hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
沖縄県の難聴患者における効率的難聴遺伝子診断の構築

本研究は、1次世代シークエンサーを用いた、ターゲットリシークエンス解析(難聴の原因として報告のある96遺伝子のエクソン領域をターゲットとして作成したHaloPlex target DNA enrichmentカスタムパネルを使用)、2ターゲットリシークエンス解析で原因となり得る変異を抽出し得なかった症例に対する、全エクソンシークエンス解析、3ターゲットリシークエンス解析および、全エクソンシークエンス解析において抽出し得た変異に対する、疾患の原因となる変異かどうかの解析(直接シークエンス法による変異確認、in silico疾患関連予測解析、臨床情報、健聴者コントロールを用いた解析)の3つの部分から構成される。本年度は、研究代表者が作成した次世代シークエンサーを用いた98難聴遺伝子に対する診断パネルでは診断できなかった、家族性中耳奇形の1家系(6検体)、BO症候群の1家系(6検体)、中等度難聴の4家系(16検体)、先天性重度難聴の1家系(4検体)、奇形症候群に伴う先天性重度難聴の1家系(3検体)において、全エクソン解析を実施・解析した。その結果、中等度難聴の4家系のうち、3家系において、OTOG遺伝子変異(OTOG; NM_001277269),c.330C>G,p.Tyr110Xを同定した。また、奇形症候群に伴う先天性重度難聴例においては、(CDC42:NM_001791),c.G203A,p.R68Qを同定し、その結果Takenouchi-Kosaki症候群の診断に至った。全エクソーム解析で同定した両バリアントはいずれも本邦未報告であり、現在、OTOG遺伝子変異に伴う難聴について、投稿中である。その他家系においては、難聴の原因となりえる遺伝子変異を同定し得なかった。現在、追加で非症候群性難聴の8家系23検体において全エクソン解析を実施し、解析中である。研究代表者は、2018年の4月より、琉球大学から宮崎大学へ転勤となった。その後も琉球大学の非常勤講師として琉球大学に出向き症例のリクルート等、研究を継続してきた。それと共に、赴任先の宮崎大学と琉球大学間での共同研究とし、宮崎大学においても研究に必要な実験室の立ち上げを行った。以上の理由から、研究の進捗はやや遅れている。現在、琉球大学、宮崎大学の両施設でにおいて、研究実施可能な環境整備が終了している。現在、非症候群性難聴の8家系23検体において全エクソン解析を実施し、データの解析中である。さらに、本年度までに、16家系(46検体)に対して、次世代シークエンサーを用いた98難聴遺伝子診断パネルによる実験(ターゲットリシークエンス)を終了しており、本年度はその解析結果をもとに、未診断例に対してエクソーム解析を追加実施する予定である。症例のリクルートにおいては、既存検体に加えて、難聴の16家系(46検体)を採取した。また、沖縄県出身のコントロール検体のリクルートにおいては、既存の108検体に加えて、新たに20検体を追加採取した。解析においては、非症候群性難聴の20家系に対して、ターゲットリシークエンスによる98難聴遺伝子の解析をおこなった。今回解析した20家系のうち7家系に対して難聴の原因可能性がある遺伝子(PTPQR、MYO15A、EYA4、ADGRV1、USH2A、OTOG)の変異を確認した。現在、抽出した変異に対して、直接シークエンス法による塩基配列の同定、およびin silico解析中である。特にOTOG遺伝子変異によると考えられる中等度感音難聴家系は、これまでに2家系しか報告が無いが、沖縄県においては、前年度までの解析結果と併せて、4家系を確認しており、創始者効果によるものと考えられる。現在、追加の発現解析およびタンパク構造等を解析中である。また、ターゲットリシークエンス解析にて原因不明であった非症候群性難聴の2家系に対し、現在、全エクソンシークエンス解析中である。研究対象症例のリクルートおよび、カスタムパネルを用いた、ターゲットリシークエンス解析は比較的順調である。ターゲットリシークエンス解析により、原因となり得る変異を抽出し得た症例においては、現在、直接シーケンス法による変異の同定やタンパク機能影響評価などの追加解析も行っており、概ね順調である。しかしながら、ターゲットリシークエンス解析および、追加の疾患の原因となる変異かどうかの解析を主として研究を進めてきたため、現在、非症候群性難聴の2家系のみが全エクソン解析中であり、研究の進捗としては、やや遅れていると評価する。本研究は、1次世代シークエンサーを用いた、ターゲットリシークエンス解析(難聴の原因として報告のある96遺伝子のエクソン領域をターゲットとして作成したHaloPlex target DNA enrichmentカスタムパネルを使用)、2ターゲットリシークエンス解析で原因となり得る変異を抽出し得なかった症例に対する、全エクソンシークエンス解析、3ターゲットリシークエンス解析および、全エクソンシークエンス解析において抽出し得た変異に対する、疾患の原因となる変異かどうかの解析(直接シークエンス法による変異確認、in silico疾患関連予測解析、臨床情報、健聴者コントロールを用いた解析)の

3つの部分から構成される。本年度は、研究代表者が作成した次世代シークエンサーを用いた98難聴遺伝子に対する診断パネルでは診断できなかった、家族性中耳奇形の1家系(6検体)、BO症候群の1家系(6検体)、中等度難聴の4家系(16検体)、先天性重度難聴の1家系(4検体)、奇形症候群に伴う先天性重度難聴の1家系(3検体)において、全エクソン解析を実施・解析した。その結果、中等度難聴の4家系のうち、3家系において、OTOG遺伝子変異(OTOG; NM_001277269),c.330C>G,p.Tyr110Xを同定した。また、奇形症候群に伴う先天性重度難聴例においては、(CDC42:NM_001791),c.G203A,p.R68Qを同定し、その結果Takenouchi-Kosaki症候群の診断に至った。全エクソーム解析で同定した両バリアントはいずれも本邦未報告であり、現在、OTOG遺伝子変異に伴う難聴について、投稿中である。その他家系においては、難聴の原因となりえる遺伝子変異を同定し得なかった。現在、追加で非症候群性難聴の8家系23検体において全エクソン解析を実施し、解析中である。研究代表者は、2018年の4月より、琉球大学から宮崎大学へ転勤となった。その後も琉球大学の非常勤講師として琉球大学に出向き症例のリクルート等、研究を継続してきた。それと共に、赴任先の宮崎大学と琉球大学間での共同研究とし、宮崎大学においても研究に必要な実験室の立ち上げを行った。以上の理由から、研究の進捗はやや遅れている。1平成29年度に引き続き、難聴者(発端者)とその家族および、沖縄県出身のコントロール検体の採取、gDNA、tRNAの抽出を行う。2カスタムパネルを用いた次世代シーケンサーによるターゲットリシークエンス解析は比較的順調であり、平成29年度と同様に行う。3既存の原因不明症例に加えて、平成29年度に行ったターゲットリシークエンス解析において、難聴の原因となり得る変異を同定し得なかった症例に対する、全エクソンシークエンス解析を継続する。ターゲットリシークエンス解析および全エクソン解析で得られた塩基配列の解析は、1.ヒトゲノムデータベースと照合した変異部位、SNPの抽出2.抽出した変異に対する、直接シークエンス法による変異の確認、必要に応じた発現解析等の追加解析3.確認できた変異について、これまでに得られたコントロール検体を用いて、一般集団における頻度確認を行う。現在、琉球大学、宮崎大学の両施設でにおいて、研究実施可能な環境整備が終了している。現在、非症候群性難聴の8家系23検体において全エクソン解析を実施し、データの解析中である。さらに、本年度までに、16家系(46検体)に対して、次世代シークエンサーを用いた98難聴遺伝子診断パネルによる実験(ターゲットリシークエンス)を終了しており、本年度はその解析結果をもとに、未診断例に対してエクソーム解析を追加実施する予定である。(理由)
津波被災地における地域包括ケア体制の構築：「保健とジェンダー」の災害社会学

(1)保健師の職能性に関する研究災害時の応急対策期におけるニーズ把握の実践を主とした被災者支援の経験が、保健師と地域社会や地域住民との関わり方の再評価に対して、どのような影響を与えているのかを、退職保健師の活動に関する事例をもとに検討した。東日本大震災での経験は、全国的にも保健師の地区担当制の再評価が生じてきた背景要因になっている。以上の考察を踏まえて、東日本大震災後の保健師の専門性の再評価について社会学的議論に位置づけることが、今後の課題であるとし、研究成果を原著論文の形式で公表した。(2)住民主体の介護予防活動に関する研究被災住民主体の介護予防実践について、岩手県陸前高田市で女性の専門職が中心に行っているコミュニティ・カフェの事例を基に検討し、その地域保健の中での役割と、実践に関わる担い手が有する社会関係を考察し、複数の学会等で報告した。岩手県陸高田市の特徴は、保健師が住民と協働で誰もが自由に集えて話せる場所を作り、そうした場所を介護予防活動や健康づくりに活用している点である。このような「はまかだ」運動や、情報共有・課題解決を目的とした住民協働の未来図会議を保健師が主導している。該当のコミュニティ・カフェにおいても、減塩食や介護予防教室や自主的な健康づくり活動が提供されており、薬剤師や歯科衛生士の資格を持つ女性が運営の中心を担っている。このようなカフェの活動を成立させている社会的ネットワーク、ソーシャル・キャピタルの在り方について、文献研究と事例研究の両方から分析している。さらに国際的な保健政策の動向をふまえて、コミュニティ・カフェが健康格差の是正に対して持つ意義に関しても、検討を進めた。29年度が最終年度であるため、記入しない。(1)リスクの社会学に関する文献研究:1年目は「リスクの社会学」分野に関する基礎的な研究を進めた。このことは地方行政職でもある保健師が社会全体におけるリスク管理に参入するモデルの検討のための理論的な枠組みとなった。本研究課題が明らかにしてきた保健師の専門知の形式と内容が科学的技術的な専門職における専門知とは内容的に異なる点に着目し、シンポジウムと科学社会学会大会において報告した。(2)「災害と女性の視点」に関する研究:本研究課題は、「保健とジェンダーの災害社会学」という副題にもみるように、リスク現象のジェンダー差に着目した災害対応、地域包括ケア体制の構築への提言を目的とするものである。「災害と女性・ジェンダー」に関する研究では、災害の被害や災害時の困難をジェンダー差に依拠して説明しようとしてきたが、ある特定の社会現象が個人の帯びる社会的属性と結び付けられて考察されるさいの相互作用過程が十分に視野に入っていない。そうした観点から(1)のシンポジウムでの報告を基にした論文を執筆した。(3)保健師の災害対応に関する事例研究:津波被災地である岩手県大槌町に過去28年間勤務した保健師への聞き取り調査と、その保健師が岩手県盛岡市で行っているみなし仮設住宅に居住する元大槌町住民に対する健康支援活動への参与観察の成果を行い、論文としてまとめた。さらに保健師と協働してこうしたみなし仮設住宅に居住する人々の健康課題に関するコホート研究、住民への聞き取り調査を行い、公衆衛生関連の学会で報告するとともに報告書をまとめた。(4)保健師一般の専門知に関する調査研究:津波被災地以外の保健師に対しても聞き取り調査を行った。自治体間の派遣で津波被災地に派遣された保健師に聞き取り調査を行い、災害時の保健師の役割や派遣体制の課題を明らかにした。成果を科学社会学会大会および医療社会学研究会で報告した。当該年度は、研究計画にしたがい、これまで進めてきた津波被災地の保健師によるみなし仮設住民への支援活動の調査研究の成果を論文としてまとめた。このことは、地区担当制という業務形態で勤務してきた保健師のケーススタディでもあり、この作業を通して、保健師の業務内容や専門性に関する基礎的な理解を深めた。そうすることにより、津波被災地外における保健師への災害支援活動との比較の論点を明確にした。比較という点では、特に派遣保健師として被災地外から派遣されてくる保健師や、既に退職した保健師への聞き取り調査を通して、保健師一般が持ちうる災害対応力に関する調査・検討を進めた。その中でも、地区担当制と業務分担制という保健師の業務形態の違いが災害対応に影響しうるという認識を保健師自身も持っていることが明らかになった。津波被災地における保健師の業務体制の比較については、今後も継続して行っていく予定である。さらに、社会理論との接点という意味では、リスク社会論に関する基本概念を踏まえたうえで、ドイツのリスク研究に関する学術書の翻訳作業を行うとともに、リスクの社会学に関するシンポジウムでコメンテーターとして登壇し、その内容を基に社会理論の観点からの論文を執筆した。このことは、被災者支援において保健師も前提としている「リスクとジェンダー」との関わりについての認識を、批判的に捉えることに役立つ視点を得たということでもある。特に保健師活動では「ハイリスク」と「ポピュレーション」という二つの区別軸が用いられることが多いことから、保健師が認識するリスクについて今後社会学的に検討していく上でも重要な成果である。(1)地域包括ケアとジェンダーに関する研究津波被災地を含む地域で実施した在宅緩和ケアの家族ニーズに関するアンケート調査研究の成果を、報告書と論文として刊行した。在宅緩和ケアで、主介護者の7割を占める女性の家族介護者が抱えている負担感の現状分析を行った。

この調査研究をふまえて保健師と協働し被災地に看取り対応の施設の開設という実践にも取り組む予定である。(2)津波被災地における保健医療福祉とジェンダーに関するフィールド調査1津波被災地でのフィールド調査への着手:当該年度は、岩手県陸前高田市でのフィールド調査に着手した。東日本大震災の発災直後から継続して行われている地域包括ケア会議に聴衆として参加し関連情報の収集に努めた。同市において地域の女性が主体となって行っている介護予防活動や食生活改善に関する自主活動について、運営者へのインタビューを行うとともに、実際の取り組みに複数回参与観察を継続しており、参加者層や参加動機、効果の内容について考察している。地域包括ケアの構築にとって重要な保健師と住民との協働の在り方という点に着目して、進めている。2被災後の高齢層への支援活動の継続:保健師と協力し、高齢層を対象としたサロン活動を、岩手県盛岡市で行ってきた。岩手県沿岸部から津波被災後に転入してきた独居女性や、高齢者世帯が主な参加者であり、血圧測定や健康相談を行う保健師の活動について、参与観察的にフィールド調査を継続してきた。これらの活動を通じて、既に行政を退職したベテランの保健師達が、被災した住民に支援を行う中で、どのような知識を活用しているのか、行政での保健師経験がどのように活かされているのかについて、社会学の立場から考察を継続している。ベテラン保健師の活用については、他の先進地域の事例についての情報も集めて検討している。当該年度は、地域包括ケアに関する調査研究として、国内でも社会科学系の分野からの研究例が少ない在宅ケアの分野に関して行ってきた調査研究について、報告書と論文を刊行した。この成果は、ケア場面での家族やジェンダーについて、地域包括ケア体制の推進の中に生じている課題を明らかにしたものであった。当該研究課題は実践的成果として、地域包括ケア体制に向けた提言を行い、専門職と協働しつつ被災地域の保健福祉を長期的に支えることを目的としているが、特に看取りの場の不足は、現在関わっている被災者支援の場面でも課題になっている。この成果は、当該研究課題を実際の被災者ニーズを考慮しながら進めていくうえで、重要な基盤になった。被災者支援における保健師の役割に関しては、前年度から継続して研究を進めてきたが、ベテラン保健師に関して行った調査研究の成果を論文として投稿することができた。保健専門職が集まる学会で報告した際の意見も、保健師が現在おかれている状況を鑑みるうえで重要な示唆になった。これらの示唆も参考にしながら、当該年度の後半からは、以前から交流のあった保健師の協力を得て、新たに津波被災地でのフィールド調査に着手することができた。フィールド調査は、女性の市民による自主的な健康づくり・介護予防活動についてのものである。コミュニティカフェという形態で住民が運営している健康づくり・介護予防活動に対して、行政の保健師ならびに福祉専門職がどのように関与しているのか、社会学的にみてコミュニティカフェという形態がもつ保健福祉的機能はどういう点にあるのかという点は、これまでの研究成果の延長線上に位置づけられる課題である。
シトクロムc多量体の生成機構と機能

タンパク質は構造変性して生体組織内に蓄積すると、コンフォメーション病が引き起こされる。電子伝達ヘムタンパク質であるシトクロムc(cyt c)は、変性すると多量化し、ポリマー化することが半世紀前から知られていたが、その形成メカニズムは不明であった。受入研究者らは、変性過程で生じる種々の大きさのウマcyt c多量体を作製、単離することに成功した。Cyt c2量体と3量体のx線結晶構造解析にも成功し、cyt cがC末端領域のαヘリックスを交換するドメインスワッピングにより多量体を連続的に形成し、ポリマー化する機構を明らかにした。しかし、cyt c多量体の生成機構や機能には、未解明な点が多く残されている。そこで本研究では、野生型および変異型ヒトcyt cの多量体を作製し、種々の分光法を用いてその形成機構と機能を調べた。平成25年度は、cyt cを変性状態からフォールディングさせると、エタノール処理と同様の構造をした多量体が得られ、cyt cの濃度を上げると多量体の量が増えた。cyt cのフォールディング過程の初期段階において、N末端領域とC末端領域がαヘリックスを形成し、2つのαヘリックスが疎水的に相互作用する。そこで、N末端ヘリックスの疎水性アミノ酸を欠損させた変異体とC末端ヘリックスの疎水性アミノ酸を欠損させた変異体を作製し、それぞれフォールディングさせたところ、どちらの変異体も多量体をほとんど形成しなかった。一方、2種類の変異体を共存させてフォールディングさせると、ヘテロ2量体だけが顕著に得られた。これらの結果より、cyt cのフォールディング過程の初期段階でN末端とc末端のαヘリックスが分子間で疎水的に相互作用し、ドメインスワッピングが起こり、多量体を精製することが分かった。さらに、cyt cのモルテン・グロービュール状態と多量体形成の関係も調べた。以上の結果より、cyt c多量体の形成機構に関する新たな知見が得られた。(抄録なし)タンパク質は構造変性して生体組織内に蓄積すると、コンフォメーション病が引き起こされる。電子伝達ヘムタンパク質であるシトクロムcは、変性すると多量化し、ポリマー化することが半世紀前から知られていたが、その形成メカニズムは不明であった。受入研究者らは、変性過程で生じる種々の大きさのウマシトクロムc多量体を作製、単離することに成功した。シトクロムc2量体と3量体のX線結晶構造解析にも成功し、シトクロムcがC末端領域のαヘリックスを交換するドメインスワッピングにより多量体を連続的に形成し、ポリマー化する機構を明らかにした。しかし、シトクロムc多量体の生成機構や機能には、未解明な点が多く残されている。そこで本研究では、野生型および変異型ヒトシトクロムcの多量体を作製し、種々の分光法を用いてその形成機構を解明するとともに、機能を調べる。平成24年度は、大腸菌発現系を用いて野生型および変異型ヒトシトクロムcを得た。ヒトシトクロムcを陽イオン交換クロマトグラフィーおよびゲルろ過クロマトグラフィーを用いて精製した。エタノール処理により野生型ヒトシトクロムc多量体を作製後、2量体を精製した。紫外可視吸収スペクトルおよびCDスペクトルより、野生型ヒトシトクロムc2量体では、ヘム鉄へのMet80の配位が外れ、タンパク質の2次構造が単量体の構造に比べて僅かに変化することが分かり、ヒトシトクロムc2量体はウマシトクロム02量体と同様の構造を有することが示唆された。さらに、野生型ヒトシトクロムcよりも多くの2量体が得られる変異体の作製にも成功した。これらの結果より、シトクロムc多量体の形成条件に関する新たな知見が得られた。

これらの結果より、cyt cのフォールディング過程の初期段階でN末端とc末端のαヘリックスが分子間で疎水的に相互作用し、ドメインスワッピングが起こり、多量体を精製することが分かった。さらに、cyt cのモルテン・グロービュール状態と多量体形成の関係も調べた。以上の結果より、cyt c多量体の形成機構に関する新たな知見が得られた。平成24年7月より新たに研究を開始したため、外部発表の機会はまだないが、データは蓄積されつつある。本年度秋には学会発表する予定であり、研究はおおむね順調に進展している。これまでに得られたデータをもとに他の測定法も試し、研究をまとめ上げる。特に、X線小角散乱法を用いて多量体の形成を確認する予定である。(抄録なし)
マウス精子の凍結保存ならびに凍結マウス精子の体外受精技術系に関する研究

安定した高い受精率が得られ、しかも融解後の精子懸濁液からの保存液除去操作を必要としない簡易な凍結マウス精子の体外受精技術系の確立を目的とし、受精の場における凍結精子懸濁液の希釈倍率の検討を行なった。さらに、受精率を高めるための卵子側からのアプローチとして受精率の低い凍結精子と透明帯切開卵子との間で体外受精を行ない、受精率向上に対する透明帯切開術の有用性について検討した。受精の場における凍結精子懸濁液の希釈倍率の検討融解したICR精子懸濁液を200mulの受精用培養液中に0.5,1,2あるいは4mul添加した後、同系雌マウスから採取した過排卵卵子をそれぞれの精子浮遊液内に導入して媒精を行なった結果、2mul以上の区(希釈倍率100倍以下)の受精率は40%以下と低値であったが、0.5および1mul添加区(200400倍希釈)で比較的良好な受精率が得られた(7175%)。受精率の低い凍結精子と透明帯切開卵子間での体外受精受精率の極めて低いC57BL/6Nの凍結精子について透明帯の一部を切開した卵子を用いて体外受精を行なった結果、受精率および供試卵に対する新生仔への発生率は、透明帯の切開を行なわなかった正常卵子を用いた時のそれら値に比べ、極めて高値を示した(受精率:67%,供試卵に対する新生仔への発生率:14%)。以上の結果より、凍結マウス精子を体外受精に用いる場合、融解後の精子懸濁液からの完全な保存液の除去処理は必ずしも必要でなく、単に保存液を含む凍結精子懸濁液を受精の場の培養液で200400倍に希釈した後に媒精すれば、受精を阻害することなく比較的良好な受精率が得られることが知られた。また、受精能の極めて低い凍結精子においては、卵子側からのアプローチとして卵子の透明帯切開術が受精率の向上に有効な手段であることが判明した。前回、各種近交系マウス精子を凍結保存し、融解後の生存性および受精能を検討した結果、系統によりかなりのばらつきが見られたことを報告した。そこで、本研究では種々の系統で安定した凍結保存成績が得られるマウス精子の凍結保存と凍結精子を用いた体外受精技術系の確立を目的とし、まず、凍結法における種々の要因、すなわち、精子採取適齢時期、凍結・融解速度および精子凍結用保存容器について検討を行なった。1精子採取適齢時期:3系統の6、8、10および12週齢の雄を用いて検討した結果、いずれの系統においても、8週令以前の精子はそれ以降のものに比べ、有意に受精率が低値であった。2凍結・融解速度:凍結速度は、室温から-196°Cまで、約20-40/minの速度で、十分であり、それ以上緩慢冷却しても、生存率の向上は見られなかった。また、液体窒素に直接浸漬することによる超急速凍結では生存率が激減した。融解速度に関しては、室温で5-7分放置して融解するのがベストであり、37°Cの温水中での融解は、精子活力は改善されるものの、受精能は向上しなかった。3精子凍結用保存容器(セラムチューブ、サンプリングチューブ、ストロー):いずれの保存容器にて凍結保存しても、融解後の精子の受精能には差は認められなかった。以上の結果より、今後は、体外受精技術系の検討、すなわち、受精の場の精子濃度、培養液量などの検討を行なうとともに、受精率を高めるための卵子側からの検討も必要であろうと考えられる。
遠心型気体機械の羽根車-回転軸系における非定常挙動と分岐現象

遠心型や軸流型の気体機械について,羽根車-回転軸系に現れる幾つかの非定常流体現象の中で,(1)軸受隙間流れ部に発生するTaylor渦の非定常挙動,(2)遠心圧縮機および送風機に発生する流体騒音とその音源領域分岐,(3)軸流型圧縮機の旋回失速パターンとセルの分岐現象,の3点に研究の焦点を絞り,数値的および実験的研究を行った.具体的な内容は以下の通りである.(1)偏心率の大きい二重円筒間流れで発生するテイラー渦の非定常挙動を把握するため,3次元N-S方程式を用いた数値解析を実施した.本年度は,新たに移動座標系を採用することで中心軸が振れ回り運動する場合に対処できる計算コードを構築した.また,エネルギ式を連立して解くことにより,非定常温度場の把握が可能になり,粘性散逸によって発生した損失熱を効率的に冷却する試みについても数値的に検討した.さらに,数値解析結果の妥当性を検討する目的で,新たに実験装置を自主設計・製作して基本性能実験を行った.(2)遠心機械の運転条件(回転数および流量)を種々に変化させた場合における騒音特性と騒音源の移動・分岐現象を調査するために,舌部近傍壁面での圧力変動と外部騒音圧との相関解析により,音源の定量的分布傾向を調査した.特に高次騒音成分の音源領域は,運転条件の変化に対して不規則な移動や分岐を示すことが明らかになった.また,この現象を詳細に把握することを目的として,従来から構築中であった数値解析モデルに代数乱流モデルを導入し,流れ構造のより詳細な調査を可能とした.(3)軸流圧縮機の旋回失速現象に関しても,失速突入過程の詳細な実験を通して,複数のセル分岐パターンを把握することができた.本年度の特徴は翼列を3段まで拡張した点であり,従来の単段機では起り得なかった複雑な失速パターンを観察し,その予兆現象を捉えることで失速を能動的に制御する技術についても合わせて検討を行った.遠心型や軸流型の気体機械について,羽根車-回転軸系に現れる幾つかの非定常流体現象の中で,(1)軸受隙間流れ部に発生するTaylor渦の非定常挙動,(2)遠心圧縮機および送風機に発生する流体騒音とその音源領域分岐,(3)軸流型圧縮機の旋回失速パターンとセルの分岐現象,の3点に研究の焦点を絞り,数値的および実験的研究を行った.具体的な内容は以下の通りである.(1)偏心率の大きい二重円筒間流れで発生するテイラー渦の非定常挙動を把握するため,3次元N-S方程式を用いた数値解析を実施した.本年度は,新たに移動座標系を採用することで中心軸が振れ回り運動する場合に対処できる計算コードを構築した.また,エネルギ式を連立して解くことにより,非定常温度場の把握が可能になり,粘性散逸によって発生した損失熱を効率的に冷却する試みについても数値的に検討した.さらに,数値解析結果の妥当性を検討する目的で,新たに実験装置を自主設計・製作して基本性能実験を行った.(2)遠心機械の運転条件(回転数および流量)を種々に変化させた場合における騒音特性と騒音源の移動・分岐現象を調査するために,舌部近傍壁面での圧力変動と外部騒音圧との相関解析により,音源の定量的分布傾向を調査した.特に高次騒音成分の音源領域は,運転条件の変化に対して不規則な移動や分岐を示すことが明らかになった.また,この現象を詳細に把握することを目的として,従来から構築中であった数値解析モデルに代数乱流モデルを導入し,流れ構造のより詳細な調査を可能とした.(3)軸流圧縮機の旋回失速現象に関しても,失速突入過程の詳細な実験を通して,複数のセル分岐パターンを把握することができた.本年度の特徴は翼列を3段まで拡張した点であり,従来の単段機では起り得なかった複雑な失速パターンを観察し,その予兆現象を捉えることで失速を能動的に制御する技術についても合わせて検討を行った.遠心型流体機械に発生する非定常現象と分岐を対象として,以下に示すように大別して3種類の実験的・数値的研究を行った.(1)遠心型送風機に発生する代表的な非定常現象として空力騒音を挙げ,その発生機構・音源位置と内部流れ場の関連について,詳細な圧力および騒音測定に基づき調査した.特にその音源位置は渦型室壁面上で不規則に変化し,複雑な分岐を伴うことを明らかにした.これにより遠心型送風機の代表騒音である翼通過周波数成分に関して,その音圧レベルを定量的に評価する方法を提案することができた.また,内部流れとの関連については,熱線流速計を用いる計測システムの構築を行い,次年度以降展開する実験の準備を行った.(2)比較的高圧の遠心型圧縮機を対象とした実験では,羽根車と案内羽根の干渉に研究の焦点を当て,性能および発生騒音の双方に注目した研究を行った.現在までにほとんど報告例のない案内羽根の影響に関しては,干渉によって発生した音響波が,羽根車,吸込管路を伝播して系外へ放出される線形モデルを提示し,実験値と精度よく一致することを示した.また,案内羽根厚さが発生騒音に与える影響を定量的に評価するために,各種形状の案内羽根を自作し,来年度以降の実験準備を行った.合わせて,羽根車と案内羽根の干渉に着目した数値解析の準備も行っている.

(3)回転軸系の分岐現象の代表例として,軸受内に発生するTaylor渦列を取り上げ,その非定常挙動および分岐状態を数値解析によって明らかにした.特に,Taylor渦のセル数と非定常トルクや流体力との関連に着目し,壁面から噴流を加えることでセル数を制御し,非定常トルクを減少させる試みを行った.また,回転加速度や内外半径比,偏心率などのパラメータを種々に変化させた数値実験を思考し,セルの分岐に関する基礎資料を蓄積することができた.遠心型気体機械の羽根車-回転軸系に現れる幾つかの非定常流体現象の中で,(1)軸受隙間流れ部に発生するTaylor渦の非定常挙動,(2)遠心圧縮機および送風機に発生する空気力学的音響と音源領域,(3)動的物体と静的物体の干渉によって発生する非定常流れ場と騒音,の3点に研究の焦点を絞り,各々の現象を支配する分岐に着目した数値的・実験的研究を行った.具体的な内容および研究成果は以下の通りである.(1)偏心して振れ回るジャーナル軸受隙間部の非定常挙動を把握するため,3次元N-S方程式を用いた数値解析を実施した.特に,従来からの報告例の少ない大偏心率条件下でのTaylor渦分岐挙動を詳細に調査し,その分岐と安定性について明らかにした.また,噴流を用いてTaylor渦の分岐を制御する試みも検討し,数値的には良好な結果が得られた.この成果を踏まえ,エネルギ方程式の数値解析を導入することで,渦の分岐に伴う非定常温度場が把握できると考えている.(2)遠心機械を対象とした実験研究により,舌部近傍で組織化される音源領域の定量的把握とその分岐の調査を行った.特に,音源領域との相関が大きい羽根車吐出流の非定常挙動を,熱膜流速計を用いた詳細な計測によって明らかにした.計測結果と音源領域は密接に関係し,音源の分岐を現象面から実験的に捉えることが可能となった.また,圧縮機の干渉騒音に関しても,内部圧力場の計測結果から音源の空間的な分布と,回転数変化に伴う複雑な分岐現象を明らかにした.(3)静的物体に羽根車吐出流が非定常的に干渉する問題に対処するため,3次元数値解析を実施した.遠心機特有の騒音減である高次BPF成分に関しては,静的物体表面上で非定常的に誘起される移流渦とその剥離が支配的であることを示した.より詳細なスケール下での現象把握を目指して,CFDプログラムの改良に取り組んでいる.遠心型や軸流型の気体機械について,羽根車-回転軸系に現れる幾つかの非定常流体現象の中で,(1)軸受隙間流れ部に発生するTaylor渦の非定常挙動,(2)遠心圧縮機および送風機に発生する流体騒音とその音源領域分岐,(3)軸流型圧縮機の旋回失速パターンとセルの分岐現象,の3点に研究の焦点を絞り,数値的および実験的研究を行った.具体的な内容は以下の通りである.(1)偏心率の大きい二重円筒間流れで発生するテイラー渦の非定常挙動を把握するため,3次元N-S方程式を用いた数値解析を実施した.本年度は,新たに移動座標系の採用により中心軸が振れ回り運動する場合に対処できる計算コードを構築した.また,エネルギ式を連立して解くことで,非定常温度場の把握が可能になり,粘性散逸によって発生した損失熱を効率的に冷却する試みについても検討した.さらに,数値解析結果の妥当性を検討する目的で,実験装置を自主設計・製作して基本性能実験を行った.(2)遠心機械の運転条件を種々に変化させた場合における騒音源の移動・分岐現象を調査するために,舌部近傍壁面での圧力変動と外部騒音圧との相関解析により,音源の定量的分布傾向を調査した.
新しいp53family遺伝子p73,p51,p40の脳腫瘍における機能的意義

本研究ではP53 family蛋白として新しく1997年にcloningされたP73および,1998年にcloningされたP63(P51,P40)について酵母内で転写活性化能を検定する酵母機能アッセイを構築し,それを用いてこれら分子の脳腫瘍における機能的意義を解明することである.この研究により以下のような成果を得た.2)P53のrecessive mutantはP73を選択的に阻害することが知られているが、膠芽腫などヒト腫瘍で見いだされたP53変異は優性阻害性変異の場合にはアリルを選択しないが、劣性変異の場合にはP73を強く阻害するArg72のアリルを選択することを明らかにした(Carcinogenesis,2001)3)ヒト癌に見いだされたP73変異P405RとP425Lの転写活性化能を解析し報告した(Oncogene,2001).5)P63,P73について定量的に転写活性化能を検討できるyeast luciferase assayを開発、近く誌上発表の予定である。本研究ではp53 family蛋白として新しく1997年にcloningされたp73および,1998年にcloningされたp63(p51,p40)について酵母内で転写活性化能を検定する酵母機能アッセイを構築し,それを用いてこれら分子の脳腫瘍における機能的意義を解明することである.本年度は以下のような成果を得た.1)p73について酵母機能アッセイを確立し,それを膠芽腫,髄膜種計52例に応用し,変異の検索を行ったところ変異は存在しないことが判明した(Nozaki et al.,投稿準備中).2)p73のC-末端領域の機能を解析し,この部分に特殊な転写活性化調節領域があることを見いだし,誌上発表を行った(Ozaki et al., Cancer Res,1999).3)p73の変異体を作製し,これを酵母発現ベクターに組み込んで,野生型p53と同時に発現させることにより,p53に対してp73がdominant negative作用を持つかどうかを検討したところ, p73はdominant negative作用を持たないことが判明した.次年度はこれらの結果をふまえ,次の研究を行う予定である.1)p63遺伝子について酵母機能アッセイを確立し,脳腫瘍での変異検索を行う.2)p73およびp63についてYeast-based luciferase assayを用いて脳腫瘍cDNA libraryからこれらの分子に相互作用する分子をクローニングする.本研究ではp53 family蛋白として新しく1997年にcloningされたp73および,1998年にcloningされたp63(p51,p40)について酵母内で転写活性化能を検定する酵母機能アッセイを構築し,それを用いてこれら分子の脳腫瘍における機能的意義を解明することである.本年度は以下のような成果を得た.1)p73について酵母機能アッセイを確立し,それを膠芽腫,髄膜種計52例に応用し,変異の検索を行ったところ変異は存在しないことが判明した.しかし,p73のisoformのうちα,β,γ,εの発現は髄膜腫の悪性度に関係し増加することが明らかになった(Nozaki et al.,Brain Pathology印刷中).3)膠芽腫などヒト腫瘍で見いだされたp53変異は優性阻害性変異の場合にはアリルを選択しないが,劣性変異の場合にはp73を強く阻害するArg72のアリルを選択することが判った(Tada et al.Carcinogenesis印刷中)次年度はこれらの結果をふまえ,次の研究を行う予定である.1)p63遺伝子について酵母機能アッセイを確立し,脳腫瘍での変異検索を行う.2)p73と相互作用する蛋白の脳腫瘍における意義を解析する.本研究ではp53 family蛋白として新しく1997年にcloningされたp73および,1998年にcloningされたp63(p51,p40)について酵母内で転写活性化能を検定する酵母機能アッセイを構築し,それを用いてこれら分子の脳腫瘍における機能的意義を解明することである.この研究により以下のような成果を得た.2)p53のrecessive mutantはp73を選択的に阻害することが知られているが、膠芽腫などヒト腫瘍で見いだされたp

53変異は優性阻害性変異の場合にはアリルを選択しないが,劣性変異の場合にはp73を強く阻害するArg72のアリルを選択することを明らかにした(Carcinogenesis, 2001)3)ヒト癌に見いだされたp73変異P405RとP425Lの転写活性化能を解析し報告した(Oncogene, 2001).5)p63,p73について定量的に転写活性化能を検討できるyeast lucifcrasc assayを開発、近く誌上発表の予定である。
チタン細繊維を用いた靱帯・骨接合部の再建

チタン細繊維からなる円筒状チタンウェッブ(TW)を用いた靱帯・骨結合部の再生は、術後4ヵ月の組織像ではTW内に腱様組織および骨組織の侵入が観察された。また、腱実質部、TW内腱様組織、骨組織の成熟度は健常組織と同程度であったことから、骨と腱組織はTWを介して結合されることが確認された。従って、骨や腱の主要な構成成分であるコラーゲンの成熟過程を阻害することなく、組織固有のコラーゲン架橋パターンを有する基質が形成されることが判明した。膝前十字靱帯(ACL)再建術後の移植腱と骨孔の固着の成否は、術後成績の向上を左右する重要な要素であり、これまで成長因子の局所投与などによる移植腱・骨結合部の再生の試みなどが行われている。しかし、臨床応用に際しては、リコンビナント蛋白の作用の安全性の確認に長期間を要することやコスト面など克服すべき問題がある。そこで、我々は、独自に開発した骨と軟部組織の親和性に優れたチタン細繊維を円筒状に加工したチタンウェッブ(TW)を用いて、腱・骨結合部の再生が可能か組織学的に検討した。また、同時にTW内の腱ならびに移植腱のコラーゲン基質の分化および成熟度を生化学的に解析したので報告する。成熟New Zealand白色家兎の膝蓋腱外側(2×15mm)(PT)を採取し、TW(外径4mm,内径2mm)の内腔に誘導した。次に、脛骨内側から骨孔(径4mm)を作製し、TW/PT複合体を骨孔内に挿入したTW(+)群、さらに反対側も同様に処置を行い、骨孔(2mm)にはPT(2×15mm)のみを挿入したTW(-)群を各々術後、1,4ヵ月目に屠殺し、HE染色を行い、移植材料周囲の腱および骨組織を観察した。また、移植腱、TW内の移植腱および骨組織、TW外の骨組織を採取し、各々組織特異的なコラーゲンの分化マーカーとなる架橋パターン、成熟度を生化学的に解析した。TW(-)群:術後1ヵ月,4ヵ月共に骨と腱の間には全周性に瘢痕様組織が介在していた。TW(+)群:術後1ヵ月では、TW内に瘢痕様軟部組織、骨組織の侵入が観察されたが、成熟した腱組織の形成は認められなかった。しかし、4ヵ月ではTW全周性に腱様組織および骨組織の侵入が観察された。コラーゲンの生化学的分析の結果、TW(+)群のTW内腱様組織は、腱実質部と同程度にコラーゲンの成熟架橋形成が生じていたが、腱実質部のコラーゲン成熟度は、本来のPTと比べて低値であった。また、向時にTW内の腱ならびに移植腱のゴラーゲン基質の分化および成熟度を生化学的に解析したので報告する。成熟New Zealand白色家兎の膝蓋腱外側(2x15mm)(PT)を採取し,TW(外径4mm,内径2mm)の内腔に誘導した。次に、脛骨内側から骨孔(径4mm)を作製し、TW/PT複合体を骨孔内に挿込したTW(+)群、さらに反対側も同様に処置を行い、骨孔(2mm)にはPT(2x15mm)のみを挿入したTW(-)群を各々術後、1, 4ヵ月目に屠殺し、HE染色を行い、移植材料周囲の腱および骨組織を観察した。また、移植腱、TW内の移植腱および骨組織、TW外の骨組織を採取し、各々組織特異的なコラーゲンの分化マーカーとなる架橋パターン、成熱度を生化学的に解析した。4ヵ月後の組織像は、TW(-)群では移植PTの粗造化・変性および腱・骨接合部の癒合を認めなかったが、TW(+)群ではTW内に骨形成と腱形成が混在しているのが認められた。生化学的分析の結果、TW(-)群では腱実質部は架橋数と架橋成熟度は著しく低下し、瘢痕型架橋パターンを示していた。TW(+)群では成熟度はNativePTに比べて低く、可溶化率も高値であるが、架橋パターンはNativePTと差がなかったことから、成熟した腱型コラーゲン組織が形成されていることが判明した。

膝前十字靱帯(ACL)再建術後の移植腱と骨孔の固着の成否は、術後成績の向上を左右する重要な要素であり、これまで成長因子の局所投与などによる移植腱・骨結合部の再生の試みなどが行われているが、臨床応用に際しては、リコンビナント蛋白の作用の安全性の確認に長期間を要することやコスト面など克服すべき問題がある。そこで、我々は、独自に開発した骨と軟部組織の親和性に優れたチタン細繊維を円筒状に加工したチタンウェッブ(TW)を用いて、腱・骨結合部の再生が可能か組織学的に検討し、さらに、TW内の腱ならびに移植腱のコラーゲン基質の分化および成熟度を生化学的に解析したので報告する。成熟New Zealand白色家兎の膝蓋腱外側(2x15mm)(PT)を採取し、TW(外径4mm,内径2mm)の内腔に誘導した。次に、脛骨内側から骨孔(径4mm)を作製し、TW/PT複合体を骨孔内に挿入したTW(+)群、さらに反対側も同様に処置を行い、骨孔(2mm)にはPT(2x15mm)のみを挿入したTW(-)群を各々術後、1,4ヵ月目に屠殺し、移植材料周囲の腱および骨組織を観察した。また、移植腱、TW内の移植腱と骨組織、TW外の骨組織を採取し、各々組織特異的な架橋パターン、成熟度を生化学的に解析した。TW(-)群における術後4ヵ月の組織像では、骨孔内腱組織は粗造化しており変性所見を呈していたが、TW(+)群ではTW内に腱様組織および骨組織の侵入が観察された。コラーゲン分析の結果、TW(-)群の腱実質部コラーゲンは、架橋形成に乏しく、ペプシン可溶性も著しく亢進しており、組織の変性所見と一致した結果を示した。これに対して、TW(+)群の腱実質部、TW内腱様組織、骨組織の成熟度は健常組織と同程度であり、ペプシン可溶化率も低値であった。以上より、骨と腱組織はTWを介して結合されることが確認された。さらに、骨や腱の主要な構成成分であるコラーゲンの成熟過程を阻害することなく、組織固有のコラーゲン架橋パターンを有する基質が形成されることが判明した。
ヒトとリスザルの因果知覚に関する比較認知心理学的研究

平成20年度はヒト成人を対象とした実験、およびリスザルを対象とした実験のテスト試行を実施した。これまで得られたデータを分析し、論文および報告書の執筆を行った。<ヒト成人を対象とした実験>今年度は昨年度の実験(色情報の効果)に引き続き、因果知覚と音声情報との関連を検討する実験を行なった。モニター上方左右から中央に向かって同時に運動し、接触した後に下方左右へ運動する2つの円刺激を用いた。接触前後の速度比(1:5,3:3,5:1)を変数として変化させた。加えて、接触前後に音声情報を導入し、音声情報が速度比による因果事象の見えにどのように影響を与えるか検討した。特に聴覚刺激の周波数、音圧、視覚刺激との同期性が因果事象に与える影響を検討した。その結果、周波数の変化は音へのイメージ変化と関連していること、同期性の変化は特定の速度変化と結びついて因果知覚に影響を与えることが示唆された。<リスザルを対象とした実験>昨年度から引き続きテスト試行を行った。独立変数は接触前後の速度比(1:5,2:4,3:3,4:2,5:1)であった。リスザルの課題は指定した刺激が最終的に運動した位置をボタン押しにより反応することであった。すべてのサルのデータを分析した結果、リスザルは2つの運動物体の速度比3:3,4:2,5:1においてチャンスレベル(50%)よりも有意に通過事象(Passing)として知覚した。この結果はリスザルとヒトの因果知覚が何らかの共通性に基づいて知覚されていることを示唆するものであった。平成18年度はヒト成人を対象とした実験のプログラム作成および予備実験実施、リスザルを対象とした実験のための装置作成・トレーニングを行なった。<ヒト成人を対象とした実験>実験プログラムの作成後、予備実験として少数の実験参加者で実験を行なった。ヒト2名を実験参加者とした。モニター上方左右から中央に向かって同時に移動し、接触した後に下方左右へ移動する2つの円刺激を用いた。接触前後の速度比(1:5,2:4,3:3,4:2,5:1)を独立変数とし、実験参加者の課題は指定した刺激が最終的に移動した位置をボタン押しにより反応することであった。現時点までの結果、接触前後の速度比の差が大きいはど、実験参加者は2刺激の運動を反撥として知覚しており、前後の速度に差がない場合と比較してより因果知覚が生じていることが示唆された。<リスザルを対象とした実験>装置・実験プログラムの作成とトレーニングを行なった。リスザルに適した大きさの遮音ブース内にモンキーチェア、刺激提示用ディスプレイ、タッチパネル、ルームライト、スピーカ等を設置し、反応装置とした。実験プログラムの作成、および実験制御はPC(PowerMacG4)を用いて行ない、I/Oインターフェースを通じて給餌装置、ホロホロ、ブザー、ホワイトノイズ等の制御を行なった。小型カメラと小型液晶モニターにより遮音ブース内の実験中のサルの様子を観察し、HDD/DVDレコーダーに記録した。被験体として3頭のリスザルを用い、現時点までに以下の3段階まで予備訓練を終了し、訓練を継続中である。1)強化子による強化に慣れるためのフィーダートレーニング2)タッチパネルを正しく押すためのタッチトレーニング3)画面に提示される小円を1回押した後、一定の遅延の後に同じ円を押すトレーニング平成19年度はヒト成人を対象とした実験,およびリスザルを対象とした実験のトレーニング・テスト試行を実施した。加えて効率的な実験のための装置拡張を行なった。<ヒト成人を対象とした実験>昨年度の予備実験で得られたデータを元に実験を行なった。モニター上方左右から中央に向かって同時に移動し,接触した後に下方左右へ移動する2つの円刺激を用いた。加えて,接触前後の色を変化させ,色の変化が速度比による因果事象の見えにどのように影響を与えるか検討した。現時点で4名の実験参加者からデータが得られ,分析の結果,色が支配的に因果知覚に影響を与える参加者と,ほとんど影響がみられない参加者の両方の参加者が存在した。これは色と速度比という2種類の因果知覚の手がかりが独立的に作用していることを示唆する結果であった。<リスザルを対象とした実験>昨年度から引き続きトレーニングを行なっている個体のうち2頭がトレーニングを終了し・テスト試行に移行した。また新たに2頭のリスザルでトレーニングを開始した。テスト試行に移行した2頭はヒトの実験と同様な手続きでテストを行なった。リスザルの課題は指定した刺激が最終的に移動した位置をボタン押しにより反応することであった。その結果,リスザルは速度比3:3,4:2,5:1においてチャンスレベル(50%)よりも有意に通過事象として知覚した。

モニター上方左右から中央に向かって同時に運動し、接触した後に下方左右へ運動する2つの円刺激を用いた。接触前後の速度比(1:5,3:3,5:1)を変数として変化させた。加えて、接触前後に音声情報を導入し、音声情報が速度比による因果事象の見えにどのように影響を与えるか検討した。特に聴覚刺激の周波数、音圧、視覚刺激との同期性が因果事象に与える影響を検討した。その結果、周波数の変化は音へのイメージ変化と関連していること、同期性の変化は特定の速度変化と結びついて因果知覚に影響を与えることが示唆された。<リスザルを対象とした実験>昨年度から引き続きテスト試行を行った。独立変数は接触前後の速度比(1:5,2:4,3:3,4:2,5:1)であった。リスザルの課題は指定した刺激が最終的に運動した位置をボタン押しにより反応することであった。すべてのサルのデータを分析した結果、リスザルは2つの運動物体の速度比3:3,4:2,5:1においてチャンスレベル(50%)よりも有意に通過事象(Passing)として知覚した。この結果はリスザルとヒトの因果知覚が何らかの共通性に基づいて知覚されていることを示唆するものであった。
植物のアスコルビン酸酸化酵素遺伝子のオーキシンによる発現調節と細胞成長

高等植物特有な酵素であるアスコルビン酸酸化酵素はアスコルビン酸を特異的に酸化する酵素であることからアスコルビン酸の定量などに用いられる有用酸素である。しかし、本酵素の生理的機能についてはほとんど明らかになっていない。一方、最近、アスコルビン酸酸化酵素が植物の細胞壁に局在することがわかってきており、本酵素が細胞成長に関係する酵素であることが示唆された。実際にカボチャのアスコルビン酸酸化酵素は、植物の成長ホルモンと言われているオーキシンによって誘導されることがわかった。しかし、本酵素はウリ科植物に特有に認められる酵素と考えられてきており、植物全体において、本酵素が組織成長にかかわっているのかどうかは疑問であった。これまでにカボチャやキュウリについてそのcDNAのクローニングがなされているが、ウリ科植物以外では遺伝子クローニングがなされていない。本研究で、ウリ科以外ではじめて、タバコのアスコルビン酸酸化酵素cDNAのクローニングに成功し、ウリ科以外の植物にもアスコルビン酸酸化酵素遺伝子が発現していることが明らかになった。また単子葉植物であるライスのcDNAも取得することができ、おそらく、植物共通に発現している酵素であることも示された。また、ノーザンブロットの結果から、タバコやライスにおいても、細胞成長が活発な組織や部位にmRNAが豊富に存在することも示され、植物全体で本酵素が細胞成長にかかわっている可能性が示された。他方、アスコルビン酸酸化酵素遺伝子のオーキシンによる発現調節の機構を解明するために本遺伝子のシス領域の解析も行った結果、オーキシンに応答するシス因子の存在が示唆された。また、この5′上流域に結合するタンパク質cDNAをサウスウエスタン法でクローニングすることができた。本タンパク質はステロイドホルモンレセプターやGATAIに似たDNA結合ドメインを持つ新規のジンクフィンガータンパク質であった。本研究において、アスコルビン酸酸化酵素について遺伝子レベルの研究をおこなった。タバコのアスコルビン酸酸化酵素の遺伝子発現の研究をする目的で、カボチャのアスコルビン酸酸化酵素cDNAをプロープとして、タバコのアスコルビン酸酸化酵素cDNAをクローニングした。cDNAから推定したアミノ酸配列はカボチャやキュウリのアスコルビン酸酸化酵素のアミノ酸配列と大きく異なっていた。おそらく、このことがタバコのアスコルビン酸酸化酵素の比活性がカボチャやキュウリの比活性に比べ著しく小さいことと関係するものと思われる。一方、アスコルビン酸酸化酵素はオーキシンにより著しく誘導されること、また、カボチャの果実の成長時や、種々の発芽時、カルス化時に著しい発現を示すことから、本酵素は細胞成長に関与する酵素であることが示唆された。また、カボチャのアスコルビン酸酸化酵素のゲノム遺伝子をクローリングし、そのプロモーター領域を解析したところ,オーキシン応答性に関与するシス領域の存在が示唆された。オーキシン応答性に関与すると思われるシス領域をプローブとしたサウスウエスタン法により、その領域に、特異的に結合する蛋白質cDNAをクローニングすることができた。本cDNAは333アミノ酸からなる蛋白質をコードしており、プロリンとセリンが豊富であった。推定アミノ酸配列中に転写因子に特徴的なロイシンジッパー様モチーフやヘリックスターンヘリックス様モチーフが認められた。また、プロリンリッチなドメインも認められており、本蛋白質が転写因子である可能性が示唆された。しかしながら、本cDNAの塩基配列、および、蛋白質のアミノ酸配列についてホモロジー検索を行った結果、有意なホモロジーを示すものは認められず、本転写因子様蛋白質が新規な蛋白質である可能性が示された。アスコルビン酸酸化酵素は高等植物に特有な酵素で、アスコルビン酸を酸化してデヒドロアスコルビン酸を生成する反応を触媒するが、その生理的機能については未だ不明である。

しかしながら、アスコルビン酸酸化酵素は銅を有する酵素として、その構造と機能について注目されている。アスコルビン酸酸化酵素の研究は、これまで、カボチャやキュウリなどのウリ科植物を用いて行われていた。そこで、タバコのアスコルビン酸酸化酵素の遺伝子発現の研究をする目的で、カボチャのアスコルビン酸酸化酵素cDNAをプローブとして、タバコのアスコルビン酸酸化酵素cDNAをクローニングした。cDNAから推定したアミノ酸配列はカボチャやキュウリのアスコルビン酸酸化酵素のアミノ酸配列と大きく異なっていた。おそらく、このことがタバコのアスコルビン酸酸化酵素の比活性がカボチャやキュウリの比活性に比べ著しく小さいことと関係するものと思われる。一方、アスコルビン酸酸化酵素はオーキシンにより著しく誘導されること、また、カボチャの果実の成長時や、種子の発芽時、カルス化時に著しい発現を示すことから、本酵素は細胞成長に関与する酵素であることが示唆された。また、カボチャのアスコルビン酸酸化酵素のゲノム遺伝子をクローニングし、そのプロモーター領域を解析したところ、オーキシン応答性に関与するシス領域の存在が示唆された。オーキシン応答性に関与すると思われるシス領域をプローブとしたサウスウエスタン法により、その領域に、特異的に結合する蛋白質cDNAをクローニングすることができた。本cDNAは333アミノ酸からなる蛋白質をコードしており、プロリンとセリンが豊富であった。推定アミノ酸配列中に転写因子に特徴的なヘリックスターンヘリックス様モチーフが認められた。また、本蛋白質がステロイドホルモンレセプターやGATA1に似た亜鉛、DNA結合ドメインを持つ新規のジンクフィンガー様転写因子である可能性が示された。