hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
子宮内膜癌におけるlipocalin2発現の機能解析と分子標的治療法

lipocalin2(LCN2)高発現子宮内膜癌細胞株HHUAのLCN2発現をshRNAで抑制すると、紫外線(UV)感受性およびシスプラチン(CDDP)感受性の増強と、アポトーシスの有意な増加を認めた。鉄イオンキレートによりコントロールHHUAでもUV感受性が増強し、LCN2発現抑制によりリン酸化Akt発現が減弱することから、LCN2は鉄イオンを介してAktリン酸化を誘導し、細胞の生存能力を高めていると考えられた。我々はマイクロダイセクション法とマイクロアレイ解析を用いて子宮内膜癌で遺伝子発現が増強する因子としてlipocalin2(LCN2)を見出した。LCN2タンパク発現について検討すると、やはり正常に比べ内膜癌で発現が増強しており、組織学的Gradeや進行期が高いほど、発現が亢進していた。さらに、高発現症例では生存期間短縮の傾向も観察された。子宮内膜癌細胞株Ishikawa, HECIBにLCN2発現ベクターを導入し、LCN2を強制発現させたところ、増殖能や浸潤能の増強が観察された。このようなことから、LCN2は子宮内膜癌の発癌進展に関与すると考えられた。このLCN2の細胞表面受容体の一つとされるSL、C22A17タンパクの子宮内膜癌組織での発現を検討したところ、五CN2同様に組織学的Gradeや進行期が高いほど、発現が亢進しており、また、組織内での局在も、LCN2同様に浸潤部位や脈管侵襲部位で強い発現が観察された。また、LCN2とSLC22A17を高発現している子宮内膜癌細胞株HHUAで、LCN2とSLC22A17を免疫共沈したところ、両者が複合体を形成していることが確認された。このようなことから、LCN2はその受容体であるSLC22A17と強調して、子宮内膜癌の進展に関与していると考えられた。一方、子宮内膜癌細胞HHUAにLCN2のsiRNAを導入したLCN2発現低下株を樹立し、各種ストレス(血清除去、UV照射など)を加えたところ、LCN2発現低下により、生存細胞数の低下が観察された。このことから、LCN2は癌細胞の生存能力の増強にも関与していることが考えられた。我々はマイクロダイセクション法とマイクロアレイ解析を用いて子宮内膜癌で遺伝子発現が増強する因子としてlipocalin2(LCN2)を見出し、LCN2および、その受容体SLC22A17高発現が、予後不良因子となることをこれまでに示してきた。そこで、子宮内膜癌におけるLCN2経路の機能をさらに明らかにするため、内膜癌細胞株を用いて研究をすすめた。内膜癌細胞株HHUAにshRNAを導入してLCN2発現を抑制したHHUA(LCN2抑制HHUA)を樹立し、培養内膜癌細胞の生存に関わるLCN2の作用について検討を行った。紫外線(UV)照射10時間後の生存細胞数は、LCN2抑制HHUAではコントロールHHUA細胞に比べて減少が大きく(74.6%減少vs.48.8%減少)、有意なUV感受性増強を認めた(P<0.05)。次にシスプラチン(CDDP)投与72時間後の生存細胞数はCDDP非投与と比較して、62.9%減少(LCN2抑制HHUA)と22.4%減少(コントロールHHUA)となり、LCN2発現抑制により有意なCDDP感受性増強を認めた(P<0.05)。また、内膜癌細胞株IshikawaにSLC22A17を強制発現させるとCDDP感受性の低下が観察された。LCN2経路は鉄イオン運搬に関わるとされるが、鉄イオンをキレートすると、コントロールHHUAでもUVおよびCDDP感受性の増強も認めた。また、UV照射やCDDPによりLCN2抑制HHUAではアポトーシスの有意な増加が観察され、またWestern blottingではリン酸化Akt発現が減弱していた。以上の結果から、LCN2-SLC22A17経路はAktリン酸化を誘導し、UV照射やCDDPによって誘導されるアポトーシスを抑制することにより、細胞の生存能力を高めていると考えられ、そこには鉄イオンが関与している可能性が考えられた。紫外線(UV)照射10時間後の生存細胞数は、LCN2抑制HHUAではコントロールHHUA細胞に比べて減少が大きく(74.6%減少vs. 48.8%減少)、有意なUV感受性増強を認めた(P<0.05)。

次にシスプラチン(CDDP)投与72時間後の生存細胞数はCDDP非投与と比較して、62.9%減少(LCN2抑制HHUA)と22.4%減少(コントロールHHUA)となり、LCN2発現抑制により有意なCDDP感受性増強を認めた(P<0.05)。また、内膜癌細胞株IshikawaにSLC22A17を強制発現させるとCDDP感受性の低下が観察された。LCN2経路は鉄イオン運搬に関わるとされるが、鉄イオンをキレートすると、コントロールHHUAでもUVおよびCDDP感受性の増強も認めた。また、UV照射やCDDPによりLCN2抑制HHUAではアポトーシスの有意な増加が観察され、またWestern blottingではリン酸化Akt発現が減弱していた。以上の結果から、LCN2-SLC22A17経路はAktリン酸化を誘導し、UV照射やCDDPによって誘導されるアポトーシスを抑制することにより、細胞の生存能力を高めていると考えられ、そこには鉄イオンが関与している可能性が考えられた。本研究の子宮内膜癌におけるLCN2およびその受容体SLC22A17発現と、その機能を解明が、おおむね順調に進捗している。マウスを用いたLCN2発現変化による造腫瘍能変化の検討も進んでいる。他の項目も検討中であるが、まだ成果を得られるまでには至っていない。24年度が最終年度であるため、記入しない。基本的に当初の研究計画の通りに遂行する。培養細胞実験に関しては、今後、recombinant LCN2を用いるなどして、機能解析を進め、マウスで造腫瘍能についてさらに検討を進める。研究遂行上、現時点で大きな問題は特にない。
マルチリガンドなスカベンジャー受容体FEELと病態との関連の解明

血管内皮細胞の同定の指標として蛍光標識したアセチルLDLの取り込み活性が広く用いられている。FEEL-1はその活性を担うマルチリガンドなスカベンジャー受容体である。FEEL-1,-2はグラム陰性、陽性の細菌や動脈硬化の発症や糖尿病の進展に関与すると考えられている酸化LDLやAGE(後期糖化反応生成物)をもリガンドとすることを報告してきた。FEEL-1の細菌の結合に必要なドメインの推定を行うこと、血管内皮細胞の培養上清に検出される可溶性FEEL-1の細菌結合活性の検討を行うこと、マウス肝臓初代培養細胞を用いてFEELの機能を明らかにすることを目的とした。ヒト臍帯静脈血管内皮細胞cDNAライブラリーよりクローン化した可溶型のFEEL-1の機能についてアデノウィルスベクターを用いた可溶型蛋白質の発現によって検討したところグラム陰性、陽性細菌を結合することが明らかになった。最近、FEEL-1が血管内皮細胞のHSP70の受容体であることを明らかにした。これらの結果はFEEL-1が細胞表面で細菌を結合するだけでなく、可溶型の受容体として細菌を捕捉する可能性を示唆している。肝臓類洞血管内皮細胞(liver sinusoidal endothelial cell, LEC)やKupffer細胞(KC)におけるFEELの細菌の結合活性への寄与を検討した。LECとKCにはFEEL-1,-2共に発現が認められた。FEELに対するmiRNAを発現するファイバーミュータントアデノウィルスを用いたFEEL-1,-2蛋白質のノックダウンによりスカベンジャー受容体活性が減少した。これらの結果はin vivoでFEELが細菌の結合、排除に重要な役割を担っている可能性を示唆している。FEEL-1,-2のノックアウトマウスの作出に成功した。マルチリガンドなスカベンジャー受容体FEEL-1,FEEL-2は発現クローニングに用いたアセチルLDLだけでなく酸化LDL、グラム陽性、陰性の細菌や動脈硬化の発症や糖尿病の進展に関与すると考えられているヒアルロン酸やAGE(後期糖化反応生成物)をもリガンドとすることを明らかにしてきた。本年度はこの受容体と動脈硬化の発症や糖尿病さらに細菌感染との関りをin vitroで検討した。マウス初代培養細胞を用いて、血管内皮細胞、特に肝臓の類洞血管内皮細胞やKupffer細胞でのFEEL-1,FEEL-2の受容体活性への寄与を検討した。ファイバー改変型アデノウィルスベクターを用いたshRNAの発現によるRNAiにより機能解析を行った。その結果、FEEL-1,FEEL-2は類洞血管内皮細胞やKupffer細胞において、酸化LDL、グラム陽性、陰性の細菌、ヒアルロン酸、AGEの結合や取り込みに大きく寄与することが初めて明らかになった。FEEL-1,FEEL-2ノックアウトマウスの作製を行いキメラマウスが得られた。ジャームライントランスミッションの確認を行っている。マウス個体にshRNAを発現するアデノウィルスを投与し、FEEL-1,FEEL-2のノックダウンを行い、個体レベルでのFEEL-1,FEEL-2の寄与を検討することにより、また作出中のFEEL-1,FEEL-2のノックアウトマウス、トランスジェニックマウスを用いてFEEL-1,FEEL-2の生理的役割と病態との関連を明らかにしていきたいと考えている。<目的>FEEL-1は血管内皮細胞の同定の指標として広く用いられている蛍光標識したアセチルLDLの取り込み活性を担うマルチリガンドなスカベンジャー受容体である。FEEL-1,-2は動脈硬化の発症や糖尿病の進展に関与すると考えられている酸化LDLやAGE(後期糖化反応生成物)をリガンドとすることを報告してきた。FEEL

-1のリガンド結合に必要なドメインの推定を行うこと、内皮細胞の培養上清に検出される可溶性FEEL-1のリガンド結合活性の検討を行うこと、マウス肝臓初代培養細胞を用いてFEELの生理機能を明らかにすることを目的とした。<成果と考察>ヒト臍帯静脈血管内皮細胞cDNAライブラリーよりクローン化した可溶型のFEEL-1の機能についてアデノウィルスベクターを用いた可溶型蛋白質の発現によって検討したところアセチルLDLやAGEを結合することが明らかになった。これらの結果はFEEL-1が細胞表面でリガンドを結合するだけでなく、可溶型の受容体としてリガンドを捕捉する可能性を示唆している。またマウス糖尿病モデルでFEEL-1,-2の発現の変化が起きることを明らかにした。肝臓類洞血管内皮細胞(liver sinusoidal endothelial cell)やKupffer細胞におけるFEELのリガンド結合活性への寄与を検討した。FEELに対するmiRNAを発現するファイバーミュータントアデノウィルスを用いたFEEL-1,-2蛋白質のノックダウンによりアセチルLDLやAGEに対する受容体活性が減少した。これらの結果はin vivoでFEELが酸化LDLやAGEの結合、排除に重要な役割を担っている可能性を示唆している。
新規ＭＡＬＤＩ－ＭＳマトリックスの分子設計、合成、分子論

MALDI-MSは高分子のみならず低分子化合物の高感度迅速分析にも適用が検討されているが、イオン化補助剤のマトリックスに関する研究は未開拓である。本研究では、系統的な有機合成による新規有機マトリックスの開発を目指した。汎用の9ーアミノアクリジン(9AA)を評価基準として、各種誘導体を合成し、それらをマトリックスとして200種類の生体代謝小分子に対してMALDIMS測定を負イオンモードで行い評価した。その結果、アミノ基が、2級、1級が必須で、アクリジンをアントラセンに変換した化合物も良好なイオン化能を示し、更なる検討で9ーAAよりイオン化能が優れたマトリックスの開発に成功した。MALDI-MSは近年、生体高分子のみならず低分子化合物の超高感度迅速分析にも適用が検討され、その特性を生かしたメタボローム研究や質量分子イメージングへの応用が期待されている。しかし、イオン化の要となるマトリックスに関する研究は未開拓である。特に生体低分子解析に重要な負イオンモード分析に適応した高機能高感度マトリックスの開発は急務である。本研究では、合理的かつ系統的な分子設計と有機合成による新規高機能有機マトリックスの開発を目指し、現時点で最も汎用されている9ーアミノアクリジ(9AA)を評価基準として、昨年に引き続き芳香族アミンの合成を行った。本年度は分析対象をアミノ酸およびその誘導体に絞り、マトリックスの芳香環の重要性について精査した。アクリジンをアントラセンに置き換えたところ、9-アミノアントラセンが9AAよりも高いイオン化能を示した。しかし9アミノアントラセンは物性として不安定であったので、部分還元を行ったアミノテトラヒドロアントラセンやアミノ基の置換位置が異なるアミノアントラセン、アミノアントラセンの二量体などを合成し、マトリックスとしての機能を調べたところ、いくつかの化合物で感度および適用範囲の広い優れたマトリックスを見出すことに成功した。測定したアミノ酸誘導体51種のうち50種が最高100 fmolオーダーの検出感度で分子イオンピークを見出すことができた。それらのUV吸収とイオン化能とはある程度の相関がみられた。また、アミノ基の1H-NMRの化学シフトとも相関がみられたことから、アミノ基の塩基性が強いことも重要であるとの示唆を得た。MALDI-MSは近年、生体高分子のみならず低分子化合物の超高感度迅速分析にも適用が検討され、その特性を生かしたメタボローム研究や分子イメージングへの応用が期待されている。しかし、イオン化の要となるマトリックスに関する研究は意外にも未開拓で、その分子論は未知である。本研究では、合理的かつ系統的な分子設計と有機合成による新規高機能有機マトリックスの開発を目指し、現時点で最も汎用されている9ーアミノアクリジン(9AA)を評価基準として、その誘導体合成から研究を開始した。まずは9AAのアミノ基にアルキル基、アリール基、アルコキシカルボニル基等の置換基を導入し2級、3級アミノ基へと変換した化合物を20種類以上合成した。それらをマトリックスとして200種類の生体代謝小分子に対してMALDIMS測定を負イオンモードで行いそれらのイオン化能を評価した。その結果、アミノ基が3級の場合ほとんどイオン化能を示さなかったが、2級アルキル、2級アリール基ではイオン化能を示した。一方、2級でもカルバメートとするとまったくイオン化能を示さなかった。以上から、1級、2級アミノ基が必須であることが分かった。また、この結果はN-H基の存在が必須であることとなり、レーザーによる励起に際して当該結合がヘテロリティックに開裂しNの負イオンとなり対象サンプルのプロトンを引き抜く機構が示唆された。またアクリジン骨格をアントラセンやキノリンに変換した化合物も数種類合成したところ、N上の置換基を変換することで良好なイオン化能を示すことがわかり、アクリジンは必須でないことが分かった。さらにアントラセンおよびその部分還元体にアミノ基を結合させた化合物も合成した。新規マトリックスの合成に関してはおおむね順調に進んでいる。イオン化能の評価に関しては、アミノ酸関連分子に的を絞ることで評価が進んでいる。新規マトリックスの合成を進めるとともに、UVスペクトルとイオン化能との相関も精査する。マトリックスは各種芳香族化合物(ナフタレン誘導体、アントラセン誘導体、アニリン誘導体、キノリン誘導体など)にアミンを搭載した化合物を主に合成する。評価対象はアミノ酸を主に用いる。物品費(試薬、ガラス器具、汎用器具、汎用消耗品など)111万円旅費(研究打ち合わせ、学会発表など)15万円その他(器具修理、英文校正など)5万円計131万円マトリックスの物性測定に関して装置の不具合などで若干よていより遅れたため、H24年度未使用額が発生した。
両生類および魚類における脳内概日時計の所在とその機能の解析

1.時計遺伝子のcDNAクローニングを縮重プライマーを用いたPCR法により試み、イモリからPer2、アユからPer2,Per3,Clock, BmallをコードするcDNA断片の塩基配列決定に成功した。両生類や魚類の脳における時計遺伝子の発現部位やリズムを調べることは脳内概日時計の所在の検索に有力な手段となることが期待される。2.イモリでは毎日定時刻のメラトニン投与は行動の概日リズムだけでなく、松果体自身の概日リズムも同調させることが松果体光受容細胞のシナプスリボンの数の概日リズムを指標とした実験で明らかになった。3.イモリの血中メラトニン濃度は夜間に上昇するが最大でも100pg/ml以下とかなり低いレベルであること、また、眼あるいは松果体のどちらかを摘出した個体では血中メラトニンは顕著に減少し日周リズムが消失することがわかった。イモリのメラトニン受容体は視床下部、中脳など脳内に広く分布していた。4.アユとニジマスの血中メラトニン濃度は明暗条件下で暗期に高く明期に低い明瞭な日周リズムを示した。このリズムはアユでは恒暗条件下でも存続し概日リズムを示したが、ニジマスでは常に高値を示し、概日リズムは観察されなかった。恒明条件下では両種とも低値を示した。5.明暗サイクル下でイモリの頭蓋にアルミホイル片を貼って松果体を遮光し、その直後に明暗サイクルを逆転させた。その結果、シナプスリボンの数のリズムを指標とする松果体の時計の位相は大きく変化しなかったが、行動リズムは数日の移行期を経て新しい明暗サイクルに同調した。このことは明暗サイクル下では脳内概日時計が松果体を介さずに直接明暗サイクルに同調できることが示唆された。6.ニジマスの自発摂餌活動を指標として検討した結果,松果体除去はニジマス脳内概日時計に影響を与えないことが判明した。1.両生類における脳内概日時計の所在を検討するひとつの方法として、日本産イモリの脳内メラトニン受容体の分布をin vitroオートラジオグラフィーにより調べた。その結果、イモリではほ乳類に比べ広範囲に分布しており、特に視床下部と視蓋に高密度に存在することが分かった。今後、さらに解像度を上げるとともに、現在進行中の免役組織学的実験など他の実験によるデータとあわせて、視床下部内にあると思われる生物時計の所在について詳細に検討する必要がある。2.これまで日本産イモリにおいてはメラトニンの生産部位と血中メラトニンの日内変動との関係について詳細に調べられていなかった。そこで眼球摘出、松果体摘出、及びその両方を摘出したイモリについて昼夜の血中メラトニン濃度を調べた結果、いずれの群においても夜間のメラトニンレベルと昼間のそれとの間に有意差が無くなった。したがって上記1.のデータとあわせ、イモリにおいては眼、及び松果体が共に夜間の血中メラトニンレベルの上昇に寄与し、それにより視床下部にある脳内生物時計を調節している可能性が示唆された。3.ほ乳類の生物時計である視交叉上核では、概日リズムに位相変位を起こさせるような主観的時刻に光パルスを与えると、c-fos遺伝子が発現してcFOSタンパクが誘導されることが知られている。このことをイモリの視床下部において調べるための前段階として、行動リズムを指標にして位相反応曲線を作成した。その結果CT21において最も大きな位相の前進、CT15において最も大きな位相の後退があることが分かった。

この結果をもとに、現在光パルスによるcFOSタンパクの出現の有無を検討している。両生類の概日リズムに関する知見は少ない.本研究では両生類の脳内概日時計の所在の検索をイモリを用いて試みた。両生類の概日リズムに関する基礎的なデータを含め、得られた知見と経過を報告する。1.まず行動リズムについて恒暗下で1時間の光パルスに対する位相反応曲線(PRC)を作成した。得られたPRCは1型で、主観的夜前半の位相後退相は主観的夜後半の前進相より大きかった。現在、最大の位相の前進及び後退が見られるCT15及びCT21に光パルスを与えcFos、phospho-CREB、phospho-p44/42MAP kinaseが発現する部位を免疫組織化学的に調べているが、位相変位と相関のある陽性反応は得られていない。2.時計遺伝子ClockのcDNAクローニングを縮重プライマーを用いたPCRにより試みているが、ClockをコードするcDNA断片はまだ得られていない。3.内因性のメラトニンの概日時計への関与を検討する為の基礎データとして、眼、松果体および血中のメラトニン濃度をRIAで測定した結果、三者ともにメラトニン濃度は夜間に高く昼間に低かった。また、眼、松果体の摘出実験により血中メラトニンは眼と松果体の双方に由来することが示唆された。メラトニンの作用部位を明らかにするためにin vitroオートラジオグラフィーによりメラトニン受容体の脳内分布を検討したところ、メラトニン受容体は視床下部、視蓋などに広く分布していることが判明した。4.マルチチャンネル細胞外記録システムを用いてイモリ脳のスライスからMultiple Unit Activity(MUA)の長期記録をするためorganotypic slice culture系を確立した。コラーゲンtype Iをコートした培養皿を用い、80%Leibovitz′s L-15+57%ウシ胎児血清の培養液中(週に一度交換)で、厚さ250μmの脳スライスは20°Cで2週間以上生存することが分かった。MUAの記録を現在試みている。
象牙質タンパクの発現を手掛かりに、歯槽骨形成細胞の起源を探る

本研究の企画時においては、"DSPが歯胚を取り巻く骨、あるいは歯槽骨、有細胞セメント質、歯根膜において特異的に局在している"という過去の我々の報告をもとに、"歯乳頭もしくは成長過程にある歯根歯髄より歯周組織形成細胞の起源細胞が移動する"ことを作業仮説とした。実際の検証においては、歯周組織形成細胞の細胞増殖能は当初予測したレベルより遥かに低く仮説の実証には今のところ至っていない。しかしながら、BrdUを投与しての本検証の過程において、歯冠硬組織の形成期以降の歯髄の成長過程で以下のような興味深い所見が得られた。まず、歯冠硬組織形成初期では、歯髄細胞の増殖活性は低く、歯冠形成中は歯冠そのものが大きくなっても歯髄細胞数自体はあまり増加しない。そして再び歯根象牙質形成期になると歯根延長のために歯根形成端付近で著しい歯髄細胞増殖がおこり、これが歯根象牙質形成に何らかの役割を果たしていることが示唆された。過去の報告で、歯髄もしくは歯乳頭細胞は最初に、歯胚形成期において増殖を盛んに行い、顎骨の中で歯(歯冠)の成長の場所を確保することが示されているが、今回の結果と併せると、歯乳頭歯髄の発生という成長過程には二回の歯乳頭・歯髄細胞増殖のピークがあることが明らかになった。この結果は、歯が顎骨に植立するために重要な、歯根の形成、再生を考えるとき重要な意義をもつと考えられる。また、今回のプロジェクトで導入した、in situ RT-PCRのシステムは、当該期間中に、世界で始めて硬組織研究において実用段階までたどり着くことができ、今後の研究方法の選択肢を増やすことができた。現在はこのin situ RT-PCRのシステムを利用して、上記の歯髄細胞の増殖に関わる遺伝子の発現について検索中である。本年度の研究では、歯周組織を形成する細胞の起源およびその成長のメカニズムについて検討するため、さまざまな週齢のラット臼歯を用い、ラットにBrdU(5-bromo2'-deoxy-uridine)を投与することにより、細胞のラベルを行い、歯周組織形成細胞の幹細胞と推察される細胞の分裂能およびその分裂がおこる領域の特定、そしてそこから歯周組織形成の場への細胞移動を観察することを試みた。現在のところ、未だ当初提起した問題を解決するようなデータは得られていないが、臼歯歯根形成における、歯髄側の細胞動態および機能について興味深い知見が得られつつあり、鋭意検索中であり、極めて近いうちに発表が可能であると思われる。また、上記研究の過程ではc-srcノックアウトマウスを解析する機会を得、歯周組織形成、特にセメント質および歯根膜形成、そして歯根膜主線維のセメント質への埋入が起こる過程の分析にかかわる非常に興味深い所見を得た。C-srcノックアウトマウスでは一般に破骨細胞の機能不全が知られているが、それに続く歯の萌出不全も既に報告されている。今回、我々の観察では、この萌出不全に陥った切歯形成細胞の一部が、切歯そのものの形成が阻害されてもなおかつ、増殖した下顎骨中にセメント質と歯根膜を形成することが、電顕あるいは免疫組織化学的手法によって確認された。この結果は、歯周組織形成細胞のactivityは我々が想像する以上に高いものであることを示唆している。なおこの結果は、次ページのように論文にまとめて発表した。

実際の検証においては、歯周組織形成細胞の細胞増殖能は当初予測したレベルより遥かに低く仮説の実証には今のところ至っていない。しかしながら、BrdUを投与しての本検証の過程において、歯冠硬組織の形成期以降の歯髄の成長過程で以下のような興味深い所見が得られた。まず、歯冠硬組織形成初期では、歯髄細胞の増殖活性は低く、歯冠形成中は歯冠そのものが大きくなっても歯髄細胞数自体はあまり増加しない。そして再び歯根象牙質形成期になると歯根延長のために歯根形成端付近で著しい歯髄細胞増殖がおこり、これが歯根象牙質形成に何らかの役割を果たしていることが示唆された。過去の報告で、歯髄もしくは歯乳頭細胞は最初に、歯胚形成期において増殖を盛んに行い、顎骨の中で歯(歯冠)の成長の場所を確保することが示されているが、今回の結果と併せると、歯乳頭歯髄の発生という成長過程には二回の歯乳頭・歯髄細胞増殖のピークがあることが明らかになった。この結果は、歯が顎骨に植立するために重要な、歯根の形成、再生を考えるとき重要な意義をもつと考えられる。また、今回のプロジェクトで導入した、in situ RT-PCRのシステムは、当該期間中に、世界で始めて硬組織研究において実用段階までたどり着くことができ、今後の研究方法の選択肢を増やすことができた。現在はこのin situ RT-PCRのシステムを利用して、上記の歯髄細胞の増殖に関わる遺伝子の発現について検索中である。
擬解析関数による偏微分方程式の研究

安倍は擬等角写像の原点である等角写像論の立場に立ち円環内正則単葉関数(ただし、一個の極をもつ関数)についてその写像を精細に調べた。その結果除外領域の面積と写像関数のLaurent展開係数との間に密接な関係があることが明かとなった。この研究結果に基ずいて擬等角写像における除外領域に関する精細な研究を今後行う予定である。猪狩は多変数解析関数論の上に立って、Cauchy問題について研究を行った。従来得られている結果はCauchy-Kowalewski定理を中心とするものであり、それは初期面は非特性的である場合である。猪狩の研究は初期面が特性的であり、重複度は変化する場合であり、初期データを(m-1)個あたえて、解が只一つ出来るための十分条件を求めた。双曲型偏微分方程式に対して、熱伝導方程式の拡張として考えられる発展方程式の研究もまた重要である。定松は一搬化された発展方程式に対する初期値問題(Cauchy問題)について、初期値に対する連続性および一意性(すなわち、一様適切性)について詳しく調べ、そのための1つの必要条件を導いた。天野は等角写像における基本定理であるRiemannの定理の応用として任意のJordan領域を単位円内に写像する数値計算法として全く新しい方法を開発した。すなわち従来の積分方程式の方法に代って、電磁気学の応用として代用電荷法によるものであり、計算アルゴリズムも簡単であり、精度も良いものである。この方法により、さらに外部問題、および、2重連続領域の等角写像の数値計算のアルゴリズムが今後研究される予定である。
発達性読字障害における科学的評価基準作成ならびに教育支援開発

発達性読字障害における科学的評価基準作成を行った。DYX1C1遺伝子変異では日本国内では有意差は検出されなかった、多チャンネル脳波周波数解析法では賦活される脳内部位に相違を認めた。読時反応検査では、読字障害者では、有意な反応時間延長と読字間違いを検出した。この結果もふまえ、障害を迂回する教育的治療法を個別に実施する訓練方法を開発し、現在学校現場で試行中である。読字書字障害には遺伝子の一塩基多系の関与が指摘されているが、読字障害候補遺伝子とされたDYX1C1では欧米では多型と障害の統計的有意差が各国で異なっている。この一因としては言語体系が異なっていることが要因にあげられている。最近日本で作成された診断ガイドラインを基準に診断された読字障害を対象に、国内でのDYX1C1遺伝子変異の検討を行った。国内での家族例を中心に、読字障害例、その家族ならびに正常ボランティアのDYX1C1遺伝子変異率は、統計上明らかな有意差は得られなかった。今後症例数を増やし、統計的検討にたえうる症例数にすることが課題である。初年度にDYX1C1遺伝子異常を認めなかった症例には、特に家族例を対象として連鎖解析により候補遺伝子を特定する。またDYX1C1遺伝子スクリーニング結果をdirect sequence結果と比較し、スクリーニングの精度を検証し有用性を確認した。下山が独自に開発した多チャンネル脳波周波数解析法により、日本語かな、カタカナ、漢字を負荷した場合の脳内賦活部位の検討を開始した。また、読字障害で検査を指向した学童と同年齢の正常コントロールとして検査ボランティアを依頼し、両者での日本語脳内認知機構の差異を解明した。以上の結果に基づき、発達性読字障害に対する視覚認知や音韻処理過程の異常の有無を検討し、障害を迂回する治療法を検討した。現在遺伝子変異を有する児童に対する電気生理学的検査を実施中であり、上記遺伝子検査を組み合わせた客観的読字障害診断基準作成を目指している。発達性読字障害を示す学童を対象にして、多チャンネル脳波周波数解析法により脳内認知機能の異常の有無を共同で研究した。昨年度に引き続き、日本判読字障害診断ガイドラインを基準に診断された読字障害児を対象に、国内でのDYX1C1遺伝子変異の検討を行った。この一因としては言語体系が異なっていることが要因にあげられており、これが日本での読字障害にもあてはまるか日本独自にさらに検討を行い、明らかにする必要がある。国内では申請者らが始めて欧米で報告されたDYX1C1遺伝子スクリーニング体制を樹立した。DYX1C1遺伝子スクリーニング結果をdirect sequence結果と比較し、スクリーニングの精度を検証し有用性を確認した。正常児やDYX1C1遺伝子異常の有無にかかわらず発達性読字障害を示す学童に対し、mismatch法による単語の脳内認知機能の異常の有無を検討した。パソコンを用いた語彙認知の反応時間を短時間で検査できるもので、学校現場で多数の児童を同時に検査可能である。読字障害児では明らかに読字反応時間の遅延を認め、語彙の処理速度の障害が推定された。現在下山が独自に開発した多チャンネル脳波周波数解析法により、日本語かな、カタカナ、漢字を負荷した場合の脳内賦活部位の検討を行っている。以上の結果に基づき、発達性読字障害に対する視覚認知や音韻処理過程の異常の有無を検討し、障害を迂回する治療法を構築し、個別の特別支援教育に応用している。前年度に引き続き新たに診断された発達性読字障害のDYX1C1変異の有無についてスクリーニングを行った。家族発症の症例ではDYX1C1遺伝子異常を多く見出した家系が存在したが、統計的には優位さは認められなかった。現在DYX1C1以外の候補遺伝子を検索中である。今回の結果得られた発達性読宇障害症例を対象に神経生理学的検査を行い、文字認知や音韻処理の脳内病態解明を行った。下山が独自に開発した多チャンネル脳波周波数解析法により、日本語かな、カタカナ、漢字を負荷した場合の脳内賦活部位の検討を行い、賦活される脳内局在の差異を検出できた。読字障害児童や難聴児童での読時における脳内賦活部位も検索し、健常児との違いも明らかにした。今後はこれら文字学習における教育効果判定にリアルタイムでの応用が可能と思われる。一方、日本語かな、カタカナ、漢字における読時反応時間を小学生高学年から中学生で検討した。特に読時反応時間検査により、アルファベットだけではなく、日本語文字でも小学校から中学校までの間で反応時間短縮が検証された。母国語においても、中学生では文字認知は発達過程であることが判明し、国語を継続的に学習する重要性が再確認された。

さらに英語やイタリア語などアルファベットと日本語文字との比較検討を英語圏、イタリア語圏で行い、言語環境での文宇認知の相違を明らかにした。日本での読字障害児童では、優位に読時反応時間の延長や読字の誤りが優位に多く検出された。我々が障害を迂回する教育的治療法を開発し、個別の文字学習プログラムを実践したところ改善が得られた。現在このプログラムをパソコンにて実施できるシステムを完成したところであり、今後教育学部附属小中学校などでトライアルを予定している。
行動変容をふまえた減量プログラムの効果維持・運動継続を支援するプログラムの開発

行動変容を踏まえた3ヶ月間の減量プログラムは、介入効果を1年後も維持させることができた。2年後では維持するものが減少する傾向にあったが、身体組成と体力測定を実施することで生活習慣を見直す機会となっていた。運動継続を支援するプログラムとして、インターネットを活用したプログラムを試みたが、個人のコンピュータリテラシーの影響を受け、継続支援を効果的に実施することはできなかった。むしろ年に1回実施した身体組成や体力測定が、現状を認識させ改善への取組を再開する機会となり、介入プログラムとあわせて運動継続を支援する効果的なプログラムであることが示唆された。本研究の目的は生活習慣病予防及び改善のための減量プログラムとして、行動変容に基づく学習型の教室プログラム(Maximize Your Body Potential ;Joyce D,Nash:1986をベースに本研究者が開発)3ヶ月間、一般市民(20歳)に実施し、その効果がどの程度継続するか(6ヶ月、1年、1年6ヶ月、2年)を各種健康指標と行動指標から検証すると共に、教室終了後の支援プログラムを開発してその効果を見るものであった。今年度の発表では、プログラム作成にあたりこれまでの予備実験の結果を発表し、運動継続に向けたわかりやすい行動目標として、1日1万歩の妥当性につて検証した。厚生労働省から提案されている身体活動のガイドラインにおおむね準じた指標であることが検証できたので、プログラムの中で採用することにした。また、肥満者の特徴を生活パターンでとらえることを試みた。その結果、正常体重者に比べて運動量だけでなく運動強度も低いことが明らかとなった。したがってこの結果から、運動強度を高める介入が重要であることが示唆されたので、教室プログラムではその点を意識したプログラムを展開した。またこれまでの予備調査で実施したデータを用いてプログラムの介入効果(直後)を学会で発表した。3か月の教室効果は効果があることは実証できたが、その後にこの効果が継続できるかどうかは本研究の課題でもある。今年度は計画初年度にあたり、計画通り5月からの3ヶ月間と10月からの3ヶ月間を実施したが、分析には両方のデータを使用するために、これらのデータを用いた研究成果の発表は,次年度に行うことになる。本研究の目的は、行動変容をふまえた学習型の減量プログラムの介入効果がどの程度まで継続するのかを明らかにすることであった。今年度はまず、行動変容を学習型の減量プログラムの教室終了直後の効果について、分析し発表した。効果は身体的効果だけでなく、行動変容を促すための演習やツールについて、参加者の評価を明らかにした。参加者の受け止め方が今後の継続に影響を及ぼすものと推察したからである。今後は昨年度末に収集した6ヶ月後データと今年度に収集した1年後データを合わせて分析し、その後の効果にどの様な影響を及ぼしているかを明らかにしていく予定である。また、3ヶ月間の介入の結果、体力的な向上が認められたので、総合的な体力因子と腹部肥満との関係も何らかの関連があるのではないかと予測し、これまでに集積したデータと合わせて解析した。その結果、総合的な体力が腹部肥満の発生を予測しうる因子である可能性が示唆されたのでこの結果についても発表を行った。学習型の減量プログラムが身体的な介入効果だけでなく、行動変容を狙ったプログラムとして有効であったかどうかについて、さらに継続性を勘案して今後分析を続けていきたい。また参加者が効果的であったと実感するプログラムにはどのようなものがあったのか、質的な部分も合わせてプログラムの効果を評価していきたい。もうひとつの目的であったICTの活用については、参加者の利用頻度が低く十分な支援体制を作ることができなかった状況があるが、これについても実際の結果についてその原因を詳細に分析し、解決策を提案できるように次年度にまとめて公表していく予定である。今年度は2年間の最終的なデータを収集することができたので、目的の一つである、行動変容学習型の減量プログラムの教室終了の継続的な効果について、教室終了後の半年後、1年後、2年後を分析し発表した。結果として、3ヶ月間の教室終了後、さらに3ヵ月後の半年では、体重や体脂肪率の身体組成が減少もしくは減少の維持が認められた。その傾向は1年後にも認められ、教室の効果が1年間継続していることが明らかとなった。さらにその中で行動として継続されているのは"体重測定"が最も高い割合を示していた。一方で"運動の記録"や"食事の記録"の継続の割合は低いことが明らかとなった。さらに2年後のデータを収集し分析した結果、体重、体脂肪率、最高血圧、最低血圧は介入前よりも低下しており、良い状態が維持されていたが、総コレステロールは有意に高い値であった。

体力については握力、長座体前屈で有意な減少であったが、上体起こしや脚筋力、閉眼片足立ちは向上していた。しかしながら、運動継続への自信や体重管理継続への自信が有意に低下しており、1年に1回以上の健康診断や体力測定を行なうことで、これらの自信を高める仕掛けが重要であることが示唆された。これらの結果は、教室のプログラムとしてウォーキングの実践や家庭でできるストレッチ、筋力トレーニングを実施しており、その成果と推察される。運動プログラムは具体的方法を学べば自分で行なうことができる。また体重についてはその管理のしかたを運動と食事の両面で学び、さらに睡眠も含めた生活の仕方や問題への対処など考え方にも及んだ行動変容プログラムが、自分なりの体重管理、健康管理を実践することに効果に働いたものといえよう。今後はこのプログラムをさらに広めるためにDVDを作成して活用方法を検討する予定である。
高齢者への薬物治療の実態解明と評価及びエビデンスの創出動向

高齢者は多病であることが多く、疾患ごとに薬剤を処方することで多剤併用の状態に陥りやすい。高齢者は、医療ニーズが様々である上、生活の場や介護の必要度等が異なり、個々の状況に応じた薬物治療を提供する必要がある。一方で、高齢者の薬物治療においては、十分に科学的な意思決定を行うためのエビデンスが不足しているのが現状である。本研究の目的は、第一に、高齢者への薬物治療の実態把握及び評価を行うことである。(1)臨床において実際に注意を要する薬剤の組み合わせとして、薬物代謝酵素を介した潜在的な薬物間相互作用(DDI)に着目して検討した。全国老人保健施設協会の調査研究事業で得られたデータを用いた。2種類以上の薬物治療を受けている入所者において、DDIは約3%にみられ、関与する薬剤として、ベンゾジアゼピン系睡眠薬・抗不安薬、プロトンポンプ阻害薬、カルシウム拮抗薬、抗てんかん薬が多かった。また、処方薬剤種類数が多いほど、DDIのリスクが高いことを確認した。研究成果は国際誌にて報告した。(2)その他の検討を行うための準備も進めている。例えば、高齢者における薬剤処方実態について検討するため、レセプト情報・特定健診等情報データベース(NDB)の利用申請を行い、データを取得後、解析を開始した。また、高齢者による医薬品利用及び高齢者を対象とした臨床研究の動向について調査するため、データソースを確認するとともに、文献調査を含めた関連情報の整理を行っている。種々の検討を行うための準備を整えつつ、研究成果も論文として発表することができた。平成30年度に取得・収集したデータの解析を進め、学会発表および論文投稿を行う。当初計画していた旅費が不要となったことで次年度使用額が生じた。使用計画としては、従来、研究利用を予定していたデータベースよりも大規模で悉皆性の高いナショナル・データベース(NDB)を利用する準備を整えた。NDBはデータサイズが大きく、解析には高性能のパソコンが必要であるため、そのリース費用に充当する予定である。
細胞膜タンパク質機能を制御する人工光応答分子の開発

細胞膜タンパク質受容体であるADRB2について,青色光依存的なタンパク質間相互作用誘起システムCRY2/CIBNを利用し,細胞内タンパク質Arrestinとの相互作用を誘導することでエンドサイトーシスが誘起されることを実証した.さらに本原理を他のGPCRや1回膜貫通型タンパク質に適用可能であるかどうかを検証した.その結果,エンドサイトーシスを光誘起可能なグループ(A)とそうでないグループ(B)が存在することを発見した.グループAに属するバソプレシンV2受容体(V2R)は,細胞質側に位置するC末端側領域のペプチド断片(V2RCT)のみでも細胞内で安定発現し,Arrestinとの相互作用を光誘導することでエンドサイトーシスが誘起されることが確認された.さらに,V2RCTはエンドソーム形成後にリソソームへと移行し,分解されることが判明した.そこで,ペプチド断片V2RCTを他のGPCR (ADRA2A, mGluR1a)に付加した融合タンパク質を作成した.光照射によりArrestin-CRYとの相互作用を誘導したところ,多くの融合膜タンパク質がエンドサイトーシスされる様子が観察された.特にADRA2Aは本来エンドサイトーシスが光誘起されないグループBに属するGPCRであり,付加したペプチド断片V2RCTによってエンドサイトーシスが誘導されたことが判明した.平行してランタニドナノ粒子(LNP)の光操作を培養細胞を用いて検討した.アップコンバージョン粒子を含むコラーゲン基板上で光制御システムを導入し,近赤外光レーザー(976 nm, CW)を照射し,青色光駆動光制御システムの駆動を検証した.近赤外光照射にともない,紫外光照射と同様のArrestinの膜以降とエンドサイトーシスが確認されたことから,LNPを用いることでCRY2の近赤外光操作が可能であることが解った.申請時に予定していた(I)膜レセプターの活性をアップコンバージョンナノ粒子(LNP)により制御する技術については,概ね予定通りの成果を得ることに成功している.特に光操作タンパク質であるCRY2が,LNPの近赤外光照射により動作することが培養細胞レベルで確認することができた.この成果を基に,LNPを用いたCRY2の光操作が,既存の光操作ツールを含め可能となり,今後の大きな展開が期待できる成果である.課題(II)細胞膜レセプターのリサイクリング(エンドサイトーシスとエクソサイトーシス)を近赤外光により操作する技術では,バソプレシンV2受容体(V2R)の細胞質側に位置するC末端側領域のペプチド断片(V2RCT)を,標的レセプターに連結することで,そのリサイクリングが青色光照射により可能であることを実証することができた.さらにLNPを分散させた培養ディッシュでは,近赤外光照射によりレセプターのリサイクリングを誘導することが可能となった.以上より研究はおおむね順調に進展している.課題(I)膜レセプターの活性をアップコンバージョンナノ粒子(LNP)により制御する技術については,LNPの表面修飾を行い,肝臓や脳への組織ターゲッティングを行う.また,LNP表面にLOV2を連結した粒子を作製し,光照射に伴う膜レセプターの凝集を実行可能にする.課題(II)細胞膜レセプターのリサイクリング(エンドサイトーシスとエクソサイトーシス)を近赤外光により操作する技術では,標的タンパク質となるEGFRのRepebodyをリアクティブタグで連結した架橋分子を作製する.そして,リサイクリング可能な膜タンパク質にリアクティブタグを反応させて,EGFRを細胞外から架橋できることを実証する.ここで細胞外から青色光照射した時,実際にEGFRがリサイクリング分子とともに,エンドサイトーシスが起こるかどうかを検証する.上手く動作しないときは,細胞膜上のリサイクリングタンパク質の発現量,光の照射タイミング,架橋反応などの条件検討を行い,効率よく内在性のEGFRがリサイクリングされることを立証する.細胞膜タンパク質受容体であるADRB2について,青色光依存的なタンパク質間相互作用誘起システムCRY2/CIBNを利用し,細胞内タンパク質Arrestinとの相互作用を誘導することでエンドサイトーシスが誘起されることを実証した.さらに本原理を他のGPCRや1回膜貫通型タンパク質に適用可能であるかどうかを検証した.その結果,エンドサイトーシスを光誘起可能なグループ(A)とそうでないグループ(B)が存在することを発見した.グループAに属するバソプレシンV2受容体(V2R)は,細胞質側に位置するC末端側領域のペプチド断片(V2RCT)のみでも細胞内で安定発現し,Arrestinとの相互作用を光誘導することでエンドサイトーシスが誘起されることが確認された.さらに,V2RCTはエンドソーム形成後にリソソームへと移行し,分解されることが判明した.そこで,ペプチド断片V2RCTを他のGPCR (ADRA2A, mGluR1a)に付加した融合タンパク質を作成した.光照射によりArrestin-CRYとの相互作用を誘導したところ,多くの融合膜タンパク質がエンドサイトーシスされる様子が観察された.特にADRA2Aは本来エンドサイトーシスが光誘起されないグループBに属するGPCRであり,付加したペプチド断片V2RCTによってエンドサイトーシスが誘導されたことが判明した.平行してランタニドナノ粒子(LNP)の光操作を培養細胞を用いて検討した.アップコンバージョン粒子を含むコラーゲン基板上で光制御システムを導入し,近赤外光レーザー(976 nm, CW)を照射し,青色光駆動光制御システムの駆動を検証した.

近赤外光照射にともない,紫外光照射と同様のArrestinの膜以降とエンドサイトーシスが確認されたことから,LNPを用いることでCRY2の近赤外光操作が可能であることが解った.申請時に予定していた(I)膜レセプターの活性をアップコンバージョンナノ粒子(LNP)により制御する技術については,概ね予定通りの成果を得ることに成功している.特に光操作タンパク質であるCRY2が,LNPの近赤外光照射により動作することが培養細胞レベルで確認することができた.この成果を基に,LNPを用いたCRY2の光操作が,既存の光操作ツールを含め可能となり,今後の大きな展開が期待できる成果である.課題(II)細胞膜レセプターのリサイクリング(エンドサイトーシスとエクソサイトーシス)を近赤外光により操作する技術では,バソプレシンV2受容体(V2R)の細胞質側に位置するC末端側領域のペプチド断片(V2RCT)を,標的レセプターに連結することで,そのリサイクリングが青色光照射により可能であることを実証することができた.さらにLNPを分散させた培養ディッシュでは,近赤外光照射によりレセプターのリサイクリングを誘導することが可能となった.以上より研究はおおむね順調に進展している.課題(I)膜レセプターの活性をアップコンバージョンナノ粒子(LNP)により制御する技術については,LNPの表面修飾を行い,肝臓や脳への組織ターゲッティングを行う.また,LNP表面にLOV2を連結した粒子を作製し,光照射に伴う膜レセプターの凝集を実行可能にする.課題(II)細胞膜レセプターのリサイクリング(エンドサイトーシスとエクソサイトーシス)を近赤外光により操作する技術では,標的タンパク質となるEGFRのRepebodyをリアクティブタグで連結した架橋分子を作製する.そして,リサイクリング可能な膜タンパク質にリアクティブタグを反応させて,EGFRを細胞外から架橋できることを実証する.ここで細胞外から青色光照射した時,実際にEGFRがリサイクリング分子とともに,エンドサイトーシスが起こるかどうかを検証する.上手く動作しないときは,細胞膜上のリサイクリングタンパク質の発現量,光の照射タイミング,架橋反応などの条件検討を行い,効率よく内在性のEGFRがリサイクリングされることを立証する.
基本翻訳因子パラログに潜む選択性を利用した環境適応機構

真核生物の翻訳開始に必須な因子eIF4Aは、eIF4A1とeIF4A2の2種類のパラログを持っている。両者は90%のアミノ酸が一致しているため、機能的な差はないと考えられてきた。しかし、申請者の解析からeIF4A1とeIF4A2は異なるmRNAの翻訳を選択的に促進していることが判明した。本研究では、eIF4A1とeIF4A2の間に存在する選択性を保証する分子機構を解明し、選択性の生理的意義を環境適応の観点から考察する。
プレフォーム型エンドレインドエアーの開発

フライアッシュは資源の有効利用およびアルカリシリカ反応対策の観点から利用の拡大が期待されている。しかし,フライアッシュコンクリートはフライアッシュに含まれる未燃カーボンがAE剤を吸着し,コンクリートの空気量を適正に管理することは難しいため,耐凍害性が低下する危険性がある。そこで本研究では,未燃カーボンの影響を受けにくいムース状のプレフォーム型AE剤を用いて,微細な空気泡を混入することにより,耐凍害性を高めることを試みた。研究の結果,以下のことが明らかとなった。1)プレフォーム型AE剤はムース状の微細泡の集合体であり,普通コンクリートに使用した場合,コンクリートのフレッシュ性状,強度特性および耐凍害性は,普通AE剤と同等かそれ以上である。2)プレフォーム型AE剤はフライアッシュに含まれる未燃カーボンの影響を受けにくく,フライアッシュ置換率30%までは空気量とAE剤使用料は比例関係にあり,空気量のコントロールが容易である。3)フレッシュコンクリートの空気量が同じ場合,プレフォーム型AE剤を用いたコンクリートの気泡間隔係数は普通AE剤を用いたコンクリートに比べて小さい。このため,耐凍害性が高い。4)プレフォーム型AE剤を高流動コンクリートへ用いた場合,その効果がより大きく,少ない空気量(2%台)でも耐凍害性が確保できる。5)プレフォーム型AE剤を用いたフライアッシュプレキャスト製品は,製造時の脱泡量が少なく,さらに製品の肌面も綺麗に仕上がる。2)プレフォーム型岨剤はフライアッシュに含まれる未燃カーボンの影響を受けにくく,空気量のコントロールが容易である。また,フレッシュコンクリートの空気量が同じ場合,プレフォーム型AE剤コンクリートの気泡間隔係数は普通AE剤を用いたコンクリートに比べて小さい。3)プレフォーム型AE剤を用いた高流動フライアッシュプレキャスト製品は,製造時の脱泡量が少なく,少ない空気量でも耐凍害性が確保できる。さらに製品の肌面も綺麗に仕上がる。