hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
高齢者肺炎における、DPP-IV阻害剤のpros and cons

DPP (Dipeptidyl Peptidase)-IV(酵素活性は、DPP-IV阻害薬はCD26のT細胞活性化を減弱させる可能性があり、分子メカニズムを考慮すると,DPP-IV阻害剤が肺炎発症のリスクを増加させる可能性がある。一方、DPP-IVは、誤嚥性肺炎発症の重要なkey物質であるサブスタンスP変性を不活性化する。したがって、DPP-IV阻害剤は、肺炎発症リスクを低下させる可能性がある。更に、糖尿病は、認知・身体機能、フレイル・サルコペニア等、重要な肺炎発症修飾因子である。以上から、糖尿病発症高齢者の肺炎発症に対するDPP-IV阻害剤の攻罪を、誤嚥性肺炎責任要因と細胞性免疫の観点から、横断・縦断コホート研究を行い調査する。
接着性ナノハイドロキシアパタイト-コラーゲン複合体膜の開発

低濃度BMP-2に浸漬したハイドロキシアパタイトーコラーゲン複合体膜を象牙質片に合わせて移植したところ早期に象牙質上に硬組織を形成できることが確認された。一方、EDC架橋したナノハイドロキシアパタイト-コラーゲン複合体にフィブリン生体接着剤を添加することで、弾性が付与されることがわかった。また同材料は生体親和性、生体分解性に優れ、BMP-2の担体として有効であることがin vivoで確認された。本研究の目的は混和法にて精製した代用人工骨膜であるナノハイドロキシアパタイトーコラーゲン複合体膜の架橋剤に生体接着剤を応用することで接着性を有した代用人工骨膜を開発することである。これまでにハイドロキシアパタイトの含有量70%で架橋剤を生体接着剤であるTAD(0.1-1mmol)としたところ、いずれにおいても接着性は認められたものの、架橋材として機能せず、機械的強度が弱いことが認められた。そこで架橋材としてEDCを使用し、さらにTADを添加したところ、機械的強度は増加し接着性が認められた。しかし、生体親和性を見るためにラット大腿筋にラット象牙質片とともに移植したところ、材料自体が移植の段階で散在し、機械的強度が操作性に耐えられない状態で、引っ張り試験で測定することができなかった。そのため、代用人工骨膜自体の強度の向上を図る必要性が生じてきた。一方、生体接着剤でも使用されるフィブリンはコラーゲンとの親和性もよく、機械的強度もあるため、これに着目して機械的強度の向上を目的とした実験を検討した。TADは加えず代用人工骨膜精製過程で0.05-0.3mg/ml : fibrinogen単独で添加した場合、EDCの場合と比べて機械的強度の向上が認められたが、接着性は認められなかった。また、生体親和性を見るためにラット大腿筋にラット象牙質片とともに移植したところ、重篤な炎症反応も認められず、4週においてほとんど分解されていたことから生体親和性、生体分解性について問題はないことが観察された。しかし、単独では骨組織の形成は観察されず、BMP-2を含浸させた移植実験では食う組織の形成が確認されたことから開発した代用人工骨膜はBMP-2の単体として機能することが確認された。このことはH22度にナノバイオメディカル学会シンポジウムにて発表した。さらに架橋剤をEDCとし、フィブリノゲン及びTDAを加えて精製した代用人工骨膜は接着性を有し、機械的強度が増すことが確認できた。我々はこれまでにナノハイドロキシアパタイトの含有量の異なるナノハイドロキシアパタイト-コラーゲン複合体(以下nHAC)を精製し、BMP-2を併用した場合、nHpの含有量が多いほど早期にBMP-2の骨形成効果を高めることを報告してきた。しかし、歯周組織はセメント質、歯根膜、歯槽骨、歯肉結合組織など多数の異なる組織によって形成される器官であり、多様な組織の再生が必要とされる。そこで、ラット大腿筋内に、異なる濃度のBMP-2溶液に含浸させたnHAC膜もしくはコラーゲン膜に脱灰処理された象牙質片を付着させて移植し、組織学的観察を行った。結果、nHAC膜群では低濃度のBMP-2群で早期に有意にセメント質様硬組織が象牙質上に観察された。このことから、nHAC膜をBMP-2と共に使用すると、nHACからnHpが分解、拡散することで局所濃度が高まり、低濃度BMP-2でも象牙質上に有利に硬組織を形成させると考えられた。一方、実験操作中に膜が象牙質片から離れることが多かったことから、膜に接着性を持たせることを検討してきた。これまでに架橋剤の変更や生体接着剤を添加して物性を検討したところ、いずれにおいても乾燥状態では象牙質と付着するものの、湿潤状態では付着させることは困難であった。しかし、その中でEDC架橋したnHAC膜にフィブリン生体接着剤を添加した場合、湿潤状態の膜が弾性を持つことが判明した。外力により歯、歯槽骨、軟組織が別々に動かされる歯周組織においては、材料が弾性の特徴を持つことは、scaffoldとして有利な機能である。nHACをブロック状に精製し、物性を検討したところ、EDC単独に比べて2倍の弾性を持つことが判明した。また組織学的観察を行ったところ、生体親和性、生体分解性に優れ、BMP-2の担体としても有効であることが観察された。
水系散発感染を検出するための下水試料ウイルス調査法の開発

下水は健康状態に関わらず全てのヒトから排出されたウイルスを含むため、臨床研究よりも集水域における胃腸炎ウイルスの真の流行状況および分子疫学を網羅的に把握することができると考えられる。ここでは、これらノロウイルスに加え、比較的高濃度で検出されるアイチウイルスの下水および河川水中における存在状況ならびに遺伝的多様性を調ベる手法を開発した。ノロウイルスを対象として、水試料中におけるウイルス遺伝子の存在状況をRT-PCR法により調べ、PCR産物をクローニングすることにより、その塩基配列を決定することが可能であった。結果として、下水および河川水のいずれについても、GIノロウイルスのほうがGIIノロウイルスよりも高頻度に検出された。GIノロウイルスはこれまで考えられてきた以上にヒトの間に広く感染していることが示唆された。選択的な検出手法の開発に関しては、ピコルナウイルスの一種であるアイチウイルスについて、遺伝子型別に検出するプライマー、プローブを設計した。アイチウイルスについても、ノロウイルスと同様の方法で多様性を調べたところ、非常に多様なウイルス株が検出された。以上より、当初からの目的であった、ウイルスの株ごとの検出手法の開発に成功した。下水試料に含まれるウイルスの遺伝子配列を調べて、アウトブレイクを引き起こしたウイルスの遺伝子配列と照合することにより、水系感染の散発事例等を検出する手法を開発することを目的としている。本研究ではこのような調査が可能となるような検査手法として、下水におけるウイルス発生状況を把握するためのウイルス測定法を開発することを試みた。具体的には、下水中に含まれる全ウイルス数を把握するために幅広くウイルスを定量する手法、特定のウイルスを排他的に測定する手法、さらには混在するウイルスを単離してそれぞれの遺伝子配列を決定する方法を開発を試みる。今年度は、下水試料に含まれるウイルスについて、存在量の比較的多いものについては、遺伝子配列を決定することができた。その結果、従来考えられていたよりも、感染流行を引き起こすウイルスが少ないことが分かってきた。このことは、病原性の低いウイルスが下水中に多く入ってきていることを意味しており、ヒトの社会の中で病原ウイルスのプールが静かに循環しているという構図が想定される。日本ウイルス学会におけるにおいても、病原性として顕在化しているノロウイルスGIIに比べてノロウイルスGIが想像よりも高い濃度で検出されるという成果発表を行い、専門家から高い関心を集めた。水中からのウイルス検出において、リスク評価を目的として病原性の高いウイルスを測定することと、水中ウイルスの概要を把握するための調査との区別が重要であることが明らかとなった。水試料に含まれるウイルスのうち、少数派のものを検出するためには、従来の多数派のウイルスを検出する方法に比べて、大容量の水試料を濃縮してウイルスを選択的に検出する必要がある。ウイルス濃縮の大容量化について、従来の平膜タイプのものに比べて20倍以上の膜面積を持つプリーツカートリッジタイプの膜を用いることにより、ろ過容量を増やすことに成功した。今年度は、この手法を河川水などの環境水試料に用いることで、その有用性を調べたところ、ウイルスの検出を阻害する物質をウイルスとともに濃縮していることが判明した。精製水にフミン酸を加えた系でも同じような結果が得られたため、環境水中のフミン質がウイルス検出阻害の一因となっていることが推定された。また、そこで問題となるウイルス検出阻害について、ゲルろ過法やシリカビーズを用いたRNA抽出法により、阻害を低減できることを明らかにした。共通のプライマーで増幅し、異なるプローブに反応するようにしており、使用する試料の液量を節約することが可能となっている。アイチウイルスはヒトに特異的に感染すると考えられており、病原性を引き起こさないものの環境試料には比較的多く含まれることから、今後、ヒト糞便の程度を表す指標としての有効性を検討する。下水は健康状態に関わらず全てのヒトから排出されたウイルスを含むため、下水および複数の下水処理場からの処理水を受容する都市河川の水を解析することにより、臨床研究よりも集水域における胃腸炎ウイルスの真の流行状況および分子疫学を網羅的に把握することができると考えられる。ノロウイルス、サポウイルスは地域の疫学的拠点においても重要な下痢症ウイルスとして頻繁に検出されており、また、その遺伝子型が決定されることも多い。

ここでは、これらノロウイルス、サポウイルスに加え、比較的高濃度で検出されるアイチウイルスの下水および河川水中における存在状況ならびに遺伝的多様性を調べる手法を開発した。水試料中におけるウイルス遺伝子の存在状況をNested RT-PCR法により調べ、PCR陽性試料に対しては、PCR産物をクローニングすることにより、その塩基配列を決定することが可能であった。結果として、下水および河川水のいずれについても、GIノロウイルスのほうがGIIノロウイルスよりも高頻度に検出された。この結果は、患者糞便からはGIよりもGIIのほうがはるかに高頻度に検出されるとする国立感染症研究所感染症情報センターの疫学データとは大きく異なるものである。このことから、GIノロウイルスはこれまで考えられてきた以上にヒトの間に広く感染していることが示唆された。アイチウイルスについても、昨年度に開発した定量系に加え、ノロウイルスと同様の方法で多様性を調べたところ、非常に多様なウイルス株が検出された。以上より、当初からの目的であった、ウイルスの株ごとの検出手法の開発に一定の成功を収めたと言える。
脳梗塞辺縁部のNG2陽性マイクログリアの機能解析と脳梗塞治療への応用

脳梗塞辺縁部に存在する活性化マイクログリアは、変性しアポトーシスする神経細胞を取り囲み貪食する。脳梗塞辺縁部で、mRNAの発現で、TREM2やeat-me signalのアポトーシス細胞の貪食に関連するMFG-E8, MerTK,Gas6, Protein S、補体(C1q,C3)のmRNAが上昇していた。免疫組織染色で、活性化マイクログリアはCD68陽性ファゴソームをもち、C3, ProteinS陽性のNeuronに接着していた。マイクログリアは、これらの貪食関連の分子を介して、ニューロンを選択的に貪食していることが示唆され、緩徐な神経細胞死を抑制するターゲットとなりうる可能性が示された。ラット中大脳動脈一過性閉塞による脳梗塞モデルを用いて、虚血再灌流3、5、7日後(days post-reperfusion; dpr)という亜急性期での、eat-me signal認識分子や、神経細胞、マイクログリアマーカーの経時的・空間的発現変動を調べた。MAP2及びシナプス関連タンパク質の発現変化から神経細胞は、3dprで梗塞巣中心部で消失し、辺縁部でも減少がみられ、その後も変化はなかった。Eat-me signal認識分子のmRNA発現では、MFG-E8発現には経時的・空間的変化がないのに対し、MerTK、GAS6、Protein Sおよび補体のC1qは5dprより増加した。補体のC3とファゴソームマーカーCD68は、7dprになって初めて有意に増加した。MFG-E8及びC1qのタンパク質レベルの変動は、3dprより増加していた。7dprのPeriでの免疫組織染色により、Protein S、C3がマイクログリアに貪食されようとする神経細胞表面に局在し、更にC3はNeuN及びシナプトフィジンとファゴソーム内に共局在していることが観察された。また、CD68陽性ファゴソームは7dprに比べ、3dprでは顕著に少なかった。よって、MFG-E8、GAS6, Protein S/MerTK、補体系という3種のeat-me signal認識システムが緩徐な神経細胞死が生じる亜急性期においてマイクログリアの変性神経細胞貪食に関与することを示唆していた。一方、大部分の神経細胞死が3dprまでに完成しているのに対し、eat-me signal認識分子群の発現上昇は3または5dpr以降に観察され、特にCD68やC3の発現が7dprになって初めて有意な上昇をみせているということは、マイクログリアの貪食が神経細胞死を促進するとの最近の主張とは矛盾するものである。初年度で予定していた、in vivoでの、eat me signalに関連する分子や、マイクログリア、神経細胞のマーカーのmRNA、蛋白発現、免疫組織化学的研究は終了している状況である。我々は、これまで脳梗塞中心部で骨髄由来マクロファージ様細胞が増殖・集積し、特にNG2プロテオグリカン(NG2)を発現する一群の細胞は虚血による組織障害の増悪を防ぐことを示してきた。この脳梗塞中心部では、脳常在性マイクログリアは早期に死滅してしまう。しかし、緩徐な神経細胞死が観察される脳梗塞の辺縁部では、脳常在性マイクログリアの活性化像が観察される。これらの細胞は、活性化アストロサイトによるグリオーシスに沿う約100&micro;m程度の幅の組織(demarcation zoneと呼ぶ)に限って存在する。この活性化マイクログリアの多くはNG2を発現し、虚血辺縁部で変性しアポトーシスする神経細胞を取り囲み貪食することを観察した。ラット中大脳動脈一過性閉塞モデル作成7日後に、梗塞中心部、辺縁部、対側(非虚血側)の大脳皮質を採取し、マイクログリアによるアポトーシス細胞の貪食シグナル分子のmRNAの発現を調べた。脳梗塞辺縁部のNeuronal proteinは、脳梗塞中心部と同様に減少している一方、TREM2やeat-me signalに関連するMFG-E8, MerTK,Gas6, Protein S、補体(C1q,C3)が上昇していた。また、免疫組織染色において、脳梗塞辺縁部の活性化マイクログリアはCD68陽性ファゴソームをもち、C3, ProteinS陽性のNeuronに接着していた。これらの結果より、マイクログリアは、これらの貪食関連の分子を介して、ニューロンを選択的に貪食していることが示唆され、これらの分子は緩徐な神経細胞死を抑制するターゲットとなりうる可能性が示された。脳梗塞中心部や辺縁部の組織を分散し、マクロファージやマイクログリアの発現している貪食マーカーやM1 M2マーカーをFACSで解析し、その経時的変化を調べる。また、次世代シークエンサーを使用して、脳梗塞中心部や辺縁部に発現している分子を網羅的に解析する。

脳虚血比較的順調に実験が計画通り進行したため、モデル動物の数や試薬の量が当初見積もりをしていたものより少なくなり、使用予定額を下回った。次年度に予定している脳組織の分散に必要な試薬やFACSの抗体、次世代シークエンスのための解析などを行うため、今年度の残額を使用する予定である。
積層欠陥の解析による、高分子結晶の形成過程に関する研究

立体規則性の異なる3種類のシンジオタクチックポリプロピレン(s-PP)を試料として用いた。s-PPは単分子層単位で積層欠陥を形成する。試料s-PPの希薄溶液をキャストしてガラスなどの基盤上に薄膜を作成し、ホットプレートを用いて様々な温度で結晶化させ、ラメラ状結晶試料を作成した。このラメラ状結晶について、極低温高分解能電子顕微鏡によって、分子鎖の配列に関する情報を記録した高分解能像を撮影することに成功した。この高分解能観察結果と、高分解能像の画像処理については繊維学会誌に投稿中である。s-PPのラメラ状結晶試料からの電子線回折パターンを解析し、積層欠陥がどの程度存在するかをマクロスコピックに定量した。結晶化温度を高くするほど欠陥の少ない結晶が得られた。また、同じ結晶化温度では立体規則性の低い試料の方が欠陥の少ない結晶を与えた。この事から、欠陥の量は結晶化速度に依存し、ゆっくりと結晶化する条件(結晶化温度が高い・立体規則性が低い)ほど成長面に付着した分子鎖が安定な配置を模索する時間が長く、欠陥の少ない結晶を与えると考えられた。これらの議論については「第10回材料学会高分子材料シンポジウム」および「第49回高分子討論会」で発表した。また、繊維学会誌にも投稿中である。光学顕微鏡を用いて成長過程を観察し、種々の結晶化温度における(010)面の成長速度を求めた。積層欠陥が存在していることにより、s-PPの(010)面は常に段差を持っているはずなので、成長レジュームIからIIへの転移は存在せず常にレジュームII成長を行うはずである。それにも関わらず、レジューム転移と同様な成長速度の変化が観察された。この点については今後の検討課題である。
細胞性粘菌を利用したSTAT関連シグナルと多細胞性獲得の進化学的解析

本研究では生物進化における謎の1つである多細胞生物出現の過程で獲得したシグナルについて、最も原始的な多細胞生物である細胞性粘菌を用いて解析した。1.既に動いているSTATaサプレッサー遺伝子のスクリーニングを継続し、新たに12個のサプレッサー遺伝子を得た。2.サプレッサーのうち、ncRNAをコードするdutA遺伝子ではSTATaのリン酸化が変化し,チロシンキナーゼの不活性化を通してSTAT活性を制御していた。この結果については論文としてまとめ投稿しアクセプトされた。3.Dd-STATaサプレッサー遺伝子Dd-CH1(SunB)がコードするタンパク質は全ての真核生物に保存され膜タンパク質と考えられる。(1)GFP融合タンパク質を観察から細胞内膜に存在し、(2)タンパク質のN末端領域がdominant negativeとして作用していた。(3)遺伝子破壊株の過程で,ゲノムデータベースと異なりゲノム中に遺伝子が2コピー存在することが判明した。現在1コピー目の遺伝子破壊に成功し,2コピー目の破壊を行なっている。4.Dd-STATaサプレッサー遺伝子NK20は100アミノ酸程の極めてセリンとグリシンに富む小さなタンパク質をコード出来るが、翻訳されるか不明であった。GFPタグ付加により翻訳されていることを確認した。細胞性粘菌ゲノムには100個程のファミリー遺伝子が存在するが,予定柄細胞でのみ発現する遺伝子のみサプレッサーであった。5.プログラム細胞死関連遺伝子をデータベースからピックアップし、ESTクローンが解析可能なもの14遺伝子について、STATaの標的遺伝子になっているかを調べた。その結果、少なくとも3つの遺伝子はSTATaの標的遺伝子になっている可能性が極めて高いことが判明した。これらについては遺伝子破壊株の作製を試みており,2つについて最終確認の段階まで来ている。また、全ての遺伝子についてプロモーターを単離して、3つについては解析出来た。その結果ELMO/CED-12familyのホモログ遺伝子の1つは明確にDd-STATa遺伝子破壊株において発現が低下していることが確認された。さらに、過剰発現株の作製とGFP融合タンパク質の発現を試みており,現在その詳細な解析を行なっている。本研究は、生物の進化における謎の1つである多細胞生物出現の過程を、最も原始的な多細胞生物である細胞性粘菌を用いて行うものである。細胞性粘菌は、子実体を形成する過程で、柄細胞のプログラム細胞死伴い、この過程に転写因子STATが必須である。また、STATシグナルは多細胞生物に特異的である。ことから、STAT関連シグナルを探索すれば多細胞化に関する何らかのヒントが得られると考えた。本年度の実施概要は以下のとおりである。1)既に動いているSTAT関連遺伝子としてのSTATaサプレッサー遺伝子のスクリーニングの継続を行った結果、新たに数個のサプレッサー遺伝子が単離された。そのうちの幾つかは、ncRNAとして機能しているのではという予備データが得られ、RNAワールドとSTATの関連性が示唆された。2)既に同定されたDd-STATaサプレッサー遺伝子Dd-CH1は、コードするタンパク質は全ての真核生物に保存された領域を持ち、膜タンパク質と考えられる。そこで、1.GFPタグを導入し、実際の細胞内局在を観察したところ膜タンパク質であることが確認できた。

2.Dd-CH1遺伝子の全コード領域をもつcDNAを親株と野生株で過剰発現させたところ、形態変化はなく、タンパク質のN末端領域がdominant negativeとして効いていることが判明した。3.Dd-CH1遺伝子の破壊株の作製は困難を極め未だ成功していない。部分遺伝子破壊株が得られているが、形態変化はなかった。また、RT-PCRの実験よりDd-CH1はDd-STATa遺伝子の下流には位置しないことが明らかとなった。3)Dd-STATaによって発現が制御されるプログラム細胞死関連遺伝子の検索について行った。細胞性粘菌に存在する全てのプログラム細胞死関連遺伝子をゲノムデータベースからピックアップした。そのうちESTクローンが存在し解析可能なもの14遺伝子について、STATaの標的遺伝子になっているかをin situハイブリダイゼーション法で調べた。その結果、少なくとも5つの遺伝子でDd-STATa遺伝子破壊株において発現が消失(あるいは低下)し、そのうち3つの遺伝子はSTATaの標的遺伝子になっている可能性が極めて高いことが判明した。これらの中にはDOCKfamilyやELMO/CED-12familyのホモログ遺伝子が含まれていた。本研究では生物進化における謎の1つである多細胞生物出現の過程で獲得したシグナルにっいて、最も原始的な多細胞生物である細胞性粘菌を用いて解明を試みている。細胞性粘菌は子実体を形成する過程で、柄細胞の転写因子STAT依存的なプログラム細胞死を起こす。本年度の実施概要は以下のとおりである。1.既に動いているSTAT関連遺伝子としてのSTATaサプレッサー遺伝子のスクリーニングの継続を行った。その結果、今年度新たに6個のサプレッサー遺伝子が単離された。2.サプレッサーのうち、ncRNAとして機能しているdutA遺伝子ではSTATaのリン酸化が上昇し,チロシンキナーゼの活性化を通してSTATシグナルと関連していることが示唆された。この結果については論文としてまとめ投稿し、アクセプトされた。3.既に同定されたDd-STATaサプレッサー遺伝子Dd-CH1(SunB)について、遺伝子破壊株の作製を試みたが,ゲノムデータベースと異なりゲノム中に2コピー遺伝子が存在することが判明した。現在1コピー目の遺伝子破壊に成功し,2コピー目の破壊を行なっているところである。4.もう一つのDd-STATaサプレッサー遺伝子NK20についても機能解析を行なった。NK20遺伝子は100アミノ酸程の小さなタンパク質をコード出来,アミノ酸組成が極めてセリンとグリシンに富んでいるため翻訳されている不明であったが、GFPタグを付けて発現させてタンパク質に翻訳されていることを確認した。遺伝子破壊株を作製したが表現型はノーマルであった。
糸状菌分生子特異的hydrophilin遺伝子の光による発現制御機構の解明

hydrophilin遺伝子上流の光応答因子結合配列に結合するタンパク質複合体を同定することを目的に以下の実験を行った。初めにEMSAによってDNA-タンパク質の相互作用のためのバッファー条件を決定し、次に核タンパク質と光応答因子結合配列のビオチン化プローブDNAを混合し、DNAアフィニティー沈殿法により結合タンパク質複合体を回収し質量分析により結合タンパク質候補を得た。ペプチド断片情報を元にプライマーを設計し、結合タンパク質候補の全長cDNAを取得し、無細胞発現系によるタンパク質の合成を行った。今後は、合成結合タンパク質候補と光応答因子結合DNA配列の相互作用を確認する。糸状菌無性胞子(分生子)中には、光により高発現する機能未解明のタンパク質が数多く含まれる。我々はAspergillus nidulansの光誘導分生子タンパク質Conが、植物種子の成熟乾燥過程で高発現するタンパク質に類縁のhydrophilinに分類され、かつ、栄養菌糸では短時間の光照射に応じて一過的に発現上昇する事を見出したが、その光による発現制御メカニズムは不明である。そこで、con遺伝子上流の光応答因子結合配列に結合するタンパク質複合体を同定することで、これら遺伝子の発現制御機構を明らかにすることを目的に以下の実験を行った。1.これまでの研究で明らかになった光応答因子結合配列の配列情報を元に外注にて50bpのプローブDNAを合成し、PCR増幅にてビオチン化及びFITC化プローブを作成した。2.A. nidulansの暗培養菌体を回収後10分間の光照射培養及び対照区として継続暗培養を行い、それぞれの菌体から核タンパク質を抽出した。DNA結合タンパク質の濃縮にはヘパリンカラムが有効であることが解った。3.DNA-タンパク質の結合に適したバッファー条件を詰めるため、予備実験としてEMSAを試みた。共雑タンパク質の非特異結合を防ぐため、L-アルギニンとNP-40の添加が有効であることが解った。バッファー塩濃度を上げると非特異吸着だけでなく、特異的なDNA-タンパク質相互作用も阻害されるため塩濃度の調整は適当ではないことが解った。その結果、再現可能な形でDNA-タンパク質複合体を検出することに成功した。我々はAspergillus nidulansの光誘導分生子タンパク質Conが、植物種子の成熟乾燥過程で高発現するタンパク質に類縁のhydrophilinに分類され、かつ、栄養菌糸では短時間の光照射に応じて一過的に発現上昇する事を見出したが、その光による発現制御機構は不明である。そこで、con遺伝子上流の光応答因子結合配列に結合するタンパク質複合体を同定することで、これら遺伝子の発現制御機構を明かにすることを目的に以下の実験を行った。26年度に明らかになった光応答因子結合DNA配列と核タンパク質との結合バッファー条件を用いて、核タンパク質とビオチン化プローブDNAを混合し、ストレプトアビジンビーズを用いたDNAアフィニティー沈殿法により結合タンパク質複合体を回収した。回収したDNA結合タンパク質をSDSPAGEにて分離し、銀染色にて検出した。バンドを切り出し、ゲル内トリプシン消化を行った。ペプチドMSフィンガープリンティングにより、結合タンパク質候補を得た。MS解析を海外の連携研究者に依頼したため、条件検討のためのやりとりに予想外の時間がかかった。光刺激は多くの生物にとって普遍的な環境シグナルであり糸状菌においては無性胞子(分生子)の形成に影響を与える要因の一つである。本研究では分生子中に存在する光により高発現する機能未解明のタンパク質hydrophilin類の光による発現制御メカニズムを明らかにすることを目的として研究を行った。遺伝子上流の光応答因子結合配列に結合するタンパク質複合体を同定することを目的に以下の実験を行った。すなわち、蛍光修飾した光応答因子結合DNA配列と核タンパク質を混合し、EMSAによるDNA-タンパク質の相互作用のためのバッファー条件を決定した。次に明らかになった光応答因子結合DNA配列と核タンパク質との結合バッファー条件を用いて、核タンパク質とビオチン化プローブDNAを混合し、ストレプトアビジンビーズを用いたDNAアフィニティー沈殿法により結合タンパク質複合体を回収し質量分析により結合タンパク質候補を得た。同定したペプチド断片情報を元にプライマーを設計し、結合タンパク質候補の全長cDNAを取得し、無細胞発現系によるタンパク質の合成を行った。これまでの研究から糸状菌hydrophilin類は機能重複していると想像されるが、共通の転写因子の人為的制御によって複数のhydrophilinの発現を同時に抑えれば、分生子の耐久性が低下すると期待される。将来的には病原糸状菌の拡散伝播を防ぐための光による分生子抑制技術、例えば、室内照明の特定波長光の制御により空気中分生子飛散量を低減する事が可能かもしれない。あるいは反対に分生子形成を誘導する波長光の利用により、伝統醸造産業にスターターとして用いられる分生子の耐久性向上や、効率的な生産技術に貢献する基盤的知見が得られると期待される。

今後は、合成結合タンパク質候補と光応答因子結合DNA配列の相互作用を確認する。プローブDNAの作成と核たんぱく質の抽出に成功したが、想定外の実験結果としてDNA-タンパク質複合体の条件検討に予想外の時間を要し、結合タンパク質の同定にいたらなかったため。しかしながら、再現性よくDNA-タンパク質複合体を検出する条件を決めることができたため、実験の遅れは想定内で済んだと考える。1.ペプチドMSフィンガープリンティングにより同定されたタンパク質の遺伝子をA.nidulansのゲノムデータベースより検索し、PCRにて遺伝子断片を取得し、クローニングする。2.無細胞タンパク質合成キットにてリコンビナントタンパク質を合成する。3.EMSAにて各タンパク質と光応答因子結合配列との相互作用を確認する。4.FRETあるいはBiFC、あるいはその組み合わせによる3者間相互作用観察により、タンパク質間相互作用をin vivoで観察確認する。5.上記により、光応答因子複合体の構成タンパク質と確認された物について遺伝子破壊株及び過剰発現株を作成し各株における既知hydrophilin遺伝子発現をノザンブロットで解析する。応用微生物1.核タンパク質とビオチン化プローブDNAを混合し、ストレプトアビジンビーズを用いたDNAアフィニティー沈殿法により結合タンパク質複合体を回収する。2.結合タンパク質をSDSPAGEにて検出する。3.ゲル内トリプシン消化を行う。4.ペプチドMSフィンガープリンティングによりタンパク質複合体の同定を行う。5.同定されたタンパク質の遺伝子をA.nidulansのゲノムデータベースより検索し、PCRにて遺伝子断片を取得し、クローニングする。6.無細胞タンパク質合成キットにてリコンビナントタンパク質を合成する。7.EMSAにて各タンパク質と光応答因子結合配列との相互作用を確認する。8.FRETあるいはBiFC、あるいはその組み合わせによる3者間相互作用観察により、タンパク質間相互作用をin vivoで観察確認する。9.上記により、光応答因子複合体の構成タンパク質と確認された物について遺伝子破壊株及び過剰発現株を作成し各株における既知hydrophilin遺伝子発現をノザンブロットで解析する。次年度使用額は研究費を効率的に使用して発生した残額である。残額については平成28年度の研究費と併せて試薬・消耗品として使用する。
造網性クモ類における配偶者認知機構とその地域変異に関する研究

平成14年度は、東南アジアから日本に至るOctonoba属のクモ類の系統関係、および同種の地理的な変異を調べるために、生物地理学的に重要な情報をもつと考えられる台湾、および日本の南西諸島の複数地点で採集を行った。また採集に際して、個体が形成していた網の構造の測定と撮影を行った。台湾での採集は主に、本島中部の東海岸側で行い、解析に使える個体数を確保することができた。南西諸島では、先行研究によって、島ごとに別種が記載されていた。しかし、その根拠は主に生殖器の形態的な差異によるものであった。今回、形態的な分類が、遺伝的にも裏付けられるかどうかを検証することができるだけのサンプルを確保することがでた。以上のサンプルを用いて、現在、DNA分析を進めている。網構造の形態に関しては興味深いことに、緯度を下がる程、網糸の総長が減少する傾向が見られた。また、体長で補正して、Octonoba sybotides(カタハリウズグモ)のパラメーターと比較すると、横糸間隔が、より広めに形成されていることもわかった。このような網構造のパラメーターは、個体の栄養状態と、環境中の餌サイズとの関連で決まると考えられるが、残念ながら滞在時間の都合により、現地の餌生物がどのような種構成で、どのようなサイズ分布であるかについては充分な情報意を得ることができていない。この件に関しては、採集を再度行うよりも、現地の研究者との連携を模索している。以上、14年度の目標であった、東アジアの島嶼に分布するOctonoba属のクモ類の系統解析用のサンプルについては、必要な分量を確保することができており、その分析を現在遂行中である。結果は、順次公表してゆく予定である。
実時間データベースシステムにおけるトランザクションスケジューリングに関する研究

本研究では,実時間データベースにおける周期的なトランザクション処理の問題を取り上げ、トランザクションの時間的制限の他、そのアクセスするデータ項目の時間的整合性をも考慮したスケジューリング方式の提案、並びに各種スケジューリング方式の性能比較・評価を行った。具体的には、まず昨年度の研究成果をさらに拡張し、実時間データベースのデータ項目について、その絶対的な時間整合性(absolute temporal consistency)の他、さらにトランザクションのアクセスするデータ項目間の相対的時間整合性(relative temporal consistency)、すなわち、データ項目間の絶対的時間整合性の差をも考慮に入れたスケジューリング方式をも実現した。さらに、本研究で提案されたものを含めたこれまでの3つのスケジューリング方式についての比較・評価を行った。それらの方式は、(1)トランザクションの時間制限のみ、(2)トランザクションの時間的制限とデータ項目の絶対的時間整合性、(3)トランザクションの時間的制限、データ項目の絶対的整合性及び相対的整合性を考慮した3つのものである。その結果、(2)と(3)の方式は(1)の方式よりトランザクションの整合性に関して、大きな改善ができることが分かった。また、トランザクションの周期が近く、かつ、システムの負荷が高くない場合は、(3)の方式は(2)の方式よりさらにトランザクションの相対的整合性を改善できることが示された。しかしながら、システム負荷が高い場合は、トランザクションの相対的整合性の改善と絶対的整合性の改善とは排他的な関係となり、相対的整合性を改善すると絶対的整合性が悪くなることが分かった。これらの結果より、実時間データベースを設計する際、システムの構築目的、使用条件などに合わせてシステムの指標値の間のトレードオフ(trade-Off)を考える必要があることが分かった。これまでの研究成果はすでに関連国際学会に発表し、また国際学術論文誌へ投稿中である。さらに、本研究の成果・技法を他の研究への応用を考え、研究を進めており、しかも、結果が得られつつある。本研究は,実時間データベースシステムにおいて,トランザクションの時間的制限及びそのアクセスする実時間データ項目の整合性を考慮したトランザクションのスケジューリング方式の提案及び性能評価を行うことを目的とする。本研究の実施にあたって、まず、これまでの研究成果の調査を行い、論文の収集、参考資料の収集を行った。トランザクションデッドライン(deadline)のみを考慮したスケジューリング方式を拡張し、トランザクションのアクケスする実時間データ項目の整合性(consistency)をも考慮するようにした。具体的には、実時間データベースシステムにおけるデータ項目の値が時間が経つにつれ、その値が無効になるため、データ項目の値が得られた時間とその有効期間を用いてデータ項目の絶対的整合性を表し、トランザクションデッドラインに加えて、データ項目値の有効期間を表す絶対的デッドラインをもそのトランザクションのデッドラインとする方式を考えた。さらに、トランザクションのアクセスするデータ項目の間において得られた値の時間差を表す相対的整合性を考慮に入れ、トランザクションを実行する前に、その整合性をチェックし、必要に応じて処理を遅らせデータ項目の更新を待つような方式を考えた。シミュレーションを用いてこれらの方式を実現し、従来の方式とを比較評価した。その結果、これらの方式は、トランザクションデッドラインミス率および整合性は従来の方式よりよい結果が得られた。これまでの研究成果は関連国際学会に発表した。現在は,これまでに得られた成果の上にさらに研究成果を積み重ねるべく研究を進行中である。
新構想大学の誘致をめぐる地方における政治・行政過程とその効果

最終年度は補足的な資料の収集を行いつつ、その整理と分析を通して研究の総括を行った。研究の成果は以下の通りである。1豊橋技術科学大学については、市当局に加え、地元の青年会議所が当初から熱心に誘致活動を展開していたこと、また活動については、豊田における高等専門学校誘致、隣県である浜松における医科大誘致の成功を「学習」していたことが明らかとなった。また、上越教育大学については新潟大学教育学部高田分校の存廃問題、兵庫教育大学については県内の深刻な教員不足が前提として控えており、教員養成系の高等教育機関の増設という潜在的なニーズが新構想大学誘致運動の原動力となっていたことを確認した。2一方、鳴門教育大学については、まず塩田跡地の有効利用という観点から、国立に限らず広く大学誘致運動が展開されたものの、最終的には新構想の教育大学誘致へと的を絞っていった過程を明らかにした。しかし徳島大学教育学部との競合が懸念されたことから、その調整に時間がかかり開校が遅れたこと、その際誘致運動の主体としては、徳島県よりも鳴門市が積極的に活動していたことを明らかにした。3さらに鹿屋体育大学に関しては、そもそも大学誘致の動機が地元での高等教育進学先の確保だったにもかかわらず、新構想大学設立という国の動向を看取して、教育大学の誘致、そして体育大学の誘致へと目標が変化していくなかで、最終的には国立大学の誘致という本質的な動機が顕わになっていく模様を指摘することができた。4なお、補足的ではあるが、新構想大学の設立という政策動向が、各地で誘致運動を惹起したこと、およびその誘致を試みながらも失敗した自治体には、例えば教育大学誘致を目指したもののそれを果たせず、その後独自で公立大学を設立した会津若松市のような事例もあり、新構想大学を巡る各地の動きが、その後の公立大学の開設につながった可能性を示唆することができた。今年度は、長岡技術科学大学、豊橋技術科学大学、上越教育大学、兵庫教育大学、鳴門教育大学、鹿屋体育大学すべての新構想大学について、まず大学誘致からその設立までの過程について開学記念誌や周年記念誌等から整理を行った。そのうち、1鹿屋体育大学については、戦前から当地があらゆる高等教育機関の誘致に熱心であり、新構想大学誘致では当初教育大学の設立を要請していたが、鳴門設置が決まると体育大誘致に切り替えており、どちらかというと大学誘致そのものに力点が置かれていたことを、当時の市の広報誌の閲覧を通して明らかにした。2鳴門教育大学については、市役所に保管されている大学誘致に関する特別委員会会議録を閲覧し、当初県内学校法人による私立大学開設を目指していた鳴門市が、国主導の新構想の教育大学の誘致へ傾いていく過程を明らかにした。3兵庫教育大学については、県全体が教員不足に悩まされてきたこと、その一方神戸大学教育学部と競合することになることから、他の事例が市主体で誘致が展開されていたのに対し、兵庫では、県議会で誘致の当否が論議されていることが明らかとなった。初年度の検討では、市主体の場合、首長の動向が大きな役割を担っていたと思われることから、次年度は人物史的アプローチを試みる必要があることが明らかとなった。なお、国立公文書館に保管されている新構想大学関係の簿冊はすべて要審査となっており、審査には長期間かかるとのことであったので、今年度初めから、それら簿冊の公開請求を行い、今年度内に大半の文書については一部公開という許可を得るに至っている。もとより、新構想大学はそれぞれ個別性の高い性格をもっており、また誘致運動する自治体の事情も区々であることから、一様に同質、同水準の資料を発掘することは難しい。とはいえ、概要に示したように、鳴門において特別委員会会議録という一次資料を得たことは大きな進捗であると言える。一方で、資料の所在や有無を問い合わせて、その返答を得るまでにかなりの時間がかかってしまった。しかし国立公文書館の新構想関係の文書については、審査手続を済ませたので、次年度当初から資料の閲覧に取りかかることが可能となっている。今年度は、昨年度の資料収集状況から比較的系統立った収集が可能と思われる1鳴門教育大学、2鹿屋体育大学の誘致関連の資料の収集と整理を重点的に行った。すなわち、1鳴門教育大学については、昨年度収集した鳴門市議会の大学誘致に関する特別委員会に対応する市議会会議録の収集を完了した。1969年前後から中央における「新幹線大学(後の新構想大学)」の議論を察知して市議会で議論が開始されていること、それが塩田の跡地問題と合体することで誘致運動が本格化してゆくこと、しかし当初は私立大学の誘致の二本立てで検討されており、どのような大学を誘致するかではなく、とにかく何らかの大学を誘致したいという意向が強かったことが明らかとなった。次第に教員養成系の新構想大学誘致へと運動の方向が定まっていくが、その過程で徳島県からの支援と、競合する徳島大学教育学部の取り扱いが議論となっていくという一連の展開も明らかとなった。2一方、鹿屋体育大学については、県議会会議録等の県レベルの資料の収集を行い、誘致達成までの会議録についてはほぼ収集を終えた。その際、鹿児島県が策定した新大隅開発計画の存在を知ることになった。1971年策定当初には記載されていなかった当該地区への大学誘致が数次の改訂後に組み込まれており、鹿屋における誘致運動が次第に全県的な課題としてとらえられるようになっていった様子を明らかにできた。

なお、副次的な実績として3新構想大学誘致は検討したものの、誘致には至らなかった地域のその後の動向を検討したところ、先端科学技術大学院大学のように新構想大学の後継大学の誘致に転換する地域、私立大学の誘致に動く地域などが散見された(これに自前で公立大学を設立する動きが加わると思われる)。結果的に新構想大学の設立は1980年代以降の大学の地方分散を促したと評価することもできる。新構想大学はそれぞれ個別性の高い性格を持っており、誘致側の事情も種々であることから、同量で同質の資料を収集することは難しいものの、二年間資料の渉猟作業を進めることで、運動が加熱していく段階で、誘致が当該基礎自治体から都道府県レベルの課題として持ち上がり、県議会等で活発に論議されていく傾向はほぼ同様であることが確認できた。今後、それぞれの新構想大学について、どのレベルの議論をどのように補充しなければならないかという、作業課題が明確になったと考える。最終年度は補足的な資料の収集を行いつつ、その整理と分析を通して研究の総括を行った。研究の成果は以下の通りである。1豊橋技術科学大学については、市当局に加え、地元の青年会議所が当初から熱心に誘致活動を展開していたこと、また活動については、豊田における高等専門学校誘致、隣県である浜松における医科大誘致の成功を「学習」していたことが明らかとなった。また、上越教育大学については新潟大学教育学部高田分校の存廃問題、兵庫教育大学については県内の深刻な教員不足が前提として控えており、教員養成系の高等教育機関の増設という潜在的なニーズが新構想大学誘致運動の原動力となっていたことを確認した。2一方、鳴門教育大学については、まず塩田跡地の有効利用という観点から、国立に限らず広く大学誘致運動が展開されたものの、最終的には新構想の教育大学誘致へと的を絞っていった過程を明らかにした。しかし徳島大学教育学部との競合が懸念されたことから、その調整に時間がかかり開校が遅れたこと、その際誘致運動の主体としては、徳島県よりも鳴門市が積極的に活動していたことを明らかにした。3さらに鹿屋体育大学に関しては、そもそも大学誘致の動機が地元での高等教育進学先の確保だったにもかかわらず、新構想大学設立という国の動向を看取して、教育大学の誘致、そして体育大学の誘致へと目標が変化していくなかで、最終的には国立大学の誘致という本質的な動機が顕わになっていく模様を指摘することができた。4なお、補足的ではあるが、新構想大学の設立という政策動向が、各地で誘致運動を惹起したこと、およびその誘致を試みながらも失敗した自治体には、例えば教育大学誘致を目指したもののそれを果たせず、その後独自で公立大学を設立した会津若松市のような事例もあり、新構想大学を巡る各地の動きが、その後の公立大学の開設につながった可能性を示唆することができた。財政規模が小さければ誘致コストも真剣に論議されることも明らかとなったことから、自治体議会会議録の本格的な渉猟、分析に着手する。また、今年度発見できた鳴門市の特別委員会のような資料が各地自体に残されていないかどうか、関係機関に問い合わせ、資料の発掘を続けたい。上述のように、基礎自治体と都道府県、それぞれのレベルにおける誘致運動やそれに関する議論を重ね合わせることが重要であることから、鳴門教育大学については徳島県県議会会議録の確認、鹿屋体育大学については市議会会議録の確認を行う。
転換期日本の国際機構外交のメカニズム-1960年代と70年代を中心に

前年度の資料調査の成果を踏まえ、本年度は補足調査と成果発表の両方に力を入れてきた。まず、補足調査について6月末に英国国立公文書館における二回目の調査を実施し、新たに公開された貴重な資料を大量に入手した。これらの資料を中心に平成19年9月末、中国の国連代表権問題に関する日英両国の政策の比較研究を英文論文に纏め上げ、それを国際関係史分野で国際的な権威を持つ学術誌International History Reviewに投稿した。11月末に同誌の編集者より論文修正に関する知らせが寄せられ、それに従い修正稿を執筆すると同時に、資料補充のため、平成20年2月中旬にオーストラリア国立公文書館において初の資料調査を行なった。その結果、2月末、修正稿を提出したが、3月初頭に同誌編集者から正式に掲載許可の知らせを受け取った。(掲載時期は本年中とされている。)この論文は国連代表権問題を日本の国連外交及び対中政策双方の視点から検証するのみならず、比較外交政策のアプローチも活用する数少ない研究成果であり、原稿を審査する匿名レフリー(3名)全員から高い評価を得ている。一方、本研究のもう一つの焦点である日本と国際文化機構との関係について前年度の後半に投稿したユネスコ協力に関する英文の論文に続き、平成19年9月に、国連大学の創設をめぐる日本と米英両国との外交交渉の過程を分析する論文も完成し、ジャーナルに掲載された。なお、この課題にっいて、英国及び豪州における資料調査の際、更に資料を補充しており、現在英文でより包括的な視点から論文の執筆を準備しつつある。また、本年度中は論文執筆とともに、平成19年10月に東京財団の主催する国連外交についての研究会及び吉田茂国際基金の主催する「吉田茂没後40周年記念シンポジウム」においてそれぞれ研究報告を行ない、いずれも好評を得たのである。本研究は外交史の視点から、1970年代前後を中心に、日本と国連(及びその専門機関)との関係の変化を検証するプロジェクトであるが、平成18年度は資料準備と初歩的な研究作業を行う段階と位置づけられている。まず、資料準備に関し、英国と米国の国立公文書館をそれぞれ訪問し、研究課題と関連性のある責重な一次資料を大量に発見することができた。また、国内において、国連中国代表権問題、ユネスコ、1国連大学などに関する外務省保管文書の開示請求を集中的に行い、その一部が開示されたのである。他方・初歩的な研究作業の一環として、日本国連学会・日本国際政治学会及び北海道大学主催の各種学術会議に参加し、本研究に関する報告を日本語及び英語で行った。更に、これらの研究活動を通して、特に進展のあった部分を二つの論文に纏めた。中では、日本のユネスコ政策に関する英文の論文は既にジャーナルでの掲載が決っており、70年代初頭の国連大学設置問題をめぐる日本外交についての論文も既に脱稿している。本研究のもう一方のテーマである政治面での日本と国際機構との関係に関し、国連の中国代表権問題という具体的な課題を定め、19年度中、論文の準備と執筆へ進めていくことになっている。その際、主に61年から71年にかけて、中国の国連代表権に対する日米英三力国の政策を視野に入れ、比較外交史の視点からこの冷戦の転換期における大国の国際機構外交を形成する国際及び国内攻治的要因を解明していく。今年度の調査を通じて既に一部の史料を入手したが、19年度中は今までの研究成果を踏まえ、再度英国、米国、また必要に応じて、オーストラリアの史料を補強しながら、英文にて投稿論文の原稿を完成する計画である。更に、このテーマは極めて幅広いものであり、最終的な研究成果をいずれ単行本にまとめる予定であるが、その準備作業も19年度中、開始したいと考えている。
抗血栓性を有する脱細胞化小口径血管の解析と小口径人工血管への応用

小口径血管は、早期血栓形成や血管狭窄などにより安定した移植成績を有しないため臨床使用が少ない。その原因の一つとして、血管内腔は基底膜と称される組織と内皮細胞から構成され、血管内皮細胞が抗血栓性の機能を有している。このため、小口径血管の安定性には、細胞の接着する基底膜構造の維持が、早期内皮化に重要だと考えられる。本事業では、脱細胞化した血管内腔構造の評価、また、脱細胞化血管内腔への血管内皮細胞播種を行い、基底膜構造と内皮細胞機能の関係性の探索を行った。その結果、脱細胞化小口径動脈は早期血栓形成や狭窄が認められず、移植後の細胞浸潤による組織再生が確認された。脱細胞化処理方法とその後の血管内腔構造破壊モデルとの比較検討を行った。本年度は主として組織構造の解析を行った。残存組織内コラーゲンの定量、及び表面構造の走査型電子顕微鏡下での微細構造の解析内容は、界面活性剤処理で処理した組織のコラーゲン量は大幅に減少していたが、内腔基底膜、内弾性板、コラーゲン繊維の配向に乱れはあるが維持がされていることが確認された。一方、50°Cで熱変性を加えた組織表面を解析した結果、表面構造に大きな変化は見られなかった。次年度に細胞を用いての表面構造の解析実験を行い、細胞接着への影響評価も含めて、この条件を脱細胞化処理のプロトコールへ反映させるようにし、さらなる高血栓性や再内皮化を促す脱細胞化小口径血管の作製への知見とした。細胞接着が進行していくこの再生メカニズム解明のため、各処理血管内腔に細胞播種および血液を滴下し、所定時間後に血栓形成を評価することも行う。さらに、血液滴下後の血管内腔表面を電子顕微鏡観察し、血小板接着などの微細評価を行い、人工血管への知見となるように研究を進めていく。動物実験モデルについては、ラット頸動脈に作成した血管を移植するモデル御構築を行った。その結果、吻合による移植は大きさのハードルにより困難である事が判明したが、カフを用いた移植方法は可能であり、本研究で得られた移植実験の方法として妥当であると考えられた。それぞれの処理に作成された血管の移植モデルを作製し、in vivoにおける構造の影響を評価していく。小口径人工血管は、心臓血管領域など広い分野で必要とされているが、早期血栓形成、血管狭窄および内皮化の遅延による低開存性により、臨床上において満足できる小口径人工血管は存在しない。本年度は本研究で血液・血管内皮細胞との関連性を明らかにするための材料作成として、様々な処理を行った脱細胞化血管を作製し、その基礎評価を行った。界面活性剤法による脱細胞化として、デオキシコール酸ナトリウムとポリオキシエチレンオクチルフェニルエーテル及びそれぞれの複合化法を用いた。脱細胞化評価として、組織内残存DNA定量、組織学的評価および走査型電子顕微鏡(SEM)を行い、脱細胞化処理による組織構造変化について検討した。組織学的評価・DNA定量より、良好な組織からの細胞除去が認められた。EVG染色による細胞外マトリクス構造評価から、界面活性剤処理後の頸動脈には、エラスチンの損傷が認められた。処理後の血管内腔表面の基底膜損傷がSEM観察から明らかになった。加えて物理的処理方法としてブタ動脈を高静水圧法により脱細胞化し、界面活性剤と同様の評価方法を用いて高静水圧法による細胞除去を検討した。作成した脱細胞化動脈のSEM観察から、脱細胞動脈は、血管内腔の基底膜様構造、内弾性板などの血管構造を維持していることが明らかになった。力学的特性評価として、破裂圧試験を行った。未処理動脈との大きな差は見られず、脱細胞化処理による力学的特性の変化を抑制することが可能であった。脱細胞化方法は各国で種々の方法により行われており、ゴールデンスタンダートはまだない。次年度の検討として抗血栓に特化した脱細胞化血管に最適な条件を検討しかつ解析をすることで、抗血栓性に有効な構造等を解析していく。最終年度は、昨年度より継続して検討している血管構造と内皮細胞との関係性を評価するため、各処理を施した脱細胞化血管内腔に血管内皮細胞を播種し、所定期間後の細胞機能等を評価した。加えて、動物実験による再組織化の観察として、それぞれの脱細胞化処理における組織の再生過程の検討を行った。再生過程の解析として組織切片観察により細胞浸潤や集合状態の観察を組織切片より行った。脱細胞化組織上への細胞の播種実験では、細胞が単層で血管内腔表面を覆っていた。