hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
フーリエ変換型蛍光寿命測定装置の開発と顕微腫瘍マッピング診断システムへの応用

本研究の目的は、1)研究代表者が考案・命名したフーリエ変換型位相変調型蛍光寿命測定装置の本格的なシステムの構築と評価を行うこと、2)提案手法のさらなる性能改善のための調査・研究を行った後、顕微鏡と結合させて腫瘍診断への応用を展開すること、3)老化組織診断を始めとする他の様々な動的生化学現象の研究、さらに内視鏡診断への応用について検討することであった。平成17年度は装置の製作と基本性能評価結果を完了させ論文としてまとめた。また一方で、励起周波数掃引最高周波数f_<max>と蛍光寿命値τの積がF_<max>τ>1の条件を満足しないと良好な蛍光減衰波形測定が行えないことを実験的および解析的に確認した。しかし装置的な条件からf_<max>を無限大にすることは全く不可能である。この問題を解決するために、研究代表者は「反復ヒルベルト変換法を用いた周波数外挿アルゴリズム」という手法を新たに着想しこれを完成させた。すなわち実際の多成分蛍光試料(Fluo5)に適用して、F_<max>=10MHzでも数ナノ秒の多成分蛍光減衰波形が良好に復元できることを確認した。さらに前年度から、生体試料(冠状静脈の組織片および歯)に対し、コラーゲンをキーワードとして老化と蛍光寿命の関係を考察するための顕微鏡下でのマッピング測定を継続して行った。これに加え同様なシステムを用いて魚鱗の蛍光寿命測定を新たに実施し、天然魚と養殖魚で蛍光寿命に僅かながら差異がある可能性を初めて見出した。さらに本年度購入した周波数特性分析器(FRA5096,15MHz,NF社)を用いて位相変調蛍光寿命測定システムが容易に構築しできることを確認した。いずれも腫瘍診断への本格的な適用が期待できる。本研究の目的は、"フーリエ変換タイプ"位相変調型蛍光寿命測定装置の本格的なシステムの構築と、提案手法自体のさらなる改良を行い顕微鏡と結合させて腫瘍診断への応用を展開すること、また、老化組織診断を始めとする他の様々な動的生化学現象の研究、さらに内視鏡診断への応用について検討するである。研究代表者が考案・命名した"フーリエ変換型位相変調蛍光寿命計"の基本原理は次の通りである。すなわち、光源の変調周波数をある低い周波数から高い周波数まで、短時間幅で掃引し、それに対する試料からの蛍光信号応答波形を、デジタルオシロスコープのメモリー上に同期積算・記憶した後、フーリエ変換を施す。その結果と参照試料のそれとを比較して、周波数領域でのデコンボリューション処理を行った後、逆フーリエ変換を施すことによって、従来の手法では不可能であった蛍光減衰波形を算出する。そこで、長周期の任意波形が発生可能なパルスパターンジェネレーター(任意波形ゼネレータ)と、メモリー点数の多いデジタルオシロスコープを購入し、システム構築の第一段階として紫外LEDを光源とした高精度蛍光寿命測定システムを完成させた。実際に、白色LED中の蛍光体や標準試料溶液である、硫酸キニーネ溶液およびローダミン6G溶液の蛍光減衰波形を取得した。また、一方で、落射型蛍光顕微光学系下で、人歯および上行大動脈試料の蛍光寿命顕微鏡マッピング測定を行い、測定部位の違いによる蛍光寿命の差異を確認した。今後は両者のシステムの統合を行い、光ファイバーと内視鏡を使用したリアルタイム腫瘍組織診断システムの構築をめざす。また、フーリエ変換型位相変調蛍光寿命計装置自体の時間分解能と測定精度の向上、励起光源の短波長化に関する開発研究を継続する予定である。

本研究の目的は、1)研究代表者が考案・命名したフーリエ変換型位相変調型蛍光寿命測定装置の本格的なシステムの構築と評価を行うこと、2)提案手法のさらなる性能改善のための調査・研究を行った後、顕微鏡と結合させて腫瘍診断への応用を展開すること、3)老化組織診断を始めとする他の様々な動的生化学現象の研究、さらに内視鏡診断への応用について検討することであった。平成17年度は装置の製作と基本性能評価結果を完了させ、論文としてまとめた。また一方で、励起周波数掃引最高周波数f_<max>と蛍光寿命値τの積がf_<max>τ>1の条件を満足しないと良好な蛍光減衰波形測定が行えないことを実験的および解析的に確認した。しかし装置的な条件からf_<max>を無限大にすることは全く不可能である。この問題を解決するために、研究代表者は「反復ヒルベルト変換法を用いた周波数外挿アルゴリズム」という手法を新たに着想しこれを完成させた。すなわち実際の多成分蛍光試料(Fluo5)に適用して、f_<max>=10MHzでも数ナノ秒の多成分蛍光減衰波形が良好に復元できることを確認した。さらに前年度から、生体試料(冠状静脈の組織片および歯)に対し、コラーゲンをキーワードとして、老化と蛍光寿命の関係を考察するための顕微鏡下でのマッピング測定を継続して行った。これに加え、同様なシステムを用いて、魚鱗の蛍光寿命測定を新たに実施し、天然魚と養殖魚で蛍光寿命に僅かながら差異がある可能性を初めて見出した。さらに本年度購入した周波数特性分析器(FRA5096,15MHz,NF社)を用いて位相変調蛍光寿命測定システムが容易に構築しできることを確認した。いずれも腫瘍診断への本格的な適用が期待できる。
亜臨界水処理によるバイオマス+プラスチック混合廃棄物のクリーン燃料化

200°C、1. 6MPaの亜臨界水中で、食品廃棄物または農作物非可食部+非塩素系廃プラスチックまたはポリ塩化ビニルという混合廃棄物を30分間、撹拌しながら水熱処理すると、粒径5mm以下、発熱量2530MJ/kg、塩素含有率0. 3wt%以下の複合燃料が生成した。この燃料は燃焼時に有害な排ガスを出さないクリーン燃料であり、その中のバイオマス成分は亜臨界水中で加熱殺菌され、表面が炭化しているので、長期保存が可能だった。亜臨界水中で、食品廃棄物+非塩素系プラスチックから、石炭並みの高発熱量を持ち、イオウ分が少ないクリーンな複合粉末燃料を生産するための基盤技術の開発を目指した。(1)亜臨界水による複合粉末燃料化の最適条件の決定亜臨界水粉末燃料化装置を用いて、食品廃棄物+非塩素系廃プラスチック混合物から高発熱量の複合粉末燃料を生成するための最適処理条件を決定した。その結果、200°C、1.6MPa、反応時間30分、撹拌速度10rpm、食品廃棄物:廃プラスチック:水分調整材=10:2:5(重量比)の条件で水熱処理すると、粒径が5mm以下、発熱量が2528MJ/kgの粉末燃料が得られ、発熱量は石炭の発熱量27MJ/kgに匹敵した。(2)亜臨界水中での複合微粒子化のメカニズムの解明亜臨界水中でプラスチックやバイオマスが加水分解し微粒子化する過程を直接観察するために、のぞき窓付きの亜臨界水加水分解観測装置を製作し、調整、試運転し良好に動くことを確かめた。(3)バイオマス成分の高速乾燥に対する亜臨界水処理効果の解析100°Cで食残(含水率80wt%)を乾燥する場合、未処理の食残では3時間、水熱処理すると0.75時間で食残の水分含有量はほぼゼロになった。また光学顕微鏡により水熱処理後の食残の細胞壁を観察したところ、らせん肥厚や壁孔が破壊されて、内部の水分が蒸発されやすくなっていることがわかった。(4)複合粉末燃料の特性評価前処理や水熱処理の条件を変化させて粉末燃料を生産し、その粒径、粒度分布、燃焼熱、かさ密度、元素組成、含水率、灰分含有率、脱水温度等の基本物性を測定した。その結果、項目(1)で示した最適条件で粉末燃料を生産すると、高発熱量、粒径が5mm以下、粒度分布が比較的狭い粉末燃料を生産出来ることがわかった。亜臨界水中で、食品廃棄物+塩素系プラスチックから、石炭並みの高発熱量を持ち、塩素分が少ないクリーンな複合粉末燃料を生産するための基盤技術の開発を目指した。(1)亜臨界水による複合粉末燃料化の最適条件の決定亜臨界水を用いて、食品廃棄物とポリ塩化ビニル混合物から高発熱量の複合粉末燃料を生成するための最適処理条件を決定した。ただしポリ塩化ビニルは窒素雰囲気下で300350°Cに加熱して脱塩化水素化してから使用した。その結果、200°C、1.6MPa、反応時間30分、撹拌速度10rpm、食残:廃プラ:水分調整材=10:2:5(重量比)の条件で水熱処理すると、粒径が5mm以下、発熱量が2530MJ/kg、塩素含有率0.20.3wt%の粉末燃料が得られた。。(2)複合粉末の粒径制御法の開発粉末燃料製造の最終の減圧工程においても撹拌を続けることにより、粉末燃料中の大きなプラスチック塊がほとんどなくなり、サイズ、発熱量の両面で安定した粉末燃料を生成できるようになった。(3)バイオマス成分の高速乾燥に対する亜臨界水処理効果の解析大気圧乾燥において、100°Cの時の完全乾燥時間は、未処理の米飯で3時間、水熱処理した粉末燃料で0.5時間と、水熱処理によって乾燥速度が36倍ほど速くなることを明らかにした。(4)複合粉末燃料の特性評価項目(1)で示した最適条件で食品廃棄物十ポリ塩化ビニルから粉末燃料を生産すると、高発熱量、粒径が5mm以下、粒度分布が比較的狭い、塩素含有率0.3wt%以下の粉末燃料を生産出来ることがわかった。亜臨界水中で、農作物非可食部+非塩素系ブラスチックから、石炭並みの高発熱量を持ち、塩素分が少ないクリーンな複合粉末燃料を生産するための基盤技術の開発を目指した。(1)亜臨界水による複合粉末燃料化の最適条件の決定亜臨界水を用いて、農作物非可食部と非塩素系プラスチック混合物から高発熱量の複合粉末燃料を生成するための最適処理条件を決定した。ただし農作物非可食部としては、硬い繊維質を多く含んでいる稲わらやもみ殻、食品加工工場からの排出量が多いキャベツを用い、非塩素系プラスチックとしてはポリエチレン、ポリプロピレン、ポリスチレンといった汎用の熱可塑性プラスチックを用いた。

その結果、200°C、1.6MPa、反応時間30分、撹拌速度10rpm、農業廃棄物:廃プラ:水分調整材=10:2:5(重量比)の条件で水熱処理すると、粒径が5mm以下、発熱量が2530MJ/kg、塩素含有率0.3wt%以下の複合粉末燃料が得られた。(2)亜臨界水中での複合微粒子化のメカニズムの解析のぞき窓付きの亜臨界水加水分解観察装置を用いてキャベツとポリスチレンの粉末燃料化過程を観察した結果、180°C付近からキャベツの微粉化と炭化が起こり始めると共にプラスチックの溶融も進行したが、キャベツの炭化により装置内の熱水が黒く着色し、プラスチックの微粒子化を観測できなかった。(3)バイオマス成分の高速乾燥に対する亜臨界水処理効果の解析22年度の食残+廃プラスチックと同様に、農作物非可食部+廃プラスチックの場合も水熱処理により乾燥速度が35倍速くなった。(4)複合粉末燃料の特性評価項目(1)で示した最適条件で農作物非可食部+非塩素系の汎用プラスチックから粉末燃料を生成すると、25MJ/kg付近の高発熱量、粒径が5mm以下、粒度分布が比較的狭い、塩素含有率0.3wt%以下の粉末燃料を生成出来ることがわかった。
人の水泳技能向上を支援する着用型トレーニング機器の開発

本年度は,本研究課題による成果の新しい展開として,昨年度までに開発した水中における全身協調運動を計測する着用型センサスーツおよびそれによる実時間フィードバック技術の実応用に関する検討や,研究成果のアウトリーチ活動を主に行なった.その過程において,本システムの想定するユーザである水泳競技者や指導者,およびスイミングスクールのユーザー等へのヒアリングを行った.その結果,開発中のシステムを用いたトレーニング手法の効果や,学習者のパフォーマンスデータの管理方法について好意的な評価を得られたとともに,センサスーツの装着性やユーザーインタフェースの改善に資するフィードバックを得ることができた.また,開発したスーツによる水泳のストローク位相を推定するためのアルゴリズムの改良も行い,機械学習手法に基づくアルゴリズムによる精度向上を図った.また,より計算性能の高いマイクロコントローラを採用した新しい制御基板の設計と製作も行なった.これにより,将来的により複雑なアルゴリズムの実装や,計測箇所の増加に伴う計算コストの増大にも対応することが可能となる.さらには,計測したデータをリアルタイムに音響変換しフィードバックするアルゴリズムも実装された.上記の研究成果のアウトリーチ活動としては,世界中の主要な大学や研究機関関係者に読まれる英国の雑誌「IMPACT」に本研究の内容が掲載されるとともに,日本科学技術振興機構による社会還元加速プログラム「SCORE」にも採択され,本課題で開発した技術の社会実装としての事業化についての検討も行った.本年度は,本研究課題による成果の新しい展開として,昨年度までに開発した水中における全身協調運動を計測する着用型センサスーツおよびそれによる実時間フィードバック技術の実応用に関する検討や,研究成果のアウトリーチ活動を主に行なった.その過程において,本システムの想定するユーザである水泳競技者や指導者,およびスイミングスクールのユーザー等へのヒアリングを行った.その結果,開発中のシステムを用いたトレーニング手法の効果や,学習者のパフォーマンスデータの管理方法について好意的な評価を得られたとともに,センサスーツの装着性やユーザーインタフェースの改善に資するフィードバックを得ることができた.また,開発したスーツによる水泳のストローク位相を推定するためのアルゴリズムの改良も行い,機械学習手法に基づくアルゴリズムによる精度向上を図った.また,より計算性能の高いマイクロコントローラを採用した新しい制御基板の設計と製作も行なった.これにより,将来的により複雑なアルゴリズムの実装や,計測箇所の増加に伴う計算コストの増大にも対応することが可能となる.さらには,計測したデータをリアルタイムに音響変換しフィードバックするアルゴリズムも実装された.上記の研究成果のアウトリーチ活動としては,世界中の主要な大学や研究機関関係者に読まれる英国の雑誌「IMPACT」に本研究の内容が掲載されるとともに,日本科学技術振興機構による社会還元加速プログラム「SCORE」にも採択され,本課題で開発した技術の社会実装としての事業化についての検討も行った.
ケハダスナホリムシ（軟体動物・尾腔綱）の生殖周期の研究

軟体動物尾腔綱の発生については未だ十分な観察がなされていない。この発生研究の基盤とするため、若狭湾西部に生息するケハダスナホリムシ類のScutopus schanderiの生殖周期を調べた。連続する12か月の各月に採集した標本の生殖腺を観察したところ、産卵は1年に1回、9月下旬から10月上旬におこなわれることが分かった。産卵誘導の可能性についても検討し、9月の産卵前に採集した動物については紫外線照射海水、セロトニン-クレアチニン硫酸塩や精子による刺激によって放卵した個体を観察したが、その効果や、最適条件等の検討は今後の課題である。本年度は若狭湾西部の水深100 m付近において、2013年4月から2013年7月までの各月と10月の合計5か月分のケハダスナホリムシ標本の採集を実施し、各月目標の30個体以上(94-183個体)、合計624個体の標本を得ることができた。また各月に、CTDを用いて表面から海底までの水温と塩分を測定記録した。これにより、昨年度のサンプリング実績と合わせて2012年7月から連続する1年間にわたる各月の標本と水温・塩分のデータが得られた。得られた標本は、順次、定めた部位から体表の棘を採取してプレパラートを作成した後、生殖巣が存在する体の中央よりやや後ろの一部分を薄切し、組織切片のプレパラートを作成して観察した。分類学的研究では昨年度の研究で採集地点にはケハダスナホリムシ属の2種が生息することが分かった。また同地点には本属が所属する軟体動物尾腔綱の別科であるケハダウミヒモ科の2属2種も生息することがわかったため、これら4種を新種として記載し、原稿をJournal of Natural History誌に投稿した。現在査読中である。生殖周期の研究は昨年度の研究で7月から9月に採集された標本では、成熟に近い、あるいは成熟した卵と精子が認められたが、10月末に得られた標本では、これまで生殖細胞が認められていない。また3月の標本には未成熟の生殖細胞が認められた。このことから9-10月にかけて産卵が行われている可能性があることが推測された。このため本年は10月初旬にも採集を実施し、生殖腺観察の準備を行っている。今年度は11月および12月採集した個体で生殖腺の観察を行ったが、生殖細胞が認められなかった。このことは産卵が年1回、10月に行われるという昨年の推定を支持するが、これを確かめるためにはさらに多くの個体を観察する必要がある。成熟した生殖細胞が見られる最小サイズの標本は固定標本の体長4.3 mmで、体長4-5 mmで性成熟に達することが推定された。本年度は若狭湾西部の水深100 m付近において、2012年7月から2013年3月までの各月、合計9か月分のケハダスナホリムシ標本の採集を実施し、各月30個体以上(35-88個体)、合計457個体の標本を得ることができた(但し3月は選別作業中で含めず)。また各月に、CTDを用いて海表面から海底までの水温と塩分を測定記録した。得られた標本は、順次、定めた部位から体表の棘を採取してプレパラートを作成した後、生殖巣が存在する体の中央よりやや後ろの一部分を薄切し、組織切片のプレパラートを作成した。この結果、まず棘の形態観察から、サンプル中には極めて類似する2種が存在することが伺われたため、棘と共に重要な分類形質である歯舌も観察したところ、両者の間に著しい形態の差異が認められたことから、採集地点にはケハダスナホリムシ属の未記載種2種が生息することが分かった。これをもとに体表の棘の形態を観察して両者を区別し、個体数の多い方の種のみについて、切片を作成し、生殖巣の観察を進めた。これまで7月から10月に採集された標本と、本研究開始前の2013年3月に採集された標本の、各月5ー10個体の生殖巣の観察を実施したところ、7月から9月に採集された標本では、成熟に近い、あるいは成熟した卵と精子が認められたが、10月に得られた標本では、これまで生殖細胞が認められていない。このことから9-10月にかけて産卵が行われている可能性があることが予測される。本年度は産卵のタイミングを絞り込む目的で、産卵期と推定される期間に3回の調査航海を実施して標本の採集を行った。同時にCTDで表面から海底までの水温と塩分を測定記録した。得られた標本は、定めた部位から体表の棘を採取してプレパラートを作成・同定した後、生殖巣が存在する部位を薄切し、連続切片のプレパラートを作成して観察した。各月30個体、12か月分で合計360個体分の切片を作製する予定であるが、これまでのところ3分の2にあたる240個体分の切片を作製した。これには12か月分の標本が少ない月でも10個体含まれており、生殖細胞発達過程の概要をつかむことができた。産卵誘導の実験では、実際に放卵、放精と、その後の発生を幼生初期まで観察することができた。産卵誘導では異常発生が見られるものの、一部は正常に発生し、幼生となって泳ぎまわるものも観察された。

さらに、同所的に棲息する同属別種との区別や、成熟期には外観で雌雄を区別することも可能であることがわかり、今後の進展が期待できる結果が得られた。分類学的研究では採集地点に棲息するケハダスナホリムシ属の2種と、同じ尾腔綱の別科であるケハダウミヒモ科の2属2種の合計4種を新種として記載し公表した。本研究は尾腔類の個体発生研究の基盤として、ケハダスナホリムシ類の1種の生殖周期を明らかとすることを目的として計画された。特に卵細胞が成熟する時期と、産卵によって生殖腺から生殖細胞が消失あるいは減少する時期を特定することが重要である。このような生殖細胞発達過程を観察するための各月30個体、12か月分で合計360個体分の生殖腺連続切片プレパラート作製を完了した。これら全個体について、重要な分類形質である体表の石灰質鱗片もしくは歯舌によって同一種であることを確認した。これらの切片の観察から本種の産卵期をほぼ特定することができた。この結果をもとに、推定産卵期に動物の採集を実施する計画を立てた。実際には、海況の悪さと調査船運用上の都合で、推定産卵期よりやや早い時期のサンプルしか得られなかったが、紫外線照射海水とセロトニンクレアチニン硫酸塩等を用いて産卵誘導を行ったところ、1個体が少数ではあるが放卵した。この卵に雄個体を切開して得た精子を振りかけたところ、発生を開始し、その後8日間にわたる観察を行うことができた。胚はトロコフォラ幼生を経て、ほぼ1週間で着底し、変態した。技術的な問題から詳細な観察はできていないが、3年連続で胚発生を観察できたこと、また受精から各発生段階まで時間がほぼ明らかとなったことは重要である。前年度までに確立した、同所的に棲息する同属別種との識別、成熟期における外観での雌雄の識別方法とあわせ、適切な時期に材料の採集を行えばほぼ確実に胚発生を観察することが可能となり、本研究の目的である、個体発生観察のための基礎を固めることができた。軟体動物尾腔綱の発生については未だ十分な観察がなされていない。この発生研究の基盤とするため、若狭湾西部に生息するケハダスナホリムシ類のScutopus schanderiの生殖周期を調べた。連続する12か月の各月に採集した標本の生殖腺を観察したところ、産卵は1年に1回、9月下旬から10月上旬におこなわれることが分かった。産卵誘導の可能性についても検討し、9月の産卵前に採集した動物については紫外線照射海水、セロトニン-クレアチニン硫酸塩や精子による刺激によって放卵した個体を観察したが、その効果や、最適条件等の検討は今後の課題である。切片作成については、当初計画より遅れている。これは網で採集される海底の砂泥から標本を選別する作業を優先したためと、切片作成補助者が海外留学し、代わりに作業できる補助者を見いだせなかったためである。選別を優先した理由は、標本を砂泥と共にホルマリンの中に長期間入れておくと、液が酸性に傾き、石灰質でできた体表の棘が溶解して同定が困難になる恐れがあるためである。系統分類学残り3分の1の生殖腺組織切片作成作業と観察を進める。これにより各月30個体分の生殖腺を1年分観察し、これまでに推定されている産卵周期と産卵期を明らかにしたい。組織切片作成の経験がある補助者を本年4月から雇用しており、切片作成作業は進展している。生殖腺の観察、卵サイズの計測も行っており、研究結果の公開に向けて情報を蓄積する。産卵推定時期に産卵期の絞り込みと、その条件を考察するために1度採集を行い、同時に各種刺激による産卵誘発と発生の観察を試みる。本研究では各月に十分な個体数の標本を採集する必要があるが、計画2年目で連続する1年の各月の標本を採集することができた。
包括的ゲノム解析によるノロウイルス新変異株の河川水と患者における早期検出系の構築

本研究では、次世代型ゲノム解析装置を用いて、自然環境(河川、下水)、および、自然環境周辺に位置するヒト集団における集団食中毒事例について、ノロウイルスのゲノム解析情報を収集し、遺伝子型の分布状況の比較や新変異株の検出について解析する。これらの情報は、ノロウイルスのヒト集団における集団発生予測の基盤情報になることが期待される。初年度は、より迅速かつ簡便な解析プログラムを作成し、既存のものと結果を比較することで精度をあげる試みを行った。今年度は、2009年に大阪府内で発生したノロウイルスGI陽性食中毒B事例(以下B事例)を対象に{料理喫食者(n=7)}、その解析プログラムを使用して調査した。糞便試料を出発材料とし、ウイルスRNA抽出、逆転写反応後、カプシド遺伝子シェル領域(300bps)をPCRで増幅した。今回は、MiSeq (illumina社)を用いて、遺伝子増幅産物の配列情報を取得した。(i) 220,622配列(約6.0×10の7乗塩基)を対象とした。(ii)本事例では、B事例では、7症例中5症例より、GI.1、GI.3、GI.型別不能の複数の遺伝子型が検出された。7症例中5症例は、GI.1が優位に高かった(61-79%)。1症例はGI.3、残り1症例は、GI.型別不能が優位に高かった。(iii)カキ等の二枚貝の喫食は確認されなかった。昨年度解析したノロウイルスGII陽性食中毒A事例(以下A事例)(6症例)では、6症例中5症例より、GII.2とGII.4の複数の遺伝子型が検出されたことから、ノロウイルスは、遺伝子群に関係なく、混合感染することがわかった。ノロウイルスは、異なった遺伝子型の共感染により、キメラウイルスが新生すると考えられている。新流行株の新生の機序を考える上で、重要な知見である。私共は、日本における新型変異株ノロウイルスの出現による流行への注意監視のため、臨床検体や河川などの環境検体より、ノロウイルス感染症の新型変異株の早期検出を試みたい。初年度は、既存の配列解析プログラムを、迅速・簡便化のため、配列解析プログラムを改良した。今年度は、、配列情報を解析する小型ゲノムサーバーを購入したため、多検体の解析を遂行することができた。昨年度、解析したノロウイルスGII陽性食中毒事例(6名分)を新たに解析し、ノロウイルスGI陽性食中毒事例(7名分)を加えて解析した。症例の遺伝子型の比率は、頻度が様々であった。喫食した食品汚染の度合い依存する可能性、また、宿主側のNoV既感染歴に影響されると考えられる。ノロウイルスGI陽性食中毒事例では、感染源が特定されなかったが、GIの複数の遺伝子型が検出されており、NoVは遺伝子型群に関係なく、混合感染することが示唆された。A事例、B事例は、同一食事による食中毒事例であったが、遺伝子型の頻度は多様であった。喫食した食品汚染度に依存する可能性や宿主側のノロウイルスに対する防御因子の関与が考えられる。A事例では、GII.4亜株分別不能株、B事例では、GI遺伝子型分別不能株が検出された。ノロウイルスは、GIおよびGIIにおいて、未知の遺伝子型が存在する可能性がある。喫食した食品汚染の度合い依存する可能性、また、宿主側のノロウイルス既感染歴に影響されると考えられる。ノロウイルスGI陽性食中毒事例では、感染源が特定されなかったが、GIの複数の遺伝子型が検出されており、ノロウイルスは遺伝子型群に関係なく、混合感染することが示唆された。ノロウイルスは、異なった遺伝子型の共感染により、キメラウイルスが新生する可能性がある。昨年度の問題点は、(1)配列情報を解析するコンピューターの購入が遅れ、市販されている一般のコンピューターで解析をしたため、解析数に制約があり、多くの検体を解析できなかった(2)自然環境(河川、下水)の採取が大変、困難であること、であったが、今年度、小型ゲノムサーバーを購入したため、(1)の問題は解決した。(2)自然環境(河川、下水)の採取であるが、大阪府内で調整をすすめ、採取への協力を得た。最終年度は、下水環境中のノロウイルスの遺伝子型の分布状況を調査検討を行う。初年度、迅速・簡便に改良した配列解析プログラムを用い、今年度、購入した小型ゲノムサーバーを用いて、解析にあたる。ノロウイルス流行株予測の系の構築のため、次世代型ゲノム解析装置を用いて、自然環境(河川、下水)、および、自然環境周辺に位置するヒト集団の(集団食中毒事例)ノロウイルスのゲノム解析情報を収集し、自然環境、ヒト個体、ヒト集団内に存在する新変異株の検出を実施する。ノロウイルスのゲノム解析情報を比較検討することで、自然環境、ヒト個体、ヒト集団内に存在する新変異株の早期探知が期待される。我々は、次世代型ゲノム解析装置を用いて、自然環境(河川、下水)、および、自然環境周辺に位置するヒト集団の(集団食中毒事例や無症候感染事例)ノロウイルスのゲノム解析情報を収集する。次世代型ゲノム解析装置は、大量に3-5億塩基、配列情報が収集されるため、解析するプログラムが必要である。

我々は、すでに、自作の解析プログラムを作成し、学術論文で報告しているが、煩雑な作業が多く、解析に時間がかかる。よって、初年度は、より簡便な解析プログラムを作成し、既存のものと結果を比較することで精度をあげる試みを行った。今回は、2009年に大阪府内で発生した集団食中毒事例を対象として、様々な遺伝子型を検出する。汚染食材を介して、料理喫食者(n=6)と感染拡大した集団食中毒事例を対象とした。糞便試料を出発材料とし、ウイルスRNA抽出、逆転写反応後、カプシド遺伝子シェル領域(300bps)をPCRで増幅した。今回は、MiSeq (illumina社)を用いて、遺伝子増幅産物の配列情報を取得した。既存の配列解析プログラムと新しく簡便化した配列解析プログラムで亜株、遺伝子型の頻度を調べ比較した。(i)カプシド遺伝子シェル領域の配列情報(約8.0×107塩基/ 6検体)を取得した。(ii)シェル領域の遺伝系統が異なるウイルス亜集団の重感染は、6検体中4検体で検出された。これは、両方のプログラムで同数であった。(iii)本事例では、GII.4 2006b株とGII.2が検出されていた。(iv)既存のプログラムでは、GII.2は、個体内に集団(2.2- 97.3%)として、4例で検出された。新規のプログラムでは、個体内に集団(2.9- 98.5%)で、ほぼ、既存のプログラムと同数であることがわかった。私共は、近畿地方に限局し、我々は、琵琶湖、流出河川である瀬田川、下流域である淀川、下流域にある感染症サーベランス定点病院との連携し、経時的に、自然環境(河川)、同地域にて急性胃腸炎で入院していた患者糞便試料を収集する予定であった。最終的に、我々は、ノロウイルス流行株予測のため、次世代型ゲノム解析装置を用いて、自然環境(河川、下水)、および、自然環境周辺に位置するヒト集団の(集団食中毒事例や無症候感染事例)ノロウイルスのゲノム解析情報を収集し、自然環境、ヒト個体、ヒト集団内に存在する新変異株の検出を行うことを目標としていた。初年度は、(1)既存の配列解析プログラムと新しく簡便化した配列解析プログラムで亜株、遺伝子型の頻度を調べ比較したところ、ほぼ同じような結果が得られ、簡便な配列解析プログラムが解析に用いられることがわかった。(2)集団食中毒事例では、シェル領域の遺伝系統が異なるウイルス亜集団の重感染が多いことがわかった(4/6例)。感染伝播の際に、遺伝的に多様な集団から一部のウイルス亜集団が抽出されるボトルネックが生じている可能性が示唆された。臨床検体の解析はできたが、現時点では、他の自治体の行政管轄の自然環境(河川、下水)の採取が大変、困難であり、解析がとん挫している。また、今回は、配列情報を解析するコンピューターの購入が遅れ、市販されている一般のコンピューターで解析をしたため、解析数に制約があり、多くの検体を解析できなかった。本研究では、次世代型ゲノム解析装置を用いて、自然環境(河川、下水)、および、自然環境周辺に位置するヒト集団における集団食中毒事例について、ノロウイルスのゲノム解析情報を収集し、遺伝子型の分布状況の比較や新変異株の検出について解析する。これらの情報は、ノロウイルスのヒト集団における集団発生予測の基盤情報になることが期待される。
意思決定の習慣化を司る脳神経回路：皮質線条体路を起点とした脳内ネットワークの解明

ヒトを含めた動物は、学習を重ねることで結果を予測しながら臨機応変に行動する“目標指向型"の意思決定から、繰り返した行動を自動的に実行する“習慣型"の意思決定に切り替えて円滑な行動を可能にする。本研究では、意思決定の習慣化を司る脳神経回路として、皮質線条体路を起点とした脳内ネットワークの解明に取り組む。平成30年度は、前年度に確立したウイルスベクターによる神経路選択的な遺伝子発現系を応用した化学遺伝学と光遺伝学を用いた皮質線条体路の機能操作を実施した。逆行性レンチウイルスベクターを線条体に注入してCreをマウスの皮質線条体路に発現させてからCre依存的に人工受容体のDREADDを発現するアデノ随伴ウイルス(AAV)-Flexベクターを大脳皮質に注入して、レンチウイルスベクターとAAVベクターに二重感染した皮質線条体路にDREADDを発現するマウスを作製した。DREADDのリガンドであるClozapine-N-Oxide(CNO)を腹腔内投与することで、皮質線条体路を薬理学的に抑制したマウスにおいて道具的条件付け学習を実施して、皮質線条体路の行動生理学的な役割を解析した。同様の二重感染法によって、皮質線条体路にチャネルロドプシンを発現するマウスを作製し、このマウスの大脳皮質への光刺激により皮質線条体路の活動操作を試みた。現在までに線条体には光照射によって発火する神経細胞は同定されていないが、大脳皮質では光刺激によって発火する神経細胞を同定できた。また神経回路選択的な遺伝子発現系として、マウス遺伝学を応用した方法にも取り組んだ。現在までに、様々なCreドライバーマウスとの掛け合わせによって、特定の神経領域において遺伝子発現を操作できることを確認した。前年度に確立した光遺伝学と化学遺伝学を皮質線条体路の行動生理学および電気生理学的な解析に応用するためには、幾つかの改良点が必要だと分かった。来年度は、それぞれの技術を改良して目的を達成していく。また当初の計画ではウイルスベクターを用いて神経回路選択的な遺伝子発現を達成する予定であったが、新たにマウス遺伝学を応用した遺伝子発現系にも取り組んだために当初の計画よりも遅れが生じた。ウイルスベクターによる遺伝子発現量を向上させるために、新しいセロタイプのAAVベクターによる遺伝子発現系を確立する。またDREADDとは別の化学遺伝学によって皮質線条体路を抑制する系の確立や、マルチユニット記録によって線条体の神経活動を計測する系の確立を行う。一方で、前年度までに実施したイムノトキシンによって皮質線条体路を選択的に破壊したマウスの行動生理学的な解析について、原著論文を準備していく。またウイルスベクター以外にも、マウス遺伝学を応用した神経回路選択的な遺伝子発現系の確立と神経機能解析を同時に進めていく。目標指向型の意思決定には、眼窩前頭皮質などの前頭前皮質から起こる皮質線条体路の関与が報告されているが、習慣型の意思決定における皮質線条体路の関与は殆ど分かっていない。本研究では、意思決定の習慣化を司る脳神経回路として、皮質線条体路を起点とした脳内ネットワークを明らかにする。平成29年度は、ウイルスベクターによる神経路選択的な遺伝子発現系を用いてイムノトキシン細胞標的法、化学遺伝学、光遺伝学といった多彩な方法によって皮質線条体路を機能操作するための実験系を確立した。逆行性レンチウイルスベクターを線条体に注入してヒトIL2αをマウスの皮質線条体路に発現させてからヒトIL2αを認識するイムノトキシンを大脳皮質に注入することで皮質線条体路を領野選択的に破壊したマウスにおいて道具的条件付けを実施して、この神経路の行動生理学的な役割を解析した。さらにCre依存的に遺伝子発現を誘導するFlexシステムを応用して、線条体と大脳皮質の其々に注入した逆行性レンチウイルスベクターと順行性アデノ随伴ウイルスベクターに二重感染した皮質線条体路のみでClozapine-N-Oxide(CNO)依存的に神経活動を操作できる人工受容体のDREADDを発現させることで、この神経路の活動を薬理的に操作できることを神経活動指標のc-Fos発現により示した。同様の方法により、皮質線条体路にチャネルロドプシンを発現するマウスを作成し、このマウスの大脳皮質において光刺激により発火する神経細胞を同定できた。来年度は化学遺伝学と光遺伝学による皮質線条体路の機能操作が線条体などの神経活動や道具的条件付けに及ぼす影響を解析していく。平成29年度は、道具的条件付けにおける皮質線条体路の役割を解析して、さらに皮質線条体路を化学遺伝学と光遺伝学により機能操作する実験系を確立した。これによって平成30年度以降に、化学遺伝学と光遺伝学により皮質線条体路を機能操作して、これを解析するための準備が整った。

平成30年度は、前年度に確立したウイルスベクターによる神経路選択的な遺伝子発現系を応用した化学遺伝学と光遺伝学を用いた皮質線条体路の機能操作を実施した。逆行性レンチウイルスベクターを線条体に注入してCreをマウスの皮質線条体路に発現させてからCre依存的に人工受容体のDREADDを発現するアデノ随伴ウイルス(AAV)-Flexベクターを大脳皮質に注入して、レンチウイルスベクターとAAVベクターに二重感染した皮質線条体路にDREADDを発現するマウスを作製した。DREADDのリガンドであるClozapine-N-Oxide(CNO)を腹腔内投与することで、皮質線条体路を薬理学的に抑制したマウスにおいて道具的条件付け学習を実施して、皮質線条体路の行動生理学的な役割を解析した。同様の二重感染法によって、皮質線条体路にチャネルロドプシンを発現するマウスを作製し、このマウスの大脳皮質への光刺激により皮質線条体路の活動操作を試みた。現在までに線条体には光照射によって発火する神経細胞は同定されていないが、大脳皮質では光刺激によって発火する神経細胞を同定できた。また神経回路選択的な遺伝子発現系として、マウス遺伝学を応用した方法にも取り組んだ。現在までに、様々なCreドライバーマウスとの掛け合わせによって、特定の神経領域において遺伝子発現を操作できることを確認した。前年度に確立した光遺伝学と化学遺伝学を皮質線条体路の行動生理学および電気生理学的な解析に応用するためには、幾つかの改良点が必要だと分かった。来年度は、それぞれの技術を改良して目的を達成していく。また当初の計画ではウイルスベクターを用いて神経回路選択的な遺伝子発現を達成する予定であったが、新たにマウス遺伝学を応用した遺伝子発現系にも取り組んだために当初の計画よりも遅れが生じた。現在までに、イムノトキシン細胞標的法による皮質線条体路の選択的破壊によって、この神経路の生理機能の解析が進んでいる。まずは、この成果を国際学術誌に論文発表することを優先して研究を進めていく。さらに本年度に確立した化学遺伝学と光遺伝学による皮質線条体路の機能操作法を用いた解析も進めていく。また皮質線条体路を構成するニューロンサブタイプの其々を選択的に機能操作できるシステムを確立することで、その神経ネットワークの違いを明らかにしていく。最終的には全脳的な解析によって皮質線条体路を起点とした脳内ネットワークの全容にも迫りたい。ウイルスベクターによる遺伝子発現量を向上させるために、新しいセロタイプのAAVベクターによる遺伝子発現系を確立する。またDREADDとは別の化学遺伝学によって皮質線条体路を抑制する系の確立や、マルチユニット記録によって線条体の神経活動を計測する系の確立を行う。一方で、前年度までに実施したイムノトキシンによって皮質線条体路を選択的に破壊したマウスの行動生理学的な解析について、原著論文を準備していく。またウイルスベクター以外にも、マウス遺伝学を応用した神経回路選択的な遺伝子発現系の確立と神経機能解析を同時に進めていく。前年度に研究機関を異動したために、当初予定していた計画の一部を来年度以降に繰り越した。来年度は、今年度実施しなかった分を含めて計画を実施していく。今年度は、計画の一部に遅れが生じたこともあり、来年度に予算の一部を繰り越した。来年度は、原著論文の発表に向けて残りの予算を計画的に使用していく。
リビングカオチン重合における成長鎖の研究とリビングポリマーの合成法の確立

1.目的-これまでリビングカチオン重合は,成長炭素カチオンが対イオンにより安定化されるため可能と考えられてきた。この重合をさらに一般化するため,遊離イオン成長鎖によるリビング重合の可能性を検討した。2.イソブチルビニルエーテル(IBVE)の遊離イオン成長鎖によるリビング重合-IBVEをHCl-IBVE付加体(1)/ZnCl_2系開始剤により,種々の溶媒中,-78°Cで重合した。C_6H_5CH_3,CH_2Cl_2,EtNO_2/CH_2Cl_2(1/1 v/v)と溶媒の極性が増加するにつれて重合速度は著しく増大した。しかし,生成ポリマーの分子量は溶媒の極性とは無関係に,重合率に比例して増加し,開始剤1分子からポリマー1分子が生成したとする計算値と一致し,分子量分布も狭い(Mw/Mn1.1)ものであった。また,重合の終了した系に新しくモノマーを添加しても同様に重合し,極性溶媒中でもリビングカチオン重合が可能なことが明らかになった。一方,生成ポリマーの立体構造から,極性溶媒中では,対イオンに影響されない解離した成長鎖(遊離イオン成長鎖)で成長していることが示され,遊離イオン成長鎖によるリビングカチオン重合の例が初めて見出された。3.p-t-ブトキシスチレン(tBOS)の遊離イオン成長鎖によるリビング重合-ビニルエーテル以外のモノマーの遊離イオン成長鎖によるリビングカチオン重合の可能性を確認するため,カチオン重合性の大きいスチレン誘導体であるtBOSについて,IBVEと同じ条件で重合を行った。tBOSでは-15°Cと比較的高温でも,IBVEと同様に遊離イオン成長鎖によりリビング重合が可能なことが示された。まとめ-遊離イオン成長鎖によるリビングカチオン重合が可能なことが見出され,これによって,より広い反応条件で多くのモノマーのリビング重合が可能になった。ビニルエーテルのカチオン重合では,適当な開始剤(対イオン)を選ぶことにより成長炭素カチオン(C^+)が安定化し,リビング重合が可能となる。本研究では,重合速度や生成ポリマーの分子量・分子量分布に加え,生成ポリマーの立体構造を測定し,リビングカチオン重合を可能とする開始剤を検討する。まずイソブチルビニルエーテル(IBVE)をモノマーとして,無極性溶媒中でリビング重合が可能なIBVE-HCl/ZnCl_2(Zn系開始剤),IBVE-AcOH/EtAlCl_2 (Al系開始剤)を用い,IBVEの重合における溶媒の極性の影響を検討したところ,溶媒の極性に無関係にZn系開始剤からはリビング重合が起こり,Al系開始剤からは分子量分布の広いポリマーが得られた。ポリマーの立体構造は,無極性溶媒(トルエン)中で生成したポリマーに関しては,開始剤の種類によりmeso含率に差があり(Zn系,m=70.2%, Al系; m=78.9%),対イオンの影響が見られた。一方,極性の大きなCH_2Cl_2/EtNO_2混合溶媒中で生成したポリマーの立体構造は,開始剤によらず同じであり(m【approximately equal】56%),成長反応は共に対イオンに影響されない遊離イオンのモノマーへの付加であることを示唆している。この事から,成長鎖の解離状態とは無関係に,リビングカチオン重合には,可逆的にイオン解離が可能なdormant種を生成する求核性の大きな開始剤(対イオン)の使用が必要なことが明らかとなった。1.目的-

これまでリビングカチオン重合は,成長炭素カチオンが対イオンにより安定化されるため可能と考えられてきた。この重合をさらに一般化するため,遊離イオン成長鎖によるリビング重合の可能性を検討した。2.イソブチルビニルエーテル(IBVE)の遊離イオン成長鎖によるリビング重合-IBVEをHCl-IBVE付加体(1)/ZnCl_2系開始剤により,種々の溶媒中,-78°Cで重合した。C_6H_5CH_3,CH_2Cl_2,EtNO_2/CH_2Cl_2(1/1 v/v)と溶媒の極性が増加するにつれて重合速度は著しく増大した。しかし,生成ポリマーの分子量は溶媒の極性とは無関係に,重合率に比例して増加し,開始剤1分子からポリマー1分子が生成したとする計算値と一致し,分子量分布も狭い(Mw/Mn1.1)ものであった。また、重合の終了した系に新しくモノマーを添加しても同様に重合し,極性溶媒中でもリビングカチオン重合が可能なことが明らかになった。一方,生成ポリマーの立体構造から,極性溶媒中では,対イオンに影響されない解離した成長鎖(遊離イオン成長鎖)で成長していることが示され,遊離イオン成長鎖によるリビングカチオン重合の例が初めて見出された。3.p-t-ブトキシスチレン(tBOS)の遊離イオン成長鎖によるリビング重合-ビニルエーテル以外のモノマーの遊離イオン成長鎖によるリビングカチオン重合の可能性を確認するため,カチオン重合性の大きいスチレン誘導体であるtBOSについて,IBVEと同じ条件で重合を行った。tBOSでは-15°Cと比較的高温でも,IBVEと同様に遊離イオン成長鎖によりリビング重合が可能なことが示された。まとめ-遊離イオン成長鎖によるリビングカチオン重合が可能なことが見出され,これによって,より広い反応条件で多くのモノマーのリビング重合が可能になった。
男性不妊症における転写因子複合体ネットワークの包括的解明と遺伝子治療への応用

補助生殖医療が現在不妊症患者には一般的になされている治療法であるが、可能であれば自然妊娠が望ましい。将来的に男子不妊症患者に対する遺伝子治療によって精子形成が可能となればこれらの問題は解決できるかもしれない。本研究では、将来の男子不妊症に対する遺伝子治療の可能性をめざした基礎的研究を行った。精子形成に関わる遺伝子の情報はさらに必要であるが、将来的に遺伝子治療が男子不妊症に対する治療法として確立することが望まれる。1.不妊モデルマウス精巣へのAd4BPISF-1およびDAX-1遺伝子導入(in vivo遺伝子導入):これまでの研究成果を発展させ、アデノウイルスベクターを用いた、Ad4BP/SF-1およびDAX-1の遺伝子導入を行った。アデノウイルスにラット由来の2遺伝子のプラスミドを組み込んで行った。精巣網および精細管から遺伝子導入を行う精細管遺伝子導入法と、精巣白膜上から精巣に直接注入する精巣直接遺伝子導入法により、上記遺伝子を精巣内に遺伝子導入した。不妊モデルマウスとして、ブズルファン投与マウスを用いた。遺伝子導入したのち、RT-PCRおよびwestern blotting法により、上記遺伝子の発現を確認した。ラットに特異的な上記遺伝子のプライマーを作成し、定量RT-PCRによって、ラット由来の上記遺伝子の増加を確認した。さらに、免疫組織化学染色法により、上記遺伝子の発現の局在を検討したところ、精細管遺伝子導入法ではセルトリ細胞に、精巣直接遺伝子導入法にではライディッヒ細胞に、その遺伝子の発現を確認した。造精機能への影響に関しては、精細管の荒廃が非常に強かったためと、投与後の感染が強かったため、造精機能の回復が明らかに認めなかった。より慎重な条件の設定が必要と考えられた。血中のFSH, LH,テストステロン濃度については変化を認めなった。2.マトリクスゲルを用いた精巣の三次元培養:GFP発現トランジェニックマウスの新生児期マウスより精巣を摘出し、マトリゲルを用いてin vitroで精細管の再構築を行った。これらをゲルから細胞塊を採取し正常のマウスに移植。精巣内でGFP由来の細胞の精細管が再構築されることを確認した。1.セルトリ細胞、ライディッヒ細胞へのDAX-1の遺伝子導入と遺伝子発現解析:セルトリ細胞株、ライディッヒ細胞株にDAX-1遺伝子導入を行い、変動遺伝子の確認を行った。特にセルトリ細胞株にDAX-1を遺伝子導入した場合、Stem cell factorおよびその受容体であるKITの変動をPCRおよびWestern blottingにて解析してきた、DAX-1がこれら遺伝子制御を行っている可能性を想定し、現在stem cell factorおよびKIT遺伝子の変異マウスを用いて遺伝子発現解析を行っている。2.プロモーターアレイによるAd4BP/SF-1およびDAX-1の標的遺伝子群の同定:発現している遺伝子の転写調節領域には転写開始複合体が結合していることが知られている。この性質を利用して、この複合体のゲノムDNAの結合部位を調べてみると、既知の遺伝子の転写調節領域だけでなく、遺伝子として同定されていない領域にも結合していることが明らかになる。このプロモーターアレイの技術を応用してセルトリ細胞およびライディッヒ細胞におけるAd4BP/SF-1およびDAX-1の標的遺伝子を同定に試みている。今後男子不妊症精巣におけるAd4BP/SF-1およびDAX-1の標的遺伝子の発現解析:正常精巣および男子不妊症精巣における同定標的遺伝子の発現量について定量RT-PCRを用い検討を加える予定である。DAX1は、先天的副腎低形成・性腺機能低下症の原因として同定された転写因子である。先天性DAX1遺伝子異常症の男児では、思春期の二次性徴が欠如しゴナドトロピンと無関係の造精機能障害を呈する。DAX1はライディッヒ細胞とセルトリ細胞に発現するが、ゴナドトロピンと無関係であり精巣独自における機能が注目されている。しかし、DAX1の精子形成に果たす役割は未だ解明されていない。DAX1の機能解明と今後の遺伝子治療を目的に、DAX1の精巣内遺伝子導入の効果を検討した。in vitroにおける検討:DAX1と蛍光タンパクEGFPの両方を発現するアデノウイルスベクターを作製し、ライディッヒ細胞株TM3とセルトリ細胞株TM4に遺伝子導入した。アデノウイルスベクターによりTM3、TM4細胞の核内にDax1遺伝子の導入が可能であった。TM3細胞ではステロイド合成に関わるArom遺伝子、TM4細胞では精子形成細胞の増殖に関わるScf遺伝子の発現が有意に亢進していた。ラット精巣において、精巣間質注入法ではライディッヒ細胞に、精細管内注入法ではセルトリ細胞に、DAX1の強発現を認めた。精子形成細胞へは遺伝子導入されなかった。核内転写因子DAX1は、ライディッヒ細胞ではエストロゲンの合成制御、セルトリ細胞ではSCFの発現制御を行っていると考えられた。思春期以降の精子形成には、セルトリ細胞におけるDAX1の発現が密接に関わっている。

セルトリ細胞でDAX1により発現調節されたSCFが精子形成細胞に存在する受容体(C-KIT)に結合しSCF/C-KITシグナル伝達経路を介することで精子形成を促進している可能性が示唆された。ラット精巣へのアデノウイルスベクター投与では、ライディッヒ細胞もしくはセルトリ細胞選択的に遺伝子導入が可能であった。精子形成細胞へは遺伝子導入を認めなかったことから次世代伝搬性もなく安全性の高い遺伝子導入法と考えられた。補助生殖医療の技術の進歩により、不妊症に対する治療には革命的変化がもたらされた。しかし、補助生殖医療が抱える種々の問題点については、十分に議論されていないのが現状である。現在の男子不妊症における最重要課題は、遺伝子レベルでの詳細な原因の解明と新しい治療の開発にあると思われる。本応募研究では、1男子不妊症の病態解明および2男子不妊症に対する遺伝子治療という二つの到達目標を掲げ研究を行った。本年は最終年度であり、前者の男子不妊症の病態解明の一つとして、プロモーターアレイを用いたゲノムレベルでの転写因子DAX-1とプロモーターの結合特異的解析に研究テーマを絞り、研究を行った。一般的に、発現している遺伝子の転写調節領域には転写開始複合体が結合していることが知られている。この性質を利用して、この複合体のゲノムDNAの結合部位を調べてみると、既知の遺伝子の転写調節領域だけでなく、遺伝子として同定されていない領域にも結合していることが明らかになる。このプロモーターアレイの技術を応用してセルトリ細胞およびライディッヒ細胞におけるDAX-1の標的遺伝子の同定を試みた。しかしながら、両細胞とも本遺伝子の標的遺伝子の同定はうまくいかなかった。おそらく免疫沈降からハイブリダイゼーションまでのプロセスに何らかの問題があるか、プロモーターアレイのシステムに問題があると考え、現在試行錯誤を繰り返しているところである。また、男子不妊症モデル動物を用いて、精子幹細胞が不活性化されていることを見出し、男子不妊症における造精機能障害の一因である可能性が考えられた。セルトリ細胞、ライディッヒ細胞へのDAX-1の遺伝子導入と遺伝子発現解析については標的遺伝子を明らかにし、機能解析もほぼ終了し計画以上の進展を認めるが、プロモーターアレイによるAd4BP/SF-1およびDAX-1の標的遺伝子群の同定については、やや遅れ気味であり、総合的にはおおむね順調に進展していると考えた。24年度が最終年度であるため、記入しない。研究計画がかなり細分化されており、長期にわたる研究であるため、その都度軌道修正する必要があると考えていた。年単位で研究計画を見直し、その都度適切な研究計画を再立案する予定であったが、おおむね順調に進展しているため、予定通り研究を進めたい。