hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
食性が顎関節の細胞外マトリックスのタンパン質・遺伝子発現に及ぼす影響

本研究では、顎関節円板の細胞外マトリックスの加齢変化をタンパク質および遺伝子レベルで分子生物学的手法を用いて解明することを目的としていた。実験動物として生後2,4,8,12,16,24、32週のWistar系雄性ラットを用いた。リアルタイムPCR検出装置による遺伝子発現の定量:本研究では、従来のRNAprobeを用いたノーザン・ハイブリダイゼーションではなく、より定量性の高いリアルタイムPCRを用いて各種プロテオグリカンの遺伝子発現を検討した。その結果、バイグリカンの発現は成長に伴い減少傾向を示したが、デコリンは増加を示した。またバーシカンの発現は生後8週まで増加したが、その後成長に伴い減少した。ウェスタン・ブロッティングによる各種分子の定量:円板からグアニジンによりコラーゲンとプロテオグリカンに分離/抽出し、透析後、凍結乾燥下で保存する。組織の各マトリックス分子のタンパク質発現は、それぞれの抗体を用いてウェスタン・ブロッティングで分析した。また、バーシカンの発現は生後8週まで増加したが、その後成長に伴い減少した。免疫組織化学染色:抗バイグリカン抗体に対する反応では、円板全体に比較的弱い、均一な染色パターンが認められたが、最も強い反応は円板後方帯において認められた。関節円板のデコリンおよびバーシカン抗体に対する反応は、バイグリカンと異なり顕著な領域差を示した。すなわち、前方帯、後方帯、前方付着部、後方付着部・下顎頭部を含む周辺部において、強い陽性反応が認められた。今後は、以上の結果を踏まえて、軟性飼料でラットを飼育することによる顎関節領域での力学的環境要因の変化が、顎関節の細胞外マトリックスの発現にどのような影響を及ぼしているのかについて検討していく予定である。本研究は、咀嚼機能が顎関節組織の細胞外マトリックスの組成あるいは組織の強度にどのような影響を及ぼすのかを、ラットに物性の異なる飼料を与えることによる顎顔面領域での力学的環境要因の変化が、(1)顎関節の細胞外マトリックス(コラーゲン、プロテオグリカン)の発現にどのような影響を及ぼしているのかについて、タンパク質および遺伝子レベルで分子生物学的手法を用いて解明することを目的としている。1.実験動物および実験方法実験動物として生後2週齢の雄性ウィスター系ラットを用いる。実験動物は、固型飼料群と液状飼料群とに分け、後者には、固型飼料を粉砕し4倍量の水を加えて液状にしたものを用いる。実験期間は、それぞれ2、4、8、12、20、40、60週とし、それぞれ実験期間の終了後に顎関節組織(下顎頭と関節円板)を摘出し、ノーザン・ハイブリダイゼーションによる各種分子の遺伝子発現の定量のために液体窒素を用い凍結保存を、免疫組織化学的検索のためにパラフィン包埋を随時行なっている。2.抗体の作製、抗体の特異性の証明市販されていないラット・バイグリカンに対する抗体の作製の前準備として、αドメインとβドメインに対応するcDNAをRT-PCRにより作成し、合成ペプチドを作製、精製を行い、抗体の作製、精製を行なった。抗体の特異性についてはウエスタン・ブロッティングによって確認された。3.ノーザン・ハイブリダイゼーションによる各種分子の遺伝子発現の定量試料が揃ったところで各群の円板をグアニジンによりコラーゲンとプロテオグリカンに分離/抽出し、透析後、凍結乾燥下で保存する。下記の分子の定量化はそれぞれの抗体を用いて、ノーザン・ハイブリダイゼーションを施し、円板の各分子の発現を観察する予定である。(a)コラーゲン;I型コラーゲン、II型コラーゲン、III型コラーゲン(b)

プロテオグリカン;バイグリカン、アグリカン、バーシカン(c)成長因子;Transforminggrowthfactor(TGF-β),insulin growthfactor(IGF)4.リアルタイムPCR検出装置による遺伝子発現の定量特定のprimerの組み合わせをもとに、PCRでの定量化を可能にするリアルタイムPCR検出装置を用いて、バーシカンの4つのisoformのmRNAの発現を半定量的に分析することができた。今後、試料が揃ったところで各群について分析を行なう予定である。本研究では、軟性飼料でラットを飼育することによる顎関節領域での力学的環境要因の変化が、顎関節の細胞外マトリックス(コラーゲンおよびプロテオグリカン)の発現にどのような影響を及ぼしているのかについて、タンパク質および遺伝子レベルで分子生物学的手法を用いて解明することを目的としている。申請者らは、今までに本課題の基礎的なデータとして、ラット顎関節円板の各種プロテオグリカン(デコリン、バイグリカン、バーシカン)のタンパク質および遺伝子発現の成長に伴う変化を検討してきた。バーシカンにはRNA splicingによる4つのisoformが存在することが知られているが、従来のRNA probeを用いたノーザン・ハイブリダイゼーションではそれらを区別して定量化することは不可能であった。そこで本研究では、特定のprimerの組み合わせをもとに、PCRでの定量化を可能にするリアルタイムPCR検出装置を用い、バーシカンの4つのisoform、および他の細胞外マトリックスの遺伝子発現に関する分析を行った。その結果、バーシカン全体での遺伝子発現は成長に伴い減少を示し、8週以降一定化することが明らかになった。また、デコリンは増加、バイグリカンは減少を示すことも明らかになった。一方、免疫組織学的検討から、タンパク質の発現は、遺伝子発現に対応して成長に伴い減少傾向を示すこと、および4週齢以降、バーシカンタンパク質の局在の領域差が顕著となり、円板中央部での反応が減少することが明らかとなった。今後は、これらのデータを基に、軟食摂取に伴う顎関節組織における細胞外マトリックスの発現を検討する予定である。本研究では、顎関節円板の細胞外マトリックスの加齢変化をタンパク質および遺伝子レベルで分子生物学的手法を用いて解明することを目的としていた。実験動物として生後2、4、8、12、16,24、32週のWistar系雄性ラットを用いた。リアルタイムPCR検出装置による遺伝子発現の定量:本研究では、従来のRNA probeを用いたノーザン・ハイブリダイゼーションではなく、より定量性の高いリアルタイムPCRを用いて各種プロテオグリカンの遺伝子発現を検討した。その結果、バイグリカンの発現は成長に伴い減少傾向を示したが、デコリンは増加を示した。また、バーシカンの発現は生後8週まで増加したが、その後成長に伴い減少した。ウェスタン・ブロッティングによる各種分子の定量:円板からグアニジンによりコラーゲンとプロテオグリカンに分離/抽出し、透析後、凍結乾燥下で保存する。
解糖系を介した情報伝達と遺伝子発現調節機構の解析

大腸菌は培地中のグルコースに応答して様々な遺伝子の転写を誘導する。この転写誘導には転写制御因子としてMlcが関わっていること、この誘導は、グルコースの取り込みに伴い脱リン酸化されたIICBGlcがリプレッサーであるMlcを膜にトラップすることによることを明らかにしてきた。Mlcの活性阻害作用機構には2つの可能性が考えられる。一つは結合によりMlcタンパクが構造変化をおこし不活性化するというものである。もう一つはグルコース輸送タンパクIICB^<Glc>との結合に伴い、膜にMlcを局在化するとMlcが膜との相互作用などにより不活性化するというものである。これらを検討するために以下の実験を行った。MlcはIICB^<Glc>の細胞質ドメインであるIIBドメインと結合することが知られていたため、IIBドメインのみを発現させその効果を調べた。するとIIBドメイン単独ではMlcを不活性化させることはできなかったが、IIBドメインを膜タンパク質であるLacYと融合させるとMlcを不活性化することができた。次にMlcをLacYと融合させ直接膜に局在させてみた。するとこの膜局在型Mlcはリプレッサーとしての機能を失っていた。LacYの膜貫通ヘリックスの一部をMlcに融合させた場合もMlcは不活性型であった。この膜貫通ヘリックスにフレームシフト変異を入れ細胞質に局在させると、Mlcは通常どおり機能した。以上の結果から、Mlcの不活性化にはIICB^<Glc>は直接には必要でなく、Mlc不活性化は膜へ局在したときに膜との相互作用によって引き起こされると結論した。ここでのIICB^<Glc>の役割はグルコースの感知とそれに伴いMlcを膜に局在させることである。大腸菌グルコース輸送タンパク質IICBGlcは、グルコース輸送に伴い脱リン酸化した状態で転写制御因子Mlcに直接結合し、これを不活性化させる。現在我々はどのようにしてIICBGlc-Mlc相互作用がMlcの不活性化につながるかそのメカニズムの解明をめざし、研究をつづけている。今年度の研究から大きく分けて以下の2つの知見が得られた。まず、Mlc遺伝子内にランダムに変異を導入し、グルコース非応答型の変異体をスクリーニングしその解析をした。この結果得られた変異型Mlcには発現量が上昇しIICBGlcによる制御からはずれたものと、IICBGlcと結合できなくなったものの2種類が存在した。後者の変異部位を決定したところMlcタンパクのN端側にアミノ酸置換が存在した。このことからMlcのN端側にはIICBGlcと結合する部位があることが示唆された。IICBGlcによるMlcの活性阻害作用機構には大きく分けて2つの可能性がある。一つは結合によるMlcのアロステリックな構造変化でオペレーターに結合できなくなるというものであり、もう一つは膜にMlcを局在させることでMlcが膜との作用などにより不活性化するというものである。後者について、MlcあるいはIICBGlcの細胞質ドメインIIBドメインを、膜タンパク質ラクトースパーメアーゼLacYに融合したタンパク質を作成し、その活性を調べその可能性を追究した。その結果MlcをLacYに結合させ直接膜に局在させたとき、あるいはLacY-IIBを介し間接的に局在させたときにいづれもその活性は低下した。これらの結果はMlcの膜への局在が活性阻害に重要であることを示していると思われる。我々はIICBGlc-Mlc相互作用がどのようにしてMlcの不活性化につながるかそのメカニズムの解明をめざし、研究をつづけている。今年度の研究で以下の知見が得られた。Mlc遺伝子内にPCRによるランダム変異を導入し、グルコース非応答型の変異体をスクリーニングした。得られた変異型Mlcには発現量が上昇しIICBGlcによる制御からはずれたものと、IICBGlcとの結合が弱くなったものの2種類が存在した。その結果MlcをLacY-IIBを介し間接的に局在させたときに活性は低下した。またMlcに直接LacYを融合させ膜に局在させたときもMlcの活性はみられなかった。細胞質タンパクであるCRPでは不活性化は見られなかった。このMlcの不活性化はLacY膜貫通ヘリックスの一部で充分であり、膜貫通ヘリックスにフレームシフト変異を入れ細胞質に局在させるとMlcは通常どおり機能した。

この転写誘導には転写制御因子としてMlcが関わっていること、この誘導は、グルコースの取り込みに伴い脱リン酸化されたIICBGlcがリプレッサーであるMlcを膜にトラップすることによることを明らかにしてきた。Mlcの活性阻害作用機構には2つの可能性が考えられる。一つは結合によりMlcタンパクが構造変化をおこし不活性化するというものである。もう一つはグルコース輸送タンパクIICB^<Glc>との結合に伴い、膜にMlcを局在化するとMlcが膜との相互作用などにより不活性化するというものである。これらを検討するために以下の実験を行った。MlcはIICB^<Glc>の細胞質ドメインであるIIBドメインと結合することが知られていたため、IIBドメインのみを発現させその効果を調べた。するとIIBドメイン単独ではMlcを不活性化させることはできなかったが、IIBドメインを膜タンパク質であるLacYと融合させるとMlcを不活性化することができた。次にMlcをLacYと融合させ直接膜に局在させてみた。するとこの膜局在型Mlcはリプレッサーとしての機能を失っていた。LacYの膜貫通ヘリックスの一部をMlcに融合させた場合もMlcは不活性型であった。この膜貫通ヘリックスにフレームシフト変異を入れ細胞質に局在させると、Mlcは通常どおり機能した。以上の結果から、Mlcの不活性化にはIICB^<Glc>は直接には必要でなく、Mlc不活性化は膜へ局在したときに膜との相互作用によって引き起こされると結論した。ここでのIICB^<Glc>の役割はグルコースの感知とそれに伴いMlcを膜に局在させることである。
アルギニノコハク酸リア-ゼのラット脳における発現の分子生物学的解析

尿素排出型動物の肝においてアンモニアの解毒に関与している尿素サイクルは5つの酵素より構成されているが、そのうち、アルギニノコハク酸リア-ゼはアルギニノコハク酸シンテタ-ゼ、アルギナ-ゼとともに脳腎などにも発現している。これまでに、ラット脳アルギニノコハク酸リア-ゼcDNAを単離し、これを解析してきた。更に今回、次のことが明らかになった。1.アルギニノコハク酸リア-ゼはアルギニノコハク酸シンテタ-ゼに比べて、脳内の狭い範囲に分布しており、preliminaryな実験では、核内にも存在している可能性があるという結果を得ている。2.脳cDNAの5'非翻訳領域に存在する2つの大きなオプンリ-ディングフレ-ムが実際に翻訳、発現されているという証拠は今のところ得られていない。3.肝脳に計3種存在するサイズの異なるmRNAの構造の差異について検討したところ、脳cDNAの5'端付近91塩基、3'端付近86塩基両者のどちらをプロ-ブとしてノザ-ン解析を行っても、3種いずれのmRNAとハイブリダイズするという結果を得た。このことより、いわゆるalternative splicingによってサイズの異なるmRNAが生じていることが強く示唆され、その詳細を解析中である。4.ラット脳cDNAをプロ-ブとしてヒト脳cDNAライブラリ-をスクリ-ニングしたところ、約200の陽性クロ-ンを得た。これらのクロ-ンを今後詳しく解析することにより、3.に述べたmRNAに対応するcDNAクロ-ンがこれらの中に見出せる可能性も充分期待できると思われる。(尚、1.は鹿児島大・佐伯武頼博士らとの共同研究である。)尿素排出型動物の肝においてアンモニアの解毒に関与している尿素サイクルは5つの酵素より構成されているが、そのうち、アルギニノコハク酸リア-ゼはアルギニノコハク酸シンテタ-ゼ、アルギナ-ゼとともに脳腎などにも発現している。)
骨軟骨欠損モデル動物を用いた次世代骨軟骨再生医療の検討

皮下脂肪由来間葉系幹細胞(AT-MSC)の凝集塊を積層して円柱の移植構造体を作製した。両側大腿骨の滑車溝に同形・同サイズの骨軟骨欠損部を作り,右に構造体を移植,左は無処置とした。移植後CT検査では,欠損部の周縁と底面から再石灰化が進行し,移植欠損部のX線不透過領域の方が早く縮小した。6ヵ月後の病理組織検査では,移植部は繊維軟骨で,対照部は肉芽組織で充填されていた。12ヵ月後では,移植部で繊維軟骨の一部に硝子軟骨が散見されたが,対照部は表層のみ繊維軟骨であった。移植部深層では軟骨下骨が充実していたが,対照では骨欠損が残存した。人工足場を用いないAT-MSC単独移植による骨軟骨再生が可能となった。【ブタ脂肪由来間葉系幹細胞の移植】ブタの頸部皮下脂肪の一部を無菌的に切除・採取し,0.05%Trypsin及び0.1%CollagenaseTypeIにより処理して脂肪組織を除去した後,遠心分離した細胞を培地と懸濁して10日間培養した。初代培養期間をPassageO(PO)として培養し接着した細胞をフラスコから剥離させて培地を加え,新たなフラスコに播種して継代した。4×10^7個の細胞が得られるまで継代を繰り返し,96穴プレートに1穴あたり5×10^4個の細胞を播種した後さらに2日間培養して,細胞集塊(スフェロイド)を形成させた。スフェロイドを直径4mmの円柱型モールドに詰め込み,さらに7日間培養して移植用プラグを作成した。マイクロミニブタの両側の大腿骨一膝蓋骨間関節を切開し,大腿骨の滑車溝背側面に外径4mmのパンチにて深さ5mmの骨軟骨欠損孔を創り,右側には移植用プラグを無菌的に充填した。一方,左側には欠損孔のみ(対照)として移植を行わなかった。右側の大腿骨及び脛骨を創外固定により14週間固定した後,移植後4週間ごとにX線CT検査にて経過を観察している。このように実験計画は順調に進行している。【ウマ滑液由来間葉系細胞の採取】関節症と診断された馬の関節から無菌的に滑液を採取し,培地を加え,遠心分離して上清を除去した。沈渣として回収された細胞を培地と懸濁し,10日間培養した。この初代培養期間をPassageO(PO)とし,接着した細胞をフラスコから剥離させて培地を加え,再び播種して継代した。P3もしくはP4で目的とする細胞数(1×10^7個)となった。細胞表面抗原の検索結果からこれらは間葉系幹細胞のキャラク「ターを有し,骨及び軟骨への分化誘導が確認されたことから移植に使用できる細胞である可能性が示唆された。実験用ミニブタを用い,大腿骨内側顆荷重面に大型欠損孔を作成して,脂肪由来間葉系幹細胞(AT-MSC)の凝集塊を三次元配置した構造体を移植し,その後の骨軟骨の再生について,CT画像診断で評価した。【実験1】局所麻酔の後,皮膚小切開から注入用カニューレを挿入し,チューメセント液を注入した。吸引用カニューレを挿入し,シリンジにて陰圧をかけながら,皮膚から皮下脂肪を擦り落とすようにカニューレ先端を動かしてチューメセント液と脂肪組織を回収した。これを繰り返して30g程度の脂肪を吸引した。50,000個のAT-MSCを1つの凝集塊とし,それを1,000個堆積して,円柱状(直径6.7mm,深さ10mm)の移植構造体を創った。大型化しても形状を維持できる特殊なストロー内での堆積・培養法を用いた。【実験2】膝関節の内側から膝蓋靭帯に沿って脛骨粗面に達するまで切皮し,関節包を切開して大腿骨内側顆荷重面を露出させた。外径6.7mmの骨円鋸を用いて深さ10mmの骨軟骨欠損孔を作成した。右膝では,ストローに入れた構造体を欠損口に充てて挿入し,構造体を巻く薄いフィルムを剥がして,欠損孔内に全体を静かに納めた。左側は対照とした。【実験3】X線CTを用いて骨軟骨欠損孔の再石灰化を画像診断した。1頭のミニブタでは,移植肢の欠損部における再石灰化が周辺骨との境界部から進行し,術後7か月で80%近い再石灰化が確認された。残る2頭のミニブタは,術後2及び4カ月であり,同様に移植肢は対照肢に比べて欠損部における再石灰化が早まっている。【まとめ】

膝関節非荷重面(滑車溝)におけるAT-MSC凝集塊構造体の移植成果を基に,臨床応用を想定して,より大型の骨軟骨欠損孔を同関節荷重面に作成し,細胞移植治療を試みた。非荷重面移植の場合と同様,移植した欠損孔は再石灰化が早まることが生体の画像診断で確認された。今後は病理組織学的な骨軟骨再生を行う。【脂肪(AT-)または滑膜(SM-)由来間葉系幹細胞(MSC)移植による骨軟骨組織の再生】○目的:膝関節の骨軟骨欠損部にAT-MSCの三次元構造体(プラグ)を自家移植して軟骨と軟骨下骨の再生を評価する。○方法:3頭のマイクロミニピッグ(S1,S2,S3)を用い,両側大腿骨の滑車溝に直径4mm,深さ6mmの骨軟骨欠損を作出した。右側欠損部には自己由来のAT-MSCによる円柱状プラグ(直径4mm,高さ6mm)を埋植する一方で,左側は無処置(対照)とした。移植後1ヵ月毎にCT撮影を行い,欠損部における骨再生の経過を監視した。S1とS3は移植後6ヵ月,S2は12ヵ月で欠損部の病理組織学的評価を行った。○結果と考察:S1とS2のCT検査では,プラグ移植側の欠損部における骨再生が移植後3ヵ月から確認できるようになり,骨欠損はその後も次第に縮小し,12ヵ月後には完全に回復した。しかしながら対照肢の骨軟骨欠損部のCT画像では,6ヵ月及び12ヵ月後においても軟骨下骨の再生は完了しなかった。S3では,いずれの側の膝関節においても欠損した骨軟骨の再生を示唆する所見は認めなかった。S1(移植後6ヵ月)の病理組織検査では,移植部における骨軟骨組織の再生は未だ不完全(表層は厚い線維軟骨組織,深層は骨組織)であったものの,S2(移植後12ヵ月)では欠損部表層の軟骨組織は周囲の正常軟骨と同じ厚さの硝子軟骨が再生されており,深層部には軟骨下骨が発達していた。その一方で,対照肢には充分な骨軟骨の再生像は確認できなかった。S3では,両側の欠損部が全層にわたって脂肪組織で充填されており,軟骨の修復及び軟骨下骨の形成は認められなかった。AT-MSCのプラグ移植による(人工足場を用いない)骨軟骨組織の再生がブタで初めて実証された。○SM-MSCの研究では,馬の骨軟骨組織欠損(骨嚢胞症例)に細胞を注入する準備を整えた。基礎実験である脂肪組織からの間葉系幹細胞の分離・培養法を確立し,骨軟骨欠損孔へのプラグ移植を4頭のブタで実施できた。次年度はこれら実験ブタの組織学的評価を行う予定である。先に行う計画となっているウマの幹細胞移植に向けて,臨床例から材料を得やすい関節液からの幹細胞分離を試み,これもすでに分離・培養を可能としている。移植に必要とされる細胞数も34継代で達成できており,ウマから脂肪を得なくとも骨軟骨欠損へ適用する移植片を作成できると考えている。25年度が最終年度であるため、記入しない。○組織由来の間葉系幹細胞(MSC)移植による骨軟骨組織再生の研究を遂行している。当初計画では,分離培養した脂肪組織由来MSC(AT-MSC)塊であるスフェロイド(小球)を760個積重ねて三次元構造体(プラグ)を作成する過程が,大きな難所であることが想定された。しかし,共同研究者の協力を得ながら,細胞構造体の形成・培養技術が初年度のうちに確立され,平成23年度末にブタへのプラグ作成手術を実施することができた。引き続き,平成24年度は移植部分の画像診断を定期的に行った。術後毎月CT画像を得て,軟骨下骨の再生を継続的に監視した。幸運なことに,3頭中2頭のブタにおいて順調な骨再生を確認できた(残る1頭では移植部で骨化が進まず,最終的に骨軟骨再生を認めなかった)。この2頭のブタは,それぞれ移植後6ヵ月と12ヵ月で病理解剖した。いずれも予め想定された再生過程と一致した病理学的所見を得ることができた。
特異的分子ツール設計法：プロテインキナーゼ指向型立体構造規制ペプチドライブラリー

プロテインキナーゼは、細胞の周辺環境に対する応答や細胞分裂の際にはたらく酵素である。ヒトゲノムには500種以上のプロテインキナーゼの存在が明らかとなっているが、多くの機能は未解明である。個々のキナーゼの生物学的機能を解明するために、研究対象とするキナーゼを特異的に制御する分子ツールの創出が必要である。また、異常型キナーゼは癌などの疾患原因となるため、異常型キナーゼに対する特異的分子ツールは、医薬品リードとして期待できる。本研究ではプロテインキナーゼ特異的阻害剤の新しい分子設計、創出手法を確立した。本手法により、生物学研究用分子ツールならびに医薬品創成研究に寄与できる。本研究課題では、プロテインキナーゼを標的タンパク質とした特異的分子ツール(阻害剤)設計方法の確立を試みた。平成26年度は、進化分子工学の代表的手法であるファージ表層提示法を基盤としたプロテインキナーゼ指向型マイクロ抗体ライブラリーの作製を試みた。(1)最初に、ファージ表層提示マイクロ抗体へ低分子化合物を導入する手法を確立した。次に(2)マイクロ抗体を基盤としたプロテインキナーゼ指向型二価阻害剤ライブラリーを作製した。(1)チオール基選択的な化学修飾法を利用して、ファージ表層提示マイクロ抗体の選択的な化学修飾を試みた。ファージには、コートタンパク質にシステインをもたない繊維状ファージ(Cys-Freeファージ)を用いた。まず、ファージのコートタンパク質pIIIに、システインを1残基もつマイクロ抗体を提示させた。マレイミドで標識されたビオチンを加えて修飾した結果、このファージがストレプトアビジンへ選択的に結合することを確認した。このように、Cys-Freeファージ表層上のマイクロ抗体に、マレイミド基をもつ化合物を導入する方法を確立した。(2)プロテインキナーゼ指向型ライブラリーとして、プロテインキナーゼのATP認識部位結合性の低分子化合物をもつマイクロ抗体ライブラリーの作製を試みた。ATPの構成要素の1つであるアデノシンをATP競合性低分子化合物として選び、これにマレイミド基を導入した化合物マレイミド-アデノシンを合成した。さらにファージ表層提示マイクロ抗体ライブラリーを調製し、このファージ溶液にマレイミド-アデノシンを加えてマイクロ抗体を修飾した。このアデノシンで修飾されたファージ表層提示マイクロ抗体ライブラリーを、プロテインキナーゼ指向型二価阻害剤ライブラリーとした。本研究課題は、プロテインキナーゼ(以下PK)を標的タンパク質とした特異的分子ツール(阻害剤)設計法の確立を目的とする。平成27年度では、先に作製したPK指向型マイクロ抗体ライブラリーを用いて、オーロラキナーゼA(以下AurA)選択的な阻害剤の創出を試みた。(1)最初に、AurA選択的に結合するファージクローンを得た。(2)次に、得られたファージクローンが提示するアデノシン修飾型マイクロ抗体を化学的に合成した。(3)さらに、合成したアデノシン修飾型マイクロ抗体について、AurA阻害活性ならびにAurA選択性を評価した。1.ファージ表層提示法を基盤とするPK指向型マイクロ抗体ライブラリーを用いて、AurA選択的なファージクローンの獲得を試みた。まず、AurAを96ウェルプレートへ固定化し、固定化量依存的なキナーゼ活性を確認した。次に、このキナーゼ固定化ウェルにPK指向型ライブラリーを加えてスクリーニングを行った。その結果、AurA選択性クローンの優先的な増幅が見られた。任意に選んだクローンのDNA配列から、獲得したマイクロ抗体のアミノ酸配列を決定した。2. 1.で得たマイクロ抗体Adc-Bip-3を合成した。まずFmoc固相合成法を用いてマイクロ抗体Bip-3を化学的に合成した。さらに、マレイミド化アデノシン反応させて、アデノシン修飾型マイクロ抗体Adc-Bip-3を得た。3.Adc-Bip-3、Bip-3、ならびにアデノシンについてIMAP TR-FRET法によりAurAに対するキナーゼ活性阻害試験を行った。Adc-Bip-3のAurA阻害性が最も高かったことから二価阻害剤獲得とした。異なるキナーゼファミリーに対して同様に評価したところ、Adc-Bip-3が最もAurAを強く阻害した。これらのことからPK指向型マイクロ抗体ライブラリーを用いたAurA選択的阻害剤の創出とした。本研究課題の平成27年度計画である、(1) PK指向型マイクロ抗体ライブラリーを使ったAurA選択的結合活性ファージクローンの獲得、(2)得られたマイクロ抗体の化学合成、ならびに、(3) AurAキナーゼ阻害活性とAurA選択性を評価した。これらのことから本研究課題はおおむね順調に進行しているとした。1. PK指向型ライブラリーを用いて多数のAurA結合性クローンを得た。一般に、ペプチドライブラリーから分子標的阻害剤を得るのは極めて困難であるが、PK指向型マイクロ抗体ライブラリーを用いることで、AurA選択的に結合するファージクローンを迅速に得ることができた。得られたファージクローンのDNA配列からマイクロ抗体のアミノ酸配列を決定したところ、コンセンサスな配列が見られた。2. 1.で最も出現頻度が高かったクローンが提示するマイクロ抗体Adc-Bip-3を化学的に合成した。最初にBip-3をFmoc固相合成法により合成してRP-HPLCにより精製した。一般にペプチドの合成効率はアミノ酸配列に依存する。Bip-3は約40残基と長鎖ペプチドにもかかわらず標準的な条件で十分量合成ができ、また十分な水溶性を有した。

このBip-3に、システイン選択的なマレイミド基をもつアデノシンを加えたのちRP-HPLCにより精製し、アデノシン修飾型のAdc-Bip-3を得た。3. IMAP TR-FRET法を用いてAdc-Bip-3のAurA阻害活性を調べた。Adc-Bip-3はBip-3に比べ、約10倍AurA阻害活性高かった。また、Bip-3の阻害様式をラインウィーバーバークプロットにより評価したところ、ATPと競合しなかった。すなわちBip-3はAurAのATP認識部位と異なる部位を認識することを明らかにした。これらの結果から、Adc-Bip-3はAurAを二価的に阻害することを明らかにした。このように研究計画(1)-(3)を実施できたことから、本研究はおおむね順調に進展しているとした。本研究課題は、プロテインキナーゼ(以下PK)を標的タンパク質とした特異的分子ツール設計法の確立を目的とする。これまでに、PK指向型マイクロ抗体ライブラリーを構築し、オーロラキナーゼA(以下AurA)選択的な二価阻害剤アデノシン(Adc)-Bip-3を創出した。平成28年度は、Adc-Bip-3への細胞膜透過性付与を試みた。(1)マイクロ抗体Bip-3を土台としたBip-3低分子化ペプチドとしてcH-Bip-3a(b)を設計し、(2)化学的に合成して立体構造を調べた。(1)架橋剤Bphはペプチド鎖のi, i+6番目のシステイン側鎖をビスアルキル化反応により架橋することで、安定な1本鎖ヘリックス構造をもつペプチドが作製できる(Chem. Commun. 2011, 47, 9396.)。ヘリックス-ループ-ヘリックス構造をもつBip-3のC末端側ヘリックス部位がAurAを認識する。この15残基ペプチドをBphで架橋したヘリックスペプチドを設計した。(2) i, i+6番目のロイシンをシステインに置換した2種のペプチドcH-Bip-3a (Ac-KCEYLKWKCWPLKGW-NH2)、cH-Bip-3b (Ac-KLEYCKWKLWPCKGW-NH2)、また土台分子由来のcH-YT1(Ac-KLAACALAALACKAY-NH2)を、それぞれFmoc固相合成法により合成した。これらの合成ペプチドをBphと反応させて環状化ペプチドを合成した。CDスペトル測定により、ペアレントペプチドYT1を土台としたcH-YT1はヘリックス構造を保持したが、cH-Bip-3aとcH-Bip-3bはともにヘリックス構造をもたなかった。(1)(2)より、細胞膜透過性付与を目的としたBip-3のAurA結合領域のダウンサイジングには、より最適な分子内架橋方法が必要なことが明らかとなった。プロテインキナーゼは、細胞の周辺環境に対する応答や細胞分裂の際にはたらく酵素である。ヒトゲノムには500種以上のプロテインキナーゼの存在が明らかとなっているが、多くの機能は未解明である。個々のキナーゼの生物学的機能を解明するために、研究対象とするキナーゼを特異的に制御する分子ツールの創出が必要である。
メチシリン耐性黄色ブドウ球菌の耐性獲得と難治性を助長する生物学的因子の解明

黄色ブドウ球菌(S.a)は鼻腔や、口腔内にも常在し、歯科治療時にも感染する可能性がきわめて高い。平成15年度は、広島大学附属病院口腔外科で、外来初診患者の口腔と鼻腔からS.aを分離し、薬剤耐性の有無を測定し、その概要を第48回ブドウ球菌研究会(広島市、2003年9月)、第14回広島感染症研究会(広島市、2003年12月)において発表した。本年度は、宿主側である口腔粘膜の感染、炎症における免疫反応を検討するため、不死化口腔粘膜上皮細胞、不死化線維芽細胞を用いて、免疫細胞遊走を主要とするchemokineの炎症時、菌体接触時における発現を検討した。材料および方法不死化口腔粘膜上皮細胞、不死化線維芽細胞を用いて、INF-γ(10ng/ml)、TNF-α(10ng/ml)、グラム陰性菌体成分であるLPS(1ug/ml)、黄色ブドウ球菌加熱死菌(1ug/ml)で刺激後、経時的に全RNAを抽出、cDNAを作製し、各種chemokineの定量的RT-PCRを施行した。結果メチシリン耐性黄色ブドウ球菌(MRSA)による院内感染は歯科領域においても解決しなければならない重要な課題である。黄色ブドウ球菌は鼻腔や,口腔内に常在しているため,歯科治療時に感染する可能性が極めて高いのにもかかわらず,歯科領域で発現したMRSAを染色体DNAに型別に分類し,またそのβーラクタム剤耐性パターンを示した報告は極めて少ないのが現状である。今後はMRSAの治療指標が必要と考えられ,その感染経路を証明し,獲得耐性と難治性への影響因子を検討することが重要であると考える。今回,当大学病院口腔外科外来初診患者120人に口腔また鼻腔よりブドウ球菌選択培地を用いて,ブドウ球菌を分離した。その分離株の中から,黄色ブドウ球菌鑑別キットを用いて,黄色ブドウ球菌を分離した。その結果,鼻腔から36株,口腔から27株の63株の黄色ブドウ球菌を分離することができた。黄色ブドウ球菌所有患者は54人(男23人,女31人)で,年齢は50歳から80歳の中高年齢層が多かった。当科受診時の臨床診断は智歯周囲炎が11人と最も多かった。鼻腔と口腔の両方から分離することができた患者は9人であり,13歳から73歳で特に年齢の差は認められなかった。それら分離株の薬剤耐性の現状を知るため,βーラクタム剤,蛋白合成阻害剤,DNA合成阻害剤等に対する最小発育阻止濃度(MIC)を測定し,さらにMRSAを分離すること。また分離した株から染色体DNAを抽出し,染色体DNA型別の分類の検討を現在行っている。黄色ブドウ球菌(S.a)は鼻腔や,口腔内にも常在し,歯科治療時にも感染する可能性がきわめて高い。今回,広島大学附属病院第二口腔外科で、外来初診患者の口腔と鼻腔からS.aを分離し,薬剤耐性の有無を測定した。方法患者140人の口腔と鼻腔から,黄色ブドウ球菌ラテックスキット(栄研)を用いてS.aを分離し,微量液体希釈法により,β-ラクタム系薬剤であるメチシリン(DPIPC),フロモキセフナトリウム(FMOX),塩酸セフカペンピポキシル(CFPN),セファクロル(CCL),イミペネム(IPM),マクロライド系のクラリシッド(CAM),ニューキノロン系の塩酸ロメフロキサシン(LFH),グリコペプチド系薬のバンコマイシン(VCM)が示す最小発育阻止濃度(MIC)を測定した。また分離したメチシリン耐性黄色ブドウ球菌(MRSA)のコアグラーゼ型を検索した。結果検索対象は,鼻腔の35株,口腔の30株で,計65株のS.aが分離できた。S.aの分離できた患者は男性21人、女性32人で、70歳以上80歳未満が最も多かった。S.a65株のうちMRSAは8株で、このうち6株はニューキノロン系薬剤耐性で、すべてがマクロライド系薬剤耐性の多剤耐性型のMRSAであった。この8株はすべてVCM感受性であった。MRSAのコアグラーゼ型はII型が8株中6株と最も多かった。MRSA保菌者は何らかの全身疾患を有している患者であることが示唆された。今回の研究の要旨を第48回ブドウ球菌研究会(広島市、2003年9月)、第14回広島感染症研究会(広島市、2003年12月)において発表した。材料および方法不死化口腔粘膜上皮細胞、不死化線維芽

細胞を用いて、INF-γ(10ng/ml)、TNF-α(10ng/ml)、グラム陰性菌体成分であるLPS(1ug/ml)、黄色ブドウ球菌加熱死菌(1ug/ml)で刺激後、経時的に全RNAを抽出、cDNAを作製し、各種chemokineの定量的RT-PCRを施行した。結果
自己免疫性肝炎の肝内CD1b陽性抗原提示細胞に抗スルファチド抗原提示の解析

本研究の目的は、肝内浸潤T細胞の約半数を占めるVα24陽性T細胞(末梢性免疫寛容の維持に関与するとされるVα24陽性JαQ陽性T細胞、自己免疫性疾患の発症に関与するとされるVα24陽性JαQ陰性T細胞)の自己免疫性肝疾患における動態を解析し、それらの細胞と自己免疫性肝疾患の病態との関連を明らかにすることである。患者さんに検体の一部を本研究に用いることを説明し承諾を得た後に採取した検体を用い検討した。1 AIH症例の50%では肝内からVα24-JαQ遺伝子断片が検出されなかった。2 Vα24-JαQ遺伝子断片が検出されない症例は、ALT値が高値で、組織学的活動性も強く、PSL治療が著効した。3 PBCでは治療の有無、ALP値、組織学的活動性に関わらず、全例で肝内からVα24-JαQ遺伝子断片が検出された。4 CHCでも活動性に関わらず、全例でVα24-JαQ遺伝子断片が検出された。これらのことから、AIHの発症進展に、肝内におけるVα24-JαQ陽性T細胞の減少が関与する可能性が示された。自己免疫性肝炎(AIH)の発症、進展に、肝内CD1b陽性抗原提示細胞によるスルファチド抗原提示、自己反応性T細胞によるCD1d陽性肝細胞障害が関与するか解析することが、本研究の目的である。本年度は以下の検討を行った。なお、当科入院中に診断、治療方針決定のために施行した肝生検時に採取した生検肝組織の一部を研究材料に用いた。この際、肝生検施行前に患者さんに研究の目的、採取した組織の一部を研究材料に用いることを丁寧に説明し、患者さん本人から承諾を得た上で実施した。1.各種肝疾患における肝内CD1b陽性抗原提示細胞の分布抗CD1bモノクローナル抗体を用いた免疫組織化学的検討により、AIH、PBC、慢性C型肝炎の肝内CD1b陽性抗原提示細胞の分布を検討した。その結果、類洞内に存在するクッパー細胞の一部がCD1b陽性であったが、発現頻度は各疾患間で有意差は認めなかった。2.各種肝疾患における肝内CD1d陽性肝細胞の分布抗CD1dモノクローナル抗体を用いた免疫組織化学的検討により、AIH、PBC、慢性C型肝炎の肝内CD1d陽性肝細胞の分布を検討した。疾患間で陽性肝細胞の多寡に差異があることを期待したが、今回用いた抗体では陽性肝細胞を検出することが出来ず、現在他の抗体を用い検討中である。自己免疫性肝疾患における肝内CD1b陽性抗原提示細胞、CD1d陽性肝細胞の動態を解析し、免疫病態への関与を明らかにすることが、本研究の目的である。患者さんに、生検材料の一部を本研究に用いることを説明し同意した後に得た肝生検組織の一部を用い検討し、以下の結果を得た。1.免疫組織化学的方法を用いて、自己免疫性肝炎における肝内CD1b陽性マクロファージの動態解析を試みたが、技術的問題によりCD1b陽性細胞の同定が困難であった。市販されている種々の抗体を用い、実験条件をさまざまに変更しても、残念ながら同定できなかった。2.一方、CD1d分子による抗原提示により活性化されるVα24JαQ陽性細胞の、種々の肝疾患の病態への関与が報告されつつあることから、AIHにおける同細胞の動態を検討したところ、検討例の半数で肝内にVα24JαQ遺伝子断片が検出された。一方、原発性胆汁性肝硬変症、慢性C型肝炎においては、組織学的活動性、ALT、ALP値のいかんに関わらず、全例で肝内にVα24JαQ遺伝子断片が検出された。3.肝組織におけるCD1d陽性細胞の動態を、免疫組織化学的方法を用いて検討したところ、慢性C型肝炎、原発性胆汁性肝硬変においては、肝細胞に均一に表出していることが明らかになり、現在AIHにおける肝細胞のCD1d発現動態を検討中である。以上より、今後本研究では、AIHにおけるVα24JαQ陽性細胞の動態、CD1d分子の発現動態に焦点をあてて検討していく予定である。

本研究は自己免疫性肝炎(AIH)における、I)肝内CD1b陽性細胞による酸性糖脂質スルファチド抗原提示機能の解析、II)自己肝細胞反応性T細胞によるCD1d陽性肝細胞障害の解析を行い、疾患特異的自己抗原の同定、抗原提示機序および肝細胞障害機序の解明という、AIHの免疫学的病態形成の根幹に関わる問題点を明らかにすることを目的とする。今年度はAIHにおけるCD1d陽性肝細胞の動態の解析を行った。患者さんに検体の一部を本研究に用いることを説明し承諾を得た後に採取した検体を用い検討した。§CD1d陽性肝細胞の動態の解析:AIHにおけるCD1d陽性肝細胞の動態解析免疫組織化学、in situ hybridization、RT-PCRにより、AIHの肝細胞CD1d発現をタンパク、遺伝子レベルで解析し、疾患活動性との関連、他の肝疾患との差異を検討したところ、他の肝疾患に比し,AIHで肝細胞のCD1d発現が著明に増強している傾向は認めなかった。また炎症性サイトカインによる正常肝細胞のCD1d発現増強効果をFACS、RT-PCRにより評価したところ、IFN-γによりCD1d発現が増強されることが示された。
遷延性術後痛発症スクリーニング検査法の開発

口腔外科領域の予定手術患者を対象に、周術期(術前、術直後、術数か月後)にCPMとTPIを評価した。CPM評価のためのテスト刺激として、利き手前腕(橈側手根屈筋)に一定の圧力で加圧可能な自作圧痛覚測定システム(プローブ面積:1cm2,圧力3 N/s (= 30kPa/s ))(AIKOHエンジニアリング,日本)を用いて圧刺激(30 kPa/s)を与え、条件刺激前、条件刺激中、条件刺激終了10分後の3回、圧痛覚閾値(pressure pain threshold: PPT)を測定した。CPM誘発のための条件刺激は、Peltier素子を電気的に制御する特注型冷温刺激装置(VICS、東京、日本)を用いて、各個人における主観的痛み(visual analogue scale: VAS)が70/100mmとなる強度で利き手反対側前腕に冷温刺激を与えた。条件刺激中と条件刺激前のPPTの比からCPM効果を算出した。TPIは、特注型冷温刺激装置を用いて、各被験者においてVAS=70/100mmとなる冷刺激温度および温刺激温度の繰り返し刺激に対する錯感覚の有無を評価した。さらに、患者背景(年齢、性別、性周期、慢性疼痛の有無およびそのVAS値と鎮痛剤使用量、疼痛罹患歴、抑うつ傾向、疼痛破局的思考尺度等)、術後急性痛発症の有無およびその主観的痛み強度(visual analogue scale: VAS)と罹患期間、術後急性痛発症時の鎮痛剤使用量について情報収集した。口腔外科領域の予定手術患者を対象に、周術期にCPMとTPIを評価し、術後急性痛および遷延性術後痛発症の有無、その主観的痛み強度(VAS)と罹患期間、術後急性痛発症時の鎮痛剤使用量、患者背景(年齢、性別、性周期、疼痛罹患歴、抑うつ傾向等)について情報収集した。口腔外科領域の予定手術患者を対象に、引き続きデータ収取の予定である。研究データ解析のためのPC、統計解析ソフト、論文投稿のための画像ソフト購入のため使用予定である。
ヒト化抗体とCD26の核内移行によるRNAポリメラーゼII標的抗がん療法の開発

CD26は多種類のヒトがんにおいて高発現している。これまでヒト化抗CD26モノクローナル抗体の開発を通じて、本抗体がCD26をがん細胞膜表面から核内に移行させ、核内CD26がRNAポリメラーゼIIサブユニット(POLR2A)の転写を抑制し細胞増殖を阻害すること、この核移行と増殖阻害ががん細胞特異的であることを報告した。さらに抗がん分子を本抗体に結合させ核内で抗がん効果を発揮させる方法を開発した。そこで本研究では、1)がん細胞におけるCD26と抗体の核輸送とPOLR2A転写抑制の分子機構の解明、2)がん組織検体におけるPOLR2A遺伝子欠失と相関するバイオマーカーの開発、3)本抗体とPOLR2A阻害剤の結合による分子標的療法の開発、を行っている。その結果、1)CD26の核輸送に関与する分子としてTransportin 1、Importin 7、NUP214を同定し、POLR2A転写調節領域でCD26と会合する分子としてRanBP1を見出し、正常細胞とがん細胞での発現・機能の解析を進めており、2)がん組織において17p13領域およびp53遺伝子とPOLR2A遺伝子の欠失があった同一腫瘍でRNAポリメラーゼII構成分子群や基本転写因子群の発現解析を行い、TFIIHなどのバイオマーカーの候補分子を選別し、3)RNAポリメラーゼII構成分子群や基本転写因子群の阻害分子をヒト化抗CD26抗体へ結合し、in vitro, in vivoでの抗がん活性を明らかにした。本抗体は、通常の免疫機構を介した抗がん作用のみならず、増殖抑制や浸潤・運動阻害などの直接的な抗がん作用を有すことから、この抗体-薬剤複合体(Antibody-Drug Conjugate;ADC)は、さらに相加・相乗的な効果が期待される。平成30年度が最終年度であるため、記入しない。その結果、1)POLR2A転写調節領域でCD26/抗体と会合する分子をtwo-hybrid法にて同定し、これらの分子の正常細胞とがん細胞での発現・機能の解析を進めており、2)がん組織において17p13領域およびp53遺伝子とPOLR2A遺伝子の欠失を明らかにし、同一腫瘍でRNAポリメラーゼII構成分子群や基本転写因子群の発現解析を通してバイオマーカーの候補分子を見出し、3)RNAポリメラーゼII構成分子群や基本転写因子群の阻害分子をヒト化抗CD26抗体へ結合することに成功し、現在、in vitroでの抗がん活性を検討している。本ヒト化抗体は、通常の免疫機構を介した抗がん作用のみならず、増殖抑制や浸潤・運動阻害などの直接的な抗がん作用を有すことから、この抗体-薬剤複合体(Antibody-Drug Conjugate;ADC)においては、さらなる相加・相乗的な効果が期待される。1)がん細胞におけるCD26と抗体の核輸送とPOLR2A転写抑制の分子機構の解明:ヒト肝癌細胞株HCC-1,ヒト肺腺癌細胞株A549の核抽出成分・細胞質成分からCD26の免疫沈降を行い、CD26結合蛋白を単離し、質量分析およびアミノ酸配列決定した。現在、核移行シグナルを有するものを候補として、免疫沈降によりCD26との会合を検証している。またPOLR2A転写調節領域でCD26/抗体と会合する分子をtwo-hybrid法にて探索すべく、CD26/抗体の核輸送効率が高いヒト中皮腫細胞株JMNとCD26/抗体の核輸送が見られないヒト血管内皮細胞の2つのライブラリーを作成した。現在、核移行シグナルを有するもの、あるいはデータベース上、核内にその存在があるものを候補として免疫沈降法によりCD26との会合を検証している。3)本抗体とRNAポリメラーゼII阻害剤の結合による分子標的療法の開発:RNAポリメラーゼII構成分子群および基本転写因子群に対する各種阻害分子(α-amanitinおよびtriptolide)を独自のリンカーを用いてヒト化抗CD26抗体へ結合させ、アフィニティカラムにてIgG1として精製した。精製した結合分子について、試験管内での抗がん活性を測定している。

そこで本研究では、1)がん細胞におけるCD26と抗体の核輸送とPOLR2A転写抑制の分子機構の解明、2)がん組織検体におけるPOLR2A遺伝子欠失と相関するバイオマーカーの開発、3)本抗体とPOLR2A阻害剤の結合による分子標的療法の開発、を行っている。その結果、1)POLR2A転写調節領域でCD26/抗体と会合する分子の候補として3分子を見出し、これらの分子の正常細胞とがん細胞での発現・機能の解析を進めており、2)がん組織において17p13領域およびp53遺伝子とPOLR2A遺伝子の欠失があった同一腫瘍でRNAポリメラーゼII構成分子群や基本転写因子群の発現解析を行い、数種類のバイオマーカーの候補分子を見出し、3)RNAポリメラーゼII構成分子群や基本転写因子群の阻害分子をヒト化抗CD26抗体へ結合し、in vitro, in vivoでの抗がん活性を明らかにした。本抗体は、通常の免疫機構を介した抗がん作用のみならず、増殖抑制や浸潤・運動阻害などの直接的な抗がん作用を有すことから、抗体-薬剤複合体(Antibody-Drug Conjugate;ADC)にすることで、さらに相加・相乗的な効果が期待される。1)がん細胞におけるCD26と抗体の核輸送とPOLR2A転写抑制の分子機構の解明:ヒト肝癌細胞株HCC-1,肺腺癌細胞株A549の核抽出・細胞質成分からCD26の免疫沈降を行い、CD26結合蛋白を単離、質量分析、アミノ酸配列決定した。現在、核移行シグナルを有する候補として、Transportin 1など3種類を見出し免疫沈降によりCD26との会合を確認した。またPOLR2A転写調節領域でCD26/抗体と会合する分子を探索すべく、ヒト中皮腫細胞株JMNのライブラリーを作成し、核移行シグナルを有するもの、およびデータベース上、核内にその存在があるものとしてNUP214など数種類を見出し免疫沈降法によりCD26との会合を確認した。3)本抗体とRNAポリメラーゼII阻害剤の結合による分子標的療法の開発:RNAポリメラーゼII構成分子および基本転写因子に対する阻害分子(α-amanitinおよびtriptolide)をリンカーを用いて抗CD26抗体へ結合させ精製した。精製した結合分子の中で、抗体とtriptolideの結合分子はin vitro, in vivoででの抗がん活性を発揮することを見出した。CD26は多種類のヒトがんにおいて高発現している。これまでヒト化抗CD26モノクローナル抗体の開発を通じて、本抗体がCD26をがん細胞膜表面から核内に移行させ、核内CD26がRNAポリメラーゼIIサブユニット(POLR2A)の転写を抑制し細胞増殖を阻害すること、この核移行と増殖阻害ががん細胞特異的であることを報告した。さらに抗がん分子を本抗体に結合させ核内で抗がん効果を発揮させる方法を開発した。その結果、1)CD26の核輸送に関与する分子としてTransportin 1、Importin 7、NUP214を同定し、POLR2A
19世紀における環日本海交易と日本海沿岸経済の研究

富山県新湊市の宮林家と新潟県能生町の伊藤家の史料調査を行い、両家所蔵文書の整理とマイクロカメラでの撮影を行った。分析の結果、両家ともに19世紀に日本海海運で活躍した船持商人であったが、明治期の両家の経営展開はかなり異なっていたことが判明した。宮林家は、18世紀は網元として大規模に鰯漁を行っていたが、19世紀前半に和船を所有して領主米を輸送したり北海道へ進出して買積経営を行った。同家は海運経営から上がった利益をもとに幕末から明治期にかけて土地取得を進め、明治35年時点で約41町歩の耕地を所有した。海運経営は明治になると縮小し、松方デフレで損失を出したためか明治20年前後に海運経営を止めた。地元会社には明治初年から積極的に関わり、明治10年の第十二国立銀行設立の際には取締役となり、明治14年の越中風帆船会社設立の際にはその有力な出資者となった。伊藤家は、18世紀は小型和船を1隻所有し、ローカルな回漕業を営んでいたが、19世紀になると大型和船を多数所有するようになり、活動範囲も北海道から瀬戸内・畿内に及んだ。宮林家と同様に伊藤家も土地取得を行ったが、宮林家ほどに大規模には行わず、むしろ明治期には西洋型風帆船を購入するなど、海運経営を発展させた。そして本店を能生町から北海道の小樽へ移転し、活動の拠点を北海道においた。新潟県の地元会社への関わりはほとんど見られず、地域経済とのつながりは薄かった。
食生活が腸管の健康とアレルギー発症におよぼす影響についての研究

徳島大学病院皮膚科外来にて軽度のアトピー性皮膚炎と診断された患者の自然排泄便の菌叢をTerminal-Restriction Fragment Length Polymorphism法と培養法により解析した。食物摂取頻度調査票を用いて調べた被験患者の食生活には特に偏りはなかったが、菌叢のパターンは健常人とも潰瘍性大腸炎患者とも異なっていた。また、糞便中の総菌数、好気性菌の生菌数は健常人と同程度であり、潰瘍性大腸炎のような菌叢の多様性の減少は見られなかった。食生活と便通異常およびアトピー性皮膚炎等アレルギー症状の有無の関連を調査するため、「食生活が腸管の健康とアレルギー発症に及ぼす影響についての臨床研究」を計画し、以下の研究内容が徳島大学附属病院倫理審査委員会により承認された。1.徳島大学病院皮膚科外来にてアトピー性皮膚炎の重症度の診断を受ける、2.自然排泄便の提供、3.食生活調査票への回答、4.腸管の透過性テスト(マンニトール服用後の0-5時間尿の提供)を1セットとして被験者1名につき3セット行うことにした。20名のアトピー皮膚炎患者、および同数のアレルギーのないコントロール被験者から得られる検体を腸内菌叢を含めた腸内環境の解析に用いる。現在、アトピー患者(無症状者も含めて)4名に同意説明文書を用いて説明を行い、3名から同意を取得した。2名については1セット目が終了しており、Terminal-R.estriction Fragment LengthPolymorphism(T-RFLP)法により腸内菌叢を解析中である。T-RFLP法による菌叢の解析結果を皮膚炎の重症度や食生活の特徴などとともにデータベース化し、健康人との比較およびMICROBIOTA PROFILERによる菌種検索を行う。このデータベースには健康人と潰瘍性大腸炎患者の解析データをすでに蓄積しているので、今回得られるアトピー性皮膚炎患者の情報を上積みすることによって、患者に特徴的な腸内菌あるいは腸内環境があるのかどうかを明らかにできると考えている。食生活とアトピー性皮膚炎等アレルギー症状の有無の関連を調査するため、「食生活が腸管の健康とアレルギー発症に及ぼす影響についての臨床研究」(徳島大学附属病院倫理審査委員会により承認済み)への被験者を募集し、同意取得できた4名の被験者について、(1)アトピー性皮膚炎の重症度の診断、(2)自然排泄便の提供、(3)食生活調査票への回答、(4)腸管の透過性テストを13セット行った。食物摂取頻度調査の結果、食生活の内容は一般健康成人とほぼ同じであった。今回の糞便の解析結果を以前に収集した健常人および潰瘍性大腸炎患者の結果と比較してみたところ、糞便中の総菌数、Enterobacteriaceaeや好気性グラム陽性球菌の生菌数には健常人との間で有意差はなかった。Terminal-Restriction Fragment Length Polymorphism(T-RFLP)法により解析したアトピー患者の腸内菌叢のパターンをBionumericsによりクラスタリングすると、健常人とも潰瘍性大腸炎患者とも異なるクラスターを形成したので、菌叢は異なっていると考えられる。T-RFピーク数は、健常人よりも多く、潰瘍性大腸炎のような菌叢の多様性の減少は見られなかった。糞便中の短鎖脂肪酸の濃度には有意差はなかった。腸管の透過性の指標として測定した尿中排泄されたlactulose/mannitolの比は既報中の健康人の値と同程度であった。糞便中のs IgA濃度は192.312721.2μg/gであった。これらの解析結果と被験者の皮膚炎スコアのマッチングを現在行っている。菌叢解析の結果および症状スコアをもとにMICROBIOTA PROFILERによる菌種検索を行い、アトピー患者に特徴的な腸内菌あるいは腸内環境があるのかどうかをさらに検討する予定である。ヒトの便中菌叢は非常に個体差が大きく菌叢の違いとアレルギー発症の関連を結びつけるのは困難であるので、今後は動物モデルを用いた検討が必要と考える。今年度はまずアトピー性皮膚炎(AD)モデル(NC/JicJclマウスにダニ抗原エキスを塗布)を用い、飼料中の食物繊維の増量による症状の抑制効果を検討したが、ダニ抗原による皮膚炎の誘導が非常に強く、食物繊維による皮膚炎スコアの改善および血清中.IgE濃度の抑制は見られなかった。ADや食物アレルギー患者では腸管のバリア機能が低下しているとの報告がある一方、腸内菌による食物繊維の発酵代謝により生成する短鎖脂肪酸、特に酪酸は大腸上皮細胞の増殖、分化を促進し、腸管バリア機能を高める作用が報告されている.そとで腸内菌のうちどの菌種穫が腸内環境を良好に保つ上で重要であるのかを明らかにするため、無菌マウスにマウス腸管内から分離した主要構成菌を定着させ、腸管組織の観察と盲腸内の短鎖脂肪酸の定量を行った。