hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
疾患細胞ミトコンドリアへの分子送達を実現する遺伝子治療用ナノマシンの創製

その結果、MITO-Porterシステムは疾患細胞Mtへの移行が十分に可能である事が確認された。これらの結果に基づき、疾患細胞へのMt送達にはMITO-Porter-Xを、遺伝子発現にはpX-mtLuc (CGG)を基盤としたシステムを構築するよう計画を再考した。計画の一部は変更しているが、ここまで示した内容は『疾患細胞Mtを標的とした遺伝子送達・発現』を目的に掲げる本研究を達成する有用な成果である。一方で、Mt環境応答性核酸ナノ粒子の構築に関してはオリゴ核酸を用いたナノ粒子形成にとどまっており、H28年度に遺伝子ナノ粒子に関する検討を開始する。以上より、現在までの達成度は『おおむね順調に進展している』と判断した。本申請研究では、ミトコンドリア(Mt)を標的とする遺伝子治療法を確立するため、疾患細胞Mtを標的とした遺伝子送達・発現を目的とする。H26年度は、「1.微小管輸送を介したMt標的型キャリアの構築」、「2. Mt遺伝子発現pDNAの遺伝子発現能の検証」、「3.自主臨床研究の整備」を中心に研究を遂行し、当初の計画以上に進展している成果を報告した。H27年度は、「1. Mt発現pDNAベクターの改良」、「2.疾患細胞を用いた細胞内動態評価」、「3.Mt応答性核酸ナノ粒子の構築」を中心に研究を遂行し、当初の計画通りの成果を得ている事を報告した。最終年度となるH28年度は、下記の項目を中心に研究を遂行した。疾患細胞を用いたMtを標的とした外来遺伝子発現の検証: pX-mtLuc (CGG)を搭載したMITO-Porterを構築し、疾患細胞Mtへの遺伝子導入・遺伝子発現を検証した。本申請研究では、自主臨床研究『Mt病に対する薬物治療法確立に向けた検討』で樹立したtRNAPheに点変異を有するMt患者由来の皮膚細胞を用いた。本疾患細胞は、複合体III活性が低下しておりミトコンドリア膜電位・ATP産生の低下が予想される。遺伝子発現検証に関しては、NanoLuciferaseタンパク質の発光を測定し評価した。本検討を通じて疾患細胞における最適なMt遺伝子発現が可能なナノキャリアを構築する事に成功した。また、治療用DNAを用いた検討も実施しており、一定の成果を得ている。本研究は、ミトコンドリア(Mt)を標的とする遺伝子治療法を確立するため、疾患細胞Mtを標的とした遺伝子送達・発現を到達目標とした。遺伝子送達に関しては、Mt融合性リポソーム、MITO-Porterを基盤とした『疾患細胞Mt標的型ナノキャリア』を構築し、疾患細胞Mtへの遺伝子送達を試みた。また、Mt独自の遺伝子コドン・転写/翻訳機構に適応する『Mt遺伝子発現プラスミドDNA』を設計し、疾患細胞Mtでの遺伝子発現に成功した。本研究で構築したMt遺伝子発現ナノキャリアは、Mtを標的とする遺伝子治療、ライフサイエンス、疾患モデル細胞・動物の作出に大きく貢献する事が期待される。微小管輸送を介したMt送達を可能とする多重構造化した新型のMITO-Porterを開発に成功し、本キャリアがHeLa細胞、CAD細胞(神経モデル細胞)に効率的に取り込まれ、Mtへ送達される事を確認した。また、設計したMtでNanoLucタンパク質を発現するpHSP-mtLuc(CGG)がMtでの外来遺伝子発現を可能とするDNAベクターである事を明らかとした。
ポリファーマシーの改善に向けた介入研究と経済分析

多剤投薬は薬剤による有害事象や薬剤依存の発生招きやすいが、減薬の効果については十分なエビデンスが得られていない。本研究は、減薬により患者の病態や安全がどう変化するかを前向き研究で明らかにしようとするものである。地域の中核的病院A病院(約460床)、B病院(200床)において、6種類以上の内服薬が処方されている患者のうち、Scottの判断基準に基づいて2種類以上の減薬が行われた患者を対象に減薬の前後で自記式調査を実施した。調査内容は患者のQOL(EQ-5D)、転倒リスク(FRI-21)、眠気(JESS)、服薬状況などである。ベースライン調査で持参薬が6種類以上の入院患者の割合は、B病院で45%である。6種類以上の投薬で2種類以上の減薬を行った場合に算定する薬剤総合評価調整加算、薬剤総合評価調整管理料の請求は合計25件であり、減薬の理由は症状が安定・解消が84%、副作用があるが8%、カスケード処方であるが4%などである。調査票を回収できた29件を解析すると、QOLスコアの平均は減薬前後で0.720から0.788に、健康状態は70.83から76.13に、転倒リスクは9.00から7.71に改善した。一方、日中の眠気は4.32から5.03とわずかな悪化がみられた。6種類以上の服薬期間は平均72.8か月である。昨日薬をすべて服用したかに「はい」の回答は72%にとどまり、時々薬を飲み忘れることがあるは23%、症状が落ち着いている場合に服用をやめてしまうことがあるは10%、症状が悪化したと思い医師の相談なしに薬の減量や中止をしたことがあるは14%であり、多剤投薬では服薬アドヒアランスが十分でないことがうかがえた。6種類以上の服薬が気になるとの回答は74%で、その理由は、できるだけ種類を減らしてほしいから(74%)、体調不良と関係があるかも知れないと感じるから(35%)などが多かった。調査対象の2病院は急性期型の病院であり、複数の疾患を有し重症度の比較的高い高齢患者が多いため、担当医により減薬の判断がなされ、自記式調査を依頼できる患者は必ずしも多くはない。すなわち、Scottの判断基準に基づいて薬剤ごとに投与の中止が可能かどうか検討されたものの、2種類を減薬することは困難と判断された症例が少なくない。また、減薬が行われても、認知症の合併や意識レベルの低下により自記式調査の回答が得られにくい患者も少なくない。こうした事情から、調査の対象数は当初の予定よりも少ない状況となっている。ポリファーマシーに係る患者調査に関し、これまでの実施上の問題点を改善しながら地域病院2施設において入院、外来患者に対する前向き研究を継続する。また、減薬前後の薬剤名、各指標の変化、患者の病態の変化を含む、これまで得られた大量のデータの解析を行う。ポリファーマシーは薬剤の副作用・相互作用による有害事象や薬剤依存の発生、服薬アドヒアランスの低下を招きやすいとされるが、減薬の効果については十分なエビデンスが得られていない。本研究は、減薬によって患者の病態、安全がどう変化するかを、新たな前向き研究で明らかにしようとするものである。初年度は地域の中核的病院(約460床、地域医療支援病院、DPC対象病院)のほぼ全診療科において、6種類以上の内服薬が処方されている入院、外来患者のうち、Scottの判断基準に基づいて2種類以上の減薬が行われた患者を対象に、減薬の前後で自記式調査を実施した。調査内容は、患者のQOL(EQ-5D)、転倒リスク(FRI-21)、眠気(JESS)、服薬状況などである。ベースライン調査で、持参薬が6種類以上の入院患者の割合は、病院全体で48%であり、80%を超える診療科もあった。直近7カ月間における薬剤総合評価調整加算、薬剤総合評価調整管理料の算定は、合計で29件であった。調査票を回収できた23件を解析すると、QOLスコアの平均は、減薬前後で0.695から0.744に改善した。転倒リスクの平均点数は、減薬前後で9.65から8.87に改善した。一方、日中の眠気の平均点数は、減薬前後で5.18から5.13とわずかな改善にとどまった。服薬状況をみると、6種類以上の薬を飲み続けている期間は平均値73.8か月、中央値42か月であった。時々薬を飲み忘れることがあるとの回答は23%、症状が落ち着いている場合に服用をやめてしまうことがあるは14%、症状が悪化したと思って医師の相談なしに薬の減量や中止をしたことがあるは19%であった。6種類以上の薬を飲んでいることが気になるとの回答は82%で、その理由としては、できるだけ種類を減らしてほしいから(72%)、体調不良と関係があるかも知れないと感じるから(33%)などが多かった。ベースライン調査で、持参薬が6種類以上の入院患者の割合は、病院全体で約半数に上ることが判明したが、複数の疾患を有し、重症度の比較的高い高齢患者が多いため、担当医により減薬の判断がなされ、自記式調査を依頼できる患者は必ずしも多くはない。

すなわち、当該病院は急性期高度急性期の機能を担っており、Scottの判断基準に基づいて、薬剤ごとに投与の中止が可能かどうか検討されたものの、2種類を減薬することは困難と判断された症例が少なくない。また、減薬が行われても、認知症の合併や意識レベルの低下により、自記式調査の回答が得られにくい患者も少なくない。こうした事情から、調査の対象数は当初の予定よりも少ない状況となっている。多剤投薬は薬剤による有害事象や薬剤依存の発生招きやすいが、減薬の効果については十分なエビデンスが得られていない。本研究は、減薬により患者の病態や安全がどう変化するかを前向き研究で明らかにしようとするものである。地域の中核的病院A病院(約460床)、B病院(200床)において、6種類以上の内服薬が処方されている患者のうち、Scottの判断基準に基づいて2種類以上の減薬が行われた患者を対象に減薬の前後で自記式調査を実施した。調査内容は患者のQOL(EQ-5D)、転倒リスク(FRI-21)、眠気(JESS)、服薬状況などである。ベースライン調査で持参薬が6種類以上の入院患者の割合は、B病院で45%である。6種類以上の投薬で2種類以上の減薬を行った場合に算定する薬剤総合評価調整加算、薬剤総合評価調整管理料の請求は合計25件であり、減薬の理由は症状が安定・解消が84%、副作用があるが8%、カスケード処方であるが4%などである。調査票を回収できた29件を解析すると、QOLスコアの平均は減薬前後で0.720から0.788に、健康状態は70.83から76.13に、転倒リスクは9.00から7.71に改善した。一方、日中の眠気は4.32から5.03とわずかな悪化がみられた。6種類以上の服薬期間は平均72.8か月である。昨日薬をすべて服用したかに「はい」の回答は72%にとどまり、時々薬を飲み忘れることがあるは23%、症状が落ち着いている場合に服用をやめてしまうことがあるは10%、症状が悪化したと思い医師の相談なしに薬の減量や中止をしたことがあるは14%であり、多剤投薬では服薬アドヒアランスが十分でないことがうかがえた。6種類以上の服薬が気になるとの回答は74%で、その理由は、できるだけ種類を減らしてほしいから(74%)、体調不良と関係があるかも知れないと感じるから(35%)などが多かった。調査対象の2病院は急性期型の病院であり、複数の疾患を有し重症度の比較的高い高齢患者が多いため、担当医により減薬の判断がなされ、自記式調査を依頼できる患者は必ずしも多くはない。すなわち、Scottの判断基準に基づいて薬剤ごとに投与の中止が可能かどうか検討されたものの、2種類を減薬することは困難と判断された症例が少なくない。また、減薬が行われても、認知症の合併や意識レベルの低下により自記式調査の回答が得られにくい患者も少なくない。ポリファーマシーの調査に関し、初年度における実施上の問題点を解決しながら、地域の中核的病院において、入院、外来患者に対する前向き研究を継続する。また、別の地域にある地域病院(約200床、7対1一般病棟)において、新たにポリファーマシーの調査を開始する。ポリファーマシーに係る患者調査に関し、これまでの実施上の問題点を改善しながら地域病院2施設において入院、外来患者に対する前向き研究を継続する。また、減薬前後の薬剤名、各指標の変化、患者の病態の変化を含む、これまで得られた大量のデータの解析を行う。
脂溶性生理活性分子の脳へのデリバリーシステム研究

AD脳では抗酸化成分であるカロテノイドの濃度が健常者と比較して有意に低値であることも報告されている。しかし、血液脳関門の存在により食品として摂取したカロテノイドが効率よく脳内に移行し、その抗酸化能を発揮させることは困難である。グリコール酸/乳酸共重合体(PLGA)ナノ粒子は生分解性高分子の1つであり体内で二酸化炭素と乳酸に分解される。また、非イオン性界面活性剤であるTween-80でコーティングすることでナノ粒子表面にアポリポ蛋白が吸着し、in vivoの動物試験では血液脳関門を通過できることが報告されている。本研究では、カロテノイドを内包したTween-80装飾PLGAナノ粒子を作成し、脳内へのルテインの移行量を増加させ、ADの発症や進行を抑制することを目標とした。β-カロテン封入PLGAナノ粒子投与群では尾静脈投与後1時間経過した血漿のβ-カロテン濃度はTween-80で覆った粒子を投与した群と比較して約162倍高濃度だった。Tween-80で表面を覆わなかったPLGAナノ粒子は表面にアポE蛋白質以外にも、様々なタンパク質が接着し、臓器へ取り込まれにくくなり血中に滞留していたと考えられた。また、ナノ粒子表面をTween-80で覆った群と覆わなかった群で脳内のβ-カロテン濃度には有意差が確認されなかったが、その原因は凍結乾燥で使用したスクロースの存在が考えられる。粒子は受容体介在性トランスサイトーシスによって脳内に移行されると考えられることを目的とした。しかし、in vitroの試験でスクロースはエンドサイトーシスの阻害物質として使用されており、PLGAナノ粒子においてもスクロースの存在によってエンドサイトーシス阻害が確認されている。今後、別の凍結乾燥保護剤を使用する方法で粒子を作成しナノ粒子の脳への取り込み検証する。(抄録なし)脳血管関門を通過するナノ粒子(受容体接着因子であるApoE3タンパクをPEGナノ粒子に抱合させ神経細胞に取り込ませエンドサイトーシスを利用し抗酸化分子を送達させ放出させる)を作成するに際し、まず脳への到達が既に確認されているTween-80で表面を覆ったPLGAナノ粒子(Proc Natl Acad Sci USA. 2011 Nov 15 ; 108(46) : 18837-42.)で検証を行った。そして、内包物は最初にカロテノイドでの検証を検討し、ルテインを使用する前に、安価で扱いが容易なβカロテンで検証を行った。調製したナノ粒子の粒経とゼータ電位はZetasizer Nano ZS(スペクトリス株式会社)で計測し、平均粒径は350nm位であることが分かり、表面の電位もマイナスに帯電していた。このことから、調製した粒子は血中でも問題なく循環できる可能性が示唆された。更に、調製した粒子でSDラットへの脳移行量を検証した。生後6週令のラットを以下の3群(1)ナノ粒子を懸濁した生理食塩水、(2)βカロテンをtween-80で分散させた生理食塩水、(3)生理食塩水のみ(コントロール群)に分けて、尾静脈投与を行った。そして、投与2時間後に断頭採血、脳の摘出を行い、組織と血漿からカロテノイドを抽出し、UV-HPLCで分析を行った。その結果、ナノ粒子投与群はβカロテンをtween-80で分散させた生理食塩水の投与群と比較して脳へ3倍高い移行量を示したことが分かった。また、面白いことに投与2時間後ではナノ粒子投与群のみ血漿中に高いβカロテン濃度を確認した。この理由として他の群では血中のβカロテンは早急に代謝されるが、PLGAで表面を覆ったことで血中に徐々に粒子が崩壊し、長時間βカロテン濃度を維持できたものと考えられた。

しかし、in vitroの試験でスクロースはエンドサイトーシスの阻害物質として使用されており、PLGAナノ粒子においてもスクロースの存在によってエンドサイトーシス阻害が確認されている。今後、別の凍結乾燥保護剤を使用する方法で粒子を作成しナノ粒子の脳への取り込み検証する。ラットの尾静脈投与の習得に時間が多くかかってしまった。粒子調製の際に、調製した粒子の粒径が望むサイズに至らない問題(400nm以下のものを作成したいが、大きいものが出来てしまう)が発生した。粒子に封入する脂溶性抗酸化物質の量が少ない。まず、粒子の粒径を安定させるため、メンブレンフィルターでふるいをかけ、望むサイズのふるいを通過したもののみ実験で使用する。粒子に封入する脂溶性抗酸化物質の封入率上昇のために、粒子調製を暗室で行うこととする。カロテノイドや他の脂溶性抗酸化物質は光や熱で崩壊しやすいにもかかわらず、現在まで室温で陽光のあたる場所で実験を行なっていたことが問題であった。(抄録なし)
運動知覚の色彩及び時空間要因分析による研究

外界の対象の動きを知覚する機能は、視覚系を持つ全ての生体に共通の機能であり、人間の感性情報処理にとっても最も基本的なものである。運動知覚に関する実心理学的研究では、複数の静止対象を適当な時空間間隔で提示した場合に観察される仮現運動現象を中心に検討がすすめられ、現在では時空間特性の異なる2種の下位系が運動視に関与すると考えられている。本研究ではこれら下位系の内遠隔運動系について、色彩刺激による往復仮現運動が消失するまでの時間を刺激-背景間のコントラストの関数として測定し色彩・明暗コントラスト、時間周波数、距離などの刺激要因の効果を検討した。その結果、時間周波数が適切な範囲内では等輝度近傍を最低部とするU字形の関数が得られ、明暗コントラスト情報が運動知覚の持続に大きく寄与していることが示された。また、刺激と背景の色彩が異なる条件では等輝度近傍でも運動消失までの時間が0とはならないという結果が得られた。これは遠隔運動系が色彩情報のみに基づいて運動信号を生成し得ることを示唆するものである。類似の刺激条件でLivingstone&Hubel(1987)が報告した等輝度近傍での運動消失は、彼らが用いた測定手続きに起因するもので、色彩情報が運動知覚に関与しないことを直接示すものではないと考えられる。さらに関数の形状は刺激間の距離に依存して組織的に変化することが示され、色彩・明暗コントラスト要因の寄与は距離要因によって制約を受けることが明らかになった。最近の運動視研究では、これまで検討の対象とされてきた刺激の提示時間、時間間隔、サイズ、距離といった要因に加え、色彩要因を考慮に入れた解析が広く行われつつある。このような試みを組織的に展開することは、従来個別に検討されてきた明暗知覚、色彩知覚、運動知覚などの研究分野の知見を統合し、ヒトの視覚情報処理機構の全体像を解明する上で有効なアプローチであると考えられる。
インド新論理学派前期の言語理論思想史の解明―ラグナータまでの主要文献の調査と解読

本研究では、インド新論理学派の思想史研究に重要な進展をもたらす未出版の註釈『アーローカ』の校訂および電子公開と、別の註釈『ディーディティ』写本の真贋判定を試みた。前者については、校訂テキスト公開のためのXML制作環境およびバージョン管理機能を含む配信環境を構築し、公開することができた。後者については、現在知られている写本の情報にカタロギングの間違い等を発見し、容易には利用できないことが判明した。本申請課題の研究は、これまで歴史的文脈から切り離されて論じられることの多かったインド新論理学派後期(ラグナータ以降)の言語理論を、その成立に先立つ文献を研究することにより、思想史研究の視野のもとで再解釈することを目的とする。そのための資料整備として、新論理学派の基礎文献『真理の如意珠』に対する(1)未刊行の『ジャヤデーヴァ註』のテキストを複数の写本を用いて校訂し、また(2)真贋が未確定の『ラグナータ註』の写本を、その真贋も含めて調査、解読する。第2年次は、当初計画に基づき、まず上記(2)と関連した、『ラグナータ註』のカルカッタ写本の解読を進めた。その結果、本物である可能性が高いと期待していたカルカッタ写本が、実はタイトル違いであったことが判明した。バラナシ写本もタイトル違いであることは昨年度確認したので、現状、『ラグナータ註』とみられる写本はなくなってしまった。残る可能性として、19世紀のカタログに載っている、南インドの個人所有の写本を調べてみる価値がある。これに関してケーララ大学図書館を訪問し、所蔵状況を調査した。上掲(1)の『ジャヤデーヴァ註』については、計画通り校訂作業に着手することができた。いまだ中途成果を公開するところまで進めていないが、最終年度の途中で公開することを目指している。写本の解読が進むにつれ、当初の想定どおり、『ジャヤデーヴァ註』を通して初期新論理学派の重要な思想史転換が見えてきた。一例として、「文の構文的正しさ」に関する古い理論を読み解き、日本印度学佛教学会学術大会で発表した。その他、本研究により得られた哲学的知見を広く還元するため、比較哲学関係のワークショップや国際学会でも発表を行った。最終的に、これらの資料に基づき、新論理学派の言語理論の性質変容を、文献実証的に分析する。初年度は、まず、写本の内容を電子化するための技術的方針を検討し、人文学でひろく用いられている「TEI XML」を拡張する独自のXMLスキーマとXSLTスタイルシートを作成した。その技術基盤の上で、当初計画に従い、(1)『ジャヤデーヴァ註』の写本校訂と(2)『ラグナータ註』のベンガル文字写本解読を前進させた。前者については複註写本をテスティモニアとして用いつつ、「言葉の信頼性」章の註釈テキストのXML化を行った。後者については、インドに赴いてディープロ・チャックラボルティ氏(ネルー大学)を始めとするベンガル人研究者らの助力を得、ティルフタ文字の影響が強い古いベンガル文字を解読する能力を習得した。これにより日本国内でも研究が進められるようになり、対象写本の約半分を解読、電子化できた。また、インド訪問時に併せて写本調査を行い、次年度の研究で重要な役割を果たす写本をいくつか複写できたほか、これまで『ラグナータ註』の実在を裏付ける重要証拠とされていたバラナシ写本が、実は異なるテキストの写本であることを確認した。成果の一部は、25年9月の日本印度学仏教学会学術大会で報告する予定である。初年度は、主に思想史研究の観点からの研究発表を3件(国内2、海外1)行った。本研究は、これまで歴史的文脈から切り離されて論じられることの多かったインド新論理学派後期(ラグナータ以降)の言語理論を、その成立に先立つ文献を調査することにより、思想史理解を得たうえで再解釈することを目的とする。そのための資料整備として、新論理学派の基礎文献『真理の如意珠』言語部に対する(1)未刊行の『ジャヤデーヴァ註』のテキストを複数の写本を用いて校訂し、また(2)真贋が未確定の『ラグナータ註』の写本を、その真贋も含めて調査、解読する。『ジャヤデーヴァ註』の校訂については、予定通り写本をインド各地の図書館で蒐集し、言語部第1章第5章の校訂テキストをウェブで公開するに至った。このテキストはいまだ校訂の途中にあるが、内容の概要を理解するには十分であろう。

データはTEI準拠のXMLで記述され、完全な変更履歴をウェブで提示している。これにより、ウェブに公開される資料の信頼性を高め、健全な研究成果公開の促進を図っている。この方法論は、近々に人文情報学の学会で妥当性を問うつもりである。『ラグナータ註』の既知の写本がタイトル違いであったことは、2年度目の調査で判明した。最終年度は、古いカタログに個人蔵として記載されていた『ラグナータ註』の所在を探して、ケーララ州の司書の助言に従い、タミルナードゥ州タンジョールの図書館を訪ねたが、そこにも見つけることができなかった。3年間の研究を通して、おそらく『ラグナータ註』は存在しないこと、しかし『ラグナータ註』と認識されていた何かが存在していたことが見えてきた。その「何か」である可能性が最も見込める『ガダーダラ』註の完全な写本を、このタンジョール訪問で入手することができた。次年度以降は、この註釈の研究を進めたい。主に『ジャヤデーヴァ註』を用いた思想史研究の成果として、最終年度は、論文を3本、研究発表を5本(内1本は国際学会)行った。インド哲学基本的に研究申請書に記載したプランに基づいて研究を遂行しており、進捗に大きな遅れはない。『ラグナータ註』と考えていた写本が偽物であると判明したことも、想定の範囲内ではある。ただし、当初は真贋判定にもっと時間が掛かるものと考えており、第3年次にも作業を計画していたが、未出版の他の註釈に同定できたため、偽物であるとの判定が第2年次で完了してしまった。3年次はその代わり、次項で述べるように、他の写本の入手と『ガダーダラ註』の写本の解読を試みる。本研究の大きな課題である『ジャヤデーヴァ註』のウェブ公開についても、準備が進行している。第2年次は京都で行われた人文情報学の学会に参加して、既に校訂テキストのXML化について実績のある苫米地等流博士と討議し、本研究の公開方法について指針を得ることができた。テキスト校訂作業については、現在全体の4分の1ほどが或る程度まとまった形になってきている。このまま進行すれば、研究期間内に予定した成果にまとめられる見込みである。基本的に研究申請書に記載したプランに基づいて研究を遂行している。以下に記載する事項は予定とは異なる事態となったが、いずれも可能性を想定していたものであり、対処可能なものであった。(1)人文学研究で一般的なXMLスキーマであるTEIでは、研究の遂行に不十分:従って、独自の拡張スキーマとその変換プログラムを作成した。(2)『ジャヤデーヴァ註』複註文献からのテスティモニア抽出に見積以上の時間が掛かる:複註の電子化を諦め、写本コピーのまま読解することにした。電子化すれば将来的に利用価値が生まれるが、初年度は計画の達成を最優先し、電子化は見送った。(3)ベンガル文字写本の解読の指導を依頼した現地研究者が、当該写本の文字を読めない:現地研究者の口コミにもとづき、当該写本を読める研究者に辿り着いて、目的は達成できた。『ジャヤデーヴァ註』のXML化は、初年度は当初計画の約半分しか達成できなかったが、その分、『ラグナータ註』の解読を前倒しして大幅に進めることができ、トータルでの進捗に大きな影響はないと見ている。
タンパク質の不溶化とコンフォメーション病に関する分子論的基礎研究

タンパク質の不溶化現象は,バイオテクノロジー分野や医学生命科学分野において大変大きな問題となってきている。本研究では,タンパク質一般の細胞内外での不溶化現象に関するタンパク質科学的,分子論的な研究を様々な方法を用いて行った。1.トリオースリン酸イソメラーゼ(TIM)の構造形成中間体の特徴付け二量体であるTIMの構造形成中間体の特徴をNMRなどの分光学的な手法を用いて明らかにし,部分的に構造をとった単量体が存在することを明らかにした。2.耐熱性Mn-カタラーゼのインクルージョンボディ化の解消Mn-カタラーゼの大量発現では,タンパク質は大腸菌内でアグリゲーションを形成(不溶化)し,インクルージョンボディを形成するが,分子シャペロン(GroEL, GroES, DnaK, DnaJ, GrpE)を共発現すると非常に効率よく可溶化し,正しい活性を持った構造になることが明らかになった。3.GroESとαシヌクレインの構造変化とアミロイド様線維形成シャペロニンの一つである7量体GroESを高濃度で,Gdn-HCl変性させて数日間放置すると,コンフォメーション変化を起こし,不溶化し,アミロイド様線維を形成することが,チオフラビンT染色や電子顕微鏡によって明らかになった。また,元々構造を形成していないαシヌクレインタンパク質では,イオン強度を上昇させて,分子をコンパクトにするとアミロイド線維を形成しやすいことが明らかになった。様々なタンパク質の構造変化としての不溶化とアミロイド様線維化の機構についてタンパク質科学的な洞察が得られた。バイオテクノロジー分野や医学分野において昨今世界的に大きな問題となっているものの一つに,タンパク質の細胞内での不溶化(インクルージョンボディ形成)やアミロイド形成によるタンパク質のコンフォメーション病がある。これらの現象のタンパク質科学的,分子論的な研究をオリゴマータンパク質やパーキンソン病原因タンパク質を用いて調べ,以下のような結果を得た。(1)Thermus属由来のMn-カタラーゼは,大腸菌内で高発現させるとほとんどが菌体内封入体(インクルージョンボディ)として蓄積される。この現象を解消するために,タンパク質の正しい立体構造形成を助ける分子シャペロン(GroEL,GroES,DnaK,DnaJ,GrpE)を共発現させた。その結果,インクルージョンボデイの約50%が活性を有する正しい構造をとり,可溶性となった。このことから,細胞内でのタンパク質の不溶化の解消に分子シャペロンが非常に有効であることが明らかになった。(2)パーキンソン病の原因タンパク質であるαシヌクレインのアミロイド線維形成をin vitroで調べた。タンパク質濃度を高くして塩濃度をかけることによって長時間放置すると,典型的なアミロイド線維が形成されることが分かった。この線維は電子顕微鏡とアミロイド染色特有のチオフラビンTによる蛍光顕微鏡によって確認された。アミロイド線維形成の時間は,シーディングによって短縮されることも明らかになった。(3)病気とは直接関連性がないオリゴマータンパク質GroESを構造形成中間体が出現するような状態にして高タンパク質濃度で放置すると,アミロイド線維が形成されることを発見した。正しい立体構造が壊れかかった状態がアミロイド線維形成に大いに関連していることも明らかになった。このことから,アミロイド線維形成はタンパク質一般に起こる共通した現象である可能性が示唆された。タンパク質の不溶化現象は,生命科学現象の中でも病気と密接に関連していることが最近明らかになってきた。本研究では,アミロイド様線維を形成するオリゴマー酵素GroESとパーキンソン病の原因タンパク質として考えられているαシヌクレインの構造変化とアミロイド線維形成についてタンパク質科学的に研究した。以下に本研究で得られた実績の概要を示す。1.GroESの変性再生反応を分子の大きさで評価するとともに,構造的に可逆反応であるかどうかを溶液X線小角散乱を用いて詳細に調べた。

その結果,高タンパク質濃度条件下ではGroESの単量体への解離は1.1M Gdn-HCIまでに安定化され,その7量体は一旦解離すると同時に変性することが明らかになった。また,変性状態から再生させたGroES7量体は構造的にも完全にフォールディングしていることが確かめられた。2.GroES濃度が高い状態(612mg/ml)で,Gdn-HCl変性させて数日間放置すると,このタンパク質はコンフォメーション変化を起こし,不溶化し,アミロイド様線維を形成することが,チオフラビンT染色や電子顕微鏡によって明らかになった。また,この線維化形成機構を2で調べた構造変化と照らし合わせた結果,立体構造が変性する構造転移領域で最も起こりやすいことが判明した。このことは,GroESのアミロイド形成反応はネイティブ状態や完全に変性した状態では起こらないことと同時に,部分的に構造形成した単量体がGroESのアミロイド様線維化反応に重要であることを示しており,この洞察は他の病因性原因タンパク質のアミロイド線維形成機構にもタンパク質科学的に重要な示唆を与えるものである。3.αシヌクレインの線維形成は塩濃度を上昇させるとコンパクトな分子になり,高濃度でアミロイド様線維を形成することが溶液X線小角散乱によって明らかになった。
有機化学の多面性を実感できる実用的化学実験教材の開発

中等教育課程の有機化学分野に関して,既習の学習内容と関連づけて身の回りの現象や材料・生体物質を捉えるとともに,生徒の興味・関心と探究活動への意欲を喚起できる実験教材を開発することを目的とし,[A]有機化学・[B]材料科学・[C]生体関連化学の3分野で研究を推進した。光学分割や構造決定、色素、高分子、代謝、医薬品など、有機化学の多様な側面を理解できる実験教材を開発した。そして、そのいくつかに対しては教育実践を行い、教材としての実用性を検証した。中等教育課程の有機化学分野に関して、既習の学習内容と関連づけて身の回りの現象や材料・生体物質を捉えるとともに、生徒の興味・関心と探究活動への意欲を喚起できる実験教材を開発することを目的とし、[A]有機化学・[B]材料科学・[C]生体関連化学の3分野で研究を推進した。[A]有機化学(1)光学異性体の導入素材であるヒドロキシ酸とアミノ酸を組み合わせて簡便に光学分割を行える実験教材を開発した。(2)Friedel-Crafts反応とアルコールの反応性を学ぶ実験教材開発の一環として、1,4-ビス(1,1-ジメチルプロピル)-2,5-ジメトキシベンゼンの結晶構造を明らかにした。(3)カルボニル化合物の定性分析に用いられる2,4-ジニトロフェニルヒドラジンに色調の異なる多形結晶の存在を見いだし、多形結晶の形成条件ならびに結晶構造と吸収特性の関係を明らかにした。(4)有機化合物の定性分析や官能基変換を用いて有機化合物の構造を決定するという探究活動を通じて、有機化合物の性質や反応を学ぶことができる化学実験教材を開発した。[B]材料科学(1)高分子の分子量を中和滴定による末端基定量と粘度測定で簡便に求める教材的手法を確立し、実験室的合成から分子量決定までの学習活動の具体例を提案した。(2)色材に含まれる金属イオンを探究的に同定する学習活動を通じて、生徒が金属イオンの反応性を理解することのできる実験教材を開発した。(4)銅フタロシアニンを素材として、その構造や性質・合成に関する探究活動を提案した。[C]生体関連化学(1)生体内化学反応の好例としてアルコール発酵を取り上げ、代謝の多段階性とアルコール発酵の量的関係を探究できる実験教材を開発した。(2)医薬品に関する実験素材として解熱鎮痛薬イブプロフェンに着目し、中和滴定による含量決定や酸塩基抽出による成分分離の教材的実験方法を提案した。中等教育課程の有機化学分野に関して、既習の学習内容と関連づけて身の回りの現象や材料・生体物質を捉えることができるとともに生徒自らの興味・関心と探究活動への意欲を喚起できる化学実験教材を開発することを研究の目的とし、以下の通り[A]有機化学・[B]材料科学・[C]生体関連化学の3分野で研究を推進した。これらの内容は国内学会(日本化学会年会・西日本大会、有機化学関連の学会)で成果公表され、さらにその一部を論文誌に公表あるいは投稿中である。(2) Friedel-Crafts反応とアルコールの反応性を学ぶ実験教材開発の一環として、1,4-ビス(1,1-ジメチルプロピル)-2,5-ジメトキシベンゼンの結晶構造を明らかにした。(2)機能性有機材料としての有機色素に着目し、その構造と物性を評価するとともに、先端化学の一端を垣間見る実験素材としての可能性を検討した。申請時の「研究実施計画」で示した3分野において、バランスよくかつ多岐にわたる教材開発を進めることができている。また、その成果の一部を化学教育の関連学会で公表するに至っている。この意味で、本研究課題はおおむね順調に進展できていると評価している。なお、研究開始後1年での実施状況報告であることから本報告書を提出する時点で掲載済となっている論文は少ないものの、投稿中論文・執筆準備中のものが蓄積されてきており、今後の成果公表を楽しみにしている。平成24年度も[A]有機化学・[B]材料科学・[C]

生体関連化学の3分野での教材開発研究を継続的に進める。これまでに明らかにされた研究成果を論文として公表できるよう努めることは勿論、新しい視点からの教材開発を積極的に推進する。現時点では各項目に対して以下のようなものを想定し、既に基礎的検討を進めている。[A]有機化学(1)定性分析や官能基変換を援用した有機化合物の構造決定、(2)グリーンケミストリーの重要性を意識させる有機化学反応の導入と学習モデルの提案。[B]材料科学(1)金属錯体に関する実験教材と学習モデルの提案、(2)高分子材料の機能性を探究できる先端的化学実験教材。[C]生体関連化学(1)生体内酸化還元反応を可視化する実験教材、(2)酵素の基質特異性や反応速度論に関する実験教材。物品費として、教材開発に当たって必要となる試薬類・ガラス器具ならびに計測機器消耗品の他、前年度には購入できなかったデジタル旋光計等ICT機器とマルチ計測センサ・データロガーを購入予定である。国内旅費として、日本科学教育学会第36回年会、日本化学会西日本大会2012、および日本化学会第93春季年会での成果発表のための旅費を支出予定である。あわせて、教材開発にかかる実験補助に対する謝金、成果発表にかかる学会参加登録料・論文投稿料を支出する予定である。なお前年度から繰り越して使用予定の研究費が若干あるが、これは投稿論文の掲載決定が今年度にずれこんだためである。今年度になって受理されたので、その論文投稿料として支出するように予定している。
ドイツ現近代文学における黙示録的想像力のはたらきと変遷

人がある破局的かつ大規模な出来事に遭遇したばあい、そのショックを受け止め、判断の指針を見いだすための手がかりとして、すでに与えられている何らかのイメ-ジやことばを咄差に思い浮かべることがしばしばある。ヨハネ黙示録のなかにちりばめられた数々のイメ-ジやことばも、そのドラマチックな使信と鮮明な画像性のゆえに、たえず文学者や芸術家の想像力をかきたて、問題の焦点をしぼる役割を果たしてきた。ここではまず、そうした具体的な一例として、ヨハネ黙示録冒頭の「時が迫っているからである」ということばをめぐって、パウル・ツェラ-ンの詩『暗黒』と、その詩のきっかけとなったヘルダ-リンの『パトモス』冒頭の詩句をくらべている。おなじ"nah"ということばから出発しておりながら、時代の危機を真っ向から受けとめて雄々しく乗り越えていこうとするヘルダ-リンのばあいとちがって、ツェラ-ンの詩においては正反対の「負のイメ-ジ」に転換されている。このように、あるイメ-ジを受けいれ、変容させていく感性のありかたや、溶け込まされた経験の質において、作家ごとにまったく異なるわけで、ヨハネ黙示録が根底において「死」の問題をふまえている以上、個々の作家の体験や死にたいする心構えが、ヨハネ黙示録のさまざまのイメ-ジの受容の仕方にも大きな影響を与えていることがうかがわれる。特に児童文学のばあいには、作品そのもののなかに抽象的な論議をもちこまないだけに、かえってそうした根源性がはっきりとあらわれており、黙示録に特続的な関心をしめている作家としてここではまず(スウェ-デン人ではあるが)アストリッド・リンドグレ-ンをとりあげた。ひきつづきミヒャエル・エンデおよびC.S.ルイスのばあいを突き合わせることにより、黙示録の捉えかたそのものとそれぞれの作家の宗教観や人生観との結びつきをあきらにしていくつもりである(この作業は現在続行中)。この一年間におこなってきたことは、ヨハネ黙示録からドイツの宗教書や文学書に至るまで、要所要所にあらわれる黙示録的なイメ-ジや語彙をデ-タベ-ス化しつつ、表面的には見えにくい内的な連関を、薄紙をはぐようにして丹念に読みとっていく作業であった。世紀末やひとつの時代の終焉に際して、黙示録的な要素が噴出してくることは、従来からすでに指摘されてきたが、その場合、黙示録的な「イメ-ジ」と「語彙」があたかも鉄道線路の転轍機のように意識の方向をさし示す重要な役割をはたすことが、このような具体的な場に即した研究によってあきらかになっている。宗教改革の時代に関しては、文献入手の制約が大きすぎて断念せざるを得なかったため、一般的な研究の成果を踏まえるしかないのが残念であるが、今後は一層、個々の文学作品の分析に向かうことが大切であることがはっきりした。現在は、シュペングラ-の『西欧の没落』を手がかりに、第一次世界大戦前後の世紀末的様相をさぐる作業をすすめつつある。二十世紀に突入しながら、なお前世紀,終末論的要素をひきずっていたのは何故であろうか。わたしたちの過ごしてきた20世紀という時代全体が、終末論的意識の集大成といってもいい面を露見しつつある。論文にまとめるには到らなかったが、現在準備中。今後は20世紀の文学の分析を中心に作業をすすめ、もう一度、ポイントをチェックすることになる。デ-タベ-ス化した語彙集をさらに充実することも併行して行われている。

時代ごとに異なるヨハネ黙示録そのものについての解釈、および歴史的・思想的なその影響をさぐる基礎的な段階は、いちおう前年度まででしめくくり、いよいよ本命ともいうべきドイツ現近代文学の具体的な作品を対象に、黙示録の影響を具体的にたどってきた。これ以上の戦線拡大は無理なので、主として19世紀末から20世紀にかけての幾人かの詩人(ゲオルゲ、リルケ、ツェランなど)、および児童文学の作(エンデ、ケストナ-など)を選ぶことにした。詩と児童文学に的を絞ったのは、そこに生死、別世界、戦争など、根源的な問題がもっとも鮮明なかたちで示されていると考えたからである。児童文学の場合など、ドイツ語圏だけの作品では論じられない点が多いので、比較のため同時代の他国の作家(リンドグレ-ン、C.S.ルイスなど)にも向かうことになった。その一端は既に『アルマジロ』誌の「作家とその風土」のシリ-ズに書き、現在もさらに掲載を続行中である。これまでの研究により、黙示録における終末観のとらえ方には、大きく分けて二つの潮流があることが明らかになってきた。そのひとつは、スウェ-デンボルなど神秘思想の流れをくむものであり、他方は、本来の意味でのヘブライ的・キリスト教的な終末観である。後者においては、終末を「一回限り」の歴史の推移のなかで「あれかこれか」の決着を迫る神の出来事としてとらえる。それに対し、前者においては、神秘的な修錬や体験によって永遠を悟れば、ただちに解決がつく問題にすぎない。本年度の学部紀要に全体的なまとめを掲載するつもりで作業をすすめていたが、眼病や各種委員としての活動など公的・私的な事情により執筆が遅れている。次年度の紀要原稿締切が11月末なので、その時期までに仕上げるつもりである。
受精前の卵子は最終分化した細胞なのか：全能性獲得の準備段階としての卵子

受精前の卵は分化した細胞であるが、受精後の1細胞期胚は全能性を獲得し、あらゆる種類の細胞へと分化できる能力を有するようになる。この受精前後における分化・全能性の変化を調節する機構はこれまでほとんど明らかにされていない。本研究においては、全能性の獲得機構が受精後にすべて突然に機能し始めるのではなく、受精前の卵においてすでに何らかの準備がなされているのではないかという仮説の下に、これを検証するための実験を行うことにした。前年までに結果で、全能性を持つ1細胞期胚の特徴である緩んだクロマチン構造が成長期の卵でも見られ、クロマチン構造を緩める働きをもつChd9がこの時期の卵で高いレベルで発現していることを明らかにした。そこで本年度はChd9をノックダウン(KD)することでこの遺伝子が成長期卵での緩いクロマチン構造に関与しているかを確かめることにした。その結果、Chd9のKDによりクロマチン構造が締まることが明らかとなり、Chd9による卵でのクロマチン構造の緩みが全能性獲得の準備となっていることが示唆された。また、リンカーヒストンH1の変異体であるH1fooは卵で高発現しており、さらにクロマチン構造を緩める働きがあることが知られていることから、このタンパク質の卵での働きが全能性獲得に関与していることを考え、成長卵においてH1fooのKDを行った。その結果、減数分裂は正常に進行するが、受精後の1細胞期に発生が停止した。この結果は、H1fooも成長期の卵において全能性獲得の準備に関与している可能性を示すものである。29年度が最終年度であるため、記入しない。一方、申請者のこれまでの研究において、成体組織の体細胞では見られない受精後の胚に特徴的な現象の一部が、受精前の卵でも観察された。したがって、受精前の卵は最終分化した細胞というよりは、むしろ全能性を持つ受精後の胚の前段階の状態にあるということが考えられる。すなわち、全能性への変化は受精を機に一気に開始されるのではなく、受精前の卵形成過程ですでに準備がなされているということである。そこで本研究では、この仮説を検証することを目的として、まず、クロマチン構造および遺伝子発現について受精前の卵と受精後の胚での共通な要素を明らかにしていく。本年は、まず受精前の卵において、クロマチン構造が全能性を有する1、2細胞期胚と近い状態にあるのかどうかについての検証を行った。すなわち、全能性を有する、1、2細胞期胚の特徴であるクロマチン構造の緩みをFRAP法で調べたところ、成長期卵は1細胞期胚よりは締まった構造をしていたが、2細胞期胚よりも緩んだ構造となっていることが分かった。したがって、受精後の胚に特異的な性質の一部が受精前の卵ですでに備わっていることが示された。また、クロマチン構造を緩める機能を持つChdファミリーの発現を受精前後で調べたところ、Chd9が卵で高発現していることが分かった。次に、全能性を有する1細胞期胚の特徴として遺伝子間領域が活発に転写されているということが明らかとなっているが、これについてRNAシーケンスのデータを解析したところ、受精前の卵でも遺伝子間領域が活発に転写されていることが明らかとなった。本年度の計画は、まず、研究実績の項で記したように、受精前の卵におけるクロマチン構造を調べることである。すなわち、全能性を有する1、2細胞期胚は極端に緩んだクロマチン構造をしているが、分化した細胞では締まった構造になっていることが知られており、これが受精前の卵ではどのようになっているかを明らかにするというものである。その結果、卵では1、2細胞期の中間程度に緩んでおり、卵では全能性獲得の準備状態が進行していることが示唆された。また、卵でクロマチン構造を緩める因子の候補を本研究室のRNAシーケンスデータで探索したところ、クロマチンの構造の調節に関わるCHDファミリーの中のChd9が有力な候補として挙げられた。以上、本年度ではまずクロマチン構造に関しての解析を行う計画となっていたが、順調に実験が進行し、仮説通りというよりもむしろ想定していた以上に卵でクロマチン構造が緩んでいることが明らかとなり、十分な研究の進展があったものと考えられる。次に、1細胞期胚の特徴である遺伝子間領域での活発な転写についても、RNAシーケンスの解析で卵においても同様の傾向があることが明らかとなり、当初の計画が十分に達成されたものと言うことができる。さらに、RNAシーケンスの解析によって、卵において高発現しているクロマチン構造を緩める因子を見出すことができ、全能性を調節する因子の候補などが得られたことから、本年度の研究計画は順調に達成されたものと考えられる。

本研究においては、全能性の獲得機構が受精後にすべて突然に機能し始めるのではなく、受精前の卵においてすでに何らかの準備がなされているのではないかという仮説の下に、これを検証するための実験を行うことにした。前年までに結果で、全能性を持つ1細胞期胚の特徴である緩んだクロマチン構造が成長期の卵でも見られ、クロマチン構造を緩める働きをもつChd9がこの時期の卵で高いレベルで発現していることを明らかにした。そこで本年度はChd9をノックダウン(KD)することでこの遺伝子が成長期卵での緩いクロマチン構造に関与しているかを確かめることにした。その結果、Chd9のKDによりクロマチン構造が締まることが明らかとなり、Chd9による卵でのクロマチン構造の緩みが全能性獲得の準備となっていることが示唆された。また、リンカーヒストンH1の変異体であるH1fooは卵で高発現しており、さらにクロマチン構造を緩める働きがあることが知られていることから、このタンパク質の卵での働きが全能性獲得に関与していることを考え、成長卵においてH1fooのKDを行った。その結果、減数分裂は正常に進行するが、受精後の1細胞期に発生が停止した。この結果は、H1fooも成長期の卵において全能性獲得の準備に関与している可能性を示すものである。当初の実験計画にChd9の機能解析を加え、以下の実験を行う予定とする。(1)Chd9の機能解析:卵において緩んだクロマチン構造の形成に係る因子の候補であるChd9をRNAiでノックダウンした後、FRAP解析を行うことで、クロマチン構造の変化を調べる。(2)卵における転写制御機構の解析:発現遺伝子の制御領域の解析を行うことで、卵および1、2細胞期胚における転写制御機構の類似点および相違点を明らかにする。(3)リプログラミング準備段階の検証:ヒストン変異体および(2)で明らかになった転写制御の類似あるいは相違に関わる因子を成長期卵でノックダウンあるいは過剰発現させて、受精後の全能性獲得への影響を調べる。以上のステップのうち、まず、計画(2)のステップについては、発現遺伝子の制御領域の解析を行うことで、卵、初期胚およびES細胞における転写制御機構の類似点および相違点を明らかにする。次いで、これまでの研究および(2)で明らかになった転写制御の類似あるいは相違に関わる因子を成長期卵でノックダウンあるいは過剰発現させて、その全能性獲得への影響を調べる。これらの実験によって、受精後の胚に特異的な性質の一部が受精前の卵ですでに備わっていることが、受精後の全能性獲得に必要であるかどうかを検証することができる。29年度が最終年度であるため、記入しない。
プロリル異性化酵素Pin1の糖尿病発症における役割の解明

IRS-1結合蛋白としてプロリル異性化酵素Pin1を同定した。HepG2にPin1を過剰発現させるとインスリンシグナルの亢進が認められ、ノックアウトすると抑制が認められた。さらにPin1 KOマウスはコントロールマウスに比べてインスリン抵抗性を示し、糖尿病モデルマウスにPin1を過剰発現させると血糖値の改善が認められた。以上のことからPin1はインスリンシグナルの調節に重要な役割を果たしていることが明らかとなった。本年度はIRS-1に結合するタンパクとしてプロリン異性化酵素Pin1を同定し、Pin1のインスリンシグナル及び糖尿病発症への関与について以下の検討を行った。(1) IRS-1とPin1はHepG 2での過剰発現系だけでなくマウス肝での内在性の結合も認められた。この結合は脱リン酸化阻害剤オカダ酸処理により増強され、脱リン酸化処理により阻害されるためIRS-1のリン酸化がPin1との結合に必要であることが明らかとなった。(2) Pin1とIRS-1の結合領域について検討したところ、Pin1はN末側のWW domainが、IRS-1はSET domainの領域で結合することが明らかとなった。(3) HepG 2にPin1を過剰発現させるとIRS-1のチロシンリン酸化、PI3kinaseとの結合、Aktのリン酸化の顕著な増大が認められ、Pin1阻害剤Juglone処理やsiRNAによるノックダウンを行うと、インスリンシグナルの抑制が認められた。これらの結果より、Pin1はインスリンシグナルを促進させることが示唆された。(4) Pin1の発現量は、高脂肪食負荷により、肝・筋ともに増加し、絶食時に減少することからPin1の発現は栄養状態により変動することが示唆された。(5)糖尿病モデルマウスであるob/obマウスにPin1を過剰発現させると、インスリン抵抗性が改善し、Pin1ノックアウトマウスはコントロールマウスに比べてインスリン抵抗性を示した。以上の結果より、Pin1はIRS-1と結合することにより、インスリンシグナルを亢進させ、糖代謝の調節に重要な役割を担っていることを明らかにした。本年度はPin1結合蛋白として新たに糖新生系に関与するCRTC2を同定し、Pin1の糖新生系への影響について以下の研究を行った。(1)Pin1結合蛋白を同定するために、Flagタグが付いたPin1をマウス肝臓に発現させ、解析を行ったところCRTC2が同定された。この結合はSf9細胞やHepG2での過剰発現系のみならず、マウス肝での内在性での結合も認められた。さらにアルカリフォスファターゼ阻害薬であるオカダ酸により結合の増強が認められることから、この結合はリン酸化依存的であることが示唆された。(2)Pin1とCRTC2の結合部位の同定を試みたところ、Pin1はN末側のWW domainが、CRTC2は核移行シグナル内にあるSer136が必要であることが明らかとなった。(3)HepG2でのPin1過剰発現はフォルスコリン刺激によるCREルシフェラーゼ活性を抑制し、Pin1ノックダウンにより活性の増強が認められた。(4)CRTC2はフォルスコリン刺激により、細胞質から核へ移行し、CREBと結合することによりCRE転写活性を促進する。Pin1過剰発現により、CRTC2の核移行、CREBとの結合及びPEPCKプロモーターへのリクルートが抑制された。(5)STZ投与マウスは肝でのPEPCK発現が亢進しているが、Pin1過剰発現により発現が抑制され、血糖値の改善も認められた。以上の結果より、Pin1はCRTC2と結合することで肝の糖新生系への調節に重要な役割を担っていることが明らかとなった。