hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
商特異点と導来圏

一般の三角圏に対して,Bridgelandは安定性条件のモジュライ空間と言う複素多様体を構成した.この複素多様体は,いろんな観点から重要な空間であると考えられている.特に,安定性条件のモジュライ空間には,三角圏の自己圏同値のなす群が,自然に作用する.本年度はA型特異点の極小特異点解消の上の,連接層の有界導来圏に対する安定性条件の空間について,上原北斗氏や植田一石氏とともに,研究した.本年度にわかったことは,これが連結な複素多様体である,ということである.これまでに,この場合の安定性条件のモジュライには,特別な連結成分があり,それがアフィンワイル群の複素鏡映面(の加算無限個の和集合)の補集合と,複素平面から原点を除いたものの直積の,正則被覆空間になることがわかっていた.今回わかった事は,連結成分がこれしかない,ということである.また,この導来圏の自己圏同値のなす群は,Seidel-Thomasによるツイスト函手と自明な函手(直線束,多様体の自己同型,シフト函手)により生成されることがわかっていた.この事実は,上記連結成分が自己圏同値によって他の連結成分に移らない,と言う事と同値であったから,連結成分が一つしか無い,というのは自己圏同値のなす群の生成系を決定した結果よりも強い結果である.あと重要な問題としては,安定性条件のモジュライ空間が単連結であろう(上記被覆空間が普遍被覆空間であろう),というBridgelandの予想がある.これは,ツイスト函手のなす群がアフィンブレイド群に同型であるか,という問題と同値である.本年度は,この問題に対しても若干の進展を見た.単純特異点の極小解消Xの例外集合Zに台を持つ連接層の導来圏D_Z(X)の自己同値に付いて調べた.導来圏の自己同値としては,直線束のテンソル,多様体の自己同型による引き戻し,シフトという「自明なもの」が存在する.非特異射影多様体については,その標準直線束K又はその双代が豊富であるとき,導来圏の自己同値はそれら自明なもので生成されることが知られている.Kが自明に近くなると,そのようなことは成り立たず,例えばspherical objectによるツイスト函手という非自明な自己同値が存在する.これはホモロジー的ミラー対称性の解釈においても重要なものである.曲面上のspherical objectになる層として考えられるのは,(-2)-曲線上の直線束又はK3曲面上のベクトル束である.我々が考察の対象にしたのは前者であり,次のような結果を得た:A_n型特異点の極小解消Xの場合には,D_Z(X)の自己同値の同値類のなす群は,ピカール群,自己同型,シフトおよび(-2)-曲線上の直線束によるツイスト函手により生成される.ツイスト函手のなす群Bとピカール群は共通部分を持ち,それらで生成される群はBとZ/(n+1)Zの半直積になる.それと自己同型群との半直積を取り,シフトのなすZとの直積を取ったものが求める群である.また,Bridgelandの定義した安定性条件のモデュライ空間をD_Z(X)の場合に考えると,Bridgelandの考えた連結成分は,自己同値群の作用により自分自身に移るということになる.安定性条件のモデュライ空間の具体的記述についても予想が出来るが,現在研究中である.2次元単純特異点の極小解消の上の,例外集合に台を持つ連接層の導来圏に関して,その自己同値の同型類のなす群および,安定性条件のモデュライ空間について研究した.安定性条件のモデュライ空間とは,弦理論に起源を持ち,Bridgelandにより一般の三角圏に対して定義された複素多様体で,代数多様体に付随して定まる重要な空間であると思われる.三角圏の自己同値の同型類のなす群は,このモデュライ空間に自然に作用する.2次元単純特異点の極小解消の上の例外集合に台を持つ連接層の導来圏の場合には,このモデュライ空間のある連結成分は,アフィンワイル群の複素鏡映面(の加算無限個の和集合)の補集合と,複素平面から原点を除いたものの直積の,正則被覆空間になることがわかった.また,アフィンワイル群の各複素鏡映面についてのモノドロミーは,導来圏における,(-2)-曲線上の直線束によるツイスト函手の引き起こすものであることがわかった.ここで,ツイスト函手とはSeidel-Thomasにより定義された函手であり,球状対象によるツイスト函手は,導来圏の自己同値になる.我々の状況では,各(-2)-曲線上の次数が4の直線束は球状であり,さらに基本サイクルの双対化層も付け加えると,拡大ディンキン図式の頂点に対応する球状対象が得られる.各球状対象によるツイスト函手は組紐群の関係式を満たすが,A型の場合には,導来圏の自己同値の対象ごとの同型類のなす群は,上記ツイスト函手と自明な函手(直線束,多様体の自己同型,シフト函手)により生成されることを示した.上記アフィン型の組紐群の作用が忠実かどうかは,安定性条件のモデュライ空間の連結成分が単連結かどうかということと同値となる.一般の三角圏に対して,Bridgelandは安定性条件のモジュライ空間と言う複素多様体を構成した.この複素多様体は,いろんな観点から重要な空間であると考えられている.

特に,安定性条件のモジュライ空間には,三角圏の自己圏同値のなす群が,自然に作用する.本年度はA型特異点の極小特異点解消の上の,連接層の有界導来圏に対する安定性条件の空間について,上原北斗氏や植田一石氏とともに,研究した.本年度にわかったことは,これが連結な複素多様体である,ということである.これまでに,この場合の安定性条件のモジュライには,特別な連結成分があり,それがアフィンワイル群の複素鏡映面(の加算無限個の和集合)の補集合と,複素平面から原点を除いたものの直積の,正則被覆空間になることがわかっていた.今回わかった事は,連結成分がこれしかない,ということである.また,この導来圏の自己圏同値のなす群は,Seidel-Thomasによるツイスト函手と自明な函手(直線束,多様体の自己同型,シフト函手)により生成されることがわかっていた.この事実は,上記連結成分が自己圏同値によって他の連結成分に移らない,と言う事と同値であったから,連結成分が一つしか無い,というのは自己圏同値のなす群の生成系を決定した結果よりも強い結果である.あと重要な問題としては,安定性条件のモジュライ空間が単連結であろう(上記被覆空間が普遍被覆空間であろう),というBridgelandの予想がある.これは,ツイスト函手のなす群がアフィンブレイド群に同型であるか,という問題と同値である.本年度は,この問題に対しても若干の進展を見た.
チタン表面に接着する骨芽細胞のナノインターフェイスの解析

現在のところ,オッセオインテグレーションをμmレベルで見ると,骨組織とインプラントが直接接触しているのではなく,その間にbiofluidが介在していることが分かっている.しかし,nmレベルの結合様式は全く解明されておらず,早期のオッセオインテグレーションを目指すためにはインプラント・骨界面における分子レベルの結合様式を明らかにしなければならない.そこで,チタンの表面性状が骨芽細胞の初期接着にどのような影響を与えるかについて,細胞接着関連分子などに焦点をあて分子生物学的に解明することを目的として,研究を計画した.削りだしチタン(Ti),チタンプラズマコーティング(TPS),ブラスト処理の表面性状を持つチタンディスクを用意し,それぞれのディスクに株化骨芽細胞(HOS)を播種し,接着細胞数の測定および細胞伸展形態の観察(走査型電子顕微鏡:SEM)を行った.さらに細胞接着関連分子の局在をレーザー共焦点顕微鏡を用いて検討したところ,以下の結果を得た.1.各試料における細胞接着率の比較においては,TPSにおいて最もよい結果が得られ(85%),Tiおよびブラスト処理では明らかに低い接着率(2628%)であった.2.SEMによる細胞形態観察では,TiおよびTPS上で緊密に接着している細胞が観察された.一方,ブラスト処理に対しては試料と細胞との間に空隙が存在するルーズな接着形態を呈しているのが見られた.3.さまざまな細胞接着関連分子をレーザー共焦点顕微鏡にて観察したところ,アクチンフィラメントを染色した場合,各試料間で明らかな違いが見られた.Tiにおいては細胞の長軸方向に沿って明瞭なアクチンフィラメントの走行が見られたのに対し,TPSおよびブラスト処理ではこのような走行は明瞭でなかった.以上より,チタンの表面性状が骨芽細胞の初期接着に影響を与える可能性が示唆された.現在のところ,オッセオインテグレーションをμmレベルで見ると,骨組織とインプラントが直接接触しているのではなく,その間にbiofluidが介在していることが分かっている.しかし,nmレベルの結合様式は全く解明されておらず,早期のオッセオインテグレーションを目指すためにはインプラント・骨界面における分子レベルの結合様式を明らかにしなければならない.そこで,チタンの表面性状が骨芽細胞の初期接着にどのような影響を与えるかについて,細胞接着関連分子などに焦点をあて分子生物学的に解明することを目的として,研究を計画した.削りだしチタン(Ti),チタンプラズマコーティング(TPS),ブラスト処理の表面性状を持つチタンディスクを用意し,それぞれのディスクに株化骨芽細胞(HOS)を播種し,接着細胞数の測定および細胞伸展形態の観察(走査型電子顕微鏡:SEM)を行った.さらに細胞接着関連分子の局在をレーザー共焦点顕微鏡を用いて検討したところ,以下の結果を得た.1.各試料における細胞接着率の比較においては,TPSにおいて最もよい結果が得られ(85%),Tiおよびブラスト処理では明らかに低い接着率(2628%)であった.2.SEMによる細胞形態観察では,TiおよびTPS上で緊密に接着している細胞が観察された.一方,ブラスト処理に対しては試料と細胞との間に空隙が存在するルーズな接着形態を呈しているのが見られた.3.さまざまな細胞接着関連分子をレーザー共焦点顕微鏡にて観察したところ,アクチンフィラメントを染色した場合,各試料間で明らかな違いが見られた.Tiにおいては細胞の長軸方向に沿って明瞭なアクチンフィラメントの走行が見られたのに対し,TPSおよびブラスト処理ではこのような走行は明瞭でなかった.以上より,チタンの表面性状が骨芽細胞の初期接着に影響を与える可能性が示唆された.
トロンボポエチン様血小板増加作用をもつ新規低分子化合物の開発

従来の免疫不全SCIDマウス、NOD/SCIDマウスにヒト造血幹細胞を移植しても、ヒト巨核球・血小板造血をマウス体内で構築することは不可能であった。唯一の方法として海外では、ヒト胎児骨を免疫不全マウスの皮下に移植し、その局所にヒト造血幹細胞を移植する方法が取られてきた。しかしながら胎児組織の利用は、我が国では倫理的な問題もあり、実際の利用はきわめて困難である。NOD/SCIDマウスでは、ナチュラルキラー細胞活性が高いことが欠点とされており、(財)実験動物中央研究所がNOD/SCIDマウスとinterleukin-2レセプターγ鎖ノックアウトマウスを掛け合わせ、新規にNOD/SCID/gamma null (NOG)マウスを作製した。放射線照射したNOGマウスにヒト臍帯血、骨髄血、末梢血由来の造血幹細胞を移植したところ、マウス骨髄内にヒトCD41陽性の成熟した巨核球、マウス末梢血中にヒト血小板を検出することを確認した。照射する放射線の総量、線量率、移植する細胞の種類、細胞数について、様々な検討を行った。マウスにヒト臍帯血由来造血幹細胞を移植後、経時的にヒト血小板キメラ率を測定したところ、移植後半年以降も継続してヒト血小板が検出されることを確認した。試験管内でヒトトロンボポエチンレセプターを刺激する化合物の評価をコロニーアッセイ法などで進めており、本研究で樹立したヒト巨核球・血小板造血モデルマウスは、候補化合物の血小板造血刺激能を評価するうえで、有用と考えられた。
速度知覚によるVORゲイン調節のメカニズム

頭部が突然左右に回転すると直ちに眼を頭と逆方向に回転させる反射性の眼球運動(前庭性動眼反射,VOR)が働き,空間に対する視線の向き(ゲイズ)は一定に保たれる.VORは頭部角速度を検出する内耳の半規管から外眼筋へと伝わる信号によって営まれ,きわめて高速な応答を実現している(潜時はおよそ10ms).頭部角速度信号から眼球速度信号に変換される際の利得(VORゲイン)は,一般に暗中(視覚のフィードバックが働かない状況)で頭部を回転させたときの頭部角速度に対する眼球速度の比から算出される.被験者の注意が静止物体に向けられているとき,VORゲインの値は0.91.0であることが報告されており,意図しない頭部の動揺が生じてもその動きの大部分はVORによって補償される.さて,視覚対象が運動している場合,我々は動物体と同じ方向に頭部を回転させて追跡(ゲイズパシュート)を行う.ゲイズパシュート中の眼球速度は前庭性信号(VOR系)と視覚性信号(スムーズパシュート系)から得られる眼球速度信号の線形加算により決定される.上述したようにVORは静止世界に対する視覚の安定化にはきわめて有効であるが,動物体追跡時にはむしろ目標追跡を妨げる向き(スムーズパシュートと逆向き)に作用することになる.本研究では,対象物の速度に応じてVORゲインを調節する神経機構を実験的に明らかにするため,最初に頭部静止時および能動回転時のゲイズ速度を比較した.その結果,能動回転時においてゲイズの最高速度が大幅に増加することがわかった.次に,ゲイズパシュート中に頭部に外乱を加えることによりVORゲインを推定したところ,視標運動時のVORゲインは静止時のおよそ76%であった.また,暗中で静止目標を想起しながら能動的に頭部を回転させたときのVORゲインが平均1.0であったのに対して,運動目標を想起したときのVORゲインは平均0.8で,静止目標想起時に比べて有意に低下していた.以上のことから,脳は視標運動時にVORゲインを低下させることにより目標追跡速度を高める戦略をとっており,視覚または記憶情報を通して形成された対象物の運動知覚に基づいてVORゲインを調節する神経機構の存在が示唆される.日常生活において頭部は頻繁に動揺するが,視覚のブレを感じることはほとんどない.頭部が上下左右に回転すると直ちにVOR(頭と同じ速度で逆向きに眼を回転させる反射)が働き,空間に対する視線の向きは一定に保たれる.VORは静止世界に対する視覚の安定化にきわめて有効であるが,視覚対象が運動している場合,頭を動物体と同じ方向に回転させるとVORは目標追跡を妨げるよう作用することになる.このことから,動物体追跡時にはVORの働きを抑制することにより目標追跡速度を高めている可能性は十分考えられる.本研究では,対象物の速度に応じてVORゲインを調節する機構の存在を明らかにするため,(1)広範囲にわたる目標速度(20100deg/s)に対する頭部静止時と能動回転時の視線速度,(2)暗中で静止あるいは運動目標を想起したときのVORゲイン(眼球速度/頭速度)について調べた.左右に正弦波振動(0.8Hz)する視標に対して,比較的低速(2040deg/s)のときには頭部静止時と回転時の視線速度に顕著な差は見られなかったが,視標速度が増加する(40100deg/s)につれて頭部回転時の視線速度は静止時に比べて大きくなった.視標速度が100deg/sのとき,頭部回転時の視線速度は6名の被験者について平均70deg/sであったのに対して頭部静止時ではわずか51deg/sであった.これは,頭部能動回転時においてVORの働きが一部抑制されたことが原因だと考えられる.次に,暗中で静止目標を想起しながら能動的に頭部を回転させたときのVORゲインを調べたところ平均1.0であった.一方,運動目標を想起したときのVORゲインは平均0.8で,静止目標想起時に比べて有意に低下していた.以上のことから,視覚情報や記憶情報を通して形成された対象物の運動知覚に基づいてVORゲインを抑制する神経機構の存在が示唆される.頭部が突然左右に回転すると直ちに眼を頭と逆方向に回転させる反射性の眼球運動(前庭性動眼反射,VOR)が働き,空間に対する視線の向き(ゲイズ)は一定に保たれる.VORは頭部角速度を検出する内耳の半規管から外眼筋へと伝わる信号によって営まれ,きわめて高速な応答を実現している(潜時はおよそ10ms).頭部角速度信号から眼球速度信号に変換される際の利得(VORゲイン)は,一般に暗中(視覚のフィードバックが働かない状況)で頭部を回転させたときの頭部角速度に対する眼球速度の比から算出される.被験者の注意が静止物体に向けられているとき,VORゲインの値は0.91.0であることが報告されており,意図しない頭部の動揺が生じてもその動きの大部分はVORによって補償される.さて,視覚対象が運動している場合,我々は動物体と同じ方向に頭部を回転させて追跡(ゲイズパシュート)を行う.ゲイズパシュート中の眼球速度は前庭性信号(VOR系)と視覚性信号(スムーズパシュート系)から得られる眼球速度信号の線形加算により決定される.上述したようにVORは静止世界に対する視覚の安定化にはきわめて有効であるが,動物体追跡時にはむしろ目標追跡を妨げる向き(スムーズパシュートと逆向き)に作用することになる.

本研究では,対象物の速度に応じてVORゲインを調節する神経機構を実験的に明らかにするため,最初に頭部静止時および能動回転時のゲイズ速度を比較した.その結果,能動回転時においてゲイズの最高速度が大幅に増加することがわかった.次に,ゲイズパシュート中に頭部に外乱を加えることによりVORゲインを推定したところ,視標運動時のVORゲインは静止時のおよそ76%であった.また,暗中で静止目標を想起しながら能動的に頭部を回転させたときのVORゲインが平均1.0であったのに対して,運動目標を想起したときのVORゲインは平均0.8で,静止目標想起時に比べて有意に低下していた.以上のことから,脳は視標運動時にVORゲインを低下させることにより目標追跡速度を高める戦略をとっており,視覚または記憶情報を通して形成された対象物の運動知覚に基づいてVORゲインを調節する神経機構の存在が示唆される.
硝酸呼吸系に含まれる銅タンパク質の構造と機能の研究

Axg-NIRのDNA塩基配列から推定されるAxg-NIRのアミノ酸配列を他のNIRの配列と比較した結果、同じ青色NIRであるAlcaligenes xylosoxidans NCIB 11015(Axn-NIR)およびPseudomonas aureofaciensのNIRは共に77%、緑色NIRであるAlcaligenes faecalis S-6,・Achromobacter cycloclastes IAM1013のNIRとそれぞれ67%、70%の高い相同性を有していることが明らかになり、同様の高次構造を取ることが示唆された。また、2つの銅の配位残基であるType1銅の2His,Met,CysおよびType2銅の3Hisはすべて完全に保存されており、銅中心の構造も類似しているものと考えられる。酸化型Axg-NIRのX線結晶構造解析(2A^^.分解能)では、既に報告のあるAxn-NIR(3A^^.分解能)よりも精度のよいデータが得られた。それによると、Type1銅は2His,Met,Cysの4残基が配列した歪んだ四面体構造であり、同じ配位残基を持つが、緑色NIRの銅周りのように歪んだ平面四配位とは異なっていた。Type2銅部位は、今までに報告のあるNIRと同様で、3His残基と水分子が配位した歪んだ四面体構造であった。また還元型では、酸化型と比べてType1銅部位は変化なかったが、Type2銅部位の水分子が外れて三配位構造であった。
サイボーグ技術に不可欠な埋植型低インピーダンス神経用電極の開発

脱神経筋を支配する末梢神経内に神経細胞を移植し、脱神経筋の神経再支配と電気刺激による機能再建を試みた。また、筋芽細胞の増殖や融合、神経細胞の生存や軸索伸長を促進すると考えられているbasicfibroblast growthfactor(FGF-2)の追加投与による影響を検討した。移植した神経細胞は生存し、軸索を伸ばすことで筋神経接合部を形成していることが確認できた。また、神経細胞移植と同時にFGF-2を投与した群では、生食投与群に比べ、筋湿重量は優位に大きかったが、筋線維横断面積、運動神経伝導速度や振幅には優位な差を認めなかった。ロボット技術の進歩は自然の手に近い動きを再現できる軽量な義手の作成を可能にしたが、神経系と制御用コンピューターのインターフェースの性能の低さがmoter neuroprosthesisの実用化を拒む主因となっている。もう一つの電動義手での課題が知覚機能である。手が持つより繊細な機能を再現するために知覚機能は不可欠である。ここでも機械と神経とのインターフェースが重要であり難しい問題である。最初にアダルトラットの後根神経節(DRG)を採取し、DRG neuronを培養した。このprimary cultureを用いて3種のコーティング(Laminin coated、Poly-L-lysine Hydrobromide coated、RGD coated)を行った金属(Titanium)上での分散培養を行い、コーティングによる細胞接着、神経突起伸展状態の違いについて蛍光実態顕微鏡を用いて観察した。Laminin coated上での培養で最も良好な接着、神経突起伸展が見られた。続いて名古屋大学工学部からSiO_2とAuを用いて試作された電極の提供を受け、この電極上にLamininコーティングを施行後、DRG neuronの培養を行った。この電極は神経細胞に電気刺激を与えることが可能であり、結果、DRG neuronが長軸方向に一定の配列となり、電極を超えて軸索が伸長してくる事が確認できた。これは神経回路網形成にとって重要な知見である。また、アルファメッドサイエンス社製でガラスチャンバー上に64個の微小電極がパターニングされているMEDプローブ上でもDRG neuronの培養を行い、電極刺激とneuronの自発活動電位を計測した。微小電極間を神経が架橋してしまう問題があり、プローブ上で細胞接着性の有無を制御することが課題である。前年度に名古屋大学工学部からされた電極の提供を受け、この電極上にLamininコーティングを施行後、DRG neuronの培養を行った。その後、微小電極間を神経が架橋してしまう問題があり、プローブ上で細胞接着性の有無を制御することが困難であった。そこで発想の転換であるが、脱神経筋を支配する末梢神経内に神経細胞を移植し、脱神経筋の神経再支配と電気刺激による機能再建を試みた。また、筋芽細胞の増殖や融合、神経細胞の生存や軸索伸長を促進すると考えられているbasicfibroblast growthfactor (FGF-2)の追加投与による影響を検討した。実験ではラットの坐骨神経を切離し、両端を結紮した。胎生14日目のラット脊髄神経細胞を切断した脛骨神経内に移植して電気生理学的、組織化学的にcontrol(培地投与)群と比較検討を行った。加えて、神経細胞移植と同時にFGF-2を腓腹筋内に投与し、control(生食投与)群と比較検討を行った。結果、10週間後、脛骨神経内でmotoneuronは生存し、軸索を伸ばすことで筋神経接合部を形成していることを確認した。また、移植神経細胞の電気刺激により腓腹筋が収縮し、足関節の底屈が可能であった。toluidine blue染色にて軸索の髄鞘形成を確認できた。また、神経細胞移植と同時にFGF-2を投与した群では、生食投与群に比べ、筋湿重量は優位に大きかったが、筋線維横断面積、運動神軽伝導速度や振幅には優位な差を認めなかった。
環状ポリフェニレンの分子設計・合成ならびに機能

最近、曲がった共役系化合物が注目を集めている。このような化合物は、これまでに研究されてきた共役系化合物の概念を大きく変える可能性を持っており、これからその重要性は増していくものと考えられる。ここで分子設計した標題化合物は、直径1020Åの円筒状の非平面共役系である。その芳香環の内部および外部ではπ電子の密度や電荷などにかたよりを生じ、その結果、特異な物性を示すことが期待される。これらの内、シクロパラノナフェニレンは直径13.5Å、シクロパラテトラデカフェニレンは直径20Åの分子であり、C_<60>などのフラーレン類を分子内に取り込むことが期待できるので、ナノマシーンとしての機能も予想される分子である。ベンゼン間のパラ位とオルト位で環状に連結したシクロノナフェニレンを合成し、その内部空孔の性質を検討した。その結果シクロノナフェニレンは銀イオンを空孔内に取り込んだ錯体を形成することが明らかとなった。そのほかにもベンゼン環のパラ位とオルト位で環状に連結したシクロヘキサフェニレンやそのフッ素置換誘導体、シクロノナフェニレンよりさらに大きいシクロドデカフェニレンなどの合成についても検討したが、現在までのところ完成には至っていない。今後更に検討する予定である。チオフェン環の2,5位をアセチレンで結合させた環状オリゴマーの合成についても検討し、環状5量体や環状10量体の誘導体が得られることがわかった。これらの化合物では、ドナー性を持ったチオフェン環を構成要素として持ち、分子内にかなり大きな空孔を持つことが予想されるので現在その構造や包摂能力・酸化還元挙動などについて調べている。最近、曲った共役系化合物が大きな注目を集めている。これらの化合物は、これまで主に研究されてきた共役系化合物の概念を大きく飛躍させる可能性を秘めており、これからますます発展させるべき研究課題であると言える。この様な観点から申請者は、表題の非平面共役系化合物を設計し、合成することを計画した。申請者の標的とする化合物は、直径10-20Åの円筒状分子であり、その芳香環の内部および外部ではπ電子の密度、電荷などに偏りを生じ、その結果特異な物性を示すことが予想された。標的化合物の合成は申請者の開発したカップリング反応を鍵反応として用いて行った結果、幾つかの分子を合成することが出来た。(1)大きな平面分子であるトリベンゾヘキサデヒドロ[12]アヌレンおよびその置換体を合成して、溶液中で銀錯体の生成を調べたところ、非常に大きなサンドイッチ錯体が生成することがわかった。(2)テトラベンゾヘキサデヒドロ[16]アヌレンを合成して合成レセプターとしての機能を調べたところ、選択的に1-2個の銀カチオンを取り込むことがわかった。(3)大環状ポリフェニルアセチレンを段階的合成法を用いて合成し、それらの構造を調べると共にその内部空孔が合成レセプターとして働くことを見いだした。(4)炭素同素体の基本単位であるアセチレンで拡張した[4]ラジアレンを合成してその物性を調べた。この分子は内部に大きな空孔を持つ巨大分子であり、曲ったアセチレン部を持つ特異な構造に特徴がある。
単層培養からの自然発生スフェロイドの特性解明と阻害剤の探索研究

乳がん細胞株を高密度培養することにより生じた自然発生浮遊細胞塊では、がん幹細胞マーカーのCD133の発現が上昇した。次世代シークエンサーで遺伝子発現パターンを解析したところ、WntやTGF-βシグナルに関与する遺伝子群の発現変動が見られた。また、アルデヒドデヒドロゲナーゼ(ALDH)活性の上昇が観察された。一方、自発的浮遊細胞はドキソルビシンなどの抗がん剤に対して抵抗性を示すが、HER2のリン酸化が亢進しており、2種類のHER2阻害剤に対してnMオーダーの感受性を示した。乳がん細胞株を高密度培養することにより生じた自発的浮遊細胞の遺伝子発現パターンを次世代シークエンサーで解析した。自発的浮遊細胞は、通常のモノレイヤー培養、強制的浮遊培養とは大きく異なる遺伝子発現パターンを示し、特にWntやTGF-βシグナルに関与する遺伝子群の発現変動が大きかった。中でも、DKK1遺伝子の発現上昇は再現性が良く、自発的浮遊細胞のマーカーとして使える可能性が示された。幹細胞では、Aldehyde dehydrogenase (ALDH)活性が上昇していることが知られている。Aldefluor試薬を用いて、自発的浮遊細胞のALDH活性を解析したところ、顕著な活性上昇が観察された。また、NSGマウス(NOD-scid, IL2 receptor gamma chain knockoutマウス)の皮下へ自発的浮遊細胞を移植し、造腫瘍性を解析したところ、モノレイヤー培養の細胞に比して造腫瘍性が高いことを示唆する結果を得た。今後、自発的浮遊細胞の造腫瘍性の精査と抗がん幹細胞活性を有する化合物の探索を試みる。乳がん幹細胞のマーカー候補として、ALDH活性とHER2などが知られている。自発的浮遊細胞のALDH活性の上昇については昨年度報告したが、今年度は、HER2発現やそのリン酸化状態について検討した。その結果、自発的浮遊細胞ではHER2のリン酸化が亢進していることが明らかとなった。そこで、乳がん幹細胞の抗HER2療法を想定し、2種類の低分子量HER2阻害剤(LapatinbとCanertinib)の自発的浮遊細胞の増殖への影響を検討した。自発的浮遊細胞がドキソルビシンなどの抗がん剤に対して抵抗性を示すのに対して、2種類のHER2阻害剤は本細胞の増殖をnMオーダーの濃度で顕著に阻害した。HER2に加えて、Wntシグナル経路も幹細胞性維持に重要なことが広く知られている。次世代シークエンサーを用いた自発的浮遊細胞の遺伝子発現プロファイルの結果からWntシグナル経路の関与が示唆されたため、Wntシグナル阻害剤の影響も検討した。我々が開発したWntシグナル阻害剤IMU-1003を添加することによって、自発的浮遊細胞の増殖が阻害された。HER2阻害剤とWntシグナル阻害剤は、通常培養した細胞に比較して自発的浮遊細胞の増殖を特異的に強く阻害することも明らかとなった。乳がん細胞株を高密度培養することにより生じた自然発生浮遊細胞塊を回収し、がん幹細胞マーカーの発現、各種抗がん剤に対する感受性や軟寒天培地中でのコロニー形成能及びヌードマウス皮下への造腫瘍性等を解析した。CD133、CD44、CD24、Oct4、Nanogなどの幹細胞マーカーの発現をウェスタンブロット法により解析したところ、スフェロイドではCD133の発現が優位に上昇することが分かったが、継代によって発現が低下する傾向が見られた。そこで、マーカー発現細胞のポピュレーションの変動や細胞内局在等に特徴的な変化があるかないかを今後明らかにする。次に、がん幹細胞様スフェロイド集団を用いて抗がん剤に対する感受性を比較したところ、ドキソルビシン、エトポシド、マイトマイシンCに対する感受性の低下が観察された。一方、造腫瘍性と最も相関性が高い事が知られている軟寒天培地中でのコロニー形成能を調べたところ、コロニー形成率はむしろ低下した。また、ヌードマウス皮下への造腫瘍性についても検討を加えたが、がん幹細胞様集団は親株細胞に比較して造腫瘍性が低いことが明らかとなった。低い造腫瘍性は、がん幹細胞のDormancyを反映する結果と解釈することもできるため、今後の検討課題とする。今後、がん幹細胞様集団の遺伝子発現プロファイリングを行い、その性質の分子基盤に関する情報を得る。また、がん幹細胞に特異的に増殖阻害活性を示す化合物の探索を進める。自発的浮遊細胞の遺伝子発現パターンを次世代シークエンサーで解析した。接着培養細胞と強制浮遊細胞との3群比較において、自発的浮遊細胞の遺伝子発現パターンは他の2群と比べ大きく変化していた。楕円を用いた4つの集合のVenn diagramにより、発現に10倍以上差があったものとして、約200個に遺伝子の上昇が見られた。逆に減少したのは128個であった。

そのうち、幹細胞に関連するいくつかの遺伝子について、real-time PCRで実際の発現量を解析し再現性が確かなものとして、TGFbeta、Wntシグナル系に関わる遺伝子群の発現の上昇や減少を確認することができた。3年計画の1年目の研究としてはおおむね順調に進展していると考えられる。幹細胞マーカーの発現の不安定性や造腫瘍性の指標の低下など、想定外の結果が得られたが、これらはむしろがん幹細胞のDormancyを反映する結果と解釈することもできる。今後、一層の検討が必要である。細胞の性質が培養日数(継代数)で変化することを見出した。すなわち、DKK1とFN1遺伝子の発現については自発的浮遊細胞でも、短期培養では発現は高いものの、長期培養では発現が低下するということが分かった。そこで、DKK1の発現量でモニターすると同時に、幹細胞のもう1つの指標として、多くの幹細胞で高発現が知られているALDH活性も指標に加えることで、幹細胞様の集団をモニターできる可能性が示された。今後、造腫瘍性との関連性を追求する。がん幹細胞様集団の遺伝子発現プロファイリングを行い、その性質の分子基盤に関する情報を得る。また、がん幹細胞に特異的に増殖阻害活性を示す化合物の探索を進める。造腫瘍性を解析したところ、モノレイヤー培養の細胞に比して造腫瘍性が高いことを示唆する結果を得た。今後、自発的浮遊細胞の造腫瘍性を精査するとともに、抗がん幹細胞活性を有する化合物の探索を試みる。遺伝子発現プロファイリングの解析薬剤感受性試験とスクリーニング免疫不全マウスを用いた造腫瘍能の解析
我国におけるトランス脂肪酸の動脈硬化リスクとしての評価

トランス脂肪酸が心血管病の発症を増加することが証明されている。本研究では、我国のトランス脂肪酸血中の影響を検討した。まず、日本人のトランス脂肪酸血中濃度は若年の冠動脈疾患患者で高値であり、プラークの脆弱性の指標である菲薄化線維性被膜を有する患者は、トランス脂肪酸濃度が高値であった。さらに、トランス脂肪酸血中濃度が高いと心血管イベントが増加することが判明した。LDL受容体欠損マウスにトランス脂肪酸を負荷すると、脂肪組織、筋肉、肝臓などに蓄積し、炎症性サイトカインや酸化ストレスを亢進した。以上より、トランス脂肪酸は冠動脈プラークの発症や脆弱性、予後と関連することが示唆された。欧米の臨床試験によってトランス脂肪酸が心血管病の発症を増加することが証明され、トランス脂肪酸の食品中含有量や摂取量が規制されている。しかし、我国ではトランス脂肪酸の血中濃度や動脈硬化リスクとしての意義は不明である。そこで、我々は日本人のトランス脂肪酸血中濃度を直接測定し、日本人における冠動脈疾患との関連性を解明するとともに動物実験によりその機序を解明することを目指した。1.血中トランス脂肪酸(エライジン酸、リノエライジン酸)は、年齢と逆相関し、腹囲と正相関した。また、血中LDL-C、トリグリセリド値と正相関し、HDLーC値と逆相関した。年齢における4分位で冠動脈疾患患者と非冠動脈疾患患者の血中濃度を比較したところ、若年群では非冠動脈疾患患者と比べて冠動脈疾患患者においてトランス脂肪酸濃度が有意に高値であった。以上より、日本人においてもトランス脂肪酸血中濃度が冠動脈疾患の促進因子となることが示された。2. LDL-R KOマウスを、トランス群(5%エライジン酸)、シス群(5%オレイン酸)、対照群に分け、8週間負荷後、血中の脂質・脂肪酸プロファイル・酸化LDL・各臓器中の炎症性サイトカインを測定した。トランス群では、シス群および対照群と比べて、血清コレステロールおよび中性脂肪濃度には変化がなかったが、血中酸化LDLが増加していた。また、トランス群では、動脈硬化病変が増大しているとともに、大動脈壁の酸化ストレスが亢進していた。さらに、各組織中の炎症性サイトカイン濃度の上昇が認められた。以上より、トランス脂肪酸は脂質とは独立した機序で血管の酸化ストレスを促進することが示された。植物油の加工過程で副産物として生じるトランス脂肪酸の摂取が、心血管病の発症を増加することが証明され、欧米では規制対象となっている。しかし、多くの欧米の臨床研究では、トランス脂肪酸の危険性は血中濃度ではなく推定摂取量に基づいて評価されている。また、我国ではトランス脂肪酸の意義は不明である。昨年度は、日本人のトランス脂肪酸血中濃度を測定し、若年になるほど冠動脈疾患患者で血中トランス脂肪酸濃度が高値であることを証明した。今年度は、冠動脈疾患における動脈硬化プラーク性状と血中トランス脂肪酸濃度との関連性を検討した。184人の冠動脈疾患患者において、冠動脈造影時に光干渉断層法(OCT)を用いて動脈硬化病変の組織性状を評価した。全ての患者は、二次予防のため冠危険因子が適切に管理されており、78%でスタチンが投与されていた。しかし、解析した232病変のうち57病変にプラークの脆弱性の指標である菲薄化した線維性被膜(TCFA)を認めた。TCFAを有する患者は、有さない患者に比べて、トランス脂肪酸(エライジン酸)、トリグリセリド、RLP-Cの血中濃度が有意に高値であった。一方、血中LDLーC濃度には差がなかった。多変量解析ではエライジン酸はTCFAの規定因子であった。すなわち、内服治療により古典的な危険因子が適切に管理されている冠動脈疾患患者において、トランス脂肪酸が冠動脈プラークの脆弱性と関連し残余リスクとなっていることが示唆された。LDL受容体欠損マウスに高エライジン酸食と高オレイン酸食(対照)を負荷し、脂質代謝と動脈硬化病巣を解析した。エライジン酸はオレイン酸に比べて、脂肪組織、筋肉、肝臓、血管など多くの臓器に蓄積する傾向があり、局所で炎症性サイトカインの発現亢進とNADPH oxidaseの活性化により炎症と酸化ストレスを惹起し、動脈硬化を促進することが明らかとなった。臨床研究、基礎研究ともに順調に進行している。臨床研究では症例数を増やすことと、トランス脂肪酸が冠動脈疾患の予後(心血管イベント)に及ぼす影響を前向きに検討している。とくに予後の検討には相応の時間がかかることが予想される。基礎研究では、トランス脂肪酸が炎症や酸化ストレスを亢進させる分子機序(関与する分子や細胞内シグナル伝達機構)を明らかにするための実験をしている。植物油の加工過程で副産物として生じるトランス脂肪酸の過剰摂取は、心血管病の発症を増加することが証明され、欧米では規制対象となっている。しかし、多くの欧米の臨床研究では、トランス脂肪酸の危険性は推定摂取量に基づいて評価されており、血中濃度に基づいたものではない。本研究では、我国におけるトランス脂肪酸血中濃度の動脈硬化リスクを評価した。初年度は、日本人のトランス脂肪酸血中濃度を直接測定し、若年の冠動脈疾患患者で血中トランス脂肪酸濃度が高値であることを証明した。

昨年度は、冠動脈疾患における動脈硬化プラーク性状と血中トランス脂肪酸濃度との関連性を検討し、プラークの脆弱性の指標である菲薄化した線維性被膜(TCFA)を有する患者は、有さない患者に比べて、トランス脂肪酸(エライジン酸)、トリグリセリド、RLP-Cの血中濃度が有意に高値であることを示し、多変量解析ではエライジン酸はTCFAの規定因子であることを証明した。本年度は、若年の冠動脈疾患患者を血中トランス脂肪酸濃度により四分位に分類し、主要の有無をカプランマイヤー法によって予後を検討したところ、トランス脂肪酸が高いと心血管イベントが増加することを証明した。すなわち、内服治療により古典的な危険因子が適切に管理されている冠動脈疾患患者でも、トランス脂肪酸濃度が冠動脈プラークの脆弱性と予後と関連し、残余リスクとなっていることが示唆された。トランス脂肪酸の動脈硬化促進作用の分子機序を解明するために、LDL受容体欠損マウスに高エライジン酸食と高オレイン酸食(対照)を負荷し、脂質代謝と動脈硬化病巣への影響を検討した。エライジン酸はオレイン酸に比べて、脂肪組織、筋肉、肝臓など多くの臓器に蓄積し炎症を惹起する。とくに、炎症性サイトカインの発現亢進とNADPHoxidase活性化による酸化ストレスの亢進により動脈硬化を促進することを証明した。トランス脂肪酸が心血管病の発症を増加することが証明されている。本研究では、我国のトランス脂肪酸血中の影響を検討した。まず、日本人のトランス脂肪酸血中濃度は若年の冠動脈疾患患者で高値であり、プラークの脆弱性の指標である菲薄化線維性被膜を有する患者は、トランス脂肪酸濃度が高値であった。さらに、トランス脂肪酸血中濃度が高いと心血管イベントが増加することが判明した。LDL受容体欠損マウスにトランス脂肪酸を負荷すると、脂肪組織、筋肉、肝臓などに蓄積し、炎症性サイトカインや酸化ストレスを亢進した。以上より、トランス脂肪酸は冠動脈プラークの発症や脆弱性、予後と関連することが示唆された。臨床研究、動物実験ともに順調に進行している。作用機序を完全に解明できていない部分があり、今年度の検討課題としたい。1.臨床研究ではさらに症例数を増やし、トランス脂肪酸が冠動脈プラークの性状に及ぼす影響を明らかにする。また、トランス脂肪酸が冠動脈疾患の予後に及ぼす影響を検討中である。2.トランス脂肪酸の血中濃度は摂取量を反映すると考えられるが、腸管における吸収や、体内における分解代謝機構によっても制御されている可能性がある。そこで、トランス脂肪酸の血中濃度に影響を及ぼす病態と薬物療法を明らかにすることを目指している。まず、既存の脂質代謝異常症や糖尿病治療薬の投与により、血中トランス脂肪酸濃度が影響を受けるかを検討する。また、レムナントの代謝異常とトランス脂肪酸血中濃度との関連性を明らかにする。3.基礎研究では、トランス脂肪酸が炎症や酸化ストレスを亢進させる分子機序(関与する分子や細胞内シグナル伝達機構)を解明する予定である。とくに、トランス脂肪酸が血管構成細胞(内皮、平滑筋、マクロファージなど)においてToll-like受容体を介してNADPH oxidaseを活性化することに着目し、その分子メカニズムを解明する。循環器内科学臨床研究では、トランス脂肪酸が冠動脈病変の性状(複雑性)や冠動脈疾患の予後に及ぼす影響を検討する予定である。
医薬品の動態および安全性の早期予測システムの構築

本課題における研究期間中における主な研究成果は、冊子体の報告書に全文を記載した9報の英文論文として報告した。特に成果として特筆すべき論文の2題を以下に要約する。【肝毒性化合物5種類の投与における網羅的遺伝子発現変動解析】肝障害性というフェノタイプと網羅的遺伝子発現プロファイルの関係について、DNAマイクロアレイを用いて典型的な肝毒性化合物5種類について検討した。個々の化合物はそれぞれ特徴的な遺伝子発現のプロファイルを示した。アセトアミノフェンは他の化合物とは異なるクラスターに分類された。遺伝子発現プロファイルと毒性を示す時間を考慮して、10個の発現が誘導される遺伝子と、10個の発現が抑制される遺伝子を共通してpick upすることが出来た。これらは肝障害に共通するマーカー遺伝子と考えられた。Quality-Threshold(QT)クラスター解析により、個々の化合物による特徴的な遺伝子の発現変化を見出すことができた。QTクラスター解析における平均遺伝子変化は、生化学値と一致した変動を示した。さらに、この変動は、肝障害性の大小に係わらず同じパターンを示した。すなわちこれらの遺伝子の発現プロファイルから、肝毒性の程度に関係なく毒性発現時間を推測することが可能であることを示した。【肝毒性化合物の投与量と遺伝子発現の相関解析】本研究ではチオアセタミドを代表的な肝毒性化合物として用い、肝障害性のフェノタイプと特定の遺伝子の発現プロファイルの変化との相関を検討した。その結果、肝障害の初期段階のクラスターと後期のクラスターは、時間依存的にも、投与量依存的にも分けることができた。一方、主たる遺伝子のQuality-threshold(QT)クラスタリングでは、血清学的な値の最大値を、遺伝子変化のプロファイルから予測することができた。肝障害に係わる遺伝子の発現プロファイルのQTクラスタリング手法は、肝障害性を予測する為の有用な解析であることを示した。薬物誘導性の肝毒性発現において、薬物投与に起因して発現が変動する共通のマーカー遺伝子を見出すことを本年の目的とした。典型的な肝毒性を示す化合物5種類について、ラットin vivo投与後の肝における網羅的な遺伝子の発現変動について、投与6,12,24,48時間後の検体を用いて、ラットDNAチップにより解析した。検討した化合物と投与量は四塩化炭素(CT,1mL/kg)、ブロモベンゼン(BB,2.5mmol/kg)、アセトアミノフェン(APAP,500mg/kg)、ジエチルニトロソアミン(DMN,20mg/kg)、チオアセタミド(TA,400mg/kg)、であり、DNAチップはCode Link社製を用い、解析までの全てを当研究室で行った。血清ALT,AST,LDHおよびビリルビン値は、6時間では変化が全くなく、12時間以後に値が変動する投与量を設定した。DNAチップに搭載されている約1万の遺伝子について網羅的な解析の結果、最も多くの遺伝子が変動する時間は、化合物によって大きく異なっており、CT:6時間、APAP:12時間、TA,BB:24時間、DMN:48時間であった。カテゴリー解析では、特定の遺伝子群の変動と毒性に関係は見出されなく、遺伝子群の中でも様々な変動が認められた。階層クラスタリングの結果、どの投与後時間においてもAPAPは他の化合物と異なったクラスターに分類された。さらにQTクラスタリング解析などを駆使し、各化合物において最も多くの遺伝子が変化を示す各時間において、共通して誘導および抑制を受ける遺伝子の候補を各5種類選択した。これらの遺伝子について、各ラットにおいてreal-time PCRにより発現変動を細かく調べた結果、DNAチップのデータは信頼性が高いことが認められた。

さらに、これらの遺伝子の発現誘導または抑制が実際のin vivoに及ぼす影響についてsiRNAを用いた遺伝子機能を阻害する手法により検討中である。薬物誘導性の肝毒性発現において、薬物投与に起因して発現が変動する共通のマーカー遺伝子を見出すことを本年の目的とした。典型的な肝毒性を示す化合物5種類について、ラットin vivo投与後の肝における網羅的な遺伝子の発現変動について、投与6,12,24,48時間後の検体を用いて、ラットDNAチップにより解析した。検討した化合物と投与量は四塩化炭素(CT,1mL/kg)、ブロモベンゼン(BB,2.5mmol/kg)、アセトアミノフェン(APAP,500mg/kg)、ジエチルニトロソアミン(DMN,20mg/kg)、チオアセタミド(TA,400mg/kg)、であり、DNAチップはCode Link社製を用い、解析までの全てを当研究室で行った。血清ALT,AST,LDHおよびビリルビン値は、6時間では変化が全くなく、12時間以後に値が変動する投与量を設定した。DNAチップに搭載されている約1万の遺伝子について網羅的な解析の結果、最も多くの遺伝子が変動する時間は、化合物によって大きく異なっており、CT:6時間、APAP:12時間、TA,BB:24時間、DMN:48時間であった。カテゴリー解析では、特定の遺伝子群の変動と毒性に関係は見出されなく、遺伝子群の中でも様々な変動が認められた。階層クラスタリングの結果、どの投与後時間においてもAPAPは他の化合物と異なったクラスターに分類された。さらにQTクラスタリング解析などを駆使し、各化合物において最も多くの遺伝子が変化を示す各時間において、共通して誘導および抑制を受ける遺伝子の候補を各5種類選択した。これらの遺伝子について、各ラットにおいてreal-time PCRにより発現変動を細かく調べた結果、DNAチップのデータは信頼性が高いことが認められた。【トログリタゾンにより肝障害を発症した患者における自己抗体の検討】トログリタゾン投与によって、肝障害の兆候が現れたために、投与を中断した患者2名の血清試料を入手し、血清中に出現する自己抗体の有無について検討を行った。その結果、肝サイトゾル画分に存在するアルドラーゼBという酵素に対する自己抗体を見出した。アルドラーゼBが自己抗体の抗原になることの最初の発見である。さらなる検討によって、この自己抗体はトログリタゾン特異的ではなく、慢性肝疾患の患者の多くに見出されたために、肝疾患のマーカーとしての可能性が示された。この研究成果は、英国の国際学術誌Toxicology,216:15-23(2005)に掲載された。【リボゾームタンパク質P0の肝障害への関与】
形質転換雄性配偶子による受精を経由した形質転換植物作出の試み

花粉にパーティクルガンによって遺伝子を導入した後,受粉を行い,形質転換体を作成することを目標に実験を行った.一回の受粉で多数の種子をつける植物が有利だと考え,タバコを実験に用いた.パーティクルガンの条件設定にはpBI211を用い,トランジェントな発現をGUS活性によって検出した.さらに,形質転換体を得る実験ではhygromycin phosphotransferaseをセレクションマーカーに持つプラスミドp35s-GUS-HPT2-KSを(株)三井東圧ライフサイエンス研究所より分譲を受けた.パーティクルガンはdu PontのBiolystic,Helium-Driven PDS-1000/Hesystemを使用した.採取した花粉は,花粉発芽培地に懸濁し,吸引濾過によってニトロセルロース膜に載せた.一回あたり0.5mgの金粒子に1μgのDNAを処理してbomberdmentを行った.圧力は900psi,1100psi,1300psiの3通り,金粒子の大きさは1.0μmと1.6μmの2通りで条件設定を行った.その結果金粒子は1.6μm,圧力は1300psiで最も良い結果が得られた.しかし,現在のところ,GUS活性が確認できた花粉はおよそ10,000個に1つなので,2,000個種をつけるタバコでさえ,一回の受粉で受精できる確立は5分の1という低い確率になる.さらに,金粒子を打ち込まれた花粉はそうでない花粉に比べて活力が低く,受精までの競争で負ける可能性が高いのではないかと考えるとさらに確率が低くなると思われる.また,成熟した花粉に遺伝子を導入しているため,受精後細胞分裂を開始するまで導入した遺伝子が核のゲノムに取り込まれないので,かなり高い確率で、花粉に遺伝子が導入されることが望まれる.その点で,パーティクルガンを利用する場合には技術的に困難ではないかと思われる.花粉にパーティクルガンによって遺伝子を導入した後,受粉を行い,形質転換体を作成することを目標に実験を行った.一回の受粉で多数の種子をつける植物が有利だと考え,タバコを実験に用いた.パーティクルガンの条件設定にはpBI211を用い,トランジェントな発現をGUS活性によって検出した.さらに,形質転換体を得る実験ではhygromycin phosphotransferaseをセレクションマーカーに持つプラスミドp35s-GUS-HPT2-KSを(株)三井東圧ライフサイエンス研究所より分譲を受けた.パーティクルガンはdu PontのBiolystic,Helium-Driven PDS-1000/Hesystemを使用した.採取した花粉は,花粉発芽培地に懸濁し,吸引濾過によってニトロセルロース膜に載せた.一回あたり0.5mgの金粒子に1μgのDNAを処理してbomberdmentを行った.圧力は900psi,1100psi,1300psiの3通り,金粒子の大きさは1.0μmと1.6μmの2通りで条件設定を行った.その結果金粒子は1.6μm,圧力は1300psiで最も良い結果が得られた.しかし,現在のところ,GUS活性が確認できた花粉はおよそ10,000個に1つなので,2,000個種をつけるタバコでさえ,一回の受粉で受精できる確立は5分の1という低い確率になる.さらに,金粒子を打ち込まれた花粉はそうでない花粉に比べて活力が低く,受精までの競争で負ける可能性が高いのではないかと考えるとさらに確率が低くなると思われる.また,成熟した花粉に遺伝子を導入しているため,受精後細胞分裂を開始するまで導入した遺伝子が核のゲノムに取り込まれないので,かなり高い確率で、花粉に遺伝子が導入されることが望まれる.その点で,パーティクルガンを利用する場合には技術的に困難ではないかと思われる.
核移動の左右極性化をキューとする左右非対称性の新奇形成機構の解析

からだの左右非対称性が形成される機構は、進化的に多様で、無脊椎動物においてはよく理解されていない。ショウジョウバエの左右非対称性形成機構は、胚の前半部と後半部で異なるというユニークな特徴をもつが、前半部の左右非対称性形成機構についてはほとんど理解されていなかった。これまでの研究から、胚前半部の左右非対称性形成が、中腸内臓筋の核の左右非対称な移動から始まることをみいだしている。さらに、核移動の左右極性化は、中腸内臓筋細胞での非古典的Wntシグナルの活性化、核膜アンカータンパク質などに依存して起こることが示唆された。この細胞では何らかの左右極性化が起こっていると考えられるが、その実態は不明である。そこで、本研究では、核移動の左右極性化に必要な遺伝子、細胞内分布に左右極性を示す因子の同定などによって、核移動の左右極性化による左右非対称性の形成機構を分子レベルで理解することを目的とする。この目的を達成するために、IとIIの実験を実施する。平成30年度には、Iのi)、ii)の実験、IIのi)の実験を実施し、それぞれ以下の成果を得た。(I)中腸環状筋細胞の左右極性化機構の解明i)遺伝的スクリーニングを用いた核移動の左右極性化で機能する遺伝子の探索、同定胚前半部の左右非対称性をランダム化するnarigoma遺伝子の遺伝子座を特定した。ii)核移動の左右極性化におけるWntシグナルの作用機序Wntシグナルを構成する二つの遺伝子の突然変異体において、核の移動方向の左右非対称性がランダム化した。(II)左右非対称な核移動の機構の解明i)核移動の左右極性化におけるアクチン動態の関与光褪色後蛍光回復法の条件検討を実施した。当初計画していたUAS-LifeActでは、GFPを光褪色させることが難しことがわかった。ii)核移動の左右極性化における核膜アンカーの機能平成30年度の研究では、以下のような成果が得られており、研究の進捗状況はほぼ予定通りである。(I)中腸環状筋細胞の左右極性化機構の解明i)遺伝的スクリーニングを用いた核移動の左右極性化で機能する遺伝子の探索、同定研究代表者は、全ゲノム遺伝子をほぼ網羅をした、胚消化管の左右非対称性に異常を示す突然変異体のスクリーニングを完了している。前半部消化管の左右非対称性がランダム化する突然変異のうち、narigoma遺伝子の遺伝子座を、全ゲノム配列解析と、CRISPR-Cas9によるゲノム編集で作出した染色体欠失を用いて同定することができた。GAL4/UASシステムを用いて、narigoma突然変異体胚の中腸環状筋の核を核局在型赤色蛍光タンパク質(Redstinger)、細胞の輪郭を膜局在型緑色蛍光タンパク質(Myr-GFP)で可視化し、タイムラプス撮影で核移動を解析する準備を進めた。(II)左右非対称な核移動の機構の解明研究代表者は、消化管前半部の左右非対称形成は、アクチン細胞骨格に依存するが、微小管には依存しないことを明らかにしている。このとこから、アクチン細胞骨格が、核移動の極性化に重要な機能を担っている可能性が考えられる。そこで、光褪色後蛍光回復法を用いて、アクチンやミオシンIIの細胞内動態が、核の移動方向と関連する左右極性を示すかどうかを調べる。アクチン細胞骨格の安定性は、UAS-LifeActを中腸環状筋細胞で特異的に発現させ、共焦点レーザー顕微鏡を用いた光褪色後蛍光回復で調べた。しかし、レーザー照射による光褪色を誘発できる条件を見出すことができなかった。これは、LifeActの細胞内拡散が速すぎるためではないかと考えられた。そこで、その他のF-アクチン結合タンパク質とGFPの融合タンパク質をプローブとする実験計画を立てた。(I)中腸環状筋細胞の左右極性化機構の解明i)遺伝的スクリーニングを用いた核移動の左右極性化で機能する遺伝子の探索、同定平成30年度までの研究で、前半部消化管の左右非対称性がランダム化する突然変異の責任遺伝子を新たに定した。そこで、これらの突然変異体において、GAL4/UASシステムを用いて、中腸環状筋の核を核局在型赤色蛍光タンパク質(Redstinger)、細胞の輪郭を膜局在型緑色蛍光タンパク質(Myr-GFP)で可視化し、タイムラプス撮影で核移動を解析する。これらの突然変異体における核移動の左右極性化の異常を調べ、各責任遺伝子の左右非対称な核移動における機構を明らかにする。ii)核移動の左右極性化におけるWntシグナルの作用機序研究代表者は、中腸環状筋細胞の核移動の左右極性化が、非古典的Wntシグナル(β-カテニン非依存性経路)に依存して起こることを明らかにしている。中腸環状筋細胞内に平面内細胞極性経路、カルシウム経路の左右極性が存在すると仮定し、ライブイメージングでこれを検出する。また、カルシュウム・スパイクは、UAS-GCaMP6を同様に発現させ、ライブイメージングで検出する。