hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
活性酸素をシグナルとして利用した蛋白質の構造と機能に関する研究

ある種の窒素固定菌におけるヘムの生合成は、その前駆体であるポルフィリンの合成酵素の発現を抑制する転写因子Irr(Iron response regulator)によって制御されている。Irrは十分量の鉄が供給された時、ヘムと酸素を利用して自らを酸化修飾することで分解し、ポルフィリン合成の阻害が解消される。このような酸化修飾が端緒となって分解する特異な機構は、Irrがヘムと結合した酸素が活性酸素種に変換し、それが酸化修飾に利用されると推定されている。昨年度は、Irrが過酸化水素を産生し、それがIrrの酸化修飾に重要な活性酸素種であることを示した。しかし、過酸化水素はアミノ酸を直接酸化できないため、Irrには過酸化水素をさらに活性化する機構が存在すると考えられた。今年度は、Irrにおける過酸化水素の活性化機構について調べた。過酸化水素の再活性化はIrrと相同性の高い過酸化水素センサー蛋白質PerRでも観測される。PerRの場合、蛋白質中に含まれる非ヘム鉄イオンが過酸化水素と反応し、生成する高い反応性をもつ活性種ヒドロキシラジカルが鉄イオンのリガンドであるヒスチジンを酸化する。この酸化により、鉄イオンが蛋白質部分から解離し、蛋白質構造が不安定化することで転写機能が失われる。Irrについても元素分析から、非ヘム鉄が含まれることが示され、また、質量分析からPerRの場合と同様、Irrにおいて非ヘム鉄の配位子の一つと考えられるヒスチジンのHis63が酸化されることが分かった。このことから、IrrにおいてもPerR同様、過酸化水素は内在性の非ヘム鉄によって活性化され、非ヘム鉄近傍のアミノ酸残基が酸化修飾されることで、その蛋白質構造の不安定化が引き起こされ、最終的には蛋白質分解につながると考えられた。窒素固定細菌Bradyrhizobiumjaponicum由来のIron response regulator(Irr)は、鉄濃度に応じてポルフィリン合成酵素の転写を調節する。鉄濃度が低い時は、Irrはヘム合成酵素の転写を抑制し、鉄濃度が正常な時、Irrはヘムとの結合後、自らを酸化修飾して不活性化し、ヘム合成酵素の転写が促進される。しかし、Irrがヘムを利用して不活性な酸素をどのような酸化活性種に変換するのか、さらに、Irrにおけるどの残基を酸化することで不活性化するのかは不明であった。本研究ではまず、酸化活性種の特定のため、ヘムと結合したIrrを酸化活性種に対する除去剤存在下で酸化修飾反応を行い、酸化修飾残基を認識する抗体を用いてIrrの酸化修飾を検出した。その結果、過酸化水素の除去剤カタラーゼの添加時、Irrの酸化が抑制された。この結果は、過酸化水素がIrrの酸化に関与することを示している。しかし、過酸化水素はアミノ酸を酸化するほどの反応性を有していない。そこで、過酸化水素はIrrにより反応性の高い活性種に変換されると考えられた。エCP発光分光分析により、Irrが鉄イオンを含むタンパク質であることが分かったことから、Irrは、産生された過酸化水素を鉄イオンと反応させて活性種ヒドロキシルラジカルに変換し、ヒドロキシルラジカルを用いて自らを酸化し不活性化すると考えられる。さらに質量分析により、鉄結合残基であるHisが部位特異的に酸化されることが分かった。このHisの酸化により鉄イオンに対するアフィニティが低くなり、構造が不安定化して不活性化するものと考えられる。以上、本研究によりIrrのヘムを利用した酸化修飾・不活性化機構を明らかにした。
個々の固体表面吸着種の同定

本研究の結果、走査型トンネル顕微鏡発光分光により、個々の固体表面吸着種の同定が可能になった。走査型トンネル顕微鏡は原子位置分解能で固体表面上にあるナノ構造を画像化するための優れた手法であることはよく認識されている。固体表面上に吸着した個々の原子や分子が走査型トンネル顕微鏡により画像化されるが、この画像だけからこれらの原子や分子を同定することはできない。個々の吸着種を同定するための手法が表面科学やナノテクノロジーの種々の分野で強く求められている。走査型トンネル顕微鏡の探針先端から放出されるトンネル電子ビームにより発光を励起することができる(走査型トンネル顕微鏡発光)。この電子ビームはその断面積が原子サイズ程度まで収束されているので、対応するサイズの領域を選択的に励起することができる。従って、探針を吸着種上に固定すると走査型トンネル顕微鏡発光はその吸着種の物性を反映するようになる。このプロジェクトの目的は走査型トンネル顕微鏡発光スペクトルの解析から画像化された個々の吸着種が同定できることを実証することにあった。この目的のために、Cu(110)、Ni(110)、Ag(110)上の酸素原子、Ni(110)上の水素原子、Cu(110)、Pt(110)、Ni(110)上の一酸化炭素分子、グラファイト上のローダミン6G分子からの走査型トンネル顕微鏡発光スペクトルを計測した。その結果、これらの吸着種の発光スペクトルは対応する基板のスペクトルと異なっていることを見いだした。この結果は走査型トンネル顕微鏡発光分光による個々の吸着種の同定が可能になることを明確に示す。STMでイメージされる固体表面の個々の吸着種の同定をそこからのSTM発光スペクトルを解析することにより行うことが本研究の目的である。この目的を達成するために以下の2点を実施する。(1)既存のSTM発光分光装置に探針位置固定機構を導入し、高い位置分解能を維持したまま長時間の露光計測を可能にする。この結果、吸着種からの微弱な発光の計測が原子レベルの位置分解能で可能になる。(2)種々の基板-吸着種(原子・分子)の組み合わせに対してSTM発光スペクトル計測し、吸着種のどのような物性がSTM発光スペクトルに反映されるかを明らかにする。(1)に関しては、STMコントローラー等を購入し、探針固定機構をSTMシステムに組み込んだ。現在、最終調整を行っている。(2)に関しては、Ni(110)上に吸着した水素原子(Ni(110)-H)とHOPG上に吸着したローダミン6G分子(HOPG-R6G)からの発光を計測した。Ni(110)-Hに関しては、水素の振動エネルギーがSTM発光スペクトルの解析から決定できることがわかった。すなわち、STM発光により個々の吸着種の振動分光が可能になることがわかった。HOPG-R6Gに関しては、孤立したR6G分子のトンネル電子励起発光スペクトルの計測に成功した。計測されたスペクトルがフォトルミネッセンス・スペクトルとよい一致を示したことから、非弾性トンネル過程によりR6GのHOMO準位にある電子がLUMO準位に励起され、それがHOMO準位に遷移する際に発光していることが結論される。本研究の目的は、走査型トンネル顕微鏡(STM)の発光による個々の固体表面吸着原子・分子種の同定法の開発にある。過去の研究から予め吸着物性のわかっている原子もしくは分子種を固体表面に吸着する。STMの通常の走査で、個々の吸着種をイメージし、その上に探針を固定して原子位置分解能でSTM発光スペクトルを計測する。既知の吸着物性と計測された発光スペクトルを比較することにより、発光スペクトルに反映される吸着種の物性を明らかにする。このような知見を多くの吸着種に対して蓄積することにより、STM発光スペクトル計測から吸着種を同定することが可能になる。平成16年度は主に吸着分子種からのSTM発光を研究した。

Cu(110)、Ni(110)、Pt(110)の各基板に吸着したCO分子の発光スペクトルは、基板が異なっても、統一した特徴を有することがわかった。すなわち、スペクトル中の微細構造のエネルギー間隔は、これらの基板に吸着したCO分子の伸縮振動エネルギーと一致した。現在、伸縮振動エネルギーが発光スペクトルの微細構造として現れる物理的機構を解明するための調査・研究を行っている。高配向熱グラファイト(HOPG)上に吸着したErythrosin B分子(発光性色素の種)からのSTM発光を観測した。STM像からErythrosin B単一分子であると判断される構造からのSTM発光スペクトルは、従来報告されている会合体を形成していない分子(溶媒中に均一に希釈された分子)のフォトルミネッセンス・スペクトルと一致した。STM像で2個以上の分子が会合した構造(会合体)からのスペクトルは、単一分子からの発光スペクトルに対してレッドシフトを示した。解析はこれからであるが、吸着分子が単独で吸着しているか、会合体として吸着しているかをイメージとして識別できるのはSTMだけである。STM発光が単一分子分光のための極めて有効な手段であることがわかった。本研究の目的は、吸着種の直上に探針を固定したときに観測される走査型トンネル顕微鏡(STM)発光スペクトルから吸着種の同定を可能にすることであった。そのために、いろいろな吸着種(酸素原子、水素原子、一酸化炭素分子、ローダミン分子等)について、吸着種の特性(電子状態、振動エネルギー等)がSTM発光スペクトル中にどのように反映されるかを研究してきた。平成15年度には吸着種の振動エネルギーが発光スペクトル中に反映されることを発見した。各吸着種は特有の振動エネルギーを有するので、吸着種の振動エネルギー計測(振動分光)は、吸着種同定のためによく用いられている。STM発光で個々の吸着種の振動分光が可能になることを発見したことは、本研究プロジェクトでの最大の成果である。今年度は、トンネル電子により試料-探針間隙に励起される局在プラズモン強度が大きく異なるタングステンと銀の探針を用いて同じ試料系に対してSTM発光実験を行った。その結果、(1)トンネル電子に加えて局在プラズモンも吸着種の振動を励起すること、(2)どちらで励起されるかにより、発光スペクトルへの振動エネルギーの反映のされ方が異なること、を見いだした。この知見に基づき、平成15年度に計測した一酸化炭素の発光スペクトル中の微細構造を解釈することができた。また、銀探針を用いて孤立エリスロシン分子のSTM発光分光を行った。タングステン探針の場合よりも10倍程度発光強度が増倍されることと、STMの誘電関数理論により発光スペクトル形状に対する探針材質の誘電応答的な影響を除去できること、を見いだした。
開心術の体外循環に伴う肺障害のメカニズムの解明及び予防に関する研究

開心術患者において、(1)胸骨正中切開直後および(2)体外循環中、大動脈遮断解除後完全対外循環から部分対外循環に移行後5分の2点で肺胞洗浄を行った。肺胞洗浄液から回収したマクロファージおよび血液中の単核球はフローサイトメトリーを用いて細胞表面抗原の解析を行った。血清および肺胞洗浄液中のTNFα、IL-6,IL-8、可溶性ICAM-1とE-セレクチンを測定した。末梢血および肺胞マクロファージ培養上清中のTNFα、IL-6、IL-8を測定した。肺胞洗浄液の細胞分画は体外循環前はマクロファージが92±4%、大動脈遮断後はマクロファージが94±2%と大部分を占めた。モノクロナール抗体を用いたマクロファージの表面抗原のフローサイトメトリーによる解析では、体外循環前と大動脈遮断解除後の平均蛍光強度の比は、抹梢血マクロファージではCD11a、CD11b、CD11c、CD18は明らかな変化を認めなかったが、肺胞マクロファージではCD11a、CD11b、CD11c、CD18の4抗原が大動脈解除後高値を示した。体外循環前と大動脈遮断解除後の血清および肺胞洗浄液中のTNFα、IL-6、IL-8は有意の変化を示さなかった。血清および肺胞洗浄液中の可溶性ICAM-1とE-セレクチンは体外循環前と大動脈遮断解除後で有意の変化を示さなかった。末梢血および肺胞マクロファージ培養上清中のTNFα、IL-6、IL-8の測定では、末梢血マクロファージ培養上清中のサイトカインは体外循環前と大動脈遮断解除後で有意の変化を認めなかったが、肺胞マクロファージ培養上清中のTNFα、IL-8の有意の上昇が認められた。以上より、体外循環により肺胞マクロファージの接着分子の発現が増強し、接着分子を介した細胞間の接着とそれに引き続くサイトカインの放出が体外循環後の肺障害のメカニズムの一つであることが示唆された。
大電力パルススパッタにおけるパルスオフ期間のターゲット電位を用いた薄膜構造制御

大電力パルススパッタリング(HPPMS)において、プラズマ電位を制御することで、イオン化されたスパッタ粒子の接地基板に対する入射エネルギーを変化させ、堆積する薄膜の構造を緻密化・平坦化する手法を開発した。申請時には、これをターゲットに印加する電圧波形によって実施する計画であったが、第三電極を追加してプラズマに接触させることで、この効果をより効率的に実現することが可能となった。水冷基板に堆積させたCu膜において、非常に平坦な薄膜構造が実現された。また堆積粒子の垂直入射とエネルギー制御とが要求されるMo微小電子源の作製において、本手法の有効性を確認できた。本研究の目的は、大電力パルススパッタ(High Power Pulsed Magnetron Sputtering: HPPMS)で実現されるスパッタ原子の高いイオン化率に、プラズマ電位の制御を組み合わせることで、低温の接地基板に堆積される薄膜の構造を制御することである。本研究の申請時には、プラズマ電位の制御をアフターグロー期のターゲット電位を通して行うことを目指していたが、昨年度にプラズマに接触する新たな電極を追加して、ここに正の電位を加えることで、より有効なプラズマ電位制御が可能となることを見出し、薄膜構造制御についてもより効果的な結果が得られた。平成24年度に得られた成果はISSP2013, IVC19の2つの国際会議で発表し(後者は口頭発表)、2014年2月にはJpn. J. Appl. Phys.誌に投稿論文が掲載された。平成24年度の手法は、既存のスパッタガンのアノードキャップの上に煙突様の電極を追加するかたちであったが、(1)プラズマ観察の視野を妨げる、(2)スパッタ粒子の輸送の障害となる、などの欠点があった。これを鑑み、今年度はアノードキャップを接地電位から絶縁し、任意の電位を印加できるようなスパッタガンを特注で作製し、実験を行った。昨年度の手法と同様に、アノードキャップ電極への+20V程度の電位印加によって、HPPMS膜は顕著な平坦化を示した。またプローブ測定によっても、期待されたプラズマ電位の上昇を確認した。また、HPPMSを含むスパッタプロセスにおいて、成膜速度や膜厚均一性を制御するための鍵となるスパッタ粒子の輸送過程について、実験・理論の両面から評価を行った。スパッタ粒子が雰囲気のガスと衝突・散乱しながら輸送される過程を考察したもので、各1報の論文を出版した。本申請研究の目的は、大電力パルススパッタ(High Power Pulsed Magnetron Sputtering: HPPMS)とプラズマ電位の制御を組み合わせることで、堆積される薄膜の構造を制御する手法を確立することである。具体的には、HPPMSで得られる高密度プラズマによってスパッタ粒子のイオン化を促進し、プラズマー基板間の電位差によってエネルギーを付与して基板に入射させ、膜構造を緻密化する。研究申請の段階では、パルスoff期のターゲット電位を正に制御し、アフターグロープラズマがこの電位を遮蔽しようとして自らの電位を高める効果を利用する計画であった。パルスon時に生成した堆積粒子イオンが基板に輸送されるタイミングと、電位の高いアフターグローに切り替えるタイミングとを同期させることを、主要な実験目的としていた。しかし本年度初頭に、プラズマ電極を制御するための電極を装置に追加すれば、パルスon期にもプラズマ電位の制御が可能で、上述のようなHPPMSの特性をより効果的に引出すことが可能であろうとの着想に至った。具体的には、ターゲット(カソード)およびアノードキャップからなる2インチのスパッタガンの上部に、高さ15mmの円筒型電極を追加した。この電極に、接地電位に対して+040V程度の電位を加え、ターゲットカソードのoff期電位は通常の0Vで放電させた。この方針で成膜実験とプラズマ計測とを優先して行い、実際にプラズマon期にもプラズマ電位の上昇がプローブ測定によって確認できた。また従来のパルスoff期ターゲット電位によって膜構造の変化を得るには+100V程度の電位が必要だったのに対し、新たな方法では追加電極電位+2040Vほど(ほぼプラズマ電位に等しい)で顕著な膜構造の変化を観察できた。本申請研究は、イオン化スパッタの一手法である大電力パルススパッタ(HPPMS)において、プラズマ電位を制御して接地基板との間に電位差を設け、堆積粒子のエネルギーを通して薄膜の構造を変化させることを目的とした。当初はHPPMSの放電間欠期間のターゲット電位を正の値とし、アフターグロー期間のプラズマ電位上昇を試みていたが、プラズマに接する第三の電極を装置に追加し、大電力パルスのon/off両方を通してプラズマ電位を上昇させるという着想に至った。追加電極へ正の電位を印加すると、実際にプラズマ電位が上昇することがプローブ測定によって確認でき、また堆積したCu膜が平坦化・緻密化することが観察できた。最終年度には、本手法をSpindt型微小電子源のエミッタ作製に援用する研究を行った。

産業技術総合研究所ナノエレクトロニクス研究部門との共同研究で、二層のフォトレジストで作製したキャビティ構造に、上部に開けたホールを通して膜を堆積させ、穴の閉塞を利用して錐状構造を形成させる手法である。実際に我々の三極型HPPMSによってMoの堆積を行い、錐状構造の形成を確認した。高融点金属であるMoは電子放出源として有利だが、真空蒸着では強い引っ張り性の応力を示すため、フォトレジストのキャビティを壊してしまう問題があった。三極型HPPMSによるプラズマ電位制御は、錐状陰極の形成に要求される法線方向に揃った粒子束を実現しただけでなく、入射エネルギーによって引っ張り応力を緩和する効果があったものと考えている。また、平坦な基板上に作製したMo膜を、前年度までのCu膜と比較したところ、平坦化・緻密化への一定の効果は見られたが、Cuの場合ほど顕著でなかった。これはAndersによる構造ゾーンモデルと対応付けることによって説明でき、本手法の有効範囲について議論できた。薄膜工学HPPMSとプラズマ電位の制御によって、接地された、かつ水冷された基板上に、緻密な構造を持つ金属膜を堆積する手法を確立できた。すなわち、高密度プラズマによって得られるスパッタ原子の高イオン化率というHPPMSの特徴に、プラズマの空間電位を上げて接地基板との間に電位差を設ける手法を組みあわせることで、金属イオンを高い運動エネルギーで基板に入射させることが可能となり、これによって膜の構造を緻密化することができた。追加電極をプラズマに接触させることで、HPPMSの高密度プラズマが生成されているパルスonの期間にもプラズマ電位を上昇させることが可能となり、イオン化した原子の利用効率が高まった。このため、プラズマ電位が20V程度でも十分な平坦化効果を得ることができ、基板以外の周囲部品へ与えるダメージも軽減できることがわかった。さらに今年度は、スパッタガンのアノードキャップを電極として接地電位から絶縁し、この部分の電位を制御することによっても、同様に放電空間のプラズマ電位を制御することが可能となった。イオンの基板への入射エネルギーを高めるには、基板電位を負にする手法が従来から用いられてきたが、接地基板への入射エネルギー制御を可能とする我々の手法は、装置設計の自由度を上げ、HPPMSの実装置への導入を容易にするものと考える。申請時にはターゲットに印加する電圧波形を制御し、アフターグロー期のプラズマ電位を高める手法を目指していたが、電極追加によってon期のプラズマ電位を上げる手法は、本質的に当初のアイデアよりも優れたものであると考える。ただしパルス電位による効果は、スパッタ粒子の輸送過程に関連して理学的な興味の対象ではあるので、最終年度に引き続き研究の対象としたい。実績の概要で述べたような研究方針の変更によって、HPPMSとプラズマ電位の制御によって緻密な膜を得る手法を確立する、という研究の大きな目的については、まずひとつの手段を実現できたものと考えている。「プラズマは自らに接する電極のうち、もっとも高い電位のものに自らの電位を上昇させる」という、本研究が立脚する仮説についての検証にも進展があった。
和漢の辞書・類書の書誌的研究

本研究では、中近世期の東アジアに広く行われた辞書および類書につき、その社会的影響の基盤となった出版情況を明らかにすべく、和書班と漢籍班の二班に分かれて、関連する文献の書誌調査と研究を行った。和書班は、関場・川上新一郎(前半2年のみ・斯道文庫・教授)・佐々木の3名、漢籍班は高橋・住吉の2名によって組織した。関場は、『節用集』類の総合的伝本研究を行い、慶應義塾図書館主催の「辞書の世界-江戸・明治期版本を中心に」展を企画・立案し、解題図録を作成した他、特に「早引節用」類の書誌調査を行い論文を執筆した。川上は、版行された近世期歌枕書類の調査研究を行い、辞書的構造を持つ歌枕書とその他の文献との関係を整理し、解題書目「近世版行歌枕書一覧(稿)」を作成した。佐々木は、類書的な性格を有する『新類題和歌集』と『歌合部類』を取り上げ、伝本研究を行って、歌書をめぐる商業出版と社会的需要の関係を考察し、論文を執筆した。高橋は、中国明清時代に於ける音韻学書の書誌的調査を行い、特に慶應義塾大学言語文化研究所所蔵永島文庫と台湾師範大学所蔵趙蔭棠旧蔵書を集中的に調査し、各々の書目や解題を作成した。住吉は、中国元代成立の類書『韻府群玉』の東アジアに於ける普及を主題として研究を進め、東アジアとアメリカでの総合的な伝本研究を行い、その改編・版刻の経過を追跡し、その成果を書目や論文などの形で発表した。以上の成果の一部は、平成13・14年度の単独の研究成果報告書、及び平成15・16年度調整班(B)出版物の研究の成果報告書に発表している。本研究では、従来から蓄積されてきた文字情報による書誌解題に加え、画像情報を付随したデータ蒐集と整理方法の開発に重点を置き、先ず本研究の主題である辞書・類書関係の書誌情報の更なる蓄積のため、各自関係諸機関への原本調査を行って、調査ノート並に複写物等の画像情報の蒐集を図った。加えて、調査に基づく諸本の整理及びアナログ画像情報のディジタル化を進め、論文・目録・データベース等による公開の準備を行った。和書班では、関場武が、『節用集』並に『大広益会玉篇』類の総合的伝本研究に向け、今年度は高性能コンピュータ、スキャナ等を購入して、慶応義塾大学図書館・同附属研究所斯道文庫所蔵関係諸本類の画像データ化を図り、既得の情報と合せて整理・研究を進捗させた。上述の研究成果を一般に普及するため、慶応義塾図書館主催の「辞書の世界」展を企画・立案し、解題図録を作成した。なお同企画には本研究の分担者全員が参与・協力した。また川上新一郎は、近世に数多く出版された実用的な歌枕書の中、『歌枕秋のね覚』『名所小鏡』『名所方角抄』の調査を行い、上記の他、通俗的歌書版本を調査した。佐々木孝浩は、類書的な性格を有する類題和歌集を取り上げ、出版には至らなかったものの組織的な書写活動により版本に準ずる特異な存在となった『新類題集』に注目し、本年度はその性格を確認するための調査を継続的に行った。漢籍班では、高橋智が、慶応義塾大学言語文化研究所所蔵永島文庫(中国音韻学資料)の目録解題作成並に画像付きデータベース化のプロジェクトについて、今年度は永島文庫中の『爾雅』等の古字書並に『洪武正韻』等の音韻学関係書の書誌調査を終了し、そのデータベースの入力を開始した。

これに関連して台湾師範大学の音韻学資料・趙蔭棠文庫についても同様の調査を始めた。また住吉朋彦は、宋元間成立韻書・類書版本類の伝本研究として『韻府群玉』諸本並に『古今韻会挙要』『新編事文類聚翰墨全書』類の書誌調査を行い、調査カード並に写真複製の蒐集に努め、『韻府群玉』に関して、増修本の『新増説文韻府群玉』の成立に関する事柄を版本学的に明らかにした。また慶応義塾図書館および斯道文庫所蔵類書類の総合的書誌調査を行い、その尤品を慶応義塾図書館主催の「辞書の世界」展に展示し、同解題図録を分担作成した。本研究では、中近世期の東アジアに広く行われた辞書および類書につき、その社会的影響の基盤となった出版情況に関する書誌調査並びに文献研究を行った。各員の研究項目と成果は以下の通り。1.和書班では(1)関場が、慶應義塾図書館蔵書を主に近世期の通俗辞書・百科事典類の調査を行い、特に「玉篇」「和玉篇」「節用集」類諸本の研究を行って、出版経過の詳細を明らかにした。平成13年度に、その中間段階の成果によって図書展示会「辞書の世界-江戸・明治期版本を中心に」展(慶應義塾図書館主催)を企画実行したが、本年度はその補足調査を行い完備を図った。(2)川上は、出版に附された近世期歌枕書類の調査研究を行い、辞書的構造を持つ歌枕書とその他の文献との関係を整理し、解題書目「近世版行歌枕書一覧(稿)」を編集した。(3)佐々木は、近世期の類題和歌集、特に『新類題和歌集』の調査研究を行って、歌学書をめぐる商業出版と社会的需要の関係を考察し、論文「写本と版本の間-『新類題和歌集』三十冊本をめぐって-」を執筆した。2.漢籍班では(1)高橋が、慶應義塾大学言語文化研究所所蔵・中国語言学関係蔵書・永島文庫の調査研究を行い、また蔵書研究の立場から関連する蔵書の調査を行って、蔵書解説・書目「慶応義塾大学言語文化研究所所蔵永島栄一郎氏旧蔵中国語言学(小学)資料について」および「中国の字書・韻書等についての版本研究-慶応義塾大学所蔵永島文庫・台湾師範大学所蔵趙蔭棠旧蔵書を中心とする版本調査報告(第一次所在報告)-」を執筆編集した。(2)住吉は、中国・朝鮮・日本で広く受容された類書『韻府群玉』諸本の改編・版刻の経過について調査研究を行い、論文「『韻府群玉』版本考(二)」「同(三)」および「韻府羣玉版刻書目長編」「王元貞校刻本新増説文韻府羣玉修刻書影」を執筆編集した。以上の研究は、個別の文献研究から蔵書研究に至るまで、対象文献群設定の多様化を図ったもので、文献研究の形式的可能性の拡大に努め、またディジタル情報処理機器を用いた書誌解題と画像の関連付けの上に製作された。これらの成果を踏まえ統合する立場から、関場が、辞書・類書の編集と出版の関係について考察し、論文「辞書と版本」を執筆した。関場は「節用集」の内の「早引節用」類の諸本研究を進め、高橋は趙蔭棠旧蔵語言学資料の継続調査、関連書のテキスト所在調査を行ない、佐々木孝浩は版本『歌合部類』の影響力を探るべく、同本所収の『歌合貞永元年八月十五夜』について、写本を含めた伝本調査を総合的に行ない、住吉は本邦室町期に流布した元代成立の韻書・類書・詩学書類を調査し版本研究を進捗させた。このうち住吉は、成果の一部として、『新増説文韻府群玉』の王元貞校本につき論文を執筆した。同書の初刻は元朝に遡るが、世上に流布する版本の過半は、明万暦年間以降に出版された王元貞の校本である。王元貞は明後期の南京の人、国子監に学びながら学者や官僚にならず、文雅と義行を以て官僚社会の周辺に位置を占めた者であるが、主要な足跡は万暦前期の版刻の事業にある。
象形文字ルウィ語の歴史言語学的研究

象形文字ルウィ語の歴史的考察として、カルケミシュで発見された碑文の言語分析から導入したinitial-a-finalとr転化の二つの通時的な指標マーカーの有効性をカルケミシュ以外のアムク、ビート・アディニ、サマルから発見された碑文言語から確証した。更に、象形文字ルウィ語碑文に散見される記念碑体と草書体の字体の碑文の作成年代別の比較考察からの両字体の混用が後代に作成された碑文ほど多いことや造字法上の工夫(頭音法、多音法や同音異字等)も指摘できた。象形文字ルウィ語の歴史言語学的研究を発展させるために、同言語資料の精密な碑文成立年代の把握を行ってきた。その基礎的なデータはD.J.Hawkinsの「Corpus of Hieroglyphic Luwian Inscriptions」(2000)に基づくが、同資料の文献学的な精密さに比べて、歴史言語学的考察に援用可能な正確な碑文言語の年代を決定する基準の指標が不明確であった。つまり、その年代決定の示唆的な言語的特徴を先行研究では、initial-a-finalとr-転化に絞って検証したが、今年度は同指標でのカルケミシュ碑文やテル・アフマルを主要な地域とする南東アナトリアの更に東部地域周辺の碑文に加えて、北方シリア地域の碑文(アレッポ碑文、カラブル碑文等)、更に南部のハマ碑文、アナトリア中央地域のキリキア地域のカラテペ碑文、マラシュ地域のマラシュ碑文にも適用したが、これを更に進展させて、より正確な碑文の成立年代の指標として、ヒッタイト象形文字の母音の音節文字表記におけるplene writing(盈記法)の可能性を考察した。つまり、-a-挿入表記(plene writing)のza-a-ziかza-zi(代名詞za-“これ"のpl.nom.com.)の表記上の相違と碑文の成立年代の関連性の検証を進めて、同表記には本来、語中の母音の長さの表出との関係も示唆されるなかで、同表記法の使用頻度が低いのが後期の碑文である蓋然性が非常に高いことをカルケミシュ碑文や上記の碑文等の比較文字学の観点から指摘している。同表記法による言語資料の年代区分の指標としての有用性は、印欧アナトリア語派の同系のヒッタイト語のヒッタイト楔形文字のplene writingと同様の様相(ex.古期文書のku-e-en-ziと後期文書のku-en-zi「彼らが殺す」等)からも推知される。象形文字ルウィ語碑文のカルケミシュ地域以外のアムク、ビート・アディニ、サマル地域から発見された碑文の通時的な言語特徴であるinitial-a-finalとr転化の出現傾向を分析した。同特徴は先行研究のカルケミシュ碑文言語の通時的研究から得た新旧の時代区分の指標となるマーカーであり、この特徴の出現傾向が各碑文言語の成立年代の解明、最終的な象形文字ルウィ語の歴史的研究の全容解明に重要なものと推知したことの検証を行い、結論としては、上記の地域からの碑文言語の両特徴の出現傾向は、カルケミシュ碑文言語から得た指標マーカーとしての信頼性を追認することができた。今後の展開としては、両言語的特徴の出現傾向によって、象形文字ルウィ語の歴史的考察の更なる進展を確証することができた。同様に、象形文字ルウィ語碑文に散見される字体である記念碑体と草書体の碑文成立年代別(上記の両通時的言語特徴による碑文年代の追認を含めて)の混用傾向の考察においても碑文の成立年代が後代になるにつれて記念碑体と草書体の混用傾向が多くなることが指摘できた。更にこの字体の混用傾向のみならず、字体が有する音価についても、音価付与の頭音法(acrophony)、1文字による多音字(polyphone)、[a]音価明示のための字体工夫([a]音価の二重線の象形文字からの転用)、[m]音明示のための4本線付与(「4」示す4本線の象形文字の転用)、現時点では明確な起源は不明のいくつもの同音異字体([sa][ta][za][tu][zi][ha][li]等の音価の文字)の存在もヒッタイト/ルウィ象形文字の通時的な形成過程の結果とみなされる。象形文字ルウィ語の歴史言語学的研究が発展しなかった理由は、同言語資料の成立年代が明白でなかったことが大きな理由であった。しかし、D.J.Hawkinsの「Corpus of Hieroglyphic Luwian Inscriptions」(2000)の公刊によって各象形文字ルウィ語碑文の成立年代が明確になったおかげで、同言語の通時的な考察が可能になった。

筆者は先行研究として、特に時代区分が同定できるカルケミシュ碑文の言語変遷をinitial-a-finalとr転化に限定して分析すると、同現象が通時的な変遷を同定する重要な言語指標であることを指摘した。つまり、initial-a-finalは古い時代に出現傾向が強く、後代の碑文ほど表出されない傾向がある。逆に、r転化は古い時代の碑文には生起せず、後代の碑文ほど生起傾向が強いことを指摘した。同指標が他の地域の象形文字ルウィ語碑文言語においても同様の表出傾向を指摘することが出来れば同指標の信頼性が実証されることになる。そこで、Sangara王もアッシリア資料から活発な外交政策を行ったと言われているカルケミシュ地域に近い周辺地域のビート・アディニ地域からの出土資料によって検証した。特に象形文字ルウィ語碑文資料としては、テル・アフマル碑文(Tell Ahmar)とアレッポ碑文(Aleppo)を分析した。その結果、これらの地域の碑文においても、カルケミシュの碑文の通時的な変遷傾向と同様の変遷傾向が指摘できた。D.J.Hawkinsの象形文字碑文の翻字翻訳の公刊で音節文字表記の年代別の異字も明らかになり、更に先行研究でinitial-a-finalとr-転化の特徴が年代決定に有用な指標であることも明らかになった。それに加えて、その補強的な指標としてのplene-writingの指標が有用であることが明らかになったことで、ほぼ成立年代が把握できるカルケミシュ碑文から他の碑文の成立年代とその言語的特徴の歴史言語学的な考察がより広範に且つ正確に考察対象となり、最終年度に向けてその成果が期待できる。先行研究による言語変遷の指標となるinitial-a-finalとr転化の言語特徴が、現時点では、カルケミシュと非常に近い地域であるビート・アディニ地域のテル・アフマル碑文とアレッポ碑文に限定されるが、他の地域の言語資料の通時的な言語指標となりえることが確認できた。そこで同考察によって、カルケミシュからさらに遠方の地域の碑文言語においても同言語特徴の通時的な指標になりえる蓋然性が高まったことが推知できる。この言語指標が全ての象形文字ルウィ語碑文で確証されるならば、同言語の歴史言語学研究の大きな成果となりえる。先行研究で、カルケミシュ碑文言語のinitial-a-finalとr-転化の特徴の通時的指標の有用性の確立、同碑文地域の前年度の研究での年代確定に加えて、plene writingの指標の有用性も付加することで、カラテペ碑文、マラティア碑文、アレッポ碑文等を含む象形文字ルウィ語碑文の包括的な歴史言語学的研究を進めて、同言語の通時的な観点からの言語変遷を明らかにする。先行研究の成果であるカルケミシュ碑文言語のinitial-a-finalとr転化の特徴が通時的な指標となりえること、さらに23年度の研究成果である両特徴がカルケミシュの近隣地域といえるビート・アディニのテル・アフマル碑文とアレッポ碑文においても確証されたことから、今後の展望として、より遠方の出土地の象形文字ルウィ語碑文の言語資料の中から上記の両特徴の抽出と分析によって、両特徴の通時的な指標の有効性と信頼度の検証をすることが象形文字ルウィ語の歴史言語学的な考察に必至と考えられる。該当なし。主要な研究データ分析は従来通り、J.D.Hawkinsによる「Corpus of Hieroglyphic Luwian Inscriptions」(2000)によるが、最近も同言語碑文はトルコの各地で発見されて出版されているので、同資料の収集と同碑文に関する研究文献、研究書の購入、及びなお整備されていない未収の言語資料と同言語の関連領域の比較言語学および古代アナトリアの諸言語、古代小アジアの歴史書の文献収集を行う。
赤痢菌と大腸菌が保有する細胞膨化致死毒素遺伝子の水平伝播に関わる遺伝学的解析

5種類ある大腸菌の細胞膨化致死毒素(Ec-cdtI-V)遺伝子と赤痢菌のSh-cdt遺伝子のうち、Ec-cdtI、Ec-cdtIVとSh-cdt遺伝子はラムダ様ファージ上に存在した。Ec-cdtV遺伝子はP2ファージとラムダ様ファージ遺伝子に挟まれていた。Ec-cdtIIIは、プラスミド上に存在したが、Ec-cdtIIの上流・下流には水平伝播に関わる遺伝子は見いだせなかった。大腸菌が産生する細胞膨化致死毒素(CDT)は、少なくとも5種類ある。また、赤痢菌もS.dysenteriae、S. flexneri、S. boydii、S. sonneiでcdt遺伝子を保有することが報告されている。この5種類のCDTを産生する下痢症患者由来あるいは家畜から単離した大腸菌及びcdt遺伝子が陽性の赤痢菌をマイトマイシンC存在下で培養し、プラークアッセイでファージが誘導されるかどうか調べた。その結果、家畜由来の大腸菌ではどの型のCDT産生菌でもプラークは形成されず、下痢症患者由来の大腸菌では、CDT-I産生菌以外ではプラーク形成は見られなかった。プラーク形成が見られたCDT-I産生性大腸菌の特徴は、eae遺伝子陽性で、腸管病原性大腸菌の血清型に属する大腸菌であった。^32Pで標識したcdt遺伝子プローブを用いたプラークハイブリダイゼーションにより、cdtIファージを同定し、大腸菌C600株に溶原化させた。一方、バングラデシュの下痢症患者から分離されたCDT産生性大腸菌でcdtIとcdtIVのキメラ遺伝子で構成されていることを見いだした。即ち、cdtA遺伝子はcdtI遺伝子と相同性が高く、cdtBとcdtC遺伝子は、cdtIV遺伝子と相同性が高がった。cdtA遺伝子の上流はCDT-Iファージと相同性が高く、cdtC遺伝子の下流は、cdtIV遺伝子の下流と相同性が高く、cdt遺伝子の上流・下流を含めcdtIファージとcdtIVファージの相同組み換えによって作製されたキメラ毒素である可能性を示した。以上の結果は、cdt遺伝子が過去においてファージやプラスミドを介して菌株間を移動していた可能性、また、相同組み換えによって新たなバリアントが出現してきている可能性を示した。また、赤痢菌もS.dysenteriae、S.flexneri、S.boydii、S.sonneiでcdt遺伝子を保有することが報告されている。本研究では、CDT-Iファージゲノムの多様性解析およびcdt遺伝子の上流・下流領域を解析し、これらcdt遺伝子の水平伝播機構を明らかにすることを目的とした。CDT-Iファージゲノムの多様性についてPCR-RFLPで解析した結果、8つに分けた領域全てでプロトタイプと同様の結果を示した株は、調べた35株の中で1株のみであり、もう1株は一部予想される断片より大きな断片が得られた。その他の株では、一部の領域でPCR産物が得られたものの17株では全く増幅断片が得られなかった。領域8が増幅された株はcdt遺伝子の下流、すなわちファージの挿入領域がprfC遺伝子であった。それ以外の株のファージの挿入部位はserU遺伝子であった。また、cdt-II, -III, -IVや-V遺伝子を保有する株では、調べた全ての株においてPCR産物が得られなかった。一方、cdt遺伝子の上流、下流の塩基配列をゲノムウオーキング法で解析した結果、上流域にはEHEC、UPEC、APECやShigella属菌で見つかっているファージ関連蛋白をコードした遺伝子が見いだされた。下流域においては、UPEC、APECやサルモネラ属菌で見いだされたファージ関連蛋白をコードした遺伝子が見いだされた。以上の結果より、CDT-Iはファージを介して大腸菌および赤痢菌の間に広がった可能性が高いが、ファージゲノムにはかなりの多様性があると考えられた。また、cdt遺伝子の上流、下流はUPEC、EHEC、APEC、Shigella菌およびサルモネラ属菌のファージ関連遺伝子と相同性が高いことから、cdt遺伝子はラムダ様ファージによって様々な菌種間に広がった可能性が考えられた
生体分子モーターが躍動する非平衡界面と細胞の破れた対称性の物理学

細胞内では,力生成を行うモータータンパク質と,力を空間的に伝える繊維状タンパク質から成る「アクトミオシン細胞骨格」が,細胞の運動や細胞核配置の対称性とその破れ,心筋細胞の拍動など生命維持に不可欠な機能を担っている.これら細胞機能をアクトミオシンの非平衡力学から理解するため,細胞小器官など他の要素による干渉を避け,理想化された系の構築が求められている.本研究では,アクトミオシンを細胞サイズのカプセルに封入した「人工細胞」に着目する.人工細胞内で自発的に形成されるアクトミオシン収縮波とアクトミオシン・ネットワークの動態を解析し,細胞内空間の対称性とその破れを力学的に検知するメカニズムを解明する.細胞内では,力生成を行うモータータンパク質と,力を空間的に伝える繊維状タンパク質から成る「アクトミオシン細胞骨格」が,細胞の運動や細胞核配置の対称性とその破れ,心筋細胞の拍動など生命維持に不可欠な機能を担っている.これら細胞機能をアクトミオシンの非平衡力学から理解するため,細胞小器官など他の要素による干渉を避け,理想化された系の構築が求められている.本研究では,アクトミオシンを細胞サイズのカプセルに封入した「人工細胞」に着目する.人工細胞内で自発的に形成されるアクトミオシン収縮波とアクトミオシン・ネットワークの動態を解析し,細胞内空間の対称性とその破れを力学的に検知するメカニズムを解明する.
発育の時系列解析で得られる健康情報とその伝達及び活用

平成6年度より8年度までの3年間の研究概要は以下の如くである。1.身長や体重のトレンドに現れる波動は、自己回帰過程であり、発育でも老化でも同じであった。2.有意な季節変動の例数は、沖縄では身長<体重であり、北海道では身長>体重である。沖縄から鹿児島市まで同じであるが、北九州に至って逆転する。3.95年兵庫県南部地震では、小学生の毎月の体重に、時系列解析でも、測定値及び前月との差のグラフでも、地震の影響が認められた。4.28組の双生児を毎週測定したところ、一卵性10組の身長では8組で二人の身長の発育曲線が重なり、体重もかなりよく重なった。身長では体重よりも遺伝的要因が強い。5.小学生は夏に体重が増加して肥満になるが、75年頃から、エアコンが普及し始めた時期と、肥満が問題にされ始めた時期がほぼ一致した。6.しのぎやすい夏の北海道でも、肥満の小学生は夏にも体重増加が見られた。7.身長の季節変動は月間の日照時間や平均気温と関係が高かった。8.乳幼児の身長・体重で時系列解析を行った。従来の発育曲線の当てはめでは得られない発育の個人情報が得られた。母乳栄養児は、身長・体重とも有意な季節変動は人工栄養児に比べて少なかった。9.若年者の視力低下の原因と考えられる咬合力を幼児で調べたところ、個人差が極めて大きかった。10.沖縄の長寿村の保育園の月次データは、間もなく時系列解析が行える。11.分析方法としての時系列解析の発育学への適用は、欧米の研究者が確立したものではなく、東郷が71年に開始した発育の長期・頻回測定の研究の方向の中で見出されたものである。時系列解析は時間がかかり、遠回りのように思えるが、発育の真の姿に接近できる。多少の困難は伴うが、各人が次第に時系列解析に移行していて、従来の方法では得られなかった成果を挙げつつある。今後も一歩でも完成の域に近づけるべく精進したい。今年度は3年の研究期間の初年度ではあるが、前年度から継続して研究を進めてきている。新たに札幌市の保育園のデータが入手できたので、これも加えてわが国の緯度別に季節変動をみると、秋田から札幌、旭川では季節変動は身長にはみられたが、体重は極めて稀簿である。この傾向の南限は未だ不明である。宮古、八重山を含む沖縄県や、奄美大島などの諸島を含む鹿児島県の発育データが入手できて、次年度には台湾から九州まで季節変動が詳細に解明できる。沖縄県の長寿村における発育はすでに毎月一回の測定が行われている。ここでは身長・体重以外にも体内脂肪の分布までを目標にした測定が二つの村立保育所で行われている。同県水納島小・中学校のデータも蓄積されてきつつある。埼玉県のある小学校では毎月身体計測を行ってきたが、ある児童が頭痛その他神経系の異常を訴えたので、身体計測値を添えて病院で受診したところ、脳腫瘍を疑われ、精密検査の結果脳腫瘍が発見された。発育データが、正確な診断を迅速に下すのに役立ったとのことであった。本年度の計画にも入っている朝晩2回の測定値をまとめた論文に対し、東京大学教育学部は博士号を授与することになった。

昨年6月にハンガリーで開かれた国際発育会議では、日本人の時系列解析による発育の研究が五題報告され、この手法による研究は日本のお家芸で、多くの参加者の関心を集めた。まだ具体的な成果を得ていない研究分担者も夫々精進しているので、3年の期間の切れる迄には、発育の基礎的な研究、発育データから健康情報を得る研究、養護教諭や保母など小児を直接預かる方々の役割についても、まとまった成果が得られるものと期待できる。我々は発育の進行を、時系列解析で評価してきた。しかし、現場では時系列解析を使わずに、簡単で、しかも必要な情報は十分得られる方法が求められている。前者は、デコンプによる時系列解析で、定説では否定されて来た波動が自己回帰(AR)過程であることが分かった。これにより、身体発育のメカニズムに接近する手段が与えられた。季節変動は、その地域の気象条件や、肥満の例では室内というミクロの気象によっても、さらに心理的な影響も受けていることが、いじめの例で認められた。体重発育は、各種の環境の影響を示す指標ともなる。これらの研究はごく初期の段階に過ぎない。後者は、現場で保母、養護教諭や育児中の母親をも含めて、発育に関心のある全ての人々が、毎月計った発育値を、グラフ用紙に記入するだけのことで、波動を示しながらも右上がりのカーブとなれば、発育は正常で、もしも不自然な、大幅な上がり下がりや、伸び悩みが、認められたら、専門家に相談すればよい。不幸にも、この簡単なことが、必ずしも実行されてこなかった。前者と後者の結果は、細部まで一致するとは限らないが、グラフを書くことで、実用上十分な情報が得られることも分かってきた。これにより、発育の測定値から、何時何処ででも役に立つ評価が可能となってきた。多数の組の双生児の月次観測による研究も進んできて、まもなく時系列解析が可能となる。系統的な乳児の研究や、各地での測定から、地域による季節変動が多彩なものであることも次第に明らかになってきた。沖縄の長寿村での小児の発育の観測も進行している。肥満の裏づけとなるインピーダンス法による体脂肪の測定も継続して行われている。今後は、現場での経験を集め、発育の理解を深めると共に、多くの現場でグラフを利用した発育の評価を実行に移してもらい、小児の心身の健康に貢献出来れば幸いである。平成8年度の研究は、平成6、7、8年度の3年間の連続した観測値に基づいて行われたものである。1.身長や体重のトレンドに現れる波動は、自己回帰過程であり、発育でも老化でも同じであった。2.有意な季節変動の例数は、沖縄では身長<体重であり、北海道では身長>体重である。沖縄から鹿児島市まで同じであるが、北九州に至って逆転する。3.95年兵庫県南部地震では、小学生の毎月の体重に、時系列解析でも、測定値及び前月との差のグラフでも、地震の影響が認められた。4.28組の双生児を毎週測定したところ、一卵性10組の身長では8組で二人の身長の発育曲線が重なり、体重もかなりよく重なった。身長では体重よりも遺伝的要因が強い。5.小学生は夏に体重が増加して肥満になるが、75年頃から、エアコンが普及し始めた時期と、肥満が問題にされ始めた時期がほぼ一致した。6.しのぎやすい夏の北海道でも、肥満の小学生は夏にも体重増加が見られた。7.身長の季節変動は月間の日照時間や平均気温と関係が高かった。8.乳幼児の身長・体重で時系列解析を行ったところ、従来の発育曲線の当てはめでは得られなかった発育の個人情報が得られた。母乳で育てられた子は、身長・体重とも有意な季節変動は人工栄養児に比べて少なかった。
長寿命蛍光プローブの論理設計による超高感度in vivo病態イメージングの実現

希土類金属イオンは長い蛍光寿命を有するため、時間分解蛍光測定法の活用によって夾雑物由来の自家蛍光を排除した測定が可能となる。それ故これらの金属を用いた蛍光性錯体は、蛍光標識剤としてスクリーニングの分野で広く応用されている。しかし上記のような手法では、リアルタイムでの反応の可視化や生細胞イメージングへの適用は不可能である。そこで私は、光誘起電子移動(PeT)という現象を活用することにより、所望の反応によって蛍光強度が変化する"長寿命蛍光プローブ"が論理的に開発できるのではないかと考え研究を行い、昨年度までにタンパク質分解酵素やpHを標的とした長寿命蛍光プローブの開発に成功した。これらのプローブは血液のような系においても機能する点では有用であったが、励起波長が紫外領域に限定されるため細胞系や動物への適用には不向きであった。そこで今年度は、より生体適合性の高い長波長領域での測定が可能な錯体を目指して研究を行った。長波長領域に蛍光を有する金属としてはNdやYbが知られているが、現在のところ水溶液中で十分な蛍光強度や安定性を持つこれらの錯体は存在しない。従って、まずは母核となる錯体の基本骨格を検討した。具体的には、励起波長や吸光係数等の点で優れた性質を有する蛍光団であるBODIPYに着目し、希土類金属イオンに対する強力な配位子であるDTPAと結合させた錯体を合成した。その結果、蛍光団と金属との距離が近い場合には金属由来の強い蛍光が観察された。続いて、蛍光団の近傍に電子供与能の高い芳香環を導入した錯体を合成し、PeTによる消光が見られるか否かを検討した。すると意外にも、BODIPY部分に由来する蛍光は消光しているにもかかわらず、金属由来の長寿命蛍光はむしろ増強される場合があることが判明した。このような現象はこれまでに報告が無く、光化学的にも大変興味深いものである。
神経細胞初代培養系におけるGABA_B受容体を介した転写調節の制御

マウス大脳および小脳より神経細胞初代培養系を調製し、てんかん欠神様発作症状を誘発させることが示されているγ-ヒデロキシ酪酸(GHB)の核内cyclic AMP responsiveelement(CRE)およびactivator protein 1(AP-1) DNA結合活性に及ぼす影響、および両DNA結合活性調節における細胞内Ca^<2+>の役割を検討した。また、各種転写調節因子の抗体を用い両DNA結合活性上昇に関与する転写調節因子を同定した。小脳顆粒細胞初代培養系において、核内CREおよびAP-1 DNA結合活性は、細胞を1mM GHBで60分間処理することにより上昇したが、これらの上昇は、GABA_B拮抗薬のCGP 35348およびCGP 55845で拮抗された。大脳初代培養系においてもGHBは、GABA_B受容体を介して両DNA結合活性を上昇させた。小脳顆粒細胞初代培養系において、細胞内Ca^<2+>キレート剤であるBAPTA-AMや小胞体のCa^<2+>-ATPase阻害薬であるthapsigarginの前処置によりGHBによる両DNA結合活性上昇は認められなくなった。さらに、カルモジュリンキナーゼIIの阻害薬であるKN-62やKN-93の前処置によっても両DNA結合活性上昇は抑制された。各種転写調節因子の抗体の影響を調べたところ、CRE結合活性は、CRE binding protein(CREB)抗体でスーパーシフトし、リン酸化CREB抗体により抑制された。一方、AP-1 DNA結合活性は、c-Fos、c-Jun抗体によりバンドが消失した。以上より、GHBは、GABA_B受容体を介し、細胞内貯蔵部位からCa^<2+>を遊離させること、および、このCa^<2+>動員が核内CREおよびAP-1 DNA結合活性上昇に重要な役割を演じていることが示唆された。また、GHBによるCRE結合活性の上昇には、リン酸化CREBが関与しており、そのリン酸化にはカルモジュリンキナーゼIIが関与していることが示唆された。てんかん欠神様発作症状を誘発させることが示されているγ-ヒドロキシ酪酸(GHB)による核内cyclic AMP responsiveelement(CRE)およびactivator protein 1(AP-1)DNA結合活性上昇における細胞内Ca^<2+>の役割を神経細胞初代培養系を用いて検討するとともに各種転写調節因子の抗体を用いてDNA結合活性上昇に関与する転写調節因子を同定した。マウス小脳顆粒細胞初代培養系において、核内CREおよびAP-1 DNA結合活性は、細胞を1mM GHBで60分間処置することにより上昇したが、両DNA結合活性の上昇は、GABA_BアンタゴニストであるCGP35348およびCGP55845により拮抗された。また、細胞内Ca^<2+>キレート剤であるBAPTA-AMまたは小胞体のCa^<2+>-ATPase阻害薬であるthapsigarginの前処置によりGHBによる両DNA結合活性上昇は認められなくなった。各種転写調節因子の抗体の影響を調べたところ、CRE結合活性は、CRE binding protein(CREB)抗体でスーパーシフトが認められた。また、リン酸化CREB抗体によりCRE結合は抑制された。

以上より、GHBは、GABA_B受容体を介し、細胞内貯蔵部位からCa^<2+>を遊離させること、また、このCa^<2+>動員が核内CREおよびAP-1 DNA結合活性上昇に重要な役割を演じていることが示唆された。また、GHBによるCRE結合活性の上昇には、リン酸化CREBが関与しており、そのリン酸化にはカルモジュリンキナーゼIIが関与していることが示唆された。てんかん欠神発作発現に重要な役割を演ずる脳部位の1つである大脳より神経細胞初代培養系を調製し、欠神様発作症状を誘発させることが示されているγ-ヒドロキシ酪酸(GHB)の核内cyclic AMP responsiveelement(CRE)およびactivator protein 1(AP-1)DNA結合活性に及ぼす影響について調べ、これまでマウス小脳顆粒細胞初代培養系で検討したGHBの両DNA結合活性に対する作用と比較した。マウス大脳神経細胞初代培養系において、核内CREおよびAP-1DNA結合活性は、細胞を1mMGHBまたは1μMバクロフェンで60分間処置することにより上昇した。^3H-バクロフェンを用いた受容体結合実験により、マウス大脳初代培養系にGABA_B受容体が存在すること、およびGHBは^3H-バクロフェン結合を阻害することを確認した。マウス小脳顆粒細胞初代培養系において、核内CREおよびAP-1DNA結合活性は、GHBの処置により上昇し、これら両DNA結合活性の上昇は、GABA_BアンタゴニストであるCGP35348およびCGP55845により拮抗されることを昨年度明らかにしたが、本年度の結果より、小脳顆粒細胞初代培養系のみならず、大脳初代培養系においても、GHBが、GABA_B受容体を介し、核内CREおよびAP-1DNA結合活性を上昇させることが示された。また、昨年度、小脳顆粒細胞初代細胞系において、GHBが、GABA_B受容体を介し、細胞内貯蔵部位からCa^<2+>を遊離させ、このCa^<2+>動員が核内CREおよびAP-1DNA結合活性上昇に重要な役割を演じていること示したが、今後、大脳初代培養系におけるGHBによるCREおよびAP-1DNA結合活性上昇機構の詳細についてCa^<2+>の関与を中心に検討する予定である。