hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
ワイヤレス充電時のインピーダンス変化に基づく充電情報計測システムの実践的検証

シャント抵抗値の最適化などにより,計測誤差4%未満で実用上問題ないレベルを達成した.我々はこれまで充電式心臓ペースメーカの研究を進めてきた.体内に埋め込んだ心臓ペースメーカの充電状況を体外から推定することは出来なかった.そこで我々は充電状況に応じて2次側インピーダンスが変化することに着目し,体内からの電気パラメータから充電状況を推定する方法を提案した.本研究では充電制御に必要となる体内パラメータを体外側パラメータから推定する方法について検討したので報告する.更に,サイズやコストの面から矩形波によるワイヤレス給電を想定し,矩形波駆動におけるインピーダンス推定についても検討したので報告する.若手研究(B)課題番号「24700602」で提案した「心臓ペースメーカのワイヤレス充電時における外部からの充電状況推定システム」をブラッシュアップし,実用化に向けた実践的検証を進める研究である.体内に埋め込まれたペースメーカの充電状況をワイヤレス充電時に体外から計測するシステムの構築を目指し,充電状況に対応してインピーダンスが変化する事に着目し,その変化を外部から推定するものである.(1)H28年度にはワイヤレス給電時の1次側電気パラメータのみから電池残量に対応する2次側インピーダンスを推定するインピーダンス推定法以外にも,ワイヤレス給電時の2次側電流,2次側電圧および送受電コイル間の結合状況を計測するための推定法を提案し,伝送実験を通じて,これらの計測が可能であることを確認した.(2)H28年度には,矩形波を用いたワイヤレス給電においても良好な充電状況を推定するための知見を得ることができた.また,矩形波交流のduty比制御によってワイヤレス給電時の電力制御が可能であることとに加えて,各duty比においても充電状況(インピーダンス)を推定できることが分かった.本研究期間全体を通じて,体外の電気パラメータから体内の植え込み装置の状況(2次側インピーダンス,2次側電流,2次側電圧,コイル間結合係数)を推定する手法を提案し,検証を行った.また,携帯型の矩形波ワイヤレス充電器の試作が完了し,今後は充電状況推定システムの実装を検討中である.(1)で提案した複数のパラメータ推定を導入することで,より高度な充電制御システムを提案することができた.今後はこれらの知見をもとに2次側充電状況推定システムを実装した携帯型ワイヤレス充電器の試作と,生体内を模擬した発熱評価等を行い実用化を目指す.1ワイヤレス充電時のチタンケースに生じる渦電流損に相当する等価抵抗を考慮した提案式による充電状況推定において,チタン以外の金属においても1次側パラメータから電池残量に応じて変化する2次側インピーダンスを計測できるか検証した.その結果,受電側コイルにある程度の電力が伝送できていれば2次側インピーダンスの推定が可能であることが分かった.コイル間ギャップが015mm(結合係数0.2以上)の場合は良好な充電状況推定が可能であった.
悪性黒色腫における生理活性脂質の抗がん剤耐性調節機序の解明

スフィンゴ脂質代謝において重要な役目を果たすスフィンゴシンキナーゼ(SK)はS1P合成を制御し、種々のがん細胞で高発現が知られている。そこで、S1P受容体拮抗薬であるFTY720とシスプラチン(CP)との併用効果を悪性黒色腫の抗がん剤耐性株SK-Mel28を用いて検討した。CPとFTY720の併用により細胞死及びアポトーシスが増加した。またSKのアイソザイムであるSK1の発現が低下し、リン酸化(p)-PI3K、p-Akt、p-mTORの発現量が減少した。したがってS1Pを介する系を基にした抗がん治療の可能性が考えられ、そのシグナル伝達は主にPI3K/Akt/mTOR経路が担うことが示唆された。本研究は悪性黒色腫における抗がん剤耐性とスフィンゴ脂質代謝との関連に焦点を当て、がん幹細胞の増殖・分化のスフィンゴ脂質代謝による制御機構を明らかにし、新規治療薬の分子標的の基盤となる知見を得ることを目的としている。そこで、まず悪性黒色腫培養細胞株を培養し、培養液にシスプラチン(CDDP)、ダカルバジン(DTIC)などの抗がん剤を添加し、MTT測定法で、細胞生存率、すなわち各々のIC50を測定した。その結果から、これらの抗がん剤に対する耐性株Mel128と感受性株A375を以下の実験に用いることとした。抗がん剤耐性については他のがん細胞において細胞内スフィンゴシンキナーゼ(sphingosine kinase, SPHK)の高発現が注目されている。そこで悪性黒色腫の各細胞株におけるSPHKの発現を検討したところ、抗がん剤耐性株のMel128では高発現していることが明らかになった。SPHKはスフインゴ脂質代謝において、細胞増殖や生存作用のあるS1P(sphingosine 1-phosphate)の発現レベルを調節する際に重要な役割を担う。SPHKの高発現によりS1Pは受容体を介して生存シグナルを促進し、抗がん剤耐性を生じるメカニズムが考えられる。そこで、S1P受容体のアンタゴニストであるFTY720に着目し、抗がん剤と併用することにより、抗がん効果を検討した。その結果、耐性株のMel128ではシスプラチンとFTY720の併用により、相乗的にアポトーシスを促進させることが明らかになった。さらに、耐性株のMel128におけるシスプラチンとFTY720の併用時のシグナル伝達メカニズムを検討した。その結果、epidermal growth factor (EGF)受容体の発現減少、PI3K、Akt、mTORのリン酸化の低下が観察された。以上の点からFTY720は抗がん剤との併用において有用な薬剤と考えられ、そのメカニズムとしてPI3K/Akt/mTOR系のdownregulationとEGFRの減少が関与すると考えられた。本研究は悪性黒色腫における抗がん剤耐性とスフィンゴ脂質代謝との関連性に焦点を当て、がん幹細胞の増殖・分化のスフィンゴ脂質代謝による制御機構を明らかにし、新規治療薬の分子標的の基盤となる知見を得ることを目的としている。そこで、まず悪性黒色腫臨床分離培養細胞(7種)および悪性黒色腫細胞培養株(5種)を培養し、培養液にシスプラチン(CDDP)あるいはダカルバジン(DTIC)を添加し、MTT測定法で細胞生存率、すなわち各々のIC50を測定した。その結果から、これらの抗がん剤に対する耐性株Mel28と感受性株A375を以下の実験に用いることとした。抗がん剤耐性については他のがん細胞において細胞内スフィンゴシンキナーゼ(sphingosine kinase , SPHK)の高発現が注目されている。そこで悪性黒色腫の各細胞株におけるSPHKの発現を検討したところ、抗がん剤抵抗性株のMel28ではSPHKが高発現していることが明らかになった。SPHKはスフィンゴ脂質代謝において、細胞増殖や生存作用のあるS1P(sphingosine 1-phosphate)の発現レベルを調節する際に重要な役割を担う。SPHKの高発現により、S1Pは受容体を介して生存シグナルを促進し、抗がん剤耐性を生じるメカニズムが考えられている。そこで、S1P受容体のアンタゴニストであるFTY720に着目し、抗がん剤と併用することにより、抗がん剤耐性に対する効果を検討した。その結果、感受性株のA375ではシスプラチンとFTY720の併用により、細胞死を促進させることが明らかになった。耐性株については現在検討中である。FTY720は抗がん剤耐性にとって有用な薬剤である可能性が考えられ、現在そのメカニズムについて検討中である。本研究は悪性黒色腫の抗がん剤耐性に対するスフィンゴ脂質代謝の関与を明らかにすることを目的とした。

そこで、まず悪性黒色腫細胞培養株(5種)を培養し、シスプラチンあるいはダカルバジンを添加した後の細胞生存率から、これらの抗がん剤に対する耐性株SK-Mel28と感受性株A375を以下の実験に用いることとした。各悪性黒色腫細胞培養株で細胞内スフィンゴシンキナーゼ(SPHK)の発現を検討したところ、耐性株SK-Mel28での高発現が明らかになった。SPHKはスフィンゴ脂質代謝において細胞増殖や生存作用のあるS1P(sphingosine 1-phosphate)の発現調節する際に重要な役割を担う。SPHKの高発現により、S1Pは受容体を介して生存シグナルを促進し、抗がん剤耐性を生じると考えられる。そこで、S1P受容体のアンタゴニストであるFTY720に着目し、抗がん剤との併用時の抗がん剤耐性に対する効果を検討した。その結果、耐性株SK-Mel28ではシスプラチンとFTY720の併用により、有意に細胞死を増加させ、アポトーシスも促進することが明らかになった。SPHKには2種類のアイソザイム(SK1、SK2)があるが、耐性株SK-Mel28ではシスプラチンとFTY720の併用により、SK1の発現が低下するが、SK2には変化がないという結果を得た(Ishitsuka A et al. Int J Mol Med. 2014)。さらに、S1P受容体を介するシグナル伝達を検討した。シスプラチンとFTY720の併用により、24時間ではp-Akt、p-mTORの発現量が、48時間ではp-PI3K、p-Akt、p-mTORの発現量が減少した。したがってSK-Mel-28のS1Pを介するシグナル伝達は主にPI3K/Akt/mTOR経路が担う可能性が示唆された。以上の機序を介してSPHK、S1Pを中心としたスフィンゴ脂質代謝が抗がん剤耐性に関与すると考えられるため、今後の新規抗がん剤治療の開発につなげたい。皮膚科学悪性黒色腫の抗がん剤耐性株Mel128におけるスフィンゴシンキナーゼ(sphingosine kinase, SPHK)の高発現、S1P受容体のアンタゴニストであるFTY720と抗がん剤の併用による、SPHK1の増加、アポトーシス促進を証明し、この系にPI3K/Akt/mTOR系のdownregulationおよびEGFRの減少が関与する可能性を示した。これらのデータは学会で報告し、論文にまとめて投稿し現在審査中である。本研究では1)抗がん剤によるがん細胞死制御におけるスフィンゴ脂質代謝およびがん幹細胞マーカータンパク質CD133/CD44/nestin発現の検討、2)抗がん剤感受性株および耐性株におけるセラミド(CER)の代謝経路の検討、3)抗がん剤によるスフィンゴ脂質代謝酵素活性調節機構および他の生存シグナル系との関連を計画した。その中で、抗がん剤感受性細胞株および耐性細胞株でのCERの代謝経路の検討のためにまず抗がん剤感受性を悪性黒色腫の各細胞株で検討し、今後の実験において主に用いる細胞株を決定した。現在はそれらを用いてCERの代謝経路および抗がん剤によるスフィンゴ脂質代謝酵素活性調節機構を検討中である。研究は全体としておおむね順調に計画通り進行している。臨床分離がん組織におけるスフィンゴ脂質代謝酵素とがん幹細胞マーカー発現の免疫染色および免疫ブロットを用いた検討を行いたい。
海産魚の口腔保育習性と活用機能からみた骨格系構造の進化学的研究

平成8年度は、研究材料の収集と現地での潜水観察(水中VTR撮影を併用)を鹿児島県の奄美大島沿岸域(瀬戸内町阿鉄湾)で行った。テンジクダイ科魚類相の調査を近年実施してきたなかで、奄美大島の阿鉄湾には多様な環境水域が存在するので、およそ本科魚類20属が確認・採集された。本研究期間では、最も個体数が多く保育習性や行動観察がしやすい2属7種を選定した。フィールドにおける2属7種の保育習性については、雄が雌より卵塊を受けとり、ひき続き雄のみが口腔保育を行うことが観察された。またこの習性は実験水槽(水族館の飼育魚を含む)でも確認できた。本科魚類のなかには通常「群れ・群がり生活」をするものと「単独生活」するものとがあり、番形成に関してそれぞれの生活型による相違の有無を観察した。その結果、産卵期においての番形成は「群れ・群がり生活」をする種のほうが「単独生活」をする種よりも複数回の番形成が有利であることが確認された。また2属4種についての日周期活動の研究(24時間観察)では、本科魚類の主たる活動習性は夜行性であり、日没後には行動が活発になり、日昇前に活動が停止することが判った。夜間の行動は主に採餌活動であり、その行動範囲は各種共に広範囲に及んでいた。また生活型の相違により、活動習性と活動時間、活動の終始時間に明瞭な差がることも判明し、本年度の主たる目的である保育習性と関連した行動解析にかかわるデータの集積が行えた。また本研究期間中にPterapogon属の口腔保育習性を水族館水槽において観察した。本属魚類は、雄の口腔から浮出した仔魚が、幼魚に成長したのちも雄の口腔内に危険回避することが確認された。また今後、幼魚に成長したのちも雄の口腔内に危険回避することが確認された。また今後、本属の頭部骨格系の詳細な観察により、機能や構造分化の方向性がさらに明瞭になることが期待できることが判明した。平成7年度は潜水観察を、鹿児島県奄美大島の沿岸域で実施する予定であったが、奄美大島付近海域の群発地震により、沖縄県八重山郡西表島(東海大学海洋科学センター)に収集と観察フィールドを変更せざるを得なかった。従って旅費の予定額を多少変更した。しかしテンジクダイ科魚類の分布種数や観察に必要な数量は十分に確保できた。水中VTRシステムは使用に際して多少の熟練を要するので、平成7年度は主に予備観察における撮影実験とし、本格的な水中観察は平成8年度に主体をおくことにした。産卵行動と保育行動の撮影には、フィールドでの本科魚類の産卵期が本州沿岸域とくらべると長期にわたるので、比較的容易に(平成7年度は12種類)産卵・口腔内保育状況を撮影できた。平成7年度の各骨格系の部分的な観察と計測は、デジタルマイクロスコープ(KEYENCE社製:レンタル使用)を用いて実施し、データの保存(フロッピ-ディスクによる)や画像の保存(VTRプリンターによる)がきわめて容易であり、光学顕微鏡による問題点がいくつか解消された。
遺伝子ベクターとしてのブロック共重合体とDNAとの複合体形成の物理化学的特性解析

低分子凝縮剤によるDNA凝縮と、PEG-PLLによるDNA凝縮では類似の滴定曲線が得られ、いずれも2成分に分離可能である。各々の熱力学的パラメータを導出する際に、既知のtwo-site bindingモデルによるフィッティングを行うと、第1結合過程と第2結合過程のカチオン種の結合では必ず前者が強いという条件下で解析が行われるが、本研究で開発したフィッティング法ではこの条件に制約されることなく結合挙動を解析できる点が優れている。カチオン性高分子によるDNA凝縮では、重合度の減少と塩濃度の増加に伴いカチオンのDNAへの結合力が減少し、結合に伴うエンタルピー変化は小さく、自由エネルギーとエントロピーの変化は同程度で大きいことから、自由エネルギー減少に伴って本来系の外に発熱するはずの熱が系の内部でのエントロピー増加に用いられることが明らかとなった。DNAの構造変化のみに対応する熱力学変数を、DNA凝縮を伴う結合過程における熱力学変数から凝縮を伴わない初期の結合過程における変数の差によって表されることを示し、この結果からもエントロピー効果に関して同様の結論を得た。PEG-PLLとPLLホモポリマーの比較の結果、後者で顕著な二次凝集による熱量変化に関する知見を得ることも出来た。本研究は、人工遺伝子ベクターとして設計されたブロック共重合体であるポリエチレングリコール-ポリ(L-リシン)(PEG-PLL)と治療用遺伝子が搭載されるプラスミドDNA(pDNA)との複合体形成機構に関する特性解析を行うことを目的とする。計画初年度は、原子間力顕微鏡(AFM)による高次構造解析及び、滴定型等温熱分析装置(ITC)によるPEG-PLLのpDNAへの結合挙動の解析を行った。以下に詳細を述べる。1)PEG-PLL/pDNA複合体の高次構造解析では、複合体形成時の混合比(N/P比)を系統的に変化させ、生じた複合体の構造を観察した。N/P比の増大に伴い、pDNAの構造はドーナツ状あるいはロッド状の凝縮構造へと変化するが、化学量論的なN/P比より低い領域より凝縮DNAが出現し、この挙動は蛍光消光試験の結果と一致した。N/P比をさらに上昇させると、より凝縮度の高い球状凝縮体が観察された。これらは、無細胞系の遺伝子発現評価で発現低下がみられ、凝縮状態と遺伝子発現量との相関が示唆された。2)ITCによる分析では、低分子の凝縮剤によるDNA凝縮を参照しつつ、PEG-PLLによるpDNA凝縮の系に関する測定・解析を実施した。PEG-PLL/pDNAの系でも低分子凝縮剤による場合と類似する滴定曲線が得られ、いずれの場合も滴定曲線は2成分に分離可能であったが、各々の熱力学的パラメータを最適化するには、既知のtwo-site bindingモデルによるフィッティングが適用できないことが判明した。既知のモデルでは、最初の結合イベントにおける結合定数が2つ目のイベントの結合定数よりも低くなることを前提とする点が、DNA凝縮に対応しないことが判り、新規のモデルを開発した。このモデルにより求められた熱力学的パラメータは、低分子及び高分子いずれのDNA凝縮にも適用可能であることが判明した。
インクレチンによる小腸粘膜や膵臓の恒常性維持に関する研究

本研究課題では、インクレチンであるGLP-1応答を活用した生活習慣病予防の提唱を目指し、妊娠期の栄養状態が母児のGLP-1R応答感受性や胎児の生活習慣病発症素因形成に与える影響について明らかにした。特に、GLP-1R応答の惹起には、安全性が確認されている生体由来の骨基質蛋白質である非(低)カルボキシル化オステオカルシン(GluOC)を用いることで実験を行った。研究の結果から、GluOCがGLP-1応答を介して妊娠母体の糖脂質代謝を正常化し、世代を越えた糖脂質代謝異常を回避させる可能性が示唆され、GluOCによる次世代への健康障害伝播を阻止する予防医学の基盤確立に貢献できる研究成果であった。本研究は、(1)小腸におけるインクレチン応答機構の理解と(2)インクレチン応答を活用した生活習慣病予防基盤の提唱を目標に掲げ、遂行中である。今年度は、(1)については、主に組織学的解析で、野生型およびGLP-1R欠損マウスを用いた実験で、GLP-1Rの発現の有無によって、小腸粘膜の状態に影響を及ぼすか、他のインクレチンシグナルによる代償機構も考慮に入れて解析を行った。また、(2)については、GLP-1R応答感受性に焦点を当てて妊娠期の母体の栄養状態や児の将来の耐糖能異常症発症リスクについて解析を進めた。今回大きく進捗が得られたのは、特に(2)についてであった。現在の生活習慣病における予防医学の主眼は専ら生活習慣の改善であるが、本課題によって、現在考えられている生活習慣病発症のメタボリックドミノよりさらに上流に、胎児期の生活習慣病素因形成があることが実証されたことから、次世代への健康障害の伝播を阻止する予防医学基盤の確立が見込める。さらに、本研究では、(GLP-1は生体内半減期が短いこと、また、妊婦への安全性が確保されていないこと等の理由から)GLP-1R応答を誘導する骨基質蛋白質であるオステオカルシンを活用した解析を行ったが、本蛋白の妊娠マウスへの為害性は確認されなかったことから、本課題の結果は、出産後2型糖尿病発症に移行しやすい妊娠性糖尿病の予防対策という側面からも魅力的な知見を提示することが予想される。研究結果は、(1)(2)それぞれについて、平成26年度に開催された国内の関連学会(第13回西日本骨関節関連疾患懇話会、第88回日本薬理学会年会)において成果発表を行っており、専門分野の研究者からの評価を得ている。最終年度は、主にインクレチン応答を活用した生活習慣病予防の提唱を目指し、妊娠期の栄養状態が母児のGLP-1R応答感受性や胎児の生活習慣病素因形成に与える影響について明らかにした。特にGLP-1応答の惹起には、前年度にその安全性が確立された非(低)カルボキシル化オステオカルシン(GluOC)を用いることで動物実験を行った。まず、妊娠中に高脂肪高ショ糖食(HFD;脂肪含量30%[v/v]、ショ糖含量20%[v/v])を摂取した母親の産仔は、通常食(ND)を摂取していた母親から生まれた産仔より体重が有意に重く、また、膵発生やβ細胞増殖に寄与するPdx-1 (pancreatic- duodenal homeobox factor-1)の膵臓での発現が増強していた。これらの傾向は、仔が成獣となった後も引き続き観察され、離乳後にこれらの仔の栄養状態(HFD/ND)を区別して追跡した場合にも、母親の妊娠期の栄養状態が大きく反映されていた。さらに、上記の妊娠母体過栄養による(仔に対する)影響は、妊娠母体がGluOCを摂取することで回避され、この傾向がGLP-1受容体欠損マウスを用いた同様の実験では観察されなかったことから、GluOCがGLP-1応答を介して妊娠母体の糖脂質代謝を正常化し、世代を越えた糖脂質代謝異常をも回避させる可能性が示された。現在の生活習慣病における予防医学の主眼は専ら生活習慣の改善であるが、本課題によって、現在考えられている生活習慣病発症のメタボリックドミノよりさらに上流に、胎児期の生活習慣病素因形成があることが実証されれば、次世代への健康障害の伝播を阻止する予防医学基盤の確立が期待できる。(年度途中の)平成26年10月1日より、九州大学から福岡大学への異動があり、実験の遂行を一時止めざるを得ない状況になった。そのため、計画していた状況より若干の遅れが生じているが、平成27年度に当初の計画通りに取り戻せる見込みである。生化学、歯科薬理学

平成26年度に得られた結果をもとに、平成27年度はさらに、糖脂質負荷を行った妊娠マウスモデルにおいて、特に周産期における血糖制御に小腸を含めた全身でのGLP-1R応答がどの段階で如何なる寄与をしているのか、経時的な糖関連血清学的検査、膵ラ氏島の組織学的解析から明らかにする。母体の過度の高血糖状態や低栄養状態は、児の成育後の生活習慣病発症のリスクを高めることが示唆されていることから、この実験では、母体のみならず、児の追跡実験も行い、膵臓の発生段階からの形態・機能比較や、出生時(臍帯血)から成獣(静脈中)に至るまでの血糖値/インスリン比を指標とした経時的血清学的検査、膵ラ氏島の組織学的解析を行う。また、組織学的解析では、発生原基を膵β細胞と共通とする小腸の発生についても観察を行う。また、平成27年度内に国内外の専門誌へ成果発表を行う。平成26年10月1日付けにて九州大学から福岡大学への異動があった。そのため、動物実験の計画等、異動先の大学において新たに承認をうけるべき事項があり、1ヶ月程度の実験の滞りが生じた。このことにより、198,989円を次年度へ繰り越した。上記に記した実験の滞りについては平成27年4月現在では解消されつつある。そのため、昨年度使用予定であった試薬や消耗品を平成27年度に購入することで実験は順調に進めることが可能であり、当初の実験計画に沿った研究内容の遂行を行う。
情報ネットワーク技術の動向とその社会的インパクト

日本オペレーションズ・リサーチ学会の「オープンネットワークとその応用研究会」と合同で毎月研究会を開き、オープンコンピュータ・ネットワーク、ネットワーク管理のオープン化、イントラネットの動向、インターネットのセキュリティ、CATVインターネットの動向、赤外線通信の標準化の動向、ISDBのサービス、マルチメディアでのワークスタイルなどについて事例を調査した上で、その問題点を議論し検討した。これらの活動を踏まえて平成7年12月、および平成8年12月に、これらのメンバーに他地域の研究者等を加えて2泊3日の合宿形式のシンポジウムを開催した。そこでは、(1)通信ネットワークの危機管理、とくに阪神大震災における情報通信のリスク・マネジメントの諸問題、(2)情報通信の基盤整備の問題、(3)マルチメディア・サービスの導入上の問題点、(4)テレワークの現状と課題、(5)テレワークと日本的経営、(6)グループウェア導入効果と今後の課題、(7)ワークフロー管理システムの課題、(8)ネットワーク社会の現状と可能性、(9)エレクトロニックコマ-ス(EC)の動向と問題点、(10)地方自治体におけるインタクコマ-ス(EC)の動向と問題点、(11)地方自治体におけるインターネットの導入状況と問題点、(12)情報ネットワーク社会を迎えての情報セキュリテイの考え方と問題点、(13)情報ネットワークを利用した集団意思決定のあり方と組織論の動向、(14)情報通信ネットワークの信頼性評価手法、など幅広いテーマについて議論し、問題点を整理し、成果報告書としてまとめた。日本オペレーションズ・リサーチ学会の「情報ネットワーク研究部会」と合同で毎月1回の研究会を開き、ネットワーク構築上の問題点、安全性、効率性の面からみたネットワーク・マネジメントの問題点、ネットワーク導入による経済効果、情報・通信の新技術の利用状況と技術上、社会上の問題点などについて議論し、検討してきた。12月にはこれらのメンバーに他地域の研究者等を加えて、2泊3日の合宿形式のシンポジウムを開催した。そこでは、(1)通信ネットワークの危機管理、阪神大震災における情報通信のリスク・マネジメントの諸問題など、(2)情報通信の基盤整備の問題、特に中国における状況、(3)インターネットのビジネス利用に関する諸問題、(4)マルチメディア・サービスに対するユーザーの意識と市場に与えるインパクト、などについて議論し、問題点を整理した。また、情報通信技術・方式の現状と動向について検討するために、日本OR学会の待ち行列研究会と合同で、96年1月に「情報通信ネットワークに関する性能評価の総合的研究」に関するシンポジウムを開催した。そこでは、情報通信ネットワークにおけるATMなどの各種通信方式の性能評価、信頼性の評価などについて検討した。今年度は2つのシンポジウムを開催し、2種類の報告文を作成したため印刷費が当初の予定より幾分多くなっている。そこでは、(1)マルチメディア・サービスの導入上の問題点、(2)テレワークの現状と課題、(3)テレワークと日本的経営、(4)グループウェア導入効果と今後の課題、(5)ワークフロー管理システムの課題、(6)ネットワーク社会の現状と可能性、(7)エレクトロニックコマ-ス(EC)の動向と問題点、(8)地方自治体におけるインターネットの導入状況と問題点、(9)情報ネットワーク社会を迎えての情報セキュリテイの考え方と問題点、(10)情報ネットワークを利用した集団意思決定のあり方と組織論の動向、(11)情報通信ネットワークの信頼性評価手法、など幅広いテーマについて議論し、問題点を整理し、成果報告書としてまとめた。
線虫の塩走性行動における時間的多重化の4Dイメージング解析

本研究では、行動中の線虫の神経活動の包括的な観測を通じて、塩走性に関わるピルエット機構と風見鶏機構の使い分けについて信号の時間的多重化が利用されているか確かめることを目指す。2018年度は、微小流路下で線虫を保定し、繰り返し刺激を与えながら特定の神経の活動を観察して、塩濃度刺激の情報が神経回路中のどの細胞までどのような態様で届くか調べた。風見鶏行動に深く関わると考えられる神経細胞のうち、塩刺激を受容する感覚神経及び一次・二次介在神経については、首振りの周期と同程度の早い周期に対して応答できることが確認できた。とくに二次介在神経については、刺激に対する神経応答の強さが線虫自身の姿勢と関連している様子が観測された。この現象から、線虫の姿勢に関する自己受容性の情報と環境刺激の情報とが二次介在神経のレベルで統合されている可能性が示唆された。一方、二次介在神経の下流に位置する運動神経については塩刺激依存的な神経活動が確認できなかった。保定下では応答が観察しにくい可能性があるため、線虫が頭部を自由に動かせる微小流路に切り替えて測定を進めている。また頭部全神経の包括的な観測のため、代表者らが所属する研究室に設置されたスピニングディスク型共焦点顕微鏡の整備を進めた。蛍光の漏れ込みや褪色が想定より大きかったため、条件検討を行った。ディスク回転と撮影タイミングの同期をとるための制御プログラムを作成し、定量の精度を向上させることができた。繰り返し刺激に対する線虫の神経活動を測定し、姿勢に関する自己受容性の情報と環境刺激の情報とが統合されている可能性のある神経細胞を見出すことができたため。頭部全神経の包括的な観測のため、代表者らが所属する研究室に設置されたスピニングディスク型共焦点顕微鏡の整備を進める必要がある。また行動中の線虫の単一神経の活動もあわせて観察することで、保定下との神経活動の違いを明らかにすることを検討する。スピニングディスク型共焦点顕微鏡の整備を進めるために、追加的な条件検討を行った上で装置を購入することが必要になったため。
ナチス私法学と民法典改正

ナチス期の法学・法実務の研究について、近年の西ドイツにおける発展ぶりはめざましいものがある。報告者の研究課題に即していえば、「ドイツ法アカデミー・民族法典編纂委員会」の議事録・一件資料が刊行された。また研究書としても、Anderson、"The Academy of Geimaun Law 1933-1945"(1987)が克明である。これらの新しい資料や研究を目を配りながら、本年度は「所有権」の展開を中心的な研究対象としフォローした。ナチスの初期には、若い学者たちによって、「権利」概念そのものに対し、根本的な批判が提起される。その内容は、権利の私益的性格を非難し、民族共同体に対する義務を内在化させるべし、というものであった。実際に、ナチス期の土地法法制を検討してみると、そこでは所有権の自由は極めて大きく制限された。イデオロギー(理論)的にも、実定法制度においても、所有権に化体されるべき個人の私的自由は、この時代にはもはや正当なものとはみなされなかった。これらをうけて、ドイツ法アカデミー・土地法委員会は、ドイツ民法典903条の「自由で排他的な所有権」規定に代えて、所有権者に「民族共同体の福利と健全な民法感情」にしたがって土地(目的物)を管理すべき義務を明定すべきことを提案した。さらに、1942年に発表された「民族法典草案」においては、所有権は「国民経済的な目的設定の範囲内」でのみ、利用し、処分しうるものとされた。ナチス期の法理論の一つの特徴として、公法、私法の融合、共同体法の提唱があげられるが、土地法委員会および民族法典の表象した「所有権」は、まさに、公的目的への私的利益の全面的従属、私的所有者への公的義務賦課という構造を示すことによって、公私法一体論を、理論的には反映したものであったといえよう。所有権論と所有権制度の相互関連を検討することは、今後の重要な課題である。
線虫の神経機能に関与する遺伝子のゲノムワイドなスクリーニング

1)線虫の生殖細胞形成に関わる遺伝子の逆遺伝学を用いたスクリーニング線虫の生殖腺に特異的に発現するcDNAをできるだけ多く同定するために、生殖腺内に減数分裂期の生殖系列細胞を多く持つglp-1(ts)変異株由来のcDNAから、生殖腺を持たないglp-4(ts)変異株のcDNAを差し引くサブトラクションを行った。遺伝研の小原らのcDNAプロジェクトにより得られた約7500種(予想される全遺伝子の約4割)の分類済のcDNAがスポットされたhigh density gridフィルターに対し、上記のようにサブトラクトしたcDNAプールをプローブに用いてハイブリダイゼーシヨンを行い、約300の生殖腺特異的cDNAの候補を得た。このように同定された約300種のcDNAのうち約120クローンについて、各cDNAから順次二重鎖RNAを合成して線虫に微小注入し、機能阻害実験を行った。この結果、約20%(23クローン)で不妊の表現型が得られた。これらの表現型は生殖腺が発達せず生殖幹細胞が増殖しないGlp表現型、逆に生殖幹細胞が増殖し続けるGld表現型、受精又は排卵不能の3つに分けられた。2)神経機能に関与する遺伝子の解析線虫C.elegansのRasであるlet-60の機能欠失型変異、活性化型変異のいずれもが匂い物質に対する化学走性に欠損を持つことを見いだした。Rasの下流のMAPキナーゼ系の各因子の変異によっても同様の欠損が見られる。ヒートショックプロモーターや細胞特異的プロモーターによるlet-60の発現実験により、発生の過程ではなく、成虫の嗅覚神経でRasが機能することが明らかとなった。また、活性化型MAPキナーゼに対する抗体を用いた組織染色により、匂い刺激により嗅覚神経でMAPキナーゼが活性化されることがわかった。
骨細胞の基質ミネラル調節に対するＦＧＦ２３－ｋｌｏｔｈｏシグナルの関与

これまでに、骨細胞・骨細管系は骨幹端の骨梁よりも、成熟骨である皮質骨で規則的な配列を示し、メカニカルストレスの感知などを行うことを報告してきた。骨細胞はリンの再吸収を抑制するFGF23の産生・分泌するだけでなく、副甲状腺ホルモン(PTH)投与により骨細胞周囲の骨基質を溶解(骨細胞性骨溶解)することで骨基質ミネラルを調整する可能性が示唆されている。さらに近年、授乳期において乳汁へ多量の血清Caが移行することから母マウスが低カルシウム血症に陥ることがあり、そのようなマウスの皮質骨で骨細胞性骨溶解が起こることが報告されているが、その一方で否定する声もきかれる。そこで1生後11週齢の雄性野生型マウスにhuman PTH:80&micro;g/kgの濃度で外頸静脈から直接投与したPTH投与マウス、および2出産直後からCa欠乏食を12、24、36、48時間給餌した授乳期マウスを用いて、血中カルシウム濃度の測定、免疫組織化学(プロトンポンプサブユニットd2、プロトンポンプサブユニットa3、FGF23)、准超薄切片観察、透過型顕微鏡観察、原子間力顕微鏡によるナノインデンテーション、カルセイン標識による蛍光顕微鏡観察および共焦点レーザ顕微鏡観察、44・42Ca安定同位元素を用いた同位体顕微鏡観察を行った。その結果、1および2どちらの実験系でも、骨小腔周囲の骨基質がわずかに溶解し、骨小腔は拡大し、拡大した骨小腔内部にはコラーゲン線維が分解されたと思われる不定形構造物と断片的な石灰化物が見られた。また、カルセイン標識および44・42Ca安定同位元素を用いた同位体顕微鏡観察により、骨小腔周囲にカルシウムの沈着が認められた。以上より、骨細胞は血中Ca濃度によって一過性に周囲の骨基質の溶解・沈着を行うことが示唆された。27年度が最終年度であるため、記入しない。研究代表者は、骨細胞の基質ミネラル調整に関する機構の解析を目的として、以下の研究を実施した。(1)骨細胞から発するFGF23-klotho作用は腎臓だけでなく、骨組織にもフィードバックされて、一度形成された骨基質の石灰化ミネラルの維持・流出入を調節する可能性を推察している。そこで高リン・高カルシウム血症を呈するklotho遺伝子欠損マウスの骨組織を解析したところ、骨小腔内に石灰化を誘導するような所見が得られた。このことは骨細胞が血清リン・カルシウム濃度を感知して骨基質ミネラルとして沈着する可能性を示唆している。すなわちFGF23-klotho軸の骨細胞における局在作用が推察された。(2)骨細胞はFGF23を産生・分泌することだけでなく、副甲状腺ホルモン(PTH)投与により骨細胞周囲の骨基質を溶解(骨細胞性骨溶解)することで骨基質ミネラルを調整する可能性が示唆されている。そこで、野生型マウスおよび破骨細胞が存在しないRANKL^-/-マウスで、腎動静脈を結紮し、血中カルシウム濃度を測定すると、PTH投与1時間後で血中Ca濃度が有意に上昇した。また、規則的な骨細管系を示す皮質骨の骨細胞で、骨小腔周囲に未石灰化基質が認められ、透過型電子顕微鏡にて観察を行うと、骨小腔壁は粗造となり、拡大した骨小腔内部にはコラーゲン線維が分解されたと思われる不定形構造物や、断片的な石灰化物が観察された。また、骨細胞はPTH投与の際に、破骨細胞とは異なるサブユニットからなるプロトンポンプによって周囲の骨基質ミネラルを脱灰していると考えられる。加えて、原子間力顕微鏡によるナノインデンテーションを行うと、PTHを投与すると、骨細胞周囲の骨基質ミネラルが完全に脱灰されていなくとも、弾性率は低下し、物理的に脆弱化していることが明らかになった。また、カルセインを投与すると骨小腔周囲にカルセイン標識が認められることから、骨細胞は破骨細胞の有無に関わらず、基質の溶解だけでなく、再石灰化を行う可能性が示された。骨細胞はFGF23を産生・分泌するだけでなく、副甲状腺ホルモン(PTH)投与により骨細胞周囲の骨基質を溶解(骨細胞性骨溶解)することで骨基質ミネラルを調整する可能性が示唆されている。そこで、野生型マウスおよび破骨細胞が存在しないRANKL-/-マウスの皮質骨の骨細胞を観察すると、骨小腔周囲に未石灰化骨基質が認められ、透過型電子顕微鏡にて観察を行うと、骨小腔壁は粗造となり、拡大した骨小腔内部にはコラーゲン線維が分解されたと思われる不定形構造物や、断片的な石灰化物が観察された。原子間力顕微鏡によるnanoindentationを行うと、PTHを投与すると、骨細胞周囲の骨基質ミネラルが完全に脱灰されていなくとも、弾性率は低下し、物理的に脆弱化していることが明らかになった。さらに別の実験系として、授乳期のマウスでも骨細胞性骨溶解が見られることが指摘されているため、その現象の有無を検討した。

出産直後からCa欠乏食を給餌すると、Ca欠乏食給餌3648時間後には血中Ca濃度が有意に低下した。そのような皮質骨の骨細胞を観察すると、骨小腔周囲に未石灰化骨基質が認められ、さらに透過型電子顕微鏡で観察すると骨小腔壁は鋸歯状を呈し、骨小腔内部にはコラーゲン線維が分解されたと思われる不定形構造物が観察された。またカルシウム欠乏食を3日間与えた後、普通食に切り替え6日後に固定すると、骨小腔と骨細管に一致してカルセイン標識が観察された。以上の事から、骨細胞は血中のCa濃度に応じて骨基質を溶解・添加することが強く示唆された。これまでに、骨細胞・骨細管系は骨幹端の骨梁よりも、成熟骨である皮質骨で規則的な配列を示し、メカニカルストレスの感知などを行うことを報告してきた。骨細胞はリンの再吸収を抑制するFGF23の産生・分泌するだけでなく、副甲状腺ホルモン(PTH)投与により骨細胞周囲の骨基質を溶解(骨細胞性骨溶解)することで骨基質ミネラルを調整する可能性が示唆されている。さらに近年、授乳期において乳汁へ多量の血清Caが移行することから母マウスが低カルシウム血症に陥ることがあり、そのようなマウスの皮質骨で骨細胞性骨溶解が起こることが報告されているが、その一方で否定する声もきかれる。そこで1生後11週齢の雄性野生型マウスにhuman PTH:80&micro;g/kgの濃度で外頸静脈から直接投与したPTH投与マウス、および2出産直後からCa欠乏食を12、24、36、48時間給餌した授乳期マウスを用いて、血中カルシウム濃度の測定、免疫組織化学(プロトンポンプサブユニットd2、プロトンポンプサブユニットa3、FGF23)、准超薄切片観察、透過型顕微鏡観察、原子間力顕微鏡によるナノインデンテーション、カルセイン標識による蛍光顕微鏡観察および共焦点レーザ顕微鏡観察、44・42Ca安定同位元素を用いた同位体顕微鏡観察を行った。その結果、1および2どちらの実験系でも、骨小腔周囲の骨基質がわずかに溶解し、骨小腔は拡大し、拡大した骨小腔内部にはコラーゲン線維が分解されたと思われる不定形構造物と断片的な石灰化物が見られた。また、カルセイン標識および44・42Ca安定同位元素を用いた同位体顕微鏡観察により、骨小腔周囲にカルシウムの沈着が認められた。以上より、骨細胞は血中Ca濃度によって一過性に周囲の骨基質の溶解・沈着を行うことが示唆された。研究代表者は組織化学的解析、透過型電子顕微鏡・蛍光顕微鏡・共焦点レーザー顕微鏡観察、さらに原子間力顕微鏡によるナノインデンテーションなど、様々な手法を精力的に用い、現在のところ良好な結果を得ている。さらに国内での学会発表だけでなく、国際学会でも発表やセミナーを行い、研究結果に対して多くの関心を得られている。27年度が最終年度であるため、記入しない。骨小腔周囲のミネラルの沈着の可能性について、カルセイン標識だけでなく、安定同位体であるCa44およびCa42を給餌し、PTH投与マウスおよび授乳期マウスで骨小腔周囲にCaの添加が認められないか検索を行う予定でる。研究代表者は組織化学的解析、透過型電子顕微鏡および蛍光顕微鏡観察だけでなく、原子間力顕微鏡によるナノインデンテーションなど、様々な手法を用いて研究目的を達成するべく努力をしており、現在のところ良好な結果を得ているため。骨細胞が産生・分泌している酸の特定、骨小腔周囲の石灰化を示すためにカルセイン標識だけでなく、安定同位体であるCa44およびCa42を給餌し、同位体顕微鏡を用いて観察し、骨小腔周囲へのCaの沈着を検索する。
シロイヌナズナの器官形成における機械刺激受容カルシウムチャネルの役割

(1)atmid1a欠損株の根は接触感知に異常をもつことを明らかにした。すなわち、我々が開発した二層寒天法において、atmid1a欠損株の根は、野生株の根とは異なり、相対的に柔らかな寒天培地から固い寒天培地に侵入することができなかった。ただし、atmid1a欠損株を播種時から固い寒天培地で生育させれば、その根はこの固い寒天培地に侵入することができた。これらの結果は、AtMid1Aが寒天の固さを感知し、適応することに関与することを示唆している。(2)AtMid1A-GFPタンパク質を発現するシロイヌナズナを作製し、局在部位を共焦点蛍光顕微鏡で調べ、このタンパク質が細胞膜に局在していることを明らかにした。(3)atmid1a atmid1b二重欠損株は通常の条件下で生育遅延することを明らかにした。すなわち、この二重欠損株では野生株に比べ、葉の展開が約0.5日遅れ、花茎の伸長が約2日遅れた。(4)イネの電位依存性Ca^<2+>チャネルの候補遺伝子OsTPC1 cDNAを酵母細胞で発現させ、その薬理学的性質を調べた。その結果、動物のL型電位依存性Ca^<2+>チャネルのブロッカーであるベラパミルとニフェジピンによってOsTpc1の活性が阻害された。したがって、OsTpc1は電位依存性Ca^<2+>チャネルであると推測される。(5)電気生理学的方法を使って、我々はシロイヌナズナの葉肉細胞のプロトプラスト上に陰イオンを透過させる機械刺激受容チャネルを発見した。このチャネルは細胞の浸透圧の上昇を感知している可能性が考えられる。(6)酵母の電位依存性Ca^<2+>チャネル候補Cch1は、植物のTpc1と構造上似ている。大腸菌に障害を与えるCCH1遺伝子のクローニングは長い間不可能とされてきたが、我々は大腸菌を用いないクローニング法によりそれに成功した。この遺伝子を利用して、Cch1が活性をもつためには、AtMid1Aのホモログである酵母のMid1の共存が必要であることを明らかにした。機械刺激受容カルシウムチャネルは重力や接触などの機会刺激のセンサーであり、器官形成に重要である可能性が示唆されているが、分子レベルでそれを証明した研究は未だ報告されていない。我々はその証明を行うべくシロイヌナズナの機械刺激受容カルシウムチャネルの遺伝子であると予想される遺伝子を2種単離し、それらをAtMID1AおよびAtMID1Bと名付け、研究を進めている。これまでの研究から、1)AtMID1A遺伝子の産物(AtMID1A)は膜の伸展刺激に応じてCa^<2+>電流を発生させること、2)AtMID1AとAtMID1Bの単独ノックアウト株およびその二重ノックアウト株の作出したこと、3)エクオリンをプローブとした細胞内Ca^<2+>濃度測定系を確立し、AtMID1A高発現株では腹伸展刺激によって細胞内Ca^<2+>濃度が野生株より高く上昇すること、4)AtMID1A高発現株は高CaCl_2培地で生育阻害を受けるが、低CaCl_2培地では野生株と同様に生育できること、5)AtMID1AとAtMID1Bのホモログである植物モデル生物(出芽酵母)のMid1は細胞膜と小胞体膜に存在すること、6)Mid1はS-S結合による多量体を形成すること、などの研究成果を得た。

大腸菌に障害を与えるCCH1遺伝子のクローニングは長い間不可能とされてきたが、我々は大腸菌を用いないクローニング法によりそれに成功した。この遺伝子を利用して、Cch1が活性をもつためには、AtMid1Aのホモログである酵母のMid1の共存が必要であることを明らかにした。
咀嚼、嚥下、呼吸の相互メカニズムの解明

咀嚼,嚥下,呼吸の相互メカニズムを解明するにあたり,咀嚼・嚥下時の顎運動,甲状軟骨の上下運動および咀嚼筋活動を同時記録し,咀嚼と嚥下の両者の関係について検索した.被験者は実験の主旨を理解し同意の得られた正常有歯顎者とし,被験食品は大きさ4段階,硬さ3段階と異なる計12種類の球状寒天とした.筋電図は咬筋,側頭筋,顎舌骨上筋および顎舌骨下筋とした.その結果,咀嚼中には閉口筋と開口筋が相反性に活動するのに対し,咀嚼に引き続き行われる嚥下直前には開・閉口筋がほぼ同時に活動することが明らかとなった.さらにこの開・閉口筋の活動開始点を詳細に分析した結果,活動開始が一番早いのが咬筋,ついで側頭筋,顎舌骨上筋,最後が顎舌骨下筋となり,食物の動態とほぼ一致することが明らかとなった.本年度は呼吸と嚥下の時間的な関係を解明するために,鼻からの呼気・吸気量と顎運動,甲状軟骨の上下運動および咀嚼筋活動を同時記録した.被験食品は,大きさが3段階に異なる3つの球状寒天および5ml,20mlの水とした.その結果,いずれの食品においても嚥下は呼気相の途中で起こり,無呼吸の状態になることが明らかとなった.この状態は,水および大きい食品では呼気相の早期におこっていた.すなわち,食品の性状および体積により嚥下のタイミングが異なることが明らかとなった.また,舌骨上筋の活動開始点と甲状軟骨の移動開始を指標として嚥下のスムーズさを見たところ,被験食品のうち20mlの水を飲んだときが他の食品嚥下時に比較し有意に早くすなわちスムーズに嚥下していた.以上の結果から,嚥下の筋活動および甲状軟骨の上下動および呼吸には食品の性状や大きさが密接に関与しており,飲み込みやすい食品および量が存在し,正常者でも嚥下困難となる食品も存在することが推察された.咀嚼,嚥下,呼吸の相互メカニズムを解明するにあたり,本年度の前半は,咀嚼,嚥下時の顎運動,甲状軟骨の上下運動および咀嚼筋活動を同時記録し,咀嚼と嚥下の両者の関係について検索した.被験者は正常有歯顎者とし,被験食品は大きさ4段階,硬さ3段階と異なる計12種類の球状寒天とした.筋電図は咬筋,側頭筋,顎舌骨上筋および顎舌骨下筋とした.その結果,咀嚼中には閉口筋と開口筋が相反性に活動するのに対し,咀嚼に引き続き行われる嚥下直前には開・閉口筋がほぼ同時に活動することが明らかとなった.さらにこの開・閉口筋の活動開始点を詳細に分析した結果,活動開始が一番早いのが咬筋,ついで側頭筋,顎舌骨上筋,最後が顎舌骨下筋となり,食物の動態とほぼ一致することが明らかとなった.さらに本年度後半は,同様の方法を用い,食品の性状の違いによる顎運動の変化について検索した.その結果,咀嚼運動中の側方偏位量は食品の大きさに影響を受けるが食品の硬さにはほとんど影響を受けないことが明らかとなった.以上の結果をもとに,次年度は呼吸との関係を明らかにしていく所存である.咀嚼,嚥下,呼吸の相互メカニズムを解明するにあたり,咀嚼・嚥下時の顎運動,甲状軟骨の上下運動および咀嚼筋活動を同時記録し,咀嚼と嚥下の両者の関係について検索した.被験者は実験の主旨を理解し同意の得られた正常有歯顎者とし,被験食品は大きさ4段階,硬さ3段階と異なる計12種類の球状寒天とした.筋電図は咬筋,側頭筋,顎舌骨上筋および顎舌骨下筋とした.その結果,咀嚼中には閉口筋と開口筋が相反性に活動するのに対し,咀嚼に引き続き行われる嚥下直前には開・閉口筋がほぼ同時に活動することが明らかとなった.さらにこの開・閉口筋の活動開始点を詳細に分析した結果,活動開始が一番早いのが咬筋,ついで側頭筋,顎舌骨上筋,最後が顎舌骨下筋となり,食物の動態とほぼ一致することが明らかとなった.本年度は呼吸と嚥下の時間的な関係を解明するために,鼻からの呼気・吸気量と顎運動,甲状軟骨の上下運動および咀嚼筋活動を同時記録した.被験食品は,大きさが3段階に異なる3つの球状寒天および5ml,20mlの水とした.その結果,いずれの食品においても嚥下は呼気相の途中で起こり,無呼吸の状態になることが明らかとなった.この状態は,水および大きい食品では呼気相の早期におこっていた.すなわち,食品の性状および体積により嚥下のタイミングが異なることが明らかとなった.

また,舌骨上筋の活動開始点と甲状軟骨の移動開始を指標として嚥下のスムーズさを見たところ,被験食品のうち20mlの水を飲んだときが他の食品嚥下時に比較し有意に早くすなわちスムーズに嚥下していた.以上の結果から,嚥下の筋活動および甲状軟骨の上下動および呼吸には食品の性状や大きさが密接に関与しており,飲み込みやすい食品および量が存在し,正常者でも嚥下困難となる食品も存在することが推察された.
Pin1酵素阻害剤の迅速スクリーニング用プローブの開発

Pin1阻害能の迅速評価が可能な蛍光性Pin1結合プローブを開発することを目標として検討を行った。具体的には、プローブ分子内蛍光性官能基が、タンパク質結合時の疎水性相互作用によって、蛍光性が変化し蛍光性が上昇する性質を目指して開発を行った。既存の阻害剤の疎水性相互作用部位に環境応答性蛍光団を導入したところ、低極性有機溶媒中での蛍光上昇が観察された。またPin1タンパク質との結合によってわずかな蛍光上昇がみられた。一方非特異的結合による蛍光上昇も観測されることが判明した。より結合活性の高い構造を探索すべく既存化合物に変わる阻害剤探索から検討したところ、脂肪族環を有する高活性阻害剤を見いだした。Pin1阻害剤であるVER1の化学構造を基に、酵素疎水性部位と結合する部分構造を環境応答性蛍光性官能基に置換した化合物を分子設計した。Pin1酵素のPDB登録立体構造に基づいて、リガンド結合シミュレーションソフトウエアであるGlideおよびCLC Drug Discovery Workbenchをもちいて、設計化合物のドッキングシミュレーションを行い、リガンド結合指標値がよい値を示した化合物の合成を行った。合成した化合物について、まずPin1酵素阻害能を評価した。評価にあたっては、既存の酵素活性評価法を用いた。その結果、合成化合物の内、4種類に比較的強い酵素阻害能が見いだされた。これらのうち2種の酵素阻害能は、母化合物であるVER1と同程度のものであった。このことから、合成化合物のうち4種について、Pin1酵素に結合して基質代謝を阻害できることが判明した。次に、これらの化合物とPin1酵素を混合した際の、化合物の蛍光変化について観察した。その結果4種の化合物のうち、3種についてはPin1酵素存在下と非存在下における蛍光強度およびスペクトルに顕著な変化が見られず、Pin1結合時の蛍光変化による結合能評価には使用できないことが分かった。又、1種についてはPin1酵素存在下において、わずかに蛍光が上昇する傾向が見られたが、既存の阻害剤であるVER1との明確な競合は見られなかった。今後、環境応答性蛍光性官能基の結合位置、官能基の種類を変更して蛍光強度変化の大きい分子を設計・合成するとともに、蛍光性官能基に消光団を結合させた分子設計も導入することとした。昨年度までに得られた化合物であるPin1に結合してわずかに蛍光強度変化を起こす化合物2について、典型的阻害剤であるVER1との競合について再度検討した。化合物2は、Pin1に結合しわずかな蛍光増大を示した後、VER1の添加によっても蛍光減弱が観察されなかった。化合物2が遊離の状態で水溶液中に存在する場合蛍光は減弱することが判明したので、蛍光源弱が観察されなかったのは、化合物2がPin1酵素の基質結合部位以外の疎水性環境を認識して結合しているためであると考えられた。化合物2の基本構造は典型的阻害剤であるVER1と類似しているが、蛍光団結合部に親水性の高いスルホンアミド構造を有するため、VER1の結合様式と異なる様式で結合した可能性が考えられた。このため、蛍光団を有するVER1誘導体の更なる最適化および蛍光団含有VER1にさらに消光団を結合してFRETを誘導する分子設計は、効果的な蛍光増大の見込が少ないと考えられた。これらの検討から、VER1を基本構造として、基質結合部のポケット深部に結合する構造(VER1ではナフタレン部)を蛍光性官能基へと変換する分子設計、およびポケット深部に結合することで蛍光団を形成する基質様反応プローブの設計が必要であることが判明した。一方、合成した化合物2は基質結合部位にも結合していることが示されているため新たな阻害剤候補として利用できることが分かった。大きな蛍光変化を起こす化合物の同定には至っていないものの、環境応答性蛍光性官能基を用いることで結合によって蛍光増大を起こすという当初のコンセプトに沿った傾向を示す化合物は得られており、置換位置や蛍光団の検討によって改善が見込めるから。創薬化学、ケミカルバイオロジー環境応答性蛍光性官能基の種類と置換位置を変更した化合物を複数分子設計し検討する。また、これらの蛍光団に適切なリンカーを介して消光団を導入して、蛍光変化率の向上を図る。さらに、傾向偏光測定を応用し、結合時と非結合時の傾向偏光解消の違いを測定する。合成化合物とPin1酵素を混合した際の蛍光強度変化が比較的小さかったため、化合物の置換基、蛍光性官能基との結合様式の検討など、化合物の構造展開に関する検討に時間を費やしたため、酵素アッセイの回数が予定より少なくなったため。今年度検討に基づいて、化合物とPin1酵素を用いた酵素活性阻害実験および酵素結合時の蛍光強度測定など、生化学実験が増加することが見込まれる。