hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
高齢者漁業を前提とした社会基盤の再構築―浜の会社を目指して―

本研究では、第1に高齢漁業者のなかでも超高齢と言える80才前後の高齢漁業者や引退漁業者への面談調査を通じて漁業の継続動機・引退動機を明らかにした。積極的な継続・引退とやむを得ずの継続・引退がある。第2に漁業センサス分析を通じて、高齢漁業者の多くは男子1名ないし夫人と2名で操業しており、子息と同居しているケースも少ないことを明らかにした。高齢化により限界集落化する漁業地区で漁業生産を継続していくためには、地区外からの新規参入者を受け入れることも必要である。この点で、第3の研究成果である高齢漁業者が地区外者の受け入れを決断し、技術を継承し、生活面での支援まで行っている三重県の2事例を抽出した。本研究は、高齢者漁業を前提とした社会基盤の再構築方法を探求することにある。本研究を通じて、高齢になるのを機に引退してしまった漁業者の引退年齢、引退動機、引退後の生計の状況を把握し、やる気も体力も残っているのに辞めざるを得ない高齢漁業者がなお漁業を継続するためにはどの様な社会基盤が必要かを検討すること、複数の漁業者が合同で漁業を行う形態として協業化・法人化があるが、法人は高齢漁業者が引退した後も漁業の担い手として存在しうるため、そのような「浜の会社」が高齢者を多数抱えた沿岸漁村の社会基盤になりうるのかを検証することを目的としている。これらの課題を探求するため、本年度は千葉県銚子、勝浦、富浦、富津、船橋において高齢漁業者・引退漁業者へのヒヤリング調査、漁業センサスを用いた文献調査、岡山県瀬戸市牛窓町において高齢漁業者の新規参入実態の調査、長崎県において高齢者の受け入れに積極的な自治体における中高年を対象とした新規就業者への漁船リース事業の実態調査を行った。その結果、高齢漁業者の引退動機は疾病のほかは、家族の強い反対によるものであること、2013年漁業センサスから漁業後継者のいない高齢かつ単世代で構成される高齢単世代漁家の増加実態と主とする漁業種類別の状況について明らかになった。また他職の定年後に就業するケースでは1本釣りに着業し、少量ながら水揚げをしている実態があり、一本釣り漁業者に占めるそうした漁業者の割合が2割程度にのぼること、高齢者の移住受け入れに積極的な長崎県の島嶼部では、県が中高年を対象とした漁船リース事業に取り組んでおり、先住の高齢者が新規参入者の指導を行い報酬を得ているケースもあることが明らかになった。平成27年度は次の3つの課題について調査・研究を行った。1すでに引退した漁業者の引退年齢、引退動機、引退後の生計の状況を把握する、2辞めざるを得ない高齢漁業者を引き止める社会基盤の抽出、3社会基盤としての「浜の会社」の活用事例の検討を行う。上記1については千葉県銚子、勝浦、富浦、富津、船橋において、高齢漁業者・引退漁業者のヒヤリングを行った(山下)。ヒヤリング対象者は疾病の他は、家族(夫人や子供など)の強い反対によって引退を決めている。文献調査では、2013年漁業センサスを資料として高齢漁業者の就業実態・存在形態・生産実態について分析し、漁業後継者のいない高齢かつ単世代で構成される漁家(以下、高齢単世代漁家とする)の増加と主とする漁業種類別の状況について明らかにした(工藤)。上記2については岡山県における高齢漁業者の新規参入実態についての実態調査を実施した(工藤)。他職の定年後に漁業に就業するケースが見られる岡山県瀬戸内市牛窓町漁協地区を調査し、1本釣り漁業者のなかには定年後に趣味と実益を兼ねて漁業を始めたものが2割程度存在し、また組合員ではないがボートを所有して少量ながらも漁協に漁獲物を水揚げしている高齢者も存在する。地区における1本釣りの水揚げ金額は大きいものではないが、これらの高齢漁業者が存在することで釣りものの水産物が市場に供給されており、その意義は小さくない。上記3については長崎県における新規就業者対策の実態調査を行った(工藤)。県では2015年度から中高年を対象とした漁船リース事業に取り組んでおり、高齢者の移住受け入れに積極的な島嶼部では本事業を活用して漁業への新規就業を促進する動きが見られること、また、本事業では新規就業者を指導する指導者に対しても報酬が支払われることになっており、指導者としての高齢漁業者の役割にも期待が大きいことが明らかになった。本年度は高齢漁業者ヒヤリングと研究成果発表(学会報告)を行った。ヒヤリングは富山県新湊漁協(9月)、宮城県遠洋漁業引退者・桃の浦かき生産合同会社(10月)、青森県平内漁況・三厩漁協(11月)、愛媛県久良漁協(12月)、北海道苫小牧漁協(3月)で概ね80歳以上の高齢漁業者・引退漁業者へのヒヤリングである。昨年度から経験済みであるが、引退漁業者との面談が難しい。漁協を通じて依頼した時点では、漁協側は心当りを思い浮かべて引き受けてくれるが、いざ正式に依頼すると応諾しなかったり、応諾しても当日欠席したりした。この事実自体が貴重な情報であるため、10月に行った地域漁業学会大会での山下の研究成果報告にはこの事を盛り込んだ。我々は「浜の会社」を作る事で漁業者相互間の業務融通を計り、それによって就労を続けたい高齢漁業者がいつまでも働き続けられる環境を確保したいと考えている。そのために先進的な法人化の事例を探している。今年度は山下・工藤が一緒に有名事例である桃の浦を訪問した(10月)

ほか、日本農業市場学会に参加して農業における法人化の事例収集を行った(7月)。この研究成果は工藤が水産海洋学会で行った報告に盛り込まれている(11月)。ヒヤリングの成果を概括すると、高齢になっても働き続けている漁業者は家族(息子や親戚)との相乗りが多い。単独操業者の多くは家族(夫人、子供など)から引退勧奨を受けている。そのためにいったん引退した漁業者が、再開を決意し船を修理中という事例もあった。引退した漁業者の引退事情は、本人の病気・けがに加えて二人乗りの相方の病気・けがによるやむを得ない廃業があった。これらは環境整備により漁業継続が可能である。相方は近隣で斡旋できるし(しかし漁協は仲介業務を行わない)、杖に頼っている引退漁業者の中にも、船に乗せてくれれば、漁獲物の仕分けはできる、と述べる者がいたからである。概ね計画通り進展している。今年度ヒヤリングを申し入れていた数漁協(三重県志摩、山口県光、長崎県対馬)が来年度に延期になった。漁業センサス2013を用いたデータ分析については、工藤は計画通り進んでいるが、山下は個票の取得が難航していてまだ分析には至っていない。これらは平成29年度に実施する予定である。研究成果報告の論文化についても、工藤は一本「その他」に掲載したが山下については来年度へ延期となった。地域漁業学会誌への投稿論文が修正ののち掲載可となっているため、平成29年度前半に出版される予定である。本研究は、高齢者漁業を前提とした社会基盤の再構築方法を探求することにある。研究を通じて、高齢になるのを機に引退してしまった漁業者の引退年齢、引退動機、引退後の生計の状況を把握し、高齢漁業者がなお漁業を継続するためにはどの様な社会基盤が必要かを検討した。最終年度である本年度は、現地調査、学会報告および学会でのシンポジウム開催を行った。現地調査については、工藤が三重県志摩市志島地区および尾鷲市早田地区において新規就業者対策における高齢漁業者の役割について現地調査を実施した。その結果、1.このままでは漁業者が皆無となる臨界点に達した時に地区外からの新規就業者を確保することを高齢漁業者が決意したこと、2.地区外からの新規就業者を確保するにあたってこれまでの地域漁業のルール・慣行を高齢漁業者が改革したこと、3.技術継承に加えて住宅確保、集落活動への参加等の生活面において高齢漁業者が新規就業者を総合的に支援していることが明らかになった。また山下は北海道釧路地区における沖合漁業(いわしまき網)の操業・水揚げ・加工選別における高齢者の就業実態を視察した。3年間の研究期間を通じた研究成果の報告として、2つの学会報告および1つの学会シンポジウム開催を行った。シンポジウムについては、平成29年10月28日に大東文化大学において開催された地域漁業学会第59回大会において、一般報告枠の「ミニ・シンポジウム」として『高齢漁業者を生かした地域づくり・浜づくり』と題して開催した。山下・工藤のほか、韓国大邱慶北研究院の金智薫氏より「韓国における漁業者高齢化の現状と対策」、(一財)漁港漁場漁村総合研究所の後藤卓治氏より「高齢漁業者も利用しやすい漁港づくりについて」発表した。山下・工藤による本シンポジウム報告とともに学会誌に掲載された。その他の研究成果発表につては本報告書7.に掲載したとおりである。
Merrifield型多孔質ガラス担体の蛋白工学への利用

今年度終了した試験研究において多孔質ガラス表面でDNAを合成するいわゆるMerrifieldの方法について、われわれのグル-プが開発したSPG型(SiーCaーB)とCPG型(SiーB)の二つのタイプの多孔質ガラスを比較しながら条件の最適化を図った。この研究ではこれを更にアミノ酸からペプチドの合成やペプチドのNー末端からアミノ酸の配列順序を決定する方法に適用し、従来からこれらの用途にガラスが適しないとされている点を詳しく具体的に解明しようとした。この結果、アミノ酸の縮合に当たってアミノ基保護のBOC基を取り除く際に酸を使うとこれによってシランカップリング剤の結合が解離することが確認された。アミノ保護基にFmocを用い弱塩基性の処理でこれを取り除くようにすると重合度の大きいペプチドも合成できる事が分かった。また、ガラス上に固定化したペプチドをEdman分解でアミノ酸を1つづつ溶離して行くと10量体ぐらいまでシ-クエンシングが可能であるが、やはり酸にたいする安定性が望まれる。このほか、固定化酵素としてはまえに行ったグルコ-スイソメラ-ゼの他にリバ-ゼと果糖転移酵素について試み、いずれも非常に堅牢で高活性の固定化酵素を得た。また、ヘパリンを固定化しアミノ糖の定量法と蛍光x線による硫酸根の定量からいずれも良く一致する定量を行ったうえで、アンチトロンビンと会合してプロトロンビンの活性化を阻止する活性を測定する検査試薬を利用して固定化されたうえでなお活性が認められる処理条件を見いだした。このようにして固定化されたヘパリンは長時間血液中に浸漬した後にもなお活性が認められる。今後、耐酸性のアミノ化多孔質ガラスを開発して行く。また今期準備を完了した蛋白工学的手法を組み入れて各種の固定化酵素や免疫学的アフィニティ-クロマトグラフィ-へと展開する。
咀嚼器官の形態形成に関わる神経堤細胞・HoxB遺伝子群の相互間係

本研究では(1)スンクス胚の全胚培養法の確立と、それを応用した咽頭弓形成阻害技術の確立、および(2)咽頭弓形成期の細胞動態をRNAプローブで解明することを目的とした。(1)の結果:スンクス胚の全胚培養を市販の全胚培養装置(池本理科、東京)を用いて、潅流ガス条件を変えて行った。結果は1-5体節期胚から始める場合、純ラット血清培地で、20%O_2・50ml/min(バランスはCO_2と5%N_2)から始め、開始日の24:00ころに60%O_2・25-30ml/min、その約12時間後に同ガス・50ml/min、さらに12時間後に同ガス・75ml/minの条件下で最も良好な結果が得られた。咽頭弓の形成異常はall-trans retinoic acid(RA)(Sigma,MO)およびFertilysin(N,N'-Octamethylene-bis-2,2-dichloroacetamide)(Sigma,MO)によって誘発することを試みた結果、RA作用下でのみ、濃度依存的・発生ステージ依存的な異常が認められた。4-6体節期胚を60ng/mlRA濃度培地で培養することにより、第1,2咽頭弓の形成不全や癒合を誘発することができた。また、4-6体節期胚の予定第1,2咽頭弓領域を、タングステン針で出血しない程度に破壊することによっても類似の形成不全が生じた。(2)の結果:二度に渡って作製したcDNAライブラリー(13日胚の全胚由来)の力価が低かったことから、HoxB遺伝子のオーソログは単離できなかった。神経堤細胞のマーカーとして現在、Smtwistのみを単離している。他種の関連遺伝子との比較により、Smtwistはtwistのオーソログであると考えられる。現在、新たなcDNAライブラリーを作製して、HoxB遺伝子群オーソログの単離を行っている。今後、単離されたプローブを使って正常胚と咽頭弓形成不全胚のこれら遺伝子の発現パターンを解析する。本年度はスンクス胚の全胚培養法の向上およびレチノイン酸・フェリチリシンを培地に添加し、その影響を調べた。また、スンクス12日胚よりcDNAライブラリーを作製してHoxB・twistのクローニングを試みた。1)全胚培養および咽頭領域形成異常胚スンクス体節形成期胚の全胚培養をスンクス血清・ラット血清およびその混合で比較したが特にスンクス血清で優れた結果を得ることはなかったので、入手が容易なラット血清で十分である。しかし、市販の血清の使用は避けるべきである。酸素濃度はマウス・ラットと異なり高酸素分圧(20%)から培養を開始し、比較的低い酸素分圧(60%)で発育した胚を培養した場合に良好な結果が得られた。良好な結果が得られる培養期間は1-10体節期胚から培養を始めて約48時間である。レチノイン酸処理による咽頭弓形成異常は4-5体節期胚に0.06μg/ml濃度で処理した場合に第1・2咽頭弓に癒合その他の異常が生じることがわかった。フェリチリシンによる処理では今のところ異常発生胚を確認していない。

2)スンクス胚cDNAライブラリー2度にわたりcDNAライブラリーの作製を試みたがいずれも力価が低く期待したライブラリーにはならなかった。その中で、hoxb1,b2,b3,twistについてcDNAのスクリーニングを行った結果、twistについてはポジティブプラークを得ることができ、現在それの塩基配列決定を行うところである。また、cDNAライブラリーの作製を再度行うためにスンクス胚を収集している。本研究では(1)スンクス胚の全胚培養法の確立と、それを応用した咽頭弓形成阻害技術の確立、および(2)咽頭弓形成期の細胞動態をRNAプローブで解明することを目的とした。(1)の結果:スンクス胚の全胚培養を市販の全胚培養装置(池本理科、東京)を用いて、潅流ガス条件を変えて行った。結果は1-5体節期胚から始める場合、純ラット血清培地で、20%O_2・50ml/min(バランスはCO_2)から始め、開始日の24:00ころに60%O_2・25-30ml/min、その約12時間後に同ガス・50ml/min、さらに12時間後に同ガス・75ml/minの条件下で最も良好な結果が得られた。咽頭弓の形成異常はall-trans retinoic acid(RA)(Sigma,MO)およびFertilysin(N,N'-Octamethylene-bis-2,2-dicholoroacetamide)(Sigma,MO)によって誘発することを試みた結果、RA作用下でのみ、濃度依存的・発生ステージ依存的な異常が認められた。4-6体節期胚を60ng/mlRA濃度培地で培養することにより、第1,2咽頭弓の形成不全や癒合を誘発することができた。また、4-6体節期胚の予定第1,2咽頭弓領域を、タングステン針で出血しない程度に破壊することによっても類似の形成不全が生じた。(2)の結果:二度に渡って作製したcDNAライブラリー(13日胚の全胚由来)の力価が低かったことから、HoxB遺伝子のオーソログは単離できなかった。神経堤細胞のマーカーとして現在、Smtwistのみを単離している。他種の関連遺伝子との比較により、Smtwistはtwistのオーソログであると考えられる。現在、新たなcDNAライブラリーを作製して、HoxB遺伝子群オーソログの単離を行っている段階なので、これらのプローブによる正常胚と咽頭弓形成不全胚の比較研究まで進んでいない。
低欠陥ダイヤモンド薄膜の合成

出来る限り、低欠陥のダイヤモンド薄膜を合成することを目的として、容量結合型の高周波(13.56MHz)プラズマCVD装置に赤外線加熱を併用して、ダイヤモンド薄膜の合成を行った。エチルアルコールと水素の総ガス流量を100sccm、放電電力を500MWにして、総ガス圧力、エチルアルコール濃度、加熱温度、添加ガス流量を変化させ、種々条件での製膜を試みた。欠陥の評価としてはラマン分光による非ダイヤモンド成分、ESRによるスピン密度を用いた。このようにして、以下の結果が得られた。(1)エチルアルコール濃度を0.5%に保ち、4弗化炭素を0.5%添加すると、350°Cの低温でも非ダイヤモンド成分の無い良質の膜が成長する。この膜のスピン密度は1.6×10^<18>cm^<-3>である。(2)上の場合、加熱温度を増加させてゆくと、550°Cで最良の膜が成長する。この膜のスピン密度は5.2×10^<17>cm^<-3>で、この研究では最も少なくなっている。(3)エチルアルコール濃度が1.0%加熱温度が350°Cの場合、4弗化炭素の量が0.2%のとき最も良質膜になり、このときの膜のスピン密度は7.3×10^<17>cm^<-3>である。加熱温度を高くすると、(2)の場合とは違って、膜質は悪くなる。(4)4弗化炭素を添加したときのプラズマの発光分析によれば、エチルアルコール濃度が0.5%のときにはC_2ラジカルの増加が、エチルアルコール濃度が1.0%のときにはCHラジカルの増加が観測される。(5)窒素を原料ガスに添加すると、ある場合には膜中のスピン密度と非ダイヤモンド成分の減少が観測される。膜質の改善に対して、窒素は4弗化炭素ほどは効果的でない。出来る限り、非ダイヤモンド成分、ダングリングボンドなどの欠陥の少ないダイヤモンド薄膜を合成することを目的として、静かなプラズマ条件でのダイヤモンド堆積の実験を試みた。用いた装置は、管径が35mmの石英反応管の周りに2つの電極をもつ容量結合型の高周波(13.56MHz)プラズマCVD装置で、基板温度を制御するために赤外線ヒーターを外部に備えている。エチルアルコールと水素を原料として、500Wの一定の放電電力のもとで、総ガス圧力、エチルアルコール濃度、基板温度などをパラメーターとして、種々の製膜を行った。得られた膜はラマン分光,SEM,ESRによって評価した。その結果、以下の事が明らかになった。1、総ガス圧力は13Torr、エチルアルコール濃度は13%、基板温度は550600°Cの範囲で、非ダイヤモンド成分の殆ど無い良質なダイヤモンド膜が得られる。2、350°Cの低温でもダイヤモンドが析出するが、非ダイヤモンド成分の含有もある。この膜のSEM像によると、膜は多重双晶のボール状の粒子より構成されている。3、小量の4弗化炭素を加えると、350°Cでも自形面が明瞭で、非ダイヤモンド成分の無い良質のダイヤモンド膜が得られる。この場合、最良の4弗化炭素濃度は0.2%である。4、4弗化炭素を加えると、基板温度が600350°Cの範囲で良質のダイヤモンド膜が得られる。5、ダングリングボンド密度は通常は10^<18>10^<19>cm^<-3>であるが、

ここで述べた高周波CVD装置を使って作製した膜では10^<18>cm^<-3>である。また、4弗化炭素を加えて作製した良質膜では6×10^<17>cm^<-3>と、最も少なくなっている。出来る限り、低欠陥ダイヤモンド薄膜を合成することを目的として、容量結合型の高周波(13.56MHz)プラズマCVD装置に赤外線加熱を併用して、ダイヤモンド薄膜の合成を行った。エチルアルコールと水素の総ガス流量を100sccm、放電電力を500wにして、総ガス圧力、エチルアルコール濃度、加熱温度、添加ガス流量をを変化させ、種々条件での製膜を試みた。欠陥の評価としてはラマン分光による非ダイヤモンド成分,ESRによるスピン密度を用いた。このようにして、以下の結果が得られた。(1)エチルアルコール濃度を0.5%に保ち、4弗化炭素を0.5%添加すると、350°Cの低温でも非ダイヤモンド成分の無い良質の膜が成長する。この膜のスピン密度は1.6x10^<18>cm^<-3>である。(2)上の場合、加熱温度を増加させてゆくと、550°Cで最良の膜が成長する。この膜のスピン密度は5.2x10^<17>cm^<-3>で、この研究では最も少なくなっている。(3)エチルアルコール濃度が1.0%加熱温度が350°Cの場合、4弗化炭素の量が0.2%のとき最も良質膜になり、このときの膜のスピン密度は7.3x10^<17>cm^<-3>である。加熱温度を高くすると、(2)の場合とは違って、膜質は悪くなる。(4)4弗化炭素を添加したときのプラズマの発光分析によれば、エチルアルコール濃度が0.5%のときにはC_2ラジカルの増加が、エチルアルコール濃度が1.0%のときにはCHラジカルの増加が観測される。(5)窒素を原料ガスに添加すると、ある場合には膜中のスピン密度と非ダイヤモンド成分の減少が観測される。膜質の改善に対して、窒素は4弗化炭素ほどは効果的でない。
ウニ精子鞭毛運動におけるダイニン分子の挙動とその制御機構の解明

細胞運動の多くは,モーター蛋白質が起こす滑り運動を原動力とする.滑り運動は,化学エネルギーを機械的エネルギーに変換することにより起こるが,このときモーター蛋白質がどのように力を発生し,力発生がどのように制御される結果,細胞の運動につながるかについては明らかにされていない.本研究では,ウニ精子鞭毛におけるダイニンに着目し,その分子レベルの機能を,新しい生理学的アプローチを用いて,制御機構との関連のもとに解明することを目指した.滑りの制御機構はin vitro系では普通失われてしまう.本研究の代表者は,エラスターゼを用いることにより,ある程度制御機構を保持したままで滑り運動を起こさせる系を開発した.そこで,この系を応用することにより,上記目的を達成することを目指した.鞭毛膜を抽出後断片化した軸糸をcagedATPとともにチェンバーに入れ,エラスターゼ処理後顕微鏡下で,UV-flashによりcagedATPを光分解して滑りを起こさせダブレット微小管1本になるようにした.このダブレットに重合微小管にビーズをつけたもの作用させ,再び光分解によりATPを放出させてダイニンによる力の発生を光ピンセット法にnm計測の技術を組み合わせて測定した.その結果,ダイニン1個の腕あたり約6pNの力発生があることが解った.この力発生に伴い,力の振動が観察され,その振動は0.75mM ATP付近では約72HzでATP濃度の低下とともに減少した.ダブレット上のダイニンのうちの外腕を抽出しない腕のみにした場合にも測定を行った.その結果,やはり1分子あたり約6pNの力を発生し,力の振動も見られた.したがって,ダイニン1分子の振動は少なくとも内腕によってい引き起こされるらしいことがわかった.細胞運動の多くは,モーター蛋白質が起こす滑り運動を原動力とする.滑り運動は,化学エネルギーを機械的エネルギーに変換することにより起こるが,このときモーター蛋白質がどのように力を発生し,力発生がどのように制御される結果,細胞の運動につながるかについては明らかにされていない.本研究では,ウニ精子鞭毛におけるダイニンに着目し,その分子レベルの機能を,新しい生理学的アプローチを用いて,制御機構との関連のもとに解明することを目指した.滑りの制御機構はin vitro系では普通失われてしまう.本研究の代表者は,エラスターゼを用いることにより,ある程度制御機構を保持したままで滑り運動を起こさせる系を開発した.そこで,この系を応用することにより,上記目的を達成することを目指した.鞭毛膜を抽出後断片化した軸糸をcagedATPとともにチェンバーに入れ,エラスターゼ処理後顕微鏡下で,UV-flashによりcagedATPを光分解して滑りを起こさせダブレット微小管1本になるようにした.このダブレットに重合微小管にビーズをつけたもの作用させ,再び光分解によりATPを放出させてダイニンによる力の発生を光ピンセット法にnm計測の技術を組み合わせて測定した.その結果,ダイニン1個の腕あたり約6pNの力発生があることが解った.この力発生に伴い,力の振動が観察され,その振動は0.75mM ATP付近では約72HzでATP濃度の低下とともに減少した.ダブレット上のダイニンのうちの外腕を抽出しない腕のみにした場合にも測定を行った.その結果,やはり1分子あたり約6pNの力を発生し,力の振動も見られた.したがって,ダイニン1分子の振動は少なくとも内腕によってい引き起こされるらしいことがわかった.
結晶方位解析用の試料表面を無歪に仕上げる研磨装置の開発

「目的」所属の研究室では,各種金属材料のEBSPによる結晶方位解析を行っている。EBSPは試料表面50nm程度からの情報を得るため,試料表面は平滑で結晶が無歪の状態でなければならない。既存の研磨機を用いた試料準備では,研磨盤の振動による影響や試料を保持する専用ホルダーが無い為に作業者の手による保持で行っており,学生もしくは作業者の力加減で試料の出来が決まってしまうという問題が生じている。さらに,多相合金においては各相で硬さが違うために,各相を共に無歪の状態に研磨するのは細心の注意が必要で,熟練を要し非常に困難である。本研究の目的は,EBSP測定用の試料を高い精度で無歪な表面状態に研磨できる装置(微小試料ホルダーを含む)を作製し,試料を高品質で容易に準備する方法を確立することにある。「研究方法と研究成果」研磨装置は,研磨時の振動をより小さくするために研磨盤の支持に大径のベアリングを用い安定性を上げ,回転速度計を付加した。研磨盤中心から40mm外側における振動幅は最大で12μmで,非常に安定したものとなった。試料ホルダーは,研磨時に試料表面が歪むのを避けるため軽い素材(ジュラコン)で作製した。ホルダーの重量は約120gと非常に軽いものとなった。これらの研磨機と専用ホルダーを用い,硬さの違う試料として純金属(Ni,Cu),金属間化合物(NiAl),合金(SUS304),二相合金(Nb固溶体,Nb3Si)を研磨したEBSP測定の結果は,いずれも極点図や結晶方位のマップから非常に歪の少ないという測定結果が得られた。純Ni,NiAlやSUS304においては,試料の表面状態や信頼性を表すIQ値,CI値がそれぞれ60以上,0.8以上となり,従来の手研磨による試料に比べてより信頼性の高い結果を得ることが出来た。また,二相合金においても,これまでの手研磨ではどちらか一相からしか得られなかった結果が,両相共に非常に歪の少ない結果を同時に得ることが出来た。これらの結果から,当初の目的とした研磨装置と試料ホルダーが完成し,EBSP測定用試料が高品質で作業者の熟練度によらず容易に準備することが可能となった。今後,他の金属材料においてもEBSP測定用試料が容易に準備できることが期待できる。
悪性脳腫瘍に対するがん免疫療法の治療効果判定：PETによる研究

当研究課題は、脳腫瘍におけるWT1ペプチドワクチンにおける脳内ミクログリア活性化および神経炎症を評価することを試みた。脳腫瘍モデルマウスを用いて、WT1ペプチドワクチンによる治療経過中に、ミクログリア活性化を評価するF-18 DPA-714 PETを撮像し、摘出した病理標本との対比を行った。その結果、WT1ペプチドワクチンによって、治療開始早期に腫瘍の周囲にミクログリア活性化が生じていることが証明された。神経膠腫は原発性脳腫瘍の中で最も頻度が高い腫瘍である。手術での摘出が困難なことが多く、放射線治療・化学療法が施行されるが、治療効果が十分とはいえず、新たな治療法等として、がん免疫療法の開発・研究が行われている。本研究では担脳腫瘍モデルマウスを用いて、WT1ペプチドワクチンを用いたがん免疫療法前後で、神経炎症のマーカーとなる活性化ミクログリアを可視化するF-18 DPA-714 PETを経時的に撮像し、形態画像(MRI)および病理学的評価も並行して行った。これらの基礎実験により、さらなる精度の高いPET診断に関する画像評価システムの確立を目指す。手術での完全な摘出が困難なことが多く、放射線治療や化学療法が施行されるが、治療効果が十分とはいえず、新たな治療法としてがん免疫療法の開発、研究が行われている。本研究では、担脳腫瘍モデルマウスをもちいて、WT1ペプチドワクチンを用いたがん免疫療法の前後で、神経炎症のマーカーとなる活性化ミクログリアを可視化するF-18 DPA-714 PETを経時的に撮像し、形態画像(MRI)および病理学的評価も並行して行った。これらの基礎実験によりさらに精度の高いPET診断に関する画像評価のシステムを確立する。脳腫瘍モデルマウスの作成については他部署からの協力もあり、腫瘍生着率の安定したモデルマウスの作成ができた。モデルマウスを用いて、WT1ペプチドワクチン群とプラセボ群に分けて、経時的にPETおよびMRIの撮像を行い、病理標本を作成した。PETにおける経時的な変化を評価を行い、適切なパラメーターについて検討中である。手術での摘出が困難なことが多く、放射線治療・化学療法が施行されるが、治療効果が十分とはいえない。新たな神経膠腫の治療として、WT1ペプチドワクチンを用いた免疫療法がある。本研究の目的は陽電子断層撮像(PET)を用いて、WT1ペプチドワクチンによる神経膠腫の治療前後の変化を可視化することにより、WT1ペプチドワクチンの有効性をPET画像から解明する。担脳腫瘍マウスモデルを作成し、ワクチン投与前及び投与開始後に、腫瘍活動性評価のためにC-11メチオニンPET、神経炎症評価のためにF-18 DPA714PET、腫瘍サイズ評価のためにMRIを撮像し、治療前後の変化の評価を行った。担脳腫瘍マウス11匹を作成し、ワクチン投与群6匹とプラセボ群5匹の2群に分け、それぞれ1週間毎にワクチンあるいはプラセボを皮下注射にて投与した。MRIは治療開始2日前、治療開始後7日後、14日後、21日後、28日後、C-11メチオニンPETは治療開始1日前、治療開始14日後、28日後、F-18 DPA714PETは治療開始直前、治療開始7日後、15日後、22日後、29日後に撮像した。また治療開始後はF-18 DPA714の撮像後に、ワクチン群とプラセボ群のマウスを1匹ずつサクリファイスし、脳を摘出し、切片を作成して、組織染色および免疫化学染色による病理学的な評価を合わせて行った。ワクチン投与7日後のF-18 DPA714PETでワクチン群の腫瘍辺縁の集積が亢進しており、神経炎症が生じている可能性が示唆された。PETによる非侵襲的な神経炎症の評価によるWT1ペプチドワクチンの治療効果予測および治療効果判定への応用が期待される。このモデルマウスを用いて、WT1ペプチドワクチン群とプラセボ群に分けて、週に1度投薬を行い、経時的にPET、MRIを撮像し、また病理学的切片を作成した。しかし、PETの画像解析において、病変のサイズが小さいため、適切な解析を行うことができず、現時点では、明らかな成果には至っていない。次年度はこれまでに得られたPETおよびMRIの画像解析、病理学的な評価、画像と病理所見の対比を行う。得られたデータを学会にて発表する。医歯薬学今年度は昨年度に得られたPETおよびMRIの画像解析、病理学的所見の評価、およびこれらの詳細な比較検討を行い、治療前後および経時的な変化を評価する。また、引き続き動物実験を継続する。

画像解析が遅れたため、学会発表、論文作成などの成果発表に遅れが生じた。PET画像の解析が遅れたため、さらなる追加実験を行うことができなかった。次年度は画像解析、その結果の発表(学会・誌上)に研究費を使用する予定である。次年度は動物実験と画像解析、その結果の発表に研究費を使用する予定である。大阪大学大学院医学系研究科附属PET分子イメージングセンターで動物実験を行う施設利用料、PET薬剤の合成費用、マウスの購入費・飼育料、WT1ワクチン・アジュバントの購入、免疫染色の抗体・試薬購入費用、研究成果の発表などに研究費を使用する。
HIVのコレセプター活性阻害を利用したオーファンGPCRのリガンドの同定

(1)HIV-1のコレセプターとしてG protein-coupled receptor(GPCR)に分類される、GPR1,D6,FML-1が働くことを明らかにしてきた。GPR1はオーファンレセプターであり、そのアミノ酸の配列から判断すると、ケモカインレセプターとは相同性が余り高くない。そこでGPR1のリガンドを推定するため、ヒトゲノムプロジェクトの結果から数百種類あるとされるGPCRについて、その推定されるアミノ酸配列を基に近縁性を利用して系統樹を作製した。既知のCCRあるいはCXCRのケモカインレセプターはひとつの群を形成した。一方GPR1は、別のオーファンレセプターであるDEZと最も近縁であった。また、FML-1とも比較的近縁であった。FML-1は、細菌由来の消化されたオリゴペプチドのレセプターであるので、GPR1も外来性のペプチドに対するレセプターである可能性が考えられた。(2)コレセプターへの結合を阻害するペプチドがHIV-1の感染を阻害し、感染阻害を指標にリガンドが探索できるかNP-2/CD4/GPR1細胞などを用い検討した。GPR1,CCR5,およびCXCR4のN末のペプチドを用い検討したところ、GPR1のN末27アミノ酸からなるペプチドに著明な感染阻害効果が認められた。この結果は、この細胞系を用いHIV-1感染の阻害を指標にリガンドをスクリーニングできる可能性を示唆した。(3)蛋白研究所から入手できた色々の特徴をもつオリゴペプチドを百種類以上用い、HIV-1感染を阻害するか検討したが、著明に抑制するペプチドは見出せなかった。リガンド未同定の受容体(オーファンレセプター)の本来のリガンドを同定することは、医薬品の開発を面で貴重な情報を提供する研究と考えられている。中でも、G蛋白質共役レセプター(GPCR)に属するオーファンレセプターは、多数知られており、今後の医薬品開発の標的としては、最も重要であると考えられている。ヒト免疫不全ウイルス(HIV)とサル免疫不全ウイルス(SIV)は、GPCRをコレセプターとして細胞に感染する。我々は、オーファンGPCRであるGPR1およびRDC1が、特定のHIV/SIVのコレセプターとして機能することを見出した。特に、GPR1がHIV-1の脳血管周細胞指向性決定コレセプターであることを見出した。本研究では、HIV/SIVの感染阻害を指標として、リガンド未同定のGPCRの本来のリガンドを同定することを目的とする。1.RDC1発現細胞の樹立発現ベクターpMX-puroにクローニングしたRDC1遺伝子を、レトロウイルスベクターを用いてNP-2/CD4細胞に導入し、ピューロマイシン選択により安定発現細胞を樹立した。この細胞は、HIV/SIVに対して感受性となったが、その程度は余り高くなく、感染実験の実施に不自由な点がある。2.MuLV感染によるRDC1コレセプター活性の上昇この系を用いることで、RDC1のコレセプター活性をより正確に定量でき、そのリガンド同定の研究にも有用と思われる。3.GPR1の点突然変異体の作成コレセプター機能には、アミノ末端細胞外突出領域が重要であり、リガンドのGPCRへの結合でも同じ領域が重要である可能性が高い。GPR1のアミノ末端配列に欠失や置換変異を系統的に導入して活性の変化を解析し、コレセプター活性に重要な領域を同定した。4.GPCRの系統関係の解析現在までに約700種類のGPCRの遺伝情報が報告されている。近縁のリガンドに対するコレセプターは、レセプターとしても系統関係が密接である可能性が高い。GPR1は、細菌由来のペブチドであるformyl-peptideのreceptorと近縁であることが明らかとなった。一方、RDC1は、adrenomedullinの受容体と近縁であった。

5.コレセプター候補オーファンGPCRのクローニング今までの解析から、GPR15、DEZなどが、オーファンGPCRであり、かつHIV/SIVのコレセプアターとなるので、新規にクローニングした。今後、GPR1やRDC1と同様にそのリガンドの同定を検討する予定である。(1)HIV-1のコレセプターとしてG protein-coupled receptor(GPCR)に分類される、GPR1,D6,FML-1が働くことを明らかにしてきた。GPR1はオーファンレセプターであり、そのアミノ酸の配列から判断すると、ケモカインレセプターとは相同性が余り高くない。そこでGPR1のリガンドを推定するため、ヒトゲノムプロジェクトの結果から数百種類あるとされるGPCRについて、その推定されるアミノ酸配列を基に近縁性を利用して系統樹を作製した。既知のCCRあるいはCXCRのケモカインレセプターはひとつの群を形成した。一方GPR1は、別のオーファンレセプターであるDEZと最も近縁であった。また、FML-1とも比較的近縁であった。FML-1は、細菌由来の消化されたオリゴペプチドのレセプターであるので、GPR1も外来性のペプチドに対するレセプターである可能性が考えられた。(2)コレセプターへの結合を阻害するペプチドがHIV-1の感染を阻害し、感染阻害を指標にリガンドが探索できるかNP-2/CD4/GPR1細胞などを用い検討した。GPR1,CCR5,およびCXCR4のN末のペプチドを用い検討したところ、GPR1のN末27アミノ酸からなるペプチドに著明な感染阻害効果が認められた。この結果は、この細胞系を用いHIV-1感染の阻害を指標にリガンドをスクリーニングできる可能性を示唆した。(3)蛋白研究所から入手できた色々の特徴をもつオリゴペプチドを百種類以上用い、HIV-1感染を阻害するか検討したが、著明に抑制するペプチドは見出せなかった。
慢性炎症性血管肥厚における肥満細胞キマ-ゼの病態生理学的意義

1.病態生理学的検討:雄性イヌ(体重約10kg)を用いて2種類の慢性炎症性血管肥厚モデル、即ち頚動脈バルーン傷害モデルと大動脈内膜傷害モデルを作製し、偽手術対照群と比較した。傷害1ヵ月後の時点における両モデルに共通した所見を挙げる。(1)傷害部位に一致して内弾性板の一部断裂、新生内膜肥厚、外膜の繊維性肥厚、および外膜における血管新生の増加を呈した。(2)中膜平滑筋層は若干の配列の乱れを生じたのみで肥厚を示さなかった。(3)外膜において肥満細胞数、線維芽細胞数、およびコラーゲン量が増加した。(4)キマ-ゼ活性およびアンジオテンシン変換酵素(ACE)活性が上昇し、これら酵素活性の反応産物であるアンジオテンシンIIの傷害血管組織中含量も増加していた。(5)定量的逆転写PCRによる解析の結果、キマ-ゼ、ACEともにmRNA量が増加した。以上の結果とは異なり、抗キマ-ゼ抗体を用いた免疫組織化学の解析結果は両モデル間で若干の差異を示した。頚動脈バルーン傷害モデルにおいては外膜肥満細胞ならびに内皮直下基底膜と思われる構造に陽性染色を認めた。大動脈内膜損傷モデルにおいては外膜肥満細胞のみが陽性であり、内皮細胞基底膜は陰性であった。2.薬理学的検討:頚動脈バルーン傷害モデルにおいてキマ-ゼの役割を検討する目的で、ACE阻害薬とアンジオテンシンII拮抗薬の連続投与による内膜肥厚抑制効果を比較した。ACE阻害薬は傷害血管組織のACE活性をほぼ完全に抑制したにも拘わらず新生内膜肥厚を有意に抑制しなかった。一方、アンジオテンシンII受容体拮抗薬は内膜肥厚、外膜線維性肥厚のいずれに対しても顕著な抑制効果を示した。以上の成績から、物理的傷害に応答した慢性血管炎症過程において過剰発現したキマ-ゼが、増殖因子的作用を有するアンジオテンシンIIの過剰産生を通じて血管内膜・外膜肥厚を促進することが明らかになった。
熱ショック蛋白による実践的ぶどう膜炎の免疫学的研究

熱ショック蛋白のうち,ウシ結核菌由来のHSP-65とヒト由来のHSP-60は,ベーチェット病患者の血清中に抗体が出現し,またラットに投与することによってぶとう膜炎を惹起することが既に知られている。この研究においては,これらの熱ショック蛋白投与ラットにおける細胞性および体液性免疫動態の解明が研究を主目的とした。すなわち,ヒトの重症自己免疫性ぶとう膜炎に,現行の各種抗原より類似した病態をとりうる熱ショック蛋白によってラットにぶとう膜炎を惹起し,その発症をひきおこす吸子を分子的なレベルで解析し,再発をおこすメカニズムを分析して臨床的な治療の道を開くことを目的とした研究である。その結果,以下のような結果が得られた。(1) HSP-65で免役されたラットにおいては,HSP-65に対するものだけでなく,複数種類の結核菌HSPの中のペプチドに対する抗体も形成されており,それとhomologousなヒトHSPのペプチドに対する抗体も誘導されていた。IgGに比べ,IgA抗体の上昇の程度は高くはなかったが,発症した動物と発症しなかった動物を比較するとIgA抗体における差の方がより大きく,IgA抗体の関与も重要であった。(2)あらかじめ微量の抗原を投与しておき,通常量の免疫を行っても免疫反応が誘導されない状態を免疫学的寛容というが,HSP-65,-60による免疫に先立って抗接着分子モノクローナル抗体を投与し,発症が抑制されるかどうかを観察し,抑制確認後,再びHSP-65,-60を投与して発症が抑制されうるか観察した。この状態におけるリンパ節や脾臓の細胞も表面マーカーをフローサイトメトリーによって解析したところ,寛容の導入が行われたことが見出された。このようなラットにHSPを投与しでも発症は得られなかったことも確認された。・熱ショック蛋白によるぶどう膜炎の体液性免疫動態ルイスラットをHSP-65,-60およびそれらの合成ペプチドで免疫し,免疫後7日後から経時的に血清を採取した。ぶどう膜炎の発症がみられる14日目を含む28日めまでの血清標本において,上記の抗原に対する抗体価を酵素特異的免疫染色法(ELISA)によって測定した。抗体はIgGとIgAの両者を測定し,粘膜免疫に特徴的なIgAの関与がどの程度あるか検討した。その結果,ぶどう膜炎を発症させるペプチドは4つであり(111-125,311-326,136-150および336-351),ペプチド免疫により発症したラットと発症しなかったラットとの比較では発症したラットに有意に高い抗体価が見られた。HSP-60免疫ラットの時系列的解析では111-125,154-172および311-326に対するIgG抗体の上昇が見られ,IgA抗体は早期に上昇するが高値に達するのは311-326のみであった。ELISAの阻害試験による免疫原生のあるエピトープの解析では,HSP-60に対するIgG抗体はペプチド111-125,311-326,336-351および154-172とエピトープの共有が見られ,IgA抗体はペプチド311-326と336-351とがエピトープを共有していた。これらの結果からこの実験モデルの液性免疫に関するエピトープが明らかにされた。T細胞エピトープと共有のものもあるが,異なるものも含まれ,アミノ酸の立体構造もその要因に含まれると考えられる。
昆虫神経系の性的二形とその分化過程に関する生理学的解析

コオロギの神経系及びその標的器官の性二形を解析し、次の諸結果を得た。1.雌雄それぞれの最終腹部神経節には、背側に細胞体をもつ背側不対ニューロンのみならず腹側に細胞体をもつ腹側不対ニューロンの数や形態に雌雄差が見出された。特に、性二形の明瞭な腹側不対ニューロンは、両側の第2,第7神経束に軸索を伸ばすニューロン群で、ニューロン数,細胞体の大きさ及びそれらの標的器官における雌雄差が顕著であった。2.雄成虫の付属腺を取り巻く筋及びその開口部にある筋は、最終腹部神経節に存在する約130個の背側不対ニューロンによって支配されている。3.付属腺にはプロクトリンが存在し、それは背側不対ニューロンの電気刺激及び付属腺のKCL処理によって付属腺外に放出されることが、HPLC法及びバイオアッセイ法で確認された。神経終末の全く認められない移植付属腺では、プロクトリン活性は認められなかった。4.雄成虫の付属腺及び精包内にセロトニンを検出し、さらにセロトニンが雌成虫の貯精嚢管の律動的な収縮を誘発することを見出した。5.発音運動を引き起す雄の前翅の筋M90の湿重量は、成虫脱皮後、除々に増加した後、一定値に落ち着くが、雌の相同筋の湿重量はいったん増加した後、減少する。また、雄の筋繊維の直径は雌のものより大きい。一方、前翅の筋M99の湿重量は脱皮後、やや増大するが、雌雄差はみられない。後翅の飛翔筋の湿重量は、雌雄ともに成虫脱皮後、次第に増大したのち、ゆっくりと減少する。ただし、最大値に達してからの減少速度は、雄が雌より著しい。これらの事実は、成虫脱皮後多くの飛翔筋は雌雄それぞれの後胚発生のプログラムにしたがって成長、退化することと、これらの成長,退化は飛翔運動の発現や雄における求愛歌の発現に密接に関与していることを示唆する。
乳児の顔知覚発達の成立要因を検討する実験的研究(早産児と満期産児の比較実験)

生後2ヶ月から7ヶ月までの乳児各月齢10名を被験者とし,「顔を規定する物理的特性の検討」,「主観的輪郭知覚の成立」,「拡大縮小運動知覚の成立」などを調べる実験を行った。「主観的輪郭の知覚」に関しては,生後3ヶ月の乳児で動きからの奥行き情報を加えることにより,主観的輪郭図形の認識が促進されることが判明し,既にこの月齢から乳児が主観的輪郭線を知覚している可能性が示唆された。これは従来の知見と比べ速い知覚形成を示唆するものである。さらに動きの情報をなくした場合は,生後8ヵ月で主観的輪郭を検出し,これは従来の研究と一致した。「拡大縮小運動知覚」に関しては,生後3ヶ月頃から,縮小運動よりも拡大運動に対して敏感であることが判明した。この見方は大人と同様であるため,この種の運動知覚に関しては,生後3ヶ月頃から大人と同じ見方をすることが推測される。「顔を規定する物理的特性の検討」に関しては,顔の左右対称性と顔らしさを規定する物理的特性を操作する実験を行った。その結果、左右対称性が顔を特定する重要な物理的特性であることが判明した。しかもこの特性は,生後4ヶ月頃から認識され始めることが判明した。これらの実験とともに,2名の早産児を対象に,上記のそれぞれの課題の成立時期を検討した。事例的な研究ではあるが,本実験で使用した課題が,早産児の視知覚発達を調べる課題となりうる可能性があることが示唆された。生後1ヶ月から8ヶ月までの乳児を対象とし,「顔のプロトタイプ形成」にかかわる成立要因を調べる実験を行った.顔知覚の面からは「逆さ顔の知覚」,知覚の成立の観点からは「主観的輪郭の知覚」,「陰影の知覚」,「眼球運動(OKN)」などの発達課題を調べることとした.「主観的輪郭の知覚」に関しては,生後3ヶ月の乳児で主観的輪郭図形に対する好みが形成されることが判明し,既にこの月齢から乳児が主観的輪郭線を知覚している可能性が示唆された.これは従来の知見と比べ速い知覚形成を示唆するものである.さらに,生後3カ月は主観的輪郭の構成する動きに,生後5カ月では形そのものに敏感になることが判明した.「陰影の知覚」に関しては,生後5ヶ月から陰影を付けた物体が近づくことを知覚できることが判明し,従来の知見と比べ速い知覚形成を示唆するものであった.プラッド運動図形を乳児に見せ眼球運動を調べたところ,生後2カ月児から大人と同様な眼球運動が見られ,プラッド運動を知覚できることが判明した.「逆さ顔の知覚」に関しては,逆さ顔どうしは正立顔どうしよりも弁別されやすいことが判明した.生後5カ月でヒトの顔の逆さ顔,生後7カ月でネコの顔の逆さ顔を区別できることが判明した.逆さ顔が優先ということから,乳児の観察方向による顔の学習効果の重要性を示唆し,かつヒトとネコの顔で同様の結果が見られたことから幼い段階からヒトとネコの顔を同一化して処理している可能性を示唆するものであった.以上の様々な知覚発達の結果をもとに,「顔のプロトタイプ形成」との関係を検討していく.生後2ヶ月から7ヶ月までの乳児各月齢10名を被験者とし,「顔を規定する物理的特性の検討」,「主観的輪郭知覚の成立」,「拡大縮小運動知覚の成立」などを調べる実験を行った。
CD200をターゲットとした大腸癌肝転移に対する新規治療法の開発

免疫療法のターゲットの一つにT細胞不活化経路が存在し,B7/CTLA-4,PD-L/PD-1などが報告されている.なかでも抗PD-1抗体による免疫療法はすでに臨床応用され,高い治療効果が報告されている.CD200/CD200R経路は,T細胞不活化経路の一つとして最近注目されている.一方,本邦における大腸癌の罹患数は増加しているが,肝転移に代表される進行症例の予後は,依然として満足なものではなく,有効な治療法の開発が課題である.これまで,大腸癌におけるCD200/CD200R経路についての報告はない.本研究では進行大腸癌のCD200発現に着目し,大腸癌予後改善に向けた新規治療の開発を目標とする.免疫療法のターゲットの一つにT細胞不活化経路が存在し,B7/CTLA-4,PD-L/PD-1などが報告されている.なかでも抗PD-1抗体による免疫療法はすでに臨床応用され,高い治療効果が報告されている.CD200/CD200R経路は,T細胞不活化経路の一つとして最近注目されている.一方,本邦における大腸癌の罹患数は増加しているが,肝転移に代表される進行症例の予後は,依然として満足なものではなく,有効な治療法の開発が課題である.これまで,大腸癌におけるCD200/CD200R経路についての報告はない.本研究では進行大腸癌のCD200発現に着目し,大腸癌予後改善に向けた新規治療の開発を目標とする.
ウニ胚の骨片形成に必要な因子の精製と検定法の改良について

ウニ胚の骨片形成に必要な因子を精製するために、間充織胞胚をCa・Mg欠如海水で洗い、1Mグリシン中で胚細胞を解離し、その遠心上清を8M尿素中で透析して可溶化した後、陰イオン交換カラムクロマトグラフィーを行った。しかし、試料をカラムに添加する最に圧力が上昇し流速が低下する問題が生じた。また、活性因子の溶出に必要な塩濃度は緩衝液中の尿素濃度により異なるので、最適な条件を検討した。まずバッジ法にて8M尿素を含む緩衝液中で50mMNaClの塩濃度で因子をゲルに保持させ、250mMの塩濃度で因子を回収した。次のカラムクロマトグラフィーでは、4M尿素を含む緩衝液を用い、50mMの塩濃度で試料をカラムに添加し、500mMへ直接的に塩濃度を上げ分画した。ほとんどの蛋白は低濃度の塩で溶出してきた。各分画を海水で希釈し検定した場合、蛋白量の多い分画に骨片形成誘導因子の活性があった。しかし、各分画を0.5%の低濃度の馬血清を含む海水で希釈し検定したところ、高濃度の塩で溶出される分画にも高い活性が認められた。この分画の成分は10μg/ml以下の濃度でも効果があった。SDSポリアクリルアミド電気泳動では、この分画には特に分子量100kD以上の成分が顕著であった。単離小割球の培養による生物検定で、低濃度の血清に替る有効な成分を探すため、これまで小割球-第一次間充織系の細胞に対して各々遊走や仮足形成の効果が報告されているフィブロネクチンとインシュリン、また骨片形成への関与が報告されているコラーゲン(typeI,IV)について調べた。低濃度の血清の替りに各々の物質を加えた海水でウニ胚由来の骨片形成因子を希釈し、生物検定での効果を調べたところ、馬血清に匹敵する効果を示すものはなかった。今後、既知の他の物質や精製過程で因子と分画された物質を探究していく必要がある。
セラミック複合材料の界面機能評価装置の開発

高応力下で一定の応力を負荷してクリープ変形あるいは複合材料の界面剥離等を誘起させ、その後の内部摩擦を測定し、界面機能を評価する装置を開発することが目的である。この3年間で、(1):振幅依存性が測定できる高温用チャックの開発、(2):振幅依存性から複合材料の界面剥離現象を把握する、(3):C/C複合材料のデータ収集、(4):本装置の限界の把握、の項目について検討した。その結果、剛性の高いしっかりした内部摩擦測定用掴み具の開発に成功し、(1):1500°Cまで、最大振幅2度で270MPaの剪断応力を負荷することが可能となった。また、(2):C/C複合材料のデータ収集を完了し、(3):本装置の限界の把握も終了した。その結果として(4):多結晶マグネシアの高振幅内部摩擦から転位の移動によると思われる内耗のピーク高さが振幅ならびにMgOの粒径に依存することを明らかにし、別個に測定した高温圧縮クリープデータと内耗データの4要素モデルによる対応づけにも成功した。また、MgOの内部摩擦には800°C付近の刃状転位の移動によるピークと、1200°C付近の螺旋転位の移動によるピーク並びに1400°C以上での高温バックグラウンドと呼ばれる部分に分けられ、ピークに関しては、本装置の捻り応力がパイエルス応力を越えた場合に現れることを明らかにした。(5):窒化ケイ素の粒界ガラス層の粘性を内部摩擦のピーク温度から推定することにも成功した。採用した内部摩擦測定装置は、低周波でねじり共振させ、ある振幅に達した後自由減衰率を測定する装置である。この装置に関して、まず、内部摩擦装置のチャック機構に関して検討した。試料形状は、調製の容易な3(幅)xl(厚み)x40mm(長さ)の平板試料とした。高温用にSiC製のチャックを試作してみたが、脆さの故にチャックのネジの締めすぎによる破損が気になり、且つSiCの酸化物の試料との反応が起こり、試料の脱着の困難さを伴う。そのため、電気炉の加熱部分を小さくし、試料を炉の外に出して低温部分で金属チャックを用いて固定を試み、ジルコニアと窒化ケイ素の内部摩擦を測定したところ再現性・信頼性ともにあるデータが得られた。電気炉としては2硅化モリブデンを発熱体とする事により、1500°Cのデータは容易に得られた。また、振幅依存性に関して、振幅検出装置の取付軸の長さを変化させる事により振幅角度が調節可能となった。精度を落とす事無く調節可能な最大振幅角度は、現時点で約1度で、これは5x10^<-4>%の剪断歪に対応する。すなわち、これは低応力クリープ試験時の応力レベルであり、クリープ破断を目的とした試験には振幅を数倍上げるか、大きな定荷重を印可する必要もある事が分かった。また、SiCウィスカー/ガラス複合材料を作製し、予備的に内部摩耗を測定したところ、内部摩擦が同じ値となる温度が、ガラス単味に比べて100°C以上高くなる事が分かった。尚、来年度用の複合材料試料の作製は順調に進んでいる。高温下で一定の応力を負荷した後の内部摩擦を測定し、転位の移動、界面の剥離等の界面機能の評価装置の開発を目的とする。本年度は、(1):広範囲な振幅依存性、振動数依存性を検討するための高温用チャックの改造、(2):解析プログラムを開発し、活性化エネルギーを求める、(3):界面剥離現象の把握、(4):C/C複合材料のデータ解析、(5):本装置の限界検討、の項目について検討した。その結果、(1):振幅は、2度迄振る治具を開発でき、これによりMgOで約270MPaの剪断応力を負荷する事ができた。