hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
膵癌における糖鎖構造変化解析とその臨床的意義を解明する研究

膵癌は発見時に進行していることが多く、また切除できても術後生存成績は非常に悪いのが現状である。早期発見、予後不良患者の同定は膵癌治療成績を向上する上で重要である。そこでます膵癌患者の予後解析、糖鎖抗原との関連を調べるために当科における過去の膵癌患者のデータベースを作成し予後解析を施行した。一方、我々はがん組織に高発現する複合糖質について研究を行い、KL-6とよばれる抗体によって認識されるムチン(KL-6ムチン)の発現が、乳頭部がんや大腸がんといった消化器がんにおけるがんの病態に関与することを明らかにしてきた。本研究では、予後が悪い膵癌(pancreatic carcinoma)における早期診断や予後診断に有用な腫瘍マーカーの開発を目指し、様々な手法を用いた膵癌におけるKL-6ムチンの臨床的意義を明らかにすることを目的とした。膵癌患者の過去のがん組織を用いた研究の結果KL-6ムチンが高頻度に発現していることが示唆された。更に膵癌切除標本から癌部、非癌部を採取し発現している糖鎖抗原を更に検索した。膵癌標本においてKL-6ムチンに対するタンパク質レベルでの種々の生化学的解析を試みたところ、がん細胞の細胞質や細胞膜におけるKL-6ムチンの局在性が、がん細胞の接着性や悪性度に関係することが明らかとなった。また癌化することが問題となっている膵管内乳頭腺腫でも悪性化するに従ってKL-6ムチンが発現していくことが明らかになり、膵癌発生過程との関連も示唆された。さらに、最近の当科の研究では、肝癌や肝内胆管癌に発生する種々の腫瘍におけるKL-6ムチンの高発現が明らかとなり、病態の進行との関連性が各種消化器がんと同様に示唆された。従って、本研究の結果より、KL-6は膵癌の発癌、予後に強く関連し早期発見のための腫瘍マーカーや予後不良患者を同定する因子となり得る可能性があるほか、各種がん疾患の病態解明のツールとして利用できることが期待される。膵癌は、消化器癌の中でも最も予後の期待できないものの一つであり、その浸潤や転移の解明や生物学悪性度の評価が重要とされている。本研究では、種々のがん組織で糖鎖の発現に変化が起きていることに注目し、膵癌組織における糖鎖分布とその臨床的意義を明らかにすることを目的とした。過去12年間に当科で切除した膵腫瘍検体(膵頭部癌62症例、膵体部癌21症例、膵管内乳頭腺腫24症例)のホルマリン標本を使用し、これを薄切後、糖鎖認識プローブとして各種のレクチンやモノクローナル抗体を用いた免疫染色を実施した。また、膵管内乳頭粘液産生腫瘍に関しても同様の免疫染色を実施した。その結果、シアル酸含有糖鎖を抗原の一部とするモノクローナル抗体で認識される糖鎖抗原の発現が、ほとんどの膵癌組織で陽性となった。一方、正常膵組織では全く染色されず、膵管内で一部陽性となるのみであった。また、膵管内乳頭腺腫でも、この糖鎖抗原の発現は陰性であった。このことから、このモノクローナル抗体で認識される糖鎖抗原が通常型膵癌組織に特異的に発現していることが明らかになった(学会発表予定)。次に、本研究で得られた糖鎖抗原解析の結果を臨床応用するため、膵癌患者の臨床データを収集し整理した。まず、膵腫瘍の臨床像、進展度、転移の有無等につき詳細に検討し、予後因子などを規定した。さらに予後調査を実施し、長期予後を含む臨床データベースを作成した。現在、この臨床データベースと糖鎖抗原に関する免疫組織化学的解析データから、糖鎖抗原発現の臨床的意義を探求しつつある。

従って、本研究の結果より、KL-6は膵癌の発癌、予後に強く関連し早期発見のための腫瘍マーカーや予後不良患者を同定する因子となり得る可能性があるほか、各種がん疾患の病態解明のツールとして利用できることが期待される。
ヨウ化物による第二臨界現象発現の立証

近年、水の有する数々の熱力学的異常性が低密度水相ー高密度水相境界線の端点、第二臨界点、の存在に由来するという見方に急速に収束した。しかしながら、この「臨界点シナリオ」の大前提である臨界点はおろか、低密度水も高密度水も実際に観測できない。報告者は自身の理論予測に基づき、液体ヨウ化錫の高圧下での放射光X線その場吸収実験によって世界で初めて第二臨界点の存在を示した。また、その存在を間接的に示す、密度極大領域の存在も示した。水のポリアモルフィズムに関するシナリオの完全終結には第二(液相間)臨界点の存在を示す必要がある。この点を現実には観測できない水の代わりにヨウ化錫SnI4、あるいは、その類似物質であるヨウ化ゲルマニウムGeI4を使って「前人未到」の第二臨界領域に足を踏み入れることが本研究全体の目的である。初年度となる平成26年度はGeI4液体構造の定量的評価を計画した。まず、GeI4の融解曲線が示す異常性(論文出版済)から、3GPa付近での液相間転移の存在を予想した。SnI4だけでなくGeI4も扱う理由は3GPa付近の方が観測し易いためである。手始めとして、基準構造となる低圧液体構造を知るためにSPring-8 BL04B2にて1気圧下での精密な構造測定を行った。逆モンテカルロ法で決めた実空間構造に対するVoronoi多面体解析の結果、9面体という多面体の存在が、こうした四面体構造をユニットとしてもつ不定形構造の特徴を表すことを示した。この構造解析を行うために標準液体模型を構築し、融解現象を論じた(論文印刷中)。次に、局所構造の変化の有無を明らかにするべく、KEK-AR NE5Cにてた放射光X線その場観察実験を行ったところ、構造因子で見る限り、低圧液体と高圧液体構造に明確な差が見出せなかった。特に、高圧側で構造因子の高波数側が不明瞭である。これがKEK放射光の高エネルギー成分不足によるためか、あるいはGeI4の性質であるものかを見極めるため、SPring-8 BL14B1で追試したところ、後者によるものであることが分かった。実空間構造の圧力依存性はSnI4同様の特徴を有している。これまでの測定結果を総合すると、3GPa付近での低圧から高圧構造の移り変わりは確かに認められるが、その変化は決してシャープではない。これらの結果は日本物理学会秋季大会にて報告の後、論文として出版予定である。水のポリアモルフィズムは臨界点シナリオによって矛盾なく、且つ簡潔に説明できる。ただし、その足場となる臨界点はおろか、その付近の低密度水と高密度水そのものを直接観察することは許されない。そこで、代替物質としてヨウ化錫に着目し、「前人未踏」の第二臨界点存在の立証を試みることがが本研究全体の目的である。目的達成に必要な重要な知見が得られた年度であった。1 GPa付近での圧力領域でのX線小角散乱測定を計画していたが、装置上の制約のため、単色X線吸収測定に変更した。比較的低圧で液体ヨウ化錫を長時間封入保持するために容器蓋の再設計と改良に取り組んだ。これまで実績を積んできたSPring-8 BL22XUでの測定だけではなく、東北大・鈴木昭夫氏のご尽力により、KEK-AR NE7Aを利用した測定も可能になった。KEK放射光X線の横発散の大きさのため、密度に関する定量的な解析は困難なものの、定性的な再現性の確認を行うことができた。まず、特筆すべき点として、950 Kと1000 Kに保ったまま、圧力印加を行うと、(報告者による理論予想通り)1.5 GPa付近で急な吸収増加が見出される。以前、970 KにてSPring-8で同様な測定を行った際に見出した現象を完全に再現した。これは低密度液相から高密度液相への不連続相転移境界を横切ったことを表している。一方、1200 Kでの圧力印加では、こうした吸収の「跳び」は見られず、単調に吸収が増加する。これらのことより、第二臨界点は間違いなく1.5 GPa付近、1000 Kと1200 Kの間に存在することが言えた。この結果は、この付近での液体構造の局所変化のその場観察の結果と併せてStatPhys26で報告するとともに学術誌に速報する予定である。また、水に見られるような密度極大が1 GPa未満の低圧領域に現れることも明らかにした。計画段階ではX線小角散乱による測定を計画していたがガス圧ではやや圧力不足ということが判明したため、プレス型高圧発生装置を用い、単色X線吸収測定に切り替えた。幸い、SPring-8での課題も採択され、満足な結果が得られた。KEK-AR NE7Aに設置された高圧発生装置を利用したX線吸収測定が可能になったことは本研究の進展に大きな役割を果たした。後者の利用により、結果の再現性が確認された。これにより、第二臨界点の存在は不動のものとなったと言えよう。水の有する数々の熱力学異常性が高密度水と低密度水とを隔てる相境界線の端点である、第二臨界点に由来するものだという主張が実験・理論による研究により急速に支持されてきた。

この「臨界点シナリオ」はもはや揺らぐこともない考え方となっているが、その第二臨界点はおろか高密度・低密度水は水の凝固点以下の領域(「前人未踏領域」と呼ばれる)に存在することになっており、我々にはそれらを直接観察することが許されない。即ち、シナリオの大前提を水では検証できないのである。一方、報告者はヨウ化錫のポリアモルフィズムに関する既存事実が水の臨界点シナリオによって矛盾なく説明できることを見出していた。平均場計算ではヨウ化錫の第二臨界点は1.3GPa、970Kに位置する。この圧力・温度領域は決して「前人未踏領域」ではない!そこで、放射光X線吸収測定を用いてヨウ化錫の第二臨界点存在を立証することを立案した。ただし、ヨウ化錫液体の高圧下でのその場観察は決して容易ではない。そこで、高圧下での吸収測定の豊富な経験を有する東北大・鈴木昭夫氏と東大・西田圭佑氏、ヨウ化錫の扱いに長けた新潟大・大村彩子氏、実験パーツの作製には原子力(現量研)機構・齋藤寛之氏に加わっていただき、SPring-8 BL22XUとKEK-AR NE7Aでの実験を行った。2015年度の実験により、1000K未満では加圧途上1.5GPa付近での吸収の不連続な変化があるのに対し、それより高温では吸収は圧力に対して連続的に変化すること、即ち、第二臨界点がほぼ予想通り、1.5GPa、1000K付近に存在することを示せた。これに加え、1GPa、1200K付近で第二臨界点の「尻尾」である密度極大が存在することもつきとめた。2016年度は再現実験を試みた。これらの研究から第二臨界点が実在することを初めて実験的に立証でき、本研究の目標を完全に達成できた。近年、水の有する数々の熱力学的異常性が低密度水相ー高密度水相境界線の端点、第二臨界点、の存在に由来するという見方に急速に収束した。しかしながら、この「臨界点シナリオ」の大前提である臨界点はおろか、低密度水も高密度水も実際に観測できない。報告者は自身の理論予測に基づき、液体ヨウ化錫の高圧下での放射光X線その場吸収実験によって世界で初めて第二臨界点の存在を示した。また、その存在を間接的に示す、密度極大領域の存在も示した。初年度には水型オープンネットワーク構造模型の標準化と低近似解に関する研究を計画していたが、これは同年度に訪問したチェコ科学アカデミーのNezbeda教授との共同研究に発展している。課題が大きく、且つ、さらに系統的になった分、進展が遅くなっているが、同教授から示唆されたBuckinghamポテンシャルを採用した新模型により、当初予想していなかったプラスチック相転移も現れ、その相構造がリッチな様相を呈している。まずは、液体構造の圧力依存性を精査することにした。一方で次年度に予定していたSnI4液体の密度極大の観測はKEK-AR NE7Aの高圧発生装置の仕様に変更を加え、先行予備研究として実施した。これにより低圧(1GPa未満)での液体安定保持には、試料容器周りに更なる改善が必要であることが分かり、具体的な方策は平成27年度に実施予定のSPring-8での実験へフィードバックされる。2015年度の実験研究により、実験面での目的は達成された。2016年度は、これらの重要な知見を国際会議で発表するだけでなく、高インパクトファクター誌に速報する。また、2014年度に行った理論研究にフィードバックし、第二臨界現象のカイネティクスを議論する足場作りを試みる。物性理論KEK放射光予算削減による放射光ビームタイムの半減、および日本原子力研究開発機構の改組は本課題申請時、および採択時には不明であった。
レーザ溶射法を用いた傾斜機能材料の機械的・熱的性と膜応力に関する研究

レーザ溶射およびプラズマ溶射法により金属膜あるいはセラミック膜を作成し、X線応力測定法を用いて溶射膜の残留応力ならびに加熱処理による残留応力の変化、また、硝削加工による残留応力を調査検討した。その結果、低炭素鋼、ステンレス鋼、アルミナさらにNiN膜について残留応力測定が可能であることが明らかになった。溶射膜の残留応力は溶射膜材料、基材、溶射方法によって違いはあるものの、すべての場合において引張残留応力であった。また、プラズマ溶射法で作成したNiCrからアルミナへの傾斜組成膜と傾斜しない膜を比較すると、最表面アルミナ層の残留応力値に顕著な違いは認められなかった。金属膜においてはその後の加熱処理によって残留応力は変更され、十分な加熱を施すと被膜と基材の熱膨張係数差により説明可能な残留応力状態となった。しかし、プラズマ溶射により作成したアルミナ皮膜に対しては均一加熱を施しても残留応力の際だった変更はなく、引き続き膜構造も含めてX線的残留応力の物理的意味を調査しなければならない問題点が浮かび上がってきた。2次元軸対称問題として単層膜および積層組成膜の内部応力状態を弾性解析したが、積層化による最外層の応力の緩和は大きいものではなく、層界面を介して応力の変化が緩やかになることにそのメリットがあることがわかった。連続傾斜膜に対しては応力分布が連続になることが予測され、膜の剥離を抑制することになることが考えられる。今後は積層化膜が熱衝撃特性の改良に及ぼす効果について、残留応力の変化とともに考察を加える計画である。本年度は基材として低炭素鋼およびアルミニウムを用い,レ-ザ溶射により軟鋼およびステンレス鋼の皮膜を作製し,膜残留応力の特性を調べた。溶射膜は単一層であり,それぞれ2種類の厚さ(0.250.63mm)の膜を同意し,X線応力測定にはFaKα特性X線を用いた。軟鋼膜およびステンレス鋼膜に対してそれぞれ(211)および(311)回折面を用いることによって残留応力測定の可能なことが明らかになった。まず,溶射膜の結晶の配向性を調査したが,多少の配向性はあるものの,いわゆるPVD法による薄膜に存在するような強い配向性は見られなかった。すなわち,これらの金属のレ-ザ溶射膜に対しては従来の応力解折法としてのsin^24法の適用できることが明らかになった。溶射膜中には主として溶射材料に存在して決る引張残留応力の発生することが明らかとなった。ステンレス鋼膜で+100+160MPa,軟鋼膜で-15+35MPaであった。次に,溶射被覆した材料を均一に加熱冷却することによる膜残留応力の変化挙動の調査を行った。十分な高温で数時間加熱して冷却することにより,膜残留応力は圧縮側に変化し,最終的には基材と膜の熱膨張係数の差に基づいて評価される残留応力値となって安定することが明らかになった。すなわち,軟鋼基坂上のステンレス鋼膜は約+120MPaの引張応力,アルミニウム基板上のステンレス鋼膜は約-80MPa,またアルミニウム基板上の軟鋼膜は約-40-80MPaへと変化して安定した。次年度ではTiからTiNへの傾斜機能膜を作成して残留応力を調査する予定であり,そして,いかなる層の組合せが最適な膜残留応力状態になるかについて検討を進める予定である。昨年度はレーザ溶射により軟鋼およびステンレス鋼の金属材料を溶射材料として溶射被膜の残留応力測定および加熱処理による残留応力の変化挙動を観察した。これに続いて本年度はプラズマ溶射法を用いて低炭素鋼基材の上にまず中間層としてNiCrを、その上にNiCrとアルミナの混合比を変えて2層、3層および5層の傾斜組成膜を作成した。最上層をアルミナとしてこの層の残留応力に及ぼす傾斜化の影響を調査した結果、いずれの系においても引張残留応力が観測されたものの、その値は130MPa200MPaであり、傾斜化によって系統的な差は認められなかった。

また、973Kまでの加熱処理によって表面残留応力の際だった変動はなく、1173K加熱で引張残留応力がさらに上昇する傾向がみられた。これは被膜と基材の熱膨張係数差による残留応力の予測とはその傾向まったく異にするものであり、セラミック膜の場合は金属被膜の場合と同様な説明することができないことが明らかになった。また、レーザ溶射法を用いてTiN膜を作成した。基材としては低炭素鋼、ステンレス鋼、アルミニウムおよび黒鉛を用い、基板の熱膨張係数や熱伝導度などの物性値の違いが膜の残留応力値に及ぼす影響を調査した。この結果、溶射TiN膜には50100MPaの引張残留応力が存在し、応力値の基板の種類による系統的な依存性は認められなかった。さらにこの表面をダイヤモンド砥石で研削仕上げしたが、研削により残留応力はほぼ無応力に近くなり、従来のセラミックスに対する結果のように研削は残留応力を圧縮側に移行させることがわかった。今後溶射膜の構造に調べて、とくにセラミック溶射膜のX線的残留応力の物理的意味を究明し、さらに、組成を傾斜することのメリットを熱衝撃試験を対象にして実験する予定である。
ヒト造血幹細胞におけるCD34抗原の発現意義とその機能解析

HSCは、自己複製能と多分化能を有しており、生涯にわたり造血を支持する。従来より、ヒト骨髄HSCはCD34+分画に存在すると考えられてきた。しかしながら、ヒトHSCにおけるCD34抗原の発現意義は、未だに明らかになっていない。そこで、本研究はヒトHSCにおけるCD34抗原の機能的発現意義の解明を目的とした。本研究期間において、申請者は、CRISP/Cas9システムを用いることにより、ヒトCD34+ HSCからのCD34抗原のknock-out(KO)に成功した。しかしながら、今後の実験を正確に行うためには、KO効率をさらに上げる必要があり、現在高効率でのKOシステムを検討している。本年度において、申請者はヒト骨髄由来Lineage-CD45-CD271+SSEA-4+ (DP)分画より樹立した間質細胞(MSC)に発現する、ヒト臍帯血由来CD34陰性(CD34-)造血幹細胞(HSC)からのCD34陽性(CD34+)HSC産生促進因子の探索のため、以下の実験を行った。最初に、他のMSCと比較し、DP MSCで特異的に高く発現する、既知のHSC支持因子のCD34- HSCに対する効果をin vitroで検討した。その結果、IGF-2およびJagged1がCD34- HSCからのCD34+細胞の産生に関わっていることが明らかとなった(Stem Cells, in press)。しかしながら、DP MSCによるCD34- HSCからのCD34+細胞産生促進効果の大部分は接着を介して行われていることも明らかとなった。そこで、次に、申請者があらかじめ作成していた、CD34- HSCを含む細胞集団に対する反応性を有する抗体ライブラリーを用いて、DP MSCによるCD34- HSCからのCD34+細胞産生阻害効果を有する抗体のスクリーニングを行った。具体的には、CD34- HSCを含む細胞集団とDP MSCの共培養系にハイブリドーマ由来抗体を添加することにより、スクリーニングを行った。その結果、CD34- HSCからのCD34+細胞産生能を著しく阻害する抗体産生ハイブリドーマ(4-4-1)を得た。Western Blottingによる解析から、4-4-1抗体の抗原はおよそ85 kDaの分子量を持つことが明らかとなった。現在、免疫沈降および質量分析により、この分子の同定を進めている。本年度において、申請者は主に、高いヒト造血幹細胞(HSC)支持能を有する、ヒト骨髄由来CD45-Lin-CD271+SSEA-4+分画より得られた間葉系幹細胞(DP MSC)による、HSC支持機構の解析を行った。最初に、DP MSCと他の分画より得られたMSCとの間で、既知のHSC支持因子の発現の差を、qRT-PCRにて解析した。その結果、DP MSCは他のMSCと比較し、IGF-2、Jagged-1、Wnt3aおよびTGFβ3を高く発現していることが明らかとなった。次いで、これらの既知のHSC支持因子を培養系に添加し、そのHSC支持効果を検討した。その結果、IGF-2およびJagged-1は、1週間の培養系において、HSC支持能を示した。しかしながら、その効果は、DP MSCのHSC支持能と比較すると、非常に小さいものであった。このことから、DP MSCによる、HSCの支持は、他の接触性シグナルを介して行われていることが示唆された。現在、スクリーニングにより見出した、DP MSCによるHSC支持能阻害効果を有する、モノクローナル抗体(mAb4.4.1)の抗原の同定を、質量分析により進めているところである。申請時の研究計画では、初年度にゲノム編集技術を用いて、ヒトHSCおよびMSCの遺伝子改変技術を確立する予定であった。しかしながら、現時点において、未だ技術の確立はできていない。これは、作製した抗体ライブラリーの中から、DP MSCによるHSC支持能を大きく阻害する抗体が見つかり、そちらの抗原同定を優先しているためである。この抗原同定も、後1か月程度で終わる目途がついている。そのため、申請書の計画と順番は前後するものの、今後、HSCにおけるゲノム編集技術の確立は速やかに行う予定であり、全体としての進捗速度は、おおむね予定通りである。本年度において、申請者は主にCRISPR/Cas9システムを用いた、CD34+/-造血幹/前駆細胞(HSPCs)からのCD34抗原のノックアウトの系の立ち上げを行った。予備実験として、最初に、ヒトHSPCsが高度に純化される、ヒト臍帯血由来18Lineage-CD34+CD133+細胞への遺伝子導入の条件を検討した。導入遺伝子は、陽性コントロールとしてGFPが組み込まれたプラスミドを用いた。遺伝子の導入方法は、浮遊系細胞へ高効率で遺伝子導入が可能と報告されている、nucleofectionにより行った。その後、遺伝子の導入効率をFCMにて解析した。その結果、18Lineage-CD34+CD133+細胞にほぼ100%の効率でGFP遺伝子を導入出来ていることが確認された。次いで、CD34遺伝子のエキソン1をターゲットとしたgRNA配列を設計した。その後、この配列のオリゴをレポーター遺伝子としてGFPが組み込まれたプラスミドpx458に組み込んだ。次に、このCD34遺伝子ノックアウト用のプラスミドを、ヒト臍帯血由来18Lineage-CD34+CD133+細胞にnucleofectionにより導入した。

その結果、当該細胞からのCD34抗原のノックアウトに成功した。また、同時に作製済みである、CD34+/-HSPCsに結合性を示す抗体ライブラリーより、DP MSCによるヒトHSC支持能阻害活性を有する抗体のスクリーニングに従事した。その結果、前年度に見出したクローン4.4.1とは異なる、新たなヒト骨髄由来Lin-CD45+CD271+SSEA-4+陽性分画より樹立したMSC (DP MSC)からのHSC支持能に対する阻害活性を有する抗体クローン8.1.2を見出した。現在、このクローン8.1.2が認識する抗原の同定を試みている。HSCは、自己複製能と多分化能を有しており、生涯にわたり造血を支持する。従来より、ヒト骨髄HSCはCD34+分画に存在すると考えられてきた。しかしながら、ヒトHSCにおけるCD34抗原の発現意義は、未だに明らかになっていない。そこで、本研究はヒトHSCにおけるCD34抗原の機能的発現意義の解明を目的とした。本研究期間において、申請者は、CRISP/Cas9システムを用いることにより、ヒトCD34+ HSCからのCD34抗原のknock-out(KO)に成功した。しかしながら、今後の実験を正確に行うためには、KO効率をさらに上げる必要があり、現在高効率でのKOシステムを検討している。申請時における、本研究計画は以下の通りである。2)ヒト臍帯血由来CD34+/-HSCおよび骨髄由来CD34+ HSCの幹細胞特性の比較解析3) CD34- HSCからCD34+ HSCへの転換誘導因子の同定と転換機構の解明1)に関しては、現在、CD34抗原のKOコンストラクトのデザインを進めている。2)に関しては、in vitroのコロニーアッセイ等により予備実験を進めている。3)に関しては、阻害抗体を用いた実験により、因子の同定を進めており。全体的としては、おおむね予定通り進行中である。最終年度である、今年度の研究計画以下のとおりである。最初にCRISPER/Cas9システムによる、ヒトHSCからのCD34遺伝子のノックアウトを試みる。具体的には、ヒトCD34遺伝子の第1エキソンをターゲットとしたコンストラクトを作製する。次いで、ヒト骨髄由来18Lin-CD34+CD38-CD133+細胞およびヒト臍帯血由来18Lin-CD34+CD38-CD133+および18Lin-CD34-CD133+細胞より、CD34遺伝子をKOした後、重症免疫不全マウスに移植する。また、対照群として、コントロールベクターを導入したHSCの移植も行う。その後、各HSC移植群間で、長期骨髄再構築能および多分化能を比較解析し、HSCの多分化能および自己複製能に対するCD34抗原の機能を評価する。また、DP MSCによるHSC支持因子受容体が質量分析により明らかになった後には、同様の方法でHSC上に発現するこの支持因子受容体をKOした後、マウスへ移植することにより、その機能解析を行う。以上により、申請時当初の目的は遂行できるものと考えられる。幹細胞生物学現在デザイン中の人工ヌクレアーゼによりヒトHSCを用いたCD34抗原のKO実験を進める。
基本転写因子のプロモーター構造特異的な作用機構

1, TFIIHは転写開始時にRNAOPIIの最大サブユニットのC末端領域を燐酸化するが、この活性がGal11とTFIIEの両方により制御されていることを明らかにした(J.Biol.Chem.273:9534-9538)。さらに、転写開始においてDNA鎖が「開く」過程におけるGal11,TFIIE,TFIIHの機能について検討した。その結果、これらの因子はDNA鎖のopeningにも関与していることが示唆された。2, TFIIEのプロモーター特異的な作用機構を調べていく過程で、TFIIEやTFIIHは転写活性化因子に対しても特異性を示すことが明らかになった。現在、転写活性化領域の構造との関連について検討している。3, TFIIE非依存的なGAL80遺伝子は、転写開始点領域(イニシエーター)のみで正確な転写を行う。そこで、イニシエーターに依存した転写機構について解析した結果、イニシエーターに特異的タンパク質が結合することが転写制御に必要であることが明らかになった(BBRC 255:157-163)。これらの研究によりGal11,TFIIEおよびTFIIHは転写開始から伸長反応への移行過程を制御していることが示唆された。この過程が遺伝子のコアプロモーター構造や転写活性化因子により制御されていることは非常に興味深い。この特異的な作用機構の解明は、今後、遺伝子の発現調節を理解する上で重要な課題と考えられる。1)TFIIEのプロモーター特異的な作用機構TFIIE遺伝子の温度感受性変異株を用いて、TFIIEはTATAboxに依存した転写には必須であるがTATA-less遺伝子の転写には必要ないことを示した(J.Biol.Chem.272:15936-15942)。現在、様々なコアプロモーター構造を持つ遺伝子について解析を進め、TFIIEの遺伝子特異的な作用機構について更に検討を加えている。2)Gal11と結合しないTFIIE変異株の解析Gal11と結合しないTFIIE変異株を作製し、この変異株とgal11変異株における転写調節について調べた。各々の変異株は同様の遺伝子(プロモーター構造)特異性を示したことより、TFIIEとGal11は転写調節段階の同じステップを協調して制御することが示唆された(J.Biol.Chem.272:32663-32669)。これらの研究より基礎補助因子のGal11は、TFIIEと協調して、TFIIHの酵素活性(RNAPIIのC末端領域を燐酸化)を制御することにより、転写調節をすることが示された。また、これらのタンパク質の相互作用が遺伝子のコアプロモーター構造に対し特異的に作用することが示唆された。しかし、特異性を決定するプロモーター上の構造については依然明らかではなく今後の課題である。
受精におけるエンドサイトーシス過程の解析

1.マウスを用いたエクアトリンとエンドサイトーシス関連タンパク質との相互作用解析野生型マウス精子より調製したエクアトリンを含む複合体を抗エクアトリン抗体EQ70-83(受精を阻害しない)を用いて免疫共沈降した。得られたサンプルの質量解析を行なった結果、先体膜タンパク質や膜裏打ちタンパク質、プロテアソーム関連タンパク質、核周囲鞘関連タンパク質などが同定された。今後、可溶化条件を変更し候補を絞り込むとともに、抗体染色やリコンビナントタンパク質を用いて相互作用の解析を行なう。2.精子の卵子へのエンドサイトーシスから精子核脱凝縮に至るまでの過程における核周囲物質の挙動の解析。EQT-EGFP発現量の多いマウスを得るため、遺伝子座の同定を試みた結果、染色体2番と10番にEQT-EGFPが挿入されている2系統を確立した。それぞれの系統において、片方のアリルにしかEQT-EGFPを持たないマウスの精子は、それぞれの系統ともに、受精のイメージンクに充分な蛍光を有していた。EQT-EGFPマウスの精子を解析した結果、先体の形態や先体反応、妊孕性に異常は認められず、ノックアウトマウスの機能回復実験にも用いられると考えられる。受精から前核形成までにおはる核周囲鞘の変化をEQT-EGFPを指標に解析する準備が整った。現在、系統維持と実験に用いるためのマウスを繁殖中である。
単球・マクロファージにおけるHTLV-1遺伝子転写活性化機構の解明

「目的」成人T細胞白血病の原因ウイルスであるHTLV-IはT細胞だけではなく単球・マクロファージにも感染し、感染単球・マクロファージは神経・肺障害やブドウ膜炎などのHTLV-I関連炎症性疾患に重要な役割をしている。今回我々は単球・マクロファージにおけるHTLV-I遺伝子活性化機構を検討した。「方法」HTLV-I遺伝子はlong terminal repeat(LTR)領域への転写因子結合により制御されており、LTRを含むレポーターをヒトTHP-1株化単球細胞に導入した。「結果」LPSによるLTR領域活性化:THP-1単球において、LTR領域はp40Taxにより強力に活性化されたが、エンドトキシンの活性本体であるLPSも有意にHTLV-I LTR遺伝子を活性化した。LTR遺伝子は3つのGGAAサイトを有し、それぞれ5'側よりPuB1、PET、PuB2と称しているが、PETならびにPuB2を変異することにより、LPSによるLTR活性化は阻害された。しかし、T細胞におけるTaxによるLTR活性化にはGGAAサイトは必要とされなかった。これらはLTR領域が単球においてLPS依存性に活性化され、この活性化は単球特異的に少なくとも2つのGGAAサイトを介していることが明らかとなった。LTR・GGAAサイト結合転写因子の同定:LPS刺激THP-1細胞核蛋白とLTR GGAAシークエンスをプローブとして、ゲルシフトアッセイを行った。その結果、結合たんぱく質はEts1、Elf1などの抗体とは反応せず、PU.1に対する抗体と著明に反応した。さらに、THP-1細胞核蛋白の代わりに、遺伝子組み換えPU.1蛋白を用いた場合、PU.1蛋白は明らかな結合能を示した。この結果は、LPSによるLTR活性化には、PU.1のLTRへの結合が不可欠あることを証明した。さらに、PU.1はゲル移動度より他の蛋白と複合体を形成し、LTRに結合していることが明からかであり、その蛋白はIRF-8であることが示唆された。また、Tax刺激Jurkat T細胞では、LTRへのPU.1の結合は観察されず、単球特異的であった。「結語」以上、LPS誘導LTR活性化には単球・マクロファージ特異的転写因子PU.1のLTRへの結合が不可欠であり、一方、T細胞におけるTaxによるLTR活性化はこの蛋白を必要としなかった。HTLV-I感染単球・マクロファージは細菌感染などのエンドトキシン刺激により、単球・マクロファージ細胞特異的転写因子PU.1を通じて、強くHTLV-I遺伝子活性化を行い、T細胞とは異なるHTLV-I遺伝子発現機構が存在した。

ヒトレトロウイルスHTLV-Iは成人T細胞白血病(adult T-cell leukemia ; ATL)の原因ウイルスであるが、近年HTLV-I感染は神経障害、関節症、肺障害やブドウ膜炎などの種々の疾患を引き起こす事が報告されている。HTLV-IはTリンパ球にとどまらず、単球・マクロファージ、Bリンパ球、線維芽細胞、関節滑膜細胞にも感染し、特にHTLV-I感染単球・マクロファージは臨床病態形成に重要な役割をしている。HTLV-I遺伝子転写はlong terminal repeat(LTR)領域に転写因子が結合することにより制御されており、Tリンパ球ではHTLV-I遺伝子産物であるTax蛋白がHTLV-I遺伝子転写を誘導していることが知られている。申請者は、Tax蛋白が単球・マクロファージにおいてヒトIL-1β遺伝子の転写を誘導することやATL細胞において既知のSTAT蛋白とは異なるLIL-Stat蛋白が恒常的に活性化されていることを明らかにした。さらに、申請者は単球・マクロファージにおいてもTax蛋白が強力なHTLV-I遺伝子LTR領域の活性化因子であり、転写活性を数100倍に容量依存性に増強することを観察した。さらにT細胞とは異なり単球・マクロファージにおいて細菌の菌体成分であるlipopolysaccharide(LPS)も容量依存性にLTR領域を活性化する事を観察した。特に興味あることにTaxとLPSの同時刺激は、それぞれの単独刺激と比べ約数100倍と相乗的にLTR領域を活性化し、TaxとLPSとの間に相乗刺激効果が認めた。この結果、細菌感染においてHTLV-I感染単球・マクロファージは強くHTLV-I遺伝子転写を亢進し、ウイルス産生を行うことが示唆された。HTLV-Iは成人T細胞白血病(adult T-cell leukemia ; ATL)の原因ウイルスであるが、近年HTLV-IはTリンパ球だけではなく単球・マクロファージにも感染し、HTLV-I関連疾患の病態形成に重要な役割をしていることが証明されている。HTLV-I遺伝子転写はlong terminal repeat (LTR)領域に転写因子が結合することにより制御されており、Tリンパ球ではHTLV-I遺伝子産物であるTax蛋白がHTLV-I遺伝子転写を誘導している。さらに、申請者は単球・マクロファージにおいてTax蛋白がSpi-1/PU.1などの単球・マクロファージ特異的な核内転写因子と結合し、強力な遺伝子転写促進複合体として働くことを証明した。さらにTaxは単球・マクロファージにおいてもHTLV-I遺伝子LTR領域の活性化因子であることを観察した。さらに単球・マクロファージにおいて細菌の菌体成分であるlipopolysaccharide (LPS)が容量依存性にLTR領域を活性化する事を観察した。特にTaxとLPSの同時刺激は、それぞれの単独刺激と比べ約数100倍と相乗的にLTR領域を活性化し、TaxとLPSとの間に相乗刺激効果が認めた。
Y染色体遺伝子が規定する性差の分子基盤の解明

今年度はY染色体遺伝子TSPYおよびSMCYについて解析を行った。まず精巣胚細胞腫瘍NEC8細胞においてアンドロゲンによる細胞増殖充進およびTSPYによる増殖抑制を見いだした。続いてヒト精巣胚細胞腫瘍症例の組織検体を用いてTSPYおよびARの発現量解析を行った結果、ARはセミノーマに対し悪性度の高い非セミノーマ群において高発現を示した。一方TSPYの発現量が逆に非セミノーマ群で低く、セミノーマにおいて高いことが示された。これら二者の発現の逆相関の結果から、AR/TSPY比は精巣腫瘍増悪速度の目安として捉えられる可能性が示され、精巣腫瘍組織における予後マーカーとして臨床応用できる可能性を示した。続いてヒトおよびマウスY染色体精子形成責任領域に保存されるSMCY遺伝子の分子機能解析を行った。具体的には、まずヒト精巣胚細胞腫瘍由来NEC8細胞株NEC8細胞株においてSMCYがH3K4脱メチル化酵素活性を有する事を確認した上で、生化学的手法により精巣特異的なSMCYの機能的相互作用因子の取得を試みた。NEC8細胞より調製した核抽出液に対し、リコンビナントFLAGタグ融合SMCY全長タンパク質をベイトとしてアフィニティー精製を行い、TOF-MS解析によって、精子形成に必須である減数分裂特異的タンパク質MSH5を複合体構成因子として取得した。マウス精巣における両者の発現を共焦点蛍光顕微鏡で観察した結果、MSH5は初期レプトテン期の細胞では凝集DNAとの共局在を示さず、SMCYの発現するレプトテン/ザイゴテン期の細胞において、凝集したDNA上でのSMCYとの共局在が観察された。さらに、連続切片を用いた免疫組織化学解析により、SMCYおよびMSH5が共発現するレプトテン/ザイゴテン期の細胞において、強いジ、トリメチル化H3K4と弱いモノメチル化H3K4が観察された。以上の結果から、ヒストン脱メチル化酵素として知られるJmjドメインを有するSMCYが減数分裂制御因子MSH5との相互作用を示し、減数分裂前期の精母細胞においてヒストンH3K4の脱メチル化を介してDNA凝集に作用する可能性を示した。今年度は、Y染色体遺伝子TSPYおよびDBYを中心に研究した。Y染色体遺伝子TSPYについて、アンドロゲンレセプター転写活性の制御と、ヒストンシャペロン能についての分子機能解析を行った。TSPY、DBY遺伝子を含むY染色体遺伝子群は精巣に限局して発現することから、精巣癌細胞であるNEC8細胞を研究に用いた。薬剤耐性選択法によりTSPY遺伝子を恒常的に発現させた細胞株の取得に成功した。その細胞株を用い、ヒストンH2Aのバリアントの一つであり、DNA修復や減数分裂時のX,Y染色体の対合に関わるとされるH2A.Xとの結合を見いだすことが出来た。また、アンドロゲンレセプターとの直接結合も免疫沈降法により見いだした。次に大量培養したNEC8細胞から細胞質画分、核抽出液、クロマチン画分を調製し、GST-TSPYをベイトとしてグルタチオンセファロースを用いたアフィニティー精製を行った。その結果、それぞれの画分においてTSPYと相互作用する因子の存在が確認された。また、細胞質画分においてのみアンドロゲンレセプターと結合を示す結果が得られた。さらにTSPY遺伝子安定恒常発現細胞株を大量に培養し、細胞質画分、核抽出液、クロマチン画分を調製し、FLAG抗体によるアフィニティー精製を行った。各画分においてTSPYが発現していることがウェスタンブロッティング法により確認できたので、現在TSPY遺伝子の相互作用因子の同定をMALDI/TOF-MS法により行っている。さらに、DBY遺伝子欠損マウスの作出を目的とし、以下のような研究を行った。マウスDby遺伝子領域を含むBAC(細菌人工染色体)クローンを購入し、それを用いたBAC組み換え法によりターゲティングベクターの作製を行った。本研究ではCreを発現するマウスとの掛け合わせにより遺伝子欠損を呈するloxP配列を組み込んだfloxedタイプのマウスを作製する予定であるので、loxP配列を組み込んだベクターを構築した。BACクローンをエレクトロポレーション法により導入した大腸菌株の作製を行った。現在大腸菌内での組み換えを利用してベクターの構築を行っているところである。今年度はY染色体遺伝子TSPYを中心に研究を行い、アンドロゲンレセプター(AR)転写活性化能の制御能についての分子機能解析を行った。精巣癌由来NEC8細胞、およびARが高発現しアンドロゲン依存性癌として知られる前立腺癌由来LNCaP細胞を用いて内在性ARとTSPYの結合を検討した。FLAGタグ融合TSPYを安定発現させたNEC8細胞(TSPYstable細胞と記す)およびLNCaP細胞において、TSPYとARはリガンドであるDHT非依存的に結合を示した。次に、GST-pulldown法により、GSTタグ融合TSPYとARが直接結合することを示した。ERaおよびERbとの結合は見いだされなかった。TSPYがARの転写活性化能を抑制することを前年までに見いだしていたため、TSPYのsiRNAによるARの転写活性化能への影響を解析した。その結果、TSPYstable細胞においてTSPYのノックダウンによりARの転写活性が回復した。LNCaP細胞における内在性のTSPYによるARの転写抑制も、TSPYのノックダウンにより回復した。また、TSPYとARの細胞内局在を蛍光免疫染色法により解析した。

ARはリガンドと結合し、核移行を示すことが知られており、実際にNEC8細胞内で同様の挙動を示した。それに対し、TSPYはDHTに依存せず細胞質に留まり、TSPYとARの共局在は細胞質においてのみ観察された。次にTSPYとARの細胞内結合を生化学的手法により検討した。DHT投与後、経時的に回収したTSPYstable細胞を細胞質画分および核抽出液画分に分画し、抗FLAG抗体で免疫沈降を行った。TSPYとARの相互作用は細胞質画分のみで見られことが明らかとなった。さらに、TSPYのノックダウンにより、TSPY結合ARが減少し、細胞質ARお減少と核内ARの割合の増加が見られた。精巣癌由来NEC8細胞において、リガンド添加後の細胞増殖を検討した結果、NEC8細胞においてもアンドロゲン依存性の増殖亢進が見られることが明らかとなった。また、TSPYstable細胞ではそのアンドロゲン依存性増殖が抑制されることを見いだした。今後TSPYおよびARの発現量と精巣癌の悪性度に相関が見られる可能性を考え、臨床サンプルを用いた解析を試みている。今年度はY染色体遺伝子TSPYおよびSMCYについて解析を行った。まず精巣胚細胞腫瘍NEC8細胞においてアンドロゲンによる細胞増殖充進およびTSPYによる増殖抑制を見いだした。続いてヒト精巣胚細胞腫瘍症例の組織検体を用いてTSPYおよびARの発現量解析を行った結果、ARはセミノーマに対し悪性度の高い非セミノーマ群において高発現を示した。一方TSPYの発現量が逆に非セミノーマ群で低く、セミノーマにおいて高いことが示された。これら二者の発現の逆相関の結果から、AR/TSPY比は精巣腫瘍増悪速度の目安として捉えられる可能性が示され、精巣腫瘍組織における予後マーカーとして臨床応用できる可能性を示した。続いてヒトおよびマウスY染色体精子形成責任領域に保存されるSMCY遺伝子の分子機能解析を行った。具体的には、まずヒト精巣胚細胞腫瘍由来NEC8細胞株NEC8細胞株においてSMCYがH3K4脱メチル化酵素活性を有する事を確認した上で、生化学的手法により精巣特異的なSMCYの機能的相互作用因子の取得を試みた。NEC8細胞より調製した核抽出液に対し、リコンビナントFLAGタグ融合SMCY全長タンパク質をベイトとしてアフィニティー精製を行い、TOF-MS解析によって、精子形成に必須である減数分裂特異的タンパク質MSH5を複合体構成因子として取得した。マウス精巣における両者の発現を共焦点蛍光顕微鏡で観察した結果、MSH5は初期レプトテン期の細胞では凝集DNAとの共局在を示さず、SMCYの発現するレプトテン/ザイゴテン期の細胞において、凝集したDNA上でのSMCYとの共局在が観察された。さらに、連続切片を用いた免疫組織化学解析により、SMCYおよびMSH5が共発現するレプトテン/ザイゴテン期の細胞において、強いジ、トリメチル化H3K4と弱いモノメチル化H3K4が観察された。
情動を制御する眼窩前頭皮質ー扁桃体回路の発達様式とストレスが与える影響の解明

児童虐待に代表される幼少期の過剰なストレスは、不安障害、うつ病に加え、衝動性を主徴に持つ種々の精神疾患の発症リスクを増加させる。しかし、幼少期に情動制御を担う神経回路が発達するメカニズムや、そこにストレスが与える影響は、未だ不明な点が多い。一方、児童虐待を経験した患者は、情動制御に重要な眼窩前頭皮質(OFC、前頭葉腹側部)と扁桃体間の結合性の異常が報告されている。前頭葉-扁桃体投射経路は幼少期に発達するため、幼少期のストレスがOFCー扁桃体回路の発達に悪影響を及ぼすとことで、成熟後の情動制御異常を招く可能性が示唆される。そこで本課題では、げっ歯類のOFC-扁桃体シナプスの電気生理学的特性の発達変化と情動行動への寄与を調べ、情動回路の発達様式の解明を目指す。さらに、その発達変化に幼少期ストレスが与える影響を調べることで、幼少期ストレスが情動行動の異常を招くメカニズムの一端を明らかにする。本年度は、幼少期ストレスモデルマウスの立ち上げとOFCから扁桃体に投射投射するシナプス伝達の単離計測系の立ち上げを行った。1)離乳後のすぐのマウスに隔離飼育ストレスを与えることで(離乳後社会的隔離)、成熟後の社会性の低下、衝動的攻撃性の増加となどの行動異常が観察され、幼少期ストレスマウスモデルの確立に成功した。2)アデノ随伴ウィルスベクターを用いてマウスOFCに光感受性陽イオンチャネル:ChR2を発現させ、投射先の扁桃体スライスからパッチクランプ記録を行い、青色光を照射することでOFC-扁桃体外側基底核(BLA)間のシナプス伝達の単離計測に成功した。興味深いことに、幼少期ストレス負荷の予備的検討として、成熟後のストレスがOFC-BLAシナプス伝達に与える影響を検討した結果、ストレスによってAMPA電流比が増加するなどの後シナプス可塑性の変化が観察され、この回路のストレスへの感受性が示唆される。ストレスモデル動物の確立、およびアデノ随伴ウィルスベクター、光遺伝学を用いたOFC-BLAシナプス伝達の計測法の確立が完了した。これより、発達変化やストレスの影響を調べる準備が整ったため、おおむね順調であると判断した。当初の予定通り、OFC-BLAシナプスの発達変化に社会的隔離飼育ストレスといった幼少期ストレスが与える影響を検討する。加えて、扁桃体は様々な亜核に分かれ、担う機能も核亜核において異なるため、BLA以外の扁桃体亜核への投射シナプスへの影響も検討する。さらに、OFC-扁桃体回路の発活動依存的な発達メカニズム解明のため、薬理遺伝学およびCre-loxPシステムを用いたOFC-BLA投射回路特異的な神経活動操作法の予備的検討も同時並行で行う。

当初はウィルスベクター投与手術の効率向上のため、マイクロインジェクションポンプ購入分を計上していた。しかし、当施設に確立済みのセットアップで対応できたので、購入を取りやめ、次年度使用額が生じた。次年度のChR2やDreadds発現のためのウィルスベクターおよびベクター精製キットの購入費に使用予定である。
人口動態論に由来する吸収爆発混合型の非線形楕円型境界値問題の分岐解析

人口動態論に由来する非線形楕円型方程式,いわゆる拡散効果を加味したロジスティック方程式を非線形境界条件のもとで考察した.内包するパラメータと解空間の直積空間において,正値解から成る連続体分岐枝の大域的な存在を示し,パラメータ依存した分岐枝の漸近挙動を研究した.ロジスティック非線形項が示す吸収型非線形性,境界条件に現れる爆発型非線形性,そして方程式に内包する空間依存した符号不定な係数の相互作用が分岐枝の大域的挙動を分類した.人口動態論に由来する非線形楕円型方程式,いわゆる拡散効果を加味したロジスティック方程式を非線形境界条件のもとで考察した.内包するパラメータと解空間の直積空間において,正値解から成る連続体分岐枝の大域的な存在を示し,パラメータ依存した分岐枝の漸近挙動を研究した.ロジスティック非線形項が示す吸収型非線形性,境界条件に現れる爆発型非線形性,そして方程式に内包する空間依存した符号不定な係数の相互作用が分岐枝の大域的挙動を分類した.本年度は,まず当初の計画通り,これまでの研究成果の発表,及び非線形理論に関する新たな手法の開発に向けた意見交換を目的に,ドイツ国,ドレスデンで開催された国際会議8th AIMS Conference on Dynamical Systems, Differential Equations and Applicationsに出席した(2010年5月25日から28日まで).さて,今年度の研究成果は正値解の分岐連続体の漸近挙動に関するものである.非線形境界条件下において人口動態論から由来する非線形楕円型境界値問題を考察し,その正値解の集合が解空間とパラメータ空間の直積空間においてどのように現れるかを調べた.特に漸近挙動を与える表示式の高次の項を方程式に含まれる係数を用いて厳密に与えた.漸近挙動に加えて,この表示式に基づいて正値解の一意性と安定性を論じた.これらの考察では未知関数のあるスケール変換が本質的な役割を果した.この変換によって得られた非線形問題を有限次元分岐方程式に帰着させて解いた.この成果について2010年9月28日に洞爺解析セミナーにおいて口頭発表した.また論文にまとめて微分方程式の国際学術誌に投稿した.なお投稿論文は現在査読中である.その後方程式に内包するパラメータが十分に大きいときの正値解の一意性を考察した.現在のところわかったことは,この一意性定理が確立されれば,既に証明された大域的分岐連続体の存在から発展させて,正値解の多重性の分類定理がパラメータの臨界値を用いて定式化されるということである.多次元ユークリッド空間の滑らかな境界を持つ有界領域において、ロジスティックタイプの反応項に従った半線形楕円型境界値問題を爆発型の非線形境界条件のもとで考察した。内在するパラメータによる正値解の存在と大域的挙動を分岐解析を駆使して研究した。本年度の成果を以下に述べる。2008年にGarcia-Melian,Morales-Rodrigo,Rossi,and Suarezによって得られた分岐成分の大域的挙動に関する結果を変数係数の場合に拡張した。本研究では領域内部の吸収項であるロジスティック項と同次の爆発型非線形境界条件を仮定した。このとき、Suarezらは定数係数の場合に分岐成分が折り返し点を持つことを示し、あるパラメータの臨界値が存在して、それを超えると正値解を持たないこと、それ未満では安定な正値解をただ一つ持つ(最小正値解の存在)ことを導いた。非存在の結果は、呼応する時間発展方程式において、どんなに小さな初期値を選んだとしても解は爆発することを示唆している。つまり、その臨界値は生物の個体数の安定な定常分布と爆発を特徴付ける。この定数係数はロジスティック成長率による淘汰を仮定しないときの生物固有の成長率にあたる。本研究において、この成長率の空間非一様性を仮定して、Suarezらの既存の結果を得るには、境界のチューブ形状成る近傍において係数が正値であれば十分であることを示した。実際、境界においてこの係数が完全に退化する場合には、分岐成分はパラメータに関して大域的に延長可能であり、与えられる正値解は安定であることを示した。得られた結果の証明は、陰関数定理、及び境界の近傍で局所化された時間発展方程式の爆発解析による。成果を平成24年3月9日に首都大学東京、変分問題セミナー(倉田和浩教授主催)において報告した。多次元ユークリッド空間の滑らかな境界から成る有界領域において、生物モデルであるロジスティックタイプの反応項を持つ半線形楕円型境界値問題を,爆発型の非線形境界条件のもとで考察した.分岐解の大域的挙動を調べることによって,内在するパラメータに従った正値解の存在を研究した.2008年にGarcia-Melian, Morales-Rodrigo, Rossi, and Suarezによって得られた分岐成分の大域的挙動に関する結果を変数係数の場合に拡張した.より具体的に述べると,1.符号変化する変係数,つまり成長率の空間非一様性のもとで,境界のある点で係数が正値であれば分岐成分が折り返し点を持つのに十分であることを示した.前年度までに仮定した十分条件「境界のチューブ形状成る近傍において係数が正値である」を弱めることができた.2.いわゆるクランダルとラビノビッツの意味での横断条件(transversality condition)を満たさない場合について,位相解析的手法を用いて分岐正値解の大域的構造を明らかにした.従来の結果は研究代表者による局所構造の解析に留まっていたが,これを横断条件を満たす場合の大域的な結果と同等まで引き上げることができた.

分岐成分の大域的な振る舞いの解析においてキーとなる、折り返し点の存在についての考察が順調に進展している。24年度が最終年度であるため、記入しない。分岐成分の折り返し点の存在に関する議論を精密化する。分岐成分の大域的な振る舞いにおける爆発型非線形境界条件と変数係数(個体の実質成長率)の関わりを朋確にする.そのためには境界近傍における局所的な解析において、新たな比較原理を構築することが必須であると考える。
高温超伝導体及び遷移金属酸化物のラマン散乱

1次元S=1/2量子スピン反強磁性体Ca_2CuO_3は06000cm^<-1>にCuGeO_3は0600cm^<-1>に幅の広い2-マグノン散乱スペクトルを示す。これらの高エネルギー端は2πJ(Jは交換相互作用)に対応し、古典的2-マグノン散乱の高エネルギー端2Jよりはるかに高エネルギーである。1次元反強磁性体の2-マグノン散乱は禁止されているにもかかわらず観測されるのは、鎖間相互作用よりもむしろスピン-フォノン相互作用が重要であると考えられる。高温超伝導体のキャリアーをドープしない絶縁体でもラマン散乱不活性なA_g対称2-マグノン散乱がラマン活性なB_<1g>対称2-マグノン散乱と同程度の強度を持っているのはスピン-フォノン相互作用が重要であると考えられる。La_2NiO_<4+δ>はδ=0.1以上にキャリアーをドープしても絶縁体でδ=0.125では長距離秩序を持つスピン密度と電荷密度の分離が起こることが分かっている。δ=0のとき1500cm^<-1>以下の電子ラマン散乱は温度の上昇と共に増加する。2-マグノン散乱は温度の上昇と共に強度、エネルギー共に低下して、450Kで消失するが、500K以上で高エネルギー側に再び現れる。δ=0.02ではδ=0のときより高エネルギーで温度変化は小さい。このことからキャリアー密度が非常に小さいとき(δ=0で450K以下)は一様に分布するが、それ以上の密度ではスピンと電荷密度の分離が起こることを示している。δ=0.02のときはキャリアーの存在する場所のフォノン・エネルギーが低下し、最高エネルギーのフォノン・ピークが2本に分離する。δ=0.02のときは高温超伝導が抑制されるLa_<2-x>Ba_xCuO_4(x=0.125)と同じLTT構造をとる。このとき電子散乱スペクトルは80K以下で先の最高エネルギーのフォノン・エネルギー以下の散乱強度が減少し、それ以上の強度が増加する。すなわちこのフォノンが関与してフェルミ面近くの電子状態密度が減少することを示しており、La_<2-x>Ba_xCuO_4(x=0.125)の超伝導の抑制に関係していると考えられる。