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高地トレーニングに関する基礎研究：化学受容器における神経伝達物質の分子機構

高血圧ラット(SHR)の頚動脈小体(CB)は、正常圧ラット(WKY, NWR)に比べ肥大していた。チロシン水酸化酵素(TH)とドーパミンβ水酸化酵素の免疫活性は、SHRの化学受容細胞で高く、CBの興奮はノルアドレナリンによって抑制的に調節されている。セロトニン(5-HT)は、化学受容細胞内のCa2+濃度([Ca2+]i)に影響を与えなかったが、低酸素暴露ラットでは上昇し、5-HTにより増強された。これらの結果は、5-HTが低酸素感受性を高めることを示す。一方、5-HTは細動脈平滑筋の[Ca2+]iに影響を及ぼさなかったが、毛細血管の周皮細胞では増加させ、阻害剤で抑制された。高血圧状態下では化学受容器(頚動脈小体)における感受性が変化していることが考えられるが、その詳細は明らかにされていない。その一端を解明するために、高血圧動物の頚動脈小体を対象に、ノルアドレナリン合成酵素であるドーパミンβ水酸化酵素(DBH)の発現について免疫組織化学的に検討した。高血圧自然発症ラット(SHR)および対照群ラット(WKY)を潅流固定後に頚動脈小体(CB)を採取し、へマトキシリン(HE)染色およびチロシン水酸化酵素(TH)とドーパミンβ-水酸化酵素(DBH)に対する免疫染色を行った。また、CBにおける両酵素(THとDBH)のタンパク発現量をイムノブロット法により調べた。SHRのCBはWKYのCBに比べ扁平化しており、SHRのCB容積はWKYに比べ有意に増加傾向を示した。イムノブロット法で調べると、SHRとWKY間でTHおよびDBHのシグナル強度は類似しており、カテコールアミン合成酵素のタンパク発現量に顕著な差は認められなかった。THの免疫染色像では、CBの化学受容細胞およびCB周囲に分布する神経線維に陽性反応が認められ、その染色密度はSHRとWKY間で大きな差は認められなかった。DBHの免疫染色像では、SHRのCBには強陽性を示す化学受容細胞が多数認められ、その分布密度はWKYのCBに比べ有意に増加した。SHRにおいてDBH強陽性を示す化学受容細胞はCB内に分散して存在し、細胞質突起を伸ばしていた。また、SHRおよびWKYの両系統において、DBH陽性神経線維が血管および化学受容細胞の周囲に観察された。これらの結果から、高血圧動物の頚動脈小体における化学受容細胞では、ノルアドレナリン合成能が増強していることが示唆された。動脈系化学受容器である頚動脈小体の化学受容活性は、セロトニン(5-HT)によって興奮性に調節されていると考えられている。しかし、頚動脈小体における5-HT関連分子の分布や、頚動脈小体内へ入力する神経線維との関係については不明な点が多い。平成26年度の課題として、頚動脈小体における5-HT関連分子の形態学的基盤を解析することを目的として、RT-PCRおよび免疫組織化学を行った。RT-PCRでは、前頚神経節および頚動脈小体からtotal RNAを抽出し、セロトニン合成酵素(TPH-1、TPH-2)、セロトニン2A(5-HT2A)受容体、セロトニントランスポーター(SERT)のmRNA発現を解析した。また、免疫組織化学では、頚動脈分岐部の凍結切片を作製し、5-HT、TPH-1、SERT、ノルアドレナリン合成酵素(DBH)に対する抗体を用いて免疫染色した。RT-PCRでは、頚動脈小体においてTPH-1、TPH-2、5-HT2A受容体、SERT mRNAの発現が認められた。TPH-1 mRNAと比較して、TPH-2 mRNAは非常に低い発現量を示した。また、前頚神経節においてもTPH-1、TPH-2、SERT mRNAの発現が認められた。免疫組織化学では、化学受容細胞に5-HT、TPH-1、SERT陽性反応が認められた。頚動脈小体内に分布する神経線維では、TPH-1、SERTに対する強い免疫反応性が認められた。また、頚動脈小体内に分布する神経線維で認められたSERT強陽性反応は、DBH陽性反応と共存していた。これらの結果から、5-HTは化学受容活性の増強に関与していることが示唆された。また、頚動脈小体内に分布するTPH-1、SERT陽性の神経線維は、前頚神経節から入力していることが推察された。各種病理学的環境下の化学受容器における酸素および炭酸ガスの受容機構を明らかにするために計画されたものであり、外因性環境変化(高地の低酸素環境)と内因性環境変化(高血圧)の両変化により誘発される化学受容器の動態変化について、特に、神経伝達物質関連分子の発現について分子生物学的手法を駆使して検討を行った。H25年度には、高血圧自然発症ラットの頚動脈小体化学受容細胞におけるドーパミンβ水酸化酵素の免疫反応性について検討し、ノルアドレナリン合成能が増強していることを確認した。H26年度には、頚動脈小体におけるセロトニン関連分子による調節について検討し、化学受容細胞および交感神経線維が5-HTを合成および分泌している可能性を示唆した。最終年度(H27年度)には、化学受容細胞における細胞内Ca2+濃度[Ca2+]iの解析ならびに電気生理学的検討を行った。定常環境下では、5-HTは化学受容細胞内Ca2+濃度に影響を与えなかった。低酸素刺激すると、同一細胞において間歇的な細胞内Ca2+濃度の上昇が認められた。

この上昇は5-HTにより増強し、5-HT2受容体の阻害剤により抑制された。これらの結果から、5-HTは5-HT2受容体を介して化学受容細胞の低酸素感受性を増強していることが推測された。電気生理学的検討では、低酸素ガスを吸入暴露すると、頚部交感神経幹からの神経活動頻度は増加し、頚動脈小体への交感神経系入力は増加していると考えられた。細動脈と毛細血管を分離摘出した標本では、ノルアドレナリンによって細動脈平滑筋において細胞内Ca2+濃度の上昇が確認されたが、5-HTでは変化は認められなかった。一方、毛細血管の標本では、5-HT2受容体阻害剤で抑制された。低酸素状況下で活性化した交感神経は、5-HTを介して頚動脈小体の化学受容機構を間接的に増強している可能性がある。高血圧ラット(SHR)の頚動脈小体(CB)は、正常圧ラット(WKY, NWR)に比べ肥大していた。チロシン水酸化酵素(TH)とドーパミンβ水酸化酵素の免疫活性は、SHRの化学受容細胞で高く、CBの興奮はノルアドレナリンによって抑制的に調節されている。セロトニン(5-HT)は、化学受容細胞内のCa2+濃度([Ca2+]i)に影響を与えなかったが、低酸素暴露ラットでは上昇し、5-HTにより増強された。これらの結果は、5-HTが低酸素感受性を高めることを示す。一方、5-HTは細動脈平滑筋の[Ca2+]iに影響を及ぼさなかったが、毛細血管の周皮細胞では増加させ、阻害剤で抑制された。本研究課題は、化学受容器(頚動脈小体)が各種環境変化(低酸素環境、高血圧症)に対してどのように適応するかを検討することを目的に計画されたものであるが、平成25年度の三次元的解析ならびに各種伝達物質の免疫組織化学的検討をもとにして、平成26年度は、セロトニン(5-HT)関連分子の形態学的基盤を解析することを目的に逆転写ポリメラーゼ連鎖反応(RT-PCR)および免疫組織化学的検討を行った。頚動脈小体で合成される5-HTは化学受容活性の増強に関与していることが示され、今年度の目的は、おおむね達成されたものと考えている。総合領域平成25年度および26年度に得られた結果をもとに、今年度は、頚動脈小体の化学受容細胞内のカルシウム動態に関する検討を行うべく、fura-2を用いた顕微蛍光測光法の準備を進めている。本研究課題は、化学受容器(頚動脈小体)の外因性環境変化(低酸素環境)と内因性環境変化(高血圧症)に対する動態変化を検討することを目的に計画されたものであるが、平成25年度は、高血圧動物の頚動脈小体を対象に、三次元構造解析の後にノルアドレナリン合成酵素や科学受容細胞に対する抗体を使用し免疫組織化学的に検討した。化学受容細胞と神経線維との関係を三次元的に解析することにより、第一段階として目的を達成出来たものと考えている。免疫組織化学、逆転写ポリメラーゼ連鎖反応や細胞内カルシウムの蛍光測光等に使用する試薬は、海外から取り寄せるものが多く、為替レートの関係で試薬価格が変動する。また、研究課題を遂行する過程で購入の必要がなくなった試薬があった。以上の理由で差額が生じた。すでに得られている低酸素環境下における実験結果と比較検討を進める一方、セロトニン合成酵素やその受容体のmRNA発現の解析を試みる。今年度も各種抗体や試薬等を購入予定であるが、価格変動への対応に使用する。
NMDAおよび虚血による緑内障モデルに対するジアゾキサイドの神経保護効果

まず、in vitro研究により、ジアゾキサイド(diazoxide)はラット網膜神経節細胞由来細胞株に対し細胞死の抑制効果があり、この効果はミトコンドリア内膜に存在するATP感受性リウムチャンネルを介していることが確認できた。また、経時的に測定した視覚誘発電位や眼組織標本などを用いたin vitro研究においても、NMDAによる緑内障モデルの神経障害の回復を促進させ、神経保護作用を持つことがウサギおよびサルの両者において示された。背景:ジアゾキサイドはミトコンドリア内膜に存在するATP感受性カリウムチャンネルを開放する薬剤で、心臓などの眼以外の臓器において保護作用を持つことが報告されている。眼科領域ではこれまで、in vitroでの効果が報告されているが、in vivoでの神経保護作用に関する報告はまだない。目的:N-methyl-D-asparate(MDA)硝子体注入による網膜内層障害モデルを用いてジアゾキサイドのin vivoでの神経保護効果について検討した。方法:ジアゾキサイド(200nmol)もしくは溶媒を家兎の硝子体に注入後NMDA(1μmol)を注入し、視機能変化を視覚誘発電位(VEP)と網膜電図(ERG)をNMDA投与の2週後まで測定した。結果:NMDAによりVEP振幅は投与3時間後には基準値の20%程度に減弱するが、ジアゾキサイドの併用により投与1,2週間後にはVEP振幅の回復が促進されるのが確認された。ERGには両群とも有意な変化を認めなかった。結論:ジアゾキサイドはNMDAによる神経障害の回復を促進させ、神経保護作用を持つことが示唆された。<実験2>高眼圧による神経障害モデル背景:高眼圧にともなう虚血による神経障害は緑内障だけでなく硝子体手術後も発生しているが、まだ治療方法が確立されていない。目的:虚血による視神経障害に対するジアゾキサイドの神経保護効果を、術後の障害についても検討するためプレリミナリー実験を行った。方法:家兎に白内障および硝子体手術を行い、術中に高眼圧負荷(80mmHg、30分)をかけた群と手術のみ行った対照群とを比較した。結果:高眼圧負荷群では対照群に比べ有意なVEP潜時の延長と神経節細胞層細胞数の減少がみられた。結論:この実験モデルは術中虚血による術後神経障害モデルとなると考えられた。ジアゾキサイド(diazoxide)の神経保護作用背景:ジアゾキサイドはミトコンドリア内膜に存在するATP感受性カリウムチャンネルを開放する薬剤で、心臓などの眼以外の臓器において保護作用を持つことが報告されている。眼科領城ではこれまでin vitroでの効果が報告されているが、in vivoでの神経保護作用に関する報告はまだない。昨年度の研究で、家兎ヘジアゾキサイドを硝子体注入することによって、N-methyl-D-asparate(NMDA)による神経障害の回復を促進させ、神経保護作用を持つことが示唆された。目的:人により近い、サルを用いて、家兎と同様にN-methyl-D-asparate(NMDA)硝子体注入による網膜内層障害モデルを作成し、ジアゾキサイドのin vivoでの神経保護効果について検討した。方法:ジアゾキサイド(200nmol)もしくは溶媒をサルの硝子体に注入後NMDA(1μmol)を注入し、視機能変化を視覚誘発電位(VEP)と網膜電図(ERG)をNMDA投与の2週に測定した。組織切片を作成し、神経節細胞層の細胞数を比較した。結果:NMDAにより投与2週間後のVEP振幅は減弱するが、ジアゾキサイドの併用によりVEP振幅の回復が促進され、平均振幅は併用しない場合の約1.3倍となった。神経節細胞の細胞数は、正常対照に比べNMDAにより20%以下に減少するが、ジアゾキサイドの併用により30%程度に減少するのみとなった。結論:ジアゾキサイドは家兎だけではなくサルにおいても、NMDAによる神経障害の回復を促進させ、神経保護作用を持つことが示唆された。背景:ジアゾキサイドはミトコンドリア内膜に存在するATP感受性カリウムチャンネルを開放する薬剤で、心臓などにおいて保護作用を持つことが報告されている。一昨年と昨年のわれわれの研究で家兎およびサルで神経保護作用を持つことが示された。目的:ジアゾキサイドの神経保護効果の作用機序を検討した。方法:1.ラット網膜神経節細胞由来細胞株(RGC-5)に対するoxygen glucose deprivation (OGD)誘発綿胞死をWST-8 assayで検討し、ジアゾキサイドの用量依存性を検討した。2. RGC-5のOGD誘発細胞死に対するジアゾキサイドの神経保護効果と、その神経保護効果に対するミトコンドリア内膜に存在するATP感受性カリウムチャンネルを特異的に遮断する5-hydroxydecanoic acid (5HD)の併用の効果をFACS (fluorescence activated cell sorting)(flow cytometory)を用い、annexinとヨウ化プロピジウムで2重染色し、生細胞の%を基準に測定した。

結果: 1.ジアゾキサイドは10μMで有意な細胞死の抑制効果が読められた。2. OGDで67%に低下した生細胞が、ジアゾキサイドで84%に増加し、その効果は5HDにより、69.3%に減少した。結論:ジアゾキサイドの効果はミトコンドリア内膜に存在するATP感受性カリウムチャンネルを介していることが確認できた。さらに全身投与の実験系としてラット視神経挫滅モデルを作成し、挫滅後1週間で生じるRGC lossとcaspase 3, GFAP, Thy-1などの遺伝子を基準にジアゾキサイドの全身投与(腹腔内投与)の効果を現在検討中である。
超低損失電力素子実現に向けた炭化珪素における点欠陥の物性解明と制御法の確立

次世代省エネパワーデバイスとして期待されているSiCデバイスの性能に大きな影響を与える深い準位(点欠陥)の制御法を確立するため、深い準位の起源(である点欠陥)を明らかにすることが本年度の目標であった。そのために、DLTS (Deep Level Transient Spectroscopy)による評価に加えEPR (Electron Paramagnetic Resonance)による評価を行い、両者結果を比較した。ただし、前者は点欠陥の電気的な情報(深い準位の特性)を得ることが可能な測定法であり、後者は点欠陥の原子構造を特定することが可能な測定法である。これまでは、DLTS測定結果とEPR測定結果の比較において以下の二つの問題が存在し、深い準位と点欠陥の定量的な比較は行われてこなかった。一点目は、DLTS測定ではドナー密度より低いトラップ密度が要求されるのに対し、EPR測定では10^<16>cm^<-3>以上の高い欠陥密度が求められる点である。本研究では、異なるドナー密度を有する試料に対し、照射量を変えて電子線照射を行い様々なトラップ密度を有する試料を作製し、DLTSおよびEPR測定結果を比較できる条件を見出した。二点目は、DLTS測定では試料最表面付近のトラップ密度を測定するのに対し、EPR測定では試料全域の点欠陥数の合計を測定する点である。本研究では、機械研磨とDLTS測定を繰り返すことでエピ層全域のZ_<1/2>密度を測定することで、両測定結果の比較を可能にした。両測定の結果、いずれの試料においても、深い準位の中ではZ_<1/2>センターが、点欠陥の中ではV_Cが最も高い密度を示した。さらに、いずれの試料においても、Z_<1/2>密度とV_C密度は一対一に対応することが判明した。以上の結果により、Z_<1/2>センターの起源はV_Cであることが明らかになった。本研究結果は、4H-SiCのライフタイムキラーであり最も重要な深い準位であるZ_<1/2>センターを制御する上で不可欠であり、産業・学術両面にインパクトのある結果であると考える。当初の計画通り、SiC中で最も重要な深い準位(Z_<1/2>センター)の起源を解明することに成功したため。研究最終年度に相応しい結果を得ることができたと考える。省エネルギーに関心が集まる現在、SiC(炭化珪素)は優れた物性値を有するため次世代パワーデバイス材料として注目されているが、SiC結晶中の点欠陥(に起因する深い準位)に関する研究報告は限られている。深い準位はキャリアトラップおよび再結合中心として働き、それぞれ導電率の減少およびキャリア寿命の減少を引き起こす。よって、高性能・低消費電力SiCデバイス実現に向け、SiC中に存在する深い準位を明らかとし、深い準位を制御することが本研究の目的である。以上の目的の下、当該年度は予定通り、デバイスプロセスにより生成される深い準位を解析した。主に、デバイス作製の際に必須であるイオン注入およびRIE(反応性イオンエッチング)について調べた。その結果、両プロセスともに様々な深い準位を生成することが明らかとなった。これらの深い準位の中には非常に高密度なもの(>1×10^<17>cm^<-3>)や生成深さが2μm以上に達しているものも存在し、デバイス性能に大きな影響を与える可能性が示された。特にRIE後の試料ではショットキー容量が極端に小さくなることが判明し、RIEによってSiCを加工する際は注意が必要であることが分かった。以上は、SiCデバイス作製の際に重要となる知見であり、意義深い成果である。本研究ではさらに、上記デバイスプロセスによって生成された深い準位に対して熱酸化が有効であることを明らかとした。また、熱酸化に加え、Ar雰囲気下で高温(>1300°C)アニールを行うことで、ほぼ全ての深い準位を低減できることを示した。以上は、SiC中の深い準位制御を実現する大きな足がかりとなる結果であり、高性能・低消費電力SiCデバイス実現に一歩近づける成果と言える。社会の省エネルギー化が急務となっている現在、SiC(シリコンカーバイド:炭化珪素)は超低損失電力素子を実現する材料として注目されている。しかし、SiC結晶中の欠陥がSiC電力素子を実用化する妨げとなっている。特に、(点欠陥に起因する)深い準位はキャリアトラップおよび再結合中心として働き、素子の導電率およびキャリア寿命を減少させる。本研究の目的は、高性能・低消費電力SiC電力素子実現に向け、SiC結晶中に存在する深い準位を明らかにし制御することである。本年度は特に「熱酸化を用いた深い準位制御法の確立」を目指し、「A熱酸化による深い準位低減のメカニズムを解明すること」および「B熱酸化後の深い準位分布の予測を可能とすること」に挑戦した。その結果、以下に記す方法を用いて、目標A、Bともに達成した。深い準位を低減する方法は、現時点で二つ発見されている。一つは熱酸化、もう一つはCイオンを注入した後に高温でアニールする方法(本報告ではCイオン注入法と呼ぶこととする)である。Cイオン注入法によって深い準位が低減する理由は、「注入されたC原子がアニール中にSiC中に拡散し、深い準位の起源であるC空孔を埋めるためである」と考えられる。目標Aを達成するため、深い準位に対する熱酸化およびCイオン注入法の影響を比較した。

その結果、両試料において同じ種類の深い準位が低減・生成することが分かり、熱酸化においても格子間原子の拡散現象が生じ深い準位が低減している可能性が高いことが明らかになった。目標Bを達成するため、上述のモデルに基づいた拡散方程式を解き、熱酸化後の深い準位の深さ方向分布を予測した。その結果、あらゆる酸化温度・酸化時間・初期の深い準位密度分布において、実測値を再現することに成功した。これにより、プロセス実行前に必要な酸化条件を知ることが可能となり、「熱酸化を用いた深い準位制御法の確立」へ大きく近づいた。次世代省エネパワーデバイスとして期待されているSiCデバイスの性能に大きな影響を与える深い準位(点欠陥)の制御法を確立するため、深い準位の起源(である点欠陥)を明らかにすることが本年度の目標であった。そのために、DLTS (Deep Level Transient Spectroscopy)による評価に加えEPR (Electron Paramagnetic Resonance)による評価を行い、両者結果を比較した。ただし、前者は点欠陥の電気的な情報(深い準位の特性)を得ることが可能な測定法であり、後者は点欠陥の原子構造を特定することが可能な測定法である。これまでは、DLTS測定結果とEPR測定結果の比較において以下の二つの問題が存在し、深い準位と点欠陥の定量的な比較は行われてこなかった。一点目は、DLTS測定ではドナー密度より低いトラップ密度が要求されるのに対し、EPR測定では10^<16>cm^<-3>以上の高い欠陥密度が求められる点である。本研究では、異なるドナー密度を有する試料に対し、照射量を変えて電子線照射を行い様々なトラップ密度を有する試料を作製し、DLTSおよびEPR測定結果を比較できる条件を見出した。二点目は、DLTS測定では試料最表面付近のトラップ密度を測定するのに対し、EPR測定では試料全域の点欠陥数の合計を測定する点である。本研究では、機械研磨とDLTS測定を繰り返すことでエピ層全域のZ_<1/2>密度を測定することで、両測定結果の比較を可能にした。両測定の結果、いずれの試料においても、深い準位の中ではZ_<1/2>センターが、点欠陥の中ではV_Cが最も高い密度を示した。さらに、いずれの試料においても、Z_<1/2>密度とV_C密度は一対一に対応することが判明した。以上の結果により、Z_<1/2>センターの起源はV_Cであることが明らかになった。本研究結果は、4H-SiCのライフタイムキラーであり最も重要な深い準位であるZ_<1/2>センターを制御する上で不可欠であり、産業・学術両面にインパクトのある結果であると考える。本年度の目標は、熱酸化による深い準位低減のメカニズムを解明することであった。その点で、本研究は計画通りに進んでいると言える。当初は申請書で提案した通り三つの手法を用いて解析を進める予定であったが、手法1(同位体制御エビ層を用いたSIMSによる評価)に関しては、要求される純度のSiC原料ガスの入手が不可能であることが判明したため、実験継続を断念した。ただし、その他の二つの手法用いて上記結果を得ることができたため、本件は「熱酸化を用いた深い準位制御法の確立」を達成する上で支障とはならないと考える。当初の計画通り、SiC中で最も重要な深い準位(Z_<1/2>センター)の起源を解明することに成功したため。
石像建造物における各種石材の風化特性とその地球科学的・工学的意義

本研究では、歴史的遺産の保守や耐久性の高い建築物に用いられる石材の耐久性に関する資質評価を行うことを目的としている。劣化原因が塩類によることが多いため、その破壊メカニズムを調べるために、硫酸ナトリウム溶液および硫酸マグネシウム溶液を用いた実験を行った。用いた材料は、大谷石凝灰岩、芦野凝灰岩、インド砂岩、多胡砂岩である。インド砂岩以外は、すべて日本国内の石材であり、広く日本の建物あるいは装飾用石材として使用されているが、近年では採掘量が減り、入手困難な貴重なものもある。各石材の物性(細孔特性、一軸圧縮強度、鉱物分析)と、石材自体の初期吸水能力、硫酸ナトリウムの飽和溶液(20°C)に浸漬させた時の吸収能、および塩吸収量を測定した。塩溶液の供給方法としては、1)石材全体を溶液に浸し、乾湿繰り返し環境下で曝露したもの(CTI : Cyclic Total Immersion Method)、2)石材下部のみを溶液に浸し、乾湿繰り返し環境下で曝露したもの(CPI : Cyclic Partial Immersion Method)、の2種類の方法をとった。乾燥条件としては40°Cあるいは105°C、湿潤条件としては10°Cあるいは20°Cを設定した。各石材を5×5×15cmの角柱に整形した供試体を実験に使用した。実験結果からは、完全浸漬実験では表面近傍にしか破壊が及ばないが、部分浸漬実験では内部から破壊が起こることが立証された。石材耐久性試験のほとんどが完全浸漬試験により評価されるが、この実験結果からはその試験方法が必ずしも正確に耐久性を評価できるものではないことが示された。また、ミラビライト(Na_2SO_4・10H_2O)/テナルダイト(Na_2SO_4)の相変化が破壊の主要因であるという従来の定説に疑問を呈し、十分な期間があればテナルダイトのみが析出する条件でも破壊の程度に差はないことが明らかになった。ほとんどあらゆるパターン(条件)での実験を行い、これまでの評価方法の是非に繋がる成果を得たから。本研究課題としては終了したが、今後は、この実験レベルでの検証結果を実用化できるよう、複数種の物性値をパラメータとした定式を作成すべきと考える。古い時代に造られた大型の石造建築物に対しては、人類共通の遺産であるという観点から、丁寧に保存し修復するという気運がある。しかし、原石材は採石場閉鎖のためもはや利用できないことが多く、代替石材を選定する必要があり、色やテクスチャーを含めた比較可能な物性を持つ石材、風化に対してさらに高い耐久性をもつ石材を適正に評価する仕組みが必要である。本研究では、石造文化財を実際の風化劣化問題から守るための効果的な保存修復方法における重要な情報を提供することを目的として、1)歴史的石造文化財の風化・劣化状況の把握、2)歴史的石造文化財周辺の環境データ(気温や湿度等)と風化・劣化状況との相互関係、3)石材の基本データとしての各種岩石物性の収集と石材の資質評価、について研究を進めている。この達成のために、国内の研究対象地域(国指定史跡「吉見百穴」:埼玉県吉見町)において、劣化の進行速度(壁面後退速度)を推定するためのデータ(温度・湿度などの環境条件、塩類析出状況、崩落物質量)収集を行っている。また、室内実験としては、実際の建設や修復に用いられている石材を入手して、岩石物性に関する詳細データ(化学的性質、鉱物学的性質、物理的性質、力学的性質)を取得し、塩溶液の毛管上昇特性を把握した。本来であれば、平成22年度中に、これらのデータをもとに塩類風化実験を行うところまで予定していたが、東日本大震災の影響で一部の機材の入手が困難になり、実験開始を延期した。実験自体は平成23年度に引き継ぐものの、岩石物性データ(とくに間隙径分布)と毛管特性とは、調和的な結果が得られた。石造文化財を実際の風化劣化問題から守るための効果的な保存修復方法における重要な情報を提供することを目的として、1)歴史的石造文化財の風化・劣化状況の把握-とくに、塩類風化と凍結融解風化の複合作用、2)歴史的石造文化財周辺の環境データ(気温や湿度等)と風化・劣化状況との相互関係、3)石材の基本データとしての各種岩石物性の収集と石材の資質評価、の観点から研究活動をすすめた。1)および2)については、主として硫酸ナトリウムにより顕著な塩類風化が進行しているOrval Abbey(オーバル修道院、ベルギー)の劣化状況を詳細に把握した。実際に現地に赴き、年間継続の環境データと、塩類および、あらたな比較検討材料の人工石材(1900年代初頭に製造のもの)を収集した。これらを持ち帰り、物性測定に供した。3)については、各種の石材試料を入手して物性を測定し、塩溶液の供給方法による劣化程度の相違に着目した塩類風化実験を行った。この実験結果の速報を、2011年10月にキプロスで行われた国際会議SWBSS 2011(International Conference on Salt Weathering of Building Stones and Sculptures)で発表を行った。この実験結果については、その後、多孔体中の溶液の毛管上昇速度にさらに着目して考察をすすめている。この検討をふまえ、論文執筆を行い、国際学術誌への投稿を準備中である。

劣化原因が塩類によることが多いため、その破壊メカニズムを調べるために、硫酸ナトリウム溶液および硫酸マグネシウム溶液を用いた実験を行った。用いた材料は、大谷石凝灰岩、芦野凝灰岩、インド砂岩、多胡砂岩である。インド砂岩以外は、すべて日本国内の石材であり、広く日本の建物あるいは装飾用石材として使用されているが、近年では採掘量が減り、入手困難な貴重なものもある。各石材の物性(細孔特性、一軸圧縮強度、鉱物分析)と、石材自体の初期吸水能力、硫酸ナトリウムの飽和溶液(20°C)に浸漬させた時の吸収能、および塩吸収量を測定した。塩溶液の供給方法としては、1)石材全体を溶液に浸し、乾湿繰り返し環境下で曝露したもの(CTI : Cyclic Total Immersion Method)、2)石材下部のみを溶液に浸し、乾湿繰り返し環境下で曝露したもの(CPI : Cyclic Partial Immersion Method)、の2種類の方法をとった。乾燥条件としては40°Cあるいは105°C、湿潤条件としては10°Cあるいは20°Cを設定した。各石材を5×5×15cmの角柱に整形した供試体を実験に使用した。実験結果からは、完全浸漬実験では表面近傍にしか破壊が及ばないが、部分浸漬実験では内部から破壊が起こることが立証された。石材耐久性試験のほとんどが完全浸漬試験により評価されるが、この実験結果からはその試験方法が必ずしも正確に耐久性を評価できるものではないことが示された。また、ミラビライト(Na_2SO_4・10H_2O)/テナルダイト(Na_2SO_4)の相変化が破壊の主要因であるという従来の定説に疑問を呈し、十分な期間があればテナルダイトのみが析出する条件でも破壊の程度に差はないことが明らかになった。研究目的に沿って実験を行うとともに、現地での調査でも順調にデータを取得できたため。ほとんどあらゆるパターン(条件)での実験を行い、これまでの評価方法の是非に繋がる成果を得たから。本年度は、研究最終年度であるため、これまでに得られたデータの解析・考察をすすめ、学会発表を行う。また、論文執筆も行う。本研究課題としては終了したが、今後は、この実験レベルでの検証結果を実用化できるよう、複数種の物性値をパラメータとした定式を作成すべきと考える。
肝炎ウイルスによる代謝修飾・炎症による肝発がんとその予防

C型肝炎ウイルス(HCV)感染では持続的炎症が発がん率を高める。しかし、HCV感染による持続的炎症の機構には不明な点が多い。本研究では炎症惹起に重要な働きをするサイトカインの産生がHCVによりどのように制御されているか、また、HCV感染のどのような環境下においてこれらのサイトカインが産生されるかを明らかにする目的で研究を行った。その結果、HCV感染においては既に報告されている免疫担当細胞以外に、HCV感染肝実質細胞と星細胞とのクロストーク、炎症状態で惹起されるAPOBEC1によるサイトカイン産生変化等が存在する事を見いだし、これらが持続感染状態における炎症の維持に寄与する可能性を明らかにした。C型肝炎ウイルス(HCV)感染による肝疾患、肝がんの発症には細胞の脂肪代謝変化が重要な働きをしていると考えられる。HCV感染細胞で脂肪代謝変化が生じる理由について解析をすすめ、(1)HCVのコア蛋白質依存的に脂肪滴の増加が観察される事、(2)細胞外へのHCV粒子放出の際に、リポ蛋白質構成成分と会合することなどから、肝細胞のリポ蛋白質の分泌系を利用することなどが明らかになった。感染細胞内での脂肪滴の機能やウイルス粒子とリポ蛋白質との会合は、ウイルス増殖にとって必須の事象である。つまり脂肪代謝変化は、感染してウイルスが増殖するために必要な環境を細胞内に構築するための手段であると考えられた。脂肪代謝系の変化とHCV増殖との関連性をさらに深めるために、リポ蛋白質の構成成分のひとつであるApolipoprotein E (ApoE)がウイルス複製に果たす役割を調べた。ApoE遺伝子には3種類のアイソフォーム(ApoE2, E3, E4,これらの中でApoE3が人口の80%を占め、ApoE2,E4はそれぞれ5%をしめる)が知られている。ApoEノックダウン細胞からは感染性粒子の産生は著しく抑制された。この細胞に外来的にApoE3あるいはApoE4を導入すると感染性粒子産生は回復した。一方、ApoE2を導入した細胞からのHCV産生は著しく阻害された。この事から、HCVの生活環にApoEが重要な働きを持つ事が明らかになった。ApoE2はlow density lipoprotein receptor (LDLR)との親和性が低いので、HCVの感染にはLDLRを介した細胞への吸着反応が重要である可能性が示唆された。ApoEはVLDL,HDLなどの構成成分のひとつであり、脂肪輸送に重要な働きをする。一方、HCVがApoEと会合する事により感染性を獲得している事を考えると、細胞外の放出されたウイルスはリポ蛋白質と一部類似の挙動を取りうるとも考えられ、この事が脂肪代謝変化をもたらす原因のひとつになりうる。HCV感染は細胞内の脂肪代謝を変化させる事を、ウイルス蛋白質による脂肪代謝の活性化と細胞から放出される脂肪輸送系の変化との関連で解析した。これらの変化が感染細胞の脂肪代謝を変化させ、脂肪肝の様な肝発がんの危険要因になる疾患の発症と関連すると考えられる。これらの脂肪代謝変化は、ウイルスの増殖に重要である。細胞内に蓄積した脂肪滴周辺でウイルス粒子の集合がおこり、それが小胞体、ゴルジを経由して細胞外に放出される。さらに粒子が放出されるときに、細胞の脂肪輸送経路が必要であり、放出された粒子はリポ蛋白質と複合体を形成している。ウイルス粒子と複合体を形成するリポ蛋白質の成分のアポリポ蛋白質E(ApoE)はウイルスが感染する際の細胞表面に存在する受容体への吸着に必要であり、ApoEが存在しないと感染は成立しない。HCVが細胞に吸着する際に、リポ蛋白質受容体(LDLR,SR-BP1等)がウイルスの受容体として働くが、効率よい吸着には両者が存在する事が必要である事を示唆する結果を得た。HCV感染や細胞へのストレス等の負荷により産生される遺伝子編集酵素の中で、APOBEC1が増えることを見いだした。他の研究者が、ApoB48がHCVと会合するという報告を出している等から、HCV感染細胞におけるAPOBEC1の意義を調べたが、HCV自身はAPOBEC1の遺伝子発現を活性化しない。しかし、HCV感染細胞ではAPOBEC1 mRNAの減衰が抑制されていることを見いだした。これらの事から、HCV感染によるAPOBEC1の細胞内の量的変化が推測されたが、発現が低いために蛋白質量を測定するには至っていない。APOBEC1は生理的には小腸で産生され、ApoB100からApoB48への変換を行う事が知られている。また、動物実験から、APOBEC1の異所性発現はがん化を促進する事が知られている。

その機構は不明であるが、APOBEC1の生理的な働きを明らかにする事は、HCV感染による肝発がんの解明に寄与すると考えられる。C型肝炎ウイルス(HCV)感染は慢性肝炎を効率に誘導し、それを背景にして肝がん発症率が高くなる。炎症の過程で傷害の度合いが高いほど発がん率も高くなるといわれている。感染による持続的な炎症の継続ががん化への負のスパイラルを形成する。HCV感染による炎症性サイトカインは、種々の方法で誘導される事が明らかになりつつある。これまでにHCV感染肝細胞と星細胞とのクロストークにより感染肝細胞からMIP1betaが誘導される事を明らかにした。さらに詳細に解析を進め、MIP1beta以外にIL-6, IL-8, CXCL2, CXCL1, MIP1alpha等も誘導される事が分かり、クロストークによる各種サイトカイン、ケモカインの誘導産生が生理的に重要な働きをしている可能性が考えられた。また、ある種のがん組織や慢性炎症組織においては本来分化した小腸においてのみ発現が見られるApobec1(Apo1)が異所性に産生する。この異所性に発現するApo1の意義を解析している過程で、Apo1が種々のサイトカインやケモカインmRNAと会合する事を見いだした。特にある種の肝細胞ではIL-8 mRNAとの会合が高く、IL8産生向上に関与していた。Apo1とIL-8 mRNAとの会合は細胞特異的であり、それにはApo1と会合する別の蛋白性因子の存在が必要である結果を得た。このようにHCV感染による炎症を誘導し、維持させるのに必要なサイトカイン類の産生誘導は肝組織内の免疫関連細胞によるものの他に、多彩な機構が存在する事が明らかになり、それが発がんスパイラルを亢進する可能性が考えられる。C型肝炎ウイルス(HCV)感染は慢性肝炎を引き起こし、それが肝がん発症の危険要因になっている。その過程で、肝傷害の程度が高いほど発がん率も高くなる。肝傷害が炎症により引き起こされるので、感染による持続的な炎症の継続ががん化への負のスパイラルを形成する。これまでに、HCV感染が炎症性サイトカインを誘導することが報告されているが、それは主として感染細胞におけるウイルスタンパク質の働きによる場合が多い,一方肝臓は肝実質細胞のほかに肝組織を維持する他の細胞も含む集団で構成されている。慢性肝炎が持続すると肝の線維化が生じて次第に悪性化する。これには肝星細胞が関与するので、感染による実質細胞の変化を星細胞が感知する微小環境が存在すると考えられる。事実肝実質細胞と星細胞はお互いに細胞の一部分を通して接触して存在する。そこで、感染細胞と星細胞の間にどのような細胞間コミュニケーションが存在するかを、培養細胞を用いて解析した。HCVに感染したヒト肝細胞と不死化したヒト星細胞を混合培養すると、炎症性サイトカインの一つであるMIP1betaなどの産生が増加した。非感染細胞と混合培養しても本サイトカインの発現誘導は見られない。この現象を詳細に解析した結果、星細胞から放出されるIL-lalphaにより肝細胞内でのMIP1betaなどの炎症性サイトカイン産生が誘導されることが分かった。それが感染細胞ではC/EBP1の発現が亢進する結果であることも明らかになった。
高専におけるLSI設計教育高度化に向けた調査研究

最近、大学・高専等の教育機関におけるLSI設計教育の充実・高度化の必要性が広く認識されるようになり、東京大学に、全国共同利用を目的とした大規模集積システム設計教育研究センターが設置された。その成果も着実に上がっている。しかしながら高専においては経験の不足から実際にLSI設計教育が行われているところは極少数である。本研究では、高専におけるLSI設計教育の高度化を推進するために、高専のLSI設計教育の現状を調査するとともに、高専の教官と既に経験のある大学の教官が議論を交わすことにより、今後高専におけるLSI設計教育を推進する上での指針を得ることを目的とした。まず、各高専におけるLSI教育の現状とLSI教育の重要性に対する意識調査、またどのようなLSI設計教育が望ましいか、などについての調査を行った。その結果、LSI教育に対する重要性の認識は極めて高いことが明らかとなった。現状の意識としては、ASIC設計レベルの本格的なものよりも、比較的取り組みやすいFPGAを用いた設計に対して、強い関心があることも明らかとなった。また、高専におけるLSI設計教育を支援するネットワーク作りに対しても強い関心があることがわかった。このようなアンケート調査結果の公開、高専におけるLSI設計支援のネットワーク作りを進めることを目的として、平成11年2月12日から13日にかけて、「高専におけるLSI設計教育高度化」研究会を開催した。高専で既にLSI教育に取り組まれている教官からの実施例の講演、LSI設計に関して経験の豊富な3大学からの講演、豊橋技術科学大学と高専が共同で実施しているLSI設計教材作成のプロジェクトの報告、アンケート調査結果の報告及びこれに基づく討論を実施した。当初予定していた人数の約2倍の参加者があり、高専におけるLSI教育に対する関心の高さをうかがい知ることが出来た。
制御性分泌における液胞型プロトン・ポンプの役割と分子機構

細胞外刺激存在下に神経伝達物、ホルモン、酵素等の活性物質を貯留小胞や分泌性リソソームから開口放出する制御性分泌は、高等生物が持つ高次生命機能の発現に密接的に関与する。制御性分泌の機能異常が多くの疾患を引き起こすことが最近明らかになってきた。本研究は、貯留小胞や分泌リソソーム内部の酸性pHが制御性分泌における役割およびその分子機構に着目し、酸性pHの形成が制御性分泌における役割および分子機構を明らかにすることを目的とする。研究代表者が貯留小胞や分泌性リソソームに局在する液胞型プロトン・ポンプV-ATPaseが同じイソフォーム構成を持つことを明らかにした。貯留小胞や分泌性リソソームに特異的に局在するa3サブユニット・イソフォームに着目し、a3サブユニット欠損変異マウス(oc/oc)を用い、(1)インスリン分泌β細胞の貯留小胞の形態;(2)糖負荷におけるインスリン分泌;(3)欠損マウス由来の膵島を用いたin vitro分泌について詳細に解析を行い、a3サブユニット・イソフォームを持つV-ATPaseが貯留小胞の分泌に必須であることを証明した。さらに、V-ATPaseサブユニット・イソフォームa3とpH感受性型緑色蛍光タンパク質(GFP)との融合タンパクのノックイン・マウスの作出に成功した。オルガネラ膜輸送および酸性pHをGFPのみならず、個体レベルで酸性コンパートメントを可視化し、プロトンの動態を追跡する系を構築した。貯留小胞や分泌性リソソームに特異的に局在するa3サブユニット・イソフォームに着目し、a3サブユニット欠損変異マウス(oc/oc)を用い、(1)インスリン分泌β細胞の貯留小胞の形態;(2)糖付加にインスリン分泌;(3)欠損マウス由来の膵島を用いたin vitro分泌について詳細に解析を行い、a3サブユニット・イソフォームを持つV-ATPaseが貯留小胞の分泌に必須であることを証明した。
エネルギーバランスにおける弓状核GABABシステムの機能解析

Cre-loxPシステムを用いてPOMCニューロン特異的にGABA_Bレセプターをノックアウトしたマウスを作成した。本マウスに高脂肪食を生後4週から12週間投与したところ、野生型マウスと比較して副睾丸周囲の白色脂肪が増加し、体重も有意に増加した。さらに血中インスリンおよびレプチンもノックアウトにおいて野生型マウスと比較して高値を示した。以上よりPOMCニューロンのGABA_Bレセプターを介したシグナルは肥満の発症・進展を抑制するのに重要な役割を果たしていることが示唆された。我々はこれまでに(1)GABA_Bアゴニストであるバクロフェンを肥満モデル動物であるdb/dbマウスやdiet-induced obesity (DIO)マウスに末梢投与すると視床下部弓状核におけるneuropeptide Y (NPY)の発現が抑制されるとともにproopiomelanocortin (POMC)の発現が増強すること、また(2)バクロフェンがdb/dbマウスやDIOマウスの摂食量および体重を減少させることを確認している。これらの結果は視床下部弓状核においてGABA_Bシステムがエネルギーバランスの調節を行っている可能性を示唆している。本研究では視床下部弓状核におけるGABA_Bシステムの機能をより明らかにすることを目的とし、NPYニューロンおよびPOMCニューロン特異的なGABA_Bレセプターノックアウトマウスを作成してその表現型を解析する。具体的にはGABA_Bレセプターのノックインマウス(GABA_B^<loxp>マウス)と、NPYまたはPOMCニューロン特異的にCreレコンビナーゼ(Cre)が発現するトランスジェニックマウスを交配してニューロン特異的なGABA_Bレセプターノックアウトマウスを作成する。GABA_B^<loxp>マウスはスイスのバーセル大学から譲渡してもらい、C57/BL6マウスとのbackcrossにより現在N4の段階まで至っている。POMC-CreマウスはJackson labから購入してC57/BL6マウスとのbackcrossにより現在N2の段階まで至っている。またAGRP-Creマウスは神戸大学から譲渡してもらい、まもなくC57/BL6マウスとのbackcrossを開始する予定である。本研究では視床下部弓状核に存在するGABA_Bシステムのエネルギーバランスにおける役割をより明らかにすることを目的とし、NPYニューロンおよびPOMCニューロン特異的なGABA_Bレセプターノックアウトマウスを作成してその表現型を解析する。スイスのバーセル大学から譲渡してもらったGABA_Bレセプターのノックインマウス(GABA_B^<flox>マウス)およびJackson labから購入したPOMCニューロン特異的にCreレコンビナーゼ(Cre)が発現するトランスジェニックマウス(POMC-Creマウス)に関しては、それぞれ第5世代までC57/BL6マウスとのbackcrossが終了し、両者のmatingを開始した。一方、NPYニューロン特異的にCreを発現するAGRP-Creマウスは同じくJackson labから購入し、現在第4世代までC57/BL6マウスとのbackcrossを終了した。GABA_B^<flox>マウスとPOMC-Creマウスとのmatingから生まれたマウスに関しては各臓器から抽出したDNAを用いて、POMCが発現する視床下部、下垂体および脳幹部においてのみGABABレセプターがノックアウトされていることを確認した。またGABA_B^<flox>マウスとPOMC-Creマウスとのmatingにおいて、germ lineの段階でrecombinationが生じて全身のGABABレセプターノックアウトマウスが産まれてしまうことは稀であることも確認された。まもなくPOMCニューロン特異的なGABABレセプターノックアウトマウスのhomozygote、heterozygoteに高脂肪食を与えて、体重を初めとしたエネルギーバランスの指標の変化を野生型マウスと比較検討する予定である。視床下部のGABA_Bシステムがエネルギーバランスにおいて重要な役割を果たしている可能性が示唆されているが、視床下部弓状核のPOMCニューロンにおけるGABA_Bレセプターの機能は十分には解明されていない。本研究ではloxP配列によりはさまれたGABA_Bレセプター遺伝子のノックインマウス(GIBA_B^<loxp>マウス)と、POMCニューロン特異的にCreレコンビナーゼ(Cre)が発現するトランスジェニックマウス(POMC-Creトランスジェニックマウス)を交配することにより得られたPOMCニューロン特異的なGABA_Bレセプターノックアウトマウスホモ接合型、ヘテロ接合型および野生型マウスの表現型の解析を行った。いずれのマウスも4週齢以降16週齢まで高脂肪食を投与した。雄ではホモ接合型マウスの体重が野生型マウスに比較して8週齢以降16週齢まで有意に高値を示した。16週齢の雄ではホモ接合型マウスの副睾丸周囲の白色脂肪重量が野生型マウスに比較して有意に高値を示した。

8週齢の雄において午前9時に採血した随時血糖値は各群間で有意な差を認めなったが、ホモ接合型マウスの血中インスリン値が野生型マウスに比較して有意に高値を示した。また16週齢雄のホモ接合型マウスの血中レプチン値が野生型マウスに比較して高値の傾向を示した。一方雌では野生型、ヘテロ接合型およびホモ接合型マウスのいずれの群間においても表現型に有意な差を認めなかった。GABA_Bレセプターをニューロン特異的にノックアウトするに成功したのは我々が最初であり、今回の解析結果よりPOMCニューロンのGABA_Bレセプターを介したシグナルは肥満の発症・進展を抑制するのに重要な役割を果たしていることが示唆された。
原因不明なメンデル遺伝疾患のRNAシークエンス解析による責任遺伝子の同定

疾患責任遺伝子のイントロン領域に変異が認められているKabuki syndrome、2症例に対して、RNAシークエンス解析(RNA-Seq)を行った。得られたfastqデータを用いて、1.FastQC(version 0.11.7)によるクオリティーチェック、2.Trimmomatic(version 0.36)によるトリミング、3.再度FastQC(version 0.11.7)によるクオリティーチェック、4.Hisat2(version 2.1.0)によるreferenceゲノムへのマッピングを行った。その後、Integrative Genomics Viewerを用いて、スプライス異常の転写産物が検出された。さらにRNAよりRT-PCRを行い、スプライシング異常の確認を行った。2019年4月に所属機関の変更があり、実験機器の移動等が生じたため。現在は再開している。引き続き、疾患責任遺伝子のイントロン領域に変異が認められている、新たな症例に対してRNA-Seqを行い、既知責任遺伝子のスプライス異常、および発現量の変動を確認する。これらのいずれかが確認された場合には、当該検体の全領域のゲノム配列をサンガーシークエンスにかけることにより、エクソン以外の領域における配列の変化の有無を確認する。2005年に次世代シークエンサー(NGS)が市場に初めて登場し、2006年にNGSを用いて全ヒトゲノム配列の解読、2010年には世界で初めてメンデル遺伝性疾患の1種であるMiller症候群の3家系を対象に、エクソンキャプチャー法と次世代シークエンス技術を組み合わせた、全エクソームシークエンス解析(WES)により責任遺伝子の単離がなされた。以来、多くのメンデル遺伝性疾患の責任遺伝子がWESにて同定されている。しかし、疾患責任遺伝子と表現型の相関が明らかである孤発例の遺伝疾患を対象に、WESを行いエクソン領域内の変異を隈無く解析しても、既知責任遺伝子内のエクソン領域上には病的な変異が認められない症例や、常染色体劣性遺伝病において2つ存在するはずである遺伝子座の変異が、片方の遺伝子座にしか認められないといった症例が少なからず存在している。その場合、WESでは解析することが不可能なノンコーディング領域(エクソンから離れたイントロン領域、転写調節領域など)の変異によるスプライス異常、あるいは遺伝子発現量の異常が疑われる。本研究では、RNAを用いて網羅的RNAシークエンス解析(RNA-Seq)を行うことにより、イントロンリテンション(スプライシングの際に、全てのイントロンが除去されずに特定のイントロンが残されたままになること)や、エクソンスキッピング(エクソンが読み飛ばされること)をともなうスプライス異常の高感度検出、あるいは発現アレイやリアルタイムPCRのような一部分の遺伝子の発現量でなく、遺伝子全体にわたる発現を定量的に測定することを目的とする。まずはポジティブコントロールを用いてRNA-Seqの解析系の確立を行った。疾患責任遺伝子のイントロン領域に変異が認められている患者由来のRNAを用いてキャプチャー後、RNA-Seqを行い、スプライス異常の転写産物の検出を行なった。疾患責任遺伝子のイントロン領域に変異が認められている症例に対して、RNAシークエンス解析(RNA-Seq)を行った。得られたfastqデータをRNA-SeqのマッピングツールであるSTARにてマッピングを行い、Integrative Genomics Viewerにてスプライス異常の転写産物の検出を行なったが、3'UTRのcoverageが異常に高く出ていることが確認されたことから、再度ライブラリーの作成を行っている。そのため当初の予定よりやや遅れている。現在は再開している。引き続き、疾患責任遺伝子のイントロン領域に変異が認められている症例に対して、RNAシークエンス解析(RNA-Seq)を行い、異常転写産物が検出可能かどうか検討する。それが確認されれば、既知責任遺伝子のエクソン内に病的な変異を認めない症例に対して、RNA-Seqを行い、既知責任遺伝子のスプライス異常、および発現量の変動を確認する。理由:当初予期していなかった実験上での遅れが生じたため。使用計画:研究を遂行するための消耗品費、学会参加のための旅費に使用する予定である。
個体差の発現機序に関する行動遺伝学的・生理生化学的・生態学的研究

行動における個体差の発現機序を知るために、藤田が選択交配により作ってきたTsukuba高・低情動系ラット(いずれも近交系)とそれ以外の近交系またはクロ-ズド・コロニ-系である6系統のラット、および2系統の近交系マウスを用いて、実験室における行動遺伝学的・生理生化学的研究と野外フィ-ルドにおける生態学的研究を行を行なった。1. Tsukuba高・低情動、F344、Donryu、LongーEvans,SpragueーDawley、WistarーLamihci系ラットについて、嫌悪性の異なる3種類の新奇場面(ランウェイ、オ-ブン・フィ-ルド、I迷路)における行動比較を行なった結果、遺伝に基づく明白な系統差が3場面に一貫して得られた。2. Tsukuba高・低情報、F344、LongーEvans、Wistarーlmamichi系ラットに、ランナウェイ・テストを10日間連続して課すことで、活動性と情動性の関連を検討した。主成分分析の結果、活動性と情動性の因子が抽出され、さらにLongーEvans系はこの点で特異的であることが分かった。3. 2系統のラット(WistarーImamichi、F344)と2系統のマウス(BALB、C57BL)の、オ-ブン・フィ-ルド(強制場面)と、シェルタ-付オ-ブン・フィ-ルド(自由場面)における行動を比較した結果、ラットではシェルタ-は不安を低下させたが、マウスではそれを回避する傾向(シェルタ-・フォビア)が見られた。4. Tsukuba高・低情動、Wistarーlmamichi、LongーEvans系ラットを、別の野外フィ-ルドに投入して、餌制限条件下で自然繁殖にまかせた。餌制限無しの場合と異なり、高情動系でも給餌時刻には地上に出て、しかも、金網に登って給餌者を待つという行動が見られるようになった。5. Wistarーlmamichi系ラットの採餌行動に及ぼす餌の大きさ・採餌距離の影響を、実験室場面と野外フィ-ルドにおいて検討した結果、採餌行動は少なくともこれらの要因によって規定されることが分かった。1.大型野外人工フィ-ルドの改修および小型フィ-ルド新設の工事を行った。2.Tsukuba情動系ラットとWistar系・F344系ラット3系統のラットの情動反応をランウェイ、オ-プン・フィ-ルド、I型直線走路の3場面において検討した。結果は情動反応にはすくみ反応と逃避反応があり、THE系はすくみ反応が優位であり、F344系では逃避反応優位が優位であることが確認された。3.第35世代以降は5世代ごとに選択交配され、他の世代には兄妹交配によって維持されているTsukuba情動系ラットと、同じく35世代を親として野外人工フィ-ルドで自然繁殖してきたTsukuba情動系ラットの情動反応性の変化を4年間にわたって追跡した。結果は実験室集団、野外集団とも親世代の情動反応性を維持していること、また選択交配停止後実験室集団に見られた両系得点の歩み寄りは交配事故によるコンタミネ-ションによるものではないことが確認された。4.電気泳動により高低2系のTsukuba情動系ラットの生化学的遺伝標識について検討したところ2系はエステラ-ゼなどにおいて多型を示しており、3つの遺伝マ-カ-が見いだされた。