hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
界面運動を伴う非線形現象の大域挙動の研究

世界的に研究の進展を見せる界面を伴う非線形現象のうちで、この研究課題では主に次の二点に関して研究を進めた。1.相分離現象を記述する方程式の解析。2.数理ファイナンスに現れる行使界面挙動の研究。まず相分離現象の解析であるが、平成12年度頃より始めた江口教授(福岡大)の提唱したモデル方程式系、EOM系の解明に取り組んだ。一次元についてはある程度の成果を挙げることができた。これは相分離現象を、考えている物質の密度に対する方程式と、系に内在する秩序変数に対する方程式との係わりにおいて説明しようとした方程式系である。定常解の構造を詳しく調べ、界面、すなわち遷移層が現れることを見た。さらに高階微分の係数が消えていく、いわゆる特異極限の問題を考察した。さらに定常解に対する分岐現象の解明を行った。これらはすべて査読者の評価も高かった。最後の論文に関しては、EOM系は温度変数を主パラメータとするが、この主パラメータに対する分岐を詳しく調べたものである。単純な定常解では単純な分岐しか現れないが、やや複雑な定常解からはやはり複雑な分岐現象が観察された。その他では、力学系の観点からより詳しい解析を行う準備をした。しかし、論文をまとめるような水準まで研究は進まなかった。この研究資金での活動は終了するが、研究そのものは今後も続行する。次に数理ファイナンスに現れる行使界面挙動の研究であるが、まず高岡准教授(一橋大)の提唱したモデルから導かれる偏微分方程式の厳密解を求めた論文が出版された。さらに取引費用を考慮した場合のBlack-Scholes偏微分方程式にっいて研究し、解の存在等示した。平成18年9月のスロバキアにおける国際研究会で発表し、様々な指摘を得てさらに推敲した。論文は投稿中である。論文は投稿中である。この数年来、極めて研究の盛んになってきた、界面運動を伴う非線形現象の解析において、今年度は特に「相分離方程式の大域挙動」および「曲率流とらせん模様」に関して精力的に研究を行った。ともにいくつかの重要な知見を得ることができた。そのほかには遷移層方程式に関して、既知の結果に簡単な証明法を与えることにも成功した。研究発表欄に記すように、すべてこの分野では評価の高い雑誌に公表することができた。まず「相分離方程式の大域挙動」の研究については、いわゆる江口タイプ(EOM)のモデルに対して厳密な数学解析を遂行した。このモデルは高階方程式であるCahn-Hilliard方程式と、超伝導でも著名なGinzburg-Landau方程式を結びつけるものである。空間1次元における成果であるが、解の存在とその大域挙動、特に収束性について証明を与えた。さらに定常解の構造について、変分法を巧みに用いることにより、その豊かで複雑な内容を明らかにした。今後の課題としては、これら定常解を含む方程式の解の安定性があり、現在取り組んでいる。次に「曲率流とらせん模様」の研究については、いわゆる運動学的モデルの自己相似解の構造を明らかにした。運動学的モデルは、現実をよく記述するモデルとして重宝されており、今回得られた自己相似解の構造は、材料科学の方面に対しても有意義なものであると期待している。これは台湾師範大学の郭忠勝教授との共同研究として成された。最後に遷移層方程式の研究については、牛島健夫(東京理科大学)との共同で、3階方程式の解の存在に対する初等的かつ簡単な別証明を与えることに成功した。数値計算も行い、理論と計算の精度良い一致を確認した。極めて多様な様相を見せる界面を伴う非線形現象のうちで、平成17年度は主に次の二点に関して積極的に研究を進めた。1.相分離現象の分岐現象の解析。

2.数理ファイナンスに現れる行使界面挙動の研究。まず相分離現象の分岐現象の解析であるが、前年度に引き続いて江口教授(福岡大)の提唱したモデル方程式系、EOM系の解明に取り組んだ。これは相分離現象を、考えている物質の密度に対する方程式と、系に内在する秩序変数に対する方程式との係わりにおいて説明しようとした方程式系である。既に定常解の構造を詳しく調べ、界面、すなわち遷移層が現れることを見た。平成17年度の主要結果は、この定常解に対する分岐現象をある程度解明したことである。EOM系は温度変数を主パラメータとするが、この主パラメータに対する分岐を詳しく調べた。単純な定常解では単純な分岐しか現れないが、やや複雑な定常解からはやはり複雑な分岐現象が観察された。中村教授(日本大)中村助手(電通大)と共同で論文を執筆し投稿した。またこの研究課題では、定常解の特異極限問題を考察した論文が出版された(成果欄参照)。査読者2名の評価がともに高かったものである。次に数理ファイナンスに現れる行使界面挙動の研究であるが、これは平成17年度に入り急速に興味を持つことになった研究課題である。周知のように数学と金融分野の接点となる研究分野であり、現在では極めて研究が盛んである。一般的には確率過程の言葉を用いて記述されるが、非線形偏微分方程式での定式も捨て難く思われる。平成17年度は、高岡助教授(一橋大)の提唱したモデルから導かれる偏微分方程式を研究し、まずその厳密解を求めた。平成18年度は、自由境界問題としての、その行使界面挙動を追跡している。世界的に研究の進展を見せる界面を伴う非線形現象のうちで、研究計画最終年度の平成18年度は、平成17年度に続き主に次の二点に関して研究を進めた。1.相分離現象の分岐現象の解析。まず相分離現象の分岐現象の解析であるが、平成16年度、17年度に引き続いて江口教授(福岡大)の提唱したモデル方程式系、EOM系の解明に取り組んだ。平成17年度の主要結果であるこの定常解に対する分岐現象の解明は、中村教授(日本大)中村助手(電通大)との共著論文として公表された。査読者の評価も高かった。これは、EOM系は温度変数を主パラメータとするが、この主パラメータに対する分岐を詳しく調べたものである。その他では、力学系の観点からより詳しい解析を行う準備をした。しかし、論文をまとめるような水準まで研究は進まなかった。この研究資金での活動は終了するが、研究そのものは平成19年度以降も続行する。次に数理ファイナンスに現れる行使界面挙動の研究であるが、まず高岡准教授(一橋大)の提唱したモデルから導かれる偏微分方程式の厳密解を求めた論文が出版された。
教科教育学における教材研究・授業設計法の開発

授業設計を行う際の基礎となる教師の教材研究・授業設計という内観的な思考過程に焦点をあて、教材研究・授業設計の方法を明確にし、それに基づき教科教育における教材研究・授業設計の指導方法を確立することを目的としている。1.教師の授業計画に関する思考過程の分析と教材研究・授業設計の方法に関する指導教材の開発・作成を行った。(1)授業をコミュニケーションの視点から捉え、教師の発問及びそれに対する反応・応答等の情報を抽出できるモデルを選択し、ビデオ教材を作成した。(2)授業における発問過程に焦点をあて、教材内容と教授学習過程の構成(発問系列・構成)に関して現職教師とい教育実習生の方略について調査・分析した。(3)上記の教材を用いて、授業展開に関わる教授方略に関する学生の読み取り能力について調査・分析した。調査から授業設計において、経験を経た教師は授業展開に関わる教授方略を持って設計を行っているが、実習生はそこまで意識していないことが明確となった。これらの調査を踏まえ、学生の自己学習及び小集団による課題解決活動により、教材研究・授業設計とそれに基づくマイクロティーチングを組み込んだ教科教育プログラムを開発し、実験・試行した。学生の教材研究と授業設計に関する方法と思考過程を分析した結果、その教材の子どもの認識過程の理解にこのプログラムが寄与するとの知見が得られた。教師の授業計画に関する思考過程の分析と教材研究・授業設計の方法に関する指導教材の開発・作成を行った。1)小・中学校の授業をビデオ収録した。その授業をコミュニケーションの視点から捉え、教材研究・授業設計において必要な学習者のレディネスと教師の発問及びそれに対する反応・応答等の情報を抽出できるモデルを選択し、授業筆記記録を作成し教材化を図った。2)授業における発問過程に焦点をあて、教材内容と授業学習過程の構成(発問系列・構成)に関して現職教師と学生の方略について調査・分析した。3)上記の教材を用いて、授業展開に関わる教授方略に関する、学生の読みとり能力について調査・分析した。これらの調査から、授業設計において、実習生は、教科内容(教材)の伝達に授業の重点をおき、現職教師は、学習課題の設定と学習者の課題追求及びその後の討議に授業の重点をおいていることがわかった。実習生と現職教師の授業の重点とそこにおける役割が異なるのは、授業展開に関わる教授方略について、経験を経た教師はそれを明確に持って授業設計を行っているが、実習生は設計段階においてそこまで意識していないことが要因であることが明確になった。(2)授業における発問過程に焦点をあて、教材内容と教授学習過程の構成(発問系列・構成)に関して現職教師と学生の方略について調査・分析した。(3)上記の教材を用いて、授業展開に関わる授業方略に関する、学生の読みとり能力について調査・分析した。調査から授業設計において、経験を経た教師は、授業展開に関わる教授方略を持って設計を行っているが、実習生はそこまで意識していないことが明確になった。2.これらの調査をふまえ、学生の自己学習及び小集団による課題解決活動により、教材研究・授業設計とそれに基づくマイクロティーチングを組み込んだ教科教育(初等数学科教育法)の授業プログラムを開発し、実験・試行した。学生の教材研究と授業設計の活動に関する方法と思考過程を分析した結果、その教材の子どもの認識過程の理解にこのプログラムが寄与するとの知見が得られた。
ストローマ細胞由来未熟B細胞刺激因子(PBSF)の作用機構と生理的意義

ストローマ細胞が産生する可溶性因子のうちIL-7とSCFはB細胞造血に重要な分子であることが示されているが、これらの分子のみではB細胞造血の分子機構を十分説明できない。我々はストローマ細胞依存性B前駆細胞クローンDW34ストローマ細胞由来cDNAラウブラリーより89個のアミノ酸からなるインタークリンファミリーに属する分泌蛋白(PBSF)をコードするcDNAを得た。このPBSFは骨髄B前駆細胞のIL-7による増殖を相乗的に増強する活性をもつ。本年度は、PBSFのinvivoにおける機能を解析するために、PBSF欠損マウスの作製を行った。まずマウスPBSF染色体遺伝子をクローニングし、その構造を決定した後、その一部を用いてターゲティングベクターを作製した。さらにターゲティングベクターで胎児幹細胞株のPBSF遺伝子を破壊し、その胎児幹細胞株よりキメラマウスを作製した。交配実験よりこの破壊されたPBSF遺伝子は、子孫に生殖細胞を通して伝わることが明かとなった。
水産魚種の成長に伴う経済的価値上昇を考慮した最適な漁獲制限体長の推定

沿岸性水産重要魚種の価格形成に関する基礎情報を収集するため、前年度に引き続き、週45回のセリ市場調査を実施し、水揚げ物の種と大きさなどを記録した。前年度までに実施したブダイ科魚類とハタ科スジアラ属魚類に加え、ハタ科バラハタ属2種とマハタ属4種で、魚体の大きさ上昇に伴うセリ単価の変化を明らかにした。すべての種で体重増加に伴うセリ単価の上昇が確認でき、一部の種では大きすぎると単価が下がることを明らかにした。これらの成長に伴うセリ値上昇の情報と、過去に知見のある生活史情報(最高年齢・成長パラメータ)を用い、ブダイ科3種とハタ科8種で適切な漁獲制限尾叉長を推定した。その結果、現在八重山地域で設定されている漁獲制限体長は、大型種に限り、引き上げるべきであると考えられた。大型種である、ハタ科スジアラ属3種、バラハタ属2種、フエフキダイ科フエフキダイ属2種では、昨年度に引き続き、セリ市場で個体ごとに尾叉長、体重、電気抵抗値を計測・記録した。いずれの種でも、季節的な肥満度(体重/体長^3)の変化、電気抵抗値の変化が見られた。沖縄の市場における漁獲物の冷却度合は漁業者によってばらつきがあり、温度の影響を受ける電気抵抗値をそのまま脂の乗りの指標として利用することは適切でないと推測された。一方で肥満度は、産卵期や魚体の大きさとの関連が大きく、個体の質を反映する指標になりうることが示唆された。生活史情報のない水産上重要な沿岸魚種であるフエフキダイ属2種については、標本収集を継続し、年齢査定、成熟度判定のために、耳石・生殖腺を収集した。市場における調査は、予定より高頻度で順調に実施しており、生活史情報の不明な2種の標本収集も順調である。個体情報の詳細な調査対象とした5種については、電気抵抗値を用いた体脂肪率推定が沖縄県の市場では困難なことが明らかになった。一方で、簡易的に計算できる肥満度により、身質の推定がある程度できる可能性があることが分かった。沿岸魚類のセリ値形成と身質評価に関連して、学会で2件口頭発表した。ブダイ科魚類のセリ値形成に関する論文が学術雑誌に受理・掲載された。ブダイ科魚類のセリ値に大きく影響する寄生虫について、寄生虫の専門家と協力し、寄生虫の種類、宿主の種による寄生率の違いについてまとめ、学術雑誌に論文を投稿した。この寄生虫がブダイ科魚類に与える生態的な影響についても1仮説を提唱し、学会で1件発表した。ブダイ科とハタ科の主要な数種で適切な漁獲制限体長を推定できたので、次はフエフキダイ科で推定し、沿岸魚類に広く適用可能な数値や簡易的な計算方法を検討する。フエフキダイ科2種で、年齢・成長などの基礎的生活史情報を明らかにする。推定した適切な漁獲制限体長について、八重山漁協内の資源管理委員会で漁業関係者向けに紹介し、資源管理を適切に進めていくうえでの参考情報としてもらう。セリで決まるキログラム単価が、魚体の大きさや脂の乗り具合によって変化しうるかどうかを、過去に十分な量のデータを収集した魚種で検討した。深海性のフエダイ科ハマダイ属4種では、成長に伴う単価の上昇が認められるものの、34キロ以上の個体では逆に単価が下がることを明らかにした。クロマグロでは、150200キロの個体で単価が高く、250キロ以上では安くなったが、電気抵抗値を基に推定した体脂肪率が、セリ価格と強く関係していることを明らかにした。沿岸性水産魚種の価格形成に関する基礎情報を収集するため、週23回のセリ市場調査を実施し、水揚げ物の種と大きさを記録した。ブダイ科、ハタ科、フエフキダイ科から、それぞれ数種ずつの対象魚種を選定した。このうち、大型種である、ハタ科スジアラ属3種とフエフキダイ科フエフキダイ属2種を、詳細な個体情報収集調査の対象に設定し、個体ごとに尾叉長、体重、電気抵抗値を計測・記録した。フエフキダイ属2種については、生活史情報の蓄積のために標本を収集した。個体の詳細な調査と標本収集は、年度途中から実施しているため、十分なデータ量が確保できるまで次年度以降も継続する。2011年から市場調査をしているブダイ科魚類については、セリ値に影響する他の要因を除去し、成長に伴うセリ単価の変化について明らかにした。結果、ブダイ科で最重要種のナンヨウブダイでは、1.5キロ程度まで単価が急上昇することが分かった。2015年から記録しているスジアラ属3種についても同様に、成長に伴うセリ単価の変化について解析し、2キロ程度の個体が最も単価が高いことを明らかにした。現在沖縄県で設定されている漁獲制限体長は、ナンヨウブダイで25センチ(約0.34キロ)以下、スジアラ属で35センチ(約0.7キロ)以下であることを考えると、制限体長の引き上げが資源管理に有効である可能性が示唆された。市場における調査は、予定通りの頻度で順調に実施しており、調査対象魚種の中に、詳細な個体情報収集の対象種も設定した。詳細な調査対象種については、体脂肪率測定器による電気抵抗値に加え、尾叉長と体重も個体ごとに計測・記録するようにした。標本の収集も順調である。また、沿岸魚類のセリ値形成に関連して、学会で2件口頭発表した。沿岸魚類の調査と別に、過去に収集したデータに基づいた、セリ値形成に関する解析も実施した。

深海性フエダイ類の体サイズとセリ値について、学会で1件発表した。クロマグロの体サイズ・体脂肪率とセリ値については論文にまとめ、1報が学術雑誌に受理された。沿岸性水産重要魚種の価格形成に関する基礎情報を収集するため、前年度に引き続き、週45回のセリ市場調査を実施し、水揚げ物の種と大きさなどを記録した。前年度までに実施したブダイ科魚類とハタ科スジアラ属魚類に加え、ハタ科バラハタ属2種とマハタ属4種で、魚体の大きさ上昇に伴うセリ単価の変化を明らかにした。すべての種で体重増加に伴うセリ単価の上昇が確認でき、一部の種では大きすぎると単価が下がることを明らかにした。これらの成長に伴うセリ値上昇の情報と、過去に知見のある生活史情報(最高年齢・成長パラメータ)を用い、ブダイ科3種とハタ科8種で適切な漁獲制限尾叉長を推定した。その結果、現在八重山地域で設定されている漁獲制限体長は、大型種に限り、引き上げるべきであると考えられた。大型種である、ハタ科スジアラ属3種、バラハタ属2種、フエフキダイ科フエフキダイ属2種では、昨年度に引き続き、セリ市場で個体ごとに尾叉長、体重、電気抵抗値を計測・記録した。いずれの種でも、季節的な肥満度(体重/体長^3)の変化、電気抵抗値の変化が見られた。沖縄の市場における漁獲物の冷却度合は漁業者によってばらつきがあり、温度の影響を受ける電気抵抗値をそのまま脂の乗りの指標として利用することは適切でないと推測された。一方で肥満度は、産卵期や魚体の大きさとの関連が大きく、個体の質を反映する指標になりうることが示唆された。生活史情報のない水産上重要な沿岸魚種であるフエフキダイ属2種については、標本収集を継続し、年齢査定、成熟度判定のために、耳石・生殖腺を収集した。市場における調査は、予定より高頻度で順調に実施しており、生活史情報の不明な2種の標本収集も順調である。個体情報の詳細な調査対象とした5種については、電気抵抗値を用いた体脂肪率推定が沖縄県の市場では困難なことが明らかになった。一方で、簡易的に計算できる肥満度により、身質の推定がある程度できる可能性があることが分かった。沿岸魚類のセリ値形成と身質評価に関連して、学会で2件口頭発表した。ブダイ科魚類のセリ値形成に関する論文が学術雑誌に受理・掲載された。ブダイ科魚類のセリ値に大きく影響する寄生虫について、寄生虫の専門家と協力し、寄生虫の種類、宿主の種による寄生率の違いについてまとめ、学術雑誌に論文を投稿した。この寄生虫がブダイ科魚類に与える生態的な影響についても1仮説を提唱し、学会で1件発表した。成長に伴うセリ値の変化について、ブダイ科とハタ科スジアラ属では初年度でおおむね明らかにできたので、各種の最適な漁獲制限体長の推定に注力する。ハタ科他種とフエフキダイ科については、セリ値形成要因について解析する。セリ市場における詳細な調査対象5種については、体長ー体重関係等の季節的な変化についても検討する。フエフキダイ属2種で生活史情報の解明が必要になったことから、産卵期における各種各サイズ個体を必要量収集する。ブダイ科とハタ科の主要な数種で適切な漁獲制限体長を推定できたので、次はフエフキダイ科で推定し、沿岸魚類に広く適用可能な数値や簡易的な計算方法を検討する。フエフキダイ科2種で、年齢・成長などの基礎的生活史情報を明らかにする。
プロテインキナーゼCの生体内での基質の網羅的探索

プロテインキナーゼC(PKC)γは小脳において運動協調やプルキンエ細胞におけるシナプス除去に重要な役割を担っていることが知られている。しかし、生体内におけるPKCγの基質が同定されていないために、その分子メカニズムは不明であった。本研究ではマウス小脳を用いた定量的リン酸化プロテオミクスによって、生体内におけるPKCγの基質候補を同定することができた。これらの分子の機能解析によって、PKCγによる小脳機能の制御メカニズムが明らかになると期待できる。本研究では、マウス脳のリン酸化プロテオミクスによってプロテインキナーゼC(PKC)gammaの基質を同定し、小脳機能におけるPKCシグナルの重要性を明らかにすることを試みた。昨年度までにPKCgammaノックアウトマウス(KO)の作製と小脳におけるリン酸化ペプチドの相対定量を行った。その結果、PKCgamma KOにおいて特にリン酸化の低下が顕著であった117種類のタンパク質を同定することができた。本年度はこれらの基質候補タンパク質の機能を解析するために下記の実験を行った。(1)リン酸化候補タンパク質の発現解析PKCgamma KOにおいてリン酸化量が大きく低下していた3つのタンパク質(Protein NDRG4, diacylglycerol kinase zeta, Serine/Threonine kinase Tao1)について、mRNAの発現解析を行った。マウス小脳よりtotal RNAを調製し、oligo-dTプライマーによって逆転写を行った。次に、それぞれの遺伝子についてリアルタイムPCRによって、mRNAの発現量を比較した。その結果、それぞれの遺伝子の発現量に野生型とKOとの間に大きな変化は見られなかった。このことからPKCgamma KOにおけるリン酸化量の低下は遺伝子発現量の変化によるものではないことを確認することができた。(2)リン酸化ペプチドに対する抗体の作製上記三種類のタンパク質についてリン酸化抗体の作製を行った。それぞれのタンパク質に対して、MS/MSによって同定されたアミノ酸残基がリン酸化されたペプチドを合成し、ウサギに接種した。ELISAによって抗体価の上昇したウサギより全採血を行い、抗血清を得た。現在これらの抗血清を用いて、ウエスタンブロットによるリン酸化量の変動解析と、免疫染色によるプルキンエ細胞における局在解析を行っている。本研究は、小脳プルキンエ細胞におけるプロテインキナーゼC(PKC)gammaの基質をプロテオミクス手法によって探索し、小脳機能におけるPKCシグナルの重要性を明らかにすることを目標にする。本年度は、研究実施計画に従って実験を行い、下記の成果を得た。(1)PKCgammaノックアウトマウスの作製PKCgammaノックアウトマウスの凍結胚を偽妊娠マウスの卵管に移植することによって、マウス個体に復元した。次に、得られたPKCgammaホモ欠損マウスの小脳懸濁液のウエスタンブロット解析を行い、PKCgammaの発現が消失していることを確認した。またヘテロ欠損マウス同士を交配することによって、引き続きPKCgammaホモ欠損マウスを作製すると同時に、系統の維持を行った。(2)PKCgammaノックアウトマウス小脳のリン酸化プロテオーム解析7週齢の野生型およびPKCgammaホモ欠損マウスそれぞれ2個体(計4個体)の小脳を単離し、ホスファターゼ阻害剤を含むバッファーでホモジェナイズし、タンパク質抽出液を作製した。タンパク質抽出液はトリプシンによって消化し、リン酸化ペプチドの濃縮を行った。得られたリン酸化ペプチドを個体ごとに異なる4種類の安定同位体(iTRAQ)によって標識し、nano-LCタンデム質量分析計によって野生型とPKCgammaホモ欠損マウスとの間でリン酸化ペプチドの相対定量を行った。その結果、野生型と比較してPKCgammaホモ欠損マウスにおいてリン酸化量が半分以下に低下したタンパク質を115種類同定し、2倍以上上昇したタンパク質を52種類同定することができた。これらのタンパク質は小脳においてPKCgammaによって直接的・間接的にリン酸化による制御を受けている因子であると考えられ、小脳におけるPKCgammaの役割を明らかにする上で重要であると示唆される。本年度行ったリン酸化プロテオームの解析は、世界的にみても難易度の高い質量分析技術である。その上、本研究ではマウスの脳組織を材料として用いており、通常用いられる培養細胞のプロテオームと比較して、格段にマススペクトルの複雑性が高くなる。このような研究は現在までほとんど例がなかったが、申請者は遺伝子操作マウスとプロテオミクスを融合させ、野生型とPKCgammaノックアウトマウスのリン酸化プロテオームを質量分析によって相対定量することによって、技術的な困難を解消することを試みた。その結果、3万5千種類を超えるリン酸化ペプチドを同定することができ、これらの中から野生型とPKCgammaノックアウトマウスとの間でリン酸化量の異なるタンパク質を多数見出すことができた。以上のことから、当初の研究実施計画通りに研究を進め、実績をだすことができたと判断できる。リン酸化プロテオーム解析によって同定することができたPKCgammaの基質候補タンパク質について網羅的に以下の解析を行う。

(1)PKCgammaの基質候補タンパク質の生化学的解析野生型およびPKCgammaノックアウトマウス小脳において、基質候補タンパク質の発現量をウエスタンブロット・定量的RT-PCRによって調べる。この実験によって、ペプチドのリン酸化量の変化がタンパク質の発現量によるものであるかどうかを明らかにする。また、小脳切片の免疫染色によって基質候補タンパク質の小脳プルキンエ細胞内での局在を明らかにする。次に、PKCgammaおよび基質候補タンパク質を培養細胞内で強制発現し、抗PKCgamma抗体を用いた共免疫沈降実験を行う。これによってPKCgammaと基質候補タンパク質との相互作用を解析する。(2)PKCgammaの基質候補タンパク質の生理機能解析プルキンエ細胞における基質候補タンパク質の機能を明らかにするために、培養神経細胞もしくは培養小脳スライスにプルキンエ細胞特異的にGFPおよびshRNAを発現するノックダウンベクターを導入する。培養細胞での形態変化もしくはGFP標識されたプルキンエ細胞の形態、登上線維のシナプス除去などを解析することによって、小脳機能におけるPKCgammaおよび基質候補タンパク質の役割を明らかにする。また、小脳スライス実験において興味深い表現型が観察された基質候補タンパク質については、ノックアウトマウスや、リン酸化部位をアラニンまたはフェニルアラニンに置換した変異体を発現するトランスジェニックマウスの作製を行い、運動協調や運動学習といった個体レベルでの機能解析を行う。これらの解析を通して、プルキンエ細胞におけるPKCgammaの基質を同定するとともに、小脳機能におけるPKCgammaシグナル伝達経路の重要性を明らかにする。(1)次年度使用する研究費が生じた状況本研究はPKCgammaの基質候補タンパク質の同定とその機能解析を、それぞれ1年ずつ行う研究計画である。本年度は基質候補タンパク質の同定を行ったが、期待以上に多くのタンパク質を同定できたため、プロテオミクス解析に使用する予定であった研究費の一部を次年度の分子機能解析に使用し、より多くの基質候補分子について機能解析を行うこととした。計画の一部変更によって次年度使用する研究費が生じたが、これによってプルキンエ細胞におけるPKCgammaシグナルについてより多くの知見を得ることができると考えられる。(2)研究費の使用計画今後の研究の推進方策に掲げた実験を行うための研究費の使途は以下のとおりである。(1)ノックアウトマウスおよび野生型マウスの飼育経費。(2)細胞およびスライス培養に用いるプラスティック器具。(3)ノックダウンベクター作製のためのオリゴDNAおよび酵素・試薬類。(4)タンパク質発現・局在解析のための抗体。(5)研究成果発表のための国内旅費。
機能物質の動態と作用性の解析

本研究は植物生活環の進行を調節する内生機能物質の作用機構と動態を分子レベルで解明するすることを目的とした。今関は機能物質及び傷害によるエチレン生合成の調節機構を解明するため律速酵素をあるACC合成酵素を組織傷害を与えたカボチャ果肉から単離し、特異抗体を得た。この抗体及び無細胞翻訳系を用いて傷害によるACC合成酵素量及びmRNA量の変化を測定するとともにACC合成酵素のcDNAのクローニングに着手した。酒井はすでにヤエナリから単離した2種の可溶性オーキシン結合蛋白質機能を実証するため単離核によるRNA合成に対する効果を調べた。核調製法を格段と改良して、正常なサイズのrRNAが合成され、かつ転写開始が起こる核を調製することに成功し、オーキシン結合蛋白が核内で合成されるmRNA組成を変えることを証明した。サイトカイニンの緑葉老化抑制作用を解析する目的で、渡辺はハツカダイコン緑化子葉が暗条件に置いて老化する時に発現するcDNAをクローン化し、暗条件で変化するmRNA合成の様相を明らかにした。近藤はソラマメの気孔閉鎖をABAが促進するとき【K^+】の排出を促進し【H^+】の排出を抑制することを明らかにした。動態研究は主として分子の多様性があるジベレリン、ブラシノステロイドの相互変換を解析することを目的とした。ジベレリンのC3位の水酸化反応の無細胞系を確立し、本酸素の部分精製を行うとともに(神谷)、放射性カスタステロンとブラシノライドを調製して、イネに根系から与え、何れもかなり茎葉部に転流されること、根、茎葉部で活発に極性の高い代謝物に変換することを明らかにした。これらの代謝物は配糖体等の中性物質ではなく、酸性の新しいタイプの代謝物であることを明らかにした。
DNA膜モチーフによる人工膜システムの創成

本研究の目的は,塩基配列をデザインして人工的に合成したDNA分子(膜モチーフ)により人工の膜面(DNA膜)を構成することである.今年度は,DNAモチーフ間のループ・ループ相互作用を実現するための基礎ステップとして,硬い二本鎖ステムと柔らかい一本鎖ループを有するD字型モチーフを設計した.まず熱力学的シミュレーションに基づいて,配列長および塩基配列を決定した.実験的にその特性を調べるため,一本鎖部分の配列を共通として,ステム部の長さを3種類に変えたNormal, Relaxed, Stressedを合成した.これらのDNA鎖を混合し,アニーリングによりDモチーフを作製した.酵素反応(ライゲーション,エクソヌクレアーゼ,RCA)により,意図通りのモチーフが形成されていることを確認した.まず,DNA鎖の混合順序によりモチーフ同士が絡み合うものとそうでないものが作り分けられることがわかった.電気泳動による相互作用の確認を行ったところ,モチーフ2量体のバンドがごく弱くあらわれただけで,それ以外の多量体形成は確認できなかった.これは,そもそも多量体形成ができていないか,あるいは,結合が弱いため,ゲルの中を泳動中に多量体が壊れたと考えられる.それを確認するため,ループ相互作用の融解温度を測定したが,やはり有意な温度変化は観測されなかった.最後に,モチーフ単体および複合体の粒子径の温度変化を測定したところ,3種のモチーフの粒子径に差はなく,結果として,多量体形成が確認できなかった.モチーフの設計および単体モチーフの形成は実験的に確認できたが,モチーフ間の相互作用が予想と異なり,かなり弱いため,意図した多量体の形成ができていない.モチーフ間相互作用する一本鎖部分の長さの延長,配列の工夫(GC含有量及び繰り返し配列を入れるなど),モチーフ濃度を上げる,バッファー塩濃度を上げるなどにより,より強い結合強度をもたせ,多量化させることを目指す.本研究の目的は,塩基配列をデザインして人工的に合成したDNA分子(膜モチーフ)により人工の膜面(DNA膜)を構成することである.今年度は,DNAモチーフ間のループ・ループ相互作用を実現するための基礎ステップとして,硬い二本鎖ステムと柔らかい一本鎖ループを有するD字型モチーフを設計した.まず熱力学的シミュレーションに基づいて,配列長および塩基配列を決定した.実験的にその特性を調べるため,一本鎖部分の配列を共通として,ステム部の長さを3種類に変えたNormal, Relaxed, Stressedを合成した.これらのDNA鎖を混合し,アニーリングによりDモチーフを作製した.酵素反応(ライゲーション,エクソヌクレアーゼ,RCA)により,意図通りのモチーフが形成されていることを確認した.まず,DNA鎖の混合順序によりモチーフ同士が絡み合うものとそうでないものが作り分けられることがわかった.電気泳動による相互作用の確認を行ったところ,モチーフ2量体のバンドがごく弱くあらわれただけで,それ以外の多量体形成は確認できなかった.これは,そもそも多量体形成ができていないか,あるいは,結合が弱いため,ゲルの中を泳動中に多量体が壊れたと考えられる.それを確認するため,ループ相互作用の融解温度を測定したが,やはり有意な温度変化は観測されなかった.最後に,モチーフ単体および複合体の粒子径の温度変化を測定したところ,3種のモチーフの粒子径に差はなく,結果として,多量体形成が確認できなかった.モチーフの設計および単体モチーフの形成は実験的に確認できたが,モチーフ間の相互作用が予想と異なり,かなり弱いため,意図した多量体の形成ができていない.モチーフ間相互作用する一本鎖部分の長さの延長,配列の工夫(GC含有量及び繰り返し配列を入れるなど),モチーフ濃度を上げる,バッファー塩濃度を上げるなどにより,より強い結合強度をもたせ,多量化させることを目指す.膜モチーフ実験のために,多種類のオリゴマーの合成を外部委託したが,一部のオリゴマーが年度内に納品されなかったため.このオリゴマーは,引き続き次年度の実験に用いる.
トランスポーターを介した腎不全悪性サイクルの遮断と治療

CKDにおいて体内に蓄積する尿毒症物質は炎症や酸化ストレスなどを惹起し腎障害を悪化させまた尿細管に発現するトランスポーターの発現にも影響を与え尿細管分泌を介した薬物や代謝物質の排泄を障害する可能性が示唆されている。我々は尿毒症物質インドキシル硫酸が濃度依存性にSLCO4C1の発現を低下させることを明らかにした。一方、インドキシル硫酸は腎エリスロポエチン遺伝子の転写を有意に低下させ、このEpo転写抑制作用はSLCO4C1と同じGATA阻害剤にてキャンセルされることが明らかになった。この結果は尿毒症物質の蓄積がトランスポーターの発現抑制と腎性貧血の原因と治療ターゲットになることを明らかにした。尿毒症物質は濃度依存性にSLCO4C1のmRNA発現を低下させた。またルシフェラーゼアッセイから尿毒症物質はSLCO4C1遺伝子発現を転写レベルで有意に低下さることが明らかとなった。この尿毒症物質によるSLCO4C1転写抑制作用はAhRの結合するXRE配列より更に5'上流にある転写因子GATAの阻害剤にてキャンセルされた。一方、慢性腎臓病において腎性貧血は主要な合併症のひとつであり腎性貧血の病態はエリスロポエチン(Epo)産生の低下を基盤とすることが知られている。腎機能の低下がどのようにEpo産生に影響を及ぼすかについては不明な点も多いが血液透析によって腎性貧血が改善したという報告があり、尿毒症物質がEpo産生低下を引き起こす可能性が考えられていた。そこで我々は低酸素条件下でエリスロポエチン(Epo)産生が誘導される細胞を用いて尿毒症物質を含んだ培地で培養しEpo産生への影響を評価したところEpo産生を有意に抑制した。Epo遺伝子の5'上流域を用いたルシフェラーゼアッセイを行ったところ、尿毒症物質はEpo遺伝子の転写を有意に低下させ、このEpo転写抑制作用はSLCO41と同じGATA阻害剤にてキャンセルされることが明らかになった。この結果は腎不全時においては尿毒症物質の蓄積はトランスポーターの発現抑制を起こし尿毒症物質の更なる蓄積が進行し、同時に貧血を惹起するという2つの作用があること、そしてそのどちらの作用もGATA転写因子という共通のメカニズムを介していることを明らかにしたものであり新たな慢性腎臓病の治療のストラテジーになり得ることを示した。尿毒症物質であるインドキシル硫酸は濃度依存性にSLCO4C1のmRNA発現を低下させた。またルシフェラーゼアッセイからインドキシル硫酸はSLCO4C1遺伝子発現を転写レベルで有意に低下さることが明らかとなった。このインドキシル硫酸によるSLCO4C1転写抑制作用はAhRの結合するXRE配列より更に5'上流にある転写因子GATAの阻害剤K-7174にてキャンセルされた。そこで我々は低酸素条件下でエリスロポエチン(Epo)産生が誘導される細胞を用いてインドキシル硫酸を含んだ培地で培養しEpo産生への影響を評価したところ、インドキシル硫酸はEpo産生を有意に抑制した。次にマウスEpo遺伝子の5'上流域を用いたルシフェラーゼアッセイを行ったところ、インドキシル硫酸はEpo遺伝子の転写を有意に低下させ、このEpo転写抑制作用はSLCO41と同じ転写因子Ahrの阻害剤にてキャンセルされることが明らかになった。この結果は腎不全時においては尿毒症物質の蓄積はトランスポーターの発現抑制を起こし尿毒症物質の更なる蓄積が進行し、同時に貧血を惹起するという2つの作用があること、そしてそのどちらの作用も転写因子という共通のメカニズムを介していることを明らかにしたものであり、転写因子GATAの阻害剤K-7174やAhR刺激剤がトランスポーターの発現増強作用と貧血改善作用を併せ持ち、新たな慢性腎臓病の治療のストラテジーになり得ることを明らかにした。尿毒症物質が直接SLCO4C1遺伝子の発現を抑制する可能性を検討するため,腎機能低下とともに血中に蓄積する各種化合物を用いこれらのSLCO4C1 mRNA発現への影響をスクリーニングした.その結果インドキシル硫酸(IS)が濃度依存性にSLCO4C1発現を抑制し,同時に転写因子であるGATA3の発現を濃度依存性に亢進させていることが明らかとなった。SLCO

4C1遺伝子のプロモーター領域にはGATA配列が複数存在することから,GATA3がSLCO4C1の転写へ及ぼす影響を検討したところ,GATA3はSLCO4C1の発現を負に制御することが明らかとなった。.次にラットにISを投与したところ,腎機能は不変であるにも関わらず腎slco4c1の発現が低下し,さらにslco4c1の基質であるGSAの血中濃度が上昇した.また慢性腎不全モデルラットに対しAST-120を投与したところ,腎機能はコントロール群と比較し差は見られなかったが,ISの血中濃度の低下とともにslco4c1 mRNAの発現が有意に上昇し,GSAの血中濃度が低下した。これらよりSLCO4C1の発現はGATA3により負に制御されており,ISはGATA3の発現増強を介してSLCO4C1の発現を低下させることが示唆された.以上よりISはSLCO4C1の発現を抑制してしまうことで本来SLCO4C1により排泄されるべき尿毒症物質の蓄積も引き起こしてしまう可能性が示唆された。ISによるGATA3発現増強のメカニズムは今後検討する必要があるがGATA3の抑制がSLCO4C1の発現を回復させる可能性が示されたことから,尿毒症物質排泄のターゲットとしてGATA3も候補となりうると考えられた。慢性腎不全おけるトランスポーターの新たな制御機構を解明し、その治療法の糸口を解明したと考えられるため。25年度が最終年度であるため、記入しない。我々は尿毒症物質が腎臓のトランスポーター機能を低下させ、更にその低下が腎機能を悪化させるという悪性サイクルのメカニズムを明らかにした。尿毒症物質の中でもインドキシル硫酸は尿毒症物質トランスポーターであるSLCO4C1の発現を転写調節因子GATA3を介して調節していることが明らかとなり、またインドキシル硫酸を除去するAST-120がトランスポーター機能の改善をもたらす事を世界に先駆けて明らかにした。上記の結果は論文投稿中であるり、本申請の目的を達成していると考えられる。今後はGTA転写因子阻害剤を5/6腎摘ラットやGBM抗体投与腎炎ラットに投与し腎機能の各種パラメーターと酸化ストレスマー、さらに血中尿中メタボローム解析を行い、腎不全の新たな治療法としての有用性を検討する予定である。尿毒症の排泄機能回復が腎機能と同時に転写調節因子GATA3を介していることが明らかになったので、今後は更に尿毒症物質と腎性貧血との関係を明らかにしてゆく。
新国産免疫抑制剤を臓器移植臨床に応用するための研究

新国産免疫抑制剤である、15ーdeoxyspergualin(DSG)とFK506の臨床応用を目指した本研究の今年度の研究実績を報告する。免疫抑制機序:1.カニクイザルリンパ球に対しDSGは、ConA誘導ILー2産生能、ILー2レセプタ-発現能を抑制せず、ConA誘導幼若化反応を増強した(寺尾寿治)。2DSGはinvitroのヒトリンパ球混合培養反応を抑制するが、PHAやOKT3幼若化反応は抑制しない。しかし、FK506とシクロスポリン(CYA)は全反応を抑制する(園田孝夫)。臓器移植における免疫抑制効果:1.カニクイザル腎移植においてDSGは有効であった。副作用として可逆性の消化器障害症状と皮膚炎様症状を示した(深尾立、岩崎洋治)。2.イヌ腎移植において、少量のCYA連日投与とDSG術後4週間併用は有効であった(深尾立、岩崎洋治、藤井敬二)。3.ブタ肝移植において、DSGは肝毒性がなく、予後も良好であった(土肥雪彦)。4.FK506とCYAはイヌ腎移植において併用効果があった。またFK506とラパマイシンも、ラット心移植とイヌ腎移植において併用効果があった(落合武徳)。5.ラット同種皮膚移植において、DSGとCYA又はステロイドとの併用効果があった(藤井敬二)。腎移植臨床における効果:1.DSGは急性拒絶反応寛解効果があることが示唆された(雨宮浩、園田孝夫、深尾立、岩崎洋治)。特にステロイドとの併用が有効であった(雨宮浩)。2.FK506の予防的投与は有効であることが示唆された(園田孝夫、深尾立、岩崎洋治)。3年間の研究結果から、DSGおよびFK506の臨床応用は充分可能であり、かつ有効であることが予想された。研究目的:新国産免疫抑制剤15-deoxyspergaulin(DSG)とFK-506の2剤の、毒性、拒絶反応反応抑制効果、作用機序と代謝経路の検討を行い、それらが臨床使用可能か否か判定することを目的としている。研究成果:1.拒絶反応抑制効果:DSGはイヌ腎移植の急性拒絶反応の寛解効果がある(雨宮、深尾)。DSGはニホンサルの移植腎生着延長効果がある(雨宮)。DSGはイヌ腎移植において、移植後DSG短期間投与でも拒絶反応の出現を遅延させ、移植腎長期生着させる(土肥)。DSGはラット同所性肝移植の生着延長させる(土肥)。イヌ腎移植において、FK506の血中濃度と拒絶反応抑制効果が相関する(落合)。2.毒性、副作用:DSGはイヌ実験で食欲不振、下痢などの消化器症状を起こす(雨宮、深尾、土肥)。サルではそれらの副作用は少ない(雨宮)。FK506はイヌ実験にて食欲不振、体重減少を起こすが、心血管系への障害は認めない(落合)。DSGはラット骨髄造血幹細胞総数を増加させるが、有核細胞数は減少させる。それらの反応は投与中止により回復する(滝田)。3.作用機序、in vitroの効果:DSGもFK506もヒトマクロファージの貧食能を阻害しない(深尾)。サルマクロファージのIL-1産生能はDSGは抑制しないが、FK506は抑制する。その貧食能を両者ともに抑制するが、多形核白血球の貧食能をDSGは亢進させる。サルNK細胞活性を両者ともに抑制しない(寺尾)。ヒト赤血球に溶血斑を作る単球産生に対し、DSGは抑制効果を示すがFK506は示さない(園田)。今年度の研究結果では、2剤の毒性は比較的少なく、免疫抑制効果が高いこと、in vitroでの種々の作用が明らかとされた。次年度はさらに研究を深め、サルを使った毒性、免疫抑制効果の確認も行ってゆく予定である。新国産免疫抑制剤である15-deoxyspergualin(DSG)とFK506を、臓器移植の臨床に応用するための基礎的臨床的研究を行った。免疫抑制機序:1、DSGはヒト免疫担当細胞の細胞障害活性エフェクタ-細胞産生を抑制し、IL-2レセプタ-発現抑制作用が主作用であった。(園田孝夫)またラット移植心生着延長にMLR抑制細胞が関与していた(園田孝夫)。2.マウス骨髄脾細胞移植におけるDSGの強いgraft versus host reaction抑制は、細胞障害性T細胞の誘導抑制と増殖抑制によるものであった(藤井敬二)。3.カニクイザルにおいてDSGとFK506は、若于の免疫担当細胞サブセットの変化と、T細胞機能低下を起こす。特にIL-2産生抑制が明らかであった。臓器移植における効果:1.DSGがイヌとヒトの腎移植においてon-going急性拒絶反応治療に有効であることが証明された(雨宮浩、園田孝夫、土肥雪彦、岩崎洋治、深尾立)。2.イヌ腎移植における予防的DSG投与も、移植腎生着延長に有効であった(土肥雪彦)。3.カニクイザル腎移植において、6mg/kg/day投与DSGは著明な移植腎生着延長効果を示した(深尾立、寺尾恵治)。4.イヌ腎移植において、FK506の免疫抑制効果をその血中濃度によりモニターできることが証明された。

またciclosporinとの少量併用も有効であり、副作用の少ない投与法を設定できる見とおしがついた(落合武徳)。副作用:1.カニクイザルにFK506とDSGを4週間連続大量投与した。DSG投与で皮膚発疹を起こすことがある。血液一般、生化学33項目の検査では、BVNのみが両薬剤で軽度上昇した。全般的に見て両薬剤とも重大な副作用を示さなかった。しかし、腎移植後はDSGによる食欲減退、皮膚発疹が見られた(寺尾恵治、深尾立、岩崎洋治)。新国産免疫抑制剤である、15ーdeoxyspergualin(DSG)とFK506の臨床応用を目指した本研究の今年度の研究実績を報告する。免疫抑制機序:1.カニクイザルリンパ球に対しDSGは、ConA誘導ILー2産生能、ILー2レセプタ-発現能を抑制せず、ConA誘導幼若化反応を増強した(寺尾寿治)。2DSGはinvitroのヒトリンパ球混合培養反応を抑制するが、PHAやOKT3幼若化反応は抑制しない。しかし、FK506とシクロスポリン(CYA)は全反応を抑制する(園田孝夫)。臓器移植における免疫抑制効果:1.カニクイザル腎移植においてDSGは有効であった。副作用として可逆性の消化器障害症状と皮膚炎様症状を示した(深尾立、岩崎洋治)。2.イヌ腎移植において、少量のCYA連日投与とDSG術後4週間併用は有効であった(深尾立、岩崎洋治、藤井敬二)。3.ブタ肝移植において、DSGは肝毒性がなく、予後も良好であった(土肥雪彦)。4.FK506とCYAはイヌ腎移植において併用効果があった。またFK506とラパマイシンも、ラット心移植とイヌ腎移植において併用効果があった(落合武徳)。5.ラット同種皮膚移植において、DSGとCYA又はステロイドとの併用効果があった(藤井敬二)。腎移植臨床における効果:1.DSGは急性拒絶反応寛解効果があることが示唆された(雨宮浩、園田孝夫、深尾立、岩崎洋治)。特にステロイドとの併用が有効であった(雨宮浩)。2.FK506の予防的投与は有効であることが示唆された(園田孝夫、深尾立、岩崎洋治)。3年間の研究結果から、DSGおよびFK506の臨床応用は充分可能であり、かつ有効であることが予想された。
新規高分散石炭液化触媒の開発

(1)種々の金属の石炭液化反応に対する触媒活性を豪州褐炭を対象に検討したところ、鉄と同じく周期律表の第8族の第二遷移周期に位置するルテニウムが種々の金属の中で著しく高い触媒作用を発揮することが見しだされた。その触媒活性は従来知られている金属の中で最も高い活性を発揮するモリブデン化合物よりもさらに高活性であった。石炭液化触媒に要求される性能の中で、石炭と触媒の接触を良好にならしめるためルテニウムを反応の媒体油に可溶な形態にした有機錯体、Ru_3(CO)_<12>,Ru(COT)(COD)などが特に優れ、著しく高い触媒作用を示した。(2)炭種の影響について検討した結果、褐炭のみではなく、亜歴青炭(Wayodak)、歴青炭等(I llinois No6、Miーike)のいずれの石炭にも有効であり、Illinois No6炭の様な高硫黄含有炭においても高い触媒作用が認められ、硫黄による触媒の被毒作用は受けなかった。(3)反応の諸条件の影響につして検討し、褐化の液化のおいては400°C水素初圧3MPa程度の著しく穏和な条件で油分の収率50%に率した。これは現行の鉄触媒によるパイロットプラントでは450°Cで17MPa程度が必要なのと比較すると石炭直接液化では著しく穏和な条件である。触媒量の影響について検討した結果石炭に対してルテニウム金属として0.1%程度で十分な触媒作用を示した。また、液化反応の速度論的検討を行い、本触媒の触媒作用は主として石炭から生成した中間体のプレアスファルテン、およびアスファルテンの軽質化に特に効果的であることが認められた。その作用は鉄触媒に比較して同じ量の触媒で比較すると50ー100倍程度と評価された。
肝星細胞の可視化と発現解析を可能とするBac-TRAPマウスを用いた血栓症の解析

私達は、肝星細胞で特異的に発現するADAMTS13のプロモーターの下流に、EGFPとリボソームタンパク質L10aからなる融合タンパク質cDNAを挿入し、ADAMTS13発現細胞でEGFP-L10aが発現するマウスを作製した。EGFP-L10aが8コピー入っているマウスの肝臓のホモジネートをウェスタンプロットし、融合タンパク質EGFP-L10aの発現を確認した。このマウスの肝臓切片を抗GFP抗体で染色し、類洞壁の星細胞と思われる細胞の染色を観察した。本研究では、ロックフェラー大学のHeintz教授らが開発したBAC-TRAP法(Cell, 2008)を用いて、肝星細胞を蛍光標識し、かつ細胞で翻訳中のmRNAのトランスクリプトーム解析を行う。Bac-TRAP法は、Bacterial artificial chromosome (Bac)を使ったトランスジェニックマウス作製の手法を用いて、EGFPで標識されたリボソームタンパク質L10aを細胞特異的に発現させ、その細胞で翻訳中のmRNAをEGFP抗体を用いて回収し、トランスクリプトーム解析(Translating ribosome affinity purification, TRAP)を行うというものである。私達は、この手法を肝星細胞に応用し、肝星細胞の研究および抗血栓因子ADAMTS13の研究を進める。まず、ADAMTS13遺伝子のプロモーターを用いて、蛍光タンパク質GFPとリボソームタンパク質L10aの融合タンパク質EGFP-L10aが発現する、Adamts13-Bac-TRAPトランスジェニックマウスを作製した。次いで、EGFP-L10aが8コピー入っているBac-TRAPマウスの肝臓および腎臓のホモジネートをウエスタンブロットし、融合タンパク質EGFP-L10aの発現を確認した。このBac-TRAPマウスの肝臓切片を抗GFP抗体で染色し、類洞壁の星細胞と思われる細胞の染色を観察した。ADAMTS13は肝星細胞に加え、腎臓足細胞、糸球体内皮細胞、脳グリア細胞でも発現すると報告されている。そこで、このマウスの脳と腎での発現を調べたが、特異的な染色は得られなかった。本研究では、ロックフェラー大学のHeintz教授らが開発したBac-TRAP法(Cell, 2008)を用いて、肝星細胞を蛍光標識し、かつ細胞内で翻訳中のmRNAのトランスクリプトーム解析を行う。Bac-TRAP法は、Bacterial artificial chromosome(Bac)を使ったトランスジェニックマウス作製の手法を用いて、EGFPで標識されたリボソームタンパク質L10aを細胞特異的に発現させ、その細胞で翻訳中のmRNAを抗GFP抗体を用い回収し、トランスクリプトーム解析(Translating ribosome affinity purification, TRAP)を行うというものである。私達が研究している抗血栓因子ADAMTS13は肝星細胞に特異的に発現する。この性質を用いて、EGFP-L10a融合タンパク質を肝星細胞に発現させて細胞を蛍光で可視化し、肝星細胞で翻訳中のmRNAを回収しトランスクリプトーム解析を行う。このため、研究の1年目にADAMTS13遺伝子のプロモーターの下流に蛍光タンパク質EGFPとリボソームタンパク質L10aの融合タンパク質EGFP-L10aをコードするcDNAを組み入れたBacベクターを構築し、Adamts13-Bac-TRAPトランスジェニックマウスを作製する。2年目にBac-TRAPマウスを用いたADAMTS13産生細胞の確認と発現モニター法の確立、およびポリソーム免疫沈降による翻訳遺伝子プロファイリングを行う。Heintz教授からEGFP-L10a融合タンパク質をコードするcDNAが挿入された組換えベクター(S296.EGFP-L10a)と組換え酵素RecA発現ベクター(pSV1-RecA)を恵与された。マウスAdamts13遺伝子を含むBacを持つ大腸菌を購入した(ダナファーム社、クローン名:bMQ-108g14)。Bacインサート両端とAdamts13遺伝子の塩基配列を確認し、Adamts13遺伝子の開始コドン直前の552 bpをPCRで増幅後、組換えベクターのEGFP-L10a配列の直前に挿入し、組換えベクター(S296.Adamts13-EGFP-L10a)を作製した。次いで、Bac含有大腸菌にRecA発現ベクターをCaCl2法で導入し、この大腸菌に組換えベクターをエレクトロポレーション法で導入した。PCR法およびサザンブロット法により、マウスAdamts13遺伝子の開始コドン直下にEGFP-L10a配列が挿入されたBac(Adamts13-BacTRAP)をもつ大腸菌をスクリーニングし、Bac DNAを精製した。次いで、このBac DNAを前核期受精卵に注入し、合計754個の受精卵をレシピエントマウスに移植した。

誕生したファウンダーマウスの中から、Bac DNAが挿入された個体をPCR法にて選別した。Bac DNAの継代が確認できたF1マウスを用いてサザンブロット解析を行い、挿入されたBac DNAのコピー数を算定した。以上の結果、6ラインのAdamts13-Bac-TRAPトランスジェニックマウスの作製に成功した。マウスに挿入されたEGFP-L10aのコピー数は、1コピーが3ライン、2コピーが2ライン、8コピーが1ラインであった。本年度は、Adamts13-Bac-TRAPトランスジェニックマウスの作製を目標としており、計画通りの目標を達成することができた。平成23年度に得られた結果を基にして、Bac-TRAPマウスを用いたADAMTS13産生細胞の確認と発現モニター法を確立する。まず、Adamts13-Bac-TRAPマウスの利点を活かし、胎児ホールマウント、成体各組織切片、血液スメアのEGFP蛍光観察により、ADAMTS13産生細胞を特定する。次に、深部組織を観察可能な2光子励起共焦点顕微鏡を用いて、肝組織中の星細胞とそのADAMTS13発現量の変化をin vivoでライブイメージングする観察系の確立を試みる。次いで、ポリソーム免疫沈降による翻訳遺伝子プロファイリングを行い、肝星細胞の翻訳遺伝子を網羅的に解析する。最後に、Bac-TRAPマウスにジメチルニトロサミンを投与して肝硬変を誘発し、病状の変化と星細胞でのADAMTS13発現変化との関連性をin vivoライブイメージングにより解析する。血漿ADAMTS13活性の迅速測定系を確立しているため、星細胞内でのADAMTS13発現量と血中での活性との関連も併せて解析する。さらに、肝組織ライセートのポリソーム免疫沈降により、星細胞内の翻訳遺伝子プロファイリングを行い、肝硬変症状の増悪および治癒過程における産生蛋白質の変化を解析する。最終的に、得られた結果を取りまとめ、成果の発表を行う。私達は1年目の研究で、6ラインのAdamts13-Bac-TRAPトランスジェニックマウスの作製に成功した。これらのラインを維持する必要があり、マウスの維持と管理に研究費を支出する。Adamts13-Bac-TRAPトランスジェニックマウスでのEGFP(即ちADAMTS13)の発現を解析するため、胎児ホールマウントと成体各組織切片のEGFP蛍光観察を行い、ADAMTS13産生細胞を特定する。次いで、EGFP(即ちADAMTS13)発現がみられた細胞(組織)については、抗GFP抗体を用いた免疫染色を行う予定である。蛍光観察などの実験に必要な消耗品を購入する。組織染色は専門の業者に外注する予定である。肝星細胞(および新たに同定したADAMTS13強発現細胞)を含む組織のライセートを調製し、抗GFP抗体を用いた免疫沈降により、EGFP-L10