hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
歯の移動に伴う疼痛:新規治療薬の探索と発現機構の解明

矯正治療は国民のデンタルIQ向上に伴い症例数が増加している.また,矯正装置や理論の進歩から矯正期間短縮などがもたらされ,患者満足度も向上している.しかし歯の移動には、個人差はあるが疼痛は存在する.我々は歯の移動時に生じる疼痛の管理方法の確立を目的とし,矯正力に由来する疼痛強度を定量評価可能な動物モデルを作製しその妥当性を確認してきた。本申請では,研究を更に進め,本モデルを用いた新規疼痛管理薬物の探索ならびに矯正力負荷で生じる侵害受容機構の変化を明らかにすることを目的としてきた.以前より,コイルスプリングを門歯と上顎右側の第一臼歯に装着したラットの開口反射を指標として,歯の移動を目的とした矯正力負荷がもたらす疼痛を経時的に定量評価可能な動物モデルを考案し,その妥当性・有効性を検討してきた.本モデルでは,開口反射を誘発する閾値を左右で比較することで疼痛を評価することが可能で,閾値は装置装着後1日目では右側が有意に低く,7日目には左右差が反転するという結果を得ていた(Neuroscience 2014, 2013日本矯正歯科学会:優秀ポスター賞受賞).矯正治療は不正咬合の改善や審美的な要因から求められ,小児から成人まで幅広い年齢層を対象として行われている。矯正処置を開始して間もない時期には,患者の多くは頬粘膜に生じる矯正装置由来のびらんや歯の移動に伴う激しい疼痛を訴える.このような疼痛は,摂食障害を引き起こし,矯正治療継続に対するモチベーションを低下させる原因となるため、明海大学歯学部形態機能成育学講座矯正学分野では,歯の移動に影響を与えない鎮痛薬の探索を目的として系統的に研究を行っている.応募者は,コイルスプリングを門歯と上顎右側の第一臼歯に装着したラットの開口反射を指標として,矯正力負荷がもたらす疼痛を経時的に定量評価可能な動物モデルを考案し,その妥当性・有効性を検討してきた.本モデルでは,上顎両側第一臼歯部歯肉に電気刺激を加え,開口反射を誘発する閾値を左右で比較することで疼痛を評価することが可能で閾値は装置装着後1日目では右側が有意に低く,3日目でほぼ左右差が消滅し,7日目には左右差が反転するという結果を得た。また,矯正力負荷後1-3日間は鼻根部刺激に応答して頭部を回避させる刺激閾値も,左側に比較して右側が有意に減少していることも報告した.そこで、開咬反射閾値と同時に第一大臼歯部は脱灰し薄切標本を作製し,TRAP染色にて破骨細胞浸潤を矯正側と非矯正側で比較し、破骨細胞数の測定を行っている。現在、今年度計画してた実験は終了し、論文投稿準備中である。ラットの上顎両側門歯と上顎右側第一大臼歯(移動歯)をニッケルチタンコイルスプリング矯正装置にて連結し,3050 gの矯正力を負荷する。ラットを矯正装置装着から1日ごとに7日目までの群に分け実験を行った。歯の移動量の定量評価を矯正側ならびに非矯正側で比較した。また、形態学的解析を行うことで,矯正誘発疼痛の強度と歯の移動量,破骨細胞浸潤ならびに三叉神経節活動性変化への薬物投与の影響を同時に検討した。予定したデータはほぼ、収得されたため、おおむね順調に進展していると思われる。矯正治療は不正咬合の改善や審美的な要因から求められ,小児から成人まで幅広い年齢層を対象として行われている。矯正処置を開始して間もない時期には,患者の多くは歯の移動に伴う激しい疼痛を訴える.このような激しい疼痛は,摂食障害を引き起こし,矯正治療継続に対するモチベーションを低下させる原因となる.歯科領域の疼痛管理には酸性非ステロイド性抗炎症薬(NSAIDs)が頻用される.炎症部位で鎮痛・消炎効果を示す.しかしながら,PG類は生体内で様々な機能を持っており,その一つに破骨細胞前駆細胞の分化誘導が挙げられる.つまり,NSAIDsの投与が疼痛緩和とともに破骨細胞の抑制(骨吸収抑制)を引き起こすことから,歯の移動を目的とした治療時にNSAIDsの投与は避けるべきと考えられている.このようなことから,歯の移動時の疼痛管理については有効な手段がなく,患者の苦痛軽減のためにも確立が強く求められている.このような社会的要請に応えるべく,明海大学歯学部形態機能成育学講座矯正学分野では,歯の移動に影響を与えない鎮痛薬の探索・開発を目的として系統的に研究を行っている.実験として、1上顎両側門歯と上顎右側第一大臼歯(移動歯)をニッケルチタンコイルスプリング矯正装置にて連結し,3050 gの矯正力を負荷。2歯の移動量の定量評価:矯正力負荷前と開口反射誘発閾値測定後、ラットの上顎を印象採得し,模型を作成し,左右の上顎第一大臼歯と第二大臼歯間の距離を精密ノギスにて測定.3第一臼歯部を脱灰し10μmの薄切標本を作製し,TRAP染色にて破骨細胞浸潤を矯正側と非矯正側で比較した。初年度の計画として、ラットの上顎両側門歯と上顎右側第一大臼歯(移動歯)をニッケルチタンコイルスプリング矯正装置にて連結し,3050 gの矯正力を負荷する。ラットを矯正装置装着から1日ごとに7日目までの群に分け,以下の実験に用いる。

歯の移動量の定量評価:矯正力負荷前と開口反射誘発閾値測定後(矯正力負荷1,3,7日後)のラットの上顎を印象採得し,模型を作成し,左右の上顎第一大臼歯と第二大臼歯間の距離を精密ノギスにて測定する.次年度以降の計画として、第一臼歯部を脱灰し10μmの薄切標本を作製し,TRAP染色にて破骨細胞浸潤を矯正側と非矯正側で比較する.生理学的・薬理学的検討の結果を中心に国内学会の他にIADRなどの国際学会への参加ならびに国際科学誌(Journal of OrthodonticsとJournal of Dental Researchなど)への投稿を行う予定であった。これらの実験計画はほぼ、予定通りに進行し、2017年度、国外学会紙への投稿・受理となった。矯正治療は国民のデンタルIQ向上に伴い症例数が増加している.また,矯正装置や理論の進歩から矯正期間短縮などがもたらされ,患者満足度も向上している.しかし歯の移動には、個人差はあるが疼痛は存在する.我々は歯の移動時に生じる疼痛の管理方法の確立を目的とし,矯正力に由来する疼痛強度を定量評価可能な動物モデルを作製しその妥当性を確認してきた。本申請では,研究を更に進め,本モデルを用いた新規疼痛管理薬物の探索ならびに矯正力負荷で生じる侵害受容機構の変化を明らかにすることを目的としてきた.以前より,コイルスプリングを門歯と上顎右側の第一臼歯に装着したラットの開口反射を指標として,歯の移動を目的とした矯正力負荷がもたらす疼痛を経時的に定量評価可能な動物モデルを考案し,その妥当性・有効性を検討してきた.本モデルでは,開口反射を誘発する閾値を左右で比較することで疼痛を評価することが可能で,閾値は装置装着後1日目では右側が有意に低く,7日目には左右差が反転するという結果を得ていた(Neuroscience 2014, 2013日本矯正歯科学会:優秀ポスター賞受賞).本申請の研究は,電気生理学的検討ならびに解剖学的検討ともに,本学歯学部矯正学分野の須田直人教授と薬理学分野の安達一典准教授の指導・協力のもとで進められる。同准教授の研究室では,筋電図採取の実験ならびに軟硬組織の形態観察を大学院生や専攻生が行っており,彼らの協力も得て効率よく研究を進める。前年度に引き続き,電気生理学的検討と解剖学的検討を効率よく進める.新規治療薬の探索には上記の他に,PG産生に影響を与えない鎮痛薬としてボツリヌス毒素Aならびに(+)-naloxoneを候補物質として使用する.いずれの薬物もコイルスプリング装着直後から投与を開始し,その効果を前出の方法で生理学的・解剖学的評価を行う.新たな検討方法を模索し、国際学会で発表予定である。また、研究は,電気生理学的検討ならびに解剖学的検討ともに,本学歯学部矯正学分野の須田直人教授と薬理学分野の安達一典教授の指導・協力のもとで進められる。同教授の研究室では,筋電図採取の実験ならびに軟硬組織の形態観察を大学院生や専攻生が行っており,彼らの協力も得て効率よく研究を進める予定である。実験計画よりも物品費用が少なかった。計画していた実験数に達しなかったことが大きな理由である。実験計画よりも物品費用が少なくなった。若干ではあるが、予定よりも実験を行う回数が少なかったことが考えられる。今年度の計画を次年度に持ち越して行う。
コーポレートガバナンス改革と企業内労働市場

この研究では経営者に対する「報酬の支払い方」が重要かどうかを分析した。経営者の報酬と企業の業績の関係を計測した。この関係の高い企業と低い企業の業績を比較した。エージェンシー理論によると、報酬-業績関係の高い企業では経営者の努力インセンティブが高いため、企業の業績も向上する。日経225インデックスに含まれる非金融企業210社の1993年から1995年までのデータをサンプルとして実証分析を行った。ランダム効果プロビットモデルを用いて、報酬-業績関係を強化した企業の業績が向上したかどうかという分析をした。この実証分析ではこのような関係を確認することはできなかった。すなわち経営者への報酬の支払い方と業績の間には有意な関係はなかった。経営者の労働市場が、外部労働市場ではなく企業内労働市場と密接な関係があるという考え方と、この結果は整合的である。さらに1部上場企業を対象に、役員報酬と従業員賃金の関係を分析した。日本企業の役員報酬にはいくつかの特徴がある。第一に、多くの役員は、従業員から選別され、昇進して役員になっている。多くの従業員にとって役員に昇進することが目標となっている。役員報酬は、昇進した従業員に対する賞与という側面をもっている。昇進することで高い役員報酬を得られると考える従業員は、昇進するために努力するであろう。もう一つは、役員報酬と従業員賃金には多くの類似点があるという点である。従業員の賞与も役員賞与も企業利益と強い相関がある。これらの点から、役員報酬と従業員賃金の間に強い関係があると思われる。東京証券取引所1部上場企業を対象に、操作変数法を用いた分析によると、経営者の報酬と従業員賃金の間に有意で正な関係が観察された。これらの結果から、目本の経営者のインセンティブは内部労働市場と密接な関係を持っていることが明らかにされた。この研究では最近の日本における取締役改革と経営者のインセンティブの関係を分析することが目的である。特に、取締役改革が実際にどのように行われているのか、またどのような会社がこのような改革を行っているのか、経営者はどのようなインセンティブをもってこのような改革を行っているのかを分析している。平成15年には、まず、上場企業を中心に、さまざまな企業のコーポレートガバナンスに関する情報を収集することを中心に行った。特に、ここでは経営者のインセンティブに関する情報を収集した。経営者のインセンティブについては電子的なデータベースでは入手不可能なものもあるため、過去の有価証券をあたって、必要な情報を収集しデータとして整理を行った。また、実際に経営者のインセンティブを分析するために、企業の業績と役員報酬との関係のデータを整理し、簡単な分析を開始している。具体的には、業績の変化に対しての役員報酬の感応度を計測を行った。すなわち、企業価値を上昇させた経営者は、どのくらいの額の報酬をそれによって得ているのか、という分析である。この関係の計測に関しては、パネルデータ分析、ロバスト回帰などさまざまな手法を用いている。また、時系列的な変化を追うため過去にさかのぼってデータを構築することも継続中である。役員報酬の研究の問題点として、日本においては最高経営責任者の報酬額が公表されていないということが指摘されている。そこで、取締役会の構成およびその他の情報から、最高経営責任者の報酬を推定した。このことにより、最高経営責任者のインセンティブをより正確に把握できること、諸外国との研究との直接的な比較が可能となった。
パーキンソン病モデルラットを用いた睡眠障害メカニズムの解明

パーキンソン病は、特徴的な運動障害を示すが、殆ど全ての患者で睡眠障害を伴う事が報告されている。特に日中の過度の眠気や睡眠発作は、パーキンソン病の治療薬を服用する事で増悪する。このような睡眠障害は、生命に関わる重大な事故に繋がる可能性が極めて高く、非常に重要な臨床症状である。それにも関わらず、運動障害に比べ睡眠障害の原因については、依然として不明な点が多い。そこで本年度は、昨年度検討した薬剤投与量及び投与方法を用いて、パーキンソン病発症モデルラットの作製を試み、モデルの有用性を検討した。まず、ロテノンを埋め込み式ポンプにより持続投与を行い、体重及び行動量の変化を測定した。ロテノン投与群は、投与開始10日前後から体重及び行動量の減少が認められたが、大きな個体差が見られた。一部の個体では、急激な体重減少の開始後数日で死亡した。また、体重及び行動量の急激な減少が認められた個体では、埋め込み式ポンプの除去後、体重及び行動量が回復したことから、ロテノンの急性毒性によるものである可能性が高い。一方、4週間の持続投与で生き残った個体では、体重、行動量の緩やかな減少の後に動作緩慢と寡動の症状を示した。コントロール群では、体重及び行動量の減少と異常行動は認められなかった。さらに脳の凍結切片を作製し、抗チロシン水酸化酵素(TH)抗体を用いて中脳黒質のドーパミン産生細胞の障害を検討したところ、4週間の持続投与で生き残った個体では、TH陽性細胞数の著しい減少が認められた。一方、急激な体重減少を引き起こした個体では、TH陽性細胞数はコントロール群と比較して、有意な差は認められなかった。以上のことから、睡眠測定を行うには4週間の持続投与で生き残った個体のみを用いる必要があり、今後これらパーキンソン病発症モデルラットを用いて睡眠解析を行う予定である。このような睡眠障害は、生活の質を著しく下げるだけでなく、生命に関わる重大な事故に繋がる可能性が極めて高く、非常に重要な臨床症状である。そこで本年度は、パーキンソン病の睡眠障害メカニズムを解明するのに有用なモデルラットをより効率的に作製するために、以下の研究を行った。まず、パーキンソニズムを引き起こすロテノンの溶媒組成を検討した。一般的に多くの文献で、DMSOとPEG(50:50)の混合液を溶媒として用いているが、多量のDMSO投与が睡眠量に影響を与える事が報告されている。そこで、各種組成を作製して、持続投与用の埋め込み式ポンプに注入可能かつロテノンを溶解できる最適な組成を決定した。次に、ポンプの流速を決定するために、生体に近い環境(37°C、生食水)でポンプを作動させ、ロテノン溶液が正確に送液される流速を検討した(2.5ul/hr, 3.8ul/hr, 5ul/hr)。その結果、いずれの流速でも、チューブ先端にロテノンの析出が見られたが、流速5ul/hrで最も正確に送液することを確認した。そこで、実際にパーキンソン病様症状をラットで再現するために、ラットの背部にポンプを埋め込み、持続投与(3mg/kg/day, 4weeks)を行った。その結果、流速5ul/hrで投与した個体でパーキンソン病様の症状を示した。一方、2.5ul/hrで投与した個体では、チューブ先端の詰まりにより十分な送液ができず症状を再現できなかった。今後は、これらのモデルラットを用いて薬剤の投与及び睡眠解析を行う予定である。

一方、急激な体重減少を引き起こした個体では、TH陽性細胞数はコントロール群と比較して、有意な差は認められなかった。以上のことから、睡眠測定を行うには4週間の持続投与で生き残った個体のみを用いる必要があり、今後これらパーキンソン病発症モデルラットを用いて睡眠解析を行う予定である。
地球物理への応用

重力波検出を目指して集約された極限計測技術を地球物理学の分野に応用し、従来のレーザーひずみ計よりも23桁精度の高い10^<-13>の桁の分解能を有する(1)Michelson型レーザー直線ひずみ計と(2)直交2軸の直線ひずみの差を検出するせん断ひずみ計を開発するとともに凹面鏡2枚を用いて100mのFabry-Perot干渉計を構成し、電気光学変調器によりレーザー光の出力に変調側波帯を発生させ、基線長の絶対値を可変水晶発振器の周波数にロックさせることにより、基線長の距離変化を10^<-9>の桁の分解能で計測できる(3)絶対ひずみ計を開発した。これらのレーザーひずみ計システムを東京大学宇宙線研究所神岡宇宙素粒子研究施設の神岡鉱山内の地下実験施設に設置して、地球の自転振動の常時励起や地球潮汐日周潮帯に現れる流体核共鳴効果の定量的な検証をおこなうとともに、跡津川断層系の地殻変動の時間的変化を高精度でモニタリングし、活断層周辺で発生する地震と地殻変動との時間的変化の関係を明らかにしつつある。平成17年度は、(1)と(2)のシステムで得られた観測データに基づき、台風通過に伴うひずみ変化の解析を行ったほか、2004年12月26日に発生したスマトラ沖地震前後のデータを解析し、10^<-9>の桁のストレイン・ステップを検出した。さらに、潮汐にずみ変化に関して、観測データにBAYTAP-Gプログラムを適用して得られた観測結果とGOTIC2プログラムから得られた理論的な予測値の間にみられる1020%の差は、観測室周辺の地形影響によってひきおこされていることを3次元有限要素法を用いて明らかにした。重力波検出を目指して集約された極限計測技術を地球物理学の分野に応用し、従来のレーザーひずみ計よりも23桁精度の高い10^<-13>の桁の分解能を有するMichelson型レーザー直線ひずみ計と直交2軸の直線ひずみの差を検出するせん断ひずみ計を開発するとともに、凹面鏡2枚を用いて100mのFabry-Perot干渉計を構成し、電気光学変調器によりレーザー光の出力に変調側波帯を発生させ、基線長の絶対値を可変水晶発振器の周波数にロックさせることにより、基線長の距離変化を10^<-9>の桁の分解能で計測できる絶対ひずみ計を開発する。これらのレーザーひずみ計システムを東京大学宇宙線研究所神岡宇宙素粒子研究施設の神岡鉱山内の地下実験施設に設置して、地球の自由振動の常時励起や地球潮汐日周潮帯に現れる流体核共鳴効果の定量的な検証を行うとともに、跡津川断層系の地殻変動の時間的変化を高精度でモニタリングし、活断層周辺で発生する地震と地殻変動との時間的変化の関係を明らかにする。平成14年度前半に神岡鉱山内に直交100mのL字型観測坑道が新たに掘削されたが、観測坑道の掘削が終了し、坑道内塗装工事が始まる前の短いタイミング(平成14年8月下旬)をねらって、坑道内弾性波探査を実施した。坑道内約20m毎に10ヶ所に地震計を設置し、4ヶ所で小規模発破を実施した。その結果、Vp=5.49km/s、Vs=3.10km/sの値が得られた。平成14年11月には、地球物理用レーザー干渉計の台石(花崗岩製80×80×60cm)の据付工事、平成15年2月には真空配管及び真空槽の設置を行った。また、購入したレーザー発振器(532nm,50mW)の波長をヨウ素の吸収線を基準に安定化し、光学系のテストを行い、平成15年3月に現地搬入を行った。さらに、京都大学防災研究所上宝観測所の地震及び地殻変動観測データの収集を行った。重力波検出を目指して集約された極限計測技術を地球物理学の分野に応用し、従来のレーザーひずみ計よりも23桁精度の高い,10^<-13>の桁の分解能を有する(1)Michelson型レーザー直線ひずみ計と(2)直交2軸の直線ひずみの差を検出するせん断ひずみ計を開発するとともに、凹面鏡2枚を用いて100mのFabry-Perot干渉計を構成し、電気光学変調器によりレーザー光の出力に変調側波帯を発生させ、基線長の絶対値を可変水晶発振器の周波数にロックさせることにより、基線長の距離変化を10^<-9>の桁の分解能で計測できる(3)絶対ひずみ計を開発する。このうち、(1)と(2)は平成14年度に設置が終了し、平成15年度のはじめに調整を行い、平成15年度6月11日にデータ取得が開始された。得られたデータは地震波帯域、潮汐帯域ともにきわめて質の高いデータが得られており、これらのデータの蓄積を待って、地球内部ダイナミクスの研究が大幅に進展すると期待できる。また、(3)は平成16年3月に設置され、現在調整を続けている。

重力波検出を目指して集約された極限計測技術を地球物理学の分野に応用し、従来のレーザーひずみ計よりも23桁精度の高い10^<-13>の桁の分解能を有する(1)Michelson型レーザー直線ひずみ計と(2)直交2軸の直線ひずみの差を検出するせん断ひずみ計を開発するとともに、凹面鏡2枚を用いて100mのFabry-Perot干渉計を構成し、電気光学変調器によりレーザー光の出力に変調側波帯を発生させ、基線長の絶対値を可変水晶発振器の周波数にロックさせることにより、基線長の距離変化を10^<-9>の桁の分解能で計測できる(3)絶対ひずみ計を開発する。これらのレーザーひずみ計システムを東京大学宇宙線研究所神岡宇宙素粒子研究施設の神岡鉱山内の地下実験施設に設置して、地球の自由振動の常時励起や地球潮汐日周潮帯に現れる流体核共鳴効果の定量的な検証を行うとともに、跡津川断層系の地殻変動の時間的変化を高精度でモニタリングし、活断層周辺で発生する地震と地殻変動との時間的変化の関係を明らかにする。平成16年度は、(1)と(2)のシステムで得られた東西方向及び南北方向の潮汐ひずみ変化の解析を行い、観測データにBAYTAP-Gプログラムを適用して得られた観測結果とGOTIC2プログラムから得られた理論的な予測値の間にみられる1020%の差は、観測室周辺の地形影響によつてひきおこされていることを3次元有限要素法を用いて明らかにした。また、台風通過に伴う10^<-8>オーダーの微小なひずみ変化を見出した。重力波検出を目指して集約された極限計測技術を地球物理学の分野に応用し、従来のレーザーひずみ計よりも23桁精度の高い10^<-13>の桁の分解能を有する(1)Michelson型レーザー直線ひずみ計と(2)直交2軸の直線ひずみの差を検出するせん断ひずみ計を開発するとともに凹面鏡2枚を用いて100mのFabry-Perot干渉計を構成し、電気光学変調器によりレーザー光の出力に変調側波帯を発生させ、基線長の絶対値を可変水晶発振器の周波数にロックさせることにより、基線長の距離変化を10^<-9>の桁の分解能で計測できる(3)絶対ひずみ計を開発した。これらのレーザーひずみ計システムを東京大学宇宙線研究所神岡宇宙素粒子研究施設の神岡鉱山内の地下実験施設に設置して、地球の自転振動の常時励起や地球潮汐日周潮帯に現れる流体核共鳴効果の定量的な検証をおこなうとともに、跡津川断層系の地殻変動の時間的変化を高精度でモニタリングし、活断層周辺で発生する地震と地殻変動との時間的変化の関係を明らかにしつつある。平成17年度は、(1)と(2)のシステムで得られた観測データに基づき、台風通過に伴うひずみ変化の解析を行ったほか、2004年12月26日に発生したスマトラ沖地震前後のデータを解析し、10^<-9>の桁のストレイン・ステップを検出した。さらに、潮汐にずみ変化に関して、観測データにBAYTAP-Gプログラムを適用して得られた観測結果とGOTIC2プログラムから得られた理論的な予測値の間にみられる1020%の差は、観測室周辺の地形影響によってひきおこされていることを3次元有限要素法を用いて明らかにした。
ヘリウムイオン顕微鏡による単電子トランジスタの作製

200nmの厚さの窒化シリコン薄膜(メンブレン)上にヘリウムイオン顕微鏡により(1)ソース・ドレン細線(ナノワイヤ)を形成できること、(2)その細線をヘリウムイオン顕微鏡で加工することで(細線の二カ所をヘリウムイオン照射により切断することで)クーロン島形状を形成できることを確認した。その後、ソース・ドレン細線の電流電圧特性を調べたところ、昨年度まで形成できていた金属的細線ができないことがわかった(形成された細線は絶縁体であった)。その原因はプレカーサーガスのガス切れと考えられる。そのため、ヘリウムイオン顕微鏡の所有・管理を行っている機関にタングステンカルボニール[W(CO)6]の詰め替えを依頼したが、その機関から詰め替えができない趣旨の回答があり、その機関での細線の形成を断念した。また、国内にはヘリウムイオン顕微鏡を保有する機関がその他に2機関あることから、その2機関にタングステン細線の形成ができないか打診した結果、どちらの機関も形成できないことがわかった(一方の機関はタングステン細線形成に未対応、もう一方の機関はガスインジェクションシステム故障中)。そのため、アメリカのヘリウムイオン顕微鏡の製作販売会社にタングステン細線の形成を打診したが、細線を形成するサービスを行っていないとの回答を得た。そのため、研究実施計画の大幅な変更をせざるを得なかった。形成できる細線の太さがヘリウムイオン顕微鏡ほど細くはないものの所望の位置にタングステン細線を形成できるFIB(集束イオンビーム)により細線を作製し、その細線の電流・電圧特性、及び超伝導特性を測定した。電流・電圧特性はヘリウムイオン顕微鏡で形成した細線とほぼ同様であること、および転移温度が約4.7Kであることがわかった。ナノワイヤの応用(単電子トランジスタ化)を見据えて、前駆体として鉄カルボニールガスを用いて電子ビーム誘起デポジションで作製した鉄ナノワイヤの許容電流密度(電気特性)をヘリウムイオン顕微鏡内でスイープ電流を増加させながら繰り返し電流・電圧特性を測定することによって求めた。ナノワイヤがブレークダウンする直前に流れた電流値は217μAであった。ナノワイヤのブレークダウンの理由はナノワイヤがブレークダウンした直後のヘリウムイオン顕微鏡の観察から、ナノワイヤの溶融と考えられる。また、単位断面積あたりの許容電流を計算するためにはナノワイヤの断面積の情報が必要になることから、原子間力顕微鏡によってナノワイヤの形状及びナノワイヤの高さを計測した。その結果、電子ビーム誘起デポジションで作製したナノワイヤの断面形状はガウシアン及び高さは16.9nmであることがわかった。また、ナノワイヤの幅に関しての情報はヘリウムイオン顕微鏡の観察によって求めた。その結果、ナノワイヤの幅は11.0nmと求められた。以上のことから、鉄ナノワイヤの単位面積あたりの許容電流は4.7e7[A/cm2]とかなり大きな値であることがわかった。さらに、鉄ナノワイヤをヘリウムイオン顕微鏡によって単電子トランジスタ構造を作製し、室温で電流ー電圧特性を測定した結果、クーロンブロッケードと考えられる電流ー電圧曲線が観察された。上記の結果から電子ビーム誘起デポジションで作製したナノワイヤを用いて単電子トランジスタを作製できる可能性が十分にあると考えらる。物質・材料研究機構のヘリウムイオン顕微鏡が昨年1月から11月まで故障していた。及び、ヘリウムイオン顕微鏡の加工の再現性は照射量の制御で非常によいものと考えられていたが、ビーム径が毎回違っていることから、再現性よく加工することが難しい。物質・材料研究機構のヘリウムイオン顕微鏡の修理が終わったことから、利用可能となった。また、ナノワイヤをin-situで電気特性を調べつつ加工を行う方策をとることとした。

国立研究開発法人物質・材料研究機構のヘリウムイオン顕微鏡が平成28年4月(詳しくは平成28年1月)より11月まで故障のためヘリウムイオン顕微鏡の使用ができなかった。そのため、ガスインジェクションシステムを用いてナノワイヤの作製が遅れた。それによりヘリウムイオン顕微鏡のヘリウムイオンビームあるいはネオンイオンビームを用いてナノワイヤに障壁を製作できなかったことから、次年度使用額が生じた。国立研究開発法人物質・材料研究機構のヘリウムイオン顕微鏡の故障も平成28年11月より直ったことから、できるだけ次年度に単電子トランジスタ作製を試みる。時間が不足した場合、動作温度の高温化の研究は次期計画とすることも考える。
家畜の卵胞発育に関する内分泌学的機序-特にFSHとインヒビンの関連について

本研究によって得られた成果は以下の通りである。1.ブタとウシの卵胞液からのインヒビンの純化に成功した。2.ブタとウシのインヒビンの抗体を作成し、その抗体を用いてブタ、ラット、ウシ、ヤギとヒトのインヒビンのRIA系を確立した。3.ブタやラットのような多胎動物の性周期においては激しいインヒビンの変動が見られた。すなわち、卵胞期においてインヒビンの分泌は亢進し、その結果血中のFSH濃度は徐々に減少した。成熟卵胞が排卵すると血中のインヒビンは急速に減少し、いわゆるFSHのセカンドサージが誘導された。この排卵後のサージは次回の排卵卵胞の発育にとって重要であると考えられているがその分泌調節機序は不明であった。しかしながら本研究により末梢血中のインヒビン動態が明らかにされることにより、FSHのセカンドサージはインヒビンにより直接支配されていることが示唆された。4.単胎や双胎のウシや山羊においてもFSHのセカンドサージのあることを初めて明らかにした。これらの動物のFSHのセカンドサージもインヒビン分泌の減少に伴って起こっていた。5.ヒトの月経周期中のインヒビンの分泌パターンは前記の哺乳動物とは異なっていた。つまり卵胞期にインヒビンは漸増し、FSHは逆に減少するが、排卵後一時的に下ったインヒビンは再び上昇し、黄体期にインヒビンの大量放出が見られる。この黄体期のインヒビンは黄体から分泌されていた。6.インヒビンの分泌と作用機序についても培養顆粒膜細胞や下垂体細胞を用いて検討し新たな知見を得た。さらにアクチビンのレセプターが顆粒膜細胞に存在し、アクチビンが卵胞の発達やステロイド産生に重要な役割を果たしていることを明らかにした。本研究の補助金により本研究課題の目的は達成することができた。1985年から1986年にかけて、我々の研究グループと他の2,3ケ所でほぼ同時に豚と牛の卵胞液中のFSH分泌抑制物質,インヒビンの精製に成功した。ついで遺伝子工学的手法を用いて化学構造の全容が明らかにされた。その化学構造はαとβ鎖の二本鎖から成り、その構造内にproteaseにより特異的に切断される部位を内在しているために、分子量的にも多様性がある。このように複雑な分子形態を有するインヒビンを大量に精製することは容易ではなく、それらの抗体を作成するに充分な量を得ることは、殆んど不可能であった。しかしながら、我々の研究により以下のような成果を得ることができた。1.従来から通常使用されている分離方法と異なるアフィニティークロマト,8モル尿素を含んだ緩衝液,逆相のHPLCを用いることにより、収率よく豚と牛のインヒビンを得ることができた。2.豚インヒビンの純品を家兎とニワトリに免疫し、抗体を作成することに成功した。3.この抗体を用いて末梢血中レベルのインヒビンの測定可能な、高感度のRIA系を確立した。4.豚インヒビンの抗体とラットインヒビンの交差を利用してラットのインヒビンのRIA系を確立した。5.牛インヒビンの純品を用いて単クローン抗体を作成した。その抗体によりimmunoaffinityクロマトを行い大量の精製牛インヒビンを得ることができた。6.精製牛インヒビンを家兎に免疫し多クローン抗体を作成した。

7.この牛インヒビン抗体を用いて牛の末梢血中インヒビンの測定可能な高感度のRIA系を確立した。これらのRIA系を用いて、豚,牛およびラットにおける血中のインヒビンの動態を解析することが可能となった。次年度において明らかにしたい。本研究費の補助金により上記の実験のような充分な成果を挙げることができた。昨年においてウシとブタのインヒビンに対する抗体を作成した.この抗体を用いて本年度はウシ,ブタのインヒビンはもとよりラット,ヤギとヒトのインヒビンの血中レベルの変動を明らかにすることに成功した.ブタのインヒビンのRIA系を用いてラットのインヒビンの測定が可能であった.性周期中の末梢血中のインヒビンを測ったところ興味深い結果を得た.排卵前のGTHの放出後のFSHの,カンドサージは末梢血中のインヒビンの減少によることが明らかとなった.さらにその後においても,基底レベルのFSHの変動はインヒビンの変動と逆相関を示してした.ブタのFSHの分泌はラットよりさらにインヒビンとの関連が深いことが明らかとなった.つまり卵胞期のインヒビンの上昇に伴いFSHは抑制され, LHのサージ期には殆んどFSHの上昇は見られず,排卵時にインヒビン濃度が減少することによってFSHの値は頂値を示した. .またヤギにおいて排卵期のインヒビンの上昇によりFSHは抑制され, GTHサージ後排卵に伴うインヒビンの減少によりFSHのセカンドサージが誘起された.これらのインヒビンとFSHの変動は多胎動物において非常に似たパターンを示すことから,多排卵のメカニズムインヒビンが深くかかわっていることが示唆された.一方,単胎動物であるウシやヒトの性周期中のインヒビンの分泌パターンは多胎動物のそれとは異なるパターンを示していた.卵胞期に卵胞が発育するに従いインヒビン濃度は上昇した.このインヒビンの上昇によりヒトとウシのFSHはゆるやか抑制された. GTHのサージ後インヒビン濃度は一過性に減少し,ウシにおいては小さなFSHのセカンドサージが見られたが直ちに増加するインヒビンにより抑制された.ヒトにおいてはさらに黄体期においても顕著なインヒビンの分泌が起こりFSHの放出を完全に抑制した.単胎唐物の黄体期のインヒビンの上昇は卵胞発育の抑制機構に関与していると思われる.本年度は主に前年度までの研究成果をまとめ論文及び著書として出版した。また国の内外のシンポジウムに招待され我々の成果を広く発表することができた。また本研究の成果に対して、家畜繁殖学会より島村賞を授与された。2.昭和63年3月日本畜産学会において長谷川は「牛の性周期中の血中インヒビンの変動」について発表した。3.昭和63年4月家畜繁殖学会において長谷川は「インヒビンの微量測定法の開発とその応用」と題する学会賞受賞講演を行なった。5.昭和63年10月日本内分泌学会の秋期大会において「新しい性線の調節因子」と題するシンポジウムにおいて長谷川は「卵巣性インヒビンの生理作用」について話題提供を行なった。さらに別紙のように本年度発表した原著論文は既に6編を数え、総説が4編発表された。また既に印刷中の論文と総説が5編と3編ある。これらの研究発表により私共の研究成果が充分に広まると共に、インヒビンの生殖生理学における重要性が認められた。
中国のトキソプラズマの系統学及び病原性の解析

トキソプラズマの中国株については、分泌型病原性因子に着目して解析した。既知の病原性因子の配列を中国分離株とI/II/III型株の間で比較した。またB6由来のマクロファージに原虫を感染させ、LPSなどTLRリガンドによる炎症性サイトカインの産生を抑制されたことから、ROP16が原因候補遺伝子であると考えられた。また高病原性I型原虫のようにIFNγ刺激により原虫数が低下しなかったことから、ROP5, ROP17, ROP18やGRA7が原因遺伝子候補として挙げられ、マクロファージ感染における免疫学的解析から調べる病原性因子を絞り込bんだ。この結果、それらの配列はI型原虫であることが分かった。さらに、I型あるいはII型由来のROP16、ROP18、GRA6、GRA15、GRA16, GRA24は宿主因子であるStat3, ATF6β, NFAT4, NFκB, p53, p38にそれぞれ活性化あるいは不活化することが分かっているため、中国分離株のマクロファージ感染によって、それらの宿主転写因子・シグナル伝達分子の活性化(核移行・リン酸化)や不活化(分解)などをウェスタンブロット法やIFAにより検討した。さらに転写因子の活性化に影響がある病原性因子については、中国分離株の病原性因子を哺乳類細胞用の発現ベクターに組み込み、哺乳動物細胞である293T細胞に過剰発現させ、転写因子依存的なルシフェラーゼレポーターを使用した機能アッセイにより、決定的な塩基配列多型によるアミノ酸置換・欠損変異を検討した結果、I型原虫で見られた変異に最も近いことが分かった。平成29年度が最終年度であるため、記入しない。本研究は、日本に向けて非常に多くの食肉を生産している中国におけるトキソプラズマ原虫の遺伝的クレードを解析することにより、特異的な遺伝子変異と病原性因子を同定することを目的としている。該当年度は、中国の共同研究先で中国固有のトキソプラズマ原虫株よりDNAを単離し、送られてきたDNAサンプルを用いて解析を行った。ゲノム配列を読む前に送付されてきたDNAの原虫DNA純度について検討したところ、大量の宿主由来DNAが混在しており、このような状況ではトキソプラズマ原虫由来のDNA配列を読むことは困難であったため、まずトキソプラズマ原虫DNAの純度を上げるための条件検討を中国の共同研究先と話し合った。トキソプラズマ原虫は細胞内寄生生物であることから、宿主細胞の混入は必然であるが、培養細胞で増殖が可能であれば混入を軽減できると考え、培養細胞を用いた原虫増殖系を検討した。しかし、現在他の実験に使用しているトキソプラズマ原虫株の培養細胞で増える諸条件では中国特有株は増殖せず、また、様々な培養条件を検討しても中国特有株は培養細胞を用いた系では増殖させることができなかった。そこで、培養細胞での増殖を諦め、マウス生体内での増殖に変更した。中国固有トキソプラズマ原虫である2株のうち、1株は免疫系が低下しているマウスでないとマウス腹腔内で増殖できなかったことから、野生型マウスでも腹腔内で増殖することのできる1株を用いて、マウス生体内でトキソプラズマ原虫を増やし、より純度の高い原虫DNAを得られる系の構築を試みる。当初の計画では中国の共同研究者から送られてくるDNAを直接ゲノム解析に使用できると考えていたが、実際は宿主由来の染色体量がトキソプラズマ原虫の染色体量よりも膨大なため、ごくわずかな宿主細胞の持ち込みでもトキソプラズマ原虫DNA量と同等もしくはより多くのDNA量となってしまうことが明確となり、トキソプラズマ原虫DNAの精製度の向上が強く求められている。該当年度は中国特有のトキソプラズマ原虫のマウス生体内からの高純度での精製方法の確立を行った。中国側の報告からマウス腹腔内での増殖が可能であった株を、マウス腹腔内に投与し、感染数日後腹腔内に増殖しているトキソプラズマ原虫を回収した。この回収液には宿主由来の細胞も多数含まれていることから、超遠心分離方等を駆使してトキソプラズマ原虫と宿主由来細胞を可能な限り分離し、このゲノムDNAを日本に送付してもらった。得られたゲノムDNAはトキソプラズマ原虫由来のDNAが98%と非常に高純度に含まれていたことから、次世代ゲノムシークエンサーであるPacBioとMiSeqにこのゲノムDNAをかけ、中国特有株のゲノム配列の同定を試みた。二つの次世代ゲノムシークエンサーの結果から、現在300ほどのコンティグにまでゲノム配列を絞り込むことに成功しているが、これまでに報告されているトキソプラズマ原虫のゲノムは大抵が16コンティグであるため、中国特有株も16コンティグであることが想定される。さらにコンティグを減らすためには、より多くのゲノムDNAを用いてPacBioを行うことが必須であり、より多くのゲノムDNAを得るためにサンプルを増やしている。昨年度に計画の変更を行ったが、試行錯誤の結果トキソプラズマ原虫由来のゲノムDNAをある程度の純度で得られる実験系に到達できたため、この条件でDNAを単離し、PacBioシークエンサーを用いて、ゲノム配列の同定を試みることができたため。

既知の病原性因子の配列を中国分離株とI/II/III型株の間で比較した。またB6由来のマクロファージに原虫を感染させ、LPSなどTLRリガンドによる炎症性サイトカインの産生を抑制されたことから、ROP16が原因候補遺伝子であると考えられた。また高病原性I型原虫のようにIFNγ刺激により原虫数が低下しなかったことから、ROP5, ROP17, ROP18やGRA7が原因遺伝子候補として挙げられ、マクロファージ感染における免疫学的解析から調べる病原性因子を絞り込bんだ。この結果、それらの配列はI型原虫であることが分かった。さらに、I型あるいはII型由来のROP16、ROP18、GRA6、GRA15、GRA16, GRA24は宿主因子であるStat3, ATF6β, NFAT4, NFκB, p53, p38にそれぞれ活性化あるいは不活化することが分かっているため、中国分離株のマクロファージ感染によって、それらの宿主転写因子・シグナル伝達分子の活性化(核移行・リン酸化)や不活化(分解)などをウェスタンブロット法やIFAにより検討した。さらに転写因子の活性化に影響がある病原性因子については、中国分離株の病原性因子を哺乳類細胞用の発現ベクターに組み込み、哺乳動物細胞である293T細胞に過剰発現させ、転写因子依存的なルシフェラーゼレポーターを使用した機能アッセイにより、決定的な塩基配列多型によるアミノ酸置換・欠損変異を検討した結果、I型原虫で見られた変異に最も近いことが分かった。中国の共同研究者とより密に連絡を取り、宿主細胞の混入を可能な限り減少させてトキソプラズマ原虫のゲノムDNAを単離・精製する方向を模索する。トキソプラズマ原虫由来のゲノムDNAに対してPacBioならびにMiSeqといった次世代シークエンサーを用いて、ゲノム配列の同定を試み、300余りのコンティグにまで現在絞り込めているが、より絞り込むためにはより多くのトキソプラズマ原虫由来のゲノムDNAが必要である。より多くのトキソプラズマ原虫由来のゲノムを単離・精製し、再度PacBioシークエンスを行うことにより、16コンティグまで絞り込み、中国特有株の全ゲノム配列の同定を試みる。平成29年度が最終年度であるため、記入しない。
胎児期からの母子コミュニケーション-胎内聴覚環境とクロスモダル知覚の比較研究

ヒトの妊娠中期後期にかけて母親声に対する行動反応の増加および心拍数の増加のあることを確認した。これらの指標の利用によって胎児の聴覚経験と「母親」的な刺激の識別,出生後のクロスモダル知覚の関連を問う基盤ができた。また,胎児期-新生児-乳児のクロスモダル知覚の種差を検討するうえで参照すべきヒトとチンパンジーの脳機能発達にかかわる共通性およびヒトに独自な特徴を把握することができた。本研究では、胎児-新生児期の視聴覚世界の研究に比較認知発達研究の視点と方法を導入し、主として以下の4点を明らかにすることを目的として進めている。(1)胎児は母親の声をそれ以外の声や音と識別することがわかっているが、声によって表現される母親の感情も識別することができるか。(2)母親の声の識別は、胎外から届く声のうち母親の声の頻度が圧倒的に多いことが原因と考えられるが、母親以外の他者(父親や祖母)の声が頻繁に聞こえる日常生活があれば、これらの声の識別も生じるか。(3)胎児期に識別の生じた対象には、出生後に聴覚-視覚のクロスモダル知覚が生じるか。(4)以上で明らかになる胎児-新生児期の視聴覚特性の発達は、ヒトにもっとも近縁なチンパンジーとどのように共通し、どのように異なるか。視覚の未だ十分に機能しない出生まで、胎児にとって「聴くこと」が、胎外からの情報を取得するうえでもっとも重要な活動となる。本研究では、胎児期の聴覚経験と出生後のクロスモダル知覚との関連を検討する。本年度は、第一段階として、胎児の身体運動や表情を、4次元超音波画像診断装置(4Dエコー)を用いて観察し、妊娠中期20週以降を対象として、母親声と他人声を聞かせて各音声刺激に対する行動的反応(口の開閉)と心拍を測定した。現往、資料収集を継続中である。また種比較資料の収集のため、チンパンジーについても、妊婦3個体の胎児の発達を、4次元超音波画像診断装置(4Dエコー)を用いて観察した。1個体では胎齢22週から、もう1個体では胎齢9週から、最後の1個体では胎齢4週から4Dエコーを用いた観察を開始した。これによって得られた結果をヒトの胎児の知見と比較した。その結果、身体成長に関しては、受精後16週齢頃までチンパン.ジーとヒトの成長速度はほぼ同じであり、その後徐々に差が生じてチンパンジー胎児の方が相対的に小さくなった。運動に関しては、チンパンジー胎児においても、口を開閉する、手を口に入れる、手や足で別の手や足を握る、手指を細かく動かすなどの行動が見られ、こうした行動の初出時期はヒトの胎児とほぼ同じだった。ただし、妊娠後期になるとチンパンジー妊婦の羊水量はヒトに比べて相対的にかなり少ない状態となり、胎内の空間が限られて、胎児の運動は物理的に制限されていた。この点において、妊娠後期でも比較的広い胎内空間で運動することのできるヒト胎児と異なることが明らかになった。以上のことは、両種で、妊娠後期における聴覚一運動活動の発達の質的差異の生じる可能性を示唆している。本研究は、主として、以下の4点を明らかにすることを目的として実施している。1)胎児は母親の声をそれ以外の声や音と識別することがわかっているが、声によって表現される母親の感情も識別することができるか。2)母親の声の識別は、胎外から届く声のうち母親の声の頻度が圧倒的に多いことが原因と考えられるが、母親以外の他者(父親や祖母)の声が頻繁に聞こえる日常生活があれば、これらの声の識別も生じるか、3)胎児期に識別の生じた対象には、出生後に聴覚一視覚のクロスもダル知覚が生じるか。4)以上で明らかになる胎児一新生児気の視聴覚特性の発達は、ヒトにもっとも近縁なチンパンジーとどのように共通し、どのように異なるか。今年度は第二段階として、昨年度に引き続き、母親と母親以外の他者の声の提示に対する胎児の反応を調べるため、母親の腹部表面にラウドスピーカーを設置し、あらかじめ録画しておいた映像から、母親の声、母親以外の他者の声を発生させた。それぞれ同じ絵本を朗読したり、歌を歌ったりするものとした。これらに対する胎児の反応を、4次元超音波画像解析装置による身体運動と表情の3次元動画像撮影、胎児心拍測定によって記録した。さらに、同じ音声を出生直後、生後2か月および生後3か月に聴取させた。出生後実験の対象児の行動はすべてビデオ記録し、口開けやnon-nutritive suckingの口唇運動や、全身運動、刺激への注視の多寡などを胎児期に得た同一刺激に対する3次元動画像記録と心拍増減とともに現在分析中である。

1)胎児は母親の声をそれ以外の声や音と識別することがわかっているが、声によって表現される母親の感情も識別することができるか。2)母親の声の識別は、胎外から届く声のうち母親の声の頻度が圧倒的に多いことが原因と考えられるが、母親以外の他者(父親や祖母)の声が頻繁に聞こえる日常生活があれば、これらの声の識別も生じるか。3)胎児期に識別の生じた対象には、出生後に聴覚-視覚のクロスモダル知覚が生じるか。4)以上で明らかになる胎児-新生児期の視聴覚特性の発達は、ヒトにもっとも近縁なチンパンジーとどのように共通し、どのように異なるか。本年度は、3)について、人間の胎児期の母親による絵本朗読経験の有無が出生後のクロスモダル知覚に影響を与えるかを調べる課題に着手した。胎内で継続聴取した母親の音声が母親自身の映像/他人女性の映像、音声と感情的に対応する表情映像/対応しない表情映像などと対提示したとき、それぞれの映像を音声なしで提示したとき、音声を映像なしで提示したとき、音声や映像が途中で他の音声や映像に変化したとき、などのさまざまなモードで反応に違いが見られるかを、実験群と対照群で比較する。口開けやnon-nutritive suckingの口唇運動、全身運動、刺激への注視の多寡などを分析するため、資料収集継続中である。また、本年度は、本研究が比較対象としたチンパンジー3個体の出産時の姿勢が人間と同様であることも報告した。母親認知の基盤たる母子関係の姿勢運動的かかわりにおいて人間とチンパンジーが出生時から共通の特徴を有することが見出された意義は大きい。本研究では、胎児-新生児期の視聴覚世界の研究に比較認知発達研究の視点と方法を導入し、主として以下の4点を明らかにすることを目的とした。1)胎児は母親の声をそれ以外の声や音と識別することかわかっているが、声によって表現される母親の感情も識別することができるか。3)胎児期に識別の生じた対象には出生後に聴覚-視覚のクロスモダル知覚が生じるか。本年度は、3)について、人間の胎児期の母親による絵本朗読経験の有無が出生後のクロスモダル知覚に影響を与えるかを調べる課題を継続した。胎内で継続聴取した母親の音声が母親自身の映像/他人女性の映像、音声と感情的に対応する表情映像/対応しない表情映像などと対提示したとき、それぞれの映像を音声なしで提示したとき、音声を映像なしで提示したとき、音声や映像が途中で他の音声や映像に変化したとき、などのさまざまなモードで反応に違いが見られるかを、実験群と対照群で比較し、口開けやnon-nutritive suckingの口唇運動、全身運動、刺激への注視の多寡などを分析するための資料収集を継続中である。また本年度は、本研究が比較対象としたチンパンジー3個体の胎児期における脳容積を3Dデータから算出し、その増加曲線を人間の場合と比較した。1)脳容積は胎齢16週ですでに人間がチンハンジーの2倍近くあり、2)拡大速度は人間では胎齢30週以後も増加するのに対し、チンパンジーでは胎齢22週ごろに減速に転じることなど、両者の差異について重要な結果が得られた。
分裂酵母における浸透圧環境適応の分子メカニズム

本研究では分裂酵母の浸透圧環境への応答機構を調べるために高浸透圧感受性変異株を複数取得した。これらの中で最も浸透圧感受性の高い1株について、その感受性を相補する遺伝子を分裂酵母の染色体DNAライブラリーから検索した。その結果、2種類のグリセロール-3ーリン酸デヒドロゲナーゼをコードする遺伝子が取得できた。これら2つの遺伝子(gpd1^+とgpd2^+)をそれぞれ欠失させ、その表現型を調べたところ、gpd1欠失変異株のみが高浸透圧感受性を示した。次にグリセロールの合成能を調べたところ、野性株では高浸透圧条件下でグリセロール合成量が上昇し、さらにそれが細胞内に高度に蓄積することが明らかとなった。一方、gpd1欠失変異株ではグリセロールの合成及び細胞内蓄積が顕著に低下していた。さらにgpd1^+の転写は高浸透圧時に顕著に誘導されることも明らかとなった。これらのことより分裂酵母では高浸透圧時に細胞内にグリセロールが高度に蓄積することが高浸透圧適応に重要であり、それは主にgpd1^+の転写レベルでの調節によるものであることが明らかとなった。一方、他の研究者らによって、MAPキナーゼキナーゼのホモログであるWis1の欠失変異株が高浸透圧感受性になることが報告され、Wis1が浸透圧情報の伝達に関与することが示唆されていた。我々は、取得したgpd1^+遺伝子を多コピーでWis1欠失株に導入すると浸透圧感受性が相補されることを見いだした。さらにWis1欠失株ではgpd1^+遺伝子の発現がわずかにしか認められず、細胞内にグリセロールも蓄積しないことを明らかにした。以上のことからgpd1^+遺伝子がWis1が関与するMAPキナーゼカスケードの支配下にあると結論した。今後、他の高浸透圧感受性変異株についても解析を進める予定である。
サンゴに共生する褐虫藻類オルガネラゲノムの環境変化に伴う機能調節機構の解明

共生性渦鞭毛藻の褐虫藻Symbiodinium minutum (クレードB1)のプラスチドゲノムとミトコンドリアゲノムの全配列を決定し、その解析結果を論文として報告した(Mungpakdee et al., 2014; Shoguchi et al., 2015)。プラスチドゲノムは、14個のミニサークルDNA(1.8-3.3 kbp)からなり、各々のミニサークルに一つの遺伝子がコードされ、それらの全てがRNA編集を受けることを明らかにした。ミトコンドリアゲノム解析では、褐虫藻とアピコンプレクサ類マラリア原虫との間で多くのノンコーディングRNAsが保存されていることを明らかにした。本研究では、温度及び紫外線照射ストレスによる、褐虫藻クレードBのオルガネラゲノムにコードされた17個の遺伝子のRNAエディティングの変化を調べる。この解析を行う上でオルガネラゲノムの配列を高精度で決定しておく必要がある。よって本年度は、これまでに得られていたプラスチドゲノム及びミトコンドリアゲノムとそのトランスクリプトームの解析を引き続き行い、それぞれの解析結果を論文としてまとめた。この解析は、主に連携研究者の協力を得て行った。渦鞭毛藻類のミトコンドリアゲノムは、組み換えを起こしたものが様々な長さで存在していると報告されてきている。クレードBのゲノム概要配列の中には、約2kbpから40kbpの長さのミトコンドリアゲノム配列が20個以上存在していた。今回共同研究者の協力を得て、高いカバーレージを示すリード配列をさらにアセンブルすることにより、約291kbpの長いミトコンドリアゲノム配列を決定することに成功した。そのゲノム上には、cobとcox3遺伝子に加えて、rRNAのLSUの遺伝子がコードされていた。またそのゲノム上にトランスクリプトームをマッピングした結果は、ほとんどの領域が転写されていることを示した。それゆえ、cob、cox3、LSUの遺伝子はポリシストロニックに発現し、RNAプロセッシングをうけることにより3つのmature RNAとなっている可能性が考えられた。よって今後は論文として報告予定のオルガネラゲノム配列を基盤として、RNAエディティングの変化をより高精度に決定していくことが可能になるため、今年度の研究成果は重要なものになると考えられる。本研究では、まず褐虫藻Symbiodinium minutum(クレードB1)のオルガネラゲノムにコードされた17個の遺伝子のRNA編集メカニズムが、温度及び紫外線照射ストレスなどによりどのように応答するのかを調べる。S. minutumのプラスチドゲノムの配列を連携研究者らと決定し、報告した(Mungpakdee et al. 2014)。その際にトランスクリプトームの解析も行い、通常の培養条件下でRNA編集を受けている471のサイトを同定し、報告した。またミトコンドリアゲノムの配列決定とそのトランスクリプトのRNA編集サイトに関する論文をまとめ、投稿した(Shoguchi et al.,リバイス中)。以前は1種類と考えられていた褐虫藻は、現在では大きくAからIの9つのグループに分けられるほど多様であることが分かっている。クレードB1のオルガネラゲノムに加えて、クレードAやCのオルガネラゲノムの配列決定とそのRNA編集サイトの決定に必要なデータを次世代シーケンサーから得た。野外のサンゴAcropora digitiferaに共生している褐虫藻のオルガネラゲノムの多型パターンの解析に必要なデータを、共同研究者の協力により得た。さらにサンゴ幼生の存在下やサンゴ細胞内に共生した環境下においてオルガネラゲノム由来のトランスクリプトームのRNA編集に変化が起きていないのかを解析するためのデータを得た。渦鞭毛藻類の褐虫藻Symbiodinium minutum (クレードB1)のプラスチドゲノムとミトコンドリアゲノムの配列を決定し、その解析結果をオリジナル論文として報告してきた(Mungpakdee et al., 2014; Shoguchi et al., 2015)。共著者とともに、S. minutumのプラスチドゲノムが14個のミニサークルDNA(1.8-3.3 kbp)からなり、各々のミニサークルに一つの遺伝子がコードされていることを明らかにした(Mungpakdee et al. 2014)。またそのゲノムとトランスクリプトームの比較により、どのようなRNAエディティングを受けているのかを示した。ミニサークルにコードされるタンパク質の3次元構造の予測とアミノ酸組成の解析から、RNAプロセッシングがプラスチドの機能において重要であることをサポートする結果を示した。渦鞭毛藻類のミトコンドリアゲノムとして初の、非コード領域を含む全ゲノム配列(326 kb)を報告した(Shoguchi et al., 2015)。比較解析により、褐虫藻とアピコンプレクサ類マラリア原虫との間で多くのノンコーディングRNAsが保存されていることを明らかにした。これまで、白化しやすいサンゴに共生している褐虫藻は培養できないこともあり、そのオルガネラゲノムにおいても詳細に調べられてきていない。褐虫藻S. minutumの核ゲノム配列は報告してきており(Shoguchi et al., 2013)、本研究により褐虫藻のオルガネラゲノムの研究基盤も整ったことは、今後培養できない褐虫藻のゲノム研究を行う際に参照配列として重要な意義を持ってくると考えられる。共生性渦鞭毛藻の褐虫藻