hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
第2世代核酸医薬を用いた分子治療法の確立:基礎研究から臨床応用への展開

本研究では複数の転写因子を同時に制御可能なキメラデコイを新規に作成し、新しい分子治療法開発を目指した。大動脈瘤の進展には血管壁の炎症、matrix metalloproteinases (MMP)の発現による弾性繊維の破壊が強く関与している。これらの現象に関与しているNFκBとets-1の2つの転写因子に注目し、これらを同時に阻害するキメラデコイを作成し家兎動脈瘤モデルで効果を検討した。キメラデコイ群で有意な動脈瘤の拡大予防効果を認めた。さらにキメラデコイ群はコントロール群に比べ用量依存性に動脈瘤を縮小させ、これは血管造影でも確認できた。キメラデコイ治療群はマクロファージの浸潤を抑え、弾性繊維の破壊を抑制していた。2)Decoyを用いた内膜肥厚抑制NFκBは炎症に関わる因子を制御する転写因子であるが、平滑筋細胞の増殖にも不可欠である。このことからNFκBの結合をブロックするNFκBデコイを導入することが内膜肥厚の予防に有効であると考え、コレステロール負荷家兎バイパス不全モデルで効果を検討した。ex-vivoでNFκBデコイを4週後の組織検査では有意な内膜肥厚の抑制、中膜の肥厚とI/M比の低下を認めた。さらにNFκBと細胞増殖を制御する転写因子のE2Fとを同時に結合阻害するキメラデコイを用いた検討では静脈グラフトの吻合部狭窄を抑制することができた。NFκB結合阻害の効果としてマクロファージの浸潤抑制とPDGF-BBの発現低下があり、E2Fデコイの結合阻害効果として平滑筋細胞の増殖に関するPCNAの発現低下を確認した。これらの結果よりバイパス術の長期開存に有効な治療法と考えられる。本研究では核酸医薬を用いた血管疾患への新しい分子治療法の確立を目的としている。既に転写因抑制療法である二重鎖核酸医薬(おとり型核酸医薬)デコイ療法の有用性について我々は報告してきたが、今回は特に複数の転写因子活性を同時に阻害できるキメラデコイを作成し、その有用性を検討した。1)大動脈瘤に対する抑制効果ラット大動脈瘤モデルを用いて検討。動脈瘤進展にマトリックス分解酵素(MMP)が深く関与していることに注目し、MMPを制御する転写因子NFkB及びetsのキメラデコイを作成した。またNFkBは接着因子を制御する転写因子であることも知られており、MMPを分泌する主たる細胞であるマクロファージの遊走・浸潤を抑制する効果も得られる。新規にデコイデリバリーシートを作成し、血管壁へのデコイ導入はMMP産生を抑制し、また炎症性細胞浸潤を抑制して動脈瘤拡大を有意に阻害した。さらにウサギにおいても検討したが同様の効果が得られ、さらに興味深いことに既に拡大した瘤に対しても退縮作用も認められた。大動脈瘤に対する低侵襲的な治療法の可能性を示唆した。2)再狭窄に対する有用性ウサギグラフトモデルにおいて、キメラデコイは炎症性細胞浸潤を抑制し、グラフト後再狭窄を有意に抑制した。デコイの導入には移植血管への圧負荷にて導入可能であることも示し、簡便な方法として臨床応用も可能であると考えられる。ブタ冠動脈再狭窄モデルにおいてもNFkB単独デコイで内膜肥厚を抑制しており(血管造影及びIVUSにて確認)、このデータをもとに既に臨床研究(Japan Trial to Prevent Restenosis After Angioplasty or Stent using NFkB decoy Oligodeoxynucleotides as Gene Therapy(J-PRAN))を実施中である。さらに強力な効果を得るべく、NFkB/E2Fキメラデコイの効果を現在検討中である。既に転写因子抑制療法である二重鎖核酸医薬(おとり型核酸医薬)

デコイ療法の有用性について我々は報告してきたが、今回は特に複数の転写因子活性を同時に阻害できるキメラデコイを作成し、その有用性を検討した。1)大動脈瘤に対する抑制効果転写因子NFkB, etsを同時に抑制するキメラデコイを作成し、ラット大動脈瘤モデルにおけるキメラデコイによる大動脈瘤進展抑制効果は既に15年度に明らかにした。臨床応用を検討すべく行ったpre-clinical studyであるウサギ大動脈瘤モデルにおいても、NFkB, etsの上昇が病態に大きく関与していることが明らかになり、キメラデコイによるMMP産生抑制と炎症性細胞浸潤抑制による動脈瘤の進展抑制が確認できた。安全性について血液検査を施行したが、明らかな毒性・有害事象は確認できなかった。興味深いことに、post treat(動脈瘤進展後にデコイを導入)において、進展した動脈瘤の退縮効果を認め、NFkB抑制によるTNF-α阻害を介したエラスチン産生亢進などがそのメカニズムとして考えられた。大動脈瘤に対する低侵襲的な治療法の可能性を示唆した。さらに高血圧モデルにおいて動脈瘤がより進展し、高血圧が動脈瘤進展の危険因子であることを明らかにできた。同モデルにおいてもキメラデコイの有用性が確認できた。2)再狭窄に対する有用性ウサギグラフトモデルにおいて、圧負荷にて導入したキメラデコイは炎症性細胞浸潤を抑制し、グラフト後再狭窄を有意に抑制した。さらに、バイパス手術時の人工血管吻合部狭窄も臨床上問題であるが、血管平滑筋細胞増殖に関与する転写因子E2F、さらに炎症に関与する転写因子NFkBの両転写因子を同時に抑制するキメラデコイを作成し、吻合部位狭窄を予防しうることを動物実験において示した。
銅, 亜鉛スーパーオキシドデスターゼ(SOD)の立体構造と整理作用

CU, ZN-スーパオキシドジスムターゼ(CU, ZN-SOD)の立体構造と機能や生理作用の関係を知るために,ホウレンウソよりCU, ZN-SODを抽出・精製し,その全アミノ酸配列を決定するとともに, X線結晶解析によりその立体構造をも明らかにした.一次構造の決定は,ホウレンソウCU, ZN-SODのnative酵素及びアセチル化後のBrCN分解物を直接に,また,過ギ酸酸化後リジルエンドペプチダーゼあるいはV8プロテアーゼによる消化を行ない,逆相HPLCにより分離した各ペプチド断片を,それぞれ気相シークエンサーで解析することによって行なった.その結果,ホウレンソウSODは154残基のアミノ酸をもつサブユニット2つにから構成されており,一次構造既知の他の7種のCU, ZN-SODと5357%の相同性を示した.これら2つのサブユニットは, 2回軸によって関係づけられる.ホウレンソウCU, ZN-SODのX線結晶解析は2A分解能で多量同型置換法で行なった.その結果,ホウレンソウSODは非結晶学的2回軸によって関係づけられる等価なサブユニット(dimer)からなり,サブユニット間はC末端の数残基と100pの1つで接触していることがわかった.また,ホウレンソウCU, ZN-SODの基本的な構造は, 8本の逆平行β鎖よりなるβバレルと3つのループからなり,分子表面に活性中心であるCu^<2+>を,やや内部にZn^<2+>を含んでいる. Cu^<2+>とZn^<2+>との距離は6.1Aで両金属イオンはHisのイミダゾール環を介して結合している.今回解析したホウレンソウSODと立体構造既知の牛のSODとの構造比較から構造と機能の関係をある程度知ることができた.現在, SODは種々の分野において注目されている.抗炎症剤として開発されている一方,老化の主たる原因として考えられている酸素圧下での生物の生活とのかかわりあいについての研究も進んでいる.今後,さらに, SODを通じてこの方面の研究に進めて行きたい.CU, ZN-スーパオキシドジスムターゼ(CU, ZN-SOD)の立体構造と機能や生理作用の関係を知るために,ホウレンウソよりCU, ZN-SODを抽出・精製し,その全アミノ酸配列を決定するとともに, X線結晶解析によりその立体構造をも明らかにした.一次構造の決定は,ホウレンソウCU, ZN-SODのnative酵素及びアセチル化後のBrCN分解物を直接に,また,過ギ酸酸化後リジルエンドペプチダーゼあるいはV8プロテアーゼによる消化を行ない,逆相HPLCにより分離した各ペプチド断片を,それぞれ気相シークエンサーで解析することによって行なった.その結果,ホウレンソウSODは154残基のアミノ酸をもつサブユニット2つにから構成されており,一次構造既知の他の7種のCU, ZN-SODと5357%の相同性を示した.これら2つのサブユニットは, 2回軸によって関係づけられる.ホウレンソウCU, ZN-SODのX線結晶解析は2A分解能で多量同型置換法で行なった.その結果,ホウレンソウSODは非結晶学的2回軸によって関係づけられる等価なサブユニット(dimer)からなり,サブユニット間はC末端の数残基と100pの1つで接触していることがわかった.また,ホウレンソウCU, ZN-SODの基本的な構造は, 8本の逆平行β鎖よりなるβバレルと3つのループからなり,分子表面に活性中心であるCu^<2+>を,やや内部にZn^<2+>を含んでいる. Cu^<2+>とZn^<2+>との距離は6.1Aで両金属イオンはHisのイミダゾール環を介して結合している.今回解析したホウレンソウSODと立体構造既知の牛のSODとの構造比較から構造と機能の関係をある程度知ることができた.現在, SODは種々の分野において注目されている.抗炎症剤として開発されている一方,老化の主たる原因として考えられている酸素圧下での生物の生活とのかかわりあいについての研究も進んでいる.今後,さらに, SODを通じてこの方面の研究に進めて行きたい.昭和60年度の研究において、ホーレン草スーパオキシドジスムターゼ(SOD)のアミノ酸配列の決定及び5【A!°】分解能でのX線結晶構造解析に成功した。本年度は申請書に記載した研究計画に従って2.0【A!°】分解能での構造解析及び構造精密化を行った。その結果、結晶学的なR因子は24.9%となった。SODは分子内に【Cu^(2+)】と【Zn^(2+)】との2種の金属イオンを持っているが、これらの金属イオンは、その電子数がわずか1しか違わないので、電子密度分布図で区別することができない。そこで、申請者らは、波長可変であるシンクロトロン放射光を用いて、両イオンの異常分散効果の違いを測定し、いわゆる「異常分散差フーリエ合成」を行うことによって、これら2種の金属イオン種を区別することに成功した。この方法は新しい解析法で、今後、原子番号の近い金属イオン或は金属原子の区別に多く用いられるものと期待される。ホーレン草のSODは、8本の逆平行のβ鎖からなるβバレルと3つのループから構成されている。活性中心に存在する2種の金属イオンのうち、【Cu^(2+)】は分子表面に存在し、活性発現に直接関与しているが、【Zn^(2+)】は分子内部に存在し、活性中心附近の立体構造保持に関与しているように思われる。

【Cu^(2+)】は歪んだ平面4配位の構造を、【Zn^(2+)】は正4面体の構造をそれぞれとっているが、両金属イオンはイミダゾール環を介して結ばれた複核錯体を形成している。既に構造解析されている牛血液のSODと立体構造を比較してみると、対応するCd原子間のr.m.s.は1.5【A!°】で、立体構造の類似性は極て高いものであった。数個所においてみられる立体構造の違いは、主に分子表面で、一次構造上で挿入・欠失が起っている所である。現在、一次構造上での変化と立体構造の変化について詳細に検討している。これらの検討結果から、本酵素の立体構造と生理作用との関係についての知見が得られるものと期待している。
脱顆粒反応を指標にした卵黄タンパク質のアレルゲン性評価システムの構築

本研究は,I型アレルギーの中心的な実験モデル動物であるマウスを対象に,食品(卵黄)のアレルゲン性評価システムの構築を目指すものである。判定には対象物質を摂取させたマウス体内で誘導されたIgEによるマスト細胞の脱顆粒反応を利用する。筆者らは,前年度までにマウス骨髄由来マスト細胞(BMMC)をマスト細胞種細胞株と細胞融合することにより,IgEを介した脱顆粒応答能を持つハイブリドーマの樹立に成功した。今年度は,実際に人為的にマウスを免疫して得られたIgEを含む血清を用い脱顆粒応答による検出試験を行った。抗原特異的なIgE誘導が行われていることを明確にする目的で,強いTh2型の免疫応答能を有するBALB/cマウスへの感作を行った。抗原として,Habaら(1974)の方法にならいジニトロフェニル基(DNP),標識された卵白アルブミンを得た。一般にDNPはIgEの抗原となりやすいハプテン構造であることが知られており,これをIgE誘導能を有する仮想アレルゲンとして6週齢のBALB/cマウスに水酸化アルミニウムゲルとともに腹腔内投与を行った。また,コントロールとして0VAのみを同様に投与する群も設けた。2週間後に追加免疫を行い,それぞれ抗DNP特異的IgEを含む血清の採取を行った。これを濃度でBMMCハイブリドーマに作用させ,脱顆粒応答により検出が可能であることを確認した。またこの脱顆粒応答能について,その成立に重要な役割を果たすIgE濃度別の応答性について検討をおこなったところ,これまで報告されていたラット好塩基球細胞株RBL-2H3を用いた測定法の検出限界となる10倍以上の感度にあたる数ng/mlのオーダーにおいても検出が可能であった。これによりマウスIgE誘導系とマウスマスト細胞の相互作用を応用した本測定系の有用性が示された。本研究は、鶏卵をモデルに食品のアレルゲン性を評価するための判定系の構築を目指している。原理として、対象となる食品を摂取させたアレルギーモデルマウス(NC/Nga系マウス)の血清IgE、低分子化と分画を行った抗原、マウスIgEを介した脱顆粒応答能をもつマウス由来の株化細胞、以上の3つを組み合わせて脱顆粒反応を再現する。細胞株の特性を生かし、I型アレルギーの抗原が必然的に持つIgEを介した脱顆粒反応を詳細に解析することで、未知の食品のアレルゲン性評価も視野に入れている点に特色を持つ。今年度は、モデル全体の課題を抽出するため、扱いの比較的容易な鶏卵白に対象を絞り、検討を一通り行った。その結果以下の課題が明らかとなった。(1)マウス由来マスト細胞株MC9のマウスIgEを介した脱顆粒応答性を検討したところ、さまざまな培養条件下にあっても応答性が弱く、異種交差反応性で脱顆粒反応が報告されているラット好塩基球細胞株のRBL-2H3と比較しても優位性は確認できなかった。(2)一般的な食品アレルゲンの分子量1万-7万を含む8千-10万という分子量を設定し、鶏卵白成分のゲルろ過クロマトグラフィーにより得られた画分と、卵白を摂取させたNC/NgaマウスのIgEによるRBL-2H3細胞の脱顆粒反応を確認できたが、対象成分による脱顆粒反応の差は予想より小さく、画分の分子量の見直しが必要だと考えられた。(1)に関しては、RBL-2H3でも検討は可能であるが、完全なマウスの系での構築を目指す本研究の意義が薄れてしまうため、マウス由来の脱顆粒反応を持つ細胞株の樹立を目指す方向ですでに検討を進めている。また(2)に関しては、脱顆粒が起こる可能な限り低分子の画分に重要な情報が含まれていると考え、より低分子の画分を対象にした検討を行うことで、この系の最適化をさらに進めることとした。本研究は、I型アレルギーの中心的な実験モデル動物であるマウスを対象に、食品(卵黄)のアレルゲン性評価システムの構築を目指すものである。判定には対象物質を摂取させたマウス体内で誘導されたIgEに対するマスト細胞の脱顆粒反応を利用する。昨年度まではマスト細胞の代替としてラット由来好塩基球細胞株を用いたが、FcεR Iのマウス-ラット間の種特異性により、ポリクローナルな抗体に対する応答性の差異が指摘されている。この点に関して、有用なマウス細胞株が存在せず、唯一マウス骨髄細胞より誘導されるマスト細胞(BMMC)が十分な脱顆粒特性を持っているが、分化誘導期間の長さや寿命の問題で現実的に系の構成要素とすることは難しい。そこで本年度の研究では今年度BMMCの脱顆粒特性を持つマウス株化細胞の樹立を試みた.検討を行うにあたり、株化の手段としてハイブリドーマ作成技術を応用した手法を試みた。その際にパートナー細胞としてマウスマスト細胞腫細胞株であるP815細胞を用いた。これは、P815が脱顆粒応答に必要なFcεR Iのα、βーサブユニットを欠損している反面、増殖特性に優れ、長期の培養にも特殊な因子を必要としないことから、これをBMMCと融合することで、FceRI発現と無限増殖能を有するハイブリドーマが選択的に得られるという予想に基づいている。

そこで、まずP815細胞を6-チオグアミンを含む培地で選択することで、ヒポキサンチン、アミノブテリン、チミジン(HAT)培地に感受性の細胞を得た。これをポリエチレングリコール法により既法により分化誘導したBMMCと融合した。得られたハイブリドーマは、マウスIgEを介した脱顆粒応答能を持ち、FcεR Iのα、βーサブユニットの発現も確認された。異常の検討により本研究の目指す用途に適するマスト細胞が成果として得られた。本研究は,I型アレルギーの中心的な実験モデル動物であるマウスを対象に,食品(卵黄)のアレルゲン性評価システムの構築を目指すものである。判定には対象物質を摂取させたマウス体内で誘導されたIgEによるマスト細胞の脱顆粒反応を利用する。筆者らは,前年度までにマウス骨髄由来マスト細胞(BMMC)をマスト細胞種細胞株と細胞融合することにより,IgEを介した脱顆粒応答能を持つハイブリドーマの樹立に成功した。今年度は,実際に人為的にマウスを免疫して得られたIgEを含む血清を用い脱顆粒応答による検出試験を行った。抗原特異的なIgE誘導が行われていることを明確にする目的で,強いTh2型の免疫応答能を有するBALB/cマウスへの感作を行った。抗原として,Habaら(1974)の方法にならいジニトロフェニル基(DNP),標識された卵白アルブミンを得た。一般にDNPはIgEの抗原となりやすいハプテン構造であることが知られており,これをIgE誘導能を有する仮想アレルゲンとして6週齢のBALB/cマウスに水酸化アルミニウムゲルとともに腹腔内投与を行った。また,コントロールとして0VAのみを同様に投与する群も設けた。2週間後に追加免疫を行い,それぞれ抗DNP特異的IgEを含む血清の採取を行った。これを濃度でBMMCハイブリドーマに作用させ,脱顆粒応答により検出が可能であることを確認した。またこの脱顆粒応答能について,その成立に重要な役割を果たすIgE濃度別の応答性について検討をおこなったところ,これまで報告されていたラット好塩基球細胞株RBL-2H3を用いた測定法の検出限界となる10倍以上の感度にあたる数ng/mlのオーダーにおいても検出が可能であった。これによりマウスIgE誘導系とマウスマスト細胞の相互作用を応用した本測定系の有用性が示された。
セラミックスウイスカーが開拓するX線イメージング技術の新展開

X線面光源を実現するにあたり、セラミックスウイスカーを代表とする無機系微小電子源を配列した数本のワイヤー型電子源をえて、さらに対向したターゲットからX線が電子源方向に放射(バックスキャッタ)するような新しいコンセプトのX線面光源(バックスキャッタ型X線源)を実現した。面光源から得られたX線により電子回路などのX線像が得られた。炭素系F-Nトンネル型電子源を金属棒表面に組み、50mmx50mmの大きさの電子源を作製した。仕上げた平面冷陰極の電子顕微鏡観察を現有の走査型電子顕微鏡で実施したところ、ナノメーターの大きさの薄板状の突起物が金属棒表面に形成されていることがわかった。50mmx50mm冷陰極の電界放射・X線測定のために、その大きさに対応した高真空チャンバー・排気システムを組み上げた。タングステンのターゲットを用いて、超高真空下において冷陰極から発生した電子をそのターゲットに照射したところ、X線計測器で十分スペクトルが得られる程度のX線放射が観測された。測定装置で平面冷陰極からの電界放射電流を測定したところ、電圧5kVの印加で1mA以上の電流を得ることができた。さらに、その電流でアルミニウム電極に電子衝撃したところ、条件によってアルミニウムが溶融した。F-Nトンネル型電子源を金属ロッド上に組み、それを数本組み合わせることにより、50mmx30mmの平面型電子源を作製した。これに対して対向する陽極に加速電圧を印加し、電界放射を得た。ターゲットに銅電極を選択して、そこに対してF-Nトンネル型電子源から得た電子を衝撃し、X線を得た。10kV以上で銅ターゲットから特性X線と連続X線とが得られた。比較的強いX線が得られたのにもかかわらず、銅ターゲットに熱損傷は見られなかった。X源からの発生X線の強度についてはロッドの本数でほぼ決まった。ロッドの本数が多くなるとその分だけX線の強度をあげることができる。ただし構造上、あまりロッドの本数を大きくするとX強度が弱くなる傾向にある。次にX線イメージング実験を行った。得られたX線を利用して、プラスチックシリンジ、本の中の釘、ベークライト回路基板上の部品やタナゴヤヒメダカなどの小魚などの透過像を得た。電子源となるロットを1本でX線を得たところ、X線イメージングによる透過像の分解能は0.5mm程度であったのが、電子源となるロットを3本でX線を得たところ、その分解能は0.1mm程度まで改善した。より平行な電子線が銅ターゲットにあたることで、より平行なX線が得られるために、分解能が高くなったと思われる。厚さ50mm程度の木の中に釘を打ち込み、その透過像を得たところ、釘は十分なコントラストで結像した。タナゴヤヒメダカなどの骨格や内臓の様子なども生きて水中にいながら得ることができた。F-Nトンネル型電子源を利用した平面発光X線源は明確な透過像を得るのに十分ふさわしい技術であることがわかった。昨年度に引き続き、F-Nトンネル型電子源を金属ロッド上に組み、それを1-3本組み合わせることにより、50mmx30mmの平面型電子源を作製した。X線源を真空チャンバー内に設置し、そこから100mm程度離れた位置にBe窓を設置し真空と大気を遮断し、さらに50mmの位置にX線イメージングカメラを置いた。10kV以上の加速電圧を印加することで銅ターゲットから特性X線と連続X線を得た。X線イメージングカメラにて面内のX線強度分布を測定した。その結果、直径60mmの面内において、中心部におけるX線強度を最大としたときに、60mmの辺縁部において15-20%の強度低下が見られた。これは、平面型電子源の大きさに比較してBe窓の大きさが大きくなっているためである。次に平面回路基板にて画像の質の評価を行った。X線源から直進してくるX線による透過像は鮮明で、イメージングカメラ上での分解能は0.3mm程度であった。しかしながら、画像中心から30mm程度はなれると画像がぼけ始め、辺縁部である60mm付近では分解能は1mm程度まで落ち、画像はぼけた。生体イメージングでは、X線エネルギーが軟X線領域にあるため十分な透過像が得られなかった。そこで20kV程度までの加速を試みできるだけ硬X線領域まで近づけたが、X線強度も同様に強くなり、イメージがホワイトアウトしてよい画像が得られなかった。
高エネルギー電磁ビームに誘起される放電とその工学的応用

高エネルギーのレーザーやミリ波ビームにより誘起される爆轟波を工夫された実験系により純粋な1次元現象に帰し,その計測結果の解析によってレーザーとミリ波の双方の放電・爆轟現象に内在する普遍的な物理モデルを構築することを目的とし,以下の2つの課題について研究を行った.(1)レーザー放電爆轟波1次元伝播実験装置を構築し,従来の実験で使用していた集光された1ミリメートル径レーザービームを,ほぼ平行な7ミリメートル径ビームに拡大し,壁面による側方膨張制限が有るものと無いもので実験を行った.その結果,ビーム径拡大によって爆轟波伝播速度がおよそ2倍になる一方,壁面制限の有無は伝播速度にほとんど影響を及ぼさないことが分かった.Raiser等の理論では,伝播速度と側面への膨張によるエンタルピー流出の関係を直接的に関連付け定式化していたが,今回の実験結果はこの理論では説明がつかず,新しいレーザー爆轟波伝播理論が必要となることが示唆された.(2)ミリ波放電爆轟波の詳細なフィラメント構造を撮影し,その特徴的な放電伸展のメカニズムに迫ると共に,詳細な多次元数値シミュレーション結果との比較を行うため,高解像度(4百万画素)の高速シャッターカメラの選定を行った.また放電実験に用いるミリ波発振器ジャイロトロンの基礎設計を開始した.真空管のボア径をできるだけ小さく設計することで超電導マグネットを小型化し,実験室に収まる装置を製作可能であるとの見通しが立った.本基盤研究Aに続く,基盤研究Sでジャイロトロン装置の製作を行う.27年度が最終年度であるため、記入しない。27年度が最終年度であるため、記入しない。
ガス吸蔵・磁気相転移の協奏的応答を実現する多孔性磁石の創成

水車型二核錯体を電子ドナー(D),TCNQを電子アクセプター(A)兼架橋配位子として用いることにより,D2A型の組成を持つ二次元層状配位高分子磁石を多数合成し,その磁気特性やガス吸着特性について検討を行った.以下,顕著な特性が見られた化合物の概要を示す.{Ru2(3,5-F2PhCO2)4[TCNQ(OMe)2]}の脱溶媒相は76 Kのフェリ磁性体であり,N2,CO2,O2に対する吸着能を示した.N2,CO2下では,磁気相転移温度はそれぞれ88,92 Kへと上昇した一方で,常磁性のO2下では,圧力に応じてフェリから反強磁性体への連続的な変化が観測された.単結晶X線回折の構造解析結果より,窒素吸着型と定圧酸素吸着型の構造は同構造であるにもかかわらず,前者はフェリ磁性体,後者は反強磁性体であった.これは,酸素の持つ電子スピンが層間の磁気相互作用を媒介しているためだと考えられる.本化合物は酸素ガスの電子スピンを感知する全く新しい材料であり,酸素ガスの吸脱着による磁石のON-OFF制御を初めて実現した.{Ru2(m-FPhCO2)4[TCNQ(OMe)2]}は,合成直後の結晶溶媒を包含した状態では[D+A2-D+]の組成で表される二電子移動状態をとっており,磁気秩序を示さないが,真空引きにより脱溶媒を試みると,程なく一電子移動状態[D0A-D+]へと不可逆に構造転移し,相転移温度88Kのフェリ磁性体となる.さらに,脱溶媒が完全に進行すると,構造を維持したまま,電荷不均化状態[D0.5+A1.5-D+]へと変化し,磁気相転移温度は30 Kへと低下した.以降溶媒の吸脱着により,磁気相転移温度を88Kと30Kの間で可逆にスイッチすることに成功した.溶媒の吸脱着と協奏した電子状態変化には,溶媒と配位骨格間の水素結合が重要であることが,量子化学計算の結果から示唆された.研究の最大の目標の一つであった,「ガス吸脱着による巨大磁化応答の可逆制御」が達成された.特に,「酸素ガスの持つ電子スピンが,磁気秩序をスイッチする鍵たり得る」ことを実証できたと言える.既に同化合物群において,ガス吸脱着に対して巨大な磁化応答を示す化合物が複数見付かっており,しかも,前述の酸素ガスのスピンが介在する以外の機構によっても磁化の巨大応答が発現することが分かってきた.酸素ガスの関与する現象も,後発の化合物群においても見いだされており,本研究課題の標榜する「ガス吸着」という化学的外場による磁気相転移制御に関する研究,すなわち「ガス応答型多孔性磁石」は,着実な拡がりを見せている.このような系統的な研究展開は,ある意味当初の予定通りではあるが,実際に得られつつある結果の多様性は,予想以上であった.また,昨年度中には,ガス雰囲気下での単結晶X線回折の測定系を立ち上げ,測定・解析手法のノウハウの蓄積に努め,最終的に非常に強力な測定手段として確立することができた.従来の手法(ガス下粉末X線回折+Rietveld解析)と比較して圧倒的に優れた精度,確度で骨格中のガス分子をも決定できるようになった.本測定系は,(放射光などを必要としない)実験室系であり,かつ測定を行うまでのハードルが非常に低いのが大きな特徴であるため,測定のスループットが高く,今後も大いに活用されていくものと予想される.以上の点を勘案し,初年度の進展具合は当初の計画以上であると判断した.昨年度に見いだされた,多数の未発表の「ガス応答型多孔性磁石」について,それぞれの細部を詰め,論文投稿の水準に仕上げていく.物質探索の結果,予想を上回るペースで有望な物質群が見いだされているため,今年度は個々の物質を掘り下げる方向に注力する.一方で,新規物質開拓の方向性についてもまだ,「ガス応答性多孔性磁石」として有望な候補化合物が見付かっている状況であるため,バランスをとりつつ,随時新規物質についてもガス下での物性検討を進めていく.また,「ガス応答型多孔性磁石」の示す現象に多様性が認められるようになってきた状況を踏まえ,これらの化合物群を,ガス応答性まで含め予測・設計出来るような法則・学理を追究していこうと考えている.具体的には,物質の構築素子や構造と,実際に観測されたガス応答現象の間の相関を探るために,量子化学計算などの理論的手法を取り入れるほか,紫外可視吸収スペクトルやラマンスペクトル,磁気円偏光二色性スペクトル(MCD)といった電子分光学的な側面からの実験を取り入れていこうと考えている.測定環境の整備としては,当初の実験計画通りに磁場下でのガス吸着量測定や,ガス下での電子吸収スペクトル測定の実現を目指す.磁場下ガス吸着量測定に必要な物品は既に購入済みであり,今年度は測定環境の整備に取り組む.電子スペクトルに関しても既に試作機の制作中である.加えて今年度は,上述のようにガスの種類により様々な磁化応答が観測されるようになった現状を踏まえ,混合ガスを用いた実験が行えるよう,環境を整えていこうと考えている.水車型二核錯体を電子ドナー(D),TCNQを電子アクセプター(A)兼架橋配位子として用いることにより,D2A型の組成を持つ二次元層状配位高分子磁石を多数合成し,その磁気特性やガス吸着特性について検討を行った.以下,顕著な特性が見られた化合物の概要を示す.{

Ru2(3,5-F2PhCO2)4[TCNQ(OMe)2]}の脱溶媒相は76 Kのフェリ磁性体であり,N2,CO2,O2に対する吸着能を示した.N2,CO2下では,磁気相転移温度はそれぞれ88,92 Kへと上昇した一方で,常磁性のO2下では,圧力に応じてフェリから反強磁性体への連続的な変化が観測された.単結晶X線回折の構造解析結果より,窒素吸着型と定圧酸素吸着型の構造は同構造であるにもかかわらず,前者はフェリ磁性体,後者は反強磁性体であった.これは,酸素の持つ電子スピンが層間の磁気相互作用を媒介しているためだと考えられる.本化合物は酸素ガスの電子スピンを感知する全く新しい材料であり,酸素ガスの吸脱着による磁石のON-OFF制御を初めて実現した.{Ru2(m-FPhCO2)4[TCNQ(OMe)2]}は,合成直後の結晶溶媒を包含した状態では[D+A2-D+]の組成で表される二電子移動状態をとっており,磁気秩序を示さないが,真空引きにより脱溶媒を試みると,程なく一電子移動状態[D0A-D+]へと不可逆に構造転移し,相転移温度88Kのフェリ磁性体となる.さらに,脱溶媒が完全に進行すると,構造を維持したまま,電荷不均化状態[D0.5+A1.5-D+]へと変化し,磁気相転移温度は30 Kへと低下した.以降溶媒の吸脱着により,磁気相転移温度を88Kと30Kの間で可逆にスイッチすることに成功した.溶媒の吸脱着と協奏した電子状態変化には,溶媒と配位骨格間の水素結合が重要であることが,量子化学計算の結果から示唆された.研究の最大の目標の一つであった,「ガス吸脱着による巨大磁化応答の可逆制御」が達成された.特に,「酸素ガスの持つ電子スピンが,磁気秩序をスイッチする鍵たり得る」ことを実証できたと言える.既に同化合物群において,ガス吸脱着に対して巨大な磁化応答を示す化合物が複数見付かっており,しかも,前述の酸素ガスのスピンが介在する以外の機構によっても磁化の巨大応答が発現することが分かってきた.酸素ガスの関与する現象も,後発の化合物群においても見いだされており,本研究課題の標榜する「ガス吸着」という化学的外場による磁気相転移制御に関する研究,すなわち「ガス応答型多孔性磁石」は,着実な拡がりを見せている.このような系統的な研究展開は,ある意味当初の予定通りではあるが,実際に得られつつある結果の多様性は,予想以上であった.また,昨年度中には,ガス雰囲気下での単結晶X線回折の測定系を立ち上げ,測定・解析手法のノウハウの蓄積に努め,最終的に非常に強力な測定手段として確立することができた.従来の手法(ガス下粉末X線回折+Rietveld解析)と比較して圧倒的に優れた精度,確度で骨格中のガス分子をも決定できるようになった.本測定系は,(放射光などを必要としない)実験室系であり,かつ測定を行うまでのハードルが非常に低いのが大きな特徴であるため,測定のスループットが高く,今後も大いに活用されていくものと予想される.以上の点を勘案し,初年度の進展具合は当初の計画以上であると判断した.昨年度に見いだされた,多数の未発表の「ガス応答型多孔性磁石」について,それぞれの細部を詰め,論文投稿の水準に仕上げていく.物質探索の結果,予想を上回るペースで有望な物質群が見いだされているため,今年度は個々の物質を掘り下げる方向に注力する.
パイ共役炭化水素における炭素-炭素共有結合とイオン結合のスイッチングの精密制御

1.モノアルキルフラーレンカチオンの熱力学的安定性の定量的評価先に我々が初めて観測に成功した、モノアルキルフラーレンカチオンの熱力学的安定性をpK_<R^+>値およびソルボリシスの反応速度により検討した。pK_<R^+>値は、p-トルエンスルホン酸-硫酸混合溶媒中で分光法により求めたフラレノール類のイオン解離度データから、ジクロロメチル基および1,1,2-トリクロロエチルカチオンが結合したフラーレンカチオンについてそれぞれ-16.0、-15.7と決定された。一方、これらのカチオンに対応する塩化物は、トリフルオロエタノールーアニソール(1:9v/v)混合溶媒中でソルボリシスを受け、半減期2時間および14時間(25°C)で溶媒置換生成物を与えた。反応速度の精密測定により、活性化自由エネルギーは、それぞれ24.0および25.0kcal/molと決定された。以上の熱力学パラメータは、t-ブチルカチオンについての値(pK_<R^+>=-14.8,活性化自由エネルギー=26.9kcal/mol)に近接しており、モノアルキルフラーレンカチオンが第3級アルキルカチオンに匹敵する安定性を有することが示された。2.モノアルキルフラーレンカチオンを経由する反応フラーレンカチオンを中間体として経由する反応は、合成化学上重要性が高いと考えられる。本研究では、上述のソルボリシスのほか、塩化アルミニウムあるいは銀イオンを触媒とするRC_<60>Clの求核置換反応(求核種:アルコール類、置換ベンゼン)、ClCH_2-C_<60>-Clの1,2-置換体と1,4-置換体の異性化反応が副反応を伴わずに進行することを確認した。
母語と連携する小学校英語教材の開発と実践：中・韓・台の検定教科書分析を通して

外国語教育においては、学習者が、母語と外国語の相違を意識することにより、メタ言語能力を活性化し、適切な言語運用の能力を育てることが考えられる。このようなことばへの気づきが言語能力の向上に繋がることが伺える。しかし、母語と外国語を一体化した言語教育の視点から見る英語教育の検討が乏しい。母語との連携に関する教材開発及び授業実践研究が不足している。そこで本研究は、1既に15年以上先行している東アジア地域の中国・韓国・台湾の現行小学校英語教科書を検討し、英語教材の共通点及び注意点を明らかにし、母語との連携に焦点をあてて分析し、結果を考察する。2教科書分析から得た知見を母語との連携を取り入れる教材を開発し、授業実践を試みる。当該年度の研究実績は以下のとおりである。1.中国・韓国・台湾の現行小学校英語教科書の分析:母語との連携に焦点をあてて分析した結果をアジア比較教育学会で口頭発表をした。2.母語と連携する外国語の授業実践:前年度には、ことばへの気づきを目指した外国語活動の授業実践をIATEFL国際英語教育学会及び日本全国英語教育学会で口頭発表をした。今年度には、現職教員と協働して、日本語・英語・中国語を取り入れたことばへの気づきを促進する英語科の授業を実施した。一連の授業実践及び考察を論文化した。3.日本国内小学校英語の公開授業研究会、実践研究会に参加:小学校英語教育学会、小学校英語実践研究三重大会、京都市小学校英語公開研究会に参加した。平成30年度が最終年度であるため、記入しない。本研究の目的は、日本と同じく、外国語としての英語教育を扱う中国・韓国・台湾の小学校英語検定教科書を分析することによって、入門期の英語教材の共通点及び注意点を明らかにし、母語との連携を見据え、日本の英語教科書作成に提案し、授業実践を試みることである。、本研究では、具体的な単元内容に焦点を当て、中国・韓国・台湾の現行教科書を分析することを通して、入門期の小学校英語教材の共通点及び留意点を見出すと共に日本の小学校英語教科書作成に示唆を与え、母語と連携する教材を開発し、授業実践を行う。1.母語と連携する小学校外国語教育のあり方の提案:中等教育における国語科と英語科連携のプロジェクトの実践から、小学校外国語教育における国語・英語・中国語を取り入れる連携の必要性とその可能性を探った論文を発表した。2.対象国の小学校英語教科書の収集及び授業実践の参観:中国・韓国・台湾の現行検定小学校英語教科書を収集し、実態の聞き取り調査を行った。また、中国天津市市内の二つの小学校で英語授業の実践を参観し、現地の教員と授業協議会を行った。3.日本国内小学校英語の先進校の公開授業研究会への参加:文部科学省指定研究地域の福井県勝山市をはじめ、小学校英語実践研究札幌大会や京都教育大学附属桃山小学校などの公開授業研究会に参加した。4.ことばへの気づきを目指した外国語活動の授業実践:福井市市内公立小学校四年生を対象にし、外国語活動の時間で日本語・英語・中国語を通してことばへの気づきを促進する授業を実施した。今回の実践は、教職大学院の院生の授業実践の一環として行った。当初英語教科書の分析対象として中国・韓国・台湾で既に使用中の検定教科書を予定していたが、現在は日本の先行実施地域で使われている新指導要領に対応した小学校英語教科書『Let's try』と『We can』の分析も進めている。また、新教材を使用した授業実践に焦点を当て調査を進めている。母語と連携する英語授業の教材開発を進めると同時に、授業実践を積極的に行う。また、研究対象の海外諸国での母語を大切にする小学校英語授業実践の事例を協働的に集める。
クラウド時代におけるマーケティングのパラダイムシフトに関する研究

本研究ではクラウド時代のマーケティングパラダイムのシフトを、プラットフォームの進化、マーケティングとコストマネジメントの融合による知覚価値の変革、ビッグデータの分析、サプライチェーン・プラットフォームのサブテーマから分析した。クラウド時代のインフラによってウェブ2.0が展開され、モバイルの普及、ビッグデータの収集・分析可能になった。伝統的にマーケティングの焦点は消費者のニーズが何であるかに焦点を当て、消費者に関するデータを収集することから始まった。クラウド時代に入るとソフトウェアの進化、モバイル普及によって企業と消費者の1対1のマーケティングが行われるようなった。2014年度の研究ではクラウド時代のマーケティングパラダイムのシフトを,プラットフォームの進化,マーケティングとコストマネジメントの融合による知覚価値の変革,ビッグデータの分析,参加とコラボレーションによる価値創造,サプライチェーン・プラットフォームのサブテーマから分析した。クラウド時代ではウェブ2.0が展開されることによって,モバイルが普及し,ビッグデータの収集・分析が可能になった。伝統的なマーケティングの焦点は消費者のニーズが何であるかに焦点を当て,まずは消費者に関するデータを収集することから始まった。クラウド時代に入るとソフトウェアの進化,モバイル普及によってオンラインで消費者のデータが入手でき,オンラインマーケティングモデルが開発された。サブテーマでは融合コストマネジメント論を包含する戦略管理会計について,マーケティングとコストマネジメントの融合による知覚価値の変革,パラダイムシフトなどを視野に入れて,1先行研究から戦略管理会計の意義・特徴について整理・考察し,2企業アンケート調査の分析し,3企業訪問・ヒアリングによる実態調査を加え,戦略管理会計技法の活用について展望した。また,プラットフォームへの参加とコラボレーション・ネットワークの理論分析を行った。さらに,クラウド時代における流通をめぐる様々な組織間関係が生み出すパフォーマンスの多次元的属性に焦点を当てながら,それを説明しうる変数を探り出していくことを視野に入れて,1流通分野およびサプライチェーン・マネジメントに関する企業事例の文献を中心に,その他主要な学術的ジャーナルとその関連図書を加えつつ整理・考察し,2企業訪問・ヒアリングによる実態調査を加えながら,サプライチェーン・プラットフォームに関する分析枠組みについて考察した。クラウド時代に入ると多数がスマートフォンやPCを持つようになった。その結果取引がコンピュータを媒介にして行われるので、すべての取引データをプラットフォーム企業が取引コストをかけずに入手できるようになった。クラウド時代のマーケティングパラダイムシフトを、プラットフォームの進化、ビッグデータの分析、サプライチェーンマネジメント、マーケティングとコストマネジメントの融合による知覚価値の変化をサブテーマとして分析を行った。クラウド時代ではビッグデータに対応できるようにプラットフォームが進化する。それによって取引コスト、とりわけ知覚コストが低減する。知覚価値は消費者が製品に対して抱く品質やコストに対する総合的な価値判断である。そのコストは総顧客コストであり、心理的コストなどを含む。また競争優位性を獲得するためのサプライチェーンマネジメントの領域を分類し、情報コストアプローチから得られる流通システムにおける戦略、構造、プロセス、パフォーマンスの枠組みを構築した。これを踏まえて企業数社へのヒアリング調査の結果をベースとしながら、競争優位のサプライチェーンマネジメントについて分析を試みた。2015年8月5日甲南大学において研究会を行い、中田善啓、石垣智徳、玄野博行が本研究のまとめにむけて発表を行った。また2016年3月5日南山大学における消費者行動ワークショップで中田善啓、石垣智徳が発表を行った。本研究の成果は中田善啓、西村順二編『先を読むマーケティング』(同文舘,2016年3月)で玄野博行「サプライチェーン組織のマーケティング」(第3章)、石垣智徳「ビッグデータとマーケティング」(第4章)、三上和彦「ツーサイド市場の価格戦略」(第7章)、中田善啓「ビッグデータ時代におけるマーケティングパラダイムのシフト」(第8章)に掲載されている。クラウド時代のマーケティングパラダイムシフトについて製造企業が販売チャネルをコントロールし,ユーザ(特に消費者)のニーズを調査して製品化するクローズドシステムから,オープンシステムへの変化について研究を行った。マーケティングとコストマネジメントの融合による知覚価値の変革,コラボレーション,サプライチェーン,ビッグデータの分析について,それぞれのメンバーがその専門分野から主として文献研究を行い,インターネットやプラットフォームがマーケティングにどのような変革をもたらしたかを分析した。オープン化によってユーザの参加によるコラボレーション,プロシューマの出現によってコラボレーション,さらにはコラボレーションによるイノベーションが行われている。このようなシフトについて主として文献研究を通じてそのシフトの要因を明らかにすることができた。2014年度は主として理論研究を中心に行ったが,同時に企業訪問を行い,その変革の実態を明らかにすることができた。したがって,本研究はおおむね順調に進展している。マーケティング情報システムの進化によってマーケティングのパラダイムがどのようにシフトしたかについて前年度に引き続き,理論研究を進めると同時に事例研究を行う。特にグーグル,フェイスブックなどのソーシャルメディアプラットフォームではユーザが検索エンジン,メール,位置情報,ソーシャルボタンなどを通じてプラットフォームにアクセスすることを通じて参加している。同時にユーザはプロシューマとしてコンテンツの作成に参加している。これらのユーザのデータに基づいてターゲッティングマーケティング,特にターゲッティング広告が行われている。このようなソーシャルメディアプラットフォーム,特にグーグル,アマゾン,フェイスブックについて事例研究を行う。

サブテーマでは,ジオメディア,ジオサービスが内在するゲーム性,仮想空間の交流と融合した新たなコミュニーケーションが生む知覚価値に焦点をあてて,融合コストマネジメント論を発展させる。また今年度集めた資料をもとにネットワークの情報共有と伝播について分析を行い,マーケティング・モデルについてその概要と変遷ならびに最新の動向をまとめる。サプライチェーン・プラットフォームの分析ではマーケティングパラダイムのシフトに伴う今後の展開を明らかにする。
個体NMR法を用いた立体構造解析法の開発

本研究では,我々がこれまでに開発したさまざまな固体NMR法を用いた実践的な分子の3次元構造(立体配座)決定法を確立する.平成14年度は,まず,分子運動の影響を除くための低温測定システムを導入し,性能の検討を行った.それと平行して,構造が決定されているテスト試料として,炭素と窒素を全て炭素13と窒素15でそれぞれ置換したN-アセチル-L-プロリルグリシル-L-フェニルアラニンを固相法を用いて合成した.この試料に対しDARR法を用いた遠隔炭素間距離の一括測定の検討を行い,実験的なパラメーターの最適化を行っている.また,原子間距離を用いて分子の立体構造を決定するためのプログラムとしてX-PlorというYale大学で開発されたプログラムを導入し,N-アセチル-L-プロリルグリシル-L-フェニルアラニンで現在得られている多数の炭素間距離による構造決定を行い,本手法で簡便にある程度の精度で3次元構造を得ることが出来ることを示すことができた.現在,このようにNMRで炭素間距離を測定することで得られた構造と,X線回折法で得られている構造との比較を行い,本手法の精度や問題点などの評価を行っている.同時に,構造が決定されていない神経伝達物質の一種であるエレドイシンのC端側6残基(K-F-I-G-L-M)の構造決定を行うために,炭素,窒素をそれぞれ炭素13,窒素15で全て置換したエレドイシンを合成し,炭素13や窒素15の固体NMR信号の帰属など構造決定のための予備的な実験を行った.本研究では,分子の3次元構造決定法を確立することを目的として、我々がこれまでに開発したさまざまな固体NMR法の問題点を明らかにすると共に、それを克服するための新規な手法を模索・開発する。本年度は、多スピン系の試料を用いて、多数のおおまかな距離情報を一度に決定するという、これまでに希求されてきたが実現されていなかった固体NMR法を検討・開発した(Chem. Phys. Lett.,344,631-637(2001))。この手法では、観測核スピンへのラジオ波照射を必要としないために、距離測定時間の制限が一般的に長い縦緩和時問になる。したがって、長距離の測定が行えるという大きな特徴がある。また、観測は高分解能の条件で行うことが可能であり、他にも多スピン系への応用に適した特性を持っている。現在、C^<13>で同位体ラベルしたペプチド試料をモデル分子として用意して、この手法により得られる距離の精度や測定限界を検討中である。また、N^<14>のスピン状態が+1と-1の間の遷移(オーバートーン遷移)に着目して、これまで誰も成功していない粉末試料でのN^<14>の高分解能NMR測定を行った(J. Am. Chem. Soc.,123,10786-10787(2001))。窒素は,生体分子機能の発現にかかわる高次構造を維持する水素結合などに必ず含まれる重要な核である。ところが、粉末試料では、天然に99.6%存在するN^<14>の高分解能NMRの測定は困難であり、N^<15>で置換した試料を作成して測定が行われてきた.新しく開発した手法を用いることで、多くの試料でN^<15>Nによる同位体置換が不必要になるのみならず,N^<15>の化学シフト相互作用よりも近傍の構造や電子状態にはるかに敏感なN^<14>の四重極相互作用を測定することが可能になった。本研究では,我々がこれまでに開発したさまざまな固体NMR法を用いた実践的な分子の3次元構造(立体配座)決定法を確立する.平成14年度は,まず,分子運動の影響を除くための低温測定システムを導入し,性能の検討を行った.それと平行して,構造が決定されているテスト試料として,炭素と窒素を全て炭素13と窒素15でそれぞれ置換したN-アセチル-L-プロリルグリシル-L-フェニルアラニンを固相法を用いて合成した.この試料に対しDARR法を用いた遠隔炭素間距離の一括測定の検討を行い,実験的なパラメーターの最適化を行っている.また,原子間距離を用いて分子の立体構造を決定するためのプログラムとしてX-PlorというYale大学で開発されたプログラムを導入し,N-アセチル-L-プロリルグリシル-L-フェニルアラニンで現在得られている多数の炭素間距離による構造決定を行い,本手法で簡便にある程度の精度で3次元構造を得ることが出来ることを示すことができた.現在,このようにNMRで炭素間距離を測定することで得られた構造と,X線回折法で得られている構造との比較を行い,本手法の精度や問題点などの評価を行っている.同時に,構造が決定されていない神経伝達物質の一種であるエレドイシンのC端側6残基(K-F-I-G-L-M)の構造決定を行うために,炭素,窒素をそれぞれ炭素13,窒素15で全て置換したエレドイシンを合成し,炭素13や窒素15の固体NMR信号の帰属など構造決定のための予備的な実験を行った.
骨格筋における細いフィラメントの制御メカニズムについて

骨格筋細胞にRNAi法を用いてネブリンをノックダウンさせること、さらにその骨格筋細胞のサルコメア構造および細いフィラメントの長さを解析することはできなかった。しかし、昨年度の結果よりマウス骨格筋から骨格筋組織幹細胞である筋衛星細胞を効率良く調製する方法を確立した。従来までは筋衛星細胞だけが骨格筋細胞に分化できる唯一の細胞と考えられていたが、最近になって筋衛星細胞以外からも骨格筋細胞に分化可能な細胞の存在が示唆されている。そこで筋衛星細胞以外の細胞がどのようにして骨格筋細胞への分化するのかを明らかにするために、骨髄細胞の一種であるsidepopulation (SP)細胞に着目し、in vitroにおいて骨髄SP細胞の骨格筋細胞への分化実験を行った。骨髄SP細胞を単独で培養しても筋分化しないため、GFP transgenicマウスから骨髄SP細胞を、B6マウスから筋衛星細胞を調製し共培養を行ったところ、共培養開始3週間後にGFP陽性の筋管が観察された。これらの筋管は自己収縮能を有しデスミン陽性であった。さらに骨格筋特異的な遺伝子の発現も確認できた。in vitro系での骨髄SP細胞と筋衛星細胞の共培養により、はじめて骨髄SP細胞由来の筋管が出現すること、さらに筋衛星細胞を培養するのに用いた培養液を骨髄SP細胞の培養液として使用しても骨格筋細胞に分化しないことの2点を考慮すると、骨髄SP細胞が骨格筋細胞に分化するためには筋衛星細胞から分泌される成長因子等の液性因子よりも骨髄SP細胞と筋衛星細胞との接触刺激が重要であることが示唆された。本研究成果は、筋原線維タンパク質の筋形成過程における挙動を研究する上で有効な手段になると考えられる。本年度の研究目標の一つであった筋衛星細胞を効率良く分画する方法については、マウス骨格筋から酵素処理により調製した単一筋線維を直接培養することにより、極めて純度の高い筋衛星細胞を得ることに成功した。この単一筋線維を直接培養する方法は、従来から行われているマウス骨格筋を機械的に細かく処理した後、トリプシンやコラゲナーゼなどの酵素処理することにより得られた細胞を培養する方法と比較すると、得られる細胞数は少ないものの、線維芽細胞あるいは内皮細胞といった筋細胞以外の細胞の混入がほとんどないことが長所としてあげられる。得られた単核細胞に分化誘導をかけると多核の筋管を形成することからも、本法で調製した細胞は正常に分化能力を有することも確認できた。この単一筋線維を直接培養する方法は筋衛星細胞を利用する実験を行う上で極めて有用な調製方法であることがわかった。また二番目の目標はRNAi法を用いてネブリンをノックダウンさせた筋衛星細胞を作り出しその細胞を解析することであったが、残念ながら現在までにノックダウンさせた筋衛星細胞を得るには至っていない。実験が成功しなかった理由として、(1)ネブリンは分子量が800kDaと巨大なタンパク質であるので効果的にノックダウンさせるためのRNAを設計するのが困難であること、および(2)RNAを細胞に導入する際の効率の低さなどが考えられる。今後は(1)に関しては再度RNAの設計をし直すこと、(2)に関してはトランスフェクションの方法を変える、あるいはdouble strands RNAを直接作り出すplasmidを筋細胞にトランスフェクションする方法に切り替えること等について検討し、問題点を克服していきたいと考えている。