hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
テフラで構成される斜面の崩壊現象に関する層序学的・歴史学的研究

その結果,すべり面下位の土壌層が上位のテフラ層に比べて,シルトなどの細粒成分に富んで堅く締まっており,さらに透水性も低いことがわかった.つまり,こうしたすべり面上下での粒度組成・硬度・透水性の差異が斜面崩壊の原因になったと考えられる.伊豆大島火山における研究はおおむね順調に進展したが,阿蘇火山については平成28年熊本地震による道路の寸断や安全上の問題から,現地への立入や調査が実施できない状況が生じた.平成29年度は,阿蘇火山周辺域における過去の斜面災害について歴史資料等を精査し,その発生要因や発生地点の分布について検討した.参考とした資料は『熊本県災異誌』や『八代地方の災害史年表(改訂増補版)』,『肥後近世史年表』等の歴史文献である.また,歴史文献に記載されていない年代の災害については熊本市立図書館所蔵の九州日日新聞や熊本日日新聞などを参照して災害史年表を作成し,阿蘇火山周辺域で過去に起こった斜面災害の概要を把握した.まず斜面災害発生時の降雨条件に関して,気象庁阿蘇山測候所で観測された雨量データを使用して解析した結果,日雨量が100 mm未満の場合は斜面崩壊が起こる可能性が低く,100 mm以上であれば斜面崩壊が起こる可能性が徐々に高くなる傾向が認められた.また,最大時間雨量については10 mm以下では斜面崩壊が起こりにくいことが明らかになった.しかし,このデータでは斜面崩壊の発生地点と雨量の観測地点が離れているという問題があったため,より多くの観測地点の降雨データがある2001年6月と2012年7月の災害時の状況について検討した結果,総雨量が200 mm以上の場合では斜面崩壊が起こる可能性が高くなり,400 mm以上になるとほぼ確実に発生していることが判明した.歴史記録から得られた発生地点の分布を考察した結果,崩壊の起こっている地点の周辺地域では斜面災害が何度も繰り返し起こっていること,さらに地域的には阿蘇カルデラの北東部で斜面崩壊の発生頻度が高いことが明らかになった.斜面崩壊が多発している地域のカルデラ壁はAso-1およびAso-2火砕流堆積物からなる急崖斜面やその下位に巨礫が混在する不安定な崖錐斜面を有しているなどの地質学的特徴が認められ,こうしたことが斜面崩壊発生と密接に関係していると推察された.歴史文書等による調査はおおむね順調に進展したが,現地調査については平成28年熊本地震による道路の寸断や安全上の問題から,調査地への立入や調査が実施できない状況が続いている.平成30年度は,阿蘇火山における過去の斜面災害の形態や発生履歴をテフラ層序学的に検討した.現地調査を実施したのは,阿蘇カルデラ東側壁直下の砂防堰堤掘削断面であり,その観察結果から以下のことが明らかとなった.調査した断面に露出する堆積物は,石礫に富む基質支持の土石流堆積物と未固結なテフラ片や土壌片を多く含む岩屑なだれ堆積物の2つに区分され,前者は5層,後者は2層確認された.そのなかで,下位の岩屑なだれ堆積物は掘削断面のほぼ全面(幅約70 m)にわたって露出するもっとも特徴的な堆積物で,径数cm数10 cmのテフラ片や土壌片が多量に含まれるとともに,それらが著しく褶曲したり分断するなどの変形構造が観察された.この堆積物は水で運搬された形跡が認められないことから,大きな地震に伴うものと推定された.発見された堆積物間に挟在する年代既知の火山灰層や埋没土壌層の放射性炭素年代値から,豪雨に伴う土石流は4001800年間隔で起こっていることがわかった.ただ,同じ豪雨であってもすべての渓流で土石流が発生するとは限らないため,阿蘇カルデラ壁全体ではより高い頻度で豪雨に伴う斜面崩壊と土石流が発生しているものと考えられる.一方,調査したカルデラ壁斜面では岩屑なだれが最近6300年間に2回発生していることが明らかとなった.
沖縄の保健人材確保の経験と国際協力への実用化に関する社会医学的研究

本研究は過去3年間の研究成果として、論文9本、学会発表17演題、図書3冊、視聴覚教材ビデオ8本、データベース(CD)8枚が産出された。特に最終年度には以下のような具体的な研究実績の収束に努めた。(1)第2回ケース・メソッド研修の実施(平成14年6月30日)昨年度の第1回同研修に引き続き問題解決型開発教育モデル制作の研修を実施した。受講者は本研究協力者で、この研修後、6本のケース教材が完成した。同教材は、(5)のビデオ教材のジャケットに納める小冊子に添付され、国際協力用の教材として広く活用されている。(2)保健人材班ワークショップ開催(平成14年7月6/7日)過去3年間でまとめた沖縄の保健人材に関する量的データを用い、システムダイナミックス・シミュレーションモデル策定のワークショップを開催した。結果は(7)で発表した。(3)国際協力への実用化-途上国の保健医療人に対する研修への応用(平成14年4月15/16日,平成15年1月17.23-25日)JICA(国際協力事業団)の研修へと多岐にわたり応用された。4月は九州・久留米市の聖マリア病院での地域保健指導者研修コースで、1月には沖縄国際センターでの島嶼保健医療政策研修コースにて、本研究にて作成された視聴覚教材とケース教材を用いた授業が展開され、受講生(途上国の医師・看護師・助産師)から好評を得た。(4)論文、学会発表、図書今年度は本研究に関する論文が8本、学会抄録は8本、図書は1冊が産出された。これらは、初年度からの業績も含め、広く世界の研究者と共有すべく、英語に翻訳して、報告書並びに本研究のwebページで情報を開示する作業を進めている。(同年5月末完成予定)(5)視聴覚教材の制作前年度の2本のビデオ制作に引き続き、今年度は6本のビデオを制作。ビデオ検討会議(各6本分のビデオに関する内容検討会議を、年3回、各6本分のビデオ開催)を経て、平成15年1月に日本語版と英語版が完成。JICA研修((3))をはじめ、日本や諸外国の大学・研究機関にて活用されつつある。(6)データベース(CD)米国民政府の公衆衛生関連資料をまとめたDB、沖縄県復帰前の保健医療関連新聞記事をまとめたDB、昭和35年から現在までの衛生統計データをまとめたDB、今まで制作した計8本分のビデオ教材をパワーポイント化したDB、の計4種のCDに関して本科研費を用いて作成した。(7)国際シンポジウムの開催(平成15年1月24-26日)過去3年間の集大成として、国際シンポジウム「沖縄における保健医療人材確保の経験から過去50年の検証」を開催。内外からシンポジストを迎え、ビデオ会議、同時通訳付で活発なる意見交換が行われた。同シンポジウムの本番記録は、本研究Webページで公開されている。また、現在、CDにまとめる作集を行っている。(8)最終報告書(英語版)の作成計418ページにわたる報告書を英語版で作成し、3年間の研究・実践の成果を広く世界の研究教育機関にアピールする。初年度の研究者構成は、地元沖縄県出身者が6割を占める。主任研究者は、分担研究者5名、同協力者9名、顧問3名、アドバイザー3名、総計20名の支援のもと本研究を計画に基づき執行している。主な連携先は国際協力事業団(JICA)であるが、年2回の全体班会議と年7回の個別班会議を通じ、当該研究者の所属先である県福祉保健部・各保健所、沖縄大学、沖縄県立看護大学との地域連携も深めつつある。研究の目的は、沖縄の保健医療の経験の体系化(途上国から見て何が学べるか)と国際保健医療協力分野における問題解決型開発教育モデルと教育メディアの確立である。本年度は、主に同研究目的の基盤づくりに重点が置かれた。また年度末には中間報告書をまとめた。(1)離島医療の実態把握県内島嶼の保健医療人材配置状況について調査した。対象地域は南北大東島(2診療所)及び八重山諸島(7診療所)であり、歴代診療所長の勤続状況と地元住民の受容について聞き取り調査を行った。((5)で実績発表)。(2)聞き取り調査保健人材に関する育成機関、民間団体設立、研修カリキュラム、法令策定(沖縄開発特別措置法)に直接関与した方へのインタビューを実施し、文字化した。(3)情報の電子化明治以降の沖縄保健医療統計資料(計474表)、沖縄の保健医療史に関する文献(計4998件)を電子化し、本研究のWebページ(http://www.cc.u-ryukyu.ac.jp/^socmedok)にて、情報を開示した。(4)研究結果の実用化主任研究者は、国際開発高等教育機構)研修で学んだケースメソッド教材作成法をJICA島嶼保健医療政策研修コースの講義に適用し、途上国の研修生より好評を得た。(5)学会発表今年度の研究成果として沖縄県公衆衛生学会にて「60年代の沖縄の保健医療政策と保健所とその役割」と「復帰後の八重山諸島における離島診療所の医療人材配置の変遷分析」の2演題を発表した。

(1)第2回ケース・メソッド研修の実施(平成14年6月30日)昨年度の第1回同研修に引き続き問題解決型開発教育モデル制作の研修を実施した。受講者は本研究協力者で、この研修後、6本のケース教材が完成した。同教材は、(5)のビデオ教材のジャケットに納める小冊子に添付され、国際協力用の教材として広く活用されている。(2)保健人材班ワークショップ開催(平成14年7月6/7日)過去3年間でまとめた沖縄の保健人材に関する量的データを用い、システムダイナミックス・シミュレーションモデル策定のワークショップを開催した。結果は(7)で発表した。(3)国際協力への実用化-途上国の保健医療人に対する研修への応用(平成14年4月15/16日,平成15年1月17.23-25日)JICA(国際協力事業団)の研修へと多岐にわたり応用された。4月は九州・久留米市の聖マリア病院での地域保健指導者研修コースで、1月には沖縄国際センターでの島嶼保健医療政策研修コースにて、本研究にて作成された視聴覚教材とケース教材を用いた授業が展開され、受講生(途上国の医師・看護師・助産師)から好評を得た。(4)論文、学会発表、図書今年度は本研究に関する論文が8本、学会抄録は8本、図書は1冊が産出された。これらは、初年度からの業績も含め、広く世界の研究者と共有すべく、英語に翻訳して、報告書並びに本研究のwebページで情報を開示する作業を進めている。(同年5月末完成予定)(5)視聴覚教材の制作前年度の2本のビデオ制作に引き続き、今年度は6本のビデオを制作。ビデオ検討会議(各6本分のビデオに関する内容検討会議を、年3回、各6本分のビデオ開催)を経て、平成15年1月に日本語版と英語版が完成。JICA研修((3))をはじめ、日本や諸外国の大学・研究機関にて活用されつつある。(6)データベース(CD)米国民政府の公衆衛生関連資料をまとめたDB、沖縄県復帰前の保健医療関連新聞記事をまとめたDB、昭和35年から現在までの衛生統計データをまとめたDB、今まで制作した計8本分のビデオ教材をパワーポイント化したDB、の計4種のCDに関して本科研費を用いて作成した。(7)国際シンポジウムの開催(平成15年1月24-26日)過去3年間の集大成として、国際シンポジウム「沖縄における保健医療人材確保の経験から過去50年の検証」を開催。内外からシンポジストを迎え、ビデオ会議、同時通訳付で活発なる意見交換が行われた。同シンポジウムの本番記録は、本研究Webページで公開されている。また、現在、CDにまとめる作集を行っている。(8)最終報告書(英語版)の作成計418ページにわたる報告書を英語版で作成し、3年間の研究・実践の成果を広く世界の研究教育機関にアピールする。本研究の目的は、"沖縄の保健医療史から途上国は何を学べるか"を主眼に経験の系統的な研究を実施することと、それを手段とし国際保健における開発教育モデルを確立することにある。平成13年度は、論文2本、学会発表6本、図書2冊、視聴覚教材ビデオ2本、CD1枚が本地域連携推進研究により産出された。本研究の今年度の主な実施内容は以下のとおりである。(1)僻地の受療行動調査沖縄県本島北部の無医村地区の経時的医療人材派遣状況について資料収集し、その変遷をMapInfoにまとめた。また、現在の北部3村住民の受療行動調査を実施した。(2)保健行動調査
新たなp53の機能であるタンパク質合成の制御機構の解明と新規抗癌ターゲットの発見

本研究では癌抑制遺伝子p53が癌細胞における小胞体の機能制御に重要な役割を果たしていることを世界で初めて見出した。その制御機構としてp53の機能喪失によりIRE1の分解が抑制されることでその発現が増加し、IRE1/XBP1経路が活性化することで小胞体の機能が亢進していることが示唆された。また、マウス癌移植モデルにおいてIRE1阻害剤の投与により変異型p53移植癌の大きさは顕著に減少したがp53野生型移植癌の大きさはあまり抑制されなかった。以上、p53の機能喪失により活性化するIRE1/XBP1経路の阻害は、p53変異癌に対する選択的な抗癌剤のターゲットとして有望であることが示唆された。小胞体の機能亢進は癌細胞の悪性化を誘発し、転移や薬剤耐性の獲得に関与していることも報告されている。しかし、癌細胞特異的な小胞体の機能を亢進させる機構については明らかになっていない。そこでまず癌特異的な癌抑制遺伝子の機能喪失に注目して小胞体の機能を調べたところ、p53が癌細胞における小胞体の機能制御に重要な役割を果たしていることを見出した。野生型p53癌細胞と変異型p53癌細胞において小胞体ストレス応答に関与している種々の蛋白質の発現を比較したところ、IRE1と活性型XBP1の発現が変異型p53癌細胞で顕著に増加していた。また、変異型p53癌細胞では蛋白質の分泌が促進され、小胞体ストレスによる細胞死も抑制されていることを発見した。次にp53の機能喪失による小胞体機能の変化がIRE1の発現増加に依存しているかをIRE1阻害剤によりIRE1からのシグナル伝達を抑制することで調べた。IRE1阻害剤の処理により、変異型p53細胞で増加していた活性型XBP1の発現、蛋白質の分泌、及び小胞体ストレスによる細胞死への耐性化のすべてが抑制された。一方で変異型p53細胞ではIRE1のプロテアソームによる分解が抑制されIRE1蛋白質の安定性が増加することも見出した。さらにp53はE3ユビキチンリガーゼであるSynoviolin 1とIRE1の結合を促進していることも突き止めた。以上の結果からp53機能喪失によりIRE1の分解が抑制されることでその発現が増加し、IRE1/XBP1経路が活性化すること、及びこの経路の活性化がp53機能喪失による小胞体の機能亢進を誘導していることが示唆された。癌抑制遺伝子p53がどのような機構で小胞体の機能制御、特にIRE1の発現を制御しているかについて検討を行った。まず、他の代表的な小胞体ストレスセンサーであるPERK及びATF6経路の活性化にp53が与える影響を調べたところ、p53はこれらの経路に影響を与えなかった。この結果から、p53はIRE1の発現を小胞体ストレス応答経路を介さずに制御していることが示唆された。次にp53の機能喪失によるIRE1の発現上昇の機構を検討した。その結果、mRNAの発現調節ではなく、タンパク質レベルで行われていることを新たに発見した。その分子機構を解析したところ、IRE1をユビキチン化するsynoviolin1とIRE1の結合をp53が促進していることが明らかになった。つまり、p53の機能喪失によりIRE1のユビキチン化が抑制され、IRE1の分解が阻害されることでIRE1の発現量が上昇することが考えられる。以上の研究結果より、多くの癌細胞でみられるp53の機能喪失により、IRE1のプロテアソームでの分解が抑制されIRE1の発現量が増加することを示唆した。さらに、このIRE1の発現増加による小胞体機能の亢進は、癌細胞を低栄養や虚血といった様々なストレスに体する耐性を獲得することに重要であることが考えられる。故にIRE1経路の阻害は癌細胞の生育を選択制に阻害するような抗癌剤のターゲットとなることが予想される。上記のように、p53変異癌細胞でIRE1の発現が増加していること、またその機構としてSynoviolin 1が関与していることを解明した。このIRE1の発現増加により、p53変異癌細胞で小胞体の機能が亢進していることを明らかにすることができた。以上、本年度は計画通り目標であるp53の小胞体機能の制御機構の解明を達成できた。27年度が最終年度であるため、記入しない。分子生物学<p53によるATF6経路とPERK経路の活性化に与える影響>p53野生型細胞とp53変異細胞において、ATF6経路とPERK経路の小胞体ストレスによる活性化に違いがあるかを調べる。ATF6経路については、小胞体ストレスにより切断され産生される活性型ATF6の発現をイムノブロット法で調べる。

PERK経路については、PERKのリン酸化とその下流の因子であるeIF2αのリン酸化を調べる。<IRE1阻害剤がp53変異癌選択的に毒性を示すのか>変異型p53癌細胞は悪性度の高い表現型を示し、特に核酸合成を阻害するような抗癌剤に対して耐性を示すことが知られている。そこでIRE1阻害剤はp53変異癌に選択的に高い毒性を示す新たな抗癌剤として有望ではないかと考え、p53変異癌細胞を移植するマウス癌移植モデルを用いて検討を行う。27年度が最終年度であるため、記入しない。
運動会（体育祭）による学校づくりカリキュラムの検討

本研究の目的は、(1)「地域」「企業」及び「学校」運動会の成果とサービス評価をアンケート調査で比較し、(2)学校運動会の実践カリキュラムの課題を検討することである。(1)運動会では、学校の成果(協力意識、役割や責任、まとまり感)が最も高く、なかでも小学校が他校種に比べ、「周りや皆との協力」意識などが高い結果を示した。また、サービス評価の結果から、参加者は意見や要望を聞き改善すること、安全を求めていることが明らかとなった。(2)学校運動会では、事後の「運動会サービス評価アンケート(16項目)」を活動の内容に加え、カリキュラムを組み立てることを提案した。日本国内での運動会は減少傾向にあったが、コミュニケーション不足、組織活力の低下から、昔から行われてきた「運動会」の見直しが進められている。本研究では、地域と企業の運動会の実態と成果を明らかにする。2013.11.1516の2日間、「地域運動会参加者」206名、「企業運動会参加者」206名の合計412名を対象にインターネットリサーチを行った。内容は、基本的属性、意識〔参加形態、意味、種目、楽しさ(不満の理由)など〕、成果(目標、発見、主体性、役割と責任、安全、役員への尊敬、年代間の協力、団結感など)である。調査の結果、運動会の参加者は「自発的な参加(40%)」と「参加要請・仕方なく参加(40%)」とほぼ二分化され、「人間関係の獲得(地域:22.3%,企業:25.5%)」や「目標に向かっての団結(企業;97名,24.7%)」、「生活のアクセント(地域;76名,19.2%)」と意味づけている。好きな種目と実施種目はほぼ一致しており、評価は参加者の約8割以上が楽しいとしている。しかし、約1割5分は「楽しくない」とし、理由を「参加者の意欲(3割弱)」、「全体のまとまり(約2割)」「当日のスケジュール(約2割弱)」としている。運動会の成果として有意差が認められた(回答を数値化し平均値の差を検定)のは、「安全なプログラム進行(企業3.12,地域3.02,F=9.518)」,「主体的な取り組み(地域2.92,企業2.90,F=7.110)」「前回以上の団結感(企業3.08,地域3.02 ,F=5.252)」であった。以上のことから、両運動会は、「人間関係の獲得」を目指して、役割分担をしながら(企業ではプログラム参加と実施・運営委員がそれぞれ約40%)、80%以上の参加者が「楽しい」と評価している実態が明らかとなった。尚、「役員分担の強制」は強い不満理由となることが確認された。平成25年度に実施した「地域」「企業」の運動会を参考に、本年度は学校の運動会(体育祭)についてネットリサーチを用いて実態を明らかにした。対象者は、全国の小学校5年生と6年生169名、中学生166名、高校生160名であった。(1)開催時期は、春期230名(46.5%)、秋期233名(47.1%)、土曜日225校(45.5%)、日曜日118校(23.8%)でほぼ週末に実施されていた。(2)地域への愛着は学校が好きな者ほど、運動会などのスポーツ行事に積極的に参加し(293名:59.2%)、地域への愛着は高い傾向が示された(どちらかと言えば好き以上で389名で78.6%)。しかしながら、地域での運動会が開催されているかを知らない者(152名:30.7%)が多く、地域のスポーツ行事等には学年が進むにつれて参加する者が少なくなっている。(3)運動会への参加価値は、「テーマに基づく団結意識の獲得(290名;29.6%)」、「生活の中のアクセント(198名;40.0%)として」、「人間関係に対する自信(171名;17.4%)の獲得」であった。(4)種目は、走競技(33.4%)、団体競技(23.4%)、団体演技(10.2%)、準備運動(4.8%)、行進(6.7%)、応援合戦(8.1%)、その他であった。リレー(ブロックや部活動)、ソーラン節、組体操、集団行動、応援合戦が盛り上がる種目として挙がっていた。(5)運動会の成果としては、「絆が深められた(M=3.24)」「仲間の良いところの発見(M=3.15)」「安全な集団行動(M=3.12)」であり、「今後の学校生活に活かそう(M=2.85)とする意識の獲得」が低い結果となった。運動会の評価(6)については、適切に情報提供がなされ、スムーズな運営で高評価が得られていた。改善点は、「施設と駐車場の確保」、「プログラム数の増加」が望まれていた。平成27年度は、(1)ネット調査で得られた成果を基に、(2)実際の運動会の実施計画及びプログラムの資料収集を行う。さらに、(3)運動会と「学校生活」や「ソーシャルスキル」との関連を測定するための調査票を作成し、可能であれば小学生を対象に実施する。

(1)これまでのネット調査(学校・地域・企業:929名)では、全体で「運動会が楽しくない(132名:14.2%)」理由として、「意欲(51名:38.6%)」「内容(46名:34.8%)」「まとまり感(46名:34.8%)」が挙げられた。内容では、学校での好嫌種目いずれにも「リレー」「徒競走」が挙がり、地域や企業では嫌いな種目は挙がっていない。安全面への配慮が指摘される「組体操」「騎馬戦」「棒倒し」は盛り上げ種目となっている。学校の運動会では、「基礎体力の獲得(地域<企業・学校)」「まとまり感(地域<学校)」が評価され、「目標をもってがんばる(学校<地域・企業)」や「皆で協力(学校<企業・地域)」は低い評価となっている。また、発達段階が進むほど運動会の評価が低く、なかでも「役割分担に対する責任感」と「観客を含めた楽しさ」はその傾向が顕著である。全体分析では、「役割分担に積極的に参加した人」ほど、運動会の成果を高く評価する傾向にあり、運動会の活性化には、その関わり方(役割分担)が重要となる結果が得られた。(2)運動会の事例として徳島県では「阿波踊り」を取り入れている学校が多く、阿呆連より指導者派遣を依頼し、地域との連携を図りながら、伝統文化の継承に努めていた。全国調査では、運動会を「ソーラン節」や「リズムダンス」など発表の場とする傾向が強い。(3)児童生徒の「学校への適合感」や「社会的スキル」と運動会の関連性を測定することで、他者と関わり合う場面で、どのような要因に不適合感を感じるのか、社会生活を営む上での自己理解に繋がる。平成27年度では、課題(3)で運動会と「学校生活」や「ソーシャルスキル」との関連を測定するための調査票を作成し、可能であれば小学生を対象に実施することを目指した。しかし、児童が学校でどのような活動に不適合を感じているのか、また不適合改善のためにどのような活動が効果的かを判断するのに時間を要した。なかでも、組織の状態を測る尺度として、当初、「スクールモラール」を測定尺度を想定していたが、「学級」を対象とする研究が多く、運動会は学年を越えて縦割りで編成されることが多く、児童生徒の主観的な「学校適応感」を理論的中心とした尺度が適切と判断した。「学校適応」に関する研究では、測定に様々な指標が用いられている。その代表的な尺度が絶版となっており(樋掛・内山,2011)、石田(2009)の尺度は「学校全体」「学習関係(意欲)」「教師関係」「友人(級友)との関係」で測定され、従来の研究を踏まえて提案されている。本研究では、感情や認知を含めた子どもの行動的機能の観点から、アンケートを再検討したため、現在までの進捗状況がやや遅れていると判断した。平成28年度は、(1)学校、地域、会社の3領域で運動会に対するネット調査のデータ整理及び(2)校種差(学校)を分析した。対象は、学校437名(小学校高学年156名、中学校125名、高校156名)、地域住民168名、会社員167名の計772名である。(1)3領域を比較すると、1目的は、学校の「目標に向かっての団結(34.6%)」に対し、地域と会社は「人間関係への自信(地域23.8%、会社27.0%)と異なり、3プログラムの特徴は、3領域とも「有り」が23割で少ない結果となった(χ2値=17.5,P<0.05)。さらに、3領域で各項目との多重比較検定を行った結果、2積極性(F値=6.5)は学校が会社よりも高く、4楽しさ(F値=11.1)、7次年度への意欲(F値=9.5)、5成果【「皆との協力(F値=20.4)」「組織力の向上(F値=11.3)】等は、学校が会社より、地域が会社よりも平均値が高い結果を示した。6運動会の改善点(サービス評価分析)は、全体で「不審者チェック」、「意見要望の言いやすさ」が挙がり、学校で「用具の安全性」「更衣室・休憩室の確保」、地域で「駐車場の確保」、会社で「更衣室・休憩室の確保」「救急場所の周知」が挙がった。
植物個体における光合成機能統御の分子基盤

文部省科学研究費補助金重点領域研究「植物個体における光合成機能統御の分子基盤」(領域代表者杉山達夫、平成9年平成12年度)が平成9年度発足分として選定された。本研究は、当該研究分野及び関連する分野について調査を行い、当重点領域研究の計画研究内容と公募研究の方針、研究組織の体制と運営、評価体制等、重点領域の計画・実施における根幹部分に関する計画を立て、その実施に向けての準備を図ることを目的とする。以下の企画・調査研究を計画し、実施した。1.研究班会議を9月、10月、及び2月に開催し、当重点領域研究の計画研究内容と公募研究の推進、研究組織の体制と運営、評価制等について、実施むけての基本方針を決定した。2.上記研究班会議の役割と実施を円滑に推進するために、調査及び企画の立案のワーキンググループによる会議を5回開催し、討議の原案を作成した。3.当重点領域研究の計画班員予定者を中心に当該領域の動向・将来への展開を提起し、わが国の研究者への理解と協力および意見聴取を目的とし、公開シンポジウムを3回(9月京都、10月東京、3月京都)開催し、その成果の一部を日本植物生理学会の講演要旨集にて公表する。
京都市における蚊媒介性感染症発生時の安全・安心の強化：社会対応による蚊防除の提案

日本における感染者の発生が危惧されているデング熱などの蚊が媒介する感染症の流行時には、医療の領域を超えて媒介蚊の生息数を抑制するための社会対応が必要となる。蚊防除で国際的に高い評価を受けている観光地である都市国家シンガポールの感染症対策は、京都市のような国際観光都市にとり有用であると考えられた。医科学・社会科学両方の視点から研究を行った結果、人的資源・物質の確保、システム構築、公衆衛生教育の普及などの課題が浮き彫りになった。しかし、どのような蚊防除が京都市において有効であるかに関する考察には、2013年にシンガポールにおいて蚊媒介性感染症の患者数が急増したことにより、さらなる研究が必要である。平成24年度には、医科学おび社会科学分野の先行・関連文献の調査を重点的に行い、東南アジア地域における現地調査を行うとともに、関連性の強い国内学会・研究会(5回)・国際学会・会議(5回)の参加を通じて、他国における対応事例および本症の情報収集を行った。とくにシンガポール環境庁との意見交換(8月、11月、1月)を通じて、同庁が主導している産・官・民による蚊防除への取り組み内容の詳細を得て、資料を入手することが出来た。89月にかけて10日間にわたって世界保健機関とシンガポール外務省、環境庁、タントクセン病院らが共催したデング熱・出血熱対策の研修プログラムには、日本から唯一の参加者として受講を認められ、各国の研究者と情報交換を行いながら、同症の最新状況および媒介蚊の薬剤耐性の知見を得て、成虫・幼虫の種属同定方法、蚊の体内のデングウイルスの有無の検査方法などの技術を習得することが出来た。加えて、媒介蚊防除方法および人々の行動にインパクトを与えられる手法として定着しつつあるCOMBIに関する各国の進捗状況の把握も行った。これらはいずれも、京都市に有益な手法や情報と考えられるので、どのように京都市に応用できるのか次年度に検討すべき事項であると確認した。11月にはこのCOMBI実施国であるインドネシアにおいて保健省を訪問し、最新の国レベルの症例数の動向および世界でも有数の観光地であるバリ島における症例動向について聞き取り調査を行った。2010年の大流行を受けて導入した媒介蚊対策の試みについて、バリ島での臨地情報収集が望ましいと判断した。国内においては国立感染症研究所による輸入症例に関する最新動向および国内における教育普及の試みについて情報収集し、京都市衛生環境研究所のヒトスジシマカ捕獲調査の結果に関する報告会にも参加した。シンガポールにおける調査の中間報告を10月と3月に行った。1)海外調査:シンガポールでは環境庁が行った公衆衛生教育の状況および成果に関する分析(未公開情報)を含む情報を収集した。首相を筆頭に国をあげて行われた環境衛生キャンペーン活動に参加し、住民にどのような情報提供が行われているかを把握するとともに、住民参加の様子を参与観察した。草の根運動のとりまとめを担う機関における聞き取り調査を実施し、一次資料を入手した。カンボジアでは、世界保健機関を訪ね、蚊媒介性感染症に関する公衆衛生教育の資料を入手した。インドネシアバリ島については後述する。2)国際研究協力および国内における調査:シンガポール環境省のシニアマネージャーを京都市に招聘し、京都市衛生環境研究所衛生動物部門をはじめとする複数機関へシンガポールおよび東南アジアにける媒介蚊に関する情報提供を行うとともに、京都市における媒介蚊防除活動の戦略立案に関する意見交換を行った。国内一般企業および京都市の住民と旅行者に蚊媒介性感染症および蚊防除に関する聞き取り調査を行った。3)国内外学会における情報収集および成果発表:研究成果の中間報告を兼ねて、国際学会(国際旅行医学会:於マーストリヒ、デング熱会議:於バンコク)および日本渡航医学会において意見交換・中間成果発表を行った。本研究は、グローバル都市シンガポールにおいて有効である社会対応を応用し、京都市における安全・安心の強化につながる提案を行うことを目的とした。しかし2012年までは優れた蚊防除により症例発生頻度を低レベルに抑えていたシンガポールにおいて、2013年にデング熱が大流行するという予想外の事態により、調査対象機関の変更およびインドネシアバリ島における住民教育の内容および官民協働型の社会対応に関する調査結果を加えることにより、国際観光地京都市が参考とできうる社会対応の提案に必要な事例収集を完遂行した。1度に3週間の期間を連続して臨地調査にあてることが6月に異動後困難な状況が続いているため、次年度と分けて数回行うことにした。そのため、シンガポールにおける民間企業と住民組織の調査がやや遅れている。その一方、国際会議とワークショップにおける各国の蚊防除の取り組みに関する情報収集および本研究に関連する文献の収集・調査が当初の計画以上に進展しており、総合的におおむね順調に進展している、と判断している。25年度が最終年度であるため、記入しない。シンガポール環境庁との意見交換を続けながら、シンガポールにおける調査を続行し、インドネシアおよび京都市内における調査も追加的に行う。

9月以降シンガポール環境庁の研究者を招聘して京都市内の防除戦略について意見交換および講演会を行う計画であるが、平成25年5月現在、同国では主流の血清型の移行によるものと考えられる症例数急増の傾向が認められ、大流行が危惧されていることが懸念材料である。流行に対応するためにシンガポール環境庁の研究者が来日できなくなった場合には、ほかの研究者を招聘するあるいは、開催地および講演会のテーマを変更するなどして対応する計画である。25年度が最終年度であるため、記入しない。
蛋白質のα-β構造転移とアミロイド形成のモデル化

近年、タンパク質の3次元構造変化(ミスフォールディング)に起因した疾病の発病機構に高い関心が集まりつつある。これらタンパク質の3次元構造変化は、α-へリックス構造からβ-構造への転移に代表され、さらにはそれらの不溶性アミロイド形成が疾病の原因と考えられている。これらタンパク質2次構造の超構造的集合体形成機構の解明がタンパク質機能ひいては疾病の原因解明につながる一道を開くものと考えている。しかしながら、巨大な天然タンパク質の立体構造変化の機構は非常に複雑である。そこで、天然タンパク質の複雑機構の設計モデル化を行うデノボ設計法に関する研究が興隆してきた。本研究では、本手法を適用しモデル化合成ペプチド系を用いることにより、立体構造変化(ミスフォールディング)機構の単純化および系統的評価を行い、疾病発現機構解明への一助となることを目的とした。簡略化したアミノ酸配列を有すペプチドを設計・化学合成し、そのペプチドが水溶液中でα-へリックス構造からβ-シート構造へと自己触媒的、自己複製的に転移し、アミロイド繊維へと自己組織化することを各種分光器や電子顕微鏡等を用いて明らかにした。さらに、そのペプチドに対して系統的なアミノ酸置換を行い、アミロイド繊維への自己組織化はペプチドの一次構造が厳密に認識されて行われることが分かった。
メダカを用いた生体脳情報処理プロセス研究のための実験解析手法確立に関する基礎研究

メダカ(Olyzias latipes)が誘引、あるいは忌避応答を示す物質を調べるため走化性検定を行った。アンモニウム塩、糖、アミノ酸、アルコール、重金属塩など18種類の物質を用いたところ、硝酸アルミニウム、塩化アンモニウム、キニーネに関しては忌避応答を、シクロヘキシミド、人工飼料に関しては誘引応答が見られることが示唆された。また、感知応答に影響する他の要因を調べるために、アルミニウムを検定物質として調べたところ、飢餓状態において忌避応答が顕著になること、また、性差がありオスの方が強い忌避応答を示すことが示唆された。これらの物質を主に感知している部位を調べるため、体の様々な部位に内径1mmのチューブで直接アルミニウムを暴露したところ、口腔付近で一番強い応答を示した。また、Gタンパク質共役受容体遺伝子の発現部位を調べるためRNAプローブを用いたin situハイブリダイゼーションを試みた結果、メダカ頭部の切片サンプルでは口腔部内の表皮において強いシグナルが検出された。匂い刺激に対する脳の応答を時空間的にとらえるために、膜電位感受性色素を用いた光学的な測定を行い、メダカの脳表面における膜電位の同時計測を行った。メダカの頭部を解剖し脳を露出させた後、膜電位感受性色素(RH414)で染色、大脳の下部に位置する嗅球における膜電位の光学計測を行った。脳が酸欠状態に陥るのを防ぐため、解剖中および光学測定中は酸素を通気した人工脳脊椎液(ACSF)を還流し続けた。脳を完全に摘出した状態で、嗅神経より電気刺激(10mA,1ms)を与えたところ、刺激が嗅球全体に伝播する様子が確認でき、この条件で測定が可能であることが示された。次に、メダカの鼻の部分を残したままで嗅球部分を露出し、匂い刺激を与えたときの嗅球での応答を光学計測した。その結果、嗅球で局所的に伝播する応答が確認できた。メダカの脳と嗅覚感知組織である鼻腔の三次元モデル構築と味覚感知組織である味蕾の分布を調べるため、メダカの頭部をパラフィン包埋し、ミクロトームを用いて厚さ約7μmの連続スライス標本をsagittal, horizontal, transverseの3方向で作製した。作製したスライス標本はヘマトキシリン・エオジン法で染色し、実体顕微鏡および倒立顕微鏡により組織観察を行った。魚類においては味蕾は口腔内だけでなく全身に分布すると言われている。メダカ頭部においても味蕾と思われる特徴のある組織が確認されたが、メダカでは体表面に味蕾はそれほど存在せず、頭頂部においてもこの切片以外には数個確認できただけであった。連続スライス標本を実体顕微鏡および倒立顕微鏡に接続したCCDカメラを用いてデジタル画像としてコンピュータに取り込み、鼻腔の輪郭にあたる部分の座標を取得して三次元モデルを構築した。このモデルに今後in situハイブリダイゼーションの結果を追加していく。同様に脳についても三次元モデルを作成中である。また、匂い刺激に対する脳における応答を解析するため、メダカの嗅脳に対してブラインドパッチクランプを試みている。さらに走化性実験をおこない、嗅覚・味覚情報に対するメダカの行動を調べた。アルミニウムは、200μM以上において忌避性を示した。また、排泄物の成分である塩化アンモニウムは、100mM以上で忌避性を示した。一方、誘引物質としてエサ抽出物を用いた場合は、開始直後は誘引されるが、時間が経過すると明確な差がなくなる。これはメダカがエサを認識する際に嗅覚・味覚情報だけではなく視覚情報も重要になってくるためではないかと考えられる。各種アミノ酸を用いても同様に調べているが、現在のところ明確なものが見つかっていない。

次に、メダカの鼻の部分を残したままで嗅球部分を露出し、匂い刺激を与えたときの嗅球での応答を光学計測した。その結果、嗅球で局所的に伝播する応答が確認できた。
生物教育における定量的実験・観察の開発

中学校・高等学校における生物の実験・観察の内容の調査・分析を行うと共に,授業で活用できる定量的な生物実験の開発を行った。1.「光の強さと光合成量」の関係を定量的に調べる実験として,各照度におけるウキクサの成長量(湿重量)を1日毎に電子てんびんで計量し,各照度における成長量を定量的に調べる実験方法と,常緑樹の葉を用いて,各照度における葉の二酸化炭素吸収量を一定時間後にガス検知器を用いて測定する方法とを開発した。前者は,数日間の継続実験として,後者は12時間の実験として,探究的な定量的実験として授業に活用できる。2.「湿度と呼吸量」の定量的実験として,各温度における呼吸量を,メダカの鰓蓋の運動回数で測定する方法と,発芽種子が呼吸で消費する酸素量をメスピペットで測定する方法とを研究した。両者の方法とも,簡単な実験装置で,しかも50分の授業時間内で容易に呼吸量が測定できるので,定量的な実験として有効であることが明らかとなった。3.「外的条件と蒸散量」の定量的実験として,一定時間に蒸散によって減少した水量を電子てんびんで計量し,葉面積の測定は重さに置換する方法で求めることで,一定時間における単位面積当たりの蒸散量が正確に定量できることが明らかとなった。この方法は,従来の方法より簡単で,しかも50分の授業時間内に行える有効な実験といえる。4.理科教科書に見られる定量的な生物実験・観察の調査・分析中学校及び高等学校の理科教科書を基に,生物の実験・観察の内容を調査・分析した結果,定量的な見方をする実験・観察が占める割合は,極めて少なく,小学校よりも中学校のほうが,また,従前の教科書よりも現行のもののほうがその占める割合が小さいことが明らかとなり,生物教育における定量的な実験・観察の導入の必要性が明らかとなった。生物教育に活用できる定量的な実験・観察の開発として,平成2年度は,「光の強さと光合成量」,及び「外的条件と蒸散量」について定量的に測定する実験方法の研究を行った。「光の強さと光合成量」の実験開発としては,ウキクサを用いて「光の強さと成長量の関係」を定量的に調べる実験方法について研究した。即ち,各照度におけるウキクサの成長量(湿重量)を,24時間毎に電子てんびんで計量した。その結果,実験期間を56日に設定すると,照度8,000ルクスまでは,ウキクサの成長量(湿重量)は,照度(ルクス)に比例することが明らかになった。又,今回の研究で,8,000ルクスまでならば,等差級数的な照度に設定しなくても,即ち任意の照度で成長量を測定しても,光の強さと成長量の関係は比例関係にあることがとらえられることが明らかになった。この実験では,一定の照度に調整することが困難であるため,照度を調整する簡単な方法を開発することが次年度の研究課題である。「外的条件と蒸散量」に関する研究では,蒸散量の定量的な測定方法を確立した。即ち,一定時間に蒸散した水量の測定は,減少した水量を電子てんびんで計量した。又,葉面積の測定は,実験に用いた植物の葉を厚紙に写しとって切り抜き,その重さを面積に置換する方法を用いた。この方法によると,授業時間内の実験で,外的条件(光・温度・湿度など)や植物の種類による蒸散量の差を定量的に求めることができることが分かった。この実験における外的条件の条件設定の在り方や,実験に最も適する材料を明らかにすることが次年度の研究課題である。

生物教育に活用できる定量的な実験・観察の開発として,平成3年度は,次の二つの事項について研究を行った。1.陸生植物を用いた「光の強さと光合成量」の実験の開発「光の強さと光合成量」の関係を調べる実験として,ウキクサの代わりに常緑樹の葉を用い,各照度における光合成量を調べる方法の開発を試みた。各照度における光合成量は,一定時間後(15,30,45,60分)における二酸化炭素の減少量を,ガス検知器を用いて測定した。その結果,この方法で,光の強さと光合成量の関係をとらえることのできるグラフが得られることが分かった。ただ,この方法では,各実験毎に材料を入れ替える必要があり,この点の改善を要することが問題点として残った。2.「温度と呼吸量」の実験の開発「温度と呼吸量」につての定量的測定実験の開発では,本年度は,水生動物(メダカ)を用い,各温度における呼吸量を,水中に排出された二酸化炭素量を呈色反応を用いて測定する方法と,鰓蓋の運動回数で測定する方法とで行った。前者の方法では,呈色反応を目で判定するため,デ-タのばらつきが大しく,方法の改善が必要であること分かった。後者の方法は,理論値に近い方法が得られるので,生徒実験としては後者の方が適していることが分かった。だだ,メダカの高温時の呼吸運動は速いので,測定がしやすい動物を見つけ出すことが,今後の課題である。また,「温度と呼吸量」の関係を調べる実験として,現在,発芽種子を用いて,各温度における呼吸量(二酸化炭素の排出量)を定量的に測定する実験を開発中である。本年度は,「温度と呼吸量」に関する実験として,植物の発芽種子を用いた定量的実験の開発と,理科教科書に見られる定量的な生物実験・観察の分析を中心とした研究を行った。1.「温度と呼吸量」の実験の開発温度と呼吸量との関係を定量的に測定する実験の開発について,昨年度は実験材料として動物(メダカ)を用いたので,本年度は植物材料として発芽種子を用いる方法について研究を行った。発芽種子の呼吸量の測定方法は,呼吸で消費された酸素量を測定する方法をとった。この方法は,簡単な実験装置で30°Cまでの呼吸量がほぼ正確に,しかも短時間に測定できるので,中学校理科の実験として有効であることが明らかとなった。また、発芽種子の場合は,実験前に乾燥重量が測定できるので乾燥重量当たりの各温度における呼吸量の測定が可能となり,より精度の高い呼吸量の測定ができることが明らかとなった。2.理科教科書に見られる定量的な生物実験・観察の調査・分析生物教育における定量的実験の開発の必要性は,生物実験・観察に定量的なものが少ないことにある。この問題の実態を把握するために,中学校及び高等学校の理科教科書を調査・分析して,生物実験・観察のうちで定量的なものが占める割合を明らかにした。その結果,定量的な見方をする生物実験・観察が占める割合は,極めて少ないが,小学校理科よりも中学校理科のほうがさらに小さいことが,.また,昭和22年版学習指導要領(試案)施行期や昭和44年度学習指導要領施行期の時よりも現行の教科書のほうがさらに低いことが明らかとなり,中学校理科の生物に定量的な実験・観察を導入する必要性があることが判明した。
ATPからポリリン酸へ、生命エネルギー進化の逆をたどる分子改変

ATPは生命エネルギーの通貨と言われ、多くの酵素がATPをエネルギー源あるいはリン酸化の基質として利用している。我々はポリリン酸(polyP)を利用してグルコースをリン酸化する酵素(polyP-GK)を発見し、その立体構造を解明した。本研究ではATPを利用するグルコキナーゼ(ATP-GK)を改変し、polyPを利用できる様にする分子改変に挑戦した。1,ATP-GKの触媒部位周辺の塩基性のアミノ酸が比較的少ないため、polyPとの親和性が低い可能性がある。そこで、触媒部位の入り口のAsp302をLysに置換したがpolyPを利用できるようにはならなかった。2,ATP-GKのC末端に別酵素のpolyp結合ドメインを挿入し、polyPに対し親和性の高い融合タンパク質をつくった。しかし、この融合タンパク質はATPによる酵素活性は検出できたが、polyPを利用できるようにはならなかった。3,polyP-GKの触媒部位の構造に比べ、ATP-GKのリン酸結合部位が柔軟性を欠くことから、構造が不安定なpolyPとの親和性が低い可能性がある。リン酸結合部位の柔軟性を高めるため、Ala261のGlyへの置換及びGlyの挿入を行なった。しかし、その両方の酵素にグルコキナーゼ自体の酵素活性が消失した。以上の結果より、ATPの触媒部位への結合による構造変化(アロステリック活性化)が起こる酵素では、polyPを利用させることが困難であることが考えられる。しかし、アロステリック活性化を示さないタイプのATP依存酵素を使えば、潜在的にpolyPも利用できる可能性があると考えられた。一方ポリリン酸(polyP)は数十から数百のリン酸が結合したポリマーであり、原始生命が生まれたとされる火山の熱水中に含まれる。このことから原始生命は複雑なATPよりもむしろポリリン酸をエネルギーとして利用したのではないかと考えられている。我々はポリリン酸を利用してグルコースをリン酸化する酵素(polyP-GK)を発見し、その立体構造を解明した。ATPを利用してグルコースをリン酸化する酵素(ATP-GK)と構造を比較した結果、両起源が同じであることが推定できた。本研究ではATPを利用する酵素を改変し、ポリリン酸を利用できる様にすることに挑戦した。まず、大腸菌ATP-GKの溶液に、ATPに対し3倍濃度のトリポリリン酸を添加した実験では、polyP-GKとATP-GKのリン酸結合部位の共通性にも関わらず、ATP反応の阻害が起きなかった。このことから、ATP-GKには、polyPがリン酸結合部位で結合しないことが示唆された。それは、触媒部位内のリン酸結合部位におけるリン酸の結合が強くなく、その結合よりも、リン酸を触媒部位へと誘導するメカニズムが重大な役割を果たしている可能性を示している。負電荷を帯びているpolyPを触媒部位へと誘導するには、触媒部位の入り口とその周辺に塩基性のアミノ酸残基が大きく関わっている可能性がある。実際、polyP/ATP-GMKとpolyP-GKの触媒部位の入り口の回りには、多数の塩基性のアミノ酸が存在する。しかし、ATP-GKの場合は、触媒部位の入り口の上部にいくつかの塩基性のアミノ酸が存在するだけで、比較的少ない。以上の結果より、触媒部位の入り口とその周辺のアミノ酸として、Asp302、Gly262、Asn14の置換が考えられた。
マウス表皮細胞から形質転換した角膜上皮様細胞を用いた角膜上皮再建の試み

自己の表皮細胞から形質転換させた角膜上皮細胞を用いることが可能となれば、角膜上皮再生医療の臨床効果は飛躍的に改善されると推測される。本研究では、マウス表皮細胞、表皮sp細胞を用い、マウス強角膜片を用いた器官培養ならびに輪部線維芽細胞との共培養による細胞シート作製を検討し、これらの培養系にて角膜上皮様細胞への形質転換が誘導される可能性を示した。さらに、実質細胞の働きに着目しトランスクリプトーム解析を行い、形質転換に関与する可能性のある複数の因子を見出した。これら実質由来因子の検討をさらに進めその働きを解明することで、器官培養およびフィーダー細胞を必要としない培養法の開発が可能になると考えられる。角膜上皮の再生医療は他分野に先駆け臨床応用が行われ、かつて難治とされた瘢痕性角膜疾患において良好な治療成績が報告されている。しかしながら、現状では他家角膜上皮または自家口腔粘膜上皮を用いた培養上皮移植にとどまり臨床的効果は限定的である。自己の表皮細胞から形質転換した角膜上皮細胞を用いることが可能となれば、限られた細胞源しかない角膜上皮再生治療に非常に有用と考えられる。我々は、まず角膜上皮特異的サイトケラチン(K12)の発現によりGFPを発現するK12Cre/ZEGマウスを作製し、角膜輪部実質上においてマウス表皮由来細胞から角膜上皮様細胞への形質転換が可能であることを明らかにした。また、輪部実質細胞由来の因子に着目し、マウス角膜中心部実質と輪部実質由来の線維芽細胞に対してトランスクリプトーム解析を行ったところ、輪部実質由来線維芽細胞において、Sfrp2を始めとする複数のWntシグナル関連因子の高発現が認められることが分かった。これらの因子が上皮細胞分化に与える影響について検討し、形質転換誘導因子の同定を行うため、効率的に因子のスクリーニングが可能な培養系の確立を試みた。本検討では、まずマウス輪部実質線維芽細胞(MLF)を培養、マイトマイシンC(MMC)処理を行った。さらに、生後0日のマウスの表皮からside population(sp)細胞をFACSにより分取し、MMC処理後のMLF上に播種して培養を行った。Real-time PCRによりK12遺伝子の発現を調べたところ、表皮sp細胞でのK12遺伝子発現を定量可能であることが分かった。一方で、MLFまたは表皮sp細胞を単独で培養した場合にはK12遺伝子の発現は認めなかった。本培養系を用いることで、輪部実質特異的因子が上皮細胞分化に与える影響について解析し、形質転換誘導因子のスクリーニングが可能になると考えられる。角膜上皮の再生医療は他分野に先駆け臨床応用が行われ、良好な成績が報告されている。しかしながら、現状ではalloの角膜上皮または自家口腔粘膜上皮を用いた培養上皮細胞移植にとどまり臨床的効果は限定的である。自己の細胞(表皮細胞)から形質転換させた角膜上皮細胞を用いることが可能となれば、臨床的効果は飛躍的に改善されると推測される。我々はこれまでの研究において、角膜上皮特異的サイトケラチン(K12)の発現によりGFPを発現するK12Cre/ZEGマウスを作製し、マウス表皮細胞から角膜上皮様細胞への形質転換が可能であること、さらに形質転換に角膜輪部実質由来の因子が関与する可能性を明らかにしてきた。本年度の研究では、形質転換による角膜上皮再建に有用な細胞源について検討することを目的に、K12Cre/ZEGマウスの培養表皮(前駆)細胞または表皮sp細胞を調製し、角膜輪部実質由来線維芽細胞との共培養にて角膜上皮様細胞(K12陽性細胞)への形質転換を試みた。その結果、表皮sp細胞と輪部線維芽細胞の共培養においてGFP陽性細胞が認められ、さらにTaqMan®Gene Expression Assay (Applied Biosystems)を用いたRT-PCRによりK12遺伝子の発現が確かめられた。また、輪部実質細胞由来の因子に着目し、マウス角膜中心部実質と輪部実質由来の線維芽細胞に対してトランスクリプトーム解析を行ったところ、輪部実質由来の線維芽細胞において、Sfrp2を始めとする複数のWntシグナル関連因子mRNAの高発現が認められることが分かった。Wntシグナルは、種々の遺伝子発現を調節することが知られるシグナル伝達経路であり、輪部における上皮細胞の分化制御に関与している可能性がある。今後これらの因子が上皮細胞分化に与える影響についても検討を行いたいと考えている。iPS細胞を始め、再生医療の進歩には目覚ましいものがある。

中でも角膜上皮の再生医療は他分野に先駆け臨床応用が行われ、良好な成績が報告されている。しかしながら、現状ではalloの角膜上皮または自家口腔粘膜上皮を用いた培養上皮細胞移植にとどまり、臨床的効果は限定的である。自己の表皮細胞から形質転換させた角膜上皮細胞を用いることが可能となれば、臨床的効果は飛躍的に改善されると推測される。本研究では、マウス表皮細胞、表皮sp細胞を用い、マウス強角膜片を用いた器官培養ならびに輪部線維芽細胞(MLSF)との共培養による細胞シート作製を検討し、これらの培養系において角膜上皮様細胞への形質転換(K12遺伝子発現)が誘導される可能性を示した。さらに、どのような環境あるいは因子が形質転換に必要かについて検討するため、角膜実質細胞の働きに着目し、トランスクリプトーム解析を行い、形質転換に関与する可能性のある複数の因子を見出すことが出来た。これら因子には、5種類のWntシグナルに関連する因子を含む分泌タンパク質のコード遺伝子が21種、細胞外マトリクスの構成タンパク質をコードする遺伝子が15種含まれていた。また、Wnt関連因子はその多くがsFRP2やDKK3などのWnt阻害因子であった。Wnt阻害因子のノックアウトが角膜上皮の表皮様分化を促進することが知られており、本研究で見出された因子によるWntシグナルの調節が角膜上皮の分化に関与する可能性が考えられる。今後、Wnt関連因子を含む輪部実質由来因子の検討をさらに進め、上皮細胞の分化における働きを解明することで、器官培養およびフィーダー細胞を必要としない培養方法の開発が可能になると考えられる。また、これら輪部因子に関する知見は、細胞移植のみならず、輪部機能を再生するための遺伝子治療または薬物治療の新たなターゲットとしても大いに期待できると考えられる。眼科学本研究では、マウス表皮細胞から形質転換した細胞を用いた角膜上皮シートを作製し、ヒト臨床応用の基礎となる動物モデルの確立を目的としている。そのため、使用する細胞源の選択ならびに角膜上皮再建のための培養法に関する種々の検討を段階的に行う必要がある。我々はこれまでに、表皮sp細胞が形質転換による角膜上皮再建に有用である可能性を示すと共に、輪部実質由来因子に着目してトランスクリプトーム解析を行い、上皮細胞の分化誘導に関与する可能性のある角膜輪部特異的因子の候補遺伝子について解析を進めてきた。候補遺伝子は分泌タンパク質のコード遺伝子(21種)、細胞外マトリクスの構成タンパク質のコード遺伝子(15種)を含んでいる。これらの因子がマウス表皮由来細胞の分化に与える影響について検討し、形質転換誘導因子の同定を行うため、効率的に因子のスクリーニングが可能な培養系の確立が必要不可欠であった。そこで、MMC処理後の輪部実質由来線維芽細胞をフィーダーとした表皮sp細胞の培養系について検討を行い、本培養系において、表皮sp細胞での角膜上皮分化マーカー遺伝子の発現を定量的に解析出来ることを明らかにした。本研究では、マウス表皮細胞から形質転換した細胞を用いた角膜上皮シートを作製し、ヒト臨床応用の基礎となる動物モデルの確立を目的としている。