hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
シリコン量子構造体の形成・物性制御と室温動作デバイスへの応用

さらに、熱酸化膜表面のSi-OH結合は、Si-H結合に比べ熱的に安定であることに着目して、上記微細加工技術で形成したSi基板上のSiO_2パターンを希HF処理後熱酸化することで、熱酸化膜上にSi-OH結合で終端された領域を2次元的に形成し、この領域にSi量子ドットが選択的に形成することを確認した。また、この手法でドット成長の高い選択性を確保するには、熱酸化膜形成後の雰囲気制御が極めて重要であることも明らかになった。H_2雰囲気中で電子線誘起還元反応を促進させて、熱酸化膜表面に局所的にSi-OH結合で終端した領域を形成すれば、より高精度なドット位置制御が十分期待できる。形成したSi量子ドットの帯電状態は、AuコートAFM探針をケルビンプローブモード(ノンコンタクトモード)で駆動することで、局所表面電位変化として検出できることが明らかになった。SiH_4ガスの減圧CVD(LPCVD)において、シリコン酸化膜(SiO_2)上での反応初期過程を精密制御して、シリコン量子ドットや量子細線構造を自己組織化形成する技術を確立するための研究を推進した。特に、室温動作するシリコン量子デバイスの実現する上で、要となる形成制御技術、具体的には、寸法および形成位置を自在に制御する技術の開発に力点を置いた。昨年度までの研究で、シリコン酸化膜表面に意図的に形成したSi-OH結合がLPCVDの反応活性サイトになる事を実験的に明らかにした。また、クリーンルーム大気下で必然的に生じる表面汚染(有機物や吸着水)が、Si初期核形成における選択性を著しく低下させる要因であることを示した。本年度は、高選択・高精度位置制御技術の開発に向け、表面汚染を実質的に最小限度に抑えることができる以下の2つの手法を検討した。手法1)先ず、Si-AFM探針を用いて水素終端Si表面をクリーンルーム大気下で陽極酸化し、極微細SiO_2パターンを形成する。その後、乾燥酸素雰囲気中(23Pa)で1000°C熱処理してSiO_2パターンの原子密度向上させ、続いて、0.1%HF処理により、SiO_2パターン表面をSi-OH結合終端にした。この時、パターン以外の表面は、極薄SiO_2膜が完全に除去されて水素終端となる。この試料を、表面Si-OH結合が安定に残留する750°Cで再酸化すると、水素終端表面には、Si-O-Si結合が形成して、SiO_2膜上に微細なSi-OH結合領域が形成できる。引き続き、大気に曝すこと無くこの表面にLPCVDを施す事で、高さ35nmのSi量子ドットを50nm以下の間隔で規則配列する事に成功した。手法2)では、真空一環プロセスによる量子ドット位置制御技術を検討した。具体的には、Si基板上に極薄SiO_2膜を形成し、この表面を大気に曝すこと無く10^<-5>Paの水素分圧下で、バイアス印加したPt/Ir-STM探針で走査した。清浄なPt/Ir探針表面には、水素は解離吸着し、探針-試料(SiO_2/Si)間に±10V程度のバイアス印加すると、原子状水素はイオン化脱離して試料表面に到達する。負バイアス印加した探針先端からは、原子状水素(負イオン)ビームと共に低エネルギー電子ビームがSiO_2膜表面に照射されるので、電子ビーム照射で生成されたダングリングボンドを水素が効率良く終端するために、反応活性サイトとなるSi-OH結合やSi-H結合の生成効率が極めて高くなる。
ホスホニウムベタインを用いたデザイン型マルチ機能触媒の設計開発

テトラアリールホスホニウム塩をホスホニウムベタイン前駆体として、第二級アルコールの存在下における第一級アルコールの選択的アシル化反応を検討した。触媒存在下、酸無水物をアシル化剤に用いたところ、反応が円滑に進行し、第一級アルコールが選択的にアシル化されることを見出した。また、テトラアリールホスホニウム塩触媒を用いる二酸化炭素固定化反応を試みた。種々検討した結果、触媒存在下ではエポキシドと常圧の二酸化炭素との反応が進行し、目的の環状カーボネートが収率良く得られた。一つの分子が異なる反応形式で基質を活性化する、従来の有機分子触媒では困難であったマルチ触媒としての機能をもつ新規有機分子触媒の創生とその多機能性の評価を軸に「デザイン型マルチ機能触媒による高効率・高選択的な新規触媒反応の開発」を目的とし、研究を行った。本研究ではホスホニウムベタインの性質を理解する必要があるため、まずアキラルなホスホニウムベタインの合成から着手した。具体的にはブロモフェノール誘導体を出発原料とし、カップリング反応と中和反応の2工程を経ることにより、目的とするホスホニウムベタインの合成に成功した。化合物の構造は、NMRスペクトル解析および単結晶X線解析によって決定した。これまでホスホニウムベタインの合成例は限られており、今回確立した合成法は触媒ライブラリ構築の観点からも優れた手法であるといえる。また、その触媒能を調べた結果、アルコールのアシル化を促進することを見出した。一方、ホスホニウムベタインによる二酸化炭素固定化も検討したが、エポキシドの環拡大による環状カーボネート合成反応においてベタインは全く触媒能を示さなかった。しかし、ベタイン前駆体のホスホニウム塩を用いたところ、同反応の触媒として機能することが明らかとなった。基質一般性を調べた結果、光学活性なエポキシドを用いた場合はほぼ完全な立体保持で生成物が得られ、本触媒系の有用性を示すことができた。今後は光学活性なホスホニウムベタインの合成とそれを用いた不斉触媒反応の開発を目指す。アキラルなホスホニウムベタインの合成に成功し、アシル化反応におけるホスホニウムベタインの触媒能を見出しており、触媒合成法の確立という観点からはある一定の目標は達成されたと考えている。一方、当初の目標としているマルチ機能の創出には至っていない。また、不斉触媒についても、既に鍵合成中間体であるホスホニウム塩の合成は行ったものの、ホスホニウムベタインへの誘導および不斉触媒反応は未検討となっている。したがって現在までの進捗状況を「やや遅れている」と判断した。一つの分子触媒により種々の基質を異なる反応形式で活性化できれば、従来の有機分子触媒では困難であったマルチ触媒としての機能が期待できる。新規有機分子触媒の創生とその多機能性の評価を軸に、デザイン型マルチ機能触媒による高効率・高選択的な新規触媒反応の開発を目的として研究を行った。H28年度はH27年度に引き続きアキラルなホスホニウムベタインの合成およびその触媒能評価を行い、さらにキラル触媒の開発と不斉反応の検討を行った。まず合成した触媒の構造について単結晶X線構造解析の結果を精査したところ、当初の想定とは異なり酸素原子上の負電荷がリン原子に直結する炭素上まで非局在化していることが明らかとなり、ホスホニウムベタインではなくホスホニウムイリドとして扱うほうがより適切であることがわかった。触媒量のホスホニウムイリド存在下、酸無水物を用いる第二級アルコールの共存下における第一級アルコールの選択的アシル化反応を検討した。その結果、イソ酪酸無水物を使用した場合に良好な選択性(19:1)でアシル化反応が進行することを見出した。基質一般性を調べたところ、1,2-、1,3-ならびに1,4-ジオールに対し、第一級アルコールアシル化体が選択的に得られた。NMR実験によりイリドと酸無水物との反応が非常に速く、かつ可逆的に進行することを明らかにした。さらにアシル化反応では一般に補助塩基の使用が必要となるが、イリドは補助塩基無しの条件でも反応を促進し、第一級アルコールのアシル化を与えることがわかった。二酸化炭素固定化反応に関しては、イリド前駆体であるホスホニウム塩が有効に機能し、エポキシドと二酸化炭素のカップリング反応においてグラムスケールでの環状カーボネート合成を実現した。研究実績の概要にも示したが、アキラルなホスホニウムベタインがアルコールのアシル化を触媒するという結果が得られている。したがって、ベタインを用いた2級アルコール存在下における1級アルコールの選択的なアセチル化を検討する。また、ベタイン前駆体のホスホニウム塩がエポキシドと二酸化炭素とのカップリング反応を促進することが明らかとなっている。触媒反応を通してホスホニウム塩の性質を理解するという研究目的に従い、本反応をさらに検討する他、エポキシドの窒素類縁体であるアジリジンにも展開し、反応のスコープを拡充する予定である。28年度が最終年度であるため、記入しない。合成化学28年度が最終年度であるため、記入しない。
自己重力系・長距離力系の準平衡進化

自己重力系をはじめとした長距離力系では,緩和時間が非常に長いことが知られている.また,長距離力系で緩和に向かう途中段階で,初期条件に依らず,時間的変化が非常にゆっくりとした準平衡状態が存在する場合がしばしばみられる.この準平衡状態を記述する方法を,統計力学の立場からの解析的手法,およびGPUなどのプロセッサを用いて高速化したN体粒子シミュレーションの両方を用いて検証した.この結果,自己重力系についてはLangevin方程式を用いた手法で,Kingモデルと呼ばれる密度分布を再現できることを示した.また,長距離力系の簡単なモデルである二次元HMFモデルについて,比熱が負のエネルギースケールでは,準平衡状態が非加法的エントロピーを最大にする分布でフィットできることを示した.一方で,比熱が負のエネルギースケールでは,非加法的エントロピーを最大にする分布関数でフィッティングはできなかった.自己重力系をはじめとした長距離力系では,緩和時間が非常に長いことが知られている.また,長距離力系で緩和に向かう途中段階で,初期条件に依らず,時間的変化が非常にゆっくりとした準平衡状態が存在する場合がしばしばみられる.この準平衡状態を記述する方法を,統計力学の立場からの解析的手法,およびGPUなどのプロセッサを用いて高速化したN体粒子シミュレーションの両方を用いて検証した.この結果,自己重力系についてはLangevin方程式を用いた手法で,Kingモデルと呼ばれる密度分布を再現できることを示した.また,長距離力系の簡単なモデルである二次元HMFモデルについて,比熱が負のエネルギースケールでは,準平衡状態が非加法的エントロピーを最大にする分布でフィットできることを示した.一方で,比熱が負のエネルギースケールでは,非加法的エントロピーを最大にする分布関数でフィッティングはできなかった.質量、エネルギーが保存されるミクロカノニカル分布の下で、Boltzmann-Gibbsエントロピーが最大になる時の分布関数を導出し、システムの平衡状態およびそれに至る緩和過程を議論する。我々は2005年に、エネルギー拘束条件を線形化すろことで、分布関数の収束性を数学的に証明できる、全く新しい逐次近似法を開発した(Tatekawa et al. (2005))。この手法を用いる事により、長距離力系といえども平衡状態を示す質量分布、エントロピー、温度を素早導出でき、臨界エネルギーや相転移の次数の判断も容易である。この解析で得られた平衡状態にシステムがどのように緩和していくかを、多体シミュレーションを用いて調べる。このシミュレーションでは、一般的なモデルにおいては2体相互作用の計算が膨大なものなるため、我々はグラフィックプロセッサを活用した。GPGPUと呼ばれる大規模計算の手法を適用するシミュレーションコードを開発した。また一方で、準平衡状態を記述する可能性があると期持される、様々なエントロピーのモデルについて、エントロピーを最大にする分布関数を導出する手法の構築を試みた。2005年に開発した方法ではBoltzraann-Gibbsエントロピー以外のエントロピーモデルヘの拡張が困難だったため、我々はまた新たな逐次近似法を開発した(Tatekawa et al, in preparation)。この方法は収束性の保鉦はないが、様々なエントロピーモデルへの応用が比較的容易である。新たに開発した逐次近似法を用い、我々はまず平均場でポテンシャルが記述可能である空間2次元モデルの平衡状態、および準平衝と想定される状態の質量分布、温度を導出した。一方で、多体シミュレージョンを用いてカ学的発展を行い、シミュレーションで得られた準平衡状態は、様々なエンドロピーモデルで記述可能かを調査した。平成21年度は逐次近似法計算、計算の途中段階であり、結果の妥当性を検証しているところである。これらの成果については平成22年度に学術論文発表、学会発表を行う予定である。昨年度に引き続き、自己重力系を中心とした長距離力系の進化、緩和過程、平衡状態について考察した。球状星団のモデルとして、エネルギー分布を有限の範囲にとどめたKingモデルがよく用いられる。我々は粒子の集団が及ぼす力を考慮したLangevin方程式を立て、その定常解としてKingモデルに対応する密度分布が与えられる事を示した。この分布は、専用プロセッサを用いた多体問題のシミュレーションの結果ともよく合う。また、多体問題の1つの粒子の質量を他の粒子の質量の510倍にしても、密度分布に大きな影響を与えないことを示した(Tatekawa and Tashiro, 2010 ; 2011)。また、2次元HMFモデルと呼ばれる「負の比熱」のエネルギースケールを持つ、長距離力系のモデルの力学的進化、緩和過程、および平衡状態の解析を行った。多体問題によるシミュレーションを実施したところ、時間変化が非常にゆっくりで、準平衡状態とみなすことが出来る緩和過程が存在することが分かった。一方、非加法的統計力学がこの準平衡状態をうまく表せるかどうかを検討した。この結果、「負の比熱」のエネルギースケールでは、非加法的統計力学によるフィッティングがある程度うまくいき、時間とともにBoltzmann統計に収束していくことが分かった。一方で「正の比熱」のエネルギースケールでは、非加法的統計力学ではフィッティングできないことが分かった(Tatekawa et al., in preparation)。平成22年度は前半の自己重力系の進化について学術論文をまとめ投稿している。また、2次元HMFモデルの進化については国際会議発表を行った。こちらの結果は現在、学術論文としてとりまとめているところである。
哺乳類顎関節形成メカニズムの解析

Trichorhinophalangeal症候群(TRPS)の患者において特徴的な顔貌が見られる要因を見出すことを目的とし、TRPSの約8割で変異が見られる転写因子であるTrps1の遺伝子欠損マウスの頭頸部発生様式を詳細に解析した。Trps1遺伝子欠損マウスはすべてのホモ個体で特に下顎、鼻尖部の矮小化が認められ、下顎においては近位部骨格の低形成を認めた。顎関節を構成する下顎頭の関節軟骨は細胞増殖の低下により重篤な発生障害を示した。また、顎関節の発生も認めず、顎の円滑な運動に必須の関節円板、関節腔の形成が見られなかった。昨年度にマウスTrps1遺伝子欠損マウスにおいて胎生期の顎関節発生異常が認められることを見出した。このことからヒトにおけるTrichorhinophalangeal syndrome(TRPS)の患者において小額が認められる原因の一端が下顎頭成長板の発生異常に起因することが示唆された。またTrps1遺伝子欠損マウスは関節円板、ならびに関節腔の形成がほとんど認められなかったことから、このマウスにおける顎関節形成過程を透過型電子顕微鏡を用いて詳細に観察した。野生型マウスとの違いが認められ始めるのは胎生15.5日において発生中の下顎頭付近の線維芽細胞のコラーゲン分泌量がノックアウトマウスにおいて軽度に減少している像が認められた。ノックアウトマウスにおけるこの傾向は胎生16.5日になるとさらに強くなり野生型との差はさらに明らかになった。胎生18.5日では野生型マウスにおいて明瞭に関節形成要素が認められるようになるが、ノックアウトマウスでは関節円板の形成は認められず個々の細胞の形態は細胞質の量が極度に減少しほとんどが核のみで占められていた。胎生15.5日から16.5日齢において認められたコラーゲン分泌量の低下はin situ hybridization法を用いたI型コラーゲンの遺伝子発現解析から転写レベルでの低下によることが示唆された。コラーゲンは細胞外基質として細胞の分化や局在に寄与することから、Trps1ノックアウトマウスにおいて関節円板の正常発生が認められない原因の一つは適切な場が形成されないことであることが考えられた。TRPS1の変異により起こるTrichorhinophalangeal症候群は骨格、毛髪、顔貌に異常を示す疾患であり、発症する頻度は低いものの著しい低身長や若年での関節炎発症など表現型が重篤な場合がある。また、TRPSの患者は特徴的な鼻部の形態や小顎など頭部の発生異常を示すが、申請者らはその発症メカニズムを解明する目的でTrps1遺伝子欠損マウスの下顎発生過程を詳細に調べた。まずTrps1の遺伝子発現は下顎の近位部に顎関節発生初期から発現し続けることを見出し、その遺伝子欠失により関節円板、関節腔、下顎頭が正常に発生しないことを見出した。そこで次にTrps1遺伝子の発現制御機構を知るため、ヒトとマウスの転写開始部位上流領域のゲノム配列を比較したところ相同性の高い領域がいくつか存在することが分かった。申請者らは転写開始部位約4kbのクローニングを行い、この下流にCreリコンビナーゼのcDNAを組み込んだトランスジーンを用いてトランスジェニックマウスを作製した(Trps1-Cre)。Trps1-CreマウスをCreのレポーターマウスと交配することで、この遺伝子断片の個体レベルでの活性を見ることが可能となる。複数のTrps1-Creマウスのラインを確立後、各々のラインをレポーターマウスと交配した。その結果、いずれのラインも活性の強弱はあるものの、関節軟骨、心臓、腎臓、一部の毛包に活性を認めた。残念ながら顎関節には発生を通じていずれのラインでも活性は見られず、顎関節のエンハンサーはこの4kb以外の領域に位置することが考えられた。上下顎の正常発生は円滑な哺乳、捕食、呼吸に必須である。様々な病態により下顎の低形成(小顎症)が起こるが、特に体幹に近い近位部に低形成の認められる傾向が強いことが知られている。哺乳類において下顎の近位部には側頭-下顎関節(顎関節)が形成される。ヒトTRPS(Trichorhinophalangeal syndrome)はTrps1遺伝子の変異により起こる遺伝性の疾患である。TRPSにおいて下顎の低形成が認められることはすでに知られているが、その原因は全く解析されていない。本年度はTrps1遺伝子欠損マウスの頭蓋顔面部の表現型解析を行い、この遺伝子欠損マウスで重篤な顎関節の発生異常を呈する事を見出した。Trps1遺伝子欠損マウスで胎生14日齢では野生型とほぼ顎関節原基の発生様式を示した。しかし、胎生17日齢においてTrps1遺伝子欠損マウスでは下顎頭軟骨の著明な低形成を認めた。組織学的な検討から、Trps1遺伝子欠損により下顎頭軟骨の成長板における増殖が早期に停止し、分化が促進していることが分かった。

遺伝子発現マーカー検索により、軟骨細胞の肥大化への分化を促進する転写因子Runx2、ならびにそのターゲット因子であるMmp-13の発現領域の拡大が認められた。Trps1の下顎頭軟骨における発現は一時期Runx2の発現と重複する部位がある。さらに、Trps1はRunx2の作用を抑制することが既に報告されているが、ヒトTRPSにおいて認められる変異Trps1はRunx2の転写活性を抑制できないことが分かった。Trps1遺伝子欠損マウスでは顎関節の骨格領域の発生異常のみならず、関節胞、関節円板の発生も全く認められず、顎関節全体の発生にTrps1が必須であることが分かった。今年度は昨年度に得られた知見をさらに詳細に解析する目的で顎関節発生領域を電子顕微鏡により観察した。その結果、関節円板、関節腔を形成する細胞は存在するものの、正常な細胞外基質が産生されないため適切に分化しない可能性を見出した。Trps1遺伝子は発生中の円板発生予定領域に発現することは申請者がすでに報告している。Trps1は過去の報告から転写抑制因子として作用することが報告されており、Trps1ノックアウトマウスにおいて円板発生領域でのコラーゲンの転写が抑制される機序は別因子を介する可能性が考えられる。マウスTrps1遺伝子の転写調節はvivoにおける制御様式を確かめる目的でTrps1遺伝子転写開始部位上流4kbの配列の下流にCre recombinaseを配置したトランスジェニックマウス作成用のトランスジーンのクローニングを終了した。本年度はTrps1遺伝子欠損マウスの頭蓋顔面領域の表現型を詳細に解析し、顎関節の重篤な発生異常が起こっている事を見出した。この結果はヒトTRPSにおいて小顎が認められる原因の一つが下顎頭軟骨成長板の早期の消失により生じている可能性を示している。軟骨細胞が肥大化する過程に必須の転写因子Runx2の発現ならびに作用の拡大が認められ、軟骨細胞の増殖と分化のタイミングをTrps1が調節していることが分かった。また、Trps1は関節円板ならびに関節胞の発生にも必須であることも同時に見出した。これらの結果はCell&Tissue Research誌に発表した。Trps1の遺伝子発現調節機構の解析は、3年目に予定している遺伝子組換えマウスを用いてのエンハンサー解析を成功させるために、マウスTrps1遺伝子転写開始部位上流4kbまでのクローニングを行った。現在全長の塩基配列を確認している。この遺伝子断片を用いプロモーター解析を引き続き行う予定である。今後は以下の二つの点を中心に据えて解析を続行する。マウスTrps1遺伝子上流4kb配列制御下でCre recombinaseを発現するトランスジェニックマウスラインの確立。このトランスジェニックマウスのラインは複数確立できると考えられる。Cre recominaseの発現する細胞の確認はマウスRosa26遺伝子座を利用したレポーターマウスと交配させることにより確認する。レポーターマウスはすでに当学部マウス飼育室で飼育されている。Creマウスとレポーターマウスを交配後、妊娠マウスより胎仔を回収、ホールあるいは切片によるX-galを基質とした染色を行う。
ＰＥＮＤＲＥＤ症候群患者由来のｉＰＳ樹立とそのＰＥＮＤＲＩＮ機能解析

(1)PENDRED症候群特異的iPS細胞の樹立:PENDRED症候群患者3症例から採血を行い疾患特異的iPS細胞を樹立した(2)内耳PENDRIN陽性細胞の誘導法の確立:これまでに内耳PENDRIN陽性細胞の誘導方法は知られていなかった。今回、新規誘導法を樹立し、iPS細胞から内耳前駆細胞マーカー陽性細胞を経て内耳細胞特異的マーカーおよびPENDRED症候群の原因遺伝子であるPENDRINの発現を示す内耳PENDRIN陽性細胞の誘導法を確立した。誘導法の効率化も行いほぼ100%の細胞でPENDRINを発現する高効率誘導法の確立にも成功した。(3)疾患iPS細胞から誘導した内耳PENDRIN陽性細胞と、正常コントロールラインから誘導した内耳PENDRIN陽性細胞の細胞生物学的特性の比較:疾患iPS細胞から誘導した内耳PENDRIN陽性細胞と正常コントロールラインから誘導した内耳PENDRIN陽性細胞の細胞生物学的特性の比較を行い、ストレス脆弱性を疾患iPS細胞から誘導した内耳PENDRIN陽性細胞では示すことを発見した。(4)疾患iPS細胞におけるゲノム編集技術を用いた遺伝子変異修復:疾患iPS細胞に対してTALENを用いてゲノム編集(遺伝子修復)を行い、H723R homo変異ラインにおいて、1アリルのみ正常化したラインおよび2アリルとも正常化されたラインの樹立に成功した。前述の疾患細胞由来の内耳細胞にのみみられるストレス脆弱性は遺伝子修復により軽減されることを確認した。(5)疾患iPS細胞から誘導した内耳PENDRIN陽性細胞におけるストレス脆弱性をターゲットとした薬剤スクリーニング系の構築とそれを利用した既存薬スクリーニングの実施:疾患細胞由来の内耳細胞にのみみられるストレス脆弱性を評価対象とし、既存薬スクリーニングを行いストレス脆弱性を軽減する薬剤の同定に成功。翌年度、交付申請を辞退するため、記入しない。Pendred症候群患者由来の疾患特異的iPSの樹立:当初の予定通り今回我々は、国立病院機構東京医療センターとの共同研究として、同センターより患者採血検体の供給を受け血球細胞に対してエピソーマル法で遺伝子導入を行いPENDRED症候群特異的iPS細胞の樹立を慶應義塾大学岡野研究室との共同研究で行った。すでに3患者から3ラインずつ計9ラインの樹立を終えており、正常核型、未分化細胞マーカー発現、多分化能についても確認を終えている。正常対象及び患者由来iPS細胞の分化誘導:PENDRED症候群はSLC26A4遺伝子の変異により生じる異常PENDRINが原因であると考えられており、内耳における疾患iPS細胞を用いた病態生理解明を行うためには、内耳PENDRIN陽性細胞の誘導が必須であった。今回我々は当科における独自の内耳のPENDRIN陽性細胞の誘導に成功した。本方法では、まず、内耳前駆細胞を誘導し、そこからさらに分化誘導することにより内耳PENDRIN陽性細胞を得ることに成功した。PENDRINの発現を免疫細胞染色、PCR法およびWB法で確認しており、その他の内耳特異的マーカーの発現も確認している。本誘導方法は、ほぼ100%の細胞がPENDRINを発現することがわかり、申請書で記載したレポーター作成は不要であった。正常対象および患者由来iPS細胞から誘導された内耳PENDRIN陽性細胞の比較検討:前述の方法で、正常対象から誘導されたPENDRIN陽性細胞と患者iPS細胞由来のPENDRIN陽性細胞の比較検討を行った。この結果、後者には前者には見られない細胞レベルでのストレス脆弱性が認められた。この表現型はこれまでのPENDRED症候群のモデルマウスでは報告されておらず今後さらなる分子生物学的検討を行う予定である。

当初の計画で予定されていた、疾患iPS細胞の樹立と内耳PENDRIN陽性細胞の誘導法の確立については、ほぼ終えており、また誘導法の高効率化に成功したためレポーター作成は不要になった。病態生理の解明を目指した疾患解析はまだ達成途中であるが、新規病態生理解明に結びつく新規ストレス脆弱性も見出しており、計画初年度を終えた段階での達成度としては当初の計画以上と考えている。翌年度、交付申請を辞退するため、記入しない。今後の研究の推進方策であるが、正常対象と患者由来iPS細胞から誘導したPENDRIN陽性細胞の表現型解析をさらに進めていく方針である。この差をより明確に示すために患者由来iPS細胞の遺伝子異常をゲノム編集技術を用いて修復し、変異部分以外はすべて患者iPS細胞と同じゲノムを持つISOGENIC LINEの樹立も行う予定である。このラインにおいて前述の表現型が患者型でなく正常対象と同じになれば、今回見出した新規表現型が疾患に伴う変異に由来することが示せ、疾患解析の大きな力となる。また、同時にこのストレス脆弱性を軽減するような薬剤スクリーニングについても取り組んでいく方針である。
遺伝子操作マウスを用いた住血吸虫症ワクチン開発に関する基礎的研究

住血吸虫症のワクチンの開発に資するため、遺伝子操作マウスを用いて住血吸虫感染に対する防御免疫機構について検討した。まず、日本住血吸虫感染においては、γ線照射セルカリアを免疫に用いた場合、DBA/2マウスでは攻撃感染に対する強い防御免疫が誘導だれるのに対し、C57BL/6では全く防御免疫が誘導されないが、このことをC57BL/10やB10D2マウスなどを用いて再度確認するとともに、Th1及びTh2サイトカイン応答について検討した。その結果、DBA/2やBALB/cではIFNγのさん清華認められるのに対し、C57BL/6ではその産生が全く認められないことが判明した。そこで、Th1応答に障害の感染に対する防御免疫について検討したところ、KOマウスでは有意な感染防御が観察されず、脾細胞の免疫応答では、野生型(WT)と比較し、Th2(IL-4、IL-10)の2次応答は同程度に起こるが、IFNγの2次応答は顕著に低下していることが判明した。また、産生されたサイトカイン総体としてのマクロファージ刺激能を、シストソミュラ障害性およびNO産生で検討したところ、いずれも顕著に低下していた。さらに、組換えIFNγでの刺激実験により、マクロファージ自体のシストソミュラ障害能も低下していることが明らかになった。以上の事実から、転写因子IRF-1はマンソン住血吸虫感染に対する防御免疫において必須であることが明らかになった。一方、好酸球増多のみられるIL-5トランスジェニックマウスでは、この免疫方法では日本住血吸虫感染に対する防御免疫を誘導することができなかったことから、in vitroの系で抗体依存性シストソミュラ障害作用をラット好酸球と比較したところ、マウス好酸球は後者に比べ障害作用が弱いことが判明した。また、その理由として、幼虫への接着能並びにペルオキシダーゼやO_2の産生と分泌が低いことが明らかとなった。住血吸虫症ワクチンの開発に資するため、遺伝子操作マウスを用いて住血吸虫感染に対する防御免疫機構について検討した。すでに、マウスにおいては、マンソン住血吸虫の感染に対し、γ線照射セルカリアの接種により不完全ながら防御免疫を誘導できることが知られており、IFNγやNOの関与の可能性が報告されてきている。そこで、Th1応答に障害のみられることが予想されるIRF-1ノックアウト(KO)マウスを用いて、マンソン住血吸虫感染に対する防御免疫について検討した。その結果、KOマウスでは有意な感染防御が観察されないことが示された。脾細胞の免疫応答では、野生型(WT)と比較した場合、Th2(IL-4、IL-10)の2次応答は同程度に起こるが、IFNγの2次応答は顕著に低下していることが判明した。また、産生されたサイトカイン総体としてのマクロファージ刺激能を、シストソミュラ傷害性およびNO産生で検討したところ、いずれも顕著に低下していた。さらに、組換えIFNγでの刺激実験により、マクロファージ自体のシストソミュラ傷害能も低下していることが明らかになった。液性免疫では、IgG抗体産生が低下していた。以上の事実から、転写因子IRF-1はマンソン住血吸虫感染に対する防御免疫において必須であり、IRF-1KOマウスではさまざまなレベルで虫体に対する免疫応答が低下した結果、感染防御の消失が観察されることが明らかになった。

まず、日本住血吸虫感染においては、γ線照射セルガリアを免疫に用いた場合、DBA/2マウスでは攻撃感染に対する強い防御免疫が誘導されるのに対し、C57BL/6では全く防御免疫が誘導されないが、このことをC57BL/10やB10D2マウスなどを用いて再度確認するとともに、Th1及びTh2サイトカイン応答について検討した。その結果、DBA/2やBALB/cではIFNγの産生が認められるのに対し、C57BL/6ではその産生が全く認められないことが判明した。そこでTh1応答に障害のみられることが予想されるIRF-1遺伝子欠損(KO)マウスを用いて、マンソン住血吸虫感染に対する防御免疫について検討したところ、KOマウスでは有意な感染防御が観察されず、脾細胞の免疫応答では、野生型(WT)と比較し、Th2(IL-4、IL-10)の2次応答は同程度に起こるが、IFNγの2次応答は顕著に低下していることが判明した。また、産生されたサイトカイン総体としてのマクロファージ刺激能を、シストソミュラ傷害性およびNO産生で検討したところ、いずれも顕著に低下していた。さらに、組換えIFNγでの刺激実験により、マクロファージ自体のシストソミュラ傷害能も、低下していることが明らかになった。以上の事実から、転写因子IRF-1はマンソン住血吸虫感染に対する防御免疫において必須であることが明らかになった。一方、好酸球増多のみられるIL-5トランスジェニックマウスでは、この免疫方法では日本住血吸虫感染に対する防御免疫を誘導することができなかったことから、in vitroの系で抗体依存性シストソミュラ傷害作用をラット好酸球と比較したところ、マウス好酸球は後者に比べ傷害作用が弱いことが判明した。また、その理由として、幼虫への接着能並びにペルオキシターゼやO_2の産生と分泌が低いことが明らかとなった。
タンガニイカ湖産シクリッドにおける生殖行動の多様化と精しょうタンパク質の進化

カワスズメ科魚類(以下ミクリッド)の精液中には精しょう糖タンパク質SPP120が存在し、このタンパク質はミクリッドに特徴的な口内受精行動において受精成功に寄与えるタンパク質と考える。一方で、タンガニイカ湖に生息するミクリッドには口内受精行動を示さない種が多くいる。本研究課題では、受精行動の変化とSPP120の分子進化率の関係性を検討した。その結果、数ある口内受精行動を示さない種の多くでは、複数のコドンの正の選択が明らかとなった。以上の結果は、行動の変化が受精成功に関わる遺伝子の進化に影響を及ぼしたことを示すものである。カワスズメ科魚類(以下シクリッド)の精液中には精しょう糖タンパク質SPP120が存在する。このタンパク質は、多くの糖鎖付加サイト、VWDドメイン、C8ドメイン、ZPドメインをもつ。推察されていた機能は、精液の粘性を上昇させるとともに、精子の運動を抑制すると報告されていた(Mochida et al2002)。またこのシクリッドに特徴的な行動として、口内受精行動がある(Mrowka 1987)。これは、雌が雄の生殖口から精液を口の中へ移動させたのち、産んだ卵を直ちに口に含み、受精が起こる行動である。この受精行動に対して、粘性および精子の運動抑制を起こすSPP120は口内に精液をとどめるといった観点から機能的である。一方で、種分化の過程で、口内受精行動を示さなくなった種も多くおり、このような種では、精液が受精する際にいち早く拡散し、精子の運動も即座に開始することが、受精成功に寄与すると考えられる。しかしながら、産卵行動の詳細な観察と、SPP120の分子進化の関係性は不明なままであった。そこで、産卵行動の観察と、様々な受精行動を示すタンガニイカ湖産シクリッドからSPP120の遺伝子を単離し、受精行動の変化に伴ってSPP120の機能変化が起こったか、非同義/同義置換率を指標に解析した。その結果、数ある口内受精行動を示さない種の中でも、雄が砂で半円状のbowerと呼ばれる産卵場所を作成する種では、野外観察から、雄は精液を雌の口内へ直接渡す訳ではなく、雌が卵を産卵する前に、雄はbower内に精子を放出し、その放出した精子を用いて受精が起きている可能性が高いことが判明した。さらに、このような受精行動の変化した種で、複数のコドンに特異的に非同義置換率が上昇していたこと(正の選択)が明らかとなった。今後、この正の選択がどのような機能変化を生み出したか、多角的に検証して行く予定である。タンガニイカ湖に生息するカワスズメ科魚類(シクリッド)は、同じ科内でありながら多様な配偶行動を示す。なかでも、メスがオスの生殖口から精液を吸い、メスの口内で受精が完了する口内受精行動は特筆すべき行動の1つである。この口内受精行動において、精液はメスの口内へ伝達する必要があるため、口内受精行動を示す種では精液はコロイド状の精しょうに包まれており、精しょう中では精子の運動は抑制されている。このコロイド状の精しょうにはシクリッドにしかない精しょうタンパク質SPP120が含まれている。予備的な研究で、このSPP120は精子の運動を抑制する報告があり、精子の運動抑制に関わると推察されている。従って、SPP120は精液をメスの口内へ効率よく伝達するために精子の運動を抑制しコロイド状の精液を産み出していると考えられる。つまりSPP120は口内受精行動に適したタンパク質であると言える。一方で、タンガニイカ湖に生息するシクリッドの多くは、種分化の過程で口内受精行動から他の受精行動へと変化した種が多く、SPP120は受精成功に適していないと考えられる。これらの種では、精液が素早く拡散し、そして精子の運動の活性化が素早く起きるほうが、受精に適していると考えられる。つまり、口内受精行動とは異なり、SPP120の機能を必要としない。このような受精行動の変化が、SPP120の進化とどのような関係性があるか、1)行動の観察、2)SPP120のcDNAクローニング(20種)、3)SPP120の翻訳(28種)に関して考察を行った。結果として1)口内受精行動を示さない種ではSPP120は偽遺伝子化している事が多い、2)SPP120の翻訳は、口内受精行動を示す種で多く発現している事が判明した。現在、非同義/同義置換率を指標にした分子進化解析を行って、変異がSPP120の機能にどのような影響を及ぼすか検討中である目標である1)多くのシクリッドのサンプルを採集し、2)遺伝子の単離を行う、は概ね順調に進んでいる。採集はタンガニイカ湖産シクリッドの20種くらいは採集に成功した。

ただし、非常に採集の難しい種(L.profundicola)もおり、この種の採集には成功していない。次年度に、捕獲方法等を含めた対策を検討している。SPP120の機能をさらに詳細に検討するために、1)非同義/同義置換率の検討をPAMLで行い、2)行動の変化した種でどのような変異が選択されたか検定する、3)変異の選択されたコドンサイトに人工的に変異を入れた発現コンストラクト(pColdベクターなどを使用)を作成し、SPP120の機能に繋がるか検討する。旅費:20万円消耗品費:90万円(発現ベクターによる発現系の解析など)
半単純リー群のユニタリ表現の分岐則とその応用

次の3つの異なる分野i)不定値な計量をもつ等質多様体における不連続群(特に一葉格子)の存在問題ii)非コンパクト不定値Stiefel多様体上の離散系列表現の構成iii)非コンパクトリーマン多様体のラプラシアンの点スペクトラム(砂田氏の提起した問題)において研究代表者が最近数年行ってきた研究の接触点において,ユニタリ表現論の新しい結果が生まれつつあった状況で,当該研究は出発した。さて,半単純の既約ユニタリ表現の中で特に重要なクラスである表現は楕円軌道のindefinite-Kahler polarizationによる幾何学的量子化として得られるAq(λ)という表現であるが,当該年度の研究の主なものは,1.既約ユニタリ表現Aq(λ)を簡約部分群に制限したとき連続スペクトラムが存在しないための十分条件を証明した。2.1.の応用として,主な非コンパクト等質多様体について離散系列表現が存在するかを決定した。3.1.の応用として,球調和関数における古典的な有限次元表現の分岐束を非コンパクトな設定に拡張し,無限次元ユニタリ表現の制限公式を証明した(デンマークのOrsted教授と共同研究)。4.1.の応用として,ある局所エルミート対称空間のホッジ構造において,整数論から予想されていた消滅定理を証明した(東京大学の織田孝幸氏と共同研究)。5.1.とは逆に,連続スペクトラムが存在するための十分条件を証明した。6.曲面の積分幾何の逆公式を無限次元多様体の上での解析を行って証明しこれを等質多様体の調和解析に応用した。(アメリカのGindikin教授との共同研究)7.一般の実線形簡約リー群の等質多様体に離散部分群が作用しているときこの作用が固有不連続になるための必要十分条件を証明した。
非線形力学系理論による斜め追波中の船舶の転覆現象の解明

本年度は、非線形力学系理論による斜め追波中の船舶の転覆現象の解明に向けての研究の第1歩として、追波、斜め追波中の船の非線形船体運動の定性的性質を網羅的な数値計算により検討した。また、そこに用いた数学モデルに2次の項を加えることでの改良も試みた。まず運動の定性的性質については、波の2次の項をすべて無視した4自由度数学モデルを用いて、プロペラ回転数とオートパイロット・コースという二つの操船パラメーターを密なグリッドに区切って網羅的な数値実験を行った。得られた結果について運動の特性の判定を行い、定常周期運動、安定波乗り、ブローチング、転覆にすべて分類され、その他の運動は存在しないことを確認した。さらに異なる運動の間の境界がなめらかな場合とフラクタル的な場合のあることを示した。またブローチングと周期運動の間の境界がヘテロクリニック分岐とみなせることも確かめた。モデルの改良については、平水中非線形操縦性流体力微係数を付加した場合を計算し、その影響が無視できることを見いだした。さらに、線形操縦性流体力微係数が波により変動する影響を細長体理論により計算し、既存の拘束模型実験と比較した。そしてさらに、この微係数の変動が運動にどのような影響を及ぼすかを検討した。その結果、旋回や舵に関する微係数変動の影響は無視できるが、横流れに関する微係数変動の影響は有意であることを見いだした。しかしながら、これらの2次の項の付加は自由航走模型実験との一致度を改善することにはつながらず、今後のすべての2次の項を考慮したモデルの構築を待つ必要が残った。
機能性プラスチック光ファイバを用いた各種アルコールの光センシング

本研究は、プラスチック光ファイバ(Plastic Optical Fiber:POF)やプラスチック光導波路を用いて、メタノールなどのアルコールを検出する光センサの実現を目指すものである。その原理は、センシングクラッドにアルコールに対して膨潤を示すポリマを用いることで、POFなどの導波路の導波状態が、漏れ導波路型から導波型へ変わることによる大きな透過光強度変化を用いるものである。以下の結果が得られた。[POF型センサヘッド]1.市販のポリカーボネート(PC,nd=1.58)製POFの一部をテーパー型にし,その部分のクラッド層を除去してポリスチレン導波層(PS,nd=1.60)をコーティング後,さら膨潤性ノボラック錯体(nd=1.61)をセンシング層とする半漏れPOF型センサの作成を行った。このセンサは、エタノール水溶液に対して、良い応答を示した。検出特性は、その濃度が5%以下でも測定可能であり,その応答も1分程度と非常に短いことが確認できた。2.コア径0.25mm,センサ長が5cmのPMMAコア上に、センシングクラッドとして、ポリエチレンビニルアルコールを塗布することによってPOF型センサを作成した。このセンサは、11%のメタノール蒸気に対しては40倍の透過光強度増加を示した。本センサは濃度2%以下でも測定可能であり,その応答は2分程度あることが確認できた。[チャネル導波路型センサヘッド]本研究は、プラスチック光ファイバ(Plastic Optical Fiber:POF)やプラスチック光導波路を用いて、メタノールなどのアルコールを検出する光センサの実現を目指すものである。[チャネル導波路型センサヘッド]本研究は、安価なプラスチック光ファイバー(Plastic Optical Fiber : POF)を用いたメタノール、エタノール、イソプロピルアルコールなどを検出するアルコールセンサの実現を目指すものである。その原理は、センシングクラッドにアルコールに対して膨潤を示すポリマを用いることで、POFの導波状態が漏れ導波路型から導波型へ変わることによる大きな出力光強度変化を用いるものである。本年度は、最適なPOFアルコールセンサの作成、およびその基本的なセンシング特性の測定を行った。[センサヘッドの作成]さまざまな形状のPOFセンサを試みた結果、市販のポリカーボネート(PC,nd=1.58)製POFの一部をテーパー型にし,その部分のクラッド層を除去してポリスチレン導波層(PS,nd=1.60)をコーティング後,さら膨潤性ノボラック錯体(nd=1.61)をセンシング層とする半漏れPOF型センサーヘッドにしたものが最適であることがわかった。[基本的なセンシング特性]センサーヘッド部コア径0.25mm,センサ長が5cmのときに、本POFセンサはエタノール水溶液に対して、良い応答を示した。このことから、POF光アルコールセンサとして使用できる可能性が示された。本研究は、メタノールなどのアルコール検出する光センサの実現を目指すものである。その原理は、プラスチック光ファイバー(Plastic Optical Fiber:POF)やチャネル導波路のセンシングクラッドにアルコールに対して膨潤を示すポリマを用いることで、これらの光導波路が漏れ型から導波型へ変わることによる大きな出力光強度変化を用いることによる。本年度は、センシングポリマとして新たにポリアセタールとポリエチレンビニルアルコールを用いると共に、POF型の他にチャネル導波路型センサも作成して、そのセンシング特性の測定を行った。1.センサヘッドの作成POF型センサとして、直径0.5mmおよび0.25mmのPMMAコア上に、センシングクラッドとして、ポリアセタールまたはポリエチレンビニルアルコールをディップコーティング法で塗布することによりそれぞれ作成した。チャネル導波路型センサとしては、5μm×5μmと35μm×65μmのチャネル導波路の上部にポリアセタールまたはポリエチレンビニルアルコールを塗布することによって作成した。2.センシング特性POF型センサについては、ポリエチレンビニルアルコールをクラッドポリマを用いた、コア径0.25mm,センサ長が5cmのものが良い特性を示し、11%のアルコール蒸気にたいして40倍の透過光強度増加をしめした。
HMGB1蛋白過剰発現間葉系幹細胞移植を用いた心不全に対する再生医療の開発

本研究においては、採取法と継代培養法を確立させたラットからの初代培養骨髄間葉系幹細胞(mesenchymal stem cell:MSC)を、HMGB1タンパクを過剰発現させるように遺伝子導入して遺伝子改変を行い、そのHMGB1タンパク過剰発現MSC株の安定した培養法の確立を目指していた。ラットより採取したMSCの採取方法と継代培養法は確立することができた。しかしながら、MSCに遺伝子導入法を用いてHMGB1タンパク過剰発現MSC株を確立するため、当初センダイウイルスベクターを用いて初代培養によって得たMSCに遺伝子導入しようとしたが成功しなかった。さらにはアデノウイルスベクター、レトロウイルスベクター、アデノ随伴ウイルスベクター等の様々な試薬やプラスミドベクターを用いてHMGB1タンパク過剰発現MSC株の確立を試みたが、目的とするHMGB1発現量を達成することができなかった。その原因としては、初代培養MSCへの遺伝子導入法がなかなか確立できなかったことに加えて、HMGB1タンパクを過剰発現させるために必要な野生型HMGB1発現プラスミドも様々な論文を参考にしたが、最適に遺伝子導入されるためのHMGB1プラスミドを確立することができなかった。以上の理由から本研究を遂行するための絶対条件であるHMGB1過剰発現初代培養MSC株の樹立に至らず、本研究の目標を達成することができなかった。平成27年度の研究計画においては、ラットからの骨髄間葉系幹細胞(MSC)採取法とその継代培養法の確立とHMGB1蛋白過剰発現株の確立を目指していた。本研究の実験モデルが自家骨髄由来間葉系幹細胞移植モデルであるため、ラットは近交配系ラットであるLewis系ラットを使用した。イソフルレン吸入麻酔下でラットを頸椎脱臼させて安楽死させた。速やかに腓骨および脛骨を採取し清潔下で骨髄を採取した。遠心分離によって線維組織成分と分離させた細胞成分をminimum essential medium(MEM)αに混合し、それをフラスコ内に播種し、継代培養を繰り返したところ、線維芽細胞様の紡錘形細胞の増殖が観察された。上記の方法によって採取できた細胞がMSCであるかどうかを確認するためには、これらの細胞が多分化能、特に骨細胞分化能・脂肪細胞分化能を証明しなければならないため、それそれの細胞への分化誘導培地を準備し、上記細胞を、それぞれの分化誘導培地下で培養した。骨への分化を確認するためにはAlkalinephospatase染色を、脂肪への分化を確認するためにはOil red O染色を行わなければいけないが、現在骨および脂肪への分化誘導の確認中である。本年度中に上記の初代培養法により獲得できたMSCにHMGB1発現プラスミドを遺伝子導入して、HMGB1過剰発現株の確立を目標としていたが、それに関しては現在遂行中である。MSCの初期培養法および継代培養法の確立に難渋している。平成28年度の研究計画においては、平成27年度で採取法と継代培養法を確立させたラットからの骨髄間葉系幹細胞(mesenchymal stem cell:MSC)を、HMGB1タンパクを過剰発現させるように遺伝子導入して遺伝子改変を行い、そのHMGB1タンパク過剰発現MSC株の安定した培養法の確立を目指していた。平成27年度研究計画におけるラットMSC採取法とその継代培養法の確立が遅れていたため、同時にその確率も目指していた。イソフルレン吸入麻酔下でラットを頸椎脱臼させて安楽死させ、速やかに大腿骨および脛骨を採取し清潔環境下で骨髄を採取した。遠心分離によって得た細胞成分をminimum essential medium(MEM)αに混合し、フラスコ内に播種し、継代培養を繰り返すことによって、繊維芽細胞用の紡錘形細胞の増殖が観察された。上記の方法によって採取できた細胞がMSCであるかどうかを確認するためには、これらの細胞が他分化能、特に骨細胞・脂肪細胞への分化能を有することを証明しなければならないため、それぞれの細胞への分化誘導培地を準備し、上記細胞をされぞれの培地上で培養した。現在、それらの分化能を確認中である。また、HMGB1タンパク過剰発現MSC株を確立するため、当初センダイウイルスベクターを用いて初代培養によって得たMSCに遺伝子導入しようとしたが、未だ成功せず、現在様々な試薬やプラスミドベクターを用いてHMGB1タンパク過剰発現MSC株の確立を遂行中である。MSCの他分化能確認のための方法の確立に難渋している。本研究の進行状況は遅れており、平成29年度の研究計画においては、採取法と継代培養法を確立させたラットからの骨髄間葉系幹細胞(mesenchymal stem cell:MSC)を、HMGB1タンパクを過剰発現させるように遺伝子導入して遺伝子改変を行い、そのHMGB1タンパク過剰発現MSC株の安定した培養法の確立を目指していた。上記の方法によって採取できた細胞がMSCであるかどうかを確認するためには、これらの細胞が他分化能、特に骨細胞・脂肪細胞への分化能を有することを証明しなければならないため、それぞれの細胞への分化誘導培地を準備し、上記細胞をそれぞれの培地上で培養した。

また、HMGB1タンパク過剰発現MSC株を確立するため、当初センダイウイルスベクターを用いて初代培養によって得たMSCに遺伝子導入しようとしたが、未だ成功せず、現在様々な試薬やプラスミドベクターを用いてHMGB1タンパク過剰発現MSC株の確立を遂行中である。本研究においては、採取法と継代培養法を確立させたラットからの初代培養骨髄間葉系幹細胞(mesenchymal stem cell:MSC)を、HMGB1タンパクを過剰発現させるように遺伝子導入して遺伝子改変を行い、そのHMGB1タンパク過剰発現MSC株の安定した培養法の確立を目指していた。ラットより採取したMSCの採取方法と継代培養法は確立することができた。しかしながら、MSCに遺伝子導入法を用いてHMGB1タンパク過剰発現MSC株を確立するため、当初センダイウイルスベクターを用いて初代培養によって得たMSCに遺伝子導入しようとしたが成功しなかった。さらにはアデノウイルスベクター、レトロウイルスベクター、アデノ随伴ウイルスベクター等の様々な試薬やプラスミドベクターを用いてHMGB1タンパク過剰発現MSC株の確立を試みたが、目的とするHMGB1発現量を達成することができなかった。その原因としては、初代培養MSCへの遺伝子導入法がなかなか確立できなかったことに加えて、HMGB1タンパクを過剰発現させるために必要な野生型HMGB1発現プラスミドも様々な論文を参考にしたが、最適に遺伝子導入されるためのHMGB1プラスミドを確立することができなかった。以上の理由から本研究を遂行するための絶対条件であるHMGB1過剰発現初代培養MSC株の樹立に至らず、本研究の目標を達成することができなかった。他の研究施設で確立された方法を試行しているが、その他の液体培地やサプリメントを試行する予定である。他施設で確立された方法を施行しているが、その他の液体培地やサプリメントを施行する予定である。研究計画書に則った方法での研究推進に最大限の努力を払うが、他施設での報告を参考にし、施行することで最良の方法にup-dateしていく実験の進行が遅れており、当該年度に目標としていた実験が行われなかったものがあるため。実験の進行が遅れており、当該年度に目標としていた実験が行われなかったものがあるため。(理由)実験の進行が遅れており、当該年度に目標としていた実験が行われなかったものがあるため。(使用計画)MSCへの遺伝子導入方法の確立のための試薬やベクター類を考慮し、施行する予定である。MSCの初期培養法と継代培養法の確立に別の培地や別種のラットの使用を考慮し、また実際に試行する予定である。MSCへの遺伝子導入方法の確立のための試薬やベクター類を考慮し、施行する予定である。
神経回路形成期におけるチロシンホスファターゼPTPδ及び相互作用分子の機能解明

ニューロピリン1(NRP1)とPTPδの相互作用の検討:昨年度見いだした細胞外領域における2分子の相互作用をさらに検討した。マウス脳より抗PTPδ抗体を用いて免疫沈降を行ったところ、NRP1が免役共沈した。これは生体内においても2分子が相互作用していることを示す。COS-7細胞にNRP1とPTPδを同時に発現させ、セマフォリン-3A(Sema3A)を添加すると、細胞の形態変化が見いだされた。この反応は以前に報告されたNRP1とPlexin-Aの複合体によって媒介される反応に類似した。またNRP1,PTPδをそれぞれ単独で発現させた細胞ではSema3Aによる形態変化は見いだされなかった。次にこの反応がPTPδの細胞内ホスファターゼ領域により媒介されるかを検討した。PTPδは2つのホスファターゼ領域(D1,D2)を持ち、D1領域のみに酵素活性があると考えられている。D1領域の変異体とNRP1を共発現させた細胞は、Sema3Aによる形態変化を起こさなかった。一方、D2領域の変異体は野生型と同様に反応を媒介した。この結果はPTPδD1領域のホスファターゼ活性によりSema3Aの反応が細胞内へ伝えられることを示唆している。さらにPTPδと同じファミリーの分子であるLARやPTPσを用いて同様の実験を行ったが、細胞の形態変化は見いだされなかった。1)PTPδに結合する100kDaチロシンリン酸化タンパク質の同定及び機能解析100kDaチロシンリン酸化タンパク質をMALDI-MS解析にて同定し、Zinedinを得た。HEK293T細胞にPTPδとzinedinを共発現させ、相互作用を確認した。しかしZinedinはHEK293T細胞中ではチロシンリン酸化されず、現在この相互作用の意義は不明である。Plexin-A4の細胞外領域に対する抗体を作成し、マウス脳を可溶化した分画からの免疫沈降を試みた。100kDaにはチロシンリン酸化されたタンパク質は見いだされなかったが、120KDaのチロシンリン酸化タンパク質が会合していることがわかった。現在このタンパク質の同定を試みている。ADE2はPTPδのD2領域に結合すること、さらにADE2のSAICAR領域がこの結合に関与することがわかった。しかしこの結合はD1領域の酵素活性は変化させなかった。4)PTPδと細胞外で相互作用する分子の検索および解析PTPδには選択的スプライスにより細胞外領域の長さが異なるものが4つ存在する(A,B,C,D)。そのうち、3つのイムノグロブリン様(Ig)領域を持つC,Dが、Sema3Aの受容体であるニューロピリン1(NRP1)に数nMの親和性で結合することがわかった。この結合はPTPδC,Dの最初のIg領域と、NRP1のCUB領域との相互作用と考えられた。CUB領域はSema3Aが結合する領域と同じであり、Sema3AとPTPδC,D細胞外領域は競合関係にあると考えられた。実際にPTPδDの細胞外領域はSema3AのNRP1への結合を阻害し、さらにSema3Aによる脊髄後根神経節の退縮反応を阻害した。