hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
MEMS技術を用いた複合ナノ熱分析システムの開発

これにより,管内の水により先端部の濡れ性が向上した状態で微小物体の付着・取り上げを行い,ヒータ加熱による先端部の乾燥により濡れ性を低下させた状態で微小物体の分離・設置を行うマニピュレーションが可能なことが示された。カロリメータに関しては,マイクログラムレベルの試料に対して,熱の出入りと質量変化を同時に観察する実験により,その有効性が示された。さらに,温度走査により共振周波数がドリフトする課題が明らかとなったが,時間差計測により試料正味の質量変化がナノグラムレベルで観察できること,あるいはカンチレバーに異種材料を積層することで温度ドリフトを解消できる可能性を示すことが出来た。電子顕微鏡への導入準備としては,真空環境下でのカロリメータの動作特性を調べ,周囲空気の影響を定量的に明らかにすると共に,真空環境でも熱・質量分析が実施できることが確認された。本研究は,MEMS技術で作成される微小カロリメータをSEMやEDXS分析と複合化し,微小試料に対する超高速,高感度な熱・質量分析を行う格段に分析能力の優れた複合ナノ熱分析システムの開発を目標としている.そのため,微小カロリメータによる熱分析技術に加え,極微量質量計測技術,微小試料のマニピュレーション技術の開発とSEM内で行う複合分析法の研究開発を実施している.本年度は,SEM内で微小カロリメータを利用したナノ熱分析とSEM観察の複合化と針状プローブ先端の濡れを制御して微小試料をマニピュレートする技術の研究を行った.SEM内熱分析に関しては,微量なインジウムと金を試料として,熱分析中に融解・混合して合金化する反応を対象として,相変化の潜熱,反応熱の発生と形状変化を同時に観察することに成功した.従来の熱分析波形から現象を推定することと比較し,形状や動きがミクロの視点でとらえられることは,現象理解や分析力を効果的に高めることが示された.微小試料のマニピュレーションに関しては,先鋭化したガラスパイプに微小ヒータを巻き付け,内部に水を入れたメニスカスチップを開発し,先端部の濡れを熱的に変化させることで,基板上の微小物体(ガラスビーズ)をチップに付着させて取り上げ,任意の場所へ設置する作業が高い確率で実施できることが示された.微小球と対象として付着力計測では,先端部の濡れ状態で約15マイクロニュートンの付着力が乾燥状態では2マイクロニュートン以下に低減することが示され,微小物体のマニピュレーションに十分使用できることが示された.本研究は,MEMS技術で作成される微小カロリメータを電子顕微鏡(SEM)やエネルギー分散型X線分析装置(EDXS)と複合化し,微小試料に対する超高速,高感度熱・質量分析を行う格段に分析能力の優れた複合ナノ熱分析システムの開発を目的としている.このため,研究実施計画として,カンチレバー型微小カロリメータの共振を利用した極微量質量計測技術,SEMと微小カロリメータを組み合せたナノ熱分析の複合化,微小試料を取り扱うサンプルマニピュレーション技術研究を計画た。結果として,260800ミクロン長さの微小なカンチレバー型のカロリメータをMEMS技術で製作し,マイクログラムナノグラム試料を金属,無機試料を対象とした熱分析,質量分析に関し以下の成果を得た。微量質量計測技術に関しては,振動を光学的に検出し共振振動数を計測する方法に加え,歪ゲージを内蔵したカンチレバー型カロリメータを開発し,計測システムの簡素化を実現し,室温から800°Cにわたる広い温度範囲で熱・質量計測が可能なことが示された。SEMにカンチレバー型カロリ
多機能性抽出媒体としてのイオン液体

イオン液体キレート抽出系において優先抽出種を安定化する因子の探求を指向した研究を、配位不飽和中性錯体と配位飽和陰イオン性錯体の2つのケースに分けて実施した。前者については、残余の配位水分子がイオン液体構成陰イオンと置換することによって安定化が図られていることを示す知見が得られた。一方、後者のケースは17族原子を含む陰イオン性キレート抽出剤を用いた場合に事実上限定されていたが、新たに17族原子を含まないキレート抽出剤とハロゲン化物イオンによる陰イオン性三元錯体の安定化を示す知見が得られたイオン液体キレート抽出系において優先抽出種を安定化する因子の探求を指向した研究を、配位不飽和中性錯体と配位飽和陰イオン性錯体の2つのケースに分けて実施した。一方、後者のケースは17族原子を含む陰イオン性キレート抽出剤を用いた場合に事実上限定されていたが、新たに17族原子を含まないキレート抽出剤とハロゲン化物イオンによる陰イオン性三元錯体の安定化を示す知見が得られたイオン液体キレート抽出系における優勢抽出種を安定化させる因子の探求という観点から、以下に示す研究を実施した。1.配位不飽和中性錯体を安定化させる因子に関する検討これまで中心金属の残余配位座には水分子が結合していると考えてきたが、2-テノイルトリフルオロアセトンによる3価ランタノイドイオンの抽出では水分子が結合していないという結果が得られた。ランタノイドの抽出では、中性配位子共存による協同効果が発現しており、親水性が必ずしも抽出に有利には作用していない。このことから、水分子に代わりイオン液体陰イオンが何らかの相互作用をしている可能性が示唆された。一方、キレート試薬にイミダゾリウム構造を組み込んだ1-メチル-3-[2-(8-キノリニルアミノスルホニル)エチル]イミダゾリウム塩を用いて2価遷移金属イオンの抽出を行った場合、組み込み前より抽出能が増大した。この場合の抽出種は見かけ上陽イオンとなることから、配位状態と電荷との間には必ずしも相関はなく、配位部位での構造的議論が重要であると示唆された。2.配位飽和陰イオン性錯体を安定化させる因子に関する検討荷電錯体の抽出には、イオン液体構成イオンとのイオン交換が必須である。陰イオン性錯体が抽出されているのは現在のところフルオロ化部位を有する配位子の場合にほぼ限定されており、またイオン液体自身の疎水性が高いほど曲出能が高い。このことと疎水性イオン液体の化学構造とを勘案すると、フッ素原子由来の特異的静電的相互作用が安定化に大きく寄与すると示唆された。この部分について、この制約を破る系の探索も含めて今後さらに検討を行っていく。イオン液体キレート抽出系における優勢抽出種を安定化させる因子の探求という観点から、以下に示す研究を実施した。1.配位不飽和中性錯体を安定化させる因子に関する検討2-テノイルトリフルオロアセトンによる3価ランタノイドイオンの抽出において、水分子が結合していないという前年度の成果についてさらに詳細な解析を行い、あらかじめ合成した水和錯体をイオン液体に溶解した場合でも脱水和が起こることを確かめた。この結果は、水分子とイオン液体構成イオンとの間で配位子交換もしくはそれに類する反応が生じていることを示唆するものである。一方、キレート試薬にイミダゾリウム構造を組み込んだ抽出剤を用いた場合の2価遷移金属イオンの抽出増大効果を評価したところ、イミダゾリウム構造と錯形成部位との距離が近い場合の方が高い増大効果を示した。このことから、錯体中心近傍での電荷状態が抽出特性に何らかの寄与をしていることが示唆された。2.配位飽和陰イオン性錯体を安定化させる因子に関する検討多量の塩化物イオンが共存する条件下で2価遷移金属イオンのイオン液体キレート抽出を行ったところ、一定の抽出増大効果が見られた。通常の有機溶媒を用いる場合には逆に抽出抑制効果が現れることを考慮すると、イオン液体系では「配位不飽和錯体であっても抽出される」という考え方が正しく、安定な配位飽和荷電錯体が形成される場合にはむしろその形でイオン交換抽出される方が有利であると思われる。この点についてはさらに詳細な検討が必要である。1.配位不飽和中性錯体を安定化させる因子に関する検討:2-テノイルトリフルオロアセトンによる3価ランタノイドイオンの抽出において、抽出種である中性錯体にはイオン液体を構成するビス(トリフルオロメタンスルホニル)イミド陰イオンが水和水分子と交換して配位していることを示す知見が得られた。このことは、配位不飽和中性錯体を安定化させる因子の一つにイオン液体陰イオンによる溶媒和が挙げられることを意味している。しかし、配位能を有さないヘキサフルオロリン酸塩型イオン液体でも類似の特性を示すという事実は、安定化に寄与する因子が他にも存在しうることを示唆しており、今後より詳細な検討が必要である。2.配位飽和陰イオン性錯体を安定化させる因子に関する検討:多量の塩化物イオン共存条件下での2価遷移金属イオンのイオン液体キレート抽出における抽出増大効果の発現という前年度の成果をふまえ、共存イオンを臭化物イオンとする比較対象実験を行ったところ、逆に抽出抑制効果が見られた。

このことは、抽出に有利な陰イオン性三元錯体には一定の構造的制約要件が存在すること、またその制約にはイオン液体による溶媒和との競争反応が含まれていることをを意味している。この結果は、新たな物質分離系の創成における有用な情報であり、今後さらなる研究を進めていく必要がある。配位不飽和中性錯体を安定化させる因子に関する検討を中心に、一定の研究成果が得られていると評価できるため。24年度が最終年度であるため、記入しない。基礎的検討については一定の成果を得ていることから、計画最終年度には、さらに基礎的検討を推し進めていくとともに、さらにこれらの成果を応用面で生かしていくための指針を得たいと考えている。具体的には、イオン液体系特有の新たな分離系の構築を視野に入れていきたい。
陽性情動やエンリッチ環境が脳内エピジェネティクス修飾に及ぼす影響と疼痛制御

遺伝子発現の網羅的解析により、ストレス(隔離飼育)や陽性情動(Tickling刺激)が、扁桃体で多くの遺伝子やmiRNAを変動させることがわかった。ストレス応答に関わるアドレナリンα受容体遺伝子やmiR-375-3pなどは個別飼育により発現が変化し、Ticklingにより適正化された。これは、陽性情動が抗ストレスに働くことを示している。運動が疼痛を緩和させるメカニズムとして、脊髄後角でのミクログリアでのH3K9のアセチル化のようなエピジェネティクス修飾が関与することを示した。さらに光遺伝学的手法により、病的な状態において脳報酬系の活動状況が疼痛閾値に影響を与えることを明らかにした。陽性情動(笑い、喜び)や遊びが疼痛を緩和し、免疫系や脳機能にもよい影響を与えることが報告されているが、そのメカニズムについては不明である。本研究では、その基盤にあるエピジェネティクス修飾による遺伝子発現制御機構を解明することにより、疼痛制御・治療に応用することを目指す。平成24年度は、ラットで快情動を示す50kHzの超音波発声(USV)を惹起することができるTickling刺激により、脳報酬系の要である側坐核においてドーパミン(DA)が放出され、DA受容体アンタゴニストの投与で、50kHzのUSVの発生が抑制されることを明らかにした。さらに一日10分間のTickling刺激を4週間続けたラットと、触刺激で置き換えた対照群のラットとの間で、マイクロアレイにより前頭葉・側坐核・海馬・扁桃体における遺伝子発現の変化について検討した。結果については解析中。また、マウスにおける遊びのモデルとされるRough-and-tumble playについて、小動物用超音波測定解析システム(Avisoft, SAS Lab)を用いて、隔離飼育の必要性、時期(週齢)、回数などの検討を行っている。モデル動物として確立した時点で、microRNAの網羅的解析を行う予定である。陰性情動のモデルとして神経障害性疼痛モデルを作製し、脊髄後角や脳報酬系におけるエピジェネティクス修飾についても検討を行っており、陽性情動との違いを明らかにする。村上・堀らは離乳直後(21日齢)より隔離飼育されたラットに対して、adolescent期の4週間にわたり継続的(5日間/週)にTickling刺激を施し、脳組織(扁桃体・側坐核・海馬・前頭前野)からcDNAおよびmiRNAを抽出し、Tickling刺激群、隔離飼育群、集団飼育群(3匹/ケージ)に対して遺伝子発現解析・miRNA発現解析を用いて比較解析を行った。その結果、Tickling刺激群、集団飼育群は個別飼育群に比べて、脳報酬系に関わる遺伝子群の中で共通に発現変動する遺伝子が存在した。このことは、隔離飼育による変化をTickling刺激(陽性情動)が補ったことを示唆する。また、隔離飼育による不安・恐怖反応を、Tickling刺激が緩和することは行動実験によっても明らかにしている(Hori M.et al., Physiol Behav. 2014 Apr 13)。近年、側坐核領域を中心とした脳報酬系の神経活動の変化が快楽(pleasure)と苦痛(pain)に深い関わりがあり、pleasureとpainは裏表の関係にあることが明らかとなってきた。そこで成田・仙波らは、腹側被蓋野から側坐核へ投射している中脳辺縁ドパミン神経に着目し、その活動を制御した際の疼痛閾値について検討を行った。まず、ドパミン神経特異的に光活性化イオンチャネルChR2やeNpHRを発現するトランスジェニックマウス、ならびにドパミン神経特異的にCre組み換え酵素を発現するTH-CreマウスとChR2を組み込んだAAVベクターを用い、光遺伝学的手法により中脳辺縁ドパミン神経の活動を制御できる系を確立した。これらのマウスを用いて中脳辺縁ドパミン神経の活動を制御した際の疼痛閾値を検討した。また超音波発声やRough-and-tumble playに与える影響について今後検討を進める。村上・堀らは仔ラットを離乳後から集団飼育群、隔離飼育群、Tickling刺激群(快情動喚起/隔離飼育)に分け、脳組織(扁桃体・側坐核・海馬・前頭前野)において発現変動する遺伝子を網羅的に解析した。その結果、扁桃体で多くの遺伝子やmiRNAが変動し、社会隔離ストレスと快情動喚起では、異なったPathwayが抽出された。また、アドレナリンα受容体遺伝子やmiR-375-3pなどは個別飼育により発現が変化するが、Tickling刺激によって適正化された。これまでの研究から幼若期の快情動を喚起する経験が、ストレス耐性の獲得や恐怖記憶の消去に重要な役割を果たすことを見出したが、その脳基盤として扁桃体の微少環境の変容があることが示唆された。仙波らは、身体運動により神経障害性疼痛(NPP)が緩和されるメカニズムについて検討した。

坐骨神経部分損傷(PSL)により作製したNPPモデルマウスに、術後2日目から5日間、トレッドミルによる走運動を行わせた。機械的アロディニアと熱痛覚過敏は、走運動により有意に緩和された。また走運動はPSLマウスに生じる脊髄後角でのGAD 65/67とGABAの減少を抑制し、ミクログリアにおけるヒストンH3K9のアセチル化を高めた。これらの結果から、脊髄後角でのGABA産生の維持とミクログリアにおけるepigeneticな転写活性化が、走運動によるNPPの緩和に重要な役割と担うと思われる。睡眠障害と不安は、慢性痛患者のQOLを著明に低下させる。成田らは、PSLマウスにおいて睡眠障害を起こすメカニズムを、optogeneticな手法を用いて検討したところ、前帯状回におけるastrocyteの活性化および青斑核のNAニューロンが関与することがわかった。さらにPSLマウスの扁桃体における遺伝子発現を網羅的に解析し、疼痛により惹起される不安に関連する蛋白を同定した。26年度が最終年度であるため、記入しない。神経解剖学、神経科学、疼痛学26年度が最終年度であるため、記入しない。比較的若いラットでは50kHzの超音波発声(USV)(快情動の指標)を惹起することができる。堀らは、Tickling刺激により脳報酬系の要である側坐核においてドーパミンΦA)が放出され、DA受容体アンタゴニストの投与で、50kHzのUSVの発生が抑制されることを明らかにした。仙波らは、今年度購入した小動物用超音波測定解析システム(Avisoft,SAS Lab)を用いて、マウスの様々な行動とUSVとの関係について検討を進めている。USVの解析方法についても確立した。成田らは、疾痛(陰性情動)による脳内エピジェネティクス解析を進め、精力的に論文を発表している(Imai et al., J Neurosci. 31:15294-15299, 2011,Imai et al., Brain. 136:828-843,2013)。今後さらに3グループの協力関係を進め、陽性情動による脳でのエピジェネティクス修飾を明らかにして行きたい。村上・堀らはマイクロアレイによる遺伝子発現の網羅的解析を行い、報酬系に関わる脳部位(扁桃体・側坐核・海馬・前頭前野)から快情動に特異的な遺伝子群を抽出し、その遺伝子群の機能をPathway解析Gene Ontology解析によって推察した。成田らは、疼痛(陰性情動)による側坐核でのエピジェネティクス解析を進め(Imai et al., J Neurosci. 31:15294-15299, 2011, Imai et al., Brain. 136:828-843, 2013)、今年度は、脳報酬系の制御が陽性情動・陰性情動に与える影響について検討するため、光遺伝学的手法により中脳辺縁ドパミン神経の活動を制御できる系を確立した。仙波らは、神経障害性疼痛が軽度から中等度の運動負荷により緩和されることを明らかにし、そのメカニズムの一つとして脊髄後角のミクログリアにおけるエピジェネティックな変化が関与することを明らかにした。さらに下行性疼痛調節系や報酬系における変化についても検討を進めている。
前立腺特異抗体および放射性金属を用いた前立腺腫瘍シンチグラフィの基礎的検討

前立腺腫瘍シンチグラフィの臨床化の目的に基礎的検討を行っている。平成3年度研究実績報告書に記載した通り,全身オートラジオグラフィ用クライオスタットOT-SEA(平成3年度設備備品)の納品が大幅に遅れ本機器が使用可能となったのは平成4年2月であった。従って,平成4年度研究計画調書に記載した通り,平成5年度も引き続き本研究を遂行する。研究成果報告書は平成6年度に提出する予定である。ヒト前立腺腫瘍の動物モデルに関しては,ヒト前立腺癌細胞株LNCaPを継代・培養の後,雄ヌードマウスに移植,担LNCaP腫瘍ヌードマウスを樹立し、現在継代中である。本LNCaP腫瘍は組織学的に低分化型腺癌に相当するが、ヒト前立腺に特異的な糖蛋白であるガンマ-セミノプロテイン(γ-Sm),前立腺性酸フォスファターゼ(PAP),そして,前立腺特異抗原を産生する。このことは免疫組織化学的手法により確認したが,さらに腫瘍ホモジネートを検体として測定すると,γ-Smで平均260.8ng/ml(N=7),PAPで平均146.9ng/ml(N=7)と極めて高値を示した。抗PAPモノクローナル抗体(マウスIgG)にNa^<125>を加え,LPO法によりヨード化,ゲルフィルトレーション(G-75)の後,比活性49KBq/μgの標識化合物を得,実験に供した。0.2μmミリポアにより徐菌の後,1043KBq/30μgを担LNCaP腫瘍ヌードマウスの尾静脈より投与,投与後2,3,4,6、そして,7日目に全身オートラジオグラフィ(ARG)およびオートウェルガンマカウンタによる計測を行った。全身ARGの上では,投与後2,3,4日までは肝.腎など背景に活性が高いが,6,7日では背景の活性は低下するが腫瘍部の活性は持続するため,明瞭に観察された。臓器内放射能濃度(F値)は,3日で血液13.1,腫瘍33.6,肝5.8,腎9.3,6日で血液5.2,腫瘍7.7,肝4.0,腎3.8などであった。放能性金属に関しては現在検討中である。前立腺腫瘍シンチグラフィの臨床応用を目的とした基礎的検討を行っている。本法の確立にはヒト前立腺腫瘍に極めて強い親和性あるいは特異性を示す放射性薬剤の検索が必須である。本研究の遂行にあたっては,ヒト前立腺腫瘍の特徴をそなえた動物モデルの樹立,そして,放射性薬剤の体内動態を定性的,定量的に評価するべく手法が必要である。体内動態の評価に際しては,全身オ-トラジオグラフィを中心に検討してゆくが,先に提出した平成4年度研究計画調書(継続),当初計画との変更点の項目に記載した如く,平成3年5月に英国ブライト社に発注した,全身オ-トラジオグラフィ用クライオスタットOTーSEA型の製品化,輸送,通関などに時間がかかり,結局,該当研究施設に納品されたのは平成3年12月末であった。従って全身オ-トラジオグラフィに関しては,平成3年度下半期分の研究を遂行しているのが現状である。

ヒト前立腺腫瘍の動物モデルの樹立に関しては,ヒト前立腺癌細胞株LNCapを継代・培養の後,ヌ-ドマウス(balb/nuーnu,SLC,オス)への移植を試みてきたが,移植に成功し,現在,担LNCap腫瘍ヌ-ドマウスを継代中である。本LNCap腫瘍は病理組織学的に低分化型前立腺癌に相当するが,免疫組織化学的検討では,本腫瘍細胞内にヒト前立腺に極めて特異的なガンマ-セミノプロティンあるいは前立腺特異抗原の局在を確認している。すなわち,本LNCap腫瘍は,ヌ-ドマウス皮下に移植・継代された後も,ヒト前立腺癌としての性格を失っておらず,本研究の遂行にあたっては極めて理想的な実験モデルと考えられる。さらに,本LNCap腫瘍の特性を検索する目的で,ヌ-ドマウス仙骨部皮下に移植し一定の径に達した時点で6MeV電子線を20005000cGyの範囲で照射,照射後,一定期間の後摘出,免疫組織化学的検討を行った。腫瘍細胞内の前立腺特異抗原等の局在は照射線量に反比例して減少した。前立腺腫瘍シンチグラフィの臨床化を目的に基礎的検討を行っている。平成3年度研究実績報告書に記載した通り,全身オートラジオグラフィ用クライオスタットOT-SEA(平成3年度設備備品)の納品が大幅に遅れ,本機器が使用可能となったのは平成4年2月であった。従って,平成4年度研究計画調書に記載した通り,平成5年度も引き続き本研究を遂行する。研究成果報告書は平成6年度に提出する予定である。ヒト前立腺腫瘍の動物モデルに関しては,ヒト前立腺癌細胞株LNCaPを継代・培養の後,雄ヌードマウスに移植,担LNCaP腫瘍ヌードマウスを樹立し,現在継代中である。本LNCaP腫瘍は組織学的に低分化型腺癌に相当するが,ヒト前立腺に特異的な糖蛋白であるガンマーセミノプロティン(γ-Sm),前立腺性酸フオスファターゼ(PAP),そして,前立腺特異抗原を産生する。このことは免疫組織化学的手法により確認したが,さらに腫瘍ホモジネートを検体として測定すると,γ-Smで平均260.8ng/ml(N=7),PAPで平均146.9ng/ml(N=7)と極めて高値を示した。抗PAPモノクローナル抗体(マウスIgG_1)にNa^<125>Iを加え,LPO法によりヨード化,ゲルフィルトレーション(G-75)の後,比活性49KBq/μgの標識化合物を得,実験に供した。0.2μmミリポアにより除菌の後,1043KBq/30μgを担LNCaP腫腫ヌードマウスの尾静脈より投与,投与後2,3,4,6,そして,7日目に全身オートラジオグラフィ(ARG)およびオートウェルガンマカウンタによる計測を行った。全身ARGの上では,投与後2,3,4,日までは肝,腎など背景の活性が高いが,6,7日では背景の活性は低下するが腫瘍部の活性は持続するため,明瞭に観察された。臓器内放射能濃度(F値)は,3日で血液131,腫瘍33.6,肝5.8,腎9.3,6日で血液5.2,腫瘍7.7,肝4.0,腎38などであった。放射性金属に関しては現在検討中である。
超高圧合成による光・電気・分子機能性有機材料の開発

1.β-ケトエステル類のMichael付加反応: β-ケトエステル類とMVKあるいはアクリル酸エステルとのMichael付加反応、あるいは活性化シクロプロパン類とのHomo-Michael付加反応に対するYb(OTf)_3触媒/高圧反応系あるいはシリカゲル吸着条件の開発。さらには、TfOH触媒下無溶媒条件によるMichael付加反応の開発。2.含窒素複素環系不斉触媒の開発: L-乳酸を光学活性源とするキラルオリゴピリジン類の合成、D-カンファーを光学活性源とするC_2-対称性キラルピリジン類の合成。さらに、4-クロロピリジン類と光学活性第二級アミンとの高圧縮合反応に基づくキラルDMAP関連誘導体の合成。3.アミジン類とo-フルオロベンズアルデヒドとの縮合反応によるキナゾリン誘導体の合成:アミジン類とo-フルオロベンズアルデヒド誘導体との高圧縮合反応を基軸とするキナゾリン関連液晶材料の新規合成法の開発。4.シリカゲル吸着反応の新展開:シリカゲル吸着無溶媒条件を用いるエポキシドとLiXとの反応によるハロヒドリン誘導体の簡便かつ一般的合成法の確立、シリカゲル吸着Yb(OTf)_3触媒を用いるN-Bocカルボキシアミド類の高効率的脱Boc化反応の開発。5.天然物合成への応用:高圧反応の知見に基づく抗潰瘍性天然物AI-77-Bの全合成の完成。6.シリカゲルと生体高分子との高圧縮合による有機-無機複合材料の開発:ショ糖脂肪酸エステルを吸着活性面とするシリカゲルのリパーゼ固定化、本複合材料のHPLC用カラム充填剤としての機能評価。7.その他:アジド化合物の新規還元的Boc化反応、Sc(OTf)_3あるいはTfOHを新規触媒系とするBaeyer-Villiger反応、フランあるいはチオフェン誘導体を基質とするLiClO_4触媒エポキシ開環反応の開発。本年度得られた成果の概要は以下の通りである。1.アジド化合物の新規還元的Boc化反応の開発:我々が以前報告しているN-Bocラクタムの高圧縮合反応(Tetrahedron Lett.,1992,33,4945)に関連して、アジド化合物の新規還元的Boc化反応の開発に成功した。本反応は、程々のアミノ酸誘導体との縮合によるペプチド化合物を簡便に合成するための基本反応となりうる。2.β-ケトエステル類の高圧条件下でのMichael付加反応:β-ケトエステル類とメチルビニルケトンあるいはアクリル酸エステル等とのMichael付加反応について、Yb(OTf)3触媒を用いる系を検討した。その結果、高圧条件あるいはシリカゲル吸着条件のいずれかの条件を使い分けることによる反応の促進効果を明らかにした。3.エポキシ化合物と種々の複素環化合物との縮合反応:我々は以前、インドールやピラゾールのような含窒素複素環化合物との縮合反応が高圧条件下有効に進むことを報告している。この延長として、フランあるいはチオフェン誘導体についても検討し、この場合LiClO4のようなルイス酸が有効にはたらくことを見つけた。本反応の、ポルフィリン関連物質合成への応用については現在検討中である。4,アミジン類の縮合反応を基軸とするキナゾリン化合物の新規合成:アミジン類とo-フルオロベンズアルデヒド誘導体との高圧縮合反応を基軸とする、キナゾリン関連液晶材料の合成を検討した。その結果、高圧下では複雑な混合物を与えるだけであったが、常圧下モレキュラーシ-ブズを共存させることによって高収率で目的化合物を得ることに成功した。本反応は、種々の有機機能性材料の合成に有用性が高いものと考えている。

5.無機材料の高圧縮合テンプレート化:無機材料に吸着させた血清アルブミンに有機低分子化合物を混在させ、高圧条件下で反応を行うことによって、アルブミン分子への低分子テンプレート化に成功した。反応物をステンレス管に充填し、水/メタノールを移動相としてカラム評価を行った結果、テンプレート形成反応に用いた分子を選択的に保持し、その効果をクロマトグラフ的に実証した。本年度得られた成果の概要は以下の通りである。1. N-Bocカルボキシアミド化合物の新規脱Boc化反応の開発:我々が以前報告している、N-Bocラクタムの高圧縮合反応(Tetrahedron Lett.,1992,33,4945)に関連して、シリカゲル吸着Yb(OYf)3触媒を用いる無溶媒下でのN-Bocカルボキシアミド化合物の新規脱Boc化反応の開発に成功した。本反応は、極めて高い官能基選択的を有し、合成化学的にも優れている。2. β-ケトエステル類の無溶媒条件下でのMichael付加反応:我々が以前報告したβ-ケトエステル類と種々のMichaelアクセプターとのYb(OTf)3触媒存在下でのMichael付加反応(Tetrahedron Lett.,1997,38,7583)に関連して、TfOH触媒を用いる新規な反応系を開発した。すなわち、アクリル酸エステルをアクセプターとして用いる場合、無溶媒条件を用いるのが極めて有効である。3. β-ケトエステル類の高圧条件下でのHomo-Michael付加反応: (2)の研究に関連して、活性化シクロプロパン類とβ-ケトエステル類とのHomo-Michael付加反応が、Yb(OTf)3触媒存在下、高圧反応条件を用いて行うときれいに進むことを見つけた。この場合、特にシクロプロパンジカルボン酸ジエステルをアクセプターとすることが有効である。4.エポキシ化合物と種々の複素環化合物との縮合反応:我々は以前、インドールやピラゾールのような含窒素複素環化合物との縮合反応が高圧条件下有効に進むことを報告している。この延長として、フランあるいはチオフェン誘導体についても検討し、この場合LiClO4のようなルイス酸が有効にはたらくことを見つけた。5.天然物合成への応用:我々は以前、N-Bocラクタム類の高圧縮合反応(Tetrahedron Lett.,1992,33,4945)を基軸とする抗潰瘍性天然物AI-77-Bの合成研究を報告している。今回、その最終段階を高圧反応を用いて行うと、目的とする反応は全く進まず、アミノイソクマリン化合物の異性化のみが優先することを見つけた。この知見は、AI-77-B全合成における重要な指針となった。1.β-ケトエステル類の無溶媒条件下でのMichael付加反応:我々が以前報告したβ-ケトエステル類のYb(OTf)3触媒存在下でのMichael付加反応に関連して、TfOH触媒を用いる無溶媒反応条件の開発に成功し、アクリル酸エステルをアクセプターとした場合特に有効であることを実証した。2.β-ケトエステル類の高圧条件下でのHomo-共役付加反応: (1)の研究に関連して、活性化シクロプロパン類とβ-ケトエステル類とのHomo-共役付加反応が、Yb(OTf)3触媒存在下
コンピュータの仕組みから理数系基礎科目への導入を目指した実践的メディア教育の試み

理科系基礎科目においては、「その学問が、いかに大切なのか、なんに役立つのか」ということが学生にとってわかり辛い点が問題の1つとして挙げられる。そこで、本研究では、学生が比較的興味を持つ「コンピュータの仕組み」を例に挙げ、コンピュータを構成する各部において、その原理を数学、物理等の理科系基礎科目の範疇で解説を行うことで理科系基礎科目の一部分の習得を狙うと同時に、いかに基礎科目の習得が重要であるかを認識させることを目指したオンライン教材の作成および評価を目的とした。コンテンツとしては、主としてWebCT及びMoodle等の学習管理システム(LMS)上に構成し、HTMLによるオンラインテキスト、達成度確認用自動採点テスト、可視化およびシミュレーションのためのJavaアプレット、Java3Dによる仮想実験、Javaによる遠隔実験等の開発を行ってきた。コンテンツの可搬性向上のため、IMS準拠、Locale対応の国際化可能な構成とした。Javaによる遠隔実験は、各種センサの測定をTelnetからWebブラウザ上のJavaアプレットまで行えるものを研究開発した。また、各種サーバを分散活用することに起因するユーザ認証の問題を解決するため、統合認証システムCASをサポートすることでシングルサインオンを実現し、サーバ間をシームレスに接続する手法や、Javaアプレットに関しては、CASをサポートしたWebアプリケーションとの連携による個人毎のパラメータの保存等についても、研究開発を行った。運用面では、学内LMSによる運用だけでなく、「くまもとインターネット市民塾」上でも公開可能とした。これらの研究成果は、国内外の学会で発表するとともに、学術雑誌でも論文として広く公開した。情報科学に関する講義は、ほとんどの学生がある程度の意欲を持って取り組むが、数学、物理等の理科系基礎科目の講義においては、なかなか意欲を持って取り組める学生の割合が少ないように感じる。その理由の一つとして、理科系基礎科目においては、「その学問がいかに大切なのか、なんに役立つのか」ということが学生にとってわかり辛い点が考えられる。そこで、本研究では、学生が比較的興味を持つ「コンピュータの仕組み」を例に挙げ、コンピュータを構成する各部において、その原理を数学、物理等の理科系基礎科目の範疇で解説を行うことで理科系基礎科目の一部分の習得を狙うと同時に、いかに基礎科目の習得が重要であるかを認識させることを目指したオンライン教材の作成および評価を目的とする。本年度はコンテンツの充実に重点を置き、コンピュータを構成する各部の原理を数学、物理等の理科系基礎科目の範疇で解説したHTMLおよびCourse Management System (CMS)上のコンテンツ、CMSを利用した達成度確認用小テスト、可視化およびシミュレーションのためのJavaアプレット、Java3Dによる仮想実験、Javaによる遠隔実験の開発を行ってきた。コンテンツの可搬性を向上させるため、コンテンツおよびテストはIMSに従い、プログラミングを伴うものは出来る限り環境に依存せず国際化可能な構成とした。Javaによる遠隔実験は、各種センサの測定をTelnetからwebブラウザ上のJavaアプレットまで行えるものを製作した。本年度より熊本大学において、学務情報システムSOSEKIと連携し、全学生、全教官、全科目が登録されたラーニングマネージメントシステムWebCT上でコンテンツの整備、学内試験公開を行った。また、最近急成長を遂げているオープンソースのラーニングマネージメントシステムであるMoodleへのポーティングも平行して行ってきた。

Moodleは、地域貢献特別支援事業の熊本大学LINK事業における一般市民への講座である「e-Learning Station」の本配信に他、熊本大学情報基盤センターとしても協力している「くまもとインターネット市民塾」でも採用しており、このカスタマイズにも協力している。本年度は、センサ、デジタル、アナログ電子回路、インターフェースに関しての解説と問題開発に重点を置いたが、インターネットの仕組みに関してのJavaScriptによるインタラクティブな解説等を取り入れる等の工夫を行った。Java3Dによる3次元表示、遠隔実験に関してはまだまだ改善の余地があり、来年度継続して行いたい。また、受講者の反応に関しては取得できていないコンテンツもあり、公開、反応取得方法を改善して行きたい。研究分担者の役割は、中野が全体のとりまとめ、物理学関係のコンテンツ作成とJava3Dによる仮想実験を、喜多が数学的解説、サーバサイドの3次元表示、教育用メールシステム関係、秋山が電磁気学関係のコンテンツ作成とビデオストリーミングを主に担当し、Javaによる可視化、シミュレーション、遠隔実験等については協力して開発を進める。なお、本研究に関連して、ICETA2004国際会議(スロバキア,2004年9月)での招待講演を行った。数学、物理等の理科系基礎科目の講義においては、なかなか意欲を持って取り組める学生の割合が少ないように感じる。その理由の一つとして、理科系基礎科目においては、「その学問が、いかに大切なのか、なんに役立つのか」ということが学生にとってわかり辛い点が考えられる。そこで、本研究では、学生が比較的興味を持つ「コンピュータの仕組み」を例に挙げ、コンピュータを構成する各部において、その原理を数学、物理等の理科系基礎科目の範疇で解説を行うことで理科系基礎科目の一部分の習得を狙うと同時に、いかに基礎科目の習得が重要であるかを認識させることを目指したオンライン教材の作成および評価を目的とする。世界的に利用され、熊本大学としても採用しているLearning Management System(LMS)であるWebCT上でコンテンツの開発・整備を行うとともに、オープンソースのLMSのMoodle上へもポーティングを行い、熊本大学情報基盤センターとして協力関係にありMoodleで運営される「くまもとインターネット市民塾」上でも公開可能とし、市民塾の体制整備と共に公開予定である。また、Javaによるシミュレーションや仮想実験を目的としたインタラクティブなコンテンツ開発を行うとともに、開発支援を行うオンラインJavaApplet開発支援ツールをMoodleのモジュールとして作成し、WebブラウザのみでJavaAppletの作成からMoodle上の教材としての登録までを可能にした。
共振感覚に着目した身体的コミュニケーションの遠隔支援メディアに関する研究

身体表現の共創におけるつながりの感覚(共振感覚)の発現を遠隔地間で実現すること目指した。そのために、他者と手と手を触れ合わせて即興に創る手合わせ表現に着目し、これを遠隔で行うシステムの設計・開発を行った。具体的には、手のひらの動作に加え、それに先立つ身体の潜在的な動作の情報を双方に伝達する手法を考案し、システムの開発を行なった。さらに小型の力触覚デバイスによって遠隔地間で手合わせ表現を実現するためのハードウエアの開発も合わせて行なった。本研究では,手のひら同士を合わせて即興的におこなう身体表現(手合わせ表現)を題材に,双方の身体間でやりとりされる力覚情報と他の感覚チャンネルの情報をどの様に組み合わせて伝達すれば共振感覚の発現を遠隔で支援できるかを検討する.本年度は研究計画に従い,以下の研究を遂行した.1.手合わせ表現の力のやりとりを物理的に隔てた場所において伝達する,力覚的情報の提示システムの設計・開発を行った.具体的には,双方の披験者が向かい合って座った状態で行なう手合わせ表現を遠隔地間で実現することを構想し,前後にスライドする機構を駆動することで,手に力覚を呈示するデバイスを2台作成した.2.先の研究において,熟練者を対象にした実験の結果,イメージを創りながら手のひらで表現を行ってもらった場合においては,手の動きに対して身体全体の無意識的な動きが先行する傾向があることが分かっており,さらに,被験者らが共振感覚に近い感覚が発現したと報告した試行においては,双方の被験者の身体の動きが共に先行する時間帯が多く見られた.このことは表現を創り合う身体においては,顕在的なプロセスと潜在的なプロセス存在し,これらが双方で共時的に表出する二重的なインタラクションによって,共振表現が可能になることを示唆している.そこで,本年度は潜在的なプロセスが表出すると考えられる身体全体の動作情報に着目し,遠隔地間における表現の共創支援手法を検討した.具体的には,重心移動を音に変換し,他者に伝達するシステムを開発した.複数人が即興的に身体表現を行ない,他者との関係が深まる際には,自身と他者の身体の境界が開かれ,あたかも一体となる感覚が各人の内面に生じることがある(共振感覚).申請研究では手と手を触れ合わせながら行なう手合わせ表現を題材に,共振感覚の発現を遠隔地間で支援する技術の設計手法の指針を得ることを目的とした.以上を踏まえ,本年度は以下の研究を遂行した.(1)これまでの研究を通じて,表現を共に創りあい,共振感覚が発現するような深いつながりが生じた場合には,合わせた手のひらに先立って双方の身体が共に先行する頻度が高まることを計測にて捉えた.一方で,この実験では手の動きを1自由度に制限した状態で計測を行なっていた.そこで,上記の一般性について確かめるため,身体を拘束せずに,手の動きと上半身の動きを捉える3自由度の計測システムを開発した.計測の結果,表現を共に創りあうことが出来たと報告された試行においては,双方の上半身の動作の相関が高くなることが分かった.また,上半身の動作が先行する様子なども確認された.(2)上述の結果は,手の動き先立つ身体の無意識的な働きが共有されることで,表現を同時的に創出することを実現していることを示唆している.そこで,遠隔で手合わせ表現を支援するために,手の動きに加えて,手の動きに先立って生じる身体の無意識的な動作情報を,双方に伝達する手法を考案した.具体的には,手のひらにおいて生じる力や位置を共有する力・位置の対称型のバイラテラル制御を実装した力触覚デバイスを開発し,さらに身体の先行的動作の情報を風船型装置で手に触覚呈示する装置を開発した.身体表現の熱諌者が被験者となった実験の結果,本手法により,双方が間合いを取りやすくなる可能性が示唆された,以上に加え,小型の力触覚テバイスによって遠隔地間で手合わせ表環を実現するためのハードウエアの開発にも取り組んだ.
減数分裂関連遺伝子分裂酵母dhp2^+及びマウスホモログの機能およびその制御の研究

出芽酵母のSEP1遺伝子産物は、減数分裂の進行に必須である。本研究では、分裂酵母(dhp2^+)とマウス(Dhm2)のSEP1ホモログを用いて、これらが減数分裂過程にどのように関与するかを調べることを目的としている。まず、分裂酵母のdhp2^+の転写パターンを調べた結果、dhp2^+の発現が、減数分裂期に特異的な転写量の増大とスプライシングによって制御されていることが明らかになった。一方、マウスDhm2cDNAをプローブとしたノザン分析により、マウスの各臓器におけるDhm2の転写パターンを調べたところ、精巣においてのみ、ORFの長さから予想されるシグナルがみられ、その他の臓器では、ORFの大きさよりもかなり大きい位置にシグナルがみられた。後者のシグナルは、Dhm2の転写産物のうち、一部のイントロンがスプライシングされずに残っているものであると考えられた。つまり、マウスDhm2の発現は、分裂酵母dnp2^+と同様に減数分裂期特異的なスプライシングによって制御されていることが示唆された。さらに、Dhm2に関するノックアウトマウスを作製する前段階として、Dhm2構造遺伝子の単離を行い、得られた染色体DNA断片を解析した。cDNAで約5kbからなるDhm2のコード領域は、染色体上では少なくとも60kbにわたっていることがわかった。Dhm2構造遺伝子断片を用いて染色体マッピングを行った。また、ヒトのSEP1ホモログのcDNAのクローニングと塩基配列決定を行い、それがDhm2に類似していることを示した。
日仏の消費者保護法制と契約法理論の変容の研究

伝統的な民法学では、契約を、複数の当事者による意思の合致であると考えてきた。そして、契約が当事者を拘束するのは、契約が自らの自由意思に基づくものであると説明し、私的自治の原則を強調してきた。このような契約に対する理解は、今日においても適切である。しかし、近年は、当事者の一方に情報提供義務が認められ、合意ではなく、信義則によって義務が認められてきている。ところで、この情報提供義務は、事業者と消費者との情報量及び情報の収集能力の格差があり、私的自治を回復するために認められるものである。そして、フランス私法では、近年、伝統的な商人と非商人との区別に代えて、このような事業者と消費者という区別が重要な枠組みとなってきている。例えば、担保の領域では、保証契約について、事業者によってなされた場合とそうではない個人によってなされた場合とで、その法制を異にしていた。そして、契約法の領域では、瑕疵担保責任と債務不履行責任に関しては大きな動きが見られる。すなわち、1999年5月25日の売主の担保責任に関するEC指令は、フランスでは、2005年2月17日のオルドナンスによって、ようやくその消費法典(L.211-1条以下)への転換が実現した。この規定によれば、消費者である買主は、事業者である売主に対して、引き渡された物の不適合を理由に担保責任を追及することができる。ところで、民法典では、引渡債務の不履行に基づく解除訴権(1184条)・損害賠償訴権(1147条)および瑕疵担保責任に基づく訴権(1641条以下)の2つを有している。そこで、買主である消費者は、この3つの訴権を用いることができるため、消費者にとっては手厚い保護となっている。このように、消費者の保護は、私法全体の枠組みを変更させる契機を含んでいるといえよう。本研究の目的は、契約当事者の「合意」を中心に組み立てられてきた伝統的な契約法理論が、現代においてどのように変容し、今後どのような方向に向かって展開してゆくかを、消費者法制を1つの手がかりとして、明らかにすることを試みるものである。その初年度にあたる平成15年度は、具体的な問題として、「情報提供義務」ないし「説明義務」を取り上げた。この義務は、フランスの理論をもとにわが消費者契約法に規定されたものではあるが、当事者の合意に基づくものではなく、むしろ信義則に基礎づけられるものである。そして、その適用領域は様々であるが、大きく分けると、一回的な不動産売買と継続的なフランチャイズ契約とでは、その機能が異なることが明らかである。すなわち、一回的な不動産売買では、情報提供義務違反の効果として、単なる損害賠償ではなく、契約そのものの覆滅が重要であり、そのための法律構成としては、詐欺・錯誤等の意思表示の瑕疵、あるいは、契約締結上の過失などの解除が援用されることになる。したがって、これらの形成権と情報提供義務との関係が問題となろう。これに対して、継続的契約においては、信義則の領域が大きく、より情報提供義務が当事者に課されることとなる。ただし、フランチャイズ契約などでは、事業者同士の契約という側面もあり、自己責任の原則が強く働くため、損害賠償の額は、かりに認められるとしても大きく減額される傾向にある。このように、情報提供義務は、契約類型や当事者の属性によっても、その要件や効果が異なるものである。なお、情報提供義務と関連して、私立大学の学納金不返還特約も、かつては特約ということで有効とされていたが、近時はその合理性につき、大学側に説明責任が課されるとともに、消費者契約法の施行によって、特約の有効性に対する考え方も大きく変化した領域であると解される。

本研究の目的は、契約当事者の「合意」を中心に組み立てられてきた伝統的な契約法理論が、現代においてどのように変容し、今後どのような方向に向かって展開してゆくかを、諸費者法制を手がかりとして、明らかにすることを試みるものである。そして今年度は、主として担保契約につき、フランスおよびEU法の消費者保護法制の影響によって、その基本的な考え方が変容していることを、フランスでの調査も含めて検討した。より具体的には、伝統的な私法契約における商人と非商人の区別が失われつつあり、それに代わって、事業者と消費者(非事業者)の区別が担保契約においても重要になってきていることを指摘することができる。たとえば、担保権の選択についても、所有権担保や請求払補償契約のような国際商事取引では、事業者間にのみ利用され、一般の消費者はそれを利用することはできない。また、フランスにおける保証契約では、会社の経営者のような事業者によってなされる保証と、非事業者によってなされる保証とでは、適用される法制度が異なっている。とりわけ、保証人が非事業者である場合には、判例によれば、金融機関が助言義務(情報提供義務の一種)を負うとされている。ただし、2003年8月1日の法改正によって、事業者であると非事業であると問わず、保証人に手書き(mention manuscrite)が要求され、それがないと保証契約が無効とされることとなり、この点での両者の区別は明確ではなくなったといえよう。しかし、消費者保護法制が契約に与える影響は明らかであり、今後はより一般的な契約にも検討の幅を広げることとしたい。フランス私法では、近年、伝統的な商人と非商人との区別に代えて、事業者と消費者という区別が重要な枠組みとなってきている。例えば、人的担保の領域では、保証契約について、事業者によってなされた場合とそうではない個人によってなされた場合とで、その法制を異にしていた。また、物的担保についても、所有権担保は主として事業者間において利用されている。そして、契約法の領域では、瑕疵担保責任と債務不履行に関して大きな動きが見られる。すなわち、1999年5月25日にヨーロッパ議会において採択された、消費財の売買と担保責任の一定の側面についてのEC指令第44号は、2002年1月1日までに加盟国の国内法に転換されなければならないとされていた(11条1項)。しかし、フランスでは、2005年2月17日のオルドナンスによって、ようやくその消費法典(L.211-1条以下)への転換が実現した。この規定によれば、消費者である買主は、事業者である売主に対して、引き渡された物の不適合を理由に担保責任を追及することができる。ところで、民法典では、引渡債務の不履行に基づく解除訴権(1184条)・損害賠償訴権(1147条)および瑕疵担保責任に基づく訴権(1641条以下)の2つを有している。そこで、消費者保護の観点からは、この3つの訴権を消費者が用いることができるため、手厚い保護であると考えられる。しかし、民法の制度は、やや複雑なものとなった。とりわけ、その効果としての、(1)瑕疵修補、(2)代物請求、(3)解除、および、(4)代金減額請求における優先関係を認めるかどうかが今後の課題となろう。
ゲノム反復配列の核内テーミング

28年度までに、クロマチンの「弛緩の程度」をゲノム全体に渡ってプロファイルできるATAC-seq法を用いて、ゴノサイトでのクロマチン構造変化を明らかにした。その結果、産まれる数日前(E17.5)というタイミングで一過的にオープンなクロマチン構造を取る染色体領域を発見し、それらをDAD(Differentially Accessible Domain)と名付けた。DADはマウスゲノムに広く存在し、数Mbから十数Mbと広い領域に渡って形成される。また、DADは遺伝子砂漠に形成されていた。次に、DADの時系列的な振る舞いを明らかにするためにプロファイルするタイムポイントを増やした。その結果、E17.5で一旦形成されたDADはその後消失し、DADはゴノサイトで一過的に形成されることが明らかになった。29年度の解析から以下のことを明らかにした。DADに形成されるピークのおよそ80%はゲノム上の反復配列であるトランスポゾン上に存在する。ゴノサイトを用いたChIP-seqの解析からH3K27me3やH3K9me3といった抑制性のヒストンマークはE13.5ではDAD内のATAC-seqピーク上に濃縮しており、それらはE17.5にかけて減少する。一方、活性性のヒストンマークであるH3K4me3はそれらと相補的な局在を示す。これらのことから、ゴノサイトにおいてトランスポゾンの多くはヒストンによってその発現が制御されていることを明らかにした。上記の解析に加えて、DADとde novoDNA methylationとの関係性に着目した。ゴノサイトでのde novo DNAmethylationは2回起きるが、DADは二度目のmethylationによってメチル化を受けることがわかった。つまり、ヘテロクロマチン化されているDADはまずオープンなクロマチン状態になった後に、DNAメチル化される。29年度が最終年度であるため、記入しない。今年度は、トランスポゾンなどに代表されるようなゲノム上の反復配列の生物学的意義を統合的に解析する手法を開発してきた。具体的には、TALENやCRISPR/Cas9などのゲノム編集技術を応用して特定のゲノム領域のみを特異的に細胞から回収することを目指している。系の確立のために、リピート配列によって構成されるゲノム構成配列である、セントロメアやテロメアをターゲットに実験を進めた。まず初めに、それぞれの領域をターゲットするTALEコンストラクトを構築し、これらにVenus配列とflag配列を付加させた。さらに、このコンストラクトを恒常的に発現する細胞株を単離した。この細胞株から抗Venus抗体と抗flag抗体とで2回連続的に免疫沈降したところ、ネガティブコントロールローカスと数万倍のシグナルノイズ比が得られた。現在、細胞数を大幅に増やして免疫沈降を行って得られたサンプルを質量分析にかけている段階である。以上の手法開発に加えて、それを利用する対象を現在開拓している。これまでに、マウスの雄性生殖細胞のクロマチン環境をATAC-seq法によって解析した。まずその解析のために必要なマウスの取り寄せや、生殖細胞だけを分取するFACSの条件検討、さらに数万程度の少量の細胞からATAC-seqライブラリーを作製するためのプロトコルの改善等を行った。それにより、マウスの生殖細胞におけるクロマチン状態変化を時系列的にプロファイルすることに成功した。その結果、特定のトランスポゾンが数メガベースに渡って密集しているゲノム領域においてアクセシビリティが一過的に上昇することが明らかとなった。さらにこの現象を詳細に明らかにするために、ダイナミックにクロマチン状態が変化する時期の生殖細胞におけるトランスクリプトームを明らかにしようとしている。本研究においては、クロマチン状態を統合的に解析する手法の開発を目指している。これと同時に申請者は、手法開発とともにそれを実際に利用する対象となるような生命現象を探索してきた。手法開発の部分に関しては、免疫沈降を2回行うことで得られた沈降産物に以前よりも非特異的な物質の混入を低くすることに成功した。さらにタグタンパク質の免疫沈降時に用いる抗体のモノクローナル抗体を作出した。これにより、以前よりも質の高い抗体を免疫沈降に用いることができ、さらに抗体に対してかかった経費を低く抑えることが可能になった。よって現在この改善されたプロトコルを用いて、質量分析に供するサンプルを調製している。上述の手法を利用できる対象として、マウス生殖細胞のクロマチンを構想している。現在までにマウス生殖細胞のクロマチン状態を時系列に沿ってプロファイルする系を確立した。その結果得られたデータを解析している。

DADに形成されるピークのおよそ80%はゲノム上の反復配列であるトランスポゾン上に存在する。ゴノサイトを用いたChIP-seqの解析からH3K27me3やH3K9me3といった抑制性のヒストンマークはE13.5ではDAD内のATAC-seqピーク上に濃縮しており、それらはE17.5にかけて減少する。一方、活性性のヒストンマークであるH3K4me3はそれらと相補的な局在を示す。これらのことから、ゴノサイトにおいてトランスポゾンの多くはヒストンによってその発現が制御されていることを明らかにした。上記の解析に加えて、DADとde novoDNA methylationとの関係性に着目した。ゴノサイトでのde novo DNAmethylationは2回起きるが、DADは二度目のmethylationによってメチル化を受けることがわかった。つまり、ヘテロクロマチン化されているDADはまずオープンなクロマチン状態になった後に、DNAメチル化される。「クロマチン状態を統合的に解析する手法」に関しては引き続き、条件検討と大量細胞からのサンプル調整を行っていく。その結果、遺伝子座特異的に存在するタンパク質が見られた場合、それらの分子生物学な解析を行う。「マウス生殖細胞のクロマチン」に関しては、ATAC-seqによる分析がほぼ済んでいる。よって、今後H3K27me3、H3K4me3、H3K9me3といった主要なヒストン修飾に関してChIP-seqを行う。さらに、各分化段階におけるトランスクリプトームをCAGE-seqによって明らかにする。29年度が最終年度であるため、記入しない。