hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
低周波域における音波の音速・吸収の精密測定

低周波断熱圧縮率測定法は、二成分臨界溶液、液晶等の数KHz以下の動的物性の研究に、極めて有効であるが、その応用範囲を、生体高分子溶液等に広げるには、高精度化が是非必要である。そこで、高精度化を目指し、圧電積層体、並びに、電力増幅器を使用することにより、励振体積変動振幅は、従来に比べて、2桁から3桁大きくなり、S/Nは、相当向上した。又、電極部分を試料と接しない構造としたことにより、従来測定が困難であった水溶液系等、電気伝導度の高い系に対しても、適用が可能となった。励振体積変動振幅の増大に伴ない、圧力センサーからの出力電圧が増し、これまで用いてきたロックインアンプによるアナログ処理にかわって、ディジタル処理が可能となった。低周波においては、位相角測定そのものが、時間遅れ測定に対して不利である。すなわち、低周波では、位相角遅れとしては小さくても、時間遅れとしては、十分大きく、トランジェントレコーダーを利用して、時間遅れをディジタル的に算出する方が高精度の測定が可能となる。具体的には、参照信号出力信号を、それぞれ、十分なクロックスピードで、ディジタルサンプリングし、その信号に対して、それぞれA sin wt+B cos wtの形の関数の最適あてはめを、G ram-S chmitの直交化法により行ない、振幅比、位相遅れを、それぞれ算出するわけである。又、ディジタル処理が可能となったことにより、従来の周波数ドメインでの測定のみならず、時間ドメインでの測定も可能となった。このような測定法が可能であるのは、本方法が非共振法であることによっている。ステップ的な励起に対する応答に、フーリエ変換を施すことにより、周波数スペクトルを得ることができるようになった。上記のディジタル処理により、複素断熱圧縮率の実部・虚部の精密な測定が可能となった。
底曳網の選択性パラメータにおける変動要因と資源管理におけるリスク評価

SSR1型着底トロールによる資源調査のデータから、東シナ海における規制目合に該当する目合内径54mmのコッドエンドによる選択性曲線パラメータを、魚類20種(ハモ,カゴシマニギス,ニギス,マエソ,クロエソ,マトウダイ,アカムツ,キントキダイ,アカアマダイ,マアジ,マルアジ,カイワリ,キダイ,シログチ,イボダイ,タチウオ,ゴマサバ,マサバ,メイタガレイ,サラサハギ)および頭足類2種(ケンサキイカとスルメイカ)について推定し、最小成熟体長や初回産卵体長と比較して,単一の目合による網目規制による資源保全の有効性を検討した論文を、英文誌で公表することができた。駿河湾では深海性の生物を対象に行われている小型機船底曳網漁業(駆け廻し式)について、静岡県戸田漁協所属の小型底曳網船を傭船し,コッドエンドにより細かなカバーネットを取り付けた試験を行うことで,この漁業でが主な漁獲対象としているアオメエソChlorophthalmus albatrossisに対する現状の目合(目合内径25.3 mm)に対して、拡大した目合内径31.9 mm(呼称目合10節)の網目選択性を求めた。そして,現在使われているコッドエンド(目合内径25.3 mm)から目合内径31.9 mmを拡大した場合のアオメエソの加入当たりの漁獲量,水揚げ量(YPR),投棄量を試算し,コッドエンドの目合拡大による水揚げ量の変化および投棄量の削減効果を検討した。その結果、目合拡大によって、漁獲死亡係数が高い場合ほど、アオメエソの水揚げ量を減らすことなく投棄量を削減でき、また加入あたりの水揚げ量の増加が見込めるなど、自然死亡係数と漁獲死亡係数の影響を評価することができた。底曳網の資源管理における重要な方策のひとつとして,コッドエンド(袋網後端部)の網目選択性がしばしば用いられる。これは網目の大きさ(目合)を規制することで,小型の魚を逃がして,漁獲する魚の大きさを制御することを想定している。連携研究者が所属する西海区水産研究所が2004年以降に行ったSSR1型着底トロールによる資源調査(カバーネット(目合18mmあるいは目合10.3mm)が装着されたコッドエンド(目合内径54mm,東シナ海における規制目合に該当)のデータから,コッドエンドとカバーネットの体長組成を求めた。特に,全数が測定された操業回を抜き出し合算して,コッドエンドの選択性曲線をロジスティック式で表し,そのパラメータを推定誤差とともに最尤推定した。魚類20種(ハモ,カゴシマニギス,ニギス,マエソ,クロエソ,マトウダイ,アカムツ,キントキダイ,アカアマダイ,マアジ,マルアジ,カイワリ,キダイ,シログチ,イボダイ,タチウオ,ゴマサバ,マサバ,メイタガレイ,サラサハギ)および頭足類2種(ケンサキイカとスルメイカ)の選択性を求めることができた。得られた選択性パラメータ(50%選択体長l50と選択レンジS.R.)と魚体型の関係を検討した。さらに,95%選択体長(ほぼコッドエンドの網目を抜けない体長)を,最小成熟体長や初回産卵体長と比較して,単一の目合による網目規制による資源保全の有効性を検討した。また,マアジとカイワリ,スルメイカ,ヤリイカについて曳網ごとの選択性曲線を求めた。そのほか,東京海洋大学練習船海鷹丸がズボン式網を用いて東シナ海の大陸斜面水深200m付近において行ったトロール調査結果から,深海性の底魚であるカゴシマニギス,ニギス,トンガリヒゲ,キュウシュウヒゲ,ヤリヒゲ,ギンメダイ,ユメカサゴ,スミクイウオ,ワキヤハタに対する網目選択性曲線の推定を行った。当初の予定通り,東シナ海において代表的な漁獲対象種のコッドエンド選択性を求めることができ,複数種の資源保全に対する単一の目合による網目規制の有効性について検討することができた。成果を日本水産学会平成29年度春季大会においてポスター発表を行ったものの,投稿にまでは至らなかった。また,曳網間変動を検討する対象種についても曳網毎の選択性曲線の推定を開始したものの,具体的な検討にまでは至っていない。しかしながら,これまで求められていない大陸斜面水深200m付近に生息する深海性の底魚についてコッドエンド選択性を推定できた点は,想定以上の成果である。したがって,おおむね順調にしていると判断した。東シナ海における底曳網選択性パラメータにおける曳網間変動を,マアジ,カイワリ,スルメイカ,ケンサキイカについて求め、変動への影響要因としてコッドエンド内での漁獲量や対象種の標本個体数,コッドエンドとカバーネットの標本抽出率比等を取り上げ,魚種ごとにパラメータ推定値や推定誤差に及ぼす影響を検討した。安定したパラメータを得るためにはある程度の標本数が必要であり,特に標本抽出率比は従来指摘されているほどの大きな影響はなかった。むしろ標本体長組成の範囲が選択レンジをカバーする割合を要因として挙げることができた。選択性パラメータの推定時に,ブートストラップ法を導入することで,選択性パラメータの変動を調べるとともに,調査対象となった資源の体長組成をその推定誤差とともに求める方法を整備した。すでに得られたパラメータの誤差からシミュレーションによって同様な計算も可能である。これを拡張することによって,選択性パラメータの変動が,投棄魚を削減しようとする目標において,投棄量の削減値に及ぼす影響を検討することができる。

この投棄量削減の目標を検討する漁業として駿河湾における小型機戦底曳網漁業(かけ回し式)の投棄実態を調査し、特に,コッドエンドの目合拡大の制約条件でもある小型種のアオメエソとヒゲナガエビの投棄と水揚げの体長組成のデータを得た。初年度における成果として,東シナ海において代表的な漁獲対象種(魚類20種,頭足類2種)について、コッドエンドの網目選択性曲線パラメータと魚体形状との関係を検討し,最小成熟体長などの成熟パラメータとの比較から単一目合による資源管理では資源保全が困難であることを示した英文論文原稿を投稿した。また,東シナ海陸棚斜面域に生息するニギス,ユメカサゴ,スミクイウオ,ワキヤハタに対する底曳網コッドエンド選択性についても取りまとめて,日本水産学会春季大会で発表した。当初の予定通り,コッドエンド網目選択性パラメータとその誤差を曳網ごとに推定することができ,変動要因を分析することができた。また,パラメータの変動が及ぼす管理目標別のリスク評価として,資源体長組成の推定誤差への影響を検討手法を整備することができた。さらに,初年度の成果をとりまとめた論文を投稿すること,および予定していた学会での発表を行うことができた。このことから,予定通りに研究は進捗して,成果の公表も実施できており、おおむね順調に進展していると判断した。SSR1型着底トロールによる資源調査のデータから、東シナ海における規制目合に該当する目合内径54mmのコッドエンドによる選択性曲線パラメータを、魚類20種(ハモ,カゴシマニギス,ニギス,マエソ,クロエソ,マトウダイ,アカムツ,キントキダイ,アカアマダイ,マアジ,マルアジ,カイワリ,キダイ,シログチ,イボダイ,タチウオ,ゴマサバ,マサバ,メイタガレイ,サラサハギ)および頭足類2種(ケンサキイカとスルメイカ)について推定し、最小成熟体長や初回産卵体長と比較して,単一の目合による網目規制による資源保全の有効性を検討した論文を、英文誌で公表することができた。駿河湾では深海性の生物を対象に行われている小型機船底曳網漁業(駆け廻し式)について、静岡県戸田漁協所属の小型底曳網船を傭船し,コッドエンドにより細かなカバーネットを取り付けた試験を行うことで,この漁業でが主な漁獲対象としているアオメエソChlorophthalmus albatrossisに対する現状の目合(目合内径25.3 mm)に対して、拡大した目合内径31.9 mm(呼称目合10節)の網目選択性を求めた。そして,現在使われているコッドエンド(目合内径25.3 mm)から目合内径31.9 mmを拡大した場合のアオメエソの加入当たりの漁獲量,水揚げ量(YPR),投棄量を試算し,コッドエンドの目合拡大による水揚げ量の変化および投棄量の削減効果を検討した。その結果、目合拡大によって、漁獲死亡係数が高い場合ほど、アオメエソの水揚げ量を減らすことなく投棄量を削減でき、また加入あたりの水揚げ量の増加が見込めるなど、自然死亡係数と漁獲死亡係数の影響を評価することができた。昨年度成果をとりまとめた論文原稿の投稿に努める。当初の予定通り,コッドエンドの網目選択性の曳網毎の推定結果を整理して,曳網間の変動について分析に取り組む。また,深海性底魚類に対する選択性についてとりまとめて,学会などでの公表を行う。選択性パラメータの変動に及ぼす影響要因を論文にとりまとめていくとともに,こうした選択性パラメータを推定する調査手法において,パラメータ推定値の変動を抑制するための調査方法の改善策を検討する。
事業・政策に対する認識の動態と負担の受容過程についての研究：社会的要因に着目して

本研究は、スリランカの高速道路事業における用地取得・住民移転を題材に、市民の負担受容に関する調査と分析を行うものである。具体的には、(a)移転住民の認識の変化と、それに影響を与える社会的要因を明らかにするとともに、(b)地理情報やフィールド実験を取り入れた調査を実施し、事業や負担に対する認識の決定要因についての考察を行う。本研究の対象地域であるスリランカでは、現在高速道路の建設が盛んにおこなわれており、特に開通から数年を経た南部高速道路・開通間際あるいは直後のコロンボ外環高速道路・計画中の北部高速道路が同時に存在しており、複数のフェーズにおける道路建設や、それに伴う移転に対する住民の認識を同時に観察できる好機を迎えている。本年度は、前年度に実施した、(a)南部高速道路事業について、研究代表者が2016年23月に実施した調査の内容と対象を拡充した調査、および、(b)中部高速道路事業の移転世帯に対して実施した調査の分析を行うとともに、その結果に関する(d)フォローアップ調査を12月に実施した。(a)(b)の調査をもとに、移転対象住民のリスク認識を高めておくことが移転後の生活再建にとって重要であると考えられる項目を選定したうえで、(c)(d)の調査では住民移転が進行中の中央高速道路事業の移転対象住民に対してシナリオを用いたフィールド実験を設計・実施した。過去の事業における他者の移転の経験が、これから移転する住民の事業や移転に対する認識の変化をもたらすかを確認したところ、一部の住民について認識の変化がもたらされることが確認された一方で、そうした変化や他者の経験が有用だと答える傾向は、経済水準の低い層において特にみられることが明らかとなった。次年度は分析結果の口頭発表が予定されているほか、論文としての公表を進めるとともに、1度のフィールド調査を実施する予定である。本研究の目的に掲げた二つの課題、(a)移転住民の認識の変化と、それに影響を与える社会的要因を明らかにすること、及び、(b)地理情報やフィールド実験を取り入れた調査を実施し、事業や負担に対する認識の決定要因についての考察を行うこと、のそれぞれについて、重複はするものの、それぞれ2年間、また、各年度において、調査結果の解析と、次の調査の準備、実施を行う計画となっている。ただし前半二年間のうちの1年目にあたる昨年度は、中部高速道路事業の用地取得・住民移転が進展しつつあることから、当該事業における移転予定世帯に対する調査を早期に実施しておくことが研究目的を達するために重要であると判断し、南部高速道路事業における移転世帯への調査と並行して調査を実施したため、データ整備が中心的な活動となった。そこで本年度は、これらのより詳細な分析と結果の発表に重点を置いて研究を進め、成果の公表を進める段階に至ることができた。成果の公表については一部(特に中央高速道路事業に関する分析結果について)次年度に持ち越した部分はあるものの、第一の課題である「移転住民の認識の変化」に影響を与える要因として「情報」(本研究では特に以前の事業に伴う他者の移転の経験に関するもの)の役割に注目しつつ、第二の課題の一環としてフィールド実験の要素を含んだ質問紙調査を実施し、結果を得ることができ、第一の課題と第二の課題を融合した形で研究を進めていることができたと考えている。今後は、第二の課題のうち地理情報にも注目し、「移転住民の認識の変化」に対して地理的・環境的要因を検討するとともに、社会経済的要因との相互作用等についても研究を進める予定である。(i)本年度に得られた研究成果の発表と、(ii)後半2年間のテーマである地理情報を用いた道路事業・移転に対する市民の認識の研究を進める。(i)について、特に中央高速道路事業に関する分析結果について本年度中に公表しきれなかったものがあるが、次年度日本行政学会年次大会での報告が決まっており、そこでの議論や、研究協力者であるケラニヤ大学社会学部のカルナティラケ教授との議論も踏まえて国際論文誌への投稿を行う。また、中央高速事業においては、その援助主体や事業主体の点において南部高速道路事業と性質の異なるものであり、過去に置ける教訓を活かした制度設計となっていない場合があることが調査の過程で明らかになってきており、事業や移転政策の受容側である住民の認識と同時に、供給側である政府関係者への聞き取り調査も実施している。こうした聞き取りから得られた成果についても別途取りまとめて公表したいと考えている。(ii)については、カルナティラケ教授とともに現地調査の準備を共同で行い、第四四半期を目途に調査を実施するため、調査設計を進める。地理情報からは、事業区域までの距離等、住民の認識に直結する情報を含みうると考えられる一方で、コミュニティ全体のマクロ的な社会経済状況を反映する指標を導く可能性もあることから、本年度までに実施してきたミクロな影響のみならず、マクロな影響と、両者の相互作用も捉えられないか検討を進めていきたい。

本年度は、現地においてこのうち中部高速道路事業の用地取得・住民移転が進展しつつあることから、南部高速道路事業における移転世帯への調査と並行して、中部高速道路事業における移転予定世帯に対する調査を設計し、データ整備に重点を置くこととした。まず、研究代表者は前年度にあたる2016年23月に南部高速道路事業における移転世帯に対する開通5年後の調査を実施しており、この調査の内容と対象を拡充した調査を、研究協力者の助けを得つつ、夏に実施した。併せて、移転前後でデータが取得できることが期待できる中部高速道路事業の移転世帯に対する調査について、11月に来日したスリランカ側の研究協力者であるカルナティラケとともに現地調査の準備を共同で行い、2月に調査を実施し、データを得た。次年度は、これらのデータ分析をもとに得られた結果の発表を進める予定である。本研究の目的に掲げた二つの課題、(a)移転住民の認識の変化と、それに影響を与える社会的要因を明らかにすること、及び、(b)地理情報やフィールド実験を取り入れた調査を実施し、事業や負担に対する認識の決定要因についての考察を行うこと、のそれぞれについて、重複はするものの、それぞれ2年間、また、各年度において、調査結果の解析と、次の調査の準備、実施を行う計画となっている。ただし、第一の課題である「(a)移転住民の認識の変化」について、本年度は特に、現地において整備済み・計画中の事業のうち、中部高速道路事業の用地取得・住民移転が進展しつつあることから、移転前の世帯のデータを入手することができる中部高速道路事業における移転予定世帯に対する調査を早期に実施しておくことが研究目的を達するために重要であると判断した。そこで、本年度は、南部高速道路事業における移転世帯への調査と並行して、中部高速道路事業における移転予定世帯に対する調査も設計し、データ整備が中心的な活動となった。このため、前半二年間のうち、今年度の進捗としてはデータの蓄積の方が先行する形となっているが、次年度は、これらのより詳細な分析と結果の発表に重点を置きたいと考えている。また、第二の課題である「(b)地理情報やフィールド実験を取り入れた調査」については、既に今回の調査においてもGPS機器を持ち込み、本調査でも地理情報を取得することを試験的に行っている。今後、「(a)移転住民の認識の変化」についてのデータ分析の際、地理情報データが分析に応用可能かどうかを併せて検討する予定である。本研究は、スリランカの高速道路事業における用地取得・住民移転を題材に、市民の負担受容に関する調査と分析を行うものである。具体的には、(a)移転住民の認識の変化と、それに影響を与える社会的要因を明らかにするとともに、(b)地理情報やフィールド実験を取り入れた調査を実施し、事業や負担に対する認識の決定要因についての考察を行う。本研究の対象地域であるスリランカでは、現在高速道路の建設が盛んにおこなわれており、特に開通から数年を経た南部高速道路・開通間際あるいは直後のコロンボ外環高速道路・計画中の北部高速道路が同時に存在しており、複数のフェーズにおける道路建設や、それに伴う移転に対する住民の認識を同時に観察できる好機を迎えている。本年度は、前年度に実施した、
炭素ナノ粒子の妊娠期曝露による母子免疫系のエピジェネティックな変化に関する研究

本研究は、カーボンブラックナノ粒子の妊娠期経気道投与が次世代免疫系に及ぼす影響を、エピジェネティクスの観点からメカニズムを解明すること、ならびに妊娠中の投与時期(妊娠前期・中期・後期)による影響の差異を検証することを目的として行った。その結果、ナノ粒子の次世代免疫系への影響発現機序におけるエピジェネティクスの寄与は大きくないが、胸腺における転写因子NF1ならびにGFI1が機序に関与している可能性が示された。また、次世代免疫系への影響は、器官形成期(妊娠中期)における曝露の影響が最も大きい可能性が示唆された。本研究により、カーボンブラックナノ粒子(95μg/kg体重×2回)による次世代免疫系への影響は、妊娠前中期の曝露では新生児マウスに抑制的(脾臓T細胞の減少)に現れるのに対し、妊娠中後期の曝露では亢進もしくはアレルギー惹起の方向(脾臓T細胞の増加)に現れることが明らかになった。しかし、妊娠前期(着床直後)、中期(器官形成期)、後期(胎児成長期)のいずれかの期間のみの曝露では、総曝露量が同程度であっても比較的影響が微弱であった。ただし、器官形成期のカーボンブラック曝露による次世代(新生児期)免疫系への影響は、他の時期の曝露による影響と比較と比べると大きかった。また、同様の方法で二酸化チタンナノ粒子の妊娠期曝露による次世代(新生児期)免疫系への影響を検証した結果、95μg/kg体重×2回のカーボンブラックナノ粒子投与で生じた影響は8mg/kg体重×2回の二酸化チタンナノ粒子投与でも認められなかった。この結果は、二酸化チタンナノ粒子の妊娠期曝露による次世代・新生児期免疫系への影響は、カーボンブラックナノ粒子と比較すると非常に弱い可能性を示唆している。本研究において、マイクロRNAを中心としたエピジェネティクス解析を行ったが、エピジェネティックな機構が影響発現機序に関わることを示す結果は得られなかった。しかし、本研究の成果は、エピジェネティクス以外の観点からナノ粒子による次世代免疫系への影響発現機序を示唆する内容が多く含まれておる。今後の研究により、それらを標的にしたナノ粒子のリスク回避(予防・治療)の方法が見出されると期待される。さらに、本研究の一連の遂行の中で、大気中ナノ粒子のリスクの実際的かつ効果的な回避策を実現するためのリスク・コミュニケーションのあり方についても検討を行った。これも社会における平時・有事のナノ粒子のリスク回避を強くサポートすることが期待される。本研究の目的は、炭素ナノ粒子の妊娠期曝露が母子の各個体の免疫系に及ぼす影響を、抗原感受性とエピジェネティックな変化を評価指標として明らかにすることである。当年度は、カーボンブラックナノ粒子(CB-NP)の次世代影響について、とくに新生児期の脾臓および胸腺に生じる影響を検討した。その結果、新生児脾臓におけるCD3、CD4、CD8発現リンパ球の割合を指標とし、CB-NP曝露(妊娠前期から中期)の影響を生後35日目において評価できることが明らかになった。とくに、CB-NP曝露群の脾臓においてCD3陽性細胞(T細胞)数の減少が認められ、併せてCD4陽性細胞、CD8陽性細胞の減少傾向が認められた。しかし、マイクロRNAを中心としたエピジェネティクス解析を行った結果、リンパ球表現型への影響の発現機序を示す変化が脾臓組織および脾臓リンパ球中では認められなかった。そこで、生後35日目以前の新生児胸腺を解析した結果、胸腺リンパ球(Tリンパ球前駆細胞)の成熟が抑制される傾向が認められた。網羅的遺伝子発現データから胸腺に生じる影響の機能解析を行った結果、生後15日目の新生児胸腺において、CB-NP曝露群では転写因子NF1、GFI1の下流遺伝子の多くが発現低下することが明らかになった。また、CB-NP曝露群における脾臓中T細胞数の減少は、生後14日目までに対照レベルにまで回復していた。回復時期の脾臓組織において、ケモカインCcl19およびその受容体Ccr7をはじめとする複数のケモカイン、ケモカイン受容体の発現亢進が生じていた。また、CB-NP曝露を妊娠中期から後期に行った場合にも、胸腺リンパ球のCD4/CD8発現パターンに変動が生じるというpreliminaryなデータを得つつあり、曝露時期による影響発現の詳細およびメカニズムの解析を始めた。当初の計画以上に進展と言える理由は、1)カーボンブラックナノ粒子の妊娠期曝露が次世代免疫系に及ぼす影響が、新生児期の胸腺で明瞭に現れることの示唆と、2)妊娠中におけるカーボンブラックナノ粒子の曝露時期により、次世代免疫系に生じる影響のパターンの比較とを、初年度中に始めることができたためである。なお、1)の部分については、まもなく論文投稿をする予定である。加えて、カーボンブラックナノ粒子の妊娠期曝露により新生児期の胸腺に生じる影響について、すでにマイクロアレイからの網羅的遺伝子発現データが得られた。

このデータ解析により、新生児期の胸腺に生じる複雑かつ雑多な影響の機能的特徴(とくに鍵となる転写因子)もすでに把握できつつある。また、新生児期胸腺に生じる影響の経時的変化についても、多くはないものの、すでに有意なデータを得ることができた。さらに、新生児期に生じる影響の一部が収束していく過程についてもデータが得られつつある。この影響が収束していく過程の存在は、カーボンブラックナノ粒子の妊娠期曝露による次世代影響に対する生体防御機構の存在を示唆するものであり、ここにはナノ粒子曝露に対する生体側の頑強性/脆弱性/感受性を決定し得る情報が含まれていると考えられる。現在までに、ナノ粒子の妊娠期曝露が母子の各個体に及ぼす影響についても、カーボンブラック以外のナノ材料についてデータが得られつつある。ここでは分子生物学実験に通じた研究者の協力を仰ぎ、エピジェネティクスのうちとくにマイクロRNAの発現パターンについてデータを取得した。本研究課題の実施期間(2年間)で当初の計画を完遂するために必要なデータを、1年目に十分に得ることができたと考えている。今後は、カーボンブラックの妊娠期曝露により、一次リンパ組織の一つである胸腺に生じる影響を主要な研究対象とする。研究開始時は一次リンパ組織(胸腺)と二次リンパ組織(脾臓、リンパ節)の両方を研究対象にしていた。しかし、二次リンパ組織に生じる変化は、一次リンパ組織に起こった変化を反映しているに過ぎないことが判ったため、その観察だけではカーボンブラックナノ粒子の妊娠期曝露による影響の発現機序に迫ることができないと考えられる。そのため、本研究課題では今後、一次リンパ組織に研究対象を絞ることが妥当であると考えた。また、リスク評価に向けた研究方針として、本研究課題では用量依存性よりも材料(粒子の組成)間での影響比較を推進する予定である。それは、初年度の実績を踏まえて、材料間比較によりナノ粒子の性状と次世代免疫系への影響との相関性を明らかにすることが、用量依存性を検討することよりもリスク評価に有用かつ優れた知見を提供できると考えられるためである。以上の方針のもとで、今後(二年目=本研究課題の最終年度)は、1)妊娠期間中のカーボンブラックナノ粒子の曝露時期の違いによる次世代免疫系への影響の差異の検証、2)次世代免疫系への影響についての経時的変化の検証、3)ナノ粒子の組成・性状の違いによる次世代免疫系への影響の差異の検討を、初年度に明らかになった標的RNA群を中心に行っていく。とくに2)については、新生児期リンパ組織で認められた影響が、成長後の個体の免疫機能や抗原感受性にどのような変化を及ぼすのかについての検討を進める。最後に、本研究課題の中で影響発現に重要なマイクロRNAを明らかにし、RNAiの観点から影響発現を制御できる方法、すなわちリスク回避の方法を本課題の中で検討する。該当なし
癌におけるPTENリン酸化異常の分子機構とその役割の解明

これまでに成人T細胞白血病(ATL)の統合的ゲノム解析から癌抑制遺伝子候補としてNDRG2を単離し、ゲノム・エピジェネティック変化によるNDRG2の不活化は、PTEN C末端のリン酸化(Ser380/Thr382/Thr383, STT)を誘導し、PI3キナーゼ(PI3K)-AKT情報伝達経路の活性化を導くことを示した。さらに、NDRG2はPP2Aホスファターゼと結合しPTENにリクルートすることで、PTEN-STTの脱リン酸化に関与することを明らかにした(Nature Communications.2014)。そこで、PTENリン酸化異常によるPI3K-AKT活性化機序を解明するため、PTENリン酸化を制御する上流経路について検討した。NDRG2欠失変異体を用いた免疫共沈降および過剰発現実験より、NDRG2のC末端領域がPP2Aとの結合、PTENの脱リン酸化に重要であることがわかった。そのC末端配列には、Ser/Thrタンパク質キナーゼによるリン酸化部位が存在しており、その変異解析からNDRG2 Ser332のリン酸化がPP2Aとの結合やPTENの脱リン酸化に必須の役割を果たしていることが示された。NDRG2 Ser332のリン酸化を担うキナーゼとして、AKT, SGK1, S6K1などが候補として知られるが、これらのうちATL細胞では、SGK1がNDRG2 Ser332をリン酸化することがわかり、さらにSGK1はPI3K下流の分子PDK1によりリン酸化・活性化されることから、PI3K-SGK1-NDRG2ループは、PI3K経路の負のフィードバック機構の一つとして機能することが示唆された。また、PTEN-STTのリン酸化を担うキナーゼを同定するため、質量分析による結合タンパク質の解析を行ったところ、Ser/Thrタンパク質キナーゼSCYL2をその候補として得た。ATL細胞においてSCYL2は高発現しており、shRNAによるSCYL2の発現抑制はPTEN-STTの脱リン酸化およびAKTの活性化を抑制したことから、ATL細胞ではSCYL2高発現とNDRG2発現低下によりPTEN-STTの恒常的なリン酸化がもたらされているものと考えられた。成人T細胞白血病(ATL)のゲノム解析から単離したNDRG2は、PTEN結合タンパク質であり、PP2Aホスファターゼを介してSer380/Thr382/Thr383 (STT)リン酸化を抑制し、PI3K/AKT経路を抑制する。ATLにおけるNDRG2発現低下は、PTEN-STTリン酸化を亢進し、PI3K/AKTの恒常的活性化を誘導する。NDRG2は、PI3Kの標的であるSGK1によりリン酸化されることから、NDRG2を介したPTENリン酸化調節がPI3K経路の負のフィードバック経路の一つとして働くことが示唆される。NDRG2は、低酸素誘導遺伝子であることから、今回、ATLにおけるNDRG2発現低下と低酸素ストレス応答の制御異常との関連について検討した。正常細胞由来HaCaTを用いて、低酸素処理がNDRG2発現およびSGK1によるNDRG2 Ser332のリン酸化を増加させ、PTEN-STTリン酸化、AKT活性化を低下させることがわかった。一方、ATL細胞株や、神経芽細胞腫SK-N-SH等の癌細胞株では、NDRG2はプロモーターメチル化等のエピジェネティック変化により発現低下しており、低酸素によるNDRG2発現の誘導はみられない。実際これらの細胞株では、低酸素においてもPI3K/AKTの活性化は高く、PTEN-STTリン酸化も亢進していた。また、ATLでは、SGK1のリン酸化が亢進していることを見出し、ATL細胞は、NDRG2を不活化することで、低酸素による増殖抑制を回避している可能性が示唆された。PTENリン酸化の機序としては、SCYL2の高発現がPTEN-STTリン酸化の亢進に関与することから、SCYL2のキナーゼ活性およびSCYL2を活性化する上流シグナル経路について検討を行った。KK1-ATL細胞抽出液より精製したSCYL2は、in vitroにおいて有意な活性を示し、SCYL2がPTEN-STTのリン酸化を担っていることが示唆された。また、エンドサイトーシスの被覆小胞に関わるSCYL2結合タンパク質クラスリンの高発現がPTEN-STTリン酸化の亢進に関わることを見出し、SCYL2阻害剤はATL細胞の有望な分子標的となる可能性が考えられた。実際、正常細胞由来HaCaT細胞株の低酸素処理は、NDRG2発現を誘導し、PTEN-STTリン酸化の減少、及びAKT活性化の低下が起こり、細胞増殖が抑制されるのに対して、プロモーターメチル化によりNDRG2発現が損失するATL細胞株では、NDRG2発現の誘導は起こらず、PTEN及びAKTとも高リン酸化状態を保ち、高い増殖能が見られた。このことから、NDRG2発現の不活化は、低酸素環境における細胞増殖応答の破綻を導き、癌細胞の生存・増殖に寄与することが示唆され、さらに、造血幹細胞(HSCs)においてNDRG2発現が亢進しており、HSCsでは低酸素環境とPI3K経路の抑制が必須であることから、その低酸素を介したHSCsの維持機構おけるNDRG2の機能が推測され、今後の重要な研究課題の一つである。

本年度において、NDRG2によるPTEN-STTリン酸化制御を解明することを目的に、PI3K経路の負のフィードバック経路としての役割に着目して、シグナル伝達経路およびそのフィードバック調節の異常による細胞機能への影響を中心に解析を行った。NDRG2/PP2AによるPTEN-STTの脱リン酸化は、PI3K/AKT経路の負のフィードバック経路を介して起こり、その機序として、PI3K活性化は、PDK1によるSGK1の活性化を誘導し、活性化されたSGK1がNDRG2 Ser332をリン酸する。このNDRG2 Ser332のリン酸化は、NDRG2とPP2Aの会合を促進させ、NDRG2に結合するPTENにPP2Aがリクルートされ、PTEN-STT脱リン酸化の促進、PTENの活性回復により、PI3K/AKT活性化が抑制されることが明らかになった。一方、NDRG2は低酸素等の細胞ストレスにより発現誘導される遺伝子で、癌細胞は低酸素ストレスにおいて抵抗性をもち、癌の発達、転移に関与することから、低酸素応答におけるPTEN-STT脱リン酸化制御について解析した。その結果、ATL細胞はNDRG2発現低下により、低酸素刺激によるPTENの脱リン酸化およびAKT活性化の抑制がなくなり、低酸素による増殖抑制を回避できる可能性が示唆された。多くの癌においてNDRG2の発現低下は、PTEN脱リン酸化の制御異常を介して、細胞増殖や細胞ストレス時の生存に重要な役割を担っている可能性が考えられる。また、PTENリン酸化を担う候補分子SCYL2の機能解析を行い、SCYL2活性化に関与する上流のシグナル分子として、SCYL2結合タンパク質クラスリンを同定した。キナーゼアッセイにより、SCYL2がPTENをリン酸化するタンパク質であることが示唆され、更なる解析によりPTENリン酸化を標的にした分子標的薬への応用の道筋がつけられるものと思われる。以上は、本年度の研究課題について概ね成果を得たものと考えられる。腫瘍生化学ATLにおけるSCYL2の高発現および活性化の分子機構を明らかにし、PTEN-STTリン酸化の制御異常の分子機序の全貌を明らかにする。SCYL2の上流シグナル分子として、クラスリンの関与が明らかになったことから、上流レセプターやSCYL2の活性化を担うキナーゼ等の分子機序を明らかにし、PTEN-STTリン酸化を導くシグナル伝達経路を明らかにする。SCYL2阻害剤は、PI3K/AKT経路の効率的な分子標的薬として、またATLの新規治療薬として可能性があることから、SCLY2阻害剤のスクリーニング系を確立し、化合物ライブラリーのスクリーニングを行う。SCYL2タンパク質をバキュロウイルス発現系により作製し、PTEN-STTペプチドを基質に、ADP-Gloキット(promega)を用いてキナーゼ活性を検討する。これまでの解析からSCYL2は、細胞内でリン酸化修飾を受けておりSCLY2キナーゼ活性に関与することが示唆された。現在、これらリン酸化の機能解析を行っており、疑似リン酸化変異体の作製等、活性型のSCYL2タンパク質を精製する。化合物スクリーニングにより得られた候補化合物について、細胞増殖やPI3K/AKT経路の抑制効果等について検討する。
JNCASTで評価した産後1ヵ月の「不妊治療後版母子相互作用促進プログラム」開発

本研究の目的は,不妊治療後分娩した正期産後1ヵ月の母子を対象にJapanese Nursing Child Assessment Satellite Training (JNCAST)を用いて母子相互作用を評価し,評価を基に母子相互作用を促進する介入プログラムを開発することであった。不妊治療後の母子にJNCASTの母子相互作用評価尺度を用いて自然妊娠の母子と比較した結果,総合得点は低く(p<.05),母親は子へ言葉や接触等が少ないことが明らかとなった。この結果を基にプログラムを開発し,パイロット研究で実施した結果,介入後の総合得点は高く,介入前後に有意差を認めた(p<.05)。平成26年度の研究目標、研究計画は、不妊症治療後妊娠・出産した母子を対象に産後1ヵ月母子相互作用を調査し、その特徴を明らかにすることであった。研究開始前に大阪大学および関西の4研究協力施設の倫理審査委員会で承認を得た後、調査対象である正期産で出産した入院中の母子を各施設の研究協力者が選定し、研究代表者が文書と口頭で説明し同意を得られた母子とした。各施設外来で1ヵ月健康診査を受診した際、母子相互作用を評価するため、個室で遊び場面および授乳場面をビデオで録画した。同時に母親へ属性、子ども総研式育児支援質問紙、育児動機尺度、愛着尺度の自記式質問紙調査を実施した。データ数は48組で、若干目標数に到達していないため期間を延長し調査を継続している。得られたデータは、JNCAST評価表に基づき評価を実施した。評価者は、NCAST国際認定者であるが、データのバイアスを回避するため、研究者でない者に依頼した。現在、統計解析ソフトSPSSを用いて分析を行っており、その結果を基に平成25年度に調査した自然妊娠で出産した母子を対象としたJNCASTの母子相互作用評価および質問紙調査の各尺度結果を比較し、不妊症治療後出産した母子の産後1か月の特徴を明らかにする。さらに平成27年度は、平成26年度の結果から不妊症治療後の母子の特徴から連携研究者および研究協力者とともに指導教材の開発、およびプログラムを考案し検討する計画である。平成27年度は,不妊治療後に妊娠・分娩した産後1ヵ月の母子相互作用を調査し,不妊症治療が母子相互作用に及ぼす影響について検討した。対象は,不妊治療後に妊娠・分娩後で同意を得られた母子で,遊び場面38組,授乳場面27組であった。1ヵ月健康診査時に評価尺度Japanese Nursing Child Assessment Satellite Training(JNCAST)に基づき,授乳場面および遊び場面をビデオ録画し,母子相互作用を評価した。母親へは,ビデオ録画の際に3尺度(育児動機,愛着,育児不安)で自記式質問紙調査を実施し,母子相互作用と母親の主観的評価を比較した。データの分析は,平成26年に自然妊娠後の産後1ヵ月の母子相互作用結果とF検定で比較し,不妊症治療後の母子相互作用の特徴を明らかにした。その結果,不妊治療後の産後1ヵ月の母子相互作用は,遊び場面および授乳場面の総合計得点ともに自然妊娠と比べ低く,有意差が認められた(p<.006,p<.004)。また,両場面ともに母親下位尺度「社会情緒的発達の促進」が低く,有意差が強く認められた(p<.001, p<.001)。母親の主観的評価を自然妊娠と不妊治療別に比較した結果,不妊治療後の母子は,育児動機が低く,有意差を認めた(p<.05)。以上のことから,自然妊娠と比較し不妊治療後に妊娠・分娩した産後1ヵ月の母子相互作用は低く,とくに母親の社会情緒的発達の促進が低いことが明らかとなった。又,母親は育児動機が自然妊娠と比較し低いことも明らかとなった。平成28年度は,母子相互作用を促進するプログラムを開発し,介入後の母子相互作用を比較・評価するパイロットスタディを実施する予定である。平成27年度の研究計画は,不妊治療後の母子と自然妊娠の母子相互作用を比較し,不妊治療後が母子相互作用に及ぼす影響を検討すること,検討した結果,母子相互作用を促進するプログラムを開発することであった。しかし,平成26年度で終了する予定であった対象である不妊治療後の母子から同意を頂くのが難しく,データ数不足により半年研究期間を延長した。現在,介入プログラムを開発している段階で,若干予定よりも遅れているが,平成28年度は,介入プログラムを実施する予定である。平成28年度は、平成27年度の研究で明らかとなった不妊治療後に妊娠・分娩した母子は、自然妊娠と比較し、産後1ヶ月の母子相互作用が低い結果を得られたことから、対象となる母子へ介入研究を計画していた。研究デザインはパイロット研究で、正期産で分娩した自然妊娠と不妊治療後の初産母子各5組を対象に、母子相互作用促進プログラムであるJapanese Nursing Child Assessment Statellite Training(JNCAST)に基づいて実施し、介入前後の産後1ヶ月の母子相互作用を比較・評価する研究である。JNCASTは、国内外の先行研究で、介入された母子が相互作用を促進したことを検証されたプログラムであるが、これまでに不妊治療後の母子はされていない。JNCASTプログラムは、非常に詳細な規定のもと国際認定評価者のみが研究を許可されている。しかしながら、平成28年度は、研究代表者の所属する大学の看護教員数が退職等で過度に不足し、担当科目数は昨年度と比較し4倍に増加した。その結果、研究を遂行する時間の確保が非常に困難になり、計画していた研究を遂行することが不可能となった。

したがって、平成29年度へ期間を延長し、平成28年度の計画を実施することとなった。平成28年度は、研究代表者の所属する大学の看護教員数が退職等で過度に不足し、担当科目数は昨年度と比較し大幅に増加したため、研究を遂行する時間の確保が困難になったためである。したがって、平成28年度の計画を平成29年度で実施する予定である。これまで,産後1ヵ月の自然妊娠や不妊治療後の母子にJNCASTの評価尺度を用いて母子相互作用を調査した。その結果,不妊治療後の母子は,自然妊娠と比較し母子相互作用が低い結果となり,母親は子へ言葉や接触等が少ない社会情緒的発達の促進が乏しいのが特徴であった。この特徴をふまえ,JNCASTを基に「不妊治療後母子相互作用促進プログラム」を開発した。本プログラムは,研究者が分娩後3日に母子相互作用を評価し,分娩後5日に母子相互作用を促進する介入を行う。介入は73項目の評価から得点した項目を具体的に称賛するフィードバックで,社会情緒的発達の促進を必ず5項目入れた10項目を説明し,産後1ヵ月で介入後評価をする。平成29年度の研究目的は,Japanese Nursing Child Assessment Satellite Training (JNCAST) Projectを基に,不妊治療後の母子を対象に開発した「不妊治療後母子相互作用促進プログラム」をパイロット研究で実施し,1自然妊娠の母子と比較し,介入効果を明らかにする,2パイロット研究の結果から,プログラムの課題を明らかにして改善することである。研究対象者は,正期産の初産母子10組で,不妊治療後母子5組(介入群),自然妊娠母子5組(介入対照群)であった。研究方法は,研究協力者から紹介頂いた母子へ文書と口頭で説明し同意を頂き,産後3日に介入前母子相互作用場面を録画した。録画は直ちに1名の共同研究者が評価を実施し,評価を基に個別のパンフレットを作成した。退院前にパンフレットを用いて介入を実施した。介入後の産後1ヵ月健康診査では,産後1ヵ月の母子相互作用場面の録画を実施し,介入前と異なる1名の共同研究者が評価した。現在,データの入力を行っており,今後はデータの分析し,研究目的に基づき考察する予定である。本研究の目的は,不妊治療後分娩した正期産後1ヵ月の母子を対象にJapanese Nursing Child Assessment Satellite Training (JNCAST)を用いて母子相互作用を評価し,評価を基に母子相互作用を促進する介入プログラムを開発することであった。不妊治療後の母子にJNCASTの母子相互作用評価尺度を用いて自然妊娠の母子と比較した結果,総合得点は低く(p<.05),母親は子へ言葉や接触等が少ないことが明らかとなった。この結果を基にプログラムを開発し,パイロット研究で実施した結果,介入後の総合得点は高く,介入前後に有意差を認めた(p<.05)。平成26年度研究目的は、不妊症治療後妊娠・出産した母子を対象に産後1ヵ月母子相互作用を調査し、その特徴を明らかにすることであった。現在調査を継続中ではあるが、ほぼ終了している段階で、データの分析を実施しており、順調に計画を遂行していると考えられる。
糖尿病患者における歯内疾患悪化メカニズムの解明

糖尿病は他の疾患同様に歯の神経の病気にも大変影響をしている考えられる。そこで、糖尿病になったマウスを検証してみた。虫歯を実験的に作ると歯の根の先が化膿するまでの時間が健常なマウスと比較して糖尿病のマウスは早かった。そのメカニズムは、体中を巡っている白血球が血糖値の上昇とともに何らかの影響を受けて、炎症が急速に進む可能性があることが分かった。つまり、血糖値が常時高い値を示している人は、血液中の細胞に異常が起き、虫歯が進行し歯の神経まで到達すると健常者よりも急速にあごの骨の中に炎症と感染が進行する可能性があるということである。歯髄組織と根尖周囲組織には糖最終産物の受容体(RAGE)の産生を認める。特に歯周靭帯由来繊維芽細胞での産生は確認できた。その他、炎症に深くかかわっている炎症細胞である好中球とマクロファージでの産生は確認できた。糖尿病患者群から採取した好中球では、健常者群から採取した好中球と比較してRAGEの産生量は増加している。また、それぞれの群から採取した好中球の産生する活性酸素量を測定すると、1.52倍程度糖尿病患者群から採取した好中球の方が産生量が多かった。また、RAGEのリガンドであるS100タンパク質を健常者群から採取した好中球に作用させると糖尿病患者群から採取した好中球の産生する活性酸素量と同等の産生量となった。これらの結果から、炎症時に重要な役割を担っている炎症担当細胞はRAGEを介して炎症に深くかかわっている可能性が示唆できた。また、歯髄組織や根尖周囲組織でもRAGEの発現があることから、RAGEは何らかの役割を果たしている可能性を示唆装結果は獲得できた。しかし、歯髄組織や根尖周囲組織を形成する細胞に発現しているRAGEが炎症の波及や憎悪、進行へどのように関与しているかということはまだ明らかにできていない。昨年度は、in vivoを中心に実験を行った。先ずは、マウスの歯内病変モデルマウスを作成した。歯内病変モデルを作成する際に、下顎の第一臼歯を露髄させ、1,3,5,7日後の根尖周囲の炎症波及の範囲は、組織切片をHE染色し炎症所見を確認した。歯内病変モデルでは露髄範囲に応じて根尖への炎症波及速度に差があるため第1臼歯の咬合面全体を露髄させる、#6の根管形成用ファイルを根管孔内に挿入し根管内の歯髄に感染を容易にする工夫をした。そして、その手技を用いて糖尿病誘導マウスと健常マウスを用いて歯髄炎→根尖性歯周炎に至る速度の違いを確認した。糖尿病誘導マウスの作製は、5週齢のオスのKK/TaJclマウスにHight Fat Diet 32(HFD32)を8週間与えることで作成した。糖尿病誘導マウスの8週後(13週齢)の血糖値は450±54 mg/dl、体重は43±2.8gであり、健常マウス(普通食投与群)は血糖値が212±17mg/dl、体重は31±1.4gであった。根尖周囲への炎症波及範囲は露髄後3日後から明らかな差が生じていた。今回の研究で注目している糖化最終産物レセプター(RAGE)の関与を証明するためにリコンビナントRAGE(rRAGE)を露髄後すぐに根管内に投与群と非投与群を作成し比較した。rRAGE投与群は非投与群と比較して炎症の波及が緩やかである傾向が出た。しかし、注射を直に歯髄空内にするという投与法にはやや問題があるのではないかという考え、今後も投与法を検討する必要がある。その他、RAGEノックアウトマウスを用いることで、歯内病変へのRAGEの関与を確認する予定である。本研究では、糖尿病患者の歯内疾患に対する免疫反応を調べるために、3つの因子に着目し実験を計画した。1.糖化最終産物(AGE)2.S100タンパク質(S100)3.AGEの受容体(RAGE)in vitroの系では、歯髄細胞や根尖周囲由来の細胞でのRAGEとS100タンパク質(S100)の発現、および、3つの因子の炎症増悪に対する役割を解析する。また、in vivoの系において糖尿病モデルラットを用いて歯髄炎と根尖性歯周炎の経時的な進行速度と組織破壊を解析し、糖尿病罹患時における歯内疾患悪化メカニズムを明らかにすることとした。実施したin vivoの実験では糖尿病誘導マウスの8週後(13週齢)の血糖値は450±54 mg/dl、体重は43±2.8gであり、健常マウス(普通食投与群)は血糖値が212±17mg/dl、体重は31±1.4gであった。RAGEの関与を証明するためにリコンビナントRAGE(rRAGE)を露髄後すぐに根管内に投与群と非投与群を作成し比較した。in vitroの実験では、まず、好中球におけるRAGEの発現を確認した結果、糖尿病患者から採取した好中球の発現が増加していた。

また、S100タンパク質を作用させた健常者の好中球の産生する活性酸素量が糖尿病患者から採取した好中球が産生する活性酸素量が同レベルまで増加する結果を得た。歯髄由来繊維芽細胞のRAGEの発現は糖尿病モデルマウスと健常マウスで差はなかった。このことから、in vivoで得た糖尿病マウスの歯髄疾患の進行が早い傾向にあるという結果は、歯髄由来細胞よりも好中球などの血液由来の炎症細胞が関係している可能性が示唆された。糖尿病は他の疾患同様に歯の神経の病気にも大変影響をしている考えられる。そこで、糖尿病になったマウスを検証してみた。虫歯を実験的に作ると歯の根の先が化膿するまでの時間が健常なマウスと比較して糖尿病のマウスは早かった。そのメカニズムは、体中を巡っている白血球が血糖値の上昇とともに何らかの影響を受けて、炎症が急速に進む可能性があることが分かった。つまり、血糖値が常時高い値を示している人は、血液中の細胞に異常が起き、虫歯が進行し歯の神経まで到達すると健常者よりも急速にあごの骨の中に炎症と感染が進行する可能性があるということである。歯内病変モデルを作成するのにやや手間どったうえ、歯内病変に対するRAGEの関与を確認する際にrRAGEの投与法に苦心した。現在もまだ最良と考える投与法は見つかっていないことがやや目的達成が遅れている最大の要因と考える。歯内歯周病学これまで行ってきたin vivoの実験結果を裏付けるために、ヒトの歯髄細胞を用いて炎症を誘導し、rRAGEが炎症波及に関与しているか確認する。その際には、炎症性のサイトカイン発現確認していく予定である。細菌の構成タンパクを炎症誘導因子として用い、RAGEへの直接的関与と間接的関与の両方を確認することも計画している。糖尿病モデルマウスへの歯髄炎と根尖性歯周炎の誘導にRAGEの関与を確認する際に、モデルマウスの血糖値や体重だけでなく糖最終産物(AGE)の発現量に差ができるまで観察する必要がある。そのモデルマウスの作成に時間を要している結果、やや遅れているという達成度となっている。動物実験に手間取りin vitroでの実験系の進行が遅れたため。in vivoの系では糖尿病を誘導した上でAGEとRAGEの発現量が増加しているモデルラットを作成する。そのマウスを用いてRAGEの役割を調べるために分泌型RAGEによってRAGEの働きをブロックし、炎症の波及にどのような影響が出るかを調べる。in vitroの系では歯髄由来繊維芽細胞と血管内皮細胞、歯周靭帯由来線維芽細胞を用いてRAGEの発現をノックアウトし炎症性サイトカインの発現やCox2の発現を確認し炎症への関与を明らかにする。ヒト健常歯髄細胞の培養のため培地の購入に使用する予定当該年度は動物実験でモデルマウスの作成に手間取り、ターゲットタンパクであるRAGEに機能を確認することがほとんどできなかった。また、In Vitroの実験系ではそれなりの成果が出てきていると考えるが、計画をたてていた歯髄細胞を用いた実験が十分にできなかった。機能解析などを行うための抗体やリコンビナントタンパク質の購入に充てる予定である。また、歯髄細胞や歯周靭帯由来繊維芽細胞を用い、各種細胞へのRAGEを介したS100タンパク質やAGEの影響を確認していく予定です。
鉄によるDNA損傷とその癌遺伝子、癌抑制遺伝子への影響

ヒトにおいて体内の鉄貯蔵量増加は発癌のリスクとなることが明らかとなったため、鉄による発癌機構の分子病理学的解明をめざした。この際、中性で自由鉄でありうる鉄キレート化合物が重要となる。鉄ニトリロ三酢酸の反復投与はラット、マウスで高率に胃癌を発生させる。また、鉄クエン酸はヒトのヘモクロマトーシスにおける血中の自由鉄である。両鉄キレート化合物は本研究者らの開発したsupercoiled plasmidを使用したin vitroの系でDNAを切断し修飾塩基を生成した。この反応は、温度、還元剤、pH、鉄とキレート剤の比率に依存した。次に、鉄ニトリロ三酢酸を投与したラット腎において、ガスクロマトグラフィー/マススぺクトロメトリーによりDNA修飾塩基を検討し、癌遺伝子であるc-fos、c-junの蛋白について酵素抗体法により解析を加えた。投与後1-3hrsをピークとして、8-hydroxyguanine(8-OH-Gua)をはじめとする7種のDNA修飾塩基の増加を認めた。8-OH-GuaはG:C toT:A transversionの原因として注目されるが、生成修飾塩基の中には変異原性に関するデータがいまだ報告のないものもある。近位尿細管の変性壊死再生に伴い、修飾塩基が存在することは変異を誘発し固定するという意味において発癌過程で重要な役割を果たしていると考えられる。投与後16hrs以後再生上皮にc-fos、c-jun蛋白の増加がみられ、これらの蛋白の発癌過程への関与が示唆された。
フリーラジカル消去系低下の肝障害に及ぼす影響についての研究

SD系雄性ラットに、Cu,Zn-SOD阻害剤diethyldithiocarbamate(DDC)1000mg/kg及びD-ガラクトサミン(GalN)200mg/kgを各々単独あるいは併用投与して、肝障害の程度を血清トランスアミナーゼ、肝過酸化脂質(LPO)の測定と肝組織より評価検討した。DDC単独投与ではCu,Zn-SODのみならずカタラーゼなども低下し、フリーラジカル消去系の破綻が認められた。さらに血清トランスアミナーゼ、肝LPOの軽度増加、軽度の組織変化が認められ、肝障害の発現が確認された。ガラクトサミン肝障害にDDCを前投与すると(DDC+GalN肝障害)、GalN単独投与に比べ、血清トランスアミナーゼは約14倍、肝LPOは約9倍に増加した。組織学的にもGalN単独投与で細胞壊死が見られなかったのに対し、DDC+GalNでは出血壊死が認められた。以上の結果より、フリーラジカル消去系の低下によっても肝障害の惹起、進展憎悪が認められ、肝障害防御因子としての内因性消去系の重要性が示唆された。またDDC+GalN肝障害モデルに、抗酸化剤としてalpha-トコフェロール、コエンザイムQ10を前投与すると、非投与群と比較して、血清トランスアミナーゼ、肝LPOの低下、組織学的改善が認められた。内因性消去系の破綻で生じた脂質過酸化反応の亢進が、抗酸化剤の投与による補充で改善したものと考えられた。なお以上の結果については、第9回近畿肝臓病研究会で発表し、また第34回近畿大学医学会学術講演会で医学会賞受賞記念講演を行った。さらに近畿肝臓病研究会論文集に掲載予定であり、DDC+GalN肝障害に対する抗酸化剤の効果については論文作成中である。慢性肝疾患患者の血清酸化能、血清抗酸化能については現在測定中である。またoxidative stressのパラメーターになるといわれている赤血球由来のO2-について新たに慢性肝疾患患者を対象として測定を予定している。