hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
女性教師のライフコースに関する事例的質的調査研究

女性教師たちのライフコースから導き出されるのは、日常の教職生活に内在し、教師たちの発達を支え促していく機能(=インフォーマルな性格を持つ「発達サポート機能」)の存在の大きさである。勤務校における子どもたち(特に様々な問題を抱え個別対応が求められる子どもたち)との出会いと格闘、その経験過程で得られる先輩教師たちからの援助や助言、あるいは自らの子どもの出産・育児といった私的経験までもが、教師としての力量形成に大きな影響を与え、教師としての発達を支え促す機能を発揮しているのである。本研究は、学校教師が直面する様々な特徴と課題を集約的に抱える女性教師に焦点を当て、彼女らの「教師としての発達と力量形成」のプロセスを明らかにしつつ、男性教師も含めた教師全体の発達・力量形成サポートシステム構築に向けた基礎的データの収集・蓄積・提供を目的としている。研究の初年度であった平成19年度は、出身大学・学部、年齢、勤務校種の異なる、男性1人を含む5名の教師にインタビュー調査を実施した。インタビューは、一人46時間に及び、かなり丁寧なライフコースの聞き取りが可能となった。男性教師を対象に加えたのは、男性という立場に加えて、主幹職という立場からの、現在の学校現場における女性教師の抱える問題を聞き取ることを目的としたからである。4人の女性教師は、すでに職場において中心的位置にある40歳代の教師と、新任期の困難さを乗り切った20歳代後半の教師、各2人ずつである。それぞれの職場での位置と役割の違い、キャリアの違いに起因する様々な問題が得られたことに加えて、4人とも共通して職場での仕事の加重、子どもとその保護者の意識と態度の多様性と困難性を訴えたことが特徴的であった。現在、新たな対象者に対してのインタビュー調査実施の準備とともに、インタビュー調査データに対する質的な分析枠組みと方法についての理論的整備を合わせて行っている段階である。研究最終年度である平成20年度に、インタビュー調査実施して得られたデータを用いて、それらを問題提起していく予定である。教師は、自らの専門的な力量を生涯にわたって自己形成し、教育専門家としての発達を遂げていく。このことは、数多くの教師たちの経験が物語っている事実である。とりわけ、授業を担う実践的な指導力量は、教職に就いて以降の現職教育段階で、赴任した学校の中で数多くの授業実践を遂行し、教師の同僚間の経験交流や集団的な授業研究の取り組みの過程で、次第に獲得されていくのである。女性教師の場合、そのライフコース上、教師としての発達と力量形成を支え促す観点・要因として、次のような事柄が重要であることが明らかとなった。1.「子どもたちとの出会い」の中での力量形成と発達担当する子ども(特に非行・問題行動・障害・不登校などを抱え個別の指導を必要とする子どもの場合が重要である)の指導経験のみならず、教師自身の出産・子育て経験2.職場や地域における「教師集団」の中での力量形成と発達さまざまな教育実践上の困難な状況の中で、教師たちを支え、励まし、克服の方向性を示し、具体的な助言を与えてくれる存在としての職場や地域における先輩教師たち女性教師たちのライフコースから導き出されるのは、日常の教職生活に内在し、教師たちの発達を支え促していく機能(=インフォーマルな発達サポート機能)の存在の大きさである。勤務校における子どもたちとの出会いと格闘、その経験過程で得られる先輩教師たちからの援助や助言、あるいは自らの子どもの出産・育児といった私的経験までもが、教師としての力量形成に大きな影響を与え、教師の発達を促す機能を発揮しているのである。
骨芽細胞の老化過程と核蛋白質動態

未熟間葉系細胞の老化過程を誘導する為に、完全無蛋白質培養を行った。これにより電子顕微鏡的およびフローサイトメトリー上でプログラムされた細胞死、すなわちアポトシスが起こった。しかし通常の方法ではDNAの断片化が証明されず、アポトシスではあるものの、異なった分子機構によって生じる細胞死であることが判明した。そこでパルスフィールドゲル電気泳動を用いて解析すると、50から150キロ塩基対の長大な断片が証明された。Hoechst 33342を用いたフローサイトメトリーではアポトシスと長大な塩基対の断片化とが直接に関係することが示された。このアポトシスは阻害剤による検索の結果として特定の核酸切断酵素によるものであると考えられた。最終的には未熟間葉系細胞の分裂低下と老化過程の最終段階ではDNAの長大な断片化という特異的な過程が存在することが判明した。この変化は間葉系細胞に特異的なものと考えられた。これとは別に、数理的方法を用いて骨の老化を一般化する方法を試みた。これは巨視的意味で骨の形態学的変化を捉えようとするものであって、とくに長管骨の内径と外径との関係に注目した。両者の数学的関係について内径と外径とで決定される骨皮質の面責を一定とすると、両者の4乗差で定義されるイナーシアと呼ばれる機械強度は径が拡大するほど高くなる。このような場合に見かけ上の骨量は減少し、一般的な骨粗莇鬆症変化と合致するのである。このような場合でも機械強度の増強が可能なのである。すなわち径の拡大は機械強度と高める上で、合目的な変化である。一般的に骨粗鬆症で見られる長管骨の径拡大は一定骨量を最適化する過程であると看做しえた。この結果とアポトシスの結果は骨粗鬆症が遺伝子によってプログラムされた分化過程の一部である事を示唆した。腫瘍細胞における老化過程が分化過程の終えんであるか,細胞内にプログラムされた老化貴伝子の発現によるのかを決定しようとして,分化過程の一般化を試みた結果,正常細胞の分化過程と腫瘍細胞のそれとは根本的に異なることを明らかにした。とすれば正常の分化とは何かという疑問が提出される。そこで得られた結論は,分化とは体細胞社会における共生関係に帰着することが明白となり,その基本的概念を報告した。さらにこの共生関係の支配的調節因子として個体内における免疫系の存在に着目して,免疫系の存在意義を共生維持のために必要な内的認識であるという仮説を提出した。

これとは別に、数理的方法を用いて骨の老化を一般化する方法を試みた。これは巨視的意味で骨の形態学的変化を捉えようとするものであって、とくに長管骨の内径と外径との関係に注目した。両者の数学的関係について内径と外径とで決定される骨皮質の面責を一定とすると、両者の4乗差で定義されるイナーシアと呼ばれる機械強度は径が拡大するほど高くなる。このような場合に見かけ上の骨量は減少し、一般的な骨粗鬆症変化と合致するのである。このような場合でも機械強度の増強が可能なのである。すなわち径の拡大は機械強度と高める上で、合目的な変化である。一般的に骨粗鬆症で見られる長管骨の径拡大は一定骨量を最適化する過程であると看做しえた。この結果とアポトシスの結果は骨粗鬆症が遺伝子によってプログラムされた分化過程の一部である事を示唆した。
量子ホール液体における量子相転移の研究

分数量子ホール状態にある電子系は、その系の周縁部にエッジ状態とよばれる低エネルギー励起をもつ。このエッジ状態は分数量子ホール系のトポロジカルな性質を特徴づけ、系の電気伝導を担っている。今年度主に行った研究は、2つの分数量子ホール系のエッジ状態間の共鳴トンネル電流の計算である。具体的には、2つの量子ホール液体が間に量子ドットを介してつながっている状況を考察した。これは、半導体界面の2次元電子系にゲート電極をつけることにより、実験的に十分実現可能である。量子ドットと量子ホール液体の間には、ゲート電圧によって制御可能なトンネル障壁があるものとして、トンネル電流をマスター方程式を解くことにより求めた。量子ドットにおけるクーロンブロッケイド効果により、この系のコンダクタンスはゲート電圧の関数として、クーロン振動現象を示す。この振動にあらわれるピークに形状およびその温度依存性が、分数量子ホール系のランダウ準位充填率νで決定されることを明らかにした。ピークコンダクタンスは、温度をTとしたとき、T^<1/ν-2>のように変化する。これは、エッジ状態が朝永-ラッティンジャー流体であることのあらわれで、トンネル状態密度がE^<1/ν-1>のエネルギー依存性をもつことの結果である。ピークコンダクタンスが低温で0になることは、共鳴トンネル電流がincoherentなsequential tunneling processによって流れることを意味する。一方、共鳴ピークからはずれたところでは、十分低温におけるトンネル電流は主にcoherentなelastic cotunneling processによって運ばれ、コンダクタンスはT^<2/ν-2>の温度依存性をもつことを示した。
口腔内環境下でのT細胞アポトーシスの分子機構とその意義

T細胞が歯周組織を含む口腔内環境下で生体防御の機能を果たすためには、その分化の過程と末梢組織でのホメオスターシスの維持のためにT細胞自体の能動的な死、すなわちアポトーシスが重要な役割を担っている。申請者らは、T細胞の分化過程では胸腺ではT細胞アポトーシスは生理的なサイトカインを含む種々の細胞内情報伝達系のクロストークにより制御されていることを明らかにした。これを基に、成熟した末梢T細胞のアポトーシスが如何に制御されているかを、脾臓より調整したT細胞を試料とし、DNA切断を指標に検討した。その結果、(1)末梢T細胞は胸腺細胞にアポトーシスを引き起こすTPA,A23187では全くアポトーシスが誘発されない。(2)蛋白合成阻害剤シクロヘキシミドはそれ単独でDNA切断を引き起こす芽、その程度は24時間培養でも35%以下である。(3)cAMP,グルココルチコイドはその用量、時間依存性にDNA切断を誘発し、その切断はシクロヘキシミドで抑制される。このことは末梢T細胞には少なくとも蛋白合成に依存した過程と蛋白合成の阻害により誘発される過程の二つの機構でアポトーシスが制御されていることを示唆している(論文作成中)。(4)マウス舌顎下腺の抽出分画、および唾液祖分画にはT細胞のアポトーシスを修飾する因子は認められなかった。(5)精製された唾液中のセリンプロテアーゼはT細胞にネクローシスを誘発し、アポトーシスは認められなかった。末梢T細胞は胸腺細胞と異なったアポトーシス制御機構をもつことからその細胞内のでの分子機構とそれを修飾する口腔内因子との関連性の解析、特にマクロファージとの相互作用、マトリックスとの相互作用などを明らかにする必要があると考えられる結果を得、その研究を推進していく予定である。
延髄呼吸性ニューロンのバースト形成に関わるイオンチャネルの解析

延髄腹外側部の呼吸性ニューロンは,高閾値(N,L型),中間閾値(P型)及び低閾値(T型)のCa^<2+>チャネルを持つ.本研究では,新生ラット摘出脳幹一脊髄標本を用い,Pre-I及び吸息性ニューロンについて,バースト形成に重要と思われる高閾値及び中間閾値Ca^<2+>チャネル,Ca^<2+>依存性K^+チャネル,そして内因性の膜電位振動形成に関与する持続性Na^+チャネルを,パッチクランプ法を用いて解析した.結果:1)P型Ca^<2+>チャネルブロッカーであるω-Aga-IVA(0.2μM)の投与により,バーストの大きさは減衰した.2)N型Ca^<2+>チャネルブロッカーであるω-CgTX(2μM)処理によって,バーストの大きさは増大し,活動電位の不活性化が見られた.またCa^<2+>依存性K^+チャネルの間接的な抑制により,スパイク後過分極を抑制した.3)Ca^<2+>依存性K^+チャネルブロッカーapamin(0.4-1μM)の投与は,バーストの増大,活動電位の不活性化を引き起こした.4)L型Ca^<2+>チャネルブロッカーであるnifedipine(20μM)は,バーストの持続時間を短縮させた.5)Cd^<2+>(0.1mM)によりCa^<2+>チャネルをブロックした時,バースト活動の抑制後,Pre-Iニューロンにおいては緩徐脱分極応答及び脱分極依存性の膜電位振動が観察された.その活性化の閾値は-45mV付近にあった.さらにK^+チャネルブロック下で,自発性のバースト活動及びプラトー電位を発生した.これらの反応は,すべて0.5μM TTXによりブロックされた.考察:Pre-IニューロンにおけるTTX感受性-持続性Na^+チャネルとP型Ca^<2+>チャネルの働きによる内因性緩徐脱分極がバーストの立ち上がりに重要である.続いてN,L型Ca^<2+>チャネルが活性化されバーストが増強される.Ca^<2+>依存性K^+チャネルはバーストの持続と終了に関与するものと考えられる.結論:一連の研究によって、延髄腹外側部呼吸性ニューロンが持つ,イオンチャネルが明らかにされ,それぞれのバースト形成における機能が示唆された.呼吸リズム形成の神経機構を明らかにするためには,ニューロンネットワーク及びそれを構成するニューロンのイオンチャネルを解析する必要がある.本研究の目的は,新生ラット摘出-脳幹脊髄標本を用いて,呼吸性ニューロンのバースト形成のイオン機構を解明することにある.これまでの結果より,延髄腹外側部の呼吸性ニューロンが,TTX存在下及びK^+チャネルブロック下で高閾値(N,Lタイプ),低閾値(Tタイプ)及び中間閾値(Pタイプ)のCa^<2+>依存性膜電位応答を示すことがわかった.本研究では,これらのCa^<2+>チャネル及びCa^<2+>依存性K^+チャネルの呼吸性ニューロンバースト形成における役割を,主にパッチクランプ法を用いて明らかにする.このため,標準潅流液下の呼吸性(特に吸息性及びPre-I)ニューロンバースト形成に対する,各種Ca^<2+>チャネルブロッカー(Co^<2+>, Cd^<2+>, nifedipine (L type), ω-conotoxin (N type), ω-agatoxin (P type) )の効果を調べ,以下の成果を得た.1)共通の効果:呼吸性ニューロンの膜の過分極,膜抵抗の減少,後過分極の抑制,シナプス活動の減少; C4/C5吸息性運動神経活動の大きさの減少または停止などであった.2)Co^<2+> (2mM), Cd^<2+>(0.1mM) :ニューロンのバースト形成及びC4/C5活動の完全な抑制(可逆的)を引き起こした.3) ω-conotoxin (1-2μM) :ニューロンバースト(特にPre-I)及びC4/C5活動の減衰を引き起こした.シナプス活動は顕著に抑制された.吸息性ニューロンにおいてwash-out時にバースト時の脱分極及びバースト後過分極が大きくなることがあった.4)ω-agatoxin (0.2-0.4μM) :呼吸リズムの抑制はω-conotoxinに比べ強い.Pre-Iニューロンのバースト時脱分極を強く減少させた.しかしシナプス活動の抑制はω-conotoxinより弱かった.4)Nifedipine (20μM) : ω-conotoxinの作用に類似していたが,効果はより弱かった.これらの結果は,Ca^<2+>チャネル(特にP及びNタイプ)が呼吸性ニューロンのバースト形成に重要であること,また,NタイプCa^<2+>チャネルはCa^<2+>依存性K^+チャネル機能を介して吸息性バーストの終了に関わることなどを示している.特に,Pre-IニューロンではPタイプCa^<2+>チャネル(デンドライトに存在する?)が,他のPre-Iニューロンからの興奮性シナプス入力による脱分極により活性化され,バーストの開始及びバースト時の脱分極を増強するように働く可能性もある.またCa^<2+>チャネル機構は,おそらく間接的に(Kコンダクタンスを調節することで)静止電位の決定にも関与することが示唆された.

延髄腹外側部の呼吸性ニューロンは,高閾値(N,L型),中間閾値(P型)及び低閾値(T型)のCa^<2+>チャネルを持つ.本研究では,新生ラット摘出脳幹一脊髄標本を用い,Pre-I及び吸息性ニューロンについて,バースト形成に重要と思われる高閾値及び中間閾値Ca^<2+>チャネル,Ca^<2+>依存性K^+チャネル,そして内因性の膜電位振動形成に関与する持続性Na^+チャネルを,パッチクランプ法を用いて解析した.結果:1)P型Ca^<2+>チャネルブロッカーであるω-Aga-IVA(0.2μM)の投与により,バーストの大きさは減衰した.2)N型Ca^<2+>チャネルブロッカーであるω-CgTX(2μM)処理によって,バーストの大きさは増大し,活動電位の不活性化が見られた.またCa^<2+>依存性K^+チャネルの間接的な抑制により,スパイク後過分極を抑制した.3)Ca^<2+>依存性K^+チャネルブロッカーapamin(0.4-1μM)の投与は,バーストの増大,活動電位の不活性化を引き起こした.4)L型Ca^<2+>チャネルブロッカーであるnifedipine(20μM)は,バーストの持続時間を短縮させた.5)Cd^<2+>(0.1mM)によりCa^<2+>チャネルをブロックした時,バースト活動の抑制後,Pre-Iニューロンにおいては緩徐脱分極応答及び脱分極依存性の膜電位振動が観察された.その活性化の閾値は-45mV付近にあった.さらにK^+チャネルブロック下で,自発性のバースト活動及びプラトー電位を発生した.これらの反応は,すべて0.5μM TTXによりブロックされた.考察:Pre-IニューロンにおけるTTX感受性-持続性Na^+チャネルとP型Ca^<2+>チャネルの働きによる内因性緩徐脱分極がバーストの立ち上がりに重要である.続いてN,L型Ca^<2+>チャネルが活性化されバーストが増強される.Ca^<2+>依存性K^+チャネルはバーストの持続と終了に関与するものと考えられる.結論:一連の研究によって、延髄腹外側部呼吸性ニューロンが持つ,イオンチャネルが明らかにされ,それぞれのバースト形成における機能が示唆された.延髄腹外側部の呼吸性ニューロンは,高閾値(N,L型),中間閾値(P型)及び低閾値(T型)のCa^<2+>チャネルを持つ.本研究では,新生ラット摘出脳幹一脊髄標本を用い,Pre-I及び吸息性ニューロンについて,バースト形成に重要と思われる高閾値及び中間閾値Ca^<2+>チャネル、Ca^<2+>依存性K^+チャネル,そして内因性の膜電位振動形成に関与する持続性Na^+チャネルを,パッチクランプ法を用いて解析した.結果:1)P型Ca^<2+>チャネルブロッカーであるω-Aga-IVA(0.2μM)の投与により,バーストの大きさは減衰した.2)N型Ca^<2+>チャネルブロッカーであるω-CgTX(2μM)処理によって,バーストの大きさは増大し,活動電位の不活性化が見られた.またCa^<2+>依存性K^+チャネルの間接的な抑制により,スパイク後過分極を抑制した。3)Ca^<2+>依存性K^+チャネルブロッカーapamin(0.4-1μM)の投与は,バーストの増大,活動電位の不活性化を引き起こした.4)L型Ca^<2+>
先天性白質形成不全症の遺伝子単離と治療薬検討

また先天性白質形成不全症に骨病変を伴う亜系があることを見出し、報告した。神経変性疾患新規遺伝子単離は順調に進んでおり、新たなターゲットも見出し報告している。また治療薬検討についてはplp1発現の認められるラットC6グリオーマを用い、plp1の発現を下げる薬物を見出すことを目的に、新たに入手したライブラリーを用いスクリーニングを開始し、すでに候補化合物を得ており、そのうちの1つについては、共同研究として報告した。新規遺伝子単離が、エクソーム解析によりなされた。治療薬検討についても、スクリーニングを進めている白質形成不全症の新規遺伝子は順調に進み、保険診療のPLP1遺伝子検索に加え、GJC2,POLIIIA, POLR3B、TUBB4の遺伝子によりほぼ8割程度の診断が可能となった。治療薬検討については、現在までにマウス投与でPLP1の発現を下げる薬物を見出しておらえず、新しいスクリーニング方法を考える時期に来ている。1)重複型の薬物スクリーニングPLP1遺伝子重複のPMDが遺伝性白質形成不全症の、もっとも多い原因である。我々の施設でのPMD診断例は、平均2歳であり、画像上の萎縮性変化が生じるより前に、遺伝子診断がなされる例が増えてきた。すなわち細胞変性をきたす前に遺伝子重複によるPLP1過剰発現を抑制すれば、停止した髄鞘化の解消と二次的細胞変性の予防による治療が可能と考える。我々は、内因性plp1を発現するC6グリオーマを用いて、その発現を指標として140種類以上の食品化合物をスクリーニングした。その結果生理的濃度の薬物添加下でPLP1の発現が50%以上低下する食品化合物を2種類、30%以上低下する食品化合物をすでに11種類同定している。これらの薬物を、ヒトでの投与量の上限を体重換算した量を、4週令の正常マウスに一週間腹腔内投与したが、有意な発現減少が得られなかった(未発表)。この原因として中枢神経移行率が悪い、あるいは細胞で認める発現変化は組織では代償されてしまいその変化が得られない等が考えられる。そこで今回は、すでに上市されている薬剤の中から、中枢神経に移行することがわかっている、約200種類の薬剤を用い、C6グリオーマの系で同様の実験を行い、より臨床応用に近い薬剤のスクリーニングを行う。ライブラリーの一部はナミキライブラリーより購入あるいは慶応大学、既存薬ライブラリーから貸与を受ける。主としてスクリーニングの化合物の購入にあてる。1件3万円程度として、30件の購入が可能である。9月に異動があり(神奈川県立こども医療センターより自治医科大学)、そのため研究室のセッティングに時間を要したため。必要な、研究物品の移動、セッティングが終了し、実験を再開した。今後スクリーニングの為の、細胞培養システム(プラスミド、培地、安定細胞株作成用の抗生剤等)を立ち上げており、そのための費用として用いる血液脳関門を通過することがわかっている、既存薬剤のライブラリーを入手する。入手できないものは、ナミキライブラリー等から購入するため、各々2万円程度必要となる。そのための支出が数十万円計上している。その他iPSや幹細胞の継代等に数十万円の支出を予定している。
培養肺胞上皮細胞気管内注入による肺病変修復促進の分子生物学的検索

1.培養肺胞II型上皮細胞気管内投与による投与細胞の動態-ラット肺より肺胞II型上皮細胞を分離し、細胞が培養皿に付着しないようにバクテオロジカルデイシュに一日培養し、4-diamino-2-phenylindole(DAPI)を用いて細胞核を染色してから他のラット肺に気管内投与した。数日後ラット肺を凍結固定し、凍結切片を作成して蛍光顕微鏡にて観察すると、投与した細胞が塊を作って肺胞壁に付着しており、形態的に生きている細胞が確認された。培養細胞を肺胞上皮細胞増殖因子であるKGFで、12時間刺激しDAPIで染色後、気管内投与してその動態を検索し、同様の結果を得ている。現在、細胞をマークしないで(少し細胞障害があると思われるため)気管内投与し、投与肺を組織学的、電顕的に検索している。肺表面活性物質アポ蛋白質SP-Aの抗体による免疫組織化学的検索でも、気管内投与したと思われる細胞にSP-A陽性が観察された。2.呼吸不全動物肺での細胞動態変化-エンドトキシン、ブレオマイシンや塩酸による障害ラットを作製し、KGFで刺激した培養肺胞II型上皮細胞を呼吸不全動物ラット肺に気管内投与し、その投与細胞の動態を検索しているが、肺水腫などが強いためか肺胞壁まで達していなく付着した細胞が少ない。最適投与時期を検索するため、経時的な変化を観察している。また、DAPIの細胞内取り込みがあまりよくないので、ダイオ-なとの他のマーカーも用いた細胞動態の検索を検討している。3.KGF刺激培養肺胞上皮細胞と人工サーファクタント併用による肺障害抑制効果-予備実験でKGF刺激培養細胞投与による肺障害抑制効果がはっきりしなかったので、人工サーファクタントとの併用効果を試みて居るが、急性期には肺水腫が著しく投与物質が肺胞に達しないと思われ、効果があまり見られなかった。現在経時的に投与日を変え効果のある時期を検索中である。さらに、プロテアーゼ阻害薬などの併用効果も検索中である。4.今後の展望-肺障害作製後人工呼吸管理を併用して(初期の肺水腫を抑えて)KGF刺激培養細胞を投与する研究を検討している。さらに、アデノウイルスを用いたgene transferによる研究も検討し始めている。
発がん活性を有する合成エストローゼンの微小管との作用機序の研究

合成エストローゼンのジエチルスチルベストロール(DES)は、ヒトに対し発がん活性を示すことが知られている数少ない医薬品の一つである。我々は、DESがin vitroで微小管の重合阻止活性を有することを初めて証明し、DESの発がん機序の一つとして微小管に対する作用が関与する可能性に焦点をおき研究を行ってきた。すなわち、微小管は、真核細胞生物の細胞骨格の役割を果たす他に、細胞分裂における紡錘糸の重要な構成々分でもある。従って、微小管に対し強力に作用する物質は抗がん物質にもなりうる。ビンクリスチンはその代表例である。本研究は各種のDES誘導体を合成し、次いで精製した微小管構成タンパク質に対する作用、および培養細胞に対する作用を調べDESの発がん活性解明の基礎研究を行った。〔実験結果〕DESおよびmeso-hexestrolを原料として、各種の立体異性体、モノおよびジメチルエーテル体、ヒドロキシ体、エポキシ体の合成、および鏡像体の光学分割を行った。微小管タンパク質はブタ脳より分離し、これよりPC-tubulin、S-tubulin、MAP2およびtauを得た。このタンパク質を用い、合成したDES誘導体のin vitroでの作用を濁度測定、電顕観察により調べた。その結果、特にmeso-hexestrolとE、E-dienestrolは微小管タンパク質から新しいタイプのリボン構造の形成を誘導すること、さらにdl-、(+)-および(-)-hexexstrolにその活性の差を見出した。また誘導体の一部につきChinese hamster V79細胞に対するコロニー形成率および染色体数に及ぼす影響を調べ、構造活性相関を明らかにした。最近、DESの発がん作用の1つとしてDESが代謝される過程で生ずる活性酸素によるDNA中のデオキシグアノシンの変化が提出されてる。本研究における微小管重合阻止の活性とあわせ、重要な知見と考えられる。第二年度の研究として,微小管に作用するジエチルスチルベストロール(DES)関連化合物の新しい誘導体を合成し,これらの微小管タンパクおよびPC-tubulinに対する作用をしらべた.さらに, PC-tubulinのsubtilisin処理で得られるS-tubulinの調整法を確立した.2.微小管タンパクおよびPC-tubulinとの相互作用:(1)meso-Hexestrolの重水素標識体として,〔4, 4′, 6, 6′-^2H_4〕-meso-hexestrolを合成し,微小管タンパクに対するin vitroの作用を濁度測定でしらべ,重水化により活性が約80%に減じた.(2)〔^3H〕-meso-HexestrolとPC-tubulinとの相互作用については,現在,実験が進行中である.(3)trans-DES-epoxideは,微小管タンパクに対しDESがほゞ完全に重合を阻止する濃度(200μM)においても殆んど活性が認められなかった.本年度は、昨年度に合成したジエチルスチルベストロール(DES)関連化合物の微小管タンパク質に対する作用を調べ、また新たにDES誘導体の合成にも着手した。さらに、Sーtubulinにおよぼすmeso-hexestrolの影響およびChinese hamster V79細胞に対するDES関連化合物の作用についても検討した。2.DES誘導体の微小管タンパク質に対する作用:昨年度に合成したtrans-DES-oxideのin vitroでの微小管重合阻止活性はDESの約1/10であったが、電顕観察では200μMの濃度で多数の短い微小管が認められた。また、4ーhydroxy-meso-hexestrolの微小管重合阻止活性はmeso-hexestrolとほぼ同様の活性であり、電顕観察でもmeso-hexestrolの場合と同じくリボンの形成が見られた。

3.S-tubulinにおよぼすmeso-hexestrolの影響:昨年度に引き続きPCーtubulinをsubtilisinにより限定分解して得られるSーtubulinの調製法を確立した。meso-hexestrolはSーtubulinのシート状への重合を阻害する作用を有するが、このときSーtubulinからリボン構造物の形成は認められなかった。4.Chinese hamster V79細胞に対するDES関連化合物の作用:Chinese hamster V79細胞を用い、DES関連化合物を添加した場合におけるコロニー形成率および染色体数の解析に関する基礎を確立し、DESおよびそのメチルエーテル体の活性を調べ、活性の強さはDES>モノメチル体>ジメチル体の順であった。
共鳴格子による広範囲・高感度・高速検知可能な光学式水素センサー

本研究では,将来の水素エネルギー社会に向けた安全性確保のために,水素濃度を広範囲で高感度・高速で検知できるパラジウム膜上共鳴格子型光学式センサの開発に向けて研究を行った.高速に検知するために分光器を用いて共鳴波長シフトを0.1秒で測定した.水素濃度が1%から4%において最も感度が高く,既報のセンサより高くなった.水素濃度分解能にすると0.13%となった.また,高感度・高速検知のための位相差測定法として,ラジアル偏光とカメラを用いた方法とグースヘンシェンシフトというビームの位置ズレを測定する方法について検討した.水素の測定にはいたらなかったが,高感度化・高精度化できる可能性を示した.将来の水素エネルギー社会に向けた燃料電池の高効率化と安全性確保のために,水素濃度を広範囲で高感度・高速で検知できるパラジウム膜上共鳴格子型光学式センサーの開発を目的とする.新規提案構造(水素検知部分であるパラジウム薄膜を光強度が集中する導波層中心部に設置した)とすることで,従来よりも共鳴角度あるいは共鳴波長のシフト量を増やす,つまり高感度化が可能であることが設計により確かめられた.しかし,検知分解能に関係する角度半値幅または波長半値幅が太くなってしまうというトレードオフの関係があることが判明した.その理由は,光強度が集中する部分に金属膜を設置した結果,光吸収が増え,導波層中の横方向伝搬距離が減ったためである.これを解決するには,プラズモンの長距離伝搬モードあるいは金属材料の検討のような何らかの工夫が必要であり,容易には解決できない.そこで,入射角度または波長を変える必要がなく,高感度計測が可能な位相差検出方法について研究をすすめた.当初の計画では,ラジアル偏光(中心から放射状に電場が向いた光)入射によるセンサーからの反射光の強度分布をカメラで計測することにより,位相差をワンショットで面検出して算出することを考えていた.実は,共鳴が生じるときに,反射光が大きな位置ズレ,つまりグースヘンシェンシフトを起こすことが知られている.そこで,この位置ズレを測定することで,より簡易な光学系で同じオーダーで位相の代替測定ができる可能性を数値計算で示した.上記のラジアル偏光入射に対する反射光のカメラ計測では,光入射位置における構造のばらつきの影響が顕著に現れるが,グースヘンシェンシフト測定では,入射ビームスポットは固定するため,ビーム径にほぼ等しいおよそ1mm径の範囲で構造のばらつきを抑えればいいので,センサーの作製においてもメリットとなると期待できる.大きな共鳴角度シフトまたは波長シフトによる高感度化と検知分解能に関係する角度または波長半値幅の細さとがトレードオフの関係にあるため,効果的な構造の設計ができていない.しかし,より高感度測定可能な位相差検出に適した設計では,入射角度と波長は固定するので大きなシフト量は必要ではなく,角度または波長半値幅が細いほうが位相の急激な変化が起こることから,細い半値幅の設計は可能である.そこで,位相差測定について検討する中で,位相差を回転検光子法などで直接測定する代わりに,グースヘンシェンシフトを測定することを提案し,直接測定よりも分解能は落ちるが,簡易な光学系で同じオーダーの分解能が実現できる可能性を数値計算で示した.しかし,試作に関しては,サブ波長格子構造を紫外線レーザー干渉露光により作製しており,強度分布のばらつきの影響で,計算値の約3倍と大きな半値幅のセンサーしかできていないため,遅れている.将来の水素エネルギー社会に向けた燃料電池や水素発電の高効率化と安全性確保のために,水素濃度を広範囲で高感度・高速で検知できるパラジウム膜上共鳴格子型光学式センサの開発を目的とする.金属膜上共鳴格子では,特定の波長・入射角において反射率が急激に下がる共鳴反射が生じる.金属部分のパラジウムが水素を吸収すると,その濃度に応じた屈折率変化によって,共鳴の生じる波長や角度がシフトする,あるいは反射光の位相差が大きく変化する.特に,共鳴角度シフトや位相差を検出する方式で水素濃度センサシステムが試作されたが,回転機構が必要であり,計測に時間を要していた.そこで,共鳴波長検出法として,光ファイバを用いて共鳴格子からの反射スペクトルを分光器で捉え,共鳴波長シフトから水素濃度を検出するセンサシステムを開発した.試作センサは,S偏光を垂直入射したとき,水素濃度分解能が0.13%,計測時間が0.1秒であることを実証した.また,1%未満と4%以上の水素濃度で,パラジウムの屈折率変化が小さくなり,感度が悪くなった.広範囲で高感度化するには,別の水素検知膜が必要である.ラジアル偏光と呼ばれる中心から放射状に電場が振動する光を入射し,共鳴格子からの反射光の強度分布をカメラで計測し,位相差をワンショットで算出する研究については,ラジアル偏光を発生させ,強度分布がドーナツ形状になるところまで確認できたが,そのあとの画像取得からの位相差算出の検証は未達成である.また,位相差に基づく反射光の位置ズレ,つまりグースヘンシェンシフトを測定する実験については,簡単のために,金膜を蒸着した三角プリズムのP偏光(参照光)とS偏光(共鳴光)の反射ビームの位置ズレの差を,位置検出素子を利用して測定した.屈折率の異なる液体を金膜上に滴下したとき,ビームの位置ズレの差が変化することは確認できたが,定量的な評価には至っていない.全体の測定法に共通して,密閉容器,水素ボンベと窒素ボンベ,流量計により,水素濃度をコントロールできるようになったので,水素濃度に対する定量的な評価ができるようになった.波長検出法については,上記ガス混合システムにより,水素濃度変化によるセンサの時間応答も測定できたので,ほぼ計画どおりの成果が得られた.

また,ラジアル偏光入射によるワンショット位相差測定については,画像取得からの位相差算出の検証は未達成であるため,やや遅れている.グースヘンシェンシフト測定については,定性的にはビームの位置ズレが確認できたが,定量的な評価ができていないため,遅れている.試作に関しては,格子構造の作製に用いた紫外線レーザーの強度分布のばらつきの影響が大きかったが,レーザー強度をモニターすることで,露光時間を決定し,露光量を一定にすることで,時間に対するばらつきの影響が少なくなり,センサ作製の再現性を向上できた.本研究では,将来の水素エネルギー社会に向けた安全性確保のため,水素濃度を広範囲で高感度・高速で検知できるパラジウム膜上共鳴格子型光学式センサの開発に向けて研究を行った.高速に検知するために分光器を用いて,共鳴波長シフトを0.1秒で測定した.水素濃度が1%から4%において最も感度が高く,既報のセンサより高くなった.水素濃度分解能にすると0.13%となった.また,高感度・高速検知のための位相差測定法として,ラジアル偏光と呼ばれる中心から放射状に電場が振動する光を入射し,反射光の強度分布をカメラで取得し,位相差をワンショットで算出する方法を検討した.カメラを用いることで,測定の高速化および,画像というデータ量の多さから位相検出の精度向上が期待できる.高精度に検出するため,偏光パラメータ,ビーム中心,強度分布などの未知数から算出したビームプロファイルの仮想画像と取得画像とのマッチングをとり,最も高い相関が得られる偏光パラメータを探す手法を提案し,検証した.ここでは,実証のために,金膜を成膜したプリズムを用いた.従来手法である回転検光子法と比較したところ,両者はよく一致し,計算値とも一致した.位相差の繰り返し測定のばらつきより精度を評価した結果,3倍の精度が得られた.また,共鳴が生じるときに,反射光が急激な位相変化のために大きな位置ズレを起こすことが知られている.このズレをグースヘンシェンシフトと呼ぶ.この位置ズレをPとS偏光の差として測定することで,より簡易な光学系で高感度に位相の代替測定ができる可能性を数値計算で示した.次に,実際にグースヘンシェンシフトを測定可能かどうか,金膜プリズムを用いて,実験で確かめた.入射角を変えて,位置ズレの差を記録したところ,計算値とよい一致を示した.今後は,これらの位相差測定方法を用いることで,水素センサの高感度化・高精度化が期待できる.本研究では,将来の水素エネルギー社会に向けた安全性確保のために,水素濃度を広範囲で高感度・高速で検知できるパラジウム膜上共鳴格子型光学式センサの開発に向けて研究を行った.高速に検知するために分光器を用いて共鳴波長シフトを0.1秒で測定した.水素濃度が1%から4%において最も感度が高く,既報のセンサより高くなった.水素濃度分解能にすると0.13%となった.また,高感度・高速検知のための位相差測定法として,ラジアル偏光とカメラを用いた方法とグースヘンシェンシフトというビームの位置ズレを測定する方法について検討した.水素の測定にはいたらなかったが,高感度化・高精度化できる可能性を示した.平成28年度は,グースヘンシェンシフト測定の実証実験をする予定である.
高エナンチオ選択的不斉2,3転位反応の開発

ベンジルイソプロペニルエーテル2をモデル基質として不斉リガンド・ブチルリチウム錯体による不斉2、3転位反応を検討した。種々の不斉ジアミン、ジエーテル、アミノアルコールを合成し、不斉反応に適用したところ、アミノエーテル1が目的の転位体を68%収率、37%eeで与えることを見い出した。さらに基質のスクリーニングを行ったところ、プロパルギルエーテル誘導体が最も良い結果を与え、4aからは51%収率、62%eeで対応する転位体5aが得られた。鎖状化合物を基質としたエナンチオ選択的不斉2、3転位反応としては現在知られている最高のエナンチオ選択性を示している。転位体5は分子内にアレン、アセチレン、アルコールを持ち合わせる高度に官能基化された化合物で、複雑な光学活性化合物の有用なキラルシントンとなりうる。不斉誘起のメカニズムはプロパルギル位のエナンチオトピックな二つの水素を識別した不斉脱プロトン化に由来すると考えられる。
低栄養ラット骨格筋での高エネルギー燐酸化合物生成に対する中鎖脂肪乳剤の効果

体重200g前後のWistar系ラットを2群に分け、両群とも入荷後1週間は自由摂食とした摂食群はその後の1週間も自由摂食とした(F群、n=10).一方絶食群(S群、n=11)ははその後の1週間は水分のみを与え絶食とした.毎日一定時間に体重を測定し、2週間の飼育が終了した時点でF群の5匹とS群の6匹をエーテル麻酔下に大動脈採血にて犠死させ、血清総蛋白、血清アルブミン、プレアルブミン、レチノール結合蛋白、トリグリセライド、総コレステロールを測定した.残りのラット(F群、n=5;S群、n=5)を用いてペントバルビタール麻酔下に大腿筋群上の皮膚を剥離し、神経刺激装置により筋肉を150v,4rpsで5分間強制反復収縮させ骨格筋を疲労させた.燐核磁気共鳴スペクトロスコピーにてクレアチン燐酸(Pcr)/無機燐(Pi)の比率を測定しながらこの比率が前値に戻った時点で筋再び疲労させ、合計3回の筋疲労状態を作成した.【結果】血清総蛋白はF群で5.57±0.28g/dl、S群で5.02±0.30(p<0.01)、血清アルブミンはF群で3.93±0.15g/dl、F群で3.71±0.23g/dl(NS)、プレアルブミンはF群で3.46±1.78、S群で0.79±0.28(p<0.005)、レチノール結合蛋白はF群で2.5±1.0mg/dl、S群で0.55±0.25mg/dl(p<0.005)、トリグリセライドはF群で112.8±39.1、S群で34.1±14.9(p<0.01)、総コレステロールはF群で57.8±3.9mg/dl、S群で46.1±11.0mg/dl(p<0.01)であった.2週間の飼育終了時点での体重はF群の249.2±12.2gに対しS群では174.0±28.6g(p<0.01)であった.3回の筋疲労におけるPcr/Piの低下はF群では疲労前の55.1±9.8%,65.9±20.5%,78.0±17.3%であり、疲労回数を重ねるにつれて減少率が少なくなったのに対し、S群では37.6±9.7%,50.3±9.6%,45.8±5.4%とF群に比べて減少率も大きく、また疲労回数が多くなってもPcr/Piの減少率の回復は著明ではなかった.【まとめ】骨格筋を疲労させると全身のエネルギー基質が動員され骨格筋における高エネルギー燐酸化合物生成を旺盛にするというホメオスターシスが存在する.低栄養ラットではこのホメオスターシスが抑制された.現在低栄養ラットでの疲労骨格筋におけるクレアチン燐酸合成を促進する輸液を、グルコース、長鎖脂肪酸乳剤および中鎖脂肪乳剤について検討中である.体重200g前後のWistar系ラットを2群に分け、両群とも入荷後1週間は自由摂食とした摂食群はその後の1週間も自由摂食とした(F群、n=10).一方絶食群(S群、n=11)ははその後の1週間は水分のみを与え絶食とした.毎日一定時間に体重を測定し、2週間の飼育が終了した時点でF群の5匹とS群の6匹をエーテル麻酔下に大動脈採血にて犠死させ、血清総蛋白、血清アルブミン、プレアルブミン、レチノール結合蛋白、トリグリセライド、総コレステロールを測定した.残りのラット(F群、n=5;S群、n=5)を用いてペントバルビタール麻酔下に大腿筋群上の皮膚を剥離し、神経刺激装置により筋肉を150v,4rpsで5分間強制反復収縮させ骨格筋を疲労させた.燐核磁気共鳴スペクトロスコピーにてクレアチン燐酸(Pcr)/無機燐(Pi)の比率を測定しながらこの比率が前値に戻った時点で筋再び疲労させ、合計3回の筋疲労状態を作成した.【結果】血清総蛋白はF群で5.57±0.28g/dl、S群で5.02±0.30(p<0.01)、血清アルブミンはF群で3.93±0.15g/dl、F群で3.71±0.23g/dl(NS)、プレアルブミンはF群で3.46±1.78、S群で0.79±0.28(p<0.005)、レチノール結合蛋白はF群で2.5±1.0mg/dl、S群で0.55±0.25mg/dl(p<0.005)、トリグリセライドはF群で112.8±39.1、S群で34.1±14.9(p<0.01)、総コレステロールはF群で57.8±3.9mg/dl、S群で46.1±11.0mg/dl(p<0.01)であった.

2週間の飼育終了時点での体重はF群の249.2±12.2gに対しS群では174.0±28.6g(p<0.01)であった.3回の筋疲労におけるPcr/Piの低下はF群では疲労前の55.1±9.8%,65.9±20.5%,78.0±17.3%であり、疲労回数を重ねるにつれて減少率が少なくなったのに対し、S群では37.6±9.7%,50.3±9.6%,45.8±5.4%とF群に比べて減少率も大きく、また疲労回数が多くなってもPcr/Piの減少率の回復は著明ではなかった.【まとめ】骨格筋を疲労させると全身のエネルギー基質が動員され骨格筋における高エネルギー燐酸化合物生成を旺盛にするというホメオスターシスが存在する.低栄養ラットではこのホメオスターシスが抑制された.現在低栄養ラットでの疲労骨格筋におけるクレアチン燐酸合成を促進する輸液を、グルコース、長鎖脂肪酸乳剤および中鎖脂肪乳剤について検討中である.
アルツハイマー病におけるオリゴマーアミロイド蛋白の病因論に関する基礎研究

アルツハイマー病の発症原因として議論されているAβオリゴマー仮説について検証した。Aβオリゴマー仮説の病因論としての正当性と重要性について、遺伝性アルツハイマー病の分子基盤を解明し、分子機構について培養細胞やモデルマウスを作製して、神経細胞内にAβオリゴマーが異常蓄積することが発症原因である証拠を発見した。今後、Aβオリゴマーの検査と治療薬開発によりアルツハイマー病医療が展開すると考えられる。本研究は、高齢化社会での重要な医学的、社会的問題となっているアルツハイマー病認知症に関する研究であり、主として正確な診断法に関する検討を基礎医学的に実施したものである。具体的には、臨床症例を対象とした研究を中心としており、臨床上の問題点を整理することで現行化合物の意義を深め、同時に新規化合物開発への新しい視点を提供する基礎研究である。基本的には、健常人と孤発性アルツハイマー病患者間の比較検討を中心とした解析の上に、早期発症型家族性アルツハイマー病を対象とした脳画像を取り上げることで、早期脳画像変化に焦点を絞った検討を実施した。第2に臨床的認知症度とPiBシグナルに基づく脳内アミロイド蓄積量との関係を検討した。第3に、PiBシグナルとFDG-PETシグナルを比較検討することで、脳機能とアミロイド蓄積量との関係を調査した。その結果、現行でグローバルに試用されている化合物として米国で開発されたPiB化合物については、PETシグナルが意味する画像解析は未完成であることから、多様な臨床症例にて分析が進んでいる。本研究においては、正常例、孤発性アルツハイマー病症例をベースに、家族性アルツハイマー病を対象とした本PiB-PET研究を中心に実施した。概ね従来研究成果を支持する結果であり矛盾しないことを確認することで、本研究組織・体制に間違いがないことが確認された。さらに詳細には、家族性アルツハイマー病の特徴として、線状体での高いPiB保持率に対して皮質ではやや低いPiB保持率であることが明らかとなった。しかも、臨床症状での多様性とは異なり、PiBによる検討では脳内Aβ蓄積のパターンと程度は、各変異種によらないと結論した。高齢化社会での重要な医学的、社会的問題となっているアルツハイマー病認知症に関する研究であり、主として正確な診断法に関する検討を基礎医学的に実施したものである。APP E693Δマウスは、現在主要原因分子として注目されているAβオリゴマーのみを発現するように工夫した新規アルツハイマー病モデルマウスである。これは、大阪変異(E693Δ)をもつ患者分析から得られた遺伝変異を、脳組織とりわけニューロン選択性の特異性が高いプロモーターの作用で発現するコンストラクトを作成し、マウスに導入したものである。モデルマウスの認知諸機能、神経活動、そして脳組織の生化学的分析と脳病理学的検索を実施した。まずwater mazeでの学習記憶試験をした結果、APPE693Δマウスでは記銘力の学習記憶障害が8ヶ月例以後に、経時的に顕著に確認された。また、記憶保持力二層等するプローブ試験でも有意に低下していることを観察した。ついで、姫路獨協大・薬・松山正剛先生との共同研究でシナプスでの長期増強作用(LTP)を検討した結果、non-Tgマウスでは正常であったLTP作用が、APPE693Δマウスではほぼ完全に障害されていることが観察された。さいごに、凍結脳組織を用いた生化学的検索であるSDSポリアクリルアミドゲル電気泳動および転写後の抗体検出をしたところ、Aβオリゴマーの有意な上昇が認められた。脳神経病理でも、ノースウェスタン大学Klein博士より供与された抗オリゴマー抗体による免疫組織化学的検索を実施した結果、APPE693ΔマウスではAβオリゴマーのニューロン細胞内の異常蓄積が加齢と共に、行動異常の出現時期と同じくして確かめられた。具体的には、脳画像で現れる脳萎縮といわゆる中核症状と説明されている記憶障害についての基礎医学的解析を実施した。まず、脳萎縮は、神経脱落に起因するニューロン細胞死が原因で生じることが知られている。本研究では、その原因が細胞内Abオリゴマーの異常蓄積であることをしめし、その作用機構が、小胞体ストレス、細胞な輸送機構の破綻だけではなく、ミトコンドリア機能障害に由来する可能性を強く示唆することができた。さらに、記憶障害という臨床症状については、同じく細胞内Abオリゴマーの異常集積によってシナプス機能の破綻が生じることが原因であることを示した。このことは、シナプス特異分子であるシナプトフィジン免疫染色によって形態学的に、準定量的に示すことができた。さいごに最近、生活習慣病によってアルツハイマー病の発症リスクが上昇することが議論されはじめ、いくらかの疫学的調査は脂質異常証、高血圧、糖尿病のリスクを示唆してきている。

本研究では、アルツハイマー病モデルマウスに高コレステロール食餌を与えた場合、アルツハイマー病の最初期変化である細胞内Abオリゴマーの異常蓄積が加速されることを示すことができた。その結果、記憶障害のテストである空間学習能力、シナプスフィジン低下、異常リン酸化タウの上昇が生じることを明らかにした。
ストレス感受性転写因子NPAS4の機能破綻による精神疾患発症機構の解析

我々は、本研究においてストレス刺激がDNAメチル化亢進を介して、神経シナプス形成に重要な転写因子Npas4発現を低下させることを明らかにした。またNpas4発現低下がGABA作動性神経機能に及ぼす影響について追究し、Npas4遺伝子欠損マウス(Npas4-KOマウス)がPPIの障害を示し、小脳ではGABA受容体サブユニットmRNAレベルが顕著に低下することを示した。また、痙攣誘発剤ペンチレンテトラゾール(PTZ)刺激はNpas4発現を上昇させ、Npas4はHomer1aの転写を誘導した。Npas4-Homer1a経路は、てんかん治療の新しいターゲットとなりうる。NPAS4は、GABA作動性抑制性神経の発達やシナプス形成との関連が報告される転写因子である。NPAS4がストレスにより発現低下することから、この転写因子がストレス・GABA神経系障害・精神症状発症の関係の鍵であると考えられる。そこで本研究では、NPAS4の発現減少とGABA作動性神経系の機能異常との関連を調べる。平成26年度は、全身性NPAS4遺伝子欠損(NPAS-KO)マウス脳内のGABA作動性神経関連分子の発現解析およびNPAS4-KOマウスの精神疾患様行動発現解析をおこなった。1326週齢のNPAS4-KOマウスおよび野生型マウス(C57BL/6)から脳の各部位(前頭前皮質、側坐核、線条体、海馬、小脳)を採取し、GABAA受容体サブユニット、GABAB受容体サブユニットおよびGABA作動性神経関連分子のmRNA発現レベルをreal time RT-PCR法により解析した。GABA作動性神経関連分子の発現は、NPAS4-KOマウスの線条体においてGABAA α3, α5, β3サブユニットおよびGABAB R1, R2サブユニットmRNA量が野生型マウスに比べて有意に低下した。Npas4-KOマウスの小脳ではα2, α3, β1を除く全てのGABA受容体サブユニットmRNAレベルが顕著に低下した。また行動試験として、行動量測定、オープンフィールド試験、高架式十字迷路試験、Y字型迷路試験、新奇物体認識試験、恐怖条件付け試験、社会的行動試験、PPI試験およびロータロッド試験を行ったところ、Npas4-KOマウスは多動、不安関連行動の減少、恐怖記憶の低下と共に、PPIの障害を示した。また、協調運動や運動学習能力の低下も認められた。以上の結果はNPAS4の減少がGABA受容体発現異常や精神疾患行動発現につながることを明らかにするものであり、現在投稿準備中である。これまでに、全身性NPAS4遺伝子欠損(NPAS-KO)マウス脳内のGABA作動性神経関連分子の発現解析およびNPAS4-KOマウスの精神疾患様行動発現解析をおこない、Npas4-KOマウスが多動、不安関連行動の減少、恐怖記憶の低下、PPIの障害の他、協調運動や運動学習能力の低下を示すことを明らかにした。また、Npas4-KOマウスの脳各部位においてGABA受容体のmRNAレベルが顕著に低下していることを見出した。平成27年度は、ストレス負荷によるNpas4プロモーターのDNAメチル化亢進についてさらに詳しく解析した。3週間の拘束ストレスはNpas4プロモーターの転写開始点付近のCpGアイランドのDNAメチル化を亢進し、この領域に含まれる2つのCRE配列に部位特異的変異を導入するとNpas4プロモーター活性が低下したことから、これらのCRE配列がNpas4プロモーター活性に重要であり、ストレス負荷が誘発するDNAメチル化亢進がCRE配列を介したNpas4転写を抑制したことが示唆された。この結果は、Neuroreportに掲載された。さらに、脳の発生やシナプス調節に重要な役割を持つ因子がNPAS4のターゲットである可能性を見出したので、解析を進めている。また、Npas4の発現上昇が精神疾患の治療に結びつくのではないかと考え、ヒトNpas4プロモーターをクローニングしてプロモーターアッセイ系を確立し、Npas4プロモーター活性を誘導する化合物探索を開始した。平成27年度の目標は、(1)全身性Npas4-KOマウスの小脳切片をプルキンエ細胞マーカーであるcalbindinやparvalbuminで染色し形態を解析する。また、Npas4-KOマウスのストレス応答性について調べる。(2) Npas4-floxマウスの脳各部位にCreウイルスを感染させることで部位特異的Npas4-KOマウスを作製する系を完成し、Npas4の部位特異的欠失により発現する精神疾患様行動を解析すると同時にGABA受容体およびNMDA受容体の発現変動を確認する。(3)ストレス負荷マウスのNpas4発現レベルやNpas4プロモーターDNAメチル化頻度を解析する。(4)ヒト血液におけるNpas4遺伝子解析を行うため倫理委員会への申請を行う、であった。ストレス負荷マウスのNpas4発現レベルやNpas4プロモーターDNAメチル化頻度の解析については、反復的な拘束ストレス負荷によりマウス海馬のNPAS4発現が低下しこの時Npas4プロモーターDNAメチル化レベルが亢進することを明らかにした。