hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
多能性血液幹細胞の増殖・分化機構に関する研究

今回検討した増殖因子のうち、明らかに添加濃度依存性にCFUーS数を増加させたのは、ILー3、EPOおよびSCFであった。しかし個々に見て行くとCFUーS各群の反応性は異なっており、ILー3とSCFーS両群を増加させるのに対し、EPOは少なくとも10u/mlまでの濃度ではCFUーS_8のみを増加させた。また両者を増加させたILー3に対する濃度依存曲線も、CFUーS_8とCFUーS_<12>では異なっており、この点からも両者が異なった。populationであることが示唆された。EPOのCFUーS増加作用については、諸家の報告と^3HーTdR suicideを含む我々の結果を総合的に考えると、EPOはCFUーS_8を赤芽球の方向へ分化させると同時に、CFUーS_<12>にも働いてこれを赤芽球系へcommitしたCFUーS_8へ分化・増殖させるものと考えられる。それに対してILー3は、5FU抵抗性の未分化なものから比較的分化の進んだ幹細胞まで幅広い細胞群に作用しそれらの増殖を促進することが明らかになった。SCFの作用については未だ十分な検討がなされてはいないが、これまでの我々の結果でみるかぎりは、ILー3に近い増殖刺激作用を示している。ILー6とLIFは単独ではわずかにCFUーS数を増加させるのみであったが、ILー3の存在下ではいずれもCFUーSの両群にたいして増加作用が認められた。以上のように今回検討した増殖因子の血液幹細胞に対する作用は3種類に大別される。すなわちILー3とSCFのように単独でCFUーS_8とCFUーS_<12>の両者を増加させるもの、EPOにようにCFUーSのうち分化のすすんだ群のみを増加させるもの、さらにILー6やLIFのように単独では殆ど有意の増加はみられず、ILー3等他の因子の共存下でその作用がみられるものである。これらの因子の生体内での血液幹細胞の増殖・分化に果している役割については、未だ不明なものが多く今後の解明を待たねばならない。初年度は、短期液体培養の実験系において、mlL-3が造血幹細胞各群に対してどのように作用するかという点を中心に検討した。まず培養日数による変化について検討したが、2-4Hで結果に有意の差は認められなかったので、以後の検討はすべて2日間の培養で行った。その結果、1)増殖因子無添加ではCFU-Sは減少するが、その速度はCFU-S各群間で異なり早期発現群でより急速であること、2)mlL-3は10-200u/mlの検討域では早期発現CFU-Sと後期発現CFU-S両者を濃度依存性に増加させること、3)^3H-チミジン自殺試験の結果から、その作用は少なくとも幹細胞の増殖を伴った現象であり、幹細胞両群がその標的細胞になっていること、4)IL-3の定量曲線の解析から、早期発現CFU-Sと後期発現CFU-Sでは異なった反応曲線を示すことが明らかになった。以上の知見からIL-3は非常に未分化なものから比較的分化の進んだ幹細胞まではば広い細胞群に作用して、その増殖を促進し少なくとも培養系における誘導的造血においては、未分化な幹細胞の増殖あるいは自己複製にはより多量のIL-3を必要とするものと思われる。

rhEPOについては未だ単一量の検討のみであるが、1u/mlの添加で早期発現CFU-Sのみを増加させるという結果を得ており、その作用はIL-3とは異なるものと思われるがさらに定量的な検討を予定している。血液幹細胞の濃縮法については、初年度計画に沿って免疫磁気ビ-ズを用いて検討を進めているが、抗CD34抗体と抗マウスIgG抗体結合ビ-ズを用いた方法を貧食細胞除去と併用することにより、ヒトの造血前駆細胞(CFU-GM,BFU-E,CFU-mix)については20倍程度の濃縮が可能であった。現在他の抗体との併用によりさらに濃縮率をあげる方法を試みている。第2年度も引きつずき、短期液体培養と脾コロニ-法を用いて、CFUーS各群の増殖因子に対する反応性につてて検討した。まず初年度の検討結果を基に、150mg/kgの5FU投与2日後の骨髄細胞を用いてrmIL3の5FU抵抗性幹細胞にたいする作用について検討した。結果は、培養2ー4日目に後期発現CFUーS数の有意の増加を認め、ILー3がより未分化な幹細胞にも増殖刺激作用を有することが示唆された。次に0.1ー10.0u/mlのrhEPOを用いてCFUーSの反応曲線をとると、早期発現CFUーSは濃度依存性に増加を認めたが、後期発現CFUーSは全く増加を示さなかった。さらに200μCiの^3HーTdRを用いて自殺実験を行ったところ、培養開始24時間目にはILー3添加群、EPO添加群ともに早期発現および後期発現CFUーSの両者において、DNA合成期比率の有意の増加を認めた。以上の結果から、ILー3とEPOはいずれも造血幹細胞の両群に対して増殖刺激作用を有するが、ILー3が幹細胞の自己再生を含む広範な造血細胞群に働くのに対し、EPOは主として分化を伴う増殖を刺激し、その結果より分化の進んだ早期発現CFUーSのみを増加させるものと考えられる。次に同様の方法でrhILー6の作用について検討した。ILー6単独の添加ではCFUーSの増加は全く認められなかったが、ILー3に加えて添加することにより2日培養でCFUーSの両群をさらに軽度増加させた。しかし6日培養では有意の増加は認められなかった。血液幹細胞の純化については、初年度に引きつずき、免疫磁気ビ-ズと抗CD34抗体を用いてヒト前駆細胞の濃縮を行い、抗T,抗B抗体によるnegative selectionを組み合われることでさらに高い濃縮率をあげたが、結果の再現性に問題があり、現在KGーla細胞を用いてより効率よくビ-ズ分離をするための基礎実験を行っている。またマウス血液細胞の分化抗原にたいする抗体が入手できたので、これを用いてマウス幹細胞の濃縮も試みている。最終年度にあたり、前年度までの成果を基にまとめの作業に入るとともに、一部は昨年度に行ったILー6の作用についての再検討し、また最近クロ-ニングされその作用が注目されているサイトカインであるLeukemia Inhibitory Factor(LIF)及びStem Cell Factor(SCF)について、これまでと同様の実験系で検討した。1000u/mlの濃度のILー6またはLIFの添加により48時間培養後のCFUーSは、無添加対象に比べ最高2倍までの軽度の増加傾向が見られたが、明らかな濃度依存性は認められなかった。しかしILー3の共存下ではILー6はCFUーS_8とCFUーS_<12>の両群に、LIFは主としてCFUーS_<12>に20ー30%の上乗せ効果が見られた。
下肢の筋特性を考慮したFES交互屈伸運動システムの構築と評価法に関する研究

本研究の目的は,下肢の下肢の運動機能に問題を抱える人の残存する筋肉の筋力維持と運動特性の向上を目指し,機能的電気刺激(Function Electrical Stimulation,以下FESと呼ぶ)を用いた下肢リハビリテーションシステム(以下,下肢リハビリシステム)を提案することであり,具体的にはFESペダリング運動とFESローイング運動(ボート漕ぎ)の利点を兼ね備えたFES交互屈伸運動に対する制御手法の確立,リカンベントトライクを用いたリハビリシステムの構築ならびに評価方法の検討を実施することである.本年度は下肢の交互屈伸運動をオイラーラグランジュシステムとしてモデル化し,筋の出力方向を考慮した刺激方法を制御入力とした開ループ系を構成した.そして,目標軌道に沿って下肢を運動させるための制御則を提案し,構成される閉ループ系における安定性をリアプノフの安定定理に基づいて理論的に示した.そして,既存のリカンベントトライクのペダリング機構を交互屈伸運動を実現する機構に変更した.具体的には,チェーン・プーリギア機構により左右のペダルが180度の位相差を持ったまま直線運動させることを実現し,フリーホイールを複数用いることで下肢より得られる直線運動を回転運動に変換する機構を実現した.構築したFES交互屈伸リハビリシステムを用いて,協力関係のある病院にて片麻痺患者に試乗してもらうことで,安全に使用するための問題点を検討した.具体的には,機構可動部の耐久性について改善を要する.また,屋内環境における健常者での検証実験により,屋外環境での走行での可能性を示した.上述した成果の一部を論文としてまとめて投稿中である.機能的電気刺激を用いた交互屈伸運動に対する制御則を提案し安定性解析をおこなった.そして,既存のリカンベントトライクのペダリング機構を交互屈伸運動を実現する機構に変更することで,FES交互屈伸リハビリシステムを構築した.また,屋内環境における健常者での検証実験により,おおむね構築したシステムが予定したように稼動しているため,計画通りに進展していると判断する.提案した制御則では筋力比率を既知としているため,被験者個人に合うようなパラメータ更新則を検討する.実験システムにおいては,路面状況が変化する屋外環境においての検証実験や,非健常者を被験者とした検証実験の実施準備を進める.そして,筋活動量を考慮した評価方法について検討する.本研究の目的は,下肢の下肢の運動機能に問題を抱える人の残存する筋肉の筋力維持と運動特性の向上を目指し,機能的電気刺激(Function Electrical Stimulation,以下FESと呼ぶ)を用いた下肢リハビリテーションシステム(以下,下肢リハビリシステム)を提案することであり,具体的にはFESペダリング運動とFESローイング運動(ボート漕ぎ)の利点を兼ね備えたFES交互屈伸運動に対する制御手法の確立,リカンベントトライクを用いたリハビリシステムの構築ならびに評価方法の検討を実施することである.本年度は下肢の交互屈伸運動をオイラーラグランジュシステムとしてモデル化し,筋の出力方向を考慮した刺激方法を制御入力とした開ループ系を構成した.そして,目標軌道に沿って下肢を運動させるための制御則を提案し,構成される閉ループ系における安定性をリアプノフの安定定理に基づいて理論的に示した.そして,既存のリカンベントトライクのペダリング機構を交互屈伸運動を実現する機構に変更した.具体的には,チェーン・プーリギア機構により左右のペダルが180度の位相差を持ったまま直線運動させることを実現し,フリーホイールを複数用いることで下肢より得られる直線運動を回転運動に変換する機構を実現した.構築したFES交互屈伸リハビリシステムを用いて,協力関係のある病院にて片麻痺患者に試乗してもらうことで,安全に使用するための問題点を検討した.具体的には,機構可動部の耐久性について改善を要する.また,屋内環境における健常者での検証実験により,屋外環境での走行での可能性を示した.上述した成果の一部を論文としてまとめて投稿中である.機能的電気刺激を用いた交互屈伸運動に対する制御則を提案し安定性解析をおこなった.そして,既存のリカンベントトライクのペダリング機構を交互屈伸運動を実現する機構に変更することで,FES交互屈伸リハビリシステムを構築した.また,屋内環境における健常者での検証実験により,おおむね構築したシステムが予定したように稼動しているため,計画通りに進展していると判断する.提案した制御則では筋力比率を既知としているため,被験者個人に合うようなパラメータ更新則を検討する.実験システムにおいては,路面状況が変化する屋外環境においての検証実験や,非健常者を被験者とした検証実験の実施準備を進める.そして,筋活動量を考慮した評価方法について検討する.購入を検討していたセンサが,通信方法の問題で既存のシステムに組み込むことが難しいことが判明したため,購入を見送った.現在,代わりとなるセンサを調査し再検討しているため,その分の予算を次年度に使用する予定である.
バイオフィルム形成阻害を目指したバクテリアのシグナル物質分解技術の開発

環境面や医療面において多大な問題を引き起こしている微生物が形成する生物膜(バイオフィルム)に対する新技術として、バイオフィルム形成を制御している細胞間情報伝達機構を阻害する技術の応用を進めた。細胞間情報伝達機構のシグナル物質を分解する天然酵素を種々取得することに成功し、バイオフィルム形成阻害に対する有用性を確認した。また、シグナル物質をトラップ、分解する化学的手法の開発にも成功し、そのバイオフィルム形成阻害に対する有用性も確認した。環境面や医療面において多大な問題を引き起こしている、微生物が形成する生物膜(バイオフィルム)の除去は、現在、強力な薬剤の使用や物理的な洗浄に頼っている。この従来の手法に代わる新技術として、我々は細胞間情報伝達機構(Quorum Sensing)を阻害することによるバイオフィルム形成制御の手法の開発を進め、一定の成果を収めてきた。そこで、本研究課題では、より一層効果的なバイオフィルムの形成阻害技術を確立するために、Quorum Sensingに関わるシグナル物質を積極的に分解する技術を確立し、Quorum Sensingを阻害することによる新たなバイオフィルム形成制御技術の開発を目的としている。今年度は、グラム陰性細菌のQuorum Sensingシグナル物質であるアシル化ホモセリンラクトン(AHL)の分解細菌のスクリーニングを行なった。その結果、植物葉面細菌より種々のAHL分解細菌の取得に成功し、その同定を行なった。さらに、AHL分解能を有する新規化合物として、アミノ酸残基を導入した修飾シクロデキストリンの合成を行ない、AHL包接能、分解能について検討を開始した。今年度は、昨年度に引き続き、グラム陰性細菌のQuorumSensingシグナル物質であるアシル化ホモセリンラクトン(AHL)の分解細菌のスクリーニングを、様々な試料を用いて行なった。その結果、植物葉面細菌に加えて、植物根面細菌、そして、下水処理場で用いられている活性汚泥中より種々のAHL分解細菌の取得に成功し、その同定を行なった。活性汚泥中からのAHL分解細菌の取得と同定はこれまでに例がない。一方、AHL分解能を有する新規化合物として、種々のアミノ基を導入した修飾シクロデキストリンの合成を行ない、その分解能について検討を行なった。アミノ基修飾シクロデキストリンは、比較的短時間でAHLのラクトン環の開裂を引き起こすことが示された。AHL分解能を有する化合物の合成は、今まで報告されていない。バイオフィルム形成実験については、フローセル系での実験系を確立し、静置系との比較検討を開始した。これまで、直接の比較検討例はほとんどなく、成果が期待される。環境面や医療面において多大な問題を引き起こしている微生物が形成する生物膜(バイオフィルム)除去は、現在、強力な薬剤の使用や物理的な洗浄に頼らざるを得ない。この従来の手法に代わる新技術として、本研究課題では、細胞間情報伝達機構(Quorum Sensing)を阻害することによるバイオフィルム形成制御の手法の開発を進め、本年度は下記のとおりの成果を収めた。I.グラム陰性細菌のQuorum Sensingシグナル物質であるアシル化ホモセリンラクトン(AHL)の新規分解細菌を種々取得し、分解酵素のスクリーニングにも成功した。AHL分解細菌を共培養することにより、対象細菌のQuorum Sensingが抑制されること、また、取得したAHL分解酵素を組み込むことにより、対象細菌のバイオフィルム形成能が低減することに成功した。II.グラム陰性細菌のQuorum Sensing制御物質として、新規な修飾シクロデキストリンの合成に成功した。得られた修飾シクロデキストリンによるAHLの分解が観測された。また、得られた修飾シクロデキストリンの培養液中への添加により、Quorum Sensing阻害能が観測され、さらに、緑膿菌などのバイオフィルム形成阻害能も確認された。III.バイオフィルム形成実験手法について、マイクロタイタプレートを用いる静置培養法とフローセルを用いた培養法の比較を行い、両者が示す結果が場合によって異なることを明らかにした。得られた結果をもとに、その評価の指針を構築することに成功した。種々の環境試料中より、Quorum Sensingシグナル物質であるアシル化ホモセリンラクトン(AHL)の分解細菌の単離と同定に成功した。特に、活性汚泥中からの取得は初めての報告である。また、AHL分解能を有する新規化合物の合成に成功した。24年度が最終年度であるため、記入しない。さらに多くの環境試料中よりQuorum Sensingシグナル物質であるアシル化ホモセリンラクトン(AHL)の分解細菌の単離と同定を進め、利用可能な酵素の単離や微生物の直接利用を検討する。
ヒストンメチル化酵素を標的とした創薬への挑戦

ヒストンH3の9番目のリジンのメチル化に関与するSETDB1と、この酵素によるトリメチル化に必要なMCAF1との相互作用について調べ、1から195番目のSETDB1分子と、562817番目のMCAF1分子とが複合体を形成している事を確認した。また、この複合体の構造を明らかにするために両タンパク質を大腸菌で発現させ、精製を行い、結晶化に用いる試料を調製した。次にSETDB1の欠失変異体について、これらの翻訳後修飾と酵素活性を調べた。そして、酵素活性にユビキチン化修飾が必要である事を明らかにした。SETDB1とMCAF1の相互作用を調べるために、まずSETDB1の欠失変異体を作製し、全長のMCAF1との複合体形成を免疫沈降実験で調べた結果、SETDB1のN末端から195番目のアミノ酸配列領域までで相互作用することがわかった。これまでMCAF1については、562から817番目の領域がそれに関与することが報告されていたため、この領域とさらに範囲を絞り込んだ567から669番目の領域について、SETDB1の1から195番目の領域との複合体形成を調べた。その結果、MCAF1のいずれの領域もSETDB1の1から195番目の領域と相互作用することが判明した。そこで次に、これら相互作用しているMCAF1ーSETDB1タンパク質複合体の立体構造を明らかにするために、この複合体タンパク質の精製を行った。構造解析が容易なように最小分子同士の複合体を解析することにした。GSTとHisタグを付加したSETDB1分子(1から195番目)と、MCAF1分子(567から669番目)を同時に大腸菌で発現させ、複合体が形成されている状態での精製を試みた。細胞を破砕後、可溶性画分について、NiアフィニティークロマトグラフィーおよびGSTアフィニティークロマトグラフィーを行い粗精製を行った後、プロテアーゼでタグを切断してタグのついていない複合体の精製を行った。しかし、タグがついている時に粗精製ができていた複合体がタグを切ることによって不安定になり、生成物が見られなくなった。そこでタグ付き状態での複合体の精製を行った。この精製タンパク質複合体を用いて結晶化を試みているが、現時点で結晶は得られていない。一方、SETDB1の構造と機能の解析から、C末端側の修飾が機能と関係することを示唆するデータが得られ、N末端側の相互作用の解析に加え、C末端側の修飾についても創薬標的としての検討の必要性があることがわかった。ヒストンH3の9番目のリジンのメチル化に関与するSETDB1と、この酵素によるトリメチル化に必要なMCAF1との相互作用について調べた。昨年度は1から195番目のSETDB1と、567669番目のMCAF1との複合体の精製を試み、不安定な構造のためタグを除去した複合体を得る事ができなかったため、今年度は少し大きい562817番目のMCAF1を用いて発現、精製を行った。SETDB1(1-195)にGSTタグおよびHisタグを導入し大腸菌で両タンパク質の共発現後、GSTアフィニティクロマトによる精製を行ったところ、MCAF1も含まれていた。これにより複合体として存在している事が判明したため、アフィニティー精製後にタグを切断し、再度アフィニティ精製、ゲル濾過クロマトを行い、複合体を単離する事ができた。現在結晶化のスクリーニングを行っている。SRTDB1の翻訳後修飾については、動物細胞でSETDB1の発現を行った場合にはSDS-PAGEで2本のバンドが検出されるが、大腸菌での発現では1本しか見られない事から、翻訳後修飾が動物細胞内で行われている事が予想された。また大腸菌で発現された分子は酵素活性がみられない事から、この修飾が酵素活性に重要である事が示唆された。そこで、種々N末端側を欠失させたSETDB1変異体をHeLa細胞で発現させ、翻訳後修飾と酵素活性を調べたところ、N末端から570アミノ酸を欠如しても修飾され酵素活性も有しているが、681アミノ酸を欠如すると、両方とも無くなる事がわかった。そこで、これら2つの変異体について、どのような違いがあるかを質量分析装置を用いて調べたところ、ユビキチン化に違いが見られた。そこで抗ユビキチン化抗体によるウエスタンブロット解析を行ったところ、酵素活性のある変異体(全長分子を含む)は全てユビキチン化されていた。本研究で初めて、SETDB1のユビキチン化と酵素活性との関係を明らかにすることができた。分子生物学平成25年度実施計画のSETDB1とMCAF1の相互作用部位の同定と複合体の精製については、予定通り精製方法が確立でき当初到達レベルまで達成できており、結晶化の試みまで至っている。

一方、その過程においてSETDB1分子が修飾を受けることがわかり、またその修飾が活性に関与していることもわかってきた。そこで、当初は創薬の標的をSETDB1とMCAF1に絞って、構造解析とスクリーニング系の確立を計画していたが、創薬標的の視野を拡げる意味から、スクリーニング系の構築を後回しにして、先にSETDB1の修飾を標的とした解析を計画に入れて研究を進めることに変更した。従ってスクリーニング系の構築は、ベクターの作製段階で止まっているが、新たな修飾と活性に関する知見を得ることができている。11.の達成度の部分で記したが、SETDB1とMCAF1の相互作用を標的にした創薬アプローチについては、これまでの計画通り複合体の精製、結晶構造解析をとおして立体構造解析を行うが、別の作用点としてSETDB1のC末端側の修飾についても解析を行い、活性を抑える標的探索を進める。ヒストンメチル化酵素SETDB1タンパク質について、多方面からのアプローチを試みたい。実験を遂行している中で、SETDB1分子が修飾を受けることがわかり、またその修飾が活性に関与していることもわかってきた。そこで、当初は創薬の標的をSETDB1とMCAF1に絞って、構造解析とスクリーニング系の確立を計画していたが、創薬標的の視野を拡げる意味から、スクリーニング系の構築を後回しにして、先にSETDB1の修飾を標的とした解析を計画に入れて研究を進めることに変更したため、未使用額が生じた。次年度は、計画通りの複合体の精製、結晶構造解析に加え、新たな計画であるSETDB1のC末端側修飾に着目した新たな標的解析を先行して進めることを計画しており、これらを実行するために使用させていただきたい。
煮熟に伴う貝類の呈味成分の変化に関する研究

1)加熱に伴なうエキス成分の変化:加熱に伴ないアサリエキス中の遊離アミノ酸の減少、結合アミノ酸の増加しが、アミノ酸分析およびセファデックスG-10ゲルろ過により明らかにされた。加熱に伴う最も大きな変化は、タンパク質の細切化に伴うペプチドの生成にあると推定されたので、イオン交換、HPLC(アサヒパックGS-220、GS-320)による分離を行った。その結果、加熱に伴ない酸性画分の量が増加し、低分子ペプチドが生成していることを明らかにすることができた。現在、ペプチドを単離すべく検討中である。2)アサリ,アカガイ、トリガイの3種の貝について呈味成分の分析を行った結果、主要アミノ酸量には大きな差が認められなかったが、アカガイではβ-Ala、トリガイでは大量の結合アミノ酸が検出された。これらが、それぞれの貝の味の特徴を反映しているか否かを合成エキスを調製して検討した。3)アサリ、アカガイ、トリガイの合成エキスの味:アサリは生の貝の味、カニ様の味、とろみがあり舌にからみつく、後味が強いが先味は弱い、こく広がりがあると評価された。トリガイは塩あじが強いことを指摘する者が多かった。アサリと異なり先味が強く後味が弱いことが挙げられ、カニの味、貝様のフレーバーを有する点では一致していた。アカガイの場合には、貝の味があり、先味も後味も強く特に甘味が後に残ると指摘された。トリガイと同じく塩あじが強いいことも指摘された。これらの合成エキスの味に対する評価と成分との関係は目下検討中である。4)合成エキス中における各成分の役割:Gluを欠いた場合にはは、うま味ならびに持続性、複雑さ、こく等が少なくなる。コハク酸は五基本味には余り影響はないが、複雑さ、こく等の風味質と関連していた。AMPもコハク酸と同様な役割を果たし、Glyは甘味並びに風味質に関与していることが明らかとなった。1)アサリ,アカガイ,トリガイの熱水およびTCAエキスを調製し,それらのエキス窒素量,含窒素化合物および有機酸の分析を行った.2)エキス窒素量アサリ(熱水718mg/筋肉100g, TCA350mg/筋肉100g,以下は同様),アカガイ(663mg, 570mg),トリガイ(674mg, 546mg)であった. 3)遊離アミノ酸アサリ(熱水)ではGly(854mg), Tau(553mg), Arg(346mg)が極めて多く,ついでGlu(68mg), β-Ala(54mg)の順であったが他の成分は少なかった.アカガイ(熱水)では, Tau(640mg), β-Ala(635mg), Gly(199mg), Glu(167mg), Ala(162mg), Arg(106mg), Asp(45mg)等が多かった.トリガイではTau(737mg), Gly(247mg), Glu(98mg), Arg(91mg), Ala(87mg), Orn(63mg)等が多かった.各TCA抽出液は,熱水抽出液とほぼ同様の傾向を示した.4)結合アミノ酸加水分解後に増加したアミノ酸は,アサリおよびアカガイでは, GluとGlyを除くとわずかであった.

トリガイではGlu(120mg), Asp(93mg), Lys(85mg), Arg(54mg)の他, Gly, Leu, Pro, Ser等の増加が認められた.5)核酸関連物質アサリおよびアカガイではAMP(それぞれ21, 26mg)が最も多く,イノシン,ヒポキサンチンは少なかった.トリガイではイノシン4mg, AMP2mg検出された.6)TMAOアサリおよびトリガイではそれぞれ24, 15mg,アカガイでは1mgであった.TMAはアサリ(3mg),アカガイ(1mg),トリガイ(5mg)であった. 7)4級アンモニウム塩基アサリ(グリシンベタイン5mg,ホマリン5mg,トリゴネリン2mg),アカガイ(27mg, 8mg, 1mg),トリガイ(14mg, 11mg, 1mg)であった.8)無窒素成分各貝とも有機酸としてはシュウ酸が最も多く,ついでコハク酸,乳酸,プロピオン酸の順であった.1)加熱に伴うエキス成分の変化:アサリは通常加熱してから食されるが加熱に伴いエキス成分に生ずる変化をセファデックG-10ゲルろ過およびアミノ酸組成から検討した。セファデックスゲルろ過により、加熱することにより生エキスには存在しない低分子ペプチドのピークが出現し同時にタンパク質と考えられる高分子のピークが消失した。また、加熱により遊離アミノ酸量は減少するが、結合アミノ酸量は増加し、ゲルろ過の結果と一致していた。2)アサリ、アカガイ、トリガイの呈味成分について:遊離アミノ酸組成は三者ともTau、Gly、AlaおよびArgが多い点は類似していた。アカガイではこの他にβ-Alaが、トリガイではOrnが著量認められた。結合アミノ酸については、トリガイにGlu、Gly、Leu、Lys等が著量検出され、アサリやアカガイとは異なる様相を呈した。3)殻付きとむき身のアサリより得たエキスの違い:味は殻付きの方が良いとの評価を得た。組成を比較してみると両者の最も大きな違いはNa^+およびCl^-の量にあった。窒素化合物、その他のイオン類には大きな差は認められず、殻付きより得ただし汁の味の良さはNaCl量と関連しているものと推定された。4)合成エキスのオミッションテスト:アサリ熱水抽出エキスの分析結果をもとにして市販の薬品を混合し、合成エキスを調整した。合成エキスは官能検査員により貝らしい味がする、アワビのような味がする等を評価された。オミッションテストはAxg、AMP、ベタイン、コハク酸、Tau、Glu、Glyおよびβ-Alaについて実施しこの中ではGlu、コハク酸、Gly、B-Ala、AMP等がアサリの味の発現に深く関与していることが明らかとなった。コハク酸の貝類の呈味発現に果す役割については今迄懸案事項であったが、本研究によりアサリの味に関係していることが判明した。
長距離輸送される桜島煙の遠隔地での検出手法に関する研究

桜島の南側にある鹿児島市の有村観測所において粉じん試料を採取した.この時は北西風が吹いたため桜島からの噴煙が山の斜面を降りて観測所に達した.この採取を2回行った.比較試料として鹿児島市で採取された爆発時の降灰を鹿児島県の環境センターよりいただいた.遠隔地で採取された試料として沖縄で採られた粉じん試料,隠岐,屋久島等で採られたものを準備した.爆発でない常時出ている状態の噴煙の試料を酸分解し誘導結合プラズマ質量分析装置を用いて元素分析した.同時に鉛同位体比を測定した.同様に降灰の分析を行いデータの比較を行った.結果としてビスマス,タリウム,錫,鉛などの揮発性元素が噴煙中に濃縮されていることがわかった.特にビスマス,タリウムは濃縮度が高く指標元素として使えるものと考えられた.一方鉛同位体比は両者変わらず日本の基本的な岩盤と同じ値を持っていた.従ってこれに関しては指標性は期待できなかったが補助的には使えると思われた.この結果から,ビスマス,タリウムに着目して測定を行うこととした.沖縄で特に北向きの風が強い時期に硫酸塩濃度が高い場合があり,この原因の一つとして桜島などの火山からの影響が想定された.また隠岐島で南西風時に高い硫酸塩が観測された場合などを検討した.その結果,沖縄の高硫酸塩濃度時には相対的に高いビスマス,タリウム濃度が観測され,火山からの影響があると考えられた.ただしそれらの濃度変化は硫酸の変化とは少し異なっており,なにか別の要因の検討が必要と考えられた(例えば桜島以外の火山からの影響など),一方,隠岐での場合は,特にビスマス,タリウムの濃縮がみられず,人為起源のものと判定された.今後,桜島に比較的近い屋久島での試料でのさらに検討を行いこれらの現象を確かめる予定である.桜島の南側にある鹿児島市の有村観測所において粉じん試料を採取した.この時は北西風が吹いたため桜島からの噴煙が山の斜面を降りて観測所に達した.この採取を2回行った.比較試料として鹿児島市で採取された爆発時の降灰を鹿児島県の環境センターよりいただいた.遠隔地で採取された試料として沖縄で採られた粉じん試料,隠岐,屋久島等で採られたものを準備した.爆発でない常時出ている状態の噴煙の試料を酸分解し誘導結合プラズマ質量分析装置を用いて元素分析した.同時に鉛同位体比を測定した.同様に降灰の分析を行いデータの比較を行った.結果としてビスマス,タリウム,錫,鉛などの揮発性元素が噴煙中に濃縮されていることがわかった.特にビスマス,タリウムは濃縮度が高く指標元素として使えるものと考えられた.一方鉛同位体比は両者変わらず日本の基本的な岩盤と同じ値を持っていた.従ってこれに関しては指標性は期待できなかったが補助的には使えると思われた.この結果から,ビスマス,タリウムに着目して測定を行うこととした.沖縄で特に北向きの風が強い時期に硫酸塩濃度が高い場合があり,この原因の一つとして桜島などの火山からの影響が想定された.また隠岐島で南西風時に高い硫酸塩が観測された場合などを検討した.その結果,沖縄の高硫酸塩濃度時には相対的に高いビスマス,タリウム濃度が観測され,火山からの影響があると考えられた.ただしそれらの濃度変化は硫酸の変化とは少し異なっており,なにか別の要因の検討が必要と考えられた(例えば桜島以外の火山からの影響など),一方,隠岐での場合は,特にビスマス,タリウムの濃縮がみられず,人為起源のものと判定された.今後,桜島に比較的近い屋久島での試料でのさらに検討を行いこれらの現象を確かめる予定である.
膀胱平滑筋におけるムスカリン性アセチルコリン受容体の役割と機能的意義

これまで、膀胱平滑筋には様々なムスカリン受容体が存在し、その役割がサブタイプにより異なることをin vitroにおいて検討した。昨年はin vivoにおいて、骨盤神経刺激で膀胱平滑筋を収縮させ、膀胱内圧を測定する方法を確立した。本年はその実験系を応用し、マイクロダイアリシス法を併用して、in vivoでアセチルコリン放出量を測定する方法の確立を行った。また、アトロピンを投与し、膀胱内圧の変化とアセチルコリン放出量の変化を検討した。雌性S-Dラットを麻酔後開腹し、両側尿管を同定し結紮切断した。経尿道的に20Gのアンギオカテーテルを膀胱内に挿入し、外尿道口とともに結紮し固定した。膀胱内には排尿反射が起こらない最大量の生理食塩水を注入し、膀胱内のカテーテルを圧トランスデューサに接続し、膀胱内圧変化を記録した。また、膀胱頂部に専用透析プローブを刺入し、透析液を2μl/minで還流させ、10分毎に透析液を回収した。片側の骨盤神経は結紮切断し、残りの骨盤神経を十分剥離した後、末梢側に糸をかけて切断し、それをフック型双極電極に乗せ、電気刺激(duration 1msec、frequency 1-10Hz、train60s)を行った。回収した透析液は、電気化学検出器付き高速液体クロマトグラフィーに注入し、解析装置でアセチルコリン量を測定した。アトロピンを経静脈的に投与し、膀胱内圧、アセチルコリン放出量を検討した。骨盤神経の電気刺激により、膀胱内圧は2相性に収縮反応を示し、周波数依存性に増加反応を示した。また、アトロピンの投与により、膀胱内圧の持続相は濃度依存性に抑制されたが、アセチルコリンの放出量には有意な変化は認められなかった。以上の結果から、ラット膀胱におけるムスカリン受容体の役割は様々であり、本法によりin vivoにおいてもムスカリン受容体の薬理学的解析が可能であることが示唆された。ムスカリン性アセチルコリン受容体は膀胱の収縮機構において重要な役割を果たしており、頻尿、尿失禁治療薬として抗コリン剤が、排尿筋収縮力低下の治療薬としてコリン作動薬やアセチルコリンエステラーゼ阻害薬が臨床応用されている。最近ムスカリン受容体はいくつかのサブタイプに分類されており、膀胱におけるサブタイプの役割を検討することで、様々な病態に応じた治療の開発が可能であると考えられる。本年はIn vitroにおいて膀胱平滑筋におけるシナプス前後の受容体サブタイプの役割を検討した。家兎を麻酔し、膀胱を摘出し、幅3mm、長さ10mmの平滑筋条片を作成した。作成した平滑筋条片にマイクロダイアリシス用のプローブを刺入し、Ringer液を潅流させながら等尺性トランスデューサを接続した筋浴槽内に固定した。これらに経壁電気刺激を行い、その際の張力変化と、回収した透析液中のアセチルコリン濃度を高速液体クロマトグラフィーで測定した。収縮反応とアセチルコリン放出量に対する各種選択的ムスカリン性アセチルコリン受容体拮抗薬の影響を検討した。アトロピン(非選択的拮抗薬)、4-DAMP(M3拮抗薬)はアセチルコリンの放出量を変化させなかったが、収縮力は著明に抑制された。ピレンゼピン(M1拮抗薬)はアセチルコリンの放出量と、収縮反応を減少させた。メトクトラミン(M2拮抗薬)はアセチルコリンの放出量は増加させたが、収縮反応には影響を与えなかった。以上の結果から膀胱平滑筋におけるムスカリン受容体の役割はサブタイプにより異なることが考えられた。今後ヒトにおいての検討や、in vivoでの検討を継続していく予定である。昨年までの研究において、膀胱平滑筋には様々なムスカリン受容体が存在し、その役割がサブタイプにより異なることがin vitroにおいて示唆された。そこで、本年はin vivoで同様の作用があるか検討するために、ラットを実験動物として、In vivoで骨盤神経を電気刺激し、膀胱内圧測定を行う方法の確立を行った。生後2ヶ月の雌性S-Dラットを900mg/kgのウレタンの皮下投与にて麻酔後、開腹し、両側尿管を同定し結紮切断した。膀胱内圧測定は経尿道的に20Gのアンギオカテーテルを膀胱内に挿入し、外尿道口とともに結紮し固定した。膀胱内には排尿反射が起こらない最大量の生理食塩水を注入しておき、このアンギオカテーテルを圧トランスデューサに接続し、圧変化を記録した。骨盤神経は手術用拡大鏡を用いて確認し、片側の骨盤神経は結紮切断し、残りの骨盤神経を十分剥離した後、結紮切断し、末梢側は糸をかけて確保しておいた。その糸を用いて骨盤神経をフック型双極電極に乗せ、ビニールにて絶縁し、電気刺激(duration 1msec、frequency 10Hz、train 60sec)を1分間隔で5回行った。骨盤神経の電気刺激により、膀胱内圧は二相性に収縮反応を示した。また、周波数依存性にその収縮反応は増加反応を示した。以上の実験からラットにおいてin vivoでの骨盤神経刺激による膀胱内圧測定が可能であることが確認された。今後、この実験系においてin vitroでのマイクロダイアリシスの方法を応用し、アセチルコリンの回収、測定法を確立していき、さらに薬剤の投与を行うことでムスカリン受容体のサブタイプの役割を検討していく予定である。

これまで、膀胱平滑筋には様々なムスカリン受容体が存在し、その役割がサブタイプにより異なることをin vitroにおいて検討した。昨年はin vivoにおいて、骨盤神経刺激で膀胱平滑筋を収縮させ、膀胱内圧を測定する方法を確立した。本年はその実験系を応用し、マイクロダイアリシス法を併用して、in vivoでアセチルコリン放出量を測定する方法の確立を行った。また、アトロピンを投与し、膀胱内圧の変化とアセチルコリン放出量の変化を検討した。雌性S-Dラットを麻酔後開腹し、両側尿管を同定し結紮切断した。経尿道的に20Gのアンギオカテーテルを膀胱内に挿入し、外尿道口とともに結紮し固定した。膀胱内には排尿反射が起こらない最大量の生理食塩水を注入し、膀胱内のカテーテルを圧トランスデューサに接続し、膀胱内圧変化を記録した。また、膀胱頂部に専用透析プローブを刺入し、透析液を2μl/minで還流させ、10分毎に透析液を回収した。片側の骨盤神経は結紮切断し、残りの骨盤神経を十分剥離した後、末梢側に糸をかけて切断し、それをフック型双極電極に乗せ、電気刺激(duration 1msec、frequency 1-10Hz、train60s)を行った。回収した透析液は、電気化学検出器付き高速液体クロマトグラフィーに注入し、解析装置でアセチルコリン量を測定した。アトロピンを経静脈的に投与し、膀胱内圧、アセチルコリン放出量を検討した。骨盤神経の電気刺激により、膀胱内圧は2相性に収縮反応を示し、周波数依存性に増加反応を示した。また、アトロピンの投与により、膀胱内圧の持続相は濃度依存性に抑制されたが、アセチルコリンの放出量には有意な変化は認められなかった。以上の結果から、ラット膀胱におけるムスカリン受容体の役割は様々であり、本法によりin vivoにおいてもムスカリン受容体の薬理学的解析が可能であることが示唆された。
細胞間接着分子ネクチンによる遺伝子発現の制御機構

細胞間接着は、細胞同士の接着にとどまらず、細胞の分化、増殖、形態変化等に必須の役割を果たしている。上皮細胞間接着は主にタイトジャンクション、アドヘレンスジャンクション(AJ)からなっている。AJではカドヘリン-カテニン系が必須の接着機構として機能しているが、私共は、AJにおけるもう一つの接着機構としてネクチン-アファディン系を見出している。ネクチンは免疫グロブリンスーパーファミリーに属する接着分子で、細胞内裏打ち蛋白質アファディンを介してアクチン細胞骨格系と連結し、カドヘリン-カテニン系と相互作用している。本年度の研究においてネクチンによる遺伝子発現の制御機構について以下の結果を得た。1.上皮細胞においてトランス結合をしていないネクチンが、カドヘリンのトランス結合によるRacへのシグナル伝達を抑制していること、またネクチンのトランス結合によりその抑制が解除されることを明らかにした。2.ネクチンのトランス結合によるCdc42の活性化は、c-SrcおよびCdc42-GEF FRGを介していることを明らかにした。3.トランス結合したネクチンは、アファディン、p120ctnおよびRap1依存的に細胞膜上でE-カドヘリンを安定化させ、E-カドヘリンの細胞内へのエンドサイトーシスを抑制していることを明らかにした(論文revise中)。以上のように、本研究は当初の計画以上の成果が得られ、成功したと考えられる。
有害ガス処理のための触媒反応アシスト型マイクロ波プラズマリアクターの開発

大気に含まれる有害ガスを放電プラズマにより処理するための各種リアクターが提案されてきている。これまで半導体プロセス等の低圧においては,マイクロ波プラズマなどの高周波放電が主に利用され,その有効性が示されてきたが,高気圧での利用にはプラズマを発生させるのが困難であった。本研究では,アルミナチューブで被覆した細長いカーボンロッドをマイクロ波結合素子として用いることで大気圧でプラズマを長時間安定に発生させることに成功した。リアクターは矩形導波管のH面に垂直に挿入した石英ガラス管よりなる。2.45GHzのマイクロ波により加熱したカーボンロッドの先端より熱電子が放出されることによりプラズマが発生可能となる。応用として,窒素酸化物や揮発性有機化合物の一つであるトルエンの分解を行った。分解特性は有電極方式で処理断面積の比較的小さなバリヤ放電など他の非熱平衡プラズマによる処理と同程度であり,特に高濃度での分解に有効であることがわかった。濃度1002000ppm程度の窒素酸化物やトルエンを含み,数L/minの流量で流れる処理ガスに対して,分解率は8095%程度,エネルギー効率は330g/kWhを得た。さらに,光触媒であるTiO_2との併用化の方式を考案した。触媒とプラズマの相乗効果は投入電力が比較的小さいときに現れることを見いだした。本装置の特徴より,真空プロセスチャンバーの排気やドラフトチャンバーから大気側へ放出するガスの処理,吸着剤にためられ高濃度となった有害ガスの後処理などへの適用が考えられる。環境有害ガスの処理や廃棄物処理に大気圧での放電プラズマの利用がある。これまで半導体プロセス等の低圧においては,マイクロ波プラズマなどの高周波放電が主に利用されてきたが,高気圧でのプラズマ発生は困難であった。真空排気装置やドラフトチャンバーなどから大気側へ放出するガス処理などへの適用には特徴あるプラズマの生成法の確立が待たれている。本研究では,アルミナチューブで被覆した細長い黒鉛棒をマイクロ波結合素子として用いることで大気圧でプラズマを長時間安定に発生させることに成功した。数L/minのガス流量に対してプラズマは30W以下の電力で発生できた。応用として,揮発性有機化合物の一つであるトルエンの分解を行った。分解特性は有電極方式で処理断面積の比較的小さなバリヤ放電など他の非熱平衡タイプのプラズマ処理と遜色なく,エネルギー効率としては100ppm程度の低濃度トルエンで数L/minのガス流量に対して最大3g/kWhを得た。さらに,光触媒であるTiO_2との併用化の方式を考案し,検討を行っている。触媒とプラズマの相乗効果は,マイクロ波放電が低電力のときに見られた。

本装置の特徴より,真空プロセスチャンバーの排気やドラフトチャンバーから大気側へ放出するガスの処理,吸着剤にためられ高濃度となった有害ガスの後処理などへの適用が考えられる。
好アルカリ性細菌の呼吸鎖末端酸化酵素の分子構造とプロトンポンプ活性

絶対アルカリ性細菌Bacillus YN-1から呼吸鎖末端酸化酵素を電気泳動的均一にまで精製し、その分光学的性質および分子的性質を明らかにした。また、すでに精製されている通性アルカリ性細菌Bacillus YN-2000のaco型チトクロムc酸化酵素との比較生化学的研究を行なった。絶対アルカリ性細菌Bacillus YN-1の呼吸鎖末端酸化酵素は酸化型で412nm、還元型で442、522、550および597nmにそれぞれ吸収極大を示した。またCO結合型酵素は420、520、550、595nmに吸収極大を、438nmに肩を示した。これらの分光学的特徴は本酵素がcaa_3型であることを示唆し、ヘムの分析結果からも確認された。本酵素はチトクロムc酸化酵素活性を示し、その至適pHは6.5、Vmaxは2.9sec^<-1>、Kmは1.8μMであった。至適pHおよびKmはaco型チトクロムc酸化酵素と相同であったが、Vmaxは約1/10であった。また、精製酵素は分子量53000、46000の2種類のサブユニットからなり、aco型チトクロムc酸化酵素とほぼ同じ分子量のサブユニットから構成されることが明かとなったが、抗aco型チトクロムc酸化酵素抗体とは全く免疫交差しないことから、両サブユニットともaco型酵素のサブユニットとはその蛋白質構造がかなり異なることが示唆された。さらに本酵素は1分子中に銅を1原子持っていた。2原子の銅(Cu_A、Cu_B)を含aco型チトクロムc酸化酵素と本酵素の近赤外スペクトルの比較から、Bacillus YN-1のcaa_3型チトクロムc酸化酵素にはCu_Aが存在しないことが確認された。つぎに精製された酵素をリポソームに再構成し、ウマチトクロムcを用いてプロトンポンプ活性を測定したが、有為なプロトンポンプ活性は見いだされなかった。そこで、本細菌から精製した膜結合性チトクロムc-550を用いてプロトンポンプ活性を測定したが、この場合も有為なプロトンポンプ活性は見いだされなかった。
管内マイクロ噴流の乱流混合と化学反応に関する数値解析的研究

本研究は,分散型エネルギーシステム用熱機関として数kW級マイクロガスタービンに注目し,その主要構成要素である燃焼器内の低レイノルズ数流れの現象を数値解析的手法により解明し,安定でかつ高効率な小型燃焼器の開発を目的としている.燃焼器としては,燃料ノズルを中心に複数の空気噴流孔が環状に取り巻くマルチ噴流孔の提案と開発を行っている.本年度は,このマルチ噴流孔の各噴流孔の大きさと相互位置関係,そして流量が混合促進効果に与える影響を検討し,効果的な燃焼器の形状の開発を行った.まず昨年度に引き続き,燃焼器内の解析に用いる計算コードの改良と開発を,新たに考案した複数の計算手法を取り入れつつ行い,非構造格子に基づく計算コードを完成させた.燃料と空気の混合割合の評価方法として,燃料の質量(濃度)輸送方程式を解き,その拡散分布を基に評価を行っている.その結果,マルチ噴流孔を用いると同軸2円管の場合と比較して混合が促進し,レイノルズ数が100の場合では,燃料が半径方向に十分に拡散するに要する主流方向距離が1/4以下に縮小された.また,レイノルズ数が増大するに従い,この効果がより顕著に表れた.これは,マルチ噴流孔では,それぞれ周方向と管軸方向に軸を持つ三次元的な循環流が形成されることに帰する.これらの循環流は,燃料孔下流で逆流領域を形成し,燃料を管半径方向へ輸送する効果をもたらす.この循環流の大きさ及び位置は,主に燃料と空気の噴流の流速比に影響される.よって燃料と空気の流量比や,噴流孔径比,孔数,そして空気噴流孔の管半径方向位置にそれぞれ混合促進効果の最適値が存在し,その値を本計算結果から見出している.更に,旋回流など噴流孔上流の流れの境界条件を複数検討し,噴流孔下流での燃料と空気の混合現象への影響を示した.また,噴流孔上流部に後ろ向きステップを設け,その設置位置によって噴流孔下流での混合現象を制御する新たな方法も提案している.これらの内容を3本の論文にまとめ,現在国際論文集での掲載待ちとなっている.本研究は,分散型エネルギーシステム用熱機関として数kW級マイクロガスタービンに注目し,その主要構成要素である燃焼器内の低レイノルズ数流れの現象を数値解析的手法により解明し,安定でかつ高効率な小型燃焼器の開発を目的としている.燃焼器としては,燃料ノズルを中心に複数の空気噴流孔が環状に取り巻くマルチ噴流孔の提案と開発を行っている.本年度は,このマルチ噴流孔の各噴流孔の大きさと相互位置関係,そして流量が混合促進効果に与える影響を検討し,効果的な燃焼器の形状の開発を行った.まず昨年度に引き続き,燃焼器内の解析に用いる計算コードの改良と開発を,新たに考案した複数の計算手法を取り入れつつ行い,非構造格子に基づく計算コードを完成させた.燃料と空気の混合割合の評価方法として,燃料の質量(濃度)輸送方程式を解き,その拡散分布を基に評価を行っている.その結果,マルチ噴流孔を用いると同軸2円管の場合と比較して混合が促進し,レイノルズ数が100の場合では,燃料が半径方向に十分に拡散するに要する主流方向距離が1/4以下に縮小された.また,レイノルズ数が増大するに従い,この効果がより顕著に表れた.これは,マルチ噴流孔では,それぞれ周方向と管軸方向に軸を持つ三次元的な循環流が形成されることに帰する.これらの循環流は,燃料孔下流で逆流領域を形成し,燃料を管半径方向へ輸送する効果をもたらす.この循環流の大きさ及び位置は,主に燃料と空気の噴流の流速比に影響される.よって燃料と空気の流量比や,噴流孔径比,孔数,そして空気噴流孔の管半径方向位置にそれぞれ混合促進効果の最適値が存在し,その値を本計算結果から見出している.更に,旋回流など噴流孔上流の流れの境界条件を複数検討し,噴流孔下流での燃料と空気の混合現象への影響を示した.また,噴流孔上流部に後ろ向きステップを設け,その設置位置によって噴流孔下流での混合現象を制御する新たな方法も提案している.これらの内容を3本の論文にまとめ,現在国際論文集での掲載待ちとなっている.
歯の形態形成におけるステロイド受容体の役割-ステロイド療法の歯への作用機序解明-

糸球体腎炎や腎臓移植等によりステロイド療法を受けた患者に、歯髄腔の狭小、象牙前質の拡大、歯の発生段階では萌出速度の異常がみられることが知られている。また、歯の窩洞に副腎皮質ホルモンを直接投与した実験では象牙前質の縮小、象牙芽細胞層の不規則化といったさまざまな歯の異常が報告されている。我々は、ステロイドホルモン受容体であるエストロゲンレセプターが歯性細胞、特にエナメル芽細胞に特有のパターンを持って発現していることを報告し、また、ステロイドホルモンの標的タンパクである、amiloride-感受性Naイオンチャンネル膜貫通型タンパク複合体(ENaC)の歯性上皮系細胞における発現局在を明らかにした。さらに、他の研究グループより培養細胞でのENaCの発現の制御に、エストロゲンレセプターが関与していることが報告され、歯牙組織、特に歯性上皮性細胞でのエストロゲンレセプターとENaCの発現パターンの類似性に関して、また、歯性上皮でのステロイドホルモンの重要性が明らかになりつつある。これら一連の研究により、主にカルシウムの動態に主眼がおかれていた歯の硬組織における物質輸送は、エナメル器乳頭層細胞がENaCを特異的に発現したことから、ナトリウムイオンの動態、その輸送タンパクの局在に移す必要性が出てきた。さらに,最近の我々の研究により明らかになりつつある乳頭層細胞の形態的変動、毛細血管との局所解剖学的相関関係から、これまで、付加的な細胞、accessory cellとしてしかみなされなかった歯胚乳頭層細胞がエナメル質の成熟過程に重要な役割を果たしている可能性が示唆された。また、歯性上皮細胞、および、間葉系細胞に広範にステロイド受容体(グルココルチコイド受容体、ミネラルコルチコイド受容体)免疫陽性反応が観察されたことにより、歯牙形成過程での、ステロイドホルモンの重要性が示唆された。副腎皮質ホルモン(ステロイド)は身体に様々な副作用を引き起こすことが知られている。しかし、歯および刺繍組織におけるステロイド受容体の発現に関する報告は全くない、そこでわれわれはラット切歯を用いて硬組織および周囲組織形成細胞におけるステロイド受容体の発現の局在を明らかにすることにより、歯の発生過程における、エナメル芽細胞、象牙芽細胞、歯根膜細胞の分化におけるステロイドホルモンの関与を考察している。免疫組織学的手法によるステロイドレセプターの局在について報告する。脱パラ切片を0.03%過酸化水素水による内因性ペルオキシダーゼブロック処理後、PBS洗浄、切片を1%ウシ血清アルブミン含有PBSで30分間、室温で処理し、組織中の非特異的結合を阻害した。それぞれ至適希釈倍率に希釈した、抗血清で4°C、24時間処理。切片をPBSで洗浄後、2次抗体としてビオチン化抗ウサギIgG抗体を用いABC法にて検出した。対比染色はメチルグリーンを用いた。グルココルチコイドレセプター抗体による免疫染色では、エナメル芽細胞では分化の程度に関係なく免疫陽性反応が認められた。また、外エナメル上皮にも、エナメル芽細胞の分化に関係なく強い陽性反応示が認められた。歯根膜組織では線維芽細胞に、歯髄組織では、象牙芽細胞にも強い免疫陽性反応が見られた。ミネラルコルチコイドレセプター抗体による免疫染色では、エナメル芽細胞に免疫陽性反応はなく、成熟期後期外エナメル上皮乳頭層のみ陽性反応が認められた。歯根膜、歯髄組織には免疫陽性反応を認める細胞は存在しなかった。現在、ステロイド療法治療下のヒト乳歯を組織形態学的に検索中である。