hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
水曜海山に生息する核膜構造が不完全な深海微生物の系統進化学的解析

従来、ドミノ移植では、ドナー由来のアミロイドの沈着は数年から数十年の単位で起こると見込まれてきたものの、ALMDを用いた本研究成果により、移植後わずか1年で初期アミロイドの沈着は生じており、これがシードとなって、レシピエントにアミロイドーシスを発症させるメカニズムを明らかにした。原核生物と真核生物をつなぐ生き物はこれまで見つかっておらず、所謂進化のミッシングリンクと呼ばれている。小笠原沖水曜海山深海底は極めて生物の多様性に乏しいことから、我々は、本海域に当該生物の存在を求めて深海底調査を行った。得られたサンプルのうち、環形動物門多毛類のウロコムシに寄生する深海微生物には、核膜構造が不完全な形態を有するものがいることを見出し、電子顕微鏡による形態観察ならびにレーザーマイクロダイセクション法で摘出して系統進化学的解析を行うことを目的に本研究を行った。本年度においては、おもにレーザーマイクロダイセクション法で得られたサンプルの質量分析手法の改良を目的として、蛋白質可溶化手法の開発を行った。蛋白質の可溶化手段として、申請者らが見出した蛋白質多量体Unfoldinを用いると、高効率な可溶化活性が得られるが、安定したUnfoldinの回収は困難であったため、この理由を調べたところ、アミノ末端側36/37の箇所で切断されている分子とそうでない分子が存在することを見出した。本切断箇所は、ミトコンドリアシグナルペプチターゼIcp55による切断箇所と一致することから、ミトコンドリアに移行して切断を起こした分子は本活性を有さないこと、一方、細胞質側で発現しており全長を有するものは多量体を形成して蛋白質可溶化活性を呈すること(Monkawa et al., MOJ Cell Science Report)を明らかにした。また、高効率な蛋白質可溶化活性を呈しているのはN末端側が保持されている分子のみであることもあわせて明らかにした。平成28年度における申請者の所属機関の移動により、新規研究環境の立ち上げに時間を要し、研究の進捗に影響してしまったため。【目的】原核生物と真核生物をつなぐ形態を有する生物は見つかっていないので,進化の過程において既に淘汰されてしまったか,あるいは,採取困難な場所に生息しているか,であろう。本研究は,後者の可能性を見込み,深海底から採取した微生物を用いて当該生物を見出すこと,さらに,当該生物の単離において極微小領域を摘出可能な実験手法(改良型レーザーマイクロダイセクション法)を新規に構築すること,を目的とした。【方法】伊豆・小笠原諸島の水曜海山付近の深海底は生物の多様性が比較的乏しいことから,当該生物が存在する可能性も少なからずあると考え,2007年5月に海洋研究開発機構による深海底調査(NT-07-08)を行い,深海ウロコムシ,イソギンチャク,ヒバリガイの採取を行った。採取後,船上にてグルタルアルデヒドによる電顕観察用固定,凍結切片用固定,ならびに生化学的解析用の凍結サンプルを作成した。これらのサンプルを用い,透過型電子顕微鏡観察による網羅的なスクリーニングを行った。
植物における細胞膜信号伝達分子のレドックス調節機構の解明

生体内で還元調節を仲介する分子の一つであるチオレドキシンは、分子量1万2千の小さなタンパク質で、他の酵素のジスルフィド結合を還元することで活性を制御する。本研究はチオレドキシンにより還元調節される膜タンパク質分子のスクリーニングで、我々が新たにチオレドキシン標的候補として、同定した分子のうち、細胞機能の重要性から、細胞膜アンカー型カルシウム依存キナーゼに焦点を絞り、この酵素の還元調節機構を生化学的に解析した。その結果、この酵素は酸化により活性が抑制され、チオレドキシンで特異的に還元されると活性が回復すること、酸化型分子では97番目と108番目のシステイン残基が分子内ジスルフィド結合しており、チオレドキシンはこの結合を還元・解離することが示された。この細胞膜アンカー型カルシウム依存キナーゼ分子の酸化と還元が細胞内で実際に起こることをシロイヌナズナ培養細胞で調べ、この酵素が通常は還元型であるが、過酸化水素を与えた場合に細胞内で酸化されることを明らかにした。このような現象が植物細胞や個体レベルで実際に起こることを確かめ、その生理的役割を明らかにするため、野生型遺伝子とシステイン97と108をセリンに置換した変異遺伝子それぞれでシロイヌナズナを形質転換し、過剰発現体を得た。この形質転換植物の表現型をさまざまなストレス条件下で解析した結果を現在論文投稿中である。本研究はチオレドキシンにより調節を受ける膜タンパク質分子を探索し、得られた分子を生化学的に解析することで、チオレドキシンによる還元制御の仕組み、その生理的意義を明らかにすることを目的とする。シロイヌナズナ培養細胞の細胞膜画分を界面活性剤で可溶化し、チオレドキシン変異体固定化担体カラムに供与して、アフィニティークロマトグラフィーを行った。新たに同定した分子には、細胞膜アンカー型分子である、カルシウム依存キナーゼとホスホイノシチド特異的リパーゼが含まれていた。本年度は、カルシウム依存キナーゼのチオレドキシンによる還元調節を生化学的に解析した。その結果、この酵素は酸化により活性が抑制されるが、チオレドキシンで還元すると活性が回復することが分かった。酸化型分子では97番目と108番目のシステイン残基が分子内ジスルフィド結合しており、チオレドキシンはこの結合を還元・解離することを明らかにした。くわえて、このカルシウム依存キナーゼ分子の酸化と還元が細胞内で実際に起こるか確かめるため、シロイヌナズナ培養細胞に様々なストレスを与え、酸化型あるいは還元型の分子が現れるかを調べた。そして、ストレスを与えない条件ではカルシウム依存キナーゼは還元型であるが、過酸化水素を与えた場合にこの分子が細胞内で酸化されることを見出した。現在は、過酸化水素にくわえて他条件でも酸化型が現れるかを調べている。これらの研究から、細胞膜アンカー型カルシウム依存キナーゼの還元調節がどのような生理的役割をもっているのかを明らかにしたい。

その結果、この酵素は酸化により活性が抑制され、チオレドキシンで特異的に還元されると活性が回復すること、酸化型分子では97番目と108番目のシステイン残基が分子内ジスルフィド結合しており、チオレドキシンはこの結合を還元・解離することが示された。この細胞膜アンカー型カルシウム依存キナーゼ分子の酸化と還元が細胞内で実際に起こることをシロイヌナズナ培養細胞で調べ、この酵素が通常は還元型であるが、過酸化水素を与えた場合に細胞内で酸化されることを明らかにした。このような現象が植物細胞や個体レベルで実際に起こることを確かめ、その生理的役割を明らかにするため、野生型遺伝子とシステイン97と108をセリンに置換した変異遺伝子それぞれでシロイヌナズナを形質転換し、過剰発現体を得た。この形質転換植物の表現型をさまざまなストレス条件下で解析した結果を現在論文投稿中である。
１細胞内環境の特徴を有するナノチャネルを用いた細胞死に関わる生体分子の１分子計測

本研究では、細胞死を1分子精度1細胞レベルで定量的に理解するために、1細胞分析に最適かつ1細胞内環境の特徴を有するナノチャネルを用いて、細胞死に関わる最も重要なタンパク質の1つであるシトクロムc(cytochrome c)の1分子計測法を開発する。外部で未発表のため詳細はここでは割愛するが、本年度は、昨年度に確立した技術で作製した1分子計測ナノ流体チップを用いて、提案の手法に基づいて、検出濃度の検討に取り組み、シトクロムcの1分子検出に成功し、本研究の目的をほぼ達成した。さらに、長時間・高コストをかけて作製した1分子計測チップを繰り返し使用するため、昨年度末に検討を始まった1分子計測チップの再生方法に関して、今年度は6段階熱化学的分解による再生工程を最適化して確立した。一度使われた1分子計測チップが再利用できるようになり、1分子計測チップのみならず、ナノ流体デバイスに関する研究の効率面及び経済面を促進した。この結果は、化学マイクロ・ナノシステム分野で最高峰の学術誌であるLab on a Chipに発表され、さらに裏表紙(Issue 15、2015)を飾った。また、超微量の1細胞内容物(ピコリットルレベル、pL = 10ー12 L)をハンドリングするために、フェムトリットル(fL = 10ー15 L)レベルの流体を自在に制御する技術を確立した。この研究成果は、シトクロムcの1分子計測チップを用いた1細胞内容物の網羅的な分析に利用できるだけではなく、化学、バイオなどのプロセスに画期的な革新をもたらすと予想される。27年度が最終年度であるため、記入しない。本研究は、細胞死を1細胞かつ1分子レベルで定量的に理解するため、1細胞分析に最適かつ1細胞内環境の特徴を有するナノチャネルを用いて、細胞死に関わる最も重要なタンパク質の1つであるシトクロムc(cytochrome c)の1分子計測法を開発する。アポトーシスにおけるシトクロムcを1細胞かつ1分子レベルで定量することは、細胞死を起こす原点の究明に迫り、細胞死の初期段階における化学反応様式の定量的な理解を可能とし、ナノメディシン研究目標である細胞環境における分子反応への理解の推進に大きく貢献できる。平成26年度では、シトクロムcの1分子計測チップを設計し、その作製条件を検討した。実験で明らかにした作製条件に基づいて、独自に開発したガラスナノチャネルの低温または室温接合法(従来は高温1000°Cが必要)とナノチャネルで光の回折限界を超える自在なナノパターニング法、という二つの世界初の技術を利用し、シトクロムcの1分子計測チップの作製ができた。さらに、このチップを用いて、シトクロムcの1分子計測の全ステップを試し、提案した手法に基づくシトクロムcの1分子計測に関する知見が得られ始めている。平成26年度は、研究実績の概要でも述べたように、シトクロムcの1分子計測チップの作製のために必要かつ不可欠である条件を明らかにするとともに、シトクロムcの1分子計測チップを用いてシトクロムcの1分子計測の全ステップを行っており、若干の方針の変更はあったものの、当初の目的はほぼ達成した。また、チップの作製はプロセスが多く大変時間がかかるが、一つのチップは一度の実験しかできない。再利用ができないため、シトクロムcの検量線を明らかにするには、たくさんのチップの作製が必要である。計画スケジュール通りにプロジェクトを推進するために、当初の計画を推進しながら、シトクロムcの1分子計測チップの再生方法を提案し、実験で検討した。外部で未発表のため詳細はここでは割愛するが、チップの再生条件を明らかにし、作製したチップを三回以上再利用可能とした。この手法は、シトクロムcの1分子計測チップに限らずに、あらゆるガラスナノ流体チップに適合していると考えられ、未熟なnanofluidics分野をより効率的・エコ的に発展させることに貢献できると期待される。

従って、平成26年度は、当初計画以上に進展していると言える。27年度が最終年度であるため、記入しない。平成27年度は、シトクロムcの1分子計測チップを用いてシトクロムcの1分子検出の確認、検量濃度範囲の確定、任意濃度のシトクロムcの1分子計測に取り組む。具体的には、シトクロムcや、シトクロムc捕捉用抗体、シトクロムc検出用抗体を使用し、提案の手法に基づくシトクロムcの1分子検出の原理をポアソン統計理論よりさらに確認する。また、様々な濃度のシトクロムcを用いて実験を行い、1分子計測の濃度検出線形範囲を確定する。さらに、確定した1分子計測の濃度検出線形範囲に基づいて、任意濃度のシトクロムcの検出を行う。許研究室HPには本研究の最新の研究結果に関して随時を発信しています。
極微磁性多層膜細線のメゾスコピック磁化過程制御

軟磁性層、非磁性層、硬磁性層からなる金属磁性多層膜に微細加工を施すことにより、クォーターμmオーダの磁性多層膜細線を作製し、強い形状磁気異方性に起因する特異な磁化過程の詳細を明らかするとともに、その磁性ランダムアクセスメモリ(MRAM)への応用に関する基礎検討を行い以下のような成果を得た。1)電子ビーム露光条件、イオンミリング条件等の最適化を図ることにより最小線幅0.2μmの磁性多層膜細線作製プロセス、及び極微領域における巨大磁気抵抗効果測定のための極微電極形成技術を確立した。2)磁性超薄膜における膜構造の不連続性を数値モデル化したマイクロマグネティクスシミュレーションにより、結晶粒間の交換結合や静磁気相互作用等の材料パラメータと、磁性細線の磁化反転様態や磁化反転時のエネルギー障壁との相関を明らかにした。3)磁性多層膜細線と局所磁界発生用極微導体パタンを備えた評価素子を作製し、導体電流磁界によるサブμm^2領域の局所磁化反転を磁気抵抗測定により検証した。また、このようなメゾスコピックな磁区制御が新しいMRAM記憶方式に応用できることを基本動作実験により検証した。
厚さ方向に単一粒子から成るイオン導電体薄膜における粒界伝導の直接測定

標記課題について,昭和6162年度にわたり研究し,以下の成果を得た.1.当初意図した薄膜の厚さ方向に単一粒界をもつ試料の作製は,装置上の制約と対象としたイオン導電体の性質から極めて困難であることが判明した.したがって,薄膜の電気的性質を詳細に検討することにより,新しい知見を集積し,その結果を系統的に解析することに重点をおいて研究を進めた.2.イオン導電体としては,当研究室において研究実績のあるNasiconと水酸アパタイトを対象としたが,製法の容易さ,組成制御のし易さ,高純度で微粒子が得られる点等を勘案して,水酸アパタイトに重点をおいて実験を行った.3.水酸アパタイトは,中高温においてプロトン又は水酸イオンが電荷担体となるイオン導電性を示すが,室温付近では表面伝導に基づくプロトンイオン導電性を示すことが,直流・交流電気伝導度測定,昇温脱離法による水の分析及びSEMによる組織観察を総合的に検討することにより確かめられた.4.試料の表面を湿式或いは乾式法により化学的に処理することにより,表面伝導度を大きく変化させ得ることがわかった.これは表面水酸基と物理収着した水の量が変化するためであることが明らかにされた.5.400°C程度の温度領域においては,水酸アパタイトの表面伝導度は空気中の水分とともに炭酸ガスの濃度にも依存することが確認された.種々の条件で処理した試料表面をXPSを用いて系統的に分析した結果,この電気伝導度の変化は,表面水酸基又は表面近傍の結晶内部の水酸基が可逆的に炭酸ガスと置換し,そのことにより表面伝導度が大きく影響されることによると推定された.標記課題について,昭和6162年度にわたり研究し,以下の成果を得た.1.当初意図した薄膜の厚さ方向に単一粒界をもつ試料の作製は,装置上の制約と対象としたイオン導電体の性質から極めて困難であることが判明した.したがって,薄膜の電気的性質を詳細に検討することにより,新しい知見を集積し,その結果を系統的に解析することに重点をおいて研究を進めた.2.イオン導電体としては,当研究室において研究実績のあるNasiconと水酸アパタイトを対象としたが,製法の容易さ,組成制御のし易さ,高純度で微粒子が得られる点等を勘案して,水酸アパタイトに重点をおいて実験を行った.3.水酸アパタイトは,中高温においてプロトン又は水酸イオンが電荷担体となるイオン導電性を示すが,室温付近では表面伝導に基づくプロトンイオン導電性を示すことが,直流・交流電気伝導度測定,昇温脱離法による水の分析及びSEMによる組織観察を総合的に検討することにより確かめられた.4.試料の表面を湿式或いは乾式法により化学的に処理することにより,表面伝導度を大きく変化させ得ることがわかった.これは表面水酸基と物理収着した水の量が変化するためであることが明らかにされた.5.400°C程度の温度領域においては,水酸アパタイトの表面伝導度は空気中の水分とともに炭酸ガスの濃度にも依存することが確認された.種々の条件で処理した試料表面をXPSを用いて系統的に分析した結果,この電気伝導度の変化は,表面水酸基又は表面近傍の結晶内部の水酸基が可逆的に炭酸ガスと置換し,そのことにより表面伝導度が大きく影響されることによると推定された.厚さ方向に単一粒子あるいは数粒子から成る水酸アパタイト焼結膜を作製し、その組織・構造を調べるとともに微小電極を付与して、その電気伝導度を測定した。実験に用いた試料は炭酸カルシウムとリン酸から常法に従って調製し、沈殿物を凍結乾燥した後、所定温度で仮焼して得た。粒子は球状で直径0.20.3μmであった。これを有機系樹脂、溶媒および可塑剤と均一に混合してスラリーとした後に、ドクターブレード装置を用いて製膜した。未乾燥時の膜厚を100500μm程度の範囲で変化させ、種々の条件を検討した。溶媒揮発後の乾燥膜の膜厚は30200μm程度であった。これを適当な大きさに切断断して、電気炉中にて有機系樹脂を飛散後本焼成を行った。現段階では厚さ方向に単一粒子あるいは数粒子から成る膜は、水酸アパタイトの粒成長が遅いこともあって得られていない。しかし、原料粉体の調製条件やスラリーへの分散状態等を検討することにより、単一粒子から成る膜を得ることも可能になると予測される。焼結後の膜厚が50100μmの膜に関しては、電子顕微鏡観察・ESCAによる表面分析あるいはIRやX線による同定等を行った後、微小電極を付与して電気伝導度を測定した。その過程で当初予測しなかった空気中の水蒸気や炭酸ガスが試料の電気伝導度に影響を及ぼすことが確認された。水酸アパタイトの表面には、水酸基が存在しているが400°C以下の温度では吸着した水分子も微量存在して、それが電気伝導度に関与していることが示唆されている。これは電気伝導度の温度依存性、電流一電圧特性、湿度による影響等から、イオンによる伝導が支配的であることから言える。更に、表面にハロゲン化物などの異物質を添加することにより、電気伝導度や雰囲気依存性を著しく増大させることも可能で、今後粒界伝導に加えて表面伝導を考慮した系統的実験を行う予定である。
地球環境保全を基盤においた森林資源利用のあり方に関する総合研究

太陽エネルギーを有効に利用してCO_2と水から生産される木質資源は、利用においては建築や家具の材料として生活空間に安全な構造と優れたアメニティーをもたらし、さらにパルプや紙の原料となるほか、最近ではバイオマスとして飼料、燃料、糖質など人間生活のあらゆる分野に使われている。木質はまた生態環境の中で公益的に生産され、加工や廃棄に際しても無公害で、しかも、生産・利用・廃棄・再生産の理想的な循環系をもっている人類の生存にかかわる未来型の資源である。この研究では、これら木質資源の循環系のあらゆる局面における問題点を洗いだし、地球未来的観点にたってその合理的な解決方法を考え、『木質資源の理想循環系の確立』を旗印にその科学的な方法論を明らかにする目的で計画された。取り組んだ研究内容は、(1)汚染された大気を効率良く浄化する機能、耐火性や耐生物劣化性などをもち、かつ、樹幹成長率が極端に良い特性遺伝子を発現するような新品種の創成とその育林技術の確立、それによる生態系の攪乱の可能性評価と沈静技術の模索、(2)早生樹種の省エネルギー的で高歩留まりな加工と利用方法の確立、廃材・未利用植物繊維等の建築材料やバイオマスとしての有効利用、(3)木質環境の生活空間としての医学的、情操発育的見地からの評価、さらにはエネルギー的、耐久的見地からの評価など、未来における居住空間の在り方の探求と提言、(4)地球規模で森林生産と木材利用の調和を保つための国際協力の在り方とその問題点解決の提案、などを含んでいる。今後、これらの内容をより深く検討し、医、理、工その他の分野の研究者に呼びかけて、時期をみて『重点領域研究』として申請していきたい。
4配位ホウ素を組み込んだ共役系化合物の研究

ジピリルメテン-ボラン錯体は蛍光プローブとして有用であり、各種誘導体が市販されている。しかしながら、従来の合成法ではホウ素の導入を塩基存在下、フッ化ホウ素エーテル錯体との反応により行うため、置換基の導入は炭素骨格部位に限定されていた。そこで本研究では、従来の合成法とは異なる方法として、(1)ホウ素上にフッ素以外の置換基を導入する、(2)メチン部位に種々の置換基を導入するための脱離基を導入する、ための条件検討をそれぞれ行った。ホウ素の置換基としてブロモ、エチル、あるいはエトキシ基を導入する反応を行った。ジピリルメテン塩酸塩に対し2当量のブチルリチウムを作用させてアニオン種を発生させ、種々のホウ素化合物と反応させた。この結果、スペクトルデータに基づき構造の確認を行ったが、単離精製には至っていない。メチン部位への置換基の導入法として、従来塩化ベンゾイル誘導体を用いてジピロメタン骨格を合成し、脱水素反応-ホウ素導入により錯体を得る方法が用いられてきた。本研究ではメチン部位に優れた脱離基であるトリフラートを導入し、カップリング反応を用いて種々の置換基を導入する方針をとった。そこで今回、前駆体であるジピリルケトンの合成法を改良し、トリフラートヘの誘導を試みた。ケトンの合成法として、ピロールとホスゲンあるいはチオホスゲンとの反応が従来行われてきた。今回開発した方法では、まずピロールに臭素を導入し、次いでアニオン種をin situで発生させてカルバミン酸エステルとの反応を行い、高収率でジピリルケトンを得た。ジピリルケトンとトリフルオロメタンスルホン酸無水物との反応を各種溶媒中において行ったところ、何れの条件においても原料の消失は確認されたが、目的とするトリフラートの生成は認められず、タール状物質が得られた。酸による重合と考えられるため、適当な塩基により錯体の合成は達成できるものと考えられる。アズレンと等電子構造であるピロール縮環ボレピンの2種類の異性体(ピロールの2.3位および3,4位でそれぞれ縮環した化合物)について新たに設計・合成を行った。ピロールの2.3位および3,4位に置換基を持つ化合物の合成法は大きく異なり、今回新たに合成方法の開発を行った。合成したピロール縮環ボレピンについて以前に合成されているチオフェン縮環ボレピン誘導体とともに、スペクトル解析に基づいて構造・物性の比較検討を行った。その結果、(1)いずれの分子もヘテロール環部分が正、ボレピン環部分が負となった分極構造を取り、ボレピンが共役系を通し電子受容性基として有効に働いている。(2)ヘテロールの種類、あるいはヘテロールの縮環部位の違いによって、ホウ素共役系の電子状態や電子受容性などの性質が大きく異なってくる。(3)ヘテロールの3,4位で縮環した化合物について励起状態において分極が著しく大きくなり、ホウ素が基底状態に比べ励起状態において炭素共役系と有効に相互作用することを示す結果が得られた。さらにホウ素部分でのLewis酸性を検討するためにアミンとの錯形成反応を行った結果、ヘテロール部分の違いによりアミンとの錯形成の平衡定数に数千倍の差が見られた。また励起状態において2,3位縮環系と3,4位縮環系との間でホウ素部分の電子状態の変化に差が認められることから、光エネルギー移動を始めとした励起状態での性質の違いが現れる可能性がある。以上の様に10年度の研究を通して、非ベンゼン系炭化水素と等電子構造を持つ含ホウ素共役系化合物の特異な共役特性を明らかにすることが出来た。この結果は共役系部位の違いによってホウ素共役系の性質をコントロールすることが出来ることを示唆している。これらの知見に基づいてさらに安定な4配位ホウ素原子を組み込んだ共役系の開発を行い、その物性についてさらに検討を行う予定である。

今回開発した方法では、まずピロールに臭素を導入し、次いでアニオン種をin situで発生させてカルバミン酸エステルとの反応を行い、高収率でジピリルケトンを得た。ジピリルケトンとトリフルオロメタンスルホン酸無水物との反応を各種溶媒中において行ったところ、何れの条件においても原料の消失は確認されたが、目的とするトリフラートの生成は認められず、タール状物質が得られた。酸による重合と考えられるため、適当な塩基により錯体の合成は達成できるものと考えられる。
虚血再灌流ストレスに対する心筋応答の分子機構の解明およびそれに基づく治療法の確立

(1)低酸素刺激/(低酸素刺激後)再酸素化刺激に対する心筋細胞応答の分子機構の解析:低酸素および再酸素化の両刺激によって、Src familyのtyrosine kinase ,p21^<rin>、3つの異なるMAPKfamily memberとそれらの上流および下流のkinase、FAKなどの接着斑関連のtyrosine kinase、さらにJak/STAT系tyrosine kinase、ATF-2などの転写因子等の活性化を介して遺伝子発現に至ること、また両刺激の間で細胞内情報伝達経路が少なくとも一部は異なることを明らかにした。(2)低酸素刺激/再酸素化刺激による細胞内情報伝達系の活性化を媒介していると考えられる液性因子のオートクライン機構の解明:(A)低酸素刺激による一連のシグナル・カスケードはVEGFのオートクライン的な作用を介して活性化されることを明らかにした。また、低酸素刺激に対する心筋細胞応答において、VEGFのオートクライン機構はapoptosisを抑制したり細胞外基質との接着を増強したりすることによって、細胞保護的に作用していると考えられた。(B)再酸素化刺激についても、同様に何らかの生理活性物質を介するオートクライン機構が存在することを見い出し、現在それを単離・精製し解析中である。(3)相対的な低酸素刺激に対する心筋細胞応答の分子機構の解析:培養心筋細胞に反復する機械的な伸展刺激を加えることにより相対的な低酸素状態を作り出し、これに対する心筋細胞応答を解析したところ、心筋細胞からVEGFが放出されオートクライン的に作用することによりMAPKなどの細胞内情報伝達系を活性化することを明らかにした。(4)虚血(再灌流状態)に対する心筋細胞応答を媒介する液性因子の血中動態:(A)急性心筋梗塞発症早期に再灌流療法を施行した患者の血清中のVEGF濃度を測定したところ、VEGFが虚血状態の鋭敏な指標となりうることが明らかとなった。また、このことは同時に(2)(A)の結果を裏付けることにもなった。1.低酸素負荷および低酸素負荷後再酸素化刺激に対する心筋細胞応答の分子機構の解明(培養心筋細胞を用いたIn Vitroの系で):我々はこれまで、ラットの培養心筋細胞に一定時間低酸素(Hypoxia)刺激(O_2濃度0.1%以下)および低酸素負荷後再酸素化(Reoxygenation)刺激を行なうことにより虚血・再灌流のin vitroのモデルを作成し、HypoxiaおよびReoxygenationの両刺激によって、Src familyのtyrosine kinase→p21^<ras>→MAPK→S6K、FAKなどの接着斑関連tyrosine kinase、などの一連のリン酸化カスケードが活性化されることを明かにしてきた。今回、さらにp21^<Rac1>の下流にあってストレス反応で重要な経路p65^<PAK>→MKK3/MKK4→p38MAPK/SAPK(JNK)、およびJak/STAT系の活性化を検討したところ、両刺激はともにp38MAPK/SAPK(JNK)に至る経路を活性化し、さらに転写因子ATF-2の活性化を誘導した。Jak/STAT系については、HypoxiaではJak2・STAT1・STAT2が活性化されたのに対し、ReoxygenationではSTAT3の活性化が認められた。以上より、虚血刺激および虚血後再灌流刺激に反応して心筋細胞では、3つの異なるMAPKfamilyのリン酸化カスケード、さらにJak/STAT系tyrosine kinase、転写因子等の活性化を介して遺伝子発現に至ること、また両刺激の間で細胞内情報伝達経路が少なくとも一部は異なること、が明らかとなった。

2.低酸素負荷および低酸素負荷後再酸素化刺激に反応して心筋細胞から放出される生理活性物質の同定:1.と同様の系を用いて、Hypoxiaによって短時間のうちに心筋細胞からVEGFが放出され、それが心筋細胞上のVEGF receptorに作用することによってこれらの一連のシグナル・カスケードが活性化される、というオートクライン機構が存在することを明らかにした。Reoxygenationについては、生理活性物質を精製し解析中である。(1)低酸素刺激/(低酸素刺激後)再酸素化刺激に対する心筋細胞応答の分子機構の解析:低酸素および再酸素化の両刺激によって、Src familyyのtyrosine kinase、p21^<ras>、3つの異なるMAPKfamily memberとそれらの上流および下流のkinase、FAKなどの接着斑関連のtyrosine kinase、さらにJak/STAT系tyrosine kinase、ATF-2などの転写因子等の活性化を介して遺伝子発現に至ること、また両刺激の間で細胞内情報伝達経路が少なくとも一部は異なることを明らかにした。(2)低酸素刺激/再酸素化刺激による細胞内情報伝達系の活性化を媒介していると考えられる液性因子のオートクライン機構の解明:(A)低酸素刺激による一連のシグナル・カスケードはVEGFのオートクライン的な作用を介して活性化されることを明らかにした。また、低酸素刺激に対する心筋細胞応答において、VEGFのオートクライン機構はapoptosisを抑制したり細胞外基質との接着を増強したりすることによって、細胞保護的に作用していると考えられた。(B)再酸素化刺激についても、同様に何らかの生理活性物質を介するオートクライン機構が存在することを見い出し、現在それを単離・稍製し解析中である。(3)相対的な低酸素刺激に対する心筋細胞応答の分子機構の解析:培養心筋細胞に反復する機械的な伸展刺激を加えることにより相対的な低酸素状態を作り出し、これに対する心筋細胞応答を解析したところ、心筋細胞からVEGFが放出されオートクライン的に作用することによりMAPKなどの細胞内情報伝達系を活性化することを明らかにした。(4)虚血(再灌流状態)に対する心筋細胞応答を媒介する液性因子の血中動態:(A)急性心筋梗塞発症早期に再灌流療法を施行した患者の血清中のVEGF濃度を測定したところ、VEGFが虚血状態の鋭敏な指標となりうることが明らかとなった。また、このことは同時に(2)(A)の結果を裏付けることにもなった。
半導体レーザの直接変調を用いる正弦波位相変調干渉計に関する研究

光源として半導体レーザを用いる正弦波位相変調干渉計について研究を行なった。まず、半導体レーザの注入電流を正弦波状に変調したとき得られる干渉信号を理論的に導き、その特性を明らかにした。その結果、従来、正弦波状に振動している反射鏡によって行っていた正弦波位相変調を半導体レーザの直接変調によって行えることが分かった。半導体レーザを用いた場合、正弦波位相変調の振幅は物体光と参照光の光路差に比例することが示された。次に、この解析結果に基づき、正弦波位相変調干渉計を構成し、1次元CCDイメージセンサを用い、磁気ディスク用のアルミニウム円板の1次元の表面形状を測定した。その結果、半導体レーザを用いる他の高精度干渉法に比べ、正弦波位相変調干渉計は正確な位相変調が行なえるため、最も良い測定精度が得られることが分かった。最後に、周囲温度の変化による半導体レーザの発振波長の変動、あるいは周囲の振動によって引き起こされる干渉計の光学部品の振動により生じる干渉信号の位相変動を干渉信号から検出し、半導体レーザの注入電流にフィードバックすることにより、位相変動を減少させることを試みた。干渉信号の中から変調周波数の基本周波成分を取り出す事によって、位相変動を含む信号を作り出すことができる。そして、この信号を半導体レーザの注入電流にフィードバックすることにより干渉信号に生じる外乱の影響を除去でき、完全に正確な正弦波位相変調が得られた。その結果、周囲の環境条件の悪い場合においても、外乱除去機能を持つ本レーザ干渉計によってナノメータオーダの高精度の測定を行なうことができた。
コイ目魚類における高次倍数体の養殖品種化

1.ドジョウ六倍体の生殖と子孫:2nの配偶子を作る四倍体原種の受精後、第二極体放出阻止により六倍体を作出した。これらの性比は1:1であり、3nの配偶子を産すること、卵径は四倍体、二倍体の産む卵に比べ大きいことが判った。六倍体雌の、六倍体、四倍体、二倍体雄との交配により、それぞれ六倍体(6n×6n)、五倍体(6n×4n)、四倍体(6n×2n)の生存性子孫が作出できることが判った。2.ドジョウ四倍体等の育種特性:長期(23年)混合飼育により特性を比較した。2年間の飼育では三倍体(2n×4n)の成長が良かったが、3年目では三倍体(4n×2n)と二倍体(2n×2n)に差は無く、四倍体(4n×4n)の成長が劣った。GSI等の観察から三倍体の成熟抑制が判った。四倍体では体長に対して頭部の割合が大きかった。3.ドジョウ六倍体等の育種特性:孵化後1年までの個別飼育では、五倍体(6n×4n)の成長が良かった。その後2年間の混合飼育の結果、六倍体(6n×6n)の成長は著しく劣った。六倍体、五倍体の性比は1:1であったが、四倍体(6n×2n)は全雌であった。六倍体では体長に対する頭部の割合が大きかった。4.ドジョウ非還元卵の特性:三倍体(2n×4n)が形成する3n卵の紫外線照射精子の受精から誘起した雌性発生三倍体第一代は全雌であり、3n非還元卵を高い率で産んだが、異数体卵(1.5n)を産むこともあった。3n卵より誘起した雌性発生三倍体第二世代は完全なクローンではないが遺伝的類似度の高いことが判った。野生集団の二倍体の中にクローンに近い2n非還元卵を産む個体を見いだした。5.ギンブナ四倍体の作出と特性:雌性発生三倍体ギンブナの受精卵の温度・圧力処理により精子核が取り込まれ、この手法で同質・異質四倍体が作出できることが判った。1.ドジョウ高次倍数体の作出:自然四倍体(4n)ドジョウの通常受精の後、高水圧により第二極体放出を阻止して作出した六倍体(6n)は雌雄とも妊性を示し、卵子、精子を産した。これらの配偶子ならびに二倍体(2n)、四倍体(2n)の配偶子を用い、正逆交配6nx6n、6nx4n、6nx2nを行ったところ、生存性の子孫が得られた。DNA量フローサイトメトリーにより倍数性を調査したところ、各々の子孫は6n、5n、4nであり、六倍体は3nの配偶子を作ることが判った。2.ドジョウ倍数体の特性比較:生殖形質を調べたところ、6nは4nよりも、4nは2nよりも大きい卵を産んだ。

また、雌性発生4nが全雌であること、正常発生4n、6nの性比が1:1であることから、雄ヘテロ型の性決定が示唆された。2n6nの生存、成長を比較するため、混合飼育群(2nと3n、2n、3nと4n、5nと6n等)を設定したが、結論を得るには到っていない。3.フナ四倍体の作出:雌性発生によりクローン生殖を行う三倍体ギンブナの卵にキンギョの精子を媒精後595分の間に高温処理(40°C、1分間)を行い、子孫の倍数性調査とRAPD-PCRにより精子ゲノムの取り込みを見たところ、雄由来のDNA断片を有する四倍体あるいはモザイクが得られた。また、同様の受精卵について温度勾配恒温器により33、35、38°C高温処理(1分間、受精後5分)を行い子孫を得たが、倍数性判定には到らなかった4.フナ倍数体の特性:三倍体の受精卵(クローン)を異なる水温(温度勾配恒温器:19、29、22、24°C)で培養し、予備的に孵化仔魚のサイズを調べたところ、温度が低いほど有意に大きかった。1.ドジョウ倍数体の特性評価:通常交配により作出した二倍体、四倍体、そして三倍体(二倍体雌×四倍体雄)を、孵化後2ケ月令より約2年3ケ月間同一水槽で飼育し、諸特性を比較した結果、以下の点が明らかになった。(1)倍数体間に生存率の差はない。(2)三倍体の体長、体重は二倍体、四倍体より有意に大きい。(3)二倍体の卵形成は四倍体より早く進行し、三倍体の卵数は少ない。(4)四倍体の体長に対する尾柄長は有意に大きい。(5)倍数体間で単位重量あたりDNA量に差はない。(6)倍数体間で脂質含量に差は無い。なお、平成9年度作出の六倍体、五倍体(六倍体×四倍体)、四倍体(六倍体×二倍体)の諸特性についての比較飼育試験は継続中であり、結論を得るには至らなかった。2.ドジョウ高次倍数体の作出:三倍体非還元卵に由来する雌性発生三倍体を雌親魚として、HCG注射による排卵誘発を試みたが、今年度は良質卵が得られず、実施できなかった。3.ギンブナ人為倍数体の特性比較:三倍体ギンブナ卵のキンギョ精子による受精後の高温処理による精子核取り込み操作から生じた四倍体を、同腹の雌性発生三倍体とともに同一の水槽で1014ヶ月飼育し、諸特性を比較した結果、以下の点が明らかになった。(1)両者の体長、体重に差は無い。(2)三倍体は全雌であるが、四倍体では卵巣を示す雌は半数で、残りの生殖腺は未分化。4.ギンブナ自然四倍体の特性と維持:野生集団ギンブナ中に四倍体を偶々発見、養成し、得た成熟卵をキンギョ精子で受精し、生じた子孫の遺伝的特性を調査したところ、これらは四倍体雌でクローンであることが判った。ギンブナ倍数体の研究を今後、さらに発展させるための材料が確保できた。1.ドジョウ高次倍数体の特性評価:平成9年度に作出した二倍体、四倍体(四倍体雌x四倍体雄)、三倍体(四倍体雌x二倍体雄)の混合集団2組、六倍体(六倍体雌x六倍体雄)、五倍体(六倍体雌x四倍体雄)、四倍体(六倍体雌x二倍体雄、あるいは四倍体雌x四倍体雄)の混合集団3組について、飼育を継続した。一部個体を引き抜いて、血液をDNA量フローサイトメトリーに供し、各倍数性個体の生存を確認した。しかし、今年度は測定を行わなかったため、生残・成長・成熟についての結論をうるには到らなかった。2.非還元卵によるドジョウ高次倍数体の作出:三倍体(二倍体雌x四倍体雄)の産する非還元卵に由来する雌性発生三倍体を雌親魚として、HCG注射による排卵誘起を試みたところ、比較的多数の大型卵(1.401.65mm)と少数の小型卵(0.951.20mm)の外、ごく少数の中型卵(1.251.35mm)が見られた。UV照射精子で受精したところ、中型卵からは1.5n相当の染色体をもつ雌性発生異数体が生じた。大型卵からは雌性発生三倍体が生じ、三倍体の次世代においても非還元的な卵形成が起こることが判明した。したがって、この様な三倍体系統由来の非還元配偶子による高次倍数体作出の可能性が示された。また、自然集団において、二倍性の卵子を産する二倍体個体が見られる。この様な卵をUV照射精子で受精すると倍数化処理なしに雌性発生二倍体が得られ、これらのDNAフィンガープリント像は母親に同一もしくは極めて類似した。
細胞傷害性T細胞への抗原提示を決定する新たな小胞体分子シャペロンの同定

がん細胞を攻撃する細胞傷害性T細胞(CTL)を研究する上で、HLAクラスI (HLA-I)分子による抗原提示機構を理解する事は重要である。私は、わずか1個のアミノ酸置換のあるHLA-A2の変異分子HLA-A2-H74Lが、小胞体内で自己ペプチドと結合するにもかかわらず抗原ペプチドとは結合できないためCTLへ抗原提示できないことを発見した。この現象から、小胞体内のHLA-I・ペプチド複合体形成過程で、自己ペプチドから抗原ペプチドへと置き換える新たな分子シャペロンの存在が強く示唆される。本研究の目的は、この未知の分子シャペロンを同定することである。実験計画に沿って、FLAGタグ融合HLA-A2またはHLA-A2-H74Lを発現させた細胞株の細胞溶解液を調整し、抗FLAG抗体で免疫沈降を行った。SDS-PAGEの分離パターンを比較したところ、HLA-A2のみに見られるバンドが見られた。そこで質量分析にかけてタンパク質を同定したが、分子シャペロンではなかった。最近、低親和性ペプチドから高親和性ペプチドへと置き換える新しい分子シャペロン、TAPBPR (Science 358:1060 & 1064, 2017)が発見された。特性が類似しているため我々の求めている分子シャペロンではないかと考えたが、異なることがわかった。しかし、なんらかの関係があると考え、GFP融合TAPBPRを発現させた細胞を作製し、抗GFP抗体で免疫沈降を行った。その分離パターンを比較したところ、明らかにHLA-A2発現細胞にのみ見られるバンドが存在した。今後、このバンドに相当するタンパク質を同定する予定である。当初の実験計画に沿って、FLAGタグ融合HLA-A2またはHLA-A2-H74Lを発現させた細胞株の細胞溶解液を調整し、抗FLAG抗体で免疫沈降して、SDS-PAGEの分離パターンを比較した。HLA-A2のみに見られるバンドが見られたため、質量分析にかけてタンパク質を同定したが、分子シャペロンではなくHLA-A2分子自身であることがわかり、有益な結果は得られなかった。その後、低親和性ペプチドから高親和性ペプチドへと置き換える新しい分子シャペロン、TAPBPR (Science 358:1060 & 1064, 2017)が発見された。TAPBPRの特性が類似しているため、我々の求めている分子シャペロンはTAPBPRと相互作用していると考えた。そこで、発現ベクターにGFP融合TAPBPR遺伝子を組み込み、HLA-A2またはHLA-A2-H74L発現細胞に遺伝子導入し、GFP融合TAPBPRを発現する細胞株を作製した。そして、抗GFP抗体で免疫沈降を行い、その分離パターンを比較したところ、明らかにHLA-A2発現細胞にのみ見られるバンドが存在した。すなわち、TAPBPR-HLA-A2-ペプチド複合体に新たなタンパク分子が結合しており、HLA-A2-H74Lでは1つのアミノ酸変異(H74L)のためにその分子が結合できないと予想できる。この分子は、我々が求めている分子シャペロンである可能性があるため、このバンドに相当するタンパク質を質量分析で同定する予定である。従って、この1年間で可能性のある分子をみつけられたため、おおむね順調に進展していると考えられる。前述のように、HLA-A2とHLA-A2-H74Lとで異なるバンドを分離し、質量分析を行ってどのタンパク質かを同定する。このバンドが、求める分子シャペロンでなかった場合、HLA-I-ペプチド複合体の他の成分で免疫沈降し、SDS-PAGEの分離パターンを比較する。異なるバンドが見られたら、質量分析でタンパク質を同定する。当初の研究計画では、免疫沈降物を、1次元のSDS-PAGEにかけるのではなく全自動2次元電気泳動装置(Auto2D, SHARP)にかけ2次元的に分離し分離パターンを比較することにしていたが、Auto2Dが予想以上に不安定で少し濃いサンプルをかけるとすぐに止まってしまった。また、質量分析をお願いした会社のプロテオームの専門家から1次元の分離で十分であるとのアドバイスをいただいたので、不安定なAuto2Dは使用しない。タンパク質が同定できれば、CRISPR/Cas9法を使って、その分子シャペロン候補のゲノム遺伝子をノックアウトしたHLA-A2発現細胞株を作製する。同定した分子シャペロン候補は1つに限らない。おそらく複数同定できると考えられるが、それらすべてのノックアウト細胞株ライブラリーを作製する。CRISPR/Cas9法を用いて作製するゲノム遺伝子ノックアウト細胞は、さまざまな遺伝子で作製した経験があるのでさほど困難ではないと予想される。作製した細胞株をターゲットにして、CTLが抗原特異的に認識できるかどうかCTLアッセイで明らかにする。抗原特異的CTLは、HLA-A2トランスジェニックマウスから作製する。

実験計画に沿って、FLAGタグ融合HLA-A2またはHLA-A2-H74Lを発現させた細胞株の細胞溶解液を調整し、抗FLAG抗体で免疫沈降を行った。SDS-PAGEの分離パターンを比較したところ、HLA-A2のみに見られるバンドが見られた。そこで質量分析にかけてタンパク質を同定したが、分子シャペロンではなかった。最近、低親和性ペプチドから高親和性ペプチドへと置き換える新しい分子シャペロン、TAPBPR (Science 358:1060 & 1064, 2017)が発見された。特性が類似しているため我々の求めている分子シャペロンではないかと考えたが、異なることがわかった。しかし、なんらかの関係があると考え、GFP融合TAPBPRを発現させた細胞を作製し、抗GFP抗体で免疫沈降を行った。その分離パターンを比較したところ、明らかにHLA-A2発現細胞にのみ見られるバンドが存在した。今後、このバンドに相当するタンパク質を同定する予定である。当初の実験計画に沿って、FLAGタグ融合HLA-A2またはHLA-A2-H74Lを発現させた細胞株の細胞溶解液を調整し、抗FLAG抗体で免疫沈降して、SDS-PAGEの分離パターンを比較した。HLA-A2のみに見られるバンドが見られたため、質量分析にかけてタンパク質を同定したが、分子シャペロンではなくHLA-A2分子自身であることがわかり、有益な結果は得られなかった。その後、低親和性ペプチドから高親和性ペプチドへと置き換える新しい分子シャペロン、TAPBPR (Science 358:1060 & 1064, 2017)が発見された。TAPBPRの特性が類似しているため、我々の求めている分子シャペロンはTAPBPRと相互作用していると考えた。そこで、発現ベクターにGFP融合TAPBPR遺伝子を組み込み、HLA-A2またはHLA-A2-H74L発現細胞に遺伝子導入し、GFP融合TAPBPRを発現する細胞株を作製した。そして、抗GFP抗体で免疫沈降を行い、その分離パターンを比較したところ、明らかにHLA-A2発現細胞にのみ見られるバンドが存在した。すなわち、TAPBPR-HLA-A2-ペプチド複合体に新たなタンパク分子が結合しており、HLA-A2-H74Lでは1つのアミノ酸変異(H74L)のためにその分子が結合できないと予想できる。この分子は、我々が求めている分子シャペロンである可能性があるため、このバンドに相当するタンパク質を質量分析で同定する予定である。従って、この1年間で可能性のある分子をみつけられたため、おおむね順調に進展していると考えられる。前述のように、HLA-A2とHLA-A2-H74Lとで異なるバンドを分離し、質量分析を行ってどのタンパク質かを同定する。このバンドが、求める分子シャペロンでなかった場合、HLA-I-ペプチド複合体の他の成分で免疫沈降し、SDS-PAGEの分離パターンを比較する。異なるバンドが見られたら、質量分析でタンパク質を同定する。当初の研究計画では、免疫沈降物を、1次元のSDS-PAGEにかけるのではなく全自動2次元電気泳動装置(Auto2D, SHARP)にかけ
新規流通系ESR法による青果物に含まれる脂溶性成分の活性酸素消去評価法の構築

食品などの混合成分の抗酸化活性を分析するためにHPLC-ESRシステムを構築した。このシステムはHPLCカラムで分離した成分の濃度に関する情報を光吸収スペクトルで得るとともにESRシステムにより溶出成分の抗酸化活性をオンライン分析で評価することができる。また、ESRクロマトグラムのピーク強度と面積強度は、カラム溶出成分のスーパーオキシドアニオンラジカル消去活性および濃度に依存することから、青果物および食品などの混合系試料の抗酸化活性評価とそれに含まれる高活性成分の探索が可能となる。この装置を用いて測定したESRクロマトグラムの線形シミュレーションにより抗酸化活性の定量評価法の確立を行った。近年、食品の抗酸化活性を系統的に数値化する研究が進められている。食品成分の分析には多数の混合成分を分離し各成分の抗酸化活性を評価することが必要である。我々は、HPLC分析装置とESR装置を融合したHPLC-ESR装置を開発した。この装置は、HPLCカラムで分離した成分の濃度に関する情報を光吸収スペクトルで得るとともに、ESRシステムにより溶出成分の抗酸化活性をオンライン分析することが可能である。この装置で得られるESRクロマトグラムのピーク強度と面積強度は、カラム溶出成分のO2-・ラジカル消去活性および濃度に依存することから、食品、青果物および飲料などの混合系試料の抗酸化活性評価とそれに含まれる高活性成分の探索が可能となる。HPLC-ESR装置を用いて青果物およびコメなどの混合成分のO2-・抗酸化活性を測定し、ESRクロマトグラムを既知の化合物であるコーヒー酸で換算することにより、抗酸化活性の数値化が可能となる。抗酸化活性の数値化により品種間での抗酸化活性を比較することができる。抗酸化活性成分の構造については、HPLCカラムより溶出した成分を分取し1H-NMRおよび質量分析することで成分を明らかにする。また、青果物やコメに含まれる高分子量成分については、77K-ESR測定をすることで含有する金属イオンが測定可能である。この装置を青果物やコメの脂溶性成分に応用するために、アセトニトリルやメタノールを溶媒とする新規HPLC-ESR装置を開発し、青果物や食品から有機溶媒に可溶成分の抽出方法等を確立する。このようにして青果物およびコメの水溶性成分と脂溶性成分の抗酸化活性を包括的に議論することができれば、HPLC-ESR法が食品の機能性に関する新規評価法として発展する可能性がある。我々は、青果物中の抗酸化活性を明らかにするためにHPLC分析装置とESR装置を融合したHPLC-ESR装置を開発している。この装置はHPLCにより含有成分の濃度情報を得ることができ、ESRクロマトグラムから溶出成分の抗酸化活性をオンライン分析することが可能である。またカラムをバイパスすることでFI-ESRとなり、抗酸化活性成分のID50値の測定も可能である。この装置を青果物に含まれる抗酸化活性を数値化するために、ID50値および2次反応速度が既知であるコーヒー酸を用いて、ESRクロマトグラムの線形、ピーク強度、面積強度を速度論的に解析した。コーヒー酸のESRクロマトグラムを競争反応に基づく解析法で行うと、濃度およびコーヒー酸のID50値から得られたESRのクロマトグラムのピーク消去率は実測値と一致した。しかしながら、青果物等の混合溶液系では抗酸化活性成分の濃度やID50値が未知であるため、ESRクロマトグラムをガウス線形でシミュレーションをすることにより解析を行った。コーヒー酸を基準物質として、そのID50値とESRクロマトグラフのピーク消去率から、ピークにおけるCA換算濃度を求めた。次に、線幅を最適化してガウス線形としてESRクロマトグラフを再現すると、測定した線形と良い一致が得られた。さらにガウス曲線を積分すると、ESRクロマトグラムに寄与した抗酸化物質の総量をコーヒー換算濃度として数値化できた。この方法を実際の青果物等の水溶性成分の抗酸化活性の評価方法として応用した。ESRクロマトグラムから得られた各成分の抗酸化活性を合計したコーヒー酸換算値とFI-ESRより算出したコーヒー酸換算値が一致した。また、ESRクロマトグラムの全ピークの面積強度に関する各ピークの面積強度の比率をとることで各ピークで溶出する成分の比活性をもとめることが可能となった。分析化学HPLC-ESR装置を用いて青果物およびコメの水溶性成分の抗酸化活性を成分を探索し、高活性成分の分子構造を明らかにした。1)青果物およびコメの調製法:青果物の調製法は、可食部の3倍量の超純水を入れミキサーで攪拌後、濾紙を用いて濾別することで水溶性抽出成分を得た。炊飯したコメに関しては、糊状になってしまい従来の抽出法では困難であった。炊飯したコメを凍結乾燥後、超純水と混合後、超遠心機で分離することでコメの水溶性成分の抽出方法を確立した。

2)ESRクロマトグラムの線形シミュレーション:得られた青果物およびコメの水溶性成分をHPLC-ESR法を用いて分析した。ESRクロマトグラムから溶出成分の抗酸化活性を評価する手法として既知のコーヒー酸(CA)を基準とするESRクロマトグラムの線形シミュレーションによる解析法を検討した。ESRクロマトグラムに観察される下に凸のピークの強度は、カラム溶出成分に消去活性成分が含まれることを意味しており、ピークの強度と面積強度は溶出成分のO2-・消去活性と濃度に比例して増加する。実際のESRクロマトグラムを既知化合物であるコーヒー酸(CA)の濃度変化にガウス線形を考慮することでシミュレーションすることが可能となる。ESRクロマトグラムの全ピークの面積強度に関する各ピークの面積強度の比率として各ピークで溶出する成分の比抗酸化活性(%)を求めることが可能となった。3)抗酸化活性成分を有する成分の分析:青果物10種類の中で最も高活性であった菜の花は、桂皮酸ポリフェノール誘導体やクロロゲン酸が消去活性成分として含有していることが明らかになった。炊飯米に関しては、ニコチン酸誘導体が活性成分であることが分かった。1)同種の青果物の異なる品種の抗酸化活性:青果物10種類のO2-・消去活性を測定したところ、花蕾類が最も高活性であった。その中でも、菜の花の品種であるおいしい菜やチンゲン菜花が高い抗酸化活性を有することが明らかになった。同種の青果物の抗酸化活性および成分を比較することで品種間での差別化が可能になると考えられる。コメに関しては、国内米2種と外国産米2種の品種間差が明らかになった。国内米の検体数を増やすことで基準となる平均値を算出する。また、古代米など品種の異なるコメの解析を行う。2)青果物およびコメに含まれる脂溶性成分の抗酸化活性評価:青果物およびコメに含まれる脂溶性成分の抗酸化活性HPLC-ESR法で評価する。有機溶媒系でO2-・のスピントラッピング反応の最適化を行うとともに、有機溶媒系で含有成分と分離するカラムを選択する。今までの予備的な研究で、含水メタノール系で水分量が10から50%までなら現在の装置と同様の反応系でO2-・の対する抗酸化活性を測定することが可能であると判明している。3)高活性成分の同定:青果物およびコメの混合成分の1H-NMRを測定することにより、主要成分を明らかにしたが、微量成分の解析は至っていない。そのため、HPLCカラムより分離した成分を分取し、各成分のNMRおよび質量分析することで微量な高活性成分の詳細を明らかにする。4)異なるラジカル種に対する抗酸化活性評価:ORAC-ESR法を流通型ESR系に応用することで、異なるラジカル種に対する抗酸化活性評価を行う。青果物とコメに含まれる水溶性および脂溶性成分の抗酸化活性成分の数値化を行うために、平成25年度は、HPLC-ESRシステムを青果物およびコメなどの水溶性溶液に応用し、抗酸化活性の数値化および高分子量成分の分離および同定を行った。この研究に関する情報交換を共同研究先であるデザイナーフーズとする予定であったが、日程など未確定であったため当該助成金が生じた。