hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
顔面部癌性疼痛における三叉神経脊髄路核の神経-免疫系機構の解明

末期ガン患者はしばしば治療困難な耐え難い痛みを訴える。特に、口腔顔面領域に発生するガン性疼痛は重篤な状態に陥りやすい。それゆえ、一刻も早い効果的な鎮痛法の開発が望まれるが、いまだガン性疼痛のメカニズムの詳細は明らかになっていない。本研究では顔面ガンモデルラットを作製し、口腔顔面領域におけるガン性疼痛の特性を明らかにする。(目的)近年、さまざまな難治性神経疾患は、患者の生活の質低下、医療費高騰に大きな影響を及ぼしている。したがって、それら疾患の病態メカニズムの解明とそれに基づく治療法の確立が極めて急務と考えられる。神経因性疼痛や癌性疼痛などの慢性疼痛も例外ではなく未だ有効な治療法が無い。本研究では癌性疼痛の分子機構解明を脊髄の神経-グリア相互作用の時系列的・局所的変化の解明によって、神経栄養因子誘導による治療が予防的および慢性期に応用できるか否かの、基礎的知見を得る。脊髄ニューロン死の機序の解明を脊髄三叉神経核脊髄路核で神経細胞のapoptosis有無やc-fos遺伝子発現やマイクログリアとの関係を明らかにする。また、神経系の症状改善や細胞活性化をもたらし、神経因性疼痛などを改善する神経栄養因子関連治療剤の癌性疼痛への予防・治療への効果の可能性の有無を検討する。(研究内容)GFP(緑色蛍光タンパク質)を発現させたラット由来乳癌細胞を3週齢雄性ラットの右側鼻毛部に接種し、口腔顔面癌モデルを作成した。接種前と接種後3日目に疼痛テスト(von Frey hairによる機械刺激疼痛閾値・放射熱による熱刺激逃避潜時・自発的顔面グルーミング時間)を行った。(結果および考察)疼痛テストにおいてGFP発現癌細胞を投与した癌モデルでは、投与後1日目より機械的刺激疼痛閾値や熱刺激逃避潜時の低下、さらにグルーミング時間の延長がみられ自発痛、allodyniaやhyperalgesiaが引き起こされることがわかった。本研究では癌性疼痛の分子機構解明を脊髄の神経-グリア相互作用の時系列的・局所的変化の解明によって、神経栄養因子誘導による治療が予防的および慢性期に応用できるか否かの、基礎的知見を得ることを目的とする。まずWister系ラットを用いて、癌性疼痛モデルの作製を行った。チオペンタール腹腔内投与による麻酔下に、右側上顎骨部分に1ml注射器にて癌細胞(Walker256B carcinocarcinoma;2x10^6)を注入し、癌性疼痛モデルとした。この顔面癌モデルにおいて、癌細胞接種後に自発痛が出現することを観察した。異常疼痛は時間経過とともに増悪し、アロディニアや痛覚過敏を示す領域は拡大された。この顔面癌モデルにおける異常疼痛の発生時期は、これまでに報告されるどのガン性疼痛モデルと比較しても圧倒的に発症が早かった。この結果は、口腔顔面部の癌患者における早期のガン性疼痛発症を反映していると考えられた。ちなみに予備実験として、Walker256B細胞が1日に1回程度で倍数分裂していることを確認した。ガン性疼痛モデルを用いた研究より、腫瘍増大や骨浸潤に伴った2次的炎症および圧迫や浸潤による神経障害がガン性疼痛の原因となっていることが示唆されたため、モルヒネ、NSAID(非ステロイド性消炎剤)、をくも膜下腔に投与して鎮痛効果を調べると共に、細胞修復を詳しく調べるため、1、3、7、14日目に脊髄を摘出、凍結切片を作成、これらの組織切片に対してc-fos遺伝子発現をin situ hybridization法にて検討している。本研究では癌性疼痛の分子機構解明を脊髄の神経ーグリア相互作用の時系列的・局所的変化の解明によって、神経栄養因子誘導による治療が予防的および慢性期に応用できるか否かの基礎的知見を得ること、脊髄ニューロン死の機序の解明を脊髄・三叉神経脊髄路核で神経細胞のapoptosis有無やc-fos遺伝子発現やマイクログリアとの関係を明らかにすること、また、神経系の症状改善や細胞活性化をもたらし、神経障害性疼痛などを改善する神経栄養因子関連治療剤の癌性疼痛への予防・治療への効果の可能性の有無を検討する。チオペンタールの腹腔内投与による麻酔下のマウスを用いて、右側上顎骨部分に癌細胞(Walker256B carcinocarcinoma;2x106)を注入し、癌性疼痛モデルを作製した。マウスのくも膜下腔にモルヒネ、非ステロイド系解熱鎮痛薬を投与して鎮痛効果を調べた。また、細胞修復を詳しく調べるため、一定期間後に脊髄を摘出し、凍結切片を作製した。これらの組織切片に対してc-fos遺伝子発現をin situ hybridization法にて検討した。また、異なる組織切片でDNA断片化に対するTUNEL染色とFas、Fas-ligandに対する免疫染色を検討した。おおむね順調に進展していると考えられる。24年度が最終年度であるため、記入しない。我々の研究結果は中枢グリア細胞を標的とした薬物投与がガン性疼痛抑制に効果的であることを示している。

しかし、この結果はあくまでもガン性疼痛の発生初期にたいする影響であり、一旦発生してしまった後の抑制効果について示しているものではないと考えられる。臨床では疼痛は発症してから患者に疼痛治療が行われることを考えると、本モデルにおけるガン性疼痛の発症後期でのプロペントフィリンの効果について検討する必要があると考えられる。24年度が最終年度であるため、記入しない。
扁平母斑の治療後再発に関する基礎的研究

〈対象と方法〉単一褐色モルモット(Brown TAKEI)5匹(3週齢、雄、体重190230g:平均216g)の背部皮膚をワックス脱毛後、カライドスコープ付医用ルビーレーザー装置を用い、エネルギー密度10,15,20,25,30J/cm^2、パルス幅300mu秒でレーザー照射を行った。レーザー照射直後、2,4,7,14日目、1,2カ月目に生検し、H-E染色、フォンタナ・マッソン染色で表皮基底層メラニンの再生過程を経時的に観察した。〈結果および考察〉1.単一褐色モルモットの背部皮膚は組織学的に、表皮基底層と真皮毛包周囲にメラニン色素を認め、ヒト扁平母斑モデルとして適当と考えられた。2.肉眼的に、照射直後、エネルギー密度に応じて皮膚の水疱、糜爛を認めたが、2日目に痂皮形成、4日目には全てのエネルギー表皮再成を認めた。14日目には発毛を認め、皮膚色調低下は4,7,14日目まで認め、1,2カ月目には発毛、皮膚色調とも周辺正常部と同等に回復し、各エネルギー間に差は認めなかった。3.組織学的に、照射直後の影響・変性は表皮内に限局し、その程度はエネルギー密度に比例していたが、真皮内毛包への影響は認めなかった。組織学的な発毛は、7日目より認めたが、表皮基底層のメラニン色素の回復は14日目より認め、両者ともに正常部と同等までの回復は1カ月目以降であった。4.肉眼的、組織学的観察より、レーザー治療後の表皮基底層へのメラニンの回復は、発毛過程と密接に関係し、扁平母斑の再発も毛包部よりの発毛に伴って生ずるものと推測された。
ショウジョウバエ神経-筋特異結合における異所発現系の開発

トランスジェニック法を用いた異所発現(ectopic expression)は分子の生体での機能を解析するための重要な手段の1つである。本研究では異所発現系の神経特異結合研究への応用の有用性を調べるために、細胞接着分子Connectinの異所発現を試みた。Connectinはleucine rich repeatfamilyに属する膜蛋白質で、その神経、筋双方における特異的な発現から、神経-筋結合過程における標的認識に関与していることが期待された。そこで少数の筋肉での発現を促すTollのエンハンサー、全ての筋肉で発現するMHC(myosin havy chain)promoterにConnectinのcDNAを結合しP因子転換法を用い個体に導入した。その結果、転換株において予想どおりのConnectinの異所発現が認められた。転換株における運動神経走行を調べたところ、Connectinの筋肉における異所発現が、運動神経SNaにたいし誘引的な、そしてSNbに対し阻害的な働きかけをすることが明らかになった。このことから、神経-筋結合過程においてConnectinは、2重の役割を果たしていることが示唆された。すなわち、まず共にこの分子を発現する、運動神経(SNa)とその標的筋肉間のhomophilicな誘引分子として機能することにより、両者の結合を促進する。それと同時にSNbなど近傍の他の神経にたいし、heterophilicな阻害分子として働きかけることにより、これらが不適切な標的領域に侵入することを阻害していると考えられる。本研究は異所発現系を利用してこの種の神経特異認識分子の機能を示した最初の例の一つであり、この系の有効性を示すものである。今後エンハンサーをさらに拡充することにより、特定の神経筋肉、神経における異所発現がさらに自由に行えることが期待され、神経結合の特異性を分子レベルで操作できる非常にユニークな場を提供するであろう。
ノックアウトマウスを用いたRasファミリータンパク質の機能解析

Rasファミリー因子の個体内機能を明らかにする目的で、以下の実験を行なった。Ras抑制性因子Gap1^mノックアウトマウスの作成に関して、組換えアレルを有するES細胞クローンを複数作成し、キメラマウスの作成を行なった。しかし変異アレルをもったF1マウスを研究期間内のうちに得ることができなかった。またカルシウムシグナリングに応答するsmall GTPase Rinのノックアウトマウスを作成したが、顕著な形質変化は見いだせていない。Rasファミリー因子の標的因子として、多くのタンパク質キナーゼが活性化され、さらにシグナルを伝達していくことが示されている。そこで、これらのキナーゼが関与するシグナル伝達系の全貌を明らかにすべく、金属キレートカラムを用いたリン酸化タンパク質の精製と2次元ゲル電気泳動を組合わせることにより、ERKシグナル伝達系の構成因子であるMEK、ERK、RSKの活性化を可視化した。さらに新規ERK基質と考えられる因子の同定を行ない、当該因子が細胞中でERKによりリン酸化されることを明らかにした。これらのERK基質を試験管内でリン酸化し、さらにリン酸化ペプチドを質量分析器で構造解析することにより、基質リン酸化部位の同定を行った。同様のアプローチをp38 MAPキナーゼ系にも応用し、p38 MAPキナーゼカスケードの中でリン酸化される基質を網羅的に検索した。その結果、p38 MAPキナーゼによってリン酸化を受けて活性化されるMAPKAPK-2の基質であるBAG2タンパク質を同定し、そのリン酸化部位を決定した。SH2領域およびp130Cas結合領域をもつアダプター因子Chatの機能を解析した結果、Chatの過剰発現によりRap1が活性化されることが判明した。ChatによるRap1活性化は、CasおよびCrkのドミナントネガティブ変異体で抑制されることから、Chatによる直接の活性化ではなくCas-Crk-C3G経路を介するものであることが示唆された。Chatを過剰に発現している細胞ではRap1活性化にともなってファイブロネクチンに対する細胞接着性が顕著に上昇したが、この接着性の上昇も同様にCas、CrkおよびRap1の変異体により抑制された。これらの結果からChatによりRap1を介した細胞接着制御の新たな機構が示された。血球系細胞ではChatのアイソフォームであるChat-Hが発現しているが、その機能解析のためヒトT細胞由来Jurkat細胞でChat-Hを過剰に発現する細胞株を樹立してその効果を検討した。その結果、Chat-H発現株ではT細胞受容体刺激にともなうIL-2産生が数倍に亢進し、逆にChatの変異体発現によりIL-2産生は抑制された。これらの結果はChat-HがIL-2産生にいたるシグナル伝達系を制御していることを示している。海馬神経細胞の初代培養細胞を用いてMAPキナーゼ活性化機構を研究した結果、海馬神経細胞においてMAPキナーゼを活性化する種々のシグナルはいずれもRasを経由して伝達されること、またRap1はMAPキナーゼ活性化には寄与しないことを示した。RasファミリーGTPaseおよびその調節因子は、細胞増殖や細胞接着を制御する因子と考えられ、細胞のがん化・がん細胞の転移等の機構を明らかにする上で重要な研究対象である。Rasの抑制性因子Gap1mは、同じ機能を有するNF1遺伝子産物とがん抑制遺伝子である可能性があり、そのノックアウトマウス作成のためのES細胞を作成した。またRasファミリーに属しカルモジュリン結合能を有する因子Rinのノックウトマウスを作成したが、現在までに著しい異常は認められていない。細胞接着制御にRasファミリー因子Rap1の関与が示されているが、Cas結合性アダプター因子ChatはCrk-C3G経路を介してRap1を活性化し、インテグリンの活性化と細胞接着性の増強をもたらすことを見いだした。またJurkatT細胞において過剰発現をした場合、JNKの活性化を介してIL-2産生に必須の機を果たすことを見いだした。Rasをはじめとする低分子量GTP結合タンパク質はその標的因子として、セリン・スレオニンキナーゼを有するものが数多く知られており、キナーゼ基質の同定はRasファミリー因子群の機能を明らかにする上で重要なステップと考えられる。近年、2次元ゲル電気泳動法と質量分析器を用いた微量タンパク質の同定法は大きな技術的進展が見られており、こうした技術を応用し、キナーゼ基質の網羅的な解析技術の開発を試みた。本研究では、リン酸化タンパク質を金属キレートカラムにより濃縮・精製し、その後2次元ゲル電気泳動により分析する実験系を確立した。この技術はさまざまなキナーゼに応用可能であり、新規キナーゼ基質の同定に極めて有用な手段と考えられる。SH2を有するアダプター因子Chatは、Casに結合しJNKの活性化を介してT細胞におけるIL-2産生に必須の因子であることを明らかにしてきたが、さらにChatがCas-Crk-C3G系を制御することにより、Rap1を活性化することを示した。その際に150kDaのチロシンリン酸化タンパク質との結合が重要であると考えられた。またT細胞刺激における細胞接着の亢進にCDC42/Ackを介したRap1活性化が必須であることを示した。

従って細胞内のキナーゼ基質を網羅的に解析することは、シグナル伝達系の生理的意義の理解の上で重要なステップである。本研究では、金属キレートカラムを用いて、リン酸化タンパク質が効率的に精製し得ることを示し、2次元ゲル電気泳動上で、MEK、ERK、RSKの活性化を可視化した。さらに新規ERK基質と考えられる因子の同定を行なっている。Rasファミリー因子の個体内機能を明らかにする目的で、以下の実験を行なった。Ras抑制性因子Gap1^mノックアウトマウスの作成に関して、組換えアレルを有するES細胞クローンを複数作成し、キメラマウスの作成を行なった。しかし変異アレルをもったF1マウスを研究期間内のうちに得ることができなかった。またカルシウムシグナリングに応答するsmall GTPase Rinのノックアウトマウスを作成したが、顕著な形質変化は見いだせていない。Rasファミリー因子の標的因子として、多くのタンパク質キナーゼが活性化され、さらにシグナルを伝達していくことが示されている。そこで、これらのキナーゼが関与するシグナル伝達系の全貌を明らかにすべく、金属キレートカラムを用いたリン酸化タンパク質の精製と2次元ゲル電気泳動を組合わせることにより、ERKシグナル伝達系の構成因子であるMEK、ERK、RSKの活性化を可視化した。さらに新規ERK基質と考えられる因子の同定を行ない、当該因子が細胞中でERKによりリン酸化されることを明らかにした。これらのERK基質を試験管内でリン酸化し、さらにリン酸化ペプチドを質量分析器で構造解析することにより、基質リン酸化部位の同定を行った。同様のアプローチをp38 MAPキナーゼ系にも応用し、p38 MAPキナーゼカスケードの中でリン酸化される基質を網羅的に検索した。その結果、p38 MAPキナーゼによってリン酸化を受けて活性化されるMAPKAPK-2の基質であるBAG2タンパク質を同定し、そのリン酸化部位を決定した。
産後うつ予防システム確立に向けたバイオマーカーとしてのオキシトシンの有用性

オキシトシンと産後女性の抑うつ状態との関連を明らかにすることが研究目的である。これまでストレスバイオマーカーとしてカテコールアミン,コルチゾールなどネガティブな感情に視点を置いた指標との関連が主に検討されてきている。その中で本研究では特に,産後うつや虐待の根底ともなる愛着形成や,母親の感情に大きく関与すると言われているオキシトシンを指標にするための検討をする。現在,オキシトシンと関連のある脳内物質とストレス,抑うつ状態との関連についても踏まえ,研究方法や指標とする項目を再検討するための文献レビューを進めている。産後の女性を対象とし,心理状態を検討する目的でオキシトシンを測定した先行文献が少ない。正確なデータを得るために再度妥当な検体の種類や採取方法,分析方法,並びに主観的指標として使用する尺度について先行文献より再検討を進めている。そのため,計画よりもやや遅れている状態である。現在,産後の女性を対象としてオキシトシンを測定するために妥当な検体の種類や採取方法,分析方法,並びに主観的指標として使用する尺度について先行文献より再検討を進めている。さらに,オキシトシンと関連が深い脳内物質等との関連についても先行文献より整理し,客観的指標として測定が必要である項目について再度検討している。実際に検体を収集し,測定を行う時期が次年度となったため次年度使用額が生じた。
平滑筋弛緩薬の新しい細胞内シグナル伝達に対する作用機構

血管収縮反応は細胞内カルシウムイオン(Ca2+)濃度により調節されていると考えられているが刺激の種類や弛緩薬の種類によっては必ずしもCa2+濃度と収縮反応は相関性が無いところから、Ca2+-カルモデュリン依存性ミオシン軽鎖リン酸化反応に加えてそのCa2+感受性を制御する機構が存在することが示唆されている。その中の有力な1つにカルポニンのリン酸化反応の関与が考えられる。カルポニンは平滑筋に豊富に存在するアクチン結合性蛋白質であり、プロテインキナーゼC (PKC)の優れた基質であることを以前我々は報告し、更にそのリン酸化部位とカルボニンの機能調節の関係を明らかにした。また、カルポニンはアクトミオシンのATPase活性を阻害するが、この作用はPKCによりリン酸化されると減弱することが明らかとなっている。本研究では、今まで説明できなかった血管収縮機序を解明する目的でカルポニンに焦点を当て、カルポニンのPKCによるリン酸化反応とドメイン機能について、さらに、このカルポニンリン酸化反応による制御機構が生筋レベルでどのように関与しているのかについて詳細に検討した。その結果、ブタ冠動脈を用いた実験でエンドセリン-1およびホルボールエステルにより収縮した血管において、PKCによるカルポニンのリン酸化反応およびそのリン酸化部位が確認された。さらに、その脱リン酸化反応およびCa2+感受性に対する影響についてスキンドファイバーを用いた実験やカルポニンペプチドを用いた実験により、カルポニンのPKCにより最もリン酸化されやすいT2部位は、カルポニンのアクチン結合部位でもあることが明らかになった。さらにT2ペプチドはウサギ血管のスキンドアファイバーにおいて、収縮反応におけるCa2+感受性の上昇することが明らかになった。PKCによるカルポニンのリン酸化部位である繰り返し構造(T1、T2、T3)のうち最初の繰り返し構造のT2部位のリン酸化反応がPKCによるカルポニンを介する平滑筋収縮調節において重要であることが示唆された。血管収縮反応は細胞内カルシウムイオン濃度により調節されていると考えられているが刺激の種類や弛緩薬の種類によっては必ずしもカルシウム濃度と収縮反応は相関性が無いところから、カルシウム-カルモデュリン依存性ミオシン軽鎖リン酸化反応に加えてそのカルシウム感受性を制御する機構が存在することが示唆されている。カルポニンは平滑筋に豊富に存在するアクチン結合蛋白質でアクトミオシンのATPase活性を阻害するが、この作用はプロテインキナーゼCによりリン酸化されると減弱することが明らかとなっている。このカルポニンのリン酸化反応が生筋レベルで平滑筋収縮機序にどのように関与しているのか明らかにすることで今まで説明できなかった平滑筋収縮機序の解明を試みるのが本研究の目的である。その結果、我々は、^<32>Pでラベルしたブタ冠動脈で、ホルボールエステルおよびエンドセリン-1による収縮時にカルポニンがリン酸化されることを見い出した。さらに、カルポニンのリン酸化酵素について、プロテインキナーゼC阻害剤GF109203Xの作用や2次元ペプチドマップアによる解析により検討を行ったところ、ホルボールエステルおよびエンドセリン-1で収縮したブタ冠動脈において、カルポニンのリン酸化酵素はプロテインキナーゼCであることが示唆され、プロテインキナーゼCによるアクチン側の血管平滑筋調節機構の存在を示した。血管収縮反応は細胞内カルシウムイオン濃度により調節されていると考えられているが刺激の種類や弛緩薬の種類によっては必ずしもカルシウム濃度と収縮反応は相関性が無いところから、カルシウム-カルモデュリン依存性ミオシン

軽鎖リン酸化反応に加えてそのカルシウム感受性を制御する機構が存在することが示唆されている。その中の有力な1つにカルポニンのリン酸化反応の関与が考えられる。カルポニンは平滑筋に豊富に存在するアクチン結合性蛋白質であり、プロテインキナーゼCの優れた基質であることを以前我々は報告した。カルポニンはアクトミオシンのATPase活性を阻害するが、この作用はプロテインキナーゼCによりリン酸化されると減弱することが明らかとなっている。カルポニンのCキナーゼによるリン酸化部位は、3つの繰り返し構造(Tl、T2、T3)に少なくとも3箇所以上あることを我々は明らかにしている。そこで、今回、我々はこれらのフラグメントを用いてカルポニンの最初の繰り返し構造(T2)の平滑筋収縮反応における機能について検討した。その結果、1、T2フラグメントの合成ペプチドはカルポニンのFアクチンに対する結合をKm値を上昇させ、優位に阻害したが、Tlの合成ペプチドにはその作用は認められなかった。2、このT2フラグメントの作用はすでに報告されているカルポニンのアクチン結合部位を含むペプチド(141G-160G)と同程度であり、T2フラグメントはカルポニンの最多リン酸化部位であるとともに重要なアクチン結合部位でもあることが明らかとなった。3、T2フラグメントはスキンドファイバーを用いた実験からカルシウム感受性を調節していることが明らかになった。以上の結果によりCキナーゼによるカルポニンのリン酸化部位であるT2は平滑筋収縮調節において重要な機能部位であることが示唆された。
ソフトウェアの新しい開発方式を通じた日本企業の競争力向上に関する研究

企業が利用するコンピューターシステムについて、その開発方法や開発の契約方法など、開発に関わる諸問題を分析することにより、その企業の競争力を高めるためのコンピューターシステムの開発のあり方について検討した。多数のソフトウェア企業への聞き取り調査を実施することにより、開発方法や開発の契約方法などについて、多くの事例に関する情報を収集した。さらに、それらの情報の分析を行った。今年度の実施計画は、日本および米国での聞き取り調査等の結果を比較検討し、ソフトウェアの新しい開発方式が、どのように顧客企業の競争力を向上させているかを解明することである。そのため、ソフトウェア企業への聞き取り調査の結果の分析するとともに、日米間、及び各企業間の比較を行った。同時に、ソフトウェア開発に関する新しい開発方法を理論的および実践的の両方の観点からさらに発展させるために必要な論点を明確にすることに重点を置いた。なかでも、企業構造や他企業との関係が、緊密な意思疎通の実現にどう影響を与えるのかに焦点を当ててきた。これにより、各ソフトウェア開発方法の特徴、特に長所と弱点を明らかにした。日本のソフトウェア開発の技術水準を高める方策をみつけるためには、技術面だけでなく、所有構造を分析する必要がある。日本のソフトウェア産業は、日本特有の巨大な多重下請け構造を持ち、その下層には技術水準の低い企業が多数存在する。この問題をどう克服して行くかが、本研究を進める上で大きな課題となる。来年度の聞き取り調査では、以上の問題への解決策を模索する。さらに、その結果をもとに、マネジメントの効率化に貢献するシステム開発の在り方を、理論面および実証面の両面において提示する。これにより、ソフトウェアの新しい開発方式と企業の競争力に関する関係性が明らかになるとともに、そのためのソフトウェア開発の全体像を解明することに役立つであろう。今年度の実施計画は、ソフトウェア企業への聞き取り調査と、その調査結果の分析である。本研究の目的は、ソフトウェア企業とその顧客企業とが緊密に意思疎通を行うことで、より品質の高いソフトウェアを開発することを目指すものである。本年度はその初年度に当たり、その開発における現状を分析した。同時に、ソフトウェア開発に関する新しい開発方法を理論的及び実践的の両方の観点からさらに発展させるために必要な論点を明確にすることに重点を置いた。今年度の成果は、来年度の聞き取り調査の基礎となる資料や考察の材料を与えることとなる。来年度の聞き取り調査では、非公開の開発方法や開発実態などをより正確に把握することが必要となるため、その準備として十分なものとなった。今後、理論面および実証面の両面において、ソフトウェア開発の全体像を解明することに役立つであろう。本年度の実施計画は、企業を管理運営するためのシステムの開発方法を検討し、その移行過程を含めた理論化を進めることである。現在、企業のシステムをつくるソフトウェア開発において、従来のように最初にすべての作業の見積もりをしてそれを受注する業者を入札で決めるという方式だけでなく、様々な方式が出てきている。例えば、ある企業は、先に金額と時間を提示し、その範囲内で作れるシステムを提供し、顧客はそれに対する使用料を毎月支払う。顧客は、そのサービスをいつ解除してもいい。このため、顧客は、システムに関する巨額の先行投資なしに、その状況を見ながら満足度の高いシステムを利用することができる。こういった形で必要なシステムを少しずつ作ることが、顧客企業の競争力強化にも影響を与えている。従来の方式のように、最初に見積もりを出して開発業者を決めると、結果的にその案件で赤字となってしまうことが時々起こる。こういった事例を減らし、安定した収益を得られるようにするため、従来の開発方式を改め、上述のような全く新しい方式の受注方式を導入することが求められている。ほかにも、新しいビジネススタイルに基づく開発方式は広がっているが、まだ一般的ではない。その普及にはまだ克服しなくてはならない点が多い。とりわけ、技術的な問題点をどう克服するかが、研究上の大きな課題として残されている。この点を解明することにより、本研究をさらに進展することができる。企業経営論データ収集などが、予定通りに進んでいる。データ収集などが、予定通りに進んでいる。当初の予定に従い、データの収集と分析を行う。国内だけでなく、外国のデータを収集するために、現地調査を行う。同時に、そうしたデータの理論化を進める。従来の理論を発展させて、新しい理論を構築するとともに、その内容について学会報告などを通じて各研究者と議論を重ねる。

従来の理論を発展させて、新しい理論を構築するとともに、その内容について学会報告などを通じて各研究者と議論を重ねる。今年度の旅費が予想より少なくて済んだため、次年度使用額が生じた。つまり、研究は順調に進んでおり、それにしたがって支出したが、予想外の余剰金が生じた。次年度の旅費が不足する可能性があるので、それを補てんする。該当なし
三次元モーションデータを用いた振付創作システムの開発と応用

本研究は、舞踊学を専攻する学生の専門的教育とコンテンポラリーダンスの職業的な振付家(以下「プロ振付家」)の芸術的創作を支援する振付創作システムの開発および応用である。そのために、すでに開発してきた3DCGによるダンスの振付シミュレーションシステムの全面的な改良を行う。具体的な作業としては、プロ振付家の振付メソッドを分析し、その「振付語彙」と「振付文法」を振付創作システムに組み込む。また、舞踊学を専攻する学生を協力者とする教育効果の評価実験と、職業的な振付家を協力者とする創作効果の評価実験を行い、その結果をフィードバックしてシステムを完成させ、劇場において成果発表を行う。
ネットワーク化情報環境における知的擬人化インタフェースエージェントシステム

現在主流のCUIを超える各種の新形態のインタフェースの研究開発が行われるようになっているが、我々は人間のface-to-faceコミュニケーションをメタファにしたマルチモーダル擬人化インタフェースに注目し、研究開発を行った。特に、進展しつつあるWWW情報環境に適合して有効に使用できる形態にし、実用的価値を高めた。以前より我々が開発してきた、3Dモデル上にテクスチャマッピングした自然感の高い顔を持ち音声会話能力を持つVSA(Visual Software Agent)システムを基盤として、これをNetscape WWWブラウザに結合した。これによって巨大な情報コンテンツの宝庫であるWWW情報空間の新形態のインターフェースを具体化した。単にインターフェースとしてだけでなく、WWWページに埋め込まれた自然感の高い顔を持つ擬人化エージェントがユーザと簡単な音声対話によるインタラクションを行う、WWW上の新形態のマルチモーダル情報コンテンツを実現するシステムVPA(Visual Page Agent)の開発も行った。これと関連して、新しい情報コンテンツとしてCGキャラクタを用いたマルチモーダルプレゼンテーションの実用性に注目し、これを誰でもが共通の記述形式で簡単に記述することを可能にするマークアップ言語MPML(Multimodel Presentation Markup Language)の設計、処理系の実装を行った。MPMLはXML準拠のマークアップ言語であり、WWW上での流通にも適している。MPMLと関連ツールは実用レベルになっており、広く使用できるように公開ソフトウェアとしている。VSA(Visual Software Agent)は我々が8年程前より開発を行ってきた、自然感の高い動作する顔、音声対話能力を有するマルチモーダル擬人化エージェントシステムである。本研究によりこのVSAをwwwブラウザ(具体的にはNetscape)と結合し、巨大な分散データベースに育っているWWW情報空間の新形態のインタフェースを実現した。Face-to-face型で音声駆動の新しいWWWブラウザを開発したことになる。ブラウザの制御やハイパーリンク先への移動などを音声で指示することができる。ハイパーリンク先を示すアンカ文字列を全て音声認識できる訳ではないので、表示されたWebページをスキャンし、含まれるハイパーリンクを全て抽出して番号付けして提示し、ユーザがこの番号を発話すれば、Webページの移動を可能にする機能を実現している。Netscapeとの結合はプロキシ(代理サーバ)を介して実現した。日常頻繁に擬人化エージェントを通じてアクセスするようなwww上の情報ソース(例えば天気予報など)を定期的にプリフェッチし、ネットワークによる遅延なく情報提供出来るようにするサブ・ソフトウェアエージェント機構も開発した。キャラクタエージェントを用いるマルチモーダルインタフェースは上記の我々のシステムのように、これまで主として入出力を含むインタラクションの新形態として開発されてきたが、出力系を主とするマルチモーダルプレゼンテーションの用途も重要になってくる。www上の新しい魅力あるマルチモーダル情報コンテンツの流通基盤としても重要となる。このようなキャラクタエージェントを用いるマルチモーダルプレゼンテーションの記述を特定のシステムに依存せず、容易に記述できるようにするためにマークアップ言語MPML(Multimodal Presentation Markup Language)を作成した。MPMLはXML(eXtensible Markup Language)に準拠し、メディア同期機能はSMILに準拠している。MPMLから音声入出力機能を持つキャラクタシステムであるマイクロソフトエージェントを動作させるコンバータを作成し、魅力的なプレゼンテーションが実現できることを実証した。MPMLの仕様はwww上で公開している。現在主流のGUIを超える各種の新形態のインタフェースの研究開発が行われるようになっているが、我々は人間のface-to-faceコミュニケーションをメタファにしたマルチモーダル擬人化インタフェースに注目し、研究開発を行った。以前より我々が開発してきた、3Dモデル上にテクスチャマッピングした自然感の高い顔を持ち音声会話能力を持つVSA(Visual Software Agemt)システムを基盤として、これをNetscape WWWブラウザに結合した。これによって巨大な情報コンテンツの宝庫であるWWW情報空間の新形態のインタフェースを具体化した。

単にインタフェースとしてだけでなく,WWWページに埋め込まれた自然感の高い顔を持つ擬人化エージェントがユーザと簡単な音声対話によるインタラクションを行う、WWW上の新形態のマルチモーダル情報コンテンツを実現するシステムVPA(Visual Page Agent)の開発も行った。これと関連して、新しい情報コンテンツとしてCGキャラクタを用いたマルチモーダルプレゼンテーションの実用性に注目し、これを誰でもが共通の記述形式で簡単に記述することを可能にするマークアップ言語MPML(Multimodal Presentation Markup Language)の設計、処理系の実装を行った。MPMLはXML準拠のマークアップ言語であり、WWW上での流通にも適している。MPMLと関連ツールは実用レベルになっており、広く使用できるように公開ソフトウェアとしている。
造血制御におけるToll like receptor情報伝達経路の全容解明

我々はこれまでに、病原微生物由来物質(ssDNAやdsRNA等の核酸)は、パターン認識受容体(pattern recognition receptors, PRRs)の介在・非介在の両経路において、ヒト造血幹細胞(CD34+細胞)の増殖や分化を制御すること、その結果宿主の生体防御反応を抑制したり、自己免疫を誘導すること、を明らかにしてきた。平成30年度においては、CD34+細胞を含む各培養段階の細胞におけるTLR4の発現、LPSによるTLR4発現の影響を確認した。また、FACS、ELISA、Western-blot法を用いて、TLR4下流シグナル経路の蛋白質のリン酸化の同定、及びこれらの阻害剤による関連シグナル伝達経路を明らかにした。すでに報告したように、ssDNAが配列特異的に造血制御に関与し,dsRNAが配列非依存的にヒト造血幹・前駆細胞のアポトーシスを誘導する。今後本研究を通じて、微生物由来物質による造血制御の機構を明らかにし、感染を契機として発症する血液疾患や自己免疫疾患のメカニズムや治療法の開発に新たな視点を提供したい。平成30年度は、平成29年度に遅れていた実験計画から進めてきた。LPSはCD34+細胞の顆粒球系・単球系細胞への増殖と分化を促進することを確認した。TLR4はCD34+細胞及び顆粒球系・単球系細胞へ分化する前駆細胞レベルに発現し、TLR4の阻害剤であるC34によって、LPSによるCD34+細胞の分化・増殖の変化が抑制された。また、TLR4下流シグナル経路のリン酸化酵素であるTGF-β活性化キナーゼ1(TAK1)、細胞外シグナル調節キナーゼ(ERK)1/2は、LPSの添加によりリン酸化され、これらのシグナル阻害剤によって、C34と同様にLPSの作用が解消されることを明らかにした。また、TLR4シグナル伝達経路の細胞増殖やアポトーシス等に関わる転写因子、核内因子κB(NF-κB)を阻害することもLPSによるCD34+細胞の分化・増殖の変化を抑制した。更に、LPSによるCD34+細胞の分化・増殖促進作用に関わるサイトカインはInterleukin-6(IL-6)とIL-8であったことを解明した。以上よりLPSはTLR4シグナル経路を介して、CD34+細胞の顆粒球系・単球系への分化・増殖を促進することを明らかにした。Flow cytometry抗体及びwestern blot抗体の不具合、研究支援員の手技養成等によって、初年度から当初予定していた研究進行に遅れが生じていた。今年度は上記を克服したが、ヒト末梢血幹細胞から顆粒球系・単球系細胞への分化・増殖が効率不良な細胞系であり、研究遂行には予想より時間がかかってしまったため、平成30年度は平成29年度分のみを達成した。前年度に解析したTLR4-TAK1-ERK1/2シグナル伝達経路以外のTLR4シグナル下流経路についても、同様な手法で確認する。TLR4シグナル経路の中、LPSによるCD34+細胞の分化・増殖促進作用に関わるシグナル経路を同定していく。また、H30年度は理化学研究所と連携し、顆粒球・単球系前駆細胞において、LPS添加前後の蛋白発現変化をプレテオミックスを用いて網羅的に解析した。これから詳しく解析し、LPSによるCD34+細胞の分化・増殖促進作用との関連を明らかにしていく。平成29年度においては、PRRs介在経路として、グラム陰性菌の細胞壁外膜成分であるリポ多糖体(lipopolysaccharide, LPS)がPRRsの一種であるToll様受容体(Toll like receptor, TLR)のTLR4を介してCD34+細胞に及ぼす影響を明らかにする研究計画であった。CD34+細胞は顆粒球コロニー形成刺激因子(Granulocyte Colony Stimulating Factor, G-CSF)によって顆粒球系へ分化・増殖する。LPSの添加によって、顆粒球系細胞のうち好中球の増殖が増強され、同時に単球・マクロファージへの分化・増殖が更に強く促進された。この効果は、TLR4阻害剤によって抑制された。以上から、LPSがTLR4を介して、造血に関与していることが示唆された。現在CD34+細胞を含む各培養段階の細胞におけるTLR4の発現、LPSによるTLR4発現の影響、およびその下流シグナル伝達経路を解析中である。平成29年度はLPSによる造血制御機序に関して、細胞生物学的解析及び生化学的解析により、TLR4シグナル伝達経路を明らかにする計画であった。細胞形態や細胞数等で、LPSによるヒトCD34+細胞の分化・増殖の変化を明らかにした。また培養環境によるTLR4の発現様式の変化を一部明らかにした。

LPS-TLR4シグナル阻害は、LPSによるCD34+細胞の分化・増殖の変化を解消することを確認したが、その下流のシグナルはまだ解析中である。Flow cytometry抗体及びwestern blot抗体の不具合があり、予定より大幅に時間を費やした。また、研究支援員の手技養成にも時間がかかり、当初予定していた研究進行に遅れが生じた。現在、上記問題を解決しており、今後進めていく。我々はこれまでに、病原微生物由来物質(ssDNAやdsRNA等の核酸)は、パターン認識受容体(pattern recognition receptors, PRRs)の介在・非介在の両経路において、ヒト造血幹細胞(CD34+細胞)の増殖や分化を制御すること、その結果宿主の生体防御反応を抑制したり、自己免疫を誘導すること、を明らかにしてきた。平成30年度においては、CD34+細胞を含む各培養段階の細胞におけるTLR4の発現、LPSによるTLR4発現の影響を確認した。また、FACS、ELISA、Western-blot法を用いて、TLR4下流シグナル経路の蛋白質のリン酸化の同定、及びこれらの阻害剤による関連シグナル伝達経路を明らかにした。すでに報告したように、ssDNAが配列特異的に造血制御に関与し,dsRNAが配列非依存的にヒト造血幹・前駆細胞のアポトーシスを誘導する。今後本研究を通じて、微生物由来物質による造血制御の機構を明らかにし、感染を契機として発症する血液疾患や自己免疫疾患のメカニズムや治療法の開発に新たな視点を提供したい。平成30年度は、平成29年度に遅れていた実験計画から進めてきた。LPSはCD34+細胞の顆粒球系・単球系細胞への増殖と分化を促進することを確認した。TLR4はCD34+細胞及び顆粒球系・単球系細胞へ分化する前駆細胞レベルに発現し、TLR4の阻害剤であるC34によって、LPSによるCD34+細胞の分化・増殖の変化が抑制された。また、TLR4下流シグナル経路のリン酸化酵素であるTGF-β活性化キナーゼ1(TAK1)、細胞外シグナル調節キナーゼ(ERK)1/2は、LPSの添加によりリン酸化され、これらのシグナル阻害剤によって、C34と同様にLPSの作用が解消されることを明らかにした。また、TLR4シグナル伝達経路の細胞増殖やアポトーシス等に関わる転写因子、核内因子κB(NF-κB)を阻害することもLPSによるCD34+細胞の分化・増殖の変化を抑制した。更に、LPSによるCD34+細胞の分化・増殖促進作用に関わるサイトカインはInterleukin-6(IL-6)とIL-8であったことを解明した。以上よりLPSはTLR4シグナル経路を介して、CD34+細胞の顆粒球系・単球系への分化・増殖を促進することを明らかにした。Flow cytometry抗体及びwestern blot抗体の不具合、研究支援員の手技養成等によって、初年度から当初予定していた研究進行に遅れが生じていた。今年度は上記を克服したが、ヒト末梢血幹細胞から顆粒球系・単球系細胞への分化・増殖が効率不良な細胞系であり、研究遂行には予想より時間がかかってしまったため、平成30年度は平成29年度分のみを達成した。
筋の“伸縮"が骨格筋の生理学的状況に果たす役割

筋収縮において骨格筋の成長・肥大・タイプ変換に影響を及ぼすと推察される“機械的刺激"のうち、「静止張力発生を伴わない筋の長さ変化」に着目し、収縮による筋の「動き」が骨格筋に及ぼす影響を検討するための細胞モデルおよび生体モデルを開発し、骨格筋への影響を検討した。平成9年度は、培養細胞に受動的な伸縮を負荷する装置を開発し、伸展させて張ったシリコン膜ディッシュにラット新生児体肢から抽出した筋芽細胞、線維芽細胞をまき、4日後に筋管が形成された時点で伸縮運動を開始した。培養開始後8日で培養・運動を完了し、細胞を回収して分析を行った。同条件で静置培養した細胞を対照とした。SDS-PAGEにより筋蛋白質組成の変化の検討および蛋白分子量の測定を行った。伸縮運動を負荷した細胞では数例でアルブミンがわずかに増大したが、収縮タンパクに変化は認められなかった。平成10年度には、マウス下腿ヒラメ筋が、1.伸張域でのみ、または、2.短縮域でのみ活動するような可動域制限ギプスを片脚に施して運動を行わせ、5週間後、無処置の対脚ヒラメ筋とともに摘出して、筋長-等尺性単収縮張力関係を調べた。いずれのギプス筋も対照筋に比べ筋重量は低下したが、その低下は伸張域運動群でより小さかった。静止張力は、短縮域運動群で立ち上がりが速くなったが、伸張域運動群では対照筋と同様であった。至適長および最大単収縮張力で標準化した筋長-張力関係は両ギプス群とも変化しなかった。以上より、「静止張力を伴わない筋運動」は通常の収縮および「静止張力を伴う筋運動」に比べ筋の萎縮と弾性低下を引き起こすが、筋の収縮タンパク組成および収縮特性には変化を及ぼさないことがわかった。筋収縮において骨格筋の成長・肥大・タイプ変換に影響を及ぼすと推察される"機械的刺激"のうち、「張力発生を伴わない筋の長さ変化」に着目し、収縮による筋の「動き」が骨格筋に及ぼす影響を検討するためのモデルを開発し、妥当性を検討した。筋細胞内に「動き」を受容する機構があるかどうかを調べるため、培養細胞に強制的な動き(=張力の発生を伴わない受動的な伸縮)を負荷し、細胞の構成タンパク質の分析を行った。培養細胞の運動装置として、湿気・耐熱にすぐれたモータを備え常に正確に作動する細胞テーブル移動装置を開発した。ラット新生児の体肢を破断・懸濁し、培養用の細胞を抽出した。加熱滅菌した装置にシリコン膜ディッシュを伸展させて張り、中央部に筋芽細胞、膜周辺部に線維芽細胞をまき、栄養培地で満たしてインキュベータ内に設置し培養した。細胞を観察しながら培地を変換して分化を促進させ、4日後に筋管が形成された時点で伸縮運動を開始した。伸縮運動は、全長の2%の短縮およびその引戻しを1サイクル/5秒で行い、6時間の運動ごとに3時間の休息をはさんだ。対照となる培養群には同期間運動を加えず静置培養した。細胞はシリコン膜上から回収して、SDS-PAGEにより筋蛋白質組成の変化の検討および蛋白分子量の測定を行った。伸縮運動を負荷した細胞では3/10例で分子量約60kDaの蛋白質がわずかに増大した。また、O'Farrell (1975)の方法により2次元泳動を行った結果、この蛋白質はほぼpI=4.5をもつ単一のものであることが分かった。

筋収縮において骨格筋の成長・肥大・タイプ変換に影響を及ぼすとされる「機械的刺激」のうち、近年では特に筋の「伸張」が重要視されているが、一方で、筋に対する刺激の強さとしては「収縮(トレーニング)」による方が大きいのが普通である。本年度は機械的刺激因子として、筋の「伸張による静止張力発生」と「収縮による活動張力発生」の因子を分離して筋に対する影響を検討する生体モデルを作成し、両因子の筋に対する影響を比較検討した。マウス下腿ヒラメ筋を対象とし、完全伸展時の足関節角度を180゚とした場合、下腿筋が、1.伸張域(足関節角度30゚120゚以下)でのみ活動する[伸張域運動群],または2.短縮域(足関節角度120゚180°)でのみ活動する[短緬域運動群]、ような2種類の可動域制限ギブスを片脚に施した。同一個体の無処置の対脚を対照とし、自由活動(歩行・走行・跳躍)による運動を行わせた。5週間のギブス期間後、腫脹のない個体についてのみ両脚よりヒラメ筋を摘出した。筋の両端を装置および微小荷重トランスデューサに接続し、95%02-5%CO2を通気したRinger液中に固定した。筋長をマイクロマニュピレータで変化させ、筋長-等尺性単収縮張力関係を調べた。収縮特性測定後、筋湿重量を測定した。いずれのギブス筋もコントロールに比べ筋重量は低下したが、その低下は伸張域運動群でより小さかった。対脚のコントロール筋重量には差がなく、対側のギブス処置による補償性肥大は認められなかった。静止張力は、短縮域運動群で立ち上がりが速くなったが、伸張域運動群ではコントロールと同様であった。至適長および最大単収縮張力で標準化した筋長-張力関係は両ギブス群とも変化しなかった。以上より、ギブスによる可動域制限は筋の萎縮と弾性低下を引き起こすが筋の収縮特性を質的には変化させないことがわかった。
分裂酵母に見いだした新規経時寿命関連因子の解析

本年度の研究成果は主に以下の2点が挙げられる。(1)分裂酵母CCAAT結合転写複合体サブユニットPhp2欠損が引き起こす経時寿命延長効果の解析Php2欠損による経時寿命についてその理由のいくつかが明らかになった。解析の結果、Php2欠損では経時寿命の延長だけではなく、一般的に分裂酵母の培養に用いられる最少培地EMM培地ではほとんど生育しないことがわかった。そして、この培地における生育不良は炭素源であるグルコースの量を増やすことで回復することがわかった。また、この欠損株では呼吸に欠陥を示すことを確認した。そして、より具体的なデータとして、Php2転写因子は呼吸に関連する遺伝子cyc1^+(シトクロムcをコードする遺伝子)、rip1^+(電子伝達系複合体IIIサブユニットをコードする遺伝子)の上流配列に結合し、直接転写制御を行っていることがわかった。このように、どうやらPhp2は呼吸に欠陥を持つため、細胞は上手くエネルギーを得られないようだ。現在、このエネルギー生産の欠陥と寿命延長について論文を作製する方針である。(2)Eclタンパク質によるhsr1^+遺伝子の発現誘導メカニズムの解析このテーマの解析結果を(Ohtsuka et al.,2012)の論文として発表した(詳細は13.研究発表にて)。これまで高発現により分裂酵母の経時寿命を延長させるが、機能の不明な因子ecl1^+,ecl2^+,ecl3^+に関して解析を行ってきた。解析の結果、Ecl1ファミリー遺伝子を高発現させると性分化に関わる遺伝子、ストレス応答に関わる遺伝子などの発現を上昇させる。そして、分裂酵母において新たに6つの遺伝子stel1^+、spk1^+、lsd90^+、rsv2^+、hsp9^+、hsr1^+を高発現することで経時寿命の延長を引き起こし、これら遺伝子はEcl1ファミリー遺伝子の高発現で発現が上昇することを報告した。さらに、Ecl1ファミリー遺伝子による経時寿命延長は転写因子Hsr1に一部依存することを発表した。そして、Ecl1ファミリー遺伝子による寿命延長は、このHsr1のさらに上流の転写因子Prr1に大きく依存することを報告した。本年度の研究実施計画として4つの項目を挙げていた。以下にその成果について記す。(1)Ecllとタンパク質間相互作用を行っている因子の探索酵母two-hybrid法による解析が終了し、Tdh1やCpc2など10種のタンパク質が候補として取れた。免疫沈降法についても解析を続けている。結果、Tdh1については質量分析機によってもEcl1と結合していることがわかった。Hsf1のChIPについても解析が終了し、解析の結果、Hsf1タンパク質はecl1^+,ecl2^+,ecl3^+の上流DNA配列に結合している証拠を得ることができた。また、ecl2^+においては熱ショックによってその結合活性が上昇することも明らかになった。このことによって高発現により経時寿命を延長させる新規遺伝子ecl1^+,ecl2^+,ecl3^+が多くの生物種に広く保存される熱ショック転写因子Hsf1との関わる証拠がまた一つ得られた。(3)HAP複合体とEcl1,2,3のタンパク質間相互作用の確認分裂酵母脚複合体サブユニットPhp2のタンパク質量がEcl1,2,3の高発現により減少することがわかった。これによってEcl1,2,3はPhp2のタンパク質量を減少させることによって経時寿命を延長させている可能性があることがわかった。(4)Ecl1,2,3下流因子の解析現在ecl1^+,ecl2^+,ecl3^+のさらなる標的としてrsv2に焦点を絞り解析を進めている。rsv2は経時寿命延長因子hsr1と類似配列を持ち、hsr1と同様にecl1^+,ecl2^+,ecl3^+の高発現で発現が上昇することが分かっている。(1)ショック転写因子Hsf1とEcl1ファミリー遺伝子の解析熱ショック転写因子Hsf1が分裂酵母の経時寿命に関与することを明らかにした。つまり、分裂酵母において、Hsf1を高発現することにより経時寿命が延長する。また、この寿命延長には、Ecl1ファミリー遺伝子が必要であることを示した。そして、Hsf1が熱ショックに応答して、ecl2^+の上流DNA配列に結合することも明らかにした。以上の発見を「Ohtsuka et al., 2010」で報告した。(2)Ecl1フミリー遺伝子のマイクロアレイを用いた解析Ecl1ファミリー遺伝子の高発現株を用い、マイクロアレイ解析を行った。その結果、ecl1^+、ecl2^+、ecl3^+らEcl1ファミリー遺伝子は高発現により、経時寿命延長、酸化ストレス耐性の他に、胞子形成率および接合率の促進にも関与していることがわかった。そして、その酸化ストレス耐性だが、これはカタラーゼをコードする遺伝子ctt1^+に依存することがわかった。また、Ecl1ファミリー遺伝子の高発現株で発現上昇していたいくつかの遺伝子を解析したところ、ste11^+、spk1^+、lsd90^+、rsv2^+、hsp9^+、hsr1^+の6つの遺伝子が新たに分裂酵母の経時寿命に関与していることが判明した。そして、その中でも、hsr1^+は高発現により大きく分裂酵母の経時寿命を延長した。

加えて、Ecl1ファミリー遺伝子の高発現による経時寿命延長はこのhsr1^+遺伝子に一部依存することがわかった。また、Ecl1ファミリー遺伝子の高発現によっておこるhsr1^+遺伝子の発現上昇は転写因子Prr1に依存することも判明した。さらに、Ecl1ファミリー遺伝子による経時寿命延長はこのPrr1に大きく依存することがわかった。本年度の研究成果は主に以下の2点が挙げられる。(1)分裂酵母CCAAT結合転写複合体サブユニットPhp2欠損が引き起こす経時寿命延長効果の解析Php2欠損による経時寿命についてその理由のいくつかが明らかになった。解析の結果、Php2欠損では経時寿命の延長だけではなく、一般的に分裂酵母の培養に用いられる最少培地EMM培地ではほとんど生育しないことがわかった。そして、この培地における生育不良は炭素源であるグルコースの量を増やすことで回復することがわかった。また、この欠損株では呼吸に欠陥を示すことを確認した。そして、より具体的なデータとして、Php2転写因子は呼吸に関連する遺伝子cyc1^+(シトクロムcをコードする遺伝子)、rip1^+(電子伝達系複合体IIIサブユニットをコードする遺伝子)の上流配列に結合し、直接転写制御を行っていることがわかった。このように、どうやらPhp2は呼吸に欠陥を持つため、細胞は上手くエネルギーを得られないようだ。現在、このエネルギー生産の欠陥と寿命延長について論文を作製する方針である。(2)Eclタンパク質によるhsr1^+遺伝子の発現誘導メカニズムの解析このテーマの解析結果を(Ohtsuka et al.,2012)の論文として発表した(詳細は13.研究発表にて)。これまで高発現により分裂酵母の経時寿命を延長させるが、機能の不明な因子ecl1^+,ecl2^+,ecl3^+に関して解析を行ってきた。解析の結果、Ecl1ファミリー遺伝子を高発現させると性分化に関わる遺伝子、ストレス応答に関わる遺伝子などの発現を上昇させる。そして、分裂酵母において新たに6つの遺伝子stel1^+、spk1^+、lsd90^+、rsv2^+、hsp9^+、hsr1^+を高発現することで経時寿命の延長を引き起こし、これら遺伝子はEcl1ファミリー遺伝子の高発現で発現が上昇することを報告した。さらに、Ecl1ファミリー遺伝子による経時寿命延長は転写因子Hsr1に一部依存することを発表した。そして、Ecl1ファミリー遺伝子による寿命延長は、このHsr1のさらに上流の転写因子Prr1に大きく依存することを報告した。