hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
均一相ホウ素-炭素-窒素系ナノチューブの合成と評価

均一相のB-C-N系ナノチューブの合成を目指して、合成における特異性、合成における不純物の影響及び温度の影響を、透過電子顕微鏡(TEM)及び分析電子顕微鏡(EELS)などで研究し、得られた結果を基にナノチューブの生成機構を提案した。本研究で得られた成果は以下のようである。1)プラズマ蒸発法でナノチューブの合成を行うには易蒸発性の出発原料が効率的である。2)生成するナノチューブは、炭素、窒化ホウ素、炭素内包窒化ホウ素ナノチューブの三種類であることをEELS分析で明らかにした。3)ナノチューブの合成におけるニッケル金属の影響について研究し、単層炭素ナノチューブとニッケル内包窒化ホウ素ナノカプセルの優先的な生成を明らかにした。これはニッケルに溶存する炭素、ホウ素、窒素が冷却時に析出することによって生成することを推論した。4)ナノチューブの合成における温度の影響について研究し、ナノチューブは約3000K以上で生成し、ナノカプセルは2500K以上の温度範囲で生成することを明らかにした。5)加熱法によるナノチューブ合成法の可能性を実証した。6)B-C-N系ナノチューブの生成機構を結合エネルギーと炭素と窒化ホウ素の蒸気圧の差から考察し、出発原料とナノチューブの微細構造の類似性から、出発原料の一部を構成するセグメントがナノチューブ生成の前駆体として作用するナノチューブの生成・成長機構を提案した。ナノチューブの生成プロセスは非常に速いため、原料と生成物の情報が得られるものの、中間生成物の情報がない。そのため、その生成機構は億測の域を出るものではない。確度の高い生成機構の構築のためには、中間生成物の情報を、加熱温度と微構造の関係から把握する必要がる。本年度は、B-C-N系ナノチューブの合成における温度と微細構造の関係を調べた。窒素、炭素、ホウ素の三成分からなる固化体を合成した。これを炭素発熱体の電気炉中で所定時間加熱した。加熱温度は1500から2300°Cで、加熱時の雰囲気は窒素である。加熱後の試料をTEM観察した。得られたB-C-N系ナノチューブの微細構造と温度の関係は次ぎのようである。原料固化体は層状構造である。1500°Cから2000°Cで加熱した試料中には楕円状の中空構造体(ナノカプセル)が観察された。2000°C以上になると、ナノカプセルとナノチューブが混在するようになる。そして、2300°C以上の温度でナノチューブが生成するようになる。以上のTEMの観察結果から推定されるナノチューブの成長モデルは次ぎのようである。層状構造の原料が加熱により、先ずナノカプセルに変わる。このナノカプセルが高温で成長し、ナノチューブになる。そして、ナノチューブに至る中間段階で、長軸、短軸が共に成長したナノカプセルが生成する。ナノチューブの成長のためには2300°C以上の温度が必要である。これは、ナノチューブが気相を経由する化学輸送でより生成しやすいことを示唆している。温度をコンピュータシミュレーションし、B一C一N系多孔体試料の温度と生成するナノチューブの関係を調べ、次ぎのような結果を明らかにした。炭素ナノチューブ、BNナノチューブおよび炭素ナノチューブを包埋したBNナノチューブは3000K以上の温度で生成すること、3000K以下の温度ではナノチューブは生成しないこと、ナノカプセルはいずれの温度域でも生成すること、を明らかにした。この実験結果を従来のジュール加熱法で再実験し、温度と生成するナノチューブの関係を確認し、コンピュータシミュレーションによる温度計算がが正しいことを明らかにした。すなわち、炭素とBNナノチューブは3000K以上の温度で生成することを明示した。多孔体の詳細なTEM観察により、ナノカプセルとその前駆体について推論し、多孔体中に存在するミニナノチューブがナノチューブの前駆体になることを明らかにした。

そして、ナノチューブおよびナノカプセルの生成と前駆体の関係から、ナノチューブおよびナノカプセルの生成機構を推論した。また、ナノチューブの生成と不純物の関係についてもしらべ、添加物の種類と量の関係からナノチューブの生成について検討した。その結果、1%以下の比較的微量の不純物がナノチューブの生成を促進することを推定している。ホウ素-炭素-窒素(B-C-N)系ナノチューブをプラズマ蒸発法で合成し透過電子顕微鏡(TEM)・分析電子顕微鏡(EELS)で評価して、合成おける諸問題、温度の影響、添加物の影響、ナノチューブの生成機構などについて検討した。プラズマ蒸発法で得られるナノチューブは、炭素-、窒化ホウ素-、および炭素包埋の窒化ホウ素ナノチューブの3種類であることを、TEMおよびEELSであきらかにした。気相からの凝縮のみならず原料物質の加熱によってもナノチューブを合成しうることを明らかにし、ナノチューブは3000K以上の温度で、ナノカプセルは2500K以上の温度で生成することを示した。B-C-N系均一相ナノチューブは3000K以下の温度で生成することを明らかにした。ナノチューブの合成におけるニッケル添加物の影響について検討し、単層炭素ナノチューブは溶融ニッケルに溶解した炭素の析出によって生成することを示した。また、窒化ホウ素ナノカプセルも単層炭素ナノチューブと同様の方法で生成することを明らかにした。ナノチューブの生成機構について、多孔体の原料物質とナノチューブの構造の類似性から検討し、原料中のセグメントがナノチューブの生成の前駆体となる生成機構および液滴から生成するバルーン状前駆体によるナノチューブの生成機構を提案した。
時間分解超高分解能ナノ計測画像処理システムの開発

本研究では、高解像度で画像をAD変換し、高精度でデジタル画像を制御出来るシステムを構築し、実際の観察でその有用性を確認した。構築したシステムでは、その場観察の画像はすべてデジタルで直接記録し、それをコンピュータ上で1フレーム毎に解析するようにした。これにより記録時やその後の画像処理における画像の劣化やノイズが抑えられた。GaNを用いて、本システムの点分解能とコントラストの確認を行った結果、N原子の非常に弱いコントラストにも関わらず、画像処理により0.113nmの点分解能が必要なGaNの原子像を結像できることが分かった。このシステムを用いた実用材料に対するその場観察実験では、BN膜の特異的力学的挙動の研究や、反応性ぬれ先端の反応相生成機構、窒化ケイ素の破壊現象等を原子レベルで明らかにした。ICP-CVDで作成したtBN膜に対する研究では、電子顕微鏡内のその場観察から、膜に応力を加えても膜は非常に大きく変形するだけで破壊しない、という極めて特異な力学的性質をtBNが有することを明らかにした。また、反応性ぬれへの応用では、ぬれ広がる溶融合金先端で稠密面のlayer by layerの成長様式により反応相が生成しているのを見いだし、また、ぬれ速度の違いによってその成長様式が変化することが明らかになった。他方、セラミックスの粒界破壊機構の解析への応用では、窒化ケイ素の粒界破壊では、破面は粒界層と結品粒の境界を進むことが明らかになり、さらにこれはダングリングボンドの数に関係していることが判明した。粒内破壊においても、ボンドの数が少ない領域をクラックが進行することが分かった。本年度は、一連のその場観察実験のうち、高解像度で画像をAD変換し、高精度でデジタル画像を制御出来るシステムを構築し、実際の観察でその有用性を確認した。観察に用いた試料はBN膜及びGaN膜である。ICP-CVDで作成したBN膜の場合は、一般にaBN、tBN、cBNの3層構造をしていることが知られているが、その予備観察から、tBNは基盤付近で特定の乱れ方をしており、それが膜の成長に従って方位をそろえる構造になっていることが分かった。このtBN膜について応力を加えるその場観察実験をしたところ、非常に大きく変形し、また繰り返し変形に対しても破壊しないことが分かった。ダイヤモンドに次ぐ硬度を持つcBNの下部組織であるtBNがこのような変形能を持っていることは、大きな驚きであり、BN膜の成長機構に新たな知見を加えるものである。これに対し、GaN薄膜の予備観察では、GaNの原子構造を直視できただけでなく、その結晶性を低下させる原因となるInversion domain boundaryが積層欠陥によって終端するという、膜の高品質化に対する重要な結果を得ることができた。この物質を用いて、本システムの点分解能とコントラストの確認を行った結果、N原子の非常に弱いコントラストにも関わらず、画像処理により0.113nmの点分解能が必要なGaNの原子像を結像できることが分かった。昨年度までの研究によりシステム自身のノイズがなく、微妙な階調を再現することが出来る解像度の高い連続的なデジタル記録システムを構築することが出来た。本年度は実際にこのシステムを用いて実用材料に対するその場観察実験を行った。まず、反応性ぬれへの応用では、新たにぬれ広がる溶融合金先端で稠密面のlayer by layerの成長様式により反応相が生成しているのを見いだした。さらにぬれの速度の変化によって成長様式が変化すること、全ての反応相がぬれの先端近傍で連続的に生成する事が明らかになった。

また、基盤の種類によりぬれの形態に大きな差が見られ、反応組織の形成は溶融合金中の構成元素の固溶度、及び実際の局所濃度とぬれ先端の速度等の相互関係により決まってくることが明らかになった。これらは反応性ぬれにおける組織形成の理解に大きな前進をもたらした。他方、セラミックスの粒界破壊機構を明らかにするための電子顕微鏡内破壊実験解析への応用も試みた。本装置及びピエゾ引っ張り試験電子顕微鏡ホルダーを用いることによって、破面を大気にさらすことなく、原子レベルで正確なクラックパスを同定することが可能になった。本研究の結果、窒化ケイ素の粒界破壊では、破面は粒界層と結晶粒の境界を進むことが明らかになり、さらにこれはダングリングボンドの数に関係していることが判明した。粒内破壊においても、ボンドの数が少ない領域をクラックが進行することが分かった。
修飾を受けたDNAの切断に関する研究

抗癌剤によるDNAの酸化的損傷の一つであるデオキシリボースC4'位酸化により生じる修飾DNAの反応性、特にアミン、金属イオンによる切断とその反応機構を検討するため、種々のヌクレオチド誘導体を合成し、反応性を検討することにより修飾DNAのアミンによる解裂の反応機構を提案した。1)修飾DNA、すなわちC4'酸化ヌクレオチド(1)の前駆体としてC4'位にフェニルセレニル基を導入したヌクレオシド誘導体(2)を合成し、その反応性を検討した。その結果NBSとの反応により2はC4'酸化ヌクレオチドを再生し、前駆体として適当であることが判明した。2)修飾DNAのアミンとの反応においてその分解過程で生じると考えられるヌクレオチド誘導体(3)を合成し、そのアミンとの反応を検討した。その結果、3はアミンと反応し、3'phosphate構造を有するヌクレオチド断片を遊離すると同時にラクタム体を生成をすることを見いだした。この反応は中性、弱酸性条件下でも進行し、ヌクレオチド断片、ラクタム体を高収率(80%)で与えた。この実験結果をもとに3とアミンとの反応によるヌクレオチド断片およびラクタム体の生成機構を示し、修飾DNAのアミンとの反応による解裂、ラクタム体生成の可能性を示唆した。3)C4'フェニルセレニルヌクレオチド誘導体(4)より調製したC4'酸化ヌクレオチド(1)とアミンとの反応を行い、ラクタム体が40%程度の収率で得られた。この結果から修飾DNAがアミンとの反応により、5員環アミンの生成、脱離反応を経てDNA鎖解裂、ラクタム体生成を起こす反応経路を提案した。種々の抗ガン剤はDNAの酸化的開裂によりその活性を発現するが、酸化的修飾の一つの様式であるC4'位水酸化体より生成する修飾DNAのアミン、または金属イオンによる解裂を検討するため、モデル化合物としてC'4位にヘテロ原子、フェニンセレノ基及びメトキシ基を持つヌクレオシドの合成と反応性を検討した。4'-フェニルセレノ体の合成は、2-デオキシアデノシンより得られる3'アセチル-2'-デオキシ-N,N-ジベンゾイルアデノシンの5'位の水酸基を酸化して得られるアルデヒド体をセレノ化し、引き続きアルデヒドを還元することにより、α体,β体をそれぞれ約1対3の比率で得た。またC'4位にメトキシ基を有するヌクレオシドはチミジンより4行程で合成し、α体,β体の混合物として得た。合成したヌクレオシドのうち4'-メトキシ体については、酸加水分解によるC4'位水酸化体への変換を検討した。α体,β体の混合物を重水中オキザリルクロリドと処理を行ったが、目的とするC4'位水酸化体への変換は起こらなかった。4'-フェニルセレノ体に関しては、α体,β体をそれぞれメタノール溶液とし氷浴中過酸化水素と処理したところ、原料が消失し、アデニンが遊離することがTLCで確認された。4'-フェニルセレノ体からのアデニンの遊離は、過酸化水素によるフェニルセレノ基の酸化、オキソニウムイオンの生成を伴う脱離、C4'位水酸化体の生成、アデニンの脱離という一連の反応経路を経由していると考えられる。4'-フェニルセレノ体からアデニン脱離後のabasicな部分の構造確認は現在検討中である。DNAの酸化的修飾はブレオマイシン等いくつかの抗がん剤が活性を発現する重要な機構である。そのDNAの酸化的修飾の一つの様式であるC4′位水酸化より生成する修飾DNA(alkali labile lesion)の解裂、特にアミン、また金属イオンによる解裂を検討するため合成的に不安定な修飾DNA(alkali labile lesion)の安定な前駆体としてC4′位にフェニルセレニル基を有するヌクレオシドを合成し、その修飾DNA(alkali labile lesion)への変換を試みた。

3′,5′-ジベンゾイル-2′-デオキシ-4′-フェニルセレノアデノシンを過酸化水素で処理したところセレンの酸化によりシス脱離が進行し、エキソオレフィン体とエンドオレフィン体が生成し、目的とする化合物は得られなかった。つぎにNBSによる反応を検討したところアデニンが遊離することがNMRより確認された。また糖部からは1,3-ジベンゾキシ-4-オキソペンタナ-ルが生成したと思われたが、この化合物は不安定であり完全に精製することはできなかった。そこでNaBH_4で還元したところ3,5-ジベンゾイルペンチトールとして単離することができた。この反応はフェニルセレノ基のブロム化、脱離に伴うオキソニウムイオンの生成、C4′位水酸化体の生成、アデニンの脱離という一連の反応経路を経由していると考えられる。これにより2′-デオキシ-4′-フェニルセレノアデノシンを短いヌクレオチドに組み込みalkali labile lesionの解裂機構の検討が可能となった。現在2′-デオキシ-4′-フェニルセレノアデノシンを組み込んだヌクレオチドの合成を検討している。DNAのC4′位水酸化体より生成する修飾DNA(1)とアミンとの反応によるDNA鎖の解裂機構を解明するため種々のヌクレオチド誘導体を合成し、アミンとの反応を検討した。まずアミンとの反応過程で1より生じると予想される3′末端に2,5-ジヒドロキシ2,5-ジヒドロフルフリル基を有するジヌクレオチド誘導体(2)を用いて種々の条件下アミンとの反応を行った。アミン水溶液(pH12)との反応では5′末端リン酸エステル部分の脱離が室温で速やかに進行した。中性、弱酸性(pH5)条件下ではリン酸エステル部分の脱離に伴い、ラクタム体が80%程度の収率で生成することを見いだした。次に修飾DNA(1)とアミンとの反応性を検討した、C4′位をフェニルセレニル化した2′-デオキシアデノシン誘導体(3)を合成し、3′,5′位水酸基をメチルリン酸化した。これをNBSと処理し、C4′位置換基の水酸基への変換、アデニンの脱離により、1の部分構造である3′,5′位水酸基をリン酸エステル化した1,4-ジヒドロキシ2-デオキシリボースを調製した。ひきつづきpHを8付近に調製したアミン水溶液と反応させたところラクタム体が40%程度の収率で得られた。この結果から1はアミンと反応しラクタムを形成しながら3′,5′末端のリン酸エステル部分を脱離することによりDNA鎖を解裂するという、1のアミンとの反応によるDNA鎖の解裂における主要な1経路を示した。修飾DNA(1)の金属イオンによる切断に関してはまず2を用いてYbCl_3,CeCl_3との反応を検討したが、現在のところ解裂には成功していない。
大型宇宙システム用排熱器「液滴ラジエータ」の排熱特性の解明

宇宙太陽発電システムなどの大型宇宙システムの廃熱問題を解決する候補の一つが液滴ラジエータである.液滴ラジエータの設計には,液滴流で形成される放熱面の実効放射率のデータが必須である.本研究では,実験とモンテカルロ法を用いた数値解析により,実効放射率を取得する手法を確立した.この手法から,液滴直径と液滴間隔を変えた3種類の単一液滴流(液滴直径:0.118, 0.106, 0.090 mm,液滴間隔:0.630, 0.435, 0.212 mm)の実効放射率が,0.073, 0.087, 0.12であることが分った.宇宙太陽発電システムなどの大型宇宙システムの廃熱問題を解決する候補の一つが液滴ラジエータである.液滴ラジエータの設計には,液滴流で形成される放熱面の実効放射率のデータが必須である.本研究では,実験とモンテカルロ法を用いた数値解析により,実効放射率を取得する手法を確立した.この手法から,液滴直径と液滴間隔を変えた3種類の単一液滴流(液滴直径:0.118, 0.106, 0.090 mm,液滴間隔:0.630, 0.435, 0.212 mm)の実効放射率が,0.073, 0.087, 0.12であることが分った.平成24年度は,「排熱量測定装置」の作成と「単一液滴流からの排熱を解析するプログラム」を作成を行った。本研究の目的は,大型宇宙システム用排熱器「液滴ラジエータ」の排熱特性の取得を行うことである.実験より排熱量を測定し,排熱量からモンテカルロ法を用いた数値解析(逆解析)により液滴の放射率,反射率を逆算し,得られた液滴の放射率,反射率から,モンテカルロ法を用いた数値解析(順解析)により,排熱量に及ぼす作動流体の温度,液滴流の光学厚さ,液滴流の収束角度の影響を明らかにすることを目指している.作成した「排熱量測定装置」によって、液滴ラジエータの排熱特性を実験によって取得することが可能になった.また,作成した「単一液滴流からの排熱を解析するプログラム」により,実験によって得られた排熱量と等しくなる液滴の放射率,反射率を逆算すること(逆解析)と,逆解析から得られた放射率、反射率を用いて排熱量に及ぼす作動流体の温度,液滴流の光学厚さ,液滴流の収束角度の影響を明らかにすること(順解析)が可能になった.一方,平成24年度に実施を予定していた「単一液滴流の排熱量測定」と「液滴からの放射率,反射率,透過率の解析」は,「単一液滴流からの排熱を解析するプログラム」の作成が遅れたことにより,「排熱量測定装置」の作成も遅れ,平成24年度中に実施することが出来なかった.平成25年度の4月6月に実施することにする.本年度の研究実施計画に上げていた「単一液滴流の排熱量測定」と「液滴の放射率、反射率、透過率の解析(逆解析)」を行った。液滴直径と液滴間隔を変えた3パターン(液滴直径:0.118, 0.106, 0.0903 mm,液滴間隔:0.630, 0.435, 0.212 mm)について、「単一液滴流の排熱量測定」実験を行い、排熱量は0.600.75 W/m2である事が分かった。この排熱量と等しくなる液滴の放射率(吸収率)は「液滴の放射率、反射率、透過率の解析(逆解析)」より、0.70である事を明らかにした。放射率を0.70とした時の測定値と解析値の差は,最大6.6 %で良い一致を示した。本研究は、宇宙太陽発電システム,月基地など1 MW以上の電力や熱を取り扱う大型宇宙システムで課題となっている大量の廃熱を処理できる排熱システム「液滴ラジエータ」の実現を目指している。「液滴ラジエータ」の排熱特性を明らかにし,取得した放熱特性を基に宇宙空間での実証試験用の液滴ラジエータを設計・製造し,長時間の実証試験を行った後,最終的に大型宇宙システム用の排熱システムとして実用化することが研究の全体構想である.上記の成果は、「液滴ラジエータ」の排熱特性を単一液滴流に対し、明らかにしたものであり、宇宙空間での実証試験用の液滴ラジエータを設計に道を開くものであり、意義は大きい。また、測定しにくい液体の、しかも液滴の放射率を明らかにする手法を構築したという観点からも意義深い。これらの成果を当初の計画通り関連学会にて発表した。一方、当初の計画していた「平行液滴流の排熱量測定実験」と「モンテカルロ法を用いた数値解析(順解析)」については行う事が出来なかった。次年度に行う予定である。平行液滴流に対し、モンテカルロ法を用いた数値解析(順解析)プログラムを作成し、液滴の中心間距離(ピッチ)に対する放射量の変化を解析した。平行液滴流の幅を50 mm、厚みを10 mmに固定して、ピッチを0.5 mmから2.0 mmまで0.5 mm刻みで変化させた。作動流体は、シリコンオイルとした。

解析の結果、全てのピッチにおいて、単位質量あたりの排熱量が、従来の固体放熱板型ラジエータの2.0 W/kgを超えることが分った。この結果から宇宙太陽発電システムや月基地など大量の電力や熱(1 MW以上)を取り扱う大型宇宙システムで、液滴ラジエータは従来の固体放熱板型ラジエータよりも軽くなり、地上からの輸送の観点で優位性が高いと言える。また、本解析により、平行液滴流の各ピッチにおける実効放射率を取得することに成功した。実効放射率は液滴ラジエータを設計する上で必須のパラメータである。特に、ピッチが0.5 mmの場合、平行液滴流からの実効放射率は0.76となり、前年の数値解析と実験で明らかにできたシリコンオイル液滴自身の放射率0.70よりも高くなることが分った。この現象は、液滴が密集することにより、液滴から液滴流の厚み方向内側に射出された放射が、内側の液滴に反射して、液滴流の外側に出てくるためであることが特定された。この結果は、放射率の低い作動流体でも、ピッチを小さくし、密集させることで、実効放射率を上げることを意味し、液滴ラジエータに使用することができる作動流体の種類を広げることができるため、大変重要な結果である。26年度が最終年度であるため、記入しない。宇宙工学26年度が最終年度であるため、記入しない。平成24年度に実施を予定していた「単一液滴流の排熱量測定」と「液滴からの放射率,反射率,透過率の解析」を平成24年度中に実施することが出来ず、平成25年度の4月6月に行うことにしたため今年度実施する計画にしていた「平行液滴流の排熱量測定実験」と「モンテカルロ法を用いた数値解析(順解析)」については実施する事が出来なかったので、上記の達成度といたしました。本年度、実施することが出来なかった「単一液滴流の排熱量測定」と「液滴からの放射率,反射率,透過率の解析」を平成25年度の4月6月に行い,その後,平成25年度の研究計画を当初の計画通りに,進める予定である.今年度、実施することが出来なかった「平行液滴流の排熱量測定実験」と「モンテカルロ法を用いた数値解析(順解析)」は、来年度実施予定の内容とともに実施することにする。具体的には、本年度完成した「単一液滴流の排熱量測定」実験装置の液滴生成器と液滴生成ノズルを変更する事で、本年度実施予定であった平行液滴流と来年度実施予定の収束液滴流を作成できるので、来年度のみで実施可能であると考えている。直接経費次年度使用額が生じたのは,「単一液滴流の排熱量測定」実験と「液滴からの放射率,反射率,透過率の解析」を平成24年度中に行えなかったためである.平成25年度4月6月に上記実験と解析を行うことで使用し,平成25年度の研究費は平成25年度の研究計画に従って使用する予定である.今年度、実施予定であった「平行液滴流の排熱量測定実験」と「モンテカルロ法を用いた数値解析(順解析)」について、今年度実施する事が出来ず、これら研究項目に必要と見積もっていた予算が未使用であるため。今年度購入を予定していた液滴生成器と平行液滴流用ノズル、および来年度購入予定の収束液滴流用ノズルを購入する。今年度、実施予定で実施できなかった「平行液滴流からの排熱量解析(順解析)」と「収束液滴流の排熱量解析(順解析)」を北海道大学情報基盤センター内の並列計算機を使用して実施する。得られた成果を国内、海外で発表するとともに、査読付きの雑誌論文に投稿する。また、研究成果を広く知っていただくために、Webページを作成する。
PCNAの新規脱ユビキチン酵素群の同定と複製後修復経路の多重制御メカニズム

ヒト損傷トレランス機構には、忠実度が低い損傷乗り越えDNA合成と、忠実度が高い鋳型鎖交換反応を介したtemplate switch経路が存在する。それぞれの経路はPCNAのモノまたはポリユビキチン化によって制御されることから、そのメカニズムは遺伝的安定性の維持にとって極めて重要である。ところがヒト細胞では、ポリユビキチン化PCNAがほとんど検出されないため、その制御機構は不明な点が多い。本研究では、ユビキチン化PCNAを基質とする脱ユビキチン酵素を同定し、PCNAの脱ユビキチンの側面から、ヒトでの損傷トレランス制御機構の解析を行った。ヒト損傷トレランス機構には二つの副経路、忠実度が低い(error-prone)損傷乗り越えDNA合成(translesion DNA synthesis, TLS)と、忠実度が高い(error-free)鋳型鎖交換反応を介したtemplate switch (TS)経路が存在し、PCNAのユビキチン化により制御される。PCNAのモノユビキチン化はTLS(error-prone)を、ポリユビキチン化はTS(error-free)を促進することから、その制御は遺伝的安定性の維持にとって極めて重要である。酵母ではPCNAのモノ/ポリユビキチン化による制御機構の概念が確立しているが、ヒト細胞ではポリユビキチン化がほとんど検出されないため、その制御機構は不明な点が多い。本研究ではこの現状を打破するため、斬新な脱ユビキチン酵素を同定、解析することによって、ヒトでの損傷トレランス制御機構の解明を目指している。本年度は、ユビキチン化PCNAに対する新規脱ユビキチン酵素をHeLa細胞の抽出液中から精製し、質量分析によってその酵素を同定した。本年度は、昨年度に同定した脱ユビキチン酵素をコードする遺伝子をクローニングし、組換えタンパク質の精製法を確立した。複製後修復経路における生理機能を解析するために、これらの遺伝子をsiRNAで抑制した後、PCNAのユビキチン化状態等について解析した。当初の計画通り、ユビキチン化PCNAに対する新規脱ユビキチン酵素をHeLa細胞の抽出液中から精製することに成功した。この実験に伴って予想外の発見があり、その解析のため、当初予定した実験が十分できなかった。生化学本年度に計画した新規脱ユビキチン酵素の同定に関しては、予想外の発見に伴う解析を行ったために、研究の進行が一部停滞した。これに関しては、次年度に行う。それ以外については、これまで通りに研究を推進する。本年度は当初の計画通り、ユビキチン化PCNAに対する新規脱ユビキチン酵素をHeLa細胞の抽出液中から精製することに成功した。ところが、この実験に伴って予想外の発見があり、その解析のため、当初予定した実験を行うことができなかった。この当初予定していた実験は次年度に行うものとし、その分の経費が次年度に繰り越された。本年度に計画した新規脱ユビキチン酵素の同定に関しては、予想外の発見に伴う解析を行ったために、研究の一部を行うことができず、繰越し金が生じた。次年度は、この繰越し金を使って、新規脱ユビキチン酵素の同定についての実験を行う。
ニワトリ性染色体のクロマチン構造と遺伝子機能の解析

ニワトリの性染色体はZW型で雌ヘテロ(ZW)、雄ホモ(ZZ)の構成である。W染色体の約2/3の領域とZ染色体の一端は顕著なヘテロクロマチンを形成する。W染色体上の遺伝子はまだ知られていない。Z染色体上の遺伝子でクローニング、塩基配列決定、局在部位決定がなされたものは研究代表者らが1993年に発表したZOV3,IREBP遺伝子のみである。本研究の概要は以下の通りである。1)Z染色体端部ヘテロクロマチンの構成DNAの性質:雌ニワトリのゲノムライブラリーから約13Kbのインサートを含むpCHZTH8クローンを得た。蛍光in situハイブリダイゼーション(FISH)により、この配列がZ染色体端部のヘテロクロマチンを構成するマクロサテライトDNA配列であることが分かった。この配列の一部にはキジ目に共通のものがあるが、大部分はGallus属(ニワトリ、野鶏)に特異的で、進化上新しく増幅した配列と考えられる。2)Z染色体上の2種の遺伝子の遺伝子機能、染色体上の局在部位、進化上の保存性:ZOV3は卵巣特異的に発現し、cDNA配列から免疫グロブリンスーパーファミリーに属する新規遺伝子であることが明らかになった。IREBPは哺乳類のiron responsive element binding protein(細胞質アコニターゼとして知られていたもの)のホモログである。FISHによりZOV3はZ染色体の短腕中央部、IREBPは長腕のヘテロクロマチン末端に極く近接した部位に局在することが分かった。5つの異なる目(order)にわたる鳥類種で両遺伝子がZ染色体上に保存されていることが雌雄ゲノムDNAのサザンハイブリダイゼーションの結果から示された。3)W染色体中の非反復DNAの検索:レーザーマイクロビームによるダイセクションとシングルユニークプライマーを用いる比較的ランダムなPCR増幅により1本のW染色体由来のゲノムライブラリーを構築し、XhoI、EcoRIファミリー反復配列を含まないクローンを多数取得した。これらの中からCW01,CW02の2クローンを選び、これらをプローブとして雌ニワトリの全ゲノムライブラリーを検索して、それぞれの配列を含む約25kbずつのW染色体非反復DNA領域をカバーするクローン群を得た。1)性染色体のクロマチン構造の研究:ニワトリのW染色体の大部分とZ染色体の一端部は核内で顕著なヘテロクロマチンを形成している。蛍光in situハイブリダイゼーション(FISH)によりW染色体に特異的な反復配列であるXhoI-およびEcoRI-ファミリーがW-へテロクロマチンの主要構成成分であることが分かった。両ファミリー配列は高度湾曲性を示す特殊な高次構造を示すことから、クロマチン構造の特殊性が予想されたが、これらの配列はヌクレオソーム構造を基本としたクロマチンを形成していることが分かった。しかし、ヌクレオソーム間のリンカーDNA鎖長が通常より約20bp長いことが示され、リンカー部分へのタンパク質の結合が示唆された。XhoI-ファミリーの0.7kb反復単位を末端ビオチン化し、ストレプトアビジンを結合した磁気ビーズに固定し、ニワトリのMSB1細胞の核内タンパク質と反応させることにより、同ファミリーDNAに直接またはタンパク質間相互作用で高親和結合する一群のタンパク質を分離した。

2)性染色体の遺伝子機能の研究:レーザービームによるマイクロダイセクションとランダムPCRにより1本のW染色体および1本のZ染色体の端部から多数のゲノムライブラリーを作製した。これらのライブラリーから得られたクローンをさらにプローブとして雌ニワトリのゲノムライブラリーをスクリーニングして、これまでにW染色体の非反復領域中の約50kbの配列とZ染色体端部のヘテロクロマチン領域由来のクローンを取得した。一方、Z染色体上の2種の遺伝子(IREBP,ZOV3)のcDNAクローニングとFISHによる染色体上の局在部位決定を行なった。IREBPは従来細胞質アコニターゼとして知られていたものであり、ZOV3は免疫グロブリンスーパーファミリーに属するが、卵巣特異的に発現する新規の遺伝子であることが分かった。ニワトリの性染色体はZW型で雌ヘテロ(ZW)、雄ホモ(ZZ)の構成である。W染色体の約2/3の領域とZ染色体の一端は顕著なヘテロクロマチンを形成する。W染色体上の遺伝子はまだ見い出されていない。Z染色体上の遺伝子はいくつか知られているが、クローニングと塩基配列決定がなされ、染色体上の局在部位が決定されたものは研究代表者らが1993年に発表したZ0V3,IREBP遺伝子のみである。本年度は以下の研究を進めた。1)Z染色体端部のヘテロクロマチン構成DNA配列のクローニング:レーザーマイクロダイセクションとランダムPCR増幅により1本のZ染色体の端部から作成したゲノムライブラリーから100クローンを選び、混合プローブとしてFISH(蛍光in situハイブリダイゼーション)を行い、Z染色体端部由来のクローンであることを確認した。次に、これらの混合プローブにより雌ニワトリの全ゲノムライブラリーを検索して約13kbのゲノム断片を含むpCHZTH8クローンを得た。このクローンがZ染色体端部のヘテロクロマチン構成DNAであることを有糸分裂期および雌の減数分裂前期の染色体に対するFISHにより示した。2)Z0V3遺伝子の機能解析:cDNA塩基配列からこの遺伝子が免疫グロブリンスーパーファミリーに属することが分かった。この遺伝子のmRNAレベルの発現は卵巣の顆粒膜細胞、きょう膜細胞に特異的である。C末側半分に相当するcDNA配列をマルトース結合タンパク質遺伝子に連結して大腸菌で融合タンパク質として発現、精製し、マウスに免疫してポリクローナル抗体を作成した。Z0V3タンパク質の卵巣組織内局在部位や細胞内局在部位、糖鎖修飾、細胞間認識への関わりの可能性などの解析をこの抗体を用いて開始している。
応用演劇に基づくホームレスの就労自立支援に関する社会心理学的研究

ホームレスの就労自立に必要な4つの社会適応スキル(社交性・機転性・不当受容・不正受容)を測定する尺度SWITCHを開発した。また,就労支援センターの要望を受け,在所者のうち精神科に自閉症スペクトラムの診断を仰いだ方がよい人とその必要のない人を識別するための発達障害1次スクリーニングテストを作成した。フォーラムシアターの技法を基に,ホームレスの社会適応スキルをトレーニングする方法を開発し,実施した。3年間の実践データを元に,プログラムおよび実演するシナリオの改良を図った。最終年度に実施したトレーニングプログラムが,ホームレスの社交性・不当受容・不正受容を改善する効果を持つことが確認された。就労自立センターの入所者に対し,発達障害傾向および心理状態に関する調査および職業適性検査(GATB)を,入所時に実施した。そして,フォーラムシアターの技法を用いたスキルトレーニングを行った。このトレーニングは,劇団員が,対人関係に関わるさまざまな課題を含んだ社会生活におけるシーンを再現して見せるもので,各シーンで観察される様々な行動を演じ,トレーニング対象者に適切な行動とは何かの気づきを与え,考えさせるというものである。はじめに,調査分析については,就労自立センターの入所者の中には,発達障害を持つ入所者も少なからず存在する。彼らが社会人として自立するためには,発達障害に対する医療的ケアが不可欠である。そのため,入所者の中から精神科につなぎ医療的ケアを受けた方がよい人を特定する必要がある。これまでGATBが用いられてきたが,コストの問題からこれにかわるスクリーニング方法が望まれている。そこで,発達障害傾向尺度を開発し,GATBとの関連性について検討を行った。その結果,社会性と推察力が欠如し,敏感・こだわりの薄い人が,能力的に就労に困難さを示した。ADHD傾向の多動性は活動性を,アスペルガー傾向の敏感さ・こだわりの強さは知的作業への適性と結びついていることから,この傾向の高い人は適切な職に就くことでその能力を発揮できるということを示唆している。そして,精神科につなぐ必要があるのは,社交性と知的能力の低い自閉症傾向にある入所者ということが明らかになった。つぎに,トレーニングについては,フォーラムシアターを受講した入所者は,機転が利くようになり,他者の不正についても受容することができるようになった。これらの能力は“大人"として社会に適応するために必要な能力であることから,フォーラムシアターに基づくスキルトレーニングは,不定就労者の就労支援に有効であると考えられる。はじめに、スキルトレーニングについては、2014年度の後半から2015年度の前半までの第1期は4回構成で行った。しかしながら、参加者の出席率が芳しくなかったため、内容の精選と参加者の負担軽減を図った。そして、2015年度後半の第2期は2回構成で行った。その結果、参加者の参加率と満足感が向上した。第1期と第2期の全9回のトレーニングから得た知見を元に、2016年度の第3期に向けて、現在プログラムの改定を図っている。つぎに、質問紙調査については、以下の3つ研究を行い、学会および研究会で発表した。1つ目は、実社会に適応するために必要なスキルの特定と、それらを測定する尺度「SWITCH」の開発である。この発表は、発表した大会の優秀発表賞を受賞した。2つ目は、発達障害傾向(自閉症スペクトラム傾向)に対する精神科の診断を仰ぐ必要がある人を特定するための1次スクリーニングテストの開発である。このテストは、現在我々が研究活動をしている就労自立支援センターにおいてすでに実施されており、センター長から高い評価を受けている。このテストは日本心理学会において公表された。3つ目は、フォーラムシアターによるスキルトレーニングの効果性の検証である。この検証によって、フォーラムシアターは、社会適応の難しいホームレスのスキルを改善するというリメディアル効果を持っていることが明らかになっている。この知見のプロトタイプは研究発表会で公表された。さいごに、インタビューについては、ホームレスに対するフォーラムシアターが、従来演劇の特性と言われていた「共同性」、「客観性」、「虚構性」に加えて、「俯瞰性」、「遊戯性」という2つの特徴を持つことを明らかにした。この知見は、アートマネージメントと文化経済学共催の研究発表会において公表された。トレーニングは当初の予定通りに進行し、来期に向けたプログラムの改善に向けて十分な知見を得ている。また、現在のプロトタイプのトレーニングプログラムでも、ホームレスの個人特性を踏まえることで、従来効果の見えづらいスキルトレーニングの効果を可視化することに成功している。そのため、改善されたプログラムは、より一層の効果を挙げることができると期待される。さらに、研究遂行の過程で必要になった社会適応スキルや、就労自立支援センターから要望のあった自閉症スペクトラム傾向の1次スクリーニングテストの開発など、当初予定していなかった尺度やテストを開発し、それらが一定以上の成果を挙げている。インタビューの検討においても、これまで明らかでなかったフォーラムシアターが持つ利点を特定することに成功している。これは、フォーラムシアターによるホームレスのスキルトレーニングという本計画が、新奇なだけでなく十分な効果性を持つアプローチであることを示すものと考えられる。調査研究により,職場で社交的に振る舞い,機転を利かせて自らの仕事をこなし,自らが不当な扱いを受けたり,他者の不正な行為を目撃したりしても受け取り方を変えることでネガティブな感情にならないようにすることが,ホームレスの社会適応にとって必要であることを明らかにした。また,トレーニングを実施することにより,フォーラムシアターはシナリオの内容に対応したスキルを改善することを明らかにした。

以上の知見を踏まえ,最終年度となる第3期では,社交性,機転性,不当受容,不正受容の4つのスキルに関する問題を含むシナリオに改変した。また,初日に従来型のスキルトレーニング,2日目にフォーラムシアターという構成を改め,両日とも異なるプログラムでフォーラムシアターを行うことにより,職場の問題場面に直面したときに状況を正しく捉え適切な行動を選択する力の定着を図るようにした。その結果,4つの社会適応スキルのうち,社交性は全ての群で向上した。さらに,不当受容と不正受容はこれらのスキルが乏しい群で改善が見られた。機転性については今回のシナリオでは向上させることはできなかったが,2015年度以上のトレーニング効果を得ることができた。また,インタビュー調査から,フォーラムシアターは参加者であるホームレスに第三者の視点を獲得させることが分かった。特に社交性の高い群は「自分が主人公なら・上司なら」と、想像力を働かせながら観劇していた。一方で,参加者の中には芝居に入り込めない人もいた。このような人は,演劇を「子どもだまし」と考え,ばかばかしいものに付き合わせれている心境になっていた。以上,応用演劇の手法は客観的に状況を把握し,適切な行動について考える力を育むものの,演劇に馴染みのない者にとって心理的抵抗が働くことが明らかになった。ホームレスの就労自立に必要な4つの社会適応スキル(社交性・機転性・不当受容・不正受容)を測定する尺度SWITCHを開発した。また,就労支援センターの要望を受け,在所者のうち精神科に自閉症スペクトラムの診断を仰いだ方がよい人とその必要のない人を識別するための発達障害1次スクリーニングテストを作成した。フォーラムシアターの技法を基に,ホームレスの社会適応スキルをトレーニングする方法を開発し,実施した。3年間の実践データを元に,プログラムおよび実演するシナリオの改良を図った。最終年度に実施したトレーニングプログラムが,ホームレスの社交性・不当受容・不正受容を改善する効果を持つことが確認された。ホームレスに対するフォーラムシアターによるスキルトレーニングは,社会適応に必要なスキルを選択的に向上させるということが明らかになった。この結果は,本研究の取り組みがホームレスの就労支援にとって有効であることを示している。さらに,現在のプログラムの問題点と改善点を特定することができた。これらは,研究計画が目的通りの成果を挙げていることを示している。加えて,当初のホームレスに対するスキルトレーニングに関する事項だけでなく,研究を進めていく中で,多くの関連する知見を得ることができた。例えば,ホームレスの就労を妨げている要因には,社会的スキルや発達障害傾向など多くの問題があること,そして,これらの問題に対して,それぞれ適切なケアをする必要があることなどである。この成果は,本研究の更なる発展に寄与するものであると考えられる。
構造学的解析に基づくＬＧＩ１－ＡＤＡＭ２２複合体形成の生理機能の解明

平成30年度の研究計画に従い、これまでに明らかにしたLGI1-ADAM22の詳細な結合様式を基に、種々の脳神経疾患の発症との関連性が報告されているLGI1のファミリータンパク質(LGI2-4)とADAM22の結合特異性の評価を行った。まず、マウス脳組織を利用した免疫沈降実験によって、ADAM22と生理的に結合しうるLGIファミリータンパク質を検証した。その結果、LGI1とLGI4は効率的にADAM22と結合したが、LGI2とLGI3はほとんど結合しないことを見出した。また、in vitroの結合実験によって、ADAM22に対するLGIファミリータンパク質の結合性を比較したところ、同様の結果が得られた。この結合性の違いを構造学的に検証するために、これまでに明らかにしたLGI1の結晶構造を鋳型としたLGIファミリータンパク質の3次元構造予測(ホモロジーモデリング)を行った。モデル構造を精査した結果、LGIファミリーは互いによく似た立体構造を有する一方で、ADAM22との結合面に相当するタンパク質の分子表面には、数アミノ酸残基の違いがあると予想された。そこで、このアミノ酸残基の違いによるADAM22との結合への影響を、ファミリータンパク質の変異体を使った結合実験により検証した。その結果、LGIファミリーの分子表面の僅かなアミノ酸残基の違いが、ADAM22との結合に決定的な違いを与えることを見出した。これらの結果は、LGIファミリータンパク質の生理的な機能の違いが、ADAM22サブファミリータンパク質との結合の違いに依存している可能性を示している。したがって、LGI2とLGI3は他の受容体分子との結合を介して機能する可能性が高いと考えられた。以上の結果は、LGIファミリータンパク質の機能の違いおよび、関連する脳神経疾患の発症機序を理解する上で、重要な基礎資料となると考えられた。平成30年度が最終年度であるため、記入しない。平成29年度の研究計画に従い、構造学的解析に基づくてんかん関連リガンド・受容体LGI1-ADAM22複合体形成の生理機能の解明に向けて、生化学的な手法を軸に検討を行った。はじめに東京大学・深井周也准教授グループとの共同研究により得られたLGI1-ADAM22複合体のX線結晶構造を受け、私は特異性・定量性の高いin vitroの結合実験によって、各タンパク質の結合に関わるアミノ酸残基を決定し、詳細な結合様式を明らかにした。また、ADAM22のサブファミリータンパク質ADAM23が、ADAM22と共通の結合様式でLGI1と相互作用することを明らかにした。次に、結晶構造より示唆された、LGI1-ADAM22複合体がLGI1-LGI1結合を介した4量体(多量体)として機能する可能性に着目し、LGI1変異マウスを利用した検討によりこの可能性を検証した。検討の結果、LGI1-ADAM22/ADAM23複合体はマウス脳内で多量体として機能し、シナプス間を架橋することを明らかにした。また、家族性てんかん患者で報告されたLGI1の変異が、LGI1-LGI1結合不全を引き起こし、多量体形成を破綻させることで、てんかんを引き起こすことを明らかにした。本研究成果は以下の3点に要約される。1.これまで明らかにされていなかったLGI1-ADAM22/ADAM23の詳細な結合様式を明らかにした。2.LGI1-ADAM22/ADAM23高次複合体がシナプス間を架橋することで機能することを見出した。3.高次複合体形成の破綻、つまりシナプスの架橋不全は、既知のLGI1変異を原因としたてんかん発症機序に加えて、新たなてんかん発症機序であった。本年度、てんかん関連リガンド・受容体LGI1-ADAM22の結合様式を決定し、その生理的役割を明らかにすることを目的として以下の検討を行った。はじめに、東京大学・深井周也博士との共同研究により明らかとなったLGI1-ADAM22複合体のX線結晶構造を基に、それぞれのタンパク質の相互作用面における、結合に寄与するアミノ酸残基を決定した。本検討により、LGI1-ADAM22の結合における疎水性相互作用の重要性を見出した。また、ADAM22のサブファミリータンパク質ADAM23との結合に関して、LGI1-ADAM22とLGI1-ADAM23間の相互作用面は互いに保存されていることが明らかとなった。次に、得られた結晶構造中のLGI1-ADAM22複合体は、1:1のLGI1-ADAM22複合体が、LGI1-LGI1相互作用を介して結合した、2:2の複合体(ヘテロ4量体)であることに着目した。結晶構造中のLGI1-LGI1相互作用に関わるアミノ酸残基の一部が、家族性のてんかん患者で報告されたLGI1変異のアミノ酸残基と一致していた。そこで、この変異LGI1(R474Q)を持つヒトてんかんモデルマウスを用い、マウス脳におけるLGI1-ADAM22/ADAM23高次複合体形成の意義を検証した。検討の結果、野生型マウス脳内では、LGI1-ADAM22/ADAM23高次複合体がシナプスを架橋することで機能することを明らかにした。同時に、てんかんモデルマウス脳では、LGI1-LGI1結合が低下し、高次複合体形成によるシナプス間の架橋が阻害されることで、致死的なてんかんを誘発することが明らかとなった。

X線結晶構造から見出されたLGI1-ADAM22高次複合体形成が生理的な機能を有し、高次複合体形成の破綻がてんかんを誘発することをin vivoの実験で検証できた点は、当初の予想以上の成果であった。平成30年度の研究計画に従い、これまでに明らかにしたLGI1-ADAM22の詳細な結合様式を基に、種々の脳神経疾患の発症との関連性が報告されているLGI1のファミリータンパク質(LGI2-4)とADAM22の結合特異性の評価を行った。まず、マウス脳組織を利用した免疫沈降実験によって、ADAM22と生理的に結合しうるLGIファミリータンパク質を検証した。その結果、LGI1とLGI4は効率的にADAM22と結合したが、LGI2とLGI3はほとんど結合しないことを見出した。また、in vitroの結合実験によって、ADAM22に対するLGIファミリータンパク質の結合性を比較したところ、同様の結果が得られた。この結合性の違いを構造学的に検証するために、これまでに明らかにしたLGI1の結晶構造を鋳型としたLGIファミリータンパク質の3次元構造予測(ホモロジーモデリング)を行った。モデル構造を精査した結果、LGIファミリーは互いによく似た立体構造を有する一方で、ADAM22との結合面に相当するタンパク質の分子表面には、数アミノ酸残基の違いがあると予想された。そこで、このアミノ酸残基の違いによるADAM22との結合への影響を、ファミリータンパク質の変異体を使った結合実験により検証した。その結果、LGIファミリーの分子表面の僅かなアミノ酸残基の違いが、ADAM22との結合に決定的な違いを与えることを見出した。これらの結果は、LGIファミリータンパク質の生理的な機能の違いが、ADAM22サブファミリータンパク質との結合の違いに依存している可能性を示している。したがって、LGI2とLGI3は他の受容体分子との結合を介して機能する可能性が高いと考えられた。以上の結果は、LGIファミリータンパク質の機能の違いおよび、関連する脳神経疾患の発症機序を理解する上で、重要な基礎資料となると考えられた。これまでの研究で明らかとなったLGI1-ADAM22の詳細な結合様式を基に、種々の脳神経疾患の発症との関連性が報告されているLGI1のファミリータンパク質(LGI2-4)とADAM22の結合特異性の評価を行う予定である。過去に、LGIファミリータンパク質はいずれもADAM22と結合することが報告されているが、報告ごとに異なる実験系で結合評価が行われており、ADAM22との結合を同一の実験系内で比較した報告は無い。そこではじめに、野生型マウス脳を利用した生化学的な手法によって、ADAM22と生理的に結合しうるLGIファミリータンパク質を検証するとともに、in vitroの結合実験によってLGIファミリー間のADAM22との結合能の違いを比較する。次に、LGIファミリー間で結合に違いが見出された場合、その原因を構造学的な予測を基に検証する。具体的には、これまでの研究で得られたLGI1の結晶構造を鋳型にした、LGIファミリータンパク質の3次元構造予測(ホモロジーモデリング)を行い、ファミリー間に立体構造の違いがあるかを予測する。また、予測されたLGIファミリーの立体構造とADAM22の結合面に違い(ポケットの構造及び、アミノ酸残基の疎水性、電荷等)があるかを精査する。
小児期被ばくにおける発がん起源細胞の同定とがん化に重要なシグナル伝達系の探索

子どもは大人に比べ放射線による発がんリスクが高いと言われているが、このリスク評価を行うための基礎データは充分に蓄積されていない。これまでに、ヒト急性リンパ性白血病のモデルであるマウス胸腺リンパ腫の発がん実験において、小児期(1週齢)にガンマ線(4Gy)を一回全身照射すると、成体期(7週齢)に比べて発生率が増加することがわかった。本研究では、なぜ小児期に被ばくすると胸腺はがん化するのか、その原因を明らかにするため、1照射直後の応答と2胸腺が腫大する過程に焦点をあて実験を行った。実験1では、照射後の胸腺の回復に伴う細胞増殖・細胞死に着目し、照射後に分化・増殖が盛んな分化段階の細胞(サブタイプ)を特定し、がん化へ発展する細胞増殖メカニズムを推定する。実験2では、前がん状態から胸腺の腫大に至るまでを経時的に解析し、がんの発生に重要なメカニズムを明らかにする事を目的とした。以上の方法により、照射後の胸線細胞再生過程では、初期分化過程であるDN細胞が最初に増加し、特に1週齢被ばくでは7週齢被ばくに比べて、分化・増殖が活発であることが明らかになった。
脳内環境を制御する神経幹細胞の恒常性変化

脂質代謝酵素の機能欠失型変異体の機能解析を行うことで、神経幹細胞の可塑性を制御する分子基盤の構築を目指した。今年度は、変異体において神経幹細胞の細胞非自律的な細胞死を誘導するための原因となる細胞の特定に成功した。また、ショウジョウバエ脳の凍結切片を作成し、質量分析を用いて脳内のエネルギー代謝状況を解析した。その結果、原因となっているサブタイプの神経細胞内で産生されている物質のプロファイリングに定量に成功した。興味深いことに、今回我々が着目した物質は、変異体脳でより多く産生されていた。従って、変異体脳はある種の「過剰発火状態」にあると考えられる。質量分析法を用いて個体そのもののlysateについても解析を行った結果、同様に、この物質は変異体でより多く産生されていた。さらに、ショウジョウバエ脳を酵素処理することで神経幹細胞を単離し、初代培養する実験系を構築して解析を行った結果、上記で特定した物質が神経幹細胞の活性制御に必要である事を裏付ける結果を得た。神経幹細胞死及び個体の致死性は、原因遺伝子を神経特異的に強制発現させることで抑制することができる。同様に、変異体で観察される一連の表現型は原因遺伝子のヒトオルソログを強制発現することでも抑制できる事も見出した。従って、分子機構の多くは進化的に保存されていると考えられる。従って、本研究で解明した一連の分子基盤は、神経変性疾患の分子標的を構築する上で前衛的な知見を与え得るものであると考えられる。27年度が最終年度であるため、記入しない。神経幹細胞の可塑性に影響を与える遺伝子変異について解析を進めている。我々は、ある脂質代謝酵素の変異によって、発生過程の神経幹細胞が選択的かつ劇的に細胞死を引き起こす事を見出した。この細胞死が誘導されるタイミングを特定するために、個体発生に従った解析を行った結果、胚期及び孵化後しばらくは表現型が認められないのに対して、孵化後12時間程度から急激に観察される事を見出した。この発生時期は休止していた神経幹細胞が再活性化する時期と一致する。従って、細胞死と再活性化の関連についてさらに解析を進めた。その結果、変異体の神経幹細胞にインスリン受容体のドミナントネガティブ体を強制的に発現させた場合、及び、変異体の脂肪細胞表面のアミノ酸トランスポーターの発現を抑制した際に細胞死がほぼ完全に抑制できることを見出した。これらの遺伝学的な操作はいずれも神経幹細胞の再活性化を抑制するために用いられる手法である。さらに、ショウジョウバエの実験に用いる餌の中から酵母を完全に除き、体循環するアミノ酸濃度の上昇を抑制した場合においても、細胞死は顕著に抑制できた。以上の結果から、本変異体では神経幹細胞の再活性化に依存して細胞死が誘導されていると考えられる。また、変異体の個体レベルでの毒性を解析した結果、孵化後24時間程度から野生型と比較して個体の発育が低下した。また、孵化後24時間程度まではほぼ全ての個体が生存したが、その後、急激に生存率が低下し、孵化後72時間程度で致死となる事を見出した。これらの結果から、神経幹細胞の再活性化の異常と個体の致死性の間に相関性があることが示唆される。一部の実験において当初の予定と異なる結果を得たため計画を変更した。その結果、研究費は一部を次年度に繰越たが、予定した実験は概ね遂行できたため。研究実績の概要で示した表現型の原因となっている組織(または細胞種)を特定し、そのシグナル伝達機構を始めとする分子機構の解明を進める。そのためには、ショウジョウバエを用いた遺伝学的な手法のみならず、複数の生化学的な手法を組み合わせる必要があると考えられる。