hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
コロイド包括ゲル化処理を中核技術とする新規廃液処理プロセスの構築

アルギン酸のカルシウムイオンとのゲル化反応にコロイド懸濁質を巻き込み,系から分離する新規な分離手法について検討した。これは,(1)アルギン酸水溶液をコロイド懸濁液と混合し,(2)この混合液をカルシウム塩水溶液と混合し,(3)生成したゲル内にコロイド粒子を閉じ込め,(4)ゲル懸濁液を重力脱水し,(5)残ったコロイド包括ゲルを圧搾脱水し廃棄する技術である。この方法をナノ粒子コロイド,溶存有機物,非水溶液の処理に拡張するための検討を行った。本研究は,「コロイド包括ゲル化処理プロセスを用いた新規なコロイド粒子除去プロセスあるいは溶存有害物質除去プロセス」を開発することを目的としている。1.コロイド懸濁質としてシリカ微粒子(粒子径25200nm, 1000ppm)を含む懸濁液をアルギン酸Na (Na-Algと略記)水溶液(10000ppm)と等量混合し,この混合液を5倍量の塩化カルシウム水溶液(10000ppm)に滴下することにより,コロイド包括アルギン酸Caゲルを調製した。ゲル懸濁液は重力脱水後,70kPaで定圧圧搾した。ゲルの網目構造を変化させるため,(1)上記のNa-Alg濃度を2倍にしたゲル,(2)カルボキシメチルセルロースNa (Na-CMCと略記)水溶液をNa-Alg水溶液(10000ppm)に対し種々の割合で添加したゲルによる包括処理も行った。搾液への微粒子の漏れは,シリカ微粒子の粒子径が小さくなるほど増えるが,最大でも仕込み量の1%程度であった。漏れ量はゲル調製時のNa-Alg濃度に依存しなかった。一方,ゲル調製時にNa-CMCを添加した系では,添加量が増えるとシリカ微粒子の漏れ量が減少する傾向が見られた。2.ゲル懸濁液を内径60mmの圧密セルに仕込み,種々の予圧密圧力とその2倍以内の圧搾圧力条件下で定圧圧搾試験を行い,初期の圧搾脱水速度より網目孔径を求める手法を開発した。空隙比が20以上の圧縮条件下では,ゲル調製時にNa-CMCを添加した系の方が無添加の系より網目孔径小さくなり,1.の内容と対応する結果が得られた。1.ゲル懸濁液を内径60mmの圧密セルに仕込み,種々の予圧密圧力とその2倍以内の圧搾圧力条件下で定圧圧搾試験を行い,初期の圧搾脱水速度よりゲルの網目孔径を求める手法を開発した。この手法により得られる網目孔径は,従来の圧縮透過データから得られる網目孔径より大きい。両手法の違いは,酸化鉄,酸化亜鉛,カオリン等の粒子系試料の充填層に対しても同じ傾向であった。充填層が自然凝集体やゲル粒子からなる場合,凝集体やゲル間のマクロ流路と凝集体内あるいはゲル内のミクロ流路が混在し,従来法ではマクロ流路の情報が強調され,圧搾法ではミクロ流路の情報が協調されるものと考えられる。したがって,ゲル細孔径の測定には圧搾法が適していると考えられる。2.トルイジンブルーをモデル物質として用い,この水溶液をベントナイト懸濁液と混合し吸着処理した後,アルギン酸Na水溶液と混合し,この混合液を塩化Ca水溶液に滴下しコロイド包括ゲルを調製し,重力脱水,圧搾脱水した。ベントナイトを介在させることにより,トルイジンブルーのゲル内への捕捉量が劇的に向上した。1.「溶存有機物の包括ゲル化処理」を検討した。ブルーデキストランを溶存有機物のモデル物質として用い,この水溶液を(1)ベントナイト懸濁液,(2)アルギン酸プロピレングリコールエステル水溶液,(3)カルボキシメチルセルロースナトリウム水溶液と混合した後アルギン酸ナトリウム水溶液と混合し,この混合液を塩化カルシウム水溶液に滴下し溶存有機物包括ゲルを調製し,重力脱水,圧搾脱水した。ゲル内にベントナイト等を介在させることにより,ブルーデキストランのゲル内への捕捉量が向上した。2.「コロイド包括処理法の非水系への拡張」を検討した。モデルコロイドとしてPMMA粒子(粒子径0.15μm)を懸濁させた菜種油を用いた.この系を80°Cまで加熱した後,12-ヒドロキシステアリン酸を油分に対し3/100の割合で加え,放冷し懸濁液をゲル化させた.

この油ゲルを98kPaで定圧圧搾し,搾液中に漏れたPMMA粒子を分光光度計で定量した.圧搾に際し,モデルコロイドに含まれるPMMA粒子の95%以上がゲルの網目に阻止されゲル内に留まった。モデルコロイドに脱液助剤としてのパルプ短繊維を加えゲル化させることにより,油ゲルの圧搾脱液速度を改善することができた。また,パルプ短繊維の量が増えるにつれ,モデル懸濁質であるPMMAの搾液への漏れ量が減少した。
発光色素を円偏光発光色素に進化させる手法

昨年度に引き続き、軸性キラルビナフチルまたはナフタレンオリゴマーを用いた円偏光発光色素の開発を行った。特に、既存の発光団を用いて円偏光発光性色素を創り出す方法の開発に重点を置き、以下の研究(1), (2), (3)を進めた。(1) 1,1'-ビナフチル-3,3'-ビピリジル環状化合物を合成した。これらは連結部位(リンカー)の種類によって光学特性が大きく異なっていた。このうち、ビナフチル側から-CH2O-で連結した環状体は、プロトン化/脱プロトン化によって光物性のスイッチングが可能であり、蛍光性を保ったまま円偏光発光性のオン/オフを達成した。さらにX線結晶構造解析や理論計算により立体構造を明らかにした。(2)ナフタレン四量体骨格にピレン、ペリレン、アントラセンを6つ導入した化合物を合成した。これらは全て、導入した芳香環のエキシマーに由来する強い円偏光発光性を示した。理論計算により、カルボニル酸素同士と芳香環同士の反発によって立体配座がある程度固定されていることが示された。ねじれたエキシマーの形成が強い円偏光発光性の発現に関与していることが考えられた。(3)軸性キラルナフタレン四量体を鍵中間体として、キラルペリキサンテノキサンテン(PXX)類を合成した。隣り合うPXX環同士をメチレンジオキシ基で架橋すると、溶液および固体状態で円偏光発光性を示した。理論計算により、架橋構造によってPXX環同士は小さい角度に固定され、分子軌道に影響が及ぶことが予想された。現在までにいくつかの優れた円偏光発光色素を開発した。それらの立体構造と発現機構を明らかにできた。さらに当初は想定していなかった円偏光発光のスイッチングに成功した。まず既に合成を達成した軸性キラル化合物について、立体構造およびキロプティカル特性をより深く調査し、それらの相関を明らかにする。ナフタレン四量体に発光団を導入する手法の汎用性を確認する。π拡張した軸性キラル化合物を合成し、さらなるキロプティカル特性向上を行う。外部刺激によって円偏光発光性が変化する化合物の開発を目指す。軸性キラルビナフチルまたはナフタレンオリゴマーを用いた円偏光発光色素の開発を行った。(1)連続するキラル軸を有し、隣り合うナフタレン環同士をメチレンジオキシ基で架橋したナフタレン二量体、四量体、八量体を合成した。これらは溶液および固体状態で円偏光発光性を示した。軸の立体配置が揃うほど、またナフタレン環の数が多いほど円偏光発光性の強度は増加した。さらにX線結晶構造解析や理論計算によってこれらの立体構造を明らかにした。(2)ナフタレン二量体や四量体骨格にピレン環を導入した化合物をいくつか合成した。これらのうちナフタレン四量体にピレン環をエステル結合を介して八つ導入した化合物が、ピレンのエキシマーに由来する強い円偏光発光性を示した。理論計算により、カルボニル酸素同士とピレン環同士の反発によってピレン環の立体配座がある程度固定されていることが示された。さらに一方向にねじれたエキシマーが形成されていることが予想され、このことが強い円偏光発光性の発現に関与していることが考えられた。(3) 1,1'-ビナフチルと3,3'-ビピリジルが連結した環状化合物を合成した。このうち、ビナフチルの3,3'-位にメトキシを有する化合物はプロトン化/脱プロトン化に伴って円偏光発光性や旋光性などのキロプティカル特性が大きく変化するという興味深い知見が得られた。現在までにいくつかの軸性キラル化合物を合成し、それらの特異な立体構造を明らかにしている。さらにこれらのうちのいくつかは強い円偏光発光性や円二色性を示し、その発現機構も明らかになりつつある。

(3)軸性キラルナフタレン四量体を鍵中間体として、キラルペリキサンテノキサンテン(PXX)類を合成した。隣り合うPXX環同士をメチレンジオキシ基で架橋すると、溶液および固体状態で円偏光発光性を示した。理論計算により、架橋構造によってPXX環同士は小さい角度に固定され、分子軌道に影響が及ぶことが予想された。現在までにいくつかの優れた円偏光発光色素を開発した。それらの立体構造と発現機構を明らかにできた。さらに当初は想定していなかった円偏光発光のスイッチングに成功した。まず既に合成を達成した軸性キラル化合物について、立体構造およびキロプティカル特性をより深く調査し、それらの相関を明らかにする。またπ拡張した軸性キラル化合物を合成し、さらなるキロプティカル特性向上を行う。さらに軸性キラル骨格に様々な発色団を導入することで色調の異なる円偏光発光色素を開発する。任意の発色団に円偏光発光性を付与できれば有用な手法となるため、軸性キラル骨格側の最適化も行う。ナフタレン四量体に発光団を導入する手法の汎用性を確認する。π拡張した軸性キラル化合物を合成し、さらなるキロプティカル特性向上を行う。外部刺激によって円偏光発光性が変化する化合物の開発を目指す。有機合成や機器分析が当初予定していたより順調に進み、消耗品費が想定よりかからなかった。次年度は研究をより効率良く進行させるため、有機合成に必要な機器類を購入する。さらに、より積極的に学会等に参加し、研究成果を発表・公開する。また機器の破損や故障も想定より少なかった。
抗真菌性および易除去性を有するクリームタイプ義歯安定剤の開発

現在一般的に市販されている義歯安定剤の問題点の1つと考えられる強すぎる粘着力や誤嚥性肺炎の主要原因菌種であるC.albicansに着目し、抗真菌性および易除去性を有する義歯安定剤の開発を目的とした。最終年度の計画では、抗真菌性を有するラクトフェリンを試作義歯安定剤にさまざまな割合で添加し、最適な濃度を決定することであったが、試作義歯安定剤の構成成分比や粉液比の決定が想定よりも困難であったため、前年度から継続して構成成分、粉液比の物性に及ぼす影響について詳細に検討を行った。また当初の計画にはなかったが、操作性についても評価を行った。義歯安定剤に一般的に使用されている水溶性高分子であるカルボキシメチルセルロースナトリウム(CMC-Na)およびメトキシエチレン無水マレイン酸共重合体(PVM-MA)を用いて、さまざまな含有量の試料を、さまざまな粉液比で作製し、粘度、接合力および操作性に及ぼす影響について検討を行った。粘度は材料の広がりやすさを、接合力は義歯との粘着性を表している。結果は、粘度および接合力についてはCMC-Naの割合が高く、粉液比が大きいほど高くなる傾向を認めた。このうち接合力については粘度が高くなると大きな増加率を認めなくなることが明らかとなった。操作性については歯科医師の手指感覚により最適と思われる粘度の評価を行ったが、100Pa・s前後の粘度が適切であるという結果であった。以上の得られた結果については国内の学会のみならず、海外での学会でも発表を行い、その成果を国内外に発信した。「抗真菌性および易除去性を有するクリームタイプ義歯安定剤の開発」を目指し、平成28年度は義歯安定剤の各成分が接合力に及ぼす影響ついて検討を行った。試料となる義歯安定剤の成分には基本的な成分であるカルボキシメチルセルロースナトリウム(CMC-Na)およびメトキシエチレン無水マレイン酸共重合体(PVM-MA)の2種類を用い、各成分の割合の異なる5種類(100:0、75:25、50:50、25:75および0:100)の試料を作製した。さらに当初の計画に加え、試料の粉液比および接合間距離も因子として追加した。粉液比はISO規格を基準に4種類(0.125、0.250、0.375および0.500)、接合間距離は適合良好な義歯および不適合な義歯を想定した2種類(0.1および0.5mm)を用いた。接合力の測定には万能材料試験機(EZ Test、島津製作所)を用い、クロスヘッドスピード5mm/minで引っ張り試験を行い、最大接合力を記録した。得られた結果について3元配置分散分析を用いて統計処理を行い、成分比、粉液比および接合間距離の3因子が接合力に及ぼす影響を解析した。結果は、すべての因子およびその交互作用において有意差を認めた(p<0.05)。粉液比が大きく、接合間距離が小さい方が高い接合力を示す傾向にあった。また、粉液比や接合間距離を変化させても、CMC-Naの割合が高いほど接合力が高くなる傾向にあった。各因子の寄与率では、成分比が59.2%と最も高く、CMC-NaとPVM-MAの割合が最も接合力に影響を及ぼした。次いで粉液比が19.8%と高く、接合間距離は8.3%であった。平成28年度における結果より、CMA-NaおよびPVM-MAの成分比が最も接合力に影響を及ぼしていることが示唆された。今後は各試料の粘度および動的粘弾性について検討する予定である。当初の計画では義歯安定剤の各成分が異なる試料を作製し、接合力、粘度および動的粘弾性の3種類の物性について影響を検討する予定であったが、測定を行ったのは接合力のみとなった。これについては、物性に及ぼす因子として各成分比に加えて、粉液比および接合間距離の2因子を追加したため、試料数が増加したためであると考えられる。測定項目についてはやや遅れているが、全体的にはおおむね順調に進展している。「抗真菌性および易除去性を有するクリームタイプ義歯安定剤の開発」を目指し、カルボキシメチルセルロースナトリウム(CMA-Na)およびメトキシエチレン無水マレイン酸共重合体(PVM-MA)からなる昨年度と同様の試料20種類について、初期粘度および動的粘弾性の測定を行った。初期粘度は本材の操作性を、動的粘弾性は本材使用時の挙動を評価するうえで重要な測定項目と考えられる。測定にはストレス制御式レオメーター(AR-G2、TAインスツルメント社製)を用いた。初期粘度は測定温度23°C、せん断速度0.1100の条件下で行い、昨年度測定を行った接合力との関連性についても検討した。動的粘弾性は測定温度37°C、周波数0.01100Hzの条件下で測定し、動的粘性率、動的損失粘性率および損失正接の3種類の粘弾性係数値を用いて評価を行った。初期粘度の結果は、CMC-Naの割合が高く粉液比が大きくなるほど初期粘度は大きくなるが、接合力は粘度が1000Pa・sを超えると大きな増加率を認めなくなった。動的粘弾性の結果はCMC-Naの割合が高く、粉液比が大きくなるほど動的粘性率および動的損失粘性率は増加する傾向となった。

またCMC-Naを含む試料では粉液比が大きくなるにつれて損失正接の値が減少したが、PVM-MA単体の試料では増加した。平成29年度における結果より、CMC-NaおよびPVM-MAの割合、粉液比は初期粘度および動的粘弾性に影響を及ぼすことが示唆された。また追加の評価項目として、歯科医師による官能試験を追加し、現在実施中である。当初の計画においては義歯安定剤の各成分比が異なる試料を作製し、その影響を検討する予定であったが、粉液比も物性に影響を及ぼすことが明らかとなったため、試料数が増加した。また追加の評価項目として、歯科医師による官能試験を追加したこともやや遅れている原因と考えられる。現在一般的に市販されている義歯安定剤の問題点の1つと考えられる強すぎる粘着力や誤嚥性肺炎の主要原因菌種であるC.albicansに着目し、抗真菌性および易除去性を有する義歯安定剤の開発を目的とした。最終年度の計画では、抗真菌性を有するラクトフェリンを試作義歯安定剤にさまざまな割合で添加し、最適な濃度を決定することであったが、試作義歯安定剤の構成成分比や粉液比の決定が想定よりも困難であったため、前年度から継続して構成成分、粉液比の物性に及ぼす影響について詳細に検討を行った。また当初の計画にはなかったが、操作性についても評価を行った。義歯安定剤に一般的に使用されている水溶性高分子であるカルボキシメチルセルロースナトリウム(CMC-Na)およびメトキシエチレン無水マレイン酸共重合体(PVM-MA)を用いて、さまざまな含有量の試料を、さまざまな粉液比で作製し、粘度、接合力および操作性に及ぼす影響について検討を行った。粘度は材料の広がりやすさを、接合力は義歯との粘着性を表している。結果は、粘度および接合力についてはCMC-Naの割合が高く、粉液比が大きいほど高くなる傾向を認めた。このうち接合力については粘度が高くなると大きな増加率を認めなくなることが明らかとなった。操作性については歯科医師の手指感覚により最適と思われる粘度の評価を行ったが、100Pa・s前後の粘度が適切であるという結果であった。以上の得られた結果については国内の学会のみならず、海外での学会でも発表を行い、その成果を国内外に発信した。義歯安定剤の粉液比および使用時の接合間距離についても検討する必要があると考え、当初の計画にこの2因子を追加するように計画の修正を行った。そのため初年度に測定予定であった粘度および動的粘弾性の測定を次年度に行うように変更したため、これらの物性についての影響を検討していく予定である。義歯安定剤の物性の評価について、当初計画していた接合力、初期粘度および動的粘弾性に加え、官能試験を追加した。これらの結果から理想的な義歯安定剤の組成および粉液比を決定する。その後はラクトフェリンの添加量について検討していく予定である。初年度に測定予定であった物性について、次年度に測定するように変更した項目があるため、試料作製に掛かる物品費が一部次年度に使用する必要が生じた。本年度測定予定としていた義歯安定剤へのラクトフェリン添加量の検討を、次年度に行うように計画を修正したため、試料作製に掛かる物品費を次年度へ変更する必要が生じた。使用計画については最終年度であるため、本研究の総括を行い、国際学会での発表を検討している。初年度に実施する予定であった測定項目について、その試料を作製するために使用する予定である。
炎症性腸疾患の病態を修飾する腸内ウイルス叢を解明するメタゲノム解析

炎症性腸疾患であるクローン病と潰瘍性大腸炎においては、腸内細菌叢の変化に伴い、炎症の制御に異常を来している。健常者、潰瘍性大腸炎患者、クローン病患者の便細菌叢の解析ではクローン病や潰瘍性大腸炎患者の腸内細菌叢は、健常者と比べ、有意に異なる細菌種やウイルスを含むことが判明した。これらの微生物叢を含む患者便または健常者便をIL10欠損マウスに移植した。結果、腸炎の病理学的スコア、腸管組織の炎症性サイトカインtnf、il6、il1bの発現は有意に炎症性腸疾患便移植群が高いことが判明した。以上のことから、炎症性腸疾患患者の変化した微生物叢は、腸炎を増悪させる働きがあると考えられた。健常者10名、潰瘍性大腸炎患者10名の便からDNAを抽出しwhole genome shotgunシーケンシング用のライブラリを作成した。ライブラリのサイズを確認の後にイルミナMIseqを用いてシーケンシングを行った。得られたリードからquality control、ヒトゲノム配列リードの除去、PCR複製の除去を行った。各サンプル100万リード以上が得られ、これを用いてMetavir2にて存在するウイルス配列の解析を行った。健常者群と潰瘍性大腸炎群のウイルス配列の比較を行い、有意に異なるウイルス配列について解釈を行っている。健常者と潰瘍性大腸炎患者の便中ウイルス配列の比較を行うことができた。健常者13名、炎症性腸疾患患者25名(潰瘍性大腸炎患者17名、クローン病8名)の便からDNAを抽出しwhole genome shotgunシーケンシング用のライブラリを作成した。健常者群と潰瘍性大腸炎群のウイルス配列の比較を行い、有意に異なるウイルス配列について同定した。同時に便をマウスに移植し腸炎の発症について観察を行った。体重、病理、サイトカイン遺伝子のmRNA発現について評価を行った。炎症性腸疾患患者便移植マウスは健常者便移植マウスに比べ有意に体重が減少し、腸炎の悪化がみられた。存在するウイルスとの相関について解析中である。シーケンシング結果は細菌種の遺伝子と細菌分類についても解析を行い、ウイルス、細菌、臨床データ(活動性スコア、病型)、腸炎マウスモデルの表現型の面から多面的に解析を行っている。さらにVLP(virus-like particle)を便から獲得しDNA抽出を行う手法について実験を行っている。VLPの獲得を行うことができれば、粒子として排出されているactiveなウイルスの把握を行うことが可能である。細菌内のウイルスDNAと、粒子として排出されているactiveなウイルスDNAとの関連について解析を行うため手技手法について検討中である。健常者と潰瘍性大腸炎患者、クローン病患者の便中ウイルス配列の比較を行うことができた。さらにマウスに便を移植したときの腸管の表現型も把握した。さらにVLPの抽出によるウイルスゲノムの獲得を目指す。目的として腸内微生物叢が腸炎に与える因果関係について知るために移植実験を行った。移植するマウスとして、潰瘍性大腸炎の疾患感受性遺伝子として考えられているil10の欠損マウスと用いた。潰瘍性大腸炎の便移植マウスは健常者便移植マウスに比較し有意に炎症性サイトカインtnf、il17aの発現が高く、さらに病理スコアも悪化していた。Enteroccocaceae科の細菌が潰瘍性大腸便移植マウスの便中に有意に多く病勢との関連が考えられた。

以上のことから、炎症性腸疾患患者の変化した微生物叢は、腸炎を増悪させる働きがあると考えられた。さらに症例数を増やし、VLPの抽出によるウイルスゲノムの獲得を目指す。健常者と潰瘍性大腸炎患者、クローン病患者の便中ウイルス配列の比較を行うことができた。さらにマウスに便を移植したときの腸管の表現型も把握した。さらにVLPの抽出によるウイルスゲノムの獲得を目指す。消化器内科学H27年度の結果をもとにH28年度に集中したシーケンシング実験計画を予定したため。メタゲノム解析とマウスへの便移植実験に時間を費やしたため、さらに予定していたメタゲノム解析を次年度に行うこととし使用額を次年度にまわしたためH27年度の結果をもとにして、大規模なサンプル数でのシーケンシングを予定する。次年度使用額も加えて次世代シーケンサーによるシーケンシングを計画する。便中VLPのメタゲノム解析を予定する。
抗酸化能力が動脈コンプライアンスに及ぼす影響-加齢および運動習慣との関係から-

活性酸素は血管内のLDLコレステロールを酸化、変性させ、動脈硬化を誘発することから、血中の抗酸化能力は、動脈コンプライアンスの維持に大きく貢献すると考えられる。しかし、血中の抗酸化能力と動脈コンプライアンスとの関係については明らかではない。本研究では3ヶ月間の軽度なレジスタンストレーニング(ダンベル運動、9種目、10-15回、2セット)が、動脈コンプライアンスにおよぼす影響を血中リポ蛋白濃度、抗酸化能力指標、酸化ストレス指標の変化から明らかにすることを目的とした。被験者は、健康で高脂血症の疑いが認められない60-81歳の男女、計17名で、全員が特別な運動習慣はなく、非喫煙者であった。動脈コンプライアンス指標は、血圧脈波検査装置(VaeraVS-1000、フクダ電子)によるCardio Ankle Vascular Index (CAVI)を用いた。HDL-コレステロールはトレーニング後に有意に(p<0.05)増大し、動脈硬化指数(総コレステロール/HDL-コレステロール)は低下したが有意な変化は認められなかった。血管内でのLDLの酸化を示すMDA-LDL濃度は、トレーニング後に低下したが、有意な差は認められなかった。DNA損傷マーカーである血中8-OHdG濃度はトレーニング後に有意に(p<0.05)低下した。これらの結果は、抗酸化指標である総コエンザイムQ10濃度がトレーニング後に有意に増大したことによって組織や細胞レベルでの抗酸化機能が高まったためと考えられ、活性酸素種によるDNA損傷が抑制された可能性が示唆された。CAVIもトレーニング後に低下する傾向があったが有意な差は認められなかった。これらの結果から、生体内や血管内での酸化ストレスが軽減されたと考えられた。しかし、動脈コンプライアンスや動脈硬化指数に有意な改善が認められなかったため、運動の条件等の影響についても検討していく必要がある。高強度なトレーニングは、血中や骨格筋の還元型グルタチオン(reduced glutathione : GSH)濃度やグルタチオンリダクターゼ(glutathione reductase : GR)存などの抗酸化酵素活性を高める.我々(1998)は低強度なトレーニングでもグルタチオン系の亢進により活性酸素種生成が抑制されることをラットで確かめている.しかし、トレーニングが抗酸化能力に及ぼす影響について,ヒトを対象にした研究は少なく,特に抗酸化能力と持久性パフォーマンスとの関係についての報告は見当たらない。今年度は,持久性トレーニングを行っている陸上長距離選手の抗酸化能力とパフォーマンスとの関係を,血中のGSH濃度,GR活性と5000-m走のタイムの関係から検討した.被験者は、社会人陸上競技部に所属する男子陸上長距離選手24名(23.8±5.1歳,172.4±6.0cm,57.1±4.8kg ; mean±SD)とした.また,採血前1ヶ月以内の競技会における5000-m走ベスト記録は14.8±0.6分であった.本研究では,陸上長距離選手の5000-m走のタイムと血漿GRとの間には有意な相関関係(r=-0.538,P<0.01)が認められ,さらに血漿過酸化脂質濃度とGRとの間にも有意な相関関係(r=-0.415,P<0.05)が認められた.一方,血漿GSH濃度と5000-m走のタイムおよび過酸化脂質濃度との間には有意な相関は認められなかった.これらの結果から血中のグルタチオン系,特にGR活性が持久性運動のパフォーマンスや血中過酸化脂質濃度と密接に関っている可能性が示唆された.

最近、動脈コンプライアンスの指標として脈波伝播速度(PWV : pulse wave velocity)が有用とされ、PWVが遅いほど動脈のコンプライアンスが高いと考えられている。Tanaka et al.(1998)は、中高年の女性を対象にPWVを測定し、PWVと収縮期血圧、BMI、さらに血中の総コレステロールやLDLコレステロールとも有意な正の相関を確かめている。また同時に、PWVと最大酸素摂取量とは有意な負の相関が認められ運動習慣がPWVの低下、すなわち動脈コンプライアンスの加齢による低下を抑制することを示した。しかし、これまでに実際に一過性の運動がPWVに影響を及ぼすか否かについての基礎的データは見あたらない。そこで、今回は一過性の運動がPWVに及ぼす影響とその再現性について確かめた。被験者は健康な男性(41歳)とし、5回にわたり75%HRmax、30分間のトレッドミル走を実施し、運動前後の上腕-右足間(R)-PWV、上腕-左足間(L)-PWV、心臓-右上腕間(B)-PWVについて検討した。その結果、安静時のR-PWV、L-PWV、B-PWVはそれぞれ11.6±0.4、11.5±0.3、6.3±0.3m/s(mean±SD)、運動後3分は11.6±0.7、11.7±0.8、4.3±0.4m/s、10分は11.2±0.5、11.1±0.7、5.2±0.4m/s、そして20分では11.1±0.4、11.2±0.5、5.3±0.5m/sであった。これらの結果、R-PWV、L-PWVは運動による影響が少ないが、B-PWVは運動後に有意に低下し、運動によってPWVが低下する可能性が示唆された。またそれぞれの測定値の再現性は非常に高く測定値は妥当であると評価された。被験者は56名の健康な高齢女性(61±1.7歳,mean±SD)で、過去に心臓血管系の病歴のある者や血中脂質およびリポ蛋白濃度に異常がある者は除外した。被験者全員について、万歩計による日常の活動量(steps/day)を調べた。また、安静時に正中皮下静脈から採血を実施し、血漿中の総コレステロール(T-C)、HDLコレステロール(HDL-C)、MDA-LDL、GSH濃度およびGR活性を測定した。その結果、血漿MDA-LDLとGR活性の間には有意な負の相関関係(r=-10.603,p<0.001)が認められたが、MDA-LDLとGSH濃度との間には有意な相関が見られなかった。また、活動量とGR活性間でr=0.556(p<0.001)、活動量とGSH濃度間でr=0.614(p<0.001)と有意な相関が認められた。以上の結果、血中のグルタチオン系の抗酸化能力は日常の身体活動により高まること、また、特にGR活性が血管内の酸化LDLの生成を抑制し動脈硬化予防に貢献する可能性が示唆された。
エクソソームを介した細胞間コミュニケーションと新たな放射線治療標的の探索

放射線療法はがん治療に広く用いられているが、治療効果のさらなる向上には、放射線による細胞への影響の生命科学的な理解が不可欠である。私たちはこれまでに、放射線照射後のがん細胞の生存や浸潤性亢進に関わる分子メカニズムの一端を明らかにしてきた。さらに近年、がん細胞の放射線感受性と、細胞内小胞の分布の変化が密接に関連することを発見した。これらの成果をもとに、放射線照射後にがん細胞から分泌されるエクソソームの役割とその分子メカニズムに現在着目している。本研究は、放射線が照射された細胞の周辺または遠隔細胞への影響に、エクソソームがどのように関連しているか、という問いから展開される。
運動・ストレス・老化に関する新規バイオマーカーの開発

運動ストレスに応答するバイオマーカーを検索するため、激運動前後の血液・尿サンプルでプロテオーム解析を行い、運動前後で変動したスポットに関して質量分析装置で同定した。そのうち、尿で顕著な上昇を示した分子についてELISAを構築した。また、血中に存在するマイクロRNAに着目し、マイクロアレイを用いた網羅的解析により一過性レジスタンス運動に応答する複数の血中マイクロRNAを同定し、リアルタイムPCRを用いて発現を定量した。さらに、遺伝子発現の網羅的解析に関しては、特に翻訳動態変化の解析に特化したリボソームプロファイリングの立ち上げに国内で初めて成功し、バイオマーカー開発への応用を開始した。まず運動ストレスに応答する新規バイオマーカーを検索するため、運動後に血中、尿中に出現するペプチド、タンパク質とマイクロRNAに着目し、2次元電気泳動やマイクロアレイを用いた網羅的解析により運動に応答するバイオマーカーを検討した。プロテオミクスについては、血中より尿中に多くの分子が出現し、データベースより複数のペプチド・タンパク質が新規バイオマーカーの候補としてリストアップされた。これらについて各分子の物性、機能特性、既存の測定系の有無などを調査中である。マイクロRNAについては、リアルタイムPCRを用いて発現を定量できるように条件設定を行った。セロミクスについては、フローサイトメトリーを用いた多項目同時測定についてはまだ測定系の確立が十分にできておらず検討の余地があるものの、活性酸素産生能を中心とした好中球機能測定について検討を進めることができ、がん患者における慢性炎症の指標となりうる可能性を示すことができた。以上の検討を踏まえ、今後も測定指標の選定と条件設定の最適化を進める方針である。また、新規バイオマーカーの妥当性を検証するための調査対象を検討し、各種運動負荷、高齢者の運動トレーニングプログラムなどの介入調査で血液、尿サンプルを確保すると同時に、それらについて既存の臨床検査等の基礎データを収集した。今後、新規バイオマーカーの測定系を確立すると同時に、運動に応答するその他の血中、尿中指標との相関分析を進め、相対評価を行っていく予定である。プロテオーム解析を用いて運動負荷により変動するタンパクの網羅的解析により、尿による非侵襲的新規筋損傷バイオマーカーの探索と測定系の開発を進めた。筋損傷を誘発する運動後に採取した尿検体のうち、運動負荷96時間後までに顕著に血中筋損傷マーカーが上昇した尿サンプルを用い蛍光二次元電気泳動(2D-DIGE)を施行したところ、運動後に分子量XXkDaのスポットを検出した。このスポットをマススペクトロメトリーにより解析し、物質XのN末端フラグメントを同定した。次に物質XのN末端フラグメントを鋭敏に検出する酵素免疫測定法(ELISA)を確立した。この測定系を用いて筋損傷を誘発する運動後に採取した尿検体を測定した結果、尿中物質Xフラグメントは運動負荷48時間後から上昇し、96時間後には運動負荷前と比較して有意な上昇を認めた。運動負荷前と比較した各測定ポイントの変化率は、48時間後と72時間後において、血中筋損傷マーカーと強い正の相関を示し、同時に圧痛、関節可動域の減少、主観的筋痛などの筋症状とも相関したことから、尿中物質Xフラグメントは新規の非侵襲的筋損傷マーカーとして有用である可能性が示された。以上より、プロテオミクスにより同定された分子は、鋭敏かつ簡便で非侵襲的な筋損傷マーカーとなり得る可能性が考えられた。また、血中マイクロRNA(miRNA)や酸化ストレスに関するバイオマーカーの開発も進め、年齢や性差が交絡因子かどうかについての基礎検討を行った。方法として、若齢と高齢の健常男女を対象に、安静時血液サンプルを用いて、昨年度レジスタンス運動で変動することを見いだしたmiR-146a等の特定のmiRNAを定量した。測定したmiRNAのうち、あるmiRは高齢の男性で低下していることが明らかとなった。このことから,加齢や性差が血中miRNAレベルの交絡因子となり得ることが示唆された。運動ストレスに応答する新規バイオマーカーを検索するため、前年度に収集した激運動前後の血液・尿サンプルについてプロテオーム解析を行い、二次元電気泳動(2D-DIGE)を実施した後、運動前後で変動したスポットに関して質量分析装置で同定を行った。そのうち、尿で顕著な上昇を示したタンパク分子について、現在、異なるメーカーが市販している酵素免疫測定法(ELISA)キットを用いて定量し、統計的検定を行ったがいずれも有意差が認められなかった。これは同定されたフラグメントにELISAキットの抗体のエピトープが存在していなかったものと考えられたため、現在、ウェスタンブロット法により当該フラグメントと反応する抗体を選定しており、その結果で新規のELISAを構築できる可能性がある。なお、キーとなるバイオマーカーについては、血中と尿中で比較検討を行い、新規バイオマーカーと比較できるようにデータベースを作成した。また、血中に存在するマイクロRNAに着目し、マイクロアレイを用いた網羅的解析により一過性レジスタンス運動に応答する複数の血中マイクロRNAを同定した。

それらのマイクロRNAについて、リアルタイムPCRを用いて発現を定量した。このうちいくつかのマイクロRNAは、一過性運動によって変動を示した。また、いくつかのマイクロRNAについては血中カテコールアミン、ミオグロビン等と相関関係が認められた。これらのことから、血中マイクロRNAの変動は一過性運動によって変動するいくつかの血中指標と関連している可能性が示唆された。さらに、運動による血中マイクロRNAの変動メカニズムを検討するため、動物実験を開始した。老化のバイオマーカーについては、好中球活性化マーカーをフローサイトメーターで測定できるようにし、高齢者を対象とした運動介入研究での評価に応用したところ、炎症が軽減する効果を認めることができた。伸張性運動後のプロテオミクスより見出した新規筋損傷マーカーについて、昨年度は酵素免疫測定法による測定系を確立し、妥当性も検証したが、今年度は関連する炎症、酸化ストレスマーカーとともにレジスタンス運動や高強度運動への適用を進め、運動・ストレス関連のバイオマーカーの汎用性について検討した。レジスタンス運動については、検討した運動条件では筋損傷マーカーの変動は認められず、炎症性サイトカイン、酸化ストレスマーカーの変動も認められなかったため、これらのバイオマーカーの運動による変動は運動強度に依存する可能性が示唆された。次に短時間高強度運動での検討を行ったところ、アドレナリン、ノルアドレナリンなどのストレスホルモンの上昇は顕著であったが、筋損傷マーカーと酸化ストレスマーカーの変動は軽微であった。そこで、筋損傷と酸化ストレスを誘導する長時間の高強度持久性運動で最終確認を行う必要が生じたため、検討を進めることとなった。またマウスの疲労困憊運動モデルでも筋損傷を誘導し、骨格筋中の炎症反応との関連も検討中である。運動による血中マイクロRNA(miRNA)の変動機序についてもマウスを用いて検討した。骨格筋サンプルは、遅筋線維から構成されるヒラメ筋と、速筋線維から構成される足底筋を採取し、血液は心臓採血によって採取した。運動を負荷しないマウスをコントロール群とし、運動直後および3時間後の骨格筋および血中のmiRNAの変動を、リアルタイムRT-PCRで評価した。その結果、すべてのサンプルでmiRNAの有意な変動が認められず、骨格筋中のmiRNAの変動を前提とした血中miRNAの変動は実証できなかった。先行研究との結果の不一致に関しては、先行研究における運動負荷時の電気刺激の影響や、採取した骨格筋の違いによる影響などが考えられた。26年度が最終年度であるため、記入しない。予防医学26年度が最終年度であるため、記入しない。初年度は、バイオマーカー開発の対象となる運動負荷、ストレスとその軽減策、高齢者や患者など調査対象を検討し、基礎データをそろえることができた。
地震により発生する"粉体流"のメカニズムと発生地の予測の研究

岩橋は購入備品ミラーステレオスコープを用い、河津町及び被災対象の多い伊東市両域の空中写真からリニアメントを抽出、次にこれらが活断層・破砕帯に属するか否かを野外調査で確かめた。またこれらと現地の岩石・地層中の破断とに相関があることを明らかにした。次に河津町各地すべり地において、傾斜角・斜面長・幅等の骨組となる測量を実施し、続いて購入のミラーステレオスコープで更に詳細な地形の図化・描出を行った。以上の結果から地すべり斜面の比高、傾斜角、斜面長と粉体流の到達距離の関係、M=7.0級地震で発生する粉体流災害の及ぼす統計上の範囲を明らかにした(1960年11月14日、中部地区自然災害科学シンポジウムに於て研究発表を行った)。岩橋はその後の現地調査で風化スコリアと未風化スコリアとでは地震に対する応答に相違があり、この両者の境界面をすべり面とする地すべりが発生するという新事実を発見した。木宮は河津町"粉体流"と類似点の多い長野県御岳山大崩壊"粉体流"の堆積物の調査研究から河津"粉体流"の発生機構や堆積物の研究を行った。狩野は東伊豆町に発生した地震断層等を調査し、地盤の構造からみた地すべりの発生危険度の評価について研究中である。大塚は御岳山崩壊地の地すべり面付近のサンプルを採取、その鉱物組成、変質程度等につき分析中。また河津町域の地すべり群の現地調査を行い、新しく基盤岩および風化した崖錐様堆積物と、その上に堆積したスコリアとの間にすべり面を生じ、粉体流が発生した所があることを発見した。以上河津町と御岳山両粉体流の間に共通点が多いことが判明した。現在被覆物の風化・変質・基盤の構造・堆積物の地震に対する応答等につき総合的に検討中であり、伊東地区の粉体流発生危険地図(HazardMap)の作成作業を進め、関係学会に発表の予定である。
コメ貯蔵蛋白オルガネラを用いる常温保存可能経口蛋白医薬の開発基礎研究

経口蛋白医薬としてIL10発現米及びロタウイルス抗体発現米の作出に成功し、特にロタウイルス抗体発現米は常温安定でコメに大量に可溶化できる状態で発現され、マウスを用いた感染防御実験で、当初予定していた経口で蛋白医薬の効果を示すことができた。本研究の目的はイネのプロラミンのプロモーターからなる蛋白発現力セットと貯蔵蛋白抑制力セットRNAiを用いることで、目的の医療用蛋白(例:IL-10及びナノ抗体)をイネ種子胚乳細胞の1型蛋白貯蔵体表層に特異的に且つ高蓄積させることにより、経口投与される蛋白薬剤の消化酵素耐性を飛躍的にあげ、蛋白薬剤を粘膜上皮層や粘膜固有層に送達させ、腸炎や粘膜感染症に対する常温保存可能経口蛋白治療薬を開発することにある。1年目の今年はすでに構築済みであったT-DNAベクターをアグロバクテリリウムに導入し、イネカルスまたは芽に感染させることで、イネゲノムに目的のヒトIL10とサルロタウイルス(RRV)のVP4/7に対するナノ抗体VHH1(ラクダの1本鎖重鎖抗体の超可変部分を含むパラトープ部分)遺伝子を導入した。イネカルスは選択培地処理後、再分化培地処理を行い、PCRで遺伝子導入を確認しP1種子を得た。種子の半粒を電気泳動にかけて、予め調製していたIL10またはVHH1の特異抗体を用いてウエスタンブロットにて発現を確認した。高発現P1種子か6さらにP2種子、現在はP3種子を作出中である。ヒトIL-10及びVHH1の試験管内での活性測定法を構築できたので、IL-10は再生後の活性を確認する予定であるが、VHH1は予備実験での試験管内のRRVの阻害活性は確認できている。特にVHH1米は簡単に可溶化できることか6、経口での抗体療法の可能性が期待される。今後は両者とも本年度作出されてくるP3米を用いた本格的解析を進めていく。本研究では、イネ種子胚乳細胞の蛋白所蔵体オルガネラを構成するプロラミンのプロモーターからなる蛋白発現カセットと貯蔵蛋白抑制カセットを用いることで、イネ種子胚乳細胞に目的の医療用蛋白を特異的に且つ高蓄積させることにより、経口投与された蛋白薬剤を粘膜上皮層や粘膜固有層に送達させ、腸炎や粘膜感染症に対する常温保存可能経口蛋白治療薬を開発することが目的である。当該プロジェクトで開発された発現ベクターにより、ヒトIL-10遺伝子およびロタウイルスに対するナノ抗体をそれぞれ、0.2%及び1.0%の高発現することに成功した。特にナノ抗体発現米は高発現で、PBS等で簡単に可溶化できることから、試験管内ロタウイルスの増殖抑制効果及び幼若マウス動物モデルで、ロタウイルスナノ抗体発現米粉末からPBS抽出液の経口投与により予防及び治療効果が認められ、このデータをもとに特許申請も行った。しかしIL-10発現米は尿素でも可溶化できず、米蛋白であるプロラミン等とIL-10が分子内部で結合している可能性が考えられた。しかし尿素還元剤存在下では可溶化され、再生精製後、試験管内のヒトマクロファージには作用させることでTNF-αの産生の抑制効果を示した。現在、知られている3種のプロラミンすべてを発現抑制される発現ベクターを用いて、IL-10を発現する方法試みており、残りの1年で可溶化できれば動物モデルでの効果を調べる予定である。現在、多くの蛋白医薬の投与形態は注射等による浸襲性のデリバリーシステムにより投与され、非浸襲性、例えば経口投与による蛋白医薬の開発に成功した例はほとんどない。一方で植物をバイオリアクターと考え、組換え蛋白を発現・精製後医療用蛋白として臨床応用する研究も進んでいるが、経口で投与する試みはほとんど行われていない。す〓〓ではないにしろ、ある種の蛋白医薬、例えばインターロイキン10(IL-10)やロタウイルスに対する1本鎖抗体を発現〓分泌する乳酸菌を経口投与することで、クローン病腸炎やロタウイルス感染下痢小児の治療にもちいる研究が進んでいる。しかしこれらの組換え乳酸菌は保存安定性、薬物産生能力の変異等、実際の臨床応用には問題がある。最近我々は、コメの胚乳細胞に存在する蛋白質を貯蔵するオルガネラである蛋白貯蔵体(PB)のうち、特にイネ科特異的である1型蛋白貯蔵体(PBI)にワクチン抗原を発現することにより、ペプシン等の消化酵素に耐性で、且つ長期常温で安定な状態でワクチンを蓄積できることを発見し、コメの蛋白貯蔵体が経口ワクチンのデリバリーシステムとして働くことを見出した。しかしワクチンと違い抗体やIL-10そのものが直接ウイルス増殖や炎症抑制に働くためには、腸管内または局所のウイルス増殖または炎症を起こしている粘膜固有層に安定に薬物を到達させる必要がある。

そこで、蛋白貯蔵体PB1表層にできるだけ多くの蛋白医薬を発現させるためにPB1の疎水環境を形成している10kや16Kプロラミン以外の蛋白で、PBIに多く蓄積している蛋白である13Kプロラミン等のコメ貯蔵蛋白の発現を、RNAiを組み込んだT-DNAベクターで抑制し、そのPB形成のエネルギーと余地を、同時にT-DNAベクターに組み込まれた外来の蛋白医薬遺伝子をコードする蛋白の発現・蓄積に向けさせることにより導入された蛋白医薬の発現蓄積を大幅増強させ、且つPBIに特異的に蛋白医薬を発現させたコメを作出させることでコメ型経口蛋白医薬の開発を行う。経口蛋白医薬としてIL10発現米及びロタウイルス抗体発現米の作出に成功し、特にロタウイルス抗体発現米はコメに大量に可溶化できる状態で発現され、マウスを用いた感染防御実験で、経口でコメ型抗体を投与することで効果を示すことができた。この後、ここで確立した技術を用いて実用化するために、ヒトに投与可能なHPT選択マーカーフリー米の作出を実施する。また無精製、コメ型経口抗体の規格等の品質についていも研究すると同時に、経口で投与した場合の効果発現の機作を研究するために、経口時での安定性、腸管での抗体の分布等を確認していくことになる。
原始ＩＬ－５産生細胞による免疫と炎症の制御に関する研究

本研究では、IL-5/Venusノックインマウスを用い、肺と腸管における原始IL-5産生細胞の機能を解析した。原始IL-5産生細胞はIL-25やIL-33等により活性化し、多量のIL-5やIL-13を産生した。肺の原始IL-5産生細胞は気管支周囲に局在していた。また、肺の原始IL-5産生細胞はIL-33やアレルゲンに応答して同部位に好酸球を集積させることで、気管支喘息の病態に関与することが示唆された。一方、腸管の原始IL-5産生細胞は、腸管の恒常性維持に重要なIgAの産生に貢献する可能性を見出した。また、大腸の原始IL-5産生細胞がT細胞非依存的なIgA産生を制御することが示唆された。本研究では、肺や腸管に局在し恒常的にIL-5を産生する原始IL-5産生細胞の性状と機能を詳細に解析し、自然免疫で作動するナチュラルヘルパー細胞との異同、肺・腸管における免疫・炎症調節及びTh2型の自然免疫と獲得免疫における役割を明らかにすることを目的とした。平成24年度は、(1)原始IL-5産生細胞の同定と活性化機構の解析、(2)原始IL-5産生細胞による免疫・炎症調節とその制御、に関する研究を行った。(1)我々が作成したIL-5/Venusノックインマウスを用い、原始IL-5産生細胞とナチュラルヘルパー細胞との比較検討を行った。肺及び腸管粘膜固有層の原始IL-5産生細胞の細胞表面マーカーはナチュラルヘルパー細胞のそれと類似していた。続いてアレルギー反応を惹起するとされるIL-25とIL-33を投与し、肺・腸管での原始IL-5産生細胞を観察した。IL-25の投与で約2倍、IL-33の投与で約10倍に原始IL-5産生細胞数が増加していた。ナチュラルヘルパー細胞はIL-25への応答性が認められないとされており、サイトカインに対する反応性が異なる可能性を見出した。(2)メラノーマ細胞の肺転移モデルを用い、原始IL-5産生細胞の抗腫瘍免疫に係わる役割を検討した。IL-5もしくはIL-5レセプターを欠損したマウスでは、メラノーマ細胞移入後14日目の肺転移が増悪していた。原始IL-5産生細胞はメラノーマ細胞移入後3日目の早期の段階で23倍に増加し、その後徐々に減少していった。抗腫瘍効果が知られIL-5に応答する好酸球も同様の応答性を示した。このことからメラノーマ細胞の肺転移後、比較的初期に原始IL-5産生細胞が活性化されIL-5を分泌し、それに好酸球が呼応して集積していると考えられた。この際の原始IL-5産生細胞の活性化にはIL-33が関与している可能性も示した。この新たに証明された抗腫瘍免疫の作用機序は欧米学術誌において報告した。平成25年度は腸管免疫における原始IL-5産生細胞の動態・機能解析を中心に研究を行った。(1)腸管におけるIL-5産生細胞とその制御に関する研究:小腸と大腸では原始IL-5産生細胞の増殖に重要であるIL-25やIL-33に対する応答性が異なっており、小腸の原始IL-5産生細胞はIL-25により高い反応性を示したのに対し、大腸の原始IL-5産生細胞はIL-33に強く応答した。これはIL-33レセプターであるST2の発現量が小腸の原始IL-5産生細胞で低下しているためと考えられた。IL-5産生が腸内細菌によって制御されているかを検討するため、無菌マウスの腸管IL-5産生を調査したところ、その低下が観察された。IL-33の産生量も無菌マウスで有意に減少していた。以上から腸内細菌によってIL-33産生が促され、その結果IL-5の産生が促進していることが示唆された。(2)原始IL-5産生細胞による腸管免疫調節とその制御:IL-33を野生型マウスまたはIL-5欠損マウスに投与し、腸管免疫に与える影響を観察した。野生型マウスでは糞便IgA量が有意に増加していたのに対し、IL-5欠損マウスではその増加は観察されなかった。

IgA産生B細胞は大腸でのみ増加していたため、野生型マウスのIgA量の増加は大腸でIL-33が作用した結果であると推測された。またIgA産生の場の一つとされる大腸孤立リンパ小節では、原始IL-5産生細胞の増殖が確認された。以上からIL-33によるIgA産生の増強は原始IL-5産生細胞を介することが示唆された。(3)原始IL-5産生細胞と慢性炎症の発症:肺における原始IL-5産生細胞の役割を解析した。アレルゲンの一つであるパパインを長期間投与すると喘息様の症状を呈し、原始IL-5産生細胞が顕著に増加した。またIL-5欠損マウスでは肺への好酸球の浸潤が全く見られなかった。以上からパパイン誘導性の喘息には原始IL-5産生細胞が深く関与することが示された。(1)腸管におけるIL-5産生細胞とIgA産生に関する研究IL-33またはLPS投与によって誘導されるIgA産生におけるIL-5産生細胞の役割を検討した。1野生型マウスへのIL-33投与により、IL-5依存的に糞便中IgA産生が増加した。腸管のIL-5産生を担う細胞にはT細胞と原始IL-5産生細胞が知られているため、T細胞欠損マウスを用いて解析を行った。IL-33投与による糞便中IgA産生は、T細胞欠損マウスにおいても観察された。したがって、IL-33によるIgA産生増強は、T細胞非依存的であることが判明した。2T細胞非依存的なIgA産生は孤立リンパ小節で行われる。IL-5/Venusノックインマウスを用いて検討したところ、多数の原始IL-5産生細胞が孤立リンパ小節に存在していた。3IL-33投与により大腸粘膜固有層のB細胞がIL-5依存性に増加していた。このB細胞はIgA産生を担うB細胞であることも確認した。4LPS投与によって誘導される糞便IgA産生におけるIL-33の関与を検討した。LPS投与により、腸管におけるIL-33の増加は認められず、また原始IL-5産生細胞数にも変化を認めなかった。以上の研究成果から、IL-33によって原始IL-5産生細胞が活性化され、孤立リンパ小節における腸管IgA産生が誘導されることが示唆された。(2)腸管におけるIL-5産生細胞と慢性炎症に関する研究デキストラン硫酸ナトリウム(DSS)誘導性大腸炎モデルを用いて、腸管慢性炎症におけるIL-5産生細胞の役割を検討した。1IL-5欠損マウスを用いた実験では、野生型マウスと比べ有意な差は認められなかった。2IL-5/Venusノックインマウスを用いた実験では、DSSの投与により、原始IL-5産生細胞数に大きな変化を認めなかった。3DSSの投与により、野生型マウスの腸管におけるIL-33遺伝子の発現が増加した。以上の実験結果から、DSS誘導性大腸炎モデルの病態には、原始IL-5産生細胞は関与しないことは示唆された。26年度が最終年度であるため、記入しない。免疫学26年度が最終年度であるため、記入しない。研究実施計画に沿って研究を遂行し、欧米論文において報告するに至った。しかしながら、時間を要する研究に関しては予定より進行が遅れているため、次年度に効率的に進めていく。重要事項に関する研究は今のところ順調であるが、詳細な解析に至っていないケースも見られる。以下に平成25年度のそれぞれの研究テーマに関する成果を述べる。(1)腸管におけるIL-5産生細胞とその制御に関する研究:1小腸と大腸に存在する原始IL-