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平安・鎌倉時代の国衙機構と武士の成立に関する基礎的研究

本研究では在庁官人に関する史料の収集と分析を進め、「平安・鎌倉時代国衙関係者・在庁官人表」を完成することができた。関連して、国衙機構のしくみや全体像を知り得る史料の検討も試み、「国務条々」の読解を行った。また在庁官人と武士・国衙機構との関連を究明する材料として、武芸の1つである相撲、相撲人を出す家柄に着目し、土佐・讃岐・因幡・下野・常陸国など、従来は探求困難な地域について、新たな分析方法を呈示した。今年度に設定した課題のうち、在庁官人表の作成に関しては、業務委託による補助を得て、平安時代の分については入力を終えた。鎌倉時代に関しては史料を収集中であり、次年度にはこの作業を継続するとともに、入力の準備を進める基盤を作りつつある。次に各国在庁官人と武士め成立との関係については、九州方面に出張して、当該地域の武士生成・発展の場を実見するとともに、九州大学図書館所蔵『因幡国伊福部臣古志』の写本調査を実施した。この写本は現在一般に見ることができる唯一のもので、『古志』の全容を知るには貴重なものである。従来その前半部分に注目が集まってきたこの史料について、その後半部分に上記の課題究明に資する材料があることが判明したかうである。特に相撲人と武士の関係を探求して、武士の成立過程について新たな知見呈するという課題に関連して、『古志』の後半部分に登場する人々が在庁官人かつ相撲人を出す家柄に関係する人物であることを解明できたのは大きな成果でおる。この点については、『東洋大学人間科学総合研究所プロジェクト・日本における地域と社会集団-公共性の構造と変容-』(2010年3月)に論文「西国国衙と武士の展開-相撲人と武士、『因幡国伊福部臣古志』の検討から-」(918頁)を発表することができた。これは当該分野の研究に新たな事例と視点を加えたもの言える。また国衙機構、国務運営の全体像の解明に関連して、『朝野群載』巻22「国務条々」の善本の写真版を入手し、校訂案と略解を試み、その成果は次年度にしかるべき研究誌に掲載の予定で、成稿に努めている。なお、在地豪族と国衙機構との関係について、著書を刊行する機会があり、その中で新稿として、「地方豪族と人材養成」という論考を掲載し、郡司と国衙の関係に言及することかできた。今年度設定した課題のうち、在庁官人表の作成に関しては業務委託による補助を得て、鎌倉時代の分について入力を終えた。ノートパソコンを活用して、作業の効率化を図ることができた。昨年度の平安時代の分と合せて、概略の作業を終えたので、次年度には補足と校正を行い、報告書に在庁官人一覧表を掲載できるように作業を完成させたい。次に武士の成立に関しては、武士と相撲人、国衙機構との関係という視点から、土佐・讃岐、および下野について考察を行い、論文として公刊することができた。下野をめぐっては秀郷流藤原氏の祖であり、また武士の登場の先駆けとなった藤原秀郷について考察を行い、従来の研究で不充分であった点を掘り下げ、武士の成立過程を考究する手がかりも得ることができたと思われるので、今後そうした通時的考察の方向も探ってみたい。また受領の交替に関係する「国務条々」について昨年度の作業を論考として共著の形で公刊し、さらに藤原公任の『北山抄』巻十吏途指南の自筆本(国宝)の写真版を購入して、その読解にも着手している。これは次年度にも続く作業であるが、同様に校訂文や註解などを論考としてまとめることができばと考えている。在庁官人を統括する受領の動向や在庁官人の中央進出の契機としての受領との関係という視点も重要であることがわかり、研究の展開が期待できる。なお、史跡の巡検は今年度は行うことができなかった。やはり現地の踏査も重要であり、これは次年度の課題としたいと思う。今年度に設定した課題のうち、在庁官人表の完成に関しては、全289頁の報告書を作成し、その中に「平安/鎌倉時代国衙関係者・在庁官人表(稿)」として掲載することができた。報告書には併せて「郡司表(稿)〔第2版〕」、「諸国相撲人一覧(稿)」を掲載し、在庁官人の全国的な通覧とともに、在庁官人の出自とも関わる郡司氏族の動向、武芸の一つであり武士的人物のあり方を考える材料となる相撲人の出自と活動内容などを知る基礎的データを斯界に呈示することができたと考える。報告書は斯界の主要な研究者に配布する予定であり、広く活用されることで、当該分野の研究深化に資することが期待される。次に武士の成立や国衙機構の様相を検討するための個別事例としては、報告書に因幡国の事例を補訂して掲載した。

このため鳥取方面での現地調査・史料閲覧、また九州大学図書館所蔵の写本調査を実施し、知見の再確認・再考に努めた。その他、今年度は常陸国の相撲人と武士・国衙機構の関係について探究し、学会での報告を行った。その内容については平成24年4月末刊行予定の『白山史学』48号に掲載されることになっている。昨年度から着手した「吏途指南」自筆本の読解は未完であり、これは今後の研究課題としてさらに推進すべきものとせざるを得ない。今年度はまた、昨年度に実施できなかった史跡巡検を行い、『因幡国伊福部臣古志』に登場する伊福部臣氏の在庁名の所在地と国府や一宮との関係を現地に立って実見することができ、理解を深める上で大いに役立った。
脳内単一細胞モザイク解析法および光遺伝学による樹状突起ターゲティング機能の解明

機能的な神経回路網形成には、神経細胞の軸索と樹状突起が標的へ厳密に投射し、正しい結合相手と配線することが不可欠である。この過程において,軸索と樹状突起は種々の細胞膜分子を介して周囲の情報を認識し、下流のシグナル経路に伝達することによって、細胞骨格分子のリモデリングを行ない、正しい標的へと投射している。しかしその分子機構は完全には解明されていない。本研究では神経形態形成の分子機構を明らかにするために、ショウジョウバエ嗅覚系投射神経をモデルに用いた。投射神経の樹状突起は触角葉に存在する約50個の糸球体のうち、単一の糸球体へと投射し、軸索は高次領域へと伸長し末端において特徴的な枝分かれをもっている。遺伝学的手法を用いることによって、投射神経の形態を脳内において、単一細胞レベルで観察することが可能である。私は投射神経の形態形成に関わる分子を同定するために、候補となる遺伝子dachsousの変異体表現型解析を行った。そしてバックグラウンド変異としてチューブリン折りたたみ補因子D (Tubulin folding cofactor D (TBCD) )の変異を同定し、TBCDが投射神経の形態形成に必要であることを見出した。TBCDは5つのチューブリン折りたたみ補因子の一つであり、チューブリン二量体の形成に不可欠である。さらにTBCDと相互作用する分子として、ダウン症細胞接着分子(Dscam)を同定し、TBCDとDscamが遺伝的に相互作用することを見出した。TBCDの神経系での働きはこれまで知られておらず,この成果は国際学術雑誌Journal of Neuroscienceに掲載された。26年度が最終年度であるため、記入しない。機能的な神経回路を形成するためには、神経細胞の樹状突起と軸索がシナプス結合領域へ伸長し、正確に配線する必要がある。これまでの研究によって、多くの軸索ガイダンス分子が同定され、その分子メカニズムが明らかになってきた。しかし、樹状突起ターゲティングの分子機構はあまり知られていない。そこで本研究ではショウジョウバエ嗅覚系投射神経に遺伝学的モザイク法(MARCM法)を適応し、単一神経細胞を操作することによって樹状突起ターゲティングの分子機構の解明を目指している。投射神経にMARCM法を適用すると、野生型の単一細胞は100%の割合で1つの糸球体のみに投射した。一方、ds変異ホモ接合体投射神経では、70%という高い割合で、正しい糸球体と異所的な糸球体へターゲティングするという異常がみられた。しかしこのターゲティング異常はdsの変異によるものではなく、バックグラウンドに含まれていた他の遺伝子の変異によって引き起こされていることが明らかとなった。この原因遺伝子を遺伝学的マッピング法(SNPマッピング、欠失系統とP因子挿入系統を用いた相補性試験)によって同定した。この原因遺伝子は進化的に保存されており、細胞骨格分子である微小管の形成に不可欠であることが知られているが、樹状突起のターゲティングにどのように寄与しているかはわかっていない。今後この遺伝子の機能解析を進めることによって、微小管の形成に関わる因子がどのように樹状突起ターゲティングに関わっているか明らかにする。これまでの研究の成果を日本ショウジョウバエ研究会など複数の学会・研究会で発表している。機能的な神経回路の形成には神経細胞の軸索と樹状突起が正しく配線する必要がある。その過程において、種々の細胞膜分子とその下流のシグナル経路の情報が統合され、細胞骨格分子がリモデリングされている。これまでの研究によりアクチン骨格のリモデリングに関わるガイダンス受容体が同定されているが、微小管がどのようなガイダンス受容体やその下流のシグナルによって制御されているのかはよくわかっていない。投射神経の樹状突起は触角葉に存在する約50個の糸球体のうち、単一の糸球体へと投射している。また軸索は脳の高次領域へと伸長し末端において特徴的な枝分かれをもっている。ショウジョウバエの高度な遺伝学を用いることによって、投射神経の形態を脳内において、単一細胞レベルで観察することが可能である。そしてバックグラウンド変異としてチューブリン折りたたみ補因子D (Tubuiin folding cofactor D (TBCI)))の変異を同定し、TBCDが投射神経の形態形成に必要であることを見出した。TBCDは5つのチューブリン折りたたみ補因子の一つであり、チューブリンニ量体の形成に不可欠である。TBCD変異体投射神経では、樹状突起が一つの糸球体ではなく複数の糸球体へと投射する異常がみられた。また軸索の退縮、微小管の異常も観察された。酵母2ハイブリッド法により、TBCDと相互作用する分子として、ダウン症細胞接着分子(Dscmm)を同定し、TBCDがDscamの機能に必要であることを見出した。現在本研究の内容をまとめ、国際学術雑誌へ投稿している。

しかしその分子機構は完全には解明されていない。本研究では神経形態形成の分子機構を明らかにするために、ショウジョウバエ嗅覚系投射神経をモデルに用いた。投射神経の樹状突起は触角葉に存在する約50個の糸球体のうち、単一の糸球体へと投射し、軸索は高次領域へと伸長し末端において特徴的な枝分かれをもっている。遺伝学的手法を用いることによって、投射神経の形態を脳内において、単一細胞レベルで観察することが可能である。私は投射神経の形態形成に関わる分子を同定するために、候補となる遺伝子dachsousの変異体表現型解析を行った。そしてバックグラウンド変異としてチューブリン折りたたみ補因子D (Tubulin folding cofactor D (TBCD) )の変異を同定し、TBCDが投射神経の形態形成に必要であることを見出した。TBCDは5つのチューブリン折りたたみ補因子の一つであり、チューブリン二量体の形成に不可欠である。さらにTBCDと相互作用する分子として、ダウン症細胞接着分子(Dscam)を同定し、TBCDとDscamが遺伝的に相互作用することを見出した。TBCDの神経系での働きはこれまで知られておらず,この成果は国際学術雑誌Journal of Neuroscienceに掲載された。26年度が最終年度であるため、記入しない。樹状突起ターゲティング異常を示す変異体の原因遺伝子を計画通り同定することができた。今後その遺伝子の機能解析を行っていく。樹状突起ターゲティング異常を示す変異体の原因遺伝子を計画通り同定し、さらに原因遺伝子の機能解析を進めることができた。今後は同定した原因遺伝子が樹状突起ターゲティングにどのように寄与していくか明らかにしていく。原因遺伝子がコードしているタンパクの抗体を作成し、脳内での発現や細胞内での局在を観察する。その他の微小管の制御に関わる因子が樹状突起ターゲティングに関わっているかをノックダウン系統や変異体を用いて検証する。また酵母ツーハイブリッド法を用いて相互作用する分子を同定し、樹状突起ターゲティングへの関わりを調べる。研究計画の変更・問題点は特にない。研究計画を一部変更し、触角葉に投射している細胞(嗅覚受容体神経、投射神経、介在神経)の触角葉の発生における寄与を,遺伝学を用いてそれぞれの細胞を除去することによって検証する。また介在神経の発生過程を明らかにする予定である。
係留型連続プランクトン採集器の試作

本研究で実施した係留型連続プランクトン採集器(MCPS)の試作にあたっては、(1)構造が簡単で操作が容易であること、(2)小型であること、(3)安価であることを試作目的とした。本MCPSの主要部分は、「板枠ネット」、タイマーおよびトリガー、濾水量記録計、とそれらを収納する本体および係留系からなる。本体の主構造は、採集前の「板枠ネット」の待機部、海水通過水路部、採集後の「板枠ネット」の収納部、動作コントロール部からなる。「板枠ネット」は、縦、横14cmの塩化ビニール板(厚さ1cm)に口径10cmの穴をあけプランクトンネットを取り付けたものである。この「板枠ネット」を、待機場所から通過水路内に順次スライドさせてプランクトンを捕獲・収集し、その後、さらに保存用濃縮海水を満たした収納場所にスライドさせることにより連続採集しようとするものである。考案した4タイプのMCPSから、3タイプについて基本部品を作成し、作動実験および曳航テストを繰り返した。その中の上述の1タイプについてプロトタイプを作成した。一部の「板枠ネット」が作動しないこともあったが、おおむね作動状況も良好で、浮遊魚卵および動・植物プランクトンが連続採集された。濃縮海水による保存も良好であった。本研究については、月刊「海洋科学」(1994年、1月)「GLOBECのための連続採集器」、月刊「海洋科学」(1994年、4月)「ウナギ産卵場の探索のための連続採集器」に掲載、および、平成6年度日本水産学会春季大会(平成6年4月2-4日於東京水産大学)において「係留型連続プランクトン採集器の試作」および「浮遊卵・仔魚の海洋前線集積と沿岸域への移入に関する研究」として発表した。本研究では、構造が簡単で操作が容易であること、小型であること、安価である係留型連続プランクトン採集器(MCPS)を試作目的とした。「板枠ネット」の装着、作動状況も良好で、曳航テストでは、浮遊魚卵および動・植物プランクトンが連続採集された。本研究の結果については、月刊「海洋科学」(1994年、1月)「GLOBECのための連続採集器」、月刊「海洋科学」(1994年、4月)「ウナギ産卵場の探索のための連続採集器」に掲載、および、平成6年度日本水産学会春季大会(平成6年4月2-4日於東京水産大学)において「係留型連続プランクトン採集器の試作」および「浮遊卵・仔魚の海洋前線集積と沿岸域への移入に関する研究」として発表の予定である。

本体の主構造は、採集前の「板枠ネット」の待機部、海水通過水路部、採集後の「板枠ネット」の収納部、動作コントロール部からなる。「板枠ネット」は、縦、横14cmの塩化ビニール板(厚さ1cm)に口径10cmの穴をあけプランクトンネットを取り付けたものである。この「板枠ネット」を、待機場所から通過水路内に順次スライドさせてプランクトンを捕獲・収集し、その後、さらに保存用濃縮海水を満たした収納場所にスライドさせることにより連続採集しようとするものである。考案した4タイプのMCPSから、3タイプについて基本部品を作成し、作動実験および曳航テストを繰り返した。その中の上述の1タイプについてプロトタイプを作成した。「板枠ネット」の装着、作動状況も良好で、曳航テストでは、浮遊魚卵および動・植物プランクトンが連続採集された。濃縮海水による保存も良好であった。本研究の結果については、月刊「海洋科学」(1994年、1月)「GLOBECのための連続採集器」、月刊「海洋科学」(1994年、4月)「ウナギ産卵場の探索のための連続採集器」に掲載、および、平成6年度日本水産学会春季大会(平成6年4月2-4日於東京水産大学)において「係留型連続プランクトン採集器の試作」および「浮遊卵・仔魚の海洋前線集積と沿岸域への移入に関する研究」として発表した。
神経再生医療に応用可能なエンド型コンドロイチン硫酸加水分解酵素の同定

ヒトヒアルロニダーゼ4(HYAL4)がコンドロイチン硫酸(CS)に特異的なエンド型加水分解酵素であることを初めて報告した。マウスのオーソログ(mHyal4)もCS特異的分解酵素であったが、より広い特異性を持っていた。両酵素の様-なキメラ体、変異体を作製し、基質特異性の違いを決定するアミノ酸を同定した。神経再生医療に応用するために、活性を保持した酵素の酵母での大量発現系を構築した。脊髄損傷モデルラットから損傷部位を摘出し、その部分のCS分析とmHyal4での消化実験を行った。ヒトの生体内でのコンドロイチン硫酸(CS)の代謝に関与するエンド型の分解酵素を同定し、CSの代謝機構およびその調節機構を解明しようとしている。本年度は以下の研究を行った。1.ヒトヒアルロニダーゼHYAL4に関する実験:ヒトHYAL4遺伝子のクローニングを行い、発現ベクターにHYAL4遺伝子を組み込み、タグとの融合タンパク質として組換え体タンパク質を得た。アフィニティークロマトグラフィーを利用して組換えタンパク質を精製し、蛍光標識した基質あるいは標識していない基質に作用させた。酵素反応物のゲルろ過クロマトグラフィーあるいは陰イオン交換クロマトグラフィーによる分析から、CSが分解を受けたことを確認した。温度、pHなどの条件を変化させて消化反応を行ない、反応の至適条件を決定した。種々のCSバリアントを用いて反応を行い、詳細な基質特異性を検討した。また、ミカエリス定数Kmと最大反応速度Vmaxを求め、各基質間での親和性を定量的に比べた。さらに、酵素消化による分解産物の構造を質量分析の手法などを用いて決定した。その結果、HYAL4が特定の高硫酸化CS構造を特異的に認識することを明らかにし、CSに特異的なエンド型加水分解酵素を世界で初めて報告した。2、その他の実験:多様な構造をもったCSを得るため、種々の生物由来のCSの構造およびその生物活性を調べた。今年度は特に、イカ肝臓外皮、アフリカツメガエル、エイ軟骨のCSについて解析し、その成果を論文として公表した。また、新規の抗CS抗体も作製した。これら新規のCSや抗CS抗体は、今後のCSの解析に有効活用できると期待される。さらに、膵臓のランゲルハンス島のグリコサミノグリカンの解析も行い、ランゲルハンス島にはCSが殆ど存在しないことを初めて明らかにした。生体内でのコンドロイチン硫酸(CS)の代謝に関与するエンド型の分解酵素を同定し、CSの代謝機構およびその調節機構を解明しようとしている。また、その酵素を神経再生医療に応用しようとしている。1.マウスヒアルロニダーゼ-4(mHyal4)に関する実験:ヒアルロニダーゼ-4の機能研究を行うにあたり、マウスをモデル系として使用するため、mHyal4の解析を行なった。mHyal4遺伝子のクローニングを行い、発現ベクターに遺伝子を組み込み、タグとの融合タンパク質として組換え体タンパク質を得た。組換えタンパク質を、各種グリコサミノグリカン基質に作用させ、酵素反応物をゲルろ過あるいは陰イオン交換クロマトグラフィーによって分析し、CSを特異的に分解したことを確認した。種々のCSバリアントを用いて、詳細な基質特異性を検討した。また、ミカエリス定数Kmと最大反応速度Vmaxを求め、各基質問での親和性を定量的に比較した。さらに、分解産物の構造を質量分析の手法などを用いて決定した。その結果、mHyal4が、ヒトのヒアルロニダーゼ-4よりも広い基質特異性を持つことを明らかにした。さらに、mHyal4のmRNAの発現部位を解析し、精巣など極めて限局された部位にしか発現していないことを解明した。2、ヒトヒアルロニダーゼ-4に関する実験:ヒトヒアルロニダーゼ-4を脊髄損傷の治療など神経再生医療に応用するためには、大量の酵素が必要である。そこで、活性を保持した酵素の酵母での大量発現系の構築を行なった。3、その他の実験:多様な構造をもったCSを得るため、種々の生物由来のCSの構造およびその生物活性を調べた。今年度は特に、エイ軟骨のCSについて解析し、また、新規の抗CS抗体も作製した。これらの成果は、論文として公表された。1.ヒアルロニダーゼ-4に関する実験:ヒトヒアルロニダーゼ-4とマウスヒアルロニダーゼ-4は、若干基質特異性が異なることを見出した。

その認識の違いを決定するアミノ酸を同定するため、様々なキメラ酵素、変異体酵素を作製し、それぞれの特異性を解析した。その結果、N-アセチルガラクトサミン残基の4位の硫酸基の認識に必須のアミノ酸残基を決定することができた。この成果については、現在論文投稿中である。2.酵母を用いたヒアルロニダーゼ4の大量発現系の構築:ヒトヒアルロニダーゼ-4よりも比活性の高いマウスヒアルロニダーゼ-4を脊髄損傷の治療など神経再生医療に応用するために、活性を保持した酵素の酵母での大量発現系の構築を行なった。その結果、活性のある酵素が大量に得られた。また、それらの酵素はヒトの培養細胞で産生された酵素と同様の基質特異性を持っていた。3.ヒアルロニダーゼ4による神経軸索の再生実験:北海道大学医学部脳神経外科の黒田敏博士らの作製した脊髄損傷モデルラットから、損傷部位を摘出し、その部分のCSの分析とヒアルロニダーゼ4を用いた消化実験を行った。損傷部位でCS量が増加していること、そのCSをヒアルロニダーゼ4で分解できることを確認した。4.その他の実験:多様な構造をもったグリコサミノグリカン(GAG)を得るため、種々の生物由来のGAGの構造およびその生物活性を調べた。今年度は特に、エビ頭部とエイ軟骨に由来するGAGについて解析した。また、新規のCS合成酵素活性を検出した。これらの成果は、論文として公表した。
汎発性強皮症皮膚線維芽細胞のコラーゲン遺伝子転写活性及び情報伝達の研究

強皮症皮膚線維芽細胞においてコラーゲン遺伝子の発現および転写活性は正常皮膚線椎芽細胞と比較して3倍程度亢進していた。正常線維芽綿胞ではTCF-βおよびoncostatin M刺激にてコラーゲン遺伝子の発現が増強しだが、強皮症線維芽細胞では変化しなかった。TGF-βおよびoncostatin Mの刺激は、SP1/Sp3結合領域を介していることが知られているため、まずSp1とSp3の蛋白量、mRNA発現量を強皮症線維芽細胞、正常線維芽細胞間で比較したが、有意な差はなかった。さらにコラーゲン遺伝子プロモーター領域におけるSp1およびSp3のDNA結合性について強皮症線維芽細胞と正常線推芽細胞について検討したが有意な差は認められなかった。近年他の遺伝子でSp1の発現量、DNA結合性は変化せず、セリンリン酸化が転写活性を亢進させるという報告があり、強皮症線維芽細胞におけるSp1のセリンリン酸化の程度を検討した。強皮症線維芽細胞では正常線維芽細胞と比較してSp1のセリンリン酸化が亢進していた。この結果は強皮症線維芽細胞のコラーゲン遺伝子発現亢進にSp1セリンリン酸化が関与していることを示唆した。さらに強皮症線推芽細胞のコラーゲン遺伝子発現亢進に対するSp1セリンリン酸化の関与について検討するため、Sp1結合阻害剤を用いてコラーゲン遺伝子の発現を検討したところ、強皮症線維芽細胞のコラーゲン遺伝子発現亢進は著明に抑制され、Sp1の関与が強く示唆された。また強皮症線維芽細胞における情報伝達系の異常についても検討し、p38 MAPキナーゼの経路が強皮症線維芽細胞のコラーゲン発現異常に関与する可能性が示唆され、更に検討を進める予定である。発症初期の汎発性強皮症患者の前腕伸側硬化部位および正常人より皮膚生検を行い、線維芽細胞を培養した。培養線維芽細胞のサイトカイン(oncostatin M、TGF-β1)に対するコラーゲン合成能をmRNAレベルの解析としてnorthern blottingを用いて観察した。正常人皮膚由来線維芽細胞ではoncostatin M、TGF-β1刺激下でヒトα2(1)collagen遺伝子は発現が促進された。強皮症患者皮膚由来線維芽細胞では無刺激下で正常人皮膚線維芽細胞と比較してヒトα2(1)collagen遺伝子は2倍程度上昇していたが、oncostatin M、TGF-β1刺激にてコラーゲン遺伝子の発現は促進されなかった。また蛋白レベルの解析としてcollagenase assayを行ったが、oncostatin M刺激下で正常人皮膚由来線維芽細胞ではコラーゲンの発現が増強したが、強皮症患者皮膚由来線維芽細胞では、oncostatin M刺激にてコラーゲンの発現は促進されなかった。以上の結果より強皮症患者皮膚由来線維芽細胞はoncostatin Mに対するコラーゲン合成促進作用において異常を伴っていると考えられた。今後、oncostatin Mの強皮症患者皮膚由来線維芽細胞のコラーゲン遺伝子転写活性に対する影響をヒトα2(I)コラーゲン遺伝子プロモーター領域の種々のdeletion mutants。sitedirected mutantsを用いたCAT assayによって観察する予定である。
異物除去機構としての細網内皮系の復活と細胞生物学的意義づけ

昨年度の研究により、リポポリサッカライド(LPS)投与時に細網内皮系の細胞にSSeCKS(src-suppressed C kinase substrate)が特異的に発現すること、その状態において肝臓の類洞内皮とリンパ節の細網細胞による異物取り込み能が上昇することを示し、SSeCKSが細網内皮系の異物取り込み現象に関与するという結論を得た。今年度は、類洞内皮の取り込み能をクッパー細胞のそれと詳細に比較した。また、細網内皮系に属する内皮細胞には、肝類洞以外に、下垂体、牌臓、副腎などが含まれるので、こういった肝臓以外の組織における内皮の取り込み能を検証した。肝臓の類洞内皮とクッパー細胞は正常状態でも、20nm大のラテックス粒子を取り込み、LPS刺激下でその取り込み能は上昇した。両細胞は正常状態で100nmラテックス粒子をも旺盛に取り込むが、LPS刺激下ではクッパー細胞の取り込み能だけが上昇した。500nmラテックス粒子はクッパー細胞によってのみ取り込まれた。一方、ウシ血清アルブミン(BSA)とデキストランは、類洞内皮によってさかんに取り込まれるが、クッパー細胞による取り込みはわずかであった。類洞内皮によるBSAとデキストランの取り込みはLPSによって増加した。100nm粒子を用いて肝臓以外での取り込みを観察したところ、副腎髄質と心臓の内皮細胞によってのみ有意な取り込みが見られた。しかし、血管内皮ではなく、隣接するマクロファージが取り込んでいる可能性は否定できなかった。少なくとも肝類洞の内皮細胞はマクロファージに匹敵する異物(粒子)取り込み能をもち、炎症状態では取り込み能が増大するといえる。可溶性の高分子(蛋白質、糖)はクッパー細胞より内皮細胞が率先して取り込むことがわかった。こういった内皮の取り込み能は、現在のところ肝臓の内皮細胞に代表される。Aschoff(1924)が提唱した本来の細網内皮系(網内系)には、特定の臓器の血管内皮細胞、リンパ性組織の細網細胞、そしてマクロファージが含まれる。しかしながら、内皮細胞と細網細胞にはマクロファージに匹敵する貪食能が備わっていないことから、現在では網内系=マクロファージという考えが一般的である。Aschoffらが観察した内皮細胞と細網細胞による異物の取り込み像は幻であったのだろうか。我々は、先の研究で、細胞骨格の再構築に関係するSSeCKS(src-suppressed C kinase substrate)が網内系のマーカー物質になる可能性を示唆した。本研究では、網内系の復活をめざして、肝臓とリンパ節におけるSSeCKSの詳細な局在と異物取り込み能を検証した。リポポリサッカライド(LPS)投与により、SSeCKSが肝臓では類洞内皮、リンパ節では髄質の細網細胞に特異的に発現した。両細胞において、SSeCKSは細胞膜に沿って局在していた。これらSSeCKS発現細胞は正常では炭素粒子と20nmラテックスビーズを少量取り込んだだけであるが、LPS刺激下では取り込み能が著しく上昇した。このときの内皮細胞では、SSeCKSは細胞膜から離れ飲み込み小胞や空胞と密接な位置関係にあった。SSeCKSを強制発現させた内皮細胞において、SSeCKSは異物を取り込んだライソゾームに不随した局在を示したことからも、SSeCKSが外来異物の取り込みに関係していることが示唆された。一方、SSeCKSを発現しない肝臓の他の部位の血管内皮やリンパ節皮質の細網細胞は異物を取り込まなかった。肝類洞内皮とリンパ節細網細胞に代表される網内系は共通してSSeCKSを発現し、異物取り込み能を発揮するが、マクロファージとは異なる取り込み機構を有していると思われる。
関節軟骨・骨破壊病変における副甲状腺ホルモン関連ペプテドの臨床的意義に関する研究

変形性関節症24例、慢性関節リウマチ27例、健常者2例の関節液及び慢性関節リウマチ9例の血清中のPTHrPの免疫活性を検討した。血清カルシウム値は全ての症例で正常であった。PTHrPは、PTHrP(1-86)に特異的なIRMAとPTHrP(109-141)に特異的なRIAにて測定した。変形性関節症、慢性関節リウマチの関節液及び慢性関節リウマチの血清のPTHrP-(1-86)濃度はそれぞれ0.5-6.3、1.2-16pmol/l、0.5-1.5pmol/l、PTHrP-(109-141)濃度は34-689pmol/l、26-158pmol/l、37-59pmol/lであった。健常者の関節液中のPTHrPは検出感度以下であった。関節液をイオン交換体及びC-18を用いて濃縮したサンプルは骨芽細胞株ROS17/2.8の細胞内cAMP値を上昇させた。このcAMP上昇は濃度依存性であり、PTHrP-(1-34)による用量反応曲線と平行した。この活性はマウス抗ヒトPTHrP-(1-34抗体によって中和され、過量のPTHrP-(3-40)により阻害された。抗ヒトPTHrP-(1-34抗体を用いた免疫組織化学的検討では、PTHrPの免疫活性は慢性関節リウマチの滑膜における線維芽細胞の細胞質に局在していた。PTHrP cRNAを用いたinsituhybrididationは、有意の所見を得ることができなかった。以上より増殖した病的滑膜はPTHrPを発現し、関節液中に生物活性を持った形で分泌していることが確認された。関節液中に多量に分泌されたPTHrPは、変形性関節症や慢性関節リウマチにおける関節破壊の病因に重要な役割を演じているかもしれない。
機能的個体発光観察法を用いた神経活動依存的な遺伝子発現の意義の解明

本研究では、記憶・学習といった、高次情報処理課題遂行時の神経活動依存的な遺伝子発現の可視化を目指すものである。その目的遂行のために、神経活動依存的に転写調節される、最初期遺伝子の一つであるArc遺伝子のプロモーター領域を利用し、発光を呈する酵素であるルシフェラーゼを付加したトランスジェニックマウスを作成し、発光観察系の開発と高次情報処理課題の設定を行うものである。平成24年度までに同じ個体を繰り返し観察できることを特徴とした、侵襲性の低い定量的な個体発光観察法を確立した。また、学習課題として、匂い弁別課題を設定し、野生型およびトランスジェニックマウスにおいて学習の成立を確認した。最終年度である今年度はこの発光観察法と匂い弁別課題を組み合わせることで学習依存的に神経活動依存的な遺伝子発現が変化する部位の検出を目指した。具体的には、匂い弁別課題と発光観察法の組み合わせフロトコールの確立を行った。課題訓練前後において匂い刺激を提示した際の発光観察を行い、匂いの提示順や発光観察を行うタイミング等を検討した。また,同一個体での学習課題の訓練前後における発光観察の結果から、学習依存的な新規遺伝子発現の変化部位を同定する解析方法を画像ベースで確立し、これより、訓練の時間経過に対して訓練前に比べて、同じ匂い刺激を受けた場合でも遺伝子発現が変化している大脳皮質部位を検出することに成功した。本研究によって、初めて神経活動依存的な遺伝子発現の変化を時空間的に可視化する新しい観察系を確立し、学習依存的な遺伝子発現の変化部位を同定できることを示した。この新しい観察系を用いることで、動的な変化を観察することが困難であった、神経活動依存的な遺伝子発現をリアルタイムに観察し、主要変化部位に介入することを可能にし、記憶形成における神経活動依存的な遺伝子発現の時空間制御過程に迫る可能性を示した。平成25年度が最終年度である。本研究を遂行するにあたり、課題遂行時の発光を観察できるような高感度発光観察系の確立が必須であった。使用するカメラや顕微鏡の選択、及び安定的な発光シグナルの検出を可能にするための基質ルシフェリンの投与方法と画像の解析方法の検討の結果、今までに例のなかった、十数時間オーダーでの持続発光観察に成功している。また、課題遂行時に近い、生理的な情報入力における神経活動依存的な遺伝子発現の検出として、視覚刺激に対する視覚野での応答を検出することに成功した。また、本研究で用いる高次情報処理課題のモデルとして、匂い-報酬連合学習課題を設定し、野生型マウスを用いて、匂いや報酬の種類および提示時間、成績評価基準等の条件を確立し、複数個体において強固な学習の成立を確認した。また、トランスジェニックマウスにおいても同様の課題を行わせ、野生型マウスの結果との比較から同様に学習が成立することを確認した。さらに、外的に神経活動や遺伝子発現を時空間的に制御するため、脳内への薬剤およびウイルスのインジェクションを検討しており、脳内投与の手技の習得に向けた予備実験を行っているところである。23年度に長時間安定して発光シグナルを観察する系の開発として、顕微鏡の種類や基質ルシフェリンの投与方法等を検討し、条件を確定させたが、24年度はより定量的な長時間イメージングを可能にするべく、恒常的にルシフェラーゼを発現させるウイルスの脳への局所感染法を導入し、トランスジーン由来のルシフェラーゼ発光シグナルとの比較による定量的な計測方法を検討した。導入するウイルス系列の作成をはじめとして、局所感染の方法およびウイルス由来の発光シグナルとトランスジーン由来のシグナル強度比の検討などを行い、視覚刺激による視覚野の応答を観察している。また、本研究で用いる高次情報処理課題のモデルとして、匂いー報酬連合学習課題を設定し、野生型マウスおよびトランスジェニックマウスにおける学習の成立するトレーニング方法の検討を行っていたが、このトレーニング方法を用いて上記発光観察系と組み合わせて学習成立前後での発光観察を試みている。

最終年度である今年度はこの発光観察法と匂い弁別課題を組み合わせることで学習依存的に神経活動依存的な遺伝子発現が変化する部位の検出を目指した。具体的には、匂い弁別課題と発光観察法の組み合わせフロトコールの確立を行った。課題訓練前後において匂い刺激を提示した際の発光観察を行い、匂いの提示順や発光観察を行うタイミング等を検討した。また,同一個体での学習課題の訓練前後における発光観察の結果から、学習依存的な新規遺伝子発現の変化部位を同定する解析方法を画像ベースで確立し、これより、訓練の時間経過に対して訓練前に比べて、同じ匂い刺激を受けた場合でも遺伝子発現が変化している大脳皮質部位を検出することに成功した。本研究によって、初めて神経活動依存的な遺伝子発現の変化を時空間的に可視化する新しい観察系を確立し、学習依存的な遺伝子発現の変化部位を同定できることを示した。この新しい観察系を用いることで、動的な変化を観察することが困難であった、神経活動依存的な遺伝子発現をリアルタイムに観察し、主要変化部位に介入することを可能にし、記憶形成における神経活動依存的な遺伝子発現の時空間制御過程に迫る可能性を示した。「研究実施計画」に基づいた研究計画は全て順調に進行しており、高感度発光観察系の確立とトランスジェニックマウスでの連合学習課題の成立を確認した。「研究実施計画」に基づいた研究計画は順調に進行しており、高感度発光観察系の発展・改善とトランスジェニックマウスでの連合学習課題への応用を遂行している。今後の推進方策については、確立された高感度発光観察系を用いて、連合学習課題遂行における様々なタイムポイントでの長時間発光観察を行っていく所存である。平成25年度が最終年度である。
無線メッシュネットワークのための知的システムの実装と評価

平成29年度は粒子群最適化(Particle Swarm Optimization: PSO)と呼ばれる群の性質を用いた経験・発見的な手法に基づくアルゴリズムを用いたメッシュルータ配置位置最適化システム(WMN-PSO)と焼きなまし法(Simulated Annealing: SA)や山登り法(Hill Climbing: HC)といった局所探索法を組み合わせた手法に基づいた知的ハイブリッドシステムの性能評価を主に行った。これらの知的ハイブリッドアルゴリズム(PSOHC、PSOSA)は、PSOの広域探索能力と、SAやHCといった局所探索法の持つ局所的な探索能力により、それぞれの欠点を補い合い、またそれぞれの利点を享受することが可能である。本メッシュルータ配置位置最適化システムでは、まず問題となるネットワークを設計し、そのネットワークにおけるメッシュルータの配置位置を知的ハイブリッドアルゴリズムによって最適、もしくは準最適な位置に決定する。これらの知的ハイブリッドアルゴリズムに基いたシステムによって最適化されたネットワークと、既存の単一アルゴリズムによるシステムによって最適化されたネットワークを比較し性能評価を行った。その結果、PSOとHCやSAを組み合わせた手法に基づいた知的ハイブリッドシステム(WMN-PSOHC、WMN-PSOSA)は、従来の単一アルゴリズムによる知的システム(WMN-PSO)と比較しより良い性能を有していることを明らかにした。本研究は、無線メッシュネットワークにおけるメッシュルータ配置位置最適化に対して、知的ハイブリッドアルゴリズムが有効であることを明らかにした。29年度が最終年度であるため、記入しない。平成27年度は研究目的の一つである「様々な知的アルゴリズムを利用したメッシュルータ配置システムの実装と性能評価」のために、粒子群最適化(Particle Swarm Optimization: PSO)と呼ばれる経験・発見的な手法に基づくアルゴリズムを用いたルータ配置位置最適化システム(WMN-PSO)を実装し、WMN-PSOのパラメータチューニングを行った。次世代の無線ネットワークの中で、無線メッシュネットワークは高い頑健性と耐障害性を持たせることが比較的容易なネットワークである。メッシュルータ同士を無線接続する際、メッシュトポロジを形成することにより、あるルータに障害が発生したとしても、迂回経路を自律的に再構築できる。しかし、メッシュルータの配置位置はネットワーク全体の接続性に影響を及ぼすため、メッシュルータの配置位置の決定は重要である。メッシュルータの配置位置の決定は施設配置問題となり、計算複雑性理論の観点からNP-困難と呼ばれる難しい問題である。PSOとは群れのふるまいを模したアルゴリズムであり、個々が発見的に見つけた良好な解の情報を全体が共有しつつ、一定の規則にしたがって探索を行う手法であり、NP-困難な問題に対して有効な手法の一つであることが知られている。またPSOは他の経験・発見的な手法と比べ、パラメータのチューニングが比較的簡単という特徴を有していることで知られている。PSOの先行研究を参考に4種類のメッシュルータ配置方法を実装し、先行研究をヒントに新しい配置手法も実装した。現在WMN-PSOは合計5種類のメッシュルータ配置手法を有している。平成27年度は研究目的の一つである「知的アルゴリズムを利用したメッシュルータ配置システムの実装と性能評価」を達成するために、WMN-PSOシステムを実装し、その成果を発表した。実装したWMN-PSOシステムは、まず問題となるネットワークを設計し、そのネットワークをPSOアルゴリズムによってメッシュルータの最適な配置、もしくは準最適な配置を決定する。このシステムでは、まずメッシュルータとメッシュクライアントの数を決定し、確率分布に基づいてメッシュクライアントを配置する。メッシュクライアントの配置に基づき、粒子群最適化アルゴリズムによってメッシュルータの配置を行う。メッシュルータ配置システムの性能評価を行うため、メッシュルータ同士の接続数、メッシュクライアントカバー率、計算時間の3種類のデータを収集する。「WMN-PSOシステムの実装」を達成できたため、概ね順調に研究が進んでいると感じている。平成28年度は粒子群最適化(Particle Swarm Optimization: PSO)と呼ばれる経験・発見的な手法に基づくアルゴリズムを用いたルータ配置位置最適化システム(WMN-PSO)とネットワークシミュレータであるns-3を統合したシステムの実装とその評価を行った。また、PSOと局所探索法を組み合わせたハイブリッド手法に基づいた知的ハイブリッドシステムの実装を行った。WMN-PSOとns-3を統合したシステムでは、スループットや遅延、ジッタといったネットワークの性能指標をルータ配置を最適化する際に考慮することが可能となった。また、PSOと局所探索法を組み合わせた手法に基づいた知的ハイブリッドシステムは、WMN-PSOシステムと比較し、より良い性能を有していることがわかった。

平成28年度は粒子群最適化(Particle Swarm Optimization: PSO)と呼ばれる経験・発見的な手法に基づくアルゴリズムを用いたルータ配置位置最適化システム(WMN-PSO)とネットワークシミュレータであるns-3を統合したシステムの実装とその評価を行った。WMNテストベッドに関しては、先行研究ですでに実現されていたため、その再現に留まり、新たな業績には至らなかった。しかし、ns-3を統合したシステムの実装以外にも、当初の計画にはなかったが、PSOと焼きなまし法(Simulated Annealing: SA)や山登り法(Hill Climbing: HC)といった局所探索法を組み合わせた手法に基づいた知的ハイブリッドシステムの実装を行った。WMN-PSOシステムでは、まず問題となるネットワークを設計し、そのネットワークをPSOアルゴリズムによってメッシュルータの最適な配置、もしくは準最適な配置を決定する。このWMN-PSOシステムと既存のネットワークシミュレータであるns-3を統合し、WMN-PSOによって導かれる配置位置から、ns-3によってネットワークの各種指標をシミュレートし、WMN-PSOにフィードバックする。また、PSOと局所探索法を組み合わせた手法に基づいた知的ハイブリッドシステムは、WMN-PSOシステムと比較しより良い性能を有していることを現段階で明らかにした。「WMN-PSOシステムとns-3の統合化」を達成できたため、概ね順調に研究が進んでいると感じている。平成29年度は粒子群最適化(Particle Swarm Optimization: PSO)と呼ばれる群の性質を用いた経験・発見的な手法に基づくアルゴリズムを用いたメッシュルータ配置位置最適化システム(WMN-PSO)と焼きなまし法(Simulated Annealing: SA)や山登り法(Hill Climbing: HC)といった局所探索法を組み合わせた手法に基づいた知的ハイブリッドシステムの性能評価を主に行った。これらの知的ハイブリッドアルゴリズム(PSOHC、PSOSA)は、PSOの広域探索能力と、SAやHCといった局所探索法の持つ局所的な探索能力により、それぞれの欠点を補い合い、またそれぞれの利点を享受することが可能である。本メッシュルータ配置位置最適化システムでは、まず問題となるネットワークを設計し、そのネットワークにおけるメッシュルータの配置位置を知的ハイブリッドアルゴリズムによって最適、もしくは準最適な位置に決定する。
イオン伝導ガラスへの異常原子価イオン誘起とファイバ増幅器への展開

本研究ではガラス中に通常では存在できない(異常原子価)金属イオン(金属)を誘起するために、電池反応を利用して、ガラス中のイオンの酸化還元を試みた。その結果、異常原子価を発生することはできなかったが、リン酸鉄系ガラスで新材料を見出し、ナトリウム電池用の正極活物質として機能することを明らかにした。またスズリン酸系ガラスではナトリウムの挿入でナノすず粒子を形成し負極として機能することを明らかにした。ガラスへの電気化学的酸化還元は通常の熱処理では達成出来ない構造を誘起できることを実証した。ガラスは耐候性が良好で、賦形性に優れ、透明で散乱が極めて少なく、それらの特徴からファイバレーザなどへ展開されているが、活性イオンのサイト及び価数状態は完全に制御することが出来ていないため、特に遷移金属添加ガラスのレーザの発光効率は著しく乏しいのが現状である。非水系のリチウムイオン電池ではリチウムイオンの脱挿入に伴って遷移金属イオンの価数状態が変化する。場合によっては異常原子価状態が安定に存在することもある。本研究ではアルカリイオン伝導性ガラスへ遷移金属イオンを添加し、材料探索と異常原子価状態の誘起の可能性について検討した。研究の過程で良好なナトリウムイオン伝導性を示し、ナトリウムイオン電池の活物質として機能するリン酸鉄ナトリウム結晶化ガラスを見出した。この結晶はa軸方位に伝導チャネルを有しており、3V、91mAh/gの放電容量を示す。この結晶化ガラスを基本組成とし、各種遷移金属イオンを置換してその電気化学的特性を調査した。マンガンを置換したガラスにおいてはマンガンを添加することで4.1V近傍にMn2+からMn3+への平衡電位を確認した。但しガラス中の鉄を全置換すると放電容量は急激に低下し、電界を印加した直後に分極が起こった。またチタンを置換したガラス系ではガラス中のTi4+からTi3+への還元を確認した。この他にスズリン酸系ガラスにナトリウムを挿入することでスズイオンの還元が起こり、ナノメートルオーダーの金属微粒子を誘起することに成功した。3価のチタンや金属微粒子の分布を制御することでレーザーホスト材等の光学材料へ応用できると期待される。本研究では異常原子価状態を有する遷移金属イオンを導入した高効率新規ガラス蛍光体の創製およびガラスファイバによるレーザ発振の動作実証を目的としており、リチウムイオン電池の正極活物質と同様に電気化学的手法による異常原子価遷移金属イオンの誘起を試みている。初年度である12年度はリチウムイオン伝導ならびにナトリウムイオン伝導を示すガラス、結晶化ガラスの創製とイオン伝導性の評価を重点的に研究を進めた。その結果、新たにリチウムイオン伝導が良好なリチウム鉄ケイ酸塩ガラス、ナトリウムイオン伝導を示すリン酸鉄系ガラスを見出した。また、ゾルゲル法によるリチウムチタンケイ酸塩の薄膜化も検討した。研究の過程で当初予期していなかった新規リン酸鉄系の結晶化ガラスが見出され、13年度に重点的に実施予定のゾルゲル法ならびにスパッタ法による薄膜形成についても、一部成果が得られつつある。現状ではガラス粉末の形態での評価にとどまっているが、実際にはサブμmオーダーの膜を想定している。ゾルゲル法ならびにスパッタ法によるガラス膜を形成することで、より実用化に適した形態での異常原子価イオン誘起を計画する。詳細には(1)スパッタ法によるイオン伝導ガラス薄膜の合成、(2)グローブボックス内での電気化学的酸化、(3)発光スペクトル評価、以上の項目を遂行する。今年度未使用分にてガラス基板等の消耗品を購入し、スパッタ法によるガラス薄膜を作製する。
ゲノム編集による養殖有用系統作出の効率化に向けた技術展開研究

最近開発されたCRISPR/Cas9法は、水産増養殖の分野にも応用され始めている。本研究では、卵巣内卵母細胞にゲノム編集関連試薬を導入して、効率的にゲノム編集を行うことを目的としている。これまでの実験で分泌型ルシフェラーゼをゼブラフィッシュの筋肉に導入すると血中に分泌され、卵母細胞に取り込まれ、受精卵で検出できることがわかっている。そこで、GFPに分泌シグナル(SP)、HiBiT tag (ルシフェラーゼ断片と結合するペプチドタグ)、核移行シグナル(NLS)、ビテロジェニン受容体結合配列(Vg)、His tagを付加したベクター(CMV-SP-EGFP-NLS-Vg)を作製した。同様にCMV-SP-Cas9-NLS-Vgを作製した。CMV-SP-EGFP-NLS-Vgを雌のセブラフィッシュの筋肉にエレクトロポレーションで導入したところ、筋肉ではGFP蛍光を確認できたものの、卵巣では確認できなかった。そこで、Vgを付加し、FAM標識したペプチド(Vgペプチド)を受託合成した。さらに、無細胞合成系を用いて、GFPにVg、HiBiT tag、NLS、His tagを付加したキメラタンパク質(Vg-GFP)を合成した。VgペプチドおよびVg-GFPを雌のゼブラフィッシュに投与する実験を行った。Vgペプチド、Vg-GFPのいずれにおいても、卵巣内卵母細胞および受精卵の卵黄で蛍光が確認できた。このことから、卵母細胞にペプチドやタンパク質を導入することは可能であることがわかった。Vgペプチド、Vg-GFPは卵黄顆粒に封入されていると予想される。現在、エンドソーム破壊ペプチドなどを用いて卵黄顆粒を破壊し、Vgペプチド、Vg-GFPを細胞質に導入する方法を検討中である。筋細胞からタンパク質を分泌させて卵母細胞に導入させるために2つのベクター(CMV-SP-EGFP-NLS-Vg、CMV-SP-Cas9-NLS-Vg)を作製した。エレクトロポレーションでゼブラフィッシュの筋肉にCMV-SP-EGFP-NLS-Vgを導入したところ、GFP蛍光は筋肉でのみ観察され、卵巣では確認できなかった。また、Vgペプチドを受託合成した。Vgペプチドをゼブラフィッシュに投与したところ、卵母細胞や受精卵の卵黄でFAM蛍光を確認することができた。さらに、無細胞合成系でVg-GFPを作製した。Vg-GFPをゼブラフィッシュに投与したころ、卵母細胞や受精卵の卵黄に導入できた。ゼブラフィッシュのtyrosinase (メラニン合成酵素)を標的とする化学合成のcrRNAおよびtracrRNA、Cas9タンパクを購入した。crRNAおよびtracrRNA、Cas9タンパクの複合体(RNP)を作製した。RNPのDNAの切断活性を評価するために、ゼブラフィッシュのtyrosinaseのPCR産物を用いて、in vitro cleavage assayを行ったところ、RNPのDNA切断活性を確認できた。現在、VgペプチドとVg-GFPは受精卵に導入できているものの、卵黄に局在していて細胞質での局在は確認できていない。そこで、エンドソーム破壊ペプチドやクロロキンなどの薬剤を用いて卵黄顆粒を破壊して、VgペプチドやVg-GFPを細胞質に導入する方法を検討する。さらに、Vg-GFPのGFPの部分をCas9に置き換えたVg-Cas9を作製する。Vg-Cas9とcrRNA、tracrRNAを用いたRNP(Vg-RNP)を作製して、in vitro cleavage assayを行い、DNAの切断活性を評価する。その後、Vg-RNPと卵黄顆粒を破壊するための物質をゼブラフィッシュに投与して卵母細胞内でゲノム編集が可能か試験していく。Vg-RNPの卵母細胞への取り込みは、tracrRNAを標識しているATTO550の蛍光で判定する。また、抗Cas9抗体を用いた免疫学的手法を用いてRNPの導入の有無を判定する。さらに、Vg-RNPを導入した個体から受精卵を得てジェノタイピングを行い、変異導入の有無を判定する。

Vgペプチド、Vg-GFPは卵黄顆粒に封入されていると予想される。現在、エンドソーム破壊ペプチドなどを用いて卵黄顆粒を破壊し、Vgペプチド、Vg-GFPを細胞質に導入する方法を検討中である。筋細胞からタンパク質を分泌させて卵母細胞に導入させるために2つのベクター(CMV-SP-EGFP-NLS-Vg、CMV-SP-Cas9-NLS-Vg)を作製した。エレクトロポレーションでゼブラフィッシュの筋肉にCMV-SP-EGFP-NLS-Vgを導入したところ、GFP蛍光は筋肉でのみ観察され、卵巣では確認できなかった。また、Vgペプチドを受託合成した。Vgペプチドをゼブラフィッシュに投与したところ、卵母細胞や受精卵の卵黄でFAM蛍光を確認することができた。さらに、無細胞合成系でVg-GFPを作製した。Vg-GFPをゼブラフィッシュに投与したころ、卵母細胞や受精卵の卵黄に導入できた。ゼブラフィッシュのtyrosinase (メラニン合成酵素)を標的とする化学合成のcrRNAおよびtracrRNA、Cas9タンパクを購入した。crRNAおよびtracrRNA、Cas9タンパクの複合体(RNP)を作製した。RNPのDNAの切断活性を評価するために、ゼブラフィッシュのtyrosinaseのPCR産物を用いて、in vitro cleavage assayを行ったところ、RNPのDNA切断活性を確認できた。現在、VgペプチドとVg-GFPは受精卵に導入できているものの、卵黄に局在していて細胞質での局在は確認できていない。そこで、エンドソーム破壊ペプチドやクロロキンなどの薬剤を用いて卵黄顆粒を破壊して、VgペプチドやVg-GFPを細胞質に導入する方法を検討する。さらに、Vg-GFPのGFPの部分をCas9に置き換えたVg-Cas9を作製する。Vg-Cas9とcrRNA、tracrRNAを用いたRNP(Vg-RNP)を作製して、in vitro cleavage assayを行い、DNAの切断活性を評価する。その後、Vg-RNPと卵黄顆粒を破壊するための物質をゼブラフィッシュに投与して卵母細胞内でゲノム編集が可能か試験していく。Vg-RNPの卵母細胞への取り込みは、tracrRNAを標識しているATTO550の蛍光で判定する。また、抗Cas9抗体を用いた免疫学的手法を用いてRNPの導入の有無を判定する。さらに、Vg-RNPを導入した個体から受精卵を得てジェノタイピングを行い、変異導入の有無を判定する。