hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
Through Space n_O→π^* 及び n_O→σ^*相互作用に関する研究

直鎖の脂肪族化合物のコンフォメーションを制御する一つの新しい考え方の確立を目指して、フッ素基とシアノ基の官能基間の新規空間的軌道相互作用の研究を行い、以下の成果を得た。1)フッ素基とシアノ基炭素間の空間距離はそれら原子のvan der Waals半径の和より短く、明らかに軌道の相互作用(n_F→π^*空間的相互作用であると考えられる)が存在する。これは水素結合のように強い相互作用ではなく、弱い相互作用である。2)n_F→π^*空間的相互作用は大きくはnucleophile-electrophile interactionに分類できるものであるが、Dunitzらのnaphthalene骨格の1,8位に固定化された官能基間ではなく、自由度の高い脂肪族化合物のl,3位に大きな双極子モーメントを持つ二つの官能基が配置された系において、その立体配座をより大きな双極子モーメントを持つ立体配座に固定化できる。3)この相互作用は脂肪族fluoro nitrileの立体選択的なプロトン化反応に適用することができることを示し、共有結合の半分程度の選択性を発現することを明らかにした。従ってこの相互作用は反応の立体選択性を制御する新しい要因となりうる。4)上記フッ素基とシアノ基炭素間の空間的相互作用は酸素-カルボニル炭素間の新規相互作用(n_O→π^*空間的相互作用)に拡張することができ、この相互作用はアレンカルボン酸エステルとN-アルコキシカルボニルピロールのDiels-Alder反応において選択性を制御する通常のAlder則のHOMO-LUMO軌道二次相互作用よりも優位に働き、Diels-Alder反応におけるendo/exo選択性を制御する新しい要素になりうることを見出した。これらの新知見は有機化学の基礎知見として重要であると考えている。フッ素-シアノ基間の新規空間的相互作用の解明と直鎖化合物の立体配座の固定化による立体選択的反応への活用を目指して検討し、以下の研究成果を得た。(投稿準備中)1)1-Cyano-3-fluoro-(4-hydroxypheny1)nonaneのsyn体およびanti体を合成し、単結晶のX-線構造解析を行なった結果、anti体は予想どおりフッ素とシアノ基炭素との間で擬5員環を結ぶ様に立体配座が固定化されており(其の二面角は8.5°)、その空間距離は2.888Åでありvan der Waals半径の和(3,17Å)よりも短く、フッ素-シアノ基間の新規空間的軌道相互作用(n_0→π^*)の存在が確認できた。一方、syn体はフッ素-シアノ基間の二面角は118.6°であり擬5員環を形成していなかったが、この原因はフェノール水酸基とシアノ基窒素原子間で分子間水素結合が強く働くためであることがパッキングの分子配列から判明した。2)1-Cyano-3-fluoro-1-(4-methoxylpheny1)nonaneのsyn/anti=約1/1の混合物にブチルリチウムを作用させ、シアノ基のα-位のアニオンを発生させ、安息香酸によるプロトン化反応を検討した結果、HMPAを5当量添加した時、syn/anti=3.5/lの立体選択性(1,3-不斉誘導)が発現した。5員環を形成している対応γ-ラクトンを用いたコントロール実験の結果と対比すると、此の事実はリチウムカチオンフリーのシアノ基アニオンのシアノ基炭素とフッ素間の上記新規空間的軌道相互作用が溶液中でも発現した結果と解釈できる。従って、直鎖アルキル基の立体配座の固定化の新しい方法論を提供できたと云える。従来不可能であった双極子モーメントを一方向に揃え、直鎖化合物の立体配座を制御することを可能にする方法論としてのThrough Space n_0→π^*およびn_0→σ^*

Interactionについて検討した。F→CNの新規空間的相互作用については、4-Fluoro-2-(4-hydroxyphenyl)decanenitrileのanti体のX-線構造解析により予想どおりフッ素とシアノ基炭素との間で擬5員環を結ぶ様に立体配座が固定化されており、van der Waals半径の和(3.17Å)よりも短く、F→CN間の新規空間的軌道相互作用の存在が確認できた。この新規相互作用を立体選択的反応に応用できれば直鎖化合物の立体配座を制御できたことになる。そこで4-Fluoro-2-(4-methoxyphenyl)decanenitrileのsyn/anti=1/1の混合物にブチルリチウム(1.2当量)を作用させてシアノ基のα-位のアニオンを発生させ、各種の嵩高い酸によるプロトン化反応を検討した結果、HMPAを5当量添加した時、syn/anti=5.3/1の立体選択性(1,3-不斉誘導)が発現した。また各種アルキル化反応においても同様に4.55.6/1の立体選択性が観察された。これらの事実はリチウムカチオンフリーのシアノ基アニオンのシアノ基炭素とフッ素間の上記新規空間的軌道相互作用が溶液中でも発現した結果と解釈できる。従って、直鎖アルキル基の立体配座の固定化の新しい方法論を提供できたと云える。また、計画書に記載した他の基質(ハロゲン→CN、S→CN,ketone carbonyl O→CN,N-oxide O→CNなど)のThrough Space n_0→π^*相互作用、O→C-XのThrough Spacen_0→σ^*Interactionのについても検討した。
確率モデルと環境シミュレータを用いた地球環境変動下の帰化植物の生活史解析

1.帰化植物オオブタクサの生長および菌根形成に対する窒素態比の影響解析群馬県内の分布北限で、低温環境である水上町に自生するオオブタクサ個体群と、南部の伊勢崎市の個体群より採取した実生個体を、異なる土壌窒素態比下で栽培して、生長解析および菌根形成率の計測を行った。その結果、前年までの同等の実験により得られ結果と同様に、水上に自生するオオブタクサは、伊勢崎のオオブタクサよりも相対生長速度が遅いことが確認された。これらの結果は、栽培時の気温や日照条件など年ごとに変化する環境要因によらず、水上のオオブタクサの相対成長速度が遺伝的変異として低くなっていることを示唆している。また、水上の個体については、アンモニア処理区における相対成長速度は硝酸処理区のそれと同等となった。すなわち、水上という高アンモニア比地域において、本種がアンモニア耐性を獲得していると考えられる。以上より、生活史戦略としては攪乱地依存型戦略と競争型戦略を併せ持つとされる本種が、低温・高アンモニア比環境下に生育することにより、ストレス耐性戦略を獲得する方向に進化しつつあることが示唆された。オオブタクサの菌根形成率は、採取地および栽培時の窒素態比によらず、無施肥区とも有意差なく、すべての区で70%前後と高い値を示した。一般に菌根形成は貧栄養条件下で高く、富栄養条件下で低下するされる。これに対して本研究の結果は、オオブタクサは富栄養条件下でも菌根菌との共生に成功するということを示しており、本種が富栄養条件でさらに勢力を拡大する一因となっていると考えられる。2.生活史要素の時系列統計解析手法の確立と、新・植物個体群動態モデルフレームの構築生活史要素が時系列要因であることを前提とした統計解析方法を確立した。また本研究で得られた結果について、この解析手法を適用して、その有効性を検証した。さらに以上の結果をもとにして、植物個体群動態が、確率過程たる生活史要素から構成されるという構造を持つ、数学モデルのフレームを構築した。本年度は以下の3点について行った。1.実験温室の整備2.帰化植物オオブタクサの生活史解析群馬県内の利根川流域でのオオブタクサの分布調査を行い、現況の確認、今後の分布拡大可能性の推定、侵入・分布拡大の要因のスクリーニングを行った。分布調査の結果、群馬県内利根川中・上流域において31群落が確認された。このうち最大の群落では、ここでは河川敷におよそ4kmにわたって個体密度38本/m2の群落が続き、推定で合計約690万本ものオオブタクサが生育し、約17億個の種子を生産していた。5月11月に水上町と伊勢崎市の群落において、オオブタクサ個体を採取して生長解析を行った。この2地点では、気温や立地条件に大きな違いがあるにもかかわらず、夏秋の生長速度には有意な差は認められなかったが、伊勢崎市の個体バイオマスは常に水上町のそれの3倍以上あった。こうしたみかけ上の不整合性は、両地における発芽時期の違いに起因していたと考えられる。推定発芽日は、水上で3月中旬、伊勢崎市で1月末と、約1.5ケ月も違っていた。2000年に水上町と前橋市で採取した種子を用いて、発芽の温度特性を解析した。水上採取の種子は30/15°Cで発芽率が10%程度、15/7°Cでは80%程度が発芽した。

前橋採取の種子は、いずれの温度設定においても4585%と高い発芽率を示した。水上では高温下では発芽しない方向に進化している可能性がある。3.実験モデル植物オサバグサを用いた植物生活史の可塑性の解析可知らが従来より研究材料としているオサバクサを用いて、さまざまな光環境下における植物の生活史の可塑性を解析し、生活史モデルの構築のために必要なパラメータのスクリーニングを行った。本年度は以下の2点について行った。1.帰化植物オオブタクサ生長に対する温度と窒素態比の影響解析オオブタクサについて、群馬県内の分布北限で、低温環境である水上町に自生する個体群と、南部の伊勢崎市の個体群を用いて、現地個体の生長解析、気温・土壌窒素態比比較を行った。また、群馬大学構内で窒素肥料投与実験下での生長解析、種子生産量比較を行った。その結果、水上に自生するオオブタクサは、伊勢崎のオオブタクサよりも相対生長速度が遅いことが確認された。また、伊勢崎の土壌が水上の土壌よりも20倍以上も硝酸態窒素濃度が高いことが明らかになり、両調査地点のオオブタクサにおける生長と個体サイズの差には、気温の違い(約10°C)と土壌窒素態比の違いが影響していることが示唆された。窒素肥料投与実験においては、硝酸態窒素・アンモニア態窒素比の異なる栽培区を設けて生長解析を行った。その結果から、オオブタクサは硝酸態窒素を好むこと、気温が同じなら相対生長速度に地域個体群間差がないことが示された。以上より、今後の温暖化や河川汚染の進行によって、オオブタクサの個体の巨大化がさらに直接的に促進されることが示唆された。2.実験モデル植物オオマツヨイグサを用いた植物生活史の可塑性の解析可変性二年草の生活史をとる植物のモデルとしてオオマツヨイグサを想定した確率的個体群動態モデルにより,変動環境が個体群の増殖に与える影響を検討した.その結果,平均的な環境が同じでも環境変動の程度が大きいほど個体群の増殖率は低下することが示された.本年度は以下の2点について行った。その結果から,オオブタクサは硝酸態窒素を好むこと、気温が同じなら相対生長速度に地域個体群間差がないことが示された。2.実験モデル植物オオマツヨイグサを用いた植物生活史の可塑性の解析可変性二年草の生活史をとる植物のモデルとしてオオマツヨイグサを想定した確率的個体群動態モデルにより,変動環境が個体群の増殖に与える影響を検討した.
化学合成とＬＣ－ＭＳを用いた麻痺性貝毒生合成経路の解明

今年度は、主に安定同位体の取り込み実験を行い、安定同位体を指標にした新規生合成中間体のスクリーニングを行った。さらに推定された生合成中間体を化学合成し、質量分析(LC-MS)を用いて、生合成中間体を有毒藍藻、渦鞭毛藻から同定した。さらに得られた結果から、これまでに提唱されていた生合成経路とは異なる、生合成経路を新たに提唱した。安定同位体標識生合成中間体を用い、安定同位体を指標にすることで、生物中での変換生成物の探索を行い、生合成に関連する化合物由来の複数のピークを観測した。精密質量から生合成中間体Int-C'2が酸化された化合物の存在が示唆され、その構造として、2種の構造異性体を推定した。推定した化合物の合成を行い標品の調製を行った。麻痺性貝毒生産生物の細胞抽出液を分析し、新規生合成中間体として11-Hydoroxy-IntC'2が存在することを明らかにした。この化合物の反応性に関する知見が得られ、反応性の高さが麻痺性貝毒の特徴的な三環骨格の構築に重要であることを考察した。また、生合成中間体として、麻痺性貝毒の骨格構造を保持するInt-E'も推定されため、化学合成し、麻痺性貝毒生産生物の細胞内から同定した。昨年度に報告したシャント経路と、今回得られた知見とともに、新たに麻痺性貝毒の生合成経路を提唱した。これまでは、アミノ酸等のラベル体の取り込み実験や生合成遺伝子の情報を基に生合成経路が複数推定されていたが、直接的に生合成中間体の構造を明らかにされなかった。しかし、化学合成と質量分析を軸にした化学的手法による解明により、生合成中間体の構造を明らかにし、生合成経路を提唱した。28年度が最終年度であるため、記入しない。今年度は、主に推定生合成中間体の安定同位体を用いたラベル化合物の化学合成を行い、藍藻Anabaenacircinalisを使った取り込み実験を行った。各推定中間体のからの変換について質量分析器を用い、生合成との関連について考察、発表を行った。特に、Int-C'2からCyclic-C'への変換については、有機反応の面からの詳細な反応機構と、安定同位体を使った生産生物中での変換過程について明らかにした。また、安定同位体標識Int-A'を藍藻に投与し、Int-C'2、Cyclic-C'、及び麻痺性貝毒C1/C2がラベル化することを明らかにした。同様に安定同位体標識Int-C'2から、Cyclic-C'、麻痺性貝毒C1/C2が生成することも示した。この結果より、Int-A'、Int-C'2が麻痺性貝毒の生合成前駆体であることがわかった。一方で、安定同位体標識Cyclic-C'からは麻痺性貝毒C1/C2に変換されないことがわかり、生産生物中に新たなシャント経路が存在することを初めて示した。生物における、シャント経路の存在意義についての考察を行う必要がある。同じく麻痺性貝毒を生産する渦鞭毛藻Alexandrium tamarenseについても、Int-A'、Int-C'2、Cyclic-C'が生体内に存在するので、藍藻と同様の生合成経路・シャント経路を保有している可能性が高い。現在、安定同位体標識Int-A'やInt-C'2を用い、安定同位体を指標にすることで、生物中での変換生成物の探索を行っている。新たな生合成中間体候補構造が示された。今後、この成分についても生合成経路上の位置づけを明らかにする予定である。安定同位体15Nで標識した予想生合成中間体、Int-A'、Int-C'2、Cyclic-C'の合成を達成した。更に各標識体を、藍藻Anabaenacircinalisに添加し、取り込み実験を行う条件の最適化を行った。実際にInt-A'、Int-C'2が麻痺性貝毒の生合成前駆体であり、Cyclic-C'がシャントな化合物であったことをLC-MSを使うことで示すことが出来た。また、標識体の添加を行うことで、生合成に関連する新たな化合物探索の可能性も得られている。

また、生合成中間体として、麻痺性貝毒の骨格構造を保持するInt-E'も推定されため、化学合成し、麻痺性貝毒生産生物の細胞内から同定した。昨年度に報告したシャント経路と、今回得られた知見とともに、新たに麻痺性貝毒の生合成経路を提唱した。これまでは、アミノ酸等のラベル体の取り込み実験や生合成遺伝子の情報を基に生合成経路が複数推定されていたが、直接的に生合成中間体の構造を明らかにされなかった。しかし、化学合成と質量分析を軸にした化学的手法による解明により、生合成中間体の構造を明らかにし、生合成経路を提唱した。これまで、藍藻と渦鞭毛藻における麻痺性貝毒生合成経路に関する知見を得てきた。しかし、もっとも重要な特異な三環骨格の形成段階の生合成中間体を明らかに出来ていない。安定同位体を指標にした探索を行う予定である。生成量などから判断し、有機合成した標品との比較を行うか、単離を試みるか判断したいと考えている。また、すでに予想されている、三環を有するInt-E'の化学合成及び質量分析(LC-MS)を用いた同定を行う予定である。Int-E'の存在を明らかに出来れば、三員環の形成メカニズムの解明の一助になると期待される。これまでに藍藻における取り込み実験を行ってきたが、渦鞭毛藻を使った取り込み実験も行い、渦鞭毛藻の生合成経路の解明も試みる。28年度が最終年度であるため、記入しない。
現代インドにおける多様性接合型の発展径路とデモクラシー―総合的・長期的視点から

現代インドにおける発展径路とデモクラシーを理解するための四つの視角を提案した。(1)生存基盤論的歴史観、(2)南アジア型発展径路、(3)開発民主主義への体制変容、(4)多様性のつながりへの構造変動、である。これらの視角は、西洋型発展径路および東アジア型発展径路を相対化し、南アジア型の発展径路とデモクラシーのありかたを考察していく上で基礎となるものである。本研究は、6人のメンバーによる共同研究である。各自の専門課題についての研究を、日本での文献研究・統計分析、インドでの現地調査・資料収集、国内外での成果発表・研究交流を通じて進展させるとともに、研究会において徹底的な学際的対話と討論をなしてきた。それを通じて、南アジアの生態環境、政治経済、社会文化の特質をそれぞれ明らかにするだけでなく、それらを総合して、南アジアの発展経路とその今日的展開について、学際的なモデル化・概念化を図ってきた。なお各メンバーはそれぞれの専門課題を通じて、全体的な理論枠組みへの貢献をしてきた。その他、以下のような活動を行った。1)国内研究会の開催:メンバー間で問題関心を共有するための研究会を行った。2)現地フィールドワーク:メンバー各自がインドの担当地域で調査・資料収集を行った。3)文献調査:それぞれの専門領域における最先端の研究成果を文献調査し、研究会において情報共有する他、それらの研究が、南アジアの発展経路の総合的理解にとってどのような意味をもつのかを徹底的に議論した。4)統計調査:各州またインド全体について、センサス、人間開発指標、社会経済指標等を分析して、各州及びインド全体の特徴を明らかにすることを試みた。本年度は、昨年度行った国際会議“Vernacular Public Arena and Democratic Transformation in India"の成果を、ロンドンのRoutledgeより、英語論集Democratic Transformation and Vernacular Public Arena in India(Taberez A. Neyazi、田辺明生、石坂晋哉編)として発刊するための準備を進めてきた。本論集は、2014年夏には発刊予定である。1)国内研究会の開催:メンバー間で問題と視角を共有するための研究会を行った。本研究は、現代インドの構造変動を、南アジア地域固有の多様性主導型発展径路とその今日的展開という長期的な枠組でとらえ、生態環境・社会文化・政治経済の総合的視点から理解することを目的とする。本研究においては、6人のメンバーによる共同研究として、各自の専門課題についての研究を、日本での文献研究・統計分析、インドでの現地調査・資料収集、国内外での成果発表・研究交流を通じて進展させるとともに、研究会において徹底的な学際的対話と討論をなしてきた。それを通じて、南アジアの生態環境、政治経済、社会文化の特質をそれぞれ明らかにするだけでなく、それらを総合して、南アジアの発展径路とその今日的展開について、学際的なモデル化・概念化を図ってきた。これらの刊行物において"Vernacular Public Arena",「多様性社会」「南アジア型発展径路」「開発民主主義」「生存史観」などのキーワードを提出し、それらの観点から、南アジア地域固有の発展径路とデモクラシーの特徴について明らかにすることを目指した。1))現地フィールドワーク:メンバー各自がインドの担当地域で調査・資料収集を行った。2)文献調査:それぞれの専門領域における最先端の研究成果を文献調査し、情報共有した。3)統計調査:各州またインド全体について、センサス、人間開発指標、社会経済指標等を分析して、各州及びインド全体の特徴を明らかにすることを試みた。4)南アジア型のデモクラシーおよび経済発展径路について、メンバー各自が研究成果を発表した。(1)生存基盤論的歴史観、(2)南アジア型発展径路、

(3)開発民主主義への体制変容、(4)多様性のつながりへの構造変動、である。これらの視角は、西洋型発展径路および東アジア型発展径路を相対化し、南アジア型の発展径路とデモクラシーのありかたを考察していく上で基礎となるものである。27年度が最終年度であるため、記入しない。人類学・地域研究状況に合わせてできるかぎり当初の研究計画通り、共同研究を進める。学際的なスタイルを堅持しつつ、共同で概念や枠組を構築していきたい。その成果として、Understanding Global Indiaという共編著を刊行する準備を行う。関連の国際会議を開催するなど、研究計画通り、おおむね順調に進展している。関連の国際会議を開催し、その成果が英文論集となって発刊される予定であるなど、研究計画通り、おおむね順調に進展している。ただし当初予定していた共同でのフィールドワークについては、分担者がそれぞれの仕事で忙しいために実現していない。これについては個別のフィールドワークと、会議での報告と討議によって代えざるを得なかった。代表者及び分担者の本務において計画していた以上に時間がとられ(主に大学における事務手続きの煩瑣化による)、十分に研究(フィールドワーク)のための時間がとれなかった。当初の研究計画通り、共同研究を進める。研究代表者および分担者のあいだの日程調整が難しいため、共同フィールドワークは困難であるが、それぞれの研究成果を持ち寄りながら、学際的なスタイルを堅持しつつ共同で概念や枠組を構築していきたい。さらに今年度は12月にデリーでの国際会議を開催して、インド人研究者との間での議論も進める予定である。自分たちがフィールドワークをする時間はどんどんと減少していることはたいへん残念ではあるが、それは現状に合わせてできるところまでをやる。次年度は本研究のまとめの年であるために、海外から関連研究者を招聘して、日本において国際ワークショップを開催したい。それによって成果をまとめたい。「直接経費次年度使用額」が生じた状況としては、日程調整がつかずに、計画していた共同研究会の回数と日数が減ったこと、予定していた国際会議の招聘者の都合が急につかなくなったことによる。2013年度においては、研究会および国際ワークショップを予定通り開催して、当該助成金を使用する計画である。
象牙質形成におけるDSPP開裂のメカニズムと意義の解明

1.マウスラインの選択。Normal及びmutated DSPPタンパクコード遺伝子をIRES-GFPに繋げたcDNAをそれぞれ象牙質特異的に強発現させたトランスジェニックマウス(以下Tgと表記)の作製を試みた。まず、normal DSPP Tgにおいては歯牙特異的にGFPを強または低発現するマウスラインを樹立できた。現在、これらマウスからタンパクサンプル及び組織切片を作製し、DSPPの発現量を検討中である。Mutated DSPP Tgにおいては、founderからGFP陽性のマウスを得ることができなかったため、アメリカ合衆国国立衛生研究所のDr. Ashok Kulkarniに依頼し、コンストラクトを再injectionし、最終的に一つのGFP陽性マウスラインのfounderを得ることに成功した。2.Mutated DSPPのInvivoにおける動態解析。及び3.表現型の解析。得られたGFP陽性マウスラインは現在コロニーを増やし、DSPPの発現量を定量している状態であり、未だ表現型の解析に至っていない。次年度行う予定である。4.象牙芽細胞培養について.上記と同様の理由により、現在マウスから細胞を得ることは不可能なため、間葉系幹細胞にレトロウイルスを用いてnormal及びmutated DSPPのcDNAを遺伝子導入し、ln vjtroでのこれらDSPPの動態を解析するための実験系を樹立中である。本研究は象牙質形成において必須の役割を担うDSPP (Dentin Sialophosphoprotein)タンパクの開裂のメカニズムと意義の解明を目的とし以下のとおり実施した。マウス切歯cDNAをテンプレートとしたPCRにより、DSPPタンパクコード領域(正常DSPPをコード)のクローニングを行った。次に、BMP-1認識配列であるMQ(メチオニン-グルタミン)をIH(イソロイシン-ヒスチジン)に置換し、開裂抵抗性DSPPのクローニングを行った。これら正常及び開裂抵抗性DSPPクローンをretrovirus expressionvectorにそれぞれligationし、293細胞を用いて通法に従いレトロウイルスを作製し、MC3T3及びC3H/10T1/2に感染させた。その後選択培養を行い、それぞれ複数の安定発現細胞株を樹立した。これら細胞上清中のDSPのタンパクサイズ並びに量をDSP特異抗体によるウエスタンブロッティングにて解析した結果、HC3T3、C3H/10T1/2共に正常DSPPでは100kDa以下にスメアーに広がるバンドを認めた。開裂抵抗性DSPPでは100kDa以上に強いバンドを認め、100kDa以下には全くバンドを認めなかった。コントロールではバンドを認めなかった。以上の結果より、DSPPの開裂抑制はその細胞外分泌を抑制しないことが明らかとなった。また、開裂抵抗性DSPPにおいて100kDa以下にバンドを認めなかったことから、DSPPの開裂が完全に抑制されていることも示唆された。正常及び開裂抵抗性DSPPの細胞分化や石灰化に対する影響については現在検討中である。
微生物のオリゴ糖を介した環境認識

麹菌Aspergillusoryzaeのオリゴ糖を介した環境認識機構を明らかにするために、キシログルカンオリゴ糖(ヘミセルロースの一種であるキシログルカンの部分分解物)によって発現が誘導される遺伝子を網羅的に解析した。キシログルカンオリゴ糖(構造を均一にしたキシログルカンオリゴ糖精製物もしくは複数種類のキシログルカンオリゴ糖の混合物)、グルコースやキシロースなどの単糖、もしくは多糖類であるキシログルカン存在下で一定時間培養した麹菌からtotal RNAを抽出し、RNAseqによってトランスクリプトーム解析を行った。また、本トランスクリプトームから得られた情報の信頼性を向上させるために、キシログルカンオリゴ糖によって発現が誘導される一部の遺伝子の発現解析をリアルタイムPCRによって補完した。これらの発現解析から、キシログルカンオリゴ糖によって誘導される遺伝子、キシロースによって誘導される遺伝子、グルコース飢餓によって誘導される遺伝子などの大まかな分類を行った。また、キシログルカンオリゴ糖依存的に発現が誘導される糖質加水分解酵素の生化学的解析を行い、複数の酵素(イソプリメベロース生成酵素およびβ-ガラクトシダーゼ)の協調的作用によるキシログルカンオリゴ糖の分解機構を発見した。また、キシログルカンオリゴ糖の分解に関与する糖質加水分解酵素(イソプリメベロース生成酵素)の結晶構造解析などを行い、麹菌のキシログルカンオリゴ糖への応答機構の生化学的・酵素学的側面の解析も並行して進めた。麹菌Aspergillusoryzaeから高品質なtotal RNAを抽出するための条件検討を行い、オリゴ糖依存的に発現が上昇する遺伝子の網羅的な解析をRNAseqによって行うことができた。ただし、使用した試薬中に含まれる夾雑物に由来すると予想される遺伝子の発現変動なども一部の遺伝子において見られたため、今後は本現象の詳細な解析や当該夾雑物の除去、また、その影響を考慮したトランスクリプトームデータの解釈が必要になってくると予想される。また、上記の理由から、本年度のトランスクリプトーム解析の結果だけでは十分に信頼性の高い網羅的発現解析と断言することができず、今後の研究をミスリーデングしてしまう可能性を有することから、今後、培養条件検討のさらなる検討や遺伝子改変株でのトランスクリプトーム解析などが必要になってくると考えられる。キシログルカンオリゴ糖依存的に発現が誘導される遺伝子がコードする2つの糖質加水分解酵素(イソプリメベロース生成酵素およびβ-ガラクトシダーゼ)が相互依存的・協調的にキシログルカンオリゴ糖を分解する新しい機構を見出し、論文発表を行うことができた。また、イソプリメベロース生成酵素の結晶構造解析にも成功し、本酵素が巧みにイソプリメベロースユニット(グルコースとキシロースから成る2糖)を認識する分子メカニズムを明らかにすることができた。また、キシログルカンオリゴ糖の生産に資する新規酵素の同定および酵素学的諸性質の解析も行い、論文発表を行った。本年度のトランスクリプトームデータをより活かすために、さらなるトランスクリプトーム解析およびリアルタイムPCRによる発現解析を進める。その際、より詳細な培養条件(誘導時間・オリゴ糖濃度への依存性・単糖や多糖類が共存する条件でのオリゴ糖の転写誘導能など)の検討や、既知転写因子の欠損株などの遺伝子改変麹菌における遺伝子発現解析を行う予定である。また、麹菌の多糖類への応答機構・分解機構の全体像を明らかにするために、キシログルカンの分解に資する新規酵素の同定と生化学的解析を進め、酵素学的アプローチによってキシログルカン分解機構の全体像を明らかにする。また、これまでの研究によって明らかになったオリゴ糖の生成や分解に関与する糖質加水分解酵素がどのようにオリゴ糖を介した環境認識に寄与しているかを明らかにするために、当該酵素をコードする遺伝子の欠損株を作製し、その表現型の解析を目指す。本年度のトランスクリプトーム解析から、複数のオリゴ糖依存的に発現が誘導される遺伝子を見いだすことに成功したので、これらの遺伝子の発現制御メカニズムの解明を目指し、当該遺伝子のプロモーター配列の解析やその転写制御に関与する転写因子の探索を行う。プロモーター配列の解析や転写因子の探索はトランスクリプトームデータを用いた情報解析および麹菌もしくは酵母を用いた異種宿主によるin vivo解析(プロモーターのレポーターアッセイなど)を予定している。

また、キシログルカンオリゴ糖の分解に関与する糖質加水分解酵素(イソプリメベロース生成酵素)の結晶構造解析などを行い、麹菌のキシログルカンオリゴ糖への応答機構の生化学的・酵素学的側面の解析も並行して進めた。麹菌Aspergillusoryzaeから高品質なtotal RNAを抽出するための条件検討を行い、オリゴ糖依存的に発現が上昇する遺伝子の網羅的な解析をRNAseqによって行うことができた。ただし、使用した試薬中に含まれる夾雑物に由来すると予想される遺伝子の発現変動なども一部の遺伝子において見られたため、今後は本現象の詳細な解析や当該夾雑物の除去、また、その影響を考慮したトランスクリプトームデータの解釈が必要になってくると予想される。また、上記の理由から、本年度のトランスクリプトーム解析の結果だけでは十分に信頼性の高い網羅的発現解析と断言することができず、今後の研究をミスリーデングしてしまう可能性を有することから、今後、培養条件検討のさらなる検討や遺伝子改変株でのトランスクリプトーム解析などが必要になってくると考えられる。キシログルカンオリゴ糖依存的に発現が誘導される遺伝子がコードする2つの糖質加水分解酵素(イソプリメベロース生成酵素およびβ-ガラクトシダーゼ)が相互依存的・協調的にキシログルカンオリゴ糖を分解する新しい機構を見出し、論文発表を行うことができた。また、イソプリメベロース生成酵素の結晶構造解析にも成功し、本酵素が巧みにイソプリメベロースユニット(グルコースとキシロースから成る2糖)を認識する分子メカニズムを明らかにすることができた。また、キシログルカンオリゴ糖の生産に資する新規酵素の同定および酵素学的諸性質の解析も行い、論文発表を行った。本年度のトランスクリプトームデータをより活かすために、さらなるトランスクリプトーム解析およびリアルタイムPCRによる発現解析を進める。その際、より詳細な培養条件(誘導時間・オリゴ糖濃度への依存性・単糖や多糖類が共存する条件でのオリゴ糖の転写誘導能など)の検討や、既知転写因子の欠損株などの遺伝子改変麹菌における遺伝子発現解析を行う予定である。また、麹菌の多糖類への応答機構・分解機構の全体像を明らかにするために、キシログルカンの分解に資する新規酵素の同定と生化学的解析を進め、酵素学的アプローチによってキシログルカン分解機構の全体像を明らかにする。また、これまでの研究によって明らかになったオリゴ糖の生成や分解に関与する糖質加水分解酵素がどのようにオリゴ糖を介した環境認識に寄与しているかを明らかにするために、当該酵素をコードする遺伝子の欠損株を作製し、その表現型の解析を目指す。本年度のトランスクリプトーム解析から、複数のオリゴ糖依存的に発現が誘導される遺伝子を見いだすことに成功したので、これらの遺伝子の発現制御メカニズムの解明を目指し、当該遺伝子のプロモーター配列の解析やその転写制御に関与する転写因子の探索を行う。プロモーター配列の解析や転写因子の探索はトランスクリプトームデータを用いた情報解析および麹菌もしくは酵母を用いた異種宿主によるin vivo解析(プロモーターのレポーターアッセイなど)を予定している。
説得的メッセージに対する自動的反応の生成についての研究

説得的メッセージに対する自動的反応について、4つの実験を行った。15年に行った実験1では、メッセージ提示の基礎的研究として、命題文をあらかじめ一度提示しておくことが、その命題で述べている内容の真実度の認識を高めるか検討を行った。その結果、一度提示された実験参加者においては、より命題が正しいと認知する傾向が見られた。16年に行った実験2では、記憶がメッセージから受ける説得にいかに影響するかを検討した。説得的メッセージをあらかじめ一度提示し、2週間後に新しいメッセージと混ぜて旧メッセージを提示し、再認テストを課した。その結果、多面的思考傾向の低い実験参加者では、誤再認-フォールス・メモリーがより多く、また、フォールス・メモリーを多く示した者ほど、メッセージ内容に説得される効果が示された。実験3では、画像処理により作成された広告画像を用いて自動的処理と意識的処理の効果を検討した。実験室にある大画面(32インチプラズマTV)で提示されている映像に偶然接する自動的処理群では、イメージ的な訴求広告が効果的で、広告を評定することを目的にして映像を視聴する意識的処理群では、商品の機能を説明する論理的訴求が有効であった。メッセージ内容と処理スタイルが交互作用的な効果を持つことが示された。実験4では、メッセージの提示スタイルと受け手の感情との一致によって自動的に説得力が高まるか検討した。説得テーマのよい点を推奨するポジティブ・フレーミングでは、受け手の感情がポジティブな際により説得効果を発揮し、禁止的なメッセージを含むネガティブ・フレーミングでは、感情群問で差が見られなかった。おおむね受け手の感情とフレーミングが交互作用的な効果を有することが示された。実験2の成果は、17年1月アメリカで開催されたSociety for Personality and Social Psychology第6回大会にて発表し、実験3の成果は、17年3月に神戸で開催された日本グループ・ダイナミックス学会第52回大会にて発表を行った。自動性の研究成果を、岡隆(編)「社会的認知研究のパースペクティブ」に執筆し、実験提示の技術的問題を「パーソナル・コンピュータによる心理学実験入門」に編集、執筆した。平成15年度には、命題の真実性の認知が事前に提示しておくことで、無自覚的、自動的に上昇するかどうかを検討した。まず、テーマである自動的な反応形成について文献的な検討を行い、知見をまとめた。その成果の一部を、培風館の「社会的認知のパースペクティブ(岡隆編)」の「社会的認知と感情、行動、動機づけ」の章の中に執筆した(平成16年5月刊行予定、現在再校中)。メッセージの事前提示がある場合とない場合の効果を比較するために、7月に実験1を行った。B4用紙いっぱいに書かれた文章の中に、ターゲットとなる命題(主張的メッセージ)を埋め込み、認知的負荷のある状況で提示した。命題は感情心理学に関わる叙述であり、一般的に正しいとは言い切れない記述である。これを埋め込んだ群とこの文だけが欠けた群との2条件を設定し、提示した1週間後に、他の質問と共に、ターゲットの命題記述を実験参加者に示して、どれくらい正しい主張であると思うか、「正しい-正しくない」の7点尺度で評定させた。その結果、命題を事前に提示していた群の方が、統計的に有意により正しいと評定していた。

事前提示されていたことに自覚的に気づいていた者は、約33%であり、気づいていた者とそうでない者との間に、正しさの評定に有意差は見られなかったので、無自覚であるほど効果が強いという点は確証されなかったが、事前提示の自動的効果を確認することができた。成果をアメリカの学会で発表するために論文を翻訳した。次に、映像を伴うメッセージについて検討するために、15年10月からデジタルカメラで作成した画像をいくつか編集する作業を行った。画像の性質を統制するため、予備調査として12月に、36枚の画像について画面提示し、感情価などを評定させた。現在、選ばれた画像に音声を乗せるコンピュータ処理を行って、実験2の提示刺激を作成中である。平成16年度には説得的メッセージに対する自動的反応について3つの実験を行った。説得的メッセージの呈示に伴う無自覚的影響を検討するため、メッセージのフォールス・メモリーの検討を6月に行った。15個の説得的メッセージを説得力の評価として1度呈示し、2週間後に類似の新たなメッセージ6つを先に呈示した6つと混ぜて呈示したところ、多面的思考傾向が低い実験参加者は、新たなメッセージに対して2週間前にあったとするフォールス・メモリーを生じやすかった。さらに、フォールス・メモリーを多く生じる傾向のある者の方が、より説得メッセージの趣旨に賛成する説得効果を生じやすいことが示され、無自覚的な認知過程が説得効果に影響することが示唆された。昨年度の命題の反復効果と併せて17年1月にアメリカで開催されたSociety for Personality and Social Psychology第6回大会において発表を行った。次に、説得的メッセージを呈示するフレーミングの1種として、説得の感情的トーンの違いが受け手の感情状態とマッチすることが効果をもたらすか検討する実験を11月に行った。ポジティブ気分にある実験参加者はよいことを推奨する説得、ネガティブ気分にある者では推奨と禁止の両タイプが同程度効果的で、気分状態により説得トーンの違いが無自覚的に影響することが示された。12月には、作成した画像を利用した説得の自動的効果を検討する実験を行った。たまたま流れているビデオ画像として広告メッセージに接する場合と、意識的に接する場合を比較し、メッセージの性質-論理的訴求とイメージ的訴求によって効果が異なることを示した。論理的訴求は意識群において、イメージ的訴求は自動的処理群で効果が高かった。成果は17年3月の第52回日本グループ・ダイナミックス学会で発表された。画像呈示の方法について成果の一部を「パーソナル・コンピュータによる心理学実験入門」として編集刊行した。
gliomaの細胞相互の接着に関する分子病理学的研究

島形成型のラット腹水肝癌AH136B細胞から分離精製された接着分子(adhesive factor、以下AF)は、予め解離したAH136B細胞の凝集を増強する効果を有する。このAFに対するモノクローナル抗体の一つであるMoAF-6D6はその凝集効果を強く抑制し、さらに腹水肝癌島の解離を惹起する機能を有する。今回、細胞集合体であるspheroidを形成するラットglioma継代培養C6細胞の細胞相互の接着機構におけるAFの関与について検討した。C6細胞膜におけるAFの局在についてMoAF-6D6を用いた螢光抗体間接法で検討すると、カバーグラスに生着したC6細胞および凝集したC6細胞の細胞膜上に明らかな螢光を認めた。maleimide法による酵素標識抗体を用いた免疫電顕でも細胞膜に共通抗原物質の局在が証明された。ヒトglioma継代培養KT細胞についても同様の陽性所見が得られた。C6細胞を凝集可能な細胞濃度で96穴マイクロプレートのwell内で1時間培養すると、細胞凝集塊が形成されるが、MoAF-6D6を加えることによりその凝集は抑制されたことから、C6細胞膜表面にはAFあるいはそれに良く類似する物質が存在することが示唆された。しかし、培養3日目に形成されたspheroidにMoAF-6D6を作用させてもその崩壊が惹起されなかったことから、さらに抗体の濃度や作用時間を検討中である。一方、ヒトgliomaにおけるAFとの共通抗原物質の検討を行ったが、MoAF-6D6を用いた免疫染色法でastrocytoma、ependymomaおよびmeingiomaなどの強い細胞接着性を示す脳腫瘍に陽性反応が見られた。これらの脳腫瘍患者の髄液におけるAFの存在についてELISAで検討したが、現在の方法では陽性所見は得られず、さらに多くの量の髄液を濃縮して検討する予定である。
バイオイメージングデータの時空間解析のための情報処理技術の関発

近年、機器制御の自動化やイメージング技術の発展などの要因により、培養細胞や生体環境のライブイメージングが可能となっている。一方で、様々な実験条件下で高並列かつ長時間に渡って撮影された大量の動画からは、人力によっては定量的・客観的な解析が困難であるという問題もある。本研究では、様々な条件下で経時観察されたバイオイメージングデータを入力とし、細胞の自動追跡というニーズが発生した際に、それに潜在的に付随する一連の時空間解析までをフレームワークとして提案する。このフレームワークは「細胞の位置の追跡と状態推定によるデータの構造化の方法」と「構造化されたデータの時空間解析の方法」からなるもので、細胞動態の時空間的な差異を可視化し、定量的に比較して有意差の検定を行い、また差異の要因を推定するための方法論を提供する。本年度には、深層学習を用いた細胞の自動認識手法の開発を行った。これは、深層学習によって細胞画像の領域分割のタスクを学習するための訓練データを増幅する方法であり、敵対的生成ネットワークを用いて疑似細胞画像とその教師データを生成することで、認識精度の向上を行うものである。また、従来から開発を行ってきた、パーティクルフィルタと混合正規分布クラスタリングによる細胞追跡と、多状態生存時間分析を組み合わせた方法の成果の取りまとめを行った。この成果は近日に論文として投稿を行う。近年、機器制御の自動化やイメージング技術の発展により、培養細胞や生体環境のライブイメージングが可能となっている。一方で、様々な実験条件下で高並列かつ長時間に渡って撮影された大量の動画からは、人力によっては定量的・客観的な解析が困難である。本年度には主に次の2つの基盤技術についての研究開発を行った。1つは深層学習を用いた細胞の自動認識手法の開発である。従来の深層学習には多くの教師付きデータを必要としたが、本研究では別種のデータの認識について学習済みのネットワークを再利用し、比較的少数の訓練データから認識精度の高いモデルを構築することに成功した。もう一つは、最適化のアルゴリズムを用いた細胞追跡手法の開発である。従来のデータアソシエーションによるアプローチでは、追跡精度が細胞検出の精度に大きく依存する問題点があったため、本研究では、コンポーネントツリーと呼ばれるデータ構造を導入し、データアソシエーションと組み合わせることで最適な要素同士を繋げ、精度の良い細胞移動の軌跡を得ることのできる方法を開発した。当初の予定通りである。本年度には主に次の3つの基盤技術についての研究開発を行った。1つは深層学習を用いた細胞の自動認識手法の発展である。これは昨年度の方法を発展させたもので、認識精度の改善を達成した。もう1つは全体最適化のアルゴリズムを用いた細胞追跡手法の開発である。これにより同じような見た目の細胞が密集した状況下での追跡精度を改善した。もう1つはオプティカルフローを用いた細胞と環境の状態の定量化手法の開発である。ある種の環境下では細胞を個別に追跡するのは難しいため、deep matchingと呼ばれる方法と隠れマルコフモデルを組み合わせて、組織における炎症の程度を定量化する方法を開発した。細胞追跡の精度向上に予想以上に時間がかかっている。精度は向上しつつあるが、後続する解析に十分な精度にはまだ達していない。

本年度には主に次の3つの基盤技術についての研究開発を行った。1つは深層学習を用いた細胞の自動認識手法の発展である。これは一昨年からの方法を発展させたもので、シミュレーションで生成した疑似的な細胞画像を学習に用いることでデータ数の不足を補い、少ない学習データからの認識精度の改善を達成した。もう1つは粒子フィルタを細胞追跡に応用する方法であり、3次元空間での細胞の移動をリアルタイムで追跡可能である。もう1つは複数種類の細胞の分布の変化を定量的に評価する方法である。この方法を破骨細胞と骨芽細胞の形成するパターンの違いから、薬剤投与下における骨代謝のバランスの変化を定量的に評価することに成功した。おおむね順調に推移しているが2年目の年度の遅れを取り戻すほどには進捗することができなかった。近年、機器制御の自動化やイメージング技術の発展などの要因により、培養細胞や生体環境のライブイメージングが可能となっている。一方で、様々な実験条件下で高並列かつ長時間に渡って撮影された大量の動画からは、人力によっては定量的・客観的な解析が困難であるという問題もある。本研究では、様々な条件下で経時観察されたバイオイメージングデータを入力とし、細胞の自動追跡というニーズが発生した際に、それに潜在的に付随する一連の時空間解析までをフレームワークとして提案する。このフレームワークは「細胞の位置の追跡と状態推定によるデータの構造化の方法」と「構造化されたデータの時空間解析の方法」からなるもので、細胞動態の時空間的な差異を可視化し、定量的に比較して有意差の検定を行い、また差異の要因を推定するための方法論を提供する。本年度には、深層学習を用いた細胞の自動認識手法の開発を行った。これは、深層学習によって細胞画像の領域分割のタスクを学習するための訓練データを増幅する方法であり、敵対的生成ネットワークを用いて疑似細胞画像とその教師データを生成することで、認識精度の向上を行うものである。また、従来から開発を行ってきた、パーティクルフィルタと混合正規分布クラスタリングによる細胞追跡と、多状態生存時間分析を組み合わせた方法の成果の取りまとめを行った。この成果は近日に論文として投稿を行う。当初の予定通りに推進する。やや遅れているが予定通りに推進する。1年の期間延長が承認されたため,最終年度には成果のとりまとめと発表を行う.旅費等の費用が別の財源から補助されたため。旅費等の費用が別の財源から補助されたため。研究の進捗がやや遅れており,成果の取りまとめと発表のための予算を次年度に使用する.繰り越した費用は、発表のための旅費や開発補助の謝金として利用し、研究を推進する。繰り越した費用は、発表のための旅費や開発補助の謝金として利用し、研究を推進する。
陰イオン種認識能を有する低分子天然有機化合物の動的挙動と結合体の精密構造

生物は高度の機能を発現するために、核酸とか蛋白質などの高分子物質のほかに、生体内に存在する低分子のイオン種が重要な役割を果たしているが、これらのイオン種は単独で作用していることは少ない。例えばナトリウムとかカリウムのような陽イオンは含ヘテロ原子環状化合物と結合することによってその機能を発揮し、又その作用は後者によってコントロ-ルされている。このように陽イオンを認識しその作用をコントロ-ルするのに関与している生体物質は知られているが、生体内に著しく多種類存在する陰イオン性の物質ー例えばカルボン酸、リン酸、硫酸などのイオングル-プを持つ有機物を認識し、その機能をコントロ-ルする低分子性の物質に関する研究は殆どなかった。本研究では生体内に存在する多種多様な陰イオン物質(カルボン酸、アミノ酸、アルキルリン酸、アルキル硫酸)と相互作用する低分子天然有機化合物について研究を行なった。カリブ海産および紅海産のスボンジから単離された強い生理活性を有するPtilomycalin構造について研究し、グアニジンを含む多官性部分にパルミトイルスペルミジンが結合した構造であることが明かになった。この物質には二種類のコンフォオマ-が存在しているが、これはNMRおよびモデル化合物の挙動からアシルスベルミジン部分の第三アミドの回転異性体によるものであることが、明かにまたこのアミドプロトンは速やかに交換するが、これはグアニジン基に近接して存在するカウンタ-イオンの作用によるものであることが明かになった。
漢字習熟度テストにおける受験者の解答行動の分析

本研究では、日本語学習者を対象とした漢字習熟度テスト(以下、漢字テスト)の解答過程を明らかにすること目的とし、以下について定量的、定性的に分析を行った。使用した漢字テストは、「漢字力診断テスト」(加納1997)を参考にして作成した7種90問で、項目分析を行い、各問題形式別の正答率および弁別性の指標である識別力を母語別に算出した上で正答率及び識別力が高い項目及び低い項目を抜粋し、調査に使用した。調査は、2016年6月から2017年2月に大学の教室内において1対1で行い、解答中の手元の様子はビデオ録画した。調査協力者は都内の大学に所属する20名であった。手順は、漢字テストの受験、解答中の映像を刺激とした解答過程に関するインタビューの順であった。インタビューデータは文字化し、定性的コーディング(佐藤2009)によって解答過程をコード化し、識別力や正答率の高い問題と低い問題で使用されている解答行動を比較した。その結果、以下の点が明らかになった。1.識別力の低い問題では、「母語知識の利用」や「自動化された知識による解答」が発生していたのに対し、識別力が高い問題では「文を読む」「意味の想起」「字形の想起」が発生していた。2.正答率が低い問題では「低頻度語としての認識」「漢字の有無の判断」「選択肢間の意味の検討」が発生したのに対して、正答率が高い問題では「自動化された知識による解答」「高頻度語としての認識」が発生していた。上記の結果、漢字テストとして一般に想定される過程が発生している問題が適切に漢字力を識別していること、また受験者は解答中に、使用された漢字の頻度や使用場面を想起するなど日常生活の場面と漢字学習が強く結びついていることが示唆された。本研究は、漢字テストの解答過程の一部を明らかにし、妥当性に関する知見の蓄積に貢献したと考える。今後、統計分析を行い、学会等にて報告する予定である。
レンチウイルス抗体ディスプレイライブラリーを用いた癌標的治療法の開発

これまでの研究により、麻疹ウイルスのエンベロープであるH/F蛋白による膜融合能を、H蛋白の元来の細胞レセプターCD46及びSLAMへの吸着能を排除する変異(Haals)を加え、かつ一本鎖抗体(scFv)を付加することで制御した。そこでレンチウイルスのエンベロープをHaals-scFv/F蛋白で置換することによって、scFvを介して特定の標的細胞にのみ感染するシュードタイプレンチウイルスベクターを作出している。さらに、この技術を応用してレンチウイルスにscFvsを提示させた革新的ライブラリーを確立し、これより網羅的に悪性腫瘍特異的抗体を同定することによって新しい癌標的治療法の開発を目指している。癌は日本における死亡原因でもっとも多い病気であり、特に現行の治療法に対して抵抗性を示す難治性進行癌に対する新規治療法の確立が望まれている。これまでの研究により、麻疹ウイルスのエンベロープであるH/F蛋白による膜融合能を、H蛋白の元来の細胞レセプターへの吸着能を排除する変異(Haals)を加え、かつ一本鎖抗体(scFv)によって制御することに世界で初めて成功した。さらに、レンチウイルスのエンベロープをこのHaals-scFv/F蛋白で置換することにより、scFvを介して特定の標的細胞にのみ感染するシュードタイプレンチウイルスベクターの作出にも成功した。そこで本研究では、この技術を応用しレンチウイルスにscFvを提示させた革新的ライブラリーを確立し、このライブラリーより網羅的に悪性腫瘍特異的抗体を同定することによって新しい癌標的治療法の開発を目指している。本年度は、同定済みの腫瘍特異的scFv(CD9、CD20、CD38、CEA、EGFR、EGFRvIII、HER2、TfRなど)からなるミニライブラリーをHaalsの細胞外C末端に連結させ、そのHaals-scFvsをレンチウイルスベクターに挿入したプラスミドライブラリーを構築した。それを用いて、レンチウイルス抗体ディスプレイライブラリーを作製し、ヒト肺癌、又は膵臓癌細胞への感染によるscFvのスクリーニングを試み、各癌細胞で発現している標的分子に対する腫瘍特異的scFvが同定できるかどうかを検討した。その結果、Haals-scFv/F発現プラスミドを使ったュードタイプレンチウイルスの作出に比べて、Haals-scFvs発現ユニットをウイルスに挿入した抗体ライブラリーの作出では、ウイルスの産出量が激減し、十分なライブラリーサイズに達していないことが判明した。現在、ウイルス産出量を向上させるための改良に取り組んでいる。本年度は、多様性の異なる3種類のscFv(1複数ドナーのリンパ球より、mRNAを単離しRT-PCR反応によりcDNAを合成後、そのcDNAよりVH(重鎖の可変領域)遺伝子とVL(軽鎖の可変領域)遺伝子をPCR反応で増幅し、リンカーペプチドで結合したscFv遺伝子ライブラリー、2あらかじめファージ抗体ディスプレイライブラリーのヒト肺癌、又は膵臓癌細胞に対する23回のバイオパニングによって濃縮されたscFvライブラリー、3CD9、CD20、CD38、CEA、EGFR、EGFRvIII、HER2、TfRなど同定済みの腫瘍特異的scFvからなるミニscFvライブラリー)をHaalsの細胞外C末端に連結させ、そのHaa-scFvをレンチウイルスベクターに挿入したプラスミドライブラリーを構築した。本年度は、標的化Haa-scFvシュードタイプレンチウイルス抗体ディスプレイライブラリーを構築する計画であったが、そのレンチウイルスを産生するためのプラスミドライブラリーの作製に予想以上の時間を要した。本年度で構築したプラスミドライブラリーを用いて、レンチウイルス抗体ディスプレイライブラリーを構築し、ヒト肺癌、又は膵臓癌細胞への感染による腫瘍特異的scFvのスクリーニングと、同定したscFvのマウスモデルにおける腫瘍特異性の検討と単クローン抗体療法の検討を実施する。該当なし