hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
小児心臓移植・肺移植の臨床応用に関する総合的研究

小児心・肺移植適応基準の検討については、自施設・オーストラリアにおける先天性心疾患症例の心臓移植適応基準の検討し、Fontan手術後に心室駆出率低下、重度僧帽弁逆流、不整脈wを認める症例(failed Fontan/unreached Fontan症例)が適応と考えられること(岡田)、川崎病後心筋症の予後を検討し、心不全死、突然死した症例では心筋梗塞に伴う左室機能低下症例であり、このような川崎病症例は心臓移植の適応と考えられること(神谷)、自施設での心肺移植適応候補患者の分析し、先天性心疾患に伴う肺低形成、肺動脈低形成、肺高血圧、肺動静脈瘻症例が心肺移植の適応と考えられること(松田)が判った。小児脳死判定基準の検討については、自施設の小児脳死症例の検査結果の検討(満留)、米国における小児脳死症例の予後の検討(松石)を行い、年齢に応じた判定基準が必要であることが判った。また、適応基準を考える上で、本邦における小児心肺・肺心臓移植患者の実態調査を行うことが重要であると考え、日本小児循環器学会などの各種学会・研究会の行っている調査と協調した形で、心筋症(先天性心疾患に伴うものを含む)(加藤、門間)、肺高血圧の全国調査(佐地)、海外渡航小児心・肺移植患者の調査並びに海外での成績の検討(小池)を開始した。結果については、来年度報告する予定である。最後に、小児ドナープールを拡大する目的で、新生児ヒヒへのブタ心移植を行い、新生児ヒヒでは抗ブタ抗体が少ないために超急性拒絶反応からブタ心が回避されること(川内)が判った。昨年度に引き続いた研究課題を各分担研究者が分担し、研究した。小児心・肺移植の手術術式・保存法の検討については、肺保存においてステロイド投与が肺胞の水輸送能を保存すること(藤村)、superoxide産生阻害剤OPC-6535が心臓の再潅流障害に有効であること(安井)、呼吸停止による停止心の再生にnicorandilが有用であること(佐野)、ブタ生体肺葉移植時の肺動脈再建へのハイブリッド人工血管の応用を検討(和田)、StLouisにおける肺葉移植の成績の検討(三好)した。小児心・肺移植適応基準の検討については、小児循環器学会のアンケートをもとに、先天性心疾患の適応症例を検討し、昨年同様failed Fontan/unreached Fontan症例等が適応であり、予後不良であること(岡田)、心肺移植・肺移植の適応症例を検討し、先天性心疾患に伴う肺低形成、肺動脈低形成、肺高血圧、肺動静脈瘻症例が心肺移植の適応と考えられること(松田)、川崎病後心筋症の予後を検討し、心不全死、突然死した症例では心筋梗塞に伴う左室機能低下症例であり、このような川崎病症例は心臓移植の適応と考えられること(神谷)、自施設での心肺移植適応候補患者の分析し、が判った。小児脳死判定基準の検討については、他施設の小児脳死症例の検査結果の検討(満留)、九州地方における小児脳死症例の予後・診断法の検討(松石)を行い、年齢に応じた判定基準が必要であることが判った。また、適応基準を考える上で、本邦における小児心肺・肺心臓移植患者の実態調査を行うことが重要であると考え、日本小児循環器学会などの各種学会・研究会の行っている調査と協調した形で、心筋症(先天性心疾患に伴うものを含む)(加藤、門間)、肺高血圧の全国調査(プロスタサイクリンの使用例も検討)(佐地)、海外渡航小児心・肺移植患者の調査並びに海外での成績の検討(小池)を行い、本邦に適応症例が多数いることが判明し、詳細を検討することになった。最後に、小児ドナープールを拡大する目的で、新生児ヒヒへのブタ心移植を行い、遅発性拒絶反応におけるアポトーシスの関与を検討した(川内)。3年度にわたり以下の研究課題を各分担研究者が分担し、研究した。
クライオ顕微質量分析法による植物内有機・無機成分の輸送と貯蔵の可視化

第二年度では以下の項目について研究を行った。得られた成果について各種学会・学術誌に発表した。1)リグニン前駆物質関連分子の局在と高分子リグニン局所構造の解析:リグニン骨格構造のうち、すべての維管束植物に存在するグアイアシル核の前駆体はコニフェリルアルコールである。コニフェリルアルコール配糖体であるコニフェリンの分布について、細胞壁木化過程との相関を可視化し、オープンアクセス論文として発表した。さらに被子植物のリグニンに存在するシリンギル核前駆体の配糖体シリンギンについても同様に分析を行った。シリンギンは主に樹皮に存在し、貯蔵量の増減と木化時期とが一致しないことから木化との関係性は不明であったが、シリンギンがコニフェリン同様に木化に利用されていることが本研究により示唆された。また植物中の他生体成分として抽出成分および無機成分についても実験を行い、それぞれ興味深い成果を得た。得られた成果については各種学会に発表した。2)同位体標識化合物の合成と投与:初年度に安定同位体標識化合物の合成および植物への投与を行い、安定同位体標識化合物が植物中でリグニンへと取り込まれたことを確認した。得られた標識リグニンについて、構造解析を行った。3)各種化合物の標品スペクトルデータベースの構築:植物中には様々な水溶性・非水溶性成分がある。特に微量成分に関しては既報の化合物であっても純粋な化合物としては市販されていないことが多い。そのため、植物中の分布解析を進める上で、抽出実験を並行して進める必要がある。初年度に引き続き、各種の植物生体成分を単離・精製して二次イオン質量分析に供した。28年度が最終年度であるため、記入しない。初年度では以下の3項目について重点的に研究を行った。1)リグニン前駆物質関連分子の局在と高分子リグニン局所構造の解析:リグニン前駆体の可視化について、マトリクス効果の検証を進展させた。またレーザーマイクロダイセクションを用いた組織分離により、局所構造の解析を行った。2)同位体標識化合物の合成と投与:安定同位体標識化合物を合成し、植物への投与を行った。安定同位体標識化合物が植物中でリグニンへと取り込まれたことを確認した。得られた標識リグニンについて、引き続き構造解析を進める予定である。本年度では樹木からの抽出実験を行い、各種の抽出成分を単離・精製して二次イオン質量分析に供した。今後も各種化合物の抽出およびスペクトルデータベースの構築を継続する。初年度では3項目について重点的に研究を行った。1)リグニン前駆物質関連分子の局在と高分子リグニン局所構造の解析:前駆物質の可視化と局所構造の解析について、それぞれ一定の成果は得られたものの、それらを密接に結びつけて解明するには至っておらず、引き続き検討が必要である。2)同位体標識化合物の合成と投与:順調に安定同位体標識化合物を合成することができた。さらに当初では第二年度に計画していた投与実験の一部を先行して進めることができ、試料を得ることが出来たため、本項目については研究計画以上の進展があった。3)各種化合物の標品スペクトルデータベースの構築: 2種植物について抽出実験を行い、様々な化合物を単離・精製した。得られた化合物についてはそれぞれ特徴的な植物内分布可視化を達成した。以上のように、一部課題が残るものの、計画以上に進展した項目もあり、総合的には順調に進展しているものと判断した。

そのため、植物中の分布解析を進める上で、抽出実験を並行して進める必要がある。初年度に引き続き、各種の植物生体成分を単離・精製して二次イオン質量分析に供した。当初の計画に沿い、応用展開として様々な樹木中微量成分の時空間配置を可視化し、植物生理学的な役割を解明する。さらに各種の状態・物性解析との複合化を目指して、研究を推進する。28年度が最終年度であるため、記入しない。
算数文章題の理解と解決を支援する学習方略の開発と転移に関する縦断的研究

本研究課題の成果は以下の5項目であり、研究報告書としてまとめた。1小学6年生が算数の割合文章題を解くときにどのような学習方略を使用するかを吟味したところ、比の第3用法の難問題(問題解決のステップが2つ以上の問題)では、問題文中の言葉や数字に着目して解くという回答から線分図を描いて解くという回答に変更する児童の数が増加し、そのような児童は他の解決方略を使用する児童に比べて正解率が高いことがわかった。2小学5年生に比の第2用法と第3用法の問題を解かせたところ、自分で問題文に最適の線分図を作成して割合文章題を解く自己生成線分図方略群の児童の成績がよいことがわかった。また、質問に回答する質問回答方略と自己生成線分図方略の交互作用が認められ、2つの方略を使って問題を解くと、当該の群の児童の作業記憶の負荷が高くなり、問題解決の水準が低下することもわかった。3学習者である小学5年生自らが、割合文章題の理解・解決時に活用できるコンピュータ利用による線分図方略を開発した。4算数割合文章題の解決に関する転移研究がほとんど認められないことを明確にした。5 3において開発したコンピュータ利用による線分図方略が小学5年生の割合文章題解決に効果的であるかどうかを一年の長期にわたって縦断的に追跡したところ、割合文章題の解決成績はコンピュータ利用による線分図作成群が最もよく、3回目のテストでもその成績を維持していることがわかった。他方、割合文章題とは異なる文章題の解決を求めた転移テストに関しては、条件群間に成績の差がないことがわかった。今年度(平成10年度)の研究によって得られた知見は、以下の通りであった。(1)算数文章題の理解と解決を支援する学習方略を明確にするために、小学6年生が割合文章題を理解する場合に利用する学習方略を調査によって特定した。即ち、先行研究結果を利用して5種類の学習方略((1)線分図を描いてから解く、(2)線分図以外の図や絵を描いてから解く、(3)メモを書いてから解く、(4)問題の中のヒントになる言葉や数字を見つけ、その言葉や数字をすぐに使って式を作り、問題を解く、(5)その他のやり方を使って解く)を小学6年生に与え、各割合文章題をどのようにして解くのかを聞き、実際に解かせたところ、(4)の方略を使用する子どもが多かった。しかしながら、難問題に正解する子どもは線分図を利用する割合が高いことが分かった。(2)小学5年生に線分図の中心線のみを与え、割合文章題の内容を反映した線分図を作成させたところ、割合文章題の内容を確認するための質問を与える条件の子どもに比べて、当該の割合文章題をより多く正解した。正解の多い傾向は、より複雑な割合文章題で顕著であった。現在のところ、20台のコンピュータを設置している小学校に出向き、上記の研究成果に基づいて構成された学習方略としての線分図作成プログラムを当該のコンピュータに組み込み、小学5年生に線分図作成の訓練を実施中である。コンピュータを利用してこのような訓練を行った子どもと、線分図作成の訓練を行っていない子どもの割合文章題の理解と解決を吟味し、コンピュータ支援による学習方略の開発を行う予定である。今年度(平成11年度)の研究によって得られた知見は、以下の通りであった。(1)昨年3月に算数割合文章題のテストを実施し、得られた結果を分析して以下の成果を得た。(1)コンピュータを利用して線分図を作成する訓練をしてから問題を解いたグループ(訓練群)、コンピュータによる訓練時間と等しい時間をあてて余分に割合

文章題の授業を行ってから問題を解いたグループ(過剰学習群)、並びに割合の授業終了後に問題を解いたグループ(統制群)の3グループ間に成績の差が見られ、訓練群が最もよい成績であった。(2)1ステップの解法で解ける易しい問題では、訓練群、過剰学習群、及び統制群の間に成績の差はなかった。しかしながら、解法に2ステップを要する難しい問題の場合、「比較量」及び「基準量」どちらのタイプを求める問題の場合でも、訓練群の成績が他の2つの群の成績をまさっていた。(3)「比較量」を求める問題と「基準量」を求める問題では、「比較量」を求める問題の方が正答率が高かった。(4)問題の難易と問題タイプの交互作用及び問題の難易と問題タイプと条件群の交互作用が有意となり、「比較量」を求める問題の方が易しい問題の場合も難しい問題の場合もよく解かれ、難しい問題の場合には、訓練群が他の2群よりも正答率が高かった。(2)縦断的研究として、昨年7月と今年2月に昨年3月に実施した上記と同一のテスト並びに転移テストを同一の子供たちに実施した。昨年7月に実施した同一のテストの結果は昨年3月の結果と類似していた。転移テストに関しては3群間に差はなかった。現在、昨年7月に得たテスト結果の更なる分析方法を工夫し、かつ今年の2月に実施したテスト結果を分析中である。今年度(平成12年度)の研究によって得られた知見は、以下の通りであった。(1)昨年度までの2年間に得られた研究成果の更なる分析を行った。具体的には、(1)コンピュータを利用して線分図を作成する訓練を行ってから問題を解いたグループ(訓練群)、コンピュータによる線分図の作成訓練に要した時間と等しい時間を割合文章題の授業の時間にあて、他の条件群に比べて余分に割合文章題の授業を行ってから問題を解いたグループ(過剰学習群)、並びに割合の授業終了後に問題を解いたグループ(統制群)、の3グループ間における3回のテスト得点の推移の分析、及びコンピュータ利用による成績上位の児童と成績下位の児童の差異の分析等を行った。その結果、割合文章題の解決に関しては、コンピュータ利用による訓練群の成績は第1回目のテスト結果から他の2群に比べて成績の優位を示し、その優位は1年間を通して維持され、かつ割合の難問題において顕著であったこと、が見出された。また、コンピュータ利用による方略訓練に関しては、コンピュータによる訓練によって線分図方略が身に付いていない児童も存在すること見出された。適性処遇交互作用の考え方の重要性が再認識された。(2)7月に開催された「XXVII International Congress of Psychology」で研究成果の一部を発表するために発表原稿を作成し、1年にわたる割合文章題の理解と解決に関する縦断研究において、コンピュータ利用による線分図方略の訓練効果とその理論的背景を明確にした。
イリドイド生合成における閉環反応に係わる酵素の精製と反応機構の解明

イリドイド系化合物は薬用植物成分としてに広く分布している。なかでも、抗腫瘍活性を始め種々の生理活性を有するインド-ルアルカロイドの非トリプタミン部分がイリドイド配糖体より生合成されることはよく知られている。従って、イリドイド配糖体の基本骨格であるイリダン骨格の形成機構を酵素レベルで解明することは、イリドイド関連物質の生合成研究にとって非常に重要なことである。そこで、本研究ではインド蛇木の培養細胞を酵素源として以下の研究を行い、ほぼ初期の目的を達した。1.鎖状モノテルペン脱水素酵素。イリダン骨格を形成する閉環反応の鎖状生合成前駆物質である10ーhydroxygeraniolから10ーoxogeranialの形成にあずかる脱水素酵素を活生収率10%、87倍で、かつ単一なタンパク質として単離した。本酵素は分子量44,000のモノマ-タンパク質で、等電点pH5.4、亜鉛原子を含み、NADP(H)依存性である。Ca^<2+>,Mg^<2+>の添加は酵素反応を活性化し、チオ-ル試薬に阻害効果が認められた。本酵素反応の立体化学的過程を(4R)ー[4ー^2H]NADPHを用いて調べた結果、proーR特異的であることが分かった。本酵素のN末端アミノ酸配列19個は、植物から単離されている他のアルコ-ル脱水素酵素との間に相同性は認められなかった。2.イリダン骨格閉環機構。鎖状前駆体10ーoxogeranialから環状前駆体イリドジア-ルへNADPH存在下閉環反応を触媒する酵素を440倍に精製した。本酵素は分子量118,000の4量体であることが明かとなり、NADPHはNADHより2倍高い活性を示した。本酵素が還元的機構により閉環反応を触媒することは、環状モノテルペンの生合成における、geranyl pyrophosphateが関与する従来の閉環機構とは異なり新しいタイプのものである。この酵素を単離し、反応機構を解明したことは非常に意義あることである。
キチンによるアレルギー応答誘導機構の解析

ダニの外殻に豊富に含まれるキチンが、インターロイキン-33(IL-33)を介して、無害な抗原に対するアレルギー応答を誘導することを見出した。本研究では、抗原提示細胞の一つである樹状細胞に対するキチンの効果に着目した。その結果、キチンがIL-33存在下で樹状細胞を活性化し、炎症性サイトカイン(IL-1b)の産生を誘導することが明らかとなった。さらに、キチンとIL-33で刺激した樹状細胞が、IL-1b依存的にTh2細胞を活性化をすることが明らかとなった。したがって、キチンによるIL-33誘導やそのシグナル伝達を阻害する薬剤は、ダニによるアレルギー性喘息の発症抑制に寄与すると期待された。申請者らは、ダニの外殻構成成分であるキチンが、Th2サイトカイン誘導因子であるIL-33を介して、IL-4/13-STAT6依存的なアレルギー応答を誘導することを見出した。そこで、ダニによるアレルギー性疾患発症機構を明らかにするため、キチンによるアレルギー応答誘導機構について検討した。(1)キチンおよびIL-33の標的細胞の同定と活性化機構の解明キチンはIL-33存在下でのみ骨髄細胞由来樹状細胞(BMDC)を活性化し、IL-1b産生を誘導することを見出している。したがって、キチン・IL-33刺激により活性化した樹状細胞がIL-1b依存的にTh2応答を増強している可能性がある。そこで、野生型マウスおよびIL-1KOマウス由来BMDCをキチン・IL-33で刺激し、OVA特異的T細胞受容体を発現するOTIIマウスのCD4+ヘルパーT細胞と、OVAペプチド存在下で共培養した。その結果、IL-33・キチンで刺激した野生型マウス由来BMDCは、ヘルパーT細胞によるOVA依存的なTh2サイトカイン産生を増強したが、IL-1KOマウス由来BMDCでは、Th2サイトカイン産生が有意に低下した。したがって、キチンは、IL-33依存的に樹状細胞によるIL-1b産生を誘導することにより、アレルギー応答を誘導していると考えられる。(2)キチン受容体の同定およびキチン受容体のシグナル伝達経路の解明キチンの受容体として、TLR2が知られるが、IL-33・キチン刺激によるBMDCの活性化には関与しない。そこで、TLR2のOVA・キチン誘導性気道炎症への関与について野生型およびTLR2/TLR4KOマウスを用いて検討した。その結果、野生型およびTLR2/TLR4KOマウスで、同程度の好酸球性気道炎症が誘導された。したがって、キチンによるアレルギー性気道炎症誘導には、TLR2とは異なる受容体が関与すると考えられる。(1)キチンおよびIL-33の標的細胞の同定と活性化機構の解明キチンはIL-33存在下でのみ骨髄細胞由来樹状細胞(BMDC)を活性化することを見出している。したがって、キチン・IL-33刺激により活性化した樹状細胞がTh2応答誘導に関わっている可能性がある。そこで、キチン・IL-33で刺激したBMDCと、OVA特異的T細胞受容体を発現するOTIIマウスのCD4+ヘルパーT細胞を、OVAペプチド存在下で共培養した。その結果、IL-33・キチンで刺激したBMDCは、ヘルパーT細胞によるOVA依存的なTh2サイトカイン産生を有意に増強した。したがって、キチンは、IL-33依存的な樹状細胞の活性化を介して、アレルギー応答を誘導していると考えられる。(2)キチン受容体の同定およびキチン受容体のシグナル伝達経路の解明キチンの受容体として、TLR2及びDectin-1が報告されていることから、IL-33存在下でのキチンによるBMDCの活性化に、これらの受容体が関わることが想定される。そこで、野生型マウス、TLR2欠損マウス及びDectin-1欠損マウス由来BMDCを、キチン・IL-33で刺激した。その結果、いずれのマウス由来BMDCも同レベルの炎症性サイトカインを産生した。したがって、キチンによる樹状細胞の活性化には、TLR2及びDectin-1とは異なる、新規受容体が関与すると考えられる。申請書の研究計画において1.キチン及びIL-33の標的細胞の同定と活性化機構の解明、2.キチン受容体の同定およびシグナル伝達経路の解明を目的としている。

1.に関して、キチンの標的細胞の一つである樹状細胞は、IL-33存在下でキチンによる刺激を受けると、抗原特異的なTh2細胞の活性化を増強できることを明らかにした。しかしながら、キチンにより特異的に誘導され、Th2細胞の活性化に関与する樹状細胞由来のサイトカインや共刺激分子などのメディエーター探索が終了していないため。また、2.に関して、TLR2及びDectin-1以外の新規受容体が、キチン・IL-33による樹状細胞の活性化に関与する可能性が示唆されているが、新規受容体の同定には至っていないため。1.キチン及びIL-33の標的細胞の同定と活性化機構の解明に関して、キチン・IL-33刺激により活性化した樹状細胞が、Th2細胞の活性化を増強することを明らかにした。この機構には、キチン・IL-33刺激により樹状細胞に発現が誘導されるサイトカインや共刺激分子が関与すると考えられる。今後は、Th2細胞の活性化に関わる、樹状細胞由来のメディエーターを明らかにし、さらには、樹状細胞欠損マウス(CD11c-DTRマウス)に、野生型もしくはメディエーター欠損樹状細胞を移入再構築したマウスにおいて、OVA・キチンによるアレルギー性気道炎症の評価を行う。2.キチン受容体の同定およびシグナル伝達経路の解明に関して、TLR2及びDectin-1以外の新規受容体が、キチン・IL-33による樹状細胞の活性化に関与する可能性が示唆されている。キチン受容体はキチン結合性を有していると想定されることから、肺及びBMDC中のキチン結合タンパク質を、キチンビーズカラムを用いて精製及び同定する。さらに、同定されたキチン結合タンパク質について、siRNAもしくは遺伝欠損マウス由来BMDCを用いて機能解析を行い、樹状細胞の活性化に関わるキチンの機能的受容体を同定する。最終的には、キチン受容体遺伝子欠損マウスにおいて、OVA・キチンによるアレルギー性気道炎症の評価を行う。キチンの効果を評価するため、野生型マウス数約300匹(\2000×300 = \60万)を購入する。マウスに対するキチンの効果を評価するために、IL-4、IL-17、IFN-g、IL-1b、IL-33の5種のサイトカイン測定キット(\10万×5 = \50万)を購入する。マウス骨髄細胞からBMDCを誘導するため、rmGM-CSF 1 mg(\40万)を購入する。BMDCへのsiRNA導入のため、特異的なsiRNAとトランスフェクション試薬(\10万)を購入する。
人工的な環境における単一光子波束の伝搬と自然放出過程の研究

本研究は、真空中および人工的な環境下での原子系からの光子の放出過程および単一光子のランダム媒質中の伝搬の問題、単一光子状態の検出などの量子力学的な理論の構築とそれらの実験的な研究を目的としている。本年度は以下の研究成果があった。1光子状態のように電場の確定していない量子状態の光ヘテロダイン検出は不可能である。信号光子と局部発振光子(光電子)の検出過程おける多重検出(光子の多重散乱)確率を量子論的に計算すると、1光子状態の強度スペクトラムに対応する情報を得る事が可能であることを示した。多重散乱体中を伝搬するバリスティック(弾道)光子だけを測定できる光ヘテロダイン計測装置を作製した。これを用いて多重散乱体中の弾道光子の施光度と伝搬時間を測定する装置を開発し、マイクロ度の施光角を測定することに成功した。半導体レーザーを用いてRb原子の光磁気トラップを作ることに成功した。極低温原子のトラップには成功してたので、ZOTトラップ中のRbからの散乱蛍光を光学的ヘテロダイン法で検出することをここみている。RF電場がdressedされた原子の光暗共鳴の理論的研究を行い、通常の暗共鳴よりも鋭い共鳴となることを見つけた。さらに複雑な任意のツリー構造をもった多準位の光暗共鳴に関して理論的な研究をおこなった。振動するミラーからの反射を用いて半導体レーザー光の周波数変調法を開発した。この方法では振動変調の混変調が10-7以下であるので、レーザー冷却用光源や超精密分光用の周波数制御に最適である。今年度で研究課題に掲げた実験に用いる装置と理論的な武装が完了したといえよう。
中性子バックライト手法を用いた慣性核融合爆縮コア計測の可能性の探求

慣性核融合爆縮コアの面密度計測を最終目標に中性子バックライト計測の可能性を探求することを目標とした。中性子源は高強度レーザーをターゲットに照射したとき発生するγn中性子である。研究開始当時、発生機構が不明であり本研究ではその発生機構の解明と中性子計測器、発生を駆動する高速電子の計測並びに挙動の解明に重点が置かれた。研究を通じて中性子がγn中性子であること、高速電子とターゲットとの相互作用により中性子の発生が大きく変わること、計算機シミュレーションを通じて挙動を解明したこと、γ線と中性子を弁別できる計測器を開発したこと、およびコア面密度に必要な厚みを実験的に明らかにしたことなどが主な成果である。LFEXレーザーをターゲットに照射して発生する中性子の空間分布の観測を行った。また発生の源である電子のスペクトルの計測を並行して行った。この中性子を計測に用いる場合の最大の問題は同時に発生するX線である。今回イメージングプレートをチャンバーの各場所に張り付けてX線の空間分布を観測した。その結果、高Zの強度は金ターゲットでは前方方向に偏っているのに対して、ダイヤモンド様炭素ではX線の強度は弱く角度広がりを持つことがわかった。ただ中性子発生量はエネルギー依存性はあるもののX線量に対して正の相関を持つので、S/N比を勘案しながら最適のターゲットを模索していく必要がある。角度分布に関しては中性子は概ね全立体角に広がっているのでことを実験的に確認できており、LFEXの入射側に中性子検出器を配置することでX線ノイズを低減できイメージングが可能であることが明らかになった。ターゲットからの高速中性子をバブル検出器で測定し画像計測に耐えうる粒子数を観測できた。γn中性子はターゲットからだけではなくチャンバーからも発生する。主な発生源はLFEX対向側の電子分析器である。強力なX線および高速電子がここに照射されて発生する新たなX線とのγnにより中性子が発生すると考えられる。今後、この部分を低Z物質に交換してX線の発生ならびに中性子のをターゲット部分に局在化させS/Nの改善を行う。高速中性子に対して高い感度があるがX線に対する感度がほとんどないバブル検出器の利用の検討も進めている。バブル検出器は試験管に封入されているため、画像が行いにくい。平板状のバブル検出器が可能かどうか検討している。また中性子用イメージングプレートも市販されているが、こちらは熱中性子用であるため高速中性子に適用するためには熱化する必要がある。これによる低下した空間分解能とバブル検出器の空間分解能を比較している。LFEXレーザーをターゲットに照射して強力な中性子を発生させることができた。レーザーのエネルギーは1kJを越え、パワーは10^19W/cm2を越える。用いたターゲットは、アルミ、金、銅の薄膜、金コーン、DLCコーン、金およびDLCコーンにポリスチレンのシェルを付加したものを用いた。高速点火の実験と並行して行ったため、コーンシェルターゲットでは必要に応じて激光12号により爆縮を行った。中性子の計測は、液体シンチレータ光電子増倍管のほかバブル検出器、マンダラ多チャンネル検出器を用いた。また、高速電子とX線の計測のため電子分析器を設置した。発生のメカニズムは、重水素ターゲットを用いたときに起こるDD核反応中性子のほかにγn中性子がある。これは激光12号レーザーによる高速電子がターゲット中で停止し強力なX線を発生し、そのX線が周辺の鉄などとγn反応を起こし中性子を発生するもでである。しかしながら、実験を進めていくうちに、X線が明らかに少ないのにDD反応中性子ではなく中性子発生量の増加が観測された。ごの原因を精査したところ、高速電子に伴って加速された陽子や重陽子などがターゲットに衝突し核破砕を起こしている可能性が疑われた。これは過去の実験でポリスチレンなどの低Zターゲットで多量の中性子が観測されたり、重水素ターゲットを用いない場合でも中性子が観測された原因が理解できるようになった。現在、ターゲットに対する依存性、X線発生と中性子の発生の相関を解析中である。今年度は、11月から翌年3月まで大強度レーザーLFEXを用いた実験が行われた。昨年度までの実験ではレーザーのプレパルスが想定以上に大きくその結果、高速電子が高温化しガンマ線を多数放出した。その結果ガンマ中性子が多数発生し、この中性子を用いた実験が画策された。しかしながらこれはLFEX本来の目的である高速点火には相応しくないためプレパルスの除去が積極的に図られた。その結果プレプラズマの発生が抑制され、高速電子の低速化に成功した。しかしながらこれは、γn中性子を発生する立場からは逆効果である。LFEX全体の研究計画から大きくはずれた実験を行うのは難しいので、少し視点を変えてLFEXの性能が向上(=プレパルスが小さい)した環境下で中性子バックライトを試みる方向に転換することを考える。このような高強度レーザーで中性子を多量に出す方法を電子エネルギー分析器の実験結果と計算機シミュレーションを比較することによって模索した。電子エネルギー分析器を2台設置して電子のスペクトルを測定したところ極めて興味深い結果が得られた。実効電子温度つまり電子のエネルギーが低い程電子の空間広がりは平坦になるのである。これを平板ターゲットにおけるシミュレーションと比較する。発生した高速電子は表面付近で自己磁場によりターゲットに侵入できず周回していることが分かった。この傾向はエネルギーが低い程大きい。つまり電子電流が大きいので自己磁場が大きいためである。このことは実効電子温度を下げると通常のターゲットでは加熱しにくいことを示している。

そこで、球殻の内面に照射することを試すことにした。これなら表面を周回してもターゲットを十分加熱できるはずである。予備実験を激光XIIで行ったところ10^7の中性子が容易に観測できた。今後はLFEXにこれを適用して十分は中性子発生源として用いることができると期待される。今年度は2つの大きな進展があった。一つは有川等により開発製作された平面タイプ2次元シンチレータアレイを導入した。これを大阪大学産業科学研究所のLINACを用いて加速された電子をターゲットに照射することにより発生するガンマ中性を利用して2次元の中性子画像のテスト撮影に成功したことである。この実験では真空ポンプを被写体にしたところ、予測通り中性子の遮蔽効果の大きい低Z部分でくっきりした画像を観測することができた。もう一つは、安倍及び尾﨑によりLFEXレーザーのターゲット照射により発生するガンマ中性子を用いた実験である。被写体画像を2次元シンチレータアレイ「マンダラ」でとらえることができた。この実験においてγn中性子の発生場所が当初考えられていたターゲットチャンバーよりもターゲット自身から発生していることが明らかになった。また、ポリエチレンの遮蔽体の厚みを変えて実際のγ中性子がどの程度の厚みで目的に適うかを実験した。現在得られた結果を解析中である。この実験では同時に小型化を目指した平面型のシンチレータアレイも用いたがこれはうまくいかず今後の進展が期待される。いずれの検出器でも巨大なX線を飛行時間法を用い時間的に弁別して中性子画像を得ることができた。以上の結果はターゲットの面密度測定の可能性について指針を与えるものである。やや遅れ気味だがかなりの進展が見られた。当初計画した中性用イメージングプレートではLFEXの環境下ではX線ノイズの除去が非常に困難であることがわかった。このため2次元シンチレータアレイとマンダラを投入して飛行時間法を利用して弁別することができるようになり大きな進展が見られた。マンダラは現在オンオフモード(回路の制約で中性子が数個入ると検出器が反応しなくなる)であるため、これをアナログベースで信号処理することによりかなり精度の良い結果が期待できる。現在準備中であるが予算に制約があり全チャンネルを網羅するまでには至らない。これが進展の遅れの一つの原因である。また、遮蔽実験は当初この目的のための測定ポートが確保できる予定であったが、その前の実験シリーズが長引いたため、測定ポートに別の機器が取りついいたままで実施せざる得なかった。測定器は高Z物質であるため影響は限定的であると判断して行ったが実験精度は低下した。これも引き続き改善する必要がある。今年度は大きく2つの進展があった。
蛋白質工学によるヘモグロビン分子機能の改変

ヘモグロビン(Hb)のアロステリック機能調節の分子論的機序を明らかにする目的で,大腸菌・M13ファージ系を用いた部位指定変異導入技術によって,特定のアミノ酸残基を置換したヒトの人工変異Hbを調製し,それらの構造と機能の解析を行なった.今回は, β鎖ヘムの遠位側のアミノ酸を置換した変異体,および,ワニHbの機能を模疑する変異体を合成した.変異グロビンの合成は, Nagaiらの発現ベクターを用いて,大腸菌株QY13内で行なった.得られたβグロビンにヘミンと正常単離α鎖を加え,四量体Hbを再構成した.1.ヘム遠位側アミノ酸置換体:Val-67βをAla, Leu, IleまたはMetに置換した変異体およびHis-58βをGln, ValまたはGlyに置換した変異体を合成し,それらの酸素平衡曲線,共鳴ラマンスペクトルの測定および, X線結晶解析を行なった. T構造Hbの酸素親和性の指標である第一Adair定数K_1の値を,天然ヒトHbのK_1と比較すると, HbAla-67βでは増加, HbLeu-67βでは不変, HbIle-β67では減少した.また, 58β部位を, HisやGlnなどの極性残基が占めると, K_1が上昇した.これらの事実から, β67部位アミノ酸残基によるリガンドヘの立体障害および58β部位アミノ酸残基の極性が, Hbのリガンド親和性を調節する重要な因子であると結論した.2.ワニHbを模疑するHb:ワニHbの酸素親和性は,血中CO_2分圧に強く応答するが,それは,そのデオキシ型がHCO^-_3と強く結合するためである.HCO^-_3の結合部位を構成するアミノ酸をヒトのHbに導入した変異体を合成して,それらのCO_2の効果を測定したところ,期待に反して,その効果の増強はみられなかった.ヘモグロビン(Hb)のアロステリック機能調節の分子論的機序を明らかにする目的で,大腸菌・M13ファージ系を用いた部位指定変異導入技術によって,特定のアミノ酸残基を置換したヒトの人工変異Hbを調製し,それらの構造と機能の解析を行なった.今回は, β鎖ヘムの遠位側のアミノ酸を置換した変異体,および,ワニHbの機能を模疑する変異体を合成した.変異グロビンの合成は, Nagaiらの発現ベクターを用いて,大腸菌株QY13内で行なった.得られたβグロビンにヘミンと正常単離α鎖を加え,四量体Hbを再構成した.1.ヘム遠位側アミノ酸置換体:Val-67βをAla, Leu, IleまたはMetに置換した変異体およびHis-58βをGln, ValまたはGlyに置換した変異体を合成し,それらの酸素平衡曲線,共鳴ラマンスペクトルの測定および, X線結晶解析を行なった. T構造Hbの酸素親和性の指標である第一Adair定数K_1の値を,天然ヒトHbのK_1と比較すると, HbAla-67βでは増加, HbLeu-67βでは不変, HbIle-β67では減少した.また, 58β部位を, HisやGlnなどの極性残基が占めると, K_1が上昇した.これらの事実から, β67部位アミノ酸残基によるリガンドヘの立体障害および58β部位アミノ酸残基の極性が, Hbのリガンド親和性を調節する重要な因子であると結論した.2.ワニHbを模疑するHb:ワニHbの酸素親和性は,血中CO_2分圧に強く応答するが,それは,そのデオキシ型がHCO^-_3と強く結合するためである.HCO^-_3の結合部位を構成するアミノ酸をヒトのHbに導入した変異体を合成して,それらのCO_2の効果を測定したところ,期待に反して,その効果の増強はみられなかった.
言語構造における「標示」のインターフェイス研究

本研究は、構造構築とは独立に統語構造に与えられると現在考えられている「標示」の存在を、統語構造と外部システムとのインターフェイスの観点から追求・解明し、その理論的・経験的意義について詳細に検討することを目的とする。この目的を達成するために、今年度は、同一の「標示」を持つ、または同一の「標示」決定アルゴリズムが用いられ「標示」が決定されると考えられる統語構造が、同一の、または共通の音声・意味・統語特徴を持つのか、持たないとすればどのような統語環境でなのかについて明らかにすることに取り組んだ。同一の統語的性質を持たない要素が等位接続される構造に焦点を当て、左枝分かれ構造からの抜き出しが許される場合があること、異なる種類の内項を等位接続可能な場合があること、通常共起不可能な動詞句内要素を等位接続可能な場合があることなど、様々な形で特異な音声・意味・統語特徴が観察されることを、先行研究、コーパス調査やインフォーマントチェックなどから明らかとした。また、「標示」が決定されない統語構造があると主張する先行研究を批判的に検討し、それら統語構造が同一の、または共通の音声・意味・統語特徴を必ずしも持たないことを明らかとした。これら結果は、外部システムとのインターフェイスにおける解釈にとって「標示」以外の情報も同様に重要であることを示唆するものであり、「標示」のあり方や統語構造との関係の解明への貢献が期待できる。当初の計画にほぼ沿って研究が進んでいる。現在研究発表等に向けてこれまでに得られた成果をまとめているところである。このため「(2)おおむね順調に進展している。」とした。今年度までで、同一の「標示」を持つ、または同一の「標示」決定アルゴリズムが用いられ「標示」が決定されると考えられる統語構造が同一の、または共通の音声・意味・統語特徴を持たない場合があり、それが等位構造において観察されることを明らかとした。次年度でも継続して、その他の統語環境においても同様の観察が得られるか調査する。また、すでに明らかとされている等位構造における特異な音声・意味・統語特徴をどのような構造的特徴の下で導くことが可能か検討する。さらに、この検討により得られた構造的特徴を有する等位構造に対し、既存の「標示」決定アルゴリズムがどのように「標示」を決定するのか考察する。」とした。今年度予定していた共同研究者や研究協力者との研究打ち合わせを日程の問題で次年度にずらしたため。また次年度分として請求した助成金については当初の計画通り、「標示」のインターフェイス研究に使用する計画である。
ゼロ磁化ハーフメタル実現に向けたダブルペロブスカイト単結晶薄膜の作製

パルスレーザー堆積法を用いて、新たな物性を有する種々のダブルペロブスカイト型材料の探索を進めた。パルスレーザー堆積法によって蒸着された酸素欠損Sr2MgMoO6薄膜について、これまで使用していたSrTiO3基板に代わり、より格子整合の優れたGdScO3基板を用いて、基板の格子定数の依存性を調べた。その結果、酸素欠損Sr2MgMoO6薄膜はSrTiO3基板上には格子整合しなかったが、GdScO3基板上では面内の格子定数が一致しており、薄膜がコヒーレント成長していることが明らかになった。また前者に比べて後者は結晶性が向上すると同時に電気抵抗率が低下することを見出した。酸素欠損したSr2MgMoO6薄膜の電気抵抗率の温度依存性を解析したところ、電気伝導の形態がVariable range hoppingで説明できることを見出した。これは電気伝導を担うMoの4d軌道がMgによって空間的に分断されていることに由来すると考えられる。この結果は、Sr2MgMoO6薄膜のMg/Moのディスオーダーの増加も電気抵抗率の低下につながることを示唆する。また、上記以外のダブルペロブスカイト探索の一環として、Sr2CrRuO6薄膜の合成に着手した。パルスレーザー堆積法は一般に原料から薄膜への化学組成の転写に優れる手法といわれているが、この系においては薄膜中のRuの量が著しく低下することが判明した。このため減量中のRuの量を過剰にすることで、Ru/Cr比を1:1に近づけることができた。今後の課題として、酸素欠損の抑制や秩序構造の制御など、さらなる製膜条件の最適化が課題である。26年度が最終年度であるため、記入しない。今年度は、種々のダブルペロブスカイトについて、パルスレーザー堆積法における薄膜試料の作製条件とBサイトのオーダ率との相関を中心に探索した。研究を進める中で、バルクでは自発的なオーダーを起こすSr_2MgMoO_6をパルスレーザー堆積法によって合成することで、従来考えられていた酸素欠損量の限界を超えられることを発見した。今回、パルスレーザ堆積法で酸索欠損したSr_2MgMoO_6薄膜を作製した。薄膜の作製条件を変化させたところ、低酸素圧領域で濾酸素欠損を含んだ単相の薄膜が得られることがわかった。また、超格子ピークから薄膜のオーダー率を評価したところ、オーダー率は最も低いもので63%であり、バルクで得られる値より顕著にディスオーダーが含まれていることが明らかになった。さらに、X線光電子分光にてMo3d内殻スペクトルの測定を行い、酸素欠損量の変化を観察した。Sr_2MgMoO_6中のMoの光電子分光は周囲の条件による表面酸化・還元の影響を受けやすいことが指摘されていたが、今回はSpring-8の硬X線を用いることでバルク敏感な測定を行い、この問題を回避した。測定の結果、Sr_2MgMoO_6への酸素欠損の導入によって生じたMo^<5+>・Mo^<4+>が電気伝導を担い、これらの量は製膜条件によって制御できることを実験的に示した。電気抵抗率は300Kにおいて2.7-6.6×10^<-2>Ωcmにあり、先行研究より1桁以上低い値が得られた。ホール抵抗の結果は電子伝導性を示し、酸素欠損機構と整合していた。したがって、Bサイトのオーダ率を低下させるほど、薄膜中の酸素欠損量が増加し電気抵抗率が低下する結果が確認できた。

パルスレーザー堆積法を用いてダブルペロブスカイトの新しい物性を発見するという目的において、Sr_2MgMoO_6というオーダー率が物性制御のネックになっていた物質の物性改善を行うことができているため、おおむね研究は前進していると判断できる。これまでの研究でダブルペロブスカイトのBサイトオーダーを、非平衡反応であるパルスレーザー堆積法を用いて制御できる可能性が明らかになった。従本年度で発見したSr_2MgMoO_6について、Alなどを化学ドープした薄膜の作製を行いさらに研究を発展させる。さらに、新たなBサイトの組み合わせによる新物性を探索し、新機能をもった物質を開拓する。
胚性幹(ES)細胞における不死化の分子機構

細胞の不死化は、原癌遺伝子の活性化や癌抑制遺伝子の不活性化などの遺伝子異常によりもたらされる。胚性幹細胞(ES細胞)は様々な細胞へと分化できる多能性を維持したまま、無限に増殖する。またES細胞を生体に移植すると三胚葉系の様々な組織を含む奇形腫を形成する。遺伝子異常を持たないES細胞がなぜ不死であり腫瘍形成能を持つのかはほとんどわかっていない。これまで、ホメオボックス転写因子Nanogが分化多能性の維持に必須であることも見いだした。Nanog欠損ES細胞は分化多能性を失っているが依然不死であったことから、ES細胞の多能性と不死性は独立した機構によりもたらされていると考えられた。さらにES細胞はRas蛋白質ファミリーの新しいメンバーであるERasを特異的に発現していることを見いだした。ERasは最初から悪性変異型Rasに相当するアミノ酸を有しており、実際に大部分がGTP結合型として存在している。本研究の目的は、ES細胞における不死性におけるERasやその他の因子の役割を解析することである。1.ES細胞の樹立におけるERasの役割ERasはブラストシストを含む初期胚では発現せず、ES細胞でのみ発現している。本年度は内部細胞塊からES細胞樹立時にERasの発現がオンになる分子機構を解析した。ES細胞特異的な発現に必要なシスエレメントに結合する転写調節因子の探索を行った。その結果、E-Box結合蛋白質を候補として同定した。2.ERasのエフェクター解析ERasはPI3キナーゼを特異的に活性化するが、PI3キナーゼは分化多能性の必須因子Nanogの発現を活性化していることがわかった。PI3キナーゼを抑制するとNanogの転写を活性化す転写因子の結合が抑制された。3.ERasの膜局在機構の解明ERasの膜局在は、その活性に必須であることを明らかとした。正常細胞の不死化はほとんどの場合、原癌遺伝子の活性化や癌抑制遺伝子の不活性化などの遺伝子異常によりもたらされる。胚性幹細胞(ES細胞)は哺乳動物の胚盤胞(ブラストシスト)に由来する幹細胞で、成体を構成するすべての細胞へと分化できる多能性を維持したまま、無限に増殖する。Nanog欠損ES細胞は分化多能性を失っているが依然不死であったことから、ES細胞のもつ2つの特性、すなわち多能性と不死性は独立した機構によりもたらされていると考えられた。さらにES細胞はRas蛋白質ファミリーの新しいメンバーであるERas (ECAT5)を特異的に発現していることを見いだした。本研究の目的は、ES細胞における不死性におけるERasやその他の因子の役割を解析することであった。1.ES細胞の樹立におけるERasの役割ERasはブラストシストを含む初期胚では発現せず、ES細胞でのみ発現していることが示唆されている。ERas遺伝子を欠損したブラストシストからES細胞の樹立を試みた結果、ERasはES細胞樹立に必須でないことがわかった。2.ERasのエフェクター解析ERasの下流シグナル探索した結果、RafやRalGDSには結合せず、PI3キナーゼと特異的に結合することを明らかとした。3.ERasの膜局在機構の解明Rasが膜局在する機構を解析した結果、他のRas蛋白質と同様にファルネシル、メチル化、パルミトイル化という、複数の脂質修飾が必要であることを明らかにした。2.ERasのエフェクター解析

ERasはPI3キナーゼを特異的に活性化するが、PI3キナーゼは分化多能性の必須因子Nanogの発現を活性化していることがわかった。PI3キナーゼを抑制するとNanogの転写を活性化す転写因子の結合が抑制された。3.ERasの膜局在機構の解明ERasの膜局在は、その活性に必須であることを明らかとした。
RubiscoのC4化によるイネの光合成能力の改良

ソルガムRbcS高発現・イネRbcSノックアウトイネ(CSS系統)について生理解析を行った.実験に用いた2種類のCSS系統(CSS10,CSS16)のRubisco含量は,CSS10で非形質転換イネの50%,CSS16で35%であり,Rubisco含量を適度に減少させることに成功した.低CO2から大気条件での光合成速度は,非形質転換イネに比べてCSS系統で低い傾向にあったが,高CO2条件ではRubisco含量が低いにもかかわらず非形質転換イネと同等の光合成速度を示した.生育についても同様であり,大気条件ではCSS系統は乾物重が低くなったが,高CO2条件では非形質転換イネと同等の乾物重を示した.ソルガムRbcS高発現・イネRbcS RNAiノックダウン二重形質転換イネのRubiscoの結晶構造解析からイネRbcSに存在するIle101が,ソルガムRbcSにおいてLeu101となることで,Rubiscoの触媒サイトの構造変化が生じて触媒速度が増加することが示唆された.本年度はイネRbcSが完全にソルガムRbcSに置き換わったCSS系統のRubiscoの結晶構造解析を行い,ソルガムRbcS高発現・イネRbcS RNAiノックダウン二重形質転換イネのRubiscoと同様の構造であることを確認した.予定ではソルガムRubiscoの結晶構造解析も行う予定であったが,結晶化させることが出来ず,構造を明らかにすることが出来なかった.多収性日印交雑品種タカナリを背景とするソルガムRbcS高発現イネの光合成特性の解析を行ったが,光合成速度はタカナリと同程度であった.ネピアグラスRbcSは他のC4 RbcSと異なるメカニズムによりRubisco触媒速度を増加させていることが予想される.結晶構造解析のためのネピアグラスRbcS高発現・イネRbcSノックアウト形質転換イネを作出中である.平成30年度が最終年度であるため、記入しない。平成30年度が最終年度であるため、記入しない。ソルガムRbcS高発現イネRbcSノックダウン2重形質転換イネで発現するRubiscoの酵素特性を解析した.2重形質転換イネのRubiscoは,ソルガムRbcSを高発現しただけの形質転換イネのRubiscoに比べて,触媒速度,CO2に対するKmが高くなることが明らかとなった.しかし,RNAi法によるノックダウンではRubisco含量を適度に調節することが困難であり,光合成速度を増加させることはできなかった.そこで,ソルガムRbcSを高発現する形質転換イネのイネRbcSをCRISPR/Cas9法によりノックアウトすることを試みている.イネのRubisco活性を高めるのにソルガムRbcSよりも効果的なRbcSがあるのかを探索することも重要と考え,ソルガムと同様にC4植物であるギニアグラス,ネピアグラスからRbcSをクローニングし,イネへの遺伝子導入を行った.これまで,日本型水稲品種「日本晴」を用いて形質転換イネを作成してきた.日印交雑品種であるタカナリ,モミロマンは多収であり,光合成能力も高いことが知られている.そこで,タカナリとモミロマンにソルガムRbcSを導入して,光合成能力への効果を明らかにすることは重要と考えられる.本年度は,タカナリとモミロマンへのソルガムRbcSの導入を行った.タカナリでは3系統,モミロマンでは多数のソルガムRbcSを高発現する形質転換イネが得られている.RbcSがほぼ全てソルガムRbcSに置き換わった2重形質転換イネで発現するRubiscoを硫安分画,陰イオン交換クロマトグラフィー,ゲル濾過クロマトグラフィーにより精製した.また硫酸イオン存在下で,ハンギング・ドロップ蒸気拡散法により結晶化を行い,X線結晶構造解析を進めている.2重形質転換イネだけでなく,非形質転換イネ,ソルガムについてもRubiscoの精製を行い,X線結晶構造解析を進めている.1年目は新しい形質転換体の作出を多く計画していたが,計画はおおむね予定通りに進んでいる.計画当初はRubisco含量の調節にRNAi法を用いて,トリガー配列を工夫することにより,より効率よくRbcSをノックダウンすることを考えていた.しかし,現在,CRISPR/Cas9法がイネでも可能となったため,CRISPR/Cas9法によるイネRbcSのノックアウトを行うことに計画を変更した.X線結晶構造解析に関しては,実験計画では2重形質転換イネで発現するRubiscoのみ行うつもりであったが,比較のために非形質転換イネやソルガムのRubiscoについても解析を行う必要があると考え,それらの構造解析についても進めている.それら全てについて結晶が得られており,構造の違いも明らかになりつつある.ソルガムRbcS高発現形質転換イネのイネRbcSをCRISPR/Cas9法によりノックアウトすることを試みた.イネRbcSは4つの遺伝子(OsRbcS2-5)が存在し,塩基配列の保存性が高い領域を用いてCRISPR/Cas9のターゲット配列を設計し,ソルガムRbcS高発現形質転換イネに導入した.SDS-PAGEによるRbcSの発現解析を行ったところ,イネRbcSのバンド強度が明らかに低下した系統が複数得られた.塩基配列を解析したところ,系統によりOsRbcS2-5の遺伝子が様々なパターンで変異導入されていることがわかった.3つのRbcSがホモで欠失した系統を得ることができたが,4つ全てが欠損した系統を得ることはできなかった.

ギニアグラス,ネピアグラスからRbcSをクローニングし,イネへの遺伝子導入を行った.形質転換イネのRbcSの発現レベルをSDS-PAGEで解析したところ,導入したRbcSの発現レベルは最大でイネRbcSの30%程度であった.導入したRbcSの発現レベルが多少低いと考え,導入した遺伝子をホモ化した後代を生理解析に用いることとし,育成中である.多収で光合成能力も高い日印交雑品種であるタカナリ,モミロマンにソルガムRbcSを導入した.タカナリでは3系統,モミロマンでは多数のソルガムRbcSを高発現する形質転換イネが得られ,ホモ系統の選抜を行った.RbcSがほぼ全てソルガムRbcSに置き換わった2重形質転換イネで発現するRubiscoを硫安分画,陰イオン交換クロマトグラフィー,ゲル濾過クロマトグラフィーにより精製した.また硫酸イオン存在下で,ハンギング・ドロップ蒸気拡散法により結晶化を行い,X線結晶構造解析を行った.2重形質転換イネのX線結晶構造が明らかとなった.1-2年目は新しい形質転換体の作出を行った.CRISPR/Cas9法がイネでも可能となったため,2年目よりCRISPR/Cas9法によるイネRbcSのノックアウトを行うことに計画を変更した.今回CRISPR/Cas9に用いたターゲット配列で,イネが持つ4つのRbcSを全て欠失させることが可能であることがわかった.現在のところ,4つのうち3つを欠損した系統を得ることができている.タカナリ,モミロマンへのソルガムRbcSの導入は,効率は低いが形質転換イネは得られており,ホモ系統の選抜に進んでいる.材料づくりに時間がかかっているが,着実に研究は進んでいる.X線結晶構造解析に関しては,2重形質転換イネで発現するRubiscoについては,おおよそ解析が終了した.比較のための非形質転換イネやソルガムのRubiscoについても解析を進めている.研究は予定通り進んでいる.ソルガムRbcS高発現・イネRbcSノックアウトCRISPR/Cas9イネの作出に成功し,完全にソルガムRbcSに置き換わったRubiscoを発現し,Rubisco量が適度に減少した系統が得られた.その2重形質転換イネで発現するRubiscoの酵素特性を解析したところ,触媒速度は野生型の約2倍,CO2に対するKmは2.4倍に増加した.つまり,完全なソルガムRbcSとイネRbcLのハイブリッドRubiscoにすることで,酵素特性をC4高活性型Rubiscoに近づけることに成功した.ソルガムRbcSとイネRbcLのハイブリッドRubiscoの結晶構造を2.1Aの分解能で決定した.1.75Aの分解能で決定したイネRubiscoと比較すると,ハイブリッドRubiscoは硫酸イオンの結合数,触媒サイトの構造において違いがあることが明らかとなった.Rubiscoの結晶構造解析からイネRbcSに存在するIle101が,ソルガムRbcSにおいてLeu101となることで,Rubiscoの触媒サイトの構造変化が生じて触媒速度が増加することが示唆された.多収性日印交雑品種タカナリを背景とするソルガムRbcS高発現イネの作出に成功した.この系統の光合成速度はタカナリよりも高い傾向が得られた.ネピアグラスRbcS,ギニアグラスRbcSを高発現する形質転換イネの作出に成功した.いずれもRubiscoの触媒速度は増加することが明らかとなった.しかし,ネピアグラスに関してはイネRbcSと同様に101番目にアミノ酸はイソロイシンであった.