hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
オージェ電子プローブ時間分解表面XAFSと表面ダイナミクス研究

その結果、表面の原子状窒素が1原子消費されると、気相に1分子のN_2Oが生成することが明らかになった。さらに反応中の安定precursorとして、NOダイマーを表面XAFSで直接捉えることができた。これらのことを合わせて、precursor-mediated reaction modelでこの反応を理解できることを示した。NOダイマーは有機反応や生体反応で中間体として働くことが知られているが、表面反応でもNOダイマーが関わることを分光法的に実証した初めての例である。さらに、我々の手法と相補的である高速XPSを用いてPd(111)上のCO酸化反応のメカニズムを調べる研究を行った。高速XPSの実験はスウェーデン国立放射光施設MAX-Labのアンジュレータービームラインで行った。測定結果を解析した結果表面酸素の構造相転移に伴って、反応性が劇的に変化することが明らかになった。詳細に解析すると、表面に吸着したすべての、COではなく、弱く束縛されたCO分子のみが反応に直接関与していることが分かった。本課題は最近開発したオージェ電子プローブエネルギー分散型表面XAFS法を高度化し、表面反応などの動的表面過程の研究を行うことを目的としている。これまで、我々の手法によって、Pt(111)上の水の生成反応において、H_2OとOHの共吸着層におけるプロトン移動がreaction frontに効果的に反応種であるH_2Oを供給するうえで重要な役割を果たしている可能性が高いことを見いだしている。このプロトン移動は、反射型赤外吸収分光やDFT計算から示唆されているものの、本当にプロトン移動によって物質移動を誘起しているかどうかは明確になっていない。また、仮にプロトン移動が起こっているとしても、その移動速度については全く分かっていない。そこで、レーザー脱離法による局所脱離とH_2Oのドーズによる再吸着によって、H_2O+OH共吸着層の中に数百μmオーダーの幅のH_2O吸着層を作り、プロトン移動によってH_2O吸着層の中にOHが拡散してくる様子をマイクロXPSによってリアルタイム観測し、その解析を通してプロトン移動の時間スケールを測定した。その結果、H_2O吸着層の中心部にプロトン移動によるOHの生成を確認した。OHの被覆率の時間変化をランダムウォーク理論に基づいて解析したところ、プロトン移動過程は23±5ns間隔で起こっていることが明らかになった。以上のように、本研究において、表面2次元系におけるプロトン移動を確認する方法を提案し、それによって初めてそのタイムスケールを求めることができた。本研究成果はプロトン移動の理解への一つの道筋を拓くものである。
頭頸部癌の浸潤・転移におけるＥＭＴによる癌幹細胞活性化機構の解明

頭頸部癌細胞において、Wnt/Snailのシグナル伝達経路がEMT(上皮間葉移行)を誘導し、癌幹細胞の活性化を促進し、癌の浸潤・転移を亢進させるかどうかを検討した。その結果、Wnt/Snailのシグナル伝達経路がEMTを誘導し癌の浸潤・転移を促していることをin vitro、およびin vivoにおいて見出した。さらに、SnailによりEMTを誘導された癌細胞は、癌幹細胞マーカーの発現や治療抵抗性の増強など癌幹細胞様特性の獲得も見出された。今後、EMTに関わるこれらのシグナル伝達経路を制御することは頭頸部癌の浸潤・転移を制御することに繋がると考えられ、その意義は大きい。本研究では、頭頸部癌の治療効果の向上のため、癌細胞の浸潤・転移のしくみを解明し、そのしくみを基に浸潤・転移を阻止することを目的としている。これまでに、Wntシグナル伝達経路がSnailを介してEMT(Epithelial-Mesenchymal Transition、上皮間葉移行)を誘導することで、MT1-MMPおよびMT2-MMPを活性化させるとともに、癌細胞の浸潤・転移能を獲得させることを見出してきた。そこで、頭頸部癌細胞において、いかにしてWnt/Snailのシグナル伝達経路がEMTを誘導し、癌幹細胞を活性化させ浸潤・転移を促しているかを、in vitroおよびin vivoのレベルで分子生物学的手法および独自の浸潤・転移モデルを用いて解明する。本年度までに頭頸部癌細胞においてin vitroでWnt/Snailのシグナル伝達経路がEMTを誘導し、癌の浸潤・転移を促していることを見出してきた。その結果を踏まえて、in vivoにおいても、我々が開発・確立した鶏卵によるin vivo癌浸潤・転移モデルを用いて、Wnt1あるいはSnailを強発現させた癌細胞が、生体において浸潤・転移能、さらには腫瘍増殖能を獲得することが分かってきた。さらに、EMTを誘導された癌細胞は、癌幹細胞様の形質を獲得する可能性があり、その解析が必要となってくる。今回、頭頸部癌細胞においてin vitroでWnt/Snailのシグナル伝達経路がEMTを誘導し癌の浸潤・転移を促していることを見出した。本年度は、頭頸部癌細胞株にSnail遺伝子を導入し、導入細胞の機能解析を行った。Snailを強発現することで、細胞膜上のE-Cadhrinの発現は減弱し、細胞間接着が外れ、EMTが誘導された。

また、Snail導入細胞の運動能を解析したところ、コントロール細胞よりも細胞運動能が亢進していた。また逆に、転移浸潤能の高い癌細胞にSnail-siRNAを導入することでその機能をノックダウンすると、細胞間接着能が強固になるとともに細胞運動能も抑制された。これからの結果より、頭頸部癌細胞においてもin vitroにおいてWnt/Snailのシグナル伝達経路がEMTを誘導し癌の浸潤・転移を促していることが示唆された。当初より予定していた頭頸部癌細胞株へのSnail遺伝子の導入も実行できEMTの形質変化が確認でき、癌細胞の浸潤・転移の機能解析のためのin vitro実験も遂行できた。一方、Snail-siRNAを導入することで浸潤・機能の抑制効果も確認できた。その結果をもとに、我々が開発・確立した鶏卵によるin vivo癌浸潤・転移モデルを用いて、Wnt1あるいはSnailを強発現させた癌細胞が、生体において浸潤・転移能、さらには腫瘍増殖能を獲得するかどうかを検討した。その結果、in vivoにおいてもSnail発現細胞において浸潤能が亢進していることが示唆された。前年度までのin vitroおよびin vivoにおける頭頸部癌細胞でのSnailの発現によるEMT誘導、ならびに癌細胞の浸潤・転移の亢進の結果を踏まえて、これらの細胞群が癌幹細胞様の形質を獲得しているかを検証する。さらに、元来Snailを強発現している癌細胞(癌幹細胞)に対して、特異的なsiRNAを用いて遺伝子発現をknock downさせ、生体において転移能を抑制できるかを鶏卵によるin vivo癌浸潤・転移モデルを用いて検討する。本年度のin vitroにおける頭頸部癌細胞でのSnailの発現によるEMT誘導、ならびに癌細胞の浸潤・転移の亢進の結果を踏まえて、in vivo、つまり生体においても同様の現象が再現できるかを検証する。具体的には、我々が開発・確立した鶏卵によるin vivo癌浸潤・転移モデルを用いて、Wnt1あるいはSnailを強発現させた癌細胞が、生体において浸潤・転移能、さらには腫瘍増殖能を獲得するかどうかを検討する。さらに、Snailを強発現した癌細胞が、癌幹細胞としての形質を獲得しているかについて検証する。本年度は当初計画していた細胞培養の維持にかかる費用が軽減されたために次年度使用額が発生したが、次年度はin vitroでの癌細胞の機能実験に加え、鶏卵によるin vivo癌浸潤・転移モデルを用いての動物実験を施行するとともに、これまでの成果をまとめ、国内外の関連学会において発表し、関連学術誌に投稿するために研究費を拠出する予定である。次年度使用額については、当初計画していた細胞培養の維持にかかる費用が軽減されたために発生したが、次年度はin vitroでの癌細胞の機能実験に加え、鶏卵によるin vivo癌浸潤・転移モデルを用いての動物実験を施行するため、予想以上に実験維持費が必要となる可能性があり、次年度使用額で補填する予定である。
腺管分離法を用いた大腸腫瘍のDNA multiploidの遺伝子解析

【目的】大腸癌は種々の形態を示す単一腫瘍腺管で構成されている。従って個々の単一腫瘍腺管の分子レベルの異常を知ることは、大腸癌全体の腫瘍発生を理解する上でも重要である。そこで我々は大腸癌の単一腫瘍腺の分子レベルでの解析を行った。【方法】30例の大腸癌から腺管分離法を用いて単一腫瘍腺管を分離した。各々の症例から実体顕微鏡下に1腺管ずつ単一腫瘍腺管10腺管を回収しDNAを抽出した。回収した各10個の単一腺管で構成されるサンプル(単一腺管群)と、同一症例から30個の腫瘍腺管を回収しDNAを抽出したサンプル(代表群)との間で、それぞれ1p、5q、8p、17p、18q、22qのallelic imbalance(AI)及びMSIについて解析した。加えてp53遺伝子変異についても検索した。代表群においては、MINT1、MINT2、MINT31のメチル化をmethylation-specific PCR法を用いてCpG islands methylation phenotype(CIMP)の有無を検索した。【結果】全例において各単一腫瘍腺管の遺伝子解析が可能であった。25例において単一腺管群でみられた遺伝子異常は代表群で一致したが、5例は一致しなかった。単一腺管群の遺伝子異常の多様性がみられた症例は27例であった。【結語】1)各単一腺管には多彩な遺伝子異常がみられた。2)大腸癌における単一腫瘍腺管は多様な遺伝子異常で構成されていた。回収した各10個の単一腺管で構成されるサンプル(単一腺管群)と、同一症例から30個の腫瘍腺管を回収しDNAを抽出したサンプル(代表群)との間で、それぞれ1p、5q、8p、17p、18q、22qのallelic imbalance (AI)及びMSIについて解析した。代表群においては、MINT1、MINT2、MINT31のメチル化をmethylation-specific PCR法を用いてCpG islands methylation phenotype (CIMP)の有無を検索した。CIMPは遺伝子異常の少ない例にみられる傾向があった。3)CIMPはLOHの頻度の少ない例に関与している可能性が示唆された。
利潤増加型参入に関するゲーム理論分析

現実の産業構造を意識した上・下流の垂直構造を持つ事例を表現する経済モデルを構築し、その解析的分析や数値的分析を行った。その成果として、強い仮定の下ではあるが、陣営レベルで見れば利潤増加型参入が発生する均衡の導出に成功した。更に均衡の特徴を調べるために数値的分析を行い、どの条件が必須で強く作用しているのか、どの条件なら弱められそうなのかといった示唆を得た。本研究の全体構想は、参入によって既存企業の利潤が増える(以降、利潤増加型参入と呼ぶ)可能性を示した先駆的な実証結果と整合性のある理論モデルを提示することである。本年度は、特に卸売市場を明示的に扱った垂直的関係の市場に焦点を絞り、上述の分析を進めていった。より具体的な内容は以下の通りである。まず、技術標準をめぐる競争などの事例で多く見られた、上・下流の垂直構造を持つ事例を表現する経済モデルを構築し、その解析的分析と数値分析を行った。解析的には均衡を導出することに一定程度成功した。今回の分析で、一定の条件下で陣営レベルでは利潤増加型参入が均衡で起こり得ることが明らかになった。更に導出された条件の具体的な特性を調べるために、数値分析を行い、特定の条件が強く作用しているケースがあることを発見した。本年度の研究成果の意義の一つに次のようなものが挙げられる。現実の産業界でも多く見られるような、独立した企業群が陣営・グループを作り、そのようなグループ単位で競争する構造の市場では、businessstealingeffectが利潤増加型参入を引き起こす重要な要因の一つとなり得ることが、本年度の分析によって明らかになった。現時点では非常に限られた設定の上での話であるが、分析結果を見る限り、著しく特殊な効果ではないと推測され、ある程度一般的な性質の結果である可能性が高い。business stealingeffect自体は産業組織論の世界では非常に良く知られているものだけに、この発見は利潤増加型参入の一般性を探る上で興味深いものである。また、これらとは別に現実の事例の調査や隣接分野の文献探索といった補助的な研究活動も行った。特にマーケティング理論や会計学的資料による裏づけなどの有効性について調査している。この点については今後も継続して判断していく予定である。本研究の全体構想は、参入によって既存企業の利潤が増える(以降、利潤増加型参入と呼ぶ)可能性を示した現実的な理論モデルを提示することである。本年度は、特に現実の応用例となり得る市場の調査及び本格的な事例分析へ向けての準備作業と、候補市場の特徴を参考にした基本モデルの改良を検討した。まず、サーベイ的に様々な事例を調査していく中で、携帯電話市場が潜在的な応用事例として浮かび上がってきた。携帯電話市場では、スマートフォンの普及により、従来の音声だけでなくデータも扱うようになり、徐々に後者の比率が高くなってきている。こうした中、仮想移動体通信事業者(Mobile Virtual Network Operator, MVNO)の存在感も増してきており、相対的に大手3社がヘビーユーザーを、後発の企業がライトユーザーを主たる顧客として取り込む住み分けが進んでいる。また、MVNOの大半はNTT Docomoと回線の利用権の売買を通じて垂直的な取引関係になっている。これらの点に注目して、MVNO企業の参入活発化と既存企業の利潤との間にある関係を明らかにする方法を模索した。経営上の重要データである各種費用・収入を収集することは事実上不可能と考えられるため、財務諸表や官民のシンクタンクなどが発行しているレポートなど、一般公開されている比較的信頼性の高いデータに注目していく方法を試すことにした。そこで、各種資料に出てくる数字を読み解くために、会計学などの基礎的な準備も同時に進めた。また、現実の携帯電話市場は総務省の監督もあり卸売市場の動向は経済合理性だけで決まるわけではないこと、大手3社は回線網の構築から販売までを行うという意味で川上・川下が一体化した企業であること等を考慮した基本モデルの修正可能性について検討した。本年度は、現実の応用例となりうる市場(以降、ケーススタディと呼ぶ)の調査・分析と、それを踏まえた理論モデルの拡張可能性について検討した。昨年度よりケーススタディの主たる候補として注目していた、MVNO(仮想移動体通信事業者)業界を調査・分析した。特に、調査当初は草分け的存在で業界でも有力な地位を占めている日本通信を中心に調査していた。日本通信はほぼ専業のMVNO事業者である上、業界内でも中心的役割を果たしていた時期が長く、業界全体の構造も日本通信を通じて推測できるのではという期待も大きかった。また、東証1部上場企業のため、財務諸表などの各種公的書類が容易に入手可能であり、情報量も比較的多いため、好都合であった。しかしながら、ここ数年でMVNO業界(格安スマホ市場)は大きく成長・変化し、現在もまだ産業構造の急激な変化の最中であるため、安定した経済的事実の観測は困難になってしまった。例えば、MVNO業界では、イオンや楽天といった巨大企業の本格参入と業界内での主要プレーヤー化が目立つようになった。これら企業は本業への波及効果も考慮したビジネスモデルを展開していると思われ、複雑な企業戦略を採用している可能性が高い。

また、MVNO事業は当該企業内で相対的に小さな事業であり、詳細な情報を得られる見込みも格段に小さくなってしまった。こうした事情を考慮した上で、ケーススタディとして採用できる余地がどのくらいあるのか検討したが、現時点では結論は出ていない。また、MVNO市場を意識する程度に応じて、どのくらい柔軟に理論モデルを構築できるかも検討したが、この点に関してはかなり楽観的な見通しが得られた。注目していたMVNO(仮想移動体通信事業者)業界において、ここ数年で大きな産業構造の変化が見られる。そうした構造変化に対して、どのように研究計画を修正すべきか現在検討中である。そのため、ケーススタディの蓄積に関して当初予定より遅れが生じている。他の点に関してはおおむね順調であり、一定の目処が立っている。2016年度は、移籍で職場が変わったこともあり、十分な研究時間を確保できなかった。その結果、予定していた研究計画を全て実行することはできなかった。そのような状況ではあったが、2016年度の成果としては、携帯電話産業の事例研究の進展と基本モデルの構築の進展が主なものとなる。一般には格安スマホとして知られる、MVNO(仮想移動体通信事業者)による携帯電話事業は、大手3企業も無視できない存在となっている。また、参入の激化によるMVNO同士の競争も激しくなり、一部企業の過大広告などの弊害も報道されるようになってきた。一方、AUとソフトバンクは子会社の別ブランドに大規模なテコ入れを行い、本格的な攻勢を取り始めた。ただし、本体のサービスや料金体系には大きな変化はなく、グループ全体としてどのような経営判断を行っているのかは簡単にはわからない状況と言える。また、総理大臣まで言及するなど、携帯電話産業は政治的にも大きな注目を集めている。そうした事情から、総務省などが積極的に介入しており、経済合理性では説明できない規制や裁定などが為されていると思われる。こうした複雑で早い変化をどのように解釈すべきか、各種文献や有価証券報告書などの会計関連資料を参照しながら少しずつ解明していった。基本モデルについては、携帯電話事業固有の特徴を除いたモデルについて、幾つかアイデアを試してみた。決定的な形を得るまでは未だ至ってはいないが、色々と試しながら、少しずつ方向性を絞り込んだ。移籍で職場が変わったことや、一時体調を崩したこと、事例として注目していた携帯電話産業の構造が予想以上に複雑だったことなどが主な理由である。2017年度は、分析対象のMVNO(仮想移動体通信事業者、いわゆる格安スマホを運営する企業群)の市場構造が激変したため、その対応に苦慮した。最大の具体的事例は、楽天が第4の通信事業者として名乗りを挙げ、格安スマホから自社による通信サービスの提供へ舵を切ったことである。また、フリーテルや日本通信といったその他の有力企業が倒産・撤退するなど、様々な動きが見られた。こうした展開を受け、予定していた研究計画を一部中断し、基本モデルの再構築を中心的に行った。そのような状況ではあったが、2017年度の成果としては、基本モデルの理解の進展が主なものとなる。
Aktを介したサーカディアンリズムの制御

Aktによるリン酸化を検討するために、時計遺伝子産物CLOCKとBMAL1のトタンパク質を大腸菌に発現させ、GSTタグ付きリコンビナントタンパク質として精製することに成功した。精製済みAktと試験管内で^<32>P-ATP存在下で反応させることにより、時計遺伝子産物のAktによるリン酸化を確認した。さらに、時計遺伝子産物CLOCKとBMAL1の断片タンパク質発現バクターを作製し、各々大腸菌より精製を行なった。本断片タンパク質を用いることにより、時計遺伝子産物CLOCKとBMAL1は数カ所の部位がAktによりリン酸化されることを見いだした。主要なAkt依存的なリン酸化部位について、その部位周辺のリン酸化ペプチドをマウスに免疫することで、時計遺伝子産物CLOCKとBMAL1のリン酸化特異モノクローナル抗体を作製することに成功した。本抗体を用いることで、細胞内でもAkt依存的に時計遺伝子産物CLOCKとBMAL1がリン酸化されていることを確認した。各々のリン酸化部位をアラニンに置換した非リン酸化型時計遺伝子を作製し、Per1プロモーターを用いた時計遺伝子産物の転写活性を検討したが、1カ所のみ変異させたものでは弱い転写活性減少しか認められなかった。主要なリン酸化部位を4カ所ほどアラニンに置換することにより、Akt依存的な時計遺伝子産物CLOCKとBMAL1の転写活性化が顕著に抑制された。よって、Aktは時計遺伝子産物をリン酸化することにより、概日周期の進行に寄与している可能性が示唆された。本研究課題では、時計遺伝子発現制御機構、特にサーカディアンリズムを刻むのに欠かせないCLOCK/BMAL1ヘテロ二量体のAktによる制御機構を明らかにすることを目指している。研究代表者は既に、CLOCK/BMAL1ヘテロ二量体によるマウスPer1遺伝子転写が、野生型Akt遺伝子導入により抑制されること、逆にドミナントネガティブAkt遺伝子導入により促進されることを発見していた。種間での相違を考慮し、ヒトPer1プロモーター部位をルシフェラーゼ遺伝子の前につないだレポーターコンストラクトを作製し比較する事で、AktはヒトとマウスのPer1プロモーター活性にほぼ同様な抑制活性を示す事を証明した。ヒトPer1プロモーター領域を短くしたレポーターコンストラクトを多数作製することで、Aktにより制御されるヒトPer1転写部位として、ヒトPer1プロモーター上のE-boxドメインを同定した。E-boxドメインを3つタンデムにつなげたレポーターコンストラクトと、そのE-boxドメインに変異を入れた変異レポーターコンストラクトを作製した結果、AktはCLOCK/BMAL1ヘテロ二量体のE-boxへの結合をキナーゼ活性依存的に抑制していることを明らかにした。さらに、ChIPアッセイの結果、Aktのキナーゼ活性依存的にCLOCK/BMAL1ヘテロ二量体のDNAへの結合が低下する事も明らかにした。今後、時計遺伝子産物のAktによるリン酸化の可能性を検討していく。
より適切な母子保健環境をバングラデシュ農村に齎すマイクロインシュアランスの設計

南アジア諸国では妊産婦死亡率は非常に高く、その中でもバングラデシュは10万人につき570人の死亡率で最悪の妊産婦死亡率である。このヘルスケア危機の課題に応ずるため、バングラデシュ農村部の妊娠中女性及び産後1年の母子のためのヘルスマイクロインシュアランス(HMI)のモデルを開発した。このHMIプログラムは、バングラデシュの貧困を削減し母子の保健を改善する社会的な革新的な取り組みのトップ10の中で、2番目に重要と認められた。現在、我々はバングラデシュで開発したHMIモデルを小規模で行っていく課程の途中であり、バングラデシュの農村におけるHMIモデルの影響を評価していくところである。目的:バングラディッシュ農村部の母体死亡率は非常に高い。グラミン銀行によるマイクロインシュアランスを母体とするヘルスケアシステム(Health micro-insurance program:HMI)は、この農村部女性の健康危機に対して実効性のある保険制度として、世界的な注目を浴びつつある。このバングラデシュ農村地域とHMIを対象として,以下の調査研究を行う。1)バングラデシュ農村部の女性/母親や家庭内の意思決定者が求める母子保健(制度)の条件や課題の抽出/評価。2)HMIにより提供されている母子保健パッケージへの高い需要の分析/理解。3)予防的/治療的の両面でより有効に、より最少のコストで最大限継続されうる特別な母子保健パッケージの設計/提案。この研究実績はバングラデシュや多くの発展途上国の母子保健の発展に貢献すると同時に、その成果は我が国の母子保健制度の改善や少子高齢化問題の対策等にも広く寄与することが期待される。本年度(平成25年3月31日)の研究実施計画最初に、10の農村を研究対象として選出。6つの農村は、グラミン銀行によるマイクロインシュランスを母体とするヘルスケアシステム(Health micro-insurance program:HMI)のそれぞれの部門から、2つの農村は、他のHMI保険施設BRAC(Bangladesh Rural Advance event Comittee)から、1つはNorthernhalf(Rajshahi,Dhakaand Sylhetの三つの部門を含む)から、残りの2つの農村は、上記のHMIプログラム外から選出。それぞれの世帯からは、妊娠可能な女性と、世帯主に調査を行う。もし、妊娠可能な女性が世帯主の場合、彼女のみがその世帯の回答者となる。調査計画は、回答者から直接、確実な情報を収集する為、質問項目が順序良く配列されるよう、また途中、修正を入れ、実質的なものへと発展させる予定。データ収集と生きた情報の入力、管理作業を行う間、専門家をテータの収集と結果提出管理者として雇用する予定である。バングラデシュ農村部の母体死亡率は非常に高い。グラミン銀行によるマイクロインシュアランスを母体とするヘルスケアシステム(HMI)は、この農村部女性の健康危機に対して実効性のある保険制度である。このバングラデシュ農村地域とHMIを対象として、以下の調査研究を行った。2) HMIにより提供されている母子保健パッケージへの高い需要の分析/理解。バングラデシュや多くの発展途上国の母子保健の発展に貢献すると同時に、その成果は我が国の母子保健制度の改善や少子高齢化問題の対策等にも広く寄与することが期待される。国立国際医療研究センター、筑波大学、バングラデシュのHDRCRP(バングラデシュ農村地域住民のための健康と疾病研究センター)及びボグラ医科大学が協同で行った。本年度、我々は都市部・副都市部・農村部のそれぞれでHMIのアンケート調査を行った。それぞれの世帯から、出産可能な年齢の女性と世帯主に対しインタビューを行った。(出産可能な年齢の女性が家長である場合は、彼女はその世帯において唯一の回答者となる。インタビューは、最初の回答者から収集した質的・量的情報に対して二択選択あるいは自由回答形式の質問から構成する。)また昨年度も行ったが、再度、HMIに関するポスターを作成し、都市部を中心に配布した。重要課題別グループディスカッションも行った。本年度は最終年度であるため、データ入力とその分析に力を入れ、最終の報告書をまとめる予定である。目的:バングラデシュ農村部の母体死亡率は非常に高い。グラミン銀行によるマイクロインシュアランスを母体とするヘルスケアシステム(Health micro-insurance program : HMI)は、この農村部女性の健康危機に対して実効性のある保険制度として、世界的な注目を浴びつつある。このバングラデシュ農村地域とHMIを対象として、以下のような目的で調査研究を行う予定であった。すなわち、1)バングラデシュ農村部の女性/母親や家庭内の意思決定者が求める母子保健(制度)の条件や課題の抽出/評価。

3)予防的/治療的の両面でより有効に、より最少のコストで最大限継続されうる特別な母子保健パッケージの設計/提案。これらを踏まえた上で、今回の農村部の女性に対する調査から、これは、途上国と言われるバングラデシュにおいても先進諸国と同様にmetabolic syndromeが増えてきていること、またそれは妊娠・出産回数の多寡に関係ありそうなことが判明し、このような疾患の予防や治療の保健パッケージを考える上で、基礎的なデータになることが期待される。このように、この成果は、バングラデシュや多くの発展途上国の母子保健の発展に貢献すると同時に、その成果は我が国の母子保健制度の改善や少子高齢化問題の対策等にも広く寄与することが期待される。本年度(平成25年3月31日)の研究実施計画当初の予定では、最初に、10の農村を研究対象として選出。6つの農村は、グラミン銀行によるマイクロインシュランスを母体とするヘルスケアシステム(Health micro-insurance program : HMI)のそれぞれの部門から、2つの農村は、他のHMI保険施設BRAC(Bangladesh Rural Advance event Committee)から、1つはNorthern half(Rajshahi, Dhaka an Sylhetの三つの部門を含む)から、残りの2つの農村は、上記のHMIプログラム外から選出。それぞれの世帯からは、妊娠可能な女性と、世帯主に調査を行う。もし、妊娠可能な女性が世帯主の場合、彼女のみがその世帯の回答者となる。今回、バングラデシュの農村部の村において、15歳から75歳の女性1,219人に対して調査を実施した。その結果、妊娠回数や出産回数が多い群(4回以上)では、それより少ない群と比べて、metabolic syndrome(肥満、高血糖、高トリグリセライド血症、高血圧のうちの3つ以上を持つか、高血圧や糖尿病の治療中)の有病率が多いことが判明した。我々は、このプロジェクトの1年目に、ほぼ100%の計画を成し遂げている。調査研究の為の質問事項を処理し、鍵となる資料提供者へのインタビューを行い、集中的なグループディスカッションを行った。予備調査によると、我々はすでにバングラディシュで上位10に入る健康の向上へのアプローチのうち、ヘルスmicro insuranceシステムの設立は上位から二位の座を占める。バングラディシュの様な発展途上国では、74%の研究参加者がヘルスmicro insuranceプログラムはバングラディシュの健康発展において無くてはならないものだと考えており、84%の参加者がヘルスmicro insuranceを経済地位の向上に効果的な社会的アプローチだと考えている。
多次元送信ダイバーシチを用いたMIMOレーダによる目標物の高性能センシング技術

本研究では,MIMO (Multiple-Input Multiple-Output)レーダを用いて目標物の位置と広がりを検出するための高分解能・高効率なセンシング技術の研究開発を行った.送信側で符号拡散送信およびマルチビーム送信の複合送信ダイバーシチ方式を導入し検討を行った.その結果,遠方から到来する到来波の到来方向の推定精度が向上し,角度広がりも同時に行うことができることを示した.さらに非探索型アルゴリズムを用いることで効率的に方向と角度広がりを推定できることを示した.電波源が近傍にある場合においては,推定アルゴリズムの改良法を行い,合わせてアレー校正法を考案し,その有効性を確認した.本研究では,MIMO (Multiple-Input Multiple-Output)レーダの送受マルチアンテナを用いて目標物の位置と広がりを検出するための高分解能・高性能・高効率なセンシング技術の研究開発を行った.MIMOレーダを用いた目標物の位置と広がり推定が可能となれば,車載レーダ等において,その有用性・有効性はかなり高いと言える.平成27年度の具体的な成果を以下に記載する.(1) MIMOレーダ用推定アルゴリズムの高性能化:車載レーダを想定して,各目標物からの反射波の到来中心角とその角度広がりを推定する方法を検討した.この方法が可能であれば,1つの目標物からの反射波は1つの波と捕らえられ,素波を分解する必要な無くなるので,素子数を増やす必要もなくなる.本研究では,MIMOレーダ用推定アルゴリズムとしてパラメータ探索型のCapon法やMUSIC法,および非探索型のDOA-Matrix法に基づく推定手法を提案し,その基本特性を明らかにした.(2)近傍波源の位置と大きさ推定の実現:近傍の電波源(反射物)を推定する方法としては,MIMOレーダに近傍界DOA-Matrix法(DOA-Matrix法を近傍波源推定用に改良したもの)を用いた推定法について検討した.この方法を用いるとパラメータ空間の探索をせずとも数値演算のみで直接波源位置と大きさ(広がり)を導出できる.(3)多次元送信ダイバーシチ技術の導入によるMIMOレーダの性能向上:MIMOレーダの性能向上のため,送信側で,角度領域,符号領域など多次元にわたるダイバーシチ技術を導入することを検討した.合わせて,従来のSIMO(Single-Input Multi-Output)とMIMOとのハイブリッド方式(切替方式)の動作確認と性能向上の可能性についても検証した.高分解能到来方向推定法を用いて目標物の到来方向と角度広がりを精度良く推定することが出来ている.角度広がり推定の精度をもう少し改善することが次年度以降の課題である.また,波源位置推定についても従来法の改良が順調に行うことが出来,期待した特性が得られている.また,多次元ダイバーシチの導入については,符号領域と角度領域の複合ダイバーシチの検討であったが,有効性の確認ができた.本研究では,MIMO (Multiple-Input Multiple-Output)レーダの送受マルチアンテナを用いて目標物の位置と広がりを検出するための高分解能・高性能・高効率なセンシング技術の研究開発を行った.MIMOレーダを用いた目標物の位置と広がり推定が可能となれば,車の自動運転を支える車載レーダ等において,その有用性・有効性はかなり高いと言える.平成28年度の具体的な成果を以下に記載する.(1)近傍波源の位置推定アルゴリズムの改良:昨年度から引き続いて,近傍の電波源(反射物)の位置を推定する手法の改良を行った.複数ターゲットが角度的に接近した場合など,従来では分離が困難であった状況で推定精度を向上させるアルゴリズムを提案し,特性解析を行った.その結果,その有効性を確認した.また,アンテナの相互結合が推定に与える影響を解析した.波源が非常にアンテナに近いところにある場合,相互結合が角度推定精度向上に有効に働くことが分かった.今後はこの現象の詳細検討と解明を行う.(2)複合送信ダイバーシチ技術の導入によるMIMOレーダの性能向上:MIMOレーダの性能向上のため,昨年度から引き続いて,送信側の角度領域,符号領域複合ダイバーシチ技術について検討を行った.また複合送信ダイバーシチ用の推定アルゴリズムを考案した.この手法の特徴として,マルチビームを形成してターゲットに集中的に電波を照射することが挙げられるが,このアルゴリズムによって,ターゲットの方向推定精度のみならず反射係数(反射信号強度)の推定精度も向上することが示された.(3)ターゲットの到来方向と角度広がり推定の同時推定:全方位に対して推定できるようにアレーアンテナを直線アレーから平面アレーに拡張し,推定アルゴリズムの改良を行った.検討の結果,全方位で精度良く到来方向と角度広がりを推定できることを確認した.高分解能到来方向推定法を用いて目標物の到来方向と角度広がりを精度良く推定することが出来ている.特にアレー形状を直線から平面に拡張した結果,全方位で推定することが可能となった.また,波源位置推定についても従来,推定が困難であった状況での推定ができるようになり,改良が順調に進んでいると言える.複合送信ダイバーシチの導入については,符号領域ダイバーシチに加えて角度領域ダイバーシチとしてターゲットにマルチビームを照射する手法の特性解析に注力してきた.特に,送信マルチビームの配置の仕方(ビーム数とビーム角度間隔)と推定精度との関係を検討し,有効で今後の発展につながる知見を得ている.更にそのダイバーシチ方式に適合するアルゴリズムの考案により,推定精度が向上することも確認できた.

本研究では,MIMO (Multiple-Input Multiple-Output)レーダの送受マルチアンテナを用いて目標物の位置と広がりを検出するための高分解能・高性能・高効率なセンシング技術の研究開発を行った.MIMOレーダを用いた目標物の位置と広がり推定が可能となれば,車の自動運転を支える車載レーダ等において,その有用性・有効性はかなり高いと言える.平成29年度の具体的な成果を以下に記載する.(1)近傍波源位置推定のためのアレー校正法:近傍の電波源(目標物)の位置を推定する手法の改良を行いながら,アレーアンテナの素子間結合や素子位置誤差などの影響について検討を行った.さらに,その影響を低減するためのアレー校正法について検討した.参照波源を既知の位置に置いてその受信信号から校正を行うことになるが,十分遠方において到来角度情報のみで校正する方法が有効であることを示した.これにより推定アルゴリズムが高精度で動作することが確認された.(2)送信ダイバーシチ技術の導入によるMIMOレーダの性能向上:MIMOレーダの性能向上のため,送信側の角度領域,符号領域複合ダイバーシチ技術について検討を行った.今年度は符号領域ダイバーシチに対して受信側で仮想アレーアンテナを構成し,開口長を拡張する方法について検討を行った.その結果,素子間隔の冗長性が小さくなるように素子を配置することにより,推定性能が向上することを示した.また,仮想アレーアンテナは平面アレーでも構成でき,これにより目標物の方位角と仰角の2次元角の推定が可能であることを示した.(3)目標物の方向と角度広がり推定の同時推定:MIMOレーダの送信側に角度領域ダイバーシチ(マルチビーム送信)の導入により,目標物の方向と角度広がりの推定精度が向上することを確認した.これにより目標物の大きさを探知することができる.本研究では,MIMO (Multiple-Input Multiple-Output)レーダを用いて目標物の位置と広がりを検出するための高分解能・高効率なセンシング技術の研究開発を行った.送信側で符号拡散送信およびマルチビーム送信の複合送信ダイバーシチ方式を導入し検討を行った.その結果,遠方から到来する到来波の到来方向の推定精度が向上し,角度広がりも同時に行うことができることを示した.さらに非探索型アルゴリズムを用いることで効率的に方向と角度広がりを推定できることを示した.電波源が近傍にある場合においては,推定アルゴリズムの改良法を行い,合わせてアレー校正法を考案し,その有効性を確認した.多次元ダイバーシチの導入については,さらに周波数領域や時間領域のダイバーシチを導入し,MIMOレーダの性能向上を確認する.またマルチアンテナ(アレーアンテナ)の素子配置がレーダ性能に与える影響を調べ,最適な素子配置について検討を行う.
児童・生徒の社会認識構造の変容過程とその形成に関する発達的研究

本研究は,子どもの社会認識の発達に即した授業実践のための根拠となる認識の発達的変容に関する実証的データの収集を目的として行った。本年度は,児童期における社会認識の発達の様相(発達水準とその特質),社会認識構造(社会のわかり方)の変容過程について,縦断的調査(小学校3年生から6年生)の結果分析及び横断的調査との比較を通して検討した。まず社会認識の発達の様相としては,加齢とともに認識の視点の拡大と視点の質的な深化(具体から抽象へ)が見出され,その転換期として小学校4・5年生頃が指摘された。次に,社会認識構造の発達的変容について,個の回答内容の変化に焦点をあてながら検討した。結果を要約すれば次のとおりである。2.子どもは,社会的事物・事象に関する知識(経験)を量的に増加させる段階から知識相互のネットワーク化を図る段階へ,そしてあるまとまりとして知識を統合する段階へと発達し,これらの段階を螺旋的に繰り返しながら知識を成長させる。3.小学生における知識成長の過程は具体的な経験をまとめる段階として特徴づけられ,経験の量的拡大と具体から抽象への認識の質的深化がこの時期の学び方として重視される。これまでの先行研究の成果が授業改善に十分には生かされていないとう問題意識から,まず先行研究をその目的と方法によって整理した。目的を観点として分類するとレディネス研究とプロセス研究に大別でき,社会科教育としての発達研究では認識プロセスの解明が急務である。また研究方法は,横断・縦断的研究法と実験的教育法に分けられ,横断・縦断的研究法から得られた研究仮説を実験的教育法によって実証する研究が求められる。次に,社会認識構造の発達的変容に焦点をあてながら,小学生から大学生までを対象とする調査とその分析を行った。分析にあたっては,回答の順序性の背後にある動態的な思考プロセスの存在を仮定し,認識のネットワーク構造の変容を中心に検討した。1.子どもの社会認識の発達は,量的増加と共にいくつかの質的に異なった発達段階に区切られ,小学校4,5年生頃を過渡期として,具体的思考の段階から抽象的思考の段階へと質的に転換する。2.児童期から青年期にかけて収束的思考から拡散的思考を経て,再び収束的思考が優位になる時期へと移行し,4,5年生頃は拡散的思考から収束的思考への転換期として位置づけられる。3.子どもの社会認識構造は並列型,関連型,組み込み型,変革・創造型,総合(統合)型の5つに類型化される。4.子どもの知識成長の過程として,社会的事物・事象に関する知識を量的に増加させる段階から知識相互のネットワーク化を図る段階,あるまとまりとして知識を統合する段階へと移行し,さらにこれらの段階の螺旋的な繰り返しが想定される。5.認識の質的な転換を促進する指導,経験的・自然的な発達では十分に到達できない部分への働きかけが求められる。
糸状性光合成細菌クロロフレクサス アグリガンスの高速滑走運動を可能にする分子機構

糸状性細菌クロロフレクサス・アグリガンスの運動様式を理解することを目指し、細胞表層の運動器官の決定と運動性を制御する因子の同定を目指した。まず、運動性について、顕微鏡下での観察方法を確立した。それにより、細胞の状態によって、運動速度や方向転換の頻度を定量的に測定できるようになった。クロロフレクサス・アグリガンスの運動性は、外来性のプロテアーゼの添加によって促進されることを報告している。そこで、今年度はその制御機構を解析した。クロロフレクサス・アグリガンスの細胞を細胞形態が壊れない程度に穏やかにプロテアーゼ処理した処理液を分画し、分子量3,000以下のペプチドを含む画分に活性化因子を見出した。これは、クロロフレクサス・アグリガンスの細胞から遊離したペプチドと考えられ、そのペプチド存在下での運動性を観察すると、方向転換の頻度が上昇する様子が観察された。自身の細胞表層から遊離したペプチドによる運動性の制御はこれまで報告例がない。本菌の細胞を化学固定し走査型電子顕微鏡で観察したところ、細胞表面に特徴的な構造は確認できなかった。しかし、ネガティブ染色および急速凍結レプリカ法を用いて電子顕微鏡観察したところ、平均直径17.8 nmの繊維状の構造体が菌体表面から伸びていることが確認できた。一細胞あたり数本の繊維が観察され、10 μm以上になる長い繊維も見られた。この繊維は細胞間隙の近傍に局在している傾向があった。この繊維状構造体の伸縮や屈曲が糸状体細胞の運動に関与していると予想された。26年度が最終年度であるため、記入しない。糸状性細菌クロロフレクサス・アグリガンスの運動様式を理解することを目指し、特に本年度は、細胞の構造解析と運動に関わる遺伝子の同定に注力した。化学固定したクロロフレクサス・アグリガンスの細胞表層を走査型電子顕微鏡で観察したところ、細胞表面に特徴的な構造は確認できなかった。しかし、化学固定ではなく、細胞を液体窒素で瞬間凍結させて観察したところ、細胞表面の一部に直径3 nm程度の構造体を見出すことができた。一方、指数増殖しているクロロフレクサス・アグリガンスの糸状体細胞を、核酸染色剤で染色したところ、一つの糸状体でも染色される細胞とほとんど染色されない細胞が観察された。ひとつながりの細胞にも、細胞膜等の状態は不均一であることが示唆された。運動性について、顕微鏡下での観察方法を確立し、糸状体の長さによる運動性の違いや細胞の凝集性を捉える準備が整った。また、滑走運動の足場を変更したとき、運動性に違いが現れることを見出した。そこで、プロテアーゼがどのように本菌の運動性に影響しているのかを検討した。クロロフレクサス・アグリガンスの細胞を細胞形態が壊れない程度に穏やかにプロテアーゼ処理し、分子量約1万以上の高分子画分(プロテアーゼも含む)と低分子画分に分画したところ、低分子画分にも、運動性の促進効果が検出された。そこで、低分子画分をさらにゲルろ過クロマトグラフィーで分画した。分取した画分の中から活性画分を選択し、SDS-PAGEで分離して銀染色したところ、分子量3,000以下に複数のバンドが検出された。以上から、クロロフレクサス・アグリガンスの細胞から遊離したペプチドと考えられる低分子物質に、運動性を促進する作用があると考えられた。糸状性細菌クロロフレクサス・アグリガンスについて、その滑走運動の機構を解明すべく、分子レベルおよび細胞レベルで多角的に研究を進めた。

それによって、当初計画していたように、細胞表面に直径3 nm程度の構造体を見出すことができ、さらに糸状体を形成する細胞によって状態が異なることも示唆された。これは糸状体が直進する運動機構を理解する重要な手掛かりとなった。この細胞表面の構造体を同定するため、細胞表層の分取・精製を進めており、分取条件も確立しつつある。プロテアーゼ処理による運動性促進機構の解析によって、クロロフレクサス・アグリガンスの運動性が低分子ペプチドによって制御されていることが示唆された。細胞表層構造との関連性や走性ともかかわる重要な知見を得ることができた。本研究を進めるにおいて、顕微鏡による糸状体の滑走運動の観察は重要な技術となるが、本年度の研究により、観察方法を確立することができ、それによって運動の特徴を捉えることに成功している。糸状体が寄り添いながら、凝集体を形成することを初めて捉えることができたのは大きな成果である。本菌のゲノム情報を解析したところ、IV型線毛と考えられるタンパク質をコードする遺伝子が見出された。これらの遺伝子の役割を解析するため、クロロフレクサス・アグリガンスの遺伝子組み換え系の構築に取り組んだが、効率的な系はまだ確立できていない。しかし、運動性を保ったまま、糸状体を物理的に分断する前処理条件を見出すことができたため、組み換え系の確立に大きく近づいている。糸状性細菌クロロフレクサス・アグリガンスについて、分子レベルで、運動マシナリーを同定し、その構造と機能を明らかにする。また細胞レベルで、糸状体の各細胞が運動性を制御している機構を明らかにする。そのため、以下の研究項目を遂行する。1)遺伝子変異株の解析クロロフレクサス・アグリガンスのゲノム情報から、滑走運動に関わると予想される細胞表面タンパク質、または、膜タンパク質、分泌タンパク質等をコードする遺伝子に変異を導入し、運動性や集塊形成性、外環境に対する応答性等に影響を与える遺伝子(領域)を同定する。また、トランスポゾンによるランダム変異株ライブラリーを作成し、運動性や付着性を試験する。2)運動にかかわる細胞表面構造体の解析クロロフレクサス・アグリガンスのペリプラズムおよび細胞膜に発現しているタンパク質を同定する。各タンパク質の運動に関わる機能を推定する。また、一細胞内での発現分布、糸状体の各細胞における発現量の違いを明らかにする。さらに、培養条件、照射する光条件による分布の違いを明らかにすることで、運動器官を特徴づける。3)滑走表面との相互作用これまでに、滑走する表面の電荷等の性質を変えると運動性が影響を受けることを明らかにしている。細胞表面全体および運動マシナリーについて、滑走する表面との物理的相互作用を明らかにする。また、アグリガンスは糸状体同士の接触による超高速の滑走も知られるため、細胞表面と無機物表面での滑走運動の違いを明らかにする。以上のようにして得られる情報を統合し、各細胞の運動性について仮説を立て、それらをもとにコンピューターを用いたシミュレーションを行う。糸状体の運動機構の数理モデル化、実験的検証を繰り返し、糸状体全体の運動様式を記述する。
細胞内輸送異常を細胞死へと変換するBNip1の機能解析

我々は、ゼブラフィッシュのβ-SNAP変異体では、細胞内小胞輸送の異常が起きた時、小胞体上の蛋白であるBNip1を介して視細胞変性を引き起こされる事を報告した。正常な細胞ではBNip1は小胞体に存在し、syntaxin18 -SNARE複合体の構成因子として細胞内輸送に関与する。本研究では、BNip1の細胞死誘導能が小胞体上で活性化されること、BNip1依存性の細胞死が視細胞外節形成時期と対応していること、視細胞内の小胞輸送を低減させるとβ-SNAP変異体の視細胞の細胞死が抑えられることを確認した。この結果は、BNip1依存性の細胞死は過剰な小胞輸送をモニターするというモデルを強く示唆する。我々は、ゼブラフィッシュのb-SNAP変異体では、細胞死を誘導するBH3ドメインをもつ蛋白質であるBNip1を介して視細胞変性が引き起こされることを報告した。正常な細胞では、BNip1は小胞体に存在し、syntaxin18(stx18) -SNARE複合体の構成因子として、ゴルジ体から小胞体への逆行輸送を制御する。我々は、b-SNAPの機能欠損によって、stx18 -SNARE複合体の分解が阻害されると、その構成因子であるBNip1のBH3ドメインが活性化され、細胞死の経路が活性化するモデルを提唱した。本研究では、小胞体で活性化されたBNip1がどのようにアポトーシスを誘導するのかを明らかにすることで、上記のモデルを検証する。BNip1は小胞体上で細胞死抑制因子であるBcl2と相互作用し、その結果、細胞死誘導因子であるBaxがBcl2から離れ、活性化すると考えられる。Baxは一般にミトコンドリアの外膜の透過性を上げて、チトクロムCを放出させることで、アポトーシスを誘導する。一方、Baxは小胞体からのCaイオンの放出を介して、細胞死を誘導することも報告されている。そこで、BNip1は、ミトコンドリア膜上のBaxを活性化するのか、小胞体でからのCaイオンの放出を介して、細胞死を誘導するのか、を検証する。今年度は、小胞体でのみBaxを抑制できるER-標的Bcl2をb-SNAP変異体で強制的に発現させ、b-SNAP変異体での視細胞死が抑制されることを明らかにした。この結果から、BNip1の活性化後、小胞体上でのBcl2の枯渇がアポトーシスを誘導する最初のステップであることが明らかになった。現在、ミトコンドリア膜を標的にするBcl2のシステムを構築中であり、また、ゼブラフィッシュでCaイオンを検出できるGCaMPのトランスジェニック系統をb-SNAP変異体に入れた系統を作製している。また、ゼブラフィッシュでBNip1はBNip1a, BNip1bという2つの相同遺伝子があり、その機能分担を調べる目的で、それぞれのゼブラフィッシュ突然変異体を作製している。本研究では、小胞体で活性化されたBNip1がどの様にアポトーシスを誘導するのかを明らかにすることで、上記のモデルを検証する。昨年までに、BNip1の細胞死誘導能が小胞体上で活性化され、細胞死抑制因子であるBcl2と相互作用することを明らかにした。その結果、細胞死誘導因子であるBaxがBcl2から離れ、活性化すると考えられる。今年度はヒートショックプロモーターを用いて時期特異的にb-SNAPを発現させることで、BNip1依存性の細胞死を抑制するのにb-SNAPが必要とされる時期が受精後4日目までであることを明らかにした。細胞死が始まる受精後2日目からこの時期までは視細胞外節の成長が著しく膜輸送が盛んに行われているため、この結果はBNip1依存性の細胞死は過剰な輸送に対して感受性があるというモデルを強く示唆する。また、初期にレスキューを行ったb-SNAP変異体で生き残った視細胞はその後緩やかに変性するため、BNip1以外の細胞死も関与している可能性が示唆される。今年度は引き続き、BNip1はミトコンドリア膜上のBaxを活性化するのか、小胞体でからのCaイオンの放出を介して細胞死を誘導するのか、モルフォリノ等を用いた阻害実験で検証する。今年度は、b-SNAP変異体にヒートショックプロモーターでb-SNAP蛋白を発現するトランスジェニック系統を導入し、時期特異的にレスキューを行うことで、BNip1依存性の細胞死は視細胞外節が盛んに伸びていく時期に高い感受性を示すことを見い出した。モデルの検証は進んでいるので、おおむね順調に進行しているとした。

正常な細胞では、BNip1は小胞体に存在し、syntaxin18(stx18) -SNARE複合体の構成因子として、ゴルジ体から小胞体への逆行輸送を制御する。我々は、b-SNAPの機能欠損によって、stx18 -SNARE複合体の分解が阻害されると、その構成因子であるBNip1のBH3ドメインが活性化され、細胞死の経路が活性化するモデルを提唱した。本研究では、小胞体で活性化されたBNip1がどの様にアポトーシスを誘導するのかを明らかにすることで、上記のモデルを検証した。まず、BNip1の細胞死誘導能が小胞体上で活性化され、細胞死抑制因子であるBcl2と相互作用することを明らかにした。その結果、細胞死誘導因子であるBaxがBcl2から離れ、活性化すると考えられる。次に、ヒートショックプロモーターを用いて時期特異的にb-SNAPを発現させることで、BNip1依存性の細胞死を抑制するのにb-SNAPが必要とされる時期が受精後4日目までであることを明らかにした。細胞死が始まる受精後2日目からこの時期までは視細胞外節の成長が著しく膜輸送が盛んに行われていると考えられる。そこで、モルフォリノを用いて視細胞内の輸送を低減させると、b-SNAP変異体の視細胞の細胞死が抑えられることが確認された。この結果はBNip1依存性の細胞死は過剰な輸送に対して感受性があるというモデルを強く示唆する。我々は、ゼブラフィッシュのβ-SNAP変異体では、細胞内小胞輸送の異常が起きた時、小胞体上の蛋白であるBNip1を介して視細胞変性を引き起こされる事を報告した。正常な細胞ではBNip1は小胞体に存在し、syntaxin18 -SNARE複合体の構成因子として細胞内輸送に関与する。本研究では、BNip1の細胞死誘導能が小胞体上で活性化されること、BNip1依存性の細胞死が視細胞外節形成時期と対応していること、視細胞内の小胞輸送を低減させるとβ-SNAP変異体の視細胞の細胞死が抑えられることを確認した。この結果は、BNip1依存性の細胞死は過剰な小胞輸送をモニターするというモデルを強く示唆する。今年度は、ER-標的Bcl2のトランスジェニック系統を作製し、b-SNAP変異体に導入することで、視細胞死が抑制されることを見いだした。このことから、活性化されたBNip1が小胞体上でBcl2と相互作用することが明らかになった。現在、ミトコンドリア膜を標的にするBcl2を発現するシステムを構築している。また、Caイオンの放出を確認するために、Caイオン濃度を可視化するGCaMPトランスジェニックラインを入手し、b-SNAP変異体への導入を進めている。さらに、ゲノムエディティングを利用したTALENを用いて、BNip1a, BNip1bをそれぞれ欠損した変異体を確立中である。現在、それぞれのBNip1変異をb-SNAP変異体に導入し、視細胞変性についての表現型について解析を行っている。研究計画どおり進んでいるので、おおむね順調に進行しているとした。(1) BNip1依存性の細胞死を抑制するためにb-SNAPが必要な受精後2-4日と細胞死が抑えられる受精後4日目以降で、外節の伸長速度の差から細胞輸送の量の差を見積もり、実際に過剰な輸送に反応してBNip1依存性の細胞死が起きているのかを検証する。(2) GCaMPトランスジェニックラインを導入したb-SNAP変異体系統を用いて、Caイオン濃度の可視化を行う。