hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
2段階気相合成法による窒化ガリウム粉体への発光中心形成と蛍光体応用

1.粒子成長過程において、Zn原料としてZnS粉末を用いることにより、2段階気相法におけるGaN:Zn粉体の合成を達成した。ZnSの供給量は、キャリアガス種(N_2、HCl)および流量を変化させることにより、広い範囲で精密に制御することが可能となった。これにより、Zn濃度が1×10^<19>8×10^<20>cm^<-3>の試料を合成することができた。一方で、Zn濃度とほぼ同程度のSも、試料に混入していることことがわかった。2.合成したGaN:Zn粉体は、青色のフォトルミネッセンスおよびカソードルミネッセンスを示した。スペクトルは、Zn発光中心に特有の450nm付近をピークとするブロードなバンドなる。この発光のZn濃度依存性を詳細に調べ、Zn濃度が12×10^<19>cm^<-3>付近で最も強い発光を示すこと、Zn濃度が増すに従い発光波長が長波長側へシフトする傾向を明らかにした。3.GaN:Znの発光特性が、アンドープ試料と同様に、粒子成長過程におけるNH_3分圧に強く依存することを見出した。NH_3分圧が0.78atmまでの範囲では、分圧が高いほど強い発光が得られた。4.ZnSに替えて金属ZnをZn原料に用いることにより、試料の発光特性および結晶性が大幅に向上することがわかった。この結果より、Sの混入が試料特性を悪化させる要因であることがわかり、今後の特性改善の指針を示した。5.赤色発光を示すEuのドーピングをEuS、EuCl_3を原料に用いて試みたが、原料が問題なく供給されているにもかかわらず、試料中には取り込まれなかった。これは、EuとGaの結合半径の差が大きいためと考えられことから、より非平衡に近い粒子成長過程を実現できる新しい原料系の選択が課題として残された。
光切断リンカー付アフィニティ樹脂を用いた汎用的な生理活性物質探索法の開拓

H19-H21年度科研費研究で開発した“光切断リンカーを活用した特異的蛋白質の選択的溶出法"をベースとし、我々で開発し筑波家田化学から市販されている新規固相担体(AquaFirmusTM)を応用することにより、本研究課題の目標であったターゲット不明の生理活性物質のターゲット探索法を開拓できた。本手法はターゲット既知のFK506でも、カルシニューリンを含むターゲット複合体の効率的な一括同定に成功している。現在、共同研究継続中の製薬企業が有するターゲット未同定開発化合物に適応し、ターゲット探索に適応中である。H19-H21年度科研費研究で開発した“光切断リンカーを活用した特異的蛋白質の選択的溶出法"をベースとし、前年度までに独自に開発済みの化学的に安定で非特異的蛋白質吸着が圧倒的に少ない新規固相担体(AquaFirmusTM:つくば家田化学から一般に販売中、今秋より世界販売予定)を応用することにより、本研究課題の目標であった効率的なターゲット溶出に成功している。これまで、AquaFirmusに関する固相担体成分の更なる最適化検討を行い、さらに良好なターゲット蛋白質の同定能力を有する新規固相担体の開発に成功しており、本研究で開発済みの光照射による効率的なターゲットタンパク質選択的溶出方法との併用により、より効率的な生理活性物質のターゲット探索方法の開拓に成功している。複数の製薬企業との共同研究も始まり、創薬現場においても本手法の有用性が実証されつつある。今後も引き続き、製薬企業などが有するターゲット未同定であるが魅力的な生理活性を示す化合物(開発化合物を含む)に適応し、求まれるターゲット探索に適応する計画である。今後、本研究の目的である光切断リンカー部分のさらなる構造最適化を行い、より安定的なターゲット選択的溶出方法を開拓し、汎用的なアフィニティ樹脂による生理活性物質ターゲット探索の確立を計画している。また、より高い社会貢献を目指し、本研究で開拓された手法の公表を行う計画である。光切断リンカーとしてH19ー21年度科研費研究で使用したo-nitro-benzylamine誘導体を利用し検討を行った。当初市販の固相担体に当該光切断リンカーを導入し検討を行ったが、疎水的な性質のため、非特異的な蛋白吸着が多く見られ、目的を達成することが出来なった。また、アフィニティ樹脂用固相担体として汎用されるアフィゲルは,組成が糖誘導体であり、合成溶媒中で変性し使用不可であった。そこで、本研究では我々が独自に開発した化学的に安定で、高い親水的性質から非特異的蛋白吸着が非常に低減されたAquaFirmus(筑波家田化学販売中)を固相担体として用いることとした。また、より親水性的な環境構築および、光反応後に生じるラジカル反応種とターゲット蛋白質の結合形成等を避ける目的で、PEGスペーサーを導入し検討を行った。同時に反応条件などを検討することによって、ほぼ目的物のみを選択的に溶出可能な系を構築することができた。こうして構築したシステムを用いターゲット既知の生理活性物質を固定し、その適応を行った。その結果、得られた蛋白質はBIACOREを用いた検討から、3次元構造的にも高純度なものであることが示唆された。今後、ターゲット未知の生理活性物質(共同研究中の開発品を含む)への適応を行い、方法のブラッシュアップと共に、メカニズム解析に貢献する計画である。H19-H21年度科研費研究で開発した"光切断リンカーを活用した特異的蛋白質の選択的溶出法"をベースとし、我々が開拓した非特異的蛋白吸着が少なく、ターゲット捕獲効率に優れた新規固相担体(AquaFirmusTM:つくば家田化学販売中)を応用することによって、本研究課題の目標であった効率的なターゲット溶出に成功している。現在、いくつかのターゲット既知化合物に応用し、当該方法の効率的な使用方法に関する最適化を実施中である。これまでの検討から、当該方法を適応するのに特別な添加剤を加えることなく目的とするターゲット蛋白質を溶出・同定できることが明らかとなっているため、今後は使用する機器の最適化、光照射条件の検討を行う計画である。また、特に疎水性の高い化合物に関しては、光切断リンカーと生理活性物質との間に親水性のPEGスペーサー導入が効率的であることが判明しているため、今後スペーサー構造の検討も行う計画である。また、共同研究継続中の製薬企業が有するターゲット未同定であるが優れた薬効を示す開発中化合物にも当該技術を適応し、ターゲット探索に適応し、具体的な社会貢献も目指す計画である。具体的にはA社が抗アレルギー疾患で進める化合物や、B社がドライアイで開発を進める化合物などのターゲット探索に適用予定である。

また、秘密保持の観点から、アフィニティ樹脂を用いたターゲット探索を自社で進める製薬企業にも、当該開拓技術の提供を進め間接的な貢献も行う計画である。研究実績の概要で述べたように、計画通りに研究は遂行しており、一般的なモデル実験系のみではなく、製薬企業担当者にもその有用性が認められた。(詳細は非公開)いくつかのターゲット既知化合物に応用し、当該方法を用いることによって、特別な添加剤を加えることなく、光照射を行うのみで目的とするターゲット蛋白質を溶出・同定できることが可能となっている。また、今後の当該技術の汎用化に必要な、広範な構造や物性を有する生理活性物質での応用を可能とする、スペーサー構造の選択基準等が明確になりつつある。モデル実験での有用性は確立しているため、今後は共同研究において、より実践的な系において当該手法の有用性を示す計画である。また同時に、実践的適用実験において、現時点では認知できていないデメリットが生じた場合、更なる手法のブラッシュアップを行う計画である。これまでの検討から、疎水性の高い化合物に関しては、光切断リンカーと生理活性物質との間に親水性のPEGスペーサー導入が効率的であることが判明しているため、今後スペーサー構造の検討も行う。また、共同研究継続中の製薬企業が有するターゲット未同定開発中化合物にも当該技術を適応し、ターゲット探索に適応し、具体的な社会貢献も目指す計画である。前項で述べたように、既に進行している製薬企業等との共同研究において、当該手法の有用性を示す計画である。そのために、研究費を重点的に投資する計画である。上記研究遂行に必要な試薬(合成、生化学関係)に用いる計画である。特に、今後当該手法の有用性確認のために行うターゲット未同定生理活性物質(開発品を含む)研究に必要となる試薬類(生化学関係消耗品など)を中心に購入する計画である。
核内共生細菌の感染と増殖の分子細胞生物学的研究

下記のことを明らかにした。1.V-ATPase(プロトンポンプ)の阻害剤のコンカナマイシンA、コンカナマイシンB、バフィロマイシンA1存在下では、宿主ゾウリムシの食胞内pHの酸性化とホロスポラオブツサの食胞からの脱出が阻害される。ウシのクロマフィン顆粒のV-ATPaseに対する抗体を使った間接蛍光抗体法では、食胞膜にV-ATPaseが存在することが示された。これらの結果は、ホロスポラは、宿主食胞の酸性化を引き金にして、食胞から脱出することを示している。In vitroで、感染型ホロスポラをpH低で処理すると、タンパク質組成の変化を伴って食胞から脱出した活性型に特異的な形態変化が誘導された。同時に、アンピシリンとクロラムフェニコール非存在下で活性型特異的抗原(AF-1抗原)の出現が誘導された。これらの結果は、低pHによる活性型特異的抗原の出現は、転写と翻訳を伴うことを示している。2.増殖型のホロスポラオブツサは低温の4度だけでなく25度でも宿主の生存と細胞分裂速度を高める機能を果たしていることが分かった。どのような機構で宿主の生存と分裂を促進しているのかを明らかにすることは、寄生細菌から共生細菌への移行のしくみの例として今後明らかにされなければならない。3.しかし、増殖型から感染型に分化すると、過剰合成した細胞壁物質(IR-4-1抗原)を菌体外に分泌して大核膜に沈着させ、たとえ細胞を固定やTriton-Xで抽出しても抗体を通過させないほど核膜の物質透過性を低下させることが分かった。ホロスポラが増殖型から感染型に分化すると、宿主の分裂速度と宿主の死亡が誘導されるが、その原因が菌体外に分泌された細胞壁物質による大核膜の物質透過性の低下であることがはじめて明らかになった。感染型ホロスポラは、増殖型の時とは反対に積極的に宿主を殺害し、これによって宿主外に脱出する機会を作っていると考えることができる。IR-4-1抗原を持たない突然変異株の感染型は宿主を殺害できなかったことは、上記の考えを支持している。4.ホロスポラオブツサのストレスタンパク質のgroESとgroELの遺伝子をクローニングした。この遺伝子の塩基配列のホモロジーから、ホロスポラオブツサは、プロテアバクテリアのαグループに属し、寄生性細菌のリケッチアに最も近いことが明らかになった。5.ホロスポラオブツサの感染型特異的4.5Kタンパク質を精製し、全アミノ酸配列の決定と遺伝子のクローニングを行った。免疫電顕は、抗原がオブツサのペリプラズムに存在することを示し、cDNAを使ったノーザンブロットは増殖型から感染型への分化途中で転写が開始し完了することを示した。このタンパク質の機能はまだ不明だが、大腸菌に発現させると細胞分裂が阻害されるので、増殖型から感染型に分化する際のホロスポラの細胞分裂停止の機能を果たしている可能性がある。ゾウリムシのアクチンに対する抗体を使った間接蛍光抗体法と2次元電気泳動のイムノブロットは、ホロスポラオブツサが、この抗体と反応するタンパク質を持つことを示した。このタンパク質の性質と機能はまだ分からない。7.パルスフィールド電気泳動によるH.undulata,H obtusa,H.rectaのゲノムサイズは、1800,1740,1800kpbでH obtusaのAT%は80であった。このAT%はミトコンドリアに近い価である。ゲノムのコピーを持つかどうかについてはまだ不明である。8.ホロスポラオブツサから精製した67Kタンパク質に対するモノクローナル抗体IR-2-1は、ゾウリムシの収縮胞放射管のdecorated spongiomeのプロトンポンプと交差反応し、さらに、ゾウリムシ、テトラヒメナ、イモリ精子、細胞性粘菌、酵母菌、マウスミエローマのミトコンドリアとも交差反応することが明らかになった。ホロスポラのプロトンポンプが、収縮胞のプロトンポンプ(V-ATPase)やミトコンドリアのプロトンポンプ(F-ATPase)と共通の抗原決定基を持つことが示唆された。

3.しかし、増殖型から感染型に分化すると、過剰合成した細胞壁物質(IR-4-1抗原)を菌体外に分泌して大核膜に沈着させ、たとえ細胞を固定やTriton-Xで抽出しても抗体を通過させないほど核膜の物質透過性を低下させることが分かった。ホロスポラが増殖型から感染型に分化すると、宿主の分裂速度と宿主の死亡が誘導されるが、その原因が菌体外に分泌された細胞壁物質による大核膜の物質透過性の低下であることがはじめて明らかになった。感染型ホロスポラは、増殖型の時とは反対に積極的に宿主を殺害し、これによって宿主外に脱出する機会を作っていると考えることができる。IR-4-1抗原を持たない突然変異株の感染型は宿主を殺害できなかったことは、上記の考えを支持している。4.ホロスポラオブツサのストレスタンパク質のgroESとgroELの遺伝子をクローニングした。この遺伝子の塩基配列のホモロジーから、ホロスポラオブツサは、プロテアバクテリアのαグループに属し、寄生性細菌のリケッチアに最も近いことが明らかになった。5.ホロスポラオブツサの感染型特異的4.5Kタンパク質を精製し、全アミノ酸配列の決定と遺伝子のクローニングを行った。免疫電顕は、抗原がオブツサのペリプラズムに存在することを示し、cDNAを使ったノーザンブロットは増殖型から感染型への分化途中で転写が開始し完了することを示した。このタンパク質の機能はまだ不明だが、大腸菌に発現させると細胞分裂が阻害されるので、増殖型から感染型に分化する際のホロスポラの細胞分裂停止の機能を果たしている可能性がある。ゾウリムシのアクチンに対する抗体を使った間接蛍光抗体法と2次元電気泳動のイムノブロットは、ホロスポラオブツサが、この抗体と反応するタンパク質を持つことを示した。このタンパク質の性質と機能はまだ分からない。7.パルスフィールド電気泳動によるH.undulata,H obtusa,H.rectaのゲノムサイズは、1800,1740,1800kpbでH obtusaのAT%は80であった。このAT%はミトコンドリアに近い価である。ゲノムのコピーを持つかどうかについてはまだ不明である。8.ホロスポラオブツサから精製した67Kタンパク質に対するモノクローナル抗体IR-2-1は、ゾウリムシの収縮胞放射管のdecorated spongiomeのプロトンポンプと交差反応し、さらに、ゾウリムシ、テトラヒメナ、イモリ精子、細胞性粘菌、酵母菌、マウスミエローマのミトコンドリアとも交差反応することが明らかになった。ホロスポラのプロトンポンプが、収縮胞のプロトンポンプ(V-ATPase)やミトコンドリアのプロトンポンプ(F-ATPase)と共通の抗原決定基を持つことが示唆された。平成7年9月12日-14日に、シュツッツガルト大学でホロスポラの各研究グループごとの研究報告と将来の研究方針を協議し、これまで、さまざまな名称で呼ばれていたホロスポラの各部分と生活環の各時期の名称を統一した。さらに、ホロスポラの株の維持と供給についての役割分担を決めた。また、今後の共同研究のための具体的技術協力の計画を立てた。シュツッツガルト大学滞在期間に、共同研究を行い、共焦点レーザ顕微鏡でホロスポラの感染過程を観察し、ホロスポラの凍結保存法(山口大学)とDNA調整法(シュツッツガルト大学)を実演して教えた。また、各研究室のゾウリムシの採集法を互いに紹介し合った。
分子化学進化に及ぼすアモルファス氷の強誘電性効果

本研究は,分子化学進化においてアモルファス氷の誘電物性が及ぼす影響を解明することを目的としている.星間分子雲や原子惑星系において,氷の構造が紫外光や熱により変化することが知られている.光・熱の履歴によって氷の構造がどのように経時変化するのかを明らかにしておくことは,氷表面で起こる分子進化過程を理解する上でも極めて重要である.昨年度は,モデル単結晶Pt(111)基板上に作製した種々の膜厚の強誘電アモルファス氷が1均一核成長により結晶化する事,2回転自由度と並進自由度が独立して熱力学的に安定な構造に緩和している事を明らかにした.今年度は,上記の実験に引き続いて実験装置にD2ランプを組み込み.紫外光照射に起因するアモルファス氷の構造変化を解明することを試みた.また,分子雲の星間氷に共存しうる始原的なCOやNH3分子との共吸着によって発現する氷の強誘電性について調べた.その結果,COと共吸着させたPt(111)上の氷は強誘電性を発現させるのに対し,NH3と共吸着させたPt(111)上の氷は常誘電状態をとることが明らかになった.Pt(111)上のNH3分子は,N原子がPtに配位結合するH-up配向をとるため,NH3分子と共吸着させた氷はH-upの配向秩序を持つ強誘電氷となる事を予想していた.この予想に反し,NH3と共吸着させたPt(111)上の氷が常誘電氷になるという結果は,NH3分子のH-up配向秩序が水分子の共吸着により変調されることを示唆している.本研究により,2種分子の共吸着によって互いの分子の配向構造が変調を受け,純粋系とは異なる誘電物性を示しうることを実証する事ができた.この知見は,分子化学進化によって刻一刻と元素組成が変化する分子雲中の氷は,その組成に応じて強誘電性も時々刻々と変化させている事を示唆する.星間氷の強誘電性を決定する重要なファクターを解明する事ができた.29年度が最終年度であるため、記入しない。29年度が最終年度であるため、記入しない。本研究は,アモルファス氷の誘電物性に基づき,分子化学進化において氷が果たす触媒機能を明らかにすることを最終目的としている.星間分子雲や原子惑星系においては,アモルファス氷の構造が真空紫外光や熱により変化することが知られている.光・熱の履歴によりアモルファス氷の構造がどのように変化するのかを明らかにしておくことは,その表面で起こる分子進化のメカニズムを理解する上で極めて重要である.そこで,本年度はモデル基板上に作製した種々の膜厚(3分子層-50分子層)の強誘電アモルファス氷に対して昇温脱離法(TPD)と赤外分光法(IRAS)を同時に用いて熱的結晶化キネティクスを系統的に調べた.また,強誘電的配向秩序の熱的緩和を和周波発生振動分光(SFG)により評価した.従来の研究では,ヘテロ基板上に作製したアモルファス物質の結晶化現象は界面における不均一核生成に起因するという考え方が定説であった.しかし,本研究でTPDとIRASの同時計測により氷表面と氷内部の結晶性を同時に評価した結果,モデル基板上のアモルファス氷の熱的結晶化は氷内部での均一核生成に起因することが明らかになった.その臨界温度は氷薄膜の厚さが十分に厚いTc153 Kであったが,膜厚が薄い氷(約3分子層)ではTcが135 Kにまで低下することが判明した.氷の膜厚の増加に伴って水素結合ネットワークの組み換えが生じ,O-O間距離のバラつきが大きく柔軟性に富む水素結合構造からO-O間距離のバラつきが小さく柔軟性が低下する水素結合構造に変化している事を突き止めた.SFGで評価した強誘電的配向秩序の無秩序化は,上記のTcよりも20K以上も低温の温度領域から不可逆的に進行している事が明らかになった.これにより,強誘電アモルファス氷薄膜においては,水分子の回転自由度と並進自由度は独立して熱力学的に安定な構造に緩和していることが判明した.従来の研究では,昇温脱離法(TPD)あるいは赤外分光法(IRAS)のどちらかを用いてアモルファス氷の結晶化過程が研究されてきた.それに対し本研究では,TPDとIRASを同時に計測できるように装置を改良したことで,基板上に成長させたアモルファス氷薄膜の結晶化が均一結晶核生成に起因して進行することを確固たる実験結果に基づいて突き止める事ができた.また,基板上に成長させたアモルファス氷薄膜が強誘電性を示し,その配向秩序が結晶化(並進秩序の形成)よりもはるかに低温で崩壊(常誘電化)するという事実を,和周波発生振動分光により世界に先駆けて明らかにすることができた.本研究は,分子化学進化においてアモルファス氷の誘電物性が及ぼす影響を解明することを目的としている.

星間分子雲や原子惑星系において,氷の構造が紫外光や熱により変化することが知られている.光・熱の履歴によって氷の構造がどのように経時変化するのかを明らかにしておくことは,氷表面で起こる分子進化過程を理解する上でも極めて重要である.昨年度は,モデル単結晶Pt(111)基板上に作製した種々の膜厚の強誘電アモルファス氷が1均一核成長により結晶化する事,2回転自由度と並進自由度が独立して熱力学的に安定な構造に緩和している事を明らかにした.今年度は,上記の実験に引き続いて実験装置にD2ランプを組み込み.紫外光照射に起因するアモルファス氷の構造変化を解明することを試みた.また,分子雲の星間氷に共存しうる始原的なCOやNH3分子との共吸着によって発現する氷の強誘電性について調べた.その結果,COと共吸着させたPt(111)上の氷は強誘電性を発現させるのに対し,NH3と共吸着させたPt(111)上の氷は常誘電状態をとることが明らかになった.Pt(111)上のNH3分子は,N原子がPtに配位結合するH-up配向をとるため,NH3分子と共吸着させた氷はH-upの配向秩序を持つ強誘電氷となる事を予想していた.この予想に反し,NH3と共吸着させたPt(111)上の氷が常誘電氷になるという結果は,NH3分子のH-up配向秩序が水分子の共吸着により変調されることを示唆している.本研究により,2種分子の共吸着によって互いの分子の配向構造が変調を受け,純粋系とは異なる誘電物性を示しうることを実証する事ができた.この知見は,分子化学進化によって刻一刻と元素組成が変化する分子雲中の氷は,その組成に応じて強誘電性も時々刻々と変化させている事を示唆する.星間氷の強誘電性を決定する重要なファクターを解明する事ができた.昨年度に引き続き,得られた上記の知見を積極的に国際誌に投稿する.さらに今年度は,上記した熱的構造変化の知見に加えて真空紫外光照射に起因するアモルファス氷の構造変化を明らかにする.それらの知見を元に,氷の構造と誘電物性を制御し, NH3などの始原的な分子の吸着特性と分子化学進化について調べる.29年度が最終年度であるため、記入しない。29年度が最終年度であるため、記入しない。
記憶の認知的加齢に関する研究-高齢者の方略使用の速さと柔軟性に注目して-

本研究の目的は、高齢者が訓練によって高い記憶能力を獲得した段階での記憶方略使用の特性を、20代の若者との比較において調べることであった。老人にとっては1回のテストでも負担の大きな記憶課題を、数回のセッションにわたって訓練する最初の試みであったが、思うように実験が進まず、老人が高い記憶能力を身につけるところまでにもっていくこと自体が困難であった。科学研究費によって購入したノート型コンピュータ上に記憶刺激(単語)をひとつひとつ提示した。1セット20個の単語からなるものを3セット与えた。刺激提示の間隔をコントロールして(115秒)、提示後自由再生させた。まず大学生5名(2027歳)を対象にして5セッションの訓練実験を行なった。最初のセッションで各被験者のベースラインを測り、2回目のセッションから記憶力を高めるための方略(「場所法(method of loci)」)を教示した。これは、与えられた単語のイメージを、たとえば自分の家から最寄りの駅まで歩く道の途中にあるものと次々に連合させる記憶方略である。大学生はほぼ1回のセッションでマスターし、3セッション目からは記憶成績が向上した。老人については4名に協力したもらった。うち1名は体調の都合で途中で調査を打ち切った。残り3名(6977歳)には同じく2セッション目で場所法を教示した。3名ともこの方略自体をマスターすることができ、刺激の提示時間がある程度長ければ1015秒)、3セッションの訓練によって若者のベースラインに近いレベルの成績をあげることができた。しかし提示時間が短い場合(15秒)は、訓練後でも成績が伸びなかった。高齢者の記憶能力を高めることは、思ったほど容易ではなく、所定の目的を達成することはできなかったが、刺激の提示時間が長くて適切なイメージを生成することができれば、高齢者でもそれは記憶として頭の中に定着し、成績の向上につながることがわかった。今後老人の記憶研究を進めていく際の足がかりになるものと思う。
多剤耐性ユーイング肉腫細胞に対するヒストン脱アセチル化酵素阻害剤の効果

ピストン脱アセチル化酵素阻害剤SAHAはapoptosis抵抗性を示す多剤耐性Ewing肉腫細胞株に対してautophagiccelldeathといわれるapoptosisとは異なるprogramedcelldeathを誘導し抗腫瘍効果を発揮していることが判明した。また、SAHAは多剤耐性Ewing肉腫のマウスモデルにおいても、副作用なく抗腫瘍効果を発揮できることも判明した。今回の研究ではヒストン脱アセチル化酵素SAHAの多剤耐性Ewing肉腫細胞に対する効果を検討した。以前の研究で多剤耐性因子P-gp、MRP1を発現する多剤耐性Ewing肉腫細胞株WE-68/ADRとVH-64/ADRを樹立した。そこで今回第1の研究として、これら2つのEwing肉腫細胞株の薬剤感受性株と多剤耐性株に対してSAHAを投与し生存細胞数をCellTiter-Gloを用いてカウントした。SAHAは多剤耐性株に対しても薬剤感受性株と同様に抗腫瘍効果を示すことが判明した。続いてWestern blotでSAHAは薬剤感受性株と同様に多剤耐性株においても、この薬剤の効果判定として用いられるヒストンのアセチル化が観察でき、SAHAは薬剤排出ポンプであるP-gp,MRP1によって排出されず、これらの多剤耐性因子は克服できることが判明した。第2の研究としてSAHAによる抗腫瘍効果のメカニズムを解明するため、薬剤感受性株と多剤耐性株にSAHAを投与し24時間後にFlow Cytometryを行った。薬剤感受性株ではSub-G1分画が増加したのに対し、多剤耐性株ではG2/M分画が増加した。またSAHAは濃度依存性にG2/M分画を増加させることがわかり、SAHAの細胞死にはG2/M fractionの増加が関与する可能性が示唆れた。これは未だ報告されていない知見でありSAHAによる細胞死のメカニズムとして重要な点と考え研究を進めている。第3の研究として、新たに2種類のEwing肉腫細胞株RDESとSKNMCでの多剤耐性株の樹立を試みている。Ewing肉腫細胞株WE-68,VH-64は多剤耐性株を樹立した時と同様の手技を用いている。SKNMCではdoxorubicinの5ng/mlの耐性まで,RDESにおいても2.5ng/ml耐性まので細胞は採取できるがさらに濃度を上昇させると細胞株は死滅してしまう。耐性株の種類は多い方がデータに再現性が得られると考え、これら2細胞株に対しても耐性株樹立継続する予定である。昨年度の研究でSAHAはautophagiccell deathを誘導して多剤耐性細胞に抗腫瘍効果を発揮することが明らかとなった。SAHAを投与して細胞周期を観察すると確認するとG2/M fractionが増加していることが確認された。SAHAの濃度依存性にautophagy関連遺伝子beclin1の発現濃度が上昇し、G2/M fractionの量が増加していた。以上のことからSAHAがAUTOPHAGYの誘導とG2/M期を誘導している事が明らかとなったが二つの関連は現在調査中である。WE-68,VH-64の多剤他姓株を1.0×106の細胞をpreparationしてNu/Nuマウスにxenograftする。つづいて0,50,75,100mg/Kgの濃度のSAHAを腹腔内投与し抗腫瘍効果を検討したところ、SAHAの濃度依存性にマウスの腫瘍サイズは縮小した(論文投稿中データ)50mg/Kg投与群で生存腫瘍細胞は認められず、この濃度ではマウスに体重減少などの副作用は生じなかった。以上のことからSAHAがvivoモデルにおいても多剤耐性Ewing肉腫に対して良好な抗腫瘍効果を示すことが確認することができた。
隕石の化学組成に基づく太陽系初期の環境と物質進化に関する研究

本年度は研究期間の最終年度にあたり、研究のまとめを行うと共に、研究論文の作成を行った。すべての成果を論文形で公表するためにはまだしばらくの時間が必要であるが、全体として申請時の予定を上回る成果を上げることが出来たと総括することが出来る。本年度の研究成果をまとめると、(1)揮発性元素としてのハロゲン元素分析法の確立と、隕石試料への適用、(2)難揮発性親鉄元素の隕石中での存在度とその宇宙化学的意味の考察、(3)希土類元素、トリウム、ウランの隕石中での存在度とその宇宙化学的意味の考察、それに分析化学的研究として、(4)宇宙化学的試料の元素分析法の開発とその応用、となる。このうち、(1)では、隕石のような固体岩石試料中の安定4ハロゲン元素の分析法を開発し、隕石試料へ適用した。また、フッ素を除いた3元素について隕石中での元素の分布を調べ、ヨウ素が塩素、臭素と異なる分布をし、高温鉱物である輝石や長石にも少なからず含まれることを見出した。これはヨウ素の宇宙化学的挙動を理解する上で重要な知見である。(2)の難揮発性親鉄元素とは、いわゆる白金族を中心とする元素で、地球では核に存在する。火星隕石中のこれら元素を正確に定量したところ、火星の場合もほとんどは核に存在すると考えられるが、マントルににもコンドライト含有量の10^<-2>から10^<-3>程度存在する。これは、核が形成された後、隕石物質が火星に落下することによりもたらされたものと結論できる。(3)の研究は丁度終了したところで、これから論文の作成にはいるが、コンドライト隕石を特徴づける球粒(コンドルール)中の希土類元素、トリウム、ウランを正確に測定したところ、隕石母天体での熱変成に応じたこれら元素の動きをコンドルール中に認めることが出来た。これは、かつて全岩試料中での希土類元素の動きを考察したが(論文作成中)、その結論と整合するものである。コンドライト隕石の元素組成は太陽系の元素組成に類似することが知られているが、揮発性元素では必ずしもその関係は成り立たない。そこで、揮発性元素としてハロゲン元素を選び、コンドライト隕石中における存在度と分布を求めた。分析法に中性子放射化分析法と光量子放射化分析法を用い、塩素、臭素、ヨウ素の定量を行った。その結果、コンドライトの岩石学的分類とハロゲン元素、特にヨウ素の含有量には相関があることがわかった。また、3ハロゲン元素のコンドライト隕石中における分布を求めたところ、ヨウ素の分布が塩素、臭素とは異なることが分かった。従来、ヨウ素は揮発性の高い元素に属するものと考えられてきたが、コンドライト隕石中では、いわゆる高温鉱物にかなり分布していることが分かった。もしこの分布が2次的な元素の移動(拡散)によるものでないとすると、この結果は原始太陽系における環境下ではヨウ素の揮発性が高くなかったということを示すものであり、これまでの考えを変更せざるを得ない。また、岩石学的分類との相関は、隕石母天体の集積時に生じたものと解釈できるので、分別集積が起こったことを示唆するものである。以上の研究と並行して、コンドライト中のリンの定量を行った。リンはコンドライト中ではリン酸塩鉱物を構成する元素であるが、太陽系初期の元素の凝縮過程では恐らく親鉄元素として金属相と固溶体を形成しながら、気相から固相に移動したと予想されている。

コンドライト隕石のリンの含有量が、岩石学的分類に相関するかどうかを確かめるために、リンの系統的な分析を行った。分析にはICP原子発光分析法を用いた。共存元素によって定量値の精度に差が生じることが分かり、まず分析法を確立し、その後、各種コンドライト隕石中のリンの分析を系統的に実施した。コンドライト質隕石の元素組成は太陽系の元素組成に近似的に等しいが、揮発性元素の組成は限石間で大きく異なる。隕石中の揮発性元素の組成を正確に求めることにより、太陽系初期の環境や物質進化について考察することが可能となる。水銀は代表的な揮発性元素であるが、その存在度に関してはこれまでいろいろな問題が指摘されてきた。本研究では、炭素質コンドライトと普通コンドライトについて、水銀の含有量と、隕石を加熱することによってどのように水銀が揮発するかを調べ、併せてそのように回収された水銀の同位体比を求めた。その結果、水銀は比較的低温(200°C)でかなりの部分が揮発することが分かった。その揮発パターンは炭素質隕石と普通隕石ではそれほど違わないことも分かった。また、南極隕石では水銀の過剰存在度が見出され、南極大陸上での汚染があったものと思われる。以上の研究と並行して、2000年の1月に落下した神戸隕石について詳細な分析を行った。神戸隕石は落下直後に回収された隕石であり、地球上での汚染をほとんど経験していないことから隕石のもつ元素組成の特徴を正確に求めることができた。また、同隕石はCKに属し、これまでもっとも研究の遅れていた隕石グループの一つであったことから、その意味でも大きな意義を認めることができる。神戸隕石中の揮発性元素として、塩素、ホウ素、硫黄等を定量する事ができた。これらの元素はCIコンドライトに比べて0.2-0.3倍しか存在せず、CKコンドライトはこれら個発性元素を十分集積することなく形成されたものと考えられる。炭素質コンドライト中の揮発性元素存在度に関してはグループ間で大きな違いが見られるが、CKコンドライト中での揮発性元素の存在度はCRに次ぐもので、COと同程度であることが分かった。本年度は研究期間の最終年度にあたり、研究のまとめを行うと共に、研究論文の作成を行った。すべての成果を論文形で公表するためにはまだしばらくの時間が必要であるが、全体として申請時の予定を上回る成果を上げることが出来たと総括することが出来る。本年度の研究成果をまとめると、(1)揮発性元素としてのハロゲン元素分析法の確立と、隕石試料への適用、(2)難揮発性親鉄元素の隕石中での存在度とその宇宙化学的意味の考察、(3)希土類元素、トリウム、ウランの隕石中での存在度とその宇宙化学的意味の考察、それに分析化学的研究として、(4)宇宙化学的試料の元素分析法の開発とその応用、となる。このうち、(1)では、隕石のような固体岩石試料中の安定4ハロゲン元素の分析法を開発し、隕石試料へ適用した。また、フッ素を除いた3元素について隕石中での元素の分布を調べ、ヨウ素が塩素、臭素と異なる分布をし、高温鉱物である輝石や長石にも少なからず含まれることを見出した。これはヨウ素の宇宙化学的挙動を理解する上で重要な知見である。(2)の難揮発性親鉄元素とは、いわゆる白金族を中心とする元素で、地球では核に存在する。火星隕石中のこれら元素を正確に定量したところ、火星の場合もほとんどは核に存在すると考えられるが、マントルににもコンドライト含有量の10^<-2>から10^<-3>程度存在する。
渦鞭毛藻の環境応答・適応機構に関する研究

今年度はまず, Alexandrium tamarenseの低温適応機構の解析を行うために,他生物で低温適応機構に関与することが知られる脱共役タンパク質のcDNAクローニングを行い,4および20°Cで培養したA. tamarenseにおけるmRNA蓄積量を調べた.その結果, 20°Cのものと比較して4°CでmRNA量が増大することが示され,本生物種でも低温適応に脱共役タンパク質が重要である可能性が示唆された.次に,A. tamarenseの塩濃度適応機構を調べるために,19および38psuの塩濃度の海水で培養した細胞を用い,魚類などの塩分応答に関与するNa^+,K^+-ATPase活性を測定して比較した結果, 38psu海水で培養したものでより活性が高かったことから, A tamarenseの高塩分濃度適応にNa^+,K^+-ArPaseが関与することが示唆された.さらにAlexandriumの光応答機構を調べるために,岩手県大船渡湾において表層付近に出現するA.catenellaおよび水深10m付近に出現するA.tamarenseを用いて強光への耐性を調べた.900μmol/m^2/secの光強度の光を5時間照射した結果, A. tamarenseでは生細胞がほとんど存在しなかったのに対し, A. catenellaではほとんどの細胞が生存したことから, A. catenellaがより強い光耐性を有することが示された.最後に,A,tamarenseの光応答にも光受容体が重要であると考え, A. tamarenseからオプシン遺伝子を単離して他生物のものと比較した結果,バクテリオオプシンと類似することが明らかとなった.また, mRNA量の日周変動を調べた結果, A. tamarenseオプシンのmRNA量は明期に増大し,暗期には減少することが示されたことから,本種の走光性を含む光応答にオプシンが関与することが示唆された.渦鞭毛藻の環境応答・適応機構を明らかにすることを目的として、本年度はAlexandrium tamarenseの温度および塩分濃度応答について調べた。まず初めに、A.tamarenseの温度耐性を調べるために、15°Cで培養した細胞を0、4、15、20、25、30および37°Cで1時間処理した後、15°Cで一晩培養して生存率を比較した。その結果、025°C処理区では通常の培養温度である15°C処理区とほぼ同様の生存率を示したのに対して、30および37°Cではそれぞれ、15°C処理区の約50および20%まで生存率が減少した。次に、温度ストレス応答に関与するHeat shock protein 70(Hsp70)の熱ストレス処理による発現を、抗ラットHsp70抗体を用いたウェスタンブロット解析で調べた。その結果、15および20°Cで1時間処理した区と比較して、25および30°Cで1時間処理した区ではHsp70量が増大する事が示された。また、25°Cで30分4時間処理した細胞を用いて同様の解析を行った結果、30分、1、2および4時間と、処理時間に依存してHsp70量が増大した。さらに、A.tamarenseの塩分濃度耐性を調べるために、細胞を様々の塩分濃度の海水で作製した培地へ移して生存可能な塩分濃度を調べた。その結果、20100%(塩分濃度約735psu)の海水を含む倍地中で生存可能であることが示された。最後に、塩分濃度応答に関与することが予想されるMitogen-activated protein kinase(MAPK)のcDNAクローニングを3'-RACE法を用いて試みた結果、A.tamarense MAPKをコードする約850bpのcDNA断片を得る事ができた。昨年度は,岩手県大船渡湾より単離したAlexandrium tamarenseの温度耐性を調べ,4°Cと極めて低い温度でも生存が可能なことを示した。そこで本年度はまず,本種の低温適応機構を調べるために,他生物種でエネルギー産生に関与し,低温環境下で発現が誘導されることが報告されているArp合成酵素のγサブユニットおよびチトクロームc酸化酵素サブユニットIIのcDNAクローニングを行った。その結果,それぞれの遺伝子につき,他生物種の遺伝子と相同性を有するcDNAクローンを得る事ができた。また,4および20°Cで培養したA. tamarenseにおけるこれら遺伝子のmRNA量の変化をRNAドットプロット解析を用いて調べた結果,両遺伝子において20°C培養細胞と比較して,4°C培養のものでmRNA量が増大する事が示された。次に,A. tamarenseの栄養環境応答機構,とくに低リン応答機構を調べるため,低リン環境下で発現するタンパク質の探索を行うと共に,リン濃度が異なる培地で培養した際のアルカリホスファターゼ活性の変化を調べた。人工海水およびリン酸制限人工海水培地を用いてA. tamarenseを培養し,水溶性タンパク質を抽出してSDS-PAGEに供した結果,リン酸を含む培地で培養した細胞と比較して,リン酸制限人工海水培地培養細胞において,約75kDaのタンパク質成分の量が増大することが明らかとなった。また,水溶性タンパク質中のアルカリホスファターゼ活性を比較した結果,リン酸を含む培地で培養した細胞と比較して,リン酸制限人工海水培地のもので活性が増大する事が示された。

今年度はまず, Alexandrium tamarenseの低温適応機構の解析を行うために,他生物で低温適応機構に関与することが知られる脱共役タンパク質のcDNAクローニングを行い,4および20°Cで培養したA. tamarenseにおけるmRNA蓄積量を調べた.その結果, 20°Cのものと比較して4°CでmRNA量が増大することが示され,本生物種でも低温適応に脱共役タンパク質が重要である可能性が示唆された.次に,A. tamarenseの塩濃度適応機構を調べるために,19および38psuの塩濃度の海水で培養した細胞を用い,魚類などの塩分応答に関与するNa^+,K^+-ATPase活性を測定して比較した結果, 38psu海水で培養したものでより活性が高かったことから, A tamarenseの高塩分濃度適応にNa^+,K^+-ArPaseが関与することが示唆された.さらにAlexandriumの光応答機構を調べるために,岩手県大船渡湾において表層付近に出現するA.catenellaおよび水深10m付近に出現するA.tamarenseを用いて強光への耐性を調べた.900μmol/m^2/secの光強度の光を5時間照射した結果, A. tamarenseでは生細胞がほとんど存在しなかったのに対し, A. catenellaではほとんどの細胞が生存したことから, A. catenellaがより強い光耐性を有することが示された.最後に,A,tamarenseの光応答にも光受容体が重要であると考え, A. tamarenseからオプシン遺伝子を単離して他生物のものと比較した結果,バクテリオオプシンと類似することが明らかとなった.また, mRNA量の日周変動を調べた結果, A. tamarenseオプシンのmRNA量は明期に増大し,暗期には減少することが示されたことから,本種の走光性を含む光応答にオプシンが関与することが示唆された.
固体表面の吸着分子の配向状態及び素反応過程の時間分解観察

本研究は,固体表面における化学反応過程の微視的機構を理解する基礎として,吸着分子や反応中間体の結合と配向状態及びそれら吸着種と表面との相互作用を明らかにする新しい実験手法を開拓することを目的としている。その実現のために,全く新しい原理に基づく超高検出効率分析器(飛行時間フ-リエ変換型質量分析計)を考案し,これを用いた時間分解電子刺激脱離法の確立を目指した。電子刺激脱離法は,電子刺激により表面から脱離する化学種の角度分布,エネルギ-分布を測定するもので,分子線エピタキシ-のような動的成長過程の追跡に威力を発揮すると期待されている手法である。本研究では,上記の目的を達成するために,まず既存の超高真空槽を改造,整備して,電子刺激脱離装置を設置しうるようにした。また,飛行時間フ-リエ変換型質量分析計のイオン化室,静電シャッタ-,超高真空内2軸精密回転機構等の構成部分の設計,製作をおこなった。さらに,これらと並行して,低速電子解析/オ-ジェ電子分光装置,昇温脱離測定システム,仕事関数精密測定装置などの補助的表面分析機器,試料マニピュレ-タ,試料清浄化システム,試料温度制御機構等の開発,製作をも行なった。現在,飛行時間フ-リエ変換型質量分析計を超高真空槽内に組込み,調整を行なっている。今後は,固体結晶表面上での吸着種の配向状態の研究を進める予定である。
正常肝・障害肝の肝再生組織リモデリングにおける血管新生と非実質肝細胞の役割の解明

(目的)強力な血管新生阻害作用を有するHGFアンタゴニストであるNK4とVEGF受容体の抑制因子であるsFlt-1を用いて、肝再生に対する抑制的な効果についての検討を行なっている。(方法と結果)NK4遺伝子あるいはsFlt-1遺伝子をアデノウィルスベクターを用いマウスに遺伝子導入し、48時間後に70%部分肝切除術を施行した。対照としてLacZ遺伝子を用いた。まず、遺伝子導入後のNK4蛋白及びsFlt-1蛋白の発現をELISAにて確認したところ48時間でピークを示し、血清中での発現は約2週間持続した。NK4の血中濃度のピークは約300ng/ml、sFlt-1の血中濃度のピークは約350ng/mlであった。肝切除後、12,24,36,48,72,120時間後に組織学検討を行ったところ、NK4導入群では肝切除後の36時間においてBrdU陽性細胞数の減少及び48時間においてマイトーシスの細胞数の減少がみられCD31抗体による免疫染色においてNK4導入群では、類洞内皮細胞の増殖が抑制されていた。また、肝重量の計測においてもNK4導入群はコントロール群に比べて、肝重量の増加が遅延していた。sFlt-1導入群では、BrdU陽性細胞数及びマイトーシス細胞数は減少傾向にあるものの有意差は認めなかった。また、血管構造の安定化・不安定化に関わり血管の成熟過程において重要な役割があると考えられているAng-1,Ang-2,Tie-1,Tie-2のmRNA発現をRealtimeRT-PCRにて測定したところ、肝切除後34日においてAng-2,Tie-1,Tie-2の発現がNK4群において抑制されていた。(考察)肝再生は、血管新生に随伴する現象であり、血管成熟に必要なシグナルを抑制することにより、血管新生が抑制され、その結果肝再生が遅延したと考えられた。まず、遺伝子導入後48時間でのNK4蛋白及びsFlt-1の肝臓での発現を確認し、血清中におけるNK4及びsFlt-1の発現を経時的にELISAにて確認したところ血清中での発現は約2週間持続した。肝切除後、12、24、36、48、72、120時間後に組織学検討を行ったところ、NK4導入群では肝切除後の36時間においてBrDU陽性細胞数の減少及び48時間においてマイトーシスの細胞数の減少がみられCD31抗体による免疫染色においてNK4導入群では、類洞内皮細胞の増殖が抑制されていた。sFlt-1導入群では、BrDU陽性細胞数及びマイトーシス細胞数は減少傾向にあるものの有意差は認めなかった。肝切除後48時間における血清総ビリルビン、AST、ALTはコントロール群と比してNK4導入群・sFlt-1導入群において差を認めなかった。(考察)

肝再生は、血管新生に随伴する現象であり、血管新生を抑制することにより肝再生が遅延したと考えられた。(目的)強力な血管新生阻害作用を有するHGFアンタゴニストであるNK4とVEGF受容体の抑制因子であるsFlt-1を用いて、肝再生に対する抑制的な効果についての検討を行なっている。(方法と結果)NK4遺伝子あるいはsFlt-1遺伝子をアデノウイルスベクターを用いマウスに遺伝子導入し、48時間後に70%部分肝切除術を施行した。対照としてLacZ遺伝子を用いた。まず、遺伝子導入後のNK4蛋白及びsFlt-1蛋白の発現をELISAにて確認したところ48時間でピークを示し、血清中での発現は約2週間持続した。NK4の血中濃度のピークは約300ng/ml、sFlt-1の血中濃度のピークは約350ng/mlであった。肝切除後、12,24,36,48,72,120時間後に組織学検討を行ったところ、NK4導入群では肝切除後の36時間においてBrdU陽性細胞数の減少及び48時間においてマイトーシスの細胞数の減少がみられCD31抗体による免疫染色においてNK4導入群では、類洞内皮細胞の増殖が抑制されていた。また、肝重量の計測においてもNK4導入群はコントロール群に比べて、肝重量の増加が遅延していた。sFlt-1導入群では、BrdU陽性細胞数及びマイトーシス細胞数は減少傾向にあるものの有意差は認めなかった。また、血管構造の安定化・不安定化に関わり血管の成熟過程において重要な役割があると考えられているAng-1,Ang-2,Tie-1,Tie-2のmRNA発現をReal time RT-PCRにて測定したところ、肝切除後34日においてAng-2,Tie-1,Tie-2の発現がNK4群において抑制されていた。(考察)肝再生は、血管新生に随伴する現象であり、血管成熟に必要なシグナルを抑制することにより、血管新生が抑制され、その結果肝再生が遅延したと考えられた。
次世代シーケンサーを活用した過剰マーカー染色体の発生メカニズムの解明

小型の過剰染色体である過剰マーカー染色体は、比較的発生頻度が高い染色体異常である。病態の原因となる場合があり、その由来を知る事は臨床的に重要であるが、実際には、発生メカニズムはもとより、正確なゲノム領域やその構造もよく解らないままに診断されている。本研究では、発生機序の理解を深めることにより、詳細な解析が臨床検査に発展することを目指して研究を進めている。本研究により、過剰マーカー染色体には、染色体の重複、欠失領域を有するものや、断片化した重複領域を有するものなどさまざまであり、それぞれ発生メカニズムが異なることが推測された。また、一部の過剰マーカー染色体では、断片が順方向だけでなく逆方向の結合や、他の断片を飛び越えて結合しており、染色体粉砕現象により複雑に再編成されている知見が得られた。過剰マーカー染色体の構造解析は、分子遺伝学的解析により一部は進んだが、想定より複雑な構造を示しており、全体の解析が困難となった。引き続き、過剰マーカー染色体の再構成部位の確定を進めていく予定である。その際に、ロングリード次世代シーケンサーを用いて解析を進める予定である。過剰マーカー染色体の再編成された各断片間の結合部の解析により、発生メカニズムの解明に挑む。近年、がん細胞の染色体構造異常において、一つの染色体内の離れた複数箇所がばらばらに繋ぎ直された「染色体粉砕現象」が報告され注目されている。本研究では、生殖細胞で生じる過剰マーカー染色体は染色体粉砕現象を起点とし、複雑な構造を形成するという発生機序を仮定するとともに、様々な過剰マーカー染色体の発生機序の解析を行うことを計画した。発生機序の理解を深めることにより、詳細な解析が臨床検査に発展することを目指している。本年度は、まず、これまでに収集した過剰マーカー染色体の構成ゲノム領域の同定をマイクロアレイ染色体検査により確定した。その結果、その中の一部のケースでは、1つの染色体上に複数の領域でコピー数の増加が検出された。そして、FISH法により、増加領域は過剰マーカー染色体に起因することを確認した。これらの結果から、過剰マーカー染色体は、セントロメア近傍だけを含む単純なものばかりではなく、一部は、複雑な機構を経ている可能性が示された。解析した過剰マーカー染色体は、単純および複雑な構造を示唆させる様々なものがあり、中には染色体粉砕現象の可能性を想定させるケースが得られた。次世代シーケンス解析により、再編成結合部位の解析を進めている。昨年度の研究により、生殖細胞で生じる過剰マーカー染色体は単純ではなく、複雑な構造を形成する可能性が示された。本年度は、その一部のマーカー染色体の発生機序の解析を行うことを計画した。本年度は、重複領域と欠失領域を複雑に有するマーカー染色体を中心に、分子遺伝学的解析をおこなった。その結果、DNA複製過程で繰り返し配列を介したメカニズムにより発生したことが推定された。しかし、単なるDNA複製のエラー以外のメカニズムの関与も想定され、より複雑な過程を関していることが考えられた。マーカー染色体は複雑な構造を示唆させる様々なものがあり、メカニズムも複数想定される。本年度は分子遺伝学的解析により、一部のマーカー染色体の発生メカニズムの想定をおこなった。引き続き、新しく収集した過剰マーカー染色体の構成領域の確定を進めていく予定である。再編成された各断片間の結合部の相同配列の有無、マイクロホモロージーの数や挿入配列などは、修復機構を推定するのに有益な情報となる。次世代シーケンス解析をマイクロアレイ染色体検査の結果と対比しながら、DNA塩基レベルの再編成結合部位の同定をおこなう予定である。ライブラリー調整時のアーティファクトによる誤検出や低頻度モザイクや配列に依存し、検出が困難になる可能性がある。過剰マーカー染色体の濃縮やサンガーシーケンスによる確認をより密に行うことにより検出を試みる。

引き続き、新しいマーカー染色体を収集し過剰マーカー染色体の構成領域の確定を進めていく予定である。様々なパターンを示す複雑なマーカー染色体について、その発生機構を推定するために、現在得られているマーカー染色体の再編成された各断片間の結合部の相同配列の有無、マイクロホモロージーの数や挿入配列などは、修復機構を推定するのに有益な情報となる。次世代シーケンス解析をマイクロアレイ染色体検査の結果と対比しながら、DNA塩基レベルの再編成結合部位の同定をおこなう予定である。また、想定されたメカニズムを実証するために、マーカー染色体誘発モデル系の作成も試みる。引き続き、過剰マーカー染色体の再構成部位の確定を進めていく予定である。その際に、ロングリード次世代シーケンサーを用いて解析を進める予定である。過剰マーカー染色体の再編成された各断片間の結合部の解析により、発生メカニズムの解明に挑む。次世代シーケンサーによる解析を行うケースが予定より少なかったため、物品費を翌年度に使用する。(理由)新規マーカー染色体検体の収集が少なかったため、物品費を翌年度に使用する。(使用計画)新たに収集した過剰マーカー染色体をマイクロアレイ染色体検査や次世代シーケンサーを用いた再編成結合部位のDNA塩基レベルの同定を進める。また、新しい遺伝子改変技術を用いて、モデル系作成を進める予定である。既存の物品を用いて解析を行なっていたが、ある種の過剰マーカー染色体の結合断端が想定より複雑であり、解析が困難となった。近年、市場に出され、価格が若干安定化してきた別の次世代シーケンサーを導入することにより解析手法の変換を試み、解明に望む。新たに収集した過剰マーカー染色体をマイクロアレイ染色体検査により解析を行い、次世代シーケンサーを用いた再編成結合部位のDNA塩基レベルの同定を中心に進める予定である。