hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
臨床看護師による実践への研究成果活用支援システムの開発-EBN推進に向けて-

活用力に関係していることが明らかになった。19変数とは、「職位」、「教育・指導役割」、「研修会参加への積極性」、「専門誌の閲読量」、「1週間あたりの学習時間」、「年間学会参加回数」、「看護研究についての知識」、「研究の重要性に対する価値づけ」等である。また、このような結果を文献に照らして考察し、看護師個々の研究成果活用力に対し、「リーダーシップや教育的機能を発揮する役割の獲得状況」、「学習への積極性や最新の研究成果に触れる機会の獲得状況」、「研究に対する理解や価値づけの程度」、「研究やその成果活用に関する学習機会の獲得状況」、「研究に対する職場の理解やサポート状況」等が影響していることへの示唆を得た。第3に、これら一連の成果を統合し、「臨床看護師による実践への研究成果活用支援システム・モデル」を作成した。このモデルは、「研究成果活用力自己評価尺度-臨床看護師用-」の理解と活用を組み込んでいる。また、研究成果活用とそのために必要な能力向上への価値づけ、研究成果活用力の継続的自己評価等が、看護師個々の看護実践への研究成果活用状況の改善に重要であることを表す。
広領域宇宙地図の作製と宇宙論の実証的研究

(1)CCDカメラの製作.カメラ用機械部品及びデータ読出用電子部品の総を製作、試験を完了しているが、アメリカ側担当の望遠鏡部品の一部である水晶補正板の完成が遅れている為、其補正板の上で組立作業を行う事が必要なカメラの最終完成には至っていない.最終完成は本年8月末と見込まれる.(2)当初日本側で担当したフィルター(光学領域)の製作は前年度に此を完了しているが、アメリカ側の担当製作した紫外フィルターの特性が要求基準を満たしていない為、本年度日本側で新たに製作した.フィルターに関しては凡の製作を完了、特性測定を終えており、補正板への貼付を行うべく其納入を持っている。(3)測光解析ソフトウェアの暫定版は既に完成しており、実際に大量の観測データのオンライン解析に用いる為のものも一部を除いて出来上がっており、シミュレーションを用いたテストも終えつつある。然乍、此等のソフトウェアは実際の観測データを用いて最終検定を行う必要があり、此部分は望遠鏡製作(アメリカ側)の遅れの為未だ実行する事が出来て居ない。(4)ソフトウェア検定作業に用いるシミュレータは未だ改善の余地はあるものの一応満足出来るものが出来上がっており、項目(3)及び他のソフトウェア作業の目的の為に大いに利用されている。(5)測光較正。測光システムを定義する為の予備作業は終了しており、論文として発表済である。測光標準候補のリストには更に詳しく検討修正が加えられ、幾個かの候補星に関しては今年度予備的な観測が為され予想値と観測値の差が約±23%と言う満足すべき結果を得ている。現在、本観測に入るべく本格的な観測機械の組立を終了し、其性能試験、微調整を畧終えた段階である。(6)分光標的選定の為の研究。本年度は此項目に手を付ける余力を得なかった。(7)scienceを行う為の予備研究。本計画で得られる筈のデータと類似した観測データを用い銀河数計測に目標を置いて銀河測光及び銀河星分類の研究を行った(論文準備中)。亦銀河の明るさと距離の測定より銀河の高度函数を導くソフトウェアを書き上げた。本年度は最終年度であるがアメリカ側担当部分に大幅な遅れがある為、我々の計画も当初の目標を未だ達成し得ていない。此為報告書の提出の延期を求めているところである。(1)CCDカメラの制作、ARCより納入のテクトロニクス社2048×2048大型CCDの特性試験を実施し(此は多大の労力を要する作業である)用途に耐える15ヶを得た。此CCDチップは特別製品に付き性能のバラツキが大きく基準を満たさないものは返品した為予定外に時間を要したが漸く本年度予定分を入手し(1994年2月)CCDカメラ機械部分の制作に掛っている。此と平行してCCD駆動・読出し用の電子装置は其プロトタイプを制作・試験を終了しており現在必要台数を揃えつつある。(2)CCDカメラに取付ける光学フィルターに関しては5色中4色の制作を終え特性曲線測定の結果満足のいく結果を得ている。(3)銀河・星データを模擬生成するシミュレーターは第一号が完成しており以下のソフトウェア開発に用いつつある。シミュレーターは我々の知識の進歩、必要度に応じて順次更新される。(4)CCDデータより天体を識別するソフトウェア(Find-Object)は第一号、第二号版が完成、性能試験を終了している。星、銀河の識別ソフトウェアは幾箇かの異なるソフトウェアを作成し性能試験中である。(5)分光標的選定に関しては、其ソフトウェア選定に必要なアルゴリスムを開発し、最も簡単な場合に関しては結果を得ている。(1)CCDカメラの製作。ARCょりS1Te社(舊テクトロニクス社)製大型CCD15ヶ(紫外特殊仕様6ヶを含む)を特性試験実施後納入を終え、必要個数30ヶが揃った。但しチップ製作上の技術的困難を回避する為に納入可能素子の性能基準を引下げる必要があった。CCD駆勅・続出し電子装置は最終的なものと考えられる一台の製作試験を終えており必要台数(原型のコピー)製作に必要な基板・部品の納入を完了し、現在其等の組立に掛かりつつある(CCD仕様引下げに伴い昨年度試作のものより若干の変更を行う必要があった)。機械部分は-列分に対応するデュワ-、Tバ-、CCD取付部品の最終版の製作を終え量産準.備を進めつつある。(材料は既に入手済)(2)光学フィルター。日本側当部分の製作を完了した。(3)ソフトウェア。一応データ解析に利用可能はものが出来上がっているが未相当に改善の余地がある。既に完成しているシミュレーターに拠って発生する疑似データを用い改善作業を行っている。(4)側光較正。予備的研究を畧終了しており監視望遠鏡が稼動に入り次第標準星を定めると共に本計画に於いて用いられる等級スキームの決定を行うべく準備を完了している。(1)CCDカメラの製作.カメラ用機械部品及びデータ読出用電子部品の総を製作、試験を完了しているが、アメリカ側担当の望遠鏡部品の一部である水晶補正板の完成が遅れている為、其補正板の上で組立作業を行う事が必要なカメラの最終完成には至っていない.最終完成は本年8月末と見込まれる.

(2)当初日本側で担当したフィルター(光学領域)の製作は前年度に此を完了しているが、アメリカ側の担当製作した紫外フィルターの特性が要求基準を満たしていない為、本年度日本側で新たに製作した.フィルターに関しては凡の製作を完了、特性測定を終えており、補正板への貼付を行うべく其納入を持っている。(3)測光解析ソフトウェアの暫定版は既に完成しており、実際に大量の観測データのオンライン解析に用いる為のものも一部を除いて出来上がっており、シミュレーションを用いたテストも終えつつある。然乍、此等のソフトウェアは実際の観測データを用いて最終検定を行う必要があり、此部分は望遠鏡製作(アメリカ側)の遅れの為未だ実行する事が出来て居ない。(4)ソフトウェア検定作業に用いるシミュレータは未だ改善の余地はあるものの一応満足出来るものが出来上がっており、項目(3)及び他のソフトウェア作業の目的の為に大いに利用されている。(5)測光較正。測光システムを定義する為の予備作業は終了しており、論文として発表済である。測光標準候補のリストには更に詳しく検討修正が加えられ、幾個かの候補星に関しては今年度予備的な観測が為され予想値と観測値の差が約±23%と言う満足すべき結果を得ている。現在、本観測に入るべく本格的な観測機械の組立を終了し、其性能試験、微調整を畧終えた段階である。(6)分光標的選定の為の研究。本年度は此項目に手を付ける余力を得なかった。(7)scienceを行う為の予備研究。本計画で得られる筈のデータと類似した観測データを用い銀河数計測に目標を置いて銀河測光及び銀河星分類の研究を行った(論文準備中)。亦銀河の明るさと距離の測定より銀河の高度函数を導くソフトウェアを書き上げた。本年度は最終年度であるがアメリカ側担当部分に大幅な遅れがある為、我々の計画も当初の目標を未だ達成し得ていない。此為報告書の提出の延期を求めているところである。
精密質量解析に基づいた、標準物質が入手困難な農薬変化体の半定量方法の開発

液体クロマトグラフ-高分解能質量分析計および液体クロマトグラフ-三連四重極型質量分析計を用いて、標準試薬を購入できない環境変化体を高感度分析するための技術を開発した。実験室内において、購入した未変化体(農薬)の水溶液にクセノンランプ光を照射して環境変化体を生成させた。生成したクルードな環境変化体を標準試薬の代わりに用いて、三連四重極型質量分析計の測定条件を定めた。定めた測定条件を用いて環境サンプル中の変化体を標準試薬を用いずに検出することに成功した。農薬の環境変化体(Pesticide Transformation Products in Water environments: PTPWs)の中には試薬が市販されていない物質が多いため、環境サンプル中にPTPWsが高濃度・高検出頻度で存在しても、LC/MS/MSなどを用いた高感度分析を実施することができない場合が多い。そこで本研究では、波長290 nm以下の紫外線をカットするフィルターを透過させたクセノンランプ光を農薬の水溶液に照射してPTPWsを生成させ、これを市販されていないPTPWsの試薬の代わりに用いることを検討した。以上により、選別した分子量関連イオンのLCカラムリテンションタイム、選択反応モニタリング(SRM)条件を求め、平成26年度の研究実施計画をすべて達成した。本研究では、液体クロマトグラフー高分解能質量分析計と液体クロマトグラフー三連四重極型質量分析計を相補的に用いることによって、環境変化体を高感度検出する技術を開発した。必要とされる感度の問題から、環境変化体の検出には液体クロマトグラフー三連四重極型質量分析計が用いられることが多い。液体クロマトグラフー三連四重極型質量分析計を用いた分析を実施するためには、一般的には分析対象物質である分析種の標準試薬が必要である。しかし、環境変化体の多くは標準試薬の市販が確認できず、液体クロマトグラフー三連四重極型質量分析計を用いた環境研究が困難である。そこで本研究では、環境変化体の出発物質として農薬に着目し、実験室内で農薬に模擬太陽光を照射し、光照射により生成した環境変化体を標準試薬の代わりに用いた。しかし、光を照射すると、数多くの環境変化体が生成するので、対象とする環境変化体を特定する必要がある。そこで、液体クロマトグラフー高分解能質量分析計を用いて、対象とする環境変化体を特定した。以上のように2種類の質量分析計を相補的に用いることにより、標準物質を用いずに環境変化体を高感度検出する技術を確立した。また、確立した技術を用いて、実環境サンプル中の未知環境変化体を検出可能なことを確認した。本技術により、実環境中からの検出頻度・推定検出濃度が高い環境変化体を優先的に合成するなど、効率的な研究を実施することが可能になると期待される。また本技術は、農薬の環境変化体に限らず、化成品の変化体など、混合物として標準物質が得られる場合に有効であり、応用範囲が広いと期待される。平成26年度の研究計画をすべて達成し、高分解能LC/MSを用いた実験を完了した。さらに、高感度LC/MS/MSを用いた実験を前倒しで着手した。このため、当初計画以上に進展していると判断した。環境質量分析一方、農薬に模擬太陽光を照射して生成させたPTPWsの精密質量を測定したところ、溶媒が付加した付加イオンが観察される場合があった。その付加イオンと精密質量が一致する(分子式が一致する)PTPWsが知られている場合があり、このような場合には、溶媒が付加したPTPWsなのか、溶媒が付加していない別のPTPWsなのかを判別できなかった。そこで平成27年度は、そのようなイオンの衝突誘起解離実験を実施し、判別することが可能か否かを検討することとした。データ整理のための謝金を積算していたが、そのデータ整理を研究代表者が実施したため未使用となった。平成26年度の研究において新たに判明した問題点である溶媒が付加した付加イオンの判別実験のための試薬購入費に充てたい。
動的分子認識によるジアステレオマーの立体制御によるキラル素材の調製

医薬品をはじめとした生物活性物質は,光学活性体として供給されることが望ましい.二種の異性体間で活性強度が異なったり,全く違った生物活性が発現したりすることがあるからである.今回,アルカリ存在下で起こる可逆(平衡)反応を用いた光学活性化合物供給法を考案した.通常,平衡反応では生成物が混合物となる.そこで,不斉結晶場での分子認識現象を利用することで,平衡をより安定な包接錯体側へと導くことで,光学活性化合物の供給を目指す.具体的には,1ケトンのα位のエピメリ化平衡下でのジアステレオマーの立体制御と2分子間平衡反応を利用した光学活性ジアステレオマーの調製を検討する.医薬品をはじめとした生物活性物質は,光学活性体として供給されることが望ましい.二種の異性体間で活性強度が異なったり,全く違った生物活性が発現したりすることがあるからである.今回,アルカリ存在下で起こる可逆(平衡)反応を用いた光学活性化合物供給法を考案した.通常,平衡反応では生成物が混合物となる.そこで,不斉結晶場での分子認識現象を利用することで,平衡をより安定な包接錯体側へと導くことで,光学活性化合物の供給を目指す.具体的には,1ケトンのα位のエピメリ化平衡下でのジアステレオマーの立体制御と2分子間平衡反応を利用した光学活性ジアステレオマーの調製を検討する.
ベータ・ニュートリノ相関超精密観測装置の開発

原子核のベータ崩壊の崩壊生成物の内、ベータ線と反跳イオンを検出する事でベータ・ニュートリノ間の相対放出角度分布を決定する実験装置の開発を進めた。2005年度は2003年度に建設したベータ線飛跡検出器としての平面型ドリフトチェンバーの読み出し用データ収集系の開発を行った。2004年度は試験的に読み出しチャネル数を大幅に減じる為に、感光基板を用いたディレイライン読み出し装置を開発した。2005年度はベータ・ニュートリノ相関観測実験の他に、ベータ線の偏極度測定による時間反転対称性の破れ実験を見据えた、多重飛跡検出を行うシステムに読み出し系を全面的に改造し、全チャネル読み出しを行うデータ収集系を構築した。ディレイライン読み出しの際には6面あるセンス面の情報を12チャネルのTDC情報を読むことで単一粒子飛跡の再構築を行っていた。2005年度に構築したシステムは全センスワイヤーを読むため104チャネル読み出し可能なシステムを構築した。具体的にはASDチップを用いた64chプリアンプボードを2枚使用し、VMEの64chマルチヒットTDCを用いたVMEベースのデータ収集システムを新たに構築した。今後は2003年度に開発した反跳イオン検出器と合わせて、真空遮断用の薄膜の最適化、及び分解能の評価などと同時に本実験の準備を進めていく予定である。また、偏極8Li核のベータ崩壊を用いた、時間反転対称性の破れ探索実験を、完成したドリフトチェンバーを電子線偏極度計として動作させる事で、2006年度中にもテスト実験として開始すべく、準備を進めている。原子核のベータ崩壊の崩壊生成物の内、ベータ線と反跳イオンを検出する事でベータ・ニュートリノ間の相対放出角度分布を決定する実験装置の開発を進めている。2003年度はベータ線飛跡検出器としての平面型ドリフトチェンバーの設計、シミュレーション、そしてチェンバー本体の製作を行った。ビームライン飛跡検出器と違い、大入射角度でのベータ線飛跡決定を行う必要がある為、軸対称ドリフト速度分布を持つ、通常の平面型ワイヤーチェンバーよりも厚みの大きいものを製作した。製作は林栄精器において行い、2003年度末の段階で、高電圧試験及び生信号の確認を終了した。本チェンバーは使用用途が低レートの実験用の為、読み出しチャネル数を大幅に減じる為にディレイライン読み出しを行う予定である。ディレイライン基板の試作、前置増幅器の選定、データ収集系の構築が2004年度の研究目標である。一方で、反跳イオン検出器の開発も平行して進めている。2003年度はマルチチャネルプレートの2次元位置読み出しアノードの開発を行った。100ミクロン銅線を400ミクロンピッチでフレームに縦横に巻き付けた、Helical Cross Wire Delay Anodeの試作機を製作し、アルファ線源を用いたテストで2次元位置分解能200ミクロンを達成した。2004年度は反跳イオン検出に必要な、前置加速静電場を組み合わせ、イオン源を用いた低エネルギーイオンの位置検出を実現する。以上のドリフトチェンバー、イオン検出器を組み合わせたベータ崩壊の観測実験のテスト実験を理化学研究所に於いて2004年度に行う予定である。原子核のベータ崩壊の崩壊生成物の内、ベータ線と反跳イオンを検出する事でベータ・ニュートリノ問の相対放出角度分布を決定する実験装置の開発を進めている。2004年度は2003年度に建設したベータ線飛跡検出器としての平面型ドリフトチェンバーの読み出し系の開発を行った。読み出しチャネル数を大幅に減じる為に、感光基板を用いたディレイライン読み出し装置を開発した。6面あるセンスワイヤー面にはそれぞれ約20本のアノードワイヤーがあり、これらを一層毎に一枚のディレイライン基板へ接続し、その両端から伝播してきた信号を読み出した。アノードワイヤーの位置は両端の信号の到達時間差から求めることが出来る。全12チャネルの信号を、一旦ASDチップを用いた前置増幅回路を通してECL論理信号へ変換し、TDCへ入力するデータ収集系の構築を行った。得られたTDC情報から直線飛跡を求めるための飛跡再構成プログラムの開発を行った。ソフトウエアによる分解能低下量を定量的に見積もる為、まずはモンテカルロシミュレーションで、実際のTDCデータと対比すべきデータを生成し、再構成プログラムの最適化を行った。一方で、反跳イオン検出器の開発も平行して行った。本年度はマルチチャネルプレートを10枚装着した崩壊観測用の真空槽を建設し、線源を用いたテストを行う準備を進めている。また、同装置にドリフトチェンバーを取り付け、真空遮断用の薄膜の最適化、及び分解能の評価などを今後進めていく予定である。

ディレイライン読み出しの際には6面あるセンス面の情報を12チャネルのTDC情報を読むことで単一粒子飛跡の再構築を行っていた。2005年度に構築したシステムは全センスワイヤーを読むため104チャネル読み出し可能なシステムを構築した。具体的にはASDチップを用いた64chプリアンプボードを2枚使用し、VMEの64chマルチヒットTDCを用いたVMEベースのデータ収集システムを新たに構築した。今後は2003年度に開発した反跳イオン検出器と合わせて、真空遮断用の薄膜の最適化、及び分解能の評価などと同時に本実験の準備を進めていく予定である。また、偏極8Li核のベータ崩壊を用いた、時間反転対称性の破れ探索実験を、完成したドリフトチェンバーを電子線偏極度計として動作させる事で、2006年度中にもテスト実験として開始すべく、準備を進めている。
中膜平滑筋層を有した心臓血管組織再生法の開発

再生医療では理論的には理想的な移植材料を創出しうるが、心臓血管組織の様に「強靱」かつ「しなやか」な組織再生は未だ困難である。そこで本研究では、心臓血管組織の機械特性を担う「中膜平滑筋層の再生」を目指した研究を行った。まず、平滑筋細胞へ分化可能な骨髄由来間葉系幹細胞を効率的に分化するための手法を検討し、培養液中の添加因子としてTGF-b1とアスコルビン酸、細胞外マトリクスとしてラミニン、動脈同様の機械刺激環境下での培養などそれぞれの有効性を発見した。またそれらの細胞を脱細胞化組織へ磁力を用いて層状に播種する手法を開発した。さらに、中膜平滑筋層の再生を促す、生体吸収性材料を用いた血管の再生を試みた。1.適切な細胞源骨髄間葉系幹細胞(MSC)をTGF-betalとアスコルビン酸を用いて平滑筋細胞への分化誘導を試み、Western blot、免疫染色、FACS解析で約40%の細胞が幼弱な平滑筋細胞と同等のタンパク発現をしめした。しかし、成熟平滑筋細胞に発現するミオシン重鎖SM1/2は発現しなかった。2.適切な培養方法A.細胞外マトリクスの中でもラミニンがMSCの平滑筋細胞分化に有効な傾向を示した(平滑筋細胞特異的タンパクおよび遺伝子発現の確認)。そのメカニズム解明のために、インテグリンの遺伝子発現や、ERK, Aktのリン酸化といったシグナル伝達系の変化を観察したが、有意な所見は今のところ見られていない。B.MSCに生理的なメカニカルストレス(バイオリアクターを用いて拍動流進展ストレス)を付与すると、多くの平滑筋細胞特異的遺伝子(a Smooth Muscle Actin, Calponin, Caldesmon, SM22a, myocardin, SMemb)発現を亢進させた。3.三次元再構築法中膜平滑筋層再生のための3次元構築には、magnetic tissue engineeringの技術を用いた。細胞に磁性ナノ粒子を取り込ませ、磁力を用いて細胞を操作し、担体に細胞を層状に播種し、細胞層を持った構造物を構築した。現在、脱細胞化マトリクスの上に上述のように細胞を層状に構築し、ラット頸動脈移植モデルを用いて、in vivo実験を準備している。心臓血管組織再生を目指した、中膜平滑筋層の再生技術の開発を以下の観点から行った。(1)管腔状の足場材料への細胞播種法開発Magnetic CationicLiposomeを用いて、磁力を使った細胞操作法で管腔構造物(脱細胞化血管)に細胞を播種法を開発し滴下法に比して、有意に効率的であった(約8倍の播種効率)。本法で、層状の平滑筋層を作成した。(2)骨髄由来間葉系幹細胞(MSC)の平滑筋細胞(SMC)への効率的合化誘導(3)生体吸収性材料による担体の開発生体吸収性のポリマー(PLA, PGA, PCL)を用いて、エレクトロスピニング法で担体を作製した。吻合部狭窄が問題となるため、生体吸収性の材料に新生内膜肥厚抑制効果の期待できる薬剤(FK506)を混和し、徐放化するドラッグデリバリーシステムを開発した(特許出願)。本研究成果は、心血管組織再生研究の進歩に大きく貢献した。
ビフィズス菌による腸管上皮－Ｔ細胞間相互作用の制御に基づく腸炎抑制機構の解明

昨年度までに、大腸炎抑制効果の高い菌株(BN株)は大腸上皮のβ-cateninシグナルを活性化することで上皮の修復を促進することを示した。一方、このようなβ-cateninシグナル活性化によるcyclin D1やc-mycの発現亢進は、大腸癌などのがん細胞増殖に寄与する。そこで、大腸癌モデル動物にBN株を投与した際、大腸癌に及ぼす影響を解析した。アゾキメタンをマウスに腹腔内投与後、デキストラン硫酸ナトリウム(DSS)を自由摂取させ、大腸癌を誘発した。また試験期間中BN株を毎日経口投与した。その結果、体重減少や生存率などの指標についてはBN株投与により若干の抑制効果がみられたが、有意な差は確認されなかった。また、大腸癌の数、サイズについてもBN株投与による影響はほとんどみられなかった。また、DSS誘導性大腸炎の発症初期におけるBN株の作用を検討した。DSS投与後の宿主の変動について、腸管透過性の亢進、上皮細胞のアポトーシス亢進、およびCD11b+細胞(好中球を含む)の大腸組織への浸潤を経時的に観察した。その結果、DSS投与3日後から腸管透過性の亢進が確認された。一方、このタイムポイントにおいて、上皮細胞のアポトーシスおよびCD11b+細胞の浸潤は確認されなかった。また、ZO-1およびOccludinの発現量をWestern blotで解析したが、DSS投与3日後の大腸において、これらのタンパク質の発現量に変化はみられなかった。一方、各タンパク質の局在を解析した結果、ZO-1およびOccludinの局在がDSS投与3日目に変化していることが明らかとなった。さらに、BN株の投与によりこれらの局在変化は抑制され、腸管透過性の亢進も抑制された。以上の結果から、BN株は大腸炎初期におけるタイトジャンクションタンパク質の局在変動を抑制し、上皮の恒常性を維持することが明らかとなった。27年度が最終年度であるため、記入しない。これまでの研究により、腸管上皮細胞が発現するCD40分子が、腸管上皮-T細胞間相互作用において重要な役割を果たしていることを確認している。今回、デキストラン硫酸ナトリウム(DSS)誘導性大腸炎モデルマウスにおいて、大腸組織におけるCD4+IL-17A+細胞が増加することを確認した。また、大腸炎マウスの腸管上皮細胞がCD4+T細胞からのIL-17A産生をCD40依存的に誘導することを確認した。コンベンショナル環境下で飼育したマウスではDSS投与により腸管上皮CD40発現増加は確認できたものの、SPFおよび無菌環境下で飼育したマウスではCD40発現は確認出来なかった。このことから、ある種の腸内細菌がCD40発現増加に寄与していることが考えられた。そこで、コンベンショナルマウスの糞便を無菌マウスに投与し、腸内細菌叢を移植したexGFマウスを作製した。その結果、DSS投与に腸管上皮CD40のmRNA発現増加を確認することができた。一方、SPFマウスの糞便を無菌マウスに投与し同様の試験を行った場合、CD40発現増加は確認できなかった。このことから、コンベンショナルマウスの腸管に存在するある種の菌が、上皮CD40発現増加に関与していることが示唆された。そこで、コンベンショナルマウスおよびSPFマウスの糞便中腸内細菌叢を16S rDNA pyrosequencingにより解析した。Unifrac法の解析により、両者の腸内細菌叢は大きく異なることが確認できた。また、コンベンショナルマウスの方が大腸炎発症による腸内細菌叢の変動が大きいことが明らかとなった。現在、これらのメタデータ解析を進め、腸管上皮CD40発現増加に関与する菌の特定を行っている。【ビフィズス菌5菌株の大腸炎抑制効果の比較】すでに全ゲノム解読が完了しているビフィズス菌5株の大腸炎抑制効果の比較を、DSS誘導性大腸炎モデルマウスを用いて行った。その結果、1菌株のみ高い大腸炎抑制効果を示した。今回、大腸炎発症による上皮CD40の発現異常は確認できなかった。これは、マウス飼育施設がかわったため、腸内細菌叢が以前と異なるためだと考えられる。そこで、BN株の大腸炎抑制メカニズムの解析を改めて行った。大腸組織切片を作製し、TUNEL染色およびKi-67の免疫染色を行った結果、BN株投与により上皮アポトーシスが抑制される一方、上皮細胞増殖が促進されることが明らかになった。さらに、β-cateninの免疫染色を行った結果、BN株投与により上皮においてβ-cateninの蓄積が促進されることが確認された。以上の結果から、BN株により上皮Wnt/β-catenin経路が活性化され、ダメージ受けた上皮細胞の修復が促進されたと考えられた。そこで、Wnt/β-catenin経路のターゲット遺伝子であるc-mycおよびcyclin D1のmRNA発現量を測定したところ、BN株投与によりこれらのmRNA発現量が有意に増加していた。【比較ゲノム解析による活性成分の同定】大腸炎抑制効果の高いBN株とその他の菌株との比較ゲノム解析を行った。その結果、exopolysaccharide(EPS)合成に関与する2つの遺伝子クラスターがBN特異的遺伝子として検出された。

そこで、BN株およびその他のビフィズス菌株からそれぞれEPSを抽出し、DSS大腸炎マウスに投与することでEPSの大腸炎抑制効果を評価した。その結果、BN株由来のEPS投与により、disease activity indexの増加および大腸の萎縮が有意に抑制された。一方、その他のビフィズス菌株由来のEPS投与では大腸炎抑制効果はみられなかった。これらの結果から、BN株が産生するEPSが活性成分の一つであることが明らかとなった。また、EPSの活性が菌株レベルで異なることが明らかとなった。昨年度までに、大腸炎抑制効果の高い菌株(BN株)は大腸上皮のβ-cateninシグナルを活性化することで上皮の修復を促進することを示した。一方、このようなβ-cateninシグナル活性化によるcyclin D1やc-mycの発現亢進は、大腸癌などのがん細胞増殖に寄与する。そこで、大腸癌モデル動物にBN株を投与した際、大腸癌に及ぼす影響を解析した。アゾキメタンをマウスに腹腔内投与後、デキストラン硫酸ナトリウム(DSS)を自由摂取させ、大腸癌を誘発した。また試験期間中BN株を毎日経口投与した。その結果、体重減少や生存率などの指標についてはBN株投与により若干の抑制効果がみられたが、有意な差は確認されなかった。また、大腸癌の数、サイズについてもBN株投与による影響はほとんどみられなかった。また、DSS誘導性大腸炎の発症初期におけるBN株の作用を検討した。DSS投与後の宿主の変動について、腸管透過性の亢進、上皮細胞のアポトーシス亢進、およびCD11b+細胞(好中球を含む)の大腸組織への浸潤を経時的に観察した。その結果、DSS投与3日後から腸管透過性の亢進が確認された。一方、このタイムポイントにおいて、上皮細胞のアポトーシスおよびCD11b+細胞の浸潤は確認されなかった。また、ZO-1およびOccludinの発現量をWestern blotで解析したが、DSS投与3日後の大腸において、これらのタンパク質の発現量に変化はみられなかった。一方、各タンパク質の局在を解析した結果、ZO-1およびOccludinの局在がDSS投与3日目に変化していることが明らかとなった。さらに、BN株の投与によりこれらの局在変化は抑制され、腸管透過性の亢進も抑制された。以上の結果から、BN株は大腸炎初期におけるタイトジャンクションタンパク質の局在変動を抑制し、上皮の恒常性を維持することが明らかとなった。無菌マウスに大腸炎を発症誘導してもCD40発現の亢進は見られなかったが、通常環境下で飼育したマウス糞便を無菌マウスに移植することでCD40発現の亢進を確認することができた。このことは、ある種の腸内細菌が腸管上皮CD40の発現増加を誘導することで大腸Th17細胞の活性化を誘導することを示唆している。残念ながら、その後のマウス飼育室の移動に伴い、大腸炎発症誘導による腸管上皮CD40発現増加が確認出来なくなった。これは腸内細菌叢の変化に伴うものであると考えられる。そこで、他のメカニズムを介した大腸炎抑制効果に焦点をあて解析を試みた。当初の予定であったビフィズス菌数菌株の大腸炎抑制効果の比較検討を行った結果、効果のある菌株とない菌株を選出することができた。
多読による速読力と語彙サイズへの影響調査と指導指針の提言

本研究2年目に当たる平成30年度では、主に以下の二つを行った。一つは、平成29年度に調査した、英語多読を経験した学習者が英文読解速度をどのように高めていくかに関する研究結果を分析し、その成果を3件の国内外の学会で口頭発表を行い、2件の学会誌に論文発表を行ったことである。またもう一つは、授業内多読を1年間経験した学習者を対象に、語彙サイズを年に2回調査したことである。英語多読が読解速度に与える影響について行った研究では、以下の知見を得られた。(1) A1レベルの学習者を対象に、1学期間(15週間)で5万語程度の多読を行うことで、多読を行わない場合と比べ、意味理解を伴った読解速度は有意に上昇する。また、読解速度は3万語程度の読語数に達した時点で意味理解が安定しない状態でまず高まり、その後5万語程度の読語数に達したところで意味理解を伴った速読力となる。(2)英語運用能力の高い学習者の方が、多読による速読力向上の効果が早く出る可能性がある。(3)英文読解速度を大きく高めた学習者の英語の読み方は、多読が精読とは異なる読み方であることを理解し、本の中の語や表現にも意識が向く余裕を持てる本を読んでいる傾向と、多読を行うことが英語力の様々な側面の向上に効果的であるという認識を持ちながら取り組んでいる傾向が示唆された。これらの知見から得られる教育的示唆としては、A1レベルの学習者を対象にして読解速度を顕著に高めるための指導を行う場合、1学期間で5万語以上の読語数に到達するようなシラバスを作成する必要性と、適切な選書ができるように学習者に介入する必要性である。本研究最終年度である3年目では、多読が語彙サイズの伸長に与える影響について分析し、成果を公表していくとともに、多読指導に有用な教育的示唆をまとめていく予定である。本研究2年目に当たる平成30年度で実施した、英語多読を経験した学習者が英文読解速度をどのように高めていくかに関する研究結果の分析と成果発表、および、授業内多読を1年間経験した学習者を対象に行った語彙サイズ調査は、研究実施計画通りの進行であり、現在まで研究の進捗状況は順調であると考えている。本研究最終年度である3年目では、当初の予定通り、多読が語彙サイズの伸長に与える影響について、学習者の読語数の観点からだけでなく、英語の読み方の質の観点からも分析を行う。そして、その成果を、中部地区英語教育学会などの学会で口頭発表および論文発表を通して公表していく。さらに、これらの成果公表の中では、多読指導によって読解速度や受容語彙を高めるための指導指針を提示し、教育的意義の高い研究に仕上げていきたい。本研究最終年度にあたる2019年度では、定期的な授業内での英語多読を行うことによって、学習者の語彙サイズにどのような影響を与えるかに関して、読語数だけでなく、読み方の質の観点からも継続して調査を行うとともに、過年度に実施した調査結果を分析し、その成果を国内外の学会で口頭発表および論文発表というかたちで公表する。また、上記の成果公表の際には、研究1年目で取り組んだ読解速度に与える影響に関する調査で得られた知見とともに本研究の成果をまとめ、多読指導に必要かつ有用な教育的示唆も提示し、教育的意義の高い研究になるように努めていく。本研究期間の1年目にあたる平成29年度は、授業内で定期的に英語多読を実施することによる、学習者の英文読解速度への影響について調査、分析を行った。先行調査では、高等専門学校2年生118名を対象に、週に1回、30分程度の授業内多読を半期間(14回程度)行い、その間に同程度の難易度と語彙レベルであることを確認した英文3種類を用いて3回速読調査を行い、それぞれWPMと、意味理解を伴った修正WPMの値を調査した。その結果、WPMにおいて、1回目の調査と比較し、2回目および3回目の調査で有意に上昇し、修正WPMにおいて、1回目および2回目の調査と比較し、3回目の調査で有意に上昇していたことが分かった。さらに、参加者を英語習熟度、および期間内読語数に応じて3群に分けて分析した結果、英語習熟度が高い学習者は元々英文読解速度が速いだけでなく、多読指導によって速読力が大きく上昇すること、期間内に多くの英語を読む学習者ほど、速読力の上昇が大きく、特に意味理解を伴った速読力の養成に貢献する可能性が示唆された。しかし、この研究には対照群がなかったため、異なる高等専門学校2年生123名(1年次受験TOEIC Bridgeのスコアにおいて、先行研究の参加者と有意差なし)を対照群として、授業内多読を行わない前期半期間に先行研究と全く同じ調査を同じ回数行い、先行研究の参加者を実験群とすることで、多読による速読力の変化への影響を研究することにした。この調査の結果を先行研究と比較したところ、WPMおよび修正WPMの変遷において、1回目、2回目の調査では両群間に有意差はなかったが、3回目の調査では実験群が有意に統制群を上回ったことが分かった。この2年間の結果から、授業内多読を半年間行うことで、行わない場合と比べ、速読力は有意に高まること、その傾向は多読を開始して5カ月頃から現れ始めることが示唆された。研究1年目では、当初の計画通り、英語多読を行うことによる英文

読解速度に与える影響を調査し、対照群の結果と比較することで、より精緻な分析が可能になった。さらに、参加者に質問紙調査を行ったことで、WPMおよび修正WPMが大きく上昇した学習者たちに共通して見られる英語の読み方の質や選書の仕方の考察も可能になった。質問紙調査の結果、WPMを大きく上昇させた上昇群は、多読が英作文力向上やリスニング向上に繋がると回答した割合が、他の群と比較して有意に高かった。さらに、英文内で出会った単語や表現を使おうと思って読んでいる割合や、多読がスピーキング力向上の寄与に繋がると回答した学習者の割合も10%水準で高いものだった。上昇群の学習者からは、多読の効果を感じ、自信を持って読み進めることで、速読力を向上させている姿が浮かび上がった。一方で、多読図書の選書の仕方とWPM変化の違いの間に注目すべき相関関係は見られなかった。以上のように、本研究1年目の調査は計画通りに進み、2年目ではこの研究成果を公表していくとともに、次の研究課題に取り組みたい。本研究2年目に当たる平成30年度では、主に以下の二つを行った。一つは、平成29年度に調査した、英語多読を経験した学習者が英文読解速度をどのように高めていくかに関する研究結果を分析し、その成果を3件の国内外の学会で口頭発表を行い、2件の学会誌に論文発表を行ったことである。またもう一つは、授業内多読を1年間経験した学習者を対象に、語彙サイズを年に2回調査したことである。英語多読が読解速度に与える影響について行った研究では、以下の知見を得られた。(1) A1レベルの学習者を対象に、1学期間(15週間)で5万語程度の多読を行うことで、多読を行わない場合と比べ、意味理解を伴った読解速度は有意に上昇する。また、読解速度は3万語程度の読語数に達した時点で意味理解が安定しない状態でまず高まり、その後5万語程度の読語数に達したところで意味理解を伴った速読力となる。(2)英語運用能力の高い学習者の方が、多読による速読力向上の効果が早く出る可能性がある。(3)英文読解速度を大きく高めた学習者の英語の読み方は、多読が精読とは異なる読み方であることを理解し、本の中の語や表現にも意識が向く余裕を持てる本を読んでいる傾向と、多読を行うことが英語力の様々な側面の向上に効果的であるという認識を持ちながら取り組んでいる傾向が示唆された。これらの知見から得られる教育的示唆としては、A1レベルの学習者を対象にして読解速度を顕著に高めるための指導を行う場合、1学期間で5万語以上の読語数に到達するようなシラバスを作成する必要性と、適切な選書ができるように学習者に介入する必要性である。本研究最終年度である3年目では、多読が語彙サイズの伸長に与える影響について分析し、成果を公表していくとともに、多読指導に有用な教育的示唆をまとめていく予定である。本研究2年目に当たる平成30年度で実施した、英語多読を経験した学習者が英文読解速度をどのように高めていくかに関する研究結果の分析と成果発表、および、授業内多読を1年間経験した学習者を対象に行った語彙サイズ調査は、研究実施計画通りの進行であり、現在まで研究の進捗状況は順調であると考えている。本研究最終年度である3年目では、当初の予定通り、多読が語彙サイズの伸長に与える影響について、学習者の読語数の観点からだけでなく、英語の読み方の質の観点からも分析を行う。そして、その成果を、中部地区英語教育学会などの学会で口頭発表および論文発表を通して公表していく。さらに、これらの成果公表の中では、多読指導によって読解速度や受容語彙を高めるための指導指針を提示し、教育的意義の高い研究に仕上げていきたい。
中学校技術科の4領域を統合するバイオ燃料使用ボイラー船教材開発

中学校新学習指導要領において、技術・家庭科(技術分野)は、「A材料と加工に関する技術」、「Bエネルギー変換に関する技術」、「C生物育成に関する技術」、「D情報に関する技術」の4つの内容に分類された。現段階において、これら4つの内容を統合させた市販教材は存在しない。そこで、「ものづくり」を中心に、4つの要素を含み、また、それぞれの内容を関連づけた教材開発を行い実践した。内容は次の通りである。1、ボイラー船の設計:コンピュータを活用し、ブリキ板から立体である船を設計し、展開図を作成する。2、ボイラー船の作成:代表的な金属加工法である、塑性加工、切削加工、溶接の学習をする。3、植物の栽培:サツマイモを育て、植物育成の基礎知識を学習をする。4、バイオ燃料の精製:3で育てたサツマイモを発酵させ、燃料(アルコール)を精製する。5、ボイラー船の実走:自分で設計し、作成した船を、自作の燃料で走行させる。本教材の中心となるボイラー船は、多くの学校で教材として採用されてきた。今回は特に、3、4で扱う植物の栽培からバイオ燃料の精製に重点を置いた。サツマイモを育て、収穫する。加熱後、水、麹、酵母とともに瓶に入れ、発酵させる。さらに濃度を上げるために、蒸留し、アルコール濃度約60%のバイオ燃料を精製する。このバイオ燃料により、前述したボイラー船を走行させ、エネルギー変換に関する実体験をさせた。また、本教材では、これまでのような、1つまたは2つの内容のみ学習できる教材に比べ、4つの内容すべてに渡っての学習が可能であり、それぞれの内容を関連づけることによる教育効果、および年間35時間(3学年は技術と家庭を合わせて35時間)の限られた授業時間での教育効果が期待できる。
ネットワークソフトウェアのコンプレキシティを克服する環境適応型エージェント

無中断予備バーチャルパス(VP)予約方式、複数マルチキャストツリー予約方式、自動車走行制御スケジューリング方式、アドホックネットワーク階層ルーティング方式という代表的な事例研究を推進し、環境適応型エージェント技術がネットワークソフトウェアのコンプレキシティの克服に有効な手段であることをシミュレーション実験によって評価した。無中断予備バーチャルパス予約方式では、マルチエージェントを用いて複数の予備VPの候補から最適なものを選択して予約する方法を提案した。また、候補数を増やすほど最適な予備VPが効率的に求まることを示した。複数マルチキャストツリー予約方式では、各情報元からマルチキャストメンバに情報を伝達するためにマルチエージェントを用いてマルチキャストツリーの複数の候補から最適なものを求める方法ならびにメンバの加入・脱退に適応してツリーを動的に変更する方法を提案した。また、提案法の処理時間は、ツリー数、候補数、メンバ数の変化数に比例して増加せず、効率的であることを示した。自動車走行制御スケジューリング方式では、インプリサイス計算の概念を高速道路の自動車走行制御スケジューリングに応用し、輻輳状態の変化に適応して複数のスケジューリングを切り替える方法を提案した。また、輻輳状態が変化しても効率的な自動車走行制御が実現できることを示した。アドホックネットワーク階層ルーティング方式では、移動する各ノードの機能を局所情報に基づいて自律的に変更して階層構造を維持し、リンクステートルーティングと非循環ルーティングを組み合わせた階層ルーティングを提案している。また、到着率とオーバヘッドにおいて提案法が有効であることを示した。以上の事例研究から、環境適応型エージェントに基づく手法はネットワーク環境の変化に対する適応性が高く、ネットワークソフトウェアの設計に有効であると考えられる。エージェントに基づくネットワークソフトウェア設計の事例研究として、マルチエージェントを用いた無中断予備VP設定方式ついて検討し、新たな通信路資源予約法を提案した。ATMネットワークの高信頼化の有力な手段として、ソースとデスティネーションの間に複数のVPを設定し、現用VPが故障した場合に予備VPに切替える方法がある。高信頼化のためには、異なるペア間の予備VPの容量ができりだけ重ならないように全てのペア間の予備VPを予約する必要がある。研究代表者らは、このような予備VPを、マルチエージェントを用いて、複数の予備VPの候補から最適な予備VPを選択して予約する方法を提案した。この方法では、各ノードにエージェントを置いて、エージェント間のメッセージ交換により自律的に予備VPを求めている。この方法の特長は、ネットワークトポロジ、リンク容量、ソースとデスティネーションのペアの変化を各エージェントに対する外部環境の変化と捉え、これらの変化に迅速に適応して最適な予備VPを求めることである。この特長を実証するためにシミュレーション実験を行った。その結果、予備VPの候補数が増加しても最適な予備VPが求まる比率はその数に比例して高まること、最適な予備VPが求まる時間はその数に比例して増加しないことが示された。この結果は、候補数を増やすほど最適な予備VPが効率的に求まることを示している。この事例研究にとどまらずマルチエージェントを用いて通信路資源を予約する方法の適用範囲は広く、外部環境の変化に対する適応性は高いことが確認している。エージェント外の環境の変化に適応する環境適応型エージェントについて事例研究を通してその有効性を示した.具体的には,複数のマルチキャストツリーの予約,自動車走行制御スケジューリングに対してマルチエージェント,インプリサイス計算に基づいた手法を提案し,シミュレーション実験を用いて適応性を評価した.各ソースノードから特定のグループに同じ情報を流すマルチキャストを行うためには情報の伝送路を構成するマルチキャストツリーを予約する必要がある.複数のマルチキャストツリーを同時期に予約する場合,できるだけリンクを共有しないように複数のマルチキャストツリーを予約することが望ましい.

この問題に対して各ノードに配置されたエージェント間のメッセージ交換により,マルチキャストツリー候補のなかから最適なマルチキャストツリーを求める手法を提案した.シミュレーション実験により,提案法の処理時間はツリー数および候補数に比例して増加しないことを示した.高度交通システム(ITS)に関連して、インプリサイス計算に基づく高速道路の自動車走行制御スケジューリングについて研究を進めた。インプリサイス計算では,正常の負荷では解の精度を維持し,異常の負荷が発生した場合には解の精度を落とすことにより,デッドラインまでの計算完了を保証する.このインプリサイス計算の概念を応用し,高速道路上の輻輳状態の変化に適応して複数の自動車走行制御スケジューリングを切り替える手法を提案した.シミュレーション実験により,輻輳状態が変化しても効率的な自動車走行が実現できることを示した.いずれの事例研究に対しても,環境適応型エージェントに基づく手法は変化に対する適応性が高い.これらの研究成果からネットワークソフトウェアの設計には環境適応型エージェントに基づく手法が有効であると考えられる.本年度は,マルチキャストとアドホックネットワークに関する環境適応型エージェント技術とその評価について研究を進めた.同時に発生するマルチキャスト通信を実現するためには,複数のマルチキャストツリーを予約する必要がある.しかも,その予約は,マルチキャストメンバの加入・脱退という変化に適応できることが求められる.本研究では,マルチキャストメンバの変化に適応できる複数のマルチキャストツリーの予約法を提案した.この提案法は,各ノードに配置されたエージェント間のメッセージ交換を並行して行うものである.シミュレーション実験により,提案法の処理時間は,マルチキャストメンバの変化の回数に比例して増加せず効率的であること,および,変化の間隔分布の分散が大きい場合に有効であることを示した.アドホックネットワークではノードが移動するため階層構造を維持することが容易ではない.本研究では,エリアの規模の調整,ノードの機能の変更を局所情報に基づいて自律的に行うことにより,階層構造を維持する適応的階層構造構成法を提案した.この提案法では,ノードの移動に適応して,エリアおよびノードの機能を自律的に変化させている.提案法のパラメータを決めるにあたり,移動するノードの数,移動方向,移動速度等を変化させて,ノードの移動に対する提案法の適応性を評価して,提案法の有効な適用範囲を明らかにした.特にノードが高速度で移動する場合において,提案法が有効であることを示した.更に,適応的階層構造成法を用いた階層ルーティングを提案した.
スピネル型結晶構造を有する高温酸化物熱電半導体の開発

本研究ではMgIn_2O_4,CdIn_2O_4,Zn_2SnO_4などのスピネル型酸化物を中心にそれらを合成し、その熱電物性を評価して、熱電半導体としてそれらの応用の可能性を検討した。(1)スピネル型酸化物の合成Zn_2SnO_4は、ZnOとSnO_2の化学量論的な混合粉末を静水圧加圧した成型体を大気中で1000°C、6h反応させて得た。熱電物性測定の便宜上、相対密度を上げるため成型体をを粉砕し、再び静水圧加圧成型し、大気中で1400°C、6h焼結したものを試料とした。MgIn_2O_4とCdIn_2O_4は市販の試薬を静水圧加圧した成型体を大気中で1300°C、5h、さらに1400°C、5h焼結したものを試料とした。XRD測定により全試料はスピネル型構造単相であることを確認した。また、熱分析測定からも焼結温度範囲内では安定であることを確認した(2)熱電物性MgIn_2O_4,CdIn_2O_4,Zn_2SnO_4いずれの試料もn型半導体であり、酸素分圧が低くなると導電性が向上した。Zn_2SnO_4は高温領域で導電率は低いもののゼ-ベックの絶対値が400500μV/Kと大きく、MgIn_2O_4とCdIn_2O_4は比較的低温領域でも導電性があり、ゼ-ベック係数の絶対値も80200μV/K程度であった。以上のスピネル酸化物は金属酸化物として導電率が大きく、そのわりにゼ-ベック係数が比較的大きいことから電子移動度が大きいことが推測される。また、これらの酸化物は高温ほどパワーファクターが大きいことと熱伝導率が低いことを生かして適切なドーパントを探せば、高温熱電半導体としての応用が可能であると考えられる。
細菌バイオミネラリゼーションを応用したシールド・レストレーション

供試菌としてCorynebacterium matruchotiiを用い、寒天培地および液体培地に塩化カルシウムを添加して培養した。誘導およびミネラル形成期間を212か月とし、石灰化物の形成を観察した。その結果、液体培養では2か月よりミネラル形成を示し、ミネラル形成期間の増加にともない、菌体内石灰化が明らかになった。固形培養では明らかな石灰化物形成を認めなかった。C. matruchotiiにおいて、カルシウムを多く含む環境で培養することにより細菌のバイオミネラリゼーションを生じさせることができた。また、誘導方法は、液体培地での誘導が望ましいとの結論を得た。昨年度に引き続き、歯石形成に関与しているとされるCorynebacterium matruchotiiを用い、バイオミネラリゼーション誘導について検討をおこなった。培養法は、液体培地あるいは固形培地を用い2種の方法を比較した。いずれの場合にもミネラリゼーション誘導群は1mmol/Lの濃度でカルシウムを添加した。誘導およびミネラル形成期間は2か月12か月に設定し、比較検討した。Corynebacterium matruchotiiはグラム陽性桿菌であり、グラム染色では細長い線状の菌体が紫色を呈していることが確認できた。液体培養では、2か月よりHE染色にて一部の菌が暗紫色を呈し、アリザリンレッド染色においても薄い赤色を呈した。4か月後には、染色状態は明瞭かつ広範囲になり、アリザリンレッド染色においては赤色を呈した。12か月後には、アリザリンレッド染色の赤色変化は著明であった。高拡大観察では、菌体そのものが染色されており、菌体内石灰化が誘導されていると考えられた。菌塊の変化を比較した場合、ミネラリゼーション期間を延長するにともない、菌体の凝集が増加したが、菌どうしの接着の減少が認められた。このことは菌体内の石灰化が進行した結果、菌体の生活反応が減少し細胞間のつながりが減少したためであると予測された。固形培養では、12か月のものでも明らかな染色変化は認められなかった。以上、Corynebacterium matruchotiiにおいて、カルシウムを多く含む環境で培養することにより細菌のバイオミネラリゼーションを生じさせることができた。本研究の基盤となる口腔由来細菌の石灰化について検討した。供試菌としてこれまでに報告のあるCorynebacterium matruchotiiを用い、既報を参考に液体培地および寒天培地上で培養し、石灰化物の形成を観察した。具体的にはブレインハートインフュージョン(BHI)培地をベースに塩化ナトリウム、炭酸カルシウム塩、リン酸塩、塩化カリウム塩を含む寒天培地、およびカゼイン加水分解物をベースに各種塩類、ビタミン類、ヌクレオチド類、増殖因子を混合した半合成液体培地を作成し、実験群には高濃度の塩化カルシウムを添加した。また実験群寒天培地には低濃度のシリコンも同時に添加した。12か月培養後菌体を回収し、観察に供した。寒天培地上に形成された集落をホルマリン溶液で固定後、パラフィン包埋を行い、厚さ5μmの切片を作製した。カルシウム化合物の検出を目的として、ヘマトキシリン・エオジン染色(HE染色)およびアリザリンレッド染色を施し、光学顕微鏡にて観察した。HE染色では、一部の菌がカルシウム陽性を示唆する暗紫色を呈していた。同部は、アリザリンレッド染色においても、薄い赤色を呈しており、カルシウム化合物沈着の可能性を示した。いずれの場合も菌体そのものが染色されており、菌体内石灰化が誘導されている可能性を示唆していた。また、液体培地で培養した場合に菌の内部に粒状物を認めた。今後、粒状物の電子顕微鏡による観察、培養法による菌体内石灰化の相違および時間的変化について検討を行う予定である。平成24年度の研究実施計画はおおむね順調に達成できた。特にCorynebacterium matruchotiiにおいて菌体内石灰化が誘導されている可能性を示唆することができたことは評価できると考えている。また、液体培地で培養した場合に菌の内部に粒状物を確認できており、今後の研究の発展に大きく貢献すると思われる今後、Corynebacterium matruchotiiの菌の内部の粒状物の電子顕微鏡による観察、培養法による菌体内石灰化の相違および時間的変化について検討を行う予定である。平成25年度の研究において菌体内石灰化が誘導されていたCorynebacterium matruchotiiを用いて菌体外においても石灰化が誘導されるかどうかを検討する。また石灰化前後での遺伝子発現の状態を解析し比較する。さらにヒトう蝕歯から軟化象牙質を採取しCorynebacterium matruchotiiを用いて再石灰化を試みる。その後接着性レジンを適用し再石灰化の状態や接着性を検討する予定である。
トランスクリプトーム解析に基づく歯の運命決定因子の同定とその応用

本研究課題は、トランスクリプトーム解析を用いて、歯の運命決定因子および歯の形態形成に重要な因子の同定を目的としている。本年度は、マウスより採取した歯、毛、唾液腺など上皮ー間葉相互作用により形成される器官と胎仔全体をCAGE (Cap analysis of gene expression)法を用いて解析することで、それぞれの器官特異的な転写開始点および、様々な器官に共通して発現する転写開始点の同定に成功した。これら転写開始点より転写される因子として、本年度は歯の形態形成に関わると思われるホメオボックス転写因子Nkx2-3の機能解析を行った。Nkx2-3は歯および唾液腺に強く発現し、発生初期の形態形成期に強い発現を認めた。本因子は上皮細胞、特に歯の咬頭形成に重要とされるenamel knotに局在し、細胞増殖抑制因子であるp21の発現を制御している可能性を発見した。そこで、ChIP assayおよびLuciferase assayにより転写活性を調べてみると、p21の転写開始部位に結合し、転写制御を行っている可能性を見出した。さらに、外胚葉異形成症の原因因子として知られるEDA/EDARの異常は、歯において咬頭形成が阻害されることが知られている。そこで、歯原性上皮細胞株にEDAを添加すると、Nkx2-3の発現が上昇することを発見した。これら知見は、Nkx2-3がEDA/EDARシグナリングの下流で歯の形態形成に重要な役割を果たしていることを示し、Nkx2-3は歯胚咬頭上皮の細胞増殖を制御することで歯の咬頭形成を調節している可能性が示唆された。本年度は歯の形態形成に関わる遺伝子のスクリーニングに成功し、機能を明らかにすることができたため、おおむね順調であると評価できる。スクリーニングした歯の形成に関わる候補遺伝子の機能解析を進める。上皮ー間葉相互作用スクリーニングシステムを用いて、上皮ー間葉相互作用にかかわる遺伝子の同定を図る。