hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
Vβを認識する抗T細胞レセプター抗体を用いたTリンパ腫の治療に関する研究

C57BL/6マウスのHー2^b restricted,HーY specificなcytotoxic Tcell(CTL)はTcR β鎖V portionの8番目の遺伝子(Vβ_8)を高頻度で使用していることが知られている.そこでVβ_8を用いているCTLクローンを作製すべく,まず雄C57BL/6マウスの脾細胞を雌C57BL/6マウスに免疫し,雄C57BL/6と反応性を示すCTLクローンOIー6を作製した.次にOIー6に対する抗clonotype抗体を作製する為にSJLマウスをOIー6で免疫し, OIー6と反応性を有する単クローン性抗体MR5ー2を作製した. MR5ー2のアイソタイプはγ2aである.(1)雄C57BL/6由来の細胞とOIー6との反応性をMR5ー2は特異的に阻害する事(2)MR5ー2と対応する抗原は,分子量が各々43KDのヘテロダイマーである事等より, MR5ー2はVβ_8を認識する抗TcR抗体である事が明らかになった.この抗体は正常マウスT細胞の十数%と反応する.よって担癌マウスにMR5ー2を投与した場合に,担癌個体の免疫系が変化する可能性が考えられた.そこで(C57BL/6×B10,BR)F_1マウスに1mgのMR5ー2を連日7日間投与し,生体に及ぼす抗体の影響を,マイトジェンに対する反応性や抗原刺激に対する応答性の面から検討した.その結果Vβ_8を認識する抗体を投与しても,生体の免疫系は変調を来さないと推定された.更に, MR5ー2と反応するTリンパ腫の樹立を試みる目的でOIー6とAKR由来のTリンパ腫BW5147とを細胞融合させて, MR5ー2と反応性を示すT細胞ハイブリドーマKD11を作製した.次に担癌マウスにおいてMR5ー2の抗腫瘍効果を検討した. 5×10^6個のKD11を, 500RAD放射線照射した雌の(C57BL/6×B10,BR)F_1マウスにivし, 2時間後に1mgのMR5ー2をivした.更に24時間おきに同量のMR5ー2を計7回ivし, MR5ー2抗体の担癌マウスのlife spanに及ぼす効果を判定した. MR5ー2の投与を受けないマウス群は, KD11注射後25日以内にすべてのマウスが死亡した.しかし同じKD11をivされてMR5ー2で治療を受けた群でも腫瘍注射後の平均寿命は有意に延長せず, KD11注射後25日ですべてのマウスが死亡した.C57BL/6マウスのHー2^b restricted,HーY specificなcytotoxic Tcell(CTL)はTcR β鎖V portionの8番目の遺伝子(Vβ_8)を高頻度で使用していることが知られている.そこでVβ_8を用いているCTLクローンを作製すべく,まず雄C57BL/6マウスの脾細胞を雌C57BL/6マウスに免疫し,雄C57BL/6と反応性を示すCTLクローンOIー6を作製した.次にOIー6に対する抗clonotype抗体を作製する為にSJLマウスをOIー6で免疫し, OIー6と反応性を有する単クローン性抗体MR5ー2を作製した. MR5ー2のアイソタイプはγ2aである.(1)雄C57BL/6由来の細胞とOIー6との反応性をMR5ー2は特異的に阻害する事(2)MR5ー2と対応する抗原は,分子量が各々43KDのヘテロダイマーである事等より, MR5ー2はVβ_8を認識する抗TcR抗体である事が明らかになった.この抗体は正常マウスT細胞の十数%と反応する.よって担癌マウスにMR5ー2を投与した場合に,担癌個体の免疫系が変化する可能性が考えられた.そこで(C57BL/6×B10,BR)F_1マウスに1mgのMR5ー2を連日7日間投与し,生体に及ぼす抗体の影響を,マイトジェンに対する反応性や抗原刺激に対する応答性の面から検討した.その結果Vβ_8を認識する抗体を投与しても,生体の免疫系は変調を来さないと推定された.更に, MR5ー2と反応するTリンパ腫の樹立を試みる目的でOIー6とAKR由来のTリンパ腫BW5147とを細胞融合させて, MR5ー2と反応性を示すT細胞ハイブリドーマKD11を作製した.次に担癌マウスにおいてMR5ー2の抗腫瘍効果を検討した. 5×10^6個のKD11を, 500RAD放射線照射した雌の(C57BL/6×B10,BR)F_1マウスにivし, 2時間後に1mgのMR5ー2をivした.更に24時間おきに同量のMR5ー2を計7回ivし, MR5ー2抗体の担癌マウスのlife spanに及ぼす効果を判定した. MR5ー2の投与を受けないマウス群は, KD11注射後25日以内にすべてのマウスが死亡した.しかし同じKD11をivされてMR5ー2で治療を受けた群でも腫瘍注射後の平均寿命は有意に延長せず, KD11注射後25日ですべてのマウスが死亡した.
感染細胞内でそのアンチセンス機能を発揮するオリゴヌクレオチドの構築と感染制御

本研究では全く新しい考え方のアンチセンスオリゴマー、即ち、アンチセンスオリゴマーがウイルス感染細胞質または核内で、はじめてその機能を発揮できるような非常にユニークなオリゴマーを考案した。その構造はアンチセンスDNAとセンスRNAが二重鎖を形成し、両DNA-RNAをヘアピン型で結合した環状ダンベルRNA/DNAオリゴマーである。そこで、この環状ダンベルRNA/DNAオリゴマーの構築とその抗ウイルス活性、さらにはその作用機序を明らかにすることを目的とする。はじめに、10%serum中での安定性を調べたところCDRDは天然型DNAオリゴマーより安定性が高いことから、実際に細胞系に用いられることが明らかとなった。実際にここで提案したダンベルRNA/DNAキメラオリゴマーが予想通り細胞内のRNaseH活性によりRNA/DNA二重鎖のセンスRNAが分解された後、アンチセンスDNAが遊離して標識となるmRNAへ結合するかどうかをin vitro中で検討した。CDRDは一旦センスRNAが切断された後に、アンチDNAが標的となるmRNAに結合してから再びRnaseH活性を受け、mRNAが切断されていることから我々が提案したダンベルRNA/DNAキメラオリゴマーが予想通りの反応機構で進行することを明らかにした。最後にHIV-1の構造タンパク質であるgag遺伝子の翻訳開始コドンAUGを標的にした環境ダンベルDNA/RNAキメラオリゴヌクレオチド(CDNRDON-gag-AUG)をHTLV-IIIBで感染させたヒト末梢血リンパ球細胞(PBMCs)に加えて2日間インキュベートした後、p24抗原量を測定したところ、CDNRDON-gag-AUGは10μgで80%p24産生を抑制し、配列特異的に坑HIV-1活性を持つアンチセンス核酸であることがわかった。臨床実験で使用されているホスホロチオエ-トオリゴマーは本来のアンチセンス機構とは異なる作用をすることが明らかとなり、本研究ではこの問題点を解決すべく新しい概念、すなわちウイルスが感染した細胞内でその機能をはじめて発揮するオリゴヌクレオチドを考案した。このオリゴマーはダンベル型DNA/RNAキメラオリゴマーでRNaseH酵素により、RNA分子が切断された後に、遊離DNAアンチセンスオリゴマーが標的となるウイルスmRNAに結合してウイルスタンパク質の合成を阻害する。はじめに環状ダンベルDNA/RNAキメラオリゴマーの構築を試みた。標的遺伝子をウイルスmRNAのタンパク質合成翻訳部位AUGを含み、これに相補的なアンチセンスDNAとセンスRNAを含むニックダンベルDNA/RNAキメラオリゴマーを自動合成機を用いて容易に化学合成することができた。このニックオリゴマーをT4DNAリガーゼでライゲーションを試みたがニック部位の塩基配列によりそのライゲーションの効率に影響することがわかった。ここで得られたオリゴマーが細胞外で二重鎖部分が開裂し、オープンサークルとなれば分解酵素で分解されたり、細胞膜透過性が低下することから、二重鎖の安定性を検討したところ、二重鎖のみのDNA/RNA、ニックオリゴマーよりも高い融解温度、またゲル電気泳動でも安定な構造を形成していることがわかった。さらに、3′-エキソヌクレアーゼ(スネ-クベノムホスホジエステラーゼ)と10%牛血清中での耐分解酵素性を検討したところ、期待通り他のオリゴマーよりも安定であることが明らかとなり、新しいタイプのアンチセンスオリゴマーとなりうることがわかった。臨床実験で使用されているホスホロチオエートオリゴマーは本来のアンチセンス機構とは異なる作用をすることが明らかとなり、本研究ではこの問題点を解決すべく新しい概念、すなわちウイルスが感染した細胞内でその機能をはじめて発揮するオリゴヌクレオチドを考案した。

このオリゴマーはダンベル型DNA/RNAキメラオリゴマーでRNase H酵素により、RNA分子が切断された後に、遊離DNAアンチセンスオリゴマーが標的となるウィルスmRNAに結合してウイルスタンパク質の合成を阻害する。前年度までに環状ダンベルRNA/DNAキメラオリゴマーが期待通りの作用機序、すなわち細胞内でRNase HによりRNA側が切断され、アンチセンスDNAが産生し、標的となるmRNAへと結合することが明らかにされた。本年度はダンベル型オリゴマーのループ部位をエトキシアルキル基に変換することでより分解耐性を高めることができた。また、当オリゴマーは一本鎖のアンチセンスオリゴマーより高い細胞導入機能を有することがわかった。現在、これらのオリゴマーを用いてヒトTリンパ球細胞系で抗HIV活性を評価中である。臨床実験で使用されているホスホロチオエートオリゴマーは本来のアンチセンス機構とは異なる作用をすることが明らかとなり、本研究ではこの問題点を解決すべく新しい概念、すなわちウイルスが感染した細胞内でその機能をはじめて発揮するオリゴヌクレオチドを考案した。このオリゴマーはダンベル型DNA/RNAキメラオリゴマーでRNase H酵素により、RNA分子が切断された後に、遊離DNAアンチセンスオリゴマーが標的となるウイルスmRNAに結合してウイルスタンパク質の合成を阻害する。最終年度はHIV-1のgag遺伝子のAUG翻訳開始部位を含むmRNAを標的として環状ダンベルRNA/DNA(CORDON-gag)を培養細胞系での評価と細胞内挙動を観察した。はじめに、抗HIV剤として重要な細胞内挙動について蛍光ラベルしたFITC-CORDON-gagを用いレザー顕微鏡で観察したところ、一本鎖アンチセンスDNA(S-ODN-gag-AUG)よりも細胞質と核内に強く蛍光が発光していた。また、細胞をヒト末梢血リンパ球(PBMCs)を用い、ウイルスをHTLV-IIIB(MOI.0.1)で感染した細胞を用いてオリゴマーを評価したところ、配列特異的に抗HIV活性を示すことが分かった。また、10μg濃度で70%と高い抗HIV活性を示した。一方、従来汎用されていた一本鎖アンチセンスDNA(S-ODN-gag-AUG)は約10%と低い抗HIV-1活性を示した。これはS-ODN-gagは細胞膜透過性が低いため、標的となる細胞内の遺伝子に到達できないためにこのような結果となったものと考えられる。以上、我々が提案した環状ダンベルDNA/RNAオリゴマーは従来のアンチセンスDNAに代る新しいアンチセンス核酸としてウイルス病の治療に応用が期待される。
顎関節内障病態における関節滑膜細胞の遺伝子発現の変化についての細胞生物学的研究

当教室の外来を訪れた顎関節症患者の内、顎関節手術の対象となった重度症例(顎関節授動術4例、顎関節円板切除術4例、顎関節鏡視下剥離受動術3例)の顎関節滑膜の一部を無菌的に切除し培養を試みた。今日までヒト顎関節滑膜細胞の培養に関する報告は皆無であり、まずその培養条件を確立することを第一目標とした。顎関節から採取できうる滑膜の絶対量は、ひざの滑膜に比較して著しく少量で、そのため膝関節滑膜培養法に準じて滑膜細胞以外の組織を物理的または化学的に除去した場合、ほとんどの症例でわずかの細胞しか残存していない。そこで我々はヒト顎関節滑膜細胞の培養の最適手術を開発した。その設定条件は、培養のみ、5%および10%ウシ血清アルプミン含有培地であった。その結果、培地のみ、5%ウシ血清アルプミン含有培地の群では、ほとんど細胞増殖は観察できなかったが、10%ウシ血清アルプミン群で38時間経過すると滑膜の増殖が観察できた。この細胞を免疫組織化学的に抗サイトケラチン、抗ビメンチン抗体にて染色したところサイトケラチンに反応した細胞は皆無であったが、大多数の細胞がビメンチンに反応を示しその反応形式も変異にとんでいた。これより結合組織由来の細胞で構成されていることが判明した。また、10%ウシ血清アルブミン含有培地下に培養を試みた顎関節滑膜は、開口障害あるいは疼痛の強い患者から得られた滑膜細胞ほど、細胞増殖が激しいことが観察された。更にこの培養細胞上清液中に含有されるTGF-β,IL-1β,IL-6値をELISAにて定量計測した。その結果IL-6値はどの培養細胞株でも高い濃度を検出できたが各株間の有為差はなかった。他のTGF-β,IL-1βはどの培養細胞株でも検出できなかった。一方、テネイシンのIn-situ-hybridizationを施行したところmRNAが顎関節円板最表層特に肥厚をともなった病的滑膜に確認でき、その産生が明らかとなった。また肥厚した滑膜内層にTGF-βとテネイシンが局在し、そのさらに内部に毛細血管新生しているのが免疫組織化学的に確認できた。今年度われわれは顎関節疾患患者の顎関節手術症例(顎関節授動術3症例、顎関節円板切除症例4例、顎関節鏡視下剥離受動術症例3症例)より得た顎関節滑膜を30%自己血清下に培養を試みた。その結果、開口障害あるいは疼痛の強い患者から得られた滑膜細胞ほど、細胞増殖が激しいことが観察された。これは、滑膜細胞の何らかの形質変化によりサイトカインのオ-ククラインによる滑膜細胞の異常増殖、発痛物質の発現などを示すものと考えられた。そこで、この培養細胞に対してでTGF-βのELISAによる定量を行ったが正常血清と有為差はなかった。さらに、プロスタグランジン(PGE1)の分泌の有無の定量を急いでいる。

また、これら細胞株が滑膜細胞由来であるか線維芽細胞由来であるかの同定を、アクチン、ビメンチン、サイトケラチンなどを用いた免疫組織化学的手法にて試みたが、残念ながら滑膜細胞由来であるか線維芽細胞由来であるのかの有意義な同定法とはならなかった。ただし、特に炎症、増殖、肥厚をともなった病的顎関節腔内の顎関節滑膜細胞には、その培養細胞を用いた研究でも免疫組織化学的にテネイシンの局在を確認できた。そこで、同じ摘出標本のパラフィン切片を用いてテネイシンのIn-situ-hybridizationを施行したところ、テネイシンのmRNAが顎関節円板最表層特に肥厚をともなった病的滑膜、線維芽細胞に確認できた。これにより顎関節内障の滑膜での滑膜細胞のテネイシンの産生が明らかとなった。今後は、さらにTGF-β,EGFなどのサイトカインを滑膜培養細胞に添加して細胞の変化を観察するとともに、これらサイトカインのIn-situ-hybridizationを施行しその産生分布を解明したい。当教室の外来を訪れた顎関節症患者の内、顎関節手術の対象となった重度症例(顎関節授動術4例、顎関節円板切除術4例、顎関節鏡視下剥離受動術3例)の顎関節滑膜の一部を無菌的に切除し培養を試みた。今日までヒト顎関節滑膜細胞の培養に関する報告は皆無であり、まずその培養条件を確立することを第一目標とした。顎関節から採取できうる滑膜の絶対量は、ひざの滑膜に比較して著しく少量で、そのため膝関節滑膜培養法に準じて滑膜細胞以外の組織を物理的または化学的に除去した場合、ほとんどの症例でわずかの細胞しか残存していない。そこで我々はヒト顎関節滑膜細胞の培養の最適手順を開発した。その設定条件は、培地のみ、5%および10%ウシ血清アルブミン含有培地であった。その結果、培地のみおよび5%ウシ血清アルブミン含有培地の件下で滑膜培養を試みた群では、ほとんど細胞増殖は観察できなかったが、10%ウシ血清アルブミン条件下で滑膜培養を試みた群で38時間経過すると滑膜の増殖が観察できた。この細胞を免疫組織化学的に抗サイトケラチン、抗ビメンチン抗体にて染色したところサイトケラチンに反応した細胞は皆無であったが、大多数の細胞がビメンチンに反応を示しその反応形式も変異にとんでいた。これより結合組織由来の細胞で構成されていることが判明した。また、10%ウシ血清アルブミン含有培地下に培養を試みた顎関節滑膜は、開口障害あるいは疼痛の強い患者から得られた滑膜細胞ほど、細胞増殖が激しいことが観察された。更にこの培養細胞上清液中に含有されるTGF-β,IL-1β,IL-6値をELISAにて定量計測したが各症例間に有為差はなかった。一方、テネイシンは炎症、増殖、肥厚の激しい病的滑膜に高濃度局在し免疫組織化学的に確認できた。同じ摘出標本からテネイシンのIn-situ-hybridizationを施行したところ、テネイシンのmRNAが顎関節円板最表層特に肥厚をともなった病的滑膜に確認でき、その産生が明らかとなった。たま、線維芽細胞はIn vitroにおいてTGF-βがテネイシンの産生を調節している事実は知られているが、肥厚した滑膜内層にTGF-βとテネイシンが局在し、そのさらに内部に毛細血管新生しているのが免疫組織化学的に確認できた。
内分泌攪乱物質による精巣機能障害発現時に変動する遺伝子の機能解析

マウス精巣上体頭部の初代培養細胞に温度感受性simian virus 40大型T(tsSV40LT)抗原遺伝子を導入し,条件付不死化精巣上体頭部細胞株MECP5を樹立することに成功した.許容温度33°Cでは,大型T抗原が発現し,細胞が増殖した.一方,非許容温度におけるT抗原の発現低下と33°Cにおける細胞密度の上昇は,細胞増殖を停止し,p21^<waf1>のタンパク質発現を誘導した.本細胞は,ME-1,SGP-2やアンドロゲン受容体等精巣上体頭部に発現する遺伝子を発現した.興味深いことに,ME-1とSGP-2の遺伝子発現は,細胞増殖停止の状態において顕著に増加した.tsSV40LT抗原遺伝子導入トランスジェニックマウス由来の精巣セルトリTTE3細胞は,33°Cは増殖するが,39°Cでは大型T抗原の発現が低下し,細胞分化が誘導される.この分化誘導の機構を詳細に解明するために,我々はcDNAマイクロアレイを用いて遺伝子の経時的な発現変化を解析した.865遺伝子を解析した結果,14遺伝子の発現量が増加することが明らかとなった.リアルタイム定量的PCR測定法により,p21^<waf1>,MFGME-8,HRP12とselenoprotein P遺伝子の発現が顕著に上昇することを確認した.以上より,精巣上体頭部MECP5とセルトリTTE3細胞は,男性生殖システムにおける遺伝子発現や内分泌攪乱物質を研究する非常に有用なモデルになると考えられる.以前の我々の研究において,セルトリTTE3細胞へのビスフェノールAの暴露によりfra-2,c-mycやODCを含む31遺伝子の発現が誘導されることを示した.現在,樹立した細胞株を用いて内分泌攪乱物質による男性生殖器障害におけるfra-2,c-mycとODCの役割を検討している.マウス精巣上体頭部の初代培養細胞に温度感受性simian virus 40大型T(tsSV40LT)抗原遺伝子を導入し,条件付不死化精巣上体頭部細胞株MECP5を樹立することに成功した.許容温度33°Cでは,大型T抗原が発現し,細胞が増殖した.一方,非許容温度におけるT抗原の発現低下と33°Cにおける細胞密度の上昇は,細胞増殖を停止し,p21^<waf1>のタンパク質発現を誘導した.本細胞は,ME-1,SGP-2やアンドロゲン受容体等精巣上体頭部に発現する遺伝子を発現した.興味深いことに,ME-1とSGP-2の遺伝子発現は,細胞増殖停止の状態において顕著に増加した.tsSV40LT抗原遺伝子導入トランスジェニックマウス由来の精巣セルトリTTE3細胞は,33°Cは増殖するが,39°Cでは大型T抗原の発現が低下し,細胞分化が誘導される.この分化誘導の機構を詳細に解明するために,我々はcDNAマイクロアレイを用いて遺伝子の経時的な発現変化を解析した.865遺伝子を解析した結果,14遺伝子の発現量が増加することが明らかとなった.リアルタイム定量的PCR測定法により,p21^<waf1>,MFGME-8,HRP12とselenoprotein P遺伝子の発現が顕著に上昇することを確認した.以上より,精巣上体頭部MECP5とセルトリTTE3細胞は,男性生殖システムにおける遺伝子発現や内分泌攪乱物質を研究する非常に有用なモデルになると考えられる.以前の我々の研究において,セルトリTTE3細胞へのビスフェノールAの暴露によりfra-2,c-mycやODCを含む31遺伝子の発現が誘導されることを示した.現在,樹立した細胞株を用いて内分泌攪乱物質による男性生殖器障害におけるfra-2,c-mycとODCの役割を検討している.これまでに我々は,温度感受性SV40大型T抗原遺伝子導入トランスジェニックマウスから樹立した精巣セルトリ細胞とcDNAマイクロアレイを用いた研究から,内分泌攪乱物質ビスフェノールAによって誘導される遺伝子を数多く明らかにした.本研究では,セルトリ細胞と気道上皮細胞において,内分泌攪乱物質との関連性が予測される,HSP70,クルステリンとDJ-1の細胞機能に対する作用を検討した.気道上皮細胞にヒトHSP70を高発現させた時,通常の細胞機能には影響を与えなかったが,ヒートショックによる大型T抗原タンパク質の変性・分解・機能低下を有意に抑制することが明らかとなった.また,HSP70の補助因子として機能するHSP40は,このHSP70による機能回復を有意に亢進させることが判った.セルトリ細胞にDJ-1やDJ-1の変異体を安定高発現する細胞株の樹立に成功した.野生型のDJ-1の高発現は細胞の機能に影響を及ぼさなかったが,変異体の高発現は細胞増殖を有意に低下させた.DJ-1が細胞の増殖に何らかの影響を与えていることが示唆された.温度感受性SV40大型T抗原遺伝子を用いて,精巣上体頭部上皮細胞株MEPC5の樹立に成功した.透過電子顕微鏡を用いた形態学的評価により,MEPC5細胞は正常組織由来の初代培養細胞と差異が見られないことが明らかとなった,また,本細胞はME1やアンドロゲン受容体等精巣上体頭部のマーカータンパク質を発現しており,精巣上体頭部の生理機能,遺伝子発現,内分泌攪乱物質の作用機構を調べるための有用な細胞モデルになると考えられた.温度感受性SV40大型T抗原遺伝子を用いて精巣上体頭部上皮細胞株MEPC5の樹立に成功し,その細胞機能を詳細に解析した.

透過電子顕微鏡を用いた形態学的評価により,MEPC5細胞は典型的な上皮細胞の形態を示し,正常組織由来の初代培養細胞と差異がないことが示された.細胞の増殖は,導入された温度感受性の大型T抗原タンパク質の発現で制御され,また,細胞増殖は接着阻害により抑制された.本細胞はME1やアンドロゲン受容体等精巣上体頭部のマーカータンパク質を発現しており,精巣上体頭部の生理機能,遺伝子発現,内分泌攪乱物質の作用機構を調べるための有用な細胞モデルになると考えられた.これまでに,研究代表者らはスタンフォードタイプのcDNAマイクロアレイと精巣セルトリ細胞を用いた研究から,内分泌攪乱物質ビスフェノールAによって誘導される遺伝子を数多く明らかにした.しかしながら,本系では評価している遺伝子数が約2,000個と少ないので,網羅的な評価をしているとは云えない.そこで,約12,000種類の遺伝子が評価できるGeneChipシステムを用いて,前実験と同様の条件下で再度評価した.その結果,約2,000種類の遺伝子の発現が変動することが明らかとなった.現在,得られた結果をクラスター解析ソフトおよびパスウエイ解析ソフトを用いて詳細に検討している.温度感受性SV40大型T抗原遺伝子導入精巣セルトリ細胞は,非許容温度39°Cで培養すると細胞増殖が停止し,細胞分化が誘導される.cDNAマイクロアレイを用いてこの過程で変化する遺伝子を調べた結果,p21^<waf1>やSelenoprotein Pが顕著に発現誘導されることが明らかとなった.
冬尺蛾における平行進化現象の理解に向けた生活史調節機構とその遺伝的基盤の解明

本研究課題では、生物がどのように多様化していくかを明らかにすることを目的として、フユシャク属(Inurois属)内で生じた初冬型繁殖期と晩冬型繁殖期の平行進化がどのように生じたかを明らかにする。フユシャク属の中ではクロテンフユシャクは種内で初冬型と晩冬型の二型があり、さらに近縁種でも初冬型と晩冬型の姉妹種ペアが複数存在しており、本研究では、2つの型の間での違いが生じる具体的な発育段階を特定すること、およびその違いを規定する遺伝子の探索を行う。異時的種分化が生じていると考えられるクロテンフユシャクの初冬型と晩冬型を用いて、繁殖季節の違いが具体的にどのような生活史変異によってもたらされるものかを明らかにするため、同一環境下において飼育した。その結果、卵および幼虫の発育について初冬型と晩冬型の間で差は見られなかった。このことから両者の繁殖期の差は蛹期の発育によってもたらされるものと推定された。本種は蛹期中に休眠することから、休眠の違いが繁殖期の違いの原因となっていると考えられた。ただし、今年度の飼育では蛹の発育が悪く、休眠機構の違いについて詳細を明らかにすることはできなかった。また、初冬型と晩冬型の違いについてゲノムからアプローチするために、晩冬型1個体を材料として、53ギガのロングリードデータおよび100ギガのショートリードデータを得た。さらに初冬型1個体から90ギガのショートリードデータも得ている。これらのデータは現在解析中である。当初は今年度に休眠機構の違いについて概ね明らかにし、来年度の飼育実験でより詳細な機構を明らかにすることを予定していたが、今年度は休眠機構の違いについては明らかにすることはできなかった。この点については当初予定よりもやや遅れているとも言えるが、一方で、当初は来年度に予定していたゲノムデータの獲得を今年度中に済ませることができた。またリシーケンス解析用のサンプルこ今年度中に収集することもできたために、全体としては研究課題で予定している作業は大きく前進したと言える。今年度の飼育実験の手法を改善して、蛹期のデータを採れるように工夫する。これについては現時点で既に方策を実施している最中である。さらに、ゲノムデータをすでに獲得できたので、この解析を進める。また、今年度中にゲノムデータを得ることができたので、実験スケジュール的に余裕ができた。そこで、クロテンフユシャクの初冬型と晩冬型および近縁種の詳しい系統関係を明らかにする予定である。
ヒストンバリアントが細胞増殖と個体発生を制御する機能解析

カノニカルヒストンのmRNAの切断と成熟にFLASH/casp8ap2が関わっている。FLASHの発現を抑制すると細胞周期の進行がS期で停止し細胞死が誘導されるが、この時にカノニカルヒストンH1.4の発現が阻害されノンカノニカルヒストンH1tの発現が誘導されることを示した。一方、FLASH発現細胞でH1.4の発現を抑制しても細胞周期の進行は影響を受けないが、H1tを一過性に強制発現すると細胞増殖が抑制され細胞死も誘導された。FLASHの発現抑制による増殖抑制と細胞死誘導がH1tの発現によると考え、現在H1tノックアウト細胞を作製しており、H1tの新しい機能を更に解析している。染色体を構成するヒストンは、細胞周期のS期に強発現し、3'末端にpoly-Aを持たないmRNAを介して発現するカノニカルヒストンが主成分である。一方、細胞周期非特異的に転写されるpoly-A付加mRNAから翻訳されるヒストンバリアント(ここではノンカノニカルヒストンと称する)には多数のサブタイプが存在する。FLASH/casp8ap2は細胞周期S期進行と初期胚の発生に必要な分子であり、その発現抑制はカノニカルヒストンの発現減少とノンカノニカルヒストンの発現増加を伴う。FLASHの発現抑制によって、カノニカルヒストンの代わりにノンカノニカルヒストンが染色体に取り込まれるのではないかと考え、ヒストンH1に焦点を当てて解析を行った。KB細胞株においてFLASHの発現抑制により、細胞周期の進行がS期で停滞するが、この時にカノニカルヒストンH1.4とH1.5の発現が減少し、ノンカノニカルヒストンH1tの発現が増加することを見いだした。そこで、H1.4の発現抑制とH1tの発現が細胞増殖に与える影響を解析した。H1.4の発現抑制を特異的shRNAの発現によって誘導したが、細胞増殖には影響がなかった。一方、H1tを過剰に発現させた細胞は、FLASH knockdown細胞と同様の形態を示し、細胞増殖能が低下すると共に、FLASH knockdownに対する感受性が増大していた。H1tの発現上昇は、FLASH knockdownによる細胞形態補変化や増殖停止などの効果に関わることが示唆された。固形腫瘍由来細胞株において、FLASHの発現抑制を誘導すると、細胞周期S期の進行が停滞して細胞増殖が停止し、細胞形態は若干大きくなるとともに基質への接着が弱まる。この現象にカノニカルヒストンの発現減少とノンカノニカルヒストンの発現増加が関わる可能性を考え、ヒストンH1の全バリアント分子の発現パターンをFLASH発現細胞と発現抑制誘導細胞で比較した。その結果、カノニカルヒストンH1.4とH1.5の発現が減少し、ノンカノニカルヒストンH1tの発現が増加することを見いだした。さらに、外来性のH1tを発現させることによって、細胞増殖の抑制と基質への接着の減弱というFLASHの発現抑制と類似した表現系が誘導されることを示した。FLASHの発現抑制によって、カノニカルヒストンの代わりにノンカノニカルヒストンが染色体に取り込まれて、様々な表現型が誘導されるのではないかという仮説について、これを支持する結果を得たと考えている。染色体の構成成分であるヒストンは多様であるが、細胞周期で発現が誘導されるカノニカルヒストンが主成分である。カノニカルヒストンmRNAは3'末端が切断されて成熟するが、その切断にFLASH/casp8ap2の関わることが明らかとなっている。FLASHの発現を薬剤誘導的shRNA発現システムを用いて抑制誘導すると、カノニカルヒストンの発現が抑制され、ノンカノニカルヒストンの発現が上昇すると共に、細胞周期の進行がS期で停止する。この時に細胞周期S期の進行に関わることが報告されているヒストンH1の各種バリアントの発現をヒトKB細胞において解析した。FLASHが発現しているときには、ヒストンH1としてカノニカルヒストンH1.4とH1.5が主成分として発現していた。一方、FLASHの発現を抑制すると、カノニカルヒストンH1.4とH1.5の発現が抑制され、ノンカノニカルヒストンH1tの発現が誘導されることを示した。FLASHを発現するKB細胞においてH1.4やH1.5の発現を抑制しても細胞周期の進行は影響を受けなかったが、H1tを一過性に強制発現すると細胞増殖が抑制された。H1t発現の影響をより明確にするため、Cre-loxPシステムを用いたH1tの発現誘導系を構築し、ヒトKB細胞に導入した。その結果、H1tの発現を誘導すると、細胞周期がS期で停止することが分かった。FLASHの発現抑制時における細胞周期S期の停止がH1tの発現による可能性が示唆された。この点をより明らかにするため、FLASHの発現を薬剤誘導的に抑制できるKB細胞において、CRISPER-Cas9システムを用いたゲノム編集法でH1t遺伝子のノックアウトを現在行っており、H1tノックアウト細胞においてFLASHの発現抑制を実行したときの表現型解析をこれから実行する予定である。

FLASHの発現抑制による増殖抑制と細胞死誘導がH1tの発現によると考え、現在H1tノックアウト細胞を作製しており、H1tの新しい機能を更に解析している。「FLASHの発現抑制によって、カノニカルヒストンの代わりにノンカノニカルヒストンが染色体に取り込まれて、様々な表現型が誘導される」という仮説は、「FLASHの発現抑制によって、ノンカノニカルヒストンH1tが染色体に取り込まれ、細胞周期S期進行の停止と基質への接着の減弱が誘導される」という具体性を帯びた仮説に発展した。しかし、この仮説を証明するためにはH1tの発現抑制細胞では、FLASHの発現抑制による効果が誘導されないことを示す必要がある。これまで用いてきたshRNAの系によってH1tの特異的発現抑制を試みようとしたが、H1バリアント遺伝子間でのDNA配列の相同性により特異的発現抑制は困難であった。そこで、CRISPR-Cas9の系を用いてH1t遺伝子をノックアウトした細胞を作製して解析を行う必要があると考えている。具体的には、FLASHの発現を誘導的にノックダウンできる細胞株において、H1t遺伝子をノックアウトした後に、FLASHの発現抑制を誘導し、細胞増殖の抑制が解除されるか、基質への接着の減弱をともなう形態変化も抑制されるかを解析する必要がある。また、外来性H1tの発現細胞の解析を行ったが、H1tの発現が細胞増殖の抑制を誘導するのなら、細胞株を取得する際に、増殖能を維持した細胞を選択していることになり、H1tの活性を正しく検出できていないと考えられる。そこで、外来性H1tの発現を誘導できる細胞株を作製して、解析を行う必要もあると考えられる。これらの解析によって、「FLASHの発現抑制によって、ノンカノニカルヒストンH1tが染色体に取り込まれ、細胞周期S期進行の停止と基質への接着の減弱が誘導される」ことを証明する。分子細胞生物学
癌ペプチドを用いた口腔癌の早期診断法およびオーダーメイド免疫療法の開発

癌ペプチドを用いたオーダーメイド免疫療法と早期診断法の開発のためには、癌に対する免疫監視機構やその調節機構を十分に理解しなければならない。本研究では、口腔癌の癌ペプチドの中ではSART-1が最も抗原性が強く、免疫監視機構における中心的役割を果しており、それゆえに口腔癌の治療ならびに診断に応用可能な癌ペプチドであることが判った。しかしその一方で、口腔癌が腫瘍関連抗原であるRCAS1を発現・分泌し、活性化T細胞のアポトーシスを誘導して免疫監視機構を制御していることが判った。免疫監視機構を賦活するためには癌ペプチドを用いるだけでは不十分であり、このRCAS1の作用を制御する必要性が明らかとなった。多くの癌に対して癌ペプチドを用いた特異的免疫療法が試みられているが、癌に対する免疫監視機構やその調節機構は十分に理解されておらず、多くの問題が残されている。本研究では、口腔癌に対する免疫監視機構および口腔癌による免疫監視機構の調節機能を十分に理解し、その上で有効なオーダーメイド免疫療法と早期診断法の開発を目指している。そのため、以下の2つの目的のために研究を進める。(1)癌細胞に対する免疫監視機構の解析従来の研究を継続し、個々の口腔扁平上皮癌患者における癌ペプチドの発現およびそれに反応する抗腫瘍T細胞の同定を行う。新たな癌ペプチドの同定方法としては、最新の分子生物学的手法を駆使した(1)SSCPを用いる方法、(2)West-Western法、(3)TCR transfectant法を用いる。(2)癌細胞による免疫監視機構の調節分子の発現を解析個々の口腔扁平上皮癌患者における免疫調節分子の発現、さらにはその発現調節機構を解析し、可能であれば免疫監視を増強するような対処方法を検討する。本年度は以下のような2つの研究を行った。1)癌細胞に対する免疫監視機構の解析個々の口腔扁平上皮癌患者における癌ペプチドに反応する抗腫瘍T細胞の同定を行った。抗腫瘍T細胞の検出はin vitroでのCTL誘導能により行っており、現時点で最も高頻度に抗腫瘍T細胞が検出できるのはSART-1であった。HLA-A24と癌ペプチド抗原のテトラマーによる同定方法、およびDNAプローブによる同定方法は現時点では成功していない。新たな癌ペプチドの同定方法としては、最新の分子生物学的手法を駆使した1)SSCPを用いる方法、2)West-Western法、3)TCR transfectant法を用いており、現在も解析途中で、現時点では新たな癌ペプチドは同定できていない。2)癌細胞による免疫監視機構調節分子の発現の解析個々の口腔扁平上皮癌患者における免疫調節分子の発現を免疫組織学的染色およびin situhybridization法で解析したところ、HLAクラスIおよびII抗原、B7ファミリー、接着分子、RCAS1の異常発現がみられた。現在はさらにその発現調節機構を解析している段階である。1)癌細胞に対する免疫監視機構の解析口腔扁平上皮癌患者から採取した末梢血単核球(PBMC)に複数の癌抗原ペプチドをふりかけて培養することでPBMC中の細胞傷害性T細胞(CTL)前駆体からCTLを誘導し、IFN-gammaの産生によって判断した。CTL誘導の有無により口腔扁平上皮癌ペプチドワクチンの候補として期待することができる。現時点で高頻度にCTLを誘導できる抗原ペプチドはSART-1であった。抗原ペプチドを用いたテトラマー法やDNAプローブ法では現時点では成功していない。新たな抗原ペプチドの同定方法として、最新の分子生物学的手法を駆使した1)SSCPを用いる方法、2)West-Western法、3)TCR transfectant法を用いて解析途中である。2)癌細胞による免疫監視機構調節分子の発現の解析口腔扁平上皮癌患者における免疫調節分子の発現を免疫組織学的染色およびin situhybridization法で解析したところ、HLAクラスIおよびII、B7ファミリー(CD28,CD80,CTLA-4,ICOS,B7h)、接着分子(ICAM-1,PD-1)、T細胞のアポトーシスを誘導するRCAS1の異常発現がみられた。

また近年はそれらの分子のsingle nucleotide polymorphismにも注目し研究を進めている。多くの癌に対して癌ペプチドを用いた特異的免疫療法が試みられているが、癌に対する免疫監視機構やその調節機構は十分に理解されておらず、多くの問題が残されている。本研究では、口腔癌に対する免疫監視機構および口腔癌による免疫監視機構の調節機能を十分に理解し、その上で有効なオーダーメイド免疫療法と早期診断法の開発を目指している。本年度は以下のような2つの研究を行った。1)癌細胞に対する免疫監視機構の解析口腔扁平上皮癌患者から採取した末梢血単核球(PBMC)に複数の癌抗原ペプチドをふりかけて培養することでPBMC中の細胞傷害性T細胞(CTL)前駆体からCTLを誘導し、IFN_<-γ>産生によって判断した。CTL誘導の有無により口腔扁平上皮癌ペプチドワクチンの候補として期待することができる。現時点で高頻度にCTLを誘導できる抗原ペプチドはSART-1であった。抗原ペプチドを用いたテトラマー法やDNAプローブ法では現時点では成功していない。新たな抗原ペプチドの同定方法として、最新の分子生物学的手法を駆使した1)SSCPを用いる方法、2)West-Western法、3)TCR transfectant法を用いて解析途中である。2)癌細胞による免疫監視機構調節分子の発現の解析口腔扁平上皮癌患者における免疫調節分子の発現を免疫組織学的染色およびin situhybridization法により解析したところ、HLAクラス1およびII、B7ファミリー(CD28,CD80,CTLA-4,ICOS,B7h)、接着分子(ICAM-1,PD-1)、T細胞のアポトーシスを誘導するRCAS1の異常発現がみられた。現在はさらにその発現調節機構を解析している段階である。さらに、それらの分子のsingle nucleotide polymorphismにも注目し、それらの発現量と癌関連抗原ペプチドに反応するT細胞数、活性化の程度、ならびにサイトカイン産生などとの関連について解析を始めたところである。多くの癌に対して癌ペプチドを用いた特異的免疫療法が試みられているが、癌に対する免疫監視機構やその調飾機構は十分に理解されておらず、多くの問題が残されている。本年度は以下のような研究を行った。口腔扁平上皮癌細胞に対する免疫監視機構の解析口腔扁平上皮癌患者(N=35)から採取した末梢血単核球(PBMC)から13種類の腫瘍抗原ペプチドをふりかけて培養し、抗原特異的CD8陽性細胞の活性を検索した。その結果、免疫化学組織染色においてCD8陽性細胞の活性化と免疫反応に正の相関を認めた。
臓器連関システムのマルチスケール数理モデルの開発と糖尿病の病態解析

臨床実験や動物実験の一部を代替するために,世界で初めて,細胞内生体分子ネットワークと臓器間ネットワークを統合する分子,細胞,組織,臓器の階層的マルチスケール数理モデルを開発する.各臓器をつなげる血管内の物質動態を動力学方程式で記述し,各臓器細胞のゲノムスケール代謝システムをFlux Balance Analysis (FBA)で構築する.生理学や生化学実験データを基に代謝流束に制約条件を与えて,臓器特異的酵素活性分布(基質・生成物・蓄積物流束分布の全体)を推定する新規機械学習法を提案する.臨床実験や動物実験の一部を代替するために,世界で初めて,細胞内生体分子ネットワークと臓器間ネットワークを統合する分子,細胞,組織,臓器の階層的マルチスケール数理モデルを開発する.各臓器をつなげる血管内の物質動態を動力学方程式で記述し,各臓器細胞のゲノムスケール代謝システムをFlux Balance Analysis (FBA)で構築する.生理学や生化学実験データを基に代謝流束に制約条件を与えて,臓器特異的酵素活性分布(基質・生成物・蓄積物流束分布の全体)を推定する新規機械学習法を提案する.
公平な順位決定ルールと利益分配ルール

複数の参加者の活動がそれぞれ様々な数字のデータで表され、また、その参加者の活動が全体としてなんらかの経済的利益を発生させる状況を考察対象とする。そういった状況で、それぞれの参加者の活動を評価・比較し参加者を適切に順位付ける方法と、参加者全体の活動の結果発生した経済的利益を参加者間で適切に分配する方法を理論的に考察する。理論的な考察としてはゲーム理論を主としたアプローチをとる。
情報環境の変化に適切に対応する目録規則の在り方に関する研究

図書館における目録規則は,196070年代に基本的枠組みが確立されており,情報のデジタル化・ネットワーク化が急速に進む中で,抜本的な再構築の必要性に迫られてきた。本研究では,目録規則の基盤となる「概念モデル」の構築と,それに基づく目録原則,目録規則の国際的動向を分析・評価した。また,日本の目録規則の今後の方向性について,特に他の東アジア諸国に注目しながら検討を行った図書館における目録規則は,196070年代に基本的枠組みが確立されており,情報のデジタル化・ネットワーク化が急速に進む中で,抜本的な再構築の必要性に迫られてきた。また,日本の目録規則の今後の方向性について,特に他の東アジア諸国に注目しながら検討を行った本研究は、目録規則(図書館界のメタデータ規則)を情報環境の進展によって顕在化した諸要求を踏まえて捉え直し、今後の在り方を理論的・実践的の両側面から明らかにすることを目的としている。本年度は、3つのサブ課題を設定し、周辺の事項も含めて7回の研究会を開催した。研究会はいずれも一般公開とし、参加者で討議を行った(概要記録・配布資料等はウェブで公開)。(1)「東アジア圏の目録規則」:中国・韓国から専門家を招き、日本を含む3カ国の目録規則の成立過程や現状を比較検討する国際研究会「東アジアの目録規則」(1月)を実施した。これに先立ち国内専門家による研究会「中国と韓国の目録をめぐる動向」(10月)も開催した。非基本記入制など世界的には珍しい特徴を共有する3カ国の規則について相互理解を深め、今後の目録規則のありかたを相対性をもって考えて行く基礎を得られた。(2)「FRBR/FRAD概念モデル」:これからの目録規則の基盤となる概念モデルについて、研究会「統制形データの概念モデル」(4月)を開催した。また、本モデルとの関わりで重要な典拠コントロールと「国際目録原則」についても検討し、研究代表者が論文を発表した。(3)「RDAの調査・分析」:6月に公刊された英語圏の新目録規則RDAについて検討を重ね、研究会「RDAの完成とこれからの目録」(11月)、「RDAから得られるもの:機械可読性の観点から」(12月)をそれぞれ開催した。また、研究分担者による論文発表、代表者による学会発表も行った。(4)その他:研究会「情報組織化をめぐる最近の動向」(5月)、「ネットワーク文化情報資源で活用する人名典拠情報構築」(7月)を開催した。特に後者は図書館コミュニティを超えてより幅広く「デジタルアーカイブ」の文脈で問題をとらえるものである。以上の各方面で研究活動を行った。総合化は2年目以降の課題であるが、一定の素地を得ることができた。本研究は、目録規則(図書館界のメタデータ規則)を情報環境の進展によって顕在化した諸要求を踏まえて捉え直し、今後の在り方を理論的・実践的の両側面から明らかにすることを目的としている。1.「書誌的世界の概念モデル・概念枠組み」:これからの目録規則の基盤となる概念モデルや枠組みについて検討を行い、研究会「FRBR研究会の取り組み」(6月)、「識別と記述のフレームワーク」(10月)、「目録はどうなる」(3月)を開催した。また、本モデルとの関わりで重要な典拠コントロールについての動向をまとめた論文発表も行った。2.「RDAの調査-分析」:2010年に公刊された英語圏の新目録規則RDA」について検討し、研究会「変革期の目録法」(12月)を開催した。また、その機械可読性について考察した論文を研究代表者が発表した。3.「わが国における目録規則の今後」:改訂への緒についた日本目録規則について分析・検討を行った。研究会「変革期の目録法」(上述)にその内容の一部を含んだほか、国内の新動向について、研究会「国立国会図書館の典拠データ提供の新展開」(9月)、「KOSMOS IIIにおける目録システムの設計」(11月)を開催した。4.その他:今後の目録規則検討においては他のコミュニティのメタデータとの関連も視野に入れるため、研究会「Dublin Coreのこころ」(4月)、「20世紀前半の米国におけるアーカイブズと図書館の関係」(7月)、「GUIを用いた関連語編集機能とメタデータへの関連語登録機能を実装したDigital Cultural Heritageの実践例」(1月)を開催した。最終年度に目指す総合化に向けて、一定の進展をはかることができた。本年度は、2つのサブ課題を設定し、周辺の事項も含めて10回の研究会を開催した。1.「目録規則の構造に関する調査・分析」:英語圏の新目録規則「RDA」について引き続き検討した。

研究会「アーカイブズの典拠レコード標準とRDAの比較」(7月)、「典拠形アクセスポイントの諸相」(12月)を開催し、また研究分担者(和中)が複数の論文を発表した。一方、ISBD(国際標準書誌記述)についても研究した。研究会「ISBDの現在・過去・未来」(5月)、「ISBD統合版の研究」(1月)を開催し、また研究分担者(松井)が口頭発表を行った。2.「日本目録規則の検討・分析」:抜本改訂の途上にある日本目録規則について、引き続き検討した。研究会「新しい日本目録規則へ」(2月)を開催し、また研究分担者(和中)が書誌コントロールの戦後体制について論文を発表した。加えて、国立国会図書館や大学図書館の目録の動向についても研究会を開催した。3.その他:目録規則にも関わる基礎理論研究として「索引の構造」、目録データにも用いられる国立国会図書館の「DC-NDL」、アーカイブ資料管理等についても研究会を開催した。最終年度であることから、年度後半は本研究の全体をとりまとめ、3月に『情報環境の変化に適切に対応する目録規則の在り方に関する研究研究成果報告書』(286p)を発行した。報告書は、研究概要、公開研究会記録、国際研究会「東アジアの目録規則」(22年度)詳細記録、「図書館目録をめぐる動向:20072012」、それに3年間の外部成果発表再録から成る。3つのサブ課題を中心に、研究会開催等は予定通り実施することができた。本年度内の論文等の発表は22年度に比してやや少なくなったが、24年度前半に持ち越して予定しているものがある。24年度が最終年度であるため、記入しない。24年度は本研究計画の最終年度となる。引き続きサブ課題の検討を進めるとともに、総合化をはかり、最終報告書としてまとめを行いたい。
酵素-金属複合触媒による革新的不斉合成法の開発

加水分解酵素とバナジウム化合物を同時に用いることで,入手容易なラセミ体アリルアルコールを1つの鏡像体に変換する方法を開発した。この研究成果は医薬品開発などに不可欠な不斉合成技術に革新的な概念を提示するものである。また,酵素と金属バナジウムという共に高活性で異質な触媒が1つのフラスコ内で共存し,且つ機能を十分に発揮できるよう,メソポーラスシリカの細孔を利用して両触媒の作業空間を区分したことが特筆される。光学活性な有機化合物は医薬品,農薬,香料などの様々な製品に用いられている。その需要は年々高まり,環境に負荷をかけない供給法の開発が急務ある。著者は最近,アリルアルコールにリパーゼとOV(OSiPh3)3を反応させると,水酸基の1,3-転位を伴う動的光学分割が進行し,(R)-アリルエステル(>90%ee)が収率90%以上で得られることを見出した。本研究では,この酵素-金属複合触媒法を発展させ,ラセミ体アルコールから光学的に純粋な有機化合物を短工程,高収率で不斉合成する革新的手法の開発を行う。本年度は,研究実施計画に基づき次の成果を得た。1. OV(OSiPh3)3の中心金属や置換基を変換して,より高活性なラセミ化触媒を探索した結果,ポリマー担持リン酸に結合したオキソバナジウム化合物が高活性を示し,かつ同一反応液中でリパーゼと共存できることを見出した。そこで,この金属触媒とリパーゼを併用し,鎖状,環状,脂肪族,芳香族,含複素環など多様なアリルアルコールから-挙に(R)-アリルエステル(90-99%ee)を収率60-99%で不斉合成する方法を開発した。本法は,入手容易なカルボニル化合物と炭素陰イオンを原料にして全24工程で高光学純度のアリルエステルを簡便に提供するものである。さらに,アリルアルコールの位置異性体が等価な基質として利用できるために,基質合成ルートを柔軟に選択できる利点もある。2. (S)-アルコールを選択的にエステル化する加水分解酵素のスブチリシンは不安定であったが,界面活性剤と糖を添加して固定化することで反応性と安定性を向上させることができた。今後,金属触媒との併用による動的光学分割を検討する。これによって,酵素の選択によるR-, S-両エナンチオマーの作り分け法を開発する。医薬品,農薬,香料などの様々な製品に用いられる光学活性化合物の需要は年々高まり,さらに最近では,環境に負荷をかけない供給法が求められている。著者は最近,アリルアルコールにリパーゼとOV(OSiPh3)3を同時に反応させると,水酸基の1,3-転位を伴う動的光学分割(DKR)が進行し,(R)-アリルエステルを高収率で得られることを見出した。本法は多段階の反応が一つの反応容器内で進行して一挙に光学活性化合物を選択的に与えるため,冒頭の要求に適う方法である。1.オキソバナジウムをメソポーラスシリカの細孔内部に固定化した新規触媒を調製した。本触媒はOV(OSiPh3)3よりも活性が高く,また,リパーゼとの併用によるDKRによって,光学活性アリルエステルをより高収率で与えた。2.ジエノール化合物に,ジエノフィル部位を有する活性アシル化剤とリパーゼを反応させると,触媒光学分割に続き分子内Diels-Alder反応が連続進行して,ヒンバシンの中心骨格となる3環性構造をエナンチオ,並びにジアステレオ選択的に合成できることが分かった。H23年度は,これを動的光学分割に拡張し、ヒンバシンの不斉全合成を達成する。3. (S)-アルコールを選択的にエステル化するプロテアーゼの固定化を検討した。現段階では十分な活性を得るに至っておらず,H23年度も引き続き検討する。4.リパーゼ-バナジウム複合触媒を用いる動的光学分割をアルケニルクロロヒドリンに適用し,光学活性アルケニルオキシランの高収率合成法を開発した。光学活性な有機化合物は医薬品,農薬,香料などに用いられている。本研究では,この要求に適う方法として,加水分解酵素とオキソ金属触媒の複合触媒によって,ラセミ体アルコールから光学的に純粋な有機化合物を短工程,高収率で不斉合成する革新的手法を開発する。著者はH22年度までに,ポリマー担持リン酸,並びにメソポーラスシリカの細孔内部に各々オキソバナジウムを結合した2種類の固定化触媒が光学活性アルコールのラセミ化を触媒する優れた性能をもつことを見いだした。これらと脂質加水分解酵素リパーゼの組み合わせにより,ラセミ体アリルアルコールの動的

光学分割(DKR)法を開発した。本年度はこの成果を発展させ,研究実施計画に基づき,次の成果を得た。1.上記DKR法を生物活性化合物の不斉合成に応用した。まず,ラセミのアルケニルクロロヒドリン誘導体のDKRを鍵工程として,R(R)-imperaneneの不斉全合成を達成した。また,(+)-tanikolideの鍵中間体を短工程,高収率で不斉合成し,形式全合成を行った。更に,viridinの中心環構造を構築するための鍵化合物を収率良く不斉合成することができた。2.メソポーラスシリカに固定化したオキソバナジウムを用いるDKR法によって,基質アリルアルコールへの適用性が格段に広がり,また収率も向上した。更に本法は,ベンジルアルコール誘導体にも適用できることがわかった。3.市販されている数種類のリパーゼが上記DKR法に利用できることがわかった。本法では基本的に,不斉中心の絶対配置がRの生成物を与えた。現在,他の加水分解酵素プロテアーゼをDKRに利用してぷ体を得る手法を開発中である。特に,酵素の固定化法を種々検討し、酵素の活性向上と,上記オキソバナジウムとの共存性向上を目指している。
TLR9ノックアウトマウスを用いたアレルギー疾患の発症予防および治療効果の検討

(目的)最近、菌体成分由来のCpG DNAがTLR9のリガンドであることが判明し、アレルギーを抑制する物質として注目されている。今年度は、CpG DNAによるアレルギー発症予防・治療機序を解明するため、その標的細胞の一つとされるヒト形質細胞様樹状細胞(pDC)の活性化メカニズムを検討した。(目的)近年、アレルギー疾患の保有率が上昇し、安全で効果の高い治療法を確立することが期待されている。最近では、感染症罹患率の低下による免疫恒常性の不均衡がアレルギー疾患の保有率の上昇に関連すると示唆されている。そこで、PAMPsを認識するTLRsがアレルギーの発症に関わっていると推測し、申請研究の予備実験として、今年度は、TLR9のリガンドであるCpG DNAの経口的ワクチンとしての有用性をヒト口蓋扁桃由来の細胞を用いて検討した。(方法)手術前に同意が得られた患者の摘出口蓋扁桃より単核細胞を分離し、CD40/IL-4添加IgE産生環境下においてA type及びB type CpG DNAでそれぞれ刺激し、総IgEの産生、各種サイトカインの産生、Foxp3,T-bet, GATA3の発現、およびCD4^+CD25^+細胞の陽性率を検討した。また、BDCA2抗体を添加することによりCpG DNAによるpDCの活性化を抑制した状態で同様の実験を行った。(結論)ヒト口蓋扁桃由来単核細胞におけるIgE産生抑制には、A type CpG DNAによるpDCを介したTh1誘導機構の関与が推測された。これらのことから、A type CpG DNAのアレルギーの経口的ワクチンとしての有用性が示唆された。次年度は、実際にマウスを用いて、CpG DNAのアレルギー疾患発症との関与を検討する予定である。