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ドミナントネガティブトランスジェニックマウスを用いた肝臓でのレチノイドの機能解析

レチノイドは上皮細胞の増殖・分化に密接に関与している。最近、非環式レチノイドが肝細胞癌の治療後に投与されると、その後の再発が有意に減少させると報告され、レチノイドの有用性が報告された。そこでわれわれは、肝臓でのレチノイドの機能解析のため、レチノイン酸レセプタードミナントネガティブフォームを肝細胞特異的に発現させたトランスジェニックマウスを作成し、肝臓でのレチノイドの機能解析を行った。その結果、レチノイン酸のシグナルの欠如したマウスは、著明な脂肪性肝炎を呈した。脂肪滴は小滴性であり、壊死巣は散在性の巣状壊死を呈していた。また、核細胞質比の増大、細胞増殖亢進、染色性の不均一化を生じていた。肝細胞ではサイクリンE、CDK2の発現が増加していた。また、明らかにミトコンドリアでの脂肪酸のベータ酸化が抑制されていた。ペルオキシソームは代償的に増加し、ペルオキシソームのベータ酸化によって生じる過酸化水素が増加していた。また、CYP4a酵素群の発現量が増加し、マイクロソームでの脂肪酸のオメガ酸化の増加も推定された。さらに、過酸化水素により生じるDNAの酸化障害の指標である8-OHdGも増加していた。月齢12か月以降には肝細胞癌を発生したが、この機序の一つとして活性酸素の発生が推測された。したがって、レチノイン酸は正常の肝組織の構築に必須であり、肝発癌に抑制的に作用すると考えられた。レチノイドは種々の細胞の分化や増殖に密接に関与している。事実、白血病細胞の分化誘導作用より白血病の治療にも使用されている。最近レチノイドには肝癌細胞のアポトーシスを誘導することが報告されている(Biochem Biophys Res Commun 207,382-388,1995,Biochem Biophys Res Commun 219,100-104,1996)。また、ヒト肝臓癌の再発を抑制することが報告されている(N Engl J Med 334,1561-1567,1996)。さらに、レチノイドが肝再生や繊維化にも関連することが多くの実験的事実より明らかとなっている。私たちは肝臓におけるレチノイドの生物学的意義を明らかにする目的で、レチノイドレセプターのドミナントネガティブフォーム(RARE, J Biol Chem 269,19101-19107,1994)を肝細胞に発現するトランスジェニックマウス作成を試みている。RAREが肝細胞に発現した際、肝細胞特異的にレチノイドレセプターの機能が消失し、したがって肝臓でのレチノイドの機能を明らかにすることが可能となる。私たちはアルブミンプロモーターにRAREを接続し、さらにSV40イントロンポリーAを結合したトランスジーンを作成した。このトランスジーンをマウス受精卵に導入し、数匹のF0マウスを得ている。さらにF1マウスにトランスジーンが伝わり、肝臓特異的なRAREの発現を得ることができるかを現在検討している。本マウスを得ることができれば、肝発癌、肝再生、肝障害、肝繊維化など種々の肝病態でレチノイドの関与の検討が可能となる。1、トランスジーンの作製まず、レチノイドリセプターアルファのドミナントネガティブフォーム(RARA-E、J.Biol.Chem.269,19101ー19107,1994)をpBluescriptIIKS+/-にサブクローニングした。肝細胞特異性をもたせるため、RARA-Eの上流にアルブミンエンハンサー、プロモーター(Proc Natl Acad Sci USA 89,373-3773,1992,Hepatology 19,962-972,1994)を継続し、下流にSV40イントロンポリAを付加したトランスジーンを得た。

2、トランスジェニックマウスの作製このトランスジーンをBFD1マウス受精卵へマイクロインジェクションし、5系統のラインを作製した。この内、2系統を選び、F2,F3を作製している。これらのマウスではRARA-Eは肝臓に特異的に発現していることをRT-PCRにて確認した。3、トランスジェニックスマウスでの表現型これらのトランスジェニックスマウスの肝細胞にはRARA-E蛋白の過剰発現を免疫化学染色法にて確認した。トランスジェニックマウス肝細胞は野性型の肝細胞に比較し、ヘマトキシリンエオジン染色で好酸性が増しており、核の大小不同がみられ、明らかに肝細胞の表現型が変化していた。今後、ノーザン法により発現強度の確認、ウエスタン法により蛋白発現量の定量化を行い、かつ肝臓の表現型の変化の検討を継続していく予定である。1、トランスジーンの作製レチノイン酸レセプターアルファのドミナントネガティブフォーム(RARE,J Biol Chem269,19101-19107,1994)をpBluescriptIIKS+/-にサブクローニングした。肝細胞特異性をもたせるため、RAREの上流にアルブミンエンハンサー・プロモーターを接続し、下流にSV40イントロンポリーAを付加したトランスジーンを得た。2、トランスジェニックマウスの作製このトランスジーンをBFD1マウス受精卵へマイクロインジェクションし5系統のラインを作製した。この内、発現量の高い2系統を選び、F2、F3を作製している。これらのマウスでは肝臓特異的、肝細胞特異的にRAREが発現している。3、RAREトランスジェニックマウスの表現型野性型のマウスの体重、肝体重比は各々1.36±0.40g、5.24±1.22%であったが、トランスジェニックマウスでは2.16±0.31g、7.76±0.49%と有意に増加していた。この際、S期細胞の増加が有意に増加していた。また、サイクリン/cdk2複合体が有意に増加し、このためRAREトランスジェニックマウスの肝細胞増殖が促進しているものと考えられた。肝細胞特異的にレチノイン酸レセプタードミナントネガティブ(RARE)トランスジェニックマウスを作成した。このマウスは脂肪性肝炎を生じ、やがて肝細胞癌を発生した。まず、脂肪変性は小滴性脂肪変性であり、門脈域優位に発生した。また、巣状壊死が、小葉内に発生したが、中心静脈の近傍に発生する傾向を認めた。月齢12か月より、肝腫瘍を発生した。肝腫瘍は月齢とともに増加し、月齢18か月では70%以上のマウスに発生した。一方、野性型マウスでの肝腫瘍の発生はなかった。脂肪変性をきたしたので、脂肪酸の代謝異常があると考え、脂肪酸代謝の検討を行った。その結果、ミトコンドリアでのべータ酸化が低下し、ペルオキシソームでのべータ酸化が亢進していた。さらにエンドプラスミックレチクルムのオメガ酸化の亢進を認めた。これはサイトクロームp450cyp4a12、cyp4a14により媒介され、さらにジカルボン酸の発生が認められた。ジカルボン酸はペルオキシームのべータ酸化の基質となるため、ペルオキシソームのさらなる亢進につながるものと考えられる。そして、この際発生する過酸化水素、ヒドロキシラジカルなどの活性酸素発生量は明らかに増加していた。したがって、これらの脂肪酸の代謝異常が脂肪性肝炎、肝細胞癌の発生に寄与するものと推定される。
マウス歯・頭・顔面頭蓋の成長発育を支配する遺伝要因と母体要因の生命工学的研究

受精直後から着床直前までの哺乳精卵の初期発育における,遺伝要因と環境要因の関与については,十分に解明されていない点が多い。そこで,5系統の近交系マウスから2細胞期の受精卵を採集し,人工培養条件下で胚盤胞後期までの72時間培養した。この期間の受精卵の生存率は,87%92%と高い値を示した。そしてこの生存率における遺伝要因の影響度は16%と低い値であった。以上の結果より,本実験における受精卵培養条件は比較的良好であり,またマウス受精卵の初期発育には非遺伝的要因がより大きな影響を与えていることが示唆された。更に着床後のマウス受精卵の子宮内発育における,母親マウスの子宮内環境の影響について検索した。即ち,DDD系統の受精卵をDDD,C3H,C57BLおよびDBAの4系統のレシピエント雌マウスの子宮内に移植した。そして移植受精卵より発育した新生仔マウスの頭部を,頭部X線規格写真撮影装置により観察し,2次元画像分析装置を用いて分析したところ以下の結果を得た。(1)受精卵移植技術は,移植受精卵の子宮内への着床および着床後の子宮内発影に影響を与える可能性が示唆された。(2)新生仔マウスの頭蓋の大きさとリッターサイズの間には,負の相関があった。一方,頭蓋の大きさと妊娠期間の間には正の相関があった。(3)4系統の雌マウスの胎仔マウスの成長への貢献度は一様ではなかった。これらの結果より,移植受精卵の子宮内発育に対して,母親マウスの子宮内環境は重要な役割を果していることが解明された。人間を含めた哺乳類の成長発育過程においては,遺伝要因や環境要因のみならず母体要因も大切な役割を担っている。これら3つの要因の相対的役割の大きさを解明する目的で近交系マウスを用いて,マウス受精卵人工培養とマウス受精卵移植術などの実験体系を確立したので,その研究の進展状況や研究成果について以下に報告します。5系統の近交系マウスを用いた受精卵の人工培養実験の結果より,2細胞期から胚盤胞後期まで人工培養下で培養された受精卵の生存率における遺伝力は、16でマウス受精卵の初期発育における遺伝要因の影響は小さいことを解明し,その研究成果は第41回西日本畜産学会(平成2年11月6日・佐賀大学)で発表した。また移植受精卵より発育した胎仔マウスの頭部を頭部X線規格写真撮影装置により観察した後,骨格染色標本を併せて作成した。このうち得られた頭部X線規格写真上に設定した計測点のXーY座標値を二次元座標入力システムにより入力し,顎顔面頭蓋の大きさを求めた。そして移植受精卵より発育した胎仔マウスの顎顔面頭蓋の大きさに対する母体効果の影響について,現在までのところ4系統のrecipientマウスを用いて分析したところ,各系統から生まれた仔マウスの顎顔面頭蓋の大きさには有意な系統間差が認められ,各親マウスはその子宮内環境の違いを通して仔マウスの顎顔面頭蓋の発育に有意な影響を与えていることを解明し,その研究成果は第7回ソフトウエア・カンフアレンス(平成3年3月8日・大阪科学技術センタ-)で発表した。平成3年度は,平成2年度に引き続き骨格染色標本のうち下顎骨の大きさを画像入力装置により定量化・分析を行ない得られた研究成果について学会発表および論文発表を行ない報告書としてまとめる予定である。受精直後からの哺乳類の受精卵の初期発育における遺伝要因と環境要因の関与については,十分に解明されていない。我々は,5系統の近交系マウスの2細胞期の受精卵を採集し,胚盤胞後期まで約72時間人工培養した。

この間の各系統の受精卵の生存率は,87%97%の範囲でありまた生存率の遺伝力は,約16%であった。これらの結果より,人工培養下でのマウス受精卵の初期発育には,非遺伝的要因がより大きな影響を与えていることが示唆された。引き続き,着床後のマウス受精卵の子宮内発育における,レシピエンした胚盤胞期の受精卵を,4系統のレシピエント雌マウス(DDD,C3H,C57BL,およびDBA)の子宮内の外科的に移植した。移植受精卵より発育した新生〓マウスの頭部を,X線規格写真撮影(頭蓋の大きさについての分析を行ない,次のような結果を得た。(1)移植受精卵より発育した胎〓マウスと通常の自然発育した胎〓マウスの生下時での頭蓋の大きさには,有意な差を認めなかったが,妊娠期間は移植実験群がコントロ-ル群と比較して,約1日延長していた。(2)4系統のレシピエント雌マウスから産出された新生〓マウス間に共通した所見として,リッタ-サイズと頭蓋の大きさとの間では負の相関があり,一方妊娠期間と頭蓋の大きさとの間には正の相関があった。これらの事は,リッタ-サイズが大きくなると,頭蓋の大きさは小さくなり,妊娠期間が長くなると,頭蓋の大きさが大きくなることを意味している。これらのリッタ-サイズと妊娠期間の影響と回帰直線を利用して統計学的に差し引いた後の頭蓋の大きさに対して,レシピエントの系統の有意な影響がみられた。これらの結果は,マウス受精卵の子宮内発育に対して,各系統の雌マウスはそれぞれの子宮内環境を通して様々な異なる影響を与えた事を示唆する。
滑らかな係数と精密な対角化による発展方程式解析の新たな展開

本研究では、滑らかな係数を待つ発展方程式に対する精密な対角化の手法を用いて、変数係数を持つ波動方程式やクライン・ゴルドン型方程式、一般の2階双曲型方程式、半線形波動方程式に対して、従来の手法では困難であった精密な解の評価を行うことに成功した。これらの証明の中で発展させた手法は、今後、非線形波動方程式の一種であるキルヒホフ方程式の大域可解性の問題など、他にも様々な問題に対して応用が期待される。本年度は以下のテーマに関する研究を行った:この研究テーマに関しては、変数係数のKlein-Gordon型方程式のエネルギー評価に関して、最近興味深い成果を出しているフライベルグ工科大学のC.Boehme氏と共同研究を行った。Boehme氏の最近の研究は、特に単調な係数に対する特殊関数の性質等を用いた非常に精密な評価であるが、この係数にC^m,C^∞class,更にGevrey classの滑らかさと、振動の効果を加えた場合の摂動問題について、係数の滑らかさに応じた精密な評価を得ることができた。(2)振動する係数を持つ2階双曲型方程式のエネルギー評価双曲型発展方程式の特別な場合であるの斉次2階双曲型方程式の初期値問題の解は、係数が振動する場合、それらの相互作用によるある種の共鳴や干渉の効果によって、単調な係数の場合には起こり得ない複雑な現象が起こる可能性がある。このような効果は、係数のC^2の滑らかさの特性を考慮した対角化によって取り出すことが可能であることが、これまでの研究により明らかになっているが、当時の技術で到達できたのは非常に限定された結果であった。本年度の研究では、ハノイ工科大学のB.T.Bao Ngoc氏とともに、係数のより高い滑らかさの効果と、最近の研究で確立されつつあるて新たな対角化の手法を導入することによって、2階双曲型方程式の解の安定性を規定する、より本質的と考えられる「高階のLevi条件」の概念を導入することによって、より精密な解の評価に関する結果を得ることができた。平成23年度の研究実績は以下の通りである。(1)伝播速度が時間に依存する半線形波動方程式の大域可解性定数係数の場合には既知である半線形波動方程式の初期値問題に対する大域可解性の問題は、変数係数の場合、次のような変数係数特有の効果により、定数係数の場合と比較してはるかに困難である。A,係数の振動による線形部分におけるエネルギーの流入出B.増大する拡散係数によるエネルギーの安定化C.係数の滑らかさの影響(滑らかさの低い係数は、線形方程式の解の挙動に深刻な影響を及ぼす可能性がある)既知の研究ではAとBの影響に関する考察が主であり、Cについてはほとんど考慮されていなかった。本研究ではCの影響を考察することにより、これまでの研究では到達できなかった精密な結果を得ることができた。また、この研究で用いた手法はこの問題に限らず、変数係数双曲型方程式に対するより一般の問題に対しても適応可能であり、今後更なる応用が期待できる。(2)変数係数斉次双曲型方程式の適切性とエネルギー評価波動方程式を一般化した変数係数斉次双曲型方程式は、係数の変動やそれらの相互作用によって、波動方程式の場合には考えられなかった様々な複雑な現象を生みだす可能性がある。平成23年度は、定数係数の摂動とみなせる変数係数の非自明な条件について、係数の滑らかさとその振動の相互作用(レビ条件)という立場から精密な考察を行った。この研究成果については、現在、共同研究者とともに論文執筆予定である。平成25年度の研究実績は以下の通りである。(1)伝播速度が時間に依存する波動方程式のエネルギー評価について:伝播速度が時間に依存する波動方程式のエネルギー評価に関する研究は数多くあるが、ここでは特にCm-classの滑らかさを持つ係数が、単調減少な関数に漸近する場合、または時間無限大で0に退化するモデルについて研究を行った。ここで得られた結果は、弱双曲型方程式と消散型波動方程式を統一的な理解のための基礎となる結果である。(3) Kirchhoff型方程式の大域可解性:大きな初期値に対するKirchhoff型非線形波動方程式の大域可解性を、実解析関数のクラスに含まれない新しい関数のクラスにおいて成り立つことを証明した。本年度は特に結果を補強するために、新たに導入したクラスと既知の関数のクラスの関係について研究を行った。平成24年度の研究実績は以下の通りである。(1)伝播速度が時間に依存する半線形波動方程式の大域可解性:定数係数の場合には既知である半線形波動方程式の初期値問題に対する大域可解性が、変数係数の場合には成り立たない可能性がある。このような問題において、係数のC2-classの滑らかさが、解の安定性のための評価に寄与することは過去の研究から知られていたが、係数のC3-class以上の滑らかさの寄与についてはよくわかっていなかった。このような問題に対して、本研究代表者が開発した手法を用いて、一般のCm-class、更にはGevrey classで記述される係数の滑らかさが、大域可解性に与える影響を精密に記述することに成功した。

(2)2階単独弱双曲型方程式のultradifferentiable classにおける適切性について:時間変数に関してultradifferentiable classの関数として特徴付けられる係数を持つ2階単独弱双曲型方程式の適切性を証明した。これは、Cm-classの係数に対する既知の結果の一般化であるが、ここで証明された係数の滑らかさと解空間の精密な関係は、単なる先行研究の改良では難しく、本質的に新しい手法を導入したことによって証明できたものである。(3)Kirchhoff型準線形波動方程式の大域可解性:小さくない初期値に対するKirchhoff型準線形波動方程式の非実解析関数の空間における大域可解性に関する考察を行った。平成24年度は、大域可解性が成り立つことが期待される解空間の設定に関する考察を主に行った。この研究により、次年度に当初の目標である、その空間におけるKirchhoff方程式の大域可解性の証明を行ってゆくための道筋をつけることができた。非線形波動方程式の大域可解性の問題については当初の計画通りの目標が達成できたが、変数係数斉次双曲型方程式の適切性とエネルギー評価の問題については、一部で当初予想しなかった困難が生じた。問題となる部分については今後の課題とし、現在はその箇所を除いた範囲で研究結果をまとめている。25年度が最終年度であるため、記入しない。非線形波動方程式の大域可解性の問題、Kirchhoff型準線形波動方程式の研究については、当初の計画通り順調に進んでいる。しかし、変数係数斉次双曲型方程式の適切性とエネルギー評価の問題については、一部で当初予想しなかった困難が生じたため、計画を少し変更し、当初の目標に準じた結果の証明を試みる予定である。本研究課題で導入した手法は、今回扱った方程式に限らず、より一般の発展方程式に対する問題にも適応可能であると考えられる。今後は周辺分野の研究者と連携しながら、具体的な応用の可能性を探ってゆく予定である。今年度までの研究によって、最終年度である次年度終了時までに、当初の計画はおおむね達成されそうである。一方、その過程で、関連する新たな興味深い問題も生じ、その幾つかの解決のためには新たな発想が必要であると考えられる。今後は、現在取り組んでいる研究の仕上げと同時に、次の問題を解決するためのヒントを周辺分野の研究者と連携しながら探ってゆく予定である。
市場形成段階に於ける企業と政府部門…中国工作機械産業の生成と展開を事例として

1中国の工作機械産業について、中央機械工業部所属のものについては基本的に全企業についての基礎的資料を収集し利用可能なデータベースとして整理することができた。特にそのうちの、比較的規模の大きい企業28社、さらに関連する産業の企業約10社について、中国の工作機械産業全体の中での位置づけ、設立の経緯、経営層及び党組織指導者の推移と経歴、品種の選択と移り変わり、現在の経営体制などを詳しく調査した。企業の設立年次、設立主体、設立目的などにより、企業の経営状況にはそれぞれ顕著な傾向が存することを明らかにすることができた。2工作機械産業における人材の獲得と熟練形成について、日本及び発展途上諸国との比較が可能な量の資料を得ることができた。3企業と所有権者としての国家との関係については、現在、管理体制、税制、利潤分配、人事制度等々について急激な変化のさなかにあるが、それぞれについて、詳細な資料の収集が得られつつある。行政部門の指導から企業は独立傾向を強めているが、資金供給及び雇用・人事において行政部門の支配権は依然として強力であり、このために企業の経営の近代化を阻む結果となっている。4企業と被雇用者との関係については、経済改革により労働市場の育成を促進しているにも関わらず基本的に終身雇用を保障する姿勢は変わらない。ただし、国有部門に雇用されること自体が改革以前に比べ遙かに狭き門になってきている。また同時に、企業間の業績と分配水準の格差は拡大の一途をたどっている。このため被雇用者にとって、ある特定の国有企業への雇用は常にその機会費用が意識されるものとなってきている。現状は、被雇用者が自らの職場の業績に積極的な関心を示す契機をもたらしつつあると評価することができる。5総じて、国有企業の現状は、所有者よりもその経営者ないし被雇用者の強い利害にもとづき行動を選択する主体へと変化していく局面にあると結論づけることができる。
キラル高分子

キラル高分子およびキラルモノマーの合成、並びにその機能についての研究から本年度は下記の成果を得た。(1)アセチレン架橋複核金属錯体を触媒に用いて、キラルイソシアニドとアキラルイソシアニドとの共重合を行い、らせん方向の識別選択性を検討したところ、興味あることに両モノマーの比率から予想される選択性よりも高いらせん方向識別重合が観察された。また、イソシアニドポリマーがリオトロピックおよびサーモトロピック両液晶性を示すことも見いだした。(2)官能性有機化合物の効率的不斉合成法の開発研究の一環として、「キラル配位剤を用いる不斉リチオ化手法」を用いて、エナンチオ選択的な[2,3]-Wittig転位とカルボアニオン環化反応を検討し、前者によってホモアリルアルコール類が、後者によって置換シクロペンタノール誘導体が高い不斉収率でえられることを見い出した。(3)通常のC2対称光学活性メタロセン触媒で得られるポリ(3-メチル-1-ブテン)やポリ(エイコセン)は、立体規則性が低いために比旋光度が小さい。そこで、非常に高い立体特異性を示すC1およびC2対称メタロセン触媒の合成を目指して、不斉配位子を用いた光学活性メタロセン錯体の選択的合成を試みた。その結果、配位子の光学分割において高純度の不斉配位子を高収率で得るための幾つかの指針が得られた。(4)高分子主鎖の立体配置によるキラル発現を環化共重合法で達成し、そのキラル発現の効率に対するテンプレートの嵩高さの効果を調べ、モノマーの回転異性体が係わる支配を明かにした。また、モデル環化反応による環化ユニマーの単離およびエナンチオマーの生成分布の定量から重合におけるキラル発現の因子を確認した。テンプレートから高分子の連鎖がキラルになる最小の構造単位として、孤立二連子B-A-A-Bによるキラル発現をポリマーの旋光度と孤立二連子の重量分率の相関から実証した。(5)光学活性アミン存在下、ポリマー主鎖に誘起されたポリ((4カルボキシフェニル)アセチレン)のらせん構造が、光学不活性なアミンで置換後も保持されることを見い出した。また、光学活性なポリチオフェン誘導体が様々の金属塩存在下、らせん構造を形成し、長波長領域に誘起CDを示すことも見い出した。キラル高分子およびキラルモノマーの合成並びにその機能についての研究から下記の成果を得た。(1)アセチレン架橋複核錯体を触媒に用い、イソシアニドのリビング重合を検討し、ヘキサブロック共重合体の精密合成に成功した。(2)1の知見を基に、リビング重合法を応用して、アリールイソシアニドのらせん方向選択的重合に成功した。この重合法により、アキラルなイソシアニドから、らせんキラリティを持つポリイソシアニドを合成することができた。(3)アイソ特異性を持つ光学活性ジルコノセンを合成し、それを触媒に用いてプロキラルなオレフィンの重合を検討し、有益な知見を得た。(4)光学活性ビナフトール由来のチタン錯体を用いてケトンのヒドロシリル化反応、アルデヒドのアルキル化反応及びアルデヒドのシアノシリル化反応の不斉触媒化に成功するとともに、キラルなビスオキサゾリンを不斉配位剤に用いてエナンチオ選択的[2,3]Wittig転位系を開発した。(5)側鎖にカルボキシル基を有する光学不活性なポリフェニルアセチレンが、溶液中、光学活性なアミン存在下、らせんを形成し、誘起円偏光二色性を長波長領域に示すことを見いだした。この誘起円偏光二色性の符号と強度はアミンの絶対配置、立体構造の予測に有効であることを示した。(6)クロロホルム可溶のらせん状セルロースフェニルカルバメート誘導体のキラル識別機構をNMRを用いて詳細に検討し、分子レベルでの機構解明に成功した。(7)希土類錯体を用いて嵩高い置換基をもつメタクリレート、およびアルキルイソイアナ-トの重合を検討し、前者については立体障害のためオリゴマーを得たのみであったが、後者の重合反応は円滑に進行することを見いだした。(8)シクロペンタジエニル基上にメンチル基を持つ光学活性希土類錯体を合成した。(1)アセチレン架橋複核錯体を触媒に用いて、pーメントキシカルボニルフェニルイソシアニドの重合を行うと一方向のらせん構造を持つらせんキラルなポリイソシアニドが生成すること見出した。また、そのオリゴマー(重合度20-20)錯体がアキラルイソシアニドのらせん方向選択的重合に有効であることを見出した。(2)光学活性モノマーの効率的不斉合成法の開発を指向して、(1)ビナフトール由来のキラルチタン錯体を触媒とする不斉アルデヒド/ジエチル亜鉛付加反応、(2)バイナップ由来のキラルパラジウム錯体を触媒とするエノールシリルエーテルの不斉プロトン化反応の2つの不斉触媒反応の開発に成功した。(3)光学活性メタロセン触媒で得られたポリ(3-メチル-1-プテン)およびポリ(1-エイコセン)のミクロ構造を明らかにした。その結果、これらのポリマーの立体規則は低く、これを反映して、比旋光度が小さいことがわかった。そのような観点から、さらに高性能な光学活性触媒の開発をスタートした。

(4)高分子の連鎖がキラルになる最小の構造単位として、孤立二連子B-A-A-Bによるキラル発現を、環化共重合におけるポリマーの旋光度と孤立二連子の重量分率の相関から実証した。さらに、孤立四連子B-A-A-A-A-Bがキラルな主鎖の発現因子になる環化共重合系を見出した。(5)ロジウム触媒を用いて重合して得た、側鎖に光学活性なアミノアルコール残基を有する立体規則性ポリ(フェニルアセチレン)誘導体が、光学活性な酸存在下、酸のキラリティーに応答してヘリックス-ヘリックス転移が起こり、そのCDスペクトルのパターンが大きく変化することを見いだした。光学活性体の絶対配置を予測する新規なプローブとしての利用が可能であると思われる。キラル高分子およびキラルモノマーの合成、並びにその機能についての研究から本年度は下記の成果を得た。(1)アセチレン架橋複核金属錯体を触媒に用いて、キラルイソシアニドとアキラルイソシアニドとの共重合を行い、らせん方向の識別選択性を検討したところ、興味あることに両モノマーの比率から予想される選択性よりも高いらせん方向識別重合が観察された。また、イソシアニドポリマーがリオトロピックおよびサーモトロピック両液晶性を示すことも見いだした。(2)官能性有機化合物の効率的不斉合成法の開発研究の一環として、「キラル配位剤を用いる不斉リチオ化手法」を用いて、エナンチオ選択的な[2,3]-Wittig転位とカルボアニオン環化反応を検討し、前者によってホモアリルアルコール類が、後者によって置換シクロペンタノール誘導体が高い不斉収率でえられることを見い出した。(3)通常のC2対称光学活性メタロセン触媒で得られるポリ(3-メチル-1-ブテン)やポリ(エイコセン)は、立体規則性が低いために比旋光度が小さい。そこで、非常に高い立体特異性を示すC1およびC2対称メタロセン触媒の合成を目指して、不斉配位子を用いた光学活性メタロセン錯体の選択的合成を試みた。その結果、配位子の光学分割において高純度の不斉配位子を高収率で得るための幾つかの指針が得られた。(4)高分子主鎖の立体配置によるキラル発現を環化共重合法で達成し、そのキラル発現の効率に対するテンプレートの嵩高さの効果を調べ、モノマーの回転異性体が係わる支配を明かにした。また、モデル環化反応による環化ユニマーの単離およびエナンチオマーの生成分布の定量から重合におけるキラル発現の因子を確認した。テンプレートから高分子の連鎖がキラルになる最小の構造単位として、孤立二連子B-A-A-Bによるキラル発現をポリマーの旋光度と孤立二連子の重量分率の相関から実証した。(5)光学活性アミン存在下、ポリマー主鎖に誘起されたポリ((4カルボキシフェニル)アセチレン)のらせん構造が、光学不活性なアミンで置換後も保持されることを見い出した。また、光学活性なポリチオフェン誘導体が様々の金属塩存在下、らせん構造を形成し、長波長領域に誘起CDを示すことも見い出した。
人工妊娠中絶前後の心理状態の把握とサポートの実践

妊婦健診時の超音波検査や,羊水検査,近年では母体血を用いた新しい出生前遺伝学的検査といった出生前診断が実施されているが,その結果の人工妊娠中絶については課題が議論され,適切な情報提供やカウンセリングが必須と言われている。心の専門家によるサポートが求められているが,臨床心理学領域では周産期喪失に特化したケアの実践研究や人材育成,その効果の評価が未発展である。そこで本研究では,出生前診断結果による人工妊娠中絶の心理ケア体制構築と実践のため,親に対して心理専門家が介入を行い、(1)人工妊娠中絶を経験した親の体験様式の現れの構造をとらえる,(2)退院後1ヶ月時の心理評価と検討,(3)退院後6ヶ月時の心理評価と検討,の3点について研究を計画した。1年目である平成30年度は心理評価をおこなうため質問紙配布の準備を行い、データ収集・整理を行った。質問紙には二次元レジリエンス尺度,複雑性悲嘆尺度,改訂出来事インパクト尺度を使用し、心理士介入希望のニーズについても把握した。複雑性悲嘆尺度は通常6ヶ月以上経過した時点での評価が必要であることから,半年後に再度実施し評定値の推移を把握する。数件はすでに6か月後の状況について郵送にて回答を回収しているが、現在も継続して調査実施中である。また、周産期喪失をした親へのカウンセリングを実施し、実践的にデータの蓄積を行い、スーパーヴィジョンを受けながら事例検討を行った。倫理的配慮を十分に行い研究を計画通り遂行し、日本質的心理学会で発表した。また、2年目の学会発表準備を行った。適宜、多職種間での連携や研究協力者とのミーティングの機会を持ち、関連する研修や学会への参加を行った。計画通り、(1)人工妊娠中絶を経験した親の体験様式の現れの構造をとらえる,(2)退院後1ヶ月時の心理評価と検討,(3)退院後6ヶ月時の心理評価と検討,を中心とした3点の研究が進んでいる。3年間の研究実施期間において予定しているデータの4割を収集できた。また、国内外での学会発表も順調に実施・準備ができている。引き続き、質問紙調査を行いデータの蓄積を行う。また、複雑性悲嘆尺度については通常6ヶ月以上経過した時点での評価が必要であることから,評定値の推移を把握する。カウンセリング実践も継続して行い事例の蓄積を行い分析を進める。参加を計画していた19th Congress of the International Society of Psychosomatic Obstetrics and Gynaecologyの開催地が、当初予定されていた韓国から、社会情勢によりオランダでの開催と変更され、旅費が予定よりも高額となる。そのため次年度使用が必要となったため。
森林放射性セシウム動態データベースの構築とマルチモデルによる将来予測

昨年度に引き続き放射性セシウムデータと調査地の情報の入力を行った。レコードの総数は約16000となった。また、入力された値を一つずつ確認する、位置情報を用いて航空機モニタリングの沈着量情報を結合し、各部位の濃度データをプロットすることで異常値を検出する等で、データの精査を行った。データベース構築の進捗状況を、国際原子力機関IAEAのMODARIAIIプロジェクトの会合(ウィーンIAEA本部)、およびそのワーキンググループ4: Fukushima datasectionの中間会合(福島大学)で報告し、海外の専門家のアドバイスを受けた。国立環境研究所において開発されたFoRothCsモデルのパラメータを、森林総合研究所の行っているモニタリングデータを用いてチューニングし、モデルの精度向上を検証した。結果をJournal of Environmental Radioactivityに発表した。なお、プログラムのコードはGithub repositoryで公開した。また改良版RIFE1モデルを2013年に発表された最初の2年のデータを用いてチューニングした予測結果(インベントリー)は、その後に行われた観測結果とおおむね一致したが、常緑針葉樹(スギ)林においては、リターから鉱質土壌への放射性セシウムの移行を過大評価していた。落葉広葉樹(コナラ)林は初期の予測値とその後の観測が非常に良く一致した。改良版RIFE1モデルを森林総合研究所の最新のモニタリングデータを用いて再チューニングし、モデリングを行った。材の濃度も、スギ・コナラ・アカマツの異なる挙動を良好に再現できた。その結果を用いてマップ化を行った。当初の計画に沿って、森林内の放射性セシウム動態のデータベースを構築し、またFoRothCsおよびRIFE1の二つのモデルを用いて森林内の放射性セシウム動態を予測した。平成30年度が最終年度であるため、記入しない。本研究は、森林内の放射性セシウム動態の観測データを最大限収集整理しデータベースを構築すること、またそのデータを用いてマルチモデル(複数モデル)による将来予測を行うことを目的としている。さらに、データベースとモデルはオープンアクセス化する。今年度は、福島の放射性セシウム観測データが報告されている複数の学術論文および林野庁事業の報告書をもとに、データベースのプロトタイプを構築した。データベースは、利用しやすさを考慮し、マイクロソフト社のエクセルを採用した。データベースには、文献情報、位置情報、森林の属性情報(林齢や樹種など)、放射性セシウム情報(各部位の単位重量あたりのセシウム量および単位面積あたりのセシウム量やその測定法)を入力していくが、位置情報から、外部データから得られる気温や降水量、航空機モニタリングのデータが入力できるようにした。構築したプロトタイプのデータベースを、国際原子力機関IAEAのMODAIRAIIプロジェクトの第1回専門家会合で報告し、海外の専門家のアドバイスを受けた。その結果、QA/QC (quality assurance/quality control;品質保証/品質管理)としてダブルチェックを加えることや、プルダウンメニューを構築することによる入力ミスを低減する仕組みを取り入れることとなった。また国立環境研究所において開発されたFoRothCsモデルを、森林総合研究所が行っているモニタリングデータを用いてパラメータ決定可能か検討を開始した。最適なパラメータ探索には、近似ベイズ計算の手法を用いた。データベースのプロトタイプを構築することができ、データ収集の基礎ができた。本研究は、森林内の放射性セシウム動態のデータベースを構築すること、またそのデータを用いてマルチモデル(複数モデル)による将来予測を行うことを目的としている。今年度は、昨年度構築したデータベースのプロトタイプを改良しながら、データ入力を行った。Web of ScienceやJ-Stageを活用しながら、英語・日本語の学術誌から論文を収集し、データを抽出してデータ入力を行った。加えて、林野庁の調査と福島県によるモニタリングデータも入手し、データ入力を行った。現時点でレコード数は約10000となった。データベースからスギの葉および表層リターに関してデータを抽出し、初期の総沈着量で正規化した濃度をサンプリング年でプロットし時間変化を調べたところ、葉・リターともに初期の総沈着量によらず時間とともに確実に指数関数的に濃度が低減していた。しかし、事故当時に比べて非常に小さい値に収束している葉の濃度に比べ、リターの濃度は4分の1程度のところで定常しているように見受けられた。データベース構築の進捗状況を、国際原子力機関IAEAのMODAIRAIIプロジェクトの第2回専門家会合(ウィーンのIAEA本部で開催)、およびそのワーキンググループ4: Fukushima datagroupの中間会合(筑波大学で開催)で報告し、海外の専門家のアドバイスを受けた。また、データベースに収録されている森林総合研究所のモニタリングデータと福島県のモニタリングデータを比較した。さらに国立環境研究所において開発されたFoRothCsモデルのパラメータを、森林総合研究所が行っているモニタリングデータを用いて決定する方法に関して、観測値を直に用いるのではなく、データに指数関数を適用し指数関数の定数を比較する方法を検討した。データベース構築及びモデル化は順調に進展している。データベースは現時点で10000レコードを超えるデータを収集することができた。またモデル化も進んでおり、モデル論文が1本投稿中である。また国際会議で発表を毎年行っている。これらのことから、おおむね順調に進展していると判断する。

また、入力された値を一つずつ確認する、位置情報を用いて航空機モニタリングの沈着量情報を結合し、各部位の濃度データをプロットすることで異常値を検出する等で、データの精査を行った。データベース構築の進捗状況を、国際原子力機関IAEAのMODARIAIIプロジェクトの会合(ウィーンIAEA本部)、およびそのワーキンググループ4: Fukushima datasectionの中間会合(福島大学)で報告し、海外の専門家のアドバイスを受けた。国立環境研究所において開発されたFoRothCsモデルのパラメータを、森林総合研究所の行っているモニタリングデータを用いてチューニングし、モデルの精度向上を検証した。結果をJournal of Environmental Radioactivityに発表した。なお、プログラムのコードはGithub repositoryで公開した。また改良版RIFE1モデルを2013年に発表された最初の2年のデータを用いてチューニングした予測結果(インベントリー)は、その後に行われた観測結果とおおむね一致したが、常緑針葉樹(スギ)林においては、リターから鉱質土壌への放射性セシウムの移行を過大評価していた。落葉広葉樹(コナラ)林は初期の予測値とその後の観測が非常に良く一致した。改良版RIFE1モデルを森林総合研究所の最新のモニタリングデータを用いて再チューニングし、モデリングを行った。材の濃度も、スギ・コナラ・アカマツの異なる挙動を良好に再現できた。その結果を用いてマップ化を行った。当初の計画に沿って、森林内の放射性セシウム動態のデータベースを構築し、またFoRothCsおよびRIFE1の二つのモデルを用いて森林内の放射性セシウム動態を予測した。今後は網羅的に文献やレポートを集めてデータを入力していく。データベース構築およびモデル化はおおむね順調に進展しているので、このまま研究を推進する。データベースは今後、収録データを精査し、公開へ向けて準備を行う。またマルチモデル(複数モデル)での予測を行っていく。平成30年度が最終年度であるため、記入しない。
α２－アンチプラスミンのＮａｋｅｄ　ＤＮＡ直接注入法による口腔癌遺伝子治療の開発

α2-アンチプラスミン遺伝子導入細胞をヌードマウス背部皮下に移植し,形成した腫瘍を免疫組織化学染色にて検索した.遺伝子導入細胞による形成腫瘍は,親株での形成腫瘍と比較し,細胞膜上でE-カドヘリンの高い染色性を認めた.さらに,E-カドヘリンの裏打ち蛋白であるβ-カテニンの細胞膜での発現が,遺伝子導入細胞による形成腫瘍では亢進していた.これらの結果は,α2-アンチプラスミン蛋白によるプラスミン活性の阻害が,口腔扁平上皮癌細胞の分散能を低下させる可能性を示唆している.したがって,α2-アンチプラスミン蛋白発現誘導は口腔癌の浸潤・転移を抑制する,新しい遺伝子治療の開発につながることが期待できる.プラスミンは細胞外基質蛋白に対し強い分解活性を示すほか,他の不活性型蛋白分解酵素を活性化し,がんの浸潤・転移を制御していると報告されている.本研究者は,プラスミンが,細胞間接着分子であるE-カドヘリンを切断し,がん細胞の分散能を亢進することを報告し,さらに,プラスミンが癌細胞の増殖能を亢進することを示してきた.したがって,プラスミンは,細胞外基質蛋白分解系の中心的な役割を果たすほか,E-カドヘリンをプロセシングすることで,がん細胞の分散能と増殖能を亢進させ,がんの浸潤・転移を促進していると推測している.本研究では,プラスミン阻害物質であるα2-アンチプラスミン蛋白の発現を誘導し,扁平上皮癌の蛋白分解活性のみならず細胞分散能と増殖能を低下させることで,口腔癌の浸潤・転移を抑制することを目的としている.実験には口腔扁平上皮癌細胞株と,その細胞株にα2-アンチプラスミン遺伝子を導入した細胞を用いた.α2-アンチプラスミンの発現誘導が,扁平上皮癌細胞の細胞増殖に与える影響について検討するために,まずプラスミノーゲンを含む培地で各細胞を培養し,経時的に増殖細胞数を算定した.α2-アンチプラスミン遺伝子導入細胞は低い増殖能を示し,培養7日目の増殖細胞数は親株の約1/2であった.つぎに1000万個の各細胞を0.1mlの培地に浮遊させ,4週齡ヌードマウスの背部皮下に接種し,経時的に腫瘍の大きさを測定した.遺伝子導入細胞は腫瘍を形成するものの増大を認めず,親株にくらべ増殖能が著しく低下していた.これらの結果は,α2-アンチプラスミン蛋白の発現によるプラスミン活性の低下が口腔扁平上皮癌細胞の浸潤増殖を抑制している可能性を示唆している.したがって,α2-アンチプラスミン蛋白発現誘導は口腔癌の浸潤・転移を抑制する,新しい遺伝子治療の開発につながることが期待できる.プラスミンは細胞外基質蛋白に対し強い分解活性を示すほか,他の不活性型蛋白分解酵素を活性化し,がんの浸潤・転移を制御していると報告されている.本研究者は,プラスミンが,細胞間接着分子であるE-カドヘリンを切断し,がん細胞の分散能を亢進することを報告し,さらに,プラスミンが癌細胞の増殖能を亢進することを示してきた.したがって,プラスミンは,細胞外基質蛋白分解系の中心的な役割を果たすほか,E-カドヘリンをプロセシングすることで,がん細胞の分散能と増殖能を亢進させ,がんの浸潤・転移を促進していると推測している.本研究では,プラスミン阻害物質であるα2-アンチプラスミン蛋白の発現を誘導し,扁平上皮癌の蛋白分解活性のみならず細胞分散能と増殖能を低下させることで,口腔癌の浸潤・転移を抑制することを目的としている.実験には口腔扁平上皮癌細胞株と,その細胞株にα2-アンチプラスミン遺伝子を導入した細胞を用いた.α2-アンチプラスミンの発現誘導が,扁平上皮癌細胞の細胞増殖に与える影響について検討するために,まずプラスミノーゲンを含む培地で各細胞を培養し,経時的に増殖細胞数を算定した.α2-アンチプラスミン遺伝子導入細胞は低い増殖能を示し,培養7日目の増殖細胞数は親株の約1/2であった.つぎに1000万個の各細胞を0.1mlの培地に浮遊させ,4週齡ヌードマウスの背部皮下に接種し,経時的に腫瘍の大きさを測定した.遺伝子導入細胞は腫瘍を形成するものの増大を認めず,親株にくらべ増殖能が著しく低下していた.これらの結果は,α2-アンチプラスミン蛋白の発現によるプラスミン活性の低下が口腔扁平上皮癌細胞の浸潤増殖を抑制している可能性を示唆している.したがって,α2-アンチプラスミン蛋白発現誘導は口腔癌の浸潤・転移を抑制する,新しい遺伝子治療の開発につながることが期待できる.α2-アンチプラスミン遺伝子導入細胞をヌードマウス背部皮下に移植し,形成した腫瘍組織中を免疫組織化学染色およびWestern Blotにて検索した.遺伝子導入細胞によるヌードマウス形成腫瘍は,親株での形成腫瘍と比較し,細胞膜上でE-カドヘリンの高い染色性を認めた.さらに,E-カドヘリンの裏打ち蛋白であるβ-カテニンの細胞膜での発現が,遺伝子導入細胞による形成腫瘍では亢進していることが確認された.α2-アンチプラスミン遺伝子導入細胞のリンパ節転移能を検索するために,現在,遺伝子導入細胞をヌードマウス足蹠皮下に移植し,膝窩リンパ節への転移の有無や転移巣の大きさおよび数を検討している.

プラスミンは細胞外基質蛋白に対し強い分解活性を示すほか,他の不活性型蛋白分解酵素を活性化し,がんの浸潤・転移を制御していると報告されている.本研究者は,プラスミンが,細胞間接着分子であるE-カドヘリンを切断し,がん細胞の分散能を亢進することを報告し,さらに,プラスミンが癌細胞の増殖能を亢進することを示してきた.したがって,プラスミンは,細胞外基質蛋白分解系の中心的な役割を果たすほか,E-カドヘリンをプロセシングすることで,がん細胞の分散能と増殖能を亢進させ,がんの浸潤・転移を促進していると推測している.本研究では,プラスミン阻害物質であるα2-アンチプラスミン蛋白の発現を誘導し,扁平上皮癌の蛋白分解活性のみならず細胞分散能と増殖能を低下させることで,口腔癌の浸潤・転移を抑制することを目的とした.実験には口腔扁平上皮癌細胞株と,その細胞株にα2-アンチプラスミン遺伝子を導入した細胞を用いた.α2-アンチプラスミン遺伝子導入細胞をヌードマウス背部皮下に移植し,形成した腫瘍組織を免疫組織化学染色およびWestern Blotにて検索した.遺伝子導入細胞によるヌードマウス形成腫瘍は,親株での形成腫瘍と比較し,細胞膜上でE-カドヘリンの高い染色性を認めた.さらに,E-カドヘリンの裏打ち蛋白であるβ-カテニンの細胞膜での発現が,遺伝子導入細胞による形成腫瘍では亢進していることが確認された.これらの結果は,α2-アンチプラスミン蛋白によるプラスミン活性の阻害が,口腔扁平上皮癌細胞の分散能を低下させる可能性を示唆している.したがって,α2-アンチプラスミン蛋白発現誘導は口腔癌の浸潤・転移を抑制する,新しい遺伝子治療の開発につながることが期待できる.α2-アンチプラスミン遺伝子導入細胞をヌードマウス背部皮下に移植し,形成した腫瘍を免疫組織化学染色にて検索した.遺伝子導入細胞による形成腫瘍は,親株での形成腫瘍と比較し,細胞膜上でE-カドヘリンの高い染色性を認めた.さらに,E-カドヘリンの裏打ち蛋白であるβ-カテニンの細胞膜での発現が,遺伝子導入細胞による形成腫瘍では亢進していた.これらの結果は,α2-アンチプラスミン蛋白によるプラスミン活性の阻害が,口腔扁平上皮癌細胞の分散能を低下させる可能性を示唆している.したがって,α2-アンチプラスミン蛋白発現誘導は口腔癌の浸潤・転移を抑制する,新しい遺伝子治療の開発につながることが期待できる.平成26年度はα2-アンチプラスミン遺伝子導入細胞をヌードマウス背部皮下に移植し,形成した腫瘍組織中のE-カドヘリンおよび細胞増殖関連蛋白の発現を免疫組織化学染色およびWestern Blotにて検索することとしていた.遺伝子導入細胞によるヌードマウス形成腫瘍は,親株での形成腫瘍と比較し,細胞膜上でE-カドヘリンの高い染色性を認めた.さらに,E-カドヘリンの裏打ち蛋白であるβ-カテニンの細胞膜での発現が,遺伝子導入細胞による形成腫瘍では亢進していた.しかしながら,細胞増殖関連蛋白の発現についてはまだ確認できていない.また,α2-アンチプラスミン遺伝子導入細胞のリンパ節転移能を検討するために,遺伝子導入細胞をヌードマウス足蹠皮下に移植し,膝窩リンパ節への転移の有無や転移巣の大きさおよび数を測定するとしていたが,現在進行中でまだ結果は得られていない.本研究では,α2-アンチプラスミン遺伝子を,病原性のない安全なプラスミドDNAすなわちNaked DNAの形状で腫瘍組織内へ直接注入することにより,α2-アンチプラスミン蛋白のin vivoでの発現を誘導し,扁平上皮癌における蛋白分解活性のみならず細胞分散能と増殖能を低下させることで,口腔癌の浸潤・転移を抑制する,新しい遺伝子治療の開発を目的としている.α2-アンチプラスミン遺伝子細胞によるヌードマウス形成腫瘍で,細胞膜でのE-カドヘリンの発現亢進を認めたことから,α2-アンチプラスミンが癌細胞の分散能を低下させることが期待される.
ヒト心筋分化誘導因子の同定－細胞医療を視野に入れた複合治療戦略の創成－

成体内のさまざまな臓器由来の間葉系幹細胞株を確立し、細胞寿命の延長に関わる遺伝子を導入して細胞の増殖能の増加、寿命の延長を検討した。間葉系細胞を効率よく心筋細胞に分化させる因子を網羅的に分析し、その一部としてGrem1が同活性を有していることを発表した。高い心筋分化効率を有する間葉系幹細胞株にのみ強発現している遺伝子をMicroArray法により同定し、CD29high CD34low c-kit+ CD140a+に着目し、細胞の検証を行い間葉系幹細胞から心筋細胞に分化しやすい細胞を選択する方法を確立した。間葉系細胞の傷害心筋へのin vivo移植実験を行い、心筋細胞補充療法の基盤を確立した。心不全・心筋梗塞の新しい治療法として再生治療が注目されている。現在、骨格筋芽細胞、骨髄細胞、内皮前駆細胞による細胞移植が臨床試験中であるが、臨床的に十分な数の心筋細胞と血管の両者を再生する方法は確立されていない。我々はUBET細胞がES細胞やP19CL6細胞株を高率に心筋細胞に分化させる分泌因子を産生していることを発見し、その蛋白質の一つを同定した。本研究では骨髄間葉系細胞、心筋幹細胞を心筋細胞に分化誘導する因子と、血管新生を促進する因子を単離精製し、非侵襲的な心血管分化誘導療法の確立を目的とする。本研究において、(1)様々な臓器由来のヒト間葉系幹細胞株から効率よく多量の分化心筋細胞を獲得する方法の確立、骨髄間葉系細胞を心筋細胞に分化誘導する分泌分子の単離精製と臨床応用を目指したin vivoでの効果の検討、(2)心臓幹細胞である心臓Sidepopulation(SP)細胞の心筋細胞への分化誘導、(3)移植組織の血管新生の機序と促進因子の同定を行う。本年度はヒト由来間葉系幹細胞に着目し、採取方法、培養方法の標準化をおこなった。培養方法については完全ヒト型培養法の確立を目指し、未分化状態での維持法ならびに分化誘導培養法の標準化についても検討した。これらの培養で維持された細胞について、効率よく心筋細胞に分化させる因子を質量分析、シグナルシークエンストラップ法(SST法)などにより網羅的に分析し、複数精製する。さらに、高い心筋分化効率を有する間葉系幹細胞株にのみ強発現している遺伝子をMicroArray法により同定した。本研究では骨髄間葉系細胞、心筋幹細胞を心筋細胞に分化誘導する因子と、血管新生を促進する因子を単離精製し、非侵襲的な心血管分化誘導療法の確立を行う。本研究において、(1)様々な臓器由来のヒト間葉系幹細胞株から効率よく多量の分化心筋細胞を獲得する方法の確立、骨髄間葉系細胞を心筋細胞に分化誘導する分泌分子の単離精製と臨床応用を目指したin vivoでの効果の検討、(2)心臓幹細胞である心臓Side population(SP)細胞の心筋細胞への分化誘導、(3)移植組織の血管新生の機序と促進因子の同定を目指し研究を遂行した。ヒト由来間葉系幹細胞に着目し、採取方法、培養方法の標準化の検討を行った。培養方法については完全ヒト型培養法の確立を目指すとともに、未分化状態での維持法ならびに分化誘導培養法の検討も行った。培養上清中の物質を、P19CL6の心筋細胞への分化誘導能を指標に精製し、質量分析により同定した。シグナルシークエンストラップ法(SST法)により、UBET細胞より分泌される分子を多数同定し、P19CL6の心筋細胞分化誘導能を指標とした。SST法によりなるべく多くの分泌蛋白質を同定した。UBET細胞と心筋細胞分化誘導能のない間葉系細胞のDNAchip解析またはサブストラクションを行い、発現の異なる分泌性分子より、心筋細胞分化誘導因子を検討した。ヒト間葉系幹細胞を高率に心筋に分化させるのに必要な条件を、バイオインフォマティクスの手法を用いて推測した。我々の保持している多種の組織由来のヒト間葉系細胞の中から心筋に分化しやすい細胞の特徴を解析することで、心筋分化の可能性の高い細胞を有効に選択する技術開発を行った。骨格筋芽細胞、骨髄細胞、内皮前駆細胞による細胞移植が臨床試験中であるが、臨床的に十分な数の心筋細胞と血管の両者を再生する方法は確立されていない。

本研究では骨髄間葉系細胞、心筋幹細胞を心筋細胞に分化誘導する因子と、血管新生を促進する因子を単離精製し、非侵襲的な心血管分化誘導療法の確立を目的とした。本研究において、1様々な臓器由来のヒト間葉系幹細胞株から効率よく多量の分化心筋細胞を獲得する方法の確立、骨髄間葉系細胞を心筋細胞に分化誘導する分泌分子の単離精製と臨床応用を目指したin vivoでの効果の検討、2心臓幹細胞である心臓Side population(SP)細胞の心筋細胞への分化誘導、3移植組織の血管新生の機序と促進因子の同定、を目的とし研究を遂行した。本年度は、「バイオインフォマティクスを用いた心筋分化因子の探索」を行った。ヒト間葉系幹細胞を高率に心筋に分化させるのに必要な条件を、バイオインフォマティクスの手法を用いて検討した。我々の保持している多種の組織由来のヒト間葉系細胞の中から心筋に分化しやすい細胞の特徴を解析することで、心筋分化の可能性の高い細胞を有効に選択する技術開発を行った。従来、ヒト骨髄由来間葉系細胞を心筋に分化させるのに用いてきた、マウス胎児心筋の発現遺伝子を解析し、心筋分化に必要な液性因子(サイトカイン、成長ホルモン、転写因子など)の明確化を行った。また「異種動物成分を排除したヒト間葉系幹細胞培養法・維持法の標準化」を行った。ヒト血清ならびにヒト液性因子のみ、あるいは無血清培地を用いた培養法の検討を行った。ヒト間葉系幹細胞の培養・心筋への分化誘導法の確立ヒト由来間葉系幹細胞に着目し、採取方法、培養方法の標準化を行った。培養方法については完全ヒト型培養法の確立を目指すとともに、未分化状態での維持法ならびに分化誘導培養法の標準化も行う。これらの培養で維持された細胞について、効率よく心筋細胞に分化させる因子を質量分析、シグナルシークエンストラップ法(SST法)などにより網羅的に解析した。さらに、高い心筋分化効率を有する間葉系幹細胞株にのみ強発現している遺伝子をMicroArray法により検索した。また、UBET細胞培養上清中に存在する心筋細胞分化誘導因子を同定するために、培養上清中の物質を、P19CL6細胞の心筋細胞への分化誘導能を指標に精製し、質量分析により解析した。SST法によりなるべく多くの分泌蛋白質を同定する。UBET細胞と心筋細胞分化誘導能のない間葉系細胞のDNA chip解析またはサブストラクションを行い、発現の異なる分泌性分子より、心筋細胞分化誘導因子を検索した。バイオインフォマティクスを用いた心筋分化因子の探索については、ヒト間葉系幹細胞を高率に心筋に分化させるのに必要な条件を、バイオインフォマティクスの手法を用いて推測した。具体的には我々の保持している多種の組織由来のヒト間葉系細胞の中から心筋に分化しやすい細胞の特徴を解析することで、心筋分化の可能性の高い細胞を有効に選択する技術を開発する。従来、ヒト骨髄由来間葉系細胞を心筋に分化させるのに用いてきた、マウス胎児心筋の発現遺伝子を解析することで、心筋分化に必要な液性因子(サイトカイン、成長ホルモン、転写因子など)に関する検討を行った。心不全・心筋梗塞の新しい治療法として再生治療が注目されている。現在、骨格筋芽細胞、骨髄細胞、内皮前駆細胞による細胞移植が臨床試験中であるが、臨床的に十分な数の心筋細胞と血管の両者を再生する方法は確立されていない。