hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
振動法による立木材貭の測定法の検討と立木材貭を基準とする新しい間伐法の開発

すなわち、東京大学千葉演習林、および岐阜県美濃、岡山県勝山町、愛媛県小田町の各民有林のスギ造林地において、それぞれ26ー50本の立木を任意に選び、それらについて応力波伝播時間(△T)を測定して動的ヤング係数(E)を求めた。同時に樹高、胸高直径さらに一部では成長錐を用いて比重、含水率等の測定を行なった。また、サンプリングした立木を伐倒して製材品となし、その材質を測定した。これらの調査結果を総合的に検討した結果、次のような結論が得られた。(1)△Tが立木→丸太→製材(たいこ挽き)で変わらないことが確かめられた。このことは△Tが重力の影響を受けないこと、また応力波は最短距離を伝播することを示し、これを基本としてEの計算法を検討した。(2)各立木について測定した比重と応力波伝播速度(v)を用いてEを算出したが、このEとv^2が直線関係にあり、その勾配は各林分によって変わらず0.8を示した。この数値を使えばvのみにてEが得られる。(3)胸高直径、樹高とEは相関がないことが明らかになった。Eによる除間伐、主伐法の合理性が確かめられ、システム確立の可能性が立った。(4)本法により立木の内部欠損の判定も可能である。
宇宙活動の長期的持続可能性の動きと日本が選択すべき衛星を防護するための対処法

本年度は「宇宙活動の長期的持続可能性の動きと日本が選択すべき衛星を防護するための対処法」という研究テーマにおいて、後半の「日本が選択すべき衛星を防護するための対処法」に焦点を置き研究を進めた。成果として、衛星を防護するための対処法においては、国際的な枠組みを締結することが重要であると共に、宇宙状況認識など日本も積極的に行い、国際社会と情報を共有して行くことが課題であることが明らかとなった。研究を行う上で、文献収集として以下のフィールドワークを行った。2011年6月6-10日宇宙技術および科学の国際シンポジウム、ISTS(沖縄)、2011年7月26-28日国連軍縮会議in松本(松本)、2011年9月24日第12回日本安全保障貿易学会(京都)、2011年10月27日Policy and Regulatory Risk Seminar IV-II of the Practitioner and Industry Seminar Series: Risk Associated with Space Activity(ロンドン、イギリス)、2011年12月11日国際安全保障学会(東京)、2012年3月1-2日人類の持続的宇宙開発利用のための国際シンポジウム-宇宙デブリ問題へのチャレンジ-などの学会に参加し、「宇宙空間に関する行動規範草案」や「宇宙活動の長期的持続性ガイドライン」の審議状況や採択可能性に関する情報収集を行うと同時に、日本がこれらのソフトロー審議においてどのような姿勢で挑んでいるか情報収集を行わた。さらに、日本の宇宙活動における最新の動向を把握するために社団法人日本航空宇宙公教会が主催する宇宙環境保全検討委員会に委員として参加および発言を行い、外務省の宇宙物体登録・損害賠償問題に係る法的研究会を傍聴した。日本の宇宙活動における基本計画や基本法は施行されているものの、宇宙活動法が未だに草案段階にあることや防衛省の活動が宇宙戦略本部において審議されていないため、環境保全などと連携がとれていない印象がある。さらに、国内だけではなく、「宇宙空間に関する行動規範草案」や「宇宙活動の長期的持続性ガイドライン」などの国際的な審議の遅れも影響している。いずれの文書も草案段階で審議が止まっていることから、あくまで仮定の話しか検討できないが、いずれかの時点で区切りをつけ、審議が停滞している事由を踏まえた上で今後の日本が選択すべき最良の衛星防護への対策を提案することが望ましいと考える。本年度は「宇宙活動の長期的持続可能性の動きと日本が選択すべき衛星を防護するための対処法」という研究テーマにおいて、前半の「宇宙活動の長期的持続可能性の動き」に焦点を置き研究を進めた。その成果として博士号学位論文『宇宙物体に対する意図的破壊を禁止する国際法の形成可能性:スペースデブリ低減策を含む「宇宙活動に関する行動規範草案」の検討』を執筆した。本学位論文は、宇宙物体の意図的破壊行為が禁止されていないことにより、宇宙活動の長期的持続可能性を阻害されているという視点から執筆されたものである。研究成果を行う上で、文献収集として以下のフィールドワークを行った。2010年5月8日日本国際法学会(大阪)、2010年10月国際宇宙会議(International Aeronautic Congress, IAC2010)(プラハ、チェコ)、2010年11月Global MilSat Com(ロンドン、イギリス)、2011年2月23日Forum on Air & Space Law(ワシントン、アメリカ)などの学会に参加し、「宇宙空間に関する行動規範草案」や「宇宙活動の長期的持続性ガイドライン」の審議状況や採択可能性に関する情報収集を行った。また2011年2月24日アメリカ議会図書館(ワシントン、アメリカ)において米国議会での宇宙物体の意図的破壊行為に関する議事録や、2011年2月ニューヨーク国連本部ダグ・ハマーショルド図書館(ニューヨーク、アメリカ)においてCDにおける宇宙空間の平和利用に関する文献などの文献収集を行った。

日本の宇宙活動における基本計画や基本法は施行されているものの、宇宙活動法が未だに草案段階にあることや防衛省の活動が宇宙戦略本部において審議されていないため、環境保全などと連携がとれていない印象がある。さらに、国内だけではなく、「宇宙空間に関する行動規範草案」や「宇宙活動の長期的持続性ガイドライン」などの国際的な審議の遅れも影響している。いずれの文書も草案段階で審議が止まっていることから、あくまで仮定の話しか検討できないが、いずれかの時点で区切りをつけ、審議が停滞している事由を踏まえた上で今後の日本が選択すべき最良の衛星防護への対策を提案することが望ましいと考える。
任意の細胞に特異的遺伝子導入するための組換えレトロウイルスベクターの産生系の確立

HIV-gp120 binding domainを持つtruncateしたCD4分子を挿入したchimeric envelopeを発現させたecotropic retro viral vector産生細胞を樹立した。この産生細胞からつくられるretroviral vectorparticleは、chimeric env.を取り込んでおりHIV-gp120発現細胞への特異的な遺伝子導入が可能であった。しかし、導入効率は、低くtiterは10100cfu/mlであった。そのため、full lengthのCD4を挿入したchimeric env.を構築したがcytosolでのみ発現が得られ、何らかの機序によりcell surfaceへの輸送の段階で阻害を受けたと考えられた。さらに、導入効率を上げる試みとしてHIVの感染のco-receptorであるfusinをvector産生細胞に発現させvector particleへの取り込みを検討中である。別な方法として、HIVのgp120に対する抗体のvariableregionをcloningして同様にecotropic envelopeに組み込んだchimeric env.を作成した。このchimeric envも細胞のなかでのみ発現が認められた。しかし、HIV-vector産生plasmidとco-transfectionするとHIV-env.gp120の発現が抑制されることから、細胞内で発現したchimeric env.は、HIV-gp120とinteractionしていると考えられた。今後さらに改変を加え、cell surfaceでの発現を検討したい。任意の細胞に遺伝子を導入するための、Targeting vectorを開発するためにHIVのEnvelope protein gp120と、CD4を利用したモデルの作製を進めた。まずEcotropic virusのEnverope protein gp70に種々のサイズのCD4を組み込んだ発現ベクターを作製した。Ecotopic retoro virus packagingcell lineに各々の発現ベクターをtransfectionし細胞表面でのキメラenvelopeの発現を検討した。4種類の発現ベクターを検討したが、細胞表面上に発現しているのはfull lengthのCD4をtruncationさせgp120とのBinding domeinを残したものだけであった。他の発現ベクターの物は、cytosolでは発現が認められ細胞表面上での発現までの過程に障害がある事が示唆された。さらにHela細胞にこのtruncateさせたCD4を組み込んだキメラenvelopeを発現させたところHIVの感染が認められこのCD4分子がgp120とのbindingに十分な事が示された。標識遺伝子としてlac Z遺伝子を組み込んだecotropic retrovirus vector産生細胞株を樹立し、さらにCD4とのキメラeco.envelopeを発現する細胞をクローニングした。まずこの培養上清をReconbinant gp120がcoatingしてあるplateでELISAを行ったところ培養上清には、gp120と結合するウイルス粒子が存在する事が示唆された。さらに、gp120発現ベクターにより細胞表面にHIVのgp120を発現させた細胞にこの培養上清を用いて遺伝子導入実験を行ったが、期待されるような遺伝子導入は、認められなかった。同じ条件下でベクター粒子の標的細胞へのbindingを検討したところ細胞表面上でのbindingは認められた。現在、これらの結果を詳細に検討しており有効なtargeting vectorの開発に向けて研究を進めて行きたい。
芳香環オキシゲナーゼ遺伝子シャフリングによる新規な分解代謝系の構築

芳香族炭化水素への初期酸素添加に関与する酵素(オキシゲナーゼ)は末端酸素添加酵素(大小サブユニット)とNADHからの電子伝達系(フェレドキシン及びその還元酵素)から成る多成分酵素である。本研究では、まず、大サブユニットが基質特異性に関与することを明らかにした。ついで分解機能の異なるPseudomonas pseudoalcaligenes KF707株とBurkhoderia cepacia LB400株の二つのビフェニルジオキシゲナーゼの大サブユニット(BphAl)遺伝子間でDNAシャフリング法を適用した。即ち、両bphAl遺伝子をPCRにより増幅、DNAaseIで10-50bpに分解、プライマーを入れないPCR、ついでプライマーを用いたPCRにより、KF707-bpAlとLB400-bpAlのキメラ遺伝子を構築した。これを大腸菌で他の遺伝子と共発現させて、キメラ酵素の機能を解析した。その結果、DNAシャフリングにより、各種ポリ塩化ビフェニル(PCB)に対して2,3-dioxygenation及び3,4-dioxygenationの両反応により効率よく分解する酵素が得られた。また、親酵素が分解できないベンゼン、トルエンを分解できる新規な酵素、諸種のアルキルベンゼンに高い分解能を示す酵素が得られた。次にKF707BphAl遺伝子についてランダムヘキサオリゴマー利用した変異を行った。その結果、KF707株酵素が分解できないジベシゾフラン、ジベンゾ-p-ダイオキシンに対してlateral dioxygenation及びangular dioxygenationの両反応により酸化できる変異酵素が得られた。上記の改変酵素のアミノ酸配列を決定し、新規な分解能獲得に関与するアミノ酸配列を同定し、素の構造と分解能について考察した。微生物起源の芳香族炭化水素の分解遺伝子クラスターの構造と機能は、微生物の物質変換機能の進化的側面を反映している。ビフェニルオキシゲナーゼ、トルエンオキシゲナーゼなどの芳香環初期酸素添加酵素はマルチコンポーネント酵素で、4つのサブユニットから構成される。即ち、分子状酸素を活性化し、芳香環基質に添加する末端オキシゲナーゼ(大小サブユニットより構成)とNADHからの電子伝達系に関与するフェレドキシンおよび還元酵素から成る。本研究では遺伝子間でサブユニットタンパク質の相互置換、機能ドメインの相互置換、およびDNAシャフリングの手法を用いて新規な機能をもつハイブリッドオキシゲナーゼを構築する。(i)PCB分解能の異なる5種類の分解菌から基質特異性に関与するbphA1遺伝子(末端オキシゲナーゼの大サブユニット)をPCRにより増幅し、Pseudomonas pseudoalcaligenes KF707株由来の他のオキシゲナーゼサブユニット遺伝子クラスター(bpbA2/bphA3/bphA4)の上流に挿入、大腸菌で発現させた。その結果、構築したハイブリッド酵素の基質特異性はbphA1由来の親株の酵素に類似していた。即ち、ビフェニルジオキシゲナーゼの基質特異性はBphA1に大きく依存することが明らかとなった。(ii)Pseudomonas pseudoalcaligenes KF707のbphA1遺伝子は基質特異性に関与することからランダムオリゴプライマー(ヘキサマー)を用いてbphA1遺伝子にランダムに変異を導入した。これらの変異bphA1をbphA2/bphA3/bphA4の上流に繋ぎ大腸菌で発現させた。これらのクローンから、野生酵素が元来アタックできないジベンゾフランに活性を示す数株を取得した。微生物起源の芳香環の初期酸素添加に関与するジオキシゲナーゼはマルチコンポーネント酵素で、3つ乃至4つのサブユニットから構成されている。本研究ではこれまでに鉄・硫黄タンパク質である大サブユニットがジオキシゲナーゼの基質特異性に関与していることを明らかにした。本年度は以下の研究成果が得られた。

(1)本年度は昨年度に引き続き、Pseudomonas pseudoalcaligenes KF707株のビフェニルジオキシゲナーゼの大サブユニットであるbphA1遺伝子にランダムヘキサマーを用いて取得した諸種の変異ジオキシゲナーゼを大腸菌で発現させ、改変ジオキシゲナーゼの機能を検討した。その結果、昨年取得したジベンゾフランを酸化分解する新規な酵素遺伝子を更に改変することにより、野生株酵素が全く分解できないダイオキシンをも分解できる酵素を新たに取得できた。ついで、この遺伝子の解析からダイオキシン分解に関与するアミノ酸を推定した。(2)ビフェニル資化菌である上記P.pseudoalcaligenesKF707株とBurkholderia cepacia LB400株はともにPCBを分解するがその分解特性は非常に異なっており、前者は塩素数13のPCBしか分解できないのに対し、後者は45のPCBをも分解できる。しかし、その分解遺伝子クラスターの構造および個々の遺伝子の塩基配列は極めて類似している。両菌株のビフェニルジオキシゲナーゼの大サブユニットであるbphA1に対してDNAシャフリングを行い取得したキメラジオキシゲナーゼから、野生株の酵素が全くアタックできないベンゼンとトルエンおよび諸種のアルキルベンゼンを速やかに分解するキメラジオキシゲナーゼがスクリーニングされた。このキメラBphA1の解析から4つのアミノ酸がLB400株から由来していた。芳香族炭化水素の初期酸化に関与するオキシゲナーゼは一般に基質特異性が広く、多くの化合物を酸化する。本研究ではビフェニルジオキシゲナーゼ(Bph Dox)を材料に各種の手法を用いてこれを改変し、新規な機能を持つ酵素の取得と解析を目的として、本年度は以下の研究を行った。(1)分解能の異なる二つのBph Doxの大サブユニット遺伝子(bphA1)に対して、DNA shuffling法により80のポジティブクローンが得られた。このうち、5つの改変bphA1遺伝子を導入した大腸菌はLB寒天培地上で深青色を呈した。これはindoleがオキシゲナーゼにより酸化されindigoに変換されたことに起因するものであり、フェノール、トルエン、スチレンのような単環ジオキシゲナーゼを大腸菌で発現させた時に認められる。これら5つのクローンについて単環化合物に対する環開裂黄色化合物の蓄積量を測定した。全てのクローンが両親株由来のBph Doxに比べethylbenzeneなどのアルキルベンゼンに対し、高い分解能を示した。特にE.coli[pHSF1072」はアルキルベンゼンだけでなく、ベンゼン、トルエンに対して新規な分解活性を獲得した。
子宮頚部にneoplasticな病変がないHPV感染者の自然史の解明

目的:日本におけるHPVスクリーニングとワクチン投与の基礎的なデータを得る。方法:2282人の筑波大学附属病院と茨城西南医療センター病院を検診あるいは子宮頸部疾患を治療するために受診した日本人女性(1517人の正常細胞診、318人のCIN1、307人のCIN2-3、140人のICC)からHPV DNAのデータを分析した。HPVジェノタイピングにはL1プライマーを使用したPCR法を採用した。結果:ICCでのHPV分布は多い順にHPV16型(40.5%)、18型(24.4%)、52型(8.4%)、33型(3.1%)、58型(3.1%)だった。細胞診正常とCIN2-3・ICCのHPV分布を比較すると、病変進展のリスクはジェノタイプによって異なり、16/18/31/33/35/52/58型はprevalence ratio(PR)=1.92、95%CI=1.58-2.34、他のoncogenic typeはPR=0.31、95%CI=0.19-0.50。non-oncogenic typeはPR=0.09、95%CI=0.03-0.43.。16・18型はそのほかの型との混合感染を含めて日本人女性でのICCの67.1%とCIN2-3の36.2%に寄与している。より重要なのは、16・18型の分布が年齢によって非常に異なることである。20-29歳で最も多く(ICCの90%、CIN2.3の53.9%)その後年齢とともに減少し、60歳以上で最も少なくなる(ICCの56.3%、CIN2・3の25.0%)。結論として、型特異的なHPV検査を行うことでCIN2.3と子宮頸癌への進展する可能性が高い日本人女性を検出することが可能かもしれない。日本では現在ワクチンで約70%のICC予防が可能と予測されており、妊孕性のある若年層での子宮頸癌と前がん病変を減らすことが期待できる。目的:浸潤子宮頸癌の99.7%にHuman papillomavirus(HPV)感染がある事が確かめられているが、HPV感染者のどれほどの割合が全癌状態である子宮頚部異形成となるかは明らかではない。この自然史と感染、進展のリスクファクターを解明する事を目的とした。対象と方法:文書による同意を得た一般病院受診者を対象として、子宮頚部細胞診とHPV DNA検査を同時に施行した。子宮頚部細胞診およびcolpsopeにて異常所見がなく(臨床上病変がないと考えられる対象群であり、侵襲的検査である組織診の施行は倫理的問題があるので行わず、細胞診で異常が出た際に初めて行う事とした)、HPV陽性の患者(HPV感染未発症者)を追跡調査の対象症例とした。HPV DNA検査はL1領域のコンセンサスプライマーを用いたPCR法により行った。初回検査時に性行動を含む生活習慣のアンケート調査を行い、6ヶ月ごとに子宮頚部細胞診とHPV DNA検査を行う事とした。アンケートは1年ごとに生活様式、性行動の変化についても追跡する事とした。成果:初年度は症例を蓄積した。

約1年間で388名の患者に子宮頚部細胞診とHPV DNA検査を同時に施行し、HPV感染未発症者101例を新たに登録した。研究計画では年間登録見込みを80例としていたのでこれを上回った。既に蓄積していた同様の対象群194症例を648ヶ月(中央値24ヶ月)追跡した結果、1例のCIN2と2例のCIN3への進展が組織学的に確認されており(合わせて1.52%)本研究費による新たな対象患者を合わせて追跡する事でHPV感染未発症者の自然史を解明できる期待が高まっている。アンケートの解析は途中だが(回答率75.7%)、HPV感染者の初交年齢は12-25歳(中央値18歳)、非感染者は13-33歳(中央値19歳)で現在のところ初交年齢に関して有意差はなかった。目的:子宮頸部HPV感染者が前癌状態である子宮頚部異形成となる割合は明らかではない。この自然史と感染、進展のリスクファクターを解明する事を目的とした。また、アンケートの解析によりHPV感染のリスクを抽出する。また、HPV感染は高いsexual activityがリスクと報じられ、子宮頸部病変発症者が、親近者から奇異の目を向けられる事がある。sexual activityが低い群での感染率を算出し、対象と方法:文書による同意を得た一般病院受診者を対象とし、子宮頚部細胞診(以下、細胞診)とHPV DNA検査を同時に施行した。細胞診およびcolposcopeで異常所見がなく、HPV陽性の患者を追跡調査の対象症例とした。HPV DNA検査はL1領域のコンセンサスプライマーを用いたPCR法により行った。初回検査時に性行動を含む生活習慣のアンケート調査を行い、6ヶ月ごとに細胞診とHPV DNA検査を行う事とした。アンケートは1年ごとに生活様式、性行動の変化についても追跡する事とした。成果:H16-17年度の約2年間で625名の患者に細胞診とHPV DNA検査を同時に施行し、HPV感染未発症者153例を登録した。研究計画では年間登録見込みを80例としていたのでこれを若干下回った。これらの症例を018ヶ月追跡した結果、1例のCIN1と1例のCIN3への進展が組織学的に確認された。今後症例が増え、追跡期間が延びる事で自然史の解明への寄与が期待される。アンケートからは年齢補正を行った多変量解析の結果、HPV感染は経産回数0回に対し3回以上、生涯パートナー数は1-2人に対し3以上が有意なリスクファクターであった。ところで、しかし、アンケートの解析から生涯パートナー数が1人であっても27.3%、初交年齢が初婚年齢と同じであっても35.7%にHPVを感染を認め、HPV感染者はsexual activityが高くない集団でも相当の割合で存在する事が明らかとなった。sexual activityが低い群での感染率を算出し、対象と方法:文書による同意を得た一般病院受診者を対象とし、子宮頚部細胞診(細胞診)とHPV DNA検査(HPV検査)を同時に施行した。HPV検査はL1領域のコンセンサスプライマーを用いたPCR法により行った。初回検査時に性行動を含む生活習慣のアンケート調査を行い、6ヶ月ごとに細胞診とHPV検査を行う事とした。
力伝達障害としての拡張型心筋症の病態メカニズムの解明

原子間力顕微鏡(AFM)を用いて心筋細胞の押し込み試験を行ったところ2ミクロンの周期を持つ押し込み剛性のピークを観察した。この剛性は細胞骨格の主要な要素である微小管(チューブリン)を脱重合するコルヒチン処理によっては変化しなかったが浸透圧ショックによってT管構造を破壊したところ消失した。またこの際細胞膜のAFM観察を行ったところT管の開口部とそれらをつなぐz-grooveと呼ばれる構造が消失していた。細胞膜のみで構造を支えることは当然考えられないためその近傍にあるタンパクに注目し蛍光抗体法によって構造を観察した。T管の破壊は筋原線維を横に連結するデスミンやZ帯を構成するαアクチニンなどには変化をもたらさなかったが膜の裏打ちタンパクであるスペクトリンの蛍光は低下もしくは消失していた。このことは細胞を横に貫く構造であるT管が裏打ちタンパクとともに構造要素をして機能していることを示している。また筋原線維を単離して同様に押し込み試験を行ったところ緩衝液のカルシウム濃度上昇による剛性の増加が認められたがサルコメア構造を反映した周期性は観察されなかった。したがって現時点では細胞表面の周期性をとサルコメアとの関係は不明でありさらなる検討が必要である。細胞モデルについては細胞内構造を拡張したモデルの開発を行った。特に拡張型心筋症の発症との関連が指摘され介在板に存在するvinculinに注目しその欠失モデルを作成した。細胞モデルにおいて短縮は影響がなかったがこのような細胞から構成される心臓のマルチスケールシミュレーションを行ったところ著明な駆出率の低下が再現され病態形成メカニズム解明に示唆が得られた。ラット心筋細胞から単離した筋原線維について原子間力顕微鏡(AFM)を用いて形態観察と押し込み試験を行った。この結果Z帯に一致した周期で固さのピークが認められ、このピークは溶液のカルシウム濃度を上昇させることによって顕著となった。また細胞自体についても同様の実験を行ったところz-grooveと呼ばれるサルコメア周期と一致した構造を認めこの部分での固さのピークを検出した。この部分は筋原線維のz帯とT管およびその裏打ち構造をなす細胞骨格によって連絡しているためこれらの構造を介して筋原線維が発生した力が細胞膜に伝達していると考えた。この仮説を検証するためformamideを用いたosmotic shockによってT管と細胞表面の細胞膜との連絡を破壊した後に測定を行った。細胞膜表面の観察ではZ-grooveが消失しており固さのピークも消失した。Osmotic shockが細胞骨格に変化をもたらす可能性を検証するため主要な細胞骨格を免疫染色によって観察した。細胞膜の裏打ち構造であるスペクトリンはT管部分で変化が見られたが筋原線維を横に結合するデスミン、Z帯を構成するαアクチニンについては明らかな変化を認めなかった。これらの結化はT管構造が筋原線維と細胞表面の細胞膜、おそらくは接着分子、との機械的結合に重要な役割を果たしていることを示唆しているが、現時点で細胞膜のみからなる構造が面内引っ張り以外の剛性を御持つとは考えておらず今後T管を支持する細胞骨格要素を検索する予定である。今回の結果は従来興奮収縮連関との関連においてのみ捉えられてきた細胞内のT管構造に他の重要な機能があることを示唆する重要な知見と考えられる。
感冒に伴う気管支喘息の増悪機構の解明

気管支喘息患者が感冒に罹ると、喘息の増悪をひき起こすことがしばしばある。感冒ウイルスであるrespiratory syncytial (RS)ウイルスは、喘息増悪因子のひとつとされるが、その感染に伴う喘息増悪機構は解明されておらず、根本的治療法もみつかっていない。このような状況下、最近我々は、RSウイルス感染に伴う喘息の増悪機構に関与する可能性があるいくつかの因子を見出した。そこで本研究では、これらの因子に焦点を合わせ、RSウイルス感染に伴う喘息増悪のメカニズムを解明することを目的とする。この解明は、その分子や細胞を標的とした治療の開発につながることが期待される。
冷戦後世界の構造変化と国際政治学の新しい理論構築

1996年9月に開催される、アメリカ国際政治学(ISA)と日本国際政治学会によの合同大会に向けての、研究上の準備が本研究の大きな目的であった。この点に関しては、まずほとんどの研究分担者が同大会での各セッションで報告をなしもしくはセッションのコンヴィーナーとして参加できるまでになったことは大きな成果であった。そしてこの報告はいずれ大会のプロシ-ディングスや国際政治学会の『国際政治』に掲載される予定である。ついで各分野に関しては以下のような成果がみられた。まず(1)理論のグループでは、本研究期間中西欧との国際政治学者との交流を通じて、既成の概念の組み直し、それと関連して実体分析に加えて国際政治の「意味空間」を把握するための方法論において成果がみられた(参照、高橋、田中論文)。(2)ついでヨーロッパ国際政治のグループでは、冷戦後の激変をどう理解するかが最大の問題となり、いわゆる統合解体の側面(旧ユ-ゴ)と統合の側面(バルト海)の実証的研究がなされた(参照、木戸論文、百瀬共著)。そして(3)アジア太平洋に関しては、この地域で急速に進展している統合の側面とそれを支える要因の分析が大きなテーマとなり、さらにそれと関連してこの地域における日本の位置づけの解明が急がれた(参照、黒柳、玉木論文)。(4)最後の安全保障・軍縮のグループでは、核兵器の今後の問題が検討され、特に冷戦後の核兵器の状況をにらんだ核抑止論の検討がなされた(参照、鴨論文)。以上が主な研究成果であるが、このような成果を踏まえて、現在急速に振興しているグローバル化の問題を継続して研究中であり、また高橋は、ヨーロッパとアジア・太平洋の地域主義に関わる諸問題を比較考察しており、いずれも1996年には成果が公表される予定である。本年度は、研究の1年目であるため、資料・文献収集・基礎的研究が主たる活動であり、そのため公表された研究成果は数少ない。(1)理論研究グループでは、研究分担者を中心に、日本では紹介されることの少ないヨーロッパの研究状況の把握に努めた・その一環として開催された日仏の国際政治学者のセミナーでは、仏側の関心が国際政治の意味理解を強調しており、実体分析に傾斜しがちの日本の国際政治学に再検討する機会を提供した。(2)ヨーロッパ国際政治グループは、ヨーロッパで最近提唱され始めたグローバル・ポリティクス(あるいは世界内政政治)モデルを中心に検討し、その1部は、高橋論文として公表した。次年度は以上のモデルの妥当性をヨーロッパ統合に代表されるヨーロッパでの地域主義を中心に検討することを予定している。(3)アジア・太平洋の国際政治のグループは、APECに代表される地域主義を解明するために、既存の国際統合理論の再検討を行った。なかでも注目されるのが、EC統合の歴史研究のなかから提起された国民国家を重視して考える理論であり、次年度はこの視点を発展させて、国民国家の均一化と地域協力・国際統合の関係を解明する予定である。(4)安全保障・軍縮グループは、いままで放置されてきた核拡散に関する理論についての考察を行った。その一端は、研究分担者の鴨が9月に開催された国際会議のペーパーで明らかにした。次年度もこのテーマを継続する予定である。1996年9月に開催される、アメリカ国際政治学会(ISA)と日本国際政治学会による合同大会に向けての、研究上の準備が本研究の大きな目的であった。この点に関しては、まずほとんどの研究分担者が同大会での各セッションで報告をなす、もしくはセッションのコンヴィーナーとして参加できるまでになったことは大きな成果であった。そしてこの報告はいずれ大会のプロシ-ディングスや日本国際政治学会の『国際政治』に掲載される予定である。各分野に関しては以下のような成果がみられた。

まず(1)理論のグループでは、西欧の国際政治学者との交流を通じて本研究期間中に、既成の概念の組み直し、それと関連して実体分析に加えて国際政治の「意味空間」を把握するための方法論、において成果がみられた(参照、高橋、田中論文)。(2)ついでヨーロッパ国際政治のグループでは、冷戦後の激変をどう理解するかが最大の問題となり、いわゆる統合解体の側面(旧ユ-ゴ)と統合の側面(バルト海)の実証的研究がなされた(参照、木戸論文、百瀬共著)。そして(3)アジア太平洋に関しては、この地域で急速に進展している統合の側面とそれを支える要因の分析が大きなテーマとなり、さらにそれと関連してこの地域における日本の位置づけの解明が急がれた(参照、黒柳、玉木論文)。(4)最後の安全保障・軍縮のグループでは、核兵器の今後の問題が検討され、特に冷戦後の核兵器の状況をにらんだ核抑止論の検討がなされた(参照、鴨論文)。以上が主に研究成果であるが、このような成果を踏まえて、現在急速に進行しているグローバル化の問題を継続して研究中であり、また高橋は、ヨーロッパとアジア・太平洋の地域主義に関わる諸問題を比較考察しており、いずれも1996年には成果が公表される予定である。
久山町住民における遺伝・環境要因を考慮したインスリン分泌能の長期追跡

【目的】福岡県久山町において、インスリン分泌能に影響しうる遺伝・環境要因について検討した。【結果】40歳以上の住民の2,074名を対象とすると、5年間の経時的なインスリン分泌能低下と有意に関連する臨床的な因子はBMIであった(p<0.001)。この結果をもとに性・年齢・BMIを調整してGWAS研究で同定された27遺伝子上の36SNPsを検討すると、インスリン分泌能低下と有意に関連するSNPsは、rs2283228(KCNQ1)、rs12779790(CDC123,CAMK1D)であった。【結論】BMIのレベルと2つの遺伝子は、日本人の経時的なインスリン分泌能の低下と関連することが示唆される。本年度は、久山町の2002年度の生活習慣病健診受診者をベースラインとした前向き研究のデータ整備と理化学研究にて各遺伝子のSNPの測定を行った。2002年の集団は、40歳以上住民の77.6%にあたる3,328名の受診者を得て、その96%にあたる3,196名から遺伝子解析のためのインフォームド・コンセントを取得した。この集団を前向きに2003年2009年の合計7年間追跡し、各年度でインスリン分泌量についてHOMAβを用いて算出した。今後の予定は、ヒトゲノム・遺伝子解析に関する倫理指針に準拠したセキュリティで保護された久山町内にある既設の遺伝子サーバーで、疫学データとSNPデータをリンクさせインスリン分泌に関連する遺伝子同定を行う予定である。【目的】福岡県久山町の追跡調査において、インスリン分泌能に影響しうる遺伝・環境要因について検討をおこなった。【対象】久山町の40歳以上の住民のうち、2002年と2007年の両方の住民健診を受診し、インスリンの分泌指標であるHOMA-βを測定できかつ糖尿病がない2,074名を対象とした。臨床的に分泌に影響を与えうる因子として、性、年齢、BMI(body mass index)、運動、飲酒、喫煙、糸球体濾過量、総コレステロールを用い、遺伝的な影響を検討するために、ゲノムワイド関連解析研究(GWAS)で糖尿病との関連が明らかになったSNPsを用いた。【結果】経時的なインスリン分泌能低下と有意に関連する臨床的な因子はBMIであった(p<0.001)。【結論】BMIのレベルと2つの遺伝子は、日本人の経時的なインスリン分泌能の低下と関連することが示唆された。医歯薬学SNPの測定は完了しており、統計解析を行う準備は整っている。遺伝多型解析も完了し、順調に経過している。今後、2007年の健診結果からHOMA-βの値を算出し、5年間にわたるインスリン分泌の低下度と各SNPsとの関連を検討する予定である。1インスリン分泌能の評価方法を追跡研究にて検討:久山町では、5年ごとに町内の一斉健診を繰り返しており、2012年(平成24年)がこの年に当たる。HOMA-β及びInsulinogenic Indexによる評価を継続し、経年的な評価を行う。2007年の3300名の各種のインスリン分泌能の傾きに、遺伝・環境要因がどのような影響を与えているのかを明らかにすることができる。2インスリン分泌能の加齢に伴う自然史を遺伝・環境要因を含め検討:1988年、1993年、1998年、2002年、2007年の5つの健診を全て受診した対象者にて、環境要因に加え、遺伝要因を合わせてインスリン分泌能の経年的な変化に対する遺伝・環境要因を同時に考慮した解析を行う。Belfast Diet Study(Q J Med 2003; 96:281-288)によれば、糖尿病発症後の経口薬投与後のインスリン分泌能は、急速に低下している。2002年の集団以降、内服薬治療の種類についても詳細に検討できており、これらの因子を考慮した解析を行う。3各種のインスリン分泌能の指標が、糖尿病・心血管病の発症リスクに及ぼす影響を検討:2007年の集団の追跡研究をもとに、Insulinogenic Index、HOMA-βで評価したインスリン分泌能が、糖尿病及び虚血性心疾患や脳卒中の発症リスクに及ぼす影響を検討する。研究成果は国内・国際学会で報告するとともに、英文誌に投稿する。

また久山町住民のみならずわが国国民に対して、マスメディア及び公開講座を通じて情報を発信する。2007年のインスリン値の測定は完了しているが、電子化作業が遅れたため、予算の執行が遅れた。今後早期に、2007年度の電子化作業を行って、データセットを整備し、解析を行う予定である。統計ソフトの購入費用としての物品費健診を推し進めるための、人件費、データ整理のための人件費追跡調査の費用、学会発表のための旅費論文の校正費用、別刷代などの費用を見込んでいる。
脊髄小脳失調症6型脳内で凝集する新規蛋白分子の同定と細胞変性機序の解明

本研究では、脊髄小脳失調症6型(SCA6)の患者脳内で凝集する蛋白分子を同定することが目的である。研究代表者らはこれまでに、患者脳内で最も強く変性する小脳Purkinje細胞に限って、2種類の異なる凝集体が形成されることを明らかにしてきた。1種類は原因蛋白であるα1A-カルシウムチャネル蛋白であるが、もう1種類は異常伸長ポリグルタミン鎖を認識する抗体で検出されるポリグルタミン封入体で、その蛋白が何に由来するかは不明であった。このため、本研究ではこの蛋白分子の同定を試みた。最初two-hybrid法でポリグルタミンを有するカルシウムチャネル蛋白とinteractする蛋白分子の同定を試みたが、two-hybridに適したベクターを構築する段階で休止した。一方、同時に進めていたヒトカルシウムチャネル蛋白に対する新しいポリクローナル抗体作製の試みでは、3種類の抗体作製を計画し、このうち1種類で実際に新しい抗体を作製することが早期に出来た。培養細胞でのrecombinant蛋白の発現を確認し、抗体の特異性を確認した。これまでにヒト対照脳およびSCA6患者脳でウエスタン・ブロットを行い、SCA6患者脳では変異蛋白の量が減少していないことを報告した。さらに、患者Purkinje細胞に新しい抗体でも凝集体を確認した。その形態や細胞内の分布様式はポリグルタミン封入体とかなり類似しており、一部はこれまでに報告してきたカルシウムチャネル封入体とも共通していた。以上の結果より、当初同定する目的であった新規蛋白分子は、チャネル蛋白から断片化された蛋白である可能性が高いことが明らかになった。脊髄小脳失調症6型(SCA6)は本邦に比較的頻度の高い常染色体優性遺伝性脊髄小脳変性症の1型である。本疾患の原因はα1A-カルシウムチャネル遺伝子内の3塩基(CAG)繰り返し配列が異常に伸長することが原因である。我々はこれまで、このSCA6患者では臨床的に純粋な小脳症状を呈し、小脳Purkinje細胞の選択的な脱落を示すことを示した。また、同チャネル蛋白に対する抗体を作製し、免疫組織学的に変異カルシウムチャネルが患者の小脳Purkinje細胞にのみ凝集していることを明らかにしてきた。さらに、CAG繰り返し配列がグルタミン鎖に翻訳されるため、異常伸長ポリグルタミン鎖に対する抗体を用いたところ、患者脳内のやはりPurkinje細胞にのみ、新たな凝集体を形成することを明らかにした。本年度我々は、患者脳内での蛋白発現を確認するため、先述の抗チャネル蛋白抗体を用いてwestern blotによる蛋白発現を解析した。その結果、患者脳内では確かにα1A-カルシウムチャネル蛋白は発現していることを確認し、さらに細胞脱落を考慮すると、同チャネル蛋白は減少していないことを明らかにした。一方、ポリグルタミン鎖に対する抗体では、異常な蛋白は検出されず、他のポリグルタミン病とは異なり、明らかなポリグルタミン鎖蛋白の凝集はないものと考えられた。さらにwestern blotでは患者脳で発現する特異的な蛋白分子種は確認できなかったため、変異α1A-カルシウムチャネル蛋白に結合する新規蛋白分子を同定する目的で、bacteriaによるtwo-hybridシステムを準備した。現在この手法により、解析を進めている。また、新たな特異抗体を作製し、これらを用いてwestern blotを行う方針である。
抗HIV戦略に関する基礎研究

本研究で我々は、主として以下にまとめる成果を得た。1,HIV-1Gagの機能。HIV-1Gagはウイルス複製サイクルの全般にわたって重要な役割を果たす。複製初期の脱殻/逆転写に欠損を持つGag変異体には宿主細胞依存性の複製能を示すものがあり、この過程に宿主因子が関与することが明らかとなった。また、初期機能に欠損を持つGag変異体の多くが野性株の複製を強力に阻害した。Gag組換え体(SHIV)や変異体(C3a,M3b,N1a,N1b,C6b等)を利用することにより、動物モデルや、それを用いた種々の抗HIV療法の検証への展望が開かれた。2,HIV-1Envと宿主因子。Env gp41変異体の解析から、HIV-1Envのウイルス粒子の取込みには宿主因子が関与していることが明らかになった。3,HIV-1Vifの機能。Vifはウイルス複製サイクルの後期に作用する。多数のVif変異体の解析から、Vifの機能は産生細胞依存性であるばかりでなく、標的細胞にも依存することが示された(論文投稿中)。Vifの効果はウイルス複製初期にあらわれる。4,HIV-1Nefの機能。Nefはウイルス複製サイクルの後期に作用する。Nefは培養細胞でのウイルス感染価やCD4down-regulationとは無関係にMHC-Iをdown-regulateする活性があることが明らかになった。5,HIV-1Vprの機能。HIV-1/VSV-Gシュードウイルスを用いた解析から、Vprに強いアポトーシス誘導能があることを明らかにした。しかし、抗アポトーシス活性は認められなかった。以上、本研究により、HIV-1複製機構の詳細が明らかにされた。また、動物モデルシステムによってHIV-1複製とその阻害を検討することの重要が強く示唆された。本年度の主な成果は要約は以下の如くである。作製したHIV-1 Gag変異体22株のうち14株がトランスドミナントに野生株の複製を阻害した。抑制効果のあるものは、マトリックス(MA)、キャプシド(CA)及びp6変異体であった。特に強い抑制効果を示すCA変異体は、モル比2倍量で完全に野生株の複製を阻害し、阻害効果は複製初期(脱穀/DNA合成過程)と後期(放出/成熟過程)の両方に認められた。CD4陽性株にこのCA変異体を発現させるとその細胞は完全にHIV抵抗性となった。この場合も変異Gagはわずかの発現量で野生株の複製を阻害した。これらのGag変異体の中にはHIV-2の複製をも阻害するものがあった。結論として、HIV-1 Gag変異体、特にCA変異体は様々なHIVに対して強い複製阻害効果を示し、抗HIV遺伝子として極めて有望である。Vpr発現ベクターを導入して樹立した細胞株は、ソルビトール処理によるアポトーシスに抵抗性となった。しかし、その細胞ではVprの発現量が極めてわずかであったため、細胞選択の過程で特殊な細胞が得られている可能性があった。この点を明確にするため、HIV-1とVSV-Gとの間でシュードタイプウイルスを作製し、細胞選択を行なわずにHIV-1 Vprのアポトーシス抑制能を検討してみた。このシステムでは高力価のシュードタイプウイルスが安定に得られ解析が容易であった。全ての細胞がウイルスに感染した状態で解析すると、HIV-1 VprはアポトーシスをCD4陽性細胞に誘導すること、また、抗アポトーシス作用はないことが明らかとなった。今後HIV-1複製とアポトーシスの関係を明確にし、抗HIV戦略の基礎としたい。

本年度の主な研究成果は要約以下の如くである。HIV-1のアクセサリー蛋白質であるVifは末梢血リンパ球やマクロファージでのウイルス複製に必須であるが、Nefは必須でない。Vifはウイルス産生細胞依存性に作用すること、Nefはウイルス感染個体レベルで重要な働きをしエイズ発症に関与することなどが報告されている。VifおよびNefにつき各種変異体を用いて分子生物学的な解析を行ない、Vifの標的細胞特異性、NefのMHC-I down-regulation能をウイルス感染性との関係で総合的に検討した。その結果、Vifの標的細胞特異性が初めて証明された。NefのMHC-I down-regulation能が培養細胞でのウイルス感染性と無関係であることも初めて明らかになった。これらの成績から、Vifの作用機構は今まで信じられている程単純でなく、また、感染個体がエイズ発症に至るまでのNefの重要な役割、特に免疫担当細胞との相互作用、も示唆された。従って、アクセサリー蛋白質はエイズ発症抑制のための新しい標的となり得る。HIV-1の構造蛋白質であるGagとEnvに関する研究も進展した。HIV-1 EnvのC末領域を欠損した変異体の解析から、Envのウイルス粒子の取り込みには宿主細胞因子が関与していることが明らかになった。また、HIV-1キャプシドのサイクロフィリンA結合領域にSIV macの対応する領域の6アミノ酸を挿入したキメラウイルスは複製可能であった。サルリンパ球では未だ複製不能だが、このウイルスを基にサル細胞で複製可能なHIV-1が作れる可能性がある。成功すれば、HIV-1の感染動物モデルとして大いに期待できる。
遺伝子異常診断法のアレルギー疾患への応用

各人の遺伝的要因が、アレルギーの発症に関与することは、その発症に家族性があることから知られ、またアレルギー反応には免疫グロブリンIgEが関与することが明らかにされている。本研究は、遺伝子操作法により単離したヒト免疫グロブリンH鎖のDNA断片をもちいて、この領域の遺伝子レべルの変異とアレルギー発症との関連の有無を検索し、アレルギー疾患診断法の一助とすることを目的とした。健常者およびアレルギー患者の末梢血より得たDNAを検体としてCε,SεおよびD領域のDNA断片をプローブとしてSouthern法により解析した。その結果、【◯!1】134検体について、Sε,【Cε_1】,【Cε_2】,【Cε_3】のすべてについて大きな欠失や挿入は検出されなかった。【◯!2】D領域での欠失がみられた。【◯!3】ε1遺伝子の5′側、約4kbにあるBamH【I】切断部位および、ε2を含むHind【II】,Sac【I】断片について多型がみられた。その頻度はそれぞれ0.68/0.32,0.69/0.31,0.71/0.29であった。血中IgE安や病態と制限酵素切断部位変異との間に直接的な相関はみられなかった。【◯!4】D領域の欠失はD4の3′側からD1を含む約10kbにおよんでおり、欠失型の遺伝子頻度は0.5であった。この変異とアレルギー発症との関連はみられなかった。【◯!5】家系DNA試料を解析して、これら多型がみられた変異の遺伝的伝達を確認した。以上の結果より、集団中に高頻度に存在しヒト免疫グロブリンH鎖のDからCまでの領域の遺伝子の変異を解析するうえで有効な指標として利用できるものである、しかし、一般的にアレルギー発症と、本研究で検索したヒト免疫グロブリンH鎖領域におけるDNAの変異とは連関していないものと考えられる。
江戸時代後期における風景表現に関する研究

本年度は、江戸時代後期における風景表現についての基礎的な調査と研究を行った。特に、本研究の中心に据えた岡田半江に関する基礎資料の収集及び絵画作品の調査に努め、主に個人蔵の半江の作品について、合計31件(掛軸30件、画巻1件)の調査を行い、それぞれについて基礎的なデータを収集し、全図・部分の写真を撮影した。半江は未だ包括的な研究が行われておらず、作品を捜索し所在を明らかにした上での悉皆調査が必要となる。本年度は、実見することのできた31件に加え、新たに個人蔵72件の作品及び書簡の所在を確認している。その72件については、来年度に調査予定である。半江に加え文人画、森派、原派などの個人蔵の風景図10件(掛軸)の調査も行った。研究成果の一部は、静岡県富士山世界文化遺産センターにて開催の「富士山に迫る」展を記念して行われた講演会にて「江戸時代後期の風景表現について」と題した発表を行った。展覧会の主作品である谷文晁「富士山中真景全図」を交え、広く近世絵画における風景表現の変遷について伝えることができた。また、本研究の課題の一つである「西洋・中国・朝鮮からの影響を念頭においての近世絵画研究」というテーマを、目に見えるわかりやすい形で広く公開・発信するべく、東京国立博物館における総合文化展示「近世絵画における海外との交流」(本館8室にて2019年6月18日7月21日展示予定)の準備を行った。主に風景・人物・花鳥作品において、海外との交流を経て生み出された作品を展示予定である。岡田半江の研究については、ほぼ予定通りに進捗している。作品の所在確認も想定以上の情報を集めることができたと考える。本年度は研究課題の中でも、特に岡田半江に焦点をしぼった調査活動を行ったため、淵上旭江や江戸時代以前から日本に伝来した西洋・中国・朝鮮絵画の確認作業が課題として残された。主に岡田半江の情報収集と実作品の調査に努めてきたが、現段階において、すでに想定以上に現存作例が多いことが予想される。課題の一つである淵上旭江や伝来の西洋・中国・朝鮮絵画の確認作業にも目を配りつつ、まずは来年度も半江における実作品の調査を優先的に行い、基礎的な情報を整理することを目標としたい。作品に書かれた賛や跋、箱書等を見ることにより、半江の制作態度のみならず、交流関係などの江戸後期文人ネットワークを具体的に探っていきたい。パソコンおよび周辺機器を購入予定の金額分であったが、年度末の購入を避け、新年度に最新の機種を購入することにした。
色素上皮細胞の賦活化および移植による加齢黄斑症の治療の基礎と臨床

加齢黄斑変性症に対する治療の基礎的、臨床的基盤を築いた。加齢黄斑変性症の硝子体手術は全部で38例39眼となり2段階以上の改善が29眼、不変4眼、悪化が6眼であった。移植を目的とした手術手技は臨床症例を応用して、ラット、ウサギ、サルにまで広げられたが、手術手技を確立したのみならず移植した細胞を組織学的に免疫学的に検討し、MHC classII陽性細胞がRPEを移植し視細胞変性を遅延させた個体で減少していたことは、RPE移植が視細胞変性によって生じる、あるいは視細胞変性のひきがねのための免疫反応を抑制していることを推測させる実験結果と思われた。しかし電気生理学的面から免疫反応による葡萄膜炎等の可能性も推測された。この免疫反応をできるだけ回避するには自己の細胞を用いるのが最良と考えられ、同じ眼杯外板由来の虹彩色素上皮は採取することを考えても最良と考えられた。この細胞に遺伝性網膜変性動物の網膜変性の進行を遅延させると報告されているbFGF遺伝子を組み込むことにより網膜変性を遅延させることができ、新しい治療法の可能性を明らかにした。また細胞を冷凍保存しても、免疫染色あるいはウエスタンブロッティングによる検討で保存前後に差はみられず分化度はある程度保存されていることが確認された。培養した細胞はこの方法で70%以上の生存率を、培養していないウシRPEも60%以上の生存率が確認された(冷凍保存期間1ヶ月)。またtyrosinase,TRP-1,TRP-2といった色素合成に関与する遺伝子の発現にも冷凍保存前後で差を認めなかった。この冷凍保存した細胞も同じく視細胞の変性を阻止することが確認された。色素上皮細胞の賦活化には、bFGFを始めとする増殖因子が重要である。基礎研究では、加藤、石黒らが、ウシ網膜抽質出液によるニワトリ色素上皮細胞の増殖効果を認め、神経網膜内在性色素上皮細胞増殖因子の精製を進めている。また、網膜色素上皮と種々の細胞外基質の影響を検討し、SV40largeT抗原遺伝子導入マウス色素上皮細胞が、ラミニン存在下では細胞が浮遊したまま生存するという知見を得た。この系は、色素上皮細胞の遊走モデルとして、色素上皮細胞が関与する病態の解明にも役立つと思われた。これらの知見を加藤が学会で発表した。荒川らは、種々の因子の硝子体内投与に必要となるリピド二重膜から成るリポソームを作製し、in vitroでは比較的安定して薬物を保存可能であることを示し学会で発表した。徐放性の改良、リポソーム自身のin vivoでの影響につき検討中である。Durluは、採取された色素上皮細胞の継代培養を行い、色素上皮が網膜機能を維持する上で必要と思われる諸酵素の活性低下を認めた。山田らのin situ hybridizationによって、それらの変化が遺伝子レヴェルより解明されつつある。in vivoでは、山田らが、ヨウ素酸ソーダを用いた色素上皮障害家兎眼で免疫組織化学を行い、神経伝達物質とされるGABA、グリシン、グルタミン酸の中で、グリシンのみ障害による局在の変化を認めた。こうした神経伝達物質、およびbFGFを始めとする増殖因子に関し、実験動物での膜色素上皮細胞の移植のもたらす影響を観察中である。臨床研究では、山田が、現在までの病巣の評価にMRIを加えることによって診断に有益な情報が得られることを学会にて発表した。さらに、走査型レーザー眼底検査による評価を加えることにより、病態の解明と、色素上皮移植の人への応用に際しの最適な適応の選択基準の確立に役立つものと思われる。移植用の培養網膜色素上皮細胞の実験で、cell line化に成功した人間および牛の網膜色素上皮細胞を家兎眼に移植した。

その際、随時移植に用いるために、冷凍保存した培養網膜色素上皮細胞を用いる方法を開発した。in vitroの実験では、冷凍保存した培養網膜色素上皮細胞を解凍した後でも、細胞の活性は失われておらず、in vivoで家兎を用いた網膜色素上皮細胞移植の実験でも、宿主側網膜下にこの網膜色素上皮細胞の移植が成立した。冷凍保存した培養網膜色素上皮細胞を移植に用いる方法が実用になることが示されたことは意義深く、今後の人間の加齢黄斑変性症治療への網膜移植の応用を行う上で重要な成果である。また、コラーゲンゲル上に一層に生育させた培養網膜色素上皮細胞を家兎眼の網膜下に移植することに成功した。現在、経過観察中であるが、異種間の移植では拒絶反応の起こる可能性が示唆されている。細胞極性の制御や細胞の賦活化には成功していないが、コラーゲンゲル上に一層に生育させた培養網膜色素上皮細胞を移植できたことは、一歩前進であった。加齢黄斑変性症の網膜下病巣除去手術の症例は、通算33眼となった。手術による視力変化は、2段階以上改善が24眼、不変が6眼、悪化が3眼であった。長期経過観察では視力が0.5に達した症例もあり、手術の結果は良好であった。加齢黄斑変性症の網膜下病巣除去手術の手技が安定し、治療成績が向上してきたことは、将来の網膜移植による治療導入の重要な基礎となる成果である。加齢黄斑変性症の硝子体手術は全部で38礼9眼となり2段階以上の改善が29眼、不変4眼、悪化が6眼であった。移植を目的とした手術手技は臨床症例を応用して、ラット、ウサギ、サルにまで広げられたが、手術手技を確立したのみならず移植した細胞を組織学的免疫学的に検討し、MHC class II陽性細胞がRPEを移植し視細胞変性を遅延させた個体で減少していたことは、RPE移植が視細胞変性によって生じる、あるいは視細胞変性のひきがねのための免疫反応を抑制していることを推測される実験結果と思われた。しかし電気生理学的面から免疫反応による葡萄膜炎等の可能性も推測された。この免疫反応をできるだけ回避するには自己の細胞を用いるのが最良と考えられ、同じ眼杯外板由来の虹彩色素上皮は採取することを考えても最良と考えられた。この細胞に遺伝性網膜変性動物の網膜変性の進行を遅延させると報告されているbFGF遺伝子を組み込むことにより網膜変性を遅延させることができ、新しい治療法の可能性を明らかにした。また細胞を冷凍保存しても、免疫染色あるいはウエスタンブロティングによる検討で保存前後に差はみられず分化度はある程度保存されていることが確認された。培養した細胞はこの方法で70%以上の生存率を、培養していないウシPREも60%以上の生存率が確認された(冷凍保存期間1ヶ月)。またtyrosinase、TRP-1, TRP-2といった色素合成に関与する遺伝子の発現にも冷凍保存前後で差を認めなかった。この冷凍保存した細胞も同じく視細胞の変性を阻止することが確認された。