hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
2時間を刻む生物時計による神経分化制御

胎児神経幹細胞ではHes1の発現は約2時間周期でオシレーションし、Hes1によって周期的に抑制されるためプロニューラル遺伝子Ngn2やNotchリガンドDll1の発現もオシレーションした。Dll1オシレーションによってNotchシグナルが相互に活性化されて神経幹細胞が維持された。一方、Hes1の発現が無くなると、Ngn2の発現が持続してニューロンに分化した。成体脳でも神経幹細胞からのニューロン新生が必須で、神経幹細胞はNotch-Hes経路によって維持された。以上から、胎児および成体神経幹細胞制御におけるリズム遺伝子Hes1の重要性が明らかになった。発生途中の神経系は、境界によっていくつものコンパートメントに区切られる。境界は、モルフォゲンを分泌することによって、コンパートメント内の領域特異的な細胞分化を制御する。境界は特殊な放射状グリア細胞により構成されるが、コンパートメント内の放射状グリア細胞に比べて一般に増殖能が低く、またニューロンにも分化しないことが知られている。しかしながら、コンパートメントと境界の構成細胞の性質の差を決める分子機構についてはよくわかっていない。今回、Hes1の発現モードの違いがコンパートメントと境界の構成細胞の性質の差を決めていることを見出したので報告する。コンパートメント内の放射状グリア細胞ではHes1の発現量は変化し、オシレーションすることが示唆された。また、Hes1の発現が低下した細胞ではプロニューラル遺伝子Mash1の発現がみられ、ニューロンに分化しつつあると考えられた。一方、境界内の放射状グリア細胞では常に高レベルにHes1が発現しており、プロニューラル遺伝子の発現はまったく見られなかった。しかし、Hes1;Hes3;Hes5欠損マウスでは、境界でプロニューラル遺伝子が発現して異所性のニューロン分化が起こるとともに、モルフォゲンの発現も消失あるいは低下した。すなわち、Hesを欠損すると、境界は形成されないか、形成されても維持されないことが示された。逆に、コンパートメントの細胞にHes1を持続発現させるとニューロン分化が抑制されるとともに、細胞増殖能が低下した。以上の結果から、Hes1の発現が高レベルで持続すると増殖能やニューロンへの分化能を抑制して境界細胞としての性質を獲得すること、一方、コンパートメント内の放射状グリア細胞が高い増殖能を維持するにはHes1の発現が持続しないこと(おそらくオシレーションすること)が必要であることが示された。コンパートメント内の放射状グリア細胞ではHes1の発現量は様々であった。リアルタイムモニターシステムを用いてHes1の発現を解析したところ、ダイナミックに変動することがわかった。これらの細胞ではプロニューラル遺伝子であるMash1やNgn2の発現が見られた。コンパートメントの細胞にHes1を持続発現させるとニューロン分化が抑制されるとともに、細胞増殖能が低下し、境界細胞の性質を獲得した。以上の結果から、Hes1の発現が高レベルで持続すると増殖能やニューロンへの分化能を抑制して境界細胞になり、コンパートメントの放射状グリア細胞の維持にはHes1の発現オシレーションが重要であることが示唆された。神経前駆細胞におけるHes1の発現様式およびその意義を明らかにするために、我々が開発したリアルタイムイメージングシステムを用いて、マウス胎児の終脳の分散培養におけるHes1の発現動態をしらべた。その結果、神経前駆細胞においてHes1の発現は約2時間周期でオシレーションすることがわかった。また、終脳のスライス培養を行ったところ、神経前駆細胞でのHes1の発現は約2時間周期でオシレーションした。次に、Hes1オシレーションの意義を探るために、Hes1を高レベルで持続発現したときに発現低下する遺伝子をマイクロアレー法によってスクリーニングした。その結果、プロニューラル遺伝子のNgn2やNotchリガンドのDll1の発現が抑制されていた。逆に、Hes1が欠損すると、これらの遺伝子の発現は増加した。さらに、発生途中の神経系の組織切片を用いてNgn2およびDll1の発現をしらべたところ、神経前駆細胞においてHes1とほぼ逆の関係を示した。

すなわち、Hes1を高レベルで発現する神経前駆細胞ではNgn2とDll1の発現は低く、逆にHes1を低レベルで発現する神経前駆細胞ではNgn2とDll1の発現は高かった。さらに、リアルタイムイメージングシステムを用いてNgn2とDll1の発現を可視化したところ、ニューロンでは持続発現するが、神経前駆細胞ではオシレーションしていた。Ngn2やDll1のオシレーションは、Hes1オシレーションによって制御されていると考えられた。Notchシグナルを抑制すると、Hes1の発現は低下し、Ngn2とDll1の発現は持続的に増加するが、このとき神経前駆細胞はニューロンに分化する。これらの結果から、Hes1オシレーションはDll1オシレーションを引き起こすことによって、Notchシグナルを活性化しあって神経前駆細胞を維持することが示唆された。神経幹細胞におけるHes1の発現様式およびその意義を明らかにするために、我々が開発したリアルタイムイメージングシステムを用いて、マウス胎児終脳でのHes1の発現動態をしらべた。その結果、神経幹細胞においてHes1の発現は約2時間周期のリズムを刻むこと(オシレーション)がわかった。一方、Hes1の下流で働くプロニュープル遺伝子Ngn2やNotchリガンドDll1は、ニューロンでは持続的に発現するが、神経幹細胞ではオシレーションしていた。神経幹細胞におけるNgn2やDll1のオシレーションはHes1によって制御されており、Hes1オシレーションはDll1オシレーションを引き起こすことによって、Notchシグナルを活性化しあって神経幹細胞を維持すると考えられた。次に、タモキシフェン誘導性Creリコンビナーゼ(CreERT2)をNestinプロモーター/エンハンサーによって神経幹細胞に発現するNestin-CreERT2マウスとNeuron-specific enolase遺伝子にloxP-STOP-LoxP-DTAを挿入したマウスとを交配し、生まれたマウスに対して生後2ヶ月目にタモキシフェンを投与した。このマウスでは、タモキシフェン投与後に神経幹細胞でSTOPカセットが除かれ、その後生まれたニューロンはジフテリア毒素(DTA)を発現し、細胞死を起こす。このマウスは、海馬・歯状回依存性の空間記憶に障害があり、嗅球の組織構造が崩れた。すなわち、成体脳でもニューロン新生が必須であり、そのため神経幹細胞を維持することが重要であると考えられた。成体脳において神経幹細胞を維持する分子機構を明らかにするために、Hes1の発現をしらべたところ、成体脳の神経幹細胞にもHes1が強く発現していた。今後、成体脳の神経幹細胞におけるHes1の発現動態および機能を解析する予定である。従来、ニューロンの産生は発生期においてしか行われないと考えられていたが、ヒトを含めた哺乳類の成体脳においても神経幹細胞が存在し、ニューロン新生が続いている事が解ってきた。しかし、神経幹細胞が一生涯維持され、継続的にニューロン新生が行われる分子基盤は不明であった。
多チャンネル高周波数超音波プローブを用いた光音響サイトメトリーの開発

従来の光音響サイトメトリーでは、レーザマニピュレーションによって血球を1列に整列させ、レーザーによって血球から発生した光音響波を受信することで細胞分類を提案している。しかしながら、生体中では光の散乱・吸収の影響を大きく受け、体表に近い橈骨動脈(深さ3 mm)でさえもレーザマニピュレーションによる血球の整列は困難である。本研究では、音響的に焦点を設定することで生体の光学的散乱吸収を最小にし、生体深部の観察を可能にする手法の開発を行った。平成28年度はZnO薄膜多チャンネル高周波数超音波プローブの開発及び光音響スペクトロスコピー計測のアルゴリズム確立を行った。多チャンネル高周波数超音波プローブは当初の計画通り、設計した音響レンズ上に順にAu-Cr電極蒸着、ZnO薄膜をスパッタリング、最後にAu-Cr電極蒸着することで多チャンネル高周波数超音波プローブを作製する。この際には、音響レンズは平面音響レンズ(幾何学的フォーカス無し)と直線集束ビーム(LFB)音響レンズ(幾何学的フォーカス有り)の2種類用意し、それぞれの比較を行った。計測結果としては、各チャンネル間でのばらつきは期待していたよりも少なく、ビームフォーミング適用可能範囲であった。また、抵抗値も設計通りの値が得られた。また、当初購入計画していたシングルエレメントの超音波センサは上記の手順で製作し、多チャンネル高周波数超音波プローブとの比較を行った。また、光音響スペクトロスコピー計測のアルゴリズム開発においては、当初計画していた波長(生体透過性の高い近赤外領域:700-1000 nm)よりも広い400-1200 nmの波長領域を用いて検討を行った。これは分類したい計測と同時に血流分布も把握するという目的からである。また、計測対象としては、当初検討していた微小粒子に加えて、細胞用の染色液に関しても検討を行った。結果として得られた光音響強度の波長依存性は計測対象の光学的な吸収係数と非常によい一致を示しており、光音響スペクトロスコピー計測のアルゴリズムが確立できたと考える。当初の計画通り、ZnO薄膜多チャンネル高周波数超音波プローブの開発及び光音響スペクトロスコピー計測のアルゴリズム確立が出来たため、平成29年度に予定していた計画に進めることが可能である。平成29年度は平成28年度に開発したZnO薄膜多チャンネル高周波数超音波プローブを用いて光音響スペクトロスコピー計測を行った。それに加えて、円環に素子が配置されたアニュラアレイプローブおよびシングルエレメントの超音波プローブも用いて比較実験を行った。(1)受信ビームフォーミングに関して当初計画していた自己相関法を用いた受信ビームフォーミング(S. W. Flax, et al. "IEEE Trans. Ultrason. Ferroelectr. Freq. Control 1988 35(6) 758-767)をさらに発展させ、Wiener filterおよび光音響波の特性を生かしたビームフォーミング手法を確立させた。本手法によって、適用しない場合の空間分解能と比較するとおよそ3倍程度の改善が確認できた。さらに、発生する光音響波がその音源の形状に依存した初期位相を有する特徴に着目し、その点を補正することでさらに空間分解能を向上させることが可能であることも確認した。(2)光音響スペクトロスコピーを用いた基礎実験に関して平成28年度と同様に400-1200 nmの波長領域を用いて、開発したビームフォーミング手法と光音響スペクトロスコピー計測のアルゴリズムを組み合わせた計測を行った。計測対象は基礎実験として、蛍光微小粒子と染色した培養細胞を用いて、光音響強度の波長依存性の計測を行った。計測した光音響強度の波長依存性は計測対象の光学的な吸収係数と非常によく一致を示した。さらに、培養細胞をマウスに移植し、体表から開発したイメージング手法を用いて可視化することが可能であり、開発した手法の有用性を示した。平成29年度では平成28年度に製作した多チャンネル高周波数超音波プローブを用いて、開発した光音響スペクトロスコピー計測によって血液模擬ファントムの分類を行う。これによって、分類検出精度検証を行う予定である。また、可能であれば、音響レンズの形状の検討も予定である。29年度が最終年度であるため、記入しない。医工学29年度が最終年度であるため、記入しない。
精巣上皮細胞のNGF受容体に対する一酸化窒素の影響

精巣におけるNGF/NGF-Rを介した生殖細胞と精巣内体細胞との細胞間のコミュニケーションに対してNOがどのような役割を果たしているのかを検討し,以下の研究成果を得た.・免疫組織化学的染色実験から,(1)ラット精巣では生殖系細胞(精母細胞,精細胞)にNGF抗体と反応する物質が局在する.(2)精巣上皮細胞(セルトリ細胞)にはNGF-R(p75)抗体,Trk-pan抗体(TrkA, B, Cを認識)と反応するタンパク質が局在する.(3)NGF-R, TrkA, TrkBは,セルトリ細胞表面全体(細胞膜上)に分布している.また,それらは被覆小窩と共に取り込まれて核上細胞質にクラスター様集落を示す.・培養セルトリ細胞のRT-PCR実験ならびにウェスタン解析実験から,(5)NGF-R抗体に反応する76kDaのバンドとTrk-pan抗体,TrkA抗体(140kDa),TrkB抗体(145kDa)と反応するそれぞれのバンドを発現している.・培養セルトリ細胞へのNOドナー添加実験から,(7)NOドナー処理によって,核上細胞質に認められたクラスター様の蛍光像を示す細胞集団が減少していた.・培養セルトリ細胞へのNOドナーと受容体リガンドの添加実験から,(8)BDNF(100ng/ml)あるいはNGF(100ng/ml)をセルトリ細胞の培養系に添加した場合には,いずれにおいてもTrk-pan抗体と反応する146kDaタンパク質が明らかに増加した.(9)NOドナーの添加による146kDaタンパク質の減少は,BDNFやNGFが共存する事によって抑制された。以上の事から,精巣上皮細胞(セルトリ細胞)はNGF-R, TrkA, TrkBを発現し,これら受容体からのシグナルを介して精子形成の統御に関わっている事が示された.また,精巣における過剰のNO産生はセルトリ細胞の神経刺激因子受容体の発現に重篤な影響を与え,、受容体下流のシグナル伝達系制御に変調をもたらし,精子形成の統御の異常を惹き起こす可能性も示された.これに対して,受容体のリガンドであるNGFやBDNFといった神経刺激因子はNOのこうした影響を抑制し,精子形成の統御を維持する事が出来ることが明らかになった.精巣におけるNGF/NGF-Rを介した生殖細胞と精巣内体細胞との細胞間のコミュニケーションに対してNOがどのような役割を果たしているのかを検討し,以下の研究成果を得た.・免疫組織化学的染色実験から,(1)ラット精巣では生殖系細胞(精母細胞,精細胞)にNGF抗体と反応する物質が局在する.(2)精巣上皮細胞(セルトリ細胞)にはNGF-R(p75)抗体,Trk-pan抗体(TrkA, B, Cを認識)と反応するタンパク質が局在する.(3)NGF-R, TrkA, TrkBは,セルトリ細胞表面全体(細胞膜上)に分布している.また,それらは被覆小窩と共に取り込まれて核上細胞質にクラスター様集落を示す.・培養セルトリ細胞のRT-PCR実験ならびにウェスタン解析実験から,(5)NGF-R抗体に反応する76kDaのバンドとTrk-pan抗体,TrkA抗体(140kDa),TrkB抗体(145kDa)と反応するそれぞれのバンドを発現している.・培養セルトリ細胞へのNOドナー添加実験から,(7)NOドナー処理によって,核上細胞質に認められたクラスター様の蛍光像を示す細胞集団が減少していた.・培養セルトリ細胞へのNOドナーと受容体リガンドの添加実験から,(8)BDNF(100ng/ml)あるいはNGF(100ng/ml)をセルトリ細胞の培養系に添加した場合には,いずれにおいてもTrk-pan抗体と反応する146kDaタンパク質が明らかに増加した.(9)NOドナーの添加による146kDaタンパク質の減少は,BDNFやNGFが共存する事によって抑制された。以上の事から,精巣上皮細胞(セルトリ細胞)はNGF-R, TrkA, TrkBを発現し,これら受容体からのシグナルを介して精子形成の統御に関わっている事が示された.また,精巣における過剰のNO産生はセルトリ細胞の神経刺激因子受容体の発現に重篤な影響を与え,、受容体下流のシグナル伝達系制御に変調をもたらし,精子形成の統御の異常を惹き起こす可能性も示された.これに対して,受容体のリガンドであるNGFやBDNFといった神経刺激因子はNOのこうした影響を抑制し,精子形成の統御を維持する事が出来ることが明らかになった.本年度は研究計画に従い実験を進め,以下の結果を得た.(1)ラット精巣における神経成長因子(NGF),低親和性NGF受容体(p75NGF-R),高親和性NGF受容体(Trk)の局在性に関して:ラット(70日令)精巣の凍結超薄切片を作成し,免疫組織化学的染色を行なった.その結果,精母細胞,精細胞にNGF陽性の染色が認められ,セルトリ細胞には微弱ながらp75NGF-Rの陽性の蛍光シグナルが検出された.また,Trk-pan抗体(TrkA,B,Cを認識)による染色でも,微弱な陽性シグナルがセルトリ細胞上に検出された。(2)培養セルトリ細胞におけるp75NGF-R,Trk(A,B,C)の局在性に関して:

高純度セルトリ細胞の培養系を用いて,p75NGF-RとTrksの発現を免疫細胞化学的染色により検討した.Trk-pan抗体により,非常に微弱ではあるが,セルトリ細胞の細胞質に陽性のシグナルを認め,上記組織染色実験の結果がin-vitro培養系でも再確認出来た.しかし,p75NGF-Rについては明瞭な蛍光染色像は得られなかった.(3)セルトリ細胞におけるp75NGF-R,Trk(A,B,C)の発規に対するNOの影響に関して:培養セルトリ細胞をNOC18(NOドナ-,400μM)含有培地で24時間培養した後,セルトリ細胞の可溶性画分,またはtotal RNAサンプルを調製し,Trks,p75NGF-Rのタンパク質とmRNAの発現変動を解析した.その結果,Trk-pan抗体によるウェスタン解析から,主要バンドの146kDaの免疫反応バンドがNO添加によって減少することを認めた.また,p75NGF-R抗体による解析では,76kDaの反応バンドが認められたが,このバンドはNO処理によって僅かではあるが減少した.一方,p75NGF-R,TrkA,TrkBのmRNA発現をRT-PCR解析により確認することできた.この事から,上記のTrk-pan抗体を用いた免疫染色実験で得られたシグナルは,TrkA,TrkB,によるものと考えられる.また,NO処理したセルトリ細胞では,p75NGF-R,TrkBのmRNAが減少している傾向が認められ,ウェスタン解析におけるタンパク質量の変動と矛盾のない結果であった.以上のことから,精巣上皮細胞(セルトリ細胞)はp75NGF-R,TrkA,TrkBを発現し,これら受容体からのシグナルを介して精子形成の統御に関わっている事,また,精巣での過剰のNO侵襲はこれらの受容体発現に重篤な影響をもたらす可能性が示された.本年度は研究計画に従い実験を進め,以下の結果を得た.発達段階(幼若期/16-20日令,思春期/45-50日令,成熟期/70-90日令)の異なるラット精巣におけるNGF,NGF-R(p75),Trk(A,B,C)の発現と局在性の日齢による変化を免疫組織化学的方法によって検討した.NGFの染色陽性反応は,生殖細胞系(特に精母細胞,精細胞)に認められ,NGF-R(p75),TrkA,TrkBの染色反応は微弱ながらセルトリ細胞に認められた.しかし,日齢による発現変動などは明瞭には捉えられなかった.また,NOドナーを精巣内に局所的に投与し,それらの発現への影響を調べたが,今回の実験条件下では明確な差としては捉え切れず,条件設定などを再考し継続中である.高純度の幼若ラットセルトリ細胞の培養系を用いてにおいて,セルトリ細胞におけるNGF-R(p75),Trk(A,B,C)の発現を検討した.NGF-R(p75),TrkA,TrkBの蛍光染色像は,それぞれ細胞表面全体(細胞膜上)に分布している細胞集団と核上細胞質にクラスター様の被覆小窩取り込みを示す細胞集団が認められた.NOドナー処理後には,核上細胞質に認められたクラスター様の蛍光像を示す細胞集団が減少していた.このことから,外因性の高濃度NOはセルトリ細胞上のNGF-R(p75),TrkA,TrkBなどの受容体取り込みに影響を与える可能性が考えられる.今後はリガンドの受容体への結合やリガンド・受容体複合体の細胞質えの取り込みに対するNOの影響を見極める必要がある.(3)セルトリ細胞におけるNGF-R(p75),Trk(A,B,C)の発現に対するNOの影響:セルトリ細胞の培養実験において,NGF-R(p75),Trk(A,B,C)のタンパク質とmRNAの発現変動をウェスタンブロット解析ならびにRT-PCR解析実験により検討した.
脳動脈瘤の増大、破裂機序:細胞外マトリックスの変動に関する研究

1ヒト脳血管と脳動脈瘤における細胞外マトリックスの分布と発現2ラットに作成した実験動脈瘤における実験ラットに血流負荷、高血圧処理を行い9-10ヶ月後に灌流固定、脳動脈を取り出して観察した。実験は処置の条件を変えながら6回行った(各群n=15)。至適条件にて40-50%に脳動脈瘤が作成された。
大振幅不規則短波頂中の船体運動計測・解折システムの開発

実験水槽における波浪中船体運動計測は、理論の検証だけでなく、理論で予測できない現象をとらえると言う意味でも重要である。一方、造波装置の進歩により不規則な短波頂波の造波が可能になり完全に実海面を模擬した波浪中での実験が可能になりつつあるが船体の大振幅平面運動状態をも含む様な大変位の6自由度運動の計測方法についてはまだ確立されているとは言いがたい。そこで本研究では不規則短波頂波中での大振幅の6自由度船体運動を光学的な手法で計測する方法の開発を第一目的とし、更に計測結果の解析をも含めた1つのシステムを作りあげることを第2の目的とした。初年度は遠隔式測定装置を製作した。即ち変位を計測する手法としては無コード型の光学的センサーを使用し6自由度の船体運動を計測しうるようにした。変位のデターはデジタル量として記録し、その後の解析に便ならしめる様に配慮した。次に本年度は2年計画の最終年度であり先ず前年度作製したシステムによって得られたデジタルの座標データから6自由度の運動を得るプログラムを開発した。これをリアルタイムで実行するには計算量が多くなり高速演算が必要である。従ってそのために専用の解析装置を購入し、かつその解析ソフトも開発した。その上で平水中及び波浪中の模型実験を実施し速度変動も含めて検証した。模型としては走航状態の例として自由航走肥大船、の他に停止状態の例として海洋構造物のモデルを使用した。波浪は長波頂の規則波、不規則波の他に方向スペクトル波を使用した。その結果船体等の大振幅運動変位を計測、解析する本手法の妥当性を確認し本研究の目的の大略は達成された。実験水槽における波浪中船体運動計測は、理論の検証だけでなく、理論で予測できない非線型な現象をとらえると言う意味でも重要であることは言うまでもない。一方、本学での開発による造波装置の進歩により不規則な短波頂波の造波が可能になり完全に実海面を模擬した波浪中での実験が可能になりつつあるが大振幅の6自由度運動の計測方法についてはまだ確立されているとは言いがたい。そこで本研究では大振幅不規則短波頂波中での大振幅の6自由度船体運動を光学的な手法で計測する方法の開発を第一目的とし、更に計測結果の解析をも含めた1つのシステムを作りあげることを第2の目的としている。船体運動を実際と同じ状態で捉えるには無拘束の状態が良いことは明かである。ところで従来のジンバル等を用いて船体運動を計測する方法では回転軸などにある程度の拘束を与える事になり、特に微妙な横運動の計測ではフリ-に近いとは言い難かった。本年度はこの点を特に考慮して遠隔式測定装置の部分を計画し製作、購入した(本年度備品費による)。変位を計測する手法としては非接触型の光学的センサ-等を使用し6自由度の船体運動を計測しうるようにした。又、そのような計測を可能ならしめるにはデ-タ間の相互の高速演算が必要となるので、変位のデ-タ-はデジタル量として記録し、その後の解析に便ならしめる様に計画した。更に新たに製作した装置を用い、実際に波浪中での運動を計測しデジタルデタ-を得た。前年度は遠隔式測定装置を製作した。即ち変位を計測する手法としては非接触型の光学的センサーを使用し6自由度の船体運動を計測しうるようにした。又、そのような計測を可能ならしめにはデータ間の相互の高速演算が必要となるので、変位のデターはデジタル量として記録し、その後の解析に便ならしめる様に配慮した。

次に本年度(平成4年度)は2年計画の最終年度であり、先ず前年度作製したシステムによって得られるデジタルの座標データから6自由度の運動を得る式を導出し、それに基づいて計算プログラムを開発した。その為の手法の1つとしては時々刻々とキャリブレーションをするシステムとした。これをリアルタイムで実行するには計算量が多くなり高速演算が必要である。従ってそのために専用の解析装置を購入し、かつその解析ソフトを開発した。その上でこれらを確認するために、平水中及び波浪中の模型実験を実施しさらに実際のデーターを得た。使用模型としては走航状態の例として肥大船の他に停止状態の例として海洋構造物のモデルを用いた。波浪は長波頂の規則波、不規則波の他に方向スペクトル波を使用した。なお実験水槽、方向スペクトル造波装置およびモデルは現有のものを使用した。又、実験時には8ミリカメラ、ビデオカメラなども併用してシステム全体の精度を確認し実験データの信頼性をチェックした。
生殖腺刺激ホルモン合成の撹乱を介した環境ホルモンの生殖機能への影響解析

性ホルモンは生殖腺刺激ホルモン(FSH, LH)合成の重要な調節因子である。そのため、性ホルモン様作用をもつ化学物質がGTH合成の撹乱を介して生殖腺の発達に影響を及ぼす可能性がある。本研究課題ではこれまで、ビスフェノールA(BPA)およびp-ノニルフェノール(NP)のGTH合成に対する影響を解析してきたが、その程度は非常に小さいものであった。この結果は、ある程度成長した個体のGTH合成に対するEDCsの影響はさほど大きくないことを示唆している。そこで本年度は、性分化期における女性ホルモンおよびEDCsの曝露が成長した個体のGTH合成にどのような影響を及ぼすのかを遺伝的コイ全雄群を用いて解析した。2001年および2003年に雄性発生により作出した超雄(YY)と通常雌(XX)との交配により遺伝的全雄(XY)コイ個体群を作成した。孵化後約1ヶ月目から6ヶ月間、薬剤(エストラジオール-17β(E2)あるいはNP)をそれぞれ種々の濃度で含有させた餌を与えることにより曝露を行った。曝露終了後は薬剤無添加の餌を与え、通常条件にて飼育した。2003年の個体群については曝露期間中および期間後、2001年の個体については2年後の生殖腺発達が認められる期間にそれぞれサンプリングを行い、FSHβおよびLHβmRNAの発現レベルを測定した。稚魚期(性分化期)の個体へのNPあるいはE2の曝露により、LHβmRNA発現量が曝露薬剤の濃度依存的に増加した。この結果は、これまで成魚を使った試験により得られた結果とほぼ同様であり、性分化期の個体の生殖腺刺激ホルモン合成にもこれら物質が影響を及ぼすことが明らかとなった。2001年度の曝露個体を解析した結果、NP投与群でLHβおよびFSHβmRNA発現量の双方が(特にFSHβmRNA発現量)対照群と比較して低レベルであった。同様の解析において、E2曝露群ではそのような変化は認められなかった。これは、NPの持つ高い毒性が脳下垂体のGTH産生細胞等に何らかの不可逆的影響を及ぼした結果である可能性が考えられた。生殖腺刺激ホルモン(GTH : FSHおよびLH)の合成は、多くの内分泌因子によって調節されているが、性ホルモンがその重要な因子の一つであることはよく知られている。そのため、性ホルモン作用を示す内分泌攪乱化学物質(EDCs)によってその合成量が撹乱される可能性が高い。そのため、EDCsの直接的な影響のみならず、GTHの合成・分泌撹乱を介した間接的な生殖機能への影響も予想される。昨年度我々は、コイ(Cyprinus Carpio)のGTH合成、特にLH合成に及ぼすビスフェノールA(BPA)およびp-ノニルフェノール(NP)の短期曝露(一回投与)の影響を解析した。その結果、未熟期および成熟初期の個体において、非常に弱いながらもそれら物質がLH合成量を増加させることを明らかにした。本年度は、それら化学物質の継続曝露(複数回投与)のLH合成に及ぼす影響を明らかにした。BPAの反復投与では、LHβmRNA量は僅かながら増加したが、その増加度合は昨年度に報告したBPAの一回投与の結果と殆ど変わらない程度の弱いものであった。一方、NPの反復投与では、LHβmRNA量に有意な変動は認められず、昨年報告したNPの一回投与の結果と異なるものであった。これら本年度の結果と昨年度までの結果を考え併せると、NP投与によるLH合成への影響は、その投与の頻度および期間(生体内濃度)の違いによって異なることが示唆された。2001年度の曝露個体を解析した結果、NP投与群でLHβおよびFSHβmRNA発現量の双方が(特にFSHβmRNA発現量)

対照群と比較して低レベルであった。同様の解析において、E2曝露群ではそのような変化は認められなかった。これは、NPの持つ高い毒性が脳下垂体のGTH産生細胞等に何らかの不可逆的影響を及ぼした結果である可能性が考えられた。
高炉スラグ高含有セメントコンクリートの温度ひび割れ制御技術の確立

本研究では,高炉C種セメント(BC)コンクリートの温度ひび割れ抵抗性を明らかにすべく,拘束応力を支配する見掛けの線膨張係数に注目し,炭酸カルシウムや石膏などの少量混合成分の増量により,これを大幅に低減できることを見出した。さらに,BCコンクリートの水和物の定量分析を行い,特に温度履歴ピーク後において,自己収縮を増大させ見掛けの線膨張係数を増大させるモノサルフェートの生成を抑制する材料構成を見出し,ひび割れ抵抗性をさらに高めたBCコンクリートを提案した。また、線膨張係数の時間変化について検討し,時間依存性について数式化を行い,温度応力を精度よく予測できる3次元FEM解析方法を初めて提案した。本研究では、高炉スラグを高含有した高炉セメントC種によるコンクリート(BCコンクリート)のマス部材を対象に、高い環境性能に加え耐久性に富むRC躯体を実現すべく、物理的視点に加え化学的アプローチに基づき最適化を可能とする温度ひび割れ制御手法の構築を目的とする。本研究の目標は、i)温度ひび割れ抵抗機構の定量評価と構成則の提案、ii)初期水和機構の解明と温度ひび割れ抵抗性向上に資する材料構成の最適化、iii)温度ひび割れ制御設計法の構築とその妥当性の検証で、これらを国内外に先駆け達成することで高炉セメントの利用拡大を図り、建設工事の環境負荷低減へ貢献する。初年度となる平成27年度では、上記i)に関連する検討実験および解析を実施した。温度応力拘束試験装置(TSTM)を用いた実験結果から、少量混合成分である石こうおよび炭酸カルシウムを増量したBCコンクリートの温度ひび割れ抵抗性が普通コンクリートと比較して優れていることを定量的に明らかとした。この要因として、初期高温履歴を受けるマス部材の温度・自由ひずみ測定実験により、発熱が小さいことに加え、自己収縮の影響を含む見掛けの線膨張係数が小さいことが大きく貢献していることを見出した。また、温度ひび割れ挙動を解析的に再現するために必要なクリープについて、若材齢クリープ実験結果に基づき数値モデルを提案した。線膨張係数の部材寸法依存性については実験を継続中で、H28年度には引き続き水分分布が及ぼす影響を考慮した前記依存性を解明する計画である。概ね当初計画に基づき順調に進展しており、BCコンクリートの温度ひび割れメカニズムに関する新しい知見や構成則のデータが抽出され、本研究の最終目標に繋がる研究実績が得られている。■初期水和機構の解明と温度ひび割れ抵抗性向上に資する材料構成の最適化本年度は、高炉C種セメント(BC)の初期水和機構を詳細に検討し、セメントの材料構成が異なる場合に、温度ひび割れ抵抗性に与える影響を明らかにした。温度ひずみおよび温度応力を支配する見掛けの線膨張係数は、高炉B種セメント(BB)コンクリートに比べ、炭酸カルシウムや石膏などの少量混合成分を増量することで、大幅に小さくできることを定量的に明らかとした。また、線膨張係数の時間変化についても検討し、前記最適化により、温度応力が急増する温度下降の初期に線膨張係数の増大を遅延させることで応力緩和が可能であることが分かった。さらに,BCコンクリートに初期高温履歴を与え、温度履歴の時系列に沿ってX線回折法(XRD)に基づくリートベルト解析を用い水和物の定量分析を行い、特に温度履歴ピーク後において,自己収縮を増大させ見掛けの線膨張係数を増大させるモノサルフェートの生成を抑制する材料構成を見出し、ひび割れ抵抗性をさらに高めたBCコンクリートを提案した。以上の実験結果からBCセメントの材料構成の最適化により、線膨張係数と温度変化の積の時間累加として表される温度ひずみを抑制し、BCコンクリートの温度ひび割れ抵抗性を大幅に向上させる見通しを得た。■構造体コンクリートの確保さらに,強度発現についても追加的に検討し,構造物に使用した場合の構造体コンクリート強度を確保するための補正値についても実験的に明らかとし,実適用に際しての課題を解決した。当初計画に基づき成果を創出しており,温度ひび割れを抑制するため最適化した材料構成を提案し,温度ひび割れに関する諸物性を把握した。また,BCコンクリートの実適用に際して重要な課題である構造体コンクリート強度の確保についても実験的に把握し,高い信頼性で同強度を確保するための補正値を提案した。これらは本研究の最終目標につながる重要な知見である。また,BCコンクリートの水和物の定量分析を行い,特に温度履歴ピーク後において,自己収縮を増大させ見掛けの線膨張係数を増大させるモノサルフェートの生成を抑制する材料構成を明らかとし,ひび割れ抵抗性をさらに高めたBCコンクリートを提案した。さらに,線膨張係数の時間変化について検討し,時間依存性について数式化を行うとともに,新しいクリープモデルを構築することで,温度応力を精度よく予測できる3次元FEM解析方法を初めて提案した。強度特性についても追加的に検討し,構造物に使用した場合の構造体コンクリート強度を確保するための補正値についても実験的に明らかとし,実適用に際しての課題を解決した。以上の実験結果からBCセメントの材料構成の最適化により、線膨張係数と温度変化の積の時間累加として表される温度ひずみを抑制し、BCコンクリートの温度ひび割れ抵抗性の大幅向上が可能で,その抵抗性を事前に解析にて定量的に精度よく予測できる見通しとなった。このことは,環境影響低減に大きな効果を有するBCコンクリートの普及拡大に向け,実務的に重要な後押しとなると考えられる。

本研究では,高炉C種セメント(BC)コンクリートの温度ひび割れ抵抗性を明らかにすべく,拘束応力を支配する見掛けの線膨張係数に注目し,炭酸カルシウムや石膏などの少量混合成分の増量により,これを大幅に低減できることを見出した。さらに,BCコンクリートの水和物の定量分析を行い,特に温度履歴ピーク後において,自己収縮を増大させ見掛けの線膨張係数を増大させるモノサルフェートの生成を抑制する材料構成を見出し,ひび割れ抵抗性をさらに高めたBCコンクリートを提案した。また、線膨張係数の時間変化について検討し,時間依存性について数式化を行い,温度応力を精度よく予測できる3次元FEM解析方法を初めて提案した。H28年度目標:初期水和機構の解明と温度ひび割れ抵抗性向上に資する材料構成の最適化H28年度は、BCコンクリートの初期水和機構を詳細に検討し、温度ひび割れ抵抗性に及ぼすセメントの材料構成の影響を明らかにする。温度ひずみおよび温度応力を支配する見掛けの線膨張係数は、高炉B種セメント(BB)コンクリートに比べ、炭酸カルシウムや石こうなどの少量混合成分を増量することで、大幅に小さくできることが初年度の実験から示唆されている。これを受け、BCコンクリートに初期高温履歴を与え、温度履歴の時系列に沿って水和物の定量分析を行う。水和物分析には、X線回折法(XRD)に基づくリートベルト解析を採用する。特に温度履歴ピーク後のエトリンガイトとモノサルフェートの生成量が焦点であり、自己収縮を増大させ見掛けの線膨張係数を増大させるモノサルフェートの生成を抑制する材料構成を見出し、ひび割れ抵抗性をさらに高めたBCコンクリートを実現することを目指す。また、この最適化BCコンクリートについては、TSTMにより温度ひび割れ抵抗性を定量評価し、その効果を実験により検証する。以上の実験および解析の結果から見込まれる材料構成の最適化により、線膨張係数と温度変化の積の時間累加として表される温度ひずみを抑制し、BCコンクリートの温度ひび割れ抵抗性の向上に資することを目標とする。■温度ひび割れ制御設計法の構築とその妥当性検証2016年度までの成果に基づき、温度ひび割れ制御設計法を構築する。設計法は、クリープ係数、見掛けの線膨張係数をはじめとするBCコンクリートの温度応力解析のための構成則を組み込んだ非線形FEMを基礎とする。提案する設計法の精度を明らかにするため、実大部材による妥当性検証実験を実施する。検証実験では、実際のマス部材の断面内の温度に加え無拘束ひずみと実ひずみ(拘束された状態のひずみ)を計測する。併せて、既存材料と比較するため、既存コンクリートおよびBCコンクリートで同一断面の模擬部材を製作し同様に計測を行って、その結果からひび割れ抵抗性の定量比較を行う。さらに、計測されたデータをもとに、提案する設計法を適用し、温度応力解析に基づく応力強度比ηを算定する。さらには、ηと実際のひび割れ状況の比較から、設計の妥当性を明らかにすることを目指す。29年度が最終年度であるため、記入しない。
リピート長制御によるトリプレットリピート病の新規治療法の開発

トリプレットリピート病は3塩基繰り返し配列(リピート)の異常伸長が原因であり、リピートが長いほど重症となる。このリピートは年齢とともにさらに伸長し、症状の進行に寄与している。従って、リピート長を制御することは、治療の観点からも重要となる。今回われわれは、こうしたリピートの伸長機構解明と、リピート長を安定化あるいは短縮させる治療法の開発を目的に研究をおこなった。この結果、リピート病モデル細胞および患者由来iPS細胞を用いて、リピートの伸長に影響を与える因子を同定した。また、リピート長を安定化・短縮させる化合物を見出し、細胞モデルでの効果も実証しており、将来の臨床応用が期待できる。ハンチントン病や筋強直性ジストロフィーなどのトリプレットリピート病では、CAGやCTGといった3塩基繰り返し配列(リピート)が異常に伸長しており、そのリピート長は症状の重症度と比例する。これらトリプレットリピート病患者では、年齢とともにリピート長がさらに伸長することにより、症状が進行するとされる。こうした症状進行の原因となるリピート伸長機構を解明するため、800のCTG・CAGリピートを持つヒト細胞モデル(HT1080)を用いて、リピート不安定性に関与する因子をそれぞれsiRNAにより抑制し、リピート長の変動をsmallpool PCR法により解析した。この結果、ヘアピン構造をとるリピート部分でのDNA・DNAミスマッチ形成を修復する蛋白であるMSH2やMSH3が、リピート長の数百にわたる大きな伸長を促進することが判明した。また、このような大きなリピート長の伸長を抑制できれば、トリプレットリピート病の進行を抑制することが可能となることから、ミスマッチ修復蛋白の作用を阻害する低分子化合物の効果も検証した。上述の800リピートを持つHT1080細胞モデルへ、ミスマッチ修復抑制作用をもつ低分子化合物を投与すると、リピートの伸長が予防できることを確認した。本年度の研究実績から、こうした作用をもつ低分子化合物は、トリプレットリピート病のリピート長のさらなる伸長を防ぎ、症状の進行を抑制する、新たな治療薬となる可能性が示された。本研究では、こうした症状進行の原因となるリピート伸長機構を解明し、その制御を可能にすることでトリプレットリピート病の治療を目指している。今年度は、前年度に同定したリピート伸長に関与する因子が、DNA修復機構に及ぼす影響を検証した。またこうしたDNA修復蛋白、特にミスマッチ修復蛋白の作用を阻害するリピート結合低分子化合物による、リピート伸長抑制効果をHT1080細胞モデルならびにハンチントン病患者由来細胞で実証した。さらに、Slipped strand DNA構造をとるプラスミドを用いて、低分子化合物によるリピート伸長抑制効果は、リピート部分の転写の際に生じるミスマッチ修復を抑制することによることを明らかにした。また、こうしたリピート伸長抑制効果は、異常伸長リピートに特異的であり、遺伝子の各所に存在する通常の長さのリピートには変化を及ぼさないことも確認した。リピート結合性低分子化合物の細胞モデルでの検証は非常に順調に進み、その効果を短期間で実証した。また、今年度はin vitroプラスミドモデルを用いたリピート長変動機構の解明に重点的に取り組んだが、こちらも順調に推移し、DNA転写機構の関与を明らかにした。さらに、siRNAを用いたノックダウンにより、リピート短縮因子であるsenataxin(SETX)の同定にも成功した。前年度までに異常リピートの伸長を抑制する低分子化合物を同定していたが、今年度は異常伸長リピートの短縮を誘導する化合物を新たに同定した。本化合物投与により、800ものCAG・CTGリピートをもつHT1080細胞モデルで異常伸長リピートの短縮効果を実証した。In vitroのアッセイ系での評価により、低分子化合物によるこうしたリピート短縮作用は、DNA修復機構を介してなされることも解明した。本年度の研究実績から、異常リピート短縮作用をもつ低分子化合物は、トリプレットリピート病のリピート長のさらなる伸長を防ぐだけでなく、究極的にはリピート長を正常化させ疾患の根治にいたる、新たな治療薬となる可能性が示された。さらに、リピート結合性低分子化合物であるアクチノマイシンDやヘプタミジン(ペンタミジン誘導体)、エリスロマイシンには、異常RNAの毒性を低減させる作用があることも筋強直性ジストロフィー細胞モデル、マウスモデルで証明した。異常リピートの伸長を抑制するだけでなく、よりリピート病への治療効果の高い、リピート短縮を誘導する低分子化合物を同定することができた。細胞モデルでの検証は非常に順調に進み、その効果を実証した。

これらトリプレットリピート病患者では、年齢とともにリピート長がさらに伸長することにより、症状が進行するとされる。本研究では、こうした症状進行の原因となるリピート伸長機構を解明し、その制御を可能にすることでトリプレットリピート病の治療を目指している。今年度は、筋強直性ジストロフィー患者由来iPS細胞を用い、骨格筋や心筋、および神経細胞へ分化誘導することで、リピートの伸長機序を解明した。前年度までに同定した、異常伸長リピートの短縮を誘導する低分子化合物を投与することにより、ハンチントン病患者由来細胞で異常伸長リピートの短縮効果を実証した。こうしたリピート短縮効果は、異常伸長リピートに特異的であり、遺伝子の各所に存在する通常の長さのリピートには変化を及ぼさないことも確認した。さらに、in vitroでのbinding assay, repair assayなどにより、リピート短縮にかかわるDNA修復蛋白を同定した。またすでに、こうした低分子化合物の動物モデルへの投与も開始しており、順調に治療効果の解析も進んでいる。本年度の研究実績から、異常リピート短縮作用をもつ低分子化合物は、トリプレットリピート病のリピート長のさらなる伸長を防ぐだけでなく、究極的にはリピート長を正常化させ疾患の根治にいたる、新たな治療薬となる可能性が示された。トリプレットリピート病は3塩基繰り返し配列(リピート)の異常伸長が原因であり、リピートが長いほど重症となる。このリピートは年齢とともにさらに伸長し、症状の進行に寄与している。従って、リピート長を制御することは、治療の観点からも重要となる。今回われわれは、こうしたリピートの伸長機構解明と、リピート長を安定化あるいは短縮させる治療法の開発を目的に研究をおこなった。この結果、リピート病モデル細胞および患者由来iPS細胞を用いて、リピートの伸長に影響を与える因子を同定した。また、リピート長を安定化・短縮させる化合物を見出し、細胞モデルでの効果も実証しており、将来の臨床応用が期待できる。ヒト細胞モデルHT1080での、siRNAを用いたリピート不安定性に関与する因子のノックダウンにより、MSH2やMSH3などのミスマッチ修復蛋白を始めとした、当初の予想を超える数のリピート伸長促進因子、短縮促進因子を同定することができた。また、CAGヘアピン結合低分子化合物であるNAの作用についても、in vitroプラスミドモデルでのミスマッチ修復蛋白結合抑制効果の確認や、蛍光標識化合物による細胞への核内移行性の確認を終え、細胞モデルでのリピート長伸長抑制効果も実証することができた。さらには当初予定していたとおり、クロマチン免疫沈降法により、細胞モデルでのNAによるミスマッチ修復蛋白結合作用の抑制効果も確認された。
細胞リプログラミングによる新しいがんワクチン開発

近年、自己複製能を持ち多分化能を有するがん幹細胞の存在が提唱されている。がんの新しい治療法を考えた場合、このがん幹細胞を標的にすることは非常に高い効果が期待される。本研究ではがん幹細胞の免疫学的特性を分析した。マウスグリオーマ幹細胞と非幹細胞の比較に置いて、前者においてMHC class Iの発現が高い事を見出した。同分子はNK細胞の抑制因子として知られる。そこで、NK細胞による細胞傷害試験を行うと、前者の方が殺されにくかった。即ち、がん幹細胞はNK細胞の機能を抑制する事でその腫瘍形成能を獲得している可能性が考えられた。近年、細胞の分化状態は以前考えられていたよりも比較的容易に制御可能である事が分かって来た。その最たるものがiPS細胞であるが、がん細胞についても同様に分化状態を変更できるかどうか検討して来た。iPS細胞を作成するのに使われる転写因子をがん細胞株に導入した場合、形態の変化や幹細胞マーカーの発現は見られたが、完全な理プログラミングは困難であった。一方、がん細胞の分化状態を適切に制御する事で、がん免疫を増強する事が出来ないかどうか検討して来た。我々はマウス脳腫瘍の株を入手し、その亜系の一つはがん幹細胞として働く事、もう一つは腫瘍形成能がないことを確認した。これらの細胞の発現する免疫関連分子を検討すると、前者でMHC class Iが比較的高く発現している事が判明した。MHC class IはNK細胞の抑制を担う分子として知られる。がん幹細胞様の細胞は、NK細胞を抑制する事で生体内で腫瘍形成能を発揮している事が示唆された。実際、試験管内の細胞傷害試験を行うと、がん幹細胞様の細胞の方がNK細胞による細胞傷害に対して抵抗性であった。同細胞をマウス生体に投与して腫瘍形成を見た。この時に抗アシアロGM1抗体でKN細胞を除去する群を作製した。しかし、予想に反して、NK細胞の有無は生体における腫瘍形成頻度に影響を与えなかった。現在、NK細胞以外の免疫細胞による影響を見るべく、同様の細胞除去実験を行っている。近年、細胞の分化状態の可塑性について新たな知見が集積している。その最たるものはiPS細胞に代表されるリプログラミングであり、理論的には細胞を様々な分化状態へ変化させることが可能になることも予想される。がん細胞についても同様であり、近年、自己複製能を持ち多分化能を有するがん幹細胞の存在が提唱されている。また、がんの新しい治療法を考えた場合、このがん幹細胞を標的にすることは非常に高い効果が期待される。そのひとつの方策として、がん幹細胞を得意的に認識しこれを攻撃するような新しい免疫細胞療法の可能性を探ることを考えた。先ず、がん細胞のなかでも幹細胞マーカーと言われる分子や形質を示す画分を抽出し、これを直接抗原提示細胞(樹状細胞)に変化させることを考えた。幹細胞マーカーとしてはCD133やSPを用い、それらを抽出した。そしてCEBPaやPu.1と言った転写因子を細胞に導入することで抗原提示細胞様に変化するかどうか検討した。しかし、細胞の分化転換は予想以上に困難であり、遺伝子導入の効率の改善法などについて検討した。陽性コントロールと考えられるB細胞にこれらの遺伝子を導入したが、報告例ほどの変化は認められなかった。同時期に、我々はマウスグリオーマ細胞を数種類入手した。これらのうち2つの細胞株は同じ細胞から分化したものであるが、一方は少ない数でも腫瘍を形成するというがん幹細胞の性質を持つものであった。それらの遺伝子発現を検討すると、免疫系に関する分子発現が大いに異なることを発見した。それらは、ある種の幹細胞関連転写因子の遺伝子導入により減弱したり増強することが判明した。今後はこれらの細胞を用い、がん幹細胞性を規定する遺伝子と免疫系分子の発現の相関について検討を行う。当初計画していた細胞を用いた実験では遺伝子導入と形質転換が予想に反しうまく行かなかった。しかし、がん幹細胞、幹細胞関連遺伝子、免疫抑制分子を繋ぐと思われる興味深い細胞を見出した。当初の計画通りではないが、がん幹細胞と免疫を繋ぐ研究として再スタートを切ったと考えており、やや遅れているという評価だ。新たに見出した、がん幹細胞を免疫系観点から規定する可能性のある細胞の解析を進め、がん幹細胞が生体内でどのように免疫系に認識されどのように攻撃されるのか検討を進める。がん幹細胞が免疫系を抑制し、そのために少数の細胞でも生着するという機構が発見されれば、その抑制分子を阻害するという治療戦略も考えられ、その分子メカニズムの解明を行う。該当なし
光回復に着目した紫外線ストレスに対するハダニ類の生理的適応戦略の解明

太陽光中の中波長の紫外線(UVB)は生物に様々な影響を及ぼす。最近の研究により、植食性のダニであるハダニ類に対してもUVBが生存率低下や産卵数減少等の様々な影響を及ぼす事が明らかとされた。特に、ナミハダニにおいてはUVBの生物影響が積算照射量に比例し、またUVB照射された個体の生存率が可視光照射によって回復する光回復効果と呼ばれる現象も確認されている。本研究ではこれらUVBによる損傷機構及びその修復機構の解明を目的として取り組んでいる。ハダニ類におけるUV損傷およびその修復等に関する生理機構が解明できれば、陸上の小型植食者のUV適応について大きな知見が得られると共に、農業害虫のUVBによる物理的防除を促す有用な知見となる可能性がある。昨年までの研究によりナミハダニにおけるUVBの悪影響および光回復効果が実証されたが、幼虫にUVB照射した際、照射直後では、形態的・行動的に正常であるかのように見られたが、その後の第一静止期において多数の個体が発育停止や脱皮失敗によって死亡した。これに関して、次ステージへの体形成における重要期にUVB悪影響が顕著に生じたためと考えている。UVBによる悪影響は水生生物やバクテリアなどを含め、多数報告されているがUVBによる発育・発生の時期特異的な死亡は知られていない。そこで最終年度である今年度は幼虫におけるUVB照射による静止期特異的死亡の実証を試みた。幼虫期にUVBを照射した個体の約80%が第一静止期で死亡し、静止期特異的死亡が実証された。さらに、RNA-seqによる網羅的遺伝子発現状況の比較によりトランスクリプトームの観点から発育ステージ特異的死亡の要因を探った所、UVB照射により多くのキューティクルプロテイン遺伝子発現が減少した。これより、静止期特異的死亡について脱皮発育における外骨格・表皮の代謝崩壊が主な原因の一つである可能性が示唆された。28年度が最終年度であるため、記入しない。ナミハダニを用いたUVB損傷と光回復の分子生理機構の解明を目的として取り組んできた。幼虫を用いて、UVB照射による生存への影響とUV特異的DNA損傷であるCPDsおよび6-4PPs量を検証した。その結果、UVBの積算照射量に伴って生存率は減少し、UVBが大きな致死効果を与える事が確認された。その際のUV誘発DNA損傷をELISAにより定量したところCPDs、6-4PPs共にUVBの積算照射量に伴って増加した。一方で、UVB照射後の幼虫に対し、可視光を照射したところ減少した生存率が大幅に回復した。暗黒条件下に置いた処理区では生存率は上昇しなかった事から、ナミハダニにおいて光回復効果がその生存に大きく寄与する事が改めて確認された。その際のUV誘発DNA損傷を定量したところ、CPDsはUVB照射後に減少したが、可視光存在下でより大幅に減少していた。これらから、UVBによって誘発されるCPDsと6-4PPsがナミハダニの生存に大きく影響する事が明らかとなった。さらにUV適応におけるDNA修復機構の関与を調査するため、CPDフォトリアーゼ遺伝子とNERのコア因子の一つであるXeroderma pigmentosum A(XPA)遺伝子のUVB・可視光照射前後の遺伝子発現をリアルタイム定量RT-PCRにより検証した。その結果、UVB照射処理および可視光の有無によってCPDフォトリアーゼ遺伝子発現量は変化しなかった。一方XPA遺伝子発現量はUVB照射によって上昇傾向が見られ、その後の可視光照射により暗黒条件下に置いた時よりも発現量は上昇した。この事から、可視光により生存率が回復する光回復の至近要因はPERによるCPDs修復のみでなくNERも寄与している可能性がある。これらは、陸上の小型植食者のUV適応に関する有用な知見であると共に、農業害虫のUVBによる物理的防除を促すと考えられる。昨年度の研究ではナミハダニ幼虫におけるUVBによる死亡および光回復による生存率上昇とUV誘発DNA損傷(CPD・6-4PP)の関係について検証し、DNA損傷がハダニの死亡に大きく影響する可能性を示唆した。また、光回復効果の主要因であると考えられる光回復酵素(フォトリアーゼ)による反応(PER)および最も生物普遍的なDNA修復の一つであるヌクレオチド除去修復反応(NER)の寄与を検証するべく、フォトリアーゼ遺伝子、NERのコア因子XPA遺伝子の発現を検証し、光回復にはPERのみでなく、NERも寄与している可能性を見出した。当該年度はこれら昨年度までの成果を受け、フォトリアーゼ遺伝子発現に関する追加検証、フォトリアーゼ遺伝子発現における日周リズムの検証および当初計画していたRNA-seqによるUVB損傷メカニズムの検証を行った。当該年度では、昨年度までの成果を論文にまとめ投稿作業などを行った。