hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
酵母のメタノール制御系を利用した新規異種遺伝子発現系の開発

近年、組み替え微生物による物質生産が多く報告されるようになったが、実験室モデル生物である大腸菌やパン酵母などでは、条件設定が困難な誘導因子によりその大量発現が行われていたり、またその生産量が低かったりしている。本研究では、メタノール資化性酵母Candida boidiniiを用いて安価なメタノールの存在により強く誘導される新規な異種遺伝子発現系の構築を目指した。まず、本酵母内へ外来遺伝子を導入する技術を確立するために、本酵母における高頻度形質転換系を構築した。本実験では、C.boidinii染色体DNAよりSaccharomyces cerevisiaeとCandida boidiniiの両宿主内で自己複製活性を持つDNA断片(CARS1,CARS2)を取得して、リチウム法を改良することにより形質転換頻度の改良を行い、C.boidinii形質転換系を確立した。次に、先にクローニングされているC.boidiniiAOD15'-隣接断片をS.cerevisiaeADK1構造遺伝子の上流に連結してC.boidinii染色体内へ導入して、アデニル酸キナーゼの大量発現を試みた。すると菌体内蛋白質の28%にも及ぶアデニル酸キナーゼがC.boidinii内で大量発現された。また大量発現されたアデニル酸キナーゼは、このように大量発現された条件下でも、S.cerevisiae内にある時と同様にそのN-末端がアセチル化されており、蛋白の修飾も効率よく行われていることが示された。また、染色体挿入型あるいは自律複製型など様々な種類の形質転換体を作成しその発現制御について検討した結果、先にクローン化されたC.boidiniiAOD1遺伝子の5'-隣接領域にはAOD1遺伝子の発現制御を司るのに必要十分なcis-配列が存在していることが明らかとなった。
林地斜面における土壌物理特性の不均質分布の計測と不均質分布が斜面水文過程に及ぼす影響のモデル化

林地斜面土層内の不均質な水移動の実態を解明する目的で,TDR式水分計による体積含水率の計測を,高空間分解能で行った。計測は,滋賀県南部の田上山系内に位置し,ヒノキ,コナラを主木とし,ヒサカキ,ネジキ,リョウブ等の下層植生を有する天然性林において行った。縦50cm,横50cmの土壌断面を掘削し,縦・横10cm間隔の格子点上に合計25本のTDRセンサーを設置した。TDRセンサーは,センサーロッド長30cmのものを10cmにカットし,より小範囲の水分状態を詳細に計測できるようにした。このため,出力値を含水率に変換するために提示された既往の経験式を用いることができない。このため,現段階では含水率の絶対値の議論を行うことはできず,本年度は出力値の変動からみられる水みちの様子について解析を行った。2002年の秋から冬にかけては,土層の左半分に偏った浸透が見られたが,その後,その偏りが徐々に緩和され,土層の表面から順に平均的に浸透する様子が観測された。2002年の夏から秋にかけては,例年にない小雨で,土壌が極端な乾燥状態にあった。乾燥にともなう土壌の撥水性の発現により,2002年の秋から冬にかけて浸透の不均質性が大きくなり,時間の経過と共に撥水性の影響が少なくなったものと考えられた。2003年の4月より約2ヶ月おきに,含水率計測地点付近の表層土壌から採取した土壌サンプルを用いて,撥水性の試験(WDPT試験)を行った。いずれ計測でも,現場の含水状態では大きな撥水性が観測されなかったものの,サンプルを乾燥させた後に計測した結果は,いずれも大きな撥水性を示した。このことから,表層土壌が潜在的に撥水性を持ち,土壌の乾燥に伴ってそれが発現されることが確かめられた。研究者の所属するグループが既往研究において行った,林地斜面土層から採取した大型不撹乱試料中の水移動に関する実験,および林地斜面土層の2次元断面における不均質水移動の詳細な観測の結果を整理した。その上で,実験・観測データに基づいて水移動に関わる土壌物理特性を抽出する手法について検討した。また,既存のシミュレーションモデルのレビューを行い,土壌の不均質性をRichards式へ組み込む際の問題点について整理した。さらに,土壌水文モデルで解析を行う水文データを取得する目的で,観測森林流域を設定するために,現地踏査を行い,土層厚分布,地下水位存在状況,土壌物理特性の予備的な試験を実施した。その上で,設定した森林流域において,水文観測を開始した。本研究で構築する土壌水文モデルは,水資源管理や洪水・土砂災害発生予測を意図したものであるため,降雨量,流域からの流出量,流域内部の地下水位と土壌水分の空間分布の観測を行う装置を設置した。この際土壌水分については,不均質な水移動の実態を解明する目的で,TDR式水分計による体積含水率の計測を,高空間分解能で行うようにした。計測結果は,土壌の表層においては,季節毎に湿りやすい場所,湿りにくい場所が変化することを示していた。これに対して下層では,湿りやすい場所,湿りにくい場所が比較的安定しており,常に決まった部位にプレファレンシャルフローが存在していることが示唆された。
周術期における低酸素依存性遺伝子応答に関する研究

周術期使用薬剤が、酸素代謝の調節に中心的な役割を果たしている低酸素誘導性遺伝子応答に与える影響を分子生物学的に検討した。1.静脈麻酔薬propofolは、HIF-1の構成的な活性を抑制するが、1%低酸素条件下での活性化には影響しない。一方、静脈麻酔薬thiamylal.thiopentalは構成的かつ誘導性のHIF-1の活性を抑制する。2.局所麻酔薬lidocaine、bupivacaineは、HIF-1の構成的、誘導性の活性に影響を与えなかった。3.μ,κ,δオピオイド受容体の特異的なリガンドは、HIF-1の構成的、誘導性の活性に影響を与えなかった。5.カルシウム拮抗薬のうち第3世代薬剤cilnidipineが、HIF-1の構成的、誘導性の活性を抑制する。6.敗血症の病態の進展に中心的な役割を果たすグラム陰性細菌由来菌体lipopolysaccharideは、単球から分化成熟化したマクロファージ様細胞株において分化状態依存的にHIF-1の活性化をもたらした。以上の研究結果は、関係学会で発表するとともに専門誌に公刊した。周術期使用薬剤が低酸素誘導性遺伝子応答に及ぼす影響を明らかにすることが本課題の目的である。私たちは転写因子hypoxia-inducible factor 1(HIF-1)の活性化を指標にしこの問題を検討し初年度の研究成果として以下の結果を得た。1.静脈麻酔薬プロポフォールが細胞の酸素分圧感知機構に影響を与えるのではなく、HIF-1のアルファサブユニット(HIF-1a)の翻訳を阻害することによりHIF-1の活性を阻害することを培養細胞株を用いた分子生物学的な手法で明らかにした。2.局所麻酔薬リドカインとブピバカインが低酸素誘導性のHIF-1の活性化を阻害しないことを培養細胞株を用いた分子生物学的な手法で明らかにした。3.ニトロプルシッド、イソソルバイド、ニトログリセリンの三種の硝酸製剤のうちニトロプルシッドが選択的にHIF-1aの細胞内蓄積を阻害することによりHIF-1を介した低酸素誘導性遺伝子応答を阻害することを明らかにした。さらにニトロプルシッドの作用はnitric oxide(NO)に依存しないことまた可溶性グアニル酸シクラーゼの活性にも依存しないことを培養細胞株を用いた分子生物学的な手法で明らかにした。4.NOの供与体であるNOC-18が、MAPK、P13K依存的にHIF-1を活性化することを培養細胞株を用いた分子生物学的な手法で明らかにした周術期使用薬剤が低酸素誘導性遺伝子応答に及ぼす影響を明らかにすることが本課題の目的である。私たちは転写因子hypoxia-inducible factor 1(HIF-1)の活性化を指標にしこの問題を検討し計画二年目の研究成果として以下の結果を得た。1.ムスカリン作動性のアセチルコリン受容体の刺激がHIF-1の活性をもたらすことを培養細胞を用いた実験系で示して成果を公刊した。2.昨年度に概要を明らかにしていた、静脈麻酔薬プロポフォールが細胞の酸素分圧感知機構に影響を与えるのではなく、HIF-1のアルファサブユニット(HIF-1α)の翻訳を阻害することによりHIF-1の活性を阻害するこという結果を公刊した。3.昨年度に概要を明らかにしていた、肝細胞由来また神経細胞由来の培養細胞株において、局所麻酔薬リドカインとブピバカインが低酸素誘導性のHIF-1の活性化を阻害しないという結果を公刊した。4.三種類のオピオイド受容体の刺激がHIF-1の低酸素誘導性の活性化に影響を及ぼさないことを分子生物学的な手法を用いて明らかにした。周術期使用薬剤が低酸素誘導性遣伝子応答に及ぼす影響を明らかにすることが本課題の目的である。私たちは転写因子hypoxia-inducible factor 1(HIF-1)の活性化を指標にしこの問題を検討し計画三年目の究成果として以下の結果を得た。1.本年度までに明らかにしていた静脈麻酔薬プロポフォールのHIF-1への阻害的な作用の発見に続き、静脈酔薬チオペンタール、サイアミラールが、HIF-1の常酸素下における構成的な活性に加えて、低酸素誘導性活性化を用量依存的に阻害することを培養細胞株を用いた検討の結果に見いだした。

この阻害作用はGABA容体に対する作用を介するものでないことを示唆する実験結果も得た。2.オピオイド受容体ライガンドが、神経細胞由来細胞株において常酸素分圧下、低酸素分圧化のいづれにいてもてHIF-1の活性に影響を及ぼさないことを見出し、公刊した。3.局所麻酔薬キシロカイン、ブピバカインが、神経細胞由来細胞株において常酸素分圧下、低酸素分圧化いづれにおいてもてHIF-1の活性に影響を及ぼさないことを見出し、公刊した。4.降圧薬ヒドララジンが、血管平滑筋、血管内皮細胞において、常酸素条件下で臨床使用濃度でHIF-1の強い誘導作用を持つことを見いだした。
ポリコーム遺伝子bmi-1による幼若リンパ球の増殖と細胞死のバランス調節機構

多様な抗原を認識するT細胞受容体(TCR)のレパトアは、幼弱Tリンパ球の著しい増殖過程によって形成される。本研究は、この増殖期における細胞死抑制のメカニズムとその意義についての検討を目的としたものである。その成果として、ポリコーム遺伝子Bmi1は、ガン抑制遺伝子であるInk4a/Arf遺伝子座のヒストンH3トリメチル化を維持する事で、Arf遺伝子の発現を抑制し、増殖期でのアポトーシスを抑制している事がわかった(Immunity 2008)。さらに、Arf遺伝子発現制御の生理学的意義とその細胞死誘導機構を解明するため、Arf遺伝子欠損マウスと強制発現(Tg)マウスをさらに解析した。結果として、Arf遺伝子は、幼若T細胞のβ選択において非常に強力な抑制作用を持ち、その機構は、p53を活性化しアポトーシス誘導遺伝子であるPuma, Baxを高発現させることであることを、Arf-Tg ; TCR-Tg ; p53-/-マウスを作製・解析することで明らかにした(unpublished)。そしてArf遺伝子の発現意義について、arf-/- ; rag1-/-ダブルノックアウトマウスだけでなく、arf-/- ; scid-/-ダブルノックアウトマウスを作製し、arfがbmi-1-/-だけでなく、正常なT細胞分化・選択においても、check-pointの分子として機能する事を証明した(unpublished)。このbmi-1→arf→p53→puma/baxという経路は何の為にあるのか?幼若T細胞は、他の細胞分化と比べても顕著な増殖過程を必要とする。増殖期の細胞の核内のヌクレオソーム構造は、非常に緩くDNA damageを受けやすい。つまり癌化の危険が非常に高いと言える。我々が明らかにしたpathwayは、おそらくこの増殖過程における癌化の監視機構として働いていると考えられる。実際、Arf KOやp53 KOマウスは、非常にlymphomaを起こしやすく、この事を証明していると言える。現在、さらに詳細な解析を加え、論文を作製している段階である。
円形脱毛症における調節性T細胞の関与と局所免疫療法との関連について

昨年度までに治療前の脱毛症患者から皮膚生検によって頭皮組織を得た。さらに局所免疫療法を行った円形脱毛症患者において、発毛を認めた部位より検体を得た。健常者コントロールとなる頭皮については、頭部の皮膚腫瘍切除術で得られた検体の健常部位を使用した。検体より凍結切片を作成しCD4とCD25に対する抗体を使用した免疫組織化学染色における2重染色により、Tregを同定した。さらにTregの活性化に必要なFoxp3の発現についても同様の検討を行った。これまでの研究において、健常人の毛包周囲にはリンパ球浸潤はごくわずかであるが、成長期毛の周囲にCD4+、CD25+細胞を認めた。一方、円形脱毛症の病変部における毛包周囲にはいわゆるswarm of beesを呼ばれるCD4+T細胞が密に浸潤していた。その多くはCD25-細胞であった。一方、局所免疫療法を施行し、発毛を認めた部位では毛包周囲のCD4+T細胞は減少していたが、一部にCD4+CD25+T細胞を認めた。すなわち、局所免疫療法を施行することによってTregが浸潤し、自己反応性のT細胞の活性を抑制することで、毛包に対する自己免疫反応を抑制している可能性が示唆された。さらにFoxp3の発現も同様の傾向を示した。統計的な差を検討するためにはさらなる検体数が必要である。また末梢血でもCD4+CD25highの細胞の増加がみられ、局所免疫療法が全身の免疫反応に対しても影響を与えていることが示唆された。よって局所免疫療法が抑制性T細胞を増加させることが治療効果の機序の一つであると思われる。初期の円形脱毛症では毛包周囲にリンパ球が密に浸潤しており、毛包のimmune privilege(IP)が破綻されることで自己免疫性脱毛がおこると考えられている。我々は、毛包のIPの維持のためにregulatory Tcell(Treg)が重要な役割を演じており、その機能や数の減少がIPの破綻とそれに引き続く円形脱毛症の発症に関与があるのではないかと考えた。またsquaric acid dibutylester(SADBE)による局所免疫療法が治療として有効であるが、その機序についてはまだ不明な点が多く、Tregとの関わりについて検討した。これまでに治療前の脱毛症患者から皮膚生検によって病変部の検体を得た。さらに局所免疫療法を行った円形脱毛症患者においては、発毛を認めた部位より検体を得た。健常者コントロールとしては、頭部の皮膚腫瘍切除術で得られた検体の健常部位を使用した。検体より凍結切片を作成しCD4とCD25に対する免疫組織化学染色によりTregを同定した。さらにTregの活性化に関与するFoxp3の発現についても同様の検討を行った。健常人の成長期毛の周囲では、リンパ球浸潤はごくわずかであるがCD4+,CD25+細胞を認めた。一方、円形脱毛症の病変部における毛包周囲にはいわゆるswarm of beesと呼ばれるCD4+T細胞の密な浸潤を認めたが、多くはCD25-細胞であった。局所免疫療法により発毛を認めた部位では毛包周囲のCD4+T細胞は減少していたが、一部にCD4+CD25+T細胞を認めた。今後さらに組織や末梢血におけるTregを中心とした表面マーカーの検討、機能についての評価を行っていく予定である。
歯の再生医療システム構築のための基盤技術開発

本研究では、歯の再生医療システム構築のための基盤技術開発を行った。マウスiPS細胞から神経堤様細胞を誘導し、胎生マウス歯胚から単離した歯性間葉細胞と一定濃度で混合し、それらを歯胚上皮組織と再構成して器官培養した結果、再生歯胚の発生が認められた。また、マウスiPS細胞および神経堤様細胞から歯性細胞を誘導する技術の開発を行った。さらに、IGF-1が歯性間葉細胞の増殖と象牙芽細胞分化を亢進することを明らかにし、現在論文作成中である。メカニカルストレスを応用した再生歯胚作製のための基盤的知見を得るために、メカニカルストレスに対する骨細胞と頭蓋縫合の反応を解析し、得られた成果を論文発表した。歯の欠損の治療は、現在人工材料を用いた補綴処置が主である。しかしこれまでの動物、細胞を用いた活発な研究の成果により、歯の再生医療が現実味を帯びてきた。本研究課題では、1)再生歯胚を作製するための成体内細胞シーズの探索、2)歯胚形成誘導遺伝子を用いた歯の再生医療システムの構築に向けた探索研究、3)再生歯胚・再生歯の移植システムの開発、4)IGF-1をはじめとするサイトカインとメカニカルストレスによる形態制御技術の開発を推進し、歯の再生医療システム構築のための基盤技術開発を行う。まず、マウスiPS細胞を用いた再生歯作製のための上皮および間葉細胞の誘導を行った。その結果、マウスiPS細胞をマウス歯胚細胞から採取した培養上清を用いて培養することにより、複数の歯性上皮あるいは間葉細胞マーカーを発現する細胞に誘導できることが明らかとなった。また、分化した細胞の上皮および間葉細胞マーカーのタンパク質発現を解析するために免疫蛍光染色を行い、デコンボリューション倒立顕微鏡を用いて現在解析中である。さらに我々は、IGF-1により歯胚が大きくなることを見いだしており、その分子制御機構の解明を行った。以上の研究から、再生歯胚作製のためのiPS細胞由来歯性上皮および間葉細胞の誘導に関する基盤的な知見を得ることができ、今後より効率的なiPS細胞由来上皮および間葉細胞の誘導方法を確立するうえで大きな意義がある。今後は、iPS細胞から誘導した上皮および間葉細胞を3次元的に構築し器官培養と実験動物への移植実験を行うことによって、再生歯胚の作製を目指す。しかしこれまでの動物、細胞を用いた活発な研究成果により、歯の再生医療が現実味を帯びてきた。本研究課題では、1再生歯胚を作製するための成体内細胞シーズの探索、2歯胚形成誘導遺伝子を用いた歯の再生医療システムの構築に向けた探索研究、3再生歯胚・再生歯の移植システムの開発、4IGF-1をはじめとするサイトカインとメカニカルストレスによる形態制御技術の開発を推進し、歯の再生医療システム構築のための基盤技術開発を行った。平成25年度は、歯性間葉細胞発生過程で認められる因子の発現亢進を示す細胞をマウスiPS細胞から誘導し、PCRによる遺伝子発現解析とデコンボリューション倒立顕微鏡による免疫蛍光解析を行った。得られた細胞を、胎生マウス歯胚から単離した歯性間葉細胞と一定濃度で混合し、それらを歯性上皮組織と再構成して器官培養した結果、歯胚の発生が認められた。得られた歯胚をマウス腎皮膜下へ移植し、歯の発生について現在解析中である(論文作成中)。また、再生歯胚の形態制御技術の開発を目指し、IGF-1により再生歯胚の大きさが増大するメカニズムの解析を行った。その結果、IGF-1は歯性間葉細胞の増殖と象牙芽細胞分化を亢進することが明らかとなった(論文作成中)。さらにメカニカルストレスを応用した再生歯胚作製のための基盤的知見を得るために、メカニカルストレスに対する骨細胞と頭蓋縫合の反応を解析し、それぞれ論文発表(Hoshi, Takeshita, Takano-Yamamoto et al., J Bone Miner Res, 2013)と論文投稿を行った。以上の結果から、iPS細胞由来歯性細胞から再生歯胚の作製が可能であることが示された。また、IGF-1とメカニカルストレスは、再生歯胚発生における分子機構を制御することが示唆される。

本研究課題では、1再生歯胚を作製するための成体内細胞シーズの探索、2歯胚形成誘導遺伝子を用いた歯の再生医療システムの構築に向けた探索研究、3再生歯胚・再生歯の移植システムの開発、4IGF-1をはじめとするサイトカインとメカニカルストレスによる形態制御技術の開発を推進し、歯の再生医療システム構築のための基盤技術開発を行う。まず、歯の再生医療システムの構築に向けて、iPS細胞を用いた再生歯作製のための上皮および間葉細胞の誘導を行った。その結果、マウスiPS細胞をマウス歯胚細胞から採取した培養上清を用いて培養することにより、複数の歯性上皮あるいは間葉細胞マーカーを発現する歯性の細胞に誘導できることが明らかとなった。また、これらのiPS細胞由来歯性上皮あるいは間葉細胞と、胎生マウス歯胚の上皮および間葉細胞の遺伝子発現パターンを比較し、より天然の歯性細胞の特性に近づけるための歯胚形成遺伝子の絞り込みを行った。さらに、BMPやFGFなどのサイトカインが、iPS細胞から歯性上皮および間葉細胞への誘導におよぼす影響と、IGF-1による歯胚形態制御機構についても検討を行った。以上の研究から、再生歯胚作製のためのiPS細胞由来歯性上皮および間葉細胞の誘導に関する基盤的な知見を得ることができ、今後より効率的なiPS細胞由来上皮および間葉細胞の誘導方法を確立するうえで大きな意義がある。今後は、iPS細胞から誘導した上皮および間葉細胞を3次元的に構築し器官培養と実験動物への移植実験を行うことによって、再生歯胚の作製を目指す。歯の再生医療システムの構築に向けたiPS細胞から歯性上皮および間葉細胞の誘導実験を行い、歯性上皮あるいは間葉細胞マーカーを発現する細胞の誘導が達成できたため。25年度が最終年度であるため、記入しない。当初予定していた、1)歯の再生医療システムの構築に向けた探索研究における歯胚形成遺伝子の絞り込み、2)再生歯形成のためのiPS細胞由来上皮および間葉細胞の作製、および3)サイトカインによる再生歯胚形態制御技術の開発に関する研究を行い、歯性上皮あるいは間葉細胞マーカーを発現するiPS細胞の誘導が達成できたため。今後は、iPS細胞から歯性上皮および間葉細胞誘導方法の確立とそれらを用いた再生歯胚の作製、およびiPS細胞由来再生歯胚の移植システムの確立を目指して、以下の実験を行う。1)歯胚形成遺伝子を用いた歯の再生医療システムの構築に向けた探索研究の達成を目指し、歯胚形成遺伝子をマウスiPS細胞に遺伝子導入して作製した、歯胚形成遺伝子を有する上皮および間葉細胞を再構成させて再生歯胚を発生させる。発生させた再生歯胚から歯を形成させてマイクロCT撮影し、3D-CT画像を3次元構築して定量的形態計測を行うとともに組織学的に解析する。2)メカニカルストレスおよびサイトカインによる再生歯胚形態制御技術の開発を目指し、単一化した歯胚間葉・上皮細胞をコラーゲンゲル内に注入し再構成歯胚を作製して、IGF添加するとともに振動刺激を与えて培養して発生した形態制御再生歯胚を組織学的に解析する。負荷するメカニカルストレスは、振動刺激以外に伸展刺激なども検討する。3)再生歯胚・再生歯の移植システムの開発を目指し、iPS由来の細胞を用いた再生歯胚作製技術、歯形成遺伝子導入による再生歯作製技術および形態制御再生歯胚作製技術を確立させた上で、H25年度には、それらの技術を用いて再生歯胚を作製する。作製した再生歯胚を成体マウスの臼歯を抜歯して自然治癒させた顎骨に移植して、再生歯胚の発生と萌出を解析する。マイクロCT解析および組織学的解析を行い、移植システムの基盤的研究を推進する。
小脳プルキンエ細胞におけるリアノジン受容体を介した樹状突起形成制御機構の解明

小脳のプルキンエ細胞におけるリアノジン受容体を介した樹状突起形成制御機構を明らかにするために、単一細胞エレクトロポレーションを用いたsiRNA導入やカルシウムイメージングなどの手法を用いた解析を進めた。プルキンエ細胞で発現するリアノジン受容体1型が樹状突起形成に重要な役割を果たし、その下流でCaM kinase IIa, IIb, IVが共通する基質をリン酸化することによって樹状突起形成を促進することが示された。一方で、顆粒細胞で発現するリアノジン受容体2型も脳由来神経栄養因子(BDNF)の分泌促進を通してプルキンエ細胞の樹状突起形成を促進することが示された。小脳のプルキンエ細胞で発現するリアノジン受容体1型(RyR1)及び2型(RyR2)が樹状突起形成に果たす役割を明らかにするために、培養プルキンエ細胞に対してRyR1及びRyR2のsiRNAを単一細胞エレクトロポレーションという独自の手法を用いて導入し、樹状突起形成への影響を調べた。RyR1のsiRNA導入によって樹状突起形成が抑制されたのに対して、RyR2のsiRNA導入による影響は見られなかった。RyR1とRyR2のsiRNAを同時に導入しても、RyR1 siRNA単独導入の効果を強めることはなかった。これらの効果は、別の配列のsiRNAによっても再現されることを確認した。プルキンエ細胞におけるリアノジン受容体の発現量はRyR1が強く、RyR2が弱いことを考えると、プルキンエ細胞の樹状突起形成にRyR1が大きな役割を果たしていると考えられる。また、リアノジン受容体抑制条件下において、グルタミン酸刺激に対するプルキンエ細胞内カルシウム濃度上昇が抑制されることも確認した。一方で、プルキンエ細胞に入力する顆粒細胞ではRyR2が強く発現しているため、顆粒細胞で発現するRyR2がプルキンエ細胞樹状突起形成に果たす役割についても解析した。培養小脳細胞中の顆粒細胞に対してRyR2のsiRNAを導入すると、プルキンエ細胞の樹状突起形成が抑制された。リアノジン受容体抑制条件下では培養液中への脳由来神経栄養因子(BDNF)の分泌が減少するとともに、この条件下で培養液中にBDNFを添加するとプルキンエ細胞の樹状突起形成が回復した。リアノジン受容体抑制条件下において、グルタミン酸刺激に対する顆粒細胞内カルシウム濃度上昇も抑制されることを確認した。これらの結果から、顆粒細胞で発現するRyR2もBDNFの分泌促進を通してプルキンエ細胞の樹状突起形成を促進する役割を果たすことが示された。前年度までの研究によって、プルキンエ細胞で発現するリアノジン受容体1型が樹状突起形成に重要な役割を果たすことが明らかになった。本年度は、リアノジン受容体の下流で活性化し樹状突起形成に影響を与えることが予想されるシグナル分子(カルシウム依存的に活性化する蛋白質リン酸化・脱リン酸化酵素及びそれらの調節因子)について、そのsiRNAを単一細胞エレクトロポレーションを用いて導入し、樹状突起形成への影響を調べた。CaMKIb、CaMKIIa、CaMKIIb、CaMKIVの各siRNA及びそれらの組み合わせを導入したところ、単独のsiRNA導入による影響は現れなかったが、CaMKIIa、CaMKIIb、CaMKIVのsiRNAを同時に導入すると樹状突起の分枝が抑制された。これより、リアノジン受容体の下流でCaMKIIa、CaMKIIb、CaMKIVが働いて樹状突起形成を促進する可能性があること、その際にはCaMKIIa、CaMKIIb、CaMKIVに共通する基質のリン酸化が重要な役割を果たすことが示唆された。また、DARPP-32、CPI-17の各siRNA及びそれらの組み合わせの導入も試みたが、いずれの場合も樹状突起形成への影響は見られなかった。一方で、単一細胞エレクトロポレーションによってプルキンエ細胞に発現プラスミドを導入して遺伝子の強制発現を行う実験系の構築を行った。GFP発現プラスミド(5.5 kbp)を用いた強制発現を試みたところ、通常の方法によってはGFPが発現しなかった。しかし、通常の内径(0.75 mm)よりも大きな内径(0.94 mm)のガラス管から作製した微小電極を用いたり、プラスミドを制限酵素処理して小さく(3.3 kbp)することによって、GFPを強く発現させることに成功した。最適条件で発現させた細胞では、GFPの発現が20日以上持続した。前年度までの研究によって、プルキンエ細胞で発現するリアノジン受容体1型が樹状突起形成に重要な役割を果たすこと、その下流でcalcium/calmodulin-dependent protein kinase (CaMK) IIa, IIb, IVが共通する基質をリン酸化することによって樹状突起形成を促進することが示唆された。本年度は、プルキンエ細胞の樹状突起形成に関与するCaMKIIa, IIb, IVに共通する基質を探索し、微小管結合蛋白質MAP2がこれに該当することを明らかにした。さらに、リアノジン受容体と同じく細胞内カルシウム放出チャネルであるIP3受容体の関与や、それら以外のカルシウムチャネルとしてカルシウム透過性AMPA型受容体の関与について検討を行った。単一細胞エレクトロポレーションを用いてIP3受容体のsiRNAをプルキンエ細胞に導入した結果、樹状突起形成への影響は認められなかった。一方で、AMPA型受容体GluR2サブユニットのsiRNAをプルキンエ細胞に導入してAMPA型受容体にカルシウム透過性を持たせた結果、樹状突起の伸長と分枝及びスパイン形成が抑制された。

プルキンエ細胞の樹状突起形成過程では、リアノジン受容体を介した促進性のカルシウムシグナルが働くとともに、GluR2を発現することによってAMPA型受容体のカルシウム透過性を抑制する調節機構も働くことによって、正常な樹状突起形成が実現することが示された。小脳のプルキンエ細胞におけるリアノジン受容体を介した樹状突起形成制御機構を明らかにするために、単一細胞エレクトロポレーションを用いたsiRNA導入やカルシウムイメージングなどの手法を用いた解析を進めた。プルキンエ細胞で発現するリアノジン受容体1型が樹状突起形成に重要な役割を果たし、その下流でCaM kinase IIa, IIb, IVが共通する基質をリン酸化することによって樹状突起形成を促進することが示された。一方で、顆粒細胞で発現するリアノジン受容体2型も脳由来神経栄養因子(BDNF)の分泌促進を通してプルキンエ細胞の樹状突起形成を促進することが示された。単一細胞エレクトロポレーションを用いたsiRNA導入という独自の手法を生かして、プルキンエ細胞に対して多種類のsiRNA及びそれらの組み合わせを導入してその効果を解析し、リアノジン受容体の下流で活性化し樹状突起形成に影響を与えるシグナル分子の候補を見出すことができた。また、単一細胞エレクトロポレーションを用いた遺伝子強制発現にも成功した。以上の理由から、本研究はおおむね順調に進展していると考えられる。分子神経生物学2.リアノジン受容体と同じく細胞内カルシウム放出チャネルであるIP3受容体について、ノックアウトマウスを用いた研究では、プルキンエ細胞で発現するIP3受容体は樹状突起形成に関与しないことが報告されている。しかし、IP3受容体をリアノジン受容体と同時に発現抑制すれば、IP3受容体の発現抑制効果が現れる可能性がある。そこで、IP3受容体とリアノジン受容体のsiRNAを単一細胞エレクトロポレーションを用いて同時に導入し、リアノジン受容体のsiRNAのみを導入した時と比較して樹状突起形成抑制効果が強まるかを調べる。3.成熟したプルキンエ細胞においてはGluR2が強く発現しておりAMPA受容体がカルシウム非透過性であるが、幼弱なプルキンエ細胞においてはGluR2の発現が弱いためAMPA受容体がカルシウム透過性である可能性がある。このようなカルシウム透過性AMPA受容体が、リアノジン受容体とともにプルキンエ細胞の樹状突起形成に関与する可能性について検討する。4.単一細胞エレクトロポレーションを用いた遺伝子強制発現系を構築できたので、siRNA導入によって樹状突起形成に影響が現れる遺伝子を強制発現させて表現型が回復することを確認する。単一細胞エレクトロポレーションを用いたsiRNA導入という独自の手法を生かして、プルキンエ細胞で発現するリアノジン受容体の樹状突起形成への関与について、サブタイプ(RyR1及びRyR2)別に明らかにすることができた。また、顆粒細胞で発現するRyR2の関与についても明らかにすることができた。
白血病細胞における分化特異的転写因子発現の解析とそれに基づく病型診断法の開発

転写因子による遺伝子発現制御機構の解明は細胞分化や発癌の機構を理解する上で重要である。本研究では、細胞分化や白血病への理解を深め、より合理的な病型分類や診断に役立てるために、血球の分化や増殖に関連の深いGATA因子などの転写因子の白血病患者芽球における発現状況の解析を行い、さらにGATA-2遺伝子発現調節機構の解明を試みた。平成7年度には、白血病細胞でのGATA-2因子発現様式は正常血球の対応する各分化段階のものにほぼ一致し、特に、幼若な骨髄性細胞で高率に発現されていることが明らかにされ、GATA-2発現の解析は白血病細胞の分化方向の診断に有用であると考えられた。平成8年度には、GATA-2発現は血球系細胞が造血幹細胞や前駆細胞であるための機構と密接に関連していると推察されることから、その調節機構を探るため、マウスGATA-2遺伝子5'調節領域の解析を行った。その結果、GATA-2遺伝子発現は2つのプロモーターの選択により制御されており、特に、新同定のISプロモーターが造血幹細胞や前駆細胞で特異的に使われていることか知られた。平成9年度には、GATA-2遺伝子調節領域の機能を遺伝子導入マウスを用いて解析した結果、本遺伝子発現は複数の異なる調節領域を介した時間的、空間的な調節を受けていることが明らかにされた。特に、成人型造血細胞の起源として重要なAorta-Gonad-Mesonephros領域での発現を支持する調節配列の一部が同定された。一方、卵黄嚢造血では、GATA-2は初期にのみ重要であり、ある程度他の因子により代償されるものと考えられた。GATA-2因子は幹細胞や前駆細胞で発現され、全系列の血液細胞の発達に不可欠である。従って、その発現調節機構の解明は血球分化や白血病細胞の本体に関し新しい観点からの知見を付け加え、白血病の診断・治療の進歩に寄与するものと期待される。転写因子による遺伝子発現制御機構を解明することは細胞分化や発癌の機構を理解する上で重要であり、血液細胞はそれを解析するよい材料である。最近、転写因子の変異が白血病細胞での染色体転座と関連して注目されているが,なお未解決な点が多い。本研究では、白血病患者芽球を材料として血球の分化や増殖に関与するGATA因子を始めとする転写因子や分化特異的形質の発現を調べ、その意義を解析する。このような研究は、細胞分化機構や病因への理解を深めるだけでなく、現在主として組織化学的、免疫学的方法によっている病型分類や診断をより合理的に行い、治療に役立てる上でも極めて有用である。平成7年度には,血球分化の過程で重要な役割を果しているGATA転写因子群の発現様式が、悪性化した造血細胞においても保たれているのか、あるいはどのように変化しているのかを明らかにするため、小児白血病患者の芽球についてGATA因子の発現状況を解析した。18例の骨髄性白血病および24例のリンパ性白血病について調べた結果、骨髄性白血病ではGATA-2mRNAの発現とCD34およびc-kit抗原の発現とがよく相関していた。一方、急性リンパ性白血病患者のCD34陽性細胞ではGATA-2mRNAもc-kit抗原も検出されなかった。また、T細胞性急性リンパ球白血病と診断された8例全例にGATA-3mRNAが発現していたが、B細胞性急性リンパ性白血病の症例ではGATA-3mRNAは検出されなかった。これらの結果は、GATA-2抑制はリンパ球系列への、GATA-3発現はT細胞系列への分化に重要な要件であることを示唆する。このように、白血病細胞でのGATA因子発現様式は正常血球分化における対応する各細胞のものにほぼ一致しており、GATA因子発現の解析は未分類の白血病細胞の分化方向の診断に有用な手段となると考えられる。

GATA-2因子は幹細胞や前駆細胞で発現され、全系列の血液細胞の発達に不可欠である。従って、その発現調節機構の解明は血球分化や白血病細胞の本体に関し新しい観点からの知見を付け加え、白血病の診断・治療の進歩に寄与するものと期待される。転写因子による遺伝子発現制御機構の解明は細胞分化や発癌の機構を理解する上で重要であり、本研究では、血球の分化や増殖に関与するGATA因子群等の転写因子の白血病細胞における発現を調べ、その意義を解析する。昨年度の白血病細胞での検討から、白血病細胞でのGATA因子発現様式は正常血球分化における対応する各段階の細胞のものにほぼ一致していることが知られた。特に、GATA-2は分化段階の若い段階からGATA-1より広範囲に発現しており、骨髄幹細胞のマーカーとされるCD34が陽性の細胞に高率に発現していた。本年度には、本年度には、このようなGATA-2遺伝子発現の調節機構の解明を試み、1)マウスGATA-2遺伝子について、その発現調節には2つのプロモーターが働いており、下流側のプロモーターIbは既報のヒトやアフリカツメガエルのGATA-2プロモーターと相同のものであるが、上流側のプロモーターIaは本研究で新たに見出だされたものであること、2)造血幹細胞や前駆細胞では主にIaプロモーターが使われていること、3)プロモーターの転写開始点の上流-79-61bpの領域が細胞系列特異的なIaプロモーター活性に関与し、さらに、この領域にはいくつかの未知のタンパク質因子が結合し、これらのタンパク質間の複雑な相互作用の存在が示唆されることなどを明らかにした。また、ヒト白血病由来サトトカイン依存性細胞株M-TAT細胞にトロンボポエチン(TPO)受容体(MPL)遺伝子を導入した細胞株(M-TAT/MPL細胞)を作成し、エリトロポエチン(EPO)とTPOの信号によって誘導される転写因子の解析を行った。その結果、M-TAT/MPL細胞ではGATA-1、GATA-2、NF-E2p45、MafKなどの転写因子の発現レベルがTPO刺激以前に上昇しており、TPO刺激による巨核球への分化に際しては、これらの因子に明確な変動が見られず、他の因子の関与が考えられた。本研究では、血球の分化や増殖に関与するGATA因子群等の転写因子の白血球細胞における発現を調べ、その意義を解析して来た。昨年度までに、白血病細胞でのGATA因子発現様式は正常血球分化における対応する各段階の細胞のものにはぼ一致していること、特に、GATA-2は分化段階の若い段階からGATA-1より広範囲に発現しており、骨髄幹細胞画分の細胞に高率に発現していることを明らかにした。既に、GATA-1およびGATA-2遺伝子の発現は2つのプロモーターの選択により制御されていることを示したが、さらに、本年度は、これらの転写因子遺伝子の発現調節機構について、推定される調節領域の機能をレポーター遺伝子との融合遺伝子を用い、遺伝子導入マウスを作り検討した。
固相抽出濃縮法を導入した超微量環境汚染物質のゼロエミッション分析

サイクリックフローインジェクション分析が可能な反応系について探索した。結果として1,10-フェナントロリンを利用し、化学発光を検出することにより、Fe(III)の定量が可能であることを見出した。発光原理は触媒作用を示すFe(III)の存在下で過酸化水素により生成するラジカルが1,10-フェナントロリンを攻撃し、ジオキセタンを生成発光する。ラジカルはNBT法により、スーパーオキシドアニオンラジカルであることが確認された。Fe(III)は触媒作用を示すため、サイクリック分析に適用するばあい、ベースラインの増大をもたらし適用困難になる。そこで、鉄イオンの触媒作用を抑え、一回の酸化還元反応で生じるラジカルを利用する最適条件を求めた。反応温度はベースラインの安定性から、0°Cが選定された。得られた検量線は広い範囲で定量可能な再現性に優れるものであった。この方法は廃液をださず100回の定量にも十分耐える方法であった。しかし、触媒作用を抑制したために、感度は低下した。これを補うために濃縮効率に優れる固相抽出法を導入した。これはテフロンチューブの内表面に正の電荷を有する金属イオンが吸着するのを利用するもので微量のエタノールで溶出の容易な方法である。開発された方法により、飲料水中の鉄が定量され、再現性、正確さに優れた結果が得られた。確立された定量条件は次のようである。循環使用する試薬溶液は150ml(phen:6.0×10^<-5>M),H_2O_2:12%,試料溶液pH:7.5,流量:2.3ml/minである。濃縮に使用する試料溶液14ml(50ppb,Fe)に対し、50回の繰り返し定量が可能であると確認された。化学分析において、排出される環境負荷物質を減少させるためにはフローインジェクション分析法(FIA)を利用し、使用済み溶液を再度フローシステムに戻し、循環させる必要がある。その際、一般の化学反応の利用ではベースラインの上昇から多数回の分析を繰り返すことが不能になる。そこで、排出された溶液に含まれる分析目的物がベースラインの上昇に寄与しないためには、反応速度を減少させるマスキング剤を添加するか酸化還元反応を利用する必要がある。本研究では酸化還元反応により生成するラジカル反応に着目し、化学発光を利用する検出法を検討した。その結果、過酸化水素の共存下でオルトフェナントロリン(phen)により鉄イオンの定量法の開発に成功した。利用する原理は鉄(III)と過酸化水素が反応し、生成したヒドロキシルラジカルがphenと反応し、励起状態のジオキセタンを生成する。このジオキセタンが基底状態に戻るとき発光し検出される。このとき還元された鉄(II)は次の反応には関与しない。分析条件として反応温度は室温で、溶液pHは約7、流速は2.3ml/minで1回の注入に使用する試料量は800μlであった。試料溶液注入後の反応コイル長さは50cmとした。この方法は100回の連続測定においてもベースラインは一定で再現性にも優れていた。ただし、感度は悪く、検出限界は数十ppbであり、濃縮法の導入が不可欠である。濃縮法は電解還元法の適用を検討し、今後はクロムなど鉄以外のイオン種に適用することを検討する予定である。亜鉛、コバルト、銅などの重金属イオンのゼロエミッション分析が可能と考えられる。昨年度に引き続き、オルトフェナントロリン(phen)による鉄イオンの化学発光定量条件を検討した。未反応試薬を含む使用済の排液だめから、試薬溶液を吸引し、一流路で試料溶液と反応させ、化学発光させて検出した。

これを100回程度くりかえしても、ベースラインの変動がなく、分析精度にも影響されない条件を確定した。特に酸化剤である過酸化水素の安定性が問題であり、長時間の有効利用のために、0°Cで循環させることにした。本法は数回の測定後、一日放置し、次の日に再度測定するという利用法であっても、再現性に問題がなく、循環させる試薬溶液体積が300ml程度であれば、1週間で100回測定後であっても検量線の傾きに変化は見られなかった。さらに、微量成分分析に適用するため、濃縮法を検討した。濃縮法はテフロンチューブへの吸着濃縮を利用する方法であり、長さ5m、内径0.5mmのテフロンチューブに対し、流量2.8ml/minで5分間鉄成分を捕集し、その後、0.1mlのエタノールで溶出し、循環させている試薬溶液の流路に導入、検出した。濃縮のメカニズムは鉄イオンの水酸化物が正に帯電したコロイドになり、これが、アルカリ処理された、テフロンチューブ内壁に吸着されたものと推定された。濃縮により、濃縮しない場合に比較し、80倍の感度の向上がみられ、0.1ppbの鉄イオンの検出が可能となった。本法におけるメカニズムにはまだ不明な点が多く、例えば界面活性剤の役割や生成ラジカルの影響など検討すべき点がいくつかみられる。今後はこれらを解明しながら、環境汚染物質と考えられる、鉛イオンのゼロエミッション分析に発展させる予定である。サイクリックフローインジェクション分析(cyc-FIA)は循環式のフローシステムで構築されているため、試薬の有効利用や廃液の減少といった利点がある。しかし、廃液中に分析目的化学種を含むため空試験値が側定回数の増大とともに上昇するという問題がある。この問題を解決するには酸化還元反応を利用する方法がある。そこで、本研究では新規のcyc-FIA(ゼロエミッション分析法ともいう)を確立するために酸化還元反応を利用する反応系の探索を行った。分析目的物は環境汚染物質を中心に検討したが、分析可能な化学種は鉄、銅、鉛、クロムなどであり、なかでも鉄イオンが最も高感度で定量可能であることが分かった。鉄イオンは数10ppbであっても工業製品の品質を低下させ、特に食品関係の品質に大きく影響する。そこで、鉄イオンを環境汚染物質の一種と考え、その分析条件を詳細に検討した。検出には化学発光検出器を使用した。反応メカニズムはFe(III)と過酸化水素が反応して生成するスーパーオキシドアニオンラジカルが1,10-フェナントロリンとジオキセタンを生成し、化学発光する。このときFe(III)は還元されFe(II)に変化するため、使用後の排液(検出試薬溶液)中に含まれても、次の分析反応には関与せず、妨害とはならない。その結果、一定のベースラインが得られ、100回の連続測定も十分可能であった。本反応系は鉄イオンの1回のみの酸化還元反応を利用することから、感度において十分ではない。そこで、感度不足を補うために、テフロンチューブ固相抽出濃縮法の導入を検討した。この方法は少量の溶離液で溶出が可能であり、捕集率は低いものの、結果として高い濃縮液を得ることができ、オンライン分析に適した濃縮法である。溶離液はエタノールを用いることにより、排液中にあっても妨害することは無かった。一方、溶離液に酸を用いた場合には分析回数が進むにつれ、pHが低下し、分析不能になった。
インスリン抵抗性及び炎症のバイオマーカーとしての非コレステロールステロールの検討

マウスを用いた基礎研究では、ステロール代謝経路に同じ操作を加えても個体の状態によりインスリン抵抗性や炎症に対する効果は異なるものの、飽食状態である現在人を反映するモデルでは、内因性ステロール合成亢進はインスリン抵抗性を悪化させ、外因性ステロール吸収亢進は炎症性サイトカイン低下をもたらすことが判明した。臨床横断研究では、ラノステロールがインスリン抵抗性・炎症と正相関し、外因性/内因性ステロール比がインスリン感受性と正相関する可能性が示唆された。両研究結果を合わせると、肝臓でのステロール合成マーカーはインスリン抵抗性・炎症と正相関し、吸収/合成比はインスリン感受性と正相関する可能性が示唆された。1.ABCG5/8欠損マウスを用いた植物ステロールの高脂肪食誘導による体重増加、脂肪肝・脂肪組織の炎症、インスリン抵抗性への影響について検討した。ABCG5/8欠損マウスは、ホモ型ではヘテロ型と比較して、通常食飼育下では、体重増加、臓器重量は変化がなかったが、ホモ型の方が肝臓、脂肪組織ともに炎症性メディエータの発現が増加していた。一方で、高脂肪食飼育下では、ホモ型の方が、体重増加が緩やかであり、精巣周囲脂肪組織、肝臓重量が小さく、炎症性メディエータの発現は低下していた。空腹時血糖、インスリン値は両群間で有意差は認められなかった。2.肝臓NPC1L1, LDL受容体の食餌誘導インスリン抵抗性に対する影響について、食餌誘導肥満マウスにこれらのタンパクを、アデノウイルスを用いて過剰発現させ検討した。空腹時、自由摂食下血糖は、NPC1L1過剰発現群、LDL受容体過剰発現群で対照群と比較して低下していたが、その機序は、NPC1L1過剰発現群では、FoxO1の抑制による糖新生抑制作用、LDL受容体過剰発現群では、肝臓におけるIRS1, IRS2発現増加によるインスリン抵抗性の改善作用が考えられた。3.平成27年度の検討に向けて、HMG-CoA還元酵素をコードするアデノウイルスを作成した。4.平成27年度の検討に向けて、インスリンによる治療を行っておらず、また脂質異常症治療薬を内服していない、40歳以上65歳未満の対象者(インスリン抵抗性のない正常血糖群、インスリン抵抗性のある正常血糖群、糖尿病群)約210名の血清サンプル、臨床データを集めた。1.動物を用いた基礎研究1植物ステロールと炎症、および糖代謝の関連:ABCG5/8欠損ホモ接合体マウスはヘテロ接合体と比較して、通常食下では体重増加・臓器重量に相違はないものの、肝臓および脂肪組織における炎症性サイトカインの発現量が増加していた。高脂肪食負荷下では、ホモ接合体はヘテロ接合体と比較して体重増加は緩やかであり、肝重量・精巣周囲脂肪重量は少なく、炎症性サイトカインの発現量は低下していた。高脂肪食負荷ABCG5/8欠損マウスでは、ホモとヘテロ間に空腹時血糖値やインスリン値に変化は認めなかった。2.動物を用いた基礎研究2肝臓内コレステロール代謝経路と糖代謝・炎症との関連:胆汁中へのコレステロール排泄を抑制するNPC1L1過剰発現マウスでは、筋肉や肝臓でのインスリン感受性には変化を認めなかったが、肝臓での糖新生抑制により血糖値が改善した。LDL受容体発現マウス、HMG-CoA還元酵素あるいはラノステロール合成酵素発現マウスでは、インスリン感受性亢進による血糖値の改善を認めた。3.ヒト検体を用いた臨床研究:健診受診者185名(糖尿病11名、非糖尿病174名)、外来通院中の非糖尿病患者(5名)および糖尿病患者(35名)の空腹時血清を用いて、サイトカイン測定、ステロール精密分析を行った。糖尿病患者は非糖尿病患者よりも有意にHOMA-IRが高くHOMAβが低かったが、IL-6やTNFαの炎症性サイトカインは低く、吸収マーカーステロールと合成マーカーステロールの比は糖尿病患者で高値であった。全例での解析で、IL-6およびTNFαはデスモステロール・ラノステロールと正の相関、吸収マーカー/合成マーカー比と負の相関を認めた。非糖尿病症例のみの解析ではIL-6はHOMA指数とは相関はないもののラノステロールと正の相関を示し、吸収マーカー/合成マーカー比と負の相関を示した。TNFαはHOMAβと正の相関を示したが非コレステロールステロールとの相関は認めなかった。1.マウスを用いた基礎実験系はほぼ順調に達成できているが、当初予定していたPCSK9のクローニング、アデノウイルス作成は終了していない。2.倫理申請まで時間がかかり、臨床研究に関しては、被験者の血清サンプルおよび臨床データ収集を終了したところである。代謝平成27年度は、マウスを用いた基礎実験は、HMG-CoA還元酵素の過剰発現によるインスリン抵抗性への影響について検討する予定である。

また、平成26年度中に終了できなかった血清サンプルの、炎症性マーカー(TNF-α, IL-6, hsCRP)やアディポネクチンを測定する予定である。さらに、平成26年度に収集したマウスサンプル、ヒトサンプルのステロール一斉測定を行い、各ステロールのインスリン抵抗性や炎症との関連を探索し、インスリン抵抗性の観点から最適な脂質異常症治療戦略を提議する。本研究で比較的コストがかかるのは、非コレステロールステロール測定、ELISAキットを用いた炎症性サイトカインやアディポネクチンのアッセイである。当初、平成26年度中に、ヒトおよびマウスの血清検体を用いての、HPLCでの非コレステロールステロールの解析、ELISAでの各種炎症性マーカーやアディポネクチンのアッセイ、を開始する予定にしていたが、特にヒトの検体収集には大学での倫理審査に時間がかかった。そのため上記の測定・アッセイを行うことができなかったことが、次年度使用額が生じた理由である。本研究に必要な症例数の検体はほぼ終了しており、平成27年度中に、今回生じた次年度使用額の資金と平成27年度の資金の一部を合わせて、アッセイを進める。
外傷後ストレス障害の日常的実態の把握と日常臨床に適用可能な包括的予防策の開発

今年度(平成18年度)は,昨年度(平成17年度)に引き続き,慢性のPTSD患者に対する認知行動療法の適用事例の分析を行った。研究代表者が実施した実際の臨床場面を録画したビデオや,面接者と患者の発話内容を記録した逐語録を参照しながら,効果的な面接について検討を加えた。PTSD患者のなかには,外傷的な出来事を経験した後,数年間も,精神的な不調に悩まされるケースがある。そのような場合,パーソナリティ面に変容を来たし,自尊心や対人関係が大変不安定になり,治療関係にも支障を来すことがある。慢性のPTSD患者との面接場面では特に,患者が治療から脱落するのを抑えながら,外傷的な出来事の記憶に直面させる高度な技術が必要とされた。想起の臨場感を高めつつ,温かい励まし,現実感の強調,体験の合理的な意味づけなどを行いながら,記憶に対する統制感を慎重に育むことが必須であった。具体的な言葉がけ,メタファー,ジェスチャーについては,米国の治療例(ビデオ)と比較しながら,日本国内の患者に適した関わりを探求した。面接外の緊急時対応についても,院内の救急外来との連携など,不安定な患者の安全を守る手段の確保が必要と考えられた。今年度は,半期で特別研究員を中途辞退したため,研究計画を十分に展開することができなかったが,今後も引き続き,PTSDに対する認知行動療法の効果研究を続ける予定である。本研究の知見は,治療マニュアルにまとめることを検討している。初年度の研究として,外傷後ストレス障害(PTSD)に対する予備的な治療効果研究,介入技法に関する権威者との意見交換,臨床家を対象としたPTSDの意識調査,PTSDの一次予防策に関する文献研究を行った。1.エクスポージャー法の効果研究(未発表)成人のPTSD患者1名に対して,フォア博士のプロトコルに基づくエクスポージャー法を施行し,ポストテストや治療終結後6ヶ月後におけるPTSDの治癒を確認した。単一事例が対象であるものの,エクスポージャー法の優れた効果や実施上の課題点を予備的に明らかにした。2.エクスポージャー法に関する権威者との意見交換エクスポージャー法の創始者であるペンシルバニア大学のエドナ・フォア博士とともに,日本の適用例を参照しながら,文化差の問題や治療プロトコル(手続き)の改善点について議論した。独立行政法人国立病院機構(旧国立病院)の精神科医師・心理士を対象として,PTSDに関する意識調査を行った。精神科医師,心理士ともに,PTSDの疾病概念としての存在は認めているものの,診断/アセスメントに対してはやや消極的な態度を示していた。PTSD患者の治療に携わる頻度は,23年に1名程度であり,非常に限られていた。PTSDに関する診断/アセスメントのツールや治療技法を国内で早期に確立することの重要性が示唆された。4.PTSDの一次予防に関する文献研究(精神保健研究)災害後のPTSD予防策について,最近の実証研究を参考にしながら,具体案と研究課題を提示した。本年度は,外傷後ストレス障害(PTSD)の一次予防策,二次予防策の基礎の開発に取り組んだ。PTSD治療を専門とする海外のエキスパートとの意見交換や災害時のメンタルケアに関する文献研究,認知行動療法による治療場面(録画場面)の行動観察などを行った。1.PTSDに対する一次予防策PTSDの発症を促進する危険因子の同定と発症を防ぐ心理的応急措置のまとめを行い,回復力焦点型心理教育プログラムの考案に取り組んだ。危険因子に関する文献のレビューにより,外傷的出来事の直後(特に災害直後)には,身体的安全の確保が最優先課題となること,そして,身体の安全が結果的には心理的安心にも通じることが判明した。その一方で,外傷的出来事やその後の出来事に対するネガティブな認知がPTSDの発症や慢性化を促すことが明らかとなっており,必要に応じた自己開示の促進や社会的サポートの充実などが重要であることも判明した。さらに,対象者の属性(個人,被災住民,専門職員など)によっても,援助の手続きを変えるべきことがわかった。2.PTSDに対する二次予防策海外のエキスパートの協力を得て,PTSD治療の第一選択(心理療法)として推奨される曝露療法,認知療法,EMDRのプロトコルを修得し,手続き上の共通要素や特異的要素の抽出を試みた。安全や安心感を確保しながら,外傷後認知の再体制化を促す方法を探った。プロトコルの一部は,日本の患者にも適用し,ノウハウの蓄積や改良点の探索も行った。なお,二次予防策の開発に伴い,PTSD治療の効果を測定する日本語版外傷後ストレス診断尺度の開発も同時に進めた。

具体的な言葉がけ,メタファー,ジェスチャーについては,米国の治療例(ビデオ)と比較しながら,日本国内の患者に適した関わりを探求した。面接外の緊急時対応についても,院内の救急外来との連携など,不安定な患者の安全を守る手段の確保が必要と考えられた。今年度は,半期で特別研究員を中途辞退したため,研究計画を十分に展開することができなかったが,今後も引き続き,PTSDに対する認知行動療法の効果研究を続ける予定である。本研究の知見は,治療マニュアルにまとめることを検討している。