hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
担癌生体の肝類洞に見られるTcRγδ細胞の増殖とその活性化機構

ヒトの剖検例において、担癌患者と非担癌患者の肝由来単核細胞中におけるγδT細胞の割合を調べたところ、担癌患者の約6割において、γδT細胞が15%以上の高値を示した。このような傾向は、担癌患者の末梢血や脾臓中のリンパ球には見られない。このようなヒトのデ-タから、本年度はマウスにおいて、担癌状態と肝γδT細胞の動態を詳しく検索した。C3H/HeマウスにsyngeneicなMH134腫瘍細胞株をマイトマイシン処理して1×10^1腹腔投与したところ、肝類洞に単核細胞の増多が誘導され、この中の15%はγδT細胞であった。コントロ-ルマウスの肝には10%以下のγδT細胞しか存在しない。さらに興味深いことは、このようにして誘導した肝のγδT細胞は、芽球様の形態を示し、<in>___ー<vitro>___ーで自発増殖能を示すことが明らかになった。このことは、γδT細胞が肝類洞で胸腺外分化している可能性を示唆している。肝のγδT細胞は、PCR法によってそのV gene segment使用を検索するとVγ1or2/Vδ6を好んで使用していて、胎生期の胸腺由来とされる皮膚や腸管に存在するγδT細胞とは性状が異なっている。担癌刺激によってVγ1or2/Vδ6以外のV geneも肝に出現することから、肝は他のV geneを使用したいろいろなγδT細胞を分化、増殖されるポテニシャルをもっているものと考えられる。以上のような肝類洞における特有なγδT細胞の誘導のみならず、胸腺外分化の特徴をそなえたαβT細胞をも誘導していることも、本実験で明らかになった。抗腫瘍免疫において、以上のような肝類洞で胸腺外分化してくるγδやαβT細胞が重要な役割を果たしているものと考えられる。
口唇裂口蓋裂患者における上顎骨の振動動態に関する研究

本研究では、モード解析の理論を応用し、上顎の歯に動的衝撃を加え、上顎骨内の振動の様相を明らかにすることを試みた。まず、本実験系の再現性を確認したのち、健常成人12名(男性7名、女性5名、平均年齢25.9歳)を被験者とした。すべての被験者の伝達関数において、一つの明瞭なピークが見られ、同一被験者内では、側定点が違っても、伝達関数の形状は非常に類似していた。また、カーブフィットもすべての被験者において行うことが可能であった。カーブフィット後の共振周波数は546.7Hzから785.5Hzの間であり、各側定点での振幅は、前歯部で最大となり、側定点が後方になるにしたがって小さくなった。振動のアニメーションでは、上顎歯列は振動を受けた後、一周期内で、アーチが外側にふくらみ、内側にしぼむといった振動様相を呈した。さらに、矯正治療が終了し、顎裂部に骨移植術を受けていない補綴処置開始前の左側唇顎口蓋裂患者男性2名(20歳および22歳)を被験者とした。口蓋裂患者においても、伝達関数は明瞭な一つのピークを示し、いずれの被験者においてもカーブフィットが可能であった。共振周波数は614.7Hzと597.9Hzであり、健常者の範囲内であった。振幅は健常者と同様後方になるほど小さくなったが、特にスモールセグメントで、小さな値を示した。また、振動のアニメーションも外側にふくらみ、内側にしぼむといった様相を呈したが、両セグメントの間に位相のずれが見られた。その後この患者に顎裂部への骨移植術を行い、半年経過した後に同一の方法で計測を行った。その結果、位相のずれがなくなり、上顎骨が一体として振動している様相が確認され、本方法が骨移植術の評価にも適用可能であることが明らかとなった。まず、本実験系の再現性を確認するため、同一被験者に同日内に3回、さらに日を変えて3日、計9回の測定を行った。その結果、各側定点でので伝達関数は明瞭な一つのピークを持ち、その形状が非常に類似していた。また共振周波数は、535.1Hzから565.9Hzの範囲で、変動係数も0.03%から2.0%の範囲と生体を対象とした実験では極めて小さく、本実験系は十分な再現性を有すると考えられた。そこで、健常成人12名(男性7名、女性5名、平均年齢25.9歳)を被験者とした。

口蓋裂患者においても、伝達関数は明瞭な一つのピークを示し、いずれの被験者においてもカーブフィットが可能であった。共振周波数は614.7Hzと597.9Hzであり、健常者の範囲内であった。振幅は健常者と同様後方になるほど小さくなったが、特にスモールセグメントで、小さな値を示した。また、振動のアニメーションも外側にふくらみ、内側にしぼむといった様相を呈したが、両セグメントの間に位相のずれが見られた。本研究では、モード解析の理論を応用し、上顎の歯に動的衝撃を加え、上顎骨内の振動の様相を明らかにすることを試みた。まず、本実験系の再現性を確認したのち、健常成人12名(男性7名、女性5名、平均年齢25.9歳)を被験者とした。すべての被験者の伝達関数において、一つの明瞭なピークが見られ、同一被験者内では、側定点が違っても、伝達関数の形状は非常に類似していた。また、カーブフィットもすべての被験者において行うことが可能であった。カーブフィット後の共振周波数は546.7Hzから785.5Hzの間であり、各側定点での振幅は、前歯部で最大となり、測定点が後方になるにしたがって小さくなった。振動のアニメーションでは、上顎歯列は振動を受けた後、一周期内で、アーチが外側にふくらみ、内側にしぼむといった振動様相を呈した。さらに、矯正治療が終了し、顎裂部に骨移植術を受けていない補綴処置開始前の左側唇顎口蓋裂患者男性2名(20歳および22歳)を被験者とした。共振周波数は6I4.7Hzと597.9Hzであり、健常者の範囲内であった。その後この患者に顎裂部への骨移植術を行い、半年経過した後に同一の方法で計測を行った。その結果、位相のずれがなくなり、上顎骨が一体として振動している様相が確認され、本方法が骨移植術の評価にも適用可能であることが明らかとなった。
植物細胞間隙に生息する微生物群集のメタゲノム解析と病害防除への利用

植物の葉表面や葉組織には微生物が生息し、植物や病原微生物と相互作用することによって、植物の生育や様々な環境ストレス・病虫害に対する耐性に関わっているものと推察されている。本研究では、イネ植物体の細胞間隙に生息する微生物群集の多様性と、同微生物の植物への耐病性付与について研究を行なった。その結果、(1)イネの細胞間液から抽出したDNAを鋳型とした16Sと18S_rDNA断片のPCR-DGGE法によるバンドパターン解析と塩基配列を用いたデータベース解析から、微生物集団の多様性と微生物種の推定が可能である。(2)有機栽培イネの細胞間隙液に特徴的な内生菌として、Pseudomonas sp., Bacillus sp., Curtobacterium sp., acinetobacter sp.等を見出すことができた。(3)同分離菌の中には、イネいもち病菌の感染、増殖に抑制的な働きをもつものや、イネもみ枯細菌病菌による苗腐敗症を抑制するものが存在していた。以上のことから、有機栽培イネの細胞間隙液に存在する内生菌集団の中には、病原菌の感染、増殖に抑制的な働きを持つものが存在している可能性が考えられた。しかし、実際の自然環境中において、難培養性微生物を含めてどのような微生物種が生息し、植物や病原微生物とどのように関わっているのかはほとんど明らかになっていない。本年度の研究では、モデル植物としてイネを用い、イネ葉身、葉鞘の組織内に生息する内生菌集団から直接DNAを抽出する方法を確立するとともに、得られたDNAを鋳型とし、細菌用として16SrDNA可変領域、糸状菌用として18SrDNA可変領域をそれぞれPCR増幅し、Denaturing Gradient Gel Electrophoresis (DGGE)法により内生菌集団を構成する微生物の多様性を、まるごと解析ことを目的とした。その結果、(1)植物組織を、界面活性剤を含む蒸留水中で減圧浸透後、遠心分離により細胞間隙液を回収し、同液体よりDNAを抽出する方法を確立した。さらに、(2)同DNAを鋳型としてrDNA増幅プライマーを用いたPCRにより得られた増幅産物を、DGGE法により解析したところ、多数のバンドが再現性よく検出された。次に、(3)いくつかのバンドをクローニングして塩基配列決定とデータベース解析を行ったところ、既報の難培養性微生物などと高い相同性を示したことから、同手法により単離されたDNAは、イネ内生菌に由来するDNAを含んでいることが明らかになった。今後、本手法により、生育ステージ、土壌、品種、栽培条件の異なるイネを用いて、内生菌群集の多様性を比較解析する予定である。本研究では、イネ植物体中の細胞間隙に生息する微生物群集の多様性と、同微生物の同定および植物への耐病性付与について研究を行ない、植物組織内に生息する微生物群集の病害抑制における役割を明らかにする。本年度は、(a)有機および慣行栽培イネの細胞間隙液に由来する微生物群DNAの解析とフラジェリン遺伝子の単離、および(b)同細胞間隙液に由来する微生物群の培養による比較解析と(有機栽培イネの細胞間隙液に特徴的な微生物の推定を行った。その結果、(1)有機および慣行栽培イネの細胞間隙液に由来する微生物群16SrDNA断片のDGGE法による比較解析:有機および慣行栽培イネ苗の細胞間隙液よりDNAを抽出し、16SrDNA断片をPCR後、DGGE法により細菌群の多様性を比較解析したところ、有機栽培と慣行栽培で、濃度に変化が認められたバンドが存在したが、全体的なバンドパターンは類似していた。(2)有機および慣行栽培イネの細胞間隙液に由来する微生物群の培養による比較解析:有機・慣行栽培

水田より採取したイネの葉身と葉鞘から細胞間隙液を採取し、NA培地に塗布して培養したところ、苗および田植え後のイネの細胞間隙液において、有機栽培に特徴的なコロニー(培地上に形成されるコロニー数が慣行栽培イネに比べて明らかに多い)が認められた。有機栽培イネに特徴的な16菌株を単離・培養した。(3)有機栽培イネの細胞間隙液に特徴的な微生物の推定:有機栽培イネに特徴的なコロニーの形態および培養性状より、同コロニーは細菌であると判断されたため、16SrDNA断片をPCR増幅し、クローニングを行った。得られたクローンの塩基配列を決定し、相同性検索を行ったところ、16菌株中6菌株がPseudomonas sp.であった。植物の葉表面や葉組織には微生物が生息し、植物や病原微生物と相互作用することによって、植物の生育や様々な環境ストレス・病虫害に対する耐性に関わっているものと推察されている。しかし、実際の自然環境中において、難培養性微生物を含めてどのような微生物種が生息し、植物や病原微生物とどのように関わっているのかはほとんど明らかになっていない。前年度の研究において、イネ細胞間隙液に含まれる微生物集団を培養することにより得られたコロニーから、16SrDNA塩基配列に基づき、Pseudomonas sp.を分離した。そこで本年度は、同細菌をイネに施用することにより、いもち病などの病害誘導が抑制あるいは助長されるか解析を行った。(1)有機栽培イネに特徴的な微生物を施用したイネにおけるいもち病抑制活性の評価:有機栽培に特徴的な7菌株をそれぞれ処理した5葉期のイネを用いて、葉鞘接種検定により、いもち病菌侵入率への影響を調べた。その結果、AZ2株(Pseudomonas sp.)処理によっていもち病菌侵入率が有意に低下した。さらに、いもち病菌28S rDNA量からいもち病菌バイオマスを推定したところ、比較無処理区に対してAZ2株処理区ではいもち病菌のバイオマスが減少する傾向が認められたことから、有機栽培イネの細胞間隙液に存在する菌株の中には、いもち病菌に感染、増殖に抑制的な働きをもつものが存在している可能性が考えられた。(2)有機栽培イネに特徴的な微生物のイネもみ枯細菌病菌による苗腐敗症の抑制効果の解析:有機栽培に特徴的な内生細菌がイネの生育初期に比較的多く認められたことから、苗病害に対する効果を評価した。イネもみ枯細菌病菌による苗腐敗症に対して、Bacillus sp., Curtobacterium sp., Acinetobacter sp.と推定される内生細菌を施用した場合に発病度が抑制されることが示唆された。また、有機栽培の育苗土にもイネもみ枯細菌病抑制効果が認められ、この効果はオートクレープ処理により失われたことから、何らかの生物的要因による効果と推定された。
全光検出型電子スピン分光法による電荷輸送過程の電子スピン制御機構の解明

過渡的な磁気光学効果の検出系の最適化のために、定常状態でのFaraday Rotation(FR)測定装置を組み上げた。安定なProbe光の選定、検出系として光学ブリッジの最適化を行った。また、時間分解測定装置の性能確認に適当と考えられる光反応系の探索を、光誘起分子内電荷分離反応系を中心に進めた。同時に、既存のレーザーシステムと同期させることにより、時間分解測定装置として組み上げた。この装置を用いて、電荷輸送過程での電子スピン動力学的挙動を解明するための観測・解析を行った。本申請研究は、分子スピンエレクトロニクス研究の基盤となる電子スピンコヒーレンスの高速検出手法の開発を行い、分子内の電子スピン系の動的挙動を解明する手法として確立することを目的として行った。この目的を達成するために、以下の点について検討を進めた。1過渡的な磁気光学効果を観測する全光検出型電子スピン分光システムを組み上げて、電子スピンコヒーレンスの消長の観測と定量的な解析を進める。2素子構造を持つ有機半導体薄膜系に展開し、電荷移動過程でのスピン混合の寄与について提案されているモデルの検証とその改良を行う。過渡的な磁気光学効果の観測系の構築に向けて、定常状態でのFaraday Rotation(FR)測定装置を組み上げ、最終的に目的とする時間分解FR装置の検出系の性能確認を行った。この中で安定なProbe光の選定、検出系として光学ブリッジを組み上げ、検出条件の最適化を行った。さらに、既存のレーザーシステムにより、pomp-probe法を用いた時間分解測定装置として組み上げた。特に電子スピン分極が強く表れる系を取り上げ、生成するラジカル対の電子スピン分極のスピン動力学的な解析を進めた。過渡的なFR信号以外の観測系からの装置的な搖動がスピン分極したラジカル対に起因する微弱な信号に重畳して現れるので、この要因を取り除くために、外部静磁場との関係も含めた多様な実験配置で改良を行った。このことにより、時間分解FR法の電子スピン系の動力学を解析する有力な分光法となりうることを明らかにした。しかしながら、当初、目的とした電荷輸送過程での電子スピン動力学的挙動を取り扱うために十分な質の高い信号を観測するに至っていない。この点については、高速・高感度検出系の最適化が今後の主要な課題であると判明した。この研究を通じて、全光検出型電子スピン分光法の新しい応用を開拓する契機を提供したと確信している。本申請研究は、分子スピンエレクトロニクス研究の基盤となる電子スピンコヒーレンスの高速検出手法の開発を行い、分子内の電子スピン系の動的挙動を解明する手法として確立することを目的として行う。このために、過渡的な磁気光学効果を観測する全光検出型電子スピン分光システムを組み上げて、光誘起電子移動反応初期過程で生成する分子内電荷分離系の電子スピンコヒーレンスの消長の観測と定量的な解析を進める。さらに、素子構造を持つ有機半導体薄膜系に展開し、電子スピンコヒーレンスに関する観測結果をもとに、スピン輸送あるいは電荷再結合過程でのスピン混合の寄与等について提案されているモデルの検証とその改良・確定することを目的として研究を進めた。今年度の研究計画としては、定常状態でのFaraday Rotation(FR)測定装置を組み上げ、最終的に目的とする時間分解FR装置の検出系の性能確認を行うことを目指した。Probe光の安定性と観測される"信号の質"について検討し、研究目的の達成に十分な性能を持ちうるレーザー装置を確定した。これと並行して、1/2波長板、GLプリズム、Photodiodeは、基本的な光学ブリッジの構成して、このブリッジを用いた検出法の最適条件を決定した。最終的に、標準試料を用いて完成した定常状態FR測定装置の性能を確認した。さらに、既存のレーザーシステム(パルス色素レーザー)を転用することにより、pomp-probe法を用いた時間分解測定装置として組み上げるための予備的な実験を進めた。特に、励起とプローブレーザー間の同期制御系の最適化を行った。また、時間分解測定装置の性能確認に適当と考えられる光反応系の探索を、光誘起分子内及び分子間電荷分離反応系を中心に進めた。当該研究の研究目的を達成するために、本年度の「研究実施計画」で2つの中心的な課題を提起した。それは、定常状態Faraday Rotation(FR)測定装置の組み上げと時間分解測定装置への展開を指向した周辺設備・技術の整備にあった。これらの課題は、おおむね当初の計画通りに進んでいる。具体的には、前者については、高感度高性能の定常状態でのFaraday Rotation測定装置を組み上げること、その結果を基に検出系の核心部分である光学ブリッジ(1/2波長板、GLプリズム、Photodiodeで構成される)の最適な実験配置を確定した。この検出系は、最終的に目的とする時間分解FR装置の検出系として組み込むことになるので、今後、必要となると考えられる改良に柔軟に対応できる体制を確立した。

このために、外部静磁場との関係も含めて性能確認を行い、多様な実験配置での結果を整理した。また、後者については、時間分解FR装置の開発に向けた準備に着手し、pompーprobeレーザー間の同期と信号取り込み・処理系のsoftwareの開発も含めた作業を進めた。同時に、試作装置の性能確認には、強く電子スピン分極した光反応系が好都合であるのでその探索を進めた。その中で、分子内電荷分離系に適当と思われる光反応系を見出したので、生成するラジカル対の電子スピン分極のスピン動力学的な解析を進めた。定常状態FR測定装置とパルスレーザーを組み合わせたシステムでは、スピン分極したラジカル対に起因すると期待される微弱な信号を得ている。しかしながら、過渡的なFR信号以外の相知的な要因を排除できていない。次年度に向けて、改善すべき問題点の絞り込みも系統的に進めているので、計画はおおむね順調に進んでいると考えている。初年度において、定常状態FR法及び時間分解測定法について所要の成果を得ているので、研究計画に即し当初の研究目的を達成するための研究を推進する。時間分解FR法の電子スピン系の動力学を解析する新規手法として確立するために、装置の検出感度の改善、位相情報の抽出、時間分解能の改善等について検討を進める。一連の改良作業を経て組み上げた全光検出電子スピン分光法を用いて、従来のパルスEPR法では電子スピン相関に関する情報が抽出不可能な系への応用研究を進める。先ず、既に、時間分解EPR測定により、系の電子スピン動力学的な研究が完了している試料系を用いて、観測される時間分解FR信号のダイナミクスとの対応について研究する。さらに、電荷輸送系への応用の典型例として、電子受容体をDopeしたPolyvinylcarbazol薄膜中に生成する電子-正孔対を中心に進める。この系は、Dopeした電子受容体によりGMR効果が大きく変化するが、関与する電子-正孔対の電子スピン相関に関する情報を従来の分光手法では得ることが出来なかった。この系について、電子スピン相関時間・位相緩和時間を精度よく決定しGMR効果との対応について明らかにする。当該研究期間で得られた研究成果を整理し、この新規手法が常磁性種の電子スピン検出のための有力な分光手法でとして位置づけられることを明らかにする。さらに、システムの時間分解能は原理的にはパルスレーザーのパルス幅で決まるので、現在のパルスレーザー技術の到達からすればフェムト秒域までの改良は容易に可能である。これらの可能性について検討するとともに、研究過程で明らかになった問題点を克服する展望について検討を進め、一連の研究を総括する。次年度使用額は、今年度の研究を効率的に推進したことにともない発生した未使用額であり、平成25年度請求額とあわせ、平成25年度の研究遂行に使用する予定である。
口腔扁平上皮癌由来Side Population細胞の癌幹細胞としての特性解析

癌幹細胞研究において他の細胞集団から幹細胞群を正確に分離・同定する事が重要である。癌幹細胞の機能的特徴を利用する方法として,ABC transporterによる薬剤排出能力を利用する方法がある。癌幹細胞は薬剤を排出する能力が高く,DNA結合蛍光色素Hoechst 33342で処理した癌細胞をフローサイトメトリー(FACS)解析することにより,蛍光強度の高い細胞集団main population (MP)と蛍光強度の低い,すなわち薬剤排出能力の高いside population(SP)細胞群に分離される。SP細胞群には高頻度に癌幹細胞が存在するといわれている。生体内の多くの組織中には正常な組織幹細胞が存在している上に,悪性腫瘍の中にも骨髄由来幹細胞が動員されることが知られている。そのため癌組織から癌幹細胞と正常幹細胞とを区分して分離精製する事は極めて困難である。正常幹細胞のコンタミネーションがほとんどないと考えられる培養癌細胞株を用いることで口腔扁平上皮癌(OSCC)幹細胞モデルの構築の可能とあると考えられる。本研究では,含有成分の明らかな無血清培養系で培養したOSCC癌細胞からFACSを用いて分離することに成功した。分離したSP細胞群の生物学的特徴について以下の検討を行った。すなわちSP細胞群の細胞増殖能,sphere形成能、さらに抗癌剤処理の影響,さらに低酸素環境下での増殖能などを検討した。またマウスでの造腫瘍能などの癌幹細胞に必要な細胞特性を検討した。今後、幹細胞が存在するとされるニッチと同様な低酸素状態でのSP細胞の動態や遺伝子発現の解析を行う。最終的には,OSCCの癌幹細胞を分離・同定すること,自己複製能と分化能を制御している機構や癌化のメカニズムを解明することで「癌幹細胞を標的とした質的診断・治療法」を確立する。本研究では,ヒト口腔扁平上皮癌細胞株より分離したSP細胞群の細胞・分子生物学的特徴の解析を,無血清培養系を用いて行っている。現在まで,以下のことが明らかとなった。・各OSCC細胞株において, SP細胞の全細胞における細胞数の比率は0.52%であった。一方,無血清浮遊培養系では, SP細胞のsphere形成能はMP細胞と比較し上昇していた。またSP細胞はMP細胞に比較し,無血清単層培養系および浮遊培養系で高い抗癌剤耐性を示した。SP細胞の比率は,抗癌剤存在下および低酸素培養下で増加していた。・SP細胞は少数の細胞数でもヌードマウス背部皮下に腫瘍を形成する高い造腫瘍能を有していた。・SP細胞はMP細胞および親株細胞と比較し,薬剤耐性遺伝子や血管新生遺伝子を高発現していた。以上より,SP細胞がOSCC癌幹細胞の性格を有している可能性が明らかにされつつある。これまでの結果を参考に、SP細胞はMP細胞の遺伝子発現の相違や癌幹細胞マーカーとの関連について以下の検討を行う予定である。SP細胞はMP細胞のDNAマイクロアレイ解析により,薬剤耐性遺伝子や細胞接着に関与する遺伝子を解析する。癌幹細胞マーカー候補であるCD133とSP細胞群の関連を検討するため、CD133-siRNA導入によりSP細胞群の細胞・分子生物学的特徴の変化を解析する。またSPリッチ細胞から, CD133陽性細胞とCD133陰性細胞を分離し,これら細胞間の遺伝子発現の差異をDNAマイクロアレイ解析で検討する。SP細胞とMP細胞あるいはCD133陽性細胞とCD133陰性細胞間のPathway解析を行う予定である。

・各OSCC細胞株において, SP細胞の全細胞における細胞数の比率は0.52%であった。一方,無血清浮遊培養系では, SP細胞のsphere形成能はMP細胞と比較し上昇していた。またSP細胞はMP細胞に比較し,無血清単層培養系および浮遊培養系で高い抗癌剤耐性を示した。SP細胞の比率は,抗癌剤存在下および低酸素培養下で増加していた。・SP細胞は少数の細胞数でもヌードマウス背部皮下に腫瘍を形成する高い造腫瘍能を有していた。・SP細胞はMP細胞および親株細胞と比較し,薬剤耐性遺伝子や血管新生遺伝子を高発現していた。以上より,SP細胞がOSCC癌幹細胞の性格を有している可能性が明らかにされつつある。これまでの結果を参考に、SP細胞はMP細胞の遺伝子発現の相違や癌幹細胞マーカーとの関連について以下の検討を行う予定である。SP細胞はMP細胞のDNAマイクロアレイ解析により,薬剤耐性遺伝子や細胞接着に関与する遺伝子を解析する。癌幹細胞マーカー候補であるCD133とSP細胞群の関連を検討するため、CD133-siRNA導入によりSP細胞群の細胞・分子生物学的特徴の変化を解析する。またSPリッチ細胞から, CD133陽性細胞とCD133陰性細胞を分離し,これら細胞間の遺伝子発現の差異をDNAマイクロアレイ解析で検討する。SP細胞とMP細胞あるいはCD133陽性細胞とCD133陰性細胞間のPathway解析を行う予定である。予算の執行は確実に行ってきたが,少額の端数(2,699円)が生じてしまった。次年度経費と合わせて物品費に使用する予定である。
肝修復過程におけるu-PA/プラスミン系による新規なマクロファージ機能制御機構

本研究では肝修復過程におけるu-PA/プラスミン系によるマクロファージの機能制御機構を検討した。その結果、肝修復過程においてu-PA/プラスミン系が障害部位へマクロファージを集積させ、肝修復に必須であることが明らかになった。さらに、u-PA/プラスミン系は肝障害部位周囲の微小環境中のサイトカイン発現を介して集積したマクロファージにおいて多様な表現型と細胞極性を誘導し、壊死組織の貪食に寄与することが明らかになった。プラスミノゲンアクチベーター(PA) /プラスミン系は肝臓の修復に寄与することが指摘されているが、その詳細な機構は不明である。本研究課題ではPA/プラスミン系による肝修復過程におけるマクロファージの機能制御機構を解明することを目的とする。1.マクロファージによる肝壊死組織の貪食におけるPA/プラスミン系の役割:肝障害部位周囲に集積したマクロファージを透過型電子顕微鏡で観察した。野生型マウスではマクロファージが偽足を伸展して壊死組織を貪食する様子が観察され、さらに細胞極性を有していた。また、それらのマクロファージの細胞体は障害部位に接していないマクロファージと比較して大きく、核やゴルジ体などの細胞内器官が発達していた。一方、ウロキナーゼ型PA(u-PA)欠損マウスおよびプラスミノゲン欠損マウスではマクロファージにおける肝壊死組織への偽足の伸展は少なく、細胞極性が消失した。さらにu-PAおよびプラスミノゲンの欠損によってマクロファージによる肝壊死組織の貪食も減少した。2.肝障害部位周囲におけるサイトカイン発現におけるu-PAの役割:レーザーマイクロダイセクション法によって採取した肝障害部位周囲の組織におけるサイトカインの遺伝子発現を検討した。u-PA欠損マウスでは肝障害部位周囲におけるインターフェロンガンマおよびインターロイキン(IL)-4の発現が野生型マウスと比較して減少した。さらに、腫瘍壊死因子アルファやIL-1ベータの発現もu-PA欠損マウスにおいて有意に減少した。以上より、肝修復過程においてu-PA/プラスミン系がマクロファージの貪食能活性化に寄与することが明らかになった。さらに、u-PAが肝障害部位周囲の微小環境中のサイトカイン発現を調節してマクロファージの活性化を制御する可能性が示唆された。プラスミノゲンアクチベーター(PA) /プラスミン系は肝臓の組織再生・再構築において中心的な役割を果たしているが、その詳細な機構は不明である。本研究課題では、PA/プラスミン系による肝修復過程におけるマクロファージの機能制御機構を解明することを目的とする。1.肝障害部位へのマクロファージ集積におけるu-PAの役割:u-PA遺伝子欠損マウスとその野生型マウスの肝臓に障害を誘起し、障害部位へのマクロファージの集積と障害部位の減少を検討した。その結果、野生型マウスと比較し、u-PA遺伝子欠損マウスではマクロファージの集積が有意に減少するとともに、障害部位の減少が著明に遅延した。一方、t-PA遺伝子欠損マウスおよびu-PA受容体欠損マウスでは肝障害部位へのマクロファージの集積に変化は見られなかった。2.マクロファージの表現型誘導におけるu-PAの役割:野生型マウスの肝障害部位周囲において、マクロファージはCD206や誘導型一酸化窒素合成酵素を発現し、多様な表現型を示していた。一方、u-PA遺伝子欠損マウスのマクロファージではこのような表現型の多様性は見られなかった。3.マクロファージの貪食能におけるu-PAの役割:u-PA遺伝子欠損マウスおよび野生型マウスの腹腔由来マクロファージの貪食能に有意な差は見られなかった。また、マクロファージをu-PAによって刺激したが、貪食能に変化は見られなかった。以上より、肝修復過程においてu-PAは障害部位へのマクロファージの集積とそれらの活性化に寄与することが示唆された。また、u-PAはマクロファージの貪食を直接活性化しないことから、障害部位においてその周囲の微小環境を調節してマクロファージの機能を制御することが示唆された。現在まで、研究はほぼ計画通りに進行しており、本年度の研究成果の一部は既に海外の学術雑誌に掲載されている(Kawao N. et al. 2011. Thromb Haemost., 105.892-900.)。さらに、第89回日本生理学会大会などにおいても成果の発表を行った。また、来年度に計画している実験についても基礎的な検討を終了している。これらのことを総合的に判断して、おおむね順調に進展しているとした。現在までの研究が順調に遂行しているため、大きな計画の変更は行わず、基本的に来年度の計画に則り研究を推進していきたいと考えている。また、来年度は本研究課題の最終年度であるため、すべての実験を12月までに終了し、それ以降は研究のまとめや成果発表を行う予定である。来年度は本研究課題の最終年度であるため、消耗品費は12月までにすべて使用するとともに、実験を終了する計画である。

さらに、研究成果のまとめとして、論文投稿に必要である論文校正費用および論文掲載費用は1月までに使用する計画である。また、来年度は研究成果発表のため海外出張旅費(アメリカ)を10月に使用する予定である。
ケミカルダイレクトリプログラミングによるヒト線維芽細胞から褐色脂肪細胞誘導の試み

7種類の低分子化合物の組み合わせを詳細に検討した結果、複数のヒト皮膚由来線維芽細胞から最も効率が良く褐色脂肪細胞へダイレクトリプログラミングする低分子化合物の組み合わせを同定した。これにより生じる低分子化合物誘導性褐色脂肪細胞(ciBA: chemical compound-induced brown adipocyte)は、生体内の褐色脂肪細胞に特異的な遺伝子の発現、多量のミトコンドリアの局在、酸素消費量の増加、アドレナリン受容体作動薬による熱産生遺伝子の発現誘導などが確認された。このciBAは今後より安全な細胞移植治療や、創薬研究、個別化医療などに利用されることが期待される。本研究の目的は、低分子化合物を用いてヒト線維芽細胞から褐色脂肪細胞へダイレクトリプログラミング(直接誘導)を行うことである。初年度では当初の計画に基づき、基本となる7種類の化合物(SB-431542、CHIR99021、PD0325901、LDN-193189、Pifithrin-a、Forskolin、Rosiglitazone)を組み合わせ、ダイレクトリプログラミングの最適化を行った。その結果、Pifithrin-aの代わりにDorsomorphinを使用した組み合わせが、より効率よく褐色脂肪細胞を誘導することが判明した。またWntシグナル経路の活性化剤であるCHIR99021を除くことで、リプログラミングの効率が大きく促進することが判明した。これらの細胞の遺伝子発現をリアルタイムPCRによって解析したところ、脂肪を蓄えるために必要な遺伝子群だけでなく、同時に褐色脂肪細胞のマーカー遺伝子であるUcp1の発現が大きく誘導されていた。次に、免疫染色によってUCP1の発現と局在について解析したところ、誘導された脂肪様の細胞に強い染色が確認された。また市販のMitoTrackerを用いてミトコンドリアを染色したところ、これらの細胞では褐色脂肪細胞の特徴である多量のミトコンドリアが局在していることが判明した。低分子化合物の組み合わせを3週間インキュベーションした後、化合物を除いた脂肪細胞用の培地で1週間培養すると、細胞内に脂肪がさらに蓄積するとともにUCP1の発現レベルの上昇が見られることからことから、褐色脂肪細胞の成熟化が確認された。そして1ヶ月以上化合物を除いて培養しても、線維芽細胞に戻ることなくその脂肪細胞様の形態とUCP1の発現が維持されることより、ダイレクトリブログラミングによって誘導された褐色脂肪細胞が安定してその状態を維持していると考えられた。初年度の研究では、低分子化合物のみによってヒト線維芽細胞から褐色脂肪細胞へのダイレクトリプログラミングに成功した。詳細な条件検討の結果、最も効率が良く褐色脂肪細胞へダイレクトリプログラミングする低分子化合物の組み合わせ、および培養のプロトコールを決定することができた。これにより生じた低分子化合物誘導性褐色脂肪細胞(ciBAs: chemical compound-induced brown adipocytes)は、生体内の褐色脂肪細胞に特異的な遺伝子の発現が見られ、特徴の一つである多量のミトコンドリアの局在が細胞質で観察されている。また化合物を除いて長期間培養しても、その脂肪細胞様の形態とUCP1の発現が維持されていることから、安定した褐色脂肪細胞へのダイレクトリブログラミングが行われているものと考えられる。このように本研究は順調に推移しており、現在のところ特に問題点はない。初年度の研究では、詳細な条件検討の結果、最も効率が良く褐色脂肪細胞へダイレクトリプログラミングする低分子化合物の組み合わせ、および培養プロトコールを決定することに成功した。これにより生じた低分子化合物誘導性褐色脂肪細胞(ciBA: chemical compound-induced brown adipocyte)は、褐色脂肪細胞に特異的な遺伝子の発現、および特徴の一つである多量のミトコンドリアの局在が観察されている。次年度では、当初の計画に基づきciBAの機能的な解析を行った。ciBAでは、ミトコンドリアによる酸素消費量が増加しており、またProton Leakに相当する酸素消費量も増加していることから、これがミトコンドリアの内膜に局在するUCP1によるものであることが示唆された。次にciBAが、ノルアドレナリン刺激に応答しUcp1などの熱産生遺伝子の発現が誘導されるか調べるため、アドレナリン受容体作動薬Isoproterenolを投与しUcp1の発現量を調べた。その結果、低濃度でも投与して3時間でUcp1の発現活性化が見られたことから、ciBAには生体内の褐色脂肪細胞と同様な熱産生経路が備わっていることが示唆された。また、各低分子化合物が制御するシグナル伝達経路の下流に位置する転写因子および標的遺伝子に注目し、線維芽細胞から褐色脂肪細胞への直接誘導メカニズムについて考察を行った。本研究のような、遺伝子の導入の必要ないダイレクトリプログラミングは、安全性がより高いことが想定され、今後ヒトへの臨床応用を考える上で大きなメリットとなる。また、褐色脂肪細胞が体内で作られる仕組みの解明や、創薬研究、オーダーメイド医療などに利用されることなどが期待される。これにより生じる低分子化合物誘導性

褐色脂肪細胞(ciBA: chemical compound-induced brown adipocyte)は、生体内の褐色脂肪細胞に特異的な遺伝子の発現、多量のミトコンドリアの局在、酸素消費量の増加、アドレナリン受容体作動薬による熱産生遺伝子の発現誘導などが確認された。このciBAは今後より安全な細胞移植治療や、創薬研究、個別化医療などに利用されることが期待される。初年度の研究により、低分子化合物によるヒト線維芽細胞から褐色脂肪細胞へのダイレクトリプログラミングに成功したため、今後の研究はこれらの細胞の機能的な解析が主となる。具体的には、褐色脂肪細胞内のミトコンドリアのエネルギー代謝を解析するため、酸素消費量(OCR)の測定を行う予定である。またこの結果を解析することで、ミトコンドリアの内膜に局在するUCP1によるProton Leakの量が実際に増加していることを実証する。また生体内の褐色脂肪細胞と同様に、ノルアドレナリン刺激による細胞中のcAMP上昇に応答しUCP1などの熱産生遺伝子(Thermogenic genes)が誘導されるかどうか調べるため、アドレナリン受容体作動薬IsoproterenolあるいはForskolinを投与しUcp1の発現量を調べる。その他、マクロアレイによって網羅的に遺伝子発現を解析することで、iPS細胞から誘導された褐色脂肪細胞と比較し、どの程度似ているか、またどこに相違があるかについて解析する。また、各低分子化合物が制御するシグナル伝達経路の下流に位置する転写因子および標的遺伝子に注目し、ダイレクトリプログラミングのメカニズムについても解明を目指す。並行して、褐色脂肪細胞を免疫不全ヌードマウスに移植し、動物モデルにおける糖および脂質の代謝の改善についてその機能解析を行う予定である。再生医学
酸水化物による水素化触媒反応の開拓

アンモニア合成に関しては、酸水素化物を担体に使用すると、酸化物に比べて活性が数倍から数十倍向上することが確認された。活性以外の面でも、活性化エネルギーの現象、水素被毒への耐性など様々な効果が確認できた。さらに、Fe, Ruなどを担持せずとも、一部の酸水素化物のみでも触媒反応が進行することが確認でき、全く新しいTi系触媒の発見に至った。アンモニア合成反応以外でも、二酸化炭素の水素化(メタン生成)では酸水素化物担持触媒の優位性を示せた。その他、アンモニア分解反応の速度論的解析を通して、酸水素化物触媒全体に対する総合的な理解が深まった。[研究目的]アンモニア合成、CO水素化、CO2水素化反応などの不均一触媒では、酸化物の触媒担体は表面積の提供や間接的な電子的効果の発現など、脇役的な存在であった。申請者は数年前に、Ti系の酸水素化物(H-を有する酸化物)を開発した。Ti系酸水素化物は400-500CでH2, NH3などの解離・分解が可能である。この独自の反応性を活かして、本研究では、水素・窒素などのガス種と直接反応し、従来の酸化物担体とは桁違いスピルオーバー効果を有する触媒を提案する。最終的には、担持金属がゼロであり、酸水素化物が直接反応に寄与するアンモニア合成、CO水素化、CO2水素化反応を目標に新しい触媒系を構築する。[研究成果]当初の実験計画では、初年度でN2分子活性化・アンモニア合成・アンモニア分解などの反応を行い、次年度にCO、CO2の水素化反応の活性を行い、速度論的考察を行う予定であった。しかし、研究の設備上の理由から、初年度はN2分子活性化、CO2水素化に対して重点的に研究を進め、一定の成果が得られた。N2分子活性化に関しては、酸水素化物がN2雰囲気下でも窒化できることが確認でき、N2結合の乖離能を間接的に証明できた。CO2のメタン化反応では、Ni/BaTiO3, Ni/BaTiO3-xHx触媒を比較した結果、BaTiO3-xHx担体触媒の活性がより高かったものの、生成した水により酸水素化物が酸化してしまい、活性が持続しない課題がはっきりした。次年度では他の水素化反応を探索する必要が判明した。アンモニア合成に関してもTi系酸水素化物の高い活性が確認でき、その理由を探るべく、触媒としてのTi系酸水素化物の基本的性質(固体塩基性・H/N拡散速度・H/N交換能)などの定量評価を新たに試みている。[研究目的]アンモニア合成、CO水素化、CO2水素化などの不均一触媒では、酸化物の触媒担体は表面積の提供や間接的な電子効果の発現など、脇役的な存在であった。申請者は数年前に、Ti系酸水素化物(H-を有する酸化物)を開発した。この独自の反応性を活かして、本研究では、水素・窒素などのガス種と直接反応し、従来の酸化物担体と桁違いのスピルオーバー効果を有する触媒を提案する。最終的には、担持金属がゼロであり酸水素化物が直接反応に寄与するアンモニア合成、CO水素化、CO2水素化反応を目標にああらしい触媒系を構築する。[研究成果]酸水素化物の基礎的な化学性質を求める実験で、いくつか進展があった。水素の交換・脱離のしやすさを比較する手法の開発が重要であったが、水素脱離温度をKissinger-Redhead解析で行うことにより、熱励起の関係を確認し、水素脱離の活性化エネルギーを求めることに成功した。他にも同位体交換(SSITKA)など様々な実験を行ったが、現在の所、この実験・解析法が最もうまくいっている。また、電子供与(すなわち固体塩基性)の定量評価も以前から必要であったが、これに関しては1-buteneの異性化反応で、酸水素化物が酸化物に対して明らかに違う挙動を示したのが確認でき、塩基性評価への糸口が見つかった。CO2水素化反応では、昨年度は副生成物である水による触媒の劣化(酸化)が課題だった。これに対し、表面の疎水化処理、反応温度の調整などでこの影響をある程度回避できることがわかった。酸水素化物の基礎的化学性質を評価する方面で、一定の進展が見られた。本年度では、CO2メタン化反応の反応次数を測定し、速度論的な考察を行った。その結果、水素に関しては異なる反応次数がはっきりと観測された。アンモニア合成でも同様の反応次数の違いが確認されており、同様の結果となった。つまり、アンモニア合成反応では、H2による反応次数解析により、酸水素化物担体が外界と水素のやりとりをしていることが示唆されている。これにより、担体と外気でのH2のやりとりや、粒子内でのヒドリド拡散を、より定量的に評価し、様々な酸水素化物を比較するツールが必要となった。いぜんからSSITKAなどの方法を試みていたが、解釈が不可解なデータしか得られず、他の方法を検討するに至った。そこで、BaTiO2.5H0.5試料にD2ガスを流しながら昇温させ、H/D交換に伴う活性化エネルギーを算出する実験を行った。一定の速度で昇温を続けると、H/D交換が盛んに進む温度でHDがピークとして放出される。

これのピーク温度(およそ400450C前後)は昇温速度に依存するのだが、両者はKissinger式という関係式で関連付けられている。その式を元に、H/D交換の活性化エネルギーを算出することができる。本手法は電子伝導性のある試料、や磁性試料など、交流インピーダンスやNMRと従来の手法では測れなかった試料にも適応できる。今後、酸水素化物触媒の領域全体の発展の加速と、イオニクスなど他分野への応用も期待できる結果となった。アンモニア合成に関しては、酸水素化物を担体に使用すると、酸化物に比べて活性が数倍から数十倍向上することが確認された。活性以外の面でも、活性化エネルギーの現象、水素被毒への耐性など様々な効果が確認できた。さらに、Fe, Ruなどを担持せずとも、一部の酸水素化物のみでも触媒反応が進行することが確認でき、全く新しいTi系触媒の発見に至った。アンモニア合成反応以外でも、二酸化炭素の水素化(メタン生成)では酸水素化物担持触媒の優位性を示せた。その他、アンモニア分解反応の速度論的解析を通して、酸水素化物触媒全体に対する総合的な理解が深まった。CO2水素化、N2分子活性化に関して、およその状況が判明した。アンモニア分解は設備がまだ整っていないが、アンモニア合成反応に関する研究も順調である。他の反応の開拓、および酸水素化物の基本的触媒性質の評価も始まっており、当初の計画から少しのずれはあるものの、概ね順調である。ーアンモニア分解反応を試みる。ー系統的に、酸水素化物中のヒドリドの動きやすさ・交換のしやすさを評価する。無機材料化学-アンモニア分解反応を試みる。-酸水素化物担体のより基礎的な触媒評価を定量的に行う(塩基性・アニオン交換能など)。-金属無担持触媒の反応を試みる。
難水溶性抗がん剤の新規エマルション製剤化による臨床的付加価値の多面的付与

近年、優れた抗がん効果を有するものの、その低い水溶性のため、臨床での使用に際し、問題を有する抗がん剤が少なくない。本研究課題では、これら難水溶性抗がん剤をエマルション製剤化することにより溶解性を改善できるだけでなく、抗がん剤内封エマルション製剤の体内動態を各種製剤技術により時間的・空間的に制御することによって、更なる臨床的な付加価値を付与できることを示した。抗がん剤パクリタキセルは、非常に優れた抗がん作用を示すが、水への溶解度が非常に低いため、主要な投与形態である点滴用の液剤調製時において溶解補助剤の使用を余儀なくされている。さらに、使用したこれら溶解補助剤に起因する過敏症が報告され、近年ではパクリタキセルの投与前に、すべての患者に対してステロイドならびに抗ヒスタミン薬の投与が必要とされている。エマルションは水溶性の低い薬物を油滴内部に保持可能な微粒子性薬物運搬体であるため、パクリタキセルのような難水溶性薬物の溶解性を高める上で、非常に魅力的な剤形である。さらにエマルションからのパクリタキセルの放出速度を製剤技術により制御することで、その抗がん作用の持続化も可能となると考えられ、本化合物の臨床上の有用性を、製剤としての安全性とともに飛躍的に高めることができると考えられえる。本年度はまず、エマルションの油相成分としてトリグリセリド(トリカプリリン、トリカプロイン、トリアセチン)を、サーファクタント、コ・サーファクタントとして、それぞれ卵黄レシチン、ツイーン80を選択し、常法に従い調製した。調製したエマルションの粒子径、ゼータ電位、パクリタキセルの油相中溶解度、安定性といった物理化学的特性を検討し、総合的に評価した結果、検討を加えた12種類の処方のうち、トリカプリリン:トリカプロイン=1:3のEmulsionA、トリカプロイン:トリアセチン=3:1のEmulsion D、トリカプリリン:トリアセチン=3:1のEmulsion Gを選択し、以後の評価を行った。まず、選択した三種のエマルション製剤の生体適合性を、ラットの皮膚における血管透過性亢進作用、ラット肥満細胞からのヒスタミン遊離促進作用、および溶血活性を指標としてそれぞれ評価した。その結果、いずれのエマルションもコントロールと同程度の値を示したことから、これら三種のエマルション製剤は高い生体適合性を示すものと考えられた。次に、エマルションからのパクリタキセルの放出特性を、平衡透析法とMTTアッセイを用いて評価した。平衡透析法を用いた評価の結果、エマルションを腹水あるいは血清のいずれと共存させた場合においても、Emulsion Dからのパクリタキセルの放出が最も速いことが示された。また、MTTアッセイの結果、in vitro条件下におけるがん細胞の生存率はEmulsion Dを添加した場合が最も低いことが示され、このことはEmulsion Dからのパクリタキセルの放出が他の製剤と比較して速いことを支持するものであった。本研究課題において、生体適合性の高いパクリタキセル内封エマルション製剤の処方を三種類見出すことができた。これら三種のエマルションからのパクリタキセルの放出速度は、いずれも遅いものであったが、Emulsion Dからのパクリタキセルの放出が他の二種と比較して速いことが示された。また、腹水がんモデルマウスにおいてEmulsion Dを投与したマウスにおける顕著な生存日数の延長が示され、これらのことよりEmulsion Dの速い放出特性がその高い抗腫瘍効果に結びついたものと考えられた。さらに固形がんモデルマウスにおいては、エマルション間では顕著な差は認められなかったものの、いずれのエマルション製剤も腫瘍増殖を有意に抑制することが明らかとなった。これらの結果は、調製したパクリタキセル内封エマルション製剤が種々のがんに対して有効性を発揮する可能性を示唆している。今後はより広範な腫瘍モデルを用いて、パクリタキセル内封エマルション製剤の有用性を明らかにしていく予定である。これら一連の検討結果を理論的に整理することにより、本研究課題において標榜していた、(1)パクリタキセルの溶解性の改善、(2)過敏症発生の抑制(製剤の安全性の担保)、(3)放出速度制御による抗がん作用の持続化、(4)標的組織へのデリバリー効率の改善による抗がん作用の増強、(5)他臓器への移行性を低下させることによる副作用の低減を、適切に達成することが可能となり、本化合物に対して臨床的な付加価値を多面的に付与できると考えられた。
大線量X線照射による膵・胆道癌細胞の細胞死機序とその促進方法の研究

我々は、これまでヒト培養膵癌細胞株に30GyのX線を照射すると、蛋白合成を必要とする能動的細胞死であるアポトーシスがおこることを見いだしている。また、エトポシドは、アポトーシスをもたらす代表的は薬剤であり、ヒト膵癌細胞株に対しても、アポトーシスによる細胞死をもたらす。そこで、この2つのアポトーシスをおこす刺激を同時に膵癌細胞に加えて、細胞死促進効果を検討した。細胞死はトリパンブルー色素排除試験によった。大線量X線照射による細胞死は、同時投与ではエトポシドの濃度によらず増加しなかった。次に、0.5μMの低濃度エトポシドを24時間前に投与した後に30GyのX線照射をおこなって細胞死を観察した。照射単独では4日後に51.8%の死細胞をみとめ、エトポシド低濃度前処置では65.1%と有意な細胞死の増加がみられた。フローサイトメトリーによって細胞周期の変化について検討をしてみると、大線量X線照射では、ほとんど全ての細胞群がG_2M期へ集積しており、高濃度のエトポシドでもG_2M期への集積がみられた。0.5μMのエトポシドを投与すると、24時間後には47.5%の細胞がS期へ集積していた。これらの結果から、エトポシドの前投与によって細胞周期をS期へ集積させることで、膵癌に対する術中照射の効果を促進させることが可能で、今後の臨床治療上考慮されるべき重要な知見と思われた。しかしながら、大線量X線照射による細胞死は、同時投与ではエトポシドの濃度によらず増加しなかった。この結果から、まったく異なる刺激であっても結果的に同一の細胞死であるアポトーシスをおこす場合、一定の細胞周期にある細胞群のみが高い感受性を示すのではないかと思われた。そこで、細胞周期を変動させることを目的として、0.5μMの低濃度エトポシドを24時間前に投与した後に30GyのX線照射をおこなって細胞死を観察した。すると、有意な細胞死の増加がみられた。フローサイトメトリーによって細胞周期の変化について検討をしてみると、0.5μMのエトポシドを投与すると、24時間後には大部分の細胞は、S期へ集積していた。また、大線量X線照射では、ほとんど全ての細胞群がG_2M期への集積しており、高濃度のエトポシドでもG_2M期への集積がみられた。現在、エトポシドによる細胞死促進効果の機序をさらに検討するとともに、他の薬剤による効果も検索している。

照射単独では4日後に51.8%の死細胞をみとめ、エトポシド低濃度前処置では65.1%と有意な細胞死の増加がみられた。フローサイトメトリーによって細胞周期の変化について検討をしてみると、大線量X線照射では、ほとんど全ての細胞群がG_2M期へ集積しており、高濃度のエトポシドでもG_2M期への集積がみられた。0.5μMのエトポシドを投与すると、24時間後には47.5%の細胞がS期へ集積していた。これらの結果から、エトポシドの前投与によって細胞周期をS期へ集積させることで、膵癌に対する術中照射の効果を促進させることが可能で、今後の臨床治療上考慮されるべき重要な知見と思われた。
ネパールにおけるマージナルグループの教育様式の政治人類学的研究

ネパールの政情不安のために・ネパールと関係の深いブータンやインドについてのマージナルグループへのフォーマル・ノンフォーマル、インフォーマルな教育様式もあわせて提示することにした。前平泰志は、ブータン・ネパールへの調査活動によって、開発とノンフォーマル、インフォーマルな教育の問題を主としてブータン社会の女性と子どもに焦点を当てて論じた。結論として、ブータンの開発と教育戦略は、伝統的な文化的価値規範を保持しつつ、国際社会での生き残りをかけた戦略的な独自の開発モデルを提示していることが示された。今井一郎は、山岳地帯での少数民族の生活様式や教育様式に触れながら、山岳観光の及ぼす影響を論じた。マンフレッド・リングホーファーは、20万人を越えるといわれるネパール国内のブータン難民キャンプに入り、ブータン国内で使用されている教科書と難民キャンプ地での、小学校6年生の歴史教科書をケーススタディに比較調査研究を行った。その結果・ブータン難民キャンプで使用の教科書には、難民の生活環境に合わせながら、帰国に備えていること、また同時に、民主主義や人権なども早い段階から教えていることに注目している。杉本均は「貧者のためのエリート校」といわれるインドの「新しい朝日の学校(ナボダヤ・ビドゥアラヤ)」を辻本雅史とともに訪問見学した記録を残している。さらに、インドのマージナルグループ(指定カースト・指定部族・その他後進諸階層)への教育援助措置がどのようなものであるかを詳細に明らかにしている。長岡智寿子は研究協力者としてブータンの女性とノンフォーマル教育の実情を調査した。同じく、宮本万理はブータンの独自の制度と思われる労働徴収制度に言及した論考を寄せた。最後に、小林茂は森野良典が翻訳した「国民語政策提言委員会答申」を紹介しながら、複雑なネパールの言語問題に言及した。今年度は科研の初年度であり,基本的に来年度以降現地調査のための準備期間と位置づけた。従って,ネパールから専門家を招へいするなど数回の研究会を持ち,ネパールの教育事情についての理解を深めた。(1)トリブヴマン大学,教育革新開発センター,Sumom Tuladhar教授を京都大学に迎え,ネパールの教育についての全般的なレクチャーを受けた。同時に,来年度以降のフィールドワークのための具体的な研究協力の方法について協議した。(2)大阪大学大学院文学研究科小林茂教授を迎えて「ネパールの低開発と教育」という題での報告と研究調査に関する助言をいただいた。小林茂教授はネパールの現地事情に詳しい人文地理学者である。(3)畠博之氏(神戸大学大学院国際協力研究科修士課程在学中)より「ネパールのカースト/エスニック・グループ間の教育格差とその要因に関する実証的研究」と題した研究発表を聞いた。畠氏は永くネパールに滞在しJICAの職員として活躍した人である。(4)ユネスコアジア・太平洋地域中央事務所(バンコク)プログラム・スペシャリストの大安喜一氏に「アジアの基礎教育:ユネスコの事業から」と題した報告を受け,その後アジアの教育開発に関する意見の交換を行った。今年度は,ネパールの政治情勢が緊迫しており,日本の外務省から日本人に対して渡航制限が通告されることも多く,同地での長期的,集団的なフィールド調査は困難をきわめ,多くの場合,断念せざるをえなかった。とはいえ,今井が比較的長期間にわたってネパールの山岳地帯に住む少数民族の研究を行なった。またマンフレッド・リングホーファーも短期間集中的にネパールのブータン難民キャンプを訪れ、同地の子どもの教育様式の研究に取り組んだ。月原は,ネパールのみならずネパールと隣接するインド,ブータンのチベット難民の学校を訪れ,それらに共通する特性と同時に歴史的、地理的差異から生ずる種差性を射程に入れた研究を継続している。