hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
低分子量G蛋白質による細胞の増殖、運動の制御機構

低分子量G蛋白質RasとRhoの細胞増殖や運動における役割を解析した。Ras/RalGDS/Ral/RalBP1/POB1の下流にEps15とEpsinが存在して、インスリンとEGF依存性の受容体のエンドサイトーシスを制御した。RasのGDP/GTP交換反応促進蛋白質Ras-GRF1が、G蛋白質共役型受容体刺激によりチロシンリン酸化され、DHドメインを介してRacのGDP/GTP交換反応を促進した。SH2領域およびRasGRF相同領域をもつ新規因子ChatはCasに結合し、MAPキナーゼによりリン酸化された。Rap1の不活性化因子Rap1GAPのファミリーである新規蛋白質Rap1GAPIIのN末端側のGolocoモチーフが三量体G蛋白質Giのαサブユニットに刺激依存性に結合し、Rap1を不活化した。Rac1依存性のラッフル膜形成にARF6とPI(4)P5Kαが関与した。酵母Rho3の不活性型と結合する蛋白質として単離したRab型G蛋白質Ypt11は、Rho3の標的蛋白質Myo2とも結合し、Myo2の活性がYpt11により制御された。翻訳後修飾を受けている酵母Rho1はその標的蛋白質であるグルカン合成酵素を活性化すると共にFks1とも効率よく結合した。酵母Rho1の標的タンパク質でフォルミンファミリーに属するBNI1が細胞膜表面の極性マーカーとして働き、細胞質微小管と相互作用して核分裂の方向を制御した。これらの結果から、低分子量G蛋白質のGDP/GTP交換反応促進蛋白質(RasGRF,C3G,Dbl)がチロシンキナーゼにより活性化されることが明らかになった。また、低分子量G蛋白質間の制御機構が酵母から哺乳動物細胞まで普遍的に存在すると考えられた。さらに、Rho1がアクチン系と微小管系の両者を制御する可能性が示唆された。低分子量G蛋白質の中でも発がん、転移に重要であるRasとRhoの活性化機構と作用機構について解析を行った。Rasはチロシンキナーゼ型受容体により活性化されるが、血球系細胞においてサイトカイン受容体のIL-3受容体とG蛋白質共役型のトロンビン受容体からのシグナルによりRasが活性化され、いずれの系においてもmSos1が関与し、その上流で異なるチロシンキナーゼが機能していることが明らかになった。IL-3は血球系細胞の増殖、生存維持においてJNK1を活性化するが、この際にRasが必要であった。また、新規のRas抑制因子であるGapm1は選択的スプライシングによりその活性が調節されている可能性を見い出した。インテグリンを標的蛋白質とするR-RasはRasの活性化因子であるRasGRFにより活性化され、またGapm1およびp120GAPにより機能が抑制された。Rasの標的蛋白質であるRalGDSはRafと相乗的に作用して、遺伝子発現を促進した。さらに、RalGDSにより活性化されるRalの標的蛋白質であるRalBP1と結合する新規蛋白質POB1を同定した。一方、Rhoは哺乳類細胞でも酵母でも細胞骨格を制御することが明らかになっているが、酵母Rho1が蛋白質リン酸化酵素Pkc1pと新規蛋白質Bni1pを介して、アクチン繊維の動態制御に関与し、さらにRho1pが酵母細胞壁の主要な構成成分である1,3-β-グルカンを合成する酵素の制御サブユニットとして働いた。また、酵母rho3の多コピー抑圧因子Sro9はトロポミオシンと共にアクチンの局在を制御し、Sro7はミオシンと結合した。ヒトRhoAは既に報告されているPLD活性化因子のARFと相乗的にPLDを活性化し、さらに、RhoAはPLDのC末端部分と直接結合した。Ras-RalGDS-Ralの下流で機能する新規蛋白質POB1とEpsinを見出した。RalやRalBP1(Ralの標的蛋白質)、POB1(RalBP1の結合蛋白質)、Epsin(POB1の結合蛋白質)は、いずれもインスリンとEGF依存性のエンドサイトーシスを制御した。Ras-GRF1が三量体G蛋白質βγサブユニットの刺激により、RacのGDP/GTP交換促進因子として機能し、この活性にはDb1ドメインが必要であった。三量体G蛋白質G12のαサブユニットがGTP依存性にGap1mのPHドメインに結合し、Gap1mのGAP活性を促進し、その結果、EGFによるRasの活性化を抑制した。Rap1の新規活性化囚子CalDAGIとcAMP-GEFを同定した。CalDAGIのRap1に対する活性は、Ca^<2+>およびDACにより活性化された。また、cAMP-GEFはサイクリックAMPにより活性化されされた。酵母Rho3は、極性分泌を制御するExocyst複合体のコンポーネントであるExo70とミオシンVであるMyo2とに結合し、Exo70の細胞内局在がRho3により変化した。酵母Rho1pの標的酵素である1,3-β-グルカン合成酵素の温度感受性変異株のうちで、推定上の基質結合部位近傍に変異を持つ4つの変異株では、in vitroでのグルカン合成酵素活性が特に制限温度下で顕著に低下していて、多くの細胞が小さな芽様の突起を出して増殖を停止した。

PLD1とPLD2はそれぞれ後期エンドソーム/リソゾームと細胞膜/オルガネラ膜系に局在し、EGF刺激により、PLD1の局在は変化しないが、PLD2はラッフリング膜に濃縮された。低分子量G蛋白質RasとRhoの細胞増殖や運動における役割を解析した。Ras/RalGDS/Ral/RalBP1/POB1の下流にEps15とEpsinが存在して、インスリンとEGF依存性の受容体のエンドサイトーシスを制御した。RasのGDP/GTP交換反応促進蛋白質Ras-GRF1が、G蛋白質共役型受容体刺激によりチロシンリン酸化され、DHドメインを介してRacのGDP/GTP交換反応を促進した。SH2領域およびRasGRF相同領域をもつ新規因子ChatはCasに結合し、MAPキナーゼによりリン酸化された。Rap1の不活性化因子Rap1GAPのファミリーである新規蛋白質Rap1GAPIIのN末端側のGolocoモチーフが三量体G蛋白質Giのαサブユニットに刺激依存性に結合し、Rap1を不活化した。Rac1依存性のラッフル膜形成にARF6とPI(4)P5Kαが関与した。酵母Rho3の不活性型と結合する蛋白質として単離したRab型G蛋白質Ypt11は、Rho3の標的蛋白質Myo2とも結合し、Myo2の活性がYpt11により制御された。翻訳後修飾を受けている酵母Rho1はその標的蛋白質であるグルカン合成酵素を活性化すると共にFks1とも効率よく結合した。酵母Rho1の標的タンパク質でフォルミンファミリーに属するBNI1が細胞膜表面の極性マーカーとして働き、細胞質微小管と相互作用して核分裂の方向を制御した。これらの結果から、低分子量G蛋白質のGDP/GTP交換反応促進蛋白質(RasGRF,C3G,Dbl)がチロシンキナーゼにより活性化されることが明らかになった。また、低分子量G蛋白質間の制御機構が酵母から哺乳動物細胞まで普遍的に存在すると考えられた。さらに、Rho1がアクチン系と微小管系の両者を制御する可能性が示唆された。
抗ウィルスマシーナリー-2-5Aシステム-の構造生物学

2-5Aシステムはインターフェロンの抗ウィルス作用を担う集合系型生物マシーナリーであり,2′,5′オリゴアデニル酸(2-5A)合成酵素と2-5A依存性リボヌクレアーゼ(RNase L)から成る.本研究は,2-5Aシステムを構成する酵素群の立体構造と,その活性発現機構を明らかにすることを目的とした.酵素の立体構造を解明するために,RNase L(83.5kDa),RNase Lの2-5A結合部位および触媒部位であるアンキリンドメイン(40 kDa)とRNaseドメイン(43.5 kDa),2-5A合成酵素(41kDa)を大腸菌で発現,精製し結晶化条件を検討した.その結果,2-5Aとアンキリンドメインの二者複合体について針状柱状の結晶を得ることに成功した.アンキリンドメインについては更に,メチオニンの代わりにセレノメチオニンを取り込ませた場合でも同様に結晶化に成功し,多波長異常分散法による構造決定が可能な状況となった.今後,ビームタイムが得られ次第アンキリンドメインの構造解析を行い,2-5Aとの結合様式を明らかにする.また,RNase Lの活性発現機構に関する手がかりを得るために,触媒残基が存在すると考えられている711から720残基のアミノ酸をそれぞれアラニンに置換したアラニンスキャニング実験を実施した.しかし,いずれの変異体も野生型酵素と同程度の活性を示したことから,触媒残基はその他の部分に存在することを明らかにした.平成11年度は,ヒト組換え型2-5A合成酵素の発現の検討およびヒト組換え型リボヌクレアーゼL(2-5A依存型リボヌクレアーゼ)の発現と結晶化条件の検討を行った.2-5A合成酵素については,大腸菌で発現させると封入体を形成したため,昆虫細胞で発現させるべく,組換えウィルスを作製中である.組換え型リボヌクレアーゼLも,大腸菌発現系を用いた場合,ほとんどが封入体として存在し,機能を維持した状態で可溶化できないことが判明した.そこで,発現タンパクの溶解性を高めることを目的にグルタチオンSトランスフェラーゼ融合酵素およびマルトース結合タンパク酵素を発現した.しかし,いずれの場合も溶解性は改善されなかったため,培養温度を下げることで発現タンパクの溶解性を改善した.次に,発現効率を上げることを目的として,発現プロモーターの検討を行った.プロモーターはlacとT7の2種を検討したが,一般に高効率と言われるT7では,リボヌクレアーゼLの発現はほとんど認められなかった.以上により,リボヌクレアーゼLの大量発現系を最適化した.精製したリボヌクレアーゼLについては,現在結晶化条件を検討中である.また,リボヌクレアーゼLは2つの機能ドメインに分けられることから,それぞれの機能ドメインの発現系を構築した.カルボキシ末端側ドメインについては,精製方法を検討中であるが,2-5Aを結合する機能を持つアミノ末端側ドメインについては,非融合型タンパクの精製方法を確立した.精製酵素を用いて結晶化条件を検討した結果,本ドメインの結晶を得ることができた.なお,本実験に関する結晶化実験は全て昭和大学薬学部の田中信忠先生との共同研究で行った.2-5Aシステムはインターフェロンの抗ウィルス作用を担う集合系型生物マシーナリーであり,2′,5′オリゴアデニル酸(2-5A)合成酵素と2-5A依存性リボヌクレアーゼ(RNase L)から成る.本研究は,2-5Aシステムを構成する酵素群の立体構造と,その活性発現機構を明らかにすることを目的とした.酵素の立体構造を解明するために,RNase L(83.5kDa),RNase Lの2-5A結合部位および触媒部位であるアンキリンドメイン(40 kDa)とRNaseドメイン(43.5 kDa),2-5A合成酵素(41kDa)を大腸菌で発現,精製し結晶化条件を検討した.その結果,2-5Aとアンキリンドメインの二者複合体について針状柱状の結晶を得ることに成功した.アンキリンドメインについては更に,メチオニンの代わりにセレノメチオニンを取り込ませた場合でも同様に結晶化に成功し,多波長異常分散法による構造決定が可能な状況となった.今後,ビームタイムが得られ次第アンキリンドメインの構造解析を行い,2-5Aとの結合様式を明らかにする.また,RNase Lの活性発現機構に関する手がかりを得るために,触媒残基が存在すると考えられている711から720残基のアミノ酸をそれぞれアラニンに置換したアラニンスキャニング実験を実施した.しかし,いずれの変異体も野生型酵素と同程度の活性を示したことから,触媒残基はその他の部分に存在することを明らかにした.
生殖細胞の性分化機構

生殖細胞の性分化機構に焦点をあて、オス化、メス化に必須な分子機構の解明を目ざしている。オス化に関しては、RNA制御のマスター因子であるNanos2とそのインタラクターCNOT複合体及びDND1が、いつどこで、どのような機構で標的RNAを認識結合し、分解あるいは、翻訳抑制しているのかをその分子機構を明らかにする。メス化機構に関しては、メス化決定因子であるSMAD4とSTRA8の標的を明らかにし、これらの遺伝子を同時にKOした場合に下流でどの遺伝子が変動してオス化がおこるのか、下流候補遺伝子を同定し、in vivo機能解析を行う。この解析は生殖細胞のメス化機構を明らかにすると同時に、性分化機構の解明につながる。29年度はNanos2の機能におけるP-bodyの必要性を解明するため、P-bodyの形成に必須なDDX6遺伝子のノックアウトES細胞を作製し、キメラ解析により、P-bodyの必要性を検討中である。また雌化因子であるStra8, Smad4の下流解析を可能にするマウスの作製を開始している。重複制限によりこの研究は終了することになった。29年度が最終年度であるため、記入しない。
生体高分子を利用した薬物担体の腫瘍集積性

悪性腫瘍に対する薬物療法においては,作用部位への送達能を有する薬物担体の開発が望まれている。特に高分子は腫瘍組織の血管系とリンパ系の特徴により受動的に腫瘍へ集積することが知られ,制癌薬の薬物担体として有用であると考えられている。しかしながら,その体内動態は化学的な修飾により変化することが推測され,化学修飾した高分子ハイブリッド医薬の物性や標的部位への指向性を評価する必要がある。本研究では生体高分子としてアルブミン,フェツイン,トランスフェリン及びグロブリンを選び,これらを化学修飾した生体高分子の物性と腫瘍集積性を中心とした体内動態を検討した。その結果次記の新たな知見を得,雑誌論文へ発表した。フルオレセインイソチオシアネートを用いて生体高分子の蛍光標識体を合成し,これに酢酸,グルタル酸,マレイン酸,コハク酸等のアシル酸を結合させた。生体高分子のアミノ基の大部分は修飾を受けたが,これらの化学修飾は蛍光標識含量に影響しなかった。また,生体高分子の分子径はアシル酸修飾により増大し,立体構造が著しく変化することが示唆された。担癌マウスを用いた検討から,アシル酸修飾した生体高分子は代謝を受け易くなり,血中から速やかに消失することが明らかになった。さらに,生体高分子の正常臓器への分布濃度は,グルタル酸またはマレイン酸修飾により減少したが,腫瘍への分布濃度はアシル酸修飾により変化しなかった。以上より,生体高分子の腫瘍への分布特性は,グルタル酸またはマレイン酸修飾により相対的に向上することが明らかになった。また,アシル酸による修飾部位はスペーサーとして作用し,生体高分子からの薬物の遊離放出性に影響を及ぼすと考えられる。したがって,これらの化学修飾は,腫瘍集積性と薬物の遊離放出制御機能を備えた,高分子ハイブリッド医薬を分子設計する上で有用であると考えられる。
医療系廃棄物管理システムの計画と評価規範の策定に関する研究

病院、医療系研究機関等より発生する医療系廃棄物について、処理処分システムの計画・設計、衛生学的管理システム構築の基礎に関することを目的とした。研究成果の概要はつぎの3点に要約される。1.医療系廃棄物の排出動態について、大学附属病院の調査結果などから、病床1日あたりの発生原単位は1.26.5kg/bed・dであること、1050%は感染性廃棄物であること、感染性廃棄物の組成としてプラスチック類繊維類の占める割合が高く、とくに繊維類に限ってはその大部分が感染性であること、医療系廃棄物組成として約4割がプラスチック、ゴム類であり、その中に医療用ディスポ製品の廃棄物が多いことなどの知見を得た。これら医療系廃棄物の排出動態に関する知見は極めて少なく、今後これらを基本とした処理処分システムの計画・設計を検討していく必要がある。2.医療系廃棄物処理にともなう微生物動態について、感染性廃棄物の熱処理(高圧蒸気滅菌、焼却)にともなう微生物の動態調査を中心に滅菌法の問題点の抽出を行った。耐熱性芽胞をもつ細菌として枯草菌(Bacillus subtilis)、易熱性細菌として大腸菌(Escherichiacoli)を用いて試験した結果から、十分な水蒸気置換を行い、所定の圧力と温度を与えてやれば十分な滅菌効果は得られるが、充填方法など制御困難な状況が多い廃棄物を対象とした場合、高圧蒸気滅菌といえども完全な滅菌効果を得られない場合もみられた。また、医療系廃棄物焼却残査の細菌数測定・分離菌識別の結果、高濃度の一般細菌、大腸菌群が検出される場合があった。焼却法は耐熱性の芽胞といえどもこれを死滅させることは十分可能であるものの、適切な炉設計、運転管理が要求される。3.適正管理システムの基本構想について、医療系廃棄物の発生から中間処理、最終処分にいたる全体の医療系廃棄物管理システムの基本指針策定を行い、基本構想案を提示した。
ヒトメタニューモウイルスの病原性とインターフェロンアンタゴニズム

2001年に発見された新規呼吸器ウイルス、ヒトメタニューモウイルスの病原性発現の機構について研究をすすめた。本ウイルスには、宿主の防御機構の要となるインターフェロンシステムに対する対抗機構が存在することを見いだした。本対抗機構を担うウイルス蛋白質はM2-2蛋白質で、形質細胞様樹状細胞に特化しているTLR7/9経路を介したインターフェロンα遺伝子の転写活性化を阻害することを明らかにした。ヒトメタニューモウイルス(hMPV)Jpn03-1株の遺伝子塩基配列(L(RNAポリメラーゼ)以外)を決定した。その結果、本ウイルス株は、A、B両遺伝子系統のうち、A系統に属することが明らかとなった。さらに、各ウイルス遺伝子(L以外)発現ベクターを構築し、インターフェロン(IFN)関連シグナル伝達に対する影響を調べ、各遺伝子の抗IFN能を検討した。1)IFN誘導遺伝子の活性化経路であるJAK-STAT経路を阻害するウイルス蛋白質は見いだされなかった。2)RIG-1やMDA5は、ウイルス感染を感知し、IFN-β産生に導く細胞質内センサー分子である。これらの分子の過剰発現によるシグナル伝達経路の活性化は、いずれのウイルス蛋白質でも阻害されなかった。3)エンドソーム膜に結合したTLR7/9は、細胞外のウイルス核酸を感知し、IFN-aや炎症性サイトカインの産生を促す。これらの分子は、plasmacytoid dendritic cell(pDC)等に特化して発現している。そこで、TLR7/9の下流シグナル伝達分子を293T細胞に過剰発現させることにより、本シグナル伝達を再構成し、各ウイルス蛋白質の阻害効果を検討した。伝達分子MyD88、TRAF0、IRF7の同時発現によるIFN-a-4プロモータの活性化は、M2-2蛋白質により強く抑制されることが判明した。本蛋白質は、IRF7のみの過剰発現によるIFN-a-4プロモータの活性化も抑制した。しがたって、M2-2は、IRF7あるいはIRF7近傍で働く分子に作用していることが推定された。4)TLR7/9経路の阻害活性は、パラインフルエンザ1型ウイルス(センダイウイルス)のCやV蛋白質でも見られ、パラミクソウイルスに共通した活性であることが示唆された。pDC(plasmacytoid dendritic ce11)は,そのエンドソーム膜に細胞外のウイルス核酸を感知するTLR7/9をもち,IRF7やNF-κBの活性化を通してインターフェロン(IFN)-αや炎症性サイトカインを産生する。前年度の研究から,ヒトメタニューモウイルス(hMPV)のM2-2蛋白質には,このTLR7/9シグナル伝達を阻害する活性が存在することが明らかとなった。この活性によりhMPVは宿主の免役応答から逃れていると考えられた。そこで今年度は,本阻害のメカニズムをさらに詳細に検討した。その結果,1)M2-2はIRF7の転写活性を抑制したが,NF-κBの活性化を阻害しなかった。したがって,IFN-αの誘導は抑制するが炎症性サイトカインの誘導は抑制しないと考えられた。2)M2-2蛋白質はIRF7分子と特異的に結合することが明らかとなった。3)M2-2蛋白質が結合するIRF7のドメインはIRF7の二量体形成に関わる領域であった。4)M2-2蛋白質のN端2/3の領域でもfull sizeのM2-2と同様な阻害活性とIRF7結合活性を示した。以上から,M2-2はIRF7を標的としてIRF7依存性のシグナル伝達を阻害していると推測された。したがって,pDCのような特化した細胞でのみ働いているTLR7/9経路以外でもIRF7の関わる伝達経路は阻害されうると考えられた。一般の細胞では,IRF7の発現は検出限界以下であるが,IFN誘導遺伝子のひとつであるため,IFNがいったん細胞に作用するとIRF7が発現するようになる。このように誘導されたIRF7は転写因子として機能しIFN-βのさらなる大量産生とIFN-αの産生とを促す。したがって,M2-2はpDCのみならず,一般細胞のIFN産生の増大を阻止する役割もあると考えられた。前年度までに、ヒトメタニューモウイルス(hMPV)のM2-2蛋白質には、TLR7/9シグナル伝達を阻害する能力が存在することを明らかにした。TLR7/9経路は、pDC(形質細胞様樹状細胞)に特化して見られる経路で、インターフェロン(IFN)-αの大量産生に関わっている。したがって、hMPVは、M2-2蛋白質によってIFN-α産生を抑制し自らが増殖しやすい環境を作り出していると考えられた。しかし、hMPVのように呼吸器局所に感染が限局するウイルスでは、そのIFN-αの産生にpDCがほとんど関わらないことが最近報告され、何故hMPVがこのような機構を持っているのか、大きな疑問が生じた。

この問題について考察するため、本年度は感染様式の異なる種々のパラミクソウイルスが、TLR7/9経路阻害活性を持つかどうかについて検討した。得られた結果は、以下のようである。1.局所感染型、全身感染型ウイルスともに、V蛋白質にTLR7/9経路を阻害する活性が認められた。3.Vは特異的にIRF7に結合した。4.VがIRF7に結合する領域は、Vユニークな領域(C末端領域)であった。以上から、Vは、ウイルスの感染様式にかかわらず、TLR7/9シグナルを阻害する能力を保持しており、その標的はIRF7だと推定された。一般の細胞では、IRF7の発現は検出限界以下であるが、IFNがいったん細胞に作用するとIRF7が誘導発現され、IFN-βのさらなる産生とIFN-αの産生とを促す。したがって、V蛋白質はpDCのみならず、一般細胞のIFN産生の増大も阻止し、そのことが感染様式に関わらず本能力が保持されている理由だと考えられた。
会計基準と会計実務のコンバージェンスおよびその相互作用に関する研究

本研究の目的は、日本ではなぜ会計基準のコンバージェンス(国際的統一)が慎重に進められているのかを、内外の会計基準、アンケート調査結果、証言などを用いて客観的に分析することであった。分析の結果、日本の会計制度は欧米の制度に近似していること、とりわけ日本の会計専門家の倫理観・判断力は欧米の会計専門家に近似していることが明らかにされた。しかし、会計基準のコンバージェンスを促進するにあたり、日本のローカルな側面、すなわち歴史的、組織的、社会的、制度的、政治的、経済的環境等を考慮する必要があり、これら制度間の補完関係がコンバージェンスが慎重に進められている原因となっていることが明らかにされた。本研究の目的は、日本ではなぜ会計基準のコンバージェンス(国際的統一)が慎重に進められているのかを客観的なデータや証言を用いて分析することにある。平成26年度は、「日本の固有性」に関する先行研究を収集・整理した上で、国際財務報告基準(IFRS)適用の是非を検討している企業会計審議会総会・企業調整部会合同会議の議事録を分析対象にしてコンテント・アナリシス(内容分析)を実施し、IFRS適用に関する企業会計審議会の各委員の多様な意見を検証した。分析の結果、日本の会計環境は社会的、経済的、法的、文化的、組織的、専門的および歴史的ファクターによって形成されていることが明らかにされた。また、企業会計審議会の委員のうち、会計研究者、財務諸表作成者(製造業からの代表者等)は、日本公認会計士協会からの代表者、財務諸表利用者(アナリスト等)に比べて、IFRSの強制適用に反対する割合が高いこと、2011年6月30から2013年6月19日にかけての議論は、2008年10月23から2009年6月11日にかけての議論に比べて、IFRSの強制適用に反対する割合が高い傾向にあったこと、ステークホルダー・グループ(学識経験者等も含む)ごとに、また期間ごとに、用いられたロジック(想定している諸環境)が異なることが明らかにされた。たとえば、IFRS強制適用反対派は「日本経済における製造業の重要性」や「日本の会計基準のIFRSに対する優位性」をはじめとしたローカルな視点を重視する傾向があるのに対し、IFRS強制適用賛成派は「海外市場での資金調達の可能性」や「財務報告の国際的な比較可能性」をはじめとしたグローバルな視点を重視する傾向があった。ただし、「魅力ある資本市場の構築」や「リサイクリング・純利益の重要性」については意見の差はなく、オールジャパンの声であることが確認された。本研究の目的は、日本ではなぜ会計基準のコンバージェンス(国際的統一)が慎重に進められているのかを客観的なデータや証言を用いて分析することである。平成27年度は、主として、会計専門家の判断特性および会計基準の並存化を題材にして、欧米諸国とは異なる「日本の固有性」を検証した。具体的に、リース会計基準を用いて、日本の(公認)会計士の判断特性を検証した。その結果、(1)原則(フル・ペイアウト)に賛同する会計士はリース取引の資本化を推奨する傾向にあるが、ガイダンス(概ね90%)に賛同する会計士はリース取引の資本化を推奨しない傾向にあること、(2)厳格なガイダンス(概ね88%)に賛同する会計士はリース取引の資本化を推奨する傾向にあるが、厳格なガイダンスは原則に比べて資本化推奨能力に劣ること、(3)日本の会計士はリース取引の資本化を回避しようとする経営者のインセンティブ(負債比率の)の高低にかかわらず、バイアスの少ない判断を行う傾向にあることが明らかとなった。日本では国際財務報告基準(IFRS)にみられるような原則主義的な会計基準の(過度の)適用に対して懸念が表明されてきたが、リース取引の資本化に関しては、むしろ原則のガイダンスに対する優位性が確認されたことになる。また、日本ではなぜ少なくとも6つの会計基準(日本基準、IFRS、米国基準、修正国際基準(JMIS)、中小指針、中小指針)が並存するに至ったのかを、JMIS策定の経緯などに触れながら検証した。分析の結果、いわゆる連単分離方式を前提とし、IFRSへの迅速な対応が図られたために、連結財務諸表と個別財務諸表との乖離だけでなく、金融商品取引法と会社法、財務報告と課税所得計算、大企業と中小企業の会計の分化が促進され、このことが会計基準の並存化をもたらした一因となっていることが確認された。本年度は、雑誌論文を8編公表し、学会報告を4回行うことができたため。本研究の目的は、日本ではなぜ会計基準のコンバージェンス(国際的統一)が慎重に進められているのかを、内外の会計基準、アンケート調査結果、証言などを用いて分析することである。平成28年度は、主として、会計基準および認識論・測定論の動向と課題を調査するとともに、日本の会計専門家の判断特性を検証した。具体的に、財務報告におけるローカルな側面とグローバルな側面に着目しつつ、会計基準の並存化・複線化問題、会計実務や周辺制度の多様化問題、リスク要因の増大化問題などについて検討した。その結果、グローバライゼーションは個別主義の普遍化および普遍主義の個別化の相互浸透を含む多重の過程であり、複数の均衡解が存在しうるので、並存化や多様化はある意味で必然であること、並存化や多様化によってむしろリスクが緩和されている可能性があること、今後、バラエティの最適水準に関する研究が必要であることを指摘した。

また、認識論・測定論の動向を調査する作業を通じて、国際会計基準審議会(IASB)は、金融危機があった2008年頃を境にして、公正価値に基づく単一測定モデルから公正価値と歴史的原価を使い分ける混合測定モデルに提案を変化させていったこと、それに応じて利益観も資産負債観からホーリスティック観へと提案を変化させていったこと、今後、ビジネスモデル・アプローチとの関連でホーリスティック観の具体的な中身を研究する必要があることなどを指摘をした。さらに、会計実務のコンバージェンスに関連づけながら、日本の(公認)会計士の判断特性を検証した。その結果、会計士は外部(クライアント)からの圧力の影響のみならず、内部(パートナー)からの圧力の影響を受ける可能性があること、会計士の判断は専門家意識および組織に対する愛着や義務感を醸成させることによって向上することなどが明らかにされた。本年度は、雑誌論文を7編公表し、学会報告を3回行うことができたため。本研究の目的は、日本ではなぜ会計基準のコンバージェンス(国際的統一)が慎重に進められているのかを、内外の会計基準、アンケート調査結果、証言などを用いて分析することである。平成29年度は、主として、大企業と中小企業におけるリース利用実態と会計処理の差異を調査するとともに、日本の会計専門家の判断特性を検証した。具体的に、中小企業のリース利用実態は大企業と比べてなにが相違しているのかを調査したうえで、中小企業会計のあり方を検討した。分析の結果、中小企業は大企業に比べて自社の資金状況により購入かリースかを決める傾向にあること、リースを重要な資金調達手段と捉える傾向にあることがわかった。また、中小企業は所有権移転外ファイナンスリース取引の会計処理として賃貸借処理を選好する傾向にあることがわかった。これらは、国際財務報告基準(IFRS)の影響を直接的・間接的に受ける大企業向けの会計とその影響を極力、緩和させようとする中小企業向けの会計の分化が進んでいる可能性を示唆するものである。また、会計実務のコンバージェンスに関連づけながら、日本の会計専門家(公認会計士)の倫理特性や判断特性を検証した。その結果、会計士は外部(クライアント)からの圧力の影響のみならず、内部(パートナー)からの圧力の影響を受ける可能性があることが明らかにされた。あわせて、会計士の倫理観や判断力は、専門家意識や組織に対する愛着・義務感を醸成させるような教育訓練によって向上することが明らかにされた。本研究の目的は、日本ではなぜ会計基準のコンバージェンス(国際的統一)が慎重に進められているのかを、内外の会計基準、アンケート調査結果、証言などを用いて客観的に分析することであった。分析の結果、日本の会計制度は欧米の制度に近似していること、とりわけ日本の会計専門家の倫理観・判断力は欧米の会計専門家に近似していることが明らかにされた。しかし、会計基準のコンバージェンスを促進するにあたり、日本のローカルな側面、すなわち歴史的、組織的、社会的、制度的、政治的、経済的環境等を考慮する必要があり、これら制度間の補完関係がコンバージェンスが慎重に進められている原因となっていることが明らかにされた。本年度は、雑誌論文を3編公表し、学会報告を6回行うことができたため。次年度は、実験会計学の手法を用いて日本の会計専門家の判断力・倫理観の特性を引き続き分析する予定である。
スポーツチームの心理的コンディショニングプログラムの作成の試み -指導者とプレイヤーとのコミュニケーションを中心として-

本研究ではプレイヤーの競技意欲に関する指導者とプレイヤーとの認識を分析し,両者のコミュニケーションの重要性について検討した.そして,競技中の指導者の行動とプレイヤーの行動をVTRに記録し,それをもとにコンピュータによりVTR編集,分析を実施した.競技中の指導者とプレイヤーとのコミュニケーションを中心とした行動をVTRに記録する場合,プレイ前,プレイ中(競技種目による),プレイ後のそれぞれの行動をとらえることが大切であると思われる.特に指導者の言語も含めた記録によって,プレイヤーの行動に対応した指導者の行動を良く理解できた.画像取り込みボード,デジタルビデオカメラを使用することで,画像編集作業にかかる時間が飛躍的に短縮され,デジタル信号で編集を行なうので画質が落ちず,競技行動の内容を十分把握できるようになった.サービスを出してからゲームが展開され,一つ一つのゲームに対する指導者の対応行動が表記しやすいことから,卓球競技を研究対象とした.指導者にマイクをつけ競技中の言語と行動を記録し,これを時系列的に記録用紙に表記することにより,指導者の対応行動がとてもよく理解できたと評価を受けた.また競技中のプレイヤーの心理的な動きを表すために,セットからサービスを出すまでにかかる時間を記述し,これにゲーム得点を表記したグラフを作成した.プレイヤーに対してこのグラフを提示しながらVTRを見てもらったところ,失点時,得点時のかけひき,自己の心理状態が十分よく理解できると評価を受けた.これらのことから,本研究で試みた競技中の心理的状態をプレイヤーや指導者に伝えるため,また心理的コンディションを調整するために一つのプログラムとして提示できる資料作成手順を開発することができた.これらの資料は,チームの心理的なコンディションを改善するために有効に作用するものと考えられる.【目的】1)プレイヤーの競技意欲に関する指導者とプレイヤーとの認識の構造を分析する.2)認識の構造と先行研究をもとに,ビデオ撮影,及び分析方法について検討を加える.3)コンピュータを使用したビデオ分析,編集方法について検討を加える.4)心理的コンティショニングプログラムで使用する競技行動シミュレーションプログラムの手法的な問題点について検討を加える.【結果】1)一次分類の結果,競技レベルが低いチームではプレイヤーは競技意欲の高まる要因としてチームメイトより指導者とのコミュニケーションを多くの者が回答した.これに対して競技レベルの高いチームでは指導者よりチームメイトを多くあげていた.すなわち,競技レベルが高まるとプレイヤーは指導者から自立して,プレイを行うことができるようになったのではないかと考えることができる.2)チームのコミュニケーションを中心として行動をビデオ記録する場合,一つのプレイの前,プレイ中(競技種目による),プレイ後のそれぞれのかかわり方の変化をとらえることが必要であると考えられる.それには特に指導者の言語活動も含めた撮影を行うこと,またプレイヤーではプレイ前,プレイ後の行動を中心に記録することによって,行動分析に有効な示唆を与えることができると思われる.3)画像取り込みホ-ド,デジタルビデオカメラを使用することで,画像編集の作業が飛躍的に早くなった.また,デジタルのままで画像編集を行うので画質が落ちず,内容把握が容易にまった.4)プレイヤーと指導者のコミュニケーションの善し悪しを編集したテープを心理的コンディショニングプログラムで使用するためプレゼンテーション用テープの作成を試みたが,編集ソフトにより容易に作成できることが確かめられた.次年度のコンディショニングプログラムで有効に働くことができると考えられる.本研究ではプレイヤーの競技意欲に関する指導者とプレイヤーとの認識を分析し,両者のコミュニケーションの重要性について検討した.そして,競技中の指導者の行動とプレイヤーの行動をVTRに記録し,それをもとにコンピュータによりVTR編集,分析を実施した.競技中の指導者とプレイヤーとのコミュニケーションを中心とした行動をVTRに記録する場合,プレイ前,プレイ中(競技種目による),プレイ後のそれぞれの行動をとらえることが大切であると思われる.特に指導者の言語も含めた記録によって,プレイヤーの行動に対応した指導者の行動を良く理解できた.画像取り込みボード,デジタルビデオカメラを使用することで,画像編集作業にかかる時間が飛躍的に短縮され,デジタル信号で編集を行なうので画質が落ちず,競技行動の内容を十分把握できるようになった.サービスを出してからゲームが展開され,一つ一つのゲームに対する指導者の対応行動が表記しやすいことから,卓球競技を研究対象とした.指導者にマイクをつけ競技中の言語と行動を記録し,これを時系列的に記録用紙に表記することにより,指導者の対応行動がとてもよく理解できたと評価を受けた.また競技中のプレイヤーの心理的な動きを表すために,セットからサービスを出すまでにかかる時間を記述し,これにゲーム得点を表記したグラフを作成した.プレイヤーに対してこのグラフを提示しながらVTRを見てもらったところ,失点時,得点時のかけひき,自己の心理状態が十分よく理解できると評価を受けた.これらのことから,本研究で試みた競技中の心理的状態をプレイヤーや指導者に伝えるため,また心理的コンディションを調整するために一つのプログラムとして提示できる資料作成手順を開発することができた.これらの資料は,チームの心理的なコンディションを改善するために有効に作用するものと考えられる.【目的】スポーツチームの心理的コンディショニングプログラムの開発を目指して,特にプレイヤーの競技意欲を高めるような指導者のかかわり方,プレイヤーの行動のとりかたを提示できるような,行動分析,ならびにプレゼンテーションプログラムの作成を試みることが,主な目的である.プレゼンテーションは,できる限りルーティン化できるような内容とすること,さらに視覚的に情報を提供できるようにすることをねらいとして研究を進めた.【結果】指導者にマイクを装着し,競技中の行動とあわせて言葉も記録した.プレイヤーは行動のみを記録した.これらの記録からまず時系列的に行動や言動を記述用紙に記録した.

この行動記述では,これをもとに,指導者と検討を繰り返し,実践の指導場面に応用できる資料提示を心がけた.本研究で対象にした卓球は,サービスからゲームが展開されることから,セットからサービスにかかる時間を記述し,それをもとにグラフかした.このグラフから連続失点部分をピックアップして,VTRに収めた失点部分の記録を眺めた.このグラフはプレイヤーの試合中の心理的な動きをよく理解でき,作戦上の不具合や心理的な動きを指摘するのに有効であった.プレイヤーはVTRを見ながらこのグラフを目で追いかけていた.また指導者へ提示した資料は,指導者の試合中の行動と言動を時系列的に表記した一覧表であるが,このときにも各試合ごとのサービスにかかった時間をあらわしたグラフを提示したところ,プレイヤーの試合中の技術的,心理的な状態がよくわかると回答があった.これらのことから,本研究で試みたチームの心理的コンディショニングプログラムは,チームの心理的な状態を改善するために,有効な資料を提示できるものと考えることができる.今後さらに指導者やプレイヤーから意見を取り入れながら,コンディンョニシグプログラムの完成を目指す.
非侵襲光学的血糖計測法（パルス・グルコメトリ）の実用化のための先駆的開発研究

国際糖尿病連合によれば2015年の糖尿病人口は4億1,500万人に上り、我が国は世界9位の糖尿病大国である。その疾病管理には血糖計測が不可欠で、特に採血不要の非観血計測が最も望ましく、それが実用されれば糖尿病予備軍や健常人のヘルスケアにも適用できるが、未だに実用化の成功事例はない。我々は近赤外光を用いた非侵襲血糖計測のための革新的・独創的な方法論(パルス・グルコメトリ)を提案し、基礎的検討を進めてきた。本法の実用化には、グルコースの吸光波長域での光電容積信号を高精度・高感度かつ簡便に検出する新手法が必須であり、本研究ではその開発に力点を置き,世界初の実用化の礎を目指した先駆的研究を遂行した。平成26年度は,当初研究計画書で記載した次の2項目について研究開発を実施し,以下の成果を得た。(1)グルコース吸光波長帯域における血糖計測の実験的検討と超高速分光測光システムによる妥当性検証現有の超高速分光測光システムによる血糖値(BGL)予測におけるBGL吸光波長帯域を再検討し,実験用多波長指尖部PPG同時計測システムの基本仕様を決定した。第一段階として,その方式は光源としてレーザー(LD),光検出にはフォトダイオード(PD)を用い,光散乱強度計測には積分球式検出法(ISDと略す)を導入したシステムの有効性を検討した。予備実験として,本年度では組織内水分の吸収が極めて高いが,BGL吸収波長の1つである1600 nmのLDを用いたISD実験システムを試作し,指尖部脈波(PPG)計測の可能性について検討した。その結果,従来型の透過型光散乱計測法(CTD)では殆どPPG計測は不可能であったが,ISDでは高SN比で計測可能であることが示された。これは水分を含む高吸収体の生体組織におけるPPG計測が世界で初めて実験的に示された有意義な知見である。一方、上記の光計測実験と共に、BGL予測に用いる吸光度解析において,光散乱体である生体組織に応用した修正Lambert-Beer則に基づいて,近接光波長導入による光散乱効果を除去した理論的解析手法を考案した。本手法は今後の実験的BGL予測実験で利用して行く予定である。(2)最適波長帯域の選定と高精度・高感度小型光計測システムの全体基本設計上記の実験的所見に基づき, BGL予測に最適な近接波長を(1550, 1600, 1650, 1702, 1749)nmの6波長と決定し,6つのLDs(半値幅;7nm以下)および1つのPDを用いた6-chパルス駆動レーザー計測システムの基本設計を行い,現在試作開発を進めているところである。平成27年度は,研究計画書で記載した次の2項目について研究を実施し,以下の成果を得た。(1)適波長帯域の選定と高精度・高感度小型光計測システムの全体基本設計血糖値(BGL)に吸光特性を持つ波長域は、組織内水分の吸光が著しく高く、従来の透過又は反射方式の光電容積信号(PPG)計測は殆んど不可能である。しかし、この波長域でのPPG計測は、本研究目標の達成に不可欠な重要課題である。本年度も積分球式光検出法(ISD)に関して、特に水の吸収が小さい波長域と大きい波長域を用い、従来の透過方式(TPD)とISDとの詳細な同時計測実験を行った。その結果、特に水の吸収が強い波長域において、TPDはPPG計測不能、ISDでは高SN比でPPG計測が可能であることが実証された。この成果は世界的にも初めてであり、学術誌PLOS ONE(10(12), e0143506, 2015)に公表した。更に、BGL吸光波長域の知見から選定された近接波長(1550, 1600, 1650, 1700, 1750 nm)、及び参照波長として1160 nmの6波長を用いたレーザー光計測実験プロトタイプの試作開発を行った。また、ISD方式の更なる簡便法、特にレーザーダイオード(LD)と光検出器の配置関係についても検討が進められた。(2)ヒト手指を計測対象としたプロトタイプの設計・試作開発と性能評価試作開発した6-chレーザー光計測プロトタイプ用い、ISD方式でヒト指尖部での計測を実施した。自作した積分球の構造設計に依存し、全てのチャンネルでの安定計測までには至っていないが、現在、積分球の構造見直し、更に上述した簡便方式の両方を検討しながら、PPGの安定計測可能な方法を追求しているところである。本研究の最終ゴールは小型簡便な方法で血糖値(BGL)を非侵襲計測する実用装置開発であり,本研究開発はその実用化への先駆的基盤構築を行い,実用開発の基礎資料を提供することを視野に研究計画を立案した。

本年度の研究の前期後期前半では,前年度までに得たレーザー光計測実験システムを用い、組織内水分による光吸収が小さい波長(血中アルコール(BAL)の吸収波長の一つである)と光吸収が非常に強い波長(本研究の対象成分BGLの吸収波長である1600 nm)を用い、TPDとISD方式で指尖部PPGの同時計測を行い、水の吸収の強い波長領域におけるISD方式の優位性を世界で初めて実証し、インパクトファクターの高い学術誌PLOS ONE(10(12), e0143506, 2015)に掲載されたことは、研究成果として極めて高く評価できると考えている。一方,BGL予測に用いる吸光度解析において,光散乱体である生体組織に応用した修正Lambert-Beer則に基づいて,近接光波長導入による光散乱効果を除去した理論的解析手法に基づき、実際に1550, 1600, 1650, 1700, 1750 nm、及び参照波長として1160 nmの6波長半導体レーザー(半値幅;7nm以下)と1つの光検出器(PD)を用いたパルス駆動レーザー計測システムを試作開発したことも大きな成果である。現在更に,ISD方式にこだわらず、光検出をさらに簡便化した方法、特にLDとPDの配置関係を工夫して、光散乱光を効率よく検出する技術開発も進行中であり、次年度に向けた実験的研究が推進できる状況である。以上より,本研究はほぼ当初計画通りに順調に進展しており,相応の研究成果も達成していると言える。平成28年度は,研究計画書で記載した次の2項目について研究を実施し,以下の成果を得た。(1)多波長光計測システムの試作開発と改良研究血糖値(BGL)に吸光特性を持つ波長域(15001750nm)は、組織内水分の吸光が著しく高く、従来の透過又は反射方式の光電容積信号(PPG)計測は殆んど不可能に近い。しかし、この波長域でのPPG計測は、本研究目標の達成に不可欠な重要課題である。平成28年度は、前年度までに得た積分球式光検出法(PLoS One, 10(12),e0143506, 2015)をさらに発展させ、実用に供し得る簡便法を考案した。すなわち、レーザー光源(LD)と光検出センサ(PD)の配置関係を試行錯誤で種々に変えてPPGが計測できる至適配置(LDとPDを直交配置し、両者の物理的光路長が45mm)を見出し、本手法を側方散乱PPG検出法(side-scattered PPG detection: ssPPG)と命名した(現在、学術誌に投稿中)。更に、これまでの知見から選定された波長(1550, 1600, 1650, 1700, 1750 nm)と参照波長として1160 nmの6波長を用いた多波長PPG計測システムを試作開発した。(2)ヒト手指を計測対象とした実験的検討と性能評価開発した6-chPPG計測システムを用い、ヒト指尖部での計測を実施したところ、全てのチャンネルでssPPG法は安定計測可能であることが実証された。現在、この知見をさらに発展させ、BGL計測の高精度化のために、光吸収特性と光散乱現象を利用した新たなPPG検出法の検討を、平成29年度実施に向けて追求しているところである。本研究の最終ゴールは小型簡便な方法で血糖値(BGL)を非侵襲計測する実用装置開発であり,本研究開発はその実用化への基礎資料を提供することを視野に研究計画を立案した。平成28年度は,前年度までに得た世界初の積分球式PPG検出法(PLoS One, 10(12), e0143506, 2015)の成果に基づき、実用に供し得る新なる簡便法を考案し、ヒト指尖部を用いた実験で、その有用性を世界で初めて実証したことは大きな成果である。すなわち、レーザー光源(LD)と光検出センサ(PD)の配置関係を試行錯誤で種々に変えてPPGが計測できる至適配置(LDとPDを直交配置し、両者の物理的光路長が45mm)を見出したことは極めて高く評価できる。この手法を側方散乱PPG検出法(side-scattered PPG detection: ssPPG)と命名し、現在、インパクトファクターの非常に高い学術誌に投稿中である。
アルツハイマー病因ペプチド凝集体の固体NMRによる立体構造解析

アルツハイマー病因ペプチドである42残基のβアミロイド(Aβ42)は、凝集して神経細胞毒性を示すことから、Aβ42の凝集機構の解明が強く望まれている。しかしながら、Aβ42は不溶性かつ非結晶性であるため、溶液NMRやX線結晶構造解析などの高分解能構造解析法を適用できない。本研究は、非晶質固体の構造解析に適用可能な固体NMRを用いて、Aβ42の凝集ならびに毒性発現機構を解明することを目的としている。Aβ42の神経細胞毒性発現機構の一つとして、ラジカル産生による酸化ストレスが注目されている。本研究代表者らは最近、38、39番目にターン構造を有するC末端分子内β-シートの形成により、毒性を示すラジカル種であるMet-35の硫黄ラジカルカチオンが、Ala-42のC末端カルボキシルアニオンにより安定化され、長期に渡る酸化ストレスを誘導することを示唆した。本反応により電荷が消失したC末端分子内β-シートが疎水性の核となり、安定化されたラジカルが長期的な酸化ストレスを引き起こすものと考えられる。本モデルを検証する目的で、Aβ42凝集体におけるこれらの残基間距離を固体NMRにより測定した。Aβ42凝集体のMet-35とAla-42を^<13>Cで標識し、炭素間距離を選択的に測定できるR2(rotational resonance)法で解析した。その結果、Met-35の側鎖炭素とAla-42のカルボキシル炭素は6Å以内の距離にあり、C末端カルボキシルアニオンがMet-35の硫黄ラジカルカチオンを安定化できる位置にあることが明らかになった。本研究で同定された38、39番目のターン構造を特異的に認識して排除する抗体は、アルツハイマこ病の新しい治療戦略になることが期待される。アルツハイマー病因ペプチドであるβアミロイド(Aβ42)は、凝集して神経細胞毒性を示す。本申請者らは最近、22、23位におけるターン構造の形成が、Aβ42の凝集において重要であるとする新しいモデルを提示した。本研究は、22、23位でターン構造をとりやすい配列をもち、かつ凝集能が高いE22K(Italian変異型)に着目し、固体NMR法を用いて、本凝集モデルを検証することを目的としている。本申請者らはこれまでに、E22K-Aβ42凝集体の2124位の立体構造を、固体NMRを用いて解析している。その結果、2種類のコンホーマーが観測され、これらのいずれもが22、23位付近にターン構造を有することが示唆された。本年度はまず、このモデルを精密化するために、その周辺部位(19位および2527位)を安定同位体標識して、固体NMR法により解析した。固体NMRの測定には、研究協力者である竹腰らにより考案された13C-13Cの二次元距離相関NMRであるDARR(dipolar assisted rotational resonance)法を用いた。その結果、存在比が少ないコンホーマーでは、Lys-22とAsp-23の側鎖どうしの静電的相互作用により、22、23位におけるターン形成が促進され、25位以降のP-sheet領域が増大していることが示唆された。そこで、Lys-22とAsp-23の側鎖間をアミド結合で連結させて、この静電的相互作用を模倣したAβ42の配座固定アナログを化学合成した。本アナログは、E22K-Aβ42よりも遥かに高い凝集能および細胞毒性を示した。E22K-Aβ42では、Lys-22とAsp-23の静電的相互作用が、病原性の高い`悪性コンホーマー'の割合を増大させているものと考えられる。アルツハイマー病因ペプチドであるβアミロイド(Aβ42)は、凝集することにより神経細胞毒性を示す。本研究代表者らは最近、Glu-22、Asp-23付近にターン構造を有する毒性コンホマーの形成が、Aβ42の凝集および毒性発現において重要であることを明らかにした。本研究は、22、23番目でターン構造をとりやすい配列をもち、かつ凝集能が高いE22K(Italian変異型)に着目し、Aβ42による毒性発現機構を解明することを目的としている。E22K-Aβ42では、Lys-22とAsp-23の側鎖間の静電的相互作用により毒性コンホマーの形成が促進されることから、22、23番目の側鎖をアミド結合で連結した毒性コンホマーの配座固定アナログであるAβ42-lactam(22K-23E)を化学合成した。Phenyl-tert-butyhlitrone(PBN)をスピントラップ剤として用いた電子スピン共鳴(ESR)法による解析において、本アナログは顕著に高いラジカル産生能を示した。さらに、本アナログを電気泳動法とウエスタンブロッティングにより分析した結果、神経細胞毒性が非常に高いオリゴマーを形成しやすいことが明らかとなった。以上の結果から、毒性コンホマーの形成がラジカル産生を誘導し、オリゴマー化の引き金となることが示唆された。一方、E22K-Aβ42凝集体の分子間β-sheet構造を、^13C-^13C距離を選択的に解析できる固体NMR法であるrotational resonance法を用いて解析した。その結果、β-sheet鎖のAla-21およびAla-30の位置における分子間距離が6Å以内であることが示唆された。

このことは、E22K-Aβ42凝集体が分子間平行β-sheetを形成していることを強く支持している。アルツハイマー病因ペプチドである42残基のβアミロイド(Aβ42)は、凝集して神経細胞毒性を示すことから、Aβ42の凝集機構の解明が強く望まれている。しかしながら、Aβ42は不溶性かつ非結晶性であるため、溶液NMRやX線結晶構造解析などの高分解能構造解析法を適用できない。本研究は、非晶質固体の構造解析に適用可能な固体NMRを用いて、Aβ42の凝集ならびに毒性発現機構を解明することを目的としている。Aβ42の神経細胞毒性発現機構の一つとして、ラジカル産生による酸化ストレスが注目されている。本研究代表者らは最近、38、39番目にターン構造を有するC末端分子内β-シートの形成により、毒性を示すラジカル種であるMet-35の硫黄ラジカルカチオンが、Ala-42のC末端カルボキシルアニオンにより安定化され、長期に渡る酸化ストレスを誘導することを示唆した。本反応により電荷が消失したC末端分子内β-シートが疎水性の核となり、安定化されたラジカルが長期的な酸化ストレスを引き起こすものと考えられる。本モデルを検証する目的で、Aβ42凝集体におけるこれらの残基間距離を固体NMRにより測定した。Aβ42凝集体のMet-35とAla-42を^<13>Cで標識し、炭素間距離を選択的に測定できるR2(rotational resonance)法で解析した。その結果、Met-35の側鎖炭素とAla-42のカルボキシル炭素は6Å以内の距離にあり、C末端カルボキシルアニオンがMet-35の硫黄ラジカルカチオンを安定化できる位置にあることが明らかになった。本研究で同定された38、39番目のターン構造を特異的に認識して排除する抗体は、アルツハイマこ病の新しい治療戦略になることが期待される。