hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
組織常在性記憶T細胞によるアトピー性皮膚炎の再発機構の解明

本年度、CD4+及びCD8+TRMのどちらがLSM形成に重要かを検討した。T/B細胞の欠損のためLSMが形成されないSCIDマウスにCD4+又はCD8+細胞を除去した野生型マウスの皮膚所属リンパ節細胞を移植し免役すると、どちらの細胞を欠損していてもLSM反応が回復したことから、CD4+又はCD8+TRMのどちらか一方のみでLSMが形成されることが示唆された。同様の結論が、LSMを欠損するT細胞受容体Tgマウス(BALB/c-DO11.10)への単離したCD4+又はCD8+T細胞の移植実験、及び、野生型BALB/cマウスへの抗CD4又はCD8抗体の投与によるT細胞除去実験でも得られた。よって、形成されたLSMを無くし抗原感受性の上昇を元に戻すためには、CD4+及びCD8+TRMの両方を皮膚から取り除く必要があることが分かった。更に、活性化したTRMから放出されるサイトカインを同定するため抗原再暴露後の皮膚全体のmRNAを解析したところ、早期(1.5h)にIFNgの発現が著しく亢進し、TNFやIL-4の発現も亢進した。遅れて(3h)、IL-1b, IL-9, IL-22, CXCL1/2等が亢進した。よって、TRMは主にIFNgの放出を通じてLSM反応を生じさせると考えられた。これを証明するために抗原再暴露と同時にIFNgの中和抗体を投与する実験を行ったがLSM反応は抑制されず、TNF等の他のサイトカインもLSM反応に関与することが示唆された。当初の計画通り実験を行い、CD4+とCD8+TRMのリダンダンシーが明らかになり、抗原再暴露時のサイトカインの経時的な発現変化からLSM反応の分子機構の一連の流れが見えてきた。LSM反応の最上流に位置するTRMから放出され引き金となるサイトカインを同定するためには、中和抗体を用いた阻害実験でLSM反応を抑制できることを示さなければならないが、最有力と考えていたIFNgの抑制のみでは不十分なことが分かり、現段階では発現解析以上の結論を得られていない。サイトカイン(IFNgとTNF)にもリダンダンシーが存在する可能性があり、当初の計画通りにはこの点を解決できていない。LSM反応を生じさせる分子機構を特定するため、IFNgの中和抗体に加え同時にTNF等も中和し、LSM反応を抑制できるか検討する。また中和抗体だけで無く、IFNgやTNFシグナルの下流分子(JAK1/2, NF-kB)の化学阻害剤を用いることでも検討する。また次年度の計画通り、TRMを皮膚から除去するために脂質代謝阻害剤等の種々の化学抑制剤を継続的に皮膚に塗布または投与する。TRMを除去しLSMを解消することができるか検討する。

また次年度の計画通り、TRMを皮膚から除去するために脂質代謝阻害剤等の種々の化学抑制剤を継続的に皮膚に塗布または投与する。TRMを除去しLSMを解消することができるか検討する。
肥満の減量に対する高地および走者応答型トレーニングシステムの有効性に関する研究

本研究は、肥満者を対象に、低圧環境下の歩行運動に対する運動終了後のエネルギー消費量(実験1)、さらに、12週間のトレーニング期間で歩行運動を週3回の頻度で、1回が高地(低圧低酸素環境)、残り2回が平地(常圧環境、走者応答型トレッドミル使用)の併用によるトレーニングの有効性(実験2)等を検討した。その結果、実験1では、1.低圧環境下の運動終了30分、60分後のエネルギー消費量は、常圧環境後の値に比べて,有意な高値を示した(p<0.05)。2.翌朝の安静時代謝量は、低圧環境後の方が非運動時の値に比べて、有意な増加を示した(p<0.01)。安静時の脂肪からのエネルギー消費量は、低圧環境後の方が常圧環境後に比較して、有意な増加を示した(p<0.01)。実験2では、1.トレーニング前後の体重は、実験群と対照群(週3回、常圧環境下の歩行運動)とも、有意な低下を示した(p<0.01、p<0.05)。トレーニング前後の平均値の差では、実験群が対照群に比して、大きな傾向を示した。2.体脂肪量は、両群とも有意な低下を示した(p<0.05)が、平均値の差では実験群が対照群に比して、大きな傾向を示した。3.トレーニング前後の安静時代謝量は、実験群が有意な増加を示した(p<0.05)。4.安静時の脂肪からのエネルギー消費量は、両群とも有意な増加を示した(p<0.01、p<0.05)が平均値の差では、実験群が対照群に比べて、大きな傾向を示した。以上、本研究の成績から、低圧環境下の歩行運動は、運動後、長時間にわたって脂質代謝を亢進させ、エネルギー消費量を高める可能性のあること、さらに、トレーニング頻度を週3回とした場合、1回の高地と2回の平地による併用の歩行運動が単に平地の歩行運動に比べて、長期間、継続することで安静時代謝量の亢進と脂質代謝の改善が行われ、より効果的な減量ができる可能性のあることが示唆された。これらの観点からも本トレーニングシステムは、肥満の有効な運動療法の1つになると考えられる。1.目的:本研究は、減量・ウェイトコントロールを必要とする肥満者を対象に、低圧環境下における乳酸性閾値の強度を指標とした歩行運動が運動終了後のエネルギー消費量にどのような影響を及ぼすか検討した。2.方法:実験対象は、2560歳の男子肥満者6名を被験者とした。肥満者は、常圧環境下(気圧;760mmHg)と低圧環境下(標高1500mに相当する気圧;634mmHg)に分け、それぞれ60分間の歩行運動を行わせた。3.結果および考察:(1)運動中の全エネルギー消費量は、低圧環境下と常圧環境下との間に有意の差がみられなかった。糖質および脂肪からの推定エネルギー消費量も両環境間に顕著な差が認められなかった。(2)低圧環境下における運動終了

30分後のエネルギー消費量は、常圧環境後の値に比較して,有意な高値を示した(p<0.05)。(3)運動終了60分後のエネルギー消費量も運動終了30分後の変化と同様に、低圧環境後が常圧環境後に比して、高値を示した(p<0.05)。脂肪からの推定エネルギー消費量も低圧環境後が常圧環境後の値に比較して、有意な高値を示した(p<0.05)。(4)運動終了後の翌朝における安静時代謝量は、両環境間で有意な差がみられなかった。しかし、低圧環境後の値は、非運動時の安静時代謝量に比較して、有意な増加を示した(p<0.01)。安静時における脂肪からのエネルギー消費量は、低圧環境後の方が常圧後の値に比較して、有意な増加を示した(p<0.01)。以上、本研究の成績から、肥満者に対する標高1500mに相当する低圧環境下における60分間の歩行運動は、運動後、長時間にわたって脂質代謝を亢進させ、安静時代謝量を高める可能性のあることが示唆された。したがって、近年、女性や中高年者が週末を利用してトレッキングなどでの高地登山の増加は、登山後の長時間にわたるエネルギー代謝の亢進がみられ、肥満の予防および健康増進の観点から推奨されるであろうと考えている。本研究は、減量・ウエイトコントロールを必要とする肥満者を対象に、12週間のトレーニング期間で歩行運動を週3回の頻度で、1回が高地(低圧低酸素環境)、残り2回が平地(常圧環境)の併用によるトレーニングの有効性について身体組成およびエネルギー代謝の面からどのような影響を及ぼすかを検討した。その結果、1.トレーニング前後の体重は、実験群および対照群(週3回、常圧環境下の歩行運動)の両群とも、有意な低下を示した(p<0.01、p<0.05)。トレーニング前後の平均値の差では、実験群の方が対照群に比較して、より大きな傾向を示した。2.体脂肪率は、実験群および対照群とも有意な低下を示した(p<0.01、p<0.05)。3.体脂肪量は、実験群および対照群とも有意な低下を示した。(いずれもp<0.05)。トレーニング前後の平均値の差は、体重の変化と同様に実験群が対照群に比較して、より大きな傾向を示した。除脂肪体重、(LBM)は、両群ともトレーニング前後でほぼ同値を示した。トレーニング前後の安静時代謝量は、実験群が有意な増加を示した(p<0.05)のに対して、対照群では、有意な差が認められなかった。5.トレーニング前後の安静時における脂肪からのエネルギー消費量は、実験群および対照群とも有意な増加を示した(p<0.01、p<0.05)。以上、本研究の成績から、肥満者を対象に、トレーニング頻度を週3回とした場合、1回の高地(低圧低酸素環境)と残り2回の平地(常圧環境)の併用による歩行運動は、単に平地(常圧環境)の歩行運動(週3回の頻度)に比較して、長期間にわたって継続することで安静時代謝量の亢進および脂質代謝の改善が行われ、より効果的な減量ができる可能性のあることが示唆された。これらの観点からも本トレーニングシステムは、肥満の有効な運動療法の1つになることが考えられる。
自己組織化ナノ構造構築とトップダウンアドレッシングを融合する多機能人工ペプチド

本申請は、自己組織化を利用したボトムアップ・ナノ構造構築における問題点である「アドレッシング」を、無機材料結合ペプチドの特異的結合能を利用したダイレクトパターンニング法(DP法)により解決し、続いてBioLBL法により「アドレッシング」に従ったナノ積層構造体形成法、DP-BioLBL法の開発を目指すものである。本年度は、トップダウン法である電子線リソグラフィーによってチタンと白金をナノスケールでアドレッシングした基板を用いて、DP法をおこない、続いてBioLBL法による積層化をおこなった。形成された構造体の走査型電子顕微鏡像から、X-Y面でナノスケールのアドレッシングに沿った積層構造が観察され、さらに断面像の透過形電子顕微鏡による解析からz軸方向においても、プログラム順に正しく積層膜が形成されていることを確認した。このことは、自己組織化ナノ構造構築とトップダウンアドレッシングの融合技術であるDP-BioLBL法の開発の成功、すなわち、従来法では困難な作りたいところに作りたいナノ構造をボトムアップに作製する技術開発という目標を達成した。本申請は、自己組織化を利用したボトムアップ・ナノ構造構築における問題点である「アドレッシング」を、無機材料結合ペプチドの特異的結合能を利用したダイレクトパターンニング法(DP法)により解決し、続いてBioLBL法により「アドレッシング」に従ったナノ積層構造体形成法の開発をするものである。本年度は、以下の成果を得た。(1)DP法とBioLBL法の条件の擦り合わせDP法とBioLBL法の融合にあたり、従来のBioLBL法に於けるミネラル層として用いてきたシリカの前駆体の活性が高く、そのため非特異的なミネラル層形成およびブロッキング剤がミネラル層中に取り込まれてしまうなどの問題が生じた。そこで、前駆体の活性が低く極めて安定なチタニアをミネラル層形成に用いたDP法とBioLBL法の溶液条件の擦り合わせを行い、BioLBLが機能していることを水晶発振質量分析装置により確認した。次に、電子線リソグラフィーによってチタンと白金をサブマイクロメートルスケールでパターン化した基板を用いて、DP法をおこない、続いてBioLBL法により積層化を進めた。ナノ積層膜の配置制御がコンセプト通りに進行したことを、走査型電子顕微鏡により確認することができた。原子間力顕微鏡による観察も試みたが、解像度の点からは満足のいく結果が得られなかったが、予備的な結果ではあるものの位相差像からミネラル層の物理的な情報を得ることに成功した。現在、金属ナノ粒子をDP-BioLBL法を用いて積層膜中に積層方向に配列制御できることを透過型電子顕微鏡により確認を進めている。(3)化学修飾によるペプチド提示法の検討ペプチドの末端にシステイン残基を付加し、側鎖のSH基をターゲットに、ペプチドの標的粒子表面への修飾に成功し、BioLBL法により多層化することに成功した。
鉄鋼材料の疲労特性におよぼす残留応力の影響

本研究は,『鉄鋼材料の疲労特性におよぼす残留応力の影響』を定量的に解明することを目的としている.具体的にはまず,種々の大きさの残留応力をもつ疲労試験片を作製するための熱サイクルを開発した.次に,開発した熱サイクルで焼入処理を施した試験片の,疲労強度と破壊メカニズムを詳細に調べることを通じて,構造材料の疲労特性におよぼす残留応力の影響について定量的観点から検討・考察を加えた.研究成果の概要は以下の通りである.1.疲労特性の調査・破壊機構の解析:残留応力のピーク値が異なる試験片を2シリーズ選択し回転曲げ疲れ試験を行い,各シリーズの疲労強度を調べた.その結果,残留応力の大きさに依存して疲労強度は変化することが明らかになった.破断した試験片に対しては,破面のマクロ観察ならびに走査型電子顕微鏡によるミクロ観察を行い,破壊起点部を特定すると同時に疲労破壊機構を明確にした.2.総合的考察(破壊起点部位・疲労強度と残留応力の関係):ミクロ・マクロ観察結果に基づき決定した破壊起点部の位置と疲労試験前にそこに存在した残留応力との関連を調べ,破壊の起点と引張残留応力との関連を解明した.また,1.で求めた疲労強度の値と残留応力との関係を詳細に調べ,疲労強度におよぼす残留応力の影響について定量的観点から検討・考察を加えた.本研究は、「鉄鋼材料の疲労特性におよぼす残留応力の影響」を定量的に解明することを目的としている.具体的にはまず,種々の大きさの残留応力をもつ疲労試験片を作製するための熱サイクルを開発した.次に,開発した熱サイクルで焼入処理を施した試験片の、疲労強度と破壊メカニズムを詳細に調べることを通じて,構造材料の疲労特性におよぼす残留応力の影響について定量的観点から検討・考察を加えた.研究成果の概要は以下の通りである.1.熱処理プロセスの開発とモデル試験片の作製:回転曲げ疲れ試験片形状に機械加工した供試材に調質処理を施した後、マイクロパルスシステムを用いて,試験片平行部のほぼ中央まで,しかも表面層のみを焼入れにより硬化させることにより,非硬化域に引っ張り残留応力のピークが発生することを見出した.また,加熱温度や時間を種々の変化させて焼入処理を行うとともに表面における残留応力分布の測定し,引張残留応力のピーク値が異なる複数の試験片を製作するための処理条件を確立した.2.疲労特性の調査・破壊機構の解析:項目1.の結果から残留応力のピーク値が異なる試験片を2シリーズ選択し回転曲げ疲れ試験を行い,各シリーズの疲労強度を調べた.破断した試験片に対しては,破面のマクロ観察ならびに走査型電子顕微鏡によるミクロ観察を行い,破壊起点部を特定すると同時に疲労破壊機構を明確にした.本研究は,『鉄鋼材料の疲労特性におよぼす残留応力の影響』を定量的に解明することを目的としている.具体的にはまず,種々の大きさの残留応力をもつ疲労試験片を作製するための熱サイクルを開発した.次に,開発した熱サイクルで焼入処理を施した試験片の,疲労強度と破壊メカニズムを詳細に調べることを通じて,構造材料の疲労特性におよぼす残留応力の影響について定量的観点から検討・考察を加えた.研究成果の概要は以下の通りである.1.疲労特性の調査・破壊機構の解析:残留応力のピーク値が異なる試験片を2シリーズ選択し回転曲げ疲れ試験を行い,各シリーズの疲労強度を調べた.その結果,残留応力の大きさに依存して疲労強度は変化することが明らかになった.破断した試験片に対しては,破面のマクロ観察ならびに走査型電子顕微鏡によるミクロ観察を行い,破壊起点部を特定すると同時に疲労破壊機構を明確にした.2.総合的考察(破壊起点部位・疲労強度と残留応力の関係):ミクロ・マクロ観察結果に基づき決定した破壊起点部の位置と疲労試験前にそこに存在した残留応力との関連を調べ,破壊の起点と引張残留応力との関連を解明した.また,1.で求めた疲労強度の値と残留応力との関係を詳細に調べ,疲労強度におよぼす残留応力の影響について定量的観点から検討・考察を加えた.
食道癌肉腫の分子生物学的解析による食道扁平上皮癌・間葉系機構の解明

食道癌肉腫は癌腫成分と肉腫成分が混在する腫瘍である。その組織発生はこれまでの遺伝子解析では解析遺伝数が少なく一元、二元両説が存在する。癌腫・肉腫成分についてそれぞれ全遺伝子変異解析を行った。体細胞変異は癌腫成分で216個、肉腫成分で131個、両成分に共通する変異が42個検出された。コピー数以上(copy number variant: CNV)は、癌腫成分で190、肉腫部分で571領域と肉腫部分で多かった。食道癌肉腫はsingle cell originから発症し、体細胞変異を主体とし蓄積する癌腫成分とCNVを主として獲得する肉腫部分に分かれ増殖することが示唆された。癌の発生・進展には癌細胞周囲の間葉系細胞も重要な役割をもつ。癌間葉系機構には癌細胞からの上皮間葉系移行(EMT)、癌幹細胞からの上皮系・間葉系型腫瘍細胞への分化、癌関連線維芽細胞などの宿主側細胞による癌微小環境の変化、などがあげられる。癌肉腫は癌と肉腫が混在する稀な腫瘍であるが、前述の癌間葉系機構で通常癌に比べて特殊な異常が生じていることが考えられる。食道癌肉腫症例の、病理組織学検討では粘膜固有層より浅層や進行癌深部での肉腫化は見られず、表在食道癌と粘膜筋板周囲が癌肉腫発生の鍵となることが示唆された。癌腫・肉腫部をLaser microdisectionにて分離採取したDNAは断片化が強く、PCR-Sangar sequenceは困難で直接次世代シークエンサーによる変異解析を行う方針とした。DNA qualityから十分なdepthが得られない可能性が高く、標的遺伝子を絞ったtarget sequenceを検討した。他の癌腫で頻用される50の癌関連遺伝子パネルを用い食道扁平上皮癌5症例で解析したところ、TP53とFBXW7の2遺伝子しか変異が同定されなかった。発生組織特有の遺伝子パネルが必要と考えられ、食道癌Exome sequenceの既報告で共通して5%以上の頻度で変異が確認される25遺伝子を搭載した食道癌パネルを作成した。今後、食道癌組織での変異同定率を確認後、癌肉腫症例の部位別sequenceを施行予定である。食道癌肉腫症例は2000年以降症例で7症例存在した。多発食道癌を伴うもの、臨床像は様々であるが、病理組織学検討では粘膜固有層より浅層や進行癌深部での肉腫化は見られず、表在食道癌と粘膜筋板周囲が癌肉腫発生の鍵となることが示唆された。癌腫・肉腫部をそれぞれLaser microdisectionにて分離採取しDNA抽出後、TP53の変異同定を試みたが、DNA断片化が強く解析不能であった。100bp程のフラグメントへの断片化と考えられ、PCR-Sangar sequenceでの確認は省略し、直接次世代シークエンサーによる変異解析を行う方針とした。次世代シークエンサーによる網羅的(半網羅的)遺伝子変異解析ではその変異同定効率も重要となる。ホルマリン固定パラフィン材料など微量DNAからの次世代シークエンスではそのDNA qualityから十分なdepthが得られないことも多く、ある程度標的遺伝子を絞ったtarget sequenceが必要である。Sequence準備として食道癌5症例における癌関連遺伝子50個のhotspotを標的としたCancer Hotspot Panel (CHPv2)とTP53のすべてのexonを標的としたTP53 panelを用いたtarget sequenceを行いその効率を検証した。CHPv2では、TP53における4つのミスセンス変異と2つのナンセンス変異さらにFBXW7のミスセンス変異1つが確認された。TP53 panelでは、これらのTP53変異に加え、intronの変異が確認された。CHPv2とTP53 panelによる変異検出率はそれぞれ64個/1Mbp, 580個/1Mbpであり、exome解析の変異検出率3.1個/Mbpよりも10倍以上であった。食道癌肉腫症例の、病理組織学検討では粘膜固有層より浅層や進行癌深部での肉腫化は見られず、表在食道癌と粘膜筋板周囲の異常が癌肉腫発生の鍵となることが示唆された。癌腫・肉腫部を分離採取し次世代シークエンサーによる半網羅的変異解析を行う方針とした。食道癌症例で他の癌腫で頻用されるCancer Hotspot Panelを用いた解析では、1症例あたり1.2個の変異しか検出されなかったため、31遺伝子を標的とした食道癌パネルを独自にデザインした。これにより効率的に食道癌症例の遺伝子異常を検出することが可能となったため、本研究で対象とする癌肉腫の他、通常食道癌での腫瘍内のheterogeneityの解析にも応用可能である。。当初予定していた癌肉腫の部位別sequenceでは、ホルマリン固定標本材料からの解析となるため、100bp程度に断片化したDNAでは塩基配列決定が困難である。

新鮮標本での検討が望ましいため、新規癌肉腫症例からの標本採取を予定している。また、ホルマリン固定標本からのシークエンスが可能な他の次世代シークエンスのプラットフォームを用いた解析も検討中である。食道癌肉腫症例は2000年以降症例で7症例存在した。多発食道癌を伴うもの、臨床像は様々であるが、病理組織学検討では粘膜固有層より浅層や進行癌深部での肉腫化は見られず、表在食道癌と粘膜筋板周囲が癌肉腫発生の鍵となることが示唆された。癌腫・肉腫部をそれぞれLaser microdisectionにて分離採取しDNA抽出後、TP53の変異同定を試みたが、DNA断片化が強く解析不能であった。100bp程のフラグメントへの断片化と考えられ、PCR-Sangar sequenceでの確認は省略し、直接次世代シークエンサーによる変異解析を行う方針とした。次世代シークエンサーによる網羅的(半網羅的)遺伝子変異解析ではその変異同定効率も重要となる。ホルマリン固定パラフィン材料など微量DNAからの次世代シークエンスではそのDNA qualityから十分なdepthが得られないことも多く、ある程度標的遺伝子を絞ったtarget sequenceが必要である。食道癌5症例における癌関連遺伝子50個のhotspotを標的としたCancer Hotspot Panel (CHPv2)を用いた検討では、1症例あたり1.2個の変異しか検出できなかった。そこで、食道癌で変異頻度の高い31遺伝子を標的とした食道癌パネルを独自にデザインした。本panelでは平均8.1個の変異が検出され、さらにEGFRをはじめとする複数の遺伝子のcopy数上昇も確認できた。これにより効率的に食道癌症例の遺伝子異常を検出することが可能となったため、本研究で対象とする癌肉腫の他、通常食道癌での腫瘍内のheterogeneityの解析にも応用可能である。食道癌肉腫症例で臨床経過では再発病変への治療も含め特に肉腫部分で化学療法の効果を示した症例は見られなかった。食道癌肉腫に対し術前化学療法を施行し、癌部のみcomplete responseが得られ遺残した肉腫成分に対し食道切除を施行した症例について遺伝子解析を施行した。治療前内視鏡生検により得られた癌部サンプル、切除後に得られた肉腫部サンプルよりそれぞれDNAを抽出し、食道扁平上皮癌で変異を効率的に検出可能な独自デザインした食道癌パネルを用いた次世代シークエンサー(NGS)解析では、TP53 Y220C , CDKN2A D14fsの2つの変異が両成分に共通して見られたが、TP53 R280Tは癌成分にのみ見られた。Digital PCRによる解析でも肉腫成分のTP53 R280Tの変異アリル頻度(MAF)は0%であり、NGSの検出限界による差ではなく両成分のgenetic cloneが大きく分枝していることが示唆され、この差異が化学療法効果にも影響しているものと考えられた。両成分に対し全遺伝子変異解析では、癌成分で216、肉腫成分で131の体細胞変異が見られ、このうち41変異が両成分に共通する変異であった。両成分のMAF平均値は癌部で19.7%,肉腫部で33.0%と肉腫部で高値であった。コピー数異常(CNV)の検討では、癌部で190領域、肉腫部で571領域のコピー数異常が認められた。
上行性運動連鎖により関節負荷低減を図った脳卒中片麻痺のための足関節支援システム

我々は脳卒中片麻痺患者のための足関節運動支援装置を開発してきた。片麻痺患者は筋の随意性低下によって代償歩行となり、踵接地時に股・膝関節に衝撃が加わることで、変形性膝関節症等の原因になる。そのため誤学習した歩行を改善し関節負荷を低減する装置の提案が必要となる。これまでは底背屈・内外反動作のうち単一動作を支援する機器が研究されてきた。そこで本研究では足関節の底背屈・内外反の制御機構と、股・膝の負担が最小限となる足関節の制御手法の提案を目的とする。まず本提案手法が有効と考えられる患者を特定するため、背屈支援が重症度と杖の有無によって膝関節へ及ぼす影響の変化について検証した。結果、重症度が比較的低く股関節外旋を伴う患者の場合、背屈支援による膝関節への影響が比較的大きく、上行性運動連鎖を用いた膝関節アライメントの調整により、より正しい歩容が実現できる可能性が示唆された。一方で、重症度が低く、健常に近い歩容を示す患者では、装置の機能によっては、既に獲得した歩容を崩す可能性が明らかとなった。また重症度が高く元々膝折れ歩行となっている患者の場合、常に背屈している状態であるため背屈支援による効果が得られ難い他、背屈角度や装置の機能によっては膝折れを悪化させる恐れがある。そして杖により免荷をしている患者の場合では、患側への加重が杖により免荷されているため、背屈支援による膝への影響は低い事が示唆された。本結果から、本提案手法は膝関節屈曲傾向がなく、股関節外旋を伴う患者に対して有効である可能性が示唆された。
ジフェニルリン酸アジドを用いる生理活性物質の新規構築

ジフェニルリン酸アジド(DPPA)は、我々が開発した多目的有機合成反応剤である。このDPPAを用いる有機合成反応をキイステップとして、種々の生理活性物質の新規構築法を以下のように検討した。1.ペプチド結合形成反応(N-アシル化)近年強力な抗腫瘍活性を示す数種の環状ペプチドが、海洋産ホヤより単離され構造研究が行われている。我々はDPPAを用いるペプチド結合形成反応をキイステップとして、抗腫瘍性環状ペプチドドラスタチン3(推定構造),アンジアサイクラマイド,パテラマイドA,B,C,スリチアサイクラマイド,ユリサイラマイドの合成研究を行い、これに成功した。2.炭素-炭素結合形成反応(C-アシル化)カルボン酸をDPPAで活性化し、活性メチレン化合物と反応させると、容易にC-アシル化反応がおこる。この反応をキイステップとして、レーダウノサミン,L-バンコサミン,D-リストサミンなどのアミノ糖類,ならびに鉄キレーターで、アンジオテンシン変換酵素阻害作用を有するムギネ酸の効率的合成法を確立することが出来た。3.アミノ基導入反応(アミノ化)芳香族のグリニアあるいはリチウム反応剤に、DPPAを反応させるとトリアゼン誘導体が出来る。これをハイドライド還元剤で処理すると、対応する一級アミンの得られることが判明した。この反応をキイステップとして、肺炎菌より単離され、アンスラマイシン系抗生物質の骨格を有するティリバリンを、完全に立体選択的に、かつ効率よく合成することに成功した。上記で用いられた諸反応は、いずれも簡便に実施することが出来、また一般性の大きいものである。今後さらにこれらの反応を駆使して、種々の生理活性物質の新規構築を行いたい。
心房細動のトリガーの抑制を機序とした新しい抗不整脈薬の探索

本研究では、心房細動を対象とした新規抗不整脈薬の可能性を探るために、細胞内Ca^2+濃度の上昇により活性化し心房細動のトリガーとなりえるTRPM4チャネルに焦点を置き、TRPM4チャネル阻害薬の新規抗不整脈薬としての可能性を探った。TRPM4チャネル電流はヒト心室では実験的に観測されておらず、TRPM4チャネルの選択的阻害薬は心室での副作用が少ないと期待される。ヒトに特化した心房筋細胞モデルによる理論的検証により、新たな薬物作用機序像に基づいた、心房細動に特化した新規抗不整脈薬の可能性を探り、TRPM4チャネルの選択的阻害薬が高い可能性を持つことを示した。初年度である平成22年度はTRPM4イオンチャネルのモデルとその活動電位への影響と、TRPM4チャネル阻害の薬物効果の検討を行った。心房細動をはじめとする不整脈のトリガーの機序として、筋小胞体からのCa2+放出による脱分極がある。従来の研究では、ナトリウムカルシウム交換輸送体が細胞内Ca2+濃度の上昇を探知して、膜電位を脱分極させると説明されていた。しかし、ナトリウムカルシウム交換輸送体は心室のみならず多種多様な細胞に存在し、ナトリウムカルシウム交換輸送体の阻害を心房細動を抑える機序としては使用できない。一方、近年TRPM4チャネルがヒト心房筋細胞で大きな役割を果たしている可能性が示唆されている。本研究グループが予備研究で用いたCourtemancheらのモデルを使用して、TRPM4イオンチャネルとその活動電位への影響の検討を行った。TRPM4チャネルの細胞内カルシウム依存的活性化がモデルの中に取り込まれているために、生理条件下の静止膜電位でもある程度脱分極しているが、脱分極を引き起こす程度ではなかった。しかし、頻脈時に細胞内の筋小胞体からカルシウムが漏れてくる時に遅延後脱分極を引き起こすことが解析により分かった。しかし、TRPM4は複数のイオンを通すために、その等価電位は0mvに近く、あくまで興奮の閾値を超すこと役割しか果たさないことも分かった。さらに、TRPM4イオンチャネル阻害の薬物効果のモデル化として、TRPM4イオンチャネルのモデルを用い、TRPM4イオンチャネル阻害の薬物効果のモデル化を心房筋細胞に入れ解析を行った。その結果、遅延後脱分極は頻脈時に起きることから、理想的な特性は頻脈時に効果が大きくなる薬物プロファイルが理想的であろうと推測された。昨年度において、TRPM4イオンチャネルのモデル構築とその活動電位への影響及びTRPM4チャネル阻害の薬物効果の検討を行ったが、本年度にでは、昨年度の検討を基本として、さらなる心房細動に有効な薬物プロファイルの探索を行った。心房細動をはじめとする不整脈のトリガーの機序として、筋小胞体からのCa^<2+>放出による脱分極がある。従来の研究では、ナトリウムカルシウム交換輸送体が細胞内Ca^<2+>濃度の上昇を探知して、膜電位を脱分極させると説明されていた。今年度においては、より正確な薬物プロファイルを把握するために、心房細動の発生源である肺静脈を想定し、心房細動に特化した抗不整脈のプロファイルを検討した。基本的に肺静脈においては活動電位が短いために、心室や心房と異なる挙動をしめしたが、やはり頻脈時に細胞内の小胞体からカルシウムが漏れてくる時に遅延後脱分極を引き起こすことが解析により分かった。このような考察からTRPM4阻害剤の有効性が示唆された。
IL-18の多彩な生理活性を可能にするシグナル伝達系の解析

IL-18受容体はIL-1受容体と、相同性が高く、特に細胞内ドメインの相同性は著しく高い。しかし、IL-1と異なり、IL-18は免疫応答上多様な活性を示す。IL-18はIL-12と共存すると、強力にTh細胞からのIFN-γ産生を誘導するが、IL-2と共存すると、Th2型のサイトカインの産生を促進する。また、IL-18はIL-3と共存すると、マスト細胞や好塩基球からのヒスタミン遊離を促す。さらに、IL-18単独刺激でNK細胞からのIFN-γ産生を誘導し、また、NK細胞障害活性を増強する。このような多様なIL-18の生理活性が、シグナル伝達系の相違に依存するのか否かを当該研究にて検討してきた。その結果として次の項目が明らかとなった。1.NK-細胞の障害活性の増強並びに、NK細胞からのIFN-γの産生には、細胞内アダプター分子であるMyD88が必須であることが明らかとなった。また、JAK kinaseの一員であるTyk2も重要な働きを果たす。Tyk2欠損NK細胞をIL-18で刺激しても、IFN-γの産生は、野生型のそれに比べて顕著に低値であった。同刺激により、野生型NK細胞はNK活性を亢進して、NK細胞感受性の細胞はより強く傷害された。しかし、TyK2欠損NK細胞はIL-18刺激に対して、NK活性の亢進が観察されなかった。このように、NK細胞の活性増強並びにIFN-γ産生誘導にいたるIL-18のシグナリングにはTyk2並びにMyD88が必要であることが判明した。2.MyD88欠損CD4陽性T細胞あるいはTyk2欠損CD4陽性細胞は、野生型CD4陽性T細胞に認められるIL-18とIL-12の刺激に対するIFN-γ産生誘導が観察されなかった。このように、CD4陽性細胞がIFN-γ産生誘導にいたるためのIL-18のシグナリングにはTyk2並びにMyD88が必要であることが判明した。3.Tyk2欠損CD4陽性細胞は、野生型CD4陽性T細胞に認められるIL-18とIL-2の刺激に対するIL-4・IL-13産生誘導が観察されなかった。以上の結果から、CD4陽性細胞がIL-4・IL-13産生誘導にいたるIL-18のシグナリングにはTyk2並びにMyD88が必要であることが判明した。以上のことから、MyD88ならびにTyk2はIL-18の生理活性発現には必須の分子であることが明らかとなった。

IL-18はリンパ球に作用して強力にIFN-γを産生誘導する炎症性サイトカインとして同定された。しかし、その後の研究から、免疫学的に対極にあるアレルギー性応答にも深く関与することが明らかになった。ところで、IL-18シグナルは、MyD88をアダプター分子とし、TRAF6のリン酸化を経てNF-κBの活性化へと伝達される。当該研究は、IL-18が呈する相異なる生理活性がIL-18のシグナリング経路の差異に基づくか否かを明らかにするもので、今年度はIL-18シグナリングに関与する種々の遺伝子を欠損マウス由来の細胞を用いて検討した。MyD88欠損NK細胞やMyD88欠損CD4陽性T細胞はIL-18で刺激をしても、IFN-γを産生しなかった。さらに、MyD88欠損CD4陽性T細胞をIL-2とIL-18で刺激をするとIL-4並びにIL-13の産生は著しく低下した。このことから、IL-18はMyD88依存的に炎症応答並びにアレルギー応答を発揮することが判明した。ところで、JAKsの一つであるTyk2はIL-12のシグナリングに関与することが最近明らかになった。そこで、Tyk2欠損細胞のIL-18に対する応答性を検討したところ、両応答性を欠くことが明らかとなった。これらの結果を総合すると、IL-18シグナルはMyD88依存性、Tyk2依存性に伝達され、炎症性応答とアレルギー性応答の両方の活性をもたらすことが強く示唆された。今後、リン酸化酵素であるTyk2がどのようにしてMyD88シグナル系に関与するかを明らかにするとともに、これらの細胞内シグナリングがどのように制御されているかを検討する。IL-18受容体はIL-1受容体と、相同性が高く、特に細胞内ドメインの相同性は著しく高い。しかし、IL-1と異なり、IL-18は免疫応答上多様な活性を示す。IL-18はIL-12と共存すると、強力にTh細胞からのIFN-γなどのTh1関連サイトカインの産生を誘導するが、IL-2と共存すると、IL-13やIL-4といったTh2型のサイトカインの産生を促進する。また、IL-18はIL-3と共存すると、マスト細胞や好塩基球からのIL-13やIL-4産生を誘導し、またヒスタミン遊離を促す。さらに、IL-18単独刺激でIL-12が無くても、NK細胞に作用すると、IFN-γ産生を誘導するのみならず、NK細胞活性を増強する。このような多様なIL-18の生理活性が、シグナル伝達系の使い分けに依存するのか否かを検討してきた。NK細胞の障害活性の増強並びに、NK細胞からのIFN-γの産生には、細胞内アダプター分子であるMyD88が必須であることが明らかとなった。また、JAK kinaseの一員であるTyk2も重要な働きを果たしていることが判明した。Tyk2欠損NK細胞をIL-18で刺激しても、IFN-γの産生は、野生型のそれに比べて顕著に低値であった。また、同刺激により、野生型NK細胞はNK活性を亢進して、NK細胞感受性の細胞はより強く傷害された。しかし、Tyk2欠損NK細胞はIL-18刺激に対して、NK活性の亢進が観察されなかった。また、Tyk2欠損CD4陽性細胞は、IL-18とIL-2刺激に対して、IL-4やIL-13をほとんど産生せず、野生型CD4陽性細胞に観られる応答が欠損していることが明らかとなった。以上のことから、Tyk2はIL-18の生理活性発現には必須の分子であることが明らかとなった。
気管支喘息におけるIL-18の役割の検討

IL-18はIL-12と共同で多量のIFN-γを産出するため喘息の治療ターゲットとして期待されるが、気管支喘息病態におけるIL-18単独の役割は不明である。本研究では喘息でのIL-18の役割を解析するため、マウスアレルギー性気道炎症モデルを用い、IL-18欠損の気道への影響、更に喘息反応に対するrecombinant IL-18(rIL-18)投与の効果を検討した。その結果IL-18KOマウス、Wild-type(WT)マウスともovalbumin(OA)暴露後には炎症細胞の著明な気道集積が観察された。IL-18KOマウスはWTマウスと比較して好酸球数のみが有意に高値であった。サイトカインの解析では、IFN-γはIL-18KOマウスではWTマウスと比して有意に低値であった。rIL-18投与後、IL-18KOマウスでは暴露後の好酸球やCD4+T細胞、macrophage数は生理食塩水投与群に比較して有意に底値となった。一方、好中球数はむしろ高値となった。rIL-18投与はIL-4の増加を抑制し、IL-5の産生は亢進させた。一方、気道周囲のapoptosis細胞とFasligand(Fas-L)陽性細胞はrIL-18投与にて増加した。これらの所見はIL-18欠損の抗原暴露後の好酸球集積増強作用にはIFN-γ低値による相対的なTh2免疫反応の優位性が一部関与していると考えられる。また、rIL-18の投与がIFN-γの産生に影響を及ぼすことなく、好酸球とCD4+T細胞の減少をもたらした所見はIL-18によるFas/FasL系を介したapoptosisの活性化が関与すると考えられた。以上からIL-18は気管支喘息においてTh1/Th2バランス維持に際して重要な役割を有しており、かつ気道での炎症細胞の細胞死を誘導することが示唆された。喘息の病態におけるIL-18の役割を検討する目的で,オブアルブミン(OVA)感作暴露によるマウス喘息モデルを用いてIL-18欠損の喘息反応に及ぼす影響を観察した.IL-18KO喘息マウスでは野生型喘息マウスと比べ気道内の好酸球増多の有意な増強を認めた.一方好中球,CD4,CD8,マクロファージなど他の炎症細胞の浸潤は,気管肺胞洗浄液および肺組織中において明らかな差を認めなかった.これらの所見はIL-18が気管支喘息において好酸球の抑制に関与している可能性を示唆した.一方IL-18KO喘息マウスに対してリコンビナントIL-18(rIL-18)を投与すると気道周囲の好酸球の有意な減少が認められた.従ってIL-18は気管支喘息での好酸球の浸潤に対して抑制的に作用することが明らかになった.次に気道におけるサイトカインを測定しIL-18欠損による好酸球の浸澗亢進作用の機序を検討した.その結果IL-18KOマウスでは野生型マウスに比べてIFN-γの産生低下を認めたものの,OVA暴露後のIL-4,IL-5,IL-12は有意差を認めなかった.IL-18によるapoptosisの誘導効果に関しては培養系ではすでにIL-18の単独の効果としてFas-Lの発現増強作用が報告されている.好酸球は低濃度ながらFas receptorを発現している.

IL-18のFas/FasL pathwayを介する好酸球のapoptosisを検討する目的でIL-18KO喘息マウスに対してrIL-18を投与した結果,OVA暴露後の好酸球浸澗は非投与群に比べて有意に減少した.更にrIL-18の投与によって気道局所のFas-L positive cellとapoptotic cellの増加が観察された.従って気道局所の炎症細胞,特に好酸球のクリアランスにはIL-18のapoptosisの誘導が有用であり,IL-18が気管支喘息の治療に応用できる可能性が示唆された.IL-18はIL-12と共同で多量のIFN-γを産生するため喘息の治療ターゲットとして期待されるが、気管支喘息病態におけるIL-18単独の役割は不明である。本研究では喘息でのIL-18の役割を解析するため、マウスアレルギー性気道炎症モデルを用い、IL-18欠損の気道への影響、更に喘息反応に対するrecombinant IL-18(rIL-18)投与の効果を検討した。その結果IL-18KOマウス、Wild-type(WT)マウスともovalbumin(OA)暴露後には炎症細胞の著明な気道集積が観察された。IL-18KOマウスはWTマウスと比較して好酸球数のみが有意に高値であった。サイトカインの解析では、IFN-γはIL-18KOマウスではWTマウスと比較して有意に低値であった。rIL-18投与後、IL-18KOマウスでは暴露後の好酸球やCD4+T細胞、macrophage数は生理食塩水投与群に比して有意に低値となった。一方、好中球数はむしろ高値となった。rIL-18投与はIL-4の増加を抑制し、IL-5の産生は亢進させた。一方、気道周囲のapoptosis細胞とFas ligand(Fas-L)陽性細胞はrIL-18投与にて増加した。これらの所見はIL-18欠損の抗原暴露後の好酸球集積増強作用にはIFN-γ低値による相対的なTh2免疫反応の優位性が一部関与していると考えられる。また、rIL-18の投与がIFN-γの産生に影響を及ぼすことなく、好酸球とCD4+T細胞の減少をもたらした所見はIL-18によるFas/FasL系を介したapoptosisの活性化が関与すると考えられた。以上からIL-18は気管支喘息においてTh1/Th2バランス維持に際して重要な役割を有しており、かつ気道での炎症細胞の細胞死を誘導することが示唆された。
神経膠腫における癌関連遺伝子のエピジェネティックな転写制御に関する研究

本研究は、神経膠腫の再発、悪性転化という脳腫瘍において最も重要な因子でありながら充分な検討が行われていない点に関して、glioblastoma(GBM)を臨床経過と遺伝子異常の検索からprimary glioblastoma(PGBM)とsecondary glioblastoma(SGBM)に分けて、癌関連遺伝子のジェネティック、エピジェネティックな変異という観点から腫瘍の解析を行った。更に、神経膠腫における各gradeに認められる遺伝子変異についても検索した。これらの結果を踏まえて、low gradeとhigh gradeの領域が混在するGBMに関して組織ごとに遺伝子変異の検出を行い、この組織多様性を示すGBM発生の機序についても検討を行った。本研究は、神経膠腫の再発、悪性転化という最も重要な因子でありながら充分な検討が行われていない点に着目し、glioblastomaを明確な基準でprimary glioblastoma(PGBM)とsecondary glioblastoma(SGBM)に分けて検索するという独創的な方法を用い、癌関連遺伝子のジェネティックな変異だけでなく、エピジェネティックな変異という観点からも腫瘍を解析することを目的とした。次に、ヒストンH3、H4のアセチル化レベルを検索するためにそれぞれに対する抗体を用いて、免疫組織化学的に検索したところ、ヒストンH3、H4ともに各grade間における低アセチル化の頻度に優位の差がみられるとともに、SGBMの方がPGBMよりもピストンH3、H4の低アセチル化がみられた。
結晶位置選択励起法による酸化特超伝導体の電子構造に対するPrの影響の研究

双晶を取り除いて結晶の軸をそろえたYBa_2Cu_3O_7及びPrBa_2Cu_3O_7単結晶を使い、放射光により酸素2pのx線吸収測定と発光分光測定を行った。結晶位置の違いにより4種類ある酸素を区別して測定することが出来た。吸収スペクトルでは、YBa_2Cu_3O_7では、鋭いピークをなすのに、PrBa_2Cu_3O_7では、幅広いピークを形成した。このYBa_2Cu_3O_7とPrBa_2Cu_3O_7での非占有電子状態の違いは、YBa_2Cu_3O_7で存在したCuO_2面上のホールがPrBa_2Cu_3O_7では存在せず、上部ハバードバンドが形成され、それとともにFerenbacher and Riceにより予測されたPr^<IV>状態にホールが入った状態が観測されたものと解釈された。それを証明するものとして、YBa_2Cu_3O_7及びPrBa_2Cu_3O_7のCuO_2面上の酸素の占有状態の電子状態が比較された。両方のスペクトルを比較してみると、PrBa_2Cu_3O_7ではO(2)のpπ状態が、Prの4f軌道との混成の結果広がっているのが明らかに確認された。両方のスペクトルの差分は、Lichitenstein and Marzinのバンド計算結果の差分と比較するとよく一致することが分かった。このようにして、Ferenbacher and Riceにより予測された、Prの4f軌道と酸素Oの2pπ軌道の混成による電子状態の広がりが、実験的に確認された。同様な実験は、YBa_2Cu_4O_8及びPrBa_2Cu_4O_8単結晶についても行われ、この系でもPrの4f軌道と酸素Oの2pπ軌道の混成が存在することが、確認された。PrBa_2Cu_3O_7とPrBa_2Cu_4O_8とでの、鎖位置の酸素の占有状態の観測から、PrBa_2Cu_4O_8の2重鎖の酸素は、一重鎖位置酸素に比べ格段に広いバンド幅をもっていることが確認された。この結果は、PrBa_2Cu_4O_8が金属的伝導特性を持つことと関連している。高温超伝導銅酸化物のうちRBa2Cu307(Rは希土類元素)は、希土類元素の種類に依らずほとんど同じ90Kの超伝導臨界温度Tcを持つ。しかしその唯一の例外がPrBa2Cu307で、半導体になり超伝導にはならない。この現象にたいして、Fehrenbacher and Riceは、Pr4fと02pの混成によりPr4fと酸素02pπとの反結合準位PrIV(pπ*)だけがCu02面のZhang-Rice singlet準位(pσ*)の上に位置し、p-ホールがPrIV(pπ*)に移行することにより、Pσホールが減少し超伝導は消失するとのモデルを提案した(Fehrenbacher and Rice,Phys.Rev.Let.1993)。

我々は、これを検証するためにPrBa2Cu307とYBa2Cu307の単結晶に放射光による酸素1sから2pホールへのX線吸収スペクトルと発光スペクトルの偏光解析実験を行った。吸収実験は、KEK-PFにおいて行い、発光スペクトルの実験は、米国ローレンス・バークレイ研究所ALSにおいて行った。吸収スペクトルから、鎖位置にある酸素一種類(O(1))面内酸素2種類(O(2),O(3))、頂点酸素一種類(O(4))の計4種類の酸素のホールの状態を識別する事に成功した。吸収実験で識別された酸素位置を選択的に励起しそこでの発光スペクトルの観測からそれぞれの酸素位置での局所的電子状態の知見を得た。鎖位置にある酸素一種類(O(1))、頂点酸素一種類(O(4))では、PrBa2Cu307とYBa2Cu307の試料でほとんど同じ形状のスペクトルを観測したが、面内酸素2種類(O(2),O(3))では、PrBa2Cu307とYBa2Cu307とで明らかなスペクトル形状の差異が観測された。この結果は、Liechtenstein and Mazinの計算結果と比較し、よく一致していることを見いだした。これは、Cu02面上の酸素がPrとの共有結合性を有することの反映である。高温超伝導銅酸化物のうちRBa2Cu307(Rは希土類元素)は、希土類元素の種類に依らずほとんど同じ90Kの超伝導臨界温度Tcを持つ。しかしその唯一の例外がPrBa2Cu307で、半導体になり超伝導にはならない。この現象にたいして、Fehrenbacher and Riceは、Pr4fと02pの混成によりPr4fと酸素02pπとの反結合準位PrIV(pπ^*)だけがCu02面のZhang-Rice singlet準位(pσ^*)の上に位置し、p-ホールがPrIV(pπ^*、FR状態)に移行することにより、Pσホールが減少し超伝導は消失するとのモデルを提案した(Fehrenbacher and Rice,Phys.Rev.Let.1993)。平成11年度我々は、PrBa2Cu307とYBa2Cu307の単結晶に放射光による酸素1sから2pホールへのX線吸収スペクトルと発光スペクトルの偏光解析実験をKEK-PFと米国ローレンス・バークレイ研究所ALSにおいて行い、FR状態の観測に成功した。今年度(平成12年度)は、PrBa2Cu4O8とYBa2Cu4O8のいわゆる124系についての実験を行った。123系についてと同様に、鎖位置にある酸素一種類(O(1))面内酸素2種類(O(2),O(3))、頂点酸素一種類(O(4))の計4種類の酸素のホールの状態を識別した。そして、面内酸素2種類(O(2),O(3))の発光スペクトルでは、PrBa2Cu408とYBa2Cu408とで明らかなスペクトル形状の羞異を観測しFR状態を明確に分離する事に成功し、Liechtenstein and Mazinの計算結果とよく一致していることを見いだした。さらに、鎖位置酸素の発光スペクトルは、123系が酸素と銅の波動関数の混成が少ないスペクトルであるのに較べ、124系では幅広い発光スペクトルが観測された。この結果は、123系が半導体的伝導性を示すのに較べ、124系が金属伝導性を示すことを反映している。
脊髄小脳変性症の原因となる易凝集性変異γPKCの特性解析と治療薬探索への応用

遺伝性脊髄小脳失調症14型(SCA14)の原因として同定された変異γPKCは細胞内で凝集体を形成し、アポトーシスを誘発することが明らかとなっている。そこで、SCA14の病因究明と新規治療薬を探索する目的で研究を推進し、以下の結果が得られた。(1)変異γPKCの凝集体形成は、ユビキチン・プロテアソーム活性の低下とそれに引き続く小胞体ストレスを引き起こし、さらにアポトーシスを誘導することが明らかとなった。(1)変異γPKC発現培養細胞を用いたin vitro薬物スクリーニング系の確立。ドパミン神経由来細胞株であるSH-SY5Y細胞にアデノウイルスベクターを用いて変異γPKC-GFPを発現させた。発現後1-2日で変異γPKC-GFPの凝集体形成が蛍光観察可能であり、さらに3日後には多くの細胞でアポトーシスが誘発されていた。この細胞系を用いることで凝集体抑制作用を有する薬物のスクリーニングが可能と考えられるた。(2)二糖類トレハロースにより変異γPKCの凝集体形成、アポトーシス誘発が抑制された。(1)で確立した実験系を用い、様々な薬物の凝集体形成に対する効果を検討したところ、二糖類の一つであるトレハロースにより変異γPKCの凝集体形成が有意に抑制された。また、変異γPKCによるアポトーシスも有意に抑制した。以上の結果より、トレハロースは変異γPKCによる細胞毒性に抑制効果があることが判明し、未だ有効な薬物が得られていないSCA14の新規治療薬の候補となるかもしれない。1)SCA14由来変異γPKC-GFPの特性をさらに明らかにし、神経変性に至る分子機序を明らかにする。1.変異γPKCが凝集体を形成する分子メカニズムをPKCのターゲティングを指標に明らかにする。従来研究を行っていた上皮細胞系のCHO細胞のみならず、神経細胞由来の培養細胞株、初期培養プルキンエ細胞においても、SCA14由来変異γPKCは凝集体を形成することが明らかになった。また、凝集体を形成していない細胞において、変異γPKCの流動性が減少していることが明らかになった。2.変異PKCの凝集体形成がどのように神経細胞死を引き起こすのか、その分子機序を明らかにする。変異γPKCは細胞質内にドット上の凝集を作り、やがて核周辺に集積し塊状となることが明らかとなった。また、凝集体を有する細胞は、プロテアソームの活性が減少し、ERストレスが誘発されることが明らかになった。2)SCA14由来変異γPKC-GFPを誘導発現できる細胞株作製し、薬物スクリーニング系を構築する。さらに構築したスクリーニング系で実際に凝集体形成を減弱する薬物探索を行う。Gene Switchシステムを用いて、変異γPKC-GFPを誘導発現できる細胞株作製した。さらにアデノウイルスベクターを用いて神経由来培養細胞株に変異γPKC-GFPを発現させ、凝集体の形成や細胞死を評価できる実験系を確立した。2糖類のトレハロースが、変異γPKC-GFPの凝集体形成と細胞死を抑制することを明らかにした。(2)変異γPKC発現培養細胞を用いたin vitro薬物スクリーニング系の確立。

発現後1-2日で変異γPKC-GFPの凝集体形成が蛍光観察可能であり、さらに3日後には多くの細胞でアポトーシスが誘発されていた。この細胞系を用いることで凝集体抑制作用を有する薬物のスクリーニングが可能と考えられるた。(3)二糖類トレハロースにより変異γPKCの凝集体形成、アポトーシス誘発が抑制された。(2)で確立した実験系を用い、様々な薬物の凝集体形成に対する効果を検討したところ、二糖類の一つであるトレハロースにより変異γPKCの凝集体形成が有意に抑制された。また、変異γPKCによるアポトーシスも有意に抑制した。以上の結果より、トレハロースは変異γPKCによる細胞毒性に抑制効果があることが判明し、未だ有効な薬物が得られていないSCA14の新規治療薬の候補となるかもしれない。