hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
進化的アプローチとプロテオーム解析を基盤とした熱ショック応答機構の解明

申請者は、DNAプルダウンアッセイとプロテオーム解析を基盤とした手法により、HSF1転写複合体の構成因子を同定した。まず進化的アプローチにより、HSF1のDBD領域にある1アミノ酸と、領域X内の22アミノ酸が活性化に必要であることを明らかにした。そこで、野生型および変異型HSF1を用いHSF1転写複合体の構成因子群をプロテオーム解析により明らかにした。約200の因子を同定し、その中にはHSF1の転写活性と相関して、結合量が変化する因子群が複数存在した。その中には、既知だけでなく、新規のHSF1相互作用タンパク質が数多く見つかった。そこで、これらの中から11因子に着目し、ノックダウンを行い、熱依存的なHSP70の誘導能の変化を調べた。その結果、5因子がHSP70誘導能の低下を引き起こした。そこで申請者は、染色体分配関連因子に着目した。同因子は、熱刺激時の転写との関連について報告はない。この因子は、熱刺激時にHSF1依存的にHSP70プロモーター領域へ呼び込まれることが分かった。また、この因子は、様々なマウスの細胞においても、熱依存的なHSP70の誘導に必要であることがわかった。さらに、熱依存的な細胞死についても、同因子のノックダウンは、強い細胞死の誘導とユビキチンタンパク質の蓄積の上昇が見られ、熱依存的なプロテオスタシスの維持に必要であることがわかった。今後は、この因子がどのようにHSP70の転写誘導を活性化するのか、その分子機構を明らかにしたい。熱ショック応答は、熱ショックタンパク質(HSP)の誘導を特徴とし、主に進化の過程で保存された熱ショック因子(HSF)群によって制御される。熱ショック応答は、温熱ストレスに対する応答機構だけでなく、最近では通常状態における細胞内のタンパク質の質的及び量的制御を司る機構であることが分かってきた。HSF群には4つのファミリー分子が存在するが、特にHSF1が熱ショック応答を制御する。本申請では、進化的アプローチとプロテオーム解析を基盤としてHSF1による転写制御機構の解明をめざす。我々は現在までに、カエルおよびトカゲのHSF群の分子クローニングを行い、進化的なHSF群の機能の変化について検討を行ってきた(論文投稿中)。さらに本研究では、ニワトリと近縁のトカゲのHSF群のスワップ解析により、ヒトを含めたHSF1のHSP70誘導に必要なアミノ酸を明らかにした(未発表)。これらの転写活性化能の異なるHSF1を発現させた細胞抽出液から、新たに確立したDNAプルダウン法を用いて、新規HSF1転写複合体の構成因子の同定を行った。HSF1転写複合体の構成因子として既知のものと、多数の新規の因子を同定した。さらに同定した構成因子の機能スクリーニングを行うことで、HSF1の転写活性化に関わる複数の候補因子に絞り込んだ。今後は、新たなHSF1転写機構およびそれがプロテオスタシス容量、神経変性疾患やがん形成に及ぼす効果を明らかにする。これまでに申請者は、ニワトリ、トカゲ、ヒトのHSF1の比較から、HSF1の転写活性に関わるアミノ酸を同定した。また野生型および変異HSF1を作成し、両HSF1に相互作用するタンパク質を網羅的に解析した。HSF1相互作用タンパク質を同定するために、新規にHSP70プロモーター領域をテンプレートとしたDNAプルダウン法を確立し同法によって、HSF1の転写活性に従って結合量の減少する複数の因子を同定した。この中には、p300やCBPなどの既知のHSF1相互作用因子だけでなく、新規因子が多数認められた。次に、HSF1転写複合体を構成する因子の中でも、HSF1の転写活性を制御する因子を調べるために、約10の因子に絞り、ノックダウン法により熱依存的なHSP70の発現に影響のある因子を調べた。その結果、HSP70の発現を正または負に制御する因子が約半数認められ、その中でもHSP70の発現を強力に促進する因子Aに着目した。因子Aは、これまでにHSF1転写複合体の構成因子としての報告のない新規の構成因子であり、また、因子AがHSF1転写複合体の新規の構成因子であることは間違いなく、今後は因子Aを介した新しいHSF1の転写制御機構を明らかにしたい。我々は現在までに、カエルおよびトカゲのHSF群の分子クローニングを行い、進化的なHSF群の機能の変化について検討を行ってきた(Takii et al 2017)。

さらに同定した構成因子の機能スクリーニングを行うことで、HSF1の転写活性化に関わる複数の候補因子に絞り込んだ。さらに同定した因子と相互作用するタンパク質を網羅的に解析し、新たな因子を同定した。その結果、HSF1-A-Bの3者が転写前複合体の形成を促進することが示唆された。今後は、その3者複合体によるHSF1の転写活性化機構の解明と、新たなHSF1転写機構およびそれがプロテオスタシス容量、神経変性疾患やがん形成に及ぼす効果を明らかにする。これまでに申請者は、ニワトリ、トカゲ、ヒトのHSF1の比較から、HSF1の転写活性に関わるアミノ酸を同定した。また野生型および変異HSF1を作成し、両HSF1に相互作用するタンパク質を網羅的に解析した。HSF1相互作用タンパク質を同定するために、新規にHSP70プロモーター領域をテンプレートとしたDNAプルダウン法を確立し同法によって、HSF1の転写活性に従って結合量の減少する複数の因子を同定した。この中には、p300やCBPなどの既知のHSF1相互作用因子だけでなく、新規因子が多数認められた。次に、HSF1転写複合体を構成する因子の中でも、HSF1の転写活性を制御する因子を調べるために、約10の因子に絞り、ノックダウン法により熱依存的なHSP70の発現に影響のある因子を調べた。その結果、HSP70の発現を正または負に制御する因子が約半数認められ、その中でもHSP70の発現を強力に促進する因子Aに着目した。因子Aは、これまでにHSF1転写複合体の構成因子としての報告のない新規の構成因子であり、従来、転写との関連は報告されていない。さらに因子Aに対する相互作用タンパク質を質量分析を行い網羅的に解析をし、因子Bが同定できた。因子Bは、既知の転写の促進因子で、HSF1-A-Bの3者が転写前複合体の形成を促進することで、熱ショック応答が起こることを明らかにした。申請者は、DNAプルダウンアッセイとプロテオーム解析を基盤とした手法により、HSF1転写複合体の構成因子を同定した。まず進化的アプローチにより、HSF1のDBD領域にある1アミノ酸と、領域X内の22アミノ酸が活性化に必要であることを明らかにした。そこで、野生型および変異型HSF1を用いHSF1転写複合体の構成因子群をプロテオーム解析により明らかにした。約200の因子を同定し、その中にはHSF1の転写活性と相関して、結合量が変化する因子群が複数存在した。その中には、既知だけでなく、新規のHSF1相互作用タンパク質が数多く見つかった。そこで、これらの中から11因子に着目し、ノックダウンを行い、熱依存的なHSP70の誘導能の変化を調べた。その結果、5因子がHSP70誘導能の低下を引き起こした。そこで申請者は、染色体分配関連因子に着目した。同因子は、熱刺激時の転写との関連について報告はない。この因子は、熱刺激時にHSF1依存的にHSP70プロモーター領域へ呼び込まれることが分かった。また、この因子は、様々なマウスの細胞においても、熱依存的なHSP70の誘導に必要であることがわかった。さらに、熱依存的な細胞死についても、同因子のノックダウンは、強い細胞死の誘導とユビキチンタンパク質の蓄積の上昇が見られ、熱依存的なプロテオスタシスの維持に必要であることがわかった。
テスト理論による法学テストの能力試験化へ向けての研究

TOEFLやTOEICなどで用いられている等化という方法によって、異なった試験の成績を比較することができるようになる。こうした成績測定の分野はテスト理論として研究されている。本研究は、テスト理論の見地から、複数の法律学試験において等化を行い、その下でも成績測定が適切に行えるかを検証している。法律学試験は「資格試験」として実施されることが多いが、実質的には一回限りの競争試験となっている。この研究は、本来の意味での資格試験としての法律学試験の可能性を探る基礎研究である。本年度は先行研究の検討をふまえ、日本のテスト文化と法学の体系性の特性を前提としたテスト設計のあり方の検討、法学検定試験の実試験データの分析、25年度実施予定の実験計画の立案と関係諸団体との打合せを行った。テストの信頼性に関わる側面では、テスト理論の観点からは共通受験者モデルにより等価を行うことで、法学テストの能力試験化(スコア化)が十分に可能であることが明らかとなった。他方、テストの内容的妥当性に関わる側面では、法学テストで問われる法律学の知識は、その体系性と個別知識の拡散性の両者があり、限られた項目数でそれらを適切に測定することの課題が明らかとなった。これらの検討を受け、本研究において実施する実験計画法に基づくデータ収集(模擬試験調査)は、当初の計画通り、2段階で実施し、第一段階では、憲法・民法・刑法に絞り、複数の問題セットであっても等化されていれば、能力測定において十分信頼性のある測定が可能であることを実証することとした。第2段階の模擬試験調査は、科目を増やし、科目内の出題分野の割合も考慮した問題セットの作成が可能であるかの実験を行うという方針を確定した。そのうえで、模擬試験調査実施についての協力を得る法学検定試験委員会との調整を行い、次年度前半での実施に向けての準備を完了した。本年度は、実験計画の協力を得ている法学検定試験委員会とともに、より実施可能な実験計画を立案した。データ収集に協力を得られる場合、通常90分である授業時間中に問題や解答用紙の配布回収を終わらせなければ予定するサンプル数が収集できないことが明らかとなった。そのために問題構成を当初の計画から改めるする必要が明らかとなった。択一問題から正誤問題へ大きな設計変更を行うこととなった。共通問題モデルによる等化を行えるように準備を進めた。過去3年分(一部科目は4年分)の法学検定試験問題をその性質によって選択肢ごとに分類した。選択肢単独では正誤問題として成立しない問題は排除した。分類にあたっては、条文知識、判例知識、学説知識を基本として分類し、それに複数の学説知識が必要か否かを加味して分類表を作成した。その分類表に基づいて、問題セットの作成にあたった。問題セットは全部で3セット作成した。3セットに共通の問題とセット独自の問題から構成し、また法学検定の各級からもバランスよく問題を配置することで、異なる問題セットを構成した。実験計画では、古典的テスト理論ベースでの問題セット間の比較とともに、共通問題をベースとした等化を行った上で、IRTにかかるパラメータを計算し、IRTモデルでの比較を行う。このことにより問題セットが異なるとも十分な設計がなされた法律テスト問題が一定程度能力値を比較可能な形で比較できることを示し、かつ高度な知識体系たる法学知識に対するテスト理論の応用性を示す点にある。これらの実験については、確実に実施するための準備を進めている。研究期間の最終年度にあたり、法律学試験の模擬試験実験データ収集を実施した。本模擬試験実験問題セットは、憲法・民法の2科目につき、それぞれ正誤問題54問、合計108問で構成されている。効率的かつ確実な解答データ収集のため、科目数を絞り、ウェブによるデータ収集を行った。回答者については、法律学知識を前提とする資格試験学習歴を中心とするスクリーニング質問を実施し、最終的に400ケースを収集した。本模擬試験実験は、「同一受験者モデル」をとり、項目反応理論にもとづく試験成績の等化が可能となるように設計されている。また、回答選択肢につき、「正しい」「誤り」という正誤問題における典型的な回答選択肢に並べ、「自信ないが正しいと思う」「自信ないが誤りと思う」の選択肢を加えている。このことにより解答の確信度を加味して検討することも可能となる。各科目54問を、それぞれを27問ごとの下位ユニット(難易度で易中程度と中難程度の2ユニット)に分割し、その下位ユニットそれぞれが独立の試験(ただし、受験者は同一)であると仮定して分析を進めた。「自信ないが・・・」も含めて正解として、前者における正解率に基づく指標を真の能力値として仮定して等化を実施した結果よりも、「自信ないが・・・」をいずれも不正解として、確信をもって正解した正解率をベースとして等化を行った場合の方が、下位ユニット間の等化結果が信頼できるという結果を得た。

他方、「自信ないが・・・」も含めて正解とした場合でも、その等化結果は、実際上十分に信頼できる範囲であった。古典的テスト理論による丁寧な問題設計を行った上で、適切な等化を行うことにより、異なった問題セットでも信頼できる能力測定が可能であることも明らかとなった。これら一連の研究についてまとめた書籍の出版を準備中である。26年度が最終年度であるため、記入しない。法社会学26年度が最終年度であるため、記入しない。本研究の目的であるテスト理論の能力試験化の可能性を探る実験計画については順調に進行しているが、海外の法律テスト実施機関等の視察が行えなかったため。実験計画についてはやや遅れているが、在外研究中の研究分担者を中心に合衆国の司法試験択一式問題の作成体制等についてヒアリングも進んでおり、おおむね計画通りに進んでいる。なによりも2回に渡る模擬試験調査をしっかりと準備して当初の計画通り実施することに全力をあげる。26年度は最終年度に当たるので、これまでの実験計画によって収集したデータ分析と成果の報告、合衆国におけるテスト理論の司法試験への応用状況等についての研究成果を出版する。そのための打ち合わせを出版社と進める。25年度に繰り越す基金分については、前年度実施できなかった海外機関視察と2回にわたる模擬試験調査に追加して用いる予定である。実験計画によるデータ収集が次年度に実施となったことと海外視察計画が在外研究等との関係で次年度実施により、より効果的に用いることができるためである。次年度使用額は概ね実験計画法によるデータ収集と海外視察に用いられる。
NMDA型グルタミン酸受容体のヘテロオロゴメリゼーションとシナプス発現機構

N-methyl-D-aspartate (NMDA)受容体は電位依存性のマグネシウム阻害と高いカルシウム透過性を背景として、神経活動依存的なシナプス回路の発達制御、シナプス可塑性の誘発、学習や記憶の基盤として重要な役割を果たしている。本研究では、NMDA受容体のシナプス局在制御機構を解明する目的で、海馬CA1特異的NR1ノックアウト(NR1-CA1-KO)マウスを用いて、NR1欠損状態におけるNR2サブユニットの細胞内局在変化を解析した。NR1-CA1-KOマウスでは、NR2サブユニットの転写レベルに変化は見られなかった。しかし、NR1欠損に伴い、NR2サブユニットのシナプス局在は完全に消失し、錐体細胞の細胞体に集積するようになった。その細胞内集積部位について包埋後免疫電顕法で解析した結果、NR2サブユニットは電子密度の高い顆粒(intracisternal granule)となって小胞体の腔内に貯留していた。一方、NMDA受容体と結合するシナプス後膜分子PSD-95やAMPA型グルタミン酸受容体の細胞内分布に変化は見られなかった。以上の結果は、NR2サブユニットの小胞体からゴルジ装置への輸送はNR1サブユニットに依存しており、その非存在下では小胞体腔内において凝集体となり処理されることを示している。
集積型オクタシアノ架橋型金属錯体における新奇光磁性現象の観測

採用者の所属する研究室では、シアノ架橋型金属錯体に着目し、様々な物理的、化学的な刺激に応答して結晶構造や磁気特性が変化する機能性を示すことを報告してきた。本研究では、新たな機能性を示すオクタシアノ金属錯体を構築することを目的として、Mn^IIと[Nb^IV(CN)_8]を組み合わせ、有機配位子の4-アミノピリジンを導入した分子磁性体の合成を行った。元素分析、単結晶構造解析から、得られた化合物の組成はMn_3 [Nb(CN)_8]_2(4-アミノピリジン)_<10>(4-アミノピリジニウム)_2-12H_2Oと示唆された。また単結晶構造解析からシアノ基で架橋されたMnとNbからなるネットワークは2次元レイヤー構造を形成していた。結晶構造中には非配位の4-アミノピリジニウム、結晶水が存在しており、4-アミノピリジニウム、配位水、結晶水からなる水素結合ネットワークが存在していた。100 Oeにおいて磁化温度曲線を測定したところ、9Kにおいて磁化値は鋭い極大を示した。また異なる外部磁場で磁場中冷却磁化曲線を測定した結果、外部磁場400 Oe以下では磁化値の極大が存在したのに対し、500 Oe以上では温度低下とともに磁化は単調に増加する振る舞いを示した。また、磁化磁場曲線を測定した結果、200 Oe付近でスピンフリップが起こったことが示唆された。これらの磁気特性から、本化合物がメタ磁性体であることが示唆された。また湿度100%下においてインピーダンス測定により伝導度を測定したところ、温度295Kでは1.0×10^<-4> S cm^<-1>、温度322Kでは4.6×10^<-4>S cm^<-1>を示した。また、低湿度では伝導度が非常に小さかったことから、本化合物超イオン伝導(>10^<-4> S cm^<-1>)を示すプロトン伝導体であることが示唆された。本化合物には1次元の水素結合ネットワークが4-アミノピリジニウム、配位水、結晶水から形成されており、MnのLewis酸性により配位水のプロトンの脱離が、促され、脱離したプロトンが水素結合ネットワークを移動するGrotthussメカニズムにより本化合物が高いイオン伝導性を示したと考えられる。本年度は、オクタシアノ金属錯体を用いて新規機能性を見出すことを目的とし、Mn^<II>と[Nb^<IV>(CN)_8]、有機配位子の4-アミノピリジンを組み合わせた分子磁性体を合成した。その結果、MnとNbがシアノ基を介して交互に架橋した2次元レイヤー構造を有する錯体の合成に成功し、メタ磁性と超イオン伝導が共存する分子磁性体の構築に成功した。この結果はオクタシアノ金属錯体を用いた超イオン伝導体の初めての報告であり、順調に研究が進展していると考えている。(抄録なし)光で磁気特性を制御するという光磁性現象は、学術的な研究のみならず、応用展開という観点からも興味深い現象として注目されている。一方、温度や光などの外場により電子状態が変化する現象としてスピンクロスオーバー現象が知られているが、光誘起スピンクロスオーバーをメカニズムとした光磁性はこれまで達成されていなかった。そこで本研究では、光誘起スピンクロスオーバー強磁性の実現を目的とし、金属イオンがシアノ基で直接架橋されたシアノ架橋型金属錯体に着目し研究を行った。具体的には、Fe^<II>と[Nb^<IV>(CN)_8]、4-pyridinealdoximeを組み合わせた[Fe^<II>(4-pyridinealdoxime)_4]_2[Nb^<IV>(CN)_8]・2H_2Oを新規に合成し、結晶構造の解析、各種分光測定、磁気測定を行った。その結果、この錯体はFe^<II>とNb^<IV>がシアノ基によって交互に架橋された3次元構造を有し、130K付近でスピンクロスオーバーを示す錯体であることが判った。また、低温でFe^<II>低スピン状態(S=0)の本錯体に、波長473nmのcwレーザー光照射を行ったところ自発磁化の発現を観測し、この光誘起相は磁気相転移温度20K、保磁力240Oeの強磁性体であることが明らかとなった。また、分光測定の光照射実験から、観測した光磁性現象のメカニズムは、光誘起スピンクロスオーバー現象が起こることでFe^<II>高スピン状態(S=2)が生成し、さらに3次元的にシアノ基で架橋されたFe^<II>(高スピン、S=2)とNb^<IV>(S=1/2)の間の大きな磁気相互作用により強磁性が発現したことが示唆された。このように本研究では、スピンクロスオーバー現象を示すFe^<II>イオンを、不対電子を持つ[Nb^<IV>(CN)_8]と3次元的に集積化させることにより、光誘起スピンクロスオーバー強磁性の初観測に成功した。分子磁性体は光磁性現象や、湿度応答型の磁性、非線形磁気光学効果など、さまざまな磁気機能性を付与することが可能であるため、非常に注目されている。一方、分子磁性体の磁気相転移温度(Tc)は一般に低いものが多く、その向上が1つの課題となっている。本研究では、高いTcを示す分子磁性体の構築を目的とし、オクタシアノ金属錯体の[Nb^<IV>

(CN)_8]と、V^<II>イオンを組み合わせた分子磁性体の合成を新規に行った。IRスペクトル、元素分析結果より組成はK_<0.59>V^<II>1.59V^<III>0.41[Nb^<IV>(CN)_8]・(SO_4)_<0.50>・6.9H_2Oと決定された。粉末X線回折パターンはブロードであり、結晶性が低いことが示唆されたが、以前に当研究室において報告したK0.10V^<II>0.54V^<III>1.24[Nb^<IV>(CN)_8]・(SO_4)0.45・6.8H_2OのXRDパターンと類似していたことから、本錯体は正方晶の3次元ネットワークを有することが示唆された。磁気測定の結果、本錯体は210Kという非常に高いTcを示し、オクタシアノ錯体を組み合わせた分子磁性体の中で最高のるを記録した。また、磁化磁場曲線の測定の結果、外部磁場5テスラにおける磁化の値は4.6μ_Bであり、V^<II>、V^<III>とNb^<IV>の間に反強磁性的な超交換相互作用が働き反平行に配列した場合に計算される飽和磁化値4.6m_Bと整合していた。以前、当研究室では[Nb^<IV>(CN)_8]とV^<II>イオンを組み合わせた錯体においてTc=138Kの錯体の合成に成功していたが、今回、合成法や合成条件を工夫することによってさらに高いTcの実現に成功した。このような高い磁気相転移温度が実現したのは3d軌道の広がりが大きいV^<II>と、8配位という高い配位数を有し軌道の広がりの大きい4d遷移金属からなる[Nb^<IV>(CN)_8]の間に大きな磁気相互作用が働くためと考えられる。実際に、分子磁場理論からV^<II>とNb^<IV>の間の交換相互作用定数は-51cm^<-1>とかなり大きい値であったことから、V^<II>の割合の増加により大きな超交換相互作用が働くV^<II>-Nb^<IV>間のパスが増え、高い磁気相転移温度を示す分子磁性体の構築につながったと考えられる。採用者の所属する研究室では、シアノ架橋型金属錯体に着目し、様々な物理的、化学的な刺激に応答して結晶構造や磁気特性が変化する機能性を示すことを報告してきた。本研究では、新たな機能性を示すオクタシアノ金属錯体を構築することを目的として、Mn^IIと[Nb^IV(CN)_8]を組み合わせ、有機配位子の4-アミノピリジンを導入した分子磁性体の合成を行った。元素分析、単結晶構造解析から、得られた化合物の組成はMn_3 [Nb(CN)_8]_2(4-アミノピリジン)_<10>(4-アミノピリジニウム)_2-12H_2Oと示唆された。また単結晶構造解析からシアノ基で架橋されたMnとNbからなるネットワークは2次元レイヤー構造を形成していた。結晶構造中には非配位の4-アミノピリジニウム、結晶水が存在しており、4-アミノピリジニウム、配位水、結晶水からなる水素結合ネットワークが存在していた。100 Oeにおいて磁化温度曲線を測定したところ、9Kにおいて磁化値は鋭い極大を示した。また異なる外部磁場で磁場中冷却磁化曲線を測定した結果、外部磁場400 Oe以下では磁化値の極大が存在したのに対し、500 Oe以上では温度低下とともに磁化は単調に増加する振る舞いを示した。
細胞骨格のプレハブ再構築仮説の実証

細胞内における物質輸送は、細胞の巨視的な活動(形態形成や運動など)を考える上で重要な現象である。走査型プローブ顕微鏡(SPM)を用いて、生きた細胞を我々は、既存装置の約500倍の高速(測定時間:数sec/frame)で測定できる生体高速SPM測定法を開発した。この装置を用いて、生きた細胞の骨格形成のダイナミクスを測定し、単粒子追跡解析法によってその運動を解析した。その結果、細胞表面で数百nm径のアクチン繊維(F-actin)からなる硬い顆粒が多数生成し、ブラウン運動に似た拡散運動をした。モータータンパク質であるミオシンIIを阻害する薬剤(ブレビスタチン)の投与および温度のわずかな低下によって、顆粒の拡散速度が著しく低下した。よって、顆粒の運動は、アクチンネットワークがモータータンパクによってランダムに張力が働き、その結果、拡散が起こっているといえる。この機構が、細胞膜付近の小胞にも起こっているか否かを膜小胞について調べた。小胞に局在するRab5タンパク質を緑色蛍光タンパク質で標識しその運動を調べた結果、単純拡散様の性質は見られなかったものの、熱的な揺動力による細胞骨格線維の曲げ変形の理論と一致する性質を見出した。この性質は、細胞骨格を破壊する試薬を投与することにより大きく乱された。従って、膜小胞の動きには細胞骨格が寄与しているものの、細胞骨格線維の滑り運動ではなく曲げ変形の動力学が支配的に働いていると考えられる。細胞膜付近における小胞輸送には、細胞骨格の曲げ変形のダイナミクスが輸送過程を支配している。ここに活性化したミオシンIIが加わると、ミオシンIIが局所的にアクチン線維同士の架橋を破壊しながらアクチン線維を滑らせる。この滑り運動に基づいて新たに単純拡散様の輸送過程が発生し、2つの異なる輸送過程が細胞内で混在すると考えられる。細胞骨格をレールとする方向性のある輸送は、非常に微量にしか生産されないタンパク質を遠隔の目的地に運ぶために必須の方法である。現在知られているものの大半は細胞骨格として微小管を用いたものである。他方、走査型プローブ顕微鏡(SPM)を用いて、生きた細胞を我々は、既存装置の約500倍の高速(測定時間:数sec/frame)で測定できる生体高速SPM測定法を開発した。この装置を用いて、生きた細胞の骨格形成のダイナミクスを測定した。その結果、ストレスファイバーが形成されていないとき、細胞表面で数百nm径の硬い顆粒が多数の生成し、その多くは数十nm/secの速度で一方向に運動をした。その後、ストレスファイバーが形成されると、顆粒は消滅した。この結果は、顆粒の生成消滅がストレスファイバーの形成に関与していることを示唆する。免疫蛍光染色法によって組成を調べると、顆粒がアクチン繊維(F-actin)からなっていることがわかった。アクチン線維を破壊する薬剤(サイトカラシンD)やモータータンパク質であるミオシンIIを阻害する薬剤(ブレビスタチン)の投与で、顆粒の運動速度が著しく低下した。基盤との接着斑を構成する細胞内タンパク質(ビンキュリン)と顆粒の会布を比較した結果、両者の分布に相関があった。これらの結果は、顆粒が重合したアクチン繊維から成り、従来、細胞骨格繊維の形成はトレッドミル等によってGアクチン分子によって形成がなされていると考えられていたが、それとは異なる方法である。また、顆粒はモータータンパクによってアクチンネットワークを用いて運動し、接着斑を介して細胞外基盤と相互作用することを示唆する。
尿失禁とβ_3アドレナリン受容体遺伝子変異に関する研究

定量的RT-PCRを用いて、ヒト膀胱におけるアドレナリン受容体(AR)サブタイプの発現量を検討した。サブタイプの中で、α_<1a>、α_<1b>、α_<1d>、β_1およびβ_2の発現量は少なく、β_3-ARのみが全体の94.4%を占めた。機能的にもβ_3-ARを介する弛緩のみが著明で、他のサブタイプの機能、関与は見られなかった。したがって、β_3-ARはヒト膀胱で優位の発現をし、蓄尿期における膀胱弛緩に重要な役割を担っていることが明らかとなった。β-ARを介する膀胱弛緩の機序をmicrodialysis法を用いて検討した。排尿筋が静止状態にある時には、cAMPに依存する機序が作動し弛緩をもたらす。一方、排尿筋が収縮している場合は、cAMP依存性の他にcAMP非依存性の機序も関与することが明らかにされた。このcAMP非依存性の機序として、BKcaチャネルの開口が示唆された。同様の機序はβ_3-ARを介する弛緩反応にも観察された。すなわち、β_3-ARの機能として、cAMPの産生のみならずBKcaチャネルの活性化も考慮に入れなければならない。ヒトβ_3-ARを発現させたCHO-K1細胞を使用し、受容体機能における遺伝子変異の影響を調べた。ノルアドレナリンによる結合度およびcAMP産生能に関する限り、wild typeとmutationの間に差は認められなかった。しかし、この結果をin vivoにおける弛緩反応の差に当てはめることはできない。過活動膀胱(OAB)の患者100名とコントロール群101名を対象に、β_3-ARの遺伝子変異を解析した。ホモとヘテロを合せた遺伝子変異の出現頻度は、OAB郡で47%にもなり非OAB群(control)の22.8%と比較し有意の高値となった(p>0.01)。OABの病因は多数あるとされているが、OABの患者のうち約半数がβ_3-ARの遺伝子変異を持つことが明らかにされ、この遺伝子変異がOABの発症に強く関与していることが示唆された。したがって、β_3-ARはOAB(切迫性尿失禁)のgenetic markerになり得ると結論された。被験者の毛髪(毛根)からβ_3-アドレナリン受容体の遺伝子変異(Trp64Arg)を同定し、尿失禁病態と正常例における変異出現率を比較した。平成12年に調査した症例数はまだ十分な数ではなかったが、尿失禁群38例中この変異があったのは16例で、約40%の変異出現であった。一方、同時に調査した正常群では、60例中15例の変異(約25%)を認めた。したがって、尿失禁群では確かにTrp64Arg変異の出現率が高くなる傾向を示しているが、さらに症例数を1群あたり250例まで増やさなければならない。また、尿失禁と最も関連することが予測されたホモの変異は、まだ2例しか見つかっていないので、今後さらに調査を拡大するつもりである。

一方、手術時に得られたヒト膀胱筋切片に関する研究は、種々の情報を提供した。β受容体サブタイプの発現をmRNAのレベルで検討したところ、β_3mRNAが圧倒的に多くβ_1およびβ_2mRNAは極めて少なかった。この事実はアゴニストによる弛緩実験でも裏付けられ、β_3mRNAのみが弛緩反応を引き起こしたが、β_1とβ_2アゴニストによる弛緩反応は見られなかった。次の課題は、この弛緩反応とβ_3の遺伝子変異との関係である。β3-アドレナリン受容体(AR)の遺伝子変異と尿失禁(不安定膀胱)との関連を見るため、尿失禁患者群と正常コントロール群における変異出現率を比較した。尿失禁群(64名)では、ヘテロ型変異(Trp64Arg)とホモ型変異(Arg64Arg)はそれぞれ45%および5%となり、合せて50%の高い出現率であった。一方、正常群の遺伝子変異出現率は32%(ヘテロ29%、ホモ3%)を示した。したがって昨年の報告と同様に、β3-AR遺伝子変異は尿失禁の発症に強い相関を有する結果となった。しかし、症例数がまだ十分得られていないので、各群250例を目標に調査を継続していく予定である。ヒト膀胱平滑筋におけるβ3-ARの機能について、幾つかの基礎研究を施行した。今回はβ3-AR遺伝子がヘテロ型変異を持つ膀胱を2症例検討することができた。これら2症例からの膀胱筋切片は、いずれもβ3-アゴニストにたいし弛緩反応を示した。この結果から、β3-ARはたとえ遺伝子変異を起こしていても合成アゴニストに対しては正常に機能することが示され、天然のアゴニスト(ノルアドレナリン)に対する反応を検討することが今後の課題として残された。また、β3-アゴニストによる弛緩反応は、c-AMPの産生がプラトーになってもまだ進行していくことが明らかとなった。したがって、c-AMP産生以外の機序も弛緩反応に関与することが示唆された。1. β_3-アドレナリン受容体(AR)の遺伝子変異と切迫性尿失禁との関係を調べるため、尿失禁患者120名および正常非尿失禁者105名を対象に変異出現率を解析した。その結果、正常コントロール群では遺伝子変異率が31.5%(ヘテロのみ)であったのに対し、尿失禁群における変異率は53%(ヘテロ48%、ホモ5%)と高い値になった。したがって、毎年症例数を増して行くに従い、β_3-ARの遺伝子変異が切迫性尿失禁の発症に関与していることが確実になってきた。次年度はさらに症例数を増して検討する。2.ヒト膀胱平滑筋のβ_3-アゴニストによる弛緩反応には、c-AMP産生に依存しない部分があることを見い出した。c-AMP産生がプラトーになってからの弛緩反応はイベリオトキシンやカリブドトキシンで抑制されるため、Ca作動性Kチャネルの関与が強く示唆された。3.ヒト膀胱におけるβ-ARサブタイプの発現を定量的RT-PCRで解析し、β_3のmRNAの発現が全体の97%にもなることを明らかにした。この成果の一部は、雑誌"Urology!に発表してある。1.アドレナリン受容体全体において各サブタイプの発現量をヒト膀胱について定量的RT-PCRで解析した。ヒト膀胱ではα_<1a>、α_<1b>、α_<1d>、β_1、β_2の各サブタイプの発現はきわめて微量であり、β_3受容体が全発現量の94%にもなることを明らかにした。この成果は、雑誌J.Uro1に発表した。2.膀胱平滑筋のβ_3-アゴニストによる弛緩反応には、cAMPに依存しない径路があることを見い出した。この径路は平滑筋が収縮している時に強く関与するが、静止状態では作動せずcAMPに依存する系が主体となった。
大規模シーケンスを用いたApoE4とX11Lによるアルツハイマー病発症機構の解明

ApoE4はアルツハイマー病(AD)の発症危険因子として知られている。近年の研究から、ApoE4キャリアのAD患者では遺伝子発現の変化が認められ、その制御因子として我々が以前に同定したX11Lが報告された。本研究では、ApoE4-KI/X11L-KO等の遺伝子改変マウスの遺伝子発現解析を網羅的に行い、AD発症に寄与する遺伝子の上流に共通して見出される核内受容体FXR結合モチーフを見いだした。X11LがApoEの発現を制御しうる事を見いだし、その下流でFXRにより発現が制御される遺伝子がAD発症に関わる可能性を明らかにした。アルツハイマー病(AD)の発症危険因子として、アポリポプロテインE4(ApoE4)が知られているが、ApoE4が寄与するAD発症機構は明らかではない。近年の研究から、ApoE4による遺伝子発現制御の存在が明らかとなり、AD患者においてその制御変化が認められ、その制御因子としてAPP結合因子として我々が同定したX11Lが見出された。本研究では、マウス脳においてApoE4及びX11Lが制御する遺伝子を明らかにすると共に、その制御機構のAD発症への寄与を解明することを目的とした。昨年度までに、遺伝子改変マウスを用いた網羅的遺伝子発現解析を終了し、AD発症に寄与すると考えられる遺伝子の同定を行った。本年度は、まず、その発現変化遺伝子群の発現制御に関わる共通性を見出す検討作業を行った。各遺伝子の転写開始点から100塩基下流及び1,000塩基上流の遺伝子配列に共通して見出されるモチーフを検討したところ、核内受容体として知られるFarnesoid X receptor(FXR)結合モチーフが有意に存在していることが分かった。FXRは肝臓に特異的に発現することが知られる因子であるが、マウス脳を用いたmRNA-seqの結果及び公知遺伝子発現解析データベースの結果から、脳においても発現していることが見出された。そこで、FXRのクローニングを行い、マウスES細胞由来神経細胞に発現させる系を構築した。その局在を検証したところ、通常の培養環境下において主に核内に局在するが、細胞質に局在を示す細胞も存在した。このことは、FXRの局在を制御する分子機構が同細胞に存在することを示唆した。また、ApoE及びX11Lを発現する系を構築していたところ、X11LがApoEの発現を制御しうる現象を見出した。現在、同系を用いて新たなAD発症分子機構の解明に取り組んだ。神経生化学
インターネットを利用する統計計算分散処理システム

統計的手法を実践するためには,計算機を利用する必要があるので,計算機技術の最新の進歩を統計解析システムに効果的に採り入れ,強力で利用しやすい統計解析環境を作成することは,統計理論と現実のデータの間を取り持つための統計学の重要な一分野である.特に,最新の技術であるインターネットの利点を生かすことができれば,統計解析システムはさらに使いやすいものにできるはずである.インターネット技術の中でも,ユーザインタフェースと通信による分散処理が,統計計算においては重要であると考えている.本研究においては,特別なハードウエアやソフトウエアなどがなくても,現在のインターネット技術を利用して統計計算を簡単に分散処理できるようなシステムを提案することを目標とした.その結果として,プロトタイプシステムとしての統計解析システムJasp(JAva based Statistical Processor)を作成した.このシステムはJava言語で作成されており,多種の計算機上で稼働する.そして,ユーザインタフェースも言語も,分散処理を考慮して設計されている.システムはクライアント/サーバ構造で設計されており,ユーザインタフェースの部分と計算の部分を別々のコンピュータ上で分散して処理することが可能であるし,複数のサーバを利用するような実験的な機能も実現されている.したがって,当初の目的をある程度実現することができたと言える.現時点ではJaspはあくまで実験レベルのものである.信頼性には問題があるし,機能の不十分な点も多い.これを実用的なシステムにするには,多くの改良と機能の追加が必要である.今後はそのような作業を行い,Jaspを実用的で有用なシステムに育てたいと考えている.統計的手法を実践するためには,計算機を利用する必要があるので,計算機技術の最新の進歩を統計解析システムに効果的に採り入れ,強力で利用しやすい統計解析環境を作成することは,統計理論と現実のデータの間を取り持つための統計学の重要な一分野である.特に,最新の技術であるインターネットの利点を生かすことができれば,統計解析システムはさらに使いやすいものにできるはずである.インターネット技術の中でも,ユーザインタフェースと通信による分散処理が,統計計算においては重要であると考えている.本研究においては,特別なハードウエアやソフトウエアなどがなくても,現在のインターネット技術を利用して統計計算を簡単に分散処理できるようなシステムを提案することを目標とした.その結果として,プロトタイプシステムとしての統計解析システムJasp(JAva based Statistical Processor)を作成した.このシステムはJava言語で作成されており,多種の計算機上で稼働する.そして,ユーザインタフェースも言語も,分散処理を考慮して設計されている.システムはクライアント/サーバ構造で設計されており,ユーザインタフェースの部分と計算の部分を別々のコンピュータ上で分散して処理することが可能であるし,複数のサーバを利用するような実験的な機能も実現されている.したがって,当初の目的をある程度実現することができたと言える.現時点ではJaspはあくまで実験レベルのものである.信頼性には問題があるし,機能の不十分な点も多い.これを実用的なシステムにするには,多くの改良と機能の追加が必要である.今後はそのような作業を行い,Jaspを実用的で有用なシステムに育てたいと考えている.まず当初の研究計画にしたがって、統計システムXploReを用いて統計計算のための分散処理機構を実現することを試みた。XploReがJava言語によるServer/Client機能を実現しているので、Java言語で分散処理用のClientを書こうとした。その過程で、次のことが判明した。まず、XploReに対してわれわれの目標とするような分散処理機構を、Serverの内部を変更せずに、Clientを書くだけで実行しようとすることは、かなりのオーバーヘッドを必要とするのであまり望ましくない。次にJava言語には統計解析のための基本となる、行列計算、グラフィックス描画、確率分布の計算、乱数発生などのよいライブラリが存在する。また、Java言語の優れた性質をうまく生かしながら、より簡単で使いやすいPnutsというスクリプト言語がフリーソフトウェアとして発表されている。これらのことより、当初の計画を早め、ただちに独自の汎用的な統計解析システムの設計にとりかかることにした。言語の基本にはPnutsを利用し、統計解析システムとしてPnutsに不足しているところはできるだけフリーのJavaライブラリを用いる。さらに、それらを統一的に組合せ、オブジェクト指向プログラミングが可能なようにPnutsを変更する。また、システムはServer/Client型で構成し、分散処理がグラフィカルユーザインタフェースからも容易に行えるようにする。また、言語の設計に関しては、XploRe言語を参考にし、可能ならばそれとの協力もできるようにする。このような方針で新しい統計解析システムJasp (Java based Statistical Processor)の基本的な設計を行ないながら、プロトタイプシステムを実現した。その結果、システムとしてはまだまだ不十分な状態ではあるが、この方向で当初の目的である使いやすい分散処理システムが実現可能であることを確かめることができたと考えている。本年度は,昨年度設計したシステムJasp(JAva based Statistical Processor)のグラフィカルユーザインタフェース(GUI)の改良を行い、また、多くの人の意見を取り入れることができるように,World Wide Web上での公開を開始した.Jaspはクライアント/サーバシステムとして実現されている。これはインターネットを用いた分散処理を考えているからであり,GUIもWebブラウザ上からアプレットとして利用できる.Jaspのユーザインタフェースでは,Jasp言語によるプログラミングを行うためとコマンドを使って解析を行うためのキャラクタユーザインタフェース(CUI)と試行錯誤的な統計解析をアイコンで分かりやすく表示し解析を行えるようにするためのグラフィカルユーザインタフェース(GUI)が同等に扱われる.これらは独立に利用することができる.そして,同時に相互に密接に関連しており,CUIとGUIの一方の操作はもう一方にもほとんど同時に反映されるようになっている.

ユーザはシステムの習熟度に応じてこれらを自由に使いわけることができる.初心者はGUIを,熟練者はCUIを使うことを望むだろう.ここではこのようなユーザインタフェースを混合インタフェースと呼び,統計解析システムのユーザインタフェースとして提案する.GUIにおいてはデータをアイコンで表し,それを直接に操作するという,データに基づくインタフェースを用いるが,これにより,過去の解析履歴をアイコンの木構造で表現する仕組みが可能となっている.なお,JaspのWorld Wide Web上のホームページではJavaアプレットとしてJaspを試すことができる.ソースコードも公開しているため,ダウンロードして自分の計算機にインストールすることができる.昨年までに、システムをクライアント/サーバ構造として作成することにより、ユーザインタフェース(グラフィカルユーザインタフェースとキャラクタユーザインタフェース)の部分と計算の部分を別々のコンピュータ上で分散して処理することが可能になっていた。また、複数のサーバを利用するような実験的な機能も実現した。この実装のためには、JavaのRM1機能を利用した。まず、Jasp言語の改良として、GUIの補助と簡単なヘルプ機能のための情報をJava docのような形式のコメントとしてプログラム中に記述できるようにした。これにより、言語の文法を複雑にすることなく、付加的な情報を埋め込むことができるようになった。複数サーバを利用する関数に関しては、MPIライブラリのsend, receiveに対応する関数とオブジェクトの移動を行う関数を実装した。また、複数のサーバへの必要なプログラムの配布も行えるようにした。これにより、複数のサーバを同時に利用して、複雑な計算の負荷を分散させることが可能となった。ただし、本年当初に計画したRMIの拡張であるJiniの利用については簡単なテストを行ったにすぎない。また、これを用いても、サーバ間の自動的な負荷の調節を行うことは容易ではないことがわかった。ただ、Jiniを利用することによって、サーバの動的な追加などが可能となるので、分散処理に関しては、今後はJiniを利用することに決定した。
粘弾性体中におけるプレート間相互作用と地震との関係についての研究

日本周辺域のプレート境界では,大地震がほぼ一定の間隔で繰り返し発生していることが知られている。大地震の長期的予測の観点に立てばテクトニック応力の蓄積過程を地殻変動データの解析を通じて明らかにすることの方が重要となる。よって我々は過去約100年にわたる測地測量データのインヴァジョン解析により地震サイクル中でのプレート間カップリングの時空間的な強度分布を推定した。長期間にわたる測地測量データを解析するためには,アセノスフェアの粘弾性緩和を無視することができない。そのため,我々は粘弾性緩和を考慮した新しいインヴァジョン解析手法を開発した。粘弾性応答は履歴積分が必要になるため,我々は地震サイクルが92年であることを仮定することにより,プレート境界面上での辷りに対応する粘弾性応答を92年間遡って履歴積分することを可能にした。3次元的なプレート境界面を設定し,B-SPLINE関数の重ねあわせによってプレート境界面上の辷り分布を表現する。このとき我々はいくつかの先験的な情報を仮定した。(1)空間的に辷り分布は滑らかである。(2)時間的に辷り分布は滑らかである。(3)方向がプレートの沈み込む方向に一致する。(4)地震時の辷り分布は滑らかである。(5)地震時の辷り分布の浅い領域は津波データからの辷り分布を取り入れる。上述の解析を四国沖の南海トラフに適応した。主な特徴は1946年の南海道地震直後の主破壊領域の深部において約1mのafterslipがあることが明らかになり,地震直後の急速なプレート間カップリングの回復の存在も認められる。また,地震の90年後には四国沖に約6m,紀伊半島沖には約4mの滑り欠損の蓄積があり,この分布は1946年の南海道地震の地震時の辷り分布とよく一致する。プレート間カップリングの下限はプレート境界面の深さ約30kmに位置し,最大の滑り欠損領域を示す深さは約20kmとなっている。プレートカップリングの下限は明瞭であり,現在まで言われていた滑り欠損の遷移帯よりも狭いと考えられる。
マウス野生集団からの新しい変異遺伝子の導入とその作用機構の解析

マウスの種々の突然変異個体は,いわゆる疾患モデルとして開発育成されてきたが,より基本的な生物機能のモデルという意義も決して小さくない.しかし,従来の実験用マウスだけを対象にしている限り,十分な変異個を得ることは難しい.本研究では,従来の実験用マウスとは進化的に約100万年近い分岐時間を有する日本産野生マウスMus masculus molossinasに着目し,その野生集団の含む豊富な遺伝子変異の中から研究目的に適合したものを撰別して実験用マウス系統の中に導入して新しい実験用マウス系統を育成することを試みた.本年の主な研究成果は次のとおりである.(1)野生集団から導入したHー2遺伝子をもつB10.MOLコンジェニック系統10系について,Hー2内遺伝的組換え促進遺伝子の有無を検定し,3系にその存在を認めた.(2)これらの内,B10.MOLーSGR系から,更に多数のHー2内遺伝子組換系統を開発育成した.(3)Hー2内組換促進遺伝子の位置をHー2遺伝子複合領域をカバーするコスミッド・クローンを用いて分析し,スイスからの報告とは異る位置にあることを確認した.また,この組換ホット・スポットの大きさは制限酵素パターンから1Kb以下と推定された.(4)Hー2内高頻度組換元が雄にはなく雌の生殖細胞でのみおこることを示した.(5)東南アジア産castaneus亜種に特有なリンパ球抗原遺伝子Ly2.3を見出し,これを実験用マウスに導入して新しいコンジェニック系を育成した.(6)中国嘉峪関産の亜種に新しいヘモグロビンβ鎖の変異遺伝子が高頻度に存在する.現在系統化を進めている.(7)日本及びアジア産野生亜種を広く探索した結果,この地域に高頻度に出現するハプロタイプがあることを血清学およびDNAのレベルで見出した.(8)日本産野生亜種のYー染色体末端部の亜種特異性の発現が,遺伝的背景によって支配される.日本産野生マウスのH-2染色体を導入して育成したB10・MOLH-2コンジエニック系統の内B10・MOL-SGR系統はH-2領域に著しい染色体組換えをおこすことが見出され、この系との交配によってさらに多数のH-2組換系が作り出された。これらのリコンビナントH-2染色体をホモ接合にしてリコンビナント系統を育成する研究を進め本年度までに30系統以上の新しい系統が作られた。B10・MOL-SGRを他のBIOコンジェニック系に免疫して10数系統のモノクローン抗体産生ハイブリドーマ株を作り、これらのモノクローン抗体を用いて世界中の主要な野生マウス亜種を比較した。SGRに特異なプライベート抗体が2系見つかったが、他はアジア産の亜種には交叉反応するもの、世界の主な亜種と交叉反応するものであった。2系統のプライベート抗体に反応する野生マウスがカナダのピジョン地方から見出され、そのH-2DNAの構造をSGRと比較したところ、5'端より上流に差異があることがわかった。一方、SGRのH-2にみられる高頻度遺伝子組換えをおこすエンハンサー遺伝子の所在を詳しく調べるため、コスミッドライブラリーを用いて検索を行ったが、制御酵素地図を作って分析したデータからみると、IA領域にいわゆるホットスポットが存在することが示された。この部域のDNAをクローニングしてエンハンサー遺伝子の本体を明らかにする試みを進めている。またSGRに由来するリコンビナント染色体の中に致死遺伝子が含まれている例が見出され、この染色体構造の分析も進められた。その結果、H-2複合遺伝子の中のS領域に不均等染色体乗換がおこった可能性が示唆されている。これによってC4と21OHを含む部域が脱落しホルモン代謝が乱れ生後10日目頃に致死作用があらわれているらしい。野生から新しい変異を導入した系統として小笠原原産のRb型染色体をBALB/Cマウスに導入する試みは引続き進められ、戻し交配10代を越えた。マウスの種々の突然変異個体は,いわゆる疾患モデルとして開発育成されてきたが,より基本的な生物機能のモデルという意義も決して小さくない.しかし,従来の実験用マウスだけを対象にしている限り,十分な変異個を得ることは難しい.本研究では,従来の実験用マウスとは進化的に約100万年近い分岐時間を有する日本産野生マウスMus masculus molossinasに着目し,その野生集団の含む豊富な遺伝子変異の中から研究目的に適合したものを撰別して実験用マウス系統の中に導入して新しい実験用マウス系統を育成することを試みた.本年の主な研究成果は次のとおりである.(1)野生集団から導入したHー2遺伝子をもつB10.MOLコンジェニック系統10系について,Hー2内遺伝的組換え促進遺伝子の有無を検定し,3系にその存在を認めた.(2)これらの内,B10.MOLーSGR系から,更に多数のHー2内遺伝子組換系統を開発育成した.(3)Hー2内組換促進遺伝子の位置をHー2遺伝子複合領域をカバーするコスミッド・クローンを用いて分析し,スイスからの報告とは異る位置にあることを確認した.また,この組換ホット・スポットの大きさは制限酵素パターンから1Kb以下と推定された.(4)Hー2内高頻度組換元が雄にはなく雌の生殖細胞でのみおこることを示した.(5)東南アジア産castaneus

亜種に特有なリンパ球抗原遺伝子Ly2.3を見出し,これを実験用マウスに導入して新しいコンジェニック系を育成した.(6)中国嘉峪関産の亜種に新しいヘモグロビンβ鎖の変異遺伝子が高頻度に存在する.現在系統化を進めている.(7)日本及びアジア産野生亜種を広く探索した結果,この地域に高頻度に出現するハプロタイプがあることを血清学およびDNAのレベルで見出した.(8)日本産野生亜種のYー染色体末端部の亜種特異性の発現が,遺伝的背景によって支配される.