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地域の健康課題解決に結びつく行政保健師と大学が協働する教育研究活動のあり方・方法

看護大学教員が行政保健師と協働した教育・研究活動の事例調査から、教員と保健師との協働活動のプロセス、協働活動における教員と保健師の役割および協働関係の構築の方法、保健師が認識していた課題の変化、教育(実習)環境づくりや学生の学びへの影響が確認できた。また、共同研究に取り組む行政保健師と看護系大学教員の協働についての調査から、教員と保健師と互いに利点をもたらす協働の方法を明らかにした。さらに、文献検討から、行政保健師の実践改善の方法を概説するなどした。1)大学教員と行政保健師との協働した教育研究活動実践が、どのような重なりによって展開され、どのように地域の健康課題解決に結びついているのか、そのプロセスを明らかにする。2) 1)により解決に結びついた地域の健康課題とはどういうものか、研究開始の時点から、何が、どのように、どの程度課題解決が促進されたのか、その内容を明らかにする。3) 1)において行政保健師と大学教員が果たしていた役割と協働の方法を明らかにする。4) 1)2)3)を通して、地域の健康課題解決に結びつく教育研究活動のあり方・方法を検討する。大学教員と行政保健師との協働した教育研究活動のプロセスと役割と協働の方法、それにより解決が図られた地域の健康課題の内容の変化を明らかにするために、下記の研究を実施した。1.行政保健師と協働した教育研究活動の事例調査の実施。2町の保健師との地域の健康課題解決に向けての初年度の取り組みでは、保健師問の検討会への教員の参加や実習打ち合わせ等を通して、課題の明確化を図っていた。また、教員と保健師間で課題を共有することで、保健師の活動を推進していくための実習や共同研究の方向性を検討できた。2.国内の保健師の実践改善に関する文献調査(2文献)。分析の視点を明確にした。今後、保健師の実践の改善が図られた文献を絞り込み、分析をすすめていく予定である。3.共同研究や実習を地域の健康課題解決の機会として生かせる可能性と必要条件の整理をした。実習の場合は、実習の形態によりその機会となるかどうかが異なる。その機会となる可能性のある実習(単独訪問実習、卒研実習)では、学生、保健師、教員間で地域の課題について十分に話し合うこと等が必要である。4.共同研究に取り組む行政保健師と大学教員の協働実践についての断面調査の実施。2004年2006年の日本地域看護学会の学術集会誌(3冊)と日本地域看護学会誌(6冊)の中から、看護系大学教員と行政保健師が共同で報告している地域看護研究の55課題を選び、研究メンバーである大学教員と保健師の各筆頭者に郵送調査を実施した。大学教員においては、保健師との共同研究を通して、地域の課題解決への貢献と保健師の専門能力の向上を目指していた。また、共同研究を実施することで教育活動およびそれ以外にもプラスになる面が様々あることがわかった。5.行政保健師と共同研究に取り組む大学教員の協働実践について聞き取り調査の予備調査を実施した。共同研究に取り組む大学側の体制、研究プロセス、教員が大事にしていたこと、実施してよかったことを質問項目として取り入れる必要がわかった。看護系大学教員が行政保健師と協働した教育研究活動の初期におけるプロセスと役割・協働の方法を主に明らかにした。1.2町(各1事例)における行政保健師と協働した教育研究活動は、地域の健康課題解決に向けての1年前後の取り組みであった。その一つの、卒業研究実習と共同研究事業を連動させ多胎児支援を目指した活動事例での協働関係においては、開始、実行、振り返りのプロセスがあった。協働関係の始まりの条件としては、実践上の課題が基点になること、選択と合意があった。また、その条件を整えるためには、知る・伝えるなどのコミュニケーションを円滑に図ること、互いにアドバンテージのあること、それぞれの立場で助力の意志をもって目標をたて具体的に実行計画にうつし互いの立場で責任を果たそうとするなどのコミットメントが必要と考えられた。2.共同研究に取り組む看護系大学教員と行政保健師との協働実践についての郵送調査の分析を行なった。回答数(延べ人数に対する回答率)は、保健師延べ27名(57.1%)、教員延べ21名(50%)であった。教員側の取り組みをまとめた結果、教員がどのように保健師と協働して共同研究を進めたか、その共同研究と教育活動との関連が明らかになり、教員にとって共同研究を行なう意味が考察できた。また、保健師の取り組みの結果からは、保健師の協働の進め方と保健師が教員との共同研究に求めているものがが明らかになった。そして、共同研究を通して得られたもの(成果・評価)を合わせて、保健師の求めるものに応じた共同研究になるための教員の協働のあり方や方法が考察できた。3.2の調査回答の中で承諾の得られた対象者に対し、教員と保健師をペアにした聞き取り調査を3事例行なった。

共同研究のきっかけは様々であり、そのきっかけの違いによって、研究を通して教員と保健師とが協働する方法は異なっていた。今後さらに事例を重ね、分析をすすめていく予定である。1.町保健師の実践上の課題と連動させて、実習(単独訪問実習、卒業研究実習)を行うことが、学生の学びや学習環境にどのように影響を及ぼしたのかを、2町(各1事例)について調べた。その結果、実習環境においては、臨地実習指導者の指導の充実が図られ実習内容が充実していること、学生においては、単独訪問実習では、個人・家族への援助、個別の援助から地域を対象とした援助のつながりを学べていること、卒業研究実習では、自らが課題解決の取り組みに関与していたと実感し実習の達成感も高まると同時に、グループへの支援や地域ケア体制、連携・協働について学べていることなど、課題に連動させて実習をすることは効果的であり、さらによりよい実習方法について検討することができた。2.共同研究に取り組む看護系大学教員と行政保健師との協働実践について、教員と保健師をペアにした聞き取り調査を、前年度に引き続き3事例実施した。共同研究のきっかけは様々であり、それによって、教員と保健師とが協働する方法も異なるのであるが、教員が関わる意義として共通するものがあった。3.行政保健師による地域の健康課題の解決を図る方法について文献検討を行い、保健師が取り組んだ地域の課題とその理由となる保健師の判断を読み取り記述し、保健師が目指したこと、活動の成果、課題に対する実践方法について内容分析した。行政に所属する保健師には、多様化・複雑化している地域の健康課題を主体的に捉えて活動の展開を図ることが求められており、今回の分析結果を基に、保健師のどのような実践方法を、どのように、今後強化すべきか検討していくことが重要であると考える。行政保健師と協働した教育・研究活動の事例調査を継続して行った結果、そのプロセスは、協働活動の計画、実施、評価、そして、計画修正、実施という循環しながら発展するサイクルですすみ、実習指導においても教員と保健師との協働がすすみ、実習指導体制が一層整い、学生の実習内容の充実につながるプロセスであった。共同研究のプロセスは、実践の改善を図る方向性を見出すと同時に、保健師がその援助・地区活動の意味を再確認し、学びを得るプロセスであった。このプロセスにおける、保健師と教員との協働関係の構築の方法として、8つの要素が挙げられた。また、このように解決に向けて取り組んだ結果、保健師が認識していた課題の変化として、保健師の実践の質の変化や地域の潜在ニーズを捉え、早期に対応する点における意味が挙げられた。教員と行政保健師とによる共同研究事例(6例)を分析した結果、共同研究をすることは、保健師と教員間において協働関係をつくりながら、保健師と教員のみでなく、住民サービスの向上や地域の看護職への波及も含めた地域にとっての利点があり、保健師、教員、地域にとって「三方良し」の利点があることが確認できた。文献検討の結果から、行政保健師が地域の健康課題の解決を図るとは、直面している課題の解決を図るだけでなく、今後も同様の課題が出現したときに解決できるように、継続して実践や体制を改善すること等を確認した。
超高圧下におけるコア物質の結晶構造、融点、熱伝導率の測定

地球コアは超高圧・超高温下にあり、実験が困難であることから、コア物質の構造や物性は未だに良く理解されていない。そこで本研究は、レーザー加熱式ダイヤモンドアンビルセル(DAC)を用いた超高圧実験を行い、地球コア物質の状態図と物性をあきらかにしようとするものであった。具体的には、主に大型放射光施設スプリングエイトのX線を用いて、コア物質の結晶構造、融解曲線、電気伝導度を、コアに相当する135万気圧以上、4000ケルビン以上の超高圧・高温下で測定することを目的としていた。また今年度は、Fe-10wt%NiとFe-10wt%Siの結晶構造、純鉄の融解温度、純鉄の電気伝導度の測定を計画していた。他の課題が採択になったため、本研究は3ヶ月で廃止することになったが、本課題研究を遂行した4月から6月までの間に、スプリングエイトのビームラインBL10XUにおけるX回折実験により、Fe-10wt%Siの構造をコアに相当する超高圧・超高温下で決定した。結果はまだ予察的ではあるが、高温で、六方最密充填構造相単相から、六方最密充填構造相と体心立方構造相の混合相への変化を観察することができた。この試料について透過型電子顕微鏡による化学分析も試みたが、うまく化学組成を決定することができなかった。また、レーザー加熱DACを用いて、高圧高温下で純鉄の電気伝導度測定も試みた。その結果、電気伝導度の温度依存性につき、予察的な結果を得ることができた。
弾性表面波を用いた電着応力測定法に関する研究

◎研究代表者は、電子・通信工学の分野で盛んに研究、利用されている弾性表面波を新たな応力センサーとして注目し、それを利用した電着層の内部応力測定法についての研究、開発を平成4年度より進めている。平成5年度は測定対象として新たにセラミックコーティング材料について測定を行うとともに、非破壊測定法として研究代表者らが開発を進めている白色X線による測定法を組み合わせたハイブリッド手法についても検討した。1.表面波の励振用および受信用として使用している「くさび型トランスジューサ」の形状、加工精度、試験片への装着方法などによって測定データの精度、再現性が大きく変化する。これらの要因について検討を行ったが、データの精度についてはくさび角の加工精度、データの再現性についてはくさび型トランスジューサの試験片装着面の表面粗さおよび試験片への装着圧力が主な原因であることが明かとなってきた。これらについては引き続き定量的検討を行う。2.オーステナイト系ステンレス鋼SUS316に窒化チタンTiNをスパッタリングにより3mumコーティングした試料を製作し実験を行った。弾性表面波を用いてコーティング層表面の残留応力測定を行うためには、TiNの平板状の無ひずみ試料が零応力較正のために必要である。無ひずみ試料の製作のために、コーティング試料を真空炉中で900°C-2hour保持後徐冷し焼きなましを行ったが、TiN層に剥離を生じたため測定には使用できなかった。無ひずみ試料の製作方法について、現在、検討中である。無ひずみ試料が製作でき次第、弾性表面波による測定を行う。3.同一試料に対して白色X線による測定を行った。その結果、TiNコーティング層には圧縮の残留応力、SUS316基材にはTiNとの接合界面に圧縮の残留応力および接合界面近傍に応力勾配が測定された。残留応力の釣合い条件から基材には引張り残留応力の存在が予想されるが、今回用いた測定方法では確認できなかった。急な応力勾配に対応した測定法の開発を検討している。
中空系メンブレンバイオリアクターにおける余剰汚泥ゼロ運転性能

当初は汚泥発生ゼロとする膜分離バイオリアクターの開発を中心課題としていたが、当研究室で開発中であるナノろ過膜を組み込んだバイオリアクターを用いた技術が、さらに地下水と人間界の独立型インターフェース技術として有望であるとの認識の下、研究計画を立て直した。しかし、研究課題にある分散・独立型水再生利用システムを構築するにあたっては、まず分散的に発生する汚泥を管理する問題が最重要課題であると再認識するとともに、研究開発の最終目的である地下水涵養技術と地下水の有効利用技術による水資源開発を進めるに当たっては、初心に還った精密ろ過膜を使用したシステムでまず実用化、普及化を図るべきであろうとの結論に至った。現在の膜分離バイオリアクターシステムは、コンパクト化を達成するため汚泥引抜を前提に運転されており、分散型維持管理の隘路となっており、この問題点の解決なくして先に進めない。この方針の下、実下水処理場の流入原水を用いた汚泥引き抜きなしの膜分離バイオリアクターの運転を行なった。循環式硝化・脱窒法を採用し、総滞留時間6時間から10時間であった。高度メンブレシステムとしての開発の焦点は、無酸素槽の構造の工夫であり、当初のアイデアである傾斜板の効果を確認した。汚泥濃度が高いため通常の傾斜板の機能とは異なると考えられるが、間欠曝気と組み合わせることにより、整流効果により汚泥の無酸素槽に於ける濃度分布が撹乱されることを防ぎ、結果的に曝気槽の汚泥濃度を低く抑えることでファウリングの制御に成功した。従って、特に細胞破壊装置を加える必要もなく、省エネルギーで汚泥引き抜き無しの運転を6ヶ月継続することに成功している、引き続き長期試験を継続し、地下水涵養できる水質を与えかつ独立。分散型水再生利用システムを膜分離バイオリアクターの開発を中心に構築していく。
ナノカーボンにおける光誘起欠陥生成反応の動力学とその制御に関する理論的研究

本年度は,X線自由電子レーザー(XFEL)の光とナノカーボンの相互作用にも研究対象を広げ,内殻励起によって生成するフラーレン超多価カチオンC60q+ (q = 20-60)の解離機構も解明した.電荷qによらず,正電荷間のクーロン反発によって多価原子カチオンが10-20 fs程度で非統計的に放出されるクーロン爆発が起こり,続いて中性・1価分子フラグメントの統計的脱離が起こるという2段階機構を明らかにした.また,クーロン爆発過程が解離直前の分子構造を鋭敏に反映することを利用してナノ分子の構造変化をフェムト秒オーダーの時間分解能でイメージングする新たな手法を開発することに成功した.この手法では,時間の異なる2つの2次元フラグメント運動量分布の共分散を計算することで分子形状の変化を抽出する.本年度は特に,C60の近赤外レーザーパルス誘起コヒーレント振動のイメージングに原理検証として取り組んだ.その結果,C60の偏長・扁平(hg(1))振動による構造の変化を明瞭に運動量分布から抽出することに成功した(論文投稿準備中).現在,開発した手法の鋭敏性と安定性を高めるべく更なるアルゴリズムの改良を行っている.また,より複雑な構造を持つナノ分子のダイナミクス抽出につなげるために,クーロン爆発開始直前におけるC60の電荷分布と生成フラグメントの運動量分布にどの様な相関が見られるかについて解析を進めている.26年度が最終年度であるため、記入しない。26年度が最終年度であるため、記入しない。2.フラーレン超多価カチオンC_<60>^<q+>(q=20-60)における光誘起解離動力学の解明:X線自由電子レーザー(XFEL)をフラーレンC_<60>に照射した際に生成する超多価カチオンC_<60>^<q+>(q=20-60)の解離機構を勲力学的に解明し,ナノ分子多価カチオンの超高速解離反応に対して一般的に適用できるような反応機構を提案した.具体的には,電荷q=20,28,60(閉殻構造)初期余剰振動エネルギーE_<in>=100eVの場合の解離反応についてSCC-DFTB法によるトラジェクトリ計算を実行した.なお,本計算では中性C_<60>の最安定構造からC_<60>^<q+>へと瞬時に垂直イオン化されると仮定した.その結果, qやE_<in>に関係なく爆発的な2段階機構で1ps以内に解離していくことを見いだした.この機構では,多価の原子カチオンC^<z+>(z=2-4)がクーロン反発によって10-20fs程度で放出された後に,解離せずに残っている炭素クラスターからC_n<z+>(n=1, z=1,2)が熱的に脱離する.なお, qが小さくなるにつれて放出される分子カチオンのサイズが大きくなり,中性の原子・分子フラグメントも放出されるようになる.本成果は近日中にJ. Phys. Chem. Lett.に投稿する予定である.本年度は,X線自由電子レーザー(XFEL)の光とナノカーボンの相互作用にも研究対象を広げ,内殻励起によって生成するフラーレン超多価カチオンC60q+ (q = 20-60)の解離機構も解明した.電荷qによらず,正電荷間のクーロン反発によって多価原子カチオンが10-20 fs程度で非統計的に放出されるクーロン爆発が起こり,続いて中性・1価分子フラグメントの統計的脱離が起こるという2段階機構を明らかにした.また,クーロン爆発過程が解離直前の分子構造を鋭敏に反映することを利用してナノ分子の構造変化をフェムト秒オーダーの時間分解能でイメージングする新たな手法を開発することに成功した.この手法では,時間の異なる2つの2次元フラグメント運動量分布の共分散を計算することで分子形状の変化を抽出する.本年度は特に,C60の近赤外レーザーパルス誘起コヒーレント振動のイメージングに原理検証として取り組んだ.その結果,C60の偏長・扁平(hg(1))振動による構造の変化を明瞭に運動量分布から抽出することに成功した(論文投稿準備中).現在,開発した手法の鋭敏性と安定性を高めるべく更なるアルゴリズムの改良を行っている.また,より複雑な構造を持つナノ分子のダイナミクス抽出につなげるために,クーロン爆発開始直前におけるC60の電荷分布と生成フラグメントの運動量分布にどの様な相関が見られるかについて解析を進めている.26年度が最終年度であるため、記入しない。2014年度は,電子励起状態を経由する非断熱SWRを効率良く誘起する近赤外パルスを実時間時間依存DFTB法を用いた動力学計算に基づいて設計する.また, C_<60>^q+超多価カチオンの2段階爆発機構が逐次イオン化によってどの様に変化するかを調べるために,初期余剰運動エネルギーE_<ex>=100-600eVをC_<60>の電荷増加にあわせて段階的に注入した場合のトラジェクトリを計算する.そして,生成する解離種の分岐比や運動エネルギー分布がE_<ex>の増加につれてどの様に変化するかを調べる. q・E_<ex>・イオン化の時間間隔Δt等の条件を変えて複数回の計算し統計的な解析を行う.
地域プラットフォームを基盤とした学習社会の形成策に関する研究

本研究は,地域活性化に向けた関係主体間の学習が自律的に生成される社会を「学習社会」と呼称し,地域づくりのプラットフォームを基盤として学習社会を構築するための方法論について,理論的・実証的に検討する.そして,地域活性化に向けた学習社会の具備すべき社会的・制度的要件を検討し,学習社会の構築に寄与する都市・地域政策の指針や課題を提示する.本研究は,地域活性化に向けた関係主体間の学習が自律的に生成される社会を「学習社会」と呼称し,地域づくりのプラットフォームを基盤として学習社会を構築するための方法論について,理論的・実証的に検討する.そして,地域活性化に向けた学習社会の具備すべき社会的・制度的要件を検討し,学習社会の構築に寄与する都市・地域政策の指針や課題を提示する.
活性炭クロスの表面改質と電極(キャパシタ)への応用

大容量、高出力の電気二重層キャパシタを得るためには、電極としての活性炭クロスが大表面積を持つことが必要である。しかし、活性炭クロスの表面には、官能基が存在し、これらの阻害作用により、容量の低下や内部抵抗の上昇が起こると考えられている。そのためには表面官能基の少ない活性炭クロスが必要である。表面官能基として含酸素表面官能基が報告されており、その評価法として、有機化学的分析法が行なわれきた。しかし、その方法は非常に煩雑なため、精確なキャラクタリゼーションは難しい。GC-MASSは微量の化学種を検出でき、また赤外拡散反射法は表面官能基を直接調べることができるため、表面官能基の同定を行った。表面に塩基性物質を吸着させ、その相互作用から表面の改質についての情報を得ることを試みた。活性炭クロスをつくる出発物質である炭化クロスを賦活処理することによって、表面積の変化や細孔の生成過程を調べた。その結果、約600°Cからそれらが急激に変化することを見い出した。同時に、表面官能基が変化する様子をも調べた。水蒸気による賦活過程では、表面積の変化しない表面化学種の分解過程と、表面積が大きく変化する活性化過程がある事がわかった。表面官能基は塩基性物質を吸着させると、スペクトルにその影響があらわれるが、ボルタンメトリーによる電気容量はあまり変化が認められなかった。活性炭クロスの電極容量は活性化過程で徐々に増加し、分解過程とは対照的なボルタモグラムが得られた。明らかに表面積の変化や細孔分布の変化が大きく電極容量に効くことが推測された。現在は活性化過程と電極容量の関係についてさらに詳しく研究中である。大容量、高出力の電気二重層キャパシタを得るためには電極としての活性炭クロスが、大表面積を持つことが必要である。しかし、活性炭クロスの表面には、官能基が存在し、これらの阻害作用により、容量の低下や内部抵抗の上昇が起こる。TG-MASSは微量の化学種を検出できるため、本研究ではこれを用いて表面官能基についての詳細なキヤラクタリゼーションを行っている。また、赤外拡散反射法は表面官能基を直接調べることができるため、表面に塩基性物質を吸着させ、その相互作用から表面の改質についての情報を得る試みを行っている。活性炭の表面は細孔分布や表面積及び表面官能基によって支配されるため、表面を修飾する方法を見い出し、改質された活性炭クロスのキャパシタの性能を向上させることが不可欠である。活性炭クロスをつくる出発物質である炭化されたクロスを賦活処理することによって表面の変化を追跡した結果、約600°Cで劇的な変化をすることを見い出した。特に、赤外拡散反射法による観察では顕著である。現在はTG-MASSやGC-MASS等を使用して詳しい測定を行っているところである。ボルタンメトリーによると賦活前の電気容量は非常に小さいが、賦活によって増大することがわかった。明らかに表面状態の変化による影響である。表面積の変化や細孔分布の変化ついても研究中である。

しかし、その方法は非常に煩雑なため、精確なキャラクタリゼーションは難しい。GC-MASSは微量の化学種を検出でき、また赤外拡散反射法は表面官能基を直接調べることができるため、表面官能基の同定を行った。表面に塩基性物質を吸着させ、その相互作用から表面の改質についての情報を得ることを試みた。活性炭クロスをつくる出発物質である炭化クロスを賦活処理することによって、表面積の変化や細孔の生成過程を調べた。その結果、約600°Cからそれらが急激に変化することを見い出した。同時に、表面官能基が変化する様子をも調べた。水蒸気による賦活過程では、表面積の変化しない表面化学種の分解過程と、表面積が大きく変化する活性化過程がある事がわかった。表面官能基は塩基性物質を吸着させると、スペクトルにその影響があらわれるが、ボルタンメトリーによる電気容量はあまり変化が認められなかった。活性炭クロスの電極容量は活性化過程で徐々に増加し、分解過程とは対照的なボルタモグラムが得られた。明らかに表面積の変化や細孔分布の変化が大きく電極容量に効くことが推測された。現在は、活性化過程と電極容量の関係についてさらに詳しく研究中である。
ヒドラの散在神経系の神経生物学

ヒドラの散在神経系について、その構造(神経解剖学)・機能(神経生理学、行動生理学)・形成(発生神経生物学)の全ての側面について、また、これらを分子レベルから個体レベルまで、総合的に追究した。その結果、この神経系の興味深い側面が明らかになった。中でも特筆すべき結果は、私達が同定したヒドラの神経分化に関連するペプチド分子が、幹細胞の神経細胞分化の決定(それに続く神経前駆細胞の形成)に効くことが判明したことである。すなわち、幹細胞の最初の運命決定の過程に作用するという非常に興味深い結果である。また、私達が中枢神経系の原型ではないかと仮説しているヒドラの頭部に見られる神経環の機能がひとつ判明した。それは、全ての触手を同調して動かす行動であった。クラゲなどでも神経環は、電気的に結合した巨大軸索的な機能と、化学シナプスによる情報統合の機能の2つが考えられていて、今回の場合は、前者にあたるものであった。さらに、この神経環の電子顕微鏡レベルの観察に成功した。それは、約30本の有芯小胞を沢山含む神経線維の束であった。この神経環内の神経結合(シナプス)の詳細を検討中である。さらに、散在神経系の機能に関連して、組織レベルで散在神経網でも方向性をもった興奮の伝達を見ることができた。更に、ヒドラの散在神経系は、哺乳類などで知られている消化管の消化運動(食道反射、ぜんどう運動、脱糞反射)と同じ運動を示し、腸管神経系と散在神経系の構造的、機能的類似点が明らかになった。また、ヒドラの神経網の化学解剖学を多重染色法なども取り入れながら、詳細な解剖図を作成している。定量的な評価も行い、既に、全神経細胞の3割近くは抗体により可視化できていることも判明、また、散在神経系においても内胚葉と外胚葉の神経網の表現型は著しく異なることも判明した。散在神経系の構造(神経解剖学):私達のヒドラ・ペプチド・プロジェクトの過程で沢山の同属体からなるペプチドファミリーが同定された。このペプチドファミリーの生物学的意義を明らかにするため、それぞれのメンバーに特異的な抗体の作製を行い、RFamideファミリーについては特異抗体の作成に成功し、各メンバーの空間分布は異なることが判明し、ファミリー集団内の詳細な解剖図が作製できた。遺伝子発現との関連を調べると、ペプチドの局在には前駆蛋白質の翻訳後調節の新しい機構が示唆された。更に、GLWamideファミリーについても同様の解析を継続中である。また、中枢神経系の起源と私達が考えるヒドラの神経環について電顕による微細形態の解析を行った。その結果、約30本の神経線維の束からなる神経環が観察できた。この神経環の繊維は沢山の有芯小胞を含んでいて、化学伝達が示唆された。散在神経系の機能(神経生理学、行動生理学):ヒドラの散在神経系は、高等動物では中枢神経系で行われる機能を(ここでは中枢機能と呼ぶ)持つことを私達は実証してきた。後者の機能についての解明が待たれる。

更に、ヒドラの散在神経系は、哺乳類などで知られている消化管の消化運動(食道反射、ぜんどう運動、脱糞反射)と同じ運動を示し、腸管神経系と散在神経系の構造的、機能的類似点が明らかになった。散在神経系の神経伝達物質(分子神経生物学):私達は神経伝達物質の起源はペプチドであると言う仮説を提唱している。それを更に検証するた新しい希少アミンの抗体の作成に取り組み、これに成功した。これを用いてヒドラの神経細胞の染色を試みたが陰性であった。ここで、再び、散在神経系ではアミン類は主要な伝達物質ではないことが支持された。ヒドラの散在神経系について、その構造(神経解剖学)・機能(神経生理学、行動生理学)・形成(発生神経生物学)の全ての側面について、また、これらを分子レベルから個体レベルまで、総合的に追究した。その結果、この神経系の興味深い側面が明らかになった。中でも特筆すべき結果は、私達が同定したヒドラの神経分化に関連するペプチド分子が、幹細胞の神経細胞分化の決定(それに続く神経前駆細胞の形成)に効くことが判明したことである。すなわち、幹細胞の最初の運命決定の過程に作用するという非常に興味深い結果である。また、私達が中枢神経系の原型ではないかと仮説しているヒドラの頭部に見られる神経環の機能がひとつ判明した。それは、全ての触手を同調して動かす行動であった。クラゲなどでも神経環は、電気的に結合した巨大軸索的な機能と、化学シナプスによる情報統合の機能の2つが考えられていて、今回の場合は、前者にあたるものであった。さらに、この神経環の電子顕微鏡レベルの観察に成功した。それは、約30本の有芯小胞を沢山含む神経線維の束であった。この神経環内の神経結合(シナプス)の詳細を検討中である。さらに、散在神経系の機能に関連して、組織レベルで散在神経網でも方向性をもった興奮の伝達を見ることができた。また、ヒドラの神経網の化学解剖学を多重染色法なども取り入れながら、詳細な解剖図を作成している。定量的な評価も行い、既に、全神経細胞の3割近くは抗体により可視化できていることも判明、また、散在神経系においても内胚葉と外胚葉の神経網の表現型は著しく異なることも判明した。
大西洋および日本海深海掘削コアの植物由来有機分子分析による第四紀古植生変動の復元

国際深海掘削計画(IODP)北東大西洋イベリア半島沖(U1385)と日本海北海道南西沖(U1423)で掘削された海底堆積物コアにおいて、陸上植物テルペノイドなどの植物バイオマーカーと花粉の分析を行った。その結果、U1423において過去約430万年間の長期の古植生変動を、U1385では酸素同位体比ステージ(MIS)1210に注目して数百年スケールの短周期の古植生変動を復元した。特に、スギ・ヒノキ科由来やマツ科由来のジテルぺノイド指標による古植生変動が、氷期/間氷期スケールやさらに数百年スケールのグローバルな寒暖の気候変動とよく同調することがわかり、新たな古植生指標として高い適用性を提示した。本研究は、国際深海掘削計画(IODP)地中海流出水航海(339次航海)とアジアモンスーン航海(346次航海)で、それぞれ北東大西洋イベリア半島沖(Shackleton site; U1385)と日本海北海道沖(U1422、U1423)で掘削された第四紀海底堆積物コアを対象に、高等植物由来テルペノイドなどの植物バイオマーカーと花粉の分析を行い、それらの結果を直接比較して、花粉-植物バイオマーカー植生解析データの対応関係モデルを体系的に構築し、植物バイオマーカーおよび花粉分析により、北東大西洋(西ヨーロッパ)と北西太平洋(極東アジア)の過去約150万年間の古植生・陸域古環境の年代変動を復元するものである。平成26年度におけるおもな研究成果は次のとおりである。1.日本海北海道沖掘削コア(U1423)から植物ワックス成分である長鎖n-アルカン、脂肪酸などを検出した。さらに高等植物テルぺノイド(HPT)として、カダレン、レテンなど続成作用をうけた炭化水素や、生体成分であるデヒドロアビエタン酸やフリーデリン、β-アミリンなど様々なタイプのバイオマーカーが検出されることを確認した。また、未知のジテルペノイドの同定を試みた。2.U1423コアにおける長鎖n-アルカンの平均鎖長比(ACL)の結果は、年代によって多様であることがわかった。これは異なる後背地や後背地の植生の年代変動を示していると考えられる。特に、約370万年前に顕著な変化が見られた。この年代にはn-アルカン全体の堆積フラックスも増加しており、急激な植生および気候の変化が推察される。3. U1423コアの花粉分析をほとんどすべての層準で行い、おおまかな古植生変動を復元した。花粉データの確認を進めている段階である。本研究は、国際深海掘削計画(IODP)イベリアマージン航海(339次航海)と日本海航海(346次航海)で、それぞれ北東大西洋イベリア半島沖(Shackleton site; U1385)と日本海北海道沖(U1422、U1423)で掘削された第四紀海底堆積物コアにおいて、陸上植物由来テルペノイドなどの植物バイオマーカーと花粉の分析を行い、それらの結果を直接比較して、花粉-植物バイオマーカー植生解析データの対応関係モデルを体系的に構築し、植物バイオマーカーおよび花粉分析により、北東大西洋(西ヨーロッパ)と北西太平洋(極東アジア)の過去約150万年間の古植生・陸域古環境の年代変動を復元するものである。平成27年度におけるおもな研究成果は次のとおりである。1.日本海掘削コアU1423(北海道奥尻沖)のほぼ全試料において、陸上植物バイオマーカー分析と花粉分析を一通り終了した。花粉による過去500万年間の約5万年の解像度の古植生変動を復元した。2.スギ・ヒノキ由来のテルペノイド(スギオールなど)について、既知標準物質を使用して、それらの同定・定量分析を確立した。また、その派生物も同定を試みた。これにより、日本近海の海底堆積物のバイオマーカー分析によるスギ・ヒノキ科植生の解析が可能になった。3.U1423コアにおいて、植物ワックスバイオマーカーの濃度と組成比の過去500万年間の年代変動を復元した。植物ワックス濃度の変動は、総有機炭素量(TOC)や全花粉量の変動とよく同調することがわかった。植物ワックスの堆積フラックスがTOC、花粉の堆積フラックスと同じ傾向を示すのか、日本海底層水の酸化還元条件に影響を受けた有機物の保存状態を反映しているのか、検討している段階である。日本海掘削コアU1423 (北海道奥尻沖)の植物バイオマーカー分析と、共同研究者である五十嵐博士の花粉分析が予想以上に早いペースでほぼ完遂した。深海堆積物中の多くの陸上植物由来バイオマーカー分子の中でも、スギ、ヒノキ由来のテルペノイドが多様に含まれていることが確認され、スギ・ヒノキ科植生の変動の復元に期待ができる。平成26年度に本科研費で購入したガスクロマトグラフ質量分析計(GC-MS)によって、分析ペースが上がったことが予想以上の進展の要因だと思われる。日本海掘削コアU1422 (北海道留萌沖)も花粉分析については開始していて、ペースが早い。ただし、北東大西洋イベリア半島沖(Shackleton site)の掘削コアの分析がやや遅れ気味である。7月末に名古屋で行われた国際第四紀学会(INQUA)において、研究協力者であるボルドー大学Sanchez Goni教授の研究グループと当グループにおいてShackleton siteの研究成果・情報の交換を行った。

本研究は、国際深海掘削計画(IODP)イベリアマージン航海(339次航海)と日本海航海(346次航海)で、それぞれ北東大西洋イベリア半島沖(Shackleton site; U1385)と日本海北海道奥尻沖(U1423)で掘削された第四紀海底堆積物コアにおいて、陸上植物テルペノイドなどの植物バイオマーカーと花粉の分析を行い、それらの結果を直接比較して、花粉-植物バイオマーカー植生解析データの対応関係モデルを体系的に構築し、植物バイオマーカーおよび花粉分析により、北東大西洋(西ヨーロッパ)と北西太平洋(極東アジア)の過去約150万年間の古植生・陸域古環境の年代変動を復元するものである。平成28年度におけるおもな研究成果は次のとおりである。1.日本海掘削コアU1423のほぼ全試料において、陸上植物バイオマーカー分析と花粉分析を行った。花粉による過去500万年間の約5万年の解像度の古植生変動を復元した。2.スギ・ヒノキ由来のテルペノイド(スギオールなど)の同定・定量分析を確立した。これにより、日本近海の海底堆積物のバイオマーカー分析によるスギ・ヒノキ科植生の解析が可能になった。3.U1423における植物ワックスバイオマーカーの濃度・組成比の過去500万年間の年代変動を復元した。植物ワックス濃度の変動は、総有機炭素量(TOC)や全花粉量の変動とよく同調し、陸源有機物の輸送・堆積量の変動を示していると推察した。4.イベリア半島沖掘削コアU1385のMIS1211の試料を重点的に分析し、特に被子植物テルペノイドであるルペオール、β-アミリンに注目した。ルペオール/β-アミリン比は氷期/間氷期の温度変動に同調して変動することがわかった。ルペオールが比較的寒冷種であるキク科・イネ科植物に由来し、寒冷のシグナルを示すためと考えられる。これを新たな古気候解析指標として提示した。国際深海掘削計画(IODP)北東大西洋イベリア半島沖(U1385)と日本海北海道南西沖(U1423)で掘削された海底堆積物コアにおいて、陸上植物テルペノイドなどの植物バイオマーカーと花粉の分析を行った。その結果、U1423において過去約430万年間の長期の古植生変動を、U1385では酸素同位体比ステージ(MIS)1210に注目して数百年スケールの短周期の古植生変動を復元した。特に、スギ・ヒノキ科由来やマツ科由来のジテルぺノイド指標による古植生変動が、氷期/間氷期スケールやさらに数百年スケールのグローバルな寒暖の気候変動とよく同調することがわかり、新たな古植生指標として高い適用性を提示した。日本海北海道沖掘削コア(U1423)の植物バイオマーカー分析が予定どおり進んでいて、かつ共同研究者である五十嵐博士の花粉分析が予想以上に早いペースで結果が得られている。深海堆積物であるが陸源の植物バイオマーカー成分が多様に含まれていることが確認され、今後の古植生変動の解析に期待ができる。平成26年度に本科研費で最新のガスクロマトグラフ質量分析計(GC-MS)を購入し、分析ペースがさらに上がると期待できる。北東大西洋イベリア半島沖(Shackleton site)の掘削コアの分析がやや遅れ気味である。今年度(最終年度)は、日本海掘削コアU1422 (北海道留萌沖)とイベリア沖Shackleton site試料の植物テルペノイドバイオマーカー分析と花粉分析を行う。
アミロイド可溶化を指向するリポソーム膜上ペプチド断片提示技術の研究

リン脂質ニ分子膜からなる閉鎖系小胞であるリポソームを生体膜モデルとして用い,リボソーム膜上におけるAβ/ Cu錯体の結晶形態(多形)と触媒機能を体系的に解析した.リポソーム膜の酸化損傷状態がアミロイドの形態に顕著な影響を与えると共に,酸化反応の触媒活性の制御にも関与している事が明らかになった.ペプチド断片をリポソーム膜上に提示した触媒材料(LIPOzymeと定義)を比較系とした実験により, Aβ/ Cu錯体の触媒活性の制御機構を明らかにした.このような機能を透析モジュールと組み合わせる新規なリポソーム充填法を開発し,生体膜異常化の診断/正常化を制御するシステムの開発が原理的に可能である事が示された.リン脂質ニ分子膜からなる閉鎖系小胞であるリポソームを生体膜モデルとして用い,リボソーム膜上におけるAβ/ Cu錯体の結晶形態(多形)と触媒機能を体系的に解析した.リポソーム膜の酸化損傷状態がアミロイドの形態に顕著な影響を与えると共に,酸化反応の触媒活性の制御にも関与している事が明らかになった.ペプチド断片をリポソーム膜上に提示した触媒材料(LIPOzymeと定義)を比較系とした実験により, Aβ/ Cu錯体の触媒活性の制御機構を明らかにした.このような機能を透析モジュールと組み合わせる新規なリポソーム充填法を開発し,生体膜異常化の診断/正常化を制御するシステムの開発が原理的に可能である事が示された.ドーパミンはアミロイド分解を担う鍵物質である.本研究課題では,ドーパミンを利用しつつ,細胞表層のストレス状態に応じて,ドーパミン変換/アミロイド形成を制御する生体内反応システムを理解し,アルツハイマー病のもう1つの側面を明らかにする事を目的とする.アミロイド分解を目的として,ドーパミン代謝経路に必須な変換システムをリボソーム膜上に構築するための設計戦略を展開した.研究を効率よく遂行するため,以下の課題に分類した.A班:断片提示されたAβの多機能性の検討,B班:APPを出発物質とするLIPOzyme設計,C班:ADにおける生体膜異常化の診断/正常化プロセスの検討A班では,まず反応機構の解析を行った.リボソーム膜上におけるAβ/Cu錯体の反応機構を検討し,プロトン移動に伴う電子移動,膜界面の水和状態が鍵であることを見出した.次に,結晶多形性を体系的に解析した.電子顕微鏡や全反射顕微鏡を用いて,異常生体膜上におけるアミロイド線維,スフェルライト,アモルファスを形成する条件を整理・検討した.B班では,ドーパミン代謝系酵素の表面特性解析を進めた.水性二相分配法(表面/局所的疎水性),固定化リポソームクロマトグラフィー(局所的疎水性),固定化リポソーム水晶振動子法(IL-QCM)(分子内水素結合安定性)による表面特性解析を行う.ストレス条件下における構造活性相関を検討する.C班では,B班支援のためのIL-QCMの開発,および,メンブレンチップのプロトタイプを作成し,メンブレノーム情報の基盤を構築した.翌年度のB班の網羅的解析に協力する体制を整備した.ドーパミンはアミゴイド分解を担う鍵物質である.ドーパミンを利用しつつ,細胞表層のストレス状態に応じて,ドーパミン変換/アミロイド形成を制御する生体内反応システムを理解し,アルツハイマー病の疾病機構を明らかにする.その一つとして,アルツハイマー病原因タンパク質Aβからなるアミロイドの分解を指向し,ドーパミン代謝経路に必須な変換システムをリボソーム膜上に構築するための設計戦略を展開する。そのため以下の3段階に分けて検討を進める【第I段階】ドーパミン酸化反応の活性中心(Aβ/Cu錯体)のリボソーム膜上への断片提示(初年度)【第II段階】Aβ前駆体タンパク質(APP)を出発物質としたAβ候補ペプチド(断片)の選定(2年目)・メンブレンチップシステムによる提示ペプチド(断片)に必須な要素の絞り込み・チロシン→ドーパミン→ノルアドレナリンの反応系の評価【第III段階】LIPOzymeモジュール設計とアミロイド分解への応用(3年目)2年目である本年度は第II段階の研究に着手した.初年度において,Aβ/Cuのリボソーム膜上への提示技術を確立したので,そのLIPOzyme機能を利用してドーパミン酸化特性を検討した(A,B班).その結果,アミロイド分解に有効な酸化誘導体を生成することが示唆された.チロシンではアミロイド形成は阻害されないが,ドーパミンやノルアドレナリンは阻害効果を有することが分かった.したがって,チロシン→ドーパミンへの変換反応が促進される必要があること示唆された.また,メンブレンチップシステムを用いて,中性脂質に酸化脂質を混合したリボソームはペプチド断片の提示に有効であることを見出した(C班)ドーパミンはアミロイド分解を担う鍵物質である.ドーパミンを利用しつつ,細胞表層のストレス状態に応じて,ドーパミン変換/アミロイド形成を制御する生体内反応システムを理解し,アルツハイマー病のもう一つの側面であるアミロイド分解過程を明らかにする事を目的とする.アミロイド分解のため,ドーパミン代謝経路に必須な変換システムをリポソーム膜上に構築するための設計戦略を展開する.最終年度では,以下の通りに検討を進めた.A班については,ドーパミン代謝系酵素のLIPOzymeを用いて,アミロイドの可溶化に成功した.また,LIPOzymeによるアミロイドの多形形成に関する理解も進み,アミロイド可溶化との関連性が示唆された.

B班については,このLIPOzymeの錯体分子化学的な検討も進める事ができ,アミロイド分解の分子論的理解が進んださらに,A班の研究成果に基づき,脂質組成の選択の指針が得られた.C班については,単純な脂質組成のリポソームを用いたモジュール設計法を確立し,それに立脚して,アミロイド可溶化に必要なモジュール様環境の構築が可能である事が示された.以上を総括して,アミロイド分解を目的として,ドーパミン代謝経路に必須な変換システムをリポソーム膜上に構築するための指針を得る事ができた.
Astro-E2衛星硬X線検出器によるガンマ線バーストのMeVガンマ線放射の研究

すざく衛星(Astro-E2)は2005年7月の打ち上げ以来、現在まで順調な運用をつづけている。本研究で使用した搭載検出器である硬X線検出器広帯域全天モニタ(Suzaku-WAM)も我々開発チームのメンテナンスもあり、大きな問題なく順調に動作し続けており、すでに年間100個以上、計200個以上のガンマ線バースト(GRB)を検出してきた。これは打ち上げ当初に予想されたものと同程度であり(現在活躍中の検出器としても最大規模である)、当初の予想通りの性能がでていることが実証された。Swift衛星搭載BAT検出器などで位置がわかったものについては、エネルギースペクトルの解析を行い、GCNと呼ばれる速報を世界に向けて発信した。これまで35個のGCNを発信しており、その存在を世界の中で確固たるものとした。中にはMeV領域に輻射をもつものもGRBO70125,GRBO60429などあり、放射エネルギーのピークが1MeVも超えるものもでてきた。これらはBATSEなど過去の衛星との結果と比較する上で非常に興味深い。これらWAMに関する現状の報告は、5つの国際会議で発表された。WAMは周囲を衛星上の機器に覆われており、入射ガンマ線が吸収や散乱の影響を受けてしまう。そのため、エネルギー応答関数の構築が極めて困難である。我々は衛星上を精密に模擬して、モンテカルロシミュレーションを行い、応答関数を構築し、地上実験である特定の方向について実証してきた。さまざまな方向についての検証は、GRBを使って機上で行う必要がある。本年度は新たに国際協力としてSwift衛星BAT検出器チーム、Wind衛星搭載Konus検出器チームとの共同のもと、同時に検出されたGRBを用いて、相互較正を行うこととした。そのための最初の打ち合わせをNASA Goddard SpaceFlight Centerで行った。その後、23個のGRBのデータを交換し、現在の応答関数がほとんどの方向でフラックスについて20-30%程度で測定できていることがわかった。これは十分な精度といえる。これらの結果を用いて、短い継続時間をもつGRBの特性について調査した論文を投稿し、受理されている(Ohno et al. PASJ 2007)。現在はさらに精度を上げるべく機上較正を行っている。さらに、複数衛星を用いてその到来時間の時間差を用いて位置決めを行う惑星間GRBネットワークにより、6個のGRBの位置決めを1日後程度で速報してきた。中でもGRBO70125はX線や可視光での対応天体が発見され、赤方偏移が決まるなど大きな成果をあげている。現在、論文にまとめているところである。今年度はX線天文衛星Astro-E2の打ち上げ前動作試験に参加し、検出器に異常がないか万全のチェックを行った。その後、Astro-E2は2005年7月に鹿児島内之浦から無事打ちあげられ、「すざく」と命名された。「すざく」に搭載された硬X線検出器、および本研究で用いられるそのシールド部の初期運用を行った後、これまで大きな問題もなく順調に動作している。シールド部は50-5000keVの広帯域X線ガンマ線に感度をもつ全天監視装置(Wide-band All-Sky Monitor : WAM)となり、ガンマ線バースト(GRB)を検出することが期待されていたが、2005年8月22日より本格的運用を開始し、2006年2月までに62個のGRBの検出に成功した。これは実に年間120個以上のペースであり、現在活躍中のGRB検出器では最大級である。GRB051008などいくつかのGRBでMeVを超えるエネルギーをもつガンマ線を有意に検出している。同時に、WAMの性能を最大限ひきだすため機上較正を行ってきた。Swift衛星搭載BAT検出器と同時に検出されたGRBを用いて、様々な入射方向について調査し、20%以内の不定性でフラックスを決定できることが分かった。これら較正に基づいてエネルギースペクトル解析を行い、Swift/BATと組み合わせることでGRBに特有なエネルギーピークを数10keVから1MeVまで測定できる可能性を示した。今後、BATチームの協力も仰ぎつつGRB放射の研究を推し進める。さらにGRB惑星間ネットワーク(IPN)に参加し、複数衛星の到来時間の遅延を用いたGRBの高精度位置決めを行う体制を整えた。GRB060213では、約1日後に数10分角で位置決めに成功し、可視光対応天体の発見をもたらした。今後もGRBの起源を解明すべく、国際協力のもと位置決め速報を世界に発信してゆく。

これまで35個のGCNを発信しており、その存在を世界の中で確固たるものとした。中にはMeV領域に輻射をもつものもGRBO70125,GRBO60429などあり、放射エネルギーのピークが1MeVも超えるものもでてきた。これらはBATSEなど過去の衛星との結果と比較する上で非常に興味深い。これらWAMに関する現状の報告は、5つの国際会議で発表された。WAMは周囲を衛星上の機器に覆われており、入射ガンマ線が吸収や散乱の影響を受けてしまう。そのため、エネルギー応答関数の構築が極めて困難である。我々は衛星上を精密に模擬して、モンテカルロシミュレーションを行い、応答関数を構築し、地上実験である特定の方向について実証してきた。さまざまな方向についての検証は、GRBを使って機上で行う必要がある。本年度は新たに国際協力としてSwift衛星BAT検出器チーム、Wind衛星搭載Konus検出器チームとの共同のもと、同時に検出されたGRBを用いて、相互較正を行うこととした。そのための最初の打ち合わせをNASA Goddard SpaceFlight Centerで行った。その後、23個のGRBのデータを交換し、現在の応答関数がほとんどの方向でフラックスについて20-30%程度で測定できていることがわかった。これは十分な精度といえる。これらの結果を用いて、短い継続時間をもつGRBの特性について調査した論文を投稿し、受理されている(Ohno et al. PASJ 2007)。現在はさらに精度を上げるべく機上較正を行っている。さらに、複数衛星を用いてその到来時間の時間差を用いて位置決めを行う惑星間GRBネットワークにより、6個のGRBの位置決めを1日後程度で速報してきた。中でもGRBO70125はX線や可視光での対応天体が発見され、赤方偏移が決まるなど大きな成果をあげている。現在、論文にまとめているところである。
亜急性硬化性全脳炎(SSPE)の病態についての研究

麻疹ウイルスM蛋白遺伝子のAが選択的にGに変異(biased hypermutation)しSSPEウイルスが生じる。神経細胞で活性が高いunwindase蛋白(二本鎖RNAを解きほぐす)がこの変異に関与する。麻疹ウイルスがSSPEウイルスになるにはM蛋白遺伝子のAが、最低何個Gに変異する必要があるのか、その数が問題なのか、変異するアミノ酸が問題なのか、部位が問題なのか、不明である。この点を解明するため、通常の潜伏期間(78年)で発症した症例1と、短い潜伏期間(3年)で発症した症例2と症例3を対象とし、hypermutationの詳細を検討するために、経時的保存髄液中のM蛋白遺伝子増幅法を開発した。一定のprimerを用い、RT-PCRおよびnested PCRを行うことにより、10年前の保存髄液からも安定してPCR産物を得ることができた。しかし、オートシークエンサ-で求めた、塩基配列は、種々の塩基が混在するパターンで、特定のピークを識別することができなかった。PCR産物をゲルから切り出し生成しても、あるいは精製キットを使用しても同様で、sequence primerを変更しても改善を得ることができなかった。原因として、髄液中に存在するSSPE virusは、異なるhypermutationを持つ幾つものクローンからなっている可能性が考えられる。本研究は重要な内容を含んでおり、引き続き研究を継続する予定である。なを、学童期にSSPEの鑑別疾患となる若年型Alexander病を疑われる症例を経験し、遺伝子診断を行い、SSPEではなくAlexander病であると確定診断した。これまでにない遺伝子変異の発見であり、結果は論文として発表した。Mタンパク遺伝子を検索するための予備実験として、SSPEウイルスでも麻疹ウイルスでも遺伝子配列が同様で、変異が少ないH蛋白遺伝子をターゲットにし、保存髄液中でもH蛋白遺伝子が確認できるかどうかを検討した。-80度に長期保存されたSSPE患者の髄液1mlをon iceで解凍し、即座に遠心した。上澄みを吸い取り、残100μlとし、RNA精製キット(QIAGEN、RNeasy Mini)を用いRNAを分離した。最終的に容量が30μlとなるようにし、その内5μlをone step RT-PCRキット(QIAGEN、OneStep RT-PCR Kit)の基質とした。麻疹ウイルスの遺伝子配列81068701間が増幅されるように、長さ20merのprimerで挟みone step RT-PCRを施行した。この段階でPCR産物を確認できなかったため、さらに遺伝子配列81068482間をnested PCR法で増幅した。その結果、PCR産物を確認する事ができた。種々の保存検体で検討し、5年前の保存髄液を検体としても、以上の方法にてSSPEウイルスを検索する事が可能である事が分かった。今後、Mタンパクをターゲットにし、治療経過に伴う保存髄液中SSPEウイルスMタンパクのhypermutationの変化について検索を進める予定である。H12年度は予備実験として、nested PCRを用いたRT-PCR法で5年前の保存髄液からもSSPEウイルスH蛋白遺伝子の存在を確認することができた。本年度は麻疹ウイルスとSSPEウイルスの違いを作り出す、M蛋白遺伝子について検索した。SSPEウイルスのM蛋白遺伝子は変異が多いため、primerを幾つか合成し、RT-PCR法を行った。その結果、(1)保存髄液からのRNA抽出法を工夫する、(2)RT-PCR法とそれに引き続くnested PCR法のprimerを種々に調整する、(3)PCRの条件を多様に設定してみる、などにより10年前の保存髄液からも安定して、M蛋白遺伝子を増幅するごとができるようになった。これまで、SSPEの診断に、SSPE遺伝子が髄液中に存在することを示すことは容易ではなかったので、今回のM蛋白遺伝子増幅法はSSPEの診断にも利用できるものと考えられる。

本研究の目的である、M蛋白遺伝子の経時的変化様式を明らかにするために、増幅されたPCR産物の塩基配列決定を試みた。しかし、シークエンスデータがオーバーラップした不明瞭な結果しか得ることができなかった。変異の程度が種々の段階にあるM蛋白遺伝子が多数存在するためなのか、それとも、PCR反応レベルで不均一な産物となっているのか、あるいはシークエンス反応に問題があるのか、原因を現在検索している。PCR primerやシークエンスprimerを種々に設定し、シークエンス反応を繰り返す予定にしている。次年度は、最終年度になるので、このシークエンスの問題を解決し、目的とするM蛋白遺伝子の経時的変化について結論を出す予定である。過去2年間の研究から、亜急性硬化性全脳炎(SSPE)患者から採取した長期保存髄液(最長10年)を使用し、RT-PCR法により、SSPE virusの存在を確認する方法を確立することができた。今年度は最終目的である、SSPE virusで選択的遺伝子変異(biased hypermutation)がもっとも起こりやすいとされる、M蛋白領域の遺伝子を増幅し、その塩基配列を求めた。しかし、オートシークエンサーで求めた、塩基配列は、種々の塩基が混在するパターンで、特定のピークを識別することができなかった。PCR産物をゲルから切り出し生成しても、あるいは精製キットを使用しても同様で、sequence primerを変更しても改善を得ることができなかった。原因として、保存髄液中でSSPE virusに不規則な変位が生じてしまっている事などが考えられた。残念ながら、研究期間中に結論を出すことができず、論文発表には至らなかった。しかし、本研究は重要な内容を含んでおり、引き続き研究を継続する予定である。なお、学童期にSSPEの鑑別疾患となる若年型Alexander病を疑われる症例を経験し、遺伝子診断を行い、SSPEではなくAlexander病であると確定診断した。これまでにない遺伝子変異の発見であり、結果は論文として発表した。