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牛白血病における急性期糖蛋白の糖鎖解析と接着分子結合能

本研究では疾患時における急性期糖蛋白の糖鎖構造の質的変動を解析することを目的として,牛α1酸性糖蛋白(α1AGP)に対するモノクロナル抗体(Mab)の作製,L-selectin(L-sel)の遺伝子クローニングと蛋白発現,糖鎖構造の解析,リンパ球に対する機能解析を行なった.1.モノクローナル抗体の作製:健常牛および白血病牛血清からα1AGPを分離し,これを抗原としてマウスを用いてMabを作製し,3つのクローン(IgM class,κ鎖)が得られ,Western blot法で牛α1AGPを認識した.また,本Mabは糖鎖を除去したα1AGPを認識せず,糖鎖結合領域.のepitopeを認識するものと考えられた.これを用いたELISAでは約0.1-10μgの範囲で測定可能であった.2.牛L-selectinの遺伝子クローニングと蛋白発現:牛L-selをコードするcDNAをクローニングした.そのORFは1110bpで370aaをコードしていた.また,大腸菌発現では不溶性となったが,バキュロウイルス発現系では膜蛋白として発現し,抗体と良好な反応性を示した.3.糖鎖構造の解析:Con Aに対するα1AGP糖鎖結合能は,正常牛では強い結合能を示す2分画しか認められないのに対し,白血病牛では第2分画の上昇とより結合能の低い第3分画,全く示さない第4分画が認められた.またSialyl Lewis X抗体との反応性は弱いものの,白血病牛ではやや上昇する可能性が示され,E-selectinとの結合性についても同様であった.4.リンパ球の機能解析:牛リンパ球におけるサイトカインmRNA発現について検討した.ConA刺激ではIL-2は個体により異なる反応性を示したが,個体差はあるもののIL-4の低下およびIFN-γの上昇が観察され,これらの個体におけるα1AGPに差がみられた.本研究では疾患時における急性期糖蛋白の糖鎖構造の質的変動を解析することにより,その病態発生あるいは免疫防御機構における作用を解明することを目的として,本年度はそのモデルとなる白血病牛あるいは健康牛のa1酸性糖蛋白(a1AGP)を分離精製し,モノクローナル抗体の作製と牛L-selectinの遺伝子クローニングとin vitroでの蛋白発現を試みた.(1)分離精製:健常牛および白血病牛から,イオン交換カラムクロマトグラフィーおよび免疫吸着法を用いてa1AGPを分離した.(2)モノクローナル抗体の作製:精製a1AGPをマウスに免疫した後,脾細胞を採取してミエローマ細胞と融合し,抗体活性のあるクローンを限界希釈法によりクローニングした.その結果,3つのクローン(IgMクラス,κ鎖)が得られ,何れもWestern blot法で牛a1AGPを認識するものであった.また,a1AGPをendoglycosidase Fで処理して糖鎖を除去した後,Western blot解析を行ったところ,これを認識できないことから,本法により得られたMabは糖鎖結合領域を認識するものと考えられた.(3)モノクローナル抗本を用いたELISA法:本モノクローナル抗本を用いて直接吸着法を用いたELISAにより,血清a1AGPの濃度測定を試みたところ,0.1μg10μgの範囲で測定可能であった.(1)牛L-selをコードするcDNAをリンパ球mRNAを用いてクローニングした.牛L-selのORFは1110bpで,370aaをコードし,38aaのシグナルペプチドを含んでいた.これを用いて大腸菌で発現したところ,不溶性となったが,バキュロウイルス発現系では膜蛋白としで発現し,抗体と良好な反応性を示した.本研究では疾患時における急性期糖蛋白の糖鎖構造の質的変動を解析することを目的として,牛α1酸性糖蛋白(α1AGP)に対するモノクロナル抗体(Mab)の作製,L-selectin(L-sel)の遺伝子クローニングと蛋白発現,糖鎖構造の解析,リンパ球に対する機能解析を行なった.1.モノクローナル抗体の作製:健常牛および白血病牛血清からα1AGPを分離し,これを抗原としてマウスを用いてMabを作製し,3つのクローン(IgM class,κ鎖)が得られ,Western blot法で牛α1AGPを認識した.また,本Mabは糖鎖を除去したα1AGPを認識せず,糖鎖結合領域.のepitopeを認識するものと考えられた.これを用いたELISAでは約0.1-10μgの範囲で測定可能であった.2.牛L-selectinの遺伝子クローニングと蛋白発現:牛L-selをコードするcDNAをクローニングした.そのORFは1110bpで370aaをコードしていた.また,大腸菌発現では不溶性となったが,バキュロウイルス発現系では膜蛋白として発現し,抗体と良好な反応性を示した.3.糖鎖構造の解析:Con Aに対するα1AGP糖鎖結合能は,正常牛では強い結合能を示す2分画しか認められないのに対し,白血病牛では第2分画の上昇とより結合能の低い第3分画,全く示さない第4分画が認められた.またSialyl Lewis X抗体との反応性は弱いものの,白血病牛ではやや上昇する可能性が示され,E-selectinとの結合性についても同様であった.4.リンパ球の機能解析:牛リンパ球におけるサイトカインmRNA発現について検討した.ConA刺激ではIL-2は個体により異なる反応性を示したが,個体差はあるもののIL-4の低下およびIFN-γの上昇が観察され,これらの個体におけるα1AGPに差がみられた.

本研究では疾患時における急性期糖蛋白の質的変動を接着分子結合能の点から解析し,種々の疾患あるいは疾患モデルにおける病態を把握し,診断・治療に役立てることを目的とし,以下について検討した.1.α1酸性糖蛋白(α1AGP)における糖鎖構造の変動まず,Concanavalin Aに対するα1AGP糖鎖結合能について検討したところ,正常牛のものでは強い結合能を示す2分画しか認められないのに対し,白血病牛のものでは第2分画の上昇とより結合能の低い第3分画および全く示さない第4分画の出現が認められた.このことは糖鎖構造の質的変動を示す結果であり,ここで注目しているSialyl Lewis X(SleX)抗原の付加の変動が推察されるため,抗体を用いて検出を試みたところ,正常では反応性は弱く,白血病では上昇する可能性が示された.この定量性については詳細に検討する必要性があるものの,新たな測定系確立の可能性が示された.また,E-selectinとの結合性についても同様の所見が得られた.α1AGPは牛リンパ球や好中球に対して抑制活性を示すが,遺伝子レベルでの詳細な報告はないため,基礎的研究としてリンパ球におけるサイトカインmRNA発現にっいて検討した.ConA刺激ではIL-2 mRNAでは個体により種々の反応性がみられたが,個体差があるもののIL-4 mRNAの低下およびIFN-gの上昇が観察された.これらの個体におけるα1AGP濃度には差がみられ,このα1AGPはリンパ球膜上に存在することから,本蛋白の関与がin vivoで既に影響を及ぼす可能性が示された.
バナッハ環における保存問題の研究

本研究でバナッハ環の一般線形群の間の距離を保存する写像の構造を決定した。その応用としてC*環の一般線形群の間の距離を保存する写像の形を決定した。またMazur-Ulamの定理の非可換化を行いこの応用としてヒルベルト空間上のユニタリー群の間の等距離写像の形を決定した。また、ある種の可換バナッハ環の間のノルムを非対称に保存する写像についての知見を得た。さらに解析関数からなるF多元環の間の積を保存する等距離写像の形を決定した。単位的可換バナッハ環の間のスペクトル半経を「和的に」保存する全射についてその形を完全に決定した。その際に極大イデアル空間の間の線形荷重合成作用素と共役線形荷重合成作用素の部分に分けて記述されることを示した。これは単位的可換C*-環の間の線形全射等距離写像に関するBanach-Stoneの定理を含む結果である。また、単位的バナッハ環の可逆元全体からなる群の開部分群の間の全射等距離写像について、それは与えられたバナッハ環の間の全射実線形等距離写像をラディカル要素平行移動したものに一意的に拡張できることを示した。一般に単位的半単純可換バナッハ環の間の単位的複素線形等距離全射は乗法的とは限らない、つまりバナッハ空間として同形であっても積の構造を含めての同型性はまったくいえないことは良く知られている。この中で上記結果を用いると次が分かる:単位的半単純可換バナッハ環の可逆元全体の群の開部分群間の全射等写像は与えられたバナッハ環の間の全射等距離実多元環同形写像にユニタリー元をかけたものになる。つまり単位的半単純可換バナッハ環の群の開部分群が距離空間として同形ならば、与えられたバナッハ環は実バナッハ環として同形であることがいえる。バナッハ環が非可換の場合は、状況は複雑であることが十分に予想できるか、対象とする標準的作用素環(standard operator algebras)の場合には可逆元全体の群の開部分群の間の等距離写像の一般形を記述することができた。また、関数環の間の乗法的にスペクトル、ノルムなどを保存する写像の研究においていくつかの知見が得られた。Mazur-Ulamの定理は距離構造の和の構造への影響について述べた定理であるが,これを距離群の場合に転進した。その際にinverted Jordan productを定義した。距離群では代数的中点は一意に定めがたくそこで代数的中点が等距離写像により保たれるという主張のMazur-Ulamの定理に対してinverted Jordan productが保たれることを示した。今後この定理の応用が順次示されていくと思われる。単位的バナッハ環の可逆元全体からなる群の開部分群の間の等距離写像の形を決定した結果を用いて,懸案であった単位的C*-環の場合に可逆元全体からなる群の開部分群の間の等距離写像が中心射影とジョルダン*同形写像を用いて完全に記述した。特に与えられるC*-環がヒルベルト空間上の有界線形作用素全体からなるバナッハ環の場合にはその形をユニタリー変換を用いて記述した。またC*-環のユニタリー群の間の等距離写像についてもヒルベルト空間上の有界線形作用素全体からなるバナッハ環の場合にはその構造を決定できてきた。ノイマン環の場合への拡張ができたと思われる。さらにその際に用いられた解析的な方法を適用することにより正値可逆作用素全体の間のThompson等距離写像についてその記述をできることとその応用についての展望を開いた。局所コンパクト群の同形性をその上の環により記述する問題については,局所コンパクト可換群上の測度環の可逆測度全体が等距離であれば与えられた局所コンパクト可換群は同相同形であることが示された。また球や多重円板で定義された正則関数からなるある種のF-多元環の間の乗法的等距離写像の形を決定した。超鏡映的亜距離空間の間の亜距離保存写像についての結果をまとめた。さらに関数環の間に定義された乗法的にスペクトルを保存する写像とその一般化について,特に弱乗法的に抹消スペクトルを保存する写像について弱い仮定のもとで,その形を決定した。等距離写像についてその歴史は1930年代のBanach-Stoneの定理にまでさかのぼることができるが現在に至るまで対象となる空間が線形構造をもったものについて多くの研究がなされてきた。このような中でMazur-Ulamの定理の非可換化に成功することによりBanach環の線形とは限らない部分構造間の等距離写像についてその形を決めることができるようになってきた。たとえば単位的C*環のユニタリー群の間の等距離写像について一般の場合についてその形を決定することに展望を開いた。また単位球や多重円板上で定義されたF-環上の乗法的等距離写像の形も与えることができた。さらに特殊直交群などの古典リー群の間の等距離写像についても取り扱うことのできる方法を確立した。

さらに単位的Banach環やC*環の各種の部分構造の間の等距離写像を記述する一つの方法を確立できた。これは正値可逆元からなる集合に微分幾何構造を考えた場合の距離や測地線を保存する写像の形を決定するための新たな方法論を与えることにつながり、具体的にはCPR空間のThompson等距離写像の形を決定する方法を確立した。これによって類似のRiemann多様体のある種の距離を保存する写像の形を決定するための道具立てができた。線形構造があるとは限らない対象に対しての等距離写像の構造について多くの結果が得られた。またそこで用いられた方法によりさらに発展が見込まれるため。24年度が最終年度であるため、記入しない。今までに得られた研究成果をさらに充実させさらに新たな機軸を打ち出し未解決の問題について特にその解決を図りたい。
新しいプレクチンファミリー分子の構造と遺伝子発現

ある自己免疫性水疱症患者血清が認識する450-kDa分子の構造およびその遺伝子発現研究する目的で、以下の実験をおこなった。同血清をプローブにしてヒト表皮細胞由来のcDNAライブラリーより2種のcDNAクローン(pE450-B ; 0.8kb、pE450-C/D ; 2.0kb)をわれわれは同定していた。(1)450-kDa分子の構造pE450-B、pE450-C/Dの特異配列を蛋白発現ベクターに組込み融合蛋白を作成し、450-kDaを認識する患者血清との反応を検討した結果、患者血清はpE450-C/D由来の蛋白質とのみ反応した。またpE450-BはヒトのプレクチンのcDNAとほぼ一致したが、pE450-C/Dは一致せず、450-kDa自己抗原はプレクチン・ファミリーに属する新しい分子であることが確定し、プレクチン2と名づけられた。pE450-C/Dはプラーク・ハイブリダイゼイション、5^lRACE(rapid amplification of cDNA ends)法により全長14kb中3^l側8kbまでその塩基配列を決定した。その結果プレクチン2のカルボキシ末端側には534アミノ酸残基からなる3回の繰り返し構造が存在した。これは、6回の不規則な繰り返し構造を有するプレクチンとは対照的で、3回の繰り返し構造をもつデスモプラキンにむしろ類似していた。異なるスプライシング・フォームと考えられるクローンも得られ、カルボキシ末端側には2種のフォームが存在することが明らかになった。@ 450-kDaゲノム・クローンの単離pE450-C/Dに特異的にハイブリダイズするゲノム・クローンを2個、またpE450-B、pE450-C/D共通にハイブリダイズするゲノム・クローンを5個単離し、現在解析中である。ある自己免疫性水疱症患者血清が認識する450kDa分子の構造およびその遺伝子発現を研究する目的で、既に得られた2.0-および0.8-kbの2種の450kDa cDNAクローンを用いて実験を行い以下の結果を得た。1.450kDa分子のcDNA塩基配列決定PCR-RACE(rapid amplification of cDNA ends)法により全長cDNAを得ようとしたが、成功しなかった為、元来のプラーク・ハイブリダイゼイション法に変更した。既に明らかになった2.0-kbの3'側の塩基配列をプローブにしてHeLacell由来のcDNAライブラリーをスクリーニングし、1.4-,1.8-,2.5-kbの3種のクローンを得た。これらは2.0-kbクローンの3'側と各々0.2-,0.6-,1.0-kbオーバーラップしていたが、それ以外の部分の互いのホモロジーは低く、また1.4-kbクローンの1285番目の塩基配列に停止コドンがあらわれた為2.5-,1.8-,1.4-kbの順にtandemに配列していると考えられた。これらのクローン間になお未知の塩基配列が存在すると考えられるが、既知の2.0-kbも含め3'側のcDNAのほぼ5-6kbの配列(全長1213-kbとして約2分の1)が決定された。PCR-RACE法が成功しなかった理由の一つとして、この分子内に多くの繰り返し塩基配列が存在することが考えられた。2.450kDa分子の遺伝子クローン単離また5'末端のcDNAが得られてから遺伝子ライブラリーをスクリーニングする予定であったが、上記の如く5'末端cDNAがまだ得られていないため、手持ちのcDNAをプローブに遺伝子ライブラリーをスクリーニングした。

2.0-および0.8-kbの2種のcDNAクローンの各々に特異的にハイブリダイズする遺伝子クローンを2および1個、また両者にハイブリダイズする共通のクローンを5個得て、現在その制限酵素によるマップを作成中である。(1)平成8年(1996年)度に生じた外国での研究状況450-kDaを認識する患者血清をプローブにしてヒト表皮細胞由来のcDNAライブラリーより2種のcDNAクローン(pE450-B、pE450-C/D)をわれわれは同定していた。ところがヒト胎盤および表皮細胞由来のプレクチンのcDNAが相継いで単離され、それらはpE450-Bにほぼ一致したが、pE450-C/Dとは一致せず、別の分子であることが明らかになった。(2)平成8年(1996年)度の本研究の進展状況pE450-B、pE450-C/Dの特異配列を蛋白発現ベクターに組込み、融合蛋白を作成し、450-kDaを認識する患者血清との反応を検討した結果、患者血清はpE450-C/D由来の蛋白質とのみ反応した。この結果450-kDa自己抗原はプレクチン・ファミリーに属する新しい分子であることが確定し、プレクチン2と名づけられた。pE450-C/DのcDNAは3'側は終止コドンまでのクローンがすでに一種類単離されていたが、異なるクローンも得られ、カルボキシ末端側は、2種の異なるスプライシング・フォームが存在することが明らかになった。この部分にはまた534アミノ酸残基からなる3回の繰り返し構造が存在した。5'側へはこの繰り返し構造を抜け出たため、5'RACE(rapid amplification of cDNA ends)法を応用し、新たに2-kbのクローンを得た。現在、解析中である。これで全長14-kb中8-kbのcDNAが単離された。現在まで、450-kDaと反応する患者血清は一人のみであったが、他に一人見い出された。本患者は肺癌を有しており、第一例も肺癌で死亡したことから、この自己抗原と肺癌との関連性が示唆された。
地理的分野における科学的思考力育成のための単元開発

1研究目的本研究は,地理的分野における科学的思考力の育成のためにはどのような学習が有効であるかを、単元開発を通して検証しようとするものである。2研究方法千葉県に立地する金属工業と石油化学工業の立地理由を、JFEと出光興産を題材にして追究し、そこで得られた認識をもとに、高付加価値型の機械工業の立地私有を、ソニーのデジタルカメラを題材にして追究する単元を開発した。単元開発を行う際に、次の3点に留意して行った。(1)授業者が単元を構造的に把握すること。(2)社会認識を段階的に深化させること。(3)学習の転移を必要とする場面を意図的に設定すること。3研究成果本研究の結果、次のことが明らかになった。(1)社会認識を段階的に深化させることは、科学的思考力を育成するために有効な手段であること。(2)下位の社会認識を獲得している生徒ほど、上位の社会認識に到達できること。(3)事実に立脚した推論を強調することで、科学的思考力の育成は促進できること。(4)研究結果は第40回全国中学校社会科教育研究大会において発表し、全国に発信することができた。
Coiled-coil領域の重合阻害を誘導する薬剤による融合遺伝子肺癌の治療開発

EML4-ALK融合遺伝子を有する非小細胞肺癌に対して、EML4の重合阻害を引き起こすペプチドを創薬した。EML4のcoiled-coil(CC)領域に一致したペプチドを作成し、また、CC領域の三量体結合部位を変異させた変異CC領域、さらにCC領域のペプチドを安定化させるためにペプチド間をstaple構造架橋を加えて固定し、細胞内透過性やペプチド安定性を増した試薬を作成した。EML4-ALK融合遺伝子を有する、非小細胞肺癌細胞株であるH3122細胞株に対してこれらのペプチドを添加して細胞増殖抑制効果を各種濃度で検討したが、30 ng/mlの濃度で添加した場合、細胞増殖アッセイで-20%の増殖抑制を認めた。市販のiDimerizer kitを用いALKの細胞内ドメインを人工的に2量体化/単量体化する実験系を作成し、マウス由来のIL6依存性B細胞株であるBaF3細胞に遺伝子導入した。単量体ではALKリン酸化活性を失い、細胞増殖は止まり、免疫不全マウスの皮下腫瘍移植モデルでは、単量体化することで腫瘍は縮小することが明らかになった。ALKが単量体で活性を有するF1174L変異体に関する検討も行っている。野生型より細胞増殖抑制効果が低いことを確認している。現在、このペプチドの細胞内移行性を調整し、安定化させるためにCC領域ペプチド各種修飾を行っている。今後より有効な細胞内デリバリーを検討しペプチド創薬とつなげていく予定。ペプチドの解析や細胞内移行の検討に時間を要したが、おおむね順調に進展しているマウスなどの皮下腫瘍移植モデルにおいても本ペプチド治療が有効であるか検討する。使用予定のペプチドを再考して次年度に作成することにしたため
メゾスケールに制限した高分子混合系の光誘起階層構造の計測

本プロジェクトは、メゾスケールにおける高分子の凝集構造を光反応で発現・制御した一連の研究である。化学反応のみでは、オングストローム(□)の構造までしか制御できないが、化学反応を臨界現象と結合(カップリング)させると、化学反応の効果は長距離に変わり、高分子のメゾスケールにおける凝集構造を発現・制御できる。本特定領域研究助成により、以下に述べる研究成果が得られた。1)新しい計測法の開発:バルク状の高分子における反応誘起弾性ひずみを光照射下でin situ観測するためにMach-Zehnder干渉計を設計して、この弾性ひずみの緩和過程を観測・解析した。2)コンピュータ支援光照射(CAI)法の開発:コンピュータを用い、2次元光パターンをデザインして、デジタルプロジェクターを通して、顕微鏡下に設定された試料を照射して、非一様な条件下で引き起こした高分子混合系の相分離をin situ観察・計測を行った。3)高分子の階層構造の設計・制御:光照射で二成分高分子混合系の相分離を引き起こすことは、混合系をその相図上において光で移動させることに対応する。光反応のこの利点を利用して、光照射過程にON/OFFを導入して「相分離構造の中の相分離」を引き起こすことができ、数十ミクロンと数ミクロンの相分離の構造を同一の混合系に実現することができた。また、その形成動力学についても明らかにした。その形成過程の道4)周期分布を有する高分子材料の設計:相分離によってできた構造の周期は過冷却度に依存することに注目して、上記したコンピュータ支援光照射(CAI)法により、固体高分子に様々な凝集構造や傾斜構造をもたらし、その構造・物性の相関関係を明らかにした。本研究では、光架橋反応を用いて、二成分高分子混合系の相分離を引き起こし、発現した相分離構造の周期やその分布を制御した。バルク状高分子中の化学反応が、分子鎖セグメントの自由体積分布などの局所の不均一性により、反応が空間的に非一様的に進行していく。架橋反応の場合では、反応のこの不均一性により、混合系内に局所的な架橋密度が形成される。結果として、反応が進行すると共にこの局所ひずみが増大し、臨界点近傍では、生成された様々な濃度ゆらぎとカップリングして、モルフォロジーに大きな影響を及ぼす。ここでは、1)架橋反応の不均一性によって混合系に形成した局所(ナノスケール)弾性ひずみの直接計測とその緩和過程の測定を行った。さらに、この局所弾性ひずみを計測するためにMach-Zehnder干渉計を設計して、光照射しながら、試料中に生成した弾性ひずみをin situ測定し、解析を行った。一方、紫外光照射下で進行している反応の動力学を紫外可視分光光度計により追跡した。この動力学のデータから照射時間と共に生成された架橋密度が得られた。この架橋の結果と生成した弾性ひずみとの間に強い相関関係があることがわかった。2)上述した分子鎖セグメントの自由体積分布などの局所の不均一性によりheterogeneous kineticsを示す。特に混合系の場合では、この分子鎖の自由体積分布に加えて、異なったガラス転移に起因する動的不均一性によってこのheterogeneous kineticsが増大する。本研究では、このheterogeneous kineticsを利用して、相分離しつつある高分子混合系に多重時間と空間スケールの臨界現象を引き起こして、種々の階層凝集構造を発現させることができた。現在、この階層構造の形成動力学を解析している。次年度には、高分子系における時間および空間の階層性の発現機構とその階層間のダイナミクスを解明する予定である。平成17年度は下記した3つの研究課題を遂行して、次の結果を得た。1)光架橋した高分子に発現したナノ領域における弾性ひずみの観測・解析:バルク状高分子に化学反応を導入した場合、局所構造の不均一性(自由体積の分布など)により、反応がセグメントのオーダーで非一様に進行する。

分子鎖を架橋する場合、混合系内に弾性ひずみが誘発される。反応の進行度によって、この弾性歪が緩和したり、系内に残留したりして、反応誘起相分離機構やモルフォロジーに大きな影響を及ぼす。このひずみをin situ観測するためにMach-Zehnder干渉計を作製して、測定を行った。結果として、光架橋によって混合系内に発生したナノメータ域の弾性ひずみとその緩和過程を測定することができた。2)光照射によるミクロン域の傾斜構造の設計と解析:光が試料中を通過する際、Lambert-Beerの法則に従って、伝播した距離の指数関数的に減衰することは知られている。一方では、光反応で高分子混合系の相分離を誘起する場合、反応収率がある臨界値に達すると系が不安定になり、相分離が起こる。この事実を利用して、様々な強度の紫外光を高分子混合物に照射し、相分離を起こした。結果として、ミクロン域における傾斜共連続構造を有する高分子が設計できた。相3)空間変調に引き起こされた相分離構造と物性:高分子混合系が熱力学的に不安定になって分離する場合、まず周期構造が発現・成長してから、ドロップレットに粗大化し、次第に混合系が相平衡に達する。最初に発現する構造の周期まで混合系を空間的に閉じ込めるため、Computer-Assisted Irradiation(CAI)法を開発した。この新しい方法を用いると、任意の光のパターンのみならず、光パターンの時間および空間周期も設定して、照射することができた。この方法を用いることにより、20ミクロンまで制限できることがわかった。1)高分子場における反応の不均一性と発したナノメータ域の弾性ひずみの計測:バルク状高分子における化学反応は、ほとんどの場合、セグメントの自由体積などにより不均一的に進行する。その結果、局所ひずみが形成される。これらの反応誘起ひずみの形成と緩和過程を測定するためMach-Zehnder干渉計を組み立てて、in situ測定を行った。2)反応の不均一性を利用したミクロン域の傾斜周期構造を有する高分子材料の設計:物質中の光強度は透過する距離の指数関数に従うことと、混合系の過冷却度が架橋密度に依存することを利用して、強い光強度で相分離を誘発することによって高分子の様々な階層構造を成形させることができた。3)架橋反応の不均一性を利用した共連続階層構造を有する高分子の設計相溶する高分子混合物を光照射して相分離を引き起こすと核生成・成長が起こり、片方の成分高分子のドロップレットが生成される。ある程度反応が進行すると架橋によってドロップレットの成長が停止され、六方細密充填が起こり、hexagonal phaseが形成された。途中で、光照射を一時的に中断してから照射を再開するとhexagonal packingが乱れ、共連続構造がランダムになり、非常にブロードな力学のtanδのピークが得られた。4)コンピュータ支援
重度視覚障害者のアルゴリズム学習を実現する教具の開発と検証

本研究は、重度の視覚障害者に対して、コンピュータサイエンスの優れた学習法である「アンプラグド学習法(以下、アンプラグドと記す)」について、学習効果の向上と学習対象の拡大を目的に、重度視覚障害者への適用を試みたものである。視覚障害者にとってプログラマーなどのエンジニアは、社会的自立に繋がる貴重な職域の一つである。しかし、その基礎教育として多くの教育機関で取り入れられているアンプラグドは、カードなどを操作しながらアルゴリズム的な思考力を向上させる手法のため、視覚障害者にはその活動が困難である。本研究では、視覚情報を音声と触覚で代替する教具を用いることで、その活動(動き)を実現し、アルゴリズム的思考力の向上が得られるようになるかを検討した。研究は、4月に大学教員らとの打合せで教具の構想を練りはじめ、5月に大学生らと共同で視覚障害者の動作を支援する教具を、AR技術を用いて製作した。6月に高校生らの晴眼者を対象に予備実験を行い、8月に視覚障害者を対象とした検証実験を行った。その結果、重度の視覚障碍者に対しても支援教具を工夫することで、本来と同程度の活動を行わせることが可能であり、アルゴリズム的思考が得られることがわかった。その一方で晴眼者が通常アンプラグドで味わう「ゲームのような楽しさ」を視覚障害者が感じるようなことはなく、むしろ苦痛を伴う活動であることがわかった。視覚障害者が晴眼者と同じように、アンプラグドの活動を通してアルゴリズム的思考力を向上させるためには、同じ活動(動き)ができればよいというのではなく、動作の支援以外に、活動の楽しさや達成感が味わえるような工夫や配慮を施すことが、アルゴリズム的思考力の工場には必要であることが示唆された。この研究から得た知見は、10月に奈良女子大で開催された情報処理学会のCE129研究会(コンピュータと教育研究会)で発表し、優れた研究として奨励賞を受賞した。
細胞周期同調培養下における細胞成長因子.癌遺伝子の発現機構に関する研究

I)人子宮内膜癌由来培養細胞Ishikawa(IK)、HEC-1(HEC)におけるステロイドホルモン添加時の細胞成長因子の発現の変動エストロゲン受容体(ER)、プロゲステロン受容体(PR)陽性、細胞成長因子(EGF)、細胞成長因子受容体(EGFR)陽性のIK細胞と、ER、PR陰性、EGF、EGFR陽性のHEC細胞に対し、各種濃度のEstradiol-17β(E_2)あるいは各種濃度のProgesterone(P)を添加し経時的に細胞周期の変動とEGF、EGFRの発現について検討を行った。1)IK細胞では、各種濃度のE_2添加群とも薬剤添加24時間以後G_0+G_1期細胞が軽度に増加したが、各種濃度のP添加群では変化がなかった。細胞内EGFの発現は、高濃度P添加群において薬剤添加48時間以後に対照群に比しG_0+G_1期、S期、G_2+M期細胞における細胞内EGF fluorescent intensity(EGF FI)が軽度に上昇した。細胞内EGFRは、P添加群では、P添加後48時間以後でG_0+G_1期、S期細胞における細胞内EGFR FIが軽度に低下した。2)HEC細胞では、特にP添加群で薬剤添加48時間後でG_0+G_1期細胞の著名な増加と、S期細胞の著名な減少が見られた。細胞内EGFは、特に高濃度P添加群において薬剤添加24時間以後で各細胞周期におけるEGF FIが上昇した。細胞内EGFRは、特に高濃度P添加群で薬剤添加48時間以後各細胞周期においてEGFR FIが上昇した。III)細胞周期同調培養下における癌遺伝子の発現その結果C-mycの発現は、TDR、あるいはSB添加により一定の傾向を示さなかったが、Ha-rasではすべてのcycle phaseで発現が増強した。ER、PR陽性、EGF、EGFR陽性のIK細胞と、ER、PR陰性、EGF、EGFR陽性のHEC細胞に対し、10^<-6>M(A群)、10^<-7>M(B群)、10^<ー8>M(C群)のEstradiolー17B(E_2)あるいは10^<-5>M(D群)、10^<-6>M(E群)、10^<-7>M(F群)のProgesterone(P)を添加し経時的に細胞周期の変動とEGF、EGFRの発現について検討を行った。1)E_2あるいはPを添加したIK細胞では、A、B、C、群とも薬剤添加24時間以後G_0+G_1期細胞が軽度に増加したが、D、E、F群では変化がなかった。細胞内EGFの発現は、D群において薬剤添加48時間以後に対照群に比しG_0+G_1期、S期、G_2+M期細胞における細胞内EGF fluorescent intensity(EGF FI)が軽度に上昇した。細胞内EGFRは、D、E、F群では、P添加後48時間以後でG_0+G_1期、S期細胞における細胞内EGFR FIが軽度に低下した。2)E_2あるいはPを添加したHEC細胞では、特にD、E群で薬剤添加48時間後でG_0+G_1期細胞の著名な増加と、S期細胞の著名な減少が見られた。細胞内EGFは、特にD群において薬剤添加24時間以後で各細胞周期におけるEGF FIが上昇した。細胞内EGFRは、特にD、E群で薬剤添加48時間以後各細胞周期においてEGFR FIが上昇した。

これらのことよりER、PR陽性のIK細胞では、E_2、P添加により細胞周期および細胞内EGF、EGFRの変動が軽微であったのに対し、ER、PR陰性のHEC細胞では、特にP添加により細胞周期と細胞内EGFとEGFRが著名に変動したことよりステロイドホルモンリセプタ-陰性内膜癌細胞の増殖の制御はgrowthfactorによりコントロ-ルされている可能性が示唆された。子宮内膜癌培養細胞株Ishikawa(IK)において癌遺伝子産物CーmycおよびHaーrasのモノクロ-ナル抗体を用いて細胞内CーmycおよびHaーrasの発現と細胞周期との関連について検討を行った。IKにおけるG_0+G_1期細胞、S期細胞、G_2+M期細胞の割合の経時的変化は、24時間でそれぞれ50.8%、21.6%、27.7%であり、48時間では56.8%、20.5%、22.7%であった。また72時間では、それぞれ59.0%、18.5%、22.4%であった。IKにおけるCーmyc蛋白の発現を蛍光強度で表すと、24時間におけるG_0+G_1期の蛍光強度は、21.9、S期の蛍光強度は、27.5、G_2+M期のそれは33.4であり、48時間ではそれぞれ14.4、20.5、22.7、72時間では8.4、10.7、15.0と各細胞周期におけるCーmycの発現はG2+M期で高い結果が得られた。同様にHaーras蛋白の各細胞周期における発現を蛍光強度で表すと、24時間におけるG_0+G_1期の蛍光強度は23.6、S期の蛍光強度は31.2、G_2+M期の蛍光強度は37.4であり、48時間ではそれぞれ15.1、22.0、25.7、72時間ではそれぞれ15.9、25.6、32.9とHaーrasの発現もG_2+M期で高い結果がえられた。核内蛋白型癌遺伝子であるmyc familyとGTP結合蛋白型癌遺伝子であるRas familyは、細胞の増殖、分化の制御に大きな役割をはたしており、これら癌遺伝子の発現の増加が癌細胞では顕著に認められることが知られている。我々は、C-mycおよびHa-ras癌遺伝子産物より作成されたモノクローナル抗体を用いてflow cytometryにより検討を行った結果、ヒト子宮内膜腺癌由来培養細胞Ishikawa(IK)においてC-mycおよびHa-rasが共に発現していることを見い出した。この結果をもとに細胞周期同調作用を有するThymidine(TDR)、Sodium butylate(SB)を用いて、細胞周期同調時におけるC-myおよびHa-rasの発現の変化について検討を行った。C-myc癌遺伝子産物より作成されたモノクローナル抗体を用いた検討では、TDR添加1.5時間群(A群)、TDR添加3時間群(B群)は対照群に比しS期細胞の著名な増加が見られた。またSB添加24時間群(C群)、SB添加48時間群(D群)、SB添加72時間群(E群)では、D群、E群においてG_2+M期細胞の軽度増加が見られた。myc蛋白の発現は、A群ではすべてのcycle phaseで増強したが、B群では対照群とほぼ同様の発現状態を示した。またC群ではその発現が低下したが、D群では一時増強し、E群では再度軽度の低下が見られた。このことよりmyc蛋白の発現は、TDR、あるいはSB添加により一定の傾向を示さなかった。Ha-ras遺伝子産物より作成されたモノクローナル抗体を用いた検討では、細胞周期の変化は前者と同様の結果が得られた。Ras蛋白の発現は、A群、B群ともすべてのcyclephaseで増強し、この事はC、D、E群でも同様であった事よりTDR、SB添加によるRas癌遺伝子の増幅が示唆された。
大腸癌細胞膜表面EGFR検出によるCetuximab感受性予測法の開発

セツキシマブは,癌細胞の表面に位置する上皮成長因子受容体(EGFR)に結合し,EGFRからのシグナル伝達を阻害して腫瘍増殖・転移に関与する細胞機能を抑制する分子標的治療薬の一つです.本研究は,セツキシマブを用いてEGFRを検出する方法を新しく開発し,この新しい手法により定量したEGFR発現量と大腸癌細胞における腫瘍増殖抑制効果の相関を示すことに成功しました.本研究の結果より,セツキシマブ治療群の中でもより感受性の高い症例の抽出が可能となり,薬剤選択に大きな指針を与える可能性があると考えられました.セツキシマブは細胞外EGFRにリガンドと競合的に結合して腫瘍増殖シグナル伝達経路を抑制するが、免疫染色で検出されたEGFR発現量とセツキシマブの治療効果に相関がないと報告されている。本研究は、セツキシマブを一次抗体として用いたフローサイトメトリー(FCM)により検出されたEGFR発現量と腫瘍増殖抑制効果の相関および臨床的意義を検討した。4種のヒト大腸癌細胞株(Caco-2、WiDR、SW480、HCT116)を対象とし、各細胞株のKRAS、BRAF、PIK3CAの変異の有無を確認したうえで、ビオチン修飾セツキシマブを用いてFCMによりEGFR検出を行った。限界希釈法により作成したサブクローンからこのFCMによりEGFRの高発現株と低発現株を抽出し、MTT法を用いてセツキシマブの腫瘍増殖抑制試験を行った。また、免疫不全マウスを用いて異種移植モデルを作成し、セツキシマブ感受性試験を行った。限界希釈法で作成したサブクローンから抽出されたEGFR高・低発現株を用いたセツキシマブの腫瘍増殖抑制効果試験では、EGFR低発現株で高発現株に比して腫瘍増殖抑制効果が見られなかった。マウス異種移植モデルを用いた感受性試験も同様にEGFR低発現の腫瘍は高発現のものに比して有意な差を持って腫瘍増殖抑制効果が認められなかった。これまでの免疫染色によるEGFR発現とセツキシマブ感受性には相関がないことが報告され、乳がんに対するトラスツマブとは異なっていた。S492変異のあるEGFRへセツキシマブが結合しないことが報告され、セツキシマブが作用するEGFRの発現量を定量する必要性が示唆された。本研究ではセツキシマブにより検出されたEGFR発現量はセツキシマブ感受性と相関することが示唆され、今後臨床検体を用いた実験で同様の結果を得ることができれば、薬剤選択に大きな指針を与える可能性がある。セツキシマブは,癌細胞の表面に位置する上皮成長因子受容体(EGFR)に結合し,EGFRからのシグナル伝達を阻害して腫瘍増殖・転移に関与する細胞機能を抑制する分子標的治療薬の一つです.本研究は,セツキシマブを用いてEGFRを検出する方法を新しく開発し,この新しい手法により定量したEGFR発現量と大腸癌細胞における腫瘍増殖抑制効果の相関を示すことに成功しました.本研究の結果より,セツキシマブ治療群の中でもより感受性の高い症例の抽出が可能となり,薬剤選択に大きな指針を与える可能性があると考えられました.我々は細胞膜表面型EGFR(Epidermal growth factor receptor)発現量に着目し,この膜表面型EGFR発現量とCetuximab治療効果の相関を解明するとともに,癌免疫療法が分子標的薬治療に及ぼす影響を検討することを目的とした.ヒト大腸癌細胞細胞株であるCaco-2,WiDR,SW480,HCT116の4種と基底細胞癌細胞株のA431を対象として実験を開始し,Scorpion-ARMS法を用いて各細胞株のK-ras,B-rafの変異の有無を確認した.その結果,K-ras変異はSW480,HCT116に見られ,B-raf変異はWiDRに見られ,Caco-2はどちらも野生型であった.次に,ビオチンで修飾したCetuximabを一次抗体として各細胞株に使用してフローサイトメトリーにより細胞膜表面のEGFR検出を行った.cell sortingにより細胞膜表面EGFRの高発現株と低発現株の樹立を目指したが,これは困難であることが判明したため,Limiting dilution法により作成したサブクローンより細胞膜表面EGFRの高発現株と低発現株を抽出することとし,これに成功した.この高発現,低発現株においてMTT法を用いてCetuximabの腫瘍増殖抑制試験を行った結果,細胞膜表面のEGFRが低発現株では高発現株に比して腫瘍増殖抑制効果がみられなかった.これらの結果より,in vitroにおいて細胞膜表面型のEGFR発現量とCetuximab治療効果との間には相関関係がある可能性が示唆された.現在はこれらの細胞膜表面型EGFR高・低発現をBalb/c nude mouseに皮下注射しXenograft modelの作成を行っている.現時点でin vitroにおける実験計画はおおむね順調に進展していると考えている.研究目的としている膜表面型EGFR発現量とCetuximab治療効果の相関はこれまでの結果より示すことができると考えている.Limiting dilution法を用いて更なるサブクローンを作成し,細胞膜表面EGFRの高発現株と低発現株を抽出することを今後も継続して行い,細胞膜表面型EGFR高・低発現株を集める。細胞膜表面型EGFR高発現群と細胞表面型EGFR低発現群の2群に分け,これをBalb/c nude mouseに皮下注射しXenograft modelの作成を継続していく.

このモデルにcetuximabを投与し多段階でsacrificeを行い,その効果を免疫染色やwestern blotなどの方法で検証する事を計画している.これらの研究実績を本年度・来年度の国内・国外学会で発表することを計画するとともに,研究成果を英文誌へ投稿する予定である.次年度は作成に成功した細胞膜表面型EGFRの高・低発現株の培養に必要な機材やXenograft modelを作成するためのBalb/c nude mouseの購入などにおもに研究費を使用することを計画している.また,国内・国外学会での発表の際の旅費・経費として使用することも計画している.
行為における言語的要素と非言語的要素との関係

本研究において、人間が人間的なる生を送る際に(時には何も行わないというかたちで)その重要な側面をなしている行為という事象に関し、特にそこに様々な形で介在する言語的要素--行為の間主体的な意味的分節への働きかけから、行為の反省的自己統御や行為の命令等、とりわけ意志と自己意識を介在させた高度な活動のエレメントたり得るもの--あらゆる活動に伴わざるを得ない身体という基盤とその運動的な働きの機構・食物摂取や性的行為など生命的衝動・身振り手振りや共感レベルでの他者との感応--との交錯という機制の解明を中心主題として、接近が企てられた。この課題を達成するために、各参加者の見解を集約し、同時に周辺科学の成果についての知見が広く渉猟された。この結果、(1)現代英米哲学における行為論を、ギリシャ哲学以来の実践哲学的思考の影響という観点から再構成すること(2)言語ゲームに関して、そこにおける成員の活動の行為的連関を、組織論の観点から説明すること(3)制度とそこにおけるコミュニケーションの構造について、主体的行為と言語秩序の間の連関の解明に基づき、説明すること以上の成果を挙げることができたと考える。平成7年度の各分者の研究は、以下のように行われた。松永澄夫は、コンディヤック、メ-ヌ・ド・ビランを中心とする近代フランスの哲学を検討しながら、生物学、動物行動学、心理学等の成果も視野におさめ、主体というものの形成に関わる身体行為と記号の問題を探究した。菅豊彦は、特に後期ウィトゲンシュタインを中心とする現代英米の哲学を検討しながら、言語ゲーム理論を身体行為そのものとの連関において深めつつ、社会哲学的な視点を踏まえ、行為における言語的要素の摘出につとめ、所期の成果を収め得た。森俊洋は、古代ギリシャ、特にアリストテレスの実践的三段論法に関する検討を中心に、行為の構造の論理的分析という視点から、言語的要素と非言語的要素との連携を検討した。檜垣立哉は、今世紀の構造主義的言語論のインパクトを踏まえつつ、特に言語学の成果を押さえながら、言語と主体性との関わりを問題にし、主体性の発揮の場としての身体行為の機制を捉えた。高橋克也は、フランスの反省哲学の系譜の中に、行為主体の道徳的自己評価の中に関与する記号の役割という問題意識の展開を探り、あわせてカント哲学との比較を行った。下野正俊は、カント哲学における「判断力」の意義を再検討し、その際、イギリス経験論の諸思想との比較の視点を取り入れた。相互の討議の中で特に問題となったのは、身体性と記号がいかなる関係をもつか、行為の道徳性はそうした問題とどう関連づけられるか、といった点であった。これらは、継続して研究がなされ、次年度に成果がまとめられる予定である。本研究において、人間が人間的なる生を送る際に(時には何も行わないというかたちで)その重要な側面をなしている行為という事象に関し、特にそこに様々な形で介在する言語的要素--行為の間主体的な意味的分節への働きかけから、行為の反省的自己統御や行為の命令等、とりわけ意志と自己意識を介在させた高度な活動のエレメントたり得るもの--あらゆる活動に伴わざるを得ない身体という基盤とその運動的な働きの機構・食物摂取や性的行為など生命的衝動・身振り手振りや共感レベルでの他者との感応--との交錯という規制の解明を中心主題として、接近が企てられた。
発生学的アプローチによる心血管領域の性差機構の解析

心血管病には、発症から進展・予後に至るまであらゆるところに性差があることが、先進諸国では明らかとなっているが、分子メカニズムの解明は限定的である。本研究では、心臓の再生・発生の段階を解析する事により、心血管領域の機能・病態の性差機構を探索することを目的とした。胎児マウス冠血管径に明確な性差があり,この性差は血管拡張剤により消失したことから,胎児期における血管収縮機構に性差があることが明らかとなった.DNAマイクロアレイによる網羅的解析から性差の原因となる候補の遺伝子を同定した。この研究結果を、心疾患病の予防・発症における性差を理解する為の基盤としたい。心血管病の性差の分子機構を解明することを目的とし、発生段階・再生心筋における性差に注目して研究を行った。1)ヒトiPS心筋については、細胞ごとの活動電位波形のばらつきの一因として,成体心室筋細胞と比較して,活動電位の立ち上がり速度が遅く,最大弛緩期膜電位が浅いことを見出した。最大弛緩期膜電位を深くするタンパクを過剰発現することにより,自動能は完全に消失し,刺激により発火する心室筋様の活動電位を計測することに成功した.本システムは,心室筋の再分極に作用する薬剤の作用解析に非常に有用なツールとなると考えられる.2)野生型胎児マウスの発生段階ごとの冠動脈走行を雌雄差を解析する為,インク微小注入による血管造影法を用いて比較検討した。ICRやC57BL6/JマウスE17.5を用いた実験から、左冠血管(LCA)の径に雌雄差が見られることを明らかにしてきた.C57BL6/Jマウスでは、雌において主枝の径が有意に短く,血管弛緩薬の投与により雌の主枝が弛緩して雌雄差が消失した.この雌雄差は収縮機構の違いによると示唆され,弛緩薬のうちCa拮抗薬が良く作用した。さらに,Y染色体上の精巣決定遺伝子Sryの自然発症欠失変異と常染色体上へのTGを組み合わせることで表現型が性転換するマウスでも同様の雌雄差が確認できるか検討中である。3)本年は,成体で見られる性差(雌雄差)と胎児期もしくは幼児期に見られる性差(雌雄差)のメカニズムが同じであるかどうか,アレイデータベースから検討することに着手した。まずは,各種正規化法を使用することにより,論文で既報の変動遺伝子より圧倒的に多くの遺伝子群を同定できる方法を確立した.心血管病の性差の分子機構を解明することを目的とし,発生段階・再生心筋における性差に注目して研究を行った.1)ヒトiPS細胞由来分化心筋について,昨年度に発見した成熟心筋化にする因子の開発を進め特許を出願した.アデノウイルスベクターを用いて蛋白XをヒトiPS心筋に過剰発現したところ,代表的なQT延長薬2剤による細胞外電位持続時間の延長の作用が臨床結果を反映できるようになった.さらに,収縮ー弛緩を非侵襲的に計測する手法も開発し,本技術と組み合わせることに成功した.2)胎児マウス心臓の冠血管に雌雄差があることを,インク微笑注入による血管造影法を用いて明らかにした.この結果を受けて,当該年度は,Y染色体上の精巣決定遺伝子Sryの自然発症欠失変異と常染色体上へのTGを組み合わせることで表現型が性転換するマウスでも雌雄差が見られるという結果を得た.3)成体マウス心臓標本のDNAアレイデータに対し,適切な正規化法を施すことにより,雌雄差遺伝子を500以上同定する事に成功した。当該年度は,新たに2)の実験と同時期の胎児マウスの心臓におけるmRNAの発現の雌雄差についてDNAアレイにより調べたところ(雌雄各n=3),有意な雌雄差がある25遺伝子を同定した.心臓の形態発生や冠血管発生に重要な遺伝子も含まれることから,病態の雌雄差を決定する因子である可能性を今後は検討していく.心血管病には、発症から進展・予後に至るまであらゆるところに性差があることが、先進諸国では明らかとなっているが、分子メカニズムの解明は限定的である。1)ヒトiPS心筋については、培養条件をコントロールするのが難しいと判断したため、CDI社から購入したiPS由来心筋を使用することにした。パッチクランプ法により、活動電位波形を計測したところ、細胞ごとに波形がばらつき、主に結節型、固有心筋型に分類できた。活動電位のAPDも100 msから500ms以上であった。2)野生型胎児マウスの発生段階ごとの冠動脈走行を雌雄差を解析する為にで、西山先生・栗原先生(東京大医)との連携・協力により、インク微小注入による血管造影法を用いて比較検討した。

ICR胎児マウスE17.5を用いた予試験では、左冠血管(LCA)の先端分枝数や第2分枝の径に雌雄差が見られたが、トランスジェニックマウスと比較検討する為C57BL6/Jマウスにて解析したところ、雌において主枝の径が有意に短いことを示した。血管弛緩薬により雌の主枝が弛緩して雌雄差が消失することから、この雌雄差は収縮機構の違いによると示唆される。一方、コントロールでは分枝の経に雌雄差は認められないが、血管弛緩薬の投与により雄の分枝が弛緩して、雌雄差が見られた。Y染色体上の精巣決定遺伝子Sryの自然発症変異を組み合わせることで表現型が性転換するマウスの交配と繁殖に成功した。1)ヒトiPS由来心筋での性差の解析;当初の目的は活動電位波形の解析と薬物作用の解析までの予定だったが,ヒトiPS由来心筋の未熟な性質故に薬物作用解析は思うように進まなかった.そこで,新たな蛋白導入を発案したところ,薬物作用解析に適したiPS心筋を得ることに成功した.この細胞は,心筋活動電位再分極相に作用する薬剤全般に適応可能であり,不整脈誘発物質のin vitroスクリーニングアッセイ系としての応用が期待できる.2)冠血管脈管形成の性差の解析;当初の目的通り,トランスジェニックマウスでの解析を開始することができた。繁殖が難しいマウスであるが,現在のところ当研究室では繁殖に成功している.3)マイクロアレイデータベース解析;この実験は当初の予定にはなかったが,他研究費の計画遂行のために学んだアレイ解析のノウハウを今年度から新たに発生学的解析にも導入した.主に、血管に作用する遺伝子群に注目してq-PCR解析も行っている.1)ヒトiPS由来心筋での性差の解析;細胞培養、パッチクランプ法のための細胞分散のプロトコルを固め、活動電位波形測定のプロトコルを決定するなど、系の立ち上げは完了した。iPSの株間での違いを議論できるかどうかを判断できる結果を得たので、申請時の達成目標は達成したと言える。2)冠血管脈管形成の性差の解析;トランスジェニックマウスでの解析に先立って、野生型マウスでのコントロール条件での解析を終了した。冠血管の主枝の径に雌雄差がある事を示した。さらに、血管弛緩剤に対する反応性も雌雄差がある事を見出し、平成24年度の研究計画に直接つながる結果を得た。なお、当初は性転換マウスの繁殖までを年次計画として提出していたが、順調に進んだため、性転換マウスを用いた機能解析も既に開始した。1)ヒトiPS由来心筋での解析;前年度は,活動電位測定でのばらつきが大きかったため、男性由来、女性由来の細胞を比較解析するのは得策ではないと判断した。しかし今年度のブレイクスルーにより,再分極過程は安定して検討可能となった.そこで,これまで申請者は性ホルモンによるイオンチャネルの機能制御が不整脈発症の性差に関わる事を示唆する結果を発表してきたので、再分極過程に対する性ホルモンの作用を検討することとする。今年の1月には,FDAが初めての男女別薬物投与量設定を発表した.これは,女性での副作用発現が顕著であったことに起因する.ヒトiPS由来心筋は、薬物による心臓突然死の毒性試験への応用について急速に研究が進められてきており、その流れの中で性差について解析するのは益々重要であると考えられる。薬物による心臓突然死のうちQT延長によるものがよく知られるが、男性より女性で約2倍以上の頻度であることが知られている為、毒性試験において性ホルモンの影響を反映させることで、試験の精度向上に役立てることを期待する。