hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
ヒト毛組織における男性ホルモン作用機序の解明

以上の知見より腋毛、男性型脱毛の前頭部毛より培養した毛乳頭細胞は髭毛乳頭細胞とは異なりII型の5α-リダクターゼは有しないものと推測される。しかしながら数代の継代を経ておりII型の5α-リダクターゼの発現が抑制された可能性も考えられ現在検討中である。毛乳頭細胞の分泌する男性ホルモン依存性の毛包上皮系細胞増殖因子に関しては、in vitroで毛の発育作用が報告されているHGF,IGF等についてmRNAの発現を検討中である。ヒトの毛の発育の男性ホルモン感受性の違いを分子レベルで解析するために毛組織の上皮系、間葉系それぞれの細胞を培養し、男性ホルモンレセプター、5α-リダクターゼについて蛋白レベル、mRNAレベルで解析した。手術時に得た皮膚より手術顕微鏡下に頭髪、髭、腋毛等の外毛根鞘、毛乳頭を単離し継代数4-6代に達した細胞を実験に用いた。髭毛乳頭細胞は至適pHが5.5に認められるII型の5α-リダクターゼ活性を示したが、外毛根鞘細胞、腋毛の毛乳頭細胞はいずれもpH6-9に5α-リダクターゼ活性を示し、いわゆるI型の5α-リダクターゼを有すると考えられた。I型、II型それぞれの5α-リダクターゼのmRNAの発現をRT-PCR法で調べたところ、I型5α-リダクターゼのmRNAはすべての外毛根鞘、毛乳頭細胞に認められたが、II型の5α-リダクターゼは髭及び前頭部毛乳頭細胞で強く発現していた。男性ホルモン受容体mRNAの発現は、腋毛の毛乳頭細胞で最も強く後頭部毛乳頭細胞ではわずかに認めるのみであった。男性ホルモン受容体に対するポリクローナル抗体を用いた免疫組織染色では、いずれの部位より得た毛包においても上皮系の細胞は陽性所見を示さず男性ホルモン受容体は毛乳頭細胞に局在していた。後頭部毛乳頭細胞には男性ホルモン受容体は認められなかった。以上の知見より髭、腋毛、男性型脱毛の前頭部毛の毛乳頭細胞はいずれも男性ホルモンの標的細胞であるが、II型の5α-リダクターゼは髭、男性型脱毛など強い男性化徴候を示すために必要と考えられた。毛乳頭細胞の分泌する男性ホルモン依存性の毛包上皮系細胞増殖因子について、in vitroで毛の発育作用が報告されているFGF、HGF、IGF-I等についてmRNAの発現を検討したところ、IGF-IのmRNAの発現のみが男性ホルモンにより促進されていた。また髭毛乳頭細胞と外毛根鞘細胞の混合培養では、男性ホルモンによる外毛根鞘細胞の増殖促進はIGF-Iに対する中和抗体により抑制された。これらの結果より髭組織においてはIGF-Iが毛乳頭細胞由来の男性ホルモン依存性の毛の増殖因子の一つであることが明らかとなった。
精神障害者の社会参加効力感とその関連因子の国際比較

精神障害者社会参加効力感尺度(SESP)は27項目からなる、精神障害者の社会参加に対する自己効力感(自信)の強さを測定する尺度である。本研究では、我が国の精神障害者の社会参加自己効力感とその関連要因の実態とその特徴をより客観的に理解できるよう国際比較を行った。日本と中国のどちらにおいても年収が関連因子であり、様々な社会参加の形が認められる一方で、やはり社会に参加していくにあたり、年収あるいは就労の有無という因子は影響要因として考えていく必要があると思われた。また、日本で自尊感情や生活全般の満足度が関連因子であった。そのため、日本においては社会参加に対する自己効力感に限らず、一般性自己効力感を高めていく支援や自尊感情を高める支援が社会参加を進める上で有効である可能性が示唆された。本研究の目的は、精神障害者の社会参加自己効力感とそれに影響を及ぼしうる関連因子について国際比較によりその傾向を明らかにし、わが国の精神障害者の社会参加促進に向け、今後の精神医療保健福祉における有用な示唆を提案することである。諸外国の精神保健医療福祉事情や国際比較先行研究の精査および現地医療関係者による専門知識の提供から地域文化・地域精神保健医療福祉制度・システム、精神障害者の現状を比較検討した。その結果、地域精神保健福祉が発達しており、わが国の精神科リハビリテーションに多大な影響を与えている米国と文化的な類似性の高い中国に絞って、わが国との国際比較を行う方針とした。質問紙は社会参加に対する自信と、先行研究から示唆された影響を与えうる概念(自尊感情、ソーシャルサポート、健康度等)で研究枠組みを構成した。米国版調査用紙の作成に際して、現地の精神保健医療サービス施設を視察した。現地のケアの特徴は「対象」が重視されていることであった。すなわち、問題が何であれ、対象の抱えている問題が取り組むべき課題であり、評価や目的は対象の満足度や問題が解決することであるという立場でサービスが行われていた。このような地域保健医療サービスの現状と現地研究協力者の見解をまじえて調査用紙の内容妥当性を検討し、一部修正した。調査票で用いる既存尺度(英語版)は、尺度作成者に全て許可を得ることができた。現在はバックトランスレーション実施し、今後、協力施設開拓とパイロットスタディを実施する見通しである。中国調査に向けても、中国人の精神医療分野の専門家2名の協力のもと、中国の保健医療制度やサービスの現状を鑑みて質問紙のフェイスシート等一部修正を行い、中国版質問紙の作成に向けてバックトランスレーションを実施中である。本研究は、精神障害者の社会参加促進に向け、精神障害者の社会参加自己効力感とそれに影響を及ぼしうる関連因子について国際比較により、今後の精神医療保健福祉における有用な示唆を得ることを目的とした日・中・米比較調査研究である。2年目にあたる本年は、文化的な類似性の高い中国に絞って、わが国との国際比較を行う方針とした。研究協力の得られた中国河南省にある鄭州第8病院と精神衛生センターの医療関係者に対し、日本の精神科リハビリテーションの現状について現地セミナーを開催し、主に日中の精神障害者と保健医療福祉の現状について比較討議を行なった。その中で、日本は比して精神科リハビリテーションプログラムや社会保障が進んでおり、一方の中国は精神科リハビリテーションプログラムが少なく精神医療が中心であるため退院後の支援は家族に負うところが大きいことなどが判明した。また社会参加については日本では精神障害者を対象とした就労支援プログラムが拡大する傾向にあるが、一方の中国はそうした就労支援プログラムがなくても発症前の職場に本人の希望に応じて復帰しやすい社会状況があるなど、社会参加を推進する上での相違点が明らかになった。双方の医療関係者が精神障害者の社会参加を推進する上で役立つ情報を得ることができた。このような状況理解を深めた上で、国内の研究分担者および中国の研究協力者とともに検討を加えて日中比較分析用の中国版質問調査用紙は完成した。そして中国調査は140名の研究参加者を得てデータ収集を終えることができた。現在は分析中である。そこで最終年度に向けて残された課題は、日中の精神障害者の社会参加自己効力感とその影響する要因について統計的分析結果を明らかにすることと、米国の視察や資料に基づき得られた情報分析結果も踏まえ、国際比較研究の成果をまとめたいと思う。本研究は、精神障害者の社会参加促進に向け、精神障害者の社会参加自己効力感とそれに影響を及ぼしうる関連因子について国際比較により、精神医療保健福祉における有用な示唆を得ることを目的とした。最終年度にあたる本年は、日中の精神障害者の社会参加自己効力感とその影響する要因について統計解析し、比較検討した。日本の対象者は統合失調症が7割程度を占めている一方で、中国の対象者は統合失調症5割程度であった。

また中国の対象者は3割程度の者が常勤職に就いている一方で、日本の対象者は0.3割の者しか常勤職に就いていなかった。日本と中国の対象者の社会参加効力感尺度得点、自尊感情尺度得点、SOC得点、家族の関係に対する満足度以外の満足度は中国の対象者の得点が日本の対象者より高かった。社会参加効力感尺度得点を従属変数、社会参加効力感尺度得点と関連のみられた因子を独立変数として投入し、変数減少法で重回帰分析を行った。日本の対象者における重回帰分析の結果、重回帰式のR^2は0.82であり、有意な関連の確認された因子は、自尊感情尺度得点、生活全般の満足度、年収であった。中国の対象者における重回帰分析の結果、重回帰式のR^2は0.78であり、有意な関連の確認された因子は、宗教の有無、生活機能自立度、地域住民および自分自身への満足度、GHQ得点、年収であった。以上から、日本と中国のどちらにおいても年収が関連因子であり、様々な社会参加の形が認められる一方で、やはり社会に参加していくにあたり、年収あるいは就労の有無という因子は影響要因として考えていく必要があると思われた。また、日本で自尊感情や生活全般の満足度が関連因子であった。そのため、日本においては社会参加に対する自己効力感に限らず、一般性自己効力感を高めていく支援や自尊感情を高める支援が社会参加を進める上で有効である可能性が示唆された。本研究の目的や必要性を中国や米国の研究協力者が深く理解してくれているため、誠実な協力が得られており、視察・討議・調査の一部が順調に進んでいる。現時点でおおむね順調に進んでいるため、最終年度の研究も基本的には計画通りとする。なおいっそう、調査結果の分析・考察を進め、こうした知見に詳しい研究者の集う国際学会にて討論する機会を持つこととする。また、本研究は国際比較研究であるため、調査結果の背景を考えるにあたり、現地国の精神障害者を取り巻く生活・医療環境状況を、より正確に理解することが研究精度に関係すると考える。そのため、現地の医療関係者や研究協力者と定期的な交流や意見交換を行なう。
インドを含むアジア諸国における証券市場の発展と財務会計制度の展開

オーストラリア,マレーシア,シンガポール,中国,台湾,そして,香港の各国において資料収集を行い,さらに収集資料について分析した。マレーシアにおいては,Universiti Utara Malaysiaに滞在して,同国内での株式所有構造,配当性向についての統計資料の入手に努めた。この結果,つぎのことが判明した。第1に,マレーシアにおいては10ヵ年計画などの国家プロジェクトのもとで策定された,マレー系,インド系,中国系などの各民族を基準にする株主構成目標数値が存在しており,これが企業ガバナンスの中心であること。第2に,国家が強力な権限のもと,主な産業企業の主要株主となり,各企業を実質的にコントロールしていること。第3に,旧宗主国である英国の影響が依然強く,英国を起源とする国際会計基準をほぼ自動的に採用していること。第4に,公認会計士の資格について,英国,オーストラリア,カナダなどの英連邦構成国で取得した資格を,そのまま,マレーシア国内においても有効と認めていること。なお,これらの第3と第4については,シンガポールと香港についても妥当する。中国では,復旦大学,北京大学をはじめ多くの機関の協力を得た。中国の動向には大いに注意を要することが判明した。英米の最近の展開を速やかに導入しようとする国家戦略の下で財務会計・監査システムが構築されようとしている。会計士などの実務家の育成についても同様である。東呉大学の柯瓊鳳先生他と,金融派生商品についての共同研究を発表した。監査人選任と配当規制の2点に焦点をおきつつ,コーポレート・ガバナンス問題の視点から各対象国の会社法の比較分析についての論文をまとめている。本年度は,研究計画の初期の段階として,主に中国,香港,台湾の3カ国を中心に資料の収集とその分析の途中にある。収集した資料は,中国語の著書のみでも40冊を越えている。現状では,上記3カ国における会社法,証券取引法,公認会計士制度,証券取引所,等々の整備情況について分析の段階にある。中国(大陸)の財務会計制度が日本の1950年代初めに相当する段階にあること。中国は,米国のFinancial Accounting Standards Boardと国際会計基準委員会との双方の動向を重視しながら,その国際化に照準を合わせつつも,日本の行政指導のスタイルを導入しつつあること。また,台湾については,会計原則の設定主体が民間機関であるが,日本にほぼ近い進捗情況であること。そして,香港については英国のスタイルに類似していること。大阪証券取引所(大証)を2回訪ねて,資料収集をした。同取引所では,中国系マレーシア人である,専門家(陳玉羆氏)の指導を受けることができた。同氏を通じて,米国のNASADAQと大証とが取り組んでいる,いわゆるベンチャー・ビジネスの株式公開への取り組みについても教えていただいた。東京において,インド大使館,日印協会,その他の諸機関を訪問して,資料収集をした。インド大使館においては,一等書記官,C.Rajasekhar氏より、丁寧な説明を得ることができた。本年度は,研究計画の第二年度にあたる。シンガポール,インド,そして,ニュージーランドの三カ国について資料の収集と分析を行っている。8月末よりほぼ一週間シンガポールに滞在した。この間,創設されたAsianAcademic Accounting Associationの総会に参加した。数多くのアジア各国からの研究者達と情報交換をしつつ質問をした。また,シンガポール証券取引所やシンガポール公認会計士協会などを訪ねて,資料を求めつつ情報収集をした。シンガポール国民一人一人の勤勉性や経済意識の高レベルを実感した。シンガポールの証券市場や財務会計制度は,旧宗主国である英国のそれから自発的に離れて米国のそれに近づこうとしているように思われた。南洋工科大学のビジネス・スクールを訪ねてたが,そのレベルはすべての面において我が国を超えているように感じられた。ごく近い将来には,我が国は国際会計基準の導入過程に関してシンガポールの経験から多くを学ぶことになるであろう,と思われた。

インドについては,資料収集が極めて困難である。しかし,インドの会社法や証券法を入手できた。インドの証券市場は古い歴史を有しており,米国の連邦証券取引委員会に相当する国家機関がすでに存在していることが判明した。インドの会計原則等の財務会計制度については,不明のままである。現在は,マクロ経済情報の入手に努めている。ニュージーランドについては,会社法などの入手ができた。この国は,隣国大国のオーストラリアに吸収されることのないように留意しつつ新たなシステムの導入を考えていることが判明した。本年度は、台湾を中心に資料収集とその分析行った。平成13年11月台湾の東呉大学において開催されたコンファレンス参加を兼ねて、台北市にほぼ7日間滞在した。この間、台湾の証券取引所、店頭登録市場、証券取引委員会、財務、などの多くの機関を訪ねて、同国の証券市場と会計制度について実にたくさんの教示と提言を受けることができた。この結果、以下のことが判明した。1.経済規模全体が、日本に比して大きくはない。2.ペイ・オフ制度の導入が日本に先じていることなど、投資家の自己責任制度への認識が日本より進んでいる。3.直接金融の担い手である投資家の大部分が投資規模の小さい個人投資家であって、長期投資と情報分析能力に優れている機関投資家がほぼ皆無である。4.間接金融の主体である銀行と政府との関係が極めて強いことにより、銀行融資が健全市場での判断により必ずしも決定されているのではない。5.企業規模が全体的に小さいことや台湾固有の経済発展などが理由と思われるが、いわゆる企業における支配と所有との分離がまだ進んでいない。6.アジア諸国の経済全般について、欧米のそれに比して、クローニイ(crony)経済といわれている。台湾の場合、この説明がかなりのケースで的を射ている。7.企業情報開示について、インサーダー取引規制システムを含む証券取引制度の整備が充分ではない。8.監査人としての公認会計士の独立性については、米国に比して、厳しい訳ではない。平成14年度は,マレーシア,シンガポール,中国,台湾,そして,香港の各国において資料収集を行い,さらに収集資料について分析した。マレーシアにおいては,Universiti Utara Malaysiaに滞在して,同国内での株式所有構造,配当性向についての統計資料の入手に努めた。この結果,つぎのことが判明した。第1に,マレーシアにおいては10ヵ年計画などの国家プロジェクトのもとで策定された,マレー系,インド系,中国系などの各民族を基準にする株主構成目標数値が存在しており,これが企業ガバナンスの中心であること。第2に,国家が強力な権限のもと,主な産業企業の主要株主となり,各企業を実質的にコントロールしていること。
Ｑｕａｌｉｔｙ　ｉｍｐｒｏｖｅｍｅｎｔ　ｓｐｅｃｉａｌｉｓｔ　に関する研究

医療・看護の質を向上に関わる国内外の医療機関のQuality improvement Specialistの役割・業務を調査し、「Quality Leaderのための教育プログラム」を構築した。教育プログラムは、約6ヶ月間に、前期3日間、中期1日間、後期2日間の質指標や質改善事例に関する集合研修を行い、研究者らが受講者らに質改善計画の実行支援を通じてQuality Leaderとしての能力開発を行うこととした。受講者の多くは研修で立案した「個別性のある看護ケアの提供」、「働きやすい職場づくり」等の医療・看護の質改善計画を実施し、目標が達成できたと評価するに至った。平成24年度は、ケアの質向上を目指すQuality Improvement Specialistの教育プログラム開発のため研究会議を3回およびトヨタ流病院経営に関する研究の第一人者である真野俊樹氏による勉強会(平成25年3月2日)を開催した。研究会議は計3回開催し、参加者は主任研究者を含め3名、会議では平成23年度の日米の医療機関および日本企業における調査結果をもとに、日本版のQuality Improvement Specialist (以下QIS)がどのような役割・能力を備えることが必要かを検討した。日本版QISの教育プログラムの目的は、「医療・看護の質に関する情報等から自施設の医療・看護の質改善につなげる活動のリーダーを育成する」とした。職務として、「1.医療・看護の質指標、医療関係者、患者からの要望・意見等に関する情報を収集し、分析し、その結果を病院全体・各部署に提示する。2.情報をもとに、どのような医療・看護の質を改善するのか病院責任者、担当部署の責任者にアドバイス・協議する。3.医療・看護の質を改善するために、様々な分野・プロジェクトでの活動計画、実施、分析を主体的に進める。4.医療・看護の質を改善するために、人材育成、教育、アドバイス等を行う。」とした。また、質を改善するための活動手法としては、トヨタ流質改善手法(以下TPS)を用いる。教育日数は、全5日間とした。質改善の手法を考え、自施設の問題を明確にし、何を改善するべきなのかを前半の3日間で検討し、約半年後の2日で質改善の活動の進捗状況を共有化する教育プログラムを検討した。前半の3日間では、主に、医療・看護の質指標の概念、データ収集方法や、TPSにおける5W1H,KYT,5S,アンドン,QCサークル活動などを学習し、後半では活動状況の確認と評価を行う。Quality Leaderのための教育プログラムの効果及び課題を明確にすることを目的とした。対象は、東京都近郊の中規模病院に所属する医療安全管理者、看護管理者を対象に参加者を募った。本プログラムは、前期3日間、中期1日間、後期2日間の研修で、前期では、医療・看護の質に関する概要、質指標やトヨタ流改善計画などの講義とし、参加者らは自施設の医療・看護サービスの質改善計画立案を行った。中期はフォローアップとし、後期では、参加者が立案した自施設の質改善計画の成果発表会を行った。研究方法として本プログラムに関するアンケート調査及びグループインタビューを実施した。参加者14名は、教育プログラムを通して概ね自施設の質改善目標を達せできたと回答したが、「演習の充実」、「自施設の持参データの明確化」「分析ツールの具体的な説明」の必要性が指摘された。また、Quality Leaderとしての能力を客観的に評価する評価ツールの必要性が明らかになった。さらに、今後、教育プログラムの費用対効果をあげるためには、参加者数を増やし、集合教育と少人数教育を分けて行う等の工夫、医療機関の質改善活動のニーズ把握、Quality Leaderに必要な知識とスキルの段階別研修が必要であると考える医療・看護の質を向上に関わる国内外の医療機関のQuality improvement Specialistの役割・業務を調査し、「Quality Leaderのための教育プログラム」を構築した。米国の2つ医療機関で活動しているQuality Improvement Specialistの役割、必要な能力を明らかにした。2つの医療機関とも組織の中に質改善を行うための専門の部署が位置づけられており、そこに専従としてQuality Improvement Specialistが配属されていた。主な役割として看護の質指標(NDQI)から所属医療機関とベンチマーキングされたデータを分析すること、質改善のため各病棟等にアドバイスを行うこと等であった。必要な能力としては、職種を超えて活動するためのコミュニケーション能力,具体的な質改善の知識(シックスシグマ,TQM,リーン生産方式),データ分析手法(統計解析ソフトの操作)等が必須であることが分かった。また、質改善を行う役割を担うため"Certified Professional in Healthcare Quality"として、資格制度が整えられてきていることが分かった。さらに日本で先駆的に質改善を行っている1つ医療機関での役割を担う者の活動を調査した結果、質改善の役割を担う独立した部署(TQM部)が存在し、専従の質改善を行うための職員が配属されていた。TQM部はクリティカルパスを管理、作成支援する者、感染対策、褥瘡対策、安全管理、さらに疾病統計、予期せぬ死亡・手術を含む情報管理を行う者で構成されていた。

また、日本の2つの企業を対象に調査を実施した結果、質改善を行うための部署があり、全スタッフを巻き込んで経営理念や使命を周知徹底させながら問題改善に取り組んでいることが分かった。また、質改善を推進するキイとなる者は、経営品質協議会が主催するセミナーなどを通して教育を受けていた。また企業内で質改善を行うためにはファシリテーション能力や、コンサルティング能力が必須であることが分かった。予定通り研究会議を開催し、米国、日本の企業での調査でトヨタ流の質改善手法が有効であることが明確になり、医療機関での応用を勉強会を通して検討を行った。今後、本研究をトヨタ流の質改善の第一人者と共同しながら実施する予定である。平成23年度の予定は主に国内外において先駆的に質改善を行っている医療機関、企業にその実態を調査し、Quality improvement Specialistの役割、能力、さらに、その役割を担うための必要な教育内容を明らかにすることであった。すでに米国で2つ、国内で1つの医療機関を訪問し調査しており、予定はほぼ達成しているが、日本において先駆的な質改善に取り組んでいる医療機関がまだ存在しているため、もう1医療機関を平成24年度に訪問する予定である。さらに、企業を対象とした調査も終了しているが、米国の医療機関が日本のトヨタ方式に習い病院の理念、経営戦略をたてたうえ、質改善の手法も実施しているため、トヨタ方式をとっている企業に訪問する予定である。平成25年度は、本研究の最終年度を迎える。教育プログラムを開発しその妥当性、有効性を検証する予定である。単に研究の一環での教育プログラムとして終わるのではなく、学会の資格認定や職種を問わずに学べる研修プログラムとして広く用いられるような教育プログラムを目指す。医療機関雑誌への投稿を行い、周知し、臨床現場でのニーズを踏まえながら、随時、教育内容を修正しながら継続することを検討している。平成24年度は、先駆的に質改善の取り組みを行っている1医療機関、1企業に訪問調査し、すべての情報を整理した上、Quality improvement Specialistに必要な教育プログラムを開発する予定である。開発の際には、看護管理学を専攻した研究者、臨床の実践家、経営学者などを交え意見交換を行いながら作成する。その後、平成25年度は、実際に研修を企画し、参加医療機関を募り、研修後の活動をモニタリングし、その成果を検証する予定である。各年度の成果は、日本看護管理学会、日本医療マネジメント学会等に報告し、今後日本の医療機関で質改善を担うためのSpecialistの育成するための資料とする。平成25年度は、本研究の最終年度となっている。教育プログラムに従って試行し、その教育効果を検証する。具体的には、Quality Improvement Specialistの教育プログラムに必要な教材等の開発・作成を行うことを検討する。
糖尿病、高脂血症による骨髄幹細胞の機能障害に関する分子機序の解明と治療法の開発

自己骨髄幹細胞は心筋細胞、肝細胞など様々な細胞に分化できるといった多分化能を有し、再生治療の有力な細胞ソースである。しかし、加齢、糖尿病や高脂血症などによる骨髄幹細胞の機能低下が報告されている。このように機能が低下した自己骨髄幹細胞を用いた場合には臓器再生治療効果が損なわれると考えられるので、機能回復が必要である。骨髄幹細胞の機能低下の原因としては酸化ストレス亢進などが挙げられるが、その詳細な分子機序は不明である。そこで、本研究では、糖尿病や高脂血症下での骨髄細胞の機能障害に関する分子機序を解明し、抗酸化治療によって骨髄幹細胞の機能が回復するか否かを検討する。本年度は糖尿病、高脂血症による骨髄幹細胞の機能障害とその分子機序を明らかにすることを目的とした。糖尿病、高脂血症を有するII型糖尿病モデルマウス(C57BLKS/J Iar- +Leprdb/+Leprdb)と健常マウス(C57BLKS/J Iar-m+/+Leprdb)から、骨髄単核球細胞を採集し比較検討した。糖尿病マウスの骨髄細胞中のFlk-1^+/CD34^+細胞(内皮前駆細胞)率は、健常マウスよりも低かった(p<0.01)。また、健常マウスと比較して、糖尿病マウスの骨髄細胞では細胞内活性酸素量が高値を示し(培養3日後:p<0.01)、内皮細胞への分化能が低下していた(培養7日後:p<0.01)。さらに、1)炎症性分子、2)接着分子、3)細胞周期調節分子、4)幹細胞の維持に関与する分子に焦点をあてたマイクロアレイを用いて、CD117^+骨髄幹細胞の遺伝子発現プロファイルを比較すると、糖尿病による発現の変化が認められた。以上の結果から、糖尿病マウスの骨髄細胞では機能障害が生じており、その原因として酸化ストレスの関与が示唆された。また、その分子機序の一部が明らかとなった。
イモリの遺伝集団間の複数の分布境界での生殖隔離の実態とその成立プロセスの検討

アカハライモリのmtDNA系統のうち、いくつかの系統間には核ゲノムでも明瞭な違いが見られた。分布境界では様々な程度の交雑が生じており、中国地方の交雑帯では多くの交雑個体がみられるのに対し、中部地方の交雑帯では純系集団の中にまれに交雑個体がみられることなどが明らかになった。中国地方の2系統間には、交雑帯を介した非対称な遺伝子浸透が確認され、これにより交雑帯は徐々に西に移動しつつあるものと考えられる。一方、形態的な違いが指摘されてきた北日本集団の中の東北種族と関東種族の間、九州南西部の西日本集団と南日本集団の間では、明瞭な遺伝的差異はみられず、遺伝子頻度は緩やかに変化した。本年度のサンプリング収集は、東北地方の複数地点で行った。また、開発したマイクロサテライトマーカーを用いた多型解析を開始した。まず、ミトコンドリア(mt)DNAに基づく系統解析で明らかになったアカハライモリの4集団のうち、中国地方で分布を接する中部日本系統(集団)と西日本系統(集団)の分布境界での両者の遺伝的関係を解明するために、mtDNA、マイクロサテライト、外部形態形質をもちいて境界地域付近の個体群を調査した。その結果、3地点で、mtDNAの中部日本系統と西日本系統が同地的に見られること、2つのmtDNA系統は、両者が同地的に見られる地域を挟んで側所的に分布することが明らかになった。マイクロサテライトの解析の結果でも、この地域のアカハライモリは中部日本集団と西日本集団の2集団に区分され、mtDNAの境界と同じ地域に両者の境界が見られることが明らかになった。mtDNAの2系統が見られた3地点のうち2地点の個体は、すべて中部日本集団に含まれ、残りの1地点の多くの個体が両者の中間的特徴を示すことが明らかとなった。また、mtDNAでは西日本系統に含まれる個体からなる個体群がマイクロサテライトでは中部日本集団の特徴を示す例も2地点で見つかった。外部形態の比較の結果、中部日本集団と西日本集団は多変量解析で区分され、その区分はマイクロサテライトの結果と一致した。マイクロサテライトで中間的特徴を示した集団は、外部形態も中間的特徴を示し、両者の雑種集団であると考えられた。こうしたことから両者は境界地域で狭い交雑帯を形成していると考えられるが、全体としてどの遺伝的、形態学的指標でも両者の差は明瞭であることから、別種の関係にあると考えられた。これらの成果の一部を学術雑誌、学会発表を通して発表した。2014年度は、長野県、山梨県、新潟県、静岡県、埼玉県周辺に存在すると考えられた東日本系統と中部日本系統分布の境界地域で採集を行い、各地点平均10個体程度のサンプルが得られた。群馬県については十分に野外調査の時間が取れず、採集できなかった。こうして得られたサンプルをマイクロサテライトマーカーにより分析を進めた結果、長野県の北東部に両者の境界があることが明らかになり、複数の遺伝子座で対立遺伝子の置換が見られることも明らかになった。このことから、両者には少なくともある程度の生殖隔離が存在すると考えられる。また、現在も分析を継続中であるが、その地理的パターンはおおよそミトコンドリアDNAの境界と一致するようである。今のところ、両者の混生地域は見つかっておらず、両者が交雑帯を形成しているという括弧たる証拠は見つかっていない。ただし、予備的な形態解析やミトコンドリアDNAの解析では、両者の分布境界は直線的でなく、非常に複雑に入り組んでいることが明らかとなっており、今後更なる検討が必要である。またミトコンドリアDNAでの分析を進めた結果、伊豆半島の南部の集団は東日本系統の姉妹群となることが明らかになり、伊豆半島北部や中部に分布する中部日本系統と側所的に分布することが明らかとなった。この地域でも両者が混生する地域は見つかっていない。この地域の境界についてもマイクロサテライトマーカーを用いて核遺伝子の挙動や、生殖的な隔離の有無について調査を行っている。昨年度は、アロザイム、形態によって区分されるがミトコンドリアDNAでは明瞭に区分されない東北集団と関東集団の境界域を調査した。茨城、福島、栃木の約1週間の調査で、境界領域を含む広範な地域から15地点でサンプリングできた。現在、これらのサンプルの解析をマイクロサテライトとミトコンドリアDNAを用いてすすめている。一部地域のサンプルで解析を行ったところでは、ミトコンドリアDNAでは、先行研究で示唆されるとおり、東北集団と関東集団は区分されないことが確かめられた。マイクロサテライトでの結果は、解析中であるが、幾つかのマーカーの対立遺伝子頻度がクライン状に変わっていることが示唆された。今後、サンプル数を増やし、全体としてもそのような傾向が見られるのか確認する必要がある。また、野外調査では、関東集団と東北集団はほぼ側所的に分布しており、先行研究で示されるとおり、尾の形状など形態学的な差違は大きいこと、境界を堺にして急激に形態が変わることが確認されたが、一部の境界地域の個体の中には両者の中間的特徴を示すものもみられた。これら形態的な差違については、液浸標本を用いた詳細な調査を行う必要がある。中国地方と中部地方の境界については、ミトコンドリアDNA、マイクロサテライトともにほぼ結果が出ており、現在、交雑帯の動態を把握するための種々の解析を行っている。生殖隔離に関わる可能性のある遺伝子の変異については、共同研究者に境界呂域付近のサンプルを送り、現在解析を進めてもらっている。毎年のサンプリングで、ほぼ主要な境界領域のサンプリングを完了させることができている。

また、マイクロサテライトやミトコンドリアDNAを用いた解析についても順調に進んでいる。生殖隔離に関わる可能性のある遺伝子の変異ついては、自身で行うことが困難だったために、専門とする研究者と共同研究として進めることとなった。最終年度には、未調査の主要な分布境界である九州南部でのアカハライモリのサンプリング、関東地方の形態的2型(関東型と東北型)の遺伝的差異の調査、中国地方の交雑帯をまたいだ性フェロモンの地理的変異についての調査を進めた。本研究の研究機関全体を通じての結果として、mtDNAの主要系統間の多くには核ゲノムレベルでも分化がみられることが明らかになった。一方、分布境界では、さまざまな程度の交雑が起きていることも確認した。分布を接する2系統とそれらの交雑個体の遺伝子型頻度が一山型になる交雑個体が多く生じている交雑帯(中国地方の西に日本系統と中部日本系統の交雑帯)もあれば、遺伝子型頻度が純系2系統にそれぞれピークがあり、まれに交雑個体が見つかる交雑帯(中部地方の北日本系統と中部日本系統)も見つかった。また、中国地方の交雑帯で、交雑帯を介した遺伝子浸透を確認し、それは両方向に進むというよりも、一方向の遺伝子浸透が生じていることも明らかになった。結果として交雑帯が徐々に西に移動し、中部日本系統が分布を拡大しつつあるらしいことも推定された。一方で、古くから形態的な違いが指摘されてきた東北型と関東型の遺伝的組成の違いはマイクロサテライトでは明瞭ではなく、分布境界を挟んで、遺伝子頻度は緩やかなクライン状の変化した。これについては次世代シーケンサーを用いた解析を現在進めており、多くの核マーカーに基づく結果を得て両者の関係を明らかにする予定である。また、新たな発見として、伊豆半島南部の集団がその周辺の地域の集団とは遺伝的にずいぶん異なる集団であることも明らかになった。アカハライモリのmtDNA系統のうち、いくつかの系統間には核ゲノムでも明瞭な違いが見られた。分布境界では様々な程度の交雑が生じており、中国地方の交雑帯では多くの交雑個体がみられるのに対し、中部地方の交雑帯では純系集団の中にまれに交雑個体がみられることなどが明らかになった。中国地方の2系統間には、交雑帯を介した非対称な遺伝子浸透が確認され、これにより交雑帯は徐々に西に移動しつつあるものと考えられる。一方、形態的な違いが指摘されてきた北日本集団の中の東北種族と関東種族の間、九州南西部の西日本集団と南日本集団の間では、明瞭な遺伝的差異はみられず、遺伝子頻度は緩やかに変化した。今年度は、主要な分布境界の一つである東日本系統と中部日本系統の境界を調査し、おおよそ目標の結果を得られた。伊豆半島の2集団についての論文を公表することが出来たため、おおよその目標は達成したと考える。2016年度は最終年度であり未発表の結果を公表できるよう心がける。現在、種々の遺伝解析の手法を試行錯誤中であり、その分野に詳しい人の助言も求めて解析を進め、論文執筆、投稿までもっていきたい。また、未解析のサンプルについても順次解析を行い、アカハライモリの遺伝集団間の主要な境界領域について、集団間の遺伝的交流の有無について、調査を進めていく。
Aβ投与及び外傷性軸索損傷モデルにおける骨髄幹細胞移植:電気生理学的解析

whole-cell patch-clumpにてNMDA, AMPA, GABA, Achなどの神経伝達物質の電流解析を行うため、マウス海馬の錐体神経細胞の単離培養およびラット海馬切片の組織培養を行った。培養条件のうち、培養温度については従来より指摘されているように、34度の低温の方が特に組織培養系で生存率が良い事が確認できた。血清濃度と至適培養温度について比較検討し、血清濃度は通常より高い20%が実験に適している事が判明した。培養後一週間でβアミロイド投与の有無による神経細胞死の評価を行い、神経細胞死が誘導されることが示唆された。同様の実験系を海馬スライス培養系を用いて確立する。また、axonal stretchinjury modelをラット皮質からの神経培養を用いて行ったが、現時点で有意な結果を得るところまで解析は進んでいない。今後の追加実験が必要である。βアミロイドに関連して、体循環からの骨髄由来細胞の脳損傷部位への動員をGFP遺伝子導入マウスの骨髄細胞を5FU処置マウスの末梢血に注入しキメラマウスを作成、collagenaseを線条体に定位的に注入し脳内出血を作製し解析した。出血後day28まで脳切片中の骨髄由来細胞の出現と消退について観察した。出血後1-3日では血腫内に末梢血中のGFP(+)の白血球が観察された。免疫染色にて、血腫周辺にて一過性にvWF(+)の管腔形成に骨髄由来細胞は関与した。また、Iba-1(+)細胞の出現をday8から認めこれはday28まで続いた。一方、GEAP、Neu-Nに対しては骨髄由来細胞は陰性であった。骨髄由来細胞が神経系細胞へ分化する可能性については議論が多いが、今回の実験系では組織学的レベルで神経系細胞への分化は確認できなかった。骨髄間質細胞を用いて、電気生理学的手法により軸索損傷実験モデルにおいて神経再生機構の解析することを目的としている。Axonal stretchinjury modelを用いてβアミロイドが神経可塑性の低下に関わる影響を実証し、さらに、細胞移植による軸索の再生を定量解析するため、以下の方法を考案した。(1)βアミロイド投与による神経培養細胞の細胞死についての解析を神経細胞培養系および海馬スライス培養を使用し、組織学的に解析する。(2)Axonal stretchinjury modelに置けるβアミロイドの発現を蛋白レベルで定量する。これらの実験系において、whole-cell patch-clumpにてNMDA,AMPA,GABA,Achなどの神経伝達物質の電流解析を行うため、平成17年度では、マウス海馬の錐体神経細胞の単離培養およびラット海馬切片の組織培養の予備実験を行った。培養条件のうち、血清濃度と至適培養温度について比較検討し、血清濃度は通常より高い20%が実験に適している事が判明した。また、培養温度については従来より指摘されているように、34度の低温の方が特に組織培養系で生存率が良い事が確認できた。今後、培養後一週間でβアミロイド投与の有無による神経細胞死の評価を行い、同様の実験系を海馬スライス培養系を用いて確立する。また、axonal stretch injury modelをラット皮質からの神経培養を用いて確立する。この神経細胞に対して急性期(24時間以内)と慢性期(28日まで)それぞれにておいて、APPおよびβアミロイドの発現を解析する。
ストレス蛋白発現における活性酵素野役割

ストレス蛋白の発現制御の分子細胞生物学的解析が詳細に行われているが、個体レベルでのストレス応答機構の分子論的解析とその制御に関する研究は極めて少ない。ストレス応答には視床下部-下垂体-副腎-血管軸を介する脳-自律神経-循環制御反応系が重要な役割を果たし、これに血管や自律神経系におけるNOラジカルやO_2^-等の活性酸素種が大きく影響する。また、強度のストレスが免疫能を弱体化することが知られている。しかし、いずれもその分子論的実態は不明であった。本研究では、各種の酸化ストレス下におけるSOD、Heme Oxygenase(HO),HSP-70などの遺伝子発現動態を上記Axisにおいて動力学的解析、及び生体の主要抗酸化物質であるグルタチオンの代謝動態の解析を行い、以下の結果を得た。1)水浸拘束負荷ラットでは肝のグルタチオンが著明に減少して胃潰瘍病変が出現した。この際、胃粘膜のHSP70やHOが一過性に発現増強する現象が見られた。胃粘膜病変はグルタチオンや病巣指向性SODで改善されたが、ストレス蛋白の発現動態は影響されなかった。2)水浸拘束や低温ストレス負荷ラットでは胸腺リンパ球の著明なApoptosisが誘起されることが判明した。本現象は病巣指向性SODでは影響されず、グルタチオンやN-acetylcysteineで大きく影響された。SOD誘導体は細胞外に分布するが、上記のチオール化合物は細胞内や核内にも分布することから、上記のストレス病態を核内と細胞外の活性酸素代謝との関係でさらに解析することが重要であることが判明した。3)水深拘束ストレスや低温ストレス負荷ラットでは肝や副腎のグルタチオンが著明に減少することが判明した。現在、GSHおよび関連化合物により生体のチオール代謝を制御し、胸腺の免疫病態とストレス蛋白および活性酸素代謝酵素系の発現制御機構の関係を分子論的に解析しつつある。
316ステンレス鋼に及ぼすその場照射損傷及び温度パルスの効果の研究

核融合炉材料では、通常の繰り返し応力に加えて高エネルギ-中性子によるパルス照射が予期されるが、これは疲労環境としては全く未知のものである。本研究では、疲労過程に及ぼすその場照射の効果をより解析的に理解する目的で、[照射損傷パルスの効果]=[パルス照射の効果]ー[温度パルスの効果]と仮定し、316ステンレス鋼の溶体化処理材について、互いに比較し得る条件での高サイクル疲労試験を20MeVプロトンパルス照射(25μA/cm^2)の場合とハロゲンランプ光による温度パルス(△T【similar or equal】10K)の場合について進めた。316ステンレス鋼の溶体化処理材では疲労誘起析出が高サイクル疲労の過程で重要な役割を演じている。まず、炭素含量がそれぞれ0.08w%の316(STー1)、0.04w%の316F、0.001w%の316PSIについて非照射疲労試験を行い、疲労硬化並びに疲労寿命が炭素含量の低下とともに大きく減少することを見いだした。この結果は、疲労誘起析出物は主として炭化物であることを示唆している。[照射損傷パルス]は、炭素含量の比較的高い316(STー1)では疲労誘起析出の促進をもたらし、炭素含量を減じた316Fでは疲労試験温度により抑制あるいは促進をもたらした。これらの結果は、炭素含量の低下にともない疲労誘起析出物の大きさが小さくなり照射分散を受けやすくなると考えると基本的には説明できるが、316Fで見られた複雑な温度依存性については更に研究を進める必要がある。[温度パルス]は常に疲労硬化を抑制した。これは、転位運動の促進による疲労誘起析出物の分散に起因すると推測された。以上のことは、その場照射あるいは温度パルスは316ステンレス鋼の疲労過程に重大な影響を及ぼすことを示唆する重要な結果である。照射下疲労試験についての報告例は極めて限られており、更に研究の推進を計る必要がある。
海洋生物由来菌類の産生する抗がん剤のシーズの探索及びリード化合物の開発

新たに種々の海洋生物から分離した菌類の代謝産物を検討した。カイメンから分離した真菌より、3種の新規物質を単離し、このうちの1つについてその絶対立体構造を決定することができた。ウニより分離した真菌の代謝産物より1種の新規物質を単離し、それらの平面構造を決定した。絶対構造の検討のため、数段階の化学反応を計画し、あと一段階で本品の絶対構造が明らかとなるところまで進むことができた。これまで検討してきた細胞毒性物質産生菌について引き続き代謝物の精査を行ったところ、新たに多くの新規物質を単離した。その中には、有意な細胞増殖阻害活性を有する化合物が含まれる。種々の海洋生物を採取し、それらから分離した菌類の代謝産物についてスクリーニングし、細胞毒性物質産生菌を選出するという昨年度の研究により見出された菌類の代謝物について、活性本体およびその類縁化合物を探索することを目的とし引き続き大量培養を行った。このうちムラサキウニから分離した真菌Trichoderma harzianumより、3種の新規物質を単離し、それらの平面構造を決定した。目下、これらの絶対立体構造を検討中である。また、クロイソカイメンより分離した真菌(未同定)の代謝産物より2種の新規物質を単離し、それらの平面構造を決定した。これらは前例が稀有な構造を有している。絶対構造および詳細な活性の検討にはさらなる補充必要があり(補充は培養により可能)、今後の課題である。他の細胞毒性物質産生菌の代謝物についても単離には至ってないものの優位な活性を示す分画が認められており今後の分離・精製に期待が持てる。さらに以前からの継代培養菌においては沖縄産ラッパウニから分離した真菌Aspergillus fumigatusより1種の新規細胞毒性物質を単離した。この化合物は、前例の少ないユニークな炭素骨格を有しており、その相対立体構造をNMRをはじめ各種スペクトルの解析により確定し、論文報告した。また、海水魚ボラより分離した真菌Aspergillus fumigatus(上述とは別の菌)より本研究計画の目的の一つである構造活性相関を検討するうえで重要な化合物の追加に成功した。これらの細胞増殖阻害活性は弱いものの、絶対構造とCDスペクトルのCotton効果の間に興味深い相関を見出すことができ、今後の天然有機化合物の構造決定に有意な情報を与えることが期待できる。同じくボラより分離した真菌Chaetomium globosumから新たな類縁体を単離し、その絶対構造及び生理活性について論文で報告した。種々の海洋生物から分離した菌類の代謝産物を検討した結果、得られた細胞毒性物質産生菌について活性本体およびその類縁化合物を探索することを目的とし、引き続き大量培養を行った。クロイソカイメンから分離した真菌Trichoderma harzianumより、3種の新規物質を単離し、それらの平面構造を決定した。このうちの一つについて化学反応及びCDスペクトルを用いてその絶対立体構造を決定することができたので論文で公表した。残る二つについても同様の方法を用いてこれらの絶対立体構造を目下検討中である。ムラサキウニより分離したAlternaria属真菌の代謝産物より2種の新規物質を単離し、それらの平面構造を決定した。これらは前例が稀有な構造を有しており、絶対構造の検討のため、さらなる培養によりこれらの補充を行った。補充ができた化合物について絶対配置の決定を目的として数段階の化学反応を計画し、実施した。その結果、あと一段階で本品の絶対構造が明らかとなるところまで進むことができた。これが完了すれば多くの化合物の絶対配置決定に有用な方法になると期待できる。今後は、より微量でも実用化できるように検討していく予定である。また、このような反応成績体についても細胞毒性することによって、構造中のファーマコフォアを見出せる期待がもてる。以前からの継代培養菌においては、海水魚ボラより分離した真菌Aspergillus fumigatusより本研究計画の目的の一つである構造活性相関を検討するうえで重要な化合物の追加に成功した。これらの細胞増殖阻害活性は弱いものの、絶対構造とCDスペクトルのCotton効果の間に興味深い相関を見出すことができた。このパターンを解析したところ、新たに数種類の立体異性体が存在することが明らかとなり、今後も本菌の代謝物を検討していくこととした。大阪府泉南郡岬町沿岸において海洋生物を採取し,各々の切片もしくは内臓及びその内容物を6種類の成分の異なる寒天平板培地に塗布し、生えてきたバクテリア、放線菌及び真菌を随時同じ成分の寒天培地の入った試験管(以下スラント)に拾い、のべ約160種類の菌類を分離した。

次にこれら菌類をそれぞれ同じ成分の液体培地で37日間静置培養後、酢酸エチル-MeOH (5 : 1)で菌体ごと抽出し、得られたエキスについてP388マウスリンパ性白血病細胞及びHL-60ヒト急性骨髄性白血病細胞に対する増殖阻害活性試験を実施し、9種の菌が優位な細胞毒性物質産生菌として残った。同種の菌でも培地が異なれば生長の速度や代謝物の成分が変化し、活性に影響するため、煩雑ではあるが有用な菌の取りこぼしが少ない。次に各々の菌を採取した寒天平板培地と同じ成分で大量培養し(4週間静置培養)、今度はろ過により菌体と培養液に分離し、菌体はMeOHで冷浸、また培養ろ液は酢酸エチルで抽出し、それぞれ2種類のエキスを得た。得られた各2種類のエキスについて先と同様に細胞増殖阻害活性試験を実施し、活性の強く、さらに代謝物の収量が多いものを中心に分離・精製を行った。分離・精製にはShephadex LH-20、シリカゲル及びHPLCなどのクロマトグラフィーを用い、細胞増殖阻害活性試験の活性を指標に進めていき、活性本体の探索を行った。また、活性の弱い分画においても1H NMRスペクトルを測定することにより、構造的見地からの代謝物検出のアプローチを行った。その結果、今回ダイダイイソカイメンより分離した真菌(未同定)の代謝産物より立体化学はまだ不明であるが新規物質を1つ単離している。また数種の既知物質を単離・同定した。その他単離には至ってないものの優位な活性を示す分画が各菌の代謝物に認められており、今後の分離・精製に期待が持てる。昨年度の研究計画に基づいた研究により見出された細胞毒性物質産生菌を大量培養し、それらのうち数種の菌類の代謝産物から新規細胞毒性物質の単離し、構造を決定する当初の目的は達することができた。また、構造活性相関検討のための類縁体の単離も少しずつではある進行している。さらに、従来から継代培養を行ってきた細胞毒性物質産生菌の代謝物からは微量成分の補充に成功し、その相対立体構造を決定することができ、論文で公表した。また、別の継代培養菌については、同一平面構造を有する16種類の立体異性体における構造活性相関の検討とCDスペクトルによる絶対配置の帰属が完成しつつある。その他の継代培養菌についても新たに新規化合物を単離し、論文により続報の公表を行うことができた。初年度の目的の第一に掲げた種々の海洋動植物からの有用な細胞毒性物質産生菌の分離は、計画通り達成することができた。さらにこれらの菌を大量培養し、その代謝産物について分離・精製を進め、含有成分の検討において有意な知見を得た。これらの菌の中には、強い生理活性を産生するもの、類縁体を多く産生するものなどが認められ、さらなる有用菌の絞り込みをするための情報を得ることができた。また、従来より継代培養を行ってきた細胞毒性物質産生菌の代謝物からは微量成分の補充に成功し、それらの化学構造を決定した。さらに、生理活性を検討し、これらの結果を学会及び論文で公表した。引き続き見出した有用な菌の代謝産物について検討を行い、新規細胞毒性物質の単離及びその化学構造の決定を第一の目標とする。しかる後、得られた生理活性物質及びその類縁体の活性から活性発現に必要なコア構造を明らかにし、それらをシーズとして、新たな機能性リード化合物の開発を目指す。
脂肪細胞由来の血中アディポサイトカインを指標にした動物体脂肪の測定法の開発

アディポサイトカインとは脂肪細胞で合成され血中に分泌される蛋白質の総称である。本研究の目的は、血中に存在するアディポサイトカインによって伴侶動物と家畜の体脂肪を簡便にかつ定量的に測定する方法を確立し利用することである。特に代表的なアディポサイトカインであるレプチンに焦点を絞って、以下の研究実績を得た。1,イヌの脂肪組織から抽出したmRNAからレプチンcDNAを得て、その塩基配列を決定した。それから推定されるアミノ酸配列はマウス、ラット、ヒトと80%以上の高い相同性があった。2,上記でクローニングしたイヌレプチンcDNAをもとに、大腸菌で組換え蛋白質を得た。これをウサギに免役し特異抗体を作成して、血中レプチン測定用のELISA系を構築した。3,ビーグル犬を用いて各種の生理的条件下での血中レプチン濃度の変動を調べ、特に体脂肪量と高い正の相関があることを見いだした。また、動物病院での臨床例についても検討し、肥満度の定量的指標となることを確立した。4,ネコレプチンについても同様にcDNAクローニング、ELISA系の構築を行い、イヌと同様に血中レプチンによって肥満度を判定できることを明らかにした。5,ウシとヒツジの血中レプチン濃度を各種の生理的、病理的条件で測定し、反芻動物でのレプチン合成の調節機構が齧歯類やイヌとは大きく異なることを見いだした。アディポサイトカインとは脂肪細胞で合成され血中に分泌されるタンパク質の総称である。本研究の目的は、血中に存在するアディポサイトカインによって伴侶動物と家畜の体脂肪を簡便にかつ定量的に測定する方法を確立することである。本年度は、代表的なアディポサイトカインであるレプチンを取り上げ、以下の様に、イヌのレプチンcDNAをクローニングし、抗体を利用した免疫学的測定法を開発した。1、ビーグル犬の脂肪組織RNAからRT-PCR法とRACE法により3kbpの全長cDNAをクローニングした。これにコードされる167アミノ酸からなるイヌレプチンは他の動物種のレプチンと高い相同性を示し、脂肪組織にのみ特異的に発現していること、などがわかった(Res.Vet.Sci.に発表)。2、大腸菌に発現させた組み換えイヌレプチンに対するウサギ抗血清を用いて、イヌレプチンに特異的なELISA系を開発した。この方法により、イヌ血中レプチンを0.5-30ng/mlの範囲で測定可能であった(J.Vet.Med.Sci.に発表)。3、体重が大きく異なる20頭のビーグル犬について、血中レプチン濃度を測定したところ、別に重水希釈法で求めた体脂肪含量と高い正の相関(相関係数0.920)を示した(論文投稿中)。これらの結果から、血中レプチンがイヌの体脂肪量を反映するよい指標であることが明らかになった。現在、さらにネコレプチンについてもcDNAクローニングを進めており、同様に測定法を開発して伴侶動物の肥満研究や診断へ利用する計画である。代表的なアディポサイトカインであるレプチンについて、昨年度にイヌのレプチンcDNAをクローニングし抗体を利用した免疫学的測定法ELISAを開発したので、本年度は、これを用いて血中レプチンと体脂肪・肥満との関係を解析し、以下の成果を得た。1、20頭のビーグル犬に高カロリー食を与えて長期間飼育した後、血中レプチン濃度を測定したところ、別に重水希釈法で求めた体脂肪含量と高い正の相関(相関係数0.920)を示した(Am.J.Vet.Res.に発表)。

2、様々な犬種、性別、年齢の59頭の臨床例について調べたところ、適性体重群における血中レプチン濃度(2.7±0.3ng/ml)に較べて、過体重あるいは肥満群ではそれぞれ9.7±0.7ng/ml、12.3±1.5ng/mlと、何れも有意に高値であった。しかし、性別や年齢による差異は認められなかった(J.Vet.Med.Sci.に発表予定)。これらの結果から、血中レプチンがイヌの体脂肪量を反映する良い指標であり、犬種や性別、年齢に拘わらずに肥満度の定量的評価に利用出来ることが明らかになった。更にネコレプチンについてもcDNAクローニングを終えたので(J.Vet.Med.Sci.に発表)、同様に測定法を開発する予定である。アディポサイトカインとは脂肪細胞で合成され血中に分泌されるタンパク質の総称である。本研究の目的は、血中に存在するアディポサイトカインによって伴侶動物と家畜の体脂肪を簡便にかつ定量的に測定する方法を確立し利用することである。代表的なアディポサイトカインであるレプチンについて、昨年度までにイヌのレプチンcDNAをクローニングし抗体を利用した免疫学的測定法ELISAを開発し、血中レプチン濃度が体脂肪含量と高い正の相関を示し、犬種や性別、年齢に拘わらずに肥満度の定量的評価に利用出来ることを明らかにした。そこで本年度は、ネコのレプチンについても同様の検討を行い、以下の成果を得た。1、ネコの脂肪組織から抽出したmRNAからレプチンcDNAを得て、その塩基配列を決定した。それから推定されるアミノ酸配列は、イヌやマウス、ラット、ヒトと80%以上の高い相同性があった。2、上記でクローニングしたネコレプチンcDNAを大腸菌に導入し、16kDaの組み替えレプチンタンパク質を得た。これをラットレプチン受容体を発現する細胞に作用させたところ、STAT3のリン酸化が誘発されたので、生物活性を持つことが確認された。3、上記組み替えネコレプチンをウサギに免役し、特異抗体を得た。その反応性を確認した上で、ELISA測定系を作成した。それを利用して、健康な28頭のネコの血中濃度を測定したところ、0.4-17.5ng/ml(平均3.4±0.7ng/ml)であり、体脂肪率と正の相関が認められた。これらの結果から、イヌと同様にネコでも血中レプチンが体脂肪量を反映する指標となることが示唆された。