hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
臨床応用をめざした羊膜上培養角膜上皮シートの開発

作成した角膜上皮シートをこれまでに難治性の眼表面疾患患者14名に移植したところ、術後2日目には培養角膜上皮が眼表面に生着していることを全例で確認した。さらに、この角膜上皮細胞は術後5日目には周りの角膜実質上へ伸展、移動、増殖し、ほぼ角膜全体を被覆うする事を確認した。新生血管を伴う異常結膜上皮が角膜上皮を覆う難治性眼表面疾患に対しては、現在角膜上皮移植術、軸部移植術が行われているが、最重症の眼表面疾患ではこれらの術式が必ずしも奏功するわけではない。我々は近年眼表面再建術で注目されている羊膜を基質に用いることにより、培養角膜上皮シートの作成法を家兎およびヒト角膜上皮細胞でほぼ確立した。羊膜上皮を除去した羊膜上で3T3 fibroblast cellをfeeder layerとして用い、上皮細胞の分化誘導を促すair-lifteng法も併用し、約4週間培養した角膜上皮細胞は4-5層に重層化したシートを形成していた。さらに、常に均質な性質を持った培養角膜上皮シートを供給するためには、角膜上皮の幹細胞を適切かつ的確に採取し培養系に導入する必要があると考え、酵素処理により角膜上皮幹細胞をより確実に含むCell suspension法による培養角膜上皮シートの作成を開発した。本方法により作成した培養角膜上皮シートは、正常角膜上皮と同様に4-5層に重層化しており、角膜特異的なケラチン(K3/12)、角膜上皮で最も発現頻度の高い遺伝子産物であるクラスタリンも発現していた。また、電子顕微鏡による考察により、細胞間接着に重要な働きをするデスモゾームやヘミデスモゾームも従来の方法より本方法により多く確認された。これまでに難治性の眼表面疾患患者31名に移植したところ、術後2日目には培養角膜上皮が眼表面に生着していることを全例で確認した。今後は大量の培養角膜上皮シートを作成し、緊急手術が必要な例に対しても対応できる生産ラインを考慮した培養角膜上皮シートの作成システムの確立を目指す。
共鳴非弾性Ｘ線散乱による強相関電子系の磁気励起の研究

L吸収端を用いた共鳴非弾性X線散乱スペクトルの解析を行った。第一に、銅酸化物絶縁体におけるスペクトルの解析を行い、自発的対称性の破れの影響を考慮することにより、2マグノン励起も取り込んだ解析に成功した。引き続き、スピン-軌道相互作用の大きなイリジウム化合物、Sr2IrO4、Sr3Ir2O7、Na2IrO3、CaIrO3に対して、微視的電子模型を基礎に、強結合および弱結合からの展開を行いスペクトルを計算した。実験のスペクトルをよく説明するとともに、その起源を明らかにした。共鳴非弾性散乱を用いた強相関電子系における磁気励起の理論的研究を行い、以下の成果を得た。1.スピン軌道相互作用が大きい5d金属化合物として注目を集めているSr2IrO4に対して、強結合理論を用いて磁気励起の研究を行なった。スピンハミルトニアンとして、ハイゼンベルグ項に加えて、スピン軌道相互作用とフント結合との競合により、小さな異方的な項が現れることを導いた。また、このハミルトニアンを用いてマグノン励起を計算し、2つのモードに分裂することを導いた。続いて、対応する共鳴非弾性X線散乱(RIXS)スペクトルの計算を行い、上記マグノンモードの分裂に対応して、スペクトルに2ピーク構造が現れることを予言した。2.弱結合理論(RPA)に基づき、Sr2IrO4における一般化された密度相関関数を計算し、その素励起を研究した。マグノン励起は相関関数における束縛状態として現れ、強結合理論において見出されたものと同様に2モードに分裂していることを見出した。また、連続スペクトル領域の低エネルギーの境界に鋭い共鳴モードが存在することを見出した。これは、RIXSにおいて観測されているエキシトンモードに対応すると思われる。RIXSスぺクトルの計算により比較することが今後の課題である。3.L吸収端を用いた共鳴非弾性X線散乱スペクトルに対する定式化を、これまで用いられているfast-collision近似を用いずに行った。この定式化はfast-collision近似を極限に含んだより一般的なものである。Fast-collision近似の適用条件を満たさない場合も多く、今後のスペクトルの具体的計算への道を開いた。共鳴非弾性X線散乱(RIXS)を用いた強相関電子系における磁気励起の理論的研究を行い、以下の成果を得た。1. La2CuO4の反強磁性状態におけるL吸収端RIXSスペクトルの磁気励起部分に対して、その定式化を完成し、具体的計算の手続きを示した。系が自発的対称性の破れた状態にあることを反映して新たな項が見出され、その項の具体的計算を通して、RIXSスペクトルの磁気励起部分においては遷移運動量がゼロ近傍の強度が増大することが見出された。この項の存在は、これまでのfast-collision近似を用いた定式化では見過ごされていた項で、今後の詳しいRIXS実験によりその存在が明らかになると期待される。2.スピン軌道相互作用の強い典型物質であるSr2IrO4におけるIr-L吸収端RIXSスペクトルに対して、遍歴電子系の立場からタイトバインデング模型を導入して解析を行った。ハートレーフォック近似を用いて反強磁性基底状態を求め、そこでの励起スペクトルを乱雑位相近似を用いて求めた。RIXSスペクトルは、強いスピン軌道相互作用とフント結合との競合により特異な磁気励起とエクシトン励起から構成される。磁気励起に対応する分散関係は実験結果を自然に再現する結果がえられた。また、エクシトン励起に対応する部分は、一般化された密度相関関数のスペクトル分布をより増強した形で現れることが計算から示され、RIXS実験のスペクトル形状を良く説明することができた。この系に対しては、局在電子描像からの計算が行われているが、本研究の結果は、遍歴電子描像に基づく弱相関理論がよい出発点であることを示していると考えられる。スピン軌道相互作用の強いIr化合物において、Na2IrO3はKitaev模型と関連すると考えられ、その素励起が盛んに研究されている。多くの研究が局在電子描像に基づくものであるのに対して、本研究では、遍歴電子描像に基づき、Honeycomb格子を形成するIrイオン上の電子に対してtight-binding模型を構成し、ハートレーフォック近似を用いて基底状態を構成した。自然なパラメーター領域で、一電子エネルギー分散にギャップをもつ反強磁性絶縁体状態が得られた。反強磁性秩序はzigzag型が一番安定であるが、ネール型やstripy型の秩序状態とのエネルギー差は極端に小さいことが分かった。この基底状態において、一般化された動的密度ー密度相関関数を乱雑位相近似に基づき計算した。電子正孔対励起から構成される連続スペクトルに加えて、多数の束縛状態が存在することが分かった。いくつかの束縛状態が50meV以下の励起エネルギーをもって見つかり、磁気励起に対応すると考えられる。それにくわえて、400meV以上の励起エネルギーをもった束縛状態が得られ、エクシトン励起に対応すると考えられる。磁気励起の結果は局在電子描像の結果とも対応しており、エクシトンの存在とあわせて、RIXS実験で得られているスペクトルとよく対応していて、本研究の手法の有効性を示すことができた。

動的密度ー密度相関関数のスペクトルは直接RIXSスペクトルをあらわしているわけではないという点を考え、今後は、RIXSスペクトルの直接の計算がRIXS実験との比較のために望まれる。本研究において既に、Sr2IrO4に対するRIXSスペクトルの解析をおこない、素励起の構造を明らかにし、実験結果をよく説明することができた。その過程で、同じIr化合物で、二層構造を持つSr3Ir2O7や、Kitaev模型につながるNa2IrO3や、異方性の強いCaIrO3等のRIXSスペクトルを、同じ手法で解析し比較検討することは、素励起の特徴をより深く理解する上で、また、解析手法の有効性を示すうえでも必要であると考えるに至った。その研究がまだ計算途上にある。また、銅酸化物RIXSスペクトルの解析に関しては、局在電子系に対しては、長距離秩序の存在の影響を取り入れた手法が完成した。しかしながら、ドープ系を念頭においた遍歴電子系に対する解析を試みてきたが、超伝導長距秩序を取り入れた定式化に手間取り、数値計算が完了していない状態である。強相関電子系における素励起が共鳴非弾性X線散乱(RIXS)スペクトルにどのように反映されるかを明らかにする目的で、理論的研究を行い、以下の成果を得た。強相関電子系では、Ir化合物に着目した。Ir-5d状態の強いスピン軌道相互作用とクーロン相互作用との競合から、特異な電子状態が形成されると考えられるからである。今年度は、以下のIr化合物に対して、RIXSスペクトルの解析を行なった。第一に、二重層をからなる二次元構造を持つSr3Ir2O7に着目して、RIXSスペクトルを、基底状態についてはハートレーフォック(HF)近似を、また励起状態に対しては乱雑位相(RPA)近似を用いて計算した。その特異なスペクトルをよく再現する結果を得るとともに、磁気励起およびエクシトン励起の起源を解明することができた。また、本研究課題ですでに単層構造をもつSr2IrO4の計算を行っているが、それと比較することで、励起状態の起源について深い理解が得られた。引き続き、post-peroskite構造をもつCaIrO3のRIXSスペクトルの計算を行った。この物質の基底状態がa軸方向に反強磁性的でないため、HF近似+RPA近似を用いた計算はうまくいかない。局在電子模型から出発して、低エネルギー有効模型を導くことにより、基底状態および励起スペクトルの計算を行った。実験と符合するキャントしたスピン配列をもつ磁気基底状態が得られ、励起スペクトルも合理的な結果が得られた。これらの結果により、前年度までに行ったNa2IrO3のRIXSスペクトルの解析結果とあわせて、Ir化合物の励起状態とRIXSスペクトルの関係はほぼ解明できたと考えられる。L吸収端を用いた共鳴非弾性X線散乱スペクトルの解析を行った。第一に、銅酸化物絶縁体におけるスペクトルの解析を行い、自発的対称性の破れの影響を考慮することにより、2マグノン励起も取り込んだ解析に成功した。引き続き、スピン-軌道相互作用の大きなイリジウム化合物、Sr2IrO4、Sr3Ir2O7、Na2IrO3、CaIrO3に対して、微視的電子模型を基礎に、強結合および弱結合からの展開を行いスペクトルを計算した。
消費者団体の影響力行使に関する日米英比較ネットワーク分析-経済的規制の緩和における果を事例として-

この研究の目的は、日本、アメリカ、イギリスの消費者団体の政策過程における影響力行使の相違を、経済的規制の緩和の過程を事例として、おもにネットワーク分析の手法によって検討することであった。しかし研究を進めるうちに、関係者ごとに影響力行使についての評価が大きく違うため、それを的確に検討することが困難になってきた。そこで研究め関心は、影響力行使の相違、そしてその前提となる政治行動の相違よりも以前の段階である、各団体の政策選好の相違に移っていった。したがってこの研究は、消費者団体が持つネットワークが、その政策選好を規定するという観点から検討を進めた。また関連して、消費者団体の研究を相対化するために、それと同様に広範な顧客層を持つ地域住民組織の研究も進めた。下記の業績のうち、最初のものは「消費者・顧客」としての住民の利益が政策選好とどのように結びつくかを検討したものであり、後のものは地域住民組織の政策選好の規定要因を検討したものである。また本来の研究対象である伝統的な意味での消費者団体については、本年度は、とくに後半、アメリカのユタ大学のRobert Mayer教授より招聘を受け、Department of Family and Consumer StudiesのVisiting Associate Professorとして、アメリカの団体の調査を実施した。具体的には、Consumer Federation of Americaを初めとする消費者団体の指導者に面接調査を実施し、それらの団体の政策選好の規定要因を検討した。そしてその結果として、他国の消費者団体に比べて自立性が強いとされるアメリカの消費者団体についても、Public Citizenを除く主要な消費者団体の政策選好は、労働組合を初めとする他の利益団体のそれに大きく影響されてきたこと、またそれは経済的規制の政策過程においてとくに顕著であることが分かった。これらの検討結果、およびそのイギリスとの比較については、現在執筆中の論文において明らかにされることとなっている。この研究の目的は、日米英の消費者団体の政策過程における選好・行動・成果を、各々の組織それ自体の特徴よりも、それが形成する連合の特徴によって、つまり組織が持つ属性という組織内要因よりも、組織の持つ関係という組織間要因によって説明することであった。そこで今年度は、(1)消費者団体に関する組織論の再検討、(2)OECD諸国の消費者団体に関するデータベースの作成、(3)米英両国の消費者団体の規制緩和における選好・行動・成果の取材を実施することとした。このうちまず(1)については、当初は消費者団体を既成の組織として組織間関係論の観点からネットワーク分析する予定であったが、同団体はその成立の際してすでに他組織の強い影響を受けていることが分かったため、ネットワーク分析をする以前に、改めて同団体の発生に関する理論的検討を行わざるをえなかった。(2)については、依然として主要国のみについてであるが、おもに各種刊行文献、インターネット、メールなどを通じて、消費者団体の主要指標に関するデータベースを作成した。(3)については、まず英国の消費者団体について、9月に訪英し4つの消費者団体、および国際消費者機構(CI)を取材した。それに対して米国の消費者団体については、9月のテロ事件の影響で訪米できなかったため、詳細な取材については来年度に実施せざるをえなくなった。米英両国の規制緩和については、おもに各種刊行文献による研究を実施し、その成果の一部を『公共政策の国際比較』として公刊することとなった。なお本研究に関連して、ユタ大学のロバート・メイヤー教授と共同研究することとなり、日米両国の消費者団体について、各種の情報交換を実施した。
転写因子CREBの遺伝子変異による新規胎児致死症候群の解析

本研究課題は、子宮内発育遅延による死産・新生児死亡の病理解剖症例を対象に、シグナル伝達に関連する転写調節因子や形態形成に関連した遺伝子の異常を解析し、病態との関わりを検討し、新規の胎児致死症候群を同定することをめざす。これまでに、子宮内胎児死亡剖検症例のパラフィン包埋病理組織からCREBのexon 5の遺伝子変異を検出している。116番目アミノ酸がアスパラギンからグリシンに変異(CREE116)するものであり、この変異が機能的ドメインのどの位置に存在するか、アミノ酸の3次元解析から想定される部位について、詳細を検討中である。症例と同一のCREB変異体の発現ベクターを構築して培養細胞に導入し、CRE-luciferaseを用いたレポーターアッセイを行った結果、CREB116の転写促進活性は野生型の1/6と著しい減弱を示した。培養細胞に、野生型とCREB116、既報のCERB変異体を導入して免疫沈降Western blotting法にて比較検討すると、CREB116では、CREB蛋白のリン酸化は野生型と同等であったが、その後の転写共役因子CBP/P300との結合が見られず、dominant negativeとして作用し、野生型と競合することで、転写効率を下げる可能性が示唆された。アミノ酸変異が共役因子との結合に及ぼす影響について、詳細を検討中である。発端となった症例では、諸臓器の異常の中でも、肺の拡張障害が高度で治療抵抗性であった。CREB116が、特定臓器の形態異常や機能不全を引き起こす機序は明らかでない。本年度は、肺の病理組織を用いて、肺胞上皮の蛋白発現を検索した。新生児/胎児死亡の剖検例で、CREB野生型の症例を対象に比較検討すると、一連のサーファクタント関連蛋白のうち、著しい低下を示すものがあり、呼吸不全に寄与した可能性が示唆された。以上の知見に関しては、今後内外の学会にて報告するとともに、論文投稿準備中である。
慢性肝疾患モデルマウスにおける感染起因性腎障害の病理病態学的検討

薬剤よって誘発される慢性肝障害モデルマウスを用いて、慢性肝疾患患者の腎臓に生じる病理病態学的変化を解明する研究を行った。その結果、このモデルは薬剤や感染によって誘発される腎臓障害の悪化をオートファジーなどにより抑制することがわかった。このことより、このモデルは腎臓が薬毒に対する耐性を獲得する機序の解明、さらに感染併発時に悪化する腎障害の進行を抑制する治療法の開発に有用であることが明らかとなった。慢性肝障害に感染症を合併した時に生じる腎臓の病理組織学的変化と腎機能障害の経時的変化を明らかにし、診断方法や治療法の開発に貢献することを目的に研究を進めている。まず、BALB/cマウスに3,5-diethoxycarbonyl-1,4-dehydrocollidine(以下、DDC)という薬剤を食餌性に投与することで慢性肝障害マウスを作製した。そして、DDC投与により肝障害が進行したマウスでは、細菌の内毒素(以下、LPS)投与に対する腎臓の感受性が変化しているかを確認するために、慢性肝障害が進行したDDC投与後2週間の段階で、生理食塩水、或いは、LPSをマウスに投与した。そして、それぞれの16時間後の腎組織像や腎機能障害マーカーを比較した。その結果、LPS投与群は、対照群である生理食塩水投与群に比較して、16時間後の病理所見や腎機能障害がむしろ軽度であった。このことは、DDCが腎組織にLPSに対する耐性を獲得させた可能性を示唆している。そこで、DDC投与が腎組織に耐性を獲得させるかを確認するために、DCC投与のみによる腎機能障害マーカーの変化と腎臓病理組織学的変化を調べた。その結果、DDC投与群では腎機能障害の軽度悪化が認められるにもかかわらず、通常の光学顕微鏡検査では形態的な腎組織傷害は検出されなかった。そのため、電子顕微鏡検査でさらに詳細な形態的変化を検索したところ、DDC投与群の腎臓近位尿細管に通常の光学顕微鏡では検出できなかった微細な形態異常とオートファゴゾームの増加が認められた。オートファゴゾームは、急性腎障害の悪化を防止する機序の1つとして、最近、知られるようになっていることから、このオートファゴゾームがDDC投与によって腎組織に誘導されたLPSに対する耐性機序の可能性の1つと推定された。昨年度までの実験で、3, 5-diethoxycarbonyl-1, 4-dehydrocollidine(以下、DDC)という薬剤を食餌性に投与されることで慢性肝障害に陥ったBALB/cマウスでは、肝障害の高度進行にも拘わらず腎機能は極軽度障害されるのみで、病理組織学的検討でも腎臓には明瞭な形態異常は示さないことが明らかとなった。このことから、DDC投与マウスの腎臓は、所謂、sublethal tubular cell injuryと呼ばれる最近ヒトの腎障害の1つとして注目されている病態を示すことが確認された。そして、電子顕微鏡検査を加えることで、この腎機能悪化を防止する耐性機序の1つとしてオートファジーが関与している可能性も示した。そこで、今年度はこのオートファジーが関与していることをさらに確認するために、オートファジー関連蛋白質のLC3-I, IIやp62をウェスタンブロッティング法や螢光免疫染色法を追加することで検証した。その結果、DDC投与群の腎臓近位尿細管では、オートファジーが活発に起きていることが明瞭に示された。また、オートファジーは、ミトコンドリア障害の反応としても発現することが知られているので電子顕微鏡を用いてDDC投与群の腎臓近位尿細管を調べたところ、コントロール群に比較してミトコンドリアの障害が高度であることがわかった。さらにミトコンドリアが障害されると酸化ストレスが誘導されることもわかっているので、免疫染色法を用いて酸化ストレスが生じていることを示すマーカーを2種類検索したところ、いずれのマーカーもDDC投与により上昇していることが確認された。以上のことからDDC投与群のマウスでは、ミトコンドリア障害とこれに続く酸化ストレスが惹起されるもののオートファジーが活発になることで腎機能が急激に進行することを抑制していることがわかった。研究計画の「腎臓の病理形態学的変化の特定とその経時的推移の把握」のうち、「HE所見およびアポトーシス・壊死・再生の有無」と「障害尿細管の同定」の経時的変化については前年度におおむね達成していた。そして、今年度は免疫染色でこれらの形態変化を詳細に検証すると共に、前年度に開始するも残されていた「超微細構造変化の観察」を継続研究することで達成でき、ミトコンドリア異常や近位尿細管の微絨毛障害を明らかにすることができた。さらに、今年度以降の研究計画に含まれている「各種腎機能障害マーカーの測定と評価」のうち、「腎機能の評価」と「近位尿細管の障害および再吸収機能の評価」も血液および尿の検体を用いることで検討でき、sublethal tubular cell injuryと呼ばれる注目すべき所見を得ることができた。以上を総合的に鑑み、平成27年度終了時点においては研究計画に沿って本研究はおおむね順調に進展していると考えられる。昨年度までにBALB/cマウスに3,5-diethoxycarbonyl-1,4-dehydrocollidine(以下、DDC)という薬剤を食餌性に投与することで誘導される慢性肝障害モデルマウスを用いて、慢性肝障害時における腎臓の病理組織学的変化と機能障害を検討した。

そして、肝障害の高度進行にも拘わらず腎機能及び病理組織像は極軽度の障害に留まり、所謂、sublethal tubular cell injuryを示すことを確認した。さらに、電子顕微鏡検査、オートファジー及び酸化ストレスマーカーに対するウェスタンブロッティング法や螢光免疫染色法により、腎障害機序はミトコンドリア障害と酸化ストレスであり、オートファジー活性化が腎機能悪化を抑制していることを明らかにした。そして、学会及び査読付英文雑誌で報告した。そこで、今年度は慢性肝障害に感染を併発したときの腎臓の病理病態学的変化を明らかにするために、DDC投与マウスに内毒素(以下、LPS)を投与し、DDC依存性に腎機能が悪化するかを検討した。DDCを2週間投与後にLPSを腹腔内投与し、通常餌対照群マウスと比較したところ、肝臓はDDC投与群が対照群より有意に障害されたが、腎臓ではDDC投与群の方がむしろ機能の悪化が抑制された。この結果と、LPS投与群の腎組織障害は対照群に比較して軽度であった初年度の結果、そしてこのモデルのオートファジー活性化による腎機能悪化抑制機序を総合すると、この肝障害モデルでは、オートファジーが活性化することで薬毒物に対する耐性が獲得され、感染症合併時でも腎機能の悪化を抑制することが示唆された。以上より、この慢性肝障害モデルマウスは、オートファジーによる薬毒物耐性獲得機序の解明や肝障害に併発する腎機能障害の進行を抑制する治療法の開発に有用であると判明したので、現在、論文投稿の準備をしている。薬剤よって誘発される慢性肝障害モデルマウスを用いて、慢性肝疾患患者の腎臓に生じる病理病態学的変化を解明する研究を行った。その結果、このモデルは薬剤や感染によって誘発される腎臓障害の悪化をオートファジーなどにより抑制することがわかった。このことより、このモデルは腎臓が薬毒に対する耐性を獲得する機序の解明、さらに感染併発時に悪化する腎障害の進行を抑制する治療法の開発に有用であることが明らかとなった。平成26年度に計画した「腎臓の病理形態学的変化の特定とその経時的推移の把握」のうち、「HE所見およびアポトーシス・壊死・再生の有無」と「障害尿細管の同定」については、経時的推移の把握の詳細を残しておおむね達成している。また、「超微細構造変化の観察」については未だ緒に就いたところであるが、上述の研究業績の項で述べた如くオートファゴゾームについての検証を進める段階に至っており、順調に進展していると言える。これらに加え、当初は平成27年度に実施を予定していた「各種腎機能障害マーカーの測定と評価」を研究業績の項でも述べたように既に平成26年度中に進めている。以上を総合的に鑑み、平成26年度終了時点においては研究計画に沿って本研究はおおむね順調に進展していると考えられる。前年度までの研究で、慢性肝障害に伴う腎臓の病理組織所見と機能障害は、薬剤投与に抵抗性を示し軽微な障害に留まることが明らかとなった。これは、sublethal tubular cell injuryと呼ばれる腎機能障害に一致するもので、ヒトが敗血症時に意外に軽微な障害を示すことと類似していたので、この主旨を論文に纏め前年度中に発表した。この結果は慢性肝障害を有するヒトは感染症合併時に腎機能障害を進展させない何らかの機序を有していることを示唆している。
ヒト精巣機能の分子生物学的制御機構に関する研究

研究課題の初年度(平成元年度)では,まずヒト精巣組織の器官培養を用いた実験系でもDNA/RNAレベルの検討が可能なことを確認した後、estrogenが17αーhydroxylase mRNA及びandragen recepter(AR)mRNAに及ぼす作用を検討したか,本年度は同様の実験系を用いて以下の検討を行なった。1.不妊男性の生検精巣組織を器官培養し, ^3Hーthymidine, ^<14>Cーuridineの取り込みによりDNA,RNA合成を評価した。ホルモン非存在下においてDNA合成が少ない精巣組織ほどhMG,hCGを培養液中に加えてもDNA合成の増加率が低いことが判明し,不妊男性に対するhMGーhCG療法の選択に有用な方法と考えられた。4.前立膜癌患者の去勢術の際得られた精単組織の器官培養を用い,種々のホルモンのステロイド合成系酵素の17αーhydroxylaseや,hCG受容体(hCGーR)への影響を検討した。高濃度のhCG投与によりP450_<17α>,hCGーRmRNAは著明に減少することが判明した。GnRH,Prolactin,EGFは,これらのmRNAには影響を及ぼさなかった。研究課題の初年度である本年度は、まずヒト精巣組織より実験に用いるのに十分なmRNAの抽出が可能か検討した。即ち、in vivoの条件下で得られたヒト精巣組織1g当たりLiCl法で100μg程度のtotal RNAが、さらにoligo-dT columnを使用することにより2μg程度のmRNAが得られることが判明した。またin vitroで器官培養の実験を行なった後の精巣からも同様にmRNAを得ることが可能であった。以上の検討の後、以下の検討を行なった。(1)(2)の結果より、estrogenは17α-hydroxylaseを低下させ男性ホルモン合成を減少させるのみならず、標的部位でARを減少させることが判明した。2.estradiol、progesteroneによるsteroid 21-hydroxylaseの誘導(1)(2)の結果よりestradiol、progesteroneによる21-hydroxylaseの誘導が判明した。研究課題の初年度(平成元年度)では,まずヒト精巣組織の器官培養を用いた実験系でもDNA/RNAレベルの検討が可能なことを確認した後,estーrogenが17αーhydroxylase mRNA及びandrogen receptor (AR) mRNAに及ぼす作用を検討したが,本年度は同様の実験系を用いて以下の検討を行なった.1.不妊男性の生検精巣組織を器官培養し, ^3Hーthymidine, ^<14>Cーuridineの取り込みによりDNA,RNA合成を評価した.ホルモン非存在下においてDNA合成が少ない精巣組織ほどhMG,hCGを培養液中に加えてもDNA合成の増加率が低いことが判明し,不妊男性に対するhMGーhCG療法の選択に有用な方法と考えられた.4.前立腺癌患者の去勢術の際得られた精巣組織の器官培養を用い,種々のホルモンのステロイド合成系酵素の17αーhydroxylaseや,hCG受容体(hCGーR)への影響を検討した.高濃度のhCG投与によりP450_<17α>,hCGーR mRNAは著明に減少することが判明した.GnRH,Prolactin,FGFは,これらのmRNAには影響を及ぼさなかった.
ＤＮＡ修復経路におけるＲＵＮＸ１／ＡＭＬ１の機能解析

RUNX1の癌抑制遺伝子としての機能を解明することを目的として本研究を実施した。その結果、造血幹細胞において、RUNX1のC端欠失変異はDNA二重鎖切断への修復能を低下させることがわかった。また、RUNX1は、DNA損傷応答分子Gadd45aを転写レベルで制御していることがわかった。さらに、RUNX1のC端変異を有する骨髄異形成症候群患者では骨髄単核球中のGadd45の遺伝子発現量が低下していた。本研究を通してRUNX1は、DNA損傷、とくにDNA二重鎖切断からの修復過程に重要な働きを有しており、RUNX1の機能抑制型変異が、DNA損傷の蓄積と白血病の発症をもたらす可能性が考えられた。RUNX1C導入細胞のDNA損傷修復能力を評価するため、RUNX1dCを導入したマウス細胞株32dcl3 (32D-RUNX1dC)を用いたリペアアッセイを行った。このアッセイ法は、特定のDNA損傷因子で処理した後の細胞のコロニー形成能力を測定することによって、テスト細胞のDNA損傷からの修復機能を評価するというものである。その結果、RUNX1dC導入細胞はトポイソメラーゼII阻害薬のVP-16投与後のコロニー形成能が低下していることが分かった。以上のことから、RUNX1dCはSTAT5のリン酸化を通してマウス造血幹/前駆細胞の増殖を促進すること、そして、DNA損傷の単鎖、二重鎖切断からの修復を抑制することによって白血病の発症へと導くことが示唆された。RUNX1はマウスの二次造血の発生に必須の転写因子である。RUNX1自体が造血幹細胞から骨髄球系やリンパ球系への分化の運命決定機構に携わっている可能性が示唆された。造血幹細胞からの運命決定機構におけるRUNX1の役割を検討する目的でマウス胎児造血幹細胞と早期リンパ球前駆細胞での遺伝子発現プロファイルを比較したところ、クロマチン構造制御分子Satb1の発現が早期リンパ球前駆細胞で上昇していることが分かった。本研究はRUNX1の癌抑制遺伝子としての機能を解明することを目的として実施した。DNAの一本鎖損傷および、DNA二重鎖切断修復におけるRUNX1の役割:造血幹細胞において、RUNX1のC端欠失変異はDNA二重鎖切断への修復応答を低下させることがわかった。DNA損傷付与による、RUNX1の転写標的の変化および、結合蛋白の変化の解析:RUNX1は、DNA損傷応答分子Gadd45aを転写レベルで制御していることがわかった。またRUNX1のC端変異を有する骨髄異形成症候群患者では骨髄単核球中のGadd45の遺伝子発現量が低下していたことなどから、RUNX1変異を有する患者の白血病発症にはGadd45aの発現低下がDNA損傷蓄積などを引き起こしていることが示唆された。ストレス応答に関わるRUNX1の転写標的の造血幹/前駆細胞における機能解析:二次造血に必須の転写因子であるRUNX1の造血幹/前駆細胞における機能解析を行う上で、マウス胎児造血幹細胞と早期リンパ球前駆細胞の遺伝子発現プロファイルを比較したところ、クロマチン構造調節分子SATB1の発現が、リンパ球への分化とともに上昇することが分かった。平成25年度はこの研究を進めることで、造血幹細胞からのリンパ球初期分化におけるSATB1の機能の重要性を明らかにした(Immunity, 2013)。4その他:新規のRUNX1変異家系を見出し、その機能解析を行った。このRUNX1変異は、N端より283アミノ酸までしか有しない。機能解析の結果、この変異体が野生型に対してドミナントネガティブ体として働くことが明らかとなった。以上の事から、本研究を通してRUNX1は、DNA損傷とくにDNA2重鎖切断からの修復過程に重要な働きを有しており、RUNX1の機能抑制型変異がDNA損傷の蓄積と急性骨髄性白血病の発症をもたらす可能性が考えられた。RUNX1がDNA損傷応答分子Gadd45aの発現を転写レベルで調節していること、そして、RUNX1のC端欠失変異体RUNX1dCは、RUNX1によるGadd45aの活性化を抑制することを明らかにした。また、RUNX1のC端変異を持つ骨髄異形性症候群患者では、骨髄単核球中のGadd45aの発現がRUNX1変異を持たない骨髄異形性症候群患者のサンプルと比較して有為に低下していることが分かった。この一連の研究結果をLeukemia紙にて発表した。新規のRUNX1遺伝子変異家系を見いだした。この変異は、野生型RUNX1bが453アミノ酸配列を保持するのに対して、283アミノ酸しかなく、それ以降のC末端を欠失している。これまでの研究より、このX283変異は野生型RUNX1の優勢阻害型変異体として機能する可能性が考えられた。

そこで、RUNX1の転写の標的であることが分かっているc-mplプロモータールシフェラーゼコンストラクトを用いて、レポーターアッセイを行った。その結果、RUNX1X283は、RUNX1bによるc-mplプロモーターの活性化を抑制することが明らかになった。RUNX1ノックアウトマウスの繁殖が、動物実験施設の汚染問題などで順調に進まず進展させることができなかった。しかし、細胞レベルの実験によって重要な知見を得ることができた。また、RUNX1の造血幹細胞での機能を見る目的で行った遺伝子発現プロファイルによって、新たな展開を得ることができた。RUNX1ノックアウトマウスの繁殖が順調にいかず、このマウスを用いた研究を進める事ができなかった。しかし、RUNX1の新しい家族性変異を見いだすという新しい発見を得る事ができた。現在RUNX1ノックアウトマウスは順調に増殖しており、今後はこのマウスを用いた研究をすすめる予定である。RUNX1のDNA損傷修復メカニズムにおける役割をRUNX1変異体(RUNX1dCおよびX283変異体)を用いてさらに検討する。造血幹細胞からの運命決定機構におけるRUNX1とその関連分子の機能を明らかにする。RUNX1のDNA損傷修復能における役割を明らかにするために、RUNX1ノックアウトマウス造血幹細胞のDNA損傷刺激(放射線照射、抗がん剤投与など)に対する反応を解析する。RUNX1X283変異の固有の機能を明らかにするために、RUNX1ノックアウトマウス造血幹細胞にRUNX1X283を導入し、骨髄移植実験をおこなう。RUNX1X283変異は野生型RUNX1bに対して、非常に協力なドミナントネガティブ効果を持っており、この変異の導入がRUNX1のがん抑制遺伝子機能を抑制することで、白血病の発症をもたらす可能性がある。これまでの研究により、RUNX1とその関連分子が造血幹細胞からの分化において未知の機能を有している可能性が示唆された。これらの分子の機能をさらに詳細に検討するため、RUNX1とその関連分子のノックアウトマウス造血幹/前駆細胞の遺伝子発現プロファイル解析を外部業者への受託研究として行う予定である。研究成果発表、情報収集を目的とした学会参加費として使用する予定である。クロマチン免疫沈降ーシーケンス(ChIP-Seq)法を用いて、DNA損傷付与前後のRUNX1転写因子の標的遺伝子の変化を解析する。また、RUNX1ノックアウトマウス造血幹細胞を用いたDNA損傷修復アッセイを行う。情報収集と成果発表のために、国内国外の学会に出席する。
回転超流動内および超流動自由表面における量子乱流現象の実験的研究

本年度は超流動ヘリウム中の量子渦に関して1核生成および2Kelvin波の励起に着目し研究を遂行した。下記にその概要を示す。1.量子渦核生成は流体中の速度が臨界速度を超えることで生じ、また核生成課程は巨視的トンネル効果の候補として非常に興味深い。一方、核生成の閾値である臨界速度はこれまで実験的に明らかではなかった。我々は超流動ヘリウム自由表面直下に二次元正イオンを蓄積し、イオン速度の電場依存性の測定を行うことで臨界速度を測定した。イオン速度がある臨界値を越えると急激に少することをこの系で初めて観測した。この状態の転移はイオンの周りの流れ場が非回転な流れから量子渦を伴う流れへと転移をすることに対応していると考えられる。臨界値には特徴的な温度依存性が確認された。温度依存性は巨視的量子トンネル確率が量子摩擦によって抑制されることに起因することが示された。2.近年、粘性がゼロの超流動ヘリウム中で発現する量子乱流系と粘性流体の古典乱流のエネルギーカスケードの相似性が注目されている。量子乱流系においては渦度が独立に存在するため、乱流減衰の本質である渦のエネルギー散逸を観測するに適する系と考えられている。我々は回転下において、上記の正イオン系に対する低入力電場領域でのプラズマ共鳴実験を行った。回転下では渦芯まわりのイオンが量子渦終端点にトラップされることが期待される。この手法により量子渦へ量子乱流減衰の本質であるKelvin波を励起できることを期待している。回転数を増加することで試料容器内の量子渦密度を増加すると、共鳴周波数および半値幅が回転数に比例して増大する変化が観測された。これらの結果は量子渦にトラップされたイオンに渦の張力が働くことによる共鳴周波数の増加、および正イオン系が量子渦糸にKelvin波を励起することでエネルギーの移動が起きたことによる半値幅の増加に対応していると考えている。本研究ではヘリウム表面直下に形成される二次元イオンに系の輸送現象に対する量子渦の影響、量子渦と自由表面の相互作用の様子、および二次元イオン系が形成する量子渦輪により引き起こされる超流動乱流状態に対する渦糸の影響を観測するのが目的である。超流動ヘリウム中でヘリウムの正イオンもしくは負イオンを加速すると、臨界速度以上において量子渦輪の生(nucleation)もしくはロトンの自己放出によりイオン近傍より超流動性の破壊がおこることが知られている。負イオンを用いたバルク中の実験では量子渦輪のnucleationメカニズムが実験的に明らかになっている。しかし、正イオンに関しては現在に至るまで詳細な実験が行われていない。上記目的を完遂するに当たり、これまでの実験から正イオンの方が表面近傍に安定して保持されることがわかった。正イオンに対する量子渦生成に関する臨界速度を明らかにするため、本年度は二次元正イオンの系の輸送現象の測定を行った。イオン系への印加電場を増加し、イオンを加速すると、低速度では外場に対して線形応答を示すが、特徴的な臨界速度において急激に非線形応答領域へと遷移する現象がこの系で初めて観測された。この非線形応答の起源は、イオンの作る速度場により超流動中に生成された量子渦輪がイオンに付着することに寄っていると現在考えている。また臨界速度は温度依存性を示すことが明らかになった。臨界速度およびその温度依存性はこれまで負イオンで考えられてきたnucleationモデルと一致しない。これは負イオンと正イオンの超流動液体に対する境界条件の違いに起因すると考えている。

これらの結果は量子渦にトラップされたイオンに渦の張力が働くことによる共鳴周波数の増加、および正イオン系が量子渦糸にKelvin波を励起することでエネルギーの移動が起きたことによる半値幅の増加に対応していると考えている。
特異点を許容する曲面論と特異点論の研究

特異点を許容する曲面論と特異点論の応用として、1.1径数族と2径数族の枠付き曲面族の包絡面の研究を行いました。ルジャンドル写像族に対する研究を行いましたので、曲面の場合により詳しく研究を行いました。包絡面定理として、包絡面を持つための条件を基本不変量の言葉で求め、包絡面の性質の研究を行いました。特に、包絡面は枠付き曲面になりますので、基本不変量と曲率を求めました。また、包絡面定理の応用として、1階偏微分方程式系と1階偏微分方程式の完全解と特異解に対して、特異解の射影が完全解の射影の包絡面になるための条件を求めました。2.ラグランジュ特異点論とルジャンドル特異点論の関係の研究を行いました。ラグランジュ部分多様体芽族に対して、グラフ型ルジャンドル開折芽族が同値関係を含めて対応していることを示し、この結果を用いて、焦面の分岐の生成的な分類結果をまとめ投稿しました。3.枠付き曲線に対してベルトラン曲線とマンハイム曲線を定式化し、これらの曲線は枠に依存することを示しました。また、非退化な正則曲線に対して、定義を定式化し、存在する必要十分条件を与えました。4.3次元球面の枠付き曲面の研究を行いました。基本不変量を求め、3次元球面の枠付き曲面の性質の研究を行いました。また、特異点の判定とフロンタルとしての双対性とルジャンドル曲面としての双対性の研究を行いました。5.A同値やK同値の一般化であり、様々な写像の同値関係を記述することが出来る幾何学的同値関係の研究を行いました。30年度の研究目的と研究計画において、枠付き曲面族の包絡面の研究、ラグランジュ特異点論、ルジャンドル特異点論の研究、2次元間の可微分写像の研究をまとめましたので、おおむね順調に進展しています。また、その他にも、ベルトラン曲線とマンハイム曲線の定式化、3次元球面内の枠付き曲面の研究、双曲空間内のカスプ状曲面の平坦曲面の研究、幾何学的同値関係の研究を行いました。しかし、枠付き曲面のブローアップによる定式化はまだ進んでいませんので、おおむね順調であると言えます。現在までの進歩状況の成果をまとめ論文投稿する予定です。また、枠付き曲面のブローアップの研究、枠付き曲面の焦面の研究、枠付き曲線と線織面の研究、ミンコフスキー空間内の曲線の研究を行います。そのため、研究集会やセミナー等に参加し、意見交換・研究打合せを行い、研究を推進します。特異点を許容する曲面論と特異点論の研究として、1.枠付き曲面と1径数族の枠付き曲線の関係の研究を行いました。枠付き曲面に対しては基本不変量により、1径数族の枠付き曲線に対しては曲率により合同を除いて決まります。その関係性を調べることにより多面的に特異点を許容する曲面論を展開できるようになりました。特に、余階数が1の写像の場合は常に1係数枠付き曲線として考えることが出来ますので、クロスキャップ等、フロンタルでない場合でも統一的に扱うことが出来るようになりました。2.1径数族の枠付き曲線に対して、包絡線を定義し、その性質を研究を行いました。1径数族の枠付き曲線に対して曲率が合同に関する完全不変量になり微分幾何学的性質を調べることが出来ます。特に、包絡線はまた枠付き曲線になることが分かりました。また、平面への射影や球面への射影した場合の包絡線との関係を調べました。3.特異点を持つ平面間の写像として、1径数族のルジャンドル曲線として研究を行いました。1径数族のルジャンドル曲線に対して曲率を導入し、曲率が合同に関する完全不変量になり微分幾何学的性質を調べることが出来ます。平面間の写像が1径数族のルジャンドル曲線になる条件を求めました。また、特別な平面間の写像の特異点の分類を曲率を用いることにより行いました。4.ルジャンドル写像族に対して、包絡面の定義を行い、性質を研究しました。クレロー型の場合は特異解の射影は包絡面になることが知られていますが、完全積分可能な1階偏微分方程式に対して、特異解の射影が包絡面になるための条件を与えました。5.特別な特異点を許容する曲面として、フロンタルの回転面の研究を行いました。ルジャンドル曲線と枠付き曲面を用いて、曲率の計算を行い微分幾何学的性質の研究を行いました。29年度の研究目的と研究計画において、枠付き曲面と1径数族の枠付き曲線の関係性、1径数族の枠付き曲線の包絡線の微分幾何学的性質、2次元間の可微分写像の特異点の研究として1径数族のルジャンドル曲線に研究、ルジャンドル写像族の包絡面の研究などほぼ全ての研究実施計画を行うことが出来ました。さらに、特別な特異点を許容する曲面として、回転面の研究を行いました。しかし、枠付き曲面のブローアップによる定式化はまだ研究が進んでいないため、おおむね順調に進展していると言えます。

包絡面定理として、包絡面を持つための条件を基本不変量の言葉で求め、包絡面の性質の研究を行いました。特に、包絡面は枠付き曲面になりますので、基本不変量と曲率を求めました。また、包絡面定理の応用として、1階偏微分方程式系と1階偏微分方程式の完全解と特異解に対して、特異解の射影が完全解の射影の包絡面になるための条件を求めました。2.ラグランジュ特異点論とルジャンドル特異点論の関係の研究を行いました。ラグランジュ部分多様体芽族に対して、グラフ型ルジャンドル開折芽族が同値関係を含めて対応していることを示し、この結果を用いて、焦面の分岐の生成的な分類結果をまとめ投稿しました。3.枠付き曲線に対してベルトラン曲線とマンハイム曲線を定式化し、これらの曲線は枠に依存することを示しました。また、非退化な正則曲線に対して、定義を定式化し、存在する必要十分条件を与えました。4.3次元球面の枠付き曲面の研究を行いました。基本不変量を求め、3次元球面の枠付き曲面の性質の研究を行いました。また、特異点の判定とフロンタルとしての双対性とルジャンドル曲面としての双対性の研究を行いました。5.A同値やK同値の一般化であり、様々な写像の同値関係を記述することが出来る幾何学的同値関係の研究を行いました。30年度の研究目的と研究計画において、枠付き曲面族の包絡面の研究、ラグランジュ特異点論、ルジャンドル特異点論の研究、2次元間の可微分写像の研究をまとめましたので、おおむね順調に進展しています。また、その他にも、ベルトラン曲線とマンハイム曲線の定式化、3次元球面内の枠付き曲面の研究、双曲空間内のカスプ状曲面の平坦曲面の研究、幾何学的同値関係の研究を行いました。しかし、枠付き曲面のブローアップによる定式化はまだ進んでいませんので、おおむね順調であると言えます。現在までの進歩状況の成果をまとめ論文投稿する予定です。また、枠付き曲面のブローアップの研究や更なる枠付き曲線・枠付き曲面の理論構築を行い、30年度の研究実施計画に従い研究を推進します。そのため、研究集会等において意見交換・研究打合せを行い研究の推進を行います。また、枠付き曲面のブローアップの研究、枠付き曲面の焦面の研究、枠付き曲線と線織面の研究、ミンコフスキー空間内の曲線の研究を行います。そのため、研究集会やセミナー等に参加し、意見交換・研究打合せを行い、研究を推進します。トポロジープロジェクトの1つとして研究集会を開催することになり、次年度使用額が生じました。使用計画として、必要な図書の整備として物品費の支出、研究集会への参加、共同研究、研究打合せ等として旅費の支出、研究集会の会場費としてその他を計上します。国外での研究打合せを計画したため、次年度使用額が生じました。使用計画として、必要な図書の整備とコンピュータとして物品費の支出、研究集会への参加、共同研究、研究打合せ等として旅費の支出を計上いたします。
移植・培養縫線核ニューロンに対する成長因子としての脳内ペプチドの形態学的研究

胎生期ラットからの脳幹縫線核組織を成熟ラット小脳に移植し、セロトニンニューロンが宿主組織に対してどのように再生していくのかを検索した。成熟ラットの脳室に5,6-DHTを投与し、内在性のセロトニン線維を化学的に変成した後に、中脳と延髄の2つの領域からのセロトニンニューロンをそれぞれ小脳へ移植した。中脳由来のセロトニンニューロンは小脳内で正常にくらべてはるかに豊富な突起の伸長(hyperinnervation)を示したのに対し、延髄由来のセロトニンニューロンは正常とほぼ同じ分布パターンを示した。セロトニンニューロンの海馬組織への軸索伸長能力を、セロトニン線維を破壊した成熟ラット海馬への縫線核組織の移植、成熟ラット前眼房水内への縫線核組織組織、縫線核・海馬組織の組織スライス培養法(organotypic slice co-cultures)を用いて検討した。いずれの実験においてもセロトニンニューロンは軸索を海馬内に伸長させ、同様の分布パターンが示された。特に密なセロトニン神経叢が歯状回の顆粒細胞の基底部に存在し、この部位にはGFAP陽性、s-100β陽性のグリア細胞が密に分布した。以上の結果から、セロトニン線維とグリア細胞の分布に相関性が示された。グリア細胞の主要構成タンパク質であるs-100βタンパク質を遺伝的に欠くミュータントマウスを用いて、免疫組織化学的(セロトニン、s-100β)にs-100βタンパク質のセロトニンニューロンの発達に及ぼす影響について検討した。その結果、homozygoteの海馬においてs-100β陽性グリア細胞は認められず、さらにセロトニン陽性線維の分布がきわめて少なく、変性セロトニン線維も観察された。このことは、s-100βとセロトニン線維の発達の間に関連性が認められ、セロトニン線維に対するs-100βの神経成長因子としての働きが示唆された。胎生期ラットからの脳幹縫線核組織を成熟ラット小脳に移植し、セロトニンニュ-ロンが宿主組織に対してどのように再生していくのかを検索した。とくに小脳を選んだ理由としては、組織構築が比較的単純であり、かつ明瞭な層的構造を呈しているからである。言い換えると、小脳の各層には特定の神経伝達物質を持った線維が分布しており、各層に存在するペプチドとセロトニンニュ-ロンの再生との関係がより明確な形で解析されると予想されたからである。成熟ラットの脳室に5,6ーDHTを投与し、内在性のセロトニンニュ-ロン線維を化学的に変性したのちに、中脳と延髄の2つの領域からセロトニンニュ-ロンをそれぞれ小脳に移植した。中脳由来のセロトニンニュ-ロンは小脳内で正常にくらべはるかに豊富な突起の伸長(hyperinnervation)を示したのに対し、延髄由来のセロトニンニュ-ロンは正常とほぼ同じ分布パタ-ンを示した。この事実は、セロトニンニュ-ロン神経線維の宿主組織に対する伸長機構には組織特異的要因が強く関与しており、伸びだす神経線維とその標的部位には特定の親和性・非親和性結合機序の存在を示している。この特異的結合を決定する化学的物質のひとつとして、小脳皮質に豊富に分布しているペプチドがあげられ、このペプチドが神経線維の伸長に栄養因子として働いていることが推測された。また、胎生ラット縫線核を含む領域を成熟ラットの前眼房に移植し、移植片でのセロトニンニュ-ロンの突起の伸長程度を検討した。

次年度は小脳各層におけるペプチドをはじめとする伝達物質とセロトニンニュ-ロン神経線維再生のより特異的な構造化学連関について検索を深めていく予定である。胎生期ラットからの脳幹縫線核組織を成熟ラット小脳に移植し、セロトニンニューロンが宿主組織に対してどのように再生していくのかを検索した。成熟ラットの脳室に5,6-DHTを投与し、内在性のセロトニン線維を化学的に変成した後に、中脳と延髄の2つの領域からのセロトニンニューロンをそれぞれ小脳へ移植した。中脳由来のセロトニンニューロンは小脳内で正常にくらべてはるかに豊富な突起の伸長(hyperinnervation)を示したのに対し、延髄由来のセロトニンニューロンは正常とほぼ同じ分布パターンを示した。セロトニンニューロンの海馬組織への軸索伸長能力を、セロトニン線維を破壊した成熟ラット海馬への縫線核組織の移植、成熟ラット前眼房水内への縫線核組織組織、縫線核・海馬組織の組織スライス培養法(organotypic slice co-cultures)を用して検討した。いずれの実験においてもセロトニンニューロンは軸索を海馬内に伸長させ、同様の分布パターンが示された。特に密なセロトニン神経叢が歯状回の顆粒細胞の基底部に存在し、この部位にはGFAP陽性、s-100β陽性のグリア細胞が密に分布した。以上の結果から、セロトニン線維とグリア細胞の分布に相関性が示された。グリア細胞の主要構成タンパク質であるs-100βタンパク質を遺伝的に欠くミュータントマウスを用いて、免疫組織化学的(セロトニン、s-100β)にs-100βタンパク質のセロトニンニューロンの発達に及ぼす影響について検討した。その結果、homozygoteの海馬においてs-100β陽性グリア細胞は認められず、さらにセロトニン陽性線維の分布がきわめて少なく、変性セロトニン線維も観察された。このことは、s-100βとセロトニン線維の発達の間に関連性が認められ、セロトニン線維に対するs-100βの神経成長因子としての働きが示唆された。