hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
タングステートを基盤とした新規な液相選択酸化反応系の開発

中心元素がケイ素・ゲルマニウム・リンからなる新規二原子欠損型ポリオキソメタレート[γ-XW_<10>O34(H_2O)_2]^<n-> (X = Si, Ge, P)を新規に合成した。中心元素がケイ素である二原子欠損型ポリオキソメタレートは、過酸化水素:基質=1 : 1の量論条件下においても、過酸化水素を酸化剤とした種々のオレフィン類のエポキシ化反応やスルフィド類の酸素化反応に対して高い収率(87-99%)と高い過酸化水素利用効率(89-99%)を示すことを見出した。また、新規セレン中心二核ペルオキソタングステート[SeO_4{WO(O_2)_2}_2]^<2->を合成した。基質量に対して1当量の過酸化水素を酸化剤とした種々のホモアリルアルコール・アリルアルコール類のエポキシ化反応に対し高い活性を示し、対応するエポキシアルコールが高い収率で得られることを見出した。本申請研究では、分子性酸化物クラスターであるポリオキソメタレートおよびペルオキソメタレートの触媒活性点構造を原子レベルで制御し、触媒活性点上で酸化剤や基質の活性化を行い有害な副産物を生成しない酸化的官能基変換プロセスの開発を目的としている。今年度は、(1)セレンを中心元素に含む新規二核ペルオキソタングステート[(n-C_4H_9)_4N]_2[SeO_4{WO(O_2)_2}_2](触媒I)合成と(2)触媒Iによる過酸化水素を酸化剤とした高効率的酸素添加反応系の構築に成功した。(1)セレン酸とペルオキソタングステートとの反応を種々の分光学的キャラクタリゼーションにより詳細に検討した。タングステンに対して4当量のセレン酸存在下、テトラブチルアンモニウムを添加することで、有機溶媒に可溶な触媒Iの単離に成功した。触媒Iは、VI価のセレンを中心としたタングステン二核構造からなることが明らかとなった。触媒Iは、過酸化水素を酸化剤とするオレフィンのエポキシ化反応に従来のペルオキソタングステートやセレン化合物の中で最も高活性であった。また、基質:過酸化水素=1:1の量論条件下で、種々のアリル型アルコール・ホモアリル型アルコールのエポキシ化反応が化学選択的、位置選択的、ジアステレオ選択的に進行した。スルフィドの酸化反応においては、過酸化水素と基質との量論比を変化させることで、得られる生成物を変化させることができた。1当量の過酸化水素を用いた場合には対応するスルフォキシドを、2当量の過酸化水素を用いた場合には対応するスルフォンを高収率で得た。本年度は、セレンを中心元素に含む新規二核ペルオキソタングステート[(n-C_4H_9)_4N]_2[SeO_4{WO(O_2)_2}_2]による過酸化水素を酸化剤とした高効率的酸素添加反応系の開発と、リンを中心元素に含む二原子欠損型ポリオキソタングステート[(n-C_4H_9)_4N]_3H_4[γ-PW_<10>O<34> (H_2O)_2]の合成・キャラクタリゼーションについて検討した。セレン中心二核ペルオキソタングステートが、過酸化水素を酸化剤とするアリル型アルコール・ホモアリル型アルコールのエポキシ化反応が化学選択的、位置選択的、ジアステレオ選択的に進行することを見出した。速度論や量子化学計算を用いて反応機構を検討した結果、ヘテロ原子にセレン中心を導入することによるタングステン中心のルイス酸性の著しい向上と、触媒と基質であるアルコールとの間の強い水素結合生成による基質の活性化が、従来触媒にはない高い触媒活性の発現に起因することが明らかとなった。また、合成時の出発原料・化学量論・pH・濃度・温度などを厳密にコントロールすることにより、中心元素をリンとする新規な二原子欠損型ポリオキソタングステートの合成を行った。IR、UV-Vis、CSI-MS、P^^<31>及びW ^^<183>
非等価な絶縁層を有する高温超伝導体のジョセフソン・プラズマ及び面間電荷応答

高温超伝導体は二次元的なCuO_2面を持っている。CuO_2面が電気伝導を担い,常伝導状態ではそれに垂直方向方向(c軸方向)は絶縁体的な振る舞いを示す。一方,超伝導状態になると,C軸方向にジョセフソン結合することにより,C軸方向にもキャリアのコヒーレントな運動が可能となる。最も簡素な構造を持ち,かつ比較的低い転移温度を持つ高温超伝導体であるLa_<2-x>Sr_xCuO_4とSmLa1_<-x>Sr_xCuO_<4-δ>のTSFZ法による単結晶作成作成及び,赤外分光器Bruker(204000cm^<-1>)やsubmmメーター分光器(540cm^<-1>)を用いて面内及び面間の光学反射率測定を行った。これらの物質は,今まで,結晶中に小さなグレインが混ざったり,単一ドメインの良質な結晶を得ることが難しく,光学反射率測定において,面内のスペクトルにおいては,絶縁体的な面間(C軸)スペクトルが混じり,面内固有の定量性のある実験結果を得ることが困難とされていた。最近になって,単結晶作成の技術的向上により,非常に均一な良質の単結晶が得られるようになり,面内のスペクトルにおいても定量的な議論が可能な試料が得られるようになった。一方,測定技術においては,従来のフーリエ型赤外分光器では,測定領域外の,低エネルギー領域までをカバーする分光器を最近になって,Stuttgart大学のDresselグループが開発した。このように,本研究の最大の特徴としては,良質の単結晶を用いて,高いエネルギー領域の測定を行ったのみならず,従来では測定できなかった低エネルギーの光学反射率測定までを行ったことである。このことにより,従来では検出できなかったこれらの物質の面内の超伝導応答が,3040cm^<-1>という非常に低いエネルギー領域に抑制されていることが明らかになった。このことからこれらのスペクトルから超伝導凝縮成分を定量的に見積もって,μSRやマイクロ波といった実験方法から得られた実験結果とつき合わせて議論することが可能となり,高温超伝導体の超伝導状態での面内の電子状態に対する知見・理解がさらに深まったといえよう。また面内(c軸)の光学反射率スペクトルに関しては,すでに論文(PRL86,4140(2001))で発表している内容に加え,組成依存性を定量的に調べ,理論的に予想されているCuO_2面に電荷が帯電することによるジョセフソンプラズマの強い抑制(帯電効果)の是非について検証した。その結果,これらの理論から期待される二次元の電荷圧縮率0.25に近い値が,実験結果からも得られ,その理論が妥当であることが実験結果から明らかになった。これらの結果は,秋・春の日本物理学会で報告し,現在,雑誌に投稿すべく,実験結果のまとめ等を行っている。

その結果,これらの理論から期待される二次元の電荷圧縮率0.25に近い値が,実験結果からも得られ,その理論が妥当であることが実験結果から明らかになった。これらの結果は,秋・春の日本物理学会で報告し,現在,雑誌に投稿すべく,実験結果のまとめ等を行っている。
上肢筋力のCross-educationに関わる神経基盤の解明

2018年度は前年度末に完了した研究をまとめて外部に発表した。ひとつは、自作した装置を用いた手指筋力測定の信頼性検証研究であり、結果をまとめて学会発表した。具体的には、若年健常者18名を対象として7±2日の間隔を空けながら2名の検者で3回の測定を実施した。その結果、左右の測定ともにICC(1,1)は0.90以上、ICC(2,1)は0.88以上の値を示し、十分な相対的信頼性が保証された。絶対信頼性に関してはBland-Altman分析で検討し、固定誤差も比例誤差も認められないことを確認した。また、最小可検変化量95%信頼区間を計算し、同一検者が計測する際には2.3 N以上、複数の検者で計測する際には2.9 N以上の変化が観察されたときに有意な変化を検出できることを示した。その一方で、今後実施予定の小規模ランダム化比較試験におけるコントロール群のタスク(端座位での足背屈運動)についても、評価方法とする筋力測定の信頼性検証研究を紀要論文に発表した。具体的には、若年健常者10名の利き足を対象として、研究代表者以外の1名の検者が数日間に渡って筋力測定を実施した。その結果、ICC(1,1)は0.550.75の範囲であった。ICCに関する先行研究に基づいて信頼性は不十分であると解釈し、コントロール群に課すタスクを再考することとした。当初は、さらに大脳皮質ー脊髄運動神経系の機能的連結性を評価する脳波・筋電図計測法を完了させる計画であったが、研究エフォートの確保が想定以上に難しく、計測方法の吟味を行った段階で留まってしまった。補助事業期間延長の承認を受けて、今後はこの実験の遂行を喫緊の課題のひとつとして取り組む予定である。科研費申請時には想定していなかった自身の状況の変化があり、採択期間を通して研究エフォートの確保が難しかった。結果的に、年度ごとの遅れが積み重なって大幅な遅れに繋がってしまった。当初の計画では、2017年度以降に(1)大脳皮質ー脊髄運動神経系の機能的連結性を長期追跡できる脳波・筋電図計測法を確立し、(2)手指筋力のCross-educationに関わる神経基盤解明のための小規模ランダム化比較試験を実施することとしていた。しかし、実際に着手できたのは(1)のみであり、外部へ発表できたのはそれまでに完了した信頼性検証研究のみであったことから「遅れている」とした。Cross-educationを誘導するトレーニングプロトコルについては、主に関連研究の分析によって準備しているが、確認作業が十分でない。したがって、このトレーニングプロトコルの確認作業を速やかに進める。また、コントロール群のタスクとして予定していた運動課題については、上述のとおり、介入効果を調べる筋力測定の信頼性に問題があることが明らかになった。これに対しては、他国から発表されている多くの関連研究の方法を見直し、コントロール群のタスクは安静、あるいは、運動を必要としない心理課題を課すことで対応する。その一方で、上記(1)の大脳皮質ー脊髄運動神経系の機能的連結性を長期追跡できる脳波・筋電図計測法の検討作業も併行して進める必要がある。ただし、これまでの研究エフォートを省みると同じ取り組み方では十分推進できない可能性もあるため、謝金を準備して研究補助者を確保することで対応する予定である。“Cross-education"とは、四肢の片側で運動訓練を行った際に非訓練側でも運動機能が高まる現象のことであり、筋力や運動スキルなどのトレーニングで観察されることが知られている。しかし、この現象の性質や神経基盤は明確でなく、トレーニング手段として応用利用されるには至っていない。本研究では筋力を取り扱い、運動制御系のひとつである大脳皮質ー脊髄運動神経系及び大脳皮質内の機能的連結に着目し、筋力と神経活動の変化を長期追跡することでこの現象の神経基盤を明らかにすることを目的としている。これにより、障害側とは反対側の上肢・下肢からの筋力増強手段を確立し、疲労や疼痛、運動麻痺に対する効率の高い訓練プロトコルの開発に繋げることを目指している。本研究では実験的に扱いやすい手指筋力の計測を計画であるが、既製品で適当なものが無かったため、平成28年度はまずその手指筋力計測装置を作製した。具体的には、TEAC社の協力を得ながらポータブルデジタル指示計とロードセルを組合せ、リアルタイムフィードバックが可能な小型の筋力計測装置を作成した。これにより、筋力計測に関しては場所の制約を受けにくい条件を整えた。その一方で、今後の脳波計測に備えて、実験環境の整備と生体信号収録装置の準備を完了した。現在は、筋力計測及び脳波・筋電図計測の再現性確証を得るためたの実験を進めており、平成29年度内に若年健常者を対象とした介入実験を行う予定である。当初の予定では、再現性を得るための実験は完了し、介入実験についても一部は完了することを想定していたため、明らかな遅れが生じているといえる。この理由のひとつとして、所属機関内での自身の役割が変化したことによるエフォートの大幅な減少が挙げられる。特に平成28年度は役割が変化した最初の年度であったため、そちらにエフォートを譲らざるをえなかった。その他の理由としては、実験に必要な性能を筋力計測装置にもたせるために新製品リリースまで待ったことと、そのこととの兼合いで生体信号収録装置の再選定を進めたことによる、実験準備の遅れが挙げられる。

一般に筋力増強のためには4週間以上のトレーニングが必要であり、Cross-education(四肢の片側で運動訓練を行った際に非訓練側でも運動機能が高まる現象)の発現までにも同様の期間を要することが知られている。したがって、この現象の神経基盤を明らかにするためには、筋力及び神経活動について4週間以上の追跡が可能な計測方法を確立する必要がある。平成29年度は、前年度に作製した手指筋力計測装置を用いて、信頼性のある筋力計測方法を確立した。具体的には、まず手指伸展の筋力発揮課題に伴いやすい代償運動を防ぐため、安定した支持面を与える工夫を施した。次に、手の大きさの性差・個人差に由来する計測肢位のばらつきを認めたため、その調整方法と許容範囲を検討した。このような準備の後に、若年健常者を対象として、独自に考案した手指筋力計測法の信頼性検証を行った。筋力計測の間隔は今後の介入研究を想定して7±2日に設定し、検者内信頼性と検者間信頼性を検証した。その結果、高い信頼性を備えていることが実証され、(1)示指伸展筋力の計測方法の確立を完了した。その一方で、今後の介入研究を見据えたコントロール課題の準備も進めた。先行研究ではコントロール群に対して運動課題が課されていないことが多いが、神経活動の変化を観察する場合は単なる運動後の変化と判別するため、Cross-educationが想定されない遠隔部位(例えば下肢)の運動を課す方が好ましい。このことから、若年健常者を対象として、手指筋力計測と同様の椅座位における足背屈筋力計測の信頼性検証を行った。その結果、類似の先行研究と比較して信頼性が低いことが示され、より制御しやすい運動を選択する必要性が示唆された。今後は、(2)大脳皮質ー脊髄運動神経系の機能的連結性を長期追跡できる脳波・筋電図計測法の研究とともに、コントロール課題の検討も進める予定である。平成28年度の遅れが影響していることと、研究エフォートの確保が予想以上に難しかったことが主たる理由である。当初の計画では、平成28年度中に(1)示指伸展筋力の計測方法の確立を終えて、平成29年度には(2)大脳皮質ー脊髄運動神経系の機能的連結性を長期追跡できる脳波・筋電図計測法の確立と(3)Cross-educationを誘導するトレーニング方法の確立を完了する計画であったが、現在完了しているのは(1)のみであることから「遅れている」とした。2018年度は前年度末に完了した研究をまとめて外部に発表した。ひとつは、自作した装置を用いた手指筋力測定の信頼性検証研究であり、結果をまとめて学会発表した。具体的には、若年健常者18名を対象として7±2日の間隔を空けながら2名の検者で3回の測定を実施した。その結果、左右の測定ともにICC(1,1)は0.90以上、ICC(2,1)は0.88以上の値を示し、十分な相対的信頼性が保証された。絶対信頼性に関してはBland-Altman分析で検討し、固定誤差も比例誤差も認められないことを確認した。また、最小可検変化量95%信頼区間を計算し、同一検者が計測する際には2.3 N以上、複数の検者で計測する際には2.9 N以上の変化が観察されたときに有意な変化を検出できることを示した。
植物ウレイド研究の新展開：アラントインのストレスシグナリング作用と分子機構の解明

プリン体の分解中間体で代表的なウレイド化合物であるアラントインは,植物では長らく窒素栄養の貯蔵・輸送物質と認識されてきたが,乾燥などの過酷環境下で顕著に蓄積し,ストレスに対する植物の適応能力や耐性を高めることを示した。本研究では,このようなアラントインの生理作用がどのような仕組みで発揮されるのかを分子レベルで解明し,代謝中間体の蓄積という一見阻害的な生理現象に秘められた,動けない植物の巧妙な生存戦略の理解を目指す。
中国清朝文書資料に関する国際研究集会の企画立案

本研究計画では、研究分担者を以下の3班構成として研究を実施した。(1)清朝前期の〓案・文献研究班(神田、松村、河内、佐藤、松浦茂)は、主として康煕朝以前の〓案・版本等に関する調査・研究を担当。(2)清朝中期の〓案・文献資料研究班(加藤、細谷、香坂、松浦章、石橋、岸本、楠木)は、主として雍正朝以降の〓案・版本等に関する調査・研究を担当。(3)清朝後期の〓案文献資料研究班(濱下、江夏、中見、ダニエルス)は、主として南京条約以降の〓案・版本等に関する調査・研究を担当。平成4年9月、研究代表者加藤および3班を代表して、(1)班の神田、松村、(2)班の細谷、(3)班の中見の5人が研究打ち合わせ会を開き、当該年度の研究計画と、将来予定される国際研究集会「清代〓案国際シンポジウム」(仮称)に関する協議を行なった。その結果国際シンポジウムは平成8年度開催を目途に準備を行ない、そのために日本側の重要なテーマのひとつである「日本における中国〓案資料研究の現状と課題」(国際集会においては、中国、台湾、イタリア、アメリカ合衆国の研究者が、各々の国における中国〓案資料研究の現状を報告する予定である)について、現在のわが国における〓案研究の状況、また各研究者の抱える問題、そして中国における〓案保存機関の現状などを調査整理することになった。また同年11月、研究代表者と各分担者が会して全体研究会を実施し、清朝文書資料に関する全体的把握と個別研究に関する検討・討論を行なった。そして、これらの調査と研究を総合する報告書を作成した。本報告書は、中国を代表する清朝史研究者である金啓〓氏にも原稿を依頼し、併せて代表者および各分担者たちが実際に調査を行なった中国や台湾の文書保存機関における清代〓案の現状ならびに〓案に関する種々の情報などをまとめている。また、もうひとつの大きな研究課題であるわが国における清代〓案に関する諸情報のデータベース化については、現在、各分担者がそれらを集積・整理中であり、データ処理ソフト等の問題を検討したのち、あらためて具体的なかたちで公表する予定である。
ラ氏島内毛細血管障害におけるII型糖尿病の発症増悪機構の解明

自然発症糖尿病モデルラットOLETF(Otsuka Long Evans Fatty)におけるラ氏島内毛細血管変化を、共焦点顕微鏡によって、β細胞と同時に解析し、毛細血管変化の原因因子と糖尿病発症増悪への関与について分析した。ラ氏島内毛細血管は、インスリン抵抗性が出現し始める8週齢に拡張し始め、糖尿病発症時期には著明な拡張を呈し、糖尿病発症後、狭小化し粗になることが明らかになった。また、インスリン染色性が良好なラ氏島辺縁部では、毛細血管網の密度、径は対照と変わらぬが、内側の毛細血管拡張が顕著であり、最中央部では毛細血管が狭小化し粗であることが判明した。さらに、canaliculiと考えられる微細な流れが、毛細血管拡張部や狭小化部分では見られないことを明らかにし、canaliculiへの流入障害がラ氏島機能に影響していると考えた。この毛細血管には毛細血管症様の構造変化が生じていた。糖尿病発症後のラ氏島では、β細胞が存在しない毛細血管網様構造領域や、毛細血管網が発達していない小β細胞集塊の散在を認めた。。OLETFでは、糖尿病発症時、ラ氏島が肥大化し、一見、十分なβ細胞量が存在するようであるが、ラ氏島内毛細血管変化による血流不全の部分が多く、そのため、一部のβ細胞領域のみが有効な機能を発揮し、相対的にβ細胞機能不足となっていると考えられた。さらに、毛細血管変化の予防により、β細胞機能低下を抑制可能かの検討を試みたが、インスリン抵抗性が改善されてしまい、予防効果は不明であった。。(1)毛細血管変化と糖尿病発症時期との関係を明らかにした。4週齢では正常コントロールとの間にラ氏島の形態および毛細血管に差を認めなかったが、インスリン抵抗性が出現し始める8週齢で、膵ラ氏島の形状は保たれていたが、一部の膵ラ氏島で毛細血管の拡張傾向を認めた。糖尿病を発症しだす16週齢になると、ラ氏島は拡大し、血流の乏しい領域、正常量の領域、血流の増大した領域が混在しているが、大部分で毛細血管の拡張が目立つ様になった。糖尿病を発症して4週間以上経過した24週齢では、拡大したラ氏島内で一部の領域に拡張した毛細血管を認めるのみで、大部分の領域で毛細血管は正常コントロールよりも狭小化し、粗になっていた。ラ氏島毛細血管の拡張が、糖尿病による高血糖以前に生じており、インスリン抵抗性がラ氏島内毛細血管の拡張を引き起こしていると考えられた。16週齢のラ氏島の断面像を観察すると、拡大したラ氏島の最外周部の毛細血管は、正常ラ氏島の毛細血管と比較的近似していたが、その内側の毛細血管は著明に拡張していた。また、最深部では毛細血管を認めず、細胞間のcanaliculiと思われる部分に血流を認め、この段階で、毛細血管網が粗になる変化が生じていると考えられた。24週齢では、毛細血管は狭小化し、canaliculiの血流も減弱していた。(2)透過電子顕微鏡による観察では、毛細血管内の微小血栓を認めなかったが、毛細血管内皮細胞の肥厚化、窓形成、毛細血管を取り巻く周辺組織の肥厚を認め、毛細血管自体の変化が明らかになった。(3)腎糸球体毛細血管も膵ラ氏島毛細血管と同様に拡張しており、経過と共に一部で毛細血管血流の途絶、狭小化が生じていることが明らかになり、膵毛細血管と腎糸球体毛細血管変化が同様に推移していることが明らかになった。平成10年度にラ氏島の毛細血管変化と腎糸球体毛細血管が類似しているという観察結果を得た。

そこで、腎糸球体毛細血管拡張を抑制し、アルブミン尿を低下させる作用のある薬剤ドキサドシン(αブロッカー)投与を行ない、ラ氏島毛細血管に対する効果を検討し、ラ氏島内毛細血管変化と腎糸球体毛細血管変化が同様の機序によって生じてくるか、ラ氏島内毛細血管変化を抑制できた時にラ氏島機能保持が可能であるかを検討した。ドキサゾシン4週間投与により、血圧は正常対照ラットレベルになり、尿中アルブミン排泄量は減少した。体重増加、随時血糖に変化を認めなかったが、HoAlcは投与群で低下傾向をみた。腎糸球体の毛細血管は、非投与群で拡張していたが、投与群で拡張を認めず、ほぼ通常径であった。ラ氏島毛細血管は投与群で拡張を認めず、正常対照よりも細いと思われる程度になっていたが、血管網はほぼ正常対照と同程度の密度であった。膵灌流を行ない糖に対するインスリン分泌反応を比較した。非投与群ではインスリン分泌第1相、第2相ともに正常対照LETOに比し、低反応となっていた。投与群では第1相インスリン分泌は非投与群と差を認めなかったが、第2相の分泌低下が軽度で、インスリン分泌反応の低下は軽度であった。しかしながら、念のために、グルコースクランプを行ない、インスリン抵抗性を検討したところ、投与群ではインスリン抵抗性が非投与群に比し軽度であった。減量や運動によるインスリン抵抗性改善が膵ラ氏島の肥大化や線維化を抑制することがわかっており、インスリン抵抗性改善によりラ氏島内毛細血管変化が改善されたと考えられた。インスリン抵抗性改善作用がなく、ラ氏島毛細血管拡張抑制作用を有する薬剤を捜して検討する必要があると考えられた。
遺伝子導入による新しい骨化抑制療法の開発に向けた脊柱靱帯細胞の生物学的解析

脊柱靭帯骨化症は内軟骨性骨化過程により骨形成・進展をきたし、骨化前線部での細胞分化の調節・制御が本症の病態に深く関与すると考えられる。Wnt/β-cateninは内軟骨性骨化に重要なsignalingであり、脊柱靭帯骨化症におけるWnt/β-catenin signalingの役割について靭帯組織由来の培養細胞、および採取靭帯の脱灰薄切標本を用いて検討した。頚椎後縦靭帯骨化症、胸椎黄色靭帯骨化症の手術時に採取した骨化靭帯より得た培養細胞では、β-catenin、Runx2、VEGFのmRNAの発現は非骨化靭帯由来細胞と比較して高値であり、さらにcyclic tensile strainを24時間加えることで、これら因子のmRNA発現は有意に上昇した。またWntおよびWntreceptorの発現はcyclic tensile strainを加えることによって亢進していた。骨化前線部における免疫組織化学的局在を観察すると、β-cateninは石灰化前線近傍の増殖期軟骨細胞、Runx2、VEGFは石灰化軟骨層の肥大軟骨細胞、WntおよびWnt receptorsは未分化間葉系細胞に強陽性であった。これらの結果から、骨化靭帯細胞では骨芽細胞や軟骨細胞の分化・誘導に関与する因子の発現が高値であり、cyclic tensile strainを加えることでこれらの発現がさらに亢進することは、骨形成の促進に関与する1つの因子であると考えられた。また骨化前線の近傍には血管形成とともに未分化な間葉系細胞がみられ、Wnt/β-catenin signalingを介して骨芽細胞へと分化誘導されることが示唆された。脊柱靭帯骨化症では内軟骨性骨化過程により骨化巣は形成されるが、組織学的には靱帯組織と骨組織の間に存在する骨化前線における細胞の分化が重要と考えられる。本研究では、ヒト脊柱靭帯骨化症(後縦靭帯、黄色靭帯)の手術時に採取した靭帯組織について、組織学的、免疫組織化学的検討を行った。また採取した靭帯から遊走させて得た培養靭帯細胞の生物学的特徴について解析した。採取した黄色靱帯は組織学的評価として、骨化靱帯を脱灰固定して薄切標本を作製し、β-catenin、Osterix、Runx2、Sox9、TGF-βの免疫組織化学的局在を観察した。また、骨化靭帯よりExplant法にて細胞を遊走させて得た培養細胞は、5継代培養して実験を行った。機械的ストレスはFlexercell FX-3000を用いて行い、ストレス反応時間は0、6、12、24時間とした。この際の各因子の発現について免疫組織化学染色およびreal time RT-PCR法にて評価した。その結果、骨化前線部においてβ-catenin、Sox9の発現は間葉系細胞、増殖期軟骨細胞に強陽性であった。Runx2、TGF-βは増殖期・肥大軟骨細胞に広範に発現していた。培養骨化靱帯では、β-catenin、Sox9、Runx2のmRNA発現量は非骨化靱帯と比較して有意に高値であり、機械的ストレスを加えることで発現量はさらに上昇していた。以上より、骨化前線部の軟骨細胞の分化・誘導は成長因子や転写因子を介して行われており、骨化の調節・制御に大きな役割を果たすと考えられた。さらにこれらの因子は骨化靱帯において発現量が高値であり、このことが靭帯骨化形球の背景として存在することが考えられた。また、機械的ストレスは靱帯細胞の骨化誘導因子の発現を増強させ、この異常発現状態が持続することは骨化形成に重要な因子の1つであることが示唆された。Wnt/β-catenin signalingは内軟骨性骨化における軟骨細胞と骨芽細胞の分化に関連しており、このsignalingの異常活性により骨端線閉鎖に異常をもたらすことが指摘されている。脊柱靭帯骨化症におけるWnt/β-

catenin signalingの役割について靭帯組織由来の培養細胞、および採取靭帯の脱灰薄切標本を用いて検討した。頚椎後縦靭帯骨化症、胸椎黄色靭帯骨化症の手術時に採取した骨化靭帯より得た培養細胞では、β-catenin、Runx2、VEGFのmRNAの発現は非骨化靭帯由来細胞と比較して高値であり、さらにcyclic tensile strainを24時間加えることで、これら因子のmRNA発現は有意に上昇した。またWntおよびWntreceptorの発現はcyclic tensile strainを加えることによって亢進していた。骨化前線部における免疫組織化学的局在を観察すると、β-cateninは石灰化前線近傍の増殖期軟骨細胞、Runx2、VEGFは石灰化軟骨層の肥大軟骨細胞、WntおよびWntreceptorsは未分化間葉系細胞に強陽性であった。これらの結果から、Wnt/β-cateninsignalingが骨化前線部の細胞分化に関連しており、特にストレス条件下ではβ-cateninの発現が異常上昇し、それに伴い骨芽細胞の分化を促進させる転写因子の発現が亢進することが推測された。骨化前線部では、成長因子や転写因子を介してautocrine/paracrineに細胞が分化・成熟して層構造を形成するが、Wnt/β-catenin signalingの持続的かつ過剰発現はこれらを異常促進させ、骨化形成・伸展に関与する1つの要因であることが示唆された。
実験的歯周炎における歯肉溝滲出液、歯肉および歯槽骨プロテオグリカンの動態

歯肉溝滲出液(GCF)に含まれるプロテオグリカン(PG)の炎症に伴う分子量の変化、由来組織は不明である。本研究はイヌ実験的歯周炎の進行に伴うGCF,歯肉,歯槽骨のコンドロイチン4硫酸プロテオグリカン(C4S-PG),コンドロイチン6硫酸プロテオグリカン(C6S-PG),デルマタン硫酸プロテオグリカン(DS-PG)の分子量の変化と、それらを各サンプル間で並列比較検討してGCFの由来組織を考察するために行った。雑種成犬12頭の臼歯部歯肉に絹糸を2重に結紮して実験的歯周炎を惹起し、0日(健常,非結紮)、結紮3,7日(急性炎症期)、21日(慢性炎症期)の各ステージで、血清、GCF、歯肉、骨を採取し、サンプルを抽出し、作製し、その後各サンプルはウエスタンブロティングを行い、モノクローナル抗体(2-B-6,3-B-3)を用い免疫染色を行った。
骨による骨格筋増強作用の分子メカニズムの解明

骨と骨格筋はどちらも環境、および、年齢に応じて、筋量・骨量が同調して変化するため、骨と筋肉の間のクロストークが存在するのではないかと考え、その相互作用を解明するために、本研究を行った。研究のモデルとしては、培養細胞系を用いて、骨芽細胞株と筋芽細胞株の共培養を行ったところ、分化した骨芽細胞との共培養により、筋芽細胞の融合が進み、形成された筋菅が自発的な収縮を起こすことが明らかとなった。本研究により、骨芽細胞と筋芽細胞の間には筋芽細胞の分化を促進する直接作用が存在することが明らかとなった。骨と骨格筋はどちらも環境、および、年齢に応じて、筋量・骨量が変化するが、その増減は同調することが多い。栄養、成長ホルモン、性ホルモン、運動などは筋量・骨量の増加に寄与し、一方、飢餓、加齢、グルココルチコイド、などは筋量・骨量の減少に寄与する。外部からのシグナルだけでなく、筋量・骨量の増減を同調させる骨と筋肉の間のクロストークの存在の可能性が考えられた。すでに筋肉から骨への作用については、骨格筋の収縮によるメカニカルストレスが骨量の増大にすることが明らかとなっているだけでなく、骨格筋の分泌するマイオカインの重要性が明らかとなっている。しかしながら、骨から骨格筋に作用する分子には不明な点が多い。そこで、本研究では骨と筋肉のクロストークの中でも骨から筋肉へ作用する分子の同定することを目的として研究を行った。骨のモデルとして、骨芽細胞を用いて、未分化な骨芽細胞と骨分化した骨芽細胞で遺伝子発現をRNA-seqにより網羅的解析した。統計的に有意に骨分化誘導に伴って発現が4倍以上に増加する遺伝子として、143遺伝子が検出された。続いて、DAVIDのGene ontology解析により、分泌される因子を抽出したところ、32個の遺伝子が得られた。Ccl8、Ccl2、Il18、Il34といったサイトカインの発現が増加することが明らかとなった。RNA-sequenceの結果を確認するために、QPCR解析を行ったところ、サイトカイン(Ccl8、Ccl2、Il18、Il34)の発現の上昇を確認することができた。本研究の最終目標は骨と骨格筋のクロストークを解明することであり、残り1年でこれまで得られたサイトカインの解析を行うことは妥当であるから。この筋芽細胞の分化亢進は、骨芽細胞のconditioned mediumの添加や筋芽細胞と骨芽細胞が直接接触しないTranswellを用いた共培養では観察されなかったことから、細胞ー細胞間の直接の接触が必要であることがわかった。共培養開始後24時間ではMyogeninの発現がRNAレベルでもタンパクレベルでも増加しており、Myogeninの発現を誘導することが筋芽細胞の分化亢進に重要であることが示唆された。また、筋芽細胞の分化の様子を観察するために、GFPで可視化した筋芽細胞と骨芽細胞の共培養を蛍光タイムラプス顕微鏡を用いて解析したところ、共培養により筋芽細胞の移動度が亢進し、細胞が突起を伸ばす像が得られた。このことは骨芽細胞が筋芽細胞の細胞骨格に作用することを示唆している。今後の課題としては、クロストークの分子メカニズムを解明するために、シグナル分子を同定することである。これまで得られたサイトカインを購入もしくは、合成し、筋芽細胞株を用いてin vitroで評価する。骨格筋
不育症克服を目指した新規胎盤関連因子の探索と機能解析

本研究ではまず、独自の細胞材料とマイクロアレイを組み合わせた網羅的解析から新規胎盤関連候補遺伝子を探索し、続いて、得られた候補遺伝子のマウス個体レベルでの機能解析を行った。その結果、1過剰発現により胎盤形成不全や胎仔発育不全を呈する遺伝子、ならびに、2発現欠損により、胎盤肥大や分娩異常、新生仔貧血や新生仔期高死亡率など、出産前後の母仔に複数の異常を呈する遺伝子、を見出すことに成功した。これらの遺伝子改変マウスは、新しい不育症モデルになり得ると期待できる。本年度は、前年度の探索研究によって見出された8つの新規胎盤関連候補遺伝子を対象として、生理的な意義の解明を目的としたin vivo解析に着手した。具体的な成果を以下に示す。1胎盤特異的遺伝子操作技術を利用したin vivo機能解析各候補因子のcDNAを発現するレンチウイルスベクターを構築し、透明帯を除去したマウス胚盤胞期胚に感染させて偽妊娠マウスに移植することで、栄養外胚葉層ならびに胎盤特異的な過剰発現を行った。原因は不明であるが、3つの候補因子については、マウス初期胚への遺伝子導入に十分な高力価のレンチウイルスベクターを得る事ができず、過剰発現実験は行えなかった。残りの5つの候補因子について、移植後胎生13.5日目に解剖して生存している胚の数をコントロール群と比較したところ、若干の増加や減少の傾向はあるものの、有意な差は認められなかった。そこで、さらに詳細な解析を行ったところ、1つの候補因子については、胎生18.5日目の胎児ならびに胎盤重量の有意な低下が確認され、胎盤組織切片を観察したところ、海綿状栄養芽細胞層が減少していることが明らかとなった。現在、ヒト不育症病態との関連性等について解析を進めている。一方で、shRNA発現レンチウイルスベクターを利用した同様の解析ではどの因子も明らかな表現型を示さなかったが、in vivoにおける発現抑制効果が十分でないためと考えられたため、ノックアウトマウス作製による確実な解析を行う事とした。2ノックアウトマウスの作製ならびに解析8つの新規胎盤関連候補遺伝子全てについて、ノックアウトマウスの作製を行った。短期間で完成させるために、3つの因子については組換えES細胞を、5つの因子についてはターゲティングベクターを、The International Mouse Phenotyping Consortiumから購入した。現時点で5系統のヘテロマウスが完成しており、ホモ化を進めるとともに種々の解析に着手している。本年度は、これまで偶発的に発見されてきた胎盤関連因子を系統立てて探索し、生理的に重要な意義を持つ新規因子を発見することを目的として、独自の細胞材料とマイクロアレイ解析を利用した網羅的スクリーニングに着手した。1マイクロアレイ解析による胎盤関連因子の網羅的探索:本研究では、胎盤の最外層を形成し、着床や胎盤形成に重要な役割を果たしていると考えられている巨大栄養膜細胞(giant cell)に着目した。我々はこれまでに、マウス胚盤胞期胚から樹立した栄養膜幹細胞(TS cell)を、一定の培養条件下でgiant cellに分化させることに成功しており、この細胞がin vivoの性質を反映していることを明らかにしている。そこで、TS cellとgiant cellに発現する遺伝子ならびにmiRNAを、マイクロアレイ解析により網羅的に比較した。2胎盤関連候補因子の絞り込み:2回ずつのマイクロアレイ解析で共通して差があった因子を抽出し、構造や機能、発現部位などに関する情報を最新のデータベースを利用して検索した。miRNAについては現在解析を進めている途中であるが、遺伝子に関しては、胎盤に豊富に発現している遺伝子や、発現が胎盤に限局している遺伝子、胎盤における機能が未知の遺伝子など、8つに絞り込むことができた。RT-PCR解析により、8つの候補遺伝子全てがgiant cellに高発現しており、さらに、マウス胎盤組織においても発現していることが確認された。また、胎盤以外の主要組織における発現についても調べた結果、ほぼ胎盤のみでしか発現が検出されない遺伝子が4つ存在した。以上の結果より、in vivo解析に進める8つの遺伝子を決定した。初年度は、これまで偶発的に発見されてきた胎盤関連因子を系統立てて探索し、生理的に重要な意義を持つ新規因子を発見する事を目的として、独自の細胞材料とマイクロアレイ解析を利用した網羅的スクリーニングを行った。その結果、8つの新規胎盤関連候補遺伝子を見出し、H25年度には、胎盤特異的な遺伝子操作技術を駆使して各候補遺伝子のin vivo機能解析を進めるとともに、遺伝子欠損マウスの作製にも着手した。最終年度となる本年度は、完成した遺伝子欠損マウスの解析を中心に研究を遂行し、興味深い表現型を示す遺伝子X欠損マウスを見出した。遺伝子Xは妊娠後期のマウス胎盤で特異的に発現上昇しており、遺伝子X欠損マウスでは出産前後の母仔に複数の異常が観察された。

具体的には、胎生18.5日目の胎盤が野生型の2倍以上にまで肥大し、遺伝子X欠損雌雄を交配した雌マウスは、時期が来ても分娩出来ずに死亡した。また、遺伝子X欠損新生仔は体色が明らかに白い貧血様の外観を呈し、その多くは数日以内に死亡するか、著しい成育不全により離乳前に死亡した。胎盤肥大や分娩不全、新生仔貧血や新生仔期高死亡率といった、個々の表現型を呈する遺伝子欠損マウスはこれまでにも報告されているが、全てを同時に引き起こすマウスは前例がない。複数の周産期障害を呈する遺伝子X欠損マウスは、個々の異常についてはもちろんのこと、それぞれがどのように他の異常と関わっているかについて個体レベルで解析できる、全く新しい疾患モデルになり得ると期待できる。発生工学・遺伝子工学・生殖生理学胎盤関連因子の探索は、遺伝子とmiRNAの2つに着目して遂行する予定であったが、miRNAに関しての解析が予定よりも遅れている。胎盤関連因子の探索は、遺伝子とmiRNAの2つに着目して遂行する計画であったが、miRNAに関しての解析が予定よりも遅れている。本研究で見出された新規胎盤関連候補遺伝子について、現在独自に作製を進めているノックアウトマウスを完成させる。完成したノックアウトマウスは、各候補遺伝子の個体レベルでの機能解析に利用するとともに、不育症モデルマウスとしての有用性を評価し、不育症の原因究明や予防・診断・治療法開発に繋がる知見の収集を目指す。初年度の計画では、胎盤関連因子の探索について、遺伝子とmiRNAの解析を並行して行う予定であったが、興味ある候補遺伝子が多く見出されたため、最終年度の解析は遺伝子のみに対象を絞る計画に変更する。胎盤関連miRNAについてはin vitro解析を続行し、in vivo解析に進める因子の絞り込みを行う。胎盤関連遺伝子については、in vitro解析により決定した8つの候補をin vivo解析に進め、生理的な機能を明らかにする。年度末に少額の研究費が残ったが、基金化により使用の自由度が上がったため、無理な使い切りは行わなかった。本研究に必要な消耗品の購入に使用する。該当なし
様々な遺伝子操作動物を応用した睡眠覚醒関連神経回路網の機能的同定

カルシウムイメージング法を用いてオレキシン神経活動に影響を与える物質のスクリーニングを行い、新たな調節物質として、ニューロテンシン、コレシストキニン、バソプレシン、オキシトシンを同定した。なお、コレシストキニン(CCK-8S)についてオレキシン神経特異的に緑色蛍光タンパク質を発現するトランスジェニックマウスを用いスライスパッチクランプ法により、その作用機序を解析した。CCK-8Sの反応はCCKA受容体阻害薬で阻害薬濃度依存的に阻害され、また、CCKB受容体作動薬では反応は見られなかった。さらにオレキシン神経細胞上にCCKA受容体が発現していることを免疫組織化学的解析により確認しており、CCK-8Sによる作用はCCKA受容体を介していることが明らかになった。また、CCK-8Sによる内向き電流は細胞外液のNa除去により、ほぼ消失し、細胞外のCaの除去で増大した。さらに内向き電流は非選択的陽イオンチャネルの阻害薬で抑制された。以上から、CCK-8SはCCKA受容体を介して非選択的陽イオンチャネルの開口を引き起こし、オレキシン神経を脱分極させることが明らかになった。次に、細胞内カルシウム上昇の機序について検討した。電位依存性カルシウムチャネルの阻害薬で、細胞内カルシウムイオン濃度の上昇の持続時間は抑制されたが、カルシウム濃度上昇のピーク値は変化なかった。一方、非選択的陽イオンチャネルの阻害薬でカルシウム濃度上昇が抑制されたことから、細胞内カルシウム濃度上昇に非選択的陽イオンチャネルの関与が示唆された。CCK-8S、バソプレシン、オキシトシンは脳内に広く発現しており、扁桃体での発現も確認されていることから、これらが情動による睡眠覚醒調節に関与している可能性が示唆された。
黒毛和種牛バンド3欠損症における致死性回避の分子機構

赤血球の主要膜内在性蛋白質であるバンド3は、従来、生命推持に必須とされてきた。本研究は、黒毛和種牛の遺伝性バンド3欠損症における知見をもとに、この定説の妥当性を検討し、代償機構を解明することを目的とする。得られた成果の概要は以下のとおりである。1)遺伝子型と赤血球表現型との解析により原因遺伝子異常がR664X変異であること、本疾患が優性遺伝形式をとることを実証した。2)赤血球膜病態の解析に基づき、ホモ接合型とヘテロ接合型の赤血球球状化機序が異なること、即ち、前者ではバンド3-アンキリンースペクトリン間結合の消失が、後者では変異バンド3のドミナント・ネガティプ作用によるバンド3減少がそれぞれ球状化の原因となることを示した。これらの知見から膜骨格の形成とバンド3の生合成とが独立した現象であり、バンド3は膜骨格形成には不要であるが、その後の膜安定化に必須であることを提唱した。3)バンド3完全欠損赤血球には本来は前駆細胞のみにみられるバンド3の構造類似体AE2によるアニオン輸送能が存在することを解明した。さらに、迅速なアニオン輪送は全く代償さえておらず、バンド3によるアニオン輪送は平常時のガス交換に必須の要索ではないことを実証した。A.新生子期の高致死率をもたらす要因の解明1.新生子期における赤血球の膜蛋白質、膜脂質、血漿脂質等を解析し、成牛赤血球との相違を検討した結果、牛の場合、出生直後の血液が老化した形態異常(Poikilocytosis、あるいはAcanthocytosis様)を示す赤血球で占められることが判明した。これは出生前後の時期、生理的な赤血球の産生低下が生じていることを示すものである。この時期の赤血球の変形能、安定性を検討中である。B.ヘテロ接合型個体における潜在病態の解明1.先に確立したPCR-RFLP法により、約150頭の黒毛和種牛の遺伝子診断を実施、20頭のヘテロ接合型個体を検出・同定した。2.上記へテロ個体とホモ個体について、一般臨床検査、赤血球膜蛋白質構成、赤血球形態、アニオン輸送の解析を行い、ヘテロ接合型赤血球に表現型の異常、即ち、バンド3、他の膜骨格蛋白質の部分欠損、球状赤血球症、アニオン(^<35>SO_4^<2->)輸送能の低下が明らかなこと、したがって本疾患が常染色体性優性遺伝であることを立証した。同時に、赤血球産生が盛んで球状赤血球症による貧血を完全に代償していることが判明した。C.酸素・二酸化炭素交換の代償機構の解明1.既報でホモ接合型赤血球内の塩素イオン濃度の低下、pHの上昇が明らかとなった。水チャネルブロッカー等を用いた各種条件下における検討から、これが赤血球内におけるHCO_3^-の蓄積によるものとの示唆を得た。したがって、二酸化炭素の効率的運搬に患牛赤血球は寄与していないことになる。その代償作用として、今後、炭酸脱水素酵素(CA)の適応、特にを、末梢組織で産生されたCO_2を赤血球外でHCO_3^-へ変換するアイソザイムCAIVの発現(mRNAと蛋白質の検索)を解析する。D.バンド3欠損が他の膜骨格蛋白質の部分欠損をもたらす機序の解明1.特にバンド3欠損にともない、ほぼ完全に消失するP4.2に焦点をあてた解析を培養細胞系で行うために、牛赤血球膜P4.2の遺伝子(cDNA)を単離した。逆に、量的変化を認めないP4.1についても同様の目的でcDNAの単離を行っている。A.新生子期の高致死率をもたらす要因の解明1.新生子期における赤血球の形態異常(Poikilocytosis、あるいはAcanthocytosis様)が膜脂質の過酸化によるものであるとの仮説を検証中である。特に、牛赤血球ではヒトや他の動物種と異なり、血漿脂質との交換反応が起きやすいフォスファチジルコリンがなく、起きにくいスフィンゴミエリンか多いことに焦点を当て、その過酸化産物の膜内蓄積を検討中である。

B.ヘテロ接合型個体における潜在病態の解明1.ヘテロ接合型赤血球膜でのバンド3存在様式・多量体形成を、非イオン性界面活性剤による可溶化、ゲル浸透クロマトグラフィーによるサイズ分画により解析し、正常赤血球と比較検討した。その結果、ヘテロ赤血球におけるバンド3の部分欠損は、量的異常によるものであり、多量体の形成異常等の質的異常によるものではないことが明らかになった。2.小胞体存在下、in vitro合成した正常、ならびにR664X変異バンド3の免疫沈降、およびサイズ分画の検討から、本疾患の原因遺伝子異常であるR664X変異が、正常バンド3の発現に対してドミナント・ネガティブに作用し、その発現を阻害することが判明した。3. NOSAI山形の伴らと共同で臨床現場でのスクリーニング、遺伝子診断を実施し、遺伝コントロールを行い著効をあげた。C.酸素・二酸化炭素交換の代償機構の解明1.既報でホモ接合型赤血球内の塩素イオン濃度の低下、pHの上昇が明らかとなった。赤血球内におけるHCO_3^-の蓄積によるものと考えられ、イオンクロマトグラフィーでその実証を試みている。D.バンド3欠損が他の膜骨格蛋白質の部分欠損をもたらす機序の解明1.バンド3と相互作用する可能性のある膜蛋白質P4.2、P4.1、ならびにアンキリンの各cDNAを単離した。Xenopus卵母細胞で、バンド3とこれらを同時に発現させると、バンド3の活性発現に対しP4.2は抑制的に作用し、一方アンキリンは増加させた。このことは、P4.2とアンキリンが、バンド3の膜への輸送途中で何らかの調節作用を有することを示唆するもので、本疾患におけるバンド3以外の膜蛋白質の減少機序、ならびに生理的膜構築機構の解明に有用な知見である。詳細を検討中である。1.新生子期の高致死率をもたらす膜病態の解明(1)新たに、同じくR664X変異のホモ接合型で赤血球膜のバンド3を完全に欠損していながら、(a)スペクトリン、アクチンが著しく減少し、膜の物理的安定性が極度に低下している個体と、(b)スペクトリン、アクチン含量が正常で、膜安定性の低下がある個体とが存在することが判明した。膜骨格構成蛋白質の機能異常、脂質構成の異常の両面から解析を進めている。(2)新生子期における赤血球の形態異常(Poikilocytosis、あるいはAcanthocytosis様)が膜脂質の過酸化によるものであるとの仮説を検証中である。2.ヘテロ接合型個体における膜病態の解明(1)無症候性ヘテロ赤血球の膜ではバンド3の部分欠損により膜骨格蛋白質にも減少が生じ、物理的安定性が極めて低下していること、即ち本疾患が常染色体性優性遺伝で、かつcombined band 3 deficiencyであることを明らかにした。(2)ヘテロ接合型赤血球におけるバンド3の部分欠損は、膜骨格と連結されていないダイマー、連結されているテトラマー両者に生じている量的異常であることが明らかになった。(3)へテロ接合型ではR664X変異mRNAがバンド3RNA総領の25-30%を占めること、正常バンド3とR664X変異バンド3が結合し得ること、カエル卵母細胞発現系における正常バンド3による陰イオン輸送がR664X変異バンド3の存在(量比1:0.25-1:4)で明確に阻害されること明らかにした。これらから、本疾患の原因遺伝子異常であるR664X変異が、正常バンド3の発現に対してドミナント・ネガティブに作用することが判明した。
ABO血液型不適合移植腎障害におけるADAMTS13、vWFと免疫学的順応

ABO血液型不適合腎移植では多くの症例で免疫学的順応が成立するが、その成立維持機構は不明である。一方いまだに一部の症例では抗体関連拒絶反応や血栓性微小血管障害による腎障害がおこる。われわれはこの現象に着目しグラフト側因子としての腎血管内皮血液型糖鎖抗原とアンカー蛋白であるPECAM-1、vWF,ADAMTS13の役割について明らかにするとともに、レシピエント側因子として、免疫学的順応成立患者においてはドナー血液型抗原特異的な抗体産生の抑制が起こっていること、その本態はB細胞性アナジー(免疫学的不応答性)誘導の結果であることを新たに見出し、免疫学的順応誘導機構の解明に一歩近づいた。今年度は研究初年度であり、1臨床症例の臨床病理学的並びに血液学的検討、2ABO血液型糖鎖抗原合成糖鎖と血管内皮細胞特異的蛋白質の結合試験を主におこなった。1自施設におけるABO血液型不適合腎移植症例の0時間・1時間・イベントまたはプロトコル腎生検標本におけるADAMTS13、vWF、Fibrinogen,C3c,C4d,IgG, IgMの系統的活経時的変化と臨床経過について検討を行った。移植後抗体関連型拒絶反応(AMR)、血栓性微小血管障害(TMA)を発症した症例とそれ以外の症例において血管内皮細胞障害が強い症例においては臓器障害の前後でADAMTS13活性の一時的な低下と回復が認められた。2合成血液型糖鎖をコードする遺伝子をHEK293細胞にトランスフェクトし、合成糖鎖を発現する細胞を作成し、その発現状態をイムノブロッティング・フローサイトメトリーで確認した。平成26年度に研究を開始した。平成27年度は昨年度に引き続いて1臨床症例の臨床病理学的検討、血液学的検討2ABO血液型糖鎖抗原合成糖鎖と血管内皮細胞特異的発現蛋白質の結合実験を進めた。1についてはABO血液型不適合腎移植症例の移植0時間生検、1時間生検、イベントまたはプロトコル生検標本をもちいてADAMTS13,vWF,Fibrinogen, C3c, C4d, IgG,IgMの系統的・経時的変化と臨床経過の関連について検討を進めている。移植後抗体関連型拒絶反応(AMR)・血栓性微小血管障害(TMA)発症症例ではADAMTS活性低下が認められた症例があるが、平成27年度はABO血液型不適合腎移植症例数が2例で、うちAMR・TMA発症は見られなかったため、昨年度に比べて十分な進展・検討が進んでいない。2ABO血液型糖鎖を発現したHEK293細胞は作成できたが、腎血管内皮細胞において観察されたvWF, PECAM-1などの血管内皮細胞特異的機能蛋白質を共発現させることが上手くてきていない。そこで血液型抗原サブタイプ構造をもつ人工合成糖鎖をもちいてヒト血清における抗A抗B抗体の血液型抗原サブタイプ別の抗体価を測定する系を新たに作成し、まず抗体の特異性についての研究を進めている。1ABO血液型不適合腎移植の腎生検標本におけるADAMTS13vWFをはじめとする凝固線溶系及び補体関連分子のの免疫組織学的検討は徐々に進んでいるが、症例数が限られる上にAMRやTMAを発症する症例は近年少なくなっているため、期待するほどの症例数・検体数が集まりづらい。2In vitroにおける培養細胞で血液型糖鎖抗原と血管内皮細胞特異的機能蛋白質をInVivoにおけると同様にmimicした細胞をもちいて基礎的検討を行う予定でいるが、上記糖鎖抗原と蛋白質を共発現する細胞の開発が滞っており、糖鎖サブタイプに対する抗体特異性の検討にとどまっている。平成26年度・27年度は1臨床症例の臨床病理学的並びに血液学的検討、2ABO血液型糖鎖抗原合成酵素と血管内皮細胞特異的蛋白質の合成を主に行った。1においては自施設におけるABO血液型不適合腎移植症例の0時間・1時間・イベントまたはプロトコル腎生検標本におけるADAMTS13,vWF,Fibrinogen, C3c, C4d, IgG, IgMの系統的経時的検索と臨床経過についての検討を行った。その結果、移植後に抗体関連拒絶反応(AMR)、血栓性微小血管障害(TMA)を発症した症例とそれ以外の症例の比較では、血管内皮細胞障害の強さに応じて臓器障害発症の前後におけるADAMTS13活性の一時的な低下とその後の回復が見られることが明らかとなった。2では血液型糖鎖合成酵素をコードする遺伝子をトランスフェクトしたHEK293細胞において、合成酵素の産生状況をイムノブロッティングとフローサイトメトリーで確認した。次の段階としてvWF,PECAM-1などの血管内皮細胞特異的蛋白質の遺伝子トランスフェクトによりこれらの蛋白質を発現させ、HEK293細胞膜上で血液型糖鎖+アンカー蛋白(vWFまたはPECAM-1)を共発現させることによりin vivoの腎血管内皮細胞にmimicさせた細胞の作成を試みた。平成28年度後半に入りようやく血液型糖鎖とvWF,PECAM-1の共発現が確認できた。ここから抽出したヒト腎血管内皮細胞類似の糖鎖アレイを用いた、患者血清中の抗A抗B抗体のポリクローナリティと特異性の解析系を確立でき、血管内皮細胞障害におけるADAMTS13とこれらの分子との相互作用についての解析が可能になった。