hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
口腔ケラチノサイトのエネルギー代謝と分化再生能を指標とした創傷治癒マーカーの開発

口腔粘膜上皮ケラチノサイトの脂肪酸組成とエネルギー代謝との関係から口腔粘膜の創傷治癒における上皮化機構を検討し,表皮に比較した口腔粘膜の「易創傷治癒性」を解明し,その結果を指標とした創傷治癒マーカーの開発を試みた.手術時に採取した表皮,口腔粘膜上皮および培養口腔粘膜上皮を使用し,1.Gas chromatographyを用いたけケラチノサイトの細胞膜脂肪酸構成比の解析,2.RT-PCRを用いた各上皮組織の基底細胞と傍基底細胞におけるグルコース・トランスポーター:GLUT-1mRNAの発現量の解析,3.培養口腔粘膜ケラチノサイトの必須脂肪酸添加分化誘導によるGLUT-1の発現解析を行なった.その成果として,1.表皮に比較し,口腔粘膜上皮ではパルミチン酸(16:0)の構成比が高値を示した.2.口腔粘膜上皮では基底層に比較し,傍基底層でのパルミチン酸(16:0)構成比,GLUT-1タンパクおよびmRNA発現量が低値を示した.3.必須脂肪酸による分化亢進ケラチノサイトではGLUT-1の発現が低下していた.これらのことから,パルミチン酸(16:0)構成比はグルコース代謝活性と比例することが明らかとなった.また表皮では,必須脂肪酸が高値を示し,さらにお必須脂肪酸は細胞分化を亢進させることも明らかとなった.すなわち,口腔粘膜上皮は表皮に比較して,低分化でかつ高グルコース細胞代謝細胞を多く有し,これが「易創傷治癒性」の一側面である可能性があることから,創傷治癒マーカーの開発への指標となりうると考えられ口腔粘膜上皮ケラチノサイトの脂肪酸組成とエネルギー代謝との関係から口腔粘膜の創傷治癒における上皮化機構を検討し,表皮に比較した口腔粘膜の「易創傷治癒性」を解明し,その結果を指標とした創傷治癒マーカーの開発を試みた.手術時に採取した表皮,口腔粘膜上皮および培養口腔粘膜上皮を使用し,1.Gas chromatographyを用いたけケラチノサイトの細胞膜脂肪酸構成比の解析,2.RT-PCRを用いた各上皮組織の基底細胞と傍基底細胞におけるグルコース・トランスポーター:GLUT-1mRNAの発現量の解析,3.培養口腔粘膜ケラチノサイトの必須脂肪酸添加分化誘導によるGLUT-1の発現解析を行なった.その成果として,1.表皮に比較し,口腔粘膜上皮ではパルミチン酸(16:0)の構成比が高値を示した.2.口腔粘膜上皮では基底層に比較し,傍基底層でのパルミチン酸(16:0)構成比,GLUT-1タンパクおよびmRNA発現量が低値を示した.3.必須脂肪酸による分化亢進ケラチノサイトではGLUT-1の発現が低下していた.これらのことから,パルミチン酸(16:0)構成比はグルコース代謝活性と比例することが明らかとなった.また表皮では,必須脂肪酸が高値を示し,さらにお必須脂肪酸は細胞分化を亢進させることも明らかとなった.すなわち,口腔粘膜上皮は表皮に比較して,低分化でかつ高グルコース細胞代謝細胞を多く有し,これが「易創傷治癒性」の一側面である可能性があることから,創傷治癒マーカーの開発への指標となりうると考えられ口腔外科臨床では,時として術後の創傷治癒不全を経験し,その対応に苦慮することがある,仮に患者の創傷治癒能が術前より明らかになるならば,手術法の選択基準の指標や術後の創傷管理の対策,さらには新しい創傷治癒管理法の開発へとつながる可能性がある.本研究では,われわれがこれまで証明してきたkeratinocyte-derived cytokineの創傷治癒における効果,有効性を応用し,全く新しい創傷治癒機構解明へのアプローチを行うことによって,今まで解明されていなかった口腔粘膜上皮におけるsomatic stem cellの局在と細胞代謝能そして上皮分化と再性能力を明らかにし,その特性から最終的には臨床応用可能な「創傷治癒予測マーカー」を開発することを目的として研究を実施した.平成21年度では,これまでの研究によって表皮形成に必要なエネルギー源(パルミチン酸16:0)の貯蔵領域とstem cellの局在領域(毛包細胞のバルジ領域)が一致したことから,毛包細胞が皮膚上皮系のすべてのstemであり,毛包細胞の表皮角化細胞への転換現象が上皮化現象であるという一側面に注目し,皮膚とは角化様式や附属器官の異なる口腔粘膜での上皮ケラチノサイトのエネルギー代謝とstem cellの局在領域を細胞生物学的に検討し,口腔粘膜の皮膚に比較した「易創傷治癒性」を解明することを目的とした.その結果,oral keratinocyteの細胞膜はepidermalkeratinocyteに比較して,より多くのパルミチン酸(16:0)で構成されていることが明らかとなった。また,basal layer cellとsuprabasal cellに分けて脂肪酸を解析すると,oral keratinocyteでは,epidemal keratinocyteに比較してパルミチン酸構成比の高い細胞が重層扁平上皮の領域(層)にかかわらず上皮層全体に分布していることが明らかとなった.これらの結果は,皮膚に比較して口腔粘膜が絶対的にエネルギー代謝量が多いということを示唆している.口腔外科臨床では,時として術後の創傷治癒不全を経験し,その対応に苦慮することがある.仮に患者の創傷治癒能が術前より明らかになるならば,手術法の選択基準の指標や術後の創傷管理の対策,さらには新しい創傷治癒管理法の開発へとつながる可能性がある.本研究では,われわれがこれまで証明してきたkeratinocyte-

derived cytokineの創傷治癒における効果,有効性を応用し,全く新しい創傷治癒機構解明へのアプローチを行うことによって,今まで解明されていなかった口腔粘膜上皮におけるsomatic stem cellの局在と細胞代謝能そして上皮分化と再性能力を明らかにし,その特性から最終的には臨床応用可能な「創傷治癒予測マーカー」を開発することを目的として研究を実施した.平成22年度は平成21年度の研究成果を再確認するという進行状態に終わった.すなわち,表皮形成に必要なエネルギー源(パルミチン酸16:0)の貯蔵領域とstem cellの局在領域(毛包細胞のバルジ領域)が一致したことから,毛包細胞が皮膚上皮系のすべてのstemであり,毛包細胞の表皮角化細胞への転換現象が上皮化現象であるという一側面に注目し,皮膚とは角化様式や附属器官の異なる口腔粘膜での上皮ケラチノサイトのエネルギー代謝とstem cellの局在領域を細胞生物学的に検討し,口腔粘膜の皮膚に比較した「易創傷治癒性」を解明することを目的とした.その結果,oral keratinocyteの細胞膜はepidermalkeratinocyteに比較して,より多くのパルミチン酸(16:0)で構成されていることが明らかとなった.また,basal layer cellとsuprabasal cellに分けて脂肪酸を解析すると,oral keratinocyteでは,epidermal keratinocyteに比較してパルミチン酸構成比の高い細胞が重層扁平上皮の領域(層)にかかわらず上皮層全体に分布していることが明らかとなった.これらの結果は,皮膚に比較して口腔粘膜が絶対的にエネルギー代謝量が多いということを示唆している.この結果を免疫組織学的に再確認し,平成21年度の結果が正しいことを証明した.口腔外科臨床では,時として術後の創傷治癒不全を経験し,その対応に苦慮することがある.仮に患者の創傷治癒能が術前より明らかになるならば,手術法の選択基準の指標や術後の創傷管理の対策,さらには新しい創傷治癒管理法の開発へとつながる可能性がある.本研究では,われわれがこれまで証明してきたkeratinocyte-derived cytokineの創傷治癒における効果,有効性を応用し,全く新しい創傷治癒機構解明へのアプローチを行うことによって,今まで解明されていなかった口腔粘膜上皮におけるsomatic stem cellの局在と細胞代謝能そして上皮分化と再性能力を明らかにし,その特性から最終的には臨床応用可能な「創傷治癒予測マーカー」を開発することを目的として研究を実施した.平成22年度は平成21年度の研究成果を再確認するという進行状態に終わった.すなわち,表皮形成に必要なエネルギー源(パルミチン酸16:0)の貯蔵領域とstem cellの局在領域(毛包細胞のバルジ領域)が一致したことから,毛包細胞が皮膚上皮系のすべてのstemであり,毛包細胞の表皮角化細胞への転換現象が上皮化現象であるという一側面に注目し,皮膚とは角化様式や附属器官の異なる口腔粘膜での上皮ケラチノサイトのエネルギー代謝とstem cellの局在領域を細胞生物学的に検討し,口腔粘膜の皮膚に比較した「易創傷治癒性」を解明することを目的とした.その結果,oral keratinocyteの細胞膜はepidermal
「学校に行かない」子どもの教育権保障をめぐる教育臨床社会学的研究

本研究では、長期間にわたり学校に行かないでいる多様なタイプの子どもの問題を、教育権の保障という観点から「学校に行かない子ども」として統一的に捉えることにより、日本の教育問題の理解に再考を迫るとともに、現行の法制度や行政システムを批判的に検討した。分析の主な対象は、不登校問題や高校中退問題であり、それらと社会経済的要因との関連である。また、諸問題に対応するために学校の福祉的機能を強化していこうとするイギリスの拡張学校(エクステンディッド・スクール)の取り組みに学ぶために、同国マンチェスター市を訪問し、現地の学校視察を行った。最後に理論面で社会的排除の概念を参照し、「学校に行かない子ども」は公教育ならびに社会の諸制度の機能不全と関わらせて分析されるべきであると指摘するとともに、学校に行かないことは累進的な社会的排除の過程における初期段階の重大事であるとして警鐘を鳴らした。本研究は、長期間にわたり学校に行かないでいる多様なタイプの子どもの問題を、教育権の保障という観点から統一的に捉えることで、問題理解に再考を迫るとともに、法制度や行政システムを批判的に検討する。日本には、不登校などの長期欠席の子ども、就学免除・猶予者、外国人の不就学者、高校中退者など、様々な「学校に行かない子ども」が存在する。しかし、これまではこれらの子どもを統一的に把握できずにきた。また、各種の問題の共通性と固有性についても整理が必要とされている。こうした分析や議論の整理に基づいて、現行法制度や行政システムを批判的に検証し、福祉国家における教育行政の在り方を再検討する。本年度は下記の2点を明らかにした。(1)学校基本調査はその性格上、学校に行かない子どもの全体量を把握することが出来ない。外国人不就学者数は同調査では不明である。また、毎年の高校中退者数は報告されているが、最終的に高校教育を修了しないまま成人していく者の数は分からない。アメリカでは、ハイスクールの中退率と修了率の統計が取られているのとは対照的である。(2)学校に行かない状況に陥るかどうかは、社会経済的要因に強く規定されている。(1)不登校については、社会経済的要因に強く規定された脱落型不登校が一定割合を占めることが伺える。(2)全日制高校に行けない場合、セーフティネットとしての定時制や通信制、高等専修学校に通えるかどうかを規定するのも社会経済的要因である。(3)児童擁護施設の子どもの高校等進学率は2004年現在で87.7%であり、全国平均と比べ、約10%の差が存在する。今後は高校中退者なども含め、各カテゴリーの学校に行かない子どもの実態を明らかにするとともに、その出現を規定している要因についてさらに分析を加える。また、彼らを学校につなぎ止めておくために、学校や自治体に何ができるかを検討し、政策提言を行いたいと考えている。本研究は、長期間にわたり学校に行かないでいる多様なタイプの子どもの問題を、教育権の保障という観点から統一的に捉えることで、日本の教育問題の理解に再考を迫るとともに、法制度や行政システムを批判的に検討するものである。本年度はとくに高校中退問題に焦点を当てて4つの課題に取り組んだ。(1)国勢調査による、高卒学歴を持たない成人割合の算出、(2)在籍する高校を辞めていく生徒の推計、(3)中退後に転学先または編入先を得られた者に対するインタビュー調査、(4)進路多様校における進路変更(中途退学)の状況に関する担任教員に対する調査。理論的には、Furlong(1997)の指摘した移行過程の直線型/非直線型という枠組みや、後期近代における自己の軌跡という視点からのアプローチなどに基づいている。このほか児童養護施設在籍児童の中卒後の進路動向、中卒非進学・非就職と家庭背景・長期欠席・学力の関係、高校における不登校から再登校への過程についての研究など、関連する各テーマについて分析を進めた。また、これらの問題に対応するために学校の福祉的機能を強化していこうとするイギリスの拡張学校(エクステンディッド・スクール)の取り組みに学ぶために、同国マンチェスター市を訪問し、現地の学校視察を行った。理論的な観点からは、アガンベンの議論を手がかりにして、今日の不登校・中退問題の理論的な含意を「難民化する子ども」という視点からとらえようとする議論を深化させた。本研究は長期間にわたり学校に行かないでいる多様なタイプの子どもの問題を教育権の保障という観点から統一的に捉えることで、日本の教育問題の理解に再考を迫るとともに、法制度や行政システムを批判的に検討するものである。

本年度はこれまで調査してきた不登校や高校中退の問題を社会的排除と包摂という視点から捉えることの必要性を指摘した。その要点は以下の3点である。第一に、社会的排除の概念に照らした場合、「学校に行かない子ども」は公教育ならびに社会の諸制度の機能不全と関わらせて分析されるべきであり、学校に行かないことは学校教育からの排除であるのみならず、累進的な排除過程における初期段階の重大事でもある。第二に、社会的包摂の観点から問題への対応を考えるためには、学校に行かないという行為だけを見るのではなく、それが招き寄せる様々な不利益を予測し、それに対する防御を含めて検討する必要性がある。第三に、社会的包摂の取り組みにおいては、既存の秩序に同化させるのではなく、排除された人々のニーズに応じて制度を改変することで、その人々を社会の構成員として包括し、その人々に対して共感することではじめて成り立つ態度を持つことが必要である。以上の検討を踏まえて今後の検討課題を3点指摘した。1.学校教育の法制度や組織内部の諸手続きが、様々なカテゴリーの子どもを排除していくように機能している実態に光を当てる。2.社会的排除の観点から教育統計について精査する。3.社会的排除のリスクを軽減させるために、学校教育の内部に留めておくための仕組みについての検討や開発を進める。なお、3点目に関連して、沖縄県の高校中退対策の取組について資料収集と関係者へのヒアリングを行った。研究計画では、(1)学校にいかない子どもの量的把握、(2)個別の事例収集、(3)福祉国家における教育の在り方についての政治思想上の検討、(4)対象となるリスク群の子どもの支援についての学校の取り組み、(5)リスク群の子どもの支援に関する諸外国の実践についての情報収集の5点を上げたが、それぞれについて研究が進展しており、様々な知見が見いだされているため。24年度が最終年度であるため、記入しない。各テーマについてさらに分析を進め、後半では最終年度として研究のとりまとめを行う。各種の事例や課題を、学校に行かない子どもという枠組みから整理するとともに、理論的な観点から考察する。また、リスクへの対応について、国内の取り組みや国外の取り組みを紹介し、その可能性を論じたい。
植物防御応答遺伝子の発現を誘導する転写因子の解析

本研究ではエリシター処理エンドウから単離された新規転写因子E84(ERDP)について解析を進めた。E84の遺伝子産物はアミノ末端付近に植物特有のDof DNA結合タンパク質ドメインを有する転写因子である。大腸菌で発現させたE84組換えタンパク質はAAAG配列を有するDNA断片に結合することがランダム結合選別法により明らかにされた。また、E84結合配列の一つBS4/37(TCATTTAAAGTGTTTT)をモデルとしてAAAG前後の配列に変異を導入して結合実駿を行ってみるとAAAGの3'側のTGT配列も高い結合親和性のために必要な配列であることが明らかとなった。また、エリシター応答性のPsCHS1遺伝子のプロモーターとの結合実験を行ってみたところ、AAAG配列を有する断片に結合した。一方、E84結合配列BS4/37を4つ直列に連結し、CAMV 35Sプロモーターの最小単位に連結させ、エンドウプロトプラストを用いたトランジェントトランスフェクションアッセイを行った。その結果、エリシター処理によりレポーターの活性が高まり、AAAG配列の直列繰り返し配列がエリシターによる転写活性化に関与することが示された。また、E84タンパク質はE84遺伝子自身のプロモーター配列にも結合することより、正のオートレギュレーションを行っている可能性も示唆された。以上のことはE84タンパク質及びその結合配列がエリシターによる転写活性化に貢献している可能性を示している。また、E84以外にDofドメインをアミノ末端付近に有する新規Dof遺伝子を6種単離し、エンドウでDof遺伝子がファミリーを形成していることが示された。これらの知見は植物防御応答時における様々な防御遺伝子の転写活性化の解明に繋がるものと考えている。エンドウ褐紋病菌由来のエリシターを処理したエンドウ胚軸から発現が誘導される遺伝子のcDNAとしてクローンE84を単離した。E84は全長1269塩基からなり283アミノ酸から構成される31.6kDaのタンパク質をコードすると推定された。推定アミノ酸配列からE84はアミノ末端付近に近年植物特有の転写因子であるDofタンパク質に属す新規転写因子であることが判明した。E84は傷あるいはエリシター処理でその発現が誘導され、エンドウ褐紋病菌由来の病原性因子サプレッサーでその発現が抑制された。E84cDNAを発現ベクターに組込み大腸菌を用いてグルタチオンSトランスフェラーゼ(GST)との誘導タンパク質を生産した。本組換えタンパク質を用いて、E84の結合するDNA塩基配列を調べたところ、AAAGをコアとする配列に結合することが明らかとなった。E84の発現がエリシターで誘導されることからE84はエリシターで転写誘導される防御遺伝子の正の転写制御因子と考えられた。そこでエリシター誘導性のエンドウCHS遺伝子のプロモーターを分割し、結合実験を行ったところ、AAAG配列を有するDNA断片だけがE84/GST融合タンパク質と複合体を形成した。本複合体の形成はGST単独では起こらなかった。更にE84遺伝子を単離したところ、そのプロモーターにも多くのAAAG配列が存在し、E84はAAAG配列を有するDNA断片に特異的に結合することが明らかになった。しかしながら、E84発現型プラスミドをCHS promoter/CATキメラ遺伝子あるいはE84 promoter/CATキメラ遺伝子と共にエンドウプロトプラストに導入してもレポーター遺伝子の発現は高くならなかったことより、E84単独では転写活性可能はないものと判断した。そこで、トウモロコシのDofタンパク質では異なる二つのDofタンパク質が複合体を形成することが知られているため、Dofドメインに保存されたアミノ酸配列からプライマーをデザインし、新たに6種類のDofドメインを有するタンパク質のcDNAを単離した。現在それらの完全長cDNAの構造解析をすすめると共に各々の発現を調べている。

エリシター処理したエンドウ上胚軸由来のcDNAライブラリーから新たに6種のDOfドメインを有する完全長のcDNAを単離し、それらのDNA塩基配列を解読した。その結果、新規Dof遺伝子(PsDof2-7)から推定されるDofタンパク質は230から396個のアミノ酸からなるタンパク質をコードし、いずれもアミノ末端側に保存されたDofドメインを有していた。更にDofドメインのすぐC末側にはセリンやスレオニンに富んだ領域があり、リン酸化や脱リン酸化によりDNAの結合能、転写活性化能、他のタンパク質との相互作用の制御に関与している可能性が示唆された。また、PsDof3とPsDof4にはグルタミンに富んだ領域が、PsDof4にはアスパラギンに富んだ領域が存在し、これらの領域もまた転写制御に関与している可能性が考えられた。これら7種のDofタンパク質のアミノ酸レベルでの相同性を比較した結果、PsDof1とPsDof2は57%の、PsDof3とPsDof4は47%の、PsDof5とPsDof6は25%の、PsDOf7はタバコのNtBBF1と44%の相同性を示した。このことからPsDofファミリーはDof以外はユニークな構造を有しているものの、いくつかのサブグループに分類できると考えた。それぞれの遺伝子の発現のノーザン解析の結果、PsDof1とPsDof2を除くPsDof遺伝子の発現は極めて低いためか検出することができなかった。PsDof1とPsDof2についてはエンドウ上胚軸でエンドウ褐紋病菌由来のエリシターで発現が誘導される傾向が見られたが、更に詳細な解析が必要である。エンドウ褐紋病菌由来のエリシター処理により発現が誘導されるエンドウ遺伝子のcDNAとしてE84が単離されている。E84の遺伝子産物はアミノ末端付近にDof DNA結合タンパク質ドメインを有することから防御応答時に発現の変動する遺伝子の転写を制御する植物特有の転写因子であると考えられた。そこでE84タンパク質のDNA結合特異性を解析することを目的として大腸菌で発現させたE84組換えタンパク質を用いてランダム結合選別法を行い、E84の至適結合配列を解析した。その結果、E84に結合するとして単離されたDNA配列は全てAAAG配列を有しており、周辺のヌクレオチドはその出現頻度からTTT/cT/cT/gT/a AAAG TGT/cTTTの配列が至適であると思われた。E84結合配列の一つBS4/37(TCATTTAAAGTGTTTT)をモデルとしてAAAG前後の配列に変異を導入して結合実験を行ってみるとAAAGの3'側のTGT配列も高い結合親和性のために必要な配列であることが明らかとなった。また、エリシター応答性のPsCHS1遺伝子のプロモーターとの結合実験を行ってみたところ、いくつかに分割したプロモーター配列の中でAAAG配列を有する断片に結合した。特に複数のAAAG
転写因子を用いた糖鎖シグナルの制御によるがん悪性形質の抑制

本研究では、転写因子Sp1の発現制御による細胞膜糖タンパク質の糖鎖修飾の変化と、がん細胞の悪性形質の発現との関係を分子レベルで解析した。本研究から、Sp1をヒト肺がん細胞でノックダウンすると接着分子E-カドヘリンの糖鎖修飾の変化に加えて、EGFレセプターからMAPキナーゼへのシグナル伝達が減弱することが初めて明らかになった。また、Sp1のノックダウンによる糖鎖修飾の変化をもたらす糖転移酵素を同定し、その機構を転写レベルで明らかにした。さらに、Sp1のノックダウンによる糖鎖修飾とシグナル伝達の変化が、がんの悪性形質である腫瘍形成能や細胞運動能の抑制に寄与するという新しい知見が得られた。昨年度の研究成果から、A549ヒト肺がん細胞においてSp1をノックダウンすると、対照細胞に比べて分子量120 KのE-カドヘリンで糖鎖修飾が変化することを見出した。この糖鎖修飾の変化に関わる糖転移酵素を同定するために、リアルタイムPCRにより糖転移酵素遺伝子の発現を定量的に解析した。その結果、Sp1ノックダウン細胞では糖鎖のガラクトシル化に関与するβ-1,4-ガラクトース転移酵素(β-1,4-GalT)ファミリーの中で、β-1,4-GalT I遺伝子の発現が対照細胞に比べて有意に低下した。そこで、β-1,4-GalT I遺伝子のプロモーター領域を単離し、その塩基配列を解析した。その結果、このプロモーター領域にはSp1結合部位が2ヶ所存在し、これらの部位がSp1のノックダウンによるβ-1,4-GalT I遺伝子の発現抑制に関与している可能性が示唆された。Sp1ノックダウン細胞では細胞運動能が対照細胞に比べて著しく低下するが、E-カドヘリンに対する機能阻害抗体を用いた実験から、運動能の抑制にE-カドヘリンが関与することが判明した。昨年度の研究成果から、Sp1ノックダウン細胞の腫瘍形成能は対照細胞に比べて著しく低下していた。そこで、Sp1ノックダウン細胞が形成する腫瘍やその周辺組織を観察した結果、対照細胞に比べて血管新生が著しく抑制されていた。さらに、腫瘍血管の新生を誘導する血管内皮細胞増殖因子(VEGF)に着目して、Sp1の発現制御による腫瘍形成の抑制のメカニズムの解明を試みた。VEGFの遺伝子発現及び培養液中への分泌量は、対照細胞に比べてSp1ノックダウン細胞で有意に低下した。本研究から、Sp1の発現制御によるE-カドヘリンの糖鎖修飾の変化に加えて、Sp1ノックダウン細胞ではVEGF産生・分泌の低下によって腫瘍血管の新生が抑制されて腫瘍形成能が低下したと考えられる。本研究では、転写因子Sp1の発現制御による糖鎖修飾の変化と、がん細胞の悪性形質の発現との関係を分子レベルで明らかにした。これまでの研究成果から、A549ヒト肺がん細胞においてSp1をノックダウンすると、対照細胞に比べて分子量120 KのE-カドヘリンで糖鎖修飾が変化することを見出した。さらに、Sp1ノックダウン細胞では細胞運動能や腫瘍形成能が著しく低下した。最終年度では、始めにE-カドヘリンとこの分子の裏打ちタンパク質であるβ-カテニンに着目して、Sp1のノックダウンによる細胞運動能の低下のメカニズムの解明を試みた。その結果、Sp1のノックダウンよるE-カドヘリンのN-型糖鎖修飾の変化によって、E-カドヘリン/β-カテニン複合体の形成が促進される一方、β-カテニンのリン酸化が抑制された。従って、Sp1のノックダウンによるこれらの変化によって細胞運動能が低下した可能性が考えられる。次に、ガラクトシル化に関与するβ-1,4-ガラクトース転移酵素(GalT) I遺伝子の転写制御機構に着目して、この遺伝子の発現が低下するメカニズムを解析した。その結果、この遺伝子のプロモーター領域に見られる2ヶ所のSp1結合部位に変異を導入すると、対照に比べてプロモーター活性が約60%低下した。従って、β-1,4-GalT I遺伝子の転写活性化にはSp1結合部位が重要な役割を果たしており、Sp1のノックダウンによってβ-1,4-GalT I遺伝子の発現が低下することが明らかになった。さらに、Sp1ノックダウン細胞ではEGFレセプターの下流のc-Raf、MEK1/2とMAPキナーゼのリン酸化が低下することが判明した。以上の結果から、Sp1のノックダウンによる糖鎖修飾の変化に加えて、EGFレセプターからMAPキナーゼへのシグナル伝達が減弱することでA549細胞の悪性形質が抑制されるという新しい知見が得られた。細胞表面に存在する複合糖質の構造は、細胞のがん化で一変する。この糖鎖シグナルは、がん細胞の悪性形質の発現に深く関わっている。

一方、転写因子Sp1は糖転移酵素を含む様々なハウスキーピング分子の遺伝子の転写を制御するが、種々のがん細胞で発現が増大することが報告されている。本研究では、Sp1の発現を制御することで生じる糖鎖修飾の変化と、がん細胞の悪性形質の発現との関係を分子レベルで明らかにする。A549ヒト肺がん細胞においてSp1をノックダウンすると、β-1,4-結合したガラクトース残基と結合するRCA-Iや2,6分岐側鎖を含む高分岐N-型糖鎖と結合するL-PHAとの結合性は、対照細胞に比べて分子量80-90 K及び120 Kの糖タンパク質で低下した。抗体を用いて糖鎖修飾が変化した糖タンパク質を解析したところ、分子量80-90 Kの糖タンパク質はLAMP-1、120 Kの糖タンパク質はE-カドヘリンであることが判明した。蛍光標識抗体を用いて解析したところ、A549細胞ではLAMP-1は細胞表面に発現していないことが判明した。次に、Sp1のノックダウンによる糖鎖修飾の変化の背景を解析するため、RT-PCRにより糖転移酵素遺伝子の発現を解析した。その結果、糖鎖のガラクトシル化に関与するβ-1,4-GalTファミリーの中で、β-1,4-GalT I, III, Vの遺伝子発現はSp1のノックダウンによって減少する傾向が見られた。一方、Sp1のノックダウンによって幾つかのシグナル伝達分子でリン酸化レベルが変化することが判明した。さらに、Sp1ノックダウン細胞ではヌードマウスの皮下での腫瘍形成が著しく抑制された。本研究から、A549細胞においてSp1をノックダウンすると、主にE-カドヘリンの糖鎖修飾とシグナル伝達分子のリン酸化が変化し、腫瘍形成が抑制されることが示唆された。平成24年度は、ヒト肺がん細胞から樹立したSp1ノックダウン細胞の腫瘍形成能及び細胞運動能の解析、糖鎖修飾の変化に関わる糖転移酵素の同定、及びその酵素遺伝子のプロモーター領域の単離を行なった。現在、同定した糖転移酵素遺伝子のプロモーター領域に存在するSp1結合部位に変異を入れて、どのSp1結合部位が、この酵素遺伝子のプロモーター活性に関与しているかを解析中である。また、ヌードマウス皮下に形成された腫瘍やその周辺の新生血管の状態を観察し、Sp1ノックダウン細胞では対照細胞に比べて血管新生が抑制されることを見出した。さらに、腫瘍血管の新生に関わるVEGFの遺伝子発現、及び培養液中への分泌量を定量的に解析し、Sp1の発現制御による腫瘍形成能の抑制メカニズムの解明を試みた。以上の研究成果から、研究目的を、おおむね順調に達成できたと考えられる。平成23年度は、ヒト肺がん細胞から樹立したSp1ノックダウン細胞における糖鎖修飾が変化した分子の同定、及び糖鎖修飾の変化に関わる糖転移酵素の候補の絞り込みに成功した。現在、候補として絞り込んだ糖転移酵素遺伝子のプロモーター領域を単離し、Sp1のノックダウンによるプロモーター活性の変化の有無を解析中である。さらに、Sp1ノックダウン細胞はヌードマウス皮下における腫瘍形成が著しく抑制されることを見出した。また、対照細胞とSp1ノックダウン細胞においてシグナル伝達分子のリン酸化の変化の有無を解析したところ、Sp1のノックダウンによって幾つかのシグナル伝達分子でリン酸化レベルが変化することが判明した。
ワクチンの免疫力増強に有用な免疫アジュバントの開発

ヒトの感染症に対するワクチンの効果発現には有効な免疫アジュバントの併用が必須と考えられる。本研究では(1)有効な免疫アジュバントの開発、(2)腎性出血熱ウイルスワクチン、特にそのリコンビナントワクチンに対する合成免疫アジュバントの併用効果について検討すると共に、(3)癌ワクチン開発への免疫アジュバントの応用についても検討した。1.免疫アジュバントの開発:特にムラミルジペプチド(MDP)、トレハロ-スジマイコレ-ト(TDM)の誘導体の化学合成と免疫アジュバント活性の検討を行った。特にMDP誘導体のうちでもB30ーMDP、MDPーLys(L18)及び1ーΒーSーB30MDPの免疫アジュバントとしての有効性を種々の評価系を用いて明らかにした。TDMはきわれて特異的な免疫アジュバント活性を有することを明らかにしたが、更にその誘導体であるTDNM、TDM(α,Β)及びTDM(Β,Β)があげられる。TDM(α,Β)及びTDM(Β,Β)がTDMに比しマウスに対する致死毒性や体重減少毒性が極めて弱く、TDMに匹敵する免疫アジュバント活性が保持されていることを見出した。2.合成免疫アジュバントのワクチン開発への応用:腎性出血熱ウイルス(Hantaanウイルス)のウイルス表面抗原をコ-ドするcDNAをBaculo virusに取り込み、夜盗蛾細胞系に感染させて表面抗原を発現させ、その細胞のホモジネ-トを抗原としてB30ーMDPと共にBALB/cマウスに2回免疫した。4週後血清中の抗体価を測定すると共に、皮内感染させた哺乳マウスに24時間後脾細胞を受身移入し感染防御活性を検討した。その結果B30ーMDPを併用した群では対照群に比し血中抗体価も、受身移入した脾細胞による感染防御も有意に上昇していることが明らかにされた。B30ーMDPを^<60>Co照射したL5178YーML25細胞と共にCDF_1マウスに皮内投与で免疫し、1週後生細胞を静脈内移植し、脾への転移を検討した結果、B30ーMDP併用免疫群においてほぼ完全に腫瘍転移の阻止がみとめられた。ヒトの感染症に対する種々のワクチンの開発研究が望まれるところであるが、それらワクチンの効果発現には強い免疫アジュバントの併用が必須であろうと考えられる。本研究ではその応用を考慮し、種々の合成免疫アジュバント、特にアシル・ムラミルジペプチド(MDP)誘導体、トレハロ-スマイコレ-ト(TDM)誘導体あるいはキチン誘導体などを化学合成し、それらの免疫増強活性を指標にスクリ-ニングし、副作用が少なく応用可能な免疫アジュバントを検索した。TDMは元来結核菌から精製された毒性糖脂質であることから、種々のTDM関連化合物の毒性試験も行なった。TDMは著明な体重減少を伴ない2週間以内に全例死亡した。その他の関連化合物は致死活性を示さなかった。単糖型のTDN関連化合物のなかで、GIcNAcM(1-deoxy)[6位にミコ-ル酸(M)が結合し更に1位をデオキシ化したGIcNAc]は強くマクロファ-ジを活性化し殺腫瘍性を誘導した。更に致死毒性及び体重減少も認められなかった。

以上の成績から、糖部分の化学修飾によりその生物(免疫)活性が著明に変化することが明らかとなった。更にGIcNAcM(1-deoxy)は転移性腫瘍の移植局所近傍に投与した場合に、原発腫瘍の大きさ(増殖)には変化が認められなかったが、その肺への転移を有意に抑制した。一方、TDMを投与した場合も著明な転移抑制効果を示したが、著しい体重の減少を伴ない死亡例も観察された。以上のスクリ-ニングの成績より極めて低毒性の合成免疫アジュバントの候補が見出された。今後更にその他の評価系にて性状を明らかにすると共に、その投与形態などを考慮することにより感染防御効果を検討したい。ヒトの感染症に対するワクチン病発において、これらワクチンの効果発現には有効な免疫アジュバントの併用が必須と考えられる。本研究では(1)有効な免疫アジュバントの開発、(2)腎性出血熱ウイルスワクチン、特にそのリコンビナントワクチンに対する合成免疫アジュバントの併用効果、(3)癌ワクチン開発への免疫アジュバントの応用について検討した。1.免疫アジュバントの開発:特にムラミルジペプチド(MDP)、トレハロ-スジマイコレ-ト(TDM)の誘導体の化学合成と免疫アジュバント活性の検討を行った。特にMDP誘導体のうちでもB30ーMDP及びMDPーLys(L18)の免疫アジュバントとしての有効性を種々の評価系を用いて明らかにしたが、新たに有効性が確認された免疫アジュバントとして1ーβーSーB30ーMDPメチルエステルとTDM(α,β)及びTDM(β,β)があげられる。1ーβーSーB30ーMDPメチルエステルはモルモットにおける遅延型アレルギ-誘導の評価系でB30ーMDPに匹敵する免疫アジュバント活性を示した。TDM(α,β)及びTDM(β,β)はTDMのもつマウスに対する致死毒性や体重減少毒性が極めて弱く、TDMに匹敵する免疫アジュバント活性が保持されている。2.合成免疫アジュバントのワクチン開発への応用:腎性出血熱ウイルス(Hantaanウイルス)のウイルス表面抗原をコ-ドするcDNAをBaculo virusに取り込み、夜盗蛾細胞系に感染させて表面抗原を発現させ、その細胞のホモジネ-トを抗原としてB30ーMDPと共にBALB/cマウスに2回免疫した。4週後血清中の抗体価を測定すると共に、皮内感染させた哺乳マウスに24時間後脾細胞を受身移入し感染防御活性を検討した。その結果B30ーMDPを併用した群では対照群に比し血中抗体価も、受身移入した脾細胞による感染防御も有意に上昇していることが明らかにされた。B30ーMDPを^<60>Co照射したL5178YーML25細胞と共にCDF_1マウスに皮内投与で免疫し、1週後生細胞を静脈内移植し、脾への転移を検討した結果、B30ーMDP併用免疫群においてほぼ完全に腫瘍転移の阻止がみとめられた。
デジタル信号直接駆動型スピーカの解析と高性能化

デジタル直接駆動型スピーカを実現するにあたり必要な基礎的データの収集のための電気一音響変換素子(圧電素子)単体の特性を評価し、複数の電気一音響変換素子を用いた場合を鑑み、圧電素子の特性ばらつきの評価を行った。圧電素子を駆動するためのデジタル信号処理部をFPGAによる実装を行い,圧電素子の特性を考慮したドライバをCMOSデバイスで実現し,この評価を行った.この結果,従来に比較して提案するデジタル信号直接駆動型スピーカは低歪み特性を実現出来ることが確認された.●電気-音響変換素子圧電素子(圧電スピーカ)の基本特性の評価:周波数特性:圧電素子単体は平坦で良好な周波数特性を示したが、200Hz以下の低周波領域では音圧の低下が観測された,また,複数の素子間では10%以上の特性のばらつきが観測された.歪み特性:圧電素子は非線形特性を有するため歪みの発生が問題なる。高調波歪み特性の実験から比較的高い歪み率32%(3次歪み)が測定された。圧電素子をそのままアナログ駆動する場合には、歪みの影響を低減する方法が必要となる。●デジタル直接駆動スピーカの高性能化の検討ノイズシェーピング・ダイナミックエレメント・マッチング法(NSDEM)の検討:デジタル直接駆動型スピーカに適したNSDEMの実現方法検討を行い,この特性をシミュレーションにより確認した,また,これに基づき論理回路設計を行い,論理合成したもののシミュレーション,検証、FPGAへの実装を行った.このFPGAの評価から,従来方法と比較して20%以上小さいハード規模でNSDEMを実現出来ることを実証した.●提案するデジタル直接駆動型スピーカの総合評価FPGAを用いた駆動回路および高速圧電素子ドライバ回路に複数の圧電素子で構成した電気一音響変換器を接続した場合の総合特性の評価:サイン波を:入力した場合の特性を評価した.その結果,平面板にサブスピーカを配置した場合,それぞれのサブスピーカは,そのユニットのばらつきおよび配置によりサブスピーカ自体の特性にばらつきが生じるが,NSDEMの効果によりその影響が低減され,歪み率2%以下の良好な特性が実現されていることを実験により確認した.デジタル直接駆動型スピーカを実現するにあたり必要な基礎的データの収集のための電気一音響変換素子(圧電素子)単体の特性を評価し、複数の電気一音響変換素子を用いた場合を鑑み、圧電素子の特性ばらつきの評価を行った。●デジタル直接駆動スピーカの高性能化の検討ノイズシェーピング・ダイナミックエレメント・マッチング法(NSDEM)の検討:デジタル直接駆動型スピーカに適したNSDEMの実現方法検討を行い,この特性をシミュレーションにより確認した,また,これに基づき論理回路設計を行い,論理合成したもののシミュレーション,検証、FPGAへの実装を行った.このFPGAの評価から,従来方法と比較して20%以上小さいハード規模でNSDEMを実現出来ることを実証した.●提案するデジタル直接駆動型スピーカの総合評価FPGAを用いた駆動回路および高速圧電素子ドライバ回路に複数の圧電素子で構成した電気一音響変換器を接続した場合の総合特性の評価:サイン波を:入力した場合の特性を評価した.その結果,平面板にサブスピーカを配置した場合,それぞれのサブスピーカは,そのユニットのばらつきおよび配置によりサブスピーカ自体の特性にばらつきが生じるが,NSDEMの効果によりその影響が低減され,歪み率2%以下の良好な特性が実現されていることを実験により確認した.本年度はデジタル直接駆動型スピーカを実現するにあたり必要な基礎的データの収集を行うため、電気-音響変換素子(圧電素子)単体の特性を評価した。また、複数の電気-音響変換素子を用いた場合を鑑み、圧電素子の特性ばらつきの評価を行った。電気-音響変換素子圧電素子(圧電スピーカ)の基本特性の評価周波数特性:圧電素子単体は平坦で良好な周波数特性を示したが、200Hz以下の低周波領域では音圧の低下が観測された。歪み特性:圧電素子は非線形特性を有するため歪みの発生が問題なる。圧電素子の素子ばらつき特性:圧電素子の最大出力音圧レベルに関しては、1dB以下のばらつきに収まっていたが、周波数特性に関しては遮断周波数に10%以上のばらつきが計測された。これは、複数の圧電素子を並列に用いた場合に問題となる可能性が高く、ばらつきの影響を低減する方法が必須であることが明かとなった。

圧電素子の駆動方法検討複数の圧電素子を並列に用いて音圧制御する場合、圧電素子のばらつきが精度を劣化させるため、この影響を低減する方法を検討した。我々が提案しているノイズシェーピング・ダイナミック・エレメント・マッチング法を適用することによって、素子値のばらつきの影響を1/100以下に低減出来ることをシミュレーションによって確認した。圧電素子が有限個の場合に生じる音圧誤差(量子化誤差)の低減方法検討圧電素子が有限個の場合に生じる音圧誤差(量子化誤差)を低減する方法として、ΔΣ変調器を応用することを検討し、さらに帯域外に生じる量子化誤差の低減方法としてアナログFIRフィルタを用いる方法を提案した。平成16年度の駆動方式の検討結果を基に駆動回路をハードウェアとして実装し,この評価を行った.圧電素子を駆動するためのデジタル信号処理部をFPGAを用いて実装し,圧電素子のドライバをCMOSデバイスで実現した.駆動回路のハードウェア実現および評価●ノイズシェーピング・ダイナミック・エレメント・マッチング法(NSDEM)を基本とした駆動回路のハードウェアでの実現方法検討デジタルフィルタ:ΔΣ変調器を実現するためのフィルタ特性設計,ハードウェアのアーキテクチャ設計を行った.オーディオ信号を再生するのに十分な演算精度を確保し,またFPGAでの実装を可能とするため各ブロックに最適なビット幅の割付を行い,高精度かつハードウェア規模を削減した構成方法を提案した.NSDEM:デジタルスピーカ実現に必要なフィルタ次数を決定し,この特性をシステムシミュレーションにより確認した.これを実現するハードウェアのアーキテクチャを設計した.論理回路設計:verilog言語を用いて上記のブロックを記述し,シミュレーション,論理合成を行いゲートサイズ150kのFPGAで実装可能であることを確認した.これを基にFPGAへの実装を行い,ΔΣ変調器が動作しノイズシェーピングが実現されていることを確認した.また,圧電素子のばらつきの影響を低減するためのNSDEMが動作し,各素子が動的に均等に用いられていることを確認した.圧電素子ドライバ回路:使用する圧電素子の特性を考慮し回路シミュレータspiceを用いてドライバ回路を設計し実装を行った.●提案するデジタル直接駆動型スピーカの総合評価FPGAを用いた駆動回路および圧電素子ドライバ回路に,複数の圧電素子で構成した電気-音響変換器(圧電素子)を接続し,その総合特性を評価した.正弦波を入力とする評価では,複数の圧電素子からの音圧の和として基本波成分が放射されていることを確認した.高周波域での特性劣化が観測されたが,その原因はドライバのスイッチング特性によることを見いだした.17年度に試作したFPGAによる評価装置およびシミュレーションにより誤差の発生するメカニズムを理論面および実験の両面から詳細な検討を行なった.総合評価では,従来に比較して提案するデジタル信号直接駆動型スピーカは低歪み特性を実現出来ることが確認された.○デジタル直接駆動スピーカの高性能化の検討ノイズシェーピンク・ダイナミックエレメント・マッチング法(NSDEM)の検討:デジタル直接駆動型スピーカに適したNSDEMの実現方法検討を行い,この特性をシミュレーションにより確認した.
磁場反転配位における周辺プラズマのモデル化に関する研究

1)磁場反転配位(FRC)における、セパラトリクス外側の周辺部プラズマの粒子閉じ込め機構解明の研究を行った。FRC配位においては磁場がゼロであるX点(双曲型特異点)が存在するため生ずる無衝突ピッチ角散乱による拡散が起こる。この機構を解明するために、粒子分布関数を無衝突ピッチ角散乱を考慮したボルツマン方程式を用いて解析し、粒子のエネルギー、正準運動量、作用変数、流れ関数、及び磁束関数を用いて定常解を求めた。2)FRCやトカマクなどの周辺プラズマと接触しているダイバータ板などの金属板近傍でのプラズマの振る舞い解明の研究を行った。通常金属板前面では磁力線が斜めに開いて入射している。このような状況において板前面での安定なシース形成条件とプラズマ領域での電位形成条件の理論解析を行った。板に向かって開いた磁力線はその勾配が静電的電界と同様に板に向かってイオンを加速する。これらの加速のためにダイバータ前面での安定なシース形成条件は一様な磁場の場合に比べてシース入り口でのイオン音速に課せられる条件が厳しくなることがわかった。しかし、その大きさの変化は磁場の変化長に対するデバイ長の大きさで通常のプラズマでは10^<-6>程度になり無視できる。さらに、シース前面のプラズマ領域での安定な静電電位形成の理論解析を行った。そこでは、イオン生成として電子衝突による中性粒子のイオン化を考えた。この状態でのプラズマ領域入り口でのイオン平均流速に課せられる条件を導出した。その結果として、プラズマ領域で中性粒子が存在しないとイオン流速はイオン音速より大きい必要があるが、中性粒子が存在して電子衝突等によるイオン源が存在すればプラズマ入り口でのイオン平均速度はイオン音速より小さくても安定な電位が形成することを示した。本年度は、磁場反転配位(FRC)における、セパラトリクス外側の周辺部プラズマの粒子閉じ込め機構解明を中心に研究を行った。FRC配位では磁場がゼロであるX点(双曲型特異点)が存在するために、セパラトリクス内の閉じた磁力線領域から漏れ出たプラズマ粒子はこのX点近傍でミラー磁場捕捉される。このような磁場配位での単一荷電粒子の軌道を追跡したところ、断熱不変量の一つである径方向の作用変数がX点以外ではよく保存しているが、X点近傍ではその値が大きく変化していることが分かった。この理由は、緩やかに変化している磁場中ではその変化に追随している粒子のピッチ角がX点近傍ではその急激な磁場変化に対応できず確率的に変化したためと考えられる。このような無衝突ピッチ角散乱は荷電粒子間のクーロン衝突によるピッチ角散乱と同様に磁力線を横切る拡散を引き起こして粒子の損失につながる。この拡散機構を解明するために、粒子分布関数を無衝突ピッチ角散乱を考慮したボルツマン方程式を用いて解析し、粒子のエネルギー、正準運動量、作用変数、流れ関数、及び磁束関数を用いて定常解を求めた。ここで、磁場を横切る拡散はクーロン衝突による磁束関数空間の拡散係数で表され、上述した断熱不変性の破れに起因した作用変数空間の拡散は計算機を用いた粒子軌道追跡から拡散係数の各種物理量依存性を求めることができた。以上の理論解析と並行して、周辺部の中性粒子のイオン化やイオンとの荷電交換などの効果をモンテ・カルロ法を用いて取り込んだ粒子シミュレーションコードを開発している。これは、周辺部のミラー磁場構造を考慮して実空間は2次元となっている。今後、この結果と上記の拡散を取り込んだ流体シミュレーションコードを構築してFRC周辺部プラズマのモデル化研究を推進していく。

本年度は磁場反転配位(FRC)やトカマクなどの周辺プラズマと接触しているダイバータ板などの金属板近傍でのプラズマの振る舞いの解明を中心に研究を行った。通常金属板前面では磁力線が斜めに開いて入射している。このような状況において板前面での安定なシース形成条件とプラズマ領域での電位形成条件の理論解析を行った。ここでは簡単化のために1次元の非一様磁場を考えた。板に向かって開いた磁力線はその勾配が静電的電界と同様に板に向かってイオンを加速する。これらの加速のためにダイバータ前面での安定なシース形成条件は一様な磁場の場合に比べてシース入り口でのイオン音速に課せられる条件が厳しくなることがわかった。つまり、一様磁場では安定なシース形成にはシース入り口でのイオン平均流速がイオン音速より大きい必要がある(ボーム条件)が、非一様磁場の場合はさらに大きなイオン流速が必要とされることがわかった。しかし、その大きさの変化は磁場の変化長に対するデバイ長の大きさで通常のプラズマでは10^<-6>程度になり無視できる。さらに、シース前面のプラズマ領域での安定な静電電位形成の理論解析を行った。そこでは、イオン生成として電子衝突による中性粒子のイオン化を考えた。この状態でのプラズマ領域入り口でのイオン平均流速に課せられる条件を導出した。その結果として、プラズマ領域で中性粒子が存在しないとイオン流速はイオン音速より大きい必要があるが、中性粒子が存在して電子衝突等によるイオン源が存在すればプラズマ入り口でのイオン平均速度はイオン音速より小さくても安定な電位が形成することを示した。これらの結果は閉じ込めプラズマの周辺部分のプラズマとの境界条件を与え、磁場反転配位(FRC)やトカマクなどの周辺部プラズマの振る舞いを総合的に研究するために重要な役割をしている。磁場反転配位における閉じ込めプラズマ部周辺のミラー磁場配位を考慮して、損失プラズマが金属板(ダイバータ板)に入射する領域(ダイバータ領域)での安定な電位(シース)形成や金属板への粒子束、熱流束に関する研究を行った。そのダイバータ領域ではダイバータ板に向かって開いた非一様磁場(磁場強度が減少)構造の効果を考慮した。その成果を以下に列挙する。1)空間一次元の粒子モデルを用いた計算機シミュレーションによって、磁場を考慮しない系のダイバータ板に中性粒子を入射することにより、その電荷交換の効果により非接触プラズマが形成されることを示した。2)空間一次元の理論解析によって、金属板前面での安定な(デバイ)シース形成条件であるボーム条件(シースへの平均イオン速度はイオン音速より大きいことが必要)は、磁場の非一様性によって少し厳しい条件が要請されるが、磁場閉じ込め核融合プラズマではその差はプラズマ半径に対するデバイ長程度であるので、無視できる大きさとなることが明確になった。3)デバイシース前面の非一様磁場配位中のプレシース領域において、ダイバータ板に向かって単調に減少する電位配位が形成されるためには、ボーム条件と同様にプレシース入口で平均イオン流束がイオン音速より大きいことが要請されることが示され、プレシース領域にプラズマ源(中性粒子の電離など)があればその条件は大幅に緩和されることを理論解析によって示した。
反発性神経軸索誘導を制御するマクロピノサイトーシスの分子機構

これまでに、反発性神経軸索誘導にマクロピノサイトーシスが重要な役割を果たしていることが報告されており、重要関連分子としてシンタキシン1(stx1)が同定されている。そこで、stx1に結合する蛋白質を探索し、一連の現象の制御メカニズムを解明しようと試みた。この過程で、研究代表者は平成20年度末に、イノシトール1,4,5-三リン酸(IP3R)がstx1に結合することを発見した。IP3Rは、細胞内に存在するカルシウムチャネルであり、そのチャネル活性を介して膜輸送システムを制御すると考えられている。そこで、stx1とIP3Rの関連について解析を進めた。平成21年度末までに、IP3Rのstx1配列内の結合部位を決定した。さらに、困難の伴ったIP3Rの部分配列組み替え蛋白を大量精製することに成功した。この精製蛋白を使用し、平成21年度末から平成22年度にかけて、IP3R配列内のstx1結合部位を同定した。さらに平成22年度には、IP3Rとstx1が直接結合することも明らかにした。次に、stx1がIP3Rに及ぼす影響について検討を行うため、培養細胞を用いた生細胞カルシウムイメージングによる機能解析を試みた。その結果、stx1によってIP3Rのカルシウムチャネル活性を抑制することを初めて明らかにした。既に、マクロピノサイトーシスも細胞内カルシウム濃度により制御されている可能性があることが見出されている。したがって、本研究で発見したstx1とIP3Rの結合、そしてstx1によるIP3Rのカルシウム放出能の制御は、マクロピノサイトーシスの重要な調節機構となっている可能性がある。今後、stx1とIP3Rの結合がマクロピノサイトーシスに与える影響が詳細に検討されることが必要であるが、本研究は細胞の膜輸送機構を制御する新規のシグナル伝達機構の解明につながる、重要な発見を達成できたと考えている。研究代表者は現在、理化学研究所・発生神経生物研究チームに出向して研究活動を行っている。これまでに、反発性神経軸索誘導にマクロピノサイトーシスが重要な役割を果たしていることが解明されている。研究代表者は、反発性神経軸索誘導におけるマクロピノサイトーシスがいかなる分子メカニズムで制御されているかを解明することを目的として、関連分子の同定を目指している。当チームでは既に、重要関連分子としてシンタキシンを同定している。そこで研究代表者は、シンタキシンに結合する新規蛋白質を同定することで、一連の現象の制御メカニズムを解明しようと試みている。新規蛋白質を同定する戦略として、(1)網羅的解析、(2)候補分子解析、の二つのアプローチを採用した。研究代表者は平成20年度内に、(1)(2)両方のアプローチから、複数のシンタキシン結合候補蛋白を同定した。その中の複数蛋白について、実際にシンタキシンに結合する新規蛋白であると裏付ける結果を、複数の実験系(GST融合シンタキシン精製蛋白による結合実験、および免疫沈降)から得た。さらに、シンタキシン中に存在する各ドメインにGSTを融合させた精製蛋白を作製し、それらを用いた結合実験から結合に重要と考えられる部位も確定することが出来ている。現在は、in vivoの実験系を確立している段階であり、これらの結合がマクロピノサイトーシスをいかに制御しているか、検討をすすめている。これらの新規シンタキシン結合蛋白は、軸索先端である成長円錐にも存在することが既に知られており、シンタキシンとの結合が反発性軸索誘導において果たす役割の重要性は大変興味深く、期待出来ると考えている。当チームでは既に、重要関連分子としてシンタキシン1を同定している。マクロピノサイトーシスを制御するシンタキシン1新規結合蛋白を同定する過程で、研究代表者は平成20年度の研究期間最後に、従来から知られる膜輸送システムを制御しうる新規のシンタキシン1結合蛋白を複数発見した。そのうちの一つが、非常に興味深い蛋白であったため、平成21年度はこの蛋白(以下タンパク質Aとする)について解析を進めた。研究代表者はまず、この蛋白-蛋白間相互作用において必要な、シンタキシン1配列内の結合部位を決定した。続いてタンパク質Aの配列内の結合部位を同定しようと試みた。しかしこのタンパク質Aの部分配列をGST蛋白に融合させた組み替え蛋白は分解しやすく、大量精製が大変困難であった。そこで実験系を工夫して新たに再構築し、ついに部分配列の全長をそれぞれ精製することに成功した。こめ精製蛋白を使用し、タンパク質Aの配列内の結合部位を同定することが出来た。また並行して、シンタキシン1とこの結合蛋白の相互作用が、細胞内のどのような刺激で膜輸送に関与するか調べるため、培養細胞に蛍光蛋白を発現させるアッセイ系を立ち上げた。その結果、このタンパク質Aが確かに膜輸送を制御することを指し示す結果が得られた。蛍光蛋白を利用したこのアッセイでは定性的な評価はできるものの、時間軸を含めた詳細な評価が難しい点も多い。そこで、平成21年度研究期間の最後期から、定量的な評価が可能なin vitro評価系を立ち上げ始めている。