hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
日常生活の反すうが概括化と無意図的想起に与える影響

2018年度前期には実験を終え、データの分析を行い、9月の日本心理学会シンポジウムにて発表う予定である。2016年度は経験サンプリング法で使用予定であったPacoが不具合を起こし、対処に追われていたが、2017年度前半には異なる方法で経験サンプリング法を実施し、無事データを得た。また、2018年度前期に行う予定である実験も予備実験を踏まえ、改良を重ねているためおおむね順調に進展している。日本心理学会第82回大会において、「ネガティブなふと浮かぶ記憶・思考との付き合い方:認知・社会・臨床心理学からのアプローチ」というシンポジウムを主催・企画した。このシンポジウムにより、これまで主に臨床分野で研究されてきたネガティブな記憶や思考が、認知心理学や社会心理学では異なる名前で検討されていること、また、双方の知見の共有により臨床分野では治療法の根拠となる知見が、認知・社会心理学分野では研究の新たな意義が見いだせることが示された。また、抑うつと反すう(ある苦痛の症状やその原因,意味,結果について繰り返し考えてしまうこと)が無意図的想起(思い出そうとしていないのに過去の出来事が意識に上ること)に与える影響を調べる実験を2018年5月10月にかけて実施した。日常生活では、無意図的想起は意図的想起(思い出そうとしていないのに過去の出来事が意識に上ること)よりも3倍近く経験することが明らかになっている。また、抑うつや反すうにより、想起内容がネガティブになるなど好ましくない影響が生じる可能性が指摘されている。しかし、これらについての研究は十分に行われていない。そのため、本実験ではこれらの要因が無意図的に想起される記憶に与える影響を検討した。さらに、前年度までの成果をまとめた論文として、抑うつが日常生活で意図的想起と無意図的想起に与える影響を経験サンプリング法(一日に数回、数日間にわたってランダムな時間にメールを送り、調べたい現象の報告を求める方法)という新しい方法で調べた研究を国外雑誌に投稿した。この研究では、これまでの研究方法の欠点を補う方法として、経験サンプリング法を用いて検討した点が高く評価された。さらに、無意図的想起がどのようにして思い出されるかについて調べた研究を国内雑誌に投稿した。前期に日常生活における反すうと概括化の関係を調べる。より具体的には経験サンプリング法を用いて、日常生活における反すう度と想起された意図的・無意図的想起の性質の関係、特に、両想起形態で概括化が生じるかを調べる。その際、あらかじCESーDを用いたスクリーニングで抑うつ傾向(高・低)者を調べ、調査への参加を依頼する。また、後期には反すうが無意図的想起の性質に与える影響について、感情語10語を使用した個別実験を行う。2018年度前期には、反すうが無意図的想起に与える影響を検討する実験を行う。すでに倫理申請を終え、予備実験で内容を改良している。本実験は5月末8月上旬に行う予定であり、参加者のリクルート先はすでに確保している。データ収集後に分析を行い、その結果を9月の日本心理学会シンポジウムで発表予定である。また、英語論文誌に投稿を予定している。予備実験を行ったが、抑うつ度の測定としてSDSを使用したことにより高抑うつ者の数・抑うつ度が十分でなかったことにより予想通りの結果が得られなかった。
反射スペクトルの長期モニター観測による小惑星表面物性の一様性に関する研究

目的小惑星表面の組成や宇宙風化の度合いが場所により異なると、小惑星の自転に伴ってスペクトルの時間変動が観測されるはずである。場所により組成や風化度が異なる原因としては他天体との衝突により風化を受けていない物質が表面に噴出したか、もともと組成や風化度の異なる天体同士の衝突合体により形成されたことが考えられる。反射スペクトルの変動については小惑星「カリン」の観測報告があるが、スペクトル変動があるという報告もないという報告もあり、時間変動を長期にわたり徹底して観測した例がないため決着が付いていない。本研究の目的は、小惑星の反射スペクトルについて長期にわたるモニター観測を徹底して実施することで、反射スペクトルの変動の有無、表面物性の一様性についての、従来からの議論に決着をつけることにある。さらにその先の展望として、取得データから隕石や小惑星の形成と進化についての議論へ発展させることを目指す。方法時間変動の検出に重点を置くという目的から、フィルターを切り替えて多色測光する方法よりも限界等級は浅くなるが分光器を用いて低分散の連続スペクトルを取得する方法が適していると考えた。また、豊富な観測時間を確保するため、小口径であっても自由に使える望遠鏡があることが必須である。そこで、小望遠鏡と市販の安価な分光器(SBIG社製DSS-7)、既存のCCDカメラ(SBIG社ST-8)を組み合わせた分光システムを構築した。本研究課題では、輝線や吸収線などスペクトルの微細構造を調べるのではなく連続波成分の傾きを調べることが目的であるため、この分光器の波長分解能15オングストロームは十分な性能である。成果構築した分光システムで試験観測を実施し、夜光のスペクトルと月の反射スペクトルデータを取得、システムが正常に機能することを確認した。今後は望遠鏡制御との連携部分を改良しながらさらに観測を進める予定である。
Porphyromonas gingivalis リコンビナント線毛の発現と精製

このPCR産物を各種ベクターに組込み,E.coliDH5およびJM109株に形質転換した.ベクターと宿主の組み合わせで得られたクローンについてその発現量とクローンの安定性を比較した.その結果pUC19をベクターとして用いたり,宿主としてE.coliDH5株を用いた場合ではクローニングされたfimAは非常に不安定であった.低コピー数ベクターのpMW119を用いた場合安定ではあるが,発現量が非常に少なかった.発現のためにTrcプロモーターを持ち,同時にlacIリプレッサーを持つpTrc99と,宿主側にもlacIリプレッサーを持つE.coliJM109株との組み合わせが安定な発現を示したが,組換え線毛の発現量はあまり多くなかった.各菌株由来のfimAのDNA塩基配列をジデオキシ法で決定した.比較してみるとfimAのオープンリーディングフレームの上流および下流域では,ほとんど同一であったが,fimA部分では変化が見られ大きく4つのグループに分類できた.DNA塩基配列の解析によればfimAは大腸菌の典型的なプロモーター構造を上流に持たず,開始コドンも一般的なATGではなくGTGであり,これが組み換えタンパクの発現が弱い原因と考えられた.そこで開始コドンをATGに変換し,pTrc99のTrcプロモーター直後にfimAがつながるようプライマーを設計した.PCR産物をクローニングするとこのクローンでは多量の組換えタンパクの発現量が見られた.このPCR産物を各種ベクターに組込み,E.coliDH5およびJM109株に形質転換した.ベクターと宿主の組み合わせで得られたクローンについてその発現量とクローンの安定性を比較した.その結果pUC19をベクターとして用いたり,宿主としてE.coliDH5株を用いた場合ではクローニングされたfimAは非常に不安定であった.低コピー数ベクターのpMW119を用いた場合安定ではあるが,発現量が非常に少なかった.発現のためにTrcプロモーターを持ち,同時にlacIリプレッサーを持つpTrc99と,宿主側にもlacIリプレッサーを持つE.coliJM109株との組み合わせが安定な発現を示したが,組換え線毛の発現量はあまり多くなかった.各菌株由来のfimAのDNA塩基配列をジデオキシ法で決定した.比較してみるとfimAのオープンリーディングフレームの上流および下流域では,ほとんど同一であったが,fimA部分では変化が見られ大きく4つのグループに分類できた.DNA塩基配列の解析によればfimAは大腸菌の典型的なプロモーター構造を上流に持たず,開始コドンも一般的なATGではなくGTGであり,これが組み換えタンパクの発現が弱い原因と考えられた.そこで開始コドンをATGに変換し,pTrc99のTrcプロモーター直後にfimAがつながるようプライマーを設計した.PCR産物をクローニングするとこのクローンでは多量の組換えタンパクの発現量が見られた.
培養シュワン細胞を生体に再移植する方法の開発

1.シュワン細胞の培養winter系ラットの新生児(生後15月)の坐骨神経を使用し,シュワン細胞を培養した。培養時,線維茅細胞が混入し増加するため,シュワン細胞を移植するには2週間以内が適当と思われた。2.神経再生の観察ラット(体重250300g)の坐骨神経に15mmの神経欠損部を作製しここにシリコンチュ-ブを置いた。シリコンチュ-ブ内には(1)軟寒天,(2)フィブリンノリ,(3)コラ-ゲンゲルを充填してみた。各充填物質において,神経の再生状態を観察したが,特に有意の差は認められなかった。次に(1)EGF,(2)ソマトメジンの成長因子を各充填物質に添加してみた。しかし神経の再生には変化は生じなかった。以上の実験の後,ラミニンを主成分とするゲル状物質(Basement Membrane MATRIGEL^<TM>)をシリコンチュ-ブに充填してみた。4週間後の観察では,チュ-ブ内に結合組識を認めまた一部にシュワン細胞を認めた。次に培養シュワン細胞をこのゲル状物質に含めシリコンチュ-ブに充填してみた。しかしゲル状物質単独の場合に比べ,有意の差は認めなかった。良好な神経の再生が得られなかった原因として,シリコンチュ-ブ内よりのゲル状物質の流出,シュワン細胞の変性消失,ゲル状物質そのものによる神経再生への障害などが考えられた。今後培養シュワン細胞をシリコンチュ-ブ内に充填する方法の改善,培養シュワン細胞の変性の防止を中心に実験を進めたい。1.坐骨神経をラット新生児より採取し、出来るだけ結合組織を除去した後、培養を行う。23日毎に坐骨神経を別の培養容器に移しかえることにより、線維芽細胞のContaminationを減少させることが出来た。倒立顕微鏡により紡錘形のSchwann細胞を確認し、またSー100蛋白を利用した蛍光抗体法も行ってみた。電子顕微鏡での観察では、特徴的な構造は確認出来なかった。2.培養Schwann細胞の再移植の方法は、細胞をゲル状物質に詰めて行っている。3.Lamininを利用した神経再生の実験では、つぎの方法を行ってみた。ただしLaminin単独ではなく、Lamininを含むBasement Membrane MATRIGEL^<TM>((Collaborative Research,Inc.)を使用した。Basement Membrane MATRIGEL^<TM>をシリコンチューブに充填ないしはチューブの半分が埋まるように置いた。ラットの坐骨神経に約15mmの欠損部位を作成し、この間にシリコンチューブを固定した。しかし結果は、シリコンチューブだけに比べて特に神経の再生が良好であるとは思われなかった。1.シュワン細胞の培養実験動物(Wister系ラット、新生児、生後15日)より坐骨神経を採取し培養した。培養開始後12週間を過ぎると、線維芽細胞が増加するが、これは1mmunocytolysisやDNA合成阻害剤を使用しても完全に防ぐことは困難であった。したがって培養シュワン細胞を移植する時期は、培養開始後2週間以内とすることが適当と思われた。2.シュワン細胞の確認(1)倒立顕微鏡による形態学的観察、(2)電子顕微鏡による観察、(3)蛍光抗体法による観察を行った。しかしシュワン細胞の確認は、これらいくつかの方法の結果を組み合わせて考えざるを得ず、確実で完全な方法はないと思われた。3.シュワン細胞の移植実験動物はWister系ラット、体重250300gを使用した。シュワン細胞をゲル状物質に含め、これをシリコンチュ-ブ内に詰めた。ラットの坐骨神経に欠損部位を作製し、ここにシリコンチュ-ブを置き、経時的に神経の再生を観察した。しかし良好な再生を認めることはできなかった。

ゲル状物質がラットの体内でシリコンチュ-ブより流出してしまうこと、これによるシュワン細胞の消失と変性、ゲル状物質そのものによる神経再生への障害などが原因として考えられた。実験動物(ラット新生児,生後15日)より坐骨神経を採取し,これを処理後シュワン細胞を培養した。この培養シュワン細胞を移植する前に次の実験を行った。1.実験動物(ラット,体重250300g)の坐骨神経に欠損部を作製し(欠損の長さ15mm),この間にシリコンチュ-ブを置く。シリコンチュ-ブ内には,軟寒天・フィブリンノリ・コラ-ゲンゲルを充填した。各充填物質において神経の再生状態を観察したが,特に有意の差はなかった。2.次に1.の物質へEGF・ソマトメジンの成長因子を添加してみた。しかし神経の再生には変化は生じなかった。以上の実験の後,ラミニンを主成分とするゲル状物質(B asement Membrane MATRIGEL^<TM>)をシリコンチュ-ブに充填し,神経欠損部に置いてみた。4週間後の観察では,チュ-ブ内に結合組織を認めまた一部にシュワン細胞を認めた。次に培養シュワン細胞をこのゲル状物質に含めシリコンチュ-ブに充填してみた。しかしゲル状物質単独の場合に比べ,有意の差は認めなかった。良好な神経の再生が得られなかった原因として,シリコンチュ-ブ内よりのゲル状物質の流出,シュワン細胞の変性と消失,ゲル状物質による神経再生への障害などが考えられた。今後培養シュワン細胞をシリコンチュ-ブに充填する方法の改善,培養シュワン細胞の変性の防止を中心に実験を進めていく予定である。
消化器癌の悪性化機序を促進する炎症性因子の同定と制御に関する基礎的・臨床的研究

炎症遷延化を引き起こすHMGB1と呼応するTLR-4、マクロファージ/TAMの動態、またEMTの存在について、ヒト肝癌(HCC)を用いて検討し、TAMに対する独自の抗FRβイムノトキシンによる制御を検討した。HMGB1レベルとTAM数、またTAM数と予後の相関がみられた。EMTに関する知見では、転写因子ZEB-1も関与した。一方、TAMの制御に関して、抗FRβイムノトキシンをヌードマウスHepG2皮下移植モデルに投与したところ、著名な腫瘍増殖抑制効果が認められた。以上の結果より、組織HMGB1とこれらにより誘導されるTAMによる腫瘍組織悪性化(形質転換)への可能性の関連が強く示唆された。H23年度には、肝細胞癌(HCC)のHMGB1発現と悪性化の関係を、臨床検体75例を用いて検索し、とくに発癌におけるHMGB1の役割に対する知見を得た。H24年度には、EMT(上皮間葉転換)に関与するとされるZinc finger E-box-binding homeobox 1(ZEB-1)の働きとEMTマーカーについての検討を行った。外科的切除が行われた初発HCC症例108例を対象として、ZEB-1およびE-cadherinの発現を免疫染色を用いて評価し、臨床病理学的因子、生存期間との関連性を検討した。123例(21.3%)でZEB-1の発現がみられ、44例(40.7%)でE-cadherinの減弱がみられた。ZEB-1陽性とE-cadherinの減弱には相関が認められた。ZEB-1陽性群は、脈管浸潤、腫瘍病期と相関し、有意に予後不良(p=0.025)であった。2E-cadherin減弱は肝内転移、腫瘍病期と相関し、有意に予後不良(p=0.048)であった。ZEB-1陽性とE-cadherin減弱を組み合わせた群は、他の群と比較してより予後不良(5年生存率29.5 vs. 62.2 %, p<0.005)であった。単変量解析では、ZEB-1陽性、E-cadherin減弱、脈管浸潤、肝内転移が予後不良因子とされたが、多変量解析では肝内転移(p=0.0086)のみが独立した予後不良因子と選定された。今回検討したHCCにおいてZEB-1陽性例は21.3%と少ないものの、その予後は有意に不良であった。また、E-cadherin減弱もHCCにおける予後不良因子であったが、ZEB-1陽性とE-cadherin減弱の組み合わせの群ではさらに予後が不良であった。これは、ZEB-1の発現によりE-cadherinの減弱が起こり腫瘍の性質が悪化したためと推察される。炎症遷延化を引き起こすHMGB1とそれに呼応するTLR-4、その存在母体であるマクロファージ/TAMの動態、またEMTなど癌形質転換の存在の有無について、ヒト肝癌(HCC)を用いて検討し、その病態解明とともに腫瘍関連マクロファージ(TAM)に対する申請者ら独自の抗FRβイムノトキシンによる制御法の検討を行った。これまでにヒト肝癌(HCC)において、1組織HMGB1レベルとTAM数の相関がみられ、2TAM数と予後の相関もみられた。また、3EMTに関する知見では、TGF-βのみならず転写因子ZEB-1も関与することを見出した。HCCにおいてZEB-1陽性例は21.3%と少ないものの、その予後は有意に不良である。さらに、よく知られたE-cadherin減弱とZEB-1陽性の組み合わせ群では、予後が極めて不良であった。これは、ZEB-1の発現によりEMT過程でのE-cadherin減弱が起こり腫瘍の性質が悪化したためと推察される。(Ann Surg Oncol; in press)一方、そのTAMの制御に関して、抗FRβイムノトキシンをヌードマウスHepG2皮下移植モデルに対して投与したところ、著名な腫瘍増殖抑制効果が認められた。以上の結果より、組織HMGB1とこれらにより誘導されるTAM、また組織悪性化(形質転換)への可能性の関連が強く示唆されたことになる。現在も、動物モデルを用いて、炎症遷延化を引き起こすHMGB1とそれに呼応するTLR-4、その存在母体であるマクロファージ/TAMの動態、そこから引きおこされるTGF-βとIL-6亢進の有無、またZEB1,Snail,Slug等の転写因子の活性化とEMTなど癌形質転換の存在の有無についてより詳細に検討を加えている。i)肝細胞癌(HCC)のHMGB

1発現と悪性化の関係を、臨床検体75例を用いて検索した。(1)HCCにおけるHMGB1蛋白とmRNA発現の有無:WBとRT-PCRを用いて、HMGB1蛋白とHMGB1 mRNAの発現を正常肝、非癌部と癌部で確認し、その全てにおいて発現を認めた。(2)癌部、非癌部、正常肝でのHMGB1発現度比較:75例のHCC患者の癌部と非癌部、7例の正常肝でHMGB1発現の定量化を行った。癌部と非癌部(CHまたはLC)におけるHMGB1の平均値は正常肝と比較して高値となる傾向がみられた。癌部と非癌部との間では有意な差はみられなかった。(3)HMGB1発現レベルと臨床病理学的因子との関係:HMGB1の発現と75症例の臨床病理学的因子を比較し、門脈浸潤、分化度、腫瘍マーカー(PIVKA-II)で有意差がみられた。すなわち、門脈浸潤陽性群は、門脈浸潤陰性群よりも低値。低分化癌は、高分化群より低値。PIVKA-II上昇群は、正常群よりも低値。またTNM stage III/IVの方が低値傾向.(4)HMGB1発現と細胞増殖活性:細胞増殖活性とHMGB1発現の相関図は、以前検討を行ったRAGE(HMGB1レセプター)の推移と一致した。また分化度が下がるとKi-67陽性細胞率は上昇し、細胞増殖活性は上昇したが、逆にHMGB1の発現は低下しており、以上のことから、HCC細胞内のHMGB1発現は細胞増殖能には明らかな関与のないことが示された。まとめると、肝臓におけるHMG1発現は、正常肝、肝硬変ならびにHCCすべてにおいてみられ、肝硬変やHCCで上昇を認める。しかし、HCC悪性度変化やその増殖能には明らかに関与しておらず、どちらかというと肝発癌から腫瘍形成初期に主に関与しているようにみえる。この推移は、そのレセプターであるRAGEの動態と酷似している。以下の3点を研究の目的としており、1に関しては平成23年度に検討された。今年度は、2に関して、とくにZEB1, E-cadherinなどに着目して検討し、肝癌における形質転換の可能性と悪性度の関係、またそれに関わる因子について知見が得られた。さらに3に関しても、実験的にまず膵癌皮下モデルで検討中である。よって、おおむね順調に進展していると判断した。1肝癌における組織炎症遷延化因子としてのHMGB1が、マクロファージ動態とくに腫瘍関連マクロファージ(TAM)に与える影響についてTLR-4レセプター系を中心に検討する。2それらの炎症性因子の癌形質転換・進展に対する関与の有無について検討する。3TAM(FRβ陽性細胞)を上記炎症の主体と仮定し、抗FRβイムノトキシン投与による抗腫瘍効果(浸潤・転移能の低下)を検討する。上記に述べた研究実績概要と別に、HCCにおけるマクロファージ進展と悪性度の関連も検討され、以下のような結果を得ている。1)肝癌においてはCD163/CD68比は予後を層別した。2)その低値群は予後不良で、FRβ陽性頻度が高い。またFRβ陽性群ではim頻度が高い傾向にあり、単結節周囲増殖や多結節癒合型が有意に多かった。3)CD68陽性細胞の中でもFRβ陽性細胞はHCC高悪性度との関連が示唆された。ゆえに本研究費の大きな目的である1)HCCの炎症性メデイエーターの関連と悪性化に及ぼす影響、2)もしその主体がマクロファージなら、それをFRβイムノトキシンで攻撃するという2点に関して、着実に結果が得られつつあることになる。
体外放電駆動パルスウォータージェットを用いたカテーテルの開発

本研究では放電によりカテーテルよりジェットを放出させ、模擬血栓の切削能力と水中気泡の挙動の学際的なデータ収集を目指したが、後者の検証の際に放電の不安定性が明らかとなり、それがジェットの性能に著しく影響を及ぼし、使用上差し支えがあることがわかったため、実用上の問題を最優先し、放電の安定性と放電電極の形状によるジェット強度の変化にターゲットを絞って研究を行った。同軸電極(陽極φ2mm,陰極φ4mmの銅またはアルミのパイプ)を用いた水中放電の実験から、気泡生成のエネルギー源が放電である場合でも水蒸気泡は単一気泡であり、レーザーの場合と大きな違いはなかった。また先行衝撃波の伝播速度は放電エネルギー0.631.0Jにて26002900m/sであり、エネルギーによる違いはほとんど見られなかった。水面近傍での放電:実験では、放電が不安定になるのは、放電前に電極周りに気泡がまったく存在しない環境である場合のほうが多く、空気の層に対し水の層が25%以下の場合ならば放電は安定しやすいという結果となった。またこの環境では放電による非線形現象が水に直接的に作用しやすく、安定性も高いことから、放電がジェット駆動に最も有効に働くことを明らかにした。また、同軸電極を用いた場合、電圧の上昇による放電成功率とジェット威力の向上はわずかであり、効率が良くないが、電極周りの形状を調整することにより放電の成功率は上昇することを確認できた。さらにこの場合でもジェット威力の現象は確認されず、むしろ形状によっては上昇することもあったことから、放電電極周りの形状について、ジェットを発生させるために適した条件を提示することが出来、ジェット生成の効率を高めることが出来るという結論に至った。これは比較的小さい放電電圧での水中放電は、電圧やエネルギーよりも電極周りの形状依存性が大きいということを意味する。本研究を遂行するに当たり、初めに放電駆動のジェットカテーテルの試作を行い、実際にジェットが発生するかを確認した。その結果、カテーテル長30cm以上ではジェット発生の成否が不安定であった。その原因について調べた結果、放電が電極周りの気泡により不安定になる場合があり、1回の放電で2度のパルス電圧上昇が認められる現象も確認された。ジェットの安定化および性能向上には、まず放電電極部の現象解明と、その結果に基づく装置の改良が必要なため、実験計画を変更し放電電極周りの現象解明に取り組むことにした。気泡が存在する場合、無い場合に比べジェットが早くなった場合も多いことから、電極面に接触する空気と水の比が放電に何らかの影響を及ぼすと考えた。そのため、実験用水槽に放電電極を取り付け、その水位を調整することにより、空気と水の接触面積比が放電電圧・電流ならびに放電の成功率に及ぼす影響について調べた。その結果、空気中に比べ、同軸形状の電極面の一部(外周部にある陰極)の一部が水中にある場合、放電時のプラスト音が最も大きく、また放電成功率も100%であった。陽極(同軸の芯線)が完全に水没すると、放電時のブラストは大きいが、放電成功率は50%以下で実用には向かなかった。また、放電電極に水没部が存在する場合、放電遅れ時間が延長された。これは絶縁物内にバルクを含む部分放電、2層誘電体中の放電に類似した現象と予想している。この結果を受け、現在電極の一部のみが水没する構造を持つ放電駆動ジェットカテーテルを試作し、その効果を確認中である。また同時に放電電極周りの現象や特性を明らかにすべく、水中衝撃圧の計測、電極材料による放電の変化、電極間距離による放電の変化、電極周りを閉塞した場合の放電について、現在実験的調査を進めるべく準備している。以上の予想外の現象があったため論文等としてまとめるのが遅れており、現在その最中である。
細胞間相互作用に基く誘導性分化の光学的画像解析による研究

マボヤ・アカボヤの分裂抑制8細胞胚から単離した動物半球頭側割球はa_<4ー2>、(1)幼生の予定神経域を含むが、単独培養すると表皮型細胞に分化し、(2)正常胚の襄胚初期の時点での(a)予定脊索割球A_<4ー1>との接着、あるいは(b)蛋白分解酵素処理により神経型細胞に分化する。この神経分化モデル系において、誘導時の細胞内機序を調べるために、蛍光指示薬を用いてCa活動度等の細胞内分布を計測する。同時にin vivoで神経分化形質の転写活性を定量的に解析するために、チャネル蛋白遺伝子の発現を可視化し、経時的に計測する。また、単離割球で得られた結果が、正常胚の胚細胞内機序を反映するか否かを確めるために、光学的試料断面で観察できる共焦点顕微鏡を用いて、in situで測定することも目的とした。誘導時点において、細胞内Caイオン動態を光学的に計測したところ、誘導と積極的に関連する結果は得られず、Caイオン以外のAキナ-ゼ、Cキナ-ゼ等の関与も証明できなかった。しかし、塩基性FGFは神経化に有効で、チロシンキナ-ゼ受容体の関与が示唆された。ホヤ胚細胞間にみられるギャップ結合チャネルの動態も、光学的手法を利用して解析し、誘導性分化の原因というよりも結果としての変化が見いだされた。Naチャネル、異常整流性チャネルの発現と転写開始時点を生理学的にあるいはmRNAレベルで決定し、神経分化にともなって前者は特異的に発現し、後者の転写は神経誘導時点以前に開始され、誘導によってむしろ転写が停止することを確かめた。また8細胞胚の時点でa_<4ー2>割球およびA_<4ー1>割球にそれぞれ異なる細胞系統マ-カ-となる蛍光色素を注入、正常胚における接着状況を共焦顕微鏡を用いて確かめた。ホヤ分裂抑制8細胞胚の動物半球頭側割球は予定神経領域を含むが、単離して培養すると表皮型に分化することが分っている。しかし、64細胞期から112細胞期にあたる時期で8細胞胚植物半球頭側割球と接着して培養するか、蛋白分解酵素処理を行なうとこの動物半球頭側割球は神経型分化に誘導される。この神経型に誘導された動物半球頭側割球に誘導時の前後で転写の特異的阻害剤であるαーamanitinを注入する実験を行った。その結果、異常整流性Kーchannelは神経型分化と表皮型分化の分離を示す最も初期のマ-カ-となること、またその変化は神経誘導時に起る恐らくKチャネル遺伝子の転写阻害にあることが示唆された。また、チャネル遺伝子の他の膜機能分子についてもこのKチャネル発現の変化と前後して発現変化を示すものを検索したところ、細胞間連絡の機能分子ギャップ結合チャネルの発現が神経誘導により抑制され、表皮分化のときは増強されることが示された。現在この現象がKチャネルの場合と同様に転写活性の変化に原因するか否かを調べている。cDNAクロ-ニングは、米国ニュ-ヨ-ク州立大学のG.Mandel博士との協同実験によって技術的な側面からの支援があり、岡村がPCR法を用いホヤcDNAライブラリ-より2種のNaチャネル遺伝子クロ-ンと考えるものを分離した。またBio Rad製共焦点顕微鏡は申請したMRCー500と異り、蛍光感度が4倍に改良されたMRCー600を購入し、現在Fluoー3を用いて正常胚の嚢胚期における予定神経領域における細胞内Caイオン濃度測定を行っている。

またルシフェラ-ゼ遺伝子mRNAを精製し、割球内に注入して冷却型CCDカメラにより発光を画像化する実験を進めている。マボヤ・アカボヤの分裂抑制8細胞胚から単離した動物半球頭側割球a_<4ー2>は、(1)幼生の予定神経域を含むが,単独培養すると表皮型細胞に分化し、(2)正常胚の襄胚初期の時点での(a)予定脊索割球A_<4ー1>との接着、あるいは(b)蛋白分解酵素処理により神経型細胞に分化する。誘導時点における細胞内情報伝達機構を明らかにする目的で、割球a_<4ー2>の細胞内Caイオン動態を光学的に計測したところ、神経誘導と積極的に関連するCaイオン濃度の上昇は見られず、Caイオン以外のAキナ-ゼ、Cキナ-ゼ等の活性化因子をもちいて実験を行ったが、これらキナ-ゼの関与も証明できなかった。しかし細胞増殖、分化などに対する作用によって最近注目されているチロシンキナ-ゼ受容体については、塩基性FGFがこのa_<4ー2>割球の神経化に有効で、その受容体の関与が示唆された。また細胞間相互作用の一つの要因として早くから注目されている胚細胞間にみられる強力なギャップ結合チャネルの動態も、単離a_<4ー2>・A_<4ー1>割球系を用いて光学的手法を利用して解析したところ、誘導性分化の要因というよりも結果としての結合の消失が明らかとなった。転写活性を定量的に解析するために、神経分化にともなって特異的に発現する分化型Naチャネルのクロ-ニングを行い成功した。このNaチャネルmRNA発現の胚における空間分布とその神経誘導時点における細胞間相互作用の関連を解析する目的で、まず8細胞胚の時点でa_<4ー2>割球およびA_<4ー1>割球にそれぞれ異なる細胞系統マ-カ-となる蛍光色素を注入、正常胚における予定神経域すなわち被誘導割球である動物半球頭側割球a_<4ー2>の細胞系統と予定脊索領域すなわち誘導割球である植物半球頭側割球A_<4ー1>の細胞系統との接着状況を共焦点顕微鏡を用いて観察した。
合成ペプチド抗体を利用した植物ウイルス特異抗体の作製とその利用に関する研究

クローバ葉脈黄化ウイルス(CYVV)及び、同ウイルスに血清学的に近縁で通常のポリクローナル抗体では類別が困難な、インゲンマメ黄斑モザイクウイルス(BYMV)について、CYVVのエピトープ解析に基づいて、CYVV-NFU株外被タンパク質N末端領域のエピトープを5種検出した。これらのうち、CYVVとBYMVに共通と考えられたエピトープI、さらに、CYVVに特異的と考えられたエピトープIIIのペプチド抗体の作製を試みた。エピトープIに対する合成ペプチドは、現在までのところ、ELISA,ウエスタンブロット法、免疫電子顕微鏡法など複数の血清学的手法で、CYVVおよびBYMVの検出が可能で、他のPotyvirusとの反応はなかった。また、健全成分との非特異反応もなく、良好な結果が得られた。さらに、モノクローナル抗体が結合するエピトープが、SPOT法で容易に検出できることを、アメリカンタイプカルチュアコレクションから得たモノクローナル抗体を用いて、確かめた。以上より、SPOT法を利用したエピトープ検出とペプチド抗体の作製が植物ウイルスでも有用であることが示された。本ウイルスについてのペプチド抗体作製の可能性が示されたため、前年度、合成ペプチドを作製しエピトープと考えられた、N-QKSKDKESRQ-C領域について、再度、抗体の作製を試みた。しかし、2羽の兎を免疫を行ったものの、両個体とも十分な力価の上昇を示さず、実用上利用可能な抗体は得られなかった。したがって、SPOT法ではエピトープとして認識されるペプチドであっても、抗原として利用できない場合、あるいは、ウイルス検出に不適な場合があることが考えられ、今後、これらの問題がペプチドの修飾によって解決するかを検討する必要もあると思われた。クローバ葉脈黄化ウイルス(CYVV)および血清学的に近縁なインゲンマメ黄斑モザイクウイルス(BYMV)について、CYVVのエピトープ解析に基づいて得られたCYVV-NFU外被タンパク質N末端領域の5つのエピトープのうち、CYVVに特異と考えられたエピトープIIIと、CYVVとBYMVに共通と考えられたエピトープIのペプチド抗体を作製した。これらのうち、エピトープIIIに対応する10個のアミノ酸残基からなる合成ペプチドは、ウサギに免疫したが十分な力価の上昇が認められなかった。一方、エピトープIに対応する11個のアミノ酸残基からなる合成ペプチドに対して作製した抗血清は、当該ペプチドに対してELISA法で、7、000倍の力価を示した。この抗血清を用いて、BYMVおよびCYVVに感染したソラマメあるいはインゲンマメからの両ウイルスの検出を試みたところ、ウエスタンブロット法、ELISA法および免疫電子顕微鏡法で検出が可能で、健全植物との反応は認められなかった。また、本抗血清と他のPotyvirusの反応についても検討した。さらに、CYVVおよびBYMVを野外のエンドウやマメ科雑草などから採集し、今後の研究用保存株とした。本研究の一部は、平成7年度日本植物病理学会大会で発表予定である。

しかし、エピトープIIIに対する抗体は十分な力価の上昇が認められなかった。本ウイルスについてのペプチド抗体作製の可能性が示されたため、前年度、合成ペプチドは作製しエピトープと考えられた、N-QKSKDKESRQ-C領域について、再度、抗体の作製を試みた。しかし、2羽の兎を免疫を行ったものの、両個体とも十分な力価の上昇を示さず、実用上利用可能な抗体は得られなかった。以上から、SPOT法ではエピトープとして認識されるペプチドであっても、抗源として利用できない場合あるいは、ウイルス検出にあたって認識できない場合があることが考えられ、今後、これらの問題がペプチドの修飾によって解決するかを検討する必要もあると思われた。
イヌの実験的歯周炎における歯肉リンパ球の抗体産生能

イヌの実験的歯周炎における歯肉リンパ球の機能を調べるために、雑種成犬5頭に実験的歯周炎を惹起し、歯肉局所に浸潤したリンパ球の抗体産生能を調べた。同時に末梢血,顎下リンパ節リンパ球の抗体産生能との比較も行った。その結果:1)採取した歯肉湿重量は平均1.5gで回収したリンパ球総数及びリンパ球の生存率は平均4.60×【10^6】(2.56.8×【10^6】)平均93%(80100%)であった。2)IgG産生量は、歯肉,末梢血,顎下リンパ節リンパ球の順に高く、培養3日目の未刺激の歯肉リンパ球がOD値で平均0.707であるのに対して末梢血,顎下リンパ節ではそれぞれ平均0.641,平均0.383であった。同様に、IgM産生能では、末梢血が最も高く、ついで歯肉,顎下リンパ節リンパ球であった。培養3日目における産生量は、順に0.362,0.253,0.118であった。PWM刺激による抗体産能の亢進は、歯肉,末梢血,顎下リンパ節リンパ球いずれの場合も認められなかった。以上のことより、歯肉に存在するリンパ球はすでにmaturationがかなり進んだ細胞と考えられ、分裂活性は低いが盛んに抗体産生を営む細胞であると考えられる。さらに、歯肉において産生される抗体はIgGが主体であり、すでにIgG産生細胞ヘクラススチイッチした細胞が多く存在する可能性が示唆された。
SCIDマウスに移植したヒト褐色脂肪組織由来新規アディポサイトカインの同定と創薬

これまでに、super-SCIDマウス(重度複合免疫不全マウス、以下SCIDマウス)の体内にヒト胎児(妊娠12週未満)の肋骨を含む周辺部位を移植した。移植後3ヶ月で、SCIDマウスに移植したヒト胎児組織は、脂肪組織様組織に分化・増殖した。胎児肋骨から分化した脂肪組織様組織は、多房性の脂肪滴で満たされ、形態学的に、この組織は、ヒト褐色脂肪組織であると示唆された。ヒト褐色脂肪組織であることを分子レベルで確認するため、SCIDマウス体内で分化させた2種類のヒト胎児由来組織片と手術で提供されたヒト成人白色脂肪組織をDNAマイクロアレイにて、発現遺伝子を比較検討した。胎児の肋骨周辺から分化した組織は、褐色脂肪組織のマーカーのUCP1(uncoupling protein1)、PGC1(PPARγcoactivator 1)、ミトコンドリアマーカー遺伝子の発現が劇的に増加しており、ヒト褐色脂肪組織であると考えられた。これらの結果は、ヒト胎児の肋骨付近に褐色脂肪組織に分化する細胞が存在しており、SCIDマウスに移植後、マウス体内ヒト褐色脂肪組織に分化・増殖したことを示唆する。ヒト褐色脂肪組織と、ヒト皮下脂肪組織のDNAマイクロアレイ解析による比較を行い、シグナル配列を有する新規のヒト褐色脂肪組織由来アディポサイトカインの候補をいくつか同定した。今後、これらの因子の体内でのエネルギー代謝におよぼす機能を解明する。
住宅生活協同組合が開発した住宅団地における居住環境形成プロセスの特性

本研究は,住宅生活協同組合(以下,「住宅生協」と略称)に開発された住宅団地の居住環境形成プロセスの特性を解明しようとするものである。平成30年度は,自身が過去に調査を実施した所沢市と神戸市の事例を対象に,両地区のステークホルダーによる開発から今日までの居住環境に対する働きかけを網羅的に把握し,経年的に整理するための資料収集及び聞き取り調査を詳細に行った。特に所沢市の事例では団地開発に深く関わった初期の住民らが長く自治会組織を担い,安定的な地区運営を行ってきたが,近年の高齢化に伴い自治会組織を刷新し,運営体制の見直しを図っている近況を中心に確認した。一方,神戸市の事例では,住宅生協の事業から発展した社会福祉法人や団地の外に根拠を持つ社会福祉法人が複数の福祉施設を住宅団地の周囲で開設し,運営してきた。近年はそれらが住宅団地内の空間ストックを活用した施設開設にシフトしており,その際の地域の合意形成を自治会が担っている状況が明らかとなった。以上の2地区に加えて,事例検討の対象地として選定した札幌市の住宅団地に関する資料(空中写真,地図,開発主体の社史,住民組織の記念誌など)を収集し,整理した。次に,全国で設立された住宅生協に関する資料が各地に散在する状況からその収集を行った。各地の住宅生協は,1960年前後の労働者の住宅運動を発端に設立されていくが,活動実態(組織体制の規模,活動期間など)や住宅供給実績(供給量,住宅団地の規模,住宅の種類など)に相違があり,必ずしも一律の実像があるわけではないことが明らかとなった。平成30年度の研究実施計画では,所沢市と神戸市の事例に加えて,札幌市の住宅団地の現地調査を実施する予定であった。しかしながら,住宅生協に関する資料が各地に散在する状況が判明したため,初年度はその収集及び整理を優先することにした。そのため札幌市の住宅団地に関しては,空中写真,地図,開発主体の社史,住民組織の記念誌などの資料収集とその整理に留めた。事例検討を行う対象地の位置付けを明確にする上で必要な情報を得ることができたため,初年度はこの分析作業を重点的に進めたことで,今後札幌市での現地調査を行う上でも重要な成果が得られた。今後は初年度の研究実施計画で予定していた札幌市の住宅団地の事例検討を行う。具体的には,団地計画(配置計画,住棟計画,住戸計画・施設計画など),地区のステークホルダー(開発者・住民・住民組織・行政機関・事業者など)による開発から今日までの居住環境に対する働きかけ,開発以降に生じた地区の空間変容(施設の増改築・建て替え・用途変更,住宅の増改築・建て替え・用途変更など)を網羅的に把握し,整理する。その成果をとりまとめ,先行して調査を行ってきた所沢市と神戸市の事例を加えた3地区間の実態を比較検討する枠組みを構築する。さらに,枠組みの構築を通じて比較要素のより詳細な情報が必要となれば,その収集を全地区で実施する予定である。

具体的には,団地計画(配置計画,住棟計画,住戸計画・施設計画など),地区のステークホルダー(開発者・住民・住民組織・行政機関・事業者など)による開発から今日までの居住環境に対する働きかけ,開発以降に生じた地区の空間変容(施設の増改築・建て替え・用途変更,住宅の増改築・建て替え・用途変更など)を網羅的に把握し,整理する。その成果をとりまとめ,先行して調査を行ってきた所沢市と神戸市の事例を加えた3地区間の実態を比較検討する枠組みを構築する。さらに,枠組みの構築を通じて比較要素のより詳細な情報が必要となれば,その収集を全地区で実施する予定である。今年度購入を予定した一部消耗品に関して自身のストックで対応できたため若干の次年度使用額が生じた。それらは次年度に使用予定の消耗品費に加算して使用する。
ヘリコバクターピロリのヘムオキシゲナーゼ活性とヘム鉄要求性胃粘膜傷害機構の研究

in vitroの系H.pylori感染粘膜において特異的に産生されると考えられるオキシダントであるモノクロラミン負荷後の胃上皮細胞株(MKN45RGM-1,GSM06,KATOIII)の変化をタイムラプス蛍光顕微鏡システム(AQUACOSMOS,HAMAMATSU PHOTONICS)で検討した。1uMのモノクロラミンにより、MKN45細胞では、細胞質内遊離モノ-,オリゴヌクレオソーム量が増加し、DNA ladder形成が観察された。この時にミトコンドリアに存在するcvtochromecは,NH2Cl投与によりサイトゾル分画に移行し、いわゆるmitochondrial permeability transitionが生じたと考えられた。モノクロラミン負荷後、アポトーシスの細胞表面マーカーであるannexin V感受性EGFP蛍光強度は上昇し、ミトコンドリア内膜電位感受性素rhodamine123の蛍光強度は著しく減少した。このときに、通常では、ミトコンドリア分画に存在するはずのチトクロムcはモノクロラミン負荷により、サイトゾル分画に漏出しておりmitochondrial permeability transition(MPT)が生じたものと考えられた。また、本アポトーシス経路は、caspase-1(ICE)は経由せず、caspase-3を活性化することも明らかとなった。また、モノクロラミンの負荷によりDNAラダーレベルと細胞質内オリゴヌクレオソーム量も亢進した。亜鉛のキレート化合物であるポラプレジンクは、そのL-carnosine部分がモノクロラミンと直接反応することによりアポトーシスを抑制した。in vivoの系生体内ではH.pylori由来の傷害因子によって惹起される上皮細胞のアポトーシスの異常亢進によってもヘム鉄が確保される。最近、一部の細菌でヘム鉄を再利用するためのヘムオキシゲナーゼ系を持つことが明らかとなったが、H.pyloriにおいて本酵素は認められなかった。つまり、本菌感染ではヘム鉄の代謝は起こりにくく、むしろ、鉄依存性の酸化ストレスが起こりやすくなる。この機序により、急性胃粘膜病変による胃粘膜出血後の胃粘膜での酸化ストレスの亢進が予測された。そこで、胃粘膜の酸化ストレスに多大な影響を与える胃粘膜微小循環障害機序について検討した。Mongolian gerbilにH.pyloriを経口接種し胃粘膜微小循環の観察及び定量的検討、生化学的炎症、酸化的マーカーの検討を行った。感染2週、4週、8週、12週後に胃粘膜微小循環を生体蛍光顕微鏡で観察し、胃粘膜細静脈における白血球転回・接着を観察し、白血球転回速度、接着数を算出した。感染後の経過とともに白血球転回速度の低下と接着数の増加がみられ、胃粘膜内ミエロペルオキシダーゼ(MPO)活性は、2週後では感染群でも有意に上昇しなかったが、微小循環での白血球転回速度の低下と接着数の増加は明らかに認められた。12週後になるとMPO活性も感染群で有意に上昇し、酸化ストレスの指標となるチオバルビツール酸(TBA)反応物質量も有意に上昇した。また、12週後の感染粘膜では、抗酸化系の一つであるグルタチオンの含量が増加しており、防御機構も誘導されてくることがわかった。つまり、微小循環系における白血球の活性化と酸化ストレス反応は非常に早期より生じており、この時点での病態コントロールを標的とした治療ストラテジーが考えられた。そこで、亜鉛のキレート化合物ポラプレジンク含有食にて同様の感染スナネズミを飼育したところ、感染2週後に認められた微小循環内白血球活性化反応の時点で、すでに抑制効果があることが明らかとなった。一方、本研究系においては、H.pyloriの感染初期の胃粘液層内での単一ビデオフレームごとの菌動態を解析し、鞭毛の回転とそれによる軌跡のシフトを示した。このビデオ画像は、世界初の本菌の初期感染動態画像となった。一方、スナネズミ(MGS/Sea)やマウス(C57BL/6)にH.pyloriを感染させ、長期経過観察したときの胃粘膜病変の進展も比較した。胃粘膜におけるアポトーシスや細胞回転を比較すると、マウス感染モデルでは、H.pylori感染により、胃粘膜上皮のアポトーシスが亢進し細胞回転の亢進が認められたが、胃癌発生の報告されたスナネズミでは、細胞増殖のみ増加し、アポトーシスは、むしろ抑制されていた。一方、アポトーシス抑制因子であるp53の部分欠損(hetero)したノックアウトマウスでは、スナネズミで観察されたアポトーシスの過剰抑制は起こらなかった。これより、アポトーシス抑制は単にp53の異常のみでは説明できないと考えられた。H.pylori感染に伴い、胃粘膜では、微小循環系の白血球の活性化が起こり、酸化ストレスが惹起され、結果的に上皮細胞を中心としたアポトーシスが惹起されるが、長期的観点からは、このアポトーシス亢進は、正常の細胞回転に必須な過程で、この破綻が癌化と関連すると考えられる。

この時にミトコンドリアに存在するcvtochromecは,NH2Cl投与によりサイトゾル分画に移行し、いわゆるmitochondrial permeability transitionが生じたと考えられた。モノクロラミン負荷後、アポトーシスの細胞表面マーカーであるannexin V感受性EGFP蛍光強度は上昇し、ミトコンドリア内膜電位感受性素rhodamine123の蛍光強度は著しく減少した。このときに、通常では、ミトコンドリア分画に存在するはずのチトクロムcはモノクロラミン負荷により、サイトゾル分画に漏出しておりmitochondrial permeability transition(MPT)が生じたものと考えられた。また、本アポトーシス経路は、caspase-1(ICE)は経由せず、caspase-3を活性化することも明らかとなった。また、モノクロラミンの負荷によりDNAラダーレベルと細胞質内オリゴヌクレオソーム量も亢進した。亜鉛のキレート化合物であるポラプレジンクは、そのL-carnosine部分がモノクロラミンと直接反応することによりアポトーシスを抑制した。in vivoの系生体内ではH.pylori由来の傷害因子によって惹起される上皮細胞のアポトーシスの異常亢進によってもヘム鉄が確保される。最近、一部の細菌でヘム鉄を再利用するためのヘムオキシゲナーゼ系を持つことが明らかとなったが、H.pyloriにおいて本酵素は認められなかった。つまり、本菌感染ではヘム鉄の代謝は起こりにくく、むしろ、鉄依存性の酸化ストレスが起こりやすくなる。この機序により、急性胃粘膜病変による胃粘膜出血後の胃粘膜での酸化ストレスの亢進が予測された。そこで、胃粘膜の酸化ストレスに多大な影響を与える胃粘膜微小循環障害機序について検討した。Mongolian gerbilにH.pyloriを経口接種し胃粘膜微小循環の観察及び定量的検討、生化学的炎症、酸化的マーカーの検討を行った。感染2週、4週、8週、12週後に胃粘膜微小循環を生体蛍光顕微鏡で観察し、胃粘膜細静脈における白血球転回・接着を観察し、白血球転回速度、接着数を算出した。感染後の経過とともに白血球転回速度の低下と接着数の増加がみられ、胃粘膜内ミエロペルオキシダーゼ(MPO)活性は、2週後では感染群でも有意に上昇しなかったが、微小循環での白血球転回速度の低下と接着数の増加は明らかに認められた。12週後になるとMPO活性も感染群で有意に上昇し、酸化ストレスの指標となるチオバルビツール酸(TBA)反応物質量も有意に上昇した。また、12週後の感染粘膜では、抗酸化系の一つであるグルタチオンの含量が増加しており、防御機構も誘導されてくることがわかった。つまり、微小循環系における白血球の活性化と酸化ストレス反応は非常に早期より生じており、この時点での病態コントロールを標的とした治療ストラテジーが考えられた。そこで、亜鉛のキレート化合物ポラプレジンク含有食にて同様の感染スナネズミを飼育したところ、感染2週後に認められた微小循環内白血球活性化反応の時点で、すでに抑制効果があることが明らかとなった。
慢性痛動物モデルに対するインターロイキン-27投与の効果

我々はインターロイキン(IL)-27と痛みの関係に注目して研究を行ってきた。IL-27は、T細胞の分化を介してIL-17(痛み誘発作用を有する)の産生を抑制し、IL-10(痛み抑制作用を有する)の産生を増加させることが知られていた。こうした背景を元に我々はIL-27ノックアウト(KO)マウスの行動解析を行い、KOマウスは生来痛覚過敏であることを見出した。この過敏はIL-27を補うことで正常に戻ることから、IL-27は疼痛感度を調節している役割を持つと考えている。また、この作用はT細胞の分化を介していないようである。本研究では、野生型マウスに慢性疼痛モデルを適用し、その病態に対するIL-27の治療効果を調べることを目的としている。神経損傷部位には様々な免疫細胞が浸潤してくることが知られており、IL-27投与によるT細胞分化を介した病態の改善を期待できると考えている。昨年度までにIL-27 4 μgの連日投与により神経障害性疼痛に対する治療効果が得られることが分かった。今年度は、このIL-27の治療効果のメカニズムに脊髄のグリア細胞が関与しているのかどうかを組織学的に検討した。神経障害性疼痛モデルにおいて、その病態形成に重要とされる脊髄後角ミクログリアの増殖を調べたが、IL-27投与群でも対照群と同様の増殖が見られた。また、同様に脊髄アストロサイトの活性化についても活性化マーカーであるGlial Fibrillary Acidic Protein(GFAP)の発現を調べたが、IL-27投与群でも対照群と同様の発現増加が観察された。これらの結果から、本実験におけるIL-27投与の効果は脊髄グリア細胞を介していないか、介していても影響は非常に少ない可能性が示唆された。今後は神経損傷部位に集積している細胞を回収し、IL-17やIL-10の発現に変化があるかを検討する必要がある。インターロイキン(IL)-27は新規な抗炎症作用も持つサイトカインで、その作用は主にT細胞の分化を介して炎症性のIL-17産生を抑制し抗炎症性のIL-10産生を促進することによると考えられている。近年IL-17が痛みを増悪させ、IL-10が慢性痛に対して治療的効果を持つことが動物モデルで報告されている。このような背景に基づいて我々はIL-27と疼痛に関して研究を行ってきた。その結果IL-27ノックアウト(KO)マウスが生来痛覚過敏であることを見出した。この過敏はIL-27を補うことで正常に戻ることから、IL-27は痛みの感度調節をしていることが示唆された。本研究では、IL-27が慢性疼痛に対する治療薬となるかを調べることが目的である。慢性疼痛モデルとして神経障害性疼痛モデルだけでなく炎症性疼痛モデルも用いた。また、投与方法としては単回の腹腔投与を行った。マウスの左L4脊髄神経を切断することにより神経障害性疼痛モデルを作製した。機械刺激による逃避閾値の測定にはUGO BASILE製、DYNAMIC PLANTAR AESTHESIOMETERを用いた。手術後6日目に逃避閾値を測定したところ、手術前と比較し低下が確認された。翌日(術後7日目)にIL-27(400 ng/マウス)を投与し、2時間後から6時間後の間に閾値の測定を行ったところ、IL-27による治療的効果は観察することができなかった。マウスの左後肢足底に完全フロイトアジュバンド(20マイクロリットル/足)を投与して作製した炎症性疼痛モデルにおいても、上述の投与法や投与量ではIL-27による治療的効果は認めることができなかった。以上の結果から、神経障害性疼痛と慢性疼痛動物モデルにおいてIL-27(400 ng/マウス)を単回腹腔投与しても治療的効果は期待できない可能性が示唆された。本年度の研究計画では、慢性疼痛モデルとして神経障害性疼痛モデルを用いることとしていたが、他の慢性疼痛モデルにおけるIL-27の役割を調べることも重要であるため、炎症性疼痛モデルも用いることとした。また、投与法は作用点を調べる目的で主に髄腔への投与を考えていたが、いずれにしても他の投与方法の検討は必要不可欠であるため、最初は単回の腹腔投与を行うこととした。単回投与以外の投与方法、400 ng/マウス以外の投与量については今回検討していない。慢性疼痛モデルの種類を神経障害性疼痛と炎症性疼痛と増やしたが、投与法の種類の検討に関しては単回の腹腔投与のみとなった。機械刺激による逃避閾値の測定には、当初von Freyfilamentによる50%閾値の計測を予定していたが、この方法は実験者に対する負担が大きいためUGO BASILE製、DYNAMIC PLANTAR AESTHESIOMETERを用いることとした。この装置のよいところは無理な姿勢をとらなくてもマウスの足底を視認することができ、また、刺激装置は機械でコントロールされているため、刺激のばらつきは少ないと考えられる。本年度に分担研究者が他施設へと移動したため、研究環境が大きく変わることとなった。移動先での実験系の構築や実験関係の書類を新たに申請するなどに時間を要した。慢性疼痛発症の機序においてサイトカイン等の様々な免疫分子の関与が示唆されている。我々はインターロイキン(IL)-27に注目して研究を行ってきた。