hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
日・中・韓の多国籍企業が行う国際経営に関する比較研究

日本、韓国と中国の多国籍企業によるグローバル展開に関する比較を行い、それぞれの組織体制と経営戦略の違いを明らかにした。特に、新興国の市場開拓において、韓国企業に比べて日本企業が現地の消費者のニーズをうまく捉えていない局面が多い。近年、中国企業による海外進出が活発化し、日本企業が中国企業に買収されるケースが増えている。しかし、中国企業は情報公開が不十分で、経営ビジョンも不明確なケースが多く、今後改善していく必要がある。本年度において、文献研究と現地ヒヤリング調査を中心に研究を進めてきた。1.文献研究(財)国際貿易投資研究所やジェトロなどの研究機関が刊行している貿易統計や多国間直接投資に関する報告書を入手し、日・中・韓3カ国の多国籍企業による海外直接投資の状況の把握に努めた。そして、韓国語と中国語の多国籍企業に関する研究論文をレビューし、両国における多国籍企業研究の現状及び分析手法などについての考察も行った。2.現地ヒヤリング調査平成19年9月に韓国ソウルと中国北京において現地の企業及び大学に対するヒヤリング調査を行った。韓国ではサムスン電子、現代自動車の本社、延世大学とソウル大学、中国では、大唐微電子、北京現代自動車、本田技研株式会社北京事務所、トヨタ自動車株式会社中国投資有限公司、中央財経大学と中国社会科学研究院を訪問し、多国籍企業の経営状況と問題点についての調査を行った。また、日本国内では大阪商工会議所国際課、株式会社小肥羊ジャパン(中国の大手しゃぶしゃぶチェーンの日本法人)に対するインタビューも行った。調査を通じて、中国においては日本企業のみならず、韓国企業にも中国戦略の見直しが迫られていること、中小企業を中心に「中国一辺倒」から「中国離れ」へとシフトしつつあることなどが分かった。そして、日本国内での調査では、最近特に中国企業の日本進出が目立つようになり、その進出背景と経営戦略についてかなり新しい視点を得ることができた。1.文献研究(財)国際貿易投資研究所やジェトロなどの研究機関が刊行している貿易統計や多国間直接投資に関する報告書、及びベトナム経済研究所が刊行している『ベトナム経済動向』(月刊誌)、『ベトナム実用法令集』などの資料を入手し、日・中・韓3ヵ国の多国籍企業による海外直接投資の状況の把握、とりわけベトナムに対する直接投資に関する研究に努めた。2.現地ヒヤリング調査平成20年9月にベトナム・ホーチミン市に対する現地調査を行い、現地に進出している日系企業マブチモーター社、ベトナムヤクルト社、プラスベトナム社、大晃機械(株)、オムロンヘルスケア社、フォスター電機社を訪問し、ヒヤリング調査を行った。また、研究代表者の孫飛舟は同年9月に中国北京に行き、北京中央財経大学、トヨタ自動車株式会社中国投資有限公司、ダイハツ自動車北京事務所、マツダ自動車北京事務所及び北京現代自動車に対するヒヤリング調査を行った。ベトナムでの調査では、日系各社の「チャイナ+1」戦略、現地(ホーチミン市)の投資環境、とりわけ人件費の上昇などの問題に対する取り組みを知ることができた。また、北京での調査では、金融危機が迫る中、中国自動車市場の変調ぶりについても肌で感じることができた。本年度においては、主に文献研究、研究成果の発表と研究論文の作成を中心に研究を進めてきた。また、補足調査として中国への現地調査も行った。1.文献研究と研究成果の発表これまでの製造業のグローバル展開に関する研究に加えて、日・中・韓のサービス企業、コンテンツ産業のグローバル展開に関する文献を収集し、研究も行った。特に最近の「韓流ブーム」に代表される韓国のコンテンツ産業のグローバル展開、日本のアニメ産業のグローバル化について研究した。また、これまでの研究成果を学会及び研究会において研究報告も行った。2.研究論文の作成研究代表者、分担者に加え、流通科学大学(日本)と北京中央財経大学(中国)の研究者と共同で『東アジアにおける経営の新潮流-組織体制と経営戦略の転換(仮題)』という著書の執筆に力を入れた。現時点で原稿が既に出来上がり、平成22年度中に出版する予定である。3.補足調査これまでの海外現地調査は、現地での経営を行っている企業に対するヒヤリングが中心であったが、それだけで企業経営のパフォーマンスを評価することは不十分である。したがって、平成21年8月に、研究代表者が中国河北省石家庄市近郊の農村部に入り、北京中央財経大学による協力のもと、自動車という耐久消費財に関する消費意識アンケート調査を行った。日本、韓国及び中国現地メーカーの製品に対する評価、及びマーケティング上の問題点を明らかにした。
再生医療・細胞移植に対する病理学的な評価システムの確立

再生医療において移植細胞の生体内での局在を検出するシステムはいまだ確立されていない.移植細胞源として期待される骨髄間質細胞を生体外にて超常磁性体酸化鉄(SPIO)でラベルした後、モデル動物へ移植しMRIによる追跡が可能か否かを検討した.方法として、ヒト骨髄より採取した骨髄間質細胞を用い、SPIOであるResovistを培養液に添加し、細胞内への導入を行った.ラベル細胞の造影効果はNMR spectrometerにてT2緩和時間を測定した.ラベル細胞を免疫不全マウスの大腿部筋層内に注入し、T2-weightedfast spin-echoにてMRイメージングを行うとともに組織像との比較を行った.Resovist導入開始24時間で98%の細胞に鉄染色陽性を確認し、spectrometerにて細胞量に依存したT2短縮効果を認めた.移植後はT2強調像にて移植部位に境界明瞭な低信号領域が描出され、組織学的にも同領域に生存する移植細胞の局在を確認した.低信号領域は移植後8週にても描出されていたが、組織学的には移植後2週以降、宿主由来と思われる鉄染色強陽性細胞の増加が見られ、MRI画像が正確に移植細胞を反映しているとは言えなかった.以上のことより、結論として生体内外において細胞に導入されたSPIOの造影効果が維持され、MR画像にて描出できることが明らかになった.マウス移植モデルにおいては、MR信号減弱が移植細胞由来であると判断できるのは1週以内であったが、移植初期の細胞局在を確認するシステムとしては有効であることが明らかになったことは、「再生医療・細胞移植に対する病理学的な評価システムの確立」にとって極めて重要な意味があると考える.細胞治療または細胞移植とは、目的の細胞の前駆細胞を増殖、分化させることによって、細胞自体を生体内マイクロデバイスとして利用する新たな治療戦略である。この新たな戦略を現実のものとするために、いくつかのステップが必要である。細胞のex vivoにおける培養技術とそれによる細胞数の確保は,第一に要求される技術である。言い換えれば細胞の増殖を維持することは、移植する細胞の数を維持する点で最も重要なことのひとつである。その際に、細胞の寿命を延ばすために培養過程でテロメラーゼ導入を含めたさまざまな手技を行ったものの、現在までに培養過程における細胞の形質転換は認められなかった。腫瘍化へのステップを遺伝子レベルで獲得していることを明らかにすることが不可能である現在、細胞移植・再生医療を念頭においた場合の評価システムの構築を推進している。さらに、本研究では細胞治療における問題点ならびに副作用についての検討課題を明らかにし、その検討課題に対し、病理組織学的なアプローチを可能とするシステムの開発を進めている。まず、ヒト細胞移植の標的とする臓器・組織による分化形質の検討をした。間葉系幹細胞のマーカーによる同定とヒト細胞特異的マーカー(中間径線維など)に対する抗体を用いた免疫染色を行い、正確な同定が可能であることを明らかにした。また、医療への還元を目的とした生体における細胞生着の精度の改良を進めるために、生体材料として、細胞をひとつのマイクロデバイスとして考えた場合、細胞の選択は最も重要な課題である。生体への生着の向上をはかるための評価システムを開発中である。腫瘍形成能に関しては、ヒト細胞を移植したマウスの寿命の限り観察を続ける。通常のマウスの寿命は2年であるが、我々が利用する免疫不全マウスの寿命は1年半である。その期間に渡り、細胞移植を受けたマウスに関し、観察を続けている。細胞治療または細胞移植とは、目的の細胞の前駆細胞を増殖、分化させることによって、細胞自体を生体内マイクロデバイスとして利用する新たな治療戦略である。細胞のex vivoにおける培養技術とそれによる細胞数の確保は、第一に要求される技術である。その際に、細胞の寿命を延ばすために培養過程でテロメラーゼ導入を含めたさまざまな手技を行った。樹立後150継代以上にわたり培養した過程におけて、細胞の形質転換は認められなかった。細胞をNOG(NOD/SCID/IL-2受容体γノックアウト)マウスに注入し、腫瘍形成を検討した。細胞移植後3ヶ月間において、腫瘍形成は生じなかった。さらに、本研究では細胞治療における問題点ならびに副作用についての検討課題を明らかにし、その検討課題に対し、病理細織学的なアプローチを可能とするシステムの開発を進めている。また、細胞は、昨年までは骨髄間質細胞のみを使用し、今年度からは骨髄間質細胞に加え、月経血由来間葉系細胞、臍帯血由来間葉系細胞を用いた検討を開始している。再生医療において移植細胞の生体内での局在を検出するシステムはいまだ確立されていない.移植細胞源として期待される骨髄間質細胞を生体外にて超常磁性体酸化鉄(SPIO)でラベルした後、モデル動物へ移植しMRIによる追跡が可能か否かを検討した.方法として、ヒト骨髄より採取した骨髄間質細胞を用い、SPIOであるResovistを培養液に添加し、細胞内への導入を行った.ラベル細胞の造影効果はNMR spectrometerにてT2緩和時間を測定した.ラベル細胞を免疫不全マウスの大腿部筋層内に注入し、T2-weighted

fast spin-echoにてMRイメージングを行うとともに組織像との比較を行った.Resovist導入開始24時間で98%の細胞に鉄染色陽性を確認し、spectrometerにて細胞量に依存したT2短縮効果を認めた.移植後はT2強調像にて移植部位に境界明瞭な低信号領域が描出され、組織学的にも同領域に生存する移植細胞の局在を確認した.低信号領域は移植後8週にても描出されていたが、組織学的には移植後2週以降、宿主由来と思われる鉄染色強陽性細胞の増加が見られ、MRI画像が正確に移植細胞を反映しているとは言えなかった.以上のことより、結論として生体内外において細胞に導入されたSPIOの造影効果が維持され、MR画像にて描出できることが明らかになった.マウス移植モデルにおいては、MR信号減弱が移植細胞由来であると判断できるのは1週以内であったが、移植初期の細胞局在を確認するシステムとしては有効であることが明らかになったことは、「再生医療・細胞移植に対する病理学的な評価システムの確立」にとって極めて重要な意味があると考える.
超分子錯体を用いた光合成酸素発生錯体の機能研究

マンガン間距離を固定した2核錯体ので陽極酸化による酸素発生植物の光合成反応中心に存在する酸素発生錯体は4核のマンガン錯体を反応中心に含み、2分子の水を4電子酸化し酸素分子を発生している。モデル錯体を設計する上でそれぞれ1個の水の配位したマンガンイオンが2電子酸化され、しかも酸素原子間距離が近接している場合酸素発生が可能となるものと考察に基づきモデル錯体を合成した。マンガンイオン間距離がMn-O-O-Mn結合を形成するのに最適である構造をとることができるような錯体としてオルトフェニレンにより結合された各種のマンガンポルフィリンを合成した。この錯体においてはマンガンイオン間距離は約4.5Å程度であり上記のようなペルオキシ結合を形成するのに適当と考えられる。含水溶液中でこれらのマンガンポルフィリン2量体を触媒とし電気化学的に陽極酸化反応を行なったところ酸素発生が認められた。これらの錯体を含まない溶液中では酸素発生が認められず、H_2^<16>O-H_2^<18>Oの1:1混合物を用いて同様の酸化を行なうと^<16>O_2・^<16>O・^<18>O・^<18>O_2が1:2:1の比で生成した。また回転電極を用いてこの反応をレビッチ式により解析したところ、反応に関与する電子数が4となった。以上の結果よりこの錯体を用いた酸化反応により、配位した水分子が4電子酸化を受け酸素発生をしていると結論付けられた。一方、この錯体よりマンガンイオン間距離が長い錯体を各種合成し酸化反応を検討したところいずれも酸素発生に対する活性は低くマンガンイオン間距離が酸素発生に重要なかぎであることが明かとなった。
高信頼性・高性能を維持した上での制御系の段階的構築

近年,宇宙構造物や原子力プラントなど,制御対象がより大規模かつ複雑になり,制御対象全体をカバーする制御系を一度に構築することがむずかしい場合が多くなってきた.そのような場合,制御対象をいくつかのサブシステムに分割した上で,コントローラを逐次増設し,その効果を見ながら,順を追って制御するサブシステムの数を増やしていくという,制御系の段階的構築は実用的である.本研究では,各段階で新たに増設されるコントローラとすでに稼働しているコントローラとの間の協調関係をポイントに,高信頼性・高性能を維持した上での制御系の段階的構築を体系的に論じた.具体的には,すべての段階における(a)耐故障性(b)制御性能(c)次段階以降でのコントローラ増設のやりやすさがコントローラ間の相互作用の特性を表すある行列に注目することによって定量的に扱うことができることを示した,特に本研究で問題となる(c)では,現段階で増設するコントローラが次段階以降の増設の妨げにならないためにその行列が満たすべき条件を導いた.さらにそれに基づき,すべての段階で上記の(a),(b),(c)を同時に考慮したコントローラの増設手法を与えることができた.本科学研究費補助金により購入したワークステーションを用いることですべての段階における制御性能などの膨大なデータを扱った数値実験が可能となり,本研究成果の有効性を確認することができた.今後はコントローラ間のネットワークを介した情報交換の要素を取り入れたより現実的な実験をすすめる予定である.近年,宇宙構造物や原子力プラントなど,制御対象がより大規模かつ複雑になり,制御対象全体をカバーする制御系を一度に構築することがむずかしい場合が多くなってきた.そのような場合,制御対象をいくつかのサブシステムに分割した上で,コントローラを逐次増設し,その効果を見ながら,順を追って制御するサブシステムの数を増やしていくという,制御系の段階的構築は実用的である.本研究では,各段階で新たに増設されるコントローラとすでに稼働しているコントローラとの間の協調関係をポイントに,高信頼性・高性能を維持した上での制御系の段階的構築を体系的に論じた.具体的には,すべての段階における(a)耐故障性(b)制御性能(c)次段階以降でのコントローラ増設のやりやすさがコントローラ間の相互作用の特性を表すある行列に注目することによって定量的に扱うことができることを示した,特に本研究で問題となる(c)では,現段階で増設するコントローラが次段階以降の増設の妨げにならないためにその行列が満たすべき条件を導いた.さらにそれに基づき,すべての段階で上記の(a),(b),(c)を同時に考慮したコントローラの増設手法を与えることができた.本科学研究費補助金により購入したワークステーションを用いることですべての段階における制御性能などの膨大なデータを扱った数値実験が可能となり,本研究成果の有効性を確認することができた.今後はコントローラ間のネットワークを介した情報交換の要素を取り入れたより現実的な実験をすすめる予定である.
一次相転移系遷移金属酸化物の電界相制御

多彩な物性を示す強相関電子系物質の応用に向けて、一次相転移を示す遷移金属酸化物の薄膜およびそれを用いた電界効果デバイス構造を作製した。電界によって二酸化バナジウムの電子相転移を不揮発に制御することに成功し、電子相転移を利用した不揮発性デバイス実現の可能性を示した。また、薄膜成長中の温度・酸素分圧を精密に制御することで、シリコン基板上に巨大な光学特性の変化を示す二酸化バナジウム薄膜を作製することに成功した。多彩な物性を示す遷移金属酸化物の応用に向けて、電場・磁場・光・圧力などの外的刺激による電子相制御が重要となってきている。しかしながら、不揮発性と可逆動作を伴う相制御の研究は初期段階にあり、その理解は未だ不十分である。本研究では、遷移金属酸化物の不揮発かつ可逆的な電子相制御の確立を目的としている。この目標達成のために一次相転移物質を使用する。これは、構造変化を伴うことで基底状態と遷移状態の双安定化が達成されるためである。特に、電界による一次相転移の制御技術の確立とその原理解明に主眼を置き、数ボルトの低電圧による光学特性の可逆的巨大応答を目指す。1.新たに開発したフッ化マグネシウム(MgF2)基板上に高品質なエピタキシャル二酸化バナジウム(VO2)薄膜を堆積することに成功した。フッ化マグネシウム基板は、従来から用いられている二酸化チタン(TiO2)基板と比較して光学特性が優れているため、光学デバイスの開発に適している。また、フッ化マグネシウム基板は二酸化チタン基板より大きな歪みを二酸化バナジウム薄膜に掛けることができ、金属-絶縁体転移の歪み制御という観点からも重要である。二酸化バナジウムの電界効果トランジスタ構造を作製し、ゲート電圧によって二酸化バナジウムの透過率が大幅に変調することに成功した。二酸化バナジウムはサーモクロミック材料としての開発が進められているが、エレクトロクロミック特性を利用した能動デバイスとしての応用に本研究が役立つものと期待する。当該年度では以下の項目について研究を行った。1.フッ化マグネシウム基板上の二酸化バナジウムを用いた電気二重層トランジスタ構造を作製し、ゲート電圧によって二酸化バナジウムの抵抗率を大幅に変調させることに成功した。そのトランジスタ動作が不揮発かつ可逆的であることを確認した。ラマン散乱分光によって、電界効果による相転移前後で二酸化バナジウムの結晶構造が変化していることを明らかにした。さらに、組成分析により相転移の原因が二酸化バナジウム中への水素イオンの移動であることを解明した。2.電子・光デバイスへの応用を目指して、Si基板上に二酸化バナジウム薄膜を作製することを試みた。成長中の温度・酸素分圧を制御することで、様々な種類の酸化バナジウム薄膜を堆積させることに成功した。また、単相の二酸化バナジウム薄膜が得られる条件を見出した。当該年度では、電界による一次相転移の制御技術の確立とその原理解明に主眼を置き、以下の項目について主に研究を行った。1.フッ化マグネシウム基板上の二酸化バナジウム薄膜を用いた電気二重層トランジスタ構造を作製し、ゲート電圧印加により二酸化バナジウム層の抵抗率を大幅に変調させることに成功した。この現象は、二酸化バナジウムの一次相転移によるものであり、不揮発かつ可逆的な変化であることを確認した。さらに、相転移前後の組成分析により、電界による相転移の原因が二酸化バナジウム中への水素イオンの移動であることを明らかにした。2.電子相転移制御技術の電子・光デバイスへの応用を目指して、Si基板上に二酸化バナジウム薄膜を作製することを試みた。成長中の温度・酸素分圧を制御することで、転移温度において大きな屈折率変化を示す二酸化バナジウム薄膜を堆積させることに成功した。相転移前後の屈折率は、エピタキシャル薄膜のそれと同等であることを確認した。具体的なデバイス応用に向けて、シリコン導波路をベースとする光スイッチの開発に取り組んだ。

電界によって二酸化バナジウムの電子相転移を不揮発に制御することに成功し、電子相転移を利用した不揮発性デバイス実現の可能性を示した。また、薄膜成長中の温度・酸素分圧を精密に制御することで、シリコン基板上に巨大な光学特性の変化を示す二酸化バナジウム薄膜を作製することに成功した。電界効果による二酸化バナジウムの相転移制御の動作原理を解明することに成功した。また、デバイス応用を目指し、Si基板上に二酸化バナジウム薄膜を成長させる研究を遂行した。材料物理二酸化バナジウムの相転移を利用した光スイッチの開発に注力する。初期段階では、環境温度や加熱によるスイッチ機能実証を行い、最終的には電界効果による光スイッチング現象の観測を目指す。目標であった電界効果トランジスタの作製と電界誘起相転移の観測に成功した。また、二酸化バナジウムにおける電界効果誘起相転移の光学的評価・結晶構造評価は一部前倒しで研究を遂行した。研究計画の一部に変更が生じたため。電界効果誘起相転移の原理については、未知数の部分も多く、静電的原理・化学反応による現象の両方が提案されている。今後は、電子相転移前後での組成分析等の手法も取り入れメカニズム解明についても注力する。論文校閲費用と論文投稿料に充てる予定である。研究実施計画の一部に変更が生じたため。分析依頼費と電気特性評価装置の購入に充てる予定である。
インスリンによるレトロマー複合体の機能制御を介したＧＬＵＴ４分解促進機構の解明

本研究により,インスリンによって産生される過酸化水素がプロテインキナーゼCK2を介してレトロマー機能阻害とGLUT4ダウンレギュレーションを起こすことが明らかとなった。本研究の成果は,インスリンによる過酸化水素の産生亢進(酸化ストレス)によりGLUT4の細胞内ソーティング方向のスイッチングが起こり,GLUT4の分解系への輸送促進と,その結果としての蛋白量減少(ダウンレギュレーション)が生じるという,新たなインスリンシグナル機構を示した点で非常に興味深いものである。インスリン作用の“負の側面"ともいえるグルコーストランスポーター(GLUT4)分解促進作用に関して,最近,我々は,インスリンが脂肪細胞において,活性酸素の産生促進を介してCK2キナーゼ依存性にレトロマー複合体の機能を阻害することにより,細胞内におけるGLUT4のソーティングをTGN方向(リサイクル)からリソソーム方向(分解)へスイッチし,GLUT4の分解を促進する,というモデルを支持する成績を得た。本年度は,この作業仮説の検証を様々な手法を用いて行い,以下の点を明らかにした。1.インスリンによる過酸化水素産生促進作用にホスファチジルコリン(PC)特異的ホスホリパーゼCが関与することを明らかにし,さらにPC水解産物であるホスホリルコリンの添加によりNADPHオキシダーゼが活性化されることを示し,ホスホリルコリンが細胞内シグナルとして機能することを明らかにした。2.インスリンおよび過酸化水素がホスファターゼPP2Aを抑制することを明らかにし,これらの刺激によりCK2活性が相対的に優位となる可能性が示唆された。3.レトロマー複合体コンポーネントであるVps35がCK2の基質であり,Vps35のリン酸化によりレトロマー機能が阻害されること,Vps35-S7A変異によりインスリンのGLUT4分解促進作用が阻害されることを明らかにした。以上の結果は,我々の当初の作業仮説を支持するものであり、インスリンの新たな作用機構に関してさらに進展がみられた。25年度は,この作業仮説の検証を様々な手法を用いて行い,以下の点を明らかにした。1.インスリンによる過酸化水素産生促進作用にホスファチジルコリン(PC)特異的ホスホリパーゼCが関与することを明らかにし,さらにPC水解産物であるホスホリルコリンの添加によりNADPHオキシダーゼが活性化されることを示し,ホスホリルコリンが細胞内シグナルとして機能する可能性を示した。以上の結果は,我々の当初の作業仮説,すなわち,インスリン受容体→PC-PLC活性化→Nox4活性化による過酸化水素産生亢進→PTP1BあるいはPP2A抑制→CK2活性の相対的優位→レトロマーリン酸化によるLDM膜からの解離→GLUUT4ソーティング方向の転換による分解促進,というシグナル経路を支持するものであり、GLUT4蛋白の運命を制御する新たなインスリン作用機構を示したといえる。インスリン作用の"負の側面"ともいえるグルコーストランスポーター(GLUT4)分解促進作用に関して,最近,我々は,インスリンが脂肪細胞において,活性酸素の産生促進を介してCK2キナーゼ依存性にレトロマー複合体の機能を阻害することにより,細胞内におけるGLUT4のソーティングをTGN方向(リサイクル)からリソソーム方向(分解)へスイッチし,GLUT4の分解を促進する,というモデルを支持する成績を得た。

以上の結果は,我々の当初の作業仮説を支持するものであり、インスリンの新たな作用機構に関してさらに進展がみられた。。作業仮説の検証上,大きな課題の一つであったPC-PLC活性化とNADPHオキシダーゼ活性化をつなぐメカニズムが解明される可能性が出てきた点が非常に評価される。この成果により,インスリン作用の未知のシグナルが明らかになる可能性が出てきた。これまでの成果は現在論文としてまとめ投稿中である。今後の研究の方向として、以下の点を明らかにする必要がある。(1)インスリンがPC-PLCを活性化する機構,(2)ホスホリルコリンがNADPHオキシダーゼを活性化する機構今後の研究の方向として、以下の点を明らかにする必要がある。(1)インスリンがPC-PLCを活性化する機構,(2)ホスホリルコリンがNADPHオキシダーゼを活性化する機構,(3)過酸化水素がプロテインキナーゼCK2を活性化する機構,(4)CK2がレトロマーを抑制する機構,(5)レトロマーが膜から解離する機構。25年度は,インスリンによるNADPHオキシダーゼ活性化機構についてさらに検討する。24年度に,PC-PLC活性化によるPC水解産物であるホスホリルコリンがNADPHオキシダーゼを活性化する無細胞実験系を確立したが,この実験系にさらに改良を加え,より特異的にNADPHオキシダーゼ活性を測定する系を確立する予定である。第2に,Vps35のリン酸化機構について,CK2およびPP2Aの両面からさらに詳細を検討する。これらの成果は2奉免の論文として発表する予定である。24年度は,まず,インスリンによるNADPHオキシダーゼ活性化機構についてさらに検討する。23年度に,PC-PLC活性化によるPC水解産物であるホスホリルコリンがNADPHオキシダーゼを活性化する無細胞実験系を確立したので,この実験系を用いて詳細な検討を行う。また,これらの成果を論文に発表する予定である。
アミノ酸細胞膜トランスポートを標的とした小児固形腫瘍に対する治療法の開発

神経芽細胞腫において低酸素状態が細胞膜アミノ酸トランスポート活性に及ぼす影響:ヒト神経芽腫細胞cellline、SK-N-SHを用い、低酸素状態が細胞膜アミノ酸トランスポート活性に及ぼす影響を検討した。8時間低酸素後のグルタミンGln,グルタミン酸GluおよびロイシンLeuトランスポートはcontrolと有意差を認めなかったが、16時間および24時間低酸素後のGlnおよびLeuトランスポートはcontrolに比し有意に上昇した(p<0.01)。この上昇は、細胞膜のアミノ酸トランスポーターの数の増加によるものであった(Vmax効果)。神経芽細胞腫アミノ酸トランスポートは、低酸素条件下でup-regulateすることが明らかとなり、本メカニズムが低酸素下での腫瘍の増殖に関与する可能性が示された神経芽細胞腫において低酸素状態が細胞膜アミノ酸トランスポート活性に及ぼす影響:ヒト神経芽腫細胞cellline、SK-N-SHを用い、低酸素状態が細胞膜アミノ酸トランスポート活性に及ぼす影響を検討した。神経芽細胞腫アミノ酸トランスポートは、低酸素条件下でup-regulateすることが明らかとなり、本メカニズムが低酸素下での腫瘍の増殖に関与する可能性が示された固形腫瘍増殖のメカニズムで、血流の乏しい条件下においても、なぜ癌細胞が増殖可能なのかは明らかでない。今回、小児悪性固形腫瘍のひとつである神経芽細胞腫細胞(SK-N-SH)において、低酸素下での腫瘍細胞増殖のメカニズムをアミノ酸細胞膜トランスポートの面から検討した。低酸素モデルは、培養条件を低酸素状態(1%O_2-5%CO_2-94%N_2)下にすることで作成した。細胞膜アミノ酸トランスポートは、8時間低酸素ではcontrolに比し有意の変化を認めなかったが、24時間低酸素でグルタミン(Gln)、ロイシン(Leu)で有意に上昇した。この上昇は、細胞膜におけるアミノ酸トランスポーターの数の増加によることが明らかとなった。DNAおよび蛋白合成は、8時間低酸素でそれぞれ84.0±4.5、72.8±7.4%control、16時間低酸素で60.3±4.4、57.6±2.1%controlと、いずれも有意に低下した。SK-N-SHの細胞特異性を調べる目的で、他の神経芽細胞腫cell lineであるNB-1細胞において同様の検討を行ったところ、SK-N-SHと同様に、8時間の低酸素でLeu、Glnトランスポートはcontrolに比し有意に上昇した。以上の結果より、ヒト神経芽細胞腫cell line、SK-N-SHにおいて、低酸素下でアミノ酸トランスポートはup-regulationすることが明らかとなった。これが、低酸素下での固形腫瘍の生存と増殖に関与するメカニズムの一つである可能性が示された。1.神経芽細胞腫において低酸素状態が細胞膜アミノ酸トランスポート活性に及ぼす影響:ヒト神経芽腫細胞cell line、SK-N-SHを用い、低酸素状態が細胞膜アミノ酸トランスポート活性に及ぼす影響を検討した。神経芽細胞腫アミノ酸トランスポートは、低酸素条件下でup-regulateすることが明らかとなり、本メカニズムが低酸素下での腫瘍の増殖に関与する可能性が示された。2.抗癌剤(Cisplatin)投与が腸管上皮細胞アミノ酸トランスポートに及ぼす影響:腸管上皮細胞のCisplatin投与に伴う反応を、主に細胞膜アミノ酸トランスポートの面から検討した。ヒト腸管上皮細胞としてCaco2を用い細胞をCisplatin投与群と対照群に分け、アミノ酸トランスポート活性、mRNA、蛋白の発現を測定した。GlnおよびLeuは対照群に比し有意に上昇した。また、Glnトランスポート遺伝子ASCT2のmRNAおよび蛋白の発現は対照群に比し優位に増加した。細胞内glutathione量およびglutaminase酵素活性も優位に増加した。Cisplatin誘導性腸管粘膜障害モデルでは、アミノ酸トランスポート活性の上昇が、抗癌剤に対する腸管上皮細胞の生存に関与している可能性が示された。
高温気化固相マイクロ抽出法の開発：血中薬物ＧＣ－ＭＳ分析の迅速化を目指して

全血から乱用薬物を迅速かつ簡便に分析する方法を検討した。<アンフェタミンとメタンフェタミンの分析>固相マイクロ抽出法(SPME)方法を採用し、血液量0.10gに水酸化ナトリウム(5N)0.1mlを添加することで良好に抽出できた。薬物を確実に気化するための最適な気化温度(ヘッドスペース温度)は約220°Cであった。気相をSPMEファイバーに暴露する最適な吸着時間は、7分であった。<バルビツレート、ベンゾジアゼピンの分析>様々な条件下で実験を実施したが、これらの薬物は、かなり分子量が大きいことから、SPMEファイバーへ吸着が困難で、引き続き良好な分析条件を検討中である。研究目的は、全血から乱用薬物を迅速かつ簡便な分析方法の開発である。多くの系統の薬物分析、アンフェタミン系、バルビタール系、ベンゾジアゼピン系などの分析を検討した。これら多くの種類の薬物の迅速で効率的な分析を可能とするため、様々な条件のもと分析の最適化を試みた。<初年度>アンフェタミンとメタンフェタミンの分析条件の検討:全血前処理方法、気化温度および吸着時間を変え、内標準、アンフェタミン、メタンフェタミンの回収を最大にするよう検討した。1)全血の前処理法:有機溶媒や固相抽出法ではなく、固相マイクロ抽出法(SPME)方法を採用した。血液量、硝子綿の添加、水酸化ナトリウムの添加等をかえて実験した結果、血液量0.10gに水酸化ナトリウム(5N)0.1mlを添加することで良好に抽出できた。2)気化温度:標的化合物の分子量が大きかったため、確実に気化するためには高温を必要とした。バイアル瓶内の気化温度(ヘッドスペース温度)は、200-240°Cの範囲で実験した。その結果、約220°Cが最適な気化温度であった。3)吸着時間:気相をSPMEファイバーに暴露する吸着時間を、515分の間で実験した結果、7分がファイバーのための最適な吸着時間であった。<第2年度>バルビツール、ベンゾジアゼピンの分析方法の確立:様々な条件下で実験を実施したが、これらの薬物は、かなり分子量が大きいことから、SPMEファイバーへ吸着が困難で、分析条件の確立には至らなかった。研究期間内で、複数の乱用薬物の迅速かつ安定した分析方法を検討した、その結果、高温で気化させSPMEを採用することで、全血からのアンフェタミンを分析する方法は開発できた。この結果を踏まえ、幅広く多数の薬物を分析可能とする方法を検討続ける予定である。本研究で、私はメタンフェタミン、アンフェタミンを主とする濫用薬物を分析する迅速・簡便で、特異的な方法を開発しようとしている。今年度は、分析を最適化する、いくつかの条件を決定したことが重要だった。この最適化は、なるべく迅速で効率的な分析を可能にするだろう。私が本研究において検討を行った、具体的な条件は全血の前処理、気化温度、ファイバー吸着時間であった。これらの条件を変えることによって、標的物質と内部標準物質の回収率を最大にし、分析をより特異的に、そして強固にすることができる。最初に、全血の前処理の最適化を試みた。全血は従来の方法で分析物を抽出するには、問題のあるマトリックスである。そこで、刺激性の有機溶媒や、高価な固相抽出媒体を使用せずに、血液マトリックスから標的物質を抽出する、固相マイクロ抽出(SPME)法を我々は用いている。全血の前処理の検討についてはこれまで有意な結果は得られず、なお検討中である。検討を行った2番目の条件は気化温度についてで、これは全血中の標的物質が、分析用バイアルの気相中に気化する温度である。標的物質の分子量が大きいために、非常に高い温度が化合物の気化に必要とされる。バイアルをセットしたホットプレートの温度は200-240°Cの範囲で検討を行った。その結果、SPMEファイバーへの薬物吸着に最適な気相温度は220°Cに決定した。検討を行った最後の条件は、ファイバー吸着時間についてで、これは温められたバイアルの気相に、SPMEファイバーが曝露される時間である。ファイバーをバイアル中に挿入し、5-15分の吸着時間について検討を行った。その結果、ファイバーの最適な吸着時間は7分に決定した。今年度は、分析の最適な条件のいくつかを決定することに成功した。これらの条件が設定され、本研究の焦点は、最も迅速で効率的な分析を可能にする分析機器の条件の検討になるだろう。

平成24年度は、分析に関連した試料調製と機器設定について、主に至適条件の検討を行った。最終的には実際の鑑定例での分析に応用することを目指し、本研究は当初の予定通り進行しているものと考える。当初の研究実施計画のように、今年度得られた結果を基に、更に検討を重ね、実際の鑑定例に応用しうる薬物スクリーニング法を作成し、確立できたものから、学会発表、論文として誌上発表することを通じ、社会・国民に還元する。平成24年度は、本研究費で購入した消耗品が、当初想定していたよりも安価に入手できたことにより、次年度使用額が発生した。今後は本研究における検討内容も増え、更なる消耗品の消費が想定されることから、次年度使用額は物品費として使用する予定である。
遺伝子増幅法を用いた超高感度生物発光イムノアッセイの開発

本研究では、イムノアッセイの高感度化を目的として遺伝子増幅法を検出系とする方法の開発を検討した。その遺伝子増幅法には等温条件下で連続的にDNA伸長反応が進行するLAMP(Loop-mediated isothermal Amplification)反応とRCA(Rolling Circle Amplification)反応を検討した。物理的及び化学的に安定なDNAを標識とするイムノアッセイ系の構築により、酵素を標識とする従来法と比較して、高い安定性の標識抗原の調製と遺伝子工学技術の応用による高効率なシグナル増幅反応を達成した。本研究ではイムノアッセイの超高感度化を目的として遺伝子増幅法の利用を検討する。その増幅法としてLAMP (Loop-mediated isothermal amplification)やRCA (Rolling Circle Amplification)と呼ばれる等温条件下で高効率なDNA増幅反応を検討し、ホタルルシフェリン-ルシフェラーゼ反応に基づく生物発光検出へと導く。本年度は、LAMP法を用いたイムノアッセィ系の構築を検討した。鋳型となる500bp DNAをエストラジオール誘導体に標識し、エストラジオールをモデル標的分子とする競合イムノアッセイの最適化を検討した。その結果、従来の酵素イムノアッセイに匹敵する検出感度が得られ、測定装置の改良などにより更なる高感度化も期待できると考えられる。また測定の精度や再現性についても良好な結果が得られている。しかしながらLAMP反応は耐熱性のDNA合成酵素を用いた60°C以上の反応温度を必要とすることから、通常の酵素であるルシフェラーゼを直接使用できないことが問題として挙げられる。従ってLAMP反応の際には蛍光試薬を利用した検出によりDNA伸長反応をモニタリングしていた。そこで次に、より緩和な条件で効率的にDNA伸長反応が進行するRCA法について検討した。まずDNA伸長反応の鋳型として使用する環状一本鎖DNAの調製法について検討した。PCRを利用して調製した一本鎖DNAの両端を連結するために、分子内ライゲーションを検討した。3種類のDNAリガーゼを用いて検討した結果、耐熱性リガーゼによる温度サイクルとパドロックプローブ法とを組み合わせて効率的な環状一本鎖DNAの調製に成功した。今後はRCA反応に最適なDNA合成酵素の探索を検討する予定である。前年度に開発したLAMP-イムノアッセイに続き、本年度ではより緩和な条件で効率的にDNA伸長反応が進行するRCA法について検討した。耐熱性リガーゼによる温度サイクルとパドロックプローブ法とを組み合わせて効率的な環状一本鎖DNAの調製に成功した。しかし、高効率なDNA増幅反応のためには高純度かつ高濃度の鋳型DNAが必要であることが明らかとなった。そこで、この一連の調製工程における反応収率と精製効率の向上について検討した。反応条件や洗浄操作などの精製法について丹念に検討して調製法を最適化した。またその他の方法として、短鎖(50-mer)の一本鎖DNAを原料にして分子間ライゲーション及びそれに引き続く分子内ライゲーション反応による環状一本鎖DNAの調製を試みた。しかしこの方法では複雑な反応の制御が非常に困難であることから、効率的な環状一本鎖DNAの調製には至っていない。本年度では前年度から続いている緩和な条件下で効率的なDNA伸長反応が進行するRCA(Rolling Circle Amplification)法について、その鋳型となる環状一本鎖DNAの大量調製法を検討した。特に本年度では生体内において一本鎖で機能しているRNAの特性の利用を検討した。即ち、PCRから得られた二本鎖DNAを鋳型として転写反応により大量のRNA(一本鎖)を得る。更にこのRNAを鋳型とした逆転写反応により、相補的なcDNA(一本鎖)を得る方法を検討した。その結果、転写反応により大量のRNAを得ることに成功した。しかし第2ステップにおいて種々の逆転写酵素を検討したが、そのいずれも逆転写反応の効率が悪く、また不完全長のcDNAも多く含まれることから目的とする一本鎖DNAの大量調製法の開発には至らなかった。より高効率な逆転写酵素の探索や開発、更にその反応条件の最適化により実現可能と予想される。次にRCA法によるDNA増幅反応を生物発光検出する方法について検討した。平成21年度に開発した方法により鋳型となる環状一本鎖DNAを調製した。本手法は大量調製法ではないものの、RCA法の開発には充分である。その環状一本鎖DNAを用いてRCA法に最適なDNA合成酵素を検討した。

酵素に望まれる特性としては、連続したDNA伸長反応により構築される二本鎖DNAを解離して伸長する「鎖置換活性」とシグナル増幅に関与する「伸長反応速度」である。「鎖置換活性」を有する酵素が少ないため、4種類のDNA合成酵素について検討した。その結果、各酵素において経時的な生物発光シグナルの増加を観測した。Bst DNA polymeraseではエンドポイント測定による生物発光検出が可能であることが示唆された。Phi29 DNA polymeraseは高い鎖置換活性を示すが、高いDNA修復能力(校正機能)も有しているために伸長速度が遅く、緩やかに発光強度が増加していると考えられた。Bsu DNA polymerase及びExo-klenow DNA polymeraseでは同様な発光シグナル挙動を示した。RCA条件の最適化及び標識に用いるDNAの検量線の作成やイムノアッセイの検出系への応用について今後検討する予定である。
高木類の生育更新・樹形特性から見た森林景観の基本構造の把握

高木類の生育更新・樹形特性から見た森林景観の基本構造の把握を目的として、以下のような研究を行った。1.静岡大学農学部附属上阿多古演習林と同大学大谷キャンパスに植栽された高木類の枝条形成パターンや樹形形成パターンについての形態生態学的解析2.静岡大学農学部附属引佐演習林全体の森林景観の構造と推移についての生態学的研究3.森林景観概念の理論的考察マテバシイやミズナラ、ブナなどは、順次開葉するコブシなどとは異なり、一斉開葉を示していたが、マテバシイやミズナラなどとは異なり、ブナには、順次開葉するコブシと類似した幾つかの成長特性が認められた(例えば、成長単位が枝条にあるという性質、枝条における葉の配列パターン、頂部支配が顕著で、長枝と短枝を分枝する特性など)。このような研究結果より、アテバシイ型(ミズナラを含む)とブナ型の違いに関する幾つかの興味ある知見が得られ、例えば、ブナ型はおそらく、何らの樹形特性も修正することなく、ただ葉間期を短くする方向に変化することだけによって、コブシ型のものから徐々に進化し、一斉開葉を示すようになったものと推察された。結局、本研究の展開により、筆者が提案している高木類を突出型樹種と沿下型樹種の2つに分ける類型区分が暖温帯域の高木類に対しても適用可能であることや、森林景観の生態学的基本構造や人間も含めた場合の森林景観の構造などがこのような考え方によって、より明確かつ具体的に説明できるようになることなどがわかった。沿下型樹種と突出型樹種の相違を明らかにすることを目的として、枝条(葉と節間)の形成過程の肉眼レベルでの測定を、静岡大学上阿多古演習林内の広葉樹見本林内と同大静岡キャンパス内に生育する暖温帯・温帯系樹種に対して試みた。調査した樹種は48種、枝条数は180である。その結果、沿下型樹種では、有機的統合度合いが高い、完成度の高い一斉開葉型の枝条形成パタンを示すのに対して、突出型樹種では、順次開葉型を示すか、一斉開葉型であっても、順次型に類似した、求頂的に形態形成が進行する傾向がある程度まで残存する、枝条の有機的統合度合いの低い、未完成な一斉開葉型の枝条形成パタンを示すものが多いことなどがわかった。実体顕・光顕レベルでの解析については、上阿多古演習林で30種約150枝条(当年生)、東大理学部附属植物園で18種90枝条を対象として、その葉長と節間長を測定し、その頂芽を採取・固定した、頂芽の観察はまだ始めたばかりで、このレベルでの成果は得られなかった。樹形調査については、上阿多古演習林の6種34個体について、分枝パタンや当年生枝条や節間の伸長量分布などを調べた。また、北大植物園と北大苫小牧演習林で、冷温帯・亜寒帯系樹木の分岐調査も行った。その結果、ブナの樹形が、どちらかというと突出型であること、一般に当年生枝条の伸長量は沿下型樹種では対数値で一山型、突出型では2山型の分布を示すが、突出型の大きいモードの値が沿下型のモードの値よりもはるかに大きいことなどがわかった。群落レベルでの研究については、静大上阿多古演習林で2箇所(0.045ha,0.1ha)、引佐演習林で3箇所のプロットを新設し、調査したほか、広葉樹見本林全体(0.42ha)の毎木調査も実施した。その結果、当初ねらっていた、提案した類型区分が暖温帯域でも当てはまる可能性が大きいことなどがわかった。静大中川根演習林高海抜域と焼岳・上高地での調査は実施できなかった。

枝条の形成過程の肉眼レベルでの測定については、計画通り、今年度は静大上阿多古演習林内と同大静岡キャンパス内に生育する約40種75枝条を対象にして調査した。冷温帯以北の高木類については、北大農学部附属植物園でデータを収集した。実体顕・光顕レベルでの解析については、主に主要樹種であるブナとミズナラを中心にして、実体顕による冬芽内の葉原基サイズの測定や、光顕による葉原基の組織構造の比較などを行った。その結果、ブナの方がミズナラよりも葉原基のサイズが有意に大きく、冬芽内での組織の発達も進んでいること、このような違いがブナとミズナラの枝条形成パターンや樹形の違いと密接に関連していることなどがわかった。林分レベルでの調査については、静岡大学引佐演習林において、今年度もさらに3箇所(マツ人工林スギ天然更新地、マツ矮生林、モミ人工林)の試験地を設定し、上層木や稚幼樹のサイズや樹形などの調査を行なった。同中川根演習林と有珠山の調査は行なわなかったが、その代わりに、静大上阿多古演習林内に、さらに6箇所(ヒノキ大径木造林地、景観帯状区、ヒノキ・コナラ混植林4箇所)の試験地を設定し、引佐演習林と同様の調査を展開した。突出型樹種と沿下型樹種の違いに着目した個体レベルでの分岐パターンの調査については、上阿多古演習林内の見本林のブナ、ミズナラ、マテバシイ、シリブカガシ各2個体、コブシ1個体について、樹形調査をあわせて展開した。以上の調査・研究の結果、提案した類型区分に従うことで、暖温帯域の森林景観の基本構造の記述が可能となることなどがわかった。高木類の生育更新・樹形特性から見た森林景観の基本構造の把握を目的として、以下のような研究を行った。1.静岡大学農学部附属上阿多古演習林と同大学大谷キャンパスに植裁された高木類の枝条形成パターンや樹形形成パターンについての形態生態学的解析2.静岡大学農学部附属引佐演習林全体の森林景観の構造と推移についての生態学的研究3.森林景観概念の理論的考察マテバシイやミズナラ、ブナなどは、順次開葉するコブシなどとは異なり、一斉開葉を示していたが、マテバシイやミズナラなどとは異なり、ブナには、順次開葉するコブシと類似した幾つかの成長特性が認められた(例えば、成長単位が枝条にあるという性質、枝条における葉の配列パターン、頂部支配が顕著で、長枝と短枝を分枝する特性など)。このような研究結果より、マテバシイ型(ミズナラを含む)とブナ型の違いに関する幾つかの興味ある知見が得られ、例えば、ブナ型はおそらく、何らの樹形特性も修正することなく、ただ葉間期を短くする方向に変化することだけによって、コブシ型のものから徐々に進化し、一斉開葉を示すようになったものと推察された。結局、本研究の展開により、筆者が提案している高木類を突出型樹種と沿下型樹種の2つに分ける類型区分が暖温帯域の高木類に対しても適用可能であることや、森林景観の生態学的基本構造や人間も含めた場合の森林景観の構造などがこのような考え方によって、より明確かつ具体的に説明できるようになることなどがわかった。
ナビゲーションを用いた生体、人脳スライス標本でのてんかん焦点抑制性受容体機能解析

本研究では、17名の難治てんかん患者に対してPETを用いたナビゲーション手術を施行した。側頭葉てんかん10例、側頭葉外てんかん7例である。MRIで病変を認めた患者は14例で、3例では病変を認めなかった。FDG-PETを全例に行い、中枢性ベンゾジアゼピン受容体拮抗薬であるフルマゼニール(FMZ)-PETを13例に施行し,3例では末梢性ベンゾジアゼピン受容体拮抗薬をtracerとして用いたPETを施行した。今回の研究目的であるFMZ-PETは、MRIで局在病変を認めた症例では、病変周囲に限局した取込み低下部位を描出した。FDG-PETよりもてんかん焦点領域を鋭敏に示す有用な検査と考えられた(研究成果の一部を誌上発表)。また、MRI上病変を認めた症例でも、脳腫瘍の患者では海綿状血管腫の患者よりもより広範囲に取り込み低下部位が描出された。この所見は脳腫瘍に起因した難治てんかんと海綿状血管腫に起因した難治てんかんの外科治療域を知る有用な検査であると考えられた(2005年アメリカてんかん学会で報告)。末梢性ベンソジアゼピン受容体は、焦点部位で取り込み増加の傾向を認めたが有意な増加は無く、今後さらなる検討が必要と考えられた。またFMZ-PET施行した13例中、6例に中枢性ベンゾジアゼピン受容体拮抗薬であるイオマゼニールSPECTを用いた検査を施行した。FMZとIMZの取り込み低下部位は必ずしも一致してはいなかったが、脳皮質形成異常症例では非常によく一致していた。また脳スライス標本を用いた研究は着実に成果をあげ、脳スライス標本で測定したFDG-PETの結果が、術前に施行したFDG-PETの結果と相関した信頼に値するdataであることを誌上報告することができた。本年度は、13名の難治てんかん患者に対してPETを用いたナビゲーション手術を施行した。側頭葉てんかん9例、側頭葉外てんかん4例であった。MRIで病変を認めた患者は11例で、2例は病変を認めなかった。FDG-PETを全例に行い、中枢性ベンゾジアゼピン受容体拮抗薬であるフルマゼニール(FMZ)-PETを10例に施行した。1例では末梢性ベンゾジアゼピン受容体拮抗薬をtracerとして用いたPETを施行したが、期待された焦点部位の取り込み増加は認められなかった。またFMZ-PET施行した10例中、3例に中枢性ベンゾジアゼピン受容体拮抗薬であるイオマゼニールSPECTを用いた検査を施行した。視覚的検査では、FMZとIMZの取り込み低下部位はよく相関している印象があったが、来年度は、統計的画像解析を行うことで同じ中枢性ベンゾジアゼピン受容体拮抗薬でも、FMZとIMZに違いがあるのかについても検討したい。また2例でてんかん脳スライス標本を用いた光学的計測を施行した。さらに来年度には摘出スライス標本上でのてんかん焦点部位の抑制性機構の破綻についての検討を行う予定である。

本研究では、17名の難治てんかん患者に対してPETを用いたナビゲーション手術を施行した。側頭葉てんかん10例、側頭葉外てんかん7例である。MRIで病変を認めた患者は14例で、3例では病変を認めなかった。FDG-PETを全例に行い、中枢性ベンゾジアゼピン受容体拮抗薬であるフルマゼニール(FMZ)-PETを13例に施行し,3例では末梢性ベンゾジアゼピン受容体拮抗薬をtracerとして用いたPETを施行した。今回の研究目的であるFMZ-PETは、MRIで局在病変を認めた症例では、病変周囲に限局した取込み低下部位を描出した。FDG-PETよりもてんかん焦点領域を鋭敏に示す有用な検査と考えられた(研究成果の一部を誌上発表)。また、MRI上病変を認めた症例でも、脳腫瘍の患者では海綿状血管腫の患者よりもより広範囲に取り込み低下部位が描出された。この所見は脳腫瘍に起因した難治てんかんと海綿状血管腫に起因した難治てんかんの外科治療域を知る有用な検査であると考えられた(2005年アメリカてんかん学会で報告)。末梢性ベンゾジアゼピン受容体は、焦点部位で取り込み増加の傾向を認めたが有意な増加は無く、今後さらなる検討が必要と考えられた。またFMZ-PET施行した13例中、6例に中枢性ベンゾジアゼピン受容体拮抗薬であるイオマゼニールSPECTを用いた検査を施行した。FMZとIMZの取り込み低下部位は必ずしも一致してはいなかったが、脳皮質形成異常症例では非常によく一致していた。また脳スライス標本を用いた研究は着実に成果をあげ、脳スライス標本で測定したFDG-PETの結果が、術前に施行したFDG-PETの結果と相関した信頼に値するdataであることを誌上報告することができた。
遺伝性運動感覚性ニューロパチーの原因遺伝子NDRG1のKOマウスを用いた機能解析

以前我々は、細胞ストレス応答遺伝子としてNDR1を同定した。NDRG1は、細胞の恒常性維持や分化に関与すると考えられているが、その分子機能は不明である。近年、ヒトNDRG1は、遺伝性末梢神経変性疾患の一つであるCharcot-Marie-Tooth (CMT)病4D型の責任遺伝子であると報告され、注目を集めている。昨年度私は、NDRG1ノックアウトマウスには脱ミエリン化を伴う進行性の神経変性が観察されることから、NDRG1は末梢神経系のミエリン鞘の構造維持に必須のタンパク質であることを示した。NDRG1ノックアウトマウスは末梢神経変性疾患のモデルマウスとして有用であり、NDRG1の分子機能の解明に貢献すると思われる。本研究におけるこれらの成果は、本年度Mol.Cell.Biol.誌に受理され、掲載された。またNDRG1ノックアウトマウスは、現在までに世界各地の4つのグループに供与され、それぞれ共同研究ベースで解析がなされている。一方で私は、NDRG1ノックアウトマウスの中枢神経系には、組織学的に目立った異常が見られないことを見いだした。これはNDRGファミリーの発現量や発現部位の差異によるためかもしれない。これを明らかにするために、NDRGファミリータンパク質それぞれに対する特異抗体を作製し、これらの抗体を用いてマウス脳組織を免疫染色した。その結果、NDRG1はオリゴデンドロサイトに、NDRG2はアストロサイトに、NDRG3はほぼすべての細胞の核に比較的豊富に発現していた。またNDRG4は脳組織において広範囲に発現していた。これらのファミリータンパク質が、中枢神経系においてNDRG1の欠損を補償している可能性が考えられる。今後、NDRGファミリータンパク質の生理的機能を明らかにしていきたい。我々は以前、細胞ストレス応答遺伝子としてNDRG1を同定した。本年度、本研究において我々は、Ndrg1欠損マウスの表現型を、主に末梢神経組織を対象とした組織化学的手法を用して解析した。Ndrg1欠損マウスは、平常に出生し雄雌とも繁殖可能であったが、生後3ヶ月ごろから後肢の運動機能障害を示した。病理組織学的解析の結果、Ndrg1欠損マウス坐骨神経において、生後5週ごろから脱ミエリン化を伴う進行性の神経変性が観察された。一方、生後12週間のミエリン鞘形成期においては、坐骨神経の組織像に野生型との差は見られないため、ミエリン形成能は正常に保たれていると考えられた。抗NDRG1抗体を用いた免疫組織化学的解析の結果、野生型マウス坐骨神経においてNDRG1はシュワン細胞の細胞質に局在しており、ミエリン鞘に陽性像は見られないことが明らかになった。これは他の多くのCMT病の責任遺伝子の発現パターンと異なっている。一方、中枢神経系においては、Ndrg1欠損マウスに組織学的な、異常は見いだされなかった。以上のことから、NDRG1は、末梢神経系のミエリン鞘の構造維持に必須のタンパク質であることが示された。Ndrg1欠損マウスは末梢神経変性疾患のモデルマウスとして有用であり、NDRG1の分子機能の解明に貢献すると思われる。本研究におけるこれらの成果は、Mol.Cell.Biol.誌に受理され、掲載予定である。