hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
壊死性腸炎発症の解明：microchimerism可視化ラットを用いたアプローチ

これらの結果をもとにラットを用いたE-GFP transgenicラットを交配させ、microchimerism可視化ラットを作成した。このラットの体内ではmaternal cellでは蛍光下に緑色蛍光を呈する細胞として確認できる。しかしmaternal cellが生体内で果たす役割については依然不明な点が多く、引き続き解明を行っていく。E(enhanced)GFPtransgenicラットを用いたmicrochimerizmモデル作成は問題なく行えるが、在胎21日ラットの臍帯へのカニュレーションは技術的に難しく手技に習熟が必要である。maternal cell microchimerismモデルの作成は可能であり、このラットを用いて、Real time-PCRをGFPprimer2を用いて行い遺伝子レベルでEGFPが存在することを証明する。maternal cell microchimerismが成立している事を確認し、次年度はFACSでの手技を安定化させ、消化管に見られるmaternal cellリンパ球のサブセットを解析する。この解析によりmaternal cellリンパ球がTcellまたNK細胞であれば壊死性腸炎の発症にmaternal cell microchimerismが大きく関わっている証明となる。また次年度はmicrochimerismがホーミングにより特異的臓器に再分布するかを研究する。maternal cell microchimerismモデルラットにも出生後よりDDSを経口投与し臍帯静脈より循環しているmaternal cellが他の臓器に比べホーミングにより消化管に局在化する事を確認する予定である。そのmicrochimerismの局在を調べるため、最もmicrochimerismが起っている時期のラットを確認しその胎生のラット用いて行う。GFPの蛍光がよく保たれるようパラホルムアルデヒドでラットを還流固定した後、組織をカルボキシルメチルセルロースで固定、粘膜やパイエル板、腸間膜リンパ節でのmicrochimerismを分析しホーミングの有無を確認しmicrochimerismの生体での役割を解明する予定である。小児外科研究を行うにあたっての技術的な問題点も解決されつつあり、今後は当初の計画通り進めていく事ができると考えている。
微小空間における化学発光の研究とマイクロ分析システムの検出法への応用

ルシゲニン(Luc)と生理活性アミンであるエピネフィリン(EP)との化学発光(CL)反応を微小空間において研究した。リアクター(容量:7μL)は光リソグラフィー/化学エッチング法によりシリコンウエファ上に製作した。製作したリアクターは検出器の光電子増倍管の前面に取り付けた。最初に、EPを含むLuc溶液とNaOH溶液の2液を連続的にリアクターに送液し、CLをCCDカメラで観察した。その結果、流速が5μl/minの条件において、発光反応はEPを含むLuc溶液側で進行した。したがって、微小空間における反応物質の拡散速度の違いが発光量に大きな影響を与えることがわかった。なお、微小空間においても発光量はEP濃度に直線的に依存し、5.0x10^<-8>MのEPが検出できた。つぎに、FIA法をμ-TASに適用するためLuc溶液の流れにEPを5μl注入し、別のラインのNaOH溶液とともにリアクターに流入して発光量を測定した。FIAの場合においても、発光量はEP濃度に依存し、検出下限は5.0x10^<-5>Mであった。FIAの場合、試料量が少ないことによる感度の低下が顕著に発現した。そこで、発光収率の向上を図るため、リアクター内での反応物の混合拡散がより増大する構造のリアクターを設計・製作した。リアクターの容量は7μLと同じであるが幅を1mmにすることにより、2液の接触面積を2倍に増大した。その結果、発光反応が進行する領域が拡大し、EPの検出下限は5.0x10^<-6>Mとなり、検出感度を10倍向上することに成功した。また、マイクロ分析システムへの応用が考えられる生物・化学発光反応に関してバルク溶液における高感度化を研究し、ホタル生物発光においてより増感効果が大きいカチオン性リポソームを見出した。フォトリソグラフィー技術を利用して、25mm角、厚さ625μmのシリコン基板表面に、KOHエッチングにより3種類のチャンネルパターンを作成した。それぞれの反応チャンネルの幅は2mm(パターン1)、1mm(パターン2)および400μm(パターン3)とし、体積はすべて7.2μ1となるように設計した。また、2つの試料導入口と1つの排出口は、シリコン基板の裏面に貫通させた。シリコン基板表面にパイレックスガラスを陽極接合し、μ-FIA用のマイクロチップとした。CL検出系のモデル反応にはルシゲニン(Luc)-エピネフリン(EP)CL反応を利用した。CL検出器内に設置したマイクロチップの裏面から、微量送液ポンプを用いてLuc/EP混合溶液およびNaOH/NaIO_4混合溶液を導入し、チャンネル内で反応させた。生じたCLを光電子増倍管で検出した。CL応答に及ぼすチャンネル幅の影響を検討した結果、いずれのパターンにおいても応答開始から数分で一定の発光強度となった。同じ流速で比較した場合、チャンネル幅が狭いほど、すなわちパターン3>2>1の順にCL強度は増大した。つぎに、パターン3におけるCL応答に及ぼす流速の影響を検討した。流速を20400μ1/minの範囲で変化させたところ、流速が速くなるにつれてCL強度は増大した。CCDカメラを用いてチャンネル内のCL反応の状態を観察したところ、チャンネル幅が狭いほど、あるいは流速が速いほど、CL反応試薬の混合が促進され、チャンネル内での発光領域が拡がっていることが確認された。また、CL応答に及ぼすEP濃度の影響を検討した。その結果、1×10^<-7>MまでEPを検出することができた。

ルシゲニン(Luc)と生理活性アミンであるエピネフィリン(EP)との化学発光(CL)反応を微小空間において研究した。リアクター(容量:7μL)は光リソグラフィー/化学エッチング法によりシリコンウエファ上に製作した。製作したリアクターは検出器の光電子増倍管の前面に取り付けた。最初に、EPを含むLuc溶液とNaOH溶液の2液を連続的にリアクターに送液し、CLをCCDカメラで観察した。その結果、流速が5μl/minの条件において、発光反応はEPを含むLuc溶液側で進行した。したがって、微小空間における反応物質の拡散速度の違いが発光量に大きな影響を与えることがわかった。なお、微小空間においても発光量はEP濃度に直線的に依存し、5.0x10^<-8>MのEPが検出できた。つぎに、FIA法をμ-TASに適用するためLuc溶液の流れにEPを5μl注入し、別のラインのNaOH溶液とともにリアクターに流入して発光量を測定した。FIAの場合においても、発光量はEP濃度に依存し、検出下限は5.0x10^<-5>Mであった。FIAの場合、試料量が少ないことによる感度の低下が顕著に発現した。そこで、発光収率の向上を図るため、リアクター内での反応物の混合拡散がより増大する構造のリアクターを設計・製作した。リアクターの容量は7μLと同じであるが幅を1mmにすることにより、2液の接触面積を2倍に増大した。その結果、発光反応が進行する領域が拡大し、EPの検出下限は5.0x10^<-6>Mとなり、検出感度を10倍向上することに成功した。また、マイクロ分析システムへの応用が考えられる生物・化学発光反応に関してバルク溶液における高感度化を研究し、ホタル生物発光においてより増感効果が大きいカチオン性リポソームを見出した。
乱流－非乱流境界面近傍の構造とエネルギー・物質輸送機構

自然や科学技術に現れるさまざまな流れにおいて、しばしば乱れの非常に強い領域と弱い領域の境界面(乱流ー非乱流境界面:T-NT境界面)が現れる。本研究では乱流中のT-NT境界面近傍の乱流場の構造とエネルギー・物質輸送機構に着目して研究を行った。とくに格子点数が4096の3乗におよぶ一様等方性乱流の大規模な乱流の直接数値シミュレーションのデータの条件付き統計解析によって、その構造やエネルギー輸送などについていくつかの特徴を明らかにした。自然や科学技術に現れるさまざまな流れにおいて、しばしば乱れの非常に強い領域と弱い領域の境界面(乱流ー非乱流境界面、以下T-NT界面と呼ぶ)が現れる。平成24年度は前年度に引き続き、大規模直接数値シミュレーション(Direct Numerical Simulation;以下DNSと略記する)のデータ解析を用いて、高いレイノルズ数の乱流中のT-NT界面近傍の(A)流れの構造、(B)エネルギー輸送、(C)物質輸送機構の視点から研究を行った。その主な研究実績の概要は以下のとおりである。(A)一様等方性乱流中の強いT-NT界面を伴う薄くて強い剪断層に着目し、その形状と内部における渦度および速度分布を、大規模DNSデータの解析によって定量的に明らかにした。その結果、その層の厚みがコルモゴロフ長の約10倍であり、層の内部で微細渦がおおむね層に平行な方向に向き、渦同士の間隔はおおよそ層の厚み程度でかなり密に分布していることが分かった。また実験データとDNSデータとがお互い整合していることが分かった。(B)大きな渦から小さな渦へのエネルギーの輸送、およびその逆方向の輸送が上記の薄くて強い剪断層内部、およびその外側近傍で強く起きていることが分かった。その層の内部では強い渦度が存在し、激しいエネルギー散逸が起きている。その散逸の程度は外部領域における散逸の約10倍程度であり、その散逸を賄う程度のエネルギーが層の外部から流入していること、およびこのことはRapid Distortion理論(RDT)と整合していることが分かった。(C)流れにより運ばれる粒子群の追跡を超並列コンピュータを用いて効率的にシミュレートするためのいくつかの数値計算スキームを検討し、その優劣を比較した。また超並列コンピュータによる流れ場のDNSを行い、T-NT界面付近の乱流構造の時間発展のデータベースを構築した。自然や科学技術に現れるさまざまな流れにおいて、乱れの非常に強い領域と弱い領域の境界面(以下T-NT界面と呼ぶ)がしばしば現れる。平成25年度は前年度までに引き続き乱流中のT-NT界面近傍の(A)流れの構造、(B)エネルギー輸送、(C)物質輸送機構に注目して研究を行った。その主な研究成果は以下の通りである。(A)強い乱流中にT-NT界面に挟まれた強いせん断層が現れる。直接数値シミュレーション(DNS)および実験データの解析により、その厚さはおおよそテイラーマイクロスケール程度であり、その内部はコルモゴルフスケール程度の直径を持つ渦管が密集し、エネルギー保有渦程度の非常に強い速度揺らぎを持っていることが分かった。ただし、そのせん断層領域は小さいため、流れ場全体の2次の速度相関や速度勾配相関などの低次の統計量には大きな影響を与えないことも分かった。(B)DNSデータは、上記せん断層領域の外側からせん断層に向けて乱流エネルギーの輸送が生じ、その輸送によりせん断層内部で細長く密集した強い渦管の生成と非常に強いエネルギー散逸が生じるという理解と整合していることが分かった。なお、実験データにより、そのようなせん断層は長い持続性を持つことが分かった。(C)乱流DNSコードに並列版3次スプライン補間粒子追跡コードを組み込み、乱流中の粒子追跡を行った。とくに、ストークス数St(流体への追従性を表す無次元数:St << 1ならば、微粒子の軌跡は流体の流線にほぼ一致する)の各粒子位置における渦度(粒子渦度)への影響を調べた結果、粒子渦度のラグランジュ的相関はStが大きいほど早く減衰すること、およびある特徴的なSt(0.05程度)が存在し、その値近傍では粒子渦度の統計平均が低いことが分かった。このことは渦度の強いせん断層やT-NT界面近傍における粒子渦度がStの影響を受けることを示唆している。その境界面の存在は流れ場全体に大きな影響を及ぼす。本研究の目的は、乱流の大規模直接数値シミュレーション(Direct Numerical Simulation;以下DNSと略記)のデータ解析によって、高いレイノルズ数の乱流中のT-NT界面近傍の(A)流れの構造、(B)エネルギー輸送、(C)物質輸送機構を明らかにすることである。平成23年度の主な研究実績の概要は以下のとおりである。(A)

一様等方性乱流の大規模DNSデータの条件付き統計解析によって、T-NT境界面近傍およびそれ以外の領域における速度、渦度場の統計の比較を行い、T-NT近傍の流れ場の構造の特徴を調べた。また、T-NT界面がその界面の一方から他方への影響の伝播に対するある種の障壁の役割を果たしていることを明らかにした。(B)一様等方性乱流中の空間上の各場所における、大きな渦から小さな渦へのエネルギー輸送(ここではカスケードと呼ぶ)の大規模DNSデータに基づく解析を、とくにT-NT界面近傍に着目して行った。また、Rapid Distortion Theory (RDT)と呼ばれる線形理論に基づいて、T-NT界面近傍でのエネルギーのカスケードおよび空間的輸送のモデルを構築し、その検証を行った。その検証は現在も続行中である。(C)流体運動によって運ばれる粒子群を、粒子の慣性効果を取り入れて追跡するためのシミュレーションコードを作成し、予備的解析を行った。その結果、粒子の慣性が大きいほど、乱流混合層のT-NT界面近傍に粒子が集まりやすいことなどが示された。「研究実績の概要」欄で述べたように、(A) T-NT界面を伴う薄くて強い剪断層近傍の流れ場の構造について、おおむね当初予定通り一様等方性乱流の大規模DNSデータの解析を行い、その構造を調べることができた。さらに、実験家の協力を得て、実験データとの比較も行うことができた。(B)エネルギー輸送については、一様等方性乱流中の上記剪断層の内部および近傍における輸送を定量的に明らかにできた。また、Rapid Distortion理論とDNSデータとの比較により、その整合性を示すことができた。(C)物質輸送機構については、流体運動によって運ばれる粒子群を超並列コンピュータを用いて追跡のための数値アルゴリズムについての知見を得ることができた。また乱流場の時間発展のデータベースを構築した。以上により、当研究はおおむね順調に進展していると評価される。「研究実績の概要」欄で述べたように、(A)T-NT界面面近傍の流れの構造について、おおむね当初予定通り一様等方性乱流の大規模DNSデータの条件付き統計解析を行い、その構造を調べることができた。また(B)エネルギー輸送については、一様等方性乱流中のエネルギーカスケードの大規模DNSデータ解析のみならず、新たなモデルを発展させることができた。さらに、(C)物質輸送機構については、流体運動によって運ばれる粒子群の追跡のためのシミュレーションコードを予定通り作成し、予備的解析を行うことができた。平成25年度以降も平成24年度までと同じ研究組織を構成し、引き続き研究を行う。具体的には以下のとおり研究を行う。(A)T-NT近傍の構造:一様乱流だけでなく、非一様乱流についてもDNSデータの条件付き統計解析によって、境界面近傍およびその他の領域における速度や渦度場を比較し、T-NT境界面近傍の特質の抽出を行う。(B)エネルギー輸送機構:乱流中のエネルギー輸送機構についてとくに相互作用する渦のスケールへの依存性に着目して解析を行い、エネルギーカスケード機構を調べる。
船底汚損スマートメンテナンスのための基盤技術の確立

フジツボ等が船体に付着して移動し本来の生息地から離れた場所で剥落する「生物越境」が問題視されている.こうした問題を未然に防ぐため,船体内部から生物付着を検知する手法の開発を目的とした. 9mm厚の鋼板を実海域に1カ月程度浸漬し,フジツボを表面に付着させた試験片を作成した.試験片のフジツボが付着していない面から付着面に向けて超音波を照射し,反射エコーの変化によりフジツボ付着の有無を判定する手法を検討した.検討の結果,反射エコーの増大に着目することでフジツボ付着を検知する方法を開発した.平成28年度には「浸漬試験による試験片の作成」,「生物付着試験片を用いた超音波エコー解析」,「3次元形状計測に向けた準備作業」および「実船舶での超音波計測」を実施した.「浸漬試験による試験片の作成」では,寸法200 mm×190 mmの一般構造用鋼(SS400)に防食塗装を施した上,海水中に浸漬して表面に生物を付着させた.「生物付着試験片を用いた超音波エコー解析」では,実際に超音波計測を実施した.作成した試験片の片面に超音波プローブを接触させ反射エコーの波形をパルサーレシーバからデジタルオシロスコープを介してノートパソコンに取り込む.航行中の船体内部からの計測を想定し,試験片の生物が付着した面を水面に接触させた状態で計測を行った.生物が付着した試験片で観測されたエコー強度のピーク値は,生物が付着していないものに比べて小さくなった.これはフジツボ付着の影響によるものと考える.フジツボはセメント質で平板上に付着しており,フジツボ付着箇所では試験片表面にセメント質の膜が構成されている.このセメント質の有無により表面での反射エコー強度に差が生じたと推測される.つまり,セメント質は水よりも超音波が透過しやすく(反射しにくく)試験片表面からの反射エコー強度が低下したと考える.「3次元形状計測に向けた準備作業」では,生物付着試験片の形状計測に向けて,高精度で3次元形状計測が可能なパターン投影式の形状計測機を導入した.「実船舶での超音波計測」では,沖合に停泊中の実船舶の機関室内に計測機器一式を持ち込み,船内壁面に超音波プローブを押し当てて計測を実施した.船体外板からの反射エコーが明確に計測されたことから,実船においても本手法が適用できると考える.一方で今回計測した船舶においては船体外板にはほとんど生物が付着しておらず,実船舶での超音波による生物付着計測の妥当性の確認はできなかった.おおむね年度当初の計画通りに進捗している.実船舶での超音波計測等,当初計画よりも進んだ試みも行った.平成29年度には「浸漬試験による試験片の作成」,「生物付着試験片を用いた超音波エコー解析」,「3次元形状計測」,「計測システムの試設計」を実施した.「浸漬試験による試験片の作成」では,H28年度と同様に,寸法200 mm×190 mm×厚さ9 mmの一般構造用鋼(SS400)に防食塗装を施したものを千葉県館山市の館山港内に浸漬し,フジツボを付着させて試験片を作成した.今年度は浸漬する時期および期間を調整することで,フジツボを(試験片全面ではなく)まばらに付着させた.このようにフジツボの付着/非付着箇所を明確に区分することで,超音波計測の結果の解釈がより容易になった.「生物付着試験片を用いた超音波エコー解析」では,今年度作成した試験片を用いて超音波計測を実施した.超音波プローブを走査(スキャン)し,試験片のある範囲の面積を計測した.スキャンのためプローブを動かす必要があることから,(プローブを動かしても試験片内へ伝播する超音波の量が変化しないように)試験片や超音波プローブを完全に没水状態で計測する「水浸探傷」を適用した.こうした計測の結果,フジツボ付着/非付着箇所での超音波エコーの特徴が明らかになった.「3次元形状計測」では,フジツボ付着試験片の3次元形状計測を実施した.形状計測の結果と超音波エコー計測の結果を照らし合わせ,フジツボの形状と計測される超音波エコーの関係について考察した.「計測システムの試設計」では,実船舶への適用を想定して必要な機器構成や船舶内でのセンサ設置位置,方法等を検討した.研究期間を通じて,船体相当の板厚(10mm程度)を隔てて超音波によりフジツボ付着の有無を検出する手法の実現可能性が示された.フジツボ等が船体に付着して移動し本来の生息地から離れた場所で剥落する「生物越境」が問題視されている.こうした問題を未然に防ぐため,船体内部から生物付着を検知する手法の開発を目的とした. 9mm厚の鋼板を実海域に1カ月程度浸漬し,フジツボを表面に付着させた試験片を作成した.試験片のフジツボが付着していない面から付着面に向けて超音波を照射し,反射エコーの変化によりフジツボ付着の有無を判定する手法を検討した.検討の結果,反射エコーの増大に着目することでフジツボ付着を検知する方法を開発した.平成29年度は,平成28年度に得られた知見を踏まえた上,超音波プローブの種類を変更する等して更に詳細な超音波エコーの分析を実施する.また,超音波エコー計測結果と3次元形状計測結果を比較・対照し,生物付着を検出するために最も適したエコー情報の抽出を検討する.応用力学競争入札等により当初予定価格よりも安価に物品購入ができたため。超音波エコー計測がより容易に行えるような治具の製作費等として使用する.
ケニア共和国における地域保健普及員に対する研修の効果 : クラスターランダム化研究

本研究は、ユニバーサルヘルスカバレッジの達成に必須である保健人材、特に地域保健人材に焦点を当てた研究である。地域保健人材は、保健人材の不足を補うためにサブサハラ以南のアフリカにおいて新たに育成し始めているが、彼らの業務遂行能力にはばらつきがあり、その解決が急務である。そのため、ケニア共和国において実施された「継続的な研修」と「患者追跡活動」が彼らの業務遂行能力にどのような影響を与えたのかを明確にすることを主目的とする。さらに業務遂行能力が向上した保健人材が、地域住民の健康問題解決にどの程度寄与しているかを明らかにすることを副目的とする。上記した2つの介入(継続的な研修と患者追跡活動)以外にも金銭的なサポートやスーパービジョンの実施などの介入に関する情報も加え、固定効果モデルを使って分析を行った。結果として、研修が彼らの知識だけでなく、家の訪問数を向上させることが明らかになった。ただし患者追跡活動を追加で行ったグループでは、知識の減少がみられたことから、彼らのキャパシティを考えながら、業務を委託する必要が示唆された。また金銭的サポートは、知識の向上はあまり見られず、家の訪問数のみを向上させた。また副目的を達成するために、地域保健人材がおり、パフォーマンスが高い地区とそうでない地区を比較した調査も実施した。この調査は、ユニセフが実施したMICSサーベイのデータと政府の地域保健人材に関する情報を組み合わせて行われた。結果として、地域保健人材がおり、高いパフォーマンスの地区は、下痢に対する適切な治療行動と有意に関連していた。この結果は、今後彼らのパフォーマンスを向上させたい政府やドナーにとって非常に貴重な資料になると考えられる。さらに彼らの有効性が示されたことで、より多くの資源が彼らの活動に分配され、持続的な活動が行われることが期待される。
肝細胞癌アポトーシス誘導因子としてのインターフェロン関連遺伝子の解析

【目的】肝細胞癌治療におけるインターフェロン(IFN)サブタイプ選択の必要性を明らかにする為、α2とα8および5-FUとの併用による肝細胞癌株でのアポトーシス誘導の相違について検討した。【方法】JAK/STAT系についてwestern blotting、caspase3・8・9の活性化について比色プロテアーゼアッセイ、ISRE活性化についてルシフェラーゼアッセイで検討した。また、これら効果の確認の為IFN情報伝達経路阻害-JAK1, Tyk2, IRF9の各蛋白のsiRNA使用、Caspase阻害-Caspase阻害剤使用、P13K阻害及びMAPK阻害-各阻害剤使用、による変化についても解析した。肝細胞癌株(Hep3B)培養上清にIFNα2・α8を1000IU/ml、5-FU10μg/mlを加え培養後アポトーシス定量を行った。JAK/STAT系についてwestern blotting、caspase3・8・9の活性化について比色プロテアーゼアッセイ、ISRE活性化についてルシフェラーゼアッセイで検討した。【成績】IFNα8の方がα2よりもアポトーシスをより強く誘導し、この効果は5-FU併用でより顕著になることが明らかになった。またCaspase8の活性化がCaspase3,9に比べてより強いことが判明した。Caspase9阻害剤投与によってCaspase9の活性は低下したが、下流CaspaseであるCaspase3の活性化の低下はわずかであった。一方Caspase8阻害剤の投与によってCaspase8,3いずれの活性も低下し、IFNと5FU併用によるCaspase活性化にはCaspase8経路がより重要であることが明らかになった。MAPK, P13Kの阻害によりアポトーシス・Caspase活性はともに抑制されなかった。JAK1, Tyk2, IRF9のいずれの作用が抑制されてもアポトーシス・Caspase活性は強く抑制され、IFN情報伝達経路全ての活性化が効果発現に必要であることが明らかになった。またJAK/STAT系の活性化は5-FUにより増強され、IFNと5-FUは相互に活性化することでその作用を増強していることが示された。【結論】肝細胞癌株に対するアポトーシス誘導能はIFNα2よりα8で強力で、5-FUと併用した場合、その差は顕著となった。この効果発現にはIFNにより活性化され、5-FUにより増強されるCaspase8の関与が大きいと考えられた【目的】肝細胞癌治療におけるインターフェロン(IFN)サブタイプ選択の必要性を明らかにする為、α2とα8および5-FUとの併用による肝細胞癌株でのアポトーシス誘導の相違について検討した。この効果発現にはIFNにより活性化され、5-FUにより増強されるCaspase8の関与が大きいと考えられた【目的】

肝細胞癌治療におけるインターフェロン(IFN)サブタイプ選択の必要性を明らかにする為、α2とα8および5-FUとの併用による肝細胞癌株でのアポトーシス誘導の相違について検討した。【方法】肝細胞癌株(Hep3B、PLC/PRF/5)培養上清にIFNα2・α8を1000IU/ml、5-FU10μg/mlを加え培養後アポトーシス定量を行った。JAK/STAT系及びP27^<Kip1>、P21^<Cip1>についてwestern blotting、caspase3・8・9の活性化について比色プロテアーゼアッセイ、ISRE活性化についてルシフェラーゼアッセイで検討した。また、IFN及びアポトーシス関連遺伝子のDNAマイクロアレイ(JGS社製)で遺伝子発現を解析した。【成績】Hep3BはIFN単独でα2に比べα8でアポトーシスが強く誘導された。PLC/PRF/5は、5-FUとの併用でα2よりα8で強くアポトーシスが誘導された。Hep3B細胞におけるマイクロアレイ解析ではα2とα8処理により生じる遺伝子発現プロファイルは異なるパターンを示していた。他方、Hep3BではJAK/STAT系、ISRE活性化・P27^<Kip1>、P21^<Cip1>の発現で両者に大きな差異は認められなかった。5-FUとの併用でcaspase3・8・9の活性化の程度がα2よりα8で高かった。【結論】肝細胞癌株に対しIFNα2とα8はアポトーシスを誘導しその程度及び5-FUと併用での増強効果は細胞株の種類により異なっており、これにはcaspase活性化の違いが関係していると考えられた。【今後の展開】caspase活性化の違いがIFNα2とα8で認められることが明らかになってきた。今後はこの相違がどのような情報伝達経路を介して生じているのか、IFN情報伝達経路とcaspase活性化の経路の関連を明らかにしていく。【目的】肝細胞癌治療におけるインターフェロン(IFN)サブタイプ選択の必要性を明らかにする為、α2とα8および5-FUとの併用による肝細胞癌株でのアポトーシス誘導の相違について検討した。JAK/STAT系及びp27^<Kip1>、p21^<Cip1>についてwestern blotting、caspase3・8・9の活性化について比色プロテアーゼアッセイ、ISRE活性化についてルシフェラーゼアッセイで検討した。また、Caspase阻害剤およびIFN情報伝達系とCaspase経路の橋渡し役であるPI3K阻害剤投与による変化についても解析した。Hep3Bでは5-FUとの併用でcaspase3・8・9の活性化の程度がα2よりα8で高かった。Caspase9阻害剤投与によってCaspase9の活性は低下したが、下流CaspaseであるCaspase3の活性化の程度はわずかであった。
地下圏に存在する電気に依存する生命圏の探索

地球上には膨大な数の微生物が存在しており、そのかなりの部分が海洋地下圏や土壌地下圏に生息していると考えられている。地下環境中には、酸素の替わりに地下圏に大量に存在する金属酸化物(鉄)に電子を移送して呼吸する固体鉄還元微生物が広範に存在する事が知られている。また、金属酸化物から供給される電子は、微生物の生命活動を支える主たるエネルギー源である可能性も出てきた。そこで本研究では、多種多様な掘削コア等に含まれる地下圏微生物群を用い、地下圏における「固体に電子を供与し呼吸する微生物」や「電気をエネルギー源とする微生物」の存在の有無を明らかにし、地下圏に存在する電気に依存する生命圏の探索に挑戦した。まず、地下圏における電気に依存する微生物の動態を知るため、港湾堆積物、下北沖掘削コア、襟裳沖掘削コア、海底の蛇紋岩海山の掘削コア、そして南関東ガス田において地下から湧出する天然ガス田湧出地下水の地下圏微生物群を微生物電気化学リアクターに供し、発電培養あるいは電気合成培養を行った。その結果、天然ガス田を胚胎する地下水を用いた電気合成培養と港湾堆積物を用いた発電培養において良好な電流産生が見られ、電気に依存して生きる微生物バイオフィルムが電極上に形成される事が分かった。この電極上に形成された微生物群集のメタオミクス解析を行った結果、酢酸あるいは水素が発電微生物の重要な栄養基質であり、海水地下圏ではGeoalkalibacter属、汽水地下圏ではGeobacter属に属する発電微生物が機能している事が示された。また、海水地下圏における電気メタン合成微生物としてMethanocalculus属とMethanobacterium属が機能している事が示唆された。本研究結果より、地下環境には地下電気生命圏を形成しうる様々な微生物群が存在する事が分かった。また、大地に常に流れている微弱な地電流などの電気エネルギーは、地下圏における微生物の生命活動を支える主たるエネルギー源である可能性も出てきた。そこで本研究では、海洋研究開発機構の保有する多種多様な掘削コア等に含まれる地下圏微生物群を用い、地下圏における「固体に電子を供与し呼吸する微生物」や「電気をエネルギー源とする微生物」の存在の有無を明らかにし、地下圏に存在する電気に依存する生命圏の探索に挑戦する。まず、地下圏における電気に依存する微生物の動態を知るため、地下圏に存在する微生物群を微生物電気化学リアクターに供し、電気を使った培養を行った。リアクター中には炭素織布で作成した電極を二枚封入し、その電極間に600mVの電圧を印加し、流れる電流値をモニタリングした。地下圏微生物の播種源として、下北沖掘削コア(海底下2000mの石炭層)、海底の蛇紋岩海山の掘削コア、そして南関東ガス田において地下600mから湧出する天然ガス田かん水を用いた。その結果、天然ガス田かん水に電圧を印加したものは良好な電流産生が見られ、電気に依存して生きる微生物バイオフィルムが両電極に形成された。下北沖掘削コアのものもバイオフィルムの形成は見られたが、電流産生は小さく、電気に依存している微生物は少量であると考えられた。蛇紋岩海山の掘削コアからは電流産生が見られず、電気に依存している微生物反応は起こっていないと考えられた。また、電極では無く、導電性ナノ粒子を介した電子授受の促進テストを行うため、マグネタイトのナノ粒子を作成した。【1】電気化学リアクターによる電気微生物の集積培養各地下圏微生物群集を、1槽式電気化学リアクター(容量400 mL)に播種し、600mVの電圧を印加した培養を行い、各電極への電子をやり取りする微生物の集積培養を行った。有機物添加や気相ガス組成などは、各コアの環境条件を模倣して決定し、発生する電流値をモニターすることで、電気活性のある微生物の増殖の有無を確認した。【2】磁鉄鉱を介した電気共生の確立各地下圏微生物群集を、導電性の磁鉄鉱(Magnetite)と共に培養を行うため、磁鉄鉱のナノ粒子の作成を行った。このナノ粒子は、磁石を用いて取り出す事が可能である事を確認した。

その結果、天然ガス田を胚胎する地下水を用いた電気合成培養と港湾堆積物を用いた発電培養において良好な電流産生が見られ、電気に依存して生きる微生物バイオフィルムが電極上に形成される事が分かった。この電極上に形成された微生物群集のメタオミクス解析を行った結果、酢酸あるいは水素が発電微生物の重要な栄養基質であり、海水地下圏ではGeoalkalibacter属、汽水地下圏ではGeobacter属に属する発電微生物が機能している事が示された。また、海水地下圏における電気メタン合成微生物としてMethanocalculus属とMethanobacterium属が機能している事が示唆された。本研究結果より、地下環境には地下電気生命圏を形成しうる様々な微生物群が存在する事が分かった。【4】メタオミクスを用いた電子輸送機序の解析地下圏における電気エネルギーに依存する微生物の種類、および電子輸送に関連する遺伝子を同定するために16S rRNAを用いた群集構造解析とメタオミクス解析を並列的に行う予定である。上記の集積培養系からDNA・RNAの抽出作業をスタートしており、H30年度は、そのシーケンス作業を逐次進めていく予定である。得られたデータより、電気活性の高い微生物のゲノム情報を作成し、そこにコードされる機能遺伝子を同定した後、菌体外との電子授受のメカニズムを解析してゆく予定である。RNA抽出作業の遅れにより、H29年度に予定していたシーケンス関連の研究をH30年度の早い段階で行うように変更したため、次年度使用額が生じた。H30年度の比較的早い段階で、シーケンス関連試薬、消耗品等に使用する予定である。
黒鉛上の酸素単分子層の磁気相転移

黒鉛表面上に吸着した酸素単分子層は、磁気モーメントをもつ理想的な2次元結晶であり、2次元磁性体として新しいタイプの磁気相転移を示す可能性がある。この磁気相転移を研究するため、種々の層厚さの酸素分子層結晶を育成し、その帯磁率、磁化過程、μSRおよびESR測定を行い、この磁性体の静的及び動的性質を研究した。帯磁率の温度依存性測定では、被覆率c=1.73.6にたいし酸素分子層の3Dバルク結晶融解にともなう異常が38K付近に、また、c=4.6では3D結晶の反強磁性相転移による異常が25Kに観測されたが、中性子回折の実験で報告されているT=11.9Kにおける2D結晶の磁気相転移の異常は観測されなかった(異常があったにしても、極めて弱いものである)。この結果は、面内帯磁率、および垂直帯磁率に共通した性質である。2テスラまでの磁化過程の測定では、磁化は直線的に増加し、磁気的相転移の証拠は観測できなかった。一方、動的な磁気的測定であるμSR測定(プローブ時間10^<-13>10^<-10>)では、零磁場縦緩和法における緩和時間及び初期非対称性に12K以下に僅かな減少が観測され、系が秩序状態になったことを示唆している。さらに、ESR測定(高被覆率試料)では、約15K付近まで信号が観測されるのにたいし、それ以下では焼失することから、15K以下に磁気秩序相存在の可能性が考えられる。これら動的な測定の結果は、酸素単分子層結晶の磁気的性質が2次元系に特有の揺らぎの効果に依っている可能性を示しており、2次元三角格子磁性体の統計力学にとって極めて興味深いものである。
シナプス形成に於けるN-カドヘリン内在化機構の解明

本研究は、平面内細胞極性因子Vangl2によるシナプス接着分子Nカドヘリンの制御の分子機構を解明することを目的とした。正常な神経細胞ではNカドヘリンと後シナプスの主要な足場蛋白質であるPSD-95は相補的な局在を示すが、Vangl2の発現をshRNAで抑制させた神経細胞では、NカドヘリンとPSD-95の共局在が増加する異常が見られた。このことからVangl2が樹状突起においてPSD-95、Nカドヘリンの分布を制御している可能性が示唆された。また、シナプス形成に於いて、Vangl2によるNカドヘリンの制御の役割を遺伝学的に調べる過程で、その異常が二分脊椎を引き起こすことが判明した。本研究は、我々が発見した、平面内細胞極性因子Vangl2によるシナプス接着分子Nカドヘリンのエンドサイトーシス制御の分子メカニズムを明らかにすることを目的とする。平成27年度はNカドヘリン/Vangl2複合体に含まれる新規結合因子の探索を試み、主に2つの成果を得た。第一に、複合体精製の予備実験の過程で、ラット海馬由来神経細胞にGFP-Vangl2を発現させ、シナプス後肥厚部の主要な足場蛋白質であるPSD-95の局在を観察したところ、Vangl2のC末端部を欠損させた変異体を過剰発現させた神経細胞ではPSD-95との共局在が減少することが分かった。また、正常な神経細胞ではNカドヘリンとPSD-95は相補的な局在を示すが、Vangl2の発現をノックダウンさせると樹状突起のPSD-95密度が減少するとともに、NカドヘリンとPSD-95の共局在が増加する異常が見られた。この時、PSD-95のシグナル強度の分布は正常細胞に比べて拡散していることも分かった。このことからVangl2が樹状突起においてPSD-95、Nカドヘリンをコンパートメント化し分布を制御している可能性が示唆された。第二には、当該複合体結合蛋白質の候補を得ることができた。具体に的にはヒト胎児腎由来293T細胞に、当該遺伝子を導入し、複合体の精製を試みた。溶出画分をSDS-PAGEで分離し、銀染色を行ったところ、複合体結合蛋白質の候補バンドが現れたので、これらをnano LC-MS/MSで解析、同定した。現在はこれらが特異的相互作用によって得られたものであることを確認するために抗Nカドヘリン抗体で共免疫沈降を行い、候補特異的抗体でウェスタンブロット、免疫染色を行っている。本研究の推進によってN-カドヘリンの細胞内輸送、及びそれに依存するシナプス結合の調節機構を明らかにできると考えられる。当初の予定では、ラット初代培養ニューロンを用いて当該複合体に結合する分子を探索する計画だったが、蛋白質量の収穫効率が良くないことから断念し、293T細胞による探索へと計画を変更した。よって、当該複合体結合候補蛋白質の同定にやや遅れが生じた。しかし、候補蛋白質に対する特異抗体は既に準備されており、細胞生物学的解析も始めているので、本計画は概ね順調に進んでいる。本研究は、我々が発見した平面内細胞極性因子Vangl2によるシナプス接着分子Nカドヘリンのエンドサイトーシス制御の分子機構を解明することを目的とした。平成27年度は、Nカドヘリン/Vangl2複合体のエンドサイトーシスを制御する可能性のある新規の結合蛋白質候補をNカドヘリン/Vangl2の免疫沈降により共沈させ、共沈物をnano LC-MS/MSで解析、候補を同定した。平成28年度は、それぞれ同定した蛋白質に対する特異抗体を用いて、共免疫沈降法によりNカドヘリン/Vangl2と複合体を形成するかどうかを解析した。しかし、候補の中にはNカドヘリン/Vangl2と結合するものは見出せなかった。そこで、これらと相互作用する既知の因子あるいは、シグナル伝達経路の中にNカドヘリンのエンドサイトーシスを制御するものがあるかどうかを調べることにした。そのために、これらの遺伝子の発現プラスミド及び、shRNAを構築した。そして、これらをNカドヘリン/Vangl2を発現した293T細胞に導入して、Nカドヘリンの細胞表面に発現する割合を評価して、その因子がNカドヘリンのエンドサイトーシスを制御しうるかどうか解析している。評価法としては細胞表面蛋白質のビオチン化標識を用いている。また、シナプス形成に於いて、Vangl2によるNカドヘリンエンドサイトーシスの制御の役割を遺伝学的に調べている。その過程で、その異常が二分脊椎を引き起こすことが判明した。

同定された分子の発現をshRNAを用いて抑制し、N-カドヘリンのエンドサイトーシス制御にどのような異常が生じるのかを調べ、また、そのシナプス形成に於ける役割を蛍光抗体法によって、LTP誘導に対する必要性を電気生理学的手法によって、それぞれ解析する。更に当該分子を抑制したニューロンに於いてNMDA受容体活性化によるLTP誘導刺激を加えた際にN-カドヘリンが正常な挙動を示すかどうか、また、コントロールニューロンに於いてそれらの刺激を加えた際に当該分子自体がどのような動態を示すのかを、分子イメージングの手法を用いて明らかにする。N-カドヘリンの動態制御に関わる新規分子群のシナプスに於ける必要性を総合的に明らかにする計画である。分子生物学年度途中の異動により、数週間、計画実行に空白期間が生じたこと、また、当該複合体結合候補の同定に時間がかかったことで、次年度使用額が生じた。平成28年度は、シナプス結合に於けるエンドサイトーシス解析や、シナプスの形態を解析するためのラット海馬由来ニューロン初代培養を多く行うので、相当数の妊娠ラットを購入する計画である。また、ニューロン初代培養は特別な培地、試薬を必要とし、遺伝子導入が困難なため高額な遺伝子導入試薬を使わざるを得ない、そのために多くの細胞培養試薬購入に使用する。また、社会に研究成果を発信するために学会発表の経費、論文投稿に係る経費を使用する計画である。
悪性腫瘍および創傷治癒において、5型ラミニンが細胞の接着に果たす役割に関する研究

5型ラミニンは基底層角化細胞と基底膜を結び付けるヘミデスモゾームを構成するanchoringfilamentに局在している。また本蛋白が先天性表皮水疱症(JEB)の最重症型であるHerlitz型で5型ラミニンの異常が報告されて、広く上皮系細胞の基底膜への接着に重要な役割を果たしていることが明らかになってきている。われわれはこれまで発表した5型ラミニン(LAM5)の細胞内アッセンブリと分泌に関する基礎的研究を踏まえて、生理的および病的状態での角化細胞の細胞外マトリクスへの接着についての知見を得ることを目的とした。準備として1)LAM5のαβγサブユニットのcDNAをpGEX発現ベクターに挿入しリコンビナント蛋白を得、兎に免疫しポリクローナル抗血清を作成した。2)ヒト表皮で器官培養を行い、表皮辺緑から角化細胞が伸長する部分(epiboly)を測定した。これは創傷治癒の際の表皮欠損の閉鎖機構を推定するのに役立ち、各種薬剤の創傷治癒への影響をアッセイするin vitroの系に適していると考えられた。この器官培養系にジブチリルサイクリックAMP(dbcAMP)やトコレチナ-ト等の創傷治癒促進効果のある薬剤を添加してepibilyの伸長を比較したところ、dbcAMP(10^<-6>10^<-7>M)には伸長促進作用がみられたがトコレチナ-トではみられなかった。また増殖マーカーであるPCNA抗原の発現につき検討したところ、dbcAMPによって表皮角化細胞でのPCNA発現がコントロールに比べ増強しておりこの細胞増殖促進作用がepiboly伸長に関連している可能性が示唆された。epiboly部での基底膜蛋白の発現について検討するには同部が凍結切片で薄切しにくいという難点があり観察不能であった。また電子顕微鏡を用いて同部の基底膜(特にヘミデスモゾーム)再構成を観察したが、動物モデルにおける観察よりも得られる情報が少ないと考えられた。器官培養実験で情報が得られなかった点について現在へアレスマウスを用いた創傷治癒実験で基底膜の再構成を含め検討を進めている。本研究は表皮器官培養を用いて、創傷治癒の一過程である表皮細胞の遊走を検討することを目的としている。現在までの進展は1)表皮器官培養コンデションの決定ウシ胎児血清を含まないDMEM培地を用いた表皮器官培養において、最低72時間まで創傷辺縁での表皮細胞遊走(epiboly)を確認した。これにより各種薬剤が表皮細胞遊走と表皮再生に及ぼす影響をより正確に測定できる。2)創傷治癒に有効とされる薬剤が表皮遊走に及ぼす影響の検討上記の実験系に、ジブチリルサイクリックAMP(dcAMP)やトコレチナ-トなどの創傷治癒を促進する薬剤を添加して表皮遊走能の変化を検討した。その結果表皮遊走能促進がdcAMP(1010)には見られたが、トコレチナ-トには見られなかった。3)リコンビナント5型ラミニン蛋白に対する抗体の作成5型ラミニンα鎖のcDNAを組み込んだ発現ベクターを用いて、大腸菌に産生させたリコンビナント蛋白をウサギに免役し、抗体を作成した。4)器官培養における表皮基底膜の再構成表皮の再生にともなって、表皮真皮の接着に重要な基底膜がいかに再構成されているかを電子顕微鏡的に検討した。また基底膜構成成分に対する抗体で免疫組織学的に観察した。

その結果今回観察されたepibolyは伸長度が低くin vivoの観察に比べ得られる情報が少ないと考えられた。今後a)epibolyの系に各種抗体を添加しその伸長を検討するb)マウスを用いた創傷治癒実験を行ない電子顕微鏡的および免疫組織学的検討を進める予定であるなおこれらの一部のデータを日本皮膚科学会総会および米国研究皮膚科学会にて発表する予定である。5型ラミニンは基底層角化細胞と基底膜を結び付けるヘミデスモゾームを構成するanchoringfilamentに局在している。また本蛋白が先天性表皮水疱症(JEB)の最重症型であるHerlitz型で5型ラミニンの異常が報告されて、広く上皮系細胞の基底膜への接着に重要な役割を果たしていることが明らかになってきている。われわれはこれまで発表した5型ラミニン(LAM5)の細胞内アッセンブリと分泌に関する基礎的研究を踏まえて、生理的および病的状態での角化細胞の細胞外マトリクスへの接着についての知見を得ることを目的とした。準備として1)LAM5のαβγサブユニットのcDNAをpGEX発現ベクターに挿入しリコンビナント蛋白を得、兎に免疫しポリクローナル抗血清を作成した。2)ヒト表皮で器官培養を行い、表皮辺縁から角化細胞が伸長する部分(epiboly)を測定した。これは創傷治癒の際の表皮欠損の閉鎖機構を推定するのに役立ち、各種薬剤の創傷治癒への影響をアッセイするin vitroの系に適していると考えられた。この器官培養系にジブチリルサイクリックAMP(dbcAMP)やトコレチナ-ト等の創傷治癒促進効果のある薬剤を添加してepibilyの伸長を比較したところ、dbcAMP(10^<-6>10^<-7>M)には伸長促進作用がみられたがトコレチナ-トではみられなかった。また増殖マーカーであるPCNA抗原の発現につき検討したところ、dbcAMPによって表皮角化細胞でのPCNA発現がコントロールに比べ増強しておりこの細胞増殖促進作用がepiboly伸長に関連している可能性が示唆された。epiboly部での基底膜蛋白の発現について検討するには同部が凍結切片で薄切しにくいという難点があり観察不能であった。また電子顕微鏡を用いて同部の基底膜(特にヘミデスモゾーム)再構成を観察したが、動物モデルにおける観察よりも得られる情報が少ないと考えられた。器官培養実験で情報が得られなかった点について現在ヘアレスマウスを用いた創傷治癒実験で基底膜の再構成を含め検討を進めている。
ルイス酸触媒の設計と反応開発に基づく機能性分子の創製

我々は,ルイス酸触媒の開発と新しい合成反応への適用について検討を行った.新規ルイス酸としてアルミニウムメチドおよびシリルメチドを開発し,これらがディールス-アルダー反応や向山-マイケル反応などに有用であることを示した.また,温和なルイス酸を用いた合成反応に関する検討も併せて行い,連続的アジド化/1,3-双極子付加環化反応を開発した.本手法は構造的観点から興味深いトリアゾール縮環型糖ミメティクスの合成に有用であった.我々は,ルイス酸触媒の開発と新しい合成反応への適用について検討を行った.新規ルイス酸としてアルミニウムメチドおよびシリルメチドを開発し,これらがディールス-アルダー反応や向山-マイケル反応などに有用であることを示した.また,温和なルイス酸を用いた合成反応に関する検討も併せて行い,連続的アジド化/1,3-双極子付加環化反応を開発した.本手法は構造的観点から興味深いトリアゾール縮環型糖ミメティクスの合成に有用であった.α,β-不飽和ラクトン類とシクロペンタジエンのDiels-Alder反応に有用なLewis酸触媒を探索し,ビス(トリフルオロメタンスルホニル)メタンとトリメチルアルミニウムから調製できるアルミニウムメチド錯体を開発した.この触媒は既存のLewis酸に比べて使用量の低減が可能であり,かつ高活性である.そこで,従来,反応性の低さから十分な検討がなされていなかった種々のα,β-不飽和ラクトンのDieb-Alder反応を検討し,ラクトン環のサイズと置換基が反応性および立体選択性に与える影響を体系づけた.この知見は,入手容易な種々のα,β-不飽和ラクトンを有用化合物の合成素子として利用する際に必要不可欠なものである.さらに,γ-ブテノリド類の合成法として利用されている2-シリルオキシフランとα,β-不飽和ケトンのビニロガスMukaiyama-Michael反応に極めて有用な触媒として1,1,3,3-テトラキス(トリフルオロメタンスルホニル)プロパンを見出した.また,以前,研究代表者が報告したインジウムトリフラートを触媒とするω,ω-ジアルコキシアルキン類の連続的アジド化/1,3-双極子付加環化反応において,問題を残していた電子豊富アルキン部位を備えた基質の反応を改善するため,インジウムトリフラートとルテニウム(II)錯体の組み合わせを用いる条件を確立した.本触媒系は,インジウムトリフラートを単独で用いると生成物が収率良く得られなかった共役ジイン構造を有する基質の反応にも有効で,ビス(トリアゾール)類の優れた合成法となる.さらに,得られた生成物が結晶状態において,ユニークなN-C-O部のアノマー効果を有することを見出し,計算化学的手法により,このアノマー効果が良く知られている2-アルコキシテトラヒドロピランのそれよりも顕著の強いことを明らかにした.前年度の検討結果ならびに本年度の研究実施計画に従い,種々のケイ素化求核種を用いる炭素-炭素結合形成反応についてテトラキス(トリフルオロメタンスルホニル)プロパンの有機Bronsted酸触媒としての触媒活性を検討した.まず, β-置換-α, β-エノンと2-シリルオキシフランのビニロガスMukaiyama-Michael反応を検討したところ, anti選択的に反応が進行することを見出した.また,これまで化学量論量のLewis酸触媒の使用が必須とされてきたMukaiyama-aldol型反応の改良を目的として,テトラキス(トリフルオロメタンスルホニル)プロパンを触媒として用いたビニロガス反応を検討し, α-置換シクロヘキサノンと2-シリルオキシフランの反応が僅かに1.0mol%以下の触媒使用量でも円滑に進行することを見出した.これらの検討結果は,炭素酸触媒であるテトラキス(トリフルオロメタンスルホニル)プロパンの構造的特徴が優れた触媒性能として発揮された結果と考えられる.さらに,有機酸触媒としての利用が期待されるフッ素置換1, 3-ジオールないし1, 3-アミノアルコールの新規合成法の開発を目的として, β-ヒドロキシーα, α-ジフルオロケトンN, O-アセタールの収束的な合成法を開発した.今後,本反応を機軸とするフッ素置換ジオールやアミノアルコールの合成を検討し,生成物の有機分子触媒としての利用が期待される.また, Lewis酸触媒反応として,本年度はインジウムトリフラートを用いたアルデヒド,イソシアニド,アルコールの三成分連結反応(alkylative Passerini反応)によるα-アルコキシアミドの合成法を開発した.この反応は,インジウム(III)塩のソフトかつ温和なLewis酸性と化学的安定性を活用した合成手法であり,錯体の特性を活用した新規合成反応の開発という本研究の目的に適う成果である.1,1,3,3-テトラキス(トリフルオロメタンスルホニル)プロパンを炭素酸触媒として用いる合成反応の開発を目的として種々の検討を行い,このものが2-シリルオキシフランや鎖状ケテンシリルアセタールを求核剤として用いるアルドール型反応にも有用であることを見い出した.特に,長いアルキル鎖を有するケトンに対するMukaiyamaアルドール反応は,TiCl_4などの常用されるルイス酸を化学量論的に使用しても効率的には進行しないことが知られていたが,炭素酸を用いることで円滑に進行することを明らかにした.また,本研究期間において開発されたMukaiyama-Michae1反応やMukaiyamaアルドール反応を,立体選択的な合成反応の開発へと展開すべく,詳細な検討を行い,ジアステレオ選択的な反応の開発にも成功した.さらに,1,

1,3,3-テトラキス(トリフルオロメタンスルホニル)プロパンの気相酸性度測定および単結晶X線解析結果から,本化合物の物理化学的性質や触媒性能の本質を明らかにした.一般に,炭素酸触媒を用いた合成反応では,立体的にかさ高い基質間での結合形成も可能であったことから,より高活性な炭素酸触媒の設計指針となる知見である.温和な酸触媒を用いた新規多成分反応の開発では,ω-ヒドロキシアルデヒド(ないしヘミアセタール)に対するイソシアニドの付加が金属トリフラートのようなルイス酸のみならず,ブレンステット酸によっても効率的に触媒されることを見い出した.また,新規四成分反応としてα,β-不飽和アルデヒド,イソシアニド,遊離脂肪族アルコールおよびアジ化物イオンの反応によるテトラゾール合成を実現した.今後,更なる検討を要するものの,これらの検討結果は,温和な酸触媒が多成分反応の優れた触媒となることを示す知見と考えられる。
慢性大腸炎粘膜局所T細胞の特異的増殖機構解明と新規治療法開発

本研究は、粘膜内Tリンパ球における特定の分子機能が大腸炎に関与する可能性を明らかにし、この分子機能を遮断することで重症・難治性炎症性腸疾患に対する疾患特異的かつ有効な新規治療法開発することを目的とするものである。本研究では当初の研究計画に示した項目につき、下記に示すごとく大きな研究成果が得られた。慢性大腸炎粘膜局所Tリンパ球がIL-7を含むある種の刺激に対し著明な増殖活性をもつことに注目し、細胞内シグナルの検討を行った。サイトカインレセプターγc鎖を介する刺激がTリンパ球増殖を誘導する機構には、STAT分子の活性化のほか多様な細胞内シグナルが関与する。TCRα欠損マウス、CD45Rbhigh移入腸炎モデルでの解析で、粘膜内Tリンパ球が正常粘膜局所と炎症局所では異なる細胞内シグナルを介することを新たに見いだした。炎症局所粘膜Tリンパ球はIL-7レセプターを高発現し、IL-7刺激でSTAT5分子の活性化を認めるが、正常局所Tリンパ球ではSTAT5からのシグナルが入らないことが明らかとなった。さらに、末梢血リンパ球との比較により、炎症局所では常に活性化されている細胞内シグナルが存在し、そこにIL-7刺激によるSTAT5分子の活性化が加わることで増殖活性を有すると想定された。この細胞内シグナルを詳細に検討中である。また、網羅的解析として、TCRα欠損マウス、CD45Rbhigh移入腸炎モデルの腸炎モデルマウスより腸管粘膜内Tリンパ球を分離し、異常増殖リンパ球において特異的に誘導される遺伝子の発現をマイクロアレイにて検討を行った。複数の活性化分子が明らかとなり、腸炎局所リンパ球増殖との関与を現在解析中である。これらの解析は特に炎症促進性に働くリンパ球のみ選択的に、かつこれら細胞特異的に活性化される増殖シグナルのみを標的とする新規治療を目指すものであり、最終的には、腸炎モデルマウスに対し候補シグナル阻害剤を用いたin vivoでの治療系検討を行う。