hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
超小型・超省電力磁気センサのための金属-絶縁体ナノグラニュラーTMR材料の開発

次世代高性能省電力磁気センサであるGIGSに用いられる金属-絶縁体ナノグラニュラーTMR膜の高性能化を目的とし、膜組成、作製条件、および膜構造のTMRに及ぼす影響を詳細に検討した。その結果、以下の成果を得た。1)新組成系であるFeCo-(Si)-AlF系膜のTMRの加熱に対する挙動は、良好な耐熱性を示す。2)加熱基板上に作製した膜は、良好な耐熱性を示し、弱磁界でTMRの大きな磁界感度を有する。3)微量Siを含む膜は、加熱による構造変化が抑制され、そのためにTMRの良好な耐熱性を示すことが明らかになった。平成19年度は、次の2つの項目について検討した。(1)膜組成:AIF_3は極めて安定な絶縁体であり、ナノグラニュラー構造における粒界相にAIF_3を用いることにより、磁性金属グラニュールと粒界相絶縁体が混じり合わず、クリアーに分離された状態のナノグラニュラー構造膜が得られる可能性が高い。本年度は、新組成系の(Fe-Co)合金とAlF_3からなるナノグラニュラー膜を作製し、TMR等を検討した。(2)成膜条件:薄膜試料は、スパッタ法によって作製した。スパッタ膜の構造は成膜条件に大きく依存する。本年度は,基板温度に着目し、種々の温度に加熱した基板上に膜中の磁性金属量と絶縁体量を変えて薄膜を作製し、膜構造やTMRを検討した。その結果、それぞれ以下に示す成果が得られた。(1)膜組成FeCo-AIF系において、従来材料のTMR最大値と同等である、室温で12%のMR比を示す膜が得られた。さらに、従来材料では、ρo=10^4=10^6μΩmに大きなTMRを示す材料が存在しないが、FeCo・AIF系はちょうどその領域において大きなTMRを示す。このことは、FeCo・AIF膜を磁気センサ(GIGS)に用いることによって、素子抵抗値などの仕様範囲・設計の自由度が大幅に拡大することを意味する。さらにTMRは、550Kまでの加熱に対し安定であり、良好な耐熱性を有する。(2)成膜条件:加熱基板上に作製した(Fe-Co)-(Mg-F)ナノグラニュラー膜は、良好な耐熱性を示し、それらのTMRは、成膜時の基板温度未満の加熱に対し安定であることを見出した。特に、基板温度673Kの基板上に作製した膜は、約14%(800kA/m、室温)のMR比を示し、GIGSの応用で必要とされる16ckAimの磁界中でも、約10%の大きな値を示した。また、これらの値は、473Klで200時間保持の長時間過熱に対しても不変であり、良好な耐熱性を有する。金属-絶縁体ナノグラニュラー材料は、ナノメーターサイズの微細構造に起因する、ユニークな物性を示す。そして、わずかな構造の変化によって、膜特性は大きく変化する。膜構造は、成膜条件や膜組成によって変化し、成膜条件および膜組成を制御することによって、意図的に膜構造を変化させ、実用的にも有用な特性を示す薄膜材料を得ることが出来る。本年度は、金属-絶縁体ナノグラニュラー膜の中で耐熱性が良好なFeCo-AlF系膜に着目し、その信頼性に係わる耐環境特性、特に耐熱性・温度安定性の向上を目的として、微量のSi添加の効果について検討した。その結果、Siを含まない場合に対し、約3at.%Siを含む膜において磁気抵抗比が増加することが分かった。さらに、加熱後の電気抵抗率と磁気抵抗比の値の変化を検討した結果、Siを含む場合において加熱後のそれらの値の変化は小さく、Siを含まない場合に対して、約50°C高い耐熱性を示す。これらの成果をまとめ、日本磁気学会において報告した。また、膜構造はSi添加によって顕著に変化し、Siを含む膜においては、粒径が23nmのグラニュールからなるナノグラニュラー構造のほかに、グラニュールが1030nmサイズに集団化した組織が形成されていることが分かった。我々が開発した省電力・高感度磁気センサであるGIGSには、金属-絶縁体ナノグラニュラー材料が用いられている。金属-絶縁体ナノグラニュラー材料は、ナノメーターサイズの微細構造に起因する、TMRなどのユニークな物性を示す。本年度は、加熱基板上に作製したFeCo-MgF系ナノグラニュラー膜について検討した。その結果、基板を加熱することによって良好な耐熱性を有する薄膜が得られた。

それらの膜のTMRは、成膜時の基板温度未満の加熱に対し安定であり、特に、基板温度673Kの基板上に作製した膜は、約14%(800kA/m、室温)の大きなMR比と同時に、GIGSの応用で必要とされる160kA/mの弱い磁界中でも、MR比約10%の大きな値を示した。また、これらの値は、473Kで200時間保持の長時間加熱に対しても不変であり、良好な耐熱性を有する。さらに、高分解能透過電子顕微鏡を用い、得られた薄膜試料の構造を詳細に検討し、優れた耐熱特性を有する微量のSiを添加したFeCo-AlF系膜、および、上記の加熱基板上に作製したFeCo-MgF系膜の膜構造を詳細に観察し、その構造の変化を明らかにした。
産業の進化プロセス：シルク産業のシステム・ダイナミズムに関する理論・実証研究

日本のシルク産業の盛衰過程で、戦前は繭増収において蚕の品種改良・普及や飼育管理・技術水準の向上が重要であったが、戦後は収繭量変化要因がより複雑化し、地域によって異なっていたこと、戦後の絹業高級品化は必ずしも高価格化や高品質化を意味しないこと等が定量分析から見出された。また、絹織物産地で現在、経営存続のため取り組まれている諸対策には地域性・歴史性があるが、消費者ニーズに対応した製品開発・販売が共通の戦略であることが事例調査分析から明らかになった。以上の実証結果に、養蚕業・製糸業・絹業間の補完性が希薄であった歴史的事実の合理性に関する理論的解釈を加え、シルク産業研究に新たな知見を提示した。昨年度に引き続き、本研究の基盤であるデータベースの構築(主に千年と加賀美が担当)と個別事例調査(野見山、横山、小野、千年が担当)を行った。前者では、前年度に構築した長期データベースを追加・修正した(戦後のデータの収集・整理が中心)。後者の個別事例調査では、絹織物/繊維業に注目して、西陣、米沢、群馬(東吾妻)等を対象にして調査/視察を実施した。実証分析では、1構築したデータベース(作成途上)を用いた戦後の絹業高級品化の実態解明分析と、2西陣・米沢の絹織物業を対象に調査した事例分析を中心に行った。1については、戦後のシルク産業の市場構造の暫定的分析過程で1960年代以降の絹織物価格の動きが特異的であることが見出され、その背景に和装需要における大衆品から高級品への転換(高級品化)の影響があるのではと着想し、高級品化の実態解明分析を行った。絹織物業の品目・品種割合の変化、価格の変化、品質の変化という3つの観点から、1960年以降の絹業における高級品化の実態を分析した結果、絹織物の高級品化過程で高級品と評される製品の生産比重が増加したことは確かだが、必ずしも高価格化、高品質化が伴っていたわけではなかったことが明らかになった。2については、絹織物需要の停滞の中で現在も産地としての地位を維持している西陣と米沢の生産主体のこれまでの対応と意向等を明らかにし、その結果を踏まえ今後の和装部門活性化に資する方策の提示を行なった。消費者ニーズに対応したきめ細かな製品(多品目少量/地産地消型)の開発・促進が絹織物産地の継続には重要となるという点は前年度、八王子の事例から導かれた結果と同様である。理論分析では、前年度に引き続き、産業発展史や産業組織論分野等の文献調査を通じて進化経済論的アプローチを整理し、それを踏まえ、シルク産業の進化サイクルの理論モデル化の概括的枠組み(暫定)を構築した。本研究の基盤であるデータベースの構築と個別事例調査を行った。データベースの構築については、前年度までに構築した長期データベースの追加・修正を行った。特に養蚕部門において繭生産数量(収繭量)、養蚕戸数、蚕種掃立卵量、桑園面積については全国統計に加え、愛媛県と山梨県の県統計を収集・整理した。個別事例調査では、絹織物/蚕種業に注目して、愛媛、奄美大島、富士吉田、十日町等を対象にした調査を行った。実証分析では、1養蚕部門の長期データベースを適用した日本の養蚕業構造変化の定量的分析と、2富士吉田市・十日町の絹織物業に関する事例分析を中心に行った。1については、長期の日本の養蚕業の盛衰過程について、長期繭生産統計を効果的に活用し、繭生産変数間の連動性の程度とその変化を定量的に明らかにした。分析に当たり収繭量を4項に分解することで収繭量の変化に対する各項の貢献度を定量的に計測できる新アプローチを開発した。計測結果をもとにした分析から、戦前では繭増収において蚕の品種改良・普及や飼育管理・技術水準の向上が重要であったが、戦後では収繭量変化要因がより複雑化し、地域によって異なっていたことが見出された。2については、山梨県・富士吉田市と新潟県・十日町の絹織物生産主体の現在の対応と今後の意向等を明らかにし、その結果を踏まえ今後の産地活性化に資する方策の提示を行なった。蚕糸・絹業提携システム事業等を活用した消費者ニーズに対応したオリジナル製品(個別的創意工夫による個性のある多品目)の開発・促進が絹織物産地の継続には重要であることが示唆された。これは前年度までの事例調査から得られた知見と整合的である。理論分析では、産業発展史や産業組織論分野等の文献調査を通じて進化経済論的アプローチを整理し、それを踏まえ、養蚕業・製糸業・絹業間の関係性が希薄であった歴史的事実の合理性について理論的解釈を行った。

本年度は、1)日本のシルク産業の特質と変容要因を明らかにする実証分析の基盤となる長期データベースの構築とそれを用いての試行的分析、2)実証・理論分析の方向性と設計に際して必要となる関連文献のレビュー、3)日本のシルク産業の歴史性と実態を把握するための個別事例調査、という3側面において研究を進めた。具体的な研究実績は以下のとおりである。1)長期データベースの構築にあたっては、統計・文献資料を基に広くデータを収集・整理・入力を行った。また、現時点で構築した時系列データベースを用いて、戦後のシルク産業の1特性を明らかにするために、試行的な実証分析を行った。養蚕業・製糸業・絹業では生産量等において同じ動きをしていなかったことが明らかになった。2)近代製糸技術、絹織物市場構造および時系列分析手法に関する文献レビューを踏まえ、実証分析の具体的な仮説を立てるとともに、上記の実証結果(暫定)の解釈を試みた。3)個別事例調査は八王子、群馬、京都、福岡における養蚕業または絹業を対象に行った。事例調査は当初の予定より限られたものとなったが、そのなかで横山(研究分担者)と小野(研究協力者)が従来から取り組んできた八王子と小松の2箇所の絹織物産地の歴史的過程と現状に関して、追加調査からの知見を加え論文として公表したことは特筆される。八王子については絹織物産地として性格とその背景にある契機、小松については戦後の織物産地としての性格と生産構造、とりわけ機業の生産対応を明らかにするとともに、両地域における産地継続のための今後の課題を提示した。消費者ニーズに対応した製品の開発が絹織物産地の継続には重要となる。本研究の基盤である長期データベース(作成途上)と個別事例調査のもと、現時点で考察可能な実証分析に取り組んだ結果、シルク産業の全体像を定量的に明らかにするまでには至っていないものの、部分的な点で新たな知見を提示することができた。しかし、長期データベースの構築は当初の予定よりも遅れている。利用可能統計の制約もあり、戦前のデータが未だ十分、整理されていない。戦後のデータはかなり整理されたものの、シルク産業を取り巻くマクロ変数の収集・整理が必要である。他方、個別事例調査については、米沢、西陣、群馬(東吾妻)、茨城(結城)、福島(二本松)で実施することができ、絹織物/繊維産地の現状と今後の展望に関する知見・情報を蓄積できた。理論分析においては、進化経済学分野の関連文献を通してシルク産業の進化サイクルの理論モデル化の概括的枠組み(暫定)を構築したが、未だ十分ではなく、精緻化が必要である。データベースの構築が遅れていること、十分な個別調査が実施できなかったこと等の問題点はあるが、一方で、試行的な実証分析により興味深い結果を得られたこと、2箇所の個別事例調査に関する論文を公表できたこと等を鑑みれば、概ね順調に研究を遂行できたといえる。長期データベースの構築にあたっては、予想よりも統計資料上の欠損値(特に戦間期)が多かったため、当初の計画どおりには進まなかった。しかし、データ・資料の収集をする上で想定していなかった興味深いデータも入手することができた。こうしたなか、現時点で構築したデータベースを用いて試行的ながらも実証分析を行い、今後の分析の方向性を明らかにできたのは意義あることであった。特に、蚕糸絹業市場の生産量変数の動きが異なっていることは興味深い結果である。関連文献を参考にして、その解釈を試みたが、現時点では十分な解釈は得られていない。今後の研究課題である。また、個別事例調査に関しては、研究者と聴き取り先の都合があわず、当初の予定より限られたものとなったが、追加調査を実施することで学術論文としてまとめることができた。
機能性材料作製のための反応設計

本研究においては、新規な機能性材料創出のための反応設計を行い、以下に示すような成果が達成された。1)金属ポルフィリン錯体、有機アルミニウム系の触媒を用いる高速リビング重合において、分子量の制御された高分子化合物の合成が可能となった。2)純粋な有機電荷移動錯体に基づく未知な有機強磁性体の合成を検討し、カチオンラジカル、アニオンラジカルとの電荷移動錯体において、はじめて強磁性的相互作用を認めることができた。3)アニオンリビングポリマーを用いて、未端にアシ1基を有するポリスチレン、スルホン基を有するポリエチレンオキシドを合成し、その1:1錯体がミクロ相分離した秩序構造を発現することが認められた。4)主鎖にπ電子系とケイ素ユニットとを交互に規則正しく含むポリマーの合成に成功した。また、それらの尊電性、感光性等の性質についてを明らかにされた。5)金属アルコキシド分子の溶液内反応制御によって、圧電体物質の前駆体構造を設定し、低温で組成と結晶構造の制御された単結晶圧電体配向膜の合成が可能であることが見出された。6)ホウ素を含むジオキサボリナン構造の高分子液晶が、ネマティック液晶を形成する主鎖型高分子液晶、およびネマティック、スメクティックA、カイラルスメクティックC液晶を形成する側鎖型高分子液晶の合成に成功した。
進行形の意味機能を巡るState概念の精緻化に関する通時的・共時的研究

平成30年度は、前半で、ここ10年程(主として平成29年夏)発表してきた学会会場からのフィードバックにより、本課題論考の客観化を図り、更なるデータ集積と分析を進め、論の展開に説得力を増す為に必要なデータを新たに洗い出した。その成果を9月に出版された書籍『認知言語学研究の広がり』に収録された論文の推敲部分に含めた。後半では、新たにhabitualityやgenericityといった、stativityと最も密接に関連する概念を追求し、それらと進行形の関係を論文に纏め学会誌に投稿した。更に、現在校正段階に入っている『認知言語学事典』に反映させた。具体的には、動詞の表す事態のaspect分類におけるstateは、従来進行形と相容れないものとして範疇化が19世紀中盤以降進んできたが、事実を検証することにより、それが不適切であることを論証した。というのも、stateを「どの一時点や局面においても同一・同質で事態の全体像を捉えることができ、変化が認識されないものと解釈され、『事態の境界:始まりや終わり』といった変化も認識外にある事態」として先行研究に沿った形で定義し、進行形の本質を「事態を、話し手のイマ・ココといった、言語使用の参与者の直接的共有時空で切り取って捉える」形であると見ると、stateを「イマ・ココ」で切り取って捉えることは可能だからである。大英国図書館及び国内外の図書館から収集し、EEBO、ECCO、COHA等やWEB上で採取した近代から現代迄の関係文献の精査により、1789年に始まり特に19世紀後半からの規範文法により、stateの進行形での使用は特に書き言葉で抑制傾向にあるものの、必要性の高い場合、及び規範の束縛を受けない自然な英語では依然として使われてきた現象を通して、例証した。エフォート10%の時間が就労時間内には確保出来ず、体調不良が続いたため。H30年度では、進行形と、stativityの主要関連概念であるhabitualityとが相性度が低い理由、同じくgenericity (物事の一般性・一般原理)とが相容れない理由を、我々が永久不変的な常なるものとして捉えようとする物事の性質や原理の表現と、進行形を使って諸行無常である現実の事物を「イマ・ココ」で切り取って捉える必要性が低いこと、或いは矛盾するからであることに焦点を当てたが、R1年度は、他のActivity, Imperfectivity, Atelicity, Continuity, Durationality, Unboundedess, Gnomic, Structurality等、これまで様々な文献で言及されてきた他の概念も整理し、それらとの関連において、近・現代英文法記述・英文法研究文献・言語哲学書・英文法書および実際の使用実例を、使用文脈と併せて分析することを通し、更なるstativityの精緻化を図る。平成29年度は、当初計画通り、進行形の意味機能を巡る「state概念輪郭の追求」という観点から、これまで収集してきた活版印刷英国導入開始以来現在迄の英語文献、英文典・言語哲学書・英語研究書・文法研究資料・使用実態資料等を再分析した。その研究成果をまず第14回国際認知言語学会(エストニア、タルトゥ大学、7月)で発表した。そこでは英文法記述・英語記述・実際の使われ方を根拠にLangackerの認知文法においてStateの解釈を受ける事態として範疇化されている概念定義を再検討する必要性を実証した。次に第15回国際語用論学会(英国、ベルファスト、7月)で、英文法記述の中でもノア・ウェブスターの見解に焦点を当て、その妥当性を論証した。本発表は興味関心を共有するオーディエンスからの好意的賛同を得、新たな方向性への提案も受けることができた。その後第23回国際歴史言語学会(米国、テキサス州立大学サンアントニオ校、8月)で、英米社会における英語やラテン語文典の役割、及びその記述における進行形とState概念との関係の変遷について発表を行った。7月の二つの学会の間に、大英国図書館及びオクスフォード大学Lady Margaret Hall図書館へ赴き、他では閲覧不能の文献資料を調査しタブレット端末やカメラで収集した。9月には、それまでの集積した資料、就中19世紀末から20世紀中葉迄のもの、特にLindley Murrayの資料でこれまで整理・分析が行き届かなかった部分について照合確認作業を行った。その成果発表として、ヘブライ語文法用語に端を発し、ComrieやLangackerの定義によるstateは進行形と相容れないものではないと結論し、一部を「ことばのパースペクティヴ:中村芳久教授退官記念論文集」の推敲部分に含め、他の部分を福岡認知言語学会記念論文集論文として執筆中である。1)進行形との関連において輪郭も明確とは言えないまま認識される様になったstative概念を、認知言語学的に再検討することにより、今日学界・英語教育界で殆ど誰も疑うことのない「進行形とstativeを表す動詞は相容れないという制限規則」を切り崩す為の素地と論拠が、少なくとも3つの学会発表の場におけるオーディエンスにとって説得力のあるものとして受け入れられたことは、本研究にとって一つの成果であった。英語だけでなくドイツ語やスカンジナビア諸語などゲルマン諸語を母国語とする人々の興味関心が高いこともこれまでの研究を裏付けるものであった。2)Lindley Murrayの初版から40版迄毎回続く改訂における加筆修正を、これまでよりシステマチックに解析調査し、進行形を巡るstative概念記述の矛盾を発見した。

平成30年度は、前半で、ここ10年程(主として平成29年夏)発表してきた学会会場からのフィードバックにより、本課題論考の客観化を図り、更なるデータ集積と分析を進め、論の展開に説得力を増す為に必要なデータを新たに洗い出した。その成果を9月に出版された書籍『認知言語学研究の広がり』に収録された論文の推敲部分に含めた。後半では、新たにhabitualityやgenericityといった、stativityと最も密接に関連する概念を追求し、それらと進行形の関係を論文に纏め学会誌に投稿した。更に、現在校正段階に入っている『認知言語学事典』に反映させた。具体的には、動詞の表す事態のaspect分類におけるstateは、従来進行形と相容れないものとして範疇化が19世紀中盤以降進んできたが、事実を検証することにより、それが不適切であることを論証した。というのも、stateを「どの一時点や局面においても同一・同質で事態の全体像を捉えることができ、変化が認識されないものと解釈され、『事態の境界:始まりや終わり』といった変化も認識外にある事態」として先行研究に沿った形で定義し、進行形の本質を「事態を、話し手のイマ・ココといった、言語使用の参与者の直接的共有時空で切り取って捉える」形であると見ると、stateを「イマ・ココ」で切り取って捉えることは可能だからである。大英国図書館及び国内外の図書館から収集し、EEBO、ECCO、COHA等やWEB上で採取した近代から現代迄の関係文献の精査により、1789年に始まり特に19世紀後半からの規範文法により、stateの進行形での使用は特に書き言葉で抑制傾向にあるものの、必要性の高い場合、及び規範の束縛を受けない自然な英語では依然として使われてきた現象を通して、例証した。エフォート10%の時間が就労時間内には確保出来ず、体調不良が続いたため。これからの論文執筆、その推敲及び推敲過程におけるピアレビューコメントを通して、様々な形で進行形に関わる現象に高い関心を寄せてきた研究者との情報交換により、「状態進行形」、即ちstativeと解釈できる動詞が実際に使われている進行形、の実例におけるV-ingのVをnon-stativeではなくstativeと主張する論拠を強固にする方策を模索する。例えば、I'm liking itのlikeには有界性が認知されstativeではないとするのがLangacker (1991: 208; 2008: 156)などで示される認知文法の見解であるが、有界性は必ずしも関係しない場合、有界性を示唆するとは考えにくい状況におけるI'm liking itの類いの使用例を、これまでより通時的・共時的に広い範囲で開拓する。それらの具体例を使用文脈と併せて分析することを通して、stative概念の透明性をあげる。stativeを同質性において捉える方向で筋の通った定義を定め、進行形と両立すると捉えることが進行形現象を最も自然に説明付けることに繋がると現段階では考えており、そのための様々な論拠を今年度は揃えていくことになる。今後も、近・現代英文法記述におけるstative概念その関連概念の明確化を追求し、説得力を高める論拠を固め得る材料として小説や聞き取り調査、web検索を通して得た実例を文脈と共に分析し、古書、およびこれまで収集してきた資料を新たな視点で再調査する。
好酸球分化成熟過程におけるMajor Basic Protein(MBP)の産生・分泌に関する研究

好酸球特異顆粒中に存在するMajor Basic Protein(MBP)は、好酸球だけでなく未熟な骨髄系細胞にも存在することが前年度の研究で示唆された。これに基づき、前骨髄球性白血病細胞株(HL-60)を好酸球および好中球に分化誘導し、その過程でのMBPの発現を観察した。細胞質内蛋白であるMBPのフローサイトメトリーでの染色法を確立し、分化過程におけるMBPとCD33(未熟な骨髄系細胞から好中球まで発現し、好酸球には発現していない)の発現を比較した。好酸球誘導条件下では、MBPは一貫して陽性であったが、CD33は9週目より減少し、12週目に消失した。また、好中球誘導条件下では、CD33は一貫して陽性であったが、MBPは6週目より減少し、10週目で消失した。以上より、MBPは未熟な骨髄系細胞から好酸球への分化過程では発現が持続するが、好中球への分化過程で消失していくことがわかった。前年度の研究で、健常人の末梢血から得た好酸球中にはpro-MBP,MBPともに存在していることがWestern blot法により明らかになった。好酸球増多症患者の好酸球中にはMBPは検出されたが、pro-MBPは検出されなかった。健常人の末梢血好酸球をPAF、カルシウムイオノフォアで刺激すると、好酸球中にpro-MBPは検出されなくなり、MBPのみ検出された。また、上清中にはMBPが検出され、その濃度は好酸球の比重と相関した。好酸球増多症患者の好酸球は健常人に比し、生体内でIL-5、GM-CSFなどのサイトカインの刺激によりpro-MBPからMBPへの変化がより強くおこっているものと推察した。
放電系流体制御による鉱物の発生・進化と地球の初期状態の復元

本年度は,ガス混合装置を組み入れた放電流体系のシステムを試作し,地球の初期状態のシュミレーション実験を行う予定であったが,市販のガス混合装置は,ガスを切り替えた時,内部にガスが残留する現象が起こる為,自家製の装置を自主製作をしたためにかなりの時間を費やすことになった.初期実験として,蒸留水中に電極の鉄棒を上下にセットして,その間に炭酸棒の中心に円筒状の穴を開け,その中にシリカ粉末を充填して,変圧器および放電溶接装置により電圧を架けて,放電(実際はショート)させた.回収された試料は微量であるため,正確な同定はなされていないが, 70ボルトまでの電圧変化に対しては試料の変化は見られない.しかしながら鉄棒と炭素棒との接触部の炭素棒の底面には極微小金属の熔解球の散在が認められ,相当の高温(鉄の隔点1535°Cと沸点2730°C)まで上昇していることが判定される.金属小球を回転対陰極の強力X線で検討したところ, cohenite FeC様のものが同定された.coheniteは隕石中に存在し,地殻中には自然鉄として産出する.原始地球は,大気にはCO_2が存在し,地表には海が形成されていたが,現在の地球ほど分化がまだ進んでいなかったと考えられ,地表には鉄元素も豊富に存在していたにちがいない.したがって,大気と地表との間で放電が激しく起こり,地表の鉄及び炭素に富んだ岩石は高温の衝撃波を受けたことが予想される.このため,現在の地球には殆ど産出しないcoheniteは,創生期の地球では豊富に存在していたことが期待される.放電が起こる地表の岩石種に応じて,発生する鉱物種が異なることは,鉱物の生成原理を構築する上で,新たなる問題を提起したことになる.今後は,水溶液,ガス中での各種の放電実験を繰り返し,放電場で様々な固相を反応させて,地球の初期状態を復元して,地殻の進化,生命の起源,鉱物生成原理等の解明を究察することになる.本年度は,ガス混合装置を組み入れた放電流体系のシステムを試作し,地球の初期状態のシュミレーション実験を行う予定であったが,市販のガス混合装置は,ガスを切り替えた時,内部にガスが残留する現象が起こる為,自家製の装置を自主製作をしたためにかなりの時間を費やすことになった.初期実験として,蒸留水中に電極の鉄棒を上下にセットして,その間に炭酸棒の中心に円筒状の穴を開け,その中にシリカ粉末を充填して,変圧器および放電溶接装置により電圧を架けて,放電(実際はショート)させた.回収された試料は微量であるため,正確な同定はなされていないが, 70ボルトまでの電圧変化に対しては試料の変化は見られない.しかしながら鉄棒と炭素棒との接触部の炭素棒の底面には極微小金属の熔解球の散在が認められ,相当の高温(鉄の隔点1535°Cと沸点2730°C)まで上昇していることが判定される.金属小球を回転対陰極の強力X線で検討したところ, cohenite FeC様のものが同定された.coheniteは隕石中に存在し,地殻中には自然鉄として産出する.原始地球は,大気にはCO_2が存在し,地表には海が形成されていたが,現在の地球ほど分化がまだ進んでいなかったと考えられ,地表には鉄元素も豊富に存在していたにちがいない.したがって,大気と地表との間で放電が激しく起こり,地表の鉄及び炭素に富んだ岩石は高温の衝撃波を受けたことが予想される.このため,現在の地球には殆ど産出しないcoheniteは,創生期の地球では豊富に存在していたことが期待される.放電が起こる地表の岩石種に応じて,発生する鉱物種が異なることは,鉱物の生成原理を構築する上で,新たなる問題を提起したことになる.今後は,水溶液,ガス中での各種の放電実験を繰り返し,放電場で様々な固相を反応させて,地球の初期状態を復元して,地殻の進化,生命の起源,鉱物生成原理等の解明を究察することになる.単結晶と溶液反応のX線その場観察には成功し、メリライト、黒雲母、ネフェリン、カンラン石等の溶脱速度に異方性の存在が明確となった。鉱物が溶液分解する時に溶脱するイオンは、同時に一様に溶出するのではなく、最初、溶液に対する溶解度の高いアルカリ系のイオンから溶脱し、それに続きSi,Al等の溶出が起こる。X線回折強度を分解の指標とすると、特にメリライトではa軸とc軸方向の溶解速度及び溶解機構に違いが見られる。結晶構造的には最初、表面付近にアルカリ系イオンが相当抜けた多孔質のアモルファス領域を生成し、そのすぐ内側に漸移的にアルカリ系イオンがまだ相当残存しているアモルファス性の中間領域があり、それに漸移して内側中心部に未反応の結晶性の鉱物が占有する三層構造が考えられ、理論的にも十分論証される新しい知見である。プリセッションカメラ用の溶液反応その場観察用セルは改良され、四軸自動回折装置に装着するセルも、検出可能な回折班点領域がより広く改作されX角に対する制限も暖和されたが、広角測定の為にはセルの形態をさらに改良する必要がある。また、温度、圧力に対する対抗性も低い為、汎用性を考慮するならば、新材質を導入して耐薬品性を強化する。溶液中での火花放電実験も一部試行を開始した。

溶液はNa-Al-Siのゲルを蒸留水に溶かしたもので、白金電極及び炭素電極をその中に浸しながら火花放電をさせたところ、電極の先端部は霧散し、特に白金の場合は溶液の色が一瞬にして青灰色となった。溶液から試料を分取したところ、徴小な回折X線が検出され、放電エネルギーによる結晶成長が確認された。しかしながら生成物は徴量の為、未定である。62年度はガス混合装置を組入れた放電流体系のシステムを完成し、地球の初期状態の復元を目指す予定である。本年度は,ガス混合装置を組み入れた放電流体系のシステムを試作し,地球の初期状態のシミュレーション実験を行う予定であったが,市販のガス混合装置は,ガスを切り替えた時,内部にガスが残留する現象が起こる為,自家製の装置を自主製作をしたためにかなりの時間を費やすことになった.初期実験として、蒸留水中に電極の鉄棒を上下にセットして、その間に炭素棒の中心に円筒状の穴を開け、その中にシリカ粉末を充填して、変圧器および放電溶接装置により電圧を架けて、放電(実際はショ-ト)させた。回収された試料は微量であるため、正確な同定はなされていないが、70ボルトまでの電圧変化に対しては試料の変化は見られない。しかしながら鉄棒と炭素棒との接触部の炭素棒の底面には極微小金属の熔解球の散在が認められ、相当の高温(鉄の融点1535°Cと沸点2730°C)まで上昇していることが判定される。金属小球を回転対陰極の強力X線で検討したところ、cohenite FeC様のものが同定された。coheniteは隕石中に存在し、地殻中には自然鉄として産出する。原始地球は、大気にはDCO_2が存在し、地表には海が形成されていたが、現在の地球ほど分化がまだ進んでいなかったと考えられ、地表には鉄元素も豊富に存在していたにちがいない。したがって、大気と地表との間で放電が激しく起こり、地表の鉄及び炭素に富んだ岩石は高温の衝撃波を受けたことが予想される。このため、現在の地球には殆ど産出しないcoheniteは、創生期の地球では豊富に存在していたことが期待される。放電が起こる地表の岩石種に応じて、発生する鉱物種が異なることは、鉱物の生成原理を構築する上で、新たなる問題を提起したことになる。今後は,水溶液,ガス中での各種の放電実験を繰り返し,放電場で様々な固相を反応させて,地球の初期状態を復元して,地殻の進化,生命の起源,鉱物生成原理等の解明を究察することになる.
山岳傾斜面における融雪水流出機構の研究

融雪地すべりの直接的な成因である山地における表面融雪量や融雪水浸透の定量的解析はほとんど行なわれていない。そこで北海道の実験流域(面積11.2【Km^2】)において、1)地形効果を考虜した熱収支法による融雪量予測、さらに2)融雪水浸透速度と表面融雪強度の関係、及び3)河川水の化学成分変化より流出成分の分離、を研究の重点項目とした。1).流域内熱収支法による山地の融雪量予測流域内を面積135m×135mの格子点に分け、各地点において地形効果を考虜した熱収支成分を求めた。融雪に寄与する最も重要な因子は放射熱であり、ついで大気からの伝達熱(顕熱)であった。融雪熱量に占めるそれぞれの割合は標高300mの低地部では放射7080%、顕熱2030%、流域山頂部では放射5060%、顕熱5040%と高度依存性を示した。2).斜面積雪内における融雪水浸透速度と融雪流出成分の分離斜面上4地点(傾斜角はそれぞれ2,4,17,28度)において融雪水の積雪内浸透速度を測定した。傾斜角が大きな地点では融雪水の1部は斜面に平行に移動するが、その距離は短かく(4050cm)、大部分は積雪内へ浸透した。浸透速度は表面融雪強度に依存して変化したが、傾斜角度による相違は認められず、平地とほゞ同じ値を得た(快晴日中0.50.8cm/min)。表面融雪水が積雪内(期間中の積雪深11080cm)を浸透し地面に達するまでの時間は100220分であり、表面融雪と河川流出のピーク時間の遅れの約半分を占めていることがわかった。次に河川水は地下水と表層水の2層流から構成されており、2層流が混合して流出する時にはイオン量が保存されるものと仮定して、融雪流出水の比電導度の変化から流出成分の分離を行なった。その結果表層流出分が2030%、地中流出分が7080%となり融雪出水時にも地中流出分が卓越することが確認された。
脳組織酸素濃度と微小血管からの酸素放出の関連

1.微小血管内酸素飽和度測定装置で複数の場所の酸素飽和度を測定するとともに、血流速度測定装置をもちいて赤血球流速、画像処理装置を用いて血管直径を測定し、これらの測定をもとに人工流路からの酸素の放出速度を計算した。2.脳表面の微小血管を、複数の干渉フィルターを切り換えながらビデオカメラで撮影し、それぞれ別の画像として画像処理装置に記録した。記録された画像に対してヘモグロビンの吸光度を計算した後、干渉フィルターの波長に応じて画像間で演算をおこなうことにより、血管内を流れている血液のヘモグロビン濃度、酸素飽和度を2次元イメージとして得ることができた。3.血管近傍の脳実質組織内にニードルpO_2電極を顕微鏡下で刺入し、生体酸素分圧測定装置で脳組織内の酸素分圧を測定した。微小血管内酸素飽和度測定装置と血流速度測定装置をもちいて人工流路からの酸素の放出速度を計算することができ、デキストランによる集合形成が、酸素放出速度を低下させることを明らかにした。また、脳表面の微小血管を複数の干渉フィルターを切り換えながらビデオカメラで撮影・保存した。保存した画像間で演算をおこなうことにより、血管内を流れている血液のヘモグロビン濃度、酸素飽和度を2次元イメージとして得ることができた。血管近傍の脳実質組織内にニードルpO_2電極を顕微鏡下で刺入し、生体酸素分圧測定装置で脳組織内の酸素分圧を測定した。3.血管近傍の脳実質組織内にニードルpO_2電極(今年度購入)を顕微鏡下で刺入し、生体酸素分圧測定装置(今年度購入)で脳組織内の酸素分圧を測定した。初年度はシステム個々の性能の確立を主眼におき、それぞれの測定装置を個々に働かせ、基礎データの採取を主におこなった。
義歯口蓋形態が発音に与える影響に関する研究-画像入力装置の規格化-

本年度は義歯の口蓋形態と発音の関係を検討すべく、パラトグラム法による義歯床口蓋面の画像情報を分析する情報入力システムを構築するため、その入力システムの構築および義歯床付着規格装置の製作、較正を主体に研究を行った。今回製作した義歯床付着規格装置は、HIP平面を構成する切歯乳頭および左右ハミュラーノッチの3点に相応する義歯床粘膜面に固定点を求める3点の平行な支持ピポッドから構成される。特に切歯乳頭に相応する義歯床粘膜面の点は、義歯床を構成する前歯部頬側面のアンダーカットにより、HIP平面に投影する際には、従来の垂直なピポッドは使用できない。そのため、形態を考慮した前方に傾斜したピポッドを設計し、また形態に応じた角度の異なる2種のピポッドを製作した。ピポッドの高径は付着装置基底面から40mm離し、画像入力時の影響を考慮した形態である。画像入力装置はNTSC出力のアナログビデオカメラを640x480ピクセルの分解能をもつ入力ボードに接続し、デジタル化したデータを検討するシステムである。アナログビデオカメラの光学系およびCCDなどの収差を考慮するため、方眼上のシートを画像入力し、カメラの角度および焦点間距離を調整し、画像入力時の投影面積の均一性等について検討を行った。立体物の面積を分析の項目にするため、単純な曲面をもつ立体物の深度と面積の補正値の関係について、検討を行った。今後、既知の3次元データをもつ金型を製作し、画像入力と立体物との代表値をもつ補正データの作製を行う所存ある。
木質系廃棄物を利用した低環境負荷型炭化物セラミックス合成法の開発

《目的および方法》樹木の樹皮は、現在まで有効なリサイクル法がなく、焼却処分により炭酸ガスを発生させていた。このような木質系廃棄物中に含まれる炭素成分を有効な工業生産用の原料とみなし、炭酸ガスとして放出させることなく、セラミックスの構成成分として固定化することを試みた。手法として、セラミックス等の大量生産が可能な燃焼合成(SHS)法を用い、木質系廃棄物と金属チタン粉末の混合物から工業的に有用な炭化チタン(TiC)セラミックスを直接的に合成した。さらに、木質系廃棄物中に含まれる各元素(炭素、水素、酸素)がSHS反応に及ぼす影響についても調査した。《結果》(1)各種木質系廃棄物の組成分析:外樹皮および内樹皮に含まれる各元素の割合は、各々約52%C、5%H、43%Oおよび46%C、6%H、48%O(質量比)であった。これは、市販のリグニン(55%C、4%H、41%O)とセルロース(43%C、6%H、51%O)のほぼ中間組成であった。(2)チタンと各種木質系廃棄物等の混合物によるSHS反応:上記の結果を基に、目的組成をTiC_<1.0>としたものを作製し、その時の燃焼波速度(反応速度)を測定した。その結果、リグニン、外樹皮、内樹皮、セルロースの順に秒速6mmから1mmへと反応速度が低下した。これは各木質系物質に含まれる炭素量の変化と相関があった。(3)生成相の同定並びに組織観察:反応生成物は、X線回折の結果より、TiCのみが検出された。しかし、その回折ピークは、化学量論組成に近いTiCのものと比べて高角側にシフトしており、TiC結晶内に格子欠陥(空格子点等)が導入されていることが示唆された。また、走査型電子顕微鏡観察により、TiCの結晶粒径は15μmであった。(4)反応機構に関する考察:反応系においてチタンと、木質系物質に含まれる炭素量の比を等モルに設定して合成を試みたが、反応中にその炭素が同じ木質系物質に含まれる酸素と反応し炭酸ガスを形成した。結果的にTiC結晶中の炭素欠損、すなわち炭素の空格子点を形成したと考えられる。
2次元クロマトグラフィーと超高感度アミノ酸分析による翻訳後修飾の絶対定量法の研究

タンパク質はDNA遺伝情報を元に生成されたあと、タンパク質の様々な機能発現に関与した化学修飾を受ける。これを翻訳後修飾(PTM)という。このPTMとタンパク質の機能との関係を解明することは重要であるが、どのような修飾を受けるかは遺伝情報に書かれていないため、タンパク質内で修飾されたアミノ酸を分析する必要がある。この修飾アミノ酸は微量であることが多く、これまで定量的な分析は困難だった。本研究では、タンパク質からアミノ酸への定量的な加水分解方法、分離能を高めるための2次元クロマトグラフィーの開発を行い、超高感度アミノ酸分析法と組み合わせることで、翻訳後修飾を受けたアミノ酸の絶対定量法を確立した。液体サンプル用の固体酸触媒の性能評価を中心に研究をおこなった。スチレン・ジビニルベンゼン共重合体を基材とする強陽イオン交換樹脂を用い、バッチ法でタンパク質の加水分解テストをおこなった。加水分解時間を変えて回収率、アミノ酸組成を評価したところ、従来の塩酸法と同等のアミノ酸回収率を得るためには、加熱温度は150°C、加熱時間は1時間が最も良いことがわかった。また、樹脂の加水分解能力を調べるため、一定量の樹脂(樹脂50%懸濁液を10マイクロリットル)を用いてタンパク量を変えて加水分解実験を行ったところ、牛血清アルブミン(BSA)は100マイクログラム程度まで定量的に加水分解ができることが明らかになった。したがって、1gのタンパク質を加水分解するためには100mL程度の樹脂が必要となる。バイオマスや食品分野などのマクロ量タンパク質の加水分解によるアミノ酸、ペプチド産生に資するために、今後スケールアップしての加水分解実験も行う予定である。また樹脂からの回収率は抽出溶液にも依存するため、抽出液の最適化を行ったところ、1Nの水酸化ナトリウム水溶液で効率よく抽出できることがわかった。また、一定量のBSAに対し樹脂量を増やしていくと回収率が減少することから、タンパク量/樹脂比が重要であることもわかった。これらの結果から、固体酸触媒を用い、適切な条件で加水分解とアミノ酸抽出を行えば、定量的なタンパク質加水分解およびアミノ酸組成分析が可能であることを示せた。また、この樹脂をカラムに充填しカラム内加水分解を行った。回収率はバッチ法よりも低く70%50%程度だった。これはインジェクション時に素通りしてしまう成分があるからであることがわかったため、インジェクション方法を変更するか、樹脂とタンパク質溶液の接触面積を増やすため樹脂粒径を小さくするなどの改善策を行うこととした。ポリアクリルアミドゲル電気泳動法(SDS-PAGE)で分離したサンプルをポリビニリデンジフルオライド(PVDF)膜に電気的にブロッティングして膜上に転写したものを分析するための膜状固体酸触媒の作成と評価を行った。膜状の固体酸触媒とするため、PVDF膜を基材とし官能基を導入した。官能基は同じフッ素系のポリマーであるスルホン化ポリマーをPVDF膜に積層することで導入した。膜に対するスルホン化ポリマーの量や積層方法について加水分解効率が最大になるよう最適化を行った。また加水分解後のアミノ酸溶出方法についても、pHを振って検討を行った結果、pH8-9程度の塩基性緩衝溶液で効率よくアミノ酸が回収できることを見いだした。作成した膜状固体酸触媒に、まずタンパク溶液をドットブロットすることでサンプルを添加し加水分解を行った。その結果、10pmol程度のタンパク量で十分に定量的に加水分解が行えることがわかった。そこで、SDS-PAGEゲルから電気的にブロッティングしたタンパク質バンドを切り出し、スルホン化ポリマーを積層し加水分解を行った。その結果、1バンドあたり1.5pmolから20pmol程度のタンパク質で、従来法の塩酸法と同等のアミノ酸組成を得ることができた。また得られたアミノ酸組成からタンパク質データベースを検索することでタンパク質の同定も可能だった。また、溶液用の固体酸触媒では耐熱性が低いために、反応温度を上げることができなかったが、膜状固体酸触媒では150°Cまで温度をあげることができるため、加水分解時間を従来の塩酸法の20時間から2時間に短縮できた。電気泳動で分離したタンパクに応用するために膜状の固体酸触媒を作成し、性能評価を完了し、従来の塩酸法と同等のタンパク質加水分解条件を確立するとともに、液体サンプル用の固体酸触媒より1/10の時間で加水分解が完了できるようになったため。翻訳後修飾を受けたアミノ酸は多くの場合、未修飾の通常アミノ酸に比べ非常に量が少ない。そこで大量に存在する未修飾アミノ酸や夾雑物ピークをあらかじめ分離することで、修飾アミノ酸を精度よく選択的に検出するため、クロマトグラフィーの2次元化を行った。1次元目にはカーボンカラムによる吸着クロマトグラフィーを用い、アミノ酸を分離・分取し、次に、回収した各フラクションのアミノ酸を蛍光誘導体化した後、2次元目の逆相クロマトグラフィーで分離し検出することとした。サンプルはHL-60細胞から酸抽出したヒストンを用いた。ヒストンをポリアクリルアミドゲル電気泳動法(SDS-PAGE)で分離し、ポリビニリデンジフルオライド(PVDF)膜に電気的にブロッティングして膜上に転写した。このうちヒストンH3.3およびH4のバンドを切り出して加水分解後、1次元目のクロマトグラフィーにかけてフラクションを分取した。分取したサンプルの一部を蛍光誘導体化試薬である6-アミノキノリル-N-ヒドロキシスクシンイミジルカルバメート(AQC)を用いて蛍光ラベル化し、2次元目の逆相クロマトグラフィーで分離・定量を行った。

比較のために、1次元目なしで加水分解後、直接AQCでラベル化し、逆相クロマトグラフィーで分離・定量を行った。その結果、2次元化することで、ヒストンH3.3からは、1次元目なしでは検出されなかったモノメチルリジンが、ヒストンH4からは、モノメチルリジンに加え、非対称ジメチルアルギニン、対称ジメチルアルギニンが検出された。このように、クロマトグラフィーを2次元化することで、1次元では夾雑物などによって検出できなかった翻訳後修飾アミノ酸を検出することに成功した。タンパク質はDNA遺伝情報を元に生成されたあと、タンパク質の様々な機能発現に関与した化学修飾を受ける。これを翻訳後修飾(PTM)という。このPTMとタンパク質の機能との関係を解明することは重要であるが、どのような修飾を受けるかは遺伝情報に書かれていないため、タンパク質内で修飾されたアミノ酸を分析する必要がある。この修飾アミノ酸は微量であることが多く、これまで定量的な分析は困難だった。本研究では、タンパク質からアミノ酸への定量的な加水分解方法、分離能を高めるための2次元クロマトグラフィーの開発を行い、超高感度アミノ酸分析法と組み合わせることで、翻訳後修飾を受けたアミノ酸の絶対定量法を確立した。当初の目的であった、液体サンプル用の固体酸触媒の性能評価を完了し、従来法の塩酸法と同等のタンパク質加水分解条件を確立することができたため。膜状固体酸触媒について、細胞から抽出したタンパク混合物の実サンプルを用いて加水分解を行う。また固体酸触媒等で加水分解したタンパク質に含まれる翻訳後修飾アミノ酸を精度良く定量するため、2次元クロマトグラフィー法を確立する。本研究の成果について論文投稿する。分析化学樹脂を用いたカラム加水分解の効率を上げるため、タンパク質の導入方法を考案する。また、電気泳動サンプルにも応用できるよう、膜状固体酸触媒の開発をし、性能評価を行う。膜状固体酸触媒の開発を優先させたため、当初予定していた設備備品を購入しなかったため。また学会参加旅費を使用しなかったため。消耗品(タンパク質および固体酸触媒原料)の購入が当初見積より少なかったため。前年度からの繰越予算も合わせ、予定していた消耗品および前年度購入しなかった設備備品を揃え、クロマトグラフィーの2次元化を行う。また、研究成果を発表するため、英文校閲代、投稿料、参加登録料等に予算を使用する。今年度は、新たな膜状固体酸触媒を開発するほか、加水分解キット作製を計画している。加えて前年度の課題として樹脂を用いたカラム加水分解の効率を上げるため、タンパク質の導入部分の構築が必要となったため、前年度繰り越し予算を使用する。
筋小胞体カルシウムポンプのエネルギー共役の中心となる中間体の解析

組み替えタンパク発現系の最適化Adeno virus、lipofection法electroporation法を試みその結果を比較し、どの方法を用いても、ミクロソームタンパク当たり2%以上の発現量を得た。また定常的にSERCA1aを発現する組み替え細胞も作成したが、十分な発現量は得られなかった。以上の結果、lipofection法をもちいて一過的に強制発現させたSERCA1aを用い解析を行うことが最適であった。COS-1細胞Microsome分画にしたSERCA1aを用いたCa^<2+>結合量測定法の確立今研究で、washerの組成を検討することにより、従来困難であった、発現SERCA1aへのCa^<2+>結合を直接測定する方法を確立し、簡便、安全にSERCA1a変異体の酵素学的性質をより詳細に調べることが出来るようにした。SERCA1a変異体のE2P中間体に存在する、内腔向き高親和性Ca^<2+>結合部位の発見定常状態でADP-非感受性EP(E2P+E2PCa)の量を測定した結果、ADP-非感受性EPの量はWTではCa^<2+>濃度を変化させても変わらないが、Y122A変異体ではCa^<2+>濃度に依存してADP-非感受性EPの量が変化した。またCa^<2+>濃度依存性はpHによって大きく変化し、pHが高いほど、高いCa^<2+>依存性を示した。これから求めた見掛けのCa^<2+>親和性は、PH7.3で、150μM程度であり、E2Pは内腔側のCa^<2+>に対して高い親和性を持っていた。SERCA1aをCa^<2+>存在下、ATPを添加してリン酸化し、定常状態でのE1P量とCa^<2+>結合量の比較を行った結果WTの場合E1Pの比率と、Ca^<2+>結合量が完全に一致したのに対し、変異体ではE1Pの比率よりCa^<2+>の結合量の方が多かった。この結果はSERCA1aの反応経路にCa^<2+>を結合したE2P中間体(E2PCa)が存在することを強く示唆している。組み換えタンパク発現系の最適化組み替えタンパク発現系の最適化のため、Adeno virus、lipofection法、electroporation法を試みその結果を比較した。その結果どの方法を用いても、ミクロソームタンパク当たり2%以上の発現量を得ることができたが、発現量が上昇するにつれて、発現したカルシウムポンプタンパク当たりのリン酸化中間体量は低下していく傾向にあった。これは無理に発現量を増やした場合、活性を持たないタンパクが増加することを示している。以上の結果、本実験ではlipofection法をもちいて一過的に強制発現させたSERCA1aを用い解析を行うことにした。反応速度論的解析による、E2PCa中間体の存在の実証

E2PCa中間体存在の実証のため、今までの解析でE2PCaの蓄積が期待される複数のSERCA1a変異体を用いて、Ca^<2+>存在下でATPを加えてリン酸化させ、定常状態が成り立っている時点でADP-非感受性EP(E2P+E2PCa)の量を測定した。その結果ADP-非感受性EPの量はWTではCa^<2+>濃度を変化させても変わらないが、変異体ではCa^<2+>濃度を1-100μMの間で変化させると、大きく変化し、Ca^<2+>濃度が低くなるほどADP-非感受性EPの量が増えた。この結果はADP-非感受性EPの中にCaを結合している分子種(E2PCa)が含まれていることを強く示唆しており、そのCa^<2+>親和性は数μMと見積もることができた。組み換えタンパクを用いたCa2+結合測定メンブレンフィルター上の^<45>Caを放射活性をイメージングプレートを用いて計測する方法を検討したところ、十分にSERCA1aのCa^<2+>結合測定に適用可能であるが、メンブレンによる遮蔽効果に留意する必要があることが分かった。COS-1細胞Microsome分画に発現したSERCA1aを用いたCa2+結合量測定法の確立従来COS-1細胞で発現させたSERCA1a(筋小胞体カルシウムポンプ)を用いる測定系では、発現量の低さとバックグラウンドの高さが問題となり、Ca2+-ATPaseへのCa2+結合を直接測定することは非常に困難であった。今研究で、私はwasherの組成を検討することにより、メンブレンフィルトレーション法で、発現したSERCA1aへのCa^<2+>結合を直接測定する方法を確立し、簡便、安全にSERCA1a変異体の酵素学的性質をより詳細に調べることが出来るようになった。SERCA1a変異体のE2P中間体に存在する、内腔向き高親和性Ca2+結合部位今までの解析でE2Pの蓄積が期待される変異体を用いて、定常状態でADP-非感受性EP(E2P+E2PCa)の量を測定した。その結果ADP-非感受性EPの量はWTではCa^<2+>濃度を変化させても変わらないが、変異体ではCa^<2+>濃度に依存して、大きく変化し、Ca^<2+>濃度が低くなるほどADP-非感受性EPの量が増えた。またこのCa^<2+>濃度依存性はpHによつて大きく変化し、pHが高いほど、高いCa^<2+>依存性を示した。これから求めた見掛けのCa^<2+>親和性は、pH7.3で、150μM程度であり、この結果は変異体のE2Pは内腔側のCa^<2+>に対して高い親和性を持っていることを示している。SERCA1aをCa^<2+>存在下、ATPを添加してリン酸化し、定常状態でのE1P量とCa^<2+>結合量の比較を行った。その結果WTの場合E1Pの比率と、Ca^<2+>結合量が完全に一致したのに対し、変異体ではE1Pの比率よりCa^<2+>の結合量の方が多かった。このことはSERCA1aの反応経路にCa^<2+>を結合したE2P中間体(E2PCa)が存在することを強く示唆している。