hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
紙テキストとWeb学習環境を融合した効果的な振り返り学習支援方法の開発

学習者が積極的に学習を継続させ成果を生み出すには、学習意欲を維持し自律的に学習に取り組む必要がある。本研究では、伝統的な「紙テキスト」と「Web学習」を融合した学習環境を構築するとともに、「授業での学習」と「授業外の学習」を連動させた自律的な振り返り学習モデルを考案した。また、学習教材は学習者の多様な興味・関心に合致するよう、一般的な教材だけでなく、学習者の専門分野に関連した内容や英文学作品など幅広い教材を活用できるように準備した。それらの学習モデルを評価する実験を繰り返し、授業と振り返り学習を効果的に支援するための学習システムと学習モデルを開発し、実験授業を通してその効果を確認した。紙テキストを用いた英語学習(以下、「紙による学習」)は、教育実践の長い歴史の中で多くの効果的な学習法を生み出してきた。しかしその一方で、最近ではe-learningの急速な普及に伴い、CDなどの電子媒体に加え、VoD(Video on Demand)やWBT(Web Based Training)などが英語学習(以下、「Web学習」)において広く活用されるようになってきている。この新しい学習法の流れは、前者の秀でた伝統的な学習法とは競合関係にある。しかし、いずれか一方の学習法が優先的に普及していくのではなく、それぞれの学習方法の優れた部分を融合させた効果的な学習法を開発する可能性もある。本研究では、前述した2つの学習法を融合させ、両者の特徴を活かした効果的な英語学習法を開発することを目的としている。そして、授業の中で長年実践されてきたNote Taking手法を用いた「紙による学習」と、そのようにして学習した内容の理解を深めるためにWebを利用した「Web学習」を併用して実施することで、新しい学習法を開発する。それら連続した学習の流れが、学習者の理解を深め、かつ自律的・自発的な学習行動を促すことを意図している。Web学習は、Web環境があれば、学習内容をいつでも好きな時に記録・保存・閲覧することが可能である。その特徴を活かし、学習者はいつでもどこでもそれらの記録を活用した「自律的振り返り学習」を実施することができる。そのような学習の流れを円滑に実施する仕組みと、それを支援する「総合英語Web学習支援システム」を開発した。今年度は学習実験を行なった際Web理解度テストにおいて問題表示に時間がかかったため、利用者が多い場合のデータ信号のスムーズなやり取りについてUniversity of LeedsのLanguage Centre担当者に相談し、助言をいただいている。紙媒体のテキストを用いた学習法(以下、「紙による学習」)は教育実践の長い歴史の中で数多くの効果的な学習手法を生み出してきた。しかしその一方で、昨今はe-learningの急速な普及に伴いWebや学習ソフトを用いてパソコン、スマートフォンなど多様な端末に対応した学習法(以下、「Web学習」)が積極的に採用されるようになってきている。英語学習もその例外ではない。こうした新しい学習法の流れは、前者の伝統的な学習法とは競合関係にあると言える。しかしいずれか一方の学習法だけを優先的に採用するのではなく、それぞれの特徴を生かして優れた部分を融合させ、効果的な英語学習法を開発することが本研究の目的である。平成27年度は、前年度に作成したシステムを用いて実際の授業に導入し学習実験を通してシステムの不具合や利便性を改良した。具体的には、「Web理解度テスト」の実施等、大人数での授業内の一斉使用に耐えられるようシステムを強化したり、教授者による学習教材登録の簡便化などの対策を行った。システムの強化に関しては、前年度末にイギリスのUniversity of LeedsのLanguage Centreに出張した際、同大学で大人数の学習者向けに提供しているe-learningプログラム担当者の助言を元に、今年度試行して実験授業での導入に耐えるものを用意することができた。同時に実験授業ではNote Takingの手法を用いた「紙による学習」を併用し、学習内容をいかに「Web学習」と効果的に連動させるかを検討した。学習者アンケートに基づき、紙媒体の教材についても改良を行っている。しかし、今年度の研究実績としてはシステムの改良や学習実験に終始した感が強く、実験授業による学習結果の分析やそれに基づいた研究成果の発表には取り組む時間を充分に取ることができなかった。前年度に作成した教材データベース、学習活動データの採取・提示システム等を統合したWeb学習支援システムは、予備実験の段階で大人数での一斉使用の際に問題が生じることがわかり、その対策にかなりの時間を費やした。具体的には「Web理解度テスト」を授業内で一斉受験した際に、設置されている大学のサーバのセキュリティ対策の関係で特定のサイトにアクセスが集中したため学習者がスムーズに解答できない事態が発生した。「Web理解度テスト」は各学習者の学習成果を測るためのデータを採取する重要な機能であり、またWeb教授法の効果を分析するための要でもあり、修正は必須であった。さらに学習者が「紙による学習」の学習内容をWeb上に転記する際に英文内の入力個所がうまく表示されないなどの不具合があり、「Web理解度テスト」と合わせてそれらへの対応、解決策の模索、システムの改善に予想以上に多くの時間と労力がかかった。多様な機能と複雑な構造をもったシステムであるため解決に一定の時間がかかるのは避けられないが、授業内・授業外で多くの学習者の使用に耐えるものにするために欠かすことのできない作業である。しかしそのため当初の研究計画よりも遅れを取っている。英語学習においては、紙ベースの教材を用いた「紙による学習」が長く行われ、その伝統の中からNote-Taking手法などの学習法が実践されてきた。

その一方で、ICTの普及に伴い電子媒体によるWebを活用した学習法も急速に普及してきている。本研究では、「紙による学習」と「Web学習」を融合させ、両者の優れた特徴を活かして独自の効果的な学習方法を開発した。この学習法では、授業と授業外の学習を連動させ、授業外においても学習者が自律的な振り返り学習ができる指導法を考案した。また、Note-Taking手法を活かした紙ベースの「調べ学習」から、その理解度を確認するための「Web理解学習」、データベースを活用した学習履歴(英文、和訳、語彙などの入力情報)に基づくサポート支援などを組み込んだ「英文法Web学習支援システム」と「総合英語Web学習支援システム」を開発した。さらに、Web学習支援システムで利用するための教材開発にも取り組んだ。「総合英語Web学習支援システム」では、基礎から実践まで多様なレベルに対応できる英語教育を目指しており、英語4技能の育成のために、基礎的な英語学習用として(株)浜島書店から教材提供を受け、それに基づくネイティブスピーカによる音声を組み込んだ学習教材を開発した。その他にも、実践的な英会話や英文学などの専門教育に向けた教材作成に取り組み、イギリスUniversity of LeedsのLanguage Centreの協力を仰ぎ、多様な英語学習教材の開発を目指した。イギリスでは英語学習を英文学研究に結びつけていくための資料収集も行ない、教材開発に利用した。そして、開発したWebシステムは複数の大学に公開提供し、学習実験による成果は学会発表や論文投稿を通して公表する予定で作業を進めている。現在、本格的な公開を目指したWebサイトの準備も行っている。学習者が積極的に学習を継続させ成果を生み出すには、学習意欲を維持し自律的に学習に取り組む必要がある。本研究では、伝統的な「紙テキスト」と「Web学習」を融合した学習環境を構築するとともに、「授業での学習」と「授業外の学習」を連動させた自律的な振り返り学習モデルを考案した。また、学習教材は学習者の多様な興味・関心に合致するよう、一般的な教材だけでなく、学習者の専門分野に関連した内容や英文学作品など幅広い教材を活用できるように準備した。それらの学習モデルを評価する実験を繰り返し、授業と振り返り学習を効果的に支援するための学習システムと学習モデルを開発し、実験授業を通してその効果を確認した。平成26年度は1「調べ学習」の開発、2「Web理解学習」の開発、3Webデータベースの開発、4「自律的振り返り学習」の開発、5Web学習支援システムの開発、6紙テキストやWebテキストなどの学習教材の開発の6つを予定していた。このうち1「調べ学習」の開発については実際の授業で紙テキストを用いて実践的に行なっている。6の紙テキストやWebテキストなどの学習教材の開発についても、教材提供を受けている(株)浜島書店の教材を元に、英文テキスト、和訳、語彙、配布用紙テキスト、問題など部品ごとにWebデータベースに登録できる形で実験授業に必要な分を用意できている。
シアル酸の付加を受けた粘液多糖類による腸管寄生虫排除の発現

マウスにおける腸管寄生虫Nipponstrongylus brasiliensis(以下Nb)の排除が、ラットで提唱されている二段階を経ているのかどうかについて検討し、マウスではStat6非依存性にNbを傷害する(ラットでの第一段階)ものの、この傷害は排除に必須ではなくStat6に依存した腸管の変化、おそらく杯細胞の変化、が排除に重要であることを示した。2.マウスにおけるNb排除は杯細胞の産生するシアル化粘液多糖類に依存する論文1でNbの排除に杯細胞の関与を示唆した。そこで、感染による杯細胞内粘液多糖類の糖鎖末端の変化を組織レクチン染色から検討した。その結果、IL-13/Stat6経路誘導性に糖鎖末端にシアル酸が付加すること、および特定のシアル酸転移酵素の発現増強がNbの排除と一致することを示した。3.今後の課題腸管寄生虫の実験モデルを代表するNbの系を用いて、排除に関わる分子を提唱することができた。現在、シアル化転移酵素の発現調節によるNb排除への影響と、杯細胞におけるStat6活性化および粘液多糖類のシアル化の時期について検討中であり、これらの結果を発表する予定である。また、杯細胞より放出されたシアル化粘液多糖類がどのようにNbに作用して腸管からの排除を引き起こしているのかが今後の大きな課題である。さらに、粘液産生細胞株におけるIL-13誘導性の粘液産生の亢進およびシアル化の機序についても解析して行きたい。レクチンによる組織学的検索から特定のシアル酸結合様式をもった粘液多糖がマウスの腸管寄生線虫Nippostrongylus brasiliensis(Nb)排除に関与していることが示唆されたことから、この点について深く検討することにした。したがって当初の研究計画の一部は遂行を停止/延期した。1.シアル化した粘液多糖の虫体への影響マウスから排除される直前のNbをマウス、あるいはラットの腸管に移植しなおすと45日はレシピエントの腸管に定着することから、シアル化した粘液多糖はNbに対して致命的な傷害を与えていないことが示唆された(石渡、中村;論文投稿中)。2.シアル酸の結合様式特異性の検討シアル酸(Sia)の結合様式に依存して結合するレクチンを用いて、Nb排除に関与する粘液多糖を組織学的に検討したところ、Siaα2,3-lactosamineを糖鎖末端にもつ杯細胞内粘液多糖の発現がIL-13誘導性のNb排除と一致して認められた(石渡)。3.シアル酸転移酵素の発現の検討シアル酸α2,3の位置に結合させるシアル酸転移酵素のうち、小腸に発現することが予想されるST3Gal IIIおよびIVのmRNA転写についてIL-13の作用を検討した。その結果、生理的な状態ではほとんど見られないST3Gal IVの転写がIL-13投与によって増強されることが明かとなった。ST3Gal IIIの転写も生理的な状態でほとんど見られず、IL-13投与で変化が見られなかった。さらに、Nbを排除できないscidマウスにIL-13を投与して排除できるようにしたグループでST3Gal IVの転写増強が認められた(石渡が渡米しDr.Urbanとともに行う;論文投稿中)。以上の結果は、IL-13誘導性にST3Gal IVが発現し、この酵素によって合成されたSiaα2,3-lactosamineを糖鎖末端にもつ粘液多糖がNbの排除に関与していることを示唆している。これらの成果は消化管寄生線虫の排除に関与する因子およびその過程を初めて明らかにするとともに、IL-13の新たな作用(糖化)を見い出した点で画期的である。Nippostrongylus brasiliensis (Nb)の腸管からの排除に、シアル化した粘液多糖(Siaα2,3-lactosamineの糖鎖末端への発現)が重要であることを平成13年度の成果として報告した。今年度はその直接的なデータを得るために以下のような実験を行った。

(主な研究担当者)2.Siaα2,3-lactosamineの生成阻害物質あるいはα2,3シアル酸転移酵素活性賦活剤のNb排除への影響;阻害物質としてGalNAc-α-O-benzyl(Huet et al. 1995)、賦活剤としてretinoic acid(Reboul et al.1996)を感染マウスに投与し、Nbの排除時期の変化を見た。2通り(経口および腹腔内)の投与方法を用いたところ、ともに阻害剤投与で排除の遅延、賦活剤投与で促進の傾向を示したが、有意な差まではとれなかった。(石渡)3.粘液産生細胞株(HT-29)へのIL-13投与による粘液産生パターンの変化;HT-29は未熟な細胞なため、小腸タイプの粘液産生細胞へと誘導するのに培養条件を徐々に変化させる必要がある。入手した細胞株を型通り培養したが、ある時点までくるとその次の段階に進めるのが困難であった。したがって、現時点では未だ小腸タイプの粘液を産生するHT-29を確立しておらず、IL-13の効果が観察できていない。(中村)4.粘液コア蛋白の遺伝子発現解析;マウス腸管組織からの遺伝子発現をreal time-PCRにて解析中である。(Dr.Urba)5.Nbの腸管絨毛への定着に対するSiaα2,3-lactosamineの影響;シアル化した粘液多糖はNbの生死には影響しない(Ishiwata et al. 2002)ので、絨毛への定着に影響していることが強く示唆される。そこで、Nbの絨毛への定着に各種物質が影響するかどうかを観察できる系を確立しつつある。(石渡)
卒前および卒後教育における災害時の公衆衛生看護活動のための教育プログラムの開発

災害への危機意識を高めながら科学的根拠に基づいた災害時公衆衛生活動ができるために、平成29年度まで、大学生に対する卒前教育および、発災直後の被災地で活動する可能性が高い職種の方への卒後教育(シミュレーションを含む)を実施し、個人情報保護やプライバシーへの配慮のもと、教育効果を評価するアンケート調査を行ってきた。平成30年度は、その評価をおこなった。まず教育対象については、看護学生や看護職だけでなく、発災直後の被災地や避難所で活動する職種との演習、また連携が必要な職となる学生を対象としたことは、今後の災害時の活動において有効であると考える。なぜなら、災害時公衆衛生看護活動は災害時公衆衛生を基礎とする活動であり、実際多職種との連携が不可欠だからである。次に、教育内容については、平成28年度から災害発生時の情報収集・アセスメント・判断・提供・対応方法とその機関に関する内容とした。東日本大震災後の災害対策として制度化された災害時健康危機管理支援チーム(DHEAT)の構成員に保健師が入っており、国はDHEATの人材育成として平成28年度から全国で災害時の情報とマネジメントに関する研修を行っている。このことから災害時の活動の基本である情報に関する教育内容は、情報の点でDHEATの研修と同じ方向性にあることから、今後、DHEAT関係の研修や災害時の活動に有効であると考える。教育効果については、卒前教育でのアンケート調査の結果、将来災害時に公衆衛生支援活動を行ないたいという気持ちが向上した学生は、情報収集・アセスメント・指揮・提供・対処と機関の判断等についてできるという気持ちが向上していた。ただし、気持ちの向上の程度は情報に関する項目によって違いが見られた。卒後教育では、アンケート調査の結果、情報に関する項目の多くが向上または変わらないであった。災害時公衆衛生活動の教育についての情報収集では、演習を中心とした教育の実施が少ないこと、具体的なカリキュラムによる研修が教育効果が高いこと、海外において原子力災害を含めて災害別の教育の効果が検証されていることが情報収集で明らかとなった。看護系大学生への災害時公衆衛生看護活動に関する教育については、大学で実施していた講義・演習の目的・内容等を検討した結果を基に、効果的な看護活動のための広い視点での公衆衛生活動に関する演習を中心に教育を行なうこととした。そして目的・内容・方法について計画立案し実施後の評価のための調査票を作成して教育を行なった。具体的には看護系大学生へ、被災者・支援方法・体制・連携の理解を目的とした段階的な内容に沿って、地域情報と災害事案の状況変化に基づき、基本的人道支援、地域診断、PDCAを活用した根拠ある多角的な対応の演習と基礎知識の講義、教育前後の調査を行なった。調査の結果、演習後、重点的に演習をした内容は支援できると思う傾向にあるが、支援の意向は減少した。災害時公衆衛生活動に関する現任教育については、看護職は災害発生直後から情報を収集し、所属機関・組織の一員として各役割で公衆衛生看護活動を行っていることから、看護職特に新任看護職だけへの教育ではなく、実際の災害対応と同様に他職種と一緒に演習を行なう教育とした。教育の目的・内容は、公衆衛生活動において重要かつ平常時の教育での強化点を検討し、活動の最も基本となる情報の収集・質的判断・分析・評価・共有、情報への対応、連絡調整等の実践能力の向上を目的とした段階的内容とし、調査票を作成した。実際、教育希望があった3自治体において、平常時の地域情報を考えながら想定されている被害の時系列の状況変化に応じた情報、対応、連絡調整等について演習を実施し、演習前後の調査で評価を行なった。その結果全体的に演習効果が見られた。本研究では、看護職に対する卒前・卒後を通じた災害時の公衆衛生看護活動の教育プログラムを開発して教育を実施し、その前後における評価を行ない、各段階に応じたプログラムの最適化を目指すことを目的としている。研究初年度は、教育に関する情報収集の結果や質的調査、これまでの教育内容を総合的に分析して、教育の目的・内容・方法の計画立案および教育前後の調査項目・調査票の作成を行なったうえで、教育の実施、教育前後の調査を実施する計画としていた。収集した教育に関する情報を基に検討して、教育の目的・内容の設定や調査項目・調査票の作成等を行なうことができた。質的調査の対象者について検討し、災害時公衆衛生看護活動を経験していない看護職を含めて多数を調査対象とするより、経験した看護職を対象に深く調査した方が、研究に有効な調査結果が得られるという検討結果になった。教育に関しては、まず教育の方針と概要を決定した上で、目的・内容・方法等の計画立案と調査の概要・計画と調査票を作成し、卒前教育として看護系大学に、また卒後教育として看護職を含む災害時活動する職員を対象に、演習を実施して、教育前後の調査を行いその結果の概要をまとめた。量的調査において研究対象者の人数をさらに増やすことが課題であった。このような研究実績と今年度の計画を比較して、概ね順調に進展していると判断した。平成27年度の研究の成果として、実際の災害時公衆衛生活動のためには、活動の最も基盤となる情報についての具体的な教育が必要であることが明確となり教育の方向性を得ることができた。この研究成果に基づき、平成28年度は、卒前教育、卒後教育ともに、情報収集・評価分析、対応、連携調整等に関して知識の習得と実践能力の向上を目標に、具体的な演習内容を取り入れた教育を行った。

看護学生への災害時公衆衛生看護活動に関する教育については、看護学生の対象者が少ないため、災害時に専門職として活動する可能性があり災害の教育を受けていないことを共通点とする看護学生、医学生、保育士学生を対象に、災害対応の講義と情報に関する演習を行い、教育効果の評価のために教育前後の調査を行なった。具体的には、情報に関する教育の目標・内容・方法について計画立案し、教育前後の調査票を作成した。教育内容は、具体的な災害発生状況と被害状況を設定して実践で必要な情報に関する具体的な内容の演習と、各学部の専門性に応じた災害対応の基本と情報についての講義とした。教育前後で「災害時できると思う」を点数化で調査した結果、全学部の対象者が、情報に関する項目全般について教育前より教育後が高くなっていた。しかし、教育前が高い点数ほど教育後との点数の差が少なかった。災害時公衆衛生活動に関する現任教育については、平成27年度と同様に実際の災害時に活動する他職種と合同で情報に関する訓練を中心に行い、教育前後の調査を行った。訓練は、タブレットを用い、実際の被害想定に添って、地域の被害状況や避難所・避難者の状況についての時系列の変化に応じた情報収集、対応、連絡調整等について行った。全項目について教育前より教育後の方が「災害時できると思う」程度が高くなったが、教育前のできる思いが高いほど教育後の差が少なかった。本研究では、看護職に対する卒前・卒後を通した災害時の公衆衛生看護活動の教育プログラムを検討し、教育を実施し、その前後における評価を行ない、各段階に最適なプログラムの開発を目標としている研究2年目の平成28年度は、平成27年度の調査結果の分析・評価を行い、それに基づき、卒前・卒後の段階に応じた教育の目標・内容・方法等の修正と教育効果の評価のための質問紙調査票の検討・作成、教育の実施、教育前後の調査を実施する計画としていた。平成27年度の卒前教育の研究については、看護学生に対する災害時公衆衛生活動全般の教育前後の調査で、「災害時情報の収集・提供ができると思う」が教育前後で3割前後であり教育前より教育後の方が少なかったこと、6割が将来看護職として活動するために情報収集・提供ができることが必要と思っていることが明らかになった。また、卒後教育としては、対象である看護職を含む災害時対応機関職員等に対する情報の教育と訓練前後の調査から、情報に関する全調査項目について訓練前より訓練後が有意に高くなっていたが、十分できる状況ではなかったことが明らかになった。さらに、保健所職員への情報、対応等の教育方法の効果の分析結果では、大まかな内容より詳細な内容の演習の方が教育効果が高かった。これらの平成27年度の研究結果を基に検討し、災害時の公衆衛生看護活動のために卒前・卒後教育ともに活動の基盤となる情報に関する教育が必要であると判断した。そして平成28年度の研究は卒前・卒後の情報に関する教育とし、教育の目標・内容等や調査項目・調査票の作成を行い、教育と教育前後の調査を実施し結果を分析することができた。しかし、実際災害時に公衆衛生活動を行なった看護職に対する質的調査は、災害の状況からインタビュー調査を行うことはできなかった。このような研究実績と今年度の計画を比較して、概ね順調に進展していると判断した。
二軸伸長過程におけるオンライン複屈折計測による配向結晶化モデルの構築

二軸伸長プロセスである同時二軸および一軸延伸過程を,He-Neレーザーを用いた複屈折計測装置,画像解析による形状変化をオンラインで詳細に解析した.結晶性高分子材料として材料物性データが豊富にあるポリエチレンテレフタレート(PET),ポリエチレンナフタレート(PEN)を用い,二軸延伸機を用いて厳密に制御した温度,一定ひずみ速度条件下で伸長応力変化を測定し,同時にレーザーを利用したオンライン複屈折測定システムによって,様々な伸長温度およびひずみ速度下での位相差の変化を詳細に測定した.PETの延伸においては,ひずみ硬化は温度・ひずみ速度に依存せず,ほぼ同じひずみで生じ,一軸延伸過程に比べて低ひずみを示した.また,等二軸延伸過程にも関わらず,ひずみ硬化が起こる前に,フィルム面内に光学異方性が生じ,この異方性はさらにひずみを増加させることによってほぼ消滅した.また,異方性が生じるひずみでの複屈折は約0.025であり,この臨界複屈折以下では応力光学則が成立することが示唆された.臨界複屈折0.025はひずみ速度および温度依存性を示さず,また一軸伸長過程でもほぼ同じ値を示すことが確認された.オフライン測定によるDSC測定,密度測定,広角X線回折やIR測定などによって,応力光学則から逸脱領域では結晶化が開始していると判明した.PENの延伸においては,ガラス転移温度(Tg:115°C)より2030°C程度高い温度では,不均一延伸となった.特に降伏が生じる延伸倍率(2.0倍)を超えるとフィルム変形に不均一が生じるが,さらに高い延伸倍率(3.5)では均一延伸と変化した.また,この挙動はひずみ速度依存性を示し,ひずみ速度が大きい場合,不均一変形が生じる延伸倍率は低くなった.さらにTg+40°Cの160°Cの延伸温度で,比較的低ひずみ速度条件下では均一変形となる挙動を示すことが明らかとなった.応力光学則の適用性に調べた結果,延伸初期ではほぼ光学則に従うが,延伸倍率が高くなると延伸応力が大きくなる以上に複屈折の変化が大きくなり,また延伸温度が高い場合または低ひずみ速度下では光学則からの逸脱は低応力で生じることが示唆された.二軸伸長プロセスである同時二軸および逐次二軸延伸過程を,He-Neレーザーを用いた複屈折計測装置,画像解析による形状変化をオンラインで詳細に解析した.結晶性高分子材料として材料物性データが豊富にあるポリエチレンテレフタレート(PET)を用い,二軸延伸機を用いて厳密に制御した温度,一定ひずみ速度条件下で伸長応力変化を測定し,同時にレーザーを利用したオンライン複屈折測定システムによって,様々な伸長温度およびひずみ速度下での位相差の変化を詳細に測定した.ひずみ硬化は温度・ひずみ速度に依存せず,ほぼ同じひずみで生じ,一軸延伸過程に比べて低ひずみを示した.また,等二軸延伸過程にも関わらず、ひずみ硬化が起こる前に、フィルム面内に光学異方性が生じ,この異方性はさらにひずみを増加させることによってほぼ消滅した.また,異方性が生じるひずみでの複屈折は約0.025であり,この臨界複屈折以下では応力光学則が成立することが示唆された.臨界複屈折0.025はひずみ速度および温度依存性を示さず,また一軸伸長過程でもほぼ同じ値を示すことが確認された。オフライン測定によるDSC測定,密度測定,広角X線回折やIR測定などによって,応力光学則から逸脱領域では結晶化が開始していると判明した.二軸伸長プロセスである同時二軸および一軸延伸過程を,He-Neレーザーを用いた複屈折計測装置,画像解析による形状変化をオンラインで詳細に解析した.結晶性高分子材料として材料物性データが豊富にあるポリエチレンテレフタレート(PET),ポリエチレンナフタレート(PEN)を用い,二軸延伸機を用いて厳密に制御した温度,一定ひずみ速度条件下で伸長応力変化を測定し,同時にレーザーを利用したオンライン複屈折測定システムによって,様々な伸長温度およびひずみ速度下での位相差の変化を詳細に測定した.PETの延伸においては,ひずみ硬化は温度・ひずみ速度に依存せず,ほぼ同じひずみで生じ,一軸延伸過程に比べて低ひずみを示した.また,等二軸延伸過程にも関わらず,ひずみ硬化が起こる前に,フィルム面内に光学異方性が生じ,この異方性はさらにひずみを増加させることによってほぼ消滅した.また,異方性が生じるひずみでの複屈折は約0.025であり,この臨界複屈折以下では応力光学則が成立することが示唆された.臨界複屈折0.025はひずみ速度および温度依存性を示さず,また一軸伸長過程でもほぼ同じ値を示すことが確認された.オフライン測定によるDSC測定,密度測定,広角X線回折やIR測定などによって,応力光学則から逸脱領域では結晶化が開始していると判明した.PENの延伸においては,ガラス転移温度(Tg:115°C)より2030°C程度高い温度では,不均一延伸となった.特に降伏が生じる延伸倍率(2.0倍)を超えるとフィルム変形に不均一が生じるが,さらに高い延伸倍率(3.5)では均一延伸と変化した.また,この挙動はひずみ速度依存性を示し,ひずみ速度が大きい場合,不均一変形が生じる延伸倍率は低くなった.さらにTg+40°Cの160°Cの延伸温度で,比較的低ひずみ速度条件下では均一変形となる挙動を示すことが明らかとなった.

応力光学則の適用性に調べた結果,延伸初期ではほぼ光学則に従うが,延伸倍率が高くなると延伸応力が大きくなる以上に複屈折の変化が大きくなり,また延伸温度が高い場合または低ひずみ速度下では光学則からの逸脱は低応力で生じることが示唆された.
難病患者家族の社会的孤立に介入するウェブ交流モデルサイトの開発

本研究の目的は、難病患者家族が抱える悩みや不安などの相談先に対するニーズを明らかにし、既存資源の問題点や不足しているサービスを整理した上で、難病患者家族が利用しやすいWeb上の相談・交流サイトの在り方を検討することである。難病患者家族のインフォーマルな相談先として、一般に「Q&Aサイト」と呼ばれる相談サイトの利用状況の分析により、ニーズの把握を試みた。さらに現在運用中のSNS(SocialNetworkingService)の利用状況を評価し、各サイト間の比較と問題点の整理をおこなった。外出が困難な難病患者家族のインフォーマルな相談先として、インターネット上で一般に「Q&Aサイト」と呼ばれる相談サイトの利用状況の分析によりニーズの把握を行った。さらに、現在運用中のSNS(social networking service)の利用の状況を調査し、各サイト間の比較と問題点の整理を行った。その後、難病ケアネットワークが試用したSNSの利用状況から運用上の問題を分析し、今後に向けた課題の整理を行った。本研究の目的は、難病患者家族が抱える悩みや不安などの相談先に対するニーズを明らかにし、既存資源の問題点や不足しているサービスを整理することである。その上で、難病患者家族が利用しやすいWeb上の相談・交流サイトのあり方を検討し、試用サイトの構築を試みる。ニーズの把握は疾病により外出が困難な相談者が多い実態を考慮し、Webを中心に行う。現在、難病に関する相談機関の確保が施策として推進されているが、本研究では、インフォーマルな相談先としてインターネット上で一般に「Q&Aサイト」と言われる相談サイトの利用状況に注目した。平成23年度は、我が国最大手サイトで検索した難病に関する質問と回答を対象に調査をした。質問内容と質問者の属性、投稿時期、回答の内容、良回答を得た回答内容と回答者の属性を分析した。投稿者の約6割は、患者本人ではなく家族であった。疾病の種類は潰瘍性大腸炎に関するものが多かった。また、時期としては症状が出現し、受診を検討している時期が最も多く、代表的な相談の内容は「受診先や受診のタイミング」「就労・経済的問題」「家族関係」であった。治療・療養に関する質問の順位は低かった。回答者の属性は患者・家族を含む当事者が最も多かった。良回答においては自身の体験に基づく情報提供や情緒的支援が行われていることが明らかになった。専門医により難病(特定疾患)と確定診断されるまでには時間を要し、不安や動揺により混乱が生じる時期においてピアサポートが機能していることが示唆された。また、患者家族は回答者としても積極的に参加している。外出困難であってもインターネットを介した社会貢献は自己実現のニーズを充足し、相互に利益がある点で意義深い。一方で、一部回答には信頼性に疑問のある情報の不適切な引用も見られた。当事者同士がweb上で安心してサポート関係を醸成できる安全な場の構築が今後の課題である。交付申請書において研究計画と示したスケジュールにおいて、平成23年度に遂行すべき課題とした項目は、(1)既存期間の相談実態及び既知のニーズの整理、(2)インターネット上の相談の実態把握、である。充分な文献検討の後、前述の通り(2)に関する研究成果を納めた。従って、研究計画は概ね順調に遂行していると考える。研究計画は順調に遂行されている。24年度計画に従い、難病患者家族の交流サイトの準備を進める方針である。それに加え、これまでの調査結果を踏まえ、サイトの有用性を高めるために、難病患者家族がインフォーマルなサイトに相談を投稿する背景をより明確にすることが望ましいと考えている。期間、また予算上の制約から小規模調査とならざるを得ないが、インターネットを利用したアンケート調査を実施し、ニーズの把握を補足することで成果の精度を高めたいと考えている。平成23年度はデータ分析作業依頼に関する人件費を計上していたが、行程を再度見直し研究者自身による作業量を増やしたこと、またボランティアによる経費節減により繰り越し金が発生した。平成24年度は実際のサイトの運用をめざしている。管理及び利用状況分析等の作業が必要となるが、当初計画よりも作業時間を必要とすることが見込まれるため、計画を修正し23年度繰り越し分は特に24年度の人件費に充当して予算を執行する計画である。
口蓋裂術後の言語障害の視覚的フィードバックを目指す新たな音声可視化システムの構築

口蓋裂手術後の鼻咽腔閉鎖機能不全は開鼻声や異常構音の主因となり、不明瞭な言語はコミュニケーション障害を引き起こす。ほとんどの症例が良好な鼻咽腔閉鎖機能を獲得するが、10%前後の症例は軽度不全不全を呈する。また約7割の口蓋裂術後の子どもたちが正常構音を獲得する一方、残りやく3割の子どもたちは異常構音を発現しており、言語訓練を受けている。これら異常構音は鼻咽腔閉鎖機能に関連しているものが多く、鼻咽腔閉鎖機能不全による開鼻声や異常構音に対する評価、そして治療アプローチを確立することは非常に重要なことだと考える。平成28年度は母音の分析を行い、口蓋裂術後の症例について鼻咽腔閉鎖機能良好な群は口蓋裂のない群と同じ色彩パタンが得られ、鼻咽腔閉鎖機能不全な群は口蓋裂のない群と異なる色彩パタンが得られることが分かった。平成29年度は瘻孔閉鎖術前後の言語の解析を行った。母音の分析については、平成28年度の方法に沿って色彩パタンを作成し、瘻孔閉鎖術後のほうが口蓋裂のない群と似たような色彩パタンになることが分かった。構音に関してはニューラルネットワークシステム(NN)を用いて、分析を行うこととした。NNは音声を解析し、客観的・視覚的に子音の構音様式、構音位置を示すことのできる音声特徴推定システムである。瘻孔閉鎖術前に口蓋化構音を認めた症例が、訓練後には消失し、NNでも構音点は訓練が進むにつれ、正常な位置へ移動し、最終的には異常構音の消失が確認できた。平成30年度はNNの異常構音の評価への応用を検討していたが、アメリカ合衆国へ留学したため、ストップしたため、補助事業期間延長承認申請を行った。当初の計画では以下のことを計画した。1健常児群の母音の色彩パタンを作成する。2口蓋裂術後の鼻咽腔閉鎖機能良好群、不全群と健常児群の母音の色彩パタンを比較する。3異常構音別の母音の色彩パタンの比較。NNを用いた異常構音の評価検討について、進めていきたい。今後は実際の訓練場面で、リアルタイムに音声の視覚化されたものを子どもに見せながら、発音と同期させ、リアルタイムに自分の音声がどのようにパタンになるのかを、自分自身にフィードバックさせながら自己修正を促していくような訓練を構築したい。具体的にはPCを用いる。母音であれば色彩パタンを用いて、子どもが発声した時にリアルタイムに色彩パタンが画面に表示され、フィードバックをしやすくする。構音に関してはNNを用いて、実際の構音点をリアルタイムに表示されることで、フィードバックを行うようにする。そのシステム作りを研究分担者とともに進めていく予定である。また約7割の口蓋裂術後の子どもたちが正常言語を獲得する一方残り3割の子どもたちは異常構音を発現しており、言語訓練を受けている。これら異常構音は鼻咽腔閉鎖機能に関連して起こるものが多く、鼻咽腔閉鎖機能不全による開鼻声や異常構音に対する評価、そして治療アプローチを確立することは非常に大切なことだと考える。平成28年度は、まず母音の分析を行い、その後異常構音別の分析を行うことを計画した。先天異常のない健常児を対象に母音を復唱してもらい録音し、熊本大学へ音声データを送り、色別に表現した。これは第13ホルマント周波数を三原色信号に変換し、母音の音韻性を固有の色彩として表示するものである。次に、当科で言語治療を行っている口唇口蓋裂患者を対象して鼻咽腔閉鎖機能の良好群、不全群に分け、健常児と同じく熊本大学へ送り、視覚的に色別に表現した。その結果、健常群の5母音を色彩表示すると、/a/が黄色、/i/が青色、/u/が薄緑色、/e/が紫色、/o/が緑色となった。鼻咽腔閉鎖機能良好群の5母音は、健常群と類似の色彩イメージが得られた。鼻咽腔閉鎖機能不全群の5母音は、健常群と比較して、/a/が薄緑色、/i/、/u/、/e/、/o/が薄青色となり、異なるイメージであった。健常群と鼻咽腔閉鎖機能良好群は同系色であったが、鼻咽腔閉鎖機能不全群は異なる色彩イメージを呈したことから、鼻咽腔閉鎖機能の評価方法として音声可視化システムが有用であることが示唆された。これまでの研究成果をもとに、本研究は音声可視化システムを用いた音声解析を口蓋裂術後の子どもたちの音声データを用いて行い、鼻咽腔閉鎖機能の評価や鼻咽腔閉鎖機能不全に対する訓練法の確立を目指して行う。平成28年度の研究期間内には以下の事を明らかにすると計画を立てた。1健常児群の音声データを収集し、音声可視化システムを用いて、音声の解析を行い健常児の母音のバランスチャートを作成する。2口蓋裂手術後鼻咽腔閉鎖機能良好群、口蓋裂手術後鼻咽腔閉鎖機能不全群のそれぞれの音声データを収集し、同様に母音のバランスチャートを作成し、健常児群とどのような違いがあるか検討する。

3異常構音を呈する群(声門破裂音、口蓋化構音、側音化構音)の音声データを収集し、異常構音別にバランスチャートを作成し、健常児群とどのような違いがあるか検討する。平成28年度は1、2については学会発表を行うことができ、データをまとめることはできたが、まだ論文投稿には至っていない。これはデータの数を増やしてから、論文投稿を行うことを考えており、データ収集に時間を要しているためである。また、3については、異常構音は子音を含むため、バランスチャートでは評価、検討しにくいので、再度評価方法を検討している最中である。口蓋裂手術後の鼻咽腔閉鎖機能不全は開鼻声や異常構音の主因となり、不明瞭な言語はコミュニケーション障害を引き起こす。ほとんどの症例が良好な鼻咽腔閉鎖機能を獲得するが、10%前後の症例は軽度不全不全を呈する。また約7割の口蓋裂術後の子どもたちが正常構音を獲得する一方、、残り3割の子どもたちは異常構音を発現しており、言語訓練を受けている。これら異常構音は鼻咽腔閉鎖機能に関連しているものが多く、鼻咽腔閉鎖機能不全による開鼻声や異常構音に対する評価、そして治療アプローチを確立することは非常に大切なことだと考える。平成28年度は母音の分析を行い、口蓋裂術後の症例について鼻咽腔閉鎖機能良好な群は口蓋裂のない群と同じ色彩パタンが得られ、鼻咽腔閉鎖機能不全な群は口蓋裂のない群と異なる色彩パタンが得られることが分かった。平成29年度は瘻孔閉鎖術前後の言語の解析を行った。母音の分析については、平成28年度の方法に沿って色彩パタンを作成し、瘻孔閉鎖術後のほうが口蓋裂のない群と似たような色彩パタンになることが分かった。構音に関しては、ニューラルネットワークシステム(NN)を用いて、分析を行うこととした。NNは音声を解析し、客観的・視覚的に子音の構音様式、構音位置を示すことのできる音声特徴推定システムである。瘻孔閉鎖術前に口蓋化構音を認めた例が訓練後には消失し、NNでの解析でも、構音点は訓練が進むにつれ正常な位置へ移動し最終的には異常構音の消失が確認された。当初の計画では平成28年度に以下のことを計画した。1健常児群の母音の色彩パタンを作成する。2口蓋裂術後の鼻咽腔閉鎖機能良好群、不全群と健常児群の母音の色彩パタンを比較する。3異常構音別の母音の色彩パタンの比較1、2については終了し、論文作成中である。昨年の報告書で3に関しては評価方法の再検討を本年度の課題とした。これについてはNNを用いることで評価を行うこととし、異常構音の視覚的・客観的な解析は可能となった。現在データをまとめており、2018年5月の学会にて発表予定である。平成29年度以降の計画として、言語訓練において視覚的フィードバックを行うとしているので、今後はこの課題について進めていきたい。また約7割の口蓋裂術後の子どもたちが正常構音を獲得する一方、残りやく3割の子どもたちは異常構音を発現しており、言語訓練を受けている。これら異常構音は鼻咽腔閉鎖機能に関連しているものが多く、鼻咽腔閉鎖機能不全による開鼻声や異常構音に対する評価、そして治療アプローチを確立することは非常に重要なことだと考える。
電気化学SPRを用いるイオン液体中における電析反応過程の解析

電気化学表面プラズモン共鳴法(ESPR)を用い、イオン液体|金界面における銅の電気化学析出(電析)過程をin-situ計測した。イオン液体には、代表的なイオン液体として知られる、1-butyl-3-methylimidazoliumbis(trifluoromethanesulfonyl)amideを用いた。サイクリックボルタモグラム(CV)と同時にSPR共鳴角を記録したところ、電位負掃引におけるCu^2+からCu^+への還元に伴い、SPR共鳴角はシグモイド型に負シフトし、溶存種のレドックスに伴う拡散層内の屈折率変化をESPRにより検出できていることが分かった。さらなる負掃引により銅を電析させると、SPR共鳴角は大きく正シフトした。正掃引ではそれぞれの逆過程が見られた。このCVとESPRを繰り返し測定すると、CVには測定回数依存性は見られないのに対し、電析に伴うSPR共鳴角の変化量は測定を繰り返すごとに減少した。CVの電流には影響がない程の微小な表面ラフネス変化をESPRが追跡していることを示している。AFMによりex-situで金表面を観察したところ、イオン液体|金界面で銅の電析を繰り返すと金表面ラフネスが減少することがわかった。有効媒質近似を用いてSPR共鳴角のラフネス依存性をシミュレーションした。ラフネスが減少するにつれて銅析出によるSPR共鳴角の変化量が小さくなった。これはESPR実験で得られた還元過程(Cu+→Cu)の共鳴角正シフト量の減少がラフネス減少によるものであることを示唆しており、AFMによる観察結果と一致する。ESPRとAFMを相補的に用いることにより電析に伴う電極表面ラフネス変化の追跡に成功しており、研究はおおむね順調に進展していると考えている。電析金属種が電極金属種と合金化するかどうかが電析初期過程に大きな影響を与えると予想しており、いくつかの電析金属種について実験する。金属イオンへの配位性の異なるアニオンからなるイオン液体で実験する。SERSやMDなどの手法を援用し、さらに分子レベルでの描像を得る。
哺乳類配偶子における同種認識と付着に関与する物質の細胞化学的研究

マウス卵に透明帯を構成する糖蛋白質の一つZP3と特異的に結合するマウス精子のもつ蛋白質SP56(Mr 56,000)は最有力の透明帯リセプター(Rzp)である。我々はDr Bleil等と共同でSP56がRzpである、同種卵の認識と結合に関与するために必要な位置に局在するか否かを調べた。マウス精子の頭部は特有な釣り針状をしているが、モノクローナル抗体によるSP56の局在を先ず共焦点顕微鏡で観察した所、先体部の辺縁に三ケ月状に分布し、既報のZP3の結合位置と一致することがわかった。又これは受精のさいにマウス精子が透明帯に付着する位置ともよく一致する。更に我々は免疫-金コロイド法と表面レプリカ法を組み合わせて、細胞膜表面にあある抗原物質の局在を細胞全景の中で電子顕微鏡レベルでとらえる方法を開発した。免疫反応により細胞膜表面に付着した金粒子はPt-C蒸着時にトラップされて、精子が溶解された後もレプリカ膜に残留し、抗原の位置を示しうる。方法はマウス精巣上体精子をTYH溶液中で1時間培養した後、1%パラフォルムアルデヒド溶液で固定し、洗浄後、APES処理したスライドグラスに付着させた。ブロッキング後、上記一次抗体で処理し、金粒子標識二次抗体を作用させ、グルタールアルデヒドで再固定後、エタノール系列で脱水、酢酸イソアミルを中間液として臨界点乾燥し、ガラス上の精子のPt-Cレプリカを作成した。ハイタ-原液でレプリカ膜をガラス面から剥がし、精子を溶解、水洗後グリッドに掬い、透過電顕で検鏡した。表面レプリカ法による観察では後輪(頭部と頸部の境界線)や先体の後端、辺縁部などが明瞭に識別できる。本法によりSP56は精子頭部最尖端部には存在せず、上記先体辺縁部を被う細胞膜外表面に局在する事が確認され、Rzpとしての条件を満たすことが確認された。又精子尾部の捩れの様子が全長にわたって観察できるので、運動の状態と尾部の捩れとの関連を調べる手段となりうる。
高等動物における細胞質型及びミトコンドリア型アイソザイム遺伝子の発現制御機構

1.マウスmAspAT、cAspAT、mMDH、cMDH遺伝子の5'隣接領域の種々の長さのDNA断片を作製して、各々の遺伝子の発現に必須なDNA領域を決定した。mAspAT遺伝子の発現には、翻訳開始点より上流177bpと165bpの間、cAspAT遺伝子には同じく上流263bpと217bpの間と203bpと159bpの間の二つの領域が重要であった。mMDH遺伝子の発現には、翻訳開始点より上流270bpと130bpの間の領域(P1)が、またcMDH遺伝子の発現には253bpと170bpの領域が必須であった。2.同定した発現調節領域内に一致して、核タンパクの結合を認めた。また、mAspAT遺伝子の転写調節にはSp1が、cAspAT、mMDH、cMDH遺伝子の転写調節にはCTF/NF1が関与していることを見いだした。3.mMDH遺伝子では、5'調節領域について3'側からの欠失変異体を用いて、翻訳開始点より上流393bpと250bp間の領域(P2)にもプロモ-タ-活性を持つ領域の存在することを明らかにした。4.マウス前脂肪細胞株3T3ーL1細胞は薬剤処理により脂肪細胞へと分化するが、これに伴ってcMDH、mMDH、mAspATのmRNAレベル及び酵素活性は著明に増大したが、cAspATは変化しなかった。5.ヒトcAspAT遺伝子を単離して構造解析を行った。ヒトcAspAT遺伝子は30kb以上の大きさで、9個のエクソンより構成されていた。5'上流域の配列はヒトとマウスで高い相同性を認め、先にマウス遺伝子で同定した転写調節因子CTF/NFIの結合配列はヒトにおいても完全に保存されていた。ヒトcAspATは413個のアミノ酸からなるが、マウス、ブタ、ニワトリのものと8092%の範囲で相同性を示し、酵素の機能発現に必須なアミノ酸配列は完全に保存されていた(略号:細胞質型及びミトコンドリア型アスパラギン酸アミノ基転移酵素;cAspAT、mAspAT、細胞質型及びミトコンドリア型リンゴ酸脱水素酵素;cMDH、mMDH)。1.マウスmAspAT、cAspAT、mMDH、cMDH遺伝子の5'隣接領域の種々の長さのDNA断片とneo遺伝子を融合させた組換え体を作製した。そして、これらの組換え体をマウス線維芽細胞NIH3T3に導入後、neo遺伝子の発現を指標にして、各々の遺伝子の発現に必須なDNA領域を決定した。2.先ず、transientな系を用いて、neo RNAのレベルをノ-ザン・ブロット法により解析した。その結果、mAspAT遺伝子の発現には、翻訳開始点より上流177bpと165bpの間の領域が、また、cAspAT遺伝子の発現には翻訳開始点より上流263bpと217bpの間、及び203bpと159bpの間の領域が重要な役割を果たしている事が判明した。G418耐性細胞の出現頻度を調べるpermanentな系を用いても同様な結果が得られた。

3.全く同じ方法を用いて、mMDH遺伝子の発現には、翻訳開始点より上流270bpと130bpの間の領域(P1)が、またcMDH遺伝子の発現には253bpと170bpの領域が必須であることを見いだした。4.この様にして同定した発現調節領域内に一致して、核タンパクの結合を認めた。また、mAspAT遺伝子の転写調節にはSp1が、cAspAT、mMDH、cMDH遺伝子の転写調節にはCTF/NF1が関与していることを見いだした。5.アイソザイム遺伝子の発現調節領域の解析過程で、mMDH遺伝子に関しては第2のプロモ-タ-(P2)が存在していることを見いだしたため、これら二つのプロモ-タ-の機能を比較解析した。6.新たに購入した蛍光イルミネ-タ-はDNAの構造解析の為に使用し、またパルスフィ-ルドゲル電気泳動装置はヒトcAspAT遺伝子をプロ-ブとして用いて、染色体上でのこの遺伝子を中心とした染色体領域の詳細な制限酵素切断地図の作製を進める実験に使用する予定である。実験糖尿病やホルモン投与等の糖新生条件下におけるアイソザイム遺伝子の発現変化について、個体レベル及び細胞レベルの解析を行った。1.高蛋白食、アロキサン及びハイドロコ-チソン投与により実験糖尿病マウスを作製し、肝臓における、細胞質型及びミトコンドリア型アスパラギン酸アミノ基転移酵素(cAspAT、mAspAT)と同じく細胞質型及びミトコンドリア型リンゴ酸脱水素酵素(cMDH、mMDH)の酵素活性とmRNAレベルを正常マウスのものと比較した。その結果、実験糖尿病マウスでは、正常マウスに比べて、cAspATの著明な発現の増大を認めたが、他のアイソザイムについては変化を認めなかった。2.ラット肝細胞株H411Eを用いて、アイソザイム遺伝子の発現に対するdexamcthasone^-(Dcx)とcAMPの効果を検討した結果、Dcx処理によりcAspAT遺伝子の発現は著明に増大し、そのレベルはcAMPとの併用でさらに増強された。一方、mAspAT、cMDH、mMDH遺伝子の発現変化は認めなかった。cAspAT遺伝子の5'上流域には2つのGRE(Glucoーcorticoidーresponsive element)様配列(GREー1;-577/-567bp、GREー2;-459/-441bp)が存在している。そこで、5'上流域の種々の長さを持つDNA断片とCAT遺伝子を融合させた組換え体を作製しH411E細胞に導入後、Dexによる発現誘導に関与するDNA領域を検索した。その結果、-501bp-385bpの領域を欠失させたものではDexによる誘導が認められず、-459/-441bpに存在するGREー2が重要と考えられた。このことを確かめる為に、それぞれのGRE様配列を含むDNA断片を、Dexで誘導を受けないことを確認したマウスSAP(serum anyloid P component)遺伝子の上流に接続し、Dexによる効果を検討した結果、GREー2を接続した場合にのみ発現の増大が認められた。アスパラギン酸アミノ基転移酵素には細胞質型(cAspAT)とミトコンドリア型(mAspAT)の2つのアイソザイムが存在するが、個々のアイソザイムの機能分担を解析する目的で、遺伝子標目組み込み法により、マウス細胞質型遺伝子の挿入変異導入による破壊を試みた。また、cAspATは生体エネルギ-獲得に必須な酵素であり、遺伝子の完全な破壊は細胞死に至る可能性も考えられたので、挿入変異導入用ベクタ-と同時に、酵素機能の部分的な破壊を目的とした点変異導入用ベクタ-の作製を試みた。1)挿入変異導入用ベクタ-の作製:マウスcAspAT
DNAチップで同定した悪性黒色腫高発現分子のRNA干渉による病態解析と臨床応用

本研究では、DNAチップで同定した悪性黒色腫で高発現する分子FABP7、MMA1、KU-MEL-3の機能解析を行った。RT-PCRおよび定量PCRでmRNA発現を解析したところ、FABP7、KU-MEL-3、MMA1は悪性黒色腫組織および細胞株において、高発現しており、RNAレベルでの発現特異性が確認された。その後、二重鎖オリゴヌクレオチドRNAを用いたRNA干渉法で標的遺伝子の発現抑制を行うとともに、FABP7、MMA1については発現ベクターに挿入した組換えプラスミドを導入して強制発現実験を行い、癌形成に関わる基本形質についてのこれらの遺伝子の影響を検討した。その結果、FABP7遺伝子発現を抑制した悪性黒色腫細胞株では、細胞増殖能、遊走能が低下し、強制発現により、細胞増殖能、遊走能が亢進した。MMA1遺伝子発現を抑制した悪性黒色腫細胞株では、細胞増殖能、細胞接着能が低下し、強制発現により細胞増殖能、接着能が亢進した。KU-MEL-3の発現抑制では抑制効果が低く、そのためか細胞増殖能には変化がみられなかった。また、我々の作製したFABP7に対するウサギポリクローナル抗体は悪性黒色腫組織15検体中11検体を染色することができ、診断マーカーとして有用なことが示された。さらに、FABP7のファージ組換えタンパク、大腸菌組換えタンパクを認識する抗体が高頻度に悪性黒色腫患者血清中に検出されたことから、FABP7が免疫系に認識される免疫治療の標的として応用できる可能性も考えられる。以上の解析結果により、FABP7、MMA1の悪性黒色腫病態への関与が明らかになり、今後の治療応用への基盤とすることができた。悪性黒色腫は、世界的に増加傾向にあるが、高転移性で化学療法や放射線療法などの効果が低い難治癌であり、新しい診断法と治療法の開発が期待されている。本研究では、先端医科学研究所細胞情報研究部門が同定した機能が未だ不明な悪性黒色腫高発現遺伝子についてRNA干渉法を用いた発現抑制を行い、悪性黒色腫の細胞増殖・生存や浸潤・転移に関わる機構への関与を解明し、臨床応用の分子標的となるかどうかを明らかにする。悪性黒色腫特異的に高発現する分子は診断マーカーに応用しうるが、本研究で過剰な遺伝子発現の病態への関与が解明できれば治療にも応用可能である。DNAチップで同定した悪性黒色腫で高発現する分子FABP7、MMA1の機能を解析するため、まず、悪性黒色腫組織および細胞株における発現量と発現特異性の検討を行った。RT-PCRおよび定量PCRでmRNA発現を解析したところ、FABP7、MMA1は悪性黒色腫組織および細胞株において、高発現しており、RNAレベルでの発現特異性が確認された。その後、二重鎖オリゴヌクレオチドRNAを用いたRNA干渉法でmRNA発現抑制を行い、癌形成に関わる基本形質について機能阻害の影響を検討するため、細胞増殖能(WCT-1細胞増殖アッセイ)、細胞死(AnnexinV抗体を用いたフローサイトメトリー)、細胞遊走能(cell migrationアッセイ)、血管新生(VEGF分泌タンパクELISA)などについてのスクリーニングを行った。その結果、FABP7もしくはMMA1遺伝子発現を抑制した悪性黒色腫細胞株で、細胞増殖能、細胞遊走能が低下していた。これらの事より、FABP7およびMMA1は癌の悪性形質に関与しており、診断マーカーへの応用だけでなく、治療にも応用できる可能性が示された。昨年度に引続き、DNAチップで同定した悪性黒色腫で高発現する分子EABP7、MMA1、KU-MEL-3の機能解析を行った。