hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
抗ラジカル型抗炎症剤XO阻害剤AHPPの新しいSMA-ミセル化剤の研究

我々は既にAHPPがXOの強力な阻害剤を見出しているが、水難溶性であること、低分子であるために体外排泄が急速で、EPR効果を示さないことが医薬品化のバリヤーであった。そこで本研究ではこれらの問題を解決するため、AHPPのPEG(ポリエチレングリコール)共有結合体(PEG-AHPP)あるいはスチレンマレイン酸コポリマー(SMA)を用いたSMAの非共有結合抱合ミセル体(SMA-AHPP)を作成した。その結果(1)In vitroでのXO阻害活性はfreeのAHPPに比べ、PEG-AHPPおよびSMA-AHPPは80%程度であった。(2)In vivoのXO阻害活性はラット肝の虚血再環流(I/R)モデルを用いて行ったところ、薬物非投与群に比べ、充分な細胞傷害作用の抑制をみた。(3)また、本態性高血圧ラット(SHR)を用いた試験では静脈内および経口投与の何れにおいても、平均正常血圧への降下作用を示した。(4)経口投与の場合でも、1回の投与でもその作用は24時間以上持続した。我々が見出したキサンチンオキシダーゼ(XO)の新規阻害剤AHPP[4-アミノ-6-ヒドロキシピラゾロ[3, 4-d]ピリミジン(AHPP)は、これまで知られているアロプリノールに比べ、酵素阻害特性の上から、明らかに優れた薬効を示したが、水に難溶性であったため、そのままでは注射投与が困難で、正確なファマコキネティック上のデータの取得が困難であった。本研究の目的は、その薬理学的な諸問題(例えば溶解度など)をDDSの手法で解決しようとするものである。その溶解度の問題は、シンプルな両親媒性のポリマー結合体、あるいはSMAミセル包合体などの高分子型薬剤を作成することによって解決した。PEG化AHPPの合成:縮合反応のための活性化エステルの合成は、まず5.0gのPEGと、3.0gのp-ニトロフェニール・クロロフォーメイトを50mLのテトラヒドロフラン(THF)に溶かし、さらにトリエチルアミンを0.29g添加し、2430時間室温で攪拌下に反応させる。次に、トリエチルアミンの塩酸塩が析出、これをろ過して除去。この濾液に対し、300mLのエチルエーテルを加え、沈殿物を生じさせ、分取し洗浄、この沈殿物を約50mLのTHFにとかし、このTHF溶液にエチルエーテルを加え、両溶媒の混液より活性化PEG-p-ニトロ-クロロフォーメイト化物の析出標品を得た。この活性化PEG1.0gを、20mLのTHFにとかし、これにAHPPの0.1M NaOH溶液(0.5g/25mL 0.1M NaOH)を加えて反応させ、THF可溶化物を得た。これがPEG化AHPPである。このPEG-AHPPは先天性高血圧ラット(SHR)において降圧効果を示した。非観血的にラット血圧測定装置により、in vivo降血圧効果を示した。PEG-AHPPまたはSMA-AHPPを経静脈、または経口投与し、SHRラットの血圧降下を3日間にわたり確認した。以上の結果はPEG-AHPPが新しいXO阻害剤による第5の降圧剤になる可能性を示唆した。我々は以前、AHPPにはキサンチンオキシダーゼ(XO)の阻害作用があることを見出した。XO阻害剤AHPPにより、XOによって生成される活性酸素(O_2-)が抑えられると、血管弛緩作用を有するNOとそのXO由来のO_2-との反応が抑えられる。即ち、NOの消費を抑える結果となり、そのNOが血管内皮に作用して血圧の低下をもたらし、抗高血圧作用があることを報告した(J.Cont.Release 2009,135,211-217)。今回の研究は、XOによるO_2-生成が炎症の1つの要因と考え、この阻害剤AHPPを高分子ミセル化することにより体内でのt_1/2を延長し、腫瘍部や炎症部へAHPPのミセル剤を集中させ、炎症性のO_2-の生成を抑え、抗炎症作用を発揮する薬剤を目指し、SMA-AHPPミセル化剤、AHPPのPEG化物を作成した。これらは両者ともミセルを形成し、ラット肝の虚血再灌流モデルにおける肝障害を抑制することを確認した。これらは文献Fang et al,Exp.Biol.and Med.available online,2010を中心に報告している。

また、SMA-AHPPは体内に投与するとアルブミンに結合するため、t_<1/2>はもとのAHPPに比べ延長されることが予想された。これらAHPPのミセルはラットの30分虚血後再灌流モデルにおける肝障害は血中肝酵素GOT、GPT、ALT、ALPで評価し、さらに腎機能の指標の尿素窒素およびクレアチニンレベルの上昇を著明に抑えることを明らかにした。このものは手術時の虚血性再灌流組織障害の予防への応用展開が可能になると考えられる。我々は体内で生ずるスーパーオキサイドアニオンラジカル(O_2^-)が感染、炎症、さらには虚血再環流時などでの生体組織傷害の重要な要因であり、そのO_2^-の多くはその産生酵素のキサンチンオキシダーゼ(XO)の誘導とその活性に起因することを明らかにしている。そこで、このXOの阻害剤を用いて医薬にする可能性を追及した。既にAHPP(4-アミノ-6-ヒドロキシピラゾロ-3,4-ピリミジン[AHPP])がXOの強力な阻害剤を見出しているが、この医薬品化における困難性はAHPPの水難溶性であることと、低分子であるために体外排泄が急速で、作用時間が短すぎ、これまた実用化のバリヤーであった。これらの目的を解決するため、AHPPのPEG(ポリエチレングリコール)共有結合体(PEG-AHPP)あるいはスチレンマレイン酸コポリマー(SMA)を用いたSMAの非共有結合抱合ミセル体(SMA-AHPP)を作成した。その結果として(1)In vitroでのXO阻害活性はfreeのAHPPに比べ、PEG-AHPPおよびSMA-AHPPは80%程度あり、満足すべきものであった。(2)In vivoのXO阻害活性はラット肝の虚血再環流(I/R)モデルを用いて行ったところ、薬物非投与群に比べ、充分な細胞傷害作用の抑制をみた。(3)また、本態性高血圧ラット(SHR)を用いた試験では静脈内および経口投与の何れにおいても、平均正常血圧への降下作用を示した。(4)経口投与の場合でも、1回の投与でもその作用は24時間以上持続した。今後は、とくにeNOSによるNO放出はAHPPによるXOの阻害によりO_2^-の産生が抑制され、NOの血管拡張作用が向上するので、AHPP-ArgのようなNO産生成分を含有する高分Fミセル化化合物を用いれば、よりAHPPの作用を増幅することが考えられる。
NOD-scidマウスを用いた嚢虫症ワクチン候補遺伝子のスクリーニング系の確立

嚢虫症はもっとも難治性な人獣共通寄生虫症の一つであり、アジア、アフリカ諸国を中心に世界規模でその流行が拡大してきている。しかし嚢虫症の原因である有鉤条虫は、人以外の終宿主がいないこと、虫卵がきわめて危険なこと、中間宿主がブタであることなどからワクチン開発の試みは極めて限定されている。研究代表者はこれまで、ネコ条虫-ラットのモデル系を使って、嚢虫症のDNAワクチン開発のための新しい戦略を検討してきた。その結果、ライブラリーワクチンの手法により、嚢虫症に有効なDNAワクチンの開発が可能であることが示唆された。しかし実際にDNAワクチンとして有効な遺伝子を特定するためには、膨大な候補遺伝子から何らかの方法で有効な遺伝子を選抜することが必要である。ブタを用いた遺伝子のスクリーニングには、取り扱い、コスト、安全面で大いに問題がある。そこで、有効嚢虫症の唯一の実験モデルであるNOD-Scidマウスを用いて、ワクチン候捕遺伝子のスクリーニング系を確立することが本研究の目的である。平成17年度までに作製したライブラリーの性状について検討した結果、ワクチンとして使用するには不十分であることが判明した。そこで最終年度になってから、再度ネコ条虫のオンコスフェアからmRNAを抽出し、5'および3'Raceのキットを使用した完全長cDNAライブラリーを作製した。作製したライブラリーには既知のテニア科条虫防御抗原のホモログや未知の蛋白質の遺伝子を含んでおり、ライブラリーワクチンとして使用できるものと考えられた。そこで、有効嚢虫症の唯一の実験モデルであるNOD-Scidマウスを用いて、ワクチン候補遺伝子のスクリーニング系を確立することが本研究の目的である。今年度は、これまでの研究で作成したプラスミドDNAをグループ化したのちマウスに注射し、免疫血清の作成を試みた。ウェスタンブロットによりネコ条虫のシスティセルクスに対する抗体産生の有無を確認したところ、微弱なバンドが認められた。しかし、抗体価の上昇は不十分であり、このままでは十分な免疫効果が得られないと考えられた。そこでライブラリー作成の際のプロモーター活性についての再検討を行った。昨年度の研究結果から、これまで作製したライブラリーの性状がワクチンとして使用するには不十分であることが判明した。

そこで今年度は、ネコ条虫ならびに同じテニア科の条虫であるTaenia asiaticaのオンコスフェアからmRNAを抽出し、cDNAライブラリーの作製を試みた。嚢虫症はもっとも難治性な人獣共通寄生虫症の一つであり、アジア、アフリカ諸国を中心に世界規模でその流行が拡大してきている。しかし嚢虫症の原因である有鉤条虫は、人以外の終宿主がいないこと、虫卵がきわめて危険なこと、中間宿主がブタであることなどからワクチン開発の試みは極めて限定されている。研究代表者はこれまで、ネコ条虫-ラットのモデル系を使って、嚢虫症のDNAワクチン開発のための新しい戦略を検討してきた。その結果、ライブラリーワクチンの手法により、嚢虫症に有効なDNAワクチンの開発が可能であることが示唆された。しかし実際にDNAワクチンとして有効な遺伝子を特定するためには、膨大な候補遺伝子から何らかの方法で有効な遺伝子を選抜することが必要である。ブタを用いた遺伝子のスクリーニングには、取り扱い、コスト、安全面で大いに問題がある。そこで、有効嚢虫症の唯一の実験モデルであるNOD-Scidマウスを用いて、ワクチン候補遺伝子のスクリーニング系を確立することが本研究の目的である。これまで作製したライブラリーの性状がワクチンとして使用するには不十分であることが判明した。そこで今年度は、ネコ条虫のオンコスフェアからmRNAを抽出し、%'および3'Raceのキットを使用した完全長cDNAライブラリーを作製した。作製したライブラリーには既知の防御抗原のホモログや未知の蛋白質の遺伝子を含んでおり、ライブラリーワクチンとして使用できるものと思われた。
日本家電企業の環境戦略に基づく包括的なバリューチェーンの設計モデル

この研究は、日系家電事業者のバリューチェーンが、都市鉱山のリサイクル事業分野にまで拡張していることを示した。この事業は、主に家電事業者とリサイクル事業者との連携によって実施されている。各事業者は、家電リサイクル法の下で、2つのグループに分かれて事業を遂行しているが、両者の間には再商品化率の差がある。その差は、関連技術の開発と普及のための組織間連携の形態の違いにあると指摘した。また、海外の国・地域において、国内の事業経験で得られた技術・ノウハウを移転している事例が数社に留まっていることを示した。以上によって、これら拡張的なバリューチェーンの特徴と課題を明らかにした。追加的な調査として、日系家電企業のグローバル経営戦略において、廃家電の再商品化事業がどのように位置づけられているのかを明らかにする必要がある。グローバル企業による製品ライフサイクル全体を含めた包括的なバリューチェーンのモデルを提案したい。企業による事業活動は、単独の企業によって完結するのではなく、複数企業の連携による協働の成果として実現される。例えば、家電組立メーカーであれば、数千点ある部品を調達するために、数百の素材・部品供給メーカーからの直接的・間接的な調達を通じて完成品を顧客に提供することができる。加えて、今日の資源循環型社会の文脈においては、メーカー・関連事業者・ユーザーの適正な役割分担の下で製品の解体・再資源化に取り組むことが、家電リサイクル法の下で制度化されている。企業の中には、環境経営を実践することのプレミアムを市場において獲得するために、自社のバリューチェーンを動脈・静脈を含む形で包括的に定義し、そのガバナンスに取り組み始めているものがある。従来から、バリューチェーンの最適化はSCM(サプライチェーン・マネジメント研究の課題として取り扱われて来ている。しかし、その内容は生産・供給に関わる動脈サイドに留まっている。本研究の対象は、資源の回収・再利用に関わる静脈サイドを含めた動脈・静脈トータルでの拡張的なバリューチェーン・マネジメントである。その現状と課題を定量的・定性的アプローチで明らかにし、さらには課題解決に貢献しうる活動オプションを処方箋として提案したい。平成19年度には,文献調査と関連資料の収集,企業訪問及びヒアリングを中心に,本研究の基礎となる調査活動を続けた。まず,財務省貿易統計や経済産業省の生産動態統計,電子情報技術産業協会や(財)家電製品協会など関連業界の公表する統計データを通じて,国内外の家電製品の流れや原料市況の変動を整理している。次に,企業訪問では,家電リサイクル法に基づいて,家電メーカーからの受託もしくは家電メーカーの出資で設立され業務を実施している再資源化事業者の調査を行った。現時点においては,家電メーカーにとって,再資源化事業は同法の遵守のための必要を満たすことが主な目的である。ただし,それはもちろんのこと,特に家電メーカーの100%出資の再資源化事業者では,製品の解体効率性の向上や素材選択に於ける技術革新を重要な課題としていることがわかった。製品の解体容易性を高めることにより,製品ライフサイクル全体のコストを低減することで,再資源化資源の価格を抑え,それを用いる次の製品価格で消費者に還元しようという考えに基づいて,家電メーカーは当事業に取り組んでいることが理解できた。また,家電製品の高性能化に伴い,様々な希少金属が製品に採用される比率が高まると,再資源化事業は,それらの安定確保において重要な役割を担うようになる。先端的な家電製品の安定供給を実現するためには,製品の再資源化ラインの内製化と外注化の選択が,家電メーカーにとって環境、資源戦略の重要な論点となる可能性がある。ただし,現在の実務レベルでは,それを踏まえた具体的な取り組みが実施されているわけでないことがわかった。全国の家電リサイクル事業者について、国内大手家電メーカーからの出資関係および再資源化業務の受託関係について公表データ(ウェブサイト、事業報告書など)に基づいた整理を行った。それを元に、受託側の事業者についてのヒアリング調査を実施した。松下エコテクノロジー(株) (現・パナソニックエコテクノロジー(株) )、関西リサイクルシステムズ(株)、アクトビーリサイクリング(株)、テルム(株)である。これら事業者へのヒアリング調査で分かったことは、AグループとBグループにおける受託事業者の動機付け要因の違いである。Aグループでは、主導的立場の企業がリサイクル技術全般を提供し、受託側はその範囲において処理効率の向上を競い合う関係にある。受託事業者が発案した処理技術を導入する際には、主導企業からの承認を要する。事業者は、お互いに競争関係にある。一方で、Bグループでは、受託事業者の組合的な組織が存在し、企業間で処理技術アイデアの交換の場が定期的にもたれている。処理品を引き受ける地域が予め定められているため、事業者間での競合が発生しないため、そのような互助関係が可能になっている。

以上のように、A・B両グループの間には、リサイクル技術開発と事業運営に関わる組織間関係の構造的な違いがあることが分かった。いまの段階では、それを集約型と分散型として内容の精査を進めたい。また、家電リサイクルに関わる製造事業者の立場の違いが、受託事業者との関係にどのように影響しているのかについても考察していきたい。平成21年度における研究成果は、家電再商品化事業におけるA・Bグループそれぞれの協働戦略について、その特徴を整理したことにある。前年度の調査においては、リサイクル事業システムのパターンを「家電企業主導型」「素材企業協働型」「産廃・プラント企業協同型」「全面委託型」として整理した。本年度は、分析単位をリサイクルグループに移し、そのグループが再商品化について、どのように機能しているのかを調査した。本研究では、Aグループは「ハブ&スポーク型」、Bグループは「相互ネットワーク型」と特徴づけられることが示された。さらには、これら2つのグループによる再商品化技術開発を関連する特許取得件数で比較した。また、再商品化技術開発でAグループの中核企業の動機付けについて、各企業の家電事業の製品別国内外市場シェアや各社の売上高全体に占める家電事業の比率などのデータから検証した。ただし、再資源化の効率化を設計段階で考慮していない家電製品が、市中の多数を占めるという現状を踏まえれば、「相互ネットワーク型」の協同戦略の方が、技術開発のスキームとして有効ではないのかという仮説を設定し、次年度の調査に課題として含めることにした。年頭の調査計画においては、欧米およびアジア市場における日本家電企業の環境戦略について整理していくという目標を掲げていたが、それにはまだ着手できていない。今年度は、家電事業者本体への取材を中心に、海外における再商品化事業について整理していくことになる。平成22年度の研究では、まず、各家電事業者単位での廃家電製品の再商品化実績に関する比較検討をおこなった。平成13(2001)年から、家電リサイクル法に則って運用されてきている本制度の再商品化実績は、全体的には逐次向上している。だだし、AグループとBグループという再商品化グループに分けた同実績では、両者の間に隔たりが生じでいる。具体的には、BグループがAグループよりも高いパフォーマンスを発揮していることが分かった。再商品化される資源を社会の共通財産であるという観点に立てば、このようなグループ間の差が生じることは、社会的な損失を拡大させてしまっていることと見なすしうる。ここでは、再商品化率の現状を個別の企業と再商品化グループの単位で把握し、それぞれの再商品化グループが解決するべき課題について指摘した。つぎに、日本の家電事業者の外国における廃製品回収と再資源化事業への取り組みについての把握に取り組んだ。
ジアステレオ選択的ケタール化反応の基質適用範囲拡大と合成化学的応用

ジアステレオ選択的ケタール化反応の適用拡大を第一の目的として,本法で得られる化合物の合成化学的な応用を第二の目的として設定した.2位に芳香環とシンナミル単位を有する化合物のジヒドロキシル化により得られるヘミケタールの選択性について検討し,高ジアステレオ選択的にヘミケタール形成と分子内ケタール形成が進行することを明らかにした.不斉ジヒドロキシル化反応では,90%e.e.程の純度で光学活性体を入手できた.次に,不斉第四級炭素から不斉四置換炭素への変換を行なった結果,オキシムのBeckmann転位によりラクタムが高選択的に得られること明らかにした.更に本品を用いて二つの天然物の合成研究を行なった.これまでの研究で合成に成功している方法と同様の経路がベンゼン環をC2位に有する化合物に適用可能かどうかを試すため,まずC2位に不斉炭素を有する置換基を導入した1,3-cyclohexanedioneに対してCuIまたはPd(0)を触媒とし,ヨードベンゼンとのカップリング反応を試みた.しかし,反応は全く進行せず,原料回収にとどまった.そこで,最初にCuIを触媒としてベンゼン環を導入し,不斉炭素はアルケンの不斉ジヒドロキシル化反応で導入する経路を検討することにした.その結果,2-allyl-および2-cinnamyl-2-phenyl-1,3-cyclohexanedioneを効率良く合成することに成功した.ついで,実際に不斉ジヒドロキシル化反応を行う前に,二つのカルボニル基のどちらを選択するかというジアステレオ選択性を検証することにした.検討の結果,allyl基を導入した基質では96:4の選択性で,cinnamyl基を導入した基質では単一の化合物としてヘミケタールを得ることができ,C2位にベンゼン環が存在する化合物でも高ジアステレオ選択的にケタール化反応が進行することを明らかにできた.一方,不斉第四級炭素から不斉四置換炭素への変換に関しては,Beckmann転位反応の検討を行った.ケトンからオキシムの変換では,通常は幾何異性体の混合物が得られるが,本化合物では不斉第四級炭素の存在により,得られたオキシムは単一化合物であった.転位反応はオキシムの水酸基をトシル化後,シリカゲルと室温で反応させる緩和な条件で進行し,立体選択的に環状ケトンをラクタムに変換する手法を確立できた.研究実績概要に記載したように,1,3-cyclohexanedioneのC2位にベンゼン環とアリル単位を有する基質の効率的な合成方法の確立とアルケンのジヒドロキシル化反応によりジアステレオ選択的にケタール化反応が進行することを明らかにできた.しかし,この原料合成手法が芳香環上に多彩な官能基が存在している化合物に対して利用可能かどうか,またベンゼン環上の置換基がジアステレオ選択的ケタール化反応に与える影響に関しては未だに試していない.また,最終的には生物活性化合物の不斉合成への適用を計画しているため,不斉ジヒドロキシル化反応による不斉合成への展開の実施も急務であると考えている.平成27年度の研究から,C2位にベンゼン環とアリル単位またはシンナミル単位を有する1,3-シクロヘキサンジオン誘導体のアルケンのジヒドロキシル化反応においても,高いジアステレオ選択性でケタール化が進行することを明らかにすることができた.そこで,平成28年度は,この基質を用いた場合の不斉ジヒドロキシル化反応でどれ程の光学純度で生成物が得られるかの検討をまず最初に行った.反応は,tert-ブタノールと水の混合溶媒中,市販のAD-mix-alphaまたはAD-mix-betaを用いて0°Cで行い,どちらの場合にも8695%の化学収率と90%程度の光学収率で生成物を得ることができた.なお,生成物の絶対配置は,まずヘミケタールをケタールに変換後,ついでケトンを還元して第二級アルコールを得たのち,(R)-および(S)-MTPAエステルに変換し,NMRの化学シフトの変化を観察することにより決定した.さらに,本反応の一般性を確認するためにC2位のベンゼン環に様々な置換基を導入した化合物やシンナミル基の芳香環に置換基を導入した化合物を合成して光学純度のさらなる上昇を試みた.しかし,微量ではあるが,予想しなかった化合物が生成した.この化合物はヘミケタールからケタールへの変換の際に,水酸基にプロトン化後に脱水してカルボカチオンが生成し,異性化を伴ってケタール化が進行した生成物であると予想している.これまでの研究により,野依教授らの手法を改良したヘミケタールと水酸基を同一分子内にもつ化合物を2,6-lutidine存在下にtrimethylsilyl trifluoromethanesulfonateと反応させると低温でケタール化が進行することを明らかにしている.今後,この反応条件のような緩和な条件でのケタール化反応を検討する予定である.研究実験概要にも記載したように,高い光学純度でケタールを合成する条件の確立,生成物の絶対配置の決定には成功したが,予想していなかった化合物が生成することも明らかになった.この副生成物は目的化合物との分離が極めて困難であるばかりでなく,微量しか生成しないことから構造を決定するために時間を予想外の時間を要してしまった.また,酸触媒の変更など,副生成物が生成しない条件の探索を行なってきたが,解決には至っていないのが現状である.

これまでの研究により,C2位にベンゼン環とシンナミル単位を有する1,3-シクロヘキサンジオン誘導体のアルケンのジヒドロキシル化反応で高いジアステレオ選択性でケタール化が進行することを明らかにすることができた.そこで,本法の生理活性化合物の不斉合成への応用を目指し,解決すべき課題の一つであるケタールの開環に関して検討を行った.まず,高いジアステレオ選択性で一方のカルボニル基がケタール化された化合物中のもう一方のカルボニル基の還元を試みた.しかし,水素化ホウ素ナトリウムではカルボニル基を還元することができず,ジイソブチルアルミニウムヒドリドのみが還元剤として機能した.なお,生成物の立体化学はケタールの酸素原子にアルミニウムが配位してアキシャル方向からヒドリドが接近したアルコールが優先的に生成することが明らかとなった.続いて,水酸基をキサンテートに変換しChugaev反応によるアルケンへの変換を試みたが,構造不明な化合物のみが得られた.そこで,アルケンへの変換は後の段階で行う事とし,水酸基をベンジルエーテルとして保護した後,ケタールを酸性条件でヘミケタールに変換した.得られたヘミケタールに対してエポキシドへの変換を伴う開環などを種々の条件で試みたが,いずれも基質の分解あるいは構造不明の化合物が得られるのみであった.最終的に,還元的な開環反応を試みる事にしたが,メタノール中の水素化ホウ素ナトリウムによる還元では生成物は全く得ることができず,テトラヒドロフラン中でのみ望む反応が進行して,トリオールが得られることを明らかにできた.現在,1,2-ジオール部の酸化的開裂と還元的アミノ化によるアミノ基の導入を行い,Amaryllidaceae alkaloidsの一種である(+)-crinane,(+)-crinine,および(-)-amabilineの不斉合成を検討している.ジアステレオ選択的ケタール化反応の適用拡大を第一の目的として,本法で得られる化合物の合成化学的な応用を第二の目的として設定した.2位に芳香環とシンナミル単位を有する化合物のジヒドロキシル化により得られるヘミケタールの選択性について検討し,高ジアステレオ選択的にヘミケタール形成と分子内ケタール形成が進行することを明らかにした.不斉ジヒドロキシル化反応では,90%e.e.程の純度で光学活性体を入手できた.次に,不斉第四級炭素から不斉四置換炭素への変換を行なった結果,オキシムのBeckmann転位によりラクタムが高選択的に得られること明らかにした.更に本品を用いて二つの天然物の合成研究を行なった.まず,合成法を確立している化合物を用いて,本法が不斉合成に適用可能かどうかを明らかにする必要がある.一般的にはジヒドロキシル化反応は,1,2-トランスアルケンに対して有効であることから,2-cinnamyl-2-phenyl-1,3-cyclohexanedioneと本化合物のベンゼン環上に置換基を有する誘導体を中心に基質と反応条件の最適化を優先的に実施して行いたい.また,本法を生物活性化合物の不斉合成に展開するために,C2位に導入するベンゼン環に置換基をもつ化合物の合成と不斉ジヒドロキシル化反応を試すことを二番目に実施する予定である.本法を生物活性化合物の不斉全合成に適用するためには,まずケタール化した化合物に存在するカルボニル基をケトン以外の官能基に変換する必要がある.
サルコペニアにおける免疫学的癌微小環境の意義

当科および関連施設にて外科的切除を施行した膵癌235例を用いて、膵癌腫瘍微小環境を形成する免疫担当細胞であるCD8陽性T細胞、regulatoryT細胞、腫瘍浸潤マクロファージ、および膵癌細胞のPD-L1の発現を免疫染色にて網羅的に解析した結果、癌細胞におけるPD-L1や腫瘍浸潤マクロファージ、CD8陽性T細胞が膵癌切除術後の再発および予後に影響を与えることが示されたが、サルコペニアとの相関は示されなかった。そこで、腫瘍浸潤マクロファージに注目し、膵癌細胞におけるPD-L1の発現との相関を調べたところ、両者に有意な相関が認められた。膵癌細胞株と活性型マクロファージの共培養の系にて実験を行い、膵癌細胞におけるPD-L1の発現は、マクロファージが分泌するTNF-αにより制御されていることが証明された。当初の予定とは異なってきたが、膵癌の免疫学的微小環境、特に膵癌細胞におけるPD-L1の発現機序の解明につながった。今後はマクロファージが分泌するTNF-αが、どのような経路を介して膵癌細胞におけるPD-L1の発現をregulateしているかの解明を目指したい。さらに、現在さまざまな癌腫で認可され注目を浴びている抗PD-L1抗体薬と抗TNF-α薬の相乗効果等を、in vivoの系を用いて検証していきたい。これまで当科において外科的切除を施行した膵癌約120例を用いて、腫瘍微小環境を形成する免疫担当細胞であるCD8陽性T細胞、regulatoryT細胞、腫瘍浸潤マクロファージ、および膵癌細胞のPD-L1の発現を免疫染色にて網羅的に解析した。その結果、癌細胞におけるPD-L1の発現や腫瘍浸潤マクロファージ、CD8陽性T細胞が膵癌術後の予後に影響を与えることが示された。そこで、次に術前のCT画像からサルコペニアの有無を解析し、サルコペニアと腫瘍浸潤免疫担当細胞、特にCD8陽性T細胞やregulatoryT細胞に相関があるかどうかを検証した。しかし、現時点でサルコペニアの有無が、腫瘍微小環境の免疫担当細胞に与える影響については確認されなかった。現在症例数を増やして検証するとともに、肝細胞癌や胆管細胞癌など、他の肝胆膵領域の癌腫についても検討を行っているところである。当初サルコペニアを有する患者では、局所での免疫力低下により腫瘍浸潤リンパ球が減少することを仮説として立てていたが、これまで行った実験結果からは、サルコペニア自体は腫瘍浸潤リンパ球の数には影響を与えていないようである。サルコペニア自体は腫瘍浸潤リンパ球の数には影響を与えていないこと、これまでの実験結果からは示唆されるが、リンパ球の機能については未だ検証できていないため、まずこの点について検証する。また、腫瘍微小環境を構成する免疫担当細胞はCD8陽性T細胞以外にもregulatory T細胞や腫瘍浸潤マクロファージ、腫瘍浸潤好中球が挙げられるため、これらの免疫担当細胞とサルコペニアの関連性を明らかにする必要があると思われる。試薬、消耗品の購入費、及び、研究データの管理、資料整理を行ってもらうための事務補佐員の雇用経費に充てたいと考える。試薬、消耗品等については、医局保管のものを使用することが出来た。研究費は主に試薬などの消耗品購入費に充てるほか、情報収集や研究発表にかかる学会出張旅費に充てたいと考える。
学童における食習慣と肥満および生活習慣病リスクマーカーに関するコホート研究

小学1年生を対象に約9年の追跡期間で、肥満、身長・体重変化、初潮年齢、血中脂質、血糖、インスリン等の生体指標を含む生活習慣病リスクマーカー(候補マーカーを含む)をアウトカムとし、特に食習慣との関連を評価するコホート研究を開始させることを目的とした。研究期間中に、計2000名を超える参加を得、1年生におけるエントリーは、これで終了とした。保護者による生活習慣に関するアンケート調査、食物摂取頻度調査による食習慣評価、起床尿採取が実施された。今後、小学校4年、中学校1年の時点でアンケート調査、生活習慣病リスクマーカー測定のための、血液採取、尿採取を実施する予定である。小学1年生を対象に約9年の追跡期間で、肥満、初潮年齢、血中脂質、血糖、インスリン、ホルモン等の生体指標を含む生活習慣病リスクマーカーと、特に食習慣との関連を評価することを目的にコホート研究を開始した。ベースライン調査として、碧南市の7学校において、保護者による児童(小学校1年生)の生活習慣に関するアンケート調査、食物摂取頻度調査による食習慣の評価、起床尿採取が実施された。これらの調査により各種栄養素・食品群摂取の他に飽満、空腹度、食事回数、食事時刻、起床時刻、就寝時刻、外食頻度、ファーストフードの摂取、母子手帳からの出生体重、1歳半あるいは3歳児健診時の身長・体重、児童の起床・就寝時刻などの生活リズム、既往歴、現在の健康状態、運動習慣、父母の喫煙歴や既往歴等についても情報を得た。小学校4年次では学校における健康診断の検査結果(脂質、血糖、ヘモグロビン値)とともに研究用血液サンプルを得る予定である。起床尿は今後の性ホルモン、カドミウム、イソフラボン代謝物、メラトニン代謝物等のバイオマーカー測定に用いるが、一部は既にコチニンの測定を実施した。今後、エントリー数を増加し、小学校4年次でのフォローアップにつなげる。また、食物摂取頻度調査票の妥当性評価のため、同小学校児童約100名を対象に、食事記録、尿のサンプルを得た。小児の肥満や血中脂質値など生活習慣病リスクマーカーは成人期まで継承される傾向があり、一方、小児の生活習慣もトラッキングが認められるため、小児期において両者の関連を評価することは疾病予防のために重要である。肥満、初潮年齢、血中脂質、血糖、インスリン、ホルモン等の生体指標を含む生活習慣病リスクマーカーと、特に食習慣との関連を評価することを目的としたコホート研究において、前年度に引き続き、小学1年生を対象にエントリーを行った。約9年の追跡期間の予定でベースライン調査として、碧南市の7学校において、保護者による子供(小学校1年生)の生活習慣に関するアンケート調査、食物摂取頻度調査による食習慣の評価、起床尿採取が実施された。1500名ほどの参加を得ている。これらの調査により各種栄養素・食品群摂取の他に飽満、空腹度、食事回数、食事時刻、起床時刻、就寝時刻、外食頻度、ファーストフードの摂取、母子手帳からの出生体重、1歳半あるいは3歳児健診時の身長・体重、起床・就寝時刻などの生活リズム、既往歴、現在の健康状態、運動習慣、父母の喫煙歴、既往歴等についても情報を得た。参加児童の保護者のは総カロリーや野菜摂取量などを提示し、栄養士のアドバイスを加えた栄養指導シートを返却した。また、4年次に用いるためポーションサイズを変えた食物物摂取頻度調査票の妥当性評価のため、同年の学童約200名を対象に食事記録をおこなった。妥当性の結果は小学校1年時に用いる調査票とおおよそ同等であった。今後、さらにエントリー数を増加し、小学校4年次、中学1年次でのフォローアップにつなげる。肥満、初潮年齢、血中脂質、血糖、インスリン、ホルモン等の生体指標を含む生活習慣病リスクマーカーと、特に食習慣との関連を研究するコホートの確立を目的とした。平成26年度に引き続き、小学1年生を対象にエントリーを行い、計2000名を超える参加を得た。参加児童の保護者には総カロリーや野菜摂取量などを提示し、栄養士のアドバイスを加えた栄養指導シートを返却した。1年生におけるエントリーは、これで終了とした。別途、小学校4年生を対象に、碧南市で行われる健康診断において、採血した一部の血液を研究用として保存し、麻しんなどの抗体価を測定し個人に還元するなど、今後コホート内で行う調査体制を整えた。同市の協力を得て、4年次、中学1年次でのフォローアプが計画上可能となった。また、横断研究において生活習慣と生活習慣病リスクマーカーとの関連を調査することも目的としており、特に尿中コチニン、NOx等の測定を行った。子供の尿中コチニンは保護者の喫煙行動と高い相関が認められ、尿中コチニン量と齲歯の有無に有意な関連があることが認められた。また、13-14歳児を対象に、Chanらの尺度(2011)を用いて第二次性徴を把握し、食習慣との関連を評価した。

小学1年生を対象に約9年の追跡期間で、肥満、身長・体重変化、初潮年齢、血中脂質、血糖、インスリン等の生体指標を含む生活習慣病リスクマーカー(候補マーカーを含む)をアウトカムとし、特に食習慣との関連を評価するコホート研究を開始させることを目的とした。研究期間中に、計2000名を超える参加を得、1年生におけるエントリーは、これで終了とした。保護者による生活習慣に関するアンケート調査、食物摂取頻度調査による食習慣評価、起床尿採取が実施された。今後、小学校4年、中学校1年の時点でアンケート調査、生活習慣病リスクマーカー測定のための、血液採取、尿採取を実施する予定である。市や医師会、教育委員会の支援を得られた。養護教員の協力を得られた。27年度が最終年度であるため、記入しない。疫学、予防医学エントリー数を増やせるよう調査票等に工夫を加える。順調に進むよう、市、教育委員会、医師会と連絡を密にする。エントリー数を増やせるよう調査票等に工夫を加える。測定費用が計画より少なく済んだ。測定項目を増やす方向である。
血管の恒常性制御による、癌の転移抑制法の開発

血管作動性物質、アドレノメデュリン(AM)と、その受容体活性調節タンパクRAMP2は、癌転移抑制の標的として期待される。本研究では、誘導型血管内皮特異的RAMP2ノックアウトマウス(血管RAMP2-/-)、誘導型リンパ管特異的RAMP2ノックアウトマウス(リンパ管RAMP2-/-)を樹立し、癌転移におけるAM-RAMP2系の意義を検討した。血管RAMP2-/-では、原発巣は縮小するものの、血管恒常性が破綻した結果、肺転移が亢進する結果が得られた。一方、リンパ管RAMP2-/-では原発巣の重量が増大し、血管新生が亢進した。現在、足底部への癌移植によるリンパ節転移について検討を進めている。生理活性ペプチドであるアドレノメデュリン(AM)と、その受容体活性調節タンパクRAMP2の持つ血管恒常性維持機構を解明し、腫瘍転移抑制法に応用展開するため、成体になってから遺伝子欠損が可能な、誘導型の血管内皮細胞特異的RAMP2ノックアウトマウス(DI-E-RAMP2-/-)を樹立した。腫瘍を足底部に移植し、遠隔臓器への転移実験を行うと、コントロールと比べ、DI-E-RAMP2-/-では転移が亢進した。RAMP2欠損後、転移先となる肺では、早期から炎症細胞が集積し、それに伴い炎症性サイトカインが上昇、さらに炎症が持続し、S100A8/A9やSAA3などの腫瘍細胞遊走因子の発現が亢進し、転移前土壌が形成されることが明らかとなった。次に、腫瘍の転移促進に関わる因子を解明するため、RAMP2欠損後に血管内皮細胞を初代培養し、遺伝子発現変化を検討したところ、炎症性接着因子であるICAM-1/VCAM-1の発現が有意に亢進していた。そこで、DI-E-RAMP2-/-の大動脈を回収し、TNF-αによる炎症刺激を行うと、血管内皮細胞の表面に多数の突起(マイクロビライ)が観察された。一方、血管内皮細胞特異的RAMP2過剰発現マウスでは、それらの変化が抑制され、内皮細胞の形態が保たれていた。さらにDI-E-RAMP2-/-ではRAMP2欠損後、著明な全身性浮腫を生じるが、Rac1/RhoAバランスの異常がアクチン重合状態に変化を生じ、血管透過性が亢進することを明らかとした。さらに、内皮細胞にAMを投与すると、VE-カドヘリン接着の増強とともに、アクチンが細胞間接着部位に集積することを見出した。以上の結果から、血管のRAMP2欠損により1血管恒常性が破綻し、慢性炎症が生じること、2腫瘍や炎症細胞が接着しやすい血管となり、細胞間接着も脆弱化し、腫瘍転移に促進的に働くことが明らかとなった。誘導型の血管内皮細胞特異的RAMP2ノックアウトマウス(DI-E-RAMP2-/-)の樹立に成功し、マウスが成体になってからRAMP2遺伝子の欠損誘導を行うことが可能となった。これにより、従来はノックアウトマウスが胎生致死であるため、成体での解析が困難であった点を克服し、AM-RAMP2系の成体での病態生理学的意義を検討することが可能となった。これまでの検討から、DI-E-RAMP2-/-では、B16F10メラノーマの皮下移植において、血管新生は減弱し、腫瘍増殖が抑制されていた。その一方で、B16BL6メラノーマを用いて、原発巣摘出後の遠隔臓器への転移の検討を行ったところ、DI-E-RAMP2-/-では肺への転移が亢進するという結果が得られている。AM-RAMP2系を活性化することで転移を抑制できるのか検討を行うと、RAMP2過剰発現内皮細胞では腫瘍細胞の接着を抑制し、血管内皮細胞特異的RAMP2過剰発現マウスでは腫瘍転移を抑制し、生存率の改善を認めることが明らかとなった。AM-RAMP2系の転移抑制メカニズムを解明するため、移植した腫瘍内の血管をインドシアニングリーン(ICG)で描出してみると、AM投与群では、腫瘍内血管が太く、安定化していた。これらのことから、AM-RAMP2系は腫瘍血管の走行を正常化することが明らかとなった。一方、癌の転移においては、血行性転移に加え、リンパ行性転移が大きな問題である。そこで、リンパ管におけるRAMP2の病態生理学的意義を明らかにするため、リンパ管特異的に発現しているProx-1遺伝子プロモーターを利用したCreリコンビナーゼトランスジェニックマウスとRAMP2floxマウスを現在交配させ、薬剤誘導型のリンパ管特異的なRAMP2ノックアウトマウス(DI-LE-RAMP2-/-)を用いた検討を進めている。内因性生理活性ペプチドであるアドレノメデュリン(AM)と、その受容体活性調節タンパクRAMP2の持つ血管恒常性維持機構を解明し、腫瘍転移抑制法に応用展開するため、成体になってから遺伝子欠損が可能な、誘導型血管内皮細胞特異的RAMP2ノックアウトマウス(血管RAMP2-/-)を樹立した。血管RAMP2-/-では、原発巣の血管新生が減弱し、腫瘍重量の増大を抑制する一方で、腫瘍を足底部に移植し、肺への転移実験を行うと、コントロールと比べ、転移が亢進していた。

RAMP2欠損後、転移先となる肺では、内皮細胞の形態異常を認め、S100A8/A9などの腫瘍細胞遊走因子の発現が亢進し、転移前土壌が形成されることが明らかとなった。また、血管のRAMP2欠損誘導後、著明な体重増加を認めるが、これは血管透過性が亢進した結果と考えられた。そこで、AMの細胞内シグナルcAMPに着目し、その下流シグナルの検討を行うと、AMはEpac-Rap1シグナルを介してVE-カドヘリン接着を増強していることが示され、血管のAM-RAMP2系は細胞間接着を強固にし、癌転移を抑制することが明らかとなった。一方、癌の転移においては、血行性転移に加え、リンパ行性転移が大きな問題である。そこで、リンパ管特異的に発現しているProx-1遺伝子プロモーターを利用したCreリコンビナーゼトランスジェニックマウスとRAMP2floxマウスを交配させ、誘導型のリンパ管特異的RAMP2ノックアウトマウス(リンパ管RAMP2-/-)を樹立した。リンパ管RAMP2-/-では、コントロールと比べ、皮下移植モデルにおいて、腫瘍重量が増大する結果となった。腫瘍内の血管評価を行うと、血管RAMP2-/-とは対照的に血管新生が亢進する所見が認められた。足底部への腫瘍移植によるリンパ節転移については現在検討を進めている段階である。血管作動性物質、アドレノメデュリン(AM)と、その受容体活性調節タンパクRAMP2は、癌転移抑制の標的として期待される。本研究では、誘導型血管内皮特異的RAMP2ノックアウトマウス(血管RAMP2-/-)、誘導型リンパ管特異的RAMP2ノックアウトマウス(リンパ管RAMP2-/-)を樹立し、癌転移におけるAM-RAMP2系の意義を検討した。血管RAMP2-/-では、原発巣は縮小するものの、血管恒常性が破綻した結果、肺転移が亢進する結果が得られた。一方、リンパ管RAMP2-/-では原発巣の重量が増大し、血管新生が亢進した。現在、足底部への癌移植によるリンパ節転移について検討を進めている。内因性のAM-RAMP2系が血管の恒常性維持に働き、腫瘍転移に抑制的に働いていることが示された。これまでの検討では、血管内皮細胞のAM-RAMP2系は腫瘍内の血管新生を促進し、腫瘍重量を増加させる結果が得られた。しかしながら、腫瘍内の血管のイメージングを行うと、AM投与群では腫瘍内血管が安定化することが示された。本研究では、AMと抗がん剤との併用投与により、原発巣の性質にどのような影響を与えるのか検討を行う。さらに、血管内皮細胞のRAMP2が欠損することで、癌転移が促進する結果が得られたことから、成体において遺伝子欠損誘導後より、原発巣、血管、転移先臓器に起こる変化を経時的に観察し、一連のプロセスの中で癌細胞の増殖、浸潤、転移に関わる因子を明らかにする。転移前土壌となりうる血管の構造変化、血管の炎症、癌細胞の接着、癌転移を促進させる腫瘍遊走因子産生などを検討することで、癌転移抑制のための新しい治療戦略の足掛かりとする。腫瘍細胞そのものだけでなく、腫瘍を取り巻く腫瘍微小環境にも着目し、マイクロアレイを用いて網羅的な解析も進める。また、DI-E-RAMP2-/-では血管のRAMP2が欠損すると著明な全身性浮腫が観察される。これは内皮細胞間接着が脆弱になり、血管透過性が亢進した結果と考えられた。一方、内皮細胞にAMを投与した所、VE-カドヘリン発現の亢進と同時にアクチンの局在が変化し、VE-カドヘリン陽性部にアクチンの束が集積する様子が観察された。cAMPはEpac-Rap
寒冷地法面の保全に向けた草本植物の根系を含む土層のせん断特性と諸因子の検討

北海道における国土保全を考えるとき,草本植物によって被覆された法面には表層土の補強効果が期待される。しかし,積雪寒冷地では一般に植物の生育適期が短期間であるなど法面保全上の問題も多い。この研究では,積雪寒冷地の北海道における法面緑化工を想定して作製された草本植物の根系を含む土供試体の一面せん断試験を実施し,防災的見地から法面保全対策としての表層土のせん断特性を総合的に考察する。具体的には,積雪寒冷地に適用可能な草本植物の種類・生育期間・環境条件などの違いが,茎葉部・根系の生育状況および根系を含む土層の力学的強度(強度定数:粘着力c・せん断抵抗角φ)に及ぼす影響について検討する。
ホットアトムと含水MoO3多孔体による99mTc医療用放射性同位元素作製法開発

含水層状MoO3結晶に中性子照射し通水するだけで99Moを生成・水相に回収するシーズ(特願2018-182149)を基にし、核反応で生成した99Moのホットアトムをターゲット内部から水相に取り出すためのMoO3多孔体を作製し、研究用原子炉での中性子照射実験と放射能測定を行う。これにより、困難な同位体分離や危険な高温NaOH溶液への溶解なしに、99Moとその娘核である99mTcを用いた製剤開発を行う。この技術により、これまで100%輸入していた99Moの、生産国産化と供給安定化させる技術開発を目指す。
EBウイルス感染によるNK細胞の細胞周期および核内構造の変化の検討

EGFP-EBVをヒトNK細胞株および健常人より分離したNK細胞に感染させると、NK細胞株の約30%、ヒト末梢血NK細胞の40-60%においてEGFPの発現が認められた。EBV感染48時間後にはNK細胞は変形・巨大化し、一部の細胞は多核となった。EBVの潜伏感染マーカーのEBERsおよび溶解感染マーカーBHLFsを用いたin situハイブリダイゼーション法により、溶解感染でなく比較的特異的に潜伏感染によってNK細胞は細胞の変形・巨大化し、更にアポトーシスが惹起されることが明らかとなった。Cdc2、Cyclin B、Cdc25C等のG2/M移行に重要な細胞周期関連蛋白質の発現量の増加と核への移行、その活性化抑制が示され、フローサイトメーターでG2/M期停止が確認された。PML、SC35、HP1等のnuclear dotを形成する蚕白質群の核内分布パターンの変化は明らかではなかったが、核の構造蛋白質と考えられるlamin、細胞骨格蛋白質のactinおよび・-tubulinの分布は著明に変化し、中心体の数の異常も認められた。EBV陰性のNK細胞株より樹立した8種類のEBV感染クローン群では実際のNK腫瘍と同様のlatency I型およびII型の両方のEBV関連遺伝子発現パターンが認められた。EBV感染により細胞の大きさが増大し、遺伝子不安定性の指標であるmicronuclei形成が増加していた。更に、EBV感染クローンにおいては抗癌剤への耐性を獲得し、細胞密度の低下、逆に飽和状態においても細胞死が起こり難くなった。GFPを組み込んだricombinant EBウイルスをヒトNK細胞株および健常人より分離したNK細胞に感染させると、NK細胞株の約30%、ヒト末梢血NK細胞の40-60%においてGFPの発現が認められた。これらの感染細胞は巨大化し、一部の細胞は多核となった。共焦点レーザー顕微鏡を用いた解析でcdc2、cyclin B、cdc25C等のG2/M移行に重要な細胞周期関連蛋白質の発現量の増加と核への移行が観察された。これらの変化に加えてcdc2、cdc25Cの活性化による泳動度の変化がWestern blottingで認められ、細胞がG2/M移行期に存在することが示唆された。更に、flow cytometryによる細胞(周期分布の検討からEBV感染後のG2/M期停止が確認された。一部にDNA量が4Nより多い細胞が認められ、G2/M期停止から逸脱して多核になった感染細胞を示すと考えられた。PML、SC35、HP1等のnuclear dotを形成する蛋白質群の核内分布パターンの変化は明らかではなかったが、GFP陽性の巨大化細胞ではactinおよびα-tubulinによる細胞骨格が著明に変化しており、多核の細胞では中心体の数の異常も認められた。核の構造蛋白質と考えられるlamin A/Cやlamin Bの染色像から多核の一部が、laminを介して繋がっている像も得られた。nocodazoleを用いてEBV感染後のNK細胞をM期で止めると多核の細胞が減少してM期のアポトーシスが多く認められるようになった。以上より、この感染実験の過程において巨大化し多核となった感染細胞では、S期からG2をへてM期に至る細胞周期の制御が破綻していることが予想される。また、EBV感染後の多核細胞の出現は、細胞融合ではなくM期制御の破綻によることが強く示唆された。GFPを組み込んだEBウイルス(EBV)をヒトNK細胞株および健常人由来のNK細胞に感染させると、40-60%の細胞においてGFPの発現が認められ、EBV関連遺伝子の転写産物もRT-PCR法で検出された。これにより、EBVがNK細胞に感染することがin vitroで初めて明確にされた。それぞれ潜伏感染および溶解感染のマーカーであるEBERsおよびBHLFsをプローブにしてin situハイブリダイゼーションを行うと、EBV感染48時間後には両方の感染様式が混在していた。

溶解感染NK細胞は円形であるのに対して、潜伏感染細胞は変形・巨大化し、その一部は多核であった。このような変形細胞において共焦点レーザー顕微鏡でG2/M移行に重要な役割を果たすCdc2、Cyclin Bの発現量の増加と核への移行が観察された。Western blot解析でもCdc2、Cyclin Bの発現量の増加およびCdc2の泳動度の変化が認められ、G2期停止が示唆された。Flow cytometryによる細胞周期分布の検討からEBV感染後のG2期停止とともに,これから逸脱してDNA量が4N以上となった多核のNK細胞の存在が示された。変形・巨大化した潜伏感染細胞では、actin、α-tubulin等の細胞骨格蛋白質の分布が著明に変化しており、中心体の数の異常も認められた。72時間後にはこれらの細胞の大部分は初期のアポトーシスに進むことがannexin Vとの結合で明らかとなった。EBV感染からクローン化までのEBV関連遺伝子の発現パターンにおいて、NK細胞はT細胞と類似し、不死化されるB細胞とは異なっていた。これらの結果から、EBV感染により大部分のNK細胞はアポトーシスで死滅するが、一部生き残ったものはEBVにより細胞周期制御・細胞形態の異常を付与され、悪性度の高い腫瘍形成に繋がる事が予想された。
ヒストン脱メチル化酵素(KDM)による造血分化制御機構の解明

昨年度は、我々が新たに開発した新規KDM1A阻害剤が、低濃度(0.031uM)で白血病や骨髄異形成症候群の細胞株の増殖を抑制することを見いだした。本年度はどのようなメカニズムで白血病や骨髄異形成症候群に作用するのかを探索した。細胞分化アッセイ、細胞周期アッセイ、アポトーシスアッセイなどを経時的に解析し、分化誘導が最初に始まることを突き止めた。次にマイクロアレイ解析にて、どのような遺伝子群が阻害剤によって発現上昇するかを解析し、複数の細胞株で共通する遺伝子群をKDM1A標的遺伝子として同定した。その中に複数の造血分化に関連する転写調節因子が含まれていた。さらに、ヒストンH3K4me2, H3K4me3, H3K27acに対するChIP-seq解析を行い、先に同定した転写調節因子のエンハンサー領域でのH3K27acが阻害剤によって誘導されることを見出した。エンハンサー領域のH3K27ac,プロモーター領域のH3K4me3, mRNAレベル,および分化マーカーを経時的に解析すると、エンハンサーのH3K27acの増強が阻害剤添加3時間後から始まり、プロモーターのH3K4me3がややおくれて増強し、mRNAはさらにおくれて18時間目から上昇し始めること、分化マーカーは24時間目から発現上昇し始めることを見出した。すなわち、KDM1Aの阻害はエンハンサーの再活性化を引き起こして、分化に関わる転写因子の発現を誘導し、分化誘導することが明らかとなった。最後に、複雑核型をもつ予後超不良型の骨髄異形成症候群患者検体に対する効果をin-vitroおよびin-vivoで検定し、単剤使用で個体から駆逐することができることを示せた。これらの結果は、エンハンサーを標的にしたエピジェネティック治療が白血病や骨髄異型性症候群の治療に有望であることを示している。26年度が最終年度であるため、記入しない。ヒストンメチル化は、遺伝子の発現調節に重要な役割を果たすエピジェネティクス機構の一つであり、その異常は白血病などの造血器腫瘍の発症・維持に深く関与する。本研究の目的は、ヒストン脱メチル化酵素(KDMs)に関して、正常造血幹細胞の維持や分化、白血病の発症・維持にどのような影響を及ぼすのかを解明し、将来の白血病新規治療薬につながるような基盤的なデータを得ることである。本年度は、我々が新たに開発した新規KDM1A阻害剤を中心に解析を行った。まず、MLL-AF9マウス白血病モデルでの検討したところ、0.3uMで増殖能力が完全に失われた。正常マウス骨髄のコロニー形成能力は、510uMでも障害されなかったことから、このモデルでの白血病維持はKDM1Aに強く依存していることが示唆された。さらに形態学的および細胞表面マーカー解析などから、阻害剤によって芽球様細胞が骨髄単球系へ分化誘導されていることが確認された。これは、KDM1Aが、白血病細胞の分化停止に関与していることを示唆している。次に、ヒト白血病および骨髄異形成症候群由来細胞株で検討を行った。数種類の細胞株において1uM以下の低濃度で増殖能力低下が認められ、骨髄単球系への分化誘導が確認された。特に面白いことに、赤血球系へ分化した細胞株HELにおいても、阻害剤によって赤血球系マーカーが減弱し、骨髄単球系の分化マーカーが増強していた。そこで、このHELで遺伝子プロファイリング解析を行ったところ、転写因子の発現パターンが、赤血球系パターン(GATA-1などの亢進)から骨髄単球系パターン(CEBPA, PU.1などの亢進)へ完全にスイッチしていることがわかった。以上のデータから、KDM1Aは血球分化に関わる重要な転写因子の発現調節に密接に関わり血球分化決定の必須因子であることが明らかになった。なお、これら阻害剤は現在国際特許申請中である。