hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
NMR緩和法による超高速化学反応速度の決定-分子内電子移動反応の場合

2.本系では、反応系と生成系は常に平衡状態に保たれている点で、これまでの光励起過程を含む超高速反応系と異なっている。本系では、反応系と生成系双方に対する擬似的な溶媒和平衡を考慮する必要があることが示唆された。NMR-スピン格子緩和時間やESRスペクトルから、溶液内でのピコ秒オーダーの分子内電子移動速度定数を以下の系について決定した。それぞれの結果について簡単に記す。(i)ビスフェロセニルアセチレンモンカチオン(Fe(II),Fe(III))昨年度の研究によって明らかになった、ビフェロセンモノカチオンに比べ、数倍程度大きな電子移動定数が得られた。この結果は、ITバンドの測定から得られた再配列エネルギーの結果からは予想し得ないことである。この結果は、アセチレンブリッジの導入によって、2つのフェロセンユニット間のコンフォーメ-ショナルな剛直生が増し、トンネルによる電子移動の効果がより効率的に起こっているためであると考えられる。事実、速度定数の温度依存性の結果はこの考察を支持している。(ii)1,3-ジニトロベンゼンアニオンラジカル低濃度の対イオン(ナトリウムイオン)をクリプテートにより包摂することによって、対イオンとの相互作用を排除した分子内電子移動速度の溶媒依存性の結果を得た。従来報告されている電解法による研究では、支持電解質とラジカルアニオンの相互作用が反応速度に多大な影響を及ぼしていることをしめした。一方、本研究による、速度定数、超微細結合定数、ITバンド測定の結果は、溶媒和の程度により、移動する電荷が異なることをはっきりと示した。上記二つの系に関して、電子移動速度に対する溶媒効果にたいして、共通に示された結果は以下の通りである。観測された反応速度は、溶媒の動的効果を取り入れたいかなる理論から予想される値よりも5-10倍以上大きい。この原因として、1.溶媒の局所的な高速モードが速度定数に対して重要な効果をあたえる。2.本系で取り扱っているいるような対照的な反応系では、トンネル効果が重要な役割を担い、溶媒和の揺らぎに伴う、トンネルスプリッティングのゆらぎ及びそのダイナミックスが反応速度の溶媒依存性に重要な効果をもたらしている。平成8年度、9年度の研究により確立された、NMR-スピン格子緩和時間から溶液内でのピコ秒オーダーの分子内電子移動速度定数を決定する方法を、以下の系について適用した。まず、それぞれの結果について簡単に記す。(1)ビスフェロセニルアセチレンモノカチオン(Fe(II),Fe(III))9年度の研究によって明らかになった、予想を大きく上回る(数倍)電子移動定数について検討を加えた。ITバンド、ESRなどの測定結果を総合すると、この以上に大きな速度を与える原因として、(i)アセチレンブリッジの導入によって、2つのフェロセンユニット間のコンフォーメーショナルな剛直性が増し、トンネルによる電子移動の効果がより効率的に起こっている。
大型エアガンによる深部地震基盤構造の精密探査

深部地震基盤構造を探る新しい方法として本来海洋に用いる大型エアガンを応用する手法が有効たり得ることが昭和59年度に示された。本研究はこの成果を踏まえ、宮城県釜房ダム湖周辺において構造探査実験を行った。エアガンの設置、操作、回収は前回の経験を生かしていくつかの改良を行ったためほぼ遅滞なく実施できた。エアガンの作動は東北大学現百システムにより行い借り上げた発電機を用いて動かした。発音は100kg/【cm^2】で70秒間隔で、ノイズの少ない夜間に動作させた。受信システムは移動用にアナログ型カセット録音方式のシステムと東北大学微小地震観測ネットワーク常設点のうち釜房、青葉山、蔵王、北阿武隅、川渡についての連続アナログ録音記録システムである。前者は上下動4、5Hzセンサ出力でダム周辺の構造決定のためのデータを得た。後者は遠方(約60km)までの伝播を調べるために観測した。近傍の構造探査は東西と南北の2測線を共に約13km、各20点以上の観測を行った。この結果、上部地かくの構造を2.9、4.3、5.5km/s層より成るものとして説明した。観測点数が多いため第1層の厚さの2次元分布も推定することができた。なおデータの処理はアナログカセットをカセットデッキで再生し、高速デジタル変換してマイクロコンピュータで行った。観測点の構造探査のための配置は今回は大きくとっていないが、常設点のデータ処理(主に信号の重合)を行った結果、60kmは充分信号の確認のできることがわかった。これはみかけ連度は6km/s程度なのでまさに初動を観測できたものと考えられる。したがって本手法により約100kmスケールの構造探査が行えるということで、その場合、範囲内に湖を見出すことはむつかしくないため、この方法の安全、簡便性とあいまって実用的であり新しい知見が期待できる。
イオン導電性アクチュエータ駆動型調節可能眼内レンズの開発

私は2015年より筑波大学医学医療系と共同でイオン導電性高分子アクチュエータによる白内障治療用調節可能眼内レンズの開発に取り組んできた.白内障治療の市場規模は2019年には4000億円(世界)に達すると予想され,日本では年間140万枚の眼内レンズが出荷される.しかしその大半が海外製であり,国産化が急務である.一方で,眼内レンズは焦点距離調節機能がなく,世界中で調節可能眼内レンズ(パッシブ)の研究が取り組まれているが,多くの欠点が存在する.我々はイオン導電性高分子アクチュエータという0.1mm厚級で眼内に挿入可能な機能材料を用いて,能動的に駆動する調節可能眼内レンズを提案する.本研究ではレンズ・アクチュエータ一体化と,ゲルレンズの弾性制御による乱視抑制に取り組み,高分子アクチュエータの医療機器材料としての優位性を示す.今年度はレンズ・アクチュエータの一体化を行い、学会発表を2件行った。アクチュエータのカプセル化を実現したという発表である。更に眼内埋め込み可能なサイズのアクチュエータ・及び人工ゲルレンズを作成済みであり、現在実験中である。また別予算研究であるが、特許申請も行った。調節可能眼内レンズのためのオートフォーカスシステムの特許で、患者が直感的に眼内レンズを操作できるようになるのみならず、どうやって眼内に電気エネルギーを伝達するかの方法にも触れている。以上のように性能向上だけでなく、実用化のための周辺技術の開発も進め、特許化した。近日中に論文投稿にいける状態となっており、概ね順調といえる。計画通り遂行することになる。別予算で筑波大学拠点AMEDの研究も行っており、併せて遂行する必要がある。研究所のネットセキュリティの動向を鑑みて、PCの納入を一時保留していた。なお、このPCは2019/05/14現在、既に納入済みである。
プロテオミクス手法による悪性黒色腫の新規癌抗原の同定と遠隔転移の抗体治療法の開発

定量的プロテオーム解析により、正常ヒト色素細胞と比較して悪性黒色腫細胞株にて高発現する膜タンパク質を探索し、癌抗原候補分子としてLSRを同定した。悪性黒色腫細胞株に本癌抗原候補分子が高発現することをFACS解析により明らかにした。また、悪性黒色腫組織中に本癌抗原が高発現することも免疫組織化学染色法により明らかにした。本癌抗原に対するニワトリ・マウスキメラモノクローナル抗体を6種類取得することに成功した。一部のクローンは癌抗原陽性細胞に対してin vitroで細胞増殖抑制効果を示したため、抗腫瘍効果の詳細な機序について、in vitroおよびin vivoで検証を進めている。悪性黒色腫はさまざまな臓器に転移する性質を持ち、化学療法も効き難いため予後が極めて悪い腫瘍である。そのため、悪性黒色腫に対する新規治療法の開発が必要とされている。本研究では独自に開発した細胞表面膜タンパク質に対する定量的なプロテオミクス解析を悪性黒色腫に対して行うことにより、抗体医薬品開発の標的となる抗原タンパク質を同定することを目的とした。さらに、癌抗原に対するモノクローナル抗体を開発し、悪性黒色腫の肺転移モデルマウスに対して、抗体を用いて悪性黒色腫の遠隔転移モデルに対する抗腫瘍効果をin vivoイメージング装置を用いて定量的に解析することで証明することとした。本年度において、悪性黒色腫細胞株として、A2058、G361、Mewo、SK-MEL5、SK-MEL28、VMRC-MELG、WM266-4、コントロール細胞として、メラノサイトを用いて細胞表面膜タンパク質のビオチン標識とアビジンビーズによる濃縮、トリプシン消化した後、iTRAQ試薬によるペプチドの標識と質量分析計による測定により、各種細胞における膜タンパク質の網羅的な定量解析を行った。その結果、491種類のタンパク質を同定し、114種類(23.2%)の膜タンパク質が含まれていた。同定されたタンパク質の中にはEGFRやHGFRなど増殖因子に対する受容体も含まれていた。その他に、悪性黒色腫に対する新規癌抗原候補分子が数種類検出されていた。現在、iTRAQ解析により得られた発現変動をしめす悪性黒色腫における新規癌抗原候補分子についてウェスタンブロット法などの手法で検証している段階である。昨年度までに、コントロール細胞としてメラノサイト、悪性黒色腫細胞株としてA2058、G361、Mewo、SK-MEL5、SK-MEL28、VMRC-MELG、WM266-4との間での、細胞表面膜タンパク質の発現差についてiTRAQ法を用いて定量的に解析した。その結果、悪性黒色腫に対する新規癌抗原候補分子が数種類検出されていた。その内の1つのタンパク質については、SK-MEL28で高発現していることをフローサイトメトリー法により確認した。本癌抗原をニワトリに免疫することで特異的な抗体の取得に成功し、Fc領域をマウスIgG2aに改変したニワトリ・マウスキメラモノクローナル抗体を6クローン開発することに成功した。これらのモノクローナル抗体の性状解析も行った。モノクローナル抗体による直接的な抗腫瘍効果について悪性黒色腫細胞株を用いてin vitroで検証中であり、in vivoでの抗腫瘍効果も解析する予定である。悪性黒色腫はさまざまな臓器に転移する性質を持ち、極めて予後不良な悪性腫瘍である。さらに、癌抗原に対するモノクローナル抗体を開発し、悪性黒色腫に対する治療効果を実証することとした。昨年度までに研究代表者はメラノサイトと比較し、悪性黒色腫細胞株(A2058、G361、Mewo、SK-MEL5、SK-MEL28、VMRC-MELG、WM266-4)に高発現する分子をプロテオーム解析した。その結果、悪性黒色腫に対する新規癌抗原候補分子が数種類含まれていた。その内の1つの抗原については、SK-MEL28で高発現していることをフローサイトメトリー法により確認した。本年度において、研究代表者は本癌抗原が悪性黒色腫に高発現する事を免疫組織化学染色法により明らかにした。さらに、ニワトリに免疫する事で本癌抗原に対する特異的なモノクローナル抗体を取得し、Fc領域をマウスIgG2aに改変したニワトリ・マウスキメラモノクローナル抗体を6クローン開発することに成功した。悪性黒色腫細胞株を用いてin vitroで本モノクローナル抗体による直接的な抗腫瘍効果が確認されたため、その詳細な機序について検証中であり、in vivoでの抗腫瘍効果も実施中である。

本癌抗原に対するニワトリ・マウスキメラモノクローナル抗体を6種類取得することに成功した。一部のクローンは癌抗原陽性細胞に対してin vitroで細胞増殖抑制効果を示したため、抗腫瘍効果の詳細な機序について、in vitroおよびin vivoで検証を進めている。H26年度までに当初の予定通り、iTRAQ法を用いて、悪性黒色腫に対する新規癌抗原タンパク質のスクリーニングを行い、候補分子を数種類同定した。このうちの1つの分子については、SK-MEL28で高発現していることをフローサイトメトリー法により確認した。本癌抗原をニワトリに免疫することで特異的な抗体遺伝子の取得に成功した。得られた抗体遺伝子について、Fc領域をマウスIgG2aに改変したニワトリ・マウスキメラモノクローナル抗体を6クローン開発することに成功した。樹立したモノクローナル抗体の性状解析も行い、nMオーダーの親和性を示す事を明らかにした。モノクローナル抗体による直接的な抗腫瘍効果について悪性黒色腫細胞株を用いてin vitroで検証中であり、in vivoでの抗腫瘍効果も解析する予定である。腫瘍免疫学iTRAQ解析により同定された悪性黒色腫に対する新規癌抗原候補タンパク質について、免疫組織化学染色により悪性黒色腫の手術組織に対して新規癌抗原候補タンパク質が高発現する事を検証し、予後との関係を検証することを予定している。さらに、新規癌抗原候補タンパク質に対して独自に開発したモノクローナル抗体については、in vitroで悪性黒色腫に対して直接的な抗腫瘍効果を示すクローンを探索する。続いて、免疫不全マウスの皮下に移植した悪性黒色腫のゼノグラフトモデルに対する抗腫瘍効果をコントロールIgG投与群と比較することで検証する。当初の予定通り、iTRAQ法を用いて7種類の悪性黒色腫細胞株、および、メラノサイトの細胞表面膜タンパク質を網羅的に定量解析することにより、悪性黒色腫に対する複数の新規癌抗原候補タンパク質を同定した。同定されたタンパク質の中には、他の腫瘍で承認済みあるいは治験が実施されている抗体医薬品の標的分子であるEGFRやHGFRなど増殖因子に対する受容体も含まれており、本解析手法が癌抗原の探索に適していることが示唆された。現在、探索から検証の段階に移行しており、候補タンパク質が癌抗原として検証できればモノクローナル抗体の開発へ進める。発注予定であった薬品の在庫がなかったため。iTRAQ解析により同定された悪性黒色腫に対する新規癌抗原候補タンパク質について、メラノサイトと比較し悪性黒色腫にて高発現する事をウェスタンブロット法により検証する。細胞株レベルで悪性黒色腫に高発現が検証されたタンパク質については、免疫組織化学染色が可能な市販抗体が入手可能な場合は免疫組織化学染色法により悪性黒色腫の手術組織に対して新規癌抗原候補タンパク質が高発現する事を検証する。その後、候補タンパク質に対するモノクローナル抗体の開発に着手する。独自に開発したモノクローナル抗体については、表面プラズモン共鳴(SPR)測定により、nMオーダーの解離定数を示すクローンを選別する。
高機能ホール素子を用いた高温超伝導体における磁束のダイナミクスに関する研究

本年度は、ホール素子を用いた局所磁場測定装置に3つ目の自由度を追加し、低温磁場下での3次元磁場分布を可能とした。また、超伝導磁石の電源をコンピュータ制御可能なものとし、ホール素子の移動、ホール電圧の測定を含め全ての測定を自動化した。この装置を用いて、一昨年から引き続きBi_2Sr_2CaCu_2O_<8+y>等の異方性の大きな高温超伝導体で見られるピーク効果を研究対象とした。特に、異方性の制御の一方法として、ヨウ素をインターカレーションした試料(I-Bi_2Sr_2CaCu_2O_<8+y>)を作製し、ピーク効果を調べた。この系でもBi_2Sr_2CaCu_2O_<8+y>と同様のピーク効果が見られるが、ピーク磁場は低温での温度依存しない部分と高温での温度依存する部分に分かれる。温度依存しない部分は、ヨウ素インターカレーションや酸素量の変化による異方性の変化を反映した特徴的な変化を示すのに対し、温度依存する部分はヨウ素インターカレイションの均一性と密接な関係があることが明らかになった。すなわち、不均一な試料ほどピーク磁場が温度依存する温度域が低温側に広がる。実際、X線では良質に見える試料でも局所磁場測定によると、試料中にマクロなスケールでの不均一性があることがわかる。I-Bi_2Sr_2CaCu_2O_<8+y>での温度依存するピーク効果はYBa_2Cu_3O_7やLa_<2-x>Sr_xCuO_4で見られるピーク効果を思い起こさせる。これらの場合も、その起因として酸素欠損などの不均一性が考えられており、今後I-Bi_2Sr_2CaCu_2O_<8+y>との詳細な比較が必要であると思われる。一方、異方性とピーク磁場との関係をよりはっきりとさせるため、静水圧下でのピーク効果の測定を行い、圧力を加えることによりピーク磁場が高磁場に移動することが明らかになった。輸送現象の測定から静水圧を加えることにより、異方性が小さくなることが知られており、この異方性の変化を反映してピーク磁場が大きくなったと考えられる。
学校改善支援主体の機能に着目した現代イギリス保守党政権下の学校主導型制度の研究

イギリスでは2015年以降保守党が政権を担っており、教育政策においては各学校に高度な自律性を付与して学校制度全体の教育水準の向上を目指す方針、すなわち学校主導型制度(school-led system)への改革が進められている。ただし、この政策により学校間格差が拡大しているとの評価もあり、2016年白書では、優秀な学校による支援や学校間の連携をより活性化する必要があると述べられている。一方では学校に高度な自律性を認めながら、他方では他校支援や学校間連携を活性化させようとする保守党政権の政策を分析することにより、学校の自律性と教育の公共性を両立するための条件や課題について明らかにすることが本研究の目的である。
古典的膠を用いた技法研究

現在一般に市販されている膠と古典的製法によって作られた古典的膠によって、基底材に施す滲み止めである礬水液の使用感の違いがどう表れるかを実験調査した。古典的膠については、北田克己教授による平成26年度基盤研究、「絵画表現における風土と技術ー膠を中心とする伝統的材料の持続性に関する調査研究ー」内で、大崎商店(姫路市)にご協力いただき、姫路高木地区に伝わる古典膠製造を再現したものを使用した。古典的膠(牛膠・鹿膠)を使用し、古典絵画技法書に記載のある作成法で作った膠水と明礬の混合液である礬水液による塗布実験を行った。古典的膠と現在一般的に市販されている膠の2種類を使用比較する事によって、薬剤の使用によって及ぼされる製品の性状や品質の違い、膠の精度の違いによって塗布した際の使用感が影響するかを比較調査した。基底材の和紙については、美濃紙と宣紙を使用する。各種支持体はロール石州紙により裏打ちを施し、パネルに張り込んだものを使用する。古典絵画の技法書を参考に、膠:明礬:水を8g:5g:450ccの割合で礬水液を作成。刷毛にて和紙に礬水を塗布した後、実験協力者に普段の制作過程を行なってもらい、各工程において使用感の差異があるのかを調査した。墨による表現においては、線描等、普段と変わらず制作が行えたとの感想を得る。胡粉による表現においては、絵の具を盛り上げて彩色した際に、下地の処理がなくてもしっかりと定着し、その後の作業が順調に行えたとの感想があった。たらし込み等の滲みを活かした表現においては、礬水がしっかりと効いているのに不必要に弾く症状が見えずに綺麗な滲みを表現する事が出来た。また紙が水を吸うまでの時間が早く、すぐに絵具が定着する為素早い作業が必要との感想があった。日本画材を筆で基底材に乗せる感覚及び乾燥後の定着性の差異が膠の種類によってどう表れるかを実験調査した。内容としては古典的膠(牛膠・鹿膠)、現在市販で購入し易い絵画用膠(和膠三千本飛鳥・播州粒膠)計4種で実施。古典膠については、平成28年度に大崎商店にご協力いただき、姫路高木地区に伝わる古典膠製造を再現したものを使用した。これは現在販売されている膠と違い、薬剤を使用していないものになる。古典的膠と市販されている膠の2種類を使用する事によって薬剤の使用によって及ぼされる製品の性状や品質の違い、膠の精度の違いによって塗布した際の使用感が影響するかを比較調査した。基底材については和紙(薄美濃紙・雁皮紙)、絹を使用する。それぞれの特性としては、薄美濃紙は原材料に楮を使用しており、筆での引っ掛かりが多く塗布しやすい。そして雁皮紙は雁皮を材料とし、虫害・退色に対しても強いため和紙の中でも永年性が最も高く古くから使用されていた。特徴としては表面が滑らかで筆が滑りやすい。最後に絹は絵具の伸びが良く、裏表の彩色が可能である為、紙の彩色とは大きく異なる。以上の三種類を使用し、基底材の違いによって現れる筆運びの差異を検証した。また日本画材は色によって性質が異なる。このため性質の大きく異なる4種の絵具、「青(天然群青8番)、緑(天然緑青8番)、赤(鎌倉朱極赤)、金(純金泥)」を用い発色・伸びの良さ・乾燥後の艶や耐水性を中心に情報収集した。収集した情報は平成29年度中にまとめる計画である。実験調査毎に記録用フォーマットに情報を収集し使用感をまとめた情報を順次書式化している。4種の膠・4種の絵具・3種の基底材(和紙2種・絹)を使用し実験を行っている為、情報量としては適量に達している。平成28年度に引き続き、日本画材を筆で基底材に乗せる感覚及び乾燥後の定着性の差異が膠の種類によってどう表れるかを実験調査した。内容としては古典的膠(牛膠・鹿膠)、現在市販で購入し易い絵画用膠(和膠三千本飛鳥・播州粒膠)計4種類で実施。古典膠については、平成28年度に大崎商店(姫路市)にご協力を頂き、姫路市高木地区に伝わる古典膠製造を再現したものを使用した。古典的膠と市販されている膠の2種類を使用する事によって薬剤の使用によって及ぼされる製品の性状や品質の違い、膠の精度の違いによって塗布した際の使用感が影響するかを比較調査を行なっている。基底材については和紙(薄美濃紙、雁皮紙)、絹を使用する。それぞれの特徴としては、薄美濃紙は原材料に楮を使用しており筆での引っ掛かりが多く塗布しやすい。雁皮紙は雁皮を原材料としており、虫害・退色に対しても強いため和紙の中でも永年性が最も強く古くから使用されていた。最後に絹は絵の具の伸びが良く、裏表の彩色が可能である為、紙の彩色とは大きく異なる。以上の三種類を使用し、基底材の違いによって現れる筆運びの差異の検証を行っている。

この性質の大きく異なる4種の絵具、青(天然群青8番)、緑(天然緑青8番)、赤(鎌倉朱、極赤)、金(純金泥)を用い発色、伸びの良さ、乾燥後の艶や耐水性を中心に情報収集を行っている。収集した情報は平成30年度中にまとめる計画である。当初予定していた実験の内、晒膠、たらし込み技法などの実験、検証を開始する事が出来なかった。次年度に持ち越し、実験、検証を行う予定である。現在一般に市販されている膠と古典的製法によって作られた古典的膠によって、基底材に施す滲み止めである礬水液の使用感の違いがどう表れるかを実験調査した。古典的膠については、北田克己教授による平成26年度基盤研究、「絵画表現における風土と技術ー膠を中心とする伝統的材料の持続性に関する調査研究ー」内で、大崎商店(姫路市)にご協力いただき、姫路高木地区に伝わる古典膠製造を再現したものを使用した。古典的膠(牛膠・鹿膠)を使用し、古典絵画技法書に記載のある作成法で作った膠水と明礬の混合液である礬水液による塗布実験を行った。古典的膠と現在一般的に市販されている膠の2種類を使用比較する事によって、薬剤の使用によって及ぼされる製品の性状や品質の違い、膠の精度の違いによって塗布した際の使用感が影響するかを比較調査した。基底材の和紙については、美濃紙と宣紙を使用する。各種支持体はロール石州紙により裏打ちを施し、パネルに張り込んだものを使用する。古典絵画の技法書を参考に、膠:明礬:水を8g:5g:450ccの割合で礬水液を作成。刷毛にて和紙に礬水を塗布した後、実験協力者に普段の制作過程を行なってもらい、各工程において使用感の差異があるのかを調査した。墨による表現においては、線描等、普段と変わらず制作が行えたとの感想を得る。胡粉による表現においては、絵の具を盛り上げて彩色した際に、下地の処理がなくてもしっかりと定着し、その後の作業が順調に行えたとの感想があった。たらし込み等の滲みを活かした表現においては、礬水がしっかりと効いているのに不必要に弾く症状が見えずに綺麗な滲みを表現する事が出来た。また紙が水を吸うまでの時間が早く、すぐに絵具が定着する為素早い作業が必要との感想があった。28年度は基本的な塗布実験を中心に行った。29年は前年使用した古典的膠の精製度を変えた物を用意し数度の実験調査を行う予定である。基本的な塗布実験の情報収集は持続して行い、古典的絵画技法を用いた際の膠毎の差異にも注目して新たな実験調査を行う。膠使用の前に寒ざらしを行ってから膠水にした際の変化があるかの実験調査を29年度から30年度にかけて行う予定。平成28年、29年度に行った基本的な塗布実験に引き続き、平成30年度は江戸時代の技法書に記述のある溶解法の再現による膠を使用した実験を行う。晒膠(膠を雪に晒したもの)の作成や古典的膠を使用した日本画技法の再現の実験と検証を行う。初年度における物品の購入予定額が当初計画より少なめに算出出来た為。29年度の実験調査に使用する費用として使用計画を立てている。材料費での支出が当初計画より少なくなった為。基底材3種(和紙2種・絹)に対し4種の膠を用いて数回実験調査をする為、都度材料の購入を予定している。
公的年金の受給・負担関係における世代間格差の要因分析

本研究の研究目的および研究計画に従って、公的年金(特に厚生年金)の受給・負担(拠出)関係における世代間格差の諸要因について比較分析を行った。要因寄与度の計量分析は容易ではなかったが、基礎率分析の結果から得られた知見等は以下のようである。1.各世代の給付(年金現価)と保険料(元利)が等しい完全積立方式を基準に、(給付/保険料)倍率の世代による違いを給付・負担関係の世代間格差と定義し、人口の高齢化、実質給付価値の維持、給付水準の政策的引上げ、保険料率改定の失敗、家族扶養負担との調整を格差要因として取り上げた。2.平成6年財政再計算に基づく推計によれば、生年1975年(昭和50年)以降の世代では、この倍率が約1倍であるのに対して、生年1960年で約1.5倍、1950年で約2倍、1940年3.3倍、1930年で約7倍、1925年で約9倍であった。3.被扶養高齢人口比率(退職高齢人口/生産年齢人口)は1975年の11.7%から1995年には20.9%へとほぼ倍増している。しかも、1975年当時の将来人口推計では、1995年は被扶養高齢人口比率は18.9%と見込まれていた。4.実質給付価値の維持を決定する賃金再評価と物価スライドの影響を把握するため、賃金・物価指数の変化を1974年と1993年で比較すると、賃金指数は約2.5倍、消費者物価指数は約2倍の上昇を示していた。5.年金給付水準の政策的な引上げ度合いを測るため、一人当たり支給額の実質価値を1974年と1993年で比較すると、賃金デフレーター調整で約1.7倍、物価デフレーター調整では約2.1倍であった。6.保険料率の改定が政治的な配慮から計画より小幅改定または施行延期となったこと、そして、現在の高齢世代が若年世代の頃に親世代の所得保障を家族内で担っていたこととの調整が格差要因の残差を説明する。
レミマゾラムによる炎症性肺疾患の新しい麻酔戦略

モルモットにおいて静脈麻酔薬およびオピオイドを単独また併用時の、in vivo, in vitroでの気管拡張作用を観察し、同時に喘息モデルでのVAL中の細胞数を測定した。オバラミンを用いた喘息モデルで、静脈麻酔薬とオピオイドを併用時には、in vivo, in vitroともに強い気管拡張作用をしめし、オピオイドの併用ない場合はこの気管拡張作用は減弱した。おなじく、VAL中の好酸球、好中球はオピオイドの併用で減少した。これらの知見は、実臨床における全静脈麻酔が、吸入麻酔同様に気道拡張作用を示すことをしめしており、その機序は静脈麻酔薬とオピオイド併用による抗炎症作用によるものと考えられる。喘息モルモットの作成とin vitroおよびin vivo試験,肺胞洗浄液による検討初年度は,喘息モルモットを作成して,喘息発作時の吸入麻酔薬セボフルラン,プロポフォール・ミダゾラムの影響をin vitroで観察した。1喘息モルモットの作成と発作の誘発オバラミン(2×0.5mg/ml)を1週の間隔をあけて腹腔内に投与し,2週間後にオバラミンを吸入し発作を誘発した。2度に分けた腹腔内投与によって,発作の誘発の成功率がほぼ100%にまで上昇していた。2張力の測定モルモットから気管・肺組織を摘出後気管組織を単離した。気管リング標本に張力トランスデューサを取り付け,カルバコールにより収縮を得た後,吸入麻酔薬セボフルラン,プロポフォールまたはミダゾラムを曝露した。それぞれの麻酔薬の喘息モデルにおけるin vitroでの有用性は,セボフルラン>プロポフォール=ミダゾラムであった。3気管支肺胞洗浄液の細胞数と細胞分画測定気道の総細胞数,好中球,好酸球を顕微鏡下でカウントした。吸入麻酔薬セボフルラン,プロポフォールまたはミダゾラムを曝露後の細胞数は予備実験とは、異なりほぼ同数であった。喘息モルモットを作成して,喘息発作時のレミフェンタニル同時投与下の吸入麻酔薬セボフルラン,プロポフォール・ミダゾラムの影響をin vitroおよびin vivoで観察した。1喘息モルモットの作成と発作の誘発:セボフルラン麻酔下で,雄のHartleyモルモット(250g)を使用しオバラミン(2×0.5mg/ml)を1週の間隔をあけて腹腔内に投与し,2週間後にオバラミンを吸入(10ml×1mg/ml,10分)し発作を誘発(ほぼ100%)しえた。2張力の測定:モルモットから気管・肺組織を摘出後,顕微鏡下で愛護的に気管組織を単離する。気管リング標本に張力トランスデューサを取り付け,37°Cの恒温槽内で張力を測定した。ムスカリン受容体刺激薬カルバコールにより収縮を得た。それぞれの麻酔薬における喘息モデルの気道弛緩効果はセボルフランで高くプロポフォールとミダゾラムで同じであった。予備実験の結果と同様に上記濃度のレミフェンタニルの添加でも、この弛緩効果の修飾はみられなかった。3気道抵抗の測定:気管切開を行いカテーテルを挿入・仰臥位とし,人工呼吸を行った。胸腔内圧を測定するため,食道内にカテーテルを挿入した。気道内圧と胸腔内圧を経時的に測定することにより,気道抵抗と全肺コンプライアンスを同時測定した。内頸静脈にカテーテルを挿入し,不動化し抵抗とコンプライアンスが一定した後,レミフェンタニル投与有無の条件下で吸入麻酔薬セボフルラン,プロポフォールまたはミダゾラムを投与しながら,アセチルコリン(10-8から10-5M)を漸増的に投与し,相乗的な気道収縮抑制効果を観察した。オピオイドの併用で、それぞれの麻酔薬の弛緩効果は増強されたが特にプロポフォールおよびミダゾラムとの組み合わせで弛緩効果の増強が大きかった。レミフェンタニル投与有無に喘息モデルにおける、セボフルラン、プロポフォール、ミダゾラムの直接的・間接的気道収縮抑制効果および抗炎症反応を検討できたが、安定したCOPDモデルの作成が遅延している。

気道上記まで得られた研究を発表し、同じくCOPDモデルの作成率を高める。研究実施計画書のごとく、レミマゾラムによる検討と、至適静脈内麻酔法の検討を行う。レミフェンタニル投与有無に喘息モデルにおける,セボフルラン,プロポフォール,ミダゾラムの直接的・間接的気道収縮抑制効果,および抗炎症効果を検討する予定であったが、現状ではレミフェンタニル投与無における検討分しか進捗していない。海外での学会発表を予定していたが、公務で出席できなかったため。上記達成した研究を引き続きレミフェンタニル投与有として研究を行う。これらの知見からセボフルラン、ミダゾラムそして,プロポフォールの喘息またCOPD疾患モデルにおけるin vitro, in vivoでの気道収縮抑制効果の知見が集積されている。またCOPDモデルを作製する。レミマゾラムによる検討と,至適静脈内麻酔法の検討を行なう。研究を遂行するため、米国麻酔科学会視察のために使用する計画である。
膜蛋白質の機能モジュレーターとしてのカロテノイド

カロテノイドは自然界に広く分布する黄-赤色の共役2重結合鎖を持つ疎水性の色素で、ビタミンAの前駆体としてだけでなく、免疫系増強と抗腫瘍の活性を持つ。それらはカロテノイドのプロビタミンA活性か抗酸化作用に基づくものと考えられてきたが、プロビタミンA活性の無いカロテノイドでもそれらの活性が観測できたこと、抗酸化作用と抗腫瘍活性の間に相関が無いことなどから、未知の型のカロテノイドの作用、例えば、膜蛋白に対しての作用などが推測されてきた。光駆動の塩素イオンポンプであるハロロドプシンは膜7回貫通型蛋白質ファミリーに属し、光誘起の構造変化(この構造変化が塩素イオンをポンプする)を分光学的に時間軸上で観測できる。ハロロドプシンを産生する好塩性の古細菌の持つC_<50>カロテノイド(バクテリオルベリン)がこの構造変化を6倍速くし、その機能を促進していることを、変異株を用いた測定とバクテリオルベリンの再構成実験から明らかにいていたので、ハロロドプシンの塩素イオンに対する結合にバクテリオルベリンが及ぼす影響と、バクテリオルベリンの作用が同じ細胞膜領域に存在する他の細菌ロドプシンに与える影響を調べ、そのカロテノイドの作用が特異的なものか否かを調べた。バクテリオルベリンはハロロドプシンの塩素イオンに対する結合力を3倍増加することが塩素イオン添加により生じる吸収変化測定から解った。さらに閃光励起により生じる光中間体の生成量の塩素イオン濃度依存性の測定から、その最大生成量の50%生成量をもたらす塩素イオン濃度もバクテリオルベリンにより約6倍低下し、ハロロドプシンの塩素イオンに対する親和力が増加していることが解った。バクテリオルベリンは、同じ膜領域に存在するセンソリ-ロドプシンの構造変化を加速しなかった。以上の結果は、バクテリオルベリンの作用は、膜の強度を増すことによりハロロドプシンに作用するというような非特異的なものではなく、ハロロドプシンにのみ作用する特異的な作用であり、バクテリオルベリンがハロロドプシン内の塩素イオン結合部位に影響を与えていることを示しており、バクテリオルベリンが遠隔的間接的出はなく、ハロロドプシンの近くに存在し直接特異的に作用をしていることを示唆している。
唾液腺組織再生における細胞増殖と細胞死の意義の解明

【概要】本研究は、唾液腺の再生過程において腺実質細胞(腺房細胞、導管細胞、筋上皮細胞など)が細胞死(アポトーシス)や細胞増殖を起こしているのか、もしそうであれば、どの時期にどの程度起こっているのかを明らかにし、唾液腺組織再生過程における各種腺実質細胞の動態とその意義について解明することを目的としている。平成16年度では免疫二重染色(PCNAとアクチン)によって、筋上皮細胞の増殖活性について検索するとともに、各種線実質細胞の分裂像やアポトーシス像を電顕的に観察した。【結果】増殖マーカーである抗PCNA抗体と筋上皮細胞のマーカーである抗アクチン抗体の両方に陽性を示す細胞は対照群および実験群の両方の顎下腺に認められた。実験群では、再生過程の各期間にダブルポジティブ細胞がみられたが、標識率を算出した結果、再生2日目から4日目において有意に高い値を示していた。最高値は4日目で6.31%であり、対象群では1.18%であった。再生過程を電顕的に観察したところ、腺房細胞や導管細胞の分裂像がしばしば認められた。また、両細胞のアポトーシス像も少数ながら観察された。このような所見は昨年度の実験においてみられたPCNAやTUNELに対して陽性を示す細胞が確実に細胞増殖や細胞死を起こしている細胞であることを裏付けるものである。一方、再生過程を詳細に観察した結果、導管の基底側に位置し、細胞内にミオフィラメントを含む細胞が細胞分裂している像を観察することに成功した。これは、筋上皮細胞の分裂像にほかならず、免疫二重染色のダブルポジティブ細胞が本当に増殖活性を有する筋上皮細胞であることを示す所見である。以上の結果より、唾液腺の再生過程には、腺房や導管においては細胞増殖だけでなく、アポトーシスも関与していること、従来疑問視されていた筋上皮細胞の分裂・増殖も確実に再生に関与していることが明らかとなった。平成15年度では動物実験、各種ブロックの作製、組織学的検索、PCNAによる免疫組織化学的検索、TUNEL法による検索がほぼ終了した。【結果】実験対象のラット顎下腺は7日間の導管結紮により萎縮した。腺組織内には多くの導管が残存していたが、腺房の多くは消失し、残存しているものは少なかった。結紮解除3日目には新生した腺房細胞がみられるようになり、以後、その数の増加と成熟化が認められた。再生過程で多くの腺房細胞はPCNA陽性を示し、再生45日目にピークを示した。これに対して、PCNA陽性を示す導管細胞は再生過程では常に減少傾向を示していた。一方、TUNEL陽性細胞は腺房細胞、導管細胞ともに少数ながら観察された。以上の結果より、萎縮顎下腺の再生過程では細胞増殖のみならず、アポトーシスも関与していることが示唆された。【今後の展望】平成16年度は免疫二重染色(PCNAとアクチン)およびTUNEL二重染色(TUNELとアクチン)を行い、筋上皮細胞についても同様に検索する。

さらに、免疫組織化学的およびTUNEL法によって同定された細胞増殖やアポトーシスを電子顕微鏡を用いて確認し、それらの結果より、唾液腺再生過程における細胞増殖とアポトーシスの意義を明らかにする予定である。【概要】本研究は、唾液腺の再生過程において腺実質細胞(腺房細胞、導管細胞、筋上皮細胞など)が細胞死(アポトーシス)や細胞増殖を起こしているのか、もしそうであれば、どの時期にどの程度起こっているのかを明らかにし、唾液腺組織再生過程における各種腺実質細胞の動態とその意義について解明することを目的としている。平成16年度では免疫二重染色(PCNAとアクチン)によって、筋上皮細胞の増殖活性について検索するとともに、各種線実質細胞の分裂像やアポトーシス像を電顕的に観察した。【結果】増殖マーカーである抗PCNA抗体と筋上皮細胞のマーカーである抗アクチン抗体の両方に陽性を示す細胞は対照群および実験群の両方の顎下腺に認められた。実験群では、再生過程の各期間にダブルポジティブ細胞がみられたが、標識率を算出した結果、再生2日目から4日目において有意に高い値を示していた。最高値は4日目で6.31%であり、対象群では1.18%であった。再生過程を電顕的に観察したところ、腺房細胞や導管細胞の分裂像がしばしば認められた。また、両細胞のアポトーシス像も少数ながら観察された。このような所見は昨年度の実験においてみられたPCNAやTUNELに対して陽性を示す細胞が確実に細胞増殖や細胞死を起こしている細胞であることを裏付けるものである。一方、再生過程を詳細に観察した結果、導管の基底側に位置し、細胞内にミオフィラメントを含む細胞が細胞分裂している像を観察することに成功した。これは、筋上皮細胞の分裂像にほかならず、免疫二重染色のダブルポジティブ細胞が本当に増殖活性を有する筋上皮細胞であることを示す所見である。以上の結果より、唾液腺の再生過程には、腺房や導管においては細胞増殖だけでなく、アポトーシスも関与していること、従来疑問視されていた筋上皮細胞の分裂・増殖も確実に再生に関与していることが明らかとなった。
口腔癌における新規癌抑制遺伝子ING1,ING2の発現と治療への応用

この抗体により、口腔癌細胞株、口腔癌組織におけるp33ING1,p33ING2の発現を、Western Blotting法により検討するとともに、正常口腔粘膜上皮ならびに口腔扁平上皮癌組織に対し、Western Blotting法ならびに免疫組織化学的検索により発現を検討した。その結果、口腔扁平上皮癌細胞株10株においてING1,ING2は、その発現量に相違は認めるものの、検索したすべての検体において発現を認めた。また、ING1,ING2の発現量に相関はなく、これらの発現量と細胞増殖活性の関係も見いだせなかった。正常口腔粘膜上皮、前癌病変ならびに口腔癌組織においてもING1,ING2とも核にその発現を認め、これらの陽性細胞率や、発現量と腫瘍の増殖活性やリンパ節転移能などは相関しなかった。一方で、免疫沈降法により、p53との結合能を検討したところ、ING1,ING2ともに結合能が消失している細胞が見いだされた。以上より、ING1、ING2の欠失は口腔癌ではほとんど生じていないものの、いくらかの口腔癌においては、p53との結合異常による機能異常が生じ、癌化に関与している可能性が示唆された。なお、ING1、ING2の欠失した口腔扁平上皮癌細胞を見いだせなかったことから、pcDNA3-p33ING1,p33ING2の発現ベクターによる遺伝導入は行わなかった。
超親水から超撥水へと変化する表面を利用した相変化伝熱の制御

本研究は,伝熱面表面の濡れ性を超親水から超撥水にわたり,広範囲に接触角をコントロールすることにより,沸騰・蒸発・凝縮などの相変化伝熱を制御することを目的とする.本年度は,超撥水面と通常面を組み合わせて作成したハイブリッド伝熱面の沸騰伝熱特性を調べた.これは昨年度の研究成果で,超撥水面の沸騰では非常に低い過熱度で膜沸騰状態になるという知見を利用したものである.すなわち,超撥水面は発泡性に優れた面と見なすことができ,低過熱度で気泡が容易に発生する.これに通常面を組み合わせ,超撥水領域の面積を制限することで,発生した気泡は超撥水面/通常面の境界で離脱させられることになる.すなわち,超撥水領域を気法生成領域,通常面の領域を液体供給領域と役割を分担させることで,すぐれた沸騰伝熱面が実現する.実験には,直径30mmの銅伝熱面に,格子状(市松模様),斑点状のパターニングを施した超撥水/通常面複合伝熱面を使用し,沸騰特性曲線を得た.格子状では,3mm×3mm,4mm×4mm,5mm×5mmサイズのパターンを,斑点状の場合は3mmφ,4mmφ,5mmφの直径の斑点を5mmピッチで配置した.大気圧飽和状態で沸騰特性を調べたところ,以下の項目が明らかになった.(1)核沸騰低加熱度領域では,通常面に比べてハイブリッド伝熱面の熱伝達率が7倍に増加し,優れた沸騰伝熱面となる.(2)過熱度約15Kで,ハイブリッド伝熱面と通常面との伝熱性能が逆転し,高熱流束域では通常面の方が伝熱特性が良い.また,限界熱流束値も通常面の方が大きい.(3)ハイブリッド面において,格子状の場合は格子寸法の影響はほとんどなく,いずれも同様の伝熱特性を示した.一方,斑点状の場合は,3mmφの面の伝熱特性が一番優れており,超撥水と通常面との面積割合に最適値が存在する可能性がある.本研究は,伝熱面表面の濡れ性を超親水から超撥水にわたり,広範囲に接触角をコントロールすることにより,沸騰・蒸発・凝縮などの相変化伝熱を制御することを目的とする.本年度は,超撥水面を用いてプール沸騰の基本的な特性を調べた.使用した超撥水面は,直径17mmの銅丸棒の基材にテフロン微粒子を分散させた液で電解メッキにより作成した.メッキ層の厚みは10μm程度であり,メッキの過程で自己組織化によりフラクタルな構造になるため,撥水性が助長されて接触角152°の超撥水状態となる.実験は,サブクール度0,5,10Kの3種類で行った.伝熱面の接触角が大きくぬれにくいため,水中でも空気の層が離れない.そのため,伝熱面を過熱し20分間沸騰させて脱気した.その後,伝熱面の気泡が消滅するまで冷却した後,実験を開始した.伝熱面ブロックのヒーター入力をステップ状に上げながら,各点で定常状態にした後,測定した.伝熱面温度が急上昇し始める直前までのデータを得た後,ヒーター入力を下げながら同様に測定した.その結果,以下の項目が明らかになった.(1)通常の表面では気泡核が活性化しない,非常に低い過熱度で伝熱面上に気泡が出現する.(2)加熱面温度を上昇させる場合は,核沸騰域はほとんど現れることなく,過熱度数Kで膜沸騰に移行する.(3)膜沸騰域から加熱面温度を下降させていくと,1K以下の極めて低い過熱度においても安定な蒸気膜が伝熱面上を覆い,膜沸騰を維持することができる.(4)サブクール沸騰においては,気泡が1度も離脱することなく,膜沸騰へ移行する.すなわち,RohsenowとGriffithが提唱する気泡充満モデルにより現象が説明できる.本研究は,伝熱面表面の濡れ性を超親水から超撥水にわたり,広範囲に接触角をコントロールすることにより,沸騰・蒸発・凝縮などの相変化伝熱を制御することを目的とする.本年度は,超撥水面と通常面を組み合わせて作成したハイブリッド伝熱面の沸騰伝熱特性を調べた.これは昨年度の研究成果で,超撥水面の沸騰では非常に低い過熱度で膜沸騰状態になるという知見を利用したものである.すなわち,超撥水面は発泡性に優れた面と見なすことができ,低過熱度で気泡が容易に発生する.これに通常面を組み合わせ,超撥水領域の面積を制限することで,発生した気泡は超撥水面/通常面の境界で離脱させられることになる.すなわち,超撥水領域を気法生成領域,通常面の領域を液体供給領域と役割を分担させることで,すぐれた沸騰伝熱面が実現する.実験には,直径30mmの銅伝熱面に,格子状(市松模様),斑点状のパターニングを施した超撥水/通常面複合伝熱面を使用し,沸騰特性曲線を得た.格子状では,3mm×3mm,4mm×4mm,5mm×5mmサイズのパターンを,斑点状の場合は3mmφ,4mmφ,5mmφの直径の斑点を5mmピッチで配置した.大気圧飽和状態で沸騰特性を調べたところ,以下の項目が明らかになった.(1)核沸騰低加熱度領域では,通常面に比べてハイブリッド伝熱面の熱伝達率が7倍に増加し,優れた沸騰伝熱面となる.

(2)過熱度約15Kで,ハイブリッド伝熱面と通常面との伝熱性能が逆転し,高熱流束域では通常面の方が伝熱特性が良い.また,限界熱流束値も通常面の方が大きい.(3)ハイブリッド面において,格子状の場合は格子寸法の影響はほとんどなく,いずれも同様の伝熱特性を示した.一方,斑点状の場合は,3mmφの面の伝熱特性が一番優れており,超撥水と通常面との面積割合に最適値が存在する可能性がある.
慢性腎臓病の合併症進展機構に関わるエピゲノム異常の解析

平成29年度に血液透析患者では高頻度にKlothoのDNAプロモーター領域がメチル化(後天的なDNAの変性)されていることを確認してが、平成30年度は同因子の後天的なDNAの変性の解析結果と患者背景や臨床所見との関係を検討した。その結果、同因子のメチル化は心血管病の既往や栄養障害と関係することが明らかとなった。この結果は日本腎臓学会学術集会、欧州腎臓学会、米国腎臓学会で報告した。さらに平成30年度は他の抗老化因子であるSurt1のDNAプロモーター領域のメチル化を検討し、血液透析患者ではKlotho遺伝子同様にSirt1遺伝子の後天的な変性の頻度が高いことが明らかとなった。また、血液透析患者での結果が腎機能が正常な患者でも認められるかを検討するために、腎機能正常患者136名においてKlothoやSurt1のDNAプロモーター領域のメチル化の頻度を解析した。その結果、心血管病のある患者で有意にメチル化が発生していることが明らかとなった。本年度の研究では保存期腎不全患者、腎機能正常患者のDNAのメチル化解析、血液透析患者と保存期腎不全患者の抗加齢因子の血清レベルやDNAメチル化に関わる酵素の異常について検討する予定であった。しかしながら、腎機能正常患者のDNAのメチル化解析や保存期腎不全患者の血液検体の採取ならびにDNAの抽出に時間がかかり、当初の研究目標よりも遅れている。現在、腎機能正常患者のDNAのメチル化解析および保存期腎不全患者の血液検体の採取ならびにDNAの抽出は終了しているため、血液透析患者と保存期腎不全患者の抗加齢因子の血清レベルやDNAメチル化に関わる酵素の異常の測定・解析を行う。その結果から透析患者と保存期腎不全患者でのDNAメチル化の発生の違いを検討する。また、腎機能正常患者においてDNAメチル化が心血管病の発症に関係する可能性が出てきたため、腎機能正常者検体を増やし、腎機能正常者でのDNAメチル化発生機序と心血管病の関係について解析を進める予定である。慢性腎臓病(CKD)患者は高頻度に心血管病や栄養障害などの合併症を発症し、また、合併症の進行が速く、重篤になり易い。最近、DNAの後天的変性が糖尿病や動脈硬化などの疾患の発症と関係することが報告されている。一方、CKDに特徴的な病態は酸化ストレスが亢進し、DNA変性が生じやすい環境にある。本研究はCKDが原因となるDNAの後天的変性に着目し、基礎的および分子疫学的に病態解析を行うことを目的としている。合併症の発症・進展抑制、腎障害の進展抑制は、CKD患者の予後を向上させるとともに、医療費の削減にもつながるため、重要な研究課題と考えられる。研究の方法は臨床研究(保存期および透析期CKD患者を対象とした分子疫学研究)および基礎研究(細胞培養系によるCKD環境下での標的遺伝子群のエピゲノム異常解析研究)から構成され、CKDのDNA変性の特徴、臨床像やアウトカムとの関係について検討する。平成28年度は対象遺伝子の後天的変性の解析を中心とした、分子疫学研究の実施を計画した。当初の計画では保存期CKD患者(n=60)、血液透析患者(n=160)、腹膜透析患者(n=30)からDNAの抽出、血清の保管を行い、DNAメチル化解析平成28年度は文書で同意を得た血液透析患者140名から白血球を採取し、DNAの抽出を行なった。DNAの後天的変性はKlotho遺伝子のプロモーター領域のメチル化解析を実施した。血液透析患者のDNA抽出は概ね計画通りに実施できたが、保存期CKA患者のDNAサンプルの集積が遅れている。また、対象の標的遺伝子のメチル化解析は、DNA処理量を最小にするための当初の解析方法を変更したため、当初の予定のよりも解析数が遅れている。文書にて本研究への参加に同意を得た血液透析患者132名に対し、白血球からゲノムDNAを抽出して凍結保存した。Klotho遺伝子プロモーター領域のエピゲノム変性は同領域のCpGアイランドのメチル化解析により同定した。Klothoプロモーター領域のメチル化・非メチル化プライマーは既報の配列を参考に作成し、保存DNAをバイサルファイト処理後に、メチル化・非メチル化プライマーを用いてPCR増幅し、電気泳動解析(COBRA法)を行った。結果、約40%の患者においてKlotho遺伝子プロモーター領域のメチル化変性を認めた。メチル化変性を有する患者は心血管病の既往歴が効率で、栄養マーカー(血清アルブミン値並びにgeriatric nutritional risk index)が低値であった。このことからKlotho遺伝子のプロモーター領域における後天的変性は血液透析患者の心血管病の発症や栄養障害に関わる可能性が示唆され、MIA症候群の発症とも関係する可能性が考えられた。現在、Sirt1プロモーター領域のメチル化を解析中であり、各ターゲット遺伝子のメチル化の有無と血清レベルの関係、DNAメチル化に関連する酵素(DNAメチルトランスフェラーゼ)活性の異常について検討を進めている。本研究成果は平成30年度の日本腎臓学会、欧州腎臓学会・欧州透析移植学会で発表する。当初の予定よりも、Klotho遺伝子、Surt1遺伝子の後天的変性の解析に時間がかかり、臨床研究(保存期および透析期CKD患者を対象とした分子疫学研究)が中心となったため、基礎研究(細胞培養系によるCKD環境下での標的遺伝子群のエピゲノム異常解析研究)が行えていない。

平成29年度に血液透析患者では高頻度にKlothoのDNAプロモーター領域がメチル化(後天的なDNAの変性)されていることを確認してが、平成30年度は同因子の後天的なDNAの変性の解析結果と患者背景や臨床所見との関係を検討した。その結果、同因子のメチル化は心血管病の既往や栄養障害と関係することが明らかとなった。この結果は日本腎臓学会学術集会、欧州腎臓学会、米国腎臓学会で報告した。さらに平成30年度は他の抗老化因子であるSurt1のDNAプロモーター領域のメチル化を検討し、血液透析患者ではKlotho遺伝子同様にSirt1遺伝子の後天的な変性の頻度が高いことが明らかとなった。また、血液透析患者での結果が腎機能が正常な患者でも認められるかを検討するために、腎機能正常患者136名においてKlothoやSurt1のDNAプロモーター領域のメチル化の頻度を解析した。その結果、心血管病のある患者で有意にメチル化が発生していることが明らかとなった。本年度の研究では保存期腎不全患者、腎機能正常患者のDNAのメチル化解析、血液透析患者と保存期腎不全患者の抗加齢因子の血清レベルやDNAメチル化に関わる酵素の異常について検討する予定であった。しかしながら、腎機能正常患者のDNAのメチル化解析や保存期腎不全患者の血液検体の採取ならびにDNAの抽出に時間がかかり、当初の研究目標よりも遅れている。次年度は、血液透析患者並びに腎機能正常コントロールの標的遺伝子のメチル化解析を進める。また、保存血清から対象となる血清タンパクの測定を進め、DNA変性と血清タンパク量との関係を確認する。また、保存期CKD患者のリクルートを増やし、効率的にDNAを抽出するために全血凍結保存からのDNA抽出を実施する。保存期CKD患者の標的遺伝子のメチル化解析は血液透析患者の結果を参考とし、変性部位のターゲットを絞った解析を行う。臨床研究(血液透析患者のKlotho遺伝子の変性頻度と腎機能正常患者や保存期腎不全患者とのメチル化変性の発生頻度を比較・検討、DNAメチル化変性に関連する遺伝子の変性の検討、DNAメチルトランスフェラーゼ活性とメチル化の関係など)の進捗に合わせて基礎研究を行う予定である。現在、腎機能正常患者のDNAのメチル化解析および保存期腎不全患者の血液検体の採取ならびにDNAの抽出は終了しているため、血液透析患者と保存期腎不全患者の抗加齢因子の血清レベルやDNAメチル化に関わる酵素の異常の測定・解析を行う。その結果から透析患者と保存期腎不全患者でのDNAメチル化の発生の違いを検討する。また、腎機能正常患者においてDNAメチル化が心血管病の発症に関係する可能性が出てきたため、腎機能正常者検体を増やし、腎機能正常者でのDNAメチル化発生機序と心血管病の関係について解析を進める予定である。3月に納品、使用となり、3月度支払期限には間に合わず次年度の支払となったため。研究の進捗が遅れたため、物品の購入が遅くなった。次年度に前年度実施予定の実験消耗品を購入予定である。前年度の解析が実施できなかった項目を次年度に繰越すため納品済みであり、次年度の支払で処理される予定である。既に伝票等は提出済みです。
膵液中c-ki-ras癌遺伝子の点突然変異の検出による膵癌診断の開発

膵癌の大部分は膵管上皮由来の膵管癌であることにより、膵液中にはは癌細胞成分が脱落してくるとの想定に基づき細胞診がなされてきたが、一般にその有用性は高くない。一方、膵癌組織における検討で,c-ki-ras癌遺伝子のコドン12に点突然変異が90%前後もの高頻度に生じることが明らかにされている。そこで,私は,内視鏡的に採取される膵液を用いてc-ki-ras癌遺伝子点突然変異の検索を行い膵癌診断に対する有用性を検討した。膵癌ならびに慢性膵炎患者より経内視鏡的に採取した膵液からDNAを抽出後,以下の各種検出方法により検討を行った。ドットブロットハイブリダイゼーション法では,膵癌20例中11例(55%)にK-rasコドン12の点突然変異が検出されたが、慢性膵炎18例では、同変異は検出されなかった。このように、膵癌患者膵液中のK-rasコドン12点突然変異の検出は、膵癌の質的診断へ応用できることを明らかにした。(Jpn J Cancer Res 84:961,1993)。さらに、その検出感度を上げる目的で、modified primerによるPCR-RFLP法では、膵癌24例中20例(83)%に同変異が検出され、慢性膵炎26例中1例に同変異が検出された。この陽性を示した慢性膵炎の1例については、厳重に経過観察中である。また、癌研究所生化学部の中村らにより開発されたMutant Allele Specific Amplification(MASA)法では、RCRにて増幅されにくい場合もあるが、膵癌5例中4例にK-rasコドン12の点突然変異が検出され、慢性膵炎5例では、同変異はみられなかった。膵液細胞診陰性でc-Ki-rasコドン12の点突然変異の陽性を示した小膵癌症例もみられた。また、ERCP,EUSなどの画像診断にて膵癌との鑑別の困難な腫瘤形成性慢性膵炎症例では、同変異は陰性である。このように、膵液中のc-Ki-ras癌遺伝子点突然変異の検索は、膵癌との鑑別困難例や小膵癌診断に対する有用な臨床検査法となりうるものと期待される。