hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
腫瘍局所における IL-17 産生制御による新しい分子標的治療の開発

マウス皮下腫瘍モデル(MC38,B16腫瘍細胞株)で,IL-17A siRNA遺伝子発現Adenovirusvector (Ad-si-IL-17)を腫瘍内投与し,腫瘍局所のIL-17Aを抑制することでコントロール群と比較し有意に腫瘍増殖を抑制することがわかった。腫瘍局所のIL-17Aを抑制することで,新生血管の抑制,腫瘍微小環境での抗腫瘍免疫の活性化することがわかった。つまり腫瘍微小環境のIL-17Aは腫瘍増殖促進に関与することが明らかとなり,腫瘍局所のIL-17Aは腫瘍増殖抑制の新たな分子標的となり得る可能性が示唆された。本研究は腫瘍局所においてIL-17の産生を抑制することで腫瘍増殖を抑制できるか否かを明らかにし、さらにIL-17制御の標的としていずれが分子標的として優れているかを明らかにすることを目的としている。本年度は、まず、局所のIL-17発現を抑制するツールとしてマウスIL-17 siRNA発現アデノウイルスベクターの作製を行った。mIL-17Aに対するsiRNA設計を行いプラスミド2種類構築した(TaKaRaに依頼)。293細胞にpBApo-CMV-mIL17とpcPURmU6-mIL-17A-shRNAを遺伝子導入試薬TransIT-293にて導入し、293細胞のRNAを抽出し、mIL-17Aの発現抑制効果を検討し、効果の良いほうのプラスミドよりmIL-17A-siRNA発現ユニットを含むフラグメントを切り出しコスミドベクターにライゲーションし、コスミドDNAを精製し、COS-TPC法にてIL-17siRNA発現adenovirus vector(Ad-IL-17siRNA)を作製した。In vivo用に精製、濃縮を行った。また、同時にIL-17発現adenovirus vector(Ad-IL-17)、コントロール用のadenovirus vecter(Ad-SNC)も前述と同様にして作製した。作製したアデノウイルスベクターの機能解析のために、IL-17の産生していないMethA細胞株に10MOIのAd-IL-17と種々のMOIにてAd-IL-17siRNAもしくはコントロールのAd-SNCを共感染させ、48時間培養後、培養上清中のIL-17をELISAで測定し、Ad-IL-17siRNAはコントロールと比べMOI依存性にIL-17のタンパク発現を抑制することを確認した。次にvivo実験ではC57BL/6マウスに5×10^5個のMC38を皮下接種した。(1)Ad-IL-17siRNA1×10^9PFU、(1)Ad-SNC1×10^9PFU、(3)PBSをDay5、Day8、Day11の3回腫瘍内に投与し(各群n=7)、腫瘍増殖抑制効果を検討し、Ad-IL-17siRNA腫瘍内投与による腫瘍局所のIL-17が腫瘍増殖を抑制した。現在、腫瘍局所でのIL-17抑制が腫瘍増殖を抑制につながったメカニズムを解明するための検討を行っている。昨年度はC57BL/6マウスに5×10^5個のMC38を皮下接種した。(1)Ad-IL-17 siRNA1×10^9PFU、(2)Ad-SNC 1×10^9PFU、(3)PBSをDay5、8、11の3回腫瘍内に投与し、腫瘍増殖抑制効果を検討した。本年度は、Ad-IL-17 siRNA腫瘍内投与におけるIL-17抑制効果を確認するために、腫瘍接種14日目のtumorを採取し、tumor lysateのELISAを行った。結果、コントロールと比べAd-IL-17 siRNA投与群で有意にIL-17抑制していた。次に、血管新生について評価するために、腫瘍接種14日目のtumorを採取し、抗CD31抗体、抗MMP9抗体を用いた免疫組織化学染色を行った。結果、コントロールと比べAd-IL-17 siRNA腫瘍内投与におけるIL-17抑制により有意に腫瘍内抗CD31抗体陽性細胞、MMP9発現の抑制していた。以上より、癌微小環境でのIL-17抑制は血管新生の抑制につながることが明らかとなった。さらに、同モデルを用いて、抗腫瘍免疫に関する検討を行った。腫瘍接種14日目のtumorを採取し、腫瘍浸潤リンパ球を抽出し、CD8陽性細胞をMACSにて分離し、^<51>Cr-release assayにてCTL活性を評価した。

結果、コントロール群と比較し、Ad-IL-17siRNA腫瘍内投与群で細胞傷害活性の増強を認めた。この結果、癌微小環境のIL17の抑制することで腫瘍浸潤リンパ球の抗腫瘍効果を増強することが明らかとなった。RORγt siRNA発現adenovirusvectorは現在作製中である。本研究は腫瘍局所のIL-17産生を抑制することで腫瘍増殖を抑制できるか否かを明らかにし、IL-17制御の標的としていずれが分子標的として優れているかを明らかにすることを目的としている。一昨年度、昨年度までにIL-17siRNA発現adenovirus vector(Ad-IL-17siRNA)を作製し、マウス皮下腫瘍モデルにおいて腫瘍増殖抑制効果を検討した。Ad-IL-17siRNAを腫瘍内投与すると、コントロールと比べて腫瘍増殖抑制することが明らかとなった。次に、腫瘍の免疫染色を行い、局所のIL-17抑制することで血管新生の抑制することが明らかとなった。さらに抗腫瘍免疫に関する検討を行うために、腫瘍浸潤リンパ球を抽出し、51Cr-release assayにてCTL活性を評価した。結果、Ad-IL-17 siRNA腫瘍内投与群で細胞傷害活性の増強を認めた。本年はRORγt siRNA発現adenovirus vectorを作製し、in vitroでのIL-17発現抑制効果を確認したが、十分なIL-17発現抑制できず、RORγt siRNA発現adenovirus vectorを使用しての実験は中断し、昨年に引き続きAd-IL-17 siRNA腫瘍内投与での抗腫瘍免疫増強のメカニズムについて検証した。昨年と同様のモデルで腫瘍浸潤免疫細胞を抽出し、Th1/Th2バランス、Treg細胞、MDCSをflow cytometoryで検討した。結果、Ad-IL-17 siRNA腫瘍内投与群ではTh1優位な環境にシフトしており、Treg細胞、MDSCは減少していた。以上の結果、IL-17siRNA発現adenovirus vectorは腫瘍局所のIL-17抑制することが可能で、IL-17制御は血管新生抑制、抗腫瘍免疫の活性化を介して腫瘍増殖を抑制するがわかった。RORγt siRNA発現adenovirus vectorの作製がやや遅れているが、その他の研究については順調に経過している。24年度が最終年度であるため、記入しない。RORγt siRNA発現adenovirus vectorの作製を作成後、IL-17siRNA発現adenovirus vectorと比べIL-17制御の標的としていずれが分子標的として優れているかを明らかにする計画である。
波動粒子相互作用直接観測システムの開発による相対論的電子加速機構の研究

世界初となるプラズマ波動-粒子間相互作用の直接計測実現を目的とする波動粒子相互作用解析装置(SWPIA)について、ERG衛星の探査領域である内部磁気圏での波動粒子相互作用観測に最適化されたS-WPIAの開発に向けた「SWPIA計測部」の研究開発、ならびに、内部磁気圏グローバルモデルと波動粒子相互作用素過程モデルを組み合わせた「SWPIAシミュレータ」によるSWPIA解析アルゴリズム開発を行った。また実際の搭載機器に相当するハードウェア上でのプログラムを開発しアルゴリズムの評価を開始した他、原理検証とアルゴリズムの高度化を目指したスペースプラズマチェンバーによる実際のプラズマ実験も行った。波動粒子相互作用解析装置(SWPIA)を開発し、世界初となるプラズマ波動ー粒子間相互作用の直接計測実現を目的とする。特にERG衛星の探査領域である内部磁気圏での波動粒子相互作用観測に最適化されたS-WPIAの開発に向けて、「SWPIA計測部」の入力となる高周波受信機と粒子パルスデータ変換・転送回路の研究開発、ならびに、内部磁気圏グローバルモデルと波動粒子相互作用素過程モデルを組み合わせた「SWPIAシミュレータ」によるSWPIA解析アルゴリズム開発を行い、内部磁気圏でのSWPIA計測技術を開発・検証・確立する。平成23年度の研究実績は以下の通りである。「SWPIA計測部」について、衛星システム組み込み状態でのSWPIAを動作させる上で必要となるハードウェアインターフェース等のデザインを行った。また、衛星に搭載されるCPUと同じデザインのCPUボードの試作を購入しSWPIAソフトウェアの開発環境を構築した。更に、SWPIAアルゴリズムの検証を行うためのスペースチェンバー実験手法について検討した。「SWPIAシミュレータ」については、設備備品費で計算機システムを導入し、モジュールA (グローバルモデル)の初期計算を開始した。実際の磁気嵐の状況におけるシミュレーション計算を行い、ホイッスラーモード波動の線形成長率の空間分布を導出した。モジュールB (素過程計算)では、モジュールAの計算結果を読み込んで初期速度分布を与えるインターフェースの開発を行った。また、SWPIAにより得られる計測量の統計的有意性を評価する方法を提案して、モジュールBによるコーラス放射発生過程の再現実験の中でSWPIA疑似計測を実施、その結果に対して提案した手法を適用する事により定量的に評価し、SWPIA計測結果の評価に活用できる事を示した。「SWPIA計測システム」の開発では、SWPIAで重要となる「波形位相」において、その較正の段階でエラーが増大しないよう、窓関数、および、時系列データの取り扱い方について検討を行い位相誤差が非常に少なくする手法を確立した。スペースプラズマ実験では、傍熱型電子ビームにより安定した波動粒子相互作用が実現できるようになり、ビーム周辺におけるドリフト波の励起が確認できるに至った。さらに、直線型プラズマチェンバーを用いた電子温度勾配モードとドリフト波の励起についての実験での、プラズマ波動励起過程の直接計測に関する実験を開始した。この実験では、波動電場ベクトルとイオン流速ベクトルとを同時に計測するコンビネーションプローブを設計・開発して計測に用いた。初期結果として、コンビネーションプローブが所期の計測精度を達成できていることと、チェンバー内で励起するkHz帯のドリフト波の電場とイオン電流の各ベクトル量を計測できていることが確かめられた。「SWPIAシミュレータ」については、磁気嵐時の現実的な状況における高エネルギー電子のダイナミクスとホイッスラーモード波動の励起の解析を行うために、高速の太陽風が生じたときの人工衛星データを境界条件としたモジュールAのシミュレーションを行い、観測されたデータとの比較を行った。また、平成24年度に開発した手法によって、非線形のホイッスラーモード波動の時空間分布も導出した。この結果、南向きの惑星間空間磁場を含む高速太陽風と北向きの惑星間空間磁場を含む高速太陽風のときでは、線形および非線形段階のホイッスラーモードの時空間変化は顕著な違いが生じ、観測された結果と調和的であった。モジュールBについては、平成24年度に得られた成果を学術誌に発表すると共に、モジュールAの計算結果に基づいて高エネルギー電子の初期速度分布を与えるモジュールを開発し、連携計算の実行環境を整えた。「SWPIA計測システム」の開発では、平成23年度に引き続き、実際のハードウェアに等価のシステム上での簡単なアルゴリズムの組込、並びに、一番処理が重い波形較正部についてのスピード評価を行い、それにより、実際の衛星観測において、1周回軌道時間内で、前周回時の取得データ処理が終了することを示した。更に、実際の観測を模擬し、計算機シミュレーション結果のデータを活用して、アルゴリズムの評価とそこから算出されるデータ信頼性の評価に対する指針を考案した。

また、ロケット実験の代替として取り組んでいるスペースプラズマチェンバー実験では、小型のプラズマ波動プローブを開発した他、チェンバー内でエネルギー分析を行うことができる粒子センサーを開発し、チェンバー内で動作することを確認した。また安定した電子ビームを実現するために「傍熱型の電子ビーム源」による実験を開始した。「SWPIAシミュレータ」については、モジュールAの計算結果を用いて、グローバルモデルが計算する分布関数および背景プラズマ環境のデータから、非線形波動粒子相互作用が発生する場所を特定する手法を開発した。具体的には、非線形波動粒子相互作用の発生指標となるOptimum AmplitudeとThreshold Amplitudeを評価し、ホイッスラーモード波動が線形段階から、非線形段階に入る条件を満たす場所と時間を特定する。この手法を用いることで、グローバルモデルの中で非線形波動粒子相互作用の場所が特定できることになった。モジュールBについては、平成23年度に提案したSWPIA計測量の統計的有意性を評価する方法とその有効性の定量的な評価について、学術論文として公表した。また、コーラス放射発生過程の再現実験を、背景磁場強度の空間スケールを様々に変化させて実施し、発生するコーラス放射の波動特性が変化する様相を明らかとした。-衛星と等価CPUによるSWPIA開発環境が構築された-ロケット実験による検証がJAXA側の理由により本計画内で実現ができなくなったが、チェンバー実験での検証手法を取り入れその準備を開始することができている。-JAXAスペースチェンバー装置を利用し、電子ビームを打ち込むことによってプラズマ波動を励起し、SWPIAの動作原理やアルゴリズムを検証するための実験を行う。-衛星と等価CPU上におけるSWPIAソフトウェアの開発を開始する。-モジュールAの計算結果を初期値とするモジュールBの計算に着手し、磁気嵐時にダイナミックに変化する内部磁気圏において、いつ・どこでコーラスの非線形発展が観測されるかをシミュレーションから導出する。また、その結果をふまえて、計算機上でS-WPIAの疑似観測を行う。(抄録なし)(抄録なし)
アイカメラによるICT活用指導法の解明に基づく、大学演習カリキュラムの開発と実践

小・中学校における電子黒板を活用した授業実践(情報提示と意見交流場面を軸に)を対象に、授業構成法と指導法について分析検討した。特に指導法については、アイカメラを用いて教師の視線推移を捉え検討を加えた。本結果もふまえ、教員養成課程の大学授業において電子黒板活用授業の実践記録動画を視聴し、教師の情報機器選択と視線推移について分析的に捉え、指導法や指導意図を読み取らせる演習授業を開発・試行実施した。平成22年度前期より4社のアイカメラを実際に試用し比較検討を行い、日常の教育実践時に用い実践研究・データ収集を行うために、最も視点の動向・停留データを正確に取得・記録でき、動作・加重・心理的な負荷、データ分析負荷等が少ない機種を再選定した上でアイカメラを導入した。一方、電子黒板・ノートパソコンを整備し、それらICT機器を用いた試案授業を現職教諭の研究協力のもと実践し、担当教諭の実践中における視点の動向・停留データを測定した。実践はビデオカメラによる記録も行った。授業後、担当教諭に振り返り調査を行った結果、電子黒板を全く使ったことのない教諭であったが、電子黒板の負荷は小さく、実践での活用に難が少ないとの意見が寄せられるとともに、実践自体も無理のない流れの中に電子黒板が位置付けられていた。電子黒板導入により特殊な授業構成法(ストラテジー)が必要となるというより、基本的な授業構成法(ストラテジー)に電子黒板による教授機能が付随していくというイメージであった。平成23年度も継続して電子黒板の実践活用をすすめる中で、当該教諭の授業構成法の変容を見ながら、ICT活用指導法の特性について明らかにしていきたい。なおアイカメラについては、学習者の言動ならびに教諭の聞き取りから、心理的な違和感・行為負荷を感じていたことも明らかとなった。平成23年度前期に継続使用し指導者・学習者相互の心理的負荷の軽減を図り、平成23年度後期より中心的な教材開発と授業開発・実践に移りたいと考える。この他、四国各県の電子黒板導入実践校を訪問し、積極的に電子黒板を活用している教諭の授業観察を行った。その結果、実践中に教諭が指導・指示などを行っていない隙間時間に電子黒板を操作する行為が頻繁に観察された。平成23年度より、使い慣れた教諭にも研究協力を頂き、アイカメラを用いたICT活用授業における指導・支援行為と指導法の解明を進めたい。(1)ICT機器を活用した授業構成法についてメディアを活用する授業の構成法としては、大きくは「導入」「展開」「まとめ」の3ブロックに分けられ、またガニエの『9教授事象』などにも見られるように、それぞれの学習シーンの学習目的/教育目的を明確にした上で、どの学習シーンでどのメディアを選択するのかを決め、支援計画を立てるというのが、これまでの主な構成法といえる。しかしながら現職教員へのアイカメラ調査+インタビュー調査をすすめると、計画段階で体上記のような授業構成の思考を行っているものの、授業実施段階においては、児童生徒の学習状況に応じて、情報提示の仕方・ICT機器の使用の有無・新たな情報提示を行う場面が観察され、また[計画]+[状況対応]という思考で授業が構成されていることが、教師自身からも報告された。(2)アイカメラを用いた調査分析平成22年度の調査より、授業実践中に教師が指導・指示などを行っていない隙間時間に電子黒板を操作する行為が見られたが、平成23年度調査においては特に「教師が指示を行い、児童生徒が何らかの思考や活動を行っている間に、ICT機器化視線を向け準備操作などをする」という行為が何事例か認められた。また、工CTから離れたところからICTに視線を向け、児童生徒の学習を支援する場面も確認された。「授業の流れ」と「教室空間全体における教師の動き」を含めて、教師の教授行為と視線の推移を分析する必要があると考える。1アイカメラを用いた授業中の教師の視線推移調査とその分析(H23継続)本年度は多校種(小・中学校)におけるIC活用授業を対象に、教師の視線推移と行動を調査分析・検討した。中学校においては、技術科「製作品の設計・製作」の授業を対象に、電子黒板活用の有無による授業の差異を分析した。その結果、発表・意見交流場面に電子黒板を活用した授業の方が、多くの生徒の意見を短時間で取り上げた。また電子黒板活用により、生徒の発表に並行して教師が考え方を整理・確認し授業を進める特徴が見られた。生徒発表時の教師の視線については、電子黒板活用時に発表者と視線を合わせたり視線を向けたりする時間割合が増える一方、視線移動時間の占める割合が約半分に短縮された。電子黒板活用授業の方が、視線推移の観点から、授業中の教師行動中の時間ロスが削減される可能性が見えてきた。一方小学校においては、小学校3年生算数・国語・理科の授業実践を対象に調査分析・検討した。学習内容により差異はあるものの、電子黒板を活用した授業においては、電子黒板操作

場面より前に、教師が電子黒板に視線を向け表示情報を確認したり、次の情報提示が停滞することなく進むよう予め機器や周辺環境を調整する行為が教科を超えて確認された。また児童に操作演示させたり説明させる場面では、特に学習に課題をもつ児童に視線を向けたり児童の傍らに存在するなど、電子黒板活用授業における教師の指導上の配慮行動が確認された。2大学演習カリキュラムの開発と実施本年度より本学教育学部の授業枠組が変更となり、本研究計画を若干変更して授業カリキュラムを開発し実施することとした。電子黒板活用授業を多角的に撮影した映像を編集したVTRを視聴させ授業理解を促した上で、2度目の視聴において、教師の「行為」と「視線対象」に焦点化し授業分析を行い、教師の指導意図を読み取らせる演習授業を実施した。従来アイカメラを用いた研究においては、被験者が常時座っている状態、あるいは殆ど体勢を変えない状態で視線推移を計測するが、本研究においては教師がアイカメラを装着し、日常の授業と同様に教室等学習空間において大きく動きながら指導する状況下において計測・データ収集を行っている。データ収集を何度か重ねる中で、アイカメラの設定精度に個人差が生じ、設定時間(休み時間など)内に十分な設定精度を高めることができず、データ精度が下がってしまったと思われることがあった。研究データとして採用しうる精度を担保するため、また複数の教師の視線推移を比較検討することによって、個人差を解釈する必要があると考えられることから、アイカメラによる教師の視線推移計測に、計画よりも時間がかかっている。24年度が最終年度であるため、記入しない。項目9に記した研究知見を基に、本年度は前期を中心に、ICTを活用した授業実践を、アイカメラを用いながら記録・分析するとともに、教師に対するインタビュー調査を継続し、項目9の(1)(2)が複数の教師・複数の実践記録に対しても認められる「ICT機器を活用した授業構成法・指導法」と言えるかどうかについて、明らかにしていきたい。これらを基に大学における演習カリキュラム(試案)を作成し、後期(10月)の大学授業において、演習カリキュラムを試行実施し、受講学生より評価を得たいと考えている。
多重選択を用いた投射経路別遺伝子発現による次世代光遺伝学ツールの開発

特定領域の神経細胞にアデノ随伴ウイルスベクター(AAV)を用いてCre-TTCを発現させ、その領域に投射している領域の神経細胞にCre依存的に遺伝子発現を生じるAAVを感染させた。既に投射が確認されている黒質から線条体へ投射するドーパミン神経を用いた。線条体領域にCre-TTCを発現するAAV-CMV-Cre-TTC-2A-mCherryを発現するAAVを感染させ、黒質領域にCre依存的にGFPを発現するAAV-CMV-FLEX-GFPを感染させた。その結果、黒質から線条体に投射する神経特異的に緑色蛍光が観察された。このことから、経シナプス逆行性に移行して機能することが確認出来た。光遺伝学は特定神経の活動を光で操作する新しい技術であり、複雑な神経回路の機能と動作原理の解明に大きな進歩をもたらした。この技術をさらに進化させ、次世代の光遺伝学を達成するためには、投射経路選択的な遺伝子発現制御が必要となってくる。本研究では、Creリコンビナーゼやフリッパーゼ(FLPe)などの組換え酵素を経シナプス的に順行性トレーサー、もしくは逆行性トレーサー分子との融合タンパク質として発現させることで、多重選択による投射経路特異的な遺伝子発現を達成し、複数領域から入出力を受ける神経細胞に対して光遺伝学の適用を可能にする。この多重選択を用いた投射経路特異的遺伝子発現制御が実現すれば、動物個体を用いた神経回路の同定と動作原理の解明に大きく貢献出来ると考えられる。これまでに経シナプス逆行性の機能を持つテタヌストキシン無毒化C末端断片とCreの融合タンパク質を発現するアデノ随伴ウイルスベクター(AAV-CMV-Cre-TTC-2A-mCherry)の開発を行った。Cre依存的に遺伝子を発現するAAV-CMV-FLEX-GFPウイルスベクターとの組み合わせによって投射経路特異的に遺伝子発現誘導を確認した。CreとFlpの二重選択で遺伝子発現を誘導するアデノ随伴ウイルスベクター(dFRT-CMV-FLEX-GFP)の開発に成功しており、これらを用いて多重選択による投射経路特異的な遺伝子発現制御を試みる。特定の領域に投射している神経細胞特異的に遺伝子を発現させるために、破傷風毒素の無毒化C末断片を融合させた経シナプスCre(Cre-TTC)を作成した。これを発現するアデノ随伴ウイルス(AAV)ベクターを作成し、様々な脳領域において発現と機能を確認した。投射元の神経細胞にCre-TTCを発現させ、投射元神経細胞に投射している神経にはCre依存的に遺伝子発現を起こすAAVを感染させた。また、AAVだけではなく、逆行性感染を起こすことが知られているイヌアデノウイルス(CAV2)を用いて投射経路特異的な遺伝子発現を確認した。投射先領域にCre依存的にフリッパーゼ(Flp)を発現するCAV2を感染させ、投射する神経にはFlp依存的に遺伝子発現を起こすAAVを感染させた。つまりCAV2を感染させた領域に投射するCre発現神経細胞だけで、Flpが発現して機能することになる。FlpはFRT配列を認識して組換えを起こすため、Cre活性とは別に遺伝子発現を制御することが可能となる。この方法を用いてCre-TTCとCAV2との投射経路特異的な遺伝子発現効率を比較して検討をおこなった。CAV2と比べてCre-TTCによる投射経路特異的ラベルは、遺伝子発現細胞が認められるものの、数が少なかった。これは、経シナプスの効率が悪いためと考えられる。そのため、さらに効率を上昇させるような改良が必要であることが分かった。投射経路特異的な遺伝子発現を確認することが出来ており、Cre-TTCが経シナプス逆行性に移行することを確認した。逆行性感染をするCAV2と効率を比較することで機能を評価することが可能となった。多重選択に用いるための、新しいトランスジェニックマウス(orexin-Flp)マウスを作成した。オレキシン神経特異的にフリッパーゼ(Flp)を発現しており、Creと異なるFRT配列を認識するために、Creと同時に多重選択に用いることが可能となる。Flpの活性とFlpのオレキシン神経特異的な発現を確認するために、orexin-Flpマウスを蛍光レポーターマウスROSA-loxP-stop-loxP-mTFPマウスと交配させた。免疫組織化学的解析の結果、オレキシン神経だけでmTFPの緑色蛍光が認められた。これらの結果は、オレキシン神経だけでFlpが発現しており、また機能していることを示している。そこで、次にorexin-Flpマウスをメラニン凝集ホルモン(MCH)-Creマウスと交配させ、orexin-Flp; MCH-Creマウスを作成した。MCH神経はオレキシン神経の近傍にあり、ウイルスベクターを用いた方法では、通常この2つの神経群に別々の遺伝子を発現させることは不可能である。Flp依存的に緑色蛍光タンパク質を発現するアデノ随伴ウイルスベクター(AAV)と、Cre依存的に赤色蛍光タンパク質を発現するAAVをorexin-Flp; MCH-Creマウスの視床下部に局所感染させて遺伝子を発現させた。その結果、オレキシン神経には緑色蛍光が、MCH神経には赤色蛍光が認められ、両者は全く一致しなかった。これらのことは、FlpとCreを用いて近傍の細胞に別々の遺伝子を発現させることに成功したことを示している(2重選択)。

同様にorexin-Flpマウスを、GABA作動性神経特異的にCreを発現するマウスや、コルチコトロピン遊離因子(CRF)神経特異的にCreを発現するマウスと交配させて、同様にそれぞれの細胞種に異なる遺伝子の発現に成功した。また、光遺伝学を適用するためにチャネルロドプシン2を発現するAAVを用いて特定神経への遺伝子発現と、光による神経活動操作も達成した。特定領域の神経細胞にアデノ随伴ウイルスベクター(AAV)を用いてCre-TTCを発現させ、その領域に投射している領域の神経細胞にCre依存的に遺伝子発現を生じるAAVを感染させた。既に投射が確認されている黒質から線条体へ投射するドーパミン神経を用いた。線条体領域にCre-TTCを発現するAAV-CMV-Cre-TTC-2A-mCherryを発現するAAVを感染させ、黒質領域にCre依存的にGFPを発現するAAV-CMV-FLEX-GFPを感染させた。その結果、黒質から線条体に投射する神経特異的に緑色蛍光が観察された。このことから、経シナプス逆行性に移行して機能することが確認出来た。当初の予定をほぼ達成しており、計画通りに順調に進展している。Cre-TTCの経シナプス移行効率を向上させるために、様々な付加配列を検討しており、それらを付加したタンパク質を発現するためのプラスミド構築を進めている。これらを用いて移行効率が上昇するかどうか確認を行っていく。神経科学経シナプスCreの開発は出来ているが、移行効率が高くない。そのため多重選択では、十分な数の神経細胞に遺伝子発現を行うことが難しい。そこで、様々なモチーフの追加や配列の工夫によってこれを向上させるための改変を行っている。
回転マグネットで内部励磁する風力・マイクロ水力用高性能誘導発電機の開発

本研究では,風力・マイクロ水力発電に利用する誘導発電機の高性能化を目的に,ロータ内部に回転マグネットを内蔵した新構造の誘導発電機(「PM誘導発電機」と仮称)について検討した。得られた成果は,次の通りである。1.設計理論の開発構造及び運転法の最適化を検討するには,特性を定量的に予測できる理論が必要である。そこで,回路モデルによる特性算定法と磁界解析法を構築した。<1.1>回路モデルによる特性算定法の構築PM誘導発電機内部の非線形磁気現象を忠実に反映するため,双対原理を用いて特性解析用の回路モデルを導出し,その妥当性を検証した。導出したモデルは,実測値と数%以内の誤差で,精度よく特性が予測できる。<1.2>磁界解析法の構築開発した回路モデルと2次元静磁界解析を組み合わせた新規な磁界解析法を構築した。これにより,機器内部の非線形電磁現象の可視化と定量的な把握を可能にした。2.性能試験2.2kWの試作機を製作し,これにより以下の性能試験を実施した。<2.1>連系時の突入電流測定試験連系時の電圧の投入位相,ロータの回転速度をパラメータに突入電流の特性を解析した。その結果,突入電流の大きさは,回転速度に依存せず,電圧の投入位相だけに関係することが判明した。今後,得られた結果を基に,突入電流の抑制法を検討する必要がある。<2.2>負荷試験力率,効率特性を中心に,三相ならびに単相運転した場合の出力特性を実測した。また,PM誘導発電機の性能をより明確に把握するため,同一体格の汎用誘導発電機と比較した。その結果,汎用誘導発電機に比べて,力率,効率ともに58%程度向上することが分かった。特に,出力が約1.31.5倍増加し,回転マグネットの効力が実証できた。本研究では,風力・マイクロ水力発電に利用する誘導発電機の高性能化を目標に,ロータ内部に回転マグネットを内蔵した新構造の発電機(これを「PM誘導発電機」と仮称している)の開発を行っている。平成14年度の研究内容及び実績は,以下の通りである。[平成14年度の研究内容及び実績]2.2kW級のPM誘導発電機を試作し,設計理論の開発と性能試験を行った。1.設計理論の開発構造や運転法の最適化を検討するには,まず,特性を定量的に予測できる理論の開発が必要である。PM誘導発電機は,汎用機と異なり,運転電圧により内部の磁気現象が極端に非線形になる。本研究では,これを忠実に反映するため,双対原理を用いて特性解析用のモデルを開発し,その妥当性を検証した。開発したモデルは,実測値と数%以内の誤差で,精度よく特性を予測できる。2.性能試験特性把握を目的に,以下の性能試験を実施した。今後得られた結果を基に,突入電流の抑制法を検討する必要がある。<2.2>負荷試験力率,効率特性を中心に,PM誘導発電機の出力特性を実測した。また,その性能をより明確に把握するため,同一体格の汎用機と比較した。その結果,汎用機に比べ,力率,効率ともに58%程度向上することが分かった。特に,出力が約1.3倍増加し,回転マグネットの効力が実証できた。

<2.3>単独発電試験汎用機は単独発電できないが,PM誘導発電機は内部に回転マグネットを有するため,これが可能であり,独立電源としても期待できる。そこで,本年度は,研究の取り掛かりとして,単位法を用いて単独発電時の運転特性を定量的に予測できる理論の開発を行い,その妥当性を検証した。以上の研究成果(一部)は,既に電気学会論文誌に1編掲載され,評価を得ている。また,同論文誌とIEEE Trans. on Energy Conversionに,現在,3編投稿中である。[平成15年度の予定]引き続き,性能の実験な評価と,種々の運転条件における解析手法の開発を進め,所期の目的が達成できるように努める。本研究では,風力・マイクロ水力発電に利用する誘導発電機の高性能化を目標に,ロータ内部に回転マグネットを内蔵した新構造の発電機(これを「PM誘導発電機」と仮称している)を開発している。平成15年度の研究内容及び実績は,以下の通りである。【平成15年度の研究内容及び実績】平成14年度に引き続き,2.2kWの試作PM誘導発電機を用いて,理論の開発と性能評価を実施した。1.理論の開発平成15年度は,主に以下の内容を重点的に検討した。<1.1>不平衡モデルの導出前年度までに開発した回路網解析を拡張し,不平衡運転下における定常性能を理論的に予測できる回路及び数学モデルを導出した。これにより,単相運転を含む特殊運転下の定常性能を理論的に評価できるようにした。<1.2>磁界解析法の開発回路網解析と2次元静磁界解析を組み合わせた新規な磁界解析法を開発した。これにより,機器内部の非線形電磁現象を定量的に把握できるようにした。2.単相運転時における性能評価前述の理論と実験により,単相系統に接続したPM誘導発電機の性能を評価した。通常,単相運転すると逆相分磁界の影響により性能が著しく低下するが,開発中のPM誘導発電機は,回転マグネットで内部励磁するため,逆相分磁界の発生が少ない。このため,通常の誘導発電機に比べて,以下の優れた性能を有することが判明した。(1)同じマシンサイズで比較すると,出力は1.5倍大きい。(2)回転マグネットにより高磁界化できるため,同一出力を得るのに系統電圧が低くて済み,鉄損が通常の1/3以下である。(3)出力増加と損失の低減により,滑りの広い範囲で,高力率,高効率で運転できる。以上の研究成果は既に幾つかの学会(講演論文)で発表し,評価を得ている。今後,学術論文として,本年度の研究成果を広く公表する予定である。
喉頭癌におけるJab1による影響と機序の解明およびp27の関連について

Jab1はもともと,転写因子c-JunとJunDに特異的に会合し転写活性化のco-activitorとして働く因子として単離されていたものであった。最近,Jab1の結合は,p27に特異的にであり,p27の分解を促進する活性をもつことがわかった。Jab1の強制発現はp27の増殖抑制能を中和し,また,Jab1を過剰に発現する細胞は増殖因子を除去しても細胞周期が進行することから,Jab1によるp27の分解促進は生理学的に意義のある現象であることがわかる。この研究では,喉頭癌において,Jab1の発現と癌の発生・進展との関連性を明らかにし,これらにより,Jab1は,p27と共に,喉頭癌の発生・進展病態において重要な役割を果たしていることを示すことができる。また,これらの蛋白質の発現解析を通じて喉頭癌の病期診断や予後診断などにも寄与することができる。
重症心身障害児における能動的コミュニケーション過程の評価と促進方法に関する研究

1.重症心身障害児・者における注意機能の評価重症者14名を対象に、注意喚起機能を評価する呼名条件、注意維持機能を評価する視聴覚複合刺激呈示条件の2条件において、行動反応および心電図を記録した。2名により注視行動の有無を観察し、各時点の注視行動生起率を求め、さらに注視行動潜時と平均持続時間を算出した。その結果、対象者は以下の3群に分類された。A群(6名):喚起・維持良好群(潜時2秒未満、平均持続時間5秒以上)。B群(6名):喚起・維持可能群(潜時2秒以上、持続時間2.55.0秒)。C群(2名):喚起困難群(生起率自体が極めて低い)。(上記については、日本特殊教育学会第35会大会にて発表予定)。これらの注視行動の生起様相は、心拍反応の評価結果(第34回報告)と対応した。2.重症心身障害児・者における援助条件下における期待反応の促進能動的コミュニケーションの1つである「働きかけに対する期待」の促進方法を検討するために、単独条件と援助条件においてS1-S2刺激事態で上記同様の測定を行った。対象者は、A群とB群に属する7名とした。援助者は、各刺激に対する注意喚起やS1-S2間隔における注意維持、S2に対する共感を意図した触刺激を伴う言語的働きかけを行った。その結果、行動反応には快の情動表出の増加、心拍反応には減速反応の明瞭化が認められ、援助による促進効果が確認された。援助の効果を、反応促進の背景となる覚醒水準の上昇を含め、持続性心拍変動より多水準的に検討する必要がある。また、C群に属する者の援助方法について検討を行う必要がある。
表面再構成構造のマイクロバランスおよび光を用いたその場測定

本研究では、結晶成長時にエネルギーを安定させるために成長最表面で起こる結晶内部と周期の異なる表面再構成構造のその場測定を行い、結晶方位や成長条件により多く存在する再構成構造を明らかにするために、以下の研究を行った。1.現在、電子線などを用いた高真空中の観察で明らかになっている種々の再構成構造をマイクロバランスを用いたその場観察方法で定量的に明らかにする、2.高真空中でなく、実際の結晶成長が行われる常圧付近の再構成表面を光を用いたその場測定装置で明らかにする。その結果、常圧においてGaAs(001)GaおよびGaAs(001)As表面の再構成構造が明らかになった。具体的には、GaAs(001)Ga面においては、キャリヤ-ガスである水素が最表面のGa原子に解離吸着し、Ga-Gaダイマー構造がAs_2-Ga-HのSP2結合に変化する、また、水素分圧と水素原子の表面被覆率の関係を明らかにした。さらに、GaAs(001)As面からのAs脱離により、常圧でも(2x4)再構成面が形成されることを定量的に初めて明らかにした。
魚類中枢神経系の生体警告・防御機構における間脳背側部の役割

魚類の間脳背側部は、交連下器官を除けば松果体・背嚢・傍松果体の3つの脳室周囲器官によって占められているが、そのうち松果体と背嚢は有窓性毛細血管の分布に富み、各々の内腔は第三脳室に開き、上皮の自由表面は髄液に露出している。一方、傍松果体は視床上部を覆う髄膜の肥厚部に埋もれており、手綱核等の脳組識との神経連絡の存在が推察される。このような間脳背側部における血液-脳関門の有無を調べ、異物の脳内侵入に対する生体警告・防御のしくみを明らかにする目的で、標識物質(タンニン酸・トリンパ青・HRP・フェリチン)をニジマスの腹腔又は直接血管中に注入した後、経時的に脳標本を採取し、実体・光学・電子顕微鏡標本を作製して写真撮影・解析を行った。その結果、次のようなニジマスの間脳背側部の血液-脳関門のしくみが明らかにされた。1.タンニン酸の細胞間輸送を遮断する閉鎖結合は、各器官の上皮細胞間頂上部に見られた。2.各器官の被膜におけるHRPに対する捕促・篩機構として、松果体と背嚢では血管周囲腔の大食細胞・線維芽細胞と毛細血管内皮細胞が、一方傍松果体ではコラーゲン線維網が重要な役割を演じている可能性が示唆された。3.松果体と背嚢では上皮細胞基底部からの標識物質(HRP・フェリチン・トリパン青)の取り込みが盛んで、取り込まれた物質の一部又はかなりの部分がライソゾームによって隔離・貯蔵された。4.松果体と背嚢の上皮細胞によって取り込まれたHRPとフェリチンの残りの部分は細胞内輸送によって頂上部へ運ばれ、エキソサイトーシスによって髄液中に放出されるが、これは内腔及び脳室内大食細胞によって取り込まれ隔離された。このように、本研究ではニジマスを用いて、間脳背側部における血液から脳室及び脳組織への異物の侵入経路とそれに対する防御の機構が明らかにされた。
「女流」浪花節の史的展開に関する研究

2018年度は、3つの方向から研究を進めた。(1)大正期半ばから隆盛をみた「女流団」の、第二次大戦後の実態に関する調査を、部分的に進めた。第二次大戦後に実際に「女流団」で活動していた経験をもつ現役・ベテランの女流浪曲師に聞きとり調査を行い、インタビュー内容を書き起こして整理し、昭和期半ば過ぎの「女流団」の具体的な活動のありかたの一側面を整理した。(2)明治大正期の女流浪曲師のリストを作成した。前年度から継続させていた作業であるが、明治大正新聞雑誌文庫と国会図書館にて当時の記事の補足調査を行い、同一覧表をほぼ完成させた。(3)大正期に活動した「女流」浪曲師のフシの分析に着手した。大正期に録音された「女流」浪曲師たちによる音盤の音(国際日本文化研究センター図書館および国会図書館所蔵)を素材に、彼女たちがどのような浪曲を誦したのか、採譜と分析を行う作業に着手した。分析の途中経過として、彼女たちそれぞれの活動初期の音盤では、当時人気を博していた男性浪曲師・二代吉田奈良丸が用いた旋律型をなぞったフシが用いられているが、各人とも次第にそこから離れて、独自のフシ、あるいは、フシとタンカ(セリフ部分)の関係という観点からみた時の独自の誦しかた、を作り上げていったさまが浮かび上がった。明治大正期の新聞言説では、女流浪曲師に関して、「奈良丸の真似」とする記事が少なからず見受けられるが、出発点はそこであっても、そこからそれぞれの「女流」が脱却して独自の芸風を作り上げていったとの仮説が導出された。2018年度の進捗状況自体は順調である。しかし、初年度である2017年度、申請者の健康状態によって、遠隔地へ赴いての資料調査やインタビューが全くできなかったことから、全体としての進捗状況は当初の計画よりもやや遅れている。2019年度は、2018年度に部分的に行ったインタビューとフシの分析をそれぞれ進める。フシの分析に関しては、2018年度に得られた仮説の検証と、「女流」浪曲師相互の影響関係の考察の段階に入る。申請者の病気により、本課題研究への着手がほぼ一年遅れて開始されたとの経緯から、計画を一年延長しての課題遂行を考えている。平成29年度は代表者の健康上の理由で、計画のうち、特に旅行を伴うインタビューについては予定通りの実施が困難となった。この事情により、限られた範囲での活動となったものの、以下の成果を得ることができた。(1)第二次世界大戦前の時期に活動した女流浪曲師のリストを、主として新聞・雑誌記事の記述をもとに整理した。平成29年度末の時点では、計110名の女流浪曲師について、1人物(本名、生没年、番付での位置、レパートリー等)、2新聞・雑誌での記述一覧、3詞章速記本一覧、4音盤一覧、のリストアップを行った。このリストは、平成30年度以降の研究のための基礎データという性格をもつ。(2)研究の途中成果の一部を、平成30年2月12日に京都府の国際日本文化研究センターで行われたシンポジウム「浪花節と講談の関係を探る」(国際日本文化研究センター・京都市立芸術大学日本伝統音楽研究センター共催)のシンポジストとして発表した。発表内容は、直接的には「女流」浪曲師に関するものではないが、浪花節のレパートリーとジェンダーの問題を考える過程で得られた観点を別の方向から探ったものである。この発表内容は、論稿として、大阪教育大学研究紀要に投稿予定である。(3)早期に音盤を吹き込んだ数名の女流浪曲師の音盤について、聴き取りによる分析を行った。分析結果の一部は、2019年度に単行本として刊行予定の浪曲論集(共著書、せりか書房)へ向けての論稿(執筆中)に反映させている。平成29年度は、代表者の入院、手術、術後の通院治療により、旅行を伴うインタビューに関して、日程と体力を確保して予定通り遂行することが厳しい状況となった。このことから、全体としての進捗状況はおおむね順調であるものの、インタビューに関しては予定の一部のみの遂行となったため、上記区分となった。

分析の途中経過として、彼女たちそれぞれの活動初期の音盤では、当時人気を博していた男性浪曲師・二代吉田奈良丸が用いた旋律型をなぞったフシが用いられているが、各人とも次第にそこから離れて、独自のフシ、あるいは、フシとタンカ(セリフ部分)の関係という観点からみた時の独自の誦しかた、を作り上げていったさまが浮かび上がった。明治大正期の新聞言説では、女流浪曲師に関して、「奈良丸の真似」とする記事が少なからず見受けられるが、出発点はそこであっても、そこからそれぞれの「女流」が脱却して独自の芸風を作り上げていったとの仮説が導出された。2018年度の進捗状況自体は順調である。しかし、初年度である2017年度、申請者の健康状態によって、遠隔地へ赴いての資料調査やインタビューが全くできなかったことから、全体としての進捗状況は当初の計画よりもやや遅れている。(1)冊子としての刊行の可能性も射程に置いて、ここまでに作業を進めた、基礎データとしての女流浪曲師リストを、さらに整備する。(2)取組が遅れた女流浪曲師へのインタビューに関して、関西の浪曲師も対象に加え、少しずつ実施を進める。(3)「女流」から見たときの浪花節の歴史を、第二次大戦前までの流れを俯瞰した上で把捉し、平成30年度から本格的に着手する予定の録音物の分析にあたっての観点を確かなものにする。2019年度は、2018年度に部分的に行ったインタビューとフシの分析をそれぞれ進める。フシの分析に関しては、2018年度に得られた仮説の検証と、「女流」浪曲師相互の影響関係の考察の段階に入る。申請者の病気により、本課題研究への着手がほぼ一年遅れて開始されたとの経緯から、計画を一年延長しての課題遂行を考えている。病気により、平成29年度に関しては、全面的に研究活動を展開することができなかった。次年度以降、インタビューならびに資料調査を補う形へと計画を組み替え、進展させてゆく。初年度(2017年度)にほとんど研究活動を行えなかったことから、繰り越しで次年度使用額が生じている。研究期間を一年延長して当初の研究目標を遂行する計画である。
腸内細菌と3型自然リンパ球による病原性真菌の腸管定着阻害機構の解明

Candida albicansは腸管内で常在する真菌であるが、腸内細菌叢の攪乱や宿主の免疫力が低下した状況では腸管内で異常に増殖し、危険な感染症の一つである侵襲性カンジダ感染症の要因となる。本研究では、腸内細菌と自然免疫細胞の一つである3型自然リンパ球に着目し、腸管におけるC. albicansの定着・増殖抑制機構の解明を試みる。特に嫌気培養装置を用いて腸内細菌を分離し、C. albicansの増殖を抑制する腸内細菌および腸内細菌由来因子を同定する。本研究は微生物の腸内定着機構という生物学的に重要な意義を有するのみならず、腸内細菌を応用した予防・診断・治療法の開発に繋がることも期待される。
サーモグラフィーを用いた非侵襲的な移植肺グラフトの評価方法の開発

研究1ではサーモグラフィーを用いて体外肺潅流中のグラフトを評価するため、ビーグル犬を正常群、潅流障害群、肺水腫群の3群に分け、潅流障害群では左下肺動脈を結紮し潅流障害領域を作成、肺水腫群では左下葉に生食を注入することにより肺水腫領域を作成した。サーモグラフィーを用いて体外肺潅流中に肺表面温度を観察すると潅流障害部位は正常部位と比較し温度が低く、また肺動脈カニューレクランプ時には肺水腫群で温度低下が遅いことにより3群を明確に区別することが可能であった。本研究の目的は移植前後のグラフトの肺障害を非侵襲的かつ即時的に評価する方法を開発することである。申請者らは「非潅流領域は温かい潅流液が潅流されず正常潅流領域と比較し温度が低い」と仮説を立て、ラット体外肺換気潅流モデルにおいて非潅流部位を同定できることをすでに証明していた。この結果に基づき、大動物を用いた体外肺潅流装置において局所障害部位の同定を試みた。ビーグル犬を正常群、潅流障害群、肺水腫群の3群に分け、潅流障害群では左下肺動脈を結紮し潅流障害領域を作成、肺水腫群では左下葉に生食を注入することにより肺水腫領域を作成した。サーモグラフィーを用いて体外肺換気灌流中に肺表面温度を観察すると潅流障害部位は温度が低く、正常部位と明確に区別することが可能であった。また肺動脈カニューレを遮断すると正常肺は温かい潅流液が末梢まで到達せず急速に冷却されるが、肺水腫が存在する場合は末梢気管支に空気が到達できないことと、空気に比べ比熱が高いことにより肺表面温度の低下が遅いことが判明し、このことにより肺水腫領域を区別することが可能であった。この成果は2017年4月の国際心肺移植学会のmini oral sessionで発表した。大動物モデルにおいて障害部位を検出できることが判明し、実験4として申請していたHumanの肺移植後の再灌流時、人工心肺離脱時の肺表面温度の測定と術後の予後との比較を54例、89グラフトを対象に解析した。肺表面温度のヒストグラムは正規分布を示したが、明らかに温度が低く、正規分布から外れたグラフトが3例認められた。その3例の内2例は在院死の転帰をたどり、残りの1例は問題なく退院となったが、術後6か月の肺血流シンチグラフィーでは血流比の左右差が認められた。この成果は2017年9月の日本胸部外科学会にて発表予定である。実験3として申請したHumanのresearch lung(障害肺)と正常な肺の比較は日本での体外肺換気潅流を行うことは現実的に難しく、実現に至っていない。現在Humanでの体外肺換気潅流を行っているトロント大学およびその他の海外の研究機関との共同研究を模索している。この成果は2017年9月の日本胸部外科学会にて発表した。

サーモグラフィーを用いて体外肺潅流中に肺表面温度を観察すると潅流障害部位は正常部位と比較し温度が低く、また肺動脈カニューレクランプ時には肺水腫群で温度低下が遅いことにより3群を明確に区別することが可能であった。当院で施行されている肺移植後のグラフトの再灌流後の肺表面温度の測定を引き続き継続し、その予後や肺血流シンチグラフィーとの対比を重ね、障害と肺表面温度との関係をより明らかにする。このことにより直後に生じた物理的なトラブルを早期に発見し手術終了前に改善でき本邦の肺移植の成績を向上し得る可能性がある。また、Humanの体外肺換気潅流を行っている施設と交渉し、共同研究としてサーモグラフィーを用いたマージナルドナー肺の体外肺換気潅流中の評価を行い、これまでの実験の臨床応用を目指す。肺移植
トランスポゾンシステムを利用したC57BL/6 マウスにおけるミュタゲネーシス

Sleeping Beautyトランスポゾンシステムを利用しての変異マウスの作製には、以前より成功していた。本研究では、多くの研究者が汎用しているC57BL/6マウスにおいて、Sleeping Beautyトランスポゾンシステムを構築することを目標とした。そのシステムの構築のためには安定したトランスポーゼースを発現させる必要性があるので、C57BL/6マウス由来ES細胞のRosa26遺伝子座にトランスポーゼースを挿入させたクローンを獲得し、いつでも供給出来る体制を整えた。これまで行っていた生殖細胞系列でのトランスポゾン転移の実験は、mixedバックグランドだった。同様のシステムをB6バックグランドで再構築する。すなわち転移の駆動力になるトランスポーゼース発現トランスジェニックマウス(SBマウス)と、トランスポーゼース認識配列を有するトランスジェニックマウス(GFPマウス)をそれぞれB6バックグランドで樹立することを目的とした。SBマウスは駆動力の高いマウスを1ライン選択するために、B6由来ES細胞に効率よくノックインできるターゲティングベクターを作製した。そのターゲティングベクターは、遺伝子が持続的で安定に発現しうるROSA26遺伝子座に目的とする遺伝子を挿入できるものである。従来のROSA26遺伝子座へのターゲティングベクターは、非相同組み換え体の獲得頻度が高かったのでスプライスアクセプターを薬剤耐性遺伝子(Neo)の上流に挿入し、相同組み換え体の獲得頻度を上昇させる工夫をした。実際にF1(126×B6)タイプのES細胞にトランスフェクトして調べたところ、多くのコンストラクトで必ずNeo耐性株のうち半数以上は目的のノックインクローンであることが判明した。現在、トランスポーゼース(SB)をROSA26ターゲティングベクターに挿入する準備をしているところである。なお、B6由来のES細胞は、購入予定である。GFPラインに関しては、多くのラインからベストのラインを選択する準備をした。まず、B6由来ES細胞を筑波大学生命科学動物資源センター杉山文博博士より供与を受けた。それらのB6由来ES細胞は生殖系列に入りやすいことが判明しているものである。そのB6由来ES細胞のROSA26遺伝子座に効率よくノックインできるターゲティングベクターを作製し、SBtransposaseがROSA26遺伝子座に挿入されたES細胞クローンを数種類得た。核型も正常だったので、その細胞由来のマウスを作製する準備段階である。他のトランスポゾンシステムも構築するため、piggybag transposaseも同時にROSA26遺伝子にノックインを行った。これらの細胞の核型も正常だったので、その細胞由来のマウスを作製する準備段階である。GFPマウスに関してはすでに樹立されているマウスから転移効率のよいものを選択する準備をしている。生殖細胞系列でのトランスポゾン転移の実験は、mixedバックグランドだった。同様のシステムをB6バックグランドで再構築し、マウスの表現型解析に利用される系を作る事が目的である。核型も正常だったので、マウス作製のリソースとしてストックした。これらの細胞の核型も正常だったので、その細胞由来のマウスを作製するリソースとしてストックした。GFPマウスは共同研究で行っているオランダのグループのマウスがそれに相当する為、転移効率の良いものが選択できる体制が出来ている。