hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
磁歪法を用いた非破壊応力測定装置によるトンネル支保構造の残留応力と作用荷重の計測

磁歪法による応力測定装置を入手し、それを用いた現場での応力測定を行った。実績概要はおおむね以下のようである。Stage 1:室内における鋼製部材を用いた応力測定装置の基本動作を確認した。この段階では、幅10cm、厚さ1cm、長さ100cm程度の鋼板の単純引っ張り、曲げなどの力学試験、またはトンネルなどで用いられるH断面の鋼製部材において、試験片表面の応力測定を行った。Stage 2:NATMトンネルで用いられる支保部材としての鋼製支保工について、現場に設置する前に基本的データとして応力測定を行った。これは、荷重が作用していない段階での応力の初期値を取ることが主な目的である。また、簡単な載荷試験を行い、曲げ、軸力などの応力値が正しく測定できることを確認した。Stage 3:NATMトンネルでの現場計測を行った。上半掘削時のアーチ型鋼製支保工、また下半掘削後に設置される鉛直鋼製部材について、設置の初期段階から切羽の進行にあわせて複数の段階で応力データを収集した。Stage 4:最後に、収集されたデータを総合的に分析した。確認のためひずみゲージで測定されたひずみから計算された軸力と、本装置で検出される軸力を比較した。また、変位計測などから推測される現場での支保構造と地盤の相互作用のメカニズムと、応力測定の結果が基本的に整合するかどうかを確認し、おおむね良好な結果を得た。
ポジトロンCTによる冬眠心筋の微小循環動態、糖代謝の定量的解析

【研究の目的】1.心機能低下を認める虚血性心疾患例でポジトロンCT(PET)を用いて、心筋血流量(MBF),水が還流可能な組織残存率(PTF),心筋血流予備能(MPR),心筋糖代謝率(MMRglc)を定量測定し、心筋viability保持機構と考えられる冬眠心筋の成立機序、維持機構を微小循環動態や糖代謝の側面から明らかにする。2.大規模臨床試験で有用性が報告されているβ遮断剤やアンジオテンシン変換酵素阻害剤を用いて長期薬物療法を施行し、冬眠心筋に対する薬物の作用機序や心筋血流、代謝に与える影響を、再度同様のプロトコールでPETを行い、治療前と比較検討する。【今年度の実施結果及び今後の展開】上記の研究目的に従い臨床研究を施行、今年度は虚血性心疾患14症例を登録、下記の結果を得た。1.臨床的に冬眠心筋の存在が証明された(冠血行再建術により心室壁運動が改善した)虚血性心疾患例では、同部位の安静時MBFやMPRは低下しているが、PTFは保たれていた。2.冬眠心筋の糖代謝は保持されている傾向を示したが、耐糖能障害例では判定困難な症例も存在し、検査条件の最適化に対する検討や正確な定量評価が必要と考えられた。脂肪酸代謝を同時に評価することにより、冬眠心筋の代謝特性の一部が明らかにできる可能性があると考えられる(未発表)。3.現在上記登録症例に対し長期薬物療法を施行中であるが、6-12ヶ月後に同条件で再度PET studyを行い、薬物療法が冬眠心筋に与える影響を比較検討する予定である。
製造業の発展要因分析:制度、教育、援助、貿易

本研究の目的は、クロス・カントリー・データの分析により、製造業の発展に「制度」、「貿易」、「援助」、「教育」が補完的にどのような強弱で影響を与えているのかを明らかにすることであった。平成22年度には、「研究実施計画」にあるとおり、製造業、制度、教育、援助、貿易のデータの整備を行った。その過程で国際比較可能な各国の国民生産(GDP)データに重要な問題があることを発見した。具体的には、同じ一人当たり実質GDPのデータであっても、多くの研究者が使用する2つのデータ・ベースであるPennWorld Tableと世界銀行のWorld Development Indicatorsで大きく値が異なること、したがってどちらを使うかによって、回帰分析の結果が異なる可能性があることを明らかした。この分析結果は、武蔵大学の紀要および国際的学術雑誌Empirical Economics Letters(査読付き)に発表した。また、援助データについても精査したところ、OECDのデータと世界銀行のデータで整合性が取れていないことを発見し、この結果は武蔵大学のDiscussion Paperとして発表した。上記結果を受け、平成23年度は具体的な国を取り上げ、製造業、制度、教育、援助、貿易の関連性について調査を行った。具体的には、アフリカで唯一「製造業」の発展による経済成長を実現したモーリシャスと日本の1945-1955年のケースである。平成23年度の調査をもとに研究を行い、日本のケースについては、制度、援助よりも貿易の方が、効果が大きかったことを明らかにした。この結果は、平成24年度に武蔵大学のWoriking Paper(日本語)およびDiscussion Paper(英語)として発表した。モーリシャスのケースについては、現在作成中で今後発表する予定である。「研究実施計画」にあるとおり、22年度は製造業、制度、教育、援助、貿易のデータの整備を行った。その過程で、以下の2つの論文を作成し、前者は既にMusashi University Discussion Paperとして発表し、米国のSocial Science Research Network(SSRN,http://www.ssrn.com/)のインターネット・サイトにおいて閲覧可能となっている。この論文はSSRNのMeasurement & Dataon National Income & Product Accounts分野において、2011年2月5日から4月6日までの間のダウンロード・ランキングで8位を記録している。後者の論文は、日本、韓国、台湾、シンガポール、香港の5か国を対象として、製造業と所得の関係を分析したもので、通常は所得の上昇とともに製造業比率が上昇し、やがて低下するが、シンガポール、台湾ではそうなっていないことを発見した論文で、この結果を以てシンガポールと台湾を訪問し、現地の研究者(シンガポール国立大学、台湾中華経済研究院)にその理由についてヒアリングを行った。平成23年度は以下の研究を行った。(1)研究過程で明らかになったクロスカントリーの所得データの問題点についてまとめ、国際的な学術雑誌および武蔵大学の紀要に論文を発表した。(2)研究過程で、アフリカで唯一「製造業」の発展による経済成長を実現したモーリシャスの存在が明らかになり、「製造業」、「援助」、「教育」、「貿易」、「制度」の相互関連を調査するため現地へ出張し、資料収集を行った。(3)研究過程で、日本の戦後すぐの「製造業」の発展において、米国からの「援助」および輸出拡大への支援が重要であったことが発見され、その詳細を調査するため、米国ワシントンDCの国立公文書館へ出張し、資料収集を行った。上記(2)、(3)で収集した資料は平成24年度の研究に活かす予定である。

その過程で国際比較可能な各国の国民生産(GDP)データに重要な問題があることを発見した。具体的には、同じ一人当たり実質GDPのデータであっても、多くの研究者が使用する2つのデータ・ベースであるPennWorld Tableと世界銀行のWorld Development Indicatorsで大きく値が異なること、したがってどちらを使うかによって、回帰分析の結果が異なる可能性があることを明らかした。この分析結果は、武蔵大学の紀要および国際的学術雑誌Empirical Economics Letters(査読付き)に発表した。また、援助データについても精査したところ、OECDのデータと世界銀行のデータで整合性が取れていないことを発見し、この結果は武蔵大学のDiscussion Paperとして発表した。上記結果を受け、平成23年度は具体的な国を取り上げ、製造業、制度、教育、援助、貿易の関連性について調査を行った。具体的には、アフリカで唯一「製造業」の発展による経済成長を実現したモーリシャスと日本の1945ー1955年のケースである。平成23年度の調査をもとに研究を行い、日本のケースについては、制度、援助よりも貿易の方が、効果が大きかったことを明らかにした。この結果は、平成24年度に武蔵大学のWoriking Paper(日本語)およびDiscussion Paper(英語)として発表した。モーリシャスのケースについては、現在作成中で今後発表する予定である。当初の予定より少し遅れているものの、研究過程で新しい発見をいくつか行い、それにかかる調査も行うことができたため。24年度が最終年度であるため、記入しない。来年度は補助金を使用した研究実施の最終年であるために、これまでの研究を終えるとともに、最終報告書を作成する。
肺高血圧モデルにおける右心機能および心室間相互作用に対する心拍数抑制効果の検討

肺動脈性肺高血圧(Pulmonary arterial hypertension: PAH)において高い後負荷(肺動脈圧)にさらされる右室機能は予後に大きく関わるが、右心不全に対する治療方法は未だに確立されていない。近年、慢性心不全に対して、選択的Ifチャンネル阻害剤イバブラジンが注目されている。心拍数抑制がPAH患者の予後を改善させうるかどうかは十分に検討されていない。今回我々はPAHモデルラットを用いて、イバブラジンによる心拍数抑制が右心不全および心室間相互作用に対してどのような治療効果を与えるかを検討している。肺高血圧モデルラット作成蛇毒であるモノクロタリンはラットに皮下注射することによりPAHは引き起こすことを確認した。注射後3週頃よりラットの肺動脈圧が上昇し、5週頃にPAHに伴う心不全死を起こすことを確認した。6週齢雄性Sprague-Dawleyラットにモノクロタリン(60mg/kg)を皮下注する日を実験0日とし、実験14日目より、モノクロタリン投与群(PAH)を2群に分け、イバブラジンを経口投与する治療群と、投与しないPAH群の2群を作成している。現在、実験28日目に、生存していた3群のラットに対して、心臓超音波検査、心臓カテーテル検査を行い、右心機能および左心機能評価を行っている。まだ、当初の予定数に到達していないので、蛋白などの解析は未施行である。今後も引き続き、実験モデル作成および治療群の心機能改善効果を検討していく。現在、研究助手の確保、研究時間の確保に手間取っており、動物実験が進行が遅れております。6週齢雄性Sprague-Dawleyラットにモノクロタリン(60mg/kg)を皮下注する日を実験0日とし、実験14日目より、モノクロタリン投与群(PAH)を2群に分け、イバブラジンを経口投与する治療群と、投与しないPAH群の2群を作成した。現在、実験28日目に、生存していた3群のラットに対して、心臓超音波検査、心臓カテーテル検査を行い、右心機能および左心機能評価を行った。イバブラジン投与により、生存率は有意に改善し、右室心機能も改善していた。心筋内の蛋白質解析にて、TGF-beta, CTGFの発現は有意に抑制され、心筋線維化面積は減少し、心筋肥大も改善傾向を示した。今後は、さらなる詳細な検討を行う予定である。現在の肺高血圧モデルによる解析が終了すれば、当初予定していた低酸素性肺高血圧モデルラット(PAH-Hx)を作成し、研究を進めていく予定である。モノクロタリンによる肺動脈性高血圧モデルにおけるイバブラジンの心拍抑制は右室心機能を改善し、右室心筋線維化を抑制する傾向にあることを確認した。また、その右室心筋線維化に関わる蛋白としてTGF-betaおよびCTGFが関与しておることを確認した。今後は、さらなる詳細な蛋白発現の確認と低酸素性肺高血圧モデルにおけるイバブラジンの投与効果を確認する。本年度の研究進行が若干遅れており、随時研究計画を進めている。その際に本来使用すべきであった研究費を次年度に繰り越して使用することになった。現在、研究進行が遅延し、研究に実際使用した金額が予定金額を下回っていたため、次年度使用金額が生じた。平成30年度に更なる動物を購入し、過去2年間に得られたデータを詳細に解明する予定である。具体的には、右室心筋線維化におけるTGF-betaおよびCTGFの下流にある蛋白発現がイバブラジンによってどのように変化したかを検討する。本年度行うはずであった研究計画を次年度に繰り越して継続していく。具体的には実験動物の購入、試薬補充、実験器具の購入など
脳内GABAB受容体の構造決定とその分子多様性及び機能解析への応用

GABA_B受容体がGiと共軛し、アデニレートサイクラーゼ活性を抑制することを精製した各構成成分及びその再構成系を用いて明らかにした。すなわち、現在までにGタンパクには種々のタイプが存在することが知られているので、GsやGoを含まず、Giだけを有している標品を調製した。この標品をGABA_B受容体やアデニレートサイクラーゼ標品とともに再構成したところ、GABA_B受容体刺激によりフォルスコリン刺激下の_CAMP生成を著明に減少させた。これらの結果より、GABA_B受容体がGタンパク連関型の受容体として機能していることを証明することができた。一方昨年度において、イムノアフイニテイーカラムより精製したGABA_B受容体標品より、Giタンパク連関型受容体と思われるアミノ酸配列の一部が明らかとなった。そこで、膜貫通領域の中の特に保存性が高い配列を利用して、PCR法による検討を行った。その結果、Gタンパク連関型受容体と思われる新規の_CDNAクローンを得ることに成功した。この_CDNAは278bpの長さを有し、3番目から5番目にかけての膜貫通領域に位置するものと考えられた。そこで、この_CDNAをプローブとして、ラット胎児脳からの_CDNAライブラリーをスクリーニングし、数個の陽性クローンを得ることに成功した。これらのクローンはいずれも約1.53kbpの長さを持つことから、Gタンパク連関型受容体の翻訳領域全長を含む可能性が高いものであった。脳内の主要な抑制性神経伝達物質であるGABAの受容体は、Cl^-チャネルを構成するGABA_A受容体と抑制性GTP結合蛋白(Gi又はGo)を介してアデニリルシクラーゼ活性やイノシトール燐酸代謝回転系を抑制する代謝共軛型のGABA_B受容体に分類されている。本研究では、このGABA_B受容体の構造決定と分子多様性の存否を解明することを目的としており、この目的達成のために本年度はインミュノアフィニティカラムクロマトグラフィの完成とこれを用いた精製標品の量産化を試みた。1)GABA_B受容体のcDNAクローニングを行うためには、(1)すでに_cDNAクローニングの成功したG蛋白共軛型受容体の部分構造を応用したhomologus screening法、(2)アフリカツメガエル卵母細胞などにpoly[A^+]RNAを注入してGABA_B受容体を発現させ、これを材料として特異的なクローンを検出するFunctional expression法、(3)精製蛋白のアミノ酸組成を決定し、合成DNAをプローブとしてcDNAクローニングを進める方法、などが考えられるが、GABA_B受容体の場合には(3)が適当であるとの結論に達した。2)インミュノアフィニティゲルを用いた精製法により、GABA_B受容体は80KD_aの蛋白であり、この他に82KD_a程度のGABA_B受容体に対するモノクローナル抗体に反応性を示すサブタイプがあることを示唆する成績を得た。3)これらのGABA_B受容体蛋白はN末端がブロックされているので、アミノ酸組成分析に適用する前にフラグメンテーションを行う必要があることが判明した。これらの成績を基盤として、来年度はGABA_B受容体の_cDNAクローニングの完成を計る予定である。ウシ大脳皮質よりGABA_B受容体を精製し、そのアミノ酸配列の解析を試みた。まず、バクロフェンアフィニティーカラムを用いて精製したところ、分子量約8万の主要なタンパクが得られた。これをGABA_B受容体のモノクロナル抗体で確認したところ、この抗体と反応するものであった。さらに、類似の分子量のところにもう一種類抗体と反応するタンパクの存在が確認され、GABA_B受容体に分子多様性が存在する可能性が示唆された。しかしながら、純度の高い精製標品を分析に必要な量まで得るのはなかなか困難であった。バクロフェンカラムの親和性が低いため収率が悪いことが一因である。その他の理由として、当初精製標品のN末端から順にアミノ酸配列を分析しようとしたが、解析不能であった。

そこで、精製標品をBrCNであらかじめ切断し、その分解産物を分析する必要が生じたため、必要なタンパク量が増加したためである。そこで、次の手段としてGABA_B受容体のモノクロナル抗体を用いた抗体カラムで精製標品を集めることを試みた。この系では多量の抗体が必要であり、またカラムの再使用に限りがあるので、困難な作業となったが、必要最小量を得ることができた。アミノ酸配列の解析を行なったところ、一つの分解産物より6アミノ酸部分の配列が明らかとなったが、他の標品からアミノ酸配列を解析するのは困難であった。この6アミノ酸部分の配列は、ある種のGタンパク連関型受容体のなかに認められるアミノ酸配列と相同性を持つ可能性が高いものであり、受容体由来の配列である可能性が考えられた。この情報を基に、予想される塩基配列のオリゴヌクレオチドを作製し、GABA_B受容体の_CDNAクローニングを現在試みているところである。GABA_B受容体がGiと共軛し、アデニレートサイクラーゼ活性を抑制することを精製した各構成成分及びその再構成系を用いて明らかにした。すなわち、現在までにGタンパクには種々のタイプが存在することが知られているので、GsやGoを含まず、Giだけを有している標品を調製した。この標品をGABA_B受容体やアデニレートサイクラーゼ標品とともに再構成したところ、GABA_B受容体刺激によりフォルスコリン刺激下のcAMP生成を著明に減少させた。これらの結果より、GABA_B受容体がGタンパク連関型の受容体として機能していることを証明することができた。一方昨年度において、イムノアフィニティーカラムより精製したGABA_B受容体標品より、Giタンパク連関型受容体と思われるアミノ酸配列の一部が明らかとなった。そこで、膜貫通領域の中の特に保存性が高い配列を利用して、PCR法による検討を行った。その結果、Gタンパク連関型受容体と思われる新規のcDNAクローンを得ることに成功した。このcDNAは278bpの長さを有し、3番目から5番目にかけての膜貫通領域に位置するものと考えられた。そこで、このcDNAをプローブとして、ラット胎児脳からのcDNAライブラリーをスクリーニングし、数個の陽性クローンを得ることに成功した。これらのクローンはいずれも約1.53kbpの長さを持つことから、Gタンパク連関型受容体の翻訳領域全長を含む可能性が高いものであった。
イネのＯｓＨＫＴ１；４輸送体を介した葉内Ｎａ＋高蓄積回避による耐塩性機構の解明

イネ(Oryza sativa)の塩抵抗性に必須である、HKT型輸送体依存の葉内Na+高蓄積回避機構を分子レベルで詳細に解明するための研究を進めた。この機構に主要に関与すると考えられるイネのHKT型輸送体は、OsHKT1;4, OsHKT1;5であり、本研究の標的である。酵母、及びアフリカツメガエル卵母細胞でOsHKT1;4を発現させ、イオン輸送解析を行った結果、OsHKT1;4は、Na+輸送活性が非常に高く、かつK+に対する選択性は極めて乏しい事が判明した。興味深い事に、OsHKT1;4は、K+を除くいくつかの陽イオン種に対しても顕著な輸送活性を示す事が示唆された。また、OsHKT1;4遺伝子発現が減少したイネ株(RNAi株)を作製し、形質転換当代を用いて塩ストレス処理後予備的実験を行った。最も発現の抑制された株においては、野生型と異なるNa+蓄積パターンを示す部位があるという結果が得られた。OsHKT1;5に関しては、OsHKT1;5を特異的に認識する抗体を作製して、免疫染色解析を行った。OsHKT1;5は、過去に既に示されていた根の導管付近以外にも、未報告の組織で発現する事が判明した。OsHKT1;5遺伝子が破壊されたホモ変異株(oshkt1;5植物)に塩ストレスを処理し、イオン蓄積様式を解析した所、oshkt1;5植物は、野生型よりも顕著に葉にNa+を高蓄積させる事が明らかとなった。両OsHKT1遺伝子の機能に障害があるイネ株を準備するために、oshkt1;5植物をもとにしてOsHKT1;4遺伝子発現減少株(RNAi株)を作製した。現在、各種形質転換イネ株のT1種子を取得中であり、今後も詳細な解析を進めていく予定である。以上の成果から、イネの重要な耐塩性機構の詳細が明らかになりつつあり、将来の応用技術開発へ向けて貴重な基礎知見を蓄積した。24年度が最終年度であるため、記入しない。イネの塩抵抗性に必須の役割を担っていると予想されるOsHKT1;4 Na^+輸送体をコードするcDNAを単離した。興味深い事に、ゲノムの配列から予想される500アミノ酸をコードする全長クローンに加えて、選択的スプライシングを受けたと予想される、それぞれ478,453アミノ酸をコードする2種のcDNA種も単離した(以下1;4-ALT1,1;4-ALT2と表記)。塩感受性変異酵母G19株で各cDNAを単独発現させ、塩ストレス下で生育試験を行った所、全長のOsHKT1;4を発現する細胞のみが、Na^+の取り込みを示唆する顕著な生育阻害を示した。G19細胞内で、全長OsHKT1;4と1;4-ALT1、あるいは1;4-ALT2を共発現させた所、OsHKT1;4のNa+輸送活性が変化する可能性が示唆された。ヘテロ多量体形成の可能性が考えられ、現在詳細な解析を進めている。OsHKT1;4遺伝子内への挿入変異によってタンパク質の機能が破壊されていると推測されるイネ株(oshkt1;4植物)の性格付けを行った。当初、塩ストレス下においてoshkt1;4植物は、野生種に比べ地上部にNa^+を高蓄積する傾向を示したが、その後再現性が安定して得られず、現在も詳細を解析中である。OsHKT1;5は、OsHKT1;4と協調して機能すると予想される。OsHKT1;5輸送体をコードする遺伝子が破壊されたと推定されるイネ株からホモ破壊株単離を行った。四つの独立したT-DNA挿入変異株候補から、それぞれホモ変異株を取得する事ができた。そのうちの2種類が完全な破壊株で、1種類が発現減少株として以後の実験に利用可能である事が判明した。

両OsHKT1遺伝子の機能に障害があるイネ株を準備するために、oshkt1;5植物をもとにしてOsHKT1;4遺伝子発現減少株(RNAi株)を作製した。現在、各種形質転換イネ株のT1種子を取得中であり、今後も詳細な解析を進めていく予定である。以上の成果から、イネの重要な耐塩性機構の詳細が明らかになりつつあり、将来の応用技術開発へ向けて貴重な基礎知見を蓄積した。24年度が最終年度であるため、記入しない。アフリカツメガエル卵母細胞を利用した電気生理実験を、共同研究先と行う予定であったが、都合により遅延が生じてしまった。また、oshkt1;4変異イネ株の表現型のデータの再現性が、予想外に得る事ができずそこで時間を大きく費やし、かつそのための回避戦略の移行に必要な時間を浪費してしまった。OsHKT1;4遺伝子の発現を人為的に減少させたイネ株を既に作製開始している。形質転換体取得後、それら植物を詳細に性格付けする。また、前年度単離した3つの独立したOsHKT1;5遺伝子破壊株を利用し、OsHKT1,4遺伝子発現減少株を作製する(即ち、OsHKT1;4,OsHKT1;5の双方の機能の欠失イネ株)。これらのイネ株の作製と並行して、酵母、およびアフリカツメガエル卵母細胞を利用した、各OsHKT1;4分子の詳細なイオン輸送特性を明らかにする。蛍光タンパク質を融合した各OsHKT1;4、およびOsHKT1;5キメラタンパク質を植物細胞内で発現させ、それらの局在性を調査する。耐塩性種ノナボクラ、ポッカリからOsHKT1;4cDNAを単離してその構造や機能、およびイネ組織内での発現パターンの違いを調査し、比較する。
廃棄物からの有価金属回収のためのメカノケミカルプロセス開発

新しい有価金属の回収法として,メカノケミカル(MC)法を提案する.この方法は粉砕処理と抽出処理を組み合わせたものであり,熱を使わないこと、抽出は水であることから"環境に優しいプロセス"であるのが特長である.平成15年度は、廃棄物として、リチウムイオン電池の正極剤(LiCoO_2)と水素吸蔵合金(MmNi_5、Mm=La等の希土類金属)を対象に、PVCとの混合粉砕処理後水洗とろ過によりメタル回収プロセスの開発研究を実施した。平成16年度は、遷移金属硫化物モデル試料と酸化カルシウムとのMC処理の効果と産物の各種溶媒による抽出率を調べた.その結果,MC処理により硫化モリブデンからモリブデン酸カルシウムが,硫化バナジウムからバナジン酸カルシウムがそれぞれ合成され、有価金属の回収率が向上することが判明した。平成17年度は、酸化カルシウムの代わりに、二酸化マンガンなどを使用すると,モリブデンやバナジウムが高い収率で回収できることが判明した。すなわち硫化物を酸化させるためには、酸化剤が必要であり,その酸化剤としては,酸化カルシウムより二酸化マンガンの方が酸化力が高い。また、マンガン酸化物はモリブデン酸と不溶性化合物を作らないので有利である。この方法によりモリブデンとバナジウムが90%以上回収できた。一方、貴金属触媒からの貴金属の環境適合型回収法も強く望まれている。基礎研究として、貴金属含有試料と硫酸アモンニウムとのMC処理を行い、貴金属の中パラジウムが水に可溶な化合物となり、王水ではなく、水洗だけでパラジウムが回収できることがわかった。以上、本研究では、科研費給付期間に、幾つかの廃棄物を対象として、含まれる有価金属を簡単に、環境にやさしいプロセスで回収する手法開発を目指し、その結果、粉砕操作(MC処理)と水洗いう簡単な操作を組み合わせた21世紀型処理プロセスを開発することに成功した。今後は、共同研究相手先企業と連携し、その実用化へ向けた更なる研究推進を行う予定である。本研究の背景として、PVCのメカノケミカル(MC)法による脱塩素処理プロセスを確立するため、CaOを主な脱塩素剤としてPVCとの固相反応機構を解明し、同時に処理産物のマテリアル・リサイクルあるいはケミカル・リサイクルの可能性を追求した経緯がある。この検討では、CaOの代わりにZnO、CoOなども同様の役割を果たすことが確認できたが、これが、本研究を提案する契機である。すなわち、廃棄物中にCoOなどが含まれている場合、PVCとMC処理した場合、PVCの脱塩素と共に、Co等の金属は塩化物となり、水洗によって回収可能になるからである。本年度は、廃棄物として、リチウムイオン電池の正極剤(LiCoO_2)と水素吸蔵合金(MmNi_5、Mm=La等の希土類金属)を対象に、含有する有価金属の回収を目標としたプロセス開発研究を実施した。すなわち、まず、小型遊星ボールミルを使用し、PVCと廃棄物との混合試料をMC処理したが、そのときの条件は、容量48mlのステンレススチール製のミルポットに,混合試料3.0gを入れ,直径15.9mmのスチールボール7個を充填し,ミル回転速度700rpmである。また、処理産物の構成相を分析・評価し、塩化物の生成を確認した。更に、処理産物を常温で水洗・ろ過し、ろ液と固体残渣に分離し、それぞれの化学組成を分析・定量し、回収率を求めた。

その結果、まず、PVC-LiCoO_2系においては、LiとCoがLiClとCoCl_2となる割合でPVCを添加した場合、LiとCoの塩化物が生成し、水洗のみでLiとCoの回収が可能で、36時間でLiが約100%、Coが約90%回収できることが確認できた。また、PVC-MmNi_5系では、それぞれの金属の塩化物が生成し、水洗のみでこれらの回収が可能であることを確認した。この場合、Ni、Co、Mnが二塩化物、希土類金属、Alが三塩化物となるようにPVCを添加してMC処理すると、36時間でNiとCoは約90%、Mnと希土類は100%近く回収できた。なお、PVCの混合割合を変化させると、希土類金属と遷移金属類の分離が可能であり、有価金属の選択的回収も期待できることを示した。以上、初年度の目的が達成でき、新規有価金属回収プロセスの開発の可能性並びにその発展性が示された。触媒にはレアメタル類を含む多くの金属が利用されており,廃触媒からの有価金属の回収は,資源の有効活用につながるため,非常に重要な課題と考えられる.脱硫をはじめとする石油留分の水素化精製プロセスで使用される触媒はモリブデン,タングステンなどのIV族遷移金属とコバルト,ニッケルなどのVIII族遷移金属の硫化物がアルミナなどの多孔質酸化物に担持された状態にあり,直接脱硫では12年,間接脱硫では7年程度でその性能が劣化し,使用済み触媒となる.この廃触媒には上記の遷移金属のほか,石油由来のバナジウムが付着しているため,これらの金属を回収する手法が提案されているが,その回収率は低く,新しい手法の開発が望まれている.筆者らは,新しい廃触媒からの有価金属の回収法として,メカノケミカル(MC)法を提案する.この方法はMC処理と抽出処理の組み合わせからなり,環境に優しいプロセスであるのが特長である.本研究は,その原理を明確にするための基礎的実験であり,遷移金属硫化物と酸化カルシウムとのMC反応について検討した.廃触媒中に含まれる有価金属回収の基礎的実験として,遷移金属硫化物モデル試料と酸化カルシウムとのMC処理の効果と産物の各種溶媒による抽出率を調べた.その結果,MC処理により硫化モリブデンからモリブデン酸カルシウムが,硫化バナジウムからバナジン酸カルシウムが合成されることが明らかになった.また,生成したモリブデン酸カルシウムは水に,バナジン酸カルシウムは炭酸ナトリウム溶液に,それぞれ可溶であり,抽出溶液により選択的に遷移金属を抽出できることが確認された.課題としては抽出率の向上とMC処理時間の短縮が挙げられ,プロセスの高効率化が望まれる.今後は,実用の廃触媒に対して本法を適用し,その効果を見極める.触媒にはレアメタル類を含む多くの金属が利用されており,廃触媒からの有価金属の回収は,資源の有効活用につながるため,非常に重要な課題と考えられる.脱硫をはじめとする石油留分の水素化精製プロセスで使用される触媒はMo, Co, Niの各硫化物がアルミナに担持された状態にある.これらの有価金属を回収する手法(従来法)は提案されているが,その回収率は低く,新しい手法の開発が望まれている.筆者らは,新しい廃触媒からの有価金属の回収法として,メカノケミカル(MC)法を提案する.この方法は粉砕処理と抽出処理を組み合わせたものであり,熱を使わないこと、抽出は水であることから"環境に優しいプロセス"であるのが特長である.16年度は、遷移金属硫化物モデル試料と酸化カルシウムとのMC処理の効果と産物の各種溶媒による抽出率を調べた.
口腔癌頸部リンパ節転移のバイオマーカーとしての血液中microRNAの探索

口腔癌は、直接口腔内を観察することで、癌の存在、再発を診断できるが、口腔癌の頸部リンパ節転移の診断は画像検査によるところが大きい。そのため、転移をより早期に発見するためには、リンパ節転移を検出するバイオマーカーが必要である。しかし、腫瘍マーカーとして頻用されている血清SCC抗原値は、口腔癌に対する腫瘍マーカーとして特異性が低いと報告されているように、臨床的に有用な口腔癌の腫瘍マーカーは存在していない。今までに頸部リンパ節転移の指標となる因子を原発癌組織で検索した結果、転写因子と癌幹細胞マーカーの過剰発現が口腔癌患者の予後と相関していることを明らかにしたが、リンパ節転移とは相関を示すことができなかった。しかし、われわれは、口腔癌リンパ節転移患者と健常者の血液中のmicroRNAを比較した結果、そのプロファイリングに大きな違いが見られることを明らかにした。初診時N0症例で原発巣切除後に局所再発がなく、頸部リンパ節に後発転移をおこした癌患者の頸部郭清術前と術後に、血液を採取してmicroRNAアレイの解析結果を行った。解析結果より、手術前と手術後に発現差があり、明らかに転移した群で発現上昇した候補となるmicroRNAを選定した。結果、miR-4664-5p、miR-6872-3p、miR-1290、miR-191-5p、miR-593-5p、miR-6778-5p、miR-4732-5p、miR-342-5p、miR-551b-5p miR-198、miR-4419b miR-3619-3p、miR-23b-3p、miR-107の発現がリンパ節転移と相関している可能性が示唆された。転移診断マーカーとなるmicroRNAの探索初診時N0症例で原発巣切除後に局所再発がなく、後に頸部リンパ節に後発転移をおこした癌患者の頸部郭清術前と頸部郭清術後に、病理組織検査でリンパ節転移を確認した後の同一患者の血液サンプルからRNAを抽出し、microRNAアレイの解析(東レ3D-Gene)を行った。5症例の解析結果より、手術前と手術後に発現が4倍以上の差があるmicroRNAを抽出した。さらに、クラスター解析、下流に存在する遺伝子の解析をあわせて行い、候補となるmicroRNAを選定を行っている。今年1年間の対象症例が少なかったこと、血液中からのmicroRNAの回収率が安定しなかったことが理由として考えられる。また、マイクロRNAのアレイの結果として候補となったマイクロRNAの数が多く、解析するマイクロRNAを絞れなったことが遅れている原因となっている。口腔癌リンパ節転移患者と健常者の血液中のmicroRNAを比較した結果、そのプロファイリングに大きな違いが見られることを明らかした。また、初診時N0症例で原発巣切除後に局所再発がなく、後に頸部リンパ節に後発転移をおこした癌患者の頸部郭清術前(体内に転移巣のみが存在)と頸部郭清術後(体内に癌細胞が存在していない状態)に、同一患者から血液を採取してmicroRNAのアレイ解析を行った。解析結果より、手術前と手術後に発現差があり、明らかに転移した群で発現上昇した候補となるmicroRNAを選定し、詳細な解析を行っている。候補microRNAの発現を定量性RT-PCRによって比較し、リンパ節転移と相関しているかを検討する。内部コントロールとなるmicroRNAの値が一定せず、内部コントロールの設定に時間を費やしたことが遅れた大きな要因である。さらに、詳細な解析を行っている。

また、候補microRNAの発現をRT-PCRによって比較し、リンパ節転移と相関しているか検討した。サンプルが予定数より少なく、候補microRNA数が多かったことが原因と考えられる。また、候補microRNAの機能解析の進捗が遅れていたことが原因と考えられる。口腔癌は、直接口腔内を観察することで、癌の存在、再発を診断できるが、口腔癌の頸部リンパ節転移の診断は画像検査によるところが大きい。そのため、転移をより早期に発見するためには、リンパ節転移を検出するバイオマーカーが必要である。しかし、腫瘍マーカーとして頻用されている血清SCC抗原値は、口腔癌に対する腫瘍マーカーとして特異性が低いと報告されているように、臨床的に有用な口腔癌の腫瘍マーカーは存在していない。今までに頸部リンパ節転移の指標となる因子を原発癌組織で検索した結果、転写因子と癌幹細胞マーカーの過剰発現が口腔癌患者の予後と相関していることを明らかにしたが、リンパ節転移とは相関を示すことができなかった。しかし、われわれは、口腔癌リンパ節転移患者と健常者の血液中のmicroRNAを比較した結果、そのプロファイリングに大きな違いが見られることを明らかにした。初診時N0症例で原発巣切除後に局所再発がなく、頸部リンパ節に後発転移をおこした癌患者の頸部郭清術前と術後に、血液を採取してmicroRNAアレイの解析結果を行った。解析結果より、手術前と手術後に発現差があり、明らかに転移した群で発現上昇した候補となるmicroRNAを選定した。結果、miR-4664-5p、miR-6872-3p、miR-1290、miR-191-5p、miR-593-5p、miR-6778-5p、miR-4732-5p、miR-342-5p、miR-551b-5p miR-198、miR-4419b miR-3619-3p、miR-23b-3p、miR-107の発現がリンパ節転移と相関している可能性が示唆された。転移診断マーカーとなるmicroRNAを同定する。また、口腔扁平上皮細胞癌株における候補となったmicroRNAの発現解析を行う。口腔扁平上皮癌細胞(SAS, CAL27細胞)を用いて、培養上清中と癌細胞中の候補となったmicroRNAをreal-time RT-PCRで定量し、microRNAが分泌型のmicroRNAであり、癌細胞由来であることを確認する。次に培養細胞における候補となったmicroRNAの機能解析を行う。培養細胞(SAS、CAL27、B88、BHY、HNt細胞)を、microRNAのインヒビターを用いて候補となったmicroRNAの機能を抑制、あるいはmicroRNA発現プラスミドを用いて過剰発現させる。それぞれ、anti miRTM miRNAinhibitor (Ambion)とanti miRTMmiRNAprecursor molecule(Ambion),あるいはmicroRNA発現プラスミドを用いる。microRNAの発現を抑制あるいは強制発現した癌細胞をヌードマウスの背部皮下(5×106個細胞)あるいは咬筋部もしくは舌(1×105個細胞)に移植し、腫瘍増殖、リンパ節転移の有無、個数を検討する。また、摘出したリンパ節のHE染色、、候補microRNAの発現がリンパ節転移に及ぼす影響を検討する。
統合失調症の病態におけるオリゴデンドロサイト/オリゴデンドロサイト前駆細胞の関与

本研究では、マウスにおける統合失調症様行動異常とオリゴ新生との関連性について解析した。野生型マウス海馬において、オリゴ前駆細胞のほとんどは脂肪酸結合タンパクFabp7を発現し、約7%ほどがPax6を発現していた。統合失調症様行動異常としてプレパルス抑制(PPI)の低下を認めるFabp7ノックアウト(KO)ホモ接合マウスでは海馬におけるOPCsの増殖に有意な変化を認めなかったが、同様にPPI低下を呈する自然発症Pax6変異ヘテロ接合マウスの海馬ではOPCsの増殖が有意に低下していた。統合失調症患者における脳画像解析および剖検脳を用いた遺伝子発現解析、遺伝学的解析等より、統合失調症の病態とオリゴデンドロサイト/ミエリン障害との関連性が示唆されている。そこで本研究では、オリゴデンドロサイトの前駆細胞として知られるオリゴデンドロサイト前駆細胞(OPCs)に着目して、マウスにおける統合失調症様行動異常とオリゴ新生との関連性について検討した。まず、孤発性の統合失調症モデル動物としてFabp7ノックアウト(KO)マウスを用い、統合失調症の病態におけるオリゴデンドロサイト前駆細胞(OPCs)の関与について検討した。8週齢のマウス海馬において、PDGFRa陽性のOPCsは海馬に一様に存在し、そのほとんどがFabp7を発現していた。Fabp7KOマウスにおいて、海馬歯状回の顆粒細胞下層に存在する神経幹細胞の増殖はFabp7の欠損によって低下していたが、OPCsの増殖には有意な変化は認められなかった。次に、Fabp7 KOマウスと同様に、統合失調症様行動異常としてプレパルス抑制(PPI)の低下を認める自然発症Pax6変異マウスに関してOPCsの解析を行った。野生型マウスでは海馬OPCsのうち約7%程度にPax6が発現しており、Pax6陽性のOPCsは増殖能が高い集団であることが明らかとなった。C57BL/6J系統のPax6ヘテロ変異マウスではOPCsの増殖が低下していたが、ICR(CD1)系統のPax6ヘテロ変異マウスではPax6陽性のOPCsの増殖は野生型と同等であった。4週齢のC57BL/6J系統Pax6ヘテロ変異マウスでは脳梁におけるミエリン塩基性タンパク質の染色性が減少する傾向にあった。これらの結果から、Pax6は脳の発達期においてOPCsの増殖を制御し、神経線維のミエリン化を促進している可能性が示唆された。統合失調症患者における脳画像および剖検脳解析より、統合失調症の病態とオリゴデンドロサイトやミエリン形成障害との関連性が示唆されている。本研究では孤発性の統合失調症モデル動物としてFabp7ノックアウト(KO)マウスを用い、統合失調症の病態におけるオリゴデンドロサイト前駆細胞(OPCs)の関与について検討した。OPCsにおけるFabp7の発現について検討するため8週齢のマウス海馬において免疫組織化学的解析を行った。PDGFRa陽性のOPCsは海馬に一様に存在し、そのほとんどがFabp7を発現していた。OPCsの増殖がFabp7によって制御されるか検討するため、Fabp7KOマウスおよび野生型同腹仔に対して増殖細胞の標識を行った。これまでの報告と一致して、海馬歯状回の顆粒細胞下層に存在する神経幹細胞の増殖はFabp7の欠損によって低下していたが、OPCsの増殖に有意な変化は認められなかった。したがってOPCsの増殖はFabp7により制御されている可能性は低いことが明らかとなった。また、抗精神病薬の投与がOPCsの増殖および分化に及ぼす影響について検討するため、定型抗精神病薬ハロペリドールの投与条件の検討を行った。今後はFabp7がOPCsの細胞形態やオリゴデンドロサイトへの分化に及ぼす影響について検討するため、より詳細な組織学的解析およびオリゴデンドロサイトの分化マーカーを用いた解析を行う。また、Fabp7KOマウスおよび野生型同腹仔に対して投薬を行いハロペリドールがOPCsの増殖および分化に及ぼす影響について検討し、さらにPPIテストやオープンフィールドテストによりFabp7KOマウスの示す統合失調症様異常行動を評価し、抗精神病薬の投薬の効果とOPCsの増殖および分化との関連性について検討する。東日本大震災の影響により、Fabp7KOマウスのコロニーを大幅に縮小せざるを得ず、解析に十分な数のFabp7KOマウスを用意するのに時間を要した。またX線照射施設の利用ができずOPCs除去実験を進めることができなかった。本年度はFabp7がOPCsの分化や細胞形態に及ぼす影響を解析し、OPCsにおけるFabp7の機能を明らかにする。また、昨年度に確立した投薬条件に従ってFabp7KOマウスおよび野生型同腹仔にハロペリドールを投与し、OPCsの増殖および分化に及ぼす影響について検討する。

さらにPPIテストやオープンフィールドテストによりFabp7KOマウスの示す統合失調症様異常行動を評価し、抗精神病薬の投薬の効果とOPCsの増殖および分化との関連性について検討する。昨年度はマウス頭部用の放射線遮蔽器具および照射条件検討用マウス購入費用を予算の一部として計上していたが、実際にはこれを執行しなかった。これは上述のとおりX線照射施設の利用ができず実験を行わなかったためである。本年度は改めてX線によるOPCsの除去システムの確立を検討していく。放射線実験器具200千円、OPCs除去実験条件検討用実験動物200千円、投薬実験用実験動物1,000千円免疫組織学解析用試薬500千円、薬理解析用試薬500千円
室内弾性波試験におけるインパルス応答の同定と受信波形のシミュレーション

代表的な室内弾性波試験であるベンダーエレメント試験において,スイープ波を送信することで試験装置系のインパルス応答が同定可能であることを示した.また,同定したインパルス応答と任意の送信波との畳込みによって,任意の送信波に対する受信波形が再現可能であることを示し,再現した受信波形から十分な精度でせん断波速度を評価できることを示した.加えて三軸試験装置および圧密試験装置による実験結果から,本手法が土の種類や試験装置によらず適用可能であることを示した.代表的な室内弾性波試験であるベンダーエレメント試験において,スイープ波を送信することで試験装置系のインパルス応答が同定可能であることを示した.また,同定したインパルス応答と任意の送信波との畳込みによって,任意の送信波に対する受信波形が再現可能であることを示し,再現した受信波形から十分な精度でせん断波速度を評価できることを示した.加えて三軸試験装置および圧密試験装置による実験結果から,本手法が土の種類や試験装置によらず適用可能であることを示した.平成19年度は本研究で提案する手法の適用性を現有する実験装置をべ一スとして用い,提案する手法で求めたベンダーエレメント試験装置系のインパルス応答から,任意の送信波に対する受信波形が予測可能であることを実験的に立証した.まず始めに,本研究で提案する手法で前提条件となる送信波と受信波の間の線形関係を確認した.次にこれまで実施してきた予備研究から得られているパラメレタ値を用いて時間引き延ばしパルスの設計とインパルス応答の同定を行った.その結果,インパルス応答は逆フィルタと呼ばれる特殊な波形を畳込む信号処理を行なうことによって適切に同定されることを確認した.引き続き得られたインパルス応答を用いて,任意の送信波を送信した場合に得られる受信波形を計算によって求めた.シミュレートした様々な送信波に対する受信波を,対応する実験から得られた受信波形と比較した結果,両者は良好に一致することを確認した.さらに両者の一致度を高めるため,時間引き延ばしパルスを設計するためのパラメータの最適化を行った.パラメータを修正して実験を繰り返し,最も計算値と実験値が近似するようパラメータを最適化した結果,適切なパラメータ値と受信波形のスペクトルの関係を見いだした.本研究の結果は系の線形性が成立するすべての室内弾性波試験において,インパルス応答から任意の送信波に対する受信波形を計算から求めることが可能であることを示している.またその物理的意味から,インパルス応答は室内弾性波試験の結果を表わす重要な指標となると考えられる.以上の研究成果はSoils and Foundations他に発表されている.H20年度は様々なベンダーエレメント試験の実施環境において提案する受信波形の再現手法が適用可能であり,手法に一般性があることを室内試験により確認した.室内試験は三軸試験装置,圧密試験装置に組込んだベンダーエレメントシステムをもちいて実施され,まず異なる試験装置において再現性が確かめられた.次に砂,粘土,泥炭の剛性の異なる土試料について同様の試験を行い,再現性の程度を確かめた.その結果,基本的に本研究で提案する手法はこれらの条件に関わらず適用可能であること,ただし,受信波の再現性の程度については再現の要となる試験装置系のインパルス応答同定に用いるスイープ波の周波数特性に影響されることをつきとめた.この結果を受けて,周波数特性の異なるスイープ波を用いた追加実験の結果からスイープ波の周波数特性を試験装置系のインパルス応答が持つ周波数特性と合致させることで受信波の再現性はもっとも高くなることを明らかにし,このことから最終的にこの手法を用いる際に必要なスイープ波の具体的な設計手法を示した.また,本手法を用いて実際に不かく乱泥炭試料のせん断弾性係数をベンダーエレメント試験によって評価した結果,妥当な値が得られることを示した.以上の研究成果は地盤工学会,土木学会東北支部で発表されている.また,本補助金の交付期間における研究成果を現在論文としてとりまとめており,近くSoils and Foundationsに投稿する予定である.
精密農法のためのリアルタイム土壌センシング及び土壌管理に関する研究

試作中のリアルタイム土中光センサーを用い,複数ほ場における深さ20cm程度の土壌画像と分光反射スペクトルを数メートル間隔で収集し,土壌タイプの判別,地力の推定など詳細な土壌マップを作成した。土壌マップを基礎にして,投入量削減による環境負荷軽減と収量・品質向上のための土壌管理モデルを提案した。具体的には,2004年6月,東京農工大学付属農場の畑地においてリアルタイム土中光センサーによるほ場実験を実施し,土中画像及び土壌反射スペクトルの詳細なデータを収集するとともに,2003年及び2004年に実施した複数ほ場における土中画像及び反射スペクトルのデータを用い,下記の解析を実施した。1.土中画像のテクスチャ解析を実施し,施肥管理(化学肥料区,牛糞堆肥区)による土壌状態の変化や異なるほ場の土壌タイプ判別を行い,土壌タイプマップを作成した。2.ニューラルネットワーク等の手法を用い,土壌タイプ判別の合理化と更なる精度向上のアルゴリズムを開発した。3.土中画像データ及び土壌反射スペクトルを用いて,水分や有機物含量などの推定精度を向上させた。4.航空リモートセンシングで取得した作物のNDVIマップと土壌マップの比較を行い,メートルオーダーの詳細な土壌パラメータ変動と作物生育変動の相関を分析し,土壌管理モデルの検討例を提示した。5.以上の研究成果を第7回精密農業国際会議(2004年7月,米国ミネソ大学)及び農業機械学会全国大会(2004年9月,神戸大学)にて発表した。
LIMキナーゼの活性化の分子機構と細胞骨格制御機構の解明

細胞の形態形成、移動、接着、細胞質分裂において、アクチン細胞骨格の再構築が重要な役割を果たしている。私達は、新規なプロテインキナーゼとしてLIMキナーゼ(LIMK1およびLIMK2)を同定し、LIMKがRac,Rhoの下流因子として活性化され、アクチン脱重合因子であるコフィリンのSer-3を特異的にリン酸化することを見い出し、アクチン骨格の再構築制御におけるRac,Rho→LIMK→コフィリンというシグナル経路の存在を明らかにした。本研究では、LIMK1,LIMK2およびその類縁キナーゼであるTESK1の活性化機構と細胞骨格の制御機構を解明することを目的として、以下の成果を得た。1.LIMK1はRacの下流因子PAKおよびRhoの下流因子ROCKにより活性化されることが知られているが、本研究において、LIMK2も同様にPAKとROCKによってThr-505のリン酸化によって活性化されることを明らかにした。また、LIMK2がコフィリン/ADFのリン酸化を介してストレスファイバーや膜泡の形成や接着斑の形成に関与することを明らかにした。3.TESK1はLIMKと同様にコフィリンのSer-3をリン酸化し、細胞に高発現させると、ストレスファイバーの形成、接着斑の形成などアクチン骨格の再構築が誘導されることを見い出した。TESK1はLIMKとは異なり、ROCK、PAKによって活性化されないが、インテグリンシグナルによって活性化されることを見い出した。
細菌べん毛モーターのトルク発生装置の解析

細菌べん毛は、細胞膜を透過するイオンの流れをエネルギーとして回転する生体超分子モーターであるが、その回転の機構はほとんどわかっていないのが現状である。生体分子機械の作動原理の解明は、生命科学のみならずナノテクノロジーへの応用に向けても重要な課題である。本研究では、イオン流のモーター回転力への変換を担う細胞膜中のナトリウムチャネルPomABの三次元構造を電子顕微鏡法で解析した他、X線結晶回折法による解析のための試料調製、結晶化を行った細菌べん毛は、細胞膜を透過するイオンの流れをエネルギーとして回転する生体超分子モーターであるが、その回転の機構はほとんどわかっていないのが現状である。本申請研究では、イオン流のモーター回転力への変換を担う細胞膜中のナトリウムチャネルPomABの三次元構造を、低温電子顕微鏡法、X線結晶回折法により、高分解能で解析する。本研究では、イオン流のモーター回転力への変換を担う細胞膜中のナトリウムチャネルPomABの三次元構造を電子顕微鏡法で解析した他、X線結晶回折法による解析のための試料調製、結晶化を行った細菌べん毛は、細胞膜を透過するイオンの流れをエネルギーとして回転する生体超分子モーターであり、約25種類以上の異なった蛋白質から構成される。現状では、その回転の機構はほとんどわかっていない。本申請研究では、イオン流のモーター回転力への変換を担う細胞膜中のナトリウムチャネルPomABの三次元構造を、低温電子顕微鏡法、X線結晶回折法により高分解能で解析し、回転機構の解明を目指している。本年度は、高圧連続式ホモジナイザー、遠心機、培養機、オートクレーブ等を導入し、効率的にPomAB複合体の精製ができるようになった。すでに、単分散した試料の負染色電子顕微鏡像からの単粒子解析法による三次元構造解析は完了し、現在論文審査の段階にある。より生理的な状態の解析に向け、低温電子顕微鏡の撮影条件の検討を行った。まず、単離精製した試料を液体窒素温度で電子顕微鏡観察したところ、ほとんどの試料がカーボン膜に吸着し氷中に包埋されにくいことが分かった。一方、PomABの機能単位は分子量が20万以下であり非染色の試料の観察は難しいと予想されていたが、電子分光によりコントラストよく解像できることが分かった。今後、試料濃度、界面活性剤濃度等の条件を変え、氷包埋条件を検討、単粒子解析法により10Å程度の分解能で三次元構造を解析する。また、ナトリウムイオン濃度を変化させ、モーターのトルク発生に関係する構造変化の可視化を行う。同時にX線結晶回折法に向け、結晶化を進めていく。細菌べん毛は、細胞膜を透過するイオンの流れをエネルギーとして回転する生体超分子モーターであり、約25種類以上の異なった蛋白質から構成される。本年度は、PCRサーマルサイクラーを導入し、PomAB複合体の発現系の検討を行った。これまでC末端側にヒスチジンタグを付加したTacプロモーター制御の発現系を用いていたが、発現量があまり多くない上に精製法も複雑であった。そこでN末端側ヘタグ及びタグ切断サイトを導入し、pETの発現系を用いたところ蛋白質発現量に改善がみられた。現在、タグの切断条件、精製法等の検討を行っている。また、結晶化実験では、初期的な結晶が得られた。そこで、条件検討を効率よく進めるため、結晶観察用の実体顕微鏡システムを導入した。一方、電子顕微鏡法による解析では、単分散したPomAB試料の単粒子解析を続けている。同法では、分解能は限られるが、結晶化することなく試料の三次元構造を解析することができる。現在、負染色像と氷包埋像から三次元密度図を再構成し両者を用いて解析の検証を行うと共に、低温電子顕微鏡法により生理的な条件下に近い状態の構造をより高い分解能で解析するべく、引き続き氷包埋条件等の検討を進めている。今後、低温電子顕微鏡法、X線結晶構造解析法の両者を相補的に用いて、ナトリウムイオンの添加に伴う構造変化の可視化等を行い、イオン流のモーター回転力への変換機構の解明を目指す。昨年度構築したPomAB複合体の発現系を改良して得た初期結晶から、SPring-8において放射光を使ったX線回折実験を行った。現在、結晶の改善のため、種々の条件検討を進めている。また、ホモログ蛋白質発現系の構築、結晶化を行った。