hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
疼痛における生体膜糖脂質の機能と鎮痛への応用のための基礎的研究

ガングリオシドGT1bをマウスの足底皮下に投与すると疼痛を引き起こし、さらに低濃度ホルマリンによる疼痛を増強する。GT1bによる痛覚過敏では皮下におけるグルタミン酸の細胞外濃度の上昇と、グルタミン酸受容体の活性化が重要である。これらを踏まえ、GT1bによる痛覚過敏がホルマリン以外の疼痛刺激により引き起こされるか検討を行い、機械刺激にも効果を持つことを示した。また、脊髄後根節神経細胞由来細胞において、GT1bは上清中のグルタミン酸濃度を上昇させる効果を有していた。以上から、GT1bは疼痛刺激に対し特異性を持ち、神経由来細胞においても個体と同様にグルタミン酸濃度調節に関与することが示唆された。現在までに、研究代表者らは糖脂質が疼痛や疼痛過敏を引き起こし、そのメカニズムとして糖脂質が皮下においてグルタミン酸の放出を促進することを見いだしている。さらに、動物実験以外からこの糖脂質によるグルタミン酸放出促進の分子メカニズムの解明に向けたアプローチとして、株化細胞を用いた検討を行った。株化細胞としては神経系由来の細胞であるNeuro2aを分化させたものを用い、糖脂質を培養液中に投与し、培養液中のグルタミン酸濃度をHPLCにより測定した。その結果、糖脂質の一種ガングリオシドを投与することで培養液中のグルタミン酸濃度が上昇することを見出した。以上を成果としてNeuroscience letters誌に発表した。現在までに、ガングリオシドをマウスの足底皮下に投与すると疼痛を引き起こし、さらに低濃度のホルマリンの同部位への投与による疼痛を増強することが明らかとなっている。また、このガングリオシドによる痛覚過敏は皮下におけるグルタミン酸の細胞外濃度の上昇と、グルタミン酸受容体の活性化が重要であることが明らかとなった。しかしながら、疼痛は多様な刺激により引き起こされ、刺激の種類により関与する分子やシグナル伝達系が異なる可能性がある。そのため、ホルマリン以外の疼痛刺激として、コールドプレート、von Freyfilamentの各刺激に対してガングリオシドをあらかじめ足底皮下に投与しておくとどのような効果を持つか検討を行った。その結果、コールドプレートによりマウスが疼痛反応を示す温度まで下げたところ、ガングリオシドによる疼痛行動の変化は認められなかった。一方で、von Freyfilamentに対する反応性はやや向上した。そのため、ガングリオシド投与による疼痛過敏に対してはある程度の刺激特異性があることが明らかとなった。また、慢性疼痛モデルとして完全フロイントアジュバントによる炎症性疼痛モデルおよび坐骨神経部分結紮による神経障害性疼痛モデルを作製し、脊髄や坐骨神経の糖脂質組成の変化を解析中である。さらに、脊髄後根神経節(DRG)ニューロン由来の細胞株F-11細胞において、ガングリオシド投与により細胞外グルタミン酸濃度が上昇することを明らかにしたので、この細胞の分化に伴う糖脂質組成の変化を解析した。その結果、分化に伴い高級なガングリオシドと思われる糖脂質が増加した。今後はこのような糖脂質組成の変化がグルタミン酸濃度調節にどのように関与するのかを検討することを予定している。本年度は、研究代表者の所属機関変更に伴い研究環境の変化があったため、研究実施のための動物実験系の立ち上げが必要であった。そのため、疼痛試験装置などのセットアップを行った。具体的には、von Freytest、Hargreavestest試験用の実験装置の導入と設置を行った。また、糖脂質の関与する疼痛モデルはとしては、代表者らにより、ホルマリンおよびホットプレートによる疼痛試験のみ検討が行われている。しかしながら、神経そのものの損傷により異常な疼痛が生じる神経因性疼痛や炎症後の疼痛は臨床的にも重要であるため、これらの疼痛における糖脂質の関与も検討するべきである。そこで、これらの解析のためにマウスを用いて神経因性疼痛モデルや炎症性疼痛モデル作製の検討を行った。以上と並行し、今後のより効率のよい分子メカニズム解析のために株化細胞培養系において検討を行った。つまり、現在までに研究代表者らが明らかにしている疼痛における糖脂質の作用メカニズムとして、グルタミン酸放出経路への関与が挙げられる。そこで、本年度では動物実験以外からこの分子メカニズムの解明に向けたアプローチとして、糖脂質によりグルタミン酸濃度が調節されうる細胞培養系の検討を行った。その結果、糖脂質の一種であるガングリオシドを培養液中に投与すると、グルタミン酸の放出能が上昇することを見出した。次年度以降は、この分子メカニズムについて解析を行い、得られた結果から生体内でも同様な分子メカニズムを介しているか、阻害剤などを用いて検討を行う。

分子メカニズムを解明しうる実験系が得られたので、以降はこの実験系を用いて糖脂質によるグルタミン酸放出能制御のメカニズムを検討し、得られた成果をマウスの疼痛実験に反映させていくことが期待される。一方で、疼痛モデルを用いた検討を今後推し進める必要がある。特に、従来の鎮痛剤が効きづらいことからも注目されている神経障害性疼痛については、ガングリオシドや、その生合成経路に関係している試薬を検討していくことが必要である。本年度は研究代表者の所属機関の変更に伴い、動物実験などのセットアップが必要であったが、おおむね順調に準備がすることができた。また、効率よく分子メカニズムの解析を行う系として、細胞培養系において糖脂質により細胞外グルタミン酸濃度を調節しうる系を見出し、将来のメカニズム解析のための実験系を立ち上げ、一定の成果を得ることができた。今後は、新たな鎮痛薬が求められている慢性疼痛に対して糖脂質が影響を及ぼすか解析を行う必要がある。具体的には、神経因性疼痛や炎症性疼痛のモデルを作製し、ガングリオシドなどの糖脂質や生合成系に関与する試薬により疼痛が影響を受けるか検討を行う。併せて、培養細胞を用い、糖脂質が制御しうるグルタミン酸分泌機構の検討を行う。なお、研究代表者の異動に伴い研究環境の変化があったので、必要に応じて研究機器を購入し、グルタミン酸や脂質解析などの測定系をセットアップする予定である。次年度以降は、本年度の準備及び研究成果を踏まえ、細胞培養系および動物個体において糖脂質がどのような分子メカニズムを介してグルタミン酸放出に対して関与しているか検討を行う。また、病的な疼痛モデルとして、神経因性疼痛モデルや炎症性疼痛モデルにおける糖脂質の効果について検討を行う。次年度は、マウスモデルを用いた疼痛実験の実施のために必要なマウス購入費、必要な試薬類の購入のために使用する。また、グルタミン酸分泌促進の実験系を用いた分子メカニズム解明のために必要な阻害剤、プラスミド、培養用品などの購入のために使用する。その他、タンパク質解析、脂質解析、遺伝子組み換え実験、細胞機能解析のために必要な器具、試薬、酵素類、抗体等に使用する。さらに必要に応じてグルタミン酸分析や、脂質解析に必要な装置などを準備する。次年度は、実際の疼痛実験の実施のために必要なマウス購入費や疼痛測定装置の購入、必要な試薬類の購入のために使用する。また、今年度の成果である、神経細胞培養系におけるガングリオシドによるグルタミン酸分泌促進の系を用いた分子メカニズム解明のために必要な阻害剤、プラスミド、培養用品などの購入のために使用する。
英米法における時間(歴史)の要素の存在構造と現行法への示唆

英米法における時間(歴史)の要素の存在構造を,特に権威的法典籍における時間的要素に対する思考法および処理方法を追究することによって考察し,英米法には歴史が本来的に組み込まれていると言われることの根元的意味と、歴史的事実における具体の現れ方を検討した。アメリカ法形成期のイングランド法継受における権威的法典籍の働き、時代と立場により変遷する反逆罪法理、および中世的訴訟手続の変化と近代的実体法の析出に焦点を合わせ、論文化した。判例法主義を採る英米法において、歴史が本来的に組み込まれて(built in)存在しているということの意味、換言すれば英米法における時間(歴史)の要素の存在構造を、特に権威的法典籍(books of authority)における時間的要素に対する思考法および処理方法を追究することによって考察し、英米法には歴史が本来的に組み込まれていると言われることの根元的意味を明らかにし、英米現行法学・法制史学のあり方に対する一定の示唆を行って、ひいてはわが国における英米法制度の摂取のあり方を見つめ直す比較的視座を提供する。第一に,(1)(4)の作業を行った。(1)ブラックストン著『イングランド法釈義』本文中に無数にちりばめられている法律用語及び法概念を,その本文の文脈に即して抽出することで,著者本人による解説付の「法律用語・法概念集」の機能を果たす基礎資料を補充作成する。(2)『釈義』に封する19,20世紀の脚註・註釈書・実務手引書から,『釈義』の行論上重要な引用先例に対して上記手引書等が付加する,最近の「類似判例」を抽出し,「引用判例の系譜」集を作成する。(3)代表的な法律事典(law dictionary)における参照・引用例を(1)(2)から抽出し,一覧表化する。(4)英米におけるいわゆる重要判例の若干における,参照・引用事例を(1)(3)から抽出し,一覧表化する。第二に,『釈義』が果たした現実の法に対する影響例の典型として,「アメリカへのイギリス法の継受は、ブラックストン『釈義』に負うところが大である」という,従来の英米法学によって行われてきた言明を検証する論文の執筆に取り組んだ。これは平成20年度中に発表する予定である。第三に,『釈義』が,中世のイングランド法と,近代のアメリカ法形成との橋渡しをした一例として,前者における反逆罪にかかわる立法ないし判例が,『釈義』を通してアメリカで学ばれ,それがさらにアメリカ建国時における厳しい政治状況により独特のニュアンスを付加されて,アメリカ法特に合衆国憲法の規定として結実し,現実にも奇妙な適用をされていったさまを研究する。これは平成20年度中に論文として発表することを目指す。1,第一に, (1)(4)の作業を行った。(1)ブラックストン著『イングランド法釈義』の本文中に無数にちりばめられている法律用語及び法概念を,その本文の文脈に即して抽出することで,著者本人による解説付の「法律用語・法概念集」の機能を果たす基礎資料を,順次補充しながら作成する。(2)『釈義』に対する19, 20世紀の脚註・註釈書・実務手引書から,『イングランド法釈義』の行論上重要な引用先例に対して上記手引書等が付加する,最近の「類似判例」を抽出し,「引用判例の系譜」集を作成する。2,第二に,上の作業の成果を利用し,『イングランド法釈義』が果たした現実の法に対する影響例を抽出する視点から,「アメリカへのイギリス法の継受は、ブラックストン『イングランド法釈義』に負うところが大である」という,従来の英米法学によって行われてきた言明を検証する論文の執筆に取り組み、発表した。3,第三に,第二と同様の方法及び視点から,『イングランド法釈義』が,アメリカ合衆国憲法中の「反逆罪条項」の成立および内容上の「法理」に大きくかかわっている事実と,他面,当時のアメリカの政治状況によってもたらされた「実理」から,その法理が実務上,特殊アメリカ的に変形された様相とを描き出し,論文として発表した。1、第一に、(1)(4)の作業を引き続き行った。(1)ブラックストン著『イングランド法釈義』の本文中に無数にちりばめられている法律用語及び法概念を、その本文の文脈に即して抽出することで、著者本人による解説付の「法律用語・法概念集」の機能を果たす基礎資料を、順次補充しながら作成する。(2)『釈義』に対する19、20世紀の脚註・註釈書・実務手引書から、『イングランド法釈義』の行論上重要な引用先例に対して上記手引書等が付加する、最近の「類似判例」を抽出し、「引用判例の系譜」集を作成する。(3)代表的な法律辞典(law dictionary)における参照

・引用例を(1)(2)から抽出し、一覧表化する。(4)英米におけるいわゆる重要判例の若干における、参照・引用事例を(1)(3)から抽出し、一覧表化する。2、英米法における時間(歴史)の要素の存在構造それ自体に関して考察し、特にアメリカ法制史学を、純粋に歴史学としての再構築することの可能性とその意義に関する考察を深めた。具体的には、19世紀のアメリカにおける訴訟手続の簡略化と、その実体法への影響のあり方を、特に不法行為法あるいは契約法の近代的生成あるいは変容の中に見、その姿を理論的に定式化することを試みる論文の執筆に取り組みつつある。3、これと同時並行に、上記『釈義』が、従来の類書とは全く異なって、訴訟方式(forms of action)の体系ではなく、「権利rights」および「権利侵害wrongs」の体系で書き上げたことに着目し、具体的な法制度の展開とのかかわりに注目して、今後のさらなる研究のための観点を整理しつつある。1,前年度までの作業を踏まえ、英米法における時間(歴史)の要素の存在構造それ自体に関して考察し特にアメリカ法制史学を、純粋に歴史学としての再構築することの可能性とその意義に関する考察を深めた。2,具体的には、19世紀のアメリカにおける訴訟手続の簡略化と、その実体法への影響のあり方を、特に不法行為法あるいは契約法の近代的生成あるいは変容の中に見、その姿を理論的に定式化することを試みる論文の執筆に取り組んだ。独立後のアメリカにおいて用いられたのは、基本的にイングランドの訴訟手続であったが、その強く中世的な性格が、社会的・法技術的実態にそぐわなくなるにつれて、アメリカ法曹は独自の訴訟手続へと実務上変化させていった。その典型が、一方では、コモン・ロー訴訟手続の基本であった訴訟方式と訴答の簡略化であり、他方それと平行して、当然には拡大するはずの陪審の法決定権を、再審理制度を拡大することによって、裁判所が制限することが可能な法実務を、特段の立法の根拠なしに確立させていった。これによって、外見上は中世的な訴訟手続を用いながら、折しも進行しつつある産業革命に伴う社会・経済の変化に対応しうる、実体法の近代化を、アメリカの法曹が実務上編み出していった。英米法の存在根拠である時間.(歴史)の要素を前提にしながら、巧みに近代に即応しうる存在構造を構築した歴史の実例であり、これがまた、「アメリカ法の形成」の重要な一局面であると言える。3,これと同時並行に、アメリカ法の形成に歴史上極めて重要な役割を果たしたと言われる、ブラックストン著『イングランド法釈義』が、従来の類書とは全く異なって、訴訟方式の体系ではなく、「権利rightsおよび「権利侵害wrongs」の体系で書き上げたことに着目し、具体的な法制度の展開とのかかわりに注目して、今後のさらなる研究のための観点を整理しつつある。
翻訳の視点から探る日本哲学―日本と東アジア・日本と西洋における言語と思想の相関性

本研究は、「翻訳」の諸問題を哲学的に検討することを目的とし、特に日本哲学における具体的な言葉と翻訳の問題を掘り下げた。この場合の「翻訳」とは、あるテキストを外国語に翻訳するという意味に限るものではなく、哲学する過程ですでにそこには翻訳・再解釈がかかわっているという意味にも用いている。欧米、台湾、日本の研究者が集まり、京都学派の哲学やマルクス哲学、仏教経典の概念・用語について、複数文化を越境する視点から哲学史上の様々な問題と関連させつつ、考察することができた。また井筒俊彦の意識の理論、中井正一の映画理論、現代の歌人の創造の体験に基づき、「言語と非言語」、「表現」の問題を検討するに至った。・7月、京都大学ー打ち合わせ会を行い、研究期間における役割分担や研究概要について確認した。・12月、京都大学ー「日本哲学史フォーラム」(定期公開講演会)を開催。講演者は科研グループの杉本耕一氏と、西田研究で知られる小林敏明氏であった。両氏の講演には言語と思考、翻訳の問題が含まれており、グループのメンバーは講演会への参加者と共にこれについて議論することができた。・12月、京都大学ー「西田幾多郎の「場所」の英訳から原著を読み直す」という研究会を開催。上原が、日本哲学を他の言語により表現することは、原著の思想を深く理解するきっかけとなる、という趣旨の説明を行った。これの実践報告は、京都大学・日本哲学史専修の学生・OD4名が担当し、グループのメンバーと議論し、場所」における様々な翻訳の問題を掘り下げることができた。小林氏も議論に参加し、この場で得た考えを論文にをまとめ、『日本哲学史研究』(京都大学・日本哲学史研究室紀要)に寄稿して下さった(平成27年度に出版予定)。・平成27年1月、台湾の中央研究院中國文哲研究所が主催するシンポジウムCross-Cultural Phenomena in the Modern Exchange between EastAsian and Western Tought"に、グループが参加。藤田正勝氏、田中久文氏、上原が発表した。三人は、日本哲学における「表現」という問題に関連する「形なきものの形」をテーマに各自報告した。・上原独自の活動:11月、東京大学ー京都大学・日本哲学史専修とUTCPの合同セミナーを開催。テーマは、Japanese Philosophy and Translation: Re-reading Nishida Kitaro's“Basho" through its Translation in English"である。「場所」の翻訳者、John W.M. Krummel氏も参加した。両大学の若手5人が、翻訳と原著の比較研究を報告し、Krummel氏と共に英語で議論した。7月:「日本哲学史フォーラム」(研究代表者が主催する定期講演会、京都大学)で、シンポジウム「表現する自己、表現する世界」を開催。三人の女性講演者(歌人、映画研究者、中国文学研究者)が、哲学の研究者とともに、表現という問題を学際的な視点から検討した。11月:研究代表者は、ヒルデスハイム大学に招かれ、ワークショップ「翻訳される日本哲学」で、「日本哲学における一人称の翻訳」をテーマに基調講演を行った。12月:「日本哲学史フォーラム」を開催。講演者二名のテーマは、「表現的存在」「日本哲学へのギリシャ哲学の受容」。前者では身体表現の問題、後者ではギリシャ語用語の翻訳の問題が論じられた。本研究プロジェクトのメンバー以外の研究者を招へいするに当たり、先方の都合や予算の関係で、予定通りの研究者に依頼することはできなかったが、最終的に、検討したい課題を扱う適任の研究者の協力を得ることができた。多少予定外のテーマではあるが、プロジェクトにそった有益な議論を行うことができた。一方、個別の検討事項について、まだ扱われていないものも多く残っているが、来年度、ライプツィヒ大学(ドイツ)でワークショップを開催し、そこで検討するという目途が立っている。結果としては、今年度もおおむね順調に成果を出すことができたと言える。「講演会」:「日本哲学史フォーラム」8月ー「漢訳仏典の音写語と翻訳不可能性」「仏教における智慧ーその翻訳と仏教理解をめぐって」という講演が行われ、分担者の美濃部仁氏がコメントを担当した。仏教用語のインド語からの漢訳に見られた、翻訳のプロセスや方法に関する歴史的な諸問題について考察し、定訳となっている現代語訳を再検討した。「ワークショップ」:1「翻訳と日本哲学」9月(ライプツィヒ大学東アジア研究所)ー代表者がドイツ側の協力を得て企画した。分担者・協力者(清水正之、竹花洋祐、藤田正勝、岡田勝明、嶺秀樹、平子友長、加藤泰史、平田俊博)、およびドイツ、フランスの日本哲学研究者8名が発表、コメントを担当した。本研究の三つの根本課題である「翻訳により生まれた日本哲学の言語」「西洋語・東アジア語に翻訳された日本哲学と日本哲学研究」「日本語で考える・哲学する」に基づき、言葉と意識、沈黙、直接性、空海と日本語、倫理学と日常言語、マルクスの用語、文化の翻訳という具体的な問題について考察し、議論した。;2「人類学と哲学の日仏会議ー文化の問題」2017年3月(仏語、仏国立社会科学高等研究院・マルセイユ)ー代表者の企画。近代日本の黎明期、西洋哲学をモデルとして「哲学」の基礎が翻訳により作られたという問題を報告し、フランスの研究者らと活発に意見を交換した。「研究定例会8月、12月」:博士課程の学生(一名は留学生)による提題「グローバル環境政治における普遍と特殊:和辻、大拙、西田」

「意識現象の場所:絶対無の立場からの実在をめぐって」、および分担者による提題「西田における弁証法的一般者」(美濃部仁)「象徴と詩作ー田辺元のヴァレリー理解ー」(竹花洋佑)を通して、近代日本哲学の基本概念(普遍、特殊、弁証法、一般者、三人称)を再検討し、さらに翻訳の観点から詩的言語についても思索を深めた。本研究は、「翻訳」の諸問題を哲学的に検討することを目的とし、特に日本哲学における具体的な言葉と翻訳の問題を掘り下げた。この場合の「翻訳」とは、あるテキストを外国語に翻訳するという意味に限るものではなく、哲学する過程ですでにそこには翻訳・再解釈がかかわっているという意味にも用いている。欧米、台湾、日本の研究者が集まり、京都学派の哲学やマルクス哲学、仏教経典の概念・用語について、複数文化を越境する視点から哲学史上の様々な問題と関連させつつ、考察することができた。また井筒俊彦の意識の理論、中井正一の映画理論、現代の歌人の創造の体験に基づき、「言語と非言語」、「表現」の問題を検討するに至った。当初の予定では、本科研費による研究グループ内でのテーマをめぐる検討会の回数をより多く入れるはずであったが、各メンバーの日程の問題があり、初年度は2回に限られた。しかし、予定外ではあったが、大変有益な研究の機会を得ることができた。ドイツで研究活動を行う小林敏明氏や「場所」の翻訳者であるアメリカのKrummel氏との研究会を実現することができた。また、台湾の中央研究院で開催されたシンポジウムにグループとして参加し議論する機会を得ることができた。従って、予定は変更されたが、全体としては順調に成果を出すことができたと思われる。具体的な計画は以下の通りである。8月仏教用語の翻訳について:インド・中国仏教を専門とする研究者、およびインド・チベット仏教を専門とする研究者に講演を依頼する。各講演に続き、プロジェクトのメンバーがコメントを行う形式のシンポジウムを開催する。9月ライプツィヒ大学で「日本哲学と翻訳」をテーマとするワークショップを開催する。ドイツの日本研究者・哲学者とプロジェクトのメンバーが参加する。ここで、まだ未検討の残りの課題を扱うことになる。上記以外の研究活動は、プロジェクトのメンバーによる研究会、および「日本哲学史フォーラム」で行い、本プロジェクトを完結させる。また、プロジェクト期間終了後、研究成果をまとめ、論文集を出版する予定であるため、その準備を開始する。28年度が最終年度であるため、記入しない。近代日本哲学、翻訳学初年度は、研究グループ内のメンバー(分担者、協力者13名)による、翻訳と哲学に関する報告が十分になされなかった。今年度は、グループ内部からの研究成果を引き出してゆきたい。この目標に向けて、すでに決まっている7月と12月の「日本哲学史フォーラム」(京都大学における公開講演会)および科研研究会という4回の場での、メンバーの調査と思索の成果発表を促したい。
分子軌道法および分子動力学法の複合的計算による氷結晶における粒界拡散の研究

氷中の物質の粒界拡散に関しては、氷床コアの中の物質移動を考える上で重要であるが、実験的にも理論的にもほぼ手つかずの状態である。本研究では氷の粒界拡散の理論的な取り扱いのため、分子軌道法と分子動力学法の複合的な計算を行うものである。実際には(1)構造モデルの作成と(2)計算に取り組んだ。(1)構造モデルの作成に関して、氷の構造にはアイス・ルールと呼ばれる水分子の配列の規則があるため、周期的境界条件を満たすモデルの作成は困難である。そこで、アイス・ルールおよび周期的境界条件を満たす、任意の大きさの構造モデルの作成プログラムの開発に取り組んだ。氷結晶中の個々の水分子は6通りの配置を取り得るので、N個の系では6^N通りの配置から上記の条件を満たす配置を探索するプログラムを作成したが、ごく小さな系を除いて、意図した構造を得ることができなかった。また、初期構造の周期的境界条件下での構造最適化を非経験的分子軌道法プログラムのGaussian03を用いて試みたが、プログラム上の問題で収束しなかったため、結晶の構造データをそのまま利用した。(2)(001)面どうしを組み合わせて擬似的に粒界層を作成し、その間にメタン分子を配置してその拡散の障壁エネルギーを求めた。周期的な境界条件では問題が生じたため課さなかった。水分子24個の層2層(計48個)を組み合わせた96個の水分子からなる界面構造で、メタンとメタンスルホン酸(MSA)の生成熱を半経験的分子軌道法プログラムのMOPACで計算したところ、後者の方が300kJ/mol以上も低く、MSAが大きな拡散係数を持つ原因と関連していると考えられる。分子動力学法による計算に関しては、周期的境界条件を満たす構造モデルの作成がその途上であるので、拡散係数の前指数因子を求めるための「熱力学的積分法」による自由エネルギー計算を実行する段階まで到達できなかった。氷中の物質の拡散に関しては、近年いくつかの実験および理論の両面から研究がなされている。その一方で、粒界拡散を対象とした研究は未だ手つかずの状態である。その内容は主に、(1)構造モデルの作成、(2)計算手法の確立である。(1)に関して、第1段階として氷の表面での分子の拡散を考えた。最近、メチルスルホン酸(MSA)の氷床コア中での異常に速い拡散が報告されており、これは、氷表面とMSAとの相互作用に起因するものと考えられる。特に、MSAの酸素原子と氷との間に特徴的な相互作用があると予想して、その解明のため分子軌道計算を行っている。氷の構造には、水素原子の配列の多様性に起因する構造の多様性と氷特有のアイス・ルールと呼ばれる規則があるため、周期的境界条件を満たすモデルの作成は困難である。そこで、アイス・ルールを満たしかつ周期的境界条件を満たす、任意の大きさの構造モデルを作るためのプログラムの開発を行っている。(2)については、拡散の障壁エネルギーを求めるため、周期的な境界条件での計算および大規模分子での計算が可能な分子軌道法プログラムのテスト計算を実行している。氷のどの表面を考えるか(たとえば、(001)面と(100)面)によって、拡散の障壁エネルギーに違いが見られたが、まだ十分な定量的な評価には至っていない。拡散係数を得るためには、障壁エネルギーだけではなく前指数因子を求める必要がある。そこで、分子動力学法のプログラムを利用した「熱力学的積分法」による自由エネルギー計算の検討を行った。今後、氷の構造モデルの作成と並行して氷表面との分子の相互作用の計算、さらに疑似粒界構造として2枚の氷表面に挟まれた分子と氷表面との相互作用の計算を行い、本研究の目的である粒界拡散の計算を実行する予定である。

水分子24個の層2層(計48個)を組み合わせた96個の水分子からなる界面構造で、メタンとメタンスルホン酸(MSA)の生成熱を半経験的分子軌道法プログラムのMOPACで計算したところ、後者の方が300kJ/mol以上も低く、MSAが大きな拡散係数を持つ原因と関連していると考えられる。分子動力学法による計算に関しては、周期的境界条件を満たす構造モデルの作成がその途上であるので、拡散係数の前指数因子を求めるための「熱力学的積分法」による自由エネルギー計算を実行する段階まで到達できなかった。
革新的膀胱温存療法：「硼素膀胱局所動注＋中性子照射」による癌細胞選択的破壊

1“マウス膀胱癌モデル"、および、“マウスbaloon occluded arterial infusionモデル"の作成。2膀胱癌細胞の核内に選択的に集積、移行するべく特殊加工した膀胱癌細胞親和性硼素化合物の作成:硼素化合物(BSH)を、transferrin、および、polyethylene glycolでcoatingしたliposome内に包埋し、さらに核移行シグナル(NLS)を付加した“BSH-TF-PEG-liposome"を作成した。3膀胱癌細胞表面抗原(UBC)に対する抗体を硼素化合物表面に付加した、より膀胱癌細胞に親和性の強い硼素化合物を開発中である。「研究の目的」硼素中性子捕捉療法(BNCT)は、癌細胞選択的に取り込まれる硼素(10B)化合物を予め投与しておき、熱中性子線を照射することにより、10Bを殆ど取り込まない正常細胞は障害されないが、10Bを多く取り込んだ癌細胞では細胞内部で硼素と熱中性子の核反応が生じ、核反応により発生した高エネルギーの中性子と7Li粒子が癌細胞を選択的に破壊するという、“癌選択的な標的粒子線治療である。我々は、1)膀胱周囲組織に極めて高濃度の硼素化合物を投与可能とする“BOAI法"(血流塞栓用バルーン付カテーテルを用いて膀胱動脈選択的に硼素化合物を動脈内投与する)を用いて、2)膀胱癌細胞、特に核内に選択的に集積、移行するべく特殊加工した“膀胱癌細胞親和性硼素化合物"を作成、投与することによって、膀胱癌細胞により選択的に高濃度の硼素化合物を取り込ませ、癌細胞を選択的に破壊するBOAI-BNCT法を考案した。「本年度の業績」1“マウス膀胱癌モデル"、および、“マウスbaloon occluded arterialinfusionモデル"の作成:マウスにて上記2つのモデルを確立した。2膀胱癌細胞の核内に選択的に集積、移行するべく特殊加工した膀胱癌細胞親和性硼素化合物の作成:硼素化合物(BSH)を、腫瘍に高発現するtransferrin(TF:腫瘍細胞に選択的に取り込ませるため)、および、polyethylene glycol(PEG:網内系への取り込みを抑え、静脈中に高濃度のliposomeを保つため)でcoatingしたliposome内に包埋し、さらに核移行シグナル(NLS)を付加した“BSH-TF-PEG-liposome"を作成し、また、膀胱癌細胞表面抗原であるurinary bladder cancerantigen (UBC)に対する抗体を硼素化合物表面に付加することによって、より膀胱癌細胞に親和性の強い硼素化合物を開発中である。「研究の目的」硼素中性子捕捉療法(BNCT)は、癌細胞選択的に取り込まれる硼素(10B)化合物を予め投与しておき、熱中性子線を照射することにより、10Bを殆ど取り込まない正常細胞は障害されないが、10Bを多く取り込んだ癌細胞では細胞内部で硼素と熱中性子の核反応が生じ、核反応により発生した高エネルギーのα線と7Li粒子が癌細胞を選択的に破壊するという、“癌選択的な標的粒子線治療である。「本年度の業績」“膀胱癌細胞親和性硼素化合物"の作成:膀胱癌細胞の核内に選択的に集積、移行するべく特殊加工した膀胱癌細胞親和性硼素化合物を作成中である。硼素化合物(BSH)を、腫瘍に高発現するtransferrin(TF:腫瘍細胞に選択的に取り込ませるため)、および、polyethylene glycol(PEG:網内系への取り込みを抑え、静脈中に高濃度のliposomeを保つため)でcoatingしたliposome内に包埋し、さらに核移行シグナル(NLS)を付加した“BSH-TF-PEG-liposome"を作成し、また、膀胱癌細胞表面抗原であるurinary bladder cancerantigen (UBC)に対する抗体を硼素化合物表面に付加することによって、より膀胱癌細胞に親和性の強い硼素化合物を開発中である。

“膀胱癌細胞親和性硼素化合物"の作成:について現在、膀胱癌細胞の核内に選択的に集積、移行する膀胱癌細胞親和性硼素化合物を作成中であり、硼素化合物(BSH)を、腫瘍に高発現するtransferrin、polyethylene glycol(PEG:網内系への取り込みを抑え、静脈中に高濃度のliposomeを保つため)でcoatingする時点まで進んでいる。該当なし
散乱線を利用した医療X線被曝低減法

(1)画面に入射する散乱X線スペクトルの測定半角45度の円錐型コリメータを検出器の前に置いて、ビーム軸上にビームストッパを置いて、この直径を少しずつ小さくして行ってスペクトル測定し、外挿法で散乱線スペクトルを求めた。次にストッパを取り除いて(一次線+散乱線)のスペクトルを測定した。両者の差は一次線スペクトルとなる。こうして、画像上の一点に入射する一次線と散乱線を分離出来た。(2)X線管から発生するスペクトルの理論計算X線管陽極に入射する電子エネルギーのばらつきを、モンテカルロ法で計算し、制動放射断面積の式を量子論の式を使って計算した。その結果、BirchとTuckerの論争を解決させた。次に、タングステン陽極から発生する特性X線について、新しいモデルを提唱した。(3)画面に入射する散乱X線スペクトルの計算モンテカルロ・シミュレーション法を用いて散乱線スペクトルを計算して、測定結果と良く一致する事を確かめた。散乱線除去用グリッドの効果もモンテカルロ法で計算した。グリッド比と照射野を変えて、Bucky factorとcontrast improvement factorを算出した。このデータから、画像のコントラストと被曝線量をバランスさせて最適なグリッドを選択する事が出来る。(4)散乱線含有率・画像のコントラスト・被曝線量の関係(1)、(3)の方法を用いて散乱線含有率を求め、含有率を変えてアルミニウムの周期的チャートのX線写真を撮影した。同じ濃度にするに要するmAs値と被曝線量が比例する事を使って、コントラストと被曝線量の関係を表す図(contrast-dose diagramと名付けた)を、種々の被写体と撮影条件について作成する事を提案した。この図は、散乱線含有率を調整して、必要最小限のコントラストを得て、被曝線量を出来るだけ減らせるような撮影条件を見出すためのものである。これは本研究の主題である。上記のチャートの写真の例を示して、この図の使い方を説明した。頭蓋骨ファントームを撮影し、トルコ鞍を観察する場合について、この方法を適用する例を示した。1.X線管から放射されるX線スペクトルについて、陽極での電子のエネルギー分布を考慮して理論計算を行った。(1)連続X線成分については、従来のBirchモデルとTuckerモデルの適用範囲を明らかにしたので、今後の理論計算に役立つ。(2)特性X線成分については、X線画像の均一性にとって最も重要な、X線強度のビームアングル依存性を説明できる新しいモデルを作った。2.散乱X線と直接X線のスペクトルの分離測定を継続して行っている。散乱X線の比率を減少させるのに二つの方法がある。(1)エアギャップ法については、管電圧70kV,被写体厚5-20cmについて、基礎データを取得した。(2)グリッド法については、スペクトルの分離測定法を確立させて、管電圧75kV,被写体厚20cmについて、基礎データを取得した。3.散乱線含有率をパラメータにとって、画像のコントラストと被曝線量の関係を表示するグラフを提案し、使い方の例を示し、臨床写真に応用した例を示した。1.散乱X線と直接X線のスペクトルの分離測定を継続して行っている。

(1)エアギャップ法については、管電圧70kV,被写体厚10-20cm,照射野直径5-30cmについて、基礎データを取得した。(2)グリッド法については、スペクトルの分離測定法を確立させて、管電圧70kV,75kV,被写体厚10-20cm,照射野直径5-30cmについて、基礎データを取得した。2.X線の画質の一つの要因である粒状について、Rossmannの三つの要因に分析した結果、以下のことを見出した。(1)低感度増感紙・フィルム系では増感紙構造モトルが主となり、管電圧依存性が少ない。(2)高感度増感紙・フィルム系では、低濃度で量子モトルが多くなる。管電圧依存性が少ない。(3)フィルムのクロスオーバー効果があるときの分離方法を提案し、管電圧依存性を求めた。3.散乱線含有率をパラメータにとって、画像のコントラストと被曝線量の関係を表示するグラフを提案し、エアギャップ法とグリッド法を用いたときの、使い方の例を示した。頭部の中央のトルコ鞍の臨床写真に応用した例を示した。4.低コントラスト被写体を撮影するときの、最適撮影条件を、蛍光量減弱曲線とフィルム特性曲線から求める方法を示し、例をあげた。(1)画面に入射する散乱X線スペクトルの測定半角45度の円錐型コリメータを検出器の前に置いて、ビーム軸上にビームストッパを置いて、この直径を少しずつ小さくして行ってスペクトル測定し、外挿法で散乱線スペクトルを求めた。次にストッパを取り除いて(一次線+散乱線)のスペクトルを測定した。両者の差は一次線スペクトルとなる。こうして、画像上の一点に入射する一次線と散乱線を分離出来た。散乱線除去用グリッドを入れた場合には、この方法で測定したスペクトルと増感紙の感度スペクトルから散乱線含有率を求めて、蛍光量計で求めた値と比較して良く一致したので、このスペクトル測定法が妥当であると結論できた。(2)画面に入射する散乱X線スペクトルの計算モンテカルロ・シミュレーション法を用いて散乱線スペクトルを計算した。100kVで加速したX線について、照射野を30×30cmまで、水ファントームの厚さを25cmまで変えて、測定結果と良く一致する事を確かめた。散乱線除去用グリッドの効果も計算した。グリッド比と照射野を変えて、Bucky factorとcontrast improvement factorを算出した。このデータから、画像のコントラストと被曝線量をバランスさせて最適なグリッドを選択出来る。(3)散乱線含有率・画像のコントラスト・被曝線量の関係(1)、(2)の方法を用いて散乱線含有率を求め、含有率を変えてアルミニウムの周期的チャートのX線写真を撮影した。同じ濃度にするに要するmAs値と被曝線量が比例する事を使って、コントラストと被曝線量の関係を表す図(contrast-dose diagramと名付けた)を、種々の被写体と撮影条件について作成する事を提案した。この図は、散乱線含有率を調整して、必要最小限のコントラストを得て、被曝線量を出来るだけ減らせるような撮影条件を見出すためのものである。これは本研究の主題である。上記のチャートの写真の例を示して、この図の使い方を説明した。
ヒト全身性エリテマトーデスの病態形成に果たすCD4+CD28-T細胞亜群の役割

SLEは全身性自己免疫患者の典型であり、その病態形成にはB細胞による自己抵抗産生とT細胞による免疫調節の異常が関与している。一方、CD28分子はアクセサリー分子の一つで、T細胞の活性化の中心的な役割を果たす。最近このCD28分子を欠いたCD4+CD28-T細胞がアナジーに陥らないことが報告され、自己免疫疾患での関与が示唆されている。我々はSLE患者においてCD4+CD28-T細胞が増加していることを見いだし、その病態における役割を解析した。正常者ではCD4+CD28-T細胞は3.2%に対し、SLE患者では11.8%と増加しており、その細胞表面抗体はHLA-DR(+),IL-2receptor(-),VLAβbright,LFA-1αbrigheで後期活性化抗原を有していた。SLE患者のCD4+CD28-T細胞のTCRの使用には偏りがあり、オリゴクロナリティーを有した細胞群であることが明らかになった。これらの結果からSLE患者のCD4+CD28-T細胞はin viroで何らかの抗原刺激を受け、拡大した細胞群であるこがあ明らかになった。CD4+CD28-T細胞から非刺激状態で大量のIL-6の産生を認めた。我々はさらに詳細にCD4+CD28-T細胞の機能解析を行う目的で、SLE患者末梢血からCD4+CD28-T細胞クローンと、CD4+CD28-T細胞クローンをそれぞれ樹立することに成功した。今後このクローンを用いてさらに解析を進めた。全身性エリテマトーデス(SLE)の病態はT細胞の機能低下とB細胞の機能過剰にある。CD28分子はアクセサリーシグナル伝達する分子で、CD4+T細胞の95%、CD8+T細胞の50%に発現されている。正常者ではCD4+T細胞にはCD28-細胞は極めて少ないが、SLEではCD4+CD28-T細胞集団が異常に増加していた。このCD4+CD28-T細胞群の増加は疾患活動性、治療、リンパ球数とは相関せず、むしろ個々の患者においては一定だった。TCRVβ特異的抗体を使用したフローサイトメーターでの解析から、CLECD4+CD28-T細胞群はTCRVβの使用に偏りがあり、このSLECD4+CD28-T細胞のTCRのオリゴクロナリティーをPCR後、single strand conformationalpolymorphism(SSCP)法で解析する事でこの細胞群がoligoclonalに増加していることが確認された。SLE患者末梢血Bリンパ球による抗体産生、特に自己抗体産生に対してはSLE患者ではCD4+CD28+T細胞とCD4+CD28-T細胞は同等のヘルパー機能を示した。サイトカインの産生能ではIL-2,IL-4,IL-6,IFNγ,TNFαのmRNA発現を認め、この点でもCD4+CD28+T細胞とCD4+CD28-T細胞はほぼ同等の機能を持っていた。以上から、SLEで増加しているCD4+CD28-T細胞は未知の抗原による刺激を受け、in vivoで既に活性化されeffector細胞に分化した細胞であることが示唆された。今後はCD4+CD28-T細胞を活性化する未知の抗原の同定が必要と思われる。SLEは全身性自己免疫疾患の典型であり、その病態形成にはB細胞による自己抗体産生とT細胞による免疫調節の異常が関与している。最近このCD28分子を欠いたCD4+CD28+T細胞がアナジーに陥らないことが報告され、自己免疫疾患での関与が示唆されている。

正常者ではCD4+CD28+T細胞は3.2%に対し、SLE患者では11.8%と増加しており、その細胞表面抗体はHLA-DR(+),IL-2receptor(-),VLAβbright,LFA-1αbrightで後期活性化抗原を有していた。SLE患者のCD4+CD28-T細胞のTCRの使用には偏りがあり、オリゴクロナリティーを有した細胞群であることが明らかになった。これらの結果からSLE患者のCD4+CD28-T細胞はin vivoで何らかの抗原刺激を受け、拡大した細胞群であることが明らかになった。CD4+CD28-T細胞から非刺激状態で大量のIL-6の産生を認めた。我々はさらに詳細にCD4+CD28-T細胞の機能解析を行う目的で、SLE患者末梢血からCD4+CD28+T細胞クローンとCD4+CD28-T細胞クローンをそれぞれ樹立することに成功した。今後このクローンを用いてさらに解析を進める。
膜結合型酵素に対する酵素阻害剤による、癌細胞増殖、浸潤および転移への抑制効果

膜結合型酵素アミノペプチダーゼに対する阻害剤であるウベニメクスによる癌細胞増殖抑制効果の実態とその機序を解明するための実験を行ない以下のことを明かにした。1)ウベニメクスによる癌細胞増殖に対する抑制作用は、MTT assayにより調べたところ、絨毛癌細胞、一部の上皮性卵巣癌細胞(漿液性嚢胞腺癌)、さらに従来より指摘されている白血病細胞であるHL-60株に特に顕著に認められた。2)この研究結果を総合した結果、アミノペプチターゼN活性の強い細胞株に対してウベニメクスはその細胞増殖抑制作用を強く示すことが判明した。3)AP-Nの酵素活性エピトープに特異的に作用して、その酵素活性をブロックするモノクローナル抗体であるWM15を用いて細胞増殖抑制効果を検討したところ、ウベニメクスとどうような細胞増殖抑制効果を認めた。4)WM15モノクローナル抗体を用いて組織免疫染色を行ないAP-N酵素の所在を調べたところ、細胞膜に特異的にAP-N活性が存在することが判明した。5.WM15を用いてImmunoblotting法による検討では、WM15は165-KDaに特異的なblottingを示し、AP-Nの分子量と一致し、AP-Bとは反応しなかった。5)ウベニメクスに3Hトリチウムをラベルしたもので各細胞のウベニメクスuptakeを調べたところ、ウベニメクスへの感受性の高い順番に最も多量のuptakeが見られ、ウベニメクスに対する感受性とウベニメクスuptake量は相関した。これは前年度より検索を進めているアミノペプチターゼN活性とも相関した。6)ウベニメクスの細胞増殖抑制作用のcell cycleへの影響を調べるため、フローサイトメトリーによるDNA histogramの解析を行なったところ、最もウベニメクスへの感受性の強い絨毛癌株についてもそのcell cycle分布への影響は見られなかった。1.ウベニメクスはアミノペプチダーゼN(AP-N)とアミノペプチダーゼBの活性を阻害することが判明しているが、我々は先ず各癌細胞の有するAP-N活性を測定した。2.ウベニメクスによる癌細胞増殖に対する抑制作用は、MTT assayにより調べたところ、絨毛癌細胞、一部の上皮性卵巣癌細胞(漿液性嚢胞腺癌)、さらに従来より指摘されている白血病細胞であるHL-60株に特に顕著に認められた。3.1と2の研究結果を総合した結果、アミノペプチダーゼN活性の強い細胞株に対してウベニメクスはその細胞増殖抑制効果を強く示すことが判明した。4.AP-Nの酵素活性エピトープに特異的に作用して、その酵素活性をブロックするモノクローナル抗体であるWM15を用いて細胞増殖抑制作用を検討したところ、ウベニメクスとどうような細胞増殖抑制効果を認めた。5.WM15モノクローナル抗体を用いて組織免疫染色を行ないAP-N酵素の所在を調べたところ、細胞膜に特異的にAP-N活性が存在することが判明した。6.WM15を用いてImmunoblotting法による検討では、WM15は165-KDaに特異的なblottingを示し、AP-Nの分子量と一致し、AP-Bとは反応しなかった。膜結合型酵素アミノペプチダーゼに対する阻害剤でるウベニメクスによる癌細胞増殖抑制効果の実態とその機序を解説するための実験を行ない以下のことを明らかにした。

1.ウベニメクスはアミノペプチダーゼN(AP-N)とアミノペプチダーゼBの活性を阻害することが判明しているが、昨年度の研究に引き続き癌細胞について、ウベニメクスによる癌細胞増殖に対する抑制作用をMTT assayにより詳細に調べた。婦人科癌のうち、絨毛癌4株では全株に高いウベニメクスに対する感受性を示し、子宮頚癌2株・内膜癌1株では中等度感受性を示し、卵巣癌5株のうち2株は高い感受性を示し、3株は感受性が無かった。消化器癌には感受性が無かった。2.ウベニメクスに3Hトリチウムをラベルしたもので各細胞のウベニメクスuptakeを調べたところ、ウベニメクスへの感受性の高い順番に最も多量のuptakeが見られ、ウベニメクスに対する感受性とウベニメクスuptake量は相関した。これは前年度より検索を進めているアミノペプリターゼN活性とも相関した。3.ウベニメクスの細胞増殖抑制作用のcell sycleへの影響を調べるため、フローサイトメトリーによるDNAhistogramの解析を行なったところ、最もウベニメクスへの感受性の強い絨毛癌株についてもそのcell cycle分布への影響は見られなかった。したがって、抗癌剤にみられるような細胞代謝サイクルの'特定のある一点'に作用するものは無いといえる。アミノペプチダーゼNの組織学的局在性などに関する研究は現在進行中である。追って論文として報告したい。
パーキンソン病におけるα-シヌクレインの構造及び機能解析

レビー小体はパーキンソン病の発症に深く関与しているが,その微細構造はよくわかっていない.本研究では,大型放射光施設SPring-8のX線・赤外線および大強度陽子加速器施設J-PARCの中性子線を用いて,パーキンソン病患者の剖検脳内のレビー小体の微細構造解析を行った.画期的な手法を用いた本研究により,レビー小体の微細構造が明らかにされたことで,早期診断法や根本的治療法の開発の新たな手がかりが得られた.本研究はおおむね順調に進んでおり,現在までに以下のような実績をあげている.アルツハイマー患者剖検の老人斑やパーキンソン病患者剖検脳のレビー小体に対する構造解析は,当初試料調整がかなり難しいと考えられたが,改良を重ねることで,ほぼ予定通りに実施されている.BL43IRにおける顕微赤外分光による患者脳切片の測定法はほぼ確立し,現在レビー小体の2次構造解析についての論文を投稿中であるが,これは実際の脳のレビー小体に対する直接的な構造解析としては世界初の報告になるものと思われる.BL40XUにおけるマイクロビームによる回折実験では,脳切片の調整法に工夫が必要であり,現在も試行錯誤を重ねながら測定を行っている.ここまでの結果からは老人班やレビー小体はこれまで考えられていたアミロイド線維の塊とは少し様相が異なる可能性が示唆されている.我々は大腸菌由来のリコンビナントのα-シヌクレインに加えて,pNATB complexを共発現させることでN末端がアセチル化されたα-シヌクレインを精製することに成功した.また,ヒト赤血球からの精製技術もさらに向上し,これら3種類のタンパクに対するX線小角散乱実験を行っており,これらの構造や凝集能の相違についての論文の投稿準備を進めている.中性子散乱実験については,α-シヌクレインの単量体とアミロイド線維の構造の揺らぎについての測定を行い,現在論文投稿中である.また,超音波照射によるアミロイド線維形成促進反応を用いた凝集測定装置(商品名HANABI)を使用したα-シヌクレインの凝集阻害剤のスクリーニングもひとまず完了しており,いくつかの候補物質を特定している.本研究は概ね順調に進んでおり、現在までに以下のような実績を上げている。アルツハイマー病患者剖検脳の老人斑やパーキンソン病患者剖検脳のレビー小体に対する構造解析は当初試料調整がかなり難しいと考えられたが、改良を重ねることでほぼ予定通りに実施されている。BL43IRにおける顕微赤外分光による患者脳切片の測定法はほぼ確立し、レビー小体の2次構造解析結果について論文を作成しScientific Reprots誌に受理された。これは実際の脳のレビー小体に対する直接的な構造解析として世界初の報告と考えられる。BL40XUにおけるマイクロビームによる回折実験に関しては昨年度に引き続き、脳切片の調整法の条件設定を行いつつ、レビー小体、グリア封入体での測定を行っている。また、前年度に確立した大腸菌由来のN末端アセチル化α-シヌクレインを用いて解析した結果、修飾のない野生型α-シヌクレインよりN末端アセチル化α-シヌクレインの方がややコンパクトな構造を取ることが示唆された。中性子散乱実験については昨年度に引き続き、α-シヌクレインの単量体とアミロイド線維構造の揺らぎについての測定結果を論文投稿し、リバイス中である。また、臨床医学の観点から家族性パーキンソン病のαーシヌクレインの変異の一つであるG51D変異α-シヌクレインの大腸菌由来リコンビナント蛋白の精製にも成功した。患者剖検脳に対する構造解析は当初試料調整がかなり難しいと考えられたが、改良を重ねることでほぼ確立した。特に顕微赤外分光による患者脳切片のレビー小体の2次構造解析結果について論文がScientific Reprots誌に受理された。また、N末端アセチル化α-シヌクレインという翻訳後修飾されたより生理的条件に近い状態のα-シヌクレインの構造解析が可能になり、α-シヌクレインの立体構造における翻訳後修飾の影響についての予備検討であるが結果がでつつある。中性子散乱実験に関しても論文投稿中である。家族性パーキンソン病のαーシヌクレインの変異の一つであるG51D変異α-シヌクレインの大腸菌由来リコンビナント蛋白の精製にも成功した全般的に順調に進行していると考えられる。最終年度である今年度も本研究は,概ね順調に進行した.レビー小体を構成する主要蛋白であるαシヌクレインが生体内では四量体として安定に存在するという四量体仮説を確かめるために行ったSPring-8におけるX線小角散乱による構造解析では,これまでの研究で用いられていた大腸菌から精製した人工的なαシヌクレインだけでなく,生体内で受けるN末端のアセチル化を付加したαシヌクレインおよびヒトの赤血球から精製したαシヌクレインも溶液中では大部分が特定の構造を単量体として存在することがわかり,Scientific Reports誌に報告した.この結果は今後のパーキンソン病の治療法開発に一定の影響を与えるものと見込まれる.一方,X線マイクロビームを用いたX線回折によるパーキンソン病患者脳内のレビー小体に対する直接的な構造解析では,人工的に作成されるαシヌクレインの凝集体とは構造が異なる可能性が示唆され,近日中に論文として発表される予定である.

この結果は,αシヌクレインの凝集をターゲットとした治療法の開発に影響を与える可能性がある.また,昨年度に発表した放射光顕微赤外分光を用いた脳内凝集体の構造解析では,多系統萎縮症患者の脳内に特徴的にみられるグリア細胞質内封入体(GCI)に対する測定も開始した.GCIも主成分はαシヌクレインとされるが,レビー小体とは異なる構造を有している可能性が示唆された.本手法は,生体試料の微細構造解析の手法としてほぼ確立しており,次世代の病理学の発展に寄与するツールとして期待される.このため,今後は神経変性疾患のみならず,癌や膠原病などの疾患に対する応用も検討していく予定である.レビー小体はパーキンソン病の発症に深く関与しているが,その微細構造はよくわかっていない.本研究では,大型放射光施設SPring-8のX線・赤外線および大強度陽子加速器施設J-PARCの中性子線を用いて,パーキンソン病患者の剖検脳内のレビー小体の微細構造解析を行った.画期的な手法を用いた本研究により,レビー小体の微細構造が明らかにされたことで,早期診断法や根本的治療法の開発の新たな手がかりが得られた.患者剖検脳に対する顕微赤外分光やX線回折実験は当初試料調整がかなり難しいと考えられたが,改良を重ねることで,顕微赤外分光の測定法についてはほぼ確立し,顕微赤外分光によるレビー小体の2次構造解析についての論文を投稿中である.小角散乱実験には大量のタンパクを必要とするが,α-シヌクレインのWildtypeに加えて,N末端がアセチル化されたα-シヌクレインやヒト赤血球から取り出したα-シヌクレインの精製法も確立しており,予定よりも早いペースでこれらに対する小角散乱実験を行っている.中性子散乱実験もJ-PARCにおける予定外の停止期間などの問題も生じたが,代わりに海外で実験を行うなどして,ほぼ予定通りに進展していると考える.剖検脳検体でのタンパク凝集体に対する顕微赤外分光による構造解析法として確立したことから、症例数、対象疾患を拡げ、様々な神経変性疾患でのタンパク凝集体に対する解析を行っていき、神経病理学分野での解析手法として確立していく。リコンビナントG51D変異α-シヌクレインやヒト赤血球由来α-シヌクレインでも比較解析を行う事で発症機序における立体構造の影響を解明したい考えである。全体としては順調に経過しており、このまま本研究課題を推進していく。28年度が最終年度であるため、記入しない。神経内科学老人斑やレビー小体といった脳内凝集体に対する顕微赤外分光の手法はほぼ確立したことから,今後は脳幹型レビー小体と皮質型レビー小体の比較や複数症例の観察を行いながら,神経病理学分野における構造解析のツールとしての確立も目指していく.小角散乱実験については,α-シヌクレインが非特異的な会合体を形成している可能性を排除するため,限外ろ過カラムを通した直後の測定を行えるシステムを構成していく予定である.また,臨床医学の観点から家族性パーキンソン病のα-シヌクレインの変異のひとつであるG51D変異タンパクについての測定を行うことで発症機序解明の手がかりとしたい考えである.