hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
筋衛星細胞が筋線維へと融合するメカニズムの解明

萎縮した筋に対して筋力トレーニングを行うと、太さの回復が促進されるとともに、筋線維核数が正常以上に増加する。この核数の増加には筋衛星細胞の筋線維への融合が関わっていると考えるが定かでない。そこで、筋衛星細胞の存在下で最終分化した筋管細胞に電気刺激により筋収縮を誘起して機械刺激を与えるin vitroモデルを作製し、成熟した筋線維への筋衛星細胞の融合応答を調べた。その結果、一定の条件の電気刺激で誘起する筋収縮によって、筋衛星細胞が既存の筋管細胞へ融合する像を捉えることができた。本モデルは生体環境を完全に再現できている訳ではないが、筋衛星細胞が融合する現象のメカニズム解明に有用であると考える。これまでに、萎縮した筋に対して筋力トレーニングを行うと、太さの回復が促進されるとともに、筋線維核数が正常以上に増加することを明らかにした。そこで、成熟した筋線維への筋衛星細胞の融合応答を検証するためのin vitroモデルを確立させ、筋が刺激を受けた時の筋衛星細胞の動態を詳細に検証することを目的とする。平成26年度には、マウスから筋衛星細胞を単離し、in vitroでの筋管細胞形成を試みた。適正な筋管細胞を得るための培養期間、培養液の条件を検証し、モデルのベースとなるマウス初代培養筋管細胞が安定的に得られるようになった。これまでに萎縮筋に対する筋力増強運動が、筋線維の太さの回復を促進するとともに、筋線維核数を正常以上に増加させることを明らかにしてきた。この現象のバックグランドとして筋衛星細胞の筋線維への融合が関わっていると考えられるが明らかでない。本研究は、in vitroモデルを作製し、成熟した筋線維への筋衛星細胞の融合応答を精査することを目的としている。平成26年度までに、マウスから単離した筋衛星細胞から、in vitroで安定的に筋管細胞を得るための種々条件を確定した。平成27年度には、平成26年度に得られた培養条件で作製した筋管細胞に対し、定量的な電気刺激を与えることで筋管細胞を収縮させ、その太さの成長を促す電気刺激条件を検証した。その結果、電気刺激を与えない条件よりも、筋管細胞の太さが太く成長する電気刺激の条件が明らかとなった。平成26年度に、筋管細胞形成に必要な培養条件を確定するのに時間を要したことに加え、平成27年度より開始した至適電気刺激条件の検証作業も遅延した。この現象のバックグラウンドとして筋衛星細胞から分化した細胞の筋線維への融合が関わっていると考えられるが明らかでなかった。そこで本研究は、in vitroにおける筋管細胞の収縮運動と筋衛星細胞の成熟した筋細胞への融合応答を精査するための、モデル作成を試みた。初年度には、マウスから単離した筋衛星細胞から、in vitroで安定的に筋管細胞まで分化させるための種々条件を確定した。翌平成27年度には、前述の培養条件で得た筋幹細胞群に対し、定量的な電気刺激を与えることで収縮を促し、その太さの成長を促す電気刺激の条件を検証した。その結果、細胞が剥離せず、効率的に筋管細胞径が太くなる電気刺激条件が明らかとなった。最終年度には、筋管細胞まで分化させた細胞群に対し、グリーンマウスから単離した筋衛星細胞を添加して、筋収縮を促す電気刺激下で共培養した。その結果、WTマウス由来の筋管細胞とEGFPマウス由来の筋管細胞が共存する像は得られたものの、WTマウス由来の筋管細胞にEGFPマウス由来の筋衛星細胞が融合する像を捉えるには至らなかった。既存筋線維への筋衛星細胞の融合は、前述のようにin vivoモデルにおいて萎縮環境に置かれた筋特有の現象かもしれない。培養細胞における廃用性萎縮環境を再現し、in vivoで起こる現象を再現することが課題となった。筋管細胞形成に必要な培養条件の再考が幾度と必要になり、検証期間が当初計画よりも多く必要であった。そのため、電気刺激条件の検証作業に発展させるのが遅れ、至適電気刺激条件を確立するに至っていない。当初計画の平成27年度の予定にある筋衛星細胞を添加した筋管細胞の共培養実験は、平成28年度に引き続き実施していく。平成28年度に予定していた関連因子の検索実験は、共培養実験と並列的に進行させることで目的達成に努める。理学療法学平成26年度に作製可能となったマウス初代培養筋管細胞を対象に、引き続き、その成長を促す電気刺激条件を探っていく。特に、幅を持たせた条件設定を行い、後の刺激効果の検証に必要なグループが形成できるように努める。

当初の実験計画期間よりも開始が遅れた実験系があるため、その実験系に必要な消耗品費が発生した。開始が遅れた系を引き続き次年度も行っていくため、その消耗品費として使用する。
生体系における一分子力学の建設

生体高分子1分子を柔らかい手(例えば、光ピンセットやガラス微小針)を用いて掴んで操作する事が出来るようになった。さらに、一分子力学の方法は、生細胞内で1分子を操作し、細胞の真似をしたり邪魔をしたりすることを可能にした。本質的にヘテロな細胞中で確率過程論的に働く生体分子機械の作動機構を解明するには、一分子力学の方法をさらに発展させる以外にない。本研究では特定領域研究として強力に1分子力学の方法を推進するため、その方法の理論的枠組み、道具立て(特殊装置の開発とその汎用機化)の基盤を形成した。1分子の操作は金コロイド、ビーズ、AFMチップなどに分子を結合させ、それらを光ピンセット、AFM、磁気ピンセットなどで操作することによって行う。pN-nNレベルの力と0.1-数nmの空間精度が達成される。これらの方法をさらに発展させ、一分子力学の方法と理論を確立した。本年は以下の3つの重点項目について、議論と意見交換をおこなった。【1】一分子の異性化/構造変化/変形/タンパク質の(アン)フォールディングなどを、1分子に力をかけておこなった。構造変化と力の関係、及び、変化にかかわるポテンシャル(エネルギーランドスケープ)を明らかにした。このとき、分子動力学計算の援用についても議論した。【2】分子間相互作用の研究を、2分子間に働く力の問題として、直接的に調べる方法と理論について。方法は【1】と同じ。特に、動的な負荷のかけ方と反応過程のエネルギーランドスケープの関係を重視した。【3】分子間相互作用や分子構造の変化と生理機能とのカップリングについて。方法は【1】と同じ。
電子シンクロトロンにおける高調波加速空洞を用いた大強度ビームの高安定化

本課題は,東北大学原子核理学研究施設にある1.2GeVストレッチャー・ブースターリング(STBリング)を用いて、電子シンクロトロンにおける高調波加速空洞の影響を研究したものである。高調波空洞として、高周波加速空洞の3倍の周波数を持った短セル空洞を用意した。まずSTBリングにおけるビーム不安定性に関して、マシンスタディーを行い、周回周波数の24倍に当たる3.6GHz付近にビーム不安定性に起因する非常に強いシンクロトロン振動の信号を確認し、このビーム不安定性の原因となっているインピーダンス源について検討を進めた。またSTBリングでの高調波空洞の影響について、モデル計算とトラッキングシミュレーションによる評価を行い、2台以上の空洞を用いることで、ビーム不安定性が抑制されうるとの結論を得た。そこで実際に、まず高調波空洞1台をインストールし、その影響を実験的に調査した。その結果、高調波空洞のチューニング角を調整することにより、1.2GeVへの加速後のゼームについて、10mA程度の周回電流に閾値が見られていたビーム不安定性を抑制することに成功した。しかしランダウダンピングを生じるに十分な電圧が誘起されてはいないと考えられるので、このビームの振る舞いを理解するために、rigid-bunch modelを用いたシミュレーションにより考察を行った。この結果、高調波空洞の高次モードを考えることで、ビーム不安定性が抑制され得ることが分かった。現在、macro-particle modelを用いたより精密なシミュレーションの準備を進めている。また今後の展開として、これらの結果を踏まえて、ビーム加速のプロセスにおいての高調波加速空洞の影響を研究する予定である。さらに、この高調波空洞に外部から電力を供給してバンチ長の制御を行うことも検討している。初年度となる本年は、当初、高調波加速空洞のプロトタイプの試作を行う予定で設計を進めていた。しかしこれと平行して行っていたSTBリングにおけるビーム不安定性の研究において、測定の結果、そのビームの振る舞いが当初の予想されていなかった原因に起因する可能性が高いことが明らかになった。通常、ビーム不安定性の主な原因と考えられているのは、主高周波加速空洞の高次モードである。しかし観測されたビームの周波数信号は、これとは異なる原因を示唆していた。高調波加速空洞の導入はビーム不安定性の抑制がその目的の一つであり、そのためには、現状のビーム不安定性の把握が本研究を遂行する上で極めて重要である。そこで、この不安定性の原因究明ため、急遽、放射光を用いたビームモニターの整備を進めることになった。このビームモニターは、電子ビームが放射したシンクロトロン光を用いて、電子ビームの振動や特性を精度良く測定するものである。現在、光学系の構築をほぼ終了し、電磁石電源の故障のため中断されていた加速器の運転が再開され次第、測定を開始する手筈となっている。なおプロトタイプの試作については慎重に検討を進めれば、省略が可能であると判断した。数十ミリアンペアという比較的に低いビーム電流でも十分な空洞電圧を誘起するためには、高いシャントインピーダンスが要求されるが、そのための形状があまり複雑になると加工が容易でなくなるので、総合的に判断する必要がある。現在、2次元の電磁場計算による空洞の内面形状にもとづいて3次元電磁場計算による設計を進めている。本年度は、高調波加速空洞の実機とローレベル制御系の製作を行う予定であったが、検討を進めた結果、施設所有の物が転用可能であることが明らかとなり、現在、テストベンチにおいて電気的特性の測定や真空リーク試験の準備を進めている。ベンチテスト終了後、早期にSTBリングにインストールを行い、ビームテストを実施する予定になっている。このための架台や真空ダクトは、既に準備ができている。

新たに用意した真空ダクトは、ビームの通る内面の形状が、空洞のビームポート部分と既存の加速器のビームダクトをなめらかに接続するテーパー状になっており、余分なインピーダンスを低減するための物である。また実機の準備と平行して、STBリングにおけるビーム不安定性に関して、主高周波空洞の高次モードに起因する可能性についても検討を進めている。これまでの検討の結果、2GHz程度までの低い周波数領域には原因となる高次モードは見つかっていないが、今後ビームダクトの遮断周波数程度までの高い周波数領域についても評価する必要がある。また、高調波空洞を用いたシミュレーションスタディーについても、現在、R.Bosch氏(University of Wisconsin-Madison,米国)とともに研究を進めており、STBリングの1.2GeV運転時での影響を評価しているところである。これまでの所、空洞の数が少なくとも、もう1台必要な可能性が高いとの見通しであるが、今後のビームテストの結果と合わせて、より詳細な評価を行う予定である。本研究は、東北大学原子核理学研究施設にある1.2GeVストレッチャー・ブースターリング(STBリング)を用いて、電子シシクロトロンにおいて高調波加速空洞の影響を研究したものである。ビームテストに先立って、まずテストベンチにおいて高調波空洞の電気的特性の測定や真空リーク試験を実施した。またビームテストの準備と平行して、STBリングにおけるビーム不安定性に関して、マシンスタディーを行った。この結果、周回周波数の24倍に当たる3.6GHz付近にビーム不安定性に起因すると考えられる非常に強いシンクロトロン振動の信号を確認できた。このビーム不安定性が主高周波空洞の高次モードに起因する可能性について検討を進めたが、空洞それ自体には、該当するような高次モードは存在しないため、空洞と両端のビームポートが一体となって共振器を構成している可能性が高いと考えている。またSTBリングでの高調波空洞の影響について、モデル計算とトラッキングシミュレーションによる評価を行った。この結果、空洞の数が少なくとも、もう1台必要な可能性が高いとの結論を得たが、モデル計算はあくまでも近似的な取り扱いであり、必ずしも全てを正確には予言できないので、実際に高調波空洞1台をSTBリングにインストールし、その影響を実験的に調査した。その結果、周回ビームの電流量を増やすことはできなかったが、1.2GeVへの加速後のビームについて、10mA程度に閾値が見られていたビーム不安定性を抑制することに成功した。現在、このビームの振る舞いをより深く理解すべく、より詳細なモデル計算の準備を進めている。また、これらの結果を踏まえて、今後はビーム加速のプロセスにおいての高調波加速空洞の影響を研究する予定である。
動脈硬化の治療戦略に役立つ核医学イメージング法：EBMのための実験的研究

本研究では、インビトロ、インビボ実験により以下の成果を得た。1インテグリンαvβ3イメージング剤18F-RGD-K5の自動合成法を確立した。2低酸素イメージング剤18F-FMISOが、18F-FDGとは異なり、低酸下のM2マクロファージに集積することを見出した。318F-FMISOの母体構造である2-nitroimidazole系化合物が動脈硬化病変に集積することを確認した。これらの成果は、臨床診断に役立つ動脈硬化イメージング法の構築に資するものである。動脈硬化病変の診断においては、早期治療を必要とする“破綻しやすいプラーク"を見出し、その治療の効果を的確に診断することが重要である。核医学的手法は、プラークの不安定性を決定付ける分子・細胞レベルの因子を高い定量性を持った画像として表現できる画像診断法である。本研究の目的は、動脈硬化プラークの破綻・血栓形成に深く関与する因子として、組織因子(Tissue Factor)とインテグリンαvβ3を選択し、これらを標的とする核医学イメージング剤の動脈硬化病変への集積に関する分子・細胞レベルのエビデンスを固め、18F-FDG(炎症イメージング)の場合と比較することにより、「18F-FDGでは病変の性状・治療効果をどこまで評価できるのか?」「新しいイメージング剤により、さらに優れた診断法を提案できるのか?」の検証することにある。平成26年度はアンジオテンシン受容体阻害剤(Irbesartan)長期投与による動脈硬化モデル動物(WHHL Rabbit)の動脈硬化病変治療効果について、18F-FDGを用いたPET/CT撮像により評価可能であることを示した。また、インテグリンαvβ3発現病変のPET診断用薬剤、18F-RGD-k5の合成方法を確立した。本研究では、動脈硬化プラークの破綻・血栓形成に深く関与する因子(組織因子(Tissue Factor)およびインテグリンαvβ3)を標的とする核医学イメージング剤の動脈硬化病変への集積に関する分子・細胞レベルのエビデンスを固め、18F-FDG(炎症イメージング)の場合と比較することにより、「18F-FDGでは病変の性状・治療効果をどこまで評価できるのか?」「新しいイメージング剤により、さらに優れた診断法を提案できるのか?」の検証を目指すこととした。平成27年度はインテグリンαvβ3発現病変のPET診断用薬剤である18F-RGD-k5について、多目的合成装置を用いた自動合成方法を確立した。また、インテグリンαvβ3発現量の異なる2種類のがん細胞を移植した担癌マウスを用いた18F-RGD-k5のPETイメージング検討を行い、18F-RGD-k5はインテグリンαvβ3高発現組織に高集積することを確認した。以上の結果より18F-RGD-k5による組織内インテグリンαvβ3発現変動を評価するための実験系を立ち上げられたことから、次年度以降は実際に動脈硬化モデル動物を用いて動脈硬化病変内のインテグリンαvβ3発現、さらには治療時のインテグリンαvβ3発現の変動について評価する予定である。平成27年度は、インテグリンαvβ3を標的としたPET診断用薬剤である18F-RGD-k5について、自動合成装置を用いた供給体制を確立すると共に、18F-RGD-k5を用いたin vivo PETイメージングにより病変内のインテグリンαvβ3発現量を測定できることを確認した。以上の事から現時点において本研究はおおむね順調に進んでいるものと考えている。本研究は、動脈硬化プラークの破綻・血栓形成に深く関与する因子(炎症反応、組織因子(Tissue Factor)、インテグリンなど)を標的とする核医学イメージング剤の動脈硬化病変への集積に関する分子・細胞レベルのエビデンスを固め、18F-FDG(炎症イメージング)の場合と比較することにより、「18F-FDGでは病変の性状・治療効果をどこまで評価できるのか?」「新しいイメージング剤により、さらに優れた診断法を提案できるのか?」を検証することを目的とする。平成28年度は、動脈硬化プラークの破綻・血栓形成に深く関与する因子として、補体、およびインテグリン(αvβ3、α2bβ3)に着目し、これらを標的とするイメージング剤に関する検討を進めた。1補体第二経路関連分子、Properdinの放射性標識体の合成法について検討した。すなわち、Properdinに金属キレーター(DOTA)を結合させた後、In-111で標識した。また、炎症モデル動物における体内動態を予備的に検討し、データ解析中である。さらに、細胞レベルでの解析のため、マクロファージ、特にM1、M2への極性化の方法を確立した。2インテグリンαVβ3、及びα2bβ3を標的とするイメージング剤に関する検討を進めた。αVβ3のイメージング剤については、[18F]RGD-K5の自動合成化を進めた。

その結果、放射化学的収率14.4%、放射化学的純度99%以上で得ることに成功した。また、α2bβ3を標的としたイメージング剤の標識合成法について検討中である。今回、動脈硬化プラークの破綻・血栓形成に深く関与する因子として、あらたに補体第二経路関連分子であるProperdin、及びインテグリンα2bβ3に着目し、これらの分子を標的とするイメージング剤に関する検討を進めたた。このため、組織因子(TF)、インテグリンαVβ3を標的とするイメージング剤の動物における評価、すなわち「TFやインテグリンαvβ3のイメージングが18F-FDGを超える診断情報を提供しうるのか?」に関する検証がやや遅れている。しかし、動脈硬化プラークの破綻・血栓形成に深く関与する因子を標的とする新しい核医学イメージング剤を開発し、18F-FDG(炎症イメージング)よりも優れた診断法を提案するという最終目標に対しては、着実に進捗してる。動脈硬化病変の診断においては、早期治療を必要とする“破綻しやすいプラーク"を見出し、その治療の効果を的確に診断することが重要である。核医学的手法は、プラークの不安定性を決定付ける分子・細胞レベルの因子を高い定量性を持った画像として表現できる画像診断法である。本研究は、動脈硬化プラークの破綻・血栓形成に深く関与する因子を標的とする核医学イメージング剤の動脈硬化病変への集積に関する分子・細胞レベルのエビデンスを固め、18F-FDG(炎症イメージング)の場合と比較することにより、「18F-FDGでは病変の性状・治療効果をどこまで評価できるのか?」「新しいイメージング剤により、さらに優れた診断法を提案できるのか?」を検証することを目的とする。平成29年度の研究では、プラークの形成に重要なマクロファージに注目した。マクロファージには、炎症促進性のM1と炎症抑制性のM2のサブタイプが存在することで知られている(Immunol Rev. 2014)。本研究では、まず、極性化マクロファージにおける2-nitroimidazole系低酸素イメージング剤(18F-fluoromisonidazole, 18F-FMISO)の集積性について評価した。その結果、M1に集積する18F-FDGとは異なり、18F-FMISOは低酸素環境下にあるM2に集積することを見出した。さらに、バルーン傷害大動脈硬化ウサギに2-nitroimidazole系化合物であるPimonidazoleを耳静脈内投与し、動脈硬化病変と無処置の大腿動脈への本薬剤の集積を比較した結果、Pimonidazoleは動脈硬化病変に選択的に集積していることが明らかとなった。これらの結果から、2-nitroimidazole系低酸素イメージング剤により、プラーク中でのM2への極性化の程度を評価できる可能性が示された。本研究では、インビトロ、インビボ実験により以下の成果を得た。1インテグリンαvβ3イメージング剤18F-RGD-K5の自動合成法を確立した。2低酸素イメージング剤18F-FMISOが、18F-FDGとは異なり、低酸下のM2マクロファージに集積することを見出した。318F-FMISOの母体構造である2-nitroimidazole系化合物が動脈硬化病変に集積することを確認した。これらの成果は、臨床診断に役立つ動脈硬化イメージング法の構築に資するものである。
カエル卵母細胞におけるカイコ細胞質多核体病ウイルスRNA合成酵素の生成

カイコ細胞質多核体病ウイルス(CPVと略称する)は10本の分節したゲノムニ本鎖RNA分子と、5種のポリペプチド、V1(分子量146K)、V2(分子量140K)、V3(分子量128K)、V4(分子量62K)、V5(分子量32K)から構成されている。ウイルス粒子には二本鎖RNAを鋳型として単鎖のmRNAを生成させるRNAレプリカ-ゼの他に、mRNAグアニリルトランスフェラ-ゼ、mRNAメチルトランスフェラ-ゼなどのキャッピング酵素が内在する。しかし、これらの酵素活性はウイルス粒子から可溶化されておらず、これらがどのペプチドに相当し、どのRNAセグメントによってフ-ドされているか明らかにされていなかった。本研究で、CPV粒子から10本の二本鎖RNAセグメントを分離・精製し、それぞれのセグメントを[^3H]UTPと共に無核アフリカツメガエル卵母細胞に注入し、RNA合成を誘起するRNAセグメントを探査した。その結果、セグメント2および3の加熱変性RNAを注入た際に,RNA合成量が増大することが判明した。セグメント2および3がコ-ドするペプチドはV2であった。したがって、V2がRNAレプリカ-ゼに他ならないことが結論ずけられた。本研究に関連して、イトマキヒトデ卵母細胞にCPVを注入したところ、アフリカツメガエルの場合と異なり、CPVタンパク質を生成することなく細胞は死に至ることが判明した。この致死因子は二本鎖RNAそのものであり、この二本鎖RNAによる致死作用には細胞内アクチンの重合が関与することがあきらかとなった。さらに、RNAポリメラ-ゼ反応を阻害する新規化合物を精製、単〓し、これがホルマイシンにきわめて類似の作用をもち、アフリカツメガエル卵母細胞に注入することによってリン酸化されることが示された。
月・火星の模擬環境となる国際宇宙ステーション曝露部実験に向けた線虫ライフ実験

月・火星有人探査を実現するためには、それらの特殊環境(特に放射線)を知ること、及びそれらの特殊環境が生体に与える影響を調べることが重要である。本研究では、国際宇宙ステーションでの月・火星・惑星間空間模擬実験を実現するための様々な基礎研究を実施した。具体的には、粒子・重イオン輸送計算コードPHITSを用いた宇宙放射線環境の推定、モデル生物線虫を用いた生体指標の重粒子線照射、高酸素と放射線の複合曝露の影響について研究を実施した。その結果、月・火星・地球磁気圏内外での線量と線質の大きな違い、体細胞のオートファジーと高感度遊泳指標を見出すとともに、複合曝露による寿命延長という興味深い結果を得た。本研究は、モデル生物線虫を用いて、将来、国際宇宙ステーション(ISS)の人口重力発生装置と組み合わせた『月・火星環境を模擬した線虫ライフ(サイエンス)実験』を実現するための様々な基礎研究を実施することを目的とする。具体的には、1宇宙放射線環境の推定、2各種生体指標の線質依存性評価、3宇宙実験を目指した実験機材の開発を行う。各テーマについて、平成27年度は以下の成果を得た。1宇宙放射線環境の推定:粒子・重イオン輸送計算コードPHITSを用いてISS軌道及び火星表面における宇宙線環境を模擬した線量推定計算を実施し、測定値とよく合うことを確認できた。この成果を、国際学会及び国際誌にて発表した。2各種生体指標の線質依存性評価:組織・細胞レベルの指標として、細胞死についてアクリジンオレンジによる染色系を、オートファジーについてlgg-1遺伝子配列と緑色蛍光タンパク質(GFP)の融合配列を導入した線虫を構築し、酸化剤の影響を調べ、その結果を国際誌に発表した。また、高酸素曝露と放射線被ばくの複合影響を解析する実験系の概念設計を完了し、実験系を構築した。3宇宙実験を目指した実験機材の開発:市販物品を用いた観察システムのコンセプトモデルを作成し、国内学会にて発表した。しかし、JAXAにてISS搭載可能な観察システムが最近開発されたため、今後は、JAXAシステムに沿って研究を進める。本研究は、3つのテーマ、1宇宙放射線環境の推定、2各種生体指標の線質依存性評価、3宇宙実験を目指した実験機材の開発、にて研究を進めている。1宇宙放射線環境の推定については、最終目的であるISS、月、火星の宇宙放射線環境の推定の内、ISS、火星について成果を挙げることができたため、当初の計画以上に進展している。2各種生体指標の線質依存性評価については、DNA損傷、酸化ストレス応答を解析するための指標(アクリジンオレンジ染色系、lgg-1遺伝子導入線虫)を構築し、それらの指標を用いて成果を得ることができた。また、高酸素曝露と放射線被ばくの複合影響の解析については、平成27年度は概念設計を目標としていたが、さらに進んで実験系の構築まで達成できた。以上より、本テーマについても、当初の計画以上に進展している。3宇宙実験を目指した実験機材の開発については、市販物品を用いた観察システムのコンセプトモデルを作成し、国内学会にて発表したが、JAXAにてISS搭載可能な観察システムが最近開発されたことがわかり、今後は、JAXAシステムに沿って研究を進めるため、本研究テーマは、来年度は廃止し、2の指標をあらたに増やすことを計画した。本テーマは当初予期していないものとなった。各テーマについて、平成28年度は以下の成果を得た。3については、JAXAにて開発済みのため平成28年度以降のテーマには含まない。1宇宙放射線環境の推定:粒子・重イオン輸送計算コードPHITSを用いて月表面における宇宙線環境を模擬した線量推定計算を実施した。2各種生体指標の線質依存性評価:個体レベルの指標として遊泳指標に与える影響に関して画像解析を用いて調べ、従来の運動に関わる有意検出線量である数百Gyと比較して2桁以上低い線量から影響を検出できる可能性を見出した。前年度までに構築した、細胞死についてアクリジンオレンジによる染色系と、オートファジーについてlgg-1遺伝子配列と緑色蛍光タンパク質(GFP)の融合配列を導入した線虫を用いて、放射線に対する影響を解析した。その結果として、細胞の自食作用であるオートファジーが体細胞でも誘導されることが確認できた。そこで、その生物学的意義を明らかにするため、線虫の全身運動に着目して解析を進めた。これらの成果を国際学会にて発表した。また、高酸素曝露と放射線被ばくの複合影響を解析するために前年度構築した実験系を用いて、線虫の寿命への影響を調べた。その結果、一時的な高酸素曝露のみでは野生株の寿命に影響しないが、同時に放射線照射することによって寿命延長が観察された。今後は、寿命延長の要因を究明するため、抗酸化系およびエネルギー代謝の制御に関与する遺伝子発現を標的として解析を進める。本研究は、3つのテーマ、1宇宙放射線環境の推定、2各種生体指標の線質依存性評価、3宇宙実験を目指した実験機材の開発、にて研究を開始したが、3についてはJAXAにおいて機材開発が完了しているため、1と2の内容について平成28年度以降研究を進めている。1宇宙放射線環境の推定については、最終目的であるISS、月、火星の宇宙放射線環境の推定の内、平成27年度にISS、火星について成果を挙げることができた。

平成28年度は、月の宇宙線環境を模擬したシミュレーションを実施した。2各種生体指標の線質依存性評価については、遊泳指標に与える影響に関して画像解析を用いて調べ、従来の運動に関わる有意検出線量である数百Gyと比較して2桁以上低い線量から影響を検出できる可能性を見出した。また、放射線に対する影響を解析した。その結果として、細胞の自食作用であるオートファジーが体細胞でも誘導されることが確認できた。そこで、その生物学的意義を明らかにするため、線虫の全身運動に着目して解析を進めた。さらに、高酸素曝露と放射線被ばくの複合影響の解析については、野生株の寿命に影響することが判明した。これまで、野生株における放射線のホルミシス効果に関する報告はあるが、高酸素との複合効果による寿命延長効果は新たな知見である。以上より、本テーマについても、当初の計画以上に進展している。平成29年度は、1宇宙放射線環境の推定、2各種生体指標の線質依存性評価について、以下の成果を得た。1の成果:粒子・重イオン輸送計算コードPHITSを用いて、地球・月・火表面及び地球磁気圏内外にある宇宙機内の宇宙線環境を模擬し、被ばく線量を推定した。月面及び火星表面の被ばく線量は、地球表面と比較して太陽活動極大期でそれぞれ368倍及び240倍、太陽活動極小期ではその差がさらに大きくなることが分かった。また、被ばく線量に最も寄与する放射線の種類が、地表面はミューオン、宇宙機内及び火星表面では陽子、月表面では重イオンであることが分かった。以上の成果は、宇宙空間における放射線防護指針の策定や生物実験を計画する際、極めて重要となる。2の成果1:線虫の体細胞で誘導されるオートファジーの生物学的意義を明らかにするため、遊泳運動に与える影響を解析した。その結果、細胞の自食作用が放射線照射後の線虫の運動回復に貢献している可能性が高いこと、また運動回復が酸化ストレス損傷に対する応答と一部共通することが分かった。2の成果2:放射線と高濃度酸素曝露の寿命延長要因について明らかにするため、遺伝子発現を解析した。放射線照射後に、sod遺伝子群などの抗酸化系、及びエネルギー代謝に関わるsco-1やsir-2.1遺伝子のいずれも著明な発現量低下を示した。しかし、放射線と高濃度酸素の複合処理から約10日後にはsod遺伝子の一部とsir-2.1遺伝子の発現量回復が見られた。この結果は、放射線照射は一時的に蛋白合成など細胞の活動を抑制するが、高濃度酸素との複合影響で抗酸化系の回復およびサーチュインによるエピジェネティックな効果が寿命延長に寄与することを示唆した。月・火星有人探査を実現するためには、それらの特殊環境(特に放射線)を知ること、及びそれらの特殊環境が生体に与える影響を調べることが重要である。本研究では、国際宇宙ステーションでの月・火星・惑星間空間模擬実験を実現するための様々な基礎研究を実施した。
変形自在なマクロ分子集合体をテンプレートとするトップダウン・ナノアセンブリ

本研究課題では、マクロ分子集合体を用いて、無機ナノ粒子の集積パターンをトップダウン的な手法によって自由に描く技術を提案する。マクロ分子集合体とは、ここでは有機分子が液相中で相分離して形成されたマクロな構造体である。ソフトマテリアルであるために柔軟性を示し、外力によって容易に形状が変化する。このマクロ分子集合体を変形自在なテンプレートとして用いる。種々の方法により析出したマクロ分子集合体を無機ナノ粒子と複合化し、2次元/3次元パターンをトップダウン的に直接描画する。続いて、マクロ分子集合体のみを除去し、ナノ粒子から成る集積パターンを得る。以上のプロセスコンセプトを検証する。2018年度は申請者らの先行研究に基づいて、柔軟なテンプレートを用いるトップダウンナノアセンブル技術の開発を進めた。界面活性剤分子のマクロスケールな自己組織化(リオトロピック液晶)と無機ナノ粒子の複合化により、無機ナノ粒子の配向パターンを形成した。界面活性剤分子としてデオキシコール酸ナトリウムを使用した場合、ファイバー状のマクロ分子集合体が形成され、この構造体にカーボンナノチューブ(CNT)を複合化させた。複合化によりゲル化が生じたため、マイクロノズルからの連続的な押し出しによってトップダウン的な直接描画が可能となった。3次元パターンを直接描画した後、界面活性剤分子を除去することにより、分子間力により配向したCNTの凝集パターンを観察した。申請者らの先行研究に基づいて、柔軟なテンプレートを用いるトップダウンナノアセンブル技術の開発を進めた。界面活性剤分子を用いて、そのマクロ分子集合体と無機ナノ粒子を複合化し、3次元パターンをトップダウン的に直接描画し、マクロ分子集合体のみを除去し、無機ナノ粒子から成る集積パターンを得たことから、おおむね順調に進展していると判断した。本年度の研究において、界面活性剤分子を利用する新たな方法論の可能性を見出した。そこで、次年度はこの詳細について調べるとともに、別の方法を用いたマクロ分子集合体の形成も検討する。国内外の学会参加が少なかったために、旅費の使用額が特に少なかった。次年度は積極的に研究成果を国内外の学会の場で公表する予定である。
温水性魚類のレンサ球菌症に関する研究

レンサ球菌症は、日本の養殖ブリ、カンパチおよびサケ科魚類の重要な病気の一つであり、経済的に問題となる。Streptococcus iniaeは海産魚と淡水魚の病原体として知られている。いっぽう、Lactococcus garvieaeとStreptococcus dysgalactiaeはブリおよびカンパチの病原体として知られている。しかしながら、これらの病原体の混合感染症がブリで発生しているため、正確な診断は時に困難である。主たる病原体が何であるのかを特定するために、この研究の中で複合PCRによる診断の有効性について検討を行った。PCRは、L.garvieaeでは16S rRNAから、S.dysgalactiaeでは16S-23S rDNAのITS領域から、またS.iniaeではlactate oxidaseから設計されたプライマーを使用して行った。これらを使用した複合PCRにより、培養したL.garvieae、S.dysgalactiaeおよびS.iniaeから各々明瞭な1,100、259および870bpの増幅産物が得られ、非特異的な増幅産物は得られなかった。また、ニジマスにこれら3種の細菌を接種し、各組織から複合PCRにより各細菌の検出を試みた結果、迅速で正確に各細菌の増幅産物を得ることができた。このことから複合PCRによるブリのレンサ球菌症の診断は有効な診断手法であると判断された。温水性魚類のレンサ球菌症に関する研究について、研究計画書の中で記載した内容に従って、以下のような研究を実施した。1.養殖魚に発生したレンサ球菌症罹病魚からStreptococcus sp.を分離することを試みた。この目的のために、鹿児島県および長野県の養殖場に赴き、鹿児島県ではブリに、また、長野県ではサケ科魚類に発生しているレンサ球菌症罹病魚から菌の分離を試みた。その結果、StreptococcusおよびLactococcusを分離することに成功した。これらの細菌は、養殖場において大量死を引き起こす病原菌として知られている。2.分離菌の同定は、通常行われている生物学的手法、すなわち6種類の培地を用いて、どの培地が分離培養に適するかを検討した(発育適温試験)。その結果、THB agar, Columbia agarおよびCSOA mediumの順に発育が良好と判断された。さらに、生化学的同定法としてAPI testおよび血清学的試験を行なった。これらの手法に加え、遺伝学的に、同定することも試みた。すなわち、すでに設計されている特異的な4種類のプライマーを用い、PCR法による同定を試みた。その結果、ブリから分離された細菌は1100bp、またサケ科魚類から分離された細菌は870bpのところにバンドが形成され、前者は、Lactococcus garviaeに、また後者はS. iniaeに同定することができた。
磁気分離活性汚泥法による余剰汚泥ゼロエミッションをめざす下水処理法の開発

1日30m^3の水処理可能な大型の実験プラントを用いて、パイロットスケールでの磁化活性汚泥の実証実験をおこなった。最初沈殿池(約1m^3)、曝気槽(7.6m^3)、最終沈殿池(約1.5m^3)からなる活性汚泥プラントにおいて、曝気槽上部に小型の回転磁石ドラム(長さ80cm×直径30cm)を備えた磁気分離装置を1基設置し、大部分の高濃度の磁化活性汚泥を磁気分離により分離に、最終沈殿池でさらに残りのSS分を分離する磁気分離・沈降分離ハイブリッド方式を適用した磁化活性汚泥法について検討した。約500010000mg/Lの高濃度汚泥を曝気槽に保持することで、自己消化による汚泥の減量を実現し、余剰汚泥を引き抜くことなく、半年間の実証試験に成功した。沈降分離槽から流出する最終的な処理水はCODCr=2030mg/L、SS=1020mg/Lと良好な処理水が得られた。また、汚泥滞留時間が長いことから、硝化が良好に行なわれることも確認された。7月に行なわれた下水道研究発表会ではポスター発表において最優秀賞を得た。また、10月に行なわれた磁気分離開発研究に関するワークショップでは、応用部門の優秀ポスター賞を得た。3月には、問い合わせのあった、イギリス・水処理企業まで出向き、国際的な共同研究・共同開発に関する打ち合わせを行なうことができた。パイロットプラントは世界初の実証規模での磁化活性汚泥法として、イギリスの磁気分離の著名研究者、荏原製作所、栗田工業などの多くの企業の見学を受けた。これらの結果は昨年3月28日にNature Science Update他に記事が掲載されたのをはじめ、6月にはアメリカ化学会のオンラインニュース誌、さらに7月にはアメリカ化学会のオンラインマガジン誌に繰り返し取り上げられるなど大きなインパクトを世界に与えたといえる。世界中の水環境関連のWebニュース、30誌以上で活性汚泥法の新しい技術として報道されている。1日30m^3の水処理可能な大型の実験プラントを建設し、パイロットスケールでの磁化活性汚泥の実証実験をおこない、実用化にむけての実証実験を開始した。最初沈殿池(約1m^3)、曝気槽(7.2m^3)、最終沈殿池(約1.5m^3)からなる活性汚泥プラントにおいて、曝気槽上部に回転磁石ドラム(長さ1.6m×直径20cm)を備えた磁気分離装置を2基設置した。磁石ドラムは塩化ビニル製パイプまたはステンレス製パイプにプラスチック磁石を巻いたもので、表面の最大磁場は0.1T、表面はN極、S極が交互に着磁されており、磁石表面から1cm離れると磁場0.01T程度であるため、磁気勾配は10T/m程度となる。ドラムは1分に110回転し、1回転毎に磁石表面に付着した磁化活性汚泥が、ゴム製のスクレーパーでこすり落とされ、全量が曝気槽に戻される。7.2m^3の曝気槽でも、強磁性粉投入後、12分で活性汚泥フロック中に強磁性粉が取り込まれ、磁気分離が可能となった。流出水中の全COD_<Cr>濃度は10/710/31の平均値で22mg/Lであった(図6)。流入全COD_<Cr>濃度は寒くなるとともに上昇しているが、流出水の値は安定している。有機物の処理に関しては非常に良好に処理されているといえる。

汚泥の滞留時間が無限大であるため、硝化菌の増殖に有利な条件となっており、流入水中のアンモニア性窒素のほとんどが硝化されている。現在、上記の磁気分離装置では、十分な磁気分離性能が得られず、磁気分離装置を改良中である。これらの結果はH.14年11月の磁気分離ワークショップで報告され、ベストポスター賞を受けるなど高い評価を受けた。現在、多くの企業の見学が月1回以上のペースで行われ、実用化に向けた共同研究が始まりつつある。1日30m^3の水処理可能な大型の実験プラントを用いて、パイロットスケールでの磁化活性汚泥の実証実験をおこなった。最初沈殿池(約1m^3)、曝気槽(7.2m^3)、最終沈殿池(約1.5m^3)からなる活性汚泥プラントにおいて、曝気槽上部に小型の回転磁石ドラム(長さ80cm×直径30cm)を備えた磁気分離装置を1基設置し、大部分の高濃度の磁化活性汚泥を磁気分離により分離に、最終沈殿池でさらに残りのSS分を分離する磁気分離・沈降分離ハイブリッド方式を適用した磁化活性汚泥法について検討した。約500010000mg/Lの高濃度汚泥を曝気槽に保持することで、自己消化による汚泥の減量を実現し、余剰汚泥を引き抜くことなく、半年間の実証試験に成功した。沈降分離槽から流出する最終的な処理水はCODCr=2030mg/L、SS=1020mg/Lと良好な処理水が得られた。また、汚泥滞留時間が長いことから、硝化が良好に行なわれることも確認された。7月に行なわれた下水道研究発表会ではポスター発表において最優秀賞を得た。また、10月に行なわれた磁気分離開発研究に関するワークショップでは、応用部門の優秀ポスター賞を得た。3月には、問い合わせのあった、イギリス・水処理企業まで出向き、国際的な共同研究・共同開発に関する打ち合わせを行なうことができた。パイロットプラントは世界初の実証規模での磁化活性汚泥法として、イギリスの磁気分離の著名研究者、荏原製作所、栗田工業などの多くの企業の見学を受けた。これらの結果は昨年3月28目にNature Science Update他に記事が掲載されたのをはじめ、6月にはアメリカ化学会のオンラインニュース誌、さらに7月にはアメリカ化学会のオンラインマガジン誌に繰り返し取り上げられるなど大きなインパクトを世界に与えたといえる。世界中の水環境関連のWebニュース、30誌以上で活性汚泥法の新しい技術として報道されている。
圧縮文字列上の高速パターン列挙に関する基盤技術開発

本年度は,本研究テーマの一つの集大成として,圧縮された文字列データから規則性をもった部分文字列を高速に計算・列挙する手法を開発した.繰り返し構造や回文構造といった文字列の規則性の発見は文字列処理の基礎であり,また,ゲノムデータの解析などに応用出来る.圧縮文字列処理では展開文字列長に比例する計算資源を用いないことを目標としており,そのため圧縮文字列を全て展開せずに処理しなければいけないという難しさがあるが,解の列挙においてはさらに出力の仕方も問題になる.単純に出力すると出力サイズに比例する時間を避ける事ができず,今回の出力である繰り返し構造や回文構造の数は展開文字列長に比例するためである.本手法では,圧縮された文字列を展開する事無く処理を行い,かつ,出力の圧縮表現を計算することでこの問題を回避した.これにより,ゲノムデータなどの大規模文字列データも,それが良く圧縮されているならば省領域かつ高速に規則性を発見することが出来る.この結果は38th International Symposium on Mathematical Foundations of Computer Science (MFCS2013)に採択され発表を行った.(抄録なし)平成24年度後半は,文法圧縮された文字列上で効率的に畳込み計算を行う手法を開発した.文字列の畳込みは,不一致を許す文字列照合やドントケア文字を含む文字列集合など様々な近似文字列照合に応用出来る重要な技術であり,本研究の成果は,文法圧縮を用いる事で畳込み計算の高速化を可能にするという画期的なものである.本研究成果をまとめた論文は,Data Compression Conference(DCC2013)に採択され発表を行った.その他,接尾辞が束ねられた文字列集合に対してポジションヒープと呼ばれる索引構造を効率的に構築するアルゴリズムや,連長圧縮を用いてLempel-Ziv78分解を高速に計算するアルゴリズムなどを提案している.本年度は,本研究テーマの一つの集大成として,圧縮された文字列データから規則性をもった部分文字列を高速に計算・列挙する手法を開発した.繰り返し構造や回文構造といった文字列の規則性の発見は文字列処理の基礎であり,また,ゲノムデータの解析などに応用出来る.圧縮文字列処理では展開文字列長に比例する計算資源を用いないことを目標としており,そのため圧縮文字列を全て展開せずに処理しなければいけないという難しさがあるが,解の列挙においてはさらに出力の仕方も問題になる.単純に出力すると出力サイズに比例する時間を避ける事ができず,今回の出力である繰り返し構造や回文構造の数は展開文字列長に比例するためである.本手法では,圧縮された文字列を展開する事無く処理を行い,かつ,出力の圧縮表現を計算することでこの問題を回避した.これにより,ゲノムデータなどの大規模文字列データも,それが良く圧縮されているならば省領域かつ高速に規則性を発見することが出来る.この結果は38th International Symposium on Mathematical Foundations of Computer Science (MFCS2013)に採択され発表を行った.本年度の研究で,文書集合中の頻出文字列パターン列挙と,文法圧縮された文字列上で近似文字列照合を効率的に行う手法に関する知見が得られた.これらは,本研究課題が目指す「圧縮文字列上で動作する列挙アルゴリズム」の基盤技術になると考えられる.文法圧縮された文字列上で繰り返し構造や回文などの特徴的な文字列を高速に列挙する手法の開発を行う.また,文法圧縮された文字列上でLyndon分解を効率的に計算する手法の開発を行う.(抄録なし)
ショウジョウバエ微小脳における性的二型を示す脳構造とその機能の解明

ショウジョウバエの脳内構造を可視化するためのマーカー抗体及び染色方法の検討を行った。ニューロピル特異抗体を用いた免疫組織化学染色法と共焦点レーザー顕微鏡を組み合わせることで、容易に脳の構造を解析することができるようになった。解析の結果、ショウジョウバエ触角葉糸球体の特定領域で、性的二型が存在することが明らかになった。Gal4/UASシステムを用い、当研究室で作成したGal4エンハンサートラップ系統及び既存の系統、計270弱について、脳内遺伝子発現パターンを可視化し、データベースを作成した。上記のスクリーニングで得られた系統を利用し、性的二型を示す糸球体に投射している感覚神経の同定を行った。その結果、性的二型を示す糸球体に投射する主な一次神経は、触角に分布するtrichoid sensillaタイプの嗅覚受容神経細胞であり、その発生はlozenge遺伝子により支配されていることが明らかになった。分離されたGal4エンハンサートラップ系統などを用い、性的二型を示す脳内特定領域の雌化や細胞死誘導による破壊を行い、交尾行動への影響を調査したが、脳内特定領域以外への影響が生じてしまい、脳の性的二型領域が交尾行動発現にどのくらい関与しているかは、まだ未解決である。この結果は、遺伝子の強制発現により雌雄モザイク作成や機能阻害を行う際には、厳密な発現調節が必要となることを示唆している。ショウジョウバエpoxn遺伝子発現神経細胞の脳内投射パターンを解析した結果、poxn遺伝子発現神経細胞は、脳のcentral conplexおよぴ触角葉からのprojection neuron群を構成していることが明らかになった。また、poxn突然変異体では、これらの脳内投射パターンが異常となっていることが示され、この異常が交尾行動の異常の原因になっていることが示唆された。シナプス特異抗体を用いた免疫組織化学染色法と共焦点レーザー顕微鏡を組み合わせ、ショウジョウバエ触角葉糸球体構造を雌雄で比較したところ、特定の糸球体の大きさが雌雄で異なり、ショウジョウバエにおいても糸球体領域に性的二型が存在することを明らかにした。本研究室において作成されたGal4系統および既存のGal4系統、269の系統について、この雌雄性を示す糸球体で発現のある系統のスクリーニングを行った。その結果、この糸球体で発現がある2つの系統を分離した。えられたGal4系統を用い、この糸球体に投射する一次神経を調査したところ、触角に広範囲に分布する嗅覚受容神経細胞であることが明らかになった。lozenge突然変異体は、嗅覚受容器のうちほとんどのBSと多くのTSを欠損する。lozenge突然変異体において、上記Gal4を発現する嗅覚受容神経細胞はその数が減少していることが明らかになった。このことは、性的二型を示すDA1糸球体に投射する一次神経は、BS/TSタイプのものが含まれていることを示している。触角葉糸球体における雌雄差が、ショウジョウバエで明らかにされている性決定カスケードのなかで、どの遺伝子により支配されているか理解するために、transformer(tra)遺伝子が糸球体の雌雄差に及ぼす影響を調査した。雄個体において雌化遺伝子tra.Fを強制発現した結果、雌雄差を示す糸球体が雌化していることが明らかになった。一方、tra突然変異体の雌では、この糸球体は雄型に変化していた。このことは、糸球体の雌雄差は性決定遺伝子traにより支配されていることを示している。poxn突然変異体は、雄不妊となり、その原因は雄の性行動異常によることが明らかになった。これに対応するように、poxn遺伝子は脳の特定領域に局在する神経細胞群で発現していることが明らかになった。
放射線損傷限界を超える細胞の分子分解能三次元イメージング

細胞分裂機構の分子構造基盤解明を目指し、細胞「丸ごと」の三次元構造解析を行う。超分子複合体を解像できる数nm分解能の達成を目指す。低温コヒーレントX線回折トモグラフィー法により、細胞内の電子密度分布を非染色・非侵襲かつ放射線損傷を低減して可視化する。放射線損傷低減下であっても空間分解能は20 nm程度が限界と予想され、(1)コヒーレントX線の干渉効果を活用した回折シグナルの増強と(2)情報科学を活用した低照射線量トモグラフィーの技術開発により、空間分解能向上を目指す。
ウイルス受容体をイメ-ジした広域性インフルエンザワクチン開発の基礎研究

本研究は、インフルエンザウイルスの受容体をイメ-ジした広域性インフルエンザワクチン開発の基礎の確立目的としている。本年度は本研究の最終年度であることを鑑み、当該研究をまとめ結論を引き出すことを考慮した。今年度は、昨年度に引き続以下の成果が得られた。(1)インフルエンザウイルスレセプタ-糖鎖を簡便かつ高感度で検索する新しい方法を開発した。(2)最も病原性が高く抗原変異による流行を続けているA型インフルエンザウイルスの全ての亜型(H1ーH13)のヘマグルチニン遺伝子の塩基配列、アミノ酸配列を決定することが出来た。また、同時に各ヘマグルチニン亜型が認識するレセプタ-糖鎖を明らかにした。これにより用いた全てのA型ウイルスヘマグルチニン亜型のレセプタ-シアロ糖鎖の認識は、ヘマグルチニンの変異とは関係なくNeuAcα2,3(6)Galβ1,4GlcNAcβ1,3Galβ1,4Glcβ1ー(ガングリオシドシアリルパラグロボシドが持つ糖鎖)をレセプタ-として最も強く認識することを初めて明らかにした(Virology,in press)。(3)上記共通のレセプタ-糖鎖に対するモノクロ-ナル抗体(NS24)の作成に成功した。天然および化学合成ガングリオシド誘導体を用いて調べた結果、本抗体は上記の糖鎖のみと反応し、極めて特異性の高い抗体であった(J.Biochem.,109,354ー360,1991)。(4)NS24によりインフルエンザウイルスの赤血球膜レセプタ-への吸着は効果目に阻害されることが解った。この結果からNS24はA型ウイルス共通のレセプタ-シアロ糖鎖を認識する抗体であることが判明した。(4)さらにNS24に対する抗イデイオタイプ抗体を産生するハイブリド-マの作成を試み、いくつかの抗ウイルス活性を持つクロ-ンを得ることに成功した。この結果はNS24が広域インフルエンザワクチンとして応用可能であることを示すものであり、ウイルス受容体をイメ-ジした広域性ワクチンの開発が可能であることを実証できたと考えられる。本研究は、ウイルスとその受容体の相補性を利用してウイルスの抗原変化とは無関係で、広域性の高い新しいインフルエンザワクチンを実用化するための実験的基礎を確立することを目的としている。本年度の成果を以下に述べる。1)多くのインフルエンザウイルスヘマグルチニン(HA)およびノイラミニダ-ゼ(NA)により共通に認識される細胞膜受容体(ガングリオシド、糖タンパク質)を単離し、その糖鎖構造をそれらの遺伝子の変異との関連で明かにした。また、HA分子内Ser(205)は、シアル酸の結合様式(α2,3,α2,6)に対する認識に重要なエピト-プであることをHA分子の三次元構造の解析と共に明かにした。また、ある種の合成ガングリオシド誘導体がインフルエンザウイルスNAの特異的インヒビタ-となることを見いだし、ウイルス感染におけるNAの役割を解明する上で極めて重要な情報が得られた。2)インフルエンザAおよびB型ウイルスに共通した受容体ガングリオシドとして最も活性の高いシアリルパラグロボシドに対するモノクロ-ナル抗体(NS24)の作成に成功した。本ガングリオシドの抗原性は極めて弱いことから抗原を菌体由来のLPSと共にリポソ-ムに埋め込む新しい方法を導入した。

本抗体は、シアリル(α2ー3)パラグロボシドとのみ反応し、類似の糖鎖を持つガングリオシドとは反応しない特異性の高いものであった。シアリダ-ゼにより細胞膜受容体を破壊した赤血球にシアリルパラグロボシドを再構成させた赤血球膜上のインフルエンザウイルス共通の受容体(シアリルパラグロボシド)と結合し、ウイルス特異的溶血を阻止することが明らかとなった。3)ウイルスに対する抗イデイオタイプ抗体はウイルス受容体の三次元的構造をイメ-ジし、ウイルスと特異的に結合する。換言すれば、NS24は広域ワクチンとして応用可能である。今後は、NS24のワクチン効果およびNS24に対する抗イデイオタイプ抗体を作成し、そのウイルス阻止作用、感染防御効果をしらべる予定である。本研究は、インフルエンザウイリスの受容体をイメ-ジした広域性インフルエンザワクチン開発の基礎の確立目的としている。本年度は本研究の最終年度であることを鑑み、当該研究をまとめ結論を引き出すことを考慮した。今年度は、昨年度に引続き以下の成果が得られた。(1)インフルエンザウイルスレセプタ-糖鎖を簡便かつ高感度で検索する新しい方法を開発した。(2)最も病原性が高く抗原変異による流行を続けているA型インフルエンザウイルスの全ての亜型(H1ーH13)のヘマグルチニン遺伝子の塩基配列、アミノ酸配列を決定することが出来た。また、同時に各ヘマグルチニン亜型が認識するレセプタ-糖鎖を明らかにした。これにより用いた全てのA型ウイリスヘマグルチニン亜型のレセプタ-シアロ糖鎖の認識は、ヘマグルチニンの変異とは関係なくNeuAcα2,3(6)Galβ,4GlcNAcβ1,3Galβ1,4Glcβ1ー(ガングリオシドシアリルパラグロボシドが持つ糖鎖)をレセプタ-として最も強く認識することを初めて明らかにした(Virology,in press)。(3)上記共通のセレプタ-の糖鎖に対するモノクロ-ナル抗体(NS24)の作成に成功した。天然および化学合成ガングリオシド誘導体を用いて調べた結果、本抗体は上記の糖鎖のみと反応し、極めて特異性の高い抗体であった(J.Biochem.,109,354ー360,1991)。(4)NS24によるインフルエンザウイルスの赤血球膜セレプタ-への吸着は効果的に阻害されることが解った。この結果からNS24はA型ウイルス共通のレセプタ-シアロ糖鎖を認識する抗体であることが判明した。(4)さらにNS24に対する抗イデイオタイプ抗体を産生するハイブリド-マの作成を試み、いくつかの抗ウイルス活性を持つクロ-ンする抗イデイオタイプを産生するハイブリド-マの作成を試み、いくつかの抗ウイリス活性を持つクロ-ンを得ることに成功した。この結果はNS24が広域インフルエンザワクチンとして応用可能であることを示すものであり、ウイルウ受容体をイメ-ジした広域性ワクチンの開発が可能であることを実証証できたと考えられる。