hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
中耳真珠腫におけるエピジェネティクス制御機構の解明

中耳真珠腫は、根治治療は手術のみである。低侵襲な経外耳道的内視鏡下耳科手術(TEES)で行う症例が増えているが、乳突蜂巣に進展する真珠腫は耳後部切開での顕微鏡下手術が必要となる。このような症例にも低侵襲に治療を行うために、TEESに追加できる補助的治療法の確立が望ましい。これまで、エピジェネティクスは腫瘍、統合失調症、生活習慣病、慢性炎症性疾患などの疾患で関与しているといわれ、腫瘍領域を中心として治療応用が報告されている。本研究では、中耳真珠腫においてエピジェネティクスな変化が遺伝子レベルでどのように影響するかを明らかにする。最終的にはTEESと補助的治療のコンバインド療法の確立を目指す。
癌治療における放射線誘発非アポトーシス型細胞死の重要性とその分子機序の解明

放射線がヒト固形腫瘍由来細胞へ誘発する細胞死形態を生細胞イメージングにて解析した結果、放射線を照射した細胞周期に依存せず、G1期で長期間の細胞周期停止が誘導されることを示した。特にG2期照射の場合では、p53存在下で分裂期を介さずにG2期からG1期へ直接細胞周期を進行させることが確認されたため、タキソールを併用する放射線化学療法がp53機能を欠損したがん細胞に対して有効な治療法となる可能性が示唆された。本年度行った研究成果から、放射線照射によって乳癌細胞で誘導される1.非アポトーシス型細胞死の系譜、2.マイトティック・カタストロフィ(MC)誘導機構を明らかにした。まず、放射線治療で用いられる10GyのX線を照射し、その後5日間にわたる生細胞イメージングを行うことで個々の細胞系譜を解析した。照射細胞の約60%は分裂期へ進行しなかったが、残りの40%は分裂期へ進行したものの、細胞分裂時に異常な細胞核分配様式を示すMCが必ず観察された。そのうち約90%は、分裂後に娘細胞同士の細胞融合が起こった結果、多数の細胞核を持つ細胞が形成された。その他、分裂期進行の有無に関係なく、ネクローシス様の特徴を示す細胞が全体で10%程度観察された。細胞老化マーカーである老化関連βガラクトシダーゼ染色の結果から、いずれの細胞系譜をたどった細胞でもマーカーに対して陽性を示した。すなわち、放射線誘発老化様増殖停止が乳癌細胞の主要な細胞死であり、一部の細胞では引き続きネクローシスが誘導されることが示された。次に、MC誘導細胞で生じた異常な細胞核分配の分子機構を調べるため、β、γ各チューブリンを照射24時間後に観察される分裂中期細胞で検出した。3個以上の分裂極をもつ細胞は1%未満で、ほぼ全ての細胞で正常な分裂極数が検出された。緑色蛍光タンパク質(GFP)でラベルされたヒストンH2Bタンパク質を導入し、染色体分配の様子を生細胞イメージングで解析した。放射線照射後では分裂極へ移動しない染色体が観察され、細胞分裂後の小さな細胞核の原因となることが明らかとなった。加えて、MCで生じる小さな細胞核領域ではCENP-Aが検出されなかった。すなわち、放射線により生じるDNA二重鎖切断が修復されないうちに分裂期へ進むと、動原体をもたない染色体断片が原因となってMCが誘導されることが示唆された。昨年度の成果より、ヒト乳がん細胞(MCF-7)における主要な放射線誘発細胞死形態が老化様増殖停止であることを示した。一般的にがん細胞では細胞周期制御機構の異常が知られているため、本年度は老化様増殖停止誘導機構の解析を行った。細胞周期マーカーを導入したMCF-7に、10Gy照射後、5日間にわたる生細胞イメージングを行い、細胞周期動態を個別に解析した。G1あるいはG2期照射に関わらず、最終的にはG1期で増殖を停止した。G1期照射では、照射後そのままG1期に留まる場合と、細胞周期を進行した場合では、次のG1期で増殖停止が誘導された。G2期照射では一過的に細胞周期の進行が遅延するが、その後分裂期、G1期まで進行した後に増殖停止した場合と、分裂期特異的な形態を示さずにG1期へ進行する経路が観察された。特に後者においては生細胞イメージングにおいてそのような細胞を特定後、蛍光免疫染色法によりG1期特異的な細胞核内への蓄積を示すサイクリンEが検出されたことから、分裂期を介さないG2期からG1期への移行、いわゆる分裂期のスキッピングが明確に示された。この分裂期をスキッピングした細胞でも、その他の経路を通過した場合と同様に老化様増殖停止の誘導が確認された。加えて、G1期チェックポイント機構において重要な機能を示すp53をshRNAによって発現抑制すると、老化様増殖停止の解除が一部にとどまったことは、p53非依存的な老化様増殖停止の発現を示唆する。一方で、p53の発現抑制は分裂期のスキッピングを抑制することに加えて、分裂期の出現頻度を増加させたので、p53が分裂期スキッピングの誘導に関与することが示された。本年度の解析結果は放射線治療に対して(1)高線量照射ではp53ステータスが放射線感受性に著しい影響を与えない、(2)p53欠損がん細胞、あるいは野生型p53がん細胞におけるp53の発現抑制は分裂期細胞を標的とした化学療法と組み合わせることで治療感受性の向上が期待できる、という2点を示唆する。
正の平均伸張を考慮した球状伝ぱ火炎の乱流燃焼速度モデルに関する研究

現在,内燃機関の燃焼技術には社会的背景として,省エネルギー化を目的とした熱効率の向上と,CO2,NOXなどの環境汚染物質排出量の低減が求められている.また内燃機関の燃料に関しても,資源枯渇問題と排ガスのクリーン化の観点から,様々な石油代替燃料が検討されている.とりわけ天然ガスは確認埋蔵量が豊富,クリーンなエネルギー(CO2,NOX、HCの排出量も少なく、黒煙,SOXはほぼゼロ),内燃機関への適用性が良好などの特徴を有し,有望な代替燃料の一つと目されている.著者はこれまで天然ガスの主成分であるメタンの基本的な燃焼特性を調べ,その燃焼促進機構の解明に関する研究を行ってきた.本研究は,これまで得られた基礎的な成果をもとに,内燃機関で重要となる球状火炎に対して乱流燃焼速度モデルの開発を目的とする.本年度は実験的研究を実施した.実験研究として大分大学にて従来から実績のある定容燃焼器を用いた.この燃焼装置は2つのファンにより内部に一様等方的な乱れ場を作ることができる.燃焼実験は所定の濃度の予混合気を容器内に充填し,中心で点火して行う.この際,乱れ強さはファンの回転数によって制御できる.燃焼器の詳細は既報に述べられている.燃焼速度は圧力センサーによって得られた情報を電圧に変換し,オシロスフープに取込み,PCにて時系列的に燃焼速度を算出した.メタン,エタン,プロパンで当量比を変化させて乱流燃焼速度と平均火炎曲率の関係を算出した.得られた結果を咋年度行った理論値と比較した結果,乱流燃焼場における火炎伸張の影響を抽出することができた.現在,内燃機関の燃焼技術には社会的背景として,省エネルギー化を目的とした熱効率の向上と,CO2,NOXなどの環境汚染物質排出量の低減が求められている.また内燃機関の燃料に関しても,資源枯渇問題と排ガスのクリーン化の観点から,様々な石油代替燃料が検討されている.とりわけ天然ガスは確認埋蔵量が豊富,クリーンなエネルギー(CO2,NOX、HCの排出量も少なく、黒煙,SOXはほぼゼロ),内燃機関への適用性が良好などの特徴を有し,有望な代替燃料の一つと目されている.著者はこれまで天然ガスの主成分であるメタンの基本的な燃焼特性を調べ,その燃焼促進機構の解明に関する研究を行ってきた.本研究は,これまで得られた基礎的な成果をもとに,内燃機関で重要となる球状火炎に対して乱流燃焼速度モデルの開発を目的とする.本年度は以下の理論研究と実験的研究を実施した.理論研究として著者滞在のカリフォルニア大学にて行う.球状火炎の平均曲率が平均の局所燃焼速度及び乱流燃焼速度に及ぼす影響の定式化を試みた.実験研究として大分大学にて従来から実績のある定容燃焼器を用いた.この燃焼装置は2つのファンにより内部に一様等方的な乱れ場を作ることができる.燃焼実験は所定の濃度の予混合気を容器内に充填し,中心で点火して行う.この際,乱れ強さはファンの回転数によって制御できる.燃焼器の詳細は既報に述べられている.燃焼速度は圧力センサーによって得られた情報を電圧に変換し,オシロスコープに取込み,PCにて時系列的に燃焼速度を算出した.メタンとプロパンで当量比を変化させて乱流燃焼速度と平均火炎曲率の関係を算出した.現在,内燃機関の燃焼技術には社会的背景として,省エネルギー化を目的とした熱効率の向上と,CO2,NOXなどの環境汚染物質排出量の低減が求められている.また内燃機関の燃料に関しても,資源枯渇問題と排ガスのクリーン化の観点から,様々な石油代替燃料が検討されている.とりわけ天然ガスは確認埋蔵量が豊富,クリーンなエネルギー(CO2,NOX、HCの排出量も少なく、黒煙,SOXはほぼゼロ),内燃機関への適用性が良好などの特徴を有し,有望な代替燃料の一つと目されている.著者はこれまで天然ガスの主成分であるメタンの基本的な燃焼特性を調べ,その燃焼促進機構の解明に関する研究を行ってきた.本研究は,これまで得られた基礎的な成果をもとに,内燃機関で重要となる球状火炎に対して乱流燃焼速度モデルの開発を目的とする.本年度は実験的研究を実施した.実験研究として大分大学にて従来から実績のある定容燃焼器を用いた.この燃焼装置は2つのファンにより内部に一様等方的な乱れ場を作ることができる.燃焼実験は所定の濃度の予混合気を容器内に充填し,中心で点火して行う.この際,乱れ強さはファンの回転数によって制御できる.燃焼器の詳細は既報に述べられている.燃焼速度は圧力センサーによって得られた情報を電圧に変換し,オシロスフープに取込み,PCにて時系列的に燃焼速度を算出した.メタン,エタン,プロパンで当量比を変化させて乱流燃焼速度と平均火炎曲率の関係を算出した.得られた結果を咋年度行った理論値と比較した結果,乱流燃焼場における火炎伸張の影響を抽出することができた.
逆問題と情報科学

1.ウェイヴレット解析の逆問題への応用について。観測データからの未知の対象について可能な限りくわしい情報を得るための逆問題を研究した。雑音を処理するという観点で1次元信号処理、2次元画像解析に関して得られた結果は次の通りである。(1)フーリエ級数展開に比べてウェイヴレット展開は不規則信号を雑音から分離するのに有効であることは最近の研究で知られていた。そのわけは局所解析に適しているからであるが、我々はもう一つ別の理由づけを明らかにした。それはウェイヴレット基底がベゾフ空間を含む多くの自然な関数空間において無条件基底になっている、ということである。これから従来の平滑化,高周波成分のカットオフの方法を改良することが可能である。つまり高周波成分でも、あるしきい値以上の係数をもつ成分は取り入れて推定関数を作れば、もとの信号のよりよい近似になることが示せた。最良のオーダーが実現されるしきい値の具体的計算を行った。(2)この結果、白色雑音のみならず、もっと一般の雑音の除去も同様に可能になった。(3)情報圧縮との関連、さらにコンピュータグラフィックスで実際に実現して見せた。2.会田は負曲率多様体の道空間で定義されたディリクレ形式のスペクトルギャップを研究。3.石毛はカーン-ヒリヤード流体の相転移を表わす変分問題をT収束を用いて研究。科学研究費による支援に深く感謝したい。4.大野は鈴木と同様に、関数解析で情報科学へのアプローチを行う。
虚血誘導性Ｇ蛋白活性調節因子を介する病態制御機構の解明

前年度の研究により、GβγサブユニットはAGS8のC末端領域(150アミノ酸)に結合することが明らかとなったので、同部位のアミノ酸配列を基に29-30アミノ酸のペプチドを複数合成した。それぞれのペプチドがAGS8-Gβγの相互作用を阻害するのか、in vitroのpull-down assayで評価した。すなわち、AGS8のC端領域をGST融合蛋白(GST-AGS8-C)として大腸菌で作製し、そこに合成ペプチドとともに精製Gβγ加え、GST-AGS8-Cに結合したGβγ量をimmunoblotで比較検討した。その結果、2つのペプチドがAGS8-Gβγの相互作用を阻害した(IC50, CP1:6.73x10^-6 M; CP9:2.77 x10^-6 M)。今回の研究ではCP9をAGS8ペプチドとし、その生物学的効果を検討した。AGS8ペプチドを培養心筋細胞に投与し、低酸素誘導心筋傷害に対する抑制効果を検討したところ、AGS8ペプチドは効果的に低酸素誘導心筋アポトーシスを抑制した。すなわち、AGS8ペプチドは低酸素暴露による活性型カスパーゼ3の増加およびTUNEL陽性細胞の増加を抑制した。また、AGS8が心筋アポトーシスを誘導する上で重要であるコネキシン43の透過性、局在に対するAGS8ペプチドの効果も検討した。AGS8ペプチドは低酸素下で心筋アポトーシスに関係するコネキシン43のインターナリゼーションと透過性の低下も抑制した。これら結果は、心筋細胞におけるAGS8-Gβγシグナルが虚血心筋保護の治療標的として有望であること、また本課題で用いた方法により、G蛋白活性調節因子を介する情報を制御可能であること示した。この成果は複数の学会において発表し、成果は論文として公表した(Sato,M. et al. PLoSOne 9(3):e91980, 2014.)。GST融合蛋白を用いたAGS8のGβγ作用部位の同定:AGS8の各領域をGST融合蛋白として大腸菌で作製し、精製Gβγと直接結合するかをpull-down assayで検討した。AGS8は200kdに及ぶ蛋白であるので、大腸菌内で生成されやすい30-40kdの大きさに6分割し、それぞれの小部分をGST融合蛋白として作製した。6つのGST融合蛋白はどれも大腸菌内で合成可能で、可溶化蛋白として精製することができた。これらを用いてGβγサブユニットが結合する部分をGST pull-downアッセイ法を用いて検討したところ、AGS8の中間部とC端にGβγサブユニットが結合することが明らかになった。しかし、AGS8中間部のGβγサブユニット結合部は細胞に導入しても、G蛋白シグナルを惹起しなかった。他方、AGS8-C端のGβγサブユニット結合部は細胞内シグナルを惹起することがすでに明らかになっている(Sato M, et al. J Biol Chem. 2009;284:31431.)。そこで、以後の研究はAGS8のC端部位に注目しこの部分をさらに5分割しそれぞれの小部分をGST融合蛋白として作製した。5つのGST融合蛋白はどれも大腸菌内で合成可能で、可溶化蛋白として精製することができた。再度、GST pull-downアッセイ法を用いてGβγサブユニット結合部分を検討したところ検討したところ、Gβγサブユニット結合部分は11-17kd(100-150アミノ酸)程度の範囲に絞ることができた。第1,2年度の研究から、AGS8-Gβγの相互作用を阻害する2つのペプチドを作製することに成功した。両ペプチドは2930アミノ酸よりなるペプチドであった。次の研究段階として、代表的な細胞膜透過性修飾であるTAT-修飾をはじめ、数種類の修飾をN端あるいはC端に付加して細胞膜透過性ペプチドを作製することを計画した。しかし、30アミノ酸ペプチドに組織でのペプチド導入効率を向上させるため細胞膜透過性修飾を付加すると、40アミノ酸以上のペプチドとなり、合成効率および細胞への導入効率が低下することが予想される。そこで、アミノ酸の数を20程度の効果的なペプチドを合成する必要があった。前年度に同定したペプチドの連続するアミノ酸配列をもとに、より短いペプチド(20アミノ酸程度)を複数合成作製した。合成したペプチドの多くはAGS8-Gβγの相互作用を阻害する効果を失っていた。一部はAGS8-Gβγの相互作用を阻害したが、前年度同定した2930アミノ酸よりなるペプチドに比べ、著しく効果が低下していた。AGS8-Gβγの相互作用には20アミノ酸より広い部分に存在するアミノ酸領域が重要と考えられた。AGS8の機能阻害をin vivoで実現するには他のアプローチも検討する必要があると考えられた。トップページ、研究発表欄で研究成果を報告生理学平成26年度当初に予定した計画はすべて達成することができた。合成ペプチドを用いたpull-downassayによるAGS8-Gβγ結合阻害実験も明快な結果を得ることができた。

また、心筋細胞へのペプチドの導入、アポトーシス防止効果も計画通りの結果を得ることができ、論文発表につなげることができた(Sato,M. et al. PLoSOne 9(3):e91980, 2014.)。平成24年度当初に予定した計画はすべて達成することができた。GST蛋白質は大腸菌内で生成されない、あるいは可溶化されない場合があるが、今回のGST蛋白はすべて順調に作製することができた。また、作製蛋白を用いたpull-downassayによるGβγサブユニット結合部分の同定も明快な結果が得られている。組織でのペプチド導入効率を向上させるため、より短いペプチドを作製し細胞膜透過性修飾を付加すること検討する。また、ペプチドの心筋保護効果を、灌流心を用いてin vivoで検討する。1.AGS8-Gβγ相互作用を抑制する効率的なペプチドの作製:今後は同定したペプチド(30アミノ酸)をもとに、細胞内への導入が有利なより短いペプチド(20アミノ酸程度)を作製し、これのAGS8-Gβγ相互作用阻害効果を検討する。20アミノ酸程度の効果的なペプチドが同定されれば、各種修飾を付加して細胞膜透過性ペプチドを作製する。すなわち、代表的な細胞膜透過性修飾であるTAT-修飾をはじめ、数種類の修飾をN端あるいはC端に付加する。細胞膜透過性は、昨年同様蛍光色素を付加したAGS8ペプチドの細胞内取り込みを蛍光顕微鏡で判定する。2.摘出灌流心におけるAGS8ペプチドの虚血心筋傷害防止効果: AGS8ペプチドの効果をラット摘出灌流心で検討する。ラット摘出灌流心での虚血心筋傷害への薬効評価は多くの研究で用いられている確立された方法である。ペプチドを導入試薬とともに灌流心に投与し、その後心筋梗塞を起こし、その大きさを心筋逸脱酵素量および病理学的に検討してペプチドの効果を判定する。AGS8上のGβγ結合部位の特定とAGS8-Gβγ相互作用阻害ペプチド(AGS8関連ペプチド)の開発1.AGS8-Gβγ相互作用を抑制するペプチドの同定:平成24年度の検討で同定された、AGS8-Gβγ相互作用部位のアミノ酸配列に基づくペプチドを複数作製し、in vitropull-downassayでAGS8とGβγサブユニットの相互作用を阻害するか検討する。作製するペプチドは比較的安定して合成可能な30アミノ酸以下のものを予定している。これにより、AGS8上のGβγ相互作用部位を30アミノ酸程度に限定することが可能になると予想する。2.AGS8-Gβγ相互作用を抑制する効率的なペプチドの作製:上記実験で同定した複数のペプチドを検討し、より強い阻害作用を持つものを見出す。さらに得られたペプチドを基に、細胞内への導入が有利なより短いペプチド(20アミノ酸程度)を作製し、これのAGS8-Gβγ相互作用阻害効果を検討する。本年度は研究実績に記載したとおり実験結果を比較的順調に得ることができ、ペプチド合成を繰り返すことが少なかったため、合成に要する費用が軽減した。また、精製Gβγサブユニットを用いたGST pull-downアッセイも、試行回数が当初予定より少なくて済み、結果として精製Gβγサブユニットの購入量が少なくなり、これに要する費用が軽減した。
褐色脂肪細胞の化学誘導技術を用いた糖尿病細胞治療法の開発

褐色脂肪細胞は生体内の糖脂質代謝や体温調節を司るが、2型糖尿病の患者ではその機能が低下している。そこで、患者自身の細胞から褐色脂肪細胞を作出して移植できれば、糖尿病に対する新しい再生治療法を提案できる可能性がある。最近我々は、遺伝子を改変せずに線維芽細胞を褐色脂肪細胞様細胞に高効率に誘導する技術を見出した。線維芽細胞は容易かつ低侵襲に採取可能な体細胞であり、本法は遺伝子改変を用いない安全な技術であるため再生治療への応用に理想的ではあるが、誘導した細胞には未解明な点が多い。そこで本研究では、誘導細胞の機能、糖尿病抑制効果と誘導メカニズムを解析し、新しい糖尿病再生治療法の基盤の確立を目指す。
情報伝達分子システムの再構成系における1分子反応解析

細胞増殖に関与する細胞内反応経路EGF-Ras-MAPKシステムの再構成系等を用いて、1分子計測と数理モデル解析により、その作動原理を解明することを目標として以下の研究を行った。EGF-Ras-MAPKシステムの応答解析:再構成系でEGFR/Grb2およびRas/RalGDS間の情報伝達反応ゆらぎを計測し、後者の時定数がより大きいことを明らかにした。この結果はシステムの過剰応答性に、MAPKカスケードとEGF-Rasシステム両者が寄与することを示唆する。生細胞における最大反応時間の細胞間ゆらぎ計測から、0.3-3nMに大きな傾きを持つ過剰応答性の存在が示唆された。反応経路の上流(Shc)・中流(Raf)と下流(ERK)は異なる閾値を持っており、過剰ノイズを下流に伝えにくくなっていると考えられる。また、反応持続時間の細胞間ゆらぎは中流が下流に比べて大きく、不活性化反応ゆらぎも下流に伝わりにくくなっていることが示唆された。構成要素の改変によるシステムの応答特性変化の解析:EGFRのチロシン1068をフェニルアラニン置換し、再構成系でGrb2との認識反応解析をおこなった結果、野生型では見られる結合反応の多状態性は、局所的な結合部位の差異ではなく、全体的な分子構造に基づいていること、解離反応の多状態性は、EGFRとGrb2の衝突頻度に依存していることなどが明らかになった。また、Raf1の分子内相互作用(S621A)および14-3-3との相互作用部位(C168S)の変異体を作製し、1分子計測によって変異体分子の構造が実際に野生型と異なることを示した。MAPKシステムの大腸菌内再構成のため、恒常的活性化型MEK、MKP3およびERKを発現制御可能なプロモータ下流ヘクローニングした。また、反応を解析するためのシミュレータを構築した。1.Ras活性化制御の解析:EGFによるRasの活性化はpush-pull反応と呼ばれる協同的反応によって起こる。セミインタクト細胞に、細胞質画分、ATP, GTPを加えた再構成系で、RalGDSのRas結合ドメインとGFPの融合蛋白質(GFP-RalGDSRBD)を用いてRasの活性化を検出する実験系を作成した。再構成系によってEGF入力に対するRasの活性化量の平衡状態とそのゆらぎの詳細が計測可能になった。反面、現在の再構成系は反応開始点の制御が困難なため遷移状態の解析には向いていない。そこでEGF受容体或いはRasの活性化を認識するGFP-Grb2およびYFP-Raf1を安定発現する細胞を作成した。今後、生細胞でもEGFR, Rasの活性化の時間変化を計測する。2.MAPKカスケードの協同性の解析:EGF濃度とERKの核移行を示した細胞の割合の関係を求め、K_M=0.56nM, Hill係数=34という過剰応答性反応であることを明らかにした。K_MはEGFとEGFRの解離平衡定数に近い。Hill係数は、EGFによる細胞内カルシウム応答(Hill係数3.9)に比べてかなり大きな値であり、Rasの下流で働くMAPKカスケードも2桁以上のHill係数を持っていることを示唆している。EGF-ERKの応答関数を生細胞で計測するため、GFP-ERKを安定発現する細胞を作成した。3.EAPKカスケードの大腸菌内再構成:MAPKカスケードの過剰応答性を詳細に解析するため、MEK, ERKの活性化反応を大腸菌内に再構成している。ERK活性を計測するための蛍光プローブ遺伝子を設計し、制作中である。

また、Raf1の分子内相互作用(S621A)および14-3-3との相互作用部位(C168S)の変異体を作製し、1分子計測によって変異体分子の構造が実際に野生型と異なることを示した。MAPKシステムの大腸菌内再構成のため、恒常的活性化型MEK、MKP3およびERKを発現制御可能なプロモータ下流ヘクローニングした。また、反応を解析するためのシミュレータを構築した。
ＭＩＭＯ伝送のためのエネルギー効率を改善する人工雑音・人工高速フェージング生成法

本研究では,多入力多出力(MIMO)伝送システムにおいてエネルギー効率を改善する人工雑音(AN)および人工高速フェージング(AFF)の生成手法を確立することを目的としていた。MIMO伝送では,複数のデータストリームを各受信アンテナで干渉なく受信できるようにするために,送信機においてプリコーディング処理が行われる。本課題では,初年度にこのようなプリコーディングを用いるMIMOシステムに通常の生成原理に基づくANを使用した場合,エネルギー損失を引き起こし,秘密レートが劣化することを明らかにするとともに,近年の高速無線通信の多くで採用されている直交周波数多重分割(OFDM)を使うMIMOシステムにおいてエネルギー損失を改善できるAN生成法を明らかにしてきた。さらに2年目以降は,人工高速フェージングの生成手法においてもエネルギー損失を低減可能な手法を明らかにしてきた。平成30年度は,マルチユーザMIMO-OFDMシステムに適した物理層セキュリティについての検討についてのまとめを行なった。ANやAFF生成法で得られた知見を応用し,仮想受信機と呼ぶ実際には存在しない受信機を仮定し,仮想受信機向けのランダム信号を送信信号に重畳することで,エネルギー損失を引き起こすことなく秘匿性を向上できる新たな方式を考案した。仮想受信機向けのランダム信号は正規受信局では打ち消されるが,盗聴局は,その信号を分離できないため,秘匿性が向上する.中でもプリコーディングとしてTomlinson-Harashimaプリコーディングを用いた方式は,盗聴局が仮想受信機の通信路を推定することができず,劇的に秘密レートを向上可能であることを明らかにした。本研究では,多入力多出力(MIMO)伝送システムにおいてエネルギー効率を改善する人工雑音(AN)生成手法を確立することを第1段階としていた。平成27年度は,まず,このようなプリコーディングを用いるMIMOシステムに通常の生成原理に基づくANを使用した場合,エネルギー損失を引き起こし,秘密レートが劣化することを明らかにした。本研究では,近年の高速無線通信で採用されている直交周波数分割多重(OFDM)を使うMIMOシステムを扱うが,OFDM信号が白色雑音と類似の性質を有することを利用し,送信機内で信号振幅を抑圧するようなAN生成法を考案した。これによりエネルギー効率を改善可能なANが生成可能であることを明らかにした。一方,平成27年度は,2年目に検討を開始する予定であった人工高速フェージング(AFF)に関しても一部検討を始めた。AFFでは,アンテナ毎にランダム重みを順次生成し各アンテナの信号に乗算するが,一つのアンテナだけは正規受信局において他のアンテナで生成したランダム重みの影響が打ち消されるような重みを生成し乗算する。ランダム重みは正規分布に従うため,それを打ち消す重みの絶対値は大きくなりやすくエネルギー効率劣化の要因となる。平成27年度は,AFFにおけるエネルギー効率の劣化量と秘密レートへの影響を定量的に明らかにすると同時に,エネルギー効率改善のためには,各重みの絶対値を小さくする必要があることを明らかにし,それらを改善可能なAFF生成法を提案し,秘密レートを改善可能なことを明らかにした。当初,平成27年度の研究実施計画に記載していた内容のうち,エネルギー効率を改善する人工雑音(AN)生成手法については,その手法の一部を国際会議で発表し,様々な研究者からのフィードバックを得た状態であり,比較すべき対象の再考など,幾つかの問題に対応するために,検討を進めている段階である。これについては,既に取り組んでおり,平成28年度中には解決する見込みである。一方,平成27年度は,平成28年度に実施すると記載していたもののうち,エネルギー効率を改善する人工高速フェージング(AFF)生成手法に関する検討も先取りして行い,こちらもその一部を国際会議において発表している。数学的見地からの検討が残っているが,文献調査により実施の目処が立っているため,こちらも平成28年度に予定どおり進められる予定である。以上より,本研究課題は概ね順調に進展していると考えられる。本研究では,複数の送受信アンテナを用いる多入力多出力(MIMO)伝送システムにおける物理層セキュリティ技術として,エネルギー効率を改善する人工雑音(AN)および人工高速フェージング(AFF)の生成手法を確立することを目的としている。MIMO伝送では,複数のデータストリームを個別に各受信アンテナで干渉なく受信できるようにするために,送信機においてプリコーディング処理が行われる。本課題では,平成27年度にこのようなプリコーディングを用いるMIMOシステムに通常の生成原理に基づくANを使用した場合,エネルギー損失を引き起こし,秘密レートが劣化することを明らかにするとともに,近年の高速無線通信の多くで採用されている直交周波数分割多重(OFDM)を使うMIMOシステムにおいてエネルギー損失を改善できるAN生成法を明らかにしてきた。さらに平成28年度は,人工高速フェージングの生成手法においてもエネルギー損失を低減可能な手法を明らかにしてきた。これらの成果は国際会議で発表済みであり,現在は論文としてそれらの知見をまとめ始めている。一方,最終年度となる平成29年度に向けて,マルチユーザMIMO-OFDMシステムに適した物理層セキュリティについての検討を始めており,ANやAFF生成法で得られた知見の一部を応用し,仮想受信機と呼ぶ実際には存在しない受信機を仮定し,仮想受信機向けのランダム信号を送信信号に重畳することで,エネルギー損失を引き起こすことなく秘匿性を向上できる新たな方式を考案している。仮想受信機向けのランダム信号は正規受信局では打ち消されるが,盗聴局は,その信号を分離できないため,秘匿性が向上することを明らかにしている。

平成27年度,平成28年度とも,当初の予定よりも早くその成果を国際会議で発表しており,様々な研究者より内容をさらに改善するためのフィードバックを得ている状態である。現在はそれらのフィードバックを元に追加のデータ採取および追加の検討を実施しており,AN生成法について1編,AFF生成法について2編の論文をまとめている段階である。一方,最終年度となる平成29年度に向けて現在まで得られた知見を応用し,マルチユーザ環境に適用できる仮想受信機を利用した新たな手法を考案しており,その一部を国際会議で発表することが決まっている。そのため,本研究課題は概ね順調に進展していると考えられる。本研究では,多入力多出力(MIMO)伝送システムにおいてエネルギー効率を改善する人工雑音(AN)および人工高速フェージング(AFF)の生成手法を確立することを目的としていた。MIMO伝送では,複数のデータストリームを各受信アンテナで干渉なく受信できるようにするために,送信機においてプリコーディング処理が行われる。本課題では,初年度にこのようなプリコーディングを用いるMIMOシステムに通常の生成原理に基づくANを使用した場合,エネルギー損失を引き起こし,秘密レートが劣化することを明らかにするとともに,近年の高速無線通信の多くで採用されている直交周波数多重分割(OFDM)を使うMIMOシステムにおいてエネルギー損失を改善できるAN生成法を明らかにしてきた。さらに2年目は,人工高速フェージングの生成手法においてもエネルギー損失を低減可能な手法を明らかにしてきた。そして最終年度である平成29年度は,マルチユーザMIMO-OFDMシステムに適した物理層セキュリティについての検討を行なった。ANやAFF生成法で得られた知見の一部を応用し,仮想受信機と呼ぶ実際には存在しない受信機を仮定し,仮想受信機向けのランダム信号を送信信号に重畳することで,エネルギー損失を引き起こすことなく秘匿性を向上できる新たな方式を考案した。仮想受信機向けのランダム信号は正規受信局では打ち消されるが,盗聴局は,その信号を分離できないため,秘匿性が向上することを明らかにした。3年間を通じて,それぞれの年度で目標としてきた内容については,ほぼ予定通りに期待する結果を得ることができた。これまでに達成してきた成果については,国際会議で計4編の発表を行った。あとは,これらの成果の総まとめとして論文誌への掲載に向けて執筆作業の準備を行っている。
人間との共存をめざした絶滅危惧・希少動物の種保存に関する分子・集団遺伝学的研究

本研究の目的は、野生動物集団における遺伝的多様性の評価法を確立すること、ならびに、人間活動によって絶滅の危機に瀕するに至った動物集団や個体数が激増した動物集団の遺伝的特徴と進化的背景を理解することである。本年は、1.個体数が過度に増加したエゾシカの集団構造、2.人畜への被害をもたらすヒグマの集団構造、3.在来種ニホンイタチと移入種シベリアイタチの遺伝的関係、について分析した。1.北海道全域におけるエゾシカ集団について、ミトコンドリアDNAの中でも進化速度の速いD-loop領域の塩基配列を分析したところ、6つのタイプを検出することができた。その中でも3つのタイプの頻度が高く、それらの分布は北海道における三大針葉樹林帯の分布とほぼ一致する傾向がみられた。これは、明治時代に絶滅の危機に瀕したエゾシカ集団が、個体数を激増させていったこと(ボトルネック)を反映している。2.ヒグマについては北海道内において3つの遺伝子系列を把握することができ、それらの分布パターンは北海道の広大な森林分布に一致していたが、エゾシカとは異なり、明瞭な分布境界が認められた。これはヒグマの行動範囲が森林地帯に強く依存していることを反映している。3.シベリアイタチは、昭和初期に人間によりアジア大陸から持ち込まれたといわれ、北九州・関西などの西日本を中心に野生化(帰化)し、在来種ニホンイタチの生息地を撹乱している。そこで、ミトコンドリアDNAに基づく地域変異を分析し、両イタチを分類する判別法を確立した。さらに、移入種シベリアイタチの多様性の低さからボトルネック効果が示唆された。
昆虫病原性糸状菌の系統解析と生態特性

本研究の目的はMelarhizium属糸状菌を昆虫病原性糸状菌のモデルとして,昆虫病原性糸状菌の昆虫および植物と関連した生態およびそれらと関連した進化の過程を明らかにすることである。本年度においては、本属糸状菌の昆虫2種に対する病原力が種間で異なることを示した。本属糸状菌の生育適温はどの種も25-30°Cであったが、生育適温域においてM. flavoviride (Mf)の菌株は他の種の菌株よりも弱い病原力を示した。また、前年度までに種間で高温および低温条件における生育が異なることを示していたが、18°Cと30°Cにおいてカイコガおよびイニシロアリに対する病原力を比較した結果、M. pingshaense (Mp)およびM. robertsii (Mr)のような高温に適応した菌株は、M. brunneum (Mb)の菌株と比較して高温条件下での病原力が強い傾向を示した。比較に用いた4種はどれも他の研究では様々な宿主昆虫から分離されており、特定の分類群の昆虫に適応した種ではないと考えられるが、温度特性も合わせると病原力の種間差が明確に表れることが明らかになった。また、本属糸状菌の野草根圏からの検出率およびシバの根圏での定着能力が種間および菌株間で異なることを明らかにした。野草根圏からは、Mpが最も多く検出され、土壌から分離を行った調査と同様の結果であった。また、Mpおよびその近縁種のMrの菌株は、これらとは属内で比較的遠縁であるMfやM. majus (Mm)の菌株と比較して長期に渡りシバの根圏で高い密度を維持した。北米における調査結果も考慮すると、MpおよびMrを含む単系統群に高い根圏定着能力をもつ菌株が多く存在することが推察される。一方で、これまでに記載のある宿主昆虫、およびカイコガに対する病原力の比較から、この群の菌株は超や物と比較して昆虫に関する宿主範囲が広いと推察される。従って、MpおよびMrを含む単系統群では、昆虫および植物のどちらかに特化するというよりは、多様な昆虫への適応に関わる幅広い代謝能力などの獲得により、植物にも定着可能になったと考えられる。(抄録なし)研究の目的は昆虫病原性糸状菌について病原性および環境適応性と関連した系統進化の過程をMetarhizium属糸状菌をモデルとして明らかにすることである。病原性と系統関係については,コガネムシ科に特異的な病原性をもつM.majusを中心に調査を行い,同種の種内で異なるコガネムシ科の種に特化した系統分化が起っていることを初めて明らかにした。このような病原型の細分化は大多数の昆虫病原性菌類の種が所属する広義のバッカクキン科(Clavicipitaceae)においても初めての発見である。病原性比較の結果から少なくともハナムグリ病原型とサイカブト病原型の2病原型が存在することが明らかとなったが,分子系統解析と宿主の関係はさらに多くの病原型の存在を示していた。また,浸漬接種と注射接種による病原性の比較の結果はM.majus内の系統間の病原性の差異がクチクラからの侵入過程で生じていることを示していた。Metarhizium属糸状菌の系統関係と環境適応性の関係を明らかにするため,生態分布の調査を行った。全国200以上の土壌サンプルの調査の結果,M.majusについては、ハナムグリ病原型は九州の3サンプルから分離され,サイカブト病原型は分離されなかった。サイカブト病原型は宿主であるタイワンカブトムシが存在する南西諸島にのみ分布していると考えられるが,南西諸島の土壌サンプルが少なかったために今回の調査では分離されなかったと考えられる。ハナムグリ病原型の分布状況については、分離頻度が少ないため,宿主の分布および生態との関連性については未解明である。他の種については,M.brunneumのみが遺伝子型と地理的分布とが対応しており,九州と北海道で遺伝子型が分かれた。昆虫病原性糸状菌において,これまでにこのような地理と関連した遺伝子型は報告は少ない。同種は森林(低温環境)に適応していることにおいても近縁種と比較して特殊であり,森林への適応と地理的隔離とが関連している可能性がある。1.Meterhizium属糸状菌の病原性の系統間差異同属糸状菌の系統間の病原性の差異をカイコガ(錦秋×鐘和ハイブリッド)を用いて定量的に示すことを試みた。同系統は糸状菌感染に対して高い抵抗性を有するが、高湿度条件下では系統間の病原力の差異が致死性として顕著に表れ、系統間の差異を定量的に示すことができた。高湿度条件でのカイコガに対する病原力にはMetathizlum属糸状菌の系統群ごとの特徴が表れる傾向があり、特にM.brunneumのクレードに所属する分離株が他のクレードに所属する分離株より強い病原力を示す傾向があった。同種の日本株は同属内では他の種よりも森林環境の土壌から検出される傾向があり低温環境での生育に適応した培養性状を示すことを昨年度明らかにしていた。森林は草地などの環境より低温であるだけでなく高湿度であるとも考えられるが、同種が他の種と比較して高湿度条件でより高い病原力を示すことは森林環境への適応である可能性がある。M.brunneumは温室内の害虫や葉面に定着する害虫など高湿度環境の害虫の防除に効果的であるかもしれない。

飼育中のエンマコオロギに流行病を起こしたMetathlzlum属の分離株は他の分離株と比較してカイコガに対しては極端に弱い病原力を示したが,エンマコオロギに対しては最も強い病原力を示した。塩基配列の解析の結果,同株はrDNAの介在領域に固有の塩基配列多型を有していた。オーストラリアのコモダスエンマコオロギ由来の株も同様の病原性を示したが,同分離株株と近縁な関係にあることが明らかとなった。野外で発見されるMetathizlum属糸状菌の多くは宿主域が広いタイプとされているが、カイコガに対する病原力の比較と塩基配列の解析により、その中から特定の昆虫に適応した系統の存在を特定することが容易になるかもしれない。2.Metathizium属糸状菌の生理学的性状の系統間差異各系統の高温刺激の生育や生存率に及ぼす影響を評価した。分生子懸濁液に高温処理(45°Cで2時間)後の発芽率を比較した結果、森林環境に適応したM.brunneumおよび,M.flavovirideのクレード内の系統では他の群と比較して生存率に影響は無かったが、発芽速度が大きく遅延する傾向が観察された。凍結解凍ストレスの生存率に及ぼす影響についても比較を行った。M.brunneumのクレード内では北海道株と九州・本州株が異なるサブクレードに分割されるが、その菌株の間に温度特性および病原性における差異は見いだされず、凍結解凍ストレスに関連している可能性を予想した。しかし、ストレス処理後の生存率は緯度や系統関係に関係した差異は見いだされなかった。ストレス処理は分生子を界面活性剤に懸濁した状態で凍結解凍を繰り返す処理を行ったが、より野外で受けるストレスにより近い凍結解凍ストレスの処理法を検討する必要があると考えている。本研究の目的はMelarhizium属糸状菌を昆虫病原性糸状菌のモデルとして,昆虫病原性糸状菌の昆虫および植物と関連した生態およびそれらと関連した進化の過程を明らかにすることである。本年度においては、本属糸状菌の昆虫2種に対する病原力が種間で異なることを示した。本属糸状菌の生育適温はどの種も25-30°Cであったが、生育適温域においてM. flavoviride (Mf)の菌株は他の種の菌株よりも弱い病原力を示した。また、前年度までに種間で高温および低温条件における生育が異なることを示していたが、18°Cと30°Cにおいてカイコガおよびイニシロアリに対する病原力を比較した結果、M. pingshaense (Mp)およびM. robertsii (Mr)のような高温に適応した菌株は、M. brunneum (Mb)の菌株と比較して高温条件下での病原力が強い傾向を示した。比較に用いた4種はどれも他の研究では様々な宿主昆虫から分離されており、特定の分類群の昆虫に適応した種ではないと考えられるが、温度特性も合わせると病原力の種間差が明確に表れることが明らかになった。また、本属糸状菌の野草根圏からの検出率およびシバの根圏での定着能力が種間および菌株間で異なることを明らかにした。野草根圏からは、Mpが最も多く検出され、土壌から分離を行った調査と同様の結果であった。また、Mpおよびその近縁種のMrの菌株は、これらとは属内で比較的遠縁であるMfやM. majus (Mm)の菌株と比較して長期に渡りシバの根圏で高い密度を維持した。北米における調査結果も考慮すると、MpおよびMrを含む単系統群に高い根圏定着能力をもつ菌株が多く存在することが推察される。
新規な不斉有機ヘテロ銅錯体の構造とエナンチオ選択的共役付加反応

1.不斉配位子として(1R,2R,3S,4S)-3-[(1-(メチル-2-ピロリル)メチルアミノ]-1,7,7-トリメチルビシクロ[2.2.1]ヘプタン-2-オールを新たに開発することにより、(E)-2-シクロペンタデセノンから天然型(R)-ムスコンを100%の光学純度で合成することに世界で初めて成功した。2.この不斉配位子80%とそのエナンチオマーを20%の割合で混合し、60%の光学純度の配位子を調製した。これにトルエン中、ヨウ化銅(I)とメチルリチウムを用いてアルコキシジメチル銅錯体を合成し、(E)-2-シクロペンタデセノンとの共役付加を行なったところ、(R)-ムスコンが76%e.e.で得られることを見いだした。これは不斉共役付加における初めての不斉増幅現象である。この不斉増幅現象は、アルコキシジメチル銅錯体が溶液中でホモキラル二量体とヘテロキラル二量体を形成するものと仮定すると合理的に説明することができる。すなわち、ヘテロキラル二量体は溶液中では安定で反応性も低いが、C_2対称を有するホモキラル二量体は高エナンチオ選択性を有し、反応性が大きいために不斉増幅が生じたものと考えられる。3.10員環から18員環エノンとアルコキシジメチル銅錯体との共役付加反応を行った。その結果、(Z)-エノンからは(S)-体のケトンが得られ、(E)-エノンからは(R)-体のケトンが選択的に得られることを見いだした。すなわちエノンの立体配置に関係なく一方方向からメチル基が導入されていることが明らかとなった。この立体選択性はアルコキシジメチル銅錯体がエノンの酸素原子と配位することにより発現されたものと考えられる。(1R,2R,3S,4S)-3-[(1-(メチル-2-ピロリル)メチルアミノ]-1,7,7-トリメチルビシクロ[2.2.1]ヘプタン-2ーオールを不斉リガンドに用いて、これにメチルリチウム、ヨウ化銅(I)、ついでメチルリチウムを反応させて新規な不斉有機銅錯体を調製した。この不斉有機銅錯体を用いて(E)-2ーシクロペンタデセノンとの共役付加反応を行ない、天然型(R)ームスコンの不斉合成に世界で初めて成功した。不斉有機銅錯体の構造を明かにするため、(E)-2ーシクロペンタデセノン:不斉リガンド:メチルリチウム:ヨウ化銅(I):メチルリチウムの量比を変化させ、得られる(R)ームスコンの化学収率と鏡像体過剰率との関係を詳細に検討した。その結果、上記の比が1:1:1:1:1の時には、(R)ームスコンの化学収率は8%で、鏡像体過剰率は40%であったが、1:1:1:1:2の比にすると、収率は80%、鏡像体過剰率は91%と向上することがわかった。さらに、1:2:2:1:2の比を用いると、(R)ームスコンの収率は93%、鏡像体過剰率は100%となることがわかった。

即ち、不斉リガンド、メチルリチウム、ヨウ化銅(I)から得られる銅錯体に、1等量のメチルリチウムを作用させて生成するヘテロモノメチル銅錯体は、(E)-2ーシクロペンタデセノンに対して低いエナンチオ選択性を示したが、このヘテロモノメチル銅錯体に、さらに1等量のメチルリチウムを反応させて生成するヘテロジメチル銅錯体が、極めて高いエナンチオ選択性を示すことが明かになった。このように、不斉有機銅錯体のエナンチオ面選択的共役付加反応を利用することによって、今までブラックボックスとされていた溶液中での有機銅錯体の構造と反応性を解明することに成功した。不斉配位子(1R,2R,3S,4S)-3-[(1-(メチル-2-ピロリル)メチルアミノ]-1,7,7-トリメチルビシクロ[2.2.1]ヘプタン-2-オールを80%とそのエナンチオマーを20%の割合で混合し、60%の光学純度の配位子を調製した。これにトルエン中、ヨウ化銅(I)とメチルリチウムを用いてアルコキシジメチル銅錯体を合成し、(E)-2-シクロペンタデセノンとの共役付加を行なったところ、(R)-ムスコンが76%e.e.で得られることを見いだした。これは不斉共役付加における初めての不斉増幅現象である。この不斉増幅現象は、アルコキシジメチル銅錯体が溶液中でホモキラル二量体とヘテロキラル二量体を形成するものと仮定すると合理的に説明することができる。すなわち、ヘテロキラル二量体は溶液中では安定で反応性も低いが、C_2対称を有するホモキラル二量体は高エナンチオ選択性を有し、反応性が大きいために不斉増幅が生じたものと考えられる。つぎに、10員環から18員環エノンとアルコキシジメチル銅錯体との共役付加反応を行った。その結果、(Z)-エノンからは(S)-体のケトンが得られ、(E)-エノンからは(R)-体のケトンが選択的に得られることを見いだした。すなわちエノンの立体配置に関係なく一方方向からメチル基が導入されていることが明らかとなった。この立体選択性はアルコキシジメチル銅錯体がエノンの酸素原子と配位することにより発現されたものと考えられる。以上の結果から、不斉配位子、ヨウ化銅(I)、メチルリチウムから調製したアルコキシ銅錯体はモノメチル銅錯体を経由してアルコキシジメチル銅錯体となり、これは二量体と平衡にあること、高エナンチオ選択性を示す活性種はアルコキシジメチル銅錯体であり、これはエノンと反応して光学活性ケトンを生成し、モノメチル銅錯体となることを明らかにした。
内分泌かく乱物質の性腺及び中枢の発育・分化に対する影響に関する研究

本年度は主として中枢の性分化に関する以下の研究を行った。(1)視床下部-下垂体-性腺軸における雄性機能の正常な発現には、新生子期のLHRHが重要な役割を果たしている。内分泌かく乱物質の多くはエストロジェン用作用を有し、LHRH分泌を抑制することから、本研究ではLHRHの分泌を抗血清で免疫学的に中和するモデルを用いて、新生時期の内分泌かく乱物質の暴露が雄ラットの生殖能力に与えると予想される変化について解析した。その結果、出生後6日間LHRH抗血清を投与した雄ラットでは、成熟後精巣に精子形成は正常と判断されたが、成熟雌に対して交尾行動をほとんど示さず、射精に至らなかった。視床下部の内側視索前野にの存在する性的二型核の断面積を比較したところ、抗血清投与群では雄より小さい、雌に近い傾向を示した。以上のことから、中枢の性分化期に、LHRHの分泌が抑制された場合は、成熟後の生殖能力に重大な欠陥をもたらす危険性が示された。(2)新生時期の中枢の性分化時期の雌に、エストロジェン作用を有する内分泌かく乱物質としてオクチルフェーノールを投与した。成熟後、中枢の周期性を調べるため、卵巣を除去しエストラジオールを投与して、LHサージの出現を検討したところ、実験群ではLHサージが欠如していた。次に、雌の交尾行動を調べるために正常な雄ラットと同居したところ、雌の交尾行動の発現頻度および強度は正常に比べ有意に低値であった。視床下部の内側視索前野にの存在する性的二型核の断面積を比較したところ、オクチルフェノール投与群では雌より大きく、雄に近い傾向を示した。本年度は、以下の研究を行った。1)ラット胎子精巣の器官培養胎齢14日の雄胎子の生殖原基を実体顕微鏡下で摘出し、24穴組織培養プレートにて72時間培養した。培養液は、1%BSAを含むDMEMを用い、MillicellTMの膜上で培養した。この培養系に粗精製したウシインヒビンを添加すると、中腎の形成は正常であるが精巣発育の抑制と生殖細胞数の減少が認められた。一方、エストラジオールの添加は、このような抑制効果は認められなかった。2)中枢の性分化視床下部に局在する性的二型核の分化は、「視床下部から分泌される黄体形成ホルモン放出ホルモン(LHRH)が下垂体へ作用してLHを分泌させ、このLHが精巣へ作用してテストステロン分泌を促進し、このテストステロンが視床下部へ到達して、局所でエスロジェンに変換させて雄性化が誘起される」と解釈されている。本年度は、次の2つの実験を行った。雌ラットの生後16日齢まで1日1回LHRH-ASを投与し、その後の発育と成熟時における交尾行動を観察した。その結果、LHRH-AS投与群では、精子形成能は正常と差が認められなかったが、交尾行動に異常が認められた。LHRH-AS投与群では、ペニスの挿入頻度は増加したが観察時間内に射精に至った個体は認められなかった。(2)エストロジェン及びオクチルフェノール投与実験雌ラット生後114日まで、1日1回エストラジオールあるいは、オクチルフェノールを投与した結果、膣開口日は促進され、いずれの投与群でも短期間に連続発情に移行した。以上の結果から(1)ウシ卵胞液中には、精巣発育を抑制する物質が存在する事、(2)エストロジェンは、培養精巣の発育に抑制効果を示さないこと、並びに(3)オクチルフェノールは、性中枢を雄性化するエストロジェン作用を有する等の事実が判明した。

内分泌かく乱物質の多くはエストロジェン用作用を有し、LHRH分泌を抑制することから、本研究ではLHRHの分泌を抗血清で免疫学的に中和するモデルを用いて、新生時期の内分泌かく乱物質の暴露が雄ラットの生殖能力に与えると予想される変化について解析した。その結果、出生後6日間LHRH抗血清を投与した雄ラットでは、成熟後精巣に精子形成は正常と判断されたが、成熟雌に対して交尾行動をほとんど示さず、射精に至らなかった。視床下部の内側視索前野にの存在する性的二型核の断面積を比較したところ、抗血清投与群では雄より小さい、雌に近い傾向を示した。以上のことから、中枢の性分化期に、LHRHの分泌が抑制された場合は、成熟後の生殖能力に重大な欠陥をもたらす危険性が示された。(2)新生時期の中枢の性分化時期の雌に、エストロジェン作用を有する内分泌かく乱物質としてオクチルフェーノールを投与した。成熟後、中枢の周期性を調べるため、卵巣を除去しエストラジオールを投与して、LHサージの出現を検討したところ、実験群ではLHサージが欠如していた。次に、雌の交尾行動を調べるために正常な雄ラットと同居したところ、雌の交尾行動の発現頻度および強度は正常に比べ有意に低値であった。視床下部の内側視索前野にの存在する性的二型核の断面積を比較したところ、オクチルフェノール投与群では雌より大きく、雄に近い傾向を示した。