hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
糖鎖認識T細胞受容体遺伝子

[目的]これまで我々はマウス・メラノーマ抗原として機能しているGM3ガングリオシドを用いたリポソームを認識するT細胞による糖鎖認識のメカニズムを、分子レベルで解析してきた。平成6年度は、以下の計画のもとに実験を行った。(1)複数のGM3認識T細胞株からT細胞受容体遺伝子を単離し、そのcDNAの塩基配列を決定する。(2)GM3ガングリオシドは特に胎盤に多いことから、これを認識するT細胞集団は正常マウスでも胎盤に多いことが考えられた。つまりこのT細胞集団は、妊娠と何らかの相関があると考えられた。そこでGM3と妊娠の関係を理解するために、GM3認識T細胞の分化・生理的意義を調べる。そのために[結果・考察](1)GM3リポソームを認識するT細胞株を用いた解析はほぼ終了した。多くの細胞株を解析してもやはり均一なVα11Jα281/Vβ13が主であることが判明した。しかしin vitroのバイアスをかけないためにGM3リポソームと同時培養したマウスspleen細胞のT細胞受容体の解析を高感度な環状PCR法、または最近我々が開発した超高感度のPCR法を用いて現在解析を行っている。ちなみにこの方法は、1個の細胞からcDNAライブラリーを作成し得る感度を有している。(2)妊娠期間中の母親の末症血中に存在するVα11Jα281という再構成の際に生ずる環状DNAの量を測定した。コントロールとして同じJα281と異なるV(Vα4)との再構成の際に生ずる環状DNAを用いた。妊娠14-16日において一過性にVα11Jα281環状DNAのみが増加していることが観察された。つまり妊娠の中期から後期において一過性にGM3認識T細胞特異的な遺伝子再構成が起きていることがわかった。このことから、妊娠中期にGM3を認識するT細胞特異的な遺伝子再構成が胎盤でまず起き、4-5日後に末梢でも同じ再構成が起きることがわかった。以上のことより、GM3を認識するVα11Jα281/Vβ13という均一な抗原リセプターを持つT細胞が妊娠の維持に関与しているのではないかと考えられるので、現在さらにこの点を追求している。このような抗原(GM3)/均一な抗原リセプター(Vα11Jα281/β13)/生理的意義(妊娠の継続)というシステムの樹立はほかに例がない。このシステムを用いることにより、糖鎖構造と生命現象は免疫学を介して解析できると考えられる。
シルバー人材センターの新規事業としてのSP養成の可能性の検討

平成30年度の計画は、1シルバー人材センターの新規事業としての「SP養成」およびカリキュラムの実施、2シルバー人材センター登録者の入院経験・闘病経験を活用したシナリオ作成、そのシナリオを活用したSP参加型教育の実施・評価、3新規事業としての研究まとめとしていた。1については、協力していただくシルバー人材センターより新規事業としては雇用形態(請負制)の関係から難しいとのことで、ひとまず登録者への研究参加依頼ならば実施可能とのことで開始した。結果、6名のシルバー人材センター登録者の参加協力を得て、前年度に作成した「SP養成」カリキュラムを実施した。カリキュラム実施中に1名の辞退者があり、結果的に5名がカリキュラムを終了した。2については、SPとなった5名の入院経験・闘病経験を活用したシナリオ作成を行い、5つのシナリオを完成した。そのシナリオを用いて学部生1年生に対して、シルバー人材センター登録者SPを活用した実習前のコミュニケーション演習としてSP参加型教育を実施した。評価のため、学生には演習前後にアンケート(藤本・大坊のコミュニケーション・スキル尺度(ENDCOREs)、坂野・東條の一般性セルフエフィカシー尺度)を実施し、SPには終了後にインタビューを行った。3については、演習前後のアンケート、参加者のインタビューおよび実際のシルバー人材センターの雇用形態などシルバー人材センター職員のインタビュー等から新規事業としての可能性の検討を行っているが、まだ終了していない。シルバー人材センター登録者への「SP養成」カリキュラムの実施、彼らの入院経験・闘病経験を活用したシナリオ作成、そのシナリオと養成したSPを活用したSP参加型教育の実施は、当初6月の実習前までに終了する予定だった。しかし、前年度の計画がずれ込み、「SP養成」カリキュラムへの着手が6月からとなり、実際のSP参加型教育の実施も12月と大幅に遅れたため、全体的に遅れが生じた。今年度の計画では、シルバー人材センターでの新規事業化としてSP養成や活用について、シルバー人材センターおよび医療職種大学(医学・薬学・歯学・理学・看護学など)へ全国調査を実施する予定である。しかし、現段階でシルバー人材センターの新規事業としては雇用形態の問題(請負=雇用者から直接業務に関する要望を作業者には指示できない)があり、この請負制については各センターで徐々に雇用形態の見直しなど過渡期であることから決して新規事業として可能性が無いわけではないが、「SP養成」をシルバー人材センターでの新規事業として全国調査を開始する以前に限界が予想される。今後の方向性としては、センターで統括するボランティア活動としての事業ならば可能(活動そのものに縛りはなく、活動依頼者からの直接的な指示や要望を行っても支障はない)であることが把握できており、全国調査もボランティア活動として登録者を募った場合のSP養成・活用方法についてを再考したうえで全国調査にとりかかる。H29年度は、1シルバー人材センターの新規事業としてのSP養成カリキュラム(以下、シルバーSP養成カリキュラムと略す)の構築、2立川市シルバー人材センターへ登録している地域住民への研究依頼・SP候補の決定を行う予定であった。1については、これまでにSP養成を行ってきた団体のSP養成カリキュラムを参考に、SP養成に長年かかわってきた方々からスーパーバイズを受け、シルバーSP養成カリキュラムを作成した。当初は、シルバーSP養成カリキュラム完成後に、シルバー人材センターへ新規事業として「SP養成」の事業開設を、シルバーSP養成カリキュラムの内容とともに説明する予定だったが、カリキュラムの作成と倫理申請が遅れたため未だ着手できていない。新規事業としての開設が不可能な場合は、本研究への協力を依頼し、立川市シルバー人材派遣センター登録者のSP候補の依頼につなげる予定である。2についても、同様にカリキュラムの作成倫理申請が遅れたため、シルバー人材センターへの研究協力の依頼を済ませたものの、現在はまだシルバー人材センターからの返答待ちの状況である。協力が得られた場合は、シルバー人材センターに登録している地域住民へ、研究参加の意思の有無を把握できるチラシを速やかに準備(研究参加申し込み添付)し、シルバー人材センターへ配布・回収を依頼し、早々にSP候補者を募り、シナリオ作成を進め、この作成したシナリオとシルバー人材センターSPを活用したSP参加型教育の実践を行う予定である。SP養成カリキュラムの作成と倫理審査に時間がかかり、前年度までに予定していたシルバー人材センターへの協力依頼に後れを生じ、SP養成・SPシナリオの作成・SPの決定が終わっていない。

シルバー人材センター登録者への「SP養成」カリキュラムの実施、彼らの入院経験・闘病経験を活用したシナリオ作成、そのシナリオと養成したSPを活用したSP参加型教育の実施は、当初6月の実習前までに終了する予定だった。しかし、前年度の計画がずれ込み、「SP養成」カリキュラムへの着手が6月からとなり、実際のSP参加型教育の実施も12月と大幅に遅れたため、全体的に遅れが生じた。当初の計画では、シルバー人材センター登録者の入院・闘病経験を活かしたシナリオを用いたSP参加型教育の実践を6月に予定していたが、これを12月に変更する。この間に遅れているSPシナリオの作成・SPの決定を進め、SP養成カリキュラムの実施も10月に行い、12月のSP参加型教育を実施する。その後、このSP参加型教育に関して今年度内に分析・評価する。これにて、来年度の全国調査(教育機関・シルバー人材センター)に当初の計画通り移行できる予定である。今年度の計画では、シルバー人材センターでの新規事業化としてSP養成や活用について、シルバー人材センターおよび医療職種大学(医学・薬学・歯学・理学・看護学など)へ全国調査を実施する予定である。しかし、現段階でシルバー人材センターの新規事業としては雇用形態の問題(請負=雇用者から直接業務に関する要望を作業者には指示できない)があり、この請負制については各センターで徐々に雇用形態の見直しなど過渡期であることから決して新規事業として可能性が無いわけではないが、「SP養成」をシルバー人材センターでの新規事業として全国調査を開始する以前に限界が予想される。今後の方向性としては、センターで統括するボランティア活動としての事業ならば可能(活動そのものに縛りはなく、活動依頼者からの直接的な指示や要望を行っても支障はない)であることが把握できており、全国調査もボランティア活動として登録者を募った場合のSP養成・活用方法についてを再考したうえで全国調査にとりかかる。初年度購入予定だったPCと、成果報告のための学会参加をせず終了したため、H30年度に実施する予定である。次年度使用額が生じた理由は、SPとしての参加協力者が当初の予定人数より集まらず、SP養成およびSP参加型教育実施にかかる費用(雇用、謝金)が少なかったことや、研究そのものがおくれまとめが年内に終了せず、成果発表のための学会参加をせずに終了したためである。使用計画については、H31年度の全国調査にむけたシルバー人材センターのボランティア活動を含めた事業に関する情報収集、および成果発表(情報収集を含めた)のための学会参加を実施する予定である。
新しい単一ショット電子速度分布関数二次元計測器の開発及び速度分布と電位分布の相関

我々はこれまでに、プラズマの基幹パラメータである電子温度の空間分布計測に広く用いられてきた、半導体X線検出器の、感度理論として、この四半世紀にわたり、「教科書に広く掲載され」、プラズマ解析に用いられてきた定説の不備を正し、最近MITが提唱した理論を覆す、「半導体X線検出器新感度理論」を提唱し、シンクロトロン放射光を用いてこの新理論を実証した。平成12年度は、本研究計画に従い、電子速度分布関数の二次元空間分布計測を目的として、X線計測の基盤を固めるため、上記の「半導体X線計測器新感度理論」を応用・拡張し、その計測が一般に困難な数10eVから数10keVまでの広範囲のプラズマX線の時間・空間分布を、1プラズマ・ショットで計測可能な、新型マトリックス型半導体検出器を開発した。更に、本検出器を筑波大学プラズマ研究センターのガンマ10タンデム・ミラー装置に設置し、本研究の新X線計測システムの確立に対する整備を行った。平成13年度は、整備した本新計測システムを用いて、X線計測をガンマ10プラズマを用いて実際に行った。更に、プラズマ・パラメータを変化させて、電子の速度分布関数の詳細計測と、電位との相関について、研究を行った。今年度は、昨年度までに確立した本新型計測器を基盤として、電子速度分布関数・電子温度及び電子閉じ込めに対する、プラズマ半径方向のシアー効果を含む電位の効果と相関、並びに電子密度、電子加熱電力、密度半径分布の影響・効果、それらを統合した、電子閉じ込め電位分布と電子速度分布関数・温度分布の相関の整理・体系化に基づく、両者の間の比例則の確立を行った。これらの成果は、欧州及び米国の学術誌に公表し、その成果を世界に広く示した。
コーディング手法を用いた異種感覚情報統合の神経基盤の解明

動物は複数の感覚器官から得られた情報を神経系で統合し,周囲の環境を正確に知覚する。しかし,複数の感覚器官で検出された同一の出来事・対象物に関する情報がどのように脳・神経系で統合されるのかは未知な部分が多い。そこで本研究は,感覚情報処理における各細胞の役割が判明しているコオロギの聴覚系および気流感覚系に着目することで,この問題にアプローチした。コオロギ聴覚回路において,聴覚細胞であるascending neuron 2(AN2)は,鼓膜器官を介して捕食者であるコウモリが発する超音波エコーに応答し,その神経応答が逃避行動を誘発させることが判明している。本研究は,超音波エコーのみならず,同じく捕食者の接近の手がかりとなる気流刺激に対してもAN2がスパイク応答を示し,聴覚と気流感覚入力を線形に足し合わせることを明らかにした。気流を検出する尾葉と呼ばれる感覚器官を切除するとAN2の気流応答が消失したことから,AN2は鼓膜と尾葉から感覚入力を受けると分かった。さらに,聴覚と気流感覚入力の線形加算による神経応答の増加に伴い,バーストと呼ばれる特徴的な高頻度発火が観察された。先行研究から,AN2はこのバースト発火を用いて音圧・音源位置などの音情報を符号化し,かつ飛行中のコオロギに逃避行動を誘起させることが判明している。よって本研究の結果は,捕食者であるコウモリが接近する際に生じる超音波エコーと気流刺激を,聴覚二次神経細胞であるAN2が統合し,逃避行動を適切に誘起できることが示唆された。これは,捕食者という特定の対象物に関する情報が,情報処理の初期段階に位置する単一の細胞において線形に統合されていることを意味する。29年度が最終年度であるため、記入しない。本研究は,コオロギの気流感覚系と聴覚系をモデルとして,刺激方向情報処理に関する異種感覚統合の神経基盤を解析することを目的とした。コオロギの神経系において聴覚と気流感覚を統合する多感覚応答性ニューロン(multisensory neuron; MSN)は見つかっていないため,1年目ではMSNの同定を目指した。始めに,MSNが存在する神経領域を絞り込むため,前胸神経節の上行性神経群の活動を細胞外記録法で測定した。記録された上行性神経群のなかに,音と気流の両刺激に対し応答するニューロンが観察され,この結果から,気流および聴覚情報を脳に運搬する以前にすでに多感覚統合がなされることが示唆された。細胞外記録で観察されたMSNを同定するため,細胞内記録法によるニューロンの活動計測,および色素導入による細胞形態の観察を行った。細胞内記録によって,すでに聴覚性二次感覚ニューロンとして同定されていたいくつかの細胞が,尾葉への機械(気流)刺激にも応答することが明らかになった。この結果から,初期の感覚情報処理段階において既に多感覚統合が生じていることが明らかになった。MSNを同定できたことで,ニューロン内での異種感覚情報処理機構とそれが行動に与える影響を調べることが可能となった。先行研究から,聴覚系および気流感覚系は共に方向性をもった逃避行動を仲介し,同定されていた聴覚性二次感覚ニューロンの一つが逃避行動を引き起こすことが分かっている。本研究において,逃避行動を仲介する聴覚性感覚ニューロンが気流刺激にも応答し,また予備実験の結果からこのMSNが音および気流刺激に対し方向感受性をもつことも示唆された。これらの結果は,刺激方向情報処理に関する異種感覚統合が方向性をもった逃避行動に与える影響を解明するための大きな一歩となると考える。初年度の年次計画の一つである多感覚統合を行うニューロンの同定を達成することができた。しかし,多感覚応答性ニューロン(MSN)からの細胞内記録が安定せず,音と気流の同時提示時のMSNの刺激強度依存性,刺激方向依存性を明らかにできなかった。この問題を解決するため,2016年5月から英国ケンブリッジ大に約1ッ月間研究室訪問し,細胞内記録法の技術を習得する予定である。また2年目では,単一モダリティに応答するニューロンとMSNが果たす機能的役割を明らかにするため,多点電極を用いた細胞外記録を予定している。テトロード電極を使用した細胞外記録法の実験技術を習得するため,2015年11月に同志社大学に出向き,その後,所属する北海道大学において多点電極による細胞外記録のセットアップを構築した。上記のように,年次計画の一つを達成し,来年度にむけて実験準備を行うこともできたため,実験はおおむね順調に進展していると考える。生物は複数の感覚器官から得られた情報を神経系で統合し,周囲の環境を正確に知覚する。異なる感覚器官で検出された感覚情報は,刺激が生じた時間と刺激源位置が一致することで,同一の出来事・対象物から発せられた情報と知覚される。しかし時空間情報処理に関する多感覚統合の神経基盤は十分理解されていない。本研究はコオロギの聴覚と気流感覚系をモデルとして,異なるモダリティの時間・刺激源位置の情報を統合する神経基盤を解明し,刺激源位置の情報処理において単一モダリティに応答するニューロンと複数モダリティに応答するニューロンが果たす機能的役割を明らかにすることを目的とする。本研究はコオロギの聴覚と気流感覚を材料とする。コオロギは聴覚系または気流感覚系を介して捕食者の接近を知覚し,方向性のある逃避行動を発現する。

両感覚系で逃避行動に影響を与える感覚ニューロンが同定され,刺激方位情報処理に関わる神経回路が解明されているが,両感覚系を統合する神経基盤は不明だった。本研究の1年目では,音と気流に応答を示すニューロンを同定し,前胸神経節に存在する複数の聴覚ニューロンが気流刺激にも応答することを明らかにした。気流に応答した聴覚ニューロンの中でも,ascending neuron2 (AN2)はコオロギの捕食者である蝙蝠の超音波に応答し,飛行中のコオロギに逃避行動を誘発する。2年目ではAN2に注目し,AN2が行う異種感覚情報の計算処理とそれを支える細胞内メカニズムの解明を目指した。音と気流刺激を同時かつ同方向から提示した時のAN2の膜電位変化を細胞内記録により計測した。音と気流の同時提示は音・気流の単独提示より多くのスパイクを引き起こし,同時提示時のスパイク数は単独で誘発されたスパイク数を足し合わせたものより多かった。つまりAN2は音と気流の入力を非線形に加算した。また同時提示では高頻度発火のburstが生じた。burstを生み出す細胞内機構を解明するため,スパイクの閾値に注目した。膜電位の時間変化と一次微分した膜電位の時間変化パターンに基づいてスパイク閾値を推定する。音・気流の単独提示,同時提示でスパイク閾値に差はみられなかったが,ISIが短くなるほどスパイク閾値が増加した。閾値がモダリティによらないため,次に各刺激で生じる興奮性膜電位(EPSP)に注目した。膜電位応答に10ミリ秒の中央値フィルターをかけてスパイクを除去し,EPSP波形を抽出した。同時提示では高さ,面積ともに音・気流単独提示より大きなEPSPが生じた。刺激で生じた1発目のスパイクで時間をそろえてEPSPを並べると,単独提示で誘発されるEPSPは1発目のスパイク後すぐに減衰したのに対し,同時提示ではEPSPが約15ミリ秒にわたって持続した。上記の結果から,AN2は閾値を上げることでburstの発生を抑えているが,音と気流という異なるモダリティの刺激が同時に入力すると長く続くEPSPが生じburstを発生させる。このburstが非線形な加算を生み出した。先行研究からAN2は蝙蝠の超音波を検出し逃避を誘発させる。本研究からAN2は異なる感覚モダリティを統合することで蝙蝠の接近をより正確に検出すると示唆される。2年次では,蝙蝠に対する逃避行動に必要なニューロンがおこなう異種感覚情報の計算処理とそれを支える細胞内メカニズムを解明できたため,本研究は期待以上の進展があったと考える。動物は複数の感覚器官から得られた情報を神経系で統合し,周囲の環境を正確に知覚する。しかし,複数の感覚器官で検出された同一の出来事・対象物に関する情報がどのように脳・神経系で統合されるのかは未知な部分が多い。そこで本研究は,感覚情報処理における各細胞の役割が判明しているコオロギの聴覚系および気流感覚系に着目することで,この問題にアプローチした。コオロギ聴覚回路において,聴覚細胞であるascending neuron 2(AN2)は,鼓膜器官を介して捕食者であるコウモリが発する超音波エコーに応答し,その神経応答が逃避行動を誘発させることが判明している。
放線菌の線状ゲノムのダイナミックな構造変化の解析

これまでの解析によって、Streptomyces griseus 402-2株の線状染色体の中央部には約2.5Mbにもわたる逆位が起きていることが明らかになっている。この逆位の両末端及び親株2247の対応する染色体領域を比較解析した結果、親株2247は約6kbのトランスポゾンを1コピーもつのに対して、402-2株は2コピーもつことが明らかになった。これらのデータから、親株染色体のトランスポゾンから約2.5Mb離れたところに2番目のコピーが逆向きに転移した仮想中間体が初めに生じた後、2つのトランスポゾン間で相同組み換えが起きて402-2株が生成したことが推定された。これを更に確認しトランスポゾンの性質を明らかにするために、subcloningと塩基配列の決定を行っているところである。(2)線状プラスミドの末端蛋白及び相互作用の解析Streptomycesviolaceoruber JCM4979株は大きさが約35kbずつ異なる390-630kbの一連の線状プラスミドをもつ。これらのプラスミドは、線状プラスミドSCP1(356kb)に環状プラスミドSCP2(31.4kb)が異なるコピー数組み込まれて生じたものと初めは推定されたが、プラスミドの大きさの違いがSCP2のサイズと完全に一致していなかった。最近、Chaterや私たちはSCP1の全塩・基配列を決定し、またSCP2の全塩基配列もAltenbuchnerらによって明らかにされた。プラスミドラダー中のSCP1-SCP2接合部の塩基配列とこれらのデータとの比較から、stability regionが欠失したSCP2 DNAとトランスポゾンTn5714を含む染色体領域が隣り合わせで増幅単位となって、これが異なるコピー数SCP1に挿入されて一連のプラスミドが生成したことが推定された。このよう極めて類似し、同じ複製開始点をもつ複数のプラスミドが同一細胞内で安定的に維持されることはたいへん興味深く、その原因を明らかにしようとしているところである。
角膜内皮と線維柱帯は、免疫ネットワーク制御をうけるのか：戦略的病態解明と治療開発

角膜内皮炎を始めとした種々の角膜内皮障害は、眼圧上昇や水疱性角膜症の発症の誘因になり不可逆性の視力障害を来し得る。そこで眼圧上昇や角膜内皮炎の臨床的関連性からこれらがいかにネットワークを形成しえるかに着目し、そのコンセプトに関わる機序を明らかにした。とくに角膜内皮は、ウイルス感染に際して自然免疫系に加えて獲得免疫系の賦活化の機能をもつことが判明した。一方、角膜内皮は、ウイルス感染や炎症により頑強な自然免疫応答を誘導したが、これにより誘導されえるメディエータは、二次性緑内障の特徴的所見と関連し、線維柱帯リモデリングを介して二次性緑内障に関与する可能性が示唆された。臨床的にヒトサイトメガロウイルス(CMV)の増殖が病態に関与しているかは明らかにするため、CMV内皮炎の臨床的特徴がCMVの検出量といかなる関連があるのかをまず検討した。患者由来前房水のサンプルを用いてreal time PCR法によりCMVコピー数の定量を行い、臨床的特徴と併せてLogistic解析により検討した結果、CMV量は、眼圧上昇、再発性前房炎症、角膜内皮減少の有意なリスク因子であることが判明した。一方、CMV感染角膜内皮の包括的な反応をひとまず理解するため、CMV角膜内皮後transcriptomeのマイクロアレーによるネットワーク解析を行った。Referenceには単純ヘルペス(HSV-1)感染後ヒト角膜内皮細胞のマイクロアレーデータセットを用いた。その結果、CMV感染内皮細胞において誘導される遺伝子群は1.インターフェロンシグナリング、2.細菌、ウイルス感染におけるpattern recognition receptorがもっとも有意な分子応答として特徴づけられた。つまり、CMV感染の結果、抗ウイルス反応と包括できる遺伝子ネットワークが角膜内皮に誘導された。HSV-1の内皮に対する誘導遺伝子を同様に解析したところ、CMV感染後に誘導される遺伝子群のほぼ半分が共通して誘導され、同様に有意な分子機能ネットワークに関連づけられた。まとめると、CMVは、角膜内皮細胞に感染し、HSV-1と同様な抗ウイルス応答を主体とする包括的炎症反応を惹起した。中でもIDO1が特徴的に共通して誘導されたことから、感染内皮の免疫調節機能の重要性が浮かび上がってきた。ヒト角膜内皮の免疫調節機能を検討するため、角膜内皮細胞にヒトサイトメガロウイルス(CMV)を感染させ獲得免疫系を賦活化できるかを検討した。このため、CMV感染既往のある健常者およびCMV内皮炎あるいは虹彩炎の患者より同意取得後、末梢血よりリンパ球を採取し、感染角膜内皮に対する応答性を検討した。まず、一般的なウイルス抗原特異的な細胞障害活性はCD8+Tリンパ球にmediateされているためCMV感染内皮細胞がCMV感染既往CD8+T細胞を刺激できるか検討した。その結果、CMV特異的に反応するCD8 +T細胞株を取得することができ、これらが実際に病態に寄与しえる可能性が示唆された。次に、この細胞株が実際に角膜内皮を障害しえるかについて検討を行った。CMVのIE1およびpp65などの主要エピトープを角膜内皮が提示できるか検討した結果、CD8+は抗原特異的にインターフェロンγを産生し、さらにグランザイム活性を誘導したことからCMV感染内皮はメモリーCD8+T細胞のCTL活性を誘導しえることが示唆された。臨床的には、CMV内皮炎・虹彩炎に対する診断は、real-time PCR法により行われており、先進医療にも認定されている。つまり、その検査結果の標準化は統一した診断基準の策定のため必須と考えられる。そこで現在、本邦においてCMV real time PCRを用いて臨床診断をおこなっている代表的な5施設の協力のもとCMV定量の標準化を行いCMV定量の感度、特異度の算出、さらに国際単位による定量の標準化をおこなった。ウイルス感染においては、感染細胞はホストの抗ウイルス反応を抑制する機構を備えていることが知られている。そこで、角膜内皮細胞がどのように自己をウイルス感染から防御するかを検討した。まず、過去の感染の既往がない状態で、感染内皮細胞が、単独でヒトサイトメガロウイルス(HCMV)を駆逐する機構を備えているかを検討した。HCMV感染後の角膜内皮の感染応答をみた場合、自然免疫系としてI型インターフェロンを介した抗ウイルス応答は通常どおり発動された。しかしながらI型インターフェロンのシグナル経路の阻害は顕著なウイルス力価の抑制を誘導できなかった。一方、I型インターフェロンは、免疫記憶を介して獲得免疫系を増強するための必須のサイトカインであり、角膜内皮の防御は、主として獲得免疫系の増強に頼っていることが推定された。そこで、感染局所でおこりえる獲得免疫系の反応として、感染角膜内皮が角膜内皮炎患者の細胞障害性Tリンパ球を活性化できるかを検討したところ、内皮炎患者においてはそのプライミング機構がIE1優位に阻害されていた。次に、ウイルス感染を始めとして炎症性眼圧上昇の機序を探るため、解放隅角緑内障、新生血管緑内障の患者の前房水のプロテオーム解析を行った結果、前房内のIL-15、MCP-1上昇が病態に寄与する可能性が示唆された。MCP-1は、単純ヘルペスウイルスやHCMV感染後、角膜内皮によっても多量に分泌される。

このため、inflammatory ocular hypertension syndromeとしての病態のメディエータである可能性を考慮し、線維柱帯細胞のMCP-1反応性トランスクリプトームを検証した。その結果、インテグリンを始めとする細胞骨格制御への寄与が示唆され、病態への寄与を探るため、さらなる検証を進めつつある。角膜内皮炎を始めとした種々の角膜内皮障害は、眼圧上昇や水疱性角膜症の発症の誘因になり不可逆性の視力障害を来し得る。そこで眼圧上昇や角膜内皮炎の臨床的関連性からこれらがいかにネットワークを形成しえるかに着目し、そのコンセプトに関わる機序を明らかにした。とくに角膜内皮は、ウイルス感染に際して自然免疫系に加えて獲得免疫系の賦活化の機能をもつことが判明した。一方、角膜内皮は、ウイルス感染や炎症により頑強な自然免疫応答を誘導したが、これにより誘導されえるメディエータは、二次性緑内障の特徴的所見と関連し、線維柱帯リモデリングを介して二次性緑内障に関与する可能性が示唆された。ヒト角膜内皮細胞へのCMV感染は一般には困難であり臨床分離株によるproductiveなウイルス産生はおこりにくくアッセイ系の構築は困難である。現在、角膜内皮においても十分に増殖できるCMV株を用いてアッセイ系の至適化を行ってきた。さらに、CMV内皮炎や虹彩炎の罹患率は高くないのみならず、HLA適合ドナーを検索する必要があったが、ドナー数も集積しつつある。特にドナー数の増加にともないCD8細胞株のストックを集積しつつある。これらは、角膜内皮の免疫調節能のターゲットの詳細を解析可能な貴重なツールとなると考えられる。免疫系を標的とした角膜内皮炎の新規治療法を考える場合、反応性エピトープの探索が不可欠であり、これによりワクチン開発へとつなげることができる。これまでの解析により少なくとも反応するエピトープがいくつか同定できており、さらに探索を広げる必要がある。眼科学これまでのところCMVが角膜内皮に感染しえること、さらに感染ウイルスのタンパクがメモリーCD8+T細胞の活性化を通じて獲得免疫系を賦活化しえることが判明してきた。このように角膜内皮細胞がunconventionalな抗原提示細胞として機能する場合、免疫賦活化のみならず調節機能を賦与する可能性も検討する必要がある。さらには、ワクチンを念頭においた治療法の提案が妥当性をもつかに関しても検証を進める必要がある。このためには、詳細なエピトープマッピングにくわえ、賦活化されるリンパ球機能の決定は不可欠であり、現在これらに注力している。おそらく同様の機能が線維柱帯細胞にもあることが想定されるが、現在のところ内皮細胞のアッセイ系の詳細な解析をまずおこなう必要があると考えている。線維柱帯細胞を用いた解析は、内皮細胞系の詳細な解析結果を礎にしての検討を予定しており、現在の解析と平行した次年度の課題と考えている。ヒトサイトメガロウイルス(CMV)内皮炎あるいは虹彩炎は、慢性化し難治ではあるものの罹患率は高くない。このため、サンプルの集積に時間を要している。我々は解析を試みて行く中で、CMV内皮炎・虹彩炎の診断及び治療を標準化するためには、統一した検査指標が必要であることを認識するようになった。
アパタイトコーティングシステムによる機能性生体材料の開発

我々はBuild-up techniqueによる二段溶着法を用いて金属表面にアパタイトコーティングを施し、強度と生体適合性に優れたアパタイト・金属複合体の生体材料を開発してきた。本研究では、まずアパタイトコーティング人工歯根の形状設計に関する三次元有限要素法解析を行って、臨床応用上最も理想的な人工歯根形態を求めた。併せてアパタイトセラミックスの破壊靭性の評価、破壊機構の究明ならびに疲労と寿命予測を行い、金属との複合体にした場合、アパタイトの靭性の低さに問題点があることが明らかになった。また、プラズマ溶射により変質したアパタイトコーティング層のレーザーによる改質も行った。更に、生体との更なる親和性と靭性の向上により応用面での拡大を目的として、アパタイト・コラーゲンの複合化を試み、その基礎となるコラーゲン繊維上へのアパタイト析出に関する実験も行い、コラーゲン繊維とアパタイトが化学的に結合することを確認した。この試作したアパタイト・コラーゲン複合体の動物実験を行い、吸収性人工骨補填材として有用であることがわかった。更に、吸収性アパタイトセラミックスの開発を目的として炭酸含有アパタイトを合成、焼結させ、その焼結性、溶解性を詳細に調査し、生体骨アパタイトに類似した試作品を得た。その生体吸収性について動物実験を行い、骨補填材としての有用性を確認した。また、人工体液浸漬チタンへの骨牙細胞の初期接着性についても検討し、チタン表面におけるアパタイト析出効果による細胞接着性の向上を確認した。我々が従来まで用いてきた35Ca・65P_2O_5ガラス、ならびにシリケートガラスではチタン表面上に強固なガラス層を形成することができず、これらのガラスを用いて二段溶着法によりアパタイトをコーティングすることは困難であることがわかった。これに代わり、チタン焼付け用陶材の一つであるオペーク陶材を使うと、強固なガラス層を形成することが確認され、当面はこの陶材を介してアパタイトのチタン基板上へのコーティングを進めている。また、チタン基板をβ-グリセロリン酸カルシウム溶液にアルカリフォスファターゼを存在下で浸漬すると、経時的にアパタイトが基板上に析出し、2週間の浸漬で約10μmの厚さのアパタイトコーティング層を得ることができた。現段階ではアパタイトの固着強度は極めて弱く、指の爪による引っかきで剥離する程度であるが、この方法ではガラス層を形成する必要がなく、かつ表面性状(研磨平滑面、多孔体面)に関係なく、アパタイトをコーティングできることを確認している。現在、この方法を用いて複雑な形状のチタン鋳造物表面へのアパタイトコーティングについて検討中である。このように、現段階では、解決しなければならない問題が残っているのが現状である。特に、二段溶着法におけるガラス組成の検討は重要で、今後の大きな研究課題の一つと考えている。なお、試作したアパタイトコーティングチタンインプラントについても動物実験により検討中である。Build-up techniqueにより金属表面にアパタイトを強固に溶着させるには、Co-Cr系、Ni-Cr系合金の場合には35Ca/65P_2O_5ガラス、あるいはシリケートガラスを介して我々の二段溶着法により実施できる。しかし、チタンには上記のガラスは熱膨張係数の不一致から実施不可能であり、チタン焼付用陶材ボンディングポーセレンを用いることにより、強固なコーティング層が得られることが確認された。さらに、チタンの場合は前処理としてβ-グリセロリン酸カルシウム溶液にアルカリフォスファターゼ存在下で漬浸することにより、チタン表面にアパタイトを析出させることができ、この方法によれば、従来のガラス層形成の必要性がなく、かつ表面性状(研磨平滑面、多孔体面等)に関係なくアパタイトコーティングの可能性が確認された。以上の方法によりアパタイトコーティングを施した試料について、細胞培養法による細胞毒性試験、幼若骨による組織培養試験を実施し、生体適合成の評価を行った。同時に、これら試料を犬の顎骨内にインプラニトレし、生体適合の評価を行った。

同時に、これらの試料を犬の顎骨内にインプラントし、その組織反応ならびに骨組織との結合性を検討した。その結果、人工歯根とし応用し得るに充分な成果を認めた。さらに、コラーゲンにアパタイトを析出させ、これと自己硬化型アパタイトセメントを複合化させた骨補填材、カーボネイトイオンを多量に置換えさせえ吸収性のアパタイトセラミックスを開発し、これら種々の特性をもつアパタイトによる機能性複合材の可能性を把握した。Build-up techniqueにより金属表面にハイドロキシアパタイトをコーティングし、アパタイト層の焼結収縮、空気中および水中での曲げ強さ、動疲労について調査し、あわせて人工歯根としての動物実験、ならびに骨芽細胞に対する親和性試験を行った。その結果、アパタイト層の焼結性の向上には微量のリン酸リチウムの添加、ならびに炭酸含有アパタイトとすることが効果的であり、リチウムレナリットがアパタイトの焼結助材として、同時に破壊靭性値(K_<IC>)の向上にきわめて有効であることが判った。一方、曲げ強さ試験においてその破壊挙動を詳細に解析し、あわせて疲労試験の結果から、このようなセラミックス・金属複合体におけるコーティング層の寿命予測を行うことができることを示した。また、疲労破壊の機構解析の結果、アパタイト焼結体中にき裂の進展を停止させるためのリン酸カルシウム源としてTetracalcium Phosphate(TeCP)粒子を分散させたHAP/TeCP複合焼結体の開発も行った。さらに、焼結温度の低下と生体内での吸収・溶解性を考慮した炭酸含有アパタイトを合成し、その焼結挙動と溶解度積を明らかにし、動物実験の結果からもその生体適合性の優秀さを明らかにし、これが骨アパタイトに最も類似していることを示した。また、骨類似のアパタイト・コラーゲン複合体を合成するための基礎的研究として牛アキレス腱コラーゲン上へのリン酸カルシウム塩の配向析出実験も行った。
学生主体型オンラインPROLOGデータベースと英語学習プログラム

本プロジェクトは、英語の授業と並行して学生自身が教科書の主な内容をデータベース化したものを学習プログラムと組み合わせることにより、クラス全体の成果を学習・復習することが可能となることを実現させるものである。データを原文(英語)のままで選抜し数理することは受講生自身のためになるが、最終的に実現されるコンピュータプログラムは大学全体の財産となり他の学生も自由に利用できるというメリットがある。当初では、学生の作ったデータをPROLOGのデータベースに入れて、大学の大型計算機に載せ、全キャンパスに公開する計画でした。しかし、本3年プロジェクトの経過中、WWWの目覚しい普及が進み、より利用・管理しやすいように次のように発想を改正しました。要するに、・WWWでアクセスできるように、データとプログラムをHTMLとJAVAで記述・苗mに接続された本外国語センターのサーバー上にプログラムを公開これらのの変化の為、予想以上の時間がかかっておりますが、平成11年6月までに、上記のものをwww.flang.tsukuba.acjp/johnsonでアクセスできる予定です。以上。キャンパス・ネットワークで使われているUNIXシステム上で、一つの授業の学生全員のメール環境を編集(.mailrcファイルにおいてすべてのクラス・メンバーの電子メールアドレスを含むリストを示すaliasを定義)することによって、授業単位でオンライン・ワークグループを構成するテクニックと教授の方法を実現した。この方法により、電子メールさえ利用できる環境であれば、システム・オペレータからシステム資源の特別な共有許可を必要としないオンライン共同作業が簡単に進められるようになった。また、同方法により授業内のサブ・ワークグループのオンライン共同作業も可能となった。学生の手による、地球環境に関する英語Q&A(質問と回答、multiple-choice形式)のデータベースの試作。(副産物として、次の成果も報告する。学生と教師共同のこのプロジェクトを通じて、英語授業でありながら、学生は情報処理センターで得ている電子メール及びタイプ・エディットの教育よりも高い水準の知識・能力・自信を獲得することができた。)本年度の続きとして来年度の計画は、b)他の授業において、分野別のデータベースの種類を増やすこと。c)PROLOGを使って、これらのデータベースを学習目的のオンライン・クイズという形にすること。データを原分(英語)のままで選抜し整理することは受講生自身のためになるが、最終的に実現されるコンピュータプログラムは大学全体の財産となり他の学生も自由に利用できるというメリットがある。平成9年度は三年計画の二年目に当たるが、具体的に行ったことは以下の通りである。●データの構造を改めた。●三つの授業にて、二つのデータベースの基本となるデータを学生に作らせた。●簡単なコンピュータプログラムをPROLOGで作成した。来年度の計画は以下の通りである。●データを整理し、充実させること。●応用性を考慮し、コンピュータプログラムをJAVAで書き直すこと。以上本プロジェクトは、英語の授業と並行して学生自身が教科書の主な内容をデータベース化したものを学習プログラムと組み合わせることにより、クラス全体の成果を学習・復習することが可能となることを実現させるものである。以上。
TLR4シグナル阻害ペプチドを用いた感染認識機構の解析及び敗血症治療薬への応用

Toll-like receptor 4(TLR4)のリガンドである内毒素のシグナルを阻害する17アミノ酸からなるペプチド(STM28)の生理作用を検討した結果、TLR4の下流に存在する2経路のシグナル伝達系をSTM28が阻害することを明らかにした。またSTM28の短縮化と非活性型と推測されるペプチドの同定を試み、TLR4のリガンド認識機序の解明および敗血症治療剤のリードコンパウンドとして利用可能な各種派生ペプチドの取得に成功した。本研究では、既に得られている17アミノ酸残基からなるペプチドのTLR4シグナルの阻害メカニズムを明らかにすることを目的の一つとして掲げている。マクロファージ様細胞を用いたLPS刺激によるTLR4シグナルの阻害をメルクマールとしたTLR4シグナル阻害ペプチドの短縮化は、その活性中心の同定を可能とするだけでなく、同時に得られると予想されるTLR4シグナル阻害活性を喪失したペプチドは、同ペプチドの作用機序を解明するうえで、ネガティブコントロールとして極めて有用なツールとなり得る。今回の一連の研究により、TLR4シグナル阻害ペプチドを10残基にまで短縮化することに成功し、さらにTLR4シグナル阻害活性が認められない派生ペプチドも得られた。これらペプチドは、今後の同ペプチドのTLR4シグナル阻害活性のブラッシュアップに寄与することは勿論、前述のTLR4シグナル阻害ペプチドの作用機序の解明に利用でき、将来的にはTLRファミリーによる病原体の認識機構の共通の分子基盤の検討にも利用できる可能性を内包している。本ペプチドの臨床応用に向けて感染実験による薬理活性の評価は不可欠である。LPSにより致死率100%を呈する条件下のエンドトキシンショックモデルにおいて、本ペプチドはその致死性を完全に回避する薬理作用を有する。今回、敗血症モデルとしてより臨床に近いと考えられる穿孔性腹膜炎モデルにおいて本ペプチドの薬理効果を評価するために同モデル系の構築を実施し、各穿孔レベルにおける致死率を検証した。その結果、18もしくは19ゲージの注射針でSPFのC57BL/6マウス(7週齢)の盲腸を2箇所穿孔する処置を行った場合、死亡率が数日内に約40100%に達することが明らかとなった。今回得られたデータは、今後穿孔性腹膜炎モデルに対して本ペプチドを投与する場合の条件検討に応用可能と考えられる。Lipopolisaccharide (LPS)により誘導されるTLR4シグナルを阻害する17アミノ酸からなるペプチド(STM28)の作用機序をより詳細に検討する為に、TLR4シグナル伝達経路を構成する2経路(MyD88依存・非依存経路)に対する作用を検証した。その結果、STM28はLPSにより誘導される両経路を介したTLR4シグナルを濃度依存的に抑制することが明らかとなった。本結果から、STM28はLPSにより惹起されるTLR4シグナル全般を抑制すること、並びにSTM28のLPSシグナル阻害機序が細胞内のシグナル伝達系より上流に存在することが示唆され、STM28の薬理作用の解明に貴重な知見が得られたと考えられる。また本年度では、エンドトキシンショックモデルにおいて明確な敗血症治療薬としての有効性を示すSTM28の薬理作用をより詳細に検討する目的で、昨年度に確立した穿孔性腹膜炎モデルにおけるSTM28の効果を検討した。その結果、STM28を投与した同モデルマウスにおいて、検討した条件下では致死率の減少は認められなかった。穿孔性腹膜炎モデルは、その処置からその起炎菌がLPSを外膜構成成分として有すグラム陰性細菌に限定されるものではないと予測される。STM28はTLR4の細胞外ドメインヘの相互作用を指標に単離されたペプチドであり、またin vitroの解析においてTLRシグナルヘの阻害作用はTLR4特異的であることが強く示唆している。従って、in vivoでのSTM28の薬理効果の精緻な検証には、同ペプチドのグラム陰性細菌による感染実験に対する効果を確認する必要性があることが本研究結果から明確となった。
地下水を汚染する塩素系有機溶媒によるアレルギー増悪化機構の解明

テトラクロロエチレン(PCE),トリクロロエチレン(TCE)および1,1,1-トリクロロエタン(1,1,1-TCE)それぞれの水道水質基準値(それぞれ0.01mg/L,0.03mg/Lおよび0.3mg/L)およびその100倍濃度の低濃度汚染水をラットに2または4週間飲用させた後にPCA反応を行い、その増強率を比較した結果、いずれの化合物においても用量依存的,期間依存的なPCA反応増強を認めた。テトラクロロエチレン(PCE)の水道水質基準値(0.01mg/L)およびその100倍濃度の低濃度汚染水をラットに2または4週間飲用させたところ、用量依存的,期間依存的なPCA反応の増強を認めたことを受けて、そのI型アレルギー増強機構として、PCEが免疫担当器官(脾臓,胸腺,リンパ節)のサイトカイン産生に及ぼす影響について検討を行った。Wistarラット(雄性,飲用開始時8週齢)にPCEの環境基準値(0.01mg/L)およびその100倍濃度汚染水を4週間飲用させた。飲用終了時に腹部大動脈より採血し、脾臓,胸腺,リンパ節(頚部リンパ節,腸聞膜リンパ節)を摘出した。全血由来のtotal RNAを用いて、RT-PCR法により1L-4,INF-γmRNAの発現量を測定してTh1/Th2サイトカイン産生に及ぼすPCEの影響を評価した。PCEを短期間経口的に摂取させた結果、また遺伝子レベルでTh2サイトカインのIL-4 mRNA発現増加が認められ、Th1サイトカインのINF-γmRNA発現には変化が認められなかった。よって低用量PCEを経口摂取したことにより、腸間膜リンパ節においてTh2分化が亢進したのではないかと考えられた。またTh1/Th2サイトカイン発現に関しては、PCE飲用群においてIL-4 mRNAが有意な発現量増加を示した。本研究の成果から、PCE曝露によって個体の体質が相対的にTh2側に偏ることがI型アレルギー反応増強機構のひとつではないかと考えられた。本結果は、環境基準値のような低用量PCE曝露により、アレルギー反応が増悪化・重症化に働く可能性を示唆するものである。1.有機塩素系溶媒により飲料水質基準値レベルに汚染した飲水曝露に伴いI型アレルギーが増悪化されるかについてのPCA試験等様々な試験法による評価テトラクロロエチレン(PCE),トリクロロエチレン(TCE)および1,1,1-トリクロロエタン(1,1,1-TCE)それぞれの水道水質基準値(それぞれ0.01mg/L,0.03mg/Lおよび0.3mg/L)およびその100倍濃度の低濃度汚染水をラットに2または4週間飲用させた後にPCA反応を行い、その増強率を比較した。結果、いずれの化合物においても用量依存的,期間依存的なPCA反応増強を認めた。また、PCEまたはTCEを同様の濃度で2週間飲用させたラットより皮膚を採取し、組織薄切切片を作成し、H&E染色およびアルシアンブルー染色により皮膚組織における病理組織学的検討を行った結果、汚染水の飲用群では、真皮においてリンパ球の著しい浸潤、また血管周辺部において肥満細胞の過剰な集積を認めた。

また、マウスにおいても上記と同様な条件でPCEまたはTCE低濃度汚染水飲用試験を行い、種差についての検討を行った結果、ラットと同様に用量依存的,期間依存的なPCA反応増強を認めた。また、その増強率はラットに比べて著しく高かった。2.肥満細胞に対する塩素系有機溶媒曝露のサイトカイン産生に及ぼす影響の検討抗DNP-IgE抗体で受動感作した培養肥満細胞(RBL-2H3)をPCEおよびTCEに曝露し、同時に抗原を添加することで抗原抗体反応を惹起した。6時間後の培養上清中のIL-4を測定した。結果、両化合物ともに水質基準値の100倍濃度において著しくIL-4産生が亢進した。3.有機塩素系有機溶媒のRBL-2H3によるヒスタミン遊離に対する影響抗DNP-IgE抗体で受動感作したRBL-2H3を低濃度有機塩素系化合物(水質基準値100倍濃度の範囲)に曝露した後、抗原を添加して抗原抗体反応を惹起してヒスタミン遊離量を測定した結果、PCE,TCEおよび1,1,1-TCEは、いずれも用量依存的にヒスタミン遊離率を増加させた。有機塩素系溶媒により飲料水質基準値レベルに汚染した飲水曝露に伴いI型アレルギーが増悪化されるかについてPCA反応試験により評価した。テトラクロロエチレン(PCE)の水道水質基準値(0.01mg/L)およびその100倍濃度の低濃度汚染水をラットに2または4週間飲用させたところ、用量依存的,期間依存的なPCA反応の増強を認めたことを受けて、そのI型アレルギー増強機構として、PCEが免疫担当器官(脾臓,胸腺,リンパ節)のサイトカイン産生に及ぼす影響について検討を行った。Wistarラット(雄性,飲用開始時8週齢)にPCEの環境基準値(0.01mg/L)およびその100倍濃度汚染水を4週間飲用させた。飲用終了時に腹部大動脈より採血し、脾臓,胸腺,リンパ節(頚部リンパ節,腸間膜リンパ節)を摘出した。全血由来のtotal RNAを用いて、RT-PCR法によりIL-4,INF-γmRNAの発現量を測定してTh1/Th2サイトカイン産生に及ぼすPCEの影響を評価した。PCEを短期間経口的に摂取させた結果、また遺伝子レベルでTh2サイトカインのIL-4 mRNA発現増加が認められ、Th1サイトカインのINF-γmRNA発現には変化が認められなかった。よって低用量PCEを経口摂取したことにより、腸間膜リンパ節においてTh2分化が亢進したのではないかと考えられた。またTh1/Th2サイトカイン発現に関しては、PCE飲用群においてIL-4 mRNAが有意な発現量増加を示した。本研究の成果から、PCE曝露によって個体の体質が相対的にTh2側に偏ることがI型アレルギー反応増強機構のひとつではないかと考えられた。本結果は、環境基準値のような低用量PCE曝露により、アレルギー皮応が増悪化-重症化に働く可能性を示唆するものである。
公共用水域の糞便汚染源の可視化を実現する宿主特異的ウイルス遺伝子マーカー群の探索

平成30年度は,本研究で確立を目指す宿主特異的ウイルス遺伝子マーカー群の候補として,体表面吸着大腸菌ファージ(体表面ファージ),F特異DNA大腸菌ファージ(F-DNAファージ)およびCrAssphageの3種類を対象とした研究を実施した。体表面ファージとF-DNAファージに対しては,単離したプラックを定量PCR法に供する際の作業効率化を目的とし,PhiX174ファージとM13ファージを用い,DNA加熱抽出の有無によるCt値(蛍光強度が閾値を超えるPCRサイクル数)の差異を比較することで,加熱抽出は省略可能であることを確認した。その手法を用い,山梨県内で採取した下水と豚舎排水における両ファージの存在実態を調査した。体表面ファージについては,プラック法でのファージの検出および定量PCR法によるマイクロウイルス科の選択的検出では糞便汚染源解析を行うことはできず,定性PCR法とダイレクトシーケンシングを用いてPhiX174マイクロウイルス属の遺伝子群を同定することが有効であることが分かった。F-DNAファージについては,豚舎排水からはプラックが検出されず,十分な検討はできなかったものの,下水試料から単離したプラックが複数の遺伝子群に分類され,高い遺伝的多様性を有していることが分かった。CrAssphageは,ヒト特異的遺伝子マーカーとして評価した場合には,100%の感度と80%を超える特異度を示したが,豚舎排水3試料すべてから検出されたことを踏まえると,ヒト糞便汚染の解析に用いることは困難であり,ヒト・動物の種類を区別せずに広く糞便汚染を検知するためのマーカーとして利用できる可能性が示唆された。他に検討したウイルスのうち,ヒトアデノウイルスはヒト糞便汚染の解析に利用できると判断されたことから,CrAssphageとヒトアデノウイルスを併用する手法が有効となることが示唆された。新たなウイルス遺伝子マーカーとして,体表面吸着大腸菌ファージ,F特異DNA大腸菌ファージおよびCrAssphageに着目して研究を実施し,これらの有効性を多面的に評価することができたため。ウイルス遺伝子マーカーとしての体表面吸着大腸菌ファージ,F特異DNA大腸菌ファージおよびCrAssphageの有効性をさらに検証するため,ヒトとブタ以外の糞便汚染源試料も採取して研究を実施する。研究成果を取りまとめて論文執筆を進める。平成29年度は,本研究で確立を目指す「宿主特異的ウイルス遺伝子マーカー群」の候補の一つとして,体表面吸着大腸菌ファージを選定し,下水やブタ飼育施設排水,河川水中における存在実態を調査した。体表面吸着大腸菌ファージは,糞便汚染源試料中に高濃度で存在しており,その検出に基づくのみでは糞便汚染源解析を行うことはできないことが分かった。単離した体表面吸着大腸菌ファージのプラックに対し,体表面吸着大腸菌ファージを構成する科の一つであるマイクロウイルス科のファージに特異的な定量PCR系を適用した結果,プラックの大部分はマイクロウイルス科であると判定され,これらの試料中においてマイクロウイルス科のファージが優占して存在していることが明らかになると同時に,科レベルの分類でも糞便汚染源の判別はできないことが示唆された。そこで,マイクロウイルス科のファージの塩基配列の一部(約400bp)を増幅可能な定性PCR系(プライマー2種類)を新たに設計し,単離したファージの塩基配列を解析したところ、ヒトとブタからの単離株は異なるクラスターに分類され,ヒトとブタの糞便汚染を判別できる可能性が示唆された。また,河川水からの単離株は,地点によってヒトとブタのいずれか,あるいは両方と同じクラスターに分類され,上流にブタ飼育施設が点在する地点からはブタ由来株が多く検出される等,流域の土地利用情報と対応した結果を得ることができた。新たなウイルス遺伝子マーカーとして,体表面吸着大腸菌ファージに着目して研究を実施し,本ファージを遺伝子型レベルで分類することで,ヒトとブタの糞便汚染を判別できる可能性を示すことができたため。CrAssphageは,ヒト

特異的遺伝子マーカーとして評価した場合には,100%の感度と80%を超える特異度を示したが,豚舎排水3試料すべてから検出されたことを踏まえると,ヒト糞便汚染の解析に用いることは困難であり,ヒト・動物の種類を区別せずに広く糞便汚染を検知するためのマーカーとして利用できる可能性が示唆された。他に検討したウイルスのうち,ヒトアデノウイルスはヒト糞便汚染の解析に利用できると判断されたことから,CrAssphageとヒトアデノウイルスを併用する手法が有効となることが示唆された。新たなウイルス遺伝子マーカーとして,体表面吸着大腸菌ファージ,F特異DNA大腸菌ファージおよびCrAssphageに着目して研究を実施し,これらの有効性を多面的に評価することができたため。ウイルス遺伝子マーカーとしての体表面吸着大腸菌ファージの有効性をさらに検証するため,ヒトとブタ以外の糞便汚染源試料も採取して研究を実施する。また,F特異DNA大腸菌ファージや他のウイルスについても研究対象とする。ウイルス遺伝子マーカーとしての体表面吸着大腸菌ファージ,F特異DNA大腸菌ファージおよびCrAssphageの有効性をさらに検証するため,ヒトとブタ以外の糞便汚染源試料も採取して研究を実施する。研究成果を取りまとめて論文執筆を進める。