hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
リンパ浮腫を薬で治す！～DDS技術を駆使したVEGF-C徐放治療の開発

リンパ浮腫の治療法として、保存的治療やリンパ管静脈吻合などの外科的治療が行われているが、治療に難渋することが多い。そのため新たなリンパ管再生を含む有効なリンパ浮腫治療法が望まれる。血管内皮細胞増殖因子の一つであるVEGF-Cはリンパ管内皮を刺激したり、リンパ管内皮細胞の遊走を促進し、リンパ浮腫組織におけるリンパ管再生を誘導することが報告されている。本研究では、リンパ浮腫の効率的な治療の開発を目指し、リンパ浮腫組織におけるVEGF-Cの役割と、浮腫組織におけるVEGF-Cの発現調節に関わる因子を解析した。その結果,リンパ浮腫組織において炎症細胞と低酸素因子が関与していることが示唆された。リンパ管新生因子であるvascular endothelial growthfactor-C(VEGF-C)がリンパ浮腫の病態に及ぼす影響を評価・検討するために、マウス後肢リンパ浮腫モデルの作成を行った。リンパ浮腫組織を採取した後、リンパ管新生因子と血管新生因子の発現の変動をreal time PCRやウエスタンブロッティング法で解析し正常組織と比較した。マウスリンパ浮腫モデルでは、VEGF-Cの発現がRNAレベル、タンパク質レベルで亢進していることが確認された。リンパ浮腫の程度が強い場合、VEGF-Cが正常組織より有意に強く発現していることを確認した。リンパ浮腫の程度と、VEGF-Cの発現レベルが相関していることが示唆された。血管新生因子であるvascular endothelial growthfactor-A(VEGF-A)はリンパ浮腫組織において、正常組織と比較して有意な発現上昇を認めなかった。浮腫部位では、VEGF-Aを上昇させる虚血部位がないことが示唆された。VEGF-Cがリンパ浮腫組織の寛解において、どのような機能を果たしているかは十分に解明されていない。このことから今回、我々が作成したリンパ浮腫モデルにより、VEGF-Cが浮腫の改善に果たす役割を解明できる可能性がある。今後もリンパ浮腫モデルを用いて、VEGF-Cがリンパ浮腫の改善に及ぼす影響と、リンパ管新生の誘導についての研究を進行していく予定である。マウス後肢リンパ浮腫モデルにおいては、浮腫の程度に応じてVEGF-CやVEGFR-3などの内在性のリンパ管新生因子の発現が変動していることが確認できた。浮腫組織において拡張したリンパ管の増生を認めるが、上記の内在性のリンパ管新生因子の発現が、実際に鬱滞したリンパ液をドレナージするリンパ管の新生につながっているかは未だ不明である。VEGF-C単体投与のみでは、リンパ浮腫を改善させるための機能的なリンパ管を誘導することが困難であることを示唆する結果が得られている。リンパ浮腫は炎症を惹起し、炎症が慢性化すると浮腫の悪化や浮腫組織における線維化が進行するとされている。リンパ浮腫の基盤にある炎症プロセスの病態的意義については十分明らかとなっていないため、マウス後肢リンパ浮腫モデルを用いて、炎症性細胞の中で特にマクロファージがリンパ浮腫組織において果たす役割について検討した。リンパ浮腫を呈した後肢の皮膚組織を採取し、免疫組織学的染色、ウエスタンブロッティングによってマクロファージ(F4/80)の発現の解析を行った。また、VEGF-CとLYVE-1の発現解析も行い、炎症性病変とリンパ管新生の関連について検討を行った。マウス後肢のリンパ浮腫組織において対照群と比較してマクロファージが多く集積・浸潤していることが確認された。マクロファージが高度に浸潤している浮腫組織では対照群と比較してVEGF-CとLYVE-1の発現が有意に上昇していた。マクロファージはリンパ管新生因子であるVEGF-Cの産生に関与していることは過去報告されている。VEGF-Cによる刺激でリンパ管新生が起こった結果として、局所浮腫・炎症性細胞浸潤の消散や抗原提示細胞の移動が促進するとされている。今回得られた知見から、マクロファージ浸潤を含む炎症応答がリンパ浮腫の病態に大きく関与していることが示唆された。マクロファージ浸潤を含む炎症応答がリンパ浮腫の病態に大きく関与していることが示唆される結果を得ている。リンパ浮腫における炎症応答は、低酸素で誘導される因子とも密接な関係にあることを示唆する所見が得られつつある。炎症応答はリンパ浮腫における線維化も進行させる働きがあるため、リンパ浮腫における炎症プロセスを制御することで、鬱滞したリンパ液をドレナージする機能的リンパ管を誘導しやすい微小環境を構築できる可能性がある。上記のように、リンパ浮腫において生じる複雑な病態が解析されつつあり、本研究はおおむね順調に進展していると考えられる。リンパ浮腫とリンパ流鬱滞に暴露された組織において発現する因子を詳細に解析するため、浮腫が安定的かつ再現性のある状態で持続するマウス後肢リンパ浮腫モデルを作製して解析した。マウス後肢浮腫モデルは我々が報告した方法に準じて(Iwasaki, D. et al. Plast. Reconstr. Surg. 139, 2017)、作製した。主な改良点は以下の2つである。1)左膝窩領域、鼠径領域のリンパ節、リンパ管を含む脂肪組織を筋肉上で徹底的に切除した。この手術的操作は、リンパ管の再生を抑え、安定的に浮腫が持続することに寄与すると考えられる。2)従来のマウス後肢リンパ浮腫モデルの作製ではリンパ節の摘出を含む外科手術とともに左鼠径領域に放射線照射を施行していた。これは放射線照射により線維化を惹起して、浅リンパ管の再生を抑制することを目的としていた。

本実験のモデルでは、放射線照射によるマウスへの影響(骨髄抑制など)を考慮して施行していない。術後浮腫組織を採取して、リアルタイムRT-PCRとウエスタンブロッティングによる分子生物学的解析を行った。リンパ管新生において重要なVEGF-C/VEGFR-3 signalingはmRNAレベルとタンパクレベルで浮腫の程度に応じて変動していることが確認された。また、同様に浮腫を呈した後肢の皮膚・皮下組織を採取し、免疫組織学的染色、ウエスタンブロッティングによってマクロファージ(F4/80)と低酸素応答因子であるHIF-1αの発現解析を行った。浮腫の程度が強い組織において対照群と比較してマクロファージが多く集積・浸潤しており、且つHIF-1αの発現増加も確認された。これらの因子が発現するパターンはリンパ管新生因子の発現パターンに相関していた。今回得られた知見から、炎症応答と低酸素応答がリンパ浮腫の病態に大きく関与していることが示唆された。リンパ浮腫の治療法として、保存的治療やリンパ管静脈吻合などの外科的治療が行われているが、治療に難渋することが多い。そのため新たなリンパ管再生を含む有効なリンパ浮腫治療法が望まれる。血管内皮細胞増殖因子の一つであるVEGF-Cはリンパ管内皮を刺激したり、リンパ管内皮細胞の遊走を促進し、リンパ浮腫組織におけるリンパ管再生を誘導することが報告されている。本研究では、リンパ浮腫の効率的な治療の開発を目指し、リンパ浮腫組織におけるVEGF-Cの役割と、浮腫組織におけるVEGF-Cの発現調節に関わる因子を解析した。その結果,リンパ浮腫組織において炎症細胞と低酸素因子が関与していることが示唆された。ドラッグデリバリーシステムを用いたVEGF-C徐放治療の開発を行い、治療効果を判定する上で重要なマウス後肢リンパ浮腫モデルを安定的に作成することが可能となった。マウスリンパ浮腫モデルでは浮腫の程度によって、VEGF-Cの発現が変動していることが確認されている。この浮腫モデルを用いてVEGF-Cがリンパ浮腫の寛解に及ぼす影響を解析することが可能であることが示唆されており、今後のVEGF-Cの有効な投与方法が明らかになる可能性がある。よって、概ね研究は順調に進展しているといえる。VEGF-C単体投与のみでは、リンパ浮腫を改善させるための機能的なリンパ管を誘導することが困難である知見が得られつつある。機能的リンパ管を誘導するためには、炎症応答を基盤とするリンパ浮腫の病態を解析することが、まず重要であると考えられる。リンパ浮腫組織の微小環境におけるマクロファージを含む炎症性応答のメカニズムを解明することで、リンパ浮腫の治療につながる因子を同定していく。炎症に深く関わる転写因子であるnuclear factor-kappaB (NF-κB)の発現についても解析していく予定である。最終的には、機能的リンパ管の効率的な誘導を目標とする。唇顎口蓋裂、リンパ浮腫VEGF-Cを各種濃度でリンパ管内皮細胞の培養液中に投与し、MTT assayにより継時的に細胞増殖と生存率を測定する。
生命倫理に関する討論と生命倫理教育における生物学者の役割

1.第1422回生命倫理教育ネットワークの勉強会を東京都立日本橋高校と麹町高校で行った。毎回1530名の高校教師の参加を得た。生命倫理教育に関する議論を、高校教師ネットワークで継続的に行っており、現段階で2冊の本を出版した。3.バイオテクノロジーや生命倫理に関するアンケート調査が、日本全国の一般大衆と科学者を対象に行われ、1991年のデータをアップデートした。4.バイオテクノロジーに関するアンケート調査の分析結果を発表しており、これには、日本の高校生、科学者や一般大衆に対して行われたオープンコメント形式のアンケートの分析結果も含まれる。人々の理由付けを理解するために、オープンコメントの分析を続行する。これには、科学者が社会でどのような役割をになっていると感じているかの理解も含まれる。5.筑波大学において、1999年11月20-23日にわたって、第5回つくば国際円卓会議(TRT5)を開催した。参加した日本人科学者は60名、海外からの研究者は36名で、全体で19カ国からの参加であった。6.2000年10月27-29日に開催された第6回つくば国際円卓会議(TRT6)は、生命倫理、健康と環境について開かれた一連の会議(東京と福井でそれぞれ引き継がれた)の出発点であった。TRT6には日本人研究者が60名、海外研究者が46名参加した(全体で17ヵ国からの参加であった)。7.日本や海外の人とのインタビューを通じて、生物学者が生命倫理においてどのような役割をになっていると感じているかを論議する。この問題に関心を寄せる、研究者との国際的ネットワークが広がりつつある。8.この結果は日本人研究者、ならびに海外の研究者と論議を重ね、いくつかの会議において発表されている。すべてのプロジェクトの結果はインターネットを通じて公開されている。2)1999年の11月2023日に第五回つくば国際生命倫理円卓会議を開催した。海外から研究者40人、国内から60人が参加し、生命倫理と生物学者の役割について討論を行った。3)日本全国の科学者を対象に、バイオテクノロジーと生命倫理に関する自由回答形式のアンケートを郵送で行い、370の回答を得た(回答率24%)。(11月12月1999年)4)日本全国の一般の人々を対象にバイオテクノロジーと生命倫理に関する由回答形式のアンケートを行い300の回答を得た。5)現在、調査結果の集計、分析、及びその国際比較を行っている。6)高校生命倫理教育ネットワークの定期会合を引き続き行い、生命倫理教育に関する教師間の討論に加え、医学者などをゲストスピーカーとして招き、遺伝子治療や遺伝子スクリーニングについてセミナーを行った。1)生命倫理教育に関する議論を、高校教師ネットワークで継続的に行っており、現段階で2冊の本を出版した。2)バイオテクノロジーに関するアンケート調査の分析結果を発表しており、これには、日本の高校生、科学者や一般大衆に対して行われたオープンコメント形式のアンケートの分析結果も含まれる。3)日本や海外の人とのインタビューを通じて、生物学者が生命倫理においてどのような役割をになっていると感じているかを論議する。4)2000年10月27-29日に開催された第6回つくば国際円卓会議(TRT6)は、生命倫理、健康と環境について開かれた一連の会議(東京と福井でそれぞれ引き継がれた)の出発点であった。
地球温暖化防止における木材の循環利用に関する環境教育プログラムの実践研究

地球温暖化防止対策として,森林の保全および生物資源である木材の利用の有用性を理解することによって,地球温暖化防止活動への参画態度形成に貢献すると共に,資源循環型社会の構築のための基本的な知識を習得し,環境に調和した持続可能な資源循環型社会を実現するための実践的態度を育てることを目標とした学習プログラムに必要な教材・教具の開発およびそれらを使用した実践を通して,学習指導事例の有効性を検証した。地球温暖化防止対策として,森林の保全および生物資源である木材の利用の有用性を理解することによって,地球温暖化防止活動への参画態度形成に貢献すると共に,資源循環型社会の構築のための基本的な知識を習得し,環境に調和した持続可能な資源循環型社会を実現するための実践的態度を育てることを目標とした学習プログラムの充実,改善を目的として,学習プログラムに沿った様々な学習指導例を立案すると共に,その実施に必要な教材教具の開発を行い,この実践を通して,立案した学習指導事例の有効性の検証を行った。まず,地球温暖化防止に貢献する木質資源の循環利用に関する基本的な事柄について知るための児童向け学習教材として制作したDVD教材「木の力」地球温暖化防止と木材利用を用い,小学校5年生(120名),中学校1年生(180名),高校1年生(73名)を対象に授業を行った結果,地球温暖化防止対策としての二酸化炭素排出量の削減に貢献する森林の役割と木材利用の意義についての知識が得られたことが確認された。さらに,今後の行動意欲として,主に樹木を植えることや,木製品を大切に使うことの意識が得られたことが明らかとなった。そこで,この結果を踏まえ,木製品を大切に長く使う行動実践を促すために,環境保全と宮崎の木材利用に関する学習と宮崎県産スギ材を用いたものづくりを組み合わせた実践を行った。その結果,環境保全に役立つ木材利用の意義について理解したことを日常行動に活かす学習内容として,木によるものづくり活動の有効性が示唆された。地球温暖化防止における木材の循環利用に関する環境教育プログラムの実践例として,これまで制作した教材「木の力」を用い,小学,中学,高校生を対象に授業を行った。その結果,地球温暖化防止対策としての二酸化炭素排出量の削減に貢献する森林の役割と木材利用の意義についての基本的な知識が得られ,この教材の有用性に対する評価は高い結果であった。また,今後の行動意欲としては,主に樹木を植えることや,木製品を大切に使うことの意識づけができた。しかし,今後の木材を正しく利用し環境を守る行動に結びつくかどうかの評価については低い傾向にあり,具体的な木材利用の行動について例示する必要性が示唆された(地球温暖化防止に貢献する木質資源の循環利用に関する環境教育プログラムの開発(第2報):日本産業技術教育学会九州支部論文集,第16巻,pp.53-60,2008)。そこで,上記結果を踏まえ,環境保全と木材利用に関する学習と宮崎県産スギ材を用いたものづくり活動を組み合わせ,木製晶を大切に長く使う意識・行動の強化を目的とした実践を行った。なお,この実践に先立ち,地球温暖化防止対策としての木材利用の意義を日常的に思い出すための製作題材(ペンケース,箸入れ,カレンダー,パズル,しおり,サイコロ,木製定規)を試作し,その中から,中学生を対象として,ペンケース製作を取り入れた実践を行った結果,環境保全に役立つ木材利用の意義について理解したことを日常行動に活かす学習内容として,木によるものづくり活動の有効性が明らかとなった。
被災地の微生物で被災地を救え－がれきを材料としたバイオプロセスの構築を目指して－

リグニンは、今日の主要な未利用バイオマスのひとつであり、効果的な有効利用法の開発が望まれている。我々は、微生物機能を利用したリグニンおよび低分子リグニンの高付加価値物質への変換に取り組んでおり、今回、低分子リグニンの一種であるシリングアルデヒド(SYAL)を基質として、これを変換、重合して有機蛍光物質を生産するPseudomonas sp. ITH-SA-1を単離した。同菌の蛍光物質生産の代謝経路や生産条件の検討から、本蛍光物質は、SYALの酸化、脱メチル化により3-O-メチルガリック酸(3-MGA)を経て、その後重合することにより生産されることが明らかとなった。Pseudomonas sp. ITH-SA-1株は、低分子リグニンの一種であるシリングアルデヒド(SYAL)を基質として菌体外に水溶性の蛍光物質を生産する菌株として海水より単離された株である。これまでの研究から、ITH-SA-1株の精算する蛍光物質は熱やpH耐性を有していたことから、既存の蛍光物質とは異なった利用も考えられ、従来と差別化された新しい応用分野が拓ける可能性がある。そこで、本研究ではITH-SA-1がSYALから作り出す蛍光物質の化学構造的知見を得ることを試みた。まず初めに溶媒溶解性を検討したところ、本蛍光物質は、水及びMeOHには易溶であるが、EtOHなど極性有機溶媒には難溶または全く溶解しないという極めて高極性の物質であることが示唆された。次に、蛍光励起スペクトルを検討したところ、Ex 356 nm、Em 498 nmの励起蛍光スペクトルを示し、青緑色の蛍光を発することを明らかにした。続いて、分子量を検討したところ、平均分子量7.2 kDaの複合体であることが示唆された。現在のところ、本蛍光物質は完全には単離できておらず、その詳細な構造は不明であるが、低分子の蛍光物質の存在はゲルろ過HPLCにて観察されないことから、比較的高分子の有機蛍光物質と考えられる。一方、高分子有機蛍光物質としては、タンパク質、アルケニルベンゼンやアルケニルチオフェンの重合体などが知られているが、本結果はこれらの可能性を否定した。東日本大震災以降、被災地沿岸の海水の微生物群集構造は、土砂やがれきの流入等により、それ以前と比較すると大幅に変化しており、陸上由来と予想される微生物群が表層海水中に土着化しつつあると予想される。今回、被災地沿岸の海水の微生物群集構造を検討したところ、震災前後で微生物群集構造が大きく変化していることを見出した。申請者は、このことに注目し、木質系バイオマスであるリグニンやその前駆体などを用いて、被災地沿岸の海水を菌源とし、基質の代謝・変換などを指標に各種スクリーニングを行った結果、例えば、海水に個体のシリングアルデヒド(SYAL)を添加した集積培養系から、SYALを出発物質として、水溶性の黒色色素や耐熱性の蛍光物質など産業応用性の高いと考えられるいくつかの物質を同時生産する菌株および複合培養系などを取得した。本研究では、これらの(複合)微生物系を利用し、木質系バイオマスから高付加価値物質を抽出・創生するためのバイオプロセスの構築に必要な基礎的基盤技術の確立を目的として、上記観点のスクリーニングから得られたPseudomonas sp. ITH-SA-1株の水溶性の黒色色素や耐熱性の蛍光物質などの化学構造、合成メカニズムなどを検討した。また、海水を微生物源としてリグニン(lgn)、SYAL、バニリン(vnl)、パラヒドロキシベンズアルデヒド(PBH)などを添加した集積培養系を構築し、新たなスクリーニングを行った。ITH-SA-1株の生産する蛍光物質は熱やpH耐性を有していたことから、既存の蛍光物質とは異なった利用も考えられ、従来と差別化された新しい応用分野が拓ける可能性がある。昨年度までの研究において、本蛍光物質は、水及びMeOHには易溶であるが、EtOHなど極性有機溶媒には難溶または全く溶解しないという極めて高極性の物質であることが示唆され、また蛍光励起スペクトルを検討したところ、Ex 356 nm、Em 498 nmの励起蛍光スペクトルを示し、青緑色の蛍光を発することを明らかにしており、さらに、分子量を検討したところ、平均分子量7.2 kDaの複合体であることを示している。本年度の研究では、まず本蛍光物質の生合成経路について検討した。培養上清のHPLC解析および各種培養試験により、ITH-SA-1株は添加したSYALをシリンガ酸(SAYC)から3-0-メチルガリック酸(3MGA)に変換し、その後3MGAが重合して蛍光物質となっていることが示唆された。

続いて、これらを大量に取得し、ゲルろ過クロマトグラフィーおよびMeOHにより蛍光物質を分離、精製したサンプルを取得した。このサンプルについて、ICP-MSで無機成分について検討したところ、無機物は約3%含まれていたが、蛍光に関与する成分は検出されなかった。続いて、NMR、ATR-FTIR解析で化学構造を検討したところ、多くのカルボニル基、エステル基等の存在が確認されたが、ベンゼン環由来のシグナルは確認されなかった。ここから、本蛍光物質は、ベンゼン環を含まない希少な構造を有しているものと示唆された。環境微生物学昨年度の研究で行ったスクリーニングから得られた菌株群から選抜されたPseudomonas sp. ITH-SA-1株の有機蛍光物質の大まかな化学的性質を明らかにできたことから、研究は概ね順調に進んでいると考えられた。Pseudomonas sp. ITH-SA-1は、上述した着眼点で着手した研究の中で、シリングアルデヒド(SYAL)を出発物質として、水溶性の黒色色素を生産する微生物としてスクリーニングされた株であり、本黒色色素には、耐熱性蛍光物質等の産業利用価値が高いと想定される物質が含まれていることから、これらの化学構造分析を行った。まず初めに、培養液中の中間代謝産物について検討した。培養上清を各種溶媒抽出、カラムクロマトグラフィー等を繰り返して精製し、分取HPLCにて黒色、蛍光並びに主要生成物を単離し、MS、NMR、元素分析等を用いて化学構造解析を行った。その結果、添加したSYALはシリンガ酸、3-メチルガリック酸を経由して重合されているものと示唆された。蛍光活性を確認したところ、中間代謝産物ではなく、重合体のピークに活性が確認されたことから、蛍光物質は重合物であると推測された。一方で、海水を微生物源としてリグニン(lgn)、SYAL、バニリン(vnl)、パラヒドロキシベンズアルデヒド(PBH)などを添加した集積培養系を構築し、新たなスクリーニングを行った。無機塩培地、および完全培地に上記化合物を各種濃度で添加し、集積培養を行った。複合微生物群衆構造の変化をDGGE等でモニターしながら、これらの物質を分解、変換、重合できる菌株の単離を試みた。その結果、新たに30株ほどの上記活性を有する候補株が単離された。続いて、それぞれの菌株を純化し、16S rDNAの配列により分類を行った。また、培養上清を採取し、蛍光活性などを確認した。その結果、Pseudomonas sp. ITH-SA-1よりも強力な蛍光活性を有する菌株をいくつか単離した。今年度は、ITH-SA-1株の生産する蛍光物質の合成経路を検討するため、分子育種と化学構造解析とリンクさせながら研究を進め、昨年度得られた最終前段階の中間代謝産物群の情報に加え、今年度は大まかな化学的性質を明らかにした。しかしながら、同時に、これ以降の検討をするためには、より詳細な遺伝情報の取得の必要性も同時に生じた。今後は、同株のドラフトゲノム解析等も行っていく予定である。平成25年度の研究では、Pseudomonas sp. ITH-SA-1株の黒色色素、蛍光物質について化学構造分析においては、、GPC分析などにより分子量を明らかにするとともに、熱処理等による分解後、構成成分構造を検討していく。
有機金属化合物を用いた触媒設計と触媒作用の研究

本研究では、新しい素材としてニオブ触媒を設計する目的で、ニオブのπ-アリル錯体を用いて新しいニオブ固定化触媒と、また、ニオブのエトキシド錯体を用いて超薄層ニオブ固定化触媒を設計した。さらに、得られたニオブ触媒の触媒機能を見い出すと共に、EXAFS分光法により決定されるニオブ活性構造との対応を明らかにした。従来の塩化ニオブなどの無機化合物を用いた方法では、Nbの縮合物がもっぱらできてしまい、しかも不均一な表面状態を持ったニオブ担持触媒しか得ることはできない。従って、本計画ではニオブのπ-アリル錯体を用い、素性の明らかな単核ニオブ触媒を合成した。この調製手法により、さまざまなニオブの単核構造をシリカ,アルミナ及びチタニア表面に作ることができた。σ-アリル配位子を持つニオブ単核構造を上記無機酸化物上に固定化すると、プロペンのメタセシス反応に極めて高い活性を持つ新しいニオブ触媒が得られた。これまで活性なニオブ触媒は知られていない。アリル配位子を水素還元で除去して得られる低原子価ニオブ構造は一酸化炭素を水素化して種々の炭化水素を合成することを見い出した。通常のニオブ固体触媒ではこのような触媒作用を全く示さない。得られる炭化水素は【C_2】から【C_4】の炭化水素が8186%の高い選択性であった。さらに、低原子価ニオブを酸素で酸化して得られる酸化型のニオブ単核構造は、エタノールの脱水素反応に対し高い触媒作用を示すことが分かった。従来の担持ニオブ触媒は主に脱水反応型であり、はじめての脱水素機能型のニオブ触媒である。一方、ニオブのエトキシド錯体を用いると、シリカ表面上に単原子層ニオブ酸化物を固定化することができた。この超薄層触媒は、単核触媒と全く異なり、エタノールの分子内脱水反応に対し高い触媒活性を持つことが見い出された。
衝撃荷重下で皮質骨の骨折強度は向上する

皮質骨の内部には生理活動を営む上で重要なハバース管、フォルクマン管あるいは骨小腔など微小空孔が存在している。最近では、日常の生活活動中において骨中にマイクロクラックが発生するとの報告があり、特に、衝撃外力により発生する骨組織の微小損傷(マイクロフラクチャ)と臨床上見受けられる骨折形態の間には密接な関係があると考えられる本研究では骨に加えるひずみ速度が、従来ほとんど行われていない準静的から高速負荷領域において、骨の破壊じん性値に急激な現象および増加を伴う極端な変化を示すことを確認した。これらの現象を説明するために、骨の構造に構造が類似した現存する材料、すなわち、繊維強化複合材料の力学モデルを用いて、次のような皮質骨の強化機構を説明する仮説を提案した。(1)準静的から高速負荷領域における皮質骨の強化機構は、内部に含まれるコラーゲン線維の切断機構により、ブリッジング(線維が延性破断)、プルアウト(線維が脆性破断)および線維強化無効の3段階に分けられる。これらが骨の破壊特性(破壊じん性値)の変化を支配する。(2)特に、高ひずみ速度域において、皮質骨の母相(ハイドロキシアパタイト)にマイクロクラック強化機構が働き、その結果、破壊じん性値が増加する。本研究では以上の両仮説の検証を試みる事を目的とした。本年度は、昨年度得られた準静的から高速負荷における多くの破壊解析データ(クラック進展画像、破断面のSEM像等)の解析・検討を行なった。以上の結果より、試験片の条件に関わらず、ひずみ速度110(l/s)近傍において、骨の高じん化機構を低下させる領域があることを確認した。生理的状態に近い湿潤骨は、乾燥骨に比較して、臨界応力拡大係数で二から三倍と高い値を示した。母相にマイクロクラック強化機構が働く事実については、現在のところ不明であるが、SEM観察からは、これらをうかがわせるデータが得られているので、今後の課題としたい。最近では、日常の生活活動中において骨中にマイクロクラックが発生するとの報告があり、特に、衝撃外力により発生する骨組織の微小損傷(マイクロフラクチャ)と臨床上見受けられる骨折形態の間には密接な関係があると考えられる。申請者はこれらの観点から、皮質骨の破壊挙動、すなわち、骨中をクラックが進展しにくい性質である骨の破壊じん性試験を実施してきた。これらによると、骨に加えるひずみ速度が、従来ほとんど行われていない準静的から高遠負荷領域において、骨の破壊じん性値に急激な現象および増加を伴う極端な変化を示すことを確認した。これらの現象を説明するために、骨の構造に構造が類似した現存する材料である繊維強化複合材料の力学モデルを用いて、次のような皮質骨の強化機構を説明する仮説を提案した。本年度は準静的から高速負荷における多くの破壊解析データ(クラック進展画像、破断面のSEM像等)の収集を行った。
FGFシグナル抑制因子Sprouty2による骨芽細胞増殖・分化制御機構の解析

FGFやBMPなどの増殖因子は、骨芽細胞の増殖・分化の制御に重要であることが知られている。FGFはチロシンキナーゼ型受容体に結合し、MAPK経路を介して細胞の増殖・分化を促進するが、その抑制因子としてSprouty/Spredファミリーという分子群が同定されている。一方、BMPシグナル経路において、その下流分子SmadはMAPK経路と密接に関連していることが報告されているが、その制御機構に関しては不明な点が多い。本研究では、骨芽細胞におけるFGF-MAPK経路とBMP-Smad経路を介したSprouty/Spredファミリーによる増殖・分化制御機構について解析を行った。マウス骨芽細胞株(MC3T3-E1)およびヒト骨芽細胞株(SaOS-2)におけるSprouty/Spredファミリー(Sprouty1, 2, 4, Spred1,2)のmRNAの発現にをRT-PCR法および、real-time PCR法を用いて解析したところ、MC3T3-E1およびSaOS-2の両方においてSprouty2,4およびSpred1,2の発現がbFGF刺激により優位に上昇した。また、Sprouty2,4のタンパク質の発現をwestern blot法を用いて解析したところ、Sprouty2において、MC3T3-E1およびSaOS-2の細胞株でbFGF刺激により優位な上昇を認めた。タンパク質レベルでのSprouty2とSprouty4の発現を、ウエスタンブロット法を用いて解析した結果、SaOS-2細胞およびMC3T3-E1細胞で、EGFならびにbFGF添加時にSprouty2と4の発現を確認した。両骨芽細胞において、Sprouty2の発現はEGF添加時よりbFGF添加時により強い発現を認めたが、Sprouty4の発現では、有意な差は認めなかった。また、骨芽細胞内(MC3T3-E1)のSprouty2と4の局在を調べるために、蛍光免疫細胞染色を施行したところ、Sprouty2と4それぞれ細胞質内に発現を認めた。骨芽細胞分化マーカーであるRunx2やALPの発現量をreal-time PCR法を用いてSprouty2強制発現群とコントロール群で比較検討を行ったところ、Sprouty2強制発現群で優位に発現量の抑制が認められた。Sprouty/Spredファミリーのマウスおよびヒト骨芽細胞株での発現は、RT-PCR法、real-time PCR法、ウエスタンブロット法を用いて解析することができ、当初より予測していた結果と大きな相違はなかった。しかしながら、Sprouty2 KOマウスは出生時または出生後早期に死亡してしまうため、KOモデルマウス作成が難航している。基礎細胞学in vivoにおける骨リモデリングに対するSprouty2,4の機能解析を行うために、Sprouty2,4それぞれのKOマウス大腿骨に滅菌生理食塩水注水下にてスチール製ラウンドバー(直径1.5mm)を用いて骨窩洞を形成し、WTと比較してSKYSCAN1172高分解能X線マイクロCTスキャナを用いて、治癒過程を経時的(処理後1日、5日、10日、20日、30日、40日目)に観察する。また、WTマウスについては、骨再生機構におけるSprouty/Spredファミリーのタンパク発現を、大腿骨を採取し免疫染色法により調べる。
シロイヌナズナ無細胞転写解析法による光依存転写機構の解析

シロイヌナズナ培養細胞で成長の速いMM2d株を材料に、無細胞転写解析系を確立した。MM2d細胞は通常の暗条件下での培養で黄化下細胞となるが、光を当てて培養することにより緑化した細胞を調製することができる。そこで、それぞれの細胞から細胞核を単離し、無細胞転写解析系を作成した。明培養および暗培養由来の無細胞系をもちいて、シロイヌナズナの光合成遺伝子であるリブロース1,5-ビスリン酸カルボキシラーゼ/オキシゲナーゼ(rbcS)遺伝子の光依存転写制御を解析することに成功した。真核生物の遺伝子の発現制御は主に転写レベルで行われている。現在、植物における遺伝子転写制御に関する分子生物学的知見は、in vitroで転写を解析できる手法の欠如ゆえ極めて乏しい。本研究では、顕花植物でポストゲノム情報および遺伝学的資産の整った、シロイヌナズナ(Arabidopsis thaliana)由来の無細胞転写系開発を目的としている。シロイヌナズナは植物体が小さいという弱点を克服するため、本研究では材料として増殖の速い培養細胞(MM2d細胞)を用いることにした。まず始めに、MM2d細胞の培養条件を検討した結果、培地組成はタバコ培養細胞BY-2株に用いていた組成が成長速度および細胞の状態において良好であった。培養時間は4日間で200gの細胞を調製し、その後の実験に用いることにした。MM2d細胞は懸濁培養液中で小さな塊を作るため、プロトプラスト調製に必要な時間を延ばすことで効率化を図った。続いて、プロトプラストからの核を単離する際に必要な条件を検討した。細胞破砕法として、ナイロンメッシュおよびダウンスホモジナイザーを試したが、前者の結果が良好であった。単離した核から可溶性画分を抽出して、シロイヌナズナのU2snRNA遺伝子を用いて、Pol II依存の転写活性を検出することにより転写活性を検定した。検出法は、in vitroで合成されたU2snRNAに対する蛍光標識プライマーを作成し、逆転写により放射性同位元素を用いずに行った。当初は、実際に活性を検出するに至なかったが、プロトプラストからさらに液胞を除去することによって弱いながら転写活性を検出した。これらの結果は大きな前進であり、今後をさらに詳細に条件を検討することによって、比較的容易に活性向上を図れることを意味する。したがって、引き続き活性向上に努め、最終目標である光依存的な転写制御の解析を実現する。植物の光合成は太陽エネルギーを使った炭酸固定を行い、食物連鎖を通して生物全体のエネルギー源を担っている。葉緑体の光合成に係わる遺伝子の多くが核に移行しており、光合成関連遺伝子の発現制御を理解するには、核における転写の仕組みを知る必要がある。本研究では、顕花植物でゲノム・ポストゲノム情報の豊富なシロイヌナズナ(Arabidopsis thaliana)由来の無細胞転写解析系の開発を目指している。前年度の実績により、シロイヌナズナのMM2d培養細胞を用い、液胞を除去する操作を経ることにより、転写装置を含む核抽出液の調製法確立に目処を付けていた。本年度はさらに詳細な条件を詰め、暗培養した細胞から転写活性の良好な核抽出液を得た。転写活性はU2 snRNA遺伝子を用いて至適化し、既存のタバコ培養細胞BY-2由来の核抽出液にも劣らなかった。α-アマニチンを使った転写阻害実験およびβグルカナーゼ遺伝子、U6 snRNA遺伝子、tRNA遺伝子の転写から、転写活性のほとんどがRNAポリメラーゼII由来であった。以上、本研究の一つ目のハードルはクリアーされた。次のハードルは、明培養により光合成能を発揮している細胞からの無細胞転写解析系の開発である。明培養により緑色になった培養細胞からの転写活性を有する核抽出液調製は困難を極めたが、結論として抽出バッファーに抗酸化剤としてアスコルビン酸を比較的多量に添加することにより実現した。この方法で調製した核抽出液は、暗培養で得られた核抽出液と同等の転写活性を示していた。シロイヌナズナの暗培養および明培養由来の無細胞転写解析系が確立できたことにより、光依存転写制御機構をin vitroで解析する下地ができあがったといえる。このことは、これまで植物では不可能であった光依存転写制御の分子メカニズムを解明する強力なツールを得た大きな意義がある。地球上に降り注ぐ太陽エネルギーは、植物の光合成能力により有機物質として固定され、食物連鎖を通じて他の生物へ供給される。光合成を含めた植物の持つ能力を理解するには、植物に特有な遺伝子発現の仕組みを正しく認識する必要がある。遺伝子発現はDNAからの転写(RNA合成)の過程が主要な制御段階である。したがって本研究では、顕花植物でポストゲノム研究の最も進んだシロイヌナズナから無細胞転写解析系を作成し、光合成関連遺伝子群の転写制御を明らかにすることが目的である。

前年度までに、シロイヌナズナの培養細胞MM2d株を用いて、暗培養および明培養細胞から無細胞転写解析系をそれぞれ開発することに成功した。α-アマニチンによる転写阻害実験により、得られた核抽出液にはRNAポリメラーゼIIの活性があることが確認できていた。今年度は更に、光合成関連遺伝子であるリブロース-1, 5-ビスリン酸カルボキシラーゼ/オキシダーゼのスモールサブユニット遺伝子(rbcS)を用いて、暗培養および明培養由来の両無細胞転写解析系を使った転写制御の研究を行った。シロイヌナズナには4コピーのrbsS遺伝子が存在し、それぞれが異なる光応答性や組織特異性を有していると考えられる。それぞれの遺伝子の転写制御領域には、光応答制御配列(LRE)が同定されている。その中で、IbAM5として知られる配列に変異を入れた遺伝子を作成し、それらを鋳型として用いて無細胞転写解析を行った。その結果、変異を加えた3遺伝子の転写が暗培養由来の転写系で著しい向上を示した。このことは、暗条件で転写抑制因子が結合することを示唆している。本研究により、無細胞系により光制御を解析可能なことを示し、未知の制御因子の発見につなげられる成果と考える。この解析系をさらに発展させ、DNAの高次構造変化による転写制御機構の解明に役立てることを期待している。
フォトニック結晶マイクロゲルによる微小空間領域の物理化学量可視化

温度応答特性をもつNIPAMハイドロゲルにシリカコロイドを分散させてフォトニック結晶ゲルを調整し,それをマイクロ流体デバイスを利用してゲルマイクロアレイを作製することで,微小領域からの物理量および化学量を計測可能なセンサの開発を行った.これらのマイクロスケールにパターニングされたゲルは,シリカ粒子によるコロイド結晶を内部に有しているため可視光領域の構造色を呈している.これにより,化学物質の濃度を可視光領域の色の変化としてマイクロスケールのアレイとして表示できることを確認した.このセンサデバイスを用いることで,エタノールの濃度と温度を同時に呈示することに成功した.本研究の目的はマイクロ流体デバイス技術により,直径10マイクロメートルオーダーのフォトニック結晶(PC)マイクロゲルの作製し,微小領域空間のpH・温度・イオン濃度・化学物質濃度などの物理的・化学的な情報量を,直接可視光領域の光の波長として高感度で取得することをための計測技術の確立を目指すものである.H27年度は,刺激応答性を持つフォトニック結晶ゲルの作製条件の検討を行った.フォトニック結晶を作製するための方法として,溶媒揮発法と脱塩法の両方により光学結晶の作製を行った.また刺激応答性ゲルとして,温度応答性のあるpNIPAMを用いた.結果として,両手法ともpNIPAM内で可視光領域のフォトニック結晶の作製に成功した.温度応答性による反射波長ピークの変化を計測した結果,脱塩法によるフォトニック結晶ゲルが溶媒揮発法のものに比べて,より大きいピーク波長のシフトが確認された.また,刺激応答性フォトニック結晶ゲルのマイクロビーズ化の前段階の検討実験として,ゲルの微小化による感度の向上を定量的に評価するために,マイクロ流路を利用してフォトニック結晶及びフォトニック結晶ゲルの微細加工に取り組んだ.異なる反射波長ピークを持つフォトニック結晶ゲルをマイクロ流路に交互に流し込み,微小領域における光学特性の計測方法の確立,及び評価を行った.結果,幅と高さ100マイクロメートルのフォトニック結晶ゲルにおいて,顕微鏡と分光器による計測方法により反射波長のピークを計測することに成功した.当初の計画の通り,H27年度はフォトニック結晶ゲルの作製方法,及び光学計測技術の開発に取り組んだ.物理化学量に応答するフォトニック結晶ゲルの作製に成功し,また微細加工にも成功した.さらにそれらの計測技術も確立したため,概ね順調に研究が進展していると評価している.H27年度の結果を踏まえ,最終年度となるH28年度は(1)刺激応答性ハイドロゲルを用いたヤヌスマイクロビーズの作製,及び(2)マイクロ流路内への複数種類の刺激応答性フォトニック結晶ゲルのマイクロパターニング,を実施し,温度,及びエタノールの検出を実施した.(1)については遠心力を用いたマイクロ液滴射出流体デバイスにより,左右に異なる蛍光マイクロビーズを封入した刺激応答性ヤヌスマイクロゲルビーズの作製に成功した.具体的にはNIPAMとアルギン酸ナトリウムを混合した溶液を塩化カルシウム溶液に打ち出し,瞬時にアルギン酸をゲル化させた後NIPAMの重合を行うことで,直径100マイクロメートル以下のマイクロゲルビーズを得た.温度による刺激に対し,刺激応答性ヤヌスマイクロゲルビーズが収縮することが確認できた.(2)については,H27年度に開発したフォトニック結晶ゲルのパターニングを発展させ,センシング用のコロイド結晶ゲルパターンと検知対象となる物質を流すマイクロ流路が,ナノポーラス膜を介して交差するマイクロデバイスを作製し,サンプル溶液中のエタノールの濃度をフォトニック結晶ゲルの反射波長のピークのシフトにより検出することに成功した.これらの成果は分野の最高峰の国際会議であるmicroTAS国際会議で発表した,また2017年度6月に開催されるTransducers国際会議での口頭発表として採択された.また国際誌に1本掲載され,1本が現在査読中である.温度応答特性をもつNIPAMハイドロゲルにシリカコロイドを分散させてフォトニック結晶ゲルを調整し,それをマイクロ流体デバイスを利用してゲルマイクロアレイを作製することで,微小領域からの物理量および化学量を計測可能なセンサの開発を行った.これらのマイクロスケールにパターニングされたゲルは,シリカ粒子によるコロイド結晶を内部に有しているため可視光領域の構造色を呈している.これにより,化学物質の濃度を可視光領域の色の変化としてマイクロスケールのアレイとして表示できることを確認した.このセンサデバイスを用いることで,エタノールの濃度と温度を同時に呈示することに成功した.今後はH27年度の結果を踏まえ,以下の2点の研究に取り組む.(1)微小領域空間計測のためのヤヌス型PCマイクロゲル:微小領域空間での物理化学量可視化のため,マイクロゲルビーズ内2種類のPCを構築する.これにより,微小領域空間に異なる格子定数の結晶を持つ2波長計測可能な「ヤヌス(Janus)」PCマイクロゲルの作製を試みる.使用する層分離のための高分子の種類・濃度,コロイドの結晶化条件と両立などが検討項目である.この水性2層系による手法が困難な場合,マイクロデバイスの小型化により直接10マイクロメートル径の液滴を作製することも代案として考慮する.(2)物理化学量の可視化によるセンシング:PC温度・pH・光量・イオン濃度などの物理化学量の絶対値の取得をおこなう.

最初は,複数種類の反射波長を持つPCマイクロゲルを同時に用いることで,広範囲空間の物理化学量の取得を目指す.PCマイクロゲルをゲルシートなどに封入し,分光器を用いずに目視による判定及び簡易な光学フィルタとフォトディテクタを用いることで,皮膚の上pHや化学物質計測,また環境計測のための光量・温度・pHなどを試み,ヘルスケアセンサや環境モニタリングセンサ応用への適用性を検討する.同時に,本手法の利点の一つであるロバスト性の検証のための長期計測(数ヶ月)などにも挑戦する.また,最終目標である微小領域空間の物理化学量の計測を行う.具体的な適用先としては,細胞培養ディッシュ上にヤヌスPCマイクロゲルを分散させることにより,一細胞レベルの空間解像度でのpH・温度の分布の計測や,代謝物の循環や分泌性シグナル因子の空間伝搬の視覚化を目指す.マイクロナノ工学H27年度に開催の国内及び国際学会への旅費を計上していたが,他の助成金による旅費補助を獲得したため.H28年度に開催予定の国際会議への旅費として使用を計画している.
ペタスケール計算環境に向けた高速フーリエ変換のアルゴリズムに関する研究

ぺタスケール計算環境に向けた並列高速フーリエ変換(FFT)アルゴリズムの検討を行った。最適なキャッシュブロックサイズは問題サイズに依存するが,キャッシュミス数を最小にする最適なキャッシュブロックサイズを決定する方法を提案した。また,並列FFTにおいては全対全通信が性能に大きく影響することから,全対全通信の自動チューニング手法についても提案した。性能評価の結果,提案する並列FFTの実装は性能を向上させる上で効果が高いことが示された。平成22年度においては,ペタスケール計算環境に向けた高速フーリエ変換(FFT)アルゴリズムとして,並列三次元FFTをマルチコア超並列クラスタで実行する際に,どのようなデータ分散および通信方法が望ましいかについて検討を行った。その結果,メニーコア超並列クラスタにおける並列三次元FFTでは,二次元方向に分割する方が通信時間の削減という観点からは優れていることが分かった。並列三次元FFTにおいては,全体に関わる性能パラメータとして,全対全通信方式とブロックサイズが存在するが,これらについて最適なパラメータを自動的にチューニングする機構をソフトウェアで実現した。その結果,並列三次元FFTにおいて実行時間の多くを占めている全対全通信に要する時間を大幅に削減することに成功した。今後,ペタスケール計算環境においては,ノード数を増加させた場合のスケーラビリティが重要になる。本年度の成果は,通信時間を削減することにより,ペタスケール計算環境において高いスケーラビリティが達成される見込みであり,多くのアプリケーションで計算時間を短縮することができるものと期待できる。また,平成22年度に行った研究成果を国際会議等で発表すると共に,それらの内容をまとめて学術雑誌等に論文を投稿する予定である。平成23年度においては,ペタスケール計算環境に向けた高速フーリエ変換(FFT)アルゴリズムとして,並列一次元FFTをマルチコア超並列クラスタで実行する際に,どのようなアルゴリズムが望ましいかについて検討を行った。その結果,メニーコア超並列クラスタにおける並列一次元FFTでは,これまでに提案されていた三次元表現よりも、二次元表現を再帰的に適用して計算することで、キャッシュヒット率をさらに向上させることができることが分かった。並列一次元FFTにおいては,全体に関わる性能パラメータとして,全対全通信方式と基底,そしてブロックサイズが存在するが,これらについて最適なパラメータを自動的にチューニングする機構をソフトウェアで実現した。その結果,並列一次元FFTにおいて実行時間の多くを占めている全対全通信に要する時間を大幅に削減することに成功した。本年度の成果は,演算時間および通信時間を削減することにより,ペタスケール計算環境において高い性能が達成される見込みであり,多くのアプリケーションで計算時間を短縮することができるものと期待できる。また,平成23年度に行った研究成果を国際会議等で発表すると共に,それらの内容をまとめて学術雑誌等に論文を投稿する予定である。
注射ワクチンはなぜ効くのか？　ー魚類腹腔における獲得免疫機構の解明ー

養殖魚の魚病対策としてワクチンの投与が行われている。ワクチンの作用基盤は獲得免疫だが、ワクチン投与部位である腹腔でどのように獲得免疫が活性化されるかはわかっていない。本研究ではまずトラフグ腹腔内の白血球組成を調べた。その結果、抗体産生細胞であるB細胞が最大であり、ついでマクロファージであった。次に、抗原を投与したところ、マクロファージだけではなく、B細胞も取り込むことが示された。さらに、腹腔内のマクロファージが産生する細胞誘引因子によりB細胞が腹腔内に誘引、蓄積することが示された。このように、魚類の腹腔における獲得免疫の活性化にはB細胞とマクロファージの連携が大切であることが示唆された。養殖魚の病害対策として用いられるワクチンは注射ワクチンが主流であり、日本ではほとんどが魚の腹腔内に投与するよう定められている。これにより、魚は獲得免疫系を発動し、病原体に対する免疫を獲得するが、腹腔内ワクチンがどのように獲得免疫を誘導するのかという根本的な部分が不明である。昨年度は腹腔内白血球がどのような細胞から構成されているのかを、ゲノム情報が公開され、免疫関連遺伝子の情報が蓄積しているトラフグを材料にして解析した。トラフグを開腹し、腹腔内の白血球を回収した。まず、得られた細胞について、細胞塗抹標本を作製してギムザ染色による細胞染色を行った。また、フローサイトメトリー(FCM)で細胞数や細胞種を解析したところ、トラフグ腹腔ではリンパ球が最も大きい細胞集団であり、次に大きいのがマクロファージ集団であった。これらのことから、この2つの細胞集団が腹腔の獲得免疫活性化に関与していると考えた。そこで、さらに、当研究室で作製した抗トラフグ免疫グロブリンM(IgM)抗体を利用したFCMを行ったところ、リンパ球の多くがIgM陽性細胞であったことから、トラフグ腹腔ではIgM陽性B細胞が主要な細胞集団であることが明らかになった。ワクチンは可溶性成分と不溶性成分の両方を含んでおり、また、可溶性抗原と不溶性の粒子状抗原では運ばれ方が異なることが示唆されている。昨年度は不溶性の粒子状抗原が腹腔内細胞にどのように取り込まれるかを調べた。不溶性の異物を腹腔に投与したところ、マクロファージだけではなく、IgM陽性B細胞に取り込まれていることが明らかになった。これまで、腹腔に投与された抗原はマクロファージや好中球に取り込まれると考えられていたことから、新たに腹腔における抗原取り込みにB細胞が関与していることが示された。26年度はまず腹腔内の貪食細胞の追跡実験を行ったが、染色した細胞の末梢組織での回収率が非常に低く、解析が困難であった。そこで、27年度の研究計画で予定していた腹腔内リンパ球の研究のうち、主要な細胞集団であることが明らかになったIgM陽性B細胞について調べた。また初年度にこのIgM陽性B細胞が貪食能を示すことを明らかにしたが、最近貪食能をもつB細胞が獲得免疫系の司令塔であるT細胞を活性化することが海外の研究チームによって明らかにされ、本細胞の獲得免疫系の活性化における重要性が示された。そこで、本年度は、これらが腹腔にどのようにして集積するのかを調べた。哺乳類ではB細胞の誘引にはCXCL13という細胞遊走因子(ケモカイン)が重要や役割を果たしている。また、このケモカインに向かって遊走する細胞にはその受容体であるCXCR5が発現している。そこで、腹腔IgM陽性B細胞での遺伝子発現をRT-PCR法により調べたところ、CXCL13は発現していないもののCXCR5の発現が認められた。このことは、他の細胞がB細胞を腹腔に誘引していることを示唆している。そこで、腹腔内のもう一つの主要な細胞であるマクロファージでこれらを調べたところ、CXCL13の発現が認められた。また、マクロファージの培養上清に対してIgM陽性B細胞が誘引されることを示した。つまり、魚類の腹腔ではマクロファージが産生するCXCL13によってIgM陽性B細胞が誘引されている可能性が示された。これにより、魚は獲得免疫系を発動し、病原体に対する免疫を獲得するが、腹腔内のワクチンがどのように獲得免疫を誘導するのかという根本的な部分が不明である。私たちはこれまでに腹腔には魚類の主要な抗体産生細胞であるIgM陽性B細胞が大量に存在することを明らかにした。多くの魚病ワクチンでは抗体が主要な作用因子であると考えられることから、腹腔内のIgM陽性B細胞に着目した。さらに同じく腹腔内に存在する腹腔マクロファージの培養上清がIgM陽性B細胞を誘引することを明らかにした。また、腹腔マクロファージがB細胞誘引因子として知られるケモカインCXCL13を発現すること、IgM陽性B細胞がCXCL13の受容体であるCXCR5を発現していることを示した。

27年度はトラフグCXCL13に対する抗血清を作製し、腹腔マクロファージ培養上清に添加した。その結果、腹腔マクロファージ培養上清によるIgM陽性B細胞の誘引は有意に抑制された。この結果から腹腔では腹腔マクロファージが産生するCXCL13により、IgM陽性B細胞が腹腔内に誘引、蓄積されることが示された。またLPS刺激によりCXCL13の発現の増強が確認されたが、それに伴い炎症性のサイトカインであるTNFalphaの発現の上昇も認められた。TNFalphaとCXCL13の関係は今後の課題である。さらに26年度の実験では腹腔貪食細胞の追跡は困難であったことから、二次リンパ組織である脾臓においてCXCL13の発現を調べたところ、脾臓においてもCXCL13の発現が確認された。こうしたことから、腹腔と二次リンパ組織には共にCXCL13を利用したIgM陽性B細胞の誘引機構が存在する可能性が示された。養殖魚の魚病対策としてワクチンの投与が行われている。ワクチンの作用基盤は獲得免疫だが、ワクチン投与部位である腹腔でどのように獲得免疫が活性化されるかはわかっていない。本研究ではまずトラフグ腹腔内の白血球組成を調べた。その結果、抗体産生細胞であるB細胞が最大であり、ついでマクロファージであった。次に、抗原を投与したところ、マクロファージだけではなく、B細胞も取り込むことが示された。さらに、腹腔内のマクロファージが産生する細胞誘引因子によりB細胞が腹腔内に誘引、蓄積することが示された。このように、魚類の腹腔における獲得免疫の活性化にはB細胞とマクロファージの連携が大切であることが示唆された。細胞追跡実験は計画通りにはいかなかったものの、次年度に予定していた腹腔リンパ球に関する実験を行い、魚類の腹腔ではマクロファージが産生するCXCL13によってIgM陽性B細胞が誘引されていることを示すデータが得られたことから、全体としてはおおむね順調に進行していると判断した。魚類生理学今後は、マクロファージの産生するCXCL13がIgM陽性B細胞を誘引していることを確認するために、培養上清に対して抗CXCL13抗体を加えることでIgM陽性B細胞の遊走が阻害されるかを検証する。これにより、魚類の腹腔におけるマクロファージによるIgM陽性B細胞誘引機構の存在を魚類で初めて示すことになる。また、直接的な細胞の追跡が困難であったため、本年度は貪食細胞を殺す薬品であるクロドロネードリポソームの腹腔への投与により、二次リンパ組織である脾臓や腎臓における貪食細胞の細胞数や性質に変化が生じるかどうかを検証する。平成25年度においては腹腔内の細胞組成を明らかにすることができ、これまで考えられていた以上に腹腔におけるリンパ球の役割が大きいことを示唆するデータが得られた。リンパ球は獲得免疫系を担う中心となる細胞であることから、腹腔においてリンパ球を中心とした獲得免疫システムの存在が示唆される。また、その中でもIgM陽性B細胞が中心となっていることを明らかにすることができた。さらに、この細胞が抗原の取り込みにも関わっていることを示すことができ、初年度のうちに大きな方向性を示すデータが得られていることから、概ね順調であると判断している。研究遂行の順番を変更し、26年度の予定を中断し、27年度に予定していた研究を前倒しで行ったたため。