hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
ボルタンメトリー法による脳虚血再灌流誘導ドパミン、セロトニン受容体機能変化の検討

生理学的条件下での各脳部位のDA及び5-HT放出動態:生理的条件下における各脳部位のDA及び5-HT放出量(動態)を検討した。DA放出においては、各部位の特色を示し、特にLH及びACCのDA放出量の多いことが認められた。一方、5-HT放出は、各部における著明な相異は認められず、セロトニン神経系の略均一分布を反映している。虚血再潅流モデル動物のK+刺激によるDA及び5-HT放出変化:虚血再灌流モデルのDA及び5-HT放出を検討した。再灌流群のK+刺激によるACC DA放出変化は、sham対照群に比べて著しい増加反応を示した。FC DA放出は、同様わずかな増加を示した。一方、LH DA放出は、sham対照群に比べて低下抑制傾向が認められた. 5-HT放出動態変化については、ACC, LH及びACC各脳部位において再灌流群とsham群2群間に差は認められなかった。虚血再潅流障害(遅延性神経障害)は側坐核及び一部皮質DA神経に著明に認められた。セロトニン神経系はドパミン神経系に比較して虚血抵抗性を示した。脳部位選択的脆弱性は、経過時間の影響を加え各神経系により大きく異なることが示唆された。追加参考実験:ロテノン投与による虚血モデルにおいて、ロテノン処置によるチロシン水酸化酵素免疫細胞の減少を伴う側坐核ドパミン及びセロトニン量減少を確認し、アルコール嗜好性の増加を認めた。脳機能障害において脳報償系補完作用と飲酒増加の関連性が示唆された。脳虚血性疾患の病態解明は、医学生物学的に重要な課題である。脳虚血代謝エネルギーが低下すると、Na+ポンプ機能が抑制され、細胞内K+濃度減少、Na+濃度増大による脱分極が細胞内Cl-濃度を増加させ脳神経細胞の不可逆的器質的障害が生じる。この脳虚血病態の神経薬理学的解明を目的として、今期一過性脳局所低酸素モデルから検討した。脳局所シアン灌流法によるシアン化ナトリウム(NaCN)誘導エネルギー産生不全発現下の神経伝達放出変化を検討した。アンペロメトリー法(ボルタンメトリー法又は電気化学検出法)を応用して、組織中毒性(NaCN)(C)低酸素症histotoxic hypoxia虚血モデルのモノアミン動態を検討した。脳微小透析膜ガイドカニューラを脳側坐核に挿入固定し、術後良好な個体を用いた。C-C群(側坐核のシアン2mM灌流2回)において、2回のC灌流エネルギー産生不全刺激に対して側坐核DAは著明な放出増加を示した。C-カリウム(K)(40mM)群においても同様なDA放出を認めた。しかし、2回目のC,K灌流刺激では側坐核5HT放出は認められなかった。今回側坐核ドパミン神経系はシアン灌流刺激に対する耐性(抵抗性)が認められたが、側坐核セロトニン神経系はシアン刺激に対するミトコンドリアシトクローム酵素系障害を含む一過性虚血脆弱性を示した。脳虚血における脳部位脆弱性は既に報告されているが、今回モノアミン神経系の相違によるシアン刺激反応性の変化を認めた。(側坐核は脳報償系を構成する中心脳部位であり、ドパミン、セロトニン神経終末とそれらの受容体サブタイプが密に存在する。)[目的]虚血は高度の局所的貧血(乏血)を意味する。虚血障害程度は、血管閉塞の緩急、持続時間、部位脆弱性を示す。酸素欠乏は結果的には細胞ATP産生を障害し壊死を示す。今回、一過性脳虚血過程におけるドパミンン及びセロトニン量放出変化の脳内各部位特異性の有無と虚血モデル動物(ミトコンドリア呼吸鎖複合体I阻害ATP産生障害)のモノアミン量及び代謝回転を検討した。[材料と方法](1)動物雄ラット(Wistar系)8週齢を用いた.

実験動物は、抱水クロラール(400mg/kg i.p.)で麻酔した。4VO(椎骨動脈焼灼)手術は、第1頸椎翼状孔椎骨動脈左右の走行確保(筋損傷を最小限に止める)し、日本光電(EL-200型)電気メスチップ(電極:ニードル型と球型併用)により瞬時に焼灼した。抱水クロラール(400mg/kg,i.p.)麻酔下、耳棒使用脳定位固定装置により、ドパミン神経終末部(側坐核、線条体)、セロトニン神経系起始核(縫線核)及び大脳前頭皮質、海馬、又は視床下部外側野にガイドカニューレを挿入固定した。4VO良好モデル動物に高K^+灌流刺激によるドパミン、セロトニン放出変化を検討した。(2)ロテノン投与モデル動物のモノアミン変化:C57BL/6Jマウスにロテノン30mg/kg経口投与し2, 8, 20時間後の側坐核、線条体、外側視床下部、皮質、海馬、扁桃体、背側縫線核、正中縫線核のドパミン、セロトニンを電気化学検出器で定量した。[結果](1)生理的条件下の対照群の脳各部位ドパミン放出は側坐核(45fM/20min)を最大値として各部位の変化を示した。一方セロトニン放出は部位特異的な放出変動は認められなかった。4VO虚血動物のK^+灌流刺激時視床下部の相対的低下以外脳各部位のモノアミン放出増加が認められたが部位特異性は認められなかった。(2)急性ロテノン投与により、8時間後ドパミン、セロトニン脳内含有量が増加したが24時間後回復した。24時間後においても側坐核、縫線核、外側視床下部のセロトニンturnoverが有意に増加した。結果考察後脳虚血後の高次機能障害機序解明に応用したい。最初にラット大脳、視床下部及び側坐核に微小脳透析膜ガイドカニューレを埋入し、術後回復良好な個体を脳虚血実験に用いた。4血管閉塞法(Pursinelli法)に準じて、椎骨動脈焼灼後両側総頸動脈をクリップにより10分間閉塞し虚血再灌流モデルを作成した。術後4日、40mMKClで脳微小透析膜を介して灌流刺激しDA,5-HT放出変化を検討した。虚血再灌流群のK+刺激-側坐核DA放出はSham群に比べて著しく増加した。同様に大脳皮質DA放出はわずかに増加したが、視床下部DAはやや抑制傾向が認められた。一方5-HT放出については、各脳部位において2群間の差は認められなかった。虚血再灌流障害(遅延性神経障害)は側坐核、一部大脳皮質DA神経系に強く補完作用が認められた。セロトニン神経系はドパミン神経系に比べて虚血抵抗性を示しモノアミン神経系の選択的脆弱性が示唆された。遅延性虚血障害機序において、神経細胞内ミトコンドリア呼吸鎖複合体1中の鉄、硫黄中心からユビキノンへの電子伝達系の阻害が示唆され、今回ロテノン慢性投与(30日間)によるモデル動物を作成した。ロテノン処置マウスは側坐核、線条体のDA,5-HT量は減少し同時同部位におけるチロシン水酸化酵素免疫陽性反応細胞の減少がロテノン処置群に認められた。一方側坐核と線条体DOPAC/DA,5HIAA/5-HT比は増加した。以上の脳内モノアミン変動は、ロテノン処置マウスのアルコール嗜好性増加(血中アルコール代謝曲線には2群間に差を認めず肝機能障害はない)を惹起した。パーキンソン病を含む高次脳機能障害における神経系補完作用としてのアルコール摂取行動(ヒト飲酒)の変化が認められた。
覚醒度と快不快度を考慮したサウンドデザインに関する研究

本研究では,快適で気が付きやすい音のデザインを実現するために,(1)等しい音圧レベル・ラウドネスにおける好ましく,目立つ鳥・虫の鳴き声の探索,(2)騒音下で目立つ鳥・虫の鳴き声の探索,(3)複数音源存在下で目立つ音の探索,を行った.1,2に関しては心理反応,3に関しては,生理反応より求めた.ピッチの明瞭な鳥・虫の鳴き声が好ましく,親密度の高い鳥・虫の鳴き声が目立つことを明らかにした.複数音源存在下で目立つ鳥・虫の鳴き声に関しては,明瞭な結果は得られなかった.覚醒度・好ましさに影響を及ぼす音響物理指標を明らかにすることを目的として,音の定量化と音に対する心理反応の定量化を行った.音の定量化に関しては,空調音50種類,鳥・虫の鳴き声100種類を,相関指標,音質評価指標を用いて解析した.相関指標では,自己相関関数パワー,最大振幅と最大振幅時の遅れ時間,初期減衰幅,音質評価指標では,ラウドネス,シャープネス,ラフネス,変動強度を用いて,各音源の物理的特徴を調べた.ニューラルネットを用いて,相関指標と音質評価指標のどちらが正確に空調音を分類できるか調べた結果,相関指標は97パーセント,音質評価指標は82パーセントの正解率で,空調音を分類できることを明らかにした.空調音,鳥・虫の鳴き声に関して,相関指標,音質評価指標の分布・ばらつきから,心理実験に用いる刺激を決定した.9種類の建物内の空調音,15種類の自動車内空調音に対する,心理的好ましさ・不快度をシェッフェの一対比較法を用いて調べた.また,18種類の鳥の鳴き声,16種類の虫の鳴き声に対する心理的好ましさ,顕著性をシェッフェの一対比較法を用いて調べた.実験から求めた空調音に対する好ましさ・不快度尺度値に関して,相関指標,音質評価指標を用いて重回帰分析を行った.その結果,相関指標,または,音質評価指標を用いることで,高精度で各被験者の心理的好ましさ・不快度を予測できること,個人差は,各指標の標準回帰係数により表すことができることを明らかにした.音の定量化,定量化指標と心理反応との関係解析など,計画通りに進展している.昨年度等音圧レベル条件で,好ましく・目立つ鳥・虫の鳴き声を調査した.しかし,心理的な音の大きさ(ラウドネス)が結果に影響を及ぼすことが示唆されたため,等ラウドネス条件で,18種類の鳥の鳴き声,16種類の虫の鳴き声について,一対比較法を用いて,音の目立ち度(顕著性)を調べた.鳥の鳴き声に関しては,カッコー,ウグイス,サンコウチョウが多くの被験者に目立つと判断された.虫の鳴き声に関しては.カッコー,ウグイス,サンコウチョウが多くの被験者に目立つと判断された.複数音源存在下で目立つ音源を調べるため,複数音源存在下で,音源に対する注意が脳活動に及ぼす影響を脳磁界反応を用いて調べた.すなわち,音の物理情報が同じ条件において,注意の向け方の違いによる脳活動の違いを調べることで,注意を向けることが容易な音源を推定した.脳磁界反応は,1θ(4-8 Hz),α(8-13 Hz),β(13-30 Hz),γ(30-50 Hz)の4種類の周波数帯ごとのパワーの解析,2単体の刺激音聴取時の脳磁界反応と混合刺激音聴取時の脳磁界反応の相関の解析,3単体の刺激音の振幅包絡と混合刺激音聴取時の脳磁界反応との相関の解析,を行った.解析1に関しては,θ帯域において,顕著性が高いウグイスの鳴き声が含まれている刺激を聴取したときのパワーが大きい傾向が見られた.しかし,他の帯域では,鳥の鳴き声に対する違いは見られなかった.また,注意の影響は見られなかった.解析2に関しては,相関をとる時間が早いほど相関係数は高く,高い周波数帯になるほど相関係数は低くなる傾向が見られた.また,相関の平均値が注意を向けている場合高くなる傾向が見られる.しかし,鳥の鳴き声に対する違いは見られなかった.解析3に関しては,相関係数は全ての条件においてあまり変化が見られなかった.計画書通り研究が進展している.本年度は,騒音下で目立つ鳥・虫の鳴き声の探索を行った.昨年度までの検討から,顕著性の異なる音源を選択した.鳥の鳴き声は,カケス,カッコー,メジロ,イカル,ツツドリ,ウグイスの6種類,虫の鳴き声は,ツクツクボウシ,ミンミンゼミ,ヒグラシ,ツヅレサセコオロギ,カンタン,スズムシの6種類を用いた.背景騒音として,Hothスペクトル型ノイズ,平均的な鉄道駅構内騒音,実測データを基に作成された自動車内騒音を用いた.等音圧レベル,等ラウドネスの2条件で実験を行った.鳥の鳴き声に関しては,等音圧レベル条件では.カケス,ウグイスが多くの被験者に目立つと判断され,等ラウドネス条件では,ウグイスが多くの被験者に目立つと判断された.虫の鳴き声に関しては,等音圧レベル条件では.ツクツクボウシ,ミンミンゼミ,ヒグラシが比較的多くの被験者に目立つと判断され,等ラウドネス条件では,個人差が大きい結果となった.暗騒音の効果に関しては,等音圧レベル条件では,自動車内の顕著性が高く,等ラウドネス条件では,暗騒音の違いは少なかった.

各音響特徴量と顕著性尺度値の関係に関しては,全体としては高い相関は得られなかった.音に対する親密度が顕著性に及ぼすことが示唆されたため,暗騒音条件で用いた鳥・虫の鳴き声に対する親密度を調査した結果,顕著性と類似した傾向が得られた.暗騒音なし,暗騒音ありの両条件において,鳥の鳴き声に関しては,ウグイスが比較的目立つことが分かった.虫の鳴き声に関しては,個人差が大きい結果となった.また,音に対する親密度が顕著性に及ぼす影響が大きいことを示唆する結果が得られた.個人差が大きいことから,個人の顕著性と音響特徴量の関係を調べることで,顕著性に影響を及ぼす音響特徴量を明らかになると考えられる.本研究では,快適で気が付きやすい音のデザインを実現するために,(1)等しい音圧レベル・ラウドネスにおける好ましく,目立つ鳥・虫の鳴き声の探索,(2)騒音下で目立つ鳥・虫の鳴き声の探索,(3)複数音源存在下で目立つ音の探索,を行った.1,2に関しては心理反応,3に関しては,生理反応より求めた.ピッチの明瞭な鳥・虫の鳴き声が好ましく,親密度の高い鳥・虫の鳴き声が目立つことを明らかにした.複数音源存在下で目立つ鳥・虫の鳴き声に関しては,明瞭な結果は得られなかった.好ましさ,覚醒度に影響を及ぼす物理指標の違い,複数の音が存在するときの,物理指標,心理反応,生理反応の解析を進める.騒音下での顕著性に関連する心理・生理反応を解析する.29年度が最終年度であるため、記入しない。環境心理生理学29年度が最終年度であるため、記入しない。
スギヒラタケの急性脳症事件の分子機構全容解明とその応用展開

スギヒラタケは食用とされていましたが、摂取者に原因不明の急性脳症が相次ぎ、現在もその毒性メカニズムは不明のままです。申請者らは複数の毒成分が、スギヒラタケによる急性脳症の発症機構に関与するという以下の仮説を立てています。本研究ではこの説を立証するだけでなく、この毒性物質の新規なタンパク質分解活性に着目することで、治療・予防への道筋を切り開くとともに新たな酵素としての応用展開を目指します。
倭玉篇諸本による和訓集成ならびに国語学的研究

和玉篇の古写本・古版本は約三十種に及ぶ、この三十種を川瀬一馬氏は、成立並びに伝流の関係から、八類に類別されている。その類別されたものの中から、第二類本の篇目次第、第五類本の慶長十年刊夢梅本、第八類本の慶長十五年刊本の三種について和訓の索引を作成して、これを公刊した。今回は第一類本の玉篇要略集、第二類本の弘治二年写本、第三類本の拾篇目集、第四類本の米沢図書館蔵本・玉篇略の五種を選び、この五本のすべての和訓を採取し、これを同一見出し漢字と同一和訓を集合させて、五種対照の索引を作成した。さらに既刊の篇目次第、夢梅本、慶長十五年刊本(以上この研究代表者の作成)と音訓篇立(他者の作成)を加えて、同一見出漢字と、同一和訓の有無を照合し、この結果を符号によって五種対照索引の末尾に示した。この結果九種の和玉篇の和訓の総合が得られた。これによって和玉篇和訓の諸問題の解明をはじめとして、他の古辞書の和訓との比較研究は当然の事のほか、語彙研究の全体に大いに貢献しうるものと考えている。次年度にはこの対照索引を公刊する予定であるので、この準備を継続的に行なう。今回取り上げた五種の本文編のうち拾篇目集(国立国会図書館蔵本)と米沢文庫蔵本は特別の許可のもと写真撮影を行なう。玉篇略と弘治二年本と玉篇要略集(大東急記念文庫蔵)の三種は複製本が公刊されてはいるが、極めて高価であることと、入手が容易でないことから、この三種については、手写本を作成した。これを影印して本文編とする。
酵素法－化学合成を組み合わせた生産系の効率向上をめざす基質分子の設計と合成

酵素触媒と有機合成をあわせて活用する物質生産プロセスの効率向上を目指し、反応速度論上のパラメーターが好適で、かつ反応媒体にもよい親和性を示す基質を分子設計、合成した。具体的には、まず、微生物全菌体還元の基質として機能するα-ハロケトンの構造最適化を行った。そのものを基質とし、新規に探索した酵素を用いた還元を鍵段階として、テルブタリンの合成を達成した。一方、位置選択性および官能基多様性を最大限に発揮できる、アラビノースやグリカール誘導体を基質設計し、大量合成法を確立した。後者では酵素反応生成物に対する立体選択的Ferrieer反応を可能とし、L-フコースやL-グルコースの合成前駆体へと導いた。4-O-メチル-ManNAc (1)は抗インフルエンザ薬、ラニナミビル(2)の酵素合成前駆体となる重要なアミノ糖である。シアル酸誘導の際に阻害剤となるグルコ型を含まない、純粋なマンノ型のみを供給可能な合成ルートが求められている。従来合成法では高価なManNAcが原料で、そこから多段階の変換を要したり、別の合成では鍵段階である窒素官能基の立体選択的導入に高価なロジウム錯体を経由している。本年度の研究では、トリアセチルD-グルカールに対するフェリエ反応生成物(3a)から出発、TBSエーテル(3b)が有する4-位の遊離ヒドロキシ基を利用し、立体選択的にエポキシ化した後、ヒドロキシ基をメチル化した。求核置換反応で3-位に優先的にアジド基を導入した。ついでアジドアルコール(4)の2-位ヒドロキシ基を脱離基に変え、アジド基を還元、立体選択的に環化し、N-アセチル化を経て、重要中間体であるN-アセチルアジリジン(5)を調製した。アジドアルコール(4)の位置異性体も同一化合物に収束した。アジリジン(5)に対し、ヨウ化物イオン存在下、位置選択的に開環ー再閉環し、目的のマンノサミン骨格を有する2-メチルオキサゾリン(6)を得た。開環、脱保護によって目的物(1)とし、各種中間体も含め酵素的アルドール反応を検討中である。酵素触媒と有機合成をあわせて活用する物質生産プロセスの効率向上を目指し、反応速度論上のパラメーターが好適で、かつ反応媒体にもよい親和性を示す基質を分子設計、合成、大量供給を可能とする実用的な生産方法、合成経路、新規酵素機能について検討してきた。初年度(H23)は、L-フコース(1)の合成を目標とし、D-アラビノースより一段階で得られるアミノオキサゾリン(3)に対し、リパーゼを用いた位置選択的変換を達成した。H24には、リパーゼによる位置選択的脱保護を経て得られる、D-グルカール誘導体(4)をフェリエ反応に付し、生成するαーアノマー(5)からシアリダーゼ阻害剤の前駆体、4-O-メチルManNAc(6)を合成した。本年度は、前年度報告した(4)の類縁体(7)に対する反応を検討、セシウムアルコキシドを作用させると、アノマー位がβ配向の生成物(8)が得られることが判明した。立体化学はX線結晶構造解析で確認した。4-位ヒドロキシ基の配向を利用し、ペイン酸化の条件で立体選択的にエポキシ化、良好な収率でエポキシド(9)を得た。このものに対し、水酸化物イオンを求核剤として用い、エポキシドを位置選択的に開環、高い収率でD-グルコースの2,3,4-位を全て反転させた物質に相当するイドシド(10)へ変換した。ここから第一級アルコールを位置選択的に酸化、ラクトンの開環で、メチルエステル(11)を調製した。現在5位のエピメリ化によってL-グルコース(12)への変換を試みている。これまで、D-グルコースを出発原料として炭素骨格を切断することなくそのまま活かし、2,3,4,5-位の立体化学を全て反転させるようなアプローチは報告されていない。本法はこれを可能とするユニークな試みで、ラベル体合成など適用範囲が広いと期待される。本年度は当初に掲げた研究テーマのうち、以下の研究について重点的に検討した。L-フコース(1)は、白血球やがん細胞が血管内皮細胞と接着する際に関与するsialyl LeXや、血液型決定因子を構成する重要な糖だが、天然資源、フコイダンからの単離・精製には多大な労力が必要である。フコースをフラノース型で投影すると、アラビノースの非還元末端から一炭素増炭した関係にあることに着目し、まず、D-アラビノース(2)からL-フコースを得るルートを検討することとした。D-アラビノースより一段階で得られるアミノオキサゾリン(3)に対しN-Boc化を試みたところ、予想に反しO-Boc化も観察され、4aのみならず4bが得られてきた。

生成物を収束させるようと触媒量のDMAPを添加し、改めてBoc保護を試みたところ、興味深いことに低収率ながら目的に適う、5-位のみ遊離となった4cが主生成物として得られるようになった。位置選択的保護については、アセチル体としてからリパーゼで加水分解する方法も試み、上記化学法とは相補的な選択性を見出すことができた。このように、原料からわずか一工程で得られる4cに対しDMP酸化を試み、増炭前駆体であるアルデヒド5を収率48%で得た。しかしMeLiやMeMgBrなどのメチル化剤を用いた増炭反応を試みたが、試薬の塩基性のためか3-位のBocオキシ基のβ-脱離が優先し、複雑な混合物を与えた。有機銅試薬や有機亜鉛試薬を用いたところ低収率ながらメチル化体(6)が得られた。現在、立体選択的増炭を検討中である。前年度のフコース誘導体に関する研究とともに、天然に豊富な糖質の骨格と立体化学を活用し、目的とする位置への官能基導入に成功した。次年度はL-グルコースの合成に展開する予定である。天然に豊富な糖質の骨格と立体化学をそのまま活かし、目的とする位置への保護基導入に成功した。立体選択的一炭素増炭には多くの解決すべき課題が予想されるので次年度継続的に検討する。具体的には、24年度に得られた化合物から出発し、酵素ー化学的手法を相補的に用いる保護基導入を鍵段階として、L-グルコースの合成を試みる。また、当初24年度実施を予定していた、ニトロソウレア誘導体のクライゼン転位を活用する化学ー酵素合成について検討する。カルバミル化合物の類縁体である、さまざまなウレア誘導体を合成する。このものをN-ニトロソ化し、不安定生成物をそのままクライゼン転位させ新規カルバミルアミノ化合物を得る。それらの生成物に対し酵素を作用させ、新規な光学活性オキサゾリジノン類を合成する。計画調書記載の方法に則って実施予定である。具体的には、24年度実施を予定している、ニトロソウレア誘導体のクライゼン転位を活用する化学ー酵素合成について検討する。また、加水分解酵素を用いたグリカール誘導体の位置選択的脱保護を基盤に、希少糖合成を試みる。トリアセチル-D-グルカールは、グルコースより2段階で合成可能、しかも1,2位を修飾することができる化合物であり、さまざまな希少糖や2-アミノ糖類への変換が期待できる。しかし、それには3箇所のアセチル基を位置選択的に脱保護し、反応性の官能基を導入する必要があり、従来報告されている事例は、非常に多くの工程を要する。本研究では、まずトリアセチル-D-グルカールの3位および6-位のアセチル基を、リパーゼを用いて選択的にエステル交換・加水分解し特定位置の水酸基を遊離とする。それらの化合物に転位・環化などの位置・立体選択的な化学変換をほどこし、リパーゼ触媒に対する基質特異性を検討する。L-グルコース、N-アセチル-D-マンノサミン誘導体、N-アセチル-D-ガラクトサミンなどを究極の標的物質とし、上記の酵素ー化学合成全体の効率向上をはかる。
腸内細菌叢・脳軸からみた月経前症候群への新治療戦略

月経前症候群治療に対する新たなアプローチとして、セルフケアで使用できる食事療法・プロバイオティクス・プレバイオティクスといった方法は簡便・低侵襲であり、治療率の向上面からも魅力的である。しかしながら、炎症・腸内細菌とPMSとの関連性を裏付けるようなデータは不十分である。そこで、本研究では、「炎症はPMSの病態において、重要な役割を果たすのか?」「腸内細菌とPMSの関連性の有無は?」の2点を解明すべき中心命題として研究を実施する。
先天代謝異常症・Wilson病の頻度、遺伝子変異、治療法等の中国と日本での比較検討と治療法の確立

ウィルソン病は常染色体劣性遺伝の銅代謝異常症である。発病率は35,000に1人、保因者は約90人に1人で、諸外国の発症率は同じである。欧米ではH1069Q変異、日本ではR778L変異が多いと報告されている。しかし、中国の患者に関する遺伝子解析、genotypeとphenotypeの分析の報告は少ない。本研究は中国のウィルソン病患者の遺伝子変異を明らかにし、更にgenotypeとphenotypeの関連について調べることを目的とした。【対象および方法】中国人医師の協力を得て、50人のコントロールと40人の子ども患者からゲノムDNAを抽出した。ATP7B遺伝子の全てのエクソン、Promotor領域およびApoEのgenotypeをPCRで増幅し、direct sequencing法で調べた。【結果および考察】1.中国人患者のATP7B遺伝子において計28の変異と17の多型が同定された。最も多い変異はR778Lであって、ヨーロッパの患者と違った結果を示した。R778L変異を有する患者においてgenotypeとphenotypeの関連はみられなかった。2.ATP7B遺伝子において変異を見つけていなかったアレルに関して、この遺伝子のPromotor領域を調べたところ、一つの変異と8の多型が同定された。1と2の結果は中国人ウィルソン病の遺伝子診断とカウンセリングするのに有意である。3.ヨーロッパの患者と違って、中国人患者の発症年齢と臨床症状はApoE genotypeとの関連はなかった。
制がん剤のアンプリファイヤーによる効果増強機構の解析と新アンプリファイヤーの開発

癌の化学療法に用いられる制がん剤の多くはDNAを作用部位とするので、制がん剤によるDNAの分子認識の研究は、大変重要である。ディスタマイシンAなどのDNA結合試薬がアンプリファイヤーとして制がん剤のDNA切断活性を増強するかどうかを検討した。新規抗癌性抗生物質であるデュオカルマイシンAは二本鎖DNAにおいて、AまたはTが三つ以上続く配列のアデニンをアルキル化(アルカリ処理により切断)するが、G・Cに富む部位での、アルキル化は認められなかった。しかし、ディスタマイシンAを共存させると、G・Cに富む部位でアルキル化の顕著な増大が認められた。そのDNA損傷の増強機構として、ディスタマイシンAはA・Tに富む溝の幅が狭いマイナーグループ(溝)を認識しアルキル化するが、ディスタマイシンAと共存した時にはG・Cに富む溝の幅が広いマイナーグループ(溝)を認識しアルキル化すると考えられる。即ち、デュオカルマイシンAとディスタマイシンAが共存するとDNAのG・Cに富む配列で三者からなる錯体が形成され、その結果デュオカルマイシンAがアルキル化することが推定された。その機構を確かめるためにコンピューターグラフィックスを用いてモデル化を行った。その結果、ディスタマイシンAとデュオカルマイシンAが2分子重なりDNAのG・Cに富む部位でのマイナーグループに結合し、三重錯体構造を形成することが判明し、この三重錯体構造がエネルギー的に最適化していることが明らかになった。この相異なる二つの分子によるDNA配列の認識を我々は"協奏的DNA認識(Concerted DNA Recognition)"と名付けた。このような新しい分子認識の機構は新たな制がん剤の開発に結び付くことが期待できる。DNA結合試狩ぎアンプリファイヤーとして制がん剤のDNA切断絶性を増強するかどうかを検討した。新規抗癌性抗生物質であるデュオカルマイシンA単独ではアルキル化はAまたはTが三つ以上続く配列のもっとも3'に近いアデニンで起こった。ところが、ディスタマイシンAの存在下では、グアニンのアルキル化が増大し、特に5'-(A or T)G(G or C)TG__-G-3'(アンダーラインは損傷部位を示す)の配列で顕著だった。デュオカルマイシンAやディスタマイシンAはA・Tに富む配列の狭いマイナーグルーブと結合することにより、A・Tに富む配列を認識すると考えられる。デュオカルマイシンAとディスタマイシンAが共存するとDNAのG・Cに富む配列で三者の錯体が形成され、その結果デュオカルマイシンAがアルキル化することがフットプリンティング法とHPLC product analysis法により推定された。この、相異なる二つの分子によるDNA配列の認識を"協奏的DNA認識=(Concerted DNA Recognition)"と名付けた。このような新しい分子認識の機構は新たな制がん剤の開発や制がん剤の投与法に結び付く可能性がある。ネオカルジノスタチン単独ではチミンまたはアデニンでのDNA一本鎖切断がおこる。DNA結合試薬の影響を検討したところ、アクチノマイシンDの存在下では一本鎖切断の増強のみならず、細胞死を引き起こし易い二本鎖切断が強く誘導された。この二本鎖切断は塩基対にした2対だけずれており、二つの炭素ラジカルがそれぞれ一本鎖切断をもたらした。このDNA切断の増強作用はアクチノマイシンDの平面状のフェノキサゾン骨格がG・CにインターカレートすることによりDNAのコンフォーメーションが変化しネオカルジノスタチンがよりDNA損傷を起こし易い形で、5'-TGT__--3'(3'-A__-CA-5')に結合できるようになったためと考えられる。培養細胞中でも同様のDNA二本鎖切断の増強がもたらされることを確認した。
中高年女性肺MAC症成立におけるエストロゲンの影響

Mycobacterium avium complex (MAC)は、従来日和見感染菌であると考えられてきたが、近年全身・肺局所に特に基礎疾患を持たない健常者に発症する肺MAC症が増加しており、注目すべきはその多くが中高年の女性であることである。我々は先に、このような肺MAC症の発症に閉経後の急速なエストロゲン濃度の低下が関連しているとの仮説のもと、マウス肺MAC感染モデルを用いた実験を行い、その結果、卵巣摘除により有意に肺内MAC生菌数が増加することを証明した。そこで、ヒトにおいてもエストロゲンが肺MAC症の発症に関与しているかどうかにつき今回検討を行った。女性肺MAC症患者及び対照として女性肺結核患者において、血中エストラジオール濃度を測定した。肺MAC症患者では、平均16.0pg/ml、肺結核患者では平均74.0pg/mlと、肺MAC症患者において血中濃度が低い傾向がみられた。このタイプの肺MAC症では、発症に、菌側の因子よりも宿主側の因子が強く関与していることが推測される。そこで、肺MAC症患者から分離されたMAC菌株について、IS1245をターゲットとしたRFLP分析を行った。すると、中高年女性の基礎疾患を持たないタイプでは、様々なRFLPパターンによるMACが感染していたのに対し、肺気腫等の基礎疾患を持つタイプでは、特定のRFLPパターンのMACが多くを占めていたことが判明し、特定の強毒菌による感染が疑われた。すなわち、中高年女性に多い基礎疾患を持たないタイプの肺MAC症では、その発症に菌側よりも宿主側の要因が大きく関与しており、その原因としてエストロゲンの関与が示唆された。全身・肺局所に基礎疾患を有さない中高年女性に、肺Mycobacterium avium complex(MAC)症が好発する原因を探求する目的で、エストロゲンのMACに与える影響を検討した。当院で肺MAC症と診断された女性の血清中17β-estradiolの濃度をELISA法にて測定した。肺結核症、一般呼吸器疾患の女性患者を対照とした。現時点では、群間における明らかな血清濃度の差を認めるには至っていない。今後、症例数を蓄積するとともに、画像所見など病態の遠いにより濃度差がみられるかにつき検討を加える予定である。また、エストロゲンの影響を考えるうえで、MAC増殖に与える直接効果の有無の検討が必要と思われたため、臨床分離MAC株を5×10^6CFU/mlの菌量で浮遊させた液体培地中に、17β-estradiolを3pg/ml、30pg/ml、300pg/mlの濃度で加え、生菌数に与える影響を検討した。結果、群間における有意差はみられず、直接効果はないものと考えられた。また、肺MAC症成立における菌側の因子を考えるために、当院で経験した家族内発症の肺MAC症2例につき分離MAC菌株のパルスフィールドゲル電気泳動分析を行ったところ異なった菌株であることが判明した。以上より肺MAC症発症には菌側の因子よりも宿主側の因子が強く関連している可能性が示唆され、その因子として女性ホルモンの影響の有無につき今後も検討を続ける予定である。
皮膚悪性腫瘍の遺伝子工学的解析

1.表皮系腫瘍におけるEGFreceptorの発現と、EGFreceptor geneの検索。種々の表皮系腫瘍を抗EGFreceptor抗体を用いて染色したところ、正常表皮では基底層ならびに有棘層下層の細胞膜にのみ陽性反応が認められたるに対し、有棘細胞癌や同リンパ節転移では、全腫瘍細胞に陽性反応が認められた。有棘細胞癌の1例は熱傷瘢痕より発生したものであったが、表皮細胞に異型性はないにもかかわらず、表皮全層に陽性反応が認められた。なお、3B4-6抗体やKi-67抗体による反応は、有棘細胞癌や同リンパ節転移では、腫瘍細胞に陽性反応がみられたのに対し、熱傷瘢痕では基底細胞層のみに認められた。一方、EGFreceptor geneをproveとしてSouthern blottingを行ったが、腫瘍細胞のEGFreceptor geneの増幅や構造変化は認められなかった。2.菌状息肉症の遺伝子解析。種々の病期における本症皮膚病変を生検し、T cell receptor geneをprobeとしてsouthern blottingを行ったところ、premycotic stageでは、monoclonalityは全く認められず、plague stage以後において、認められはじめること、しかも、複数個の病変で、全く同じpatternが認められることが分った。3.皮膚型成人T細胞リンパ腫(ATL)の遺伝子解析。HTLV-IおよびT cell receptor geneをprobeとして、ATL患者の皮膚腫瘍のDNA解析を行ったところ、末梢血中に異型細胞や同リンパ球のDNA解析異常の出現以前にHTL-I virusの取り込みと同細胞のモノクロナ-ルな増殖が認められ、皮膚型ATLの存在が遺伝子的にも確認された。
記号・数値が混在した回路網の言語的表現手法とその記号解析に関する研究

本研究では記号処理を得意とする数式処理言語を用いた回路網の記号解析手法を提案すると共に,提案する回路網記号解析手法の特徴を十分活かした回路網の表現手法や解析内容の表現方法について検討を加えた.これまで一般に,回路網を記号解析する手法としては,パラメータ抽出法などが提案されている.しかしこれら従来の数値処理言語による記号解析では,多くの繰り返し演算によっていたため,記号として取り扱うことのできる素子の数に制限があり,さらに繰返し演算による計算時間や演算誤差が問題になっている現状である.一方で数式を記号のまま計算を行う,いわゆる数式処理言語に関する研究がすすみ,現在では様々な機能を持った数式処理言語が発表されている.しかし,これらの数式処理言語を積極的に回路網の記号解析に利用しようとする試みは他にはなかった.本研究ではこのような数式処理言語により回路網の記号解析を行うための基本的な考察と,その際回路網や解析内容を手続き型言語のように表現する手法を提案した.本手法によると回路網中任意の組み合わせの回路変数を,記号として扱うか数値として扱うか自由に選択しながら回路網を解析することができるため,従来の解析手法に比べより多様な解析処理を行うことができる.また,回路網全体や解析処理内容をいくつかの部分回路や部分的な解析処理が相互に接続されたものとして取扱うことができるようになったため,より柔軟な回路網や解析内容の記述ができるようになった.さらに本研究では開発した回路解析システムをインターネット上で利用できるようシステムに改良を加えた.これによりインターネット上の任意の端末から特別なプログラムを必要とせずに本回路解析システムを利用することが可能となり,教育機関における講義や演習あるいは学生の自主的な学習にも利用できるようになった.本研究では記号処理を得意とする数式処理言語を用いた回路網の記号解析手法を提案すると共に,提案する回路網記号解析手法の特徴を十分活かした回路網の表現手法や解析内容の表現方法について検討を加えた.これまで一般に,回路網を記号解析する手法としては,パラメータ抽出法などが提案されている.しかしこれら従来の数値処理言語による記号解析では,多くの繰り返し演算によっていたため,記号として取り扱うことのできる素子の数に制限があり,さらに繰返し演算による計算時間や演算誤差が問題になっている現状である.一方で数式を記号のまま計算を行う,いわゆる数式処理言語に関する研究がすすみ,現在では様々な機能を持った数式処理言語が発表されている.しかし,これらの数式処理言語を積極的に回路網の記号解析に利用しようとする試みは他にはなかった.本研究ではこのような数式処理言語により回路網の記号解析を行うための基本的な考察と,その際回路網や解析内容を手続き型言語のように表現する手法を提案した.本手法によると回路網中任意の組み合わせの回路変数を,記号として扱うか数値として扱うか自由に選択しながら回路網を解析することができるため,従来の解析手法に比べより多様な解析処理を行うことができる.また,回路網全体や解析処理内容をいくつかの部分回路や部分的な解析処理が相互に接続されたものとして取扱うことができるようになったため,より柔軟な回路網や解析内容の記述ができるようになった.さらに本研究では開発した回路解析システムをインターネット上で利用できるようシステムに改良を加えた.これによりインターネット上の任意の端末から特別なプログラムを必要とせずに本回路解析システムを利用することが可能となり,教育機関における講義や演習あるいは学生の自主的な学習にも利用できるようになった.平成9年度は回路網の接続状況や解析手順を効率よく記述する手法について検討を加え,これらを汎用の手続き型言語のように記述する手法を提案した.また,提案する記述法に基づく回路網の記号解析システムを構築した.構築した回路解析システムは,最近開発が相次ぐ数式処理言語を積極的に利用して回路網を効率よく記号解析を行おうとするものである.回路網を記号解析することにより素子感度や雑音特性に代表される各種の性質を,繰り返し演算によらず求めることができる.このような記号解析手法については,これまでにいくつか提案されているが,これらがすべて数値処理言語によるパラメータ抽出などの手法を用いているため,記号として取り扱うことのできる素子の数に限りがあった.さらに解析処理を行う上で多くの繰り返し演算が必要であり,そのための計算時間や演算誤差が問題になっていた.提案した手法では,例えば回路網内,任意の素子値の組み合わせを記号としてあるいは数値として取り扱いながら各種の解析ができるなど,従来の手法に比べ柔軟性に富んだ回路解析が可能となった.また解析手順についても新しい型の変数を導入することにより,より柔軟な解析手順の記述ができるようになった.また,提案システムの利用法について検討した結果,利用者がインターネットのブラウザを経由して回路網や解析手順の入力が行え,また同じブラウザ上で式あるいは図形の形で解析結果を得ることができるように,システムをインターネット対応とするよう検討を始めた.これまでの研究により基本的なプログラムの開発が完了しており,今後はその動作確認ならびにシステムとしての完成度を高めるための改良を加えて行く必要がある。本研究では記号処理を得意とする数式処理言語を用いた回路網の記号解析手法を提案すると共に,提案する回路網記号解析手法の特徴を十分活かした回路網の表現手法や解析内容の表現方法について検討を加えた.これまで一般に,回路網を記号解析する手法としては,パラメータ抽出法などが提案されている.しかしこれら従来の数値処理言語による記号解析では,多くの繰り返し演算によっていたため,記号として取り扱うことのできる素子の数に制限があり,さらに繰返し演算による計算時間や演算誤差が問題になっている現状である.

一方で数式を記号のまま計算を行う,いわゆる数式処理言語に関する研究がすすみ,現在では様々な機能を持った数式処理言語が発表されている.しかし,これらの数式処理言語を積極的に回路網の記号解析に利用しようとする試みは他にはなかった.本研究ではこのような数式処理言語により回路網の記号解析を行うための基本的な考察と,その際回路網や解析内容を手続き型言語のように表現する手法を提案した.本手法によると回路網中任意の組み合わせの回路変数を,記号として扱うか数値として扱うか自由に選択しながら回路網を解析することができるため,従来の解析手法に比べより多様な解析処理を行うことができる.また,回路網全体や解析処理内容をいくつかの部分回路や部分的な解析処理が相互に接続されたものとして取扱うことができるようになったため,より柔軟な回路網や解析内容の記述ができるようになった.さらに本研究では開発した回路解析システムをインターネット上で利用できるようシステムに改良を加えた.これによりインターネット上の任意の端末から特別なプログラムを必要とせずに本回路解析システムを利用することが可能となり,教育機関における講義や演習あるいは学生の自主的な学習にも利用できるようになった.
Bリンパ腫病型決定遺伝子の同定とその作用機序の研究

本研究はPre-Bリンパ腫好発近交系マウスSL/Khのリンパ腫の発生、病型、潜伏期間の長さなどを支配している宿主遺伝子を同定し、その作用機序を解析することを目的としている。今回はSL/Khと野生マウス由来の近交系MSM/Msの交配系のリンパ腫発生を観察し、遺伝解析を加えた。F1ではリンパ腫の発生はなく、SL/Khへの退交配世代60頭のうち14頭が1年6ケ月の観察期間中にリンパ腫を発生した。この頻度から、MSM/Msは2つの優性抵抗性遺伝子を持つという仮説をたてた。退交配世代をマイクロサテライト法により遺伝解析した結果、第17染色体MHC領域と第14染色体上に優性抵抗性遺伝子がマップされ、それぞれMsmr-1,Msmr-2と命令された。SL/KhのMHChaplotypeはqで、MHC classll分子に欠損がある。SL/Kh系マウスはウイルス、あるいはリンパ腫細胞に対する免疫学的抵抗性を欠如していると考えられる。またMsmr-2はヒトの5q23-31とシンテニックであり、この部位ではヒト造血系腫瘍でしばしば転座、LOHなどが報告されている。
HBV高感受性ヒト肝細胞株の樹立とHBV増殖制御因子の解析

B型肝炎ウイルス(HBV)の基礎研究では、肝がん細胞株由来のHepG2細胞株が世界的に用いられている。本研究において、我々はHepG2と同等以上のHBV感受性を示す細胞株を樹立し、新規抗HBV剤候補の探索やHBV感染増殖に寄与する新規宿主因子の同定を目指している。本年度の研究では、HBVの感染受容体である胆汁酸トランスポーター(NTCP)を発現する肝がん細胞株由来のLi23細胞株にHBV感受性を既に見出しているが、その感受性はHepG2/NTCP細胞と比較して1/100以下だったため、限界希釈法によるサブクローニングによってHBV感受性を高めることができるか検討した。Li23/NTCP細胞は1ヶ月間培養して多様性を持たせたのちに、サブクローニングを行い数十種類のサブクローン化細胞を作成した。サブクローン化細胞のHBV感受性はHBVの感染増殖性を定量的に評価できるHBV/secNLレポーターアッセイ系を用いて評価した。評価の結果一番HBV感受性が高かったサブクローン化細胞について再度同様の手法を用いてサブクローニングを繰り返した。最終的にサブクローニングは4回行い、HepG2/NTCP細胞と同等以上のサブクローン化細胞が得られた。また、Li23細胞はHepG2細胞と遺伝子発現プロファイルが大きく異なるため、薬剤感受性に差がでることが予想された。そこで、HBVの感染阻害活性が報告されているいくつかの化合物についてHBV/secNLレポーターアッセイ系を用いて評価した。その結果、細胞株の違いによって薬剤感受性に大きな差が認められた。今年度の研究で得られたLi23/NTCP細胞由来のサブクローン化細胞は親細胞と比べてHBV感受性を飛躍的に高まりHepG2/NTCP細胞と同等以上になった。HBVの基礎研究ではHepG2細胞由来の細胞株のみで実験が行われることが多く、肝がん細胞株由来でHepG2/NTCP細胞と同等以上のHBV感受性を示す細胞株は報告されていない。また、細胞株の違いによって薬剤感受性に大きく差がでることを明らかにしたことから、複数の細胞株由来のアッセイ系で化合物を評価することが重要であることが示唆された。これらの結果から、HBVの基礎研究を発展させる重要なツールを構築できたと自負しており、化合物の評価だけでなく、HBVの感染増殖に必要な宿主因子の解析など様々な研究に役立つことが予想されることから当初の計画以上に進展していると判断した。Li23細胞株で成功した限界希釈法によるサブクローニングが他の細胞株でも利用できないか検討する。1年目の研究で得られたLi23細胞株由来のサブクローン化細胞とHepG2/NTCP細胞を用いて化合物のスクリーニングを行い、新たな抗HBV剤候補を見出す。さらにHBV感受性が高い細胞株と低い細胞株をcDNAマイクロアレイ解析などによる比較解析を行うことで、HBVの感染増殖に必要な宿主因子候補を選択する。選択した宿主因子候補はレトロウイルスベクターによる強制発現細胞の作成やsiRNAやCRISPR/Cas9システムを用いて、候補因子がHBV感染増殖に寄与しているかどうかを明らかにする。同定できた場合は免疫染色や免疫沈降などによりHBVの感染増殖にどのように寄与しているかを明らかにする。また、宿主因子に変異を導入したり欠損させたりすることで、宿主因子の機能のどの部分がHBVに重要であるかを明らかにする。

これらの結果から、HBVの基礎研究を発展させる重要なツールを構築できたと自負しており、化合物の評価だけでなく、HBVの感染増殖に必要な宿主因子の解析など様々な研究に役立つことが予想されることから当初の計画以上に進展していると判断した。Li23細胞株で成功した限界希釈法によるサブクローニングが他の細胞株でも利用できないか検討する。1年目の研究で得られたLi23細胞株由来のサブクローン化細胞とHepG2/NTCP細胞を用いて化合物のスクリーニングを行い、新たな抗HBV剤候補を見出す。さらにHBV感受性が高い細胞株と低い細胞株をcDNAマイクロアレイ解析などによる比較解析を行うことで、HBVの感染増殖に必要な宿主因子候補を選択する。選択した宿主因子候補はレトロウイルスベクターによる強制発現細胞の作成やsiRNAやCRISPR/Cas9システムを用いて、候補因子がHBV感染増殖に寄与しているかどうかを明らかにする。同定できた場合は免疫染色や免疫沈降などによりHBVの感染増殖にどのように寄与しているかを明らかにする。また、宿主因子に変異を導入したり欠損させたりすることで、宿主因子の機能のどの部分がHBVに重要であるかを明らかにする。当初の計画ではHepG2/NTCP細胞と同等以上の細胞株を樹立するためには、多数の細胞株を用いてサブクローニングを何度も繰り返す必要があると予想され、そのために必要な細胞培養用品の物品費を多く見積もっていた。しかし、多くの細胞株を試す前に目的の細胞株が得られたため、これらの物品費の消費をかなり節約することができた。来年度は得られた細胞を用いて化合物のスクリーニングやsiRNA、CRISPR/Cas9システムの導入など行ったりすることから、細胞培養用品以外の部分で多くの物品費が必要であり、次年度に繰り越した金額は使い切ることができると考えている。
脂肪肝炎におけるHSP110ファミリーの脂質、糖代謝制御機構の解明

1)ヒト肝細胞癌株Hep3Bでは、Apg-2のサイレンシングにより増殖抑制がみられたが、低グルコースメやserum starvationなどの条件下に限定された。またその際に、LKB1-AMPKのシグナルが活性化していた。HSP70はシャペロン依存性のE3であるCHIPを介してLKB1をユビキチン化しプロテアソームで分解することが知られている。HSP70と構造的に相同性の高いHSP110ファミリー、Apg-2について検討したところ、Apg-2はHSP70, CHIP, LKB1と複合体を形成することが分かった。Apg-2がHSP70によるLKB1の分解を促進させることが分かった。3)高脂肪食による脂肪肝モデルの検討で、Apg-2-/-マウスでは著明に肝脂肪化が抑制され、AMPKのリン酸化、PPARαの発現が亢進していた。さらに高脂肪食高コレステロール食による脂肪肝炎モデルでは、肝線維化も抑制されていた。Apg-2-/-マウスにpcDNA3.1-His-ubのプラスミドをハイドロダイナミック法で尾静脈より注入しプロテアソーム阻害剤MG-132を腹腔内投与し肝臓から蛋白を抽出、Hisで免疫沈降を行い、LKB1をウエスタンブロット法で検出したところ、Wtマウスで見られたLKB1のポリユビキチン化が抑制されていた。以上からApg-2はLKB1のユビキチン化を促進することでAMPKシグナルを抑制していると考えられた。蛋白質の品質管理を担う分子シャペロンの異常は、細胞の恒常性維持にかかわる蛋白の機能不全を引き起こし、代謝異常、発癌、神経変性疾患の要因となる。以前から我々は、HSP70と共役して働くHSP110ファミリーに注目し、特にApg-2がヒト肝癌で高発現していることを示した。次にApg-2ノックアウトマウスが肝発癌や高脂肪食による脂肪肝形成に抑制的であることを確認した。分子シャペロンが細胞死を迎えるべき細胞を救済するだけでなく、脂質や糖代謝に影響することで慢性炎症や発癌に関与していると考えられ、脂肪肝炎の病態解明をテーマにHSP110ファミリーの役割を代謝異常の視点から検討を行っている。これまでに我々は、ヒト肝細胞癌株の中で比較的分化度の高いHuh-7, PLC/PR5と分化度の低いHLE、肝芽腫由来でWtのP53機能を有するHepG2細胞、マウス肝癌細胞株Hep1-6を用いてSiRNAによるApg-2のサイレンシングの実験を行った。Apg-2のサイレンシングにより細胞増殖能の低下が確認された。現在はApg-2の抗アポトーシス作用にフォーカスをおいて検討している。また、Apg-2ノックアウトマウスでは肝脂肪化が抑制されることから、細胞培養においても脂肪肝炎モデルとしてパルミチン酸負荷モデル、肝脂肪化による肝内の虚血、循環不全を推定して酸素1%の低酸素モデル、ERストレスを誘導する過酸化水素投与モデルを作成している。さらにシャペロンによるユビキチンープロテアソーム系の修飾に注目し、ユビキチン化の標的蛋白であるLKB1やHSP70で免疫沈降し、Apg-2やE3であるCHIPでウエスタンブロットを行い、HSP110ファミリーのユビキチン化に与える影響を検討したところ、Apg-2存在下にHSP70によるLKB1のユビキチン化が増強する可能性があり、裏付けの検討を行っている。細胞株によるin vitroの実験は順調であるが、ヒト検体での臨床研究がサンプル収集が思うようにいかず、少し停滞していた。現段階で約100検体の収集ができ、ヒト脂肪肝炎の肝組織におけるHSP110ファミリー蛋白の発現の検討を行っている。診断目的に行った肝生検で脂肪肝炎と診断された患者の肝組織を用いてmRNAを抽出しcDNAを作成しReal-Time PCR法を用いて遺伝子発現解析を行った。さらに肝脂肪化に大事なシグナルの主要因子についても同様にmRNAレベルでの発現解析を行っている。得られた結果と、臨床パラメーターを比較し肝脂肪化、炎症、線維化の程度とHSP110ファミリーの発現との関連について統計学的解析を行っている最中である。また、ヒト肝がん組織についても検討を行うべくサンプル収集を継続している。蛋白質の品質管理を行う分子シャペロンの異常は、細胞の恒常性維持にかかわる蛋白の機能不全を引き起こし、代謝異常、発癌、神経変性疾患の要因となる。以前から我々は、HSP70と共役して動くHSP110ファミリーに注目し、特にApg-2がヒト肝がんで高発現していることを示した。次にApg-2ノックアウトマウスが肝発癌や高脂肪食負荷による脂肪肝形成に抑制的であることを見出した。分子シャペロンが細胞死に至る予定の細胞の生存に寄与し、さらに脂質や糖代謝に影響することで慢性炎症や発癌に関与していると考えられた。以上から、脂肪肝炎の発症におけるHSP110ファミリーの役割を解明するために、蛋白の恒常性維持がもたらす糖、脂質代謝異常に注目して検討を行っている。これまでに我々は、ヒト肝がん細胞株の中で高分化肝癌由来のHuh-7やPLC/PR5、低分化肝癌由来であるHLE、Wild-typeのP53の機能を有するHepG2やHep3B、マウス肝癌細胞株Hep1-6を用いてSiRNAによるApg-2のサイレンシングを行い、細胞増殖やアポトーシス、代謝に与える影響について検討を行った。

抗アポトーシス効果においてはApg-2がP53の分解と安定化に関わること、脂質代謝においてはAMPKのリン酸化を低下させることが判明した。本来、細胞内の蛋白恒常性維持に働く分子シャペロンが脂質代謝や糖代謝に影響することで、癌細胞の生存に寄与していることが示唆された。現在は、上記現象の機序を解明するために、Apg-2がターゲットとする基質蛋白の同定を行うために、Apg-2がHSP70と核酸交換因子として働くことに注目し、標的蛋白を選出し、相互関係の検討を行っている。ヒト臨床検体200例を用いたApg-2の発現と臨床プロファイルのデータ抽出を終了し、統計学的解析を行っているが、その結果を踏まえてApg-2ノックアウトマウスにおいての肝内Apg-2の発現と脂質関連、線維化関連、糖代謝関連遺伝子の関係を再検討している。また、ノックアウトマウスの実験においては高脂肪食により脂肪肝モデルを作成していたが、高脂肪食高コレステロール食による脂肪肝炎モデルの作成を終了した。しかし、それらのマウスにおいて肝線維化を検討したところ、30週投与モデルにおいて脂肪肝モデルと同様に脂肪沈着の減少が見られたものの、肝線維化はコントロールマウスにおいても程度が軽度であったため、コール酸を添加したより強力な肝線維化を誘導する脂肪肝炎モデルを作成している。このモデル作成でやや予定より計画が遅れているが、それ以外の細胞株の実験は概ね順調に進行している。1)ヒト肝細胞癌株Hep3Bでは、Apg-2のサイレンシングにより増殖抑制がみられたが、低グルコースメやserum starvationなどの条件下に限定された。またその際に、LKB1-AMPKのシグナルが活性化していた。HSP70はシャペロン依存性のE3であるCHIPを介してLKB1をユビキチン化しプロテアソームで分解することが知られている。HSP70と構造的に相同性の高いHSP110ファミリー、Apg-2について検討したところ、Apg-2はHSP70, CHIP, LKB1と複合体を形成することが分かった。Apg-2がHSP70によるLKB1の分解を促進させることが分かった。3)高脂肪食による脂肪肝モデルの検討で、Apg-2-/-マウスでは著明に肝脂肪化が抑制され、AMPKのリン酸化、PPARαの発現が亢進していた。さらに高脂肪食高コレステロール食による脂肪肝炎モデルでは、肝線維化も抑制されていた。Apg-2-/-マウスにpcDNA3.1-His-ubのプラスミドをハイドロダイナミック法で尾静脈より注入しプロテアソーム阻害剤MG-132を腹腔内投与し肝臓から蛋白を抽出、Hisで免疫沈降を行い、LKB1をウエスタンブロット法で検出したところ、Wtマウスで見られたLKB1のポリユビキチン化が抑制されていた。以上からApg-2はLKB1のユビキチン化を促進することでAMPKシグナルを抑制していると考えられた。マウスモデルの追加として、高脂肪高コレステロール食(脂肪60%,コレステロール1.25%)を8週、24週、30週間投与することでマウス脂肪肝炎モデルを作成し経時的なHSP110ファミリーの発現動態を検討する。これらの脂肪肝炎モデルではERストレス応答として転写因子HSF1が誘導されHSP蛋白の発現が亢進する。脂肪肝炎の形成段階におけるHSP70を初めとする他のHSP蛋白とHSP110ファミリーの関係を普通食投与のコントロールモデルと比較検討する。