hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
脳波測定による睡眠・匂いが言語能力向上に及ぼす効果度の解明

研究初年度の平成26年度は、昼寝とWM課題の想起率の関係を大学生を参加者とし行動実験を行った。昼寝が、宣言的記憶強化に有益という先行研究がある(Song et al,2001; Takahashi and Arito, 2000など)。我々は、宣言的記憶に分類される意味記憶で日本語の単語を昼寝群としない群に分け、想起率に差異があるか否かを実験した。参加者はA)昼寝群(研究により昼寝の時間が統一しておらず25分程度が多いので25分とした)B)全くしない群C)昼寝はしないが覚える時間を1分間与えた群の3群に分けた。3群全て刺激語(日本語の3シラブルに統一:おとこ、つくえ等LTMに格納されている9語(GA Miller, 1956:magical 7±2に基づく)の単語に関連がない名詞)を聴覚入力(東京の標準語発音)で、A群は昼寝直後入力通りの順番で単語を用紙に書く。B群は昼寝はなく入力直後に用紙に書く。C群は1分間のmemory session直後に用紙に書くWM課題である。結果は、A群(32名、平均19.8才)は、昼寝後の想起語数は、9語中平均6.38語であった。前日の平均睡眠時間は、6.7時間で睡眠時間と想起率の相関係数は0.05であった。B群(33名、平均19.5才)は、平均5.31語、平均睡眠時間は、5.56時間で上記同様、相関係数は0.31で弱い相関がみられた。C群(31名、平均20.7才)では、平均7.93語で平均睡眠時間は6時間で、相関係数は0.2であった。昼寝した群がしない群より想起語数が約1語多かった。memory sessionをした群はWMの音韻ループ上での繰り返しで長期記憶化した結果、想起語彙が8語近くと考えられる。研究初年度の平成26年度は、昼寝とWorking Memory課題の想起率の関係を大学生を参加者とし行動実験を行った。参加者はA)昼寝群(25分)B)全く昼寝しない群C)昼寝はしないが覚える時間を1分間与えた群の3群に分けた。3群全て刺激語(日本語:おとこ、つくえ等L長期記憶に格納されている9語(GA Miller, 1956:magical number7±2に基づく)の単語に関連がない名詞)を聴覚入力(東京の標準語発音)とした。次に、A群は昼寝直後入力通りの順番で単語を用紙に書く。前日の平均睡眠時間は、6.7時間で、睡眠時間と想起率の相関係数は0.05であった。B群(33名、平均19.5才)は、平均5.31語、平均睡眠時間は、5.56時間で、相関係数は0.31で弱い相関がみられた。memory sessionをした群はWMの音韻ループ上での繰り返しで長期記憶化した結果、想起語彙が8語近くになったと考えられる。今年度は、昼寝時に脳波でNREM時及び、REM時に言語記憶をさせ、また睡眠か交感、副交感神経優位かどうかをも計測し、想起率との関連を綿密に精査する。

B群(33名、平均19.5才)は、平均5.31語、平均睡眠時間は、5.56時間で上記同様、相関係数は0.31で弱い相関がみられた。C群(31名、平均20.7才)では、平均7.93語で平均睡眠時間は6時間で、相関係数は0.2であった。昼寝した群がしない群より想起語数が約1語多かった。memory sessionをした群はWMの音韻ループ上での繰り返しで長期記憶化した結果、想起語彙が8語近くと考えられる。先行研究に基づき、行動実験で、昼寝が宣言的記憶の中の意味記憶においても、記憶及び、想起率が昼寝をしない群より優位であったことを確認できた。また、Working Memory上の音韻ループで繰り返しを行うと、Millerのmagical number±2を支持できる行動実験が実現できた。その一方で、繰り返しを行わず、また昼寝も取らないと、Cowan(2001)のmagical number 4の近似値を今回の行動実験で得ることができ、有意義な研究結果を得られた。今後は、昼寝をしている時の想起率がよい場合と逆の場合の脳波計を用いて、NREM及びREM睡眠の成分分析及び、自律神経がいかなる状態で、記憶、想起率に奏功するのかを脳科学的に行う。また、今年度は人工言語の刺激を作成し、この研究の最終目的の外国語教育に応用可能な理想的な昼寝の形態を探ることとする。平成26年度に、脳波計備品を購入し、睡眠と匂いに関する脳波測定を行う予定であった。しかし、脳波計のheadcapとtrigger moduleシステムの製作に遅れが生じてしまったため、購入、納入ができなくなってしまった。そのため、平成26年度の研究計画を若干変更し、昼寝とworking memory課題の想起率との関連を調べた。よって、平成26年度末に未使用額が生じ、平成27年度使用額も発生した。平成27年度に、脳機能イメージング測定を脳波計により行うことにし、使用計画としては、脳波計のheadcapとtrigger moduleシステムの備品購入にあてることにしたい。
学校教育場面における社会的絆の形成と回復をめざす支援の検討

本研究は学校適応や人との関わりに困難を抱える生徒への教育場面での支援を行い、人との安心できる関係づくりを進め、効果を実証することを目的とした。Hirschiの社会的絆理論に着目し、絆が生徒の学校適応、対人関係の変容と回復に与える影響を検討した。中学生を対象に社会的絆尺度の調査を行った結果、社会的絆は教師・友人・家族への愛着、巻き込み、規範から成り、愛着と巻き込みは学校適応、対人的構え、信頼感に有意な正の影響を及ぼしていた。社会的絆得点が低い生徒は対人関係に傷つき体験を持ち、学校を休みたいと思っていた。生徒への支援とつながりづくりから支援の有効性、関係者の連携、教育環境の重要性が示唆された。現代社会は子どもの環境が大きく変化し人と人とのつながりの希薄化が指摘される。学校ストレス、不登校、居場所等の研究から子どもにとって人との関わりは大きなストレスであり、対人関係の回避、不安定、未発達、攻撃性など対人関係の問題を抱える生徒は決して少なくない。本研究は、学校教育において人とうまく関われない、関わりを避ける、対人関係において様ざまな傷つき体験を持つ、対人トラブルが絶えないなどの生徒への支援を通して、人とのつながりが実感でき、他者を信頼し、安心できる関係づくりをどう進めたらよいかを検討し、その効果を実証することを目的とする。生徒への支援においては、学校教育における教師と生徒、生徒と生徒、生徒と支援者間に形成される「社会的絆」という関係性に着目し、社会的絆が生徒の学校適応、対人関係の変容と回復に与える影響について検討することを目的とする。平成25年度は主に先行研究の検討を行った。その結果、1学校教育場面での社会的絆については先行研究があまり行われていない、2社会的絆は元々Hirschi(1969)の非行に関する社会学的理論として展開されており非行の理論的枠組みとして用いられているものが多い、3愛着や基本的信頼感、親子関係と関連することが指摘されている、4関連要因として学業成績、課外活動、性格特性(協調性・共感性・依存性)などがあげられる、5先行研究(高木・戸口, 2006)では大学生を対象に社会的絆の構造が検討され、情緒、否定・不安定、自然発生・安定性、繋縛性が明らかにされているが、学校教育場面での社会的絆の内容の検討、形成と回復の過程について検討されているものはあまり見られず中高生対象の研究はほとんど見られない、などが明らかとなった。以上より、今後は中高生を対象に学校教育場面での社会的絆の内容の検討、生徒への支援を通した形成と回復プロセスの解明を行う予定である。本年度の目的は、生徒にとっての社会的絆を明らかにし、関連要因(愛着や適応)との関係を検討すること、学校教育場面の人間関係において傷つき体験を持つ、人との関わりを避ける、人とうまく関われない等、支援が必要な生徒に個別的支援を実施し、人とのつながりが実感でき、安心できる関係づくりを進めその効果を検証すること、であった。この目的の下、第一に中学生102名、大学生113名を対象として社会的絆に関する調査を実施した。調査の結果、絆のイメージは1学校や部活、関係性、時間など「絆の成立する場と時間」、2ポジティブ・ネガティブ、連帯など「絆の性質・意識」、3思いやり・尊敬・安心など「絆に伴う情緒」、4団結・協力・助け合いなど「絆の有り様」などがあり、友人・仲間・家族・教師等の人間関係、情緒、学校・部活などが成立する場、団結・協力などの行動とも結びつくことが示された。人との絆の象徴としての「大切な物」の存在、意味も検討された。第二に、学校教育場面における絆形成の支援を行った。具体的には高校における生徒への個別的支援を実施した。生徒とのつながりを作る関わり方として、1生徒の背景への考慮、2共感、傾聴、生徒中心的関わり、3生徒の新たな面、ポジティブな面への気づき、3目的を見つけ共に向かうこと、などが明らかになった。生徒への支援を通して支援を行う学生にも変化が生じ、心理的支援の重要性や学生自身の気づき、学生の進路や目標の変容ももたらすことが明らかになった。次に、中学校における生徒が様ざまな悩みを抱えたクラスへの社会的絆づくりを目的とした集団的支援を実施し、集団に対する絆作りの介入実践を行った。これらの調査による尺度の検討と個別・集団への支援の実践を通し、今後は、尺度を用いて支援の効果を明らかにすること、二次的、三次的支援サービスだけでなく一次的支援の効果の実証が求められる。今年度は研究計画に基づき3つの研究を実施した。第1にこれまでの研究成果を踏まえ社会的絆尺度の作成と検討を行い,第2に社会的絆と関連要因との関連性を検討した。第3に社会的絆形成を目的とし,学校教育現場での人間関係づくり,生徒への支援を行い,その効果を検討した。第1と第2の研究では,中学生905名(男子447名,女子458名)を対象に社会的絆尺度,学校適応感尺度,信頼感尺度,親への愛着尺度,を実施した。社会的絆を因子分析した結果,「教師への愛着」「友人への愛着」「家族への愛着」「巻き込み」「規範意識」の5つの因子が抽出され,これらは学年と性で差が認められた。教師への愛着は1年生が2年生より高く,友人への愛着,家族への愛着では男子より女子が高く,学年が上がるほど得点は下がっていた。

規範意識は3年生が最も低く,女子より男子の方が高かった。社会的絆は,学校適応感,信頼感,親への愛着,友人満足,対人的構えの親和性のいずれとも中程度の有意な正の相関が認められた。重回帰分析の結果,信頼感から社会的絆,社会的絆から対人的構え,学校適応感に有意な正のパスが示された。第3の研究では,中学校1年生の生徒34名(男子19名,女子16名)を対象とし,学校教育現場における社会的絆形成のための働きかけを2週間で3セッション,それぞれ40分ずつ実施した。その結果「つながりが感じられる」と答えた生徒はそうでない生徒に比べて学校適応もよく,仲間から受け入れられていると感じ仲間とのサポートのやりとりを有意に多く行っていることが明らかとなった。中学生にとって社会的絆は,学校生活における適応や仲間との関係の形成・維持において重要な要因であることが確認された。今後は絆の回復,絆を感じられない生徒の支援についてさらに検討を進める必要がある。本研究の研究計画のうち「社会的絆」尺度の調査実施が遅れたため,27年度はこの調査実施と分析を中心に進めた。調査の分析結果から,一部,予測と異なる結果が出たことに伴い,信頼性を検証する必要が生じたため一部の調査(再調査)を年度後半に実施し,結果のまとめに時間をかける必要が生じた。このため,現在さらに結果を分析中で,当初の調査実施計画は概ね年度内に終えることができたが,研究全体のまとめを含め一部来年度に持ち越すことになった。本研究は学校適応や人との関わりに困難を抱える生徒への教育場面での支援を行い、人との安心できる関係づくりを進め、効果を実証することを目的とした。Hirschiの社会的絆理論に着目し、絆が生徒の学校適応、対人関係の変容と回復に与える影響を検討した。中学生を対象に社会的絆尺度の調査を行った結果、社会的絆は教師・友人・家族への愛着、巻き込み、規範から成り、愛着と巻き込みは学校適応、対人的構え、信頼感に有意な正の影響を及ぼしていた。社会的絆得点が低い生徒は対人関係に傷つき体験を持ち、学校を休みたいと思っていた。生徒への支援とつながりづくりから支援の有効性、関係者の連携、教育環境の重要性が示唆された。本年度は,これまでの社会的絆の尺度作成,中学校,高校での生徒への学校生活支援を通した社会的絆形成の支援を行い,その効果を検証することを目的とし,研究全体をまとめ報告した。中学生944名を対象として「社会的絆」尺度の検討を行い,社会的絆は1教師への愛着,2友人への愛着,3家族への愛着,4巻き込み,5規範観念,の5因子が抽出された。次に社会的絆と学校適応感,対人的構え,信頼感,親への安心・依存,友人関係満足との関連を検討した。社会的絆はほとんどの尺度と中程度の有意な相関を示し,特に学校適応,対人的構えの親和性,信頼感,親への愛着,友人関係満足との相関が高かった。また重回帰の結果は,規範観念を除いて学校適応感に有意なパスが示され,特に居心地の良さの感覚,課題・目標の存在への強い影響が示された。クラスター分析の結果から,生徒は,すべての下位尺度が高いグループ,低いグループ,規範だけ低いグループ,規範だけ高いグループ,友人への愛着だけ高いグループの5つに分かれ,各グループはそれぞれの特徴的に学校適応と関連していた。中学校での生徒支援(ピアサポート)では,他者とのつながりがうまく持てない生徒に支援の効果が示され,つながりが実感できる生徒には学校適応に変容が示された。
白血病関連転写因子PU.1のりん酸化・アセチル化による修飾制御と生物学的機能

1.変異PU.1を用いたリン酸化の解析(根岸)リン酸化部位と推定されるセリンをアラニンに変えた発現ベクターを用いて、転写の活性化および抑制化能に及ぼす影響を検索した。その結果、作製した全ての変異体において転写抑制化能は野生型と同等に認められたが、S132/133/148Aではタンパク質の安定性および転写活性化能が野生型より上昇していることが明らかとなった。2.変異PU.1用いたアセチル化の解析(根岸)正常PU.1がin vivoでアセチル化されることを明らかにした。アセチル化の変異ベクターK223/224/244/245/247/248/249R他を作製しO転写の活性化および抑制化能に及ぼす影響と他の転写因子や転写のコファクターとの相互作用を検索した。その結果、(1)アセチル化は、PU.1による転写の活性化には関与しないが、抑制活性に関わること(2)アセチル化の変異によりCBPとの結合は変化しないが、mSin3A・GATA-1との結合能は低下することがわかった。3.変異PU.1がMEL細胞分化・増殖・アポトーシスに及ぼす影響の解析(山田)S132/133/148AおよびK223/224/244/245/247/248/249Rの亜鉛誘導型発現ベクターをMEL細胞に導入し、分化・増殖・アポトーシスに及ぼす影響を調べた。S132/133/148Aでは、正常PU.1で誘導される分化阻害・増殖抑制は正常PU.1と同様に認められ、アポトーシス誘導能はむしろ野生型より充進していた。K223/224/244/245/247/248/249Rでは、分化阻害・増殖抑制・アポトーシスのいずれも誘導されなかった。また、K223/224/244/245/247/248/249Rでは、正常PU.1でアポトーシス誘導時に認められたbcl-2とc-myc遺伝子の発現低下も起こらなかった。以上のことから、PU.1は、(1)アセチル化とリン酸化の両方により修飾制御される(2)PU.1の132/133/148部位のリン酸化は転写活性化能に関与し、アポトーシスに対しては抑制的に働らく(3)PU.1の223/224/244/245/247/248/249のアセチル化は転写抑制活性に関わり、MEL細胞の分化阻害・増殖抑制・アポトーシスに促進的に働らく可能性が示唆された。4.成果の発表(根岸)論文としてまとめ投稿準備中である。

mSin3A(aa1-1219)を1-271,272-680,681-1219の3部位に分けたGST融合タンパク質を作製し、正常PU.1を用いてGST pull down assayを行ったところ、PH2およびPH3を含むaa272-680がmSin3AのPU.1結合部位であることがわかった。2.変異PU.1を用いたPU.1のアセチル化の解析正常PU.1を293T細胞に導入してin vivoでのアセチル化の有無を調べたところ、アセチル化されることが明らかとなった。そこで、アセチル化部位と推測されるリジンをアルギニンに変えたPU.1発現ベクターを3種類作製し、CBP・mSin3Aとの結合、転写の活性化および抑制化能を調べた。その結果、K223/224/244/245/247/248/249Rでは転写の抑制能が消失しており、mSin3Aとの結合も減少していた。以上のことから、PU.1のアセチル化が転写抑制に関与する可能性が示唆された。3.変異PU.1を用いたPU.1のリン酸化の解析正常PU.1を293T細胞に導入してin vivoでのリン酸化の有無を調べたところ、リン酸化されることがわかった。そこで、リン酸化部位と推測されるセリンをアラニンに変えた。PU.1発現ベクターを5種類作製した。現在、これらについて、CBP・mSin3Aとの結合、転写の活性化および抑制化能を検討中である。今年度は、転写のコファクターCBP・mSin3Aに加えて、血液細胞分化に関わる転写因子との相互作用とPu.1の修飾制御についても解析を進めていく予定である。1.変異PU1を用いたリン酸化の解析(根岸)リン酸化部位と推定されるセリンをアラニンに変えた発現ベクターを用いて、転写の活性化および抑制化能に及ぼす影響を検索した。その結果、作製した全ての変異体において転写抑制化能は野生型と同等に認められたが、S132/133/148Aではタンパク質の安定性および転写活性化能が野生型より上昇していることが明らかなった。2.変異PU.1を用いたアセチル化の解析(根岸)本年度は、昨年度作製したアセチル化に関する変異ベクターについて、血液細胞分化の調節因子であるGATA-1との結合を調べた。その結果、K223/224/244/245/247/248/249Rでは野生型に比べてGATA-1との結合能が低下していることがわかった。3.変異PU.1がMEL細胞分化・増殖・アポトーシスに及ぼす影響の解析(山田)S132/133/148AおよびK223/224/244/245/247/248/249Rの亜鉛誘導型発現ベクターをMEL細胞に導入し、分化・増殖・アポトーシスに及ぼす影響を調べた。S132/133/148Aでは、正常PU.1で誘導される分化阻害・増殖抑制は正常PU.1と同様に認められ、アポトーシス誘導能はむしろ野生型より亢進していた。K223/224/244/245/247/248/249Rでは、分化阻害・増殖抑制・アポトーシスのいずれも誘導されなかった。また、K223/224/244/245/247/248/249Rでは、正常PU.1でアポトーシス誘導時に認められたbcl-2とc-myc遺伝子の発現低下も起こらなかった。以上のことから、PU.1は、(1)アセチル化とリン酸化の両方により修飾制御される(2)PU.1の132/133/148部位のリン酸化は転写活性化能に関与し、アポトーシスに対しては抑制的に働らく(3)PU.1の223/224/244/245/247/248/249のアセチル化は転写抑制活性に関わり、MEL細胞の分化阻害・増殖抑制・アポトーシスに促進的に働らく可能性が示唆された。4.成果の発表(根岸)論文としてまとめ投稿準備中である。
生体内における上皮管構造の形成と伸長の制御機構

多くの管状組織が構築される際、組織伸長と細胞上皮化(管腔化)が協調的に進行することで適切な管形成が成されるが、これらのプロセスを制御する仕組みについては不明な点が多い。本研究では、単純な構造を持つトリ胚のウォルフ管(Wolffian duct、以下「WD」)を生体内のモデルとして解析を行ってきた。昨年度までにWD特異的な遺伝子操作法を中心とした解析系を用いて、WD先端部の細胞が、周囲組織から分泌されるFGF8に誘引されることにより、WDが伸長することを明らかにした。今年度は、得られた知見をさらに発展させ、主に以下の2つの結果を得た。(1)Ras/MAPK経路の活性化はWD伸長に必要である...WD伸長にはFGFシグナル下流のどの経路が寄与するかを調べる為に、それぞれの経路の阻害剤をWDに作用させた。Ras/MAPK経路の阻害剤PD184352を作用させた際、WD伸長が妨げられたことから、FGF下流でRas/MAPK経路が活性化することが伸長に必要であることがわかった。(2)Ras/MAPK経路はWD細胞の形態を制御する...Ras/MAPK経路がどのような細胞挙動を制御し、WD伸長に関わるか調べるため、Rasの過剰発現および機能抑制実験を行った。その結果、Ras活性化細胞では仮足の活発化が観察された一方で、Ras抑制細胞では仮足が著しく減少した。このことから、FGFはRas∠MAPK経路を介して細胞形態を制御し、WD細胞の移動、細胞上皮化に重要な働きを担うことがわかった。また今年度は、管組織が適切なサイズ(長さ・管腔径)を獲得するために不可欠である細胞分裂方向についても解析を開始した。これまで、伸長中のWDでは細胞が伸長軸とほぼ平行に分裂し、組織伸長に寄与する可能性を示す結果を得ている。加えて、やはりFGFシグナルが分裂方向を規定することを示唆するデータも得た。生体内のほぼすべての器官には上皮細胞から成る管組織が存在しており、これら管組織は器官特有の機能発揮に中心的役割を担う。しかしながら、この重要な管組織が実際の生体内でどのように形成されるか、特に管の伸長と上皮管構造の形成が協調的に進行するという管形成プロセスが、どのように制御されているかはほとんど明らかになっていない。本研究では、単純な管組織であるウォルフ管(Wolffian Duct、腎管ともいう。以下「WD」)を生体内での管形成のモデルとしてこの問題に取り組んでいる。これまでWD特異的な遺伝子操作法を初めて成功させ、さらにこの方法を用いてWD形成過程を1細胞レベルでライブイメージングできるシステムを立ち上げた。このライブイメージング法を用いた観察により、WD先端部(胚の後方)の細胞は糸状仮足を活発に伸ばすなど高い運動性を示す一方で、WD後方部の細胞は運動性が低く上皮様の形態を示すことがわかった。また、先端部の細胞周辺の組織を異所的に移植すると、WD細胞がその移植片に向かって誘引されたことから、WDの周辺組織が分泌因子を介して伸長プロセスを制御していることが予想された。この周辺組織が示す誘引活性の分子実態の候補因子としては以下の2つの理由から、繊維芽細胞成長因子FGFに注目した。(1)FGF8が伸長中のWD先端部の周辺組織で発現している、(2)伸長中のWDではFGFシグナルの活性化がみられ、特に伸長が活発な先端部で最も活性化している。実際にFGF8がWD細胞を誘引するかについて調べるために、FGF8を産生する細胞塊を異所的に移植したところ、移植されたFGF8細胞塊に向かってWDが誘引された。反対にFGFシグナル特異的な阻害剤(SU5402)を用いてWDのFGFシグナルの活性化を阻害するとWDの伸長が停止したことから、FGFシグナルがWDの伸長において必要十分なシグナルであることが示された。これらの結果は、WD先端部の周辺組織から分泌されるFGF8によりWDが伸長し、FGF8を受容できない後方の細胞は上皮化管構造を形成していくことでWDが形成されるというメカニズムの存在を強く示唆している。管状組織は上皮細胞によって構成され、それぞれの器官特有の生理機能の発揮に必要不可欠な役割を担う。生体内において、このような管形成プロセスは、どのようなしくみで制御されているのだろうか。本研究ではこの問いに答えるため、管形成のモデルとしてトリ胚のウォルフ管(以下「WD」)に注目し研究を行っている。昨年度までに、WD特異的な遺伝子操作法を中心とした解析系を用い、胚内でWD細胞が周辺組織から分泌されるFGF8に誘引されることにより、WDが伸長することを明らかにしてきた。今年度はこの知見を確証し、さらに発展させるため以下の2点について研究を行った。FGF8が間接的に誘引する、つまりFGFの影響で他の因子が活性化されWD細胞を誘引するという可能性を排除するため、WD細胞をディッシュ上で培養し、FGF8の誘引能を解析した。WD細胞はFGF8を染み込ませたビーズに活発に誘引された一方で、FGFシグナル阻害剤であるSU5402存在下では、そのような振る舞いは観察できなかったことから、FGF8はWD細胞の誘引因子であることが証明された。(2)FGFシグナルの下流でどのような因子が働くことで、WD細胞の形態が変化するのか。

昨年度までにFGFシグナルの阻害により、WDの管上皮化が促進することを見出している。この際、細胞の仮足数が、上皮様でない細胞より大幅に減少していることが観察されたため、FGFシグナルの下流で何らかの因子が細胞形態をコントロールすることでWD形成に寄与していることが推察された。そこで、これまで体節の上皮化をコントロールすることで知られる低分子量Gタンパク質Cdc42に注目した。実際にCdc42がWDの細胞形態をコントロールしているかを調べるために、Cdc42の活性を阻害するN-WASP-CRIBドメインをWD細胞に導入したところ、WD細胞の管上皮化が惹起されることがわかった。これらの結果から、周辺組織から発せられるFGFシグナルがCdc42を活性化し、細胞形態をコントロールすることで、WD形成が進行することが示唆された。多くの管状組織が構築される際、組織伸長と細胞上皮化(管腔化)が協調的に進行することで適切な管形成が成されるが、これらのプロセスを制御する仕組みについては不明な点が多い。本研究では、単純な構造を持つトリ胚のウォルフ管(Wolffian duct、以下「WD」)を生体内のモデルとして解析を行ってきた。昨年度までにWD特異的な遺伝子操作法を中心とした解析系を用いて、WD先端部の細胞が、周囲組織から分泌されるFGF8に誘引されることにより、WDが伸長することを明らかにした。今年度は、得られた知見をさらに発展させ、主に以下の2つの結果を得た。(1)Ras/MAPK経路の活性化はWD伸長に必要である...WD伸長にはFGFシグナル下流のどの経路が寄与するかを調べる為に、それぞれの経路の阻害剤をWDに作用させた。Ras/MAPK経路の阻害剤PD184352を作用させた際、WD伸長が妨げられたことから、FGF下流でRas/MAPK経路が活性化することが伸長に必要であることがわかった。(2)Ras/MAPK経路はWD細胞の形態を制御する...Ras/MAPK経路がどのような細胞挙動を制御し、WD伸長に関わるか調べるため、Rasの過剰発現および機能抑制実験を行った。その結果、Ras活性化細胞では仮足の活発化が観察された一方で、Ras抑制細胞では仮足が著しく減少した。このことから、FGFはRas∠MAPK経路を介して細胞形態を制御し、WD細胞の移動、細胞上皮化に重要な働きを担うことがわかった。また今年度は、管組織が適切なサイズ(長さ・管腔径)を獲得するために不可欠である細胞分裂方向についても解析を開始した。これまで、伸長中のWDでは細胞が伸長軸とほぼ平行に分裂し、組織伸長に寄与する可能性を示す結果を得ている。加えて、やはりFGFシグナルが分裂方向を規定することを示唆するデータも得た。ウォルフ管の伸長を支えるメカニズムについて、組織から分子レベル(FGFシグナル)で多くの新規の知見を明らかにできた。さらに、他の管組織の形成過程でもみられる、伸長と管上皮化が協調的に進行するメカニズムについても、FGFシグナルおよびその下流で働くであろうCdc42シグナルが大きく関与していることが明らかになりつつある。今後は、実際にFGF8タンパクの濃度勾配がWDの伸長をナビゲートするのか、Cdc42がFGFシグナルの下流で活性化するのかという2点について解析を行う。まずFGF8の検出であるが、分泌因子であるFGF
デジタル・ディファレンシャルディスプレーによる歯特異的遺伝子のスクリーニング

NCBIのデータベースを用いて、我々の研究グループが作製したマウス歯胚ライブラリーと、他組織(中枢神経組織、肝臓、肺、腎臓、筋肉、皮膚等)と発現の異なる遺伝子につきin silicoでデジタル・ディファレンシャルディスプレー法により比較した結果、歯胚に特に多く発現が認められるいくつかの分子を同定することができた。その中でも、特に他臓器よりも歯胚で発現が多く認められたアネキシン2について解析を進めた。初めに、実際の組織上でのアネキシン2の発現を調べたところ、エナメル芽細胞に時期特異的にアネキシン2が発現していることが確認された。アネキシン2はエナメル芽細胞の分化段階において、前分泌期には認められなかったが、分泌期に発現し始め、徐々に発現量が増加し、成熟期後期に最も発現が多かった。次にアネキシン2のエナメル芽細胞での機能を調べるために、ラット歯胚mRNAからRT-PCR法によりアネキシン2を増幅し、pEF6/V5-HisTOPOベクターに組み込み、アネキシン2発現ベクターを作製し歯原性上皮細胞に形質導入し、細胞中のmRNAレベルでの様々な分子の発現量の違いをマイクロアレイで解析した。その結果、アネキシン2過剰発現細胞で増加していたmRNAはkeratin comples 1 acidic gene-15、カルシトニン、FGF14などであり、減少していたmRNAはBMP15、タイトジャンクションの接着因子であるclaudin-12、FGF20などであった。また、アネキシン2過剰発現細胞を用いた歯牙特異的遺伝子についてのRT-PCR解析では、アメロブラスチンの発現が減少しエナメリンの発現が増加していた。さらに、蛋白レベルでの結合解析を進めている。(その結果は平成17年3月にアメリカ・ボルチモアで開催された国際歯科学会で発表した。)その中でも、特に他臓器よりも歯胚で発現が多く認められたアネキシン2について解析を進めた。初めに、実際の組織上でのアネキシン2の発現を調べるため、マウスの上顎切歯の組織切片を作製し、アネキシン2の抗体を用いて染色した。その結果エナメル芽細胞に時期特異的にアネキシン2が発現していることが確認された。次にアネキシン2のエナメル芽細胞での機能を調べるために、ラット歯胚mRNAからRT-PCR法によりアネキシン2を増幅し、pEF6/V5-HisTOPOベクターに組み込み、アネキシン2発現ベクターを作製した。作製した発現ベクターは、歯原性上皮細胞に形質導入し、タンパクの発現をウェスタンブロット法により確認後、アネキシン2形質導入後の細胞中のmRNAレベルでの様々な分子の発現量の違いを現在解析中である。
児童・青年期うつ病・双極性障害の発達精神病理学的診断法と包括的治療法の確立

DSM-5で抑うつ障害群の中に新たに設けられた児童・青年期の病態である重篤気分調節症(DMDD)について自験例を対象としてその臨床的特徴を検討した。DSM-5におけるDMDDの臨床症状は、慢性で激しい持続的な易怒性である。激しい易怒性は2つの特徴的な症状として現れる。第1の特徴は頻回のかんしゃく発作である。通常は欲求不満に反応して起こり、頻回に(平均して週に3回以上)、1年以上の期間にわたる。第2はかんしゃく発作の間欠期の状態である。間欠期においても慢性的で持続的な易怒的または怒りの気分が、ほとんど1日中、ほとんど毎日存在するのである。本研究では楡の会こどもクリニック(小児科発達障害クリニック)に通院中の患者の中から、DMDDの診断基準に該当する14例をとりあげて検討した。14症例の内訳は以下の通りであった。1男子13例、女子1例と男子優位であった。2年齢は平均7.9±2.2歳であった。3併存障害は、ASD12例、ADHD7例、うつ病2例、解離性障害2例、素行症(CD)1例であった。4治療は薬物療法が全例に行われ、リスパダール5例、アリピプラゾール2例、ストラテラ2例、クエチアピン2例、メチルフェニデート2例、カルバマゼピン1例であった。いずれも対症療法的に用いられていた。5精神療法的アプローチとして、7例において心理士による個別セラピーが行われ、4例において発達支援センターの個別セラピーが行われていた。69例において不適切養育(暴力5例、暴言3例、DV目撃3例、ネグレクト4例)が見られた。3例が両親離婚し、2例別居、4例が片親と死別していた。7家族歴は親のうつ病が9例、同胞のADHDが1例、反応性愛着障害が1例であった。814例の平均観察期間は2.7年であり、改善5例、軽度改善7例、不変2例であった。わが国の小・中・高校生における抑うつ症状、躁症状、自閉傾向および自己効力感の実態ならびに相互の関連について検討するため、2016年7月、小学3年生、小学5年生、中学2年生、高校2年生、計3276名に対して調査を行った。調査票には抑うつ症状尺度(QIDS-J)、躁病診断尺度(MEDSCI)、自閉症スペクトラム指数(AQ-J)、特性的自己効力感尺度(GSE)を用いた。QIDS-Jの平均スコアは4.7±4.0点であり、小3<小5<中2<高2と年齢が上がるごとに有意に高くなっていた。また中2と高2では男性よりも女性の方がスコアが有意に高かった。MEDSCIの平均スコアは4.3±4.1であり、中2と高2が小学生よりも有意に高かった。AQ-Jの平均スコアは20.4±6.1点で、小学生、中2、高2と年齢の上がるごとに平均スコアが有意に高くなっていた。GSEの平均スコアは70.4±15.3であり、小学生、中2、高2と年齢が高くなるほど平均スコアが有意に低くなっていた。またピアソンの積率相関係数において、QIDS-JとMEDSCI、QIDS-JとAQ-Jが正の相関関係を示した。またQIDS-JとGSE、AQ-JとGSEにおいて負の相関関係が認められた。QIDS-JとMEDSCIの正の相関関係から抑うつ傾向が高ければ躁傾向も高くなると考えられた。これは児童・青年期うつ病が双極性障害へ発展しやすいことと関連があると考えられた。QIDS-JとAQ-Jの正の相関関係から、抑うつ傾向が高ければ自閉傾向も高くなると考えられた。これは児童・青年期うつ病が自閉スペクトラム障害と併存しやすいことと関連があると考えられた。自己効力感との関連では、QIDS-JとAQ-JがGSEのスコアと負の相関を示したことから、抑うつ傾向や自閉傾向が高い者は自己効力感が低下している可能性があると考えられた。当初の計画通り、2016年度は児童・青年期のうつ状態、躁状態、自閉傾向、自己効力感の実態調査を行った。2016年7月に、北海道の小学3年生、小学5年生、中学2年生、高校2年生、計3276名に対して、簡易抑うつ症状尺度(QIDS-J)、躁病診断スクリーニング尺度(MEDSCI)、自閉症スペクトラム指数日本語版(AQ-J)、特性的自己効力感尺度(GSE)からなる調査票を用いた調査を行った。その結果を解析したところ、児童・青年期の抑うつ傾向はきわめて高いことが明らかになった。この調査結果をもとに、児童・青年期うつ病・双極性障害の発達精神病理学的診断法と包括的治療法の確立に向けて、研究を進めていく予定である。

第2はかんしゃく発作の間欠期の状態である。間欠期においても慢性的で持続的な易怒的または怒りの気分が、ほとんど1日中、ほとんど毎日存在するのである。本研究では楡の会こどもクリニック(小児科発達障害クリニック)に通院中の患者の中から、DMDDの診断基準に該当する14例をとりあげて検討した。14症例の内訳は以下の通りであった。1男子13例、女子1例と男子優位であった。2年齢は平均7.9±2.2歳であった。3併存障害は、ASD12例、ADHD7例、うつ病2例、解離性障害2例、素行症(CD)1例であった。4治療は薬物療法が全例に行われ、リスパダール5例、アリピプラゾール2例、ストラテラ2例、クエチアピン2例、メチルフェニデート2例、カルバマゼピン1例であった。いずれも対症療法的に用いられていた。5精神療法的アプローチとして、7例において心理士による個別セラピーが行われ、4例において発達支援センターの個別セラピーが行われていた。69例において不適切養育(暴力5例、暴言3例、DV目撃3例、ネグレクト4例)が見られた。3例が両親離婚し、2例別居、4例が片親と死別していた。7家族歴は親のうつ病が9例、同胞のADHDが1例、反応性愛着障害が1例であった。814例の平均観察期間は2.7年であり、改善5例、軽度改善7例、不変2例であった。平成29年度は、北海道大学病院精神科および楡の会子どもクリニック(小児科発達障害クリニック)で治療中の155例の児童・青年期発症のうつ病・双極性障害の発達精神病理学的診断を行う。各症例においてどのような症状の変遷があったか、診断の変更があったか、治療の修正があったかを検討する。以上により、発達精神病例学的診断法を確立する。また、楡の会子どもクリニックで治療中の22例(男性18例、女性4例)の重篤気分変調症(DMDD)の経過を観察し、その転帰調査を行い、DMDDの病態について確認し、治療法を検討する。平成30年度以降は、児童・青年期のうつ病・双極性障害患者に対し、適切な薬物療法、精神療法(認知行動療法)、認知機能改善療法(CRT)を試み、わが国独自の包括的治療法を確立するべく今後の研究を推進していく。
ライボザイムを用いたRET不活化による多発性内分泌腫瘍症2型遺伝子治療の基礎研究

RETプロトオンコジーンは多発性内分泌腫瘍症(MEN)2A、2B型、家族性甲状腺髄様癌(FMTC)、Hirschsprung(HSCR)病の原因遺伝子であることが明らかになっている。ライボザイムは酵素活性を持ったRNA分子で、標的となるmRNAもしくはウイルスRNAと相補的に結合し、それらを切断して標的となる蛋白の合成またはウイルスの増殖を阻害する。ライボザイムを用いた遺伝子の不活化は遺伝子治療のひとつである。本研究ではRETプロトオンコジーン特異的なライボザイムを作製し、変異RETを持った細胞株に導入して細胞増殖に対する影響を検討した。ヒトRet遺伝子のmRNAを特異的に切断するライボザイムを作成した。Ret遺伝子のコドン634の位置に変異を持つヒト甲状腺髄様癌細胞株、TT細胞におのおの感染させ、ライボザイムの細胞内での発現、機能について検討した。TT細胞内でライボザイムが発現したことを確認し、Ret遺伝子のmRNAおよび蛋白の発現が有意に抑制され、TT細胞の増殖も有意に抑制された。ret-PTC変異を持つTPC-1細胞に対して2種類のライボザイムを組み込んだアデノウイルスを感染させた。細胞内ドメインを切断するライボザイムを組み込んだアデノウイルスのみ、このTPC-1細胞の増殖を抑制したが、細胞外ドメインを切断するライボザイムを組み込んだアデノウイルスは細胞増殖に影響を与えなかった。以上より、ret遺伝子の部位特異的切断能力を持つライボザイムを組み込んだアデノウイルスは、ret遺伝子変異を有する甲状腺癌細胞株TT細胞、TPC-1細胞においてRet mRNA、蛋白の発現を抑制し、さらに細胞増殖も抑制した。ヒトRet遺伝子のmRNAを特異的に切断するライボザイムを作製した。一つはRetの細胞外ドメインを、もう一つは細胞内ドメインをコードする領域を切断するよう設計した。これらのライボザイムを組み込んだアデノウイルスをRet遺伝子のコドン634の位置に変異を持つヒト甲状腺髄様癌細胞株であるTT細胞に対して感染させた。この感染により、TT細胞内ライボザイムが発現し、Ret遺伝子のmRNAおよび蛋白の発現が有意に抑制された。また、この感染により、TT細胞の増殖が有意に抑制された。これに対してライボザイムを組み込んでいないアデノウィルズの感染ではTT細胞の増殖には有意な影響は見られなかつた。一方、ret-PTCと呼ばれるRet遺伝子の細胞内ドメインと無関係の遺伝子の融合蛋白が甲状腺乳頭癌において検出され、これが発ガンに大きな役割を果たしていることが示唆されている。このret-PTC変異をもつTPC-1細胞に対して、これらのライボザイムを組み込んだアデノウイルスを感染させた。細胞内ドメインを切断するライボザイムを組み込んだアデノウィルスのみこのTPC-1細胞の増殖を抑制したが、細胞外ドメインを切断するライボザイムを組み込んだアデノウイルスは細胞増殖に影響を与えなかった。以上により、我々が作製したライボザイムを組み込んだアデノウイルスはret遺伝子のmRNAを部位特異的に切断し、mRNA、蛋白の発現、細胞増殖を抑制した。ひとつはRetの細胞外ドメインを、もうひとつは細胞内ドメインをコードする領域を切断するよう設計した。2種類のライボザイムを組み込んだアデノウイルスをRet遺伝子のコドン634の位置に変異を持つヒト甲状腺髄様癌細胞株、TT細胞におのおの感染させ、ライボザイムの細胞内での発現、機能について検討した。TT細胞内でライボザイムが発現したことを確認した。その結果としてRet遺伝子のmRNAおよび蛋白の発現が有意に抑制された。またこの感染によりTT細胞の増殖が有意に抑制された。これに対してヒトRet遺伝子のmRNAを特異的に切断するライボザイムを組み込んでいないアデノウイルスの感染ではTT細胞の増殖には有意な影響はみられなかった。

ret-PTCと呼ばれるRet遺伝子の細胞内ドメインと無関係の遺伝子融合蛋白が甲状腺乳頭癌において検出され、これが発ガンに大きな役割を果たしていることが示唆されている。このret-PTC変異を持つTPC-1細胞に対してこれら2種類のライボザイムを組み込んだアデノウイルスを感染させた。細胞内ドメインを切断するライボザイムを組み込んだアデノウイルスのみ、このTPC-1細胞の増殖を抑制したが、細胞外ドメインを切断するライボザイムを組み込んだアデノウイルスは細胞増殖に影響を与えなかった。以上より、ret遺伝子の部位特異的切断能力を持つライボザイムを組み込んだアデノウイルスは、ret遺伝子変異を有する甲状腺癌細胞株TT細胞、TPC-1細胞においてRet mRNA、蛋白の発現を抑制し、さらに細胞増殖も抑制した。ヒトRet遺伝子のmRNAを特異的に切断するライボザイムを作成した。ひとつはRetの細胞外ドメインを、もうひとつは細胞内ドメインをコードする領域を切断するよう設計した。2種類のライボザイムを組み込んだアデノウイルスをRet遺伝子のコドン634の位置に変異を持つヒト甲状腺髄様癌細胞株、TT細胞におのおの感染させ、ライボザイムの細胞内での発現、機能について検討した。TT細胞内でライボザイムが発現したことを確認した。その結果としてRet遺伝子のmRNAおよび蛋白の発現が有意に抑制された。またこの感染によりTT細胞の増殖が有意に抑制された。これに対してヒトRet遺伝子のmRNAを特異的に切断するライボザイムを組み込んでいないアデノウイルスの感染ではTT細胞の増殖には有意な影響はみられなかった。以上より、ret遺伝子の部位特異的切断能力を持つライボザイムを組み込んだアデノウイルスは、ret遺伝子変異を有する甲状腺癌細胞株TT細胞、TPC-1細胞においてRetmRNA、蛋白の発現を抑制し、さらに細胞増殖も抑制した。
婦人科腫瘍の発癌過程における癌抑制遺伝子の不活性化メカニズムに関する検討

婦人科腫瘍における発癌メカニズムを解明する目的で、まずras癌遺伝子についてp21に対するモノクローナール抗体を用いた免疫組織学的な検索を子宮体癌組織を用いてその組織型、予後との関係を明らかにし発表した。、また卵巣癌を用いての検討では癌抑制遺伝子p53のPCRを用いたLOH(loss of heterozygosity)の検討では卵巣癌の約40%にその異常が見いだされその発癌過程への関与を発表した。さらに子宮体癌、卵巣癌での癌抑制遺伝子Rb,DCC,APCのPCRを用いたLOHの解析を行い子宮体癌ではRB遺伝子では約30%、、DCC遺伝子では約30%、APC遺伝子では0%のLOHを見いだしており、さらに卵巣癌ではRb遺伝子では約25%,DCC遺伝子では約15%、APC遺伝子では0%の異常を見いだした。現在はLOHの見られた各々の遺伝子についてさらに詳細に検討するためにホルマリン組織からDNAを抽出し、各々の遺伝子の全coding,regionについてPCR(polymerase chain reaction)にて増幅後、SSCP(single stranded conformational plymorphism)法を用いて遺伝子の点突然変異といった異常を検索中である。実際その様な解析により、卵巣癌細胞株のいくつかにRb遺伝子の異常を見いだした。例えばCaov-3株ではRbmRNAの発現は確認できず、それはRb遺伝子のpromotor領域の異常が原因であることを見いだした。さらにCaov-4株ではcodon123がAsn.からAsp.へのアミノ酸の置換の原因となるような点突然変異がみられた。
ヌクレオチド結合部位の動的構造の解析

UDP-グルコース合成酵素は、生体内の糖代謝において中心的な役割をもつUDP-グルコースの合成と分解を触媒する酵素で、動物や微生物に広く存在する。本酵素の構造を解明するため、重原子同型置換法によるX線結晶構造解析を行い、ソルベントフラットニングによる電子密度の改良の後、モデルビルディングと精密化を行った。その結果、モノマーで存在する本酵素は、大小2個のドメインで形成されており、小ドメインは、左巻きβらせん構造という新規なホールディングモチーフをもつことが明らかになった。また、これまでにジャガイモ酵素について、種々の親和標識試薬を用いる研究を行い、活性部位に存在する複数のリジン残基の同定とそれらの空間的配置の推定を行ってきたが、これらのリジン残基は、いずれも活性部位と考えられる領域に存在することが判明した。さらに、糖ヌクレオチド結合部位を構成するアミノ酸残基を置換した各種変異型酵素を部位特異的変異導入により作製し、それらのX線結晶解析を行った。また、糖ヌクレオチド基質を結合した酵素の構造を解析するとともに、基質結合過程の構造変化をラウエ法による時分割測定により解析中である。一方、アデニル酸キナーゼはAMPをリン酸化してADPを合成する酵素で、これまでにニワトリ筋肉酵素のヌクレオチド結合部位にあるリジン残基やその周辺に存在する数種のアミノ酸残基の役割を明らかにしてきた。また、本酵素と同じ反応様式をもつが、基質特異性の異なるUMP-CMPキナーゼを対象として、タンパク質工学的手法による基質特異性の改変を試みるとともに、ヌクレオチド結合領域の動的構造をアデニル酸キナーゼと比較しながら解析した。銅アミン酸化酵素のアポ酵素のX線結晶解析を行い、トパキノン補酵素の前駆体であるチロシン残基の位置を確定した。
分子遺伝学的リンパ管研究のための小型モデル動物の確立

本研究の目的はゼブラフィッシュをリンパ管の分子遺伝学的研究のための優れた実験モデル動物として確立することにある.第一歩として、胚から成魚に至るリンパ管系の発生解剖アトラスを編纂した.リンパ管系に欠損を持つ幾つかの変異体のトランスジェニックフィッシュ系統を確立し、リンパ管系に欠損を生ずる形成過程を形態学的に明らかにした.このデータを基に共同研究者の米国国立衛生研究所(NIH)分子遺伝学部門のDr.Weinstein研究室で、ケモカインのシグナルがリンパ管系の形成過程で主要な役割を果たすことを明らかにした(投稿中).本研究の目的はゼブラフィッシュをリンパ管の分子遺伝学的研究のための優れた実験モデル動物として確立することにある.第一歩として、胚から成魚に至るリンパ管系の発生解剖アトラスを編纂した.リンパ管系に欠損を持つ幾つかの変異体のトランスジェニックフィッシュ系統を確立し、リンパ管系に欠損を生ずる形成過程を形態学的に明らかにした.このデータを基に共同研究者の米国国立衛生研究所(NIH)分子遺伝学部門のDr.Weinstein研究室で、ケモカインのシグナルがリンパ管系の形成過程で主要な役割を果たすことを明らかにした(投稿中).1-a:ゼブラフィッシュの胚から成魚に至るリンパ管系の発生解剖アトラスの作成受精後2日-3週:リンパ管内皮細胞あるいはその前駆細胞がEGFPを発現するfli-1トランスジェニックフィッシュと岩手医科大学共同研究部門に設置された二光子顕微鏡システムZeiss Axioskop2 plus+LSM510META+非線形光学系NLOレーザー(Maitai)を使用して,リンパ内皮細胞の分化,リンパ嚢からリンパ管の形成,胸管が静脈角に開口し機能を開始するまでの生体イメージングを行った。若魚と成魚のリンパ管内に色素を注入した標本を作製した。発生解剖アトラスに必要な画像を収集し、これまでの結果を第8回国際ゼブラフィッシュミーティング(アメリカ、ウイスコンシン)と小型魚類学会(名古屋)で発表した。I-b:リンパ管系を欠損するEGFPトランスジェニックフィッシュ系統の確立と原因遺伝子の追究岩手医科大学に設置した飼育システムを使用してリンパ管系に欠損を生じた劣勢突然変異体とEGFPトランスジェニックフィッシュを交配し,変異体の系統を確立した。II:リンパ内皮細胞への分化をコントロールする関連分子と分子機構の追究リンパ管内皮分化過程をコントロールする関連分子と分子機構の追究について,本研究とは別に(研究経費では独立して),米国国立衛生研究所(NIH)分子遺伝学部門のDr.Wehlsteinとの共同研究を行った。I:ゼブラフィッシュの胚から成魚に至るリンパ目系の発生解剖アトラスの作成受精後3-5週:皮下の外側皮静脈に沿って嚢胞状のリンパ内皮が並び,集合リンパ管系である外側リンパ本幹を形成,静脈角に開口し機能を開始する.fli-1トランスジェニックフィッシュと岩手医科大学共同研究部門に設置された二光子顕微鏡システムZeiss Axioskop2 plus-LSM510META+非線形光学系NLOレーザー(Maitai)を使用して生体イメージングを行い,皮下集合リンパ管系を形成するリンパ内皮細胞の起源と発生の機序を追究した.体幹の深部に位置する胸管遠位部の生体イメージングは魚体の成長(肥厚)に伴い困難となるが,胸管が静脈角に開口し機能を開始する3週からリンパ管系への色素注入法の適用が可能となる.EGFPfli-1トランスジェニックフィッシュのリンパ管内に蛍光(赤色)ビーズを注入し共焦点顕微鏡システムを使用して血管系とリンパ管系の同時生体イメージングし.解析用コンピューターと三次元解析ソフトウエアー(Meta-Morpho)によりデータ解析,発生解剖アトラスに必要な画像を作成した.20年度と21年度で胸管と外側リンパ管の形成過程を追究し、リンパ内皮細胞が静脈内皮に由来することを明らかにした.II:リンパ内皮細胞への分化をコントロールする関連分子と分子機構の追究ほ乳類のリンパ内皮が分化する過程でリンパ内皮に特異的に発現し、静脈内皮からリンパ管内皮への分化をコントロールする関連分子について、ゼブラフィッシュで追究した.成魚の胸管と外側リンパ管でリンパ内皮分化のマスター遺伝子とされるprox1の発現を確認した.III:メダカとオーストラリア肺魚のリンパ管系について硬骨魚類のリンパ管系がほ乳類のリンパ管系とは本質的に異なるとする意見、あるいはリンパ管系が存在しないという意見もある.真骨魚類のメダカと肉鰭類のオーストラリア肺魚についてリンパ管系の存在を確認した.メダカについてはリンパ内皮でprox1の発現を確認し、オーストラリア肺魚についても追究中である.ゼブラフィッシュのリンパ管系発生解剖アトラスの作成20,21年度に作成した受精後2日-3週、3-5週魚の画像に継いで、22年度は受精後5週魚ー成魚の腹腔内に色素を注入してリンパ管内に取り込ませ、フォルマリン固定、グリセリンで透過してリンパ管系全体を可視・画像化し、2日胚から成魚に至るリンパ管系発生解剖アトラスの編纂に必要な画像データを取得した。小型魚類のリンパ管内皮の組織化学的解析両生類・は虫類・ほ乳類との比較を目的に、ほ乳類リンパ管内皮の特異的分子マーカー数種を用いてゼブラフィッシュとメダカ成魚リンパ管内皮の標識を試みた。静脈内皮からリンパ管内皮への分化に関わるマスター遺伝子とされるProx1の発現を実証した。

さらに、四足動物へと進化した現存の硬骨魚類(肉鰭類)であるオーストラリア肺魚のリンパ管内皮の標識を試みている。脊椎動物のリンパ系の起源と静脈内皮からリンパ管内皮への特性の変遷を検証することにより、魚類を脊椎動物のリンパ系の分子遺伝学的研究の実験モデル動物として用いることに正当性を与えると考える。漏出した組織間液を毛細リンパ管から吸収し、集合管を経て数カ所の静脈開口部から血液循環へと戻すことがリンパ管系の始原的な機能である.リンパ集合管である胸管の解剖学的基本構造を魚類からほ乳類へと系統発生学的に辿ると、動・静脈、神経等他構造との相対的位置関係と循環系への開口部の位置は恒常的に保持されている.胸管の解剖学的基本構造の決定過程で、リンパ管内皮前駆細胞を動脈に沿って誘導する関連分子とその分子メカニズムを初めて解明した(投稿中).