hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
内分泌撹乱化学物質のヒトP450による代謝変換とエストロゲン作用の修飾

外因性内分泌攪乱化学物質(Endocrine Disrupting Chemicals ; EDCs)のリスク評価に当たっては、摂取後の肝ミクロソームに局在するチトクロームP450(P450)に代表される異物代謝酵素による代謝変換に基づくエストロゲン活性の変動を考慮に入れなければならない。そこで本研究では日常摂取する可能性が高いと考えられるドスフェノールA(BPA)やアルキルフェノール類などの代表的な人工EDCsや大豆イソフラボンであるゲニステインなどの植物エストロゲン類のエストロゲン活性に及ぼすラットおよびヒト肝P450などによる代謝変換の影響を明らかにすることを目的とした。先ず平成12年度の研究の結果、オクチルフェノールやノニルフェノールなどのアルキルフェノールや代表的な植物エストロゲンのゲニステインはラット肝S9(P450源)により代謝的に不活性化されることが明らかとなった。一方、BPAや豆科イソフラボンのバイオカニンAではヒトおよびラット肝S9による代謝変換によりエストロゲン活性の増大(活性化)がもたらされることが明らかとなった。そこで平成13年度は、これらの代謝的活性化に焦点を絞って検討を行った。その結果、BPAの代謝的活性化にはミクロソーム(P450)とともにサイトソール中の蛋白質性因子の関与も示唆された。また、高速液体クロマトグラフィー/質量分析(LC/MS)の結果、この活性代謝物の構造はイソプロペニルフェノールの2量体の可能性が示唆された。一方、バイオカニンAはP450による代謝変換の結果、より強いエストロゲン活性を有するゲニステインを与えることが明らかとなった。これらの諸結果は摂取されたEDCsのエストロゲン作用は異物代謝酵素による代謝変換により大きく変動すること、なかでも代謝的活性化を考慮に入れたリスク評価の重要性を改めて提起するものである。生体異物としての内分泌撹乱物質(Endocrine Disrupting Chemicals;EDCs)の生体影響を正しく評価するには、体内摂取後の肝ミクロソームのチトクロームP450(P450)に代表される異物代謝酵素による代謝変換に基づくエストロゲン活性の変動(活性化または不活性化)を考慮に入れなければならない。そこで本研究では日常摂取する可能性が高いと考えられるビスフェノールA(BPA)やアルキルフェノール類などの代表的な人工EDCsやダイゼイン、ゲニステインなどの植物エストロゲン類のエストロゲン活性に及ぼすヒトP450などによる代謝変換の影響を明らかにすることを目的とした。先ず、ラット肝S9(ミクロソーム+サイトソール)を酵素源とした予備的検討の結果、ヒトエストロゲン・レセプター遺伝子を導入した形質転換酵母を用いたレポーター・アッセイにおいてBPAのエストロゲン活性が代謝により増強されること、さらにその活性化にはP450源としてのミクロソーム以外にサイトソール画分も不可欠であることを見い出した。同様の活性化はヒト肝S9によっても認められたが、酵素源の調達のし易さなどの点から本年度は主にラット肝S9を用いた基礎的検討を行なった。その結果BPAの構造類似体であるビスフェノールBにおいても活性化が認められた。しかし、オクチルフェノールやノニルフェノールおよびエストラジオールにおいてはむしろ代謝的不活性化が観察された。一方、植物エストロゲンのグニステインでは不活性化が、またバイオカニンAでは活性化の傾向が認められた。これらの結果は各種EDCsのエストロゲン活性が動物肝酵素による代謝変換により大きく変動することを示すものである。そこで次年度は胎児肝を含むヒト肝酵素を用いてEDCsの代謝が及ぼすエストロゲン活性への影響を明らかにしたい。

外因性内分泌攪乱物質(Endocrine Disrupting Chemicals ; ECCs)の生体影響のリスク評価に当たっては、摂取後の肝ミクロソームに局在するチトクロームP450に代表される異物(薬物)代謝酵素による代謝変換に基づくエストロゲン活性の変動(活性化または不活性化)を考慮に入れなければならない。昨年度の研究結果、代表的な人工EDCであるビスフェノールA(BPA)や植物エストロゲンであるバイオカニンAはヒトやラットの肝S9による代謝変換によりエストロゲン活性の増大がもたらされることを明らかにした。そこで本年度は、これらの代謝的活性化に焦点を絞って検討を行った。その結果、BPAの代謝的活性化にはミクロソーム(チトクロームP450)とサイトソールの両画分の共存が必要であること、さらに一方の加熱操作により活性化能は完全に不活化されることなどから少なくともサイトソール中の因子も蛋白質性のものであることが示唆された。また、強いエストロゲン活性を示す活性代謝物の構造を明らかにすべく高速液体クロマトグラフ/質量分析装置(LC/MS)を用いて検討を加えたところ、この活性代謝物はBPA自身よりも40マス単位大きな質量(M^+-1:267)を、またMS/MSではm/z133の単一フラグメントを与えたことなどからイソプロペニルフェノールの2量体の可能性が示唆された。つぎにバイオカニンAの代謝的活性化はチトクロームP450による4'-位の酸化的脱メチル化の結果、より強いエストロゲン活性を有するゲニステインの生成によることが明らかとなった。これらの結果は摂取されたEDCsのエストロゲン作用は異物代謝酵素による代謝変換により大きく変動すること、特に代謝的活性化を考慮に入れたリスク評価の重要性を改めて提起するものである。
ＳＰＶ法によるボトムゲート型ＴＦＴにおける多結晶Ｓｉ薄膜の結晶性評価技術の開発

交流表面光電圧法による非接触・非破壊での多結晶シリコン薄膜の結晶性評価装置の開発を行った。発光ダイオードからレーザダイオードへの励起光源の変更により,多結晶シリコン薄膜から得られる表面光電圧の高感度化を達成した。エキシマレーザアニールにより多結晶化された膜厚約50nmのシリコン薄膜では,約1mV/nmの分解能を示した。また,測定において励起光の高パワー化によるAC SPVの飽和という問題点があることを明らかにした。本研究はボトムゲート型薄膜トランジスタ(TFT)に使われる多結晶Si薄膜の結晶性評価技術を確立する目的で行っている。平成24年度に行った研究の概要を以下に記述する。(1)表面光電圧装置の低ノイズ化:多結晶Si薄膜からの交流表面光電圧検出のさらなる高感度化のために,測定装置の除震化を行った。これにより,機械的ノイズレベルは2040μVから1μV未満へと減少した。(2)多結晶Si薄膜作製:アモルファスSi薄膜の多結晶化を行う真空熱処理装置を立ち上げ,様々な試料の作製を可能にした。この装置を用いてアモルファスSi薄膜を温度300900°Cで真空中熱処理を行い,これらの試料の交流表面光電圧評価を行った。この結果,温度600°C以上で結晶化が進むこと,最も結晶化が進む温度が約800°Cであることを確認した。また,交流表面光電圧の周波数特性から,低周波における交流表面光電圧の値が結晶性により異なる傾向が見られた。さらに,交流表面光電圧は励起光パワーの増大と共に増大するが,結晶性が良い試料では光パワーの大きい領域で飽和する結果を得た。(3)試料作製のためのスパッタ装置の立ち上げ:試料作製の外部委託が研究遂行の障害になっているため,Si薄膜作製用スパッタ装置の立ち上げを行った。現在,装置の組み立てが終了し,真空排気試験を行っている。(4)多結晶Si薄膜における少数キャリア挙動の検討のため,単結晶Si角棒及び単結晶Siウェーハについて,それぞれJIS法及び光電圧法により少数キャリア寿命評価を行った。この結果,試料表面及び裏面におけるキャリア再結合による少数キャリア寿命への影響を確認した。以上,低ノイズ化により新しい多結晶Si薄膜の結晶性評価法を前進させた。また,励起光パワーの選択が重要である点を見出した。本研究は交流表面光電圧(AC SPV)法による多結晶シリコン(Si)薄膜の結晶性評価技術を確立することを目的としている。平成25年度に行った研究の概要を以下に記述する。(1)Si薄膜形成用スパッタ装置の立ち上げ:Siをターゲットとした直流マグネトロンスパッタ装置を立ち上げた。Si製膜速度は約7nm/minであり,薄膜トランジスタにおけるSi薄膜の膜厚(約50nm)を考えると膜厚制御が難しいため,製膜条件の見直しを行っている。(2)熱処理したアモルファスSi薄膜のAC SPV:作製した真空熱処理装置により実験を行い,熱処理温度とAC SPVの関係を得た。熱処理温度800°CにおいてAC SPVが最大となり,また,AC SPV減衰特性から得られた減衰時間も同様の結果を示した。一方,X線回折(XRD)測定では,結晶化による回折パターンは観察されなかった。これらの結果より,熱処理によるAC SPV及びその減衰時間の増大はSi薄膜における欠陥や未結合手に起因する再結合中心密度の減少によるものと考えられ,AC SPV法によりSi薄膜の膜質の定量的評価が出来る可能性を示した。平成25年度の結果を含めた3年間での本研究の成果は以下のとおりである。1AC SPV法による多結晶Si薄膜の結晶性評価の高感度化及び低ノイズ化の達成,2AC SPV高感度化・平面分解能向上における問題点の抽出,3AC SPV法によるアモルファスSi薄膜における再結合中心密度評価の可能性今後,Si薄膜の水素雰囲気中熱処理によるSi薄膜の再結合中心密度変化についてAC SPV評価を行っていく。また,Si薄膜作製についても引き続き実験を行い,ボトムゲート型構造試料の評価を行う予定である。平成23年度に行った研究の概要を以下に記述する。(1)表面光電圧(SPV)装置の高感度化,平面分解能の向上SPV測定装置の高感度化を行うべく,キャリア励起光源を波長365nmの紫外発光ダイオード(LED)から波長379nmの紫外レーザダイオード(LD)へと変更した。この変更に伴い,SPVプローブを新たに作製した。LDへの変更により,照射光パワーは約160mWとLEDの場合に比べ約150倍となった。

作製したSPVプローブを用いてトップゲート型構造試料(石英基板上に膜厚約50nmの多結晶Si薄膜が形成されたもの)の測定を行った結果,LED光源の場合と比較して大きいSPVが得られ,約7倍の高感度化が達成された。この事により,SPVの小さいボトムゲート構造試料への適用に大きく前進した。また,多結晶Si薄膜からのSPV波形はLED励起光を使用した際と同様であり,SPVは多結晶Si薄膜の結晶粒径に対応している事を確認した。新たに作製したSPVプローブには励起光の絞り(直径1mm5mm)を取り付け,試料への照射光面積を可変できる形にした。しかしながら,SPVの平面分解能は励起光照射面積に依存せず,SPV信号を検出するITO薄膜電極面積に依存していることが判明した。今後,SPVプローブの検出部の変更により平面分解能の向上を目指していく。(2)試料の作製と評価アモルファスSi薄膜の多結晶化条件,水素終端化条件によるSPVの違いについて検討を行うために,石英基板上へスパッタ法により約50nmのアモルファスSi薄膜を形成した試料を作製した。現在,多結晶化試料の評価中であり,その結果を基に,ボトムゲート構造試料の作製を行う予定である。本研究はボトムゲート型薄膜トランジスタ(TFT)に使われる多結晶Si薄膜の結晶性評価技術を確立する目的で行っている。平成24年度の達成度について以下に記述する。(1)交流表面光電圧測定の高感度化・低ノイズ化:励起光源をLEDからLDへ変更して約7倍の高感度化を達成した。また,除震台の導入により機械的ノイズを2040μVから1μV未満へと減少させ,測定ばらつきを軽減させた。平面分解能の向上については,交流表面光電圧検出電極面積に依存する結果が得られており,検出電極であるITO膜のついた円柱形石英ブロックの小型化が必要である。平面分解能の向上は現在も検討中である。(2)トップゲート構造試料の評価:外部委託による作製したアモルファスSi薄膜試料について,立ち上げた真空熱処理装置を用いて多結晶化を行った。この試料について表面光電圧測定を行い,加熱処理温度と多結晶薄膜の表面光電圧の関係を明らかにした。多結晶Si薄膜の表面,界面状態と表面光電圧の関係については,装置トラブルにより試料の作製が困難であるために行うことが出来なかった。現在,立ち上げ中のスパッタ装置で行う予定である。(3)ボトムゲート構造試料:ボトムゲート構造試料については,外部委託費用が増大する理由で作製を行わず,金属薄膜及びSi薄膜形成用のスパッタ装置を作製する方向へ変更した。現在,立ち上げ中のスパッタ装置の真空排気確認を行っている。ボトムゲート構造試料についての評価は達成されていない。平成23年度の達成度について以下に記述する。平成23年度は,東日本大震災及び福島第1原子力発電所の事故により,装置の復旧や研究体制を整えるために時間がかかり,研究の進捗に遅れが生じた。(1)SPV装置の高感度化,平面分解能の向上SPV信号の高感度化のため,LDを励起光源に用いたSPVプローブの作製を完了した。励起光源をLEDからLDに変更して照射光パワーを増大し,多結晶Si薄膜から得られるSPVについて約7倍の高感度化を達成した。
外来通院する早産ハイリスク妊婦の早産予防のためのセルフケア能力査定質問紙の開発

本研究の目的は、外来通院する早産ハイリスク妊婦の早産を予防するためのセルフケア能力を査定する質問紙を開発することである。平成30年度は研究メンバーで会議を開催し、研究の方向性の検討を行った。その結果、国内外で既に作成されているセルフケア能力を測定する質問紙及びそれらの質問紙の開発過程についての文献検討を行い、研究計画の詳細を明確にすること、切迫早産、早産ハイリスク妊婦の看護に関する既存の文献や、筆者等が行った切迫早産と診断された妊婦のセルフケア能力に関する過去の研究から、切迫早産と診断された妊婦が早産を予防するためのセルフケア能力を構成する要素について検討し、質問紙原案の作成準備を行うことになった。現在、セルフケア能力を構成する要素について検討中であり、質問紙原案の作成には至っていない。質問紙原案作成のために文献検討を行い、早産を予防するためのセルフケア能力を構成する要素の検討を行っているが、質問紙原案の作成に至っていない。研究者等の他業務の負担が予想以上に増加したことにより十分な研究時間の確保が難しかったことと、研究協力施設の受け入れ態勢の変化も影響している。現在行っているセルフケア能力を構成する要素の検討を進め、質問紙原案の作成を行う予定である。また、当初予定していた面接調査については対象者や研究施設を含めて再検討を行う。平成30年度は文献の購入等を目的とした支出が主体であった。当初予定していた面接調査を行っていいないため、面接調査に必要な旅費、面接内容のテープ起こしに必要な費用、データ入力に伴う人件費等が発生いていない。面接調査は対象者及び人数について検討を行っており、今後面接調査を行うことで、旅費や人件費が発生する。会議については、平成30年度は学内のメンバーのみで会議を行ったため、会議に伴う旅費が発生しなかった。今後研究の進行に伴い、学外での調査、会議などにおいて旅費、謝金などが発生する。また、想定外の業務発生に備え、研究進捗を図るため、研究補助要員を積極的に雇用することも現在検討中である。
ボトムアップ法とトップダウン法との融合によるナノ粒子集積体の作製

最近、コロイド粒子を規則配列した集積体は小型光導波路などの新規光物性制御材料への応用が期待され、様々な3次元のコロイド結晶の作製が試みられている。2次元粒子膜の作製についても数多くの報告はあるが、それを利用したポーラス薄膜の作製についての報告は少ない。また、1次元粒子配列の報告はほとんどない。コロイド粒子集積体を用いて高度な光物性制御を行うには、面内方向の粒子配列の制御法を開発する必要がある。そこで本研究では、親水・疎水パターンの基板を利用して、ポリスチレン粒子の1次元配列の形成とその形成場所の制御について検討した。また、2次元粒子膜を鋳型として、金属および有機半導体化合物の2次元ポーラス薄膜の作製を試み、以下のことが明らかとなった。PS粒子の分散溶液を二枚のガラス基板に入れて乾燥させると、粒子ワイヤーが得られることがわかった。さらに、規則的な親水・疎水性パターンを持つ基板を用いると、粒子ワイヤーの生成を親水領域に限定することに成功し、粒子配線に基盤技術が確立できた。また、PS粒子の2次元膜に金を50nm蒸着し、トルエン中で超音波照射すると、一次元に配列した金の半球面体の蒸着膜が得られることおよびその生成機構を明らかとした。さらに、金の蒸着量を200nmに増すと、ポーラス構造とハニカム構造の薄膜が容易に得られることもわかった。この技術は、金以外の銀、アルミニウムあるいは有機半導体のペリレンなどの蒸着物質にも適用可能であった。現在、粒径が光の波長程度である粒子を配列させた2次元,3次元粒子膜の作製が盛んに行われており、フォトニック結晶への応用が期待されている。本研究では、SiO_2粒子の2次元粒子膜を作製し、光学特性に及ぼす粒径と金属蒸着の影響について検討した。アンモニア存在下でテトラエトキシシランの加水分解から粒径約200500nmの単分散性SiO_2粒子を作製した。SiO_2粒子の2次元粒子膜を作製はスピンコート法とLangmuir-Blodgett法で行ったところ、前者の最適条件は回転数350rpmであることが明らかとなった。一方、後者では未処理の粒子を水面上に展開したところ、粒子は沈降し、粒子膜は作製できなかったが、アリルメトキシシランで修飾した粒子は水面に展開させることができた。最適表面圧は15mN/mであった。粒子膜はいずれもわずかに発色しており、その発色はAgを蒸着すると強くなることがわかった。この発色が増大する効果は蒸着金属をPt-Pdに変えても同じであった。一方、色調は光の反射角度やシリカ粒子の粒径によって変化し、またガラス基板の表面と裏面とでは異なることもわかった。これらのことを詳しく検討するために粒子膜の反射スペクトルを測定した結果、ピーク位置は入射角度および粒径とともに長波長側に移動し、色調変化と一致することがわかった。以上のことから、金属蒸着による発色は、粒子膜の干渉による構造色であることが明らかとなった。さらに、SiO_2粒子膜上にAgをそれぞれ0、10、50nm真空蒸着して反射スペクトルを測定したところ、Agを10nm蒸着すると反射率が増大するが、そのピーク位置はほとんど変化しなかった。このことは、金属を蒸着すると発色は強くなるがその色調はほとんど変化しないこととよく一致した。また蒸着量を30nmと増すと反射率はさらに増加したことから、発色の強さを蒸着量によって制御できることがわかった。ナノサイズの粒子は次世代材料の素材として注目されているが、ナノ粒子を機能性材料に応用するためには粒子配列制御法の開発が重要となる。代表的な配列法としては自己組織法(ボトムアップ法)があり、溶媒の蒸発速度、温度や基盤の種類などを制御することによって作製されている。しかしながら、欠陥のない大面積(センチメータサイズ)の粒子配列を得る技術は確立していない。

さらに、様々な規則的な粒子配列パターンが得られているが、その制御法も確立されていない。そこで本年度は、乳化重合法(100250nm)および分散重合法(200600nm)によって合成したポリスチレン粒子および市販のPMMA粒子を用いて基板引き上げ法によってコロイド結晶を作製し、分散溶液の乾燥過程で発生するクラック量について詳しく検討した。クラック量に及ぼす粒子の分散濃度基板の引き上げ速度および温度の影響について検討したところ、クラック量が最少(ドメインサイズが最大)となる条件はPS粒子分散濃度2.6wt%、引き上げ速度80nm/sおよび60°Cであり、ドメインサイズは約百μmとなった。さらに、高分子の添加効果について調べたところ、ポリジアリルジメチルアンモニウムクロリド、ポリアクリルアミド-アクリル酸共重合体およびポリスチレンスルホネートナトリウム塩の添加によってクラック量はほとんど変化しなかったが、アガロースを添加するとクラックの発生が抑制されることを見いだした。さらに、疎水性と親水性化合物でパターン化したガラス基板にコロイド結晶分散溶液を挟み込む方法でコロイド粒子の配列を制御したところ、親水性部分にだけコロイド粒子配列が得られること、分散濃度を変えることによって2次元配列と1次元配列とを作り分けることに成功した。
配置問題, 積分幾何, 可積分系

代数多様体上の乗法関数の積分によって定義される関数は,いろいろな性質(ホロノミックな微分方程式,差分方程式)を持っている.しかし,次元についていかなるふるまいをするかは,一般には複雑で,よくわからない.もしも,積分が特殊な対称性を持てば,我々にとって身近な,興味ある問題となる.今年度の私の主な仕事は,「典型的な例であるセルバーグ積分の相関関数が,次元について差分系をみたす」事を示したものである.これは,統計物理にも応用されると思う.又,このqー類似についても研究し, qー差分方程式との関係を論じた.最後に,樹木上のスペクトル解析について,ひとつの定理を証明した.代数多様体上の乗法関数の積分によって定義される関数は,いろいろな性質(ホロノミックな微分方程式,差分方程式)を持っている.しかし,次元についていかなるふるまいをするかは,一般には複雑で,よくわからない.もしも,積分が特殊な対称性を持てば,我々にとって身近な,興味ある問題となる.今年度の私の主な仕事は,「典型的な例であるセルバーグ積分の相関関数が,次元について差分系をみたす」事を示したものである.これは,統計物理にも応用されると思う.又,このqー類似についても研究し, qー差分方程式との関係を論じた.最後に,樹木上のスペクトル解析について,ひとつの定理を証明した.
8q23領域にマップされた家族性てんかん原因遺伝子のクローニング

我々はヒトゲノムプロジェクトの一環として8番染色体q22-q24.1の30Mbの領域のシーケンシングと解析を行ってきた。本研究でポジショナルクローニングを目指しているBAFME1/FAMEは、8番染色体バンドq23領域にマップされており、我々が解析を進めてきた領域に完全に含まれている。我々はまずてんかん遺伝子領域中に存在する全遺伝子をリスト化するため、同領域に対して網羅的な遺伝子探索を行った。その結果、ゲノム上で1.2Mbのサイズを持ち、多数のCUBおよびsushiの繰り返しモチーフをもつタンパク質をコードする73エキソンからなる新規遺伝子、CSMD3を新たに発見した。このCSMD3を含めて、てんかん原因遺伝子の最も有力な候補領域であるD8S1703からD8S1694までの12Mbの領域上に存在する21遺伝子のべ293エキソンについて、ゲノムDNAかた各エキソンを増幅するPCRプライマーを設計し、同領域に連鎖の示された4家系に対して変異検索を行った。しかし特に疾患と関与が示唆される変異を見いだせなかった。そこで同じく疾患遺伝子の存在の可能性があるD8S1694-D8S1804までの領域に探索範囲を広げて、同領域にマップされた31遺伝子のべ284エキソンについて変異検索を行ったが、その結果でも特に疾患と関与が示唆される変異を見いだせていない。現在、てんかん領域に他の遺伝子が存在していないかを再度検討すると共に、高分解能のハプロタイプ解析を行い連鎖不平衡の有無を検討し、領域をより狭めることを試みている。
採血時間に依存しない高速性・安定性を備えた被ばく線量評価バイオマーカー

大規模放射線災害時には速やかに被ばく線量を推定する必要がある。本研究では,メタボロミクスによる新規被ばくバイオマーカーの検索を目的とした。ヒト末梢血モデルにおいては、末梢血に5 GyのX線を照射し、分離リンパ球をPHAで刺激培養した。また、マウス被ばくモデルでは、マウスにX線を照射し、7日後に採血した末梢血の分離リンパ球を分裂刺激剤で刺激培養した。培養上清および細胞抽出液を解析試料として高極性カラムおよび四重極・飛行時間型質量分析計により試料を分析後,主成分分析(PCA)を行った。解析により、被ばく線量評価マーカー候補となるメタボライトが複数検出された。被ばく線量評価法のコールドスタンダードである二動原体染色体(DIC)法や,血清中バイオマーカーでは解析に時間を要することや経時的変化が著しいなどの課題がある。本研究では,四重極・飛行時間型質量分析計(Q-TF/MS)を用いて,ヒト末梢血リンパ球ex vivo被ばくモデルにおけるメタボロミクスを行い,既存の評価法が抱える問題点を解決する線量評価バイオマーカーの探索を行った。インフォームドコンセントの得られたボランティア8名より採取した末梢血に5Gy(1.0Gy/min)のX線を照射し,分離リンパ球をPHA刺激下で培養した。培養0, 24, 48時間後に試料を回収し,高極性カラムを用いて四重極・飛行時間型質量分析計(Q-TOF/MS/MS)により培養上清および細胞抽出液中の代謝物を網羅的に分析し,さらにMarker View(AB SCIEX)による主成分分析(PCA)を行った。培養上清の測定では,positive modeにおいて培養時間の経時的変化およびX線照射群と非照射群においてグルーピングが可能であった。本解析により,被ばく線量評価マーカー候補として複数の代謝物が検出され,代謝物A(m/z 112.1; RT 5.1min),代謝物B(m/z 437.2; RT 1.0 min),代謝物C(m/z 415.2; RT 1.0 min)が24時間培養と48時間培養の双方で共通に認められた。1.試料調整. Ex vivoにて0,3,5GyのX線を照射したヒト末梢血リンパ球をPHA存在下で048時間刺激培養し、培養上清及び細胞内容物を回収する。細胞内容物の抽出法として、50%メタノール固定後、凍結融解を繰り返した。2.プレカーサーイオン及びプロダクトイオンの測定.UPLC-TOF-MS/MSシステムを用いて培養上清中および培養リンパ球内の代謝物を網羅的に測定した。今回の候補物質は高極性化合物であることから、疎水性カラムへの吸着が弱く、一般的な疎水逆相カラムを用いた解析は困難であった。一方、高極性分子の保持が良好であるHILICカラムでは、イオンの分離が良好で、細胞内容物を対象としたポジティブモードで多数の代謝物が検出された。3.変量解析.解析ソフトウェア"MarkerView"を用いてメタボロミクスのプロファイリングを行い、照射線量間の変化を解析した。細胞内容物の解析の結果、被ばく群、非被ばく群の分離は可能であったが、照射線量および培養時間依存性のグルーピングは困難であった。この原因の一つとして、解析時の定量性があげられる。各測定時(繰り返し測定を含む)のイオン強度が安定しておらず、本解析に有用な内部標準物質が必要となることが示唆された。4.マーカー候補の選択と最適培養時間の決定.照射線量依存性が認められた代謝物の選択が困難であったため、内部標準を加えた解析を再度行い、本小課題を達成する予定である。5.被ばく線量依存性代謝物の同定.今回席で候補となった代謝物のプレカーサーマス及びフラグメント解析から推定される化合物を検索した結果、目的とする代謝系の物質は見つからず、再検討が必要となった。被ばく線量評価法のゴールドスタンダードである二動原体染色体(DIC)法や,血清中バイオマーカーでは,培養・解析に時間を要することや経時的変化が著しいなどの課題があり,大規模な放射線被ばく事故を想定した場合対応が困難となることが考えられる。本研究では,急性被ばくモデルマウスの末梢血リンパ球におけるメタボロミクスを行い,既存の評価法が抱える問題点を解決する新規バイオマーカーの探索を行った。C57BL/6Jマウスに,0.75Gyおよび1.5GyのX線(1.0Gy/min)を照射し,7日後に採血した末梢血の分離リンパ球をconcanavalin Aおよびphytohaemagglutinin刺激下で24時間培養した。

培養後に細胞浮遊液を回収し,高速液体クロマトグラフィおよび四重極・飛行時間型質量分析計(Q-TOF/MS/MS)により培養上清および細胞抽出液中の代謝物を網羅的に分析し,さらにMarker View(AB SCIEX)による主成分分析(PCA)を行った。培養上清および細胞抽出液中の測定の双方で,positive modeおよびnegative modeにおいて非照射群,0.75Gy照射群,1.5Gy照射群のグルーピングが可能であった。本解析により,被ばく線量評価マーカー候補となるメタボライトが複数検出された。分子細胞遺伝学BEH HILICカラムを用いた測定・解析のうち,細胞抽出液において0時間培養対24時間培養および0時間培養対48時間培養のscores plotにおいて培養時間およびX線照射の有無によるグルーピングが可能であり,loadings plotからはグルーピングに寄与する複数のメタボライトが確認できた。したがって,細胞抽出液についてはnegative modeによる測定および解析が有用である可能性がある。一方で,培養上清ではpositive modeにおいて培養時間(0, 24, 48 h)およびX線照射群および非照射群との間でグルーピングが確認できた。さらに,0時間培養対24時間培養および0時間培養対48時間培養のscores plotでも培養時間およびX線照射の有無により,グルーピングおよびそれに寄与する複数のメタボライトが確認できた。また,今回の解析で分子式まで推定できたメタボライトのほとんどが溶出時間初期のものであった。また,培養上清中の候補物質は陽イオン化しやすいこと,並びに低極性物質またはBEH HILICと低親和性の物質である可能性が示唆された。既知のバイオマーカーとして知られている核酸代謝物やDNA修復に関する分子などの多くは高極性物質であり,今回の培養上清の結果とは異なるものとなった。本研究を遂行するにあたり,問題点がいくつか浮かび上がった。一つは再現性の確保である。この問題については昨年度の研究から指摘されており,今回も一度の解析で1サンプルにつき3回測定を行ったが,測定回数ごとの検出感度が安定せず,再現性に不安が残った。これは連続測定によるQ-TOF/MSの感度低下が一番の原因であると考えられた。そこで,本研究では内部標準物質としてChlorpropamideを細胞抽出液および培養上清に添加し,得られたm/zとRetention timeのデータから標準化を行ってPCAによる解析を行ったが,標準化による感度の安定化は見られず,scores plotではむしろグルーピングが悪くなる場合もあった。細胞培養上清を対象としたメタボロミクスでは、得られるイオン数が少なく、また濃縮した場合には含有する塩の影響が危惧されることから十分な解析が困難であった。また、細胞内容物については、イオン強度が測定間で大きく異なることから、内部標準物質が必要となることが明らかとなった。ヒト末梢血リンパ球ex vivo被ばくモデルを用いたメタボローム解析において、X線照射の有無により,グルーピングおよびそれに寄与する複数のメタボライトが確認できたがX線照射後の急性応答を解析している可能性が非常に高い。被ばく後数日間経過した末梢血を採取することが望ましいが、ヒト材料を用いたモデルでは困難となる。放射線治療後の患者さんより血液を提供していただくことも可能であるが、放射線治療の多くは部分照射であるため、被ばくリンパ球と非被ばく
造血幹細胞から巨核球への分化に関わる蛋白質群の3次元構造と機能

血液中に存在する種々の血球は骨髄の造血幹細胞から分化する。その中でも血小板の前駆細胞である巨核球への分化、成熟の分子機構は、最もわかっていない研究領域である。本年度は、特に未分化な造血系組織に特異的に産生され、シグナル伝達系によく見られるリン酸化可能な配列を多くもち、巨核球への分化、細胞分裂(染色体の凝縮)に重要な役割を果たしていると推定されるヒトDRF-1(分子量約12万)に集中して結晶化を行い、X線構造解析法で3次元構造を決定し、DRF-1の機能解明を目指した。本年度の研究状況は以下の通りである。(1)ヒトDRF-1の大腸菌からの大量調製系の確立に成功していたので、本年度も引き続き、その確立した方法で数mgの蛋白質を高純度に精製し、結晶化条件の検討を行っている。特に本年度はタンパク溶液に微量に含まれる低分子化合物の除去を徹底して行い、結晶化条件の探索を行っているが、現在のところ結晶は得られていない(山縣)。(2)全長蛋白質の結晶化をあくまで追求しつつ、同時に大腸菌内在性のプロテアーゼによる精製蛋白質の分解を調べたところ、N末から主に2万と9万の蛋白質が比較的安定に得られることがわかった。そのうち2万のドメイン蛋白質を純度よく精製できたので、これについても結晶化を行っているが、現在のところ良好な結晶は得られていない(山縣)。(3)大腸菌から精製したヒトDRF-1は、可溶化剤による可溶化、巻き戻しのステップを通っているので、天然の三次元構造をもつはずの動物細胞からのDRF-1を精製、大腸菌からのものと比較することを目的にどの細胞でDRF-1が高発現かを調べCOS7細胞中の発現が多いことが判っていたのでCOS7細胞を培養し、DRF-1の精製を試みている(山縣、土井)。種々の血球は骨髄の造血幹細胞から分化する。その中で血小板の前駆細胞である巨核球への分化、成熟の分子機構は、最もわかっていない研究領域である。本研究は、研究分担者土井らにより発見された巨核球への分化の過程で産生される一連の蛋白質群の結晶化、X線結晶構造解析を行い、蛋白質の3次元構造から、巨核球への分化に関わる蛋白質一蛋白質相互作用機構の解明に貢献することを目的としている。本年度は、(1)昨年度、特に未分化な造血系組織に特異的に産生され、シグナル伝達系によく見られるリン酸化可能な配列を多くもち、巨核球への分化、細胞分裂(染色体の凝縮)に重要な役割を果たしていると推定されるヒトDRF-1の大腸菌からの大量調製系の確立に成功したので、引き続き、その確立した方法で数mgの蛋白質を高純度に精製し、結晶化条件の検討を行った。現在のところまだX線構造解析に適した結晶は得られていない(山縣)。なお、精製したhDRF-1の2次構造をCDスペクトルで調べたところ、ヘリックス、シート構造をもっていること、すなわち、ちゃんと高次構造をとっていることが示された。(2)全長蛋白質の結晶化をあくまで追求しつつ、同時に精製した蛋白質をトリプシン等で処理し、質量分析、アミノ酸分析を用いてドメイン構造を決めるため、トリプシン処理の条件検討中である(山縣、土井)。(3)大腸菌から精製したヒトDRF-1は、可溶化剤による可溶化、巻き戻しのステップを通っているので、天然の三次元構造をもつはずの動物細胞からのDRF-1を精製、大腸菌からのものと比較することを目的にどの細胞でDRF-1が高発現かを調べたところCOS7細胞中の発現が多いことが判った(土井、池水)。

(3)大腸菌から精製したヒトDRF-1は、可溶化剤による可溶化、巻き戻しのステップを通っているので、天然の三次元構造をもつはずの動物細胞からのDRF-1を精製、大腸菌からのものと比較することを目的にどの細胞でDRF-1が高発現かを調べCOS7細胞中の発現が多いことが判っていたのでCOS7細胞を培養し、DRF-1の精製を試みている(山縣、土井)。
末梢血幹細胞移植を応用した新しい虚血部血管新生療法の開発

近年、内皮前駆細胞が成人においても存在することが確認され、さらにこれらの細胞は成人における血管新生に参加することが示された。我々はこれらの細胞を虚血組織に移植することで、血管新生が有意に増強されることを報告した。実際にこの治療を臨床に応用する場合、自己の内皮前駆細胞を使用することが理想的であるが、細胞の採取(骨髄)には侵襲を伴い問題が残る。内皮前駆細胞と血球系幹細胞は起源を一つにすることから、本研究では血球系幹細胞を動員するコロニー刺激因子(rhG-CSF)が内皮前駆細胞の動員を介して血管新生を増強できないか否かを、動物実験において検討した。1)rhG-CSF(5μg/kg BW/d)背部皮下投与後、ラット末梢血白血球数は有意に増加させ、中止後は再び正常値に復帰した。従って、ラットにおいてfunctionalであった。末梢血単核球培養法において、細胞クラスター(コロニー)は十分に形成されたが、内皮前駆細胞様-細胞の発芽はむしろ抑制された。2)ラット背部皮下にrhG-CSF(5μg/kg BW/d)を7日間連続投与した群(rhG-CSF群)においては、血管新生の程度にコントロール群と有意な差は出なかった。rhG-CSFによる末梢血への幹細胞動員においては、共通の幹細胞から顆粒球系への分化が主に進み、内皮前駆細胞の分化や動員はむしろ抑制されるのではないかと思われた。rhG-CSFにより末梢血への内皮前駆細胞の動員が刺激されなくとも、虚血下肢における血管新生には影響が無かったことより、少なくともこのモデルに関しては流血中の内皮前駆細胞の血管新生における関与は比較的少ないのではないか。我々はさらに、細胞移植前の細胞虚血負荷が血管新生増強効果を有するか否かについて検討を加えた。この結果、内皮前駆細胞を移植前に虚血環境で培養したものは、しなかった細胞に比べて、血管新生効果が有意に大であった。我々はこれらの細胞を分離培養し虚血組織に移植することで、血管新生が有意に増強されることを報告した。実際にこの治療概念を臨床に応用する場合、自己の内皮前駆細胞を使用することが理想的であるが、細胞の採取(特に自己骨髄)には侵襲を伴い依然かなりの問題が残る。内皮前駆細胞と血球系幹細胞は起源を一つにすることから、本研究では血球系幹細胞を動員するコロニー刺激因子(rhG-CSF)が内皮前駆細胞の動員を介して血管新生を増強できないか否かを、まず動物実験において検討した。【結果】1) rhG-CSF(5μg/kgBW/d)背部皮下投与は、ラット末梢血白血球数を有意に増加させ、中止後は再び正常値に復帰した。2)ラット背部皮下にrhG-CSF(5μg/kgBW/d)を7日間連続投与した群(rhG-CSF群)においては、血管新生の程度にコントロール群と有意な差は出なかった。【考察】rhG-

CSFによる末梢血への幹細胞動員においては、共通の幹細胞から顆粒球系への分化が主に進み、内皮前駆細胞の分化や動員はむしろ抑制されるのではないか。rhG-CSFにより末梢血への内皮前駆細胞の動員が抑制されても、虚血下肢における血管新生に影響が無かったことより、(少なくともこのモデルに関しては)流血中の内皮前駆細胞の血管新生における関与は比較的少ないのではないか。近年、内皮前駆細胞が成人においても存在することが確認され、さらにこれらの細胞は成人における血管新生に参加することが示された。我々はこれらの細胞を虚血組織に移植することで、血管新生が有意に増強されることを報告した。実際にこの治療を臨床に応用する場合、自己の内皮前駆細胞を使用することが理想的であるが、細胞の採取(骨髄)には侵襲を伴い問題が残る。内皮前駆細胞と血球系幹細胞は起源を一つにすることから、本研究では血球系幹細胞を動員するコロニー刺激因子(rhG-CSF)が内皮前駆細胞の動員を介して血管新生を増強できないか否かを、動物実験において検討した。1)rhG-CSF(5μ9/kg BW/d)背部皮下投与後、ラット末梢血白血球数は有意に増加させ、中止後は再び正常値に復帰した。従って、ラットにおいてfunctionalであった。末梢血単核球培養法において、細胞クラスター(コロニー)は十分に形成されたが、内皮前駆細胞様-細胞の発芽はむしろ抑制された。2)ラット背部皮下にrhG-CSF(5μg/kg BW/d)を7日間連続投与した群(rhG-CSF群)においては、血管新生の程度にコントロール群と有意な差は出なかった。rhG-CSFによる末梢血への幹細胞動員においては、共通の幹細胞から顆粒球系への分化が主に進み、内皮前駆細胞の分化や動員はむしろ抑制されるのではないかと思われた。rhG-CSFにより末梢血への内皮前駆細胞の動員が刺激されなくとも、虚血下肢における血管新生には影響が無かったことより、少なくともこのモデルに関しては流血中の内皮前駆細胞の血管新生における関与は比較的少ないのではないか。我々はさらに、細胞移植前の細胞虚血負荷が血管新生増強効果を有するか否かについて検討を加えた。この結果、内皮前駆細胞を移植前に虚血環境で培養したものは、しなかった細胞に比べて、血管新生効果が有意に大であった。
脂肪組織リモデリングを標的としたＴＲＰチャネルが担う新規疼痛制御機構の解明

本研究の目的は、TRPV1による脂肪細胞および免疫細胞の機能調節が神経障害性疼痛を緩和する可能性およびその分子機構を明らかにすることである。神経障害性疼痛モデルマウスの解析により、神経障害部位における免疫細胞の集積及び脂肪細胞の肥大化が生じること、ならびに免疫細胞のTRPV1活性化は疼痛抑制につながることを明らかにした。培養細胞を用いた実験から、免疫細胞と脂肪細胞の相互作用による炎症応答を免疫細胞のTRPV1活性化は抑制することを明らかにした。本研究の成果は、免疫細胞のTRPV1が神経障害性疼痛制御分子としての可能性を示唆する。TRPチャネル活性調節が疼痛に及ぼす影響とその機序について、神経障害性疼痛の病態基盤となる細胞間クロストークの観点から、その機序の解明を目的とする。個体を用いる実験に加えて、脂肪細胞と免疫細胞の共培養によるTRPチャネル活性化以降の下流シグナルの解析も行った。1)TRPファミリー発現変化の検索と機能解析坐骨神経部分結紮による疼痛モデルについて、TRPファミリー分子mRNA発現を解析した。その結果TRPV1の発現上昇がみとめられた。TRPV1のノックアウトマウスを使用して、TRPV1分子の疼痛形成における機能的重要性を検討した結果、触アロディニアについては、野生型との間で差はみられなかった。免疫組織化学的染色を行い、免疫細胞ならびに脂肪細胞を中心にTRPV1発現分布を調べた。その結果、疼痛の形成および制御において重要なマクロファージおよび脂肪細胞におけるTRPV1の発現が明らかになった。本結果を基に、TRPV1アゴニストであるカプサイシンを投与して、疼痛に対する影響を検討した。その結果、触アロディニアの減弱効果が認められた。2)細胞間クロストーク制御機構の解析前年度に同定したクロストークを担うメディエータの発現変化に及ぼす、TRPV1アゴニストであるカプサイシンの影響について検討した。継代細胞であるJ774A(マクロファージ細胞株)および3T3-L1(脂肪細胞株)の共培養によるメディエーター分子(TNF-α、MCP-1)のmRNA発現レベルの増加がみとめられた。これに及ぼすカプサイシン適用の影響を検討した結果、発現上昇の抑制がみとめられた。これにより、TRPV1刺激はマクロファージと脂肪細胞の細胞間クロストークを制御することにより、疼痛を減弱する分子機構が示唆される。末梢神経損傷モデルを用いて、常在する脂肪細胞と損傷により集積する免疫細胞の相互作用が疼痛形成に重要であることを提唱してきた。本年度の目的は、『炎症性メディエーターのパラクラインにより、脂肪細胞と免疫細胞との間の細胞間クロストークを生じ、次いで脂肪組織のリモデリングにより、疼痛が遷延する』可能性を検証することである。具体的には、坐骨神経部分結紮(PSL)による神経障害性疼痛モデルを用いて、坐骨神経組織における免疫細胞と脂肪細胞のRT-PCRによるmRNA発現解析を行った。その結果、PSL後3から4週目において、脂肪細胞の成熟型への分化ならびに肥大化のマーカー分子の発現増加がみとめられた。坐骨神経組織全載標本のBODIPY染色により、神経上膜に分布する脂肪細胞の肥大化がみとめられた。一方、免疫細胞について検討したところ、炎症型マクロファージ(M1)のマーカー分子ならびに、選択的活性化型マクロファージ(M2)のマーカー分子の発現増加がともにみとめられた。免疫組織学的染色によりM1型マクロファージとM2型マクロファージの細胞数の増加がみとめられた。これら脂肪細胞とマクロファージの表現型の変化は、触アロディニアおよび熱痛覚過敏の発生と時間的に一致していることから、本研究結果は免疫細胞と脂肪細胞のクロストークが疼痛形成に関与する可能性を示唆する。免疫細胞に発現するTRP分子をTRPリガンドが標的にすることを明らかにするために、骨髄移植手技を用いて、TRPリガンドの鎮痛効果を評価した。TRPノックアウトマウス(TRP-KO)から野生型マウス(WT)へ骨髄移植を行い、骨髄キメラマウスを作製した。具体的には、TRP-KOから採取した骨髄をWTに投与し、WTの造血系幹細胞をTRP-KOのそれに置換した。これにより、WTの免疫細胞はTRP-KOのそれに置換された(TRP-KO→WT)。TRP-KO→WTマウスと、対照群としてWTからWTへ骨髄移植したマウス(WT→WT)について疼痛モデルを作製し、TRPリガンドの鎮痛効果を評価した。WT→WTマウスでは、坐骨神経部分結紮(PSL)により触アロディニアを生じた。WT→WTマウスにおけるPSL誘発触アロディニアは、カプサイシンの組織周囲への投与により減弱した。すなわち、カプサイシンは触アロディニアに対して鎮痛効果を示した。

TRP-KO→WTマウスのPSL誘発触アロディニアは、カプサイシンの投与により部分的に抑制された。WT由来の骨髄をTRP-KOに移植したマウス(WT→TRP-KO)では、WT→WTマウスと同程度の触アロディニアが生じた。WT→TRP-KOマウスにおけるPSL誘発触アロディニアは、カプサイシンの投与により部分的に減弱した。以上の結果より、鎮痛効果におけるカプサイシンの標的細胞は、少なくともTRPを発現する免疫細胞である可能性が示唆される。さらに、WT→TRP-KOマウスのPSL誘発触アロディニアが、カプサイシン投与により部分的に減弱したことは、TRP-KOで消失した鎮痛効果の部分的な回復を意味するものであり、標的細胞の一つがTRP発現免疫細胞であることを決定づけるものである。疼痛学本年度は、疼痛制御に関わるTRPチャネルファミリーを同定すること、それを介する細胞間クロストークを明らかにすることが目標であった。研究の結果、目標に到達することが概ねできた。本年度は脂肪組織リモデリングの分子機構を解析する予定であったが、遺伝子発現解析に止まり、阻害実験による機能解析にまでは至らなかった。しかし、当初よりも広範囲で網羅的なmRNA発現解析の結果を得たことは、今後の機能解析実験の遂行において、機能阻害の標的分子の決定を容易にすることが期待される。本年度の培養実験の結果を踏まえ、個体レベルでTRPV1発現細胞の機能的役割を検証する。TRPチャネルを治療標的とする薬物の神経障害性疼痛に対する効果を検討し、本年度明らかにした脂肪細胞とマクロファージの表現型に及ぼす影響を明らかにする予定である。当初よりも実験の遅れを若干生じており、そのため動物使用数が予定数を下回ったことが原因である。本年度の未達の計画と次年度計画を合わせた行動実験を行うために、次年度使用予定数に本年度未達の実験計画で使用数を加えた分を用いて、次年度修正計画とし、その費用に次年度使用額を充てる予定である。脂肪組織リモデリングの分子機構解明において、遺伝子発現解析遂行中に当初よりもより広い範囲の解析を行ったため、時間を要し、機能解析実験に至ることができなかった。そのため、機能解析実験における培養実験消耗品等の購入に至らなかった。当該解析については、次年度行う予定である。
骨カルシウム代謝を調節する転写調節因子の役割の解明

近年、日本は急速な高齢化社会への移行により脳血管障害とカルシウム代謝異常に起因する成人病の増加が社会問題となっている。現在、我が国の高齢者人口は全人口の15%にも達し、紀元2000年には4人に1人が高齢者になると推定している。そこで、生体のカルシウムの取り込みを制御するビタミンDの代謝調節機構ならびにカルシウムの恒常性維持に重要な役割を果たしている骨の骨塩動員の機序に関する解析を行った。その結果、腎臓において活性型ビタミンDの合成を司る25-ヒドロキシビタミンD-1a-水酸化酵素の発現は、持続的な低カルシウムあるいはビタミンDが不足している状態では、腎臓は副甲状腺ホルモン(PTH)がサイクリックAMPをセカンドメッセンジャーにして25-ヒドロキシビタミンD-1α-水酸化酵素遺伝子の転写が促進される子が明らかになった。一方、骨組織からの骨塩動員を司る破骨細胞の形成は、通常骨芽細胞あるいは骨髄間質細胞が産生する破骨細胞分化因子(ODF)ならびに同細胞が産生する破骨細胞形成抑制因子(OCIF)のバランスによって制御されていることが明らかになった。更に、炎症性骨疾患の場合にはマウス骨髄細胞をM-CSFの存在下で培養して調整したマクロファージ様細胞用いた実験系から、炎症性サイトカインとして知られるTNF-αとインターロイキンー1(IL-1)がODF/OCIFのシステムを介さない系で破骨細胞の分化と機能を調節していることから、血清カルシウムの恒常維持と炎症性骨吸収における破骨細胞形成は異なる機序により調節されていることが明らかになった。近年、日本は急速な高齢化社会への移行により、脳血管障害とカルシウム代謝異常に起因する成人病の増加が社会問題となっている。現在、我が国の高齢者人口は全人口の15%にも達し、紀元2000年には4人に1人が高齢者になると推定されている。我々は過去30年間、カルシウム代謝ならびに骨代謝の調節機序の解明を主要テーマとして研究を行ってきた。近年骨代謝研究はin vitroでの評価系が確立され、分子生物学の飛躍的進歩と相俟って骨芽細胞と破骨細胞の分化と機能発現のメカニズムの解明が分子レベルで可能となった。そこで平成10年度、生体のカルシウムの取り込みを制御するビタミンDの代謝調節機構について研究を行った。腎臓において活性型ビタミンDの合成を司る25-ヒドロキシビタミンD-1α-水酸化酵素の発現調節は、主としてビタミンD欠乏のニワトリあるいはラットを用いて調べられてきた。しかし、本酵素により合成させる1α,25-ジヒドロキシビタミンDはステロイドホルモンの一種であることから、血中濃度は一定に維持されている。そこで、我々がクローニングした25-ヒドロキシビタミンD-1α-水酸化酵素のcDNAを用いて、正常のカルシウム状態にある生体がどの様な機序で1α,25-ジヒドロキシビタミンDの恒常性を維持しているか明らかにする目的で本研究を行った。その結果、持続的な低カルシウムあるいはビタミンDが不足している状態では、腎臓は副甲状腺ホルモン(PTH)がサイクリックAMPをセカンドメッセンジャーにして25-ヒドロキシビタミンD-1α-水酸化酵素遺伝子の転写を促進していること、一方、正常のカルシウム状態にある腎臓はPTHではなくカルシトニン(CT)により1α-水酸化酵素遺伝子の転写が促進されることが明らかになった。そこで、平成11年度は骨量の維持を司る骨芽細胞と破骨細胞の機能、特に破骨細胞の形成系に関する遺伝子の発現制御に関して研究を行った。

近年、破骨細胞の形成は骨芽細胞あるいは骨髄間質細胞が産生する破骨細胞分化因子(ODF)ならびに同細胞が産生する破骨細胞形成抑制因子(OCIF)のバランスによって制御されていること明らかにした。そこで本年度、炎症性骨吸収の発症機序に関して研究を行った。その結果、炎症性サイトカインとして知られるTNF-αとインターロイキン-1(lL-1)がODF/OCIFのシステムを介さない系で破骨細胞の分化と機能を調節していることが明らかになった。即ち、マウス骨髄細胞をM-CSFの存在下で培養するとマクロファージ様細胞が出現してくるが、本細胞を更にODFとM-CSFの共存下で培養するとマクロファージ様細胞は酒石酸抵抗性酸ホスファターゼ陽性の破骨細胞へと分化する。このODFとM-CSFによる破骨細胞の形成はOCIFの添加により完全に抑制されることから、ODF依存性の破骨細胞形成と考えられた。一方、マウスTNF-aをマクロファージ様細胞に添加した場合にも破骨細胞の形成が見られ、TNFのI型およびII型受容体に対する抗体の添加によって著しく阻害された。
超臨界域における炭化水素系自然作動流体のPpTx性質の精密測定

昨年度に実施したイソブタンに関する精密な飽和蒸気圧力測定結果を論文として投稿したのち、広い温度、圧力、および変位におけるベローズ容器の内容積検定を含めた体系的な校正実験を昨年5月に完了した。続いて、温度範囲280K440K、圧力範囲200MPaまでの広い範囲において、イソブタンに関する精密測定を実施し、PpT性質実測値計164点、飽和蒸気圧力実測値計7点、および飽和液体密度実測値計7点を得た。なお、本研究で採用した金属ベローズ変容法の利点から、PpT牲質については熱力学状態曲面上の任意の温度および圧力における格子状の測定結果が得られており、熱力学関係式を介して等温圧縮率や比熱差などの誘導状態量に関しても、実測値ベースの数値情報を得ることができた。さらに、複数の測定者による既報のPpT性質実測値群との同一温度および圧力における密度測定を実施し、本実測値と文献値との良好な整合性を確認した。加えて、これまで実測値情報の一切存在しない35MPa以上の圧力範囲においては、イソブタンに関する既存の熱力学モデルによる計算結果と本実測値との明確な系統密度偏差を確認し、熱力学モデルの改良の必要性を示唆することができた。なお、得られたイソブタンに関する一連の研究成果は、国内外における学会にて口頭発表し、さらに最終的な研究成果はJournal of Chemical Thermodynamics誌に論文として現在投稿中である。一方、昨年9月下旬より今日まで、プロパンに関する精密測定を実施中であり、測定が終了し次第論文として投稿する予定である。さらに、プロパン/イソブタン系混合冷媒、およびノルマルブタンについても、順次測定を精力的に実施するとともに、本研究で得られた新しい実測値を入力値として、炭化水素系冷媒および混合冷媒に関する世界最高精度の熱力学モデルの開発を目指した研究も併せて実施する計画である。本研究では各種要素部品の完成を受け、広い温度ならびに圧力範囲におけるPρTx性質の精密測定が可能な装置の本格的な製作・組み立て作業を昨年3月より開始した。6月には、本研究の目的とこれまで得られた知見をアメリカ熱物性シンポジウムにおいて発表した。恒温槽ならびに配管などの大まかな部分を作成した後は、装置の耐圧試験(200MPa)および耐熱試験(440K)を含めた一連の性能試験やデータ解析プログラムなどの整備を行い、さらに広い温度ならびに圧力範囲における計80点の差圧検定データに加え、高純度の純水を用いた精密な内容積検定結果に基づいて、信頼性の高い差圧および内容積の校正式を準備した。一連の製作・検定作業が昨年11月に終了した後に、飽和蒸気圧力の精密測定を開始した。飽和蒸気圧力実測値には、試料内の不純物に加え、計測・制御等の問題に起因する影響が顕著に現れる。そのため本研究では、昨年12月から今年1月にかけて、温度範囲310K407Kにおけるイソブタンの飽和蒸気圧力測定を精力的に実施し、計204点の実測値を得ることができた。特に、同一温度における計測値は各温度において±0.2kPa以内のばらつきで良好に一致しており、本測定装置の高い再現性が明らかとなった。これに加え、本実測値が既往の熱力学モデルおよび他の測定者による信頼性の高い実測値情報と良好に一致することを確認した。本実測値については、アメリカのJournal of Chemical Thermodynamics誌に論文を投稿すべく準備中である。また現時点において、ベローズ内容積の変化の温度ならびに圧力依存についてのより詳細な検定試験を実施中であり、一連の検定結果から内容積検定式をリニューアルし次第、イソブタンのPρT性質を測定し、その後直ちに、プロパンおよびプロパン/イソブタン系混合流体に関する測定に移る予定である。

さらに、プロパン/イソブタン系混合冷媒、およびノルマルブタンについても、順次測定を精力的に実施するとともに、本研究で得られた新しい実測値を入力値として、炭化水素系冷媒および混合冷媒に関する世界最高精度の熱力学モデルの開発を目指した研究も併せて実施する計画である。