hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
超イオン伝導体走査探針による金属原子の連続付加による表面加工

最近、STMを利用した表面加工の研究が精力的に進められている。本研究では超イオン伝導体を加工用探針として用いることにより、表面加工材料(金属原子)を大量に貯蔵し、基盤表面への原子付加を多数回連続して行う手法の開発を試みた。探針材料としてβアルミナを選び、双探針STM装置を使って、テストを行った。1. βアルミナへのAgイオンの注入Na-βアルミナ結晶をAgNO_3中で煮沸し、NaをAgで置換し、Agイオンを探針材料に注入した。電子顕微鏡内で、電子線を照射し、Agを析出させることにより、貯蔵されたAgイオンの量を評価した。その結果、煮沸処理にAgNO_3の飽和水溶液あるいは融液を用いれば、実用上制限がないほどの量を探針内に貯蔵できることが分かった。高濃度液処理時に表面に付着するAgNO_3結晶はエタノールあるいは温湯を用いて除去できた。探針材料の劈開性(c面に平行)を利用して探針の成形を行い、双探針STMの片側探針として取り付けた。外部電源を用いて、探針に電圧(パルス)を印加できるように、プリアンプ系を改造し、Ag-βアルミナ探針から試料表面へのAg原子の付加を行った。加工用探針を用いた表面のSTM観察にはまだ成功していない。2探針間の相対的な位置ズレを試料移動で補償する機構が完成すれば、もう1本の探針を利用しての加工表面のSTM観察が可能となるが、まだ観察は行えていない。走査電子顕微鏡を用いて加工表面の観察を行った。探針の走査に伴って、Agのワイヤが表面に形成されているのが確かめられた。ただし、そのサイズは大きい。加工表面のSTM観察を行い、Agの原子細線の作製など微細加工を実現することが、今後の課題である。本研究では超イオン伝導体をSTMの探針として用いることにより、基盤表面への金属原子の付加を、多数回連続して行う可能性を探る。本年度は表面加工用の探針材料のAg置換βアルミナの作製と、Agイオンの移動の様子の電子顕微鏡観察、さらにSTMの装置整備を行った。Na-βアルミナ結晶をAgNO_3中で煮沸し、NaをAgで置換した。この材料を乳鉢ですりつぶし、c面で劈開した薄膜試料を作製した。2.超高真空電子顕微鏡によるAg-βアルミナ中のAgイオンの移動の観察前項で作製した試料をTVカメラが付属した超高真空電子顕微鏡を用いて観察した。試料の端に電子線を集中させるとAgが析出するのが見られ、Agイオンがβアルミナ中に蓄えられていること、それらがc面に沿って超イオン伝導を起こすことが確認された。試料中には大量にAgイオンが蓄えられており、この試料をSTMの加工用探針として用いた場合、基盤表面へ付加するAg原子の量には実際上制限がないことが確認された。3.双探針STM用探針ホルダーの設計と双探針STM装置の改造加工用探針を双探針STMに取り付けるための探針ホルダー(次年度設備備品)の設計を行った。また、探針に、電圧パルスを印加できるように、双探針STM装置のプリアンプ部分の改造を行った。次年度、加工用探針をSTM装置に取り付け、表面加工を行う準備は整ったと言える。
植物の新規シトクロムP450依存成長シグナルの探索

器官サイズが低下した突然変異体の解析から、シトクロムP450酵素であるCYP78Aにより合成され、器官の大きさを制御する新たなホルモン様物質の存在が示唆されている。本研究では、ヒメツリガネゴケのCYP78A二重破壊株を用いて、培養液中からこれらの表現型を回復させる物質の同定を目指した。また、既知植物ホルモンの定量分析から、CYP78Aは、内生および培養液中に放出されるオーキシンとサイトカイニン量に影響を与えることが示された。植物の器官の大きさは、作物の収量や品質を直接左右する重要形質であり、さまざまな内的、外的因子によって制御されている。近年、器官サイズが低下したイネとシロイヌナズナの突然変異体の解析から、機能未知のシトクロムP450酵素であるCYP78Aにより合成され、器官の大きさを制御する新たな低分子シグナル(ホルモン様物質)の存在が示唆されている。CYP78A遺伝子はコケ植物を含む陸上植物に広く存在し、ヒメツリガネゴケには二つのCYP78A遺伝子が存在する。本研究では、これまでに調製したヒメツリガネゴケの遺伝子破壊株や過剰発現体などの実験材料を利用して、CYP78A依存シグナルの探索を開始するとともに、既知植物ホルモンとの関係を明らかにすることを目的とした。ヒメツリガネゴケの2つのCYP78A遺伝子の二重破壊株においては、原糸体の成長が顕著に抑制され、茎葉体への分化がほとんど起こらないことが示された。そこで、野生型やCYP78A過剰発現体との共培養や培養培地の投与により、cyp78a二重変異体の表現型が(部分的に)相補されるかどうかを様々な培養条件で調べた。しかしながら、培養液や抽出物、あるいはそれらの精製画分の投与により、cyp78a二重変異体における原糸体の成長抑制を再現性よく回復させることができるような実験条件を得るには至らなかった。一方、既知植物ホルモン類の定量分析から、CYP78A遺伝子は、オーキシンとサイトカイニンの内生量と培養液中への放出量を大きく変化させることが明らかになった。これらのホルモンは、いずれもcyp78a二重変異体の表現型として観察された原糸体の成長・分化や茎葉体の形成に影響を与えることが知られている。したがって、CYP78A依存シグナルの探索には、これらのホルモンとの関係を視野に入れて実験を進めることが重要であると考えられる。
相同染色体対合に必要な非コードRNAが動的クロマチン構造と相互作用する仕組み

私たちは、分裂酵母の減数分裂において、非コードRNAであるmeiRNAが染色体の特定の部位sme2遺伝子座に蓄積し、減数分裂に必須な相同染色体の対合に寄与することを発見した。本研究は、染色体上のsme2遺伝子座に蓄積したmeiRNAの結合タンパク質を同定し、その役割を理解することによって、クロマチン機能における非コードRNAの機能を明らかにすることを目的とする。平成26年度までに、GFP融合タンパク質ライブラリを利用してmeiRNAと共局在する因子を検索し、相同染色体の対合に影響を与えるものをいくつか同定した。この中には、RNAのポリA付加に関与する因子群が含まれた。平成27年度は、ゲノムワイドに約100kbp間隔でlacOリピート配列を挿入した一群の細胞株を作成し、この一群の細胞株を活用して、生細胞イメージングを行ったところ、meiRNA共局在因子が染色体上の特定の領域に結合することを明らかにした(未発表)。27年度が最終年度であるため、記入しない。最近の研究により、非コードRNAはヒトゲノムの4割を占める広汎な領域から転写されていることが分かっている。ほ乳類X染色体の不活性化や分裂酵母の相同染色体の対合において、非コードRNAが染色体上に蓄積する例が知られているが、このような染色体機能に直接関与する非コードRNAは、その存在自体まだ報告例が少なく、ほとんど解析されていない。しかし、その分子メカニズムについては不明のままである。そのために、分裂酵母で減数分裂期に発現するmeiRNAを足がかりとして、クロマチン機能におけるRNA分子の役割を明らかにする。平成26年度は、まずmeiRNAが転写後に染色体に蓄積する仕組みを理解するために、meiRNAと相互作用するタンパク質複合体の網羅的検索を行った。まず、GFP融合タンパク質ライブラリを利用したmeiRNA共局在因子の網羅的的解析を行った。このために独自に作成したGFP融合ライブラリからmeiRNA様の核内にドットを作るものを検索しmeiRNAと共局在する因子を選別した。また、相同染色体の対合部位の網羅的な検索を行う目的で、ゲノムワイドに約100kbp間隔でlacOリピート配列を挿入した一群の細胞株を作成した。GFP融合タンパク質ライブラリを利用したmeiRNA共局在因子の網羅的的解析により、meiRNAと共局在する因子を選別することができ、さらにこの中から相同染色体の対合に影響する因子を同定することができた。また、ゲノムワイドに約100kbp間隔でlacOリピート配列を挿入した一群の細胞株を作成したことにより染色体の約130箇所を生細胞可視化できるようになった。これは本課題の目的だけでなく、染色体のダイナミクスを研究する様々な実験に活用できる有用な資源となる。これらのことから、研究はおおむね順調に進展している。GFP融合タンパク質ライブラリを利用したmeiRNA共局在因子の網羅的的解析を行った結果、meiRNAドットと共局在する因子を約10種類選別した。今後は、これらの候補遺伝子に対して、遺伝子破壊を行い、相同染色体の対合に影響を与えるものを検索する。減数分裂の進行に関わるRNA分子種の検索も行う。さらに、ゲノムワイドに約100kbp間隔でlacOリピート配列を挿入した一群の細胞株を活用し、体細胞分裂や減数分裂での染色体のダイナミクスを細胞で連続的に追跡する。また高分解能でクロマチン構造を観察するために、超分解能顕微鏡法として、3D-SIM (3次元Structured Illumination Microscope)を用いて、分裂酵母の減数分裂期の染色体繊維をトレースし、ヒストン修飾の変異のクロマチン構造への影響を解析する。ついで、コヒーシンなど相同染色体の対合に関わるタンパク質の変異体でクロマチン繊維の構造をイメージングする。これらの変異株で染色体腕部・セントロメアおよびsme2遺伝子座における相同染色体の対合を観察し、相同染色体対合に必要なクロマチン構造形成を明らかにする。

核膜タンパク質や核膜孔複合体タンパク質がRNAとの相互作用や細胞核機能に与える影響についても解析する。これまでに核膜孔複合体タンパク質の変異株のなかに染色体分離や減数分裂に障害を示すものを見いだしている。これらの変異株において、障害が生じる分子レベルでのメカニズムをイメージングと分子遺伝学により解析する。27年度が最終年度であるため、記入しない。
圧電特性を利用した自己診断材料の開発

本研究では、圧電材料として最も代表的なセラミックスであるPZT(Pb(Zr-Ti)03系セラミックス)を用いて、ピッカースインデンテーションにより圧電材料にき裂を導入し、打撃を与えることにより得られる圧電波形と圧電材料の破壊と関係を調べ、そしてき裂の数、大きさ、方向が圧電圧波形に及ぼす影響を調べ、破壊を圧電圧により評価する可能性を探った。その結果、測定した圧電波形の第一ピークと第二ピークの比と圧痕数との間には相関が見られた。また、圧電方向に対して垂直方向に一列に圧痕を導入していった場合と水平方向に圧痕を導入していった場合とでは圧痕数とピーク比の関係は異なっていた。さらに、一列に導入した圧痕の間隔もピーク比に大きな影響を及ぼしており、その間隔が小さいほど圧痕数とピーク比との関係はより明確になった。ピーク比が、圧痕導入により変化する理由として、き裂の発生による応力分布の変化と、き裂の開口による反電場の発生が考えられ、圧電気波形のピーク比は材料内部の微視破壊と密接な関係があると思われる。また、現在SEMによる破面観察、4点曲げ試験によるき裂進展と圧電特性の関係を調べたところ、き裂進展に伴い、ピーク比の単調な変化が認められた。本研究において試作した測定装置は、まだ誤差が大きく、また、き裂が存在するときの圧電圧波形の変化を正確に予測するためには、衝撃荷重下でのき裂の開口、および応力集中を計算しなければならないが、本研究により圧電圧波形の測定により、圧電材料自体の非破壊評価が可能であることが示された。
高等教育改善に資する教員・学生の授業評価力と評価測度に関する研究

従来の「学生による授業評価」の尺度は、おもに教授者とその活動を総括評価する視点で制作されてきた。それに対して、本研究では、授業評価を行う学生自身の評価視点・能力をふまえたうえで、教員-学生相互の授業評価力と改善力を向上させる視点を重視した。成果は以下のとおりである。初年度:1共同行為論の観点から理論面の整備を行い、授業改善の共通指針を明らかにした2学生の側の認知要因である授業観、授業評価観、学習のメタ認知等を、自由記述資料から探索した3教員の側の認知要因に関しても、FDや協調的授業開発の文脈のなかで検討し、認知変容の介入様式の一端を報告した4教員集団コミュニティにおける「学生による授業評価」の位置づけと含意を、授業改善の契機としてのみならず教育アカウンタビリティの観点から、実際の授業評価実践の成果をもとに根拠づけた5具体的な授業評価関連測度および授業観察関連測度に関して、とくに米国の実践状況と対比しながら吟味する一方、それらの統計的性質やデータ解析上の留意点等に関して、整理・検討を行った6教員個人でも比較的安価に構成可能な評価用紙作成・分析システムを試行的に活用・評価した。2年度:7学生の側の認知要因である授業観、授業評価観、学習のメタ認知等を、質問紙調査と調査面接によって検討した8教員の側の認知要因である授業観・授業目標・学習評価観点・評価基準等に関して、授業観察・質問紙調査等から探索した9実践面で、いくつかの授業において毎回の簡単な授業アンケートで縦断データを蓄積するとともに、最終授業で多面的な項目を含む総括的アンケートを実施する試み、および、前年度後期より京都大学工学部において授業アンケートデータを横断的に収集する試みなどを行った10以上から整理された各種指標を、学習評価などとともに蓄積・管理し、方法上の課題を検討するとともに、指標相互間の相関関係および解釈上の留意点等を検討した11高等教育教員に向けて「学生による授業評価」をふまえた授業改善のガイドブックを制作した(18年度半ばに出版予定)。それに対して、本研究では、授業評価を行う学生自身の評価視点・能力をふまえたうえで、教員-学生相互の授業評価力と改善力を向上させる視点を重視する。今年度は、まず、共同行為論の観点から理論面の整備を行い、授業改善の共通指針を明らかにする一方、学生の側の認知要因である授業観、授業評価観、学習のメタ認知などを、自由記述資料から探索した。一方、教員の側の認知要因に関しても、FDや協調的授業開発の文脈のなかで検討し、認知変容の介入様式の一端を報告した。また、教員集団コミュニティにおける「学生による授業評価」の位置づけと含意を、授業改善の契機としてのみならず教育アカウンタビリティの観点から、実際の授業評価実践の成果をもとに根拠づけた。具体的な授業評価関連測度および授業観察関連測度に関しては、とくに米国の実践状況と対比しながら吟味する一方、それらの統計的性質やデータ解析上の留意点等に関して、整理・検討を行った。同時に、教員個人でも比較的安価に構成可能な評価用紙作成・分析システムを試行的に活用・評価した。最後に、来年度末に公刊を予定する「授業評価ガイドマニュアル」(仮題)の内容構成と執筆指針等を具体化した。

それに対して、本研究では、授業評価を行う学生自身の評価視点・能力をふまえたうえで、教員-学生相互の授業評価力と改善力を向上させる視点を重視した。今年度は、前年度に引き続き高等教育における授業評価関連測度および授業開発関連手法の展望を行ったうえ、共同行為論の観点から、教授学習関係の評価枠組と授業改善の指針を明らかにした。一方、学生の側の認知要因である授業観(受講目的・授業目標の理解・参加度の基準・教師像など)、授業評価観、学習のメタ認知などを、質問紙調査等によって探索した。加えて、学生における教員印象と授業内体験、および授業評価や授業改善に関する学生の意識の関連について、因果モデルを検討した。教員の側の認知要因である授業観・授業目標・学習評価観点・評価基準などに関しては、授業観察・面接調査等から探索した。実践面では、ある授業において毎回の簡単な授業アンケートで縦断データを蓄積するとともに、最終授業で多面的な項目を含む総括的アンケートを実施する試み、および、前年度後期より京都大学工学部において授業アンケートデータを横断的に収集する試みなどを行った。以上から整理された各種指標を、学習評価などとともに蓄積・管理し、方法上の課題を検討するとともに、指標相互間の相関関係および解釈上の留意点等を検討し、高等教育教員に向けて「学生による授業評価」をふまえた授業改善のガイドブックを制作しているところである(18年度半ばに出版予定)。
英語および日本語における談話標識の分析

本年度は、研究テーマである英語および日本語の談話標識の分析について、(1)関連性理論の観点から考、(2)統計的な指標を用いて分析をすることを主に進めた。また、(3)優秀若手研究者海外派遣事業の機会を利用し、現地研究者とFrameNet(http://framenet.icsi.berkeley.edu/)について議論を深め、文を自動で生成するシステムをウェブ上に構築した。(1)日本語の談話標識である「ただ」と「ただし」について、関連性理論の立場から分析した。この理論の枠組みを用いれば、「ただ」は文脈への制約を与えるマーカー、「ただし」は想定を部分的に削除するものと規定できる(Uchida 2009)。また、フレーム結合価(下記)では捉えきれない認識的領域にかかわる用法に関して説明を与える有効な枠組みであるといえる。(2)報告者はこれまで文と文に喚起されたフレームの組み合わせであるフレーム結合価を中心に談話標識の意味記述を行ってきた。本年度は、この枠組みに基づき用例を統計処理できる形でアノテーションを施し、集計・分析を進めた。多義の接続詞であるwhileを例に対応分析の結果、「対照」の意味を表す用法が「同じフレームが喚起される傾向にある」ということが明確となった(内田2010上)。この事実をさらに深く議論するため、対照の意味を主に表す英語の接続詞whereasを例にとり、考察を進めた(内田2010下)。その結果、対照の接続詞の場合、節間に「類似」のフレームを喚起することが明らかになった。このフレーム間の類似性は、FrameNetで定義されているフレーム間関係をたどることで明らかになる。この情報を利用することで、構文的に平行ではない対照の用法に関しても意味的な平行性が規定でき、統一的に扱うことができる。これらの成果は、Uchida and Fujii(2009)で発表した。今年度は談話標織の分析の足場として、FrameNet(http://framenet.icsi.berkeley.edu/)を使った接続語の記述方法の構築を主として行った。具体的には英語の接続語whileを例に取り、主節と従属節中に喚起されたフレームの関係(フレーム結合価)を記述することが有効であるということを明らかにした。その枠組みは下記11のLexiconで発表した論文で詳しく述べている。これまで接続語の記述は経験的なものが多かったが、このアプローチを取ることで、数量的な記述が可能となった。この点で、言語処理への応用の可能性を大いに秘めていると言える。また、whileに関するフレーム結合価は、10th Conference of the Pacific Association for Computational Linguisticsで、コーパスを使った分析をしその有用性を確認した。ここでは上記の論文で構策した接続語whileの結合価リストが意味のあるものであるということが数量的に証明された。さらに、教育分野への応用として、この枠組みを応用することでより粘緻な辞書記述が可能になるということをJACETの研究会にて明らかにした。この発表では辞書での記述の問題点を指摘し、フレーム結合価をベースにした改善の方向性を具体的に提示した。また、文中に喚起されるフレームは一律に決定することができない場合があるが、そのケーススタディとして、比喩的な用法(メタファー)の分析を行った。これにより、フレーム結合価を使った接続語の分析の足場が強化され、より広範囲のデータへの応用の足がかりを築くことができた。今後の方向性としては、接続語のフレーム結合価での記述をwhile以外のアイテムに関しても行い、日本語・英語の対照研究も進めていく。また、言語処理分野への応用方法を模索する。同時に、辞書記述などの教育分野への応用と、フレームとメタファーに関する研究も進めていく予定である。本年度の研究は英語および日本語の談話標識について、1.博士論文の土台となる考察と分析、2.研究成果を応用する形の模索という二つの方向性から進めた。1.報告者の研究の目的は、談話標識(接続詞・接続副詞・間投詞などを一般に含む)と呼ばれる言語アイテムについて、分析の方法を提案し、記述を進めるということにある。それらを実現するために重要となってくるのは言語現象に対してのボトムアップのアプローチである。本年度は、博士論文の土台となる用例分析を、主にBritish National Corpusなどから抜き出した英語のアイテムに関して重点的に行った。特に、while,sinceなどの接続詞、さらにby contrast,by comparisonといった論理関係を表す副詞(句)に関しての分析をフレーム意味論の観点から進めた。その中で、フレーム意味論の枠組みを用いたフレームの辞書であるFrameNet(http://framenet.icsi.berkeley.edu/)の手法を拡大した談話標識の記述方法を提案し、博士論文完成に向けて目下データの蓄積・分析中である。特に、節または文に喚起されたフレームの組み合わせである「フレーム結合価」という概念を提出し、これを用いることでより具体的で明示的な談話標識の記述が可能となることを主張している。また、フレーム意味論の枠組みをコーパス評価や多義語・類義語・名詞の記述にも適応し、談話標識以外への応用も行った。この成果は下記内田・藤井(2009)、藤井・内田(2009)、内田(2009)の学会発表で報告した。さらに、フレームとメタファーの関係性を探るため、Uchida and Haruyama(2008)の学会発表ではdiscourse metaphorという概念を用いて日本語の分析を行い、理論的な足場を固めた。

2.研究成果の応用を模索する一つの試みとして、談話標識の辞書記述に関して、詳細な検討を行った。具体的には、現行の学習辞書での問題点を明らかにし、フレーム結合価という本研究独自の概念を適応することが有効であるということを示した。この研究成果は内田(2009)の論文で提示している。また、英和辞典への実際的な応用として、「オーレックス英和辞典(旺文社2008)」にて談話標識に関する部分の執筆を担当した。来年度は、これらの成果を踏まえ、(1)談話標識の詳細な記述データベースを構築および分析、(2)フレーム結合価などの概念を用いた英語と日本語の談話標識の対照研究などを目標に研究を進め、博士論文として成果をまとめる予定である。本年度は、研究テーマである英語および日本語の談話標識の分析について、(1)関連性理論の観点から考、(2)統計的な指標を用いて分析をすることを主に進めた。また、(3)優秀若手研究者海外派遣事業の機会を利用し、現地研究者とFrameNet(http://framenet.icsi.berkeley.edu/)について議論を深め、文を自動で生成するシステムをウェブ上に構築した。(1)日本語の談話標識である「ただ」と「ただし」について、関連性理論の立場から分析した。この理論の枠組みを用いれば、「ただ」は文脈への制約を与えるマーカー、「ただし」は想定を部分的に削除するものと規定できる(Uchida 2009)。また、フレーム結合価(下記)では捉えきれない認識的領域にかかわる用法に関して説明を与える有効な枠組みであるといえる。(2)報告者はこれまで文と文に喚起されたフレームの組み合わせであるフレーム結合価を中心に談話標識の意味記述を行ってきた。本年度は、この枠組みに基づき用例を統計処理できる形でアノテーションを施し、集計・分析を進めた。多義の接続詞であるwhileを例に対応分析の結果、「対照」の意味を表す用法が「同じフレームが喚起される傾向にある」ということが明確となった(内田2010上)。この事実をさらに深く議論するため、対照の意味を主に表す英語の接続詞whereasを例にとり、考察を進めた(内田2010下)。その結果、対照の接続詞の場合、節間に「類似」のフレームを喚起することが明らかになった。このフレーム間の類似性は、FrameNetで定義されているフレーム間関係をたどることで明らかになる。この情報を利用することで、構文的に平行ではない対照の用法に関しても意味的な平行性が規定でき、統一的に扱うことができる。これらの成果は、Uchida and Fujii(2009)で発表した。
光励起によるin situ活性種生成を利用した新規反応及び生体分子標識法の開発

本研究では申請者らが独自に合成法を確立した新規骨格の生理活性物質としての利用可能性開拓、及び物性を活かした新規有機化学反応の開発、分光分析的手法による検出法の開発を行い、それらの成果を統合し、疾患の診断および治療に有用な分子プローブ開発を行うことを目的とし研究を行った。生理活性物質については申請者が独自に開発した骨格を含む目的化合物の合成を達成し、細胞、動物レベルでの動態評価を行い、当該新規骨格を用いる医薬品化学に重要な知見を得た。また、反応開発については光のON/OFFで完全に反応の進行の制御が可能な新規反応開発に成功し、学会、論文発表を行った。本研究では申請者らが独自に合成法を確立した新規骨格の生理活性物質としての利用可能性開拓、及び物性を活かした新規有機化学反応の開発、分光分析的手法による検出法の開発を行い、それらの成果を統合し、疾患の診断および治療に有用な分子プローブ開発を行うことを目的としている。初年度であった昨年度は以下の研究を行った。まず、生理活性物質及び疾患イメージング剤としての有用性が期待できる新規化合物の合成を試み、最終目的物前駆体の合成法を確立した。今後は最終目的物の合成を達成し、その有用性の評価を行う。また、申請者らが独自に見出した骨格を用いた新規光反応の開発を行った。化合物構造、光の種類、溶媒、温度等が反応に与える影響を精査し、効率的に目的の反応を起こす系を確立した。本成果については国内学会で発表を行っており、近日論文発表を行う予定である。本年度は本反応の開発中に見いだされた別の新規反応の検討、及びそれらを用いた生体分子の化学修飾を目指した基礎研究を行う。光反応については計画段階で想定していたメカニズムで反応が進行することが分かり、条件検討により効率的に目的の反応が進む条件を確立できた。成果に関しても学会発表を行っており、近日論文発表を行う予定である。また、上記の研究中、当初想定していなかった新たな反応を発見した。本反応に関しても当初の目的である生体分子の化学修飾に有用であると期待できるため、今後より詳細な検討を行っていく。生理活性物質に関する研究は合成は概ね予定通り進んでおり、本年度はその生理活性、動態の評価を行う予定である。本研究では高度に歪んだ骨格を持つ化合物の生理活性物質としての利用、及び歪みを利用した分光学的検出及び光化学反応の開発を行い、特徴的な分光学的特性、反応特性を持つ生理活性物質を開発することを目指した研究を行った。昨年度に引き続き新規骨格を持つ生理活性物質の合成、活性及び動態評価を行った。昨年度合成に成功していた合成中間体から目的化合物の合成を達成し、脂溶性などの基礎的な物性評価、細胞、動物を用いた活性、動態評価を核医学的手法を用いて行った。その結果、当該骨格を用いる医薬品化学に重要な知見を得ることができた。今後はより詳細なデータを収集し、論文発表を行う予定である。また、昨年度開発した新規光化学反応の詳細な検討、発展研究を行った。その結果光のON/OFFで完全に進行の制御が可能な脱水縮合反応の開発に成功した。このような反応を光で完全に制御する手法は前例が無く、世界初の例である。本結果についてはOrganic Letters誌(Org. Lett. 2017, 4912)にて論文発表を行った。また、本研究を行う中で予期しない副反応の存在を確認した。副反応に関しても物質合成、生体分子標識等への有用性が期待できたため、副反応についても詳細な解析を行い、副反応を優先的に進行させる条件を確立した。近日当該新規反応についても論文発表を行う。また、これらの反応を生体分子の化学修飾に用いるための検討も行い、重要な知見を得ることができた。今後この知見を活かした生体分子化学修飾にも取り組む。計画は当初の想定通り順調に進んでいるため、当初の予定通り研究を進めていく。生理活性物質、イメージングプローブの開発に関しては目的物質の合成を達成し、その評価を行う。また、結果を受け構造を変更する必要がある場合はその構造変換を行い、合成した化合物の物性、生理活性評価を行う。光反応に関しては当初計画していた反応が効率よく進行する構造、条件を概ね確立できたので、成果に関して論文発表を行う。本成果を生体分子の化学修飾に応用すべく、生体分子を用いる反応に適した条件で本反応を行うべく、化合物構造及び反応条件の最適化を行う。また、当初想定していなかった新規反応に関しても、生体分子の化学修飾に有用であると期待できるため、その詳細な検討及び応用を試みる。29年度が最終年度であるため、記入しない。化学系薬学29年度が最終年度であるため、記入しない。
弾性線維再生の研究

体の組織の伸縮性を担うのは弾性線維という細胞外線維であり、老化に伴う弾性線維の劣化が皮膚のたるみ、肺気腫、動脈中膜の硬化などの直接原因となる。弾性線維のターンオーバーは非常に遅いため、弾性線維の再生はチャレンジングな課題である。これまで申請者は弾性線維の形成に必須の分泌タンパクを同定してきただけでなく、それらのうちで細胞培養に加えると弾性線維形成を強力に誘導するものを見出した。本研究では、細胞外マトリックスの力学的特性を評価する系を確立し、これら弾性線維形成促進因子を組み合わせて、in vitro、in vivoでの弾性線維再生に必要な条件を見出すことを目指した。本研究では、これら弾性線維形成促進因子を組み合わせて、生体内での弾性線維再生、弾性線維を持つ培養人工皮膚・血管の作成を目指す。細胞培養で作られる細胞外マトリックスの弾性測定系開発:細胞+ECM(細胞外マトリックス)のシートを作成し、シートに載せた鉄球に磁界を加えて動かし、加えた力とレーザー計測した鉄球の変位量のグラフから弾性、粘弾性を計算できる装置を作成する。薬剤誘導性の弾性線維形成因子過剰発現マウスの解析:タモキシフェン投与によって弾性線維形成因子が過剰発現するマウスを作る。これらのマウスの肺・動脈・皮膚などの組織中のデスモシンを測定し、弾性線維の過形成がおこるかどうかを調べる。1.細胞培養で作られる細胞外マトリックスの弾性測定系開発:ヒト線維芽細胞培養において作られた細胞外マトリックスを細胞とともにシートとして取り出し(温度によって接着性の変わるプレートを使用)、シートに載せた磁気ビーズに磁界を加えて動かし、加えた力とレーザー計測したビーズの変位量のグラフから弾性・粘弾性を測定できる装置を作成した。装置作成と計測は連携研究者の影島の協力を得て行った。2.弾性線維形成抑制因子としてのEGFL7の評価:分泌タンパク質EGFL7の過剰発現マウスが弾性線維形成不全をおこすことが報告された。EGFL7を阻害することによる弾性線維再生法が考えられたが、ヒト線維芽細胞培養においてEGFL7のノックダウンが弾性線維形成を促進することはなかった。3.薬剤誘導性Fibulin-5、LTBP-4過剰発現マウスの作成と解析:細胞培養において弾性線維形成促進作用のあるFibulin-5またはLTBP-4を過剰発現するマウスを作成した。今のところ、これらのマウスが過剰に弾性線維を作っているという証拠はなく、弾性線維形成には上限を決めるシステムがあることを伺わせた。細胞培養で作られる細胞外マトリックスの弾性測定系開発:レーザー測距センサーと自作のコイルを用いて、加えた力と鉄球の変位量をグラフ化する装置を作成した。またヒト皮膚線維芽細胞が作るECMのシートを作成し(細胞は薬剤で殺してある)、この装置で弾性、粘弾性の測定ができるか評価を行っている。薬剤誘導性の弾性線維形成因子過剰発現マウスの解析:弾性線維形成因子2種類について、タモキシフェン投与によってそのタンパク質が過剰発現するマウスを作った。細胞外マトリックス医学今回作成した培養細胞外マトリックスの弾性測定装置を用いて、皮膚線維芽細胞、血管平滑筋細胞などの培養で作られるECMの力学的特性を明らかにする。ついで、これらの細胞で弾性線維形成因子をノックダウンしたときに作られるECMがどのような力学的特性の変化を来すのかを調べる。また、それぞれの弾性線維形成因子ノックアウトマウスの動脈が示す力学的特性の変化とどのように対応するかを検討する。薬剤誘導性弾性線維形成因子過剰発現マウスは、各組織の弾性線維を定量するため、デスモシン(エラスチンの架橋産物)の測定を行い、弾性線維が過剰に形成されたかどうかを検討する。また喫煙によっておこる肺気腫発症に抵抗性を示すかどうかを検討する。購入物品のメーカーを見直すなどしたため。
c-kitレセプターチロシンキナーゼの恒常的活性化と腫瘍原性に関する研究

c-kitレセプターチロシンチナーゼ(KIT)は、リガンド(stem cell factor:SCF)依存性に活性化される。このKIT/SCFシステムは、造血幹細胞、マスト細胞、生殖細胞や色素細胞の増殖・分化に必須である。我々は、c-kit遺伝子にリガンドが存在しなくても恒常的に活性化するgain-of function変異が存在することを見いだした。特に、kinase領域のAsp^<816>コドン(マウスではコドン814)は恒常的活性化変異のhot spotであり造血器腫瘍の発症に関与していると考えられる。一般に、KITは二量体化し細胞内にシグナルを伝達することが知られているが、kinase領域内のc-kit変異では細胞外領域におけるダイマー形成は認められなかった。kinase領域に変異によるKITの恒常的活性化や腫瘍化シグナル伝達系における細胞外領域の役割を検討するため、野生型(wild type)KIT^<WT>と恒常的活性化KIT^<Tyr814>の細胞外領域を欠失させたDel(Δ)KIT^<WT>とΔKIT^<Tyr814>を作製し、KIT陰性であるIL-^3依存性細胞株BA/F^3へ導入した。ΔKIT^<WT>導入BA/F^3細胞では、ΔKIT^<WT>のチロシンリン酸化や活性化は認められず、IL-^3非存在下では増殖反応を示さなかった。一方、ΔKIT^<Tyr814>導入BA/F^3細胞では、ΔKIT^<Tyr814>の恒常的活性化が認められ、導入細胞もIL-^3非依存性に増殖した。このΔKIT^<Tyr814>によるIL-^3非依存性増殖は、KIT^<W42>(KITのdominant negative型)によりほぼ完全に抑制された。さらに、ΔKIT^<Tyr814>は、KIT^<WT>やKIT^<W42>と共沈することが明らかとなった。以上の結果より、kinase領域のc-kit変異によるKITの活性化やシグナル伝達系には細胞外領域は必須ではないが、モノマーで作用するものではなく細胞内領域における相互作用が重要であると考えられた。
神経分化破綻による脳腫瘍発生機構の解明

(1)腫瘍発生機構の初期段階におけるRESTの役割を解析するために、その活性化指標としてβIII-tubulinの発現を用いた。βIII-tubulinは通常は神経細胞特異的であるが、非神経系細胞においても細胞周期依存的に発現の増減が見られることを見出した。細胞周期を同調した細胞を用いた解析の結果、mRNAレベルではG2/M期にβIII-tubulinのmRNAの蓄積が見られること、クロマチンレベルでの機構であることが明らかとなった。細胞周期依存的にβIII-tubulinプロモーター領域にRESTがスイッチングすることで制御している可能性が示唆された。(2) Nucleus accumbensassociated 1, NACC-1はBEN/POZドメインを持つ脳神経特異的転写抑制因子の一種であり、幾つかの腫瘍での高発現が予後の不良と関連することが示されている。しかし腫瘍形質における詳細な機構は不明である。一方、HDAC6は細胞質に存在し、チューブリンの脱アセチル化に関与する因子であり腫瘍の転移能と関連する。NACC-1はHDAC6の機能調節を介して細胞運動能、浸潤能に関与することを示した。(3) microRNAは50nt以下の短い安定な非翻訳RNAの一種であり、生体中には数千種類もの分子種ある。その多くは、標的mRNAの3' UTR部位に特異的に相補結合し翻訳抑制する。microRNA-211が神経堤細胞腫瘍において減少していること、microRNA-211の標的としてPRAME(Preferentially expressed antigen of melanoma)の可能性があることを示した。以上の機構の破綻が、脳腫瘍を初めとした各種腫瘍のイニシエーターになっている可能性が示唆された。本研究は、神経幹細胞の分化異常と腫瘍化の関係を検討するにあたり、神経分化制御因子RFSTと細胞増殖因子β-catenin、さらにそれらの分解因子β-TrCPに注目する。通常RESTとβ-cateninは神経分化に伴ってβ-TrCPにより消失する。β-TrCPの発現もしくは活性が低下した場合、RESTとβ-cateninは残存し、それぞれ幹細胞状態の維持と高増殖能獲得に寄与すると予想される。またヒストン脱アセチル化因子の一種、HDAC6は神経幹細胞の分化に関与することが示されている。本研究は、膠芽腫や髄芽腫など、神経幹細胞由来の悪性脳腫瘍が発症する機序を明らかにし、β-TrCPやHDAC6が悪性脳腫瘍治療の標的となり得るか、基礎的知見を得ることを目的とする。上記の研究目的をふまえ、昨年度はヒト膠芽腫由来の細胞株をもちいて、各種因子のタンパク質発現レベルをウエスタンブロッティング法により確認した。その結果、ヒト膠芽腫細胞10株間で、β-TrCPやβ-catenin、RESTについて有意な発現差異が確認された。今後、高発現株についてはsiRNA法によるノックダウン、また低発現株については発現ベクターにより高発現することにより分化マーカーの発現レベルが変化するかを検討する。我々はヒト膠芽腫細胞10株間で、HDAC6のタンパク質レベルまたmRNAレベルで有意な発現差異と細胞運動能との関連を確認している。今後、HDAC6が神経分化指標としてβ-TrCPやREST、β-cateninの発現量と相関するかも検討する。脳腫瘍をはじめいくつかの腫瘍では、分化制御の破綻が腫瘍化に関与すると考えられている。正常な神経分化では、数万のトランスクリプトームの中からジェネティック・エピジェネティックな機構を利用し、特定の遺伝子セットを発現することで、時間的・空間的に厳密かつ正確な分化制御がなされている。一方、多くの脳腫瘍は神経幹細胞由来の未分化細胞である。

すなわち自律的増殖と並び、未分化状態の維持はがん細胞の生物学的特性に大きく関与しており、無秩序な幹細胞状態の維持は腫瘍化の原因の一つと考えられる。REST(Repressor Element-1 silencing transcription factor)は、神経幹細胞において幹細胞状態の維持に必須の因子である。本研究では、RESTを中心とした神経特異的遺伝子の制御機構の破綻が、腫瘍化にどのように関連するか幾つかの培養細胞株を用いて行ってきた。現在までに、(1)非神経系細胞株においてRESTの存在量は細胞周期依存的に変動すること、すなわち通常ではRESTの分解因子の一種であるβ-TrCPなどが細胞周期により活性化することでRESTの存在量を調節するが、その機構が破綻するとRESTの異所的な蓄積が起こる可能性、(2)RESTの存在量とβ-cateninの存在量が、ある細胞株において正相関すること、すなわちWnt-catenin経路へのREST制御系の関与の可能性、(3)RESTの標的遺伝子の一種であるβIII-tubulinはα-tubulinと重合することで細胞骨格の維持に関与し、HDAC6による脱アセチル化により安定性が制御されているが、幾つかの膠芽腫でHDAC6の存在量が異なることを見出している。以上の結果は、RESTを中心とした腫瘍化機構についての基礎的知見であり、今後、さらに関連する因子との関連について解析を進める予定である。
ウンカ類に対するイネの殺卵遺伝子の単離と機能解析

分げつ期の日本型イネにウンカ類(セジロウンカ,トビイロウンカ)が産卵すると,殺卵活性をもつ安息香酸ベンジルを含む分泌液で細胞間隙が満たされた液浸化が誘導される.その結果,卵が高率で死亡し,ウンカ類の増殖が抑制される.これまでにセジロウンカに対するイネの殺卵遺伝子Ovc(Ovicidal gene)を同定し,イネの染色体6上に位置付け,約40kbの領域に絞り込んでいる.Ovcは殺卵特性の発現に必須であるので,イネの殺卵特性について,将来の遺伝育種ならびにその遺伝的機構の解明のために,Ovcの単離を試みた.1.日本型イネ品種「日本晴」由来の候補遺伝子が組みこまれた形質転換ベクターを作成し,Agrobacterium法により,SL23(「日本晴」を遺伝的背景とし,Ovc領域がインド型イネ品種「Kasalath」(Ovcをもたない)に置換した系統.この系統は殺卵特性を示さない)に導入する形質転換を行い,目的の形質転換植物の殺卵特性を調査した.現在まで相補した形質転換植物は観察されていないが,引き続き実験を進めている。一方,OvcのcDNAと発現解析は現在進行中である.2.日本型品種とインド型品種を用い,Ovc候補領域のDNA多型におけるアソシエーション解析を行い,Ovcの候補となるDNA多型を検出し,候補領域をさらに絞り込むことができた.この情報を元にさらなる形質転換実験ならびにcDNA・発現解析を行う予定である.分げつ期の日本型イネにウンカ類(セジロウンカ,トビイロウンカ)が産卵すると,殺卵活性をもつ安息香酸ベンジルを含む分泌液で細胞間隙が満たされた液浸化が誘導される.その結果,卵が高率で死亡し,ウンカ類の増殖が抑制されることが明らかになっている.これまでにセジロウンカに対するイネの殺卵遺伝子Ovc(Ovicidal gene)を同定し,イネの染色体6上に位置付け,約40kbの領域に絞り込んでいる.Ovcは殺卵特性の発現に必須であり,昆虫の産下卵を殺す植物の遺伝子として初めて報告されたものである,イネの殺卵特性の遺伝的機構の解明のために,Ovcの単離を試みた.1.日本型イネ品種「日本晴」由来で,Ovcを保有する1つのBAC(Bacterial Artificial Clone)クローンからいくつかの候補遺伝子についての形質転換ベクターを作成した.次にこのクローンをAgro bacterium法により,SL23(「日本晴」を遺伝的背景とし,Ovc領域がインド型イネ品種「Kasalath」(Ovcをもたない)に置換した系統この系統は殺卵特性を示さない)に導入する形質転換を行い,目的の形質転換植物の殺卵特性を調査した.現在まで相補した形質転換植物は観察されていないが,引き続き実験を進めている.一方,OvcのcDNAと発現解析は現在進行中である.2.Ovcを保有する日本型イネ品種「日本晴」と「あそみのり」,ならびにOvcをもたないインド型イネ品種「Kasalath」と「IR24」におけるOvc候補領域約40kbのDNA塩基配列をそれぞれ決定した.SNP(Single Nucleotide Polymorphism: 1塩基多型)やDNA配列の挿入/欠失が見いだされ,Ovcの変異となり得るDNA変異箇所をいくつか特定し,更にアソシエーション解析の結果からDNA変異箇所を絞り込んだ.分げつ期の日本型イネにウンカ類(セジロウンカ,トビイロウンカ)が産卵すると,殺卵活性をもつ安息香酸ベンジルを含む分泌液で細胞間隙が満たされた液浸化が誘導される.その結果,卵が高率で死亡し,ウンカ類の増殖が抑制される.これまでにセジロウンカに対するイネの殺卵遺伝子Ovc(Ovicidal gene)を同定し,イネの染色体6上に位置付け,約40kbの領域に絞り込んでいる.Ovcは殺卵特性の発現に必須であるので,イネの殺卵特性について,将来の遺伝育種ならびにその遺伝的機構の解明のために,Ovcの単離を試みた.1.日本型イネ品種「日本晴」由来の候補遺伝子が組みこまれた形質転換ベクターを作成し,Agrobacterium法により,SL23(「日本晴」を遺伝的背景とし,Ovc領域がインド型イネ品種「Kasalath」(Ovcをもたない)に置換した系統.この系統は殺卵特性を示さない)に導入する形質転換を行い,目的の形質転換植物の殺卵特性を調査した.現在まで相補した形質転換植物は観察されていないが,引き続き実験を進めている。一方,OvcのcDNAと発現解析は現在進行中である.2.日本型品種とインド型品種を用い,Ovc候補領域のDNA多型におけるアソシエーション解析を行い,Ovcの候補となるDNA多型を検出し,候補領域をさらに絞り込むことができた.この情報を元にさらなる形質転換実験ならびにcDNA・発現解析を行う予定である.
高次元における非線形可積分系の構造

平成15年度は,トロイダル対称性を持つ高次元ソリトン方程式とパンルベ方程式との関係を探るべく,ソリトン方程式の階層の相似簡約に対して,代数的な立場からの一般論の構築を試みた(東北大・菊地哲也氏との共同研究)。本年度の研究では,アフィン・リー代数の対称性を持つ系に対しての理論を構築した。また,剛体の自由回転を記述する運動方程式の離散化と,可解格子模型におけるYang-Baxter方程式との関係を調べ,その立場から高次元空間中における離散可積分方程式の構築を試みた(立教大・鈴木敏之氏との共同研究)。これまでに得られた結果については,以下のように国内外の研究集会で報告している:●"一般化Drinfel'd-Sokolov階層の相似簡約とaffine Weyl群対称性"(講演者は菊池氏),(短期共同研究「Lie Theoryのひろがりと新たな進展」,京大数理解析研,2003年7月)●"ソリトン方程式に対するワイル群作用",(短期共同研究「可積分系理論とその周辺」,京大数理解析研,2003年7月)●"可解格子模型と離散Euler-Top"(講演者は鈴木氏),(研究集会「非線形波動および非線形力学系の数理とその応用」,九大応力研,2003年11月)●"フィボナッチ数のq-類似とq-超幾何函数"(講演者は青木氏),(研究集会「非線形波動および非線形力学系の数理とその応用」,九大応力研,2003年11月)これらの結果を元に,トロイダル対称性を持つような高次元可積分系へと拡張するという試みを,現在行っているところである。昨年度は,自己双対ヤン・ミルズ方程式とKP階層とが結合した系を中心に研究し,そこに含まれるソリトン方程式の代数的構造を調べた。これまでに得られた結果については,論文の形で発表するとともに,以下のように国内外の研究集会で報告している:●"自己双対ヤン・ミルズ方程式とトロイダル・リー代数",(研究集会「量子化の幾何学2」,早稲田大学,2002年9月)これらの研究集会に参加して得られた情報を元に,次年度の研究を進める予定である。また,A^<(1)>_2型リー代数と関連して矢嶋・及川方程式と呼ばれる方程式の研究も行い,パンルベV型方程式との関係を見出した(岡山理科大・池田岳氏,東北大・菊地哲也氏との共同研究)。この結果を,トロイダル対称性を持つような場合へと拡張するという試みを,現在行っているところである。
自然画像中の動きの解析の神経基盤

運動視の重要な問題の一つとして窓問題が挙げられる。小さい窓枠から物体の運動を見たとき、可視線分に垂直な動きの方向しか検出できないため、真の運動方向を決定できない。理論的には少なくとも2つの成分が検出できれば、真の運動方向を検出できる。どのようにして方位の統合が行われているのかを知ることは運動視の計算メカニズムを理解する上で重要である。我々はこれまで、サル大脳皮質MT野において、時空間周波数成分や方位成分が限られた視覚刺激(gratingやplaid)と多くの時空間周波数成分や方位成分を含んだランダムドット刺激との運動方向・速度選択性を比較した結果、ランダムドット刺激ではより正しく真の運動方向・速度を検出できることを報告した。しかし、これがどのようなメカニズムで実現されるかは不明であった。そこで、運動視の計算理論では最も普及しているSimoncelli Heeger(1998)のモデルを用い、方位成分の統合範囲及びopponent inhibitionの度合いを変えることでこれらの結果を説明できるかシミュレーションを行った。その結果、典型的なMT野ニューロンのplaid刺激に対するパターン特性とランダムドット刺激に対する運動方向・速度選択性を両方説明するには、157.5°程度の方位からの統合、さらには興奮・抑制の重みが約10:9であること、が必要であることがわかった。さらに抑制なしから興奮・抑制の重みが1:1までの範囲、および統合が90°から180°の範囲で40%(25/62)のMT野ニューロンの選択性を説明できることがわかった。抑制はplaidのパターン特性獲得にのみ強く貢献することから、自然界での動きの検出には抑制は重要でないと考えられる。24年度が最終年度であるため、記入しない。自然界から得られる画像に含まれる動きをどのように抽出・分析するかを理解することは質感研究の重要な課題である。本研究では、自然画像中の動きが大脳皮質MT野やV1で正しく表現されているのか、正しく表現されているとしたら、どのような計算過程で行われているのかを検証する。そのため、従来、運動視の計算過程を調べるために用いられた視覚刺激と、自然画像やそれに近い視覚刺激への反応の違いを明らかにし、1次元運動から2次元運動への変換過程を解明する。具体的には、大脳皮質MT野とV1からニューロン活動を記録し、従来の運動視研究で用いられてきたgratingやplaid刺激、ランダムドット刺激に加え、自然画像や自然画像に近い刺激に対する反応を測定する。それぞれの刺激を様々な方向、速度に動かしたときの反応を解析することで、どのような視覚刺激の2次元運動を抽出できるのか、あるいは1次元運動しか抽出できないのかを検証する。今年度はgratingやplaid刺激、ランダムドット刺激に対するMT野神経活動の記録を完成させ、V1神経活動の記録を開始した。V1ニューロンは従来通り、1次元運動しか抽出しないという解釈に合致した結果が得られた。それに対して、MT野ニューロンは、より多くの時空間周波数成分や方位成分を含んだ刺激ほど正しく真の運動方向・速度を検出できた。すなわち、従来plaid刺激で知られていた以上の強い時空間統合メカニズムが働いていると思われる。gratingやplaid刺激、ランダムドット刺激に対するMT野神経活動の記録を完成させ、V1神経活動の記録を開始できた。今後は、適切な自然画像、あるいは自然画像に近い刺激に対する反応を測定する。完全な自然画像を使ってもメカニズムの理解は難しいと思われるので、単純な2次元パターンを超えた、実験に使用可能な視覚刺激を来年度提案できるようにする。
イノシトール1、4、5-三燐酸によるCa^<2+>動員機構に関する生化学的研究

イノシトール1、4、5-三燐酸(IP_3)は小胞体の貯蔵Ca^<2+>を放出することにより情報伝達の一翼を担っている。しかしながらこの機構の物質的基盤は現在まで得られていない。本研究では小胞体上のIP_3受容体を同定することを目的とした。そのためIP_3のアジド誘導体を合成して用いた。アジドサリチル酸とβ-アラニンからアジドサリチルβ-アラニン(ASβA)を合成した。クロラミンTを用いて^<125>Iを導入し、(^<125>I-ASβA)、そしてカルボニルジイミダゾールを触媒としてIP_3との縮合反応を行ない、IP_3〔^<125>I〕ASβAを得た。サポニン処理マクロファージをIP_3〔^<125>I〕ASβAとともに紫外線照射し、SDS電気泳動、オートラジオグラフィーによりIP_3結合蛋白の同定を行ない分子量50K、27K、18KDaの三種の蛋白が強く標識されたのを認めた。そしてこれらはいずれも過剰のIP_3の共存によりラベリングが抑制された。IP_3認識蛋白としてIP_3ホスファターゼ、IP_3-キナーゼ、そして小胞体上の受容体の三種の存在がこれまでに知られている。後二者の間にはKm値、基質特異性に類似性があるためIP_33キナーゼの精製からIP_3によるCa^<2+>放出の物質的基盤を得る手掛りになると考え着手した。ブタ大動脈平滑筋を用いて可溶性分画と膜分画を得、酵素活性を調べると90%以上の活性が可溶性分画に認められた。この酵素活性は遊離Ca^<2+>濃度に依存して増大し、W-7などのカルモジュリン阻害剤により抑制された。硫安分画、陰イオン交換クロマトグラフィーによりカルモジュリンの混入をなくすことにより酵素活性はCa^<2+>感受性を失ったが、外因性にカルモデュリンを添加すると再びCa^<2+>感受性を回復した。さらに各種クロマトグラフィーによりSDS電気泳動上単一蛋白にまで精製した。精製酵素は93KDaの単一分子でカルモデュリンとのストイキオミトリーは1:1であった。