hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
在宅難病患者と家族のソーシャル・キャピタルと生活満足度に関する実証的研究

在宅で療養する難病患者とその主介護者である家族40組を対象に縦断的調査を行い、ソーシャル・キャピタルと生活満足度に関連する要因を検討した。生活満足度は患者の日常生活自立度、主観的QOL、ソーシャル・キャピタルと関連がみられた。介護者のコンボイ数と介護保険サービス利用数との関連がみられ、コンボイが家族の対処方略を促し、生活満足度を高める可能性が考えられる。本研究は,社会的要因であるソーシャル・キャピタルに着目し,個人レベルのソーシャル・キャピタルを豊かにすることは,自分らしく生きることを望む患者と家族の対処方略を促し,生活満足度を高めるという作業仮説に基づく実証的研究である.平成25年度は、(1)個人レベルのソーシャル・キャピタルのパネル調査の1年次調査(2)集団レベルのソーシャル・キャピタルの実態調査のための関係者への聞き取りである.今年度実施した内容と結果は,以下の通りである.1.個人レベルのソーシャル・キャピタルのパネル調査(1年次)A地域の在宅難病患者と家族を対象に協力依頼を行い,研究参加は60組であった.方法は,郵送による自記式質問調査であった.患者は男性33名と女性27名,家族は男性26名と女性34名であった.患者では生活満足度,QOL得点において性差はみられず,ソーシャル・キャピタルの地域への愛着において男性が女性よりも有意に高かった.家族では生活満足度,主観的幸福感,ソーシャル・キャピタルの各項目において性差はみられなかった.家族発病後に退職した者は3割であり,女性の6割は暮らし向きが悪くなったと回答していた.現在,ソーシャル・キャピタルの関連要因について詳細に分析中である.2.集団レベルのソーシャル・キャピタルの実態調査に向けた関係者への聞き取りA地域のパーキンソン病友の会等3団体の理事に聞き取りを行い,調査票を修正して保健医療福祉サービスの活用実態についても詳細に把握することになった.難病患者家族にとりソーシャル・キャピタルの概念はなじみが薄く,生活満足度やQOLに関連する要因として理解しにくいことが明らかになった.本研究は,社会的要因であるソーシャル・キャピタルに着目し,個人レベルのソーシャル・キャピタルを豊かにすることは,自分らしく生きることを望む患者と家族の対処方略を促し,生活満足度を高めるという作業仮説に基づく実証的研究である.平成24年度は,在宅難病患者と家族のソーシャル・キャピタルを時系列にとらえ,ソーシャル・キャピタルの蓄積・減少・資源(格差)の変化と生活満足度との関連を明らかにするためのパネル調査設計と調査票を作成した.難病患者家族の生活満足度に影響を及ぼす要因として個人のライフイベントを構造的・文化的要因に整理し,ライフコースアプローチによる分析方法を導くことができた.第1回調査は平成24年8月から平成25年1月の6か月間で実施予定であったが,調査協力機関との調整が遅れたため1年延期することとした.平成25年度に予定している集団レベルのソーシャル・キャピタルの実態調査に向けて,A県内の神経難病患者家族会に研究協力を依頼し内諾を得ることができ,調査の準備に入っている.本研究はソーシャル・キャピタルに着目し、個人レベルのソーシャ・ルキャピタルを豊かにすることは、患者と家族の対処方略を促し、生活満足度を高めるという作業仮説にも続く実証的研究である。平成26年度は、(1)個人レベルのソーシャル・キャピタルのパネル調査の2年次調査(2)集団レベルのソーシャル・キャピタルの実態調査である。今年度実施した内容と結果は以下の通りである。1.個人レベルのソーシャル・キャピタルのパネル調査(2年次)A地域の在宅難病患者と家族60組を対象に、郵送自記式質問紙調査を行った。2回目は、保健福祉サービスやその他サービス利用状況を追加し、ソーシャル・キャピタルとの関連を把握した。現在回収中であり、今後分析を行う予定である。2.集団レベルのソーシャル・キャピタルの実態調査難病患者会が持つ社会的機能に着目して、ソーシャル・キャピタルの現状を把握することを目的として、患者会役員10名に面接調査を実施した。患者会は、会員に対する相談支援機能を担い、会員から信頼されている一方で、会員同士のつきあいや一緒に出かけるなどのネットワークは小さかった。地域への信頼は強く、地域の中でのネットワークは大きいことが示唆された。患者会のソーシャル・キャピタルの認知、地域への期待、保健師への期待については、現在分析中である。本研究はソーシャル・キャピタルに着目し、個人レベルのソーシャル・キャピタルを豊かにすることは、患者と家族の対処方略を促し生活満足度を高めるという作業仮説に基づく実証的研究である。平成27年度は、個人レベルのソーシャル・キャピタルパネル調査の3年次調査を行った。分析対象は40事例である。藤澤らのソーシャルキャピタル6項目の合計点は経年変化がみられず、患者と家族においても差はみられなかった。患者生活満足度、QOLは日常生活動作と関連が見られ、難病患者QOL得点と生活満足度は弱い相関があった。家族においても、患者の日常生活自立度と生活満足度、主観的幸福感との関連が見られた。発病後の対処では、患者の8割以上が実施したのは「専門医受診を受診する」「生活を守る努力をする」「できることは自分で行う」「健康管理をする」の4つであり、「他の患者や家族の相談にのる」は1割と少なく、「付き合いを拡げる」「自分の望みを伝える」の対処をしている者は4割であった。

家族においても「他の患者や他の家族の相談にのる」「付き合いを拡大する」といった対処をする者は2割と少なかった。また、「患者会に参加する」「近隣の支援がある」「友人の支援がある」者は1割以下であった。本研究において、難病患者とその家族のソーシャルキャピタルは同様の傾向を示し、生活満足度とQOlに関連する要素は患者の日常生活自立度であることが示唆されたが、ソーシャル・キャピタルと生活満足度の関連はみられなかった。作業仮説に基づき、退職や家族人数の変化などライフコース・データと生活満足度、QOLの関連について事例ごとに分析予定である。ソーシャル・キャピタルの醸成においては、難病患者とその家族が患者会や地域との交流を図っていくことも課題である。パネル調査の対象者は少ないが、ソーシャル・キャピタルと生活満足度、介護福祉サービス活用実態について経年的に把握ができている。量的研究を予定していたが対象事例の抜け落ちも多く、今後は事例研究として詳細な分析を行う。難病患者と家族の個人レベルのソーシャルキャピタル(以下、SCとする)を把握するため、4年次パネル調査を行った。毎年次、研究参加者の脱落が多く、結果に影響している可能性がある。平成28年度の分析対象は32事例である。藤沢らのSC6項目の合計点は、患者と家族ともに経年変化が見られず、両者の差はみられなかった。ライフコース・データでは、就職や退職、結婚・家族人数の変化などの変化が見られた事例も数例であった。また、患者家族会に参加している事例は3例であり、参加とSCとの関連は認められなかった。生活満足度について不満足と回答した割合は患者40%に対し家族は5%であった。患者の生活満足度とQOLは、療養年数と日常生活自立度と関連が見られ、SCと生活満足度は強い相関が、SCと難病患者QOL得点は弱い相関が認められた。一方、家族のSCと生活満足度・主観的幸福感との関連はみられなかった。以上の結果から、患者の生活満足度を検討する場合、患者がSCをどのように認識しているかを理解する意義が示唆された。家族を対象とした4年次調査では、主介護者のコンボイに着目して難病患者介護者のサポート選好を把握した。家族が認識するコンボイ数は5人から8人が多く、メンバーは配偶者や子ども、きょうだいが占め、医師や看護師、介護支援専門員等の専門職は少なかった。今後、事例ごとにライフコース・データ、コンボイの認識とサポート選好、生活満足度、主観的幸福感の関連について詳細に分析していく予定である。5年間で5回の調査を予定していたが、1年次調査の実施が2年目にずれ込んだため、4回の実施にとどまっている。本研究はソーシャルキャピタルに着目し、個人レベルのソースあるキャピタルを豊かにすることは患者と家族の対処方略を促し、生活満足度を高めるという実証的研究である。平成29年度は個人レベルのソーシャルキャピタル調査の5年次調査を実施した。5年間継続調査の回答者は22組であり、患者30人、介護者24人で初年次調査対象の4割であった。5年間の抜け落ちの理由は、患者の死亡や施設入所、拒否などであった。
過渡的な時間領域性能仕様を達成するロバスト制御系設計

本研究では,最近その有効性が周波数領域仕様の制御問題で確認されたLMIツールを,より実用的な時間領域仕様をもつロバスト制御問題に適用し,その可能性について検討した.その結果,以下の成果を得た.1線形行列不等式(LMI)に基づいた時間領域仕様の統一的ロバスト解析理論の構築構造的変動を持つ制御対象が、時間領域で記述された種々の仕様をロバストに満たすための条件を与えるような,LMIに基づく統一的な枠組を構築した.具体的には,これまで個別に提案されてきた,時間領域仕様を記述するのに適した二次形式リアプノフ関数と,ロバスト性を補償するのに有効な入出力スケーリングとを,フィードバック系の有効提起性(Well-Posedness)の概念を用いて統一された観点から結びつけ,LMI条件を導出した.2時間・周波数領域仕様をもつロバスト制御系設計問題の数値最適化問題への帰着上記解析理論と既に提案されている周波数領域統一解析理論とを融合し,時間領域での過渡応答仕様と周波数領域での定常応答仕様とを同時に満たす閉ループ系をLMI条件で書き下し,ロバスト制御系設計問題を線形代数問題として定式化した.さらに,この問題の解である補償器パラメータが存在するための必要十分条件を求め,その条件が満たされた場合の全ての解をパラメトライズする方法を提案した.このようにして得られる条件は行列不等式で与えられ,それで定義される数値最適化問題を解くことにより補償器の設計が可能となる.3凸計画法を活用した設計アルゴリズムの開発項目2の最適化問題がLMIで記述される場合は凸計画法を適用し,非線形な行列不等式で表される場合は凸最適化反復法などを用いて複数のLMI問題へと帰着させることにより解を得る方法を示した.また,提案した設計法の有効性を設計例により確認した.本研究では,最近その有効性が周波数領域仕様の制御問題で確認されたLMIツールを,より実用的な時間領域仕様をもつロバスト制御問題に適用し,その可能性について検討した.その結果,以下の成果を得た.1線形行列不等式(LMI)に基づいた時間領域仕様の統一的ロバスト解析理論の構築構造的変動を持つ制御対象が、時間領域で記述された種々の仕様をロバストに満たすための条件を与えるような,LMIに基づく統一的な枠組を構築した.具体的には,これまで個別に提案されてきた,時間領域仕様を記述するのに適した二次形式リアプノフ関数と,ロバスト性を補償するのに有効な入出力スケーリングとを,フィードバック系の有効提起性(Well-Posedness)の概念を用いて統一された観点から結びつけ,LMI条件を導出した.2時間・周波数領域仕様をもつロバスト制御系設計問題の数値最適化問題への帰着上記解析理論と既に提案されている周波数領域統一解析理論とを融合し,時間領域での過渡応答仕様と周波数領域での定常応答仕様とを同時に満たす閉ループ系をLMI条件で書き下し,ロバスト制御系設計問題を線形代数問題として定式化した.さらに,この問題の解である補償器パラメータが存在するための必要十分条件を求め,その条件が満たされた場合の全ての解をパラメトライズする方法を提案した.このようにして得られる条件は行列不等式で与えられ,それで定義される数値最適化問題を解くことにより補償器の設計が可能となる.3凸計画法を活用した設計アルゴリズムの開発項目2の最適化問題がLMIで記述される場合は凸計画法を適用し,非線形な行列不等式で表される場合は凸最適化反復法などを用いて複数のLMI問題へと帰着させることにより解を得る方法を示した.また,提案した設計法の有効性を設計例により確認した.
小・中学生にとってのインターネットを用いた課題解決学習の意義と課題

問題・目的平成15,16年度の特定領域研究(2)より,小・中学生のインターネット使用に関して,以下の3点が見出された。(1)インターネット使用頻度が高い子どもは,抑うつ傾向が高まる一方,科学的・知的な事象への関心も高まる。(2)インターネットを用いた理科の授業を楽しいと感じる子どもの割合が,他の理科の時間よりも高い。(3)課題解決学習でインターネットを用いる子どもの中には,発表時に自分で作った資料に読めない漢字があることに気づく者もいる。そこで,本研究では,以下の3点を検討することを目的とした。(1)インターネット使用は,理科や他の授業,家庭での使用頻度が高まっているが,インターネットの使用は,子どもの知的関心・追究意欲に影響を与えるのか。(2)知的関心・追究意欲は,学習意欲や適応を高めるのか。(3)それらの関連の仕方に学年差はみられるのか。方法質問紙調査法:小・中学生のインターネット使用の影響へ注目。対象:小学4年生6年生約3,000名。調査時期:第1回調査2006年7月,第2回調査2007年2月。調査内容:インターネット使用率,インターネットの使用形態,追究意欲,科学的興味・関心,学業への自信,毎日の学習時間,将来展望,学校生活への満足感,仲間関係,心理的健康等。結果分析の結果,主に,以下の4点が示唆された。(1)インターネットの使用は,小・中学生の知的関心・科学的興味関心を高める一方で,抑うつをも高める。(2)小学生では,教育熱心な家庭環境と,インターネットを使用する頻度の高さが関連している。(3)中学生では,身体を動かすことや外交的人間関係へのネガティブな意識とインターネット使用頻度の高さが関連している。(4)家庭環境を反映しない程度までインターネットの普及率が高まれば,小学生でのポジティブな関連が見られなくなる可能性も懸念される。課題解決学習における学習方略の違い,特に,インターネットを用いた場合と用いない場合で,子どもの課題に対する興味・関心,理解の程度は異なるのかについて,広く子どもの特性を捉えた上で,質問紙調査によって検討する。今年度は,特に夏休みの自由研究という,より自由な学習形態の枠組みの中での調査学習形態特性を捉えることにより,子どもの学習形態の嗜好性との関連を捉える事が可能であると考えた。小学46年生約1,000名を対象として3回の質問紙調査を実施した(第1回2005年7月,第2回9月,第3回2006年2月,のべ約3,000名。)調査内容は,第1回(1)夏休みの自由研究の計画(2)課題の理解の程度,興味・関心,インターネット利用率等,学業への自信,将来展望,学校生活への満足感,心理的健康等,第2回:自由研究の振り返り,第3回調査:第1回調査(2)と同様の質問紙を実施した。調査の結果,以下の点が示された。子どものメディア習慣として,1日あたりテレビ視聴時間は23時間。テレビゲームは1時間程度。パソコンのインターネットを使用する頻度は「しない」が5575%だが,学校差がみられる。(読書量も学校差がみられる。)携帯電話でのメールなどは「しない」が90%程度。学校の好きな活動は,休み時間,図工,体育,家庭科,給食の時間,総合的な学習の時間・理科の順で,理科は,主要教科の中では最も好まれる教科として位置づけられる。順位はいずれの学校でもほぼ同様。課題解決学習におけるインターネットの利用は,利用しようという計画は高いが実際に利用する程度は低い。インターネット利用率の高い子どもの特徴として,女子が多い高学年になるほど多い。知的関心,追究意欲が高い。塾通いの割合が高い。学力は高め。抑うつ傾向が高い。小学生段階では,インターネット利用そのものが家庭環境(教育熱心な家庭像)を反映している可能性がある。

(2)小学生では,教育熱心な家庭環境と,インターネットを使用する頻度の高さが関連している。(3)中学生では,身体を動かすことや外交的人間関係へのネガティブな意識とインターネット使用頻度の高さが関連している。(4)家庭環境を反映しない程度までインターネットの普及率が高まれば,小学生でのポジティブな関連が見られなくなる可能性も懸念される。
卵巣癌における相同組換修復欠損に着目した新規分子標的治療法の探索

【目的】本研究では、1.卵巣癌においてPARP阻害剤の感受性に関わるゲノムプロファイルを調べる、2.相同組換修復異常を誘導する分子標的治療薬を同定する、3.相同組換修復異常を誘導する薬剤とPARP阻害剤の抗腫瘍効果を解明することを研究目的とした。【方法】ヒストンメチルトランスフェラーゼSMYD2の標的遺伝子の一つがPARP1であることに着目し、卵巣漿液性癌細胞株を用いて、SMYD2阻害剤とPARP阻害剤を併用し、抗腫瘍効果を確認した。これまでに収集した自施設の漿液性癌78例の全エクソンシークエンスのデータをもとに、変異シグネチャーや染色体コピー数異常を解析し、BRCA1/2変異以外に相同組換え修復異常を示すと考えられる候補症例を抽出した。【成績】SMYD2阻害剤は単独でも卵巣漿液性癌細胞に対し、抗腫瘍効果を示した。抗腫瘍効果の主たる要因として、細胞死を誘導することも明らかとなった。さらに、PARP阻害剤との併用により、相加的な抗腫瘍効果が生じることも見い出した。卵巣漿液性癌の臨床検体における全エクソンシークエンスによる変異シグネチャー解析の結果、BRCA1/2変異陽性例と類似の塩基置換パターンを示す症例が、むしろBRCA1/2変異陽性例よりも高頻度に存在することを見出した。さらに、BRCA1/2変異とは別のDNA修復経路に遺伝子変異を有するサブグループが存在することを見出した。特徴的な塩基置換パターンは、TCGA等の公的データベースによる解析でも再現性をもって検出されており、特定の遺伝子のコピー数増加と負の相関にあることが示された。【結論】卵巣漿液性癌において、PARPを標的とする新たな分子標的治療法の可能性が示された。また、PARP阻害剤の感受性、相同組換え修復不全という生物学的特性をゲノムプロファイルから詳細に推定できる可能性が示された。予定通りに研究を遂行できており、研究の成果を英語論文として報告した。変異シグネチャーについての解析データも、初回進行高異型度卵巣癌患者を対象としたオラパリブ維持療法に関する多施設共同第II相臨床試験(医師主導治験)におけるバイオマーカー評価の閾値設定に役立てている。国内外の学会発表の場でも研究成果を報告しており、本研究プロジェクトは順調に進展している状況である。2018年度は、卵巣癌においてPARP阻害剤の感受性に関わるゲノムプロファイルを調べ、DNA修復経路に作用する新規分子標的治療薬であるSMYD2阻害剤の抗腫瘍効果を検討した。2019年度以降は、相同組換修復と関連するような分子標的治療法の探索をさらに進め、相同組換修復異常と関連する変異シグネチャーとの相関を調べ、バイオマーカーとしての有用性についても検討する予定である。さらに、相同組換修復欠損を示さない卵巣癌細胞において、相同組換修復異常を誘導するような分子標的治療薬の同定も検討する予定である。

2019年度以降は、相同組換修復と関連するような分子標的治療法の探索をさらに進め、相同組換修復異常と関連する変異シグネチャーとの相関を調べ、バイオマーカーとしての有用性についても検討する予定である。さらに、相同組換修復欠損を示さない卵巣癌細胞において、相同組換修復異常を誘導するような分子標的治療薬の同定も検討する予定である。前年度までの研究費をもとにしたデータ等を活用したため。2019年度以降の更なる機能解析や分子標的治療法の探索的な研究に使用する計画である。
日本語音声における韻律的特徴の実態とその教育に関する総合的研究ー国語教育における音声教育の方策に関する研究ー

1.DAT録音による音読・朗読の実態調査(1)鹿児島市立田上小学校/16年生(男子・女子各2名)(2)都城市立大王小学校/16年生(男子・女子各2名)(3)佐賀市立本庄小学校/3・5年生(男子・女子各2名)(4)兵庫教育大学附属小学校/3・5年生(男子・女子各2名)(5)大阪教育大学附属小学校/3・5年生(男子・女子各2名)(6)秋田市立広面小学校/16年生(男子・女子各2名)(7)八戸市立図南小学校/16年生(男子・女子各2名)2.音読・朗読の実態の分析実態調査で得られた音声資料を「音声録聞見」によって視覚化し分析をおこなった。主に、ポ-ズについての解析によって、いわゆる「学校読み」の実態とその原因を追究した。その詳しい内容については、日本語音声『研究成果中間報告書1991』(総括班)に報告した。3.音読・朗読の指導の観点これまでの実態調査とその解析、その他先行研究をふまえて、D2班では、次のような指導段階を提起した。A.文字を正確に音声化する諸段階B.流暢に音声化する諸段階C.余裕をもって、一文一文を表現的に読もうとする諸段階D.全体と部分との関係を把握して、表現の特性を捉え、それを活かそうとする諸段階各々の段階についての具体的な指導の観点については、D2班の平成3年度研究成果報告書(平成4年4月刊予定)に報告する。また、音声言語表現教育のカリキュラム、方言教育その他の研究成果についても成果報告書に掲載する。
触媒的不斉タンデム反応の開発

報告者は,自身が先に開発したニッケル触媒による一段階多成分連結(タンデム)反応についての新たなる展開を目指して,この反応の不斉化すなわちエナンチオ選択的な多成分連結反応の検討を行った.その結果,ニッケルとアルミニウムフェノキシドとの複合触媒系に対し光学活性単座オキサゾリンを配位子として用いたときに,エノンとアルキンとのエナンチオ選択的な環化三量化反応が進行し,最高58%ee(鏡像異性体過剰率)で環化付加体が得らることを見出した.一方,これまでに報告されたいる触媒的不斉反応において利用されてきた光学活性ホスフィンあるいはビスオキサゾリンをこの反応の配位子として使用したところ,エナンチオ選択性の発現はほとんど見られなかった.更に興味深いことにこの単座オキサゾリンを用いた環化付加反応は付加体の位置選択性を完全に制御できることが明らかになった.これらの結果は,昨年度において報告者が示したニッケル触媒存在下でのクロロトリメチルシランとエノンとアルキンおよびジメチル亜鉛との分子間不斉タンデムカップリング反応の結果と合わせて,シンプルなモノオキサゾリンの遷移金属触媒反応の配位子としての利用に対し新たなる可能性を提示するものである.報告者は,自身が先に開発したニッケル触媒による一段階多成分連結(タンデム)反応についての新たなる展開を目指して,この反応の不斉化すなわちエナンチオ選択的な多成分連結反応の検討を行った.その結果,ニッケルとアルミニウムフェノキシドとの複合触媒系に対し光学活性単座オキサゾリンを配位子として用いたときに,エノンとアルキンとのエナンチオ選択的な環化三量化反応が進行し,最高58%ee(鏡像異性体過剰率)で環化付加体が得らることを見出した.一方,これまでに報告されたいる触媒的不斉反応において利用されてきた光学活性ホスフィンあるいはビスオキサゾリンをこの反応の配位子として使用したところ,エナンチオ選択性の発現はほとんど見られなかった.更に興味深いことにこの単座オキサゾリンを用いた環化付加反応は付加体の位置選択性を完全に制御できることが明らかになった.これらの結果は,昨年度において報告者が示したニッケル触媒存在下でのクロロトリメチルシランとエノンとアルキンおよびジメチル亜鉛との分子間不斉タンデムカップリング反応の結果と合わせて,シンプルなモノオキサゾリンの遷移金属触媒反応の配位子としての利用に対し新たなる可能性を提示するものである.報告者は,遷移金属触媒による一段階多成分連結(タンデム)反応についての自身の一連の研究成果を下にこの反応の不斉化すなわちエナンチオ選択的な多成分連結反応の実現をめざし検討を行った.その結果ニッケル触媒存在下におけるクロロトリメチルシランとエノンとアルキンおよびジメチル亜鉛と反応において光学活性単座オキサゾリンを配位子に用いたときにこれらの基質分子が一段階で連続的に結合し高い位置,立体選択性を保ちつつ比較的高い鏡像異性体過剰率(ee)でタンデムカップリング生成物が得られることを見出した.一方,これまでに報告されたいる触媒的不斉反応において利用されてきた光学活性ホスフィンあるいはビスオキサゾリンをこの反応の配位子として使用したところ,エナンチオ選択性の発言はほとんど見られなかった.本反応の結果は,分子間での不斉タンデム反応の新しい例を提供したばかりではく,触媒反応の配位子としてはこれまで注目されなかったシンプルなモノオキサゾリンの光学活性配位子としての利用の新たなる可能性を予感させるものとなった.報告者は,自身が先に開発したニッケル触媒による一段階多成分連結(タンデム)反応についての新たなる展開を目指して,この反応の不斉化すなわちエナンチオ選択的な多成分連結反応の検討を行った.その結果,ニッケルとアルミニウムフェノキシドとの複合触媒系に対し光学活性単座オキサゾリンを配位子として用いたときに,エノンとアルキンとのエナンチオ選択的な環化三量化反応が進行し,最高58%ee(鏡像異性体過剰率)で環化付加体が得らることを見出した.一方,これまでに報告されたいる触媒的不斉反応において利用されてきた光学活性ホスフィンあるいはビスオキサゾリンをこの反応の配位子として使用したところ,エナンチオ選択性の発現はほとんど見られなかった.更に興味深いことにこの単座オキサゾリンを用いた環化付加反応は付加体の位置選択性を完全に制御できることが明らかになった.これらの結果は,昨年度において報告者が示したニッケル触媒存在下でのクロロトリメチルシランとエノンとアルキンおよびジメチル亜鉛との分子間不斉タンデムカップリング反応の結果と合わせて,シンプルなモノオキサゾリンの遷移金属触媒反応の配位子としての利用に対し新たなる可能性を提示するものである.
多孔性媒質内流れの高精度数値解析による地下水汚染シミュレーション手法の構築

本研究では、地下水の流れを解析するための数理モデルについて調べ、比較検討を行った。地下水の流れに代表される多孔性媒質内の流れ解析については、古くから様々な手法が提案されてきている。本研究では、流れの現象のモデルとして浸透流方程式とNavier-Stokes方程式を取り上げ、実験結果と比較することで、これらのモデルによる数値計算について検討を行った。本研究で取り上げる多孔性媒質内の流れ解析については、古くから多くの研究が行われてきている。H.Darcyによる研究から始まって、特に土木分野では現場における必要性から多くのモデルが提案され、実用化されてきている。それらの研究においては、運動方程式として飽和・不飽和浸透流方程式と呼ばれるものが用いられている。これは、より一般的な流れの解析で用いられるNavier-Stokes方程式を簡略化したものと考えることができ、土質中のように流速が非常に遅いところでは妥当なモデルとあると考えられている。しかしこのモデルにも、圧力分布を与える関すが実験的に与える必要があること、不飽和領域に存在する多数の微細な気液界面の影響が充分に考慮されていないこと、Navier-Stokes方程式の中で重要な役割を果たしている移流項が無視された形になっていること、などの問題点があると考えられる。これらの問題点を改善して、より現実に即した、信頼性のあるシミュレーションを行うための数理モデルを構築するのが、本申請研究の目的とするところである。平成20年度は、以下の点について研究を行った。(1)多孔性媒質中のメニスカスに由来する表面張力を、体積力として運動方程式にとりこむ手法の検討(2)上記の運動方程式を効率的に解くための数値アルゴリズムを厚生し、計算コードの作成計画では20年度に土層実験との比較までを行う予定であったが、移流項の計算精度を向上させるための手法の検討と計算コードの作成に手間取ったため、実験との比較は準備を行うにとどまった。次年度には、土層実験との比較に進む予定である。(1)移流項の離散化についての検討運動方程式の移流項の離散化にCIP法を適用し、その他の離散化方法との比較を行った。まず、2次元の典型的なテスト問題を用いてプログラムの検証を行い、3次元問題に拡張して検証を行った。その結果、すでに多くの論文で報告されているように、他の風上差分法系統の方法に比べて質量保存則を高い精度で満たしていることが確認できた。(2)土層実験との比較M.Vauclinによって報告されている土層実験結果を用い、同様の条件で数値シミュレーションを行うことによってその結果を比較した。この実験は、3m×2m×0.5mの土層を用い、複数の方法で水分を与えた場合の領域内各点における飽和度の時系列変化が測定されているものである。初期状態においては、飽和領域と不飽和領域が混在している。この実験結果に対して、(1)初期状態における水分飽和度分布の考慮の有無、(2)水分量移動の式の離散化方法の違い、を与えて実験における飽和度分布の時間変化とそれに対応する数値シミュレーションによる結果とを比較し、2乗ノルムを用いてその差を評価した。(1)については、垂直方向の初期飽和度分布が結果に大きく影響した。これは主となる流れが鉛直方向であるため、その考慮の有無が水分移動の速度に大きく関わっているためと考えられる。(2)については、予想に反してCIP法を用いた場合もその他の風上差分法を用いた場合もあまり大きな違いは得られなかった。これは、元々の現象の特性速度が遅く非線形性があまり強くなかったためであると考えられる。次年度は、地下水解析の分野で広く用いられている浸透流解析の手法との比較を行う計画である。これらの比較等により、多孔性媒質内における流れの数値シミュレーションをより高精度に行い、地下水流動に関わる種々の環境問題に役立てることが可能になることが期待される。(1)浸透流方程式を用いた数植シミュレーション本年度は地下水流動解析の分野で広く用いられている浸透流解析による数値シミュレーションを行った。まず、3種類の土質からなる1次元の典型的なテスト問題についての厳密解を求め、プログラムの検証を行った。それにより、格子間隔を小さくしていくことによる厳密解への収束が確認できた。この実験による水分飽和度分布の時間変化とそれに対応する数値シミュレーションによる結果とを比較し、2乗ノルムを用いてその差を評価した。初期状態における水分飽和度分布の考慮の有無については、垂直方向の初期飽和度分布が結果に大きく影響した。(3)モデリングによる比較21年度に行ったNavier-Stokes方程式を用いた場合と、実験データとの誤差について比較を行い、浸透流方程式を用いた場合もNavier-Stokes方程式を用いた場合も、実験との誤差に大きな違いはないというという結果が得られた。

当初期待していたのはNavier-Stokes方程式を用いることによって精度の向上が実現できるのではないかということだったが、そのような結果にはならなかった。これは、対象とした実験が比較的小さな領域内の地下水流れであったこととも関係していると思われる。今後の発展としては、より大きな領域での比較を行うことを検討することが必要であると思われる。
後肢筋に空胞形成が見られる行動異常突然変異体マウスの疾患モデルとしの開発

行動異常突然変異体(Cro)マウスの後肢骨格筋中に形成される空胞の内容物の由来を知るために筋線維の構成蛋白に就いて、SDS-PAGE電気泳動法によって分画解析を行ない、正常対照との比較から異常の有無を検討した。筋小胞体画分中の蛋白をButcherらの方法で分画抽出し電気泳動を実施した結果、croマウスにおいて分子量約47000の蛋白バンドが欠失していることが見出された。この蛋白バンドは1ケ月令以降の正常対照マウスでは分子量約45,000の蛋白とほぼ等量で、1対をなし、合計2本の蛋白バンドとして認められるが、croマウスではそのうち47,000の1本が欠失していた。又、この蛋白バンドの欠失は、croマウスと、他系のBALB/cマウスとの交配F_1マウスでは全く認められず、F_2マウスでは行動異常を発症した個体では全て欠失が認められたが、発症しない個体では欠失したものと、発現するものとが認められた。この結果は、1ケの常染色体劣性遺伝子によって発現される行動異常形質と全く同じ様式で遺伝されることを示しており、従ってこの蛋白バンドの欠失はcro遺伝子によって継代される形質の一つであることが明らかになった。又、この蛋白バンドの欠失が、他の組織学的生化学的異常の発現する前に既に認められること、並びにこの蛋白バンド自体が正常個体で明らかに認められる時期から既にcroマウスでは欠失していること、などからこの欠失がcro-遺伝子による形質発現の極く初期の段階で現われる変化であることが推定され病因の解明に有力な手掛りを与えるものと期待される。更に、この欠失バンドの生理機能に関しては、泳動像をステインズオールで染色してCa^+^+との結合に就いて調べた所、ネガティブな結果が得られた。即ち、筋小胞体に存在してCa^+^+と結合して重要な生理機能を示すカルセクエストリンとは別のものであることが判った。当教室で見出した骨格筋中に空胞形成の認められる緩徐進行性の筋弱力症を発現する突然変異体マウスに就いて組織学的生化学的検索を行い以下の結果を得た。1.光顕レベルの組織学的観察によって空胞中の物質は脂質を含む蛋白質からなる筋組織由来の構造物が変化したものである事が確かめられた。又空胞は特定の筋のみでなく多くの骨格筋で認められ筋束の末端部に多発していた。2.電顕的観察により空胞部にtubular aggregatesが多数存在し、その中にはlamella構造をしたいわゆるmyeloid bodyと思われる物質が混在している事が認められた。3.血液中に含まれるアミノ酸の組成をしらべたところ正常マウスとは著しく異っており、バリン,ロイシン,フェニルアラニン,リシンなどの含量が有意に増加している事が判った。この変化はdyマウスmydマウスなど他の筋ジス・マウスでの変化と類似しており、筋疾患に共通した変化と思われる。4.アルカリ(pH9.0)側に至適pHの在るプロテアーゼ活性が8ヶ月令以降の変異体マウス後肢筋において著しく上昇する事が認められた。この活性は基質特異性阻害物に対する感受性などからキモトリプシン型の酵素に由来するものと推定される。又活性が上昇する時期が空胞形成が認められる時期とほぼ一致する事から、空胞形成に何等かの関与をしている事が考えられる。5.血清中,骨格筋中,腎臓中のγ-GT酵素の活性を測定した結果、対照マウスに比較して変異体マウスで有意に活性上昇している事が認められた。この事からこの変異体マウスでは一般的な膜の機能異常が存在する事が推測される。以上の結果からこの変異体マウスの骨格筋では細胞膜,或いは細胞内膜構造物,特にエネルギー生産系に構造的欠陥があり、そのため空胞が形成される事、又その結果エネルギー供給が不充分になる偽、筋の弱力化が進行するものと結論された。進行性に骨格筋の弱力化が認められる行動異常突然変異体(B6CBA/JーCRO)マウスでは骨格筋或いは血漿などで様々な異常を発現することが判っているがその一つに8ヶ月令以後の骨格筋線維中に高頻度に空胞形成が認められるということがある.昨年度の電顕を用いた組織学的検索の結果,空胞中にはラメラ構造をしたいわゆるミエロイド体と思はれる物質を含んだテュブラルアグリゲートの集合物が存在することが確かめられた.即ちこの集合物は骨格筋中の膜構成分の一部が何等かの原因により欠失又は破壊されたために完全な膜構造が形成出来ない結果,異常な構造物として畜積されたものと推測される.今年度は筋線維中に存在する膜構造の蛋白成分を検討する目的で主としてSDSーPAGE電気泳動法による解析を行った. 8ヶ月令のcroーマウス後肢筋のホモジネートから筋小胞体画分(SR)を採取し(Butcherらの方法),これを試料として電気泳動を行った結果構成蛋白バンドの一つが欠失していることが見出された.このバンドは分子量約50,000程度の蛋白で,2本のバンドが近接して泳動されるうちの1本である事が判った.そこでCroーマウスでのこのバンドの欠失を月令別に追跡したところ,3ヶ月令迄は,正常対照と同じ位置にバンドを持っているが,それ以降ではこのバンドが消失することが判明した.

更にこのバンドの持つ機能を検討するため正常対照マウスの試料を用いて,泳動後のスラブをステインオール法で染色しCa^<++>との結合をしらべた結果,欠失バンドはCa^<++>に対する結合能を持っていないことが認められた.従ってCa^<++>結合蛋白として知られるカルセクエストリン(分子量約60,000と推定される)とは違う蛋白であることが判明した.更に分子量が類似していることからMeissnerらのM_<55>蛋白に担当する可能性が考えられるが,その機能に就いての検討は目下続行中である.行動異常突然変異体(Cro)マウスの後肢骨格筋中に形成される空胞の内容物の由来を知るために筋線維の構成蛋白に就いて、SDS-PAGE電気泳動法によって分画解析を行ない、正常対照との比較から異常の有無を検討した。筋小胞体画分中の蛋白をButcherらの方法で分画抽出し電気泳動を実施した結果、croマウスにおいて分子量約47000の蛋白バンドが欠失していることが見出された。この蛋白バンドは1ケ月令以降の正常対照マウスでは分子量約45,000の蛋白とほぼ等量で、1対をなし、合計2本の蛋白バンドとして認められるが、croマウスではそのうち47,000の1本が欠失していた。又、この蛋白バンドの欠失は、croマウスと、他系のBALB/cマウスとの交配F_1マウスでは全く認められず、F_2マウスでは行動異常を発症した個体では全て欠失が認められたが、発症しない個体では欠失したものと、発現するものとが認められた。この結果は、1ケの常染色体劣性遺伝子によって発現される行動異常形質と全く同じ様式で遺伝されることを示しており、従ってこの蛋白バンドの欠失はcro遺伝子によって継代される形質の一つであることが明らかになった。又、この蛋白バンドの欠失が、他の組織学的生化学的異常の発現する前に既に認められること、並びにこの蛋白バンド自体が正常個体で明らかに認められる時期から既にcroマウスでは欠失していること、などからこの欠失がcro-遺伝子による形質発現の極く初期の段階で現われる変化であることが推定され病因の解明に有力な手掛りを与えるものと期待される。更に、この欠失バンドの生理機能に関しては、泳動像をステインズオールで染色してCa^+^+との結合に就いて調べた所、ネガティブな結果が得られた。即ち、筋小胞体に存在してCa^+^+と結合して重要な生理機能を示すカルセクエストリンとは別のものであることが判った。
JCウイルスの増殖制御に関与する新規核外輸送担体の同定と治療への応用

JCウイルス(JCV) agnoprotein (agno)はJCV発現蛋白の中で唯一細胞質に局在するが、その機能は明らかでない。研究代表者はagnoの核外移行シグナルを同定し、その細胞質局在が既知の核外輸送担体CRMIに依存しないことを見出した。そこでagnoの核外輸送に関与する新規核外輸送担体を同定するため、agnoをbaitとして酵母2ハイブリッドスクリーニングを施行した。その結果、ヘテロクロマチン蛋白HPIをagno結合蛋白として同定した。この結合はin vitro, in vivo両方において確認された。さらにin vivoにおいて、この結合はagnoが核膜に局在するときに起こること、この結合によって核膜の構造維持に必要なHPIとLamin B receptor (LBR)との結合が競合的に阻害され、その結果LBRが核膜から乖離されて核膜の微小構造が崩壊すること、またこの崩壊によって核内のJCV粒子が核外に放出されやすくなることを見出した。これまでJCVと同じヒトポリオーマウイルスに属するSV4Dにおいて、agnoはウイルスのcell to cell spreadに関与することが報告されているが、その機序はこれまで明らかにされていなかった。本研究によってJCV agnoは核内で複製・増殖した子孫粒子はヒトポリオーマウイルス間で非常によく保存されていることから、このagno機能はポリオーマウイルス間に共通して見られると考えられた。JCウイルス(JCV)agnoprotein(agno)はウイルス発現蛋白の中で唯一細胞質に局在し、その機能は明らかでない。申請者はagnoの核外移行シグナルを同定し、そのモチーフ配列が核外移行因子CRM1によって認識されるロイシンリッチ配列であるにも関わらず、CRM1特異的阻害薬に影響されないことを見出した。この結果はagnoの核外移行にCRM1以外の因子が関与することを示唆している。そこで平成15年度は、(1)GST-pulldown法を用いたagnoのNES配列に結合する蛋白の単離、および(2)Yeast two hybrid screening法を用いたagno結合蛋白の同定を試み、以下の進展を得た。agnoのロイシンリッチ配列を中央に含む15アミノ酸残基を、GSTとの融合蛋白として発現させ(GST-agnoNES)、GST-pulldown法を行った。しかし多くの非特異蛋白が共沈され、反応条件検討後も非特異結合を除去することができなかった。さらにGST-agnoNESは大腸菌内で強固な封入体を形成し、ラージスケールの解析に充分な量の融合蛋白を得るのが難しかったことも問題点のひとつであった。GST-pulldown法と同様に、ロイシンリッチ配列を含む15アミノ酸残基をbaitとした結果、細胞骨格蛋白等を含む100種類以上の多様な陽性クローンが得られ、非特異クローンとの鑑別が困難であった。一方、核外輸送因子と結合する為にはagnoが核内に局在する必要があることから、核内で発現するagnoのN末端側をbaitとして再度スクリーニングを試みた。その結果、核膜の構造維持に重要な蛋白が陽性クローンとして同定された。現在両者の結合が核膜の構造及びウイルスの増殖にどのような影響を及ぼすかを検討中である。
クーロメトリーを利用した新規抗酸化活性測定法の開発

抗酸化活性の評価には、その抗酸化反応による生成物の物性や反応速度に関する評価が重要である。本年度はまず、数種のポリフェノール化合物を取り上げ、電気化学酸化に伴う酸化生成物のHPLCによる分離分析を行った。オルト-ヒドロキノン骨格を持つ化合物種は、主たる酸化生成物であるキノン体がヒドロキノン体に再還元される過程が観察された。この結果から、キノン体同士の電子移動が起こっていることが示唆された。再還元のあと、生成したヒドロキノン体とキノン体との間で二量化反応が進行し、さらに還元力のある生成物が多種生成していることが確認された。このようなヒドロキノン体の再生反応は、オルト-ヒドロキノン骨格をもつ化合物に特徴的であった。酸化に伴って、再度還元力のある生成物が生成することから、オルト-ヒドロキノン骨格をもつ化合物が、その他の抗酸化剤と比較して、高い抗酸化活性を示すことが理解できる。また、抗酸化活性評価法としてしばしば用いられるDPPHラジカル消去活性について、その反応過程を電気化学的に追跡した。ほぼ可逆な電子移動を行うもの(パラ-ヒドロキノン)、DPPHへの電子移動ののち抗酸化剤由来の反応生成物が電極不活性化しているもの(カフェイン酸など)、DPPHと付加反応が示唆される、抗酸化剤・DPPH共に電極不活性な化合物を生成するものなど、反応機構はさまざまであることが明らかとなった。このような反応機構の違いは、反応相手であるラジカル化合物の種類により異なると考えられるため、反応相手により活性の大小が異なることがうかがえる。以上のように生成物に焦点を当てて、ラジカル消去反応を解析することで、これまでとは異なる視点で活性評価が行えると考えられる。現在のところ、抗酸化剤として作用するポリフェノールの代表例としてカフェイン酸(3,4-ジヒドロキシケイ皮酸)を取り上げ検討を進めている。第一に、クーロメトリー測定による電解酸化生成物の解析を行ってきた。抗酸化活性を評価するためには、抗酸化剤自身が酸化された後、どのような生成物を生成するのかを評価する必要がある。これまでの検討により、電解する試料溶液のpHを変化させて電解生成物の検出を行ってきた。測定試料を、全電解が可能な電気分解セルを通したのちHPLCにて分離・検出を行った。分離にあたり、カラム(ジーエルサイエンス社製InertSustainC18)、溶離液(酢酸アンモニウム水溶液+メタノール混合溶媒によるグラジエント分離)、電解液(酢酸アンモニウム系緩衝液)、の各条件の最適化を完了した。電解直後の試料をオンラインでインジェクションポートに注入し、分離カラムに通した。この際、注入までの時間を変化させることで、酸化生成物の時間安定性の評価を行った。カフェイン酸は、酸化直後は二電子酸化体が主生成物であったが、二電子酸化体の安定性はpHに依存し、pHが高いほど副反応の進行が速くなった。pH>7では酸化数分後に10種類程度の生成物が生成した。高pHほど副反応がより速く進行するとともに、生成物の種類が多く反応が複雑になることが明らかとなった。これらの生成物は溶存酸素によりさらなる副反応を起こすことが懸念されるが、本研究では脱ガスの上、すべてオンラインで分析を行っているため、酸素による影響は無視できるものと考えられる。またフォトダイオードアレー分光光度計によりスペクトル測定を行うことで、各分画成分の吸収スペクトルを安定に得ることができた。以上の結果から得られた電子移動機構は酸化方法(電気分解、化学酸化)によりややことなると考えられるため、今後さらに検討を進めていく。今年度は当初予定していた各抗酸化剤のORAC活性の取得には至らなかったが、ORAC活性データについて過去の報告をまとめることができた。電気化学測定については、フロー全電解セルの作製し、それを用いて全電解生成物をHPLCにて分離検出するシステムを完成させた。以上のことからおおむね順調に進んでいると判断した。一般的に抗酸化剤の活性評価には、種々のラジカル種との反応性を数値化することが行われている。それと合わせて、抗酸化反応(すなわち電子移動反応)に伴って生成する生成物の物性を評価することが非常に重要であることを主張してきた。本課題の解決にあたり、本年度は抗酸化剤の酸化生成物をHPLCシステムにて分離検出し、その生成物の構造解析を行った。フロー全電解セルによる電解酸化よって生成する酸化生成物を検出し、溶媒組成はじめ反応条件の影響を観察した。単純な二電子酸化体(キノン体)が一時的に生成するものの直ちに別の構造に変化していくことが分かった。このとき、溶媒中に水が存在すると多量化が進行し、主として二量体が多く検出された。一方、水がない環境下では多量化は進行しなかったが、キノン体のヒドロキノン体への戻りが観察された。共に酸化生成物が後続反応により再度還元力を持つ化合物を生成することが示された。これらの生成物をクーロメトリーにより検出し、各分画の電解電子数を求めた。一方、電解酸化ではなくDPPHラジカルとの化学酸化による生成物も、単純な二電子酸化体であるキノン体はほとんど生成しないことが、ボルタンメトリー検出またはHPLCにより観察された。

抗酸化剤の酸化機構は複雑で、その生成物も多様であるが、クーロメトリーにより種々の酸化生成物をより定量的に評価することができ、DPPH法やORAC法に代表される分光検出と合わせて評価を行うことができれば、より詳細な抗酸化活性の評価が可能になると示唆された。当初予定していたORAC測定時の反応追跡を行うことはできなかったが、もっともよく知られる抗酸化活性評価法であるDPPH法の反応過程における抗酸化剤の電気化学検出を行うことができた。抗酸化活性の評価には、その抗酸化反応による生成物の物性や反応速度に関する評価が重要である。本年度はまず、数種のポリフェノール化合物を取り上げ、電気化学酸化に伴う酸化生成物のHPLCによる分離分析を行った。オルト-ヒドロキノン骨格を持つ化合物種は、主たる酸化生成物であるキノン体がヒドロキノン体に再還元される過程が観察された。この結果から、キノン体同士の電子移動が起こっていることが示唆された。再還元のあと、生成したヒドロキノン体とキノン体との間で二量化反応が進行し、さらに還元力のある生成物が多種生成していることが確認された。このようなヒドロキノン体の再生反応は、オルト-ヒドロキノン骨格をもつ化合物に特徴的であった。酸化に伴って、再度還元力のある生成物が生成することから、オルト-ヒドロキノン骨格をもつ化合物が、その他の抗酸化剤と比較して、高い抗酸化活性を示すことが理解できる。また、抗酸化活性評価法としてしばしば用いられるDPPHラジカル消去活性について、その反応過程を電気化学的に追跡した。ほぼ可逆な電子移動を行うもの(パラ-ヒドロキノン)、DPPHへの電子移動ののち抗酸化剤由来の反応生成物が電極不活性化しているもの(カフェイン酸など)、DPPHと付加反応が示唆される、抗酸化剤・DPPH共に電極不活性な化合物を生成するものなど、反応機構はさまざまであることが明らかとなった。このような反応機構の違いは、反応相手であるラジカル化合物の種類により異なると考えられるため、反応相手により活性の大小が異なることがうかがえる。以上のように生成物に焦点を当てて、ラジカル消去反応を解析することで、これまでとは異なる視点で活性評価が行えると考えられる。昨年度と同様にこれらの反応生成物をHPLCにかけ、分離検出を行う。電極酸化時の結果と比較して生成物の種類が異なるか、または同じであるかの判別を行うことで電気化学酸化と化学酸化の機構の違いを評価するとともに、その相関を議論する。この結果から電気化学的な抗酸化活性の評価の妥当性を検討する。ORAC測定過程でのクーロメトリー測定を行い、抗酸化剤がORAC測定過程でどのように変化しているかを追跡する。当初の目的であったORAC法による抗酸化能評価の反応過程の追跡をクーロメトリーまたはボルタンメトリー法などの電気化学検出法により行っていく。抗酸化剤の構造とその反応過程(反応機構)の共通性について議論を深めていく予定である。
「私に近づくあなたは誰？」～嗅覚を介した社会的動機づけの形成機構の解明

コミュニケーションは社会生活に必須の要素だが、相手の情報を受け取った個体がコミュニケーションを成り立たせるために自らの行動を変化させて相手を記憶する社会的動機づけが、どのようにして形成されるのかはまだ研究が進んでいない。本研究は、ラットの嗅覚に関わる前嗅核を含む神経回路の働きが、相手を忌避する社会的動機づけと社会性記憶の形成にどのような影響を及ぼすのかを、光刺激を用いた神経活動操作法や神経回路標識法を用いて明らかにする。本研究により、非言語性のコミュニケーションに基づく意思決定や記憶形成のメカニズムの一端が明らかになり、協調や反発などの社会性行動が生み出される過程の理解が進むことが期待される。
プロトン感受性ＴＲＰＰ３チャネルの新規味覚受容機構の解明

本年度はTRPP3のゲーティングに関わる分子基盤と苦味受容における構造機能連関およびin vivoレベルにおけるTRPP3の苦味受容について詳細な検討を行った。1)TRPP3チャネルのゲーティング基盤と苦味応答との関連性の検討TRPP3チャネルの選択性フィルター近辺のアミノ酸残基のうち533番目のアスパラギン残基(N533)は、TRPP3チャネルのキニーネ応答に重要であり、キニーネに対するTRPP3チャネルの応答にはN533を基盤とした不活性化が関与することが示唆された。2)TRPP3ノックアウトマウスを用いた苦味受容解析TRPP3ワイルドタイプ(WT)マウスとTRPP3ノックアウト(KO)マウスを用いて、水とキニーネ溶液による長時間二瓶選択実験(48時間)を行い、キニーネ作用に対する忌避行動(オン応答)について検討した。キニーネ溶液摂取量の比率の濃度依存性に有意な差はみられなかった。続いて、キニーネ除去による後味に対する忌避行動(オフ応答)についての解析として、二瓶とも30 μMキニーネ溶液で前処理を行った直後に、水と30 μMキニーネによる短時間二瓶選択実験(15分間)を行った。その結果、KOマウスでは水よりもキニーネ溶液の摂取量が少なかったが、WTマウスでは水よりもキニーネ溶液を多く摂取する傾向を示した。また、in vitro実験でTRPP3活性に影響しない苦味物質であるデナトニウムを用いて同様に二瓶選択実験を行った。デナトニウム忌避におけるオン応答およびオフ応答のどちらにおいても、WTとKOマウスの間に有意な差はみられなかった。したがって、これまでにin vitroで観察された苦味物質のwash outによるTRPP3チャネル活性化に相当する事象がin vivoにおいても観察され、個体レベルにおいてTRPP3が苦味のオフ応答に関与しているものと考えられた。26年度が最終年度であるため、記入しない。TRPP3チャネルは細胞外アルカリ化により閉状態から開状態へ、さらにはイオン不透過な不活性化状態へとキネティクス制御されることを明らかとしてきたが、ゲーティングに関わる分子基盤については不明であった。これまでに電位依存性チャネルの不活性化メカニズムとして細胞内N末端が関与するN-type不活性化と選択性フィルター周辺が関与するC-type不活性化が知られていることから、TRPP3の細胞内N末端切断変異体(Δ2-90:ΔN)と選択性フィルター周辺に存在するアミノ酸残基のアラニン変異体(NANR 531-534 AAAA:4A)を作製し、各変異体発現細胞のチャネル電流の性質をホールセルパッチクランプ法により検討した。その結果、ΔN変異体はWT-TRPP3と同様のpH感受性を示したが、4A変異体ではアルカリによるチャネルの不活性化が消失していた。したがって、TRPP3の細胞外アルカリによる不活性化メカニズムには選択性フィルター周辺の531-534番目のドメインが重要な役割を果たしており、C-type不活性化が分子基盤であることが示唆された。また、TRPP3に対する様々な苦味物質の効果についてホールセルパッチクランプ法により検討した。その結果、ベルベリンとデナトニウムはTRPP3活性に影響しなかったが、キニーネとカフェインはTRPP3を活性化したことから、TRPP3は新規苦味受容体として機能している可能性が考えられた。さらに、味覚調節因子である温度がTRPP3活性に影響するかについて検討した。チャネル電流は40°Cへの温度上昇により減少したが、その後の温度低下により顕著に増大した。したがって、TRPP3は温度上昇により不活性化(オープン待機状態)へと移行しており、熱刺激除去により不活性化から開状態へと急速に遷移することで瞬時にチャネル活性が亢進するというモデルが考えられた。平成25年度は、苦味標準物質キニーネがTRPP3チャネル活性を制御する様式について詳細に検討した。TRPP3発現細胞にキニーネを作用させwash outすると、濃度依存性にTRPP3電流が増大した。この際、シングルチャネルコンダクタンスではなくチャネル開確率が増加することを明らかとした。続いてTRPP3の機能調節サブユニットと考えられているPKD1L3をTRPP3と共発現したが、TRPP3単独発現の場合と比較してキニーネの効果に有意な差はみられなかった。したがって、キニーネの効果はTRPP3分子への直接作用であることが示唆された。また、TRPP3チャネルのゲーティングは高温刺激によっても調節されることから、TRPP3チャネルのキニーネ応答に対する温度の影響について検討した。その結果、32°Cにおけるキニーネ誘導性のTRPP3チャネル活性化は25°Cの場合と比較して小さかった。これより、温度刺激とキニーネが協同的にTRPP3チャネルを制御することが示唆された。前年度の研究において、TRPP3チャネルの不活性化に選択性フィルター近辺のドメイン(531-534 : NANR)が重要であることを見出した。それゆえ本年度は、このドメインの各アミノ酸残基の点変異体(N531Q、N533Q、R534Q)を作製した。N533QおよびR534Q変異体において、野生型と比較して脱分極により生じる外向き電流が増加し、再分極後のテール電流が減少した。これより、これらの変異体ではTRPP3の不活性化が消失していると考えられた。続いて細胞外pHの効果を検討したところ、チャネル活性はアルカリpH