hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
生体内組織合成法を用いた異種移植可能な心臓弁膜用バイオシートの開発

脱細胞化、非脱細胞化した生体内組織形成術にて作成したバイオシートにて力学的強度試験及びヤギ皮下埋没試験を昨年継続して行った。バイオシートは99%以上脱細胞化されていた。力学的強度試験では脱細胞化によるバイオシートの強度低下は認められなかった。4週間ウシバイオシートをヤギ皮下に埋植したところバイオシートの分解や免疫細胞系の集積など顕著な免疫拒絶反応は観察されず血管新生を伴った線維芽細胞の浸潤によるバイオシートの臍臍傍・組織化が生じていた。この結果を踏まえウシバイオチューブをどう方法で脱細胞化してヤギの頸動脈に移植する実験を行った。その結果ウシバイオチューブは移植後1週間でやや拡大するものもその後瘤化することなく若干元の大きさに戻る傾向を示し、組織学的に4週でバイオチューブ全長を内皮細胞が被覆した。弾性線維産生を伴う血管平滑筋細胞層はNaviveからの細胞遊走により生じ、4週で全長の約2/3を、12周で全体を被覆した。バイオチューブ自体は平滑筋細胞の構築に伴い吻合部から分解されており、4週では吻合部から2mm程度、12週ではバイオチューブと周囲組織の明確な見分けがつかずほぼ分解(再構成)されているように見受けられた。これらの結果を踏まえ脱細胞化バイオシートを用いてヤギの大動脈再建術を行うモデルを作成した。5頭に対して行い1頭は術中死し、1頭は1週目に突然死した。残り3頭はそれぞれ3か月、2か月、1か月経過し生存しており、6か月後にエコーと血管造影で大動脈弁機能を評価後安楽死させ組織摘出し観察分析するべく待機中である。対象となる自己のバイオシートで大動脈弁再建術を行ったモデル、自己心膜グルタールアルデハイド固定で大動脈弁再建術を行ったモデルはすでにそれぞれ3頭ずつ6か月後安楽死させ同様の分析を終了した。力学的に劣化を認めず十分な徐細胞化を得る脱細胞化方法の確立に時間を要し、さらに圧への耐用性をまず見る実験(頸動脈移植)を追加して行う必要を認めたため実際の異種バイオシートでの大動脈弁再建術モデルの作成が遅れた。また当初連続して周術期にモデルヤギの術死が続いたのもえれ現在安楽死の時期待機中でまだその結果が得られていない理由である。対称モデルのデータはあり、脱細胞化も確定しているためすでに異種弁移植後生存観察中のヤギが3頭のうち2頭を1年モデルに変更し、さらに異種弁移植モデルを連続して作成し6か月モデルとして最終的に経時的な変化も含めて移植弁の機能、耐用性の結果を示し臨床応用へのデータを得ていく。ウシ皮下に基材を植込、2ヶ月後基材を取り出しバイオシートを得て、以下の脱細胞とDNA定量を行った。バイオシートをTritonX-100, DNaseとを含む脱細胞反応液に浸漬し、24時間ごとに反応液を全量交換しながら37°C、170 rpmにて96時間振盪した。PBS(ー)液に浸漬し室温で24時間振盪することで脱細胞反応液を洗い流した。DNA抽出キットを用いてバイオシートからDNAを抽出した後、吸光度測定により残存DNA量を定量した。次に脱細胞したウシバイオシートを用いての生体親和性試験(皮下埋植試験)を行った。未処理のバイオシート、脱細胞化したバイオシート、及びウシ心のう膜シートを生理食塩水に浸漬することで、洗浄した。成ヤギ(38kg)の背部腹部にかけての体側皮下の脂肪層に上記のシート状組織体を埋植した。埋植4週後に、組織を摘出し4%パラホルムアルデヒドリン酸緩衝液に浸漬し4°Cで一晩静置することで組織を固定化しHE染色を行うことで組織観察を行った。また以下の細胞親和性試験(細胞培養試験)も行った。生検トレパンを用いて脱細胞化バイオシートからφ2 mmの円形組織を切り出し、その上にヒト臍帯静脈内皮細胞播種し、内皮細胞増殖培地24時間培養した。24時間後組織を固定化し、その切片のヘマトキシリン染色を行うことで組織中の細胞の観察を行った。また脱細胞前後のウシバイオシートの力学的強度試験(短軸引張試験)も行った。脱細胞によりDNAはほとんど検出されなくなった。一方皮下に植えられた脱細胞シートは炎症細胞の浸潤が見られず線維芽細胞の浸潤、血管新生が見られたに対し、非脱細胞シートは周囲を肉芽組織に覆われシート内へのリンパ系細胞浸潤とそれにより細胞が分解され無細胞状態となっていた。また引っ張り強さ、最大ヤング率、破断ひずみ等脱細胞前後でウシバイオシートの強度物性に変化はなかった。ウシバイオシートの基材設計と材質特定ができずにウシバイオシートの最適な脱細胞方法、条件の特定に時間がかかり、それを用いての最適な脱細胞方法、条件特定にも時間を要してしまったが最終的には強度を保ちながらDNA含有量をなくすことができるほぼ満足行く脱細胞方法を確立することができた。実際に脱細胞バイオシートの大動脈弁位置への移植までは突立つできなかった。

4週間ウシバイオシートをヤギ皮下に埋植したところバイオシートの分解や免疫細胞系の集積など顕著な免疫拒絶反応は観察されず血管新生を伴った線維芽細胞の浸潤によるバイオシートの臍臍傍・組織化が生じていた。この結果を踏まえウシバイオチューブをどう方法で脱細胞化してヤギの頸動脈に移植する実験を行った。その結果ウシバイオチューブは移植後1週間でやや拡大するものもその後瘤化することなく若干元の大きさに戻る傾向を示し、組織学的に4週でバイオチューブ全長を内皮細胞が被覆した。弾性線維産生を伴う血管平滑筋細胞層はNaviveからの細胞遊走により生じ、4週で全長の約2/3を、12周で全体を被覆した。バイオチューブ自体は平滑筋細胞の構築に伴い吻合部から分解されており、4週では吻合部から2mm程度、12週ではバイオチューブと周囲組織の明確な見分けがつかずほぼ分解(再構成)されているように見受けられた。これらの結果を踏まえ脱細胞化バイオシートを用いてヤギの大動脈再建術を行うモデルを作成した。5頭に対して行い1頭は術中死し、1頭は1週目に突然死した。残り3頭はそれぞれ3か月、2か月、1か月経過し生存しており、6か月後にエコーと血管造影で大動脈弁機能を評価後安楽死させ組織摘出し観察分析するべく待機中である。対象となる自己のバイオシートで大動脈弁再建術を行ったモデル、自己心膜グルタールアルデハイド固定で大動脈弁再建術を行ったモデルはすでにそれぞれ3頭ずつ6か月後安楽死させ同様の分析を終了した。力学的に劣化を認めず十分な徐細胞化を得る脱細胞化方法の確立に時間を要し、さらに圧への耐用性をまず見る実験(頸動脈移植)を追加して行う必要を認めたため実際の異種バイオシートでの大動脈弁再建術モデルの作成が遅れた。また当初連続して周術期にモデルヤギの術死が続いたのもえれ現在安楽死の時期待機中でまだその結果が得られていない理由である。昨年度確立した脱細胞方法を用いて、ヤギの大動脈弁再建術を行い6カ月モデル4頭、1年モデル4頭作成して、遠隔期の弁機能評価(心臓カテーテル検査、超音波検査)、弁組織変化を分析する。対象となるのはすでにわれわれが得ている自己バイオシートモデル(6カ月、1年)と自己心膜による大動脈再建モデルとする。対称モデルのデータはあり、脱細胞化も確定しているためすでに異種弁移植後生存観察中のヤギが3頭のうち2頭を1年モデルに変更し、さらに異種弁移植モデルを連続して作成し6か月モデルとして最終的に経時的な変化も含めて移植弁の機能、耐用性の結果を示し臨床応用へのデータを得ていく。
蛍光色素カプセル化リポゾームによる血流、血液ガス同時連続測定法の開発

本研究では、リポソーム内に蛍光物質を封入し生体内における各種の計測へ応用するための基礎的検討を行い、この目的に適した形状および組成を持つリポソームの作製法を確立した。さらに、リポソームが発する蛍光信号を記録しin vitroおよびin vivoにおいてこれを測定することが可能となった。phosphatydylcholineを主成分とした多重層リポソームを逆相蒸発法によって作成した。cholesterolを添加し蛍光物質の保持効率を高め、さらに活性化methoxypolyethylene glycolを加えることにより、細網内皮系における取り込みができるだけ少なくなるようにした。孔径が均一なポリカーボネート製のメンブランフィルターを用いてリポソームの粒子径をそろえた。作成したリポソームの微小血管における挙動を蛍光で標識した赤血球と比較したところ、リポソームの直径が8μm以下であれば、その微小循環における流速は赤血球のそれと変わらないことが明らかになった。また、リポソーム投与が原因となった血管閉塞は見られなかった。リポソームの毒性および血中半減期についても検討を加え、実験動物への応用が可能であることが判明した。測定装置としては、アルゴンレーザーとAO(Acousto-Optic)変調器を組み合わせた光源を開発し、プラスチック光ファイバーと光電子増倍管によるフォトンカウンティングで蛍光を観測した。これを用い、まず蛍光寿命から酸素分圧を求める検量線をin vitroで作成した。次いで麻酔したラットの静脈に光ファイバープローブを装着して蛍光寿命の測定を行い、血液の酸素分圧が計測可能であることが実証された。この測定装置をさらに改良し、酸素分圧のみならず炭素ガスや温度等のin vivoでの同時かつ連続測定にも応用し、今まで得ることのできなかった生体機能の解析を可能にしたいと考える。蛍光物質の水溶液を含有した、保持効率の高いリポゾームを作成する技術を確立した。加圧ろ過器を用いることにより、リポゾームの直径を0.2-5μmの範囲でほぼ均一にそろえることができる。このリポゾーム懸濁液をラットの動脈に注入し、腸間膜の微小血管を落射蛍光顕微鏡下に観察し、血管内を流れるリポゾームを観察することに成功した。これによって、微小循環領域における血管内の血流速度、血管床内の血流分布が観測された。また、この結果を、従来より用いられている蛍光標識赤血球による血流計測と比較した。急性動物実験においてみられるリポゾームによる血流障害は、そのリポゾームの直径と投与量による塞栓の形成が原因であることが判明した。また、投与量が少なくても、肺や肝臓などの細網内皮系における蓄積が確認された。従って、細網内皮系で認識されにくい脂質構成のリポゾームを作成し、慢性的な毒性について評価する必要がある。当初、光源として既製品のレーザーパルス光源を予定していたが、所定の蛍光物質の吸収波長領域では十分な光強度が得られないことが判明したため、高速で光量を変調する分光光源を市販品を組み合わせて作成した。これとフォトカウンティングを組み合わせることにより、蛍光寿命の酸素分圧による変化をin vitroで測定できるようになった。光源の確立に時間を要したため、in vivoにおけるセンサープローブの作成が予定よりも遅れている。この測定技術は、当初の目的である血流計測及び血液ガスの測定以外にも、従来測定が難しかった組織の酸素及び二酸化炭素分圧の測定等に広く応用できる可能性がある。本年度は、生体内における各種計測に適したリポソームの形状および組成を決定するとともに、その作製法を確立した。さらに、このリポソームを用いてその発する蛍光信号をin vivoにおいて測定し、血液酸素分圧を計測することが可能となった。

リポソームの膜成分にcholesterolを添加し蛍光物質の保持効率を高め、さらに活性化methoxypolyethylene glycolを加えることにより、細網内皮系への取り込みを抑制することができた。作成したリポソームの微小血管における挙動を蛍光で標識した赤血球と比較したところ、リポソームの直径が8μm以下であれば、その微小循環における流速は赤血球のそれと変わらず、またリポソームの投与が原因となった血管閉塞は見られなかった。リポソームの毒性および血中半減期についても検討を加え、実験動物への応用が可能であることが明らかとなった。前年度に作成した光源は蛍光寿命を測定するには時間応答が不十分であったため、新たにアルゴンレーザーとAO (Acousto-Optic)変調器を組み合わせた光源を作成し、プラスチック光ファイバーと光電子増倍管によるフォトンカウンティングで蛍光を観測した。これを用い、まず蛍光寿命から酸素分圧を求める検量線をin vitroで作成した。次いで麻酔したラットの静脈に光ファイバープローブを装着して蛍光寿命の測定を行い、血液の酸素分圧のin vivoにおける計測が可能となった。
発生ダイナミズムを応用した大脳オルガノイド神経上皮組織による大脳皮質再生法の開発

平成30年度は我々の研究分野においては世界的にも変革の年であり、大脳オルガノイド技術の再生への応用の先駆けとなる研究が数多く報告された。そのため、世界の最新の研究成果を踏まえた上で我々の目指す目標を達成するための方法論の検討を改めて行なった。ソーク研究所のFred Gageのグループは、大脳オルガノイドをマウスのretrosplenial cortexに移植する実験を行い、in vivoの脳内でオルガノイドを成長させる試みを初めて報告した。移植片は試験官内での系と異なり細胞死が抑えられ、血管新生が進み、移植されたオルガノイド内ではventricular zoneとcortical plateの層構造は保たれ、神経は機能的にホストの神経細胞とシナプスを形成することも示された。しかしながら、我々の最終的な目標である「大脳皮質の層構造の構築・統合」は示されていない。すなわち、この報告によりオルガノイドそのものを脳内に移植する方法では大脳皮質の層構造の再生には至れないことが明確となった。そのため、自己組織化能を有した状態かつbasal-apicalの極性を保った神経上皮細胞シートの作成が必要と判断され、シート化へ向けた最初のアプローチとしてオルガノイド内の神経上皮組織の大型化に関わる条件の検討を進めている。初期の実験において、WNTシグナルの抑制は、FOXG1遺伝子発現を指標とした前脳化を促す、神経上皮組織の拡大には負の方向に働くことが示唆された。領域パターン化と神経上皮の拡大を領域を両立する至適条件の決定を進めている。またiPS細胞の培養系やオルガノイド誘導法、神経幹細胞の分化誘導法を安定させるため、技術的な改善も進めている。当初、神経上皮組織シートの作成・検討までを目標としていたが、学内での遺伝子組換え実験の手続きなどに時間を要したことや、所属研究室の改装などがあり物資が搬入できなかったこともあり、実験計画が遅れている。また、iPS細胞を十分なスケールで安定的に未分化状態で培養・保存する体制の整備およびオルガノイドや神経幹細胞にへの分化誘導する体制の整備をおこなっているが、ロット差の少ない、品質の安定した試薬の選定に難渋し、初期の実験系の立ち上げに時間を要している。現在、ややコストは上がるものの、培養試薬などで可能なものは大手ベンダー販売されるロット差の少ないものを選定し、培養系がより早期に安定するように準備を進めている。iPS細胞は未分化での品質が以後の実験系の安定性に関わるため、準備を入念に行なっている。Reprocel社のPrimate EScell mediumを使用して、SL-10、MEFを用いたオンフィーダーの培養系で拡大培養を行い、状態の良い質の安定したiPS細胞ストックを作成したのち、オルガノイドへの分化誘導を行う方針としている。我々の事前検討では選定したiPS標準株の分化能は安定していると確認されているが、本実験用に確保するストックにおいても分化指向性の検討が必要であり、ストックiPS細胞の未分化マーカーの発現の確認、未分化状態の安定性の確認、in vitroでの分化能の評価、とくに神経系への分化指向性・領域指向性などの確認にもう少し時間を要する見込みである。研究計画はやや遅れているが、iPS細胞の安定したストックが確保は今後の実験を進める上での重要な基盤となるため、十分に時間をかけ準備を行う必要がある。分化能・分化指向性が安定したストックが作成され次第、大脳オルガノイドの誘導を行う。オルガノイド誘導自体はiPS細胞の品質が安定すれば3週間程度で終えることができ、かつ安定しているためそれほど条件検討に時間を要しないと予想している。品質評価は免疫染色法による神経上皮細胞マーカーであるPAX6やSOX1, SOX2, NESTINの発現確認、定量的RT-PCR法による発現量の定量をおこない、in vitro(2次元培養下)での分化誘導した神経細胞への分化能評価をβ3-tubulin, MAP2, NeuNの免疫染色法により施行する予定である。その後、神経上皮細胞シートを作成するための検討に入るが、大脳オルガノイド由来神経上皮細胞は、パパインにより酵素的に分離、ラットより分離した嗅粘膜上に播種する実験を進める予定であるが、本年度の前半に必要な動物実験などの手続きを他実験と並行して行う予定である。大脳オルガノイド由来神経上皮細胞シートの作成及び試験官内での組織学的な評価は今年度中に行い、実験の遅れを取り戻せる見込みである。また、今年度後半から次年度に行う予定である脳内への移植実験に持ち込めるように、ラットモデルの準備を共同研究者と共に進めていくことを予定している。

すなわち、この報告によりオルガノイドそのものを脳内に移植する方法では大脳皮質の層構造の再生には至れないことが明確となった。そのため、自己組織化能を有した状態かつbasal-apicalの極性を保った神経上皮細胞シートの作成が必要と判断され、シート化へ向けた最初のアプローチとしてオルガノイド内の神経上皮組織の大型化に関わる条件の検討を進めている。初期の実験において、WNTシグナルの抑制は、FOXG1遺伝子発現を指標とした前脳化を促す、神経上皮組織の拡大には負の方向に働くことが示唆された。領域パターン化と神経上皮の拡大を領域を両立する至適条件の決定を進めている。またiPS細胞の培養系やオルガノイド誘導法、神経幹細胞の分化誘導法を安定させるため、技術的な改善も進めている。当初、神経上皮組織シートの作成・検討までを目標としていたが、学内での遺伝子組換え実験の手続きなどに時間を要したことや、所属研究室の改装などがあり物資が搬入できなかったこともあり、実験計画が遅れている。また、iPS細胞を十分なスケールで安定的に未分化状態で培養・保存する体制の整備およびオルガノイドや神経幹細胞にへの分化誘導する体制の整備をおこなっているが、ロット差の少ない、品質の安定した試薬の選定に難渋し、初期の実験系の立ち上げに時間を要している。現在、ややコストは上がるものの、培養試薬などで可能なものは大手ベンダー販売されるロット差の少ないものを選定し、培養系がより早期に安定するように準備を進めている。iPS細胞は未分化での品質が以後の実験系の安定性に関わるため、準備を入念に行なっている。Reprocel社のPrimate EScell mediumを使用して、SL-10、MEFを用いたオンフィーダーの培養系で拡大培養を行い、状態の良い質の安定したiPS細胞ストックを作成したのち、オルガノイドへの分化誘導を行う方針としている。我々の事前検討では選定したiPS標準株の分化能は安定していると確認されているが、本実験用に確保するストックにおいても分化指向性の検討が必要であり、ストックiPS細胞の未分化マーカーの発現の確認、未分化状態の安定性の確認、in vitroでの分化能の評価、とくに神経系への分化指向性・領域指向性などの確認にもう少し時間を要する見込みである。研究計画はやや遅れているが、iPS細胞の安定したストックが確保は今後の実験を進める上での重要な基盤となるため、十分に時間をかけ準備を行う必要がある。分化能・分化指向性が安定したストックが作成され次第、大脳オルガノイドの誘導を行う。オルガノイド誘導自体はiPS細胞の品質が安定すれば3週間程度で終えることができ、かつ安定しているためそれほど条件検討に時間を要しないと予想している。品質評価は免疫染色法による神経上皮細胞マーカーであるPAX6やSOX1, SOX2, NESTINの発現確認、定量的RT-PCR法による発現量の定量をおこない、in vitro(2次元培養下)での分化誘導した神経細胞への分化能評価をβ3-tubulin, MAP2, NeuNの免疫染色法により施行する予定である。その後、神経上皮細胞シートを作成するための検討に入るが、大脳オルガノイド由来神経
温熱刺激は関節リウマチに伴う筋機能の低下を改善するか？

関節リウマチ(RA)患者では,関節の障害に加え,著しい筋力低下により活動能力が低下する.本研究では,アジュバント関節炎(AIA)ラットを用い,RAに伴う筋力低下のメカニズムについて検討した.AIAラットの長趾伸筋では,TNF-α誘導性のパーオキシナイトライト生成による酸化ストレスにより,収縮機能が低下することが示唆された.さらに本研究では,これらの知見と,熱ショックタンパク質(Hsp)72の抗酸化作用を考慮し,熱刺激がAIAラットの長趾伸筋における収縮機能に及ぼす影響を検討した.その結果,熱刺激は,Hsp72発現量を著しく増加させるが,収縮機能を改善しないことが明らかとなった.先行研究において我々は,関節リウマチ(RA)モデルであるコラーゲン誘導性関節炎マウスの骨格筋において,筋張力の著しい低下が,一酸化窒素(NO)派生物によるタンパク質の翻訳後修飾を伴うことを示した.平成24年度に実施した研究では,別のRAモデルであるアジュバント関節炎(AIA)ラットの骨格筋において,類似した変化が観察された.したがって,これらの知見から,RAに伴う筋力低下には,NO派生物による酸化ストレスが関与することが示唆される.平成25年度の研究では,これらの知見と,熱ショックタンパク質(Hsp)の有する抗酸化能力に着目し,AIAラットの筋機能低下を,熱刺激応答経路の活性化が防止すると仮説し検討を行った.しかしながら,我々の仮説に反し,熱刺激により,骨格筋におけるHsp72発現量は顕著に増加したが,AIAに伴う筋機能低下に改善は認められなかった.また,AIAラットの骨格筋では,パーオキシナイトライトによるタンパク修飾の指標である3-ニトロチロシンや炎症性メディエーターであるTNF-αの増加が認められたが,熱刺激はこれらの増加を抑制しなかった.したがって,熱刺激によるHsp72発現量の増加は,AIAラットにおいて,炎症ー酸化ストレス系を介した筋機能低下を防止しないことが示唆された.ただし,本研究で用いた熱刺激条件の結果のみから,関節炎に伴う筋力低下の対策としての温熱療法の可能性を,完全に否定することはできない.今後,温度,時間,頻度等の条件を変化させた際の影響について,さらに詳細に検討する必要があると考えられる.一方,本研究の結果は,RAに伴う筋機能低下とNO派生物による酸化ストレスとの関連性を,改めて示唆するものである.今後,抗酸化剤の投与等の薬理学的な実験を行い,その関連性をより直接的に示すことで,科学的根拠に基づいた新たなリハビリテーション技術の開発に繋げたい.関節リウマチ(RA)患者では,関節の障害に加え,著しい筋力低下により活動能力が低下する.本研究では,アジュバント関節炎(AIA)ラットを用い,RAに伴う筋力低下のメカニズムについて検討した.AIAラットの長趾伸筋では,TNF-α誘導性のパーオキシナイトライト生成による酸化ストレスにより,収縮機能が低下することが示唆された.さらに本研究では,これらの知見と,熱ショックタンパク質(Hsp)72の抗酸化作用を考慮し,熱刺激がAIAラットの長趾伸筋における収縮機能に及ぼす影響を検討した.その結果,熱刺激は,Hsp72発現量を著しく増加させるが,収縮機能を改善しないことが明らかとなった.本研究の全体構想は,関節リウマチ(RA)に伴う筋機能低下の要因について,一酸化窒素の役割に着目して検討する(平成24年度)とともに,対抗手段としての温熱刺激の効果とその作用機序について明らかにする(平成25年度)ことである.実験には,Lewis系雄性ラットを用い,両膝関節腔に完全フロイントアジュバント(CFA: 2 mg/0.2 ml)を注射することでアジュバント関節炎(AIA)を惹起した.CFA投与後1週(AIA1wk群),2週(AIA2wk群),3週(AIA3wk群)において,膝関節幅は対照群に比べ増大した.また,速筋である長趾伸筋および遅筋であるヒラメ筋を採取し,強縮張力を測定したところ,長趾伸筋ではAIA3wk群において,ヒラメ筋ではAIA各群において,固有張力の低下が認められた.さらに,ウェスタンブロッティング法を用いた検討において,AIA3wk群では,いずれの筋においても,3-ニトロチロシンの含有量が顕著に増大していた.骨格筋の収縮及び弛緩において,それぞれ中心的な役割を果たすミオシンATPase及び筋小胞体Ca2+-ATPase(SERCA)は,3-ニトロチロシンの誘導物質であるパーオキシナイトライトにより機能障害を受けることから,本研究では,これらの酵素の活性を測定した.その結果,両筋ともすべてのAIA群においてミオシンATPase活性に変化は認められなかった.一方,SERCA活性は,AIA1wk及びAIA2wk群の長趾伸筋において低下し,AIA3wk群のヒラメ筋では増加することが明らかとなった.これらの知見から,AIAラットの骨格筋において認められる筋機能の低下が,一酸化窒素派生物であるパーオキシナイトライトの生成を伴うこと,また,ミオシンATPase及びSERCA機能の変化は筋機能の低下に関与しないことが示唆された.本研究の全体構想は,関節リウマチ(RA)に伴う筋機能低下の要因を探索するとともに,効果的な筋力強化プログラムの開発を目指し,温熱刺激による筋機能の改善効果とその作用メカニズムについて検討することである.平成24年度では,当初の研究計画に従い,RAに伴う筋機能低下における一酸化窒素の役割に着目して検討を行った.研究実績の概要に記載した通り,予定されたほぼすべての実験課題を実施することができたことから,現在までの達成度として,おおむね順調に進行していると判断した.

本研究の結果から,アジュバント関節炎(AIA)ラットの骨格筋ではパーオキシナイトライトの生成量の増加が生じることが示唆された.そこで我々は,パーオキシナイトライトがミオシンATPase及びSERCA機能を抑制することで,筋機能の低下を誘引すると考え検討を行ったが,これらの酵素活性と筋機能との間に関連性は認められなかった.したがって,当初実施が予定されていた,これらの酵素における翻訳後修飾の有無についての検討は実験項目から除外した.パーオキシナイトライトの生成量の増加が,筋機能低下に関与するかどうかに関しては,他の筋タンパク質,例えばエネルギー代謝に関与する酵素の機能などを測定することで今後さらに検討を進める予定である.関節リウマチ(RA)モデル動物であるアジュバント関節炎(AIA)ラットの骨格筋において,著しい筋力の低下が,筋タンパク質のニトロ化を伴うことを示した平成24年度の研究結果は,一酸化窒素派生物による酸化及び窒素化ストレスが,RAに伴う筋力低下の要因であるとする我々の仮説を支持するものであった.したがって,平成25年度は,当初の予定通り,温熱刺激がAIAラットの筋機能に及ぼす影響を検討する.これは,熱刺激により誘導される熱ショックタンパク質が,抗酸化作用及び変性タンパク質の修復・分解作用を有することから,これらが筋機能を改善する可能性があると考えられるからである.したがって,平成25年度の研究期間では,収縮機能の測定により温熱刺激の効果が認められた場合,熱ショックタンパク質の発現量及び筋タンパク質における3-ニトロチロシン含有量の測定を行うことで,その分子メカニズムについて検討する予定である.該当なし
メダカ内臓逆位変異体abecobeを用いた左右性形成機構の解明

本研究では、内臓が左右逆転したメダカ突然変異体abecobeの原因遺伝子pkd111を解析することによって、左右性形成機構の解明を目指している。・Pkd111とPkd2の相互作用解析(免疫共沈降)Pkd111とPkd2を培養細胞で強制発現させた上で、それぞれにつけたタグに対する抗体を使用して免疫共沈降をおこなった。その結果、Pkd111はC末側でPkd2と相互作用することがわかった。・Pkd2の細胞内局在の確認クッペル胞におけるPkd2の細胞内局在を、抗Pkd2抗体を用いた免疫染色により確認した。その結果、Pkd2は繊毛上に局在していることがわかった。また、abecobeにおいてPkd2の繊毛上への局在が失われていたことから、Pkd2の繊毛上への局在にはPkd111が必要であることがわかった。・Pkd111の細胞内局在の確認クッペル胞におけるPkd111の細胞内局在を、抗Pkd111抗体を用いた免疫染色により確認した。その結果、Pkd111はクッペル胞内の全ての繊毛上に局在していることがわかった。また、abecobeにおいてPkd111の繊毛上への局在が失われていたことから、抗Pkd111抗体の特異性も示された。クッペル胞におけるLRDの分布パターンを、抗LRD抗体を用いた免疫染色により確認した。その結果、クッペル胞内の全ての繊毛上に局在していることがわかった。これは、過去にマウスで報告されていた、周辺の繊毛のみに原曲しているという結果と異なる結果となった。本研究では、内臓が左右逆転したメダカ突然変異体abecobeの原因遺伝子を解析することによって、左右性形成機構の解明を目指している。本年度は以下のことを明らかにした。・MOによるノックダウン実験abecobe遺伝子のMOによるノックダウンを行い、abecobeと同様の表現型が生じることを確認した。これにより、abecobe遺伝子がabecobe変異体の原因遺伝子であることの確証を増すことができた。・allele解析abecobeのalleleを単離し、abecobe遺伝子の配列を野生型と比較した。その結果、abecobeとは異なる部位に変異が生じていることを確認した。これにより、abecobe遺伝子がabecbbe変異体の原因遺伝子であることの確証を増すことができた。成魚の各器官からcDNAを作製、abecobe遺伝子特異的なプライマーでRT-PCRを行い、abecobe遺伝子の発現部位を調べた。その結果、ユビキタスな発現が見られ、特に卵巣、肝臓で強い発現が観察された。これにより、abecobe遺伝子の空間的な発現パターンを理解することができた。abecobe遺伝子のプローブを作製し、野生型体節期胚でin situ hybridizationを行った。その結果、abecobe遺伝子はクッペル胞特異的に左右対称に発現していることを確認した。また、その発現はO体節期で最も強く、以降9体節期まで減少していった。これにより、abecobe遺伝子の時間的・空間的な発現パターンを理解することができた。・allele解析abecobeのalleleはトランスポゾンの挿入による変異であることを特定した。alleleのFosmidライブラリーを作製し、挿入領域の配列を特定した。・Cameleonトランスジェニックメダカの作製クッペル胞周辺部でのCaイオンの濃度変化を確認するために、蛍光タンパクであるCameleonのトランスジェニックメダカを作製した。その結果、野生型のクッペル胞周辺では、Caイオンの濃度に左右差はないことがわかった。・抗体作成abecobe遺伝子の抗体を作製した。培養細胞で発現させたabecobeタンパクに対してwestern blottingを実施したところ、交差性をもつことが確認された。・GFPトランスジェニックメダカの作製abecobeタンパクの局在を可視化するために、C末側にGFPを組み込んだBACを作製し、BACトランスジェニックメダカを作製した。現在までに、F2世代でのトランスジェニックメダカを確認できている。

その結果、Pkd111はクッペル胞内の全ての繊毛上に局在していることがわかった。また、abecobeにおいてPkd111の繊毛上への局在が失われていたことから、抗Pkd111抗体の特異性も示された。クッペル胞におけるLRDの分布パターンを、抗LRD抗体を用いた免疫染色により確認した。その結果、クッペル胞内の全ての繊毛上に局在していることがわかった。これは、過去にマウスで報告されていた、周辺の繊毛のみに原曲しているという結果と異なる結果となった。
母体血小板と絨毛細胞の相互作用:PIH、IUGRの病因解明をめざして

人工妊娠中絶より胎盤組織サンプルを20検体以上収集した。これらのサンプルより、本研究代表者が確立した方法を用いて絨毛外トロホブラストの分離を行った。得られた絨毛外トロホブラストを妊娠女性の末梢血由来の血小板と48時間共培養することにより、胎盤の母児境界面に見られる血管内トロホブラストに似た円形細胞への形態変化を誘導できることが確認できた。また、通常の培養を同時間行った場合には脱落膜組織内にある間質トロホブラストに似た紡錘形細胞に形態変化することも確認できた。これらの円形細胞および紡錘形細胞からRNAを抽出してcDNAを作成し、RT-PCRにより絨毛外トロホブラストでの重要な機能が想定されている種々の分子についてその発現を調べた。その結果、他の研究者が血管内トロホブラストで発現が増強すると報告しているインテグリンα1の発現が紡錘形細胞に比べ円形細胞により強いことが判明した。また、本研究代者が血管内トロホブラストに特異的に発現することを報告したケモカイン受容体CCR1にっいても、円形細胞に発現が強いことが分かった。これらの結果は分離した絨毛外トロホブラストを血小板と共培養することにより、in vivoにおける血管内トロホブラストに分化させることができるという本研究代表者の仮説を裏付けるものであった。現在、in vitroで形態変化させた円形細胞と紡錘形細胞から抽出したRNAサンプルが10ペアそろっており、本研究実施計画にあるマイクロ・アレイ分析を行うために共同研究者にそれらのサンプルを提出する準備を整えている。また、「母体血小板が血管内トロホブラストによる母体血管リモデリングを促進している」という本研究代表者の仮説を総説として英文雑誌(Medical Molecular Morphology)に投稿することで、世界に発信する足がかりができた。人工妊娠中絶より採取した胎盤組織サンプルより、本研究代表者が確立した方法を用いてextravillous trophoblast(以後EVT)の分離を行った。得られたEVTを妊娠女性の末梢血由来の血小板と48時間共培養することにより、胎盤の母児境界面に見られるendovascular trophoblastに似た円形細胞への形態変化を誘導できることが確認した。また、通常の培養を同時間行った場合には脱落膜組織内にあるinterstitial trophoblastに似た紡錘形細胞に形態変化することも確認された。これらの血小板共培養群およびコントロール群から抽出したRNAサンプル(7ペア)を用いて本研究実施計画にあるマイクロ・アレイ解析を行った結果、血小板共培養群で有意に高発現あるいは低発現している分子を同定することができた。そのうちのいくつかの遺伝子についてマイクロ・アレイ解析を行ったRNAを用いたRT-PCRでその発現変化を確認することによりマイクロ・アレイ解析結果の信頼性を証明することができた。人工妊娠中絶より採取した胎盤組織サンプルより、本研究代表者が確立した方法を用いてextravillous trophoblast(以後EVT)の分離を行い、それを実験に供した。これまでの当研究グループの検討で、血小板との12時間の共培養により分離EVTの浸潤能が亢進すること、48時間の共培養により分離EVTに胎盤に見られる血管内EVT(endovascular trophoblast、以後eEVT)に似た円形細胞への形態変化を誘導できることが明らかとなっており、それらが本研究実施計画をたてる発端となっている(Sato et al.Blood 2005)。平成21年度には、血小板共培養群およびコントロール群から抽出したRNAサンプルを用いてマイクロ・アレイ解析を行った。その結果、血小板共培養群で有意に高発現しているいくつかの分子を同定することができた。平成22年度には、マイクロ・アレイ解析で明らかになった血小板共培養により発現が増強する分子のうち細胞表面分子に着目した。その蛋白発現を免疫組織染色により検討したころ、血小板共培養群で発現が増強していたmelanomacell adhesion molecule (MCAM)が、実際の胎盤組織においても脱落膜を浸潤する間質EVT (interstitial trophoblast、以後iEVT)に比べ、eEVTで発現が高いことが明らかになった。現在EVTにおけるMCAMの機能を解析するために、MCAM特異的siRNAを分離EVTに導入し、MCAM発現をknock downすることを試みている。
果樹園とその周辺二次林における送粉共生系ダイナミクスの解析

1)外来昆虫種であるセイヨウミツバチは園芸植物への訪花割合が高く,在来昆虫種は野生植物への訪花割合が高かった.園芸植物がセイヨウミツバチを多く引き付けることにより,野生植物をめぐるセイヨウミツバチと在来昆虫の競合を緩和している可能性が示唆された.2)園芸植物の中でも特に果樹は,単位時間当たりに訪花した昆虫の平均種数および平均個体数が多く,昆虫の餌資源として大きく機能していることがわかった.3)周辺植物の開花が少ない夏期に花を咲かせるキンカンやハナツクバネウツギなどの園芸植物に多くの昆虫が訪花したことから,園芸植物が在来送粉共生系保全のために代償的に利用できる可能性が示唆された.4)モモでは,訪花昆虫を制限した袋がけ区であっても結実率が高く,訪花昆虫の重要性が低いと考えられた.しかし,レモンとキンカンでは自然交配区と比較して袋がけ区の結実率が低く,結実を訪花昆虫に依存していることがわかった.同じ自家和合性であっても,花形態や結実に必要な花粉量の違いにより訪花昆虫の必要性が異なることが示唆された.5)自家不和合性果樹のうち,リンゴは人工他家交配区と自然交配区および除雄区の結実率が同程度であり,昆虫が送粉者として十分に機能していることがわかった.しかし,ナシでは自然交配区および除雄区の結実率が人工他家交配区と比較して低かった.6)ナシとリンゴにおける訪花昆虫別の貢献度を調査したところ,ナシではセイヨウミツバチが最も貢献度の高い昆虫であった.リンゴでは,訪花個体数ではセイヨウミツバチよりも少なかったコマルハナバチの貢献度がセイヨウミツバチの貢献度の約2倍であった,コマルハナバチの活動開始時期は4月中旬であるため,4月上旬に花を咲かせるナシの開花期には観察されなかった.このことが,ナシの自然交配区の結実率が低かった原因であると考えられた.大学附属農場の果樹園において人為的に植栽された果樹類9種,緑化植物7種,および野生植物26種の開花フェノロジーを調査した.1時間当たりの平均訪花数および平均訪花昆虫種数は,それぞれ,果樹類で28,10,緑化植物で23,5,野生植物で6,4となり,果樹類,緑化植物の方が野生植物よりも送粉者の利用度が高かった.この結果は,比較的多種の果樹類や緑化植物が,送粉者の重要な餌資源として機能していることを示唆している.野生植物群集の開花フェノロジーは,7月頃に開花種数が減少する構造を示した.この時期に開花するキンカンやハナツクバネウツギ(アベリア)では,送粉者の利用度が高かった.したがって,野生の餌資源が減少する夏期に開花する園芸植物は,送粉者の代替資源としての役割が大きいと思われる.次年度も引き続き,同試験サイトにおける送粉共生系ダイナミクスの詳細な解析を行っていく.自家和合性を示すキンカンの開花前の花蕾を袋掛けしたところ,結実率は36.8%と自然受粉の半分程度となった.一方,開花前に除雄してそのまま放置すると,結実率は68.9%と自然受粉区と同程度となった.この事実は,自家和合性キンカンの結実量の増大に対する送分者の貢献度が比較的大きいことを示唆している.果樹類の結実を省力的かつ効果的に制御する上で,自然界の送粉者の存在は重要であると思われた.現在,他の果樹類について同様の調査を行っている.大学附属農場の果樹園において人為的に植栽された果樹類9種,緑化植物7種,および野生植物26種の開花フェノロジーを調査した.1時間当たりの平均訪花数および平均訪花昆虫種数は,それぞれ,果樹類で28,10,緑化植物で23,5,野生植物で6,4となり,果樹類,緑化植物の方が野生植物よりも送粉者の利用度が高かった.この結果は,人為的に植栽される果樹類や緑化植物が,送粉者の重要な餌資源としてより多く利用されていることを示唆している.ただし,学習能力が高く選好性の高いコマルハナバチは,野生植物においても比較的高い頻度で訪花していた.この事実は,コマルハナバチを主要な送粉者とする在来植物の繁殖が,比較的大きなディスプレイサイズを有する人為的に植栽された植物による負の影響をあまり受けていないことを示唆している.野生植物群集の開花フェノロジーは,7月頃に開花種数が減少する構造を示した.この時期に開花するキンカンやハナツクバネウツギ(アベリア)では,送粉者の利用度が高かった.したがって,野生の餌資源が減少する夏期に開花する園芸植物は,送粉者の代替資源としての役割が大きいと思われる.自家和合性を示す`寧波キンカン'の開花前の花蕾を袋掛けしたところ,結実率は36.8%と自然受粉の半分程度となった.一方,開花前に除雄してそのまま放置すると,結実率は68.9%と自然受粉区と同程度となった.この事実は,自家和合性キンカンの結実量の増大に対する送粉者の貢献度が比較的大きいことを示唆している.果樹類の結実を省力的かつ効果的に制御する上で,自然界の送粉者の存在は重要であると思われた.現在,他の果樹類について同様の調査を行っている.自家不和合性を示すリンゴ`ふじ'の除雄

放置区における結実率は89.5%と,無処理区(86.7%)と人工他家交配区(85.7%)と同程度だった.一方,自家不和合性を示すニホンナシ`幸水'の除雄放置区における結果率は59.3%となり,人工他家交配による結果率85.7%に比べて低くなった.これらの果樹におけるハチ目の単位時間当たりの訪花頻度は,それぞれ,`ふじ'で20個体であったのに対し,`幸水'では11個体であり,この差がナシ`幸水'の除雄放置区における結果率を低下させた要因と考えられた.1)外来昆虫種であるセイヨウミツバチは園芸植物への訪花割合が高く,在来昆虫種は野生植物への訪花割合が高かった.園芸植物がセイヨウミツバチを多く引き付けることにより,野生植物をめぐるセイヨウミツバチと在来昆虫の競合を緩和している可能性が示唆された.2)園芸植物の中でも特に果樹は,単位時間当たりに訪花した昆虫の平均種数および平均個体数が多く,昆虫の餌資源として大きく機能していることがわかった.3)周辺植物の開花が少ない夏期に花を咲かせるキンカンやハナツクバネウツギなどの園芸植物に多くの昆虫が訪花したことから,園芸植物が在来送粉共生系保全のために代償的に利用できる可能性が示唆された.4)モモでは,訪花昆虫を制限した袋がけ区であっても結実率が高く,訪花昆虫の重要性が低いと考えられた.しかし,レモンとキンカンでは自然交配区と比較して袋がけ区の結実率が低く,結実を訪花昆虫に依存していることがわかった.同じ自家和合性であっても,花形態や結実に必要な花粉量の違いにより訪花昆虫の必要性が異なることが示唆された.5)自家不和合性果樹のうち,リンゴは人工他家交配区と自然交配区および除雄区の結実率が同程度であり,昆虫が送粉者として十分に機能していることがわかった.しかし,ナシでは自然交配区および除雄区の結実率が人工他家交配区と比較して低かった.6)ナシとリンゴにおける訪花昆虫別の貢献度を調査したところ,ナシではセイヨウミツバチが最も貢献度の高い昆虫であった.リンゴでは,訪花個体数ではセイヨウミツバチよりも少なかったコマルハナバチの貢献度がセイヨウミツバチの貢献度の約2倍であった,コマルハナバチの活動開始時期は4月中旬であるため,4月上旬に花を咲かせるナシの開花期には観察されなかった.このことが,ナシの自然交配区の結実率が低かった原因であると考えられた.
3D配置問題に対する構築型解法の開発および現実問題への応用

三次元レクトリニア多面体配置問題は,直方体の容器にレクトリニア多面体を配置する問題である.三次元レクトリニア多面体とは,三次元の多面体で,各面がxy平面,yz平面,zx平面のいずれかと平行であるものをいう.本研究では,二次元レクトリニア図形配置問題と三次元直方体配置問題に対する成果を拡張することを検討した.任意の物体はレクトリニア多面体に近似することは可能であるが,その近似の精度に応じて,アイテムを表現するための複雑度が高くなる.開発する解法の性能が,このような複雑度の増大に敏感にならないようにアルゴリズム上で主にデータ構造の面からの工夫を行った.解法としては,何も配置されていない状態から始めて,アイテムをひとつずつ配置していき,最後に解を得るという構築型解法を開発した.解法の計算過程で動的に変化するアイテムの配置を効率よく保持するデータ構造を設計して,計算時間を削減した.既存研究のほとんどが直方体配置問題に対するものである.直方体は扱いが容易であるため,大規模な問題例にも適用できる高速なアルゴリズムも提案されている.一方,形状が複雑ため,三次元物体配置問題に対する研究は少なく,小規模な問題例に対するものに限られており,大規模な問題例に対する研究は申請者の知る限りこれまで行われていない.多面体数3000を超える規模の問題例に対するこのような実証実験は本問題では他に類を見ない.本研究の解法は,直方体配置問題や一般の多面体配置問題も特別な場合として扱えるという性質を持つため,様々な形状を持つ製品の配置問題に適用可能な汎用解法となる.さらに,提案した方法論が配置問題の基盤技術となり,配置を決定することが求められる問題(例えばトラックの荷物詰め込みを考慮した配送計画問題)に対するアルゴリズム設計に導入されることが期待できる.今年度は予定とおり,大規模な三次元物体配置問題について,研究を行った.まず,一般の物体を三次元レクトリニア多面体に近似する手法を提案した.また,二次元図形配置問題に対する知見を三次元物体に拡張した.三次元レクトリニア多面体を直方体の集合で表現し,解法の計算過程で動的に変化するアイテムの配置を効率よく保持するデータ構造を提案することで,計算時間を削減した.データ構造には,多面体の形状ごとに平衡探索木を用意し,多面体を順番に配置すると同時に,すべての平衡探索木を更新する.このアイデアを用いて代表的な2つの構築型解法の高速な実装を実現した.さらに,2つの解法の中間に位置づけられる構築型解法を提案し,その有効性を計算実験により確認した.本研究の手法は,アイテム数が約3000個ある問題例に対しても80秒以内で良質の解を構築できた.このような大規模な問題例に対して短時間で良質の解を構築できるのは申請者の知る限り本研究が世界初である.これから,以下の2点で研究進める.1.解の精度を高めるメタ戦略を提案する.構築型解法は解を探索するタイプの手法ではないため一度適用しただけでは十分よい精度の解が得られない場合がある.本研究では,この点を解決すべく次の2点について研究を実施する.(a)構築型解法では,アイテムを配置する順序が重要である.本研究では,アイテム固有の性質を考えた配置順序を考案することで単純な構築型解法より遥かに精度の高い解を得ることを目指す.(b)配置順序を探索空間とした局所探索型の解法やメタ戦略などのような与えられた計算時間内にできる限りのパフォーマンスを発揮する反復改善型の解法設計を狙う.2.社会に現れる実際の問題へ適用する.現実の応用に頻繁に現れる複雑な制約を抽出し,それを含む三次元配置問題をモデル化する.そして,新たな制約の性質を分析し,分析結果に基づいて開発した高精度解法を新たな制約の付加されたモデルに適用できるように拡張する.本研究ではまず2次元(2D)図形配置問題に対する研究し,そして,直方体配置問題に対する研究成果の知見を利用して,2D図形配置問題の解法を3次元物体配置問題に拡張することを検討する.まず,ビットマップ形式で入力された2D図形のストリップパッキング問題を考える.ビットマップ形式は粒度を細かくして多くのビットを用いて図形を表現すれば高い精度で任意の図形を表現でき,一般の形状を対象とするパッキング問題を高精度で近似的に解くことが出来る.一方,図形形状の近似精度を高めるためにビット数を多くすると,各軸のビット数に対して全体のビット数は2乗のオーダーで増加するため,計算量が大きくなってしまう.本研究では,ビット数が増えても図形を表現するデータ量がこのように大幅に増えないような表現方法を提案した.とくに,入力された図形がy単調であるという性質を満たす場合は各軸のビット数に対して図形を表現するデータ量が線形オーダーでしか増えないことを証明した.これらを用いた構築型解法を提案した.次は,厳密解法の研究により,配置問題の性質を見抜けるため,曲線を含む図形垂直もしくは水平線分で描かれるレクトリニア図形に対する厳密解法を提案した.レクトリニア図形を長方形の集合で表現できるため,図形の重なりを容易に判定することができる.本研究では,まず,レクトリニア図形を幅1の長方形に分解し,分解されたそれらの長方形の相対的位置を緩和した配置問題を考え,整数計画問題として定式化した.この緩和問題を解くことで,元問題の下界を得ることができる.さらに,緩和問題の解を利用し,元問題の上界を求める手法を提案した.そして,これらの手法を用いた厳密解法を提案した.

ベンチマーク問題例に対する計算実験を行い,提案手法の効果を確認した.また,いくつの問題例に対しては最適解を得ることができた.今年度は予定とおり,2次元(2D)図形配置問題に対する研究を行った.まず,図形を効率よく表現方法を提案した.その結果,入力された図形がy単調であるという性質を満たす場合は各軸のビット数に対して図形を表現するデータ量が線形オーダーでしか増えないことを証明した.その結果を利用し,高効率の構築型解法を提案し,ベンチマーク問題例に対する計算実験を通して提案手法の効果を確認した.既存研究では100個程度の図形の配置に1200秒以上かかるのに対し,本研究の手法は,図形数が約1万個ある問題例に対しても100秒以内で良質の解を構築できた.なお,レクトリニア図形配置問題の性質を分析し,厳密解法を提案した.まず,レクトリニア図形を幅1の長方形に分解し,分解されたそれらの長方形の相対的位置を緩和した配置問題を考え,整数計画問題として定式化した.この緩和問題を解くことで,元問題の下界を得ることができる.さらに,緩和問題の解を利用し,元問題の上界を求める手法を提案した.上界を求める際に,分枝限定法と動的計画法を組み,計算時間を削減した.これらの手法を用いた厳密解法の性能を,ベンチマーク問題例を用いて計算実験で検証した.いくつの問題例に対しては現実的な時間で最適解を得ることができた.三次元レクトリニア多面体配置問題は,直方体の容器にレクトリニア多面体を配置する問題である.三次元レクトリニア多面体とは,三次元の多面体で,各面がxy平面,yz平面,zx平面のいずれかと平行であるものをいう.本研究では,二次元レクトリニア図形配置問題と三次元直方体配置問題に対する成果を拡張することを検討した.任意の物体はレクトリニア多面体に近似することは可能であるが,その近似の精度に応じて,アイテムを表現するための複雑度が高くなる.開発する解法の性能が,このような複雑度の増大に敏感にならないようにアルゴリズム上で主にデータ構造の面からの工夫を行った.解法としては,何も配置されていない状態から始めて,アイテムをひとつずつ配置していき,最後に解を得るという構築型解法を開発した.解法の計算過程で動的に変化するアイテムの配置を効率よく保持するデータ構造を設計して,計算時間を削減した.既存研究のほとんどが直方体配置問題に対するものである.直方体は扱いが容易であるため,大規模な問題例にも適用できる高速なアルゴリズムも提案されている.一方,形状が複雑ため,三次元物体配置問題に対する研究は少なく,小規模な問題例に対するものに限られており,大規模な問題例に対する研究は申請者の知る限りこれまで行われていない.多面体数3000を超える規模の問題例に対するこのような実証実験は本問題では他に類を見ない.本研究の解法は,直方体配置問題や一般の多面体配置問題も特別な場合として扱えるという性質を持つため,様々な形状を持つ製品の配置問題に適用可能な汎用解法となる.さらに,提案した方法論が配置問題の基盤技術となり,配置を決定することが求められる問題(例えばトラックの荷物詰め込みを考慮した配送計画問題)に対するアルゴリズム設計に導入されることが期待できる.今年度は予定とおり,大規模な三次元物体配置問題について,研究を行った.まず,一般の物体を三次元レクトリニア多面体に近似する手法を提案した.また,二次元図形配置問題に対する知見を三次元物体に拡張した.
肢芽の未分化間充織細胞が合成するプロテオグリカン、PG-Mの構造と機能の解析

1.プロテオグリカン、PG-Mは軟骨組織の形成に先立ち、間充織凝集部位で特異的かつ一過性に発現する成分である。こうしたPG-Mの特異的な発現を制御する機構を明らかにする目的で、PG-Mのコア蛋白質をコードするゲノムDNAの解析を進めている。これまでにPG-Mの遺伝子として100kbに渡る領域を解析し、すべてのエクソンを同定した。更に転写開始点とポリA付加位置を解析し、その結果PG-Mの転写産物に見られる多様性は、選択的スプライシングによる多様性に加え、ポリA付加位置の違いによって生じていることが明らかになった。またプロモーター領域を解析する目的で転写開始点より10kb上流までをコードするゲノムDNAをクローニングし、一部塩基配列を決定した。その結果転写開始点より28bp上流にTATAボックスが確認され、更に上流に種々の転写制御因子が結合する可能性のある塩基配列が認められた。そして線維芽細胞を用いたCATアッセイの結果、転写開始点より上流200から400bp付近に強いプロモーター活性が認められた。現在更に、軟骨細胞の分化過程で働くプロモーター領域を同定する目的で、未分化間充織細胞に似た性質を示しインシュリンによって軟骨細胞に分化するマウスのテラトカルシノーマ由来の細胞株(ATDC-5)を用いてプロモーター解析を進めている。2. PG-Mが持つ生理的機能を明らかにする目的で、相同組換えによりPG-M遺伝子を破壊したマウスの作成を進めている。ES細胞にターゲッティングベクターを導入し、PG-M遺伝子に変異を起こしたES細胞を4クローン分離した。そのうちの1つのクローンについてキメラマウスの作成を試みたがキメラ個体の生殖細胞に変異が検出されず、現在残りの3つのクローンについて更にキメラマウスの作成を進めている段階である。