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肝癌に対する免疫遺伝子治療-局所遺伝子治療との併用療法の検討-

肝癌に対する遺伝子治療の確立を目指し、肝癌の発生・発育に重要な役割を演じている分子を同定するために、種々の基礎的検討を行い、以下のごとき成果を得た。まず、肝癌のモデル動物であるLECラットを用いて、肝癌発生における細胞周期関連分子の関与を検討したところ、慢性肝炎および肝癌周囲の非癌部組織に比較し、肝癌ではサイクリン依存性キナーゼ(Cdk)4とp46 Shcの発現が上昇し、リン酸化Rb蛋白質の増加がみられた。一方、cyclin D1およびCdk6の発現は、慢性肝炎から肝癌への進展過程において有意な変動を示さなかった(Int J Oncol 24:1205-1211,2004;Int J Oncol 25:1089-1096,2004)。さらに、ヒト肝癌とその周囲の非癌部肝硬変におけるCdk inhibitorの発現を検討したところ、肝癌内においてはp18^<INK4c>発現が減弱しており、p18^<INK4c>発現陰性の肝癌患者の予後は有意に不良であることが示された(Hepatology 40:677-686,2004)。したがって、肝癌の発生を防止し、肝癌患者の予後を改善するためには、肝におけるCdk4あるいはp46 Shc発現を抑制し、同時にp18^<INK4c>発現を増強させるがストラテジーが有効であることが示唆された。我々はすでに、肝癌発育には血管内皮増殖因子(VEGF)の発現が必須の因子であることを報告しているが、本年度の検討において、肝癌内のVEGFレセプター発現を抑制すれば、肝癌の発生と発育を抑制できる可能性を示した(Hepatology 39:1517-1524,2004;J Hepatol 41:97-103,2004)。さらに、組換えアデノウイルスは、in vivoにおける肝細胞への遺伝子導入効率の高さから、肝を標的とした遺伝子治療に適したベクターであるが、遺伝子の再導入・再発現が困難であることが、臨床応用の大きな障害となっている。我々は、組換えアデノウイルスの投与ルートとして胆管に注目し、ラットの総胆管より組換えアデノウイルスを逆行性に注入したところ、肝における有効な遺伝子発現の誘導が可能であり、さらに、組換えアデノウイルスをラット胆管内に反復注入すれば、肝における遺伝子発現も反復性に誘導されることを示した(Gut 53:1167-1173,2004)。本年度の研究成果より、肝癌の遺伝子治療の標的となりえる分子が判明してきており、また、実際的な肝への遺伝子導入ルートも解明された。今後はこれらの分子の発現を遺伝子レベルで制御することによって、肝癌の発生および発育を阻止しえる遺伝子治療の可能性を検討していく予定である。

本年度の研究成果より、肝癌の遺伝子治療の標的となりえる分子が判明してきており、また、実際的な肝への遺伝子導入ルートも解明された。今後はこれらの分子の発現を遺伝子レベルで制御することによって、肝癌の発生および発育を阻止しえる遺伝子治療の可能性を検討していく予定である。肝癌に対する遺伝子治療の確立を目標とし、肝癌発生あるいは肝癌発育に重要な役割を演じている分子を同定するために、種々の基礎的検討を行い、以下のごとき成果を得た。まず、ヒトにおける種々の肝疾患組織を用いて、肝癌発生における細胞周期関連分子の関与を検討したところ、慢性肝炎および肝癌周囲の肝硬変組織に比較し、肝癌ではサイクリンD1、サイクリンE、サイクリンAおよびサイクリン依存性キナーゼ(Cdk)4さらにWee1が、量的に増加しているのみならず、酵素活性が上昇していることを報告した(Hepatology, in press)。さらに,ヒト肝癌においては、p33^<ING1>やp57^<KIP2>などのCdk inhibitorの発現量ならびに活性が低下していることも確認した(Int J Oncol 20:769-775, 2002; Scand J Gastroenterol 37:1440-1448,2002)。以上の結果より、肝癌発生および肝癌発育に重要な役割を担っているサイクリン、Cdkなどの細胞周期関連分子、あるいはVEGFやbFGFなどの腫瘍発育促進分子の発現を制御できれば、肝癌の発育のみならず発生を抑制し得る可能性が示された。事実、遺伝子レベルにおける制御ではなく、蛋白質レベルにおける検討ではあるが、肝発癌モデルラットにアンギオテンシン変換酵素の阻害剤を投与すれば、アンギオテンシンIIの活性を抑制することによってVEGF活性が抑制され、肝線維化の抑制のみならず肝癌発生を阻止し得ることを確認している(Clin Cancer Res 7:1073-1078,2001; J Hepatol 37:22-30,2002)。本年度の研究成果より、肝癌の発生ならびに発育を制御し得る可能性のある分子が判明してきており、今後はこれらの分子の発現を遺伝子レベルで制御することによって、肝癌の発生および発育を阻止し得る遺伝子治療の可能性を検討していく予定である。消化器癌に対する遺伝子治療の確立を目的に、消化器癌の発生および発育に重要な役割を演じている分子を同定するために、種々の基礎的あるいは臨床的検討を行い、平成15年度においては以下のごとき成果を得た。本年度の研究成果より、消化器癌の発生ならびに発育を制御しえる可能性のある分子が判明してきており、今後はこれらの分子の発現を遺伝子レベルで制御することにより、消化器癌の発生ならびに発育を阻止しえる治療法の開発を検討する予定である。肝癌に対する遺伝子治療の確立を目指し、肝癌の発生・発育に重要な役割を演じている分子を同定するために、種々の基礎的検討を行い、以下のごとき成果を得た。まず、肝癌のモデル動物であるLECラットを用いて、肝癌発生における細胞周期関連分子の関与を検討したところ、慢性肝炎および肝癌周囲の非癌部組織に比較し、肝癌ではサイクリン依存性キナーゼ(Cdk)4とp46 Shcの発現が上昇し、リン酸化Rb蛋白質の増加がみられた。一方、cyclin D1およびCdk6の発現は、慢性肝炎から肝癌への進展過程において有意な変動を示さなかった(Int J Oncol 24:1205-1211,2004;Int J Oncol 25:1089-1096,2004)。さらに、ヒト肝癌とその周囲の非癌部肝硬変におけるCdk inhibitorの発現を検討したところ、肝癌内においてはp18^<INK4c>発現が減弱しており、p18^<INK4c>
歯周組織再生治療へのアプローチ:セナント芽細胞分化制御機構の解明

申請者らは今まで抗セメント質由来細胞接着因子(CAP)作製し、ウシ歯胚内でこの抗体がセメント質とセメント芽細胞を特異的に認識する事を確認してきた。(M.Saito et Al.,Bone.2001Sep;29(3):242-248)そこで本研究ではセメント芽細胞を採取する目的で、ウシ歯小嚢より細胞を分離培養し、解析を行った。得られたウシ歯小嚢細胞(B-ovine Dental Follicle Cells : BDFC)の特性は、低いアルカリフォスファターゼ活性を有しておりosteonectin(ON),osteopontin(OP),type I collagen(COLI)を発現しているがCAP, osteocalsin(OC),bonesialoprotein(BSP)発現していない未分化な細胞集団であることが判明した。そこでBDFCの分化能力を検証するために、免疫不全症マウスへの皮下へ移植実験を行った。その結果、BDFCは抗CAP抗体に陽性なセメント質を形成し、またBSP, OC, OR, COLIすべてを発現するセメント芽細胞に分化することが確認された。これらの実験よりBDFC中にセメント芽細胞前駆体が存在し、この細胞集団はin vivoで分化能力を有している特性を有している事が判明した。次にセメント芽細胞前駆体をクローニングするためヒトパピローマウイルスE6とE7(HPVE6E7)とヒトテロメラーゼ逆転写酵素サブユニットであるhTERTの遺伝子を導入して不死化BDFCを作製した。その結果、100回以上継代可能な不死化細胞であることが確認された。今後は不死化BDFCのセメント芽細胞への分化能を検討し、さらにはこの細胞よりセメント芽細胞前駆体をクローン化する予定である。申請者は今までの研究成果より、坑CAPモノクローナル抗体がウシ歯胚において特異的にセメント質を認識することを報告してきた(Saito et al.,Bone, Vol29,242-248,2001)。さらにこの抗体はセメント芽細胞を特異的に認識し、未分化間葉系細胞集団である歯小嚢組織と染め分けることも見出した。そこで申請者はセメント芽細胞前駆体の採取を目的に、歯小嚢細胞が坑CAPモノクローナル抗体に陽性反応を示すセメント芽細胞に分化能を有するか否かを検討した。BDFCの遺伝子導入を行うためamphotoropic retrovirussystemを用いてヒトパピローマウイルスE6とE7(HPVE6E7)遺伝子を導入したところ、その導入効率は10%以下であった。よって次に遺伝子導入の効率を上げるためVSV-G psude type組み換えレトロウイルスを作製したところ、90%以上の効率でHPVE6E7遺伝子がBDFCに導入された(BDFC^<E6E7>)。次にBDFC^<E6E7>が不死化されたか否かを確認するため長期間培養したところ、約population doubling(PD)50でcrisisを迎えることからHPVE6E7単独では不死化されないことが確認された。この原因を調べるためBDFC^<E6E7>のテロメア活性を調べたところ、その活性が無い事が確認された。この結果よりBDFC^<E6E7>はテロメア長短縮による細胞死が起きていることが判明したので、つぎにヒトテロメラーゼ逆転写酵素サブユニットであるhTERTの遺伝子をBDFC^<E6E7>へ導入しテロメア長の獲得を試みた(BDFC^<E6E7+hTERT>)。TRAPassayの結果、BDFC^<E6E7+hTERT>はテロメラーゼ活性を有しており、さらにPD80以上培養可能な不死化細胞であることが確認された。今後はBDFC^<E6
新規PDZタンパク質とグルタミン酸受容体δサブユニットC末端との相互作用の解析

グルタミン酸受容体(GluR)δサブユニッットファミリーはその分子機能や細胞内シグナル伝達機構については、ほとんど未知である。我々は、そのPDZドメインを介して、GluRδ2サブユニットのC末端に結合する新規PDZ蛋白質を見出し"Delphilin"(delta2 philic protein)(申請書類の"δ2SIP"を改名;GenBank accession # AA869045)と命名した。Delphilin/δ2SIPのPDZドメインの結合様式の解析は、PDZドメインのターゲット認識様式を研究する上でもよいモデルであると考え、様々な変異体を作製し、酵母two-hybrid systemや、BIAcoreを用いたsurface plasmon resonance法等も用いて検討した。まず、DelphilinのPDZドメインが,GluRδ2サブユニットのC末端を、直接、認識し、結合していることを証明するために、DelphilinのPDZドメインだけを発現するconstructを作製し、酵母two-hybrid systemやsurface plasmon resonanceを用いて更に検討し、DelphilinのPDZドメインはGluRδ2サブユニットのC末端を直接、認識し結合することを確認した。しかるに、酵母two-hybrid systemの系で、DelphilinのPDZドメインは、PDZドメインだけよりも、周辺領域を含むほうが,そのターゲットとなるGluRδ2サブユニットのC末端と、より高い親和性をもつ可能性、及び、Delphilinのアミノ酸残基227-352の領域がそのPDZ-GluRδ2C末端の結合に、負の作用を及ぼしている可能性などが示唆された。一方、δ2のC末端の各々-2位、-1位に存在するThr、Serがリ酸化されることによって、DelphilinのPDZドメインとの結合が調節され得る可能性を考え、BlAcoreを用いたsurface plasmon resonance法により、解析、検討し、δ2ペプチドのC末端のSer(-1位)、あるいはThr(-2位)のリン酸化によって、DelphilinのPDZドメインとの相互作用が失われたことが確かめられ、δ2サブユニットC末端のSer、Thrのリン酸化により、Delphilinとの相互作用が非常に弱くなることが示唆された。我々は、そのPDZドメインを介して、GluRδ2サブユニットのC末端に結合する新規PDZ蛋白質を見出し"Delphilin"(dalta2 philic protein)(申請書類の"δ2SIP"を改名)と命名した。Delphilin/δ2SIPのPDZドメインの結合様式の解析は、PDZドメインのターゲット認識様式を研究する上でもよいモデルであると考え、様々な変異体を作製し、酵母two-hybrid systemや、BIAcoreを用いたsurface plasmon resonance法等も用いて検討した(第22回分子生物学会年会講演要旨集p.472)。しかるに、酵母two-hybrid systemの系で、DelphilinのPDZドメインは、PDZドメインだけよりも、周辺領域を含むほうが,そのターゲトとなるGluR

δ2サブユニットのC末端と、より高い親和性をもつ可能性、及びDelphilinのアミノ酸残基227-352の領域がそのPDZ-GluRδ2C末端の結合に、負の作用を及ぼしている可能性などが示唆された。更に、コンピュータによる検索を行ったところ、結合に正または負の作用を及ぼす可能性の示唆された、それらの領域に、結合を強化または阻害する可能性を持ちうるような、何らかの既知のドメインなどは、見当たらなかった。DelphilinのPDZドメインへの結合を介して、GluRδ2サブユニットがどのような生理的機能を果たしているのかを、in vitroおよびin vivoの系を用いて、更に、解明していく予定である。我々は、そのPDZドメインを介して、GluRδ2サブユニットのC末端に結合する新規PDZ蛋白質を見出し"Delphilin"(delta2philic protein)(申請書類の"δ2SIP"を改名)と命名し、その機能的解析などを進めつつある。グルタミン酸受容体の他のタイプで、そのC末端Ser、Thrのリン酸化によって、PDZドメインとの結合が妨げられるという報告があり、δ2のC末端の各々-2位、-1位に存在するThr、Serがリ酸化されることによって、DelphilinのPDZドメインとの結合が調節され得る可能性を考え、BIAcoreを用いたsurface plasmon resonance法により、解析、検討した。δ2サブユニットの-1位のSer、-2位のThrをリン酸化したペプチドをリガンドとすると、いずれもGST-DelphilinPDZとの相互作用が著しく減少した。さらに、この相互作用の阻害効果を確認するために、競合実験をおこなった。リガンドとしてδ2ペプチドを固定化したセンサーチップに、GST-DelphilinPDZにδ2ペプチド、δ2-pTペプチド、あるいはδ2-pSペプチドをそれぞれ添加した溶液を、アナライトとしてマイクロ流路系に流したところ、δ2ペプチド添加時のみ著しい競合阻害が起こった。以上によって、δ2ペプチドのC末端のSer(-1位)、あるいはThr(-2位)のリン酸化によって、DelphilinのPDZドメインとの相互作用が失われたことが確かめられた。リン酸化ペプチドを用いた実験結果から、生体内で実際にδ2サブユニットC末端のSer、あるいはThrがリン酸化されうるならば、Delphilinとの相互作用が非常に弱くなることが示唆された。
新規な遷移金属含有型センサータンパク質の構造機能相関解明

Thermus thermophilusに含まれるCarHは、カロテノイド色素合成酵素の発現を光依存的に制御している転写調節因子であり、ビタミンB12(アデノシルコバラミン)を光受容体として利用している新規な光センサータンパク質である。暗所で調製したアデノシルコバラミン結合型CarH(AdoCbl-CarH)は、四量体構造を有しているが、これに可視光を照射すると単量体へと解離した。CarHによる光センシング、および光によるCarHの機能制御の分子機構を明らかにするため、CarHの結晶構造解析を行った。精製したアポ型CarHとAdoCblを暗所において混合することにより、AdoCbl結合型CarH(AdoCbl-CarH)を調製した。結晶化スクリーニングの結果得られた回折データを与える単結晶を用い、結晶構造決定を行った。AdoCbl-CarHは四量体を形成しており、光感知前の構造が得られたことが分かった。CarHプロトマーは、三つのドメイン(N末端側から順にDNA結合ドメイン、helix-bundleドメイン、Rossman-foldドメイン)から構成されていた。アデノシルコバラミンは、helix-bundleドメインとRossman-foldドメインに挟まれる形で結合しており、Rossman-foldドメイン中のHis177が第6配位子としてコバルトに配位していた。アデノシル基は、helix-bundleドメイン中の二本のヘリックスに挟まれて存在しており、Trp131とHis142がアデノシル基周辺に位置することにより、その配向を制御していると推定された。CarHが光を感知すると、アデノシル基が光解離することにより、コバラミン周辺のコンフォメーションが変化し、その結果として四量体から単量体への高次構造変化が誘起されるものと考えられる。平成29年度に開始した新規な光センサータンパク質CarHの結晶化実験においては、当初の結晶化スクリーニングの条件では、凝集状態を容易に形成してしまい、構造解析に適した結晶ができないことが判明した。平成30年度には、より広範な結晶化条件の検討を行い、結晶構造解析に適した単結晶を得ることに成功し、活性型CarH(四量体構造を有している)の構造決定にも成功した。得られた結晶構造を基に、光センシングおよび光センシング後のシグナル伝達に関与すると推定されるアミノ酸残基の特定しており、これらの残基にアミノ酸変異を導入した変異体の調製も開始している。得られた変異体の光応答性、および光センサーとしての機能を解析することにより、当初掲げた研究目的を達成することができると考えている。これまでの研究により、光感知前には四量体を形成しているCarHは、光感知後に二量体へと構造変化することを明らかにした。今後の研究では、光センシングにより誘起されるこの高次構造変化のダイナミクスを明らかにするため、高速原子間力顕微鏡(高速AFM)による高次構造変化の直接観測を試みる。さらに、前年度の研究において成功したCarHの結晶構造解析の結果を基に、CarH四量体のサブユニット界面において高次構造変化の制御に関与していると推定されるアミノ酸残基に系統的なアミノ酸置換を導入し、得られた変異体の光応答性を、光照射前後のサンプルを用いたゲルろ過分析および高速AFMにより解析し、CarHの光応答性高次構造変化の反応分子機構を明らかにする。また、新規なセンサータンパク質として、Fe-Ni二核金属錯体をセンサー活性部位とする水素センサータンパク質Regulatory Hydrogenase (RH)を研究対象とした研究にも取り組み、RHによる水素センシング、ならびにRH生合成の分子機構解明を目的とした研究を行う。平成29年度に開始した新規な光

センサータンパク質CarHの結晶化実験においては、当初の結晶化スクリーニングの条件では、凝集状態を容易に形成してしまい、構造解析に適した結晶ができないことが判明した。平成30年度には、より広範な結晶化条件の検討を行い、結晶構造解析に適した単結晶を得ることに成功し、活性型CarH(四量体構造を有している)の構造決定にも成功した。得られた結晶構造を基に、光センシングおよび光センシング後のシグナル伝達に関与すると推定されるアミノ酸残基の特定しており、これらの残基にアミノ酸変異を導入した変異体の調製も開始している。得られた変異体の光応答性、および光センサーとしての機能を解析することにより、当初掲げた研究目的を達成することができると考えている。ヘム(鉄ポルフィリン錯体)、およびビタミンB12(コバラミン錯体)は、代表的な遷移金属含有型補欠分子族であり、タンパク質中に存在するこれらの分子が活性中心として機能することにより、多様な生理機能を発現することはよく知られている。本研究では、ビタミンB12(コバラミン)をセンサー活性中心として利用している、新規な光センサー型転写調節因子CarHを研究対象とし、CarHによるセンシングの分子機構解明を目的とした研究を行った。Thermus thermophilusに含まれるCarHは、カロテノイド色素合成酵素の発現を光依存的に制御している転写調節因子であり、アデノシルコバラミンを光センサーとして利用していると考えられているが、その構造や機能については不明な点が多く残されている。本研究において、暗所で調製したアデノシルコバラミン結合型CarH(AdoCbl-CarH)は、四量体構造を有しているが、これに可視光を照射すると単量体へと解離することを明らかにした。光照射による四量体から単量体への高次構造変化は不可逆的な変化であり、光照後のサンプルを暗所に戻しても四量体へと戻ることはなかった。CarHによるDNA結合反応の予備的な検討実験の結果、四量体構造を有しているAdoCbl-CarHがDNA結合能を有している一方で、単量体構造のCarHはDNA結合能を示さないことが分かった。CarHによる光センシング、および光によるCarHの機能制御の分子機構を明らかにするためには、光感知前後でのCarHの構造情報が必要不可欠である。そこで、CarHの結晶構造解析のため、結晶化スクリーニングを行い、いくつかの条件で結晶を得ることに成功した。新規な光センサータンパク質CarHの発現系構築を行い、結晶化実験および機能解析のために必要な量の組換え型CarHが得られる発現系の構築に成功した。発現した組換え型CarHの精製方法の検討を行い、結晶化実験に使用可能な純度の試料が得られる精製条件を確立することができた。精製した試料を用いて結晶化スクリーニングを行ったところ、当初の結晶化スクリーニングにおいては、凝集状態を容易に形成してしまい、構造解析に適した結晶ができないことが判明した。これまでの研究により、光感知前には四量体を形成しているCarHは、光感知後に二量体へと構造変化することを明らかにした。今後の研究では、光センシングにより誘起される
波長可変赤外ピコ秒パルスを用いる固体表面吸着種の反応ダイナミクス

既存のピコ秒Nd:YAGレ-ザ-の基本波1.06μmを2個のニオブ酸リチウム単結晶(1cm×1cm×5cm)を通してパラメトリック増巾を行ない波長可変なピコ秒赤外パルスを得た。可変波長領域は27004000cm^<ー1>でYAGレ-ザ-光のニオブ酸リチウム単結晶への入射角を変化させる事により赤外波長をコントロ-ルした。約20mJ、35ピコ秒の基本波を用いて100μJオ-ダ-の強度で波数巾1020cm^<ー1>の光を取り出す事ができた。まず、この光を用いて溶融石英基板上に累積したアラキン酸カドミウムのLB膜をピコ秒赤外パルスで励起した時の変化を詳細に検討した。アラキン酸カドミウムの状態の観測には、FTーIRスペクトル及び界面和周波発生法(SFG)を用いた。アラキン酸カドミウム9層のLB膜は、引き上げ方向にメチル基が配向している事がSFGより明らかになっている。またFTーIRスペクトルより2920cm^<ー1>付近にメチレン基の非対称伸縮振動に帰属させる強い吸収がある。この2920cm^<ー1>に波長可変の赤外パルスをチュ-ニングして光照射を行なうとアラキン酸カドミウムのメチル基の配向が変化する事を見出した。この変化は、赤外パルスの波長を高波数あるいは低波数側へ変化させると観測されなくなる。つまりメチレン基の非対称伸縮振動の吸収に共鳴した変化である。またSFG観測によりこの変化により配向性を持っていたメチル基がランダムな配向になっている事が明らかとなった。この様な変化を引き続き起こす赤外パルスの強度には明確なしきい値が存在する事から、通常の熱励起によるものとは異なるピコ秒パルスによる新しい作用機構が働いている可能性が示唆された。
紛争がもたらす国民形成とその変容プロセスの包括的研究――イラクを事例に

本研究では、ポスト紛争期のイラクにおいて、国家への信頼性の欠如と強いナショナリズムが共存する要因の解明を通して、国民形成のプロセスを包括的に明らかにすることを目指している。そのために、1国家建設の頓挫と信頼喪失のプロセス、2国民統合政策の変化、3トランスナショナルなアクターとネットワークの役割の3点を順に明らかにする作業をおこなっている。本研究では、地域研究(質的調査)と世論調査の計量分析(量的調査)を組み合わせることで、複合的に問題の本質を明らかにする手法をとっている。これによって、紛争を契機に、既存の国家とは必ずしも一致しない国家観に基づいた多様なベクトルを持つナショナル・アイデンティティが構築されていく国民形成のプロセスを、包括的に浮き彫りにする。2018年度には、イラク国内の新聞・雑誌、新たに発見された旧体制の刊行物から国民統合政策の変化を分析した。それに加え、旧体制が国民統合のために用いた多様なモニュメントや博物館、シンボルが、新体制下でどのように利用されているのかという問題を、主として報道に着目して明らかにした。さらに、特に軍や警察、官僚などの国家の機構に対する信頼がどのように失われていったのか、世論調査と新聞報道の整理を通した汚職実態の把握を通して明らかにした。それに加え、この「新家産型体制」がどのように機能不全に陥ったのか、その要因を解明した。資料は、官報に加え、申請者が15年前からデータベース化している現地の諸日刊紙を利用した。申請時点で計画していたことについては、全て順調に進展している。本年度は、イラク国内で世論調査を実施する予定である。政党支持に加え、政治や国家に対する信頼度を問う質問を中心に行う予定である。それに加え、国民統合のシンボルについての調査も開始する。物品費を抑えることができたため、当初の計画よりも少ない予算で研究が可能となった。翌年度に繰り越す研究費については、世論調査の実施を予定しているため、サンプル数の拡大などに有効活用する計画である。
リポソームを利用する高感度な化学発光分析用ナノリアクターの開発

1.ペルオキシダーゼ内封リポソームの調製法の検討押出し法により、フォスファチジルコリン(PC)、フォスファチジルグリセロール(PG)及びコレステロール(Chol)からなるリポソームに西洋わさび由来のペルオキシダーゼ(HRP)を封入した。その結果、内封されたHRPの分子数は約1200であった。一方、リポソームに内封するHRPの分子数を増大するため、凍結融解法によるHRP内封リポソームの調製を試みた。その結果、約3600分子のHRPが内封でき、押出し法と比較して、内封するHRPの分子数を約3倍増大することに成功した。2.リポソーム中のHRPの高感度検出法の開発標準系およびリポソーム系について、最適濃度条件でHRPの定量下限を求めたところ、標準系では3.0x10^<-9>M、リポソーム系では1.0x10^<-9>Mとなり、リポソームの内水相をナノリアクターに用いると、より高感度にHRPの検出ができることが明らかになった。3.HRP内封リポソームの抗体への結合と発光強度の比較HRP内封リポソームを免疫測定法の標識体に応用するため、リポソームを抗体に結合することを試みた。その結果、HRP内封リポソーム標識化抗体当りの発光強度は、ビオチン-アビジン結合HRP標識体と比較して125倍増大することが明らかになった。1.ペルオキシダーゼ内封リポソームの調製ポアサイズ1000nmのポリカーボネイトフィルターを使用した押出し法により、膜構成成分がフォスファチジルコリン、フォスファチジルグリセロールおよびコレステロールからなるリポソームの内水相にペルオキシダーゼ(POD)を封入した。調製したPOD内封リポソームについてキャラクタリゼーションを行った。その結果、PODの保持効率は約10%、平均粒子径は約600nm、また、内封されたPODの分子数は約1200であった。2.標準系とリポソーム系の化学発光応答曲線の比較PODがバルク溶液に存在する場合(標準系)とPODがリポソームの内水相に存在する場合(リポソーム系)について、ルミノールと過酸化水素を添加して化学発光反応を行った。その結果、リポソーム系ではルミノールの膜透過の影響により、標準系と比較して発光速度は減少したが、ルミノールが順次膜内に供給されるために反応効率が増大し、全発光量は増大することが明らかになった。3.標準系とリポソーム系におけるPODの検出感度の比較標準系およびリポソーム系について、ルミノール化学発光によるPOD検出の最適条件を検討した。その結果、ルミノールおよび過酸化水素の最適濃度は、標準系と比較してリポソーム系のほうが高濃度なった。最適濃度条件でPODの定量下限を求めたところ、標準系では3.0x10^<-9>M、リポソーム系では1.0x10^<-9>Mとなり、リポソームの内水相をナノリアクターに用いると、より高感度にPODの検出ができることが明らかになった。1.ペルオキシダーゼ(POD)内封リポソームの調製法の検討リポソームに内封するPODの分子数を増大するため、凍結融解法によるPOD内封リポソームの調製を試みた。リポソームの調製にはフォスファチジルコリン(PC)、フォスファチジルグリセロール(PG)およびコレステロール(Chol)を用いた。凍結融解法により調製したPOD内封リポソームのキャラクタリゼーションを行った。その結果、PODの保持効率は約30%、また、約3600分子のPODが内封でき、これまでの押出し法による調製法と比較して、内封されるPODの分子数は約3倍増大した。

2.ペルオキシダーゼ内封リポソームの安定性の検討リポソームに内封されたPODがどの程度の期間、リポソーム内に保持されているか確認実験を行った。確認実験はPODがリポソームから漏出すると、ルミノール化学発光の応答曲線が変化することに着目した。その結果、PODは調製後、5日目以降から徐々にリポソームから漏出することが明らかになった。3. POD内封ビオチン化リポソームの調製法の検討POD内封リポソームを免疫測定法の標識体に応用するため、ビオチン化フォスファチジルエタノールアミン(BPEA)を合成し、PC、PG、CholおよびBPEAからなるPOD内封ビオチン化リポソームの調製を行った。ビオチン化を行っても、PODの内封に支障がないことが明らかになった。
中山間地域における土地改良・農村整備に関する研究

それぞれ3ケ所の調査フィールドを設定し、以下の問題点の解明に取り組んだ。なお調査地に選定に関しては土地改良・農村整備が地域農業に大きな影響を与えた地域であることに注意した。1.最近の中山間地域政策における短期・中期の土地利用のあり方について批判的に吟味した。そこでは、中山間地稲作の競争力、粗放的畜産向け土地利用の有利性、住環境と景観形成の価値に分析の視点を定めた。対象地域は、長野県中川村と新潟県小国町である。2.中山間地域内の農業に関わる私企業の行動を観察しながら、その影響について考察を進めた。そこでは私企業が介した場合の土地利用形態の実際に注目している。輸入農産物の増大からくる国内農産物の過剰とそれにより耕境の後退は、中山間地域に耕作放棄地の拡大という深刻な問題を引き起こしている。私企業の土地利用の観察結果から公的な農業支持が与える土地利用の歪みを明らかにした。対象地は岩手県安代町である。3.高齢化、兼業化が深化した中山間地域における農業の担い手像を検討した。高齢化、兼業化が進む地域では、作業委託への需要が大きくなってきているが、圃場整備をしていない農地では一般的に受託してもらえなくなっている。調査地は京都府和知町である。そこでは圃場整備事業をきっかけに成立した集落営農組織の盛衰過程を追跡し、中山間地域での集団営農の限界を明らかにした。またそれを補完するように発足した第三セクターの成果について財務・労務面から検討を加え、地域的な土地利用計画の重要性に着目しながら組織としての自立度を考察した。平成5年度は以下の点について研究を行った。(1)中山間地域の人口動態・就業構造に関する統計的分析。(2)現地実態調査(京都府和知町)。主として就業構造の確認し、土地改良・農村整備事業の雇用誘発効果の波及過程を追跡した。また国土保全等の農業外効果の発現形態を現地事情に即して考察した。(3)雇用誘発効果測定を前提とした地域産業連関分析の準備を行った。(4)条件不利地域政策の先進国であるEUの政策手段に関して、既往文献による論点整理を行った。具体的な対象地域が選定され現地調査も行い、就業構造を中心に地域経済を分析した。土地改良・農村整備事業がもたらす波及効果の数量的把握のために、当該地域の地域産業連関表の作成を企図したが、地域経済の活動範囲を特定する上での理論および作業の両面の問題点が明らかになった。最大の問題は、地域内外へのフローを正確に捕えることが困難な点である。一国の産業連関表の場合には国境が概念的にも実務的にも截然と確定できるので、外部から流入するもの、また外部へ流出するものの内容とその量を捉えることは容易である。行政ブロックで便宜的に分けた地域産業連関表はとりあえず存在するので、われわれの目的に合わせながらその作成手法に倣って、より地域を限定した連関表を作り上げることは可能であると思われる。しかしそこではさらにいくつかの仮定を要する。実態調査の過程で、地域経済・農業を振興するうえで土地改良が果たす役割が予想どおり大きいことが明らかになったが、それに加えて、そこで地域に投入された土地改良資本をどのようにマネージメントするかで、事業の経済成果が大きく左右されることが指摘された。現地調査を行った和知町は他地域へのモデルとなりうるシステムを作り上げているが、解決すべき課題は多く、近年発達している(内部)組織論による新たな解釈とそれに基づく提言ができるならば、当地域にとっても有用であろう。研究分担者3名は,それぞれ3ケ所の調査フィールドを設定し,以下の問題点の解明に取り組んだ.なお調査地に選定に関しては土地改良・農村整備が地域農業に大きな影響を与えた地域であることに注意した.(1)最近の中山間地域政策における短期・中期の土地利用のあり方について批判的に吟味した.

そこでは,中山間地稲作の競争力,粗放的畜産向け土地利用の有利性,住環境と景観形成の価値に分析の視点を定めた.対象地域は,長野県中川村と新潟県小国町(生源寺担当).(2)高齢化・兼業化が深化した中山間地域における農業の担い手像を検討した.そこでは圃場整備事業をきっかけに成立した集落営農組織の盛衰過程を追跡し,中山間地域での集団営農の限界を明らかにした.またそれを補完するように発足した第三セクターに成果を財務・労務面から検討を加え,地域的な土地利用計画の重要性に着目しながら組織としての自立度を考察した.調査地は京都府和知町(中嶋担当).(3)中山間地域内の農業に関わる私企業の行動を観察しながら,その影響について考察を進めた.そこでは私企業が介した場合の土地利用形態の実際に注目している.輸入農産物の増大からくる国内農産物の過剰とそれによる耕境の後退は,中山間地域に耕作放棄地の拡大という深刻な問題を引き起こしている.私企業の土地利用の観察結果から公的な農業支持が与える土地利用の歪みを明らかにした.対象地は岩手県安代町(川村担当).最後に土地改良・農村整備が中山間地農業に与える影響を総合的に考察した(研究代表者荏開津担当).
環境ストレス・脳-免疫系修飾における脳内サイトカインおよび自律神経系の役割

環境ストレスにおける脳内免疫サイトカイン動態と作用について、以下のことが明らかになった。(1)脾臓交感神経終末より放出されるノルアドレナリンのβ作用を介した脾臓NK細胞活性の抑制は、拘束ストレス時の免疫応答において、重要な役割を果たしている。(2)脳内IL-1βによる細胞性免疫機能の抑制機序の一つとして、脾臓交感神経活動の上昇がある。(3)脳内IFNαおよびIL-1βによる免疫抑制機序に、CRF系の活性化による交感神経活動の上昇がある(4)脳内CRF系の活性化機序として、PGE2のEP1受容体が関与している。(5)IFNαの脳内作用部位であるMPOは、脾臓交感神経活動を抑制性に支配することによって、免疫機能の制御を行っている。(6)脾臓NK活性は、VKH破壊による肥満の急性期では抑制され、慢性期では逆に促進する。(7)高温環境下での体温調節機序においてMPOのc-fos蛋白の発現が重要である。(8)拘束ストレス時にマウス脳内でIFNαmRNAの発現が増強している。(9)末梢から脳へのサイトカインによる情報伝達機構において、MPOやPVNに投射線維をもつAV3Vニューロンが重要である。(10)IL-1βによる胃酸分泌抑制作用の機序の一つとして、DMVニューロンに対するPG系物質を介した抑制作用がある。(11)VMHニューロン活動に対し、TNF-αは抑制性に、TNF-βは促進性に作用している。(12)IFNαは、O_2-やNOなどの二次媒介物質を介して、グルタミン酸NMDA応答を抑制する。(13)IFNαによるNMDA応答の抑制は、グリア細胞の非存在下では発現しない。IFNαの二次媒介物質と考えられるPGE2は、グルタミン酸によって誘発されるCa2+依存性K+電流を増強する。(14)IL-6は、CA1領域のLTP現象を抑制する。1.末梢サイトカインによる情報の中枢神経系情報への変換機構麻酔下ラットで、経咽頭的に記録した第3脳室前腹側領域(AV3V)ニューロンに対し、視床下部視索前野(POA)または室傍核(PVN)を刺激して逆行性興奮が誘発される、すなわちPOAやPVNに軸索を送っているニューロンのすべてが、血中投与したインターロイキンIL-1beta(IL-1beta)に応答して発火頻度が変化した。さらに、多連微小電極を用いて記録ニューロンに直接シクロオキシゲナーゼ阻害剤であるサリチル酸を投与すると、血中IL-1betaに対する応答は抑制された。以上から、血中IL-1betaは、血液-脳関門を欠く終板器官において脳内に移行し、おそらくグリア細胞に作用して産生されたプロスタグランディンE2がAV3Vニューロンに作用して活動を変化させ、その情報をPOAやPVNへ伝達していると考えられる。2.免疫機能修飾における脳内サイトカインの作用部位の同定無麻酔ラットを用い、POA、PVN、外側野(LHA)または腹内側核(VMH)にインターフェロンalpha(IFHalpha)を微量注入後、約30分で脾臓ナチュラルキラー(NK)細胞活性を^<51>Crリリース法で測定したところ、POAに注入したときにのみNK細胞活性が低下した。

また、この抑制は、脾臓交感神経の除神経によって完全にブロックされた。脾臓の交感神経の活動も、IFNalphaのPVN注入では変化しないが、POA注入によって、著明に上昇した。すなわち、脳内IFNalphaの作用部位としては、POAが最も可能性が高く、その機序として、脾臓を支配する交換神経系の関与が示唆された。末梢サイトカインによる情報の中枢神経系情報への変換機構ラットにおいて、血中に投与したIL-1βが、内側視索前野(MPO)および室傍核(PVN)へ軸索を送る第3脳室壁前腹側領域(AV3V)ニューロンの活動をプロスタグランディン依存性に修飾することはすでに明らかにしたが、さらに、HRP-WGAを用いて解剖学的にAV3VからMPOおよびPVNへの直接投射を証明した。2.自律神経系を介する中枢性免疫制御機構の脳内機序脳室内IL-1βの投与による脾臓交感神経活動の上昇が、CRFのアンタゴニストであるαヘリカルCRFの前投与によって完全に阻害されることを明らかにした。PGE2の脳室内投与によっても脾臓交感神経の活動は上昇するが、その活動上昇はαヘリカルCRFによってブロックされた。一方、CRFの脳室内投与でも脾臓交感神経の活動は上昇したが、サリチル酸の前投与ではブロックされなかった。CRFを脳室内に投与すると、脾臓NK細胞活性が低下するが、その作用部位としては、脾臓NK細胞活性および脾臓交感神経活動を指標とした微量注入実験により、MPOではなくPVNがより有効であった。すなわち、脳内PGE2→CRF系→PVNへの作用→脾臓交感神経系→脾臓NK細胞活性の制御というシステムの存在が明らかになった。3.脳内サイトカインの中枢神経細胞に対する作用機序MPOを含むスライス標本を用いてパッチクランプを行い、NMDAによって誘発される内向き電流が、IFNαの同時投与によって1時間以上にわたって抑制されることを明らかにした。そのメカニズムとして、ニューロンのオピオイド受容の活性化、およびおそらくIFNαのグリア細胞への作用による活性酸素や一酸化窒素産生の関与が考えられた。4.中枢性免疫機能の制御視床下部腹内側核を両側破壊すると過食および肥満が生じるが、破壊後4日目の急性期では脾臓NK細胞活性が低下し、ところが4週以降の慢性期においては脾臓NK細胞活性はむしろ増強することを明らかにした。1.視床下部-自立神経系を介した免疫機能修飾機序ラット脾臓交感神経の活動は、PGE2のEP1受容体アゴニストの脳室内投与でPGE2と同様亢進し、EP2アゴニストでは変化しなかった。さらに、PGE2による反応が、EP1アンタゴニストでブロックされたことから、PGE2による脾臓交感神経活動の亢進は、脳内EP1レセプターを介した反応であると考えられた。2.脳内c-fos産生系に対する環境ストレスの影響環境温を33°Cにした時のラット直腸温の上昇は2.1°Cであったが、両側視索前野(MPO)にc-fos mRNAに対するアンチセンスオリゴDNAを微量注入すると、3.1°C上昇した。従って、高温環境下におけるMPOのc-fosタンパクは、体温調節機構に重要な役割を果たしていると考えられた。3.脳内サイトカインの中枢神経細胞に対する作用機序(1)視床下部腹内側核(VMH)ニューロンに対するTNF-αおよびTNF-βの作用ラット脳薄切片のVMHニューロン活動に対し、TNFαは抑制性に、TNFβは軽度促進性に作用した。
局部火災加熱を受ける金属柱の力学的応答とその予測

既往の研究により、局部火災時の柱部材の温度分布までは火源条件が与えられれば予測が可能となっており、次の段階として、温度分布から部材の力学的挙動を予測し、架構の安全性を評価することが目標となる。まず、力学的応答予測に用いる有限要素法などの数値解析の検討モデルたり得る実験データを得ることを念頭に、局部火災加熱を受ける鉄骨角柱の載荷実験を行い、その挙動を把握した。実験は拘束条件や加力条件を変えて4種行われ、水平変形形状の推移、柱頭での熱応力拘束力、鉛直変位の推移などを把握した。さらに、これら実験結果をもとに力学的挙動予測のための有限要素モデルの確立を目的とし、上記の各実験と同じ条件で柱の挙動を有限要素法にて再現することで、熱膨張率や材料特性の設定、解析方法などを検討した。解析は汎用有限要素法ソフト"ANSYS"を用い、実験で計測された温度分布をモデルへの入力条件とし、実験ごとの拘束条件にて構造解析を行った。解析では、熱膨張率の温度依存性を設定し、鋼材の温度ごとの強度を引っ張り試験を基に多直線で近似した。その結果、試験体温度分布がある程度定常状態に近付いた後の鉛直方向の拘束力ならびに鉛直変位に関しては高い精度での予測が可能であることを示した。さらに座屈荷重を求める解析では、初期不整を求める事前解析において、温度上昇に伴う鋼材強度の低下をヤング率の低減に置き換える方法を示した。局部座屈が生じた後の挙動に差があるものの、局部座屈発生時の軸力値はよく一致し、誤差は10%以内であった。これまでの研究により、局部火災時の柱部材の温度分布までは火源条件が与えられれば予測が可能となっている。次の段階としては、これら温度分布を入力条件として部材の力学的挙動を予測し、架構の安全性を評価することが目標となる。この力学的応答予測には有限要素法などの数値解析が適用できようが、解析結果の精度の検討に使用できるような、局部火災を想定した柱部材の力学的挙動に関する研究事例は見受けられない。そこで、実際に局部火災加熱を受ける鉄骨角柱の載荷実験を行い、その挙動を把握することとした。これらから、部材内の温度分布が定常状態に近づいた後に生じる水平変形形状の推移は、鉛直拘束力や鉛直変位等鉛直方向の力学的挙動に対してはあまり影響を与えないことなどを明らかにした。解析は実験で計測された温度分布をモデルへの入力条件とし、実験ごとの拘束条件にて構造解析を行った。その結果、柱頭に軸力が加わる条件では、水平方向の変形形状の推移については実験と解析との間に差が見られるが、実験と同様、鉛直方向の拘束力や鉛直変位等材軸方向の力学的挙動に対して水平変形形状はあまり影響を与えないことが確認された。また、試験体温度分布がある程度定常状態に近付いた後の鉛直方向の拘束力ならびに鉛直変位に関しては高い精度での予測が可能で、さらに座屈荷重を求める解析では、局部座屈が生じた後の挙動に差があるものの、局部座屈発生時の軸力値はよく一致し、誤差は10%以内であった。座屈後の挙動に差があるのは、鋼材の材料特性である温度ごとの応力-ひずみの関係の設定に問題があると考えられる。
末梢神経緩徐伸長による神経欠損間隙修復法の開発

末梢神経欠損間隙の新しい治療法として末梢神経両断端緩徐伸長法を開発した。ヒトに近い種であるカニクイザルを用いた研究で本法の有用性と安全性を確認したのち、臨床研究として実際の患者様にも本法を行った。両研究とも有害事象なく良好な神経再生が得られた。従来、末梢神経の欠損の治療は体の他の部分から健康な神経を採取していたが本法はその必要がなくかつ従来法より神経再生が優れた治療法である。我々は末梢神経欠損間隙に対する新しい治療法として,末梢神経緩徐伸長法を開発し臨床応用を目指している.本研究の目的は,ヒトに使用可能な神経伸長器を新たに開発し、動物実験(成熟サル)により霊長類における本法の適応を確認することである。今年度は研究1-1:神経伸長器の開発および研究1-2:新鮮損傷時の治療法の確立を行った。カニクイザル3匹(No.1-3)を用いた。無麻酔下・数秒で各断端の神経伸長が可能な神経伸長器を開発した。No.1の動物では毎日の神経伸長に対する順化法、神経機能および上肢機能の評価法を検討したのち、前腕尺骨神経に15mmの神経欠損を作成し、上述の神経伸長器を装着、1日1mmの速度で20日間の神経伸長を行った。この間の観察により神経緩徐伸長期間に伸長により疼痛関連行動が生じないことがわかった。神経伸長後両断端は縫合可能な距離まで伸長されており、両断端の直接縫合術を行った。縫合後の神経再生能を電気生理(MCV,SEP,EMG)、知覚閾値検査(CPT)、Apple testにて経時的に評価したが、特異的な尺骨神経運動機能をApple testで評価することが困難であった。電気生理検査で神経再生が認められたため、12週目に組織採取を行ったところ組織学的にも良好な神経再生が認められた。No.2は前腕部正中神経を用い同様の実験を行った。No.3はコントロール群として正中神経の遊離神経移植術を行った。両動物について現在、術後神経再生能を経時的に観察中である。我々は末梢神経欠損間隙に対する新しい治療法として,末梢神経緩徐伸長法を開発し臨床応用を目指している。本研究の目的は,ヒトに使用可能な神経伸長器を新たに開発し、動物実験(成熟サル)により霊長類における本法の適応を確認することである。今年度はカニクイザル6匹(No.1-3)を用い前腕部正中神経に20mmの神経欠損を作成し、上述の神経伸長器を装着、1日1mmの速度で20日間の神経伸長を行った。縫合後の神経再生能を電気生理(MCV,SCV,NCV,TT)、知覚閾値検査(CPT)、Applepinch testにて経時的に評価した。対象群として従来法である遊離神経移植群を作成し、比較した。MCV,SCVは両群で初回手術後16週までに測定可能となり、術前の値と比較した回復率は神経伸長群で高い傾向であった。Applepinch testでは正中神経の機能評価として母指の外転をみたが、両群において術後12週頃から母指外転機能の再獲得が確認できた。組織評価は正中神経横断切片の有髄軸索顕微鏡下計側を行ったが、軸索総数は両群で同程度であったが軸索径は神経伸長群でより大きく、再生神経の成熟が進んでいるものと考えられた。以上の結果、神経伸長群で電気生理および組織学的により良好な神経再生が得られたと考えた。本法が霊長類においても適応でき、重大な合併症もなく有効な治療効果が得られることを確認できた。研究1:末梢神経緩徐伸長の適応と限界我々が開発した末梢神経欠損間隙の新治療法:末梢神経両断端緩徐伸長法で、どのくらいの神経欠損を架橋し得るかについて臨床前最終段階の研究として実験を行った。成熟カニクイザル,3頭を用いた.前腕部正中神経を30mm切除した。両神経断端を自家開発の神経伸長器で1日0.51mmの伸長速度で両断端可能距離まで伸長した。3頭とも神経伸長に成功し、両断端を直接縫合により修復できた。機能的回復の評価として手指のピンチ動作と電気生理学的検査(運動および知覚神経伝導速度検査,筋電図検査等)、知覚閾値検査を縫合後4,8,12,16,20,24週に評価した.また再生神経の組織学的評価を縫合後24週にMCV,SCV、短母指外転筋重量および筋張力、筋入口部10mm近位の神経横断切片の有髄軸索数,径で評価した。MCVは健側比48%,SCV54%,CMAP振幅,筋重量48%,筋張力21%、軸索数86%,軸索径52%まで回復した。ピンチ動作は3頭全部で再獲得され良好な神経再生を確認できた。

研究2:臨床応用研究1の結果を受けて、本法の臨床研究を行うことを筑波大学附属病院倫理委員会に提出、承認ののち、臨床研究を開始した。第1例目の治療を行い、13mmの神経欠損の架橋に成功、縫合術後3ヶ月で当該筋の神経再支配(筋電図、MMT)を認めた。有害事象はなかった。
高精度油膜温度計測に基づく弾性流体潤滑レオロジーモデルの再構築

弾性流体潤滑状態において,各種潤滑油をを使用した際に出現する特異油膜形状に代表されるような,高圧・高せん断場でのレオロジー特性を明らかにすることを目的に,油膜厚さと温度の計測を行った.また,静的条件での相変化をダイアモンドアンビルセルによって調べた.その結果,潤滑面の温度は極めて小さいことがわかった.また,静的条件における状態図との比較の結果,潤滑膜は接触域で圧力の影響のため固化を起こし,特異油膜形状の発生に寄与していることを実験的に裏付けることができた.弾性流体潤滑状態において,各種潤滑油をを使用した際に出現する特異油膜形状に代表されるような,高圧・高せん断場でのレオロジー特性を明らかにすることを目的に,油膜厚さと温度の計測を行った.また,静的条件での相変化をダイアモンドアンビルセルによって調べた.その結果,潤滑面の温度は極めて小さいことがわかった.また,静的条件における状態図との比較の結果,潤滑膜は接触域で圧力の影響のため固化を起こし,特異油膜形状の発生に寄与していることを実験的に裏付けることができた.平成21年度前半にはまず,既存の実験装置の改良及び弾性流体潤滑条件での油膜厚さ測定を行った.実験装置には既存のボールオンディスク型の実験装置を用いたが,最大圧力を3GPa程度まで設定可能なように,装置全体の改良を行い,剛性を向上させた.そして,特異油膜形状が発見されている一価のアルコールだけでなく,それに類似する粘度かつ融点が常温付近であるアルカン,酸,アミン,そして二価および三価のアルコールを潤滑油として数種類選定した.これらの潤滑油を用い,滑り転がり条件を変化させて油膜厚さを測定した.その結果,一価のアルコールだけでなく,無極性であるアルカン,酸,アミンにおいても滑り速度の増加にともなって特異油膜形状が出現することを明らかにした.その一方で,二価および三価のアルコールでは特異油膜形状は出現しないことが明らかとなった.本年度後半には,赤外放射計を購入し,温度計測システムの構築を行った.購入した赤外放射温度計は顕微レンズが組みつけられており,その結果,空間分解能約6μmを有するものである.さらに,この赤外放射温度計に光学バンドパスフィルターを組み合わせることにより,表面温度だけでなく,特定波長域からのみ放射する油膜温度を計測できるようにした.この赤外温度計測システムを実験装置に組み合わせて弾性流体潤滑条件における温度計測システムを完成させ,赤外透過材料であるサファイアを潤滑表面に用い,サファイアガラス越しに直径400μm以下の潤滑面の温度測定を行った.その結果,本実験システムで弾性流体潤滑下での温度分布測定が高精度で可能であることを確認した.平成22年度前半にはまず,静的状態における潤滑油の状態図を作成することを目的とし,ダイアモンドアンビルセルによる高圧力容器の設計を行った.この装置は,対向させたダイアモンドアンビルで,直径0.6mmの貫通穴を空けたステンレス製のガスケットを挟み込むことにより潤滑油を昇圧させるものである.設定可能最高圧力は3GPa,最高温度は150°Cまでとした.圧力の同定には,潤滑油内に混入したルビー片の蛍光スペクトルの圧力依存性をRaman分光測定器で測定して求めた.その結果,動的条件で特異油膜形状が発見されている一価のアルコールの一種であるdodecanolについて,設定温度60°Cでは,圧力がわずか0.2GPaで結晶化を起こすことが明らかとなった.一方,動的条件で特異油膜形状が発生しなかった二価および三価のアルコールでは,圧力を1GPaまで昇圧させても結晶化せずに液体のまま振舞っていることがわかった.本年度後半には,前年度に購入した赤外放射計を用いて,動的条件における潤滑面の温度測定を行った.潤滑面の片面には赤外透過材料であるサファイアを用い,サファイア越しに温度測定を行った.その結果,特異油膜形状が発生したdodecanolでは,周囲温度40°Cの条件では高い滑り率条件であっても潤滑面の最高温度は60°C程度であることが明らかになった.そして,動的実験で測定された温度および,最高ヘルツ圧力である0.5GPaのときにおける静的条件での相状態を調べると,dodecanolは結晶化している状態であることがわかった.以上のとおり,特異油膜形状発生時における温度及び圧力では,潤滑油は静的状態では結晶化していることが明らかとなった.本研究の成果に加え,1ms以下の通過時間中における結晶化の速度依存性が明らかになれば,潤滑油の固化による特異油膜形状の発生といった仮説がより説得力を増すが,この残された課題も,本研究の成果によって明確化したといえる.