hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
生体深部病巣診断のための生体波動遠隔発生装置の開発

MRE法による生体深部病巣診断における生体遠隔加振法の確立を目的として,装置の試作と計測実験を行った.電磁式加振機により励起した弦の横振動を,支点により弦の縦振動に変換し振動変位を伝達する.弦の他端は,生体加振部を模擬した薄肉弾性板で構成される箱形構造体に連結され,弾性板に曲げ変形を生じさせ生体を加振する構造とした.つづいて,箱形構造の曲げ変形の高精度解析法を確立するため,軸弾性拘束を受けるL字型はりの非線形振動解析を行った.これより,実験でも測定された不規則的な応答をもふくむ非線形振動挙動を明らかにしたMRE法による生体深部病巣診断における生体遠隔加振法の確立を目的として,装置の試作と計測実験を行った.電磁式加振機により励起した弦の横振動を,支点により弦の縦振動に変換し振動変位を伝達する.弦の他端は,生体加振部を模擬した薄肉弾性板で構成される箱形構造体に連結され,弾性板に曲げ変形を生じさせ生体を加振する構造とした.つづいて,箱形構造の曲げ変形の高精度解析法を確立するため,軸弾性拘束を受けるL字型はりの非線形振動解析を行った.これより,実験でも測定された不規則的な応答をもふくむ非線形振動挙動を明らかにしたガンなどの生体内病巣を同定する検査手法の一つに,MRE(Magnetic resonance elastography)法がある.MRE法を高精度化するための課題の一つに,生体内に波動を発生させる装置の開発がある.この装置は,MRI装置近傍の強磁場(3T程度)環境下で使用できるとともに,粘弾性を伴う生体に対して,振幅と位相が既知となる高精度の波動を生成する必要がある.本研究では,生体波動遠隔発生装置を,薄肉弾性体の曲げ変形により振動変位を伝達する構成により構築することを目的とする.まず,装置の試作と計測実験を行うとともに,簡易モデルに基づく理論解析により,生体波動生成の条件を明らかにし,続いて,薄肉弾性体や支持部が有する非線形性の影響や,粘弾性生体内の波動を考慮した理論・数値解析と実験を行い,最適な加振条件をより精密に求めることを目的とする.そのためにまず,薄肉弾性体を用いた遠隔加振装置の試作を行った.具体的には,張力を与えた複数の弦により細長い薄板を懸架し,板の一端に接続した加振器により,板に振動を誘起した.加振器から十分に離れた位置での板の振動を含め,多点における薄板のたわみ変位について同時計測を行い,加振の効果を検証した.とくに,弦の張力により,はりに座屈後変形を与えることで,加振変位を約6倍に増幅し,ほぼ正弦波状の波形で伝達することができた.また,特定の振動数領域では,高調波成分,亜分数次調波成分の影響が大きい非周期応答として振動が伝達するため,遠隔加振装置としての使用にあたり注意を要することを明らかにした.さらに,粘弾性体の挙動を含む,MRE法による診断システムの数理模型の構築を行った.ガンなどの生体内病巣を同定する検査手法の一つに,MRE(Magnetic resonance elastography)法がある.MRE法を高精度化するための課題の一つに,生体内に波動を発生させる装置の開発がある.この装置は,MRI装置近傍の強磁場(3T程度)環境下で使用できるとともに,粘弾性を伴う生体に対して,振幅と位相が既知となる高精度の波動を生成する必要がある.本研究では,生体波動遠隔発生装置を,弦の振動や薄肉弾性体の曲げ変形により振動変位を伝達する構成により構築することを目的とする.まず,装置の試作と計測実験を行うとともに,簡易モデルに基づく理論解析により,生体波動生成の条件を明らかにし,続いて,薄肉弾性体や支持部が有する非線形性の影響や,粘弾性生体内の波動を考慮した理論・数値解析と実験を行い,最適な加振条件をより精密に求めることを目的とする.そのために,薄肉弾性体を用いた遠隔加振装置の改良・試作を行った.具体的には,電磁式加振機により弦の横振動を励起し,それを支点により弦の縦振動に変換する.その,弦の縦振動により振動変位を数m程度離れた距離まで伝達する.弦の他端は,生体加振部を模擬した薄肉弾性板で構成されるボックス構造体に連結され,弾性板に曲げ変形を生じさせることで,生体を加振する構成とした.加振部ならびに生体加振部に対応する薄肉弾性構造体の変位について同時計測を行い,加振の効果を検証した.その結果,ほぼ正弦波状の波形で振動伝達が可能な振動数領域の存在を確認した.また,特定の振動数領域では,高調波成分,亜分数次調波成分の影響が大きい非周期応答として振動が伝達することを把握した.ガンなどの生体内病巣を同定する検査手法の一つに,MRE(Magnetic resonance elastography)法がある.MRE法を高精度化するための課題の一つに,生体内に波動を発生させる装置の開発がある.この装置は,MRI装置近傍の強磁場(3T程度)環境下で使用できるとともに,粘弾性を伴う生体に対して,振幅と位相が既知となる高精度の波動を生成する必要がある.本研究では,生体波動遠隔発生装置を,弦の振動や薄肉弾性体の曲げ変形により振動変位を伝達する構成により構築することを目的とする.

まず,装置の試作と計測実験を行う.続いて,薄肉弾性体や支持部が有する非線形性の影響を考慮した理論解析を行うことを目的とする.そのために,薄肉弾性体を用いた遠隔加振装置の計測実験を行い,最適波動条件に関するデータベース構築を行った.具体的には,電磁式加振機により励起した弦の横振動を,支点により弦の縦振動に変換し,振動変位を数m程度離れた距離まで伝達する.弦の他端は,生体加振部を模擬した薄肉弾性板で構成されるボックス構造体に連結され,弾性板に曲げ変形を生じさせることで,生体を加振した.つづいて,ボックス構造を有する弾性板の曲げ変形の高精度解析法を確立するため,軸弾性拘束を受けるL字型はりの非線形振動解析を行った.線形ばねが付加されたL字はりの非線形振動問題に対し,形状関数を用いて修正ガラーキン法を適用した.これより,実験でも測定された不規則的な応答をもふくむ非線形振動挙動を明らかにした.
水俣病被害とその影響をふまえた水俣地域市民社会の再生に関する総合的研究

水俣病の発生が確認されて60年以上経た時点において、解決していない課題について、医療・健康的側面、自然生態系循環の側面、社会経済的側面から明らかにした。調査にあたっては水俣学研究の方法論に立脚し、かつ定性的・定量的の両面から分析し、水俣病という公害病の特性である社会的被害(水俣病被害者に対する差別と偏見)を明らかにし、今日もなお地域における環境影響と密接につながっており、それらが被害者の意識の求める補償と救済のあり方および望まれる地域社会ビジョンと連動していることを明瞭にした。本研究の出発点は、水俣病の発生の公式確認後60年近くが経過している今日においてなぜ水俣病問題の解決が実現できていないのか、なにが求められているのかを水俣学の方法を援用して明らかにし、将来への展望を示す根本的な解決ヘの道筋を提示することにある。本研究計画の第二年目は熊本の水俣病発生公式確認60年を迎える。そうした時間の経過と経験の蓄積、そして被害者たちの軌跡が、将来に何をもたらすのか、明確にかつ具体的に論じる時が来ている。そのような問題意識に立ち、第一年度は[医療と健康被害調査班][自然生態系と地域環境班][社会影響・経済分析班]の三つサブ研究班を構成し、研究代表の総括のもと、研究計画に従って調査研究を実施した。[医療と健康被害調査班]では、社会の中に埋め込まれた公害による疾病、水俣病の総合的検討を課題に、病像にかかる調査研究および研究会を行い、現在の問題に関する認識を共有するとともに、水俣病にかかる人権と差別の理論的・実証的研究の必要性を確認し、研究報告を行った。[自然生態系と地域環境班]では、水俣湾特に袋湾における自然生態系研究(海辺の生物調査)を実施中であるが、生活環境の土壌などの重金属汚染の状況の測定については延期、一年目の成果としては、国際水銀規制と水銀汚染サイトとしての水俣についての研究発表を行った。[社会影響・経済分析班]では、資料収集と住民インタビューを行った。また、水俣病発生公式確認60年に鑑み、2、3月に水俣病患者・被害者団体に協力を求め、約8千5百名を対象とした被害意識調査を実施し、有効回収数2585通の回答を得ることができた。水俣病研究史の中で被害住民をアンケートは初めてのものであり、回収データの転記・入力作業を終えることができた。これら三班の調査研究の総合的検討と成果発表は本年度以降に実施される。研究計画に示した[医療と健康被害調査班]における文献サーベイや健康調査は計画通り進めることができた。[社会影響・経済分析班]におけるヒアリングや資料調査など地域社会調査は順調に進捗しており、くわえて、2016年2ー3月にかけて、水俣病被害者団体うち7団体の会員約1万名を対象とした被害意識調査を実施することができた。回収率が約30%であったが、単純集計を行った。今後、詳細な統計的な分析を加えていくこととしている。なお、「やや遅れている」とした理由は、[自然生態系と地域環境班]が水俣湾及び八幡残渣プール周辺の自然生態調査および重金属汚染に着目した環境調査に着手するとした計画部分に関わる。平成27年2月に本研究に関する地元の研究協力団体(みなまた地域研究会)が水俣湾岸の私有地の土壌分析調査を行ったところ、きわめて高濃度の水銀汚染が検出され、地元で大きく報道されるとともに、地域での反響が大きかった。平成27年4月、本研究計画が採択された後、水銀汚染が予想されている土壌採取予定地区の地権者らに説明を行ったところ、「風評被害」への懸念から協力に困難が生じた。そこで平成27年8月の調査にあたって予定していたサンプル採取をいったん断念した。今年度に改めて協力要請を実施することとした。この調査は生活環境の土壌汚染としてわれわれの研究の特色の一つでもあり、時間をかけて協力要請を続け、おおよそのめどが立った。繰越申請を検討したが、学術振興会との相談の結果、繰越事由に該当しにくいとのことから、繰越申請は行わないこととし、未使用額は本年度調整金制度の利用を申請することとしている。本研究の出発点は、水俣病発生の公式確認後60年が経過している今日においてなぜ水俣病問題の解決が実現できていないのか、なにが求められているのかを水俣学の方法を援用して明らかにし、将来への展望を示す根本的な解決ヘの道筋を提示することにある。本研究は熊本の水俣病発生公式確認60年を迎えているが、そうした時間の経過と経験の蓄積、そして被害者たちの軌跡が、将来に何をもたらすのか、明確にかつ具体的に論じようとするものである。そのような問題意識に立ち、第2年度は[医療と健康被害調査班][自然生態系と地域環境班][社会影響・経済分析班]の三つのサブ研究班を構成し、研究代表の総括のもと、研究計画に従って調査研究を実施した。[自然生態系と地域環境班]では、水俣湾特に袋湾における自然生態系研究(海辺の生物調査)を実施中であり、住民の食事から摂取するメチル水銀量の測定を行った。[社会影響・経済分析班]

では、資料収集と住民インタビューを行った。また、昨年2、3月に水俣病患者・被害者団体に協力を求め、約8千5百名を対象とした被害意識調査を実施し、有効回収数2619通の回答を得ることができた。水俣病研究史の中で被害住民のアンケートは初めてのものであり、回収データの転記・入力作業、単純集計を終えることができた。これら三班の調査研究の総合的検討と成果発表は次年度に実施される。2016年4月14日および16日に発生した熊本地震により、熊本学園大学が被災し、研究拠点としていた水俣学研究センターにおいても、研究用機材、文書・書籍類が散逸し、修復に時間が割かれ、修復に7月初旬までかかった。また研究メンバーも被災した。水俣現地においては被災は軽微であったので現地調査に支障はなかった。いっぽう、研究センターの置かれている14号館が災害避難所となり、水俣学に関わる本研究メンバーも、水俣学の研究実践を生かして5月末日まで避難所運営に注力することとなった。(それに関わる論考も発表した。)また、被災の結果、夏季休業期間が短縮されたため、研究計画全体としては変更はなかったものの、本格的な現地調査の再開は8月下旬以降となった。具体的に実施したのは、2016年2-3月に実施した大規模アンケート調査のデータ入力結果の校正作業と検討、不知火海沿岸漁民聞き取りとその記録の刊行、陰膳調査(水俣市住民の食事に含まれるメチル水銀をはじめとする重金属分析)、水俣生活圏域における土壌等の重金属汚染調査(サンプルの採取・分析及びその結果の解析)、カナダ先住民における水俣病被害者の来日に合わせたシンポジウムの開催と水俣病像の比較検討などであり、年度当初、熊本地震被災の影響で若干の遅れが懸念されたものの、その後の努力で研究計画を順調に進めることができた。本研究の課題と目的は、水俣病発生の公式確認後60年が経過している今日においてなぜ水俣病問題の解決が実現できていないのか、なにが求められているのかを水俣学の方法を援用して明らかにし、将来への展望を示す根本的な解決ヘの道筋を提示することにある。60年という時間の経過と経験の蓄積、そして被害者たちの軌跡が、将来に何をもたらすのか、明確にかつ具体的に論じようとするものである。そのような問題意識に立ち、本年度は[医療と健康被害調査班][自然生態系と地域環境班][社会影響・経済分析班]の三つのサブ研究班を構成し、研究代表の総括のもと、研究計画に従って調査研究を実施した。[医療と健康被害調査班]では、社会の中に埋め込まれた公害による疾病、水俣病の総合的検討を課題に、病像にかかる調査研究および研究会を行い、現在の問題に関する認識を共有するとともに、医療。健康的側面からの被害と水俣病にかかる人権と差別の相互連関について、研究報告を行い、著作を刊行できた(花田・田尻編、2017)。[自然生態系と地域環境班]では、水俣湾特に袋湾における自然生態系研究を踏まえて、住民の食事から摂取するメチル水銀量の測定結果(陰膳調査)の分析を行い、2018年1月に第13回水俣病事件研究交流集会で報告した。[社会影響・経済分析班]では、資料収集と住民インタビューを行うとともに、また、2016年実施した約8千5百名を対象とした被害意識調査での有効回収数2619通の回答の集計結果の分析に取り組み、2018年1月に調査の中間報告書を公表できた。
生後の脳・神経系発達に与える内分泌攪乱物質の影響とその遺伝子発現面からの解析

本年度は、神経活動依存的なc-fosと脳由来神経栄養因子(BDNF)遺伝子発現誘導に与える、内分泌攪乱物質の複合的効果を検討した。また、同時に、甲状腺ホルモンのシナプス形成に与える影響を、ラット大脳皮質初代培養系を用いて検討した。1.神経活動攪乱に関する複合的作用すでにマウス小脳顆粒細胞初代培養系で、ピレスロイド系殺虫剤permethrin、及びDDTがCa^<2+>流入依存的なc-fos, BDNF遺伝子誘導を抑制することを認めている。そこで、両穀虫剤、及び、ビスフェノールA、DESを同時に加えてその影響を検討した。その結果、これら物質の遺伝子発現誘導及び細胞内Ca^<2+>流入に相加的な阻害効果が認められた。これは、脂溶性化学物質がイオンチャネルなどの機能性に共通に影響を及ぼすことを示しており、今後、内分泌攪乱物質の複合的効果の評価に有効と思われる。2.甲状腺ホルモンの効果ダイオキシンなどは甲状腺機能低下を引き起こすが、甲状腺ホルモン(TH)が脳・神経系発達にどのように関わっているか不明である。ラット大脳皮質初代培養系にTHを加えると、形成されるシナプス数が増加した。この際、神経突起の成長が促進され、また、シナプトフィジンmRNA合成も活性化した。さらに、グルタミン酸レセプターNR2の発現も活性化された。これら発現はシナプス形成と関係しているものと考えられ、THのシナプス形成に与える影響を検討する上で、この解析系は有効であることが明らかとなった。
災害発生直後の衛星ＳＡＲ画像に基づくマルチハザード被害把握の新展開

本研究では,合成開口レーダ(SAR)衛星による災害直後の画像から,被害把握を可能にする画像解析技術を確立することを目的としている.とくに,日本や各国の最新の高分解能SAR衛星センサの性能を活かし,災害前画像の有無に縛られない革新的な被害把握技術の開発を目指している.最近発生した我が国や世界各地における自然災害を例題として,災害発生直後のSAR強度画像と,災害前の光学センサ画像,数値標高モデル(DEM),GISデータ等を併用して,被災状況を把握する画像解析手法を開発し,災害後の光学画像,航空レーザ計測データ,現地調査結果等を用いてその精度を検証する.今年度は,2016年熊本地震による複数時期の衛星SAR画像を用いて,建物被害の状況把握を試みた.その結果を航空写真や航空レーザ計測結果,現地調査結果などと比較して, SAR画像による被害抽出の適用条件や精度を検討した.その結果,画像解像度,マイクロ波の建物への照射角度,被害個所の大きさなどに依存するが,住宅などの小さい建物に対する1時期の衛星SAR画像からの被害抽出は困難であるとの結論となった.さらに,事前画像が得られにくいが解像度が極めて高い,航空機搭載の全偏波SAR画像を用いた建物や橋梁の災害把握に関する研究を行った.まず,常時における建物や橋梁のSAR画像の後方散乱係数の特性の評価を行うとともに,多偏波の1時期SAR画像による建物被害の抽出可能性を検討した.その結果,充分な事前情報が準備できれば,1時期SAR画像からでも倒壊レベルの大被害を抽出できる可能性が示された.2016年熊本地震を撮影した地震前後の高分解能衛星SAR画像,および被災状況の検証データを入手することができたので,これらを使用した1時期衛星SAR画像による建物被害の抽出に関する研究を進めることができた.また,航空機SARの研究開発を行っている研究機関と共同研究を行い,熊本地震を対象として,全偏波航空機SARによる建物被害通出に対する研究を進めることができた.高分解能の航空機搭載全偏波SAR画像を用いて,建物や橋梁の被害把握に関する研究を進める.まず,常時に撮影された全偏波SAR画像を用いて,様々な形式や寸法の建物や橋梁が,SAR画像上でどのように投影されるかについて基礎的検討を進める.とくに4成分散乱電力分解手法を用いて,マイクロ波と建物軸方向の間の角度(照射角)と散乱電力割合の関係を調べる.また,橋梁の構造形式や形状寸法,水面からの高さなどが,後方散乱係数の分布,とくにレーダ影,倒れ込み,2回反射などにどのような影響を与えるかについて検討する.また,熊本地震で落橋した橋梁および無被害の橋梁を対象として,航空機SAR画像における橋梁範囲内の見え方を照査し,航空写真や現地調査報告書と比較検討する.さらに, 2018年西日本豪雨の被災地を撮影した衛星SAR画像を用いて,浸水域の把握を行う。また、2018年北海道胆振東部地震による斜面崩壊や地盤変状がどうのようにSAR画像上に投影されるかの検討を行う.本研究では,合成開口レーダ(SAR)衛星による災害直後の画像から,被害把握を可能にする画像解析技術を確立することを目的としている.とくに,日本や各国の最新の高分解能SAR衛星センサの性能を活かし,災害前画像の有無に縛られない革新的な被害把握技術の開発を目指している.最近発生した我が国や世界各地における自然災害を例題として,災害発生直後のSAR強度画像と,災害前の光学センサ画像,数値標高モデル(DEM),GISデータ等を併用して,被災状況を把握する画像解析手法を開発し,災害後の光学画像,航空レーザ計測データ,現地調査結果等を用いてその精度を検証する.今年度は,東日本大震災の津波による橋梁被害が大きかった太平洋沿岸部の1時期および2時期の衛星SAR画像を用いて,橋梁被災状況の把握を試みた.その結果を航空写真や被害報告書などと比較して,1時期SAR画像による被害抽出の適用条件や精度を検討した.その結果,画像解像度,マイクロ波の橋軸方向への照射角度,被害個所の大きさなどに依存するので一概には言えないものの,落橋などの甚大な被害が起きた場合は,GISで橋梁の輪郭等を指定できれば,1時期の高分解能衛星SAR画像から被災の有無を把握できることが判明した.さらに,事前画像が得られにくいが解像度が極めて高い,航空機搭載の全偏波SAR画像を用いた建物や橋梁の災害把握に関する研究に着手した.まず,常時における建物や橋梁のSAR画像の後方散乱係数の特性の評価を行っている.東日本大震災を撮影した地震前後の高分解能衛星SAR画像,および被災状況の検証データを入手することができたので,これらを使用した1時期衛星SAR画像による橋梁被害の抽出に関する研究を進めることができた.また,航空機SARの研究開発を行っている研究機関と共同研究を行うことができ,熊本地震など,全偏波航空機SARによる被災地を撮影したSAR画像を使用することが可能となった.

本研究では,合成開口レーダ(SAR)衛星による災害直後の画像から,被害把握を可能にする画像解析技術を確立することを目的としている.とくに,日本や各国の最新の高分解能SAR衛星センサの性能を活かし,災害前画像の有無に縛られない革新的な被害把握技術の開発を目指している.最近発生した我が国や世界各地における自然災害を例題として,災害発生直後のSAR強度画像と,災害前の光学センサ画像,数値標高モデル(DEM),GISデータ等を併用して,被災状況を把握する画像解析手法を開発し,災害後の光学画像,航空レーザ計測データ,現地調査結果等を用いてその精度を検証する.今年度は,2016年熊本地震による複数時期の衛星SAR画像を用いて,建物被害の状況把握を試みた.その結果を航空写真や航空レーザ計測結果,現地調査結果などと比較して, SAR画像による被害抽出の適用条件や精度を検討した.その結果,画像解像度,マイクロ波の建物への照射角度,被害個所の大きさなどに依存するが,住宅などの小さい建物に対する1時期の衛星SAR画像からの被害抽出は困難であるとの結論となった.さらに,事前画像が得られにくいが解像度が極めて高い,航空機搭載の全偏波SAR画像を用いた建物や橋梁の災害把握に関する研究を行った.まず,常時における建物や橋梁のSAR画像の後方散乱係数の特性の評価を行うとともに,多偏波の1時期SAR画像による建物被害の抽出可能性を検討した.その結果,充分な事前情報が準備できれば,1時期SAR画像からでも倒壊レベルの大被害を抽出できる可能性が示された.2016年熊本地震を撮影した地震前後の高分解能衛星SAR画像,および被災状況の検証データを入手することができたので,これらを使用した1時期衛星SAR画像による建物被害の抽出に関する研究を進めることができた.また,航空機SARの研究開発を行っている研究機関と共同研究を行い,熊本地震を対象として,全偏波航空機SARによる建物被害通出に対する研究を進めることができた.高分解能の航空機搭載全偏波SAR画像を用いて,建物や橋梁の被害把握に関する研究を進める.まず,常時に撮影された全偏波SAR画像を用いて,様々な形式や寸法の橋梁が,SAR画像上でどのように投影されるかについて基礎的検討を行う.とくに4成分散乱電力分解手法を用いて,マイクロ波と橋軸方向の間の角度(照射角)と散乱電力割合の関係を調べる.また,橋梁の構造形式や形状寸法,水面からの高さなどが,後方散乱係数の分布,とくにレーダ影,倒れ込み,2回反射などにどのような影響を与えるかについて検討する.また,東日本大震災で流出した橋梁および無被害の橋梁を対象として,航空機SAR画像における橋梁範囲内の見え方を照査し,航空写真や現地調査報告書と比較検討する.さらに,2016年熊本地震の益城町を撮影した航空機SAR画像を用いて,大被害建物,および無被害建物がSAR画像上でどのように投影されるかを検討し,罹災調査結果や航空レーザー計測結果などと比較する.とくに,建物の材質や寸法形状,建物周囲の建て込み具合などがどのように影響するかを照査する.さらに,2017年九州北部豪雨の被災地を撮影した航空機SAR画像を用いて,建物倒壊や斜面崩壊がどうのようにSAR画像上に投影されるかの検討を行う.高分解能の航空機搭載全偏波SAR画像を用いて,建物や橋梁の被害把握に関する研究を進める.まず,常時に撮影された全偏波SAR画像を用いて,様々な形式や寸法の建物や橋梁が,SAR画像上でどのように投影されるかについて基礎的検討を進める.とくに4成分散乱電力分解手法を用いて,マイクロ波と建物軸方向の間の角度(照射角)と散乱電力割合の関係を調べる.また,橋梁の構造形式や形状寸法,水面からの高さなどが,後方散乱係数の分布,とくにレーダ影,倒れ込み,2回反射などにどのような影響を与えるかについて検討する.
Non-coding RNAによる組織形成の制御機構の解析

申請者らはncRNAの形態形成への関与を明らかにするためにncRNAであるmiR-199a、miR-214をコードするDnm3os遺伝子をノックアウトしたマウスを作製した。本マウスは体躯が小さく、骨格の形成不全や筋肉組織の低形成が認められた。そこで、ノックアウトした遺伝子座にRMCE法を用いてmiR-199a、miR-214を単独または同時にノックインした動物を作製した。ノックインにより各miRNAの発現が確認されたが、両者をノックインした場合にのみ骨格の形成不全等の異常な表現型の回復が確認された。しかし、単独のノックインでは明確な変化が見られなかった。よって、組織形成にそれぞれのncRNAが重要な役割を果たすこと、特に骨組織の形成に寄与することが明確となった。これらのncRNAの標的遺伝子を同定するためにDNAチップによるトランスクリプトーム解析や薬剤二重選択マーカを利用した遺伝子ライブラリのP19細胞での発現による検索を行ったが、顕著な変化を示す遺伝子は特定できなかった。この結果はmiRの作用が多数の遺伝子を標的として弱い程度に発現抑制することで発揮されるという知見に一致するものと考えられた。ところで、miR-199aとmiR-214は心臓疾患との関連が示唆されている。筆者らの研究グループでは心臓と血管系でETAR遺伝子が発現し、これらの組織の発生にETAR陽性細胞が寄与していることを明らかにしている。そこでこれらのncRNAの遺伝子をETAR遺伝子座にノックインし、心毒性が知られるドキソルビシンの投与による心筋傷害モデルにおいて表現型を解析した。その結果、両者のノックインにより心筋の線維化抑制等の組織保護作用が確認された。よって、ncRNAが病態形成に関与する可能性が示唆された。そして、本研究で用いた遺伝子ノックインを利用した研究の方法論が発生研究のみならず病態解析を推進するための基盤として有用であることが確認された。本年度はDnm3os KOマウスで認められた骨低形成等の異常がDnm3osから生成する4つのmicro RNAのうちいずれによってもたらされるのかを各microRNAないしそれらを組み合わせたノックイン動物を作成することによって明らかにすることを試みた。その結果、miR-199とmiR-214を両方ノックインした動物を作成することができた。表現型の解析を行ったところ、両者ともにノックインした場合、椎骨の融合や標準体重など、表現型の回復が認められたことから、ノックアウトしたmicro RNAが表現型の変化に責任があることの確証を得ることができた。Micro RNAが組織形成に寄与していることがより明確になった点で意義深い。薬剤耐性マーカを用いたmicro RNAの標的遺伝子のスクリーニングについてはES細胞のスクリーニング法を応用してマウスP19細胞を用いて複数種薬剤耐性タンパク質の発現量の減少に伴う細胞の生存率を指標に検索することとしたが、モデル遺伝子の場合でも細胞が死滅する傾向にあり、ライブラリ遺伝子の導入には至っていない。細胞種のMEFへの変更等を検討している。データベースを用いた候補遺伝子の検索については、Sanger研究所、EMBL-EBI、miRNA Mapなどの複数の検索サイトで共通してターゲットと予想ざれるものを選び、Sirt1、FGFRI、Activin R1B/2Bを含む20遺伝子ほどが選ばれており、ノックアウト動物での発現について解析を進めることとした。PTENおよびIGFシグナル経路への関与についてはKOマウスのMEFを用いて解析したが、AKTのリン酸化量に有意な変化は認められず、本シグナル経路の関与は可能性が低いと考えられた。

本年度は、前年度に引き続いてはDnm3os KOマウスで認められた骨低形成等の異常が生じる仕組みについて明らかにするためにDnm3osから生成するmicro RNAのうち個別のmicro RNAをノックインした動物を作成した。しかし、KOにmiR-199をノックインした動物では表現型の回復傾向が認められたが、miR-214をノックインした動物では明らかな回復が認められなかった。これらのマウスでは所定の遺伝子座への組み込みは確認できたものの、micro RNAの発現量が少なかった。よって、miR-214の表現型への寄与については遺伝子発現量が多いクローンを得て評価する必要があると考えられた。標的遺伝子の検索については野生型マウスとKOマウストランスクリプトーム解析を実施した。Dnm3oSの発現が確認できる胎仔からRNAを得てDNAチップにより解析を行ったところ多数の遺伝子で発現量に変化が認められたものの、主要シグナル経路に関連する遺伝子で2倍を超える変化を示すものは少なく、定量的なRT-PCRを実施しても再現性を取れるものはなかった。Micro RNAは転写よりも翻訳に変化をもたらすものがある。よって、本研究の標的遺伝子を明らかにするにはタンパク質量の変化を網羅的に解析することが必要と考えられた。データベースから選定した標的遺伝子の候補については特にSirt1について解析を行った。Sirt1は上述したmicro RNAについて複数の予想配列を含んでいたが、ルシフェラーゼ遺伝子の3'側にこの配列を組み込んでマウスP19細胞で発現させ、活性の減少を指標に測定したところ減少傾向が認められたところから標的の一つであると考えられた。申請者らはncRNAの形態形成への関与を明らかにするためにncRNAであるmiR-199a、miR-214等をコードするDnm3os遺伝子をノックアウトしたマウスを作製した。本マウスは体躯が小さく、骨格の形成不全や筋肉組織の低形成が認められた。そこで、ノックアウトした遺伝子座にRMCE法を用いてmiR-199a、miR-214を単独または同時にノックインした動物を作製した。ノックインにより各miRの発現が確認されたが、両者をノックインした場合にのみ骨格の形成不全等の異常な表現型の回復が確認されたが、単独のノックインでは明確な変化が見られなかった。よって、組織形成にそれぞれのncRNAが重要な役割を果たすこと、特に骨組織の形成に寄与することが明確となった。これらのncRNAの標的遺伝子を同定するために薬剤二重選択マーカを利用した遺伝子ライブラリを構築し、P19細胞で発現して検索を行ったが、顕著な変化を示す遺伝子は特定できなかった。この結果はmiRの作用が多数の遺伝子を標的として弱い程度に発現抑制することで発揮されるという知見に一致するものと考えられた。ところで、miR-199aとmiR-214は心臓疾患との関連が示唆されている。筆者らの研究グループでは心臓と血管系でETAR遺伝子が発現し、これらの組織の発生にETAR陽性細胞が寄与していることを明らかにしている。
有機分子が配位した希土類化合物の分子メモリへの応用

光照射により電気伝導性が高まる有機分子配位希土類化合物としてEu(hfa)_3(TPPO)_2を用いた。ここでhfaはhexaf luoroacety lacetonato,TPPOはtriphenylphospineの略である。Eu錯体、Eu(hfa)_3(TPPO)_2は(hfa-D)_3が3配位、(TPPO)_2が2配位した特異な配位化合物である。対称性の低さから発光効率が高められたと理解されている。400nm以下の波長の光の照射でEuのf-f遷移に起因する赤色(622nm)の強い発光が得られる。これらを薄膜化し、電子照射の効果を調べた。電子照射による抵抗率の変化があまり大きくないことがわかり、電気伝導性に大きく寄与する(発光強度と関係し、発光強度を高める)配位子を探索しこれらの合成をすることが必要になった。そこで、配位子の体積的大きくするため、Eu(TFtBu)_3(TPPO)_2やEu(TFph-Bu)_3(H20)_2に変え、さらにこれらのデンドリマーを合成し、その電子照射効果、光照射効果を調べた。まず、還流の条件で収率が大きく変化するため還流条件の最適化を図った。薄膜化と膜厚制御に関しては、溶媒、濃度、スピンナーの回転数と時間などの依存性を調べ膜厚のコントロールを行った。デンドリマーにおいては世代を増やすことにより光吸収の増大は予想通り見られたが、発光効率の向上につながらなかった。これは配位子の三重項がTF0G、TF1G、TF2Gの順に低下しEu^3+の発光準位に近づくことで、Eu^3+の発光準位から配位子の三重項へのエネルギーバックトランスファーが増加しているのではないかと考えられる。デンドリマーで吸収されたエネルギーが中心の希土類イオンにエネルギー移動が行われなかったと解釈でき、電気伝導性の改善も見られなかった原因であると考えられる。配位子の三重項が比較的高い材料を選択するべきであるという材料設計指針を明らかにした。光照射により電気伝導性が高まる有機分子配位希土類化合物として希土類イオンにEu、配位子に(hfa)および(TPPO)をベース材料に用いる。ここでhfaはhexafluoroacetylacetonato、TPPOはtriphenylphospineの略である。Eu錯体、Eu(hfa)_3(TPPO)_2は(hfa)_3が3配位、(TPPO)_2が2配位した特異な配位化合物である。400nm以下の波長の光の照射でEuのf-f遷移に起因する赤色(622nm)の強い発光が得られた。発光時と非発光時の電気的性質に大きな差が得られるよう発光強度を上げる試みを行なった。また、化合物の薄膜化、膜厚制御、電子照射効果を調べた。作成法に関しては、還流の条件で収率が大きく変化するため還流条件の最適化を行なった。薄膜化は、Eu(hfa)_3(TPPO)_2をPMMAに分散しスピンコートすることで得られ、フレキシブルなプラスチック基板に薄膜を作製することに成功した。発光強度の配位子効果を検討した。まず中性配位子をH_2OとTPPOとで比較するとTPPOのほうが6倍以上発光強度が強くなる。配位子結合の強さ、立体障害効果による歪(対称性の低下)が利いていると考えられる。アニオン配位子をアセチルアセトン(acac)、トリフルオロアセトン(tfa)、ヘキサフルオロアセトン(hfa)と変化させるとこの順番で発光強度が低下した。これらの三重項レベルはこの順番に低くなっており、バックトランスファーが利いていることが伺える。発光強度を高める重要な指針は三重項レベルが高い配位子を選択することが重要であることがわかった。光照射のオン、オフ状態での電気的性質は測定開始しており、今後これらの性質を明らかにする。

デンドリマーにおいては世代を増やすことにより光吸収の増大は予想通り見られたが、発光効率の向上につながらなかった。これは配位子の三重項がTF0G、TF1G、TF2Gの順に低下しEu^3+の発光準位に近づくことで、Eu^3+の発光準位から配位子の三重項へのエネルギーバックトランスファーが増加しているのではないかと考えられる。デンドリマーで吸収されたエネルギーが中心の希土類イオンにエネルギー移動が行われなかったと解釈でき、電気伝導性の改善も見られなかった原因であると考えられる。配位子の三重項が比較的高い材料を選択するべきであるという材料設計指針を明らかにした。
心肥大における組織レニン・アンジオテンシン系の関与

この研究は、甲状腺機能亢進症における心肥大に、交感神経系とは独立して、レニン・アンジオテンシン系が関与しているか否かを調べるために行った。Sprague-Dawleyラットを、チロキシンと6-水酸化ドパミンの腹腔注を用いて、甲状腺機能正常-交感神経温存群・甲状腺機能正常-交感神経遮断群・甲状腺機能亢進-交感神経温存群・甲状腺機能亢進-交感神経遮断群と4群に分けた。8週間後、心体重比は、甲状腺機能亢進群で63%増加したが、この増加は、化学的除神経によって消失しなかった。甲状腺機能亢進群では、心内レニン含量は33%増加し、心内アンジオテンシンII含量は53%増加し、心内レニンmRNAの発現量は225%増加した。この増加は、化学的除神経を受けなかった。また、この増加は、24時間の両側腎摘の影響を受けなかった。さらには、アンジオテンシンII受容体拮抗薬のロサルタンとカルシウム拮抗薬のニカルジピンは同程度の降圧作用を示したが、ロサルタンのみが甲状腺機能亢進症における心肥大を抑制した。これらのことは、甲状腺ホルモンが、交感神経系とは独立して、心内レニン・アンジオテンシン系が活性化していることを表す。活性化された心内レニン・アンジオテンシン系が、甲状腺機能亢進症における心肥大に関与していることが示された。
脊髄損傷、末梢神経損傷に対する臨床試験の推進

従来,損傷された脊髄組織は再生せず,その機能回復は不可能とされてきた。従って,脊髄損傷患者の予後は悲惨であり,生涯を対麻痺のために車椅子で,あるいは四肢麻痺のためにベッド上での生活を強いられる。よって、脊髄損傷の治療法の開発は急務である。われわれは骨髄単核球を用いてラット脊髄損傷の治療を行い有効性を証明した。同様の方法で脊髄損傷イヌの治療を行った。対照群では12頭中2頭が歩行可能となりその2頭では深部知覚は認めれらなかった。細胞移植群では11頭中6頭が歩行可能となりその6頭中1頭で深部知覚が認められた。有効性を確認した。骨髄単核球を用いたヒト臨床試験を行って安全性を評価した。10例実施し、本試験に関連する有害事象はなかった。今後、有効性評価を行う予定である。有効性を確認した。目的:骨髄間質細胞は神経の再生に有効であることが認識されてきている。まず骨髄間質細胞の脊髄由来neurosphereに対する作用を培養系で調べ、次に骨髄間質細胞を脊髄に損傷をくわえたラットの損傷部へ移植して神経再生に対するその効果を調べた。<培養実験>1.骨髄間質細胞とneurosphereを混合して無コートのディッシュで培養した。2.あらかじめ骨髄間質細胞を培養しておいたディッシュに後でneurosphereを加えて培養した。<移植実験>ラットの脊髄(T8-9)に挫滅損傷を与えた後、1×10^6個の骨髄間質細胞を損傷部へ直接注入した。細胞移植しないコントロール群も作製した。結果:<培養実験>1.neurosphereは培養ディッシュの底に張り付き長い突起を出していた。2.neurosphereは徐々にディッシュの底に張り付き突起を伸ばしていった。neuroshereは骨髄間質細胞を押しのけるように増殖していた。それぞれのneurosphereはお互いに細い突起でつながっていた。<移植実験>移植された骨髄間質細胞は損傷部に生着していたが、その数は時間の経過と共に減少していった。損傷部にできた空洞の体積はコントロール群にくらべて小さかった。行動の回復に関しては、移植群の内何匹かのラットは体重を後ろ足で支えることができ、前足と後ろ足の協調運動も観察された。コントロール群では体重を支えることはできず、協調運動も認められなかった。今までに脊髄損傷後の退行性変化のための治療方法を確立するために様々な栄養因子、成長因子、薬剤などが試されてきたが、私達は、ヘパリン/アルギン酸ゲル(H/A gel)にbasic Fibroblast Growth Factor(bFGF)を加えて神経繊維の伸長と機能回復を試みた。ラットの脊髄に、実態顕微鏡下で左片側の部分切除を行うことで亜急性期に起こる脊髄組織の壊死と、それに伴って起きる組織の空洞化を再現し、その部分にbFGFを加えたヘパリン/アルギン酸スポンジ(H/A sponge)の移植を行い、この方法による神経繊維の伸長と運動機能の回復が可能であることを証明した。移植後のH/A spongeは速やかにゲル化し、組織に馴染んでいくことが確認できた。移植後、1週から8週までの間に行動学的観察と病理学的検索を行なった。行動学的観察からは3週以降で左片側下肢の運動能力の回復が見られ始め、6週以降からは正常に運動しているように見られた。病理学的検索では、ヘマトキシリン/エオジン(H&E)染色と免疫学的染色法を用いてアストロサイトの反応と神経繊維の伸長を蛍光顕微鏡で観察した。術後1週ではH&E染色の観察からH/Agelが組織と充分に親和性があることを確認し、術後3週では免疫学的染色法を含めた観察からH/Agelが組織に吸収される過程で、その周辺部分にアストロサイトの反応と神経繊維の伸長を確認できた。術後8週でH/Agelは完全に吸収され、同部位にはアストロサイトと神経繊維の充分な伸長があること確認した。重要なことは、亜急性期脊髄損傷で起こる組織の空洞化を補えたことであり、その結果として神経繊維の伸長が運動機能の回復を導いたことである。脊髄損傷のラットの脳脊髄液中へ骨髄由来単核球を投与することにより歩行運動の改善,脊髄損傷程度の軽減が得られることを確認した。ラットの実験では、移植された単核細胞は損傷部で数週間以上生存することはなくやがて消失したが、髄液中のHGFが増加しており移植細胞から分泌される液性因子が脊髄の再生に関与していることが示唆された。

また、損傷部へ遊走した細胞が宿主の細胞と直接コンタクトして何らかのシグナルを伝達する事による作用も再生に関与していると予想された。獣医科病院でダックスフントの脊髄損傷に対し骨髄単核球を移植するイヌでの臨床研究を実施し、細胞移植による有害事象はなく麻痺の回復が認められた。また,ヒト脊髄損傷患者に対する骨髄単核球を用いた臨床試験は諸外国でいくつか実施され,移植による有害事象はないと報告されている。もし骨髄単核球の移植で治療効果が得られれば培養操作が不要なため簡便で広く行える治療法となりうる。動物実験データ、脊髄損傷イヌの治療データ、他の施設での臨床試験データを示すことで,倫理規制の厳しいわが国で本臨床研究が厚生労働省の承認を得ることができた。受傷後50日目に単核球を移植してASIAのAからBに回復した症例があった。正確なtherapeutic windowを決めるには、臨床試験を積み重ね結論を導き出すしか方法はない。本研究も臨床データの一つとして今後活用されていけばよいと考える。本研究はphase1-2 clinical trialであるので安全性と実現性(feasibility)を評価するものでる。投与細胞数および投与回数は厚生省が承認したものである。安全性が確認されたので、今後は細胞数、投与回数を増加させて有効性を評価していくことになる。その際には十分な患者数を集めるためmulticenter research collaborationsが必要となる。「ヒト幹細胞を用いる臨床研究に関する指針」に基づき「骨髄由来単核球細胞を用いた脊髄損傷に対する第I・II相試験」を厚生労働省に申請、実施の許可を得ることができた。24年度が最終年度であるため、記入しない。神経再生の基礎研究をさらに推進する。中枢神経に関しては脊髄再生の臨床試験を開始、患者をリクルートする。
Toll様受容体を介した口腔内グラム陽性菌の免疫活性化作用の解明

口腔内グラム陽性菌による歯周疾患誘発の詳細な分子機構は、現在まで明らかにされていない。本研究では、口腔内グラム陽性菌であるStreptococcus属ならびにActinomyces属の菌体由来リポタンパク質が、宿主細胞のToll-like receptor2を介して炎症応答を誘導するという分子機構を明らかにした。このことから、これらのリポタンパク質が歯周疾患誘発因子になっていることが推察された。Streptococcus mutansはヒト齲蝕の主要な病原細菌であり、本菌の齲蝕誘発メカニズムについては詳細な報告がなされているが、歯周疾患誘発との関連性については、ほとんど知られていない。一方、宿主細胞の自然免疫系は、Toll-like receptor 2 (TLR2)によって細菌由来リポタンパク質(LP)を認識することが示唆されているが、LPの病因論的役割は不明な点が多い。そこで本研究では、S.mutansのLPが宿主細胞のTLR2を介して誘導する免疫活性化作用を解明することを目的とした。S.mutansの標準株(6種類)ならびに臨床分離株(8種類)を使用し、菌体ならびに菌体から抽出したLPの免疫活性化能を検討した。その結果、S.mutansの菌体刺激では、いずれの菌株もヒト歯肉上皮細胞HSC-2、ヒト単球系細胞THP-1においてIL-8産生を誘導し、TLR2遺伝子を導入したHEK293細胞において転写因子NF-κBを活性化した。また、菌体抽出LPによる刺激も菌体刺激と同様な結果を示した。しかし、TLR2中和抗体の存在下で細胞を刺激すると、上記の活性が完全に阻害された。さらに、菌体抽出LPはリポプロテインリパーゼ処理によって完全に活性を失った。また、マクロファージ様に分化させたTHP-1における被貪食性は、TLR2中和抗体の影響を受けなかった。以上の結果から、S.mutansは菌体のLPがTLR2に認識されることで炎症性サイトカイン産生を誘導しているが、貪食はTLR2非依存的に起こっていることが示唆された。これらの成果は、平成21年6月28日から7月1日まで開催された第3回ヨーロッパ微生物学会にて報告した。Actinomyces viscosusは歯肉縁下プラークや根面う蝕の部位から高頻度に分離されるグラム陽性桿菌であり、歯周組織における炎症の進行に関与すると考えられているが、その詳細な分子機構については不明な点が多い。また、宿主細胞の自然免疫系は、Toll-like receptor 2(TLR2)によって細菌由来リポタンパク質(LP)を認識することが示唆されているが、LPの病因論的役割は不明な点が多い。そこで本研究では、A.viscosusのLPにTLR2依存的な炎症誘導活性が存在するかどうか解明することを目的とした。A.viscosusはATCC19246株を使用し、菌体ならびに菌体から抽出したLPの炎症誘導活性を検討した。その結果、A.viscosusの菌体は、ヒト歯肉上皮細胞HSC-2ならびにphorbol 12-myristate 13-acetate (PMA)でマクロファージ様に分化させたヒト単球系細胞THP-1(THP-1/PMA)においてIL-8ならびにTNF-αの産生を誘導し、TLR2遺伝子を導入したHEK293細胞において転写因子NF-κBを活性化した。しかし、TLR2中和抗体の存在下で細胞を刺激すると、上記の活性が有意に阻害された。以上の結果から、A.viscosusの菌体由来リポタンパク質が宿主細胞のTLR2を介して炎症応答を誘導するという分子機構が示唆された。これらの成果は、平成22年7月3日に開催された第30回昭和歯学会総会にて報告した。口腔レンサ球菌は歯肉縁上プラークや唾液中に多く存在するグラム陽性菌であるが、歯周疾患誘発との関連性について、その詳細な分子機構は明らかにされていない。一方、宿主細胞の自然免疫系は、Toll-like receptor 2(TLR2)によって細菌由来リポタンパク質(LP)を認識することが示唆されているが、LPの病因論的役割は不明な点が多い。そこで本研究では、口腔レンサ球菌属に含まれる数菌種のLPについて、TLR2依存的な炎症誘導活性が存在するかどうか解明し比較検討することを目的とした。口腔レンサ球菌としてStreptococcus mitis、S. sanguinis、S. oralis、S. mutans、S. salivariusの各標準株を使用し、菌体ならびに菌体から抽出したLPの炎症誘導活性を検討した。

その結果、いずれの菌体もphorbol 12-myristate 13-acetate(PMA)でマクロファージ様に分化させたヒト単球系細胞THP-1(THP-1/PMA)においてIL-8ならびにTNF-αの産生を誘導し、TLR2遺伝子を導入したHEK293細胞において転写因子NF-κBを活性化した。また、菌体抽出LPによる刺激も菌体刺激と同様な結果を示した。しかし、S. salivariusの菌体ならびに菌体抽出LPは、上記の活性において、他の菌種と比べて有意に低い値を示した。以上の結果から、口腔レンサ球菌の菌体由来LPは宿主細胞のTLR2を介して炎症応答を誘導するが、その活性には菌種による違いがあり、S. salivariusは他の口腔レンサ球菌と比べて炎症誘導活性が低いという可能性が示された。
授業観察支援システムの研究開発

教育実習生に授業観察の視点を把握させ、授業行動を知覚し、それに対する適切な判断と対応策が実行できるようにすることを目的とした授業観察訓練を支援するためのシステムを開発した。本システムは、教育実習の事前事後に位置付くもので、5つの段階から構成されている。1.授業観察記述システム教授学習過程を情報の入・出力関係で記述させることにより、相互作用過程として捉えることができるようにする。2.授業観察評定システム授業観察をさせ、教師の機能の視点から作成した9つの評定項目について、評定基準を参考にして評定することにより、授業観察の視点を把握させる。3.授業プロトコールシステム授業を音声・映像で記録させ、それをもとに記述形式プロトコールを作成させることにより、授業行動の特徴を具体的に把握することができる。4.授業意図・学習者行動判断分析システム授業者がどのような意図で授業行動をし、学習者行動についてどのように知覚判断をし、対応しているかを観察することができる。5.授業観察支援システム(カテゴリー分析による)授業学習行動をカテゴリーシステムを用いて授業の特徴を分析的に捉えることができるようになる。本システムを本学教育実習の事前事後訓練において試行した結果、通常の実習で行われているより(1)従来気付かなかったことまで細かく観察できる。(2)カテゴリー分析・教授意図知覚判断分析は自分の授業の特徴把握に役に立つ。等の知見を得た。等の知見を得た。
ATP加水分解スイッチ仮説に立脚したABCトランスポータ駆動メカニズムの解明

ABCトランスポータ・CFTRチャネルのATP依存性ゲーティングの動態を詳解することにより、ATP結合ドメインにおけるATP加水分解の可否を決定づけている新規の中間状態の存在を明らかにし、さらに加水分解されるATP分子数と外に対して行う仕事量が1動作サイクルごとに変化している可能性を示した。この結果はATPの加水分解が、エネルギー源ではなくスイッチとして働いている可能性を示唆している。今年度、我々はCFTRチャネルのNBDにおけるATPの安定結合に重要な働きをしていることが知られている1219番目のチロシン残基に変異導入(Y1219X)すると、正常なATP加水分解とATP加水分解失敗の明確に分けられる2つのケースが確率的に起こることを発見した[Shimizu,Yu, et al, 2010]。このことは、NBDエンジンの動作サイクルにおいて、NBD二量体形成(チャネル開口)中に、その次のステップにおけるATP加水分解の成否を運命づけている、ある隠された「ATP加水分解のための準備状態」が存在していることを示唆している。この現象は、Y1219X変異によるNBDエンジンの動作ミスがATP加水分解の異常によって引き起こされるのか、あるいはATPの結合エネルギーの違いに起因するものであるのかなど、本研究の中心命題である「ATP加水分解スイッチ」の存在とそのメカニズムの解明のために非常に重要な情報に関連しているものと考えられる。さらに今年度は、CFTR特異的阻害薬CFTRinh-172の阻害メカニズムの詳解を行い、CFTRチャネルには細胞外側にあるイオン透過ゲートの他に、より細胞内側にもうひとつルーズなゲートがあることを明らかにした[Kopeikin et al, 2010]。さらにATP依存性チャネルゲート駆動が失われた変異体G551D-CFTRの薬剤ゲニステインgenisteinとクルクミンcurcuminによるゲート駆動の回復とそのメカニズムについての研究[Yu,Miki et al 2011]をおこない、本プロジェクトの基盤ターゲットであるCFTR分子の作動メカニズムについての重要な知見を得ることができた。本年度は、CFTRチャネルが、開口状態からATPの加水分解をきっかけとして閉口状態へと移行する過程において、ATP加水分解からNBD部分が解離した閉口状態になるまでの間に、PPiによって極めて速いレートで開口状態に移行が起こる新規の中間状態Xiが存在することを明らかにした。今回、この新規の中間状態Xiにおいてポアが開状態・閉状態のいずれにあるかについては最終的な断定できなかった。しかしながら、もし新規中間状態Xiにおいてポアが開口状態にある可能性は非常に高く、それが真実とすれば、今回の発見は、CFTRチャネルの1回の開状態中に複数回のATP加水分解サイクルが回ることを意味している。このCFTRチャネルにおけるATP加水分解サイクルとゲーティングサイクルとのルーズカップリングの可能性についての発見は、CFTRがメンバーであるABCトランスポータ・スーパーファミリーのP-glycoproteinなどの他の輸送ポンプ分子の場合に当てはめて考えると、基質1分子を上り坂輸送するのに消費されるATPの数が確率的に変化している可能性があることを意味している。1分子の基質を一定の電気化学ポテンシャル差に逆らって行う仕事(外部仕事)は常に一定であるので、もしATPが従来から考えられてるように生体のエネルギー通貨として自由エネルギーを供給しているとすれば、余剰のエネルギーは熱として確率論的に放散されている可能性が考えられた。その一方で、ATP加水分解が単にATP結合エネルギーからADP-Pi間静電反発エネルギーへのスイッチ機能を果たしていると仮定した場合には、熱エントロピーの確率論的生成は起こらないはずである。したがって、作動中のCFTR分子からの熱エントロピーの測定が、本研究課題の中心命題であるATP加水分解スイッチ仮説の検証の鍵になると考えられる。最終(平成24)年度は、ABCトランスポータ・CFTRチャネルのATP依存性ゲーティングサイクルをATPアナログであるピロリン酸PPiを用いて詳しく解析した。その結果、において、チャネル開口中においてATP加水分解が完了した後、NBD2量体が部分解離してポアが閉口した状態Ciになるまでの間に、PPiの結合によって極めて速いレートで開口固定状態への移行が起こる中間状態Xiが存在することを明らかにした。この新規中間状態Xiにおいては、NBD2量体が部分解離しているのにもかかわらずポアが開口状態にある可能性が非常に高く、その場合、一回の開口イベント中に複数個のATP分子が加水分解されうることを示している。このCFTRチャネルにおけるATP加水分解サイクルとゲーティングサイクルとのルーズカップリングは、CFTRがメンバーであるABCトランスポータ・スーパーファミリーの他の輸送ポンプ分子の場合にも同じ現象が起こっていると想定すると、基質1分子を上り坂輸送(外部仕事)するのに消費されるATPの数(入力エネルギー)が確率的に変化していることを意味しており、生体エネルギーの理解において極めて重要な発見である。つぎに、金沢大学・安藤敏夫研究室と高速原子間力顕微鏡を用いた共同研究を行い、CFTR1分子の高速AFM像を空間分解能0.1nm・時間分解能300ms/frameで得ることができた。さらにPKA catalytic subunitを投与して観察したところ、CFTR分子の持つリン酸化サイトがあると予想される部位に結合・解離を繰り返す動画を得ることにも成功した。