hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
C型肝炎ウイルスによる発癌機序のの分子生物的解明

我々は宿主側の要因を除外した上で発癌や肝炎活動性を規定するHVC遺伝子領域を同定するために、経済的に異なる病像を呈した症例においてHCV遺伝子全塩基配列の経時的変化を解析した。ALT高値が持続した後にインターフェロン(IFN)治療を受けbiochemical responseを示し、その後再びALTが持続的に上昇した慢性肝炎症例から経時的に血清を採取し、RT-nested PCR法でHCV全遺伝子領域を21のfragmentに分割して増幅後、全塩基配列およびアミノ酸配列を決定した。その結果ALT高値の2時点の遺伝子は1アミノ酸の相違を有するのみであったが、ALT正常時のHCV遺伝子はALT高値時と比較し各18、17アミノ酸の相違を有していた。アミノ酸の相違を有していた。アミノ酸相違はE1領域3個、E2/NS領域4個、NS3領域2個、NS5領域9個であり、特にNS5の後半に集積していたことから肝炎活動性にNS5領域が関与する事が示唆された。活動性肝炎は非活動性肝炎に比較し肝硬変に進行し発癌するため、肝炎の活動性を規定するNS5領域の特定の構造が発癌にも関与する可能性があると考えられ、現在肝細胞癌症例および肝細胞癌非合併症例でのNS5領域を比較解析している。さらにNS5蛋白と相互作用する肝細胞蛋白を同定する目的で、肝炎活動期および非活動期のNS5領域をcloningし正常肝臓組織cDNAライブラリーとともに酵母細胞内に導入し、Two-hybrid法で分析する準備を進めている。一方、癌組織および非癌組織からRNAを抽出し、25種類のarbitary primerと3種類のanchor primerを用いてdifferential display法により解析した結果、両組織で異なる発現パターンを示すmRNAが複数検出された。現在再現性を持って癌に特異的に発現するmRNAを解析している。
機能プロテオミクス、メタボロミクスを利用した大腸菌の機能未知酵素の探索

大腸菌遺伝子のうち約半分は機能未知である。本プロジェクトは、これら機能未知遺伝子産物からプロテオミクス/メタボロミクスの手法を用いて酵素を同定するものである。キャピラリー電気泳動-質量分析装置(CE-MS)を用いたメタボローム解析技術を基盤として、酵素の基質と生成物になる化合物を深索,同定し、酵素機能をスクリーニングする手法を確立した。スクリーニング対象には、触媒ドメインや基質結合部位などの情報から、酵素である可能性が高い大腸菌機能未知タンパク質を選出した。候補タンパク質を精製し、メタボロームと補酵素を添加した溶液中で反応後、タンパク質の添加で特異的に量が変化した化合物を同定した。この手法により、いくつかの新しい酵素活性を見いだした。特に顕著な2つのタンパク質由来の活性を詳しく検証し、キナーゼ(kinase)と酸化還元酵素(dehydrogenase)であることを明らかにした。酸化還元酵素について詳細な特徴解析を行い、機能を明らかにした。対象酵素は、アルデヒド化合物をアルコール性化合物に還元する活性を示し、in vitroでは、NADHを電子供与体としてsuccinic semialdehydeやmethylglyoxalのような短鎖アルデヒド化合物に対する基質特異性を示した。さらにこの新規酵素は、生体内で有害なアルデヒドが蓄積した際の除去機構に働くこと、succinic semialdehydeの代謝経路で機能することが示唆された。プロジェクト期間内に、プロテオミクス/メタボロミクスを基盤とした酵素解析手法を確立し、大腸菌機能未知タンパク質から新規酵素を同定した。本手法は、生物種を問わず利用可能であり、タンパク質機能解析ツールとしての有効的活用が期待される。初年度では、CE-MSならびにCE-TOFMSを用いたメタボローム解析法を基盤としたin vitro酵素機能スクリーニング手法にて、大腸菌機能未知タンパク質から酵素を選出するスクリーニングを実施した。基質選出のためのメタボロームには、yeast extractから調製した化合物を主体に、一般的な酵素反応に必要な補酵素などを補ったプールを用いた。2つの機能未知タンパク質に、用いたメタボロームプールに含まれる化合物を基質とする酵素活性を見出し、特定した基質・生成物化合物とタンパク質のアミノ酸配列からデヒドロゲナーゼおよびキナーゼ活性を持つ酵素と同定した。デヒドロゲナーゼ活性を持つ酵素については、より生理的条件での基質特異性を決定するための詳細な解析を行っている。キナーゼの活性を持つ酵素では、ATP/ADPの変換を検出したが、今回のアッセイ方法では本来の基質・生成物を見つけることができていない。これは、CE-MSで検出できない化合物(中性物質など)を基質とする可能性が高い。このようなケースでは、LC-MSやインフージョンMSの使用が有効と考えられるので、今後使用の導入を検討する。2年目は、in vitroスクリーニングに用いるメタボロームとして、標準試薬から調製するカクテルの使用を検討する。含有化合物数は減る可能性があるが、化合物同定が容易になるので結果として酵素機能同定までの効率が上がると予測している。また、最初に提案したように、酵素の生理的機能の解析には、遺伝子欠損株や過剰発現株のメタボロームプロファイリングが有効と考えられるので、これまでのin vitro解析と並行して実施する。計画のように、メタボライトプロファイリングの手法を基盤として、新たな酵素のスクリーニングを引き続き行った。特に、今年度は初年度のスクリーニングで見つけた新たなデヒドロゲナーゼ活性をもつ酵素について詳細な特徴解析を行い、機能を明らかにした。また、反応は可逆反応であることも確認できた。酵素の生理学的な機能を明らかとするために現在解析を行っている。

これまでに、酵素遺伝子の欠損株、過剰発現、および野生株大腸菌の細胞内メタボロームの比較解析を行い、過剰発現株では酸化ストレス応答に関与する代謝経路やTCAサイクルの代謝物質群に変動が認められている。また、スクリーニンングによる酵素同定の効率を上げるため、対象を絞ったアプローチも開始した。反応を司る酵素が同定されていないにもかかわらず、その反応が起こった場合に生じる代謝物質が大腸菌細胞内に存在する場合、対応する酵素が存在すると推定される。このような"missing enzyme"の候補タンパク質を同じクラスの酵素タンパク質のアミノ酸配列との比較や遺伝子発現データベースから抽出した。これまでの調査で該当した候補タンパク質10個について精製を行い、よりシンプルな組成にしたメタボライト混合物を基質として活性の確認を行っている。
プラズモン超集束を用いた広帯域・高感度金属イオンセンシング

生命にとって有害(Hg, Pb, Cd)/有益(Mg, Na)な金属イオンを高感度に検出することは、生命科学的にもエコロジーの観点からも非常に重要度が高い。本研究では、詳細かつ高感度に様々な金属イオンを検出・分析できる金属イオン吸収センサーを、プラズモン超集束を用いて開発する。プラズモンの感度に多様性を加えた、真に実用的な高感度金属イオンセンシング技術とする。
環境DNA法による土壌微生物動態評価から温暖化に伴う土壌有機炭素の変動要因を探る

土壌中の有機炭素は土壌微生物による分解過程を経てCO2として大気中に放出される。この現象は微生物呼吸と呼ばれ、人間活動に由来するCO2放出量の7-10倍に相当する。温暖化に伴う微生物呼吸量の増加は地球規模の炭素収支に多大な影響を及ぼすため、その予測は重要であるものの、僅かな土壌中に数億個体が存在する土壌微生物の動態を、従来の培養法を用いて把握することは極めて困難であった。本課題では、温暖化操作実験のもと、微生物呼吸が長期に渡って測定されている西日本の森林において、最新の遺伝解析手法である「次世代シーケンサーを活用した環境DNA解析法」を用いて土壌微生物動態を把握することで、温暖化に対して土壌微生物相がどのような応答を示し、結果として微生物呼吸がどう変動するのかといった、一連の微生物呼吸プロセスの解明を行った。西日本の代表的な植生であるアラカシが優占する混交広葉樹林内に設置された10基の大型マルチ自動開閉チャンバー式土壌呼吸測定システムを用いて微生物呼吸を連続測定するとともに、5基を対象に赤外線ヒーターを使用して温暖化環境を人工的に創出することで、温暖化が微生物呼吸に及ぼす影響を把握した結果、従来の報告とは異なり、1日本の森林生態系では、温暖化環境下においても微生物呼吸量の減少をもたらすと考えられる土壌微生物種の消失や土壌微生物量の減少が生じないこと、2一方で二次的な森林においては、土壌微生物種数や土壌微生物量に変化はないものの、温暖化に応じて多様な有機物の分解に関わる放線菌や硝酸菌の出現頻度が増加すること、3これらの傾向は年間を通して生じていることなどが明らかとなった。つまり、こうした日本の森林生態系における土壌微生物相の高い温度耐性と、温暖化に応じた特定の土壌微生物グループの出現頻度の増加が、温暖化効果の長期維持(土壌呼吸量の増加)の要因になっていることなどが示唆された。この現象は微生物呼吸と呼ばれ、人間活動に由来するCO2放出量の約9倍に相当する。本申請課題では、温暖化操作実験のもと、微生物呼吸が長期に渡って測定されている西日本の森林において、最新の遺伝解析手法である「次世代シーケンサーを活用した環境DNA解析法」を用いて土壌微生物動態を把握することで、温暖化に対して土壌微生物相がどのような応答を示し、結果として微生物呼吸がどう変動するのかといった、一連の微生物呼吸プロセスの解明を行うことを目的としたものである。本年度は、西日本の代表的な植生であるアラカシが優占する混交広葉樹林において、10基の大型マルチ自動開閉チャンバー式土壌呼吸測定システムを用いて微生物呼吸を連続測定するとともに、5基を対象に赤外線ヒーターを使用して温暖化環境を人工的に創出することで、温暖化が微生物呼吸に及ぼす影響を把握した。その結果、非温暖化区に較べ、温暖化区において総微生物呼吸量の増加が見られるものの、温暖化区における微生物呼吸の温度反応曲線は非温暖化区に較べ緩やかとなることが明らかとなった。また、次世代シーケンサーを活用して土壌微生物相を把握した結果、温暖化区において多様性の減少が確認できた。15基のチャンバーシステムを用いて、土壌呼吸量を年間を通して安定的に測定するとともに、温暖化に伴う土壌微生物の種組成の変化についても把握することができたため。温暖化に伴う微生物呼吸量の増加は地球規模の炭素収支に多大な影響を及ぼすため、その評価は気候変動の将来予測において重要であるものの、僅かな土壌中に数億個体が存在する土壌微生物の動態(量、種組成および活性等)を、従来の培養法を用いて把握することは極めて困難であった。本研究では、広島県東広島市に設置された大型マルチ自動開閉チャンバー式土壌呼吸測定システムを用いて微生物呼吸を連続測定するとともに、赤外線ヒーターを使用して温暖化環境を人工的に創出した温暖化区(+2.5°C)および非温暖化区からそれぞれ土壌を採取し、次世代シーケンサーを活用した環境DNA解析法を用いて、1土壌微生物の種組成、および2土壌微生物量を評価することで、土壌微生物動態に対する温暖化の影響を評価した。その結果、1日本の森林生態系では、温暖化環境下においても微生物呼吸量の減少をもたらすと考えられる土壌微生物種の消失や土壌微生物量の減少が生じないこと、2土壌微生物種数や土壌微生物量に変化はないものの、温暖化に応じて多様な有機物の分解に関わる放線菌の出現頻度が増加することが明らかとなった。つまり、こうした日本の森林生態系における土壌微生物相の高い温度耐性と、温暖化に応じた特定の土壌微生物グループの出現頻度の増加が、これまで日本の森林生態系で報告されてきた温暖化効果の長期維持(土壌呼吸量の増加)の要因になっていることなどが示唆された。当初の計画通り、温暖化操作実験を実施している広島県東広島市の二次林において調査を行い、最新の遺伝解析技術を用いて、温暖化が微生物呼吸量と強く関係する土壌微生物動態に及ぼす影響を評価した。

これまで欧米の森林生態系で報告されてきた調査結果とは異なり、温暖化環境下においても土壌微生物種の消失や土壌微生物量の減少がなく、微生物呼吸を促す放線菌の出現頻度が増加することが明らかとなり、こうした温暖化に対する微生物の応答が、これまでアジアの森林生態系で報告されてきた温暖化効果の長期維持(土壌呼吸量の増加)の要因になっていることなど、新たな知見を得ることができた。さらに、土壌微生物量や種組成に加え、土壌微生物の活性に関する調査についてもすでに準備を行っており、研究の進捗状況は良好であると言える。土壌中の有機炭素は土壌微生物による分解過程を経てCO2として大気中に放出される。この現象は微生物呼吸と呼ばれ、人間活動に由来するCO2放出量の7-10倍に相当する。温暖化に伴う微生物呼吸量の増加は地球規模の炭素収支に多大な影響を及ぼすため、その予測は重要であるものの、僅かな土壌中に数億個体が存在する土壌微生物の動態を、従来の培養法を用いて把握することは極めて困難であった。本課題では、温暖化操作実験のもと、微生物呼吸が長期に渡って測定されている西日本の森林において、最新の遺伝解析手法である「次世代シーケンサーを活用した環境DNA解析法」を用いて土壌微生物動態を把握することで、温暖化に対して土壌微生物相がどのような応答を示し、結果として微生物呼吸がどう変動するのかといった、一連の微生物呼吸プロセスの解明を行った。西日本の代表的な植生であるアラカシが優占する混交広葉樹林内に設置された10基の大型マルチ自動開閉チャンバー式土壌呼吸測定システムを用いて微生物呼吸を連続測定するとともに、5基を対象に赤外線ヒーターを使用して温暖化環境を人工的に創出することで、温暖化が微生物呼吸に及ぼす影響を把握した結果、従来の報告とは異なり、1日本の森林生態系では、温暖化環境下においても微生物呼吸量の減少をもたらすと考えられる土壌微生物種の消失や土壌微生物量の減少が生じないこと、2一方で二次的な森林においては、土壌微生物種数や土壌微生物量に変化はないものの、温暖化に応じて多様な有機物の分解に関わる放線菌や硝酸菌の出現頻度が増加すること、3これらの傾向は年間を通して生じていることなどが明らかとなった。つまり、こうした日本の森林生態系における土壌微生物相の高い温度耐性と、温暖化に応じた特定の土壌微生物グループの出現頻度の増加が、温暖化効果の長期維持(土壌呼吸量の増加)の要因になっていることなどが示唆された。15基のチャンバーシステムを用いて、今後も継続的に土壌呼吸量を測定し、その経年変化を記録する。平成28年度は、限られた時期に特定のチャンバーを対象に土壌微生物動態の把握を行ったが、平成28年度の解析を通して、安定的に土壌微生物データが取得できることが確認できたことから、来年度はその季節変動を全チャンバーを対象に行っていく。今後は温暖化が土壌微生物量や土壌微生物の種組成に及ぼす影響の評価に加え、土壌微生物の活性に及ぼす影響についても研究を進めていく予定である。これまでブラックボックスとされてきた「温暖化環境下における土壌微生物動態」の解明を通して、森林生態系が将来に渡ってCO2吸収源として機能するのか、あるいは温暖化に伴って土壌有機物分解が促進し、更なる温暖化と微生物呼吸の増加が生じることで放出源へと転換するのか(正のフィードバック効果)といった疑問の解明を試みる予定である。
浅層高分解能反射法によるサイスミックトレンチング

今年度の研究の目的は、千葉大学が所有している震源(小型油圧インパクター)と昨年度の本科学研究費補助金によって購入した地震データ処理マシーン(iXL)によって構築された反射法地震探査システムを現場で実際に運用することによって、システムを完成させることであった。当初、テストサイト候補地としては神奈川県山北町の日向断層を考えたが、同地はノイズレベルが予想以上に高いので放棄し、北海道日高衝突帯、阪神-淡路地域、房総半島南部、中部地方中央構造線、神岡鉱山周辺等で実際の運用を試みた。特に、大鹿村の中央構造線周辺ではかなり大規模な基礎実験を行なった。それらを通じて、サイスミックトレンチングにおける効率的なデータ取得のために、システム上以下の諸点の改良を行なった。第1に、受振点の速やかな測量とそのデータを直ちにデータ処理マシーン(iXL)に入力することがことが重要である。このため、トータルステーションとGPS(ディファレンシャル)を連動させ、結果は直ちにデジタルデータとして入力するシステムを作った。第2に、受振点、発振点が稠密に配置されるために、レコーダと接続するトリガー線を引いて回ると受振ケーブルと絡み合うことが頻繁に起こる。そこで、トリガーを無線でかけるシステムにした。第3に、高角な面(例えば、高角断層)からの反射波を3成分地震計で記録する場合、現場においてオシロスコープでモニターすることが有効であることが明らかになった。そこでポ-タブルオシロスコープを設備備品費によって購入し、レコーダの周辺機器としてを設置した。本年度の主要な実績は以下の3点である。第1に、サイスミックトレンチングのシステムづくりを行なったことである。既に、千葉大学が所有している震源(小型油圧インパクター)と地震データ処理ソフトウェアiXLを活かすために、設備備品費を用いてiXL完全対応の解析装置一式を購入し、システムの中核的装置を揃えた。次いで、各種の探鉱器に対応できるように、小型油圧インパクターのトリガー機能を充実させるとともに、探鉱器のデータ記憶フォーマットと解析ソフトの対応性を拡大できるよう改良を加えた。第2に、このシステムのテストランを大学構内及び山梨県上野原町等で繰り返し実行した。特に、小型油圧インパクターの原型となっている油圧インパクターとの平行実験を行ない、性能評価を行なった。その結果、本システムで深度およそ数100メートルまでの探査が可能であること、小型油圧インパクターも200ヘルツ近い高周波成分を発生させているため、かなりの高分解能を有していることが判明した。小型油圧インパクターの操作性や走行性テストも行ない、バックで登坂するなら20度以上の傾斜でも可能なように改良した。また、小型油圧インパクターの繰り返し作動実験を通じて適切な油圧を定めるとともに、ショック緩和材としてのアンビルを新たに用いるなどの改良を施した。第3に、次年度(平成7年度)におけるサイスミックトレンチングのテストサイトとして適切な場所を選ぶ作業を行なった。候補地としては神奈川県山北町の日向断層が最適であるとの結論に達した。

このため、トータルステーションとGPS(ディファレンシャル)を連動させ、結果は直ちにデジタルデータとして入力するシステムを作った。第2に、受振点、発振点が稠密に配置させるために、レコーダと接続するトリガー線を引いて回ると受振ケーブルと絡み合うことが頻繁に起こる。そこで、トリガーを無線でかけるシステムにした。第3に、高角な面(例えば、高角断層)からの反射波を3成分地震計で記録する場合、現場においてオシロスコープでモニターすることが有効であることが明らかになった。そこでポ-タブルオシロスコープを設備備品費によって購入し、レコーダの周辺機器としてを設置した。
細胞自律的な軸索投射メカニズムの解明

神経系が伝導路を形成し回路を成立させる際には、軸索が正確な経路を移動し、対象領域に投射する必要がある。これまで対象領域の目印として軸索ガイダンス分子の濃度勾配が考えられてきたが、実際にそのような濃度勾配が観察されたことはない。その理由は、ガイダンス分子の分泌メカニズムを直接捉えられないことであったが、申請者は軸索ガイダンス分子Bone morphogenic proteins (BMPs)の機能解析をおこない、その分泌現象を可視化することに成功した。本研究ではこの研究を発展させ、長距離投射をおこなう神経回路に着目し、軸索ガイダンス分子による神経回路形成メカニズムを明らかにする。
染色体の構造と挙動の分子生物学的アプロ-チ

本研究は当該研究課題の分野における重点研究領域の成立を目指して、総合的に研究活動を行なってきた。その結果申請研究課題「染色体構造と挙動の分子生物学的アプロ-チ」(略称:染色体構造)が平成二年度より三年間重点領域研究分野として認められた。本研究分野のわが国における急速な発展を可能にならしめるための、展開、方策、研究組織の運営などについて、充分な協議を行なってきた。まず、研究代表者と研究分担者のうち三人の幹事が数回にわたって、充分な討議、連絡のための会合を開いた。その結果班会議と講演会を平成元年9月26日に京都において開催することとした。講演会は大変盛況でこの分野に対する関心の高さがうかがえた。講演者名と講演題目のタイトルを以下に挙げる。柳田充弘(京大・理);「染色体研究の展開」、水野重樹(東北大・農);「染色体の凝縮ドメインの構築」、米田悦啓(阪大・細胞工センタ-);「細胞核へのタンパク質輸送機講」、勝木元也(東海大・医);「マウス染色体への外来遺伝子の導入」、本庶佑(京大・医);「ヒト免疫グロブリン遺伝子の構成」、西本毅治(九大・医);「染色体凝縮開始の抑制遺伝子RCC1」、黒岩常祥(東大・理);「オルガネラ染色体の分配機構」、京極好正(阪大・蛋白研);「タンパク質核酸相互作用の構造研究」、松原謙一(阪大・細胞工センタ-);「ヒトゲノムにおけるレトロウイルス」。約25人が参加して行われた班会議では、当該領域を三つのグル-プに分けて推進することが承認された。すなわち「人口染色体とゲノム解析」、「分子構築」、「細胞周期における動態」である。これらの分野は今後数年間において急速な発展が見込まれる。重点領域の予定計画班員のメンバ-構成についても充分な討論が行なわれた。また、公募研究の重視についても確認が行なわれた。平成二年度二月福岡において行なわれたワ-クショップ「細胞周期における染色体ダイナミックス」をサポ-トした。極めて活気に溢れる会合で若手研究者の活躍とともに、この分野のレベルの高さと今後の発展に強い期待を抱かせるのに充分であった。
地域住民を主体とした災害対応体制の開発に関する研究－地域住民の災害エンパワメント

地域住民を主体とした災害対応体制に関する日米研究であり、米国ではカリフォルニア州、ニューヨーク州、ワシントンDCの緊急事態管理局、コミュニティ緊急事態対応チーム(CERT)を中心に調査した。また、サンフランシスコ、ニューヨークよりCERT関係者を招聘し、東京都港区で地域防災セミナーを開催し、参加者に防災意識アンケート調査を行った。本研究により、地域コミュニティ防災では地方自治体に加え中央政府にも重要な役割があること、住民は地域特有の災害への対応力に加え全国基準の共通な災害知識とスキルを備えるべきであること、ボランティアの専門性に応じたボランティア事前登録制度が必要であることなどの知見を得た。本研究は、日本の地域住民の災害対応力を高め、住民を主体とした災害対応体制の開発に向けた提言を目的とするが、これまでにこの目的に向けて以下を実践した。第一に、文献研究を行い、災害の国際的な動向、災害管理、住民が主体となる米国のコミュニティ緊急事態対応チーム(CERT)に関する先行研究、概念、動向を分析し整理した。その成果を東京都港区自治体の関係者に講義し、今後調査が必要な事項を確認した。また、これらの成果をまとめた論文「災害、災害管理、米国コミュニティ緊急事態対応チームについての研究」が、研究所年報に掲載された。第二に、米国カリフォルニア州サンフランシスコ市およびロサンジェルス市で緊急事態管理局や消防局の災害担当者、ソーシャルワーカーに、各市の災害管理とCERTについて聞き取り調査を実施した。そこでの知見を、港区の住民を対象とした区民ワークショップで講演し、同区のシニア層を対象とした生涯学習大学でも講義を行った。第三に、2014年7月に港区で、米国のサンフランシスコ市およびニューヨーク市よりCERT指導員とCERTのリーダーおよびサブリーダーを務める住民を招聘してセミナーを開催する予定で、港区の自治体および米国の関係者と調整を進めている。同セミナーは、港区の自治体、町内会や自治会を含めた地域住民、災害関係者を対象に、米国のCERTを中心に、地域住民を主体とした災害対応体制の在り方を考えることを趣旨とする。セミナーに加え、CERT招聘者と自治体や住民などとの小規模研究会も実施の予定である。以上のように、本研究は、米国から日本への招聘を伴う国際研究であること、港区をフィールドとして地域防災モデルを検討すること、成果を論文にまとめて発表するにとどまらず、自治体、災害関係者、地域住民の参画とネットワーキングも取り入れ実質的な活動を含んだ研究であることに意義があるといえる。平成26年度は、前年度の研究成果をもとに、米国サンフランシスコ市のNERTプログラム・コーディネーター(NERT指導員)とニューヨーク市のCERTチーム・チーフおよびデュプティ・チーフ3名を招聘し、7月に東京都港区で地域住民を対象とした地域防災セミナーを開催した。セミナーに加え、米国のNERTおよびCERT招聘者、港区自治体、自主防災組織や自治会などに所属する地域住民との災害対応研究会を実施した。また、港区の地域住民を対象に、災害意識および災害への備えに関する量的調査を実行した。本研究は、米国の地域住民を主体とした災害対応体制を学び、日本の文化や実情に合わせて住民を主軸とした日本の災害対応体制の強化につなげていくことを目的とすることから、研究計画には研究成果を発表することのみにとどまらず、実際の災害対応活動に結びつけていく努力も含めている。今年度の研究過程のなかで、港区自治体より、住民参加型の災害対応開発事業のアドバイザーに任命された。本研究は、地域住民を主体とした災害対応体制のあり方について、米国の事例を基に研究することを目的とするが、平成25年度から26年度までは自然災害に対する地域住民の対応について調査を進めてきた。平成26年には米国からコミュニティ緊急事態対応チーム(CERTおよびNERT)の専門家を招聘し、東京都港区で住民を対象としたセミナーを開催した。昨今、海外ではテロ活動が活発化し、世界情勢が変化していることから、平成27年度は、人災すなわちテロに対する地域住民の備えを中心に調査活動を行った。その一環として、米国同時多発テロの現場となったニューヨーク州で非常時緊急対策局、コミュニティ緊急事態対応チーム南ハーレム支部、自治体国際化協会ニューヨーク事務所、ワシントンD.C.のServe DCで、両地域の住民がテロなどの人災にどのように備えているかについて調査した。聞き取り調査では、テロ活動への備えとして地域住民に可能なことは少ないが、不審者・不審物に関する住民による通報の増加、通報によって未然に防止されているケース、またテロ以前に銃乱射など銃社会であるアメリカが抱える特有の国内問題について知見を得た。これまでの研究成果は、東京都港区の住民および大学生を対象とした防災ボランティア養成講座、同区の住民参画によるたかなわ地域防災研究事業、同地域のシニア世代リーダーを養成するチャレンジコミュニティ大学において発表し、地域住民による災害対応の開発に活かしている。日本では東海、東南海、南海地震、南海トラフ巨大震災、首都直下地震など、今後も巨大地震が予測され、災害対策の強化が急務となっていることから、研究期間を通して地域住民を主体とした自助・共助による災害エンパワメント、すなわち災害対応力の向上に働きかけることを急いだ。この研究を通して得られた知見を、今後は学術的な発表を通し、港区外への普及も計っていく。

本研究により、地域コミュニティ防災では地方自治体に加え中央政府にも重要な役割があること、住民は地域特有の災害への対応力に加え全国基準の共通な災害知識とスキルを備えるべきであること、ボランティアの専門性に応じたボランティア事前登録制度が必要であることなどの知見を得た。平成26年度に東京都港区で地域住民の災害意識および災害への備えに関する量的調査を実施したが、データ入力に時間を要し、データ分析を平成27年度に持ち越す予定である。社会福祉平成27年度は、前年度の量的調査データの入力作業を完了し、データを解析して論文にまとめる。また、これまでは自然災害への住民対応について研究を進めてきたが、次年度は人災への対応についても研究を行う予定で、結果を研究論文にまとめて発表する。さらに、港区自治体と地域住民(自主防災組織、町内会、学生)とともに、住民向けの災害対応活動を開発するための検討会を進め、研究成果を実践につなげていく。また、論文や学会での発表により、研究成果の全国的普及を目指していく。実施日程に変更はあるものの、関係者の積極的な協力を得て、ほぼ研究計画通りに進ちょくしている。これまで自然災害への住民対応について研究を進めてきたが、世界情勢の新たな展開から、人災への対応を含めて研究することの重要性が生じた。米国の地域住民は自然災害に加え、人災に対してどのような備えを行っているのかについても研究に含める。研究実績の概要に記載した通り、2014年7月に米国の関係者を招聘して地域災害体制を検討するセミナーを開催する予定であるが、このセミナーでは、参加者を対象に、災害対応に関する調査も実施する計画である。今後、同セミナーの開催準備に加え、この調査で活用する質問票を作成する。2014年度後半は、この調査で収集したデータの整理・解析、CERT招聘者と港区関係者との研究会の成果の整理・解析を行い、研究論文にまとめ、学会で発表する予定である。米国で人災への備えに対して聞き取り調査を行う計画である。本研究は米国との国際研究であり、2013年度に米国からの研究者の招聘を予定していたが、招聘に至るまでの事前研究と準備に時間を要したため、招聘を2014年度に実施することとした。そのため、2013年度の計画を2014年度に持ち越した。2014年度に、2013年度に計画していた米国からの研究者を招聘して日本でセミナーおよび研究会を開催するが、その招聘に必要な費用として、旅費および謝金を2014年度に支出する計画で、その費用に当該年度と翌年度の助成を合算して充当する。
γ鎖/RAG2ダブルノックアウトマウスを用いた新しい癌特異的免疫反応評価法の確立

癌特異的免疫療法は再び注目されだしている。効果とともに副作用が少ないことが利点としてあげられるが、癌特異抗原の同定とその抗原に対する免疫応答の個人差を見極めなければならない。我々は、リンパ球の全くない人工的な免疫不全マウスを樹立して、そのマウスにヒトリンパ球を導入し、その中で癌特異的抗原に対する免疫反応を検討するシステムの確立を目指している。本年度は、免疫不全マウスにヒトリンパ球を導入して、リンパ球の生着状態を観察した。その結果、導入したリンパ球は数ヶ月の間マウス生体内で生存しうることを認めた。生存期間は、導入するリンパ球の提供者により大きく異なった。この差が組織適合抗原によるものかどうか調べるために、HLAのタイピングを行った。なお、8月31日付で人事異動により八王子医療刑務所に出向となったため、研究費返還手続きをした。
白癬菌の角層寄生における蛋白分解酵素の発現の研究

まず、外来白癬患者から、Trichophyton rubrum、Trichophyton mentagrophytes、Microsporum canisの3菌種を分離した。次に、これらの菌種にケラチナーゼを多量に産生させる培地を検討した。1)ヒト毛髪加低栄養液体培地:これは、ヒト毛髪を凍結乾燥し、その粉末を、ごく微量の炭素源のみ含む培地に混和したものである。これには、M.canisは旺盛な発育を示したが、T.mentagrophytes、T.rubrumはほとんど発育しなかった。2)ヒト角層加低栄養液体培地:これは、ヒト足底の角層をカミソリの刃で採取し、ブレンダーで粉砕し、それを1)と同様のごく微量の炭素源を含む培地に混和したものである。この培地にはT.rubrum、T.mentagrophytes、M.canisとも旺盛な発育を示した。菌種による異なる基質に対する発育の違いは、それぞれの菌種のもつケラチナーゼの特性によるものと思われる。次に、各々の培地につき、ヒト毛髪およびヒト角層を加える濃度を変えながら、どの濃度で最も菌の発育が良いかを検討した。その結果、毛髪でも角層でも、20%の濃度で加えると発育が旺盛であることがわかった。これ以上濃度を増すと発育はかえって抑制された。現在、これらの培地の培養濾液から、ケラチナーゼの抽出を試みているが、ヒト毛髪、ヒト角層ともかなりのcontaminationがあり、より多くのケラチナーゼの収量が得られるように検討を重ねているところである。
結核菌のハイブリッドエピトープ長鎖ペプチドを用いた新規ナノ粒子ワクチンの開発

さらに細胞内寄生感染症のモデルであるリステリアのlongepitopeをPLGAに結合し、BMDCへパルスしマウスへ皮下注射したところ、脾臓におけるリステリア特異的なリンパ球増殖とインターフェロンγ産生を認めた。加えてlong epitope+PLGAをパルスしたBMDCをマウスへ皮下注射したところ、リステリア感染マウスでの脾臓での菌量低下を確認した。Long epitope + PLGAによる明らかな副作用は出現しなかった。また、蛍光標識したPLGAをin vitroにてBMDCと2時間反応させたところ、蛍光顕微鏡にてBMDCの食胞内のエンドゾーム/ライソゾームと共に存在するPLGAを確認した。以上の結果から、long epitope + PLGAによるワクチン療法は、安全かつ有効な新規ワクチンとしての利用が期待できると考えられた。PLGAとロングエピトープによるBMDCクロスプレゼンテーション能への増強作用が確認でき、概ね予想どおりの結果が得られている。細胞内寄生感染症におけるワクチン療法として、その効果が期待できると思われる。今後はPLGAとロングエピトープによるBMDCクロスプレゼンテーション能への増強作用のメカニズムを解明する予定である。特にin vivoにおいて、皮下注射したBMDCや蛍光標識したPLGAおよび抗原がどのようにリンパ節へ移動するのか、更にどの細胞がリンパ節での抗原提示に関与するのかについて、フローサイトメトリーにより確認する予定である。PLGAによるクロスプレゼンテーション能の増強効果およびH/K-HELPとTh細胞を用いたCTL増殖能の増強効果をin vitroにおいて確認できた。今後は以下に記載の研究項目に沿って研究を実施する予定である。1PLGAによりコートされたCTLエピトープを作成し、BMDCへパルスする。このBMDCをマウスへ静注あるいは皮下注し、OVA特異的なCTLの誘導能をテトラマーおよびリンパ球増殖試験、インターフェロンγ産生量などにより確認する。2OVAと比較し抗原性の高いリステリア菌のCTLエピトープを利用する。上記1の実験と同様に、PLGAによりコートされたCTLエピトープを作成し、BMDCへパルスする。上記の研究計画の実施に当たり、マウス骨髄由来樹状細胞(DC)を作成するためwild typeのC57/BL6マウスを購入する必要がある。また、DC作成、培養のためにサイトカイン(GM-CSF, IL-4)やFCSも購入する必要がある。さらにナノ粒子(PLGA)や細胞障害性T細胞を定量するテトラマー、およびリンパ球増殖試験用のCFSE、フローサイトメトリー用の各種抗体なども購入予定である。
キラル環状ハロニウムの創製による新しい不斉合成法の開発

キラルな三員環状ハロニウムの創製とこれを経由する新しい不斉合成の開拓を目的として、まず、安定なキラルヨードニウム塩を形成させるための試薬の開発を検討した。さらに、不斉誘起が期待できるモデル反応を設計した。1)キラル環状ヨードニウムの創出前年度で設計、合成したピリジンビスイミダゾリン系化合物にN-ヨードスクシンイミドを作用させ系内でキラルヨードニウムを発生させることに成功した。単離には至っていないが、各種スペクトルによりその生成を確認することができた。また、新たなヨードニウム源として、次亜塩素酸tert-ブチルとヨウ化ナトリウムから次亜ヨウ素酸tert-ブチルが発生することを明らかにし、これを活用するアルケニルスルホンアミドからの新しいヘテロ環合成法を見出した。この反応は、発生した次亜ヨウ素酸tert-ブチルが、まずアミド窒素をヨウ素化し、続いてこの窒素上のヨウ素がカチオンとしてアルケン部位に移動することが鍵となり、進行しているということが、裏づけ実験により明らかになった。そこで、キラルなスルホンアミドを合成し、次亜ヨウ素酸tert-ブチルでアミド窒素をヨウ素化すれば、キラルヨードニウムが創製できると考えた。環状スルホンアミドの窒素のα位にシクロヘキシル基とメチル基を導入した光学活性な化合物を合成することができた。2)不斉誘起可能なモデル反応の設計上記の活性なヨウ素-窒素結合をもつキラルヨードニウム源を活用する不斉反応のモデル反応として、アルケニルベンズアミドの環化反応を取り上げた。これは先に述べた次亜ヨウ素酸tert-ブチルにより進行する反応であることが明らかになったため、本キラルヨードニウム源を用いる反応に適用した。その結果、芳しい不斉誘起は認められなかったが、さらに分子設計を進めることにより、その効率の向上が十分に期待できる。新しい概念に基づくキラルヨードニウム塩の開発を以下の戦略に従って精力的に研究を進めた。まず、安定なキラルヨードニウム塩を形成させるための試薬の開発として、窒素-ヨウ素結合を有する物質の発生法ならびに反応特性を詳細に検討した。次に、新規にデザインしたピリジンビスイミダゾリン系配位子の合成を行い、環状ヨードニウム中間体を形成しうる不斉環境場をもつスペクトル的に解析した。1)クロラミンTとヨードオレフィンとの反応による環状ヨードニウム中間体の確認クロラミンTとヨードオレフィンをアセトニトリル中室温で撹拌したところ立体選択的にピロリジン誘導体が生成することが判った。この反応の経路を検討したところ、窒素-塩素結合がヨウ化ナトリウムにより還元され、窒素-ヨウ素結合が形成された後にオレフィンに付加し、環状ヨードニウムが発生し、環化反応が進行したと考えられる。この結果は、アミドのような電子不足窒素に容易にヨウ素が結合し、高い反応性を有していることを示した。2)キラルN-ヨード化合物の合成と解析ピリジンビスイミダゾリン系の窒素配位子を新規に設計・合成し、1)で明らかにした手法を用いて、窒素-ヨウ素結合を形成させることに成功した。この物質の^1H-NMRを測定したところ、各水素のケミカルシフトの変化により、確かに生成していることが判った。
四重N-混乱オクタフィリンの合成と機能

1.N-混乱オリゴピロールの合成法の確立混乱ピロールを任意の位置に組み込んだ、混乱ジピロメタン、混乱トリピラン、混乱テトラピロール(ビラン)、混乱ペンタピロール、混乱ヘキサピロールを系統的に合成することに成功した。計算化学を用いて二重混乱ビランの安定構造を検討した結果、混乱位置により、分子の立体構造が大きく異なることが判明し、その後の環化反応に用いるオリゴピロールに対する構造要件が明らかとなった。2.4重N-混乱オクタフィリンの合成計算化学を用いて、種々の混乱型オクタフィリンについて構造最適化を試みたところ、2種類の混乱位置の異なる四重N-混乱オクタフィリンが正四角形、長方形の平面型構造を取り得る事が判明した。【4+4】及び【5+3】のオリゴピロール同士のカップリング反応を試みたところ、いずれも、オクタフィリンに相当するマスピークを反応混合物中に確認した。しかし、シリカゲルカラムグラフィーにより生成物の単離を行う最中に徐々に酸化され、オキソ化された化合物に変換されることが明らかとなった。生成物の最終確認には至らなかった。3.一重N-混乱ヘキサフィリン複核金属錯体の合成一重N-混乱ヘキサフィリンがパイ共役多核金属錯体の一般配位子として機能しうることを、金及び白金錯体を用いて明らかにした。特に金属の種類、価数が異なる複核錯体を合成しうることから、混乱ヘキサフィリンの汎用性を示すことに成功した。1)任意の位置に任意の数の混乱ピロールを配置した多重N-混乱ポルフィリノイドを合成する目的で、中間体となる、ピロール二量体(ジピロメタン)、三量体(トリピラン)、四量体(ビラン)、五量体を合成した。特に、立体障害の大きなトリイソプロピルシリル(Tips)基でピロール窒素を保護して、α-位の反応性を下げたモノピロールを活用してアシル化とカップリングにより、10数種類に及ぶ混乱型オリゴピロール化合物の効率的な合成に成功した。2)四重N-混乱オクタフィリン合成の前段階として、多重混乱ヘキサフィリンの合成を行い、金属錯化の際に起こる混乱ピロールのオキソ化の反応性を検討した。その結果、混乱ピロールの数が増すにつれ、酸化が容易に進行することが明らかとなった。3)計算化学を用いて、種々の混乱型オクタフィリンについて構造最適化を試みたところ、二重N-混乱型では、8の字型構造が安定であるのに対して、2種類の混乱位置の異なる四重N-混乱オクタフィリンでは正四角形、長方形の平面型構造を取り得る事が判明した。[4+4]型の環化条件では反応がうまく進行しなく、オリゴマー形成に留まる事が明らかとなったので、二重N-混乱オクタフィリンの合成に用いた[5+3]型の環化条件を適用した。その結果、四重N-混乱オクタフィリン骨格は合成は各にオンされたが、質量分析の結果、オキソ化が逐次的に進行した化合物が安定に得られて来ることが明らかとなった。
両生類脳組織の糖脂質の構造とそれらの生理活性性

ガングリオシドは動物の神経系に多く含有されており、それらは神経機能発現のための基本的な化学物質であると考えられている。本研究では、ウシガエル(Rana catesbeiana)の脳組織からセレブロシドとガングリオシドを単離し、各種スペクトルに基づいて、構造決定した。セレブロシドは、セラミド部分の構造の類似性に基づいて、スフィンゴシン型とデヒドロスフィンゴシン型に分類された。またガングリオシドについては、先に報告した主成分である3種の他に、新たに3種類の微量ガングリオシドを単離し、その構造を明らかにした。また、イモリ(Triturus pyrrhogaster)の脳組織から主成分であるガングリオシドとともに、4種類の微量ガングリオシドを単離した。これらの結果をもとに、無尾両生類(カエル)と有尾両性類(イモリ)の脳組織の糖脂質構造の差違を明確にした。その結果、ウシガエルとイモリの脳組織には同じガングリオシドが含まれているが、成分比は両生体間で大きな違いがあることがわかった。動物の神経系におけるガングリオシドの生理的役割を解明する一環として、カエルの脳組織より単離したガングリオシドの金属イオンに対するイオン輸送活性を調べた。その結果、ガングリオシドはいずれもNa^+およびK^+を輸送するが、Ca^<2+>に対しては輸送活性を示さなかった。さらに、K^+に対する輸送活性は、Na^+に対する活性より約50倍高いことがわかった。また、この輸送においては糖鎖部分の構造が重要な因子であることが明らかとなった。今後、様々な糖鎖をもつガングリオシドについてイオン輸送機能を調べ、Na^+およびK^+イオンの輸送機構と糖鎖構造との関係を究明することが重要と考えられる。1.脳ガングリオシドーウシガエル(Rana catesbeiana)の脳組織より、3種の微量ガングリオシド(1)(3)を単離した。新規モノシアロガングリオシド(1)は、その(-)ーFABーMSおよび^1H NMRスペクトル並びに1の完全メチル化誘導体の(+)ーSIMSスペクトルにより、構造式1と決定された。一方、ガングリオシド(2)と(3)は、標品のスペクトルとの比較により、G_<D1a>およびG_<T1a>とそれぞれ同定された。モノシアロガングリオシド(1)は、同種のカエルの脳組織中に存在する3種の主成分ガングリオシドにみられたと同様に、αーNeuAcー(2→6)ー0ーGalNAcという部分構造を持っていた。この様な構造は、他の動物種の脳ガングリオシドにはみられない、カエルに特有の構造である。2.脳セレブロシドーウシガエルの脳組織より、12種のセレブロシドを単離した。これらは、いずれもβーDーGalactopyranosyl ceramideであった。セラミド部分の絶対構造を、主にCDスペクトルと1,2ーdibenzoate chirality法の適用により解明した。セラミドを構成する脂肪酸と長鎖塩基のうち、脂肪酸は(2R)ー2ーhydroxyfatty acidであることを決定した。一方、長鎖塩基は、(2S,3R,4E)ー2ーaminooctadecー4ーenー1,3ーdiolと(2S,3R)ー2ーaminooctadecaneー1,3ーdiolと決定された。カエルの脳セレブロシドの絶対構造を決定したのは、これが最初である。1.ウシガエルの脳ガングリオシドの構造ー

ウシガエル(Rana catesbe)の脳組織より,3種類の主成分ガングリオシド,(Rー3),(Rー5)および(Rー6),とともに,新たに3種類の微量ガングリオシド(Rー1),(Rー2)および(Rー4)を単離した。新規ガングリオシド(Rー1)は,その(ー)ーFABMSおよび^1H NMRスペクトル並びに完全メチル化物の(+)ーSIMSスペクトルから,構造式(Rー1)と決定された。一方,ガングリオシド(Rー2)および(Rー4)は,G_<Dla>およびG_<Tla>とそれぞれ同定された。次に,脳ガングリオシドのセラミド部分を構成している脂肪酸と長鎖塩基のうち長鎖塩基部分の絶対構造を決定した。脳セレブロシドの場合と同様な方法により脳ガングリオシドを処理し,長鎖塩基のベンゾエ-ト・ベンズアミド誘導体を得た。この誘導体のIR,MSおよびCDスペクトルから,長鎖塩基は,(2S,3R,4E)の絶対構造をもつことがわかった。2.イモリの脳ガングリオシドの構造イモリ(Triturus pyrrhogaster)の脳組織より,5種類のガングリオシド(Tー1)(Tー5)を単離した。それらは,諸スペクトルの比較により,それぞれ,(Rー1),G_<Dla>,(Rー3),(Rー5)および(Rー6)と同定された。さらに,ウシガエルでは(Rー3),(Rー5)および(Rー6)が主成分であるのに対し,イモリではG_<Dla>(Tー2)が主成分であることがわかった。神経細胞中におけるガングリオシドの生理的役割を解明する目的で、ウシガエルの脳ガングリオシド金属イオンに対するイオン輸送活性を調べた。イオン輸送活性は、透析膜によるイオン輸送能測定装置を用いて調べた。供給相としては金属塩化物の1M脱イオン水溶液を用い、受容相としては脱イオン水を用いた。有機相は試料をCHCl_3-Octanol(1:1,v/v)の混合溶媒に溶かして調製した(濃度:0.068mM)。受容相側へ輸送される金属イオンを1時間ごと5時間にわたって黒鉛炉原子吸光法を用いて分析・定量した。ガングリオシドのNa^+,K^+およびCa^<2+>に対するイオン輸送活性を調べたところ,ガングリオシドはNa^+およびK^+を輸送するが、Ca^<2+>に対しては輸送活性を示さなかった。さらに、K^+に対する輸送活性は、Na^+に対する活性より約50倍高いことがわかった。一方,コントールにおいては、実験に使用した全ての金属イオンについて輸送活性は認められなかった。以上の結果より,ガングリオシドはK^+イオンを選択的に輸送し、さらにこの輸送においては糖鎖部分の構造が重要な因子であることが明らかとなった。今後、様々な糖鎖をもつガングリオシドについてイオン輸送機能を調べ、Na^+およびK^+イオンの輸送機構と糖鎖構造との関係を究明することが重要と考えられる。
気管模型の中の流れの観察(巧妙なガス交換機構の解明)

ヒトの気管は、20回にも及ぶ分岐を経て肺胞に至る複雑な管路系から成り、巧妙なガス交換を行っている。本研究では、第1分岐部と第2分岐部を有するヒトの気管模型を透明な樹脂で製作し、模型内の呼気流れおよび吸気流れについて可視化実験(レイノルズ数Re=5004000)を行った。模型内の流路は、工業上多用される曲がり管路に比して、分岐までの距離が著しく短く、気管特有の曲率と分岐部の断面形状を有するが、気管模型内の呼気および吸気流れにも、異なった形態の複数本の「縦渦」(管軸方向に軸を持つ渦)を伴う二次流れが誘起され、これらの縦渦の形態が、管路内の「呼気」及び「吸気」の基本的な流れを特徴付けることが分かった。そして、これらの縦渦の生成は、管路の曲率にもとづく遠心力の影響に加えて、気管内特有の生成機構が存在し、気管内流の速度分布、エネルギー散逸、及び流れの混合機構に著しい影響を及ぼすことが明らかにされた。主要な実験結果は、次のようである。1.呼気合流部におけるよどみ点で、流れの方向が急変し、縦渦を生成する渦度の主流方向成分が生ずる。さらに、呼気合流部のよどみ点上流に小さなはく離渦が形成される。Re<3000の場合には、このはく離渦から、下流の縦渦(管路の曲率の影響で生成される)に渦度が供給される。Re>3000の場合には、このはく離渦から供給される渦度は新たな縦渦を形成する。2.吸気分岐部先端近くに首飾り渦に似た2組の縦渦が形成され、この渦が上流の縦渦の変形と連成を促し、下流の管路に新たな縦渦群を構成する。3.これらの縦渦の生成によって、管路断面内のエネルギー散逸が増大するが、流体要素の伸張と曲折をもたらし、組織的かつ効率的な流体の混合を促すと考えられる。ヒトの気管は、20回にも及ぶ分岐を経て肺胞に至る複雑な管路系からなり、巧妙なガス交換を行っている。本研究では、第1分岐部と第2分岐部を有するヒトの気管支模型を透明な樹脂で製作し、模型内の呼気流れおよび吸気流れについて可視化実験(レイノルズ数Re=5004000)を行った。模型内の流路は、分岐までの距離が短く、気管特有の曲率と分岐部の断面形状を有し、工業上多用される曲がり管路や分岐管路とは著しく異なる。気管模型内の流れには、呼気流の場合も吸気流の場合も、二次的に流れが誘起され、それぞれ異なった形態の複数本の「縦渦」(管軸方向の軸を持つ渦)を伴う複雑な流れになることが分かった。これらの縦渦の形態が、管路内の「呼気」及び「吸気」の基本的な流れを特徴付けることを明らかにし、これらの縦渦の生成機構を明らかにした。そして、この縦渦の生成が管内流の速度分布、エネルギー散逸、及び流れの混同機構に及ぼす影響について考察した。Daughter-Tube内の縦渦の生成は、管路の曲率にもとづく遠心力の影響に加えて、下記のような気管内特有の生成機構が存在する。1.呼気合流部におけるよどみ点で、流れの方向が急変し、縦渦を生成する過度の主流方向成分が生ずる。Re<3000の場合には、このはく離渦から、下流の縦渦(管路の曲率の影響で生成される)に過度が供給される。Re>3000の場合には、このはく離渦から供給される過度は新たな縦渦を形成する。2.吸気分岐部先端近くに首飾り渦に似た2組の渦が形成され、この渦が上流の縦渦の変形と連成を促し、下流の管路荷新たな縦渦群を構成する。これらの縦渦の生成は、流体要素の伸張と曲折をもたらし、断面内のエネルギー散逸が増大するが、組織的かつ効率的な流体の混合を促す。

さらに、呼気合流部のよどみ点上流に小さなはく離渦が形成される。Re<3000の場合には、このはく離渦から、下流の縦渦(管路の曲率の影響で生成される)に渦度が供給される。Re>3000の場合には、このはく離渦から供給される渦度は新たな縦渦を形成する。2.吸気分岐部先端近くに首飾り渦に似た2組の縦渦が形成され、この渦が上流の縦渦の変形と連成を促し、下流の管路に新たな縦渦群を構成する。3.これらの縦渦の生成によって、管路断面内のエネルギー散逸が増大するが、流体要素の伸張と曲折をもたらし、組織的かつ効率的な流体の混合を促すと考えられる。
分子シャペロンやATP依存性プロテアーゼにより認識されるσ^<32>上の構造の同定

分子シャペロンやATP依存性プロテアーゼは進化の過程でよく保存されたタンパク質であり、細胞内のタンパク質のクオリティコントロールを担っている。大腸菌の転写開始因子の一つであるσ^<32>は、転写開始因子としての活性を持つ正常に折り畳まれた状態で、複数の分子シャペロンやATP依存性プロテアーゼに認識されるという非常にユニークな性質を持つ。σ^<32>は半減期約1分と細胞内で素早く分解されるタンパク質であり、複数のATP依存性プロテアーゼや分子シャペロンがσ^<32>の分解に必要とされる。したがって、細胞内で分解されにくくなった変異型σ^<32>は分子シャペロンやATP依存性プロテアーゼの認識結合部位の構造が変化したと考えられ、そのような変異型σ^<32>を分離すれば、分子シャペロンやATP依存性プロテアーゼの基質認識機構を比較検討するための有力な材料となることが期待される。σ^<32>をコードするrpoH遺伝子にランダムに変異を導入することにより、細胞内で安定化する変異型σ^<32>を多数分離した。このうちの3つの変異型σ^<32>は、47番目から55番目の間のアミノ酸残基に変異を持っていた。野生型と比較して、47番目のロイシンと55番目のロイシンが同時にグルタミンに置換した変異型σ^<32>は10倍以上、50番目のアラニンがセリンに置換した変異型σ^<32>は約5倍、54番目のイソロイシンがアラニンに置換した変異型σ^<32>は約10倍安定化した。さらに、同じ変異によりσ^<32>の転写開始因子としての活性が、野生型と比較してかなり上昇することが観察された。以上のことは、47番目から55番目のいくつかのアミノ酸残基は、σ^<32>の素早い分解に必要とされるだけでなく、σ^<32>の活性調節にも必要とされることを示しており、この領域が分子シャペロンの認識結合部位であることを示唆する。分子シャペロンやATP依存性プロテアーゼは、進化の過程で保存された蛋白質である。大腸菌熱ショック転写因子σ^<32>は、細胞内において半減期約1分で素早く分解される。この素早い分解には、複数の分子シャペロンやATP依存性プロテアーゼが必要とされる。本研究の目的は、安定変異型σ^<32>の分離、変異部位の同定、in vitro解析を通して、分子シャペロンやATP依存性プロテアーゼが認識する基質蛋白質上の構造を明らかにすることである。細胞内で安定化する変異型σ^<32>を、レポーター遺伝子を用いて転写活性を指標に分離を試みた。一次スクリーニングとして、変異を導入したrpoH遺伝子(σ^<32>をコードする遺伝子)を持つプラスミドにより形質転換した大腸菌の中からレポーター活性が上昇するものを選択し、現在までに73株得た。二次スクリーニングは抗σ^<32>血清を用いてイムノブロッティングを行い、期待通り細胞内のσ^<32>量が増加しているものを少なくとも26株得た。そのうちの9株において、内在性の熱ショック蛋白質の増加を確認した。三次スクリーニングとして、放射性メチオニンを用いたパルス-チェイス実験によりσ^<32>の安定性を調べる予定だったが、合成培地で形質転換体の増殖が悪いためパルス-チェイス実験を行えていない。代わりに、L培地で増殖中の大腸菌にクロラムフェニコールを添加して蛋白質合成を停止させ、その後のσ^<32>の減少をイムノブロッティングにより調べた。9株中少なくとも4株でσ^<32>の安定化が観察された。しかしながら、増殖速度がコントロール株より遅いため二次的な影響をみている可能性があり、放射性メチオニンを用いたパルス実験によりσ^<32>の合成速度の変化を調べなければならない。現在、合成培地でこれら形質転換体が増殖できる条件を検討中である。安定化が観察された4株において、rpoH遺伝子の配列を調べ、変異部位を同定した。

野生型と比較して、47番目のロイシンと55番目のロイシンが同時にグルタミンに置換した変異型σ^<32>は10倍以上、50番目のアラニンがセリンに置換した変異型σ^<32>は約5倍、54番目のイソロイシンがアラニンに置換した変異型σ^<32>は約10倍安定化した。さらに、同じ変異によりσ^<32>の転写開始因子としての活性が、野生型と比較してかなり上昇することが観察された。以上のことは、47番目から55番目のいくつかのアミノ酸残基は、σ^<32>の素早い分解に必要とされるだけでなく、σ^<32>の活性調節にも必要とされることを示しており、この領域が分子シャペロンの認識結合部位であることを示唆する。