hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
胞子形成細菌における発芽カスケード反応の分子論的解析

細菌胞子発芽機構の解明に向けて、発芽の主要な生化学的事象である細菌胞子ペブチドグリカン(胞子コルテックス)分解をつかさどるコルテックス分解酵素の活性化機構をC. perfringens胞子の分解酵素SleCにおいて明らかにした。SleCは、プレプロ領域を持つ4つのドメイン構造からなる前駆体として胞子形成III期に合成され、胞子形成IV期からVI期にかけてプレプロ体のN-末端プレ領域およびC-末端プロ領域が順次にプロセシングされ、N-末端プロ領域をもつ不活性前駆体として休眠胞子の胞子殻とコルテックス層との間隙に存在することを示し、さらにその前駆体のN-末端プロ領域を切断し活性化する発芽特異的プロテアーゼGSPを同定し、その遺伝子構造並びに生化学的特性を明らかにした。GSPは胞子発芽時にSleCを活性化するシステイン-依存性セリンプロテアーゼであり、胞子コルテックス外縁部にSleCとともに局在していた。SleCはアミダーゼと溶解性トランスグリコシダーゼ活性を有する二機能性酵素であった。発芽時のコルテックスの分解は、まずSleCが胞子コルテックスの架橋構造を破壊してコルテックスを断片化し、その後、ムラミダーゼであるSleMがコルテックス断片をムロペプチドまで分解するコルテックス分解のカスケード機構を明らかにした。さらにC. perfringensのコルテックス構造はBacillus属のそれとは異なりアラニン側鎖を持たないこと、架橋度が著しく低いことなども解明し、これまで想定されてきた胞子のコルテックス構造や発芽機構は種普遍的なものではなく種特異性の存在を明らかにした。細菌胞子発芽機構の解明に向けて、発芽の主要な生化学的事象である細菌胞子ペプチドグリカン(胞子コルテックス)分解をつかさどるコルテックス分解酵素の活性化機構をC.perfringens胞子の分解酵素SleCにおいて明らかにした。GSPは胞子発芽時に活性化するセリンプロテアーゼであり、胞子コルテックス外縁部に局在していた。またN-末端プレ領域はSleCの構造形成に必須な分子内シャペロンであった。発芽時のコルテックスの分解は、まずSleCが胞子コルテックスの架橋構造を破壊してコルテックスを断片化し、その後、ムラミダーゼであるSleMがコルテックス断片をムロペプチドまで分解する機構を明らかにした。SleCによるコルテックス分解時に胞子発芽の巨視的事象である胞子の黒化とDPAの遊離を伴うことも明らかにした。さらにC.perfringensのコルテックス構造はBacillus属のそれとは異なりアラニン側鎖を持たないこと、架橋度が著しく低いことなども解明し、これまで想定されてきた胞子のコルテックス構造や発芽機構は種普遍的なものではなく種特異性の存在を明らかにした。細菌胞子発芽機構の解明に向けて、発芽の主要な生化学的事象である細菌胞子ペプチドグリカン(胞子コルテックス)分解はコルテックス分解酵素の協同的作用によることをC.perfringens胞子の分解酵素SleCおよびSleMにおいて明らかにした。発芽時のコルテックスの分解は、まずSleCが胞子コルテックスの架橋構造を破壊してコルテックス構造の力学的拘束を弛緩し、弛緩したコルテックスをムラミダーゼであるSleMが自身の基質と認識し、コルテックスをムロペプチドまで分解する機構を明らかにした。SleCの胞子内での活性化はプロテアーゼによることを既に明らかにしているが、SleMはSleCによる弛緩したコルテックス構造を基質にすることによってその活性が制御されていることを示した。

コルテックス分解時に生じるムロペプチドに解析から、SleCはアミダーゼとトランスグリコシダーゼ活性を有する多機能性酵素であるが、SleCはコルテックス構造を局所的に弛緩するのみで分解物としては遊離させない。SleCの分解時に胞子発芽の巨視的事象である胞子の黒化とDPAの遊離を伴うことも明らかにした。SleCの酵素化学的性質はBacillus属のコルテックス分解酵素SleBと非常に類似しているものの、その活性化機構並びにその構造はSleBとは異なっていた。さらにC.perfringensのコルテックス構造はBacillus属のそれとは異なりアラニン側鎖を持たないこと、架橋度が著しく低いことなども解明し、これまで想定されてきた胞子のコルテックス構造や発芽機構は種普遍的なものではなく種特異性の存在を明らかにした。
ATP感受性カリウムチャンネルを介する代謝性冠血流調節に関する研究:生理的意義及び病態による影響の検討

高血圧、高血糖の各病態におけるATP感受性カリウム(K_<ATP>)チャネルを介する代謝性冠血流調節の障害の有無を検討した。1)アデノシンによる冠血管拡張に対する高血圧の影響:高血圧ラット(SHR)、対照ラット(WKY)より摘出した心臓をLangendorff法により定流量灌流し、アデノシン、ピナシジル、ニトロプルシドによる冠血管抵抗の変化をグリベンクラミド投与前後で観察した。アデノシン、ピナシジルによる冠血管抵抗の減少はWKYに比べ、SHRにおいて小さかった。グリベンタラミドはこれらの血管拡張を減弱したが、減弱の程度はWKYに比べ、SHRにおいて小さかった。ニトロプルシドによる冠血管抵抗の減少はWKY、SHRにおいて同等であった。これらの結果より、高血圧モデルではアデノシンの冠抵抗血管拡張作用が低下しており、その機序としてKATPチャネル機能の障害が考えられた。2)アデノシンによる冠血管拡張に対する高血糖の影響:糖尿病ラット(OLETF)、対照ラット(LETO)より摘出した心臓をLangendorff法により定流量灌流し、アデノシン、レブクロマカリム、ニトロプルシドによる冠血管抵抗の変化をグリベンクラミド投与前後で観察し、両群間で比較、検討中である。これらの薬剤による冠血管抵抗の変化はOLETF、LETOにおいて同等である。グリベンクラミドはアデノシン、レブクロマカリムによる冠血管抵抗の変化を減弱する傾向にある。以上より、アデノシンによる冠抵抗血管拡張はK_<ATP>チャネルを介していることが明らかになった。高血圧ではチャネル機能の障害によりアデノシンによる代謝性血流調節が減弱していることが考えられた。糖尿病では明らかなK_<ATP>チャネル機能の障害はなかった。本研究の目的は高血圧・高血糖の各病態におけるATP感受性カリウム(K_<ATP>)チャネルを介する代謝性冠血流調節の障害の有無を検討することであり、さらに、代謝性冠血流調節に対するK_<ATP>チャネルオープナ-の効果を検討することである。今年度の研究成果を以下に示す。1ラット摘出心臓におけるアデノシンの効果の検討:WKYラットより摘出した心臓をLangendorffの方法にて定流量潅流し、冠血管抵抗の変化を潅流圧の変化により評価した。アデノシンは濃度依存性に冠潅流圧を減少し、K_<ATP>チャネルの選択的阻害薬グリベンクラミドはこの冠潅流圧減少を抑制した。また、K_<ATP>チャネルオープナ-のニコランジルは冠潅流圧を変えない低濃度でアデシノシンによる冠潅流圧減少を増強した。2病態モデル:高血圧モデルとしてSHRを使用している。高血糖モデルとしてはOLETFratを入手し、現在飼育中である。3高血圧モデルにおける冠循環特性の検討:SHRより摘出した心臓をLangendorffの方法にて潅流し、潅流圧の変化を観察した。アデノシンは冠潅流圧を濃度依存性に減少したが、グリベンクラミドはこの冠潅流圧減少にほとんど影響しなかった。以上より、アデニシンによるラット冠抵抗血管拡張はK_<ATP>チャネルを介しており、これはK_<ATP>チャネルオープナ-により増強することが明らかとなった。高血圧では、K_<ATP>チャネルが傷害されており、アデノシンによる冠抵抗血管拡張におけるK_<ATP>チャネルの役割は少ないものと考えられる。
骨髄由来間葉系幹細胞を用いた三次元軟骨組織誘導および軟骨再生に関する研究

平成14年度はヒト骨髄由来間葉系幹細胞を用いた三次元培養実験(アルジネートビーズ培養とペレット培養)を行い、in vitroでの軟骨組織誘導を試みた。平成15年度は前年度に三次元培養して得られた軟骨組織塊を動物の関節軟骨欠損部に移植する実験を行った。骨髄由来間葉系幹細胞を用いた三次元培養実験-アルジネートビース培養-:ヒト骨髄由来間葉系幹細胞をアルジネートゲル中に移し、TGF-β3を含む培地中で019日間培養した。培養0,4,8,12,16,19日の細胞の形態をTEMで観察し,collagen type I, type II, osteocalcin等の一次抗体とAuコロイドの二次抗体を用いた免疫SEMにより細胞の分化過程を検討した。その結果、培養4,8,12日に細胞表面および細胞外マトリックスにタイプIIコラーゲンとプロテオグリカンおよびオステオカルシンが発現した。培養16,19日に細胞内および細胞外にハイドロキシアパタイトの針状結晶が形成された。三次元培養実験-ペレット培養-:ヒト骨髄由来間葉系幹細胞をTGF-β3およびBMP6を含む培地中で021日間ペレット培養を行った。培養0,1,7,14,21日の細胞の形態をTEMで観察し、collagen type I, type II等による免疫電顕を行い細胞の分化過程を検討した。PCRにより細胞の遺伝子も解析した。その結果、培養14日で線維芽細胞様細胞と細胞外マトリックスから成る軟骨組織が誘導された。三次元培養軟骨組織塊を動物の関節軟骨欠損部に移植する実験:培養14日目の軟骨ペレットを、動物の関節軟骨欠損部に移植するin vivoの実験を行った。ウサギおよびラットの関節軟骨に軟骨欠損部を形成し、培養14日目の軟骨ペレットをpress fitさせ充填した。移植8週間後に良好な軟骨組織の再生が認められた。本年度は、以下の2つの実験によりヒト骨髄由来間葉系幹細胞を用いた三次元軟骨組織誘導を行った。実験2:ヒト骨髄由来間葉系幹細胞をTGF-β3およびBMP6を含む培地中で021日間ペレット培養を行った。培養0,1,7,14,21日の細胞の形態をTEMで観察し,collagen-type I, type II等による免疫電顕を行い細胞の分化過程を検討した。その結果、培養21日で線維芽細胞様細胞と細胞外マトリックスから成るペレット辺縁部と軟骨細胞様細胞と細胞外マトリックスから成るペレット中心部を持つ軟骨組織が誘導された。(第59回日本顕微鏡学会2003年6月、発表予定)。本年度は、1)平成14年度に実験した三次元培養軟骨組織の評価および2)三次元培養して得られた軟骨組織塊を動物の関節軟骨欠損部に移植する実験を行った。1)軟骨組織の評価:骨髄由来間葉系幹細胞の三次元培養結果をもとに、移植に適する培養軟骨組織の評価を行った。アルジネートビーズ培養では培養4日目で軟骨基質が形成されたが、培養9日目に細胞内外にハイドロキシアパタイトの針状結晶が形成されて、健全な軟骨組織の形成は培養初期の極めて短期間であることがわかった。

一方、ペレット培養では培養7日目にcollagen type IIとproteoglycanから成る軟骨基質が形成され、培養14日目でペレットは木きさを増し、軟骨細胞と軟骨基質から成る軟骨組織塊となった(市野瀬、日本臨床電顕学会2003年)。培養時に細胞に応力を負荷する実験ではアルジネートビーズ培養では、アルジネートゲルの硬度が十分でないため、遠沈機を用いて行った。ペレット培養では細胞ペレットの自重による応力負荷が期待できるところから、ペレットを回転して培養した。2)培養軟骨組織塊を動物の関節軟骨欠損部に移植する実験:培養14日目の軟骨ペレットを、動物の関節軟骨欠損部に移植するin vivoの実験を行った。ウサギおよびラットの関節軟骨に軟骨欠損部を形成し、培養14日目の軟骨ペレットをpress fitさせ充填した。移植8週間後に良好な軟骨組織の再生が認められた(Muneta, et al., International Cartilage Symposium Hiroshima, 2004)。
ループ空間と分類空間のホモトピー論

Hopf空間Xのloop空間Gは、「ホモトピー可換なHopf空間」の特別な一群をなしている。さらに、J.Lin,R.Kaneらによる「loop空間定理」によれば、Xが有限CW複体のとき、GのPontrjagin環は奇数次数の生成元を持たない。一方Gを有限CW複体である「ホモトピー可換なHopf空間」とすれば、J.Hubbuckの「Torus定理」によって、GのPontrjagin環は次数1以外の生成元を持たない。定理ホモトピー可換なHopf空間Gは、コホモロジーの原始元のなす加群PH(G;4/2)が有限次元(4/2-vector space)ならば、Gの整係数Pontrzagin環は2-torsionを持たず、その奇数次数の生成元は次数1にのみ存在する。さらに、「ホモトピー可換」性はWhitehead積の言葉で弱めることができる。又、S.Saitoとの共同研究により、Ganea予想に対する次の結果を、free ideal ringについての代数的な結果を用いて得ている。この結果も、「co作用」の言葉を用いて、「LS-cat≦1」の部分を弱めることができる。これらの結果はいづれも現在投稿準備中である。
カルサイトとアラゴナイトからなる軟体動物の殻体形成機構の解明

軟体動物の殻体は主にアラゴナイトやカルサイトから構成されるが、中にはアラゴナイトやカルサイトが挟在、混合する場合がある。本研究では、とくにアワビの貝殻を材料として、まず貝殻の形成時期を酸素安定同位体比分析で明らかにし、そして貝殻中のアラゴナイトとカルサイトの分布をラマン分光法によって把握した。その結果、アラゴナイトとカルサイトはレイヤー状に分布し、同時に作り分けが行われていることがわかった。H24年度には研究材料としてのアワビ類以外の軟体動物として、カルサイト殻を持つホタテガイ類、カルサイトとアラゴナイト殻を持つシンカイヒバリガイ類を材料として研究をすすめた。アワビ類については、東北地方の大槌と泊浜で採集された材料のほか、韓国南岸で採集されたものと中国地方瀬戸内海で養殖されているアワビ類も材料として用いた。これらのアワビ類の貝殻については、貝殻構造解析と貝殻の化学分析を行った。貝殻構造解析については、貝殻断面をアセテートフィルムを用い観察用に加工し、実体顕微鏡や走査型電子顕微鏡で観察し、貝殻に含まれるアラゴナイトやカルサイトの分布を把握した。また、軟X線による写真から、成長密度などを見積もった。この手法のほか、今年度は新しくカルサイトとアラゴナイトを区別して染色する方法を用いて、さらに詳細にそれぞれの鉱物の分布を把握した。ほかにラマン分光法によって、ミクロン単位での精度でカルサイトとアラゴナイトの分布を測定する手法をとりいれた。ホタテガイ類については化石と現生の標本を入手し、化石を年代測定を行った上でのカルサイトの成長速度を見積もった。シンカイヒバリガイについては、貝殻断面からアセテートピール法で断面観察、そして走査型電子顕微鏡で微細構造の観察を行い、カルサイトとアラゴナイトの貝殻成長の伴う分布変化などを見積もった。ホタテガイ類やシンカイヒバリガイ類の貝殻構造は比較的シンプルであることがわかったが、アワビ類については複雑な鉱物分布をしている。これにはラマン分光法をとりいれて研究を進めることがよいことがわかった。H25年度にはカルサイトとアラゴナイトの鉱物が共存するアワビ類とカルサイトからなるホタテガイ類の貝殻を材料として研究を進めた。アワビ類については、東北地方の大槌と泊浜で採集された材料のほか、韓国南岸で採集されたものと中国地方瀬戸内海で養殖されているエゾアワビとクロアワビを材料として用いた。ホタテガイ類については化石と現生の標本を入手し、化石を年代測定を行った上でカルサイト殻の成長速度を見積もった。現生は北海道オホーツク海およびサロマ湖と青森県陸奥湾で養殖されたものである。化石は駿河湾海底、九州西方沖海底、鹿児島の完新統から採集されたもので、約3万約1万年前の年代を示す。昨年度のアワビ殻の鉱物分布を分析した予察研究から、アラゴナイトとカルサイトの分布を測定するにはラマン分光法が適していることがわかったため、この手法を用いてアワビ殻の外殻層部分の断面の鉱物分布を検討した。ラマン分光法による分析結果から、アワビ殻の外殻層にはアラゴナイトとカルサイトが混在していることが明らかとなった。これは前年度からわかっていたことであるが、今回これらの鉱物が層状に分布していることが判明した。外側表面から、外殻層のアラゴナイト、外殻層のカルサイト、中殻層および内殻層のアラゴナイト(真珠層)という順番である。つまり、このアワビ類は同時期にアラゴナイトとカルサイトを作り分けているということである。今回は鉱物分布の比率や季節との関連性まで明らかにすることはできなかったが、今後の研究課題として、アワビ類のカルサイトとアラゴナイトの作り分けの要因について研究を進めていく方向性がわかった。H23年度には試験材料としてのアワビ類を用いて、養殖場と実験室の環境でモニターシステムを構築する予定であったが、2011年3月11日の東北沖地震によって、養殖場やサンプル提供者、水産総合研究センターなどが被災したため、予定したアワビ類の分析を行うことが出来なかった。しかし2010年に岩手県の大槌湾と宮城県の泊浜で採集したアワビ類を材料として提供していただき、分析を進めた。そのほかにアワビ類の貝殻試料を新潟県の佐渡島からの試料提供と韓国沿岸における貝殻試料を材料として収集した。韓国沿岸での調査においては、アラゴナイトの殻からなる二枚貝類も研究材料として収集した。大槌と泊浜において収集したアワビ類の貝殻については、貝殻構造解析と貝殻の化学分析を行った。貝殻の化学分析については、貝殻の粉末試料を質量分析計を用いて酸素・炭素安定同位体比の測定を行った。

また、同様に粉末試料を採取して、ICP発光分光分析計を用いて微量元素の測定も行った。酸素・炭素安定同位体比の測定結果をみると、大槌湾の試料は2006年から2010年にかけての同位体比のサイクルが明瞭に判別出来た。また、泊浜の試料では2007年から2010年にかけてのサイクルが明確となった。とくに酸素同位体比は水温のプロキシーとして使えることが明らかとなり、今後研究を進める上で、アワビ類の貝殻の成長解析には酸素同位体比をツールとすることは有効であることがわかった。今年度の研究成果は予定より大幅に遅れたが、化学分析と構造解析の手法については今後とも有効に使えるという研究成果が得られた。アワビ類の鉱物分布は複雑で、分析に時間がかかることから、試料とする貝殻を水槽で生育させる方法をとりやめ、養殖場などから入手して分析をすすめることに方向を転換した。2011年3月に発生した地震のため、本研究における飼育実験やサンプル提供を予定していた宮城県塩竃市の水産総合研究センターが被災してしまい、センターの復旧がすぐにできなかったため、購入予定の飼育機器や旅費を使用することが出来なかった。H24年度に進めた研究手法で、アワビ類を中心に鉱物組成分布や成長過程の鉱物形成を観察、分析していく。そのほかにもカルサイトやアラゴナイトからできている貝類も材料として進める。アワビ類を中心とした資料収集、貝殻構造解析と化学分析の実施旅費については、アワビ類やホタテガイ類を中心とした研究材料を東北、中部、中国、九州地方の沿岸域から収集するために使用する。物品費については、貝殻構造の観察をするために、観察前の処理を行う薬品や物品、顕微鏡で観察して画像処理および構造解析をする上での装置などの物品の購入をする。外注分析費については、貝殻の化学分析や生息環境の海水の化学分析については外注で分析会社に依頼する際に使用する。また、分析機器が職場にあるものについては、機器の使用経験のある人を雇用し謝金を支払う。実験室でのモニターシステムを構築する予定であったが、宮城県の養殖場だけで行うことに変更し、養殖したアワビ類などの貝殻を材料として貝殻構造解析と化学分析を進める予定である。国内外を問わず、アラゴナイト・カルサイトで形成された貝殻の収集も行う予定である。
脊椎動物ペプシノゲンの多様性に関する酵素機能の特異性とゲノム解析

ペプシノゲンには5種類の成分があり、哺乳類では食性の多様化とともに各成分の発現も異なっている。これらはA, B, C, F, Yと呼ばれる。ペプシノゲンは胃内でペプシンに変換され強いタンパク質分解活性を示す。本研究では、各ペプシンのタンパク質分解の特異性を中心に解析した。ペプシンAは切断部位の両側のアミノ酸、すなわちP1,P`1のアミノ酸は疎水性か芳香族の側鎖を持つものであった。ペプシンYはP`1のアミノ酸が極性あるいは解離基をもつものでありAと大きく異なっていた。ペプシンCはAに似るが、P'1にアラニン、バリンなど側鎖の小さなものしか受け付けなかった。ペプシンBはこれらのいずれとも異なりP2のアミノ酸がグリシンのものを特異的に切断した。これらの結果はP`1のアミノ酸が特異性を決めるのに大きく関与していることを示している。ペプシンAとYについて立体構造からP`1をうけいれるペプシン側の部位、すなわちS'1について比較を進めたところ、共通的な配列と成分固有の配列があることが明らかとなった。共通配列はいずれも疎水性あるいは芳香族側鎖をもっていたが、固有のものはAが疎水性Yが親水性と大きく異なっておりこの違いがタンパク質分解の特異性を生じていると推測された。この仮説に基づき、ペプシンAとYのS`1の違いについてさらに検討を進めるため部位突然変異をおこない、ペプシンAで、Met289asp, Leu291Ser, Leu298Gln,ペプシンYでAsp289met, Gln298Leuの変異体を作製した。そのため、酵母でのタンパク質発現系を確立した。得られた変異ペプシノゲンについてそれぞれの基質特異性を調べたところ、これらのアミノ酸が特異性に関与していることが明らかとなった。現在ヒトではA, Cの2成分の遺伝子のみが発現し、B, F, Y遺伝子は不活性化している。本年度は霊長類の代表的な3分類群(類人猿、旧世界ザル、新世界ザル)と他の哺乳類での比較解析をおこなった。霊長類のB, F遺伝子は哺乳類から霊長類の分岐時に、Y遺伝子は霊長類進化の過程で旧世界ザル以降に不活性化が起こったことが推測された。またA遺伝子の多様化が旧世界ザル以降急速に進行したことが明らかになった。コモンマーモセットから単離されたA, C, Y成分と、イヌから単離されたB成分を用いて、基質特異性について解析をおこなった。10残基程度のペプチドを揃え切断部位と切断速度を調べた。成分により特異性に大きな違いが見られた。A成分はサブスタンスP、bFGFなどを含めて広い特異性を示した。P1,P'1位には疎水性アミノ酸が好まれた。C成分はP'1位にアラニンやグリシンのような側鎖の小さいアミノ酸を好みA成分と異なっていた。Y成分はP'1位にリシンのような塩基性アミノ酸を好み、極めて早い分解速度を示した。B成分は他の成分と異なり限られたペプチドの切断しか出来なかった。特異性の解析ではP2位にグリシンがあるときに選択的に切断が起こる結果を示し、特殊なタンパク質やペプチドの切断に関与する酵素であると推測された。これらの解析の結果は、ペプシノゲンの多様な成分はそれぞれ異なる特異性を持ち、効率的な消化をおこなうべく動物の食性に適応して進化してきたことを示している。

ペプシノゲンには5種類の成分があり、哺乳類では食性の多様化とともに各成分の発現も異なっている。これらはA, B, C, F, Yと呼ばれる。ペプシノゲンは胃内でペプシンに変換され強いタンパク質分解活性を示す。本年度は、F除くペプシンについてタンパク質分解の特異性について解析した。ペプシンAは切断部位の両側のアミノ酸、すなわちP1,P'1のアミノ酸は疎水性か芳香族の側鎖を持つものであった。ペプシンYはP'1のアミノ酸が極性あるいは解離基をもつものでありAと大きく異なっていた。ペプシンCはAに似るが、P'1にアラニン、バリンなど側鎖の小さなものしか受け付けなかった。ペプシンBはこれらのいずれとも異なりP2のアミノ酸がグリシンのものを特異的に切断した。これらの結果はP'1のアミノ酸が特異性を決めるのに大きく関与していることを示している。ペプシンAとYについて立体構造からP'1をうけいれるペプシン側の部位、すなわちS'1について比較を進めたところ、共通的な配列と成分固有の配列があることが明らかとなった。共通配列はいずれも疎水性あるいは芳香族側鎖をもっていたが、固有のものはAが疎水性Yが親水性と大きく異なっておりこの違いがタンパク質分解の特異性を生じていると推測された。ペプシンAとYのS'1の違いについてさらに検討を進めるため部位突然変異をおこなうこととし、酵母でのタンパク質発現系を確立した。ペプシンAは切断部位の両側のアミノ酸、すなわちP1,P`1のアミノ酸は疎水性か芳香族の側鎖を持つものであった。ペプシンYはP`1のアミノ酸が極性あるいは解離基をもつものでありAと大きく異なっていた。これらの結果はP`1のアミノ酸が特異性を決めるのに大きく関与していることを示している。ペプシンAとYについて立体構造からP`1をうけいれるペプシン側の部位、すなわちS'1について比較を進めたところ、共通的な配列と成分固有の配列があることが明らかとなった。この仮説に基づき、ペプシンAとYのS`1の違いにっいてさらに検討を進めるため部位突然変異をおこない、ペプシンAで、Met289asp, Leu291Ser, Leu298Gln,ペプシンYでAsp289met, Gln298Leuの変異体を作製した。それぞれの基質特異性を調べたところ、これらのアミノ酸が特異性に関与していることが明らかとなり、仮説が証明された。
自己調整学習に基づいた自律的英語学習モデルの構築

英語教育の充実とグローバル社会で大いに活躍できる日本人の育成が、日本における重要な課題の一つとなっている。本研究は、大学英語教育におけるCAN-DOリスト活用の諸過程を、自己調整学習の観点から理論的に検証することにより、日本人英語学習者が英語学習における自律学習を促進させるための要因を解明し、自律的英語学習モデルを構築することを目的とする。本研究において構築する自律的英語学習モデルは、言語学習者が教育機関から社会に出てからも、様々な言語・文化に触れ、新しい言語を継続して自律的に学習し、異文化理解を深めようとする生涯学習としての言語学習につながる資質育成のために有効活用されることが期待される。
1930～50年代マスメディアと女性ー内容分析とライフヒストリー調査の結合

戦前の大衆的な婦人雑誌の内容分析の研究成果を生かし、当時の読者層であったと思われる、1930年代か1940年代にかけて高等女学校に通っていた世代の高齢者女性にライフヒストリーのインタビューを行い、メディアの内容と受け手の女性読者の生活や意識を関係づけることを試みた。その結果、家庭における女子への教育方針や高等女学校などの文化、当時の戦時状況などと関わりながら、マスメディアが女性たちにとってそれぞれの意味をもったことがわかってきた。今回注目した、婦人雑誌連載の大衆小説については、明確に小説名や作家名が語られることは少なかったが、日常の楽しみとして親しみ、潜在的な影響を与えていることが示唆された。1)大正デモクラシーから昭和モダニズムの1920年代、戦中のファシズム期、戦後直後の1945年から1950年代の3つの時期ごとに社会全体における女子教育・家族の在り方・女性労働・性役割・女らしさ・セクシュアリティなどについて、ジェンダー秩序の形成や変容を提示する論争や流行文化に関する文献整理を行った。そのために、従来の婦人雑誌の資料に加えて、大衆文化や女性史にかかわる文献の追加購入を行い、大衆的なメディアを中心とした研究ノートをいくつか作成した。2)今回の科研の助成以前に実施していたインタビュー調査の結果を基に、質問項目およびワーディングを整理し、インタビューガイドの充実をはかった。3)研究代表者の前勤務校である大阪女子大学(現在、大阪府立大学に統合)は戦前は女子高等専門学校であったため、その同窓会組織である斐文会にご協力を依頼し、同窓会誌に88歳以上の方々にインタビューご協力のお願いを掲載していただき、該当学年には返信用のはがきを同封していただくという実にありがたいご協力を得ることができた。其の結果、20数名のインタビュー協力者の申し出があり、2014年度は10名ほどのインタビューを実施した。さらには、研究協力者である土田陽子さんのご紹介で、戦前から高等女学校としての歴史をもつ関西の或る私立高校の同窓会のご協力を得て、高齢の卒業生にグループインタビューをすることもできた。その方々と今後個別にインタビューをお願いすることもありうる。と、インタビュー実施状況を説明4)インタビュー調査は、前述のグループインタビュー1件のほかは、すべて、協力者のご自宅やご近所の公的施設、あるいは喫茶店などで、2時間から5時間にわたる長時間のインタビューをおこなうことができた。その結果は、順々に文字起こしをすすめている。1)戦前日本の女子教育制度・進学状況、女子学生文化、家族の在り方、女性労働、性役割、性別特性(女らしさ・男らしさ)、セクシュアリティなどについて、近代的なジェンダー秩序の形成や変容に関わる論争や流行文化に関する文献整理を行った。その中でもとりわけ女性を主たる読者とした通俗小説に関する文献や資料を、図書館や古書市場、戦前の流行小説作家であった方の親族のご協力などによって、収集した。それらの資料を基に、近代日本のマスメディアや文壇におけるジェンダー・ポリティクスを描き出すべく、学術論文執筆を行った。2)2015年度に再整理していた高齢女性のライフヒストリー・インタビューガイドを基に、引き続きインタビュー調査を実施した。2015年度に調査協力の意思を示していただいていた、旧制の大阪女子高等専門学校の卒業生を中心に、85歳以上の高齢女性へのインタビューを、研究分担者である、土田陽子とともに、関西と東京を中心に各地で実施した。3)研究分担者である土田陽子は地方都市の県立高等女学校卒業生を対象にインタビュー調査を開始した。より幅広い地域や学歴層を対象にインタビュー調査を行うことで、女性のライフヒストリーの地域差や学歴による差異および共通点を描き出せると考えたからである。4)インタビュー調査は長時間にわたることが多く、その結果は順次文字起こしをすすめ、学術的な資料とする同意をいただきながら、インタビュー協力者から内容のご確認を得ている。193050年代のマスメディアと女性という点では、女性を主たる読者として大衆雑誌に発表された通俗小説に関わる貴重な資料やデータを丹念に集めることができたので、二本学術論文にまとめる成果を上げた。戦前に教育を受け、マスメディア情報を享受していた年齢層の女性へのインタビュー調査は、2015年度にいくつかの学校の同窓会組織のご協力を得て開始することができたが、当初の予定以上にご協力者が多くなるとともに、一回のインタビュー時間も長く、さらには複数回インタビューさせていただく場合もあり、2016年度は研究分担者土田陽子を得て、昨年度に引き続きのインタビュー調査を順調に実施している。二年目としては十分な成果を挙げることができたと考えている。1)1930年代後半から40年代前半(戦前)の女子教育制度と進学状況の基礎データを整理するとともに、女子学生文化、家族のあり方、女性の労働、性役割、セクシュアリティなどについての、近代的なジェンダー秩序の形成や変容に関わる論争や大衆文化・流行に関する年表的なデータ整理を文献を基におこなった。これらについて、高齢女性のライフヒストリーを聞き取る際、無意識のうちに影響を受けている文化や風潮、できごとについての記憶を呼び起こす触媒としての役割を担えるよう、インタビューガイドの形に整理をおこなった。2)上記の資料を活用しながら作成したインタビューガイドを基に、戦前に女子高等専門学校や高等女学校に通った経験のある女性を中心に高齢女性へのインタビューを実施し、総勢18名からライフヒストリー・データを得ることができた。一人に対して複数回のインタニューをおこなった場合もあり、ほとんどの場合、かなり長時間のデプス・インタビューを実施することができた。

これらのデータを文字起こしし、インタビュイーのチェックを経て、ライフヒストリーとして公表の許可が出たものについて、報告書を作成すべく、分析考察をすすめている。3)またインタビューと並行して、インタビュー対象者およびそれよりも少し上の世代が1930年代に愛読していた女性向け通俗小説について、代表的な通俗小説作家のひとりとして加藤武雄に注目し、加藤の親族や関係者への聞き取り、および資料収集をおこなった。加藤武雄は、通俗小説のみならず、本来の志であった農民文学、また子ども向けの読み物など、大量の作品を発表しているが、ほとんど図書館などに所蔵されていないため、古書で収集し、その物語分析や通俗小説についての彼の思想を明らかにするとともに、通俗小説をめぐる議論などを整理した。戦前の大衆的な婦人雑誌の内容分析の研究成果を生かし、当時の読者層であったと思われる、1930年代か1940年代にかけて高等女学校に通っていた世代の高齢者女性にライフヒストリーのインタビューを行い、メディアの内容と受け手の女性読者の生活や意識を関係づけることを試みた。その結果、家庭における女子への教育方針や高等女学校などの文化、当時の戦時状況などと関わりながら、マスメディアが女性たちにとってそれぞれの意味をもったことがわかってきた。今回注目した、婦人雑誌連載の大衆小説については、明確に小説名や作家名が語られることは少なかったが、日常の楽しみとして親しみ、潜在的な影響を与えていることが示唆された。年度当初の計画では、大阪女子大学の同窓会組織にお願いして、郵送調査→ご協力いただける方にインタビューという予定であったが、私が対象とする88歳以上(昭和元年前後より前に生まれた方々)にはアンケート調査はむずかしいのではという、同窓会のアドバイスにより、その段階はスキップしたものの、それに近い形で同窓会誌にインタビュー趣旨とご協力のお願いを掲載していただき、一気にインタビュー調査へとすすむことができた。現在、インタビュー調査は順調にすすんでおり、研究としても一年目の課題を十分にこなしたと考えている。今年度は最終年にあたるため、前半では、木村涼子はすでに内諾を得ているインタビュー協力者への調査の残りを終えるとともに、土田陽子は県立高等女学校卒業生のクラス会を通じて対象者を広げてインタビュー調査を行う。今年度後半では、高齢女性のインタビューデータを、家庭教育、学校教育、メディア受容、文化体験(習い事、音楽、スポーツ、文学、レジャーなど)、学校教育に対する意識について、また結婚、子育て、就職などライフイベントごとに、丁寧に読み直し、マスメディアおよび学校教育が女性の人生に与えた影響を分析するとともに、インタビューの中で浮かび上がってきた戦争体験の重要性についても考察したいと考えている。また、インタビュー対象者の出身学校や出身階層の違いに注目した分析も加えたい。年度末には、インタビューデータを基にした調査報告書を作成する予定である。また、適宜、学会発表や学術論文執筆の形で公表していきたい。
東アジア圏における歴史的建造物保存・修復理論の比較研究

本年度は、研究の最終年度にあたるため、これまでの研究成果を踏まえつつ、不足する情報を文献の翻訳などで補い、東アジア木造圏における建造物保存・修復理論の比較に関する視点の整理をおこなった。すなわち、日、中、韓3国における建造物保存・修復理論の差異を抽出し、その差異の生じた歴史的経緯を考察した。文献翻訳としては、中国、韓国における建造物保存・修復の理論的言説を概観しうる文献として、羅哲文『中国古代建築』(上海古籍出版社、2001)『韓国建築史研究』(Baleon、2003)を選定し、建造物保存・修復に直接関わる部分を翻訳した。これらについては、各国の比較による解題を付して、発表の機会を探りたい。また、研究成果のまとめを兼ねて、ユネスコ・アジア文化センター文化遺産保護協力事務所の木造建造物保存修復に関する集団研修において講演をおこなった。今年度の新たな知見としては、中国における建造物保存・修復が、近年、その理論的側面を大きく変質させつつあることが知られたことが挙げられる。中国イコモスは、西安で開催された2005年度のイコモス総会を契機に、オーストラリアのバラ憲章に刺激を受け、既往の修理方法・理論の再検証を始めつつある。伝統色の強かったこれまでの修理から、一足飛びに西洋の修復理論を先鋭化したバラ憲章を参照したため、両者の齟齬をいかに埋めるか、という問題に苦慮しつつある様がみてとれたが、東アジアにおける建造物保存・修復の共通の課題がここに浮かび上がっている。本研究の成果を踏まえ、来年度上半期に開催予定の日韓文化財建造物保存協力協議会において、日韓における建造物保存の比較史に関するシンポジウムを企画する予定である。今年度は、韓国における歴史的建造物保存修復に調査研究対象を絞り込み、その基礎情報の収集を主な課題とした。具体的な作業としては、保存修復についての現地調査と、文化財保護行政関係者及び韓国の建築史研究者との情報交換をおこなった。実地調査としては、まず韓国における建造物保存・修理の実態を理解することを目的とし、現在修理工事が進行中である法住寺大雄殿の修理工事を視察した他、既に修理工事がおこなわれている木造建築のうち、鳳停寺極楽殿、浮石寺無量壽殿等の年代が古い建造物について実地調査を実施した。また、保存、修理の内容を包括的に把握するために韓国文化財庁を訪問し、行政担当技官各氏へのヒアリング及び文化財保護関係資料の収集をおこなった。韓国の建築史研究者との情報交換としては、6月に長野市においておこなわれた日韓都市・建築史ワークショップWuha)において「東アジア木造建造物保存・修復史研究への視座」と題した報告の機会を持ち、東アジアにおける歴史的建造物保存・修復史研究の方法論について、近代建築史としてそれを論じていくべきとする内容を中心とした私見を提示し、意見交換をおこなった。以上の活動と並行して、東アジア比較研究の下敷きとすべく、日本における歴史的建造物保存修復についてこれまで研究を進めてきた内容を、論文として報告する準備をおこなった。次年度は、韓国における建造物保存修復の歴史と現状につき、現地調査を含めたさらなる調査をおこない、具体的な日韓比較を行う予定である。本年度は、韓国における歴史的建造物保存修復と国内におけるそれとの方法的比較を中心に研究を実施した。修復方法の基本的な思想を把握する目的で、韓国における歴史的建造物の修復現場を実地に見学し(法住寺大雄宝殿、江陵客舎門、帰信寺大寂光殿、弥勒寺址石塔の4棟)、各修復現場担当者へのインタビュー並びにディスカッションをおこなった他、韓国文化財庁、文化財研究所における建造物修復担当官及び研究者とのディスカッション、歴史的建造物修復に関する資料収集と分析をおこなった。その結果、以下のような修復の特徴が認められた。(1)韓国では、破損部材の新材への更新が日本に比して多く見られる。(2)構造補強にはなるべく木材を用いる。(3)伝統技法を習得した大工技術への信用ゆえに、伝統的修理技法が多用される。(4)部材再利用のための合成樹脂による部材修復の多用。以上の特徴を、日本における建造物修復の考え方と比較して考えると、次の3点のような考え方を読み取ることが可能なように思われる。a木造建造物修復の根本は、伝統材料としての木材を使用しての構造健全化にある。鉄等の非伝統材料の使用をなるべく避ける。b古材はなるべく尊重するが、構造的に重要な軸部の材に重点を置く。c現代における大工技術と、歴史的建造物の建設時における技術との距離を近いものとみなす。すなわち、木造建造物の建設技術に、時間を超えた一貫性をある範囲で認め、木材の徹底使用と伝統技術による建造物保存を進めることで建造物とそれを支える技術を一体として継承していこうとする認識が根底に存するように考えられる。今後は、この仮説的な知見を踏まえて、修復理論の形成過程を追うと共に、日本、中国、韓国における修復に対する考え方の共通点と差異を考察していくつもりである。文献翻訳としては、中国、韓国における建造物保存・修復の理論的言説を概観しうる文献として、羅哲文『中国古代建築』(上海古籍出版社、2001)

『韓国建築史研究』(Baleon、2003)を選定し、建造物保存・修復に直接関わる部分を翻訳した。これらについては、各国の比較による解題を付して、発表の機会を探りたい。また、研究成果のまとめを兼ねて、ユネスコ・アジア文化センター文化遺産保護協力事務所の木造建造物保存修復に関する集団研修において講演をおこなった。今年度の新たな知見としては、中国における建造物保存・修復が、近年、その理論的側面を大きく変質させつつあることが知られたことが挙げられる。中国イコモスは、西安で開催された2005年度のイコモス総会を契機に、オーストラリアのバラ憲章に刺激を受け、既往の修理方法・理論の再検証を始めつつある。伝統色の強かったこれまでの修理から、一足飛びに西洋の修復理論を先鋭化したバラ憲章を参照したため、両者の齟齬をいかに埋めるか、という問題に苦慮しつつある様がみてとれたが、東アジアにおける建造物保存・修復の共通の課題がここに浮かび上がっている。本研究の成果を踏まえ、来年度上半期に開催予定の日韓文化財建造物保存協力協議会において、日韓における建造物保存の比較史に関するシンポジウムを企画する予定である。
偏光フィルタ映像提示トリックを活用した目撃記憶変容の実験的研究

申請者が新たに開発した偏光フィルタを用いた映像提示方法(MORIテクニック)を用いて、複数の目撃者に2種類の違う映像を気づかれることなく提示し、その目撃記憶がその後の話し合いを通してどのように変容していくかを実験的に解明した。映像提示方法としてのMORIテクニックのさらなる改良も行なうとともに、その効果の検証実験も行った。自分がどの程度よく目撃できているかについての自覚が同調に影響を与えること、小学生の親子でも必ずしも子が親に同調するわけではないことなど、を見いだし、研究成果を国内外の学会および研究専門誌に公刊した。同じ事件を目撃しても,目撃者間で証言が食い違うことがたびたび生ずる。目撃者が見まちがいをしたり,目撃後に記憶ちがいをしたりすることがあるからである。しかし,実際の目撃者証言においては,どちらが見まちがいや記憶ちがいをしたのかを知ることはできない。本研究では,特殊なトリック(MORIテクニック)を用いて,目撃者にあたかも「見まちがい・記憶ちがい」が生じたかのような事態を作り出す。こうした実験により,目撃者の「見まちがい・記憶ちがい」が複数の目撃者間の話し合いによってどのように解決されていくのかを検証することを目的とする。守は過去約10年間の間に,3回の科研費の補助を受け,MORIテクニックの洗練と有効性の検証(萌芽研究:1996-1998),MORIテクニックを用いた目撃記憶の実験研究(基盤C:2001-2003),MORIテクニックを用いた目撃記憶研究の国内外での大規模共同研究(基盤B:2004-2007)を行ってきた。2007年からの4年間では,2004年から始まった国内外での共同研究プロジェクトをさらに拡大すること,さらに,これまでに目撃記憶との関連性が見出された種々の要因について,直交表に基づく実験計画を立てることで組織的な大規模実験研究を実施し,要因間の重要度を検証することを目的とする。偏光フィルタ映像提示トリックを活用した研究手法を用いた種々の実験研究を推進した。今年度は、新たに海外研究協力者としてカナダUniversity of VictoriaのStephen Lindsayおよび連合王国University of WarwickのKimberley Wadeとの共同研究を開始した。また、ニュージーランドVictoria University of WellingtonのLaurenFrenchと共同で映像提示トリックの有効性を確認する実験を行い、2つの映像の一方を見ている被験者は意識的にも無意識的にももう一方の映像に影響を受けていないことを実証した。偏光フィルタ映像提示トリックを活用した目撃記憶変容の実験研究を国内外で実施推進した。Victoria University of WellingtonのFrench, Garryらと共同で映像提示トリックの有効性を確認する実験研究を実施し、学術研究誌Behavior Research Methodsに公刊するとともに、国際学会SARMAC8で発表した。この提示トリックを使うと、2つの映像の一方を見ている被験者は意識的にも無意識的にももう一方の映像に影響を受けていないことが確認された。昨年度までに国内で実施した親子の目撃者間の記憶変容に関する実験研究の成果の一部を、北林真樹子と協同で学術研究誌Psychology Journalに公刊した。小学生の子どもとその母親が同じ場面を目撃し、食い違う情報を得た場合、常識的に考えられているように母親の意見が重視されるのではなく、子どもの目撃情報も尊重されることが実証された。昨年度新たに海外研究協力者となったUniversity of VictoriaのLindsayとその院生Azadによるカナダでのデータ採取も開始され、その一部を国際学会SARMAC8で発表した。また、偏光フィルタ映像提示トリックを教育場面や対人同調場面に応用した実験研究への活用も試みた。教育への応用研究の一部を、研究協力者の内田昭利と連名で学術研究誌Research in Educationに公刊した。提示トリックを使って、Aschの同調実験を再現した研究(新居美保と共同研究)を学術研究誌International Journal of Psychologyに投稿し、公刊予定(印刷中)である。さらに、偏光フィルタ映像提示トリックの記憶認知研究への応用をテーマにしたシンポジウムを国際学会SARMAC8において企画し、司会及び発表を行なった。偏光フィルタ映像提示トリックを活用した目撃記憶変容の実験研究を国内外の共同研究者・研究協力者と実施推進した。研究の成果として、Victoria University of WellingtonのFrench,Garryらとの共同研究では、共同目撃者同士の目撃しやすさの程度を実験的に操作すると、絶対的な見えやすさではなく、目撃者同士の相対的な見えやすさが同調に大きく影響することがわかった。この研究成果は、学術研究誌Acta Psychologicaに公刊した(French et al.,2011)。小学校入学前の幼児のペアを被験者にした共同目撃記憶実験を行い、幼児では大学生に比べ、記憶成績が悪いだけでなく、同調が起きやすいことも見いだした。この研究成果は、記憶認知応用研究学会(Society for Applied Researchin Memory and Cognition)の第9回大会で発表した(Mori & Takahashi,2011)。

この発表に併せて、MORIテクニックを応用した目撃記憶実験研究を行っているカナダ、ニュージーランド、オーストラリアの海外研究協力者とシンポジウムを開催した。さらには、偏光フィルタを用いた提示トリックを目撃記憶以外の場面にも応用し、同調実験の古典的実験研究であるアッシュの同調実験をサクラを使わずに再現する実験を行った。その研究成果も、学術研究誌International Journal of Psychologyに公刊した(Mori & Arai,2010)。また、サクラを使わずに知的課題で勝者と敗者を作り出し、その社会的認知の特質を調べた実験研究も行い、学術誌Social BehaviorandPersonalityに公刊した(Mori & Mori,2011)。
ヘム・銅酸素還元酵素のエネルギー変換機構解明のための構造・機能解析

呼吸鎖電子伝達系のヘム・銅酸素還元酵素は酸素分子の還元反応(電子伝達)で放出されるエネルギーを効率的に水素イオン能動輸送(プロトンポンプ)の駆動力へと変換する。ヘム・銅酸素還元酵素ファミリーに属するaa3タイプのX線結晶構造に基づいて、1)酸素分子の結合様式、2) O-O結合開裂機構、3)反応中間体構造、4)休止型構造、5)電子伝達に伴う構造変化が明らかになった。cbb3タイプの精製方法が確立され、cbb3タイプとaa3タイプの酵素活性を比較することにより、電子伝達効率の特性が明らかになった。呼吸鎖電子伝達系のヘム・銅酸素還元酵素はO_2還元反応とプロトンポンプのエネルギー変換を効率的に実現する。ヘム・銅酸素還元酵素は原核生物から高等生物まで普遍的に存在し、スーパーファミリーを形成する。スーパーファミリーは数タイプのサブファミリーに分類され、aa_3とcbb_3タイプではプロトン輸送経路とエネルギー変換効率が異なり、O_2分圧の異なる環境に適応して機能する。効率の高いエネルギー変換機構を解明することを目的として、aa_3タイプのX線構造解析を行った。O_2のアナログ分子(CO, NO CN-)がO_2還元触媒部位に結合した構造を1.8-2.05A分解能で決定し、O_2のアナログ分子の結合様式および結合に伴うタンパク質構造の変化を明らかにした。それらの結果に基づき、O_2還元反応過程においてO-O結合が速やかに開裂される機構を提唱した。細胞に有害な活性酸素種の生成を抑えながら効率よくO_2を還元して、それに伴う構造変化をエネルギー変換に利用する仕組みが示唆される。エネルギー変換効率を決定する構造化学的要因を解明することを目的として、aa_3タイプの構造をcbb_3タイプと比較解析する。cbb_3タイプの高分解能X線結晶構造解析を行うために、cbb_3タイプの細菌における発現系を構築した。培養条件を検討した結果、cbb_3タイプの発現が確認された。さらに、cbb_3タイプの精製を試みた結果、O_2消費活性を示す粗精製標品が得られた。効率の高いエネルギー変換機構を解明することを目的として、aa_3タイプの高分解能X線構造解析を行った。休止酸化型と還元型の酵素結晶から1.4Å分解能までの回折データを収集した。構造解析の結果、これまでに明らかになった酸化還元に伴う構造変化に加えて、新たに詳細な構造変化が見いだされた。酸化還元に伴い酵素の活性中心部位付近にある水分子のクラスター構造が変化することが明らかになり、これらの水分子の動きが酵素機能に関与していることが示唆される。cbb_3タイプの高分解能X線結晶構造解析を行うために、cbb_3タイプの大量発現条件を詳細に検討した。cbb_3タイプを大量発現させた菌体から、cbb_3タイプを精製する条件を検討した結果、十分なO_2消費活性を示す精製標品の収量と純度が向上した。aa_3タイプとcbb_3タイプの活性を比較した結果、アスコルビン酸/TMPDを電子供与体とする系ではcbb_3タイプの方がaa_3タイプよりも顕著に高いO_2消費活性を示すことが分かった。呼吸鎖電子伝達系のヘム・銅酸素還元酵素はO2還元反応とプロトンポンプのエネルギー変換を効率的に実現する。スーパーファミリーは数タイプのサブファミリーに分類され、aa3とcbb3タイプではプロトン輸送経路とエネルギー変換効率が異なり、O2分圧の異なる環境に適応して機能する。効率の高いエネルギー変換機構を解明することを目的として、aa3タイプのX線構造解析を行った。O2アナログ(CO, CN-, N3-)が結合した構造、ならびに電子伝達を担う4つの金属部位が酸化状態と還元状態の混合型構造の構造を決定した。その結果、O2アナログの結合に伴う構造の変化を明らかにするとともに、酸化還元に伴う構造変化を引き起こす金属部位を決定した。エネルギー変換効率を決定する構造化学的要因を解明することを目的として、aa3タイプの構造をcbb3タイプと比較解析する。cbb3タイプの大量発現条件、精製方法、結晶化条件の検討を引き続き進めた。細胞膜の可溶化条件、ならびにカラムクロマトグラフィーの条件を改変した結果、精製標品の収率および純度が有意に向上した。

呼吸鎖電子伝達系のヘム・銅酸素還元酵素はO2還元反応とプロトンポンプのエネルギー変換を効率的に実現する。ヘム・銅酸素還元酵素は原核生物から高等生物まで普遍的に存在し、スーパーファミリーを形成する。スーパーファミリーは数タイプのサブファミリーに分類され、aa3とcbb3タイプではプロトン輸送経路とエネルギー変換効率が異なり、O2分圧の異なる環境に適応して機能する。効率の高いエネルギー変換機構を解明することを目的として、aa3タイプの高分解能X線構造解析を行った。これまでの研究に引き続いて、休止酸化型と還元型の酵素結晶からの1.4 Å分解能での回折データ収集を進め、複数の独立したデータセットを得た。データの再現性に基づき、酸化還元に伴う水分子クラスターの構造変化が電子伝達経路の僅かな構造変化と共役することが明らかになった。水分子の動きは電子移動と共役したプロトン輸送機能を担うことが示唆される。一方で、反応中間体の結晶構造解析を進め、酸素還元反応過程での中間産物の構造的特徴が見いだされた。エネルギー変換効率を決定する構造化学的要因を解明することを目的として、aa3タイプの構造をcbb3タイプと比較解析する。cbb3タイプの大量発現条件の検討を引き続き進めた。さらに、これまでの約3倍量の菌体を処理する精製方法を導入した結果、精製標品の収量が大幅に向上した。精製標品の結晶化条件を検討した結果、微結晶様のものが観察された。アスコルビン酸/TMPDを電子供与体とする系において、酸素消費活性はpH中性領域で最大になることが明らかになった。効率の高いエネルギー変換機構を解明することを目的として、aa3タイプのX線構造解析を行った。O2アナログ(CN-, N3-)が結合した酸化状態の構造を詳細に解析した結果、O2アナログの結合に伴いO2還元部位付近において形成される水分子の水素結合状態が変化することが明らかになった。反応中間体の構造解析の結果、O2還元反応生成物のヘムと銅への結合構造、およびプロトン輸送経路の水分子の水素結合構造が明らかになった。エネルギー変換効率を決定する構造化学的要因を解明することを目的として、aa3タイプの構造と機能をcbb3タイプおよびNO還元酵素と比較解析する。cbb3タイプの精製標品を用いて酸素消費活性(電子伝達活性)を詳細に測定した結果、電子伝達効率のpH特性がメディエーター(電子伝達の媒介体)分子濃度に依存することが分かった。NO還元酵素と電子供与体タンパク質を精製し、電子供与体酸化活性(電子伝達活性)の測定および共結晶化を行った。その結果、好気条件下において活性が確認され、NO還元酵素とアズリンの混合液中で微結晶が観察された。26年度が最終年度であるため、記入しない。生物物理学