hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
近赤外広帯域固体光源に向けた遷移金属イオン添加蛍光体の発光波長制御に関する研究

初年度は2種類のクロムイオン添加酸化物蛍光体について、合成法の確立と発光特性の解明をおこなった。具体的な成果を以下に示す。Cr3+添加Mg4Nb2O9(Mg4Nb2O9:Cr3+)蛍光体についてCr3+濃度を変化させた試料の合成に成功し、その発光特性のCr3+濃度依存性を明らかにした。いずれのCr3+濃度でも、Cr3+に起因する750 nmから1250 nmに渡る広帯域発光が得られ、そのピーク波長は890 nmであった。また、発光強度はCr3+濃度が0.1mlol%から増加するにつれ上昇し、0.7mol%で最大になった。これ以上の濃度では逆に発光強度が低下した。これはCr3+の濃度消光によるものだと考えられる。この成果は第79回応用物理学会秋季学術講演会で発表した。さらに第34回近赤外フォーラムにおいて、この蛍光体とLEDとを組み合わせた近赤外広帯域光源について報告し、Best Poster Award(39件中3件受賞)を受賞した。Cr3+,Cr4+共添加Mg2SiO4(Mg2SiO4:Cr)蛍光体についてCrイオン濃度を変化させた試料の合成に成功した。また、発光特性のCrイオン濃度依存性について明らかにした。約800 nmおよび1120 nmにピークを持つ、650 nmから1400 nmにおよぶ超広帯域発光を示した。励起スペクトルの測定結果より、800 nm帯の発光帯はMgサイトを置換したCr3+、1120 nm帯の発光帯はSiサイトを置換したCr4+にそれぞれ起因したものであると考えられる。さらに、この蛍光体とLEDとを組み合わせた近赤外広帯域光源を作製し、その光出力のCr濃度依存性を明らかにした。この成果は国際会議(EL2018)で報告すると共に、論文としてまとめ、Japanese Journal of Applied Physicsに採録が決定している。2種類の蛍光体(Mg4Nb2O9:Cr3+およびMg2SiO4:Cr)について、その合成方法を確立し、発光特性を明らかにすることができた。また、その成果を学会で発表すると共に、学術論文にまとめることができた。さらに、本研究で扱う材料の応用分野である、近赤外分光技術に関する研究会でも報告し、Best Poster Awardを受賞することができた。これは、本研究がその応用分野からも興味を持たれているためだと考える。以上より、本研究は計画通りに遂行できていると判断する。前年度に得られたMg4Nb2O9:Cr3+およびMg2SiO4:Cr蛍光体について、構成元素を他元素で置換する。置換量を変化させた時の結晶構造と発光特性の変化を明らかにする。また、それらの蛍光体とLEDとを組み合わせた光源の作製および光源としての発光特性の評価も合わせておこなう。さらに、Mg4Nb2O9:Cr3+およびMg2SiO4:Cr蛍光体についてXANESおよびEXAFSスペクトル測定をおこない、蛍光体中のクロムイオンの価数およびクロムイオン周りの局所構造を明らかにする。

以上より、本研究は計画通りに遂行できていると判断する。前年度に得られたMg4Nb2O9:Cr3+およびMg2SiO4:Cr蛍光体について、構成元素を他元素で置換する。置換量を変化させた時の結晶構造と発光特性の変化を明らかにする。また、それらの蛍光体とLEDとを組み合わせた光源の作製および光源としての発光特性の評価も合わせておこなう。さらに、Mg4Nb2O9:Cr3+およびMg2SiO4:Cr蛍光体についてXANESおよびEXAFSスペクトル測定をおこない、蛍光体中のクロムイオンの価数およびクロムイオン周りの局所構造を明らかにする。
肝疾患患者血漿の血管内皮細胞に及ぼす影響

培養血管内皮細胞へ各種慢性肝疾患患者の血漿を添加し、その後の組織プラスミノーゲンアクチベータ-(t-PA)分泌量を測定し、血漿中の因子が直接的に血管内皮細胞からのt-PA放出を亢進させているか否かを検討した。また、肝疾患患者血漿添加後にトロンビンを添加し、t-PA放出刺激時における反応性の変化への関与についても検討した。慢性肝炎活動性(CH群)、代償性肝硬変(LCC群)、非代償性肝硬変(LCD群)、健常人(Nor群)の血漿を添加し、放出されたt-PAはLCD群でLCC群、Nor群に比し有意の高値を示した(p<0.01、p<0.05)。LCC群はCH群、LCD群に比し有意に低値を示した(p<0.05、p<0.01)。PAI-1は、Nor群、CH群、LCC群、LCD群とも各群間に有意差は認められなかった。トロンビン刺激により、血管内皮細胞から放出されるt-PA量(Δt-PA)はLCC群でNor群、CH群、LCD群に比して有意に低値を示した(各々p<0.01)。ΔPAI-1はLCC群で、Nor群、CH群、LCD群に比して有意に低値を示した(各々p<0.05)。肝疾患の血漿中の因子は、血管内皮細胞からのt-PA放出を直接的に制御し、さらに血管内皮細胞のt-PA放出に対する易刺激性も変化させる二重の作用が存在する事が判明した。PAI-1放出に関しては、t-PAの上昇に連動してPAI-1の放出を誘発していると考えられた。
ヒトbcl-2がん遺伝子の生理機能の解析

bcl-2がん遺伝子は、他のがん遺伝子とは異なり細胞死(アポトーシス)を抑制する活性を示し、がん遺伝子の中でもユニークな存在になっている。この研究課題の目的は、分子生物学的および細胞工学的手法を駆使しbcl-2の機能を統合的に理解することである。bcl-2たんぱくの細胞内局在を細胞分画法と免疫電顕法により検討しbcl-2は核外膜、小胞体膜とミトコンドリア外膜に存在することを示し、bcl-2のミトコンドリア内膜局在説を否定した。bcl-2の構造と機能の関係を明らかにするために系統的な欠失変異bcl-2を作製し細胞内局在と細胞死抑制活性の検討を行った。その結果、C末の約50アミノ酸領域が膜局在に必須であることが明らかになった。膜局在を失ったbcl-2たんぱくはアポトーシス抑制活性を示さず、膜局在がbcl-2の活性の発現に重要であることを強く示唆している。抗bcl-2抗体を用いてbcl-2結合たんぱくの同定を行なった。バキュロウイルスの発現系より得られたbcl-2たんぱくをプローブとしヒトcDNAライブラリーから同一の未知遺伝子を含む2クローンを得た。遺伝子産物の機能は現在検討中である。bcl-2欠損マウスの作成に成功した。bcl-2-/-マウスは正常に生まれるが、生後10日目あたりから成育不全が顕著になる。bcl-2-/-マウスにおいて個体差はあるが次のような異常がみられた。(1)耳が小さい(2)polycystic kidney(3)リンパ球のアポトーシスによる胸腺および脾臓のアトロフィ(4)小腸の発育不全(5)毛の白色化などである。これら全ての異常がbcl-2欠損による細胞死の促進であるかいなかは今後の研究に待たねばならない。
遺伝子核内配置－転写同時ライブイメージングを利用した多能性幹細胞不均一性の解明

細胞核内では各染色体が完全に混ざり合うこと無く個々の領域を保ち、DNAや核内タンパク質から成る核内構造体が不均一に分布している。また、特定の遺伝子の発現には、プロモーターと遠方の転写調節領域の相互作用が影響することが知られている。しかし、染色体や核内構造体の空間配置は細胞分裂ごとにランダムに決まり、また間期において動的に揺らいでおり、細胞間で遺伝子発現制御能の多様性を生む要因となり得るが、技術的困難が多く、詳細は不明である。本研究では、内在遺伝子の転写と核内配置の同時可視化システムを確立し、本システムを利用してマウス胚性幹細胞における遺伝子発現量の不均一性の発生メカニズムの解明をめざす。本研究の目的は、遺伝子の転写と核内配置の同時可視化システムを確立し、それを利用してマウスES細胞での核内の不均一性と遺伝子発現量の多様性の関係を明らかにすることである。まず、特定の内在遺伝子の転写と核内配置の同時可視化システムの確立のために、MS2配列をマウスES細胞のNanog遺伝子領域へ挿入した。本細胞に、転写されたMS2 RNAに特異的に結合するMCPと赤色蛍光タンパク質(MCP-RFP)との融合タンパク質、及びMS2 DNA配列へ結合可能なdCas9-GFP/sgRNAを発現させることで、特異的にNanog遺伝子領域を蛍光染色し、かつ転写活性をRFPの蛍光輝点として観察できた。また、これらシステムがNanog遺伝子の転写および翻訳に影響がないことを確認した。さらに、本システムを利用してNanog及びOct4遺伝子の転写と核内挙動を調べたところ、Nanogのみ非転写時に核内流動性が上昇することがわかった。これまでにNanog遺伝子は復数の遠方ゲノム領域と相互作用していることが報告されており、相互作用の不安定さが遺伝子発現量の細胞間多様性に寄与している可能性が示唆された。予定していた内在遺伝子の転写と核内位置の同時可視化システムが確立でき、論文として発表できた。本研究では、1)内在遺伝子の転写と核内配置の同時可視化システムを確立し、2)本システムを利用してマウス胚性幹細胞における遺伝子発現量の不均一性の発生メカニズムの解明をめざす。昨年度までに1)のシステム、Real-time Observation of Localization and EXpression (ROLEX)システムを確立し、それを利用した解析からNanog遺伝子の確率的な転写活性化には、Nanog遺伝子と複数の遠方ゲノム領域との不安定な相互作用が関係していることが示唆された(Ochiai et al., Nucleic Acids Research, 2015)。また、これらNanogと相互作用する領域にはNanogの上流因子であるSox2結合領域が極端に濃縮されていることがわかった。Sox2はマウスES細胞内で結合サイトが空間的に密集したSox2クラスターを形成することが報告されている。今後、これらSox2クラスターの一つにNanog遺伝子及びその制御領域の相互作用部位が含まれているかを検証する。一方で、Nanog遺伝子だけでなく、マウスES細胞で発現する種々の遺伝子にも解析を行うために、多数のROLEXシステムに対応したノックイン細胞の樹立を進めている。今後これらの細胞株に関して解析を進める予定である。昨年度までに内在遺伝子の転写と核内配置の同時可視化システムを確立し、それを利用した解析からNanog遺伝子の確率的な転写活性化には、Nanog遺伝子と複数の遠方ゲノム領域との不安定な相互作用が関係していることを示唆する結果を得た(Ochiai et al., NAR, 2015)。今年度はさらに、これらNanog遺伝子と相互作用する領域に、Nanogの上流転写因子であるSox2の結合サイトが多く含まれていることを見出した。当初想定した内容以上の発見があったことから、計画以上に進展していると言える。細胞核内では各染色体が完全に混ざりあうこと無く個々の領域を保ち、DNAや核内タンパク質からなる核内構造体が不均一に分布している。本研究では、1)内在遺伝子の転写と核内配置の同時可視化システムを確立し、2)本システムを利用してマウス胚生幹細胞における遺伝子発現量の不均一性の発生メカニズムの解明を目指す。一昨年度までに1)のシステム、Real-time Observation of Localization and EXpression (ROLEX)システムを確立し、それを利用した解析からNanog遺伝子の確率的な転写活性化には、Nanog遺伝子と複数の遠方ゲノム領域との不安定な相互作用が関係していることが示唆された(Ochiai et al, NAR, 2015)。また、これらNanogと相互作用する領域に密集したSox2クラスターを形成することが報告されている。

HHMI Janelia CampusのZhe Liu博士はこれまでに生きたマウスES細胞内で、Sox2クラスターを可視化する技術を確立している。Zhe Liu博士と共同で、Nanogの上流転写因子であるSox2の細胞内クラスターとROLEXシステムを利用してNanog遺伝子の転写と核内局在のライブイメージングを行ったところ、Nanogの転写時にSox2クラスターがNanog領域により近傍に位置する傾向があることがわかった。このことから、Nanog遺伝子領域の空間的な異質性が発現量に影響を与えている可能性が示唆された。細胞核内では各染色体が完全に混ざり合うこと無く個々の領域を保ち、DNAや核内タンパク質から成る核内構造体が不均一に分布している。また、特定の遺伝子の発現には、プロモーターと遠方の転写調節領域の相互作用が影響することが知られている。しかし、染色体や核内構造体の空間配置は細胞分裂ごとにランダムに決まり、また間期において動的に揺らいでおり、細胞間で遺伝子発現制御能の多様性を生む要因となり得るが、技術的困難が多く、詳細は不明である。本研究では、内在遺伝子の転写と核内配置の同時可視化システムを確立し、本システムを利用してマウス胚性幹細胞における遺伝子発現量の不均一性の発生メカニズムの解明をめざす。NanogとOct4に関しては3C関連技術を利用して、染色体内または染色体間相互作用がすでに報告されている(Apostolou et al., Cell Stem Cell, 2013; Wei et al.,Cell Stem Cell, 2013)。そこで、遺伝子の細胞核内挙動と細胞間での発現量不均一性の関係について洞察を得るために、NanogまたはOct4領域とその相互(または非相互)作用領域を同時に可視化し、それらの挙動と転写ダイナミクスを解析する。Nanogと相互作用するゲノム領域中のSox結合サイトがNanogの発現に重要であるかどうかを調べるために、これら領域にdCas9を結合させ、Nanog遺伝子の発現にどのような影響が見られるのか調べる。分子生物学
選択問題に対する数理統計的アプローチ

幾つかのグループから一つを何らかの基準に照らして選ばなければならない状況はよく起こる.この選択が、実験、調査等のデータにもとづいてなされるとき、最良母集団の選択という。この研究では、次の3つの選択問題に対する新たな手法を開発した。1.標準値、又はコントロールがある場合の最良母集団の選択2.データ間に相関がある場合の最良母集団の選択3.最良母集団の選択後、その母数の推定幾つかのグループから一つを何らかの基準に照らして選ばなければならない状況はよく起こる.この選択が、実験、調査等のデータにもとづいてなされるとき、最良母集団の選択という。1.標準値、又はコントロールがある場合の最良母集団の選択2.データ間に相関がある場合の最良母集団の選択3.最良母集団の選択後、その母数の推定1.標準値がある場合の最良正規母集団の選択k個の正規母集団の母平均(未知)の中で標準値を超える母平均があれば、その中で最大の母平均を持つ母集団を選択する問題をIndifference-zone approachを用いて研究を行った。母分散が異なる場合を取り上げ、確率要求を満たす選択方法の研究を行った。母分散の値が既知の場合と未知の場合について、Rinott、Lam、Dudewicz and Dalalの方法にもとづく選択方法(母分散の値が未知の場合は2段階選択法)の研究、特に確率要求を満たすのに必要な標本数の比較を行った。その結果、Dudewicz and Dalalの方法が最適(必要な標本数が最小)であるが、Lamの方法との差はそれほど大きくないこともわかった。2.多変量正規分布の平均ベクトルの最良成分の選択多変量正規分布の平均ベクトル(未知)の中で、最大の成分(最良成分)を選択する問題をIndifference-zone approachを用い、共分散行列が未知である場合について研究を行った。選択方法としては、n個の標本を抽出し、その平均ベクトルを求め、その成分が最大となる成分を最良成分とする選択方法を採用する。このとき問題になるのは、標本数nを確率要求を満たすように定めることである。共分散行列が未知であるとき、標本数nを予め固定すると、確率要求を満たすことができないことが分かっている。そのため2段階選択法が提案されている。本研究においては、その選択方法を改良するために3段階選択法を提案し、その特性、特に必要な標本数の比較を行った。その結果、3段階選択法は、従来の2段階選択法を改良することがわかった。1.コントロールがある場合の最良正規母集団の選択いくつかの正規母集団の母平均(未知)の中でコントロール集団の母平均(未知)を超える母平均があれば、その中で最大の母平均を持つ母集団を選択する問題をBechhofer and TurnbullのIndifference-zone approachを用いて研究を行った。母分散が未知で異なる場合を取り上げ、確率要求を満たす選択方法の研究を行った。、RinottとDudewicz and Dalal二段階法を用いて選択方法の構成を行った。それらの標本数の特性を比較するために漸近的な方法を用いた。その結果、Dudewicz and Dalalの方法の方がRinottの方法に比べて標本数が少ないことがわかった。更に、その差の数値的評価も行った。その結果から、その差はそれほど大きくないこともわかた。2.最良母集団の選択とその母平均の推定いくつかの正規母集団の母平均(未知)の中で最大の母平均を持つ母集団を選択する。ただし、その母分散の値は未知であるが等しいとする。最良母集団をBechhoferのIndifference-zoneapproachを用いて選択した後その母平均を同じデータを用いて区間推定(長さ一定の信頼区間)したい場合がある。このとき、最良母集団の選択に関する確率要求と信頼区間の信頼度という2つの要求を満たすことが必要になる。二段階法を用いてこれら2つの要求を満たす選択方法と推定方法の構成を行った。更に、その標本数の特性を漸近的な方法を用いて調べた。その結果、一次の漸近有効性を満たすことがわかった。共通の分散に関して既知の下限を仮定できれば、2次の漸近有効性を満たすこともわかった。1.最良母集団の選択とその母平均の推定(1)分散は異なる前年度引き続き、いくつかの正規母集団の母平均(未知)の中で最大の母平均を持つ母集団(最良母集団)を選択し、かつその母平均の信頼区間を構成する問題を研究した。ただし、母分散は未知で異なるとした。この場合Dudewicz and Dalalの方法を適用し、最良母集団の選択に関する確率要求と信頼区間の信頼度という二つの要求を満たす手法を構成した。最良母集団の選択には、BechhoferのIndifference-zone approachを用いて行った。しかし、その方法では、母数がIndiference-zoneに属するとき、最良母集団を正しく選択しているかどうかは分からない。そこで、Confidence statementapproachがこの場合に適用可能かどうかについて、まず等分散の場合について研究を行った。Confidence statementapproachその結果、従来知られている、Indifference-zone approachとConfidence statementapproachで要求が満たされれば、Indifference-zone approachでの上記の二つの要求が満たされることが分かった。この結果、Confidence statement

approachで標本数を決めれば、Indifference-zone approachで、母数がIndiference-zoneに属するときについても保証が可能となった。2.多変量正規分布の成分の選択多変量正規分布の最良成分の選択問題で、一つの成分がコントロールである場合に、Bechhofer and TurnbullのIndifference-zone approachを適用し、条件を満たす標本数を二段階手法を用いて求めた。まず、分散・共分散行列が既知の場合について、確率要求を満たす標本数を決定した。次に分散・共分散行列が未知の場合に、構造が仮定できる場合とそうでない場合について、確率要求を満たす標本数を二段階法を用いて決定した。更に、二つの手法の標本数の比較を行ったところ、分散・共分散行列に構造が仮定できれば、一般の場合に比べて、標本数は少なくてすむことが分かった。
酵母脂肪酸不飽和化酵素遺伝子群の発現制御メカニズムの解明

1)S. kluyveriの3つの脂肪酸不飽和化酵素遺伝子は全て不飽和脂肪酸には応答しないことが明らかとなった。2)S. kluyveriの3つの脂肪酸不飽和化酵素遺伝子は全て、低酸素環境下で転写発現が変化し、そのパターンは遺伝子毎に異なることが明らかとなった。3)Sk-FAD2、Sk-FAD3遺伝子の低温に対する応答はそれぞれ単独で一過的な増加とその後の減少が起こるのに対し、Sk-OLE1遺伝子は低温ストレスだけでなく、細胞内で合成される不飽和脂肪酸の状況やそれらを構成成分とする細胞膜の状況に応じてその転写量が増加していることが示唆された。4)Sk-OLE1遺伝子の上流228-172bpの間に低温誘導に必要な領域が存在していることが示唆された。また、この領域内にはSTRE(stress response element)と呼ばれている5'-CCCCT-3'という短い配列が含まれており、STREがSk-OLE1遺伝子の低温ストレス誘導に関与している可能性も考えられた。5)Sk-FAD2遺伝子の上流326-209bpの問に低温誘導に必要な領域が存在していることが示唆された。この領域内にはT-rich領域がみられたが、Sk-FAD2遺伝子の上流228-172bp内と共通する配列はみられなかった。6)Sk-FAD3遺伝子の上流207-145bpの問に低温誘導に必要な領域が存在していることが示唆された。この領域内にはCCAAT配列がみられたが、Sk-OLE1遺伝子やSk-FAD2遺伝子の上流の低温応答領域と共通する配列はみられなかった。以上の研究成果により、酵母S. kluyveriのストレス応答機構の一角が明らかとなった。酵母S.kluyveriがどのようなストレス環境に置かれた時に脂肪酸不飽和化酵素遺伝子群(Sk-OLE1、Sk-FAD2、Sk-FAD3)の転写発現が応答するのか、そしてそれらの転写発現制御に関わるDNA領域(シス因子)はプロモーター領域上のどこに存在するのかを明らかにするために研究を行った。先ず、ストレス環境下における脂肪酸不飽和化酵素遺伝子群の転写発現解析を行った。(1)培地中への不飽和脂肪酸添加、(2)低温ストレス、(3)低酸素状態の3つの環境条件下でのS.kluyveriの3つの脂肪酸不飽和化酵素遺伝子群の転写発現解析を詳細に解析したところ、全ての遺伝子が(1)の条件では応答はみられず、(2)の条件ではSk-OLE1とSk-FAD2が2時間後に、Sk-FAD3は6時間後に発現量が最大となるよう誘導されることがわかった。(3)の条件では、Sk-OLE1とSk-FAD2は6時間後に発現量が最大となるよう誘導されるが、Sk-FAD3は時間の経過とともに発現量が一過的に減少することがわかった。さらにS.kluyveriのFAD2やFAD3の破壊株を作製して、(2)の条件下での転写発現を解析した結果、Sk-FAD2またはSk-FAD3の発現変動は野生株と変わらないが、Sk-OLE1は各破壊株で違いが認められ、上記の3つの遺伝子は各々が異なる発現制御を受けていること、そしてSk-FAD2とSk-FAD3は低温ストレスに対して一次的に応答するが、Sk-OLE1は低温ストレス後の細胞の状態、特に細胞膜の状態を感知して二次的にも応答することが分かった。次に、S.kluyveriの脂肪酸不飽和化酵素遺伝子の発現制御領域の特定のために、β-ガラクトシダーゼ遺伝子をレポーターとしたSk-OLE1プロモーター発現解析ベクターを作製し、発現系を構築した。

そこで、PCR法を利用して作製したSk-OLE1の部分欠損プロモーターとβ-ガラクトシダーゼ遺伝子を結合した遺伝子の発現解析を行ったところ、翻訳開始点の上流-141まで削除したプロモーターでは、転写発現誘導がほとんど認められないことがわかった。-150から-141の領域にはS.cerevisiaeの低温応答配列と類似した配列があることから、S.kluyveriがでもこの領域がOLE1の転写発現誘導に関わっている可能性が示唆された。生物の有する恒常性のひとつとして様々な環境条件に適応すべく、自らの細胞膜組成を変化させて膜の流動性を維持することが挙げられる。この細胞膜の組成変化の中で脂肪酸の不飽和化反応による変化は、細胞膜の機能に深く関わる流動性を劇的に変えるため、生物において重要な反応の1つである。そこで本研究では、温度、溶存酸素量などの生育環境の変化における脂肪酸不飽和化酵素退伝子群(Sk-OLE1、Sk-FAD2、Fk-FAD3)の発現制御メカニズムを詳細に明らかにする。昨年度の研究において、S.kluyveriの3つの脂肪酸不飽和化酵素遺伝子は全て不飽和脂肪酸には応答しないことがわかり、また、これら3つの遺伝子は全て低酸素環境下で転写発現が変化し、そのパターンは遺伝子毎に異なることも明らかにした。更に遺伝子破壊株を用いた研究でSk-FAD2、Sk-FAD3遺伝子の低温に対する応答はそれぞれ単独で一過的な増加とその後の減少が起こるのに対し、Sk-OLE1遺伝子は低温ストレスだけでなく、細胞内で合成される不飽和脂肪酸の状況やそれらを構成成分とする細胞膜の状況に応じてその転写量が増加していることが示唆される結果を得た。そこで平成18年度は、平成17年度の研究成果をもとに、低温環境下におけるS.kluyveriの脂肪酸不飽和化酵素遺伝子群の発現制御領域(シス因子)の特定を中心に研究を行った。その結果、Sk-OLE1遺伝子の上流228-172bpの間に低温誘導に必要な領域が存在していることが示唆され、また、この領域内にはSTRE(stress response element)と呼ばれている5 '-CCCCT-3'という短い配列が含まれていることがわかった。このことからSTREがSk-OLE1遺伝子の低温ストレス誘導に関与している可能性も考えられた。Sk-FAD2遺伝子については、この道伝子の上流326-209bpの間に低温誘導に必要な領域が存在していることが示唆された。この領域内にはT-rich領域がみられたが、Sk-FAD2遺伝子の上流228-172bp内と共通する配列はみられなかった。そして、Sk-FAD3遺伝子に関しては、Sk-FAD3遺伝子の上流207-145bpの間に低温誘導に必要な領域が存在していることが示唆され、また、この領域内にはCCAAT配列がみられた。しかしながら、Sk-FAD3遺伝子の転写誘導街域には、Sk-OLE1遺伝子やSk-FAD2遺伝子の上流の転写誘導街域と共通する配列はみられなかった。
体細胞の細胞周期とその制御機構-RCC1-RanGTPaseの解析を中心として-

1)RanGAP蛋白質の機能解析:分裂酵母のhistone H3と動物のヒストンを用いてRanGAPとの結合性をしらべたところ、histone H3のC端とRanGAPは結合した。この結合によりRanGAPの活性は完全に阻害された。そして、RanGAP/Sprna1p温度感受性変異のサプレッサーとして分離された、Histone H3-K9 methyltransferase Clr4がこの阻害を完全に回復させる事が生化学的に証明された。In vivoにおいても、ヒストンH3の強発現はclr4遺伝子欠損株では致死となったが、野生株では致死とはならなかった。さらに、興味あることにはRanGAP蛋白質がそれ自体でRan非依存的にClr4のHistone H3-K9 methyltransferase活性を促進した。これらの結果はRanGAPがヘテロクロマチン形成に関わっている事を強く示唆する。2)SpSnf2複合体を酵母より抽出し、Ranによる機能制御の有無をしらべる。【○!3】Clr4とSrSnf2以外にSerine/threonine kinase SpKsp1pが分離されている。このキナーゼとRanとの関連を調べる。3)出芽酵母Ran/Gsp1温度感受性変異株においてはDNA障害チェックポイント機構が活性化されており、野生型で致死である、MEC遺伝子欠損がこの株では致死とならなかった。この結果はRan cycleの新たな機能を示唆する。4)Mog1蛋白質の温度感受性変異株を分裂酵母を用いて作成し、そのサプレッサーを分離した結果、多数のNTF2が分離された。この結果はMog1蛋白質とNTF2蛋白質の機能的相関を強く示唆する。5)RCC1遺伝子に温度感受性変異を持つマウスは発生初期の卵割期に染色体凝縮を起こして死んだ。この結果、培養細胞での表現型が実際の動物体においても証明された。(1)RCC1とクロマチンとの結合に関与する蛋白質の同定。(1)クロマチン蛋白質複合体を分離し、RNA helicase AがRCC1と複合体を形成していることが判明。RCC1のGDP/GTP交換活性とRNA helicaseAのヘリケース活性との間になんらかの機能的相関がある。(2)RCC1を用いたTwo-Hybrid法でヒトcDNAを検索したが新たな蛋白質は同定できなかった。(2)Ran機能の解明。(1)核細胞質間物質輸送:MOG1遺伝子の欠損を抑圧する遺伝子として脂質合成において重要な機能を持つOP13が同定された。Op13pは核膜に高濃度に存在する。(2)微小管形成:RanBPM cDNAの全長をクローニングした。新たに作成した抗RanBPM抗体はセントロソームを染めず、RanBPMと微小管形成の相関は疑わしくなった。(3)リボソームRNA代謝:出芽酵母dis3変異株とgis1変異株を比較してRanがリボソームRNA代謝に関与していることがほぼ確立した。(3)出芽酵母Ran相同体GSP1の温度感受性変異株の解析により新たなRan機能が示唆されている。(4)Gtr1p/Gtr2pサイクルのヒト相同体であるRagA,B,C,Dの解析を行った。RagA-GTPと特異的に結合する蛋白質が同定された。(5)温度感受性変異を持つマウスの作成。DBX(Dead Box X isoform,helicase like protein2)をコードするcDNAが新たに分離したBHK21株温度感受性変異株ET24を相補する事が判明した。(1)BHK21細胞より新たに分離した温度感受性変異株ET24の変異遺伝子、X染色体のDED1類似RNAヘリケース,DBX(Dead Box X isoform)を同定した。(2)温度感受性変異を持つマウスの作成。DAD1:温度感受性DAD1遺伝子をDAD1遺伝子を破壊したES細胞に挿入する段階。RCC1:RCC1遺伝子を破壊したES細胞ができた。(3)Ran GTPaseネットワークの機能。(1)RCC1のGEF活性がカフェインにより阻止されることが判明。(2)分裂酵母より14個の変異部位が相互に異なるRCC1温度感受性変異株を分離した。これらのRCC1変異のサプレッサー遺伝子の分離を進めている。(3)完全長RanBPM(分子量90kDa)をコードするcDNAを分離した。完全長RanBPMは過剰発現により微少管ネットワークを破壊せず、セントロソームに局在しないことからRanBPMが微少管形成に関与すると言う仮説を訂正した。(4)出芽酵母のRan相同体Gsp1pの温度感受性変異株がExosomeによるrRNA processingの段階に欠陥を持つことからRanがExosome活性を制御していることを示唆した。(5)Gsp1の温度感受性変異株がDNA傷害チェックポイントコントロールに欠損があることが判明。(6)RanGTPaseサイクルと拮抗するGtr1/Gtr2サイクル。RagA-GTP型に特異的に結合する蛋白質No.227とrRNAプロセッシングとの相関が明らかとなりつつある。(1)BHK21細胞より分離した温度感受性変異株ET12の変異遺伝子としてAlanyl tRNA synthetaseを同定した。この変異によりubiqutin依存蛋白質分解が亢進した。(2)RCC1遺伝子に温度感受性変異を持つマウス株の作成。

来年度早々には完成するまできた。(3)Ran GTPaseネットワークの機能。(1)RCC1とcaffeineの相関からATR活性の阻害因子としてadenine,2'-dAを新たに発見した。(2)分裂酵母RanGAP1の温度感受性変異のサプレッサーとしてHistone H3-K9 methyltransferaseとATP依存ヘリケースSNF2が分離された。(3)先の結果に一致してRanの欠損、RanGAP1の欠損がヘテロクロマチン構造を緩めることが判明した。(4)出芽酵母mec1欠損の致死性を出芽酵母Ran遺伝子変異gsp1がTEL1遺伝子依存性に回復させることが判明した。以上の結果を総合するとRCC1-Ranサイクルと細胞周期制御機構との密接な相関があらためて浮き彫りとなりつつある。(3)Ranサイクルと拮抗する新たなG蛋白質Gtr1/Gtr2とrRNA代謝との関連はいよいよ明らかになってきており、何故に出芽酵母のRCC1変異をGtr1/Gtr2欠損が相補したのか興味がでてきた。(4)Ran結合蛋白質として分離されたRanBPMの結合蛋白質としてTwa1p, Muskelinを同定した。1)RanGAP蛋白質の機能解析:分裂酵母のhistone H3と動物のヒストンを用いてRanGAPとの結合性をしらべたところ、histone H3のC端とRanGAPは結合した。この結合によりRanGAPの活性は完全に阻害された。そして、RanGAP/Sprna1p温度感受性変異のサプレッサーとして分離された、Histone H3-K9 methyltransferase Clr4がこの阻害を完全に回復させる事が生化学的に証明された。In vivoにおいても、ヒストンH3の強発現はclr4遺伝子欠損株では致死となったが、野生株では致死とはならなかった。さらに、興味あることにはRanGAP蛋白質がそれ自体でRan非依存的にClr4のHistone H3-K9 methyltransferase活性を促進した。これらの結果はRanGAPがヘテロクロマチン形成に関わっている事を強く示唆する。2)SpSnf2複合体を酵母より抽出し、Ranによる機能制御の有無をしらべる。【○!3】Clr4とSrSnf2以外にSerine/threonine kinase SpKsp1pが分離されている。このキナーゼとRanとの関連を調べる。3)出芽酵母Ran/Gsp1温度感受性変異株においてはDNA障害チェックポイント機構が活性化されており、野生型で致死である、MEC遺伝子欠損がこの株では致死とならなかった。この結果はRan cycleの新たな機能を示唆する。4)Mog1蛋白質の温度感受性変異株を分裂酵母を用いて作成し、そのサプレッサーを分離した結果、多数のNTF2が分離された。この結果はMog1蛋白質とNTF2蛋白質の機能的相関を強く示唆する。
葉緑体ＡＴＰ合成酵素の酸化ストレスによる失活の分子機構とその防御

活性酸素(ROS)ストレスで特異的に攻撃される葉緑体ATP合成酵素の生化学的な解析により、ROSによって攻撃される部位がγサブユニット上の複数のメチオニン残基であることが明らかにされている。このメチオニン残基の近傍は、γとβの相互作用領域と想定されるため、この近傍のアミノ酸にCys置換を行って分子間架橋を可能にすること、および、側鎖の大きなアミノ酸に置換して空間的な制約を与えることなどにより、γの特徴的な制御である酸化還元制御に影響のあるアミノ酸残基の特定を試みた。その結果、立体構造上特定の位置関係にあるβとγのアミノ酸の間で、特異的に分子間架橋が可能なこと、および、この架橋がγの酸化還元に影響されることが分かった。上述のROS感受性に関与するアミノ酸領域におけるβサブユニットとγサブユニットの相互作用が、この酵素の活性制御に最も基本的に役割を果たしているADP阻害機構を制御すること、および、酸化による酵素活性の抑制に深く関与していることが明らかになった。中でも、βサブユニットのDELSEED領域と呼ばれる分子下部に位置する領域は、γサブユニットのネック領域との相互作用をしており、複数のアミノ酸がこの相互作用に関与していることが明らかになった。26年度が最終年度であるため、記入しない。高等植物葉緑体が活性酸素(ROS)ストレスを受けたときに、ATP合成酵素が特異的に攻撃を受けることが明らかになっている。さらに、ROSによって攻撃される部位が、γサブユニット上の複数のメチオニン残基であることが明らかにされている。このメチオニン残基の分子内の位置は、α3β3六量体の形成するリングの入り口付近のγの接触面に近く、両者の相互作用が影響を受けることが考えられるが、その分子的な実体はまだ明らかではない。この分子の接触面の詳細を調べることを目的として、シアノバクテリアATP合成酵素複合体発現系を利用して、ROS攻撃部位の詳細な検証、攻撃部位アミノ酸への変異導入による耐性付与の可否、1分子回転観察系を用いた酵素の挙動を調べ、葉緑体型ATP合成酵素のROSによる不活性化の分子機構を明らかにすることを目指して研究を実施した。初年度は、γサブユニット上のROS感受性アミノ酸側鎖の特定について、研究を実施した。シアノバクテリアのATP合成酵素発現系を利用して、まず、これまでホウレンソウ葉緑体ATP合成酵素のγサブユニット上の感受性アミノ酸として推定されていたアミノ酸を疎水性アミノ酸に置換した変異体を作成し、酵素活性に対する影響、ROS感受性の変化を調べた。研究の過程で、変異体タンパク質のLDAO感受性が野生型とは著しく異なることを見いだした。LDAO感受性は、酵素のADP阻害の指標となるものであり、今回導入した変異が活性中心のADP阻害感受性に影響している可能性がある。この分子の接触面の詳細を調べることを目的として、本年度は、「γサブユニット上のROS感受性アミノ酸側鎖の特定」について、平成24年度中に作成した変異体タンパク質を用いて、ROS感受性に寄与しているアミノ酸の特定を行った。また、可能性のある部位に追加的に部位特異的変異導入を行い、得られた複合体タンパク質を用いて、生化学的な解析を行った。また、γサブユニットと相互作用することが予想されるβサブユニット上のアミノ酸についても変異導入を行った。これらの変異複合体について、1分子回転観察系を用いた酵素の挙動を調べた。その結果、上述のROS感受性に関与するアミノ酸領域におけるβサブユニットとγサブユニットの相互作用が、この酵素の活性制御に最も基本的に役割を果たしているADP阻害機構を制御することがわかった。また、この領域の相互作用が、酸化還元制御のような他の制御機構にも深く関与していることが明らかになった。

初年度は、シアノバクテリア複合体酵素に、葉緑体レベルで明らかになっている標的メチオニンの変異導入を行い、酸化ストレス感受性の変化を調べることを目的としており、変異体の作成、解析について予定通り進行している。2年度は、シアノバクテリア複合体酵素に、ROS感受性の付与に直接関与するγサブユニット上のアミノ酸残基の特定を行い、これに関連するβサブユニット上の残基も特定することが出来た。変異を導入した複合体の生化学的解析も順調に進行しており、7月の国際会議で成果を発表する予定である。酸化ストレス耐性の付与については、さらにアミノ産地間を検討する必要がある。また、今回の研究でADP阻害感受性の変化が見られたので、その原因を探る研究を進める。さらに、ATP合成酵素複合体(FoF1)における変異の影響にも研究を展開することを計画している。今回の研究により、ROS感受性に関わる領域がADP阻害にも関与することや、酸化還元制御にも関与することを明らかにすることが出来たので、その詳細について1分子解析を含めて解明することを計画している。
日仏における契約法のグローバル化と民法理論の変容に関する比較法的検討

本研究の目的は、民法が契約法のグローバル化に従って改正されたことを背景に、民法の基礎理論がどのように変容しているかを明らかにし、将来の民法のあるべき姿を探究するものである。例えば、わが国の債権法改正においては、ローマ法以来の法格言である1「何人も不能な債務に拘束されない」、および、2「物の滅失は所有者の責任に帰する」が否定された。その影響は大きく、危険負担や契約解除権等の法的構成にも影響を及ぼし、他国にない制度を設けている。そこで、これらの原則を大きな民法改正(2016年2月10日)の後も維持しているフランスと比較し、その当否も含めて、今後の民法の基礎理論のあるべき姿を明らかにする。
霊長類の社会構造の進化に環境と系統が与える影響

本年度は、これまでの調査成果のまとめに重点を置き、森林伐採がニホンザルの密度と食物利用可能性に与える影響についての論文、ニホンザルと鳥による種子散布についての論文を学術雑誌に発表した。また、8月に札幌で行われた国際哺乳類学会に出席し、ニホンザルの密度の決定要因についての研究を発表した。この研究についてまとめたものを学術雑誌に投稿し、出版が決定している。また、屋久島のニホンザルの標高による行動的体温調節の変異、食物条件・食物競合・社会関係の変異について2本の論文にまとめ、現在学術雑誌に投稿中である。8月に屋久島で野外調査を行い、ニホンザルの人口学的資料を収集するとともに、植生や結実量などに関する、生息環境の年変動の調査を行った。また、これまで申請者がニホンザルを対象に行ってきた研究成果を他種と比較する目的で、海外での短期間の野外調査を行った。まず、モロッコのバーバリマカク生息地を10月に訪問し、現地研究者と協力して生息地内の主要な樹種の葉を採取した。これらの葉は日本で栄養とタンニン分析を行った。申請者は屋久島で同様に葉の債主と栄養とタンニンについての実験を行っており、ニホンザルとバーバリマカクの生息環境、食性、葉の栄養・タンニン成分について、モロッコとフランスの研究者との共同で比較を行う予定である。また、マレーシア・ボルネオ島の熱帯雨林に生息する、ニホンザルの近縁種であるブタオザルをはじめとする霊長類の調査を行う可能性を探るため、マレーシアを7月3月にそれぞれ1週間から10日程度訪問した。本年度前半は、過去に調査を行った研究成果をまとめ、三本の論文として発表した。第一に、従来のライントランセクト法では組織的な密度調査が難しかった山岳地帯に住む野生霊長類にも適用可能な新しいセンサス法を開発した。第二に、野生ニホンザルの採食行動の年齢差を明らかにした。第三に、屋久島上部域におけるニホンザルの食性を調べ、この地域のニホンザルが非常に繊維性の食物に依存していることを明らかにした。また、これらの論文の執筆と並行して、ニホンザルの食物の栄養分析の実験を行った。また、本年度7月からは屋久島の上部、瀬切川・大川上流の標高1000m付近の地域でニホンザルの野外調査を行い、以下の資料を収集した。ニホンザルを7月および9月に捕獲し、温度計を装着した。8月にボランティア学生を募って一斉調査を行い、地域内の集団密度と複数の群れの構成を調査した。9月にはニホンザルの食物となる果実の結実量を調査した。10月以降はニホンザルの行動観察を行った。社会行動を観察し、メス間の順位、毛づくろいや抱きあいなどの親和的交渉、威嚇などの敵対的交渉の頻度とその相手を記録した。また、採食行動も同時に観察し、食物摂取量と同時に採食している個体を記録した。ニホンザルの温度環境を15分に1回記録した。これらの行動観察に並行して、結実フェノロジーの調査、生息環境の温度などの微気候の調査、脂肪を分解すると生成されるケトンの尿中の濃度を調査した。これらの資料をもとに、この地域のニホンザルの社会行動のパターンと食物をめぐる競合関係、ニホンザルの食物環境と栄養収支の季節変化の対応、ニホンザルの行動的な体温調節法についてまとめる予定である。本年度は、過去に調査を行った研究成果をまとめ、三本の論文として発表した。第一に、屋久島海岸部のニホンザルで発生した大量死についてまとめた。第二に、屋久島上部域のニホンザルの活動時間配分の季節変異を引き起こす環境要因についてまとめ、体温調節のコストが気温と同程度の影響を与えていることを明らかにした。第三に、屋久島のニホンザルの標高による密度の変異と、その環境要因についてまとめ、年間の総果実生産量が密度を決定していることを明らかにした。また、これまでに収集した資料をもとに、屋久島海岸部と上部域の群れについて、生息環境・食物競合のパターン・社会関係を分析して比較した。その結果、上部域では採食パッチが小さいために群れ内での食物競合が起こりやすい一方、海岸部では単位面積あたりの果実生産量が多いため、遊動域の価値が高く、海岸部では群れはそれを防衛するために群れ間関係は敵対的であることがわかった。これらの競合のパターンの違いにもかかわらず、社会生態学の理論が予想するような社会行動の変異は見られず、社会行動は個体群内で安定であることが分かった。この論文は、現在投稿準備中である。これは、ニホンザルの食物競合の結果、個体間の食物摂取量がどのように異なるかを栄養学的に明らかにすること、およびニホンザルの食物選択の基準を化学的に明らかにすることを目的として行っている。結果の分析は、来年度行う予定である。

また、これまで申請者がニホンザルを対象に行ってきた研究成果を他種と比較する目的で、海外での短期間の野外調査を行った。まず、モロッコのバーバリマカク生息地を10月に訪問し、現地研究者と協力して生息地内の主要な樹種の葉を採取した。これらの葉は日本で栄養とタンニン分析を行った。申請者は屋久島で同様に葉の債主と栄養とタンニンについての実験を行っており、ニホンザルとバーバリマカクの生息環境、食性、葉の栄養・タンニン成分について、モロッコとフランスの研究者との共同で比較を行う予定である。また、マレーシア・ボルネオ島の熱帯雨林に生息する、ニホンザルの近縁種であるブタオザルをはじめとする霊長類の調査を行う可能性を探るため、マレーシアを7月3月にそれぞれ1週間から10日程度訪問した。
上皮細胞における細胞増殖とシグナル伝達の解明

細胞接着は組織や器官の構築において基本となる重要な現象であり、単に細胞同士の接着のみならず細胞の増殖、極性、運動等の様々な重要な細胞機能に必須の役割を担っている。その中で、細胞の接着と増殖の制御機構の間には両者の綿密なクロストークが存在し、細胞増殖が厳密に調整されており、このような細胞接着と増殖の相互制御機構が、生理的には器官形成や創傷治癒の過程に重要であることが分かってきている。さらにその破綻は細胞の癌化へと繋がっている。しかし、その詳細な分子機構は依然として不明な点が多く、本研究においては、その解析を行っている。本年度の実績の概要は以下のようである。1) IQGAP3の組織・細胞内での機能解析以前の研究により、酵母におけるそのホモログは、細胞分裂に機能することが示唆されている。また我々の研究結果より、哺乳類においてIQGAP3は細胞の増殖に関与することが示唆された。そこで、さらに詳細を調べたところ、細胞分裂への関与が認められた。また肝臓の発生・再生時にIQGAP3が深く関与していることを発見し、論文として報告した。2)IQGAP3コンディショナル・ノックアウトマウスの作成IQGAP3コンディショナル・ノックアウトマウス作成の為、以前、ES細胞にてgene targetingを行い、複数個の有望なクローンを得ていた。そのES細胞を用いて、キメラマウスの作成を行い、キメラ率の高いキメラマウスを得た。さらにそのマウスよりヘテロのマウスが得られている。今後は、さらにかけ合わせを重ねることにより、将来的にコンディショナル・ノックアウトマウスを得るように進めている。さらかその破綻は細胞の癌化へと繋がっている。本年度の研究実績の概要は以下のようである。1、IQGAP3の細胞内での機能解析以前の研究により、IQGAP3は細胞の増殖に関与することが示唆されていた。さらにその下流のシグナルを明らかにすべく、研究を進めた結果、癌遺伝子であるRasとの関与が認められ、Rasの活性化を調節する機能を有することが示唆された。今後はさらにこの点について解析を進める予定である。また、細胞を用いた栄養飢餓状態からの回復過程におけるIQGAP3の役割について形跡を進めている。2、IQGAP3ノックイン・ノックアウトマウスの作成IQGAP3ノックアウトマウス作成の為、以前、ES細胞にてgene targetingを行い、複数個の有望なクローンを得ていた。さらかそのマウスよりヘテロのマウスが得られている。今後は、さらにかけ合わせを重ねることにより、将来的にノックアウトマウスを得るように進めている。
真核・原核両細胞で機能するCandida酵母のICLプロモーターの基礎解析

真核細胞であるSaccharomyces cerevisiaeと原核細胞であるEscherichia coilの双方で酢酸を炭素源とした場合に遺伝子の誘導発現を促す酵母Candida tropicalisのイソクエン酸リアーゼ(ICL)遺伝子の上流領域の機能解析を行った結果得られた知見を以下に示す。1.Dideoxy法を用いてICL遺伝子の開始コドンより上流の領域1530bpの全塩基配列を決定した。2.PCR法などを用いてICLプロモーターの様々な領域を欠失させたものを作製し、それぞれをS.cerevisiae、E.coli内に導入した。導入した各株をグルコースおよび酢酸を炭素源として培養し、ICL遺伝子の発現量を調べた。この結果、ICL遺伝子上流領域の中にS.cerevisiae内で機能するプロモーター(proA)とE.coli内で機能するプロモーター(proB)がそれぞれ独立して存在していることがわかった。それぞれのプロモーターの塩基配列を調べると、proAはS.cerevisiaeのグルコースレプレッションに関わりのあるMIG1タンパク質のDNA結合領域と高い相同性を示し、probはE.coli内のICL遺伝子aceBAKの調節にかかわりのあるlclRタンパク質のDNA結合部位と高い相同性を示した。今までに得られた結果はきわめて興味深く、今後、proA、proBに実際に結合するタンパク質を同定するなど、さらなる解析によりICL遺伝子の転写調節についてだけでなく、原核細胞から真核細胞への転写調節機構の進化についての知見が得られる可能性は高いと言える。
コケ植物における共生現象と共生生物取り込みの多様性の解明

本研究の目的は、コケ植物ツノゴケ類に共生している共生生物(ツノゴケ類の場合は、シアノバクテリアである。)の種多様性とhostとsymbiontを共生状態から分離し、再度共生状態の再構築を行うことによって、共生現象の解明を行うこととした。今研究の進展によって、コケ植物ツノゴケ類に共生しているシアノバクテリアは、1個体に必ずしも1種でないことが明らかになった。この現象は、ツノゴケ類における共生生物の取り込みの多様性であり、従来の研究報告にない新しい知見であった。しかしこの現象は、試料によって1個体に1種の共生藻のみを取り込んでいるものから、2-3種の共生藻を取り込んでいるものまで、さまざまなものが観察されたため、さらに全国各地からPhaeoceros carolinianus,Megaceros fagellarisに着目して試料の採集を行い、共生生物の取り込みの多様性を検討した。その結果、P.carolinianusでは意外と多数の試料で取り込みの多様性が認められたが、M.flagellarisでは稀であることが明らかになった。共生生物取り込みの多様性では、Nostoc sphaericumの他に、Nostoc sp.1,N.sp.2,N.sp.3など形態的に異なる種が分離された。P.carolinianusを用いて共生の再構築を行った。両者の分離に関して、hostは、Knop培地を用いて胞子を発芽させ成熟個体を形成させ、symbiontは、コケの葉状体中に共生している部分から無菌針によって取り出し、MDM培地で培養した。いずれの分離株も良好に増殖した。再合成に際し、培養液を含んだろ紙上に葉状体の一部を置床し、hormogon stageのsymbiontを添加した。少なくとも一週間以内には共生の再構築が開始され、約1ヵ月後には、symbiontの共生部分が肉眼で観察できる段階にまで発達した。また、再構築の各段階に関して組織切片を作製して観察した結果、hormogon状態のsymbiontは、葉状体腹面に存在する小穴から進入し、細胞間隙で増殖することが明らかになった。日本各地及びマレーシアからコケ植物ツノゴケ類4種,15標本を採集した。野外標本を光学顕微鏡で観察した限りでは,ツノゴケ類の葉状体内に共生生物を包みこむcavityが形成されず、細胞間隙に共生生物がコロニーを形成していることが明らかになった。ツノゴケ類の共生生物はシアノバクテリアのNoatoc sphaericumの他に別種のNostoc2種も共生していることが明らかになった。種の分類学的見当は現在進行中である。葉状体内のNostocは,培養した藻体に比較して多数のheterocystを持っていることが明らかになった。これは,heterocystによる空中窒素の固定と関係あると考えられる。ツノゴケ類4種について、胞子をKnop液体培地で培養することによって、symboint-freeの無菌葉状体を得ることに成功した。これらの葉状体は,KnopあるいはBBM寒天平板上で順調に増殖したが,一部の種では硝酸態窒素が利用できず,倍地のpH低下のため増殖が停止するものがあった。これは窒素源をアンモニア態窒素で置き換えることによって解決された。分離されたNostocを培養し,生活史の中のhormogon期を誘導し,Phaeoceros,Megacerosのsymbiont-free