hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
ナノチューブ光・電子デバイスの基礎理論

カーボンナノチューブの(1)電子-格子相互作用と電気伝導現象,(2)多層ナノチューブの層間相互作用効果,(3)バンド構造に対する多体効果と光吸収・発光現象に対する励起子効果について主として有効質量近似を用いて理論的に明らかにした.また,グラフェン研究の急展開に対応し,その電気伝導,光学的性質,電子格子相互作用,異常反磁性帯磁率などについて最先端の研究を行った.カーボンナノチューブは,通常の量子細線とはトポロジカルに異なっており,さらにグラフェン上で電子が自由電子とは異なった運動をするために,興味深い性質を示す.この特徴は,グラフェンを連続体とみなし,有効質量近似で扱うことにより,はっきりする.すなわち,ナノチューブ上の電子の運動はニュートリノに対する2行2列のワイル方程式で記述される.ただし,円筒を一周したときに波動関数に余分の位相がつく.この位相はナノチューブの螺旋構造により決まり,ナノチューブが金属になるか半導体になるのかが決まる.この研究では,カーボンナノチューブや新しいナノチューブ物質の興味深い特異な伝導現象と光応答を理論的に解明し予言することを目的とする.本研究で理論的に明らかにしたい問題は,(1)金属的なナノチューブに存在する完全透過チャネルの及ぼす効果,(2)多層ナノチューブの層間相互作用の効果,(3)ナノチューブ先端の電子状態特にトポロジカル欠陥に伴う局在状態,(4)バンド構造に対する多体効果と光スペクトルに対する励起子効果である.カーボンナノチューブの(1)電子-格子相互作用と電気伝導現象, (2)多層ナノチューブの層間相互作用効果,(3)バンド構造に対する多体効果と光吸収・発光現象に対する励起子効果について主として有効質量近似を用いて理論的に明らかにした.また,グラフェン研究の急展開に対応し,その電気伝導,光学的性質,電子格子相互作用,異常反磁性帯磁率などについて最先端の研究を行った.カーボンナノチューブは,通常の量子細線とはトポロジカルに異なっており,さらにグラフェン上で電子が自由電子とは異なった運動をするために,興味深い性質を示す.この特徴は,グラフェンを連続体とみなし,有効質量近似で扱うことにより,はっきりする.すなわち,ナノチューブ上の電子の運動はニュートリノに対する2行2列のWeylの方程式で記述される.ただし,円筒を一周したときに波動関数に余分の位相がつく.この位相はナノチューブの螺旋構造により決まり,ナノチューブが金属になるか半導体になるのかが決まる.この研究では,カーボンナノチューブや新しいナノチューブ物質の興味深い特異な伝導現象と光応答を理論的に解明し予言することを目的とする.本研究で理論的に明らかにしたい問題は,(1)金属的なナノチューブに存在する完全透過チャネルの及ぼす効果,(2)多層ナノチューブの層間相互作用の効果,(3)ナノチューブ先端の電子状態特にトポロジカル欠陥に伴う局在状態,(4)バンド構造に対する多体効果と光スペクトルに対すう励起子効果,である.本年度はこれらの問題について,以下のような成果を得た.(1)ナノチューブの電気伝導現象に関しては,プローブ2個の走査顕微鏡像のモデル計算を行い,K点とK'点近傍の波の干渉による3倍周期構造が現れること,また,片方のプローブが特殊な位置にある場合にのみそれが消滅することを示した.(2)多層ナノチューブの層間相互作用の効果について,格子構造の非整合性による完全に相殺した層間コンダクタンスが不純物効果により誘起されること,それが錯乱体による平均自由行程で決まることを明らかにした.(3)ナノチューブの光スペクトルに関しては,電場が軸垂直方向の偏光の場合でも強い励起子効果で励起子吸収が観測されること,金属的なナノチューブにおいても励起子効果が大きいことなどを明らかにした.カーボンナノチューブは,通常の量子細線とはトポロジカルに異なっており,さらにグラフェン上で電子が自由電子とは異なった運動をするために,興味深い性質を示す.この特徴は,グラフェンを連続体とみなし,有効質量近似で扱うことにより,はっきりする.すなわち,ナノチューブ上の電子の運動はニュートリノに対する2行2列のWeylの方程式で記述される.ただし,円筒を一周したときに波動関数に余分の位相がつく.この位相はナノチューブの螺旋構造により決まり,ナノチューブが金属になるか半導体になるのかが決まる.この研究では,カーボンナノチューブや新しいナノチューブ物質の興味深い特異な伝導現象と光応答を理論的に解明し予言することを目的とする.本研究で理論的に明らかにしたい問題は, (1)金属的なナノチューブに存在する完全透過チャネルの及ぼす効果, (2)多層ナノチューブの層間相互作用の効果, (3)ナノチューブ先端の電子状態特にトポロジカル欠陥に伴う局在状態, (4)バンド構造に対する多体効果と光スペクトルに対すう励起子効果,である.本年度はこれらの問題について,以下のような成果を得た.(1)電気伝導現象に関して,長波長の光学フォノン,及びK点とK'点の間の谷間散乱を引き起こすブリュアン域境界フォノンについて,相互作用の有効ハミルトニアンを導出し,強電場下での電気伝導での境界フォノンの重要性を明らかにした.(2)多層ナノチューブでは,印加電場が12層で遮蔽されること,また,磁場による大きな反磁性磁界分布が生じ,それが核磁気共鳴の共鳴形状として観測可能であることを示した. (3)

2光子吸収スペクトルの計算を行い,励起子の励起状態が観測されること, 1次元性にも関わらず,そのエネルギー準位が比較的水素原子と近いことを示した.励起準位のエネルギーが相互作用強度に敏感なために,実験との比較により,電子間相互作用強度が精密に決定できることを示した.カーボンナノチューブは,通常の量子細線とはトポロジカルに異なっており,さらにグラフェン上で電子が自由電子とは異なった運動をするために,興味深い性質を示す.この特徴は,グラフェンを連続体とみなし,有効質量近似で扱うことにより,はっきりする.すなわち,ナノチューブ上の電子の運動はニュートリノに対する2行2列のWeylの方程式で記述される.ただし,円筒を一周したときに波動関数に余分の位相がつく.この位相はナノチューブの螺旋構造により決まり,ナノチューブが金属になるか半導体になるのかが決まる.この研究では,カーボンナノチューブや新しいナノチューブ物質の興味深い特異な伝導現象と光応答を理論的に解明し予言することを目的とする.本研究で理論的に明らかにしたい問題は,(1)金属的なナノチューブに存在する完全透過チャネルの及ぼす効果,(2)多層ナノチューブの層間相互作用の効果,(3)ナノチューブ先端の電子状態特にトポロジカル欠陥に伴う局在状態,(4)バンド構造に対する多体効果と光スペクトルに対する励起子効果,である.本年度はこれらの問題の中で,特に(1)と(4)について,以下のような成果を得た.(1)電気伝導現象に関して,有限長ナノチューブに励起されるプラズモンと電磁波との結合による吸収の厳密な計算を行い,単に1個のプラズモンが励起されると仮定した簡単な単一モードの近似が驚くほど良く成り立つことを示した.かれは,金属ナノチューブで外場の遮蔽効果が非常に大きいためである.(4)半導体ナノチューブの励起子吸収効果に対するファミリー効果を有効質量近似からの補正の最低次で考察し,第一ギャップについてはほとんど完全に再現できること,第二ギャップについてはある程度不十分さが残ることを示した.また,ナノチューブのまわりの誘電物質による遮蔽効果である環境効果の計算を行い,とりまく媒質とナノチューブの距離によりそれが大きく影響されることを示した.なお,実験結果はグラファイトの層間距離程度の間隔を仮定すると理解できる.カーボンナノチューブは,通常の量子細線とはトポロジカルに異なっており,さらにグラフェン上で電子が自由電子とは異なった運動をするために,興味深い性質を示す.この特徴は,グラフェンを連続体とみなし,有効質量近似で扱うことにより,はっきりする.すなわち,ナノチューブ上の電子の運動はニュートリノに対する2行2列のWey1の方程式で記述される.ただし,円筒を一周したときに波動関数に余分の位相がつく.この位相はナノチューブの螺旋構造により決まり,ナノチューブが金属になるか半導体になるのかが決まる.この研究では,カーボンナノチューブや新しいナノチューブ物質の興味深い特異な伝導現象と光応答を理論的に解明し予言することを目的とする.本研究で理論的に明らかにしたい問題は,(1)金属的なナノチューブに存在する完全透過チャネルの及ぼす効果,(2)多層ナノチューブの層間相互作用の効果,(3)ナノチューブ先端の電子状態特にトポロジカル欠陥に伴う局在状態,(4)バンド構造に対する多体効果と光スペクトルに対する励起子効果,である.本年度はこれらの問題の中で,特に(2)と(4)について,以下のような成果を得た.
リグニン形成特異的ペルオキシダーゼの反応特性と局在解析から見る細胞壁木化機構

リグニンは植物細胞壁の主要成分の一つであり、リグニンモノマーが高度に重合した複雑な構造をもつポリマーである。リグニン生合成機構を解明するための研究が活発に行われてきた結果、リグニンモノマーの生合成過程の複雑な概観が明らかとなった。一方で、リグニンの高分子化反応は未解明であった。本研究において、高分子化反応を触媒すると考えられる酵素の活性や遺伝子発現、タンパク局在解析を試みた結果、リグニン高分子化反応を触媒するのに矛盾のない、特長のある酵素性状が明らかとなった。本研究は、植物におけるリグニンの高分子化酵素と考えられる3つの植物ペルオキシダーゼ(AtPrx-2、25、71)のそれぞれの酸化能力、発現時期、発現部位、細胞レベルでのタンパク局在を明らかにすることによって、リグニンの高分子化機構を解明することを目指している。本年度は、AtPrx-2、25、71の酸化能力を明らかにするため、1.組換えタンパクの作製・精製、2.リグニンモデル化合物を用いた活性測定、3.発現・局在解析用の発現ベクターの構築を行い、以下の結果を得た。1.組換えタンパクの作製と精製...AtPrx-2、25、71に加え、比較対象として、酸化能が既知であり代表的な植物ペルオキシダーゼの一つであるAtPrx53も同時に作製を試みた。まず植物細胞での組換えタンパクの産生を試みたが、いずれも発現しなかった。次に大腸菌発現系を用いたところ、封入体の形態で産生された。リフォールディング条件の検討を行った結果、各活性型組換えタンパクの産生法を確立できた。また精製法も確立できた。2. AtPrx-2、25、71の酸化能力...リグニンモデル化合物を基質として用いた活性測定を行ったところ、AtPrx-2、25、71は、既知の大部分のペルオキシダーゼとは異なり、シリンギル化合物酸化能と高分子化合物酸化能を併せ持つことが明らかとなった。3.遺伝子発現・タンパク局在解析...各ペルオキシダーゼの推定プロモーター領域、cDNAをクローニングした。β-グルクロニダーゼをレポーター遺伝子とする遺伝子発現解析用、およびペルオキシダーゼと緑色蛍光タンパクとの融合タンパクを産生させるタンパク局在解析用の発現用ベクターを構築した。後者を植物培養細胞で発現させたところ、細胞膜もしくは細胞壁における融合タンパク由来の蛍光が観察された。リグニンの重合化は植物ペルオキシダーゼ(Prx)によって触媒されることが知られている。しかし、大部分の既知Prxがシリンギル(S)型モノマーや、モノマーラジカルのカップリング相手となるオリゴマーを酸化できないという事実は、植物細胞壁におけるリグニン重合反応機構に疑問を投げかけてきた。本研究は、リグニン生合成に関わる3つのPrx(AtPrx2/25/71)の(1)酵素活性と(2)タンパク局在を解析し、以下の結果を得た。(1)リグニン生合成に関与するペルオキシダーゼの酸化能4種の組換えタンパク(rAtPrx2/25/53/71)の作製および精製法を確立した。AtPrx53は既知の代表的なPrxの一つであり、リグニン生合成には関与しない。予想していた通りrAtPrx53はG型基質(→guaiacol)に対して高い比活性を示したが、S型基質(→2,6-DMP)に対する比活性は極めて低く、また、高分子化合物であるシトクロムcを酸化できなかった。一方、rAtPrx2/25/71はいずれも2,6-DMPに対しrAtPrx53以上の比活性をもち、さらにシトクロムcを酸化できた。以上の結果から、リグニン生合成に関与するPrxは、関与しないPrxとは異なり、リグニン形成反応を触媒可能であることが明らかとなった。AtPrx2/25/71がいつどこでリグニン生合成に寄与するのか明らかにするため、レポーター遺伝子を用いた局在解析を行った。AtPrx2/25/71の各シグナルペプチドとEGFP融合タンパクはいずれも細胞壁、または細胞膜で検出された。また、GUS遺伝子を用いたプロモーター解析の結果、主に、AtPrx2は根、AtPrx25は後生木部や葉脈、AtPrx71は原生木部を含む若い組織でリグニン生合成に寄与することが示唆された。木質科学4種の組換えタンパクの作製と精製に成功し、リグニンモデル化合物を用いて各ペルオキシダーゼの酸化能の評価を行ったところ、AtPrx-2、25、71は、AtPrx53とは異なり、リグニン高分子化酵素として矛盾のない酸化能をもつことが示されたため。遺伝子発現・タンパク局在解析用ベクターの構築を終え、タンパクの産生も確認できたため。次年度は各ペルオキシダーゼの遺伝子発現時期、発現組織、タンパク局在部位の解明に主に取り組み、木化における各ペルオキシダーゼの役割の相違を可視化する。
イネ着生フザリウム属糸状菌におけるマイコトキシン産生性の解析

イネ着生の可能性があるフザリウム属糸状菌Fusariumgraminearumより新規マイコトキシン生合成関連遺伝子の候補遺伝子を見出した。本クローンは、ポリケタイド合成酵素全長と思われ、異種糸状菌(Aspergillus oryzae)発現系での機能発現を試みた結果、空のベクター(コントロール)には無い化合物の産生が認められた。また、各種フザリウム菌株を培養して、各種機器分析によりそれらのマイコトキシン産生性を精査した結果、これまでフモニシン産生の報告が無い菌で、フモニシンの産生を見出した。申請書の研究実施計画に従い「イネ着生フザリウム属糸状菌のマイコトキシン産生関連クラスターの探索と同定」ならびに「イネ着生フザリウム属糸状菌におけるマイコトキシン産生性の解明」のための実験を行った。その結果、「イネ着生フザリウム属糸状菌のマイコトキシン産生関連クラスターの探索と同定」については、イネ着生の可能性があるフザリウム属糸状菌より新規マイコトキシン生合成関連遺伝子の候補遺伝子を見出した。本遺伝子は新規の構造を持ったマイコトキシンの生合成遺伝子の一部である可能性が有り、機能を同定すればその意義は大きいため、引き続き解析を続ける。また「イネ着生フザリウム属糸状菌におけるマイコトキシン産生性の解明」については、これまでに独立行政法人農業生物資源研究所ジーンバンク等より入手を続けているイネ着生の可能性があるフザリウム属糸状菌(麦類赤カビ病菌Fusarium graminearum、トウモロコシ赤カビ病菌F.verticillioides、イネ馬鹿苗病菌F.fujikuroi等)の各菌株を培養して、各種機器分析によりそれらのマイコトキシン産生性を精査した結果、これまでフモニシン産生の報告が無い菌で、フモニシンの産生を見出した。これらはコメやコムギなどの毅類に着生する可能性が有り、汚染防除の意味からもマイコトキシン産生能と、フザリウム属糸状菌における種との関連の解析が必要である。さらにこれまでフモニシンは、トウモロコシ中の汚染が顕著であり、国産米や国産小麦中の汚染は知られていなかったが、今回初めて国産小麦中の汚染を検出した(M.Kushiro et al.J.Food Prot.in press)。「イネ着生フザリウム属糸状菌のマイコトキシン産生関連クラスターの探索と同定」において昨年度見出した新規マイコトキシン生合成関連遺伝子の候補遺伝子について、ポリケタイド合成酵素全長と思われるクローンの取得に成功し、異種糸状菌(Aspergillus oryzae)発現系での機能発現を試みた結果、空のベクター(コントロール)には無い化合物の産生が認められた。新規の構造を持った糸状菌由来二次代謝産物である可能性が高く、現在各種機器分析により構造情報の取得を目指している。また「イネ着生フザリウム属糸状菌におけるマイコトキシン産生性の解明」については、これまでに入手したイネ着生フザリウム属糸状菌(麦類赤カビ病菌Fusarium graminearum、トウモロコシ赤カビ病菌F.verticillioides、イネ馬鹿苗病菌F.fujikuroi等)の各菌株を培養後、各種機器分析によりそれらのマイコトキシン産生性を精査した結果、これまでフモニシン産生の報告が無い菌においてフモニシンの産生を見出した。各種穀物(コメ、コムギ、トウモロコシ)培地でのフモニシン産生能を比較した結果、一般的にはトウモロコシ培地が最適であることが示された。フモニシンは、トウモロコシ中の汚染が顕著である事実と関連しており植物と糸状菌の生理的相互作用の面から興味深い。さらにコメにおいては、長粒種(タイ米など)と短粒種(ジャポニカ米)で産生条件等に違いが見出された。これらの成果は論文化し受理された(2件)。申請書の本年度の研究実施計画に従い、「イネ着生フザリウム属糸状菌におけるマイコトキシン産生性の解明」のための実験を行った。これまでに調査したイネ着生フザリウム属糸状菌のうち、国内外でイネから単離はされているがイネ植物体上で病原性を示す報告が無いFusarium proliferatumに焦点を絞り、新たに菌株の調査と入手の手続きを取り、1)主要マイコトキシンであるフモニシン産生能の調査、ならびに2)F.proliferatumのイネでの生理作用の解析を行った。2}については、本年度、ジーンバンクの研究スタッフの協力を得て、由来が明らかに国産であるF.proliferatum 3株を用いて登熟過程のイネ植物体へ人工的に接種・感染させる実験を実施した。

その結果、1)において、日本各地域ならびに海外のイネ圃場由来のF.proliferatum 7株のうち6株でフモニシン産生能が認められた。また2)では、人工接種実験検体において、感染部位の生理的変化ならびにフモニシン蓄積を調査した結果、感染部位での変色ならびにフモニシン蓄積を観察することができた。F.proliferatumはトウモロコシの病原菌であり、イネで生理的変化を起こすという知見はこれまでになく、またLC-MS/MSを用いた高感度な分析系によるin vivoのイネ植物体でのフモニシン蓄積の検出も初めての知見である。昨年までに報告した研究成果も含めて国際マイコトキシン学会(ISM主催、マレーシア)に応募したところ、口頭発表演題に選抜された。現在、今回イネ植物体上で見られた生理的変化がイネの過敏感反応によるものではないことを検証中であり、近く論文化を行う。
変動速度-圧力相関項のハイブリッド・モデリング

本研究は瞬時の速度場データを基に圧力分布を算出することにより、定量的な評価が極めて困難であった圧力変動と速度変動の相関を求め、圧力変動を媒介とする乱流輸送機構について現象論的なモデルを構築することを目的とした。圧力場の算出は、離散化された圧力のPoisson方程式に、粒子画像流速計(PIV)により実測した速度場情報を代入し数値解析を実行し、実験と数値解析の有機的な結合によるハイブリッド手法を新たに提唱した。研究初年度は対象とする流れ場に2次元性の強い角柱後流ながれを取り上げ、計測と解析を行った。その結果、角柱の後流に放出される、角柱と同程度の規模を持つ渦構造と圧力分布との間に、おおむね妥当な対応関係を見出すことができた。また、圧力のPoisson方程式を解く際に必要となる周囲境界条件の設定に検討を加え、圧力変動強度がより妥当に評価できる手法を確立した。以上の検討を基に、乱流エネルギの輸送方程式における各項のバランスを評価し、圧力拡散と乱流拡散の相互作用を捉えることができた。研究2年度は実験と等価の条件で数値シミュレーションを行い、乱流エネルギの輸送方程式の収支について、より詳細な考察を加えた。乱流場の最小スケールに相当するコルモゴロフの長さスケールに対して、計算格子サイズを数倍程度となるように考慮し、有限体積法により計算を行った。以上のシミュレーションの結果を利用して、角柱中央断面の周囲で乱流エネルギならびにレイノルズ応力の各成分について輸送方程式中の圧力相関項の評価を行った。その結果、乱流拡散輸送と圧力拡散輸送の間の関連は、従来言われていたような比例関係が成り立たない領域が殆どであることがわかった。これは、前年度の実験結果と整合するものであった。現在の乱流モデルで使われている勾配拡散モデルではこのような物理現象を表すことができず、速度-圧力相関の項についてのモデル開発が重要であることが確認できた。本研究は瞬時の速度場データを基にして圧力分布を算出することにより,従来は定量的な評価が極めて困難であった圧力変動と速度変動の相関を求め,乱流場における圧力変動を媒介とする輸送機構を解明することを目的としている.圧力場の算出は,離散化された圧力のPoisson方程式の数値解析による方法を採用したが,その際,粒子画像流速計(PIV)により実測した速度場情報を代入することで,実験と数値解析の有機的な結合によるハイブリッド手法を新たに提唱した.技術的に根源的な課題として,今年度は以下の2点を取り上げ検討した:・PIVの速度場情報か平面に限られるため,解析するPoisson方程式も2次元に近似せざるを得ない・Poisson方程式は楕円型であるので,解析領域の全境界にわたって境界条件を定めなければならない第1の問題を軽減するために,対象とする流れ場に2次元性の強い角柱後流ながれを取り上げ,計測と解析を行った.その結果,角柱の後流に放出される,角柱と同程度の規模を持つ渦構造と圧力分布との間に,おおむね妥当な対応関係を見出すことができた.

また,第2の問題については,周囲境界で圧力の値を規定するDirichlet条件と圧力勾配を規定するNeumann条件の2種類について検討したところ,Neumann条件に工夫を加えた場合の方が圧力変動の強さがより妥当に評価できることを確認した.以上の検討を基に,乱流エネルギの輪送方程式における各項のバランスを評価した,乱流エネルギの生成は角柱の縁の急激な変形が起こる領域で大きいが,その直後の領域には,圧力拡散と乱流拡散の相互作用によって乱流エネルギが輪送されいる様子を捉えることができた.このことから,圧力拡散項の計測に見とおしを立てることができた.本研究は速度場と圧力場の相関と乱流構造の関係を明らかにするために、実験および数値シミュレーションの双方から相補的なアプローチを試みるものである。昨年度は実験を中心に検討を加えた結果、圧力拡散と乱流拡散の相互作用についての知見を得ることができた。本年度は、主に数値シミュレーションを行い、実験では不十分だった乱流エネルギの輸送方程式の収支について、より詳細な考察を加えた。数値シミュレーションは、一様流中に置かれた1辺がHの正方形断面を有する角柱の周囲の流れ場を対象とした。計算領域は、実験流路のサイズに合わせ、主流方向に20H、主流と直角かつ角柱断面内の方向に10H、スパン方向に5Hとした。同様の理由から、主流速度とHに基づくレイノルズ数を1,100とした。乱流場に存在し得る最小スケールに相当するコルモゴロフの長さスケールに対して、計算格子サイズを数倍程度となるように考慮し、主流、直角、スパン方向に140×128×24の計算体積を設け、コロケート格子による有限体積法に基づき、オイラーの時間進行法により計算を行った。以上のシミュレーションの結果を利用して、角柱中央断面の周囲5H×3Hの領域を中心に、乱流エネルギならびにレイノルズ応力の各成分について輸送方程式中の圧力相関項の評価を行った。その結果、変動速度の3重相関から成る乱流拡散輸送と、速度-圧力相関から成る圧力拡散輸送の間の関連は、従来言われていたような比例関係が成り立たない領域が殆どであることがわかった。これは、前年度の実験結果と整合するものであった。さらに、現在のレイノルズ応力方程式モデルで主流として使われている勾配拡散モデルは、いずれもこのような物理現象を表すことができず、速度-圧力相関の項について更なるモデルの検討が急務であることが判明した。
インヒビター保有血友病における抗イディオタイプ抗体誘導機序に関する研究

【目的】われわれは免疫寛容療法を施行中に高力価のインヒビター存在下でも微量の第VIII因子活性(FVIII:C)が残存し、第VIII因子製剤の輸注効果を認める症例が存在する点に着目し、この一見相反する現象を詳細に検討することで、免疫寛容療法における抗イディオタイプ抗体誘導のメカニズムを解明することを目的とする。【材料および方法】使用したインヒビターは、同種抗体(AlloAb)7種とモノクローナル抗体(MoAb)4種で、AlloAbのうち3種は重鎖A2ドメインを、4種は軽鎖C2ドメインを認識する抗体であり、MoAbは重鎖A1とA2ドメインを認識する抗体が各1種と軽鎖C2ドメインを認識する抗体が2種であった。インヒビターIgGを第VIII因子欠乏血漿で希釈し、10および20BU/mlのインヒビター含有第VIII因子欠乏血漿を作製した。それらを正常血漿と等量混合後1、10、30、60、120分の検体のFVIII:CおよびMDA-IIによる最大凝固加速度(|Min2|)を計測した。【結果】10BU/mlのインヒビター存在下で120分後、AlloAb4種で0.4-1.1U/dlのFVIII:Cを検出し、3種で0.128-0.152の|Min2|を認めた。一方、MoAb3種で0.2-5.7U/dlのFVIII:Cを検出し、4種で0.102-0.367の|Min2|を認めた。一方、20BU/mlのインヒビター存在下で、120分後には、AlloAb1種で0.8U/dlのFVIII;Cを検出し、3種で0.111-0.131の|Min2|を認めた。一方、MoAb2種で0.3-3.2U/dlのFVIII:Cを検出し、1種で0329の|Min2|を認めた。【考案】重鎖A2ドメインを認識するAlloAbおよびMoAbでは微量のFVIII:Cが検出される傾向がみられ、インヒビターの認識部位によってFVIII:Cの失活パターンが異なることが判明した。これらの知見は免疫寛容療法中に経験するインヒビター存在下での予防的止血効果との関連性を示唆するものであり、抗イディオタイプ抗体誘導を示す間接的傍証であると思われた。血友病犬にイヌクリオプレチピテートを輸注しインヒビター犬モデルの作成を試みたが、二頭のうち一頭で一過性のインヒビターの出現をみただけで、インヒビター犬作製には至らなかった。そのため、ヒト血友病A患者に発生したインヒビターを用いた実験系に切り替え、その解析をin vitroで行うこととした。まず、インヒビター患者のうち、高力価のインヒビターを有する7名の患者血漿からIgGを精製し、インヒビターIgGの生化学的・免疫学的解析を行った。ウェスタンブロット法による各インヒビターの認識部位の同定では7例中3例が第VIII因子H鎖を、4例がL鎖を認識していた。

インヒビター力価は4196 Bethesda単位(BU)/mgであった。各インヒビターIgGと正常血漿を37°Cで反応させ、第VIII因子活性の失活するパターンを継時的に観察した。その結果、インヒビターIgGを1BU/mlに調整した場合は各IgG間で有意な差は認めなかったが、10BU/mlに調整した場合はH鎖を認識するインヒビターとL鎖を認識するインヒビターの間で明らかな差を認め、インヒビターの認識部位によって第VIII因子活性の失活パターンが異なることが判明した。この知見は免疫寛容療法を行う上で、その成否に影響を与える可能性が示唆され、次年度は実際に免疫寛容療法の成功および不成功例のインヒビターIgGを用いて解析を行う計画である。目的:前年度の検討で第VIII因子のH鎖を認識するインヒビターとL鎖を認識するインヒビターの間で明らかに第VIII因子活性(FVIII:C)の失活パターンが異なることを示した。今年度はさらに凝固解析装置MDAIIによる最大凝固加速度(|Min2|)の測定も合わせて行うとともに抗第VIII因子モノクローナル抗体(MoAb)を用い、その認識エピトープによる差異を詳細に検討した。方法:インヒビター(AlloAb)は重鎖A2ドメインを認識する3種と軽鎖C2ドメインを認識する4種を、MoAbは重鎖A1とA2ドメインを認識する抗体各1種と軽鎖C2ドメインを認識する抗体2種を使用した。AlloAbおよびMoAb IgGを第VIII因子欠乏血漿で希釈し、10および20 Bethesda単位(BU)/mlのインヒビターを有する第VIII因子欠乏血漿を作製した。それらを正常血漿と等量混合後1、10、30、60、120分の検体の第VIII因子活性および|Min2|をMDAIIで計測した。成績:10BU/mlのインヒビターと120分反応後、AlloAb7種中4種で0.4-1.1U/dlのFVIII:Cを検出し、7種中3種で0.128-0.152の|Min2|を認めた。MoAb4種中3種で0.2-5.7U/dlのFVIII:Cを検出し、4種中全てに0.102-0.367の|Min2|を認めた。一方、20BU/mlのインヒビターと120分反応後には、AlloAb7種中1種で0.8U/dlのFVIII:Cを検出し、7種中3種で0.111-0.131の|Min2|を認めた。MoAb4種中2種で0.3-3.2U/dlのFVIII:Cを検出し、4種中1種で0.329の|Min2|を認めた。とくに重鎖A2ドメインを認識するAlloAbでは微量のFVIII:Cが検出される傾向がみられ、MoAbを用いた実験系でも確認された。考案および結語:高力価のインヒビター存在下でも120分後に微量のFVIII:Cが検出された。とくに重鎖A2ドメインを認識する抗体では20BU/mlの条件下でもFVIII:Cが残存する傾向を示した。これらの知見はインヒビター存在下の第VIII因子定期投与で経験する予防的止血効果との関連性を示唆するものであり、抗イディオタイプ抗体誘導を示す間接的傍証であると思われた。
膜蛋白質の選択的切断法の開発と応用

昨年度までに目的とする人工リン脂質分子の効率的な合成法を開発し、head部分に蛋白切断活性を持つ多様なリン脂質誘導体を合成することが出来た。今年度はその結果を受け、さらなるリン脂質誘導体の合成法の開発と、膜蛋白質切断を目指した生物実験を行い、以下の結果を得た。1)人工リン脂質の合成を効率化すべく、固相合成法の開発を行った。その結果、一部の蛋白質切断能が期待される人工リン脂質については、精製操作を行うことなく簡便に合成することに成功した。現在、固相とリン脂質を繋ぐリンカー部分の改良等を始めとしたさらなる検討を行っている。2)ヘマグルチニン(HA)を始めとした膜蛋白質は、リン脂質存在下、比較的容易に人工膜に再構成できることが知られている。そこで、天然由来のリン脂質とHAとの再構成膜の作成を検討した。その結果、作成条件を確立することが出来た。現在、人工リン脂質を含む人工膜の作成を検討し、その膜構造を電子顕微鏡で観測すべく検討を重ねている。3)蛋白切断後のペプチド断片の検出感度を上げるため、HAの蛍光ラベルを検討した。その結果、フルオレセインで蛍光ラベルすることに成功した。しかしながら、その蛍光の消光は比較的早く、さらなる蛍光基のスクリーニングが必要であることも分かった。現在、上記の結果に基づきHAの切断反応を検討している。膜蛋白質は、G蛋白質共役型受容体などの薬物受容体の役割を担うものも多く、創薬の観点から極めて重要な標的分子として注目されている。本研究課題において、膜蛋白質の機能・構造解析に有機合成化学の立場から貢献すべく、『膜界面での膜蛋白質の切断反応の開発と応用』を提案し、その開発を行った。すなわち、head groupとして、蛋白質切断の活性中心となるFe(III)-EDTAを有し、tail groupとして飽和脂肪鎖を持つハイブリッド型の人工リン脂質を設計し、その合成に成功するとともに膜蛋白質に対する切断活性について明らかにした。すなわちホスホロアミダイト法により、head groupとtail groupのカップリングを行った後、数段階を経て目的のリン脂質の合成に成功した。この分子を用いインフルエンザウイルスのHAをターゲットに切断反応を検討したところ、期待通り切断反応が起こることがわかった。この際、ウイルス粒子の内部に存在する、matrix protein(M)およびnucleoprotein(NP)の2種類の蛋白質は全く切断されず、本反応はウイルス粒子の外側で選択的に起こることも明らかにしている。同様の条件下、単純なFe(III)-EDTA錯体を用いて同様の反応を行ったところ、切断は起きないことも確かめており、リン脂質誘導体ならではの膜蛋白質切断能を有することも明らかにした。
発見的探索アルゴリズムの理論と実働化

人工知能の問題解決において,探索は常に鍵となる役割を果たしている.実際のアプリケーションにおいては,問題固有の知識を利用しながら探索を制御し,探索経路の組み合わせ的爆発に対する工夫を行うことが必要である.このような経験的な知識を利用した探索は,発見的探索アルゴリズムと呼ばれているが,そのパフォーマンスは個々の問題固有の性質に強く依存し,効率の良い探索技法の統一的な開発,解析が極めて困難である.この発見的アルゴリズムを計算論的学習理論の枠組みでとらえ,さらに具体的な問題を用いてその有効性を実証することを目標として研究を展開した.まず,質問学習のモデルにおいて,概念クラスが多項式回の質問によって学習可能になるための統一的な特徴付けを与えることに成功した.この特徴付けは,これまで等価性質問,所属性質問,およびその組み合わせについてそれぞれ個別に研究されてきたものであるが,我々の成果はそれを包含している.この特徴付けにより,質問による学習可能性の本質は例空間を効率よく絞り込む質問の存在と,絞り込んだ仮説が正しいことを検証できる質問の存在にあるという知見が得られた.次に,実際的によく用いられている決定木の学習アルゴリズムを土台にして,重み付き分類規則を見つけるアルゴリズムを提唱した.計算機実験によってこの方式が時間的にも,また予測精度の点からも決定木のものと同等以上の性能を有することを検証した.さらに,遺伝子の破壊と強制発現によるデータから遺伝子ネットワークを同定する問題を探索問題としてとらえ,この問題の計算量を解明し,理論的な面と実際的な面の両面からそのパフォーマンスを解析し,計算機実験を行った.人工知能の問題解決において,探索は常に鍵となる役割を果たしている.実際のアプリケーションにおいては,問題固有の知識を利用しながら探索を制御し,探索経路の組み合わせ的爆発に対する工夫を行うことが必要である.このような経験的な知識を利用した探索は,発見的探索アルゴリズムと呼ばれているが,そのパフォーマンスは個々の問題固有の性質に強く依存し,効率の良い探索技法の統一的な開発,解析が極めて困難である.この発見的アルゴリズムを計算論的学習理論の枠組みでとらえ,さらに具体的な問題を用いてその有効性を実証することを目標として研究を展開した.まず,複数の有力なアルゴリズムを統合して,よりパフォーマンスの高いシステムを構築するための手法として,重みつき投票アルゴリズム(WM)の拡張(WM^*)を行った.WMは,各アルゴリズムに予測を投票させ,その投票結果によって全体的な判断を下すものである.我々の拡張によるWM^*は,おのおののアルゴリズムが投票を棄権することを認めるもにであり,直観的には,各アルゴリズムは自信のない予測については棄権によって発言権の低下を防ぐことができると期待される.実際に我々は,WM^*による予測の方がWMによる予測よりも原理的に優れていることを理論的に証明した.このWM^*を組み込んだ領域予測システムHAKKEのプロトタイプを用いて,DNA配列の中から遺伝子領域を予測する実験を行った.また,情報検索の基本であるパターン照合問題に対して,テキストとパターンが両方とも直線的プログラムで記述されて与えられたときに高速にパターン照合を行うアルゴリズムの開発に成功した.人工知能の問題解決において,探索は常に鍵となる役割を果たしている.実際のアプリケーションにおいては,問題固有の知識を利用しながら探索を制御し,探索経路の組み合わせ的爆発に対する工夫を行うことが必要である.このような経験的な知識を利用した探索は,発見的探索アルゴリズムと呼ばれているが,そのパフォーマンスは個々の問題固有の性質に強く依存し,効率の良い探索技法の統一的な開発,解析が極めて困難である.この発見的アルゴリズムを計算論的学習理論の枠組みでとらえ,さらに具体的な問題を用いてその有効性を実証することを目標として研究を展開した.まず,質問学習のモデルにおいて,概念クラスが多項式回の質問によって学習可能になるための統一的な特徴付けを与えることに成功した.この特徴付けは,これまで等価性質問,所属性質問,およびその組み合わせについてそれぞれ個別に研究されてきたものであるが,我々の成果はそれを包含している.この特徴付けにより,質問による学習可能性の本質は例空間を効率よく絞り込む質問の存在と,絞り込んだ仮説が正しいことを検証できる質問の存在にあるという知見が得られた.次に,実際的によく用いられている決定木の学習アルゴリズムを土台にして,重み付き分類規則を見つけるアルゴリズムを提唱した.計算機実験によってこの方式が時間的にも,また予測精度の点からも決定木のものと同等以上の性能を有することを検証した.さらに,遺伝子の破壊と強制発現によるデータから遺伝子ネットワークを同定する問題を探索問題としてとらえ,この問題の計算量を解明し,理論的な面と実際的な面の両面からそのパフォーマンスを解析し,計算機実験を行った.
火成岩岩石学用エキスパート・システムの構築

火成岩岩石学用のエキスパート・システムの構築を行った。地球化学的データに基づいて、各種の判別を行う本システムは、メニュー方式で、各サブプログラム・各種ファイルを管理・運営する統合部、データを組織的に維持・管理するデータベース部、データを必要に応じてグラフ表示し、判別するためのグラフィックス部、地図上に一次データあるいは二次データを表示するデータ・マッピング部、そしてこれらのデータを用いて各種の処理・モデル計算などを行うデータ処理部から構成される。また、これとは別に、カメラならびにビデオ映像データを用いて、岩石組織や構造を取込み、簡単な火成岩類の判別を行うシステムを構築した。各種火成岩類を、その地球化学的性質や、構造・組織上の特徴に基づいて、所属グループの判別や成因・形成プロセスの判別を行う際には、規準となるデータベースを構築する必要がある。そこで、これまでに、我々のグループで各種の主成分ならびに微量成分元素の分析を行った火成岩類について、その結果をデータベース化した。さらに、蛍光X線分析法、光量子放射化法、ICP質量分析法などにより、東北本州弧新生代火山岩類、中部地方第四紀火山岩類、白亜紀空知層群火山岩類、白亜紀古第三紀四万十層群火山岩類、メキシコ第四紀火山岩類などの、各地で採取した多様な火成岩類の、主成分ならびに微量成分元素の化学分析を今回新たに行い、それらについてもデータベース化した。そして、本システムを用い、それら多様な火成岩類について、各種の判別作業を行ない、その成果の一部を公表した。平成7年度は,火成岩岩石学用エキスパート・システムの基本的構造の研究を行い,それに基づいて,解析システム(ハード)の構築,知識データベースの構築,そしてコンピュータに対する入出力インターフェイス部の構築を進めた。基本的な解析ならびに入出力システム(ハード)の設計,パ-ツの購入を終え,現在システムの構築を進めている。組織データ入力には,岩石組織の写真撮影装置とともに,偏光顕微鏡から直接組織画像が取り込み可能なカラービデオカメラを用いることとし,その表示用に21インチの大画面モニターを接続した。組織のうちの鉱物容量比測定に関しては,やはりオートマチックポイントカウンターが現在のところ最も安価で,効率的な装置であるので,これを顕微鏡にセットし,鉱物の観察・同定作業をモニターを用いて行えるようにシステムをセットした。大容量の画像データベース構築用の媒体として,いくつかの異なるメディアとドライブについて検討を行った。テクトニックに異なる地域からの代表的試料の採集,採集試料の薄片作成、記載作業等を進めている。また,分析データの入出力系と解析用グラフィック部,ならびにモデル計算部について,各種モジュールの設計とプログラミングを,DOS/Vおよびウインドウズ上で進めている。まだ,この部分は未完成であるが,その一部を用いて,東北本州弧新生代火山岩類についての,プロセス判定図の半自動作成作業を行い,その成果を用いて報告書を作成した。データ入力作業のうち,露頭写真を含めた岩石組織などの基本データの入力をかなり進めることができ,また,システムに導入し接続した組織データの入力部分についても,現在順調に機能している。各種火成岩類を、その地球化学的性質や、構造・組織上の特徴に基づいて、所属グループの判別や成因、形成プロセスの判別を行う際には、規準となるデータベースを構築する必要がある。

さらに、蛍光X線分析法、光量子放射化法、ICP質量分析法などにより、東北本州弧新生代火山岩類、中部地方第四紀火山岩類、白亜紀空知層群火山岩類、白亜紀古第三紀四万十層群火山岩類、メキシコ第四紀火山岩類などの、各地で採取した多様な火成岩類の、主成分ならびに微量成分元素の化学分析を今回新たに行い、それらについてもデータベース化した。そして、本システムを用い、それら多様な火成岩類について、各種の判別作業を行ない、その成果の一部を公表した。
電気融合による生体内への耐凍結・乾燥物質の高速高効率導入バイオチップの開発

乾燥や極低温状態で細胞を損傷なく長期間保存する為に有効な耐凍結・乾燥保護物質を効率よく細胞内に導入する技術として,細胞と保護物質を内包したリポソームの電気融合に着目し,融合を高効率に行うためのデバイスの開発と高効率融合に必要な電気操作のパラメータの最適化をおこなった.乾燥や極低温状態で細胞を損傷なく長期間保存する為に有効な耐凍結・乾燥保護物質を効率よく細胞内に導入する技術として,細胞と保護物質を内包したリポソームの電気融合に着目し,融合を高効率に行うためのデバイスの開発と高効率融合に必要な電気操作のパラメータの最適化をおこなった.本年度は,電極形状がことなるいくつかの細胞-GUV電気融合バイオチップの作製を試み,最終的に櫛形の電極の長さと形状を決定した.さらに,エレクトロローテーションにより,GUVと細胞の誘電特性を測定して,内部の電気物性を決定した.また,融合に必要な電場強度を設計するための数値解析モデルを完成させた。細胞-GUV電気融合バイオチップの形状については,幾度かの予備実験により,電極長を数mmにすることや,電極を流路内になるべく突き出さないこと,流路を50pm巾程度にすることが,1対1の対応を確実につけるためには重要であることがわかった.さらに,流路については,PDMSで型をとって作製する方法を選択することで,適切な高さの流路の作製が見込まれることがわかったので,50pm巾-高さのマイクロ型を作製した。以上,本年度の段階では,主として数値解析モデルと電気物性測定,および予備実験による流路形状の設計にとどまった.今後はチップの作製と平行して,印加パルス長さと強度の計算とワイヤー電極による予備実験の比較を行う。H21年度より繰り越された研究計画は,電気融合と電気泳動が同時に行える微小流路と電極構造を持つデバイスの製作を目的としている。同デバイスは,細胞とリポソームを1対1で電極間に配列させた後,パルス電場を印加することで,両者を電気融合する機能を実現する.この機能により,今まで不可能であった細胞内にリポソームに内包した高分子で非膜透過性の耐凍結・乾燥保護物質を効率的に導入することが可能になり,細胞の凍結・乾燥保存法に飛躍的な進展が見込まれる.当初の計画では波形の電極をマイクロ流路の両壁面に有する形状を作製したが,流路内で細胞とリポソームが均等に配列しないこと,融合を行う流路内に細胞とリポソームを停留させることが困難であることが判明した.その後の予備実験を踏まえた検討の結果,電気融合を行う流路と細胞やリポソームを供給する流路を分離し,電気融合を行う流路の両壁の電極を各壁に沿って1列に配列した柱状電極をもつデバイス形状に変更して試作を試みた.変更したデバイスでは,細胞やリポソームを供給する流路は融合流路より十分に巾広で壁面の柱状電極の接しており,供給流路内に停留することができる.また,供給流路の細胞やリポソームは柱状電極の隙間より融合流路に誘電泳動で侵入し,電極間で配列される.以上の形状をもつデバイスを,ガラス基板上に電気鋳造とMEMS加工を用いる試作を依頼した.完成した複数のデバイスの一部で,細胞とリポソーム1対1の電気泳動による配列・融合が可能であることを実験的に確認した.但し,これらのデバイスは,全ての試作品について柱状電極のアスペクト比が大きく,かつ電極間距離も非常に短い為,柱状電極とガラス基板面の接合が脆弱であったり,亀裂が生じていた.このため,電極が容易に剥離してしまうので,実用上には更なる加工法の検討もしくは,加工法を考慮した形状の変更が必要であることがわかった.最終年度では,トレハロースを内包したリポソームとJurkat細胞をワイヤー電極を用いて電気融合をおこない,その間の様子を顕微鏡観察して,あわせて融合率を測定した,また,高電圧パルス電場によるリポソームとJurkat細胞の膜電位分布や電場分布を計算できる数値シミュレーションコードを作成した.計算は,前年度に測定した両者の電気物性値を用い,顕微鏡写真より測定した配向したリポソームとJurkat細胞の形状を計算対象の形状を対象としておこなった.さらに,融合したリポソームとJurkat細胞の浸透圧を変化させて膜の透過特性の健全性を確認した.以上の実験,計算の結果,任意のパルス電場強度とパルス印加時間に対する電場・膜電位の予測ができることがわかり,電気融合に必要な膜電位の条件を見いだすことができた.一連の研究を通じて,融合するリポソームとJurkat細胞の電気物性の測定方法,融合条件の計算手法を開発し,最適な高電圧パルス電場の条件を電極形状やリポソームと細胞の大きさにあわせて予測することが可能になった.但し,当初の目的であったリポソームと細胞を1対1で配向させて電気融合を行うデバイスについては,同操作な実現するデバイスは作製できたものの,デバイスが複雑な形状を有することから今回行った加工方法では,電極部の機械的強度が不十分で導通も不安定であった為,複数回の実験に耐えうるものには至らなかった.今後は加工方法を再検討すると同時に,より単純な形状のデバイスを考案することが重要であると思われる.
分裂酵母における胞子への選択的ミトコンドリア継承機構の解明

分裂酵母の胞子形成関連因子Npg1の細胞内局在および機能を制御する上流因子を探索したところ、Npg1は減数第一分裂期以降にオーロラキナーゼArk1によりその局在や機能が制御されていることが示唆された。またATPバイオセンサーを導入して、減数分裂期から胞子形成時にかけての細胞内ATP濃度を計測すると、母細胞のATP濃度が徐々に減少する一方で、胞子内ATP濃度が増大する様子が観察された。この結果は胞子形成における、厳密に制御されたエネルギー代謝の継承機構の存在を実証するものであり、現在その分子機構についてさらなる解析を行っている。ミトコンドリア(Mt)は細胞の生存に必須なエネルギー生産を担うオルガネラであり、新規に生成されないため、細胞系列の維持には娘細胞がMtを適切に継承する必要がある。またMtの機能低下は代謝・神経疾患や老化の原因となる。分裂酵母の胞子形成時には、母細胞から新生胞子へ確実にMtが分配されるが、その分子機構は不明である。申請者はこれまでに胞子形成関連因子npg1遺伝子破壊株では胞子へのMt分配が異常になり、また胞子の生存率が低下することを発見した。これは胞子形成と共役したMt継承機構の存在を示唆する。本研究では胞子形成をモデル系として、Mtが胞子へ分配される動態やMt活性を高精度で計測する。また変異株を使用して分子遺伝学的に解析することで、細胞新生におけるMtの分配機構および品質管理機構の解明に迫る。平成27年度に実施した研究の成果は以下の通りである:(1)胞子形成因子Npg1の細胞内局在の解析Npg1は減数分裂期IとIIの間に核内に2-3個のドットとして局在するため、染色体(分裂酵母では3本)やその他の核内構造との相互作用が示唆された。そこで既知のマーカータンパク質を利用して、セントロメア、テロメア、核小体とNpg1の局在を同時に観察して比較したが、Npg1のドットはいずれの構造とも局在が一致しなかった。一方、オーロラキナーゼB Ark1も核内でドット状に局在することが知られていたので、Npg1とArk1を同時に観察した所、両者の局在は非常に良く一致した。(2)胞子形成因子Npg1とオーロラキナーゼB Ark1の遺伝学的相互作用上記(1)の結果からNpg1とArk1の相互作用が示唆されたため、Npg1遺伝子破壊株と薬剤感受性Ark1変異株を交配させて、二重変異株を作製し、胞子形成効率を観察した。二重変異株では野生株や単独変異株と比較して極端に胞子形成効率が低下しており、いわゆる正の遺伝学的相互作用が確認された。当研究課題の目的は、申請者が発見した分裂酵母の胞子形成因子Npg1の活性および局在の制御機構の解明と、胞子形成時における適切なミトコンドリア継承機構の解析である。現在までにNpg1はオーロラキナーゼB Ark1と核内で共局在すること、npg1変異とark1変異は胞子形成において正の遺伝学的相互作用を示すことを明らかにした。またArk1の活性がNpg1の局在を制御することを示唆する予備実験の結果も得られている(上記研究実績の概要では省略)。さらにark1は減数分裂期IとIIの間に、npg1と同様に発現量が増大することが知られている。これらの結果はArk1が胞子形成時にNpg1の局在や活性を制御していることを強く示唆するものである。細胞内シグナル伝達に関与するキナーゼとしてのark1の機能は、減数分裂期I以降以外の時期では詳細に解析されており、有用な変異株も既に多数製作されている。本研究でもそれらの解析法のノウハウや変異株を流用することができる。具体的にはNpg1にはArk1による予想リン酸化サイトが複数存在するため、これらの残基を非リン酸化型に改変した変異npg1株を作製して解析すれば、Ark1によるリン酸化とNpg1の活性の関係を厳密に検証することが可能である。従って本研究の目的の一つであるNpg1の上流の制御機構の解析についてはほぼ見通しが立ったと言える。また今後の実験に必要な変異株はほぼ作製が完了しつつある(研究実績の概要では省略)。よって現在までに得られた研究成果は本研究課題の研究目的に則して、概ね順調な達成度であると言える。本研究では胞子形成をモデル系として、細胞新生におけるMtの分配機構および品質管理機構の解明に迫る。平成28年度に実施した研究の成果は以下の通りである:(1)胞子形成期におけるオーロラキナーゼBArk1タンパク質量の変動の解析Ark1のプロモーター領域を解析したところ減数分裂特異的な転写因子mei4の結合モチーフであるFLEX配列が複数検出された。これは減数分裂および胞子形成時期におけるArk1タンパク質量の上方制御を示唆する。

そこでArk1タンパク質の量的変動を実際に計測するためのHAタグ融合型のArk1発現株を作製し、ウエスタンブロット法でバンドが検出されることを確認した。またこの株にさらにpat1-114変異を導入することで、減数分裂期に高度に同調させた細胞集団中のArk1タンパク質量を計測することが可能になった。(2)Npg1とArk1の遺伝学的相互作用Npg1-GFP株と薬剤感受性Ark1変異株を交配させてnpg1-GFP ark1-as株を作製したところ、この株では野生株や単独変異株と比較して胞子形成効率が低下していた。さらにNpg1局在を観察した結果、Ark1野生株では観察されないような異常なNpg1-GFPドットの局在が確認された。これらの結果はArk1活性がNpg1の正しい細胞内局在に重要であることを示唆する。当研究課題の目的は、申請者が発見した分裂酵母の胞子形成因子Npg1の活性および局在の制御機構の解明と、胞子形成時における適切なミトコンドリア継承機構の解析である。現在までにNpg1はオーロラキナーゼB Ark1と核内で共局在すること、npg1とark1変異は胞子形成において正の遺伝学的相互作用を示すこと、またArk1の活性がNpg1の局在を制御することを明らかにした。さらにark1は減数分裂期IとIIの間に、npg1と同様に発現量が増大することが知られている。これらの結果はArk1が胞子形成時にNpg1の局在や活性を制御していることを強く示唆するものである。細胞内シグナル伝達に関与するキナーゼとしてのark1の機能は、減数分裂I以降以外の時期では詳細に解析されており、有用な変異株も既に多数製作されている。本研究でもそれらの解析法のノウハウや変異株を流用することができる。具体的にはNpg1にはArk1による予想リン酸化サイトが複数存在するため、これらの残基を非リン酸化型に改変した変異npg1株を作製して解析すれば、Ark1によるリン酸化とNpg1の活性の関係を厳密に検証することが可能である。従って本研究の目的の一つであるNpg1の上流の制御機構の解析についてはほぼ見通しが立ったと言える。また今後の実験に必要な変異株はほぼ作製が完了しつつある。よって現在までに得られた研究成果は本研究課題の研究目的に則して、概ね順調な達成度であると言える。ミトコンドリア(Mt)は細胞の生存に必須なエネルギー生産を担うオルガネラであり、新規に生成されないため、細胞系列の維持には娘細胞がMtを適切に継承する必要がある。またMtの機能低下は代謝・神経疾患や老化の原因となる。分裂酵母の胞子形成時には、母細胞から新生胞子へ確実にMtが分配されるが、その分子機構は不明である。申請者はこれまでに胞子形成関連因子npg1遺伝子破壊株では胞子へのMt分配が異常になることを発見した。本研究では胞子形成におけるMtの分配機構および品質管理機構の解明に迫る。平成29年度に実施した研究の成果は以下の通りである:(1)分裂酵母細胞内ATP濃度の可視化分裂酵母細胞内のエネルギー状態を一細胞レベルで解析するために、ATPバイオセンサーQUEEN (Yaginuma et al., 2014)を発現する株を作製した。ATP産生の阻害剤を使用した実験から、QUEENのシグナルは細胞内ATP濃度変化を正しく反映できることが確認された。