hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
ブナ林の重要な景観要素として捉えるササ群落の光環境順応メカニズム

ブナ林下層を優占するチシマザサを対象とし,異なる樹種の林冠木あるいは林冠ギャップによる異なる光環境に対する順応性を明らかにした。稈の密度とバイオマスでは,ギャップで最も大きく,ブナ林冠下で最も小さく,ホオノキとミズメの林冠下ではその中間であった。そこで,チシマザサの葉面積,葉数,および個葉の光合成速度から稈1本当たりの最大光合成速度を推定したところ,ブナ林冠下で最も小さく,ホオノキ林冠下とギャップ下で差がなかった。こうして異なる光条件に応答し,それが稈の密度とバイオマスの違いを導いていることが示唆された。調査対象のブナ林において,ブナ林冠下,ホオノキ林冠下,および林冠ギャップ下で,チシマザサの稈と葉の追跡調査,個葉の重量と面積の測定,および個葉の光合成速度の測定を行った。調査の結果,以下の点を明らかにした。まず古い稈と新しい稈の入れ替わりでは,ブナ林冠下で最も遅く、ギャップ下で最も早かった。次に古い葉と新しい葉の入れ替わりでも,ブナ林冠下で最も遅く、ギャップ下で最も早かった。推定した個葉の葉面積当たりの最大光合成速度はギャップ下,ホオノキ林冠下,ブナ林冠下の順で高かったが,ブナ林冠下とホオノキ林冠下では有意な差は無かった。個葉の最大光合成速度から稈あたりの最大光合成速度を推定したところ,ギャップ下,ホオノキ林冠下,ブナ林冠下で高かった。しかし,個葉の場合と異なり,ギャップ下とホオノキ林冠下では有意な差が認められなかった。これは,いずれの林冠タイプでも葉数に差はなく,ホオノキ林冠下で個葉の葉面積が有意に大きいことがその理由であった。以上から,葉や稈の寿命と最大光合成能の間にトレードオフの関係が認められ,ギャップ下では光合成能の高い葉と稈を速く入れ替えることで生産を高め、ブナ林冠下では光合成能の低い葉と稈を長く保って生産を維持していると考えられる。ホオノキ林冠下はその中間であり,葉の寿命と光合成能の関係ではブナ林冠下型,稈の寿命と光合成能の関係ではブナ林冠下型であった。本年度の調査研究から,ブナ林では林冠ギャップだけではなくフェノロジカルギャップによる光環境の違いがチシマザサの生理的特性を変化させ,チシマザサはそのような光環境の違いに順応していることが示唆され,ブナ林のササ群落の景観構造にも影響を与えていると考えられる。このようにブナ林特有の光環境の異質性に対してチシマザサの順応メカニズムと景観構造を捉える足掛かりを得ることができた。本年度までの成果で,葉の寿命と生産速度,および稈の寿命と生産速度から,葉の寿命や稈の寿命と生産との関係にはトレードオフの関係があること,その関係が林冠タイプの違いによること,ホオノキ林冠とブナ林冠とで生じる展葉時期の違いによるフェノロジカルギャップが,このような林床のチシマザサの生理生態的特性にも影響を与えていることが示唆された。しかしながら,調査地の地形が急峻なため機器による光合成速度の測定準備に手間取り,光合成速度の測定光合成の測定を9月に1回しか実施できなかった。これによって光環境の違いが9月という季節の光合成にどう反映されているのかはわかったが,目標を達成するためには,林冠木の展葉時期,および落葉時期にも光合成を測定する必要がある。また,葉の色素分析を本年度実施することができず,これについても季節的変化を明らかにする必要がある。これらの点が不十分であるため,本年度の達成度としてはやや遅れていると判断した。本年度は昨年度に引き続き,調査対象林のブナ林において,ブナ林冠下,ホオノキ林冠下,および林冠ギャップ下で,チシマザサの稈の追跡調査,葉の追跡調査,および個葉の光合成速度の測定を行った。まず稈密度について過去の測定データから変化を検討したところ,ブナ林冠下に比べギャップ林冠下では稈の新規加入密度が高く,ギャップの形成が幹密度を高めることが明らかになった。同時にホオノキ林冠下ではもともとブナ林冠下より幹密度が高く,それによって稈の新規加入密度が高かった。継続測定によって葉群の入れ替わりを検討したところ,旧葉数と新葉数の変化から,ブナ林冠下で葉の入れ替わり速度は最も遅く、ギャップ下で最も早いと考えられた。しかし,ブナ林冠下,ホオノキ林冠下,およびギャップでの入れ替わり速度には,有意な差がみられなかった。個葉の最大光合成速度については,昨年度は葉の窒素含有量から光合成速度を推定したが,本年度は実際に光合成速度を測定することによって比較した。光合成速度はギャップ下で最も高く,ブナ林冠下で最も低い傾向があったが,ブナ林冠下とホオノキ林冠下では有意な差は無かった。春先にホオノキ林冠下で生じるフェノロジカルギャップの効果は,個葉レベルの光合成速度には反映されないのかもしれない。今後も測定を継続して確認する必要がある。以上のように林冠の違いによる光環境によって生理生態的特性に違いがみられ,チシマザサはそのような光環境の違いに順応していることが示唆された。しかし,閉鎖林冠下の中でブナ林冠下とホオノキ林冠下の違いは明確ではなかった。

実際に違いがないのかあるのか,今後さらに研究を進めることによって明らかにしていきたい。本年度までの成果で,少なくとも閉鎖林冠下とギャップ下の間で,葉の寿命と生産速度,及び稈の寿命と生産速度から,葉の寿命や稈の寿命と生産との関係にはトレードオフの関係があること,その関係が林冠タイプの違いによることが明らかになった。しかしながら,閉鎖林冠下の中でブナ林冠下とホオノキ林冠下の違いが明確ではなかったため,これについてはもう少し検討の余地が残された。そのため,成果の論文化は閉鎖林冠下とギャップ化の比較でまず始めることになり,現在執筆中であるが遅れている。また,稈密度の変動に関しても現在論文執筆中であるが遅れている。さらに,本年度光合成の測定を5月,8月,および10月に実施したが,昨年度に発生した葉のみの測定であり,葉齢の異なる葉の光合成速度の比較を行うことができなかった。目標を達成するためには,葉齢の異なる葉を対象として光合成速度を測定する必要がある。これらの点が不十分であるため,本年度の達成度としてはやや遅れている。冷温帯落葉広葉樹林のブナ林下層を優占するササ群落は樹木の更新阻害要因として,一方でブナ林の下層景観の重要な要素として重要である。そのため,そうしたササ群落の生育特性を明らかにしておく必要がある。ブナ林では,林冠ギャップだけでなく,様々な林冠優占樹種の葉群フェノロジーが異なることによって生じるフェノロジカルギャップのため林内の光環境は多様であり,下層のササ群落はそれに順応していると考えられる。そこで,本研究は西日本のブナ林とその下層を優占するチシマザサを対象とし,異なる樹種の林冠下あるいは林冠ギャップで光環境を評価し,光環境に対するササ群落の順応性を明らかにすることを目的とした。まず,稈密度と稈バイオマスに対しては,地形要因の影響はみられず,林冠タイプによる光環境の違いが影響を与え,それらの値はギャップで最も大きく,ブナ林冠下で最も小さく,ホオノキとミズメの林冠下ではその中間であった。そこで,ブナ林冠下,ホオノキ林冠下,およびギャップでチシマザサの生産特性の違いを明らかにするため,葉の形態,稈の葉数,および個葉の光合成速度の違いを検討した。光合成に関しては,9月の最大光合成速度と葉内窒素含有量との関係から最大光合成速度を推定した。その結果,単位葉面積当たりの最大光合成速度はギャップ下で有意に最も大きく,ブナ林冠下とホオノキ林冠下では有意差がなかった。一方,葉面積はホオノキ林冠下で最も大きく,ブナ林冠下で最も小さかった。その結果,個葉1枚当たりの最大光合成速度では,ブナ林冠下で最も小さく,ホオノキ林冠下とギャップ下で有意差がなかった。稈1本あたりの葉数では,3つの林冠タイプ下で有意差はなく,したがって,稈1本当たりの最大光合成速度はブナ林冠下で最も小さく,ホオノキ林冠下とギャップ下で差がなかった。こうした生産特性の違いが稈の密度とバイオマスの違いを導いていることが示唆された。ブナ林下層を優占するチシマザサを対象とし,異なる樹種の林冠木あるいは林冠ギャップによる異なる光環境に対する順応性を明らかにした。稈の密度とバイオマスでは,ギャップで最も大きく,ブナ林冠下で最も小さく,ホオノキとミズメの林冠下ではその中間であった。そこで,チシマザサの葉面積,葉数,および個葉の光合成速度から稈1本当たりの最大光合成速度を推定したところ,ブナ林冠下で最も小さく,ホオノキ林冠下とギャップ下で差がなかった。こうして異なる光条件に応答し,それが稈の密度とバイオマスの違いを導いていることが示唆された。
ヌクレオソーム構造による老化応答遺伝子の発現制御

本研究では、ヒト老化細胞において5-ブロモデオキシウリジンがヌクレオソーム構造を変化させるかどうか検証した。ヒト細胞の初期老化応答遺伝PAI-1遺伝子近傍のヌクレオソーム配置を鋭敏に検出するために、精密なヌクレオソーム位置を解析できる「プライマー伸長法」を構築した。マイクロコッカルヌクレアーゼで切断したDNAをプライマー伸長で選択的に合成し、リンカーDNAを結合させてPCRを行うと、バンドが多数出現した。いくつかの改良を施し、特異的なバンドを増幅することにほぼ成功した。検出感度は大幅に改善され、ヒトゲノム上のヌクレオソーム配置(5-7個)を正確に決定できる段階まで達した。ヒト細胞の特定遺伝子についてヌクレオソーム構造を解析するためには、BrdUに直接応答する遺伝子を選択することが必須条件となる。このため、BrdU初期応答遺伝子のプールからいくつかの遺伝子を選び、それらのプロモータ領域にPCRプライマーを設定した。また、ヌクレオソーム構造解析を進めるための、試薬購入、方法の検討などを行った。出芽酵母系で用いた従来法では、細胞核を粗精製し、マイクロコッカルヌクレアーゼでリンカーDNAを部分的に切断する。DNAを精製し、制限酵素で切断し、RI標識したプローブを用いて通常のサザンブロット解析を行うことによって、容易にヌクレオソーム構造を解析できた。しかし、同様な方法により、ヒト細胞のPAI-1遺伝子について、ヌクレオソーム配置の変化を検出したが、多量のDNAが必要であり、検出されたバンドも薄く、感度が(酵母系では感度が4-50倍高い)不十分であると結論された。本研究では、ヒト老化細胞においても、5-ブロモデオキシウリジンがヌクレオソーム構造を変化させるかどうか検証した。具体的には、ヒト細胞の初期老化応答遺伝PAI-1遺伝子近傍のヌクレオソーム配置を鋭敏に検出するために、広範囲のヌクレオソーム配置を解析できる「プライマーPCR法」と精密なヌクレオソーム位置を解析できる「プライマー伸長法」を構築した。とくに、「プライマー伸長法」を重視し、その開発と応用に時間を割いた。マイクロコッカルヌクレアーゼで切断したDNAをプライマー伸長で選択的に合成し、とリンカーDNAを結合させてPCRを行うと、再現性に乏しいバンドが多数出現した。これらの非特異的なバンドをいかにして最小に抑えるかに大半の労力を費やした。最終年度には、いくつかのDNA修飾酵素を用いて、特異的なバンドを増幅することにほぼ成功した。研究は不完全であったが、完成を目指しさらに継続する予定である。予定より若干遅れている。プロトコルを修正し、データ解析の感度を上げることに成功した。今年度より、修士学生の協力が得られるので、研究は進展するものと期待する。院生等の実験協力者の就職活動がおもな原因である。今年度より、博士研究員の協力が得られるので、研究は進展するものと期待する。前年度までの研究成果と反省点に基づき、研究課題の遂行に鋭意努力する。博士研究員や就職活動にとらわれない研究協力者を投入し、研究を推進させる。研究費は研究に必要な物品の購入に充てる。研究計画は申請書の記載に準じる。やや遅れが見られるが、研究目的と研究方法は何ら揺らいでいない。
心筋細胞肥大の情報伝達におけるp300=GATA経路の役割

他の増殖可能な細胞と異なり心筋細胞は様々な刺激に反応して肥大を起し、その集合器官である心臓は収縮機能不全に陥る。心不全は高血圧性疾患、特発性心筋症、虚血性心疾患など種々の心疾患の共通最終像であり、この問題を解決することは臨床的に極めて重要であると考えられる。これまでの研究によると、生体において何らかのストレスが心臓に加わると、交感神経系、レニン・アンジオテンシン系、エンドセリン系などの神経・体液・内分泌因子が作動することが明らかとなってきている。これらの因子は心筋細胞膜に存在するそれぞれの受容体に結合し、種々の細胞質内情報伝達を経て刺激は最終的に心筋細胞核に到達する。そして核内において何らかの転写調節因子が活性化されることにより、心筋細胞は成人型から胎児型へと遺伝子発現パターンを変化させる。これらの変化は種々の因子によって引き起こされる心筋細胞肥大に共通の変化であり、また心筋機能不全と密接に結び付いていることから、この核内情報伝達機構の詳細な解明は心不全の分子細胞レベルでの解明と根本的な治療法の開発に非常に有用である。我々は心筋遺伝子直接注射法を用い成人ラットにおいてin vivo圧負荷に反応するプロモーターエレメントを解析する方法を初めて確立した。そして詳細な検討の結果、肥大における遺伝子発現調節にGATA転写因子群が中心的な役割を果たしていること、転写コアクチベーターであるp300がGATA因子と結合し、相協力して心筋遺伝子の転写に関与していることを見出した。心筋細胞肥大は蛋白合成の量的な増加だけでなく、心筋における遺伝子発現の著明な変化を伴う。これらの変化は心筋機能不全と密接に結び付いており、その発現変化機構の解明は心不全発病の分子細胞レベルでの解明に非常に有用である。我々は、β-ミオシン重鎖、心房性利尿ペプチドやエンドセリン-1遺伝子のプロモータ解析により、肥大における遺伝子発現調節にGATA転写因子群が中心的な役割を果たしていることを見出した。現在GATA転写因子群はGATA-1から-6までがクローニングされている。GATA因子の肥大における調節機構を検討したところ、以下の3つの機序が考えられた。(1)GATA-5の心筋における発現は、胎生初期において認められるが胎生後期から成人においては認められない。我々はGATA-5がβ-ミオシン重鎖プロモータの活性化作用が最も強いこと、新生児培養心筋細胞において肥大に伴ってGATA-5の発現が著明に亢進することを見出した。(2)成人心筋に豊富なGATA-4は肥大に伴ってその発現自身は変化しない。しかし、肥大の過程でGATA-4のセリン残基が燐酸化されることによりそのDNA結合能力が著明に増加すること、その上流にMEK-1/ERK経路が存在することを見出した。(3)転写コアクチベーターであるp300がGATA因子と直接結合する能力を持ち、相協力してこれらの遺伝子の心筋における転写活性亢進に関与していることを見出した。又GATA因子との結合にはp300蛋白のシスチン、ヒスチジンに富む領域(アミノ酸1514-1922)が重要であること、このp300アミノ酸1514-1922は転写活性領域を含んでおらず内因性のp300を抑制するdominant negative変異体として作用することを示した。

これらの因子は心筋細胞膜に存在するそれぞれの受容体に結合し、種々の細胞質内情報伝達を経て刺激は最終的に心筋細胞核に到達する。そして核内において何らかの転写調節因子が活性化されることにより、心筋細胞は成人型から胎児型へと遺伝子発現パターンを変化させる。これらの変化は種々の因子によって引き起こされる心筋細胞肥大に共通の変化であり、また心筋機能不全と密接に結び付いていることから、この核内情報伝達機構の詳細な解明は心不全の分子細胞レベルでの解明と根本的な治療法の開発に非常に有用である。我々は心筋遺伝子直接注射法を用い成人ラットにおいてin vivo圧負荷に反応するプロモーターエレメントを解析する方法を初めて確立した。そして詳細な検討の結果、肥大における遺伝子発現調節にGATA転写因子群が中心的な役割を果たしていること、転写コアクチベーターであるp300がGATA因子と結合し、相協力して心筋遺伝子の転写に関与していることを見出した。
拡張アンサンブル法による蛋白質折り畳み機構の研究

本年度の主な研究成果は以下のとおりである。1.拡張アンサンブル法の一つであるマルチカノニカル法とマルチオーバーラップ法の利点を合体させた、マルチカノニカル・マルチオーバーラップ法を開発した。2.今回開発したマルチカノニカル・マルチオーバーラップ法をアルツハイマー病の原因ペプチドである、アミロイドβペプチドの29番目から42番目のアミノ酸残基に対応するペプチドフラグメント2個の系に適用して、アミロイド形成の初期過程を考察した。2つのペプチドフラグメントが空間的に離れているときは、αヘリックスやβヘアピン構造をしているが、それらが近づいてくると、2次構造がこわされて、βストランド状にまっすぐに伸びた構造が結合して、2本のβストランドが水素結合でβシート構造を作ることが示唆された。アミロイド線維はこのβシート構造が更に結合して形成されると推測された。3.数年前にわれわれが開発した拡張アンサンブル法である、マルチバーリック・マルチサーマル法は、エネルギーと体積の2次元空間でランダムウォークする手法であり、特に、タンパク質の高圧変性を研究するのに適した手法である。我々は、昨年に続き、水中のアラニンジペプチドの系にこの手法を適用して、この系の高圧実験の結果と比較した。今年は、この計算にAMBER99とAMBER96の2つのポテンシャルエネルギーを使った。我々の以前の研究のより、前者はαヘリックスを後者はβシートを作り過ぎる傾向があることが分かっている。ラーマン散乱の実験によって、得られた部分モルエンタルピーや部分モル体積は、ちょうど、これらの2つのエネルギー関数で得られた計算結果の中間にあることが判明した。理想的なエネルギー関数はこれら2つのエネルギー関数の中間的なものに対応することが示唆されたまず、2000年に我々が開発した新しい拡張アンサンブル法を(TIP3Pなどの水分子をあらわに取り入れた)アミノ酸数が十数個の小ペプチド系に適用することによって、広く使われているAMBER、CHARMM、OPLS、GROMOSなどの標準的なエネルギー関数(力場)が蛋白質の立体構造予測が可能な程の精度を持つか否かを調べた。我々の結論は既存のどの力場も完壁なものはないというものであった。そこで、我々は独自の力場パラメターの提案を我が国から初めておこなった。我々は更にタンパク質の折り畳みの遷移状態を詳しく調べることができる新しい拡張アンサンブル法を開発した。拡張アンサンブル法では、平均値は求められるが、分子動力学の情報は失われる。よって、我々は、モードカプリング理論と拡張アンサンブル法を組み合わせた、新しい分子動力学の研究手法も提案した。また、我々は独自に開発した拡張アンサンブル法である、レプリカ交換アンブレラサンプリング法をDNAの塩基スタッキングの自由エネルギー計算に適用し、実験と一致する結果を得た。このレプリカ交換アンブレラサンプリング法はタンパク質の折り畳み問題の研究に有効である。更には、拡張アンサンブル法による膜タンパク質の立体構造予測法の提案も行った。最後に、これまで我々が扱ってきた拡張アンサンブル法がカノニカルアンサンブル(定積定温アンサンブル)を元にした手法であるのに対し、マルチカノニカル法を定圧低温アンサンブルに拡張し、唯1回のシミュレーションの結果から、任意の圧力及び温度における定圧定温アンサンブル平均が得られる、新しい拡張アンサンブル法(マルチバーリック・マルチサーマル法)を開発した。この手法はタンパク質の高圧変性の研究に応用できる。本年度の主な成果は以下のとおりである。まず、レプリカ交換法と焼き戻し法の利点を合体する拡張アンサンブル法として、焼き戻しレプリカ交換法を開発した。本年我々は、レプリカ交換法とRISM理論を合体した、蛋白質の折り畳みのための新手法を提案した。本年度も、レプリカ交換マルチカノニカル法とマルチカノニカルレプリカ交換法を厳密な溶媒効果を取り入れた(TIP3Pの水分子をあらわに取り入れた)アミノ酸数十数個の小ペプチド系に適用することによって、広く使われているAMBER、CHARMM、OPLS、GROMOSなどの標準的なエネルギー関数(力場)が蛋白質の立体構造予測が可能な程の精度を持つか否かを調べた。そして、完璧な力場が存在しないと結論した。昨年、我々は最適な力場パラメターを独自に開発することにして、新しいエネルギーパラメターの最適化法を提案し、AMBER94の結果を報告したが、本年度は、新たにAMBER96,AMBER99,CHARMM22,OPLS-AAにもこれらの最適化を適用し、皆それぞれ改善が見られることを示した。昨年提案したレプリカ交換モンテカルロ法に基づく、膜タンパク質の立体構造予測法を2本のヘリックスからならglycophorin Aおよび7本のヘリックスからなるbacteriorhodopsinに適用して、有望な結果を得た。最後に、昨年、定圧定温アンサンブル(isobaric-isothermal ensemble)のマルチカノニカル法版としてマルチバーリック・マルチサーマル法(MUBATH)を開発したが、本年度はこの方法の分子動力学法版を新たに開発した。更に、モンテカルロ法版をレナード・ジョーンズ流体系の気液相転移の研究に適用した。本年度は、レプリカ交換分子動力学法(REMD)を様々な系に適用した。まず、水中とエタノール中の小ペプチドの2次構造形成傾向性を比較し、アルコールがペプチド内の静電相互作用を強め、2次構造形成を促進することを示した。また、アミロイド病を引き起こすβ2ミクログロブリンのペプチドフラグメントのREMDシミュレーションでは、βヘアピンの形成がアミロイド形成と深く関わっていることを示唆する結果を得た。

更には、X線1分子測定の実験の系を鑑み、末端を固定することがタンパク質の立体構造の安定性に与える影響を調べた。次に、REMD以外では、マルチオーバーラップ法とマルチカノニカル法を合体させた新しい拡張アンサンブル法を開発した(S.G.Itoh and Y.Okamoto, in preparation)。これによって、2つの状態間の遷移状態の情報を温度の関数として調べることができるようになった。また、一昨年に開発したマルチバーリック・マルチサーマル法をアラニンジペプチドの高圧実験の系に適用し、部分モルエンタルピーと部分モル体積が実験とよく一致することを示した(H.Okumura and Y.Okamoto, in preparation)。最後に、広く使われているAMBER、CHARMM、OPLS、GROMOSなどの標準的なエネルギー関数(力場)が蛋白質の立体構造予測が可能な程の精度を持つか否かを調べてきたが、我々の結論は既存のどの力場も完璧なものはないというものであった。特に、主鎖のねじれエネルギー項を少し変化させると、αヘリックスやβシートなどの2次構造の形成傾向が大幅に変化することを昨年示した。よって、本年度は新しい主鎖のねじれエネルギー項を提唱した(Y.Sakae and Y.Okamoto, submitted)。水分子と蛋白質の原子レベルの詳細を取り入れた分子シミュレーションによって、ランダムな初期構造から自然の立体構造までの折り畳みを実現した例として、プロテインGのC末端のβヘアピン(Gペプチド)の折り畳みに成功した。マルチカノニカルレプリカ交換法により、3回の独立な折り畳み現象を観測したまた、蛋白質系の分子動力学シミュレーションでは、膨大な計算時間が必要とされるので、拡張アンサンブル法の適用が必須であるが、更に、シミュレーションの時間ステップ大きく取ることができれば、それだけ長時間にわたる蛋白質の振る舞いが議論できる。しかし、時間ステップを大きく取ると、シミュレーション誤差が無視できなくなってしまうという困難がある。時間ステップを大きく取っても、誤差を低く抑えるには、分子動力学法の時間発展法にシンプレクティックなものを採用すれば良い。特に、生体系のシミュレーションでは、水分子や蛋白質の一部を剛体として扱う場合が多い。我々は剛体を含む系のシンプレクティックな時間発展抹を提案した。これは、能勢-ポアンカレの熱浴を用いるものであり、従来の手法より、シミュレーション誤差が小さく抑えられる事を示した。特に、水溶液の系で時間ステップと4fsまで大きくとっても安定した振る舞いが得られる事を示した。少し前に我々は新しい拡張アンサンブル法であるマルチバーリック・マルチサーマル法を開発したが、この手法では、一回のシミュレーションから任意の温度及び圧力における熱力学量が計算できるので、蛋白質の高圧変性の研究に特に適している。我々は水中のアラニンジペプチドの高圧実験の系にこの手法を適用し、部分モルエンタルピーや部分モル体積が実験値とよく一致することを示した。本年度の主な研究成果は以下のとおりである。
極低温時間分割X線結晶構造解析による銅アミン酸化酵素の自己触媒活性化機構の研究

Arthrobacter globiformis由来のモノアミン酸化酵素は、生合成時にまず前駆体不活性型として合成され、活性部位に存在するTyr残基が、銅イオンと酸素の存在下で翻訳後修飾を受けトパキノンに変換され活性型に変化する。平成9年度の本酵素の前駆体不活性型(apo型)と活性化型(holo型)の構造決定により、活性化過程における構造変化は活性部位近傍のHis残基とトパキノンに変換されるTyr残基のみにおこることを明らかにした。さらに、それらの構造を踏まえて活性化機構を推定した。平成10年度は、この提唱した活性化機構中で、最初に銅イオンがとると予測した正四面体配位構造を確認するために、トパキノン生成が起こらないことが明らかであるニッケル及びコバルトイオンを銅イオンの代わりにapo型に結合させた結晶を作製し、高エネルギー加速器研究機構のシンクロトロン放射光を用いて回折強度データを収集し、それらの構造を決定した。その結果、配位子となるべき3つのヒスチジン残基とチロシン残基の水酸基は、コバルト及びニッケルイオンの回りに正四面体に近い配置を持っていることが明らかになり、銅イオンがapo型に配位するとき最初に正四面体構造をとることを強く示唆した。この事より、酸素分子の活性化は、銅イオンの四面体配位に近い中間体構造による、酸化還元電位の上昇にあると結論づけた。また、反応中間体を低温トラップし、時間分割解析するための条件検索を行い、30%グリセロール存在下で液体窒素温度での回折強度収集ができることを明らかにした。今後の研究の基礎データとして、110Kにおいて、apo型、holo型のデータ収集を行い構造を精密化した。Arthrobacter globiformis由来のモノアミン酸化酵素の活性化型ホロ型の構造を258個の水分子を含めてR値18.4%、Rfree値25.9%の精度で決定した。また、不活性前駆体アポ型の構造をホロ型モデルをもとに精密化し、205個の水分子を含めてR値19.4%、Rfree値23.7%の精度で決定した。これらの構造を比較することにより、アポ型酵素とホロ型酵素の構造は、主鎖及び側鎖ともに良く一致しているが、Tyr382(アポ型)とトパキノン(ホロ型)および銅の配位子であるHis592に大きな位置の違いがあることを見いだした。ホロ型酵素における銅イオンは、3個のHis残基のイミダゾール窒素と1個の水分子が面配位子となり、もう一つの水分子が軸配位子となって歪んだピラミッド型構造で配位していた。アポ型酵素においては、ホロ型酵素の銅イオンの軸配位子であった水分子とほぼ同じ位置に前駆体Tyr残基のC4位の水酸基が存在していた。これらのアポ型とホロ型の構造の違いより、翻訳後修飾の自己触媒活性化反応の機構を以下のように推定した。アポ酵素の構造をとっているところへ、銅イオンがそのまま入り込むと、銅イオンの配位構造が四面体構造に近い構造をとることを強く示唆する。無機錯体化学の研究から、平面4配位構造をとる二価銅イオンは酸化還元電位が低く酸素との反応性が低いが、配位構造の平面性がなくなるにつれて、酸化還元電位が上昇して酸化力が強まることが示されている。従って、四面体構造に近い銅イオンは一価に近い状態となって酸素を一電子還元し、分子状酸素を活性化することができると考えられる。さらに本酵素の解析により、アポ型酵素に水和した銅イオンやホロ酵素に基質アミン類が溶媒中から活性部位に入っていくチャネルと考えられる部分が明らかになった。また、大きな溶媒cavityがサブユニット間に存在することも明らかになった。
インスリン分泌顆粒細胞内トラフィックのVTIRF解析

膵β細胞内インスリン顆粒の貯蔵からfusionまでの細胞内トラフィックを明らかにする目的で、VTIRF顕微鏡(evanescent場を任意に調節可能な顕微鏡)を開発し、GFP標識顆粒の時間空間的動態解析を行い、以下の点を明らかにした。(1)インスリン分泌第2相では細胞質内貯蔵プールから形質膜へ直接供給される顆粒(newcomer)のfusionが主に観察される。このnewcomerの細胞内トラフィックについて、(1)細胞質内貯蔵プール(形質膜より約500nm内部)はアクチン細胞骨格により保持されており、緩徐な細胞質内Ca^<2+>上昇が引き金となって顆粒が形質膜へ移行してfusionすること、(2)アディポカインであるアディポネクチンはアディポネクチン受容体を介してnewcomerの細胞内トラフィックを促進的に調節していることを明らかにした。(2) β細胞は膵ラ氏島の中で凝集して存在しており、そのβ細胞同士のコミュニケーションがインスリンのbasal分泌を低下させ、高グルコースによって刺激されるインスリン分泌をより増加させることが知られているが、そのメカニズムは不明であった。私達はEphAとephrinAの両方がB細胞に発現しており、EphA-ephrinAシグナルがインスリン分泌を促進・抑制の両方向に調節していることを見出した。すなわち、EphA forwardシグナルは分泌を抑制し、一方、ephrin-Areverseシグナルは分泌を促進する。高グルコース下ではEphA forwardシグナルがdownregulationされたことから、basal分泌ではEphA forwardシグナルが優勢となり分泌は抑制方向に、高グルコース下ではephrin-Areverseシグナルが優勢となり分泌は促進方向に調節されることを明らかにした。(1)β細胞におけるインスリン顆粒には形質膜上にdockingしている顆粒(previously docked granules)のプールと、形質膜から約500nm内部に存在する細胞質内顆粒プールの少なくとも2つの顆粒の貯蔵プールが存在していた。高グルコース刺激による分泌第1相は、前者の貯蔵プールからの顆粒のfusionにより構成され,一方,分泌第2相は後者の貯蔵プールから形質膜へ移動してきた顆粒(newcomers)のdocking/fusion (<50ms)から構成されていた。さらに細胞質内貯蔵プールから形質膜への移動にはアクチンによる調節が関与しており、その調節分子機構を現在検討している。このようにVTIRF顕微鏡は特に2相目のインスリン分泌の解明に非常に有用なシステムである。(2)分泌第1相における顆粒のfusion部位はSyntaxin1A (Synt1A)の局在と一致したが、第2相ではSynt1Aとは異なる部位でfusionが観察された。Synt1A欠損マウスから調製したβ細胞では第1相を担うpreviouslydocked granulesが激減し、そこからのfusionが見られなかったが、第2相でのnewcomersのfusionはwild typeと同様に観察された。Synt1A欠損β細胞にSynt1Aをアデノウイルスを用いて発現させると、previously docked granulesの数が正常値まで回復すると共に、分泌第1相が回復した。このように、インスリン分泌第1相はSynt1A依存性であり、第2相はSynt1A非依存性であることから、分泌第1相と第2相におけるインスリン開口放出は共通のメカニズムではなく、空間的にまた関与する分子が異なる機構であることを明らかにした。
ループ空間の幾何学と表現論

表現論とはある対称性がどのような実現を持ち、また複数の実現の間にどのような関係が存在するかを研究する分野である。その中での幾何学的見地の重要性は同一の幾何学的構造(多様体とその上の構造物)の異なる解釈が異なる文脈で生まれた対称性や理論たちの間を結ぶ架け橋を提供してきたことが大きい。本研究ではそこで出現する多様体(たち)の代数的ループ空間を用いて幾何学的表現論の構成を強化し、古典的な枠組みでは理解できなかった表現論の構造を統制できる枠組みを構築することを試みる。また同時に既存の研究の示唆する表現論と数理物理などとの間にある関係などをより深く理解することを目指す。
オピオイドμ/δ二量体化受容体特異的な新規鎮痛薬の開発並びに臨床応用への基盤構築

オピオイドμ/δ二量体化受容体の選択的作動薬ML335は、耐性を示さずに鎮痛効果を有することが報告された。しかし、本研究におけるμ/δ二量体化発現細胞を用いたアッセイでは、ML335はμ/δ受容体に対しlow efficacy、low potencyであった。そこでML335の構造をベースに100種弱の化合物合成を行いアッセイしたところ、5種の化合物がML335に比べμOR、δORに低親和性、かつμ/δ二量体化受容体に高親和性であった。現在、同物質の特許化およびさらなる新規化合物の合成を進めている。近年、オピオイド受容体は生体でμ/δ二量体化受容体(μ/δ受容体)を形成すること、そしてその薬物特性は単量体のものと異なることがわかってきた。その一例として、μ/δ受容体選択的作動薬が耐性を示さず鎮痛効果を有することが報告された。近年μ/δ受容体に選択性を示す部分作動薬ML335が化合物ライブラリースクリーニングより見出された。ML335は鎮痛効果を示し、加えてモルヒネ鎮痛耐性を生じたマウスに対して鎮痛効果を示したことから、μ/δ受容体作動薬が鎮痛耐性を起こさない新規カテゴリーの鎮痛薬になり得ること、従ってモルヒネ鎮痛耐性形成時に新たな薬物処方を提示できる可能性が考えられた。ML335は、CellKeyを用いた本研究での実験で、μ/δ受容体発現細胞でのefficacy、potencyは共に低く、さらにμ/δ受容体選択性は不十分であることが判明した。実験系の最適化をめざし、μ/δ受容体発現細胞の再作成を行い、さらにアッセイ系の再構築を行ったが、これまでに報告されたML335の特性を再現することができず、さらに最適化したアッセイ系構築が必要と判断した。そのため新たにμオピオイド受容体等のGPCRの活性を高感度にアッセイできるシステムである卓上型自動パッチクランプ「Ion Flux」を本研究に導入した。同システムは96ウェルプレートを用いたハイスループットアッセイ機器である。現在同システムを用い、μ受容体、δ受容体、μ/δ二量体化受容体の活性測定のための最適化の条件設定を行っている。本研究では、オピオイドμ/δ二量体化受容体特異的な新規鎮痛薬の開発、並びに臨床応用への基盤構築を目的として、3年計画の研究をスタートさせた。μ/δ受容体に選択性を示す部分作動薬ML335が近年化合物ライブラリースクリーニングより見出され、同薬物は鎮痛効果を示し、モルヒネ鎮痛耐性を生じたマウスに対しても鎮痛効果を示したことから、μ/δ受容体作動薬が鎮痛耐性を起こさない新規カテゴリーの鎮痛薬になり得ると考えた。同薬剤をシーズに、北里大学薬学部藤井秀明教授を連携研究者として新規鎮痛薬の創製をめざし、まずML335の特性を詳細に解析することとした。しかしながら当研究室で解析に用いたCellKeyでの実験では、μ/δ受容体発現細胞でのefficacy、potencyは共に低く、さらにμ/δ受容体選択性は不十分であることが判明した。したがって実験系の最適化を工夫し、さらにμ/δ受容体発現細胞の再作成を行うなど、実験の見直しを行ったものの、これまでに報告されたML335の特性を再現することができなかったため、さらに最適化したアッセイ系の構築が必要と判断した。そのため新たにμオピオイド受容体等のGPCRの活性を高感度にアッセイできるシステムである卓上型自動パッチクランプ「Ion Flux」を本研究に導入し、同システムを用いたアッセイを行うこととした。現在同システムを用い、μ受容体、δ受容体、μ/δ二量体化受容体の活性測定のための最適化の条件設定を行っているが、Ion Fluxは新規機器であるため、まだ使いこなす段階に至っておらず、その結果、予定した研究が遅れている。近年、μ/δ受容体選択的作動薬が耐性を示さず鎮痛効果を有することが報告され、耐性の少ないオピオイド鎮痛薬としてμ/δ選択的アゴニストの臨床開発が期待されている。その一例として、μ/δ受容体に選択性を示す部分作動薬ML335が報告された。このML335は鎮痛効果を示し、さらにモルヒネ鎮痛耐性を生じたマウスに対しても鎮痛効果を示したことから、鎮痛耐性を起こしにくいという利点を生かし、モルヒネ鎮痛耐性が生じた際の新たな薬物処方になる可能性が考えられた。しかし当研究室でCellKeyを用い行った実験では、ML335はμ/δ受容体発現細胞に対しefficacy、potencyは共に低く、さらにμ/δ受容体選択性もかなり低い(論文通りにはいかない)ことが判明した。実験系の最適化を何度も行いML335の活性を確認したが、報告されたML335の特性を再現することができなかった。そこでML335をシーズとして数十種の新たな化合物を作製し、CellKey assayを行った。その結果、行った化合物の中で3種の化合物に、ML335と比較しμOR、δORに親和性が低く、μ/δには活性化を有し、親和性もML335と変わらない性質があることを見出した。

現在、同物質の特許化の可能性について知財担当者と相談中であり、さらに同物質をシーズとする新規化合物の合成を行っているところである。本研究は、オピオイドμ/δ二量体化受容体特異的な新規鎮痛薬の開発、ならびに臨床応用への基盤構築を目的として、3年計画で研究をスタートさせた。μ/δ受容体に選択性を示す部分作動薬ML335がモルヒネ耐性の少ない鎮痛効果を示したことから、μ/δ受容体作動薬は鎮痛耐性を起こしにくいML335の鎮痛薬になり得ると考えたが、当研究室で解析に用いたCellKeyでの実験では、μ/δ受容体に対する選択性、効率が低いことがわかり、実験系の最適化を行った。しかしながら論文通りの結果を得ることはできなかった。そこでML335をシーズとして、新たな合成法の視点のもと数十種の新規化合物を作製し、CellKeyアッセイを行ったところ、このうち3種に、ML335に比較しμOR、δORへの親和性が低く、μ/δに高い性質を見出した。この化合物の1)特許化、2)同化合物をシーズとした新たな化合物合成を現在行っており、昨年の遅れは取り戻せたと考えている。近年、μ、δ、κで構成されるオピオイド受容体は、生体でμ/δ二量体化受容体(μ/δ受容体)を形成すること、さらにその薬物特性は単量体のものと異なることがわかってきた。特にμ/δ受容体選択的作動薬は、耐性を示さずに鎮痛効果を有することが報告され、耐性のないオピオイド鎮痛能を有する新薬としてμ/δ選択的アゴニストの臨床開発が期待されている。平成25年に初めてμ/δ受容体に選択性を示す部分作動薬ML335が報告された。ML335は鎮痛効果を示し、さらに鎮痛耐性を起こしにくいことがわかり、モルヒネ鎮痛耐性時に処方可能な薬剤として注目を浴びた。しかし同薬は未だ臨床試験に進んでおらず、また当研究室で実験の最適化を行い、μ/δ二量体化発現細胞を用いてCellKeyアッセイ行ったところ、ML335はμ/δ受容体発現細胞に対しefficacy、potencyは共に低く、さらにμ/δ受容体選択性もかなり低い(論文通りにはいかない)ことが判明した。そこでML335をシーズとして化合物の合成を行い、CellKeyによりその活性をスクリーニングしたところ、作製した100種類の化合物の中で、9種の化合物がML335と比較しμOR、δORには親和性が低く、かつμ/δ二量体化受容体にはML335を上回る活性を有することを見出した。現在、同物質の特許化の可能性について知財担当者と相談中であり、さらに同物質をシーズとする新規化合物の合成を順次進め、μ/δ二量体特異的化合物の最適化を行っているところである。オピオイドμ/δ二量体化受容体の選択的作動薬ML335は、耐性を示さずに鎮痛効果を有することが報告された。しかし、本研究におけるμ/δ二量体化発現細胞を用いたアッセイでは、ML335はμ/δ受容体に対しlow efficacy、low potencyであった。そこでML335の構造をベースに100種弱の化合物合成を行いアッセイしたところ、5種の化合物がML335に比べμOR、δORに低親和性、かつμ/δ二量体化受容体に高親和性であった。現在、同物質の特許化およびさらなる新規化合物の合成を進めている。本研究は、オピオイドμ/δ二量体化受容体特異的な新規鎮痛薬の開発並びに臨床応用への基盤構築を目的として、3年計画で研究をスタートさせた。北里大学薬学部藤井秀明教授を連携研究者として、プロトタイプであるML335のμ/δ二量体化受容体アゴニストの特性を指標に新規μ/δ特異的鎮痛薬の創製をめざした。
子ども子育て支援新制度開始５年後の自治体単独保育室の移行実態と保育環境改善の検証

2015年の子ども・子育て支援新制度の開始に伴い、認可保育所とほぼ同等の施設基準を求められる自治体単独保育室が円滑に移行できるのか、自治体単独保育室の移行状況と保育環境改善の実態を検証することで、既存建物を活用した小規模保育施設の成立要件と課題を明らかにすることが本研究の目的である。2018年度については、1自治体単独保育室の移行状況の概要調査と、2自治体単独保育室の移行実態事例調査(主に仙台市のせんだい保育室)、3小規模保育事業と認可保育所における連携施設の設定状況に関する実態調査(主に仙台市と川口市)、の3つを実施した。1の調査結果からは、自治体単独保育室の子ども・子育て支援新制度への移行状況は各自治体によって大きな差が見られることを示した。また2の調査では、2017年度に十分な考察ができなかった自治体単独保育室から認可保育所への移行事例、特に住所移転・建替えによる移行事例に焦点を当てて考察を行った。その結果、従前建物を小規模保育として活用しながら新たに認可保育所を開設した事例では、小規模保育の卒園児の受入が可能となるように認可保育所の定員設定を行うなど、小規模保育と認可保育所とで連携した運営が多くなされていることを把握した。そして3の調査結果からは、小規模保育と認可保育所との連携は未だ不十分な状況にあることを示した。またそのような中、小規模保育と認可保育所との間で多人数の連携枠を確保している事例の多数が、小規模保育と認可保育所が「同一法人の運営」、又は「一方が元自治体単独保育室」であることを明らかにした。平成30年度の研究計画として想定していた1自治体単独保育室の移行状況の概要調査と、2選定した自治体単独保育室の移行実態事例調査、は共に順調に進んだ。当初の予定通り、平成31年度については、子ども・子育て支援新制度開始4年後における自治体単独保育室の実態調査を行う。研究実績でも述べたように、自治体によっては自治体単独保育室からの移行があまり進んでいない自治体も見られるため、自治体単独保育室からの移行率が高い仙台市と川口市を主な対象として調査・研究を実施する予定である。そこで2017年度については、1自治体単独保育室の移行状況の概要調査と、2自治体単独保育室の移行実態事例調査(主に仙台市のせんだい保育室)の2つを実施し、特に2では、前年度までは事例が非常に少なかった自治体単独保育室から認可保育所への移行事例に焦点を当て、考察・分析を行った。1の調査結果からは自治体により新制度への移行状況が大幅に異なり、特に各自治体での移行期限の有無が大きく影響していると考えられること、2の調査結果からは同じ新制度への移行でも、小規模保育事業所と認可保育所とでは移行の仕方が異なっており、認可保育所の方が移転・新築事例が多く、従前建物の継続使用の事例が少ないこと、またその要因として認可保育所は建築基準法上の「児童福祉施設」であり、別用途の建物からの移行では用途変更の手続きが必要となることが影響していること、などが明らかとなった。平成29年度の研究計画として想定していた1自治体単独保育室の移行状況の概要調査と、2選定した自治体単独保育室の移行実態事例調査、は共に順調に進んでいる。当初の予定通り、平成30年度については子ども・子育て支援新制度開始3年後における自治体単独保育室の実態調査を行う。

特に仙台市のせんだい保育室では平成30年4月時点で全ての保育室が新制度に移行(廃園した一部の園を除く)しており、移行前後の比較検証を行うことが可能なため、せんだい保育室を中心に調査・研究を実施する予定である。当初の予定通り、平成31年度については、子ども・子育て支援新制度開始4年後における自治体単独保育室の実態調査を行う。研究実績でも述べたように、自治体によっては自治体単独保育室からの移行があまり進んでいない自治体も見られるため、自治体単独保育室からの移行率が高い仙台市と川口市を主な対象として調査・研究を実施する予定である。調査補助として同行予定だった学生が諸事情により現地調査に参加できなかったため、旅費相当分の次年度使用額が発生した。次年度使用額については、次年度の旅費として使用する予定である。
Fc受容体を介したIgE,IgGによるマスト細胞機能の調節

Immunoglobulin(Ig)-like receptor(IgLR)という範疇に属する新規なレセプター分子群が続々と単離され,その機能が注目され始めてまだ5年ほどしか経過していないが,これらが免疫調節に重要な役割を担う証拠が次々と挙がっている.マウスのPaired IgLR(PIR)は活性化シグナルを伝達するPIR-Aと,逆に抑制性シグナルを伝達するPIR-Bのペアからなる代表的なIgLRであるが,PIR-Bが欠損するとB細胞,樹状細胞のシグナル伝達が撹乱され,その免疫応答はTh2型に著しく偏ることを我々は本研究課題において示してきた.本年度は,正常な免疫応答に不可欠であるこのレセプター・ペアが何を認識し,どのようなシグナルを細胞内に導入しているのか,さらに免疫疾患にどのように関連しているのかを明らかにすることでマスト細胞機能,およびアレルギーや自己免疫などの発症に関する新規な機構を解明することを目的とした.その縞果,PIR-B,PIR-AともにMHC class I分子を認識し,PTR-Bの欠損によって移植片対宿主反応が亢進してホストのGVHDが増悪することが分かった,さらにマスト細胞はこの識別機構を喪失した結果,刺激感受性が増大し,アレルギーを発症しやすくなる素地を形成することが分かった.したがってPIRはTCRやKIRとともに自己MHC class Iを認識する第3のシステムを構築し,自己反応性および外界からの無用な刺激応答性を回避していることが示唆された.高井らはFc受容体およびそれらのサブユニット分子の遺伝子を欠損したマウスを用いてマスト細胞の機能ならびに生体レベルでのアレルギーや自己免疫疾患とFcRとの関係の解析を推進している.本年度からは新たに,Paired Immunoglobulin-like Receptor(PIR)-Bという新規マスト細胞上のレセプターの遺伝子欠損マウス,gp49Bレセプター遺伝子欠損マウス,さらにこれらの膜アダプター分子であるTYROBP遺伝子欠損マウスの作出に成功し,マスト細胞の機能面での解析に利用することを開始した.なおこれら遺伝子欠損マウスは本重点班内での利用にも積極的に供してゆく予定である.これらは班内のみならず既に米国をはじめ様々な研究機関において利用されはじめている.本年度に開始し,すでに成果となって現れた研究内容のひとつは,マスト細胞のFcRの活性化によってI型アレルギーとIII型アレルギーが誘発される際,マスト細胞のシグナル伝達を最上流部でコントロールするチロシンキナーゼであるLynはI型アレルギーには必須であるがIII型アレルギーには重要な関与をおこなっていないとの結論を得たことであり,この成果はJ.Exp.Med.誌に発表した.マスト細胞の機能をそのレセプターの側面から理解するために,これら欠損マウスはたいへんに重要なツールであり,多様な局面でのこれらレセプターの生理機能の解析を他の班員とタイアップして推進してゆく予定である.高井らはFc受容体およびそれらのサブユニット分子の遺伝子を欠損したマウスを用いてマスト細胞の機能ならびに生体レベルでのアレルギーなどの免疫疾患とFcRとの関係の解析を推進している.最近,マスト細胞上に発現するPaired Immunoglobulin-like Receptor(PIR)-B遺伝子欠損マウス,gp49B遺伝子欠損マウス,さらにこれらの膜アダブター分子であるDAP12遺伝子欠損マウスを開発し,マスト細胞の機能面での解析を中心に進めており,次々と興味深いことが明らかになりつつある.これまでの主な研究成果として以下の項目が挙げられる.・マスト細胞欠損マウスではIgEとFcεRlにより誘発されるアナフィラキシーによる体温低下が観察されなくなり,さらにヒスタミン欠如マウスでは同様にこの応答が観察されないことから,ショックによる体温低下にはマスト細胞由来のヒスタミンが主な原因になっていること.・PIR-B欠損マウスではB細胞とマスト細胞の機能亢進が観察され,さらにアレルギーの誘発に関係するTh2型の応答が亢進することを発見した.・マスト細胞上のFcεRIはIgE刺激により発現が亢進するが,このメカニズムにFcγRIIBの抑制回路の機能は関与していないこと.・マスト細胞のFcRの活性化によってI型アレルギーとIII型アレルギーが誘発される際,マスト細胞のシグナル伝達を最上流部でコントロールするチロシンキナーゼであるLynはI型アレルギーには必須である一方,III型アレルギーへの関与は低いこと.・gp49Aはマスト細胞上で新規な活性化型レセプターとして機能し,アレルギーなどを亢進する可能性を指摘した.Immunoglobulin (Ig) -like receptor (IgLR)という範疇に属する新規なレセプター分子群が続々と単離され,その機能が注目され始めてまだ5年ほどしか経過していないが,これらが免疫調節に重要な役割を担う証拠が次々と挙がっている.マウスのPaired IgLR (PIR)は活性化シグナルを伝達するPIR-Aと,逆に抑制性シグナルを伝達するPIR-Bのペアからなる代表的なIgLRであるが,PIR-Bが欠損するとB細胞,樹状細胞のシグナル伝達が撹乱され,その免疫応答はTh2型に著しく偏ることを示した.

B細胞と樹状細胞においてPIR-Bは定常状態の細胞の段階で既にそのITIMがチロシンリン酸化されており,その後BCR刺激やGM-CSF刺激に応じて,正常なシグナル伝達を助けている.PIR-Bが欠損したこれらの細胞ではBCRを介して,あるいはGM-CSF刺激後に細胞内に導入されるシグナル伝達が増強され,あるいは一過性になり,正常な応答が起らない.これにより樹状細胞は成熟が阻害され,IL-12産生が不十分になるためにTh1型応答への経路が阻害されてTh2型応答を起すようになると考えられる.したがって正常な免疫応答に不可欠であるこのレセプター・ペアが何を認識し,どのようなシグナルを細胞内に導入しているのか,さらに免疫疾患にどのように関連しているのかを明らかにすることがアレルギーや自己免疫などの発症を理解するうえでたいへんに重要になってきた.Immunoglobulin(Ig)-like receptor(IgLR)という範疇に属する新規なレセプター分子群が続々と単離され,その機能が注目され始めてまだ5年ほどしか経過していないが,これらが免疫調節に重要な役割を担う証拠が次々と挙がっている.マウスのPaired IgLR(PIR)は活性化シグナルを伝達するPIR-Aと,逆に抑制性シグナルを伝達するPIR-Bのペアからなる代表的なIgLRであるが,PIR-Bが欠損するとB細胞,樹状細胞のシグナル伝達が撹乱され,その免疫応答はTh2型に著しく偏ることを我々は本研究課題において示してきた.本年度は,正常な免疫応答に不可欠であるこのレセプター・ペアが何を認識し,どのようなシグナルを細胞内に導入しているのか,さらに免疫疾患にどのように関連しているのかを明らかにすることでマスト細胞機能,およびアレルギーや自己免疫などの発症に関する新規な機構を解明することを目的とした.その縞果,PIR-B,PIR-AともにMHC class I分子を認識し,PTR-Bの欠損によって移植片対宿主反応が亢進してホストのGVHDが増悪することが分かった,さらにマスト細胞はこの識別機構を喪失した結果,刺激感受性が増大し,アレルギーを発症しやすくなる素地を形成することが分かった.したがってPIRはTCRやKIRとともに自己MHC class Iを認識する第3のシステムを構築し,自己反応性および外界からの無用な刺激応答性を回避していることが示唆された.