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中国山西省山間部における資源開発と社会変容の関係:碑刻資料を用いた環境社会史研究

18世紀以降、急激な人口の増加に伴い、汾河流域平野部では農地開発が推進され、それまで遊水池の役割を果たしていた流域中の湖沼の多くが消滅した。山間部では政府の認可を受けた商人により林業・鉱業開発が推進され、農業に代わる主要産業となった。呂梁山区の山間部における林業および鉱業への極端な依存、山麓部および平野部における洪水・土石流被害の増加、19世紀以降に急速に拡大した罌粟栽培などによって、旱魃などの自然災害に対して脆弱な生業形態が形成され、内蒙古南部・西部への移民が増大した。具体的内容:当該年度においては、2010年2月27日より3月10日にかけて、呂梁山区南部の現地碑刻資料調査を実施した。調査地においては、水利・災害・信仰活動に関する碑刻資料を収集し、図書館・博物館において典籍および文物の調査を行った。また、研究協力者である山西大学中国社会史研究中心の張俊峰氏らと会議を行い、今後の調査計画を確定した。成果発表に関しては、半乾燥地域における天水農業の歴史的展開を明らかにし、自然環境と人間活動との歴史的な相互関係を探るため、2009年12月12日に開催された関西大学文化交渉学教育研究拠点第2回次世代国際学術フォーラムにて、研究発表「中国山西省東南部における祈雨祭祀の諸形態-天水農業地域の水認識と水神信仰に関する歴史学的考察-」を行い、論文を執筆した。また、環境変化に対する適応のあり方を地域社会の変容から読み解くという方法論に関しては、「消えゆく水と現れでる碑-環境社会史研究の可能性」を執筆し、中国環境研究拠点が発行する『天地人』に掲載された。意義と重要性:本研究の対象地域である山西省西部呂梁山区については、国内外における歴史研究は極めて少なく、資料等に関する情報も極めて限定されたものであった。こうした意味において、今年度の現地には新たな資料の発掘という即効性のみならず、現地情報の収集や地理環境の理解という点において長中期的効果を見いだすことができる。特に山西大学中国社会史研究中心がこれまでに収集した資料に本研究課題と密接に関連する契約文書類が多数含まれること、さらに呂梁山区に関する最新の状況を理解することができた点は今後の研究遂行に極めて大きな意味を持つ。呂梁山区の地理条件から判断して、広域に亘る現地調査はかなり制限せざるを得ないが、こうした問題点は研究中心に所蔵される資料を用いることでカヴァーすることができる。18世紀、顕在化する人口の急激な増加に伴い、呂梁山区東部を流れる汾河の平野部においては、官民双方による灌漑水路の開鑿や堰堤の設置を通した耕地開発が加速度的に進展した。その過程において、汾河に沿って存在した湿地や湖沼が相次いで干拓・耕地化されたが、これは汾河の増水時における遊水地の消滅をも意味するものであった。一方、山間区においては土地条件の制限により大規模な農業開発は行われず、石炭を中心とする鉱業と林業に開発の矛先が集中した。禁令により民間における私的な鉱山開発が制限されたため、開発の担い手となったのは政府の認可を受けて採掘を請け負った地元の山西商人や内務府より認可を受けた王綱明ら特権商人らであった。ただし、露天掘りによる石炭採掘は夏期に集中する降雨の被害を受けやすく、雨水の流入により容易に炭鉱は水没し、各地に廃坑が出現することとなった。また、木材の伐採に関しては、民山と呼ばれた私有林においては伐採および自由な売買が許可されており、耕地の稀少な交城県の山間部では植樹と伐採が農業に代わる主要な生業形態となっていた。ただし、磁器製造および木材伐採の進展は、山間区の表土露出を招き、山水と呼ばれる山々からの流れ出た鉄砲水は黄土高原の谷筋(溝)を流れ降る間に大量の土壌を包含し、その平野部と山麓部に土石流の被害をもたらした。山間部における石炭や鉄などの鉱業への依存、山麓部および平野部における洪水・土石流被害の増加、19世紀以降に急速に拡大した罌粟栽培などによって呂梁山区の農業生産力はさらに低下し、呂梁山区から黄河を越えて内蒙古南部・西部への移民が増大した。また、山西から陝西に石炭・鉄・酒・棗などの産品がもたらされ、陝西からは穀物が山西にもたらされるといった物流が確立され、旱魃などの自然災害に対して脆弱な生業形態が生み出されることとなった。
低エネルギー反応を利用する化学合成微生物の個体群動態と進化の理論的研究

地球上の生物は光か化学反応のいずれかをエネルギー源として用いる。細菌や古細菌には鉄や水素や硫黄を利用した反応からエネルギーを得るものが存在し、彼らの存在は炭素や窒素の挙動に影響するだけで無く重金属の動態や毒性にも影響をもたらす。彼らの特徴は有機物を酸素で酸化する化学反応(好気呼吸)からエネルギーを得る動物と異なり、反応から獲得することができるエネルギー量が非常に低い点である。本研究では低エネルギー反応を利用する微生物の増殖動態をモデル化し、それらの微生物の増殖過程を理解し、個体群の相互作用と進化動態について理論的な理解を試みる。
野生獣の生態観察装置の開発に関する研究

本研究は野生獣が飼育場内でどのような行動をとるかを解析するため、長時間連続的に対象動物の位置を追尾し、記禄するシステムを開発することを目的としている。原理的に多くの方法が考えられるが、現在の科学技術で実現可能であり、また安価で普及可能な方法として小型発信機を利用したマルチアンテナ法と、テレビ画像を解析するビデオ画像追跡法を取りあげた。前者は主として60年度に研究を行なったが、発信器の重量、発信継続時間に難点があったので本年も引き続きそれらの改良を行なった。ビデオ画像追跡法については60年度は理論的な検討のみを行ない、本年度初めて具体的な実験を行なった。以下にその要点をまとめる。テレビカメラによるビデオ画像から対象動物を取り出し、その位置を決定する方法は誰れもが考えるが、現在の技術水準では大型コンピュータを組み込まない限り実用的な処理を行ない得ない。そこで、マイクロコンピュータで処理ができるように対象動物を発光体でマーキングすることにした。発光体としては発光ダイオードと化学発光体をテストし、後者の発光面積が大きいことからビデオ画鎗像として記録するには有利であることを確認した。次に市販の化学発光体を首輪として対象動物(ノウサギ)に装着して実験を行った。この結果、市販のものは発光力(光量)に難点があり、テレビカメラから15cm離れると画像として記録され難いことが明らかになった。そこで透明プラスチック製の首輪を作り、化学発光体10cc程度を封入したもので実験したら、30m前後の距離でも明るい点として撮影できることが確認された。現在はこのビデオ画像から対象動物の位置を割り出し、記録するプログラムを開発中である。テレビカメラの位置をより高くし、位置の計算が一層正確になるように工夫する必要があるものの、10秒毎に約68時間継続して行動を追跡することが可能となり、当初の目的を達成しつつある。新大・農学部付属村松苗畑にある野兎飼育場に於て、野兎の生態調査の一環としてマルチ・アンテナ法による行動追尾装置の開発に関する研究を進めてきた。すなわち、同時限に複数個体の行動を同時追尾する方法の開発である。複数個体にそれぞれ異なる周波数の発信機を装着し、場内に配置した45本のアンテナ群により得た情報をもとに、それぞれの個体の行動追尾を行ってきた。しかし、今までの方法ではデータ集積記録やシステム作動効率の上に支障が認められた。今回はこれらの支障を取り除くための主としてシステムの改良を行った。1.システムの改良についてPC-9801VFを2台購入し、1台はコントローラでシステムの1部に組込み、他はデータ解析とシステムソフトの改良を行なっている。システムコントローラには、I/Oボード、GP-IBボード、A/D変換ボードを内蔵して、従来のシステムを大巾に改良した。さらに、データ記録もデータレコーダから、内蔵したフロッピイディスクに改良したため、システムの作動効率が向上し、1枚のデスケットに、1頭の行動につき理論上40時間のデータを集記録することが可能となった。2.発信機の小型化については、半円ドーナツ型のブロック化の試作機を作製し、現場実験と装着実験を実施した。その結果、約12時間の発信継続時間と装着から破壊までの継続時間約8時間を得ている。3.妨害電波実験では、新システムにおいて周波数198200KHz付近で、システムの稼動中にマイコン・デスプレーに電波障害が認められた。このため実験中は発信周波数の選択する必要が生じた。4.受信アンテナ群の整備として、アンテナケーブル吊下げ位置を地上3mにかさ上げして設置した。これは冬期、積雪深の増大に伴い、野兎によるアンテナケーブルの食害を防止するため改善したものである。
システイン酸化体を含む新規金属結合モチーフの機能解析

ニトリルヒドラターゼ(NHase)は非ヘム鉄または非コリンコバルトを活性中心とする金属酵素である。研究代表者らは、鉄型NHaseがシステインスルフィン酸(Cys-SO_2H)とスルフェン酸(Cys-SOH)というシステイン酸化体を含む新規金属結合モチーフを有することを明らかにした。これらの成果をもとに、本研究課題では、NHaseならびにNHaseと高い相同性を示す酵素チオシアネート加水分解酵素(SCNase)を材料とし、システイン酸化体を含む新規金属結合モチーフの機能に関する研究を行った。1.イソブチロニトリル(IBN)はNHaseに対して数μMで競争阻害作用を示すことが報告されていた。その阻害効果を新たに検討し直したところ、IBN自体は単なる基質であり、市販IBN試薬中に含まれる來雑物である2-cyano-2-propylhydroperoxide(Cpx)が真の阻害剤であることが明らかになった。Cpxは鉄型NHaseのCys-SOH残基を特異的に酸化し、不可逆的に失活させることを明らかにした。また、NHaseの安定化剤として知られ、その精製、保存、多くの研究に使用されているn-酪酸の機能を解析した。その結果、n-酪酸非存在下での酵素の失活はCys-SO_2Hへの空気酸化が原因であること、n-酪酸はαCys114-SOHの酸化を防ぐことで酵素を安定化していることを明らかにした。以上の結果は、αCys114のSOH基が酵素活性の発現に重要であること結論された。2.Co型NHaseならびにSCNaseにおいても、Cys-SO_2Hの修飾が保存されていることを明らかにした。また、SCNaseがコバルト型NHaseファミリーに属すること、さらにアポ体の発現系に成功した。アポ型酵素に関しては、良好な結晶化条件を決定しており、立体構造解析を開始した。ニトリルヒドラターゼ(NHase)はシステインスルフィン酸(Cys-SO_2H)とスルフェン酸(Cys-SOH)というシステイン酸化体を非ヘム鉄配位子として有する新規金属蛋白質である。このシステイン酸化体を含む新規金属結合モチーフの機能を明らかにするため、本年度は以下の研究を行った。(1)阻害剤による反応速度論的解析-イソブチロニトリル(IBN)はNHaseに対して数iMで競争阻害作用を示すことが報告されていた。その阻害効果を再検討したところ、NHaseはIBNとの反応によって不可逆的に失活し、Cys-SOHが酸化され、Cys-SO_2Hとなることが明らかになった。酸化条件をさらに詳細に検討し、酸化を引き起こしているのはIBN自体ではなく、その試薬中にわずかに含まれる他成分が反応していることを明らかにした。使用したIBNの純度は98-99%であることから、この成分は数十nMのオーダーでNHaseに作用する大変高い親和性を持つことが考えられる。この成分をIBNの試薬中から逆相クロマトグラフィーによって単離しNMRスペクトルを測定した結果、IBNの構造に良く似た枝分かれ状の側鎖をもつことが解った。(2)αCys114-SOHは酵素活性に必須である-従来、鉄型NHaseは安定化剤であるn-酪酸を必要とすることが知られていたが、この原因は全く判っていなかった。我々は、この失活がシステインリガンドの空気酸化に起因するのではないかと考えた。n-酪酸の存在、非存在下でのFe型NHaseの酵素活性および活性中心のシステインリガンドの酸化状態を好気および嫌気条件でモニターすることにより、n-酪酸非存在下での酵素の失活はCys-SO_2Hへの空気酸化が原因であること、n-酪酸はこのαCys114-SOHの酸化を防ぐことで酵素を安定化していることを明らかにした。(3)NHase相同蛋白質における翻訳後修飾の保存性-Co型NHase(Rhodococcus rhodochrous J1由来)およびNHaseと高い相同性を有するThiobacillus thioparus THI115由来チオシアネート加水分解酵素について翻訳後修飾の検討を行なった。その結果、どちらの酵素においてもCys-SO_2Hへの酸化は保存されていることがわかった。このことから、NHaseに類似の蛋白質に共通の性質であり、Rhodococcus sp.N-771由来Fe型NHaseの場合と同様に、酵素活性の発現に重要な働きをもつことを強く示している。

Cpxは鉄型NHaseのCys-SOH残基を特異的に酸化し、不可逆的に失活させることを明らかにした。また、NHaseの安定化剤として知られ、その精製、保存、多くの研究に使用されているn-酪酸の機能を解析した。その結果、n-酪酸非存在下での酵素の失活はCys-SO_2Hへの空気酸化が原因であること、n-酪酸はαCys114-SOHの酸化を防ぐことで酵素を安定化していることを明らかにした。以上の結果は、αCys114のSOH基が酵素活性の発現に重要であること結論された。2.Co型NHaseならびにSCNaseにおいても、Cys-SO_2Hの修飾が保存されていることを明らかにした。また、SCNaseがコバルト型NHaseファミリーに属すること、さらにアポ体の発現系に成功した。アポ型酵素に関しては、良好な結晶化条件を決定しており、立体構造解析を開始した。ニトリルヒドラターゼ(NHase)は、システインスルフィン酸(Cys-SO_2H)とシステインスルフェン酸(Cys-SOH)というシステイン酸化体を配位子とする新規金属蛋白質である。このシステイン酸化体を含む新規金属結合モチーフの機能を明らかにするために、本年度は以下の研究を行った。(1)阻害剤による反応メカニズム解析-昨年度、研究代表者らは、イソブチロニトトリル中には、鉄型NHaseをCys-SOH配位子をCys-SO_2Hに酸化して失活させる微量の不純物質が含まれていることを明らかにした。本年度は、この不純物質をNMR、GC-MSによって解析し、2-cyano-2-propyl hydroperoxide((CH3)_2-C(CN)-00H ; CPH)であることを明らかにした。CPHの添加による鉄型NHaseのUV-Vis吸収スペクトルおよびESRスペクトルの変化から、CPHは非ヘム鉄活性中心と安定な結合をし、鉄イオンを3価から2価に還元する事がわかった。以上ことから、CPHは非ヘム鉄と相互作用して安定な複合体を形成する一方で、Cys-SOH配位子を酸化して酵素を不活性化してしまう、新規な自殺基質であると結論した。(2)チオシアネート加水分解酵素(SCNase)とコバルト型NHaseのESR解析-SCNaseはコバルトを中心金属とし、少なくともCys-SO_2H配位子の修飾は保存されていることがわかっているNHaseファミリーに属する酵素である。本年度はSCNaseとRhodococcus rhodochorous J1由来コバルト型NHaseのESR解析を行った。どちらもESR silentであり、還元するとESRシグナルを示すことから、低スピン9価のコバルトをもつ単核のセンターであるが、どちらの酵素においても環境がわずかに異なる2糠類のセンターが存在することが考えられた。mimsENDOR測定の結果、鉄型NHaseと異なり、SCNaseとコバルト型NHaseでは第6配位子に結合しているプロトンのシグナルが弱く、プロトンが結合していても固定されていないことが予測された。また、3pulseESEEMの結果、主鎖のアミド窒素がコバルトに配位していることが予測された。以上のことから、第6配位子のプロトンの挙動に違いがあるものの、SCNaseおよびコバルト型NHaseの金属反応中心の構造は、鉄型NHaseと極めてよく似ていることが明らかとなった。
大腸癌の転移、浸潤に関わるマイクロRNA発現の腫瘍内不均一性の検討

癌の転移や浸潤にはマイクロRNAが関与する。大腸癌におけるマイクロRNAの腫瘍内不均一性を明らかにすることで転移のメカニズムの解明につながることが期待できる。大腸癌の粘膜側、中心部、漿膜側からマイクロRNAを抽出し、癌に関与する84種類のマイクロRNAの測定を行った。27種類で腫瘍内不均一性を認め、がん抑制に関わるmiR-34a、miR30-cの発現が漿膜側で低下していた。また、血液検体から採取したマイクロRNAの発現と比較したところ、漿膜側のプロファイルが類似していた。マイクロRNAの発現において、癌の漿膜側から検体を採取することで癌の浸潤能、転移能を正しく反映した結果を得ることができた。自治医科大学附属さいたま医療センターで採取した大腸癌切除標本のうち、転移を伴う大腸癌の検体を選択し、正常大腸粘膜、大腸癌部については粘膜側、中心、漿膜側のそれぞれからmicroRNAを抽出した。microRNA用のcancer panel(Cancer Focus microRNA PCR Panel(Exiqon社))を用い、癌に関与する84種類のmicroRNAの測定を行った。そのうち、27個のmicroRNAの発現で腫瘍内不均一性を認めた。特に注目した結果は、大腸癌においてtumor suppressor microRNA(がん抑制型microRNA)と考えられているmiR-34aの発現は粘膜側、中心部では同一患者の正常大腸粘膜の発現と同程度であったものの、漿膜側では1/2-1/3程度の発現になっていることが確認できたことであった。以前、われわれが報告したmRNA発現と同様に、microRNAの発現においても、癌の漿膜側から検体を採取することで癌の浸潤能、転移能を正しく反映した結果が得られることを示唆していると考えられた。また、同一患者の血液検体から採取したmicroRNAに対してもcancer panelを用いた測定を行っており、組織と血液のmicroRNA発現プロファイルを比較した。その結果、組織漿膜側のプロファイルの方がより血液の発現プロファイルに近いことが判明した。癌の漿膜側での検体を用いることで血液中に移行する癌細胞の状態をとらえることができると考えられた。上記実験に加え、転移を有さない大腸癌の検体でも大腸癌部の中心部と漿膜側のmicroRNA発現をcancer panelを用いて測定し比較した。36個のmicroRNAの発現に差を認め、現在解析中である。Cancer panelの実験の際に用いる予定だった抽出済みRNAが分解されてしまっていたため、検体からmicroRNA測定用のRNAを再度抽出し、品質確認を行ったため時間を要した。また、当初、血液検体の解析の際に非担癌患者の血液検体から抽出したmicroRNAをコントロールとして用いたが、性別、年齢に差があったため、より今回の実験の対象患者に近いプロファイルのコントロール用microRNAを準備した。これらの理由により、当初計画よりも進捗がやや遅くなってしまった。RNA再抽出、コントロール用血漿microRNA採取後は概ね予定通りに進捗している。大腸癌におけるtumor suppressor microRNA(がん抑制型microRNA)と考えられているmiR-34aの発現については10検体から抽出した計50箇所のRNAを用いq-RTPCRを施行し、バリデーションを行った。その結果、粘膜側、中心部では同一患者の正常大腸粘膜の発現と同程度であったものの、漿膜側では有意に発現が低下している(p=0.03)ことが確認できた。また、同様にtumor suppressor microRNAと考えられているmiR30-cにおいても有意差はなかったが漿膜側で発現低下している傾向を認めた(p=0.06)。いずれも転移を有さない大腸癌の検討では漿膜側とそれ以外の部位で発現差を認めなかった。また、同一患者の血液検体から採取したmicroRNAに対してもcancer panelを用いた測定を行っており、組織と血液のmicroRNA発現プロファイルを比較し、組織漿膜側のプロファイルの方がより血液の発現プロファイルに近いことが判明し、癌の漿膜側での検体を用いることで血液中に移行する癌細胞の状態をとらえることができると考えられた。

実験手法、解析手法については確立されてきているので、これまでよりもスムーズに行うことができると考えている。検体採取においては、自治医科大学さいたま医療センターに所属する臨床医や大学院生のより一層の協力を要請する。29年度が最終年度であるため、記入しない。消化器外科学29年度が最終年度であるため、記入しない。
電磁力による衝撃波層増大効果を用いたアーク気流のエンタルピー同定法の開発

昨年度は、真鍮をカバー材料に用いた水冷式プローブを開発し、JAXA大型アーク風洞にて耐熱試験(加熱率は3.6 MW/m2)を実施したところ、プローブ内部の温度上昇は20 K程度、カバー材も無損傷などの良好な結果を得た。しかし、電磁力の発生には、プローブ材は、電気的絶縁体であることが望ましいため、本年度は、プローブのカバー材をセラミック(窒化ケイ素)に変更し、さらにネオジム磁石を搭載して、再びJAXAアーク風洞での試験を実施した。熱設計では、一次元熱解析を行い、熱応力による熱破壊の安全率が5程度となるように設計した。アーク風洞の試験条件は、放電電流が300, 500, 700 Aとし、磁石ありとなしの二種類のプローブを使用した。なお、Φ40 mmの円柱ガードンゲージを用いた場合の加熱率は、それぞれ2.14, 2.95, 3.75 MW/m2であった。加熱後、窒化ケイ素カバーの表面には、アーク由来の酸化銅が付着し、多少の変色が見られたが、目立った損傷はなかった。また、模型加熱面の温度を、サーモグラフィーで撮影したところ、700 Aの場合は、加熱面の外周付近の温度が、一次元解析よりも200 K程度が高いことがわかった(それでも熱破壊の安全率は、まだ2よりも大きい)。しかし、700 Aで加熱を繰り返したところ、突然、模型が壊れた。この原因ははっきりしていない。一方、冷却水の温度上昇は10 K以下に保たれており、内部磁石の消減磁も発生せず、設計したプローブは、非常に良好な内部冷却性能を有することがわかった。また、磁場ありとなしの場合で、発光分光計測を実施し、スペクトルおよび衝撃層厚みの比較を実施したが、残念ながら優位な差が見られなかった。この原因は、気流がほとんど電離していないためと考えられるため、今後は、少量の電離シード材を気流に混ぜて計測を実施する必要があることがわかった。JAXAアーク気流で電磁力を用いたエンタルピー決定実験を実施するため、本年度は、数値計算による衝撃層拡大予測とJAXAアーク気流での磁石搭載型供試体の予備加熱試験を行った。1.衝撃層拡大と衝撃層内の熱化学非平衡状態の数値計算による予想JAXAアーク気流が1%電離していると仮定し、0.5Tの磁場を印加した場合の衝撃層変化を数値計算により調べた。電磁力により衝撃層は大きく拡大し,衝撃層内に温度平衡領域が現れた。ただし、化学平衡状態には至らず、おそらく化学平衡を衝撃層内に作るのは難しいことが示唆された。しかし、工程は増えるが、輻射スペクトル解析法を工夫すれば、熱平衡だけでもエンタルピーを決定できるため、大きな問題とはならない。また、JAXAのアーク気流は1%も電離していないことも考えらえるため、電離種としてカリウムを1%添加した計算を行ったところ、前述の計算と同じ大きな衝撃層拡大が得られ、熱平衡領域が出現することがわかった。2.磁石搭載型供試体の予備加熱試験本研究の供試体は、アーク気流の加熱に耐えるだけでなく、搭載された磁石が熱消磁を起こさないように、供試体内部への熱流入をシャットアウトする必要がある。これを可能にする材料を調べるため、一次元熱伝導解析を用いて、加熱量と加熱時間をパラメータにとり、様々なセラミックスの耐熱性を調べた。その結果、改良型チタン酸アルミ(レコジット)および窒化ケイ素が、有望な候補であることがわかった。そこで、これらの材質で供試体を製作し、磁石の熱消磁の有無を確認する予備試験をJAXAアーク気流で行った(加熱は最大加熱の1/3である2MW/m2の条件)。結果として、どちらの材質でも磁石の熱消磁は起こらなかった。また、最大加熱の条件下で試験しても供試体が再利用出来ることを目指すと、窒化ケイ素を用いて、試験模型内部を水冷する方式が最も有望であることもわかった。数値計算による予測・磁石搭載型供試体の設計・予備加熱試験を実施済みであり、良好な結果を得ている。従って、次年度の本試験(発光分光によるエンタルピー決定)の準備が滞りなくできていると言え、順調に進んでいる。本研究は、アーク気流のエンタルピーを高精度で計測可能な電磁力プローブの開発を目指している。このプローブは、電磁力を用いて衝撃層を拡大し、衝撃層内に熱平衡領域を強制的に出現させる。これにより、様々な気流条件下において、発光分光による高精度エンタルピー計測が可能になる。本年度は、前年度に行った宇宙科学研究所(ISAS)750 kW大型アーク風洞での耐熱試験結果により、プローブ材料の耐熱性およびネオジウム磁石の熱消磁の観点から、試験模型は水冷する必要があることがわかったため、新設計の水冷式プローブの開発を行った。開発したプローブは、ISASアーク風洞を用いて、加熱率3 MW/m2の条件下で一分間の長時間耐熱試験に供された。加熱試験中の冷却水温度上昇は、10度程度に留まり、プローブ内部外部ともに、非常に良好に冷却できた。結果として、開発したプローブは、ネオジウム磁石を無消磁で搭載可能、かつ長時間試験が可能であることがわかった。

但し、今回の試験では、納期の関係で、プローブの外部材料にセラミックス(電磁力の発生には、プローブ表面材料は非電導性が望ましい)の代わりに、類似の熱的材料特性を持つ真鍮を用い、磁石にもダミーの真鍮を用いているため、電磁力はまだ発生できていない。また、今回の試験では、衝撃層からの発光分光計測も行った。得られた発光スペクトルからボルツマンプロット(熱平衡を要求する)を行い、電子温度の導出を試みた。しかし、データのばらつきが大きく、結果として、電子励起が非平衡状態にあり、通常の衝撃層内は熱非平衡状態である事が確認できた。今後は、プローブ表面材料をセラミックス(材質は窒化ケイ素)に交換し、かつネオジム磁石および強磁場発生用コイルを搭載した試験を行い、電磁力衝撃層拡大を試みる。また合わせて、発光分光を行って、電磁力により衝撃層内に熱平衡領域が出現するか評価し、電磁力プローブの実証を目指す。セラミックスの業界の好景気による長納期化により、本年度の本試験(ISASアーク風洞を利用)には、セラミックス模型が間に合わなかった。しかし、本試験では、代替材料に真鍮を用いて加熱試験を行い、電磁力プローブの耐熱性の確認はできており、また発光分光試験も順調にデータを取得できたため、来年度はセラミックスを用いた電磁力衝撃層増大試験および発光分光試験が順調に行える予定である。昨年度は、真鍮をカバー材料に用いた水冷式プローブを開発し、JAXA大型アーク風洞にて耐熱試験(加熱率は3.6 MW/m2)を実施したところ、プローブ内部の温度上昇は20 K程度、カバー材も無損傷などの良好な結果を得た。しかし、電磁力の発生には、プローブ材は、電気的絶縁体であることが望ましいため、本年度は、プローブのカバー材をセラミック(窒化ケイ素)に変更し、さらにネオジム磁石を搭載して、再びJAXAアーク風洞での試験を実施した。熱設計では、一次元熱解析を行い、熱応力による熱破壊の安全率が5程度となるように設計した。アーク風洞の試験条件は、放電電流が300, 500, 700 Aとし、磁石ありとなしの二種類のプローブを使用した。なお、Φ40 mmの円柱ガードンゲージを用いた場合の加熱率は、それぞれ2.14, 2.95, 3.75 MW/m2であった。加熱後、窒化ケイ素カバーの表面には、アーク由来の酸化銅が付着し、多少の変色が見られたが、目立った損傷はなかった。また、模型加熱面の温度を、サーモグラフィーで撮影したところ、700 Aの場合は、加熱面の外周付近の温度が、一次元解析よりも200 K程度が高いことがわかった(それでも熱破壊の安全率は、まだ2よりも大きい)。しかし、700 Aで加熱を繰り返したところ、突然、模型が壊れた。この原因ははっきりしていない。一方、冷却水の温度上昇は10 K以下に保たれており、内部磁石の消減磁も発生せず、設計したプローブは、非常に良好な内部冷却性能を有することがわかった。また、磁場ありとなしの場合で、発光分光計測を実施し、スペクトルおよび衝撃層厚みの比較を実施したが、残念ながら優位な差が見られなかった。この原因は、気流がほとんど電離していないためと考えられるため、今後は、少量の電離シード材を気流に混ぜて計測を実施する必要があることがわかった。発光分光系の構築・輻射解析の準備を次年度前半で行い、山口大学の小型アーク風洞において、開発済みの磁石搭載型試験模型を用いた予備試験を行う。後半では、JAXAアーク風洞にて本試験を行い、エンタルピー決定実験を行う。本年度開発した電磁力プローブの外面材料をセラミックス(窒化ケイ素)に交換し、ネオジウム磁石を搭載した電磁力発生試験を行う。合わせて、発光分光を行って、電磁力により衝撃層内に熱平衡領域が出現するか検証する。
エピジェネティクスに注目したGABAB1a発現制御の病態的意義に関する研究

これまでの検討から我々は、エピジェネティクスの変動による背側縫線核の興奮制御異常が環境要因による精神疾患の発症/病態に関与する可能性を想定している。本研究では、社会的敗北ストレス負荷マウスの背側縫線核におけるGABA/5-HT神経系関連遺伝子の発現変動やエピジェネティクス変動と、大脳皮質前頭前野における5-HT神経系の機能変調を明らかにした。これら異常が精神機能異常に関与する可能性が考えられる。本年度は、うつ病モデルとしてよく用いられる社会的敗北ストレス負荷マウスおよびコルチコステロン慢性投与マウスの背側縫線核におけるGABAB1a mRNA発現量の解析と、GABAB1aの転写制御における最初期遺伝子Egr-1の関与について検討した。10日間の社会的敗北ストレス負荷により社会的回避行動が誘発されたマウスでは、背側縫線核のGABAB1a mRNA発現量が減少していることを見出した。こうしたマウスの背側縫線核ではセロトニン代謝回転が減少していることや、選択的セロトニン再取り込み阻害薬であるフルオキセチンの14日間投与により背側縫線核のGABAB1a mRNA発現量が増加することから、GABAB1aの転写調節にセロトニンシグナルが関与している可能性が示された。加えて、コルチコステロン慢性投与マウスの背側縫線核においてもGABAB1a mRNAの減少傾向を見出していることから、背側縫線核のGABAB1aの発現減少がうつ様状態に部分的に関与する可能性が考えられた。また、マウス神経芽細胞腫由来細胞株Neuro2a細胞を用いた検討から、GABAB1aの転写開始点周辺のCpGアイランドにEgr-1が結合することを明らかにした。さらに、protein kinase C活性化剤であるPhorbol 12-myristate 13-acetateの添加によりEgr-1の発現を誘導させることで、GABAB1aの転写開始点周辺のCpGアイランドにおけるEgr-1の結合量が増加することを見出した。本結果から、Egr-1は発現量に依存して結合量が変動することが示された。社会的敗北ストレス負荷マウスやコルチコステロン慢性投与マウスの背側縫線核におけるGABAB1aのmRNA発現減少や、GABAB1aの転写開始点周辺のCpGアイランドにおけるEgr-1の結合を見出すなど、今後の研究の足がかりを得られているため。本年度は、社会的敗北ストレス負荷によるセロトニン神経系の異常に関わるエピジェネティクス制御機構の解析を行った。昨年度までに、10日間の社会的敗北ストレスを負荷されたマウスでは、背側縫線核においてGABAB1a mRNA発現量が減少していることを見出してきた。加えて本年度では、背側縫線核においてセロトニン神経系関連遺伝子の発現量についても解析を行った。その結果、社会的敗北ストレス負荷マウスでは、セロトニン合成酵素であるTph2のmRNA発現量が顕著に増加していることを見出した。Tph2の増加はタンパク質レベルでも確認できた。また、セロトニン神経系の機能面として、社会的敗北ストレス負荷マウスでは背側縫線核のセロトニン代謝回転が減少し、大脳皮質前頭前野のセロトニン代謝回転が増加していることを見出した。さらに、in vivo脳微小透析法による解析から、社会的敗北ストレス負荷マウスでは大脳皮質前頭前野の細胞外セロトニン量が増加していることも明らかにした。こうした結果から、社会的敗北ストレス負荷マウスでは、背側縫線核から大脳皮質前頭前野に投射するセロトニン神経系に異常が生じているものと考えられた。そこで、このセロトニン神経系の異常に関わるエピジェネティックな変動を明らかにするために、社会的敗北ストレス負荷マウスの背側縫線核において顕著な発現増加が見られたTph2遺伝子のDNAのメチル化レベルを、Methylated CpG island recovery assayにより解析した。その結果、Tph2遺伝子内にあるCpGアイランドの1つにおいて、DNAメチル化の減少が見られた。本成果は、社会的敗北ストレスの負荷により背側縫線核においてTph2遺伝子のDNAメチル化が減少することで、セロトニン神経系の機能異常が生じる可能性を示すものである。本年度は、社会的敗北ストレス負荷マウスおよびコルチコステロン慢性投与マウスの背側縫線核において、GABAB1aの転写開始点周辺のDNAメチル化レベル、ヒストンアセチル化レベルを解析する。加えて、これらマウスでみられる異常行動と背側縫線核のGABAB受容体との関連性を行動薬理学的に解析する。また、Egr-1の発現とGABAB1aのエピジェネティクス変動との関連性を明らかにするために、in vitroにおいて、Egr-1の発現誘導がGABAB1aの転写開始点周辺のDNAメチル化レベル、ヒストンアセチル化レベルに与える影響を解析する。加えて、Egr-1とDNAメチル基転移酵素やヒストン脱アセチル化酵素の相互作用を明らかにする。

神経精神薬理本年度実施予定であった比較的高価な試薬を用いたエピジェネティクス解析を次年度に回し、次年度実施予定であった比較的費用のかからないEgr-1の解析を前倒ししたため。次年度は、本年度見出した結果を足がかりとし、比較的高価な試薬を用いたエピジェネティクス解析を推進する。
マイクロ波複素誘電率走査測定用センサの開発

本研究は、マイクロ波複素誘電率を測定することにより、極地の氷床から掘削される氷床コアの含有不純物量の測定を高分解能で非破壊で簡便に行なうシステムを開発することが目的であった。氷床コアに含まれる酸や塩の不純物の解析は、その氷が形成された年代の産業公害や地球環境を知る上で欠かせないものである。ところがこのような解析に化学分析を行なった場合それにかかる手間と時間は膨大なものであるため、これに変わる簡便高能率解析手法としてこの開発研究を行なった。研究の結果、ピンホール付空洞共振器を用いて空間分解能約2mmで、誘電率実数部を測定することに成功した。しかしながら、誘電率の測定分解能は約1程度と大きく、また、誘電率の虚数部は検知できていない。測定分解能の向上と虚数部の測定は今後の課題である。研究は以下の手順でおこなった。まず、測定センサとしてピンホール付空洞共振器を作成し、マイクロ波信号発信源、ロックインアンプ、検波ダイオードを用いて測定システムを構成した。そして、測定系が任意の物質に適用できるようにするために、テフロン、水晶、それに、複数種の有機物質を被測定サンプルとして用い、システムの校正をおこなった。氷床コアを用いた実測は今後の課題である。
閉鎖性水域における密度躍層の影響に関する研究

密度が不連続となる密度躍層で乱れによる拡散,混合が抑制される現象は海洋や大気中の成層化された流体中で普通に起こっている現象であり,汚染物質の拡散や熱の輸送とも直接関係するので環境問題を考える上で非常に重要な現象である.このような現象を引き起こす密度躍層の形成の機構を調べるため,この現象を引き起こす支配的な構造を実験と理論計算によって抽出し,これをモデル化することを試みた.まず実験室において密度躍層の形成と連行を再現する.まず閉鎖性水域における吹送流による混合の最も簡単な実験モデルとして成層キャビティ流の実験装置を製作した.アクリル板で組み立てたキャビティの上部で樹脂ベルトをモーターで移動させる.シャドウグラフ法,トレーサー法による流場の可視化を行い,ディジタルビデオカメラでコンピューターに取り込んで画像解析を行った.次に,密度の微小な変化や密度の不連続面である密度躍層を取り扱うため,これまで我々が開発してきた密度成層流の計算方法を用い,実験と同じ成層キャビティ流について直接シミュレーションを行った.計算結果と実験結果を比較検討した結果,密度界面近傍の流場は主流のせん断層が3次元的な不安定性に見舞われ,流れの方向に軸を持つ縦渦が形成されことが明らかになった.これは反対回転の縦渦が交互に一列に並んだ構造であり,この縦渦が密度界面を変形して下層の流体を持ち上げるため,密度界面を通した混合を促進することが示された.密度が不連続となる密度躍層で乱れによる拡散,混合が抑制される現象は海洋や大気中の成層化された流体中で普通に起こっている現象であり,汚染物質の拡散や熱の輸送とも直接関係するので環境問題を考える上で非常に重要な現象である.このような現象を引き起こす密度躍層の形成の機構を調べるため,この現象を引き起こす支配的な構造を実験と理論計算によって抽出し,これをモデル化することを試みた.まず実験室において密度躍層の形成と連行を再現する.まず閉鎖性水域における吹送流による混合の最も簡単な実験モデルとして成層キャビティ流の実験装置を製作した.アクリル板で組み立てたキャビティの上部で樹脂ベルトをモーターで移動させる.シャドウグラフ法,トレーサー法による流場の可視化を行い,ディジタルビデオカメラでコンピューターに取り込んで画像解析を行った.次に,密度の微小な変化や密度の不連続面である密度躍層を取り扱うため,これまで我々が開発してきた密度成層流の計算方法を用い,実験と同じ成層キャビティ流について直接シミュレーションを行った.計算結果と実験結果を比較検討した結果,密度界面近傍の流場は主流のせん断層が3次元的な不安定性に見舞われ,流れの方向に軸を持つ縦渦が形成されことが明らかになった.これは反対回転の縦渦が交互に一列に並んだ構造であり,この縦渦が密度界面を変形して下層の流体を持ち上げるため,密度界面を通した混合を促進することが示された.
二枚貝を飛躍的に成長させるプレバイオティクス仮説の検証

アサリなどの二枚貝種苗生産の安定化や低コスト化には,高機能餌料の安定供給技術が必要不可欠である。本研究では,餌料用微細藻類とアルギン酸の併用給餌による餌料効果の向上および餌料効果におけるアルギン酸の機能解明を目的とした。給餌試験の結果,餌料効果は低いが大量生産可能なナンノクロロプシスと低分子化アルギン酸を併用給餌することにより,高い餌料効果が認められた。また,消化管内の細菌叢解析により,飼育・餌料環境がアサリ消化管内の細菌叢に影響を与えることが示唆された。以上より,安価で大量生産可能な餌料用微細藻類とアルギン酸の併用給餌は,二枚貝種苗生産の安定化や低コスト化に寄与する可能性がある。我が国で急務とされる激減したアサリ資源の回復を実現するためには、種苗生産の安定化や低コスト化に加え、高機能餌料の安定供給技術の開発が必須である。これまでに筆者らは、アルギン酸(褐藻類などに含有する酸性多糖)がアサリの成長促進成分であることを見出した。本研究では、安価で大量生産可能な微細藻類ナンノクロロプシスとアルギン酸を併用することにより、低コストで飛躍的に餌料効果を向上させる給餌法の開発と成長促進機序の解明を目的とした。飼育水量が0.5 Lの小規模給餌試験により、微細藻類とアルギン酸の併用効果を検証した。アサリ稚貝の成長が最も良い25°Cの飼育条件では、ナンノクロロプシス(20万cells/mL)にアルギン酸分解物(4 mg/L)を添加した給餌区において、ナンノクロロプシス単独給餌区を上回る餌料効果が認められた。同様に、ナンノクロロプシスの代わりに海産ミドリムシであるユーグレナを使用した給餌試験において、アルギン酸分解物のアサリ稚貝に対する成長促進効果が認められた。また、アルギン酸の加水分解の有無によるアサリ稚貝に対する成長促進効果を給餌試験により判定した結果、アルギン酸の分解の有無によりアサリ稚貝の成長に差異が認められなかったことから、アルギン酸の分子サイズはアサリ稚貝の成長に影響しないことが示唆された。さらに、アサリ稚貝における糖類の取り込み様式を明らかにするために、蛍光標識グルコース(2-NBDLG)を用いた蛍光イメージングを行った結果、蛍光標識グルコースの添加直後からアサリ稚貝体内において局所的なシグナルが検出されたことから、アサリに摂餌された糖類は短時間で消化器官へ到達することが示唆された。以上より、ナンノクロロプシスとアルギン酸の併用は、低コストでアサリ稚貝に対する餌料効果を向上できる給餌法として大いに期待できる。当該年度の研究では、安価に大量生産可能なナンノクロロプシスとアルギン酸分解物の併用により、ナンノクロロプシス単独給餌区より高いアサリに対する成長促進効果が得られた。また、海産ミドリムシであるユーグレナにおいても同様の餌料効果が実証されたことから、当初の計画が順調に進展していると判断できる。一方、本研究では、これまで餌料効果が低いと認識されてきたナンノクロロプシスにおいて、キートセロスと同等の餌料効果が認められたことから、今後、ナンノクロロプシスの培養条件毎の栄養成分評価を行う必要がある。本研究の特筆すべき成果は、安価に大量生産可能なナンノクロロプシスや冬季の低水温環境下において増殖可能なユーグレナとアルギン酸分解物を併用することにより、アサリ稚貝に対する十分な餌料効果を明らかにした点である。現段階では、小規模給餌試験による効果実証のため正確な試算を行うことはできないものの、ナンノクロロプシスやユーグレナとアルギン酸分解物を併用した給餌は、高栄養であるが生産コストの高いキートセロスやパブロバなどの餌料を給餌する場合と比べ、大きなコスト削減につながると期待できる。さらに、計画していたアサリ稚貝の糖類取り込み機構と局在部位の可視化、および実用規模の給餌条件の検討についても順調に推移しており、次年度実施予定であるアサリ消化器官内の細菌叢解析に関する予備試験も今年度中に実施することができた。以上のことから、当該年度の研究成果は、低コストでアサリ稚貝に対する餌料効果を向上できる給餌法の開発に貢献するものであり、研究は当初の計画通りに遂行できたと判断した。本研究では、安価で大量生産可能な微細藻類ナンノクロロプシスとアルギン酸の併用給餌効果を検証するとともに、消化管内に存在する桿晶体の細菌叢を解析することにより、アルギン酸添加による成長促進機序の解明を目的とした。飼育水量が20Lの給餌試験により、微細藻類とアルギン酸の併用効果を検証した。20日間の給餌を行った結果、ナンノクロロプシスにアルギン酸分解物を添加した給餌区において、既存の餌料種であるキートセロスと同等もしくは若干上回るアサリ稚貝に対する餌料効果が認められた。しかし、ナンノクロロプシスの単独給餌区では、キートセロスより有意に成長が低下した。以上より、ナンノクロロプシスとアルギン酸の併用給餌は、アサリ種苗生産における有効な給餌法となり得ることが示唆された。

一方、殻長2.3mm程度のアサリを収容したゲージを現場海域に14日間設置し、試験開始および終了日に桿晶体を摘出して次世代シークエンサーによる細菌叢解析を実施した。同様に、殻長2.3mm程度のアサリを用いて室内にて給餌試験を行い、キートセロスおよびナンノクロロプシス単独給餌区に加え、両種とアルギン酸の併用給餌区を設定して給餌試験を行った。14日間の給餌後、桿晶体を摘出して次世代シークエンサーによる細菌叢解析を実施した。細菌叢解析の結果、アサリ桿晶体の細菌叢は、現場海域で飼育した場合と室内で飼育した場合で大きく異なっていた。しかし、室内給餌試験における餌料生物種やアルギン酸添加の有無による明瞭な細菌叢の変化は認められなかった。アサリなどの二枚貝種苗生産の安定化や低コスト化には,高機能餌料の安定供給技術が必要不可欠である。本研究では,餌料用微細藻類とアルギン酸の併用給餌による餌料効果の向上および餌料効果におけるアルギン酸の機能解明を目的とした。給餌試験の結果,餌料効果は低いが大量生産可能なナンノクロロプシスと低分子化アルギン酸を併用給餌することにより,高い餌料効果が認められた。また,消化管内の細菌叢解析により,飼育・餌料環境がアサリ消化管内の細菌叢に影響を与えることが示唆された。以上より,安価で大量生産可能な餌料用微細藻類とアルギン酸の併用給餌は,二枚貝種苗生産の安定化や低コスト化に寄与する可能性がある。実用規模試験による微細藻とアルギン酸分解物を併用した給餌法の有用性検証では、初年度の研究成果を踏まえ、ナンノクロロプシスとアルギン酸分解物を併用した給餌によるアサリの成長促進効果を実用規模で検証し、「劇的な餌料コスト削減」手法を実証する。なお、アサリ種苗生産の状況によっては20 L程度の飼育容量で試験を実施し、実用レベルにおけるアルギン酸分解物の使用方法や注意点等を明確にする。天然海域および室内実験試料の細菌叢解析(次世代シークエンサーを用いたメタゲノム解析)では、種苗生産によって得た殻長15 mm前後のアサリ稚貝を用いた小規模給餌試験を実施し、ナンノクロロプシス給餌区およびナンノクロロプシスとアルギン酸分解物給餌区のアサリ殻長、軟体部重量、生残率などの測定を実施するとともに、アサリより桿晶体などを摘出する。一方、山口県内に設けた複数のアサリ資源調査定点に殻長15 mm前後のアサリ稚貝をゲージにより周辺生物から隔離して放流し、室内実験と同様、各定点のアサリ殻長、軟体部重量、生残率の測定を実施した後、アサリより桿晶体などを摘出する。得られた試料から、16S rRNA領域増幅用プライマーによりPCR増幅を行い、Miseq次世代シークエンサーによる16S rRNA細菌叢解析を実施する。得られた解析結果から、室内実験区における細菌叢の差異を比較し、プレバイオティクスとして機能していると推定されるアルギン酸が細菌叢を変え得るのかについて検証する。また、各天然海域における細菌叢の差異を比較し、二枚貝の生理生態における細菌の役割や細菌叢の解析でアサリ活力を判定し得るのかについて検証する。水圏応用科学給餌試験が順調に推移したため、当初の計画より若干微細藻類購入費が安価となったことから、当該助成金が生じた。生じた助成金は、翌年度分として請求した除籍金と合わせ、細菌叢解析費用に利用する予定である。
遺伝子治療用アデノウイルスベクターの高生産バイオリアクタープロセスの開発

アデノウイルスベクターは患者の細胞に治療のための遺伝子を導入する遺伝子治療用のベクターとして近年多用されてきており,高品質のアデノウイルスベクターを効率良く大量生産可能な技術の確立が急務となっている.アデノウイルスベクターの生産は,ヒト胎児腎臓細胞由来の293細胞などのベクター産生細胞をあらかじめ培養し増殖させた後,これに少量のアデノウイルスベクターを感染させ細胞内で増殖させることによって行われる.本研究は,アデノウイルスベクターを高生産可能なバイオリアクタープロセスを開発することを目的として,基盤となる技術の構築を検討した.本年度は,アデノウイルスベクターの293細胞への感染特性および細胞内における増殖特性の解明を試みた.まず,アデノウイルスベクター生産に及ぼすウシ胎児血清の影響を調べたところ,アデノウイルスベクター感染後に血清無添加の基本合成培地を用いて培養を行った場合,細胞1個あたりのアデノウイルスベクターの生産量は,血清添加培地を用いた場合の約70%となることがわかった.このことから,培養途中で培地を血清無添加の基本培地に変更する二段階培養によるアデノウイルスベクターの効率的生産の可能性が示唆された.また,平均孔径60μmのポリビニルポルマール樹脂多孔質体粒子(2×2×2mm)に293細胞を固定化し,固定化細胞によるアデノウイルスベクターの生産を試みたところ,多孔性粒子内に高密度に固定化された293細胞を用いてもアデノウイルスベクターを生産可能であることがわかった.アデノウイルスベクターは患者の細胞に目的の遺伝子を導入する遺伝子治療用のベクターとして多用されてきており,高力価のアデノウイルスベクターを効率良く大量生産可能な技術の確立が急務となっている.アデノウイルスベクターの生産は,ヒト胎児腎臓細胞由来の293細胞などのベクター産生細胞をあらかじめ培養し増殖させた後,これにアデノウイルスベクターを感染することによって行われる.本研究は,アデノウイルスベクターを高生産可能なバイオリアクタープロセスを開発することを目的として,基盤となる技術の確立を目指すものである.本年度はまず,293細胞の増殖特性の解明を試みた.293細胞は本来培養器壁に付着伸展した状態で生育する付着性の細胞であるが,浮遊懸濁状態で生育しうるように馴化したアデノウイルスベクター未感染の293細胞を用いて,静置培養および振とう培養を行い,増殖曲線を作成した.その結果,振とう培養下における293細胞の比増殖速度や到達細胞密度は,静置培養下において得られた値と比べて同等以上であり,バイオリアクターを用いた浮遊懸濁状態での293細胞の大量培養の可能性が示唆された.また,比較的孔径の小さい多孔性粒子とともに振とう培養を行うことにより293細胞を粒子内に播種し,適時培地交換しながら培養を継続した.粒子内に捕捉された細胞の密度を生細胞によるテトラゾリウム塩の還元活性に基づき評価したところ,粒子1cm^3あたり10^7cells以上の高密度の固定化培養が達成できることがわかった.アデノウイルスベクターは患者の細胞に治療のための遺伝子を導入する遺伝子治療用のベクターとして近年多用されてきており,高品質のアデノウイルスベクターを効率良く大量生産可能な技術の確立が急務となっている.アデノウイルスベクターの生産は,ヒト胎児腎臓細胞由来の293細胞などのベクター産生細胞をあらかじめ培養し増殖させた後,これに少量のアデノウイルスベクターを感染させ細胞内で増殖させることによって行われる.本研究は,アデノウイルスベクターを高生産可能なバイオリアクタープロセスを開発することを目的として,基盤となる技術の構築を検討した.本年度は,アデノウイルスベクターの293細胞への感染特性および細胞内における増殖特性の解明を試みた.まず,アデノウイルスベクター生産に及ぼすウシ胎児血清の影響を調べたところ,アデノウイルスベクター感染後に血清無添加の基本合成培地を用いて培養を行った場合,細胞1個あたりのアデノウイルスベクターの生産量は,血清添加培地を用いた場合の約70%となることがわかった.このことから,培養途中で培地を血清無添加の基本培地に変更する二段階培養によるアデノウイルスベクターの効率的生産の可能性が示唆された.また,平均孔径60μmのポリビニルポルマール樹脂多孔質体粒子(2×2×2mm)に293細胞を固定化し,固定化細胞によるアデノウイルスベクターの生産を試みたところ,多孔性粒子内に高密度に固定化された293細胞を用いてもアデノウイルスベクターを生産可能であることがわかった.
透明性圧縮木材

本研究では,スギ・ヒノキ・カラマツ・アカマツの圧縮木材の透明性発現機構の解明を目的に,次の二つの機構に着目した観点から,圧縮木材の透明性発現機構を実験的に検討した.(1)樹脂流動モデル:圧縮木材中にごくわずかに存在する空隙部への樹脂成分が充満することにより空隙部が著しく減少し,光が伝播できるようになり,透明性が発現するモデル.(2)細胞壁液化流動モデル:細胞壁自体が部分的に変化し,液化した物質がごくわずかに存在する空隙部を充満することにより光が伝播できるようになり,透明性が発現するモデル.本年度は,透明性発現挙動に対する前年度の実験結果をもとに,新たな実験手法を開発し,透明性発現機構について実験的に調べた.特に,試料木材としてツキ板を用いる精密圧縮法を開発し,この手法により,辺材部と晩材部に分けて,また,柔細胞あるいは垂直樹脂道を含む領域と含まない領域を分けて,それぞれ,選択的な大圧縮を行うことが初めて可能となり,透明性発現過程を組織別に把握することが可能になった.その結果,スギの心材を一例にとると,その辺材部と晩材部では,透明性発現機構が異なる実験結果が得られた.特に,スギ心材の辺材部についでは,柔細胞が存在しない狭い領域を選択的に圧縮した場合であっても透明性が発現した.この実験結果は,スギ心材の辺材部については,少なくとも柔細胞から流出する樹脂成分の移動現象以外の機構により透明性が発現することを示唆している.本研究では,スギ・ヒノキ・カラマツ・アカマツを試料木材として取り上げ,圧縮木材の透明性発現機構を実験的に解明することを目的としている.平成21年度は,(1)透明性発現条件の解明と(2)透明性発現開始組織の特定と伝播過程の解明を行った.まず.透明性発現条件の解明については,樹脂が柔細胞から分泌されるスギとヒノキ,樹脂が樹脂道から分泌されるカラマツについて,透明性発現(透過率)に対する圧縮量(比重),含水率,木取り条件(心材,辺材),圧縮形状の簡易永久固定処理条件(熱処理温度と熱処理時間)の影響を実験的に検討した.その結果,比較的低温の熱処理条件下においても透明性が発現すること,熱処理温度が高くなるに従い透明性が発現する熱処理時間が短くなること,熱処理温度・熱処理時間により透過率が変化すること,含水率が高いと透明性が発現しやすいものの特有な割れ現象が発生し易くなること等を明らかにした.また,板目面や柾目面よりも木口面の透過率が高いことなど,光伝播について異方性が存在することについても明らかにした.次に,透明性発現開始組織の特定と伝播過程の解明については,圧縮されたスギとヒノキの各組織(仮道管,柔細胞,放射組織など)に着目して透明性発現組織と透明性伝播過程について実験的に検討した.その結果,透明性発現領域は,木材内の特定組織に対応した一定寸法をもつスポット状領域として発現し,熱処理時間が長くなるに従い,この領域が周囲に千鳥パターン的に拡大するなど,透明性発現組織と透明性伝播過程を明らかにした.本研究では,スギ・ヒノキ・カラマツ・アカマツの圧縮木材の透明性発現機構の解明を目的に,次の二つの機構に着目した観点から,圧縮木材の透明性発現機構を実験的に検討した.(1)樹脂流動モデル:圧縮木材中にごくわずかに存在する空隙部への樹脂成分が充満することにより空隙部が著しく減少し,光が伝播できるようになり,透明性が発現するモデル.(2)細胞壁液化流動モデル:細胞壁自体が部分的に変化し,液化した物質がごくわずかに存在する空隙部を充満することにより光が伝播できるようになり,透明性が発現するモデル.本年度は,透明性発現挙動に対する前年度の実験結果をもとに,新たな実験手法を開発し,透明性発現機構について実験的に調べた.特に,試料木材としてツキ板を用いる精密圧縮法を開発し,この手法により,辺材部と晩材部に分けて,また,柔細胞あるいは垂直樹脂道を含む領域と含まない領域を分けて,それぞれ,選択的な大圧縮を行うことが初めて可能となり,透明性発現過程を組織別に把握することが可能になった.その結果,スギの心材を一例にとると,その辺材部と晩材部では,透明性発現機構が異なる実験結果が得られた.特に,スギ心材の辺材部についでは,柔細胞が存在しない狭い領域を選択的に圧縮した場合であっても透明性が発現した.この実験結果は,スギ心材の辺材部については,少なくとも柔細胞から流出する樹脂成分の移動現象以外の機構により透明性が発現することを示唆している.