hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
ホモ・ヘテロ・ナノギャップ構造を持つ周期ナノドット転写法の開発

1ポインティング安定化装置改良:アイリスによる光源サイズ制限及び光量最適化を行った。2干渉パターンLIDT装置の振動防止:予備実験の結果、真空ポンプによって加工部が振動している事が判明した。そこで、軟性ポリマーホースを用いた長尺の緩衝部を設け、問題を解決した。3近赤外超短パルスレーザー4ビーム干渉パターン形成装置の構成:ショットエネルギーの安定性を増すため、基本波を用いた装置を再構成した。レンズ及びミラーを全て近赤外対応にし、さらに近赤外4ビーム回折DOE及び像転送光学系からなる干渉パターン形成装置を構成し、真空排気系(P<3kPa)を備えたLIDT加工部に導入した。4干渉パターンLIDT実験:干渉パターンは正方格子、周期は3.6μmである。材料基板及びアクセプタ基板は合成石英基板(λ/4)にマグネトロンスパッタリングで堆積したAuまたはPt薄膜(膜厚:20100nm)を用いた。5実験結果:Au及びPt薄膜を材料基板に用い、干渉パターンの格子通りに配列したナノ微粒子の堆積に成功した。Au薄膜の場合の最小サイズは500nm以下であり、サブミクロン微粒子の堆積に成功した。比較的高いフルエンスの領域では2段、3段に積み上がったナノドットが見られ、単一スポットに複数のナノドットが形成される場合がある事が分かった。一部は1段目の近隣に堆積しており、例としてギャップ長45nmのナノドットペアが形成された。また、複数回LIDTによる近接ナノドット形成の初期的結果を得た。6前年度ポインティング精密制御装置を導入したシングルビームLIDT装置を利用し、金属ナノドット形成のための転写挙動を検討し、ガラス基板上への金ナノドットのオンデマンド形成を実現した。平成30年度が最終年度であるため、記入しない。1トップフラットビームの構築と最適化:空間光位相変調装置(SLM)とフーリエ光学系を組み合わせたビーム整形装置を構築した。CyberLaserのIFRITを光源として用い、SLMに表示する位相グレーティング周期及びその位相差に対する入出力特性を明らかにした。これを用い、元になるガウシアンビームをスクエア・トップフラットビームにするための位相グレーティングを作成した。空間周波数フィルターの径をパラメーターとして最適化を行い、φ=2mmの場合で矩形の中心を通る横方向0.92mm内強度の標準偏差が3.7%のフラットネスを達成した。2干渉パターンLIDT装置の開発:スクエア・トップフラットビームを利用した干渉パターンLIDT装置を構築した。まずSLM上の位相グレーティングとターゲット表面を像転送するために縦型定盤を設置し、複数の縮小光学系を設置した。ターゲット駆動系は手動ステージと自動ステージを組み合わせた。ターゲット設置部は密閉構造とし、真空排気用ポンプと圧力モニター、リーク弁を設置し、真空排気テストをおこなった。以上の装置にターゲットを設置し、初期的なショット実験を行った。3シングルビームLIDT装置へのポインティング精密制御装置の導入:金薄膜ターゲットにおける堆積位置ならびに転写挙動のレーザーフルエンス依存性を詳細検討した。その結果、最適フルエンスにおいて直径500 nmの金ナノドットのオンデマンド堆積に成功した。最終目標の超微細ナノドット配列に向け、超精密ステージを導入した装置構築に取り組んだ。当初の計画である1トップフラットビームの構築、2干渉パターンLIDT装置の開発、3シングルビームLIDT装置へのポインティング精密制御装置の導入については、研究業績の概要に示したとおり計画を達成した。さらに追加項目として、ビーム整形技術を利用したビーム形状のスクエア化をおこない、多ショット加工時のデッドスペース減少を可能にした。1ポインティング安定化装置の導入:フェムト秒レーザーの出射部にポインティングモニター部とピエゾ駆動ミラーを配置することでポインティング安定化装置を構成した。安定前は1mrad/h程度の不安定性があり、これはSLM上では120pix.程度のずれに相当する。安定化後は10μrad/h程度となり、1.2pix.程度に抑えることが出来た。これにより、安定的なビーム整形が可能となった。2フラットトップ・スクエアビーム整形部の高度化:空間光変調器(SLM)を用いたフラットトップ・スクエアビーム整形部の安定化装置について、LDを用いたオフライン高度化実験を行った。空間周波数成分分布の最適化を行うことで、ビーム不均一性:0.087⇒0.046、エッジ急峻度:0.073⇒0.027の向上に成功した。最適化の手法については特許出願準備中である。この装置を干渉LIDT装置の光源であるフェムト秒レーザーに導入し、ビーム形状の最適化を達成した。3紫外フラットトップ・スクエアビーム発生による高効率化:上記のビームに対し、BBO結晶による第二高調波発生を用いる事で紫外スクエア・トップフラットビームを発生させることに成功した。金薄膜試料においては基本波(785nm)での吸収率は2.5%と低いが、第二高調波(392.5nm)では59.4%まで上昇する。4紫外光6ビーム干渉パターン形成装置の構成:BBO結晶を始点として紫外光6ビーム回折DOEを経由してLIDT加工部まで像転送光学系を構成し、6ビーム干渉パターン加工装置を構成した。5シングルLIDT実験において対物レンズ系LIDT装置を構成た実験をおこなった。

現在、スポット微細化によるドットの極微細化実験を進めている。また、昨年購入した高精度ステージを使ったナノドットのナノアレイ化を平行して進めている。干渉パターンLIDT実験について、昨年計画したポインティング安定化装置を達成した。前年度の改良として、新方式のフラットトップ・スクエアビーム整形技術を開発し、ビーム不均一性: 0.046、エッジ急峻度: 0.027を得た(特許出願準備中)。追加項目としてフラットトップ・スクエアビームの紫外化を行い、エネルギー利用効率を向上した。現在、サブミクロンドット転写の条件出しを行っている。シングルLIDT実験についても同様に、サブミクロンドット転写の条件出しを行っている。1ポインティング安定化装置改良:アイリスによる光源サイズ制限及び光量最適化を行った。2干渉パターンLIDT装置の振動防止:予備実験の結果、真空ポンプによって加工部が振動している事が判明した。そこで、軟性ポリマーホースを用いた長尺の緩衝部を設け、問題を解決した。3近赤外超短パルスレーザー4ビーム干渉パターン形成装置の構成:ショットエネルギーの安定性を増すため、基本波を用いた装置を再構成した。レンズ及びミラーを全て近赤外対応にし、さらに近赤外4ビーム回折DOE及び像転送光学系からなる干渉パターン形成装置を構成し、真空排気系(P<3kPa)を備えたLIDT加工部に導入した。4干渉パターンLIDT実験:干渉パターンは正方格子、周期は3.6μmである。材料基板及びアクセプタ基板は合成石英基板(λ/4)にマグネトロンスパッタリングで堆積したAuまたはPt薄膜(膜厚:20100nm)を用いた。5実験結果:Au及びPt薄膜を材料基板に用い、干渉パターンの格子通りに配列したナノ微粒子の堆積に成功した。Au薄膜の場合の最小サイズは500nm以下であり、サブミクロン微粒子の堆積に成功した。比較的高いフルエンスの領域では2段、3段に積み上がったナノドットが見られ、単一スポットに複数のナノドットが形成される場合がある事が分かった。一部は1段目の近隣に堆積しており、例としてギャップ長45nmのナノドットペアが形成された。また、複数回LIDTによる近接ナノドット形成の初期的結果を得た。6前年度ポインティング精密制御装置を導入したシングルビームLIDT装置を利用し、金属ナノドット形成のための転写挙動を検討し、ガラス基板上への金ナノドットのオンデマンド形成を実現した。レーザーのポインティング(角度)安定化装置を干渉LIDT装置に導入し、空間光変調器(SLM)へ入射する位置の安定化をおこなう。その上で位相グレーティングの再構築をおこない、経時変化の少ないスクエア・トップフラットビームを形成する。位相グレーティングを表示するSLM表面から干渉LIDT装置中のターゲット表面までの像転送を再調整し、加工部位におけるビーム形状・フルエンス分布を正規の形状に保つ。この装置を用い、干渉LIDT装置の基本特性を調査する。
損傷乗り越え複製と植物のゲノム安定性の研究

高等植物がゲノムの安定性を脅かす様々なDNA損傷ストレスに対してどのように対処しているかを明らかにする目的で、損傷したDNAの複製に関わるDNAポリメラーゼとDNA複製装置との関係や、損傷乗り越え複製機構の制御メカニズムについて解析した。その結果、異なる損傷乗り越え複製型DNAポリメラーゼ間やDNAポリメラーゼとDNA複製クランプとの間でタンパク質間相互作用がみられることが明らかになった。また、損傷乗り越え複製型DNAポリメラーゼを欠損させると相同組換えの経路が優先的に使用されることや、二つの経路の制御に熱ショックタンパク質が関与している可能性を示した。損傷乗り越え複製は、DNA修復機構によって除去しきれなかったDNA損傷をバイパス複製することにより、DNA複製が停止するのを回避する機構の一つである。本研究では、損傷乗り越え型ポリメラーゼとDNA複製装置、熱ショック蛋白質(HSP)、相同組換え関連因子等との相互作用を生化学的・分子遺伝学的手法で解析することにより、高等植物がゲノムの安定性を脅かす様々なDNA損傷ストレスに対してどのように対処しているかを明らかにすることを目的としている。本年度は、既に入手している相同組換え検出マーカー、損傷乗り越えポリメラーゼ欠損植物、ならびにHSP90のノックダウン系統を交配することにより、試験系統を確立した。また、DNA複製関連因子と損傷乗り越え型ポリメラーゼとの相互作用を検証した。これに加え、PCNAのユビキチン化の効果を解析するためのコンストラクトを作製した。1)損傷乗り越え型ポリメラーゼの欠損株と3種類の相同組換え検出系統を交配し、得られたF2系統をPCR及び薬剤耐性によってスクリーニングすることにより、マーカーがホモで挿入されている試験系統を選抜した。2) 2種のHSP90-RNAi系統とコントロール系統を相同組換え検出系統と交配し、PCR及び薬剤耐性試験によりRNAiコンストラクトと相同組換えマーカーがホモで挿入されている系統を選抜した。3) AtPCNA2をtwo-hybrid実験用のベクターに組み込み、AtRev1およびAtPolHとのとの相互作用を解析した結果、AtPCNA2は酵母内でこれらのポリメラーゼと相互作用をすることが明らかになった。4) AtPCNA2とユビキチンとの融合遺伝子をバイナリーベクターに組み込み、アグロバクテリウムに導入した。H26年度は、前年度に確立した相同組換え検出系統を利用し、植物ゲノムの安定性維持において損傷乗り越え型ポリメラーゼや熱ショック蛋白質が果たす役割を解析した。また、PCNA-ユビキチン融合蛋白質導入植物を利用し、DNA複製因子の修飾が植物のDNA損傷応答において果たす役割を検証した。1)相同組換えマーカーを導入した植物をHSP阻害剤の存在下で育成し組換え頻度を解析した結果、HSPの阻害によりDNA相同組換えの頻度が上昇することを明らかにした。さらに、組換えマーカーを導入した損傷乗り越え型ポリメラーゼ欠損株にHSP阻害剤を添加すると、ポリメラーゼ欠損の効果とHSP阻害剤の効果が相加的に効くことを見出した。2) PCNA-ユビキチン融合蛋白質を導入した植物を選抜し、試験系統を確立した。この遺伝子導入植物からFLAGタグを利用してPCNAを回収し、ユビキチン化の検出を試みた。3)損傷乗り越え型ポリメラーゼの欠損系統mmc41系統に突然変異検出マーカーを導入し、試験系統を確立した。本研究では、損傷乗り越え型ポリメラーゼとDNA複製装置、熱ショック蛋白質(HSP)、相同組換え関連因子等との相互作用を解析することにより、高等植物がゲノムの安定性を脅かす様々なDNA損傷ストレスに対してどのように対処しているかを明らかにすることを目的とする。H27年度は、前年度までに作製した試験系統に対して様々なDNA損傷刺激を加え、突然変異頻度や相同組換え頻度を調べるとともに、HSP90と損傷乗り越え型ポリメラーゼとの関係性を解析した。1)野生型植物に紫外線(UVB・UVC)を照射し、シクロブタン型ピリミジンダイマー(CPD)の生成量を測定するとともに、体細胞における突然変異頻度を計測した。その結果同程度のCPDを生じる線量で処理した場合、UVCの方が突然変異を起こしやすいことがわかった。UVC処理ではUVB処理より多くの6-4光産物が生成されたことから、6-4光産物が突然変異の主原因である可能性が示唆された。2)野生型及び誤りがちな損傷乗り越え型ポリメラーゼRev1の欠損株であるmmc41系統に対してUVCまたはガンマ線を照射し、突然変異頻度及び相同組換え頻度を解析したところ、突然変異頻度は野生型よりもmmc41系統の方が低いのに対し、相同組換え頻度は野生型よりもmmc41系統の方が高いことから、Rev1の欠損で損傷乗り越えが制限されると相同組換えが優先的に起こることが示唆された。3)野生型及び損傷乗り越え型ポリメラーゼPolηの欠損株であるpolh-

1系統をHSP阻害剤を含む培地で生育させた上でUVC処理を行ったところ、野生型ではHSP阻害剤の存在により突然変異頻度が減少したが、polh-1系統ではほぼ同等の変異頻度に留まった。このことから、Polηの欠損時にはHSPが存在しなくとも誤りがち損傷乗り越えが優先されることが示唆された。高等植物がゲノムの安定性を脅かす様々なDNA損傷ストレスに対してどのように対処しているかを明らかにする目的で、損傷したDNAの複製に関わるDNAポリメラーゼとDNA複製装置との関係や、損傷乗り越え複製機構の制御メカニズムについて解析した。その結果、異なる損傷乗り越え複製型DNAポリメラーゼ間やDNAポリメラーゼとDNA複製クランプとの間でタンパク質間相互作用がみられることが明らかになった。また、損傷乗り越え複製型DNAポリメラーゼを欠損させると相同組換えの経路が優先的に使用されることや、二つの経路の制御に熱ショックタンパク質が関与している可能性を示した。損傷乗り越え型ポリメラーゼの欠損系統を用いた解析、及びHSP90阻害剤効果の検証については予定通り達成出来た。また、PCNA-ユビキチン融合蛋白質を導入した植物を選抜し、試験系統を確立した。しかし、所属機関の建物工事により実験に必要な植物を育成するスペースを確保出来ず、HSP90ノックダウン系統を用いた解析は十分に行うことが出来なかった。生物学H27年度は、前年度までに作製した試験系統に対して様々なDNA損傷刺激を加え、DNA損傷刺激の種類やポリメラーゼの有無によって突然変異頻度や相同組換え頻度に違いがあるかどうかを解析する。また、HSP90と損傷乗り越え型ポリメラーゼとの関係性を解析する。得られた結果を総合的に分析することにより、植物のゲノム安定生維持がどのように制御されているかを明らかにする。これとともにPCNA導入植物からPCNAを精製する際に共沈して来る蛋白質を探索することで、DNA複製装置と相互作用する新規蛋白質を探索する。1)野生型および損傷乗り越え型ポリメラーゼ欠損株、HSP90ノックダウン株に対して、紫外線、放射線、酸化ストレス、熱ショックなどのDNA損傷刺激を与え、突然変異や相同組換えの頻度に差異が見られるかどうかを解析する。2) PCNA導入植物からFLAGタグを用いてPCNAを精製し、抗体を用いてユビキチン化を解析する。また、PCNA導入植物に対して様々なDNA損傷刺激を与えた際に、ユビキチン化の状況に変化が見られるかどうかを解析する。3)紫外線、放射線、酸化ストレス、熱ショックなどを与えた植物からpull-down assay等の方法でDNA複製装置複合体を抽出し、DNAに損傷を受けた際にDNA複製装置と相互作用する蛋白質を探索する。候補となるスポットが得られたらpeptide fingerprint (PMF)等によって分析し、同定を試みる。H25年度の実施計画の通り、損傷乗り越え型ポリメラーゼの欠損系統、及びHSP90ノックダウン系統に相同組換え検出マーカーを導入し、試験系統を確立することに成功した。
抗メタタイプ抗体を用いる低分子生理活性物質の超高感度イムノアッセイ法の開発

低分子化合物(ハプテン)の微量定量法として競合型イムノアッセイが汎用されているが,原理上,その測定感度には自ずと限界がある.そこで,抗原抗体複合体を特異的に認識する"抗メタタイプ抗体"という新たな概念を導入し,従来不可能とされてきたハプテンのサイドイッチタイプ非競合型イムノアッセイ法の確立を企てた.すなわち,モデルハプテンとして11-デオキシコルチゾール(11-DOC)及びウルソデオキシコール酸7-N-アセチルグルコサミニド(UDCA-7-NAG)をとりあげ,下記の研究を行った.1.抗11-DOCモノクローナル抗体のアフィニティーラベル.抗メタタイプ抗体を得るためには,目的ハプテンでアフィニティーラベルされた抗ハプテン抗体を免疫に用いることが必要である.そこで,11-DOCの4位に長さの異なるブリッジを介してカルボン酸パラニトロフェニルエステルを導入したラベル試薬2種を合成した.これら試薬は抗11-DOCモノクローナル抗体の抗原結合部位に対して11-DOCと同等の反応性を示した.また,タンパクのアミノ基へのラベル反応をpHの調整により制御し得ることが判明し,選択的なアフィニティーラベルの可能なことが示された.2.抗UDCA-7-NAG特異モノクローナル抗体の調製.抗メタタイプ抗体の調製に必要となる抗UDCA-7-NAGモノクローナル抗体を新規に調製した.すなわち,本ハプテンのウシ血清アルブミン結合体で免疫したA/Jマウスの脾細胞のP3/NS1/1-Ag4-1ミエローマ細胞と融合させて,目的抗体産生ハイブリドーマ株13種を樹立した.得られたモノクローナル抗体のうち,Ab-8-18は遊離型,グリシン及びタウリン抱合型UDCA-7-NAGに群特異的で,ELISAにおいていずれにも極めて高感度な検量線を与えた.さらに7位非抱合型肝汁酸との交差反応性はほとんど認められず,原発性肝汁性肝硬変症の診断に極めて有用と期待された.低分子化合物(ハプテン)の微量定量法として競合型イムノアッセイが汎用されているが,原理上,その測定感度には自ずと限界がある.そこで,抗原抗体複合体を特異的に認識する"抗メタタイプ抗体"という新たな概念を導入し,従来不可能とされてきたハプテンのサイドイッチタイプ非競合型イムノアッセイ法の確立を企てた.すなわち,モデルハプテンとして11-デオキシコルチゾール(11-DOC)及びウルソデオキシコール酸7-N-アセチルグルコサミニド(UDCA-7-NAG)をとりあげ,下記の研究を行った.1.抗11-DOCモノクローナル抗体のアフィニティーラベル.抗メタタイプ抗体を得るためには,目的ハプテンでアフィニティーラベルされた抗ハプテン抗体を免疫に用いることが必要である.そこで,11-DOCの4位に長さの異なるブリッジを介してカルボン酸パラニトロフェニルエステルを導入したラベル試薬2種を合成した.これら試薬は抗11-DOCモノクローナル抗体の抗原結合部位に対して11-DOCと同等の反応性を示した.また,タンパクのアミノ基へのラベル反応をpHの調整により制御し得ることが判明し,選択的なアフィニティーラベルの可能なことが示された.2.抗UDCA-7-NAG特異モノクローナル抗体の調製.抗メタタイプ抗体の調製に必要となる抗UDCA-7-NAGモノクローナル抗体を新規に調製した.すなわち,本ハプテンのウシ血清アルブミン結合体で免疫したA/Jマウスの脾細胞のP3/NS1/1-Ag4-1ミエローマ細胞と融合させて,目的抗体産生ハイブリドーマ株13種を樹立した.得られたモノクローナル抗体のうち,Ab-8-18は遊離型,グリシン及びタウリン抱合型UDCA-7-NAGに群特異的で,ELISAにおいていずれにも極めて高感度な検量線を与えた.さらに7位非抱合型肝汁酸との交差反応性はほとんど認められず,原発性肝汁性肝硬変症の診断に極めて有用と期待された.
強震時の地盤変状に対するライフライン構造物の終局耐力の評価

本研究は、都市直下に起こる強い地震動による地盤の液状化とライフライン構造物の終局耐力について明らかにすることを目的として、とくにライフライン構造物の耐震設計に必要な地盤剛性や継手剛性などのパラメータ特性や地盤変状対策効果に関する基礎資料を蓄積し、それらに基づく合理的な対策手法の評価手法と耐震設計手法の開発を目指すものである。前年度、飽和砂層模型地盤とパイプ模型を用いた液状化実験により液状化過程におけるパイプ-地盤間の地盤ばねの非線形復元力特性を把握し、また液状化時の地盤変状として永久変位に関する模型実験を行って、永久変位の解析手法及びこれを入力とするパイプの地震応答解析手法を構築した。これらの実験では振動締固めによる対策を行う場合も検討した。今年度は、以上の解析手法を用いて、2次元FEMでモデル化した種々の地盤の、有効応力解析と永久変位を解析し、液状化時の永久変位を受けるパイプの応答に関する数値計算を行った。モデル地盤の液状化解析では、既開発のサンドコンパクションパイル工法のシミュレーション手法を用いて地盤改良を行った場合についても検討した。このようなモデル地盤及びパイプの解析結果より、液状化時の地盤の永久変位の解析手法が実地盤における観測結果と概ね対応する妥当な手法であること、基盤傾斜角及び表層の厚さなど地盤のパラメータ、管種及び継手構造など管路のパラメータ、さらに地盤改良条件と、永久変位量及びパイプライン応答量との関係について明らかにした。さらに永久変位の最大値とパイプライン継手変位最大量との関係を見出すなど、強震時の地盤液状化に伴うライフライン構造物の応答とその耐震設計に重要となる終局強度のパラメータについて、液状化の対策工法の影響も含めて有意な成果を得た。本研究は、都市直下に起こる強い地震動による地盤の液状化とライフライン構造物被災との相互関係メカニズムと、それら構造物の終局耐力について明らかにすることを目的とする。とくにライフライン構造物の耐震設計に必要な地盤剛性や継手剛性などのパラメータと構造物の終局耐力との関係と、地盤変状対策効果に関する基礎資料を蓄積し、それらに基づく合理的な対策手法の評価手法と耐震設計手法の開発を目指すものである。まず、飽和砂層模型地盤とパイプ模型を砂箱中に設置して液状化実験を実施し、パイプ表面のせん断ひずみと加速度及び間隙水圧などを計測して、液状化過程におけるパイプ-地盤間の地盤ばねの非線形復元力持性について検討した。また液状化時の地盤変状として永久変位に関する模型実験を行い、永久変位の解析手法及び、これを入力とするパイプの地震応答解析手法を構築した。以上の解析手法は、地盤を2次元FEMでモデル化し、有効応力解析に基づいて永久変位を解析するものであり、また上記の模型実験の結果より得られる有効応力に対する地盤ばね定数の特性に基づいて、パイプを弾性床上のはりとして、液状化時の永久変位を受ける場合の応答を解析するものである。以上の解析手法を用いて設定したモデル地盤及びパイプの数値計算結果より、強震時の地盤液状化がライフライン構造物の応答へ与える影響及び耐震設計に重要となる終局強度等のパラメータについて検討するとともに、液状化の対策工法がそれらのパラメータに及ぼす影響についても検討を試みているが、この点は、次年度以降の課題として残された。

前年度、飽和砂層模型地盤とパイプ模型を用いた液状化実験により液状化過程におけるパイプ-地盤間の地盤ばねの非線形復元力特性を把握し、また液状化時の地盤変状として永久変位に関する模型実験を行って、永久変位の解析手法及びこれを入力とするパイプの地震応答解析手法を構築した。これらの実験では振動締固めによる対策を行う場合も検討した。今年度は、以上の解析手法を用いて、2次元FEMでモデル化した種々の地盤の、有効応力解析と永久変位を解析し、液状化時の永久変位を受けるパイプの応答に関する数値計算を行った。モデル地盤の液状化解析では、既開発のサンドコンパクションパイル工法のシミュレーション手法を用いて地盤改良を行った場合についても検討した。このようなモデル地盤及びパイプの解析結果より、液状化時の地盤の永久変位の解析手法が実地盤における観測結果と概ね対応する妥当な手法であること、基盤傾斜角及び表層の厚さなど地盤のパラメータ、管種及び継手構造など管路のパラメータ、さらに地盤改良条件と、永久変位量及びパイプライン応答量との関係について明らかにした。さらに永久変位の最大値とパイプライン継手変位最大量との関係を見出すなど、強震時の地盤液状化に伴うライフライン構造物の応答とその耐震設計に重要となる終局強度のパラメータについて、液状化の対策工法の影響も含めて有意な成果を得た。
電子情報のみを記述できる大規模・高精度・汎用的相対論的量子化学理論の開発

本研究では、(1)周期表上のあらゆる元素を含んだ大規模分子系の電子状態を高精度・高速・汎用的に計算できる理論/プログラムの開発を行い、(2)相対論効果による側面からの解析によりこれまで「重原子効果」と漠然と位置づけされてきた効果を具体的にすることを目標としている。本年度は(1)の理論開発を行った。具体的には相対論的なDiracハミルトニアンを2成分化(電子と陽電子を完全に分離)するためのユニタリー変換と相対論効果の局所性を考慮した「局所ユニタリー変換(LUT)法」を開発することで、計算律速であった2電子ハミルトニアンにおけるユニタリー変換を大きく高速化し、従来法よりも十倍以上の規模の電子状態計算が可能になった。また計算時間は系の大きさに対して線形(線形スケーリング)である。さらにLUT法による誤差はテストしたほぼすべての分子系で0.01kcal/mol以内であり、非常に高精度である。つまりLUT法により非相対論と同等の計算コストで、Dirac方程式の解と同等の精度を与える手法にすることに成功した。加えてLUT法を分割統治(DC)法や高速多重極展開法(FMM)と組み合わせることでSCFまで線形スケーリング計算を可能とし、さらに大規模な分子系への適用が可能となった。またより高精度な理論とすべく、本研究で用いている2成分化された相対論的ハミルトニアンに対応可能な電子相関理論の開発を行った。これには従来の制限・非制限Hartree-Fock (RHF, UHF)波動関数では表現できないスピンの混成を考慮するよう、一般化非制限HF(GUHF)波動関数を基盤にした拡張を行うことで可能とした。特に本研究ではMP2レベルでの電子相関を考慮した理論開発・プログラム実装を行った。その精度はDirac方程式を基盤にした手法による電子相関を99%以上再現し、非常に高精度であることが確認された。
アラキドン酸カスケードの代謝不全と血管病変に関する研究

脈管系におけるプロスタサイクリン(PG【I_2】)とトロンボキサン【A_2】(TX【A_2】)の生合成バランスの異常は種々の血管病変を惹き起こすことが動脈硬化症・糖尿病・心筋梗塞・脳梗塞などの血詮性疾患で証明されている。本研究は、(1)抗血栓効果をもつといわれるエイコサペンタエン酸(EPA)の効果の動物種差についてさらに検討を加えた。ラットおよびヒトの血管から中膜平滑筋細胞を採取し、培養の系に移した。培養液中にEPAを添加するとヒトの細胞ではPG【I_2】の産生量は減ったが、そのかわりにEPAからPG【I_3】がつくられた。これに対しラットの細胞ではPG【I_2】の産生量が減っただけでEPAからPG【I_3】がつくられなかった。PG【I_3】はPG【I_2】と同等の強い血小板凝集阻害活性をもっているので、EPAの効果がヒトとラットで異なる理由の一つがここにあると思われる。一方、EPAが存在するとヒトの血小板ではTX【A_2】の生成が強く阻害されたが、ラットの血小板ではそれほど阻害が見られなかった。このこともEPAがヒトでは有効だがラットには有効でない理由となるものと思われる。(2)中膜平滑筋細胞の遊走能亢進に及ぼすPDGFと12-HETEの作用の相互関係につき検討を加えた。その結果PDGFは中膜平滑筋細胞に作用した後、同細胞の12-HETE産生を介して、遊走能亢進作用を発揮することがわかった。中膜平滑筋細胞をインスリンを添加した培養液で培養しておくと、インスリンの濃度に依存して12-HETEの効果が促進された。これらの結果は、hyperglycemiaの患者においては、糖尿病や肥満の患者におけるが如く、動脈硬化が強く現われる事実と一致し、きわめて興味深いものである。
EMT-MET理論に基づいた新しい創傷表皮再生への試み

C57BL/6Jマウス背部に6mmパンチメスで肉様層に至る創傷を作成し、EMT誘導モデルとしてFGF2を連日局所投与し、創をday 2, 4, 6, 8, 10で回収し組織標本を作成した。まず表皮角化細胞遊走時(EMT)再上皮化時(MET)に至る形態変化についてHE標本で観察したところ、day4にて卵円形から紡錘形に変化し遊走する表皮角化細胞が最も顕著に見られ、再上皮化するday8以降はすべて卵円形に戻っていた。それぞれのタイミングにてEMTを評価し得る細胞骨格・接着分子としてpan-keratin, vimentin, E-cadherinの蛍光抗体法を行ったところ、day4にてEMTを想定させうる蛍光パターンが観察された。また同じタイミングの標本について、EMT関連転写因子としてSnail, Slug, Twist,βcatenin, Claudin1, Notch1の免疫染色をしたところ、Snail, Slug, βcateninはday4をピークとして蛍光を示したがday8では消失しており、他の分子はいずれのタイミングにおいても明瞭な蛍光を示さなかった。当初の予定どおり、in vivoモデルを用いた実験を行い、概ね解析は終わっている。予備実験において、創全体のEMT関連蛋白をPCR arrayでスクリーニングしている。その中で、一般的にEMT(あるいはMET)誘導に関わるサイトカイン(TGFβ, EGF, HGF, FGFなど)の経時的定量をRT-PCR及びwestern blotで行う。それまでの検討で注目したEMT-MET関連分子あるいは誘導蛋白について、in vitroで検討を行う。HaCaT cellあるいはprimary keratinocytesを、まずはEMT誘導蛋白添加培養して、scratch migration assayを行い、細胞遊走能の評価、EMT関連分子の発現を確認する。また、注目したEMT関連転写因子の遺伝子をトランスフェクションし細胞内で蛋白を過剰発現させ、EMTに至るか形態学的及び免疫染色にて確認、さらにその蛋白を阻害剤にてノックダウンしEMTからMETし元の細胞性質に戻り得るかを検討する。本年度は国際学会への研究データ発表機会がなかったこと、実施予定であったin vivoモデル検体のwestern blotを次年度に実施するため、必要な抗体等を購入する予定である。
ウイルスの標的組織決定における攻防

ウイルスはそれぞれの標的組織に好んで感染するが、標的組織はウイルス受容体などの感染を促進する因子群と自然免疫系などのウイルスを排除しようとする因子群とウイルスがいかに折り合うかという攻防によって決定される。本研究では、インターフェロンラムダがポリオウイルスの消化管における感染防御における重要であることを明らかにした。また、Scavenger receptor B2(SCARB2)やヘパラン硫酸プロテオグリカン(HS-PG)はEV71受容体として知られているが、SCARB2はEV71の種特異性を決定していることを示した。一方HS-PGは個体内でのウイルス病原性発現を負に制御していることを示した。ウイルスの感染の成立・不成立は宿主細胞において、ウイルス受容体やウイルス複製に必要な宿主因子など増殖に対して正に働く因子群と自然免疫系などのウイルスを排除しようとする負の因子群が存在する中でのウイルスと宿主の攻防の結果決定される。マウスはポリオウイルスや近縁のエンテロウイルス71に非感受性であるが、ヒトウイルス受容体を発現させたトランスジェニックマウスはウイルス感受性を獲得する。このことを利用し、ウイルス受容体の発現分布や自然免疫系の発動箇所を人為的に変化させ、組織の「感染コンピテンシー」が従来と異なったマウスモデルを作製する事が可能である。本研究課題では、このようなマウスモデルを用いて、網羅的な遺伝子発現解析などを用いたウイルスの病態変化、および数理モデル理論を活用することで、ウイルス固有の組織特異性を規定するメカニズムや防御の破綻による重症化機構を明らかにすることを目標とする。昨年度までにヒトSCARB2を発現するTgマウスを作成し、神経系へのトロピズムが再現できた。しかし、このマウスモデルは多量のウイルスを接種しないと発症しない難点ああるため、今年度はよりSCARB2発現量が高くなると考えられるノックインマウスの作製を開始した。マウスの改良は現在進行中である。これまでのSCARB2Tgマウスモデルを自然免疫系ノックインマウスと交配を行った。ノックアウト系統はほぼ出来上がり感染感染実験を開始した。ポリウイルス受容体(PVR)Tgマウスを用いて、粘膜感染でのラムダインタフェロンの重要性を調べた。ラムダインターフェロンの受容体であるIL28RAをノックアウトしたマウスは経鼻感染を行うとウイルス抵抗性が低下した。また鼻を含む上顎部組織でのIFN応答が低下することが証明でき、この経路でのラムダインターフェロンの重要性を明らかにすることができた。ポリオウイルスレセプタートランスジェニックマウス(PVR-tg)マウスモデルを用いて、III型インターフェロン(IFN)による感染阻止の機構を解析した。III型IFNはI型IFNと異なったIFN、異なった受容体を介して作用し、上皮細胞で主に作用していることが知られている。従ってポリオウイルスの粘膜上皮での感染において防御効果を示すことが期待される。III型IFN受容体を破壊したIFNLR1 KOマウスをPVR-tgマウスと交配し、III型IFN応答を欠損したPVR-tgマウスを作製した。このマウスにポリオウイルスを胃内接種、経鼻接種を行い、マウスの生存率、臓器でのウイルス増殖、IFN応答などを調べた。胃内接種においてはIFNAR1 KOよりもIFNARl-IFNLR1 DKOマウスがより高い死亡率、小腸でのウイルス増殖を示した。しかし、小腸においてはIFN-stimulated gene(ISG)の上昇など明確なIII型IFN応答を確認することができなかった。経鼻接種においては、WTマウスにおいて、ポリオウイルス接種時に呼吸部の上皮細胞においてISGの一つであるMx1の上昇が観察された。WTと比較してIFNLR1 KOは高い死亡率、鼻を含む上愕部でのウイルス増殖をしめした。また、呼吸部円柱上皮はIII型IFN投与によって最もよくIFN応答を示すが、この部位においてIFNLR1 KOマウスのウイルス抗原の検出頻度は上昇した。またISGの誘導はTLR3依存的に上昇することが示された。一方粘膜上皮の感染を経由しない脳内接種や静脈接種時にはWTとIFNLR1 KOにおいて生存率などで顕著な違いは見出されなかった。これらのことからポリオウイルス感染時において、III型IFNは主に上皮細胞においてウイルス増殖を抑制する機能を担っていることが明らかになった。ポリオウイルスレセプタートランスジェニックマウス(PVR-tg)マウスモデルを用いてIII型インターフェロン(IFN)による感染阻止機構を解析した。III型IFNはI型IFNと異なったIFN、並びに受容体を介して作用し、主に上皮細胞で作用していることが知られている。そこでPVRtg21マウス系統とIFNAR1ならびにIFNLR1ノックアウトマウスを交配し、I型、III型IFN応答を欠損するPVRマウスを作製した。これらのマウスに胃内接種、経鼻接種によりポリオウイルスを接種し応答を観察した。胃内接種においてはWT, IFNAR1 KO, IFNLR1 KOにおいて消化管での顕著なウイルス増殖は観察されなかったが、DKOマウスにおいてウイルス増殖が観察された。ウイルス増殖部位を免疫組織化学で調べたところウイルス抗原は上皮細胞には検出されず、パイエル板のマクロファージにおいて観察された。このことから消化管における宿主I型並びにIII型IFN応答とポリオウイルスの攻防が、体内伝播の成否を左右するキーポイントであると考えられた。

しかし、この感染モデルにおける作用点は上皮細胞ではなく、パイエル板内である可能性が示された。経鼻感染経路においてはIII型IFN KOによって呼吸部上皮細胞のウイルス感受性が増大した。このことから鼻粘膜におけるIII型IFN応答がポリオウイルス防御に重要であると考えられた。今年度ポリオウイルスとIII型IFN応答の関係についてはほぼ論文投稿が可能な程度までの進捗が見られた。特に小腸パイエル版でのウイルス感染部位が同定できたことが重要な点である一方でPVRtg55マウスを用いた中枢神経系でのウイルス増殖における攻防の研究が進展しなかった。これはPVRtg55マウスならびにそれとIFN応答経路のノックアウトマウスとの交配系統の繁殖が不調に陥り、系統維持が困難になったことが挙げられる。野生型との交配を行って遺伝子型を維持し、再度マウスのホモ化を行ったりしたために遅れが生じている。エンテロウイルス71(EV71)の受容体と病原性の関係について研究を行った。EV71受容体として細胞への結合、侵入、脱殻を行う分子としてScavenger receptor B2 (SCARB2)が同定されているが、これ以外にヘパラン硫酸プロテオグリカン(HS-PG)などがいわゆるattachment receptor (結合はするが脱殻反応は起こさない)として同定されている。Attachment receptorはウイルスの細胞への結合能力を上昇させるため、感染効率や病原性に影響を与えると考えられているが、実証されていない。EV71のVP1の145番目のアミノ酸がGluである株とGlyである株はウイルス粒子の5回対称軸付近の電荷分布が変化するため、Gly株だけが静電的相互作用によりHS結合性を示す。この変異はSCARB2を介しての結合や感染には影響はないが、HS-PGを発現しているRD細胞ではGly株の増殖が有利となり、HS非結合型のGlu株をRD細胞で継代することによりウイルスは非常に早くHS結合型へ変異する。ところが予想に反してGlu株はSCARB2tgマウスにおいて強毒性を示し、Gly株は弱毒性を示した。解析の結果、HS結合性株はマウスに静脈内接種を行った直後から血中のウイルス濃度が低下し、体内での増殖が悪かった。HS結合性株は細胞外マトリクスに存在するHSやHSを高レベルで発現しているがSCARB2の発現が低い細胞などに吸着されてしまうため、有効な感染が行えなくなるためと考えられた。ウイルスは絶えず変異を蓄積し、細胞への結合や侵入のコンピテンシーを上昇させようとしている。そのため培養細胞ではHS結合型の株が優位になるが、個体レベルではHSのようなある種のattachment receptorの利用はウイルスの生存や病原性に負の影響を持つことが明らかになった。ウイルスの感染の成立・不成立は宿主細胞において、ウイルス受容体やウイルス複製に必要な宿主因子など増殖に対して正に働く因子群と自然免疫系などのウイルスを排除しようとする負の因子群が存在する中でのウイルスと宿主の攻防の結果決定される。
コンピュータを利用した高専用化学工学学習システムの開発

1.汎用化サブルーチンとそれを利用した化学工学学習システムの開発高専レベルの化学工学分野で多用される各種数値計算法と三角座標などのコンピュータグラフィックス(CG)手法をFORTRAN77とBASICで汎用性のあるサブルーチンを開発した.そしてこれらのサブルーチンを利用して多数の化学工学学習プログラム(流動25,伝熱19,蒸発1,蒸留9, )を作成した.これら全てのプログラムを1つの大プログラムにまとめ上げることによって,キー入力のみで任意のプログラムを呼び出して実行し,その計算結果をカラフルなCGで表示できるようにシステム化した.2.ビデオ映像の利用実操業下のカセイソーダ濃縮用の多重効用蒸発缶のビデオ映像とその操作条件などの音声をパソコン画面にスーパーインポーズして,設計の計算結果のグラフィックス表示と対照させることによって学生の化学工学理解を促進できる学習システムを開発した.3.シミューレータの開発吸着・化学反応・蒸留などの複雑な化学現象を確率過程とみなし,それにモンテカルロ法を適用しその計算の途中経過をパソコン画面上に文字キャラクタ群で表わすビジュアル・シミュレータを開発した.これによって平衡とそれに達するまでの遷移過程の概念を可視的に理解させることが可能となった.また化学反応装置内の発熱反応をスタートアップから定常運転までのプラントオペレーションを安全にかつより速く行う教育訓練用シミュレータを,ポンプの起動・停止,バルブの開閉および反応装置内の温度制御をCRT上に指先で軽く触れるだけで可能なタッチスクリーンを使用して開発した.「視覚と触覚に訴える」新しい高専用のコンピュータを利用した化学工学学習システムは,数高専の化学工学教育に試用されて高い評価を得ている.1.汎用化サブルーチンとそれを利用した化学工学学習システムの開発高専レベルの化学工学分野で多用される各種数値計算法と三角座標などのコンピュータグラフィックス(CG)手法をFORTRAN77とBASICで汎用性のあるサブルーチンを開発した.そしてこれらのサブルーチンを利用して多数の化学工学学習プログラム(流動25,伝熱19,蒸発1,蒸留9, )を作成した.これら全てのプログラムを1つの大プログラムにまとめ上げることによって,キー入力のみで任意のプログラムを呼び出して実行し,その計算結果をカラフルなCGで表示できるようにシステム化した.2.ビデオ映像の利用実操業下のカセイソーダ濃縮用の多重効用蒸発缶のビデオ映像とその操作条件などの音声をパソコン画面にスーパーインポーズして,設計の計算結果のグラフィックス表示と対照させることによって学生の化学工学理解を促進できる学習システムを開発した.3.シミューレータの開発吸着・化学反応・蒸留などの複雑な化学現象を確率過程とみなし,それにモンテカルロ法を適用しその計算の途中経過をパソコン画面上に文字キャラクタ群で表わすビジュアル・シミュレータを開発した.これによって平衡とそれに達するまでの遷移過程の概念を可視的に理解させることが可能となった.また化学反応装置内の発熱反応をスタートアップから定常運転までのプラントオペレーションを安全にかつより速く行う教育訓練用シミュレータを,ポンプの起動・停止,バルブの開閉および反応装置内の温度制御をCRT上に指先で軽く触れるだけで可能なタッチスクリーンを使用して開発した.「視覚と触覚に訴える」新しい高専用のコンピュータを利用した化学工学学習システムは,数高専の化学工学教育に試用されて高い評価を得ている.昭和61年度に研究された高専用化学工学学習システムは次の通りである。1汎用化されたサブルーチンの開発連立一次方程(5種),非線型方程式(11種),近似と補間(5種),数値微分と数値積分(5種),微分方程式(11種)の解法についてのFORTRAN 77による汎用化されたサブルーチンを作成した。そしてこれを利用した化学工学演習用プログラムを多数開発し、その一部を著書として公刊した。プログラム開発にあたっては、パーソナルコンピュータと周辺機器(購入品)を電子計算機センターのホストコトピュータと回線で接続し端末装置として利用した。2コンピュータグラフィックスの開発普通目盛,半対数,両対数および三角座標のグラフ作成の汎用化されたBASICプログラムと、化学工学実験のデータ処理のためのプログラムを多数開発した。さらに、パーソナルコンピュータとビデオ関連機器(VTR,ビデオコンバータ,イメージメモリ,イメージスキャナ等は購入品)との接続については、パソコンのグラフィックスをVTRに移すことによる化学工学学習プログラムは数本完成した。来年度は、ビデオ映像をパソコングラフィックスに移すこととタッチスクリーンを利用した学習システムを開発する予定である。3データベースとシミュレータの開発小型ではあるが、熱力学定数のデータベースを作製した。これを利用した反応平衡,化学平衡の計算結果をグラフィッス表示するプログラムを作成した。以前に作成された吸着,蒸留,反応過程のビジアル・シミュレータを高専学生レベルに適した化学工学学習用に改造中である。来年度はデータベースの規模をさらに拡充する予定である。
正10角形準結晶とその近似結晶相の構造の多次元投影法による解析

本研究プロジェクトは,これまで高分解能電子顕微鏡法およびX線回折法で進めてきた準結晶および周辺結晶相の構造解析に,多次元周期格子を3次元空間に置き直す投影法を連携して,準結晶および周辺結晶相の構造を総合的に解釈することを目的としている.本研究では,当初の研究計画に基づきAl-Co-Ni-Tb系およびAl-Rh-Cu系正10角形準結晶の構造解析を行った(既報).Al-Co-Ni-Tb系準結晶の研究では,構造が5回対称を有するタイル張りによって説明できること,また,新たにS1型の長周期反射が観測できたなどの研究成果をあげることができた.研究代表者らは,正10角形準結晶の構造単位として,新たに星形クラスター,クラウン形クラスターおよび六角形クラスターを提唱し,これらのクラスターによって多くの準結晶の構造がモデル化できることを示した.Al-Rh-Cu系準結晶の研究では,さらに準結晶の構造的研究をすすめ,本研究で提唱した3種類のクラスターを構成する原子配列のモデルを提唱し,高分解能電子顕微鏡法で得られた構造像とシミュレーションによって得られた構造像とを比較検討することによって,Al-Rh-Cu系準結晶の基本的な構造を原子レベルで明らかにした.本研究プロジェクトは,これまで高分解能電子顕微鏡法およびX線回折法で進めてきた準結晶および周辺結晶相の構造解析に,多次元周期格子を3次元空間に置き直す投影法を連携して,準結晶および周辺結晶相の構造を総合的に解釈することを目的としている.本研究では,当初の研究計画に基づきAl-Co-Ni-Tb系およびAl-Rh-Cu系正10角形準結晶の構造解析を行った(既報).Al-Co-Ni-Tb系準結晶の研究では,構造が5回対称を有するタイル張りによって説明できること,また,新たにS1型の長周期反射が観測できたなどの研究成果をあげることができた.研究代表者らは,正10角形準結晶の構造単位として,新たに星形クラスター,クラウン形クラスターおよび六角形クラスターを提唱し,これらのクラスターによって多くの準結晶の構造がモデル化できることを示した.Al-Rh-Cu系準結晶の研究では,さらに準結晶の構造的研究をすすめ,本研究で提唱した3種類のクラスターを構成する原子配列のモデルを提唱し,高分解能電子顕微鏡法で得られた構造像とシミュレーションによって得られた構造像とを比較検討することによって,Al-Rh-Cu系準結晶の基本的な構造を原子レベルで明らかにした.
分子標的発見による肝臓強化新療法の基礎的研究

全身に発現するのではなく、化学発癌系の利用できる肝臓にRb遺伝子を発現するために主に肝臓で発現しているHepatocyte Nuclear Factor-1 (HNF-1)遺伝子プロモーターの支配下にヒトRb遺伝子を連結して、トランスジェニックマウスを作製し、2系統のトランスジェニックマウスを得た。A系統のマウスはトランスジーンを1倍体当たり11コピーもち、B系統のマウスは1倍体当たりトランスジーンを4コピーもっていた。A系統、B系統のマウス肝臓および野生型マウス肝臓より肝臓抽出液を調製し、SDS-アクリルアミドゲル電気泳動で蛋白を分離した後、各種抗体を用いてウエスタンブロット法にて、関連蛋白質の変化を検討した。アポトーシス蛋白であるカスペース1,カスペース3,や増殖関連蛋白p53,E2F1,E2F2,E2F3,E2F4,E2F5などに変化がなかった。アポトーシスに関わるBc12,Bc1-XL,Bc1-XS,Bad,Bidにも変化がなかったが、アポトーシス促進に働くBax蛋白がトランスジェニックマウス肝臓では野生型マウス肝臓に比して、著名に減少していることとが判明した。このことは,Rbトランスジェニックマウスでは、アポトーシス促進作用のあるBaxが著減しているため、全体として抗アポトーシス状態を呈していることが明らかになった。一方、化学発癌に対する抵抗性を担う分子については、種々の癌遺伝子や癌抑制遺伝子について検索したが、有意な変化を示す遺伝子は発見できなかった。今後の計画としては、A系統マウス肝臓からのRNAと野生型マウス肝臓からのRNAを用いて、マウス遺伝子2万個をのせてあるDNAマイクロアレイにより標的分子を網羅的に探索する予定にしている。Rb蛋白を肝臓に大量に発現するトランスジェニックマウスではアポトーシスを誘導する抗Fas抗体やTNFα投与時におこる劇症肝炎が起こらないことが判明した。次に、このトランスジェニックマウスが化学発癌抵抗性を示すかどうかを検討した。化学発癌にはRbトランスジェニックマウス雌とC3H雄のF1(遺伝的背景:B6C3F1)を用いる。F1の内、ヒトRbトランスジーンを持たないマウスをコントロール、トランスジーンを持つマウスを実験とする。肝臓化学発癌プロトコールは以下のようにする。まず、生後6週齢のマウスにジエチルニトロソアミン(DEN)を腹腔内投与し、1週後からフェノバルビタール含有水を35週継続飲水させる。コントロールマウス、Rbトランスジェニックマウス肝臓の病理標本を作製し、腫瘍性病変の性質、悪性度、頻度を検討した。コントロールマウスでは、肝細胞癌と多数の結節が誘導された。Rbトランスジェニックマウスでは、結節数が明らかに減少した。また、肝細胞癌の出現は認められなかった。以上の結果から、Rb蛋白は生体の中では、発癌抑制に働いていることが明らかになった。
マクロファージ由来の生理活性物質による脂肪蓄積制御機構の解明

申請者らが作出したマクロファージ特異的グアニリン/GC-Cダブルトランスジェニックラット(dTg)は高脂肪食に耐性を示す。本研究では、dTgラットから採取したグアニリン/GC-C発現マクロファージの炎症性マーカー(M1)を検討したところ、高脂肪食を摂取してもM1マーカーの発現が低いことが認められた。また、グアニリン/GC-C発現マクロファージは飽和脂肪酸によりグアニリンおよびGCーCの発現が増加し、脂肪酸に対して走化性が高いことから、グアニリン/GC-C発現マクロファージは脂肪酸に特異的な性質を持ち、炎症を阻止する機構が作動することで、慢性炎症や肥満を制御している可能性が示唆された。申請者は、高脂肪食を摂取しても肥満を呈さない肥満抵抗性ラットの解析から、内臓脂肪組織内マクロファージにおいて、生理活性ペプチド;グアニリンと、その受容体であるグアニリル酸シクラーゼC(GC-C)が高発現していることを見出した。さらに、グアニリン/GC-Cをマクロファージ特異的に発現させたダブルトランスジェニック(Tg)ラットを作製し、同Tgラットも肥満抵抗性であることを明らかにしてきた。近年、内臓脂肪型肥満の基盤病態として脂肪組織に浸潤したマクロファージなどの炎症性細胞が慢性炎症を引き起こし、肥満をさらに進行させることが知られている。本研究では、Tgラットが肥満抵抗性を示す機序を解明するために、グアニリン/GC-C発現マクロファージの機能的な特性とグアニリン/GC-Cの発現調節機序について検討した。Tgラットから採取した腹腔内マクロファージは野生型と比べ、脂肪酸に対する遊走能が高く、炎症性マーカーであるCD11c, IL-1およびMCP-1が有意に低いことが明らかになった。さらに、グアニリン/GC-C発現マクロファージは、飽和脂肪酸処理によりグアニリンおよびGC-CのmRNAの転写が顕著に増加した。また、これらの転写制御には、NF-kBが関与しており、それぞれのプロモーター領域に存在するNF-kB binding siteにNF-kBが結合することで制御されていることが明らかになった。申請者が作出したマクロファージ特異的グアニリン/GC-Cダブルトランスジェニック(dTg)ラットは高脂肪食を摂取しても肥満を呈さない。本研究では、グアニリン/GC-C発現マクロファージの炎症状態における特性を明らかにするとともに、同マクロファージの産生する肥満制御因子を探索し、グアニリン/GC-C/cGMPシステムの新たな脂肪蓄積制御機構を明らかにすることを目的とした。dTgラットおよび野生型(WT)ラットの脂肪組織からマクロファージを含む間質血管細胞群(SVF)を分離し、M1およびM2マーカーを検討したところ、WTラットでは、高脂肪食摂取によりM1マーカーの増加が認められたが、dTgラットではM1マーカーの増加は認められなかった。また、dTgラットから採取した腹腔内マクロファージでは、脂肪酸に対する走化性が高いことが明らかになった。マクロファージのグアニリンおよびGC-CのmRNA発現は、不飽和脂肪酸により顕著に増加したが、NF-kB阻害剤の添加により濃度依存的に抑制された。また、ゲルシフトアッセイにより不飽和脂肪酸によるグアニリンおよびGC-Cの転写調節はNF-kBを介していることを明らかにした。これらの結果から、グアニリン/GC-C発現マクロファージは脂肪酸に特異的な性質を持ち、炎症を阻止する機構が作動することで、慢性炎症や肥満を制御している可能性が示唆された。研究目的に則し、グアニリン/GC-C発現マクロファージの機能的特性やマクロファージにおけるグアニリン/GC-Cの発現調節機序を明らかにできた。内分泌学、代謝学グアニリン/GC-Cシステムの細胞内シグナルの検討および脂肪の蓄積抑制に機能するグアニリン/GC-C発現マクロファージ由来の液性因子の探索を進めている。実験の進捗状況により、一部の実験は来年度に行うため次年度に繰り越した。次年度の物品費として使用する予定である。