hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
内殻電離・オージェ効果によるバイスタンダー効果誘発に関する研究

大部分の細胞が生残する低線量域ではDNA損傷そのものよりも、それによって誘導されるさまざまなシグナル伝達、制御系が生物影響発現に重要な役割を果たしていることが明らかになってきた。このシグナルの発信という現象を放射線によるエネルギー付与量の観点から調べる為に、放射光のテューナビリティを利用して、エネルギー可変のマイクロビーム細胞照射装置を開発し、局所的に大きなエネルギーを与えるオージェ効果を誘発して、それによるシグナル伝達、その結果起きるバイスタンダー効果を調べるのが本研究の目的である。そのために当初は垂直光軸系を基本に作られた顕著鏡を水平にしたシステムを開発した。水平にすることによるいくつかの問題点を確認し、克服することによって、再現性よく、信頼出来る生物実験が行える水平マイクロビーム細胞照射装置を開発出来た。垂直型(エネルギー固定)マイクロビーム細胞照射装置の利用希望が多いので、水平型マイクロビームが十分に確保出来ないために十分なデータが蓄積されたとは言えないが、得られた生物実験の結果は以下のようにまとめられる。1.フェナンスロリン鉄を取り込ませた細胞では、鉄のK殻吸収端より低いエネルギーのX線の方がバイスタンダー効果を誘発した。2.細胞内タンパク質に存在する硫黄のK殻吸収端前後のX線を照射した場合には、照射された細胞の致死作用は低エネルギー側のX線の方が大きかったが、バイスタンダー細胞の致死作用はオージェ効果を起こす高エネルギー側の方が大きかった。予備的な実験結果ではあるが照射X線エネルギーに対するバイスタンダー効果誘発率の依存性に関して非常に興味ある結果が得られたので、今後も精力的に研究を継続している計画である。14年度から16年度の科学研究費補助金で放射光単色X線を用いたマイクロビーム細胞照射装置を完成させたが、この装置では位置精度の再現性をよくするために水平面内で動く二次元ステージを採用したためにX線をはね上げる必要があり、そのためにX線エネルギーの可変性を犠牲にしてきた。本研究の目的は、垂直平面内で動く二次元ステージを採用し、放射光の最も大きな特徴であるX線エネルギーの可変性を生かして、生体構成元素の内殻吸収端を狙い撃ちしてオージェ効果を効率良く誘発して、オージェ効果によるバイスタンダー効果の誘発を調べることである。本研究の目的を達成するために平成17年度は、水平のマイクロビームを用いて細胞試料を照射する垂直型二次元自動ステージを備えた水平型顕微鏡を開発することを計画した。ここでは1.垂直軸を持つ精度の良い自動ステージを組み込んだ顕微鏡を開発する。2.上記のステージに取り付けられ、かつ細胞の状態を良好に保てる試料皿を開発する。ことが重要となる。これらについていくつかの試作品を製作した後、目標仕様を満足するものを開発することが出来た。また17年度には、照射された細胞、および周辺の細胞に誘発される放射線応答を感度良く検出するための共焦点レーザー顕微鏡をオフライン顕微鏡に導入した。この顕微鏡では、すでに開発されている垂直ビーム利用の照射装置での座標情報を共通に利用できるので、すでに照射実験が行われている垂直マイクロビームによって照射された細胞系における影響を感度良く検出することが出来ている。今年度開発された水平ビーム用の試料皿はこの共焦点レーザー顕微鏡での観察も可能であることは言うまでもない。14年度から16年度の科学研究費補助金で放射光単色X線を用いたマイクロビーム細胞照射装置を完成させた。本研究の目的は、そこで得られたノウハウを用いて、X線エネルギーが可変となる水平光軸型マイクロビーム細胞照射装置を開発すること、そして、放射光の最も大きな特徴であるX線エネルギーの可変性を生かして、生体構成元素の内殻吸収端を狙い撃ちしてオージェ効果を効率良く誘発して、オージェ効果によるバイスタンダー効果の誘発を調べることである。本研究の目的を達成するために平成17年度は、水平のマイクロビームを用いて細胞試料を照射する垂直型二次元自動ステージを備えた水平型顕微鏡を開発した。

2.上記のステージに取り付けられ、かつ細胞の状態を良好に保てる試料皿を開発する。ことが重要となる。これらについていくつかの試作品を製作した後、目標仕様を満足するものを開発することが出来た。18年度には、システム全体のテストをかねた細胞照射実験を開始した。全体でテストしてみるとハードウエアおよびソフトウエアにおいていくつかの改善すべき点が見つかったので、適宜、改良を行ない、実験データを蓄積する基本的な実験条件を決める事ができた。この条件下で、細胞内在性のカルシウムおよび細胞内に取り込まれDNAと結合する鉄含有錯体で処理した細胞系での鉄に着目し、それぞれのK殻吸収端前後のエネルギーのX線を照射して、バイスタンダー効果誘発の実験を開始している。データは着実に蓄積されているが、共同利用ビームラインを利用しているために十分な時間がとれないので、鉄およびカルシウムでのオージェ効果がバイスタンダー効果誘発を促進するか否かについてはまだ結論を得ていない。本研究の目的を達成するために平成17年度は、水平のマイクロビームを用いて細胞試料を照射する垂直型二次元自動ステージを備えた水平型顕微鏡を開発し、かつ細胞の状態を良好に保つ試料皿を開発した。18年度から、システム全体のテストをかねた細胞照射実験を開始し、ハードウエアおよびソフトウエアにおいていくつかの改善を経て、実験を開始した。細胞内在性のカルシウムおよび細胞内に取り込まれDNAと結合する鉄含有錯体で処理した細胞での鉄に着目し、それぞれのK殻吸収端前後のエネルギーのX線を照射して、バイスタンダー細胞死誘発に関して内殻吸収に依存して効率が変化するかを調べた。得られた結果は以下の通りである。1)内在性カルシウムをねらった実験では吸収端前後では差はみられなかった。カルシウムの含有量が少ないためと判断された。2)フェナンスロリン鉄錯体で処理した細胞では、2a)照射された細胞の生存率は鉄の吸収がないX線で照射した方が低かった。2b)バイスタンダー細胞死についても、鉄の吸収がない方が顕著に見られた。2c)細胞核だけを照射した場合のバイスタンダー細胞死については、照射X線エネルギーの違いによる効果は見られなかった。実験開始前には、鉄の内殻吸収それに引き続いて起きるオージェ効果が起きた方が生物効果が大きいと予想していたが、実験結果は逆の傾向を示していた。また、細胞内での照射部位によって異なる結果が得られたことから、細胞内の鉄錯体の分布と考え合わせて、メカニズムの検討している。
ノックアウトマウスを用いたCAD、ICADの生理作用の解析

CADはアポトーシス時に活性化されるDNaseであり、死細胞内でのDNA分解を担っている。一方、アポトーシス細胞のDNA分解は、CADのみならず、死細胞を貪食した貪食細胞内のDNaseIIによっても担われていることが示唆されている。昨年度までに、DNaseIIは赤芽球から脱核した核DNAの分解に必須であり、DNaseIIが欠損すると赤血球造血に異常が生じることを示してきた。本年度は、アポトーシス細胞のDNA分解の分子機構並びに生理作用を明らかにするため、これまでに作製してきたCAD、DNaseIIそれぞれの欠損マウスに加え、CAD/DNaseII二重欠損マウスを作成し、これらを用いて解析を行った。すると、胎生17.5日目の胸腺細胞の数が、DNaseII欠損マウスでは野生型の29%、CAD/DNaseII欠損マウスでは12%に減少していた。細胞表面マーカーについてのFACS解析から、DNaseII欠損マウス、CAD/DNaseII欠損マウスでは、胸腺細胞の増殖、分化がプロT細胞ステージで抑制されていることが示された。これらの胸腺にはDNAを蓄積したマクロファージが観察された。そして、電子顕微鏡を用いた解析から、これらのDNAはマクロファージのリソソームに蓄積しており、そのDNAの形状は、CAD/DNaseII欠損マウスではインタクトな繊維状であるのに対し、DNaseII欠損マウスでは、より断片化された粒子状であることが示された。以上の結果より、生体内において、CAD及びDNaseIIがアポトーシス細胞のDNA分解に協調的に作用しており、胸腺でのアポトーシス細胞のDNA分解に異常が生じると、T細胞の発生が妨げられることが示された。
人間関係・社会への参画・自己実現を構造的に把握する教育モデルの研究

本研究では、社会的弱者の位置に置かれる子どもも含めた全ての子どもが、自身の自己実現のために必要な社会を構想しながら、人間関係を構築しつつ社会へ参画するための指導モデルを溝上泰子の教育論を手掛かりに探る。そのため、1溝上泰子が交流してきた「底辺」や「女」としての生活者の実態がどのように溝上の生活論に反映しているのかを明らかにし、その上で、2特に溝上の個人と集団の関係性の捉え方がどのように教育論に反映しているのかを明らかにする。
細胞老化阻止による筋ジストロフィーモデルラット病態改善の試み

我々はゲノム編集技術を用いてヒトデュシェンヌ型筋ジストロフィー(DMD)の病態を極めて忠実に反映するモデルラットの作出に成功した。本モデルラット骨格筋では細胞老化因子p16の発現が若齢時より亢進していたことから、早期におこる細胞老化が病態の進行に関与する可能性を考え研究を遂行した。その結果、本モデルラット骨格筋ではTGF-βの発現が増加しており、それにより骨格筋の再生を担う筋衛星細胞の老化が生じていることが明らかとなった。本研究は、我々が作出したDMDラットを用いて、その病態進行における筋衛星細胞老化の関与について詳細に検証し、さらにゲノム編集技術を用いた遺伝子改変による細胞老化阻止を図ることでDMDラットの病態進行を改善することを目的としたものである。本年度は以下のような研究成果を得た。1.DMDラットの月齢に伴う病態進行について組織学的な解析を行った。その結果、生後1ヶ月で早くも進行性の筋病変(壊死・再生像)が観察され、3ヶ月齢になると線維化が、さらに5ヶ月齢には脂肪化がみられることが判明した。10ヶ月齢に至ると、筋病変の著しい進行によりDMDラットでは激しい削痩がみられるようになり、体重は野生型の約4分の3にまで減少していた。2.DMDラット骨格筋に由来する初代培養細胞において細胞老化因子p16の発現が亢進していること、さらにその亢進にTGF-bシグナル経路の活性化が関与する可能性を示す結果を得た。さらにDMDラット骨格筋に由来する初代培養細胞では細胞老化の指標であるSA-betaGal陽性を示す細胞が出現することや、野生型ラット骨格筋由来の初代培養細胞にTGF-b処理を行うことでSA-betaGal陽性細胞が出現することを見いだした。3.ゲノム編集によるp16遺伝子欠損ラットの作出に着手した。すでにout-of-frame変異をもつ個体が作出されており、現在、p16遺伝子欠損DMDラットを得るためにDMDラットとの交配が進行中である。次年度に予定していた遺伝子改変ラットの作出に早くも着手可能な状況が整った。本研究は、我々が作出したDMDラットを用いてその病態進行における筋衛星細胞老化の関与について詳細に検証し、さらにゲノム編集技術を用いた遺伝子改変により細胞老化阻止を図ることでDMDラットの病態進行を改善することを目的としたものである。1.DMDラット骨格筋から単離した細胞を老化細胞マーカーであるSA-βGalおよびβ2Mの発現を指標にセルソーターにより分離した。こうして得られた老化細胞における各細胞系譜特異的マーカーの発現をRT-PCRにより調べた。その結果、筋衛星細胞マーカーであるPax7や筋芽細胞マーカーであるMyoDとともに、間葉系前駆細胞マーカーであるPDGFRαの発現がみられた。これらの結果からDMDラット骨格筋に存在する老化細胞には筋衛星細胞と間葉系前駆細胞に由来する複数の細胞種が混在していることが判明した。2.CRISPR法により得られたジストロフィン遺伝子変異ラットの中に、ジストロフィン遺伝子にin-frame変異をもつラットがみつかったため、それを系統化し、表現型の解析を行った。DNAシークエンスにより、本系統ではジストロフィン遺伝子のエクソン3から16にかけて1902 bpの欠損が生じており、アミノ酸634を欠く短縮型ジストロフィンタンパク質を発現していることが判明した。その表現型解析を行ったところ、骨格筋では壊死・再生像や線維化が、心筋では線維化がそれぞれ観察された。しかしながらそれらはDMDラットに比較して軽度であった。ヒトではジストロフィン遺伝子にin-frame変異をもつ筋原生疾患としてベッカー型筋ジストロフィー(BMD)があり、DMDに比べて病態は軽度である。本系統は今後BMDのモデルとして極めて高い利用価値があるものと考えられた。当初の計画通りに研究を進める。獣医生理学
亜酸化窒素生成の小さいオンサイト硫黄脱窒による農地から水系への窒素負荷の軽減

バッチ実験により、硫黄脱窒を実地施用するにあたっての、最適な環境条件を検討した。その結果、pH調整のため、炭酸カルシウムを元素硫黄と同時に土壌に埋め込むことで、脱窒がスムーズに進行することが確認された。また、適用区域が重量含水率40%以上の高含水率に保たれるように設定し、より無酸素に保つことで、充分な硝酸態窒素除去及びN_2O発生割合の軽減が可能となることがわかった。しかし、その場合、還元状態が進みすぎて、硫化物が生成するのはできる限り抑える必要があり、導入水量の適切な管理が必要といえる。土壌カラム試験では硫黄の埋込法の検討を行った。その結果、土壌と硫黄を混合した層を数十cmにわたり設けなくとも、数cmの層状に硫黄を埋め込むのみで、その層で、十分な硝酸態窒素除去が可能であることが確認された。これは実用化する場合に、実地施工がより簡易な方法でよいことを示している。また、有機物が存在しても、硫黄脱窒と従属栄養的脱窒が同時に進行し、硫黄脱窒の活性も十分保たれることがわかった。有機物添加は、特にNO(一酸化窒素)の発生量を抑えるのには有効であることが、実験結果より明らかとなったが、有機物の存在は硫酸還元を促進するデメリットの方が大きいことから、硫黄脱窒の適用区域には、有機物の流入を極力抑えるのが良いと結論づけられた。FISH法による硫黄脱窒細菌Thiobacillus denitrificansの検出では、純菌検出は十分行えることが確認された。しかし、土壌中での検出においては、土壌の自家蛍光と、probeの土壌粒子への非特異結合が問題となることが、滅菌土壌を用いた実験から明らかとなり、今後の更なる検討が必要と考えられた。実際の農地に元素硫黄を施用して脱窒を行わせる場合を想定して、水田土壌カラムを作成した。カラム上部は密閉型とし、土壌のみを使用したカラムと、理論上525gの硝酸態窒素除去可能量の元素硫黄と土壌を混合したものを充填した。流入基質は硝酸態窒素約30mgN/Lのみとし、有機物は流入させていない。間隙水を各ポイントに埋め込んだ簡易土壌溶液採取器より採取し、流入水は混合槽より、流出水はカラム出口より採取した。通水初期の脱窒反応が完全に進行しない時点では、亜酸化窒素の蓄積が見られた。これに対し、脱窒反応が完全に進行し始めると、N2Oの還元も進み、硫黄脱窒により硝酸態窒素及びN2O除去の両方が可能となった。しかし、脱窒反応が急速に進むに伴い、特に硫黄を埋め込んだ底部において、硫酸還元が起こり、硫化物が生成された。よって、それまで完全密閉としていたカラム上部を開放にした。それ以降の結果では、主に脱窒が進行していたカラム上部で、還元状態が不完全となったこと、硫黄脱窒の進行に伴いpHが低下したこと等の要因により、硝酸還元及び亜酸化窒素還元を阻害する結果がもたらされたのではないかと考えられる。土壌中に硫黄を埋め込み、硫黄脱窒を行なわせることにより、十分な硝酸態窒素除去が可能であり、脱窒反応が十分に進行すれば、亜酸化窒素も小さく抑えられた。還元状態の進行に伴い、硫酸還元による硫化物の生成が起こることから、適切な脱窒量のコントロールが必要といえ、今後具体的な施用条件の検討が必要である。電子供与体の投与及び土壌のpH調整により脱窒能の促進及び亜酸化窒素発生割合の低下が可能であるが、特に硫黄脱窒を進めることで、有機物を唯一の電子供与体とする場合より、発生する亜酸化窒素量が低く抑えられる可能性が示され、亜酸化窒素抑制の見地からみて、硫黄脱窒が有効な手段となりうるのではないかと考えられた。硝酸態窒素の除去と亜酸化窒素の発生の抑制は土壌中のさまざまな因子によって影響を受ける。含水率、p H、脱窒に利用可能な電子供与体が主たる因子であり、これらと反応の進行の関係をバッチ実験によって検討している。まず、含水率については、湛水した水田土壌のように水を多く含む場合には、脱窒が良好に進行しまた亜酸化窒素の発生量も小さいが、含水率が小さくなると脱窒速度が低下する一方で亜酸化窒素への転換が多くなることがわかった。このことは、亜酸化窒素の生成を伴わずに硝酸態窒素を除去するには畑地よりも水田のような環境の方が望ましいことを示している。次に、土壌のpHを中性に保つために炭酸カルシウムを添加することが亜酸化窒素の発生防止に大きな効果があることも明らかになった。更に、様々な物質を電子供与体として与える実験では、グルコースやセルロースなどの有機物を添加すると、硝酸態窒素の除去は大きい速度で進行するが、その一方で亜酸化窒素の生成が大きいこと、これに対して硫黄を用いた脱窒あるいは硫化物を用いた脱窒では亜酸化窒素の発生を抑制しつつ、一定程度の硝酸態窒素の除去速度が得られることがわかった。これらのことを統合し、高含水率で無酸素条件に保ち、炭酸カルシウムによって土壌を中性に保った状態で硫黄を土壌に混合することが、亜酸化窒素の発生を抑制した硝酸態窒素の除去にもっとも適しているといえる。硫黄利用脱窒細菌をFISH法によって特異的に検出するための遺伝子プローブを作成し、純菌に対する有効性を明らかにした。また硫黄を混合させたカラムに硝酸態窒素を連続的に流入させる実験によって、土壌中にこの脱窒菌が高い濃度で出現することを見いだした。

バッチ実験により、硫黄脱窒を実地施用するにあたっての、最適な環境条件を検討した。その結果、pH調整のため、炭酸カルシウムを元素硫黄と同時に土壌に埋め込むことで、脱窒がスムーズに進行することが確認された。また、適用区域が重量含水率40%以上の高含水率に保たれるように設定し、より無酸素に保つことで、充分な硝酸態窒素除去及びN_2O発生割合の軽減が可能となることがわかった。しかし、その場合、還元状態が進みすぎて、硫化物が生成するのはできる限り抑える必要があり、導入水量の適切な管理が必要といえる。土壌カラム試験では硫黄の埋込法の検討を行った。その結果、土壌と硫黄を混合した層を数十cmにわたり設けなくとも、数cmの層状に硫黄を埋め込むのみで、その層で、十分な硝酸態窒素除去が可能であることが確認された。これは実用化する場合に、実地施工がより簡易な方法でよいことを示している。また、有機物が存在しても、硫黄脱窒と従属栄養的脱窒が同時に進行し、硫黄脱窒の活性も十分保たれることがわかった。有機物添加は、特にNO(一酸化窒素)の発生量を抑えるのには有効であることが、実験結果より明らかとなったが、有機物の存在は硫酸還元を促進するデメリットの方が大きいことから、硫黄脱窒の適用区域には、有機物の流入を極力抑えるのが良いと結論づけられた。FISH法による硫黄脱窒細菌Thiobacillus denitrificansの検出では、純菌検出は十分行えることが確認された。しかし、土壌中での検出においては、土壌の自家蛍光と、probeの土壌粒子への非特異結合が問題となることが、滅菌土壌を用いた実験から明らかとなり、今後の更なる検討が必要と考えられた。
超音波ドップラ法の時間分解能向上による混相流動解析システムの構築

超音波パルスドップラ法の周波数解析手法に、FFT、自己相関法およびウェーブレット解析を導入した。ノイズ条件下における各アルゴリズム、および超音波の繰り返し回数による速度分布計測への影響について、解析的・実験的に評価した。FFTや自己相関法では速度を計測するための最適な超音波の繰り返し数が存在し、ノイズの増加に伴いその数が増加することを示した。超音波の繰り返し数をS/Nに応じて考慮する必要のないウェーブレット解析が、時間分解能の向上に有効である。超音波パルスドップラ法は、複数の超音波パルスを連続的に送受信し、エコー信号を解析することで速度を算出するため、時間分解能は数十ミリ秒オーダである。本手法を気液二相流に適用するため、気液界面の同定のための時間分解能の向上が必要であり、パルスドップラ法の時間分解能を向上させる手法について検討した。パルスドップラ法では、超音波パルスの送受信によって得られた反射信号を直交検波し、周波数解析によってドップラ周波数を得る。この際、周波数解析には一般的にFFTや自己相関法が用いられているが、新たにウェーブレット解析によるアルゴリズムを導入した。構築した計測システムを用い、連続的に反射体からの超音波反射信号を記録し、ノイズ条件下における各アルゴリズム、および超音波の繰り返し回数による速度分布計測への影響について、解析的・実験的に評価した。その結果、ノイズの多い条件では周波数解析手法にFFTやウェーブレット解析が有利であること、FFTや自己相関法では速度を計測するための最適な超音波の繰り返し数が存在し、ノイズの増加に伴いその数が増加することが分かった。ウェーブレット解析では最適な超音波の繰り返し数について決定する必要が無く、SN比が計測位置によって変化する超音波計測では有利であった。最終年度には、FFT、ウェーブレット解析よりスペクトログラムを算出することで、高時間分解能で粒子や気泡の通過が確認でき、高速度カメラとの同期計測を実施することで二相流における速度分布計測および気液分離への応用が可能であることを示した。更に、異なる間隔で超音波パルスを送受信することで計測可能速度を拡大する手法を新たに導入し、速度分布計測における有効性について検討した。これにより、気液上昇流など、気相速度が液相速度に比べて速く、従来では困難であった条件で計測可能であることを示した。超音波ドップラ法は反射体によって生じるエコー信号を解析することで、測定線上の一次元瞬時速度分布が計測可能な手法である。本手法を混相流に適用する場合、得られた速度分布を各相の速度データに分離するために界面の同定が必要とされる。気液二相流計測では界面の同定には数ミリ秒オーダの時間分解能が必要である。そこで本研究では、従来数十ミリ秒オーダであったドップラ法の時間分解能を向上させるためのアルゴリズムの検討を行った。ドップラ法では、超音波パルスの送受信によって得られた反射信号を直交検波し、周波数解析によってドップラ周波数を得る。この際、周波数解析には一般的にFFTや瞬時周波数法(自己相関法)が用いられている。そこで本研究では、高周波数成分、すなわち速度が速い領域は高時間分解能、低流速では低時間分解能となる特性を有するウェーブレット解析によるアルゴリズムを導入し、超音波パルサレシーバ、高速デジタイザおよびPCを用いた計測システムを構築した。システムの有効性を確認するため、幅50mm、高さ25mm、長さ3000mmのアクリル製水平矩形流路において単相流速度分布計測を行った。レーザドップラ流速計(LDV)によって得た速度データにノイズ成分を付加し、復調したものを超音波反射波の疑似信号として扱い、SN比および超音波の繰り返し回数を変化させて、アルゴリズムの違いに伴う速度算出結果への影響を評価した。さらに実際の速度分布計測において評価するため、超音波の反射波形を連続的に取得・保存した。同一の計測波形を用いて、異なる超音波繰り返し数やアルゴリズムでの速度算出を行い、測定精度について検証し、ウェーブレット解析の有効な条件について検討した。また二相流での計測結果を比較するための準備として、汎用数値解析ソフトを導入し、単相流における基礎的な流動解析を実施した。当該年度では、パルサレシーバ、高速デジタイザおよびPCを用いたシステムにおいて、従来のアルゴリズムに加え、新たにウェーブレット解析を導入し、その効果を検証することを研究の主たる目的としていた。実際にシステムの構築を行い、単相流におけるLDVとの比較および実験によって精度評価を実施しており、当初予定していた研究内容がほぼ達成され、予定通りの結果を得ることができた。超音波ドップラ法の気液二相流計測への適用を行うため、二相流において超音波反射波形を連続的に取得する。データ取得の最低周期は、超音波の繰り返し周波数と同等とする。得られた波形をFFTおよびウェーブレット解析による周波数解析を実施することにより、各計測位置におけるスペクトログラムを取得する。スペクトログラムでは、スペクトルの時間変化を確認可能である。

気泡の通過に伴う液相乱流の変化、および気液界面で生じる僅かな速度変動をスペクトログラムから検知することで、気液界面位置の同定が可能であると考えられる。そこでスペクトログラムの解析による界面位置の同定のためのアルゴリズム構築を行う。これにより、気泡通過時の気泡周囲の速度データを高精度に取得可能とする。さらに超音波のエコー信号強度は反射体の大きさや界面形状によって変化する。そこで反射波形を解析することで気泡数密度、局所ボイド率などの気泡パラメータの取得を検討する。構築したシステムの有効性を示すため、水平ダクト内気液二相流を対象とし、気泡通過に伴う壁面のせん断応力変化、気泡周りの液相速度分布、壁面における液膜厚さおよび気泡形状を計測する。液相速度分布計測には、気液界面の同定が必要であり、システムに組み込んだアルゴリズムを用いて計測を行う。現有の高速度カメラとの同期計測により、界面位置検出の精度検証を行う。これにより、気泡通過に伴う壁面せん断応力変化とそのメカニズムについて実験的解明を行い、流体解析ソフトを用いた数値解析結果との比較検討することにより計測精度および適用条件の検証を行う。二相流計測を行うため、既存流路の改造が一部必要である。それに伴う消耗品費、計測システム制御用のソフトウェアの購入費、研究成果発表および資料収集のための旅費として、研究費を使用する予定である。
力学系に現れるフラクタルの位相的研究

一次元複素力学系であらわれるフラクタルであるジュリア集合、マンデルブロ-ト集合には密接な関係があることが知られていた。すなわち、力学系の相空間内の不変集合であるジュリア集合の性質しパラメーター空間内の分岐集合であるマンデルブロ-ト集合の中に既に「局所的に」含まれている。ところが、今回の研究により、もっと大ざっぱな見方(組合せ的見地)をすれば、大域的な相似関係にあることがわかった。マンデルブロ-ト集合の性質を知るには、ジュリア集合を調べればよい、と標語的に言われている(一般的にジュリア集合の方が調べやすい)ことが、さらに裏付けられたことになる。また、これは実一次元力学系のkneadingsequencesの単調性の拡張にもなっており、分岐の過程で、周期点のタイプがどのように出現してくるかということを示すものでもある。そのような観点から、解析的という条件を除いた力学系についても考察した。つまり、球面上の二次のトポロジカルな分岐被覆写像による力学系である。この場合、相空間とパラメーター空間の間の関係などが解析的の場合のようになることは期待できないと思われるが、kneadingtheoryに相当するものはある程度構成することができるであろう。現在、まだ研究は完成していない段階だが次のようなことがわかっている。平面上の二次分岐被覆で、postcritically finiteな二次の多項式写像と分岐点の振る舞いが同値なものを考える。このとき、「必ず」存在する周期点の組みがあることがわかるが、それは二次多項式写像の力学系で(つまりはジュリア集合で)特徴づけられる。この事実は、複素力学系の中のある性質は、条件を緩くしたトポロジカルな力学系において既に現れていることを示している。もう少しある種の「拡大性」をつけ加えた力学系では、さらに複素力学系に近いものが現れることもわかる。
LECラットにおけるDNA組み換え異常に関する研究

LECならびに対照のWKAHラットから細胞株を樹立し、以下のような結果を得た。1.樹立された全てのLECラットの細胞が対照のWKAHラットの細胞よりも生存率においてX線高感受性を有するが、DNA合成では抵抗性である。2.LECラットの細胞はアルキル化剤やDNAに架橋を形成するマイトマイシンCなどに対してもWKAHラットの細胞よりも高感受性である。また、ブレオマイシンに対してもLECの細胞は感受性が高く、ブレオマイシン誘発DNA2本鎖切断の修復速度はLECでWKAHの細胞よりも有意に遅い。3.正常細胞で見られるX線照射後のG1期からS期への進行の一時的な停止、すなわちG1アレストがWKAHの細胞では認められるが、LECの細胞では起こらない。4.G1アレストに重要な役割を果たしている癌抑制遺伝子p53タンパク質の発現はWKAHの細胞では照射後12時間で増加するが、LECの細胞では照射後の増加は認められない。5.紫外線照射に対して生存率ではLECとWKAHの細胞の間に差は認められないが、DNA合成についてはLECの細胞でWKAHの細胞よりも抵抗性である。X線等DNA損傷因子が作用すると、G1期でp53タンパク質が一時的に高発現し、S期への進行が停止する。このG1アレストはDNA損傷を修復する重要な過程である。本研究は、LECの細胞でこの過程が損なわれていることを示し、この細胞周期の調節異常の遺伝子とX線高感受性の支配遺伝子とは別であることを示唆した。さらに、DNA2本鎖切断の修復過程にも異常があることを示し、DNAの組み換え異常との関連性を強く示した。LECならびに対照としてのWKAHラットの肺線維芽細胞にSV40の腫瘍抗原遺伝子を発現するベクターを導入することによって細胞を不死化し、それぞれ16株の株化細胞を得た。得られたすべてのLECラット由来の細胞株はWKAH由来の細胞株と比較して高い放射線感受性を示した。また、LECラットの株化細胞においては照射後ののDNA合成が放射線の照射に抵抗性であり、照射後の培養時においてもDNA合成が継続的に続くことが示された。これらの結果は照射によるG1期における細胞周期の停止、G1 arrestが起こりずらいことを示している。細胞の照射によるDNA合成の停止は細胞周期のG1期において癌抑制遺伝子であるp53タンパク質などが高発現することで起こり、このことによりDNAに生じた各種の損傷が修復される時間的余裕を得るための重要な過程である。LECの細胞においても照射後のDNA合成が放射線の照射に抵抗性であることは、この過程が損なわれていることを示すもので細胞周期を調節する遺伝子を解析する上でも重要な知見が得られた。現在、電離放射線照射後の細胞周期の進行についてやヒトの電離放射線感受性で高発ガン遺伝病であるアタキシア・テランギエクタシアの原因遺伝子との関連性を検討している。更に、LECの細胞はアルキル化剤やDNAに架橋を形成するマイトマイシンC等にも高い感受性を有することを示した。組み換え能との関係ではDNAに2本鎖切断を引き起こすブレオマイシンに対してX線と同様な高い感受性を有することが示され、組み換え能に異常があることが予想されたが、偶発ならびに放射線誘発突然変異についての検討においては、LECラットの細胞が各種の薬剤に対する感受性が高いため、その発生率の正確な評価は今年度はできなかった。また、検討した限りではマイクロサテライトDNAの不安定性はWKAHラットと有意な差は認められず、これらの点については来年度の検討が必要と考えられた。昨年度、LECラットの細胞が対照のWKAHラットの細胞よりも生存率においてX線高感受性を有するが、DNA合成では抵抗性であることを示した。今年度はより詳細な解析によって、以下のような結果を得た。

1.正常細胞で見られるX線照射後のG1期からS期への進行の一時的な停止、すなわちG1アレストがWKAHの細胞では認められるが、LECの細胞では起こっていないことが示された。2.G1アレストに重要な役割を果たしている癌抑制遺伝子p53タンパク質の発現はWKAHの細胞では照射後12時間で増加するが、LECの細胞では照射後の増加は認められないことが示された。3.紫外線照射に対して生存率ではLECとWKAHの細胞の間に差は認められなかったが、DNA合成についてはLECの細胞でWKAHの細胞よりも抵抗性であることが示された。4.ブレオマイシンに対してもLECの細胞はWKAHの細胞よりも感受性が高く、また、ブレオマイシンで誘発されたDNA2本鎖切断の修復速度はLECでWKAHの細胞よりも有意に遅いことが示された。X線やその他のDNAに損傷を与える因子が作用すると、G1期でp53タンパク質が一時的に高発現し、その結果、S期への進行が停止し、DNA合成は一時的に停止する。このG1アレストはDNAに生じた損傷を修復するための重要な過程である。本研究の結果は、LECの細胞においてこの過程が損なわれていることを示し、また、紫外線での結果と考え合わせると細胞周期の調節異常を示す遺伝子とX線高感受性の支配遺伝子とは別であることが示唆され、ヒトの電離放射線高感受性、高発ガン遺伝病であるアタキシア・テランギエクタシアとの類似性を示した。さらに、DNA2本鎖切断の修復過程にも異常があることが示され、DNAの組み換え異常との関連性がさらに強く示された。
心臓特異的ノンコーディングRNAの心肥大・心不全における機能解明

心不全病態において胎児期に発現する遺伝子が再発現することが知られている。遺伝子トラップ法を用いてトラップされたクローンのうちlong non-coding RNA中から胎児期に心臓で高発現するcardiac specific long non-coding RNA X(CSLR-X)を同定し、全身性CSLR-X強制発現(CAG-CSLR-X)Tgマウスの作製を行った。Tgは野生型と比べ、心臓組織及び心機能に関して明らかな表現型を認めなかったが、横行大動脈縮窄による圧負荷心不全モデル術後4週において心エコー解析にて、Tgは野生型に比べ心不全病態形成抑制を認めた。本年度は、1CSLR-Xの発現細胞の同定と発現制御機構の解析2心肥大・心不全に病態形成におけるCSLR-Xの機能解析を中心に検討を行った。マウス心筋組織をPercoll密度勾配遠心分離法により心筋組織および非心筋組織に細胞を分離し、それぞれよりRNAを抽出し、qRT-PCRによりCSLR-Xの発現解析を行った結果、心筋細胞、非心筋細胞の両方おいてCSLR-Xの発現を認め、発現の差を認めなかった。2心肥大・心不全に病態形成におけるCSLR-Xの機能解析CSLR-X遺伝子領域にベクターを置換したCAG-CSLR-X Tg(cis)マウスを作製した。Tgマウスは、野生型と比べ心臓組織及び心機能に関して明らかな表現型を認めなかった。TgマウスにTACモデルを作製し、術後3週で心エコーにて心機能を解析した結果、Tgマウスは野生型に比べ、心不全病態形成抑制を認めた。近年、non-coding RNAがcisに働いてその近傍の遺伝子の発現制御を認める報告がある。そこで、本来CSLR-Xが存在しない他の染色体にトラップベクターが挿入されたジーントラップマウスラインを用いて、CSLR-X発現ベクターを置換した後(CAG-CSLR-X Tg (trans)マウス)、CSLR-X欠損マウスと交配することにより、CSLR-Xのcis効果による心肥大・心不全病態形成に及ぼす影響を検討する。現在、CAG-CSLR-X Tg(trans)マウスを作製し、CSLR-X欠損マウスと交配し、準備中である。マウスの交配による産仔数が予想よりも少なかったため、実験に必要な匹数が足りず、解析時期に遅れが生じている。今年度の初めには、それらの解析を行う予定である。それ以外については予定通りに進んでいる。分子遺伝学/循環器病態学平成27年度については、平成26年度の結果に基づいて研究を進め、当初の計画通りである。主な研究としては、CAG-CSLR-X Tg(trans)マウスの表現型解析、心筋特異的CSLR-X発現マウスの個体作製および表現型解析を行う。またプロテオーム解析により網羅的に同定を行い、CAG-CSLR-Xと相互作用する分子機能解析を行う。さらに、マウスCSLR-Xのヒトのホモログの同定を行う。
アセチル化に伴うヌクレオソームの動的構造解析

本研究課題では転写活性化に関与するヒストンのアセチル化に着目し、クロマチンの最小構造単位であるヌクレオソームコアのアセチル化によって誘導される構造やゆらぎの変化を明らかにすることを目的としている。これまでの2年間において、アセチル化したヌクレオソームの構造安定性の解析とその修飾部位の解析方法について検討した。今年度は1構築した修飾部位の解析方法をアセチル化したヌクレオソームに適応する、2アセチル化の有無によって構造安定性が変化するヒストンを同定する研究を行った。まず、アセチル化したヌクレオソームの解析を行う条件を検討するために、アセチル化したヒストン2量体を例にMALDI-ISD測定を行った。その結果、ヌクレオソームで解析できるよりも高い濃度で分析することでテイル領域の情報を得ることに成功した。その結果を踏まえ、アセチル化したヌクレオソームの解析を試みたところ、構成成分である4種類のヒストンのうち3種類までアセチル化部位を解析することができた。H3に関してはテイル領域の長さが長く、アセチル化の程度も高いため、上記の測定に合わせ、酵素消化を組み合わせた方法を開発し、より長いテイル領域をカバーできるようになった。また、アセチル化の有無によって構造安定性が変化するヒストンを同定するために、水素重水素交換質量分析を試みた。この方法としてこれまで構築していたLC-MSを用いた分析ではなく、MALDI法を用いた測定方法を構築した。これにより従来よりも逆交換のリスクを軽減させた迅速な分析が可能となると考えられる。この解析手法として質量分析法を中心とした解析を試みた。まず、数多くあるヒストン翻訳後修飾のうちアセチル化のみに着目した研究を進めるため、未修飾のリコンビナントヒストンとDNAを調製し、それらから未修飾のヌクレオソームコアを再構成した。ここで使用したDNAは2種類であり、一つはヒストン八量体と最も強い相互作用を持つWidom 601 DNA、もう一つはヒトのセントロメアにあるα-satellite DNAの回文配列である。次に、再構成したヌクレオソームコアにヒストンアセチル化酵素の活性化ドメインであるp300を用いてアセチル化した。アセチル化されたヌクレオソームコアをMALDI-TOF MSを用いて解析することによって、ヌクレオソームを構成するヒストンH2A、H2B、H3、H4のTail領域がアセチル化されることがわかった。また、アセチル化されたヌクレオソームコアをタンパク質複合体をそのまま測定できるネイティブ質量分析で測定した結果、Widom 601DNAのヌクレオソームではアセチル化前後で変化がなかったのに対して、α-satellite DNAではアセチル化によってヌクレオソームコアの構造安定性が低下したことが示唆された。より生体由来のDNAにおいてアセチル化による構造安定性の低下が見られたことから、生体内のNCPではアセチル化によって構造が不安定になることが予測された。平成28年度に予定していた研究のうち、ヌクレオソームの調製とアセチル化による構造安定性の変化については予定していたDNA以外でも行うことができた。その他、アセチル化部位がTail領域であることまでは同定でき、H/D交換質量分析による解析もヒストン全体の解析を始めた段階である。昨年度までの研究においてアセチル化されたヌクレオソームはアセチル化によって構造安定性が低下することが示唆された。そのため、本年度は、アセチル化された部位の同定法の検討と、構造変化をMDシミュレーションによって明らかにする上でのセットアップを行った。まず、アセチル化部位を同定するために、配列解析手法を検討した。従来、タンパク質の1次構造解析を行う際、酵素消化したサンプルを質量分析で同定するボトムアップ法が用いられる。しかし、主に用いられる消化酵素であるトリプシンはリジンやアルギニンを認識し断片化するために、塩基性アミノ酸の多いヒストンのテイル領域の解析には向いていない。そのため、タンパク質を丸ごと質量分析内で壊すトップダウン法の一つであるMALDI-ISDによる配列解析を行った。その結果、ヒストンのテイル領域に対応するフラグメントイオンが顕著に観測されることがわかった。さらに、アセチル化したヒストン、ヌクレオソームでも解析を行ったが、それぞれのサンプルにおいてテイル領域の配列情報を得ることができた。現在はこの方法をアセチル化されたヌクレオソームに応用する条件を検討している。また、ヌクレオソームの構造変化をMDシミュレーションによって解析するために、塩濃度の異なる条件で溶液中のMDシミュレーションを行った。その結果、塩濃度の変化はヌクレオソームのコア構造には影響を与えないが、テイル領域の多様性に影響を与えることがわかった。現在は500mMのシミュレーションを行っているので、より高い塩濃度における変化とアセチル化されたヌクレオソームのシミュレーションへ発展させていく予定である。これまで行ってきた方法では、ヒストンテイル領域の部分的な配列しか得られなかったのに対し、今年度確立した方法では、テイル領域の全領域の情報が得られることになった。そのため、アセチル化部位を同定する準備ができたと考えている。また、異なる塩濃度におけるヌクレオソームのMDシミュレーションを行った。このため、実験だけでなく計算手法からもアセチル化によるヌクレオソームの構造変化を解析することができるようになった。

本研究課題では転写活性化に関与するヒストンのアセチル化に着目し、クロマチンの最小構造単位であるヌクレオソームコアのアセチル化によって誘導される構造やゆらぎの変化を明らかにすることを目的としている。これまでの2年間において、アセチル化したヌクレオソームの構造安定性の解析とその修飾部位の解析方法について検討した。今年度は1構築した修飾部位の解析方法をアセチル化したヌクレオソームに適応する、2アセチル化の有無によって構造安定性が変化するヒストンを同定する研究を行った。まず、アセチル化したヌクレオソームの解析を行う条件を検討するために、アセチル化したヒストン2量体を例にMALDI-ISD測定を行った。その結果、ヌクレオソームで解析できるよりも高い濃度で分析することでテイル領域の情報を得ることに成功した。その結果を踏まえ、アセチル化したヌクレオソームの解析を試みたところ、構成成分である4種類のヒストンのうち3種類までアセチル化部位を解析することができた。H3に関してはテイル領域の長さが長く、アセチル化の程度も高いため、上記の測定に合わせ、酵素消化を組み合わせた方法を開発し、より長いテイル領域をカバーできるようになった。また、アセチル化の有無によって構造安定性が変化するヒストンを同定するために、水素重水素交換質量分析を試みた。この方法としてこれまで構築していたLC-MSを用いた分析ではなく、MALDI法を用いた測定方法を構築した。これにより従来よりも逆交換のリスクを軽減させた迅速な分析が可能となると考えられる。平成28年度は調製したヌクレオソームの安定性にばらつきがあり、データを取得することが困難であったこともあったので、平成29年度は安定性の高いヌクレオソームの精製をするとともに、安定同位体標識されたヒストンやダイヌクレオソームの調製にも取り掛かる予定である。それと同時にアセチル化部位の同定方法について計画にはない他の消化酵素を使用した実験を行うこと手法を確立し、ペプチドレベルでのH/D交換質量分析についても測定方法を構築する予定である。今後は本年度構築したMALDI-ISDを用いてアセチル化されたヌクレオソームのアセチル化部位を同定したいと考えている。また、Native質量分析から明らかになったアセチル化によるヌクレオソームの構造安定性の低下を明らかにするために、水素/重水素交換反応質量分析を用いて安定性が低下したヒストンを同定する。この実験的なアプローチに加えて、アセチル化されたヌクレオソームのMDシミュレーションを行うことで構造安定性低下の原因について考察する。上記の結果が得られ次第、モノヌクレオソームからダイヌクレオソームへ研究を発展させる。次年度使用額が生じた理由としては、旅費、人件費、その他の経費がそれぞれ少なかったためと考えられる。
セリンプロテアーゼインヒビターによるアレルギー反応の制御機構の解明

本研究は、アレルギー反応のエフェクター細胞である好塩基球および好酸球において、セリンプロテアーゼインヒビターであるsecretory leukoprotease inhibitor (SLPI)の役割を明らかにすることを目的とした。SLPI欠損マウスの好塩基球および好酸球は、IgEやLPS刺激によるサイトカイン産生が有意に亢進していた。SLPI欠損好塩基球を移入したマウスでは、皮膚受身アナフィラキシー反応が亢進していた。Slpi欠損マウスは喘息モデルにおいて、好酸球数が著明に増加していた。これらの結果より、SLPIが、好塩基球および好酸球によるアレルギー性炎症を抑制していることを明らかにした。セリンプロテアーゼインヒビターによるアレルギー反応の制御機構の解明アレルギー反応の主なエフェクター細胞は、マスト細胞、好塩基球、好酸球である。これらの細胞は抗原の刺激により、ヒスタミンなどの化学伝達物質や様々なサイトカインを産生するが、この他にもキマーゼやカテプシンGなどのセリンプロテアーゼを産生する。これらセリンプロテアーゼは、本来細菌感染に対する防御機構として働くが、過剰な分泌は炎症反応を助長し、組織破壊を引き起こす。一方、生体には炎症性プロテアーゼを特異的に抑制するインヒビターが存在している。本研究では代表的なセリンプロテアーゼインヒビターであるSLPI (secretory leukoprotease inhibitor)の欠損マウスを用い、アレルギーのエフェクター細胞における機能の解析と、SLPI以外のセリンプロテアーゼインヒビターの探索を目的としている。平成25年度においては、SLPI遺伝子欠損マウスのマスト細胞、好塩基球、好酸球を用い、IgE刺激の応答性およびシグナル伝達解析を計画した。その結果、当初SLPIが発現していたと思われたマスト細胞には、発現が確認できず、好塩基球と好酸球に発現していることが判明した。そこで、好塩基球と好酸球においてIgEおよびLPS刺激でのサイトカイン産生を検討したところ、SLPI欠損細胞で、顕著に増加していることを見いだした。シグナル伝達の解析ではNF-kBの活性化を認めるも、詳細な解析が今後も必要と考えられた。また野生型およびSLPI欠損マスト細胞、好塩基球、好酸球においてDNAマイクロアレイ解析を行い、それぞれ高発現しているセリンプロテアーゼインヒビターを同定した。現在SLPIを含め同定したセリンプロテアーゼインヒビターのリコンビナントタンパク質を作製中であり、研究は概ね順調に進展していると考えられる。これらの細胞は抗原の刺激により、ヒスタミンやロイコトリエンなどの化学伝達物質や様々なサイトカインを産生するが、この他にもキマーゼやカテプシンGさらにはグランザイムなどのセリンプロテアーゼを産生する。本研究では代表的なセリンプロテアーゼインヒビターであるSLPI (secretory leukoprotease inhibitor)の遺伝子欠損マウスを用い、アレルギーのエフェクター細胞における機能解析とSLPI以外のセリンプロテアーゼインヒビターの探索を目的としている。平成25年度においてはSLPIの発現が好塩基球と好酸球に発現しており、IgEおよびLPS刺激でのサイトカイン産生がSLPI欠損細胞で著明に増加していることを見出した。また平成27年度の研究に先立ちDNAマイクロアレイによるSLPI以外のセリンプロテアーゼインヒビターの発現を確認した。平成26年度では好塩基球と好酸球におけるSLPIの役割を個体レベルで検討した。その結果、SLPI欠損好塩基球移入マウスでは受動型皮膚アレルギー反応が亢進していた。またSLPI好酸球移入マウスではチキン投与による肺の好酸球性炎症反応が亢進していた。さらにSLPI好酸球ではマトリックスメタロプロテアーゼが亢進しており、マトリックスゲルを介した遊走能が亢進していた。現在、shRNAによるSLPI以外のセリンプロテーゼ欠損株を作製中で、一部細胞株が得られており、研究は概ね順調に進展していると考えられる。セリンプロテアーゼインヒビターによるアレルギー反応の制御機構の解明マスト細胞、好塩基球および好酸球は、ヒスタミンなどの化学伝達物質や、サイトカインに加えてキマーゼなどのセリンプロテアーゼを分泌・産生する。しかしながら、セリンプロテアーゼを抑制するインヒビターの発現や機能は不明なままである。そこで今回、我々はこれらの細胞において代表的なプロテアーゼインヒビターであるsecretory leukoprotease inhibitor(SLPI)の発現および機能について検討した。マウス骨髄よりマスト細胞、好塩基球および好酸球を誘導した。その結果、SLPIは好塩基球と好酸球において発現していた。一方、マスト細胞にはSLPIの発現を認めなかった。次に好塩基球におけるSLPIの役割を検討した。IgE刺激後のサイトカインをELISAにて検討したところ、SLPI欠損好塩基球は野生型と比較してIL-4, 6, 13産生が有意に亢進していた。また、SLPI欠損好塩基球を移入したマウスは、皮膚受身アナフィラキシー反応が亢進していた。次に好酸球におけるSLPIの役割を検討した。LPS刺激によるサイトカイン産生を検討したところ、SLPI欠損好酸球は、野生型と比較してIL-

6産生に加えてMMP-9の発現が亢進しており、浸潤活性が亢進していた。LPS刺激後のシグナル伝達解析では、Elk-1のリン酸化が亢進していた。また、ハウスダストの経鼻投与による喘息モデルでは、Slpi欠損マウスにおいて肺胞洗浄液中に浸潤する好酸球数が著明に増加していた。これらの結果から、SLPIは好塩基球および好酸球を介したアレルギー性炎症の制御分子であると考えられた。本研究は、アレルギー反応のエフェクター細胞である好塩基球および好酸球において、セリンプロテアーゼインヒビターであるsecretory leukoprotease inhibitor (SLPI)の役割を明らかにすることを目的とした。SLPI欠損マウスの好塩基球および好酸球は、IgEやLPS刺激によるサイトカイン産生が有意に亢進していた。SLPI欠損好塩基球を移入したマウスでは、皮膚受身アナフィラキシー反応が亢進していた。Slpi欠損マウスは喘息モデルにおいて、好酸球数が著明に増加していた。これらの結果より、SLPIが、好塩基球および好酸球によるアレルギー性炎症を抑制していることを明らかにした。平成26年度では好塩基球と好酸球におけるSLPIの役割を個体レベルで検討した。その結果、SLPI欠損好塩基球移入マウスでは受動型皮膚アレルギー反応が亢進していた。またSLPI好酸球移入マウスではチキン投与による肺の好酸球性炎症反応が亢進していた。さらにSLPI好酸球ではマトリックスメタロプロテアーゼが亢進しており、マトリックスゲルを介した遊走能が亢進していた。現在、shRNAによるSLPI以外のセリンプロテーゼ欠損株を作製中で、一部細胞株が得られている。またセリンプロテアーゼインヒビターのリンコンビナントタンパク質の構築はベクター作製に問題が生じたが、培養系を変更することで解決したたため、研究は概ね順調に進展していると考えられる。免疫学平成27年度は平成25,26年度ともに不十分であったシグナル伝達の解析および、発現ベクターを再構築して培養系を変更したため、大量培養が可能となったため、セリンプロテアーゼインヒビターのリコンビナントタンパク質を用いた実験を行う予定である。大量培養系により多量のリコンビナントタンパク質の作製に成功した場合は、アレルギーモデルでの効果を検討する予定である。また作製中のshRNAノックダウン細胞株の解析を行う予定である。平成25年度においては、SLPI遺伝子欠損マウスの骨髄細胞から誘導するマスト細胞、好塩基球、好酸球を用い、IgE刺激の応答性およびシグナル伝達解析を計画した。その結果、当初SLPIが発現していたとマスト細胞には、好塩基球が混在していることが判明し、SLPIは発現していないことが判明した。
バイオクロスリンク酵素トランスグルタミナーゼの機能解析

本研究の目的は、バイオクロスリンク(タンパク質分子架橋)酵素である組織型トランスグルタミナーゼ(TG)の生理機能を多面的に解析することである。1.ラット肝抽出液で、TGの基質候補タンパク質としてarginase-I(AI)およびfructose 1,6-bisphosphatase(FBPase)を同定した。in vitro実験で、両者はともに、TGによるアミン導入あるいは脱アミドといった修飾を受けた。反応性グルタミン残基数は、サブユニット当たり、AIで3個、FBPaseで1個であった。アミン導入により両者の活性は、減少した。この結果は、TGが、AIやFBPaseの関与する代謝系を制御する可能性を示唆した。2.ヒト脳TGと相互作用するタンパク質を、酵母two-hybrid法により検索した結果、低分子量Gタンパク質である、Rinタンパク質およびRit様タンパク質が相互作用タンパク質候補として同定された。しかし、pull-downアッセイなどの方法では、TGとそれらタンパク質との相互作用は確認できなかった。3.ショウジョウバエをモデル生物としてTGの生理機能解析を試みた。ショウジョウバエTG(dTG)遺伝子に由来する2種類の転写産物dTG-RAおよびdTG-RBは、全発生段階において存在が確認された。発生開始期から全身でdTG発現を抑制すると蛹後期で致死となり、dTGの発生における重要性が示された。ハエの複眼原基でdTGを過剰発現させると、rough eye表現型が誘導された。このrough eye表現型は、JNKシグナル亢進によるアポトーシスに起因することが、示唆された。さらに翅原基でdTGを過剰発現するとextra wing veinの誘導が、発現抑制するとblistered wingの誘導が、それぞれ見られた。これらの結果は、dTGが翅脈形成に関与することを示唆した。本研究の目的は、バイオクロスリンク(タンパク質架橋)酵素であるトランスグルタミナーゼ(TGase)の生理機能を多面的に解析することである。1.ラット肝抽出液について、内在TGase活性とビオチンアミドペンチルアミンを利用した酵素反応特異的基質ラベル法を適用した結果、TGaseの基質候補タンパク質として、arginase 1とfructose 1,6-bisphophatase 1を同定した。2.ラット肝から精製したarginase 1およびfructose 1,6-bisphosphataseについて、TGaseとの反応性やTGaseによる修飾がもたらす機能変化などについて解析を開始した。3.ヒト脳TGaseと相互作用するタンパク質の検索を、CytoTrap酵母two-hybrid法により行った結果、低分子量Gタンパク質である、Rinタンパク質とRit様タンパク質が相互作用候補タンパク質として同定された。Pull-downassayによる相互作用の確認を行った後で、これらの相互作用の生理的意義について解析を行う。4.ショウジョウバエをモデル生物として、GAL4-UAS標的発現システムを利用することにより、発生時期・組織特異的なTGaseの発現抑制と過剰発現が誘導する表現型を解析した。胚期から成虫期にかけて、TGaseの発現を抑制すると、蛹後期で致死となり、TGaseがショウジョウバエの発生に必須であることが、示唆された。複眼原基でTGaseを過剰発現させると、rough eyeが誘導された。このrough eyeは、アポトーシスの亢進に起因するらしいことを示す結果を得た。翅原基でTGaseを過剰発現させると、extra wing veinの誘導が、発現を抑制すると、blistered wingの誘導が、それぞれ観察された。これらの結果は、TGaseが翅脈形成に関与することを示唆した。