hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
bZIP型転写因子RSGとその相互作用因子によるジベレリン内生量制御機構の解析

RSGは、タバコより単離されたbZIP型転写因子であり、ドミナントネガティブ型を発現きせRSGの機能を抑制した形質転換タバコは細胞伸長が阻害され矮化した。形質転換タバコでは、ジベレリン(GA)の内生量が低下しており、これが矮化の主要な原因である事が明らかとなった。RSGは、GAの生合成を制御する転写因子と考えられた。現在までにアラビドピシスにおいて、GA生合成酵素遺伝子は、CPS,KS,KO,KAO,GA 20-oxidase,GA 3β-hydroxylaseの全6つの遺伝子が単離同定されている。RSGの標的遺伝子の候補としてこれら6つのGA生合成遺伝子が考えられた。タバコで単離されている2つのGA生合成遺伝子GA 20-oxidase,GA 3β-hydroxylaseに加え、残りの4つの生合成遺伝子NtCPS,NtKSNtKO,NtKAOを単離し、ドミナントネガティブ型RSGを発現させた形質転換タバコとコントロール植物における発現量をRT-PCRにより比較した。その結果、形質転換タバコにおいて、NtKO遺伝子の発現量が減少している事を明らかにした。さらにNtKOプロモーターを単離し解析を行った結果、RSGは、NtKOプロモーターの少なくとも2箇所の領域に特異的に結合している事が明らかとなった。以上より、NtKO遺伝子がRSGの標的遺伝子である事を同定した。また、GA内生量の低下した植物では、タバコでは、GA 20-oxidase,GA 3β-hydroxylaseの発現量がフィードバック制御により、上昇することが知られているが、ドミナントネガティブ型RSGを発現させた形質転換タバコでは、GA内生量が低下しているにもかかわらずGA 20-oxidase遺伝子の発現量の上昇は認められなかったことから、RSGのフィードバック制御への関与も示唆された。そこで、タバコのGA 20-oxidase遺伝子のプロモーターを単離し解析した結果、GA 20-oxidaseのプロモーターにもRSGが結合することを明らかにした。現在、このRSG結合配列に変異を導入したプロモーターGUSの形質転換体を作製し、この結合配列とGAフィードバック制御への関与を解析している。RSGは、タバコより単離されたbZIP型転写因子であり、ドミナントネガティブ型を発現させRSGの機能を抑制した形質転換タパコは細胞伸長が阻害され矮化した。形質転換タバコでは、ジベレリンの内生量が低下しており、これが矮化の主要な原因である事が明らかとなった。RSGは、ジベレリンの生合成を制御する転写因子と考えられた。現在までにアラビドピシスにおいて、ジベレリン生合成酵素遺伝子は、CPS, KS, ent-kaurene oxidase (KO), ent-kaurenoic acid oxidase (KAO), GA20-oxidase, GA 3β-hydroxylaseの全6つの遺伝子が単離同定されている。RSGの標的遺伝子の候補としてこれら6つのジベレリン生合成遺伝子が考えられた。今年度、申請者は、さらに、タバコで単離されている2つのジベレリン生合成遺伝子GA 20-oxidase, GA3β-hydroxylaseに加え、残りの4つの生合成遺伝子NtCPS, NtKS, NtKO, NtKAOを単離し、ドミナントネガティブ型RSGを発現させた形質転換タバコとコントロール植物における発現量をRT-PCRにより比較した。また、GA内生量の低下した植物では、タバコでは、GA20-oxidase, GA 3β-hydroxylaseの発現量がフィードバック制御により、上昇することが知られているが、ドミナントネガティブ型RSGを発現させた形質転換タバコでは、GA内生量の低下が低下しているにもかかわらずGA 20-oxidase遺伝子の発現量の上昇は認められなかったことから、RSGのフィードバック制御への関与も示唆された。さらにRSGのNtKO及びGA 20-oxidase遺伝子の発現制御機構を調べる為、各遺伝子のプロモーターを単離し解析を行った。その結果、RSGは、NtKOプロモーターの少なくとも2箇所の領域に特異的に結合している事が明らかとなった。以上より、全6つのジベレリン生合成酵素遺伝子において、NtKO遺伝子がRSGの標的遺伝子である事を同定した。

さらにNtKOプロモーターを単離し解析を行った結果、RSGは、NtKOプロモーターの少なくとも2箇所の領域に特異的に結合している事が明らかとなった。以上より、NtKO遺伝子がRSGの標的遺伝子である事を同定した。また、GA内生量の低下した植物では、タバコでは、GA 20-oxidase,GA 3β-hydroxylaseの発現量がフィードバック制御により、上昇することが知られているが、ドミナントネガティブ型RSGを発現させた形質転換タバコでは、GA内生量が低下しているにもかかわらずGA 20-oxidase遺伝子の発現量の上昇は認められなかったことから、RSGのフィードバック制御への関与も示唆された。そこで、タバコのGA 20-oxidase遺伝子のプロモーターを単離し解析した結果、GA 20-oxidaseのプロモーターにもRSGが結合することを明らかにした。現在、このRSG結合配列に変異を導入したプロモーターGUSの形質転換体を作製し、この結合配列とGAフィードバック制御への関与を解析している。
子どものよい動きのとらえ方ー各種スポーツ動作の自動診断システムの開発ー

本研究の目的は,走る,跳ぶ,投げる,打つといった基本的なスポーツ動作に着目し,どのような動作が良い動作かということを多角的に解析できるシステムを開発すること,さらに,それを子どもの動作の診断・評価に応用することである.従来行なわれてきた画像解析に加えて,良い動作を力の発揮からも評価するために,筋電図と床反応の記録を同一時係列でコンピュータに取り込み,処理するシステムを開発した.筋電図記録では,多くの主要な筋から記録を導出しつつ,動作制限を最小限にするためにテレメータ法を導入した.これにより,同時に8ヶ所の筋電図記録を可能にした.また,床反力測定では,各種スポーツ動作が支障な(実施できるよう大型床反力計(60cm×120cm)を導入した.これら運動力学的データを多角的に処理するためには,プログラム作成の容易な汎用型コンピュータが必要であり,これを導入することによって動作の診断・評価がより信憑性の高いものとなった.本システムを自動診断システムへと展用していくためには,診断・評価の指標と基準が必要となる.そのために,子どもの動作への応用に先立ち,本システムを用いて,各種スポーツ動作の熟練者,未熟練者の動作を測定した.測定動作は(1)ゴルフ・スウィング(2)野球の打撃(3)テニスのサービス(4)剣道の面打ちであった.現在,動作解析システムによって得られた各動作データから,良い動作の指標,評価基準を作成中であり,これに61年度実施した子どもの跳動作の資料をあてはめて検討を加えていく予定である.本研究では、子どものよい動きの定量化という観点から、もっとも基本的な動作の1つである跳動作に着目し、練習に伴う改善の様相を検討した。幼児および児童(512才)計237名を対象にし、約2ヶ月間の走幅跳の練習を課し、練習による跳躍距離の変化と動作の改善について検討した。動作分析には、映画分析法を用い、踏切、空中、着地局面における腕、上体、脚などの動作を評価した。練習を行う前の跳躍距離は年齢とともに増加し、その増加は主に体重いいかえれば筋量の増加によることが考えられた。一方、2ヵ月の練習を課すと跳躍距離は7、8歳ごろをピークに40cm近い伸びが認められ、その前後つまり5、6歳あるいは11、12歳ではそれほど大きな伸びは現れなかった。したがって、走幅跳びにおける働きかけの至適時は、男女ともに小学校低学年であるということが示唆された。跳躍距離が助走速度と技術という2因子によって成り立っていると考えると、練習による跳躍距離の増加は技術の改善というよりもむしろ助走速度の増加という因子の方が強かった。しかし、動作それ自体を観察すると、着地動作を除けば著しい改善が認められ、着地動作をさらに指導することで、より一層跳躍距離が向上すると推定された。すなわち、本研究によって、小学校低学年までによい動きを得るための働きかけが必要であり、それを行えば跳躍距離の増大が期待できるという実証が得られ、今後の各種スポーツ動作の自動診断システムの開発にきわめて有用な基礎資料が得られた。本研究の目的は,走る,跳ぶ,投げる,打つといった基本的なスポーツ動作に着目し,どのような動作が良い動作かということを多角的に解析できるシステムを開発すること,さらに,それを子どもの動作の診断・評価に応用することである.従来行なわれてきた画像解析に加えて,良い動作を力の発揮からも評価するために,筋電図と床反応の記録を同一時係列でコンピュータに取り込み,処理するシステムを開発した.筋電図記録では,多くの主要な筋から記録を導出しつつ,動作制限を最小限にするためにテレメータ法を導入した.これにより,同時に8ヶ所の筋電図記録を可能にした.また,床反力測定では,各種スポーツ動作が支障な(実施できるよう大型床反力計(60cm×120cm)を導入した.これら運動力学的データを多角的に処理するためには,プログラム作成の容易な汎用型コンピュータが必要であり,これを導入することによって動作の診断・評価がより信憑性の高いものとなった.本システムを自動診断システムへと展用していくためには,診断・評価の指標と基準が必要となる.そのために,子どもの動作への応用に先立ち,本システムを用いて,各種スポーツ動作の熟練者,未熟練者の動作を測定した.測定動作は(1)ゴルフ・スウィング(2)野球の打撃(3)テニスのサービス(4)剣道の面打ちであった.現在,動作解析システムによって得られた各動作データから,良い動作の指標,評価基準を作成中であり,これに61年度実施した子どもの跳動作の資料をあてはめて検討を加えていく予定である.
Role of T cells during stem cell-driven regeneration: towards design of efficient stem cell-based therapies

翌年度、交付申請を辞退するため、記入しない。
ホルマリン固定材料中の高分子核酸の分取と不死化法の確立

本研究の目的はホルマリン固定材料である病理組織標本を用いて遺伝子診断を行う効率を可能なかぎり向上することにある。そのために我々は高速液体クロマトグラフィー(HPLC)を用いると従来の方法より、より高品質なDNAを抽出できることを証明した(Inadome Y and Noguchi M. Diagn Mol Pathol,2003;12:231-236)。この方法論に則ってホルマリン固定材料からDNAを抽出した場合、従来の抽出法で得られるDNAを用いたB細胞リンパ腫の遺伝子再構成解析などの遺伝子診断の効率が良くなる事を証明出来たが、手術材料等の多量の試料が得られる場合と違って生検材料等試料の量が制限される場合、HPLCを通すと最終的に採取出来るサンプル量が極めて少なく、その後の検索に用いる事ができなかった。そこで生検材料からのDNA抽出法を改良してPK処理後の抽出をより単純化し、より多量のDNAが得られるようにした。このような方法論を用いて1999年から2005年までのリンパ節、あるいはその他の組織から生検された標本97例のイムノグロブリン再構成についてPCR法を用いて検索した。ちなみに増幅する塩基数は250塩基対程度である。その結果、すべての標本でPCRが可能であり、病理組織診断と一致して遺伝子再構成が証明された例は82.5%と高率であった。以上の結果はホルマリン固定材料を用いても至適な方法論でDNAを抽出すればイムノグロブリンの再構成などの遺伝子診断は十分可能であることを示している。今回の研究では残念ながらすべての材料についてHPLCを用いて高品質DNAを抽出することはできなかったが核酸抽出の条件を至適にすれば十分PCRを基本とした遺伝子診断は可能であることが分かった。本課題における研究計画を下記の如く段階的に設定した。1.ホルマリン固定材料より採取したゲノムDNAからの高分子DNAの分離および不死化法の確立。2.点突然変異やLOHの解析を通して不死化DNAの品質の検証。3.分取されたDNAに存在するであろうニック、ギャップの修復についての検討。4.高分子DNAの抽出、不死化についての簡易キットの作製。平成16年度では上記の1.についての検討を行った。ホルマリン固定、パラフィン包埋材料からDNAを抽出し、佐々木らによるPRSG(PCR of randomly sheared genome DNA)法に準拠してDNAの不死化を試みた。同手技の概要を簡単に説明すると(1)DNAの物理的切断(2)BAL31 nucleaseとT4 DNA polymeraseによる平滑末端化(3)ENB adaptorの付加(4)シャトルPCRによるDNAの不死化である。ホルマリン固定材料中のDNAはすでに断片化しているものと考えられたため(1)の過程は行わず抽出したDNAを直接(2)以降の過程に用いた。具体的にはA.ホルマリン固定、パラフィン包埋材料(手術材料)B.ホルマリン固定、パラフィン包埋材料(剖検材料)C.メタノール固定、パラフィン包埋材料(手術材料)の3種類の固定条件、保存条件の異なる材料に対してPRSG法に準拠したDNAの不死化を試みた。シャトルPCR後のPCR産物について電気泳動を行った結果、いずれの材料でも電気泳動上100-1000bpの産物を得ることができ、不死化が技術的に可能であることが確認できた。しかし、不死化できない(電気泳動上PCR産物が確認できない)検体も多く、手技的問題や元来DNAの保存状態の劣悪さが原因である可能性が考えられた。今後、不死化DNAの品質についての検討を行いたい。手術材料、剖検材料で比較的多数の症例数を確保できる悪性リンパ腫(B細胞性)の症例より抽出したDNAについて、PCR法を用いたIgH遺伝子再構成の検索が行えるか否かを品質検証の一手段として検討を進めたい。

今回の研究では残念ながらすべての材料についてHPLCを用いて高品質DNAを抽出することはできなかったが核酸抽出の条件を至適にすれば十分PCRを基本とした遺伝子診断は可能であることが分かった。
ヒト治療薬耐性サルモネラが鶏肉に残存するのはなぜか？原因解明と汚染低減の為の研究

人の重要な治療薬である広域スペクトル・セファロスポリン(ESC)に耐性を示すサルモネラが福岡県内流通の市販鶏肉で急増し、その増加原因が養鶏産業でのセフチオフル使用にあることを明らかにした。しかし、当該薬使用中止後、ESC耐性サルモネラは一時的に減少したが現在も残存している。これまでのところ、ESC耐性サルモネラが残存する理由、それらに汚染された鶏肉の生産地域、ヒトへの感染状況は不明である。本研究は、1ESC耐性サルモネラが鶏肉に残存する理由、2ESC耐性サルモネラ汚染鶏肉の生産地域推定法の検討、3ESC耐性サルモネラの鶏肉を介したヒトへの感染状況を明らかにすることを目的とする。
免疫系レセプターのファージ提示系による高機能化と立体構造解析による機構解明

<背景と目的>免疫系細胞表面に発現する様々なレセプターは細胞間の情報伝達に関与し、様々な疾患に直接結びつくことから、医学的に大変重要である。申請者らは幅広い免疫細胞に見出されてきた免疫レセプター抑制性モチーフ(ITIM)を持つ抑制性免疫レセプタースーパーファミリー(Inhibitory-receptor superfamily,以下IRSと省略する)に着目した。このファミリーの多くは免疫グロブリン(Ig)様ドメインを持ちながら、多様なリガンドを認識するため、レセプターの分子認識を解析するには格好の標的であると考えられる。そこで本研究は、IRSレセプターの高機能化を目指して、ファージ提示系を用いて膨大なライブラリーからリガンドに対する高親和性を示すレセプターを選択し、さらに高親和性のメカニズムをX線結晶構造解析により明らかにすることを目的とした。<検討結果と考察>本年度はIRSファミリーであるKIRについて、ファージ提示系を持ちいた2量体レセプターファージの作製を行ってきたが、現在まで大腸菌の発現系を利用して作製したリガンドMHCとの結合の確認に成功していない。2量体蛋白質を作成し、実際の蛋白質レベルで結合の上昇が見られるかどうか今後確認する予定である。他方、IRSファミリーのFcγRファミリーについては、FcγRファージの作製に取り組んでいるが、現在までFcとの結合は確認できていない。しかし、FcγRに対して結合可能なペプチドをランダムペプチドファージライブラリーを用いて検索中である。これまでにいくつかのFcγRに対して親和性を示すペプチド配列の候補が得られてきている。これらのペプチドの一部を作成したところ、FcγRに対してnative gel上で結合するラとが確認できた。これらを機能構造解析に今後持ち込んで、詳細な分子認識機構を明bかにすると同時に、創薬へと結びつける基盤となるようにする予定である。<検討結果と考察>本年度はIRSファミリーであるKIRについて、ファージ提示系の遺伝子工学的作製(レセプターファージの作製)を行い、現在までタグ及びKIRに対する抗体との結合を確認することができた。しかし、表面プラズマ共鳴によりKIRレセプターファージと大腸菌の発現系を利用して作製したリガンドMHCとの結合を確認を試みたが、現在のところ成功していない。KIR-MHCの相互作用の結合定数があまり高くないことを考慮すれば、検出が難しい実験系となっている可能性が高い。そのため、遺伝子工学的にレセプターの価数を上げる、すなわち2量体化することにより、見かけの結合定数を上げ、ファージの親和性を改良しようと現在試みている。また、同時に2量体蛋白質も作製し、実際の蛋白質レベルで結合の上昇が見られるかどうか確認する予定である。他方、IRSファミリーのFcγRファミリーについては、表面プラズマ共鳴により蛋白質間相互作用の解析を行った(研究発表参照)。このデータを踏まえて、現在FcγRファージの作製に取り組んでいる。
ヒト胎児由来骨芽細胞を素材とした血管周皮細胞への分化誘導と分化関連遺伝子の同定

1これまでの報告により,ヒト正常骨由来骨芽細胞株(SV-HFC)が骨芽細胞としての性質を充分に有していることは明らかである.今回,SV-HFCがペリサイトマーカーを有していることが示された.さらに,ペリサイトマーカーとしての平滑筋アクチンの発現は,デキサメタゾン添加による石灰化同様,TGF-β1あるいはレチノイン酸添加によって抑制された.このことから,SV-HFCにおいては,骨芽細胞への分化とペリサイトへの分化が同じ生化学的メカニズムによって調節されていることが示唆された.また,種々の血管研究におけるペリサイトのソースとしてSV-HFCは有用と考えられた.2モノクローナル抗体3G5は,血管構成細胞のなかではペリサイト特異的で,in vitroでのペリサイトのマーカーとして有用である.本研究では,カルポニン陽性ペリサイトは毛細血管壁に連続性に分布し,3G5陽性ペリサイトは非連続性に分布しており,これはペリサイトのhetercgeneityを示すもので,in vivoでは,ペリサイト一般のマーカーとして,3G5に比ベカルポニンがより優れていると考えられた.3G5陽性ペリサイトが毛細血管の屈曲部および分岐部に多く分布したことは,これらのベリサイトが萌出型の血管新生に関与する可能性を示唆する.ペリサイトのhetercgeneityに基づく機能分担を解明するとすれば,3G5は非常に有用なマーカーと考えられた.1これまでの報告により,ヒト正常骨由来骨芽細胞株(SV-HFC)が骨芽細胞としての性質を充分に有していることは明らかである.今回,SV-HFCがペリサイトマーカーを有していることが示された.さらに,ペリサイトマーカーとしての平滑筋アクチンの発現は,デキサメタゾン添加による石灰化同様,TGF-β1あるいはレチノイン酸添加によって抑制された.このことから,SV-HFCにおいては,骨芽細胞への分化とペリサイトへの分化が同じ生化学的メカニズムによって調節されていることが示唆された.また,種々の血管研究におけるペリサイトのソースとしてSV-HFCは有用と考えられた.2モノクローナル抗体3G5は,血管構成細胞のなかではペリサイト特異的で,in vitroでのペリサイトのマーカーとして有用である.本研究では,カルポニン陽性ペリサイトは毛細血管壁に連続性に分布し,3G5陽性ペリサイトは非連続性に分布しており,これはペリサイトのhetercgeneityを示すもので,in vivoでは,ペリサイト一般のマーカーとして,3G5に比ベカルポニンがより優れていると考えられた.3G5陽性ペリサイトが毛細血管の屈曲部および分岐部に多く分布したことは,これらのベリサイトが萌出型の血管新生に関与する可能性を示唆する.ペリサイトのhetercgeneityに基づく機能分担を解明するとすれば,3G5は非常に有用なマーカーと考えられた.血管周皮細胞のマーカーとして最も重要なのは平滑筋アクチン(SMA)である.種々の正常細胞および腫瘍細胞におけるSMAの発現は,その病態生理と深く関与する.ヒト胎児由来骨芽細胞SV-HFOの骨化誘導能は基底膜物質のラミニンで抑制されるので、SV-HFOにおける骨化誘導を抑制したいくつかの因子が、同時に血管周皮細胞への分化を促進する因子と考え,retinoic acid、DMSO、TGFβ1,collagen、laminin、fibronectin、Matrigel、等,種々の増殖因子および培養基質を用いて平滑筋アクチンやカルポニンの発現を検討中である.さらに次年度は,SAOS-2,OHS-4などのすでに樹立されているヒト由来骨肉腫細胞株を用いて比較検討を加える.また,われわれは,SMAの発現が,消化管間葉系腫瘍(Gastrointestinal stromal tumor,GIST)の悪性度と正の相関を示すことを明らかにした。GISTをパタン認識の視点からクラスター分析することによって得られた腫瘍群は,臨床病理学的事項とよく一致し,かつ,SMAは統計学的な有意差を持って予後予測因子として有用であることがわかった.さらに,SMA陽性腫瘍は高率にc-kit遺伝子の欠損や点突然変異を伴っていた.c-kit遺伝子の異常もまたGISTの予後と相関することが知られているので,SMA発現を介した腫瘍プログレッション可能性やSMAの調節機構にc-kitが関与する可能性を検討中である.1ヒト胎児由来骨芽細胞株(SV-HFO)を用いた血管周皮細胞への分化誘導SV-HFOにおけるα平滑筋アクチン(αSMA)及びカルポニンの発現を検討した.培養開始直後よりαSMA陽性細胞が出現しており,陽性細胞数は培養日数とともに増加した.カルポニン陽性細胞はαSMA陽性細胞より多く,培養開始後4日目でほぼ全ての細胞がカルポニンを発現した.αSMA陽性細胞がより多く認められた培養条件は,α-MEM培養液(>DMEM),低細胞密度培養,グリセロールリン酸添加であった.培養基質としてのファイブロネクチンおよびラミニンは,コラーゲンタイプIと同等の効果にとどまった.TGFβ添加により一過性にαSMA陽性細胞の増加を認めた.TGFβ添加によるαSMA陽性細胞数は培養開始後4日目が最大で,8日目には無添加コントロール群と同程度に減少した.レチノイン酸添加によりαSMA陽性細胞数は抑制された.SV-HFOは,これまで報告された培養血管周皮細胞と良く似たphenotypeを示すことが明らかになった.さらに,スタンダードな培養条件で多くのαSMA/カルポニン陽性細胞が観察されたこと,石灰化を抑制するレチノイン酸が同時にαSMA発現をも抑制したことは重要な知見である.

SV-HFOにおいては,骨芽細胞としての分化機能の発現機構と血管周皮細胞としてのそれとが密接にリンクしている可能性を示唆するからである.培養内皮細胞とのco-cultureを含む基礎的検討を継続中である.2 SV-HFOにおける遺伝子発現プロファイリング(継続中)デキサメタゾン添加前後で,遺伝子の発現パタンの変化をDNAチップにより解析する.骨芽細胞と血管周皮細胞に共通した,あるいはおのおのに固有の遺伝子発現調節機構を抽出するのが目的である.設備等の遅れによって現在なお継続中である.
新たな画像技術を用いた褥婦の体幹筋損傷、体幹筋機能回復過程の解明

妊娠・産褥期の2人に1人は腰痛有訴者であり、特に産後の重度腰痛は育児や次の出産の負担となる。一方、非妊娠・産褥期の腰痛には体幹筋機能、特に深部筋の機能不良に由来した損傷が関連することまでは明らかなものの、褥婦の体幹筋機能と腰痛に関連する因子の特定には至っていない。課題1では体幹筋における機能・形態・材質特性を把握する最新の非侵襲的生体計測手法を用いて褥婦体幹筋の損傷の程度を3特性の観点から定量化し、その変容と相互関係を検証する。課題2では、損傷した体幹筋における回復過程の縦断的評価を通じて、褥婦腰痛における発症メカニズムの明確化と予防の方策を提案する。
大学実験室の特殊性に鑑みた合理的なリスク評価軸の探索

本研究は、大学における研究の本質的な特徴に鑑みた実験室の合理的なリスク評価軸の探索を目的とする。実際の実験室における化学物質の移動や置く場所といったデータ取得から化学物質の流れに関する解析や、実験室の全体を気流解析することによる化学物質の空間的な拡散に関する検討、実際に起きた実験中のトラブル事例の解析を行った。その結果、実験者の行動を含めた化学物質の取扱い方に関する特徴や実験室の気流特性を明らかにし、ガラス器具の払出し簿を活用したトラブル事例解析が実験作業の具体的なリスクを明らかするのに有効であることを示した。これらの知見は、大学の実験研究特有のリスク評価軸の抽出に役立つものとして期待される。本研究では、大学実験室の特殊性に鑑みた合理的なリスク評価軸を探索するために、実験作業および実験環境と、トラブル事例から抽出される発生リスクとの関係を検討することを目的とする。現在までに以下の検討を進めている。学生実験のトラブル事例の解析:実験室における事故は頻度的に少なく、事故の個別性が高いことから、事故事例から事故の確率を算出することは難しい。そこで、実験シナリオや作業内容毎の総作業時間数や従事人数などの情報が高精度で得られる学生実験を対象とし、実験中に補充した器具の記録である払出データを解析した。今回対象とした集団におけるトラブル発生率と事故率の関係は、概ねハインリッヒの法則に従うことや、有機化学、無機化学、物理化学、分析化学といった分野の違いによるトラブル率の差異があったことから、作業内容ごとリスクを評価する必要性があることが示された。共有空間である実験室における化学物質拡散・対流挙動の検討:実験室の空間共有におけるリスク箇所を検討するために、実際の実験室を模擬した1/10スケールの模型を作成し、気流解析を行った。室内にはドラフト給排気と換気扇が一つずつあり、それらの稼働の有無、レイアウトを変更した条件で、部屋全体の気流の変化を解析した。換気扇の給気とドラフトの位置関係により、室内気流が大きく変化する領域が生じ、実験の都合上ドラフト外で発生する有機溶媒蒸気などがある場合については、その配置に実験室気流を考慮する必要性があることが示された。学生実験のトラブル解析については計画通りに進めている。一方で、模型作成に時間を要すると考えたため、H28年度に実施予定であった共有空間である実験室における化学物質拡散・対流挙動の検討を前倒しで検討を開始した。なお、H27年度に実施予定だった実験作業の非定常性を考慮した化学物質の発生確率の定量化や実験者周辺における化学物質拡散・対流挙動についてはH28年度に実施する。学生実験のトラブル事例解析:前年度に引き続き、学生実験の器具の払出簿データをもとにトラブル率と事故率の関係について検討した。有機実験、無機実験、物理化学実験、分析化学実験と実験ごとにトラブル率が異なるため、実験手順書のどこでトラブルが起きているのかについての情報を同時に取得することにより作業内容によるトラブル率の算出が可能であることが示唆された。従って、これらのデータを取得するためにトラブル報告書のフォーマットを作成した。実験室における化学物質の取扱い方解析:実験室における化学物質の流れを追跡するために、RFIDでの検知範囲について検討を行い、検知できない範囲や状況について課題を抽出した。ビデオカメラを用いるなど実際の測定に向けて準備を行った。一方で、化学物質の流れを追跡するためのモデル実験室の候補として、いくつかの実験室を見学し、試薬庫や実験作業の内容について調査、ヒヤリングを行った。共有空間である実験室における化学物質拡散・対流挙動の検討:CFDシミュレーションソフトを用いて、モデル実験室において廃液タンクや実験台での薬品使用を想定して計算を行った。気流の流れを追跡することにより、化学物質の拡散経路については計算的には理解するに至り、実験室の中で人が居やすい場所との関係から暴露リスクについて検討することができた。平成28年6月30日から11月30日まで産休および育休を取得していたため、計画が大幅に変更になった。平成28年度に計画をしていた実験作業の非定常性を考慮した化学物質発生確率の定量化については平成29年度に検討することに変更した。その他の検討項目である、化学物質拡散と対流挙動の検討については、CFDシミュレーションなど計算的検討を進められたが、一方でCFDシミュレーションの結果を考慮して模型での測定を行う予定であったが、模型の細かい改良に時間を要したため平成29年度に測定する予定である。化学物質の取扱い方の解析においては、RFIDの検知範囲についての課題を明確に抽出し、また実際の測定実験室を選定する際のポイントなどの整理を行い、平成29年度に実際の実験室での測定する予定である。産休・育休の取得により、予定が大幅に変更になっているが、研究全体としてはおおむね順調に進展している。平成29年度は以下のように検討を進めた。実験室における化学物質の取扱い方解析:研究実験室に協力をしてもらい、実際の稼働状況の中で化学物質の流れの追跡を試みた。具体的には、RFID(Radio Frequency Identification)機器を実験室内に配置し、実験室内のどこに試薬瓶・洗瓶が置かれたかを測定した。試薬瓶にRFタグを添付し、室内に配置された受信アンテナで電波を受信し、その受信場所から試薬瓶の位置の推定を試みた。

一方で、実験者の移動情報を取得し、試薬瓶の動きと同期して実験者と試薬瓶の関係を検討するために、Beaconを使って実験者の移動情報を取得することを試みた。試薬瓶・洗瓶については、概ね実験室のどこに置いてあるのかについて情報を推定することが可能となった。一方で、動線情報については金属反射によって電波誤読が生じ、位置情報を精度よく推定するには至らず、受信機の設置の仕方にさらなる改善が必要であることが示された。共有空間である実験室における化学物質拡散・対流挙動の検討:フルスケールの1/10サイズの実験室模型を作成し、局所排気装置(ドラフト)と換気扇の稼働条件の違いによる室内気流を解析し、フルスケールの結果と比較した。その結果、渦の生成や生成位置等は1/10模型とフルスケール実験室では同様な傾向を示した。一方で、CFDシミュレーションの結果と前述の実測の結果を比較すると、風の吹き出し口等の比較的風速が速いところはベクトルの向き、速さは一致しているが、渦の生成に関しては異なる傾向を得た。これは、計算による気流の再現では、化学物質拡散を予測することは難しいことを示している。すなわち、本手法による化学物質のリスク低減の検討には、実測による留意点の整理が不可欠であることが示された。本研究は、大学における研究の本質的な特徴に鑑みた実験室の合理的なリスク評価軸の探索を目的とする。実際の実験室における化学物質の移動や置く場所といったデータ取得から化学物質の流れに関する解析や、実験室の全体を気流解析することによる化学物質の空間的な拡散に関する検討、実際に起きた実験中のトラブル事例の解析を行った。その結果、実験者の行動を含めた化学物質の取扱い方に関する特徴や実験室の気流特性を明らかにし、ガラス器具の払出し簿を活用したトラブル事例解析が実験作業の具体的なリスクを明らかするのに有効であることを示した。これらの知見は、大学の実験研究特有のリスク評価軸の抽出に役立つものとして期待される。実験作業の非定常性を考慮した化学物質の発生確率を算出するために、基本的な実験作業を対象に発生点を整理する。これらの条件をCFDシミュレーションに入力し、実験室内の化学物質拡散リスク箇所を検討し、実際の実験室で留意すべき領域を明らかにし、1/10スケールモデルでレイアウトの差異による気流変化の影響を詳細に検討する。実験室における化学物質の取扱い方に関する解析については、室内に置かれている試薬、サンプル、洗瓶等の配置をマッピングした情報と、ビデオカメラによって記録された作業者行動の情報の組合せにより、実験室内で化学物質が置かれる場所の特性を解析し、新たなリスク評価軸を探索する。前年度までに明らかになった学生実験におけるトラブル解析結果から、学生実験の作業内容を詳細に解析することにより、使用する道具、想定される状況からシナリオのどこに逸脱ポイントがあるのかを解析する。平成29年度は、下記の通りに進める予定である。化学物質発生確率の定量化:
中世末期軍記圏の基礎的研究-天草・島原の乱関係軍記を中心として-

主な天草・島原軍記で刊行されているものを中心に30作品の解題、所蔵、内容、特色等について載せ、基礎的研究として今後の研究の積み重ねになるよう配慮した。『天草軍記』(元寛日記抜粋)についての考察、本文の翻刻を行った。本作品は『元寛日記』の抜粋と本文中にも記しているが、実際には『寛明日記』等、他の記録も引用している。江戸初期のこうした日記類(『元寛日記』『寛明日記』等)については、その公式性が指摘されているようだが研究が進んでいないので、いまだ不明な点が多く、今後の新分野として検討課題となる。内閣文庫所蔵の天草・島原の乱関係軍記について主なものの書誌を調査し報告書に載せた。今後、翻刻していく必要があるものが多くある。水野勝成(福山藩十万石)のように戦国時代の生き残り大名が、子、孫を引き連れて参陣し、自分の経験を生かして幕府の上使松平信綱に意見を言う気骨に、中世末期の名残を感じさせる。また、福山藩をはじめ、一揆鎮圧に参加した諸国の大名の多くが新領地の藩兵を動員しての初めての「戦さ」となる。単なる一揆鎮圧ではなく、藩内統制のまたとない機会でもあったといえる。あわせて水野家の軍記の成立事情(後に一時的に断絶)も考察。一般に一揆方に浪人が多く加わっていることが単なる一揆ではなく、本格的な戦闘を要する内乱に発展したことは指摘されているが、鎮圧する側の幕府の側にも多くの浪人が参加し、働きによっては諸藩に召抱えてもらおうとしていた様子も多く伺える。また諸藩の対立もこの戦いに微妙な変化を及ぼしていることが前述の解題でわかった。寺澤家(唐津藩)の天草の富岡城の城代家老、三宅藤兵衛は一般には知られていないが、その出自が明智光秀の孫である。それを意識して華々しく奮戦、討死する作品もある。細川藩主の忠利もまた、明智光秀の孫であり、両者の関係(従兄弟同士)からも三宅記事の強調を図る軍記があっても不自然ではない(藤兵衛の子は後に細川藩に移っている)。戦国軍記の余韻を残している。また寺澤家は『太平記評判(秘伝理尽鈔)』の成立・流布とも深くかかわる家である。島原の乱を契機として、本書が相馬家に貸し出されて書写された事情も推測することができた。『太平記』にも良く出てくる「不思議」の語が、天草・島原の乱関係軍記にもしばしば見られる作品もある。『太平記』を意識して軍記物を製作しようと作者は考えていた可能性がある。近世後期の天草・島原軍記は、たとえば田丸具房物のような読み物的な作品も今後、単なる作り話ではなく、軍記の延長としての位置づけを試みていく余地はある。今後の課題となる。

近世後期の天草・島原軍記は、たとえば田丸具房物のような読み物的な作品も今後、単なる作り話ではなく、軍記の延長としての位置づけを試みていく余地はある。今後の課題となる。1、天草出張調査中に、『水野家島原記』の影印と翻刻が入手された。本作品の概要を兼ねて、「福山藩水野家と「島原の乱」覚え書き-『水野日向守覚書』『水野家島原記』のことなど」(『茨女国文』16号、平成16年3月)という小考を著わすことができた。2、国立公文書館の内閣文庫所蔵の天草・島原の乱関係資料が大量にある(約50作品)ことがわかったので、調査を開始した。『山鳥記』(2種)を閲覧調査し、複写をした。今後の翻刻作業に備えたい。また、研究に重要だと思われる作品も三種複写することができた。あわせて翻刻を期したい。3、基礎的作業として軍記の現状を把握するため、国文学研究資料館を利用。その成果の一部を『文学・語学』178号(平成16年3月)の学会動向(中世・散文)に生かすこともできた。4、国文学研究資料館所蔵のマイクロフィルムを活用して天草・島原の乱関係資料を探ることができた。『国書総目録』にも掲載されないものも多く、内閣文庫と同様、今後も調査していく必要がある。5、翻刻されている天草・島原関係の作品の読み込みを始めた。『末鑑(すえかがみ)』という予言書が多くの作品に共通して乱の前兆として各作品に指摘されている。中世軍記の特徴である予兆記事との関係で注目された。また富岡城代三宅藤兵衛の討ち死に記事、原城一番乗りの状況が諸作品により異なるところがある。諸大名側の視点として注目された。また、購入したパソコンによるインターネットの検索による関係文献資料の検索は有効であった。1、今年度の調査期間中に、『天草軍記』の写本が入手できたが、幕府の公式的記録ともいうべき『徳川実記』に採用されている『元寛日記』の天草・島原の乱の抜き書き的な作品であった。あまり知られていない『元寛日記』の性格も含めた考察が必要だが、一部の成果として「『天草軍記』と『元寛日記』小考」(『茨女国文』17号、平成17年3月)という小論を著わすことができた。2、前年度と引き続き、国立公文書館の内閣文庫所蔵の天草・島原の乱関係資料が大量にある(約50作品)ことがわかったので、調査を継続した。まだ大部なものを含めて約十点調査が残っているので、その調査閲覧作業を今後も続ける必要がある。また、研究に重要だと思われる作品も数種複写することができた。3、佐賀県立図書館蔵の『天草軍記』関係の写本を調査できたが、そのうちの『島原記合戦記』は同名異書(戦国時代の軍記)であった。参考として公表していく必要がある。4、引き続き国文学研究資料館所蔵のマイクロフィルムを活用して天草・島原の乱関係資料を探ることができたが、時間が限られ、現地での現物確認ができなかった。が、内閣文庫と同様、今後も調査していく必要がある。5、熊本県立図書館蔵の天草軍記関係の写本をできる限り閲覧調査し、写真撮影に努めた。なお、科学研究費で購入したデジタルカメラは期待したほど精細に撮れないことがわかり、後に拡大して読みを進めようとしたが、細かい字には限界が生じた。不慣れなこともあるが今後の課題となった。6、天草の本渡合戦での唐津藩の富岡城代である三宅藤兵衛の討ち死にと彼の評価が諸本によって異なることを検討し、戦国軍記の研究会で発表。参考意見も多く出て、今後の収穫となった。
癌抑制遺伝子INPP4Bの欠失を基盤とするメラノーマ発生・進展の分子機構

メラノーマ発生・進展におけるイノシトールリン脂質代謝酵素INPP4Bの生物学的役割を解明するため、メラノサイト特異的にInpp4bを欠失した、Tamoxifen誘導型Braf変異+Ptenホモ+Inpp4bホモ欠損マウスを作成した。本マウスにおいては100%の浸透率でメラノーマの自然発生が観察された。さらに、イノシトールリン脂質代謝が糖代謝と関連していることに着目し、糖代謝阻害薬であるブロモピルビン酸によるメラノーマの増殖抑制を試みた。その結果、ブロモピルビン酸は活性酸素の生成を介して、メラノーマ細胞に細胞死を誘導することが判明した。INPP4BはPI(3,4)P2のイノシトール環水酸基を脱リン酸化しPI(3)P2へ変換する作用を持つイノシトールリン脂質代謝酵素である。PI(3,4)P2がPI(3,4,5)P3と類似の機能を持つことより、INPP4Bは癌抑制遺伝子産物として機能しているものと推定され、最近注目を集めている。そこで、本研究課題では、メラノーマ発生・進展におけるINPP4Bの生物学的役割を解明するため、メラノサイト特異的にInpp4bを欠失した遺伝子改変マウスを用いて、細胞増殖能、アポトーシス抵抗性、各種シグナル伝達分子の相互作用などを解析するとともに、腫瘍の発生頻度や選択的阻害による転移能の抑制効果を検討する。この課題を達成するため、まずDct-CreマウスとInpp4b-flox/floxマウスないしPten-flox/floxマウスを交配して、色素細胞特異的Inpp4bホモ欠損マウス、Ptenホモ欠損マウス、Inpp4bホモ・Ptenホモ欠損マウス作成した。さらに、これらのマウスを用いて、化学発癌処理により色素細胞由来の悪性腫瘍であるメラノーマの発生率を解析した。その結果、これらのマウスでは、色素細胞由来の良性腫瘍である色素細胞母斑は発生したものの、メラノーマへ進展することは無いことが判明した。そのため、これらのマウスを用いた本研究戦略を断念し、あらたにTamoxifen誘導型Tyr-Cre:Braf変異+Pten欠損マウスを用いて、今後の研究を遂行することにした。すでにJackson Laboratoryにマウスを発注したので、Inpp4b-flox/floxマウスないしPten-flox/floxマウスと交配して、Tamoxifen誘導型Inpp4bホモ欠損マウス、Ptenホモ欠損マウス、Inpp4bホモ・Ptenホモ欠損マウス作成する予定である。この課題を達成するため、まずDct-CreマウスとInpp4b-flox/floxマウスないしPten-flox/floxマウスを交配して、色素細胞特異的Inpp4bホモ欠損マウス、Ptenホモ欠損マウス、Inpp4bホモ・Ptenホモ欠損マウスを作成した。しかし、これらのマウスでは、色素細胞由来の良性腫瘍である色素細胞母斑は発生したものの、メラノーマへ進展することは無いことが判明した。すなわち、此のマウスをInpp4b-flox/floxマウスないしPten-flox/floxマウスと交配して、Tamoxifen誘導型Braf変異+Inpp4bホモ欠損マウス、Braf変異+Ptenホモ欠損マウス、Braf変異+Inpp4bホモ・Ptenホモ欠損マウスを作成している。その結果、Tamoxifen誘導型Braf変異+Ptenホモ欠損では、メラノーマの自然発生が確認された。Tamoxifen誘導型Tyr-Cre:Braf変異+Pten欠損マウスを用いて、Inpp4b-flox/floxマウスないしPten-flox/floxマウスと交配して、Tamoxifen誘導型Braf変異+Inpp4bホモ欠損マウス、Braf変異+Ptenホモ欠損マウス、Braf変異+Inpp4bホモ・Ptenホモ欠損マウスを作成中であるが、マウスの繁殖と交配に時間がかかり、十分な個体数が確保できていない。しかし、中間段階にあるマウスが続々と繁殖しているので、近日中に必要な個体数が確保でき、研究計画の良好な進展が得られるものと楽観している。また、此らのマウスに生じたメラノーマに関して、糖代謝の観点から新規治療法を開発することを同時に開始した。すなわち、がん細胞においては糖代謝が亢進していることが知られているので、その選択的阻害を介して、細胞にオートファジーを誘導し、次いでオートファジーを阻害することにより細胞死を惹起することを試みている。

現時点では萌芽段階ではあるが、この戦略によりメラノーマに選択的細胞死を誘導できることが判明した。オートファジーの関連経路の阻害を介して、画期的な癌治療法を開発すべく、新たな準備実験を進行させている。イノシトールリン脂質数々の機能タンパク質の集積、離散、活性を制御しており、PIs代謝酵素の活性が遺伝子変異などにより変調すると、様々な病態が形成されることが報告されている。INPP4BはPI(3,4)P2のイノシトール環水酸基を脱リン酸化しPI(3)P2へ変換する作用を持つイノシトールリン脂質代謝酵素である。PI(3,4)P2がPI(3,4,5)P3と類似の機能を持つことより、INPP4BはPTENと同様に癌抑制遺伝子産物として機能しているものと推定され、最近注目を集めている。そこで、本研究課題では、メラノーマ発生・進展におけるINPP4Bの生物学的役割を解明するため、メラノサイト特異的にInpp4bを欠失した、Tamoxifen誘導型Braf変異+Ptenホモ+Inpp4bホモ欠損マウスを作成した。本マウスにおいては100%の浸透率でメラノーマの自然発生が観察された。さらに、イノシトールリン脂質代謝が糖代謝と関連していることに着目し、糖代謝阻害薬であるブロモピルビン酸によるメラノーマの増殖抑制を試みた。その結果、ブロモピルビン酸は活性酸素の生成を介して、メラノーマ細胞に細胞死(アポトーシス)やコロニー形成の抑制などを誘導することが判明した。興味深いことに、幹細胞の性質を有すると思われるslow-cycling細胞に対しても、ブロモピルビン酸は細胞死を誘導した。すなわち、この所見は抗がん剤耐性を有すると思われるメラノーマ幹細胞に対しても、ブロモピルビン酸が有効であることを示唆しており、臨床的有用性が期待される。今後は上記のTamoxifen誘導型Braf変異+Ptenホモ+Inpp4bホモ欠損マウスを用いて、細胞増殖能、アポトーシス抵抗性、各種シグナル伝達分子の相互作用、腫瘍の発生頻度などに対するブロモピルビン酸の効果を検討する予定である。この研究によって得られる成果は、メラノーマの分子病態の全貌を解明し、かつ新規治療法を模索する上で貴重な知見となるものと確信している。メラノーマ発生・進展におけるイノシトールリン脂質代謝酵素INPP4Bの生物学的役割を解明するため、メラノサイト特異的にInpp4bを欠失した、Tamoxifen誘導型Braf変異+Ptenホモ+Inpp4bホモ欠損マウスを作成した。その結果、ブロモピルビン酸は活性酸素の生成を介して、メラノーマ細胞に細胞死を誘導することが判明した。Dct-CreマウスとInpp4b-flox/floxマウスPten-flox/floxマウスを交配して、色素細胞特異的Inpp4bホモ欠損マウス、Ptenホモ欠損マウス、Inpp4bホモ・Ptenホモ欠損マウスを作成したが、予想された結果は得られなかった。
オンチップ酵素反応解析を可能にする質量分析プレートの開発

・前年度作成したウェルアレイ基盤を質量分析装置へ導入するため、専用のアダプターを作成した。一般的に用いられているレーザー脱離イオン化質量分析装置の分析用プレートでは厚みのある素材または試料を載せることができないため、作成基盤を使用するためにはプレート平面に対して垂直方向の高さの調整が必要である。種々検討の結果、通常の分析平面から掘り下げた形状のアダプターを設計し、アルミニウム削り出しにより作成した。装置導入については装置メーカーが提供しているTLC用フレームを流用することにし、フレームに固定可能なアダプター設計をした。・ポリジメチルシロキサン(PDMS)素材表面の改質法としてスパッタ装置のプラズマ処理またはHF処理による表面の親水化後に、素材上でリパーゼ反応を行ったところ、反応は進行し、親水化素材の方が無処理の素材に比較して反応が早い可能性が示唆された。脂質はPDMSに比較的吸着されやすく、素材表面の疎水性の程度が反応速度に影響することが考えられた。・上記表面改質により親水化および濡れ性は向上し、カーボンナノチューブの分散性も向上するものの、ペプチド試料の吸着および分析感度は低いままであった。親水化処理後のSEM分析を行った結果、表面に細孔の形成が見られる場合もあったが、再現性が得られなかった。時間経過にともなってPDMS表面から脱水することで、疎水的PDMS表面の復元が起こっている可能性を推察している。ウェルアレイ基盤を質量分析装置へ導入する方法の試行と、固定用アダプターの設計・作成に、予想以上に時間を要してしまった。またPDMS素材表面の改質法について期待したような効果が得られていないため、引き続き検討中である。ウェルアレイ基盤上で酵素反応を行い、基盤をアルミニウムアダプターに設置して質量分析を検討する。分析の際の同位体標識標準試料の調製を検討し、場合により試料の合成を行う。ペプチド試料の感度向上を目指して、開発素材表面へのイオン交換置換基の導入を検討する。平成28年度はシリコーンポリマー/カーボンナノチューブ複合素材の表面改質を目的とした素材作製を検討し、化合物吸着や細胞接着を指標とした物性評価を行った。ポリジメチルシロキサン(PDMS)の調製時に主剤と硬化剤の混合比(Rc)が5:110:120:130:1と高くなるに伴いPDMSの貯蔵弾性率が低下することを確認した。Rcを10:1とし、5%10%w/wのオルトケイ酸テトラエチルを混合して複合素材を成形したところ、PDMSと比較して混合素材表面の親水性が向上し、ペプチド溶液浸漬時の吸着量も増加した。また球状シリカゲルを5%10%w/w混合した場合も同様の親水性向上が見られたが、アミノプロピル基を有する添加剤の場合は成形したポリマーの強度が弱く、重合反応時にアミノ基の影響があるものと考えられた。カーボンナノチューブは凝集性が高いため、より均一な複合素材上への分散を目指して多糖類との混合による塗布を検討した。既知法としては水溶性キシランを用いる分散法が知られており、素材表面の改質と合わせて、ポリマー上へのセルロース塗布を行ない、細胞接着を指標として評価した。セルロースナノファイバー(CNF)およびリグノセルロースナノファイバー(L-CNF)をPDMSに塗布して作製した素材表面に血管内皮細胞を播種して細胞培養を実施した。L-CNFを用いた場合において、血管内皮細胞の接着細胞数が増加した。PDMSの混合比や素材の弾性率による接着数への影響は見られなかったことから、素材表面の親水化およびL-CNFのメッシュ状構造体が接着性向上に寄与している可能性が示唆された。対照的に、CNFを用いた場合はプラズマ処理PDMSと同程度の接着数であり、細胞接着においてはL-CNFのほうがより有効であることが明らかになった。当初はポリジメチルシロキサン(PDMS)のプラズマ処理による素材表面の親水化を計画していたが、時間経過と共に表面の親水性が低下する傾向にあり、予定を変更してオルトケイ酸エステルや球状シリカゲルとの混合およびセルロース繊維の塗布を検討した。より安定的に親水性が持続する結果が得られたことで、素材作製の点からは進展があった。しかしながら、素材表面の種々の官能基化やLDI-MS感度の定量的データの取得はこれから行う予定のため、点検評価は「やや遅れている」とした。1.酵素反応のLDI質量分析に向けた、ジメチルシロキサン(PDMS)表面の改質と評価を行った。PDMS素材表面のプラズマ処理またはフッ化水素(HF)水溶液処理により親水性が向上することがわかったが、その後の時間経過に伴って親水性の低下も見られた。またHF処理時にはカーボンナノチューブ分散の向上も見られたが、これは表面のナノ構造の変化によるものと推定している。素材上におけるリパーゼまたはペプチダーゼ反応は可能であるものの、ペプチドに関しては質量分析時の感度が未だ低いため、親水化に続く表面修飾も必要であることが示唆された。また、PDMS表面にセルロースナノファイバー網目構造を形成した複合素材の組成または濡れ性と細胞接着数の関係を調査した。前年度にセルロースよりもリグノセルロースの方が細胞接着性が高いことを報告しているが、素材表面の濡れ性はPDMS作成時の硬化剤割合によって変化し、濡れ性よりもセルロース素材の違いとの関連が見られたことから、リグノセルロースナノファイバーの化学構造もしくはナノ構造に由来して、細胞外マトリックスの接着が向上することが示唆された。

2.開発素材上で多検体のLDI質量分析に対応するため、ウェルアレイ基盤の作成を行った。アルミ製の金型を設計して作製し、PDMS主剤と硬化剤を流入した後で硬化させ、サイズ3mm×3mm×深さ1mmのウェルを5×5個並べたPDMS基盤を形成した。続いてスパッタ装置を使用して各ウェルの境界に金(Au)薄膜でコーティング処理を施すことで、導電性を持たせたウェルアレイを作成することができた。これまでの研究結果から、イオン化のためのカーボンナノチューブ分散と、化合物吸着を目的としたPDMS表面の化学的修飾はそれぞれ異なる要因と推定され、個別に検討する必要が生じた。当初の予定よりも先にウェルアレイの作成を行ったものの、現状では親水化LDI質量分析におけるペプチド分析の感度向上に至っていない点と合わせて、やや遅れとした。・前年度作成したウェルアレイ基盤を質量分析装置へ導入するため、専用のアダプターを作成した。一般的に用いられているレーザー脱離イオン化質量分析装置の分析用プレートでは厚みのある素材または試料を載せることができないため、作成基盤を使用するためにはプレート平面に対して垂直方向の高さの調整が必要である。種々検討の結果、通常の分析平面から掘り下げた形状のアダプターを設計し、アルミニウム削り出しにより作成した。装置導入については装置メーカーが提供しているTLC用フレームを流用することにし、フレームに固定可能なアダプター設計をした。・ポリジメチルシロキサン(PDMS)素材表面の改質法としてスパッタ装置のプラズマ処理またはHF処理による表面の親水化後に、素材上でリパーゼ反応を行ったところ、反応は進行し、親水化素材の方が無処理の素材に比較して反応が早い可能性が示唆された。脂質はPDMSに比較的吸着されやすく、素材表面の疎水性の程度が反応速度に影響することが考えられた。・上記表面改質により親水化および濡れ性は向上し、カーボンナノチューブの分散性も向上するものの、ペプチド試料の吸着および分析感度は低いままであった。親水化処理後のSEM分析を行った結果、表面に細孔の形成が見られる場合もあったが、再現性が得られなかった。時間経過にともなってPDMS表面から脱水することで、疎水的PDMS表面の復元が起こっている可能性を推察している。ウェルアレイ基盤を質量分析装置へ導入する方法の試行と、固定用アダプターの設計・作成に、予想以上に時間を要してしまった。またPDMS素材表面の改質法について期待したような効果が得られていないため、引き続き検討中である。シリコーンポリマーの表面改質は可能となったので、概ね申請時の計画に沿って、LDI-MS分析を中心に、リパーゼやペプチダーゼ酵素反応の解析を行なっていく予定である。素材表面へのアミノ基導入は重合反応の際に検討を要するが、Rcの最適化など、ポリマー作製の反応条件検討で対応する予定である。表面の官能基修飾は添加物に由来するシラノールを足掛かりとすることで可能と考えており、セルロース繊維等の多糖導入も官能基化には有利に働く。一方で、素材表面に多糖を有するLDI-MS分析