hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
ジョーズの謎：ホホジロザメの子宮内環境の解明と人工哺育技術の開発

また、ホホジロザメの繁殖生態を調査するため、ポップアップアーカイバルタグを本種の妊娠個体に装着し、沖縄周辺における生息水深、温度帯を探ることも検討しているが、当該年度はその機会が得られなかった。現状では、希少種であるホホジロザメに代わるネズミザメに関する知見が集まりつつある。繁殖様式はホホジロザメにきわめて類似していると考えられるため、妊娠後期における人工子宮環境の再現と哺育装置の設計は順調に進むと考えられる。現在、子宮上皮細胞の組織学的所見と、子宮内液の性状分析を実施しており、その結果が得られ次第、人工子宮の作成に着手する。妊娠前期の子宮内環境に関するサンプルが得られていないことから、妊娠前期の子宮内環境に関するデータが不足している。よって、30年度は9ー12月にかけてのサンプルを集中的に集め、不足データを補いたい。また、過去に得られたサンプルを利用し、ホホジロザメの子宮内における酸素供給能に関する分析を行い、その結果が学術誌(Scientific Reports)に掲載された。本結果については、沖縄美ら島財団ホームページ、沖縄美ら海水族館において広く一般にも研究内容が公表されている。一方、当該年度は沖縄海域におけるホホジロザメの混獲事例が無かったため、本種自体のサンプルあるいはアーカイバルタグの装着実験を行うことはできなかった。タグが装着できない場合でも、ネズミザメの子宮内環境の測定は可能であることから、人工保育装置の開発自体には影響を与えないと考えている。本研究は、国際的に保護対象種とされるホホジロザメの人工哺育をめざし、子宮内の胎仔を人為的に育成する環境を再現することを目的としている。2018年度は、ホホジロザメおよび本種の近縁種であるネズミザメの子宮を用いて、子宮内の基礎的情報の収集を主として調査を実施した。ホホジロザメに近縁なネズミザメ目魚類の子宮サンプルを採集するため、2019年度8月から12月にかけて、宮城県気仙沼魚市場においてネズミザメ妊娠個体のサンプリングを実施した。妊娠中期以降と思われるメス個体および胎仔については、過去2年間の調査によりサンプル採取を終えたが、妊娠初期のサンプル採取は次年度に持ち越しとなった。これまでの調査により、1)東北地方沿岸ではおよそ9月以降に交尾、妊娠が開始され、3ー4月にかけて出産を行うこと、2)妊娠後期の子宮はホホジロザメのものと類似していること、3)妊娠期間が半年程度と極めて短いこと、4)子宮内の環境や子宮上皮組織についてもホホジロザメと類似することが判明した一方、ネズミザメの妊娠期間が他のサメ類と比較しても非常に短いこと、および妊娠初期の組織分泌による栄養供給が無い(あるいは極端に短い)ことが示唆された。また、妊娠後期(卵食後)の表面での酸素交換効率を推定によると、他種のサメの250倍から400倍にも達し、魚類の鰓に匹敵する能力をもつことが明らかになったことから、胎仔への十分な酸素供給が行われていると考えられる。これまでの研究で得た知見に基づき、子宮内環境に近似する浸透圧、pH、溶存物質をもつ人工的な子宮内液を調整し、妊娠後期の子宮内環境を滅菌状態で再現した“人工子宮"に関して、既に設計を終了し、今後妊娠後期の環境を再現した人工子宮の制作を実施する。本研究は、ホホジロザメの人工哺育をめざし、子宮内の胎仔を人為的に育成する環境を再現することを目的としており、生理学的研究や生態学的研究に基づく基礎的知見の収集と、それを応用した人工子宮の完成を目指している。過年度の研究により、妊娠後期の子宮内環境に関する基礎的知見はほぼ得られており、発生後期の胎仔を哺育するための子宮環境については再現が可能な状況にある。
抗うつ薬、抗痙攣薬による神経障害性疼痛の予防－インビボパッチクランプ法による検討

本研究は、神経障害性疼痛のメカニズム解明と薬剤による予防効果の検討を目的とした。しかし脊髄後角in vivoパッチクランプ法では、ラット神経障害性疼痛モデルにおいて特有のシナプス活動変化を明らかにできなかった。行動実験では、トラマドール、デクスメデトミジン、プラバスタチン、ケタミンの腹腔内持続投与に予防効果はなく、ロピバカインの神経結紮部への局所持続投与で軽度の予防効果を認めが、今後の検討を要する。In vivoパッチクランプ法により、鎮痛薬トラマドールの全身投与が、膠様質神経細胞のシナプス活動を修飾し、これが主に代謝物であるM1による作用であることを示し、鎮痛機序の一端を明らかにした。本研究は、神経障害性疼痛の予防法を見出すことを目標に、疼痛緩和治療に用いられる抗うつ薬および抗痙攣薬等の薬物による予防効果とそのメカニズムを、電気生理学的実験と行動実験とを用いて調べる。今年度はまず最初に、神経障害性疼痛において生じる可能性が示唆されている脊髄後角膠様質神経細胞の細胞内外陰イオン濃度勾配変化について検討を始めた。ラット神経傷害性疼痛モデル(Chungモデル)を作成し、ウレタン麻酔下に脊髄後角第一層の神経細胞に、グラミシジンDを用いたperforated in vivoパッチクランプ記録を行った。長時間の安定した記録をすることに難渋し、現時点では1つの記録のみで塩素イオン勾配変化を示すIPSCs逆転電位の軽度脱分極側へのシフト(-40 mV付近)の確認ができた。グラミシジンによるperforated形成には約30分を要するため、今後も記録改善をすすめて検討を行う。併行して薬物による神経障害性疼痛予防効果を調べる行動実験を開始した2週間持続投与可能な微量注入器を用いた。モデル作成1周間前に薬物を満たした微量注入器を腹腔内に留置し、生理食塩水投与群と薬物投与群で、微量注入終了後の機械的アロディニアの程度をUgo Basile社のdynamic plantar aesthesiometerを用いて評価した。現時点までに、デクスメデトミジン、トラマドール、スタチンについて検討した。デクスメデトミジン、トラマドールには予防効果は認めなかった。プラバスタチンで軽度予防効果を認めており、効果については投与量等を変えて検討する必要がある。引き続き、抗うつ薬、抗痙攣薬の予防効果を検討する。本研究は、神経障害性疼痛の予防に有効な薬物治療法を具体化していくことを目標とし、疼痛緩和治療に用いられる抗うつ薬および抗痙攣薬等の薬物による予防効果とそのメカニズムを、電気生理学的実験と行動実験とを用いて調べることである。今年度は、神経障害性疼痛モデルラットにおける脊髄内での痛覚伝導系神経活動の変化を調べるため、脊髄後角神経細胞のシナプス活動をin vivoパッチクランプ法を用いて解析することに取り掛かった。Sprague-Dawleyラット(4ー7週齢)を用い、セボフルラン麻酔下に第5腰神経(L5)を5-0絹糸で結紮し、神経障害性疼痛モデルを作成した。神経結紮2週後、機械的アロディニアをvon Freyフィラメントを用いて確認した後、ウレタン麻酔下にL5レベルの脊髄後角第一層の神経細胞にin vivoパッチクランプを行った。通常のホールセル記録による興奮性シナプス電流(EPSCs)と抑制性シナプス電流(IPSCs)、機械的刺激によるEPSCsとIPSCsの反応を、神経結紮をしないsham手術を行ったラット(コントロール群)と比較した。機械的刺激に対するEPSCsの反応および活動電位の発生頻度増加の程度が、コントロール群より神経障害性疼痛モデル群で多い傾向を認めているが、現時点での検討数では統計学的有意差は認めていない。この差を調べることは、神経障害性疼痛の治療法および予防法を検討するためには重要な意義を持つ。本研究を進める中で、デクスメデトミジン、トラマドールなどの薬剤に脊髄後角神経細胞シナプス活動に対する作用が認められた。このように本実験手技を用いて薬剤の脊髄痛覚伝導系への作用を見出すことも、神経障害性疼痛の予防効果を検討するうえで重要である。次年度は行動実験も並行して行うため、神経結紮後のアロディニア評価、薬剤投与方法について、いくつかの薬剤を用い予備実験に着手した。本研究の目的は、神経障害性疼痛の予防に有効な薬物治療法の具体化を目標とし、疼痛緩和治療に用いられる抗うつ薬および抗痙攣薬等の薬物による予防効果とそのメカニズムを、電気生理学的実験と行動実験とを用いて調べることである。薬剤による予防効果を検討する前の段階として、脊髄後角in vivoパッチクランプ法を用いて、神経障害性疼痛モデルラットにおける脊髄後角シナプス活動の変化について、継続して解析を試みてきた。

機械的刺激に対する興奮性シナプス電流(EPSCs)の反応および活動電位の発生頻度に関して、実験開始当初はコントロール群と神経障害性疼痛モデル群の間での差を予想したが、実験個体数を増やした結果として明確な差は認めなかった。神経障害性疼痛モデルの脊髄スライスパッチクランプ法で確認されている膠様質神経細胞における細胞内外の陰イオン濃度勾配変化については、in vivo標本でのグラミシジンDを用いたperforatedパッチクランプ記録に技術面で難渋し、追加データが得られなかった。しかし、脊髄後角in vivoパッチクランプ記録を用いた研究を進める中で、鎮痛薬として用いられるトラマドールに脊髄後角膠様質神経細胞のシナプス活動を修飾するという興味深い作用を認めたため、トラマドールの鎮痛メカニズムに関する実験を行った。トラマドール全身投与はEPSCsを抑制し、抑制性シナプス電流を増強した。この作用は主に、オピオイド親和性の高いトラマドール代謝物M1によってもたらされることを示唆する結果が得られた。また前年度に引き続き、行動実験では、微量持続注入器を用いて薬剤を投与し、神経障害性疼痛予防効果を調べた。ケタミンの持続腹腔内投与には予防効果はなく、ロピバカインの神経結紮部位への持続投与は、薬剤投与終了1週間後に機械的アロディニアの軽減が認められ、さらなる予防効果の検討が必要と考えられた。麻酔学Perforated in vivoパッチクランプ記録に難渋した。グラミシジンDによるperforated形成には約30分を要するため、1時間近い安定した記録をすることが条件となってくる。この1年間、1時間近い安定したperforated in vivoパッチクランプ記録に難航したため、予定していた研究計画から遅れた。行動実験には着手できたが、電気生理学的研究の遅れの影響により、計画していた薬剤についての検討は進んでいない。平成24年度は、当初、perforatedパッチクランプ法を行い神経障害性疼痛モデルでの脊髄後角第一層神経細胞のEPSCs、IPSCs、そして膜内外の陰イオン勾配の変化を記録する予定であった。しかし、その実験の前段階として、IPSCsとEPSCsの観察に有利な通常のホールセルパッチクランプ法により、神経障害性疼痛モデルにおける脊髄痛覚伝導系神経細胞のシナプス活動や機械的刺激に対する反応がどのような変化を起こしているかを調べることが重要かつ必要と考え、その評価を優先した。さらに次年度、電気生理学的実験と行動実験を並行して行うことで研究を効率的に進めることを目標に、平成25年度に予定している行動実験の準備および予備実験にも時間を費やしたため、平成24年度に予定していた実験が遅れることになった。今後も、行動実験と電気生理学的実験を並行して行うことで、効率的に研究を進められるように実験スケジュールを組む予定である。In vivoパッチクランプ記録は、文献的にも長時間記録は可能で、専門に行っている他施設でも1-2時間の記録は行われている。In vivoパッチクランプ記録にperforated記録を組み合わせることにより、難易度が増していると考えられるが、生理学教室と他施設に指導をいただきながら、今後も記録改善をすすめて検討する。行動実験については、プロトコールが確定したので、計画している薬剤についてすみやかに検討を進めていく。
前立腺癌特異遺伝子同定の試み

我々は新規発現遺伝子を見つけだすために人の前立腺癌組織よりAcid-Guanidinium-Thiocyanate-Phenol-Chloroform (AGPC)法によってtotal RNAを抽出し、異なる条件下の細胞で発現しているpoly (A) tailを持つmRNAの差異を見つけるためにDifferential Display (DD)法を行い、次に蛍光イメージアナライザーにて解析、300bp以上の癌特異的で差異の強いバンド96個を切り出した。これらをさらに分離、精製してその内の18サンプルを、pGEM-TEasy VectorにTA-Cloningし、ゲノムDNAシークエンスより得られた結果をジーンバンクのデータと比較、検索を行った。シークエンスより得られた遺伝子配列よりプローブを設計し、我々が作成したcDNAライブラリーのオリゴヌクレオチドプローブを用いたハイブリダイゼーションによるスクーニングも行った。遣伝子のクローニングをしたうちの1サンプルが、Human Lactoferin mRAN (Accession No. M93150)2360bpの3'末端に近い361bpと同一であることが確認された。また、他の臨床検体に対するLactoferinの発現の有無を確認するため、ノーザンハイブリダイゼーションおよびRT-PCRを行った。この結果、正常組織においての同遺伝子の発現は、骨格筋、胸腺、脾臓、肝臓、肺、骨髄、乳腺、前立腺、胃、気管に見られた。RT-PCR解析では、前立腺癌10例中5例に発現が認められた。前立腺癌でのLactoferin発現には個体差がありLactoferin発現は一様ではないことが示唆された。現在、臨床情報と対照して意義を検討中である。前立腺癌の生物学的活性を予測するマーカーを同定する目的で、genomic instabilityの有無、DNA ploidy、血清中のTGF-beta 1と病理所見との対比を行った。nondiploid癌症例は62%に認められ、腫瘍体積と有意の相関を示したが、腫瘍の悪性度とは相関せず、病理所見とも相関しなかった。nondiploidyは腫瘍発生の過程での遺伝子変化集積の結果と考えられた。未治療前立腺癌において、血清中のTGF-beta 1と病理所見との間には一定の関係は認められなかった。根治術例での検討ではgenomic instabilityは19.7%の頻度に認められ、多変量解析の結果、腺外浸潤と有意の相関を認め分子生物学的マーカーとなる可能性が示唆された。その他、competitive PCR法を用いてKAI-1,PTI-1,TGF-beta,PTH-rPなどの発現比較を行ったが、腫瘍と正常組織との間に有意の差異を認め得なかった。以上の結果をもとに、生物学的活性を予測する新しいマーカーを同定すべくホルモン抵抗性前立腺癌よりcDNA libraryを作製、未知の遺伝子同定を試みている。現在、differential display法を用いて同定した前立腺癌にのみ発現している異常バンド39個につき順次解析を進めているところである。現在、3種類の異常バンドを用いてprobeを作成、northern blotによる臓器特異性を検討し、ついでアミノ酸配列を同定し、cDNA libraryをスクリーニングし遺伝子本体を隔離同定している途中である。前立腺癌による死亡率は年々増加傾向を示し、人口の高令化とともに本邦における一大問題となっている。従来、前立腺癌の剖検癌頻度に差はないものの、臨床癌頻度には極端な人種差があるとされてきた。この説明として剖検癌より臨床癌への移行に関わる遺伝子発現に人種差があるなどの原因が示唆されている。ラテント癌が多くその大部分は宿主の生命を脅かすことのない前立腺癌において遺伝子を含めた腫瘍の進展にかかわる諸因子の解明は治療の適応を決定する上でも極めて重要である。我々は分子生物学的手法を用いてホルモン抵抗性前立腺癌のcDNA libraryを作製することに成功した。

differential display法を用いて精巣由来のcDNAをコントロールとして対比し、さらにNorthern blot法を用いて発現を確認したところ39個の癌特異バンドを得ることができた。現在、cDNA libraryのスクリーニングを経て、数個の有望遺伝子のクローニング中である。前立腺癌の発生、進展に関与しているであろう未知、既知の遺伝子を検出、同定し、さらに臨床癌検体を用いて発現と癌の性状を対比していく予定である。我々は新規発現遺伝子を見つけだすために人の前立腺癌組織よりAcid-Guanidinium-Thiocyanate-Phenol-Chloroform(AGPC)法によってtotal RNAを抽出し、異なる条件下の細胞で発現しているpoly(A)tailを持つmRNAの差異を見つけるためにDifferetial Display(DD)法を行い、次に蛍光イメージアナライザーにて解析、300pb以上の癌特異的で差異の強いバンド96個を切り出した。これらをさらに分離、精製してその内の18サンプルを、pGEM-T EasyVectorにTA-Cloningし、ゲノムDNAシークエンスより得られた結果をジーンバンクのデータと比較、検索を行った。シークエンスより得られた遺伝子配列よりプローブを設計し、我々が作成したcDNAライブラリーのオリゴヌクレオチドプローブを用いたハイブリダイゼーションによるスクリーニングも行った。遺伝子のクローニングをしたうちの1サンプルが、Human Lactoferin mRNA(AccessionNo.M93150)2360bpの3端末に近い361bpと同一であることが確認された。また、他の臨床検体に対するLacfoferinの発現の有無を確認するため、ノーザンハイブリダイゼーションおよびRT-PCRを行った。この結果、正常組織においての同遺伝子の発現は、骨格筋、胸腺、脾臓、肝臓、肺、骨髄、乳腺、前立腺、胃、気管に見られた。RT-PCR解析では、前立腺癌10例中5例に発現が認められた。前立腺癌でのLactoferin発現には個体差がありLactoferin発現は一様ではないことが示唆された。現在、臨床情報と対照して意義を検討中である。
光イオン化分光法によるイオン液体中のイオン・電子の溶媒和エネルギー評価

イオン液体中の分子からの光電子放出しきい値は,放出された電子数を,励起波長を変えながら測定する“光電子放出分光"スペクトルを,H18年度に開発した装置によって計測した。種々のイオン液体における光電子放出しきい値を評価した。光電子放出収量については,ヨウ素を含むイオン液体が非常に高い電子放出効率を示すことを見いだした。この特徴を利用し,アルキルアンモニウム塩にヨウ素イオンを溶解させた系において詳細にイオン化しきい値を決定し,イオン液体におけるドライ電子の溶媒和エネルギー,いわゆる伝導帯エネルギー(V_0)の評価を行うことに成功した。この結果から,アルキルアンモニウム塩からなるイオン液体は電子を受け入れにくいことがわかった。電子状態を評価するためにイオン液体の紫外吸収スペクトルの測定を行った。イオン液体は密度が高いため,吸収スペクトル測定が非常に困難であったが,サブマイクロメーターの光学厚さを有する新しい極薄の測定セルをデザイン・作製することで測定に成功した。このスペクトル測定はイオン液体の基本的な物性であり,信頼性の高い測定が望まれていた。特に試料の純度について評価ができるため,本領域における標準試料の評価を行うことができた。また,上述のヨウ素イオンを含むイミダゾリウム塩においても吸収スペクトルの測定に成功した。深紫外励起が可能な過渡吸収分光計を試作し,動作の確認後,過渡吸収測定を行い,ヨウ素イオンの光反応について検討した。(1)光電子放出スペクトル測定装置の開発イオン液体中の分子からの光電子放出しきい値は、放出された電子数を、励起波長を変えながら測定する"光電子放出分光"法によって計測することを計画している。今年度は基本的な装置の組み立てが終わり、予備的な測定を行った。励起光源には、購入した重水素ランプを用いた。大きな信号強度を得るため、集光光学系を導入した。これにより、来年度に本格的な計測を始められるめどがつき、今後改良を重ねながら計測をすすめる予定である。(2)過渡吸収分光による光電荷分離測定の最適化イオン液体中に生成したカチオンや溶媒和電子を過渡吸収分光法によって検出する研究を進めた。一般に過渡吸収分光法は感度が低く、イオン化のような過程の検出には不向きであると思われているが、すでにナノモル濃度の希薄溶液での計測が可能な、高感度装置の開発に成功しており、これを用いて計測をすすめることができた。具体的には4級アンモニウム塩系のイオン液体において、ヨウ素イオンの励起によって生じる溶媒和電子の測定に成功した。吸収係数を見積り、溶媒和電子の生成効率、つまり光電荷分離過程の量子収率を0.34と決定した。これはイオン濃度が極限的に高いイオン液体では予想できないほど高い効率であり、イオン液体の性質について重要な知見であると考えている。さらにヨウ素イオンの存在状態を検討するために紫外波長域での吸収スペクトルを測定し、イオン液体中でイオン対を形成している可能性を見いだした。これらの結果は論文として公表した。また、インドールを溶解させた系において、イオン化収率の絶対値測定を行い、さらに励起励波長依存性を計測し、しきい値を求めることを計画した。まず、比較のため水中での測定を行い、論文発表した(J,Photochem.Photobiol.印刷中)。さらにイオン液体中ではインドールのイオン化収率が0.017と水中に比べ非常に小さくなることを見いだした。この違いを溶媒和電子の安定性から予想するモデルについて詳細を検討している。
低神経毒性放射線増感剤KIN806とKIN896の免疫賦活作用に関する実験的研究

腫瘍組織中の低酸素細胞は放射線感受性が著しく低く、放射線治療効果を妨げる要因の一つとなっている。低酸素細胞の放射線感受性を高める薬剤として2ニトロイミダゾール系化合物が知られており、これまでにミソニダゾール等が臨床に用いられてきた。しかし、いずれも神経毒性のために十分な臨床効果が得られなかった。しかし最近、2ニトロイミダゾール系化合物の側鎖に工夫を加え、脂溶性を抑えて神経毒性を大幅に低減した低酸素細胞増感剤が開発され、これらのうちのKIN806とKIN896とについて生物学的活性を検討し、臨床応用への可能性について検討した。KIN806は従来の放射線増感剤とほぼ同等の放射線増感効果を有するのみならず、肺転移をも抑制することを実験的に明らかにした。これはKIN806自体が免疫賦活作用をも有することを強く示唆した。さらにこの転移抑制作用がKIN806に特異的な現象であることを類似誘導体のKIN804、KIN844等と比較して明らかにし、併せて腫瘍局所及び転移巣に惹起される免疫反応についても比較検討し、KIN806がこれまでに類のない免疫賦活作用を有する放射線増感剤であることを明らかにした。さらにKIN806と同等の作用を有すると予想され、KIN806よりも水溶性を高めたKIN896についても同様の検討を行い、KIN896がKIN806と同等以上の増感作用と肺転移抑制作用を有することを明らかにした。KIN806あるいはKIN896が従来の放射線増感剤と同等の増感効果を保持しつつ、免疫賦活作用の利点を併せ持つ優れた薬剤であることは、今後これらの薬剤の臨床応用が十分に可能であることを意味しており、癌の治療効果のさらなる改善を大いに期待できる。KIN806の放射線増感効果及び肺転移抑制作用を検討した。材料はC3H/HeマウスとSCCVII腫瘍を用いた。全体をコントロール群,30Gy照射群,40Gy照射群,KIN806(0.2mg/g)群,30Gy+KIN806(0.2mg/g)群,40Gy+KIN806(0.2mg/g)群,KIN806(0.4mg/g)群,30Gy+KIN806(0.4mg/g)群,40Gy+KIN806(0.4mg/g)群の9群に分類した。マウスに腫瘍細胞を10^5個移植後,17日目に放射線照射を施行した。放射線は30Gy-40Gy照射した。KIN806は照射30分前に0.2mg/g-0.4mg/gを投与した。肺転移結節数は照射後3週間目に肺表面の転移結節数をカウントした。腫瘍の大きさは治療開始時の腫瘍の体積を1とした相対比で表し,3週間目ではコントロール群24.1,KIN806(0.2mg/g)群16.6,KIN806(0.4mg/g)群13.6とKIN806単独でも腫瘍の成長は抑制された。放射線の照射にKIN806を併用するといずれも著名な腫瘍の縮小効果が得られ,腫瘍の成長抑制はKIN806の投与量に依存した。3週間目の平均肺転移結節数はコントロール群は8.57,KIN806(0.2mg/g)群4.42,KIN806(0.4mg/g)群2.71とKIN806単独でも転移は抑制され,また30Gy群4.44,40Gy群3.00と照射線量の多い方が若干,転移は抑制された。転移抑制効果はKIN806の投与量に依存した。

放射線にKIN806を併用すると転移は放射線単独と比較して著明に減少した。転移抑制効果は線量には依存せず,KIN806の投与量に依存した。次にKIN806とKIN806類似放射線増感剤KIN804及びKIN844との比較試験を行った。上記と同様の方法にて照射の30分前にKIN806,KIN804およびKIN844 0.mg/gをそれぞれ投与した。放射線増感剤併用群では照射単独群と比較して腫瘍の成長は抑制され,増感剤相互の比較ではKIN806とKIN804とはほぼ同等の増感効果を示したが,KIN844の増感効果は劣った。肺転移結節数は放射線治療の有無に関わらずKIN806投与群のみに著明な転移抑制効果がみられ,KIN804とKIN844には転移抑制効果はみられなかった。増感剤の投与回数(1,3,6回)の違いによる腫瘍成長抑制効果と転移抑制作用とには差が見られなかった。KIN806のN-hydroxyethyl誘導体であるKIN896の抗腫瘍活性をKIN806と比較するとともに、腫瘍局所に惹起される免疫反応については前年に報告したKIN804(804群),KIN844(844群)を含めて検討した。材料はC3H/HeマウスとSCCVII腫瘍とを用いた。実験に際しては(1)コントロール群(C群),(2)30Gy照射群(R群),(3)KIN806投与群(806群),(4)KIN896投与群(896群),(5)KIN806投与+30Gy照射群(806+R群),(6)KIN896投与+30Gy照射群(896+R群)の6群を比較検討した。マウスに10^<51>個の腫瘍細胞を移植後17日目に^<60>Coγ線30Gyを照射した。放射線増感剤を併用する群では照射の30分前にKIN806,KIN896 0.4mg/gを腹腔内投与した。治療後20日目にはすべてのマウスを屠殺して腫瘍組織と肺とを摘出し、肺表面の転移結節数を計測した。摘出した組織はただちに液体窒素中にて保存し、後日、ABC免疫染色を行った。腫瘍体積(照射時1.00)は照射後19日目ではC群18.76,806群18.96,896群11.66と806群はC群と同等であったのに対して、896群ではC群よりも腫瘍の成長は抑制された。同じくR群3.41,806+R群0.19,896+R群0.17と放射線増感剤併用群では明らかに照射単独群と比較して腫瘍の成長は抑制された。KIN806とKIN896とではほぼ同等の増感効果を示した。肺転移結節数はC群9.78,806群4.33,896群2.43と896群は806群と同等以上の著明な転移抑制効果がみられた。腫瘍組織内浸潤単核球はC群、804群、844群、804+R群、844+R群ではHelper Tリンパ球の浸潤はみられなかったが、806群、896群、806+R群、896+R群では軽度(+)から中等度(++)のHelper Tリンパ球の浸潤がみられた。放射線の照射の有無に関わらずKIN806とKIN896投与群のみに中等度(++)から高度(+++)のMacrophageの浸潤がみられた。肺転移抑制効果の見られたKIN806とKIN896投与群にHelper Tリンパ球とMacrophageの浸潤がみられたことから、これらの増感剤は免疫賦活作用を有していることを強く示唆した。KIN806とKIN896とに見られる免疫賦活作用が他の実験系にても再現性があるか否かを明らかにし、これらの増感剤に見られる作用が構造式の側鎖に依存するか否かについても2ニトロイミダゾールのデスニトロ化合物を用いて明らかにした。材料は8週令雌C57BL/6マウスとルイス肺癌細胞、放射線増感剤にはKIN806、およびKIN896を、2ニトロイミダゾールのデスニトロ
歯周組識・歯槽骨再生のための自己間葉系幹細胞を用いた細胞移植治療の確立

1,ヒト骨髄間葉系幹細胞の採取・培養倫理委員会の許可を得て,ヒトボランティアの腸骨稜より骨髄液を採取し,培養・増殖させる方法を確立した.また,この細胞群は骨芽細胞,脂肪細胞へと分化しうる多分化能を有していることを確認した。2,結合組織成長因子(CCN-2)コーティングによるヒト骨髄由来間葉系幹細胞の細胞接着,増殖,分化の促進骨髄由来間葉系幹細胞や血管内皮細胞を遊走させることができるCCN-2を多孔質アパタイトブロックにコーティングすることによって,スキャフォード内部への骨髄由来間葉系幹細胞や血管内皮細胞の誘導に成功し,ブロック内部への血管新生,さらには骨再生を促進することに成功した.3,チタン表面に対するヒト骨髄由来間葉系幹細胞の細胞接着,増殖の促進チタン表面にポリリン酸を吸着することにより,骨髄由来間葉系幹細胞の細胞接着や細胞増殖を促進することに成功した.この知見は,ポリリン酸がチタンのオッセオインテグレーションを促進する可能性を示唆するものである.4,cDNAサブトラクション法によるチタンと骨とのオッセオインテグレーションに関連する因子の同定ポリスチレンとチタンディッシュ上で骨芽細胞様細胞株を培養し,total RNAを回収後逆転写,cDNAサブトラクティブハイブリダイゼーション法にて,チタン特異的遺伝子を検索した.その結果,チタン上で骨芽細胞を培養した場合には,sod-1,ribosomal protein L19の遺伝子発現が有意に抑制されていることが明らかになった。現在,さらに他の金属とも比較中である.1,ヒト骨髄間葉系幹細胞の採取・培養倫理委員会の許可を得て,ヒトボランティアの腸骨稜より骨髄液を採取し,培養・増殖させる方法を確立した.また,この細胞群は骨芽細胞,脂肪細胞へと分化しうる多分化能を有していることを確認した。現在,さらに他の金属とも比較中である.1.ラット骨髄間葉系幹細胞の採取・培養4週齢雄性ラット大腿骨より骨髄液を採取し、細胞を分離した。この細胞を,デキサメタゾンを含むα-MEM中で培養したところ、基質の分泌が促進され、アルカリフォスファターゼ活性の上昇も認められた。これらのことからこの細胞は骨芽細胞への分化能を有する骨髄間葉系幹細胞であると推測された。2.骨髄間葉系細胞への各種成長因子の影響ヒト、ならびにラット骨髄間葉系幹細胞をbasic-fibroblast growthfactor(b-FGF)、connective tissuegrowthfactor(CTGF)等の成長因子を添加した培養液で培養し、その増殖促進効果を検討した。その結果、これらの成長因子によって濃度依存的に骨髄間葉系幹細胞の増殖を促進していることが確認された。また、これらの成長因子による細胞接着の促進効果についても検討したところ、細胞増殖と同様に濃度依存的に細胞の接着を促進することが確認された。3.骨髄間葉系幹細胞と生態親和性材料の共培養ヒト、ラット骨髄間葉系幹細胞をチタンプレート、β-TCPフォーム等の生態親和性特性のある材料と共培養し、材料への細胞接着の様子を走査型電子顕微鏡(SEM)にて確認した。その結果、チタンプレート・β-TCPフォーム両材料ともに良好な細胞接着を確認することができた。1.骨髄間葉系幹細胞の培養と増殖因子の影響骨髄間葉系幹細胞を牛胎児血清濃度0,1,5,10%で含んだ培地でそれぞれ培養を行い,血清の濃度が骨髄間葉系幹細胞の増殖に与える影響を検討した。その結果,血清の濃度が高いほど骨髄間葉系幹細胞の増殖を促進させることが判明した。2.骨髄間葉系幹細胞の培養と各種成長因子の影響骨髄間葉系幹細胞の細胞増殖における各種成長因子の影響を検討した。成長因子として結合組織成長因子(CTGF),塩基性線維芽細胞成長因子(bFGF)を使用し,0.1%牛胎児血清を含んだ培地にそれぞれ10,30,50ng/mlの濃度で添加した。その結果,培養開始から1,4,7日目まで各群とも増殖を続け,かつ成長因子添加群では添加していない群に比べて増殖を促進させる傾向が認められた。3.骨髄間葉系幹細胞と生態親和性材料の共培養(1)骨髄間葉系幹細胞を生態親和性材料と共培養した際の細胞反応骨髄

間葉系幹細胞を培養皿底に固定したチタンディスクへ播種し,2時間後のチタンへの細胞接着を評価した。その結果,通常の培養皿と比較して高い細胞接着が認められた。(2)チタンディスクへの細胞接着と成長因子の影響上記と同様に,チタンディスク上への細胞接着が各種成長因子を添加した場合に受ける影響を検討した。その結果,CTGF, bFGF添加群とも添加していない群と比べて細胞接着が促進された。(3)ハイドロキシアパタイトへの細胞接着と成長因子の影響チタンディスクと同様にハイドロキシアパタイトを培養皿底に固定し,成長因子を20,50,100ng/mlの濃度で添加した。その結果、成長因子の濃度依存的に細胞接着が促進された。添加した成長因子間の差は認められなかった。1.骨髄幹細胞の単離,培養ヒト腸骨より骨髄液を(10ml)採取した。採取した骨髄液を培養ディッシュに播種し,培養72時間後に浮遊細胞を取り除き,接着細胞を単離した。単離した細胞をMSCBM(10%血清含有)にて培養を行い,3日に一度培地交換を行い,細胞の培養を行った。2.採取した未分化間葉系幹細胞の多分化能の確認1で採取した未分化間葉系幹細胞をDexmetazon, ascorbate-2phosphate及びβ-glycerophosphateを用いて,骨芽細胞への誘導を行った。アリザリンレッド染色にて骨芽細胞へ誘導されていることを確認した。また,troglitazoneを用いて,脂肪細胞への誘導を行った。オイル赤染色にて脂肪細胞へ誘導されていることを確認した。3.CTGFコーティングハイドロキシアパタイトにおける間葉系幹細胞の接着能の検討歯槽骨などの硬組織再生においてスキャフォールドとして有望視されているハイドロキシアパタイトを使用し,Shimoらの方法を用いてリコンビナントCTGFタンパクをこのアパタイトにコーティングした。その後,1で単離した間葉系幹細胞を播種し,細胞接着能試験(MTSアッセイ)を行い,これによりCTGFのアパタイトに対する細胞接着能を検討した。その結果,100ng/mlのCTGFをハイドロキシアパタイトにコーティングすることで細胞接着が亢進した。4.in vivoにおけるCTGF-ハイドロキシアパタイト-間葉系幹細胞による骨再生3の結果をもとに,CTGFをコーティングしたアパタイトに間葉系幹細胞を播種し,それら複合体をラットの背部皮下に移植した。2週後にサンプルを摘出したところ著明な骨様硬組織の形成が認められた。
P-S波変換地震動のH/V特性による広帯域ローカルサイト効果の解明と設計への導入

地震動は大きく地震の震源の特性,地震波の伝播特性,地表近くの局所的な地盤特性の3要因によって支配される。特に,3番目の要因はローカルサイト効果と呼称され,最も支配的な要因である。本研究では地震動および常時微動(諸々の自然ならびに人工的な振動源による微小な地盤振動)の二つの異なる振動を取り上げ,それらの振動の水平動Hと鉛直動Vの比であるH/V特性によりローカルサイト効果を評価する新たな手法を導いた。20観測ステーションの地震動データをリアルタイムに自動回収するSmall-Titanという東北工業大学のアレー強震観測システムを継続的に運営するとともに、これまでの10年におよぶ観測による地震動データを改めて整理した。また、K-NETなど他の機関の観測データとの連携をとるべく、地震動データ、関連地盤データを収集した。このデータ収集整理の作業で、関連するデータとして2004年新潟県中越地震と2007年新潟県中越沖地震の震源近傍における貴重な強震記録を処理した。この中で加速度、速度、変位における地震動の空間-時間変動をアニメーション解析して、震源特性とローカルサイトの相互作用を検討した。不整形地盤も含めて三次元地盤の各種の応答計算が可能な解析コードの高度化をこれまで開発している擬似スペクトル法により進めた。本年度は実地盤への適用の前に各種のモデル地盤への適用により解析コードの完全性確立に焦点を合わせた。このなかで、P,SV波、SH波などの実体波が斜め下方から平面波として入射する地震応答の解析コードの完成をはかった。また、平行して、P-S変換波の発生理論の理論解析を各種の想定地盤構造で実行して、数値解析との間に整合性が存在することを確認した。各種展開距離による微動SPAC法をSmall-Titanの代表的な1観測点に絞って実行した。これは研究協力者の弘前大学理工学部の片岡俊一氏から技術援助を受けて行われた。ここで得られたSPAC法による各観測点の地盤における平均S波速度は地震観測による観測点増幅度と強い相関があることが明らかとなった。20観測ステーションの地震動データをリアルタイムに自動回収するSmall-Titanという東北工業大学のアレー強震観測システムを継続的に運営した。今年度は2008年6月14日に2008年岩手・宮城内陸地震が起こり,その本震といくつかの余震による記録を得た。これらは,これまでSmall-Titanで記録された多くの地震と異なるメカニズムをもつ内陸型地震によるものであり,本研究課題を進める上で貴重な記録となった。これらの記録は、K-NETなど他の機関の観測データと連携されて処理された。また,このデータ収集整理の作業に合わせて,内陸地震として関連する2004年新潟県中越地震と2007年新潟県中越沖地震の震源近傍における強震記録も処理した。特に,2008年岩手・宮城内陸地震と2004年新潟県中越地震はほぼ同じ規模の内陸地震であるにも関わらず,構造物の被害程度が異なることから,地震動特性と被害との関係を考察する絶好の対象として,加速度,速度,変位の地震動空間分布を距離減衰特性および余震分布の観点から分析した。また,以上に加えて,不整形地盤も含めて三次元地盤の各種の応答計算が可能な解析コードの高度化を前年度に継続して擬似スペクトル法により進めた。本年度は実地盤への適用として上記の2004年新潟県中越地震および2008年岩手・宮城内陸地震で実際に強震記録を得た震源近傍の観測点地盤をモデル化して応答シミュレーションを試みた。ここでは、本研究課題の主目的であるP, SV波,SH波などの実体波が斜め下方から平面波として入射する地震応答シミュレーションを実施した。このシミュレーションでP-S変換波の発生が数値解析と整合すること,実際に観測された強震記録にその現象による相が存在することを確認した。また,K-NETによる2008年岩手・宮城内陸地震の本震および余震の強震記録を前年度に続き解析した。特に,今年度は広帯域ローカルサイト効果の解明という本研究課題の目的に合わせて長周期帯での増幅特性を明らかにすべく速度,変位記録による解析に重点を置いた。2008年岩手・宮城内陸地震による変位記録の東北地方における動的な時・空間分布解析を行った。この結果,長周期帯域での増幅は平野,盆地部で大きいのみならず,山間地でも増大すること,その原因として火山活動によるカルデラの存在が明白となった。さらに,仙台市圏という都市レベル領域での変位に関する考察をSmall-Titanによる多くの地震による記録を用いて詳細に行った。

この結果,従来知られていた知見に反して,仙台市圏では沖積層よりも洪積層領域で変位が大きくなること,これが深さ1.2kmに基盤をもつ深部不整形地盤構造により二次的に生成される表面波(Love波)によるものであることが明らかにされた。以上の強震記録の観測結果による考察に加えて,不整形地盤による理論地震応答計算を擬似スペクトル法により進めた。ここでは上記の仙台市圏における観測記録による考察結果を受けて,仙台市圏における深部不整形地盤を対象として応答シミュレーションを試みた。さらに,これらの応答シミュレーションを応用して,仙台市圏における深部地盤構造の同定を行った。この結果,仙台市圏はS波速度V_s=4km/sの基盤の上に厚さ1.2kmでS波速度Vs=1.4km/sの洪積層が堆積する地盤構造を有して,この洪積層厚が沖積層地では急激に薄くなり,長周期帯域での増幅特性を特徴づけていることが明らかとなった。
非収縮性モノマーによる適合性の良好な修復用レジンの開発研究

1.示差走査熱量計に装着可能な可視光線照射装置を試作し、その性能を検討した結果、長時間(10分以上)の連続照射においても出力の低下がなく、重合反応の検討に十分使用できることを確認した。2.側鎖にエキソメチレンやフェニール基をもつ4種の6員環アセタールのビニール誘導体を合成し、80120°Cのラジカル重合(AIBN:アゾビスイソブチロニトリル)について検討した結果、いずれにおいても無色の重合体が得られた。特にエキソメチレンを持つ6員アセタール誘導体はラジカル重合によってDouble Ring-openingし、架橋構造のポリマーを生成することが確認された。3.側鎖に環状カーボナ-トを有するメタクリレート(1,2-オキソ-5-メタクリロイルオキシメチル-1,3-ジオキサン:CMA)を合成した。4.側鎖に環状カーボナ-トを有するメチルメタクリレート(MMA)との共重合体(2種)を合成した。5.CMAをエチレングリコールジメタクリレート(1G)に溶解し、CMA/1G:30/70,40/60(重量比)からなるコモノマーを調製し、2種のラジカル重合開始剤(過酸化ベンゾイル:BPO,カンファーキノンCQ/ジメチルアミノエチルメタクリレート:amine)による重合反応を検討したところ、可視光線重合において70°Cの加熱重合より高い反応率を示すことが確認された。また、重合前後のIRスペクトルからCMA内のスピロ環およびビニール基の重合が推察された。また、CMAは1Gの重合を促進することが確認された。6.CMAとMMAからなるコポリマーをMMAに溶解し、側鎖の環状カーボナ-トの開環重合を検討中である。1)モノマーの分子構造と膨張性に関する遠藤らの研究結果(Macromolecules 27;3986-3991,1994、色材68;286-293、1995)に基づいて、環状カーボナ-ト構造の有用性に着目し、そのメタクリレート誘導体(2-オキソ-5-エチル-5-メタクリロイルオキシメチル-1、3-ジオキサン)を合成した。すなわち、トリメチロールプロパンジメチルアセタール、トリエチルアミン、メタクリル酸クロライドをジエチルエーテル中で反応させ、2-メタクリロイルオキシメチル-1、3-プロパンジオールを合成した。そして、反応生成物にエチルクロロホルメート、トリエチルアミンを加え反応を行い合成した。合成物は融点512°Cの白色結晶物であった。2)可視光線重合による検討を行うために試作した、新しい光重合装置(特注)の性能(光量調節、測定精度、再現性等)について、示差走査熱量計(セイコ-電子製・DSC装置)を用い、メタクリレート/カンファーキノン/アミン系レジンの重合熱(H)および最高発熱時間(Tp)から検討した。その結果、照射量(10、15、20mW)の増加に伴って重合熱の増加が観察されたが、Tpにはあまり変化がみられなかった。また、一回の測定には1mg程度のモノマーがあれば、重合速度や重合率の測定が十分に可能であることが確認できた。上記(I)のモノマーのMMA、スチレン、アクリルニトリル、2官能性メタクリレートへの溶解性について検討した結果、前3種のモノマーに対しては50mol%以上の溶解性を示したが、2官能性メタクリレートに対してはやや溶解性が低い傾向を示した。

1.カーボネートメタクリレート(CMA)の合成:トリメチロールプロパンジメチルアセタールとメタクリル酸クロライドをトリエチルアミン共存下で反応させ、反応生成物に濃塩酸を加え、可溶媒分解したのち、エチルクロロホルメートと反応させ、白色の結晶物(2-オキソ-5-メタクリロイルオキシメチル-1,3-ジオキサン:CMA)を合成した。そして、元素分析(C_<11>H_<16>O_4)、IRスペクトル、NMRスペクトルで構造を確認した。3.DSCに装着可能な可視光線照射装置の試作と評価:可視光線照射装置(2基)、ファイバーケーブル、電動シャッター、レーザーメーターからなる示差走査熱量計(DSC)に装着可能な可視光線照射装置を試作し、連続照射時の出力の安定性を調べたところ、1030mWの出力は10分間ほとんど一定であった。そして、3G(トリエチレングリコールジメタクリレート)/カンファーキノン・第3級アミン系の光重合レジンを試作し、重合熱の再現性を調べたところ、高い再現性を示し、光重合レジンの反応解析に十分利用できることが確認された。4.CMAの重合:CMA/1G(エチレングリコールジメタクリレート)=30/70,40/60(wt%)に重合開始剤(BPO,AIBN,CQ/Amine)を1モル%加えコモノマーを調製し、DSC中で加熱重合(70°Cx20min、70+120°Cx20min)および可視光線重合(480nm:10mWx10min)を行い、その時の重合熱を測定した。その結果、70°Cでの重合熱は120°Cでの重合熱の約3/4程度(180190mJ/mg)であったが、光重合での重合熱は120°Cの加熱重合よりやや高い重合熱を生じた。また、生成物のビニール基とスピロ環のIRスペクトルに変化が認められた。
ベイズ統合モデルに基づく熟練者の打球方向予測能力の解明

僅かな判断の遅れが勝敗を決める対戦競技では,対峙者の行動結果を素早く的確に予測する能力が求められる。従来,熟練者の優れた予測能力を支える知覚情報処理は,対峙者の行動文脈とその運動特徴を瞬時に捉えるためとされてきた。本研究の目的は,テニス競技の打球方向予測に着目し,熟練者が事前分布の「文脈情報」と最新に得る「運動情報」の2つの感覚信号をどのように統合し活用するのかについて,ベイズ統合(Kording and Wolpert, 2004)の考えに基づき明らかにすることである。心理物理学的手法を用いた知覚判断実験では,バーチャルリアリティ(VR)技術を駆使して対峙者の文脈(コートポジション)と運動(打球動作の方向性分)の両情報を任意に操作し,熟練者が予測時に採用する最適化情報の利用方略を特定する。本年度は、ベイズ統合実験で用いる実験系ならびにVR環境の構築に尽力した。VR構築ではテニス場面を設定し,対峙者となるテニスアバターの運動情報を誇張表示する方法に成功した。結果の一部は、申請書提出前に実施していた実験データが蓄積していたこともあり、国際学会(NASPSPA2018)ならび国内学会(体育学会)にてポスター発表をおこなった。なおすべての実験系の設定や仮説構築については,オランダのアムステルダム自由大学にて共同研究ならびにミーティングにて議論した。Mann准教授(アムステルダム自由大学),中本准教授(鹿屋体育大学)との議論・アドバイスにより,申請書では詰めきれなかった研究の論理構成を進めることができた。本研究の実験実施に先立ち、ベイズ統合実験の検証ならびに、それに必要なVR環境の整備ならびに、実験仮説の詳細な検証を実施することができた。また学会発表による議論に基づき、テニスアバターのモーションデータの不具合を確認することができたため、それを修正することで解決することとした。よって、ベイズ統合実験を実施できる準備が大まかに整ったといえる。以上から,評価をおおむね順調に進展しているとした。昨年度構築した実験系ならびにVRシステムを利用して、計画通り実験を実施する予定である。また本年度も、Mann准教授ならびに、連携研究者の中本准教授からの研究知見に基づき、テニス選手の予測がベイズ統合に基づいているかを検証する。実験系の調整に時間がかったことや、論文投稿に至らなかったため、一部の研究費は次年度に持ち越すこととした。2019年度は、本課題におけるVR実験の補助機具、実験参加者謝金ならびに英文構成に利用予定である。
食用植物からのアミロイドβ凝集阻害物質の探索と作用機序の解明

サツマイモ、コーヒー等に含まれるカフェオイルキナ酸(CQA)に、アルツハイマー型認知症の毒素であるアミロイドβ(Aβ)凝集阻害活性があることを見出し、活性発現にはカテコール構造が重要であることを明らかにするとともに、その作用機構の解明を行った。また、Aβ凝集阻害活性試験を指標にして、活性物質としてオリーブ等に含まれるフェニルエタノイド配糖体を見出した。さらに、得られたAβ凝集阻害活性物質には顕著な肝細胞増殖因子(HGF)促進活性を示すことを見出した。以上より、これらの化合物はAβ凝集阻害活性、抗酸化活性ならびにHGF産生促進活性をもつことで神経細胞保護作用を示すことを見出した。研究代表者らは、これまでにサツマイモ、プロポリス、コーヒー等に含まれるカフェオイルキナ酸が、アルツハイマー型認知症の毒素であるアミロイドβ(Aβ)による神経細胞死を保護する作用のあること、また記憶障害モデルマウスを用いた経口投与実験で顕著な記憶障害改善作用のあることを見出した。さらに最近、カフェオイルキナ酸類にアミロイドβ凝集阻害活性があることを見出したことから、本研究では食用植物から新たなアミロイドβ凝集阻害物質を探索するとともに生物有機化学的手法を用いてカフェオイルキナ酸類や新たに見出したアミロイドβ凝集阻害物質の作用機序を解明することで、アルツハイマー型認知症に対する予防や治療薬の開発に貢献することを目的とする。そこで本研究では、Th-T試験を指標にして種々の植物由来ポリフェノール化合物のスクリーニングを行った結果、オリーブ等に含まれるフェニルエタノイド配糖体Acteosideに顕著な活性を見出した。そこで、Acteoside類を単離し、さらに種々の類縁化合物に誘導して構造活性相関を検討した。その結果、カテコール構造がアミロイドβの凝集阻害活性発現に重要であることを明らかにした。一方、神経変性疾患において肝細胞増殖因子(HGF)が有効であることが報告されていることから、植物由来ポリフェノールについてHGF産生促進活性を調べた。その結果、カフェオイルキナ酸、フェニルエタノイド配糖体ならびにジンチョウゲから単離したDaphnane型ジテルペンやビスフラボノイド類に顕著な活性があることを見出した。したがって、カフェオイルキナ酸やフェニルエタノイド配糖体は、HGF産生を促進させることにより、神経細胞保護作用を示すという新たな知見を得ることができた。さらに最近、カフェオイルキナ酸(CQA)類にアミロイドβ凝集阻害活性があることを見出したことから、本研究では食用植物から新たなアミロイドβ凝集阻害物質を探索するとともに生物有機化学的手法を用いてカフェオイルキナ酸類や新たに見出したアミロイドβ凝集阻害物質の作用機序を解明することで、アルツハイマー型認知症に対する予防や治療薬の開発に貢献することを目的とする。そこで本研究では、すでにAβ凝集阻害活性を有する化合物として、プロポリスから見出したCQA類によるAβ凝集阻害活性の機構を調べた。まず、キナ酸およびカフェ酸を出発原料として種々のCQA類を化学合成し、天然物から単離した化合物と併せて11種類のCQA類を活性試験に用いた。これらの化合物のTh-T試験を行ったところ、カフェオイル基の数とカテコール構造の水酸基が活性発現には重要であることを見出した。次に、最も活性の高かった4,5-di-O-caffeoylquinic acid (4,5-di-CQA)と3,4,5-tri-O-caffeoylquinic acid (3,4,5-tri-CQA)を用いて、TEMによる観察ならびにCDスペクトルによるAβのコンホメーション変化を調べた結果、Aβの凝集が阻害されていることが明らかとなった。さらに、ウェスタンブロッティング法を用いてAβのオリゴマー形成への影響を調べた結果、4,5-di-CQAならびに3,4,5-tri-CQAによってAβのオリゴマー形成が抑制されていることが明らかとなった。

さらに最近、カフェオイルキナ酸類にアミロイドβ凝集阻害活性があることを見出したことから、本研究では食用植物から新たなアミロイドβ凝集阻害物質を探索するとともに生物有機化学的手法を用いてカフェオイルキナ酸類や新たに見出したアミロイドβ凝集阻害物質の作用機序を解明することで、アルツハイマー型認知症に対する予防や治療薬の開発に貢献することを目的とする。そこで本研究では、Th-T試験を指標にして種々の植物由来ポリフェノール化合物のスクリーニングを行った結果、フェノール性水酸基をもつハナノキ由来のGinnalin類とジンチョウゲ由来のビスフラボノド化合物Daphnodorin類に顕著なAβ凝集阻害活性を見出した。これらの化合物の誘導体を用いて構造活性相関を調べた結果、フェノール性水酸基の数が活性発現には重要であることを明らかにした。またカバノアナタケから単離したHispidin化合物であるPhelligridin類や地骨皮から単離したKukoamine類に顕著なAβ凝集阻害活性があることも見出した。また、これらの化合物には顕著な肝細胞増殖因子(HGF)産生促進活性のあることも見出されたことから、HGF産生を促進させることによって神経細胞保護作用を示すという新たな知見も得られた。天然物化学フェニルエタノイド配糖体類ならびにそれらの誘導体を用いてアミロイドβ(Aβ)凝集阻害活性に対する造活性相関研究を行った結果、昨年度までのカフェオイルキナ酸類での結果と同様に、アミロイドβ凝集阻害活性においてカテコール構造が重要であることを明らかにした。また、カフェオイルキナ酸やフェニルエタノイド配糖体にHGF産生促進活性が認められたため、これらの化合物の新たな神経細胞保護作用を見出した。カフェオイルキナ酸(CQA)類の構造活性相関研究により、目的としていたAβ凝集阻害活性における活性部位を見出すことに成功した。Th-T試験法を活用して、他の食用植物からカフェオイルキナ酸やフェニルエタノイド配糖体以外のアミロイドβ凝集阻害物質を探索する。また、フェニルエタノイド配糖体におけるカテコール部分の重要性を調べるために、酸化や還元環境下でのアミロイドβとの作用を調べる。一方、凝集阻害物質による神経細胞保護活性の仮説として、このような活性物質がアミロイドβのコンホメーションを変化させることが指摘されている。そこで毒性コンホマーの存在比が多いとされるE22P変異体および22,23番目のターン構造をラクタムにより固定した配座アナログ体(両ペプチド化合物は連携研究者により作製)を用いて、ウェスタンブロッティング法によりフェニルエタノイド配糖体類によるオリゴマー形成への影響を調べる。Th-T試験法を活用して、他の食用植物からカフェオイルキナ酸(CQA)以外のAβ凝集阻害物質を探索する。また、CQAにおけるカテコール部分の重要性を調べるために、酸化や還元環境下でのAβとの作用を調べる。一方、凝集阻害物質による神経細胞保護活性の仮説として、このような活性物質がAβのコンホメーションを変化させることが指摘されている。そこで毒性コンホマーの存在比が多いとされるE22P変異体および22,23番目のターン構造をラクタムにより固定した配座アナログ体(両ペプチド化合物は連携研究者により作製)を用いて、ウェスタンブロッティング法によりCQA類によるオリゴマー形成への影響を調べる。当初計画していた実験器具や試薬類が他予算や譲渡等により、十分に賄えたことから、次年度に繰り越すこととした。
『脳の領域選択的な脆弱性』と領域特有の血管環境の関連性

脳は、神経細胞、グリア細胞などから成り立っているが、これらの構成細胞の中で虚血に最も弱いのは神経細胞である。この虚血に対する神経細胞の脆弱性は均一ではなく、組織部位によって大きく異なり、選択的脆弱性の存在が古くから指摘されており、大脳皮質の第III、V/VI層、海馬のCA1は脆弱であることが示されている。本研究では、脆弱領域における毛細血管の形態学的・分子的な特徴を明確化することを目指す。