hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
インフルエンザウイルスの粒子形成機構

A型インフルエンザウイルスゲノムRNA分節のパッケージング機構を解明するため、NS RNA分節をモデルとしてパッケージングに必要な領域を同定した(16番目から56番目の塩基)。本年度はパッケージングに重要な塩基配列の同定を試みた。NS RNAの3'側27から56番目の塩基でパッケージング効率に影響を与える部分を詳しく調べたところ、27-35番目の塩基をアデニンに置換したNS-GFPのパッケージング効率は14.8%と減少したことから、翻訳領域の27-35番目の塩基はパッケージングに重要であることが示唆された。NS RNA分節のパッケージングに関与する特定の塩基配列を決定するために、シークエンス・トラップ法を用いて解析を行った。具体的には、これまでの解析で決定したNS-GFP分節のパッケージングに必要な領域を2つの領域(16-26番目、27-35番目)に分け、それぞれの塩基をランダムな配列に置き換えた変異NS-GFPを発現するプラスミドを作製した。また、HAとNSの両方の遺伝子産物(すなわち、HA、NS1、NS2)を産生するHA-NSタンデム分節を発現するプラスミドを作製した。これらのプラスミドを用いてリバース・ジェネティクス法で組換えウイルスを作製し、プラークを形成させた。GFP陽性プラークを回収し、ランダムな配列を導入した領域の塩基配列を解析した。16-26番目に関しては12個、27-35番目に関しては18個のGFP陽性プラークが得られた。これらのNS-GFP分節のランダム配列を導入した部分を解析した結果、各領域で保存された配列は見られなかった。すなわち、RNA分節が効率よくパッケージングされるためには、16-35番目の全体の配列が重要であることが示唆された。本研究から、NS RNA分節の効率のよいパッケージングには16-35番目の全体の配列が重要であることを明らかになった。A型インフルエンザウイルスは、その遺伝子として8本のRNA分節を持っている。しかし、これらのRNA分節のウイルス粒子へパッケージング機構は未だ明らかではない。各RNA分節は非翻訳領域と翻訳領域とに分かれている。本研究は、このRNA分節パッケージングの全容を解明することを目的として、NS RNA分節の翻訳領域の役割について調べた。翻訳領域にGFP遺伝子を挿入したNS::GFP RNAを発現するプラスミドを各種作製した。これらはそれぞれ異なる長さの翻訳領域を持っている。細胞内で、NS::GFP RNA、NS以外のウイルスRNA、そして10種類すべてのウイルス蛋白質をプラスミドから発現させて、人工的にウイルス様粒子を作製した。得られたウイルス様粒子を細胞に感染させた後、ウイルス陽性細胞の中でGFP陽性細胞が占める割合を求めることによりGFP遺伝子を持つウイルス様粒子の比率を算出した。翻訳領域をvRNAの3'と5'側に150塩基ずつ持つNS::GFP RNAを取り込んだウイルス様粒子は約70%であったが、翻訳領域をもたないNS::GFP RNAを持つウイルス様粒子の割合は、0.1%であった。一方、3'側に150塩基、5'側に30塩基の翻訳領域を、あるいは3'側に30塩基、5'側に150塩基の翻訳領域を持つNS::GFP RNAを取り込んだウイルス様粒子の割合はそれぞれ約30%であった。ところが、翻訳領域を3'側だけ150塩基もつNS::GFP RNAを取り込んだウイルス様粒子は約10%であったのに対して、5'側だけ150塩基もつNS::GFP RNAを取り込んだウイルス様粒子は約1%であった。NS RNA分節がウイルス粒子へ効率良く取り込まれるためには3'と5'側の翻訳領域も必要であった。また、vRNAの3'側の翻訳領域により重要な部分が存在することが示唆された。A型インフルエンザウイルスは、8種類のRNA分節をゲノムとして持っている。しかし、これらのRNA分節のウイルス粒子へのパッケージング機構は未だ解明されていない。それぞれのRNA分節は非翻訳領域と翻訳領域とに分かれており、NS RNA分節のウイルス粒子へのパッケージングには、非翻訳領域が必須であると報告されている。本研究はRNA分節パッケージングの全容を解明することを目的としている。昨年度までに、NS RNA分節の効率のよいパッケージングには翻訳領域が必要であることを明らかにした。本年度は非翻訳領域の重要性について解析を行った。翻訳領域をvRNAの3'と5'側に150塩基ずつ持ち、その間にGFP遺伝子を挿入した組換えNS RNAを発現するプラスミドを作製した。この組換えNS RNA分節の非翻訳領域を欠損させ、そのパッケージング効率を以下の方法で調べた。組換えNS RNA、NS以外のウイルスRNA、そして10種類すべてのウイルス蛋白質を細胞内でプラスミドから発現させて、人工的にウイルス様粒子を作成した。得られたウイルス様粒子を細胞に感染させた後、ウイルス陽性細胞の中でGFP陽性細胞が占める割合を求めることにより組換えRNA分節を持つウイルス様粒子の比率を算出した。非翻訳領域を持つ組換えNS RNAを取り込んだウイルス様粒子は、総感染性ウイルスの約74%であったが、非翻訳領域のvRNAの3'と5'側をもたない組換えNS RNAを持つウイルス様粒子の割合は、約1.3%であった。一方、5'側の非翻訳領域を欠損した組換えNS RNAを取り込んだウイルス様粒子は約47%であったのに対して、3'側の非翻訳領域を除いた組換えNS RNAを取り込んだウイルス様粒子は約5.7%であった。

NS RNA分節がウイルス粒子に効率良く取り込まれるためには非翻訳領域が必要であった。また、vRNAの3'と5'側の両方の非翻訳領域がその取り込みに必要であったが、3'側の非翻訳領域がより重要な役割をしていることが示唆された。A型インフルエンザウイルスゲノムRNA分節のパッケージング機構を解明するため、NS RNA分節をモデルとしてパッケージングに必要な領域を同定した(16番目から56番目の塩基)。本年度はパッケージングに重要な塩基配列の同定を試みた。NS RNAの3'側27から56番目の塩基でパッケージング効率に影響を与える部分を詳しく調べたところ、27-35番目の塩基をアデニンに置換したNS-GFPのパッケージング効率は14.8%と減少したことから、翻訳領域の27-35番目の塩基はパッケージングに重要であることが示唆された。NS RNA分節のパッケージングに関与する特定の塩基配列を決定するために、シークエンス・トラップ法を用いて解析を行った。具体的には、これまでの解析で決定したNS-GFP分節のパッケージングに必要な領域を2つの領域(16-26番目、27-35番目)に分け、それぞれの塩基をランダムな配列に置き換えた変異NS-GFPを発現するプラスミドを作製した。また、HAとNSの両方の遺伝子産物(すなわち、HA、NS1、NS2)を産生するHA-NSタンデム分節を発現するプラスミドを作製した。これらのプラスミドを用いてリバース・ジェネティクス法で組換えウイルスを作製し、プラークを形成させた。GFP陽性プラークを回収し、ランダムな配列を導入した領域の塩基配列を解析した。16-26番目に関しては12個、27-35番目に関しては18個のGFP陽性プラークが得られた。これらのNS-GFP分節のランダム配列を導入した部分を解析した結果、各領域で保存された配列は見られなかった。すなわち、RNA分節が効率よくパッケージングされるためには、16-35番目の全体の配列が重要であることが示唆された。本研究から、NS RNA分節の効率のよいパッケージングには16-35番目の全体の配列が重要であることを明らかになった。
ヒトiPS細胞由来の培養細胞を用いたプロポフォール注入症候群の機序の解明

ヒト人工多能性幹細胞由来神経細胞にプロポフォールが長時間作用した場合の影響を検討した。プロポフォール50μg/mlを48時間作用させると、NAD+/NADH比は40.1%、ATPは17.9%、生細胞プロテアーゼ活性は15.9%低下し、カスパーゼ3/7活性は24.0%上昇した。電子顕微鏡所見では、プロポフォール50μg/ml群でミトコンドリア分裂像やそれらを貪食するようなオートファゴソーム像、細胞質内の空胞化を認めた。ヒト神経細胞において、プロポフォールの高濃度かつ長時間の曝露により、電子伝達系の抑制によるミトコンドリア機能障害およびアポトーシスによる細胞毒性が誘起されることが示唆された。2016年度は、ヒト人工多能性幹細胞(iPSC)由来神経細胞を用いて、プロポフォールが培養神経細胞に与える影響を検討した。ヒトiPSC由来神経幹細胞を14日間培養し、神経細胞に分化させたものを使用した。神経細胞への分化は、βIII-TubulinとDoublecortinの発現により評価した。プロポフォール(2,10,50μg/ml)を48時間曝露した後、ATP産生、NAD+/NADH比、生細胞プロテアーゼ活性(細胞の生存率の指標)、カスパーゼ3/7活性(アポトーシスの指標)を測定した(各群n=4)。統計学的検討にはDunnettの多重比較検定を行い、P<0.05を有意とした。今回用いた細胞は、培養14日目に、βIII-TubulinとDoublecortinがともに発現陽性であった。10μg/ml群で、有意に生細胞プロテアーゼ活性の低下や細胞あたりのカスパーゼ3/7活性の上昇が起き始め、ミトコンドリアの活性を反映するNAD+/NADH比は24.6%(P<0.05)低下した。さらに50μg/ml群では、NAD+/NADH比は40.1%(P<0.01)、ATPは17.9%(P<0.05)それぞれ低下し、ミトコンドリアでのNADH利用障害とそれに並行するATP産生の低下を生じたと考えられる。生細胞プロテアーゼ活性15.9%低下(P<0.01)、カスパーゼ3/7活性24.0%上昇(P<0.05)も認められた。電子顕微鏡所見では、対照群に比べ、プロポフォール50μg/ml群において、ミトコンドリア分裂像やそれらを貪食するようなオートファゴソーム像、細胞質内の空胞化を認めた。ヒトiPSC由来神経細胞において、プロポフォールの高濃度かつ長時間の曝露により、電子伝達系の抑制によるミトコンドリア機能障害およびアポトーシスによる細胞毒性が誘起されることが示された。今年度はヒト人工多能性幹細胞(iPSC)由来神経細胞を用いて、プロポフォールが培養神経細胞に与える影響を検討し、一通りまとまった結果を得ることができた。プロポフォールの長時間大量投与による毒性の機序は、症例報告や動物実験・動物細胞実験を通じて検討されている。しかし、ヒト細胞に対する影響は未だ十分解明されておらず、ヒト培養細胞での実験系も確立されていない。そこで我々は、ヒト人工多能性幹細胞(iPSC)由来神経細胞を用いて、プロポフォールが培養神経細胞に与える影響を検討した。

電子顕微鏡所見では、プロポフォール50μg/ml群でミトコンドリア分裂像やそれらを貪食するようなオートファゴソーム像、細胞質内の空胞化を認めた。ヒト神経細胞において、プロポフォールの高濃度かつ長時間の曝露により、電子伝達系の抑制によるミトコンドリア機能障害およびアポトーシスによる細胞毒性が誘起されることが示唆された。2016年度に得られた結果を論文発表としてまとめる方針とし、追加実験等が必要となった場合には随時施行する。麻酔科学2016年度における研究を終了した段階で、若干の端数として残高が発生したため、2017年度の試薬購入資金として、繰越すこととした。培地および細胞培養に必要な培養容器等の購入費用に充てる予定である。
契約終了形態の多様化に関する法理の研究－日本・ドイツ・スイスの比較法的検討

第一に,「契約貫徹」「契約終了」「契約変容」の3類型について,ドイツ民法(BGB)に焦点を当てつつ,その諸相と境界画定に関する検討を行った。この作業を通じて,類型相互の境界が相対化されるに至っており,必ずしも明確な基準が形成されていない点が明らかとなった。第二に,「契約変容」類型の具体的な現れ方について,特に医療契約を中心に分析を行った。その結果として,従来とは異なる契約類型の把握と,変容の契機につき一定の知見を得ることができた。本研究は,「契約貫徹型」(「貫徹類型」)と「契約解消型」(「解消類型」)に基本的に整理される,広義の履行障害規範の法的効果に,第三類型としての「契約変容型」(「変容類型」)とでも称すべきモデルを構築し、その理論的基盤の確立と各類型の割当基準の明確化を主たる目的とする。従前の研究の遂行状況から,同研究には,比較法的知見を伴った,以下に示す双方のアプローチを展開していくことが肝要であるとの認識を得た:すなわち,(1)総論的課題ー特に,履行請求・第一次的義務の消滅・解除・履行利益賠償・代金減額・契約適合といった法的効果の横断的分析,(2)各論的課題ー各種契約における具体的な「契約変容」要請の実相とその現象形態の分析,である。2013年度は,このうち,(1)総論的課題における,履行不能に伴う第一次的義務の消滅と行為基礎の喪失(事情変更の原則)に基づく契約適合請求権との関係について,その考察を深める一方,(2)各論的課題としては,診療契約を中心に,契約変容の契機を探ることに注力した。(1)につき,ドイツ法においては,法改正により一応の決着を目論んだにもかかわらず,むしろBGB275条2項(いわゆる「給付困難」)と,BGB313条(行為基礎の喪失)との関係がなお活発に議論されていること,そこでは両者の境界画定議論や根拠論の深化が看取され,その中心が履行障害規範の本質論にまで遡っていることが明らかとなった。(2)では,従前から指摘されている診療契約上の転送義務の他,保険診療と自由診療との関係を巡る問題(特に保険診療から自由診療への移行の問題)が,本研究の視点からも重要である点が,その成果として挙げられる。現在,かかる問題群につき更に理解を深めると共に,前年度に得られた研究成果を然るべき媒体に公表すべく,その準備作業に取り組んでいる段階にある。本研究は,「契約貫徹型」(「貫徹類型」)と「契約解消型」(「解消類型」)とに基本的に整理される,広義の履行障害規範の法的効果に,第三類型としての「契約変容型」(「変容類型」)とでもいうべきモデルを構築し、その理論的基礎の確立と割当基準の明確化を主たる目的とするものである。本研究においては,比較法的知見を基礎としつつ,以下に示す2つのアプローチから研究を展開することが重要との認識を得た。すなわち,(1)総論的課題:特に,履行請求・第一次的義務の消滅・解除・履行利益賠償・代金減額・契約適合といった法的効果の横断的分析,および(2)各論的課題:各種契約における具体的な「契約変容」要請の実相とその現象形態の分析である。2014年度は,一方で,(1)の中でも,解消類型の典型モデルと変容類型との差異に関するドイツ法の議論を中心に検討を加えた。具体的には,履行不能に伴う第一次的義務からの解放(とりわけBGB275条2項)と行為基礎の喪失(事情変更の原則)に基づく第一次的義務の変容(契約適合請求権:BGB313条)との関係性につき,引き続き検討を加えた。その結果,ドイツにおいては,この両規範の射程につき多くの議論があり,いまだ統一的な見解に至ってはいないことが明らかとなった。他方,(2)としては,昨年度に引き続き,医療契約を中心にその変容の契機を探ることに注力した。とりわけ,従前においては,保険診療と自由診療とは医療契約という同一のバリエーションに過ぎないという理解が中心であったように思われるところ,むしろ,それらの債務内容に照らすと,両契約を別の契約類型として観念した方が,体系的適合性を有することが明らかになった。現時点では,議論の整理と方向性を指し示すことがより容易な(2)に関する問題群について,差し当たりの成果を公表すべく,その執筆作業に取り掛かっている段階にある。本研究は,「契約貫徹型」(「貫徹類型」)と「契約解消型」(「解消類型」)とに基本的に整理される,広義の履行障害規範の法的効果に,第三類型たる「契約変容型」(「変容類型」)とでもいうべきモデルを構築し、その理論的基礎の確立と割当基準の明確化を主たる目的とする。本研究では,比較法的知見を基礎に,(1)総論的課題と(2)各論的課題という,2つのアプローチから研究を展開することが有益であるとの想定のもと,各アプローチにつき順次研究を進めた。(1)については,特に,履行請求・第一次的義務の消滅・解除・履行利益賠償・代金減額・契約適合といった法的効果の横断的分析をその中心とした。他方,(2)では,具体的な契約局面における「契約変容」要請の実相とその現象形態の分析が中核となる。20142015年度は,(1)の中でも,解消類型の典型モデルと変容類型との差異に関するドイツ法の議論を中心に扱った。

具体的には,履行不能に伴う第一次的義務からの解放(とりわけBGB275条2項)と行為基礎の喪失(事情変更の原則)に基づく第一次的義務の変容(契約適合請求権:BGB313条)との関係性につき検討を加えた。ドイツでは,この両規範の射程につき多くの議論があり,いずれを優先的に適用すべきかという基本的な問題についてすら,いまだ統一的な見解に至ってはいないことが判明した。2015年度は,同時に,(2)の分析を更に深めた。具体的には医療契約を念頭に置き,契約変容の契機を探ることとした。また,その前提事項たる保険診療契約と自由診療契約との関係性についての分析を施し,両契約の差異について一定の知見を得た。2016年度は,大よその方向性が明確となった(2)の問題群につき,成果公表の準備を進めると共に,残された時間で,(1)の積み残し課題,とりわけ代金減額請求権の法理論的性質につき,なお検討を加えることを予定している。昨年度は,研究代表者の在外研究期間(ドイツ・ミュンスター大学:2013年10月から2014年9月)の成果を整理することに時間を費やした。ドイツにおける受入教員(Prof. Dr. Ingo Saenger)との面談・議論,また,ドイツでの資料収集の結果として,従来,必ずしも意識できていなかった新たなテーマの存在やそのアプローチなどにつき,貴重な示唆を得ることができたため,研究計画に照らしてその内容をどのように組み込み,また,どのような方向で検討するかが中心課題となった。本研究計画の具体的分析のために医療契約を中心に据えること,また,医療契約の中でも保険診療契約と自由診療契約とでは,契約構造論の視点から看過しえない相違があり,この点が契約変容の契機に関しても大きく作用することなどが,その成果である。もっとも,在外研究からの帰国後は,様々な本務校の積み残し課題を早急に処理する必要に迫られ,かつ,昨年度からは学内の諸業務に時間を取られる事態に陥ったため,在外研究時の成果をいまだ完全には整理分析することができていない。その意味で,当初予定されていた計画よりも遅れが出てしまっている。しかしながら,一昨年度の後半に北海道大学社会法研究にて,また,昨年度は新潟大学民事法研究会・公法研究会(共催)にて研究成果を報告し,有益な示唆を得られたりするなど,研究成果の一部につき公表する準備はほぼ整った。まずは,この点について世に問うべく作業を進めると共に,他方で,本研究の残部についても研究を継続し,当初予定からの遅れを挽回するよう邁進する所存である。本研究は,第一類型としての「契約貫徹型」(「貫徹類型」),第二類型としての「契約解消型」(「解消類型」)に基本的に整理される,広義の履行障害規範の法的効果に,第三類型としての「契約変容型」(「変容類型」)とでもいうべきモデルを構築し、その理論的基礎の確立と割当基準の明確化を主たる目的とするものである。本研究は,以下の2つの課題に沿って展開されることを基礎に据えている。すなわち,(1)総論的課題として,特に履行請求・第一次的義務の消滅・解除・履行利益賠償・代金減額・契約適合といった法的効果の横断的分析である。また,(2)各論的課題として,各種契約における具体的な「契約変容」要請の実相とその現象形態の分析である。2014年度は,一方で,(1)の中でも,第二類型と第三類型との差異に関するドイツ法の議論を中心に検討を加えた。
次世代高エネルギー密度型リチウムイオン電池およびナトリウムイオン電池用正極材料

昨年度より継続し、A+2M2+O2およびA+3M2+O2.5 (A: Li, Na, K; M: Mn, Fe, Co)およびポリアニオン系化合物の検討を進めた。オキシフッ化リン酸塩については、高圧を印加することで従来知られていなかった高圧相のNa2CoPO4Fを創生し、その結晶構造と磁気特性について報告を行った。これは、昨年度進めた高容量型の正極材料として期待されるNa2MPO4F (Mn, Fe, Co, Ni)を含む一連のオキシフッ化リン酸塩の合成と結晶構造について研究を拡張した成果である。さらにその関連化合物であるCo2PO4Fについても、結晶構造を報告し受理された。これらのCo系遷移金属系化合物は、新規な遷移金属系材料群開発の端緒になると期待している。さらに昨年度国際誌で報告したLi9Mg3[PO4]4F3とLi2MgPO4Fのイオン伝導機構について、リチウム電池国際会議で報告を行った。このように、種々の材料探索を積極的に進める中で、銅系のバナジン酸化合物が250 mAh/g以上という秀でた高容量特性を示すことを発見し、特許として出願した。現在投稿論文の作成を進めているところである。当初の目的の一つであったナトリウムイオン電池用正極材料の開発には至らなかったが、関連するNa含有複合酸化物を創生し、この分野の発展に寄与できたと思われる。とくに、リチウムイオン電池用正極材料については新規な材料を論文、国際会議、特許として報告するなど大きな進展を示すことに成功した。新しいコンセプトであったA+2M2+O2およびA+3M2+O2.5系材料で有効な正極材料は見出すことができなかったが、種々の磁性を示す新規な化合物を創生した。そのいくつかについては、オーストラリアの研究機関ANSTOにおいて、中性子線回折による実験を実施しており、本報告書に加えて更なる論文投稿の準備作業を継続している。26年度が最終年度であるため、記入しない。新規なアルカリイオン電池を提案するため、種々の酸化物を中心に電極材料を探索している。本研究開始前のスクリーニングで選択したA^+2M^<2+>O_2およびA^+_3M^<2+>O_<2.5>(A:Li, Na, K;M:Mn, Fe, Co)系はトンネル構造を有しており、正極材料として有望であると考えている。福岡で開催された第53回電池討論会バルセロナで開催されたInternational Battery Association meeting 2013において国内外の最新の研究動向を調査したところ、上記の化合物に関する先行研究は存在しない事が確認できた。その一方で、鉄オリビン(LiFePO_4)を端緒としたポリアニオン系の化合物に関する研究が、ケイ酸塩などへとそのすそ野を広げつつある。そこで、A^+_2M^<2+>O_2およびA^+_3M^<2+>O_<2.5>系に加え、本研究においても新規なポリアニオン系材料の創成も視野に入れる事とした。本年度においては、A^+_2M^<2+>O_2およびA^+_3M^<2+>O_<2.5>系の合成条件の検討を進めているものの、短い期間であったため残念ながら的確な合成条件を得るに至っていない。ポリアニオン系では硫酸塩や亜硫酸塩についての検討を行ったところ、電極材料としての有効性は確認できなかったものの3種のMn系化合物Mn_2(OH)_2SO_3、Mn_2F(OH)SO_3、Mn_5(OH)_4(H_2O)_2[SO_3]_2[SO_4]を見出し、その合成と結晶構造についてDalton Transactionsへ投稿し受理された。掲載は、次年度になる予定である。特に、Mn_5(OH)_4(H_2O)_2[SO_3]_2[SO_4]は無機亜硫酸硫酸塩として初めての報告例であり、新しい物質群開発へのきっかけになる事を期待している。新規な正極材料として、A^+_2M^<2+>O_2およびA^+_3M^<2+>O_<2.5>(A : Li, Na, K ; M : Mn, Fe, Co)およびオキシフッ化物、ポリアニオン系複合酸化物の検討を進めた。A^+_2M^<2+>O_2およびA^+_3M^<2+>+O_<2.5>については、遷移金属イオンの価数が2価であり、その比較的低い価数を維持する合成プロセスが重要である。そこで、酢酸塩等の出発原料を用い、水熱合成や封入法による合成を試みた。平成25年度末時点で、目標とする組成の化合物の創生には至らないものの、M(OH)F(M : Mn, Fe, Co)系化合物の合成に成功しその結晶構造と磁気特性について報告した。さらに、HをLiで置換えたLi含有化合物の可能性についても検討を進めた。ポリアニオン系については、新規な亜硫酸硫酸塩であるMn_6(OH)_4(H_2O)_2[SO_3]_2[SO_<-4>]を含んだ3つの相の水熱合成について報告た。

さらに、高容量型の正極材料として期待されるNa_2MPO_4F(Mn, Fe, Co, Ni)を含む一連のオキシフッ化リン酸塩の合成と結晶構造について、新規な知見を加えReviewを行った。これらの成果は、まだ未開拓な電極材料の存在について重要な示唆を与えるものであり、さらなる展開が期待される。一方で、代表的な正極材料であるLicoO_2について、結晶学的見地から解析を行い、今まで不明確であった充放電に伴う結晶構造の相転移について統一的な解釈を行った。これにより、層状岩塩型と呼ばれる一群の正極材料の充放電機構を解釈するうえで、重要な知見を提供したことになる。2013年12月にボストンで開催された材料科学会(2013MRS Fall Meeting)において、オキシフッ化リン酸塩の合成と結晶構造と電気化学特性について成果発信を行った。昨年度より継続し、A+2M2+O2およびA+3M2+O2.5 (A: Li, Na, K; M: Mn, Fe, Co)およびポリアニオン系化合物の検討を進めた。オキシフッ化リン酸塩については、高圧を印加することで従来知られていなかった高圧相のNa2CoPO4Fを創生し、その結晶構造と磁気特性について報告を行った。これは、昨年度進めた高容量型の正極材料として期待されるNa2MPO4F (Mn, Fe, Co, Ni)を含む一連のオキシフッ化リン酸塩の合成と結晶構造について研究を拡張した成果である。さらにその関連化合物であるCo2PO4Fについても、結晶構造を報告し受理された。これらのCo系遷移金属系化合物は、新規な遷移金属系材料群開発の端緒になると期待している。さらに昨年度国際誌で報告したLi9Mg3[PO4]4F3とLi2MgPO4Fのイオン伝導機構について、リチウム電池国際会議で報告を行った。このように、種々の材料探索を積極的に進める中で、銅系のバナジン酸化合物が250 mAh/g以上という秀でた高容量特性を示すことを発見し、特許として出願した。現在投稿論文の作成を進めているところである。当初の目的の一つであったナトリウムイオン電池用正極材料の開発には至らなかったが、関連するNa含有複合酸化物を創生し、この分野の発展に寄与できたと思われる。とくに、リチウムイオン電池用正極材料については新規な材料を論文、国際会議、特許として報告するなど大きな進展を示すことに成功した。新しいコンセプトであったA+2M2+O2およびA+3M2+O2.5系材料で有効な正極材料は見出すことができなかったが、種々の磁性を示す新規な化合物を創生した。そのいくつかについては、オーストラリアの研究機関ANSTOにおいて、中性子線回折による実験を実施しており、本報告書に加えて更なる論文投稿の準備作業を継続している。26年度が最終年度であるため、記入しない。本研究は、次世代のアルカリイオン電池用正極材料の創成を目指すものである。スクリーニングによっていくつかの候補材料について検討を進めているが、現在まで非常に短期間であったためまだ有用な材料の開発には至っていない。新規な電極材料の創出という野心的なテーマを設定している中で、いくつもの新化合物を発見しその特性について国際学術誌で論文を多数発表していることは順調に進捗していると評価される。さらに、既知の化合物について結晶学的な見地で新たな評価を与えたことは、電池の研究者への貢献も大きい。基本的な研究の推進方策は当初計画通りで変更はしない。
タンパク質の構造異常に関わるストレス応答ダイナミクスの評価

本申請課題では,次世代型ナノバイオチップによるタンパク質のストレス応答ダイナミクスの解析・構造異常性の機構解明を目指す.そのため,以下の項目に分けて検討した.1.リポソームのナノバイオチップへの応用リポソームの誘電分散解析を行ない,数10MHz付近に現われる誘電緩和がリン脂質分子の軸回転運動,ならびに脂質膜の流動性に対応することがわかった.この緩和特性とリポソームの膜特性((i)膜流動性,(ii)電荷密度,(iii)面・局所的疎水性)との間に対応関係を見出すことができた.さらに熱・pHなどのストレス条件下での誘電特性を評価し,リポソームのストレス応答特性データベース化を行なった.2.タンパク質のストレス応答の評価タンパク質をセンサ素子であるリポソームと共存させると,リポソームの緩和周波数の変化が認められた.リポソームの膜特性を表す緩和周波数の変化から,相互作用している各種タンパク質の変性/巻き戻り過程・多量体化・二次構造の変化の過程に関する情報をon-lineで得ることができた.また,1.で得たデータベースに基づき,電解質封入リポソームを固定化した電極を作成し,タンパク質との相互作用で誘導される電解質の漏出を電気化学的に計測することで,多変量解析によるパタン解析への展開の可能性も示す事ができた.タンパク質の構造状態を解析することができた.これらの手法を併用することで,れゆえ,生体膜上でのアミロイド性タンパク質の構造異常化に関するオンラインモニタリングの可能性を示す事ができた.生細胞と同様のストレス応答挙動を示す「リポソーム」とは、生体由来の両親媒性分子により自発的に形成される細胞様の秩序構造であり、脂質二重膜・超分子集合体である。その母体になる二分子膜構造は主として脂質分子疎水性鎖間の疎水結合により形成され、柔軟な構造をもち、表面における変性タンパク質との相互作用・リフォールディング、物質透過の制御、生体分子の可溶化などの生体膜に類似した重要なストレス応答機能を有する。平成14年度では、主としてストレス条件下で変性したタンパク質と、脂質二重膜・超分子集合体との静的・動的な相互作用に関する定量的な知見を蓄積し,誘電分散解析による膜界面のミクロ構造を解析・評価し,タンパク質との相互作用を多角的に評価することに成功した.(1)脂質膜(リポソーム)をセンサ素子とし、ストレス負荷条件での変性タンパク質との相互作用解析から、モデル細胞へのストレスを誘電率変化より評価した。このとき細胞膜誘電率・流動性動的解析システム(高感度インピーダンスアナライザー)を用いて、誘電率の周波数特性(誘電スペクトロスコピー)の高速・高精度・非定常測定に関するシステムを開発した。これにより従来法では定量的な評価が困難であった、ストレス条件での脂質膜と変性タンパク質との相互作用を解析する事が可能となった。(2)ストレス条件下で示す脂質膜・タンパク質の動的・非定常の応答得特性をデータベース化し,ストレス条件下で二次構造が特異的に変化するタンパク質を中心に,データを体系的・定量的に評価した.その結果,本データベースの量的拡充により,多変量解析に基づいて,タンパク質の構造異常性・アミロイド性の予測への展望を拓いた.次年度は,特に,(2)について詳細に検討を進める予定である.本申請課題では,次世代型ナノバイオチップによるタンパク質のストレス応答ダイナミクスの解析・構造異常性の機構解明を目指す.そのため,以下の項目に分けて検討した.1.リポソームのナノバイオチップへの応用リポソームの誘電分散解析を行ない,数10MHz付近に現われる誘電緩和がリン脂質分子の軸回転運動,ならびに脂質膜の流動性に対応することがわかった.この緩和特性とリポソームの膜特性((i)膜流動性,(ii)電荷密度,(iii)面・局所的疎水性)との間に対応関係を見出すことができた.さらに熱・pHなどのストレス条件下での誘電特性を評価し,リポソームのストレス応答特性データベース化を行なった.2.タンパク質のストレス応答の評価タンパク質をセンサ素子であるリポソームと共存させると,リポソームの緩和周波数の変化が認められた.リポソームの膜特性を表す緩和周波数の変化から,相互作用している各種タンパク質の変性/巻き戻り過程・多量体化・二次構造の変化の過程に関する情報をon-lineで得ることができた.また,1.で得たデータベースに基づき,電解質封入リポソームを固定化した電極を作成し,タンパク質との相互作用で誘導される電解質の漏出を電気化学的に計測することで,多変量解析によるパタン解析への展開の可能性も示す事ができた.タンパク質の構造状態を解析することができた.これらの手法を併用することで,れゆえ,生体膜上でのアミロイド性タンパク質の構造異常化に関するオンラインモニタリングの可能性を示す事ができた.
キルティング製造条件がキルティング布の特性に与える影響-保温性,透湿性,通気性を中心にして-

試料は縫合布に綿ブロード、中綿にポリエステルの中綿用不織布を選択した。試料は45×45cmのサイズで裁断し、中綿の重ね枚数は13枚、ステッチ線間隔(縫目線間隔)は2,4,6cmの3段階、縫製方向は地糸方向及びバイアス方向、縫製張力は2段階の構成条件を設定し、これらの条件を組み合わせて計15種類のキルティング布を制作した。保温率は中綿の重ね枚数が増し、ステッチ線間隔が広くなるにしたがって高くなることがわかった。また縫製張力が高い場合については若干保温率は低くなり、縫製方向の違いによる影響は顕著ではなかった。赤外放射温度計による測定から、キルティング布の表面温度ステッチ線部分が最も高く、ステッチ線とステッチ線の中央に向かって徐々に温度は低下していった。つまりステッチ線に沿って高温部が現れ、この部分が特に熱の放散に大きく寄与していることがわかった。一方、透湿性は中綿の重ね枚数が増加し、ステッチ線間隔が広くなるにつれて低下する傾向がみられた。このようにキルティング布の特性は特に中綿の重ね枚数とステッチ線間隔の影響を大きく受けることが示された。そこでこれらの点を定量的に把握するために、キルティング布の断面形態から近似的に平均厚さを算出し、保温率及び透湿率との関係を検討した結果、平均厚さとの間には高い相関があることがわかった。通気性はフラジ-ル型及びKES試験機により測定したが、はっきりした傾向が得られなかった。このことは中綿の重ね枚数を増やすことによって、試験機のクランプからの空気の流入の影響が大きくなったためと考えられる。今後は、試料の把持方法あるいは試験方法を再検討する必要があると思われる。
情報論的手法に基づく知識探索アルゴリズムの構築

当年度の研究では,限られた試行回数で探索すべき候補を適切に選択する問題である多腕バンディット問題において情報論的手法に基づいた効率的なアルゴリズムの開発を行った.多腕バンディット問題のうち累積報酬の最大化を目指さない純粋探索問題の枠組みでは最適腕識別が代表的な設定として知られているが,この問題では探索回数の下限すら非現実的な大きい値となることが多く,必ずしも実用に適さない.そこで本研究では,真に報酬期待値最適な候補を選ぶのではなく,報酬期待値が事前に定めたしきい値を上回る候補を可能な限り早く発見する問題を良腕識別問題として新たに構成した.さらに,この問題が純粋探索問題に属するにも関わらず累積報酬最大化と類似の構造をもつことを明らかにし,その性質を利用することで探索回数についての情報論的理論限界およびそれを達成するアルゴリズムを構成した.この結果は機械学習のトップ論文誌であるMachine Learning誌に採録された.さらに,これらのバンディットアルゴリズムの医療等への応用を考えた場合,各時刻で選択する候補は薬や治療法といったものが対応することになるが,それらの場面ではその報酬が量的でなく「完治」「効果あり」「効果なし」といったように質的にのみ観測される場合が多い.そこで,こういった質的な報酬から各候補の良し悪しを定量化する方法を社会学における手法に基づいて構築し,情報論的限界を達成するアルゴリズムを構成した.さらに,多くの場面で経験的に性能がよいことが知られているトンプソンサンプリングとよばれるアルゴリズムが本設定では場合によっては非常に性能が悪くなることを理論的に示し,本問題特有の性質を用いる重要性を示唆した.この結果は機械学習のトップ会議であるAAAI2019に採録された.当年度の研究では良腕識別という試行回数が非常に限られた場面に適した場合における効率的な枠組みを構築できただけでなく,定性的な観測を扱うアルゴリズムの構成という予期せぬ結果も得られており,この部分では予想を上回る進捗状況となった.一方,これらの手法では従来手法に比べて性能の上下界のギャップを大幅に縮めているものの,未だそのギャップは漸近論が成り立たない場面では比較的大きく,なお改善の余地がある状況である.これまでの研究状況を踏まえ,今後の研究ではより現実的な設定に適したアルゴリズムの開発および理論限界の構成を行う.本研究のこれまでの結果および既存研究から,理論限界に近い性能をもつアルゴリズムでは計算量的に難しい最適化問題が現れることが多いことが分かってきている.特に,これまで知られてきた漸近最適アルゴリズムの多くは理論限界の推定値を明示的に計算するという部分をサブルーチンとしており,このような種類のアルゴリズムでは理論限界自体が最適化問題として表される場合にはその時点で非現実的な計算量となってしまう.それに対して,トンプソンサンプリングといった乱択手法を用いるアルゴリズムでは最適化問題によってのみ表されるような理論限界を最適化計算なしに達成できる場合があることが知られているが,一方で単純なトンプソンサンプリングは理論限界を達成しない設定が数多くあることも分かってきている.そこで次年度の研究では,最適化問題を明示的に解くのを避けつつかつ広範な問題に適用可能なアルゴリズムの開発を乱択手法の性質を適切に抽出することで行う.当年度の研究では,限られた試行回数で探索すべき候補を適切に選択する問題である多腕バンディット問題において情報論的手法に基づいた効率的なアルゴリズムの開発を行った.多腕バンディット問題のうち累積報酬の最大化を目指さない純粋探索問題の枠組みでは最適腕識別が代表的な設定として知られているが,この問題では探索回数の下限すら非現実的な大きい値となることが多く,必ずしも実用に適さない.そこで本研究では,真に報酬期待値最適な候補を選ぶのではなく,報酬期待値が事前に定めたしきい値を上回る候補を可能な限り早く発見する問題を良腕識別問題として新たに構成した.さらに,この問題が純粋探索問題に属するにも関わらず累積報酬最大化と類似の構造をもつことを明らかにし,その性質を利用することで探索回数についての情報論的理論限界およびそれを達成するアルゴリズムを構成した.この結果は機械学習のトップ論文誌であるMachine Learning誌に採録された.さらに,これらのバンディットアルゴリズムの医療等への応用を考えた場合,各時刻で選択する候補は薬や治療法といったものが対応することになるが,それらの場面ではその報酬が量的でなく「完治」「効果あり」「効果なし」といったように質的にのみ観測される場合が多い.そこで,こういった質的な報酬から各候補の良し悪しを定量化する方法を社会学における手法に基づいて構築し,情報論的限界を達成するアルゴリズムを構成した.さらに,多くの場面で経験的に性能がよいことが知られているトンプソンサンプリングとよばれるアルゴリズムが本設定では場合によっては非常に性能が悪くなることを理論的に示し,本問題特有の性質を用いる重要性を示唆した.この結果は機械学習のトップ会議であるAAAI2019に採録された.当年度の研究では良腕識別という試行回数が非常に限られた場面に適した場合における効率的な枠組みを構築できただけでなく,定性的な観測を扱うアルゴリズムの構成という予期せぬ結果も得られており,この部分では予想を上回る進捗状況となった.一方,これらの手法では従来手法に比べて性能の上下界のギャップを大幅に縮めているものの,未だそのギャップは漸近論が成り立たない場面では比較的大きく,なお改善の余地がある状況である.これまでの研究状況を踏まえ,今後の研究ではより現実的な設定に適したアルゴリズムの開発および理論限界の構成を行う.

本研究のこれまでの結果および既存研究から,理論限界に近い性能をもつアルゴリズムでは計算量的に難しい最適化問題が現れることが多いことが分かってきている.特に,これまで知られてきた漸近最適アルゴリズムの多くは理論限界の推定値を明示的に計算するという部分をサブルーチンとしており,このような種類のアルゴリズムでは理論限界自体が最適化問題として表される場合にはその時点で非現実的な計算量となってしまう.それに対して,トンプソンサンプリングといった乱択手法を用いるアルゴリズムでは最適化問題によってのみ表されるような理論限界を最適化計算なしに達成できる場合があることが知られているが,一方で単純なトンプソンサンプリングは理論限界を達成しない設定が数多くあることも分かってきている.そこで次年度の研究では,最適化問題を明示的に解くのを避けつつかつ広範な問題に適用可能なアルゴリズムの開発を乱択手法の性質を適切に抽出することで行う.
ヌクレアーゼ抵抗性ヌクレオシドを搭載した細胞標的化機能性一本鎖核酸の創出

核酸医薬の細胞・組織標的化を目的にした。(1)肝臓で高発現しているmicroRNA-122に対するアンチセンス分子をヌクレアーゼ抵抗性ヌクレオシドで合成し、肝臓標的化能に優れるpH応答性カチオン性脂質から作製したリポソームに搭載しマウスに静脈注射した。その結果、microRNA-122で抑制されていたmRNAs量が回復し、血中コレステロールの低下が約2週間持続した。(2)エピジェネティックスで重要なDNA CpG配列の選択的メチル化酵素阻害剤を開発し、前立腺ガンに高発現しているPSMAを標的とするリガンドを結合した。この阻害剤はPSMA発現前立腺ガン細胞選択的に増殖抑制活性を示した。1)shRNAは内在性RNAから生成し、細胞質でDicerによりループ部分が切断されsiRNAとして機能する。一般にshRNAを外部投与する場合は、ベクター型で投与し、shRNAそのものとして投与する例は極めて少なく、化学修飾研究もほとんど行われていない。そこで、ヌクレアーゼ抵抗性、血中滞留性、細胞・組織標的化能を付与すべく本研究を開始した。まず、標的としてルシフェラーゼ遺伝子を選択し、ループ部分の変換、とステム部分5'末端の短鎖化を検討した。ループ部分を6mer-9merのTを用いる場合と、エチレングリコール(PEG)ループにしたshRNAs(55mer、3'末端2mer overhang)を化学合成しルシフェラーゼ強制発現HeLa細胞を用いて活性を比べたところ、PEG化すると活性の減弱が激しかった。一方、Tループ体(9merが最適)での5'末端の短鎖化では3merまで短鎖化しても活性は減弱しなかった。現在、一本鎖部分を2'-OMe体とPS(ホスホロチオエート)化しDicerでの切断および、細胞標的化を検討している。2)micro RNA (miRNA)は、ヒトの約半数以上の遺伝子発現制御に関与している。もし、それの過剰発現が問題になる場合は対応するmiRNAに対するアンチセンス分子(AMO)による二本鎖形成が効果的である。そこで、肝臓で特異的に発現し、コレステロール等の生成に関与しているmiR-122に対する完全相補的な23mer AMOのヌクレオシド部分とリン酸ジエステル部分を化学修飾し、Huh-7細胞に投与しその活性を調べた。その結果、すべてをPS化した2'-OMe-4'-チオリボヌクレオシドを持つオリゴマーが最も強力な活性を示し、24時間後よりも72時間の方がより高活性であった。現在、細胞標的化および標的化リポソームを用いるin vivo実験を行っている。すでに臨床使用されている一本鎖核酸医薬は、薬物送達システム(DDS)を使用しなくとも局所投与や全身投与できると考えられており、その方向での開発が盛んに行われている。今回、肝臓で主に発現しているmicroRNA-122 (miR-122)のアンチセンス分子(AMO-122)をヌクレアーゼ抵抗性(2'-OMe体およびphosphorothioate: PS型に修飾)にし、肝臓指向性にしたpH感受性型リポソーム(YSK05-MEND)に搭載し、マウスを用いるin vivo実験を行った。その結果、1 mg/kgのAMO-122をYSK05-MENDに搭載しday 0, 2, 4に3回尾静脈注射したところ、miR-122が約70%ノックダウン(miR-122で抑制されていた肝臓中の遺伝子AldoA, Bckdk, Ndrg3の発現は1.72.8倍に増加し、血中コレステロール値も低下した)が観察され、その効果は2週間以上に亘って持続した。しかし、同量のAMO-122を細胞内導入試薬リポフェクタミン2000と混合して同じスケジュールと量で投与しても活性発現はまったく観察されなかった。従って、一本鎖核酸医薬をDDSに搭載して投与することで投与量を減少させることが可能になるとともに副作用の軽減にも繋がることが期待される。一方、DNA中のCpG配列のメチル化を行うDNMT1やDNMT3の阻害剤として、新規にピリジンC-ヌクレオシド(C*)pGを含むオリゴヌクレオチド(ODN)を見いだした。このODNは、SAMやSAH非存在下でも阻害活性を示した。従来、本酵素の阻害には、二種類の複合体形成が必要であると言われていたが、その構造的実体は不明であった。ゲル電気泳動で両複合体の移動度が明らかに異なりそれらが上記の2つの型を示している可能性があり興味深い。miR-122は、70%が肝臓で発現しているmiRNAであり、肝臓におけるコレステロール代謝や、脂肪酸の合成や酸化などに関与している。

従って、細胞内でのmiR-122の制御異常は代謝性疾患の原因になる。そこで、肝臓で過剰発現しているmiR-122を、そのアンチセンス鎖(AMO-122)で作用を抑制することを考えた。AMO-122は細胞内でmiR-122と完全相補的二本鎖を形成し、miR-122がmiRISC上で対応するmRNAとの結合を阻害し、作用発現を阻害する。そこで、ヌクレアーゼ抵抗性ユニット(2'-OMe-4'-S体; MS,および天然型2'-OMe体; M)を含むAMO-122を合成し、その効果を調べた。miR-122のルシフェラーゼレポータープラスミドを調製し、このプラスミドとAMO(23mer, 0.5-5 nM)を、miR-122を高発現しているHuh-7細胞にコトランスフェクションし、24時間後にレポーターアッセイを行い、AMOによるmiR-122機能抑制効果を調べた。その結果、AMO-MS122は濃度依存的なmiR-122の抑制効果を示し、AMO-M122よりも高い効果が得られた。また、リン酸部分が天然のPO型の場合は時間経過とともに活性が現弱したが、チオリン酸型(PS)の場合は活性増強がみられた。そこで、AMO-MSPS-122をリポソーム(YSK05-MEND)に搭載し、マウスを用いるin vivo実験を行った。1.0 mg/kgを2日おきに三回静脈内投与後、肝臓を回収しmiR-122の標的酵素であるAldoA, Bcldk, Ndrg3の発現を調べたところ、いずれの酵素の発現が上昇しmiR-122の効果が低下したことを見いだした。さらに、血中コレステロール量も低下した。また、毒性の指標である血清中のALT量は大きく変化しなかった。核酸医薬は組織選択性を持たないので何らかの組織標的化をしなければならない。今年度は、前立腺がんやがん新生血管に高発現しているPSMAを標的とするウレア型ジペプチド阻害剤(以下PSMAリガンド)を、1)エピジェネティクスで重要なCpG配列のメチル化酵素DNMT1をトラップできる5-formylCpGを含むデコイ核酸と、2)Stat 3に対するsiRNAに結合し、それらを用いてin vitro実験を行った。1)両末端にアセチレンを持ち、5-formylCpGを含むヘアピン型オリゴヌクレオチド(ODN)とtris(azidoethyl)amineをCuAAC反応で環化し(J. Org. Chem. 2013, 15, 694)ダンベル型ODN(1)とした。これに末端に歪んだアセチレン分子(DBCO)を持つPSMAリガンドをSPAAC反応で結合し標的型ODN(2)を合成した。HeLa細胞(PSMA非発現細胞)に対して1, 5-formylCpGを含む二本鎖DNA(3)、または、5-methylCpGを含む二本鎖DNA (4)を作用させ、それらのIC50値を求めると、41, 66, 245 nMであった。一方、PSMA標的化した2をLNCaP前立腺がん細胞(PSMA発現)とPC-3前立腺がん細胞(PSMA非発現)に作用させると100 nMでLNCaP細胞増殖を90%抑制したが、PC-3細胞では30%しか抑制しなかった。2)ブラントエンド型の19量体siRNAのセンス鎖3'末端にリンカーを介して先と同じPSMAリガンドをSPAAC反応で結合した。
病魚自身の血清抗体を利用した簡単・迅速・安価な病原体特定手法の開発

本研究では、病魚自身の血清抗体を利用した病原体の精製と、小規模なメタゲノム解析を組み合わせ、迅速かつ安価で、誰でも簡単に実施できる病原体の特定方法の確立を目指す。魚類に共通して血中抗体と結合する担体を探索したところ、proteinA担体により効率的に抗体を吸着できるが、製品によって性能に差が有ることが明らかとなった。また、最も成績の良かった担体を用いても、ウナギの抗体は吸着することができなかった。極微量の病原体からゲノムを増幅する方法を検討したところ、断片化したゲノムにアダプターを連結し、アダプターに特異的なプライマーを用いてPCRにより増幅する手法では、細菌のようなゲノムサイズの比較的大きい病原体には有効だが、ウイルスのようなゲノムサイズの小さな病原体では増幅効率が低かった。一方で、ローリングサークル法による増幅ではゲノムの大小にかかわらず増幅が可能であった。ローリングサークル法で増幅したゲノムを超音波で断片化し、プラスミドにクローニングし、インサートをシーケンスすることで、2日間で標的病原体のゲノム配列を取得することが可能であった。以上の結果を考慮し、魚類の血清抗体が効率よく結合するproteinA担体を用いて実験感染魚の血清抗体を吸着させ、そこに病魚の臓器磨砕液を通過させることで、抗体を用いた病原体の精製を試みた。陽性対照として、解析する病原体に対して作成したウサギ抗血清を用いた。ウサギ抗血清を用いた場合では、抗体によって病魚の臓器中の病原体を補足することが可能であった。しかし、魚類の血清を用いた場合では、病原体を補足できなかった。試験に用いるバッファー組成や、洗浄方法等を工夫しても結果は改善できなかった。魚類の抗体は病原体を精製するには十分な結合力を有していないと推測された。病魚の血清に含まれる抗体を利用して、病魚の感染臓器から病原体を精製するために、本年度は主に、感染試験により作出した病魚から血清および臓器の採材と保存を行った。ブリとヒラメについて各3種類、ギンザケについて1種類の病原体(細菌4種とウイルス3種)を用いて感染試験を行い、供試魚の約半数が死亡した時点で無作為に取り上げた供試魚より腎臓および脾臓を採材し、ディープフリーザーに保存した。血清は、感染から2-4週間の間に採取した。一部の魚種および病原体の組み合わせで血清抗体価を測定したところ、多くの個体で感染させた病原体に対する抗体価が上昇していた。現在までに、感染試験により作出した病魚から血清と臓器を保存するとともに、血清抗体カラムの作成方法と、微量な病原体ゲノムを増幅してシーケンスする方法の条件検討を完了した。血清抗体カラムの作製法では、魚類に共通して血中抗体と結合する担体を探索したところ、proteinA担体によりブリ属、マダイ、ヒラメ、マハタ、イシダイの抗体を吸着できるが、ウナギは供試したいずれの担体にも結合しなかった。微量な病原体ゲノムを増幅し、クローニングする手法を検討し、ローリングサークル法によって非特異的に増幅したゲノムを、超音波によって物理的に切断し、プラスミドベクターにランダムにクローニングする方法によって、細菌とウイルスで共通の手法で簡単かつ迅速にライブラリー化することができた。

しかし、魚類の血清を用いた場合では、病原体を補足できなかった。試験に用いるバッファー組成や、洗浄方法等を工夫しても結果は改善できなかった。魚類の抗体は病原体を精製するには十分な結合力を有していないと推測された。今年度に保存した病魚の血清と臓器を用いて、条件検討により確立した血清抗体カラムの作成方法と、微量な病原体からゲノム情報を取得する方法を組み合わせ、本研究で目的とする迅速で簡単な病原体の特定が可能か検証する。検出系が確立された後に、病原体が不明の検体について本手法を応用し、病原体の特定を試みる。
顎顔面の形態発生を制御する新規シグナル伝達機構

われわれは、これまで顎顔面の形成過程においてWntシグナルが顔面突起の癒合時期に活性化するが、それを阻害すると、上顎突起組織におけるLhx8、Msx1, Msx2, Bmp4、Sox9、Tbx22、Barx1の遺伝子発現が低下し上顎組織の細胞増殖活性が減少し、上顎の骨欠損や唇顎裂を発症することを明らかにした。Wntシグナルが、唇顎口蓋裂の発症の一因であることが示唆されたため、本研究では、Wntシグナルをup-regulateさせると顎顔面にどのような変化が起きるか組織学的、分子生物学的解析を行った。その結果、Wnt3aを投与すると組織発生に重要な働きをする遺伝子Msx1、Bmp4、Tbx22、Sox9、Barx1の発現がup-regulateされていることが明らかになった。このことは、Wntシグナルをup-regulateさせると顔面組織の成長発育が促進されることが示唆された。当初の計画1real-Time RT-PCRによるmRNAの定量は、上記のとおり良好な結果を得ることができた。2形態形成の組織学的検討は、embryoの発育継続が困難なため十分な結果が得られていない。発育継続させる方法やWnt3aの投与方法を変更し試行している。平成30年度からの継続課題2形態形成への影響は、上記のとおり継続して行う。当初の計画の3細胞増殖活性と4免疫組織学的染色は、予定どおり行う。次年度は国際学会発表のため海外出張を予定している。また研究用PCが古いversionのため新規更新を予定している。これらのため使用額を留保した。