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インスリンポンプ療法を行う1型糖尿病をもつ子どもの療養生活支援・評価指標の開発

本課題の目的は、(1)インスリンポンプ療法を行う子どもの療養生活と課題を明らかにする、(2)インスリンポンプ療法を行う子どもが学校で活用できる冊子を作成する、(3)1型糖尿病の小児・思春期の療養生活評価表を作成することである。インスリンポンプ療法を行う小児と家族の療養生活について国内外の文献検討を行い、結果を元に療養生活と課題を調査、園や学校むけのパンフレットを作成した。皮膚トラブルがインスリンポンプ療法中止の原因であったため皮膚傷害性の研究を開始した。小児・思春期の療養生活評価表は、国内外の文献検討後「糖尿病児の療養行動質問紙」改訂版を作成、236通を配布し信頼性・妥当性の検討を進めている。本研究の目的は、日本において急速に増加しつつあるインスリンポンプ療法を行う小児に対し、療養生活上の課題やその対処方法を明確にし、成長発達に沿ったセルフケアができるよう支援すると共に、周囲の理解を高めサポートを得やすくすること、療養生活の評価指標を得ることである。平成25年度は、1インスリンポンプ療法を行う子どもの文献検討、および、2インスリンポンプ療法を行う小児の生活に関する調査に向けた準備を行った。以下、具体的に示す。1インスリンポンプ療法を行う小児の文献検討:小児を対象とした国内文献はほとんど得られなかったため、海外の21文献を検討した。その結果、以下が明らかになった。インスリンポンプ療法への移行において、親はストレスを体験していたが学童期以降の小児は純粋に再教育に引き寄せられポンプの機器操作に精通していた。インスリンポンプ療法の利点として【子どもも親もエンパワーされる】ことが最も多く、インスリン注射と比較してQuality of lifeが改善していた。課題として【ポンプを装着したままの生活に困難を感じる】、【学校生活での問題が生じる】が多く挙げられていた。学童・思春期の療養行動上の課題では食事の追加注入ミスが多く、インスリンポンプ療法の中断は、10歳以上、女子、開始時のHbA1cが高い者で多く、追加注入ミスを防ぐための親子の責任分担や、親の関わりの重要性が示された。以上の結果をまとめ、1月に学会誌に投稿した。2インスリンポンプ療法を行う小児の生活に関する調査:文献検討や臨床経験を踏まえ、「インスリンポンプ療法を行う子どもの療養生活の実態と課題」について、調査表を作成した(幼児は親用、学童以降は小学生,中学生以上の2種類)。現在、倫理審査委員会を通り研究参加施設との調整段階に入っている。また、最終年度の療養生活評価ツールの基盤となるセルフケアについて論文作成中。本研究の目的は、日本においても近年増加しているインスリンポンプ療法を行う小児に対し、療養行動の課題やその対処方法を明確にし、成長発達に沿ったセルフケアができるように支援するとともに、園や学校など周囲の理解を高めサポートを得やすくすること、療養生活の評価指標を作成することである。平成26年度は、1インスリンポンプ療法を行う小児の生活に関する調査の実施と分析、2インスリンポンプ療法を行う子どもが園や学校で活用できるパンプレット案の作成、31型糖尿病の小児・思春期の療養生活の評価指標に関する文献検討を行った。以下、具体的に示す。1インスリンポンプ療法を行う小児の生活に関する調査の実施と分析:インスリンポンプ療法を行う小児を診療している3医療施設の外来において、インスリンポンプを経験した44名(継続:35名、中止9名)の小児あるいは親を対象に、文献検討をもとに作成した質問紙を用いて調査を実施した。その結果、針挿入時の痛みや、挿入部位の皮膚トラブル、12日ごとに針交換が必要であることなどが中止の原因として重要であること、ポンプの使用が学校生活での負担を軽減しているときには継続できていることが明らかとなった。また、ポンプが英語表記であることにより、必要以上に周囲から尋ねられたり、アラーム音が鳴りやまないことによる困難、ゲーム機と間違われることなどが課題として明らかになった。これらの結果をもとに、2の園や学校で活用できるパンフレットを作成し、試験的に外来で使用を始めた。来年度の夏のキャンプ前に最終版を作成しHP上でダウンロード可能にする予定である。31型糖尿病の小児・思春期の療養生活の評価指標に関する文献検討:日本における評価指標は少ないため、海外文献を検索し、16の評価指標(測定用具)について分析を行った。これに基づき、次年度の評価指標の開発につなげていく予定である。本研究の目的は、1インスリンポンプ療法を行う子どもの療養生活の実態と困難や対処を明らかにし、看護を明確にする、2インスリンポンプ療法を行う子どもの生活の中で生じやすいトラブルとその対応方法について冊子を作成する、3インスリン療法を行う小児・思春期の療養行動や日常生活の評価ツールを作成することである。平成27年度の実施と成果を以下に示す。平成26年度に作成したインスリンポンプ療法を行う幼児および学童・思春期の小児が園や学校で使用するパンフレットを外来等で試行的に使用し、意見を得て修正を行った。平成28年3月には最終版を作成し、HPからダウンロード可能にした。日本において小児・思春期を対象とした糖尿病セルフケアの評価ツールは少ないため、国内外の小児・思春期を対象とした糖尿病セルフケアの測定用具について文献検討を行った。国内の測定用具は、兼松らが作成した1件のみであった。

海外の18測定用具について、下位尺度や項目の特徴を検討した結果、適切な療養行動の実施頻度を問う測定用具、療養行動を継続するために必要な要素に焦点をあてた測定用具、親や友達のサポートや親との協働に焦点をあてた測定用具があり、治療法や療養行動の変化を反映し、開発年による相違がみられた。小児が親や医療者の協力を得ながら自らインスリン注射を調節することをふまえ、小児・思春期の生活状況に合わせたサポート、問題解決能力、親や医療者との協働などの視点を強化した改訂の必要性が示唆された。これらをふまえ、1997年に兼松らが作成した「IDDM療養行動質問紙」を改訂し、47項目の「1型糖尿病をもつ小児・思春期の糖尿病セルフケア質問紙」を作成した。信頼性・妥当性の検証に向けて、1型糖尿病をもつ小学校3年生から高校3年生236名に本質問紙を配布、123名の有効回答があり(回収率52.1%)、信頼性・妥当性の検討を進めている。本課題の目的は、(1)インスリンポンプ療法を行う子どもの療養生活と課題を明らかにする、(2)インスリンポンプ療法を行う子どもが学校で活用できる冊子を作成する、(3)1型糖尿病の小児・思春期の療養生活評価表を作成することである。インスリンポンプ療法を行う小児と家族の療養生活について国内外の文献検討を行い、結果を元に療養生活と課題を調査、園や学校むけのパンフレットを作成した。皮膚トラブルがインスリンポンプ療法中止の原因であったため皮膚傷害性の研究を開始した。小児・思春期の療養生活評価表は、国内外の文献検討後「糖尿病児の療養行動質問紙」改訂版を作成、236通を配布し信頼性・妥当性の検討を進めている。H26年度は、インスリンポンプ療法を行う小児の生活に関する調査の実施と分析、園や学校で使用可能な冊子の作成、1型糖尿病の小児・思春期の療養生活の評価指標に関する文献検討を予定していた。いずれも、ほぼ予定通りに進行している。教員の研究活動として、科研のテーマ、公表論文や作成した冊子などの成果を公表し、問合せがあれば対応できるようにしている。H27年度は、インスリンポンプ療法を行う小児が園や学校で使用するパンフレットを、HPよりダウンロードできるようにした。看護学最終年度予定している「療養行動質問紙」の信頼性妥当性の検証には、多くの対象者を必要とする。対象者が得られないときには、複数の医療機関に協力を求め、遂行していきたい。平成25年度は、インスリンポンプ療法を行う小児の文献検討と、生活に関する調査を計画していた。文献検討については、国内外の文献を検討し学会誌への投稿を行った。生活に関する調査については、文献検討結果を反映させたため、開始は予定よりやや遅れたが、調査表を作成し、倫理審査に通るところまで実施できている。調査協力施設の内諾をいくつかの施設から得ている。年度末および年度初めは、研究協力を得ることが難しいため、5月を目途に研究開始を予定している。以上より、研究はおおむね順調に進展していると評価した。H26年度はインスリンポンプ両方を行う子どもが園や学校で活用できる冊子の作成を予定していたが、パンフレット(案)の作成までであったため、使用予定額に達しなかった。
ラットにおける忘却の神経メカニズムの解明

NMDA型グルタミン酸受容体(以下NMDA受容体)は記憶獲得に重要とされるが、これまでの我々の研究では同種の受容体が既に獲得された記憶の忘却(保持の低下)においても関与する可能性を示唆する結果を示してきた。昨年度の研究では、NMDA受容体サブユニットGluN2Aの働きが空間記憶の忘却に関与する一方で、GluN2Bの働きは記憶の保持に関係する可能性を示唆する結果が示された。本年度は別種の投与手続きによって昨年度に得られた結果を再検討した。1) GluN2Aと忘却との関係については、阻害薬NVP-AAM077の投与スケジュールをより精密に操作できるiPRECIOを利用した検討を実施した。成体ラットに水迷路課題訓練を行い、その7日後にプローブテストによって空間記憶の忘却の程度を測定した。結果として、訓練終了からテストまでの間にNVP-AAM077を投与したラットではプローブテストにおいて、獲得した逃避台位置に対する探索時間が長くなる傾向が示された。また、これらのラットでは、その後の空間的逆転訓練課題においても以前の逃避台位置を固執して探索する傾向が見られた。これらは、GluN2A阻害による忘却の抑制効果を示す結果であり、忘却の過程におけるGluN2Aの重要性がより確かになったといえる。2) GluN2Bと記憶保持については、阻害薬Ro 25-6981の末梢投与(腹腔内投与)によって再現性の有無を検討した。成体ラットに水迷路課題訓練を行い、その4日後にプローブテストによって空間記憶の忘却の程度を測定した。結果として本実験ではRo 25-6981投与による忘却の促進(記憶保持の悪化)は示さず、昨年度に得られた結果の再現性を確かめることはできなかった。記憶の保持や忘却の過程におけるGluN2Bの役割について結論付けるためにはさらなる検討が必要と考える。28年度が最終年度であるため、記入しない。本年度は、ラットの水迷路課題を用いて、異なる種類のNMDA受容体サブユニット(GluN2A,GluN2B)の阻害が空間記憶の忘却に与える影響を検討した。その結果、空間記憶の忘却はGluN2Aサブユニット選択的阻害薬(NVP-AAM077)の投与によって抑制されること、その忘却抑制の効果は後に行った空間的逆転課題での成績(新奇空間位置の学習)を悪化させること、一方でサブユニット非選択的NMDA受容体阻害では逆転課題での成績の悪化が生じないことが示された。これらの結果は、GluN2Aサブユニットが空間記憶の忘却に関与することを示唆している。先行研究では、記憶想起によって生じる保持の脆弱化や消去といった現象にGluN2Bが関与するという結果が報告されてきた。これらの現象はいずれも阻害薬投与以前に獲得した記憶の低下に関係する現象であることから、これまでは忘却におけるGluN2Bの関与が間接的に示唆されてきた。しかしながら、先行研究と本研究の結果をまとめると、同じ記憶の低下であっても、ある種の操作によって誘発される記憶保持の低下(脆弱化,消去)と時間の経過によって生じる低下(忘却)とでは、関与するサブユニットの種類がそれぞれ異なることが明らかとなった。NMDA受容体はシナプス伝達効率の変化において重要とされ、また、活性するサブユニットの種類によってその変化の傾向が異なることがわかっている。そのため、本研究の結果は忘却を生じさせる生理学的機能を解明するにあたって重要な知見であると考える。本年度(平成27年度)は、申請書記載の『研究1:獲得と忘却を調整するメカニズムの解明』に関する実験を遂行した。当初の計画では先行研究の知見から忘却にはGluN2Bサブユニットが特に関与するとする仮説を立てていたが、実際の結果はGluN2B選択的阻害による忘却抑制の効果は示されず、反対にGluN2Aサブユニットの関与を示唆する結果がみられた。これまで記憶保持の低下に関する他の諸現象(脆弱化、消去)を対象として示唆されてきたNMDA受容体サブユニットの役割とは大きく異なる画期的な知見であったことから、本年度中に得られた研究結果の一般性・再現性を確立する必要性を考え、そのための実験を計画し、次年度(28年度)に実施する予定である。本年度中に得られた成果は、国内外の学会(Society for Neuroscience、日本動物心理学会)で発表して議論を進めた上で、論文にまとめてBrain and Behavior誌に投稿している(現在審査中)。

成体ラットに水迷路課題訓練を行い、その7日後にプローブテストによって空間記憶の忘却の程度を測定した。結果として、訓練終了からテストまでの間にNVP-AAM077を投与したラットではプローブテストにおいて、獲得した逃避台位置に対する探索時間が長くなる傾向が示された。また、これらのラットでは、その後の空間的逆転訓練課題においても以前の逃避台位置を固執して探索する傾向が見られた。これらは、GluN2A阻害による忘却の抑制効果を示す結果であり、忘却の過程におけるGluN2Aの重要性がより確かになったといえる。2) GluN2Bと記憶保持については、阻害薬Ro 25-6981の末梢投与(腹腔内投与)によって再現性の有無を検討した。成体ラットに水迷路課題訓練を行い、その4日後にプローブテストによって空間記憶の忘却の程度を測定した。結果として本実験ではRo 25-6981投与による忘却の促進(記憶保持の悪化)は示さず、昨年度に得られた結果の再現性を確かめることはできなかった。記憶の保持や忘却の過程におけるGluN2Bの役割について結論付けるためにはさらなる検討が必要と考える。現在までの進捗状況で述べた通り、申請書記載の研究1において当初の仮説と相反する結果(GluN2A阻害による忘却抑制の効果)が示された。この結果の一般性・再現性を確立するため、保持期間の長さの異なる条件での検討や異なる種類での記憶課題を用いた実験を計画しており、次年度(平成28年度)においてそれを実施する予定である。また、GluN2A選択的阻害と非選択的なNMDA受容体阻害ではいずれも忘却抑制の効果が示されたものの、後の空間的逆転課題ではそれぞれ異なる成績を示すといった興味深い現象も示された。この知見を発展させるため、GluN2A選択的阻害と非選択的阻害との傾向の違いをより明確に検討するための実験も計画し、実施する予定である。28年度が最終年度であるため、記入しない。
わが国における全国スケールの人口移動の実態解明に関する研究

日本においては第2次大戦後、急激な経済成長に促され、多くの若年者が就職口が豊富な大都市圏に移住した。彼らはその後大都市圏内での移住を繰り返すとともに、ある者は自らの出身県へと帰還、つまり「Uターン」移住している。しかしながら主として居住経歴データの不足のため、これらの移動プロセスはこれまで十分に検証されてきたとは言い難い。そこで我々は質問紙形式による独自調査を行うことにより、19561958年、19661968年および19761978年に長野県および宮崎県内の高校を卒業した男子卒業生約5,000名分の居住経歴を調べることとした。その主要な分析結果は以下の通りである。まず、三大都市圏に一旦他出した者のうち長野県あるいは宮崎県に帰還する者の割合は、世代が若くなるほどより大きいことがわかった。また両県とも、「Uターン」者の多くが彼らの出身市町村に帰還しており、その傾向は若い世代ほどより強くなっている。一方「Uターン」する、しないの判断は、学歴や長男であるかどうかにも影響されるものの、妻の出身地がより大きな影響を与えることを示した。すなわり、長野県あるいは宮崎県出身の女性と結婚した者は、他見出身者と結婚した者よりも、より帰県する傾向が強い。また、転職を伴う「Uターン」が行われる時期についてみてみると、最初の就職から58年以内に長野県あるいは宮崎県に帰還する者が大半であることがわかった。これは通常、彼らが大都市圏において生活を始めた後比較的すぐに「Uターン」が実行されることを示している。以上の結果から「Uターン」移動は、職業生活上の最初の「転機」において、居住地や職業の選択に関して比較的制約の少ない若年地方出身者が持ち得る選択肢の一つであると結論づけることができる。本研究においては、これまで適切なデータが存在しなかったために、その実態解明が不十分であった地方圏出身者の人口「Uターン」現象について、国立社会保障・人口問題研究所による「第3回人口移動調査」の素データを再集計し、「Uターン」経験者の割合等を地域別・世代別に比較検討するなどの分析を行った。まず「Uターン」を出身県への帰還と定義して分析を行った結果、地域別には、北海道・東北地域出身者では「Uターン」経験率はやや低く、その分他出者が多いものの、その他の北陸・甲信越、中国・四国、九州・沖縄の3地域では「学卒Uターン」「転職Uターン」合わせて15%強と安定した値となっていた。一方、世代別には1926-35年出生コ-ホ-トを最小に、それ以前の世代ではむしろ「Uターン」経験率は大きく、また以後のコ-ホ-トでも時系列的に増加していることが確かめられ、近年では「学卒Uターン」「転職Uターン」合わせて20%程度で推移している。またさらに市長村単位で帰還先を集計したところ、地方中核都市を含む道県の出身者では出身市町村以外への帰還が目立つのに対し、それ以外の県の出身者では逆に出身市町村への帰還が多いことが確かめられた。これは地方中核都市が存在する道県においては、その中核都市へのいわゆる「Jターン」者が相当数存在することを示唆するものと言えよう。本研究においては次年度以降、「Uターン」者の帰還時期、帰還理由、移住の前後での生活条件の変化といった、以上のデータ分析からは把握され得ない点の解明のため、わが国地方圏から1県を選び独自データを収集するためのアンケート調査を行う。現在、九州地域を候補に現地踏査、既存資料の分析を通じ地域概況の把握に努めており、4月以降、実際の調査を開始する予定である。

本研究においては、昨年度には主として国立社会保障・人口問題研究所による「第3回人口移動調査」データの分析から多くの知見が得られたが、本年度においては、わが国地方圏から1県を選び独自の調査を行い、地方圏出身者の還流移動の実態解明をさらに進めることとした。調査対象としては宮崎県を選定し、県内の6つの高校の同窓会名簿を参照することにより調査対象者を抽出し(対象年代は昭和4143年高校卒および昭和5153年高校卒)、居住地移動経歴、移動の理由、移動前後での生活条件の変化等を尋ねる調査票を計6,000名に対して発送し、最終的に1,513通の回答を得た。得られたデータの分析から、まず調査回答者の居住経歴パターンのうち「三大都市圏残留」「学卒Uターン」「転職(勤)Uターン」「出身県定住」に着目すると、「三大都市圏残留」「転職(勤)Uターン」が減少し、「学卒Uターン」が大幅に増加している様子が観察された。「学卒」と「転職(勤)」を合わせた帰還者の増加と「三大都市圏残留」の減少から、いったん三大都市圏に他出した者の帰還確率は上昇していることが確かめられた。次に市町村単位で出身地と帰還先の関係をみたところ、両世代とも出身市町村への帰還が大勢であること、後の世代ではそれが強まる傾向にあることがわかった。また「転職(勤)Uターン」者の帰還時期を検討したところ、三大都市圏での最初の就職後58年以内という比較的早い時期に大半が帰還することが確かめられた。来年度は得られたデータの分析をさらに進め、同時に進行しつつある他県での同種調査の結果とも総合し、人口還流現象を含めたわが国における全国スケールでの人口移動について、より多くの知見を得るべく研究を進展させる予定である。今年度は昨年度宮崎県出身者に対して実施した還流移動に関する実態調査の結果をさらに詳細に分析し、研究代表者らが別途行った長野県出身者に対する同種調査の分析結果と比較検討することにより、わが国地方圏出身者の還流移動の実態とその要因に関する総合的な理解を目指した。その結果、(1)昭和3133年高校卒、4143年卒、5153年卒の3世代を比較した場合、三大都市圏にいったん他出した者のうち帰還する者の割合は世代とともに増加傾向にあり、出身者の帰還傾向はこの間着実に強まったこと、(2)既存研究における議論とは異なり、帰還者の大勢は出身県内の中心都市ではなく自らの出身市町村に帰還していること、(3)帰還率に影響を与える属性としては、学歴や続柄も無視し得ないものの、出身県が同じである女性を妻とする者は、その後の帰還傾向がきわめて強いこと、(4)還流移動者の大半が最初の就職から数年以内という比較的早い段階で帰還していること、など主要な論点に関して宮崎、長野両県での分析結果はおおむね一致していることが確かめられた。これらを含めた分析結果全般について議論を重ねた上で、本研究においては還流移動の発生メカニズムを以下のように結論付けた。すなわち、わが国地方圏出身男性の還流移動については、総合的なライフスタイル選択の結果として実行されるものととらえることは不適当であり、むしろ就職後数年以内にかなりの高確率において訪れる仕事上の最初の転機において、単身や夫婦2人世帯であるなど比較的制約が少ない地方圏出身者が待ちうる、職業生活上の選択肢の一つとして解釈することがより適切である。
気管支喘息病態へのウイルス感染の関与とその制御

マウス骨髄由来樹状細胞にダニアレルゲンをパルス、成熟させ、別のナイーブマウスの気道へ移入し、引き続きダニアレルゲンを気道内へ投与すると、好酸球浸潤と気道上皮の杯細胞化、局所のTh2優位な免疫反応で特徴付けられるアレルギー性気道気道炎症が誘導される。この樹状細胞移入マウスダニ喘息モデルを用いてRSVが樹状細胞のTh2誘導能に与える影響をin vitroとin vivoで検討した。ダニアレルゲンパルス樹状細胞にRSV感染を行うと、CD40発現が亢進し、樹状細胞からのIL-10産生が抑制された。この樹状細胞をナイーブマウス気道へ移入、アレルゲンチャレンジを行ったところ、気道への好酸球浸潤とTh2サイトカイン産生が抑制された。即ち、RSVはダニアレルゲン感作樹状細胞に直接感染した場合、そのTh2誘導能を抑制することが明らかとなった。気道におけるRSVの本来のhostは樹状細胞ではなく、気道上皮細胞である。そこでRSVが気道上皮細胞に感染した際に産生される液性因子が間接的に樹状細胞の機能へ与える影響に着目した。本研究において我々が使用した気道上皮由来因子は、ウイルス感染により産生され、且つ喘息病態への関与が深く検討されているcysteinyl leukotrienes (cysLTs)である。RSV直接感染モデルと同様にダニアレルゲンパルスマウス骨髄由来樹状細胞にcysLTsをパルスしたところ、in vitroとin vivoの両方でTh2優位の免疫反応とそれに相関するアレルギー性気道炎症は増強され、ロイコトリエン受容体拮抗薬によりこの効果は抑制された。即ち、RSVは気道上皮細胞に感染し、そこからcysLTsのような因子を産生させ、これが樹状細胞のTh2誘導能を増強することが示唆された。Respiratory syncytialvirus (RSV)は乳幼児において気管支喘息の発症や増悪に関係するといわれている。一方、成人では不完全な免疫獲得のためRSV感染が繰り返しおこるが、無症候性感染が多く、これは低力価RSV感染によると考えられる。我々は宿主免疫能には影響するが、肺に炎症をおこさない低力価RSV単回感染及び再感染がダニ感作アレルギー性喘息マウスに与える影響をメサコリン吸入に対する気道過敏性、肺組織像、縦隔リンパ節分離単核球からのIL-5,IFN-γの産生と血清IgE値によって検討した。Normal BALB/C (Cont)マウスヘの低力価RSV単回感染は気道過敏性や肺組織像に影響しなかったものの肺でのRSV複製と縦隔リンパ節よりIFN-γの産生増加を認めた。ContマウスへのRSV再感染ではダニ感作アレルギー性マウス(AS)と同様に気道過敏性の亢進を認めるものの、ASマウスと比較して肺組織像は軽度の炎症細胞の浸潤を示し、縦隔リンパ節からはIFN-γの著明な上昇を認めた。ASマウスヘの低力価RSV単回感染では、気道過敏性は消失し、肺組織像では炎症細胞浸潤は軽度になった。縦隔リンパ節でIL-5は軽度減少しIFN-γの著明な上昇を認めた。一方、ASマウスヘのRSV再感染ではASマウスと比較して気道過敏性は著明に亢進し、肺組織像も炎症細胞浸潤が高度であった。縦隔リンパ節ではIL-5が著明に増加した。血清総IgE値はContマウス、ASマウスともに感染前後で有意差はなかった。低力価RSVは喘息マウスヘの単回感染ではアレルギー性気道炎症に対してTh1サイトカインの増加により、アレルギー性気道炎症を抑制するが、再感染ではダニ抗原との相乗作用でTh2サイトカインの著明な増加によりアレルギー性気道炎症を増強する。Respiratory syncytialvirus (RSV)は乳幼児において気管支喘息の発症や増悪に関係するといわれているが、その機序は完全には明らかになっていない。我々はアレルゲン感作とウイルス感染の両方において重要な細胞である樹状細胞に着目した。樹状細胞は強力な抗原提示能を有するプロフェッショナル抗原提示細胞であるが、特異的なマーカーを発現せず、数が生体内において非常に少ないため、生体からの分離は困難である。そこでBALB/cマウスの骨髄細胞をGM-CSFとともに培養することでマウス骨髄由来樹状細胞を作製し、この樹状細胞にダニアレルゲンパルスを行う前にRSVを感染させた後、別のマウスの気道へと移入し、アレルギー性気道炎症を惹起させた。RSV感染によりマウス骨髄由来樹状細胞からの免疫調整性サイトカイン産生、表面マーカー発現はTh1優位へと変動した。また、この樹状細胞を移入されたマウスではアレルギー性気道炎症が組織学的に抑制され、所属リンパ節におけるTh2優位の免疫反応も抑制されていた。即ち、樹状細胞にRSVが感染すると、この樹状細胞はin vitroとin vivoの両方でTh1優位の免疫反応を誘導するphenotypeへと変異した。従って、少なくとも樹状細胞に直接感染した場合、RSVはアレルギ-の誘導を抑制する。マウス骨髄

由来樹状細胞にダニアレルゲンをパルス、成熟させ、別のナイーブマウスの気道へ移入し、引き続きダニアレルゲンを気道内へ投与すると、好酸球浸潤と気道上皮の杯細胞化、局所のTh2優位な免疫反応で特徴付けられるアレルギー性気道気道炎症が誘導される。この樹状細胞移入マウスダニ喘息モデルを用いてRSVが樹状細胞のTh2誘導能に与える影響をin vitroとin vivoで検討した。ダニアレルゲンパルス樹状細胞にRSV感染を行うと、CD40発現が亢進し、樹状細胞からのIL-10産生が抑制された。この樹状細胞をナイーブマウス気道へ移入、アレルゲンチャレンジを行ったところ、気道への好酸球浸潤とTh2サイトカイン産生が抑制された。即ち、RSVはダニアレルゲン感作樹状細胞に直接感染した場合、そのTh2誘導能を抑制することが明らかとなった。気道におけるRSVの本来のhostは樹状細胞ではなく、気道上皮細胞である。そこでRSVが気道上皮細胞に感染した際に産生される液性因子が間接的に樹状細胞の機能へ与える影響に着目した。本研究において我々が使用した気道上皮由来因子は、ウイルス感染により産生され、且つ喘息病態への関与が深く検討されているcysteinyl leukotrienes (cysLTs)である。RSV直接感染モデルと同様にダニアレルゲンパルスマウス骨髄由来樹状細胞にcysLTsをパルスしたところ、in vitroとin vivoの両方でTh2優位の免疫反応とそれに相関するアレルギー性気道炎症は増強され、ロイコトリエン受容体拮抗薬によりこの効果は抑制された。即ち、RSVは気道上皮細胞に感染し、そこからcysLTsのような因子を産生させ、これが樹状細胞のTh2誘導能を増強することが示唆された。
老人保健施設の日常生活援助における看護職機能の専門性について

【研究目的】老人保健施設におけるケアの質を高めることに寄与するために、看護職の実施している日常生活援助の専門性について明らかにしたいと考えた。【研究方法】実際に両職種がケア提供している場面に研究者が入り、参加観察を行うともに、同意を得て適宜8mmビデオ撮影を行う。その後ケア提供者に対してケア提供者の行為の意図やその時対象者に対して考えていたことなどについて聞き取り調査を実施した。データはGrounded Theory Approachを用い逐語的に質的継続的比較分析を行った。【結果】食事介助の場面においては、時々自力摂取している他患に目配りしながら、看護職は要介助者の何人かをラウンドするように介助して回りながら、体調不良者の食事摂取状況、発熱者の水分摂取量など主に要観察者への目配りを行なっていた。一方介護職は、全体に目配りはしているが一人の所に長く関わり、個々の食事行為の完了に関わっていた。入浴介助では、看護職と介護職の相違が明確に現れた点があった。介護職が「怖がらせない」「危険がないこと」を筆頭にあげたのに対し、看護職は「全身の皮膚や状態の観察」を筆頭にあげている。また身体状況やより良い入浴のさせ方などについて、介護職にアドバイスをする役割も果たしていた。オムツ交換も、看護職は健康観察の機会と捉えていた。【考察】看護職と介護職が実際に老人に行っている具体の援助行為はほぼ同じであるが、それぞれが目指していることや注意を払っていることは明らかに違っていた。一言で云うならば、看護職が日常生活の援助を通して健康状態の変化に目を向けているのに対し、介護職の関心は日常生活の円滑な維持に向けられている。互いの職種がどこを担っていかなければならないかについて認識することが大切であると考える。今後看護は特に、対象の健康レベルを見極め、適切な援助方法を判断し、介護職や家族に伝えることができるような力を確立しなければならない。
ラットDRGにおけるAVPを介したニューロンーグリア細胞間の相互作用の解明

昨年度までにラットSONニューロンに発現する浸透圧受容器のうち少なくとも一部は全長TRPV1によって構成されていることを明らかにした。しかし、浸透圧受容器と報告されているホモ4量体のTRPV1では逆転電位の値などいくつか性質が異なることが分かっている。今年度に実施した実験の中でラットSONでエクソンの1-5番目を欠く新しいTRPV1スプライスバリアントを発見し、この分子をTRPV1_SONと名付けた。TRPV1は4量体で一つのチャネルを形成し、他の分子とヘテロ4量体を形成しうること、そしてヘテロ4量体分子はCapsaicinに対する応答が減弱する等ホモ4量体TRPV1が示す性質が変化することが報告されている。我々はラットSONに発現する浸透圧受容器は全長TRPV1とTRPV1_SONのヘテロ4量体で構成されているという仮説を立てた。これを検証するために全長TRPV1、TRPV1_SON、TRPV1とTRPV1_SONを接続した遺伝子をそれぞれ組み込んだベクターを作成し、それぞれのベクターを導入した細胞の浸透圧応答を調べることを検討している。これまで全長TRPV1、TRPV1_SONベクターを作成した。全長TRPV1発現細胞にCapsaicinを適用するとほぼ全ての細胞で応答が見られた。応答が見られた細胞のうち約20%の細胞は高浸透圧刺激にも応答したが、繰り返しの高浸透圧刺激には応答しなかった。以上の結果からTRPV1のみ、TRPV1_SONのみを強制発現した細胞ではいずれもラットSONニューロンで見られた性質を再現することが出来なかった。このため、ラットSONニューロンに発現する浸透圧受容器はそれぞれの分子のみで構成されている分子ではないことが考えられた。本研究課題は平成26年度が最終年度のため、記入しない。背根神経節(DRG)とは脊髄の背角外側に存在する組織であり、組織中には主に感覚ニューロンの細胞体が存在している。アルギニンバソプレシン(AVP)とは視床下部で産生され下垂体後葉から体循環に分泌されるペプチドホルモンである。AVPは血管平滑筋の収縮や腎臓の集合管での水の再吸収を介した体液浸透圧を調節する役割をもつことが知られている。近年ストレスや社会認識行動にもAVPが関わっていることが明らかとなっており、体液浸透圧の調節以外にも新たなAVPの役割が明らかになりつつある。DRGニューロンの細胞体にAVPが発現しているという報告があり、DRGに存在するAVPも何らかの役割をもつことが推測される。成熟ラットから単離、培養した細胞にAVP刺激を行ったところ、非興奮性細胞で細胞内Ca^<2+>濃度([Ca^<2+>]_i)上昇反応が見られた。[Ca^<2+>]_i測定後にグリア細胞のマーカー蛋白であるS-100に対する抗体を用いた免疫染色を行ったところS-100陽性細胞とAVPに反応する細胞が同一であることが明ちかになった。また、AVPによる[Ca^<2+>]_i上昇反応はGq/PLCを介したCa^<2+>動員であること、選択的AVP-V1受容体拮抗薬存在下では消失することが明らかとなった。V1受容体にはV1a,V1bの2種類のサブクラスが存在することが知られている。V1a,V1b受容体に特異的なプライマーを作成しDRG組織および培養DRG細胞から抽出したサンプルを用いたRT-PCR法を行ったところDRG組織由来のサンプルからはV1a,V1b受容体mRNA由来のバンドが検出された。培養DRG細胞から抽出したサンプルからはV1a受容体-mRNA由来のバンドのみが検出された。以上の結果から今回用いた培養DRGグリア細胞でのAVPによる[Ca^<2+>]_i上昇反応には主にV1a受容体が関与していることが示された。2年目にはDRGグリア細胞に作用しうるAVPの供給源の検索を行った。DRGニューロンの細胞体にAVPの免疫原性があることが報告されている(Kai-Kai et al. Neuroscience. 1986)ため、DRGニューロンがAVPの供給源となるかについて検討した。抗AVP抗体を用いてELISAプレートを作成したところ2pgまでのAVPを検出することが出来た。しかし、このプレートを用いてDRG抽出サンプルからAVPの検出を試みたが、検出出来なかったためDRGニューロンはDRGグリア細胞へのAVPの供給源となる可能性は低いと結論づけた。そこで研究の方針を変更し、別のAVPの供給源の候補である視索上核(SON)ニューロンに注目し、体液浸透圧の上昇によるAVP分泌機構の解明に焦点を当てた。マウスSONニューロンの浸透圧感知にTRPV1のN末端欠損分子が関わっていることが明らかとなっている(Sharif Naeini R et al. Nat Neurosci. 2006)が浸透圧受容体の本体は同定されていない。我々はTRPV1のN末端欠損分子が複数報告されているラットを用いて浸透圧受容体の同定を試みた。RT-PCRおよび免疫染色によりラットSONには全長領域を有するTRPV1分子が発現していることが明らかとなった。また[Ca^<2+>]_i測定法および電気生理学的手法によりラットSONニューロンに発現するTRPV

1分子は24°Cでは作動薬であるcapsaicinに応答しないが36°Cにすることでcapsaicinに応答するようになること、SONニューロンの高浸透圧刺激に対する応答はTRPV1の選択的阻害薬であるcapsazepineによって可逆的に阻害されることが明らかとなった。以上の結果からラットSONに全長領域を有するTRPV1分子が機能的に発現しており、浸透圧感知に重要であることが示唆された。昨年度までにラットSONニューロンに発現する浸透圧受容器のうち少なくとも一部は全長TRPV1によって構成されていることを明らかにした。しかし、浸透圧受容器と報告されているホモ4量体のTRPV1では逆転電位の値などいくつか性質が異なることが分かっている。今年度に実施した実験の中でラットSONでエクソンの1-5番目を欠く新しいTRPV1スプライスバリアントを発見し、この分子をTRPV1_SONと名付けた。TRPV1は4量体で一つのチャネルを形成し、他の分子とヘテロ4量体を形成しうること、そしてヘテロ4量体分子はCapsaicinに対する応答が減弱する等ホモ4量体TRPV1が示す性質が変化することが報告されている。我々はラットSONに発現する浸透圧受容器は全長TRPV1とTRPV1_SONのヘテロ4量体で構成されているという仮説を立てた。これを検証するために全長TRPV1、TRPV1_SON、TRPV1とTRPV1_SONを接続した遺伝子をそれぞれ組み込んだベクターを作成し、それぞれのベクターを導入した細胞の浸透圧応答を調べることを検討している。これまで全長TRPV1、TRPV1_SONベクターを作成した。全長TRPV1発現細胞にCapsaicinを適用するとほぼ全ての細胞で応答が見られた。応答が見られた細胞のうち約20%の細胞は高浸透圧刺激にも応答したが、繰り返しの高浸透圧刺激には応答しなかった。以上の結果からTRPV1のみ、TRPV1_SONのみを強制発現した細胞ではいずれもラットSONニューロンで見られた性質を再現することが出来なかった。このため、ラットSONニューロンに発現する浸透圧受容器はそれぞれの分子のみで構成されている分子ではないことが考えられた。本研究課題は平成26年度が最終年度のため、記入しない。培養DRG細胞の中でグリア細胞がAVPに反応して[Ca^<2+>]_i上昇反応を示すことを明らかにし、またその[Ca^<2+>]_ii上昇反応に関与するAVP受容体のサブタイプ等、[Ca^<2+>]_i上昇反応のメカニズムの詳細を明らかに出来たため。以上の結果をまとめたものがBrain research誌に掲載されたため。DRGニューロンの細胞体をDRGグリア細胞に作用するAVPの供給源の第一候補として考えていたがDRGに含まれるAVPを検出することが出来なかった。このため方針を変更し、別のAVPの供給源の候補であるSONニューロンに着目し、体液浸透圧によるAVPの分泌機構に焦点を当てて研究に取り組んだ。その結果、ラットSONニューロンには全長領域を有するTRPV1分子が機能的に発現しており、体液浸透圧の変化の感知に重要であることを示唆する結果が得られたため。
金属マジックサイズクラスター群への固体高分解能NMRの導入

構成原子数の精密に揃った金属元素マジックサイズクラスターにおいて、サイト毎の電子状態の情報を実験的に得ることは困難である。高分解能核磁気共鳴(NMR)はサイト毎の電子状態の分析という手法を導入できる可能性がある。まず足がかりとして、最も構造対称性が高く信号の帰属が単純であろうAg25(SPhMe2)18の109Ag NMR信号の探索を自作プローブと特殊な高感度プローブを用いて行う。検知した信号を手がかりに、構成原子数や形状、更には組成・配位子を系統的に変えてクラスターのNMRを測定し信号の帰属を行い、NMR信号と電子状態を量子化学計算により検証しサイト毎に情報が得られていることを実証していく。
肝細胞癌の発生・進展における免疫寛容の意義の解明と新しい治療法の確立に関する実験的研究-マウス肝移植モデルにおける実験的肝癌を用いた分子生物学的検討-

われわれは,肝細胞癌が肝炎ウイルスcarrier状態(肝炎ウイルスに対する免疫寛容状態)を経て発生・進展することから,その背景には免疫寛容が深く関与しているとの仮説を立て,マウス肝移植モデルを用いた免疫寛容の研究を行ってきた.昨年度には,マウス肝移植モデル(C3H/He→DBA/2)を用いて,donor由来の培養肝癌細胞株(MH134hepatoma cell)を肝移植後14日,28日,42日に経門脈的に投与し,肝癌の成立状況を検討したところ,肝癌の発生・進展における免疫寛容の関与を示した.またわれわれの従来のデータから,マウス肝移植モデルにおいて,肝移植後28日目に免疫寛容のKey mediatorとされるIL-4のモノクローナル抗体を大量(4mg/body)に投与すると,移植肝は生着するが,免疫寛容の誘導は妨げられることが分かっている.そこで今年度は昨年度と同モデルを用いて,肝癌細胞投与と同時期(肝移植後14日,28日,42日)に,抗IL-4モノクローナル抗体11B11(4mg/body)を腹腔内投与し免疫寛容の成立を妨げ,肝癌の成立状況を検討した.その結果,投与群の肝細胞癌結節数は移植後14日投与群では4.5,28日では5.6,42日では6.5とコントロール群と比べて有為に少なかった.以上の結果は,宿主の免疫寛容を制御することにより肝癌の発生・進展が抑制されることを示し,肝癌の治療において免疫寛容制御療法は新たな治療法となる可能性を示した.われわれは,肝細胞癌が肝炎ウイルスcarrier状態(肝炎ウイルスに対する免疫寛容状態)を経て発生・進展することから,その背景には免疫寛容が深く関与しているとの仮説を立て,マウス肝移植モデルを用いた免疫寛容の研究を行ってきた.昨年度には,マウス肝移植モデル(C3H/He→DBA/2)を用いて,donor由来の培養肝癌細胞株(MH134hepatoma cell)を肝移植後14日,28日,42日に経門脈的に投与し,肝癌の成立状況を検討したところ,肝癌の発生・進展における免疫寛容の関与を示した.またわれわれの従来のデータから,マウス肝移植モデルにおいて,肝移植後28日目に免疫寛容のKey mediatorとされるIL-4のモノクローナル抗体を大量(4mg/body)に投与すると,移植肝は生着するが,免疫寛容の誘導は妨げられることが分かっている.そこで今年度は昨年度と同モデルを用いて,肝癌細胞投与と同時期(肝移植後14日,28日,42日)に,抗IL-4モノクローナル抗体11B11(4mg/body)を腹腔内投与し免疫寛容の成立を妨げ,肝癌の成立状況を検討した.その結果,投与群の肝細胞癌結節数は移植後14日投与群では4.5,28日では5.6,42日では6.5とコントロール群と比べて有為に少なかった.以上の結果は,宿主の免疫寛容を制御することにより肝癌の発生・進展が抑制されることを示し,肝癌の治療において免疫寛容制御療法は新たな治療法となる可能性を示した.われわれは,肝細胞癌は90%以上の症例がB型およびC型肝炎ウイルス感染のcarrier状態(肝炎ウィルスに対する免疫寛容状態)から発生しているという事実より,その発生・進展には宿主の免疫寛容が深く関与しているとの仮説を立て,マウス肝移植モデルを用いた免疫寛容モデルによる研究を行ってきた.平成10年度には,第一に,東北大学加齢医学研究所医用細胞資源センターよりマウス(C3H/He由来)腹水肝細胞癌株MH134の分与を受け,本研究で購入した凍結保存システム(ローケーター)を使用して,癌細胞株の継代培養を行った.第二に,マウス肝移植モデル(C3H/He→DBA/2)を対象として,donor由来の培養肝癌細胞(MH134hepatoma cell)を経門脈的に接種し実験肝癌の作成を試みるとともに,肝癌細胞株(C3H/He)に対する拒絶反応の高度の時期から完全な免疫寛容状態に至るさまざまな宿主の免疫学的状態における肝癌の発生・進展状況を解析した.その結果,マウス肝細胞癌株(MH134)の継代培養に成功した.さらに,10^2,10^4,10^6,10^8個の癌細胞を経門脈的に経時的に投与し,1カ月後に犠死せしめ,肝細胞癌の成立状況を検討したところ,コントロール群(C3H/He->C3H/He;syngeneic model)においては,投与時期を問わず癌細胞眼株投与後14日で,肝細胞癌結節数6.2のピークが得られたが,実験群(C3H/He->DBA/2;allogeneic model)においては,移植後14日目に癌細胞投与を行った群の肝細胞癌結節数は4.5と有意に少なく,一方移植後100日目に癌細胞投与を行った群の結節数は15.2ときわめて高い癌結節の形成が確認された.以上の結果は,肝癌の発生・進展における免疫寛容の関与を証明したものであり,平成11年度以後は,本研究の結果に基づき,免疫寛容状態を標的とした,肝癌の新しい治療法の開発とその意義に関する研究を進めて行くつもりである.われわれは,肝細胞癌が肝炎ウイルスcarrier状態(肝炎ウイルスに対する免疫寛容状態)を経て発生・進展することから,その背景には免疫寛容が深く関与しているとの仮説を立て,マウス肝移植モデルを用いた免疫寛容の研究を行ってきた.

昨年度には,マウス肝移植モデル(C3H/He→DBA/2)を用いて,donor由来の培養肝癌細胞株(MH134 hepatoma cell)を肝移植後14日,28日,42日に経門脈的に投与し,肝癌の成立状況を検討したところ,肝癌の発生・進展における免疫寛容の関与を示した。またわれわれの従来のデータから,マウス肝移植モデルにおいて,肝移植後28日目に免疫寛容のKey mediatorとされる抗IL-4モノクローナル抗体を大量(4mg/body)に投与すると,移植肝は生着するが,免疫寛容の誘導は妨げられることが分かっている.そこで今年度は昨年度と同モデルを用いて,肝癌細胞投与と同時期(肝移植後14日,28日,42日)に,抗IL-4モノクローナル抗体11B11(4mg/body)を腹腔内投与し免疫寛容の成立を妨げ,肝癌の成立状況を検討した.その結果,投与群の肝細胞癌結節数は移植後14日投与群ではで4.0,28日では4.5,42日では5.2とコントロール群と比べて有為に少なかった.以上の結果は、宿主の免疫寛容を制御することにより肝癌の発生・進展が抑制されることを示し,肝癌の治療において免疫寛容制御療法は新たな治療法となる可能性を示した.
神経筋共培養を利用した合成カンナビノイドの有害性予測モデルの開発

合成カンナビノイドの乱用によって痙攣のような重篤な健康被害が報告されている。合成カンナビノイドは、無数の類縁体が存在し、多くは正確な薬理作用が不明である。合成カンナビノイドの作用点は、CB1とCB2受容体が同定され、中枢神経系のCB1が精神作用の発現に関与している。一方で、抹消組織でのCB1とCB2受容体の役割についてはほとんど明らかになっていない。そこで本研究では、神経筋共培養モデルを利用して合成カンナビノイドによる細胞毒性発現と痙攣発症機序を明らかにする。さらに、このモデルを利用し、合成カンナビノイドの細胞毒性および痙攣リスクを迅速に推測可能な、新規の薬物スクリーニング法の開発を行う。
子宮内膜症組織に特異的発現をする遺伝子群の解析

今年度は、内膜症由来不死化細胞を樹立しconventional cDNA libraryを作製する方法と、内膜症病変から直接にcDNA libraryを作る方法を導入し、遺伝子クローニングを試みてきたが、まだ特異的遺伝子の同定にまでは到達していない。特に後者のcDNA library作製はpoly-TをprimerとしたPCR技術を導入して行ったが、クローニングをするにはライブラリーサイズが小さかったため3回の作製を行った。遺伝子解析に特殊技術を必要とする項目に関しては、企業に一部の解析を依頼した。遺伝子産物の特異的発現の確認実験がまだ十分には進んでいないので、論文投稿には至っていない。子宮内膜組織は月経後や分娩後にも短期間で再構成されることから、通常のアポトーシス刺激環境には耐性で、長期間にわたり単細胞から増殖可能な能力を持った、一種の幹細胞が存在すると考えられている。そこで、我々は類子宮内膜組織である子宮内膜症組織や子宮腺筋症組織にも疾患特有の類幹細胞が存在するという仮説を立て、子宮内膜症組織、子宮腺筋症組織、正所性子宮内膜組織から限界希釈法で長期生存株を複数樹立し、子宮内膜幹様細胞の存在を実証した(論文印刷中)。これらの細胞は形態学的にも、サイトカイン産生能力、各種表面抗原の発現レベルでも明らかな違いが証明されている(論文執筆中)。現在は、これらの樹立細胞からRNAを精製し、正所性子宮内膜組織由来細胞と異所性子宮内膜組織由来細胞(子宮内膜症細胞および子宮腺筋症細胞)の間でDNA microarray解析を試みている。次年度には、DNA microarray解析の結果に基づいた研究を展開する予定である。子宮内膜症病変における遺伝子発現異常分子を同定することは子宮内膜症の発症機構の解明につながるが、病巣組織が極めて微量であるために、子宮内膜症病変由来不死化細胞を樹立し無限の細胞入手を可能にして遺伝子解析を行う方法と、病変の微量組織に再現性と定量性の高い遺伝子増幅法処置を行った後に特異性の高い遺伝子解析を行う方法のふたつが成功を期待できる子宮内膜症の遺伝子解析と考えられる。この研究費申請研究では、内膜症由来不死化細胞を樹立しconventional cDNA libraryを作製しsubtractive cDNA cloningあるいはdifferential display法によるcDNA cloningを行う方法と、内膜症病変から直接にcDNA libraryを作ることによりdifferential display法によるcDNA cloningを行う方法のふたつの方法を導入し、遺伝子クローニングを行うことである。現在は遺伝子libraryの作製に専心中である。疾患特異的な遺伝子の同定は成功していないが、研究過程で樹立した内膜症由来培養細胞を用いての細胞学的解析を研究経過の報告とした。手術時に採取した内膜症腹膜病変組織、正常中皮組織、正所性子宮内膜細胞をin vitro培養し、SV40largeT抗原遺伝子導入により不死化させ、単一細胞由来不死化細胞株を樹立してきている。不死化子宮内膜症細胞の細胞生物学的諸性質の解析を行った。一部の不死化子宮内膜症細胞を用いて疾患特異的に発現が変動する遺伝子のDifferental display法による選別を行ってきた。しかし、まだ研究途上にて、明確な子宮内膜症特異遺伝子を同定するには至っていない。一方で、子宮内膜症腹膜病変、同患者の正常腹膜、同患者の正所性子宮内膜組織からそれぞれRNAを抽出し、random hexamerを用いてcDNA libraryを作製を試みてきたが、スクリーニングの価値ある大きさのpair cDNA library作製にはまだ成功していない。
EBウイルス複製起点における宿主複製開始因子複合体の機能

縮主ゲノム複製起点に類似した機能を持つEBウイルスの複製起点oriPをモデルに用いて複製開始とその制御機構の解明をめざし、ウイルス複製因子EBNA1がoriPで形成する複合体に含まれる宿主複製開始因子を同定し、細胞周期に依存して受ける制御機構を明らかにすることを目的とした。OriPによる複製は1細胞周期あたり約1回とする結果が報告されているが、これがoriPの複製効率が単に低いためなのか、あるいは細胞ゲノムと同様の制御を受けているのかは不明であった。そこでoriPを細部に導入後、nocodazoleを用いて細胞周期の進行をM期で阻止し、最初のS期に起こる複製を調べた。その結果最初のS期でDNAはすでに核内に存在していたものの、oriPからの複製はほとんど行われないことが明らかになった。Nocodazoleを培地から除き、再び細胞周期を進行させ、M期を通過しG1からS期へと移行させると、今度は複製が行われた。これらの結果からoriPから複製が開始されるには一度M期を通過することが必要であること、したがってoriPはライセンシング制御を受けていることが明らかになった。さらに、最小oriP領域からの複製もライセンシング制御を受けており、ライセンシング制御は特定の塩基配列を必要とはせずにEBNA1が形成する複合体を介して行われていると考えられた。次にEBNA1と特異的に結合する細胞因子を単離するために、ヒスチジンのタグを付加したEBNA1を発現させたHeLa細胞を作成し大量培養し、キレ-ティングクロマトグラフィー法によりEBNA1-複合体を精製することを試みている。またライセンシングに関わるMCM因子が直接EBNA1と結合することも考えられる。この可能性を検討する実験を行うことが今後必要である。