hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
マイオカインとしてのタウリンの代謝調節作用の解明

タウリンは体内に存在するアミノ酸誘導体であり、浸透圧調節作用、抗酸化作用、カルシウム調節作用などを介して、生体の恒常性維持において重要な役割を果たしている。ヒトでは体内に体重の0.1%程度のタウリンが存在し、その約70%が筋肉に存在しており、筋収縮や筋肉でのエネルギー産生において役割を担っているほか、筋肉はタウリンの体内プールとなっていると考えられている。これまでの研究から、運動により筋肉からタウリンが血中に放出され、尿中タウリン量も増加することが示されているが、この現象の生理的意義については不明である。本研究の目的は、タウリンがいわゆるマイオカンとして働き、運動時に筋肉から遊離したタウリンが他の臓器機能に影響を与えることにより、運動による全身効果の一部に関与している可能性を検討することである。1年目の本年度は、運動時の筋肉からのタウリンの遊離(タウリンの減少)を捉えるため、イメージング技術を使用した筋肉でのタウリンの可視化について検討を行った。その結果、マトリックス支援レーザー脱離イオン化イメージング質量分析法(MALDI-IMS)により、ラット筋肉におけるタウリンを可視化に成功した。タウリンのイメージングによる可視化はこれまで報告されておらず、成果は現在投稿準備中である。先行研究の結果と一致し、筋肉においてタウリンは速筋に比べ遅筋に多く存在することを確認した。次に運動による影響を調べるため、トレッドミルにてラットに中程度の運動(20 m/min)を30分から120分負荷し、筋肉中のタウリンを可視化し、半定量的にタウリン量の変化を分析した。ラットヒラメ筋のタウリンは運動後30分から減少し、120分では減少は運動前に比べ有意であった。以上、ラット筋肉中のタウリンをMALDI-IMSにより可視化し、運動による筋肉タウリンの減少を確認することができた。当初の計画では、マウス筋芽細胞(C2C12)を用い、in vitroにて細胞の電気刺激による評価を行う予定であったが、安定した評価系の作製が難しいこと、筋肉の電気刺激が運動のモデルとして妥当かどうか等の点から試験計画を見直し、細胞での評価の実施は中止した。In vivo評価では、筋肉におけるタウリンの組織分布や量的変化を捉えるため、新たな方法としてマトリックス支援レーザー脱離イオン化イメージング質量分析法(MALDI-IMS)を検討し、ラット筋肉におけるタウリンを可視化できることを明らかにした。今後、HPLCなどによる定量法を併せて、本法による筋肉中タウリンの動態評価に使用していく予定である。動物による評価として、タウリントランスポーター欠損マウスの利用を予定しているが、本学における動物飼育設備の状況や欠損マウスの数の確保等の問題があり、現在のところ、実施できる目処は立っていない。代替実験として薬物によるタウリン枯渇動物の作製を考えており、β-アラニンを投与し、組織タウリン量が減少した動物での評価を予定している。これまでの検討により、運動による筋肉からのタウリンの遊離(筋肉からのタウリンの減少)を、イメージング質量分析法にて確認した。今後、筋肉から遊離したタウリンが肝臓や脂肪組織に到達し、エネルギー産生や糖代謝に影響を与えているかどうかを証明する。具体的には、ラットに運動を負荷し筋肉のタウリンが減少した状態で、HPLCなどを使用し主要臓器のタウリン量を測定する。また、臓器のエネルギー産生や糖代謝に関係する遺伝子の発現を調べ、タウリンの関与の可能性について検討を加える。さらに、タウリンを2週間程度投与し、組織中のタウリンが増加した動物における運動の影響、あるいはβ-アラニンを投与し組織タウリン量を減少させた動物における運動の影響を調べ、タウリンがマイオカインとして作用する可能性を検討していく。

以上、ラット筋肉中のタウリンをMALDI-IMSにより可視化し、運動による筋肉タウリンの減少を確認することができた。当初の計画では、マウス筋芽細胞(C2C12)を用い、in vitroにて細胞の電気刺激による評価を行う予定であったが、安定した評価系の作製が難しいこと、筋肉の電気刺激が運動のモデルとして妥当かどうか等の点から試験計画を見直し、細胞での評価の実施は中止した。In vivo評価では、筋肉におけるタウリンの組織分布や量的変化を捉えるため、新たな方法としてマトリックス支援レーザー脱離イオン化イメージング質量分析法(MALDI-IMS)を検討し、ラット筋肉におけるタウリンを可視化できることを明らかにした。今後、HPLCなどによる定量法を併せて、本法による筋肉中タウリンの動態評価に使用していく予定である。動物による評価として、タウリントランスポーター欠損マウスの利用を予定しているが、本学における動物飼育設備の状況や欠損マウスの数の確保等の問題があり、現在のところ、実施できる目処は立っていない。代替実験として薬物によるタウリン枯渇動物の作製を考えており、β-アラニンを投与し、組織タウリン量が減少した動物での評価を予定している。これまでの検討により、運動による筋肉からのタウリンの遊離(筋肉からのタウリンの減少)を、イメージング質量分析法にて確認した。今後、筋肉から遊離したタウリンが肝臓や脂肪組織に到達し、エネルギー産生や糖代謝に影響を与えているかどうかを証明する。具体的には、ラットに運動を負荷し筋肉のタウリンが減少した状態で、HPLCなどを使用し主要臓器のタウリン量を測定する。また、臓器のエネルギー産生や糖代謝に関係する遺伝子の発現を調べ、タウリンの関与の可能性について検討を加える。さらに、タウリンを2週間程度投与し、組織中のタウリンが増加した動物における運動の影響、あるいはβ-アラニンを投与し組織タウリン量を減少させた動物における運動の影響を調べ、タウリンがマイオカインとして作用する可能性を検討していく。当初は、動物の運動実験を福井県立大学にて実施する予定で、トレッドミル購入費用として120万円を計上していた。しかし、実験場所の確保ができない等、本学での運動負荷実験の実施が難しくなったことから、トレッドミルを用いた試験は、研究分担者(東京医大、宮崎照雄)が実施した。また、マウス筋芽細胞を用いた試験を計画し、この試験に必要な備品として細胞用電気刺激発生装置の購入を予定していたが、安定した評価系の作製が難しいこと、筋肉の電気刺激が運動のモデルとして妥当かどうか等の点から、細胞での評価の実施は中止したため、本装置の購入(50万円)を見送った。次年度は、ラットの購入、臓器や血液中のタウリン量をHPLCやイメージング質量分析法により測定するための試薬、また臓器のエネルギー産生などに関連する遺伝子発現や酵素活性を調べるための試薬の購入を予定している。
東南アジアにおける有毒微細藻類の発生と海洋生物の毒化機構

東南アジア各国において、濾過食性二枚貝に記憶喪失性毒の蓄積が認められ、その毒生産微細藻類を探索した結果、Pseudo-nitzschia属など複数の珪藻種が疑われたが、確定するには至らなかった。麻痺性貝毒原因種はPyrodinium bahamenseが継続して広い海域で発生し、中毒事件を引き起こしているほか、Alexandrium属の種が散発している状況が確認された。シガテラ原因底生性渦鞭毛藻も広い海域で発生しており、その広域化機構が今後の大きな研究課題と考えられた。ベトナム中部の南シナ海に面するNha Phu湾において、二枚貝Spondylus versicoloreに蓄積する記憶喪失性貝毒のドーモイ酸の量と、それを生産していると考えられるPseudo-nitzschiaの仲間の珪藻が含まれるプランクトン画分のドーモイ酸の量の定期的観測を、研究協力者のベトナム海洋研究所のDao Viet Ha博士に依頼して行った。後者は検出されないことがほとんどであったが、7月20日のプランクトン試料から微量検出され、それに伴って前者も一週間後に急増して数週高い毒性が継続した。この7月20日に発生していたPseudo-nitzschiaの仲間の珪藻は、透過型電子顕微鏡による観察からP.pungensと同定され、以前確認されていたNha Phu湾に発生する毒生産種と目されるP.cacianthaとは異なる種が毒を生産している可能性があると考えられた。ただ、このときに作製したP.pungensの培養株からは毒生産能力は確認されなかった。7-8月の貝毒化現象の確認以降も定期観測を継続したが、プランクトン、時折微量の毒が確認されただけで、顕著な毒量発現・蓄積はなかった。有毒渦鞭毛藻Pyrodinium bahamenseによって生産された麻痺性毒の貝への蓄積と、その貝を喫食することによる食中毒事件が多発するフィリピンで、水産資源局のJuan Relox Jr.氏と共に、有毒種の広域化の様態を探るため試料と情報の交換を開始したが、2009年はミンダナオ島沿岸の従来有毒種の発生が報告されていなかった海域で、1名の死者を含む8名の中毒事件が起こっていた。また、フィリピン中部の太平洋に面するマラリナオ湾でも2010年3月に同様の中毒事件が起こった。今後、両海域を含め、培養株などを用いて形態と遺伝子形質の分析を開始する予定である。ベトナム中部の南シナ海に面するNha Phu湾において、二枚貝Spondylus versicoloreに蓄積する記憶喪失性貝毒のドーモイ酸の量と、それを生産していると考えられるPseudo-nitzschiaの仲間の珪藻が含まれるプランクトン画分のドーモイ酸の量の定期的観測を9月末まで、研究協力者のベトナム海洋研究所のDao Viet Ha博士に依頼して行った。S.versicolorのドーモイ酸は0-65μg/gの間で大きく変化し、3、6、9月の3回ピークが見られたが、プランクトン画分には8月末にしか検出できなかった。この原因としては、採集し分析できたSpondylus個体数が極めて少なく、個体間のばらつきが大きく影響したと考えられ、プランクトン画分にごく微量のドーモイ酸が見られた8-9月も含めて新たな毒化はなかったと思われた。また、同時期にもプランクトン試料中に毒生産の可能性のあるPseudo-nitzschia属珪藻が認められなかった。また、調査海域も悪天候が続き調査継続が困難であったため、今年度は継続していた調査を9月で打ち切った。フィリピンでは、情報提供依頼をしていた同国水産資源局から、サマール島太平洋岸のマタリナオ湾で有毒渦鞭毛藻Pyrodinium bahamenseによると思われる貝類の毒化現象が起こり、2名の中毒患者が出たことが知らされたが、培養株を作成することができず、研究が実施できなかった。また、マレーシアやインドネシア、タイで発生する有毒珪藻の含まれる資料を集め、種の同定について作業を始めたが、まだ培養株を作成できないため有毒種の確定に至っていない。ただ、これにより今後有毒な珪藻と渦鞭毛藻を集め、生理生態分析を行う基礎資料は集めることができた。ベトナムにおいては中部ニャチャン市に近いNhaP hu湾で、荒天で調査ができなかった9-12月を除き、ほぼ週に1回記憶喪失性貝毒の調査を行ったが、通常最も高い毒性を示すSpondylusの二枚貝ならびにプランクトン試料に毒性が認められなかったため、従来より原因種と考えられているPseudo-nitzschia属珪藻の毒生産性に関する確認が23年度はできなかった。なお、調査期間中に毒検出方法としてELISAによる比色分析法を開発し使用した。

北部ベトナムのハイフォン市に近い沿岸域で、ハプト藻Phaeocystisの一種による大規模赤潮、さらにヤコウチュウNoctiluca scintillansの赤潮発生が確認され、魚類斃死も見られた。これらについては現在水質環境の状態を確認中であるが、近隣の中国沿岸水域の富栄養化が発生に大きく関係しているものと考えられた。シガテラ魚毒による中毒は東南アジア域では2011年度は確認されなかったが、フィリピン、インドネシア、マレーシアなど調査試料を海外研究協力者から入手できた海域から原因微細藻Gambierdiscusの種が発見できた。しかし、これらの試料中の種とG.toxicusとの異同については、G.toxicusのタイプ試料が得られなかったため確認できなかった。これらの試料中にはOstreopsis ovata,O.lenticularis,O.siamensis,Prorocentrumlimaなどの底生性種が多数発見され、これらの種の正確な同定と毒生産能を含めた生理学的解析が必要と考えられた。特に、シガテラ中毒の症状の地域による差異が、Ostreopsis属やProrocentrum属の種の作る毒による影響とも考えられ、本研究で作成した培養株の継続的保存と利用が重要と考えられた。
アニメーション画像に適した電子透かしの開発

情報化社会の進展に伴い,出版,放送,広告,教育等の広範な分野においてその表現手段のディジタル化が着実に進行している。現在、ディジタルマルチメディアコンテンツの著作権保護が世界的な課題となっており、電子透かしはこの問題を解決する主要な技術のひとつとみられている。なかでも、アニメーション画像は、独自のコンテンツが希薄であるといわれているわが国において、例外的に世界市場を席巻するコンテンツであり、その知的所有権の保護はいうまでもなく非常に重要な課題である。本研究課題は、このようなアニメーションを特に対象とした電子透かし手法の研究と開発を目的としている。本研究目的を達成するため、平成15年度には、アニメーション画像が一般的にカラー画像であることに着目し、カラー画像に適した電子透かしの提案を行った。提案手法は、画像の各画素が有する輝度情報と色情報をベクトルととらえ、このベクトルの絶対値と位相成分に埋め込みを行うことで、従来よりも、埋め込み情報量が多く、さらに各種改変に対しても耐性が強い方式である。具体的には、JPEG圧縮や輝度、色差成分の変更を行っても埋め込み情報を正しく抽出できる。なお、平成17年度にはこの方式にさらに改良を加え、埋め込み可能な情報量を増加させるとともにJPEG圧縮に対する耐性を強化することに成功した。平成16年度には、アニメーション画像を含む動画像方式一般に対して有効な電子透かし法の開発を行った。動画像コンテンツの場合、静止画像コンテンツに対して考えられている改ざん行為のほかに動画像独特の改ざん行為を考慮する必要がある。提案、開発した時空間画像埋め込み方式は、動画像に対しても高速に埋め込み処理を行うことが可能であり、また、動画像を構成するフレームの一部が抜き取られたりしても、埋め込み情報を正しく抽出できるという特徴を有している。さらに、これらの動画像をビデオカメラ等で撮影した場合、微小な回転変形が加わることが考えられるが、回転変形が加えられてもその回転角度を正しく推定し、透かしの読み取りを可能にする技術の開発を行っている。平成17年度には、アニメーション画像の輪郭部分に透かしを埋め込む技術の開発と、それに関連して、文字フォントへの電子透かし埋め込み技術についても開発・研究を行った。情報化社会の進展に伴い,出版,放送,広告,教育等の広範な分野においてその表現手段のディジタル化が着実に進行している.現在、ディジタルマルチメディアコンテンツの著作権保護が世界的な課題となっており、電子透かしはこの問題を解決する主要な技術のひとつとみられている.なかでも、アニメーション画像は、独自のコンテンツが希薄であるといわれているわが国において、例外的に世界市場を席巻するコンテンツであり、その知的所有権の保護はいうまでもなく非常に重要な課題である。本研究目的を達成するため、まず、アニメーション画像が一般的にカラー画像であることに着目し、カラー画像に適した電子透かしの提案を行った。次に、アニメーション画像を含む動画像方式一般に対して有効な電子透かし法の開発を行った。

動画像コンテンツの場合、静止画像コンテンツに対して考えられている改ざん行為のほかに動画像独特の改ざん行為を考慮する必要がある。提案、開発した方式は、動画像に対しても高速に埋め込み処理を行うことが可能であり、また、動画像を構成するフレームの一部が抜き取られたりしても、埋め込み情報を正しく抽出できるという特徴を有している。情報化社会の進展に伴い,出版,放送,広告,教育等の広範な分野においてその表現手段のディジタル化が着実に進行している。現在、ディジタルマルチメディアコンテンツの著作権保護が世界的な課題となっており、電子透かしはこの間題を解決する主要な技術のひとつとみられている。なかでも、アニメーション画像は、独自のコンテンツが希薄であるといわれているわが国において、例外的に世界市場を席巻するコンテンツであり、その知的所有権の保護はいうまでもなく非常に重要な課題である。本研究課題は、このようなアニメーションを特に対象とした電子透かし手法の研究と開発を目的としている。本研究目的を達成するため、まず、アニメーション画像が一般的にカラー画像であることに着目し、カラー画像に適した電子透かしの提案を行った。提案手法は、画像の各画素が有する輝度情報と色情報をベクトルととらえ、このベクトルの絶対値と位相成分に埋め込みを行うことで、従来よりも、埋め込み情報量が多く、さらに各種改変に対しても耐性が強い方式である。具体的には、JPEG圧縮や輝度、色差成分の変更を行っても埋め込み情報を正しく抽出できる。次に、アニメーション画像を含む動画像方式一般に対して有効な電子透かし法の開発を行った。提案、開発した時空間画像埋め込み方式は、動画像に対しても高速に埋め込み処理を行うことが可能であり、また、動画像を構成するフレームの一部が抜き取られたりしても、埋め込み情報を正しく抽出できるという特徴を有している。さらに、これらの動画像をビデオカメラ等で撮影した場合、微小な回転変形が加わることが考えられるが、回転変形が加えられてもその回転角度を正しく推定し、透かしの読み取りを可能にする技術の開発を行っている。現在、ディジタルマルチメディアコンテンツの著作権保護が世界的な課題となっており、電子透かしはこの問題を解決する主要な技術のひとつとみられている。
腋芽の休眼解除に関する分子機能の解析

エンドウのPsIPT2プロモーター::GUSを導入したシロイヌナズナをオーキシンで処理すると、オーキシンに応答してエンドウ組織内と同様な時間経過でGUS mRNAが減少した。この形質転換体は、実生全体がGUS染色されるが、オーキシン濃度が高く、常に伸長している根端はGUS染色されない。そこでこの系を用いて、PsIPT2遺伝子のオーキシンによる転写抑制機構を解析するために、プロモーター約2kbを全領域にわたって順次100baseずつ欠失させたプロモーターを作製した後、GUS遺伝子と融合させたDNAを構築し、この改変PsIPT2プロモーター::GUSをシロイヌナズナに導入して形質転換体を作製した。これらの形質転換体の解析を行ったところ、転写開始点から-1516から-1598塩基上流の領域を欠失させたプロモーターを導入した形質転換体では、根端もGUS染色されることが分かった。この領域にオーキシンによって転写が抑制されるために必要なシス領域が含まれている可能性が高い。頂芽切除3時間後から茎のサイトカイニンは増加し、12時間後をピークに徐々に減少する。一方、茎のIAAは頂芽切除後減少し、12時間後から徐々に増加してきた。茎におけるサイトカイニンの減少は、新たに頂芽となった腋芽で生合成されたIAAが茎を流れ、PsIPT2の転写を抑制し、サイトカイニン生合成を抑制した結果であるとともに、サイトカイニンを代謝するcytokininoxidase(CKX)の働きにより、サイトカイニンが分解された結果と推測される。そこで頂芽切除12時間後の茎からCKXのcDNAを単離してその発現を解析した。茎からは転写の確認できたCKXが2つ単離された。そのうちの一つのCKXはオーキシンで著しい誘導を受けた。頂芽切除9時間後までCKXは転写が減少するが、18時間後には茎において誘導されることが分かった。新たな頂芽から流れてきたオーキシンによって、誘導されたと考えられた。また無傷の茎をTIBA処理すると下位の茎でのCKXの転写は検出できなくなった。頂芽優勢は頂芽が腋芽の成長を抑制し、優先的に成長する相関現象である。オーキシンにより腋芽の成長が抑制され、サイトカイニンにより腋芽の成長が促進されると考えられてきたが、その分子機構は明らかにされていない。これまで解析した結果、茎を求低的に流れるオーキシンが茎におけるサイトカイニン生合成の律速酵素adenylate isopentenyltransferase(IPT)の発現を抑制しているために、サイトカイニンが生合成されず、腋芽が成長を開始できないという結論に至った。そこで、オーキシンによるIPTの発現抑制の分子機構を明らかにするために、エンドウからPsIPT遺伝子のプロモーターを単離し、そのオーキシンに対する応答性の解析を行った。エンドウのPsIPT2プロモーター::GUSを導入したシロイヌナズナでは、GUSが植物体全体で発現するが、オーキシンで処理すると、オーキシンに応答してエンドウ組織内と同様な時間経過でmRNAが減少した。そこでこの系を用いて、PsIPT2遺伝子のオーキシンによる転写抑制機構を解析した。まず、プロモーター約2kbを全領域にわたって順次100baseずつ欠失させたプロモーターを作製した後、GUS遺伝子と融合させたDNAを構築し、この改変PsIPT2プロモーター::GUSをシロイヌナズナに導入して形質転換体を作製した。この形質転換体は次年度解析する。PsIPT2はエンドウでは、頂芽切除後の茎でしか発現しないが、シロイヌナズナに導入すると根端以外のほとんどの器官で発現する。この現象が、実験系がヘテロなために起こっているか否かを確かめるために、エンドウにおけるPsIPT2とPsIPT1の発現をさらに詳細に調べた。根ではPsIPT2もPsIPT1もほとんど発現していない。頂芽切除後の根でも発現していないが、根を切片にした後に、オーキシンfreeなbufferで振とうし、根の組織に含まれるオーキシンを減少させると、根切片でも、PsIPT2もPsIP1も誘導されることが明らかになった。つまり、エンドウにおいてもオーキシンが減少すれば根でもPsIPT2が発現する能力を持っている。これらのことは器官や植物種にかかわらず、オーキシンがPsIPT2とPsIPT1のnegative regulatorであることを意味している。

この領域にオーキシンによって転写が抑制されるために必要なシス領域が含まれている可能性が高い。頂芽切除3時間後から茎のサイトカイニンは増加し、12時間後をピークに徐々に減少する。一方、茎のIAAは頂芽切除後減少し、12時間後から徐々に増加してきた。茎におけるサイトカイニンの減少は、新たに頂芽となった腋芽で生合成されたIAAが茎を流れ、PsIPT2の転写を抑制し、サイトカイニン生合成を抑制した結果であるとともに、サイトカイニンを代謝するcytokininoxidase(CKX)の働きにより、サイトカイニンが分解された結果と推測される。そこで頂芽切除12時間後の茎からCKXのcDNAを単離してその発現を解析した。茎からは転写の確認できたCKXが2つ単離された。そのうちの一つのCKXはオーキシンで著しい誘導を受けた。頂芽切除9時間後までCKXは転写が減少するが、18時間後には茎において誘導されることが分かった。新たな頂芽から流れてきたオーキシンによって、誘導されたと考えられた。また無傷の茎をTIBA処理すると下位の茎でのCKXの転写は検出できなくなった。
増殖活性誘導を利用した進行尿路上皮癌の抗癌化学療法効果増強

抗癌化学療法薬剤投与スケジュールについての基礎的検討ではヒト膀胱由来培養細胞KU-7を標的細胞として各種濃度のMTXを添加培養した際のフローサイトメトリーによるBrdU/DNA二重解析より検討した細胞増殖動態の観察ではMTXの濃度依存的(0.1-50mcg/ml)かつ経時的に細胞のBrdU標識率は増加した。そこでMTX,VLBの2薬剤を選択し,それぞれ単独,MTX全投与VLB接触,MTX,VLB同時投与の4群で薬剤の初期投与72時間後における殺細胞効果をcristal violetdye exclusion法により検討するとMTX前投与VLB接触群に2剤同時投与群に比しより高い殺細胞効果が認められた。膀胱癌組織に対するフローサイトメトリーによるBrdU/DNA二重解析では100例の膀胱癌における検討において55例にDNAaneuploidyを認め,15例のgrdae-1腫瘍の内4例に,一方24例のgrade-3膀胱癌の23例にDNA aneu-ploidyが認められた。膀胱癌100例の平均BrdU標識率は9.6±7.9%であり,これをgrade別に検討すると,grade-1で4.8±3.0%,grade-2で8.5±7.0%,grdae-3では15.7±8.9とhigh-grade腫瘍にBrdU標識率の高値が認められた。一方これを腫瘍深度別に検討すると,表存性腫瘍71例中26例(36.6%)にのみDNA aneuploidyが認められたのに対し筋層浸潤腫瘍では全例DNA aneuploidyであった。さらに表在性腫瘍のBrdU標識率は6.6±5.2%に対し,筋層浸腫瘍のそれは17.2±8.5と有意に高かった(p<0.01)。以上の結果はフローサイトメトリーのDNA ploidy解析ではhigh-grade,high-stage腫瘍においてDNA aneuploidyが高率に認められること,さらにこれらhigh-grade,high-stage腫瘍においてBrdU標識率は高値でありその細胞増殖活性が高いことを示すものと考えらた。局所浸潤膀胱癌に対する術後抗癌化学療法の治療成績では21例の局所浸潤膀胱癌症例に対し,M-VACによる術後補助化学療法施行症例のKaplan-Meier法による3年および5年生存率はそれぞれ38.1%,・28.6%であり,一方,retrospectiveに検討した25例の術後補助化学療法非施行症例の3年生存率は32.0%であり統計学的に有意な差は認め得なかった。浸潤性膀胱癌に対する膀胱温存治療の成績では13例の本法施行浸潤膀胱癌の内2例において治療後の生検で腫瘍の残存が認められたが,他の11例は画像診断,生検および尿細胞診において腫瘍の残存を認めずCRと判定された。これら11例の平均観察期間12.2±3.6カ月(治療開始日より)において,1例を除く10例に腫瘍の再発を認めず生存中であった。本治療施行13例の生存率を検討すると18カ月における生存率は60%であり,CR症例のそれは66.7%であった。また、cisplatinumの抗ガン作用機序として活性化酸素の関与が示唆され、これをコンントロールすることにより副作用の軽減あるいは抗ガン作用の増幅が計れる可能性が示された。さらに、膀胱癌組織においてはかなり高率に顆粒球コロニー刺激因子(G-CSF)受容体を発現しており、これら細胞においてはG-CSF添加によりその増殖性が亢進する可能性が示され、今後治療への応用が示唆された。以上の結果より進行尿路癌に対する細胞の増殖活性誘導により抗ガン効果増強が可能であり、この方法を応用した集学的治療により膀胱温存治療が浸潤性膀胱癌の治療の選択肢として考慮し得るものであると思われたが,今後の長期観察が更に必要であるものと考えられた。

一方これを腫瘍深度別に検討すると,表存性腫瘍71例中26例(36.6%)にのみDNA aneuploidyが認められたのに対し筋層浸潤腫瘍では全例DNA aneuploidyであった。さらに表在性腫瘍のBrdU標識率は6.6±5.2%に対し,筋層浸腫瘍のそれは17.2±8.5と有意に高かった(p<0.01)。以上の結果はフローサイトメトリーのDNA ploidy解析ではhigh-grade,high-stage腫瘍においてDNA aneuploidyが高率に認められること,さらにこれらhigh-grade,high-stage腫瘍においてBrdU標識率は高値でありその細胞増殖活性が高いことを示すものと考えらた。局所浸潤膀胱癌に対する術後抗癌化学療法の治療成績では21例の局所浸潤膀胱癌症例に対し,M-VACによる術後補助化学療法施行症例のKaplan-Meier法による3年および5年生存率はそれぞれ38.1%,・28.6%であり,一方,retrospectiveに検討した25例の術後補助化学療法非施行症例の3年生存率は32.0%であり統計学的に有意な差は認め得なかった。浸潤性膀胱癌に対する膀胱温存治療の成績では13例の本法施行浸潤膀胱癌の内2例において治療後の生検で腫瘍の残存が認められたが,他の11例は画像診断,生検および尿細胞診において腫瘍の残存を認めずCRと判定された。これら11例の平均観察期間12.2±3.6カ月(治療開始日より)において,1例を除く10例に腫瘍の再発を認めず生存中であった。本治療施行13例の生存率を検討すると18カ月における生存率は60%であり,CR症例のそれは66.7%であった。また、cisplatinumの抗ガン作用機序として活性化酸素の関与が示唆され、これをコンントロールすることにより副作用の軽減あるいは抗ガン作用の増幅が計れる可能性が示された。さらに、膀胱癌組織においてはかなり高率に顆粒球コロニー刺激因子(G-CSF)受容体を発現しており、これら細胞においてはG-CSF添加によりその増殖性が亢進する可能性が示され、今後治療への応用が示唆された。以上の結果より進行尿路癌に対する細胞の増殖活性誘導により抗ガン効果増強が可能であり、この方法を応用した集学的治療により膀胱温存治療が浸潤性膀胱癌の治療の選択肢として考慮し得るものであると思われたが,今後の長期観察が更に必要であるものと考えられた。まずはじめに,膀胱癌腫瘍細胞における増殖活性をフローサイトメトリーによるbromo-deoxyuridine(BrdU)/DNA二重解析により検討すると,BrdU高標識腫瘍は浸潤性が強くかつ,再発の危険性が高いことが明らかとなった。つぎに,5種のヒト膀胱癌細胞株を使用して,これら癌細胞の増殖活性誘導を試みた。Methotrexate(MTX)0.5-5mcg/ml濃度においては,KU-1,KU-7,NBT-2,T-24,KKいずれの細胞においてもbromodeoxyuridineの標識率が増加し,増殖が亢進された。一方,KU-1,NBT-2,KKの3種の細胞は顆粒球増殖因子(G-CSF)の受容体を発現しており,これら細胞にG-CSFを添加すると増殖率が亢進した。これら結果を基にKU-1,KU-7細胞に対し0.5mg/ml濃度のMTXを前処置した後0.05mcg/ml濃度のvinblastine(VBL)を添加した群と,同濃度のMTX,VBLを同時投与した群とにおける殺細胞性を比較検討した。その結果MTX前投与VBL接触群においてMTX,VBL同時投与群に比し高い殺細胞効果が認められた。
群作用とフレイムド多様体

閉π-多様体のボルディズム類が自明か否かについて研究を行った。解明の手法としては、代数および幾何的側面はもちろんのこと解析的側面からの方法を考察したが、得られた結果はつぎのようにいずれも中間的なものである。1.左不変は安定枠をもつコンパクト・リー群Gのボルディズム類の位数については、Ossaが8・9[G]=0であることを示している。先に、2[SO(2n)]=0、[SO(2n+1)]_<(3)>=[Sp(n)]_<(3)>であることを見たが、2成分については今もって未解決である。OssaとHarsh-Pittieの方法を組み合わせることによって、たとえば、4・3[PSp(n)]=0(n〓0mod8)などの部分的結果を得ることができるが、包括的な結果には程遠い。今後の課題として多くの部分が残されている(南)。2.閉π-多様体の同境類の振る舞いはその安定枠にねじれを与えることによって大きく変動する。これに関連して、回転群O(4l+2)の射影群のK群の環構造を、先に発表したPSp(n)の計算に用いた方法で求めたのつぎの題目で発表した(南):3.球面S^3のC^4内の多様体をなすグラフの多項式凸包の様子はC^3内のグラフのときと異なることを、増加部分の次元の高い場合に示した。この結果は、平成8年11月に新潟大学で開催された関数環研究集会で発表した(神保)。4.C^*-部分環の包含関係の表現論が群の表現論のアナロジーとしてどこまで成立するかをいくつかのモデルで検証した。特に、既約表現の同値類の決定や表現の分解の一意性などの表現論的I型性が、どのような包含関係まで成立し得るかについて考察した(河上)。
オヒルギの耐塩性機構の解明と利用

オヒルギの耐塩性遺伝子を同定するために、3種のオミックス技術を活用した。それらは、塩応答性遺伝子の同定とその機能解析、アグロバクテリウムを宿主としたオヒルギcDNAの網羅的な耐塩性スクリーニング、プロテオーム解析による塩応答性たんぱく質の同定である。これらによって選抜された遺伝子のいくつかが、シロイヌナズナに耐塩性を付与することを確認した。前年度までに導入した3種の塩応答性遺伝子(BgARP1,BgZF1,BgLTP)を導入したシロイヌナズナの耐塩性検定を行なった。いずれの遺伝子を導入した系統も150mMNaClを含む培地で野生型に比べて良好な生育が認められた。BgARP1導入系統のマイクロアレイ解析は、予算的に実施が困難であるため、リアルタイムRT-PCR法によって耐塩性シグナルの下流に位置する遺伝子の発現を野生型と比較した。発芽4日後の幼植物を、150mMNaClを含む培地に移植した場合に、組換え系統ではosmotinの発現量が増強されていた。また、発芽1ヶ月後の植物を塩処理した場合には、組換え系統では、野生型で見られる塩処理6時間後のRD29A、RD29B、RD22の一過的な発現量の増加が抑制されていた。また、組換え系統では、塩処理条件下でのK^+イオンの含量が比較的高く保たれていた。これらのことから、BgARP1導入系統では、K^+イオンの恒常性の維持、osmotinの高発現、およびRD29A、RD29B、RD22の過剰発現の抑制により耐塩性を獲得していることが推測された。また、マイクロアレイで同定した塩応答性遺伝子のうち、新たに10種をシロイヌナズナに導入し、T_2種子を得て耐塩性検定を実施した。塩処理したオヒルギのプロテオーム解析から、塩応答性タンパク質としてFBP aldolase、osmotinと新規なタンパク質を見出した。FBP aldolaseとosmotinの発現ベクターを構築してシロイヌナズナに導入した。新たにメタロチオネイン遺伝子(BgMT1)を導入したシロイニナズナで耐塩性の向上が確認された。オヒルギ遺伝子BgZF1を導入した耐塩性シロイヌナズナ系統を塩を含まない条件で栽培した場合のマイクロアレイによる転写プロファイリングを行なった。Z検定で有意水準0.05(両側検定)で有意差があり、かつRatioが3以上の変動を示した遺伝子を7種同定した。それらは、F-box family protein, phosphate translocator-related, zincfinger family proteinと4種のunknown proteinをコードしていた。このように非ストレス下では、組換え体とWTの発現プロファイリングに大きな差異は認められなかった。また、マングローブは重金属耐性が比較的高いことが報告されており、また、各種ストレス耐性機構にはクロストークがあることが報告されているため、オヒルギの耐塩性遺伝子を導入したシロイヌナズナの重金属耐性を調べた。各組換え体を1mM Mn、100μM Cu、75μM Ni、250μM Zn、200μM Co、200μM Fe、300μM Mo、または50μM Cdを含む1/2MS培地に播種して生育を調べたところ、Bg70、BgWRKY1組換え体がWTに比較してMnを含む培地で良好な生育を示した。また、BgMT1導入個体のCu,Ni耐性、BgARP1組換え体のNi耐性が高まっている可能性が示唆された。これらの結果からマングローブの耐塩性と重金属耐性の関連性が示唆された。新たな耐塩性遺伝子を同定するために、オヒルギの11種の塩応答性遺伝子と、2種の塩応答性タンパク質の遺伝子の発現ベクターを構築して、シロイヌナズナに導入した。それらのうち、4種の塩応答性遺伝子と、2種の塩応答性タンパク質の遺伝子を発現する組換え体の耐塩性検定を行なったところ、塩応答性遺伝子のアルミニウム誘導性タンパク質遺伝子ホモログ(BgAIP)、レチクリン酸化酵素遺伝子を導入した組換え体で耐塩性の向上が認められた。また、塩応答性遺伝子のblight associated protein様(BAP)遺伝子と塩応答性タンパク質であるosmotinの組換え体では、50mM NaCl程度の弱い塩ストレスで前処理することで、その後の150mM NaClに対する耐性が著しく増強されることが明らかとなり、耐塩性シグナルが増強されやすい状態になっていることが示唆された。また、塩応答性タンパク質のFBP aldorlase遺伝子を導入した組換え体でも耐塩性の向上が認められた。BgAIP、およびBAP遺伝子組換え体のストレス関連遺伝子の発現を定量RT-PCRで測定したが、野生型と比較して際立った差異は認められず、導入遺伝子が既知の耐塩性シグナル経路へ与える影響はほとんどないと考えられた。これらの組換え体の酸化ストレス、重金属耐性を調べたところ、osmotin組換え体がNiに対して、BAP組換え体がZnに対して耐性の向上が認められた。
新規昇圧物質カップリングファクター6の心肥大・心不全病態形成の役割

Coupling factor 6(CF6)過剰発現(TG)マウスと野生型(WT)マウスを対象とし、運動負荷の施行と胸部上行大動脈と総頚動脈の分岐部に狭窄(TAC)を作成した。運動負荷によりWTマウスでは心肥大と左室短縮率の増加が認められたが、CF6 TGマウスでは不変であった。一方、TACによりWTマウスでは心肥大が認められ、左室短縮率は軽度減少したが、CF6 TGマウスではWTマウスに比較してより著明な心肥大の形成とより著明な左室短縮率の減少が認められた。以上から、CF6は生理的心肥大を抑制し、病的心肥大を促進することにより、心不全の発症・進展に関与する可能性が示唆された。結論: CF6は心収縮力を抑制する作用を有する。CF6過剰発現の生理的心肥大に及ぼす影響CF6過剰発現(TG)マウスと野生型(WT)マウスを対象とし、運動負荷として水泳1日2回(午前、午後)1回90分を5週間月曜日金曜日施行した。5週後の心エコーでは、WTマウスで運動による心肥大と左室短縮率の増加が認められた。しかし、CF6過剰発現マウスでは運動負荷による有意な心肥大と左室短縮率の増加は認められなかった。CF6過剰発現の病的心肥大に及ぼす影響病的心肥大モデルとして、生後7週のCF6過剰発現(TG)マウスと野生型(WT)マウスを対象とし、ケタミン、キシラジンによる腹腔麻酔後、実体顕微鏡下にて胸部上行大動脈横行大動脈を露出、右総頚動脈の走行を確認し、胸部上行大動脈と総頚動脈の分岐部に狭窄(TAC)を作成した。5週後の心エコーではWTマウスではTACにより有意な心肥大が認められ、左室短縮率は軽度減少した。一方、CF6過剰発現マウスではTACにより野生型(WT)マウスに比較してより著明な心肥大の形成とより著明な左室短縮率の減少が認められた。組織学的検討では、CF6過剰発現マウスのTAC群では野生型(WT)マウスのTAC群に比較して個々の心筋細胞の面積は有意に大であった。WTマウスではAkt/phopatidylinositol 3-kinase (PI3K)の亢進と心肥大と左室短縮率の増加が認められたが、CF6TGマウスではAkt/PI3K並びに心肥大と左室短縮率は不変であった。また、WTではinsulin like growthfactor (IGF)-1受容体の発現亢進とリン酸化の亢進が認められたが、TGでは不変であった。また、心組織でmitogen-activated protein kinase (MAPK)のリン酸化の亢進が認められた。一方、CF6 TGマウスではTACによりWTマウスに比較してより著明な心肥大の形成とより著明な左室短縮率の減少が認められた。MAPKのリン酸化は更に亢進していた。
インフルエンザウイルス感染に伴う抗原原罪現象の誘導機序解明

インフルエンザウイルスの2度目以降の感染時に、そのウイルスに対する免疫反応より、初回感染ウイルスに対するそれが優位に誘導される現象が知られている。抗原原罪と呼ばれているが、この現象が誘導される機序と条件は解明されていない。問題は、季節性インフルエンザワクチン接種時に抗原原罪現象が起こることである。当該年度流行株のワクチンを接種しても、昔の流行株に対する免疫応答が誘導されてしまっては、効果が薄い。本研究の目的は、この現象の誘導機序をウイルス学と免疫学の双方の視点から明らかにし、効果的な季節性インフルエンザワクチンの開発や投与法の改善につなげることである。本研究ではまず、インフルエンザウイルス感染マウスモデルを用いて実際に抗原原罪現象が起こることを確認した。現在、中和抗体をハイスループットに解析可能なマイクロニュートアッセイの系を構築中である。また、抗原原罪誘導動物モデルにおけるB細胞の系統(レパトア)解析を行うためのプラットホームを確立するために、マウスを用いて、実際に免疫グロブリン(Ig)遺伝子のレパトア解析を行った。マウスの脾臓細胞からRNAを抽出し、逆転写反応によるcDNA合成後、次世代シークエンサーを用いて免疫グロブリン(Ig)遺伝子を塩基配列を網羅的に決定した。決定された塩基配列をIg blastにて解析し、それぞれの免疫グロブリン(Ig)遺伝子のV、D、Jセグメントの由来を決定した。今後さらに詳細な解析を行っていく予定である。インフルエンザウイルス感染マウスモデルを用いた抗原原罪現象の確認が取れたこと、必要とされる解析のアッセイシステム(マイクロニュートとレパトア解析)の構築が順調であることから、現在までの進捗状況は概ね順調に進展していると考えている。この研究で最も時間がかかると予想されるのは、B細胞の系統(レパトア)解析システムの構築である。現在、データを取得するところまで来ているので、今後データ解析のフローを完成させ、いろいろな条件で抗原原罪を起こしたマウスを解析する予定である。また、抗原原罪誘導マウスにおけるB細胞ポピュレーションの継時的解析を行う予定である。免疫グロブリンのレパトア解析プラットホームの構築に時間がかかることが途中で明らかになってきたため、レパトア解析とB細胞ポピュレーションの継時的解析を行う順番を入れ替えた。そのため、経費のかかる研究内容が次年度以降に集中する事となった。
分子系統解析によるヒゲクジラ類の進化史の研究～適応放散の解明にむけて～

本研究はこれまで謎とされてきた中新世中期におけるナガスクジラ科+コククジラ科を中心とした適応放散の進化史について大量の遺伝子配列の分子系統解析を行い明らかにすることを目的とし、本年度はこれまでの成果をまとめ論文作成に至ることを心がけて研究を実施した。前年度に引き続きより多くの核遺伝子座を単離するべく候補遺伝子座(ADORA3,ADRB2,BDNF,ZFY,vWF,BRCA A2AB,ATP7A)でPCRによる実験を行った。実験の結果、研究対象としたヒゲクジラ類8種のうち一部の種では増幅が確認できたが、全種からの単離は非常に困難であることがわかった。また、ゲノムデータベースから新たに10個の核遺伝子配列を入手し遺伝子配列データ5314bpとさらにミトコンドリアタンパクコード遺伝子10894bpを解析に加えトータル17772bpの遺伝子配列に基づきナガスクジラ科の分子系統解析を行った。その結果、ナガスとザトウの系統2とシロナガス(ニタリ、イワシ)の系統3が姉妹群関係となり90%以上の統計検定値で強く支持された。この系統関係は中新世中期におけるナガスクジラ類の進化を示す興味深い発見といえる。ナガスクジラ科3系統の分子分岐年代を推定したどころ、ミンク系統1がおよそ2300万年前にナガスクジラ科の中で最初に分岐し、それから間もなく系統2と3がおよそ2100万年前に分岐したと推定された。本研究の分子系統解析はこれまで謎とされてきたナガスクジラ科内の系統進化に新たな知見をもたらすと期待される。本年度は研究課題の開始年度であり実験によるデータの収集と解析に先立ちに研究進行上の基盤となる標本収集と既知データの収集及びリストアップを行った。当初研究計画では研究開始序盤からヒゲクジラ類全14種を用いた実験が行われる予定であったが、試料に限りのある数種を除いた8種(ナガスクジラ、ザトウクジラ、シロナガスクジラ、イワシクジラ、ニタリクジラ、ミンククジラ2種、セミクジラ)で分子系統解析に有効となりそうな遺伝子を決定し、最後に全種で配列決定を行う方針で研究を進めた。既知データの収集として私はまずこれまでに哺乳類系統進化研究(Madsen et al.,Nature,2001,409:610-614など)で解析された実績のある遺伝子の配列情報の収集を行った。その結果、核遺伝子配列23個が入手できた。その他の遺伝子についてもデータベースから情報を収集し、本研究課題のデータベース基盤の充実をはかった。年度後半には実験に着手し15遺伝子配列(IRBPなど)でPCRプライマーを設計し遺伝子の配列決定を試みた。初回のPCRで遺伝子増幅に成功し配列決定が行えた遺伝子はRAG1,RAG2,APPの3つであった。これら3遺伝子の配列を分析したところ種内での遺伝的多型状態は見られず種間での変異もある程度観察された。この観察結果からこれら3遺伝子は分子系統解析に用いる遺伝子として適していることが予想された。その他の遺伝子についても現在改めてプライマーを設計し順当に遺伝子の増幅と配列決定を進めているところである。また、今年度より始まった本研究課題の進行とともに前年度まで行っていた研究の研究論文をまとめ19年度中に2報発表した。本年度は大量のミトコンドリアゲノムデータを用いた最尤系統解析法の探索とベンチワークによる核遺伝子データの収集に努めた。ウェブデータベースよりヒゲクジラ類の核遺伝子配列を入手し,ナガスクジラ科7種+セミクジラ科1種のゲノムDNAからPCR法により遺伝子の増幅を試みた。その結果,RAG1,RAG2,APP,IRBP,CNR1,EDG1の6遺伝子の増幅に成功し塩基配列を決定した。決定できた塩基配列はトータルで約4kbとなった。これらの遺伝子座を連結した配列で分子系統解析を行ったところミトコンドリアゲノムの分子系統解析(Sasaki et al.,2005,Syst.Biol.54:77-90)で示唆された3リネージの単系統性が核遺伝子の解析でも改めて支持された。しかしながらシロナガスクジラ+ニタリクジラ+イワシクジラで構成されるリネージの系統関係はミトコンドリアが(シロナガス(ニタリ,イワシ))であったのに対し核遺伝子は(ニタリ(シロナガス,イワシ))となった。この相違に関しては今後さらに核遺伝子の情報を増やして解析しより詳細に分析していく必要がある。実験的データ収集と共に大量遺伝子配列を用いた分子系統解析法の準備も行った。具体的には以前に共同研究で行ったコイ科魚類のミトコンドリアゲノムを用いた系統解析をテストケースにした最尤系統構築法の確立である。この系統解析では数十種のミトコンドリアDNA全長配列を用いており統計計算で処理する量はかつてヒゲクジラ類ミトコンドリア系統解析で行ったそれとは比にならないほど膨大である。ここで私は遺伝子毎の系統構築と各系統樹で得られた尤度の総合評価による系統解析を行う。この方法により既存の配列連結法による系統構築よりもより信頼性の高い系統関係が得られると期待される。

前年度に引き続きより多くの核遺伝子座を単離するべく候補遺伝子座(ADORA3,ADRB2,BDNF,ZFY,vWF,BRCA A2AB,ATP7A)でPCRによる実験を行った。実験の結果、研究対象としたヒゲクジラ類8種のうち一部の種では増幅が確認できたが、全種からの単離は非常に困難であることがわかった。また、ゲノムデータベースから新たに10個の核遺伝子配列を入手し遺伝子配列データ5314bpとさらにミトコンドリアタンパクコード遺伝子10894bpを解析に加えトータル17772bpの遺伝子配列に基づきナガスクジラ科の分子系統解析を行った。その結果、ナガスとザトウの系統2とシロナガス(ニタリ、イワシ)の系統3が姉妹群関係となり90%以上の統計検定値で強く支持された。この系統関係は中新世中期におけるナガスクジラ類の進化を示す興味深い発見といえる。ナガスクジラ科3系統の分子分岐年代を推定したどころ、ミンク系統1がおよそ2300万年前にナガスクジラ科の中で最初に分岐し、それから間もなく系統2と3がおよそ2100万年前に分岐したと推定された。本研究の分子系統解析はこれまで謎とされてきたナガスクジラ科内の系統進化に新たな知見をもたらすと期待される。
医薬品による発がんリスク増加に関わる輸送担体の探索とその評価系の開発

本研究では発がん修飾物質の作用点として発がん性物質の細胞内動態に着目して検討を行なった。その結果、ある種の医薬品(ジヒドロピリジン系カルシウム拮抗薬)や食品成分(クルクミン)が異物排泄トランスポーター、特にBCRPの機能を阻害することで、発がん性物質の細胞内濃度を増加させ、その生理作用を増強していることが示唆された。また、発がん性化学物質の体内動態を予測できる重層モデル実験系の作成に成功した。これを用いて、発がん性化学による遺伝毒性の変化を解析することにより、発がん修飾物質の作用機序の解析や検索に大きく貢献することが期待される。本研究では、「発がん修飾物質」の作用点として、特にイニシエーション過程における増強作用に着目し、「発がん修飾物質」の「発がん性物質の細胞内動態に及ぼす修飾作用」という観点から解析を試みる。初年度は、発がん修飾物質の標的分子の候補として肝異物排出トランスポーター(P-gp、Mrp2およびBCRP)に着目し、これらの機能的阻害、あるいは発現阻害が及ぼす影響を、発がん性芳香族炭化水素化合物(3-メチルコランスレン: MC)に対する応答性の変化を指標として解析した。まず、HepG2細胞に対して上記トランスポーターの特異的阻害剤とMCを複合処理し、MCの細胞内濃度、芳香族炭化水素受容体(AhR)活性化作用、および芳香族炭化水素の活性化酵素遺伝子(CYP1A1)の誘導に及ぼす影響を評価した。いずれの阻害剤を処理した場合にも細胞内MC量およびAhR活性化能の増加が見られたが、その程度はBCRP阻害剤の作用が最も大きかった。また、BCRP阻害剤存在下、MCによるCYP1A1遺伝子の誘導が著しく増強された。さらに、上記肝異物排出トランスポーターの発現阻害(siRNA処理)による影響についても解析を試みた。しかし、siRNAによりある種のトランスポーターの発現を阻害した場合、他のトランスポーターの発現が増加するといった、非特異的な影響が見られ、その影響を明確にすることが残念ながらできなかった。以上、初年度の実験から、発がん性芳香族炭化水素化合物(MC)の細胞内濃度維持に肝異物排出トランスポーターの一種であるBCRPが重要な役割を果たしていることが示唆された。本研究では、化学発がん物質による発がんイニシエーション過程に「発がん修飾物質」が増強作用を示す可能性について、「発がん物質の細胞内動態に及ぼす修飾作用」という点から解析を試みている。初年度の研究結果から、異物排泄トランスポーターBCRPの阻害剤処理により、発がん性芳香族炭化水素の細胞内濃度が増加し、芳香族炭化水素受容体(AhR)の活性化能や発がん性発揮に関わる遺伝子の誘導が増強されることが示されたため、この阻害作用がBCRPに起因するかを明確にするための実験を試みた。前年度、BCRPをはじめとするトランスポーター類のsiRNA処理による発現阻害系が不完全であったことを踏まえ、CRISPER/Cas9システムによる輸送担体欠損細胞の樹立に取り組んだ。一部についてはベクターを構築し、細胞に導入したところ、DNA二重鎖切断が原因と思われる強い細胞死を惹起することには成功したものの、結果として遺伝子欠損細胞の樹立には至らなかった。そこで現在、トランスポーターの発現プロファイルが異なる複数の細胞株を用いて、複合影響の有無を比較・検討している。またさらに、増強作用を示す化合物の特徴付けを試みた。その結果、発がん修飾候補物質(Nicardipine(NIC)、Curcumin(CUR))あるいはBCRPの阻害剤(Ko143、Ko134)はいずれもある種の発がん性化合物によるヒトAhR活性化を相乗的に増強したが、ある種の化合物に対しては相乗的な作用を示さなかった。発がん修飾候補物質(NICやCUR)とBCRP阻害剤による相乗作用を示す化合物のプロファイルが類似していたことから、発がん修飾候補物質もBCRPを阻害することで、ある種のAhR活性化剤の細胞内濃度を増加させ、それに引き続く毒性発現を増強している可能性が示唆された。本研究では、化学発がん物質による発がん、特にイニシエーションの過程の増強作用を示す「発がん修飾物質」の作用機序について、発がん性物質の細胞内動態に着目して検討を行っている。昨年度までの本研究から、発がん修飾物質はヒトHepG2細胞に発現している異物排出トランスポーター(P-gp、Mrp2およびBCRP)を阻害することで、ある種の発がん性化学物質の細胞内濃度を増加させ、その遺伝毒性を増強させている可能性が示唆された。そこで本年度は、3-メチルコランスレン(MC)を発がん性化学物質として、また、医薬品であるニカルジピン(Nic)を発がん修飾候補物質として、これらの複合処理が発がんにつながる細胞応答(AhR活性化およびAhR標的遺伝子の発現誘導)が、HepG2細胞に特異的であるかを、種々ヒト細胞株を用いて検討した。その結果、HepG2以外にも、Caco-2、MCF7、Hela、Ishikawaなど多くの細胞株で、NicはMCの作用を増強した。しかし、ヒト肺がんA549細胞では、Nicによるこの増強作用はほとんど見られなかった。これらの結果から、A549細胞に対してNicは発がん修飾物質とはならないことが示唆された。今回使用した細胞株間での異物排出トランスポーターの遺伝子発現プロファイルは若干異なっていたが、A549細胞におけるは顕著な発現低下は報告されていないことから、異物排出トランスポーターとは異なる分子が、Nicの発がん修飾作用発現に関わっている可能性も示唆された。