hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
リドカインは腫瘍疾患動物の予後に影響するか?放射線増感作用に着目した検討

本研究の目的は「麻酔薬や麻酔方法の選択が患者予後に影響するのか?」というテーマを検討し、適した麻酔方法を明らかにすることである。上皮成長因子受容体(EGFR)阻害薬は放射線増感剤としても期待されているが、局所麻酔薬の一つであるリドカイン(Lid)がEGFRを抑制すると報告されており、放射線治療時の全身麻酔の選択要因として、Lidによる放射線増感作用について検討を行っている。2018年度は基礎的検討として犬腫瘍細胞株(悪性黒色腫; LMeC, KMeC)を用いたLidの放射線増感作用について、Lidの細胞毒性およびコロニーフォーメーションアッセイ法による細胞増殖死に関する検討を報告した(「犬腫瘍細胞株におけるリドカインの抗腫瘍効果についての検討」第97回日本獣医麻酔外科学会、2019年1月)。すなわち、臨床で想定されるLid濃度では細胞毒性は見られず、KMeCではLidよりも放射線量増加の効果が強い一方、LMeCでは比較的低線量でも高濃度のLidの併用でその効果は増強された。引き続き全身麻酔薬についても、Lidと併用した場合の放射線増感作用、および両細胞株におけるEGFRの発現等について検討しており、2019年度に成果を発表する予定である。また、IMRTを用いた放射線治療に必要な放射線治療計画装置(Monaco, Elekta社)で、獣医療に適した条件となるようMLCパラメータの調整並びその治療プランの正確性について報告した(「獣医療におけるIMRTの初期経験とくにMLCパラメータ調整について」日本放射線腫瘍学会第31回学術大会、2018年10月)。これは、2019年度の研究計画で予定している山口大学附属動物医療センターにおける臨床治療に必要なデータであり、同時に国内外における獣医療のIMRTを用いた治療プラン作成に大きく貢献すると考えられる。細胞を用いた基礎的検討ではデータ確認のために実験を繰り返し実施したため、EGFR発現に関する検討が遅れているものの、細胞培養手技等の確立ができており、引き続き全身麻酔薬とのLid併用による効果を検討する予定である。また、今後も引き続き医学部付属病院放射線部から支援を受ける予定であり、現在までに附属動物医療センターにおけるリニアックによる放射線治療をうけた症例数は217件と順調に増えている。2018年度までの研究結果をもとに予定通りに研究計画を進められると考えている。研究計画に基づき、実際の症例に対する治療効果を検討する。当初予定になかったが、放射線治療による治療効果の評価については、腫瘍のダイス法やベクトル変位量を用いて、累積放射線量との比較を行う研究を医学部附属病院放射線治療部と共同で実施する予定であり、この研究により、実際の臨床症例においてもより詳細なLidの放射線増感作用について検討が可能であると考えている。また、引き続きLidと他の麻酔薬(プロポフォール、アルファキサロン)を併用した場合の放射線増感作用について検討する予定である。なお、これまでの検討から、2種類の細胞株で放射線増感作用が異なることが明らかになっており、RT-PCRによるEGFR発現量、EGFRのチロシンキナーゼドメインのリン酸化が放射線増感作用に与える影響についての評価を進める。上皮成長因子受容体(EGFR)阻害薬は放射線増感剤としても期待されているが、局所麻酔薬の一つであるリドカイン(Lid)がEGFRを抑制すると報告されており、放射線治療時の全身麻酔の選択要因として、Lidによる放射線増感作用について検討を行うこととした。平成29年度は、基礎的検討として犬腫瘍細胞株を用いてLidの放射線増感作用を検討した。犬腫瘍細胞株は、山口大学共同獣医学部附属動物医療センターにおけるリニアックを用いた放射線治療に来院する腫瘍疾患症例を考慮し、犬の悪性黒色腫の細胞株(LMeC, KMeC)を選択した。Lid濃度は臨床的に静脈内投与した場合から局所注射した場合の血中濃度を考慮し、0、4、40、400、4000 μMの濃度で検討を行った。まずLidの細胞毒性を評価するためにCCK8(Dojindo, Japan)を用いて検討したところ、24時間後に4000 μMで細胞障害性が観察されたが、臨床的に想定される400 μM以下では影響はないと考えられた。次に、臨床治療と並行して、リニアック(Synegy, Elekta社)による細胞株の照射を実施するために、放射線治療計画装置(Monaco, Elekta社)を用いて計算することに必要な獣医療に適した条件となるようMLCパラメーターの調整を行った。線量計算が正しいことは水等価ファントムで放射線量測定を行って確認した。この調整過程は本研究の最終年度に予定している臨床例での検討、ならびに今後の獣医療の強度変調放射線治療(IMRT)に有用なデータであると考え、次年度に概要を学会報告する予定である。現在、コロニーフォーメーションアッセイ法を行うための条件検討を行っている。細胞株の安定化までに時間を要したことの他、照射に用いるリニアックは臨床治療用として獣医療に適した条件に調整する必要があり、これまで医学部付属病院放射線部から支援を受けているが、人を対象とした治療機とは異なるため検証を行う必要があり、この作業に時間を要した分、進捗状況がやや遅れている。現在までに悪性黒色腫の犬腫瘍細胞株を用いてリドカインの放射線増感作用を検討するところまで進捗しており、最適な実験手技が確立すれば、他の麻酔薬の併用は同様の手技を用いることができると考えられる。

本研究の目的は「麻酔薬や麻酔方法の選択が患者予後に影響するのか?」というテーマを検討し、適した麻酔方法を明らかにすることである。上皮成長因子受容体(EGFR)阻害薬は放射線増感剤としても期待されているが、局所麻酔薬の一つであるリドカイン(Lid)がEGFRを抑制すると報告されており、放射線治療時の全身麻酔の選択要因として、Lidによる放射線増感作用について検討を行っている。2018年度は基礎的検討として犬腫瘍細胞株(悪性黒色腫; LMeC, KMeC)を用いたLidの放射線増感作用について、Lidの細胞毒性およびコロニーフォーメーションアッセイ法による細胞増殖死に関する検討を報告した(「犬腫瘍細胞株におけるリドカインの抗腫瘍効果についての検討」第97回日本獣医麻酔外科学会、2019年1月)。すなわち、臨床で想定されるLid濃度では細胞毒性は見られず、KMeCではLidよりも放射線量増加の効果が強い一方、LMeCでは比較的低線量でも高濃度のLidの併用でその効果は増強された。引き続き全身麻酔薬についても、Lidと併用した場合の放射線増感作用、および両細胞株におけるEGFRの発現等について検討しており、2019年度に成果を発表する予定である。また、IMRTを用いた放射線治療に必要な放射線治療計画装置(Monaco, Elekta社)で、獣医療に適した条件となるようMLCパラメータの調整並びその治療プランの正確性について報告した(「獣医療におけるIMRTの初期経験とくにMLCパラメータ調整について」日本放射線腫瘍学会第31回学術大会、2018年10月)。これは、2019年度の研究計画で予定している山口大学附属動物医療センターにおける臨床治療に必要なデータであり、同時に国内外における獣医療のIMRTを用いた治療プラン作成に大きく貢献すると考えられる。細胞を用いた基礎的検討ではデータ確認のために実験を繰り返し実施したため、EGFR発現に関する検討が遅れているものの、細胞培養手技等の確立ができており、引き続き全身麻酔薬とのLid併用による効果を検討する予定である。また、今後も引き続き医学部付属病院放射線部から支援を受ける予定であり、現在までに附属動物医療センターにおけるリニアックによる放射線治療をうけた症例数は217件と順調に増えている。2018年度までの研究結果をもとに予定通りに研究計画を進められると考えている。研究計画に基づき、つづいてLidと他の麻酔薬(プロポフォール、アルファキサロン、イソフルラン、セボフルラン)を併用した場合の放射線増感作用について検討する予定である。なお、これまでの検討から、当初の予定である放射線量を2,4,6Gyに変更する予定である。また、EGFRのチロシンキナーゼドメインのリン酸化が放射線増感作用に与える影響について、および放射線照射によるDNA二重鎖切断(DBS)に対する修復応答を検討するためのウェスタンブロット法について現在準備している最中である。また、アポトーシスについての評価は、当初の予定を変更し、カスパーゼ3/7活性を検出するアッセイキットを用いる予定である。
新規ナイロウイルスを用いたC57BL/6マウス出血熱モデルの解析と治療薬の探索

野生動物を宿主とする微生物による感染症の多くは、Neglected Diseaseであり、有効な予防法や治療法が確立していないことが多い。例えば、野生動物とヒトとの接触の機会が多いアフリカ大陸では、齧歯類のマストミスを宿主とするアレナウイルス科ラッサウイルス、ダニを媒介昆虫として感染するブニヤウイルス科ナイロウイルス属クリミア・コンゴ出血熱ウイルス(CCHFV)といった出血熱感染症の病原体が多数存在しているが、いずれの出血熱に対しても有効な治療法は存在していない。出血熱はアフリカ地域等発展途上国での発生が多いneglected tropical diseaseであり、治療薬剤、ワクチン等の開発も遅れている。これらのウイルス研究は精力的に行われているが、多くの国で高度封じ込めBiosafetylevel-4 (BSL-4)での取り扱いが義務づけられ、限定された施設でのみ実施可能な状況であることや、ほとんどの出血熱関連ウイルスが、主要な実験動物であるマウス等の小動物への感染において症状を示さないため、生体における研究は困難である。本研究者が過去の研究で発見、分離した新規アレナウイルスLuna virus、新規ナイロウイルスLeopards Hillウイルス(LPHV)は、ヒトへの病原性は報告されていないが、遺伝的にそれぞれ、ラッサウイルス、CCHFウイルスと近縁である。特に、LPHVは近交系マウスC57BL/6Jに出血熱様の症状を伴う致死的な感染症を発症させることから、ナイロウイルスによる出血熱の動物モデルとして有用であると考えられる。昨年度までに、上記ウイルス及び病原性を持たないと考えられる近縁ウイルスをスクリーニングのツールとして、アレナ、ナイロウイルス感染症に対する創薬のシード化合物となり得る高い抗ウイルス活性をもつ低分子化合物を見いだしている。基本骨格を共有する類縁化合物を探索し、構造活性相関を明らかにすることを目指した。抗ウイルス薬研究については、アレナウイルス、ナイロウイルスについてin vitroでの増殖抑制活性を持つ化合物群を得られている。これらの基本骨格から、構造活性相関も見えてきており、概ね順調な進捗であると言える。今後、in vivoでの活性を持つ化合物群を発見することを目指す。LPHVの病原性発現機構の研究は、リバースジェネティクスによる組換えウイルスの作成を引き続き検討する。これまでのところ、過去にナイロウイルスの組換えが成功したと報告のあった、DNAプラスミドからの発現法では組換えウイルスの産生が確認できておらず、RNAトランスフェクションなど他のウイルスで適用されている方法も検討する必要がある。一方、宿主側の反応として全トランスクリプトームによる解析を試みる。昨年度行った共同研究で、NGSを使用した遺伝子発現データを得たことから、この解析をすすめていく。これまでに得られた抗ウイルス活性を示す低分子化合物について、薬剤耐性株を取得することで作用点の特定をする。本化合物は、ウイルス由来RNA-dependent RNA polymeraseを含むLタンパク質に作用することが示唆されている。ブニヤウイルス科ウイルスでは、オルソブニヤウイルス属ウイルスのLタンパク質の結晶構造が解析されているが、オルソブニヤウイルスを含む他3属のブニヤウイルス科ウイルスと比べ、ナイロウイルスは特異な1次構造を持っていることから単純な比較検討ができない。本研究により、ナイロウイルスLタンパク質の構造と酵素活性についての新たな知見が得られると考えられる。また、得られた化合物のうち、十分に低濃度で抗ウイルス活性を持つ物について、マウスを使ってin vivoでの活性を検討する。LPHVの病原性発現機構の研究では、感染マウス脾臓細胞における全トランスクリプトームを行い、弱毒11SB17株、強毒11SB23株の各感染マウスと非感染マウスについて時系列の遺伝子発現データを得ている。このデータからLPHV感染と免疫機能の発現制御について解析を行う。また、リバースジェネティクスによるウイルスの作成は、これまでの所組換えウイルスを検出できておらず、DNAミニゲノムを用いた方法ではうまく作成できない可能性も考えられたことから、in vitro RNA転写でのウイルスゲノムの作成とトランスフェクションなど別の方法を検討する野生動物とヒトとの接触の機会が多いアフリカ大陸では、齧歯類のマストミスを宿主とするアレナウイルス科ラッサウイルス、ダニを媒介昆虫として感染するブニヤウイルス科ナイロウイルス属クリミア・コンゴ出血熱ウイルス(CCHFV)といった出血熱感染症の病原体が多数存在しているが、いずれの出血熱に対しても有効な治療法は存在していない。本研究者の発見した新規ナイロウイルスLeopards Hillウイルス(LPHV)は近交系マウスC57BL/6Jに出血熱様の症状を伴う致死的な感染症を発症させることから、ナイロウイルスによる出血熱の動物モデルとして有用であると考えられる。平成27年度に行った研究で、LPHVの霊長類動物における病原性をカニクイザルでの感染実験で確認し、また、マウスモデルで既存薬の核酸アナログであるリバビリンの抗ウイルス効果を確認した。さらに、創薬のシードとしてリバビリンとは異なる作用機構を持つと期待できる化合物群を探索し、in vitroでリバビリンよりも抗ウイルス効果の高い化合物を見いだした。

本研究により、そのような出血熱を模倣し、解析をすることで病原体の性質の解明や治療法につながる発見ができた。平成27年度には、新規ナイロウイルスLeopards Hillウイルス(LPHV)の性状解析のため、カニクイザルでの感染実験を行った。本実験はコウモリ由来の新規ナイロウイルスがマウスに致死的な出血熱様感染症を引き起こしたことから、他動物、特に霊長類動物においての病原性を確認した。滋賀医科大学病理学講座疾患制御病理学部門伊藤靖准教授らとの共同研究により、マウスにおいて弱毒の11SB17株と強毒の11SB23株を各3頭のカニクイザルに接種し、病態の観察、体温変化、血球数や血中ウイルス量などを測定した。いずれのウイルス株についても接種後すぐに発熱、食欲減退等の症状を示したが、致死性は見られなかった。2株間での比較においては、11SB17株の方が発熱期間、ウイルス血症の程度等で11SB23株よりも重篤な症状を示したことから、マウスとサルでウイルス感受性の違いが示された。この差違を解析するため、リバースジェネティクスによる組換えLPHVを作成するため、発現プラスミドの構築を行った。抗ウイルス薬候補となる化合物の探索では、まず、塩野義製薬との共同研究で提供された低分子化合物群についてスクリーニングを行い、in vitroで抗LPHV効果を持つ化合物を見いだした。本化合物群については引き続きスクリーニングを行うと共に、当初計画に従いアレナウイルス属ウイルスについても効果を検討する。さらに、マウス感染モデルを用いてリバビリン等抗ウイルス効果を持つ核酸アナログのin vivoでの抗LPHV効果を検討し、感染モデルとしての有用性を確認した。以上の結果から、本研究課題の目的である動物感染モデルを利用したナイロウイルス属ウイルスの病原性の解析と、創薬に向けた探索については基礎的な実験系の確認及び実験の準備が進められ、概ね順調な進捗状況であると言える。野生動物を宿主とする微生物による感染症の多くは、Neglected Diseaseであり、有効な予防法や治療法が確立していないことが多い。例えば、野生動物とヒトとの接触の機会が多いアフリカ大陸では、齧歯類のマストミスを宿主とするアレナウイルス科ラッサウイルス、ダニを媒介昆虫として感染するブニヤウイルス科ナイロウイルス属クリミア・コンゴ出血熱ウイルス(CCHFV)といった出血熱感染症の病原体が多数存在しているが、いずれの出血熱に対しても有効な治療法は存在していない。出血熱はアフリカ地域等発展途上国での発生が多いneglected tropical diseaseであり、治療薬剤、ワクチン等の開発も遅れている。これらのウイルス研究は精力的に行われているが、多くの国で高度封じ込めBiosafety
次世代高電圧直流送電を可能にする液中アークプラズマを用いた新しい遮断器の基礎研究

昨年度までに、アーク近傍を安定化チューブで取り囲むことにより、35MPa以上の過渡的な圧力上昇が得られアーク抵抗も1Ω以上となることが明らかになった。最終年度はこれまでのデータを基に限流ユニットを製作した。1.35MPaに耐えられる限流ユニット用の密閉圧力容器を製作した。密閉化でトリガワイヤによるアーク点弧が難しいため、空気シリンダを用いた電極駆動装置を製作した。製作した限流ユニットと真空遮断器を組み合わせて、遮断器モデルを構成した。2.遮断実験実施にあたり、電極開極まで通電・放電時間を従来より長くとる必要があるため、20kV180μFコンデンサバンクに加え、850V4.7μFのコンデンサバンクを併用する合成電流試験装置を開発した。また、遮断直後の電圧回復を検証するため電圧印加用の80kV直流電圧発生装置を製作した。3.遮断実験の結果、アーク抵抗は瞬間的には5Ω程度まで上昇し、限流して遮断することができた。ただし遮断点において電源のコンデンサバンク電圧は4kV程度まで減衰しており、電源容量が十分でないために容易に遮断できた可能性もあった。実験によって得られたアーク特性をモデル化し遮断数値シミュレーションを実施した。10kV送電系統で限流遮断成功するためには、実験で得られたアーク抵抗2倍程度とし、開極速度も高速化する必要があることが明らかになった。4.2倍のアーク抵抗は、限流ユニットを2個直列に構成することで実現できる。開極高速化のために、電磁反発力を用いたアクチュエータ適用を検討し机上設計を行った。その結果、3.6kV3300μFのコンデンサのパルス電流で初期速度2m/s、変位量50mm程度が得られる見込みとなった。研究期間全体を通じて、密閉容器の液体中アークの高いアーク抵抗を活用した限流コンポーネントの、高電圧直流送電の主回路遮断器への適用可能性を確立することができた。高電圧直流送電(多端子送電網)の主回路遮断器への適用を目指し、密閉容器の液体中アークの高いアーク抵抗を活用した限流コンポーネントの基礎研究を実施している。従来の交流用高電圧ガス遮断器のアーク抵抗のmΩオーダーに対し、直流限流には100Ω近いアーク抵抗が必要である。1.液体中アークプラズマの物理特性の把握:20kV180μFのコンデンサバンクを製作し、直流状電流による開放系液体中アークの電流・電圧・アーク抵抗の測定と高速カメラによる発光画像観測を実施した。開放系液体中アークは気中アークに比べ1桁程度アーク抵抗が高いことが判明した。2つの要因がある。比熱が大きいためにアークが膨張しにくく材料によってはむしろ収縮する傾向があること、解離による高い熱伝導率や電子付着性によりアークが冷却され導電率が下がることである。これら知見は今後の研究の方向付けを担うものである。2.液体種類の決定:比熱の大きい水、絶縁性能に優れたシリコンオイル、電気的負性のハイドロフルオロエーテル(HFE)で実験を実施した。各液体中のアーク抵抗は電流400Aの瞬時値で、HFE 2.5Ω、シリコンオイル1.5Ω、水1.4Ω程度と比較的高い値が得られたが目標の100Ωを達成するには密閉系が必要と思われる。画像からアーク直径を分析し抵抗率を推定した結果、HFEでは冷却による導電性の低下が、水ではアークの収縮がアーク抵抗に対し支配的であると考えられる。今後、最もアーク抵抗の高いHFEとアークの収縮効果の大きい水で研究を進める。3.圧力上昇と圧力構造物の設計:エネルギー収支と比熱から簡易的に圧力上昇を計算した結果、容易に250気圧超の圧力上昇となることがわかった。完全密閉圧力容器の場合は費用と時間がかかるため、まずは圧力壁により過渡的に局所的な圧力上昇を促しさらに高いアーク抵抗を得られるよう実験を行う予定である。概ね計画通り進展している。ただし、液中アークによる圧力上昇は当初予想の100気圧よりはるかに高い250気圧超となることがわかった。完全密閉容器の設計製作には想定以上の時間と費用がかかるため、まずは圧力壁により過渡的に局所的な圧力上昇を促しさらに高いアーク抵抗を得られるよう実験をすすめることとする。1.アーク近傍を安定化チューブで取り囲んだ閉鎖系の液体中アークプラズマ実験を行い、電流と熱流体的な物理特性及び電気的な物理特性の詳細把握を行った。コンデンサバンクのパルス電流により直流状過渡アークを発生させ、半導体トランスデューサーにより内部圧力上昇を測定した。その結果、安定化チューブ内ではアークにより発生した圧力波が伝搬し35MPa以上の圧力となっていることがわかった。しかし、この圧力は一時的なもので、チューブ外に伝搬することで低下した。圧力が極めて高い期間はアークが絞られアーク抵抗の上昇がみられることから、容器を完全密閉化し、高圧力を維持できれば直流限流に必要な100Ωの抵抗が得られる可能性がある。2.実験で測定した電流とアーク電界特性から数学的なアークモデリングを行い、ハイブリッド型遮断器の数値シミュレーションを実施した。

液体中アークプラズマによる限流装置と真空遮断器を直列に接続し、直流送電系統で地絡事故が発生した場合の遮断現象シミュレーションを実施した。その結果、実験値をベースにした液体中アークプラズマの抵抗では、限流効果が十分でなく、真空遮断器での遮断が難しいことがわかった。アークプラズマ抵抗を10倍程度とすると、75ms程度で限流遮断が可能となることが分かった。以上の結果から、完全密閉化により高圧力を維持し、現状の10倍程度のアーク抵抗を得ることで、限流遮断を実現できると考えられる。ただし、遮断時間は75msよりさらに短くする必要があり、安定的に高いアーク抵抗を得られる条件調査を進める必要がある。研究計画では、平成29年度に、光ファイバーを用いた発光分光分析によるアーク温度測定を予定していた。実施したものの、分光装置の時間分解能が不十分で、過渡的である液体中アークの温度時間変化を取得することができなかった。時間分解能の高い分光装置を準備し、平成30年度に再度実施する。昨年度までに、アーク近傍を安定化チューブで取り囲むことにより、35MPa以上の過渡的な圧力上昇が得られアーク抵抗も1Ω以上となることが明らかになった。最終年度はこれまでのデータを基に限流ユニットを製作した。1.35MPaに耐えられる限流ユニット用の密閉圧力容器を製作した。密閉化でトリガワイヤによるアーク点弧が難しいため、空気シリンダを用いた電極駆動装置を製作した。製作した限流ユニットと真空遮断器を組み合わせて、遮断器モデルを構成した。2.遮断実験実施にあたり、電極開極まで通電・放電時間を従来より長くとる必要があるため、20kV180μFコンデンサバンクに加え、850V4.7μFのコンデンサバンクを併用する合成電流試験装置を開発した。また、遮断直後の電圧回復を検証するため電圧印加用の80kV直流電圧発生装置を製作した。3.遮断実験の結果、アーク抵抗は瞬間的には5Ω程度まで上昇し、限流して遮断することができた。ただし遮断点において電源のコンデンサバンク電圧は4kV程度まで減衰しており、電源容量が十分でないために容易に遮断できた可能性もあった。実験によって得られたアーク特性をモデル化し遮断数値シミュレーションを実施した。10kV送電系統で限流遮断成功するためには、実験で得られたアーク抵抗2倍程度とし、開極速度も高速化する必要があることが明らかになった。4.2倍のアーク抵抗は、限流ユニットを2個直列に構成することで実現できる。開極高速化のために、電磁反発力を用いたアクチュエータ適用を検討し机上設計を行った。その結果、3.6kV3300μFのコンデンサのパルス電流で初期速度2m/s、変位量50mm程度が得られる見込みとなった。研究期間全体を通じて、密閉容器の液体中アークの高いアーク抵抗を活用した限流コンポーネントの、高電圧直流送電の主回路遮断器への適用可能性を確立することができた。平成29年度には、部分的な閉鎖系(圧力壁)の液体中アークプラズマの実験を中心に実施し、生成メカニズムと物理特性、特に圧力上昇の様相とアーク電圧の挙動を把握する。電源は20kV-180μFのメインバンクに375V-80Fのバンクを合成して通電時間を延ばし、遮断動作等、電極操作可能な装置に改造する。
細胞質遺伝の分子細胞機構に関する研究

本研究の目的は,(i)無性生殖生物で見られるオルガネラの分裂・増殖と有性生物でみられるオルガネラの母性遺伝・両性遺伝を細胞質遺伝として総括するとともに,(ii)分子細胞学的手法にマイクロダイセクション装置を用いたピンポイント分子生物学的手法を加え,研究実施計画で示す4つの現象を細胞と分子のレベルで解明することにある.本年度の研究実績を以下に示す.1)無性生殖生物の細胞質遺伝の機構の解析:細胞質分裂リングの形成機構を,新たな抗アクチン抗体を用いて分子細胞学的に解析し,アクチンの分布とリング形成との関わりを明らかにした.また,オルガネラ分裂リングに関しても,電顕三次元立体構築法を用いて,それが三層構造であることを明らかにした.2)母性遺伝の分子機構の解析:クラミドモナスの接合直後から発現する遺伝子(zys4)が接合子間の接着に関与していることを明らかにした.また,クラミドモナスの形質転換系を用いて,葉緑体核の形状に関わる突然変異体を単離・同定した.3)両性遺伝の分子細胞機構:両性遺伝型・母性遺伝型植物の花粉形成過程におけるオルガネラの動態を,ミトコンドリアと色素体に分けて解析する方法を開発し,ミトコンドリアと色素体のいずれでもDNA消失・残存が母性・両性遺伝の原因であるとを実証した.また,マイクロダイセクション装置を用いた極微小試料の操作技術を確立し,クラミドモナスの母性遺伝機構を細胞あるいはオルガネラ一つレベルで解析することを可能にした.4)オルガネラの雌雄性の分子細胞機構の解析:ミトコンドリア融合に関与するコイルドコイル構造と膜貫通領域を持つタンパク質の局在とその作用機作を解析するために,ミトコンドリア融合を誘導するミトコンドリアプラスミドの遺伝子産物に対する抗体を作成した.また,ミトコンドリア融合や雌雄性に関与する真正粘菌でのみ見られるミトコンドリアプラスミドの起源を明らかにした.1.マイクロダイセクシヨン装置の改良を行い、従来の装置では不可能であった極小オルガネラゲノムのダイセクシヨンが可能となった。現試作段階では、光源装置の改良、レーザーの走査システムの付加、およびマイクロ光ピンセットとの結合などによって、1個の生きている細胞内における1個のオルガネラの移動、固定細胞からのオルガネラの分取か可能である。この技術を分子生物学的手法と結合することにより、以下の2-5の細胞質遺伝の分子細胞機構の解析を更に進めたい。2.母性遺伝の分子機構については単細胞緑藻クラミドモナスを用いて解析した。接合後1O分以内に発現する2O余りの遺伝子の内、既に5つ遺伝子(ZySI-5】を単離している。ZySIをマルトース結合タンパク質とin frameで融合したタンパク質を大腸菌内で高発現させ、これを用いて抗体を作製した。抗体を用いたイムノブロッティング、免疫蛍光顕微鏡法による解析は、ZySI夕ンハク質の細胞内での生産が葉緑体核DNAの選択的消化の時期と密接に関与していることを明らかにした。3.1で改良したマイクロダイセクシヨン装置を用い、ヌクレアーゼCの葉緑体内での挙動を解析する装置の開発を始めた。4.両性遺伝の分子機構について高等植物を用いて解析した。両性遺伝型植物だけでなく、母性遺伝型植物でも卵細胞に巨大なオルガネラ核が出現することがわかった。これは、雌性配偶子の形成にも雄由来のオルガネラ遺伝子を子孫に伝達させないための機構があることを示唆している。5.オルガネラの雌雄性の分子機構について、真正粘菌のミトコンドリアの線状プラスミド上にある1O個のORFの構造を解析し、その内の1つがDNAホリメラーゼであることがはっきりした。更に、このプラスミドの関与で雌雄のミトコンドリア間でmtDNA同士が組換えを直接起こす現象を見いだした。本研究の目的は,以下の4つの現象を細胞質遺伝として統括し,分子細胞学的方法に加え超マイクロダイセクション装置を用いて,細胞と分子のレベルで解明することである。本年度の研究実績を以下に示す.1.無性生殖生物の細胞質遺伝の機構の解析:原始紅藻シアニゾシゾンのミトコンドリアゲノムの全塩基配列(32kbp)を決定し,ミトコンドリアの分裂装置が細胞核に支配されていることを示した。また,分裂装置のタンパク質はゴルジ体とマイクロボディよって分裂面表層に運搬され,ここで微細繊維の束である分裂リングを構築することを明らかにした.2.母性遺伝の分子機構の解析:単細胞緑藻クラミドモナスの接合直後に発現する遺伝子群(zys)の構造と機能を解析し,zys1A,1Bが互いに連鎖しており,これらの遺伝子産物が雄由来オルガネラDNAの選択的分解と密接に関係していることを明らかにした.また,zys3,4遺伝子に関しても遺伝子の構造を決め,抗体を作製した.3.両性遺伝の分子細胞機構:両性遺伝型植物ゼラニウムを用いて,細胞質遺伝には卵成熟過程におけるオルガネラDNAの選択的増幅が重要な役割を果たしていることを明らかにした.また,超マイクロダイセクション装置の改良を行ない,従来のマイクロダイセクションの分解能を10倍以上高めるとともに,光ピンセット装置でミトコンドリアを分離し,それらを一つずつ並べて文字を描くことにも成功した.

4.オルガネラの雌雄性の分子細胞機構の解析:真正粘菌フィサルムのミトコンドリア融合と遺伝子組換えを誘導するプラスミドがDNA,RNAポリメラーゼ遺伝子を持つことを明らかにした.また,ミトコンドリア融合現象を1個のアメーバ細胞のレベルで追跡するPCR法を用いた実験系を開発し,ミトコンドリアの片親遺伝と両性遺伝が切り替わる現象を見いだした.これによって,両性遺伝の際にミトコンドリアゲノム同士がプラスミドの関与によって組換わることを明らかにした.本研究の目的は,以下の4つの現象を細胞質遺伝として統括し,分子細胞学的方法に加えてマイクロダイセクション装置および凍結試料割断システムを用いて,細胞質遺伝の分子細胞機構を解明することにある.本年度の研究実績を以下に示す.1.無性生殖生物の細胞質遺伝の機構の解析:原始紅藻シアニジウムの葉緑体のRNAポリメレースσは細胞核にコードされており,細胞質で合成された後に葉緑体に移行することを明らかにした.オルガネラの分裂装置についても解析が進み,原始紅藻類のアクチン抗体を調製し,分裂装置の構築に関わる物質の局在やその収縮機構を凍結試料割断システム等を用いて明らかにしつつある.2.母性遺伝の分子機構の解析:単細胞緑藻クラミドモナスの接合直後に発現する遺伝子群(zys)の機能を解析し,zys3,4遺伝子の抗体を作製し,接合後の遺伝子発現,細胞壁構築や細胞接着に関連していることを明らかにした.3.両性遺伝の分子細胞機構:両性遺伝型植物ゼラニウムを用いて,花粉形成過程における色素体やミトコンドリアの挙動を免疫電顕等を用いて解析し,雄性配偶子のオルガネラDNAの消失に関して,色素体とミトコンドリアでは異なる挙動をすることを明らかにした.また,卵成熟過程で選択的にDNA増幅するミトコンドリアの三次元的動態を明らかにした.こうした挙動をするオルガネラの遺伝子構成を単一オルガネラレベルで解析するために,光ピンセット装置による単一オルガネラの分離・回収方法を考案し,PCR法によって極少数のオルガネラのDNA構成を検知できる系を開発した.4.オルガネラの雌雄性の分子細胞機構の解析:真正粘菌フィサルムのミトコンドリア融合を誘導するプラスミドは独自のRNAポリメラーゼ遺伝子を持ち,このプラスミドにコードされる遺伝子はエディテングされないことを明らかにした.これはミトコンドリアの雌雄性に関わるプラスミドの起源を探る上で極めて重要な知見である.本研究の目的は,(i)無性生殖生物で見られるオルガネラの分裂・増殖と有性生物でみられるオルガネラの母性遺伝・両性遺伝を細胞質遺伝として総括するとともに,(ii)分子細胞学的手法にマイクロダイセクション装置を用いたピンポイント分子生物学的手法を加え,研究実施計画で示す4つの現象を細胞と分子のレベルで解明することにある.本年度の研究実績を以下に示す.1)無性生殖生物の細胞質遺伝の機構の解析:細胞質分裂リングの形成機構を,新たな抗アクチン抗体を用いて分子細胞学的に解析し,アクチンの分布とリング形成との関わりを明らかにした.また,オルガネラ分裂リングに関しても,電顕三次元立体構築法を用いて,それが三層構造であることを明らかにした.2)母性遺伝の分子機構の解析:クラミドモナスの接合直後から発現する遺伝子(zys4)が接合子間の接着に関与していることを明らかにした.また,クラミドモナスの形質転換系を用いて,葉緑体核の形状に関わる突然変異体を単離・同定した.
組み換えウイルスを利用したヒトヘルペスウイルス6および7の潜伏感染の可視化と解析

ウイルスの潜伏感染時や再活性化時に特異的に活性化するプロモーターの同定と、ヒトの血液幹細胞を移植したSCID-huマウスでin vivoの潜伏感染系の確立を中心に研究を行なった。1.プロモーター解析に関しては、新規なものも含め、ウイルス増殖(再活性化)にともなって活性化するHHV-6の初期遺伝子プロモーターの同定と解析を主として行った。この結果、HHV-6の初期遺伝子プロモーターが、前初期遺伝子蛋白単独で充分な活性化が行なわれるものと、活性化するためにウイルス感染と増殖の開始が必要なものとの2つのクラスに分類されることを見出した。また、前初期遺伝子の中でも特に、前初期遺伝子IE2によって活性化さがおこなわれ、IEIとの共発現によってさらに活性化することが示された。さらに、これらの活性化にはHCMV IE2の結合モチーフであるCRSが関与していることが示唆された2.SCID-huマウスでの潜伏感染系の成立に関しては、野生株ウイルスおよび組換えウイルスを用いて、HHV-6やHHV-7の潜伏感染の主体と考えられるmyeloid系細胞の増殖・分化を維持できるNOD-SCID-huマウスの系において、ヒトの潜伏感染よりも非常に高頻度での潜伏感染細胞が長期間長期間維持できるHHV-6のin vivo潜伏感染モデルを作製した。また、骨髄中より分化の進んだmyeloid系細胞がある脾臓において、HHV-6初期遺伝子、後期遺伝子mRNA発現を確認でき、この潜伏感染システムが、潜伏感染だけでなく、再活性化の解析にも有用であることが判った。また、HHV-6の再活性化がmyeloid系細胞の分化にともなって生じることも示唆された。本研究の申請期間内での目標のうち、ウイルスの潜伏感染時や再活性化時に特異的に活性化するプロモーターの同定と、ヒトの血液幹細胞を移植したSCID-huマウスでin vivoの潜伏感染系の確立を中心に研究を行なった。1.プロモーター解析に関しては、HHV-6の初期遺伝子プロモーターの同定と解析を主として行い、HHV-6の初期遺伝子プロモーターが、前初期遺伝子蛋白単独で充分な活性化が行なわれるものと、活性化するためにウイルス感染と増殖の開始が必要なものとの2つのクラスに分類されることを見出した。また、それぞれに属するプロモーターをクローニングした。2.SCID-huマウスでの潜伏感染系の成立に関しては、HHV-6やHHV-7の潜伏感染の主体と考えられるmyeloid系細胞の増殖・分化を維持できるNOD-SCID-huマウスの系を用い、ヒトの潜伏感染よりも非常に高頻度での潜伏感染細胞が長期間維持できるHHV-6のin vivo潜伏感染モデルを作製した。またこのモデルでは、分化度の高い細胞からのウイルス再活性化も検出され、潜伏感染と再活性化の両者の研究に有効であることが判明した。これまでに、我々はU2-U8領域を欠損させ、発色マーカー遺伝子を組み込んだknockedoutウイルスH6R28が、PHA刺激ヒト臍帯血由来T細胞では充分に増殖できるが、通常のヒトT細胞における増殖の欠損があることを見出してきた。今回開発したSCID-huマウスモデルにおいても、H6R28は潜伏感染ウイルスDNAの維持と再活性化途中までのウイルス遺伝子発現はwild typeのウイルスと同様に行なえるが、完全なウイルス増殖を行なうことができないことが判明し、この組み換えウイルスを用いることにより、ウイルス増殖を介さない潜伏感染・再活性化の解析ができることが明らかになった。18年度は、17年度に引き続き、再活性化時に特異的に活性化するプロモーターの解析、SCID-huマウスモデルによる潜伏感染機構の解析を行なった。1.プロモーター解析に関しては、ウイルス増殖にともなって活性化する新規のHHV-6の初期遺伝子プロモーターの同定などを昨年までに行なっていた。

本年度はこれに加えて、これらのプロモーターが、ウイルスの増殖・再活性化時にどのように活性化するかのメカニズムの解析をおこなった。この結果、HHV-6の初期遺伝子は前初期遺伝子IE2によって活性化され、IE1との共発現によってさらに活性化することが示された。また、HCMV IE1/IE2によっても初期遺伝子プロモーターが活性化されることから、これらの活性化にはHCMV IE2の結合モチーフであるcis repression sequence (CRS)様の配列が関与していることが示唆された。2.SCID-huマウスでの潜伏感染系の確立とその解析に関しては、昨年度までのHHV-6潜伏感染システムの確立に引き続いて、その解析をおこなった。この結果、この潜伏感染マウス中には、環状のHHV-6 DNAが存在することが示唆され、HHV-6が他のヘルペスウイルスと同様の形態で潜伏感染を生じていることが判った。また、骨髄中より分化の進んだmyeloid系細胞がある脾臓において、HIIV-6初期遺伝子、後期遺伝子mRNA発現を確認でき、この潜伏感染システムが、潜伏感染だけでなく、再活性化の解析にも有用であることが判った。また、HHV-6の再活性化がmyeloid系細胞の分化にともなって生じることも示唆された。
遺伝情報維持機構へのRecQファミリーの寄与に関する無細胞実験系を用いた解析

DNA傷害に対する修復過程において、一群のRecQヘリカーゼおよびその関連タンパク質群の挙動と機能をXenopus卵抽出液無細胞実験系を用いて解析することを目的とした。Bloom症候群原因遺伝子産物Blmは正常なDNA複製の進行に応じてクロマチン上に結合し、この結合はBlmと相互作用することが知られるDNA Topoisomerase IIIα(Top3α)のクロマチン結合と相互に依存していた。また、Blm、Top3αの除去に伴うDNA複製の顕著な抑制が確認されたが、この抑制はcheckpoint経路によるものではないことが示唆された。Werner症候群原因遺伝子産物Wrn、Rothmund-Thomson症候群原因遺伝子産物RecQL4はDNA二本鎖切断(DSB)に応じてクロマチン結合し、この結合はRPAの存在に強く依存していた。卵抽出液中のDSB修復活性を定量的に解析するため、プラスミドDNAを基質に用いた相同組換え修復(HRR)活性および非相同末端結合修復(NHEJ)活性の測定系を構築した。本測定系を用いた結果、NHEJによって得られる産物はHRRによって得られるプラスミドの生産効率に比べて、約1000倍の高い効率で産生されること、検出されたNHEJ活性はDNA polymeraseα、δ、εの阻害剤であるaphidicolin、DNA-dependent protein kinaseの阻害剤であるwortmanninによって部分的に阻害されること、HRR活性はaphidicolinによって効率よく阻害されることが確認された。本測定系を用いてRecQL4のDSB修復への関与を検討したところ、RecQL4を除去した卵抽出液においてNHEJ活性の顕著な抑制とHRR活性の有意な促進が確認された。すなわち、RecQL4がNHEJに促進的に、HRRに抑制的に寄与することによりDSB修復に積極的に関与することが示唆された。DNA二本鎖切断を始めとするDNA傷害に対する修復過程において、一群のRecQヘリカーゼおよびその関連タンパク質群の挙動と機能をXenopus卵抽出液無細胞実験系を用いて解析することを目的とした。この研究課題の手がかりとして、Bloom症候群原因遺伝子産物Blm、Werner症候群原因遺伝子産物Wrn、Rothmund-Thomson症候群原因遺伝子産物RecQL4の三つのRecQヘリカーゼについてXenopusにおける相同タンパク質の抗体を作成した。この抗体を用いて解析したところ、Blmは正常なDNA複製の進行に応じてクロマチン上に結合したが、DNA複製停止やDNA二本鎖切断などの異常に応じた挙動の変化は見られなかった。また、Blmと相互作用することが知られるTop3αについてもXenopusにおける相同タンパク質を検索し抗体を作成したが、Blmと同様の挙動を示した。そこで、BlmあるいはTop3αについて免疫除去をおこないDNA複製の進行を観察したが、これらのタンパク質の欠損あるいは極度の減少によるDNA複製への影響は観察できなかった。一方、WrnおよびRecQL4についてはDNA複製の停止およびDNA二本鎖切断の生成に応じてクロマチン上に結合することが示された。Wrn、RecQL4で見られるDNA複製異常に応じたクロマチン結合はカフェインの添加により増強されることより、これらの結合がチェックポイント機構により負の制御を受けているものと考えられた。DNA二本鎖切断に応じたWrn、RecQL4のクロマチン結合についてはRPAの存在に強く依存していた。さらに、このDNA二本鎖切断に応じたWrn、RecQL4の結合とrad51のクロマチン結合との間に明らかな相互依存性は認められなかったが、RecQL4とrad51のクロマチン結合に相互の促進作用が存在することが示唆された。DNA二本鎖切断(DSB)をはじめとするDNA傷害に対する修復過程について、Xenopus卵抽出液を用いた無細胞実験系により解析することを目的とした。

とくに本年度は、RecQヘリカーゼファミリーに属するRothmund-Thomson症候群原因遺伝子産物(RecQL4)を中心に解析をおこなった。これまでの解析より、RecQL4がDSBに伴ってクロマチン上に結合することはすでに確認されており、RecQL4が何らかの形でDSBに対する応答反応に関わることが予想された。そこで、まず、卵抽出液中のDNA二本鎖切断修復活性を定量的に解析するため、プラスミドDNAを基質に用いた相同組換え修復(HRR)活性および非相同末端結合修復(NHEJ)活性の測定系を構築した。本測定系を用いた結果、NHEJによって得られる産物はHRRによって得られるプラスミドの生産効率に比べて、約1000倍の高い効率で産生されること、検出されたNHEJ活性はDNA polymerase α、δ、εの阻害剤であるaphidicolin、DNA-dependent protein kinaseの阻害剤であるwortmanninによって部分的に阻害されること、HRR活性はaphidicolinによって効率よく阻害されることが確認された。本測定系を用いてRecQL4のDSB修復への関与を検討したところ、RecQL4を除去した卵抽出液においてNHEJ活性の顕著な抑制とHRR活性の有意な促進が確認された。組換えタンパク質として入手可能なヒトRecQL4をRecQL4除去卵抽出液に添加したが、これらの活性の回復は認められなかった。しかしながら、RecQL4を除去していない卵抽出液にさらにヒトRecQL4を添加した場合に、NHEJ活性の顕著な増強が確認された。以上の結果より、RecQL4がNHEJに促進的に、HRRに抑制的に寄与することによりDSB修復に積極的に関与することが示唆された。
シクロフォスファミドの心筋障害のメカニズムと発症予防法の探求

ラット心筋細胞(H9c2)とラット肝ホモジネート(S9)を用いて、シクロフォスファミド(CY)の代謝、心筋障害モデル(CY 250μM以上)を再現した。そしてN-acetylcysteine(NAC)を併用することで、このモデルでのCY心筋障害を抑制できることを見出した。また、NAC併用でもCYの代謝(4-hydroxyCY産生量)や活性酸素の産生量は抑えられることはなく、acrolein産生が抑制され、不活性代謝物o-carboxyethyl-phosphoramide (CEPM)の著しい増加を認めた。これらよりCY心毒性の主体はCY代謝物の一つであるacroleinであろうと報告した。シクロフォスファミド(CY)はアルキル化剤に分類される抗がん剤であり、急性白血病、乳がんなど多くのがん種の治療に用いられている。CYはプロドラッグであり、肝臓で代謝を受け、抗腫瘍活性を示す4-hydroxycyclophosphamide(HCY)など様々な代謝物に変化する。CYの重大な毒性として大量投与時に起こり得る致死的心筋障害があるが、その機序は不明で予防法も確立されていない。我々は今年度、ラット心筋細胞(H9c2)、ラット肝ホモジネート(S9)を用いてCY心筋障害の機序と、その予防法について検討した。我々は、ラット心筋細胞(H9c2)、ラット肝ホモジネート(S9)を用いた研究により、シクロフォスファミド(CY)心筋障害の主体がacroleinで、N-acetylcysteine(NAC)、はacrolein産生を抑えることでCY心毒性を予防する可能性があることを始めて、見出した。このことはCY心筋障害の機序解明に大きく迫るものであると考える。ただし、acroleinのCY心筋障害への関与は間接的な実証なので、おおむね順調に進展していると判断した。小児血液・腫瘍今後はacroleinを直接的に心筋細胞に曝露し、心筋障害を起こすのか、そして心筋障害を起こすとしたらN-acetylcysteine(NAC)により防ぐことができるかどうかを検討する。また、acrolein以外の代謝物を各々曝露し、心筋障害についても同様に検討する。NACによりCYの心筋障害を防ぐことから、心筋細胞内のグルタチオン濃度など、acrolein以外の機序についても検討をしていく。
敗血症病態におけるmicroRNAによる単球系細胞内小胞体ストレス制御機序の解明

単球系細胞、ヒトマクロファージ敗血症モデルにおいて、経時的な貪食能および小胞体ストレス関連分子であるCHOPの発現変化を確認した。また、次世代シーケンサーIon PGMシステムを用いてmiRNAの発現を観察し、miR-21など数種類のmiRNAの変化を認めた。変化のあったmiRNAの遺伝子導入による過剰発現により、貪食能の変化を確認し、miRNAによる貪食能の制御が示唆された。現在miRNAの小胞体ストレスへの影響を検討しており、今後敗血症ラットモデルにおいても同様に検討していく予定である。<目的>重症敗血症では、過剰な免疫抑制状態が生じると予後不良を来す。敗血症病態において単球系細胞が貪食能低下や細胞死を起こすことがわかってきており、我々はその細胞内情報伝達系として小胞体ストレスの変化に着目し、様々な病態制御に関与しているmicroRNA(miRNA)の発現による影響を検討し、敗血症病態に対する遺伝子治療の可能性を検討することを目的とする。<方法>重症敗血症患者のヒト単球/マクロファージを分離し、次世代高速シーケンサーIon PGMシステムを使用して経時的なmiRNAの発現の変化を観察する。また、これにより変化を認めた細胞死・貪食能・炎症に関与していると考えられるmiRNAを選別し、Real time PCRで定量を行う。また、この時のヒト単球/マクロファージの貪食能などの機能の変化とmiRNA発現の変化との関係を検討する。<結果および今後の予定>次世代高速シーケンサーIon PGMシステム導入に予想よりも時間がかかり、計画予定よりもやや遅れている。そのため現在のところ、データ数がまだ少なく、十分な解析を行えていない状態である。敗血症病態においてmiR-21などの発現の上昇による影響が示唆されてきているが、今後もデータ数を増やし、解析を進めていく予定である。また、重症敗血症患者におけるヒト単球/マクロファージのデータがそろい次第、敗血症ラットモデルによる実験に進む予定である。〈目的〉重症敗血症では、過剰な免疫抑制状態が生じると予後不良を来す。敗血症病態において単球系細胞が貪食能低下や細胞死を起こすことがわかってきており、我々はその細胞内情報伝達系として小胞体ストレスの変化に着目し、様々な病態制御に関与しているmicro RNA(miRNA)の発現による影響を検討し、敗血症病態に対する遺伝子治療の可能性を検討することを目的としている。〈方法〉重症敗血症患者のヒト単球・マクロファージを分離し、次世代高速シーケンサーIon PGMシステムを使用して経時的なmiRNAの発現の変化を観察する。また、これにより変化を認めた細胞死・貪食能・炎症に関与していると考えられるmiRNAを選別し、Real Time PCRで定量を行う。また、小胞体ストレス関連分子であるCHOP、BiPなどの変化をReal Time PCRおよびWestern blot法を用いて定量する。〈結果〉敗血症患者のマクロファージにおいて、数種類のmiRNAの発現増加を認め、小胞体ストレス関連分子であるCHOPのmRNAおよびタンパク質の発現増加を認めた。現在、単球系培養細胞であるTHP1細胞を用い、LPSを投与した敗血症モデルを用いてReal Time PCRで発現増加を確認したのmiRNAの過剰発現もしくは抑制を行い、貪食能の変化を確認しているところである。今後敗血症ラットモデルにおいてmiRNAとCHOPの経時的変化および相互関係を確認していく予定である。敗血症患者からの検体採取が進みにくいことと、次世代高速シーケンサーによる解析を行う際には、1回の費用が高額であるため、ある一定量の検体が集まってから随時検体処理および解析を行っている状態なので、実験が遅れていると考える。そのため、当初の予定であった動物実験は次年度に施行予定である。集中治療医学、麻酔科学敗血症患者より採取したヒト単球・マクロファージにおけるmiRNA発現の解析敗血症ラットモデルを用いての血中/腹腔内マクロファージにおける経時的なmiRNA発現の解析および小胞体ストレスおよびマクロファージ機能の変化との関連の解析。当初より実験計画が遅れているため。miRNA関連試薬、siRNA関連試薬、抗体、PCR関連品、培養関連製品等に使用予定である。miRNAおよびsiRNA関連試薬は高価であり、1回の実験で2万円から5万円程度のコストを要することもある。
GGP-JAPAN超伝導重力観測点での絶対重力測定によるグローバル重力変化の研究

本研究の目的は、我が国が展開するGGP(Global Geodynamics Project)-Japan超伝導重力観測点において、絶対重力計による並行観測を実施することで、超伝導重力計の感度検定を行うと同時に、地上での精密重力測定により、GRACEなどの衛星重力ミッションデータとの比較にも耐えうる高精度な重力時間変動データセットを構築することにある。このため、京都、江刺、松代の国内のGGP観測点に加え、平成14度には、バンドン(インドネシア)、平成15年度には、昭和基地(南極)、平成16年度にはキャンベラ(オーストラリア)と、国外のGGP-Japan観測点において、我々自身の手で絶対重力測定を実施し、また、ニーオルスン(北極)では、ヨーロッパの研究者と協力して、定期的に絶対重力測定を行った。さらに、将来における重力経年変化の基準点として、インドネシアのジョグジャカルタ、チビノン、オーストラリアのパースで絶対重力測定を実施した。これらの成果として、当初の目的であるGGP-Japanのそれぞれ観測点における超伝導重力計の感度係数を得たことに加え、諸外国の絶対重力測定では、それぞれの重力基準点の絶対値を与えることで、将来の重力変化の検出のための基準点網の確立に貢献できたことの意義は大きい。特に、インドネシアでの絶対重力測定は、本研究による測定が、同国における歴史上初めてのものであり、インドネシアの重力測のための基準点網確立においても重要な役割を果すことができた。一方、重力の経年変化を検出するという観点からは、南極昭和基地において、同基地でのポストグレーシャルリバウンドに伴うと予想される重力変化を検出しており、また、ニーオルスンでは、現在の氷床変動に伴うと思われる重力変化の検出にも成功した。本研究の目的は、我が国のGGP超伝導重力観測点において、絶対重力計と超伝導重力計による高精度な重力測定を並行して行うことにより、現在計画されているGRACEなどの衛星重力ミッションとのデータ比較にも耐えうる高精度な重力の時間変動データセットを構築することにある。このため、平成13年度においては、京都において随時絶対重力測定を実施するとともに、2002年7月に江刺で、また8月に松代において、それぞれ、超伝導重力観測と並行して絶対重力観測を実施した。さらに、2002年11月には、インドネシア・バンドンで超伝導重力計と絶対重力計との並行観測を実施し、超伝導重力計のスケールファクターの再決定を行い、従来採用していたスケールファクターと誤差の範囲で一致することを確認した。また、インドネシアにおける将来的な重力時間変化検出のための基準として、バンドン以外に、ジャワ島中央のメラピ火山の近くに位置するジョグジャカルタにおいても絶対重力測定を実施した。インドネシアにおける重力の絶対測定は、今回、我々が実施した測定が歴史上初めてのことであり、バンドンの測定では、インドネシアの現行の重力基準点との結合測定も実施していることから、重力変化の研究のみならず、インドネシアにおける重力基準網の確立の意味でも極めた価値が高いものである。これらの成果については、2003年4月にニースで開催されるEGU-AGU Joint meetingや2003年7月に札幌で開催されるIUGG総会等で発表予定である。このため、平成15年度においては、京都において随時絶対重力測定を実施するとともに、2003年7月に江刺において、超伝導重力観測と並行して絶対重力観測を実施した。得られた結果からは、京都においては、重力の季節変化が認められた。また、2003年8月に、インドネシア・バンドンにおいて超伝導重力計の保守を行うとともに、昨年度実施した絶対重力測定データについて研究打ち合わせを行った。さらに、2003年11月に、オーストラリア・パースのパース天文台において絶対重力観測を実施した。