hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
血管弛緩を誘導する低分子ペプチドの生理とその発現機構の網羅的解明

塩基性低分子ペプチドによる血管機能改善作用には、カルモジュリンシグナルを介したCa2+関連シグナル系の遮断が関わっている可能性を見出してきた。血圧関連臓器に局在するカルモジュリン-Ca2+系を制御することにより、血管系疾患(動脈硬化、心肥大、腎不全)を予防する可能性がある。さらに、カルモジュリン-Ca2+系は炎症反応にも関与する報告があることから、塩基性低分子ペプチドは血管だけではなく、ほかの臓器においても炎症反応を抑制することが期待される。そこで、今年度は塩基性低分子ペプチドの抗炎症作用に関する詳細な知見の獲得を行った。1.ペプチドのカルモジュリン-Ca2+複合体形成阻害作用の解明これまで、塩基性ペプチドはカルモジュリンキナーゼII(CaMKII)を阻害することを明らかにしてきた。そこで、CaMKII活性化因子であるカルモジュリン-Ca2+複合体に着目し、ペプチドによる複合体形成阻害作用の実証を試みた。Ca2+特異的蛍光プローブFluo-4を用いてカルモジュリン-Ca2+複合体形成量を評価できるアッセイ系を構築し、ペプチドTrp-HisおよびHis-Trpは複合体形成を阻害することを明らかにした。さらに、水溶液系分子動力学シミュレーション法を用いたin silico解析の結果、Trp-HisおよびHis-TrpはカルモジュリンのCa2+結合部位と水素結合を介して安定的な複合体を形成することを初めて明らかにした。2.塩基性ペプチドを含む食品タンパク質の腸管炎症予防作用の実証塩基性アミノ酸を多く含む卵白タンパク質オボトランスフェリンを腸炎症モデルマウス(デキストラン硫酸ナトリウム誘導性大腸炎マウス)に投与した結果、体重減少の抑制、クリニカルスコアの改善、大腸短小化の抑制が確認された。さらに、オボトランスフェリンは大腸における炎症性サイトカインの産生を抑制していた。26年度が最終年度であるため、記入しない。今年度は、新たに構築したアッセイ系により、ペプチドの細胞内Ca^<2+>シグナル系抑制作用を評価することに成功した。さらに、University of Guelph(Canada)にて関連するペプチド機能について深化的な研究交流を実施し、当該ペプチドの抗炎症作用を実証した。よって、当初の研究実施計画をおおむね達成している。今年度は、University of Guelph (Canada)において、血管弛緩性ペプチドの抗炎症作用を動物試験で実証し、その作用機序を細胞レベルで解明した。本研究では、血管をはじめとする血圧調節組織での生理機能を明示するために、活性ペプチドの構造要件、細胞内Ca^<2+>シグナル系抑制機構の網羅的解明を目的とした。今後も、細胞内Ca^<2+>調節ペプチドの構造要件および炎症刺激細胞内での生理作用の解明を引き続き進める予定である。
大脳基底核間接路のドーパミン依存的回路動態遷移機構の解明

代表的な運動疾患であるパーキンソン病時には異常な神経活動が観測され、運動障害と密接な関係があると考えられている。この異常活動は、脳内でドーパミンが枯渇することにより生じるとされるが、その詳細についてはよく分かっていない。本研究では、関係する神経部位の数理モデルを構築し、異常活動の発生条件について解析した。主因の1つは、特定の神経回路構造をとる時であり、もう1つは、ドーパミン枯渇により淡蒼球外節ー視床下核投射が増強することである、と分かった。大脳基底核間接路に位置する視床下核ー淡蒼球外節神経回路は、正常時とパーキンソン病に代表される運動疾患時に顕著な神経活動変化を示すことから、運動機能において重要な役割を担っていると考えられているが、未だ不明な点も多い。従って、当該神経回路モデルを作成し、その回路動態の1.視床下核・淡蒼球間のシナプス結合様式、2.細胞膜特性およびシナプス伝達特性に対するドーパミンの作用、3.皮質ー視床下核および線条体ー淡蒼球入力特性、への依存的特性、について、神経回路モデルの計算機実験と得られたデータの解析により調べた。それぞれの結果は、次の通りであった。1.先行研究で示唆されているように視床下核と淡蒼球のトポグラフィカルな構造を仮定した場合、興奮性の視床下核ー淡蒼球経路と淡蒼球内の側抑制の結合範囲が一致する場合に、基底核の病的状態時に観測されるリズミックなバースト活動が生じ、それ以外では、正常時のトニック活動を示した。2.前述した様々な神経結合様式をもつ神経回路について調べたところ、細胞膜特性、シナプス伝達特性それぞれのみに、ドーパミン修飾作用を適用した場合には、前述のバースト活動の低減効果は限定的であったが、その両方への作用では、完全にバースト活動を防ぐことが確認できた。3.パーキンソン病時に観測されるβバンド活動の当該神経回路への影響を調べるため、皮質ー視床下核、線条体ー淡蒼球経路の振動入力の振幅、位相差をパラメータとして、その回路動態を解析した。皮質ー視床下核経路の入力の方が影響が大きいこと、両経路の位相差に依存し、視床下核ー淡蒼球神経活動の振動成分の強さが変化することが明らかになった。以上より、これまで個別に示唆されている実験結果や、新たに明らかになった結果を得ることができた。これを踏まえ、当該神経回路の機能的役割についての考察を進める。視床下核ー淡蒼球神経回路のドーパミン依存的な回路動態変化をもたらす可能性の1つとして、視床下核ニューロン応答特性のドーパミン依存性が考えられている。視床下核ニューロンに発現する脱分極活性型カルシウムイオンチャンネル(Cav2.2)の活性レベルがドーパミンに修飾され、細胞内カルシウム濃度の変化が、視床下核ニューロンの自律活動の規則性に影響を与えるとされている(Ramanathan et al., 2008)。この特性は従来の視床下核ニューロンモデルでは再現することが出来ないため、特に、自律活動の生成の役割を担うナトリウムチャンネルのモデル化を中心に、視床下核ニューロンモデルを構築した。視床下核ニューロンを始め、高頻度な神経活動を示すニューロンには、Nav1.6型のナトリウムチャンネルが発現している。このチャンネルタイプの既存モデルは、詳細な状態遷移を記述した計算コストの大きい(自由度の大きい)モデルであり、また、必ずしも実験データを再現するとは言えなかった。そこで、このチャンネルタイプのよりシンプル(低自由度)かつ再現性の高いモデルを構築した。その結果、計算コストは約1/8になり、かつ、従来モデルと比べ、より実験データに近い特性を示すことが確認された(Do & Bean, 2003)。またドーパミン濃度の変化を想定したシミュレーションにより、自律活動の規則性についても、実験データと定性的傾向が一致した(Ramanathan et al., 2008)。特に、計算コストの軽減は、今後実施する神経回路モデルを用いたシミュレーション研究の効率化にとって、重要な意味を持つ。大脳基底核間接路に位置する視床下核ー淡蒼球外節神経回路は、正常時とパーキンソン病に代表される運動疾患時に顕著な神経活動変化を示すことから、運動機能において重要な役割を担っていると考えられているが、その活動遷移、特に、パーキンソン病の原因であるドーパミン枯渇により引き起こされる活動遷移については未だ不明な点も多い。当該神経回路モデルを作成し、その回路動態の1.視床下核・淡蒼球間の回路結合様式との関係、2.細胞膜特性およびシナプス伝達特性に対するドーパミンの作用の影響、3.皮質ー視床下核および線条体ー淡蒼球入力に対する応答特性、について調べた。それぞれの結果は次のとおりであった。1.興奮性の視床下核ー淡蒼球投射と淡蒼球内の側抑制の結合範囲が一致し、かつ抑制性の淡蒼球ー視床下核投射が選択的な結合をとる場合に、基底核の病的状態時に観測されるリズミックなバースト活動が生じた。

それ以外では、正常時のトニック活動を示した。2.前述した様々な結合様式をもつ神経回路について調べたところ、細胞膜特性、シナプス伝達特性それぞれのみに、ドーパミン修飾作用を適用した場合には、前述のバースト活動の低減効果は限定的であったが、その両方への作用は、バースト活動をかなりの程度防ぐことが確認出来た。3.パーキンソン病時に観測される皮質由来の低周波活動やβバンド活動の当該神経回路への影響を調べ、線条体ー淡蒼球経路の強い振動入力が病態を再現することが分かった。このことから、病態神経活動を防ぐには、線条体ー淡蒼球経路の活動レベルを抑制することが効果を持つと示唆している。計算論的神経科学計画した研究についてのデータ、解析がほぼ完了しており、その成果をまとめる段階にきているため。申請書に記載した当初の計画の通り初年度は、視床下核ニューロンのモデル構築について、定量的な意味での改善は必要ではあるものの、概ね(80%以上)達成していると考えている。また同時に、2年目以降に計画している神経回路モデルの構築とシミュレーションによる解析についても、当該神経回路の回路構造に関する形態的特徴について、可能な範囲において(文献に基づく)、先行研究の調査をほぼ終えた。今後は、関係する学会・研究会等で発表し、この分野を専門とする専門家からのフィードバックを得て、それらを踏まえて論文にまとめ、学術誌に投稿する予定である。今後、(1)当該神経回路内の情報伝達を担うシナプスの特性の解析およびモデル化、(2)これまでに構築したニューロンモデル・シナプスモデル、また調査した回路構造をもつ神経回路モデルのシミュレーションとその解析、と進めていく計画である。(1)について、シナプスはニューロンが生成した神経活動を伝達する動的フィルタとしての機能をもち、ニューロンの応答特性と同じくらい重要な回路動態を決定する因子である。最新の実験的研究により、淡蒼球ー視床下核シナプスの動的特性について調べられ、その結果、このシナプスは従来のシナプスモデルではうまく再現できないことがわかっている(Atherton et al., 2013)。すでに主要なデータは提供してもらい、これに基づいて従来モデルを拡張することで、対象のシナプスのより尤もらしいモデルを構築し、回路モデルの精度を向上させる。研究の進捗が想定していたより少し早くなったため、成果発表の機会を増やすことを計画し、そのための旅費に使用と考えた。外国出張(CNS 2014)あるいは日本神経回路学会全国大会への出張旅費として使用することを検討している。初年度の視床下核ニューロンモデルの構築の過程で適用した、モデルパラメータの最適化手法についての手法そのものの研究成果発表を新たに計画したため、その発表を行う次年度に繰り越すこととした。これ以外の翌年度の研究費の使用計画については当初通りを予定している。
高レベル言語で記述されたリアクティブシステムに対する実時間性質の検証

本研究では、再帰呼び出しや割り込みなどの手続き呼び出しを持つ高レベル言語で記述された実時間プログラムの振舞いをモデル化するNested Timed Automaton(以下NeTA)を提案し、到達可能性が決定可能であることを示し、安全性検証が可能であることを示した。NeTAは、時間オートマトンをスタックアルファベットに持つプッシュダウンシステムである。さらに、時間オートマトンがスタック上にあるときにクロックを凍結する機構を導入しても、一定の条件のもとで到達可能性が保存することを示した。さらに、効率的なゾーン構成による検証手法について検討した。NeTAは、スタックアルファベットとして時間オートマトンに拡張したPushdown Systemであり、スタックを持つ実時間プログラムをモデル化することを目的とする。時間に依存した振舞いをもつプログラムの呼出しは、スタックアルファベットである時間オートマトンをPush操作、プログラム終了によってもとのプログラムへのリターンをPop操作によってモデル化する。各プログラムは局所的な時間経過に依存して動作する。呼出しレベルには制限がないため、NeTAは従来の時間オートマトンを拡張した枠組みである。NeTAの特徴は、スタックに格納された時間オートマトンのクロック変数が時間経過とともに増加することである。これは、実際のプログラムの実行においてもスタック上において時間経過は有効であることに対応している。研究開始前にNeTAは、既存研究で提案されていDTPDA(Dense-timedPushdown Automaton)の到達可能性において同等の性質をもつことが予想されていたが、NeTAをDTPDAに変換する手法を示し、NeTAが実時間システムのモデルとして有用であることを示した。この他に、時間に依存したシステムをモデル化するハイブリッドシステムの解析技法としての無限小数を導入したプログラム検証の実例、形式手法のAlloyに実数を導入した体系の拡張と検証手法の検討を行った。これらの研究では、既存のツールを時間に依存するプログラムに適用する手法について主に検討した。さらに、高階関数プログラムの停止性についての研究を実施し、高階関数プログラムに対する検証手法の拡張をおこない、研究結果を国際会議ESOPで発表する予定である。本課題の目標は、再帰関数、割り込み、高階関数、オブジェクトなど高度なプログラミング機能を含むリアクティブシステム(外部イベントに対応して動作するプログラム)の検証である。このようなプログラムが本来もつ複雑性に対する検証技術に加えて、実時間性をもつプログラムへの適用技報の確立を目指している。平成26年度については、前年度に引き続き、実時間システムとして高階性をもつ計算モデルとしてのNeTA(Nested Timed Automaton)についての研究と、並行して、高階プログラムの停止性研究について行った。NeTAの検証については、一般的に実時間性をもつプログラムの検証における計算複雑さを緩和する手法について検討を行った。NeTAは、時間オートマトンをスタックアルファベットに持つプッシュダウン計算モデルであり、到達可能性をプッシュダウンにおける到達可能性とスタックアルファベット自体の到達可能性に分解して検証する手法について検討した。[LNCS8939]高階プログラムの検証技法としては、高階関数型言語で記述されたプログラムに対して有効な二項到達可能性解析への帰着による、健全かつ相対的完全な停止性検証の手法を提案した[ESOP 2014]。高レベルプログラムの時相論理仕様検証に対して有効な構成的な検証の枠組みを提案した[CSL-LICS 2014]。この他、並行プログラムの計算モデルにおける逆計算による意味論の詳細化についても研究発表を行った。[LNCS8507]本年度は、昨年度に引き続いて実時間プログラムのモデルとしてプッシュダウンオートマトンを基礎とするNested Timed Automataの到達可能性問題に定式化、特に、時間を値として扱うためのクロック凍結機能についての研究、さらに、高階関数型言語におけるプログラム解析手法についての研究を行った。Nested Timed Automataは、実時間性を持つプログラムコードの実行をモデル化する。従来からの研究によって、クロックが停止しない場合は状態到達可能性が決定可能であることを示した。クロックの値を文脈を切り替えるタイミングで保存する機能を追加することで、クロック変数の値を保存するモデルの拡張を提案した。クロック値を保存するメカニズムをスタック操作時に限定することで、状態到達可能性が決定可能であることが示された。ここで、大域的なクロック変数を導入してクロック変数間の値代入を許す場合について、クロック変数の数が1個であれば到達可能性は決定可能、2個以上の場合は決定不能であることが示された。このことから、実時間性をもつプログラムの検証可能性についての基本的な結果が得られた。高階関数型言語におけるプログラム解析手法については、CEGAR手法を用いた安全性解析および活性検証の手法を拡張して実用的な検証手法を示した。実時間プログラムのモデルとして研究している時間オートマトンをプッシュダウンに拡張したモデルにおいて、状態の到達可能性を示すことができたのは大きな成果である。この成果から再帰構造をもつ一般的なプログラムに対して検証可能なクラスが比較的精度よくモデル化できることを示すことができた。高階の概念の取り込みについては、これらの成果をもとにプログラミング言語にとりこむ。Haskellなどの具体的なプログラミング言語に時間の概念が導入されているFunctional Reactive Programmingの概念をもとにして、検証を行う際の基礎となる。高階言語における検証については、CEGAR技法に基づいてプログラムの活性を保証する適切な型を推論する手法を示した。本年度は、前年度の引き続いて実時間プログラムの高度化モデルとしての時間プッシュダウンシステムの状態到達性に関する研究を進めた。既存研究に対してクロック凍結機能を加えて前年度までに得られたWSPDS(Well Structured Push Down System)のコーディングにもとづいて領域解析に基づく解析エンコーディングを進めた。

クロック凍結機構は、実時間プログラムの振舞いにおいて、実時間プログラムがクロックを管理する場合のモデル化として適しており、手続き呼び出しが割込みによって中断された場合に手続き呼び出し中に確保すべき時間をモデル化することができるため、より正確に実時間プログラムの振舞いをモデル化することが可能になった。このような拡張されたモデルにおいて、大域的なクロックを1個に制限すると到達可能性の決定可能性が保存され、2個以上の場合には決定性が保証されないことが示された。大域的なクロックが決定可能性について1個に制限されるという結果は、実時間プログラムの検証可能性に対する限界を示しており、高度化の理論的な限界を示している。今年度はさらに、実用的なツールのモデル化としてゾーン検証手法についての検討を進めた。ゾーン検証はより効率的に振舞いをモデル化することが期待でき、今後の実時間性を持つプログラムの検証手法として利用することが期待できる。本研究は、理論研究を基本とした実用的な検証手法の構築を目標としており、この点において基本的な結果が得られたと考えており、今後は、モデルの最適化と効率的な検証手法をさらに開発し、実用化を目指した研究を進めていく必要がある。本研究では、再帰呼び出しや割り込みなどの手続き呼び出しを持つ高レベル言語で記述された実時間プログラムの振舞いをモデル化するNested Timed Automaton(以下NeTA)を提案し、到達可能性が決定可能であることを示し、安全性検証が可能であることを示した。NeTAは、時間オートマトンをスタックアルファベットに持つプッシュダウンシステムである。さらに、時間オートマトンがスタック上にあるときにクロックを凍結する機構を導入しても、一定の条件のもとで到達可能性が保存することを示した。さらに、効率的なゾーン構成による検証手法について検討した。高階プログラミング言語に対する到達可能性と時相論理の検証についての新たな結果を得るとともに、時間オートマトンによる実時間性検証の近似的な手法についての結果を得た。本研究は、高階プログラミング言語の実時間性について検証手法について結果を得ることを目的としているが、高階プログラミング言語と実時間モデルにはそれぞれについて解決しなければならない問題が多くあり、特に実時間性については、検証の決定可能性と高階なプログラムの計算モデルの限界点が未だ明確でない。従来研究でもこの点は困難が予想されている点であり、概ね計画通りである。
救急外来を受診した慢性疾患患者の意思決定プロセスの究明

2000年1月1日より5月8日までの期間に神奈川県A救命救急センターに1次あるいは2次救急で受診した延べ5,335例の中から、慢性的健康問題を持つ成人患者を抽出し、主な健康障害の特徴別に受診前後の保健・受診行動について経過を追跡した。健康障害の特徴別に分類した受診理由で多かったものは腹部・背部痛で、その内50例が尿路結石症(疑い)の診断を受け、救急外来の受診後に泌尿器外来を受診し、受療行動を継続していた。喘鳴や呼吸困難で来院し、吸入や輸液療法を受けたのは45例あった。この事例の殆どは救急外来受診以前から気管支喘息の診断を受けており、短期間に複数回に渡って救急外来を受診している例も見られた。41例は膀胱内留置カテーテルやCAPDなどの各種ドレーンやカテーテルのトラブルで受診していた。救急外来でカテーテルの入れ替えや抜去などの処置を受けた後、定期通院中の外来を受診していた。腹痛と嘔気の症状で来院した事例の内、イレウスと診断されたり、疑われたのは35例であった。これらの殆どは腹部の手術を受けた経験を有していた。その他、高血圧症との関連が疑われた30例では、頭重感や鼻出血などの自覚症状とともに自宅で測定した血圧値の上昇が心配となって受診した事例も多かった。糖尿病に関連する健康障害で受診した22例の内、糖尿病性ケトアシドーシスを来していたのは5例のみであった。本研究の結果から、慢性疾患の急性増悪として救急外来を受診する理由は、苦痛を伴う症状の急激な発現と在宅療養上のトラブルおよび、疾病コントロールの不良に分類され、受診行動に特徴が見られた。また、患者が健康障害の発現と進行を予防するための意思決定プロセスを構成する要素が明らかとなった。平成13年度の研究実施計画に基づき、下記の項目別にまとめる1.データ収集1)神奈川県下のA大学病院救命・救急センターに、「慢性疾患の急性憎悪によって受診したと考えられる患者」の問診票から個別データリストを作成中である。2)岩手県下の受診患者リストについては、救命・救急センターに依頼中である。3)救急外来受診後に入院となった患者リストを作成中である。2.データ入力1)個別データをSPSSのデータエディターに入力中である。3.分析1)質的データの解析に使用するFact Flowの使用法について検討中である。2)判断木の作成に必要な「Answer Tree」の使用法について検討中である。4.専門的知識のレビュー1)McMaster大学とHamilton市立病院でのレビューについては、平成14年度に変更する。2)意思決定支援システムについての示唆を得るために「SASシステム」を検討している。全体概要:今度は、データ収集のための調整活動と解析法の検討ならびにデータ入力が活動の中心であった。平成14年度の研究実施計画に基づき、下記の項目別にまとめる。1.データ収集1)神奈川県下A大学病院救命・救急センターに、2000年1月より3月迄に受診したすべての患者の基本データを問診票より取り出し、データベースを作成中である。2)岩手県下B救命・救急センターでの情報収集は、収集方法について担当者と交渉中である。3)データ・ベースより、「慢性疾患の急性増悪により受診した患者」を選択中である。3.分析1)Answer Tree(SPSS社)による解析結果について検討中である。4.専門的知識のレビュー

1)McMaster大学とHamilton市立病院のレビューについては、平成15年度に順延する。全体概要:今年度は基本データの収集を続けるとともに、該当ケースについての意思決定プロセスについての解析ケースを増やす。前年度までにリストアップした2000年1月1日より5月8日までの期間に、神奈川県A救命救急センターの1次と2次救急に受診した延べ5,335例について、健康障害の特徴、受診前の通院状況、受診理由,受診後の外来受診状況を分類した。救急外来を受診した慢性的健康問題を持つ成人患者の中で、健康障害の主なものは以下の6項目であった。1.腹部・背部痛で受診し、尿路結石症(疑い)の診断を受けた50例2.気管支喘息で受診し、吸入と輸液療法を受けた45例3.膀胱内留置カテーテルやCAPDなどの各種ドレーンやカテーテルのトラブルを来した41例4.イレウスと診断されたり、疑われた35例5.高血圧症との関連が疑われた30例6.糖尿病に関連する健康障害で受診した22例以上の223例に対して、救急外来への受診前後における各診療科外来への受診状況と経過を分析した。苦痛を伴う症状が急激に発現した事例は、外来への定期受診群と通院中断群、および初回発作群に分かれた。在宅療養上のトラブルで受診した事例は、ドレーンやカテーテルの管理不備群と血糖値や血圧値の異常など疾病コントロールの不良群、および症状への心配や不安群であった。この結果をもとに、慢性疾患患者が意思決定を行うプロセスの決定木の要素を抽出した。
潰瘍性大腸炎病変部の活性化T細胞に関する研究

潰瘍性大腸員(UC)は慢性の炎症性腸疾患であるが、慢性持続型(chronic-continuous type, CC-UC)では、再燃緩解型(relapsing-remitting type, RR-UC)に比較して、難治の経過を取る場合が多い。本研究ではUCの難治例での活性化T細胞の役割を追求するために、CC-UC, RR-UC,正常対照の粘膜固有層単核細胞(LPMC)を分離し、比較検討した。flow cytometryによる解析では、UCのLPMCでは対照に比しHLA-DR陽性T細胞比率が高く、CC-UCではRR-UCに比較してHLA-DR陽性T細胞比率が更に高値を示した。CC-UCとRR-UCを経過観察し、生検組織よりLPMCを分離し検討した結果、CC-UCではHLA-DR陽性T細胞比率が持続して高値を示したのに対し、RR-UCでは緩解期のHLA-DR陽性T細胞比率には低下が認められた。mRNAの検討では、HLA-DR陽性T細胞では、IFN-γ, TNF-α, IL2R-αのmRNAの発現が高度にみられたのに対し、HLA-DR陰性T細胞ではこれらの発現がほとんどみられなかった。継代培養したLPMC由来のT細胞株を用いた検討では抗CD3抗体添加時のIFN-γ, TNF-αの産生能および大腸上皮細胞由来のHT-29細胞に対する細胞障害活性が、CC-UCではRR-UCに比べて有意に高く、CC-UCでは活性化されたT細胞が増加していうことが推測された。これらのT細胞株はHLA-DR抗原陽性であり、除去実験によりサイトカイン産生能および細胞障害活性は著明な低下を認めた。継代T細胞株の培養上清によるHT-29細胞に対するHLA-DR抗原の誘導を検討すると、CC-UCでは、対照に比しHLA-DR抗原の誘導が高率に認められた。また、CC-UCの継代培養T細胞株に対し各種薬剤(プレドニゾロン、5-アミノサリチル酸、サイクロスポリン)の影響を検討した結果、サイクロスポリンでは容量依存性に抗CD3抗体添加時のサイトカイン産生能とHT-29細胞に対する細胞障害活性の低下を認めたが、プレドニゾロンおよび5-アミノサリチル酸では抑制効果が認められなかった。潰瘍性大腸炎の粘膜T細胞の活性化の機序を探るため、T細胞レセプター可変領域遺伝子(Vβ1-Vβ20)をRT-PCR法により解析したところCC-UC、RR-UCおよび正常対照群の間にVβのレパートアについて明らかな差を認めなかった。またorgan cultureを用いた検討でIL-6, IL-8, G-CSF, TNF-αなどの炎症性サイトカイン活性がUCでは高値を示し、粘膜T細胞におけるIL-2Rなどの活性化マーカーの発現を誘導することを明らかにした。以上の結果より病変部粘膜に存在するHLA-DR陽性T細胞はpolyclonalに活性化されたT細胞であり、UCの難治化に関与していることが示唆された。

またorgan cultureを用いた検討でIL-6, IL-8, G-CSF, TNF-αなどの炎症性サイトカイン活性がUCでは高値を示し、粘膜T細胞におけるIL-2Rなどの活性化マーカーの発現を誘導することを明らかにした。以上の結果より病変部粘膜に存在するHLA-DR陽性T細胞はpolyclonalに活性化されたT細胞であり、UCの難治化に関与していることが示唆された。潰瘍性大腸炎(UC)は難治性の疾患で、病変部には大腸上皮の細胞障害に密接に関与すると考えられるIFN-γ,TNF-αなどのサイトカイン遺伝子を発現したHLA-DR陽性活性化T細胞が存在し、特に慢性持続型(chronic-continuous type,CC-UC)の症例で増加していることを明らかにした。今回その生物学的機能を調べる目的で、継代培養したLPMC由来のT細胞株を用いて抗CD3抗体添加時のサイトカイン産生能および細胞障害活性を検討したところ、CC-UC由来のT細胞株は正常対照群のみならず再燃緩解型(relapsingremitting type,RR-UC)のT細胞株と比較しても高度のIFN-γ,TNF-αの産生能を有し、大腸上皮由来のHT-29細胞に対する細胞障害活性も有意に亢進していた。さらに継代培養T細胞株に対し各種薬剤(プレドニゾロン、5-アミノサリチル酸、サイクロスポリン)の影響を検討した結果、サイクロスポリンでは容量依存性に抗CD3抗体添加時のサイトカイン産生能とHT-29細胞に対する細胞障害活性の低下を認めたが、プレドニゾロンおよび5-アミノサリチル酸では抑制効果が認められなかった。次にUCの粘膜T細胞の活性化の機序を探るため、分離直後のLPMCを用いてT細胞レセプター可変領域遺伝子(Vβ1-Vβ20)をRT-PCR法により解析した。その結果LPMCでは末梢血リンパ球に比較してVβ2,Vβ5,Vβ6,Vβ7,Vβ8,Vβ12の使用が多くみられたが、CC-UC,RR-UCおよび正常対照群の間にVβのレパートアについて明らかな差を認めず、UCの粘膜T細胞の活性化がpolyclonalに起こっていることが示唆された。またUCの腸管局所における炎症性サイトカイン産生を検討したところIL-8,G-CSF,TNF-α活性が増加し、活動期のUCのLPMCではIL-6/IL-6receptor systemの発現も亢進していた。flow cytometryによる解析でIL-6は粘膜T細胞におけるIL-2Rなどの活性化マーカーの発現を誘導することが明らかになり、これらの炎症性サイトカインが本症の病変局所での粘膜T細胞の活性化に重要な補助因子として働いている可能性が推測された。
細胞内Ca^<2+>動態制御機構の分子遺伝学的研究

BCR(B細胞抗原受容体)はB細胞に発現しており、BCRを介して細胞内プール及び細胞外からのカルシウム動員が引き起こされ、このカルシウム動員は、NF-AT活性化・アポトーシス誘導に必須の役割を担っている。私たちの研究グループでは、すてにERに存在するIP3レセプター(IP3R)がこのカルシウム動員に必須であることを、3種類のIP3Rアイソフォーム欠損B細胞を樹立することにより示したが、本研究では1種類のアイソフォームのみ発現している細胞を樹立し、それぞれの機能的差異を検討した。その結果、タイプ2IP3Rが持続的カルシウムオシレーション発生に重要であることを明らかにした。また、SHIP欠損細胞を樹立することにより、IP3のみならず、PI-3キナーゼによってBCR刺激依存性に産出されるPIP3が、ER内のカルシウムストアーを、より枯渇さすことによりカルシウム動員に関与していることを明らかにした。またPIP3のターゲット分子はチロシンキナーゼBtkであり、BtkのPHドメインにPIP3が結合することにより、Btkが膜分画にリクルートされ活性化されることが、ERカルシウムストアーを枯渇させるのに重要であることが判明した。
香粧品に配合する防腐剤から遊離するホルムアルデヒドの挙動と健康リスクに関する研究

イミダゾリジニルウレアの分解により遊離するホルムアルデヒド(FA)の挙動について調査を行った。イミダゾリジニルウレアの分解により遊離するFA量は溶解液の温度およびpHに大きく依存しており、溶解液のpHがアルカリ性になるほど遊離するFA量は著しく増加した。ジアゾリジニルウレアは香粧品中では検出されず、通常は少なくとも2種類の分解物として存在していた。クオタニウム-15が配合された化粧品は、本体に加え、分解により遊離したFA及びFA以外の分解物も殺菌作用に寄与しており、結果として防腐効果が長期間ほぼ一定に保たれていた。ホルムアルデヒド(FA)ドナー型防腐剤から遊離するFAの挙動に関する研究は、国内外でもほとんど行われておらず、当該化合物の速度論的な分解や分析法に関する報告が散見されるのみである。今年度は、我が国および欧米で使用される主なドナー型防腐剤を対象とし、分解等により遊離するFAの挙動について、詳細な検討を行った。1.我が国で使用が認められているドナー型防腐剤であるイミダゾリジニルウレア(IU)に関する検討IUの分解により遊離するFAは、溶解液のpH及び温度に大きく影響された。pHがアルカリ側になるほど遊離するFA含量は著しく増加した。pH6のリン酸緩衝液で調製した0.3%溶液を60°Cの水浴中で放置したとき、10分後に溶液中のFA濃度は約140ppmに達した。IUを添加したローション、ジェル、コンディショナーのモデル処方を作製し、25°Cの恒温庫中で30日間保存したところ、多くのモデル処方では、遊離FA濃度の経日的な増加が認められた。しかし、尿素が配合されている処方では、2日目以降、遊離FA濃度の減少が確認された。尿素が配合されている市販化粧品にIUを添加した場合も同様の現象が認められた。2.欧米での使用頻度が高いドナー型防腐剤であるジアゾリジニルウレア(DU)に関する検討緩衝液およびモデル化粧品中での、DUの分解挙動並びにFAの遊離について検討を行った。リン酸緩衝液中でのFA遊離はpH依存的であった。DUを添加したモデル化粧品(化粧水、ジェル、コンディショナー)を作成し、FA遊離濃度の経時変化を調べたところ、化粧品の種類により遊離するFA濃度が大きく異なった。ホルムアルデヒド(FA)ドナー型防腐剤は、接触性皮膚炎を引き起こすことが示唆されているが、活性本体については、不明である。これまでの我々の検討から、ドナー型防腐剤は、水系の溶解液中で速やかに分解し、FAを遊離することが示されている。ドナー型防腐剤の分解挙動を解明し、分解物の活性について検討することは、極めて重要である。今年度は、欧米で使用される主なドナー型防腐剤を対象とし、遊離するFAの挙動および分解物について、詳細な検討を行った。1)クオタニウム-15(QN)の分解と遊離するFAの挙動に関する検討QNが配合された化粧品中におけるFAおよびQN含量を測定した。全ての化粧品からFAが検出され、その濃度は、106.4493.5ppmであった。一方QNは、全ての化粧品から検出されなかった。QNの分解に伴うFAの遊離について検討した。0.3w/v%水溶液を調製し、25°Cの恒温庫で50日間保存したところ、FA含量は350ppmに達した。一方QN含量は経時的に減少し、保存50日後には、検出限界以下になった。HPLCによる分析から、FA以外のQN分解物が保存溶液中に存在し、その含量が経時的に増加することが確認された。2)ジアゾリジニルウレア(DU)の分解物の単離と構造決定に関する検討化粧品中におけるDUの分解挙動について検討したところ、4種類の分解物の存在が明らかとなった。LC-MSおよび1H-NMRによる解析から、合計で90%以上のピーク面積を占める2本については(4-hydoroxymethyl-2,5-dioxo-imidazolidine-4-yl)-urea(MW188)および(3,4-bis-hydoroxymethyl-2,5-dioxo-imidazolidine-4-yl)-urea(MW218)であることが明らかとなった。これまでの検討から、ホルムアルデヒド(FA)ドナー型防腐剤は、水系の溶液中で速やかに分解し、分解物として存在することが明らかとなった。今年度は、クオタニウム-15(QN-15)の分解物を対象とし、抗菌活性について検討を行った。

また、DMDMヒダントイン及びその分解物を対象とし分析法を開発した。1)QN-15及び分解の抗菌活性に関する検討QN-15及びその分解物の好気性細菌に対する抗菌活性について検討した。QN-15が配合された化粧品中におけるホルムアルデヒド(FA)及びQN-15含量を測定したところ、106493ppmに相当するFAが検出された。QN-15は、全ての化粧品から検出されなかった。各化粧品を対象とし、好気性細菌に対する殺菌活性を検討したところ、いずれの試料にも殺菌効果が認められ、FAが重要な役割をはたしていることが示された。また、FA以外の分解物の殺菌作用についても調査し、FA以外の分解物も殺菌効果を有することを明らかにした。さらに、QN-15本体の殺菌作用についても検討し、同様の殺菌効果を示すことを見出した。今年度における検討よりQN-15が配合された化粧品は、QN-15本体に加え、分解により遊離したFA及びFA以外の分解物も殺菌作用に寄与しており、結果として防腐効果が長期間ほぼ一定に保たれていることが明らかとなった。2)DMDMヒダントイン及びその分解物の分析法に関する検討我が国でも使用可能なドナー防腐剤のひとつであるDMDMヒダントイン及びその分解物を対象とし、HPLCによる分析法を開発した。また、市販の化粧品中における含有量の実態調査を行った。平成23年度までに、予定されていた全てのホルムアルデヒド(FA)ドナー型防腐剤を対象として、遊離するFAの挙動に関する検討を行うことができた。さらに、幾つかの防腐剤については分解物を同定することができた。24年度が最終年度であるため、記入しない。本年度は、3年計画のまとめとして、ホルムアルデヒド(FA)ドナー型防腐剤が配合された香粧品の健康リスク評価を試みる。
低人口増加率を維持するヒト個体群の長期間の生存機構の解明

本研究では、ヒトの人口再生産の基本単位となる個体群が環境条件との交互作用の中で、世代を越えて生存し続ける機構を明らかにするために、人口が変化し、かつ再生産力に個人差の大きいことを加味したモデルを構築した。また、現生の小集団(パプアニューギニア・ギデラ族)における、人口学的パラメータ、マラリア感染リスク、及び遺伝子頻度のデータを、モデルに適用できるように整理した。具体的には、3つの基本モデルを統合してギデラ族のデータに適用した。第1のモデルは個人の出生力の多様性の検討のためのもので、30世代を経て自己の遺伝子が存続した親は200人中平均26.5人となり、遺伝子の存続は遺伝子プールで考える場合よりも遥かにしにくいことが明らかとなった。第2のモデルは婚姻規制の影響の検討のためのもので、2つの同規模のクランに同数の男女がいるような人口400人の集団で、300年後には一夫多妻婚の場合の方が一夫一妻婚の場合よりも遺伝子多様度の期待値は小さくなることが明らかとなった。第3のモデルは、安定人口モデルに感染症の効果を組み込むことで、ヒト個体群の長期間の生存を包括的に検討することを試みたものである。初期人口1,000人が感染症罹患率の低い内陸部に住み、ある臨界人口を超えると感染症罹患率の高い周辺部に移住が起こるとし、感染症罹患によって死亡率が上昇すると仮定し、上昇度のパラメータを何通りかに変化させたところ、感染症罹患による死亡率上昇度が1%より低くない限り、感染症罹患率の低い地域と高い地域では遺伝子プールの構成が異なる可能性があることを明らかにした。すなわち、内陸部とそれ以外の周辺部の間でいくつかの遺伝子座についてみられる遺伝的構成の違いが、地域間のアラリア流行度の違いに関連している可能性を示すことができた。これらをさらに一般化させ、先史集団を含むヒト個体群の生存機構のモデルに関する成果を論文として公表する。シミュレーションモデルを用いたアプローチによってヒト個体群の長期間の生存機構を解明するために、平成5年度は、(1)パプアニューギニアの低地に居住するギデラと呼ばれる人々について既に20年以上にわたって蓄積されてきたデータの整理、(2)長期間の人口変動を環境と遺伝的要素を考慮してシミュレートするモデルのプロトタイプの開発といくつかのパラメータについての検討、の2点を行った。(1)としては、まず、(ア)系譜人口学の方法で得たデータを用いて個人の人口再生産数の分布、粗出生率、粗死亡率等の人口学的パラメータを推計し、次に、ギデラの居住地が環境条件から4つの村落群に大別できることから、(イ)居住者の血清を用いて抗マラリア抗体価を測定した結果からマラリア感染リスクを村落群別に推定し、(ウ)HLAをはじめとする遺伝特性のデータに基づいて村落群別の遺伝子頻度を推定した。(2)としては、(ア)居住地の中で環境収容力や淘汰圧が異なる地域間で人口増加に伴って人口が移動するモデル、(イ)婚姻関係を考慮した2倍体個体の世代間の遺伝子伝達モデルで生殖モデルとして個体の人口再生産数分布を用いたもの、の二つを構築し、シミュレーションプログラムをC言語で記述した。これは部分的には、分担者の中澤が代表者となっている奨励研究(A)と重なっているが、ギデラのデータに適用するために改変し、本助成金で購入したUNIXワークステーション上で、いくつかのパラメータについて試行した。本格的な運用は平成6年度に行う予定である。

:シミュレーションモデルを用いたアプローチによってヒト個体群の長期間の生存機構を解明するために、平成6年度は、まず婚姻規制の遺伝子伝達への効果を検証するモデルを構築した。一夫一妻と一夫多妻、クラン外婚制の有無、夫婦の年齢差の程度、といった婚姻規制のレベルをさまざまに設定することによって、小集団での婚姻成功確率が変化し、再生産力に違いがあらわれ、結果として遺伝的構成に違いが出てくることを明らかにした。総体としてみれば、婚姻規制が厳しいほど出生力の平均は低下しながらも分散は大きくなるが、それだけでは遺伝的多様性の維持への影響が小さいことを明らかにした。また、一夫多妻が許されると遺伝的多様性は失われやすくなることも明らかとなった。次いで、このモデルと、前年度に構築した二つのモデルを組み合わせることによって、パプアニューギニアの低地に居住するギデラと呼ばれる個体群について適用するための総合モデルを作成した。ギデラについての人口学・遺伝学的なデータがとれている項目はモデル上でその値を固定し、データのない項目についてはパラメータを何通りにも変えて条件検討を行った。この統合モデルはC言語で記述し、本研究助成金で購入したUNIXワークステーション上で運用した。その結果、既に分析済みのマラリアによる淘汰圧の地域差が数百年間変わらなかったと仮定し、マラリア罹患率の低い中央部からマラリア罹患率の高い周辺部への過去における移住の開始時期、さらには地域差を含む集団全体としての現実の遺伝特性がモデル上で成立する可能性を明らかとし、一般化させるための検討を行った。
クラゲを模倣したイセエビ・セミエビ類フィロゾーマ幼生の人工餌料開発

本研究では、クラゲ類などのゼラチン質動物プランクトンを食べて生活するイセエビ・セミエビ類幼生の摂餌生態にヒントを得て、クラゲ類を模倣した人工餌料の開発を試みた。原料としたクラゲ類や粘結剤の種類および濃度が異なる複数種類のゲルを作製した。これらのゲルをセミエビ科の一種であるウチワエビの幼生に与えてみた結果、幼生はいくつかのゲルを捕捉して口器に運び、大顎を左右に動かして咀嚼する行動を示した。さらに摂餌後に、幼生の中腸腺上皮細胞が中腸腺腔内を活発に流れる様子や肛門から糞粒が排泄される様子も観察された。天然海域において,水産有用甲殻類であるイセエビ・セミエビ類の浮遊幼生(フィロゾーマ)はクラゲなどのゼラチン質動物プランクトンを餌として利用していると考えられている。本研究の目的は,フィロゾーマの効率的な成長を促す「クラゲ様人工餌料」の開発を目指し,フィロゾーマの栄養生態学的知見を得ることである。クラゲ成分や粘結剤の濃度が異なる複数種類のゲルを作製し,それらをフィロゾーマ飼育のためのクラゲ様人工餌料とした。クラゲを与えて飼育し3回の脱皮を経て成長した中期フィロゾーマに,同人工餌料を与えて摂餌行動を観察した結果,フィロゾーマが一部の人工餌料を捕捉して口器に運び,大顎を左右に動かして咀嚼する行動を確認した。さらに,摂餌後に中腸腺上皮細胞が中腸腺腔内を活発に流れる様子や肛門から糞粒が排泄される様子も観察した。一連の摂餌行動をデジタルビデオカメラで撮影・解析した結果,中期フィロゾーマが人工餌料を捕捉し口器に運んでから最初の糞粒排泄を確認するまでの時間は約30分であり,消化に要する時間はクラゲを摂餌した場合とほぼ同じであることを確認した。本研究では甲殻類幼生の飼育に最適な人工餌開発のための基礎を確立することを目的としている。本年度はクラゲを材料に用いた人工餌料,およびクラゲを用いないがクラゲのように柔らかい性質(クラゲ様)の人工餌料の作製に取り組み,複数のプロトタイプを準備できた。このうち,数タイプの人工餌料について,ウチワエビ類の幼生が摂餌し,体内に取り込むことを確認した。脆弱な浮遊生物を長期的に飼育するのは難しいが,本研究において水流を工夫した水槽と水質維持の方法を工夫した浄化設備を組み合わせることで,浮遊生物を長期間維持できるようになった。この水槽を用いてウチワエビ類の幼生を飼育したところ,孵化直後から変態まで同一水槽で飼育できること,従来要した半分以下のコストで維持できることが分かった。ウチワエビ類の増養殖を商業化するには,一度に大量の水槽を省力的に維持する必要がある。今回の成果はそれを実現するための一歩となった。オーストラリアのカーティン大学との共同研究により,ウチワエビ属(Ibacus)だけではなくウチワエビモドキ属(Thenus)の幼生もクラゲだけを摂食して稚エビにまで成長することが確認された。ウチワエビモドキ属のエビはオーストラリアや東南アジアにおいて高価な水産資源として重宝されている。しかし,近年の乱獲などの影響により,漁獲量や個体サイズが極端に減少していることから,クラゲまたはクラゲ様の人工餌料を用いたウチワエビモドキ属の増養殖も期待される。ウチワエビ類幼生の人工餌料の原型を準備できた。幼生を効率的に維持する水槽も開発した。さらに,クラゲを用いた増養殖が実現する可能性はウチワエビ,オオバウチワエビ,およびウチワエビモドキの3種に広がった。したがって,本研究は計画当初の予定どおり進んでいる。本研究では甲殻類幼生の飼育に最適な人工餌料開発のための基礎を確立することを目的としている。最終年度は、幼生が体内に取り込むことのできた人工餌料を用いて幼生の継続的な飼育に取り組んだ。孵化直後の幼生に人工餌料を与えたところ、幼生は餌料を食べ続けることが繰り返し観察されたものの、脱皮をして成長するまでの確認には至らなかった。クラゲ類を継続的に確保できなかったこと、所属が変わり新しく立ち上げた水槽で健全な孵化幼生を得るのに苦労したことなどが原因であると考えている。長期飼育に関する試験は今後も継続する。また、本年度は形や粘度の異なる人工餌料を作製し、幼生による摂餌の有無を試験した。幼生は平面ではなく必ず角から摂餌を開始した。

角のない球状の人工餌料を摂餌するのには特に長い時間を要したことから、球状の人工餌料は適していないと言える。さらに、水中を浮遊しない餌料への遭遇率は極端に低下したことから、人工餌料が幼生と同じ空間を浮遊できるように形と密度を工夫する必要があることが分かった。これらの成果は、過去に行った生きたゼラチン質動物プランクトンを用いた実験の結果に概ね一致した。人工餌料の原料となるクラゲ類の調査中に、クラゲ類を含む様々なゼラチン質動物プランクトンを利用しながら浮遊するセミエビ類の幼生を観察する機会に恵まれた。観察された複数種のうち、エクボヒメセミエビに関する成果を論文として公表した。クラゲを材料に複数種類の人工餌料を作製し,さらにその一部をウチワエビ類のフィロゾーマが捕食できることを確認した。初年度に計画されていたこれらの課題を達成できたので,おおむね順調に進展していると言える。現在までにウチワエビ類幼生が摂食することを観察できた人工餌料を用いて,幼生の孵化直後から稚エビに至るまでの飼育を試みる。クラゲを与えた場合の幼生の成長・生残と比較することで,人工餌料の質的改善に向けた対応策が見えてくると期待される。農学初年度に作製した複数のクラゲ様人工餌料を用いて,ウチワエビ類フィロゾーマの継続的飼育を試みる。さらに,同人工餌料またはクラゲを摂餌するフィロゾーマの成長と比較し,フィロゾーマの成長における人工餌料の有効性を評価する。2016年5月に開催予定の国際シンポジウム(5th International Jellyfish Bloom Symposium)への参加計画を立てたが,開催時期の都合により,参加登録は年度内に,航空券は次年度に購入することになった。そのため,航空券購入に必要な金額を次年度に繰り越すことにした。繰り越し分は2015年度に計画した国際シンポジウム参加のための渡航費として,2016年の交付金は当該年度に行う人工餌料の作製および給餌に関する実験に全額使用する。
新奇青色光センサー、光活性化アデニル酸シクラーゼの光活性化と細胞機能光制御の機構

研究代表者らが発見したミドリムシの光行動の光センサー、光活性化アデニル酸シクラーゼ(PAC)はフラビンを結合する光感受ドメインとcAMPを生成する酵素活性ドメインを持っていて青色光で活性化されるユニークなタンパク質であり世界的に注目されている(Iseki et al.2002 Nature)。光活性化アデニル酸シクラーゼの進化的起源に関する系統解析により、光活性化アデニル酸シクラーゼは二次共生による葉緑体獲得時あるいはそれ以降に出現したと推測された(Koumura eta1.2004Photochem Photobiol Sci))。光活性化アデニル酸シクラーゼの光活性化に関する精製標品実験により、その光量依存性や数十ミリ秒オーダーのパルス光応答性を明らかにし、ミドリムシの光応答行動を説明するに足るものであることを示した(Yoshikawa eta1.2005 Photochem Photobiol Sci)。光活性化アデニル酸シクラーゼの光感受ドメインの光化学変化の速度論実験により、光感度・量子収率・暗回復半減期を解析した(Ito et al.2005 Photochem Photobiol Sci)。光活性化アデニル酸シクラーゼを細胞工学的に任意の細胞に導入し光条件を変えることで,細胞内のcAMP濃度を人為的に変化させ,各種の生命活動をコントロールする「細胞機能光スイッチ」として応用できることを実証するために、ドイツグループと共同研究を行い、その成果として、アフリカツメガエル卵母細胞やヒト培養細胞さらにはショウジョウバエ個体において機能をもった発現や行動の光制御の実現を世界で初めて報告した(Schroeder-Lang et al.2007 Nature Methods)。単細胞鞭毛藻ミドリムシ(Euglena gracilis)の光運動反応は紫外青色域にピークを持ちフラビンの吸収スペクトルによく対応する作用スペクトルを示す。近年、我々はこの青色光感覚を司るフラビン蛋白質を、ミドリムシの鞭毛基部のPFB(paraflagellar body)と呼ばれる構造から精製・同定した。このフラビンタンパク質(光活性化アデニル酸シクラーゼ;PAC)は分子量約40万で、大小2種類のサブユニットからなるヘテロ四量体であり、各サブユニットにはFAD結合領域と、アデニル酸シクラーゼの触媒領域がに交互に2箇所ずつ含まれている。このフラビンタンパク質のアデニル酸シクラーゼ活性は青色光照射により劇的に上昇する(Iseki et al.2002,Nature)。今年度は、4年計画の第1年度であるので、光処理に対する酵素活性の応答の解析や発色団-アポ蛋白質相互作用の分光学的解析のために、十分な量のサンプルを調製する方法の確立を目指した。種々の方法を試みた結果、FAD結合領域を大腸菌において発現させ、可溶性画分として精製し、吸収スペクトルの測定できる濃度を得ることに成功し,このサンプルについての分光学的解析に着手した。単細胞微細藻類のミドリムシは光合成に適した光環境に集まったり、強すぎる光から逃避する性質がある。我々はこのような反応を司る光センサーの実体として、青色光で活性化されるアデニル酸シクラーゼを発見している(Iseki et al.2002,Nature 415,1047-1051)。アデニル酸シクラーゼは、多くの生物の細胞内情報伝達系において重要な役割を果たす環状アデノシン一リン酸(cAMP)を産生する酵素であるが、このような、自身が光センサーとして機能するアデニル酸シクラーゼは従来全く知られておらず、極めてユニークな分子と言ってよい。我々はこれを光活性化アデニル酸シクラーゼ(PAC)と名付けている。〔PACの進化的由来〕では、ミドリムシはこのユニークな光センサーをどのように獲得してきたのだろうか?我々は、数種類のミドリムシ近縁生物からPAC類似タンパク質をコードするcDNAを検出し、得られた配列のアデニル酸シクラーゼ触媒領域について系統解析を行った。

その結果、PACは二次共生による葉緑体獲得時あるいはそれ以降に出現したものと推測された(Koumura et al.2004,Photochem.Photobiol.Sci.3,580-586)。〔PACの光活性化〕また、我々は、PACの光活性化の基本的な性質を明らかにするため、精製したPACのアデニル酸シクラーゼ活性に及ぼす光の効果を詳細に調べ、PACは光量依存的に活性化されること、PACの活性変化は数十ミリ秒オーダーのパルス光刺激に追従可能であること、等を明らかにした。これらの性質はミドリムシの光応答現象を説明するに足るものであり、また、将来、細胞工学的応用を考えるうえでの重要な基礎データでもある(Yoshikawa et al.2005,Photochem.Phobobiol.Sci. in press)。真核単細胞鞭毛藻ミドリムシの光運動反応を司るユニークな生体青色光センサー分子「光活性化アデニル酸シクラーゼ(PAC)」の青色光信号捕獲領域であるフラビン結合ドメインの光化学的変化を反応速度論的に解析した:PACはαとβの2種類のサブユニットから成り、それぞれがフラビン結合ドメイン(F)と酵素活性ドメイン(C)が交互に配列したF1-C1-F2-C2の構造をもつ。青色光信号の照射によって引き起こされるFドメインの吸収スペクトルの長波長シフトとその暗黒下における回復の過程(光反応サイクル)に着目し、αとβの2つのサブユニット由来のFドメインサンプルについて詳細に比較検討を行った結果、αとβの2つのサブユニットのF2ドメインの光感度や量子収率、さらに暗回復の半減期が大きく異なり、その間の機能分化が示唆された(後者は光感度・量子収率とも前者より1桁ほど低く、また半減期は1桁ほど短かった)。これらの結果と分子系統解析の結果を総合して考察すると、αF2とβF2は、その起源は相当異なり、またその機能は前者は弱光の比較的ゆっくりした感受、後者は強光の比較的素早い感受を受け持っていることが示唆された。(Ito et al. 2005,Photochem, Photobiol.Sci,4,762-9)ミドリムシの光行動の光センサーPACは光感受ドメインとcAMPを生成する酵素活性ドメインを持っていて青色光で活性化されるので、PACを細胞工学的に任意の細胞に導入すれば,光条件を変えることで,細胞内のcAMP濃度を人為的に変化させ,各種の生命活動をコントロールする「細胞機能光スイッチ」として応用できよう。動物の中枢シナプスでは伝達調節機構として細胞内cAMPが重要な役割をはたすので、アメフラシ側神経節内の感覚ニューロンを用い、cAMPを細胞内注入すると活動電位の高さの減少と幅の増大が見られるが、PACを細胞内注入後、または遺伝子導入により発現させた後、青色光を照射しても同様の形状変化が見られた。さらに、ドイツグループとの5年にわたる共同研究の成果として、アフリカツメガエル卵母細胞やヒト培養細胞さらにはショウジョウバエ個体においてこのような機能発現や行動の光制御の実現例を報告した。