hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
ミオシンのモルテン-グロビュール状態の解明

ミオシンは球状の頭部と棒状の尾部がネックで結合している特徴的な構造をしている。ミオシンの構造がいかに構築されるかを調べるため、ほぼ100%のヘリックス構造からなる尾部rodの加熱による構造変化の解析から検討した。rodのキモトリプシン消化物からN-末端をカバーする40kS-2とC-末端をもつ40kLMMを単離し、それらの構造安定性を、加熱による二次構造の消失を円偏光二色性の手法を用いて追跡すると、どちらも100%のヘリックス構造でありながら、S-2は43°C以上でヘリックスのほぐれが認められ、非常に安定性であるのに対し、LMMは33°Cでほぐれ、不安定なドメインであることがわかった。しかし、例えば50°Cのようなどちらの構造も破壊される温度で加熱しても、氷冷すると、両者ともヘリックス構造の完全な回復が認められ、巻き戻しに安定性の差がないことがわかった。このとき、いずれの試料でも凝集などの不可逆的な変性は認められないことをHPLC分析で明かにした。これは両者を結合しているrodでも同じであった。より高温の80あるいは100°Cでrodを加熱しても凝集程度はかなり低かった。一部加熱凝集したrodではどの部分で凝集が起きているかキモトリプシン消化で調べたところ、LMM部分の消化性はあまり変化せず、S-2部分で変化していた。その消化物をゲル濾過で解析しても、凝集している断片は認められず、消化のさいに凝集に関与していたS-2部分は小断片化され、同時に凝集体も消失してしまったと推定した。このことは2次構造安定性の優れている部分が必ずしも安定な立体構造を示す分けではないことを意味し、2次構造と立体構造の中間構造であるモルテングロビュール状態において両者で違り、フレキシブルな構造の方がかえって有利である場合もあることが示された。魚類ミオシンは哨乳類のそれに比べ不安定である。タンパク質の立体構造はアミノ酸配列の一次から始まり、基本構造の二次、そして立体構造の三次の順に構築されている。生理的条件で機能を果たしている魚類ミオシンに尿素、および熱エネルギーなど、構造破壊因子を加えていったときの二次、および三次構造の変化を円偏光二色性によるヘリックスの減少やキモトリプシン消化性から検討した。ミオシン分子は熱安定性の異なる数種のドメインから成り立っていることが両方法から知られた。そのうち、最も安定性の低い部分はミオシン尾部のC端40kDa(40kLMM)であった。一方、最も安定な部分は尾部のN端40kDa(40kS-2)であった。それらの中間部分および、頭部は中間の安定性を示した。これに尿素を加えていくと、ドメインとしてのそれぞれの安定性の違いを残しながら、次第に低温で構造破壊が起こった。さらに、同様な尿素存在下において消化温度を変えてキモトリプシン消化を行った。二次構造の破壊が起こる条件では(尿素濃度が低いときは高温で、尿素濃度が高いときは低温でも)、尾部での消化パターンが大きく変り、小断片が生成するようになった。すなわち、ミオシン分子のモルテン-グロビュール状態と思われる構造を尿素により作り出せ、その結果、構造安定性は頭部に接続したrod部分が重要な役割を果たしているであろう事が推定された。
環境マネジメントとFM手法を用いた大学と地域の連携モデル構築に関する基礎的研究

地方都市の中心施設として都市の文化性を担い近隣地域の生活と活力を支えていく大学のあり方として、大学マスタープランなどの総合計画と地域の連携システムを環境マネジメントとFMの手法を用いて、下記項目について初期研究モデルを構築した。(1)循環型のコンパクトシティーを、大学と都市の連携によって実現するためのシステムを構築する。(2)大学施設のインパクトによる周辺環境形成力の概念を提起し、大学計画と地域計画をマネジメント可能なものにする。(3)環境マネジメントとFMの手法を大学と自治体が持つ情報基盤を活用して構築する。研究は、大学と都市の連携モデルが今後の都市再生に有効であり、コンパクトシティーとして持続可能な新たな地方都市像を提示できるという着想にもとづき、以下の2つのフェイズに分けて行った。■フェイズ1:調査ヒアリング作業(1)海外調査(2)国内調査(3)アンケート調査を行った。・海外調査は、環境問題に積極的に取組んでいるハーバード大学、ペンシルバニア大学、イエール大学,MITとその母都市を対象とし、インターネットを通じた情報収集と共に現地でのヒアリング及び資料収集を行った。・国内調査は、千葉大学がある千葉市のほか、大学と地域の連携関係に特色のある内閣官房都市再生本部が指定した全国8カ所の大学とその母都市を対象として、各自治体の環境対策や大学との連携事例についてヒアリング及び資料収集を行った。■フェイズ2:枠組みの構築フェイズ1の結果をもとに、地域連携シンポジウム「地域と住まいの再生のための連携千葉市・千葉大学」を開催した。(参加者100名、パネラー:千葉市助役、都市再生機構千葉地域支社支社長他)千葉大学と千葉市の実態に即した大学と都市の連携モデル(千葉モデル)の枠組みができあがったと考えている。今後はこのモデルを他の大学や都市に適用する可能性を検討し、本研究の有効性を総合的に検証していきたい。
頸部リンパ節腫大に対する画像診断基準と診断結果の定量化と可視化に関する研究

収集した超音波所見および造影CT所見のデータの統計解析を前年度から引き続き行い、その分析結果より、口腔癌からの転移リンパ節に対する画像診断基準と診断結果の定量化と可視化に関するシステムのプロトタイプの作成を行った。このプロトタイプの検証をおよび改善のために、さらに画像所見の追加分析を行った。対象症例は2017-2018年に画像検査を行った症例とした。分析方法はこれまでの分析方法を踏襲するとともに一部新たな分析方法を導入した。超音波Bモード所見はリンパ節の長径、短径、長短径比、リンパ節内部の輝度のヒストグラム、hilumの有無とした。超音波ドプラ所見はリンパ節内部血流の血流係数、散在性係数とした。さらに超音波所見として超音波エラストグラフィーによりリンパ節の硬度を追新たに追加分析を行った。造影CT所見では長径、短径、長短径比、内部壊死巣の有無、造影効果のヒストグラム解析を行った。また、病理組織所見の分析も行った。これらの画像所見および病理所見を用いてプロトタイプのシステムの検証および改善を行っているところである。さらに、悪性リンパ腫と炎症性腫大リンパ腫との鑑別のための画像診断基準構築においてもプロトタイプ作成を行うと同時に、そのシステムの検証のための追加症例の解析を行っている。これまでの分析方法を踏襲するとともに一部新たな分析方法を導入した。超音波Bモード所見はリンパ節の長径、短径、長短径比、リンパ節内部の輝度のヒストグラム、超音波ドプラ所見はリンパ節内部血流の血流係数、散在性係数とした。超音波エラストグラフィーによりリンパ節の硬度を追新たに追加分析を行った。MRI所見ではT1長径、短径、長短径比、内部壊死巣の有無、造影効果のヒストグラム解析を行った。MRI所見ではT1強調画像、T2強調画像の信号強度、time intensity cureve, ADC値の分析を行った。腫大リンパ節の病理組織所見および画像所見の解析に多くの時間がかかってしまい、その後に行う予定であった診断結果の可視化システム構築の検討が遅れてしまった。それに伴い、可視化の方法の正当性や改善点についての外部の研究者の意見を聞く機会を逃してしまった。システムの検証および改善のために必要な追加症例の画像所見のデータ収集を早急に進め、統計的解析を行ってゆく。その後、これらのデータおよび解析結果を用いて、プロトタイプのシステムの精度を向上させる。その際に、外部の研究者の意見を聴衆してゆく。本研究課題を遂行するにあたり、先ずこれまで行ってきた超音波検査およびCT検査における口腔癌の頸部転移リンパ節と炎症性腫大リンパ節の画像所見、鑑別するための診断基準およびその診断能に関する研究成果の総ざらえと再分析を行うことにより研究結果を検証し、本研究で補足および進展させてゆくべき課題の抽出を行った。これまでの研究で未着手であった経過観察時の超音波ドプラ所見および剪断波による超音波エラストグラフィにおける頸部転移リンパ節と炎症性腫大リンパ節との所見の相違についての解析を行った。54名の口腔癌患者の85リンパ節(転移リンパ節:24個、炎症性腫大リンパ節:61個)を分析し、リンパ節内のshwear wave velosityは、転移リンパ節が有意に高い値を示した。本結果については、国際学会で報告を行った。悪性リンパ腫のMRI所見を分析するにあたり、まず節外性の悪性リンパ腫の定量的分析を行い、リンパ節の悪性リンパ腫へ応用する手法の確立を目指した。また、本分析の中で、リンパ節内の造影剤動態の数値化の、前述し前駆的解析としてた悪性リンパ腫と炎症性腫大リンパ節におけるtime intnsiry curveについて分析を行い、悪性リンパ腫に特徴的なtime intnsiry curveのパターンを見いだした。リンパ節内部性状の画像所見の定量化については、超音波ドプラ画像をこれまでの研究で開発した血流所見の定量化の手法を用いて解析を行った。その分析データについては現在統計的解析を行っているところである。これまでの研究成果の検証を行うことにより、本研究で補足および充実させるべき課題の抽出に時間をとられ、本研究の計画の実施が遅れてしまい、収集したデータの画像処理が終了していない。また、CT画像上のリンパ節所見の分析も遅れている。これまでの研究および昨年の研究結果で得た超音波ドプラ画像における口腔偏平上皮癌からの頸部リンパ節転移診断のためのリンパ節内部血流所見を定量化した診断基準(リンパ節内部の血流係数、散在性係数)および超音波Bモード画像におけるリンパ節内部性状および形態的特徴を数値化した定量的診断基準を新たに作成して、2013年から2016年の3年間で超音波検査を行い、頸部リンパ節の病理組織学的検査が行われた症例を対象として、その超音波画像の定量的診断基準の検証のための分析を行った。なお、超音波Bモード画像上のリンパ節の内部性状の数値化は、輝度の強度及びばらつき度を指標とし、リンパ節の形態的特徴は短径、長径及び長短経比を指標とした。他にhilum描出の有無を指標とした。現在、分析結果の統計的処理を行なっているところである。さらに、悪性リンパ腫と炎症腫大リンパ節との鑑別のために、超音波ドプラ画像におけるリンパ節内部の血流分布を定量化した血流係数と散在性係数を用いて鑑別能の分析を行った。

悪性リンパ腫の方が散在性係数が大きくなる傾向にあり、これらは有用な鑑別のための指標であることが示唆された。頸部リンパ節のCT所見については、造影後のCT値のピクセル単位での分布の計測を行い、そのヒストグラムの解析を行っているところであり、診断基準作成までには至っていない。MRIにおいても、頸部リンパ節の信号強度およびADC値の測定を行い、統計処理中である頸部リンパ節転移の超音波診断のための定量的診断基準のプロトタイプを作成し、その診断能について検証を行ったが、その有用性についての統計学的裏ずけに苦慮しているとともに、本プロトタイプの診断基準では、満足いく診断能とはならない可能性があり、新たな指標を考案する必要性があり、予定の研究進捗状況よりやや遅れている。CTおよびMRI画像の解析はCT値、信号強強度、ADC値の測定後の統計的分析中であり、診断基準作成までには至っておらず、研究の進捗状況は遅れている。収集した超音波所見および造影CT所見のデータの統計解析を前年度から引き続き行い、その分析結果より、口腔癌からの転移リンパ節に対する画像診断基準と診断結果の定量化と可視化に関するシステムのプロトタイプの作成を行った。このプロトタイプの検証をおよび改善のために、さらに画像所見の追加分析を行った。対象症例は2017-2018年に画像検査を行った症例とした。分析方法はこれまでの分析方法を踏襲するとともに一部新たな分析方法を導入した。超音波Bモード所見はリンパ節の長径、短径、長短径比、リンパ節内部の輝度のヒストグラム、hilumの有無とした。超音波ドプラ所見はリンパ節内部血流の血流係数、散在性係数とした。さらに超音波所見として超音波エラストグラフィーによりリンパ節の硬度を追新たに追加分析を行った。造影CT所見では長径、短径、長短径比、内部壊死巣の有無、造影効果のヒストグラム解析を行った。また、病理組織所見の分析も行った。これらの画像所見および病理所見を用いてプロトタイプのシステムの検証および改善を行っているところである。さらに、悪性リンパ腫と炎症性腫大リンパ腫との鑑別のための画像診断基準構築においてもプロトタイプ作成を行うと同時に、そのシステムの検証のための追加症例の解析を行っている。これまでの分析方法を踏襲するとともに一部新たな分析方法を導入した。超音波Bモード所見はリンパ節の長径、短径、長短径比、リンパ節内部の輝度のヒストグラム、超音波ドプラ所見はリンパ節内部血流の血流係数、散在性係数とした。超音波エラストグラフィーによりリンパ節の硬度を追新たに追加分析を行った。MRI所見ではT1長径、短径、長短径比、内部壊死巣の有無、造影効果のヒストグラム解析を行った。MRI所見ではT1強調画像、T2強調画像の信号強度、time intensity cureve, ADC値の分析を行った。腫大リンパ節の病理組織所見および画像所見の解析に多くの時間がかかってしまい、その後に行う予定であった診断結果の可視化システム構築の検討が遅れてしまった。それに伴い、可視化の方法の正当性や改善点についての外部の研究者の意見を聞く機会を逃してしまった。収集した画像所見の定量分析を行う画像処理作業を第一に行い、昨年度の研究遂行の遅れを取り戻す。
面不斉の軸不斉への転写反応

エンイン結合を有する面不斉アレーンクロム錯体を金(I)触媒を用いてcycloisomerizationを行い、軸不斉ビアリール化合物を合成した。基質としてアルキン部に二つの芳香環が結合したアレーンクロム錯体、及びアルケン部に二つの芳香環が結合した2種のクロム錯体を用いた。いずれの基質も立体選択的にcycloisomerization反応が進行し、anti-ビアリールクロム錯体が高収率で得られ、軸不斉ビアリール化合物を光学活性体として合成することができた。面不斉アレーンクロム錯体を用いた不斉反応を展開してきた。1)軸不斉をもつビアリール化合物を、面不斉ハロベンゼンクロム錯体とオルト置換アリールホウ酸とのパラジウム触媒によるクロスカップリングで、アトロブ異性の両光学対掌体を立体選択的に合成する反応を既に報告している。本研究では、さらに、軸不斉ビアリール化合物の新規合成法の開発どして、enyne結合を持つアレーンクロム錯体と金(1)触媒によるCycloisomeriationで軸不斉ビアリールクロム錯体を立体選択的に得る反応を見いだした。この反応では、熱力学的に安泰なantiゐビアリールクロム錯体が得られ、以前の方法と有機合成上相補的に利用できる。さらに、本研究の過程で、オルトリチオ化の位置選択性が親電子試薬に左右される興味ある結果も見いだしている。2)軸不斉をもつビアリール化合物は良く知られているが、芳香環と窒素が結合した軸不斉化合物の不斉合成はほとんど報告されていない。面不斉フロロベンゼンクロム錯体に、求核置換反応をおこない表記化合物を光学活性体として合成することができた。軸不斉ビアリール化合物の不斉合成は重要な研究課題であり、本研究では、エンイン結合を有するアレークロム錯体の金(I)触媒によるcycloisomerization反応で、軸不斉ビアリール化合物の立体選択的な合成法の開発を行った。cycloisomerization反応させる基質として、アルキンに二つの芳香環が結合したアレーンクロム錯体およびアルケン部に二つの芳香環が結合したクロム錯体を用いた。いずれの基質においても、金(I)触媒との反応は立体選択的に高収率で進行することが明らかになった。この反応ではanti-体のビアリール化合物が生成しており、出発原料として光学活性アレーンクロム錯体を用いることで、軸不斉ビアリール体を光学活性体として合成することができた。本研究の原料合成のさい、アレーンクロム錯体の芳香環リチオ化反応で用いる親電子試薬の相違で官能基の導入される位置が異ることも明らかになった。1,3-位にヘテロ原子のあるアレーンクロム錯体のリチオ化反応を親電子試薬でトラップすると2-位に置換基が導入されるが、DMFでトラップすると位置選択的に4-位にホルミル基が導入された生成物のみが得られた。この反応の反応機構も考察した。
新たなIVRガイダンス画像としての経静脈的探索超音波法の開発

5頭の豚を用いた動物実験で、経静脈的超音波検査が肝静脈や腎静脈において実行可能であるか、また診断・治療に実用可能な画像解像度を有するかどうかを検証した。肝静脈に血管内超音波探触子を挿入して行う経静脈的超音波検査は5例全例で実行可能であった。2頭では腎静脈からの経静脈的超音波検査も施行し、2頭とも実行可能であった。経静脈的超音波のスキャン範囲内の構造物の描出能は経静脈的超音波の方が体外超音波よりも良好であり、今後診断・治療に実用可能であると思われた。動物実験施設において,平成23年2月にぶた3頭を用いて実験動物を行った。以下の実験は全身麻酔にて施行した。まずカットダウン下に頚静脈より12Fr.ショートシースを2本右房まで挿入した。12Frシースのうち1本に8.5Fr.ガイディングシースを挿入し肝静脈まで進めたのち、血管内超音波探触子(ボストン社製ウルトラICE)を挿入。その後USガイド下にVATSマーカー(胸腔鏡手術用の術前標識マーカー:径1cm)を肝静脈近傍に留置した。血管内超音波走査と同時に体外超音波走査も行い、両者の画像を比較した。肝臓の深部においては肝静脈に挿入した血管内超音波の方が体外超音波より描出能が優れていることが確認できた。肝静脈に血管内超音波探触子を挿入して肝内を観察することが技術的に可能であることも確認できた。続いてもう1本の12Fr,ショートシースに経頚静脈的肝内門脈大循短絡術(TIPS)用10Fr.シースを挿入し、ガイドワイヤーを用いて肝静脈内に誘導した。同シース内に経頚静脈的肝内門脈大循短絡術(TIPS)用の穿刺針を挿入した。肝静脈内の血管内超音波にてTIPS用穿刺針の先端を観察し、TIPS用穿刺針先端を肝内のVATSマーカーの方向に調整した後、穿刺を行った。VATSマーカーの近傍に穿刺が可能であった。肝静脈内よりの超音波画像誘導下に穿刺が可能であることが確認できた。上記のように肝静脈に血管内超音波探触子を挿入して肝内を観察することが技術的に可能であり、肝臓の深部においては肝静脈に挿入した血管内超音波の方が体外超音波より描出能が優れていること、および肝静脈内の超音波画像誘導下に穿刺が可能であることが確認できた。平成24年2,月に動物実験施設でブタ2頭を用いて動物実験を行った。以下の実験は全身麻酔下にて施行した。カットダウンにて頚静脈よりシースを挿入した。ガイドワイヤーおよびガイディングシースを用いて血管内超音波のプローブ(ボストン社製ウルトラICE)を肝静脈および腎静脈に挿入し、スキャン範囲内の構造物や血管の描出能を検討した(経静脈的超音波検査)。つづいて経肝静脈的超音波誘導下にTIPS(transjugular intrahepatic portosystemic shunt、経静脈的1肝内門脈静脈短絡術)が可能かどうか検討した。頚静脈よりシースをもう1本挿入して肝静脈内にTIPS用の5穿刺針を誘導した。肝静脈に血管内超音波のプローブも同時に挿入し、TIPSの穿刺目標となる肝内門脈を同定した。経肝静脈的超音波の画像を参照してTIPS用穿刺針の先端を穿刺目標となる肝内門脈の方向に向けて穿刺した。上記の実験により肝静脈の他、腎静脈に関しても経静脈的超音波検査が可能で、肝静脈や腎静脈に挿入したプローブ近傍の構造物の描出が良好であることが確認できた。また、経肝静脈的超音波の画像を参照してTIPS用の穿刺が可能であることは確認できた。ただ血管内超音波の描出範囲がプローブの長軸に対して垂直であるが、穿刺針は斜め前方に穿刺するため、穿刺針の針先と穿刺目標の肝内門脈を同時に描出することができないため、正確な穿刺は困難であった。経静脈的探索超音波法(Transvascular ultrasonography)という新たな概念の超音波法を開発するため、ブタを用いて動物実験を行い、その結果を解析した。まず今回の実験により肝静脈・腎静脈に血管内超音波探触子を挿入して経静脈的超音波検査を行うことが技術的に可能であることが確認できた。また肝臓や腎臓の深部の構造物に関しては経静脈的超音波の方が体外超音波よりも描出能が良好であった。経肝静脈的超音波の画像を参照してTIPS(transjugular intrahepatic portosystemic shunt、経静脈的肝内門脈静脈短絡術)時の門脈穿刺も可能であった。

ただ血管内超音波のプローブと穿刺針を別々に静脈に挿入する必要があること、血管内超音波の描出範囲がプローブの長軸に対して垂直であるため針先と穿刺目標の肝内門脈を同時に描出することができないことから、正確な穿刺は困難であった。プローブ長軸方向を描出し穿刺ガイドと一体となった血管内超音波が開発できれば、この問題点が解決できると思われた。今後も経静脈的超音波法の開発を続け、従来の体外超音波操作により描出困難であった様々な部位のインターベンショナルラジオロジー(Interventional radiology、IVR)を可能としたい。この技術は腹水がある症例での肝腫瘍生検など、体外からのアプローチではリスクが高いIVRにも応用可能と思われる。肝静脈に関しては当初の計画より進めて同部に挿入した血管内超音波の画像を参照してTIPSの穿刺を行ったが、肺動脈・脳静脈洞からの経静脈的超音波検査は施行していない。24年度が最終年度であるため、記入しない。経静脈的超音波ガイド下に穿刺する場合、血管内超音波のプローブと穿刺針を別々に静脈に挿入する必要がある。また血管内超音波の描出範囲がプローブの長軸に対して垂直であるが、穿刺針は斜め前方に穿刺するため、穿刺針の針先と穿刺目標とを同時に描出することができない。穿刺ガイドと一体となったプローブ長軸方向の描出が可能な血管内超音波が開発できれば、上記問題点が解決できると思われる。
う触原因菌の母子間伝播に関するコホート調査

離乳期のかみ与えやスプーン等に親が口をつける習慣がStreptococcus mutans(以下SM)の母子伝播や3歳児のう蝕罹患状況に及ぼす影響を調査するため、平成15年度から年2回の歯科健診と生活習慣の調査を行った。対象となる札幌市の保育園において平成17年度調査において3歳児にあたる者は181名だった。このうち、109名の園児の保護者が調査に同意した。口うつしの調査に対し子どもに口づけをする習慣があると答えたものは68名(62.4%)、シャボン玉遊びやおもちゃのラッパなどの遊びで同じ部位に口をつける習慣があると答えたものは56名(51.4%)、子どもと同じスプーン等の食器に口をつける習慣があると答えたものが64名(58.7%)、食べ物をかみ与える習慣があると答えたものが11名(10.1%)、いずれの習慣もないと答えたものが15名(13.8%)であった。検査簡易キッド、ミューカウントによるSMの菌数の測定では子ども102名(97.1%)、母親90名(90.0%)にSMが存在していた。この調査時点での園児の平均月齢は33.3ヶ月(2739ヶ月)、う蝕罹患者率10.5%、一人平均う歯数0.42本、一人平均う歯歯面数は0.54であった。また、母親のう蝕罹患率99.0%、一人平均う歯数14.97本、一人平均う歯歯面数は47.16であった。同意者の内、検査実施日に出席できた母子は100組であった。口腔内から採取した菌をTYCSB寒天培地に蒔き、3日間培養した後single colonyを300mlのTYCS液体培地に移植し3日間培養した。母子共にSM菌を分離培養できたのは33組であった。菌体を集めてDNAを抽出し、制限酵素EcoRI、HindIII、HaeIIIでdigestして電気泳動して泳動像を比較したが、きれいなバンドが得られなかった。そこで、S.mutansの16SrRNAの塩基配列(DDBJ)の一部をプライマーとしてPCRによって16SrRNAを含む領域の約1400bpのDNAを増幅しこの部分の塩基配列の相同性を比較した。また、AP-PCR法によって増幅されるDNA断片の電気泳動のパターンを比較した。DNAを抽出できた菌株の中ではAP-PCR法で相同性を示した株はなく、16SrRNAを含む領域の約1400bpのDNAの配列にも違いが見られた。離乳期のかみ与えやスプーン等に親が口をつける頻度がStreptococcus mutansの母子間伝播や3歳児のう蝕離間状況に及ぼす影響を調査するため、平成15年度の春および秋に02歳児について歯科健診と生活習慣の調査を行った。

春秋2度の健診、調査を受け、平成17年度調査において3歳児にあたる者は181名だった。また、歯科健診の結果第1回目の健診でう蝕のあった者は7名であり、この7名を除くと174名が次年度以降の調査対象者となる。この174名のうちかみ与えの調査に対し、2度の調査期間において、離乳期にスプーン等の食器を親子別にして口をつけないと回答した者が38名(21.8%)、時々口をつけたと回答した者が88名(50.6%)、よく口をつけたと回答した者が36名(20.7%)、食べ物をかみ与えたと回答したものが12名(6.9%)であった。第2回目の調査時にう蝕のあった者は11名(6.3%)であり、X^2検定でかみ与えおよび口をつける頻度とう蝕罹患者には有為差を認めた。また、フッ化物の利用状況は第1回目の調査時においてフッ素の歯磨剤の利用ありと答えたものが18名(10.3%)、フッ素スプレーの利用が8名(4.6%)、フッ素塗布の利用が26名(14.9%)、第2回目においてはそれぞれ36名(20.7%)、14名(8.0%)、53名(30.5%)であった。また、唾液中S.mutansの菌数の測定およびパルスフィールド電気泳動装置による遺伝子解析について、その実験方法の再現性が得られるよう測定条件を検討中であるが、現時点では確立していない。離乳期のかみ与えやスプーン等に親が口をつける習慣がStreptococcus mutans(以下SM)の母子伝播や3歳児のう蝕罹患状況に及ぼす影響を調査するため、平成15年度から年2回の歯科健診と生活習慣の調査を行った。対象となる札幌市の保育園において平成17年度調査において3歳児にあたる者は181名だった。このうち、109名の園児の保護者が調査に同意した。今年度の口うつしの調査に対し子どもに口づけをする習慣があると答えたものは68名(62.4%)、シャボン玉遊びやおもちゃのラッパなどの遊びで同じ部位に口をつける習慣があると答えたものは56名(51.4%)、子どもと同じスプーン等の食器に口をつける習慣があると答えたものが64名(58.7%)、食べ物をかみ与える習慣があると答えたものが11名(10.1%)、いずれの習慣もないと答えたものが15名(13.8%)であった。また、フッ化物の利用状況はフッ化物塗布受診者34名(31.2%)、フッ化物入り歯磨剤の利用48名(44.0%)、スプレー等の利用は11名(15.6%)、いずれも利用していないが37名(33.9%)であった。SM数に検査簡易キッド、ミューカウントによるSMの菌数の測定では子ども102名(97.1%)、母親90名(90,0%)にSMが存在していた。この調査時点での園児の平均月齢は33.3ヶ月(2739ヶ月)、う蝕罹患者率10,5%、一人平均う歯数0.42本、一人平均う歯歯面数は0.54であった。また、母親のう蝕罹患率99.0%、一人平均う歯数14.97本、一人平均う歯歯面数は47.16であった。同意者109名のうち、検査実施日に出席できた母子は100組であったが遺伝子比較が可能だった母子はなかった。このため、菌の採取、輸送、培養の方法およびDNAの抽出、パルスフィールド電気泳動装置の設定条件などをさらに検討し、保存サンプルの利用や再サンプリングによって比較可能な母子を多く求められるように検討中である。
関西地域における高等女学校の校風と女学生文化に関する教育社会学的研究

本研究は、高等女学校の教育や生活に焦点をあて、その文化の内実を実証的に明らかにすることによって、女子学生の教養や学問観とそれを支えてきた文化の水脈にあらためて光をあてようとする試みである。具体的には、関西地域(兵庫県、京都府、滋賀県)にある高等女学校10校を対象に、女学校時代の家庭生活、学校生活、卒業後の生活の3つの領域についての質問紙調査、面接調査を実施し、その結果についての分析を軸にしながら、学校史等の文献資料、学籍薄、手紙・日記類などの資料の分析を合わせて行なった。そのなかで、フォーマルな学校文化のなかだけでなく、読書や趣味、稽古事などを通して幅広い教養に親しんでいたことや、それらを支えていたのが女学校での同級生や上・下級生を含む親密な友人関係であったことなどが、地域差や学校差を超えて女学生に共通の文化として見出された。一方でより詳細に分析すると、地域、公立・私立といった学校タイプ、あるいは生徒の家庭背景などによって、それぞれ異なった傾向も見出された。さらに、それらの要素が重なり合って、いくつかの女学生文化のサブタイプが存在することも抽出された。そうした文化類型の特徴のちがいと、学校の教育方針や教育理念が重なりあって、独自の校風が生み出されていくのである。このような文化の共通性と差異は、卒業後も同窓会などのネットワークを通じて維持され続けている。本研究の目的は、関西地域における高等女学校を対象として女学校時代の生活や文化と卒業後の友人関係や活動の実態をとらえることによって、学校経験の共有による社会的ネットワークのもつ意味と機能を明らかにすることである。具体的な調査方法としては、同窓会誌等の資料の収集と分析、質問紙調査、面接調査などを用いた多面的なアプローチをとっている。今年度は、まず地域特性と学校タイプを考慮して調査対象校を選定し、同窓会を通じて記念誌や同窓会誌などの資料を収集し、各女学校の特徴をまとめつつある。また、同窓会長を中心に各高等女学校卒業者に対して、女学校時代の生活や現在の生活や友人関係などについて聞き取り調査を進めている。同時に、高等女学校卒業者を対象とした先行研究と調査を検討し、女学校時代の学校生活、家庭の文化、卒業後の交友関係を柱とした質問紙を作成し、プリテストを行なった。本調査は次年度に行なう予定。本研究では、関西地域における高等女学校を対象として、女学校時代の家庭や学校での生活や文化の特徴、卒業後の友人関係や活動の実態などについて質問紙調査を軸に分析し、それに基づいて学校経験を共有することの意味や、その延長上にあるネットワークのもつ機能について考察した。具体的には、神戸地域・京都地域、滋賀県湖北地域の公・私立高等女学校10校の卒業者(昭和918年卒)約3500名に対する質問紙調査を実施し、その結果と、それに基づくインタビュー調査、さらに同窓会誌や個人の日記・手紙類などの文献・資料を分析の対象とした。その結果、家庭の文化的背景と学校文化と融合しながら独自の文化として形成されていった女学生文化が、授業を中心としながらも友人関係や読書、趣味などを通して形成されていったこと、それらが卒業後も女学校時代の友人とのネットウークを通して維持されていることなど、いくつかの共通の特徴が見出されることなどが明らかになった。特に女学校時代につくられる友人関係は独特のものであり、そうした特徴は女学生文化に独自のものであると同時にメディアを通して流通していた少女文化とも重なる部分があることも推測された。さらに、そうした共通の女学生文化を基盤として、都市部-地方、アカデミック志向、女性文化志向というた軸による学校タイプによっていくつかのグループに分かれること、卒業後のネットワークの強度もそうした学校タイプによって異なることなど、学校タイプによる差異についても分析し、そうした差異を形成する背景や要因について考察した。
妊婦の持つつわり及びその対処への反応に関する質的分析

つわりを体験する妊婦がつわりをどう捉え、どう対応しているかという視点で、つわりの実態を質的に明らかにすることを目的とし、同意の得られた妊婦20名を対象にインタビューを実施した。研究協力者は、つわりによる嘔気嘔吐を自覚し、治療中の合併症や切迫流産兆候がない22週未満の妊婦とした。本研究は兵庫県立大学看護学部研究倫理委員会及び研究協力施設の承認を得て実施した。結果、対象者20名(初産婦6名、経産婦14名)の妊娠週数14.3±3.7週、年齢33.4±3.8歳であった。妊婦には身体上の変化(気持ち悪さ・嘔吐、胃の味覚の鈍化等)、生活行動の支障(食べられない、行動する力が湧かない等)等が見られた。つわりへの対応として妊婦は、身体感覚を用いて認知(意図)的或いは感覚(無意識)的に「状況を見極め気持ち悪さを落ち着かせる・意識させない」、「漢方薬によって気持ち悪さを軽減させる必要性を見極める」などを行い、気持ち悪さや嘔吐など『症状を軽減・予防』する行動を取っていた。加えて、『可能な範囲で食べる』ことができるよう身体感覚を用いて「食べる必要がある状態と気づく」、「食べられるものを見出す」、「食べられる量を見極める」等を行っていた。更に、『可能な範囲で行動する』ことができるよう身体感覚を用いて「つわりに照らしてどこまでの活動ができるかを絞り込む」、「つわりに照らして活動ができるように対応を見出す」等を行っていた。このように身体感覚に沿った対応を選択し実施する上での影響要因としては、妊娠前からの妊婦の価値観、自らの状態の軽視、自らに合った方法の分からなさ、自らの感覚を優先した対応の選択のしにくさ、妻・母・職業人としての役割行動変更への罪悪感等があった。これより、つわりを体験する妊婦が、身体感覚を用い認知・感覚的に自らに合った方法を見出し実施することを支援する看護が望まれていると考える。
植物の乳液・滲出液および局所・微細構造が担う耐虫防御の発現機構に関する研究

本研究では、植物に広く見られる乳液とその成分が植物の耐虫性や植物-昆虫間相互作用に果す役割と分子機構を、カイコの餌であり乳液を有するクワをモデルとして解析した。クワの葉はエリサンやヨトウガ幼虫などクワを常食しない昆虫に対し強い毒性を示し、その原因はクワの傷口から分泌される乳液であった。クワの乳液自体これらの昆虫に毒性を示したがカイコは乳液の毒性に耐性であった。このことはクワの葉が乳液で昆虫の食害から身を守る一方で、カイコは乳液による防御に適応していることを示唆した。クワ乳液中には糖代謝酵素の阻害剤である糖類似アルカロイド(1,4-dideoxy-1,4-iminoarabinitolや1-deoxynojirimicin)が高濃度(湿重の2.5%、乾重の18%)で含まれ、エリサン・ヨトウガ幼虫に毒性を示した。これらの昆虫では糖類似アルカロイドが葉中の主要糖であるショ糖を分解する酵素スクラーゼを阻害するため、ショ糖の吸収が阻害され成長が遅延する。また、血リンパに吸収された糖類似アルカロイドは昆虫の血糖であるトレハロースを分解するトレハラーゼを阻害し、血糖の利用と成長を阻害した。さらに我々はクワ乳液に含まれる新規耐虫性タンパク質の精製と遺伝子配列決定に成功した。この新規耐中性タンパク質は、人工飼料湿体中で0.01%の低濃度で重要害虫ヨトウガの成長を顕著に阻害するため、農業上の応用が期待される。一方、クワを専門に食べるカイコではスクラーゼもトレハラーゼも糖類似アルカロイドで阻害されず、糖の吸収も血糖トレハロース代謝も影響されないため、糖類似アルカロイドを食べても成長できた。カイコはクワ乳液成分による化学防御に対し耐性酵素を発達させて適応していた。本研究成果は植物乳液が植物-昆虫間相互作用に重要な役割を持つことと、植物乳液が有用物質・タンパク質の宝庫であることを明確に示している。クワの葉がカイコ以外の昆虫に対して強い毒性と耐虫性をもち、それが葉の傷口から出る白い乳液に含まれる成分に起因することを解明した。具体的には、1.クワ葉はエリサン・ヨトウガ等のガ幼虫に対し毒性示すが、乳液を除去すると毒性は消失した。カイコはいずれの場合も良く成長した。乳液自体もエリサンに対して毒性で乳液がクワの耐虫性を担うことが判明した。2.クワ乳液中には糖代謝酵素阻害剤で血糖値低下効果が報告される1,4-dideoxy-1,4-imino-D-arabinitol(D-AB1)や1-deoxynojirimycin(DNJ)等の糖類似アルカロイドが高濃度で含まれ、一部の個体群や品種では総計で乳液の1.5-2.5%(対乾重8-18%)に達した。この値はクワ組織全体からの従来報告値の約100倍である。3.糖類似アルカロイドの乳液中濃度はクワ個体群・品種間で異なり、沖縄や本州の野生クワやその系統の品種で高くD-AB1が主成分であるが、中国野生クワ系品種「しんいちのせ」では低くDNJのみが存在していた。4.D-AB1やDNJはエリサン幼虫に対し毒性・成長阻害活性を示したが、カイコに対しては全く示さなかった。5.クワ乳液中には他にも高分子性の耐虫因子(毒)が存在することが示唆された。

以上、一般の昆虫が乳液中の毒成分のためにクワ葉を食べられない一方で、長い進化の過程でカイコがクワの防御機構を克服し適応したことが示された。本研究は1.人類になじみ深いカイコとクワの間に複雑な関係が存在することを初めて示した点、2.植物乳液が農薬・医薬等有用物質の宝庫であることを示した点等が高く評価され、米国科学アカデミー紀要に掲載された(Konno K. and Ono H. et al.,(2006)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 103,1337-1341)。クワ乳液が有するタンパク質性の耐虫性因子の精製同定を試みると同時にこの諸性状について生化学的な検討を行った。乳液をNative PAGE、DEAE陰イオン交換クロマトグラフィで分画した後、各画分についてエリサン幼虫を用いて毒性試験を行った結果、顕著な幼虫の生育阻害活性を示すタンパク質画分が存在した。その画分に含まれるタンパク質はトリプシン、キモトリプシン、エリサン消化液、およびカイコ消化液で分解されないことがわかり、タンパク質分解酵素耐性タンパク質であることが明らかになった。またこのタンパク質に対する抗体を作製し、他のクワ科植物にこのタンパク質が含まれているかゲル内2重拡散法により調べた結果、クワ科植物3種の乳液からはほとんど検出されず、クワ科植物群においてクワに特異的に進化してきた耐虫性タンパク質であると思われた。さらに、このタンパク質を精製しアミノ酸配列の決定に成功し、新規耐虫性タンパク質として特許申請を行った。パパイア乳液が昆虫に対する殺虫性性発現機構に関して検討を行った。パパイア葉を食べたエリサン幼虫は数時間から2日で死亡するが短時間で死亡した個体は外見上、体の一部が黒化していた。そのような死亡個体を解剖すると中腸に孔があき、中腸自体もピンセットでつまめないほど軟化・液状化していた。中腸組織(1層の中腸上皮細胞からなる)を顕微鏡で観察すると、細胞自体は保たれていたが、細胞間の接着が弱化しており、丸い形をした細胞が多く、少し引っ張るだけで細胞群集がほぐれることが判明した。一方、乳液除去葉を食べ正常に成長した幼虫の中腸上皮細胞は互いに強固に接着しており引っ張ってもはがれず1層の細胞層を保っていた。本結果からパパイア乳液摂取幼虫では中腸細胞間接着タンパク質がpapainにより消化され張力に耐えられなくなった中腸上皮に孔が空き消化管内容物が血体腔に流出し幼虫が急死する可能性が示唆された。昨年度までに、クワの葉がエリサン・ヨトウガなどカイコ以外の一般の昆虫に対して顕著な毒性を持ち、その原因耐虫性物質がクワ乳液中に高濃度で(湿重の2.5%、乾重の18%)含まれる糖類似アルカロイド(1,4-dideoxy-1,4-iminoarabinitol(D-AB1)や1-deoxynojirimicin)と新規耐虫性タンパク質であることを明らかにした。今年度は、クワ乳液中の新規耐虫性タンパク質の完全長遺伝子配列を決定を行った。その結果、本耐虫性タンパク質は394アミノ酸からなる新規タンパク質であることが判明し、N末端側に2つのキチン結合領域(hevein domain)が存在し、これら2つの領域に挟まれるように、Extensin様領域(Extensin domain)が存在した。C末端側はキチナーゼ様領域が存在した(活性は無い)。本タンパク質は人工飼料湿体中で0.01%の低濃度でヨトウムシに対し顕著な成長阻害活性を示し、農業上利用可能な耐虫性タンパク質として有望であるため、国際特許PCT出願を行った(2008年3月3日、国際出願番号PCT/JP2008/53794)。
電界誘起マグノン干渉効果

磁性絶縁体中の角運動量輸送はマグノンによって担われる。マグノンの持つ角運動量は金属/磁性絶縁体界面におけるスピン交換により伝導電子スピン流へと受け渡すことができ、このようなマグノンー伝導電子スピン流変換は絶縁体ベースのスピントロニクスの基盤となる。本研究では、磁性絶縁体から金属へと流れ出す伝導電子スピン流の精密測定により、伝導電子スピン流と結合しないマグノンモードを発見した。さらにマグノン分裂によるスピン流増大現象とスピン系緩和時間の測定により、マグノン相互作用もスピン変換効率の小さなマグノンモードを生成することが明らかになった。電荷の流れである電流に対し、電子スピンの流れ「スピン流」を生成することも可能である。伝導電子により輸送される電流が金属及び半導体中でしか存在しないのに対し、スピン流は金属・半導体中の伝導電子型スピン流に加え、スピン系の素励起「マグノン」によって絶縁体中においても伝導する。本研究は、絶縁体中を伝導するマグノンスピン流の自在な制御に向け、マグノンスピン流の生成・検出効率の最適化と外場によるマグノン制御を目指す。マグノンスピン流の生成・検出の効率化にはスピン-電荷変換効率と界面スピン交換効率の2つを向上させる必要があり、本研究では特に磁性絶縁体の表面処理とマグノンモード選択により、界面スピン変換効率増大を狙う。具体的な方針として、表面エッチング処理と界面スピン変換のモード依存性定量測定を組み合わせ、マグノン伝送測定に適した素子を設計する。これまでにスピン-電荷変換と磁気ダンピング定量を併用することで界面スピン変換のモード依存性を定量的に測定する手法は確立しており、精密な議論が可能である。界面スピン変換へのマグノン空間分布の影響を顕在化させるため、本実験では厚膜磁性絶縁体を用いる。さらに外場による制御性を高くするため、スパッタリング法により磁気緩和が小さく且つ10ナノメートル程度の薄膜磁性絶縁膜の作成条件を探る。磁気緩和測定には共振器磁気共鳴とウェーブガイドによる磁気共鳴を併用する。これによりマグノン輸送制御測定の舞台が整う。マグノンスピン流の生成・検出の効率化にはスピン-電荷変換効率と界面スピン交換効率の2つを向上させる必要があり、本研究では特に磁性絶縁体の表面処理とマグノンモード選択により、界面スピン変換効率増大を狙った。本研究により、磁性絶縁体表面の化学エッチングによるスピン流生成効率の1桁程度の増大が確認された。これを用いることで絶縁体からのスピン流生成現象を精密に議論することが可能となり、このスピン流精密測定によって、金属/絶縁体界面において伝導電子スピン流へと変換されないマグノンモードが存在することが明らかとなった。当初の計画では電界効果によるマグノン制御を中心に調べる予定であったが、上記発見はこれまで知られていなかったスピントロニクス現象であり、絶縁体ベーススピントロニクスの理解に重要となることから、研究期間内には本現象を系統的に調べた。マグノン生成・マグノン検出の最適化に関する測定を進めているが、特に検出機構に関する重要な知見が得られている。マグノンモードは大きく分けて2つあり、磁場と波数が直行する表面スピン波と磁場と波数が平行な後退体積波と呼ばれている。これまで表面スピン波の局在性から、金属との接合における逆スピンホール効果を用いた場合、このモードが高い検出効率を示すと考えられてきた。しかし、今年度の研究から得られた結果は全く逆の振る舞いを示しており、後退体積波が著しく高い効率で検出可能であることが明らかになった。また、マグノンの制御性を良くするため、ナノメートルオーダーの薄膜磁性絶縁体の作製条件を調べ、磁気緩和定数0.001程度の試料が得られている。総合理工薄膜磁性絶縁体の作製条件を最適化することで長距離のマグノン輸送長を示す磁性素子を作製し、マグノン制御を行う。素子作製には磁性絶縁体の加工が必要となるが、フォトリソグラフィプロセスによる予備実験を進めており、これまでに基本的な構造が作製できることを確認している。また、これまでに明らかとなったマグノン検出効率の高い後退体積波の存在は、金属接合界面における高いスピン交換効率を示唆している。そこで電場によるマグノン制御に加え、界面スピン交換を利用したマグノン制御を試みる。これまでに厚膜磁性絶縁体では表面洗浄よる界面スピン交換効率の改善が確認できており、本手法を薄膜磁性絶縁体にも応用する。旅費使用がなくなったため消耗品購入にあてる
c-Metプロトオンコジーンファミリーのリガンドの解明

c-Metプロトオンコジーン産物は肝細胞増殖因子(HGF)のレセプターである。本研究では、c-Metに類似した構造をもつレセプターファミリーをクローニングし、そのリガンドを明らかにすることによって、HGFファミリーの構造と機能を解明することを目的に研究を行った。トリ赤芽球症ウイルスのもつオンコジーンv-seaはc-Metと相同性の高いチロシンキナーゼ構造をもつことから、その細胞性ホモログc-seaのクローニングをまず行った。さらに、c-sea遺伝子をプローブとして、ヒトヘパトーマHepG2 c-DNAライブラリーをlow-stringencyの条件下でスクリーニングした結果、2種の新規なプロテインキナーゼSkyとLIMKをコードするcDNAをクローニングした。Skyは脳に高発現するレセプター型チロシキナーゼで、細胞接着因子様の細胞外ドメインをもつことを明らかにした。また、in situ hybridizationによりsky mRNAの発現を明らかにするとともに、Sky特異抗体を用いて、Skyの自己リン酸化活性とSrcファミリーとの会合についても明らかにした。Skyの細胞外ドメインとヒトイムノグロブリンFcドメインとの融合蛋白質を発現させ、これを用いて、Skyリガンドの発現クローニング及びアフィニティークロマトグラフィーによる精製を現在進めている。一方、LIMKは2個のLIMモチーフをN末端部にもつ新しいクラスの細胞内セリン/スレオニンキナーゼと考えられ、その細胞内での機能についても検討中である。
ヒトリンパ管内皮細胞におけるＬＹＶＥ－１ｓｈｅｄｄｉｎｇの誘導

アルカリフォスファターゼ融合LYVE-1アデノウイルスをもちいたAP-assayによる評価を行い、培養ヒトリンパ管内皮細胞においてLYVE-1 sheddingが誘導されることを確認した。この実験系においてIL-1βの刺激により培養液内のAP活性は増加しており、IL-1βによるLYVE-1 sheddingの誘導が確認された。そのシグナル経路においてはMAPKsが重要であり、切断を誘導している酵素としてADAMが働いている事を示した。アデノウイルスを用いてLYVE-1をリンパ管内皮細胞(LEC)に強制発現させることによって、培養細胞においてLYVE-1 sheddingを検出可能にした。LECにLYVE-1を過剰発現し、TPA (shedding inducer)を添加するとLYVE-1全長にあたる約70kDaのバンドに加え、切断され短くなった17 kDaのバンドが検出された。IL-1βの添加でも同様のバンドが認められsheddingの誘導が確認された。さらにアルカリフォスファターゼ(AP)を付着したLYVE-1を強制発現する事により、sheddingの定量化を行った(AP assay)。IL-1βの刺激により培養液内のAP活性はコントロールと比較して増加しており、IL-1βによるLYVE-1 sheddingの誘導が確認された。さらにこの実験系を用いて、sheddingのシグナル経路を検討した。IL-1R1、MAP Kinase(JNK、p38、ERK)の各阻害剤を添加することによりIL-1βによるLYVE-1 sheddingは有意に抑制された。さらに、CD44では切断酵素として報告されているADAM10、ADAM17が、LYVE-1 sheddingに関与しているのかについて検討をおこなった。ADAM10、ADAM17のsiRNAを用いたノックダウンによりIL-1β添加により遊離するAP活性は抑制された。特にADAM17ノックダウンにより大きく抑制されており、LYVE-1の切断にはADAM17がより大きく関与しているものと考えられた。以上より、LYVE-1のsheddingがIL-1βにより誘導される事が示された。また、そのシグナル経路においてはERK、JNKが重要であり、切断を誘導している酵素は主としてADAM17であり、ADAM10も働いている事が示された。これらの結果は炎症の起こっている組織において、これまでリンパ管内皮細胞のマーカーとして知られていたLYVE-1という分子が炎症性サイトカインであるIL-1βによりsheddingという生化学的な変化を起こすという新しい知見を示すものである。1.アデノウイルスの作製LYVE-1は生体においてリンパ管内皮細胞に発現する。しかし、培養リンパ管内皮細胞(LEC)では細胞の継代とともにLYVE-1の発現の低下がみられ、Westren BlotではLYVE-1は検出困難であった。そのため培養細胞における検討のためにはLECにLYVE-1を過剰発現させる必要があり、まずアデノウイルスの作製を行った。アルカリフォスファターゼ(AP)-tagHB-EGF-pME18SにLYVE-1cDNAを挿入し、AP-LYVE-1cDNAを作製した。さらにこれらをウイルスゲノムに組み込みアデノウイルスAx-LYVE-1、Ax-AP-LYVE-1を作製した。Ax-LYVE-1を用いてLECにLYVE-1を過剰発現すると、Western blotではLYVE-1の全長にあたる約70kDaのバンドが検出された。Shedding inducerであるTPAを感染細胞に添加するとこのバンドに加え、切断され短くなったLYVE-1にあたる17kDaのバンドが検出され、sheddingが誘導される事が分かった。またIL-1βの添加でも同様のバンドが認められ、sheddingが誘導された。次にAx-AP-LYVE-1をLECに感染させ、AP-LYVE-1を強制発現させることによってsheddingの定量化を行った。細胞をIL-1βで刺激すると、培養液中のAP活性はコントロールと比較して約14倍に増加しており、IL-1βによるLYVE-1 sheddingの誘導が確認された。刺激前にIL-1R1中和抗体を添加するとAP活性は有意に抑制された。以上よりLYVE-1においてsheddingが誘導される事が示された。LYVE-1 sheddingについての報告はこれまでなされておらず、新規の知見であると考えられる。細胞実験を行うにあたって、リンパ管内皮細胞にLYVE-1を強制発現させる必要があっため、LYVE-1アデノウイルス作製を第一に行う必要があった。アルカリフォスファターゼ融合LYVE-1アデノウイルスの作製に用いたAP-tagHB-EGF-pME18Sは当研究所に保管しており、すぐに作製に取りかかることが出来た。アデノウイルスAx-LYVE-1、Ax-AP-LYVE-1の作製は当研究所の手技を用い年度内早期に作製することが出来たため、比較的早い段階で細胞実験に取りかかることが出来た。LYVE-1のsheddingを検出する方法としてWestern blottingを用いたが、用いた抗体の種類によっては反応および染色性が悪いことがあり、LYVE-1抗体を数種類比較検討して行う必要があった。

細胞実験で使用したAP-assayは当研究室で過去に行った事のある実験系であったため、以前おこなった手技に則っておこなったが、複数回の実験により再現性も十分に認められ、概ね予定通りに研究を進めることができた。以上まとめると平成24年度の実験計画の予定通りに研究が進んでおり、概ね順調に進展していると考えられる。想定していたように、リンパ管内皮細胞においてLYVE-1のsheddingが誘導された。引き続き当初の計画にあるように、sheddingにおけるシグナル伝達経路、抑制系実験、sheddingの細胞遊走能に与える影響について検討する予定である。まず、IL-1βによるLYVE-1 sheddingのシグナル伝達経路を各々の段階に特異的な阻害剤、中和抗体を用いて検討する。方法としてはAP-assayをもちいてIL-1R1阻害剤、MAP KinaseであるJNK、p38、ERKの各阻害剤、ADAMs阻害剤(KB-R7785)を添加することによりIL-1βによるLYVE-1 sheddingが解除されるかどうかについて検討する。さらにsheddingにおいて切断酵素として働くマトリックスメタロプロテアーゼであるa disintegrin and metalloproteinase(ADAMs)をsiRNAを用いてノックダウンを行う事により抑制し、sheddingへの影響を検討する。またLYVE-1 shedding誘導により細胞遊走能がどのように影響受けるかを検討する。次年度は本研究の最終年度である。細胞実験を主として行っていくため、必要とされるプラスチック器具、細胞培養液、細胞培養用の用具一式、ヒトリンパ管内皮細胞などの消耗品に800,000円、研究成果についての学会発表、研究打ち合わせなどの旅費等について600,000円の研究費を使用する見込みである。