hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
介護保険制度導入が地域高齢者保健医療福祉システムに及ぼした効果の評価に関する研究

これについては、13年度、14年度に分析を行う。平成13年度の研究では、以下の研究を行った。1)利用者満足度調査福岡県の1保健所管内の介護保険利用者を対象に満足度調査を行い、その結果を分析した。利用者の90%以上は、現在のサービスに満足しているが、サービス提供開始の際の説明やモニタリングに関してはまだ不十分な面がある。また、利用者も制度の理解が不十分な点がある。このような点を踏まえて、利用者向け及び事業者向けのチェックリストを作成した。現在、このチェックリストを配布し、その有用性について検討を行っている。2)ケアプランの評価介護保険サービスの質向上のためには地域における十分なケアマネジメント体制の確立が必要である。この目的で、ケアプランの収集し、その内容を検討することで脳卒中、ターミナルケア、難病などの問題別のチェックリストを作成した。さらに、利用者の同意を得て、2年間分のケアプランを収集し、このチェックリストをもとにケアプランの内容を検討することで、要介護度の変化との関連についての分析を行っている。特に、この分析では予防的なサービス提供の効果について検討を行っている。3)介護保険制度の評価指標に関する研究介護保険制度の評価指標として、校区別に要介護度別対象者出現率、在宅/施設比を算出し、それを市全体の数値と比較して、SMR的な指標化を試みた。その結果、地域差の存在が明らかとなり、この結果を踏まえて、現在、そのような地域差の要因について検討を行っている。平成12年度に導入された介護保険制度の影響について調査した結果以下のような知見を得た。1)福岡県内の1自治体において、自立判定になった高齢者のADL、LADL、現病歴・既往歴、世帯の状況などを評価する総合調査票を平成12年度に作成した。自立判定者及び老人保健事業に参加している高齢者を対象に評価を行い、199名について平成14年度の状況について分析を行った。その結果、2002年11月時点で調査開始時の199名の高齢者のうち、5名のみが死亡(2名)あるいは介護保険対象者(3名)となり、その他は「自立」にとどまっている。ADL機能のうち「移動」「排泄」でそれぞれ約20%と10%の若干の低下が認められた。いずれも現病歴に「膝関節症」あるいは「腰痛」などの骨関節系の障害がある者で、そうでない者に比較して、「移動」「排泄」が低下する割合が高かった(log-rank test : p<0.05)。以上の結果は自立から要支援群の高齢者が要介護状態に陥っていく原疾患として骨関節系の傷病が重要であることを示している。また、平成14年度はこの調査票を用いて同自治体の全高齢者を対象とした実態調査を行い、中学校区別に自立度の評価を行った。2)介護保険給付の増加要因を分析するために以下のようなモデル式を作成し、福岡県内の10自治体のデータの分析を行った。両辺の1nを取り微分するとΔTCE=ΔTN+ΔR1+ΔR2+ΔCEとなり、TCEの増加の要因分析ができる。分析の結果、都市部では老人人口の増大が最も大きな介護保険給付費増の要因であり、過疎地域ではCEの増加が給付費増の主たる要因となっている。そして、CEの増加に関連する要因としては独居高齢者の数、後期高齢者の数、施設サービス量などが関連していた。
カスパーゼ阻害活性を応用した食品成分の生理機能の解明

イボタケ属のきのこから、多数のp-テレファニル骨格を有する新規物質が単離・同定されているが、ヒト肝ガン細胞HepG2を目安にした抗腫瘍活性物質探索は無く、我々はVialinin A(VAと省略)を単離構造決定した。今年度我々はボタンイボタケからVAよりメチレン基が一個少ない新規物質Thelephantin-O(TOと省略)を単離し、LC-MS/MS分析、13C-NMRの化学シフトに及ぼす同位体効果分析により化学構造を同定した。TOとVAは、p-テレファニル骨格の中央ベンゼン環に2つの水酸基がシス位で置換する特徴的構造を有しており、HepG2やCaco2の悪性腫瘍細胞の増殖を抑えるが、対応する正常細胞には何ら影響を与えない選択性を示した。さらに抗腫瘍機構解明のため、HepG2細胞に幾つかの濃度の活性物質を添加、48時間本培養を行い、細胞ライセートのカスパーゼ3/7活性を測定したところ、活性物質10μg/mlでカスパーゼ3/7活性をほぼ100%阻害することが明らかとなった。この結果はこれらの化合物の選択的抗腫瘍活性は、アポトーシスが原因ではなく、他の径路に起因するものであることを示していた(現在論文投稿中)。VAは強力な抗酸化性とヒト肝ガン細胞HepG2へのカスパーゼ阻害活性を併せ持つ生理作用を有することを明らかとしており、アルコールの慢性的な消費によって生じる金属の撹乱や酸化ストレスの増大が引き金となって引き起こされる肝障害を改善する生理効果がVAに期待されたため、慢性アルコール性肝障害モデルラットにVAを投与する動物実験を行った。VAをラットに投与する動物実験は本研究が世界で初めてであり、2010年ノーベル賞を受賞した鈴木.宮浦のクロスカップリング反応を応用した合成法を用いてVAを大量に化学合成し天然物と一致することを確認後、それを用いて慢性的な過剰飲酒モデル動物への経口投与を行った。5週齢Wister系雄ラットを使用し、液体飼料であるLieber-DeCarli dietsのPFC比のC:47. 5%のコントロール群と、C比の36%をアルコールに置換したアルコール投与群、さらにアルコール投与群と同じ食餌組成にVAを0. 0002%(w/v)または0. 001%(w/v)に調製した群の4群に分けた。アルコール投与群の食餌量を基準として、8週間pair-feedingを行った。VAの投与により肝臓や腎臓に毒性を示すような生化学的な異常、また体重や各臓器の増加、飼育期間中に異常がみられなかったが、VA投与群においては肝臓の酸化ストレスマーカーMDA値が減少する傾向がみられた。現在、VAの経口投与量を検討中である。今年度は以下のような項目について行った。

【新規抗腫瘍活性物質Telephantin-Oの単離・同定】と【カスパーゼ阻害活性の評価】担当:乗鞍、松江イボタケ属のきのこから、多数のp-テレファニル骨格を有する新規物質が単離・同定されているが、ヒト肝ガン細胞HepG2を目安にした抗腫瘍活性物質探索は無く、昨年度我々はVialinin A(VAと省略)を単離構造決定した。今年度は,ボタンイボタケからVAよりメチレン基が一個少ない新規物質Telephantin-Oを単離し、LC-MS/MS分析、NMR分析により化学構造を同定した。Telephantin-OとVAは、HepG2やCaco2の悪性腫瘍細胞の増殖を抑えるが、対応する正常細胞には何ら影響を与えない選択性を示し、いずれの化合物もp-テレファニル骨格の真ん中のフェノール性水酸基がシスという特徴的構造を有していた。さらに,抗腫瘍機構解明にHepG2細胞に活性物質(1040mg/ml)を添加後、48時間本培養を行い、細胞ライセートのカスパーゼ3/7活性を測定したところ、活性物質10μg/mlでカスパーゼ3/7活性をほぼ100%阻害することが明らかとなった。この結果はこれらの抗腫瘍活性がアポトーシスが原因で起こるものではないことを示していた。【VAの化学合成】および【慢性アルコール性肝障害モデル動物経の投与試験】担当:藤原、森永、乗鞍、松江VAの強力な抗酸化性とヒト肝ガン細胞HepG2へのカスパーゼ阻害活性から、逆に酸化ストレスの増大に伴ったアポトーシスが引き金となっておこるアルコール性肝障害を改善する生理的効果がVAに期待された。VAを投与する動物実験は本研究が世界で初めてであり、2010年ノーベル賞を受賞した鈴木-宮浦のクロスカップリング反応を応用した合成法を用いてVAを大量に化学合成し天然物と一致することを確認後、それを用いて慢性的な過剰飲酒モデル動物への経口投与を行わた。5週齢Wister系雄ラットを使用し、液体飼料であるLieber-DeCarli dietsのPFC比のC:47.5%のコントロール群と、C比の36%をアルコールに置換したアルコール投与群、さらにアルコール投与群と同じ食餌組成にVAを0.0002%(w/v)に調製した群、また0.001%(w/v)に調製した群の4群こ分けた。アルコール投与群の食餌量を基準として、8週間pair-feedingを行った。VAの投与により肝臓や腎臓に毒性を示すような生化学的な異常、また体重や各臓器の増加、飼育期間中に異常がみられなかったが、VA投与群においては肝臓の酸化ストレスマーカーMDA値が減少する傾向がみられた。
著しい口腔環境の変動にともなう歯垢微生物の糖代謝の動態の研究

糖を基質として歯垢中でつくられる酸はウ蝕の直接の原因となる。本研究では、このような歯垢中での酸産生が、口腔環境の変動に伴って変動する様相とその生化学的機構について検討した。我々のこれまでの研究結果では、中性付近のpHで垢中の主要な酸産生歯であるレンサ球歯は、糖制限・高度嫌気条件では、糖を代謝して、もっぱらギ酸、酢酸、エタノ-ルをつくることを明らかにし、広く認められてきた。しかし、歯垢中のpHは、食事ののち急激に低下する。このような低いpH条件下では、たとえ、糖の供給が制限され、高度の嫌気条件下でも、乳酸が多く産生されることが発見された。これは、低いpH条件下では、乳酸の酸性を触媒する乳酸脱水素酸素の生合成が促進され、また細菌菌体内のpHが低下し、至適pHの低い乳酸脱水素酸素が、至適pHの高いピルビン酸ギ酸リア-ゼ(PFL;ギ酸等の産生のキイ酵素)よりもはるかに活性が高くなることによることが判明した。PFLは歯垢微生物の嫌気的糖代謝に重要な役割をする酵素であるが、この酵素は高度嫌気条件下で発酵性の糖があると、不活性型より活性型に変化し、このことにより、歯垢深部のような高度嫌気条件下では、嫌気的糖代謝が活発になることが知られていた。本研究で、この酵素の活性化に、NADPHを必要とすることが明らかにされた。このことは、NADPHを産生する糖代謝経路(ペント-ス回路など)の変動がPFLの活性化(すなわち、嫌気的糖代謝の調節)と深く関わっていることを示し、歯垢中での糖代謝の変動の生化学的機構を明らかにする上で、きわめて貴重な知見が得られたものと考えられる。PFLはレンサ球歯のみならず、アクチノミセスや乳酸桿菌など、歯垢微生物に広く分布していることも見いだされ、環境変動に伴う歯垢中での嫌気的糖代謝(酸産生)の変動の機構がさらに解明された。大きく変動する口腔環境の変化にともなって歯垢微生物の糖代謝がどのような機構によって変化しているかを知るためにStreptococcus mutans Streptococcus sanguisなど歯垢中の主要酸産生菌が産生する酸の種類の決定に直接関与している二つの酵素,ピルビン酸ギ酸リアーゼ(PFL)および乳酸脱水素酵素(LDH)の環境変動に伴う活性調節の構を検討した.S.sanguisの休止歯はPFLは糖欠乏条件では再活性化可能な,酸素耐性不活性型(Rー型)に変換されて酸素傷害から守られていたが, S.mutansの休止歯はこのような変換ができなかった.しかし,これらレンサ球菌を低いpH条件に移すと両菌ともPFLをRー型に変換しこの酵素を酸素傷害から守っていることが判明した.その結果として活性型PFLが減少するため,低いpHではこれら両菌は乳酸を,ことに嫌気条件で著しく多く産生するようになった.また, S.mutansは糖欠乏条件になるとPFL不活性化因子が合成され,この酵素を失活させていることが判明した.乳酸脱水素酵素(LDH)の四次構造は菌体内の糖代謝中間体, fructose 1,6ーbisphosphateおよび無機リン酸の濃度変化によって二量体一四量体の変換を行なっていることが証明された.

試験管内では両者とも活性型である4量体に変換させることができるが,実際の菌体内ではfructose 1,6ーbisphosphateの方が重要な働きをしているものと推察される.さらに,嫌気条件下でその菌体内濃度が増加するNADHが,二量体一四量体変換に必要であることが判明した.これら, PFL,LDHの酵素型変換の様相は実際の歯垢中で,糖が摂取され,歯垢pHが低下し,歯垢が嫌気的になる条件下で乳酸の産生が増加してくる事実ときわめてよく一致し,人の歯垢中でこれら酵素の型変換が起こっていることを強く示唆した.口腔環境の大きな変動、ことに歯垢中の糖濃度による歯垢微生物の糖代謝(酸産生)の動態を明らかにするために、Streptococcus mutansの嫌気的酵素ピルビン酸ギ酸リアーゼ(Pyruvate formate-lyase)の再活性化酵素の精製を試みた。まず、再活性化酵素を収率よく採取するために種々の培養条件下での再活性化酵素の活性を測定したところ、Stationary phaseの増殖時期にこの酵素活性が最大となることが判明した。Streptococcus sanguisでも同様な時期に活性が最大となることが観察された。そこで、Stat onary phaseのStrep.mutansを採取し、この菌より、再活性化酵素を部分的に精製した。この標品は完全に純化されてはいなかったが、かなり強い不活性型のピルビン酸ギ酸リアーゼを活性化する能力をもっていた。しかし、この酵素標品は活性型のピルビン酸ギ酸リアーゼを嫌気条件下で不活性型に変える活性ももっており、再活性化酵素とX因子(不活性化因子)が同一のものである可能性も考えられた。この酵素を完全に純化するまでは明確な結論はだしにくい。糖濃度と同時にpHを変化させてStrep.mutansやStrep.sanguisを嫌気条件下で連続培養したところ、高度嫌気・糖濃度制限条件下でも、pHが低いと、もっぱら乳酸が産生されることが判明した。このことは実際の歯垢中での産生されるさんの種類の変化とよく一致していた。食事後にかなりの時間が経過し、菌体内に貯蔵した糖しかエネルギー源のない状態のレンサ球菌は実際のヒト歯垢深部と同様な高度の嫌気条件下ではほとんどギ酸、酢酸のみを産生し、乳酸はほとんど産生しないことが判明した。これは、実際のヒトの歯垢中でみられる現象ときわめてよく一致しており、この実験で観察されたような乳酸脱水素酵素とピルビン酸ギ酸リアーゼの活性調節がヒト歯垢中でも実際におこっていることが推察された。これまでの研究結果では、中性付近のpHで垢中の主要な酸産生菌であるレンサ球菌は、糖制限・高度嫌気条件では、糖を代謝して、もっぱらギ酸、酢酸、エタノ-ルをつくることが明らかにされていた。しかし、歯垢中のpHは、食事ののち急激に低下する。このような低いpH条件下では、たとえ、糖の供給が制限され、高度の嫌気条件下でも、乳酸が多く産生されることが昨年の研究により明らかにされた。本年の計画ではこのことの起こる生化学的機構を明らかにすることができた。すなわち、低いpH条件下では、乳酸の酸性を触媒する乳酸脱水素酵素の生合成が促進されていることが、糖制限・嫌気条件下で、pHを5.5に固定して各種口腔レンサ球菌を連続培養し、酵素活性を測定することによって明らかになった。また、環境のpHが低下したときのレンサ球菌菌体内のpHを測定することに成功し、低いpH条件下では細菌菌体内のpHもかなり低下し、至適pHの低い乳酸脱水素酵素が、至適pHの高いピルビン酸ギ酸リア-ゼ(PFL:ギ酸等の産生のキイ酵素)よりもはるかに活性が高くなることを明らかにし、これらの減少によって、低いpHで乳酸が多くつくられるようになることが判明した。歯垢微生物の嫌気的糖代謝に重要な役割をするPFLは高度嫌気条件下で不活性型より活性型に変化することが知られていた。
連結された2組のトリスポルフィリンによるアロステリック反応場の構築

ポルフィリンは光機能材料や酸化触媒として働くことが知られており、これらを高度に集積化することでより高機能な反応場が構築できると考えられる。本研究では2,2'-ビピリジンの5,5'位に2つのポルフィリンが直接結合した2座配位子をルテニウム錯体によって3つ集積することで、合計6個のポルフィリンからなる錯体1を構築した。ヘキサポルフィリン1は分子モデルによる検討から、トリアミンのような三座の配位子と構造変化を伴って1:2の錯体を形成することが示唆された。そこで、3回対称構造を持つ4種類のトリアミン類、トリス(アミノエチル)アミン(3)、ビス(アミノメチル)-2-プロピルアミン(4)、トリス(アミノプロピル)アミン(5)、1,3,5-トリスアミノメチルベンゼン(6)との相互作用を紫外可視吸収スペクトルによる滴定実験で評価した。まず連続変化法(Jobプロット)による実験から、ヘキサポルフィリン1とトリアミン類の結合の化学量論量を評価し、すべて1:2錯体を形成することを確認した。また、トリアミンの添加量とポルフィリンの吸収の変化量をプロットし、理論式との比較から結合定数を求めたところ、トリアミンは3においては、K_1(1つ目の結合定数)=3.0x10^8M^<-1>,K_2(2つ目の結合定数)=3.0x10^7M^<-1>となり、他のアミンよりも10倍以上大きな結合定数を持つことがわかった。特にトリアミン3とほぼ同程度のアミン間距離を持つ6のK_1、K_2を比較すると、アミン6ではK_1で1/100、K_2で1/25と大きな差があったことから、ヘキサポルフィリン錯体1は分子の大きさだけでなく、形も認識することがわかった。また、1つ目のアミンとの結合定数K_1と2つ目の結合定数K_2が異なる値をとることから、1目の結合情報が、反対側の結合サイトに伝わることもわかった。
イヌ膵管組織片の熱可逆性ハイドロゲル内培養による膵内分泌細胞の新生について

ビーグル系雑犬の膵管のみを摘出し、その組織片(0.5mm^3)を熱可逆性ハイドロゲルポリマー(thermoreversible gelation polymer TGP)を用いて、三次元培養(46週間)ついで二次元培養することにより、大きさ50μ前後の細胞集塊が形成された。この細胞集塊はsomato^+/insul^-/gluca^-で膵ラ島発生過程の一段階前の集団である。しかし、培養を継続しても膵ラ島様細胞集塊には分化誘導されなかった。そこで今年度はこのsomato^+/insul^-/gluca^-の細胞集塊をin vivo(自家移植)にて膵ラ島様細胞集塊に分化・誘導されるかどうかを検討した。これまでの方法により、膵管組織片より大きさ50μ前後のsomato^+/insul^-/gluca^-/の細胞集塊を形成させた。この細胞集塊500個前後を冷却10%TGP含有RPMI1640に入れ、ゲル化した後、膵管摘出したビーグル系雑犬の大網にpouchを作成し、その中に細胞集塊含有ゲルを自家移植した。自家移植後2週間目に大網を切除し、HE染色し、移植細胞集塊の形態学的変化を観察した。しかし、移植部位には細胞集塊は存在せず、繊維芽細胞、リンパ球を中心とする肉芽形成がみられるのみであった。ゲルは完全に消失していた。腹腔内温度が高い為か、ゲル内の水分が蒸発し、細胞集塊が生存できなかったと推定した。次いで、同様に細胞集塊含有ゲルを左右いずれかの腎被膜下に自家移植した。移植後2週目に腎摘出後、移植部位のHE染色し、形態学的変化を観察した。大網pouch内移植と同様、細胞集塊は存在せず、ゲルの一部がみられるのみであった。ゲル移植は不可能であり、細胞集塊のみの門脈内移植、又は脾内移植を検討する。これまでイヌ膵管を摘出、その組織片を熱可逆性ハイドロゲルポリマー(TGP : Thermoreversible gelation polymer)を用いた三次元培養を行い、膵前駆細胞が誘導できる培養系を確立してきた。しかしこの膵前駆細胞は培養開始4-5週目以後分裂・増殖を停止したままの状態で、かつ培養を継続しても分化しない。今回この膵前駆細胞と膵管組織由来の線維芽細胞との共培養を行い、膵ラ島様組織形成の有無を検討した。ビーグル系雑犬の腹側膵を切除し、膵管に直径100μmのガイドワイヤーを挿入、膵管のみを摘出した。0.5mm角に細切、その組織片を10%TGP含有RPMI-1640液で培養した。またこの膵管組織片を、線維芽細胞を誘導する目的で0.03%コラーゲンゲル内培養した。培養後4週目に線維芽細胞のコラーゲンゲル上に膵前駆細胞をのせ共培養した。培養液にはKGF 10ng/ml、HGF 10ng/ml、nicotinamid 10mMを添加した。経日的に位相差顕微鏡で形態観察、6週目に組織学的検討を行った。共培養後1週頃より膵前駆細胞は増殖し、3-4週頃より所々に大きさ50μm前後の細胞集塊が形成された。細胞集塊は1つの24穴プレートあたり平均20個観察され、丸く光る細胞質からなる30-50個の細胞で構成されていた。6週後のHE染色では、一部に大きさ10μm前後の管腔構造が付着した、核の大きな未分化な細胞集塊を認めた。しかし、インスリン・グルカゴン染色は陰性だった。膵管組織片より誘導された膵前駆細胞は膵管由来線維芽細胞との共培養により形態学的にislet-like structureと酷似した細胞集塊が形成された。しかし膵内分泌機能は発現されていなかった。膵前駆細胞の膵内分泌細胞への分化誘導にはまださらなる因子が必要と考えられる。ビーグル系雑犬の膵管のみを摘出し、その組織片(0.5mm^3)を熱可逆性ハイドロゲルポリマー(TGP, thermoreversible gelation polymer)を用いて三次元培養を行い、膵前駆細胞が誘導できる培養系を確立した。しかしこの膵前駆細胞は培養開始4-5週目以後は分裂・増殖を停止したままの状態で、かつ培養を継続しても分化しなかった。この現象はTGPは常に流動性であることより、細胞は接着できない-分化誘導には足場依存性が必要-ことに由来するものと推定した。そこで今年度は膵前駆細胞を培養皿底面に接着させ、さらに分化誘導因子を添加して膵内分泌細胞が形成されるかどうかを検討した。これまでの方法により、膵管組織片をKGF10ng/ml、HGF10ng/ml、nicotinamide10Mm添加した10%TGF含有RPMI1640液にて三次元培養した。培養6週目培養皿プレートを冷却してTGPを液化した。組織片・細胞集塊を培養皿底面に付着させた後、TGF含有培養液を除去した。新たにHGF40ng/ml、nicotinamide10Mm、ブドウ糖400mg/dl含有RPMI1640を添加して静置培養した。経日的に位相差顕微鏡にて形態観察し、培養後1012週目に組織学的に検討した。

付着した組織片・細胞集塊から細胞が散在性に増殖し、46週目には大きさ100150μの上皮細胞様細胞集塊が形成された。68週目頃より細胞集塊から細胞が浮遊し、大きさ50μ前後の細胞集塊を形成した。この細胞集塊を集めてinsulin、gulucagon、somatostation染色した。その結果、somatostatin陽性、insulin陰性、gulucagon陰性であった。ビーグル系雑犬の膵管のみを摘出し、その組織片(0.5mm^3)を熱可逆性ハイドロゲルポリマー(thermoreversible gelation polymer TGP)を用いて、三次元培養(46週間)ついで二次元培養することにより、大きさ50μ前後の細胞集塊が形成された。この細胞集塊はsomato^+/insul^-/gluca^-で膵ラ島発生過程の一段階前の集団である。しかし、培養を継続しても膵ラ島様細胞集塊には分化誘導されなかった。そこで今年度はこのsomato^+/insul^-/gluca^-の細胞集塊をin vivo(自家移植)にて膵ラ島様細胞集塊に分化・誘導されるかどうかを検討した。これまでの方法により、膵管組織片より大きさ50μ前後のsomato^+/insul^-/gluca^-/の細胞集塊を形成させた。この細胞集塊500個前後を冷却10%TGP含有RPMI1640に入れ、ゲル化した後、膵管摘出したビーグル系雑犬の大網にpouchを作成し、その中に細胞集塊含有ゲルを自家移植した。自家移植後2週間目に大網を切除し、HE染色し、移植細胞集塊の形態学的変化を観察した。しかし、移植部位には細胞集塊は存在せず、繊維芽細胞、リンパ球を中心とする肉芽形成がみられるのみであった。ゲルは完全に消失していた。腹腔内温度が高い為か、ゲル内の水分が蒸発し、細胞集塊が生存できなかったと推定した。次いで、同様に細胞集塊含有ゲルを左右いずれかの腎被膜下に自家移植した。移植後2週目に腎摘出後、移植部位のHE染色し、形態学的変化を観察した。大網pouch内移植と同様、細胞集塊は存在せず、ゲルの一部がみられるのみであった。ゲル移植は不可能であり、細胞集塊のみの門脈内移植、又は脾内移植を検討する。
国際社会における共通利益概念の研究

平成3年度(最終年度)は、次のとおり3回の研究会が開催され、各研究分担者による個別テ-マの研究報告が行なわれた。その概要は次のとおりである。第1回の研究会は5月11日に東京神田の如水会館にて開催され、広島修道大学の川崎恭治助教授による「国際犯罪と共通利益」、小樽商科大学の中村恵助教授による「宇宙開発と共通利益」、広島大学の西谷元助教授による「裁判管轄免除と共通利益」、関東学院大学の武藤達夫講師による「第三世代の人権と共通利益」などの各分担研究に関する報告がなされた。第2回の研究会は10月11日に大阪ガ-デンパレスホテルにて開催され、東京水産大学の佐藤好明教授による「復仇制度と共通利益」に関する研究報告がなされた。第3回の研究会は12月14日に札幌サンプラザホテルにて開催され、成城大学の横川新教授による「民族自決と共通利益」と一橋大学の山内進教授による「中世普遍社会における共通利益」の各分担研究に関する報告が行なわれた。平成2年度は、当初の予定通り、4回の研究会が行なわれ、各研究分担者による個別テ-マの研究報告が行なわれた。平成2年5月に金沢で行なわれた第1回の研究会は、広島大学の西谷による「特権免除と共通利益」の報告と山形大学の森川による「客観的制度と共通利益」の報告が行なわれたが、当研究会は、当科学研究費の配分以前であり、経費負担の対象とはなっていない。第2回の研究会は、同年7月に日光中禅寺湖畔で行なわれ、一橋大学の桑原による「国際公域と共通利益」、東京国際大学の川崎による「領域主権と共通利益」、共愛女子短期大学の篠原による「国際法の定立と共通利益」の各報告が行なわれた。第3回の研究会は、同年10月の国際法学会の直後東京神田の如水会館において行なわれ、学術振興会研究員の太田によって「T.D.Fと共通利益」についての報告がなされDた。第4回はの研究会は、平成3年1月に山形厚生年金会館において行なわれ、福岡大学の岩間による「国際環境と共通利益」、大東文化大学の臼杵による「国家承認と共通利益」の報告が行なわれた。以上の研究報告を通じて、国際社会における共通利益概念は、かなりの程度において明確化されたが、「共通利益概念」についての各研究分担者の理解が、必ずしも、統一されていない場合もあり、その為、議論に多少の混乱がみられた。次年度の研究会においては、議論を重ねて共通テ-マについてもっと統一された認識をもつ必要があると考えられる。
「中間」地域の形成と発展に関する実証的研究

1.本研究においては、山形県庄内地方および北海道十勝地方、釧路地方の調査をおこなったほか、長野県および沖縄県における「中間地域」の状況について調査し、比較検討の資料とした。主要な調査項目は、当該地方の自然条件、歴史的背景、産業構造、交通・通信等の諸条件、都市・農村社会の状況、社会的・文化的特性などであった。2.その結果、われわれのいわゆる「中間」地域が一つのまとまりある地域として形成されるについては、(1)自然条件の共通性が基礎によこたわっていること、そして(2)それにたいする人間の働きかけが、庄内地方の稲作、十勝地方の豆作など独自の産業構造をつくりあげてきたこと、(3)とくに庄内地方については、この形成過程において近世における藩政のはたした役割が重要であること、また(4)それぞれの地域内に、酒田と鶴岡、帯広など12の中心都市があり、それと周辺農村部との間の社会的交通のネットワークが形成されていること、(5)今日、産業構造の変化等によりこの一地域としてのまとまりは変容しつつあるが、しかしなお社会的・文化的特性、「人間」のタイプなどにおいて独自の地域としての生命力は保持していること、などがあきらかになった。3.このような地域的特性は、批判さるべきものとして意識されている面と逆に誇りとして語られる場合があったが、しかし、社会の発展は必然的に均質化をもたらす一方、それが豊かな内実をもつものとして進められてゆくためには多様性を保持ないし展開させることが必要であり、「中間」地域の今後の行方はきわめて重要な意味をもつと考えられた。1.平成7年度においては、研究計画にしたがい、山形県庄内地方および北海道十勝地方、釧路地方の調査をおこなった。2.その結果、われわれのいわゆる「中間」地域が一つのまとまりある地域として形成されるについては、(1)自然条件の共通性が基礎によこたわっていること、そして、(2)それにたいする人間の働きかけが、庄内地方の稲作、十勝地方の豆作など独自の産業構造をつくりあげたこと、(3)とくに庄内地方については、この形成過程において近世における藩政のはたした役割が重要であること、また(4)それぞれの地域内に、酒田と鶴岡、帯広など12の中心都市があり、それと周辺農村部との間の社会的交通のネットワークが形成されていること、(5)今日、産業構造の変化等によりこの一地域としてのまとまりは変容しつつあるが、しかしなお社会的・文化的特性、「人間」のタイプ(例えば「庄内人」と「村山人」、「十勝人」と「釧路人」など)において独自の地域としての生命力は保持していること、などがあきらかになった。3.このような地域的特性は、批判さるべきものとして意識されている面と、逆に誇りとして語られる場合とがあったが、しかしいずれにしても、社会の発展は必然的に均質化をもたらす一方、それが豊かな内実をもつものとして進められてゆくためには多様性を保持ないし展開させることが必要であるとすれば、「中間」地域の今後の行方はきわめて重要な意味をもつと考えられた。4.平成8年度においては、やはり藩政期をもつ本州の富山県砺波地方および長野県伊那地方をとりあげ、比較研究によって課題の達成をめざしたい。1.平成8年度のおいては、昨年度に引き続き、山形県庄内地方および北海道十勝地方、釧路地方の調査をおこなったほか、長野県および沖縄県における「中間地域」の状況について調査し、比較検討の資料とした。

主要な調査項目は、当該地方の自然条件、歴史的背景、産業構造、交通・通信等の諸条件、都市・農村社会の状況、社会的・文化的特性などであった。2.その結果、われわれのいわゆる「中間」地域が一つのまとまりある地域として形成されるについては、(1)自然条件の共通性が基礎によこたわっていること、そして(2)それにたいする人間の働きかけが、庄内地方の稲作、十勝地方の豆作など独自の産業構造をつくりあげてきたこと、(3)とくに庄内地方については、この形成過程において近世における藩政のはたした役割が重要であること、(4)それぞれの地域内に、酒田と鶴岡、帯広など12の中心都市があり、それと周辺農村部との間の社会的交通のネットワークが形成されていること、(5)今日、産業構造の変化等によりこと一地域としてのまとまりは変容しつつあるが、しかしなお社会的・文化的特性「人間」のタイプなどにおいて独自の地位としての生命力は保持していること、などがあきらかになった。3.このような地域的特性は、批判さるべきものとして意識されている面と逆に誇りとして語られる場合とがあったが、しかしいずれにしても、社会の発展は必然的に均質化をもたらす一方、それが豊かな内実をもつものとして進められてゆくためには多様性を保持ないし展開させることが必要であり、「中間」地域の今後の行方はきわめて重要な意味をもつと考えられた。
ウイルス的戦略を用いた生体高分子の適応設計

1.進化分子工学において、ウイルス粒子は、遺伝子型と表現型が一つの結合体になっているので、表現型の評価が即遺伝子型の選択に結びつくため、クローニング操作なしに人為淘汰が行える。これを模擬する試験管無いプロセスとして、無細胞翻訳系でmRNAと新生タンパク分子が結合体となるような系(これを以下in vitroウイルスと呼ぶ)を開発しつつある。in vitroウイルスは、逆転写、PCR増幅、転写という、レトロウイルス様のライフサイクルで増殖する。mRNAと新生蛋白の結合法として、2つの方法を試みた。一つは、その蛋白に組み込まれたビオチン様ペプチドと、mRNAに付加されたアビジンとの結合による。もう一つは、mRNAをtRNAとみなすことができるように改変する方法である。このmRNAの3'末端CCAにシンテターゼを用いて、アミノ酸をチャージする事には成功した。2.進化分子工学は生命の起源のモデルと表裏一体をなす。われわれは、進化分子工学において、遺伝子型と表現型を対応づける戦略としてのウイルス型戦略が、細胞型戦略よりも進化速度の点で有利であることに着目した。RNAワールドから、蛋白質合成系が進化してくる機構として、in vitroウイルス様の生命体があったとするモデルを構築することに成功した。すなわち、RNAワールドに登場する最初のコード化された蛋白質はRNAレプリカーゼ(当然リボザイムである)の補因子に違いないが、その蛋白質補因子はそれがコードされているリボザイムRNAに結合していたとする。すると、RNA複製系と翻訳系が、速やかに安定に漸進的に共進化してくることが、コンピュータシミュレーションで明らかにされた。それは、ウイルス型メンバーを持つハイパーサイクルである。
乗鞍岳における太陽中性子の観測

1.本観測システムでは、BP28中性子カウンタを増設することにより、太陽中性子検出感度を2倍に上げ、得られた信号は、本観測用に新たに完成した太陽中性子記録計により、10秒値として記録される。具体的には、12本のカウンタからの各々の計数、気圧、および多重度1、2、3、4、5、>5の現象を記録することにより、そのエネルギ-の情報を得ることができる。もう一つの方法として、飛行時間によりのエネルギ-を見積もるためには、正確な絶対時間が必要であり、そのために年差2秒の時計を別に備えた。2.本装置により、1989年8月15日の大フレアに伴って発生したと考えられる中性子が観測された。このときの計数率の上昇は1分値にして7σであり、地球近傍で、このエネルギ-スペクトルの羃は2.2程度が見積もられた。この結果は、第21回宇宙線国際会議で報告された。3.過去の5つの大フレアについて、太陽中性子のエネルギ-の上限が観測値を基とした計算により見積もられ、第21回宇宙線国際会議で報告された。4.本装置により、1989年9月29日の太陽フレアに伴って、最大34%に及ぶ宇宙線の異常増加を33年ぶりに日本で観測した。その観測結果は1225GeVのエネルギ-をもった粒子が地球にやって来たことを示している。この異常増加を引き起こした粒子は、観測された時間とその限界硬度により、地球を通過する惑星間磁場の方向から地球に入って来たことが判明した。フレア粒子の太陽大気中での拡散を仮定して、G.C.Reidの式を使うと、観測された立ち上がりから、太陽大気中での拡散の平均自由行程は、1.4X10^7cmが見積もられた。この結果は論文および第21回宇宙線国際会議で発表された。1.1988年9月に、乗鞍岳の中性子計を4本から12本に増設した。また1989年3月に電源および回路型を運び上げて設置し、カウンタの出力信号を10秒値として記録している。これにより、係数率は6.7×10^5/hより2.0×10^6/hに増加し、信号対雑音比は2倍近く改善された。地球近傍に300MeV以上のエネルギーを持ち、フラックス1cm^<-2>s^<-1>の太陽中性子が飛来したとすれば、10秒値で6σの感度が得られるようになり、大フレアが起これば、10秒値でも十分検出可能になった。2.データ処理システムとしては1分値データの質をチェックしてMTに書き込むまでの流れが完成した。3.地球大気中での太陽中性子の伝播から中性子計による捕捉に至る計算機シミュレイションが10MeVから400MeVまでの入射中性子に対して行なわれた。中性子のレスポンスはE^n近似で200MeVまではn=4それ以上ではn=0.8程度が見積もられた。4.フレア中での粒子の加速と中性子発生から検出までの過程を理解し今後の方向付けをするために、1989年1月27日には太陽中性子研究会が開催された。研究会集録は準備中である。5.現在、太陽活動は急激に活発化しており、1990-91年の太陽活動極大期に向けて次のような計画がある。元年度:(1),本観測装置の調整と観測を実施しする。(2),解析プログラムを開発し、データの解析を行なう。(3),得られた結果を宇宙線国際会議に発表する。2年度:(1),中性子データと共に他の電磁波や粒子のデータを総合的に解析し、フレアおよび太陽中性子生成の機構に迫る。(2),データと解析結果を持ち寄り、総合的な研究会を開催。(3),得られた結果を論文として発表する。

この異常増加を引き起こした粒子は、観測された時間とその限界硬度により、地球を通過する惑星間磁場の方向から地球に入って来たことが判明した。フレア粒子の太陽大気中での拡散を仮定して、G.C.Reidの式を使うと、観測された立ち上がりから、太陽大気中での拡散の平均自由行程は、1.4X10^7cmが見積もられた。この結果は論文および第21回宇宙線国際会議で発表された。
木質構造の部材残存強度の非破壊測定試験方法の開発

膨大な量の既存の木造建築物の中に老朽化が進行した建築物が多くあり、地震発生時に倒壊して多大の被害を人に与える危険性がある。このため既存の木造建築物に使われた構造木材の残存強度を、非破壊で測定できる技術の開発を目的として、従来から使われているヤング率の測定による方法や破壊による方法ではなく,ビスの引き抜きを用いた非破壊の試験方法に着目し、構造木材の残存強度の測定方法を開発するのに必要となる木材の曲げ強度および圧縮強度とビス引き抜き強度との関係を明らかにした。多くの種類の木材の試験体を用い、含水率が異なる場合、ビスをねじ込む長さが異なる場合および木材繊維の方向とビスの方向が異なる場合を種々に設定するなど、必要な条件のデータを得るように適切に試験を行った。試験結果を既往の研究結果と比較して、妥当性があることを考察し、ビス引き抜き試験で測定したビス引き抜き強度から、曲げ強度と圧縮強度を推定できることを明らかにした。さらにその推定式を提案し、ビス引き抜き強度から曲げ強度と圧縮強度を推定するために使う係数の値を導いた。このように、既存の木造建築物に使われた構造木材の残存強度を非破壊で測定できる技術を、適切な試験方法を使い試験結果の妥当性を裏付ける考察を的確に行うことで開発した。老朽化した木造骨組に使われた木材の残存強度を、構造体を取り壊さずに非破壊で測定できるビス引抜き試験方法を開発することを目的として、平成17年度は木材のビスの引抜き強度と曲げ強度と圧縮強度の相関について研究するため、これらの強度を測定した。ビス引抜き強度の測定は、サンコーテクノ株式会社製テクノスターR-2000NDを用い、105°Cの恒温に設定可能な定温乾燥器(アドバンテックDRA-430DA)を用いて木材試験体の含水率の調整を行い、ビスは木造骨組に外装部材を取り付けるときに使われている径5.5mm、ねじ部長さ45mm、全長70mmの鋼製イエロークロームメッキ処理ビス(JISG3539SWCH18A)を用いた。曲げ試験と圧縮試験は、秤量50000Nの油圧式万能型試験機を使って行った。木材試験体は、新材7種類と、実構造物に使用された後に廃材として出た古材4種類の計11種類とした。ビスの引抜きは寸法100×100×200mmの試験体で、繊維方向(軸方向)と繊維方向に垂直な方向について試験した。なおビスのねじ込み長さを10、20、30、40mmの4種類とし、それぞれについて試験を行った。曲げは寸法30×30×480mmの試験体とし、圧縮は寸法30×30×60mmの試験体とし、JISZ2101木材の試験方法に基づいて試験を行った。なお圧縮は繊維方向と繊維方向に垂直な方向の2種類で行った。いずれの試験においても、試験体の含水状態が絶乾状態、15%程度含水率(気中でほぼ乾燥)、30%程度含水率(繊維飽和点に近い)、飽和吸水の4種類に調整して、それぞれについて試験を行った。建築構造に使われた木材の構造材料としての性能を現す指標である曲げ強度と圧縮強度を、ビス引き抜き試験に測定したビス引き抜き強度から推定できることを明らかにすることを目的とした。老朽化した木造骨組に使われた木材の構造材料としての曲げ強度や圧縮強度は、構造体を取り壊さずには直接測定することができない。このため、非破壊で測定できるビス引き抜き強度から、これらの強度を推定する方法を用いた。サンコーテクノ株式会社製テクノスターR-2000NDを用いて行ったビス引抜き強度と、別に同種の試験戴で行った曲げ強度と圧縮強度の測定結果を比較し、両者に相関があり、前者で後者が推定できることを明らかにした。木材の種類は11種類であり、含水率が4種類のそれぞれについて、ビス引き抜き強度から曲げ強度または圧縮強度を換算する係数を導いた。ビスの先端のねじ込み長さが5mmまでは、ビスの引き抜きに対して抵抗しないことが、試験結果から判明した。このため、ビスの先端の5mmは、ビス引き抜き荷重の大きさに影響しないと考え、ビスねじ込み長さから5mmを引いた長さをビスねじ込み有効長さすることが適当であることが明らかになった。また、ビス引き抜き荷重をビスねじ込み有効長さで割ったビスの長さ1mm当たりの引き抜き荷重でビス引き抜き強度を表すことが適切であると考えられた。含水率の影響は、新材の木材で小さく、古材の木材で大きいことが明らかになった。

試験結果を既往の研究結果と比較して、妥当性があることを考察し、ビス引き抜き試験で測定したビス引き抜き強度から、曲げ強度と圧縮強度を推定できることを明らかにした。さらにその推定式を提案し、ビス引き抜き強度から曲げ強度と圧縮強度を推定するために使う係数の値を導いた。このように、既存の木造建築物に使われた構造木材の残存強度を非破壊で測定できる技術を、適切な試験方法を使い試験結果の妥当性を裏付ける考察を的確に行うことで開発した。
植物の乾燥・塩ストレス初期過程における酸化的ストレス誘導機構の解明

植物の環境ストレス耐性,すなわち生育にとって不利な環境条件(環境ストレス)による代謝の変動を緩和する能力,は「発芽した場所から移動せずに生育する」という植物の生存様式を支える重要な生理機能である。強光,紫外線,除草剤,乾燥などの環境ストレスの比較的初期の段階で細胞での活性酸素生成が増大するが,環境ストレス下での細胞の生死がどのような内的・外的因子によって決定されるのかは詳しく究明されていない。本研究では,主として乾燥ストレス・塩ストレス(水分ストレス)による植物の傷害と耐性の機構を明らかにすることを目的とした。レタスの根への水分ストレスが葉の活性酸素生成を誘導することを生葉の電子スピン共鳴測定で実証し,水分ストレス初期の葉の酸化レベル増大と同じタイミングで,葉緑体のスーパーオキシドジスムターゼが特異的に失活することを明らかにした。さらに強い水分ストレスでは,葉のしおれとともにカタラーゼが失活することも見いだした。水分ストレス下での葉の酸化的損傷は,これらの活性酸素消去酵素の特異的失活が引き金となっていることが示唆された。また,酸化的ストレスを誘導するメチルビオローゲン(MV)によるホウレンソウ葉の傷害の初期過程を詳しく解析し,MVの光還元がモノデヒドロアスコルビン酸の光還元と競合し,葉緑体内のアスコルビン酸濃度を低下させるため葉緑体APXが速やかに失活すること,この失活によって葉緑体からのH_2O_2拡散が促進され,細胞成分の酸化的損傷が進行することを明らかにした。このように,様々な環境ストレス下で植物細胞の酸化的ストレス防御を担う抗酸化酵素が,初期ターゲットとして,環境ストレスの種類に特異的に失活するために細胞の酸化的損傷が進行することを明らかにした。植物の乾燥ストレス,塩ストレスの初期における酸化的ストレス誘導機構を解析した。水耕栽培したレタスの根にポリエチレングリコール,ソルビトールまたはNaClを与え,経時的に葉を採取した。葉にラジカル発生剤としてメチルビオローゲンを加え,光照射で生ずるモノデヒドロアスコルビン酸ラジカルをin vivo電子スピン共鳴法により測定した。24時間以内に葉を不可逆に枯れさせる強い水ストレスを与えると,ストレス処理開始後1時間から4時間で酸化的ストレスが増大し,これに伴い葉のカタラーゼ活性と葉緑体CuZnスーパーオキシドジスムターゼ(SOD)活性が減少した。葉緑体アスコルビン酸ピルオキシダーゼ,モノデヒドロアスコルビン酸レダクターゼ,葉緑体電子伝達の活性はこれらの処理では変化しなかった。したがって,カタラーゼと葉緑体SODの失活が酸化的ストレスの原因であると考えられた。24時間では葉を枯らさないより弱い水ストレスではカタラーゼは失活せず,葉緑体CuZnSODのみが処理後4時間以内に失活した。葉緑体CuZnSODの失活は切除葉にアブシジン酸(ABA)を与えることで誘導され、このABAの効果はサイトカイニンにより抑制された。以上の結果から,弱い水ストレスの初期にはABAのホルモン作用により葉緑体CuZnSODの失活が誘導されること,さらに強い水ストレス条件ではストレス初期にカタラーゼも失活し,これらの抗酸化酵素の失活が細胞に重大な酸化的ストレスをもたらすことが明らかになった。植物の乾燥ストレスの初期における酸化的ストレス誘導機構を解析した。水耕栽培したレタスの根にソルビトールを与え,経時的に葉を採取した。24時間以内に葉を不可逆的に枯れさせる強い水ストレスを与えると,ストレス処理開始後1時間から葉のカタラーゼとスーパーオキシドジスムターゼ(SOD)の活性が低下した。アスコルビン酸ぺルオキシダーゼ(APX)など他の活性酸素消去酵素活性,および葉緑体電子伝達活性は影響を受けなかった。

24時間では葉をしおれさせるが不可逆的な枯死には至らない程度の弱い水ストレスでも葉のSODだけが特異的に失活した。この水ストレスで失活するのは葉緑体のCuZnSODであることをアイソザイム解析から明らかにした。すなわち,葉緑体CuZnSODは水ストレスの特異的初期ターゲットであることが初めて明らかになった。乾燥ストレスに応答する植物ホルモンであるアブシジン酸(ABA)を葉に与えても葉緑体CuZnSODの特異的失活が再現できた。また,このABAの作用は拮抗的なホルモン作用をもつカイネチンによって抑制された。すなわち,SODの失活は乾燥ストレスに応答したABAのシグナル伝達の一部をになっている可能性が示唆された。一方,除草剤パラコートによる葉の酸化的ストレス誘導では葉緑体APXが特異的な初期ターゲットであることをホウレンソウを用いて明らかにした。また,シロイヌナズナの酸化的ストレス応答に関与するP1-ゼータクリスタリンが新規な酸化還元酵素であることを明らかにした。
伸展変形挙動のその場観察による細胞内力学場評価と細胞骨格リモデリングの動態解明

本研究課題では,独自に開発した細胞伸展MEMSデバイスを用いて,ストレッチ刺激を受ける細胞の高時間・空間分解能でのその場観察を達成した.また,遺伝子導入によるアクチン細胞骨格の蛍光標識技術を用いて,ストレッチを受けた際の細胞内アクチン細胞骨格の変形動態を可視化した.研究の結果,単軸のストレッチ刺激を受ける細胞内のアクチンストレスファイバーに生じる軸ひずみの分布は均一ではなく,細胞接着基質の均一変形場とは一致しないことを見出した.また,繰り返し伸縮を付与した場合のアクチンリモデリングについて,アクチン線維の脱重合が活発に行われる領域が細胞輪郭部に局在する可能性を見出した.平成26年度には,伸展刺激を受ける細胞の高精度その場観察を可能とするために,細胞伸展マイクロデバイスの改良を行った.これまでには,マイクロデバイスにビルトインされたスライダー機構を用いてデバイスを駆動していたが,その方式を改め,マイクロマニピュレーターとマイクロニードルを用いてデバイスのアームを直接駆動する手法を採用した.その結果,伸展刺激付与時の顕微鏡焦点方向への剛体変位を大幅に抑制することに成功した.この改良によって,これまでは不可能であった,伸展刺激を受ける細胞の高時間・空間分解能でのその場観察を達成した.細胞伸展マイクロデバイスの改良を受けて,実際に伸展刺激を受ける細胞の細胞内力学場評価を行うための観察画像データ取得へと移行した.しかしながら,当初予定していたアクチン細胞骨格の蛍光標識手法が,想定よりも大幅に遺伝子導入効率が低いことが判明した.そのため,当初予定していた市販のバキュロウィルスを用いたアクチン蛍光タンパク質遺伝子導入系ではなく,プラスミドDNAを用いたLifeact-蛍光タンパク質の遺伝子導入系を採用することとした.計画変更に伴い,Lifeact-TagGFP2プラスミドDNAを骨芽細胞様細胞MC3T3-E1に導入するための条件検討を新たに行う必要が生じた.そこで,年度後半には,リポフェクション試薬の選定,および遺伝子導入条件の検討を行い,高効率での遺伝子導入条件を明らかにした.平成26年度中に遺伝子導入条件の検討がほぼ完了したため,平成27年度からは,ライブセルイメージングによる伸展刺激を受ける細胞の変形動態観察に移行する予定である.本年度は,まず骨芽細胞内のアクチン細胞骨格を蛍光観察するための遺伝子導入による可視化を行った.本研究課題で使用する骨芽細胞様細胞MC3T3-E1は,遺伝子導入効率が低い細胞株であるため,適切な遺伝子発現量に調節するためプロトコルのパラメーターフィッティングを行った.その結果,トランジェントな発現系でアクチン細胞骨格の可視化に成功した.また,アクチン細胞骨格の可視化が,すべての細胞で行えるわけではなく一部の細胞が確率的に適切な量を発現する.したがって,その細胞を用いてストレッチ付与実験を行うためには,1ディッシュにビルトインされる細胞伸展マイクロデバイスの数が多いほど実験効率が上がる.そこで,これまでの細胞伸展マイクロデバイスの構造を根本的に見直し,集積度を向上させた新型のマイクロデバイスを開発した.これらの実験系の改良により,本年度はストレッチ刺激を受ける骨芽細胞のアクチン細胞骨格が,どのように変形するか.その詳細なタイムラプス画像の取得に成功した.取得したタイムラプス画像データを元に,画像相関法を用いて細胞内のひずみ分布計測を試みた.画像処理ソフトウェアを用いて初期画像を均一に引き伸ばしたリファレンスデータを作成し,そのデータを用いて画像相関法による計測のパラメーターフィッティングを行った.その結果得られたパラメーター条件で,実際に取得したタイムラプス画像データのひずみ分布計測を行ったが,十分な精度を確保することは出来なかった.そこで,暫定的にマニュアルトラッキングにより細胞内アクチンファイバーの軸方向ひずみを計測した.その結果,細胞内の一部のアクチンファイバーには,細胞外基質に生じているひずみと一致しない不均一なひずみ分布が生じていることが明らかとなった.本年度は,計画3年間のうちの2年目である.当初の計画通り,ストレッチ刺激を受ける骨芽細胞のアクチン細胞骨格変形動態を詳細にその場観察し,タイムラプス画像を取得することに成功した.これは,本研究課題における一つの重要なマイルストーンを達成したと言え,残り一年間で目標とする細胞内アクチン細胞骨格のひずみ分布を明らかにし,繰り返し伸展刺激によるアクチン細胞骨格リモデリングとの関連性について検討することは十分可能であると考える.本研究課題では,独自に開発した細胞伸展MEMSデバイスを用いることで,伸縮刺激を受ける骨芽細胞の動態を高時間・空間分解能でその場観察することに成功した.まず,細胞伸展MEMSデバイスを改良し,繰り返し周波数1Hzで90分間の連続的な伸縮刺激付与を実現した.従来のデバイスでは光硬化性樹脂製のストレッチチャンバー把持アームを有していたが,繰り返し伸縮に伴う変形により疲労破壊することが懸念されていた.そこで,このアームを廃した新規なデバイス構造を考案し,実際に所望の性能が発揮されることを確認した.次に,Lifeact-GFP蛍光タンパク質を遺伝子導入した骨芽細胞様細胞の培養・実験観察系を確立した.これにより,伸縮刺激付与下における骨芽細胞内のアクチン細胞骨格ダイナミクスを可視化することに成功した.これらの成果を受けて,伸縮刺激を受ける骨芽細胞内のアクチンストレスファイバー構造が受ける変形のその場観察を試みた.レーザー走査型蛍光顕微鏡の画像取得による画像の歪みを抑えるために,準静的な引張り条件下において伸展付与時のその場観察を実施し,経時観察画像の取得に成功した.得られた画像から細胞内の個々のストレスファイバーに生じる長さ変化を計測し,細胞接着基質の変形と細胞内の変形場分布は必ずしも一致せず,細胞内には不均一な変形場生じていることを明らかにした.

最後に,90分間の繰り返し伸縮刺激付与下におけるアクチン細胞骨格リモデリング動態の経時的その場観察を試みた.その結果,伸縮刺激の付与により脱重合されるファイバーと構造が維持されるファイバーとが共存する様子を捉えることに成功した.この結果より,脱重合されるファイバーは細胞の輪郭周辺に局在する可能性が示唆された.しかしながらアクチンの重合を含むリモデリング動態のその場観察は達成することが出来ず,今後の課題として残った.本研究課題では,独自に開発した細胞伸展MEMSデバイスを用いて,ストレッチ刺激を受ける細胞の高時間・空間分解能でのその場観察を達成した.また,遺伝子導入によるアクチン細胞骨格の蛍光標識技術を用いて,ストレッチを受けた際の細胞内アクチン細胞骨格の変形動態を可視化した.研究の結果,単軸のストレッチ刺激を受ける細胞内のアクチンストレスファイバーに生じる軸ひずみの分布は均一ではなく,細胞接着基質の均一変形場とは一致しないことを見出した.また,繰り返し伸縮を付与した場合のアクチンリモデリングについて,アクチン線維の脱重合が活発に行われる領域が細胞輪郭部に局在する可能性を見出した.平成26年度に計画していた,細胞伸展マイクロデバイスの改良によるピントずれの抑制および高精度でのその場観察が達成されたため,当初の目的である,伸展刺激を受ける細胞の変形動態のその場観察に目処がたった.この点については計画通りに達成できたと評価できる.その一方で,アクチン細胞骨格の可視化に用いる予定であった蛍光タンパク質遺伝子導入系が,当初の想定を大幅に下回る遺伝子導入効率であったため,他の方法を採用する必要があった.そのために,当初計画していなかった,遺伝子導入のための条件検討が必要となった.この点については若干の計画の遅れを生じさせた.しかしながら,大体として採用した遺伝子導入系についても,条件検討が完了したため,全体としては概ね順調に進展していると評価できる.現在,用いている骨芽細胞様細胞MC3T3-E1は,他の一般的に用いられている細胞株等と比較して,遺伝子導入効率が非常に低いと認識している.そこで,実験効率向上を目的として,実験に用いる細胞として,MC3T3-E1に加えて骨肉腫由来のU2-OS細胞を導入することを計画している.