hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
岡山粒子望遠鏡によるミュ-オン点源探索

電磁石付天体追尾型粒子望遠鏡を用いて、Cygnus X-3等の特定の天体を追尾し、それらの天体の方向からくるミュ-オンの時間変化や頻度を運動量及び荷電の正負を計測しながら観測するのが本研究の目的であった。補助金交付期間内に、この粒子望遠鏡と稼動システムの設計・製作を行い、完成させ、これらを用いての観測・デ-タ解析行った。基礎測定等による調整後、追尾測定の第一目標であるCygnus X-3の完全な計測は1989年10月02日から現在まで行われ、まだ観測を続行中であるが、一日につき5.5時間の追尾観測を行ってきて、そのうち1989年10月02日から1990年03月01日までの半年弱の測定期間に対してデ-タ解析を行うことができた。人射角で望遠鏡の軸に対し、±3.5°内のイベントの位相解析をvan der KlisとBonnet-Bidaudによって導出された周期値を使用して運動量別、電荷の+、-別に分けて行った。Cygnus X-3の一周期を20分割した位相解析で、μ^-の[4.022.5]GeV/c(GeV:10^9eV)の運動量領域で位相値[0.65-0.7]に4.7σのピ-クを持つという明瞭な結果を得た。このピ-ク位相値はガンマ線や地下ミュ-オンの観測でも特徴的な値である。このピ-クはこの運動量領域より高い場合も低い場合も現われない。又、同じ運動量領域のμ^+でも全く現われない。μ^-でも全運動量領域を集計すると優位性が見えなくなってしまう。従って、通常の運動量弁別をしない場合は通常のミュ-オンにかくれてしまうことがわかる。低運動量でのμ^-の優位性はこれまでのどの研究グル-プも持ち得なかった新しい知見である。そのため、Cygnus X-3からのミュ-オンのオリジンにも新たな検討(例えば、低いエネルギ-ニュ-トリノ等)が必要になり、Cygnus X-3モデルの新たな発展を促すであろう。さらにニュ-トリノがオリジンだとなれば、ニュ-トリノ振動の実験やニュ-トリノ望遠鏡に対しても新しい見方が展開される等が期待される。Cyg.X-3等の特定の天体を追尾し,それらの天体の方向からくるミューオンの時間変化や頻度を運動量を計測しながら観測するのが本研究の目的である.従って,本年度は天体追尾装置及び電磁石(Solid Iron Magnet)の設計・製作が主要な目標であったので,計画通り実施し完了した.点源追尾装置は稼働させるインターフェイスを製作し,稼働テストを終了した.特定の天体に即したプログラムの整備を行えば良い段階に達している.一方,電磁石は運動量決定用の位置カウンターが製作テストを完了しないとテストできないので現在製作中である.カウンターの製作と併行して,それらからの読み取りシステムを整備中である.運動量決定精度やMDM(検出可能な運動量の上限値)の決定は次年度達成させる予定である.

Cyg.Xー3等の特定天体を迫尾して、その方向から来るミュ-オンの頻度の時間変化や、個々のミュ-オンの運動量と電荷の正負を長時間・連続的に観測するのが本研究の目的である。昨年度までに、基礎的な測定を完了し、昨年度末から本観測のデ-タが出た。本年度は最終年度に当たり、本格的なデ-タの収集を目指し、迫尾の空き時間を利用して装置を部分改良し、計画通りデ-タと成果が得られた。迫尾の主目標は、Cyg.Xー3に設定したが、これについては、3日分の欠測をはさんで180日以上の有効な連続観測がなされた。空き時間には、Cyg.Xー3以外の天体を模擬的に迫尾し、また、様々の天頂角に固定して測定することにより、基礎的デ-タを充実させた。また、電磁石の磁場強度の正確な決定と、装置の設定精度を上げることにより30GeV/c以上の運動量の測定精度を向上させた。運動量別の到来頻度観測がなされ、運動量別・電荷の正負別の天頂角依存性について新たな知見が得られた。また、Cyg.Xー3の到来頻度を運動量別に位相解析して、ある運動量範囲で、位相.6.65において、統計的に有意な頻度の増加が認められた。これらの暫定的な結果は、それぞれ、第21回宇宙線国際会議(豪州アデレ-ド、1990年1月)で発表された(HE4.6ー12、HE4.6ー11印刷中)。
腹膜透析における腹膜硬化の発症機序に関する研究

・これまで苦心していた腹膜線維芽細胞の分離・培養に成功した.そこで以下の如くヒト培養線維芽細胞と中皮細胞での各種浸透圧物質に対する増殖,種々の産生物の違いを検討した。各種浸透圧物質に対しては昨年までの中皮細胞での結果とほぼ同様でいずれの物質でも増殖抑制をきたしたがその程度は晶質浸透圧物質で強く膠質透透圧物質では軽微であった。・TGF-βは中皮細胞,線維等細胞いずれでも生成されており,培養液ブドウ糖濃度の増加と伴にその生成量も増加した。これは一昨年よりのTGF-βnRNA増加とも一致するものでTGF-βはメッセージのみでなく蛋白生成も増加することが判明した.・中皮細胞と線維芽細胞での産生物質の違いを検討したがCA125は中皮でのみ,cytokeratin fragment19は線維芽より中皮で,procullagen 1-C-peptido,prostaglindin(PGE ,6-Keto-PGF )は中皮より線維芽細胞でより産生,ピアルロン酸,インターロイキン2,6は両者でほぼ同様に産生されていた.これらのことよりCAPの排泄中のこれらの濃度変化より中央線維芽細胞の活動度を推測することが可能と考えられる.・腹膜透析患者の腹腔内ではglycationの早期生成物であるfurosireが生成されることがin vivo,in vitro実験で証明され,CAPD患者の腹腔内ではやはりglycationが起こっていることを示唆すると思われる.浸透圧物質としてブドウ糖,マンニトール癌糖,ソルビトール,グリシン,複合アミノ酸(いずれも5,25,50,100mM)を培養液中に混じて中皮細胞での^3H-thymidine uptakeを測定した。その結果,晶質浸透圧の増加は程度の差はあれ,中皮細胞増殖を抑制するがその作用はブドウ糖が最も大きかった。TGF-β,fibronectin,MCP-1のmRNA発現をブドウ糖,マンニトール培養液中で調べたがその発現はブドウ糖でいずれも増加しており、マンニトールでは増加はみられなかった。recombinant TGF-βの培養液添加により増殖抑制,fibronectin mRNA発現の増加が用量依存性に認められた。以上より,ブドウ糖による中皮細胞増殖抑制,fibronectin発現増加はTGF-β産生の増加のためと考えられる。ラットにおいて限外濾過能低下モデルの作製を試みた。高濃度ブドウ糖70ml/kg・13Wを7日間,連日腹腔内投与することにより腹膜透過能は明らかに亢進しその結果,限外濾過能は低下することが判明した。また,ヘパラン硫酸,ヘパリンを同時に腹腔内投与することにより,限外濾過能の低下を防ぐことができた。昨年度の報告の如く、腹膜透析液の浸透圧物質の検討ではいずれの晶質浸透圧物質も程度の差はあれ、用量依存性に腹膜中皮細胞の増殖能を抑制した。そこで、分子量の大きな糖であるマルトデキストリン,デキストラン70,ヒドロオキシスターチを用いて同様の検討を行ったところ、細胞増殖抑制は軽度であった。このことより腹膜透析液の浸透圧物質としては分子量1万以上の膠質浸透圧物質が好ましいと考えられた。中皮細胞のTGF-β産生能を調べるためには高感度のTGF-βassay系の確立が重要であるが、今回、このことに成功した。従来の方法では抗体の特異性が低いため血清蛋白が2%以上存在すると正確な測定ができなかったが、我々の測定方法では血清そのものでも精密な測定が可能となり、現在、種々のin vitro状件下およびCAPD患者での腹腔内でのTGF-βの産生動態を検討中である。これは一昨年よりのTGF-βnRNA増加とも一致するものでTGF-βはメッセージのみでなく蛋白生成も増加することが判明した.・中皮細胞と線維芽細胞での産生物質の違いを検討したがCA125は中皮でのみ,cytokeratin fragment19は線維芽より中皮で,procullagen 1-C-peptido,prostaglindin(PGE ,6-Keto-PGF )は中皮より線維芽細胞でより産生,ピアルロン酸,インターロイキン2,6は両者でほぼ同様に産生されていた.これらのことよりCAPの排泄中のこれらの濃度変化より中央線維芽細胞の活動度を推測することが可能と考えられる.・腹膜透析患者の腹腔内ではglycationの早期生成物であるfurosireが生成されることがin vivo,in vitro実験で証明され,CAPD患者の腹腔内ではやはりglycationが起こっていることを示唆すると思われる.
水の光分解反応を指向した新規可視光応答型光触媒の研究開発

太陽エネルギーと粉末光触媒による水の分解反応は、クリーンな水素を製造するための究極の反応として注目されている。通常、水の分解反応に際しては、光触媒"本体"に気体生成活性サイトとして働く微量の金属成分を担持したものが用いられるが、光触媒"本体"の構成成分として金属種を全く含まない材料(例えば有機化合物)が水の分解反応に用いられた例はほとんど知られていない。本年度は、有機高分子であるカーボンナイトライト(C_3N_4)を光触媒"本体"として適用し、水の分解反応に対する光触媒活性を調べだ。尚、この研究はX.Wang博士、M.Antonietti教授(ドイツMax-Planck研究所)との共同研究である。C_3N_4は、450nm付近に吸収端をもつ黄色の粉末である。この材料に水素生成の活性サイトとして働く白金ナノ粒子を担持すると、420nm以上の可視光照射下でメタノールなどの電子供与剤を含む水溶液から水素を生成する安定な光触媒として機能した。また、酸化ルテニウムのナノ粒子を酸素生成反応の活性サイトとして担持すると、電子受容剤として硝酸銀を含む水溶液から酸素を安定に生成できることがわかった。このように、有機化合物を不均一系の可視光応答型光触媒として水の分解反応系に適用し、その有用性をはじめて明らかとした。また本年度は、T.E.Mallouk教授(米国ペンシルベニア州立大学)の研究室にて、水の可視光分解反応を指向した色素増感ハイブリッド型光触媒系の構築に取り組んだ。その結果、ニオブ酸ナノチューブを構成ブロックとして用いると、可視光照射により、ルテニウム錯体(増感色素)とエチレンジアミン四酢酸(電子供与試薬)を含む水溶液から水素生成が起こることを見出した。この系の性能は、従来の酸化チタンを用いた場合よりも10倍以上高く、簡便な実験操作で高い水素生成効率の達成が可能となった。前年度までに、窒化ガリウム(GaN)と酸化亜鉛(ZnO)の固溶体(以下GaN:ZnOと表記)が可視光照射下で水を水素と酸素に分解できる安定な光触媒材料であることを見出してきた。本年度は、この材料の光触媒活性向上を目的として、水素生成反応の活性サイトとして働く新規な助触媒の開発、及び光吸収体であるGaN:ZnOの合成方法の検討を中心に研究を進めた。以下に、その成果の概略を記す。GaN:ZnOが水の分解に対して活性となるためには、酸化ルテニウムやロジウム-クロム複合酸化物などの助触媒微粒子をGaN:ZnO表面に導入する必要がある。したがって、GaN:ZnOによる水分解活性を向上させる上で、新規助触媒の開発は重要な課題である。このような理由で新規助触媒の開発を行った結果、貴金属ナノ粒子を酸化クロムで被覆したコア/シェル型ナノ粒子が、GaN:ZnOの水の分解を促進する新規助触媒となることをはじめて明らかとした。GaN:ZnO光触媒)可視光応答性は、ZnO成分の寄与によって発現していることがわかっていたが、その詳細な起源については不明であった。GaN:ZnOによる水の可視光分解活性を向上させる上で、その可視光応答性)起源を明らかにすることは重要であるため、極低温における励起発光スペクトル測定により、その解明を試みた。その結果、GaN:ZnOの可視光応答性には、GaN)バンドギャップ内に生じたZn種によるアクセプター準位の存在が大きく関与していることを明らかとした。一度合成したGaN:ZnOを空気中で再度加熱処理することで、表面近傍に存在する欠陥サイトの低減を試みた。その結果、加熱処理によってGaN:ZnOの水の分解活性は大きく向上し、その量子収率をそれまでの2.5%から5.9%に向上させることに成功した。本光触媒系の量子収率は、可視光で水を分解できる光触媒の中では現在のところ最高性能を誇っている。

その結果、ニオブ酸ナノチューブを構成ブロックとして用いると、可視光照射により、ルテニウム錯体(増感色素)とエチレンジアミン四酢酸(電子供与試薬)を含む水溶液から水素生成が起こることを見出した。この系の性能は、従来の酸化チタンを用いた場合よりも10倍以上高く、簡便な実験操作で高い水素生成効率の達成が可能となった。
腸管寄生性原虫赤痢アメーバにおけるオートファジーの解析

オートファジーは真核生物に広く保存している。典型的なモデル生物では細胞質成分をリソソームに輸送し分解・消化するシステムと捉えられているが、初期に分化した赤痢アメーバ原虫においては貪食胞の成熟過程に重要であることが知られていた。そこでオートファジーのマーカー分子であるAtg8の機能、Atg8脂質修飾に関与する分子の解明を目指し、以下の研究を行った。1)Atg8, Atg5, Atg12の貪食胞への動員を各GFP融合タンパク質を用いてライブイメージングにより検討した。2)Atg8結合タンパク質として同定した解糖系酵素のmycタグ融合タンパク質発現株を作成し、Atg8との結合、局在の検討を行った。3)Atg8遺伝子発現抑制株とコントロール株から貪食胞を回収し、貪食胞のプロテオーム解析からAtg8により制御される分子群の同定を行った。1)動物細胞貪食時の局在を検討した。Atg5, Atg12は貪食胞への局在が観察されず、一方Atg8は貪食開始直後から貪食胞の深部に局在が始まることが示された。また、このときAtg8陽性の小胞が近傍に存在する像が得られたことから、Atg8はAtg5, Atg12により局所で脂質修飾されるのではなく、脂質修飾されたAtg8が小胞から供給される可能性が高いと考えられた。2)mycタグ融合解糖系酵素は抗Atg8抗体により共沈することが示された。しかし細胞内局在は定常状態で細胞質であり、今後細胞内でAtg8と共局在する場の解明が必要である。3)貪食胞の回収方法を決定し、Atg8遺伝子発現抑制株で動員の減少するタンパク質を、103個同定した。この中にはv-ATPaseサブユニットのうち4遺伝子が含まれており、Atg8遺伝子発現抑制株での貪食胞酸性化の低下を反映していた。今後Atg8がこれらの分子の局在をどのように制御するのか解析が必要である。27年度が最終年度であるため、記入しない。赤痢アメーバAtg8の貪食胞への動員を検討した。Atg8は閉鎖した貪食胞のなかでも特に閉鎖前の貪食胞に集積した。よって貪食の初期に重要であると考えられた。さらにAtg8遺伝子発現抑制株で観察された貪食胞酸性化の遅延の分子機構を知る目的で、プロテアーゼ輸送に関わるVps26の動員を検討した。Vps26はレトロマー複合体の一つで赤痢アメーバにおいてプロテアーゼ輸送に関与する(Nakada-Tsukui et al., 2005)。Atg8遺伝子発現抑制株ではVps26の動員が遅延すると予想したが、顕著な差はみられなかった。よってAtg8が関わる分子過程はプロテアーゼ輸送とは独立したものであることが示唆された。赤痢アメーバにおいてAtg5-Atg12複合体の存在が明らかでなった。そこでAtg12候補遺伝子の発現抑制株を作成したところ、Atg8の脂質修飾が顕著に阻害された。よって赤痢アメーバAtg8の脂質修飾にもAtg5-Atg12複合体が関与することが明らかとなった。さらにGFP-Atg5, GFP-Atg12融合タンパク質発現アメーバ株を作成、その発現を確認した。

赤痢アメーバにユニークなAtg8の機能として貪食胞成熟への関与があるが、その分子過程の一端と考えられたVps26についてその関与を否定した。結果はネガティブであったが別タンパク質の関与について今後検討することができる。Atg8の結合分子について候補分子を見出し、タグ付き候補遺伝子発現株も樹立されたことから、機能解析に向けて順調に進展している。Atg12遺伝子の同定に成功したことから、赤痢アメーバにも広くモデル生物で保存しているAtg8脂質修飾過程が存在することが示された。本研究の目的である赤痢アメーバAtg8の機能解析において、脂質修飾を制御する分子の解明は大きな進展であった。27年度が最終年度であるため、記入しない。Atg8の貪食胞成熟における機能の解明について、Atg8遺伝子発現抑制株でphosphatidylinositol 3-phosphateの貪食胞への動員を検討する。また、Atg8遺伝子発現抑制株と野性株から貪食胞を精製し、プロテオーム解析からAtg8の関与する分子過程を明らかにする。Atg8結合分子について、myc-aldolase, myc-TPI発現株を用い、Atg8との結合を評価する。さらにグルコース枯渇時のaldolase, TPIそしてAtg8の局在、量の変化を検討し、解糖系とAtg8との関係を明らかにする。Atg5-Atg12の解析について、GFP-Atg5, GFP-Atg12発現株を用い貪食過程をリアルタイム観察し、Atg8の動員にAtg5-Atg12がどのように関与するか観察する。さらに抗GFP抗体による免疫沈降を行い、Atg5-Atg12複合体の全容を明らかにする。
副腎白質ジストロフィーの発症機構に関する研究

副腎白質ジストロフィー(ALD)はペルオキシソーム病の中で最も頻度の高い進行性脱髄性疾患で、ALD蛋白が病因蛋白質であるが、極長鎖脂肪酸活性化酵素(VLACS)の障害が病態と関連していると考えられている。我々はVLACSの精製・クローニングと患者解析を通じてALDの病態生理を明らかにする目的で以下の研究を行った。(1)VLACSの精製:ラット肝ペルオキシソーム画分よりVLACSを精製し、分子量約235kDa,サブユニット分子量約70kDa、極長鎖脂肪酸に活性を有し既知の長鎖脂肪酸活性化酵素と異なることを明らかにした。(2)ラットVLACS cDNAのクローニング:全長2972bpで620アミノ酸をコードし、推定分子量70692で、精製酵素と一致した。mRNAは約3kbで、主に肝臓と腎臓で発現し、ペルオキシソームとミクロソーム局在と考えられた。COS-1細胞で約50倍の活性上昇を認めた。Fatty acid transportproteinと相同性を有していた。(3)ヒトVLACS cDNAのクローニングと遺伝子座位:ヒトVLACS cDNAはラットと同じく620アミノ酸をコードしていた。ヒトVLACS遺伝子座位はFISH法により15q21.2と決定された。(4)ヒトVLACSの抗体作成:ラットVLACSの抗体がヒトVLACSと反応不良のため、ヒトcDNAよりヒトVLACSを大腸菌内で大量発現させ、カラム精製した。現在ウサギに免疫中である。(5)ヒトVLACSの発現:ヒトVLACS cDNAを線維芽細胞内に発現させるため、発現ベクターに組み込み、現在トランスフェクション実験を行っている。(6)ALD遺伝子変異解析:2例のALD患者の変異部位とALD蛋白の不安定性に関連があることを報告した。(7)ALD保因者診断法:マススクリーニング法の開発について報告した。副腎白質ジストロフィー(ALD)はペルオキシソーム病の中で最も頻度の高い進行性の脱髄性疾患で、ALD proteinが病因蛋白質であるが、極長鎖脂肪酸活性化酵素(VLACS)の障害が病態と深く結びついていると考えられている。(1)VLACSの精製:ラット肝臓のペルオキシソーム画分より精製したVLACSのnative enzymeの分子量は約235kDa,サブユニットの分子量は約70kDaで、極長鎖の脂肪酸基質に活性を有し、既知の長鎖脂肪酸活性化酵素とは異なっていた。(2)ラットVLACS cDNAのクローニング:ラットVLACSの部分アミノ酸配列よりプローブを作成し、λgtll cDNAライブラリーを用いてラットVLACS cDNAをクローニングした。全長は2972bpで620アミノ酸をコードし、推定分子量は70692で、精製酵素とよく一致した。mRNAは約3kbと推定され、主として肝臓と腎臓で発現しており、ペルオキシソームとミクロソームに局在すると考えられた。得られたcDNAをCOS-1細胞で発現させたところ、約50倍のVLACS活性の上昇を認めた。ホモロジー解析では、fatty acid transport proteinと高い相同性を有していたが、ALDPとは相同性を認めなかった。(3)ヒトVLACS cDNAのクローニングと遺伝子座位:ラットcDNAをプローブとしてヒトVLACS cDNAをクローニングした。ラットと同じく620アミノ酸をコードしており、得られた最長クローンは2362bpであった。ヒトVLACS

遺伝子座位はFISH法により15q21.2と決定された。副腎白質ジストロフィー(ALD)はペルオキシソーム病の中で最も頻度の高い進行性脱髄性疾患で、ALD蛋白が病因蛋白質であるが、極長鎖脂肪酸活性化酵素(VLACS)の障害が病態と関連していると考えられている。我々はVLACSの精製・クローニングと患者解析を通じてALDの病態生理を明らかにする目的で以下の研究を行った。(1)VLACSの精製:ラット肝ペルオキシソーム画分よりVLACSを精製し、分子量約235kDa,サブユニット分子量約70kDa、極長鎖脂肪酸に活性を有し既知の長鎖脂肪酸活性化酵素と異なることを明らかにした。(2)ラットVLACS cDNAのクローニング:全長2972bpで620アミノ酸をコードし、推定分子量70692で、精製酵素と一致した。mRNAは約3kbで、主に肝臓と腎臓で発現し、ペルオキシソームとミクロソーム局在と考えられた。COS-1細胞で約50倍の活性上昇を認めた。Fatty acid transportproteinと相同性を有していた。(3)ヒトVLACS cDNAのクローニングと遺伝子座位:ヒトVLACS cDNAはラットと同じく620アミノ酸をコードしていた。ヒトVLACS遺伝子座位はFISH法により15q21.2と決定された。(4)ヒトVLACSの抗体作成:ラットVLACSの抗体がヒトVLACSと反応不良のため、ヒトcDNAよりヒトVLACSを大腸菌内で大量発現させ、カラム精製した。現在ウサギに免疫中である。(5)ヒトVLACSの発現:ヒトVLACS cDNAを線維芽細胞内で発現させるため、発現ベクターに組み込み、現在トランスフェクション実験を行っている。(6)ALD遺伝子変異解析:2例のALD患者の変異部位とALD蛋白の不安定性に関連があることを報告した。(7)ALD保因者診断法、マススクリーニング法の開発について報告した。
クローン性造血障害における残存正常幹細胞の分離・増幅

X染色体上のphosphoglycerate transferase (PGK)あるいはhuman androgen receptor (HUMARA)遺伝子がヘテロ接合体の女性の骨髄異形成症候群(MDS)患者より採取した骨髄細胞からFicoll-Paque比重遠沈法で単核細胞を分画し、次いで抗CD34単クローン抗体処理ビーズ法でCD34陽性細胞を調整してGM-CSF、EPO、SCFなどの造血因子存在下にメチルセルロース培養を行なって各種造血コロニー形成を行なった。14日間の培養で形成された個々の造血コロニーを倒立顕微鏡下でつまみ上げ、DNAを抽出した。得られたDNAを2等分して一方はメチル化感受性制限酵素HpaIIあるいはHhaIで消化し、残りは未消化対照として各々をPCR法を用いてPGKあるいはHUMARA遺伝子の増幅を行なった。5例のMDS患者のうち4例で骨髄造血前駆細胞は多クローン性の構成を示し、父方と母方由来のコロニーの出現頻度は赤芽球系と顆粒球系で近似していた。このことは末梢血が単クローン性を示すMDSでも骨髄には非クローン性の正常造血幹細胞が存在することを示す成績であると考えられ、クローン解析を応用することによって患者骨髄から正常幹細胞が分離可能であることの理論的根拠を得た。本年度における研究はHUMARA遺伝子を用いた造血前駆動細胞のクローン性解析と造血コロニー構成細胞の特殊染色およびFISH法による病的前駆細胞の同定を行い、正常造血前駆動細胞の分離・増幅の可能性を明らかにすることにある。HUMARA遺伝子のCAG繰り返し配列VNTRがヘテロ接合体にある女性MDS患者より骨髄細胞を採取し、単核細胞分画を得た後、イムノビーズ法によってCD34陽性細胞を得た。当該細胞はGM-CSF,EPO,SCF存在下にメチルセルロース培養を行い、形成された造血コロニーをつり上げてDNAを抽出した。DNAを二分し、一方をメチル化感受性制限酵素Hha1で消化し、他方は未消化の状態でPCR法によるHUMARA遺伝子の増幅を行い、電気泳動して消化DNAのPCR産物におけるバンドパターンからクロナリティを判定した。その結果、MDSの多くの症例で優勢の病的クローンとは異なるバンドパターンを示すコロニーが存在することが明らかになり、鉄芽球性貧血においては環状鉄芽球すべて病的クローンに所属することを明らかにした。
エイズ制圧に向けての基礎研究 柱1 HIVの分子遺伝学

大腸菌で産生させ精製したHIV-1のGag先駆体p55は、リコンビナントGag(308-406)-Env(512-611)キメラ蛋白や逆転写酵素と同等の反応性を有する優れた高原であった。これらを用いた高感度診断法を確立した。HIV-2のGag蛋白p26と逆転写酵素の多量生産と精製に成功した(品川)。HIV-1とHIV-2には合計5種類のアクセサリー遺伝子がある。我々の開発したシステムによる解析から、これらの遺伝子産物が効果をあらわす時期は、Vif,Vpr,Vpr,Nefが感染初期であり、Vpuが感染後期であることがわかった。また、Gag変異体の解析からGagの機能が感染初期と後期の両方に要求されることも判明した(足立)。組換えワクシニアを用いてEnvとCD4により引き起こされる細胞融合を鋭敏に検出する方法を開発した。β-ガラクトシダーゼのαとω相補を利用するものである。この方法によりサイトカラシンDの阻害効果と、融合に関与する細胞成分の存在を示した(志田)。HIV感染者の体内のHIV-のEnv遺伝子V1領域からV3領域の構造を経時的に解析した。病態の進行した症例では、V3には塩基性荷電が蓄積し、V2には新たな糖鎖付加部位の挿入が認められた。V2の糖鎖付加部位の挿入はV3の塩基性荷電が未だ増加していない症例でも認められた(塩田)。AIDS遺伝子治療に関する基礎的研究として、HIV-1増殖に必須の調節因子Revタンパク質の機能を強力に抑制するRev変異体を作製し、in vitroにおけるこの変異体の抗ウイルス作用を解析した。Rev変異体遺伝子を恒常的に導入したヒト培養細胞ではHIV-1の増殖ならびに細胞障害性が顕著に抑制された(牧、畑中)。本研究班は、HIVを分子遺伝学的に解析して、その増殖機構を明らかにし、抗HIV療法の開発を目標としている。本年度の研究実積は以下の通りである。中田は、HIVの各遺伝子を大腸菌で発現させて遺伝子産物(タンパク質)を精製し、研究用、診断用、さらにはワクチン開はを目指しているが、gag領域をプロセスされない形で発現させてp55(未プロセス産物)を精製し、そのプロセス産物であるp17,p24およびp15の4種類のタンパク質と感染者および非感染者の血清との免疫学的反応を調ベ、p55が感染者血清と特異的に最も強い反応を示すことを明らかにした。足立は、HIV-1の一段増殖系を作成してHIVの非必須遺伝子の機能を調べた。vifは感染初期のウイルス粒子の成熟を促進し、vpuは感染後期に細胞からのウイルス粒子の放出を促進することを証明した。また、両遺伝子およびvpr,vpxの作用が細胞の種類に依存して特異的に発現することも明らかにした。志田は、プロモーターを改良したワクシニア・ベクターを作成し、cat遺伝子とHIVのenv領域を組み込んで発現を調べた。各タンパク質の細胞当たりの生産量が、バキュロ・ウイルスをベクターとしたときと同レベルに上昇することを確認した。また、このenv組換え体ウイルスの感染初期に発現したEnvタンパク質が高い免疫原性を示すことも明らかにした。塩田は、HIV感染者の血清中のenvのV3領域をRNA-PCR法で増幅して、V3領域を交換した組換え体ウイルスを作成して解析した。感染初期と後期の血清中に存在したV3をもつ組換え体ウイルスの細胞宿主域を比較し、同一感染者の病状の進行に伴ったウイルスの細胞宿主域の拡大とV3領域に生じた変異との相関関係を示した。この変異の誘発機構を明らかにしようとしている。1.tat,revの多アルギニン領域の機能を探るためにそれらと結合する細胞側因子をaffinity chromatographyにより分離精製し、解析している。pro遺伝子産物の発現と阻害剤及び耐性獲得について分子遺伝学的の研究した(畑中)。2.HIVのコードする各種タンパク質の多量発現、精製、それらの生化学的、免疫学的研究を行った。HIV-1のEnvタンパクのエピトープを解析し、感染者血清と100%反応するエピトープをGag-Envキメラタンパクとして大腸菌で多量産生させて精製する方法を確立した。更に宮崎医大・石川教授らに協力して、組換え体HIVタンパクを抗原として尿中の抗体を検出できる診断法を開発した(品川)。3.HIV-1のgag遺伝子に関するin-frame変異株を20種作製し、その増殖能を調べた。感染サイクルの後期に欠損があるものばかりでなく初期に異常があるものが見出された。しかもこの異常は標的細胞の種類により異なっていた。これらの結果はHIV-1のGag蛋白が感染初期に細胞因子とともに重要な役割を持つことを示している(足立)。4.1)我々が改良した組換えワクシニアによりEnvを生産し、5mg/10^9cellの精製Envを得た。2)HIVの誘導する細胞融合は、CD4^+細胞のマイクロフィラメントが必要であり、又、カゼインキナーゼの役割を示唆した。3)翻訳開始因子eIF5AがRevとRexのコファクターであり、又、標的RNA存在下でRexと結合する因子の存在を示唆した(志田)。5.HIV感染者一名の体内のHIVのenv遺伝子のV3領域を、PCR法で増幅して構造解析を行ったところ、時間の経過とともにV3領域の25番目のアミノ酸にアスパラギン酸からリジンへの変化が生じていた。

V3領域を組換えた組換えウイルスを作製したところ、この変化によりHIVの細胞宿主域が拡大するとともに、V3領域の抗原構造も変化することが明かになった(塩田)。大腸菌で産生させ精製したHIV-1のGag先駆体p55は、リコンビナントGag(308-406)-Env(512-611)キメラ蛋白や逆転写酵素と同等の反応性を有する優れた高原であった。これらを用いた高感度診断法を確立した。HIV-2のGag蛋白p26と逆転写酵素の多量生産と精製に成功した(品川)。HIV-1とHIV-2には合計5種類のアクセサリー遺伝子がある。我々の開発したシステムによる解析から、これらの遺伝子産物が効果をあらわす時期は、Vif,Vpr,Vpr,Nefが感染初期であり、Vpuが感染後期であることがわかった。また、Gag変異体の解析からGagの機能が感染初期と後期の両方に要求されることも判明した(足立)。組換えワクシニアを用いてEnvとCD4により引き起こされる細胞融合を鋭敏に検出する方法を開発した。β-ガラクトシダーゼのαとω相補を利用するものである。この方法によりサイトカラシンDの阻害効果と、融合に関与する細胞成分の存在を示した(志田)。HIV感染者の体内のHIV-のEnv遺伝子V1領域からV3領域の構造を経時的に解析した。病態の進行した症例では、V3には塩基性荷電が蓄積し、V2には新たな糖鎖付加部位の挿入が認められた。V2の糖鎖付加部位の挿入はV3の塩基性荷電が未だ増加していない症例でも認められた(塩田)。AIDS遺伝子治療に関する基礎的研究として、HIV-1増殖に必須の調節因子Revタンパク質の機能を強力に抑制するRev変異体を作製し、in vitroにおけるこの変異体の抗ウイルス作用を解析した。Rev変異体遺伝子を恒常的に導入したヒト培養細胞ではHIV-1の増殖ならびに細胞障害性が顕著に抑制された(牧、畑中)。
硬骨魚の光感受性色素胞における光受容分子と共役Gタンパク質の解析

ナイルティラピア赤色素胞では400・600nmの波長光で色素顆粒凝集が、500nm光で拡散が誘起されるが、光を受容する視物質として、網膜視細胞にあるのと同じ錐体赤、錐体緑、錐体青のmRNAが発現していた。ネオンテトラの虹色素胞は500nm付近の光に対して最もよく反応するが、虹色素胞に発現する遺伝子は3種で、1種はロドプシン、Pi-RH1、他の2種はblind Mexican cavefishの特異な錐体緑(g101・g103)と高い相同性を示すPi-green1、Pi-green-2であった。他の魚種の錐体緑がRH2(ロドプシンに近い錐体視物質)に属するのに対して、g101、g103、Pi-green1、Pi-green-2はヒトの緑と同様、錐体赤のグループに属する視物質であり、ネオンテトラの緑視物質は分子進化的に極めて興味深いものであることがわかった。Pi-green1、Pi-green-2は目にも発現している。目に存在する錐体赤は、虹色素胞には発現していなかった。緑オプシンに対する抗体を用いて、ネオンテトラ皮膚におけるオプシンの発現を免疫組織化学的に調べたところ、真皮に存在する虹色素胞層にのみ発現が認められた。ロドプシン抗体でも弱いシグナルが虹色素胞層に認められた。光感受性虹色素胞を多く含む皮膚部位からタンパク質を抽出、オプシン抗体を用いてwestern blottingを行い、オプシンの存在を確認した。細胞内情報伝達に関係する各種酵素の阻害剤や活性剤を用いて検討した結果、光感受性色素胞での光情報伝達に関与するのはcAMPであり、その減少が光に対する反応を誘起していることが示された。また、細菌毒素処理によりGiαが関与することが示唆された。遺伝子レベルでも、色素胞におけるGiのmRNA発現が確認されたが、完全なGtの発現は認められなかった。1.PCRにより、ナイルティラピア赤色素胞の存在する皮膚に、目と同じ錐体赤、錐体緑のオプシンmRNAが発現していることがわかった。これらのオプシンは各々、600nm光での色素顆粒凝集と500nm光での拡散に関与するものと推測される。また、ネオンテトラ虹色素胞の光感受性について細胞レベルで検討した結果、500nm付近の光が最も効果的に、反射波長光を長波長側にシフトさせることが明らかとなった。ネオンテトラの視物質についてはこれまで全く情報がなかったので、まず目に発現するオプシン遺伝子を調べ、ロドプシン、錐体緑(2タイプ存在)、錐体赤の遺伝子の塩基配列を決めた。虹色素胞の存在する皮膚でも、錐体緑とロドプシン遺伝子が発現することがわかり、特に錐体緑の2タイプがより強く発現していることが判明した。2.決定したネオンテトラロドプシンの塩基配列に基づきモノクローナル抗体を作製した。虹色素胞における発現部位を確かめたが、発現量が少ないためか明確な結果が得られておらず、引続き検討する。また他のオプシンの抗体も作製中である。4.細胞内情報伝達に関与する酵素の阻害剤や活性剤、膜透過性のcAMPとcGMPのアナログを用いての実験により、ナイルティラピア赤色素胞、ネオンテトラ虹色素胞の両者において、サイクリックAMPの濃度増減が光誘起の反応に関わっている可能性が示唆された。また細菌毒素を用いて、ナイルティラピア赤色素胞ではGiとGsが関与し、Gtは関与しないことを示した。

5.Gタンパク質の発現を遺伝子レベルで調べたところ、ネオンテトラ虹色素胞の存在する皮膚にGtのmRNAが発現することを確認した。ナイルティラピア赤色素胞ではGtの発現は認められなかった。本年度の研究成果は以下のとおりである。1.ネオンテトラ皮膚の虹色素胞は、500mm付近の光に対して最もよく反応することは昨年度すでに報告した。虹色素胞に発現する遺伝子は3種で、1種はロドプシン、Pi-RH1であった。他の2種は、blind Mexican cavefishの特異な錐体緑(g101ならびにg103と高い相同性を示すPi-green1、Pi-green-2であった。他の魚種の錐体緑がRH2(ロドプシンに近い錐体視物質)に属するのに対して、g101、g103、Pi-green1、Pi-green-2はヒトの緑と同様、錐体赤のグループに属する視物質である。すなわち、ネオンテトラの緑視物質は分子進化的に極めて興味深いものであることがわかった。Pi-green1、Pi-green-2は目にも発現している。なお、目に存在する錐体赤は、虹色素胞には発現していなかった(zoo1.Sci.,2006)。2.錐体緑オプシンに対する抗体を用いて、ネオンテトラ皮膚におけるオプシンの発現を調べたところ、真皮に存在する虹色素胞の層にのみ発現が認められた。ロドプシン抗体では弱いシグナルが虹色素胞層に認められた。3.光感受性虹色素胞を多く含む皮膚部位からタンパク質を抽出、抗体を用いてwestern blottingを行い、バンドを認めた。オプシンの存在が示唆された。4.細胞内情報伝達に関係する各種酵素の阻害剤や活性剤を用いて検討した結果、光情報の細胞内伝達に関与するのはcAMPであり、その減少が光に対する反応を誘起していることが示された。また、明所で百日咳菌毒素により処理されたネオンテトラ虹色素胞は、暗所に戻しても光反応から回復しないことから、Giαが関与することが示唆された。5.ネオンテトラ虹色素胞のホスホジエステラーゼ(PDE)のタイプはIV型であった。この結果からも、虹色素胞での細胞内二次メッセンジャーはcAMPであることが示唆された。平成19年度の成果は以下のとおりである。1)野生型ナイルティラピアでは鰭にのみ赤色素胞があり、それらは光感受性を有し、400nmと600nm付近の光で色素顆粒の凝集が、500nm付近の光で拡散が起こることを17年度に報告した。しかし、これらの赤色素胞に発現する視物質は、目の網膜視細胞にあるのと同じ錐体赤・錐体緑のオプシンだけしか確認されていなかったので、本年度は400nm光を受容する視物質の遺伝子クローニングを行ない、目の視細胞にあるSWS-2Aと同じ視物質が赤色素胞にも発現していることを確認した。2)ナイルティラピアには劣性形質として、皮膚に黒色素胞がなく、赤色素胞のみが存在する赤色ティラピアがある。すなわち、鰭だけでなく体側部にも赤色素胞があるので、これらも光感受性を有するかを調べたところ、同じ赤色素胞でありながら、光に直接反応するものは極めて稀であった。鰭の赤色素胞は、野生型の鰭の赤色素胞と全く同様の光感受性を示した。ティラピアの繁殖期の季節には太陽光のピーク波長500nmの影響で鰭の赤色素胞の色素顆粒が拡散して、鰭の赤みが増強され、婚姻色として機能すると推察される。3)視物質の抗体を用いて赤色ティラピア赤色素胞でのオプシン発現を確認した。
個別的アミノ酸輸送担体標的治療併用によるRI治療効果向上に関する研究

頭頚部腫瘍を対象に、LAT1の発現、増殖能の指標であるKi-67標識指数(Ki-67 LI)と18^F-AMTの集積性との関係を調べた結果、18^F-AMT集積はKi-67標識指数による腫瘍細胞増殖能と相関することがわかった。一方、131I-MIBG治療の効果判定においては、治療後1週間の血液中のカテコールアミン測定が有用であること、また、治療効果におけるFDG-PET、CT、I-123MIBGシンチグラフィの効果判定における有用性の比較検討では、FDG-PETによる機能診断が最適な治療効果判定法であることが示された。現在までに、癌細胞に選択的に過剰発現されているL型の中性アミノ酸の細胞内への輸送に係わる細胞表面の担体であるLATK1(L-type amino acid transporter 1)と、アミノ酸代謝の評価を行うPET検査に使われるL-3-[fluorine-18]fluoro-alpha-methyl tyrosin(以下18F-AMTと略)の集積との相関が肺癌や頭頚部腫瘍で確認されており、18F-FAMTの癌への集積性の違いによりLAT1をターゲットにした癌治療の有効な症例を選択可能と考え研究が進められてきた。今年度は、頭頚部腫瘍を対象に、LAT1の発現、増殖能の指標であるKi-67標識指数(Ki-67 LI)と18F-AMTの腫瘍組織への集積性との関係を詳細に調べ、18F-FDG集積との比較で検討を行い、18F-AMTのKi-67LIによる腫瘍細胞増殖能との有意な相関を明らかにすることがでた。今後は、さらに、増殖能と予後との関連を解析し、増殖能の高い症例に対して、治療法変更などを行うことができるかどうかなど検討を予定している。これらの成果は2009年度の米国核医学会議にて発表している。一方、ラジオアイソトープ病棟にて行っている131I-MIBG治療に関しては、本治療に対する治療効果の早期判定が可能かに関して本年度は予備的な解析を行った。結果として、本治療一週間後に血中腫瘍マーカーであるカテコールアミンンの値を測定し、これらの値の低下が十分な症例ほど、その後の数年で行われる131I-MIBG治療の治療効果が良好であり、低下しないかむしろ上昇した症例では、治療効果がその後不十分であることが確認され、治療後1週間という早期に治療効果予測が可能であり、これにより、治療抵抗性である症例は、LAT1ターゲット治療や化学療法などとRI治療の併用による治療効果増強を試みる必要もあるものと考えられた。この結果は、2009年度、欧州核医学会議に発表している。昨年度までに、癌細胞に選択的に過剰発現されている細胞表面アミノ酸輸送担体であるLAT1(L-type amino acid transporter 1)と、アミノ酸代謝の評価を行うPET検査に使われるL-3-[fluorine-18]fluoro-alpha-methyl tyrosin(以下18F-AMTと略)の集積との相関が肺癌や頭頚部腫瘍で確認されており、18F-FAMTの癌への集積性の違いによりLAT1をターゲットにした癌治療の有効な症例を選択可能と考え研究が進められてきている。今年度は、頭頚部腫瘍を対象に、LAT1の発現、増殖能の指標であるKi-67標識指数(Ki-67 LI)と18F-AMTの腫瘍組織への集積性との関係の詳細を検討し、Annals of Nuclear Medicine誌に掲載した。また、今年度は、頭頚部腫瘍で頚部リンパ節転移が疑われ、リンパ節郭清術が行われた症例で、摘出された頚部リンパ節の病理組織学的検討とFDG-PET、FAMT-PET所見の対比に関して検討を行った。その結果、FDGよりもFAMT-PETにて、より特異性の高いリンパ節転移の診断が可能であることが示された。これらの成果は2011年度の欧州核医学会議に発表予定である。一方、ラジオアイソトープ病棟にて行っている131I-MIBG治療に関しては、本治療に対する治療効果におけるFDG-PET、CT、I-123 MIBGシンチグラフィの効果判定における有用性の比較検討を行った。CTでは効果が見られるresponder症例で大きさに有意な変化が見られず、I-123 MIBGシンチグラフィでも病変の数や集積の程度に有意な変化がなかったのに対して、FDG-PETでは、responder群で有意なSUVの集積低下が見られていた。これらの結果より、悪性褐色砂防腫のI-131 MIBG治療の効果判定w行うには、FDG-PETによる機能診断が最適な治療効果判定法であることが示された。その結果は、2010年度の北米放射線学会にて、発表を行っている。現在、雑誌へ投稿準備中である。昨年度までの研究で、癌細胞膜に選択的に過剰発現されているアミノ酸輸送

担体のLAT1(L-type amino acid transporter 1)と、アミノ酸代謝の評価を行うPET検査に使われるL-3[fluorine-18]fluoro-alpha-methyltyrosin(以下18F-AMTと略)の集積との相関は、肺癌や頭頚部腫瘍で確認さており、さらに、これらの性質を利用しての、神経内分泌腫瘍の治療が期待される。本年度は、頭頚部腫瘍で頚部リンパ節郭清術が行われた症例の摘出頚部リンパ節の病理組織学的検討とFDG-PET、EAMT-PET所見の対比に関して検討をさらに行い、FDG-PETで、疑陽性集積の見られる症例で、EAMT集積は低く転移のない頸部リンパ節の診断をEAMT-PETでより特異的に行うことが可能である事を確認できたため、その結果を2011年度欧州核医学会議で挙動演者とともに発表を行った。今後は、頸部エコーなどの所見もあわせて、頸部リンパ節転移の正確な診断法に関して検討を行う一方、FAMT-PETを用いた、より正確な、顎骨腫瘍浸潤の診断などについても検討を加えていく。一方、ラジオアイソトープ(RI)病棟で施行中の131I-MIBG治療に関しては、本治療に対する効果判定におけるFDG-PET、CT、I-123MIBGシンチグラフィの効果判定における有用性の比較検討を行い、CTやI-123MIBGシンチグラフィでは、反応群と非反応群間で大きさや集積に有意差はなかったが、FDG-PETでは両群間に有意な変化率の差が見られることが確認された。これらの結果より、悪性褐色細胞腫のI-131MIBG治療の効果判定を行うには、FDG-PETによる機能診断が最適な治療効果判定法であることが示され、その結果は、European Journal of Nuclear Medicine誌に共同演者とともに掲載した。I-131MIBG治療の効果LAT1ターゲット治療の併用による治療効果増強に関しての検討は、今後の検討課題として進めていきたい。
シングルセル解析技術を用いた腸内ファージの生態系解明

ヒト腸内に存在するファージの網羅的なリファレンスゲノムセットを作成するため、下記1-3)パイプラインを構築しゲノム配列の収集を行った。1) Genbank (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/genbank/)、IMG/VR (https://img.jgi.doe.gov/cgi-bin/vr/main.cgi)データベースから全ファージゲノムデータの収集。2) NCBIのSRAからダウンロードした先行研究のヒト腸内viromeデータ(Norman JM et al 2015, Shkoporov AN et al 2018)をアセンブリすることで、完全ファージゲノムと考えられる環状コンティグを取得。3)ヒト腸内細菌叢のメタゲノムデータをアセンブリし、得られた環状コンティグの中からDeepVirFinder、VirSorter、ファージに特異的な遺伝子(terminase, capsid and tail protein)の情報等を用いてファージゲノムを取得。1-3)のパイプラインから得られた全ゲノム配列を>95% identity, >85% alignment coverageでクラスタリングすることで、vOTUs (Viral operational units)を得た。これらのvOTUsにヒト腸内細菌叢のメタゲノムデータをマッピングすることで、1被験者当たりから検出されるvOTU数や、ヒト腸内に豊富に存在する今まで知られていなかった未知の系統を明らかにした。今後各被験者のメタデータとの関連解析を行うことで、ヒトの生理状態や疾患と関連するヒト腸内ファージが明らかになると期待される。
混合溶液の潤滑特性に関する分子シミュレーション

潤滑剤中に気体分子が溶存した場合,トライボ特性に影響を及ぼす可能性があることが指摘されているが,そのメカニズムは解明されていない.本研究では,分子シミュレーションを用いた解析を行い,せん断場における潤滑剤中の溶存気体分子の挙動について検討した.数値解析には分子動力学法を用い,2つの固体壁面とその間に配置した潤滑剤によって潤滑面をモデル化した.潤滑剤は直鎖状または環状の炭化水素とし,この中に水素,酸素,水が溶存した状態で解析を行い,以下の結果が得られた.・せん断により,溶存分子の潤滑剤中における移動および壁面への吸着が誘起される.この移動量および吸着量は,水素分子>酸素分子である.・高圧下では,相対的に溶存分子の移動量が小さい.また,潤滑剤分子の層構造と溶存分子の移動量に相関が見られる.これらは,潤滑剤の密度が溶存分子の挙動に影響を及ぼすことを示唆している.・溶存分子が壁面に吸着する位置は,壁面に吸着した潤滑剤分子の隙間である.そのため,分子間に隙間が出来やすい,変形しにくい潤滑剤分子の場合に吸着量が多い.・潤滑剤が直鎖状分子の場合,鎖長によって溶存分子の移動量が異なる傾向がみられるが,更なる検討が必要である.・潤滑剤が無極性分子の場合には水分子は潤滑剤中に偏在するが,潤滑剤が水酸基を持つ分子の場合には潤滑剤中に分散する.潤滑剤分子と水分子との間に水素結合を形成することによる.・以上の結果は,潤滑剤の分子構造が溶存分子の挙動に影響を及ぼすことを示唆している.潤滑剤中に溶存した成分の挙動について分子レベルで検討するため,分子動力学(molecular dynamics : MD)法を用いたプログラムを開発した.また,CGによる分子の可視化プログラム,計算結果のデータより速度分布,密度分布,移動量,動径分布関数などを求める解析プログラムを作成した.本年度は,潤滑膜の厚さが数nm程度である超薄膜潤滑をモデル化したMD計算を行い,高圧力条件下における潤滑面近傍での溶存分子の挙動について検討を行った.固体壁面はα鉄とし,潤滑剤は,無極性の直鎖状分子であるn-ヘキサン,n-ヘキサデカン,環状分子のシクロヘキサン,極性分子の1-ヘキサノールを設定した.また,溶存成分は,水素利用機械システム内において想定される水素,酸素,水とした.温度300K,せん断速度100m/sの条件で計算した.その結果,次のような結果を得た.1.水素分子の壁面への吸着は,酸素分子に比べて多い.2.潤滑膜内部における水素分子の移動量は,酸素分子に比べると大きい.3.上記1および2は,潤滑面の停止時に比べて,せん断時において顕著に増加する.4.潤滑剤の分子構造に起因する柔軟さが溶存分子の吸着性に影響を及ぼす.5.溶存分子が極性を持つ場合,潤滑剤の極性の有無が溶存分子の挙動に影響を及ぼす.6.潤滑膜の圧力や壁面近傍での潤滑剤分子の層構造など,潤滑剤の密度が溶存分子の挙動に影響を及ぼす.潤滑剤中に気体分子が溶存した場合,トライボ特性に影響を及ぼす可能性があることが指摘されているが,そのメカニズムは解明されていない.本研究では,分子シミュレーションを用いた解析を行い,せん断場における潤滑剤中の溶存気体分子の挙動について検討した.数値解析には分子動力学法を用い,2つの固体壁面とその間に配置した潤滑剤によって潤滑面をモデル化した.潤滑剤は直鎖状または環状の炭化水素とし,この中に水素,酸素,水が溶存した状態で解析を行い,以下の結果が得られた.・せん断により,溶存分子の潤滑剤中における移動および壁面への吸着が誘起される.この移動量および吸着量は,水素分子>酸素分子である.・高圧下では,相対的に溶存分子の移動量が小さい.また,潤滑剤分子の層構造と溶存分子の移動量に相関が見られる.これらは,潤滑剤の密度が溶存分子の挙動に影響を及ぼすことを示唆している.・溶存分子が壁面に吸着する位置は,壁面に吸着した潤滑剤分子の隙間である.そのため,分子間に隙間が出来やすい,変形しにくい潤滑剤分子の場合に吸着量が多い.・潤滑剤が直鎖状分子の場合,鎖長によって溶存分子の移動量が異なる傾向がみられるが,更なる検討が必要である.・潤滑剤が無極性分子の場合には水分子は潤滑剤中に偏在するが,潤滑剤が水酸基を持つ分子の場合には潤滑剤中に分散する.潤滑剤分子と水分子との間に水素結合を形成することによる.・以上の結果は,潤滑剤の分子構造が溶存分子の挙動に影響を及ぼすことを示唆している.
12-リポキシゲナーゼの血圧に対する病態生理学的役割の解明

12-リポキシゲナーゼ(LO)およびその代謝産物である12-ヒドロキシエイコサテトラエン酸(HETE)の血圧維持における役割、特に血管収縮物質のアンジオテンシン(Ang)IIまたはAngII産生系(アンジオテンシン変換酵素とキマーゼ)に対する関連性を明確にするため、ラットおよびハムスターの高血圧モデルを用いて高血圧発症における12-LO活性の動態を解析するとともに組織AngII産生系との関連性を明確にすることを目的として研究を行った。昨年度は、ハムスターの摘出血管を用いてAngIIによる血管収縮反応を12-HETEが直接増強することを報告し(Takai et al.Eur.J.Pharmacol.358,161-164,1998)、12-LO阻害薬ではハムスター摘出血管のAngIIによる収縮反応を抑制すること報告した(Takai et al.Prostaglandins Leukot.Essent.Fatty Acids.60,135-138,1999)。本年度はin vivoの実験を行い、生体で実際に12-HETEもしくは12-LOが高血圧に関与しているかを確認するため、自然発症高血圧ラットを用いてLO阻害薬の降圧効果を確認した(Takai et al.Jpn.J.Pharmacol.80,89-92,1999)。これらの結果は試験管内のみならず、生体内においても12-LO系およびその代謝産物である12-HETEが血圧の維持機構に重要な役割を果たしていることを示唆するものである。現在、ハムスターの腎性高血圧モデルにおける血小板の12-HETE、12-LO、そして組織AngII産生系の経時的変化を解析するとともにLO阻害薬の降圧に対する影響を検討している。12-リポキシゲナーゼ(LO)の代謝産物である12-ヒドロキシエイコサテトラエン酸(HETE)は、摘出血管においてアンジオテンシンIIによる収縮反応を増加するが、ノルエピネフリンの収縮反応には影響せず、また内皮を除去してもアンジオデンシンIIの収縮反応に対する増強作用に変化がないことを報告した(Eur.J.Pharmacol.,358:161-164:1998)。内皮の有無に関係なくアンジオテンシンIIの血管収縮反応を特異的に増強させたことより、12-HETEのアンジオテンシンII収縮反応に対する増強作用は、内皮由来の血管収縮作用を持つプロスタグランジンなどの遊離を介したものではなく、アンジオテンシンIIの収縮反応に対する直接増強作用が考えられる。現在までのところ、アンジオテンシンII受容体のシグナル伝達に12-HETEが介在している事実はないが、本研究はその可能性を示唆するものであり、極めて重要な研究である。実際、高血圧動物モデルにLO阻害物質を投与すると降圧効果が認められることは多く報告されていたが、その作用機序は不明であった。本研究は、LO阻害物質の降圧作用における作用機序の一つを初めて明確にしたものである。一方、その裏付け研究として、生薬成分の一つでジンチョウゲから抽出したダフノドリンAは、非特異的ではあるがLO阻害活性を有することから、このダフノドリンAを用いて、アンジオテンシンIIの血管収縮反応に対する効果を検討したところ、濃度依存的に収縮反応を抑制することが確認された(Prostaglandins Leukot.Esscnt.Fally Acids,in press)。また、同じく生薬成分から抽出したパナキシノールは、シクロオキシゲナーゼを阻害せず、12-LO活性を特異的に抑制することが報告されているので、このバナキシノールを用いて同様の実験を行い、特異的にアンジオテンシンIIの血管収縮反応を抑制することも確認している(現在投稿中)。摘出血管におけるこれら阻害薬のアンジオテンシンIIの収縮反応に対する抑制効果は、12-LO阻害薬が、新規機序を有する抗高血圧薬として有用である可能性を示唆するものである。