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日韓経済法とその背景的文化の比較研究-アジア的競争原理の可能性の探求-

研究全体を通じて、東アジア経済法学は欧米の先端的な経済法の研究を徹底して行なうことにより、グローバルスタンダードに対抗する途を見出すべきであることが確認された。具体的には、経済法に関して韓国から2本の報告があった。サイバースペースと情報規制の問題が、韓堅愚教授(延世大学校)から、また、競争法の域外適用について申鉉允教授(延世大学校)から報告がなされた。研究分担者が役割分担に即した日常的研究を行い、論文を執筆発表した他、2002年1月17日、18日、香港で行われた第三回東アジア法哲学学会(香港大学・香港市立大学)において、今井弘道と鈴木賢が総会報告をし、分科会では稗貫俊文が報告した。同19日の経済法研究会では朴吉俊と中山武憲が報告した。今井は、歴史的に不幸な関係を指摘しつつも、1990年代以降、東アジア諸国の経済的な結びつきが深くなり、米国主導のグローバル経済における東アジア地域の共同の経済的利益の擁護と発展が考えなければならないと主張した。鈴木は、東アジア諸国(台湾、満州、韓国、中国)での日本民法の伝播と法継受の経緯を基礎に、東アジアに共通の法文化を形成する可能性を提唱した。いずれも中国、台湾、香港、韓国の研究者の共感をよび、好意的な質疑が行われた。分科会では、稗貫が、独占禁止法違反者による申告と調査の協力により、刑事罰や課徴金などが免除される制度の構想(リニーエンス・プログラム)を、欧米や韓国にならって、日本でも導入されるべきとの報告を行った。経済法の研究会で、中山武憲は、不公正な取引方法の規制の日韓比較を行った。韓国では、日本のように警告や注意に止まらず、正式手続きにより厳しく規制している実態が紹介された。朴吉俊は韓国における公正去来法のコンプライアンス(遵守)・プログラムの実施動向を紹介した。2002年3月17日、18日沖縄で研究会打ち合わせを行った。今後の共同研究の内容と方向について打ち合わせと議論が行われ、WTO下の東アジア経済共同体(自由貿易地域)の可能性を視野にいれた東アジア経済法制の議論を積み上げるべきことが確認された。競争法の研究者が集う東アジア国際会議を開催し、議論を通じて、アジア的競争原理の探求を行った。第一に、2002年11月3日4日に、中国の上海大学において、東アジアの、競争政策における東アジアの知的財産の位置づけについて、稗貫俊文「東アジアにおける知的財産権の保護」、競争政策における表示規制について、向田直範「日本における表示現制の現状と課題」、競争当局の違反処理手続きについて、申鉱允「韓国公正取引委員会における審決構造と手続きについての改善方案」の報告が行われた。第二に、2003年1月12日に、ソウルの延世大学では、李南基公正取引委員会委員長が、東アジアの競争法の運用協力と中国競争法の制定支援に関する基調報告を行った。続いて、東アジア的競争原理を民営化・知的財産・中小企業の問題の中に探るものとして、稗貫俊文「日韓両国の独占行為規制の有効性の比較と東アジアの競争原理」、同じく日韓の中小企業の東アジア的な対応を探る報告として、中山武憲「下請取引公正化に関する日韓両国法政の比較検討」の報告が行われた。また、東アジアの自由貿易協定(FTA)の可能性や、それと密接に関連する競争政策の東アジアの協力ネットワークについて、孫珠〓「韓・中・日FTA展望と競争法」と、韓国公正取引委員会の国際局のスタッフ許宣氏による「韓・中・日競争政策協力方案」の報告が行われた。
pHに応答する新規の超分子会合体を用いた貴金属ナノ結晶の分離と回収

本研究課題では、幅広い産業において重要な貴金属ナノ粒子の回収と再分散を達成するため、pHに応答する両親媒性化合物を用いたナノ結晶回収法の開発とその有効性の検討を目的とした。まず、長鎖アミンにカルボキシル基を導入した両親媒性化合物群を合成し、水中での分子集合体構造を検討した。合成したC16CAは、pH6以上では球状ミセル、pH2からpH6ではラメラ、pH2以下ではひも状ミセルと、水溶液のpHに応じて分子集合体が三態に変化することが示された。そこで、最も一般的な貴金属ナノ結晶である金ナノ粒子をC16CAのラメラにより回収し再分散することを試みた。塩基性条件のC16CA溶液にクエン酸還元法で得られた金ナノ粒子を加えると、C16CAが配位することによって保護剤効果でナノ粒子が良好に分散することが示された。この分散溶液を弱酸性に変化すると、金ナノ粒子を取り込みながらC16CAのラメラが析出した。透過型電子顕微鏡(TEM)観察を行うと、金ナノ粒子がラメラ析出物の中で粒子間隔を維持したまま取り込まれていることが確認できた。また、ナノ粒子を取り込んだラメラは、ろ過操作によって、溶液から完全に分離され、ナノ結晶の分離回収剤としての機能発現を果たした。さらに、溶液pHを弱酸性から塩基性に操作すると、金ナノ粒子を取り込んだC16CAラメラ析出物が再び溶解し、分離回収したナノ粒子を再分散できた。このとき、UV-visスペクトルおよびTEM観察から、金ナノ粒子の分散状態が回収前の初期のものと変化していないことが確認され、ラメラの中に取り込むことで析出状態にあっても粒子同士の凝集を抑制できることが示された。このことから、C16CAの分子集合体のpH応答特性を利用した溶液-ラメラ析出といった転移の制御は、ナノ結晶の分離方法として極めて簡便で有効な手法といえる翌年度、交付申請を辞退するため、記入しない。翌年度、交付申請を辞退するため、記入しない。
胃のストレス反応を制御する新規ストレス関連遺伝子とその生体内での発現調節機構

本研究では、生体のストレス応答のシグナル伝達経路を修飾するため、研究計画に沿って両側副腎摘出、あるいは横隔膜下での迷走神経切離術を施行したモデルラットを作成した。これらのラットに水浸拘束ストレスを負荷し、視床下部及び胃粘膜における熱ショックタンパク質70(HSP70)誘導とHSP70mRNAの発現を調べた。さらに、これらのラット胃粘膜での熱ショック転写因子1の発現量とその活性化についても検討した結果、急性ストレス時の胃粘膜におけるHSP70の発現誘導は、副腎由来の因子により生じることをつきとめた。これを証明するため、副腎摘出ラットに、エピネフリン、ノルエピネフリン、あるいはデキサメサゾンを投与すると、エピネフリンでのみHSP70mRNAと蛋白質が誘導させることを示した。さらに、エピネフリンによるHSP70の誘導をさらに詳細に確認するため、正常ラットに、α_1、α_<1A>、α_<1B/1D>、α_2、βアドレナリン拮抗剤あるいはグルココルチコイド拮抗剤を投与し、水浸拘束ストレスによる胃粘膜のHSP70の誘導阻害を調べた結果、α_1とα_<1A>アドレナリン拮抗剤でその誘導が完全に阻害され、その他の拮抗剤では効果がないことを確認した。これらの結果から、急性ストレス時に胃粘膜にHSP70を誘導するメカニズムとして、交感神経・副腎髄質系の活性化により放出されるエピネフリンがα_<1A>レセプターを介して胃粘膜にHSP70を誘導し、ストレス潰瘍に対する低抗力を誘導することを明らかに出来た。さらに、ストレスにより胃粘膜にRNAスプライシングファクター(RA301)のスプライシングバリアントが発現することを発見した。今後、このバリアントの生理作用の解明し、あらたなストレス研究へと進展させたい。本年度は、生体のストレス応答のシグナル伝達経路を修飾するため、研究計画に沿って、下垂体摘出、両側副腎摘出、あるいは横隔膜下での迷走神経切離術を施行したモデルラットを作成した。これを証明するため、副腎摘出ラットに、エピネフリン、ノルエピネフリン、あるいはデキサメサゾンを投与すると、エピネフリンでのみHSP70mRNAと蛋白質か誘導させることを示した。さらに、エピネフリンによるHSP70の誘導をさらに詳細に確認するため、正常ラットに、α1、α_<1A>、α_<1B/1D>、α_2、βアドレナリン拮抗剤あるいはグルココルチコイド拮抗剤を投与し、水浸拘束ストレスによる胃粘膜のHSP70の誘導阻害を調べた結果、α_1とα_<1A>アドレナリン拮抗剤でその誘導が完全に阻害され、その他の拮抗剤では効果がないことを確認した。これらの結果から、急性ストレス時に胃粘膜にHSP70を誘導するメカニズムとして、交感神経・副腎髄質系の活性化により放出されるエピネフリンがα1Aレセプターを介して胃粘膜にHSP70を誘導し、ストレス潰瘍に対する抵抗力を誘導することを明らかに出来た。これらの結果は、論文にまとめ、Gasdtroenterologyに投稿した。このように、本年度の研究計画はほぼ完了する事が出来た。本年度は、生体のストレス応答のシグナル伝達経路の研究に加え、熱ショックタンパク質以外の新しいストレス関連遺伝子の発現に取り組んだ。研究モデルとしては、ラットの水浸拘束ストレスを用いた。

また、胃粘膜細胞での新しいストレス関連遺伝子の発現については、モルモット胃底腺から分離・培養した初代培養を用いた。あらたなストレス関連遺伝子として、ペルオキシレドキシン(MSP23)、プロテインキナーゼの結合蛋白質(A170)、及びRNAスプライシングファクターである(RA301)の発現を調べた。このうち、MSP23はストレス潰瘍発生後の修復期に発現が亢進するため、潰瘍による二次的な変化と判定した。また、ストレスによるA170の発現誘導は認められなかった。一方、RA301は水浸拘束モデルの胃粘膜ならびに過酸化水素を添加した培養胃粘膜細胞において、特徴的な発現の変化を示した。非ストレス時には2.3と1.9kbpのmRNAが構成的に胃粘膜細胞に発現していたが、ストレスを負荷すると2.8kbpのmRNAが新たに発現した。この遺伝子のcDNAクローニングを行い塩基配列を決定すると、エクソン2を含むスプライシングバリアントであった。さらに興味深いことに、構成的に発現している2.3kbpのmRNAの発現が逆に低下した。このRA301のスプライシングの変化は培養細胞でも認められた。以上の結果から、ストレス時にはmRNAのスプライシングを行うRA301自身がスプライシングの修飾を受け、これによる細胞機能の変化をもたらす可能性を示すことができた。以上、本年度は、これからのストレス研究の新たな展開へと結びつける重要な知見を得ることができた。
マラリア原虫リガンドの細胞内輸送機構の分子基盤

赤血球侵入型マラリア原虫の細胞内小器官には、多くのワクチン候補抗原が局在するが、これらの細胞内分子輸送機構の詳細は不明である。RhopH2のプロモーターとシグナル配列を加えるだけでタンパク質が標的細胞内小器官に輸送されることに着目し、様々の分子について組換え熱帯熱マラリア原虫を作成し、解析した。また、EBLという分子はアミノ酸が一つだけ変化するだけで細胞内局在が変化し、病原性まで劇的に変化することを見出した。マラリアは世界中で年間23億人の感染者、150万人の死者を出す重要な感染症である。マラリア原虫のロプトリーは細胞周期の最後の分裂体期で形成されるが、ロプトリータンパク質であるRhopH2のプロモーターとシグナル配列と融合するだけで、緑色蛍光タンパク質(GFP)がロプトリーに移行することを我々は見出した。このタンパク質輸送機構の詳細は全く明らかでなく、この機構を明らかにすることで、マラリア原虫に対する新たな薬剤標的となると考えた。本研究では、赤血球侵入型マラリア原虫の細胞内小器官ロプトリーへの輸送シグナルとなるシグナル配列を明らかにし、輸送に関与するタンパク質群および輸送されるタンパク質群を同定することを目的とした。初年度はロプトリーへの輸送がロプトリータンパク質のシグナル配列の普遍的な特徴かどうかを検討するため、メロゾイト期に発現し、細胞内局在が異なるRhopH2、EBA175、SERAといった代表的な熱帯熱マラリア原虫のタンパク質のシグナル配列部の遺伝子と緑色蛍光タンパク質を結合して発現するコンストラクトを、Invitrogen社のMultisite Gatewayシステムを用いて作成し、熱帯熱マラリア原虫に遺伝子導入し、選択薬剤WR99210を加えて、組換え熱帯熱マラリア原虫を作成した。ところが、得られた薬剤耐性原虫について、分裂体期にGFPシグナルがロプトリーに局在するかどうか、共焦点レーザー顕微鏡にて観察したところ、ライブイメージでも、間接蛍光抗体法でもGFPの発現が観察できなかった。種々の条件を検討した結果、Multisite Gatewayシステムの結合部位の配列が転写を阻害している可能性が示唆された。本研究では、赤血球侵入型マラリア原虫の細胞内小器官ロプトリーへの輸送シグナルとなるシグナル配列を明らかにし、輸送に関与するタンパク質群および輸送されるタンパク質群を網羅的に明らかにすることを目的とした。メロゾイト期に転写活性を持つ複数のタンパク質のシグナル配列とGFPを融合して発現するコンストラクトを初年度に作成したが発現が確認できなかったため、本年度はプロモーター領域とシグナル配列の間にゲートウェイ組換え部位配列を入れるように、コンストラクト群を新しくデザインして作り直した。各コンストラクトを遺伝子導入し、遺伝子組換え原虫を新しく作り直し、シグナル配列とロプドリーへの輸送の関係を調べるための詳細な局在解析を行う準備を整えた。また、ロプトリータンパク質RhopH2のプロモーターとシグナル配列と融合したタグタンパク質(lnvitrogen社のLumioタグとGFP)を発現する熱帯熱マラリア原虫を作成した。この原虫からタンパク質を抽出しカラムを作成し、タグタンパク質に結合するマラリア分子(輸送に関与する分子候補)を精製する準備を整えた。さらに、研究の過程で細胞内小器官マイクロネームに局在するEBLの輸送シグナルと考えられる領域のCys残基が、ネズミマラリア原虫P. yoelii17X弱毒株では、他のEBL相同体と同様に保存されているが、17XL強毒株ではArg残基に置換しており、また、17XL強毒株でとEBLはマイクロネームに局在していすいことを見出したため、Cys/Arg置換がEBLの異なる局在の原因かどうかを遺伝子改変手法により検討したところ、Cys/Argの置換がEBLの異なる局在の原因であることが確認できた。このアミノ酸置換により侵入する赤血球のタイプも変化し、その結果、病原性も劇的に変化した。以上より、EBLを標的とするワクチン開発に対する重要な基盤情報を提供した。
嵩高いイオン液体分子の表面修飾を利用した新規反応場の創成と高性能触媒の開発

イオン液体修飾基板による新規反応場の創出について、修飾するイオン液体のアルキル鎖長による触媒反応等への影響を検討した。また金属ナノ微粒子およびFSMなどのナノ細孔材料への修飾、およびその触媒反応に関して検討した。その結果、修飾されるイオン液体のアルキル鎖長により、構築されるイオン液体反応場の性質を制御可能であるころ、金属ナノ微粒子表面やナノ最高材料内部にイオン液体反応場を構築可能であること、さらに微粒子や最高内部に構築されたイオン液体反応場に錯体分子を固定可能であることが判明した。特に最高材料内部に固定化された錯体分子による触媒反応では、高い耐久性と再利用性をを示した。嵩高いイオン液体を基板上に修飾する場合、イオン液体間の立体障害や電荷の反発から基板上に疎らにイオン液体分子が修飾され、外来性の分子を導入可能な大きさの空間をイオン液体間に創出することが可能である。我々は本技術を電極表面上へ応用し、様々な機能性金属錯体を電極上へ固定化することに成功している。本研究では本技術をナノ微粒子およびナノ細孔材料表面へ応用し、電極表面への修飾と同様の方法により機能性金属錯体をナノ微粒子や細孔材料表面へ固定化することで、新しい触媒材料の開発を試みる。平成27年度は、従来の電極表面に嵩高いイオン液体を修飾する方法を改良し、ナノ微粒子表面および細孔材料表面へのイオン液体の修飾を行った。まずナノ微粒子として金ナノ微粒子を合成し、その表面へイオン液体の修飾を行った。その結果、当初の狙い通り、嵩高いイオン液体が修飾された金ナノ微粒子の合成に成功した。合成されたイオン液体修飾金ナノ微粒子は各種顕微鏡測定およびスペクトル法により同定した。続いて細孔材料としてFSMを利用し、その表面へシランカップリング法を用いて嵩高いイオン液体を修飾した。得られたイオン液体修飾FSMは窒素吸着測定および各種スペクトル法により合成を確認した。得られたイオン液体修飾金微粒子およびFSMに関して、外来性の金属錯体としてフェロセンを用い、その内部空間へのフェロセンの取り込み実験を行った。フェロセンを含有した溶液中で各材料を撹拌することで、イオン液体間にフェロセンが固定化された金ナノ微粒子およびFSMの合成を行った。各種スペクトル測定により、それぞれの材料へのフェロセンの取り込みを確認し、当初の狙い通り、外来性の金属錯体をイオン液体修飾金ナノ微粒子およびFSM上に修飾されたイオン液体間の空間へ固定化することに成功した。平成27年度は嵩高いイオン液体の合成およびそれらが修飾されたナノ微粒子および細孔材料の開発を行うところまでが当初の計画であったが、次年度に行う予定であった外来性の金属錯体の取り込み実験まで研究が進捗した。取り込み用の金属錯体として、安定かつスペクトル・電気化学的に同定のしやすいフェロセンを用いた。まずナノ微粒子として金ナノ微粒子を用いたイオン液体修飾金ナノ微粒子の合成を行った。金ナノ微粒子は化学合成法とレーザーアブレーション法により合成した金ナノ微粒子を用いたが、レーザーアブレーションによる金ナノ微粒子合成では十分な量の金ナノ微粒子が得られなかったため、本年度は主に化学合成法により合成された金ナノ微粒子を用いた。得られたイオン液体修飾金ナノ微粒子は各種顕微鏡法およびスペクトル法により同定した。イオン液体の修飾前後で金ナノ微粒子の大きさに変化はなく、イオン液体が当初の狙い通り金ナノ微粒子上へ修飾されたことが明らかとなった。続いて、フェロセンを含む溶液に合成したイオン液体修飾金ナノ微粒子を加えて撹拌することで、金ナノ微粒子上に修飾されたイオン液体間へのフェロセンの固定化を行った。NMRおよび電気化学測定ではフェロセンに由来するシグナルおよび酸化還元波が観測され、目的通りフェロセンが固定化されたイオン液体修飾金ナノ微粒子の開発に成功した。次に細孔材料としてFSMを用いたイオン液体修飾FSM材料の開発を行った。FSM表面に修飾するためにシランカップリング法を利用し、目的のイオン液体を細孔表面へ修飾した。イオン液体の修飾は各種スペクトル法および窒素吸着測定により確認した。続いてフェロセンを含む溶液に得られたFSM材料を加えて撹拌することで、フェロセンが固定化されたイオン液体修飾FSM材料を開発することに成功した。フェロセンの導入はESRおよび窒素吸着測定により確認した。嵩高いイオン液体を基板上に修飾する場合、イオン液体は基板上に密に配向して修飾されず、イオン液体間の立体障害や電荷の反発から疎らに修飾される。その結果、イオン液体間に空間が生じ、その空間へ様々な外来性分子を導入することが可能となる。我々はこれまでに上記の技術を用いて電極上に修飾されたイオン液体間に様々な機能性分子を導入し、センサー材料や触媒能を有する機能性電極を作製することに成功している。本研究では、この技術をナノ細孔材料やナノ微粒子表面へ応用することで、主に触媒能を有する新しい機能性材料の開発を目的としている。平成28年度は、FSM細孔内部へ修飾するイオン液体の嵩高さ(アルキル鎖の長さ)を精密にコントロールすることで、イオン液体間に閉じ込められた簡単な錯体分子(フェロセン)の性質にどのような影響があるかを確認した。続いて、触媒作用をを有する金属錯体(我々が開発した銅錯体触媒)をイオン液体が修飾されたFSM内部に同様に固定化し、その酸化触媒能を評価や反応条件の検討を行った。

次にイオン液体修飾ナノ微粒子に関して、化学還元法の他に金属ナノ微粒子合成法として今年度は液中プラズマ法による合成を行った。これは昨年度まで利用していたレーザーアブレーション法による金属微粒子合成法では十分な量の金属ナノ微粒子を獲られなかったためである。今年度は液中プラズマ用法により、十分な量の均一な金属ナノ微粒子を獲ることに成功した。平成28年度は、これまでのイオン液体の構造を見直し、導入する金属錯体のサイズに応じて基板上に構築される反応場の大きさを制御可能とするために、カチオン中心(PおよびN原子)から伸びるアルキル鎖の長さをコントロールしたイオン液体の合成を行った。具体的には、カチオン中心からリンカー原子(SおよびSi原子)までの長さの制御およびカチオン中心に置換されたアルキル鎖の長さの制御によるイオン液体間の距離の制御である。その結果、導入する金属錯体によっては、完全にイオン液体間の反応場に埋没した場合よりもイオン液体層から多少露出した場合の方が、その反応性が向上することが明らかとなった。これはイオン液体間の反応場に閉じ込められた金属錯体が溶液中の分子と相互作用する際に、場合によってはイオン液体層が相互作用を妨害する可能性があることを示唆している。続いて、イオン液体が修飾されたFSMを用い、我々の研究室で過去に合成された銅錯体触媒をイオン液体間の反応場に固定し、その酸化反応について検討した。その結果、FSM内部空間に修飾されたイオン液体の間に閉じ込められた銅錯体触媒による酸化反応生成物が確認され、当初の狙い通り、FSM表面に修飾されたイオン液体間にトラップされた触媒分子による触媒反応が進行することが判明した。またレーザーアブレーション法に替わり、液中プラズマ法による金属微粒子の合成を行い、均一な大きさを有する金ナノ微粒子の合成に成功した。しかし液中プラズマ法のセットアップに少し時間を要したため、液中プラズマ法で作成した金ナノ微粒子へのイオン液体の修飾は次年度に行うこととした。以上の点より、全体としておおむね予定通りにけんきゅは進捗していると考えている。嵩高いイオン液体を基板上に修飾する場合、イオン液体は基板上に密に配向して修飾されず、イオン液体間の立体障害や電荷の反発から疎らに修飾される。その結果、イオン液体間に空間が生じ、その空間へ様々な外来性分子を導入することが可能となる。我々はこれまでに上記の技術を用いて電極上に修飾されたイオン液体間に様々な機能性分子を導入し、センサー材料や触媒能を有する機能性電極を作製することに成功している。本研究では、この技術をナノ細孔材料やナノ微粒子表面へ応用することで、主に触媒能を有する新しい機能性材料の開発を目的としている。平成29年度は、イオン液体が修飾されたFSM細孔内部へ機能性金属錯体を導入し、均一溶液中とその機能性について比較・検討を行った。まずはじめにNO分子と選択的に反応するCo錯体を導入し、そのNO分子との反応性について検討したところ、均一溶液中と同様、FSM細孔内においてもNO分子と選択的に反応していることが判明した。またCu錯体を利用した酸化反応では、イオン液体修飾FSM細孔内にCu錯体を固定化し、基質と酸化剤を用いて反応させたところ、FSM細孔内においても基質の酸化反応が振興することガ明らかとなった。
過酸化水素を利用した環境調和型物質変換を目指したコンポジット熱-光触媒の設計

本研究では、駆動エネルギー源に無尽蔵な太陽光を使用した水と酸素からの過酸化水素製造を行い、製造した過酸化水素をin-situで有機酸化反応に使用できる『コンポジット熱ー光触媒』の設計を最終目的にしている。昨年度に引き続き、「効率的な過酸化水素生成および蓄積が実現できる光触媒設計」と「生成した過酸化水素を有機酸化反応へ効果的に応用できる熱ー光触媒設計」について段階的に検討した。(1)効率的な過酸化水素生成および蓄積が実現できる光触媒設計昨年度までに、光触媒的な酸素からの過酸化水素生成において、Pd系助触媒が極めて効果的に作用することを見出している。今年度は更なる高性能化を目指し、Pd系助触媒の担持方法・条件の影響について検討した。高酸化状態のPd(PdOやPdO2)助触媒は、生成した過酸化水素の還元分解を抑制し、結果として高濃度な過酸化水素蓄積が可能になることを見出した。低担持量(Pdとして0.1 wt%以下)の高酸化状態Pd助触媒を光析出法で導入することにり、含浸法で導入した場合に比べて、約4倍の過酸化水素蓄積量の向上も達成された。(2)生成した過酸化水素を有機酸化反応へ効果的に応用できる熱ー光触媒設計過酸化水素を生成するための効果的な光触媒材料として機能するバナジン酸ビスマス(BiVO4)は、過酸化水素存在下におけるオレフィン(スチレン)酸化反応のための熱触媒として機能することがわかった。また本反応の性能は、光照射下において約5倍程度向上することも明らかとなった。昨年度に既に合成に成功しているBiVO4@SiO2を本熱ー光触媒反応系に応用することで、BiVO4の熱触媒反応系に比べて約7.5倍の性能向上が達成された。これまでに、効果的な過酸化水素の生成および蓄積を実現する様々な光触媒設計について検討しており、水と酸素を原料に使用した酸化還元的な過酸化水素生成も実現できている。特に、酸素を原料に使用した還元的な過酸化水素生成においては、高濃度の過酸化水素蓄積を実現するPd系助触媒担持光触媒の設計にも成功している。これらは、生成した過酸化水素の有機酸化反応へのin-situ利用に十分に期待できる成果である。また、過酸化水素を酸化剤に使用した有機酸化反応についても、LDH系触媒やBiVO4熱ー光触媒のような、これまでに無い視点での高性能な触媒設計が実現できている。上記の光エネルギーを利用して過酸化水素を合成する光触媒系と融合することで、画期的な『コンポジット熱ー光触媒』系の構築が十分に期待できる。上述の通り、水と酸素を原料に使用した酸化還元的な過酸化水素生成を実現する光触媒設計は達成できている。特に、酸素を原料にした還元的な過酸化水素生成に関しては、高濃度での蓄積も実現できている。しかしながら、生成した過酸化水素の酸化分解反応の抑制は未だ十分ではなく、水を原料とした犠牲剤の無い反応系では十分な蓄積量を達成できていないのが現状である。来年度は、これまでに設計した光触媒材料の各種表面処理を行うことで、過酸化水素の酸化分解も抑制し、水と酸素を原料にした条件下においても、高濃度の過酸化水素蓄積が実現できる光触媒設計を目指す。これを、これまでの成果で得られた熱触媒系と融合することで、画期的な『コンポジット熱ー光触媒』系の構築を目指す。本研究では、駆動エネルギー源に無尽蔵な太陽光を使用した水と酸素からの過酸化水素合成と、合成した過酸化水素をin-situで有機酸化反応へ利用できる『コンポジット熱-光触媒』の設計を目的としている。平成28年度は、過酸化水素を使用した有機酸化反応の高効率化を実現する熱触媒設計について主に検討した。過酸化水素による有機酸化反応は、酸化触媒の高性能化に関する試みが主であり、過酸化水素の酸化特性を制御する試みは少ない。過酸化水素は、炭酸塩等のアニオンと反応することで、異なる酸化特性を示す様々な過酸化物を生成できるユニークな特性を有している。そこで、同一担体上に酸化触媒とアニオン種を融合した複合触媒の設計について検討した。担体には、様々なアニオンの固定化が可能な層状複水酸化物の焼成物(Calcined LDH)、酸化触媒には過酸化水素を用いた酸化反応に対して優れた触媒特性を示すタングステン酸イオンを選択した。モデル反応として、テトラヒドロチオフェンの酸化反応を検討したところ、アニオンの種類によって酸化反応特性が大きく変化することが明らかとなった。特に、炭酸水素イオンをアニオン種として導入した複合触媒上では、アニオンを導入していない触媒に比べて約4倍の極めて高い酸化特性を示した。過酸化水素とアニオンの反応によって生成した過酸化物が、酸化触媒として導入したタングステン酸イオンの活性化に大きく寄与していることが示唆される。光触媒反応を利用した過酸化水素合成に関しては、最適なpH領域での光析出法によって調製した金助触媒担持バナジン酸ビスマス光触媒が、疑似太陽光照射下での水と酸素からの過酸化水素合成に対して、高い初期活性を示すことも見出した。平成29年度は、本熱触媒系を光触媒的な過酸化水素合成システムと融合することで、『コンポジット熱-光触媒』の設計も検討する。理想的なワンポット有機酸化反応系のための『コンポジット熱-光触媒』の設計において、過酸化水素を酸化剤に使用した有機酸化反応を、これまでに無い視点で極めて高効率に達成することが出来た。

太陽光エネルギーを使用して水と酸素から過酸化水素を合成する光触媒系と融合することで、画期的な『コンポジット熱-光触媒』系の構築も期待できる。本研究では、駆動エネルギー源に無尽蔵な太陽光を使用した水と酸素からの過酸化水素製造を行い、製造した過酸化水素をin-situで有機酸化反応へ効果的に使用できる『コンポジット熱ー光触媒』の設計を最終目的にしている。平成29年度は、過酸化水素を利用した有機酸化反応の高効率化を実現する熱-光触媒の設計指針を得ることを目的とし、平成28年度で高効率化に成功した金担持バナジン酸ビスマス(Au-BiVO4)にシリカ(SiO2)を導入した、コアーシェル型Au-BiVO4@SiO2の合成を検討した。従来のSiO2合成手法であるStober法を駆使することにより、50 nm程度のSiO2をAu-BiVO4上へ均一にコートすることに成功した。合成した本Au-BiVO4@SiO2は、過酸化水素を酸化剤に用いたオレフィンの酸化反応において、SiO2を導入していないAu-BiVO4に比べて2倍以上の活性向上を示した。BiVO4上に担持したAuナノ粒子が過酸化水素を使用したオレフィン酸化反応の熱触媒として機能し、それをSiO2シェルがアシストしていることが示唆される。光触媒的な過酸化水素製造の高効率化を実現する助触媒探索についても検討を行った。酸素を原料とした還元的な過酸化水素製造において、パラジウムを助触媒に選択することで、従来から本反応に広く利用されているAuを助触媒に用いた系に比べて、約10倍の飛躍的な過酸化水素生成活性の向上が確認された。パラジウム助触媒の導入は、生成した過酸化水素の蓄積(生成した過酸化水素の分解抑制)においても優れた性能を示すことが明らかとなった。平成30年度はこれらの成果を融合することにより、過酸化水素を光触媒的に製造しながら有機酸化反応へ効果的に使用できる『コンポジット熱-光触媒』の設計を目指す。平成28年度および29年度では、過酸化水素を酸化剤に使用した有機酸化反応の高効率化を実現する触媒設計について、これまでにない視点で達成することが出来た。理想的なワンポット有機酸化反応系のための『コンポジット熱ー光触媒』の設計についても検討することが出来た。光触媒的な過酸化水素製造に関しても、従来よりも極めて高性能な助触媒を見出すことにも成功しており、これらの成果を融合することで、画期的な『コンポジット熱ー光触媒』系の構築が期待できる。本研究では、駆動エネルギー源に無尽蔵な太陽光を使用した水と酸素からの過酸化水素製造を行い、製造した過酸化水素をin-situで有機酸化反応に使用できる『コンポジット熱ー光触媒』の設計を最終目的にしている。昨年度に引き続き、「効率的な過酸化水素生成および蓄積が実現できる光触媒設計」と「生成した過酸化水素を有機酸化反応へ効果的に応用できる熱ー光触媒設計」について段階的に検討した。(1)効率的な過酸化水素生成および蓄積が実現できる光触媒設計昨年度までに、光触媒的な酸素からの過酸化水素生成において、Pd系助触媒が極めて効果的に作用することを見出している。今年度は更なる高性能化を目指し、Pd系助触媒の担持方法・条件の影響について検討した。高酸化状態のPd(PdOやPdO2)助触媒は、生成した過酸化水素の還元分解を抑制し、結果として高濃度な過酸化水素蓄積が可能になることを見出した。
酵素触媒反応種の状態変化と活性制御に関する理論的研究

理論計算化学の立場から、高周期典型元素と遷移元素を活性中心にもつ酵素反応系およびモデル系を対象として、実在系に生成する感応性化学種の発見に努めた。また、大規模量子化学計算を用いて活性中心の周辺環境や反応過程に応じて状態を変化させる感応性化学種の発見と、それらが受ける摂動メカニズムの解明に寄与した。本研究では、とくに金属酵素と関連するモデル錯体について、酸化反応などの生体模倣反応やタンパク質間相互作用の機構を領域内の実験グループと連携して研究を行った。反応過程で生成する中間体のスピン状態変化およびタンパク質中での電子移動が、金属の関与する酵素触媒反応を理解するための鍵となることを明らかにした。理論化学計算は、実験的に観測困難な化学種の構造、反応、物性の研究に極めて有効な研究手段である。金属酵素は通常は困難な化学反応を常温常圧で高選択的に触媒している。本研究では、金属酵素に生成して、高い反応性を示す“感応性化学種"の理論化学的研究を領域内の実験系研究者と行った。とくに、メタン活性化、窒素固定、水分解などの精緻な生体化学反応に関わる活性種の構造と反応性の相関に焦点を当て、これを量子化学計算により研究を行った。反応過程で生じる不安定活性種を実験的に補足することは極めて困難である。一般に詳細な化学反応経路の研究を行うためには、量子化学計算に基づく素反応レベルでの理解が不可欠である。本研究では、酵素触媒での反応活性種の研究を量子化学計算により行うとともに、実験研究者と連携して、酵素触媒反応種の状態変化と活性制御に関するわれわれの理解を飛躍的に深化させ、人工酵素の開発へと展開した。とくに、人工窒素固定触媒の実験事実と理論計算の結果を組み合わせ、反応系中で生成する鉄活性種を推定した。その活性種は低配位の鉄(II)錯体である。一般に鉄(II)錯体は窒素を活性化できないと考えられているが、電子供与性の高いSiMe3基を配位子に持つことで鉄中心の反応性が向上した結果、配位した窒素分子を活性化することが可能となった。鉄を触媒とした、理論的に妥当な反応機構を示すことに成功した。触媒的シリルアミン生成は、鉄活性種に配位した窒素分子がシリルラジカルの攻撃を受けて、窒素ーケイ素結合が段階的に生成することで始まる。途中で窒素ー窒素結合の開裂を伴い、シリルアミンが1分子ずつ生成することを明らかにした。本研究では領域内の実験グループとの共同研究を一層活性化することを目的とし、量子化学計算による酵素触媒反応種の状態変化と活性制御に関する理論的研究を実施している。本年度は、酵素触媒反応種の状態変化と活性制御を目指す事を重点課題とし量子化学計算による理論研究を進めた。その結果、研究代表者グループ独自の研究として、二核モリブデン錯体によるアンモニア合成の反応機構(Nature Commun., 5, 3737/1-11 (2014), J. Am. Chem. Soc., 136, 9719-9731 (2014),Angew. Chem. Int. Ed., 53, 11488-11492 (2014))、ゼオライト担持二核銅構造による一酸化窒素の還元機構(ACS Catal., 4, 2075-2085 (2014))、酵素反応のミューテーション解析(Bull. Chem. Soc. Jpn., 87, 950-959 (2014))などについての新たな知見成果を得た。また、小澤、小島、金川ら領域内の実験研究者との共同研究をった。それぞれ、ピンサー錯体によるN-H結合の切断機構、多核ルテニウム錯体の構造と反応性、金属錯体の光電磁気物性等に関する詳細な理論解析を行い、実験研究者との共同研究を通じて有意義な成果を挙げることができた。その他に領域内外の多くの実験研究者との連携研究を活発に実施することができた。それらの成果は来年度発表する予定である。新学術領域「感応性化学種が拓く新物質科学」のA04班の計画班長として本研究に参画し、酵素触媒反応種の状態変化と活性制御に関する理論的研究を推進した。酵素触媒反応の原動力となる金属活性種の構造と反応性について探索するため、実験研究者との共同研究体制の下に量子化学計算および分子力学計算による理論研究を展開した。理論計算化学は、実験的に観測困難な化学種の構造、反応、物性の研究に極めて有効な手段であり、最近の最先端研究における理論計算の役割は極めて重要である。本研究では理論計算化学の立場から、高周期典型元素と遷移元素を活性中心にもつ酵素反応系を対象として、実在系に生成する感応性化学種の発見に努めた。本研究では、とくに金属酵素と関連するモデル錯体について、酸化反応などの生体模倣反応の機構について理論的研究を行った。密度汎関数法やQM/MM法により現実系の大規模計算を行い、酵素触媒反応種の構造と分光学的研究を行った。実験による不安定活性種の観測は困難なため、量子化学計算は有効な研究手段となる。平成27年28年には27報の原著論文を報告した。

その内、複数のグループとの領域内共同研究は14報の論文として発表され、領域内共同研究の推進にとくに貢献した。領域内外の実験研究者と金属酵素と関連するモデル錯体について、生体模倣反応の機構について理論研究の立場から共同研究を行った。密度汎関数法により現実系の大規模計算を行い、酵素触媒反応種の構造と反応性及び分光学的研究を行った。平成27年28年には27報の原著論文を報告した。その内、領域内共同研究は14報であり、領域内共同研究の推進にとくに貢献した。理論と実験のインタープレイによって、とくに複雑な酵素触媒反応の機構解明に資する研究が達成できた。新学術領域「感応性化学種が拓く新物質科学」のA04班の計画班長として本研究に参画し、酵素触媒反応種の状態変化と活性制御に関する理論的研究を推進した。酵素触媒反応の原動力となる金属活性種の構造と反応性について探索するため、実験研究者との共同研究体制の下に量子化学計算および分子力学計算による理論研究を展開した。理論計算化学は、実験的に観測困難な化学種の構造、反応、物性の研究に極めて有効な手段であり、最近の最先端研究における理論計算の役割は極めて重要である。本研究では理論計算化学の立場から、高周期典型元素と遷移元素を活性中心にもつ酵素反応系およびモデル系を対象として、実在系に生成する感応性化学種の発見に努めた。また、大規模量子化学計算を用いて活性中心の周辺環境や反応過程に応じて状態を変化させる感応性化学種の発見と、それらが受ける摂動メカニズムの解明に寄与した。本研究では、とくに金属酵素と関連するモデル錯体について、酸化反応などの生体模倣反応やタンパク質間相互作用の機構を領域内の実験グループと連携して研究を行った。密度汎関数法やQM/MM法により現実系の大規模計算を行い、酵素触媒反応種の構造と分光学的研究を行った。反応過程で生成する中間体のスピン状態変化およびタンパク質中での電子移動が、金属の関与する酵素触媒反応を理解するための鍵となることを明らかにした。実験による不安定活性種の観測は困難なため、量子化学計算は有効な研究手段となることを示した。平成28年29年には46報の原著論文を報告した。その内、複数のグループとの領域内共同研究は16報の論文として発表され、領域内共同研究の推進に貢献した。理論化学計算は、実験的に観測困難な化学種の構造、反応、物性の研究に極めて有効な研究手段である。金属酵素は通常は困難な化学反応を常温常圧で高選択的に触媒している。本研究では、金属酵素に生成して、高い反応性を示す“感応性化学種"の理論化学的研究を領域内の実験系研究者と行った。とくに、メタン活性化、窒素固定、水分解などの精緻な生体化学反応に関わる活性種の構造と反応性の相関に焦点を当て、これを量子化学計算により研究を行った。反応過程で生じる不安定活性種を実験的に補足することは極めて困難である。一般に詳細な化学反応経路の研究を行うためには、量子化学計算に基づく素反応レベルでの理解が不可欠である。本研究では、酵素触媒での反応活性種の研究を量子化学計算により行うとともに、実験研究者と連携して、酵素触媒反応種の状態変化と活性制御に関するわれわれの理解を飛躍的に深化させ、人工酵素の開発へと展開した。とくに、人工窒素固定触媒の実験事実と理論計算の結果を組み合わせ、反応系中で生成する鉄活性種を推定した。
重症患者における多臓器不全発症のメカニズム解明の試み

我々は重症患者における臓器不全の病態が糖尿病末期患者と似た部分があることから、多臓器不全発症のメカニズムを調査した。病理解剖症例の主要臓器を調査したところ、臓器不全患者において、肝臓・腎臓にプロインスリン陽性細胞が出現しており、これらの細胞はTNF-αも共陽性であった。高血糖・高サイトカインにより骨髄に出現したプロインスリン陽性異常細胞が、多臓器不全を引き起こしている可能性が示唆された。多臓器不全は現代の医療をもってしても死亡率の高い病態であるにもかかわらず、そのメカニズムについては未だ明らかとはされていない。また、近年厳格な血糖コントロール(Intensive insulin therapy)にて多臓器不全への進行が抑制されたとの報告がなされたものの、なぜその効果が得られているのかについても明らかとはされていない。当申請は、重症患者における臓器不全の病態が糖尿病末期患者と似た部分があることより、最新の糖尿病における研究結果を踏まえ、多臓器不全発症のメカニズムを勘案するものである。昨年度はまず、現在までに当院にて多臓器不全にて死亡された患者において、病理解剖を行ったケースの主要臓器(心、肺、肝、腎等)、および各臓器における微小血管の内皮細胞を組織学的に検索し、インスリン、プロインスリンの免疫染色、CD抗原マーカーの免疫染色を行った。主要臓器、特に肝臓・腎臓において臓器不全の生じている患者においてインスリン・プロインスリンの発現が認められた。また、インスリン・プロインスリン陽性細胞は抗TNF-α抗体による免疫染色にても陽性であった。骨髄細胞からのインスリン陽性異常細胞が、炎症性サイトカインを産生し、臓器不全を引き起こしている可能性が示唆された。今後末梢血液中より骨髄由来インスリン陽性異常細胞をフローサイトメトリーにて分離を試み、骨髄由来インスリン陽性異常細胞による多臓器不全発症のメカニズムニついてさらに明らかにするつもりである。平成22年度には、多臓器不全にて死亡された患者において、病理解剖を行ったケースの主要臓器(心、肺、肝、腎等)、および各臓器における微小血管の内皮細胞を組織学的に検索し、インスリン、プロインスリンの免疫染色、CD抗原マーカーの免疫染色を行った。また、インスリン・プロインスリン陽性細胞は抗TNF-α抗体による免疫染色にても陽性であり、骨髄細胞からのインスリン陽性異常細胞が、炎症性サイトカインを産生し、臓器不全を引き起こしている可能性が示唆された。平成23年度も引き続き病理解剖献体より多臓器不全患者および突然死患者に於ける主要臓器の免疫染色を行ったところ、多臓器不全患者においてはインスリン・プロインスリンの発現が認められるが、突然死患者においてはその発現を認めなかった。平成23年度の研究において、多臓器不全患者に於けるインスリン陽性異常細胞の役割がより明かとなったと考えている。また、近年厳格な血糖コントロール(Intensive insulin therapy)にて多臓器不全への進行が抑制されたとの報告がなされたものの、なぜその効果が得られているのかについては不明のままである。当申請は、重症患者における臓器不全の病態が糖尿病末期患者と似た部分があることより、最新の糖尿病における研究結果を踏まえ、多臓器不全発症のメカニズムを勘案するものであった。研究期間中、申請者は多臓器不全にて死亡された患者において、病理解剖を行ったケースの主要臓器(心、肺、肝、腎等)、を組織学的に検索し、インスリン、プロインスリンの免疫染色を行った。臓器不全の生じている患者において、主要臓器、特に肝臓・腎臓にインスリン・プロインスリンの発現およびTNF-αの発現が認められた。骨髄より各臓器に移行したプロインスリン陽性異常細胞が、炎症性サイトカインを産生し、臓器不全を引き起こしている可能性が示唆された。次に病理献体症例の死亡に至る過程を検討したところ、重篤な病態となってから3日以内に亡くなられた糖尿病を有しない患者群においては、プロインスリン陽性細胞は主要臓器において殆ど観察されなかった。しかし、糖尿病を有する患者はもちろん、重篤な病態となってから3日以上経過した、糖尿病を有しない患者群においても、プロインスリン陽性細胞が肝臓、腎臓において強く発現していた。マウスの実験にて高血糖状態が3日以上続くと骨髄にプロインスリン陽性異常細胞が出現するとの報告と一致する結果となった。今後は、実際に集中治療室に入室中の患者において、末梢血中のプロインスリンmRNAの発現の定量化と重傷度との相関の調査を継続し、異常細胞と多臓器不全との関係をより明らかとしていきたい。

血液中のインスリン陽性異常細胞をフローサイトメトリーで検出しようと試みているが今のところ成果が上がっていない。今後はまず末梢血液中白血球でのインスリンmRNAの発現についても調査を行う24年度が最終年度であるため、記入しない。インスリン陽性異常骨髄細胞の検出においては、今後は末梢血液中白血球でのインスリンmRNAの発現についての調査を行い、多臓器不全患者に於けるインスリン陽性骨髄異常細胞との相関につき調査を行う予定である。24年度が最終年度であるため、記入しない。
脂肪組織由来成熟脂肪細胞を利用した中枢神経再生への試み

Flow cytometry、real-time RT-PCR法およびWestern Blot法を用いた解析により、ラットおよびヒトDFATはnestin、βIII tubulin、GFAPなどの神経系マーカーに加え、神経栄養因子であるBDNFならびにGDNFを発現している細胞であることが明らかとなった。また、脊髄損傷モデルラットに同種移植し損傷部位で生着がみられたラットDFATにおいても、BDNFならびにGDNFの発現を確認した。これらのことから、DFAT移植後の運動機能回復の促進には、損傷部位でのDFATからの神経栄養因子の産生が寄与していることが示唆された。次いで、ヒトDFATを脊髄損傷モデルラットに異種移植し、Basso-Beattie-Bresnahanスコアを用いて後肢運動機能を評価した。細胞移植なしのコントロール群に比較して、ヒトDFAT移植群では障害を受けた後肢運動機能の回復の促進が有意に認められた。さらに、ヒトDFATを移植したラット脊髄切片をヒト核タンパク質およびヒトnestinに特異的な抗体を用いて染色したところ、損傷部位で陽性細胞が検出され、移植したヒトDFATの生着が認められた。本研究において、外傷性脊髄損傷に対するDFATの移植は、損傷後の運動機能回復を促進することが認められ、その作用機序の一つとしてDFATからの神経栄養因子産生が示唆された。従って、中枢神経再生のドナー細胞供給源として脂肪組織は有用であることが明らかとなった。新たなドナー細胞供給源として脂肪組織に焦点をあて、中枢神経再生療法に対する脂肪組織の有用性をin vitroおよびin vivoの両面からアプローチした。ラット脂肪組織より単離した成熟脂肪細胞を天井培養すると、脂肪滴をもたない線維芽細胞様の形態をした細胞(mature adipocyte-derived cells : MADCs)が得られた。MADCsは通常培養条件下において活発に増殖し、脂肪細胞への再分化能を有することを確認した。興味深いことに、MADCsはすでにいくつかの神経系のマーカーを発現していることが明らかとなった。この細胞を神経細胞へと分化誘導すると、線維芽細胞様の形態からいくつかの分枝を有する形態への変化が観察され、神経細胞特異的な遺伝子発現パターンが認められた。免疫染色を行ったところ、nestin、βIII tubulin、GAP-43およびtrkB陽性、GFAP陰性であった。これらのことから、MADCsは神経細胞への分化能を有する可能性が示唆された。次いで、ラットMADCsを重錘落下法により作製した外傷性脊髄損傷モデルラットに同種移植し、ドナー細胞としての有用性を検討した。Basso-Beattie-Bresnahanスコアを用いて後肢運動機能を評価したところ、細胞移植なしのコントロール群に比較して、MADCs移植群では障害を受けた後肢運動機能の改善の促進が有意に認められた。さらに、性差を利用したSry遺伝子の検出あるいはGFP発現トランスジェニックラットのMADCsを用いることにより、移植細胞が生着していることを確認した。従って、本研究からラットMADCsは神経細胞への分化能を有する可能性が示唆され、移植ドナー細胞として用いると損傷後の機能回復に寄与することが明らかとなった。
ミスフォールディング病の病態解析・治療を目ざした自己抗体の解析

家族性アミロイドポリニューロパチー(FAP ATTR V30M)のトランスジェニックラットおよび患者の血清中に存在する異型TTRに対する自己抗体を同定し、これら自己抗体の存在とFAPの発症年齢や症状進行との関連、更には本自己抗体が認識するエピトープを検討した。日本人およびスウェーデン人患者に、抗ATTR V30M抗体が認められた。又、全て高齢発症であった。エピトープとして、ATTR24-35、およびATTR105-115が候補に挙った。FAP ATTR V30Mの新規抗体治療を開発していく上での一つのターゲットとなる可能性がある本年は、家族性アミロイドポリニューロパチー(FAP ATTR V30M)患者の血清中に存在する異型TTR(ATTR V30M)に対する自己抗体を同定し、これら自己抗体の存在とFAPの発症年齢や症状進行との関連、更には本自己抗体が認識するエピトープを検討した。結果、日本人患者3名、スウェーデン人患者8名の計11名で、抗ATTR V30M抗体陽性と考えられた。又、この8名は全て高齢発症であった。ELISA法による検討の結果、抗ATTR V30M抗体が認識するエピトープとして、ATTR24-35、およびATTR105-115が候補に挙った。この内、ATTR24-35を認識する抗ATTR V30M抗体を持つと考えられた患者10名で、血中抗ATTR V30M抗体レベルと発症年齢との間に強い正の相関を認めた(r=0.833、p<0.05)。これらの所見は、FAP ATTR V30M患者の症状の進行、あるいは同一の遺伝子変異を持ち乍、発症年齢の異なる群が存在する理由を説明しうる一つの材料となり、又、今回同定したエピトープは、FAP ATTR V30Mの新規抗体治療を開発していく上での一つのターゲットとなる可能性がある。FAP ATTR V30Mの新規抗体治療を開発していく上での一つのターゲットとなる可能性がある23年度は生体におけるTTRの存在形式を様々な観点から明らかにすることと、2.様々な存在形式のTTRがもつ抗原性を明らかにすることに加えて、3.様々なTTRペプチドも合成し、患者血清や髄液中にこれらに反応する抗体が存在するかも検討した。具体的には以下の如くTTRの存在形式(脱重合蛋白質、細胞外分泌エクソゾーム、ペプチド断片、脂質結合)に着目し検討した。【脱重合蛋白質】一度重合し線維化したアミロイド前駆蛋白質も、脱重合を生じることが判明している。FAP患者とSSA患者の組織から水抽出法でアミロイド線維を抽出・精製し、尿素、SDS、DMSOなどの変性剤と共にインキュベーションし、可溶化した脱重合TTRを回収し、変異型と野生型TTRの存在比率を解析したところ50-60%の割合で変異型TTRが含有されていた。また多くのサンプルで断片化されたTTRが証明された。【細胞外分泌エクソゾーム】細胞外での蛋白質の存在形式の一つとして、細胞から放出されたエクソゾーム内のものが免疫や腫瘍の分野で特に注目されている。そこでFAPやSSA患者などの血清、髄液などを用いて、超遠心法で細胞外分泌エクソゾームを分離・精製し、TTRが存在するか、イムノブロットや質量分析法(SELDI-TOF MSなど)で解析した。解析の結果、確かに上記サンプル内のエキソソームにTTRが存在していることが確認された。また人工的にTTR断片ペプチド(TTR1-10,11-20,21-30,24-35,31-40,41-50,51-60,61-70,71-80,81-90,91-100,96-106,105-115,111-120,115-124,119-127)を合成し、各ペプチドと反応するTTRサンプルを検討したところ、31-40,105-115のペプチドに対して明らかな反応性が認められた。現在、FAP患者の血清や髄液に確かに特定のエピトープと反応する自己抗体が存在することを明らかにするところまで辿りつき、研究はゴールに向かって、概ね良好に進行している。このことは、一部のTTRが確かにミスフォールディングをおこし、そのステップを介してアミロイド化していることを意味する。本研究の主眼は、ミスフォールディングを起こしたTTRを制御し、アミロイド化を防ぐことが最終ゴールであり、それに向けて、順調に研究が滑り出しておりものと考える。23年度で得られた結果を基に、24年度はさらに計画を発展、変更し、研究を実施する。また、各抗TTR抗体がTTRのアミロイド形成に及ぼす影響を、試験管内のTTRアミロイド線維形成系や、培養細胞でTTR毒性解析系などを用いて検証する。得られた抗TTR抗体のうち、アミロイドーシス(FAPとSSA)

患者検体に特異的な反応を示すものは、将来的に診断法への応用を、nativeなTTRには反応せずに、アミロイド線維化の抑制効果を示す抗体は、将来的に治療法への応用を考え、検証を継続する。初年度で得られた結果を基に、各ペプチドと反応する自己抗体を患者血清などで解析するため、ビーズアレイ関連費として200千円を計上している。加えて、各抗TTR抗体との反応性を検討するために、イムノブロット関連費(200千円)およびイムノアッセイ関連費(100千円)をそれぞれ計上している。また、FAP研究の国内の情報収集や、研究成果発表のため、国内の神経学会・日本臨床化学会関連の旅費として100千円を計上している。