hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
有機・無機ハイブリット型ナノカプセルの創製と医療用ナノバイオマテリアルへの応用

本研究では、生体膜由来のベシクルであるリポソーム表面へバイオポリマーやリン酸カルシウム(CaP)など有機物から無機物に渡る幅広い物質を積層化させることにより、バラエティー豊かな壁材(capsule wall)の形成と多機能化を指向した新規ナノカプセル(リポナノカプセル)の創製を目指した。特に、(1)カプセルの表層および壁材へ骨親和性物質の付与を行うことにより、キャリア自体が骨再生を促すような、新規の骨標的指向性薬物送達システム(bone-targeting DDS)の開発、および(2)リポソーム表面でCaPとDNAを交互に吸着させることにより、新規遺伝子治療および送達システムの開発を行った。(1)新規の骨標的指向性(bone-targeting)薬物送達システムの開発昨年度までに、多糖被覆リポナノカプセルを用いて、カプセル内外から異種イオンを相互拡散させる方法により、表面にCaPを生成させてハイブリッドナノカプセルを作製した。このときリン酸基を有する高分子がCaP析出に適していることを見出した。そこで本年度はカチオン性多糖であるキトサンを化学改質することにより、リン酸化キトサンを作製した。このリン酸化キトサンをリポソーム表面へ被覆し、さらにCaP生成を行うことで、単分散のハイブリッドナノカプセルを作製することができた。リン酸化度により析出するCaPの結晶質を制御することで、キャリアの骨再生能の最適化につながると考えている。(2)新規遺伝子治療および送達システムの開発リポソーム表面にCaPを析出させ、さらにその表面にDNAを吸着させることによりDNA担持リポナノカプセル(lipo-CaP-DNA)を作製した。異なるpH条件にてlipo-CaP-DNAから遊離したDNA量を定量した結果、エンドソーム内のpHである4.0において、カプセル表層のCaPが溶解し、それに伴ってDNAが脱離することを確認した。また、血漿タンパク質であるアルブミンの存在下においても、低pHでのCaPの溶解が確認できた。カプセル層へのDNAの担持およびpHに応答した脱離能を付与することができたため、内水相に封入する薬剤や遺伝子発現促進剤と連動して機能する遺伝子送達システムの確立に向けて大きく前進した。本研究では、生体膜由来のベシクルであるリボソーム表面を吸着場または反応場と捉え、layer-by-layer法を用いてバイオポリマーやリン酸カルシウム(CaP)など有機物から無機物に渡る幅広い物質を積層化させることにより、バラエティー豊かな壁材(capsule wall)の形成と多機能化を指向した新規ナノカプセル(リポナノカプセル)の創製を目指す。本年度は特に、カプセルの表層および壁材へ骨親和性物質の付与を行うことにより、キャリア自体が骨再生を促すような、新規の骨標的指向性薬物送達システム(bone-targeting DDS)の開発に注力した。今年度は特に(1)の開発に注力して精力的に研究を進めた。リボソーム表面に多糖類を被覆したカプセルの構築技術を確立させた後にリン酸カルシウム(CAP)生成による複合化プロセスに進んだ。試行錯誤の結果、カプセル内外から異種イオンを相互拡散する手法を発案するに至り、CAPカプセルの新しい生成方法を確立することができた。さらに、反応場となるナノカプセルの多糖類の種類によって結晶の生成速度および得られる結晶の質が異なることを見出した。素材自体が骨再生を促すといった新規薬物キャリアの創製に確実に近づきつつある段階にある。また、骨モデルの粉末状ハイドロキシアパタイトへの集積能について検討した。種々のカプセルについてのアッセイから、カプセル最外層にDNAを有するlipo-CaP-DNAが最も高い骨集積能を有していることを見出し、DNAを骨ターゲティング部位とするアプローチを確立することができた。異なるpH条件にてlipo-CaP-

DNAから遊離したDNA量を定量した結果、エンドソーム内のpHである4.0において、カプセル表層のCaPが溶解し、それに伴ってDNAが脱離することを確認した。また、血漿タンパク質であるアルブミンの存在下においても、低pHでのCaPの溶解が確認できた。カプセル層へのDNAの担持およびpHに応答した脱離能を付与することができたため、内水相に封入する薬剤や遺伝子発現促進剤と連動して機能する遺伝子送達システムの確立に向けて大きく前進した。
湖底堆積物と海底堆積物の対比による高時間分解能の気候変動解析

青森県下北半島に位置する小河原湖において,過去16,000年におよぶ年縞堆積物を採取した.小河原湖への海水進入は少なくとも10,000年前に始まっており,6,000年前の縄文海進最盛期には現在よりも暖かい海水が進入し内湾を形成していた.その後,一旦は淡水化したが,今日の汽水環境は100200年前以降で起こったものである.6,000年前の暖かな海水は,日本海を経由した対島暖流水が起源と考えられ,この海流の北上は,日本海や北西部北太平洋への塩分の供給を増加させ,北西部北太平洋での中層循環の強化を引き起こした可能性が示唆された.青森県下北半島に位置する小河原湖において,過去16,000年におよぶ年縞堆積物を採取した.小河原湖への海水進入は少なくとも10,000年前に始まっており,6,000年前の縄文海進最盛期には現在よりも暖かい海水が進入し内湾を形成していた.その後,一旦は淡水化したが,今日の汽水環境は100200年前以降で起こったものである.6,000年前の暖かな海水は,日本海を経由した対島暖流水が起源と考えられ,この海流の北上は,日本海や北西部北太平洋への塩分の供給を増加させ,北西部北太平洋での中層循環の強化を引き起こした可能性が示唆された.本研究の最大の目的は、湖底堆積物と海底堆積物の対比を通して、日本列島北部の高時間分解能の気候変動を含む環境変動を明らかにすること、それに対する海洋の役割を評価することにある。この目的のため、既存の海底コアの採取点に近い下北半島の小川原湖をフィールドに、過去2万年に及ぶ湖底堆積物を採取することを考えた。ボーリング調査に先立ち、掘削地点を決定することを目的に、小川原湖の測深と地層探査を行った。測深観測の結果から、水中における音波の伝搬速度の補正、送受波器の下面から水面までの高さに関する吃水補正及び小河原湖は汽水湖であることから国土交通省高瀬川河川事務所所管の小川原湖観測所の水位データをもとに水位補正を行い、各水深値を航跡図上に展開し、等深線図を作製した。また、地層探査の結果からは、過去の小川原湖の観測や東北地方の湖沼の観測結果から小川原湖にも存在すると予想される広域的に分布する火山灰層として、白頭山苫小牧(B-Tm;AD 937)、鬼界アカホヤ(K-Ah,7.2ka)及び十和田八戸(To-H,16ka)があると判断されたため、連続性のある音響反射パターンを抽出し、その反射面の上面深度を読み取り、各側線での地層断面図を作成した。特に連続性のよかった白頭山苫小牧と鬼界アカホヤに関しては、その等深度図を作成した。この図は、両火山噴火が起こった当時の古湖地形を示すものである。これらの結果をもとに、ボーリング地点を決定し、3月末から40°47'12.5"N,141°20'12.6"Eの地点で掘削作業を開始した。本研究の目的は、湖底堆積物と海底堆積物の対比を通して、日本列島北部の高時間分解能の気候変動を含む環境変動を明らかにするにある。このため、既存の海底コアの採取点に近い下北半島小川原湖で、過去2万年に及ぶ湖底堆積物を採取した。本年度は、近接する2点で採取した柱状試料(2点の全長は50mに及ぶ)について、押出し半裁を行い、岩相記載、半裁試料のイメージスキャニング、軟X線撮影用のスラブ試料や堆積物及び間隙水の化学分析等に供する試料採取を行った。また、介在した一部火山灰試料のEPMAによる化学分析、貝片の放射性炭素年代の測定も行った。さらに、ボーリング時に採取した湖水及び周辺河川水の栄養塩、アルカリ度等化学分析を実施した。岩相記載及び半裁試料のイメージスキャニングの画像データをもとに、小川原湖湖底堆積物の総合柱状図を作成した。年代決定のため行ったEPMAの化学分析の結果から、堆積物表層から251260cmに存在する2対の火山灰層は、上位が白頭山苫小牧(B-Tm)、下位は十和田a(To-a)に対比されることがわかった。試料下部(20042211cm)には火砕流堆積物が存在し、その産状と8001523cmの間9層準で測定した放射性炭素年代の外挿から、これは十和田八戸(To-H,16ka)起源であると推察された。以上年代論に加えて、間隙水の塩化物イオンの分析やスメアスライドまた電子顕微鏡よる生物化石の検鏡の結果から、小川原湖の湖水環境の変遷史を構築した。プレボリアル期の全球的な温暖化と海水準上昇により、小川原湖の原型である溺れ谷に、10ka前後には海水が流入した。縄文海進の最盛期6ka頃には、温かい対馬暖流系の海水が進入内湾を形成したが、海退期砂州が形成湾口は閉鎖され淡水化が進行した。その後、小氷期には一旦は淡水化したが、19世紀後半以降再び海水が流入し、今日の汽水環境が成立した。

このため、既存の海底コアの採取点に近い下北半島小川原湖で、過去2万年に及ぶ湖底堆積物を採取し、介在した一部火山灰試料のEPMAによる化学分析や貝片の放射性炭素年代の測定を行なうとともに、ボーリング時に採取した湖水及び周辺河川水の栄養塩、アルカリ度、酸素同位体比等の化学分析を実施してきた。本年度は火山灰のEPMA分析をサイド実施するとともに、貝片の放射性炭素分析の結果と合わせて、年代論の再構築をおこなった。堆積物表層から251260cmに存在する2対の火山灰層は、上位が白頭山苫小牧(B-Tm)、下位は十和田a(To-a)に対比され、試料下部(20042211cm)の火砕流堆積物は十和田八戸(To-H, 16ka)起源と判断された。また、未同定であった936946cmに存在する軽石層は、EPMA分析と放射性炭素の分析結果からも、十和田中掫(To-Cu, 6.23ka)であると判断された。以上年代論に加えて、間隙水の塩化物イオンの分析やスメアスライドまた電子顕微鏡よる生物化石の検鏡の結果から、小川原湖の湖水環境の変遷史を構築した。この年代は、縄文海進の最盛期に相当し、検鏡によりフランボイダルパイライトが確認されたほか、円石藻のGephyrocapsa oceanicaや海産のケイ藻類が確認されたことから、小川原湖に温かい対馬暖流系の海水が進入し内湾を形成していたことが強く示唆された。一方、堆積物間隙水の塩化物イオン濃度は、コア表層部から100cmに向けて単調に減少しており、海進後の海退期に砂州が形成し湾口が一旦閉鎖され淡水化が進行したが、19世紀後半以降再び海水が流入し、現在の汽水環境が成立したことが明らかとなった。
緊急事態における法と裁判官の役割に関する憲法理論的研究

9.11以降の英米憲法理論の特徴は、「立憲主義の復権」の下で、拷問解禁論に象徴されるような「立憲主義の動揺」が生じた点にある。本研究はこの歴史的文脈を踏まえて、「緊急事態における法と裁判官の役割」に関する憲法理論的研究として、「Legality」の観念に注目しつつ、1国家緊急権に関する憲法理論の変容と2裁判官の良心に関する憲法学説の動向を分析した。また、3主にイギリス憲法理論を素材としつつ、法的立憲主義と政治的立憲主義の関係に関する分析を行った。その成果として、緊急事態における立憲的統制を最大化するための憲法理論のあり方と、その理論の下で期待される裁判官の役割に関する問題提起を行った。「緊急事態における法と裁判官の役割」という問題に関わる、〈9.11〉以後の英米憲法理論における議論状況の調査・分析を行うことが本研究の課題である。その初年度に当たる平成25年度は主に次の二つの研究活動を行った。(1)裁判官の令状による拷問制度の導入という提言(Alan Dershowitz)が、アメリカ合衆国の識者の間でシリアスに受け止められたこと、そして、拷問禁止緩和問題との関係で「Legality」の観念の重要性が議論されるようになったこと、以上の二点に注目して、主にアメリカ憲法学の理論動向を文献的に調査・検討した。その成果の一部を、「都市防災研究協議会(政策)第5回研究会」(2013年12月19日、京都大学東京オフィス会議室)で報告する機会を得た。(2)裁判による人権保障の普遍化(=法的立憲主義の主流化)という問題を、〈9.11〉後の憲法学の議論状況を踏まえて検討するため、主にイギリス憲法学の理論動向を調査・分析した。具体的には、1英米憲法学において注目されているJeremy Waldronの違憲審査制批判の議論の意義と問題点を検証した。また、2Martin LoughlinのPublic Law論を分析して、彼の問題提起は、裁判官の視点を特権化する憲法理論の下でイギリス憲法が「法的立憲主義」へと転換していくことの問題性を明らかにするものとして理解すると、その意義が理解できることを明らかにした。1の成果は年度内に論文として公刊した。2の成果は近日中に公刊の予定である。その2年目に当たる平成26年度は主に次の3つの研究活動を行った。(1)アメリカ合衆国における拷問禁止令状の論議を素材として、Legalityの観念に関する文献的な調査・研究を継続した。その成果の一部は、平成27年度中に「Legalityの観念と憲法理論」と題する論文にまとめる予定である。(2)裁判による人権保障の普遍化(=法的立憲主義の主流化)という問題を、〈9.11〉以後の憲法学の議論状況を踏まえて検討するため、主にイギリス憲法学の理論動向の調査・分析を前年度から継続して行った。具体的には、1前年度の研究成果であるMartin Loughlin教授のPublic Law論に関する論文を公刊した。211月のイギリスでの現地調査を踏まえて、「法的立憲主義」と「政治的立憲主義」の対抗関係の現状を分析・評価する論文を執筆した(平成27年5月に公刊予定)。(3)〈9.11〉以降の日本における「法と裁判官の役割」に関する研究に着手した。これは(1)と(2)の研究成果を踏まえて、日本憲法学に対する問題提起を行おうとするものである。具体的には、1集団的自衛権行使の限定的解禁の手法が、法の支配とそれを支える法律家(具体的には内閣法制局)に対していかなる負のインパクトを持ったのかの検証と、2「裁判官の良心」に関する近年の学説の整理・検討を、本研究の問題関心に基づいて行った。1は年度内に論文として公刊した。2は平成27年5月に公刊予定である。平成25・26年度に実施した「緊急事態における法と裁判官の役割」という問題と関わる〈9.11〉以後の英米憲法理論の議論状況の分析・整理を踏まえて、日本国憲法との関係でこの問題を検討した。具体的には、英米憲法理論の議論状況から導き出したLehalityの観念に注目しつつ、1裁判官の良心と2国家緊急権の問題に関する憲法理論的研究を行った。1の問題については、長谷部恭男教授の「裁判官の良心」論に触発されつつ、「裁判官にとっての裁判官の良心」という問題を憲法理論的に検討した。緊急事態において「法の支配」を維持するためには、裁判官としての職業倫理に関する規範的要求だけでは足りず、裁判官の通常の職務との関係で、「裁判官の良心」の主観性の確認とその意味の解明が必要であるとの立場から、従来の学説の問題点を指摘し、将来において検討すべき課題を明示した。2の問題については、国家緊急権に対する立憲的統制を可能なかぎり追求する立場から、現在の日本の国家緊急権論議を念頭に置きつつ、emergencyを「緊急事態」と「非常事態」に区別し、前者については、「憲法方式」ではなく「法律方式」で緊急対応を制度化し、可能なかぎりの立憲的統制をかける一方、後者については、Oren Gross教授の「法外モデル論」を参考にしつつ、法の外部の問題として処理し、熟議民主主義のプロセスに期待をかける議論を試論的に提起した。1と2の研究は相互に関連しており、「緊急事態における法と裁判官の役割」というテーマについて一定の研究成果を上げることができた。

9.11以降の英米憲法理論の特徴は、「立憲主義の復権」の下で、拷問解禁論に象徴されるような「立憲主義の動揺」が生じた点にある。本研究はこの歴史的文脈を踏まえて、「緊急事態における法と裁判官の役割」に関する憲法理論的研究として、「Legality」の観念に注目しつつ、1国家緊急権に関する憲法理論の変容と2裁判官の良心に関する憲法学説の動向を分析した。また、3主にイギリス憲法理論を素材としつつ、法的立憲主義と政治的立憲主義の関係に関する分析を行った。その成果として、緊急事態における立憲的統制を最大化するための憲法理論のあり方と、その理論の下で期待される裁判官の役割に関する問題提起を行った。平成26年度の研究の課題は、1イギリス憲法学の調査・研究の成果を論文等のかたちで公刊すること、2Legalityの概念に関する憲法理論的・法哲学的研究を加速することであった。1については、前年度の研究成果を論文として公刊し、さらに現地での聞き取り調査等を踏まえた論文を年度内に執筆した(平成27年5月公刊予定)。2については、文献・資料を計画的に収集し、分析・検討を行っているが、その研究成果を年度内に論文というかたちで公表できなかった。ただし、研究成果の一部は、論文「安倍『改憲・壊憲』と立憲主義・法の支配」の中で試論的に提示した。なお、当初の研究計画を前倒しするかたちで、日本の憲法学説の議論動向を参考にしつつ、研究成果の一部を利用するかたちで、「裁判官の良心」の問題を検討する論文を執筆することができた(平成27年5月公刊予定)。社会科学今後の研究推進方策としては、英米の憲法学を素材としつつ、「緊急事態における裁判官の役割」という観点から、Legalityの観念の意義と問題点の調査・検討を行う。幸い、この問題については、英米両国の憲法学者が問題関心をもつようになっているので、追加的な現地調査を行いつつ、資料・文献に基づく研究成果を今年度中にまとめて論文を執筆する。また、英米憲法学を素材とした「緊急事態における裁判官の役割」に関する研究成果を土台として、「裁判官の良心」と「国家緊急権」に関する従来の議論状況を分析・検討する論文を執筆して、日本憲法学に対する問題提起を行う。平成25年度当初の計画では、米国での調査を前提として、1アメリカ憲法学における拷問禁止論議とLegalityの観念の調査・研究を先行させる予定であったが、9月にキングズ・カレッジ・ロンドンでの研究報告の機会を得たため、2イギリス憲法学の調査・研究を並行して行うことにした。その結果として、1の調査・研究は計画どおりに進展しなかったが、2の研究は計画よりも順調に進展しており、年度内に論文を公刊できたばかりでなく、調査・研究の成果を踏まえて、2014年2月に渡英して、現地の研究者(Martin Loughlin教授やK.D. Ewing教授など)と有意義な意見交換を行うことができた。研究の性質上、外国語の文献・資料を多数注文したが、その中に予定通りに刊行されず、年度内に購入することのできないものがあったため。今後の研究推進方策としては、第一に、アメリカ憲法学を主な素材としつつ、「緊急事態における裁判官の役割」という観点から、Legalityの観念の意義と問題点の調査・検討を行う。
養護学校教員の力量の伸長を促すための研修内容・方法に関する研究

本年度の研究では、今後、養護学校教員の力量の伸長を促すための研修形態のあり方を検討するための第一段階として、まず、(1)これまで養護学校教員が受けてきた研修の形態を明らかにし、さらに(2)養護学校教員が必要としている力量の教員の個人特性と関連づけて明らかにすることを目的とした。対象は、東京、埼玉、千葉、神奈川、新潟、長野の各都県の養護学校41校(精神薄弱23校、肢体不自由9校、病弱9校)の教員2,142名に対して郵送法によるアンケート調査を実施した。有効回答数は1,418であり、回収率は66.2%であった。本研究から明らかにされた点をまとめると以下の通りである。・これまで受けてきた研修の場については、どの養護学校においても、各学校内で行う研修会等への参加が大半を占めており、外部の機関で研修を受ける者は少ない傾向にあった。・研修の内容については、障害児の教育・指導に関するものが多く、次いで、障害児の基本的理解に関するもの、学校・部経営に関するものの順になっていた。・必要であると感じる力量が、教員の個人特性に応じて違いがあるのかを分析した結果、いずれの種類の養護学校においても、年齢が高くなるにつれて、また、養護学校教員経験年数が長くなるにつれて、「障害児教育に関する基本的な知識や資質能力」→「障害児の指導に必要な力量」→「学級経営に関する力量」→「学校・部の経営に関する力量」へと移行していく傾向が認められた。・精神薄弱養護学校の教員に比べて、肢体不自由と病弱養護学校の教員の方が、養護・訓練や医学的側面に関する力量を強く求めている傾向が伺われた。
線条体機能モジュールの動作原理の解明と視床入力の役割

本基盤研究では、線条体ではどのような動作原理で情報処理がなされているのか、大脳基底核で処理されて視床を経て戻ってきた情報は線条体にどのような影響をもたらすのかについて調べた。In vitroの神経回路の研究からは線条体のFS細胞と呼ばれる抑制性ニューロンが投射ニューロンを束ねて1単位の機能モジュールを形成しており、コリン作動性細胞とLTS細胞は広く機能モジュールを束ねていた。視床一線条体投射はこの中でコリン作動性細胞に入力する。コリン作動性細胞は線条体のストリオソームとマトリックスという二つのコンパートメントの境界部に位置することが多く、μオピオイド受容体を特異的に持つストリオソームではストリオソーム内のエンケファリンを放出する投射ニューロンの活動により特異的に抑制性シナプス後電位を抑制するため、コリン作動性細胞が発火しアセチルコリンを放出する。このアセチルコリンはFS細胞をニコチン受容体の活性化により興奮させるので、FS細胞が統御するマトリックス内の機能モジュールが抑制を受けることがわかった。これらのことから明らかになったことは次のとおりである。コリン作動性細胞には視床からの指令が入るが、運動学習時にはドーパミン細胞の興奮と同期して発火が抑制されるので、その投射領域ではアセチルコリンの放出が起こらず、ニコチン受容体は活性化されない。そのため、逆にその領域に限ってドーパミンの放出濃度は飛躍的に増加する。このとき、同時にFS細胞を介した投射ニューロンの抑制は外れており、皮質一線条体投射のグルタミン酸伝達はムスカリン受容体の不活化のために抑制が外れて大きくなるため、コリン作動性細胞の投射領域では可塑的変化が生じやすくなることが明らかとなった。本基盤研究では、線条体ではどのような動作原理で情報処理がなされているのか、大脳基底核で処理されて視床を経て戻ってきた情報は線条体にどのような影響をもたらすのかについて明らかにする。4年の間に達成したい具体的な目標は以下の2点である。(1)線条体内の機能モジュールの全容を明らかにする。線条体全体の神経回路網の性質を明らかにすると同時に、LTS細胞とcalretinin細胞の役割、ドーパミン細胞との関係についても明らかにしたい。(2)視床-線条体投射と線条体機能モジュールとの関係についての研究。視床からのフィードバックが線条体のモジュールの活動にどのような影響をもたらすかについて皮質-線条体-視床スライスを用いたスライスパッチ法および電位感受性色素を用いたイメージングによって明らかにする。正常のマウスおよび遺伝子改変マウスを利用して電気生理学、電位感受性色素イメージング、免疫組織化学を駆使して、次の目標を段階的に達成していく。今年度は線条体内の局所神経回路網の全容を明らかにするため、FS細胞とMS細胞によって形作られる機能モジュールの動作原理をマウス脳のスライスパッチクランプ法を用いて明らかにした。すなわち、マウス脳の皮質-線条体スライスを用いて同時に2個の細胞からのパッチ記録を行い、線条体内の局所神経回路網の全容を生理学的に解明する。その結果、MS細胞からなる細胞集団を少数のFS細胞が抑制性シナプスを介してその活動を制御し、MS細胞集団の出力のS/N比を改善することが明らかとなった。

線条体全体の神経回路網の性質を明らかにすると同時に、LTS細胞とcalretinin細胞の役割、ドーパミン細胞との関係についても明らかにしたい。(2)視床-線条体投射と線条体機能モジュールとの関係についての研究。視床からのフィードバックが線条体のモジュールの活動にどのような影響をもたらすかについて皮質-線条体-視床スライスを用いたスライスパッチ法および電位感受性色素を用いたイメージングによって正常のマウスおよび遺伝子改変マウスを利用して電気生理学、電位感受性色素イメージング、免疫組織化学を駆使して段階的に達成していく。今年度はTHプロモーターにGFP遺伝子をつないだドーパミン細胞の光るTH-GFPマウスを導入して次のようなことを見出した。(1)黒質からのドーパミン投射(dopamine islandのちのstriosome)に一致してGFP細胞が出現するが、発達が進むにつれてstriosomeとは無関係にGFP陽性細胞は散在するようになる。(2)発生初期の黒質からのドーパミン投射領域はmu-opioid受容体陽性でstriosomeそのものであるが、生後発達に伴ってTH染色では一様になってその存在はわからなくなる。しかし、GFP陽性の明るい領域は生後も残っており蛍光顕微鏡下に明るい領域としてstriosomeを同定することができる。(3)striosome内の投射ニューロンのopioid受容体の性質を調べたところ、EPSPもIPSPもmu-opioid受容体のアゴニストに応答し、抑制された。これは殆ど応答のないマトリックスの細胞と対照的であった。本基盤研究では、線条体ではどのような動作原理で情報処理がなされているのか、大脳基底核で処理されて視床を経て戻ってきた情報は線条体にどのような影響をもたらすのかについて明らかにする。4年の間に達成したい具体的な目標は以下の2点である。(1)線条体内の機能モジュールの全容を明らかにする。線条体全体の神経回路綱の性質を明らかにすると同時に、LTS細胞とcalretinin細胞の役割、ドーパミン細胞との関係についても明らかにしたい。視床からのフィードバックが線条体のモジュールの活動にどのような影響をもたらすかについて皮質-線条体-視床スライスを用いたスライスパッチ法および電位感受性色素を用いたイメージングによって正常のマウスおよび遺伝子改変マウスを利用して電気生理学、電位感受性色素イメージング、免疫粗織化学を駆使して段階的に達成していく。今年度はTHプロモーターにGFP遺伝子をつないだドーパミン細胞の光るTH-GFPマウスを導入して次のようなことを見出し、現在投稿中である。
一酸化窒素合成酵素完全欠損動物の開発に基づく抗動脈硬化機構の解明

一酸化窒素(NO)合成酵素(NOS)には、内皮型NOS(eNOS)、誘導型NOS(iNOS)、神経型NOS(nNOS)の3種類のアイソフォームが存在する。研究代表者は、過去に、eNOSやiNOSに加えて、nNOSも重要な血管保護作用を有することを見出した(FASEB J 2002)。しかし、抗動脈硬化機構におけるNOSシステム全体の意義は不明である。この点を検討するために、研究代表者は、3つのNOSsをすべて欠失させたNOSシステム完全欠損マウス(トリプルn/i/eNOSs欠損マウス)を世界に先駆けて創出した(PNAS2005)。本研究では、このマウスにおける血管病変形成を検討した。2ケ月齢のオスのマウスを実験に使用した。血管病変形成の程度は、Masson-trichrome染色及びhematoxylin-eosin染色により評価した。マウスの一側の頚動脈を結紮し血流を途絶すると、2週間後には、結紮近位部頸動脈に、新生内膜と収縮性血管リモデリングが形成された。しかし、これらの病変形成の程度はいずれも、野生型マウスに比してトリプルNOSs欠損マウスで有意に増悪していた。新生内膜形成の増悪は、nNOS欠損マウス及びeNOS欠損マウスにも認められ、また、収縮性血管リモデリングの増悪は、nNOS欠損マウス及びiNOS欠損マウスにも見出されたが、重要なことに、これらの病変形成の程度はトリプルNOSs欠損マウスで最大であった。以上より、NOSシステムが、協調的な各NOSの相互作用を介して、重要な血管保護作用を発揮していることを初めて明らかにした。一酸化窒素(NO)合成酵素(NOS)には、3種類のアイソフォームが存在する。過去に研究代表者は、内皮型NOS(eNOS)や誘導型NOS(iNOS)に加えて、神経型NOS(nNOS)も重要な血管保護作用を有することを明らかにした。しかし、抗動脈硬化機構におけるNOSシステム全体の意義は十分に解明されていない。この点を検討するために、研究代表者は、3つのNOSsがすべて欠失したNOS完全欠損マウス(トリプルNOSs^<-/->マウス)を世界で初めて創出した(PNAS2005)。本研究では、このマウスにおける血管病変形成について検討した。最初に、自然発症の動脈硬化について検討した。オスの野生型マウズ、3種類のシングルNOS^<-/->マウス、及びトリプルNOSs^<-/->マウスを実験に使用した。血管病変形成の程度は、masson-trichrome染色及びhematoxylin-eosin染色により評価した。生後2ヶ月齢では、いずれのマウスにおいても有意な冠動脈病変は認めなかった。しかし、生後5ヶ月齢では、トリプルNOSs^<-/->マウスにおいてのみ、有意な冠動脈病変(内膜・中膜肥厚と外膜線維化)が観察された。次に、血管病変が認められない生後2ヶ月齢において、頚動脈結紮後の病変形成を検討した。頚動脈結紮2週間後の頚動脈には、eNOS欠損マウスにおいて新生内膜形成の増強が、iNOS欠損マウスでは収縮性血管リモデリングの増強が、nNOS欠損マウスでは新生内膜形成と収縮性血管リモデリングの両方の増強が認められた。重要なことに、トリプルNOSs^<-/->マウスにおける両病変形成の程度はいずれも最大であった。以上、研究代表者は、全NOSシステムが抗動脈硬化機構において重要な役割を果たしていることを初めて明らかにすることが出来た。平成19年度は、血管病変形成の分子機構の解明を行う予定である。
大脳皮質視覚野における長期増強の経験依存的機能発達に果たす役割

NR2B-NMDA受容体の活性化を必要とするシナプス可塑性が眼優位可塑性に関与する可能性を、ラットを用いて検討した。片眼遮蔽の効果は視覚誘発電位により評価した。ウレタン麻酔下のラットにサイン波状格子模様の明暗を1秒に1回逆転する視覚刺激を与え、それにより誘発される細胞外電位を遮蔽眼対側視覚野の両眼視領域から記録した。眼優位可塑性が最も強い生後25日から6日間片眼(右目)遮蔽し、生後31日に遮蔽眼の対側(左)の視覚野から記録すると、遮蔽眼刺激により誘発される電位は減少し、非遮蔽眼刺激による反応は増大する。眼優位性を対側眼誘発電位の同側眼誘発電位に対する比で評価すると、その値は顕著に減少し、対側眼優位から同側眼優位に変化することが分かる。片眼遮蔽の間、オスモティク・ミニポンプを用いてNR2B-NMDA受容体の特異的阻害薬Ro 256981を視覚野に持続注入しても、コントロールの片眼遮蔽と全く同様な眼優位性のシフトが起こった。しかし、単に片眼遮蔽を行った場合と異なり、片眼遮蔽の効果は持続せず、片眼遮蔽を終えてから次第に正常な対側眼優位の眼優位性に戻った。片眼遮蔽後、ラットを正常視覚環境で飼育しても、暗室で飼育しても、対側眼誘発電位の同側眼誘発電位に対する比は、3日でかなり大きくなり、1ケ月では片眼遮蔽なしの正常動物と同じ値になった。しかし、その戻り方は飼育環境により異なっていた。正常視覚環境で飼育すると、増大した非遮蔽眼反応はほとんど変化せずに、減弱した遮蔽眼反応が増大するのに対して、暗室飼育すると、減弱した遮蔽眼反応はほとんど変化せずに、増大した非遮蔽眼反応が減弱した。この結果は、片眼遮蔽の結果生じたシナプスの可塑的変化を片眼遮蔽終了後も維持するためには、NR2B-NMDA受容体が片眼遮蔽の間、視覚入力により活性化される必要があることを示唆している。1)大脳皮質視覚野の興奮性シナプスにおけるNi^<2+>感受性Ca^<2+>チャネル依存性の長期増強は、眼優位可塑性と同様な年齢と視覚体験に対する依存性を示す。この長期増強が眼優位可塑性に関与するかを検討した。2)昨年度のラットを用いた研究で、この長期増強はT型Ca^<2+>チャネルの活性化を必要とすることを明らかにした。また、視覚誘発電位の記録とmibefradilによるT型Ca^<2+>チャネル阻害により、この長期増強が片眼遮蔽により生ずる非遮蔽眼の視覚反応の増大に寄与することを示唆する結果を得た。3)mibefradilは選択性が低いので、本年度は、T型Ca^<2+>チャネルのノックアウトマウスを用いてこの問題を検討した。T型Ca^<2+>チャネルにはα_<1G>、α_<1K>、α_<1I>の3種類のα_1サブユットから構成されるサブタイプが存在する。この中でα_<1H>だけが高いNi^<2+>感受性を示すので、このサブタイプのT型Ca^<2+>チャネルが視覚野のCa^<2+>チャネル依存性の長期増強誘発に寄与する可能性が高いと考えられる。4)T型Ca^<2+>チャネル欠損マウスにおいて眼優位可塑性が障害されているかを、視覚野から視覚誘発電位を記録して検討した。野性型マウスを生後26日から5日間片眼遮蔽すると、遮蔽眼刺激により誘発される反応は減弱し、非遮蔽眼刺激により誘発される反応は増大し、眼優位性はシフトした。α_<1G>欠損マウスでは野性型と全く同様な眼優位性シフトが見られた。α_<1H>欠損マウスでは、遮蔽眼刺激に対する反応は減弱したが、非遮蔽眼刺激により誘発される反応に増大は見られなかった。5)以上のラット用いた薬理学実験とノックアウトマウスを用いた実験は、T型Ca^<2+>チャネル依存性長期増強が片眼遮蔽により生ずる非遮蔽眼の視覚反応の増大に寄与することと、α_<1H>サブユニットからなるT型Ca^<2+>チャネルがこの過程に重要な役割を果たすことを示唆している。

しかし、単に片眼遮蔽を行った場合と異なり、片眼遮蔽の効果は持続せず、片眼遮蔽を終えてから次第に正常な対側眼優位の眼優位性に戻った。片眼遮蔽後、ラットを正常視覚環境で飼育しても、暗室で飼育しても、対側眼誘発電位の同側眼誘発電位に対する比は、3日でかなり大きくなり、1ケ月では片眼遮蔽なしの正常動物と同じ値になった。しかし、その戻り方は飼育環境により異なっていた。正常視覚環境で飼育すると、増大した非遮蔽眼反応はほとんど変化せずに、減弱した遮蔽眼反応が増大するのに対して、暗室飼育すると、減弱した遮蔽眼反応はほとんど変化せずに、増大した非遮蔽眼反応が減弱した。この結果は、片眼遮蔽の結果生じたシナプスの可塑的変化を片眼遮蔽終了後も維持するためには、NR2B-NMDA受容体が片眼遮蔽の間、視覚入力により活性化される必要があることを示唆している。
脳プレコンディショニングにおけるCAVOLIN-1の研究と応用

Caveolin-1欠損マウスでは、脳虚血プレコンディショニングが働かず、海馬脳血管床の減少が見られ、その代償機構のためか、脳底動脈輪の側副血行形成が見られた。また、加齢に関連して見られる、海馬神経細胞のシナプスシグナリングコンポーネントの減少や、アルツハイマー病を示唆する神経変性が、若年でも見られた。更に、Caveolin-1の再発現により、アミロイドβ蛋白の発現量の減少を認めたことから、Caveolin-1の損失が神経変性と加齢を加速させることが示唆された。プレコンディショニングとは、臓器に対して細胞死を起こさない程度のストレスを与えることで、その後の致死的ストレスによる臓器障害を軽減させるという一般的な現象である。脳に関しても様々な機序が言われている中で、Caveolin-1という細胞膜構成蛋白が保護機序の一因子として報告されている。in-vivoにおいてこの現象を再現し、機序を解明することが研究目的である。研究の前段階として、wild type mouseにおける虚血プレコンディショニングの神経保護効果を確認するために、致死的虚血群、プレコンディショニング群、プレコンディショニング後致死的虚血群の処置条件設定を検討した。虚血プレコンディショニング群では、両側総頚動脈閉塞時間を3分間としたところ、術後3日目で両側海馬の生存神経細胞率が、sham手術(両側総頚動脈剥離のみ)とほぼ同じ結果となった(sham:プレコンディショニング=95.2±3.0%: 95.9±1.0%(平均値±標準偏差))。一方、致死的脳虚血群では、両側総頚動脈閉塞時間の設定に難渋したが(安定した神経細胞死と高い術後生存率を得るため)最終的に12分間とし、術後3日目生存神経細胞率が有意にsham、プレコンディショニング群より低いことを確認した(25.8±25.6%)。また、虚血プレコンディショニング後致死的脳虚血群においては、致死的脳虚血処置(12分間)の24時間前に虚血プレコンディショニング(3分間)行ったところ、致死的虚血群よりも高い生存神経細胞率を得(67.4±21.3%)、プレコンディショニングの効果を再現できた。しかしながら、1)虚血処置後脳血流量が10%以下に低下しないものがある、2)神経細胞死が左右どちらかに偏在、あるいは海馬内の各部位に散在し一定しない、3)処置後の生存期間が短い、などの問題が明らかとなった。これらの問題点は、knockoutあるいはtransgenic mouseを対象とした場合、結果に影響を及ぼすと考えられ、完全な全脳虚血モデル(両側総頚動脈+脳底動脈閉塞)への変更を予定している。1年目の研究では、wild type mouseにおける虚血プレコンディショニングの神経保護効果を確認するために、(1)致死的虚血群、(2)非致死的虚血群、(3)プレコンディショニング(非致死的虚血刺激)後致死的虚血群の処置条件設定をそれぞれ、(1)12分間の総頸動脈閉塞、(2)3分間の総頸動脈閉塞、(3)3分間の総頸動脈閉塞後24時間再灌流、その後12分間の総計動脈閉塞としたところ、両側海馬の生存神経細胞率が、sham手術(両側総頚動脈剥離のみ)95.2%±3.2%(平均値±標準偏差)、(1)25.8±19.9%、(2)95.9%±2.9%、(3)67.4%±21.3%となり、非致死的虚血刺激によるプレコンディショニングの効果を確認した。今年度はCaveolin-1 KO miceにおいて、この条件下で行ったところ、sham手術で92.4%±1.6%、(1)13.3%±18.4%、(2)89.7%±4.1%、(3)14.3%±20.0%との結果を得た。このことから、Caveolin-1蛋白が欠失しているmiceの海馬において、非致死的虚血刺激によるプレコンディショニングの効果がないことがわかった。更に、Caveolin-1 KO miceの海馬では、神経細胞数自体の減少、神経細胞のlipid raftにおけるneurotrophic receptorの減少、synaptosome内での減少など、高齢のwild type miceとの類似性が認められた。これらから、Caveolin-1蛋白がneuronのagingのコントロールポイントとなる可能性が示唆された。

プレコンディショニングとは、臓器に対して細胞死を起こさない程度のストレスを与えることで、その後の致死的ストレスによる臓器障害を軽減させるという一般的な現象である。脳に関しても様々な機序が言われている中で、Caveolin-1という細胞膜構成蛋白が保護機序の一因子として報告されている。in-vivoにおいてこの現象を再現し、機序を解明することが研究目的である。1年目の研究では、wild type mouseにおける虚血プレコンディショニングの神経保護効果を確認するために、(1)致死的虚血群、(2)非致死的虚血群、(3)プレコンディショニング(非致死的虚血刺激)後致死的虚血群の処置条件設定をそれぞれ、(1)12分間の総頸動脈閉塞、(2)3分間の総頸動脈閉塞、(3)3分間の総頸動脈閉塞後24時間再灌流、その後12分間の総計動脈閉塞としたところ、両側海馬の生存神経細胞率が、sham手術(両側総頚動脈剥離のみ)95.2%±3.2%(平均値±標準偏差)、(1)25.8±19.9%、(2)95.9推2.9%、(3)67.4%±21.3%となり、非致死的虚血刺激によるプレコンディショニングの効果を確認した。2年目はCaveolin-1 KO miceにおいて、この条件下で行ったところ、sham手術で92.4%±1.6%、(1)13.3±18.4%、(2)89.7%±4.1%、(3)14.3%±20.0%との結果を得た。このことから、Caveolin-1蛋白が欠失しているmiceの海馬において、非致死的虚血刺激によるプレコンディショニングの効果がないことがわかった。更に、Caveolin-1 KO miceの海馬では、神経細胞数自体の減少、神経細胞のlipid raftにおけるneurotrophic receptorの減少、synaptosome内での減少など、高齢のwild type miceとの類似性が認められた。これらから、Caveolin-1蛋白がneuronのagingのコントロールポイントとなる可能性が示唆された。
ナノニードルアレイを用いたマスクレス微細金属パターン創成技術の開発

本研究では,MEMS技術によって作製した極微小な中空構造を有する酸化シリコン(SiO_2)製のナノニードルアレイを用いることによって,平面基板上でのパターン形成に限らず,自由曲面へのパターニングも可能となる新規な"マスクレス微細金属パターン創成技術"の確立を目的として実施した.得られた成果は以下のとおりである.(1)静電引力を利用することで,極微小流体の高精度な吐出制御性が可能であり,吐出後も液体は基板表面との表面張力によって,ニードル外径とほぼ同程度の接触面積を維持することを示した.本提案技術によって,平均線幅3.4μm,平均高さ0.6μmの微細なNiラインパターンの形成が可能であることを実証した.さらに,マイクロニードルアレイを用いた基礎実験の結果から,めっき条件の最適化を行うことで,複数本のラインパターンを同時に形成できる可能性を示した.(2)基板表面上への極微小量のめっき液の安定供給の妨げとなる水素発生の電流密度の閾値は,基板温度を増加させることで大きくできることを示した.さらに,基板温度の増加は,Ni析出物の緻密化へも効果的であることを示した.一方,基板温度を増加させることで,めっき液の粘度が著しく増加する現象が認められた.粘度の増加は,浴中のスルファミン酸ニッケル濃度が高いほど顕著であることがわかった.以上の結果から,均一なNiラインパターンを高能率に形成するためには,電流密度を水素発生の閾値以下とし,さらに,基板表面とめっき液の濡れ性を制御することが重要であることが明らかとなった.(3)めっき液の過度の粘性増加は,基板表面との接触状態が断続的なものとなり,不連続なラインパターン形成の要因となる.しかし,この現象を適切に利用することで,立体的なNi微小構造体の形成が可能であることを示した.本研究では,MEMS技術によって作製した極微小な中空構造を有する酸化シリコン(SiO_2)製のナノニードルアレイを用いることによって,平面基板上でのパターン形成に限らず,自由曲面へのパターニングも可能となる新規な"マスクレス微細金属パターン創成技術"の確立を目的としている.得られた成果は以下のとおりである.(1)微細めっきパターン形成のための基礎的検討として,マイクロニードル(内径7.1μm,外径8.8μm,長さ23.0μm)を用いたニッケル(Ni)めっきを行った.一例として,電流密度17mA/cm^2,めっき時間287sの条件で,平均直径191.4μm,高さ6.4μmのNiの円形パターン形成が可能となった.さらに,ニードルを走査(走査速度32μm/s)することで,線幅163μmのラインパターンの形成も確認した.また,『TUT』という文字パターンの形成も行い,提案する手法によって任意のパターン形成が可能であることを示した.(2)前述の結果から,Ni微細パターン形成が可能であることが示されたが,形成されたパターン寸法は使用したニードルの外径に比べて十数倍と大きくなった.この理由は,シリンジポンプを用いた送液方法では,極微量のめっき液の吐出状態を制御できなかったためである.そこで,静電引力を用いて極微量の液体を制御性よく吐出する方法を検討した.液体吐出挙動に及ぼす印加電圧,ニードル-基板間距離などの影響を調査した結果,液体の吐出挙動は静電引力(電界強度=印加電圧/距離)によって支配されることが明らかとなり,極微小流体の高精度な吐出制御が可能となった.さらに,吐出後も液体は基板表面との表面張力によって,ニードル外径とほぼ同程度の接触面積を維持することを示した.(3)マイクロピペット(先端内径5.8μm,先端外径14.5μm)を用いて,静電引力による極微量のめっき液の制御を行った結果,ピペット先端径とほぼ同程度の直径9.1μm,高さ15μmの円形状のNiパターンの形成に成功した.さらに,ピペット(先端内径7.3μm,先端外径14.8μm)を走査(走査速度2μm/s)することで,平均線幅7.9μm,長さ214μmのラインパターン(高さ1.5μm)の形成が可能となった.本研究では,MEMS技術によって作製した極微小な中空構造を有する酸化シリコン(SiO_2)製のナノニードルアレイを用いることによって,平面基板上でのパターン形成に限らず,自由曲面へのパターニングも可能となる新規な"マスクレス微細金属パターン創成技術"の確立を目的として実施した.得られた成果は以下のとおりである.(1)静電引力を利用することで,極微小流体の高精度な吐出制御性が可能であり,吐出後も液体は基板表面との表面張力によって,ニードル外径とほぼ同程度の接触面積を維持することを示した.本提案技術によって,平均線幅3.4μm,平均高さ0.6μmの微細なNiラインパターンの形成が可能であることを実証した.さらに,マイクロニードルアレイを用いた基礎実験の結果から,めっき条件の最適化を行うことで,複数本のラインパターンを同時に形成できる可能性を示した.(2)基板表面上への極微小量のめっき液の安定供給の妨げとなる水素発生の電流密度の閾値は,基板温度を増加させることで大きくできることを示した.

さらに,基板温度の増加は,Ni析出物の緻密化へも効果的であることを示した.一方,基板温度を増加させることで,めっき液の粘度が著しく増加する現象が認められた.粘度の増加は,浴中のスルファミン酸ニッケル濃度が高いほど顕著であることがわかった.以上の結果から,均一なNiラインパターンを高能率に形成するためには,電流密度を水素発生の閾値以下とし,さらに,基板表面とめっき液の濡れ性を制御することが重要であることが明らかとなった.(3)めっき液の過度の粘性増加は,基板表面との接触状態が断続的なものとなり,不連続なラインパターン形成の要因となる.しかし,この現象を適切に利用することで,立体的なNi微小構造体の形成が可能であることを示した.
骨組織吸収過程におけるコラーゲン消化・吸収機構の解明

骨組織を構成する細胞は、骨芽細胞・骨細胞・破骨細胞とそれらの前駆細胞であり、骨改造現象はこれらの細胞連鎖機構によって行われている。破骨細胞は骨組織吸収の主役をなし、活性化されると酸を分泌し、無機質の溶解を行うと共に、また加水分解酵素を分泌し有機質の消化・分解を行うと考えられている。しかし、骨基質の有機成分の主体をなすコラゲンの消化・分解機構については十分に解明されていない。そこで、改造現象の活発なラット歯槽骨-歯周靭帯境界部組織と、培養骨芽細胞様細胞(MC3T3-E1)を用いて、コラゲン貪食細胞の局在と酵素活性を電顕で組織細胞学・組織細胞化学的に検索した。歯槽骨表面の破骨細胞に隣接する骨芽細胞・骨芽細胞様細胞にコラゲン貪食像と多数の細胞内コラゲンが観察された。これらの細胞は細胞突起を骨基質に連続するコラゲン細線維に延ばし、活性にコラゲン貪食をしていた。また、破骨細胞が存在する吸収窩周囲の線維芽細胞が露出コラゲン細線維を取り込む像と、細胞内に多数のコラゲン貪食小体が認められた。破骨細胞と隣接しない、形成相と思われる骨芽細胞にもコラゲン貪食像と細胞内コラゲンが観察された。これらのコラゲン貪食水解小体にはACPaseとカテプシンB活性が認められた。更に、培養骨芽細胞様細胞(MC3T3-E1)においても、コラゲン形成がある段階に達すると、コラゲン貪食像とコラゲン貪食小体が観察され、コラゲン貪食能と消化・吸収能を有することが明らかになった。これらの結果より、骨芽細胞様細胞(骨芽細胞・前駆細胞)は線維芽細胞・セメント芽細胞と同様にコラゲン貪食能を持ち、特異的で局所的に行われるコラゲン貪食とライソゾーム系による細胞内消化・吸収は、骨組織での生理的コラゲン消化・吸収機構に関与していることが示唆された。骨組織では、その種類や部位を問わず、常に改造現象が生じており、これは骨組織を構成する細胞である骨芽細胞、骨細胞、破骨細胞とそれらの前駆細胞の細胞連鎖機構によることが知られている。破骨細胞による無機質溶解機構はほぼ解明されている。しかし、有機質の主構成成分であるコラーゲンの消化・吸収機構には不明な点が多い。そこで、骨吸収時のコラーゲンの消化・分解過程において、いかなる細胞が、どのような酵素を生成し、作用しているかを生体組織と培養実験系を併用して組織細胞学・組織細胞化学的に検索した。材料には、ウィスター系ラットの生後1週から9週の頭蓋冠の組織培養片と、生後3週から2年の灌流固定した頭蓋冠と上下顎骨を用いた。その微細構造、ACPase活性とカテプシンDの局在を電顕で比較観察した。骨吸収窩には多核で波状緑の発達した破骨細胞が観察され、波状緑の微絨毛間にはコラーゲン細線維が多数認められた。これらの線維の他端は石灰化した骨質に連続しているものもあった。しかし、細胞外でのコラーゲン細線維の形態学的な消化・分解像は観察されなかった。また、細胞質中には多数の水解小体・貧食小体が存在し、ACPase活性を示したが、コラーゲン貧食小体は認められなかった。部位によっては、破骨細胞に隣接する前骨芽細胞・線維芽細胞様細胞(ストローマ細胞)は長い細胞突起を骨基質に延ばしており、それらの突起内および細胞体にコラーゲン貧食小体が観察された。これらのコラーゲン貧食小体にはACPase活性とカテプシンDの局在が認められた。現在、組織培養系にコラゲナーゼ・インヒビターカテプシンD・インヒビター等を添加し、コラーゲン消化・吸収への影響とコラーゲン貧食細胞について組織細胞学・組織細胞化学・および免疫酵素化学的に検索している。

更に、培養骨芽細胞様細胞(MC3T3-E1)においても、コラゲン形成がある段階に達すると、コラゲン貪食像とコラゲン貪食小体が観察され、コラゲン貪食能と消化・吸収能を有することが明らかになった。これらの結果より、骨芽細胞様細胞(骨芽細胞・前駆細胞)は線維芽細胞・セメント芽細胞と同様にコラゲン貪食能を持ち、特異的で局所的に行われるコラゲン貪食とライソゾーム系による細胞内消化・吸収は、骨組織での生理的コラゲン消化・吸収機構に関与していることが示唆された。骨組織を構成する細胞は、骨芽細胞・骨細胞・破骨細胞とそれらの前駆細胞であり、骨改造現象はこれらの細胞連鎖機構によって行われている。破骨細胞は骨組織吸収の主役をなし、活性化されると酸を分泌し、無機質の溶解を行うと共に、また加水分解酵素を分泌し有機質の消化・分解を行うと考えられている。しかし、骨基質の有機成分の主体をなすコラゲンの消化・分解機構については十分に解明されていない。そこで、改造現象の活発なラット歯槽骨-歯周靱帯境界部組織と、培養骨芽細胞様細胞(MC3T3-E1)を用いて、コラゲン貧食細胞の局在と酵素活性を電顕で組織細胞学・組織細胞化学的に検索した。歯槽骨表面の破骨細胞に隣接する骨芽細胞・骨芽細胞様細胞にコラゲン貧食像と多数の細胞内コラゲンが観察された。これらの細胞は細胞突起を骨基質に連続するコラゲン細線維に延ばし、活発にコラゲン貧食をしていた。また、破骨細胞が存在する吸収窩周囲の線維芽細胞が露出コラゲン細線維を取り込む像と、細胞内に多数のコラゲン貧食小体が認められた。破骨細胞と隣接しない、形成相と思われう骨芽細胞にもコラゲン貧食像と細胞内コラゲンが観察された。これらのコラゲン貧食水解小体にはACPaseとカテブシンB活性が認められた。更に、培養骨芽細胞様細胞(MC3T3-E1)においても、コラゲン形成がある段階に達すると、コラゲン貧食像とコラゲン貧食小体が観察され、コラゲン貧食能と消化・吸収能を有することが明らかになった。これらの結果より、骨芽細胞様細胞(骨芽細胞・前駆細胞)は線維芽細胞・セメント芽細胞と同様にコラゲン貧食能を持ち、特異的で局所的に行われるコラゲン貧食とライソゾーム系による細胞内消化・吸収は、骨組織での生理的コラゲン消化・吸収機構に関与していることが示唆された。
両生類胚のアクチビンとレチノインさんの共同作用による分化に関する免疫組織化学的研究

ツメガエル・アクチビンAおよびアクチビンB、ツメガエル・フォリスタチンについては、親水性の部域を検討して、アクチビンについてはC末端近く、フォリスタチンについては中央部分で1315merのペプチドを化学合成した。これをBSAにコンジュケードしてウサギ抗血清を得て、ペプチドカラムにより抗体を精製した。ツメガエル卵をPFAにより固定して免疫電顕を行ったところ、卵黄顆粒に有意な金コロイドのシグナルが検出された。動物極側、植物極側、背側、腹側でシグナルの密度に大きな差異は見られなかった。これらのシグナルはペプチドによる吸収で消えた。このことは、ツメガエル卵においては、アクチビンとフォリスタチンが卵黄顆粒に存在する可能性を示す。一方、東京大学・浅島研究室の福井らとの共同研究で、ツメガエルの初期胚のHPLCフラクションのEDF活性を測定したところ、3つのピークをもつEDF活性が検出され、リテンションタイムから考えて、ツメガエル初期胚にはアクチビンA,AB,Bの3種類が全て含まれるものと考えられた。また、それらを大きく上回るフォリスタチンの存在が福井より示された。ツメガエル・レチノイン酸レセプターalphaに対するペプチド抗体も作成された。クリオスタット切片で抗原の局所を調べたとこら、胚全体の核にシグナルが検出され、原腸期の神経外胚葉、陥入した中胚葉部域にやや強いシグナルが見られた。こららの結果から、母性誘導因子、あるいはそのレセプターであるアクチビンとレチノイン酸レセプターは、発生のごく初期の段階ではっきりとした局在をもとものではなく、卵全体に広がって存在していることが考えられる。