hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
新規CTC採取マウスモデルの確立と原発巣・転移巣・CTC遺伝子発現の研究

本研究は、Circulating tumor cell (以下CTC)が採取できる同種移植マウスモデルの確立であり、そのモデルから採取できる腫瘍・転移巣・CTCの遺伝子発現の違いのなどを検索することにより、Epitherial mesenchymal translation (以下EMT)や癌幹細胞の概念を介して転移のメカニズムを解明していくことを目標としている。1マウスモデルの確立は難航している。申請者はドイツ・ハイデルベルク大学でCTC採取可能な結腸癌マウスモデルの作成にかかわったが、その研究においても非常に難渋した経験を持つ。本計画は多数の細胞株・マウスを使用することとなり、実験費用の高騰も懸念されるため、限られた財源の中でいかに遂行していくか慎重に検討し、実現可能な内容へと適宜変更していく必要あると考えている。しかし、限られた財源で引き続きマウスモデル作成を目指していく。2EMTという観点からは、これまでに当教室でヒト結腸癌細胞株を用いて、CD44variantがEMTと関連しており、結腸癌の進展やその発現が予後とも関連していることを示してきた。そこで、マウスモデルの確立を目指す一方で、CD44をはじめとしてEMT、癌幹細胞との関連が示唆されている遺伝子について、qPCT、Western Blotting、Knockdownなどの手法を用いて胃癌、食道癌の細胞株を中心に検討を行っていくことを検討している。本研究では、Circulating Tumor Cell (以下CTC)を採取するための同種移植マウスモデルの確立を目指し、そのマウスモデルを用いて様々な分子生物学的な検索を行っていくことを目指している。具体的には、原発巣・転移巣・CTCの遺伝子発現の違いなどを検索することを目標としている。1マウスモデルの確立には難航している。これまでにヌードマウスを用いたモデル作りを試みていたが、腫瘍の生着がほとんど認められずnod scid mouseを用いた実験も少しずつではあるが開始した。申請者はドイツ・ハイデルベルク大学でCTCが採取できる同種移植マウスモデルの作成にかかわったが、その際にも非常に難航していた経過を目の当たりにした。その際の経験、トラブルシューティングを踏まえても非常に難しい状態である。マウスの購入・維持に費用がかかること、また手技も煩雑であることも難航している要因の一つとなっている。2昨年度の報告でEMTという観点から癌幹細胞との関連が示唆されている遺伝子についての検討について言及したが、マウスにかかわる実験費用の増加を懸念され、着手に至っていない。しかしながら、今後マウスモデルの進捗状況によっては、EMT、癌幹細胞についての分子生物学的な検討、具体的には細胞株・臨床検体を用いたqPCR、Western blottingといった各種分析を行い、成果を上げていくことも検討する必要があろう。CTC採取同種移植マウスモデルの確立をめざし、胃癌細胞株を用いて、まずは胃癌の肝転移モデルを作成することを目指している。ヒト胃癌細胞株をマウスの胃壁に注射、腫瘍の生着・肝転移の発生について観察していったが生着することがなかった。腫瘍細胞を脾臓に注射することでも肝転移作成を試みたが、肝転移を認める確率は不確かでマウスモデルの確立にいたらなかったNod scid mouseを用いて、また腫瘍細胞を門脈内注射することで肝転移を認めるマウスの確率が高まった。しかし、一方でマウスの死亡も多く、手技の安定に時間を要する見込みである。マウスが高価であるため、規模の拡大の前に手技の安定を図ることが優先されるべきだと考えている。現時点で肝転移は確認されたが、CTCの有無に関しては評価していない。今後は現時点で得られえるマウス血液内にCTCが存在するかを確認していくことを検討している、その先にはCTCからのDNA採取を目標とするのだが、ごく少数の細胞からDNAを抽出するためには高額なキットが必要となり、現時点ではまだ着手の見込みはない。癌の原発巣・転移巣・CTCはその増殖・転移の過程でEMTといった形質転換を来し、分子生物学的な特徴が変化していると推測され、それらを解明することが癌の病態解明、治療法開発につながると考えている。本研究は、CTCのみを採取できるマウスモデルを作成することが目的ではなく、原発巣・転移巣・CTCの三者が採取でいるモデル作りを目指してきた。しかしながら、CTC採取マウスモデルの作成は難航している。胃癌細胞株をマウス胃壁に注射して、胃癌原発巣に見立てた腫瘍の生着・増殖を期待してきたが、細胞の生着が得られなかった。ヌードマウスをNod scid mouseに変更して同手法を試みたが、わずかに腫瘍が生着したのみで腫瘍の増殖が不良であった。これまでの期間で現実的に胃癌細胞株を胃壁に注入するという手法で、CTC採取マウスモデルを作成することは困難と判断し別の方法の模索を迫られた。原発巣に見立てた胃腫瘍の作成を断念して、胃癌肝転移モデルを作成することを試みた。これまでの報告で、胃癌細胞株を脾臓へ注射して肝転移を作成する方法が報告されている。そこで同方法を試みたが、腫瘍の増大は緩徐であった。より短期間にmassiveな肝転移を得るために、胃癌細胞株を門脈内注射する方法を試みた。開腹手術下に胃癌細胞株を門脈内注入する手法は煩雑であり、幾らかのlearning curveが必要だったものの、一定の肝転移を来すことが確認された。

これに並行して、胃癌細胞株を腹腔内注射して腹膜播種モデルを作成することを試みた。肝転移モデル、腹膜播種モデルともに一定の腫瘍増大が確認できるものとなり、CTCの存在が期待されるものであったが、マウスより採取した血液からはCTCは検出できなかった。今後の課題として、外部委託も含めてマウス血中のCTCの検出の手技・手法を検討することが挙げられる。CTC採取マウスモデルの確立を目指し、胃癌細胞株を用いて胃癌の肝転移モデルを作成することを目指した。ヒト胃癌細胞株をマウス胃壁に注射し、腫瘍の生着・肝転移の発生について観察していった。しかし、これまでのところ胃壁への腫瘍生着・肝転移の発生のいずれも認められない。過去に結腸癌CTC採取マウスモデルを確立する際にも、同様の問題に直面しており、その際にはより免疫抑制されているnod scidmouseを使用することにより腫瘍の生着・肝転移・肺転移・CTCを得ることができた。今後対応としてマウスを変更してモデルの確立を目指しているが、高価なマウスを使用することによる費用の高騰も懸念されるため、慎重に実験計画を見直していく必要がある。CTCを血液中から採取する機器の購入を当初申請していたが、本機器は高価であり、マウスモデル確率の目途が立っていないため購入は見送っている。より確実に研究を進めていける物品・試薬の購入に投資していくこととしている。EMTマーカーの検討としては、食道癌におけるCD44の発現について検討したが、一定の傾向は認められず、現在他の遺伝子について検討を行っている。マウスモデルの作成にあたり、Nod scid mouseを使用することが一つの対策であるが、マウスそのものが高額であること、まだ手技が不安定であることから、少数のマウスで試行錯誤を繰り返している状態である。今後手技の安定が確認できた後に一定数のマウスで研究を進めていく方針である。消化器外科学マウスモデルの確立に難渋しているが、引き続きモデル確立に向けて尽力していく。しかしながら、実験費用の高騰が懸念され、現実的に断念する必要が出てくることも危惧される。この大きな目標へ向けて研究を推進していく一方で、qPCRなどの結果から抽出された、有望と思われる遺伝子について取り上げて、名古屋大学医学部附属病院にて採取された臨床検体を用いて遺伝子発現と予後との臨床的な相関についても検討していく。マウスモデルの確立に時間を要し、本年度予定していた研究段階にまで至らなかったため、来年度未使用額が生じた。来年度に行う動物実験において、マウスの購入・維持にかかる支出が増加することが想定されており、その際に使用する計画である。
特発性肺線維症の新規バイオマーカー; ぺリオスチンの研究

申請者は、難治性肺疾患である特発性肺線維症(IPF)において、新規の細胞外マトリックス(ECM)蛋白であるぺリオスチンが、IPFの病状悪化や予後の予測バイオマーカーであると報告した。従来の血清ぺリオスチンELISAは、IPF特異性に乏しいのが欠点であった。そこで、従来よりも他疾患の合併に影響されない新規のELISAシステム(SS20A×SS19D)を構築した。そこで、IPFで初の「オーダーメイド治療のバイオマーカー」として確立することを目指し、多施設共同前向きコホート研究によって、抗線維化薬であるニンテダニブのコンパニオン診断薬としての解析を開始した。また、免疫組織学解析で、肺組織におけるペリオスチンの発現がIPFの増悪、予後の予測因子であることの証明、In vitro、動物実験による肺線維症におけるペリオスチンの機能解析を行っている。1.免疫組織学的解析により、特発性肺線維症(IPF)の肺組織におけるぺリオスチン発現量がIPFの増悪、予後の予測因子であることを証明:現在、ペリオスチン免疫染色を終了し、解析中である。2.IPF特異的ぺリオスチンELISAキットを用いた大規模前向き性能試験のための全国コンソーシアムの設立3.血清ぺリオスチンの1IPFのオーダーメイド医療のバイオマーカー、2抗線維化剤のコンパニオン診断薬としての有用性を確立し、保険収載を目指す:全国30施設が参加し、観察期間は1年間、目標登録症例数は100例を達成した。主要評価項目は、ベースラインの血清ペリオスチン値による6、12か月間の呼吸機能低下予測性能の証明である。現在、観察期間中である。4.In vitroにて、線維芽細胞からのペリオスチンの産生を阻害する物質をスクリーニング5.同定された阻害物質によるマウスブレオマイシン肺傷害モデルの抑制実験を行い、IPFで初のECM蛋白をターゲットとした新規治療薬の基盤的研究とする:現在、実験準備中である。研究目標1.免疫組織学的解析により、特発性肺線維症(IPF)の肺組織におけるぺリオスチン発現量がIPFの増悪、予後の予測因子であることを証明上記の症例の半定量化を問題なく行えた場合、更に症例数を増やして半定量化を行い、臨床データや予後との相関を解析する。研究目標2.IPF特異的ぺリオスチンELISAキットを用いた大規模前向き性能試験のための全国コンソーシアムの設立:全国11施設でのコンソーシアムを設立。臨床試験を行っている。研究目標3.血清ぺリオスチンの1IPFのオーダーメイド医療のバイオマーカー、2抗線維化剤のコンパニオン診断薬としての有用性を確立し、保険収載を目指す。:研究目標2のコンソーシアムにて臨床試験を行っており、現在、目標症例数100例に対して48例が登録されている。本年度中の目標症例数への到達を目指している。研究目標1.免疫組織学的解析により、特発性肺線維症(IPF)の肺組織におけるぺリオスチン発現量がIPFの増悪、予後の予測因子であることを証明:経験のある病理医との議論により、組織の半定量化について、現実的なアイデアを頂き、研究を行う目途がたった。しかし、組織の免疫染色所見の定量化は非特異的反応もあり、評価が難しい点で難渋している。研究目標2.IPF特異的ぺリオスチンELISAキットを用いた大規模前向き性能試験のための全国コンソーシアムの設立、研究目標3.血清ぺリオスチンの1IPFのオーダーメイド医療のバイオマーカー、2抗線維化剤のコンパニオン診断薬としての有用性を確立し、保険収載を目指す。:日常業務の中、患者さんの研究参加の同意を取得し、必要な検査を行うことは医師の負担を必要とする点が問題点であるが、その中で症例数は着実に集積されている。研究目標1.免疫組織学的解析により、特発性肺線維症(IPF)の肺組織におけるぺリオスチン発現量がIPFの増悪、予後の予測因子であることを証明我々は、既にぺリオスチンの血清蛋白レベルが、IPFの呼吸機能の低下や生存期間と相関していることを証明した。現在、当大学のIPF症例の外科的肺生検施行例に対して、早期繊維芽細胞巣スコア(fibroblastic foci score; FFスコア)とぺリオスチン染色性の半定量化スコアの方法を作製した。研究目標2.IPF特異的ぺリオスチンELISAキットを用いた大規模前向き性能試験のための全国コンソーシアムの設立既に研究コンソーシアムを設立し、全国11施設で前向き試験を開始した。2018年3月より、症例登録の促進のため、登録施設を27施設に増やした。研究目標1.免疫組織学的解析により、特発性肺線維症(IPF)の肺組織におけるぺリオスチン発現量がIPFの増悪、予後の予測因子であることを証明現在、当大学のIPF症例の外科的肺生検施行例に対して、早期繊維芽細胞巣スコア(fibroblastic foci score; FFスコア)とぺリオスチン染色性の半定量化スコアの方法を作製した。SLB組織のバーチャル化し、定量化作業を行っている。

現在、目標症例数100例に対して、68症例(2018年5月15日現在)がエントリーされており、2018年9月にエントリー終了予定である。申請者は、難治性肺疾患である特発性肺線維症(IPF)において、新規の細胞外マトリックス(ECM)蛋白であるぺリオスチンが、IPFの病状悪化や予後の予測バイオマーカーであると報告した。従来の血清ぺリオスチンELISAは、IPF特異性に乏しいのが欠点であった。そこで、従来よりも他疾患の合併に影響されない新規のELISAシステム(SS20A×SS19D)を構築した。そこで、IPFで初の「オーダーメイド治療のバイオマーカー」として確立することを目指し、多施設共同前向きコホート研究によって、抗線維化薬であるニンテダニブのコンパニオン診断薬としての解析を開始した。また、免疫組織学解析で、肺組織におけるペリオスチンの発現がIPFの増悪、予後の予測因子であることの証明、In vitro、動物実験による肺線維症におけるペリオスチンの機能解析を行っている。1.免疫組織学的解析により、特発性肺線維症(IPF)の肺組織におけるぺリオスチン発現量がIPFの増悪、予後の予測因子であることを証明:現在、ペリオスチン免疫染色を終了し、解析中である。2.IPF特異的ぺリオスチンELISAキットを用いた大規模前向き性能試験のための全国コンソーシアムの設立3.血清ぺリオスチンの1IPFのオーダーメイド医療のバイオマーカー、2抗線維化剤のコンパニオン診断薬としての有用性を確立し、保険収載を目指す:全国30施設が参加し、観察期間は1年間、目標登録症例数は100例を達成した。主要評価項目は、ベースラインの血清ペリオスチン値による6、12か月間の呼吸機能低下予測性能の証明である。現在、観察期間中である。4.In vitroにて、線維芽細胞からのペリオスチンの産生を阻害する物質をスクリーニング5.同定された阻害物質によるマウスブレオマイシン肺傷害モデルの抑制実験を行い、IPFで初のECM蛋白をターゲットとした新規治療薬の基盤的研究とする:現在、実験準備中である。研究目標1.免疫組織学的解析により、特発性肺線維症(IPF)の肺組織におけるぺリオスチン発現量がIPFの増悪、予後の予測因子であることを証明:更に症例数を増やして半定量化を行い、臨床データや予後との相関を解析する。研究目標2.IPF特異的ぺリオスチンELISAキットを用いた大規模前向き性能試験のための全国コンソーシアムの設立、研究目標3.血清ぺリオスチンの1IPFのオーダーメイド医療のバイオマーカー、2抗線維化剤のコンパニオン診断薬としての有用性を確立し、保険収載を目指す。:本年度中の目標症例数への到達を目指している。目標症例数を達成後は、解析作業、統計作業を行う予定である。研究目標1.免疫組織学的解析により、特発性肺線維症(IPF)の肺組織におけるぺリオスチン発現量がIPFの増悪、予後の予測因子であることを証明免疫組織学的解析の半定量化(FFスコア、ぺリオスチン染色性スコア)を完了後は、臨床データや予後との相関を解析し、予後予測因子としての組織学的ぺリオスチン染色性スコアの意義を証明する。研究目標2.IPF
表面化学作用に基づく膨潤性粘土の力学理論の構築-地盤工学における特殊粘土の再考-

地盤工学上,ベントナイトなどの膨潤性粘土は,設計法や体系化された理論のない特殊土として扱われる.本研究では,地盤工学では考慮されていない粘土鉱物の表面化学現象を取り入れることにより,膨潤性粘土の力学挙動を合理的に説明する理論体系を構築する.研究代表者は,これまで膨潤性粘土の体積変化に関する検討を行っており,イオン浸透に伴う圧密/膨潤挙動の定性的,定量的な表現に成功している.本研究では膨潤性粘土のせん断挙動について実験的および解析的検討を行った.既往研究の文献調査を行い,イオン濃度に伴い膨潤性粘土の限界応力比が大きくなること,限界状態における間隙比も小さくなることを示した.これら実験事実を参考に,既存モデルの土粒子骨格挙動の限界状態とイオン濃度を関連付けた.改良モデルは,蒸留水で飽和された粘土(極低濃度)と高濃度イオン溶液で飽和された粘土のせん断挙動の差異を定性的に表現することができた.また,イオン溶脱(低濃度化)による海性地盤斜面の不安定化現象について,斜面応力を想定した要素シミュレーションから,イオン溶脱過程と地すべり時のひずみの蓄積過程についてパラメトリックな検討を行い,拘束応力ならびに密度によってひずみの蓄積プロセスが異なることを確認した.解析的検討と並行して,膨潤性粘土のイオン濃度変化に対応した三軸せん断試験機装置を製作している.種々応力状態におけるせん断試験を実施し,提案モデルの精度検証を行う.理論構築(解析)については概ね順調に進んでいる.一方,実験に関しては,高濃度の塩化ナトリウム水溶液に対して防錆性のある計測器および管路の加工・製作に時間が掛かったが,初年度中に製作は完了している.実験に関しては,初年度に部品などは全て製作済みであるためことに加え,試験サンプルの準備も並行して行っていることから,計画通り試験を行うことができると考えている.解析については,初年度で精度検証を行った提案モデルを境界値問題(有限要素法)に適用予定である.定式化は初年度に済ましており,二年目はコード開発を行う.地盤工学上,ベントナイトなどの膨潤性粘土は,設計法や体系化された理論のない特殊土として扱われる.本研究では,地盤工学では考慮されていない粘土鉱物の表面化学現象を取り入れることにより,膨潤性粘土の力学挙動を合理的に説明する理論体系を構築する.研究代表者は,これまで膨潤性粘土の体積変化に関する検討を行っており,イオン浸透に伴う圧密/膨潤挙動の定性的,定量的な表現に成功している.本研究では膨潤性粘土のせん断挙動について実験的および解析的検討を行った.既往研究の文献調査を行い,イオン濃度に伴い膨潤性粘土の限界応力比が大きくなること,限界状態における間隙比も小さくなることを示した.これら実験事実を参考に,既存モデルの土粒子骨格挙動の限界状態とイオン濃度を関連付けた.改良モデルは,蒸留水で飽和された粘土(極低濃度)と高濃度イオン溶液で飽和された粘土のせん断挙動の差異を定性的に表現することができた.また,イオン溶脱(低濃度化)による海性地盤斜面の不安定化現象について,斜面応力を想定した要素シミュレーションから,イオン溶脱過程と地すべり時のひずみの蓄積過程についてパラメトリックな検討を行い,拘束応力ならびに密度によってひずみの蓄積プロセスが異なることを確認した.解析的検討と並行して,膨潤性粘土のイオン濃度変化に対応した三軸せん断試験機装置を製作している.種々応力状態におけるせん断試験を実施し,提案モデルの精度検証を行う.理論構築(解析)については概ね順調に進んでいる.一方,実験に関しては,高濃度の塩化ナトリウム水溶液に対して防錆性のある計測器および管路の加工・製作に時間が掛かったが,初年度中に製作は完了している.実験に関しては,初年度に部品などは全て製作済みであるためことに加え,試験サンプルの準備も並行して行っていることから,計画通り試験を行うことができると考えている.解析については,初年度で精度検証を行った提案モデルを境界値問題(有限要素法)に適用予定である.定式化は初年度に済ましており,二年目はコード開発を行う.防錆性のある試験機および計測器の作製(試行)に時間が掛かり,支払いが次年度になったため.
素地調整を省略した橋梁点検時の応急塗装手法の確立と地方自治体の中小橋梁への適用

研究3年目は,過去2年間の成果を踏まえて,複合サイクル促進試験(以下,促進試験)による点検時応急塗装の腐食抑制効果の確認を行った.促進試験では,一定の腐食抑制効果が確認できた高耐久性塗料とさび転換塗料による応急塗装について,橋梁点検間隔5年を超える場合の腐食抑制効果を確認した.これは,本手法の保証期間(橋梁点検間隔の5年)に安全率を設けるという観点の検討である.また,さび転換塗料については,2年目以降の耐久性を向上させる目的で,高耐久性塗料の重ね塗りによる腐食抑制効果を実験的に把握した.促進試験に用いた試験片は,前年度と同サイズの鋼板とし,試験片の一部にさびを発生させ,その上に高耐久性塗料またはさび転換塗料を塗布した.また,本年度はさび転換塗料に高耐久性塗料を重ね塗りした試験片も製作した.促進試験は,橋梁点検間隔の5年より2年長い換算7年とした.促進試験後にすべての塗料とさびを除去し,試験前後の重量変化を板厚減少量に換算して,塗料ごとの変化を確認した.さらに,鋼材面の腐食状況も観察した.換算7年の促進試験の結果,点検時応急塗装を施した試験片の板厚減少量は3年目までは異なっていたが,それ以降は大きな変化は見られず,応急塗装の効果は7年目まで持続し,腐食の進行を抑制できた.また,さび転換塗料に高耐久性塗料を重ね塗りした試験片も7年間の板厚減少量に大きな違いはなく,重ね塗りしなくても十分に効果があることがわかった.これは,さび除去後の鋼材面の腐食状況の観察でも確認できた.さらに,促進試験の結果を利用して,点検時応急塗装による腐食抑制効果の長期シミュレーションを行った.その結果,応急塗装を行わなかった試験片は100年で1.2mmを超える板厚減少量となったのに対し,応急塗装を施した試験片の板厚減少量は0.2mm以内に収まることがわかった.本研究の目的は,地方自治体が管理する中小鋼橋を対象に,原則5年に1回実施される橋梁点検時において,素地調整を省略した応急的な塗装を実施することで,その防食機能の劣化や腐食を抑制する手法の確立を目指すものである.研究3年目は,高耐久性塗料とさび転換塗料の点検時応急塗装の効果について,橋梁点検間隔5年を超える7年の腐食抑制効果と,さび転換塗料と高耐久性塗料の重ね塗り方法による腐食抑制効果を,複合サイクル促進試験によって把握した.結果として,点検時応急塗装を施した試験片の腐食抑制効果は,3年目以降7年目まで持続し,腐食の進行を抑制できることがわかった.また,さび転換塗料に高耐久性塗料を重ね塗りした試験片も7年間の板厚減少量に大きな違いはなく,重ね塗りしなくても十分に効果があることがわかった.さらに,点検時応急塗装の腐食抑制効果の長期シミュレーション結果においても,応急塗装を施した試験片の板厚減少量は,100年で0.2mm以内に収まることがわかり,最終年度の研究取り纏めに有益なデータを実験的に得ることができている.一方,実橋の現場適用試験については,一部のスプレー塗料の耐久性が想定以上に低く,継続的にモニタリングできないと判断し,2年目までの現場計測結果をもとに最終年度に取り纏めを行うこととした.当初予定されていた長期の現場適用試験の実施はできなかったが,これまでの計測結果を整理することで,試験塗装後1.5年程度の外観観察結果と塗膜厚変化を評価できると考えられる.以上より,研究自体はおおむね順調に進んでいると考えられる.研究最終年度は,複合サイクル促進試験から導出された点検時応急塗装の劣化抑制効果を踏まえ,前年度に引き続き,応急塗装に関する腐食抑制効果の長期シミュレーションを行い,研究を取り纏める.前年度までの実験的検討において,高耐久性塗料とさび転換塗料に対する橋梁点検間隔5年を超える7年の腐食抑制効果,さび転換塗料と高耐久性塗料の重ね塗り方法による腐食抑制結果が把握できており,さらに複数の腐食抑制効果の長期シミュレーション結果を追加することで,研究全体を取り纏める.また,実務レベルの検討として,鋼部材さび面の状態による手法の適否の考え方,適切な塗料の選定方法や施工方法について,過去3年間の実験データを含むこれまでの知見を整理し,地方自治体の中小橋梁における点検時応急塗装の適用マニュアルの策定に繋がるように努める.なお,当初予定されていた3年以上の現場適用試験による劣化抑制効果の確認(データ取得)は実施せず,試験塗装後1.5年程度の外観観察結果と塗膜厚変化のみで結果を整理する.また,本研究期間終了後の継続モニタリングについても見送り,応急塗装を適用した実構造物については,研究終了時に現状どおりに回復させる.研究初年度は,まず,複合サイクル促進試験によって,普通塗料による腐食劣化抑制効果の確認を行った.複合サイクル促進試験はJIS K 5621のサイクルDを適用し,橋梁点検間隔の5年に相当する試験時間1,080時間で実施した.試験体はさび発生状態の違いを考慮した3種類(さび無し,表面さび,うろこ状さび)として,促進試験後のさび発生面積と塗膜付着力から効果を評価した.さび発生面積に関しては,鋼材面にそのまま塗装したさび無し試験体が約50%の面積となったのに対し,さび発生状態が表面さびとうろこ状さびの試験体に塗装を実施した場合の面積は,それぞれ約25%と約15%となった.

これは,塗料に含まれる僅かな防錆効果と既存さびが腐食因子の一部を遮断したことが影響していると思われる.ただし,さび状態がより進行しているうろこ状さび試験体の面積が小さかったことの原因については把握できなかったので今後の検討課題とした.また,塗膜付着力に関しては,さび無し試験体は促進試験後の付着力が0.4MPaであったのに対し,表面さびとうろこ状さびの試験体では0.7MPaと0.5MPaであり,すべてがほほ同等の残存付着力となった.これらの結果より,普通塗料によるスプレー塗装は,塗装前のさび発生状態がさび無し,表面さび,うろこ状さびのいずれの場合も,橋梁点検間隔の5年に耐えうる腐食劣化抑制効果は期待できないことがわかった.一方,実環境下における点検時塗装手法の腐食劣化抑制効果を確認するため,本年度は現場適用試験も開始した.地方自治体の協力により一般環境で供用されている1橋梁を選定し,本研究で提案する応急塗装(普通塗料,高耐久性塗料,さび転換塗料)を施工した.約半年のさび外観観察と塗膜厚変化より,現時点では塗装手法の違いによる効果の差は見られていない.本研究の目的は,地方自治体が管理する中小鋼橋を対象に,原則5年に1回実施される橋梁点検時において,素地調整を省略した応急的な塗装を実施することで,その防食機能の劣化や腐食を抑制する手法の確立を目指すものである.研究初年度は,複合サイクル促進試験によって,最も一般的な普通塗料の腐食劣化抑制効果を確認した結果,さび発生状態の違いに係わらず,橋梁点検の間隔5年に耐えうる腐食劣化抑制効果は期待できないことが確認できており,次年度以降の比較対象の基礎となるデータを実験的に得ることができた.また,本年度は実環境下における提案手法の腐食劣化抑制効果を確認するための現場適用試験も予定どおり開始でき,半年程度ではあるがさび外観観察と塗膜厚変化も計測できている.以上より,研究自体はおおむね順調に進んでいると考えられる.研究2年目は,前年度と同様に,複合サイクル促進試験と実橋の現場適用試験によって,点検時応急塗装手法による劣化抑制効果の確認を継続した.まず,複合サイクル促進試験(以下,促進試験)では,前年の研究で得られた結果(普通スプレー塗装では,橋梁点検間隔の5年に耐えうる腐食劣化抑制効果は期待できない)を踏まえ,スプレー塗装に用いる塗料を高耐久性塗料とさび転換塗料の2種類に変更し,橋梁点検間隔の5年に相当する腐食劣化抑制効果を確認した.促進試験に用いた試験体は,幅70mm,高さ150mm,厚さ2.6mmの鋼板SS400の一部を,塩水噴霧と室内乾燥の繰り返しによって一定期間さびさせ,その上に高耐久性塗料とさび転換塗料のスプレー塗装を塗布したものとした.促進試験は,実環境における暴露年数5年間を想定して実施した.試験後にすべての塗料とさびを除去し,試験前後の重量変化を板厚減少量に換算し,塗料ごとの変化を確認するとともに,鋼材面の腐食劣化状況も観察した.その結果,高耐久性塗料とさび転換塗料はどちらも5年で約0.2mmの板厚減少に止まっており,塗装を行わない場合の板厚減少(約0.4mm)の約50%に抑制できることが確認できた.さらに,さび除去後の鋼材面の腐食状況を観察したところ,塗装を行わない場合は孔食の兆しが見られたのに対し,高耐久性塗料とさび転換塗料では鋼材面にほとんど変化は無かったことから,点検時に応急的塗装を実施する効果が認められた.一方,昨年度より開始した現場適用試験については,一般環境で供用されている地方自治体管理の1橋梁を対象に,応急塗装のさび外観観察と塗膜厚計測を継続した.その結果,さび転換塗料は1.01.5年程度で塗膜はほぼ消失し,実環境でのさび転換塗料の耐久性は低いことが確認された.なお,他の塗料については,現時点では膜厚の変化や塗装の劣化などは見られていない.
内因性アデノシンによる局所神経回路の機能制御

多シナプス経路を介した海馬内情報処理における内因性アデノシンの役割を、アデノシン拮抗薬を海馬スライスに作用させて、電気生理学的手法および光学的測定法を用いてその効果を解析した。また、アデノシン拮抗薬で誘発した応答に細胞内cAMP濃度変化が伴うかどうかを生化学的に調べ、シナプス後部に存在するアデノシン受容体の活性化をの細胞内メカニズムを解明した。(1)電気生理学的解析:hilusを0.6mAで刺激し、CA1、CA2、CA3の各領域の細胞層でfield potentialを記録した。抑制性伝達物質GABAと内因性アデノシンの抑制効果を比較し、内因性アデノシンによる抑制がCA3aとCA2で強いことが確認された。(2)光学的測定法により、アデノシン拮抗薬の効果の空間的広がりを調べた結果、アデノシン後部特異的受容体の分布と一致した。(3)アデノシン受容体がGタンパクを介して細胞内cAMP濃度を調整していることが知られているので、Adenylyl cyclaseを活性化するフォルスコリンの効果と比較した。CA2領域のポテンシャルはA1受容体非存在下でほとんどpopulation spikeが認められず、またforskolin単独で模造鏡がなかった。ところが、forusukorinn20分投与後に、A1受容体の拮抗薬を作用させると、振幅は5mVにまで増加した。
赤痢菌感染による細胞破壊抑制機構に関わる病原因子の機能解析

赤痢菌は腸管上皮細胞に感染し、最終的に感染細胞を含む上皮組織を破壊することによって炎症性下痢を引き起こす。本研究から、赤痢菌は細胞侵入することによって、潜在的にDNAの損傷を引き起こし感染細胞の破壊を昂進する作用を持つ一方、これらの作用を抑制し感染細胞の生存を維持する機構を持つことが示唆された。本成果は赤痢菌の感染メカニズムを理解する上で非常に重要であり、感染制御の基盤的知見となると考えられる。赤痢菌は、腸管上皮細胞に侵入・拡散し上皮細胞を破壊することによって出血性下痢を引き起こす。しかしながら、赤痢菌に感染した上皮細胞の破壊に至る詳細な分子メカニズムは明らかではない。赤痢菌の病原性プラスミドのうち細胞侵入に必須の領域のみを保持する変異株を上皮細胞に感染させた結果、感染細胞においてDNA damageおよび細胞破壊の著しい昂進を認めた。このことから、赤痢菌感染では菌の細胞侵入において誘導されるDNA damageを抑制することによって、感染細胞の著しい破壊を抑制することが示唆された。また、変異株感染細胞において、核のDNA fragmentationやcaspase inhibitor存在下における細胞破壊の抑制が認められなかったことから、DNA damageの誘導にはcaspase cascadeは関与しないと考えられた。病原性プラスミド上には細胞破壊に対して抑制的に作用する遺伝子が存在すると推測されることから、本研究では当該遺伝子を同定し解析することを目的としている。平成19年度の研究成果は、当該遺伝子を同定するための良い指標となり得る。また、感染細胞が細胞破壊に至るまで過程において、赤痢菌の働きによってどのようなシグナルが活性化され、同時にそのシグナルの活性化がどのように抑制されているのかを解析することが可能となる。これは、赤痢菌の感染メカニズムを理解する上で非常に重要であり、感染制御の基盤的知見となると考えられる。赤痢菌は腸管上皮細胞に侵入・拡散し、最終的に感染細胞を含む上皮組織を破壊することによって出血性下痢を引き起こす。しかしながら、赤痢菌に感染した上皮細胞の破壊プロセスについて詳細な分子メカニズムは明らかではない。我々はこれまでに赤痢菌の病原性プラスミドのうち細胞侵入に必要とされる最小限の病原因子のみを保有する変異株の解析から、赤痢菌感染では菌の細胞侵入において誘導される感染細胞の核のDNA damageを赤痢菌自身が抑制することによって、感染細胞の著しい破壊を抑制することを示してきた。変異株感染細胞のDNA damageはクロマチンの凝縮を伴うが、アポトーシスに特異的なヌクレオソーム単位のDNA断片化を伴わず、感染細胞の破壊はcaspase inhibitorの一つであるZ-VAD-FMK存在下で抑制されなかった。また、抗リン酸化特異抗体を含む抗体マイクロアレイ解析によって感染細胞の細胞内シグナル分子の挙動をモニタリングした結果、変異株感染細胞においてHistone H2AXの139番セリン部位のリン酸化およびCDK1/2の15番チロシン部位の脱リン酸化が亢進した。これらの細胞応答はDNA2本鎖切断やDNA damageが生じた場合に生じることが知られている。また、サイトカイン活性化と炎症において重要な役割を果たすinflammatory caspasesの不活性型前駆体Pro-caspaseの減少を認めた。一方、変異株感染における感染細胞の著しい破壊はマクロファージでは認めらなかった。したがって、赤痢菌が上皮細胞に侵入する過程において、変異株では潜在的にDNA damageを引き起こし感染細胞の破壊を昂進する作用を持つ一方、野生株はこれらの作用を抑制し感染細胞の生存を維持する機構を持つことが示唆された。
酸化ストレスに基づく膵β細胞障害のシグナル伝達経路の解明

2型糖尿病GKラットおよび対照Wistarラット膵ラ氏島RNAを用い、蛍光differential displayにより2型糖尿病の膵β細胞で特異的に発現が変化する遺伝子、TSC-22(TGF-β-stimulated clone22)、clusterinおよび未知遺伝子WG126を単離しその機能解析を行った。過酸化水素負荷を行ったマウスインスリノーマ由来細胞株MIN6細胞ではTSC-22の発現が増強し、clusterin、WG126の発現が減弱しており、これらは酸化ストレス関連遺伝子であると、考えられた。そこで、これら遺伝子の発現をテトラサイクリンにより発現誘導可能な(テトラサイクリン濃度0μg/mlで遺伝子発現誘導可能な)Tet-off-MIN6細胞を構築した。TSC-22を発現誘導させたTet-off-MIN6(TSC-tetMIN)では、インスリン遺伝子の発現が減少しインスリン含有量が減少した。さらにテトラサイクリン濃度0の時間が72時間以上になるとアポトーシスが誘導された。すなわち、TSC-22はインスリン遺伝子の発現を抑制するが、TSC-22の発現が一定量以上になるとアポトーシスを誘導することが明らかとなった。clusterinを発現誘導させたTet-off-MIN6(clus-tetMIN)では、細胞増殖が増強していた。また、70%膵摘除を行ったラットで検討したところ、このラットの残存膵ではclusterinの発現が増強しており、細胞増殖のマーカーであるPCNA発現も増強していた。TSC-tetMINでの発現を検討したところclusterinの発現は低下していた。WG126を発現誘導させたTet-off-MIN6(WG126-tetMIN)ではインスリン遺伝子の発現が増強していたが、TSC-tetMIN、clus-tetMINではWG126発現に変化は認めなかった。すなわち、2型糖尿病では酸化ストレスによりTSC-22発現が誘導されインスリン発現が抑制されるが、TSC-22発現が増強すると細胞のアポトーシスが誘導され、またclusterin発現が抑制され代償的な細胞増殖も抑制されることが明らかとなった。さらに、WG126はTSC-22を介さない経路で酸化ストレスによる発現抑制を受け、インスリン発現を抑制することが明らかとなった。また、GIP受容体ノックアウトマウスを用いた検討から、2型糖尿病の酸化ストレス発生原因の一因と考えられている脂肪毒性に、GIPシグナルが関与していることが明らかとなった。2型糖尿病の膵β細胞で特異的に発現が変化する遺伝子を単離するため、2型糖尿病モデルGKラットおよび対照Wistarラットより膵ラ氏島を単離し、これよりcDNAを合成し750通りのprimerの組み合わせによりPCRを行い、自動DNAシークェンサーを用いた蛍光differential displayを施行した。その結果、GKラット膵ラ氏島に特異的に発現量が変化する遺伝子(DNA断片)を33個単離した。このうち、22個の遺伝子はGKラットでの発現量が増加しており、11個は減少していた。単離した遺伝子を既存のDNAデータベースと比較したところ14個は既知であり19個は未知であった。既知のもののうち、GKラット膵ラ氏島で発現量が増加しているTSC-22(TGF-β-stimulated clone22)はTGF-βで誘導される蛋白であり酸化ストレスと関連している可能性が高く、またロイシンジッパー領域を持つ転写因子と考えられているがその機能については不明であるため、TSC-22に注目した。インスリンプロモーター領域を導入したルシフェラーゼ発現ベクターをマウスインスリノーマ由来細胞株MIN6に遺伝子導入し、さらにTSC-22発現ベクターを構築しこの細胞株に遺伝子導入し、TSC-22のインスリン転写活性への影響を検討したところ、TSC-22はインスリンの転写活性を58%に抑制した。deletion解析ではインスリンプロモーターの-170から-88の領域にTSC-22が作用し転写活性を抑制することが明らかとなった。TSC-22の遺伝子構造を決定したところTSC-22は3exonで構成されていた。2型糖尿病患者におけるTSC-22遺伝子変異を検討し、5カ所の変異を同定したが2型糖尿病との関連を認めず、TSC-22の上流シグナルが重要であると考えられた。さらに、単離した遺伝子群から酸化ストレスによる発現調節を受けているものを同定するため、過酸化水素負荷を行ったMIN6で発現が変化するものを、今回単離した遺伝子群の中から同定し全長のクローニングを行っており、これらの機能解析を予定している。

すなわち、TSC-22はインスリン遺伝子の発現を抑制するが、TSC-22の発現が一定量以上になるとアポトーシスを誘導することが明らかとなった。clusterinを発現誘導させたTet-off-MIN6(clus-tetMIN)では、細胞増殖が増強していた。また、70%膵摘除を行ったラットで検討したところ、このラットの残存膵ではclusterinの発現が増強しており、細胞増殖のマーカーであるPCNA発現も増強していた。TSC-tetMINでの発現を検討したところclusterinの発現は低下していた。WG126を発現誘導させたTet-off-MIN6(WG126-tetMIN)ではインスリン遺伝子の発現が増強していたが、TSC-tetMIN、clus-tetMINではWG126発現に変化は認めなかった。すなわち、2型糖尿病では酸化ストレスによりTSC-22発現が誘導されインスリン発現が抑制されるが、TSC-22発現が増強すると細胞のアポトーシスが誘導され、またclusterin発現が抑制され代償的な細胞増殖も抑制されることが明らかとなった。さらに、WG126はTSC-22を介さない経路で酸化ストレスによる発現抑制を受け、インスリン発現を抑制することが明らかとなった。また、GIP受容体ノックアウトマウスを用いた検討から、2型糖尿病の酸化ストレス発生原因の一因と考えられている脂肪毒性に、GIPシグナルが関与していることが明らかとなった。
時間分解高周波ESRと磁場効果をプローブとしたナノ反応場の反応ダイナミクスの解明

30テスラパルスマグネットとTHz光を用いて,560GHz時間分解高周波ESRの開発をおこなった。併せて,磁場効果プローブを用いた不均一ナノ反応場の解析を行った。その結果,メソモーラスシリカMCM-41のナノ細孔中では,溶媒分子の部分的なクラスター化によるミクロ粘性の上昇が観測された。一方,イオン液体では,液体であるにも関わらず20-120ナノ秒の寿命をもつ不均一構造を持つことがわかった。(1)時間分解高周波ESRの開発:既存の30Tパルスマグネットに,300-550GHz帯の後進行波管(BWO)および電源,1-2μ秒の時間分解能をもつInSb熱電子ボロメーターを購入して,時間分解高周波ESRの開発をおこなった。平成22年度は,これら装置の設置ならびに感度および時間分解能のチェックを行った。テフロン製光学系およびセクターを用いてAC結合で時間分解測定をおこなったところ,300-550GHz帯において十分な感度(0.1-0.3mW)および時間分解能(立ち上がり時間:1μ秒)を得た。クライオスタットの液体ヘリウムの保持時間も10時間以上あり,時間分解ESR測定に十分であることがわかった。(2)磁場効果をプローブとした不均一反応場のナノ構造の解明:メソモーラスシリカMCM-41のナノ細孔中での光化学反応を0-5テスラの磁場下,磁場効果プローブ(MFE Probe)で解析した。その結果,細孔径の違いにより,特に高磁場領域での顕著な磁場効果の差異が観測された。細孔径が小さい場合,溶媒分子の部分的なクラスター化によるミクロ粘性の上昇が原因と考えられる。また,イオン液体のドメイン構造に関しても,MFE Probeにより解析をおこなった。従来の球体モデルでは説明できない緩和速度を,コアシェル型モデルを用いることで説明し,コアシェル構造をつくる溶媒和が,鎖長の短いイオン液体のドメイン構造の起源であることを提唱した。(1)磁場効果をプローブとした不均一反応場のナノ構造の解明:アルキル鎖が短いアンモニウム系イオン液体の不均一ナノ構造を,磁場効果プローブで検討した。磁場効果の大きさの磁場強度依存性を詳細に解析することによって,ミクロ粘性が数cPで半径2nm程度のドメインもしくはケージ構造が存在することがわかた。しかし,このサイズの構造は使用しているイオン液体(TMPA TFSAなど)のアルキル鎖による,ミセルのような構造では説明できない。そこで,溶媒分離ラジカル対モデルを適用したSLE解析により,不均一ナノ構造の解明をおこなった。次に,この不均一ナノ構造(ケージ)の寿命について,磁場効果の時間依存性から解析を行った。その結果,TMOA TFSAやDTMA TFSAなど,アルキル鎖が少し長い(炭素が8個や10個)イオン液体では,ケージの寿命が120ns程度と非常に長いことを初めて明らかにした。さらに,これまでのベンゾフェノン(BP)の光還元反応に加えて,硫黄類似体であるチオベンゾフェン(TBP)の光還元反応をプローブ反応としてイオン液体の不均一ナノ構造を検討した。その結果,溶質をBPからTBPに変えることで,イオン液体の不均一ナノ構造が変わることがわかり,MFEプローブが微妙な不均一ナノ反応場を調べるための新しいツールになることを見いだした。(2)時間分解高周波ESRの開発:30Tパルスマグネット,300-550GHz帯の後進行波管(BWO),InSb熱電子ボロメーターの光学系の組立をおこなった。また,パルス磁場とTHz光の同期をとることで高周波ESRとしての機能チェックをおこなった。1560 GHz時間分解高周波ESRの改良:本研究で新規に開発した560 GHz時間分解高周波ESRの高磁場化を目指し,パルスマグネット部の改良を行った。ボアを内径22mmから16mmに小さくすることで,従来のコンデンサバンク(125kJ)を使用してもより高磁場を発生できるマグネットの設計を行った。また,THz光学系に導波管を用いることで,高感度化を試みた。2磁場効果をプローブとした不均一反応場のナノ構造の解明:イオン液体の不均一反応場との比較を目的として,球状・棒状ミセル,逆ミセル,ベシクル,エマルジョンなどを用いて,ベンゾフェノンの光誘起水素引き抜き反応をプローブ反応として,生成するベンゾフェノンケチルラジカルの散逸ラジカル収量に対する磁場効果を,0-30 Tの磁場下で測定した。また,観測された磁場効果の磁場依存性を統計リュービル方程式(SLE)を用いて解析することで,ナノ反応場に関わる情報(大きさ,形,ミクロ粘性,ケージからの散逸確率(ケージ効果の程度))を解明した。3イオン液体のケージ寿命の解明:アルキル鎖長が異なる3種類のイオン液体について,ベンゾフェノンのフェノールからの光誘起水素引き抜き反応と,チオベンゾフェノン励起三重項状態の自己消光反応を用いて,イオン液体のケージ寿命を初めて実験的に明らかにした。

4生体反応のモデル反応の反応ダイナミクス:生体反応および光合成系のモデル反応において,不均一なナノ反応場中での反応ダイナミクスの観測を試みた。タンパク質やリボソームの代わりに,球状ミセル中でラジカル対の立体配置や反応ダイナミクスがどのように観測でき,またそれらがどのようにナノ構造を反映するかに注目し,ジスルフィドの光分解反応について調べた。MFEプローブを用いた不均一反応場解析の研究では,イオン液体のケージ寿命を見積もることに成功するなど当初の計画を越えた成果を得ることができた。一方,時間分解高周波ESRの開発に関しては,震災ならびそれに続く,研究施設の耐震改修のためにパルスマグネットがH23.3-H23.12まで使用できなかった。そのため,若干の遅れがでた.しかし,準備は順調に進んでいるので,次年度には遅れを取り戻せると考えている。24年度が最終年度であるため、記入しない。時間分解高周波ESRの開発を集中的におこなう。これに当たっては,感度向上を目指した高磁場化も視野に入れ,パルスマグネットの開発も同時進行で行う。MFEプローブを用いた不均一反応場解析に関しては,生体反応のモデル反応(大腸菌におけるタンパク質の畳み込み反応のモデルとしてシステイン,シスチン関連物質の反応)の研究に着手する。
維管束植物の起源を探る:葉緑体遺伝子によるナンジャモンジャゴケ類の系統解析

これまでコケ植物では,セン類のヒメツリガネゴケ,タイ類のゼニゴケ,ツノゴケ類のホウライツノゴケの3種類でしか葉緑体ゲノムが解析されておらず,比較の対象となる他の分類群のデータが十分ではなかった.この状況では,本研究でナンジャモンジャゴケ類の葉緑体遣伝子データを蓄積したとしても,信頼のおける系統樹は構築できないということが,平成17年度の解析の結果示唆されたので,系統的に議論の対象となる他のコケ植物の多数の葉緑体遺伝子を解析することにした.しかし,研究代表者の不慮の事故による負傷などのため,年度初めの計画に比べてあまり実験を進めることができなかった.「ナンジャモンジャゴケ同様にセン類の中で系統的に基部に位置する」と議論されることのあるミズゴケ類のオオミズゴケについては,培養株からDNAを抽出し,葉緑体遺伝子を解析することができたが,これらのデータを加えた解析はまだ途中の段階で,平成18年度中にデータ取りまとめて解析・考察し学会発表,論文発表をすることはできなかった.これまでの成果を取りまとめた解析と論文作成が急がれる.一方,データを交換し合い協力態勢をとっている名古屋大学遺伝子実験施設の杉田護教授のグループは,当方の提供した材料を用い,ナンジャモンジャゴケの葉緑体遺伝子のpsbBオペロンの6遺伝子とrpoA遺伝子を解析し,132カ所のRNA編集サイトを確認し,これまでに陸上植物で報告がないほどの高頻度RNA編集が起きていることを示していたが,この結果については協力して1報の共著論文にまとめることができた.長野県八ヶ岳北部の昨年度に発見したナンジャモンジャゴケの新産地において,同種の生育状況を調査し,サンプルを得ることができた.採集したサンプルを,光の当たる冷蔵ショーケースに保存することで,生サンプルをいつでも実験に用いることができるようになった.八ヶ岳産ナンジャモンジャゴケについて充分量のRNAおよびDNAを抽出することができた.この材料について,rbcL, psaA psaB, psbD, rpoC2の5遺伝子の部分塩基配列を,RNAおよびDNAについて決定することができた.rbcL遺伝子1278塩基中に32カ所,psaA遺伝子440塩基中に13カ所,psaB遺伝子1630塩基中に28カ所,psbD遺伝子462塩基中に26カ所,rpoC2遺伝子864塩基中に18カ所のRNA editing部位を確認することができた.名古屋大学遺伝子実験施設の杉田護教授のグループも本種の葉緑体ゲノムについて解析を進めているので,データを交換し協力体制をとっている.そこで上記5遺伝子に加え,提供を受けたatpB, petB, petD, psbB, psbH, psbNの6遺伝子のRNA塩基配列のデータを用いて,最尤法で系統解析を行った.その結果,まだ十分な情報量ではなく,統計的に有意ではないものの,ナンジャモンジャゴケ類がセン類とタイ類からなる系統群の姉妹群になり,ツノゴケ類はその外側に来て,コケ植物全体が単系統となり,現生の維管束植物とは姉妹関係になる可能性がもっとも示唆された.7月にウィーンで行われた国際植物科学会議で中間段階を発表した.陸上植物の大系統について,国内外の研究者と意見交換を行うことができた.また,本年度の成果全体について,3月に日本植物分類学会において発表し,高い評価を得,大会発表賞を受賞することができた.これまでコケ植物では,セン類のヒメツリガネゴケ,タイ類のゼニゴケ,ツノゴケ類のホウライツノゴケの3種類でしか葉緑体ゲノムが解析されておらず,比較の対象となる他の分類群のデータが十分ではなかった.この状況では,本研究でナンジャモンジャゴケ類の葉緑体遣伝子データを蓄積したとしても,信頼のおける系統樹は構築できないということが,平成17年度の解析の結果示唆されたので,系統的に議論の対象となる他のコケ植物の多数の葉緑体遺伝子を解析することにした.しかし,研究代表者の不慮の事故による負傷などのため,年度初めの計画に比べてあまり実験を進めることができなかった.「ナンジャモンジャゴケ同様にセン類の中で系統的に基部に位置する」と議論されることのあるミズゴケ類のオオミズゴケについては,培養株からDNAを抽出し,葉緑体遺伝子を解析することができたが,これらのデータを加えた解析はまだ途中の段階で,平成18年度中にデータ取りまとめて解析・考察し学会発表,論文発表をすることはできなかった.これまでの成果を取りまとめた解析と論文作成が急がれる.一方,データを交換し合い協力態勢をとっている名古屋大学遺伝子実験施設の杉田護教授のグループは,当方の提供した材料を用い,ナンジャモンジャゴケの葉緑体遺伝子のpsbBオペロンの6遺伝子とrpoA遺伝子を解析し,132カ所のRNA編集サイトを確認し,これまでに陸上植物で報告がないほどの高頻度RNA編集が起きていることを示していたが,この結果については協力して1報の共著論文にまとめることができた.
ニオイ物質オンサイト多点計測に基づく次世代文化財カビ汚染制御法の確立

文化財とその環境において、微生物、特にカビ(真菌)は、その胞子形成を介して塵と共に空中に拡散し、文化財表面に付着して増殖する。カビの大量増殖を一旦許してしまうと、現状の技術ではカビ汚染の制御が困難となる。従来法のほとんど全てがカビの発生を確認してからの対処法である。現状のモニタリング計測は、温度、湿度のみである。本研究では、見えないところでカビが発生してもニオイであれば早期発見が可能であるとの考えから、ニオイの定点観測によりカビ生育の初期段階でのモニタリングし、文化財カビ汚染制御する方法を検討している。平成30年度は、Direct Analysis in Real Time (DART)を利用したアンビエントイオン化質量分析法によって「カビ臭物質の検出方法」を検討した。DARTでは多くの場合、励起状態のガスが大気中の水と反応して水分子をプロトン化し、それがサンプル分子とプロトン移動反応することによってサンプル分子をイオン化する。気体、液体、固体サンプルのイオン化が可能であるうえにサンプルを大気圧下でDARTイオン源にかざすだけでイオン化できる簡便な操作方法であり、小型であるため、持ち運びがしやすく、文化財現場などのオンサイト分析に適する。文化財環境に生育するカビが出すニオイ物質を固相マイクロ抽出(SPME)ファイバーに吸着させ、DARTイオン源の出口に導入し、カビ臭物質を分析した。その結果、設置型のSPME-GC-EIMS装置を用いて得られたと同様の分析結果が、ポータブル型DARTを連結した装置においても得られた。また、Gaussian 16およびMobcalプログラム、TM法によりカビ臭イオンクラスターの衝突断面積およびイオンドリフト時間を理論的に予測した。その結果、実験室に設置型のSPME-GC-EIMS装置を用いて得られたと同様の分析結果が、ポータブル型DARTを連結した装置においても得られた。まず、イオンモビリティ装置において検出されたカビ臭物質は、有機分子に水などのクラターイオンが付加したクラスターイオンであると予想される。平成31年度においてはイオンモビリティーの出口を大気圧イオン源質量分析計(既存の奈良女子大学の装置)に連結してイオンモビリティドリフトグラムに出現した各ピークの分子量を計測する。計測した分子量と、イオンモビリティドリフト時間から求められた衝突断面積の結果より、検出イオンの分子構造を推定する。次に、イオンモビリティドリフトグラムは、質量スペクトルにくらべて分解能で劣っているが、20 msec毎に大量のデータを算出できる。平成31年度においては、Python言語を用いて統計解析をし、機械学習によりカビ臭物質のイオンモビリティデータからカビ種同定を試みる予定である。