hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
エコゲノミクスで創るヒラメ資源の管理と放流システム

ヒラメ天然集団における自然選択の検出を目指し、血縁関係を正確に把握することのできるDNAマーカーセットを構築した。自然選択の痕跡を検出することはできなかったが、構築したDNAマーカーセットは高精度で個体間の血縁関係を把握できた。これらのマーカーセットを用いて血縁関係からみたヒラメ天然集団の集団構造について検討したところ、血縁関係を持った個体の割合は海域間で差異がなく、日本沿岸で広範な遺伝子流動を伴った均質な集団構造であることがあらためて確かめられた。また、人工種苗の遺伝的多様性についても血縁関係により捉え直すことによって新たな知見が得られ、将来の種苗生産や放流方策に貢献できると考えられた。種苗放流によるヒラメの資源造成効果を検証するためには、天然海域において放流魚やその子孫をDNAマーカーにより特定することが求められる。そのためには、使用するDNAマーカーが親子関係のみならず完全同胞(兄弟姉妹)や半同胞(異父母の兄弟姉妹)さらに祖父母と孫といった血縁関係についても判別できる識別能を有していることが必須である。今年度は、既に報告されているヒラメのミトコンドリア(mt)DNAとマイクロサテライト(ms)DNAマーカーについて個体識別能をあらためて精査し、高い個体識別能を持ったマーカーセットを構築することを第一の目的とした。次に第二の目的として、栽培漁業センターにおいて実際に生産された人工種苗と使用された親魚集団の親子ならびに血縁鑑定を試み、これらのマーカーセットの有効性を検証した。DNAマーカーは事前にヌルアリルの有無や変異性(アリル数や平均へテロ接合度)を基準に選定したmsDNA12ローカス、ならびにmtDNA調節領域とND2遺伝子を合わせた1873塩基を用いると、天念集団での個体一致確率はmsDNAで10のマイナス17乗、mtDNAで0.001%と非常に高い個体識別能を示すことがわかった。親魚集団と種苗のDNA親子鑑定の結果、全ての種苗個体について父母を特定でき、構築したマーカーセットの有効性を確認できた。調べた種苗192個体のうち、水槽1の親魚群から生まれた個体は49個体、水槽2の親魚群から生まれた個体は143個体であった。親となっていたのは、水槽1ではメス15個体とオス16個体、水槽2ではメス21個体とオス12個体で、再生産に寄与した親魚の割合は両水槽とも53%であった。水槽1の中で1個体のメスが残した子供の最大数は15個体(30.6%)、1個体のオスが残した子供の最大数は18個体(16%)であった。また水槽2では、メスの場合が25個体(17.5%)で、オスの場合が36個体(25.1%)であった。いずれの場合も再生産への寄与度が少数の雌雄に偏っている傾向が認められた。昨年度までにマイクロサテライトDNAとミトコンドリアDNAマーカーを用いた高精度なヒラメ人工種苗のDNA親子鑑定システムを構築した。今年度はまずゲノムスキャンを通じて天然集団や種苗における自然選択あるいは人為選択の痕跡をトレースすることを試みるため、既報のマイクロサテライトDNAマーカーをさらに30座追加し、集団遺伝学的解析に用いることができるかどうかのスクリーニングを行った。その結果、初年度に用いた12座以外ではヌルアリルやラージアリルドロップアウトの存在が示唆され、正確な集団遺伝学的解析に使用するには困難な事が判明した。既に親子鑑定や集団遺伝学的解析に耐えうることが判明している12座を用いて天然集団5標本集団および人工種苗4標本集団についてLOSITANならびにBayScanによるアウトライアー探索を行った結果、いずれの座も中立性を棄却できなかった。天然集団は北海道から九州にいたるサンプリングによって入手したものだが、遺伝的分化の程度はFst=0.01と有意だが微弱な分化であった。昨年度に引き続き、天然集団を親魚として生産されている別生産場の人工種苗について、その遺伝的多様性について親魚集団とともに評価したところ、遺伝的多様性は天然集団に比べて約10%低下しており、親魚集団180尾のうち3割が再生産に貢献していることが判明した。昨年度に調べた人工種苗の結果と比較して同等あるいはやや低い親魚の貢献度であるが、種苗の遺伝的多様性は同程度であった。以上の結果は天然魚を用いた放流用人工種苗の生産と天然集団に遺伝的影響を与えない放流方策の構築に貢献するものと考えられた。当初の計画では、ヒラメ天然集団の地域適応の有無をゲノミクス情報から検討する予定であったが、次年度の計画である人工種苗そのものやその子孫を検出するためのマーカーセット作りを前倒しで行った。血縁関係を把握するための良好な検証系(実際の人工種苗生産現場)が得られ、構築したDNAマーカーセットの有効性を把握できたことは、放流効果判定システムを構築する上で重要なステップとなった。

水産遺伝学天然に放流した場合でも人工種苗の血縁関係を他の天然個体と明確に識別して把握できるかどうかについて、天然集団の遺伝子型データとあわせてシミュレーションを行う。また、天然集団のゲノムスキャンを行い、地域適応の有無について検証する。これらの知見を総合化して、ヒラメ天然集団の遺伝的特性に合わせた人工種苗放流システムについて提案する。
中性子ひずみスキャンニング法を基にした疲労寿命予測システムの開発に関する研究

1.中性子応力測定法を,実用の技術として応用するための応力測定精度を検討するために,負荷応力測定を行った。測定ひずみから応力に換算する場合に使用する回折弾性定数は,弾性領域ではクレーナモデルとセルフコンシステントモデルを組み合わせることから,単結晶の弾性定数と実測機械的弾性定数から理論的に予測することが可能である。塑性域においては,特に単軸変形では測定ひずみからマクロ応力を予測するためには,塑性異方性の検討が不可欠である。また,無ひずみ格子定数の測定方法の検討を含めて,中性子応力測定の標準的手法を骨子を作成した。2.多相材料の応力測定では,相応力測定から複合則を使用してマクロ・マイクロ応力の評価が可能である。3.材料内部の応力分布測定のためのひずみスキャンニング法の検討を行った。中性子光源の強度が十分出ないことから,空間分解能は2mm程度に制限された。このため領域の重ね測定をして向上させることが必要であった。4.中性子回折を利用して表面近傍のひずみ測定を行う場合,中性子の照射域が材料の端部から外れるために,回折プロフィルが乱れあたかも応力が存在するかのような現象が生じこれを「端部効果」と称した。照射ビームの発散角を小さくすることが端部効果を減少させるのに有効である。5.表面近傍の応力分布を高精度に測定する手法として,放射光(Spring-8)の高エネルギX線(エネルギレベル72keV程度)を利用した測定法に注目した。この手法は,従来の実験室のX線による表面測定法と中性子による内部測定法の中間の手法である.この手法をショットピーニングした鉄鋼材料の表面下の応力分布を測定することに成功した。この高エネルギX線法は,中性子応力測定の表面近傍測定における弱点を補うものであり,ハイブリツド測定の道を拓くものである。6.中性子応力測定を基にした応力測定および疲労損傷予測システムの現状での成果と,将来への展開を総括した1.中性子応力測定法を,実用の技術として応用するための応力測定精度を検討するために,負荷応力測定を行った。6.中性子応力測定を基にした応力測定および疲労損傷予測システムの現状での成果と,将来への展開を総括した1.アルミナ・ジルコニア複合セラミックスの中性子応力測定結果によると,熱残留応力は静水圧的で,ジルコニア相で引張,アルミナ相で圧縮となり,アルミナの体積割合の増加に対してほぼ線形的に変化した.2.アルミナ・炭化ケイ素複合セラミックスにおける熱残留応力は,アルミナ相で引張,炭化ケイ素相で圧縮となった.3.複合材料の熱残留応力と体積割合の関係は,介在物理論に基づく予測結果とよく一致した.4.回折弾性定数に及ぼす第2相の影響は,セルフコンシステントモデルをもとに単相材の値から予測することが可能となった.5.鋼製パイプの熱処理残留ひずみの中性子測定結果は,有限要素法による計算結果とほぼ一致した.6.中性子応力測定法により,ショットピーニングしたニッケル合金の内部における残留応力分布の大略の決定が可能となったが,精度向上のためには細かいスキャンニングが必要となることがわかった.1.実用材料中の応力を、中性子を用いて高精度に測定するための回折弾性定数に及ぼす二次的な相の影響を、セルフコンシステントモデルとクレーナモデルを結合させることから理論的に求める方法を提案し、理論予測と実験結果との一致を得た。これにより実用材料の応力測定の精度の向上が期待できる。2.中性子応力測定において重要な、材料の無ひずみ格子面間隔の新しい決定法を提案した。バルク材料を、試料台ビーム中心でランダムな回転をさせ、平均的な格子面間隔を測定することにより、限りなく無ひずみに近い格子面間隔を測定できることを示した。

3.アルミナ/ジルコニアおよびアルミナ/炭化ケイ素のセラミックス複合材料中の、各相の残留応力を中性子回折法によって測定することに成功した。各構成相の体積分率として測定された残留応力は熱膨張係数の差に起因する熱残留応力であり、Eshelby-Tanaka-Moriのモデルで予測と良く一致した。4.中性子応力測定を、突合せ溶接したパイプの溶接部近傍の残留応力分布を測定した。このパイプに疲労き裂が導入された場合を想定して模擬半楕円スリットを導入し、残留応力分布の変化を測定した。スリットの導入による残留応力の解放が検出された。理論的に予測される残留応力の再分布と実測値とは差異が認められたが、これは中性子法の空間分解能が低く測定領域の平均値を検出しているためである。5.実際の測定で重要となる集合組織を有する場合の、測定ひずみからの応力決定法を提案した。測定応力に弾性定数補正を行うことから変換ひずみを求め、それに対して等方弾性体の応力ひずみ関係を適用して応力を決定する。この方法を、アルミニウム合金の冷やしばめのリングとプラグの残留応力分布測定に応用した。1.中性子応力測定法を,実用の技術をして応用するための応力測定精度を検討するために,負荷応力測定を行った。測定ひずみから応力に換算する場合に使用する回折弾性定数は,弾性領域ではクレーナモデルとセルフコンシステントモデルを組み合わせることから,単結晶の弾性定数と実測機械的弾性定数から理論的に予測することが可能である。塑性域においては,特に単軸変形では測定ひずみからマクロ応力を予測するためには,塑性異方性の検討が不可欠である。一方,残留応力測定においては,上記の1軸塑性変形のように異方性が大きく出現する場合を除いて,一般的な多軸変形あるいは熱処理残留応力は精度よく測定が可能である。また,無ひずみ格子定数の測定方法の検討を含めて,中性子応力測定の標準的手法を骨子を作成した。2.多相材料の応力測定では,相応力測定から複合則を使用してマクロ・マイクロ応力の評価が可能である。3.材料内部の応力分布測定のためのひずみスキャンニング法の検討を行った。中性子光源の強度が十分出ないことから,空間分解能は2mm程度に制限された。このために領域の重ね測定をして向上させることが必要であった。4.中性子回路を利用して表面近傍のひずみ測定を行う場合,中性子の照射域が材料の端部から外れるために,回折プロフィルが乱れあたかも応力が存在するかのような現象が生じこれを「端部効果」と称した。この原因が線源の発散角に起因して低回折角度側であたかも回折要素があるかのごとき検出器が計測を行いピークを低角に作り上げることにあることを明らかにし,適切な補正法の検討を行った。照射ビームの発散角を小さくすることが端部効果を減少させるのに有効である。5.表面近傍の応力分布を高精度に測定する手法として,放射光(Spring-8)の高エネルギX線(エネルギレベル72keV程度)を利用した測定法に注目した。この手法は,従来の実験室のX線による表面測定法と中性子による内部測定法の中間の手法である。この手法をショットピーニングした鉄鋼材料の表面下の応力分布を測定することに成功した。
消化管間葉腫瘍(GIST)の悪性度を規定する分化・遺伝子指標

【ミオシン重鎖アイソフォームの発現】:胎児性ミオシン重鎖アイソフォームであるSMembの発現をGIST27例中18例(67%)で認めたが、平滑筋特異的ミオシン(SMI,SM2)の発現は1例で見られるのみであった。SMemb陽性を示すGIST18例の全例でKITの発現を、16例(89%)でCD34の発現が見られた。蛍光二重染色による観察では、消化管のカハールの介在細胞で、KIT,CD34,SMembの共発現を認め、GISTの発生母地と考えられた。【テロメラーゼ再活性化】:GIST原発巣24例中7例(29%)、転移巣5例全例にテロメラーゼの再活性化を認めた。テロメラーゼ陽性のGISTは全て組織学的にhigh riskに分類され、テロメラーゼ陰性のGIST17例中15例はlow riskであった。テロメラーゼの活性化は有意に予後と相関しており、悪性度の指標として有用である。また、将来、テロメラーゼ阻害剤の治療の対象となりうることが期待される。【遺伝子欠失】:マイクロサテライトマーカーを用いた検索では1p(7/19,37%),14q(9/19,47%),22q(17/22,77%)で高頻度に遺伝子の欠失が見られた。最も高頻度に欠失の見られた22qについてマイクロサテライトマーカーを追加して検索したところ、欠失は22q12領域で最も高かった。この領域にはNF2遺伝子が含まれるため、PCR-SSCPにより遺伝子変異の検索を行ったところ、22例中2例に変異が見られた。NF2遺伝子の不活化がGIST発生の一因になっている可能性がある。【c-kit遺伝子変異】:c-kit遺伝子exon11領域についてPCR-SSCPおよびダイレクトシークエンシングにより遺伝子の変異を検索した。原発巣48例中15例(31%)、転移巣7例中4例に遺伝子変異を認めた。変異のうち3例はmis-sense point mutationで16例はin-frame deletionであった。欧米の報告と異なり、c-kit遺伝子の変異とGISTの悪性度、予後との間には相関が見られず、変異部位の違いが影響している可能性が示唆された。消化管間葉腫瘍(gastrointestinal stromal tumor、GIST)の発生・分化について検討するために、GIST27症例について免疫組織学的に平滑筋ミオシン重鎖(MHC)アイソフォーム(SM1,SM2,SMemb),CD34,KITの発現について検討した。対照として、食道および子宮平滑筋腫9症例、子宮平滑筋肉腫8症例、神経鞘腫3症例についても同様に検討した。(結果)SM1,SM2,SMemb,CD34,KITの発現はGIST(0/27,0/27,19/27,23/25,25/27)、平滑筋腫(9/9,9/9,0/9,0/9,0/9)、平滑筋肉腫(5/8,5/8,2/8,0/8,0/8)、神経鞘腫は全ての抗体に陰性であった。消化管においてSMemb,CD34,KIT全てに陽性を示す細胞はCajalの介在細胞(ICC)のみであり、この結果はGISTのICC由来を示唆するものである。また、GISTにおけるtelomerase再活性化の有無について26症例29病変のGISTについて検討した。(結果)原発巣24病変中7病変(29%)で、また、転移巣5病変全て(100%)にtelomeraseの再活性化を認めた。telomeraseの再活性化は腫瘍の大きさ、増殖能、組織学的悪性度、予後と密接に相関し、GISTの悪性度の評価に有用と考えられ、また、GISTの一部が将来telomerase inhibitorによる治療の対象となりうることが示唆された。

この領域にはNF2遺伝子が含まれるため、PCR-SSCPにより遺伝子変異の検索を行ったところ、22例中2例に変異が見られた。NF2遺伝子の不活化がGIST発生の一因になっている可能性がある。【c-kit遺伝子変異】:c-kit遺伝子exon11領域についてPCR-SSCPおよびダイレクトシークエンシングにより遺伝子の変異を検索した。原発巣48例中15例(31%)、転移巣7例中4例に遺伝子変異を認めた。変異のうち3例はmis-sense point mutationで16例はin-frame deletionであった。欧米の報告と異なり、c-kit遺伝子の変異とGISTの悪性度、予後との間には相関が見られず、変異部位の違いが影響している可能性が示唆された。
取締役の機能を代替するキャリア指標による取締役会が機能を発揮するメカニズムの解明

平成30年度の研究計画は、どのような特性の企業がどのような特性の取締役を求めているかを明らかにすることであった。これを解明するために、平成30年度には取締役像をテキストデータから抽出、整理し、取締役が属する企業の特性ごとに解析する計画であった。この計画に対して、平成30年度中には取締役の選任理由を記したEDINET書類を利用して、テキストデータのマイニングによって、取締役の特性の抽出とその整理に成功した。これについては平成30年度中に関連する事項を整理して、論文1篇を執筆し、公表した。この論文は、これまでに類似の研究蓄積がない状況下で、実際に株主総会において選任された取締役の選任理由を用いた取締役像の探索手法を提示したという意義がある。また、平成30年度には上記の論文にまとめた研究成果以外でも取締役像の抽出および整理に成功している。この論文にまとめていない研究成果の方は、研究対象としている取締役に違いがあり、また、取締役がその所属する企業の特性ごとに取締役像を解析することが容易であるように工夫して整理しているものである。しかし、研究計画策定段階の計画では、取締役像を整理した後に、取締役の特性を取締役が所属する企業の特性ごとに解析することが必要であったが、「現在までの進捗状況」にて記載の理由で解析までは完了しなかった。つまり、平成30年度中には当初予定していた上記の研究目的の解明には至らず、計画は遅れている状況である。平成30年度中に、所属大学が平成30年度から開始した1件の新規事業、および平成31年度から実施する2つの新規事業の担当者となったことから、その実施や立ち上げのために多くの時間を割くことになり、本研究計画実施に充てるエフォートが想定よりも下がったため、研究遂行がやや遅れている。平成31年度には当初より計画していた、取締役会の機能が企業業績に結合するための「カギ」は何かを明らかにする研究を実施するが、これは平成30年度に実施予定であった研究成果の上に成立するものであるため、平成30年度に完了を予定していた取締役特性の企業特性ごとの解析を優先する必要がある。そこで、平成31年度には、この解析を実施した後に、当初の平成31年度計画を遂行する。平成30年度において計画よりも遅れたため、計画を進める速度を高めなくてはこれを実現できないが、エフォートを高めることで対応したい。平成31年度には平成30年度よりも担当授業が半期に限られるが1コマ減ったため、多少ではあるが、平成30年度よりもエフォートを高めることができる。また、計画が遅れる原因となった担当する所属大学の新規事業についても、平成31年4月時点でその実施に目途が立っているため、計画段階と同程度以上のエフォートを維持することができる状況にある。

研究の進捗状況が研究計画よりもやや遅れているため、研究成果を発表、公表するための費用、および印刷関係の消耗品の費用を使わずに次年度使用額が生じた。また、関係図書については所属大学がその費用で購入したため、支出する必要性がなかった。平成30年度に実施する計画であったが計画よりも遅れている分については平成31年度において実施する予定であるため、成果発表や研究遂行に必要な消耗品での費用は平成31年度において使用する予定である。また、関連する研究は世界的に盛んに行われているため、関係図書の費用についても、新たに公刊された図書の購入を中心に、平成31年度に使用する予定である。一木毅文「個々の能力を活かすチーム作りの考え方ーキャリアと多様性に着目してー」中部経済連合会第38回Next30産学フォーラム(講演)
分子動力学シミュレーションによるカルモデュリンの標的蛋白質認識・調節機構の研究

カルモデュリン(CaM)は、カルシウムイオンと結合して、多くの酵素の活性化を調節する生理学的に重要な多機能蛋白質であり、標的酵素のモデルペプチドと結合すると分子の慣性半径及び分子長の値が著しく減少し、特異な亜鈴状構造から球状構造へ変化するということが知られており、このような形態変化が標的酵素の活性化機構に非常に重要であることが示唆されている。本研究では、モデルペプチドの一つである蜂毒由来の両親媒性ペプチド、メリチンを用い、CaM-メリチン複合体をモデリングし、分子動力学法による複合体形成の水溶液中のコンピュータシミュレーションを行い、エネルギー解析に基づきメリチンと結合する際のCaM分子の形態変化のメカニズム及び標的酵素の認識機構を明らかにした。その結果CaMが水溶液中で単独の場合は、CaMのリンカー領域とEヘリックスの間に酸性残基同士の静電的な反発があり、中央ヘリックスの大きな折れ曲がりは起こらないことがわかった。一方、CaM-メリチン複合体ではCaMの中央ヘリックスのこの部分にメリチンのLys7が配置されるため、中央ヘリックスの酸性残基同士の静電的な反発を緩和し、さらにこのリンカー領域のアミノ酸残基とメリチンの残基が、CaMのNドメイン・Cドメインの両方と強力なソルトブリッジを形成することによってリンカー領域が大きく折れ曲がり、二つのドメインを接近させることがわかった。従って、CaMの中央ヘリックスの酸性残基と標的酵素の両親媒性へリックス領域の塩基性残基との相互作用が酵素認識機構に非常に重要であることが示唆された。以上の成果の一部は、8th International Symposium on Calcium-Binding Proteins and Calcium Function in Health and Disease(1992年8月、スイス)で発表した。
バクテロイディア科細菌線毛の形成モデル─Ｘ線結晶構造解析と分子再構成実験─

1.平成29年度はP. gingivalis TDC60株(II型Fim線毛)およびATCC33277株(I型Fim線毛)のFimAタンパク質のX線結晶構造解析を行い、II型FimAタンパク質では1.6Åの解像度で構造が決定できた。I型FimAタンパク質については2.5Å程度の解像度の結果が得られていたが、本年度はI型FimAタンパク質のX線結晶構造解析の解像度を高め、2.1Åの解像度での結果を得た。I型およびII型の立体構造を比較し、分子表面に露出している6つの部分に構造の相違を認めた。現在、どの部分が病原性に重要であるかを調べている。2.平成29年度は線毛様構造をとるI型FimA重合体をクライオ電子顕微鏡にて観察し、画像処理技術を用いて4.5Å程度の解像度の像を得ていたが、本年度はさらに解析を進め、3.0Åの解像度の結果を得た。I型FimAのX線結晶構造解析の結果をクライオ電顕で得られた像に当てはめたところ、C末端ストランドがドナーストランドとしてドナーストランド交換による重合が生じていることを可視化できた。現在、この成果に関する論文を作成している。3.Fim線毛のマイナータンパク質(FimC, FimD, FimE)の結晶構造についても解析を進めており、現在、FimCタンパク質の構造が最も進んでいる。その他のタンパク質についても継続して解析を進めている。平成30年度が最終年度であるため、記入しない。1.Fim線毛およびMfa線毛のピリンタンパク質の構造決定:V型線毛のなかで分子遺伝学的解析が進んでいるP. gingivalisの二つの線毛(Fim線毛とMfa線毛)についてそのピリンタンパク質の構造を決定する。現在、主要ピリンであるFimA(type IV)の構造が解析されているのみであり、28年度にはFimA(type I)とFimA(type II)の結晶化に成功した。スプリング8でX線結晶構造解析を行う予定です。FimAのタイプは本菌の病原性と深く関連があるとされており、構造上の相違から病原性の違いを検討する。2.ピリンの重合におけるC末端領域の重要性:FimA(主要ピリン)およびMfa2(基部ピリン)についてそれらのC末端を部分的に欠損した変異ピリンをP. gingivalisで発現させ、線毛の重合に影響を及ぼすかどうかを調べた。FimAのC末端を3アミノ酸残基欠損したのみで主要線毛タンパク質の重合がまったく起こらなかった。また、Mfa2のC末端を同様に3アミノ酸残基欠損しただけで基部ピリンとしての働き、すなわち、線毛を菌体に把持し、線毛の長さを調節する機能が失われた。これらの結果は主要ピリンの重合には主要ピリンのC末端領域が必須であること、基部ピリンについても主要ピリンと連結する際は基部ピリンのC末端領域が関係することが示唆された。3.システイン置換法による重合機構の解明:C末端が前方のピリンタンパク質のN末端の溝に挿入されているかどうかを検証するため、それらのストランドのアミノ酸残基をシステインに置換させ、酸化条件下で結合がおこるかどうかを調べた。その結果、予想通りの結果であった。4.セルフリー系での線毛再構成:組換えFimAタンパク質をP. gingivalisのRgpプロテアーゼで処理すると試験管内で重合が生じ、線毛が形成されることがわかった。この再構成Fim線毛についてクライオ電顕にて観察した。5.いままでの研究をCell誌に発表した。線毛の形成機構の解明について1年目で当初の目的のかなりの部分を達成でき、Cell誌に発表した。平成29年度は以下について成果がみられた。1.Porphyromonas gingivalis ATCC33277株のFimAタンパク質(Pro領域を含む)を大腸菌にて大量発現させ、高純度で精製を行った。他方、Potempa博士より分与して頂いたP. gingivalis組換え株からHisタグ付きRgpプロテアーゼを培養上清から高純度で精製した。両者を混和したのち、ポリエチレングリコールにてポリマー分子を濃縮した。酢酸ウランを用いた陰性染色を施し、透過型電子顕微鏡観察を行ったところ、ラセン状の線毛様構造をもつ線維が多数、観察された。V型線毛において初めてin vitroにて線毛様構造を呈するFimA重合体を作製することに成功した。2.P. gingivalis TDC60株(II型Fim線毛)およびATCC33277株(I型Fim線毛)のFimAタンパク質のX線結晶構造解析を行い、II型FimAタンパク質では1.6オングストロームの解像度で構造が決定できた。I型FimAタンパク質については2.5オングストローム程度の解像度の結果が得られた。3.線毛様構造をとるI型FimA重合体をクライオ電子顕微鏡にて観察し、画像処理技術を用いて4.5オングストローム程度の解像度の像を得ている。この像にX線結晶構造解析より得られたI型FimA分子構造を当てはめたところ、平成29年度のCell誌に発表した「C末端ストランドをドナーストランドとするドナーストランド交換による重合機構モデル」と合致する予備的な結果を得た。今後、さらにI型FimAのX線結晶構造解析の分解能を上げるとともにクライオ電顕による構造解析の分解能を上げる。

FimAタンパク質のtype Iおよびtype IIの構造をX線結晶構造解析で解析できた。また、in vitroでFimAタンパク質の重合体(線毛構造)を作製でき、クライオ電子顕微鏡解析が可能となった。1.平成29年度はP. gingivalis TDC60株(II型Fim線毛)およびATCC33277株(I型Fim線毛)のFimAタンパク質のX線結晶構造解析を行い、II型FimAタンパク質では1.6Åの解像度で構造が決定できた。I型FimAタンパク質については2.5Å程度の解像度の結果が得られていたが、本年度はI型FimAタンパク質のX線結晶構造解析の解像度を高め、2.1Åの解像度での結果を得た。I型およびII型の立体構造を比較し、分子表面に露出している6つの部分に構造の相違を認めた。現在、どの部分が病原性に重要であるかを調べている。2.平成29年度は線毛様構造をとるI型FimA重合体をクライオ電子顕微鏡にて観察し、画像処理技術を用いて4.5Å程度の解像度の像を得ていたが、本年度はさらに解析を進め、3.0Åの解像度の結果を得た。I型FimAのX線結晶構造解析の結果をクライオ電顕で得られた像に当てはめたところ、C末端ストランドがドナーストランドとしてドナーストランド交換による重合が生じていることを可視化できた。現在、この成果に関する論文を作成している。3.Fim線毛のマイナータンパク質(FimC, FimD, FimE)の結晶構造についても解析を進めており、現在、FimCタンパク質の構造が最も進んでいる。その他のタンパク質についても継続して解析を進めている。1.FimAタンパク質のtype I, type II, typeIVの分子構造をX線結晶構造解析より導き、それらを比較して構造の相違を明らかにする。2.インビトロで再構成したFimAタンパク質によるFim線毛を用いて宿主細胞への影響を調べる。3.クライオ電顕にてインビトロで再構成したFimAタンパク質によるFim線毛の構造モデルを構築する。(今後の推進方策)1.FimAタンパク質type IのX線結晶構造解析の分解能を高める。3.クライオ電顕での線毛構造の解析結果にX線結晶構造解析の結果を当てはめ、「C末端ストランドをドナーストランドとするドナーストランド交換による重合機構モデル」を検証する。平成30年度が最終年度であるため、記入しない。
超広視野赤外カメラによる短周期ミラ型星の完全サーベイ

この計画は、銀河面に分布する短周期ミラ型星を、銀経0度270度、銀緯±2度の広い範囲に渡ってサーベイし、周期-光度関係から距離を算出し、銀河系内のミラ型星の分布を3次元的に求めるものである。そのために、基本的観測装置として、岡山天体物理観測所の91cm望遠鏡を改造して、超広視野赤外カメラシステムを構築した。このシステムは、近赤外線で1度角という、これまでにない広視野を実現し、目標のサーベイを行うのに必須である。本研究期間の間に、超広視野赤外カメラシステムの根幹となる近赤外広視野カメラの光学系を設計・完成し、それを覆う真空デュワーおよび真空デュワー中で冷却環境下で動作させるフィルター交換機構を完成させた。これに冷凍機を装着し、冷却試験を行って予定性能を達成することを確認した。さらに、このシステムを望遠鏡に取り付けるための機構を91cm望遠鏡に装着した。また、91cm望遠鏡の主鏡を金コーティングを行い、赤外性能を向上させた。91cm望遠鏡は専用副鏡を新たに製作し、望遠鏡制御システムを全面的に更新した。さらに、検出器に関して、国立天文台ハワイ観測所で開発されたMessiaVシステムにて検出器駆動するシステムを製作・試験し、良好な駆動ができることを確認した。このほか、観測可能性の詳細検討、新たな観測目標の検討とサーベイ領域の策定を行った。諸外国の近赤外観測装置開発の動向を探り、技術的情報の交換を行うため、数回の海外出張を行い実地調査および研究交流も行った。当初計画したサーベイ観測を開始するには至らなかったが、研究期間内に観測システムの完成させることができ、本格観測への準備はすべて行うことができた。平成14年度は、超広視野赤外カメラシステムの全体構成についての設計を進め、このカメラシステムの根幹となる近赤外広視野カメラの光学系設計及び製作を行った。このカメラは波長2.5μmの赤外線まで十分な感度を持たせるために、光学系全体が真空デュワーとなっており、80Kまで冷却できる仕様となっている。また、シュミット光学系の採用によって広い視野にわたって安定した結像性能が得られるという特徴をもつ。製作したカメラ光学系は、視野1度角に渡って良好な結像性能を持っており、視野端においても光学系による像劣化が検出器1画素(18μm)以内に抑えられていることがわかった。さらに、検出器駆動回路の試作を行った。検出器はテスト用としてHawaiiアレイ(1024画素×1024画素)のエンジニアリングモデルを用いて、国立天文台ハワイ観測所で開発されたMessiaVシステムにて駆動するシステムを製作した。また、91cm望遠鏡の機械構造および駆動系の詳細な調査を行った。これを基に望遠鏡改造計画の具体化を行った。91cm望遠鏡主鏡の光学検定も行った。この結果、91cm主鏡は全体として8/λの鏡面精度を持っており、本計画実行のためには十分良好な鏡面精度を持っていることがわかった。この他、観測可能性の詳細検討とサーベイ領域の策定を行った。平成15年度は、超広視野赤外カメラシステムの全体構成の製作を進め、このカメラシステムの根幹となる近赤外広視野カメラの光学系を覆う真空デュワーおよびそれを望遠鏡に装着するための取り付け機構の設計・製作を行った。製作したデュワーはこの冷却仕様を満たすことがわかった。さらに、検出器駆動回路の試験を行った。

検出器はテスト用としてHawaiiアレイ(1024画素×1024画素)のエンジニアリングモデルを用いて、国立天文台ハワイ観測所で開発されたMessiaVシステムにて駆動するシステムを製作・試験し、良好な駆動ができることを確認した。また、91cm望遠鏡の機械構造および駆動系の改造プランを詰めて、詳細な設計を行った。この他、観測可能性の詳細検討、新たな観測目標の検討とサーベイ領域の策定を行った。諸外国の近赤外観測装置開発の動向を探り、技術的情報の交換を行うため、数回の海外出張を行い実地調査および研究交流も行った。平成16年度は、超広視野赤外カメラシステムの根幹となる近赤外広視野カメラの光学系を覆う真空デュワーの製作を行った。また、このデュワーを望遠鏡に取り付けるための治具を91cm望遠鏡に装着した。91cm望遠鏡のトップリングも改造し、副鏡支持機構および駆動機構を製作した。さらに、検出器駆動回路の試験を行った。国立天文台ハワイ観測所で開発されたMessiaVシステムにて検出器駆動するシステムを製作・試験し、良好な駆動ができることを確認した。このほか、観測可能性の詳細検討、新たな観測目標の検討とサーベイ領域の策定を行った。平成17年度は、超広視野赤外カメラシステムの根幹となる近赤外広視野カメラの光学系を完成し、それを覆う真空デュワーおよび真空デュワー中で冷却環境下で動作させるフィルター交換機構を完成させた。これに冷凍機を装着し、冷却試験を行って予定性能を達成することを確認した。さらに、このシステムを望遠鏡に取り付けるための治具を91cm望遠鏡に装着した。また、91cm望遠鏡の主鏡を金コーティングを行い、赤外性能を向上させた。さらに、検出器に関して、国立天文台ハワイ観測所で開発されたMessiaVシステムにて検出器駆動するシステムを製作・試験し、良好な駆動ができることを確認した。
植物の性の決定分化制御の分子機構

ゼニゴケ雌および雄のPACライブラリを作製した。ディファレンシャルスクリーニングにより、PACライブラリから雄特異的クローンpMM4G7を単離した。FISHによりそのDNAはY染色体由来であることを確認した。塩基配列を決定し、pMM4G7がY染色体特異的友復配列およびリングフィンガーモチーフを有するタンパク質をコードする遺伝子をコードすることを明らかにした。pMM4G7およびその他の雄特異的PACクローンを起点に全長約1.6Mbpとなる5つのコンティグを作製した。pMM4G7と同じコンティグに含まれるクローンpMM2D3の塩基配列を決定し、既知遺伝子との相同性をもとに6種類の遺伝子を見いだした。これらの遺伝子が実際に発現していることをRT-PCRで確認した。これらの遺伝子のうち4個は雄ゲノムにのみ存在することをPCRで示した。Repres entational Difference Analysis(RDA)法を用いてY染色体より5個、X染色体より2個の新規マーカー配列を単離した。これらの性染色体マーカーを用いて、PACクローンの単離・整列化を行い、Y染色体については全長約3Mb、X染色体については全長約150kbのコンティグを作製した。雌雄生殖器由来のcDNAライブラリを構築し、その中からそれぞれ無作為に約1000個のクローンを抽出し、その末端の塩基配列を決定してESTとした。このESTをデータベース解析することにより、生殖器官における遺伝子発現パターンを明らかにするとともに、性決定に関与する可能性のある新奇な遺伝子を単離した。さらに、雌雄生殖器官由来ESTの比較解析により、遺伝子発現パターンの性差についても明らかにした。性染色体にコードされる新奇な遺伝子の機能を解析するために、パーティクルガンを用いたゼニゴケの形質転換系を開発した。また、約2000株のタグ系統を作出し、生殖器官形成過程に異常が生じた変異体1株を見いだした。ゼニゴケは、雌雄で構造の異なる性染色体を保有する半数体であることから、性分化の過程を分子生物学的に解析するのに最適な植物である。本研究は、植物の性分化決定機構を解明するために、ゼニゴケをモデル植物として、生殖器官の分化に関与する遺伝子を単離・同定し、その構造と機能及び発現様式を明らかにすることを目的とした。ゼニゴケ葉状体プロトプラストから調製した高分子量DNAを用いてP1ファージ由来人工染色体(PAC)ゲノムライブラリーの作成を行った。100kb程度のインサートを持つクローンが、雄・雌について、それぞれ約4万個・約3000個得られた。少なくとも雄に関しては、ゲノムのほぼ全域をカバーするに足るクローン数が得られたことになる。ゼニゴケ雌株培養細胞およびゼニゴケ18SリボソームRNA遺伝子を含むPACクローンを用いて、(1)染色体サンプルの調製、(2)プローブDNAの標識、(3)ハイブリダイゼーション、それぞれの条件について最適化を行った。まず、染色体が最も容易に観察できる細胞分裂中期にある細胞をより多く得るための細胞周期同調処理条件を検討し、新しい培地に植え継いで3日目に8-キノリノールを加えるか、新しい培地に植え継いだ翌日に使用すれば良いことが分かった。植物細胞の場合、染色体を明瞭に観察するためには細胞壁を除く必要があるため、細胞壁を除去しつつも染色体に損傷を与えないプロトプラスト化条件を検討・決定した。ゼニゴケ18SリボソームRNA遺伝子は数百コピーからなるクラスタとして存在することが知られている。

この遺伝子を含むPACクローンを用いてFISHを行うと、常染色体の1つの先端部分に明確なシグナルが得られた。ゼニゴケ雌性生殖器官由来のcDNAライブラリーより無作為に抽出された1017クローンの部分配列を決定した。得られたExpressed Sequence Tags(ESTs)を解析し、ゼニゴケ雌性生殖器官における遺伝子発現のパターンを明らかにした。塩基配列・アミノ酸配列データベースに対する相同性検索の結果、ゼニゴケESTsのうち約54%は既知の配列と有意な相同性を示さず、残りの約46%は既知の配列と相同性を示した。後者のうち、約80%は既に機能が明らかにされている遺伝子と高い相同性を示した。タンパク質遺伝子と相同性を示したゼニゴケESTsについて、同定もしくは予測されている機能別に分類すると、ゼニゴケ雌性生殖器では他の植物種や組織と比べて遺伝子発現に関わる遺伝子(転写因子、リボソームタンパク質等)の比率が高いことが明らかになった。ゼニゴケ雌および雄ゲノムPACライブラリーを完成した。50kb以上のDNA断片をもつクローンが、雄株では32,800個、雌株では31,700個得られた。オルガネラゲノムの含有率が約30%と見積もられているので、雌雄それぞれ約22,000個の核ゲノムDNA断片をもつクローンが含まれていることになる。ゼニゴケのゲノムサイズは核型分析の結果280Mbと推定されているので、性染色体を含めてゲノムの99.9%をカバーするには、平均90kb以上の核ゲノム挿入断片を持つPACクローン約20,000個が必要である。従って、今回得られたそのようなPACクローンの数は雌雄共に十分である。上記のライブラリーより高密度フィルターを作成し、雌および雄ゲノムDNAをプローブとしたディファレンシャルスクリーニングによって雄特異的DNAを含むPACクローンpMM4G7を単離した。pMM4G7をプローブとして雌および雄ゲノムDNAに対するハイブリダイゼーションを行うと、雄ゲノムDNAのみで2.5kbの位置に強いシグナルが観察された。また、pMM4G7を用いて雄の染色体サンプルに対してFISHを行い、Y染色体にシグナルを得た。従って、pMM4G7はY染色体に由来することが確認された。pMM4G7のBamHI断片をランダムにサブクローン化し、得られたサブクローン5種類について挿入断片末端の配列を決定したところ、全て異なるサブクローンであるにも関わらず、それぞれの末端配列は非常によく保存されていた。さらに、pMM4G7のBamHIによる切断地図を部分的に作成した結果、pMM4G7にはBamHI切断部位を持つ反復配列が多数存在していることを明らかにした。ゼニゴケ生殖器官で発現している遺伝子群に関する知見を得るため、EST(expressed sequence tag)解析を行った。雌生殖器官由来715種類、雄生殖器官由来446種類のESTsを比較すると、雌雄に共通する配列102種類、雌のみで見られた613種類、雄のみで見られた344種類に分類できた。前年度に単離したY染色体由来PACクローンpMM4G7には、BamHl2.4kbの反復配列が存在する。
分子時計による分節性の成立機構

脊椎動物の分節性(繰り返しパターン)の形成及び、分節境界の形成に関わる分子機構を解析した。未分節中胚葉後方ではNotchシグナル関連分子が分節クロックとして、振動していることがわかっていたが、Notchのシグナルそのものが振動している証拠はなかった。我々は活性化したNotch分子のみを特異的に認識する抗体を用いて未分節中胚葉を解析したところ、後方部で確かにNotchシグナル自身が振動しており、それが未分節中胚葉前方部で安定化することを見出した。そのNotchシグナルはDll1-KOマウスでは消失し、Lunatic fringe (L-Fng)-KOマウスでは逆に活性が上昇しているとともに、振動も見られなかった。よって後方部におけるNotchシグナルはDll1により誘導され、L-Fngにより負の制御を受けていると考えられる。一方、Mesp2-KOマウスでは前方部のNotchシグナルが安定化せず、分節境界が形成されないことをわかった。NotchシグナルとMesp2シグナルの関係を分節境界形成過程で詳細に調べた結果、Notchシグナルは分節境界においてMesp2により抑制されることによりNotchシグナルの境界面が形成されこれが将来の分節境界を形成することがわかった。またこのときMesp2はL-Fngを誘導しており、それがNotch活性の抑制に寄与すると考えた。したがって、Mesp2はこれまで明らかにしてきた体節の前後極性の形成に加えて分節境界の形成に関わる非常に重要な転写因子であることが明らかになった。脊椎動物の分節性(繰り返しパターン)は、2つのステップにより確立する。第一段階は実際に体節が一つ一つくびれきれる過程であり、これは細胞の上皮化と密接な関係がある。第二段階は、resegmentationと呼ばれる過程であり、脊椎骨の形成過程で見られる現象である。一つの脊椎骨は実は、前方の体節の後側とその後の体節の前方側からの細胞によって形成される。従って、体節形成の時に形成された体節一個一個がそれぞれの脊椎骨になるわけではない。そしてこのresegmentationの時に重要になってくるのが、個々の体節内に形成されている前後極性であり、この前後極性は体節の分節化に先立って形成されることがわかっている。この前後極性は、明らかにresegmentaionに必要であるが、第一段階の体節形成にも重要な役割を果たすと考えられる。近年我々が単離した転写因子Mesp2は体節の前後極性の形成に最も初期に働く重要な分子であることが、マウスを用いた遺伝学的解析によって明らかになってきた。前後極性の確立に関してはMesp2がNotchシグナリングを介してDII1の発現を制御により、確立される。一方、体節の分節に関しては、前後極性の確立とは独立した機構で関与することが明らかになった。この分子機能に関しては、まだ今後の課題として残されているが、我々は分子時計を反映して発現が変化するlunatic fringeの未分節中胚葉の前方部における発現がMesp2により制御されていることを見いだしており、Mesp2の下流でいかにしてlunatic fringeが制御されているかを今後解析していきたい。第二段階は、resegmentationと呼ばれる過程であり、この過程は個々の体節内に形成されている前後極性に依存する。我々は転写因子Mesp2が体節の前後極性の形成に最も初期に働く重要な分子であることを示してきたが、今回、ゼブラフィッシュのMesp2ホモログ、mespbをマウスのMesp2遺伝子座に導入したマウスがhypomorphicな表現型を示すことを見いだした。この遺伝子座を単独でもつマウスではmespbの機能が低下しているために、正常な前後極性が確立されない。しかしそれにも関わらず第一段階の体節のくびれきれる現象(体節間の境界形成)が観察された。さらに、このとき、体節の境界形成に伴って発現する遺伝子発現が誘導されており、mespbはdosageに依存して体節の境界の形成と体節の前後極性の確立に関与する事が明らかになった。さらにこれらの過程には異なった遺伝子カスケードが関与している可能性が示唆された。しかしこのマウスでは体節間の前後極性が確立されていないため、境界は維持されず、結局癒合することも明らかになり、この2つの分節過程が協調して正常な体節形成が進行することが明らかになった。脊椎動物の分節性(繰り返しパターン)を形成する分子機構を遺伝学的に解析した。我々が以前作成した転写因子Mesp2のノックアウトマウスと、NotchシグナルDll1及びDll3のノックアウトマウスまたNotchシグナルの伝達に必須なPsen1ノックアウトマウスを交配し、それぞれのダブルノックアウトマウスにおける遺伝子発現を解析することにより、体節の前後極性の確立にかかわる分子機構をかなり詳細に解析した。その結果、NotchリガンドDlll1とMesp2はポジテイブ・ネガテイブフィードバックにより、お互いの発現を制御しており、この関係が中心となり、Mesp2とDll1を発現する細胞が分かれること、そしてそのカスケードにDll3をリガンドとしたNotchシグナルがDll1のシグナルと拮抗的に作用することにより、Mesp2とDll1の発現ドメインが体節の前後にわかれていくことが明らかになった。ただこれらの関係がどの程度直接的に制御しているのかは今後生化学的な解析が必要となる。

また今年度はエンハンサーの解析にも進展がみられた。Mesp2の上流で体節における発現に必須な最小の塩基配列を決定し、酵母のOne-hybrid系を用いて、この塩基に結合する分子を探索した。その結果Tbx6が特異的に結合することが明らかになった。しかしTbx6の発現ドメインはMesp2が発現する領域よりかなり広域であり、この因子のみでMesp2の発現を制御しているとは思えず、現在Tbx6に結合し、その活性を調節する分子の探索を行っている。脊椎動物の分節性(繰り返しパターン)を形成する分子機構を遺伝学的に解析した。体節の前後極性の確立は、転写因子Mesp2とNotchシグナルの相互作用によってもたらされることをこれまで明らかにしてきた。Mesp2遺伝子座を利用し、Mesp2の機能とNotchシグナルとの関係をより詳細に解析する目的で、Mesp2遺伝子座にDll3をノックインしたマウスを作成した。Mesp2が欠損するマウスでは、Dll1の発現抑制が起こらずに体節がすべて後方化するが、Dll3をMesp2の代わりに発現するマウスにおいて、一見Mesp2の機能がレスキューされているような表現型を得た。Dll1の発現が著しく抑制され、その下流の遺伝子uncx4.1の発現もストライプパターンが回復し、部分的に分節境界も作成されていた。これの解釈は非常にむずかしく、Dll3が細胞自立的に機能したのか、それともリガンドDll3によりNotchシグナルを介して機能したのか現在のところは不明である。しかしこのDll3の発現がDll1-Notchシグナル系に抑制的に働いたのは明らかである。今後このDll3の機能がPsen1を介して機能するのか?またRbp-jkを介した機能であるのかといった点を明らかにする必要がある。また我々はNotchレセプターを修飾するlunatic-FringeをMesp2遺伝子座に導入したマウスも作成した。現在まだ解析中であるが、やはりDll1-Notchシグナルには拮抗的に働いているようである。体節の形成過程では、未分節中胚葉におけるMesp2を中心とした遺伝子制御が中心的働きをしている。その中で、Dll-NotchとDll3-Notchという2つの経路が考えれられるがこれらがlunati-Fringeに同様に制御されているのかも今後の大きな課題である。脊椎動物の分節性(繰り返しパターン)の形成及び、分節境界の形成に関わる分子機構を解析した。未分節中胚葉後方ではNotchシグナル関連分子が分節クロックとして、振動していることがわかっていたが、Notchのシグナルそのものが振動している証拠はなかった。我々は活性化したNotch分子のみを特異的に認識する抗体を用いて未分節中胚葉を解析したところ、後方部で確かにNotchシグナル自身が振動しており、それが未分節中胚葉前方部で安定化することを見出した。そのNotchシグナルはDll1-KOマウスでは消失し、Lunatic fringe (L-Fng)-KOマウスでは逆に活性が上昇しているとともに、振動も見られなかった。
飛行時間質量分析計のための超高感度イオン検出システム

本研究の目的はパルスカウント検出器として機能し、かつ複数個(1000程度)のイオンもその個数に応じた出力をえる検出システムを開発することにより極微量の試料の組成比や同位体比の測定を容易にし、我々の開発している超高感度極微量質量分析システムの機能の飛躍的向上を目指すことであった。高速アナログスイッチとFET入力オペアンプを用いた電子回路の基本設計を行なった。それに基づき試作も行った。その結果、ほぼ予定の性能に達したが、ベースラインの変動による積分値の変動が見られたこと、初段アンプ発するノイズが測定結果に無視できない影響をあたえること、等の問題点も見つかった。本研究の目的はパルスカウント検出器として機能し、かつ複数個(1000程度)のイオンもその個数に応じた出力をえる検出システムを開発することにより極微量の試料の組成比や同位体比の測定を容易にし、我々の開発している超高感度極微量質量分析システムの機能の飛躍的向上を目指すことにある。具体的にはアナログスイッチ回路と積分回路を組み合わせた電子回路により蓄積された信号をサンプリングレートが遅くても量子化ビット数の高いADCでデジタル信号に変換してデータを取得するものである。2014年度は高速アナログスイッチとFET入力オペアンプを用いた電子回路の基本設計を行なった。その結果、ほぼ予定の性能に達したが、ベースラインの変動による積分値の変動が見られたこと、初段アンプ及び抵抗が発するノイズが測定結果に無視できない影響をあたえること、直流成分を遮断するためのキャパシターの値の検討不足があったこと等の問題点も見つかった。現在これら問題の解決に向け検討を行っている。昨年度検出システムの動作を確認した。しかし、検出器からの雑音が当初の見込みより大幅に大きく出ていることが判明した。この問題の解決を目的として今年度は疑似信号発生装置の設計製作をおこなった。この装置はマルチチャンネルプレートからの高速電流パルス信号をシミュレートするものであり、構成は発光ダイオードによる微弱光発生部と光電子増倍管による電流発生部からなっている。微弱光子発生部では毎秒100万個オーダーの光子を発生させることが目標で、そのために微弱電流を発光ダイオードに供給する電源を設計製作した。実験の結果発光ダイオードの微弱電流のほとんどが再結合電流となっていて、当初目標の発光個数が得られなかった。電流値を予定より上げることで発光を観測でき、光子1個からの高速電流パルス(幅5nS)を得ることができた。しかし、パルスの発生が不安定で疑似信号発生器として用いるには至らなかった。この原因は微弱電流の流れが不安定であると推定できる。今後は発光ダイオードはある程度の強度で発光させ、光を減衰させることで発光密度の制御を行う予定である。検出器からの予想以上の雑音の対策に時間がかかっている。この雑音の影響を低くおさえることはこの検出システムの重要なポイントであり、さけて通ることはできない。効果的な改善法を見出すべく検討を進めている。まず、高速アナログスイッチとFET入力オペアンプを用いた電子回路の基本設計を行なった。この問題の解決を目的として疑似信号発生装置の設計製作をおこなった。ほぼ予定の性能の電子回路を試作したが、想定外の問題点も見出した。疑似信号発生器の改良を進め雑音の解明を行う。その結果をふまえて、現在にくらべ雑音の影響を1桁軽減することをめざす。そのうえで、検出システムの構築、性能評価を行い検出システムの実用化をめざす。質量分析問題点を解決し、実用化に向けた改良を推進する。