初の目標(4次元観察)には及ばなかった。また、クロロフィルを含まない根細胞の観察などの回り道も必要であった。以下に、主な成果を示す。1.ホウレンソウの根を材料に植物細胞のpH観察法を確立した。MPLSMによるレーシオイメージングのプロープとしては、SNARF-4Fが優れていること、SNARF-4Fの細胞への導入には低温導入法が適していること、培養液のpH変動に応じて根のアポプラストpHは変動するがシンプラストpHは変動しないことなどが分かった。2.シロイズナズナ孔辺細胞のカルシウムイオン濃度観察では、Fra-redとfluo-3による二重染色が優れているが、正確な観察にはそれでも不十分であった。3.ホウレンソウ葉肉細胞プロトプラストのクロロフィルおよび液胞内pHは、青色光照射により、前者は低下し、後者はほぼ一定値を保った。植物あるいは植物細胞の観察は、通常の蛍光顕微鏡や共焦点レーザー走査蛍光顕微鏡(以下CLSM)を用いて行われてきており、いままでに多くの成果を上げている。しかし、これらの顕微鏡観察では、励起光に紫外線から可視光の範囲の波長の光を使用するため次の問題点があった。すなわち、これらの波長の光は植物に対して生理作用があることである。これらの顕微鏡による観察は、一種の破壊的観察といえる。なぜなら、観察のための光照射によって、観察対象に変化をもたらすからである。近年、実用化された多光子レーザー走査蛍光顕微鏡(以下:MPLSM)は、この問題を、大幅に低減する可能性を持っている。なぜなら、植物への生理作用がほぼないと考えられている近赤外線を励起光として使用できるからである。もちろん、植物から発せられる蛍光は生理作用を持つ波長域の光であり、MPLSMによって、完全に上記の問題が解決されるわけではない。本研究では、MPLSMを用いて、環境変動時の植物あるいは植物細胞内(特に葉緑体内)の変化を観察し、MPLSMでしか検出できない変化を検出し、植物生理学およびそれに基づいた作物環境制御に貢献する。今までにもMPLSMによる植物観察例は数例報告されているが、自家蛍光の観察やフォトブリーチングの観察であり、蛍光プローブを用いた本格的な観察は皆無に等しい。すなわち、技術的にもこれから開発すべき課題が山積している課題である。初年度は、そのため、次年度以降の観察の技術的な問題の検討を、カルシウムイオンの観察を取りあげて行った。以下の諸点が明らかとなった。1.MPLSMによるフォトブリーチングはCLSMに比べ一般的に大きい。2.CLSMで用いられる蛍光プローブをMPLSMで用いても、励起光の波長が2倍になるだけの違いではなく、励起スペクトル、蛍光スペクトルは大きく異なり、MPLSM用に新たに検討する必要がある。3.上記2の観点からカルシウムイオン濃度のレーシオ

イメージング観察可能なプローブを探したところ、fluo-3とFura-Redを組み合わせることが最適と判断された。本研究の最終目的は、環境変動時(主に光環境変動時)の細胞内変化を可視化することである。いままでの蛍光顕微鏡や共焦点レーザ走査顕微鏡では、観察に生理作用(主に光合成)を持つ可視光の照射が必要であったため、一種の破壊的観察(観察行為そのものが観察対象の状態を変えてしまうこと)といえる。本研究の着想は、生理作用の比較的少ない赤外域放射の照射による観察が可能な多光子レーザ走査蛍光顕微鏡によって、主に葉緑体の環境変動への応答を観察することである。昨年度は、そのための技術的問題を解決するためにカルシウムイオン濃度観察と取り組んだ。本年度は細胞内pHの観察を目標とした。観察対象はホウレンソウ葉肉細胞のプロトプラストとし、pH感受性プローブとして、SNARF1を用いた。細胞内への導入にはそのAM体を使用した。SNAF1は1波長励起2波長観察が可能であるので、レーシオイメージング法によるプローブの局在などの問題を回避した。得られた結果は以下のようである。なお、本研究は技術的問題の解決であるので、初期pHは水素イオンイオノフォアを用いて調節した。1.液胞の観察では、光を照射すると、pHが減少したのに対し、光を照射しない場合はpHはほぼ一定の値であることがわかった。当初、AM体によるプローブ導入で液胞への導入の可能性が心配されたが、導入可能であることがわかった。2.葉緑体の観察では、見かけ上、光照射しないと観察時にpHは低下したが、光照射時は、ほぼ一定の値となった。しかし、この観察結果には葉緑体の自家蛍光が含まれているため、次の観察を行った。3.SNARF1を導入せず、その他の条件は2とまったく同じにして葉緑体自家蛍光だけを観察した。その結果、自家蛍光は、光照射の有無によらず、ほぼ一定で、2での観察の大きな部分はSNARF1からの蛍光であると推測された。そこで、2での観察結果から3の自家蛍光を差し引いて解析したところ、2での結果が再確認された。いままでの蛍光顕微鏡や共焦点レーザ走査顕微鏡では、観察時に生理作用(主に光合成)を持つ可視光の照射が必要であったため、一種の破壊的観察(観察行為そのものが観察対象の状態を変えてしまうこと)といえる。昨年度は、ホウレンソウ葉肉細胞のプロトプラストを対象にpH変動の観察を行い、そのなかで、葉緑体の自家蛍光を観察された蛍光から差し引くという手法を適用した。本年度は、来年度の本格観察に向けて観察技術の改良を主眼にした。そのため、自家蛍光の問題を回避できるホウレンソウ実生の根を観察対象とし、引き続きpH変動の観察を目標とした。観察対象をプロトプラストから組織に変えることで、来年度行う予定のin vivoでの組織観察の手法を検討した。
唾液腺初期発生におけるSox9転写制御ネットワークの解明

当該研究では唾液腺初期発生におけるSox9を介した転写ネットワークを解明する目的で、胎生期唾液腺においてSox9に対するクロマチン免疫沈降シーケンス(ChIP-seq)を行い、RNA-seqによる遺伝子発現プロファイルと比較検討することにより、Sox9の唾液腺特異的な結合領域を同定することで唾液腺初期発生を制御する遺伝子群の解明を目指した。胎生13日マウス顎下腺を実体顕微鏡下で外科的に採取し酵素処理による細胞分散後に、Sox9によるChIP-seqを用いてSox9結合領域についてゲノムワイドな解析を行った。胎生期唾液腺におけるSox9結合領域にはSox dimer motifが有意に濃縮されており、検出されたピークの約40%にSox dimer motifが存在した。この結果より唾液腺発生期におけるSox9の直接的な結合領域が同定された。次にpeak近傍の遺伝子群についてGO解析を行うと腺組織の発生に関わるtermが多く抽出され、唾液腺発生期においてSox9は下流の遺伝子制御により唾液腺組織形成に関わる可能性が示された。また近傍遺伝子群について膵臓発生期におけるSox9 ChIP-seqの結果との類似性について検討すると、唾液腺で検出された約1400の遺伝子のうち約1100の遺伝子は膵臓発生期においては検出されておらず、Sox9の組織特異的な機能が示唆された。胎生期唾液腺のRNA-seqの結果より唾液腺原基の上皮部分において発現上昇を認めた遺伝子であり、Sox9の結合領域が近傍に存在する遺伝子としては、ETV5などが挙げられ、これまで唾液腺発生に関与していると報告されている遺伝子がSox9の下流遺伝子である可能性が明らかとなった。胎生13.5日マウス唾液腺原器のSox9に対するChIP-seqを行った。ChIP-seqには胎生13.5日マウス唾液腺原器を酵素処理により分散化し5x10^6個の細胞を用いた。データ解析にはCisGenomeでの解析を行いFDR 0.01以上の760領域がpeakとして検出した。検出されたpeakにはSox9の上流に位置するSOM regionと呼ばれるSox9結合領域のpeakが含まれSox9結合領域が濃縮されていることが明らかとなった。peak近傍遺伝子のGO解析の結果からは腺組織の形態形成に関わる遺伝子群が有意に濃縮されておりSox9が唾液腺形態形成に関わる転写因子である可能性が示唆された。また、胎生13.5日マウス唾液腺原基上皮部分と唾液腺原基周囲間葉組織と口腔粘膜の3領域を採取しRNA-seqによる発現プロファイルの作製を行った。RNA-seqでは唾液腺間葉部分でFGF群の発現が有意に高く、唾液腺形態形成に関わる可能性のある成長因子についても知見が得られた。ChIP-seqで検出されたpeakの近傍遺伝子と、RNA-seqで唾液腺原基特異的に発現する遺伝子(RPKM 5以上Fold change 3以上)を候補遺伝子群として抽出した。抽出された遺伝子群の中にはEtv5やSpry2などこれまで唾液腺形態形成に重要な遺伝子であることが報告されている遺伝子が含まれ、これらの遺伝子がSox9の制御を受けている可能性が示された。今後の研究の展開としては、胎生期唾液腺の器官培養を用いてSox9の制御遺伝子を候補遺伝子から絞込みSox9転写ネットワークについて解析を進める。また上記の知見を活かして胎生期口腔粘膜への遺伝子導入による唾液腺分化誘導についても検討を重ねる予定である。当初予定していたNext Generationsequenceを駆使したChIP-seq, RNA-seqの実施を行い、網羅的に唾液腺発生に関与する遺伝子群に関するプロファイルの作製が完了した。次年度に予定しているSox9の転写ネットワークの解明に必要なデータは取得できたため概ね良好な進捗状況であると考える。

候補遺伝子について蛍光抗体法やFISHを用いた局在解析に加えて胎生期唾液腺の器官培養を用いてSox9の制御遺伝子を候補遺伝子から絞込みSox9転写ネットワークについて解析を進める。また上記の知見を活かして胎生期口腔粘膜への遺伝子導入による唾液腺分化誘導についても検討を重ねる予定である。唾液腺誘導に必要な候補遺伝子については公開されている他臓器のプロファイルも利用し、唾液腺特異的な遺伝子の抽出を予定している。該当せず。