hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
敗血症の新たな治療薬の開発；骨格筋におけるタンパク質のファルネシル化に着眼して

シャムマウスと敗血症マウスの腹直筋及びヒラメ筋を電子顕微鏡で観察したところ、敗血症マウスでは明らかに形態異常(cristae構造の崩壊や巨大化)のあるミトコンドリアを観察することができた。また、敗血症マウスではシャムマウスと比較して、血中HMGB-1とミトコンドリアDNAの上昇を認めた。HMGB-1はDAMPs(aamage-associated molecular patterns)の一種として全身炎症反応を惹起する因子であると言われているが、近年血中に循環するミトコンドリアDNAもDAMPsとして炎症反応の波及に関与すると報告されている。我々のこれまでの実験結果より、敗血症刺激によって骨格筋のミトコンドリア機能障害がおき、破壊されたミトコンドリア内のミトコンドリアDNAが血中に流れ出て、DAMPsとして働き炎症反応を全身に波及させるのではないかと推測される。我々は過去の研究において、熱傷モデルマウスにおいて、FTIの投与は骨格筋のミトコンドリア機能を改善させることを示しており(Nakazawa.Sci Rep. 2017 Jul 26;7:6618)、同様の効果が敗血症マウスにおいても期待される。今後は敗血症マウスにFTIを投与することで、FTIが敗血症マウスにおいてもミトコンドリアの形態異常を抑制し、血中ミトコンドリアDNAの増加を予防することかどうか解析していく。当初の実験計画では、2年間で敗血症マウスのミトコンドリア機能障害に対するFTIの効果を解析するはずであったが、本研究に最適なCLPモデルマウスを作成するのみ時間を要したため、若干の遅れがある。しかし、CLPモデル作成後は順調に研究計画を遂行できており、延長させていただいた期間内実験は終了すると思われる。進捗状況は当初の予定と比較してやや遅れてはいるものの、おおむね順調であると考えている。すでに、研究費を用いた実験において論文報告もできており、今後もこのまま進行させていきたい。今後の予定としては、敗血症マウスにFTIを投与し、ミトコンドリアの形態変化や血中ミトコンドリアDNAへの影響を解析していく。現在、シャムマウス、敗血症マウスそれぞれに対してFTI投与群、非投与群の4群間でサンプル採取は出来ており、電子顕微鏡での観察および血中のDAMPs、ミトコンドリアDNA、乳酸値の測定を行う予定である。その後は、筋肉のサンプルを用いて蛋白質の定量解析を行う方針である。当初の予定と比較して実験の進行が遅れているため、次年度使用額が生じた。しかし、今年度からは本実験に移行できる部分が多くなるため、使用額が多くなることが予想される。具体的には、蛋白検出に使用する抗体やPCR用のプライマー、またELISAのKit等の購入が必要となる。実験モデル作成に当初の予定より時間を要したため、2年間では予定した実験を完遂できなかった。そのため、残額が生じている。今後の実験は予定通り遂行できるため、予定していた助成金を試薬代・解析外注代としてすべて使用する予定である。
重金属含有ガラスの電子構造と光学非線形性の関係

大きな3次および2次の非線形光学効果を示す物質の研究が、過去数年の間に広く行われるようになってきた。その中でガラス材料についての研究も活発に行われているが、組成やガラス構造と非線形光学特性の関係は、まだ未開明な点が多い。そこで本研究では、ガラス中で種々の配位構造を取ることが知られているTi^<4+>イオンに注目し、アルカリチタノ珪酸塩ガラスの組成と3次および2次の非線形光学特性の関係について検討した。3次の非線形光学特性は第三高調波発生法により測定した。アルカリ三珪酸塩ガラス中のSiO_2をTiO_2で置換していくと、置換量が1/3までは3次非線形光学感受率χ^<(3)>は置換と共に増大したが、置換量1/3から1/2まではχ^<(3)>はほぼ一定となり、さらに置換量を増やすと再びχ^<(3)>は増大した。このχ^<(3)>からTi^<4+>を中心とする配位多面体の超分極率α^<(3)>を求めると、その値は、Si^<4+>、Ge^<4+>、アルカリ金属などの作る配位多面体のα^<(3)>が組成によらずほぼ一定になるのと異なり、組成に大きく依存することがわかった。α^<(3)>は、TiO_2低含有領域では7x10^<-35>esu・cm^3/unit、高含有領域では3.5x10^<-35>esu・cm^3/unitであった。このように超分極率が変化するのは、Ti^<4+>の配位環境が変化するためと考えられた。2次の非線形光学特性は第二高調波発生法により測定した。アルカリ金属酸化物を15mol%、TiO_2を26mol%含む珪酸塩ガラスにポーリング処理を行った。その結果、ポーリング電圧1kV/mm以上、ポーリング温度250°C以上でポーリングを行うことにより2次の非線形光学特性が発現した。この2次の非線形光学特性はTiO_2を含まないアルカリ珪酸塩ガラスでは生じず、またSHG活性に最適なTiO_2含有量が存在することから、Ti^<4+>の周りの配位環境が歪んだ配位多面体を構成するときに、2次の非線形光学特性が発現すると考えられた。
静電トラップ法を用いた極性分子接合の作製とその電気伝導特性評価

電極と分子との接触を制御した分子接合を作製し、その電気伝導特性を評価することは分子エレクトロニクスにおける重要な課題である。本研究では、電場印加によりナノギャップ電極へ選択的に測定対象分子を吸着させること、及び作製した分子接合の電気特性評価を目的としている。固体基板上に作製したナノギャップ電極を用いた分子接合では、トランジスタ特性や温度依存性の測定が可能であるが、ギャップ間分子の状態を評価することが難しかった。我々は、直径約6nmの金ナノ粒子をオリゴチオフェン3量体の自己組織化単分子膜で修飾した複合体(Au_x/3T)を用いることで、電子顕微鏡により観察可能な分子接合を作製し、その試料構造と電気伝導特性(トランジスタ特性、温度特性:11300K)を直接対応づけて調べることができた。少数Au_x/3Tで架橋した接合では、低温で明確な単一電子トンネル伝導が観測された。また、Au_x/3Tと電極との接触抵抗値は、これまでに別の手法を用いて測定された3Tのトンネル抵抗とよく一致した。このことは、本手法において分子数個程度のコンダクタンスが測定可能であることを示している。さらに、接合のコンダクタンスの温度特性から見積もられた活性化エネルギーは、金ナノ粒子のネットワーク構造に依存して変化することを見出した。これらの特性を金ナノ粒子のクーロン帯電効果を考慮することにより説明した。本手法は広く応用が可能であり、現在、光異性化反応を示す分子(ジアリールエテン誘導体)で修飾した金ナノ粒子の電気伝導特性を測定している。その他、有機エレクトロルミネッセンス素子材料であるAlq_3を含んだ素子では、その特性がAlq_3層の配向分極に強く依存することを見出している。本年度は、電気伝導特性測定系の構築、エレクトロマイグレーション法によるナノギャップ電極の作製条件の確立、および静電気力によるギャップ電極間への無極性分子のトラップ実験を行った。電気伝導特性の測定系は、直流の電流-電圧特性だけでなく、交流印加による微分コンダクタンス測定、非弾性トンネルスペクトル測定が可能なものを構築した。また、エレクトロマイグレーション法によるナノギャップ電極の作製条件を確立し、ギャップ間隔数nmの電極を効率良く作製することができた。作製したナノギャップ電極にクーロン島としての機能が期待されるポルフィリン誘導体を導入し、その電気伝導特性を11Kで測定したところ、単一電子トランジスタ特性(クーロンダイアモンド)を得た。得られた特性は、分子軌道計算や光学測定から知られるポルフィリン分子の物性を反映しており、このことから単一分子トランジスタの作製に成功したものと考えられる。その他、ワイヤ状分子を用いて同様の実験を行い、分子由来と見られる電気伝導特性を得ることに成功している。これらの分子は、長さ2nm程度の一般的なものである。したがって、単一分子の大きさを持つ分子をナノギャップ電極へ架橋させた分子接合の作製条件が、ほぼ確立できたと考えられる。次に、静電気力によるギャップ電極間への分子トラップの条件を探るため、観察が比較的容易なカーボンナノチューブを用いて実験を行った。ギャップ電極間へ1MV/m程度の電界を印加し、カーボンナノチューブを電極間に配向、トラップさせることができた。その様子は電子顕微鏡および原子間力顕微鏡による観察で確認した。これまでに、その電気伝導には、電界効果トランジスタ特性を得ている。今年度は、ポルフィリン誘導体を用いた分子接合にっいて、素子作製に関する統計データと、対応する電気伝導特性をまとめ、その成果を国際会議(SSDM2006、ICNME2006)で発表した。内容は論文誌(英文)に掲載される予定である。また、ゲート絶縁層上に形成したナノギャップ電極間をカーボンナノチューブ(SWNT)やオリゴチオフェン誘導体(3T)で架橋させることによりトランジスタ構造を作製し、その電気伝導特性および温度依存性を11Kから300Kの間で測定した。まず、SWNTを測定対象として試料を作製した。SWNTを微量分散させた溶液をソースーゲート電極間に交流電圧(正弦波、5MHz、1.OV_<p-p>)を印加しながら滴下し、乾燥させた。その結果、単一もしくは少数のSWNTがナノギャップ電極間を横切るように架橋した構造を作製することができた。試料の電気伝導特性を測定したところ、低温で単一電子トランジスタ(SET)特性を得た。電気伝導特性は顕著な温度依存性を示し、SET特性は100K程度で消失した。室温ではドレイン電流-ドレイン電圧特性は線形で、ゲート電圧に依存しなかった。したがって、ナノギャップ電極間にトラップされたSWNTは金属性で、電極との接触において接合容量が形成され、低温でクーロン島として機能したものと考えられる。これらの成果を国際会議(ASIANANO2006、JAPANNANO2007)で発表し、論文としてまとめた。次に、同様の手法を一般的な低分子材料に応用するため、3Tを用いてナノギャップ電極を架橋させることを試みた。作製した試料の非弾性トンネルスペクトルを11Kで測定したところ、3T特有の分子振動と対応させることができた。すなわち、3Tをナノギャップ電極間にトラップすることができたものと考えられる(JAPANNANO2007で発表)。

固体基板上に作製したナノギャップ電極を用いた分子接合では、トランジスタ特性や温度依存性の測定が可能であるが、ギャップ間分子の状態を評価することが難しかった。我々は、直径約6nmの金ナノ粒子をオリゴチオフェン3量体の自己組織化単分子膜で修飾した複合体(Au_x/3T)を用いることで、電子顕微鏡により観察可能な分子接合を作製し、その試料構造と電気伝導特性(トランジスタ特性、温度特性:11300K)を直接対応づけて調べることができた。少数Au_x/3Tで架橋した接合では、低温で明確な単一電子トンネル伝導が観測された。また、Au_x/3Tと電極との接触抵抗値は、これまでに別の手法を用いて測定された3Tのトンネル抵抗とよく一致した。このことは、本手法において分子数個程度のコンダクタンスが測定可能であることを示している。さらに、接合のコンダクタンスの温度特性から見積もられた活性化エネルギーは、金ナノ粒子のネットワーク構造に依存して変化することを見出した。これらの特性を金ナノ粒子のクーロン帯電効果を考慮することにより説明した。本手法は広く応用が可能であり、現在、光異性化反応を示す分子(ジアリールエテン誘導体)で修飾した金ナノ粒子の電気伝導特性を測定している。その他、有機エレクトロルミネッセンス素子材料であるAlq_3を含んだ素子では、その特性がAlq_3層の配向分極に強く依存することを見出している。
ヨ-グルトへの生物活性付加を目指した主乳酸菌の作る機能性多糖の構造と活性発現

(1)L.bulgaricus OLL1073R-1株が生産する多糖を、各種クロマトグラフィーにより、中性多糖(NPS)および酸性多糖(APS)に分画・精製した。この多糖は分子量が120万以上で、グルコースとガラクトースが1:1.3の割合で構成されており、APSは0.1%のリンを含んでいた。多糖の化学構造について解析を進めると共に、多糖が有する生物活性をマウス由来リンパ球の幼若化を指標として検討したところ、酸性多糖(APS)に脾臓およびパイエル板由来リンパ球に対する有意な幼若化活性が認められた。また、APSは、B細胞幼弱化因子であることが確認された。APSは、グルコースおよびガラクトースを構成糖とするリン酸化多糖であり、幼若化活性の発現には、リン酸基が関与していることが示唆された。(2)L.bulgaricus OLL1073R-1株が生産する多糖のマクロファージの機能に対する作用について検討した。APSを腹腔内投与したところ、常在性マクロファージの役3倍量のマクロファージが誘導され、さらに、貪食能を有するマクロファージの誘導が増強された。一方、NPS刺激では、APSと同程度の腹腔マクロファージが誘導されたが、貪食能マクロファージの誘導は、増強されなかった。マクロファージの細胞障害性に対する作用についてin vitroで検討した結果、NPSおよびAPS共に、腹腔マクロファージを刺激し、腫瘍細胞の増殖抑制を増強することが認められた。APSの活性は、NPSの約2倍であった。以上のように、APSが、in vivoにおいて、刺激性マクロファージを誘導し、貪食能を示す活性化マクロファージの誘導を増強すること、さらに、in vitroにおいて、TG-MΦを活性化し、細胞障害性マクロファージを誘導する能力を有することが証明された。Lactobacillus delbrueckiisubsp. bulgaricusの生産する菌体外多糖の持つ生物機能を調べるために、OLL 1073R-1とNCFB2483の2株の多糖生産菌を使用し、培養した脱脂乳よりエタノール沈殿法によって多糖を分離した。OLL 1073R-1からの多糖は更に陰イオン交換クロマトグラフィーによって吸着画分(APS)と非吸着画分(NPS)に分画した。これらの成分について、マウス脾臓およびバイエル板細胞に対するリンパ球幼若化活性を調べた。その結果NCFB2483株は多糖の生産量が多かったが幼若化活性は認められず、OLL1073R-1株の生産した多糖の中の、特にAPS画分に高い活性が認められた。この成分はバイエル板に対しても活性を示した。組成分析の結果より、APSは約、0.1%のリン酸化多糖であった。フッ化水素酸分解によって脱リン化したところ、幼若化活性が消滅したことから、リン酸基が活性発現に重要な役割を果たしていることが考えられた。OLL1073R-1の多糖成分はゲルろ過の結果から、分子量約120万と推定された。糖組成はAPS、NPS供グルコース:ガラクトースが1:1.3の比で構成されていた。NMRを測定したところ両者は同一のスペクトルを示し、同じ構造を持つことが判明した。構造内の糖の結合に関与しているアノメリックプロトンの配向性は、αが2個、βが3個の繰り返しユニットを持つ5糖から成ると推定された。

結合位置を調べるために、メチル化を行い、加水分解後の部分メチル化アルジトールアセテートより、5糖の繰り返しユニットの中には^<-2>[Glc]、^<-3>[Glc]、^<-4>[Gal]が存在し、分岐したGalが3、4位2置換のGalを介して結合することが明らかになった。全体の構造については引き続き検討中である。Lactobacillus delbrueckiisubsp.bulgaricus OLL1073R-1の生産する菌体外多糖の生物活性を調べた。多糖は分離後イオン交換クロマトグラフィーによって吸着画分(APS)と非吸着画分(NPS)に分画した。前者は0.1%のリンを含んでおり、糖鎖骨格は同じである。これらについて、マクロファージの貪食能と、細胞障害性に対する活性化の作用を調べた。マウスの腹腔内にAPSおよびNPSを投与し、誘導されるマクロファージを採取した。対称としてチオグリコレート投与によって誘導されるマクロファージを採取した。両マクロファージの貪食能を、ビーズ取り込みによってFACS Caliburを用いて解析した。その結果、APS刺激で誘導されたマクロファージの約54%が高い貪食能を有する部分に分類され、この割合はチオグリンコレートおよびNPSで誘導されたものの約2倍であった。この結果、APSには免疫担当細胞のマクロファージを活性化される力があるものと判断された。次に、チオグリコレートによって誘導されたマウスのマクロファージをマイクロプレート上で培養し、APSおよびNPSを添加して刺激した。これに腫瘍細胞のSarcoma-180を加えて培養し、マクロファージと接触させた。その後腫瘍細胞に取り込まれたトリチウムチミジンの量を測定し、コントロールとの差から腫瘍細胞増殖仰制率を算出した。その結果、APS刺激マクロファージの70%以上に細胞障害活性が認められ、特に100μg/mlの濃度で高い活性が認められた。NPSにも活性が認められたが、APSの1/2であった。以上の結果から、APS,NPS共にマクロファージの細胞障害活性を増強することが判明した。これらの結果、多糖成分の中で、特にAPSが高い生物活性を持つものと考えられた。
閉口き裂の検出精度向上を目的とした非線形超音波探傷法に関する研究

本申請に係る研究の大きな目的は,微弱な非線形超音波を有効に受信して閉口き裂などの欠陥検出精度を大幅に向上させることにある。このためには,これらの超音波の発生原理を明らかにする必要があるが,その糸口として非線形超音波が効率よく発生する諸条件を探すことが有効と考えた。そこで,アルミ合金のブロック(幅100 mm,高さ50 mm,奥行40 mm)を二つ重ね,上部に設置した送信プローブより縦波超音波を入射して境界部を通過させ,底部に配置したプローブによってこれを受信する実験を行った。この実験では,二つのブロックの圧着荷重P,入射超音波の中心周波数f,ならびに境界部の面粗さRを変化させ,種々の条件の下で検討を行った。受信波形を周波数解析し,境界がない試験体(幅100 mm,高さ100 mm,奥行40 mmのアルミ合金ブロック単体)における結果と比較して考察を加えたところ,次に述べる傾向が得られた。(1)中心周波数f = 1 MHのプローブを用いた実験では,高調波の小さなピークと共に分調波が見られた。(2)中心周波数f = 2.25 MHzと5 MHzの実験では,高調波は見られず分調波のみが認められた。(3)得られた分調波と基本波の振幅比A0.5/A1.0は,中心周波数や圧着荷重に関わらず概ね0.1であった。なお,今回の検討では接触境界面の面粗さの影響については明確にできなかったため,検討を継続する。以上の実験的な検討に加え,MATLABを利用して作成したFDTD(時間領域有限差分)法のプログラムを用いた検証を行った。その結果,分調波はほとんど現れず顕著な高調波が発生する結果となり,実験と大きく異なる傾向が得られた。これは両者の拘束条件の違い等によるものと考えられるが,今後の詳しい検討を要する。本研究の目的は,不連続境界部から発生する非線形超音波の発生原理を検討するものであるため,まずはどのような条件で非線形超音波が発生するかをはっきりとさせておく必要がある。初年度の研究によって,使用する超音波の中心周波数や境界面の圧着状態等を検討し,分調波が発生する条件がある程度得られている。しかしこの分調波は非常に微弱であり,発生メカニズムを検討するには更に強い分調波を発生させることが必要であるため,最適な実験条件を詰めることが急務と考える。また,このためにFDTD(時間領域有限差分)法と呼ばれる数値計算法を援用しようとしているが,実験では分調波のみが発生しているのに対して同条件の計算では高調波のみが発生するなど,現段階では解決するべき問題点が残されている。また,き裂などの実際の不連続部へ超音波を入射して非線形超音波を発生せることを考える場合,き裂長さや間隙の寸法等の条件が強く影響するため,非線形超音波の発生は局所的であることが予想される。従って,入射超音波は欠陥部全体へ入る大きな幅を持った平面波ではなく,意図する欠陥部のある1点にフォーカスさせる集束型の超音波を用いる必要があると考え,検討を実施している。無数の組み合わせから強い非線形超音波の発生条件を探すには,FDTD(時間領域有限差分)法と呼ばれる数値計算法を有効に活用することが必須であるが,実験との比較検討結果から現状では信頼性が低い。この状況を改善する必要があるが,境界面の圧力等の具体的な境界条件が数値計算の際に再現されていないことが大きな原因と考えているため,この点に焦点を当てて検討を行う。また,欠陥部における非線形超音波の発生分布を調べれば,発生しやすい条件を探る一助となることが予想される。このためには超音波を絞って局所的にある1点へ入射させる必要があるので,フェーズドアレイ型超音波探傷器を用いる。この機器は,複数の小さな素子からなる発信プローブから任意波形の超音波を入射できるものであり,これによって意図する場所へフォーカスされた波を送ることができる。なお,本研究の大きな目標は,シミュレーションや理論計算ではなく,実験による直接的な方法で非線形超音波発生の原理を探る事であるため,物体内を伝ぱする超音波の可視化が必要である。これには光弾性法をベースとした極短波長のストロボ法を利用するが,フェーズドアレイタイプの機器から入射した超音波の可視化はあまり例がないため,この技術的な面についても検討を行う必要があると考えている。また,超音波の伝ぱ画像の中から微弱な非線形超音波の情報を抽出する画像処理などのテクニックを詳しく調査研究し,今回の問題へ適用していく考えである。

受信波形を周波数解析し,境界がない試験体(幅100 mm,高さ100 mm,奥行40 mmのアルミ合金ブロック単体)における結果と比較して考察を加えたところ,次に述べる傾向が得られた。(1)中心周波数f = 1 MHのプローブを用いた実験では,高調波の小さなピークと共に分調波が見られた。(2)中心周波数f = 2.25 MHzと5 MHzの実験では,高調波は見られず分調波のみが認められた。(3)得られた分調波と基本波の振幅比A0.5/A1.0は,中心周波数や圧着荷重に関わらず概ね0.1であった。なお,今回の検討では接触境界面の面粗さの影響については明確にできなかったため,検討を継続する。以上の実験的な検討に加え,MATLABを利用して作成したFDTD(時間領域有限差分)法のプログラムを用いた検証を行った。その結果,分調波はほとんど現れず顕著な高調波が発生する結果となり,実験と大きく異なる傾向が得られた。これは両者の拘束条件の違い等によるものと考えられるが,今後の詳しい検討を要する。本研究の目的は,不連続境界部から発生する非線形超音波の発生原理を検討するものであるため,まずはどのような条件で非線形超音波が発生するかをはっきりとさせておく必要がある。初年度の研究によって,使用する超音波の中心周波数や境界面の圧着状態等を検討し,分調波が発生する条件がある程度得られている。しかしこの分調波は非常に微弱であり,発生メカニズムを検討するには更に強い分調波を発生させることが必要であるため,最適な実験条件を詰めることが急務と考える。また,このためにFDTD(時間領域有限差分)法と呼ばれる数値計算法を援用しようとしているが,実験では分調波のみが発生しているのに対して同条件の計算では高調波のみが発生するなど,現段階では解決するべき問題点が残されている。また,き裂などの実際の不連続部へ超音波を入射して非線形超音波を発生せることを考える場合,き裂長さや間隙の寸法等の条件が強く影響するため,非線形超音波の発生は局所的であることが予想される。従って,入射超音波は欠陥部全体へ入る大きな幅を持った平面波ではなく,意図する欠陥部のある1点にフォーカスさせる集束型の超音波を用いる必要があると考え,検討を実施している。無数の組み合わせから強い非線形超音波の発生条件を探すには,FDTD(時間領域有限差分)法と呼ばれる数値計算法を有効に活用することが必須であるが,実験との比較検討結果から現状では信頼性が低い。この状況を改善する必要があるが,境界面の圧力等の具体的な境界条件が数値計算の際に再現されていないことが大きな原因と考えているため,この点に焦点を当てて検討を行う。また,欠陥部における非線形超音波の発生分布を調べれば,発生しやすい条件を探る一助となることが予想される。このためには超音波を絞って局所的にある1点へ入射させる必要があるので,フェーズドアレイ型超音波探傷器を用いる。この機器は,複数の小さな素子からなる発信プローブから任意波形の超音波を入射できるものであり,これによって意図する場所へフォーカスされた波を送ることができる。なお,本研究の大きな目標は,シミュレーションや理論計算ではなく,実験による直接的な方法で非線形超音波発生の原理を探る事であるため,物体内を伝ぱする超音波の可視化が必要である。これには光弾性法をベースとした極短波長のストロボ法を利用するが,フェーズドアレイタイプの機器から入射した超音波の可視化はあまり例がないため,この技術的な面についても検討を行う必要があると考えている。
光学活性テトロドトキシン類の全合成研究

テトロドトキシン(TTX)はフグ食中毒を引き起こす毒の主成分である。ナトリウムイオンチャンネル遮断活性を有し、現在、脳神経科学研究の必須のツールとして汎用されている。TTXは他に類例のない複雑な構造をもつ。その構造が明らかにされて以来、強力なイオンチャンネル遮断活性と特異な構造との関連の解明に向けて、多くの研究グループによる全合成研究が展開されている。初の全合成(ラセミ体)が30年前に報告されたが、光学活性体の合成は未達成である。全合成の達成には高い効率性と立体選択性を兼ね備えた連続不斉中心の立体制御が要求される。その解決法として、不斉転写型ストレッカー反応を鍵反応とする、含窒素4級炭素を含む3連続不斉中心の立体制御(キナ酸から鍵中間体となるアミノ酸の合成)に成功している。さらに保護アリルスルフィドを経由する6員環上への水酸基導入法を確立している。これまでの成果を基盤とし、本研究では、光学活性TTX、並びに、その前段階としてデオキシ類縁体の全合成研究を行った。不斉転写型ストレッカー反応より得られるアミノ酸合成中間体から、ピロリジン環の酸化的解裂、3位水酸基の反転、橋頭位酢酸ユニット構築(1炭素増炭)、テトラオール部構築法を検討した。その結果、上記提案課題を解決し、トリデオキシTTXの全合成において、最終工程となるグアニジン部導入直前までの合成経路を確立できた。さらに、ストレッカー合成反応やテトラオール部構築法の一般合成法としての有用性をgabosine類の合成並びにグルタミン酸アナログ合成において実証した。その構造が明らかにされて以来、イオンチャンネル遮断活性と特異な構造との関連の解明に向けて、多くの研究グループによる全合成研究が展開されている。本研究では、同族体を含むTTX類(光学活性体)の全合成を目的としている。TTXのシクロヘキサン環上には、3つの不斉4級炭素に加え、水酸基、アミノ基、グアニジノ基などの極性官能基が連続かつ密集している。さらに現在までに、保護基の導入、アリルスルフィドを経由する6員環上への水酸基導入法を確立している。本成果を基盤とし、全合成をさらに進展させた結果、ピロリジン環の酸化的解裂、3位水酸基の反転、橋頭位酢酸ユニット構築(1炭素増炭)、含窒素4級炭素の新しい構築法についての知見を集積できた。現在これらを集約し、トリデオキシTTX、5-デオキシTTXの全合成を進めている。
大豆たんぱく質由来レジスタントプロテインを用いた抗ガン食品の開発

我々は、大豆分離たんぱく質(SPI)を微生物由来プロテアーゼで処理した後に残る不消化画分(UDF)をラットに与えると、胆汁酸で誘発される大腸および肝発癌を強く抑制することを見いだした。UPFを与えたラットでは、糞への胆汁酸排泄量が増加し、血中胆汁酸が減少していた。糞中への窒素、アミノ酸、胆汁酸さらにコレステロールの排泄は互いに良く相関しており、このことからUDFの一部がレジスタントプロテインとなり、胆汁酸を腸管内で捕捉し糞中排泄を促進するものと考えられた。コレステロール排泄量の増加は胆汁酸が腸管内で捕捉され、ミセル形成が阻害されたものと思われる。このようなレジスタントプロテインの実体を明らかにしようと、糞中からの抽出を試みたが、その大部分が尿素やグアニジンによっても可溶化されず不溶性画分に留まった。不溶性画分のアミノ酸組成は疎水性の強いペプチドの存在を示し、また、強い胆汁酸結合能を持っていた。糞中の胆汁酸は緩衝液では抽出されず、75%エタノールで抽出されることから、胆汁酸は不溶性画分のレジスタントプロテインに疎水結合によって捕捉され、またこのため胆汁酸の大腸での発ガンプロモーター作用が抑制されるものと考えられた。このUDFをペプシン、ついでパンクレアチンで人工消化するとおよそ30%の収量で消化残渣、RF-UDFが得られた。RF-UDFのin vitroでの胆汁酸結合能はUDFのおよそ2倍であり、ラットに与えたところ10%のRF-UDFで20%UDFと同等の窒素排泄量と胆汁酸排泄促進効果が得られた。そのアミノ酸組成は、元のUDFより疎水性アミノ酸含量が増加しており、糞を加水分解して得られるアミノ酸組成ときわめて類似していた。以上の結果は、UDFの疎水性部位がレジスタントプロテインとなり、胆汁酸を結合するという我々の考えを裏付けている。現在、RF-UPFの食品への応用を検討中である。大豆分離たんぱく質を微生物由来プロテアーゼで処理した後に残る不消化画分(UDF)は優れた胆汁酸結合能を有する。我々はこれまで大豆UDFが実験大腸発癌および肝発癌を強く抑制することを報告してきたが、これはUDFの一部がレジスタントプロテインとなり、胆汁酸を腸管内で捕捉し糞中排泄を促進するためであると考えている。本研究は、このような大豆たんぱく質に由来するレジスタントプロテインの実体を明らかにし、それを用いた抗ガン食品の開発を目的としている。平成12年度はUDFを人工消化し、消化残渣の解析からその実体を明らかにすることを試みた。【方法】大豆UDF懸濁液をペプシン、ついでパンクレアチンで人工消化し、消化残渣を遠心分離で回収した後、凍結乾燥したものをRF-UDFとした。RF-UDFと大豆UDFを異なる濃度のデオキシコール酸溶液に懸濁しin vitroでの結合能を比較した。続いて、9週齢のフィシャー系雄ラットに、大豆UDF、RF-UDFを与え、経時的に糞を採取し、糞中窒素量と胆汁酸排泄量を比較した。【結果と考察】大豆UDFからおよそ30%の収量でRF-UDFを得ることができた。RF-UDFのin vitroでの胆汁酸結合能はUDFのおよそ2倍であった。

また、餌に混ぜてラットに与えたところ10%のRF-UDFで20%UDFと同等の窒素排泄量と胆汁酸排泄促進効果が得られた。また、そのアミノ酸組成は、元のUDFより疎水性アミノ酸含量が増加しており、糞を加水分解して得られるアミノ酸組成ときわめて類似していた。以上の結果は、UDFの疎水性部位がレジスタントプロテインとなり、胆汁酸を結合するという我々の考えを裏付けている。申請者らは、大豆分離たんぱく質(SPI)を微生物由来プロテアーゼで処理した後に残る不消化画分(UDF)が、胆汁酸による大腸・肝臓発ガンプロモーター作用を強く抑制することを見いだした。昨年度までの研究で、これはUDFに由来するレジスタントプロテインが、消化管内で胆汁酸を疎水結合により捕捉するためであること、さらに、UDFをペプシン、パンクレアチンで消化した残渣(RF-UDF)はUDFより強い胆汁酸結合能を有し、アミノ酸分析の結果から、UDFの疎水性部位がレジスタントプロテインとなり、胆汁酸を結合すると言う知見を得た。本年度はRF-UDFの体内胆汁酸動態への影響と、胆汁酸補足部位の解明、および胆汁酸補足機構を検討した。【方法、結果、考察】ラットにたんぱく源としてSPI、UDF、RF-UDFを含む飼料にコレステロールを添加して与え4週間飼育した。糞中胆汁酸およびコレステロール排出量はRP-UDF>UDF>SPIの順に多く、これと逆送関する形で血中コレステロールと胆汁酸が減少した。これらの効果は、糞中に排泄される不溶性ペプチドの量に依存していた。この不溶性ペプチドとRF-UDFは共に疎水性が強く、アミノ酸組成には高い類似性があった。また、いずれも様々な界面活性剤、尿素、グアニジンなどによっても可溶化出来ず、用いた限りのプロテアーゼによっても、ほとんど分解されなかった。塩酸によって部分加水分解し、単離精製できたオリゴペプチドのアミノ配列はすべてβ-conglycininのα鎖の2カ所、β鎖の1カ所のいずれかに一致し、LLPHを共通配列として持つ疎水性の高いペプチドであった。以上のことから、SPIからUDFを生産する際に、β-conglycininの疎水性の部位をコアとして、架橋などの修飾が生じ、難消化性となった部位がレジスタントプロテイン;RF-UDFとして、糞中に排泄されるものと考えられた。なお、β-conglycinin見いだされた配列を基にペプチドを合成し、胆汁酸との結合を調べたが、いずれのペプチドも胆汁酸との直接的な結合は認められなかった。従って、現時点ではこれらの配列を中心に形成される疎水領域に胆汁酸が捕捉されるのではないかと考えている。また、RF-UDFの抗癌効果や食品への導入は、未だ十分な量を得ておらず、今後の課題として残された。
ライフサイクルアセスメント等を適用した都市開発の持続性評価手法の研究

持続的な都市開発を行うことが地球環境、地域環境の双方において重要な課題となりつつある。本研究では、都市開発の環境に与える影響を捉え、有効な情報を提供するための戦略的評価手法の開発を目的とする。そのため、持続的環境評価の観点から都市開発を評価するためのフレームワークの策定及び持続性の評価指標の作成、続いて産業連関投入・産出表にもとづくライフサイクルアセスメント(LCA)手法を適用した環境影響評価手法の開発を行い、さらに、これらの成果をもとに、都市開発における開発影響を予測するためのコンピューターシミュレーションモデルを構築するというプロセスで研究を行った。本年度の研究成果は次の3点である。1.都市開発における環境・地域社会等への各種影響に関する特性について、都市開発に造詣の深い各種分野の専門家の協力を得てフレームワークを検討した。2.開発地区のミクロな情報分析と地域レベルにおけるマクロな情報分析を相互に関連させながら、都市開発に伴う物質、経済、エネルギー等の影響や相互関係を分析・把握し、持続性の評価指標を作成した。3.産業連関投入・産出表とライフサイクルアセスメント手法を結合することによる「投入・産出ライフサイクルアセスメント手法」を構築し、持続性評価シミュレーションモデルをデザインした。大規模な住宅開発等の都市開発手法においては、このような観点から開発の適切性を計画時に評価することは従来十分になされていない。その主たる理由として、計画時に行われる適切な環境評価の手法が開発されていないことがあげられる。本研究では、都市開発の環境に与える影響を捉え、有効な情報を提供するための戦略的環境影響評価手法の開発を目的とする。そのため、持続的環境評価の観点から都市開発を評価するためのフレームワークの策定、持続性の評価指標の作成、産業連関投入・産出表にもとづくライフサイクルアセスメント(LCA)手法を適用した環境影響評価手法の開発を行い、さらに、これらの成果をもとに、都市開発における開発影響を予測するためのコンピューターシミュレーションモデルを構築する。本年度の研究成果は次の2点である、1.都市の開発活動を巨視的に捉え、都市全体の成長・形態的な拡大のメカニズムを現す都市モデルをセルオートマトン、エデンモデルを用いて構築した。これらは都市開発のマクロな形態分析に有効である。2.佐賀県における住宅開発の時系列的な変化と環境への影響を分析するため、建設活動における産業連関投入・産出表を作成し、住宅構造のタイプ、建設工法及び建設材料による環境排出物への影響などをシミュレーション分析するためのフレームを構築した。これにより、住宅構造、建設材料の変化による環境に対する影響の大きさなどを把握するための基礎的な分析手法が確立できた。
機能材料の超精密切削加工に関する研究

磁気ディスクやポリゴンミラーなどの電子光学部品に多用されているAl-Mg合金を単結晶ダイヤモンドバイトで超精密切削する場合の仕上面あらさの創成機構を実験的に検討した。その結果,超精密切削面のあらさが理論あらさに比べて大きくなる要因として超精密切削面に現れる結晶粒界段差が揚げられることを確認した。そこで,超精密切削面に現れた粒界段差を構成する個々の結晶粒の面方位をECP(エレクトロ・チャンネリング・パターン)法を用いて特定し,段差を形成する個々の結晶粒の面方位と仕上面における結晶表面のレベルとの関係をステレオ三角形に対応させて求め,切れ刃の逃げ角が2,5,10,15゚のダイヤモンドバイトを用いて,逃げ角が仕上面あらさと粒界段差に及ぼす影響を検討した。その結果,逃げ角が比較的小さい場合はステレオ三角形の頂点として表される(111)面,(011)面及び(001)面から三角形中央の(124)面に近づくに従って結晶表面は高くなる傾向が顕著に現れることが明らかになった。しかし,逃げ角が大きい場合は同様な傾向が明瞭に確認できないことがわかった。また,逃げ角が小さくなるに従って切れ刃逃げ面が工作物表面を擦過するバニシ作用が強まるため,粒界段差は小さくなることが確認された。また,そのために切れ刃と工作物表面との接触面における比切削抵抗比(比切削主分力と比切削背分力との比)は逃げ角が小さくなると共に大きくなり,X線回折により求めた仕上面の残留応力は,小さい逃げ角のバイトで仕上げた表面ほど圧縮の残留応力が大きくなることが明らかになった。ポリゴンミラーなどの光学部品に多用されているAl-Mg合金を単石ダイヤモンドバイトで超精密切削する場合の仕上面あらさの創成機構を実験的に検討した。その結果,切れ刃の送り速度を小さくすることによって超精密切削面のあらさは減少するが,送り速度がおよそ10μm/rev以下では送り速度を小さくしても仕上面あらさの改善効果は低いことが明らかになった。その要因の1つが,超精密切削面に現れる結晶粒界段差であることを確認し,切れ刃の送り速度との関係を検討した。その結果,切れ刃の送り速度が大きくなるに伴って結晶粒界段差も増大することが明らかになった。しかし,仕上面あらさに占める結晶粒界段差の割合は,切れ刃の送り速度の増加とともに小さくなることがわかった。さらに,超精密切削面に現れた個々の結晶粒の面方位をECP(エレクトロ・チャンネリング・パターン)法を用いて特定し,段差を形成する個々の結晶粒の面方位と仕上面における結晶表面のレベルとの関係をステレオ三角形に対応させて求めた。その結果,ステレオ三角形の頂点として表される(111)面,(011)面及び(001)面から三角形中央の(124)面に近づくに従って結晶表面は高くなる傾向にあることが明らかになった。また,切れ刃の逃げ角が2,5,10,15°のダイヤモンドバイトを用いて,逃げ角が仕上面あらさと粒界段差に及ぼす影響を検討し,切れ刃の逃げ角が小さいほどバニシ作用によって結晶粒界段差は減少するが,仕上面あらさは切れ刃側方への材料の盛上り現象のため逃げ角が5°の場合が最も良好であることがわかった。

そこで,超精密切削面に現れた粒界段差を構成する個々の結晶粒の面方位をECP(エレクトロ・チャンネリング・パターン)法を用いて特定し,段差を形成する個々の結晶粒の面方位と仕上面における結晶表面のレベルとの関係をステレオ三角形に対応させて求め,切れ刃の逃げ角が2,5,10,15゚のダイヤモンドバイトを用いて,逃げ角が仕上面あらさと粒界段差に及ぼす影響を検討した。その結果,逃げ角が比較的小さい場合はステレオ三角形の頂点として表される(111)面,(011)面及び(001)面から三角形中央の(124)面に近づくに従って結晶表面は高くなる傾向が顕著に現れることが明らかになった。しかし,逃げ角が大きい場合は同様な傾向が明瞭に確認できないことがわかった。また,逃げ角が小さくなるに従って切れ刃逃げ面が工作物表面を擦過するバニシ作用が強まるため,粒界段差は小さくなることが確認された。また,そのために切れ刃と工作物表面との接触面における比切削抵抗比(比切削主分力と比切削背分力との比)は逃げ角が小さくなると共に大きくなり,X線回折により求めた仕上面の残留応力は,小さい逃げ角のバイトで仕上げた表面ほど圧縮の残留応力が大きくなることが明らかになった。
中国古人骨の顎顔面形態、歯の形質、歯科疾患から見た日本人の起源

本研究は、中国を中心としたアジア大陸東部の古人骨集団の顎顔面形態、歯の形質、歯科疾患を日本人の標本と比較することにより、日本人の起源に関しての有効な情報を得ることを目的としている。平成10年度は、蓄積されてきた日本の縄文時代、弥生時代、古墳時代、鎌倉室町時代、江戸時代、明治時代の18標本群1017体、中国大陸の東北部、内蒙古、山東省、河北省、山西省、〓西省、青海省、朝鮮半島、台湾などの30標本群1637体の頭骨について、頭蓋および顎骨の直接計測値、X線規格写真(セファロ)計測値、歯冠近遠心径・頬舌径、歯の形質、歯科疾患のデータセットの整備を行い基礎集計を行った。グラベラ周辺部の形態に関しては、中国人の各群ではあまり差がみられなかったが日本人の標本においては時代および地域による差がみられるように感じた。そこで新たにX線規格写真上に計測点を設定し数量化を試みた。日本人の標本集団に関しては、グラベラ部が突出している縄文時代および九州南部のものと、グラベラ部が平坦な弥生時代および九州・本州の古墳時代のもの、その中間である本州中世および近世のものにわかれた。中国標本群は平坦なグループに分類された。またグラベラ部の形態が前頭洞の発達の程度に影響を受けることが示された。このことは従来から言われていた縄文人と弥生人の特徴と一致し、これらの違いは遺伝的な違いと解釈することも可能であろうが、各集団がおかれた環境の影響を今後検討してみることが必要だと考えられた。
Notchシグナル系の脊椎動物発生における役割の解析

一回膜貫通型受容体Notch(N)はその膜貫通型リガンドDelta(Dl)、Serrate(Ser)と結合し、隣接する細胞間でシグナルの授受を行うとされるが、この点を検証するために免疫沈降法により、それらの結合能を調べた。その結果、おのおのがオリゴマー形成することが分かった。また、N/DlあるいはN/Serのヘテロマーは、隣接する細胞同士のみならず、同一細胞上で結合することを明らかにした。この同一細胞上での結合蛋白は細胞膜表面には検出されないことから、小胞体やゴルジ体等の細胞内器官で結合する可能性が示唆された。N受容体とともにDlあるいはSerが共発現した場合に、Nシグナル系の標的遺伝子のひとつであるHES-5のプロモーター活性が抑制されることから、この結合がN受容体の感度を下げ、Nシグナル系を負に制御する働きがあることが分かった。また、Dlの細胞内ドメインを削除した変異体はこのNシグナルの抑制作用を強く持つことが分かった。トリ神経管への遺伝子強制発現実験から、これらのDl、Serの変異遺伝子は内在性のSer発現を同じように増強し、しかもこの効果はNの活性型変異遺伝子を導入することで打ち消された。これらの結果から、Nシグナルへの同一細胞上における抑制作用はDlとSerで基本的に差がないこと、この効果がN受容体の受容性を減弱することによって起こることが明らかになった。Dl、Serは神経管で互いに相補的な発現パターンを示しているが、そこにはFringe(Fg)の調節が関与している可能性が高い。われわれはFgがN/Dlの結合を阻害することを見出した。以上の結果から、NとDl、Serは隣接する細胞間でシグナルを送るのみでなく、同一細胞上での受容体-リガンドの結合によってシグナル伝達を負に制御する機構があり、さらにFgによってその結合が調節されていることが明らかになった。トリ胎児cDNAライブラリからNotch-1、Serrate-1のクローニングを行い、ORF全長を得た。次にNotch-1、Delta-1、Serrate-1遺伝子あるいはそのdeletion constructを発現プラスミドに入れ、in ovo electroporationによりトリ胎児神経管に強制発現させ、内在性のNotch-1、Delta-1、Serrate-1の発現に与える影響をin situ hybridizationにより調べた。その結果、Delta-1の細胞内ドメインのみを欠く膜局在型deletion construct(Dalta-d1)の強制発現により、Serrate-1の発現が増強することが分かった。野生型のDelta-1や、膜貫通ドメインまで削った分泌型Delta-d2に発現増強作用はなかったが、Serrate-1の細胞内ドメインを削ったdeletion constructには、同様に内在性のSerrate-1の発現を増強する作用があることが分かった。また、Delta-d1とconstitutive active Notch(NICD)との共発現でこの発現増強作用は抑制されることも分かった。我々はNotchとDeltaあるいはSerrateがcell-autonomousに相互作用し、Serrate自身の発現制御を含むNotchシグナル伝達を行っている可能性を考え、その検証を行っている。免疫沈降法により、Notch-DeltaあるいはNotch-Serrateに結合能があることが確認されたが、現在これが隣接する細胞間における結合か、同じ細胞膜上での結合かを検証している。
超高速変形した鉄-ロジウム合金の応力誘起相転移機構と非熱平衡原子空孔との相関

低温でRh濃度が2050原子%の広範囲にわたってB2相を形成するFe-Rh合金の特異な応力誘起相転移機構の知見を得ることを目的として、高速変形により非熱平衡欠陥を高密度に導入し、変形試料の微細構造をX線回折、電子顕微鏡観察、陽電子消滅測定により調べた。試料としてRh濃度の異なるFe-40, 45, 50at%Rh合金を選び、高温から急冷によって得たB2相に関して広島工業大学超高速塑性加工研究センターの装置を使用して超高速衝撃変形を行った。変形時の平均授与運動量は1.84kgf/sであった。授与運動量が小さい場合にはLl_0相への応力誘起変態量が多くなった。電顕像には顕著な転位網の発達とともに同定の出来なかった歪みコントラストを示す高密度の微小欠陥が観察された。さらに応力誘起L1_0及びA1相中には高密度の微細双晶の形成が認められたことから、変形時には剪断力が主として作用したと結論できた。未変形試料においてはFe-40at%Rh合金の陽電子平均寿命は等比組成の試料に比して20%長くなった。2成分解析の結果、150ps程度の長寿命成分が60%程度存在しており、空孔型欠陥濃度が高いことを示すがこれは構造空孔に関係すると結論した。一方、1.8kgf/sの変形試料では等比組成の場合と比べて平均寿命はわずかに小さくなったが、長寿命成分の寿命の絶対値は206psとなり、等比組成の188psより長くなった。また短寿命成分の絶対値も未変形の場合よりも増大することから、陽電子は空孔型欠陥クラスターならびに双晶、積層欠陥などの面欠陥部で消滅することが明らかとなった。等比組成試料の授与運動量依存性では、平均寿命は極大を示すことから、高運動量では多重空孔クラスターが形成されることが明らかとなった。実験結果から空孔型欠陥のサイズ及び濃度が変形時の授与運動量及び合金組成に密接に関係することが示された。
再生不良性貧血患者におけるc-kit、SCFの役割に関する基礎的研究

再生不良性貧血患者7例の骨髄生検および骨髄クロットのパラフィン標本を用いて免疫組織化学を行った。対照として骨髄抑制および骨髄浸潤を認めないリンパ腫患者の骨髄組織を用いた。抗c-kit抗体はc-kit分子の細胞内ドメインを認識する抗体を、抗SCF(Stem cell factor)抗体はSCFの細胞外ドメインを認識する抗体をそれぞれ用い、その発現、分布を検討した。対照群ではc-kit陽性細胞は比較的均一に多数分布しているが、SCF陽性細胞は多少とも局在があり、しかもその数はc-kit陽性細胞に比し少ない傾向にあった。再生不良性貧血患者骨髄ではc-kit陽性細胞の数は非常に少なく、なかには陽性細胞を認めない症例もあった。また陽性細胞の染色性の程度も対照群に比べ弱かった。一方、再生不良性貧血患者骨髄中のSCF陽性細胞の数は多く、また染色性も強く、SCF産生量が上昇していることが考えられた。以上より今回検索し得た7例においては、再生不良性貧血の原因としてc-kit陽性細胞、すなわち幹細胞レベルでのc-kit発現異常が存在し、病態の一因をなすことが示唆された。また、骨髄輸注療法前後の骨髄組織を経時的に検討しているが、症例数が少ないこと、および未だ臨床的効果が現れておらず、検討を重ねていく予定である。CFU-F、CFU-GM、CFU-Eのコロニーアッセイ、検討し得た症例数が少なく、評価できる結果得られなかったが、免疫組織化学と同様、幹細胞の障害が想定される傾向にはあり、今後さらに検討を重ねる予定である。
副甲状腺ホルモンの骨形成促進作用の分子メカニズムに関する戦略的研究

本研究の目的は、PTHの細胞内シグナルの主要経路である二つのG蛋白質であるGαsとGαqによる骨代謝調節機構を、それぞれ骨組織特異的に遺伝子を欠損させた遺伝子操作マウスを用いて独立に解析し、それぞれの関連シグナルを同定すると同時に、GαsとGαqシグナルのバランスによるPTHの骨形成促進作用の分子メカニズムの解明を行った。骨組織特異的なGαsおよびGαq遺伝子欠損マウスを作出し、その骨組織の解析を行い、また各遺伝子欠損マウスにPTHを投与し、その効果の検討を行った。本年度はGαqのコンディショナルノックアウトマウスをCre/loxPシステムを用いて作製した。両蛋白をfloxで挟み込んだターゲティングベクターを構築しfloxマウスを作製した。これによって作出されたfloxマウスを、現在保有する骨芽細胞特異的にCreを発現するI型コラーゲン-Creマウスと交配させて、骨芽細胞特異的conditionalKOマウスを作出した。現在、作出したコンディショナルノックアウトマウスを継体中であり、骨組織の解析ができるよう数を増やしている。また、今まで我々が確立したPTHの骨形成促進作用が認められる骨芽細胞様細胞株(MC3T3E1、ST2等)培養系を用いてPTHシグナルの下流分子の解析を行った。GαsおよびGαqをこれらの骨芽細胞に同時に強制発現させその発現バランスにより、骨芽細胞分化、および破骨細胞形成支持能に差が現れるかを検討した。まずそのためには、効率よく強制発現させるために、恒常的に活性を持つCA-GαsおよびCA-Gαq遺伝子を含むアデノウィルスを作成し、これらを培養細胞に感染させる事により各々のG蛋白の発現量の差で、分化へ影響、あるいは骨吸収の指標となる破骨細胞形成支持能すなわちRANKLの発現への影響があるかどうかを検討した。すると、Gαsを過剰発現させることにより多くの骨形成マーカーが上昇し、また骨吸収誘導能を持つRANKLの発現も亢進していた。一方、Gαqを強制発現させると、骨形成マーカーの発現が低下しており、RANKLの発現も低下していた。以上より、骨芽細胞においては、Gαsシグナルが骨形成、骨吸収への主要なシグナルと考えられたが、一方でGαqシグナルの骨形成抑制作用も確認した。本年度は、Gαqの骨芽細胞特異的コンディショナルノックアウトマウスがCre/loxPシステムを用いて作製され、数も増えたので骨組織の解析を行った。Western blotting法により骨芽細胞特異的コンディショナルノックアウトマウス由来組織でのGαqタンパクの消失を確認したところ、ほとんどの臓器においてGαqタンパクは多く発現していたが、骨組織に於いてはその発現は認められず、骨組織特異的なGαqタンパクの消失が本ノックアウトマウスに於いて確認された。RT-PCR法によるGαq遺伝子の発現も骨組織で有意に低下しており、遺伝子レベルでの骨組織特異的な発現低下も確認された。Gαq骨芽細胞特異的コンディショナルノックアウトマウスは生後問題なく生まれ、外見上正常であった。現在40週齢まで継体中であるが、特にワイルドタイプマウスと生存率に差は無く、また妊娠率もワイルドタイプとの差も無く分娩も正常であった。成長後も同マウスでの成長障害もなく体重、身長共に差は認められなかった。組織学的検討においては、脛骨、大腿骨、頭蓋骨、椎体、肋骨を1,2,4,8,12週齢で検討したが、ワイルドタイプとの組織学的有意差は認められなかった。骨密度測定においても有意な差はなかった。以上より、生理的条件下に於いては骨芽細胞特異的Gαqノックアウトマウスでの有意な表現形は確認されなかった。現在、同マウスに副甲状腺ホルモンを投与し、その骨形性能に差が見られるか検討中である。また骨折モデルを作製し、骨折治癒過程に差が見られるか検討を開始している。細胞系の実験に於いては、引き続き我々が確立したPTHの骨形成促進作用が認められる骨芽細胞様細胞株(MC3T3E1、ST2等)培養系を用いてPTHシグナルの下流分子の解析を行った。Gαsおよびをこれらの骨芽細胞に同時に強制発現させその発現バランスにより、骨芽細胞分化、および破骨細胞形成支持能に差が現れるかを検討した。Gαsを過剰発現させることにより多くの骨形成マーカーが上昇し、また骨吸収誘導能を持つRANKLの発現も亢進していた。今後これらの確立したモデルを用いて、Gene chipの手法を利用しGαqシグナルの下流で発現が上昇するあるいは低下する遺伝子の解析を検討中である。