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炎症起因物質の放出過程におけるCキナーゼ分子種の役割と作用機構に関する研究

Cキナーゼ(PKC)は、アトピー性皮膚炎、花粉症などの基となる炎症メデイエーターの放出中心的役割を果たしているセリンスレオニンリン酸化酵素である。本研究では、マスト細胞のモデル系としてRBL-2H3細胞を用い、ヒスタミンやTNFα等の産生と放出に関わるPKC分子種の活性化機構と放出制御機構を明らかにし、PKC活性調節による炎症反応の抑制方法を開発することを目的として平成8年度より開始した。本年度、PKC分子種の種々の活性型及びドミナントネガチブ変異体を作成し、遺伝子導入発現によって、抗原刺激による脱顆粒の過程に介在するPKC分子種の同定とその役割について解析した。RBL細胞をウエスタン分析で調べると、α,βI,βII,δ,ε,ζの6種類のPKC分子種が発現しており、γ,η,θ,λは検出されなかった。これらは、ホルボールエステル非依存性のζを除いて、いずれもTPA又は抗原(DNP)刺激によって細胞質から膜にすみやかに移行し、TPA長時間刺激では量的に減少(down-regulation)した。この結果は、5種類のPKC分子がTPAによる直接刺激のみならずFcεRIを会した刺激で活性化されることを示唆する。更に、BI,BII,δの野生型遺伝子、新たに開発したドミナントネガチブや常時活性型PKC変異体をエレクトロポレーションによって強制発現させ、ヘキソサミニダーゼの活性をヒスタミン脱顆粒の指標として、細胞内における内在性のPKC分子の生理的役割を解析し、βIIはヒスタミン等の開口放出に促進的に作用し、他方、εはむしろ抑制的に作用することを明らかにした。以上の結果は、マスト細胞のIgE受容体活性化を介する炎症メデイエーターの脱顆粒において、βIIによる促進とεによる抑制の複雑な抑制が機能していることを示唆する。
基礎数理の総合的研究

この総合研究は、基礎数理の研究に関わる長期計画の一部であります。数学の学際的研究をより活発にするため、又、我国の数学者によりすぐれた研究成果を、迅速に海外に知らしめ、国際交流の実をあげるためのものです。そのために、大別して、次の3つを実行いたしました。(1)我が国の基礎数理の研究で最も活発な分野で、研究集会を定期的年1回、2年開催する。この3年間に取り上げた分野には、低次元トポロジ-、微分幾何(アインシュタイン・ケ-ラ-幾何)と偏微分方程式(モ-ジュ・ア-ペ-ル型方程式など)、複素解析、数諭とガロア理諭的幾何、数理物理(共形場理諭、統計物理の可解模型)、散乱理諭などがある。さらに、国際的な報告集“Advanced Studies in Pure Mathematics,紀伊國屋書店ーAcademic Press"を発刊しとその成果を発表する。(2)重要な研究を進行中の研究者を、その研究にとって最も適切であると思われる研究機関に派遣して活動を促進する。(3)1990年8月京都で行われた国際数学者会議、及び同時に行われた数学の種々の国際会議に向けて最も成果をあげるための内外の研究交流を促す。ややもすれば、各分野にこもりがちな基礎数理の研究を広い基盤に立ち、活性化していくこと、又、その成果を迅速に発表し、その結果、海外の研究者からの注目と称賛をあびるに到らせることてで、寄与出来たのではないかと思います。今後は、このような成果の上に立って基礎数理センタ-とは独立の活動として研究交流、出版などを小田忠雄氏(東北大学理学部・教授)、砂田利一氏(東京大学理学部・教授)らが中心となって継続していく予定です。1.「不変式と幾何-その諸問題と最近の成果」(企画者、梅村浩(熊大)、向井茂(名大))について、1988年7月4日より7月6日まで名大において研究会を行なった。2.「Zeta関数の極と零点」(企画者、黒川信重(東工大)、砂田利一(名大))について、1988年12月19日より12月21日まで名大において研究会を行なった。5.国内の数学の各種研究会に参加のため、名大、京大、東大などに所属する数人の研究者の旅費を援助した。1.「空間のゼ-タ関数」についての研究集会(企画者・砂田利一(名大)、黒川信重(東工大))が12月18日12月19日まで、東工大において行われた。2.「低次元多様体II」についてのシンポジウム(企画者・森田茂之(東工大)、松本幸夫(東大))が12月18日12月20日まで東大において行われた。3.「確率論と周辺領域」についての研究会(企画者・高橋陽一郎(東大))が1990年1月29日1月31日まで東工大において行われた。1.2については、研究成果の出版を計画している。4.その他、関数解析とその応用についての研究会(東大、学習院大、7月)、組合せ論についての研究討論会(名大、12月)、微分方程式と数理物理についての研究集会(浜名荘、2月)、組合せ論とその周辺の研究集会(京大、3月)に多数の研究分担者および研究協力者が参加した。また、共形場におけるゲ-ジ理論に関連して、若手研究者の研究交流(京大、東北大、名大、広大)を行った。尚、Vols.18,20,21,22については、現在、準備中である。

1.「トポロジ-」ワ-クショップ(企画者・森田茂之(東工大)、松本幸夫(東大))が、1990年7月30日8月2日、九大において行われた。低次元多様体、基本群の構造、力学系の大域的構造などが議論された。2.「Zeta Functions in Geometry」研究集会(企画者・砂田利一(名大)、黒川信重(東工大))が、8月14日8月18日東工大において行われた。閉塞地線の分布、力学系の数論的類似、スペクトル解析などが討論された。3.「Lie群の無限次元表現」研究集会(企画者・大島利雄(東大))が、8月30日9月3日東大において行われた。4.「確率論の周辺III」研究集会(企画者・高橋陽一郎(東大))が、1991年2月4日2月6日名大において行われた。非線型方程式の無限次元解析、数値解析などが確率論の手法で展開された。5.その他、組合せ論研究会(名大、7月)、代数幾何研究会(東京都立大、8月)など、国際数学者会議の前後に、いくつかの小研究会が行われ、多数の研究分担者、及び研究協力者が参加し研究交流があった(京大、名大、東大、九大など)。
本邦における投信資金フローに見られる投資家行動の研究

本研究は、「投資家がどのように投資信託のパフォーマンス実績を評価するのか」について従来よりも詳細な分析を行うものである。今後、公的年金の給付水準の低下が予想される下、自助努力による資産形成の促進は重要な政策課題である。投資信託はそのための金融商品として期待され環境整備も進められているが、その成長は未だ十分とはいえない。そこで、本研究は、投資家行動の理解を深めて、投資信託による資産形成を促すための施策改善に貢献することを目指す。分析は、個別投信毎にパフォーマンスを市場リターンと運用会社固有のものに分解したうえで資金フローとの関係を推定するといった新たなアプローチをとる。
肺低酸素感受機構におけるカリウムチャネルの役割の解明

研究の進行状況は、パッチクランプ法の実験装置のセッティングに多くの時間を費やした。電気生理学による解析のため、実験系のノイズの除去、解析ソフトの使用における、不具合等の調査、調整に時間を要した。また、この実験での肺動脈での低酸素感受機構と同様のメカニズムと考えられる、頸動脈小体での低酸素感受機構に対する自分自身の行った実験結果と照らし合わせることが重要と考えられる。この研究はスウェーデン、カロリンスカ研究所で留学中に行った研究であるが、このため、免疫組織学的に頸動脈小体と肺動脈を同時にカリウムチャネルの抗体を投与し、染色し検索すること、また、RT-PCR法により両者のカリウムチャネルのmRNAを同時に検索することとした。プロトコールの見直しと、現在までの予備実験を含む、過去の実験結果について検討するため、スウェーデン・カロリンスカ研究所を訪問し、研究分担者である山本先生とも議論し、先方の施設でも留学中に使用した、器具、薬剤等を利用し予備実験を行い、問題点を明確にすることができた。これまでの結果の一部を平成16年4月にフランス、パリで開催された世界麻酔学会で発表した。結果として、TASK-1のmRNAを肺動脈血管平滑筋細胞上に同定し、imunohistochemistoryにおいでもこれを細胞膜上と細胞質に同定した。また、電気生理学的にTASK-1のopenerであるhalothaneによってIknは優位に上昇し、blockerであるanandamideによって優位に減少した。今後、この結果を投稿する予定である。平成15年度の研究の進行状況は、パッチクランプ法の実験装置のセッティングに多くの時間を費やすこととなった。電気生理学による解析のため、実験系のノイズの除去、解析ソフトの使用における、不具合等の調査、調整に時間を要しており、さらなる見直しが今後も予想されている。このため、免疫組織学的に頸動脈小体と肺動脈を同時にカリウムチャネルの抗体を投与し、染色し検索すること、また、RT-PCR法により両者のカリウムチャネルのmRNAを同時に検索するための予備実験を行った。プロトコールの見直しと、現在までの予備実験を含む、過去の実験結果について検討するため、スウェーデン・カロリンスカ研究所を訪問し、研究分担者である山本先生とも議論し、先方の施設でも留学中に使用した、器具、薬剤等を利用し予備実験を行い問題点を明確にすることができた。平成16年度の研究の進行状況は、15年度同様、パッチクランプ法の実験装置のセッティングに多くの時間を費やした。
ぶどう膜炎における血液-房水関門の破綻と一酸化窒素合成酵素の関与について

平成7年度の研究によって以下の結果を得た.○L-N2Oは生体投与にて誘導型の一酸化窒素合成酵素をL-NNAは生体投与にて常在型の一酸化窒素合成酵素(NOS)をより効果的に抑制した.○エンドトキシンぶどう膜炎において、L-NNAは細胞の浸潤とたんぱくの前房漏出を著明に抑制した.またその効果は極早期の投与において著しく、6時間後では効果がなかった.○同ぶどう膜炎においてL-N2Oはたんぱく漏出はおさえたが、細胞の浸潤は抑制しなかった.このことからエンドトキシンぶどう膜炎の発症には、ごく早期に常在型NOSが(血管内皮において)関与している可能性が示唆された.平成7年度の研究によって以下の結果を得た.○L-N2Oは生体投与にて誘導型の一酸化窒素合成酵素をL-NNAは生体投与にて常在型の一酸化窒素合成酵素(NOS)をより効果的に抑制した.○エンドトキシンぶどう膜炎において、L-NNAは細胞の浸潤とたんぱくの前房漏出を著明に抑制した.またその効果は極早期の投与において著しく、6時間後では効果がなかった.○同ぶどう膜炎においてL-N2Oはたんぱく漏出はおさえたが、細胞の浸潤は抑制しなかった.このことからエンドトキシンぶどう膜炎の発症には、ごく早期に常在型NOSが(血管内皮において)関与している可能性が示唆された.
バルク金属ガラスの高精度微細成形

1.Zr基金属ガラスの結晶化過程の測定(担当:秦)Zr基金属ガラスのバルク材を用いて引張試験を行い,ひずみおよび引張速度による結晶化度の違いをX線回折により測定した.測定の結果,ひずみによる結晶化の促進が確認され,引張速度によっても結晶化の速度が影響されることを確認し,さらに引張速度によっても,結晶化速度が変化する可能性を確認した.2.結晶化防止・抑制方法の検討(担当:秦)上記の実験結果を基に,Zr基金属ガラスの引張加工における結晶化を防止するためには,過冷却液体域の高温側(結晶化開始温度側)ですばやく変形させることが有効である事を,実験的に明らかとした.3.高精度,極細径のマイクロプローブの試作(担当:秦)試験温度733K,ひずみ速度2.O×10^<-1>s^<-1>において,最大ひずみ1, 700%を達成した.また,試験温度723K,ひずみ速度3.75×10^<-1>s^<-1>において,最小破断径27μmを達成した.さらに,あらかじめ機械加工およびエッチング加工により貫通穴を開けた試験片を引張加工することで,最小径50μm,長さ40mmのノズル形状の製作に成功した.また,ひずみ速度感受性指数m=1のニュートン粘性流動は,全ての試験温度において観察された.特にニュートン粘性流動は10^<-2>s^<-1>以上のひずみ速度領域で観察され,理想的な高速超塑性であることが明らかとなった.4.研究のまとめ.(担当:全員)研究結果を総括し,今後の課題を検討した結果,引張時に発生する流動痕跡やボイドの低減が必要であることが明らかとなった.1.Zr基金属ガラスの結晶化過程の測定(担当:秦)Zr基金属ガラスのバルク材を用いて引張試験を行い,ひずみおよび引張速度による結晶化度の違いをX線回折により測定した.測定の結果,ひずみによる結晶化の促進が確認され,引張速度によっても結晶化の速度が影響されることを確認し,さらに引張速度によっても,結晶化速度が変化する可能性を確認した.2.結晶化防止・抑制方法の検討(担当:秦)上記の実験結果を基に,Zr基金属ガラスの引張加工における結晶化を防止するためには,過冷却液体域の高温側(結晶化開始温度側)ですばやく変形させることが有効である事を,実験的に明らかとした.3.高精度,極細径のマイクロプローブの試作(担当:秦)試験温度733K,ひずみ速度2.O×10^<-1>s^<-1>において,最大ひずみ1, 700%を達成した.また,試験温度723K,ひずみ速度3.75×10^<-1>s^<-1>において,最小破断径27μmを達成した.さらに,あらかじめ機械加工およびエッチング加工により貫通穴を開けた試験片を引張加工することで,最小径50μm,長さ40mmのノズル形状の製作に成功した.また,ひずみ速度感受性指数m=1のニュートン粘性流動は,全ての試験温度において観察された.特にニュートン粘性流動は10^<-2>s^<-1>以上のひずみ速度領域で観察され,理想的な高速超塑性であることが明らかとなった.4.研究のまとめ.(担当:全員)研究結果を総括し,今後の課題を検討した結果,引張時に発生する流動痕跡やボイドの低減が必要であることが明らかとなった.
テオティワカン遺跡のＣＧ復元に向けた表面テクスチャおよび形状解析

本研究では、リアリティの高い三次元コンピュータグラフィックスで遺跡を再現するために、形状データとテクスチャデータの準備を行った。そのためにまず遺跡建造物の計測および壁画資料データの収集を行うことで、画像修復の対象となる壁面の様々な条件を明らかにし、テクスチャの境界における整合性を保ったCG合成を可能とした。また、欠損した壁画の適応的内挿についての検討を行い、専門家によって作成されたトレース図を利用することで壁画作成当時の様子として画像修復する方法を実現した。考古学者らは仮説の検証や新たな推論を展開するために、遺構や遺物の製造当時の姿をCADデータとしてではなく、リアリティの高い三次元コンピュータグラフィックス(CG)で観察できることを望んでいる。そこで、本研究では特にメキシコテオティワカン遺跡の構造や様々な壁画に焦点をあて、制約が少なく従来よりも手軽に情報を蓄積できる方法を確立することを目的としている。そのために本年度はこれまでの考古学的調査に基づいたCAD情報をもとにCGによる三次元モデリングを進めるとともに、愛知県立大学多文化共生研究所の杉山三郎特任教授らと協力して、月のピラミッドや周辺の神殿の壁面やケツァルパパロトルの神殿内部にある壁画についての現地調査を行った。さらにその結果に基づいて欠損画像の修復方法を検討し、そのテクスチャ生成作業に着手した。月のピラミッドや周辺の神殿の撮影計測および壁画資料データの収集を行うことで、修復やテクスチャ作成の対象となる壁面についての様々な条件が明らかになり、大規模テクスチャの境界における整合性や欠損いた壁画の適応的内挿についての検討を始められるようになった。いくつかの方法により、修復された壁画から創建当時のテクスチャ画像を合成する方法を実現し、数種類の遺壁に適用した。現在はその結果を考古学者に評価してもらっている。しかしながら研究の採択が第4四半期と遅かったため、学会発表などその研究成果を出すまでには至らなかった。今後はこれまでに得られた研究成果を順次発表していくとともにテクスチャ合成の完成度を高めることに努める予定である。そのために本年度はこれまでの考古学的調査に基づいたCAD情報をもとにCGによる三次元モデリングを継続して行っている。また,私が注目する月のピラミッドをはじめ遺跡の大部分は時間の経過や破壊された結果,現在の建築物は考古学的に復元されたレプリカである.その壁表面は建造当時のような漆喰ではなく石肌が出ている状態で,もはやそこから直接に建造当時のテクスチャ情報を得ることは困難となっている.また,遺跡内に存在する動物や模様が描かれた壁画についても上記と同様の理由で一部分が欠けてしまっていたり所々罅が入っており,そのままテクスチャマッピングしても当時の遺跡の状態を復元したとは言えない.そこで本研究では,修復士によって修復された壁画の色情報から創建当時の各種壁面および壁画のテクスチャ画像を合成する方法、画像の欠損領域の修復方法について検証し、数種類の遺壁に試験的に適用してその結果を評価した。遺構や遺物の製造当時の姿は地道な測量作業および古文書などの解析に基づいてをCADデータとして創建当時の状態を推測・作図されている。また、壁画についても修復士による修繕作業が行われている。しかしながら、遺跡の規模の大きさやその劣化状態の悪さなどから、考古学者らは仮説の検証や新たな推論を展開するためにも、リアリティの高い三次元コンピュータグラフィックス(CG)で観察できることを望んでいる。そこで、本研究では特にメキシコテオティワカン遺跡の構造や様々な壁画に焦点をあて、制約が少なく従来よりも手軽に情報を蓄積・可視化できる方法を確立することを目的としている。そのために本年度も昨年度に引き続きこれまでの考古学的調査に基づいたCAD情報をもとにCGによる三次元モデリングを継続して行った。また、遺跡の壁面および壁画については全てが修復されているわけではないので、CGとして遺跡を再現するために必要な見えの情報は劣化した別の壁面サンプルの情報から電子的に修復して利用することとした。本研究で注目する月のピラミッドをはじめ遺跡の大部分の壁表面は建造当時のような漆喰ではなく石肌が出ている状態で、もはやそこから直接に建造当時のテクスチャ情報を得ることは困難となっている。また、遺跡内に存在する動物や模様が描かれた壁画についても上記と同様の理由で一部分が欠けてしまったいたり所々罅が入っており、そのままテクスチャマッピングしても当時の遺跡の状態を復元したとは言えない。そこで本研究では、修復士によって修復された壁画の色情報から創建当時の各種壁面および壁画のテクスチャ画像を合成する方法、画像の欠損領域の修復方法について検証し、数種類の遺壁に試験的に適用してその結果を評価した。

そこで、本研究では特にメキシコテオティワカン遺跡の構造や様々な壁画に焦点をあて、制約が少なく従来よりも手軽に情報を蓄積できる方法を確立することを目的としている。そのために本年度もこれまでの考古学的調査に基づいたCAD情報をもとにCGによる三次元モデリングを継続して行っていた。また,私が注目する月のピラミッドをはじめ遺跡の大部分は時間の経過や破壊によってされた結果,現在の建築物は考古学的に復元されたレプリカである.その壁表面は建造当時のような漆喰ではなく石肌が出ている状態で,もはやそこから直接に建造当時のテクスチャ情報を得ることは困難となっている.また,遺跡内に存在する動物や模様が描かれた壁画についても上記と同様の理由で一部分が欠けてしまったいたり所々罅が入っており,そのままテクスチャマッピングしても当時の遺跡の状態を復元したとは言えない.そこで本研究では,修復士によって修復された壁画の色情報から創建当時の各種壁面および壁画のテクスチャ画像を合成する方法、画像の欠損領域の修復方法を確立してきた。本年度はその精度向上に加えて、数種類の遺壁に試験的に適用してその結果について専門家から評価を受けるなどして検証してきた。また、その成果を次年度の国際会議17th International Conference on Knowledge-Based and Intelligent Information & Engineering Systemsで発表するべく論文を投稿した。壁画の作成時代や場所・内容によって使用された顔料や塗り方に様々な種類があることがわかり、その解析および手法の適用方法について検討が必要となった。そのため当初の計画よりも検討項目が増えるとともに、想定していた手法に一部変更を余儀なくされたが概ね順調に進展している。25年度が最終年度であるため、記入しない。本年度の研究実施計画に記載したとおり、本研究での壁画画像の調査やその修復実験を通して提案手法の有効性を確認し、その研究成果を国際会議へ投稿することができた。しかしながら、月の広場についてのCADデータが膨大であるため、当初の見込みとは異なり、CADデータに基づく三次元CGでのモデリング作業の全てを完了することができなかった。計画に変更はない。ただし、これまで研究成果を発表することがなかなか行えなかったので、今後は順次学会などで発表していくことを計画するとともにテクスチャ合成の完成度を高めることに努める予定である。.25年度が最終年度であるため、記入しない。計画に変更はない。ただし、これまで研究成果を発表することがなかなか行えなかったので、今後は順次学会などで発表していくことを計画する。さらに、テクスチャ合成の完成度を高めるために使える情報はないか調査を続ける予定である。
イオン輸送体タンパク質の巨大ベシクルへの再構成とその応用

筋小胞体カルシウムポンプを巨大ベシクルに組み込んだ再構成膜系を構築し,ポンプ活性を電気生理学的に測定して,イオンポンプにおけるエネルギー変換機構の熱力学的研究に対する再構成系の有用性を評価することを目的とした.1.ポンプ活性の測定は膜を横切る電流として測定するので,まず,カルシウムポンプの起電性の確認を,ポンプが活動した時のベシクル内容積の変化の測定により行った.ストップト・フロー-ESR装置及びスピンラベル剤TEMPONEと常磁性金属イオンとの組合せを用いて, TEMPONEのベシクル内外への分配を測定することにより,筋小胞体ベシクル内容積を求めた.グルコン酸カリウム溶液中,内容積は約10%減少した.ポンプが起電性であるならば,電荷を補償するために移動しうるイオンは,この条件下ではK^+イオンのみである. Ca^<2+>が1個入るとK^+が2個出て行くものとして,ベシクル内容積変化を見積ると,実験結果とよく一致した.2.巨大ベシクルへの再構成-筋小胞体及びバクテリオロドプシンをリン脂質と共に可容化・透析法又は超音波処理法により再構成し,凍結・融解法により巨大化させた系について,小胞内容積の測定とイオン取込み活性の測定を行った.イオンに対する障壁能をもった巨大ベシクルが生成していることが示された.3.生体膜小胞を,外在性脂質を加えることなく,そのまゝ融合させる技術の開発-生体膜小胞をプロテアーゼ処理した後に凍結・融解処理を施して巨大ベシクル(単層のように見える)が得られることが見出された.この方法を筋小胞体に適用して,直径10μm程度の巨大化筋小胞体ベシクルの生成を光学顕微鏡下に認めた.外部Ca^<2+>電極による測定から,この標品はCa^<2+>取り込み活性を有することも確認した.今後は微小Ca^<2+>電極を用いて,巨大ベシクル内部のCa^<2+>イオン濃度を直接測定する試みを行ない,所期の目的を達する見込みである.筋小胞体カルシウムポンプを巨大ベシクルに組み込んだ再構成膜系を構築し,ポンプ活性を電気生理学的に測定して,イオンポンプにおけるエネルギー変換機構の熱力学的研究に対する再構成系の有用性を評価することを目的とした.1.ポンプ活性の測定は膜を横切る電流として測定するので,まず,カルシウムポンプの起電性の確認を,ポンプが活動した時のベシクル内容積の変化の測定により行った.ストップト・フロー-ESR装置及びスピンラベル剤TEMPONEと常磁性金属イオンとの組合せを用いて, TEMPONEのベシクル内外への分配を測定することにより,筋小胞体ベシクル内容積を求めた.グルコン酸カリウム溶液中,内容積は約10%減少した.ポンプが起電性であるならば,電荷を補償するために移動しうるイオンは,この条件下ではK^+イオンのみである. Ca^<2+>が1個入るとK^+が2個出て行くものとして,ベシクル内容積変化を見積ると,実験結果とよく一致した.2.巨大ベシクルへの再構成-筋小胞体及びバクテリオロドプシンをリン脂質と共に可容化・透析法又は超音波処理法により再構成し,凍結・融解法により巨大化させた系について,小胞内容積の測定とイオン取込み活性の測定を行った.イオンに対する障壁能をもった巨大ベシクルが生成していることが示された.3.生体膜小胞を,外在性脂質を加えることなく,そのまゝ融合させる技術の開発-生体膜小胞をプロテアーゼ処理した後に凍結・融解処理を施して巨大ベシクル(単層のように見える)が得られることが見出された.この方法を筋小胞体に適用して,直径10μm程度の巨大化筋小胞体ベシクルの生成を光学顕微鏡下に認めた.外部Ca^<2+>電極による測定から,この標品はCa^<2+>取り込み活性を有することも確認した.今後は微小Ca^<2+>電極を用いて,巨大ベシクル内部のCa^<2+>イオン濃度を直接測定する試みを行ない,所期の目的を達する見込みである.
脊椎動物の中枢神経系の前後軸形成を制御するWnt経路の標的遺伝子の探索と解析

昨年度までのモデル生物を用いた研究から,2つの転写因子Otx2及びSox2が協調的に作用し,Rax遺伝子の発現を正に制御するという機構が明らかになった。Otx2,Sox2及びRaxは全て,人間の重篤な眼の形成不全である無眼球症の原因遺伝子であり,これらのタンパク質とそれらが収斂するシス制御配列が高度に保存されていることから,本研究で明らかとなった転写制御プログラムは,ヒトの無眼球症の原因となっている可能性が考えられる。転写プログラムを上流で制御するOtx2及びSox2タンパク質は眼だけでなく,脳の原基においても共に発現している。また,これらの遺伝子における変異はヒトの脳の機能へ影響することから,同定した転写プログラムは眼だけでなく,脳の発生をも支配している可能性が考えられた。そこで,哺乳類の脳神経発生系をin vitroで構築し,転写プログラムの包括的な解析を行った。具体的には,マウスの胚性幹細胞を高効率に神経へと分化させたのちに,薬剤誘導を用いてOtx2とSox2の共発現状態を実現した。そして,遺伝子発現の変化をマウス全ゲノムマイクロアレイによって包括的に測定し,統計的に解析した。経験ベイズモデルを用いた解析の結果,数多くの遺伝子の発現がOtx2-Sox2に制御されていることが見出され,さらにこれら変動遺伝子は有意に脳に関する遺伝子オントロジーを有していた。以上のように,同定した転写プログラムを哺乳類in vitro分化系と包括的解析により拡張することに成功したと言える。本研究から,中枢神経系の発生を制御するWntシグナル伝達系の標的遺伝子同士が密接に関係しあっていること,またその関係が種を超えて保存されていることが明らかになり,細胞外からの情報入力と細胞内での情報調節による神経発生支配が見出された。研究計画において、初年度に予定していたことの中心的テーマとなっていたのは、脊椎動物において高度に保存されたホメオボックス転写因子Rx1の発現制御を支配するシス制御領域の同定と、そのシス制御領域に結合するトランス因子の同定であった。私は、脊椎動物問でのゲノム比較を行うことにより、非コード領域であるにもかかわらず、高度に保存された数百塩基対の配列(CNS1)がRx1の転写開始点の上流に存在していることを発見した。CNS1のシス制御活性を調査すべく、ツメガエルトランスジェニック胚の作製及び、ルシフェラーゼレポーターアッセイを行ったところ、CNS1が転写発現量を調節するシス制御活性を有することが明らかとなった。CNS1のなかでも、特に保存性の高い35塩基対の配列(pt ; pentadecamer)について、既知の転写因子の結合配列のモチーフ検索を行ったところ、二種類の神経関連転写因子の結合配列が含まれていることがわかった。さらに、ゲルシフトアッセイにより、これらの二種類の転写因子とptとのin vitro相互作用が明らかとなった。以上の結果により、Rx1の発現を制御するシス制御配列を同定し、さらにその領域に相互作用することで発現調節を行うトランス因子の候補タンパク質を見いだすことができた。次年度においては、これらの制御についての、よりin vivoの検定を行う予定である。研究計画における、第二年度の中心的テーマは、第一年度に同定したシス制御配列(Rax CNS1)とトランス作動性因子(Otx2及びSox2)のin vivoの機能の調査であった。私は、Otx2及びSox2がRaxCNS1にin vivoで結合するかを調べるため、ツメガエル胚を用いてクロマチン免疫沈降を試みた。まず、第一段階として、エピトープタグを付加したOtx2及びSox2を発現するmRNAをツメガエル受精卵に微量注入し、胞胚後期まで培養したのちに、タグに対する抗体を用いてクロマチン免疫沈降を行い、PCR解析を行った。その結果、PCRによりRax CNS1が特異的に増幅されたことから、過剰発現したOtx2及びSox2がRax CNS1こin vivoで結合しうることが明らかになった。さらに、内在性のOtx2及びSox2がRax CNS1に結合しているかを調べるため、過剰発現を行わずに、Otx2およびSox2に対する抗体を用いて、クロマチン免疫沈降を行った。その結果、神経胚において、内在性のOtx2及びSox2がRax CNS1に特異的に結合していることが明らかとなった。また私は、トランス作動性因子Sox2のin vivoの機能を調査するため、支配的抑制変異Sox2をツメガエル胚に発現させた。支配的抑制変異Sox2のmRNAをツメガエル胚に微量注入すると、神経胚において、Raxの発現が低下することが観察された。また、アニマルキャップを用いたRT-PCRにおいて、Otx2の過剰発現によってRaxの発現は誘導されるが、その発現誘導は、支配的抑制Sox2の微量注入によって抑制されたことから、in vivoにおけるRaxの発現には、Otx2とSox2の両方が必要であることが示唆された。

また,これらの遺伝子における変異はヒトの脳の機能へ影響することから,同定した転写プログラムは眼だけでなく,脳の発生をも支配している可能性が考えられた。そこで,哺乳類の脳神経発生系をin vitroで構築し,転写プログラムの包括的な解析を行った。具体的には,マウスの胚性幹細胞を高効率に神経へと分化させたのちに,薬剤誘導を用いてOtx2とSox2の共発現状態を実現した。そして,遺伝子発現の変化をマウス全ゲノムマイクロアレイによって包括的に測定し,統計的に解析した。経験ベイズモデルを用いた解析の結果,数多くの遺伝子の発現がOtx2-Sox2に制御されていることが見出され,さらにこれら変動遺伝子は有意に脳に関する遺伝子オントロジーを有していた。以上のように,同定した転写プログラムを哺乳類in vitro分化系と包括的解析により拡張することに成功したと言える。本研究から,中枢神経系の発生を制御するWntシグナル伝達系の標的遺伝子同士が密接に関係しあっていること,またその関係が種を超えて保存されていることが明らかになり,細胞外からの情報入力と細胞内での情報調節による神経発生支配が見出された。
パルミトイル化によるタンパク質機能調節と病態の分子機構

タンパク質の翻訳後修飾の1つに脂質修飾がある。脂質修飾の中でも多くのタンパク質に見られるものとして,パルミトイル化,ミリストイル化,プレニル化(ファルネシル化とゲラニルゲラニル化),GPIアンカーが挙げられる。我々はこれまで,パルミトイル化を触媒するパルミトイルトランスフェラーゼ(DHHC1-22,24)の解析やスフィンゴシン1-リン酸受容体及び脂肪族アルデヒドデヒドロゲナーゼALDH3B1のパルミトイル化の解析を行ってきた。本研究ではALDH3B1以外のALDH3Bファミリーメンバー(ALDH3B2及びALDH3B3)の脂質修飾の有無とその役割の解析を行った。我々はALDH3Bファミリーメンバーがいずれも長鎖アルデヒドに対して高い活性を示すことを明らかにした。長鎖アルデヒドはスフィンゴ脂質の構成成分である長鎖塩基の代謝過程において産生され,ALDH3A2及びALDH3Bファミリーメンバーが代謝に関与している。我々はALDH3BファミリーメンバーがいずれもC末端のシステイン残基でゲラニルゲラニル化を受けていること,ALDH3B1のみがパルミトイル化も受けていることを見出した。ALDH3Bファミリーメンバーのゲラニルゲラニル化は長鎖アルデヒドに対する活性と膜局在に重要な役割を果たしていた。また,我々はALDH3B1とALDH3B3は細胞膜に局在しており,ALDH3B2は脂肪滴に局在していることを明らかにした。さらに我々はゲラニルゲラニル化以外に重要な残基として,ALDH3B3の細胞膜局在に働くC末端近傍のアルギニン残基,ALDH3B2の脂肪滴局在に働く2つのトリプトファン残基を同定した。26年度が最終年度であるため、記入しない。パルイトイル化はタンパク質のシステイン残基にパルミチン酸が付加する翻訳後修飾の1つである。パルミトイル化を受けるシステイン残基には決まったモチーフがないことから,パルミトイル化修飾の有無は予測が難しいことが多い。パルミトイル化を触媒する酵素はプロテインアシルトランスフェラーゼ(PAT)と呼ばれ,ヒトにはDHHC1-22及びDHHC24の23種が存在する。Gタンパク質共役型受容体(GPCR)の多くは7回目の膜貫通領域直下のシステイン残基でパルミトイル化を受けることが知られているが,その反応を触媒するPATについては不明である。我々はGPCRの中でも,スフィンゴシン1-リン酸受容体S1P1に着目し,最近我々が開発した酵母を用いたアッセイ系を利用して,S1P1のPATの同定を行った。その結果,23種のヒトDHHCタンパク質のうち,DHHC2, 3, 6, 7, 10, 15, 20が活性を示すことが明らかとなった。また,これらのうち,DHHC2, 3, 7, 10, 15, 20は別のスフィンゴシン1-リン酸受容体であるS1P5に対しても活性を示した。これらのDHHCタンパク質はGPCRに共通したPATである可能性が高い。癌遺伝子にコードされるRasのパルミトイル化はRasの細胞膜局在と活性に必要である。我々はRasパルミトイル化の阻害剤の探索を行い,9600種の化合物の中から一次スクリーニングで16個の候補化合物を見いだした。さらに,これらを用いて二次スクリーニングを行った結果,現在3個の候補を得ている。スフィンゴシン1-リン酸の代謝に関わるアルデヒドデヒドロゲナーゼALDH3ファミリーの解析により,ALDH3B1がC末端側でパルミトイル化とプレニル化の脂質修飾を受けることを明らかにした。これらの脂質修飾はALDH3B1の細胞膜局在と長鎖アルデヒドに対する活性に重要であった。

26年度が最終年度であるため、記入しない。交付申請書に記載の項目については研究実績の概要に示した通り,GPCRに対するPATの同定と機能解析,及びパルミトイル化阻害剤の開発共に殆ど全て達成することができた。交付申請書に記載以外の項目としても新たに脂肪族アルデヒドデヒドロゲナーゼALDH3B1がパルミトイル化を受けることを見いだし,細胞内局在,活性に与える影響を明らかにすることができた。GPCRに対するPATの同定と機能解析,パルミトイル化阻害剤の開発に関しては予定通り進んでいるので,それぞれ現在の解析を引き続いて行う。新たに見いだした脂肪族アルデヒドデヒドロゲナーゼの翻訳後修飾に関しては他のALDH3ファミリーに拡大して解析を行う。
障害児と健常児の共生・共習に関する日独の比較教育学的検討

1)ドイツにおける障害児と健常児の共習学習(gemeinsames Lernen)の理論と実践及び制度的対応の実態について,文献と実地視察をとおして明らかにした。ドイツの教育は州の自治権に属し,それぞれの州が独自の教育法と文部省を持ち,障害児教育においても各州ごとに特色がある。したがって,研究は州を単位に行わなければならない。障害児のインテグレーション実施に関してドイツにおいてもっとも注目されている州の一つであるザ-ルランドを取り上げ,詳細に分析して論文として発表した。インテグレーション実施に際しては大学の障害児教育研究室の果たす役割,教員組合の役割が大きいこと,インテグレーションの実施に当たっては条件整備を前提としていること,親の決定権についてはザ-ルランドでは否定しており,申請権の形態をとっていることなどを明らかにした。2)ドイツでは,学校の親の選択権を認めている場合でも,インテグレーションが行われているのは10%程度である。それは,(1)障害児学校は福祉的な機能を持っており,通常の学校に行くとそれがなくなること,(2)親も,条件のないインテグレーションは非教育的であると考えていること,(3)条件整備については,行財政的な制約が大きいこと,(4)実現する場合には,複数担任と学級定数の縮減(20人以内)が基本的なガイドラインになっていること,教師の一人は障害児教育の資格のあるものであること,(5)障害児教育の専門性が制度的に確立していること,専門性のないインテグレーションは考えられていないこと,この点で日本と根本的な違いがあることなどが明らかになった。3)ドイツと日本の障害児教育の比較研究を推進するに当たり,ポツダム大学障害児教育研究室のDr. Salzberg女史との共同研究として日本の障害児教育の現状を分析し,ドイツの研究誌に掲載することになっている。ドイツにおける障害児と健常児の共生・共習、一般にはインテグレーションと呼ばれている教育活動及び理論的探究を、本年度はザ-ルランド州を対象に研究を進めた。主として文献による研究であるが、H7年10月に約一か月間私費にて渡独し、実地の調査も行ない、文献による理論研究の裏づけを行なった。その研究成果は、「特別なニーズ教育」とインテグレーション学会」(SNE学会)の紀要に掲載することになった(3月末発行予定)1)ドイツにおける障害児と健常児の共習学習(gemeinsames Lernan)の理論と実践及び制度的対応の実態について,文献と実地視察をとおして明らかにした。ドイツの教育は州の自治権に属し,それぞれの州が独自の教育法と文部省を持ち,障害児教育においても,各州ごとに特色がある。インテグレーション実施に際しては,大学の障害児教育研究室の果たす役割,教員組合の役割が大きいこと,インテグレーションの実施に当たっては条件整備を前提としていること,親の決定権についてはザ-ルランドでは否定しており,申請権の形態をとっていることなどを明らかにした。それは,(1)障害児学校は福祉的な機能を持っており,通常の学校に行くとそれがなくなること,(2)親も,条件のないインテグレーションは非教育的であると考えていること,(3)条件整備については行財政的な制約が大きいこと,

(4)実現する場合には,複数担任と学級定数の縮減(20人以内)が基本的なガイドラインになっていること,教師の一人は障害児教育の資格のあるものであること,(5)障害児教育の専門性が制度的に確立していること,専門性のないインテグレーションは考えられていないこと,この点で日本と根本的な違いがあることなどが明らかになった。3)ドイツと日本の障害児教育の比較研究を推進するに当たり,ポツダム大学障害児教育研究室のDr.Salzberg女史との共同研究として日本の障害児教育の現状を分析し,ドイツの研究誌に掲載することになっている。
欧米における大学入試問題等の開発・改善に関する国際比較研究

(1)はじめに:大学入学者の選抜ないし入学決定において、客観テスト等の手法により基礎学力を確認し、さらにより深い学力や性格的特性を評価するために論文試験や学力以外の要因の活用を行う方式が、世界的な大勢である。このことは,先行研究で確認されたが(『世界の大学入試』時事通信社,昭61),今回の研究により,これらの大勢は維持されており,各種の試験や評価において,さらに一段と改革や改善が進められていることが解明された。すなわち、米国では大規模な標準テストの内容が改善され、さらにテストの過度の利用がもたらす弊害の反省と改善が公的議論となっている。英・独・仏各国では、資格試験内容の要項ないし基準(シラバス)について、全国的統一ないし調整が図られ、改善が進められている。スペインでは州単位で統一・調整が図られ,また学制改革に応じて大学進学準備教育の内容が再編制された。国際バカロレアにおいても国際関係の教育課程での強調や評価方法の改善が進められている。こうした潮流は,わが国大学入試の改善にも,意義深い鑑となる事態と言えよう。(2)米国調査から:(1)最も大規模に普及している2種の標準テスト(SAT,ACT)に画期的な内容改革が施され,一部に論文テストが採用された。それらの問題作成基準も改善された。(2)高校在学中に大学程度の学力の認定がなされるテスト(AP,PEP)は広く利用される傾向にある。(3)大学入学基準学力の引上げ,その最低水準の公定,高校教育課程基準の改善,全米学力調査,国際学力調査,州間学力比較試行調査など,学力向上のための各種基準の見直しや,効果の広域的測定評価事業が活発に実施されている。(4)「テストと公共政策に関する全米委員会」は昨年報告書を公刊し,テスティングの改革,その公共的責任の強調,間接的評価から直接的評価への視点の転換,授業改善のための妥当性の重視を提唱した。(3)英国調査から:(1)1988年教育改革法は、英国公教育史上画期的な改革をもたらしたが、大学進学に必要な教科目別学力を認定する一般教育証書(GCE)制度も改革され,従来の普通(O)レベルは中等教育一般証書(GCSE)に改められ,また準上級(AS)レベルが新設された。(2)GCSEの授与には,中等学校内での学習活動(コ-スワ-ク)の評価も積極的に採り入れようとしている。(3)ASレベルの運用には多くの議論がされている。(4)GCSEやGCEのシラバスの全国的調整に当たる学校試験評価審議会(SEAC)の活動が注目される。(4)ドイツ調査から:(1)大学入学資格(アビトゥア)試験のシラバスは,1979年に連邦文部大臣会議の協定により西ドイツ全連邦的調整が図られていたが,昨年のドイツ統一の結果,旧東独地域にも適用されることとなった。また,その内容は1989年に改訂され今後約10年は続けられる見込みである。(2)1970年代の改革以後,高等学校最終の2年間の校内成績が,アビトゥア合否判定の一部に使われることとなった。(3)医学部等での入学制限については,入学者選抜方法に議論が多かったが,協定による1986年からの選抜方法では適性テスト等が採用された。こうした方式の運用のため中央学籍配分機関が,学籍配分や選抜を担当している。(5)フランス調査から:(1)大学入学資格(バカロレア)の取得者は次第に増え同年齢層の44%に至った。他方その試験のシラバスは漸次整備されつつある。(2)将来同年齢層の80%までバカロレア取得者を増やそうとする教育省の政策は,その実現性に多くの議論がある。(3)しかし受験者の激増は,この制度の大改革を迫っており,高等学校の内部評価を使う方向が構想されている模様である。(6)スペイン調査から:(1)1983年以来の学制改革は,近く後期中等教育,大学予科教育の段階に及び,大学進学資格試験の内容の改革が日程に上っており,最近数年間実験的試行がなされている。(2)大学進学準備教育のシラバスが,最近次第に整備されつつある。(3)州単位の自治的行政により,これらの改革や整備が進められ,州内を統一する動向である。(4)私立学校側には,政府の教育政策に対する根強い批判がある。(7)国際バカロレア調査から:(1)国際的環境問題の科学,デザイン・テクノロジ-・劇場芸術のコ-ス新設を進めている。

国際バカロレアにおいても国際関係の教育課程での強調や評価方法の改善が進められている。こうした潮流は,わが国大学入試の改善にも,意義深い鑑となる事態と言えよう。(2)米国調査から:(1)最も大規模に普及している2種の標準テスト(SAT,ACT)に画期的な内容改革が施され,一部に論文テストが採用された。それらの問題作成基準も改善された。(2)高校在学中に大学程度の学力の認定がなされるテスト(AP,PEP)は広く利用される傾向にある。(3)大学入学基準学力の引上げ,その最低水準の公定,高校教育課程基準の改善,全米学力調査,国際学力調査,州間学力比較試行調査など,学力向上のための各種基準の見直しや,効果の広域的測定評価事業が活発に実施されている。(4)「テストと公共政策に関する全米委員会」は昨年報告書を公刊し,テスティングの改革,その公共的責任の強調,間接的評価から直接的評価への視点の転換,授業改善のための妥当性の重視を提唱した。(3)英国調査から:(1)1988年教育改革法は、英国公教育史上画期的な改革をもたらしたが、大学進学に必要な教科目別学力を認定する一般教育証書(GCE)制度も改革され,従来の普通(O)レベルは中等教育一般証書(GCSE)に改められ,また準上級(AS)レベルが新設された。(2)GCSEの授与には,中等学校内での学習活動(コ-スワ-ク)の評価も積極的に採り入れようとしている。(3)ASレベルの運用には多くの議論がされている。(4)GCSEやGCEのシラバスの全国的調整に当たる学校試験評価審議会(SEAC)の活動が注目される。(4)ドイツ調査から:(1)大学入学資格(アビトゥア)試験のシラバスは,1979年に連邦文部大臣会議の協定により西ドイツ全連邦的調整が図られていたが,昨年のドイツ統一の結果,旧東独地域にも適用されることとなった。また,その内容は1989年に改訂され今後約10年は続けられる見込みである。(2)1970年代の改革以後,高等学校最終の2年間の校内成績が,アビトゥア合否判定の一部に使われることとなった。(3)医学部等での入学制限については,入学者選抜方法に議論が多かったが,協定による1986年からの選抜方法では適性テスト等が採用された。こうした方式の運用のため中央学籍配分機関が,学籍配分や選抜を担当している。(5)フランス調査から:(1)大学入学資格(バカロレア)の取得者は次第に増え同年齢層の44%に至った。他方その試験のシラバスは漸次整備されつつある。(2)将来同年齢層の80%までバカロレア取得者を増やそうとする教育省の政策は,その実現性に多くの議論がある。(3)しかし受験者の激増は,この制度の大改革を迫っており,高等学校の内部評価を使う方向が構想されている模様である。(6)スペイン調査から:(1)1983年以来の学制改革は,近く後期中等教育,大学予科教育の段階に及び,大学進学資格試験の内容の改革が日程に上っており,最近数年間実験的試行がなされている。(2)大学進学準備教育のシラバスが,最近次第に整備されつつある。(3)州単位の自治的行政により,これらの改革や整備が進められ,州内を統一する動向である。(4)私立学校側には,政府の教育政策に対する根強い批判がある。(7)国際バカロレア調査から:
視床下部摂食中枢神経回路の補償機構と臨界期を探る

我々は視床下部摂食中枢神経回路の補償機構や臨界期の分子機構を明らかし、その破綻によって摂食障害が生じるメカニズムを解明することを目的として研究を進めている。これまでの報告で大脳皮質の発達過程における臨界期可塑性にはGABAニューロンが重要である(Hensch,2005, Nature Rev Neurosci.)(Katagiri H et al,2007, Neuron)ことがわかっている。そこで、我々は視床下部で見られる神経回路の補償機構や臨界期においても、GABAニューロンが関係していると考え、平成30年度は、視床下部摂食中枢の補償機構を制御する神経回路におけるGABAニューロンの機能を探るため遺伝子改変マウスを用いて解析を行った。具体的には、GABAニューロンでGABAを放出するために必須であるvesicular GABAtransporter (VGAT)をfloxed-VGATマウスとNkx2-1-Cre; floxed-VGATマウスを組み合わせ、大脳皮質と視床下部のみ特異的にGABAニューロンのGABA分泌を停止させて解析を行った。その結果、VGAT欠損マウスで認められる口蓋裂や臍帯ヘルニアは生じないにも関わらず、生後2日目には全て死亡することが明らかになった。生後間もない時期には、全てのマウスの胃にミルクが確認できることから、ホモマウスの致死の原因は視床下部のGABAニューロンの機能不全によると考られる。そこで、その原因を探るため生後0日目のNkx2-1-Cre; floxed-VGATホモ/ヘテロマウスの視床下部のRNAを抽出し、次世代シークエンサーを用いて変動する遺伝子を解析した。その結果、"neuron development", "axon guidance"などに関わる分子群に変動が認められた。平成28年4月の熊本地震で研究室が甚大な被害を受け、研究施設や機器の復旧にかなりの時間を費やす必要があった。さらに、地震の影響で、飼育していた遺伝子改変マウスや、実験途中の試料が一部使用不能になってしまったため、研究に遅れが生じた。平成30年度に行った研究では、Nkx2-1-Cre; floxed-VGATマウスが生後2日目に死亡することから、視床下部摂食中枢神経回路にGABAがどのような機能を果たしているか解析することができなかったが、次世代シークエンサーを用いて変動する遺伝子を解析することができたため、視床下部摂食中枢神経回路形成に関与する分子群候補を選別することができた。今後は、変動が認められた遺伝子群と摂食行動の関連や、時期特異的に視床下部のNkx2ー1系譜細胞の一部をGABA分泌不全にできるNkx2-1CreERマウスを用いて、摂食に関わる影響を解析することで、視床下部摂食中枢の臨界期と補償機構の解明を目指すことを視野に入れている。摂食障害は心理的ストレスや環境的要因、遺伝的背景などの複合的な要素により生じるが、その発症メカニズムは明らかになっていない。これまでの研究で、マウスの視床下部摂食中枢の発生発達過程に生じた異常を補う補償機構が存在すること2その補償機構は成体では消失するため臨界期が存在することを示唆されていた。平成28年度は視床下部摂食中枢の神経細胞が減少しているメカニズムを探るために、Nkx2-1creER; R26-floxed-mRFP(Ai9)reporterマウスをかけ合わせ、視床下部における年齢依存的なNkx2-1陽性細胞の分布を解析した。また、摂食中枢の臨界期を同定し、その補償機構に関わる分子群の探索を行うために、Rosa26-floxed-DTAを共同研究先より入手し、Nkx2-1creERと掛け合わせを行っている。このマウスが得られたら、年齢依存的にタモキシフェンを投与することで特定の時期のNkx2-1陽性細胞をDTAによる除去を行う。その後、摂食量や体重変化を解析することで、視床下部摂食中枢の臨界期を同定する予定である。また、タモキシフェン投与群とコントロール群の遺伝子発現の変動をマイクロアレイ解析を行うことで比較して視床下部摂食中枢補償機構に関与する分子群の同定を試みる予定である。さらに、これまでの視床下部の神経回路の研究から、その機能にはGABAニューロンが強く関係していることが示唆されている。現在、Cre依存的にGABAの放出を止めるVGAT (vesicular GABA transporter)floxedマウスを共同研究先から入手したので、Nkx2-1CreERマウスの掛けあわせを行っている。今後は、このマウスを用いて、時期特異的に抑制性神経細胞の機能を抑えることが、補償機構や臨界期に影響をもたらすか解析していく予定である。平成28年度は、研究開始直後の熊本地震の影響で、共同研究先から遺伝子改変マウスを搬入することや、掛け合わせを行うことがしばらく困難な状況であった、研究施設の復旧後は、順調に研究を進めることができたが、1年間の進展具合としては、やや遅れている状況となった。しかしながら、既に研究に用いる予定のマウスは入手し、現在は掛け合わせを進めているため、次年度は順調に研究を進めることができると考えている。拒食症及び過食症の総称である摂食障害は心理的ストレスや環境的要因、遺伝的背景などの複合的な要素により生じる。中枢を原因とする摂食障害は一卵性双生児の発症一致率が高いことや家族集積性の研究から遺伝的な関与が示唆されているが、その発症メカニズムは明らかになっていない。

申請者は、これまでの研究を踏まえ( Sokolowski K, Esumi S et al., 2015,Neuron)、視床下部摂食中枢神経回路の補償機構や臨界期の分子機構を明らかし、その破綻によって摂食障害が生じるメカニズムを解明することを目的として研究を進めている。平成29年度は、視床下部摂食中枢の補償機構を制御する神経回路を探るため、GAD67-CrePR; floxed-VGAT; Rosa26-floxed-tdTomatoマウスや、Nkx2-1-CreER: Rosa26-floxed DTR、Nkx2-1-Cre; floxed-VGAT等を作成しその細胞系譜や、ラベルされた細胞の形態を解析した。残念なことにNkx2-1-Cre; floxed-VGATマウスのホモ型は出産直後に死亡するため詳細な解析を行うことができなかったが、VGATを欠損させたGABAニューロンにおいては軸索や樹状突起の異常が認められた。現在、この形態異常の詳細な解析を進めている。平成28年4月に起きた熊本地震のため、研究に使用するマウスの入手や、掛け合わせが遅れたため、本年度も全体的な研究計画が遅れてしまった。平成30年度は摂食機構の臨界期や補償機構を探るため、上記のマウスにジフテリア毒素や、Mifepristoneを投与することで時間依存的に視床下部神経細胞を不活性化または、除去して解析を進める予定である。これまでの大脳皮質などの臨界期の研究ではGABAニューロンが重要な役割を担っていることがわかっている。また、最近の報告では、視床下部のストレス応答にGABAニューロンの可塑性が強く関係している。そのため、平成29年度は、視床下部摂食中枢の補償機構を制御する神経回路を探るため、視床下部におけるGABAニューロンの発生や機能に着目して研究を進めた。具体的には、視床下部で見られる神経回路の補償機構や臨界期に、GABAニューロンも関係していると考え、視床下部におけるGABAニューロンの機能を探るため、GABAニューロンの最重要な生理機能であるGABAの分泌を不全にし、機能不全に陥ったGABAニューロンの動態の解析を試みた。具体的には、GABAニューロンでGABAを放出するために必須であるvesicular GABAtransporter (VGAT)をfloxed-VGATマウスを用いることで時期特異的に一部の細胞で欠損させて解析を行った。予備的な実験で、Nkx2-1-Cre; floxed-VGATマウスのホモ型は出産直後に死亡することが明らかになったため、GAD67-CrePR; floxed-VGAT; Rosa26- flexed- tdTomatoマウスを用いることで、時期特異的に大脳皮質GABAニューロンの一部を赤色蛍光色素でラベルし、さらにVGATを欠損させたところ、一部の神経細胞において、軸索や樹状突起の異常が認められた。今後は、この形態異常を詳細に解析する予定である。我々は視床下部摂食中枢神経回路の補償機構や臨界期の分子機構を明らかし、その破綻によって摂食障害が生じるメカニズムを解明することを目的として研究を進めている。これまでの報告で大脳皮質の発達過程における臨界期可塑性にはGABAニューロンが重要である(Hensch,2005, Nature Rev Neurosci.)