hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
グラム陽性病原菌のプロテインキナーゼを介するシグナル伝達系の解明

グラム陽性病原菌に普遍的に存在するProtein Ser/Thr Kinase(PSTK)を介するシグナル伝達系の機能をClostridium perfringensをモデル菌として解明する。C. perfringensstrain 13のPSTK遺伝子欠損株をIn-Frame遺伝子欠損法により作製した。プラスミドによるPSTK発現株を作製し、リン酸化基質タンパク質の同定を試みた。ゲノムライブラリーを用いたYeast-Two Hybrid法により、PSTKと相互作用する基質、因子の検索を行った。PSTK遺伝子は、上流のProtein Ser/ThrPhosphatase (PSTP)遺伝子とオペロンを形成していると考えられる。PSTP-PSTK欠損株は、生育に阻害がみられ、形状はへび状の長鎖を呈した。PSTK遺伝子を欠損株にプラスミドで導入し発現させると、コンマ状の短桿菌となり、これはPSTP遺伝子欠損株と同様であった。これらのことより、PSTP-PSTK遺伝子が正常な生育(細胞壁生合成、細胞分裂)に必須であることを示した。Anti-Phospho-Thr抗体によるWestern blot解析により、基質タンパク質と考えられる約60kDのリン酸化バンドも検出された。PSTKのYeast-Two Hybrid法により、CPE1738自身および不活性な菌体内PSTK(CPE1990)が得られ、CPE1738は0ligomerPSTKで、CPE1990と複合体を形成し制御している可能性が示された。CPE1990のホモログ検索の結果、他のClostridium属およびBacillus属で検出されたが、これに関する研究の報告は無い。現在、CPE1990遺伝子欠損株の作製、基質タンパク質の同定を試みている。グラム陽性病原菌に普遍的に存在するProtein Ser/Thr Kinase/Phosphatase (K/P)を介するシグナル伝達系の機能をClostridium perfringens(ガス壊疽菌)をモデル菌として解明する。野生株は3-5μmの桿菌であるが、PKオペロン欠損株は、生育に阻害がみられ、形状はへび状の長鎖を呈し、P欠損株では、コンマ状の短桿菌となった。更に、KをPK欠損株においてプラスミドで誘導発現させると、コンマ状の短桿菌に変化した。また、リン酸化抗体によるWestern blot解析により、Kのリン酸化基質タンパク質と考えられる約60-kDaのThr-リン酸化バンドを検出した。リン酸化タンパク質をAffinity Columnにて分画精製し、トリプシン消化産物のLC-MS/MS解析を行った結果、SはCPE1057と同定された。欠損株(ΔS、ΔPKΔS、ΔPΔS)を作製し解析した結果、すべての株で60-kDリン酸化バンドが検出されず、形状はすべてコンマ型になった。ΔPΔSでSを誘導発現させると、リン酸化バンドの増加が検出された。Sのリン酸化部位は、欠損変異遺伝子の発現解析により、N末端領域に存在することが明らかとなった。またCPE1057ホモログは、Clostridium属のみに見いだされた。更にΔPKΔSにおいて、非リン酸化型Sの発現量を制御(少→多)すると、コンマ→正常→長鎖型へと変化した。しかし、ΔPΔSにおいては、Sがリン酸化されるため、その変化が大幅に軽減され、ほぼコンマ型であった。つまり、PSTK-PSTPによるCPE1057のリン酸化調節を介して、Clostridium属の菌の形態が制御されるものと考えられる。ガス壊疽菌におけるIn-Frame遺伝子破壊株の作製法、遺伝子誘導発現系の確立と共に、Kのリン酸化基質タンパク質(S)の同定(CPE1057)に成功し、同遺伝子の変異株および発現解析から、シグナル伝達系による基質タンパク質のリン酸化調節により、同菌の形態が制御されることを明らかにしてきた。野生株を正常桿菌とすると、ΔPK(K非発現株)及びΔP(K発現株)はそれぞれ、長鎖桿菌及びコンマ状の短桿菌に変化する。また、非リン酸化型Sのレベルに依存し、上記の形態変化が起きる。本年度は、Sの細胞内局在性をみるためGFP融合遺伝子を構築し、その発現解析を行った。基質タンパク質蛍光は、多くの場合、隔壁、両極に認められた。また、リン酸化及び非リン酸化基質タンパク質の局在性は同様である事が示唆された。更に長鎖桿菌でのDAPI蛍光観察の結果、明瞭な隔壁がほとんど認められないが、分配されたNucleoidをはさみ、SのGFP蛍光が観察された。Sのリン酸化型、非リン酸型の精製標品をLC/MS/MS解析にかけ、リン酸化部位の決定を行い、リン酸化部位の候補を見いだした。現在、変異株の作製、解析を行っている。更に、それぞれに相互作用するタンパク質の同定、様々な環境における、ガス壊疽菌の形態と基質のリン酸化レベルの相関を検討している。K-Pが普遍的に存在するのに対して、SがClostridium属のみに見いだされ、他のFirmicutes(グラム陽性菌)での研究で、各々異なるリン酸化基質タンパク質が同定されていることから、適応進化に応じたK-P制御の機能的多様性の存在が推定された。
尿細管間質障害の新たなバイオマーカー及び治療標的としてのミッドカインの基礎的研究

1:各種腎疾患383例の検討から、腎炎・ネフローゼ症例では尿中MKは微増に留まるものの、ATN症例では著増することを見出した。コントロール群やAKI以外の腎障害患者の尿中MK濃度に比較して、AKIの主たる原因である急性尿細管壊死(ATN)の患者において、尿中MK濃度の有意な上昇が認められた。ROC曲線のAUC(area under the curve)は0.96と単一のバイオマーカーとしては類をみない素晴らしい結果が得られた。また、尿中MK濃度のカットオフ値を70pg/mlに設定すると、尿中MK濃度を用いたAKI診断の感度は97.0%、特異度は91.1%と既存の尿中バイオマーカーを凌駕した。以上のように、尿中MK濃度がAKIの鋭敏なマーカーとなることが判明した。2:腹部大動脈瘤置換術・心臓弁置換術施行43症例を対象とした前向きの検討を行ったところ、AKIを呈した例では、術中よりリアルタイムに尿中MKの有意な上昇を認め、翌日にはほぼもとのレベルに復していることが確認された。また、早期腎癌の部分切除術においては、切除後の病側腎(30分程度の腎動脈クランプを受ける)からの初期尿で、著しくMKは上昇していた。以上の結果より、術中に尿中MK濃度が上昇する症例は、術後AKIを呈する可能性が極めて高いことが明らかとなった。換言すれば、尿中MKをマーカーに利用すれば、術中という極めて早期にAKIの発症予測が可能であることが判明した。これまでに保険適用されている他のマーカーではこのような早期の予測は不可能である。近年、心血管術後やICU管理下の急性腎機能障害を呈する患者群において、わずかなCr上昇が患者死亡に大きく寄与することが認識され、ARF(acute renal failure)からAKI(acute kidney injury)へのパラダイムシフトがおきている。AKIの定量的評価指標であるRIFLE criteriaが示され、ベースラインから25%のCr増加でもRisk、50%でInjuryとしてAKIに分類される。しかし、Crの上昇に1,2日を要することから、AKIのより早期のバイオマーカーの確立が急務であり、NGAL、IL-18などの有用性が報告されている。我々は、尿中ミッドカイン濃度がAKIのよいバイオマーカーとなるか確認するため、以下の疾患群の患者血清・尿中のミッドカイン濃度を測定した。1)腎生検症例383名2)腹部大動脈瘤血管置換術・心臓弁膜症での弁置換術症例3)腎移植症例4)腎腫瘍による腎部分切除症例現段階で1)、2)の症例に関してデータが揃いつつあり、3)・4)に関しては解析可能な症例数に向けてデータを蓄積中である。各種腎疾患383例の検討から、腎炎・ネフローゼ症例では尿中ミッドカインハ微増に留まるものの、ATN症例では有意に尿中midkineが著増することを見出した。さらに、腹部大動脈瘤置換術施行28症例を対象とした前向きの検討を行ったところ、AKIを呈した例では、術中より尿中midkineの有意な上昇を認め、翌日にはほぼもとのレベルに復していることが確認された。さらに既存のマーカーであるL-FABPとの比較ではより早期にミッドカインの上昇がみられた。以上より、尿中ミッドカインは腎虚血に由来するAKIの早期バイオマーカーとして有望であり、現在、体外循環をもちいる心臓弁膜症手術症例での検討も進めている。検査試薬としての特急申請準備中であり、今回は成果を非公表とした。1.ミッドカイン欠損マウスを用いた腎虚血再灌流障害モデルでの検討より、虚血障害によりミッドカインは、近位尿細管上皮細胞においてmRNAレベル及び蛋白レベルでも発現が増加し、直接またはMCP-1発現誘導を介して、マクロファージ浸潤を誘導し、腎障害進展に深く関与することが確認された。

2.ヒト培養尿細管上皮細胞を用いた検討では、MKは主に低酸素刺激により培養上清中にsheddingされるが、細胞分画ではMKの発現に変化を認めなかった。BSA刺激では、細胞分画・上清ともにMKの増加は認めなかった。3.各種腎疾患383例の検討から、腎炎・ネフローゼ症例では尿中MK濃度と血中MK濃度との間に全く相関がないことが確認された。以上の結果から、尿中ミッドカインは腎局所で特に虚血障害により発現が誘導され、尿細管腔に分泌されたものを反映していると考えられた。また、蛋白尿刺激ではMKは発現誘導されなかった。4.臨床研究各種腎疾患383例の検討から、腎炎・ネフローゼ症例では尿中MKは微増に留まるものの、ATN症例では著増することを見出した。さらに、腹部大動脈瘤置換術・心臓弁置換術施行43症例を対象とした前向きの検討を行ったところ、AKIを呈した例では、術中よりリアルタイムに尿中MKの有意な上昇を認め、翌日にはほぼもとのレベルに復していることが確認された。尿中MK濃度:70.0pg/ml.をカットオフ値としたRock曲線を描くと、AKIの診断の感度97%、特異度91.1%と非常に良好な結果が得られた。また、早期腎癌の部分切除術においては、切除後の病側腎(30分程度の腎動脈クランプを受ける)からの初期尿で、著しくMKは上昇していた。
Guanylate Cyclaseの活性制禦機構とその標的タンパク質の追跡

平成9年度に牛肺から可溶性グアニレートサイクラーゼの大量精製を試みた。その結果、従来の報告にあったBlue SepharoseやHydroxyapatiteカラムコロマトグラフィーでは吸着されなかったり、溶出出来なかったりした。その為、Blue Sepharoseの使用を断念し、Hydroxyapatiteは市販品を種々試し、Gigapiteを使用し、GTP-Sepharoseは自作した。その結果、牛肺4kgから約3-10mgの可溶性グアニレートサイクラーゼを精製できるようになった。此の過程で、可溶性グアニレートサイクラーゼがGTP結合タンパク質の一種であること、更に多くのGTP-結合タンパク質が細菌毒素であるコレラ、百日咳、ボツリヌス毒素等によりmono-ADP-ribosyl化を受けることから、この可能性を検討し、各種細菌毒素により本酵素のsmall-subunitに選択的にmono-ADP-ribosyl化を受け、酵素活性を通常の約10倍にすることを見いだし、これらをJ.Biochem.122,(1997)p.531に共著論文として発表した。そして、大量に精製した牛肺の可溶性グアニレートサイクラーゼが一酸化窒素とsmall-subunitのHis-105と結合し、著しく酵素活性を100倍以上にあげることから、一酸化窒素の本酵素への結合タンパク質酵素の立体構造に著しい変化を与えることをラマン分光学的に明らかにした(Biochemistyr,36,(1997)p10155)。これらの精製酵素を抗原として、モノクローナル抗体を作製した結果、small-subunitを認識する抗体とlarge,small-subunitの両方を認識するモノクロナール抗体(mAb3221)を得た。Mab3321の特徴を調べたところ、本抗体は可溶性グアニレートサイクラーゼの一酸化窒素による立体構造の変化を認識できる抗体であり、現在話題になっている一酸化窒素の検出に使用可能であることがあきらかになった。(FEBS Lett.,455,(1999)p.291)。著者は牛肺から可溶性Guanylate Cyclaseをイオン交換樹脂やGTPアフィニテイーカラム等を用いて、肺抽出液と較べて比活性で約12、000倍以上に精製することが出来た。精製されたGuanylate Cyalaseは分子量74、000と69、000のヘテロダイマーであり、酵素1mol当たり1molのhemeを含んでいた。反応液中のマグネシウムイオンをマンガンに換えるとその活性は約10倍、一酸化窒素添加で約150倍活性が上昇した。さらに、ADP-ribosyltransferase活性をもつ、コレラ、百日咳、ボツリヌスC3毒素とNADを共存させるとその活性は約10倍上昇し、マンガンイオンがあればさらに約30倍活性は上昇した。此の時、ADP-riboseは69、000のSubunit 1mol当たり1molのADP-riboseが結合していた。一方、本精製酵素に一酸化窒素を添加すると、高分解ラマン分光測定に於いて、N-O,Fe-NOの伸縮シグナルが1681、521cm^<-1>に認めたが、GTP存在下ではそれぞれのシグナルが1700、1681cm^<-1>に変化し、同じ変化がcGMP存在下でも認められたが,GTPの類似体である、ATP,guanylimidopiphosphate,GTP-gammaS,やピロリン酸では認められなかった。

これらの結果から結合NOの近くで、GTPやcGMPはheme遠位で結合し、一酸化窒素による活性制御を受けると共に、一酸化炭素やADP-ribosylationによる複合的な制御を受けていることが推察される。脳内のcGMP結合タンパク質の精製は始めたばかりであるが、現在結合能の最も高いタンパク質を追跡中である。著者は前年度に牛肺から可溶性Guanylate Cyclaseをイオン交換樹脂やGTP-アフィニテイーカラム等を用いて精製し、高ラマン分光を含む分光学的測定による本酵素の特徴を明らかにすると共に、一酸化窒素の添加や各種ADP-ribosyl化活性を持つ細菌毒素により活性が著しく上昇すること等を報告してきた。そのなかでも、一酸化窒素による可溶性Guanylate Cyclase活性は一酸化窒素添加しない場合と較べると100倍以上のCyclc GMPの産生がある。このことは、細胞内情報伝達に於ける一酸化窒素合成酵素により産生される一酸化窒素と可溶性Guanylate Cyclaseの役割、即ち両酵素の細胞内局在性が重要になる。何故なら、一酸化窒素の溶液中のHalf lifeは約2秒と非常に短い為である。一方、哺乳動物の小脳ではPurkinje細胞やAstroglia細胞に一酸化窒素合成酵素が存在し、長期記憶抑制に機能すると云う報告が有る。しかし、これらの一酸化合成酵素とGuanylate Cyclaseの役割は不明であった。本年度著者は、大量精製した牛肺のGuanylate cyclaseを抗原に単一抗体の作製を行い、此れを用いてラット小脳に於ける、両酵素の局在性を明らかにした。培養ラット小脳細胞では確かに一酸化窒素合成酵素とGuanylate CyclasseはPurkinjeやAstrongliaにあったが、Purkinje細胞では両酵素は一酸化窒素合成酵素をとりまくようにGuanylate Cyclaseが局在していたにも拘らず、Astrogliaでは両酵素は細胞質内でお互いに遍在していた。このことは小脳の唯一の情報発信細胞であるPurkinje細胞では一酸化窒素が可溶性Guanylate Cyalseのhemeに結合し立体構造変化をおこし、CyclicGMPの細胞内濃度を上昇させて細胞内情報を伝達していることを示唆する。今年度は、既に確立した精製法で牛肺から可溶性Guanylate Cyclaseを調整し、これを抗原としてマウスに投与し、モノクローナル抗体を作成した。その結果、二つのIgGを分泌するモノクローナル抗体産生ハイブリドーマ株、mAb3221とmAb28131をクローン化出来た。Westernblottingに於てmAb3221は強くlarge-subunitと幾分それより劣るがsmall-subunitを認識し、mAb28131はsmall-subunitのみを認識した。ラット小脳由来の培養細胞でこれらの抗体を用いて免疫組織染色を行ったところ、mAb3221はPurkinje細胞で一酸化窒素存在下に抗原である可溶性Guanylate Cyclaseと強く反応することが解った。
頚部リンパ節転移に対するオーダーメイド画像診断システムの開発

本研究の成果は以下のとおりである。1. CTにおいてRim-enhanceを呈した転移リンパ節の低吸収域は病理組織学的にも壊死巣を含んではいたが、すべてが壊死巣ではなく、腫瘍蜂巣、角化および線維組織も存在していた。これまでの低吸収域は壊死巣を表すとの報告に加え、腫瘍蜂巣、角化巣および線維組織も存在すると言う新たな知見である。2. CTにおいて、非転移リンパ節の低吸収域を示す領域は病理組織学的には脂肪組織または出血であった。これまで非転移リンパ節の低吸収域は脂肪であるとされていたが、出血も存在するとの新たな知見である。3. MRIのT2強調画像において、転移リンパ節の約32%が高信号領域を示すが、一方、中程度の信号領域を示す場合も約32%あった。高信号を呈する部分は病理組織学的には嚢胞様構造物および角化領域であった。中程度の信号領域は角化領域であった。このように、角化領域は高信号または中程度の信号と違った信号強度をしめした。組織学的な成熟段階により信号強度が変化することが示唆された。4. Dynamic-MRIにおいて、従来のROI法より小さいsmall ROI法を考案し、その有用性について検討を行った、本方法を用いることにより、リンパ節内の微細な組織構造の診断に有効であることが示唆された。正常リンパ組織は急増急減型、腫瘍巣は急増漸減型、壊死巣および角化巣は漸増型または無造影型を示した。5.超音波ドプラー画像において、リンパ節内の血流は歯の状態に左右されることが示唆された。本結果は個体の口腔内衛生状態を加味した転移リンパ節の超音波ドプラーの診断基準作成に有用な所見である。平成17年度は以下のような頸部リンパ節の画像および病理組織データの収集および分析を行った。1.口腔癌患者の頸部のCT、MRIおよび超音波検査を行い、各画像上でのリンパ節のサイズおよび画像所見を評価し、リンパ節の存在部位のマッピングを行った。マッピングにはすでに開発を行っていた頸部リンパ節自動マッピングシステムを用いた。なお、これらのデータベース化を行った。2.頸部郭清術を行った摘出物のMRI撮像を行い、摘出物内でのリンパ節を存在部位の同定を行うことを試みた。しかし、予測したような明瞭な像を得ることができなかった。撮像シークエンスの検討または本方法の有用性についても今後検討する必要があると考えられた。3.頸部郭清術を行った口腔癌患者のリンパ節の剖出を行い、剖出したリンパ節の病理組織所見の評価を行った。この病理所見と上記1)の画像所見との比較を行い、データベース化を行った。4.口腔癌を有しない患者の頸部リンパ節のドプラ超音波検査を行い、頸部リンパ節内の血流の走行状態および血流の分布状態の定量分析法の考案を行った。さらに、本方法を用いて、炎症性リンパ節腫大と悪性腫瘍の比較検討を行い、炎症性リンパ節における血管走行および血流分布の特徴を見出すことを行った。5.口腔癌患者の頸部リンパ節診断に対するMRIのDWIBS法のリンパ節描出能の検討を行った。DWIBS法を用いることにより、T1強調画像やSTIR画像では検出できないリンパ節を描出できるとの結果を得た。また、DWIBS法では、摘出物から剖出したリンパ節数とほぼ同じ数のリンパ節が描出可能であることを示唆するものであった。しかし、炎症性リンパ節と転移性リンパ節との鑑別はできないであろうとの結果も得た。

口腔癌からの頸部リンパ節に対する画像検査の診断基準の改訂を行い、その診断能について、positive predict value(PPV)およびnegative prodict value(NPV)の算出を行った。CT所見での診断基準については、従来から言われている内部のlow density areaの存在所見以外の有用な所見を見出すことはできなかった。そのPPVは90%以上ではあるが、NPVは60%以下と低いものであり、CTでの頸部リンパ節転移診断の限界が示唆された。また、MRI検査の有用性について検討を行った。検討の主たる目的はCT検査との比較であった。頸部の腫大リンパ節の描出能はCT検査とほぼ同様であり、かつ壊死巣の検出能も同等であった。故に、被曝のないMRI検査がCT検査にとって変わる検査であることが示唆された。さらに、MRI検査は壊死巣の描出において、種々の信号強度を呈し、CT検査より壊死の病理学的バリエーションをより表していることも示唆された。超音波検査における診断基準の改訂作業を行ったが、これまでに構築してきたリンパ節内部の血管走行、内部エコーの存在の有無以外に有用な所見を見出すことはできなかった。また、これらの画像所見を入力することにより、診断結果をビジュアルに呈示する画像診断システムの構築についても、これまでの画像診断システムの改訂を行い、LAN上でその結果を配信でき、情報が共有できるシステムへとバージョンアップを図っており、その方法論は確立した。現在、LAN上での運用について検討を行っている。
「四国八十八ヶ所巡礼の旅」の体育学的研究

本年度は一部未調査の旧へんろ道を確認した後、できる限り、旧へんろ道を通って、全行程徒歩へんろを試み、中高年者の生体的なデ-タを得る予定であったが、旧へんろ道特定のための実地調査に予想以上の時間を要したため、頭初の計画から大幅に遅れる結果となった。従って、今回の報告は、完全に調査が終った徳島県内のへんろ道の実態、及び徳島県内の1番札所から23番札所までの間を中高年者4名で実施した徒歩へんろから得られた知見に留めざるを得ない。1.1番札所から高知県境古目までのメインル-トは186.1kmであるが、その他1番札所へのアプロ-チル-トなどを含めた徳島県内のへんろ道の総距離は250.2kmであった。2.徳島県内で確認されたへんろ石は、標石272、丁石237、計509基であった。3.非鍛練の主婦を含む中高年者4名のグル-プの1番23番(150km)の所要日数は8泊9日(1日平均8時間歩行)であった。4.心拍数変動からみた中高年者への運動強度は、日常の生活習慣(日ごろどの程度歩いているか)によって、大きな差がみられた。5.上記の差は、11番札所から12番札所の間(総登行標高1060m、総下行標高545m、所要時間10時間)で、最も顕著に現れた。本年度は「へんろ道」の実地調査を中心に研究をすすめた。「四国遍路指南」(眞念・1687年)、「四国遍路絵図」、(細田周英・1764年)による仮説ルートを、現存するへんろ石によって確認する方法をとった。四国全域にわたる実地調査を行ったが、徳島県を除く他の三県については、まだかなりの部分の未調査地域を残しているので、ここでは、徳島県内の「へんろ道」について、得られた知見を示すに留めたい。(1)徳島県内の123番札所間の「へんろ道」の距離は150.6kmであり、そのうち、車両通行不能の徒歩へんろ専用道は32.9km(21.8%)である(2)その徒歩へんろ専用道のうち27%(8.9km)は通行困難または通行不能の状態である。(3)へんろ石の年代から、江戸中期以後、現代に至るまで、「へんろ道」にはかなりの変遷があり、部分的にはいくつかの複数ルートが発見された。(4)徳島県内の巡礼拝ルートとしての17ケ所詣り(1番札所から出発して、17番札所を経て再び1番札所にもどるルート)の道が、17番から1番の間のへんろ石の発見によって確認された。(5)徳島県内で発見されたへんろ石は総数473基(内丁石237基)で、これらの大部分は、現代においても、徒歩へんろのための道標としての機能を果す。(6)環境庁の補助事業として四国四県が共同で整備をすすめている「四国のみち」と徳島県内の「へんろ道」との重複は54.8km(36.3%)であり、この部分はよく整備されている上記のとおり、今年度の調査によって、徳島県内の「へんろ道」の全容が、ほぼ明らかになったが、「四国のみち」以外の「へんろ道」及「へんろ石」については、早急の保存対策が必要と思われる。本年度は一部未調査の旧へんろ道を確認した後、できる限り、旧へんろ道を通って、全行程徒歩へんろを試み、中高年者の主体的なデ-タを得る予定であったが、旧へんろ道特定のための実地調査に予測以上の時間を要したため、頭初の計画から大幅に遅れる結果となった。従って、今回の報告は、完全に調査が終った徳島県内のへんろ道の実態及び徳島県内の1番札所から23番札所までの間を中高年者4名で実施した徒歩へんろから得られた知見に留めざるを得ない。

1. 1番札所から高知県境古目までのメインル-トは186.1kmであるが、その他1番札所へのアプロ-チル-トなどを含めた徳島県内のへんろ道の総距離は250.2kmであった。2.徳島県内で確認されたへんろ石は、標石272、丁石237、計509であった。3.非鍛練の主婦を含む中高年者4名のグル-プの1番23番(150km)の所要日数は8泊9日(1日平均8時間歩行)であった。4.心拍数変動からみた中高年者への運動強度は、日常の生活習慣(日ごろどの程度歩いているか)によって、大きな差がみられた。5.上記の差は、11番札所から12番札所の間(総登高標高1060m、総下行標高545m、所要時間10時間)で、最も顕著に現れた。
非線形フォトニック結晶による深紫外コヒーレント光源の開発

本研究開発では、フォトニック結晶機能と高非線形性光学材料を融合させる新しい非線形2次元フォトニック結晶の創製を行った。非線形フォトニック結晶内において発現する非線形光学応答と特異な光分散関係(群速度等)との相互関係を定量的に検証することによって、波長変換素子や2光子吸収素子などの非線形光学デバイスの性能を劇的に向上させることに成功した。さらに本原理を用いて、高効率・コンパクトな深紫外コヒーレント波長変換素子の動作実証に成功した。本研究の目標は、光と物質との間の相互作用を高度制御する非線形フォトニック結晶を用いることによって、新たなアプローチからこれまで存在しなかった深紫外小型高性能コヒーレント光源を開発することである。平成19年度は、フォトニック結晶機能と高非線形性光学結晶とを融合させる新しい素子構造(縦型ヘテロ・非線形フォトニック結晶)を提案することにより、難加工性の問題をクリアーする高精度な素子作製技術の確立を目指した。フォトニック結晶を利用した光非線形性素子の定量的な実証研究が進んでいなかった最大の理由は、LiNbO_3結晶などに代表的される高非線形性材料の難加工性にあり、2次元フォトニック結晶のようなナノレベルの極微細構造を高精度に作製することが困難であったためである。本研究ではこの問題を克服するため、2次元フォトニック結晶スラブ層と非線形光学材料層を上下に構造的に分離し、且つ光モード的に結合させた従来にない独自の素子構造(縦型ヘテロ・非線形フォトニック結晶)を用いることを提案した。この構造を用いることによって、非線形特性に優れた高非線形性LiNbO_3結晶を用いて、ナノ微細加工技術により高精度な2次元フォトニック結晶導波路を作製することに初めて成功した。本素子に対する光学特性評価として、広帯域角度分解分反射スペクトル測定を行い、素子の実験的光バンド構造を定量的に評価し、実験的なバンド分散関係を直接明らかにした。またさらに並行して3次元時間領域差分(3D-FDTD)法を用いた理論的光バンド構造を算出し、その対応関係により、非線形2次元フォトニック結晶素子が極めて正確に作製されていることを定量的に実証した。さらに低群速度、及び位相制御により、高効率波長変換デバイスなどの高性能な新しい光非線形機能素子の創出が可能であることを示した。本研究の目標は、光と物質との間の相互作用を高度制御する非線形フォトニック結晶を用いることによって、新たなアプローチからこれまで存在しなかった深紫外小型高性能コヒーレント光源を実現することである。実施2年目である平成20年度は、初年度(平成19年度)において高精度作製に成功した高非線形性ニオブ酸リチウム(LiNbO_3)単結晶2次元フォトニック結晶素子を用いて、フォトニック結晶内における非線形(波長変換)特性と特異な光分散関係(低群速度等)との相互関係を独自に開発した光バンド構造の直接観測手法から定量的に検証し、どのような光分散制御が従来性能限界を打破する新しい光非線形機能を発現させ高性能化につながるのか解明することによって、極めて遅い群速度と新しいタイプの位相整合を併せて達成した波長変換効率の紫外領域における300倍以上の増強効果を世界に先駆け実験的に実証することに成功した。この新たな高効率波長変換技術の開発によって、相互作用が弱く高効率な動作が従来困難であった波長領域(深紫外・テラヘルツ波など)でも実用レベルの波長変換が可能となり、半導体LDでは実現できていない小型高性能な未踏波長コヒーレント光源開発実現の可能性が開かれた。またさらに非線形光学ポリマーを用いて非線形2次元フォトニック結晶導波路素子を作製し、同様の原理により、3次非線形光学応答(2光子吸収過程)性能の大幅な高効率化に初めて成功した。性能指数である2光子吸収断面積σ^<(2)>の値として90000GMという極めて高い値(世界トップデータ)を記録した。本成果により、次々世代超高密度3次元光メモリなど、これまで材料性能が低く実用化できていなかった様々な応用デバイスの実現が期待される。本年度は、極めて高い非線形性能を有するニオブ酸リチウム(LiNbO_3)単結晶をもちいて非線形2次元フォトニック結晶導波路素子を作製し、同素子を用いて光の速度(群速度)を減速し、レーザー光と物質との間の相互作用を大きく増幅させることにより、深紫外光領域における第二高調波発生強度の大幅な増大実証に初めて成功した。この新たな高効率波長変換技術の開発によって、相互作用が弱く高効率な動作が従来困難であった波長領域(深紫外光領域)でも実用レベルの波長変換が可能となり、半導体レーザーダイオードでは実現できていない小型高性能な未踏波長コヒーレント光源開発実現の可能性が開かれた。またさらに非線形分極のナノレベル制御技術を開発し、面内導波タイプの位相整合条件を満たした2次元χ^<(2)>

非線形フォトニック結晶素子を作製することで、極めて高い波長変換効率を達成した深紫外・小型コヒーレント光源の動作実証に世界で初めて成功した。2次元χ^<(2)>フォトニック結晶における深紫外領域のSHGスペクトル(325nm)を観測し、SHG変換効率を定量化した結果、変換効率11.5%/W、規格化変換効率で1157%/W/cm2という波長変換における極めて高い性能指数が得られた。以上の成果は本研究で提案した非線形2次元フォトニック結晶を用いた小型高性能な深紫外レーザー光源の実現性を実証するものであり、学術上の重要性だけではなく、産業界に対しても大きなインパクト・波及効果をもたらすことが期待される。
軟骨細胞移植におけるin vivo electroporationの応用

前年度の研究を進め、家兎膝関節から分離した軟骨細胞にelectroporationでlacZgeneを導入し、導入後にlacZを発現させることに成功した。ついでTGFβ遺伝子をQinらの方法に準じて、軟骨細胞にBone morphogenetic protein 2,Transforming growthfactor β1,basicfibroblast growth factorの導入実験を行った。この際、遺伝子導入の際の至適条件を求めるために、刺激電圧、刺激時間、細胞濃度、細胞浮遊液成分等を検討した。この結果、この至適条件の決定には導入条件によって細胞の生存率や遺伝子の発現率が大きく変化することが分かった。つまり、その条件設定は厳密性を要求するものであったため、現在その実験を繰り返している。TGF β1についてはその導入効率が約5%であった。また、その蛋白発現はELISA法によって、確認できたものの、低く、しかも導入した軟骨細胞の生存率が低いために、移植に有効な細胞s濃度を得ることが困難であることが判明した。これを改善すべく、実験を繰り返している。また、軟骨細胞だけでなく軟骨細胞に分化する間葉系幹細胞への遺伝子導入を現在検討している。これら細胞への導入効率と細胞生存率数をあげるべく導入方法を改善しするとともに、厳密な至適条件を求めている。この至適条件が設定出来次第、in vivoでの軟骨形成・再生への有効性を明らかにし、報告するつもりである。Electroporationの一般的条件設定や効率を確かめるために、予備実験として株化された培養細胞を用いた。これによって、electroporation実験に再現性があることと実用に向けての可能性があることを確認した。続いて、幼弱家兎(0.5kg)の膝関節軟骨から採取した軟骨細胞にclectroporationでlacZ geneを導入し、導入後にlacZを発現させることに成功した。しかし、導入条件によって大きく細胞の生存率や遺伝子の発現率が変化することが分かったため非常に厳密な条件設定が必要になった。そこで追加実験を慎重に行って至適条件(刺激電圧・刺激時間・細胞濃度・細胞浮遊液成分等)を決定しようとしているところである。多くの労力と長い時間がかかるが、これを十分に検索することが本研究を最終的に成功させるためには極めて重要である。また、コラーゲン・ゲル内で3次元培養した場合の導入実験も準備している。これにおいては導入DNAを細胞周囲に供給するための適切な方法の開発が昨年度の課題であったが、再現性のある効率の良い方法を検討している。また、関節軟骨だけでは関節軟骨欠損の治療に十分な細胞数が得られない場合があると予想されたため、肋軟骨や皮下組織の細胞を用いて遺伝子導入を試みた。しかし、組織からの細胞の回収率やelectroporation後の細胞生存率が低く遺伝子導入は困難であることが明らかになった。そこで、他の間葉系細胞の利用や関節軟骨の細胞を培養系で増殖させてから遺伝子を導入する方法を検討している。前年度に引き続いて、Electroporationの一般的条件設定や効率を確かめるために株化された培養細胞を用いた。続いて、幼弱家兎(0.5kg)の膝関節軟骨から採取した軟骨細胞にelectoroporationでlacZ geneを導入し、導入後にlacZを発現させることに成功した。しかし、導入条件によって細胞の生存率や遺伝子の発現率が大きく変化することが分かったため非常に厳密な条件設定が必要になった。そこで追加実験を慎重に行って至適条件(刺激電圧・刺激時間・細胞濃度・細胞浮遊液成分等)を決定するための実験を繰り返した。続いてTGF-beta geneの導入を試みたが現在までのところ十分な発現を確認出来ていない。そのため至適条件検索のため更なる実験を計画している。また、導入条件によっては細胞の生存率が著しく低下するため、関節軟骨だけでは関節軟骨欠損の治療に十分な細胞数が得られない場合があると予想された。肋軟骨や皮下組織の細胞を用いたところ、組織からの細胞の回収率やelectroporation後の細胞生存率が低く遺伝子導入は困難であることが明らかになった。そこで、他の間葉系細胞の利用や関節軟骨の細胞を培養系で増殖させてから遺伝子を導入する方法も検討している。また、コラーゲン・ゲル内で3次元培養した場合の導入実験も準備しているが、既にゲル内に包埋された細胞に均一にvectorを供給できるかどうかが大きな問題である。最終的にはin vivoにおける本研究の有効性を検討したいが、再現性のある効率の良い方法を決定することは今後の研究の有用性・信頼性に大きな影響を及ぼすため十分な検討をしていきたい。

また、その蛋白発現はELISA法によって、確認できたものの、低く、しかも導入した軟骨細胞の生存率が低いために、移植に有効な細胞s濃度を得ることが困難であることが判明した。これを改善すべく、実験を繰り返している。また、軟骨細胞だけでなく軟骨細胞に分化する間葉系幹細胞への遺伝子導入を現在検討している。これら細胞への導入効率と細胞生存率数をあげるべく導入方法を改善しするとともに、厳密な至適条件を求めている。この至適条件が設定出来次第、in vivoでの軟骨形成・再生への有効性を明らかにし、報告するつもりである。
気生微細藻類を用いるバイオフィルターの作成と環境汚染物質除去システムの構築

1.気生微細藻類利用型バイオフィルターの富栄養化物質除去能の評価気生微細藻類Trentepohlia aureaは糸状体の微生物であるために基物着生能が高く、さらに高濃度の硝酸イオンや亜硝酸イオンの液体培養下においても生育可能であることから、このような藻細胞の性質を利用することで気生微細藻類利用型バイオフィルターを作成し、その硝酸イオンおよびリン酸イオンの除去能について検討した。バイオフィルターは細胞懸濁液をガラス繊維ろ紙上に滴下し着生することによって作成したよバイオフィルターによる富栄養花物質除芸テストは様々な環現下(光強度、ph、温度)においてバッチ式で行った。除去期間は4日間とした。この結果、藻細胞はガラス繊維ろ紙に確実に着生していることが観察され、これによって硝酸イオンおよびリン酸イオンを除去することが認められた。また、バイオフィルターは比較的低い光強度下で、pH5pH9の幅広い範囲において高い富栄養化物質除去能を示し、この除去能は藻細胞の最に概ね比例することが分かった。2.バイオフィルターの保存性の検討気生微細藻類利用型バイオフィルターは、水質浄化操作における繰り返し使用に対して生物的・物理的な耐久性をもっていることが大きな特徴である。本研究では、バイオフィルターの特徴づけの一環として、その冨栄養化物質除去機能の冷暗所における保存性について検討した。この結果、作成したバイオフィルターを冷蔵庫内(暗所・4°C)で90日間置いた場合でも、それは十分機能することが分かった。したがって、バイオフィルターを予め作製しておくことで、必要なときに常時使用可能であることが期待される。3.環境汚染物質除去システムの構築本研究のバイオフィルターは、大量の排水を迅速に浄化する微生物を利用した水処理システムの構築に活用することにある。まず、ガラス製カラム内に作成したバイオフィルム(10枚程度)を水平に等間隔で配置することにより気生微細藻類利用型バイオリアクターを作った。このカラム内に合成排水を循環し、経時的に水中の硝酸イオンおよびリン酸イオン濃度を分析することでバイオリアクターの富栄養化物質除去能を評価した。この結果、循環式のバイオリアクターでは富栄養化物質の除去効率がバッチ式と比べ著しく向上することが分かった.したがって、気生微細藻類利用型バイオリアクターは水の浄化作用を十分に示し、更なる検討を加えることで新規水処理システムの構築が期待される.本研究では様々な気生微細藻類を岩場め表面から採集・単離しておりここれらの藻細胞を用いることで気生微細藻類利用型バイオリアクターの水処理システムの構築をさらに検討する予定である。以上、本年度の研究実績の概要について簡潔に記した。1.気生微細藻類のスクリーニング本年度は、山形県米沢市白布温泉、静岡県下田市鍋田海岸、山梨県北都留郡小菅村小菅温泉、および栃木県塩谷群栗山村湯西川温泉にてコンクリート塀など基物の表面に着生した気生微細藻類をスクリーニングした。この4地点から採集した藻類を無菌的に寒天培養した結果、置床してから約3ヶ月後に緑色のコロニーの形成がいずれも観察された。2.気生微細藻類の液体培養および生体成分分析寒天培養により形成したコロニーをBold's Basal培地(淡水培地)を用いてそれぞれ液体培養を行った(光強度:50μE/m^2/s、温度:25°C)。その結果、4地点から得られた藻体の生育速度は、白布温泉≫鍋田海岸>湯西川温泉>小菅温泉の順となった。また、藻体の細胞観察を行ったところ、すべての細胞において形状は球状であり、長径は約10μmであった。次に、4地点から得られた藻体の生体成分について検討した。その結果、薄層クロマトグラフィーによる色素分析にいては、特に小菅温泉から採集された藻体から赤色色素(アスタキサンチン)が検出された。アスタキサンチンはカロテノイド中で最も抗酸化作用を示すと言われている色素であり、稀に藻細胞から見つかることがある。脂肪酸分析については。小菅温泉および湯西川から採集された藻体には機能性脂肪酸であるアラキドン酸とエイコサペンタエン酸が多量に含有していることが分かった。以上、本年度の研究実績の概要について記した。1.気生微細藻類を用いるバイオフィルターの作製本年度は、山形県米沢市白布温泉、静岡県下田市鍋田海岸、山梨県北都留郡小菅村小菅温泉、および栃木県塩谷群栗山村湯西川温泉にてコンクリート塀などの基物からスクリーニングした気生微細藻類を用いてバイオフィルターを作製した。担体としてガラス繊維ろ紙を選んだ。また、ガラス繊維中の細胞観察により、それぞれの藻体がガラス繊維にしっかりと着生していることが認められた。今回使用した6種の藻体は同様の光合成色素(β-カロテン、クロロフィル、ルテインなど)をもっていることが分かり、全て緑藻類であった。2.バイオフィルターの無機窒素源除去能力の評価各藻体のバイオフィルターは、pH8.0、温度25±2°C、光強度30μE/m^2/sの条件下で液体培地の入った平底試験管に浸した。バイオフィルターによる硝酸イオン除去速度は、経時的に培地を採取しイオンクロマトグラフィーを用いることで測定した。この結果、硝酸イオン除去速度は藻体の種類によって大きく違いを示したが、白布温泉から採取した藻体が著しく高いことが分かった。

3.気生微細藻類利用型バイオリアクターの作製今回、気生微細藻類Trentepohlia aureaのバイオフィルターを用いて、ガラス製のカラム内にそのバイオフィルターを数十枚重ねることで気生微細藻類利用型バイオリアクターを作製した。そのバイオリアクター内に合成排水を循環し、経時的に排水を分析することで気生微細藻類利用型バイオリアクターの無機窒素源除去能力を評価した。合成排水中の硝酸イオン濃度は、光照射下において比較的速い速度で除去されることが分かった。以上、本年度の研究実績の概要について簡潔に記した。1.気生微細藻類利用型バイオフィルターの富栄養化物質除去能の評価気生微細藻類Trentepohlia aureaは糸状体の微生物であるために基物着生能が高く、さらに高濃度の硝酸イオンや亜硝酸イオンの液体培養下においても生育可能であることから、このような藻細胞の性質を利用することで気生微細藻類利用型バイオフィルターを作成し、その硝酸イオンおよびリン酸イオンの除去能について検討した。バイオフィルターは細胞懸濁液をガラス繊維ろ紙上に滴下し着生することによって作成したよバイオフィルターによる富栄養花物質除芸テストは様々な環現下(光強度、ph、温度)においてバッチ式で行った。除去期間は4日間とした。この結果、藻細胞はガラス繊維ろ紙に確実に着生していることが観察され、これによって硝酸イオンおよびリン酸イオンを除去することが認められた。また、バイオフィルターは比較的低い光強度下で、pH5pH9の幅広い範囲において高い富栄養化物質除去能を示し、この除去能は藻細胞の最に概ね比例することが分かった。2.バイオフィルターの保存性の検討気生微細藻類利用型バイオフィルターは、水質浄化操作における繰り返し使用に対して生物的・物理的な耐久性をもっていることが大きな特徴である。本研究では、バイオフィルターの特徴づけの一環として、その冨栄養化物質除去機能の冷暗所における保存性について検討した。この結果、作成したバイオフィルターを冷蔵庫内(暗所・4°C)で90日間置いた場合でも、それは十分機能することが分かった。したがって、バイオフィルターを予め作製しておくことで、必要なときに常時使用可能であることが期待される。3.環境汚染物質除去システムの構築本研究のバイオフィルターは、大量の排水を迅速に浄化する微生物を利用した水処理システムの構築に活用することにある。まず、ガラス製カラム内に作成したバイオフィルム(10枚程度)を水平に等間隔で配置することにより気生微細藻類利用型バイオリアクターを作った。このカラム内に合成排水を循環し、経時的に水中の硝酸イオンおよびリン酸イオン濃度を分析することでバイオリアクターの富栄養化物質除去能を評価した。この結果、循環式のバイオリアクターでは富栄養化物質の除去効率がバッチ式と比べ著しく向上することが分かった.したがって、気生微細藻類利用型バイオリアクターは水の浄化作用を十分に示し、更なる検討を加えることで新規水処理システムの構築が期待される.本研究では様々な気生微細藻類を岩場め表面から採集・単離しておりここれらの藻細胞を用いることで気生微細藻類利用型バイオリアクターの水処理システムの構築をさらに検討する予定である。
骨質維持における副甲状腺ホルモンと骨細胞性ネットーワークの分子調節機構

本研究の解析目標は(1)骨細胞のミネラル調節の微細メカニズム、(2)骨細胞・骨細管系が骨質に与える影響、(3)PTHが骨細胞および骨基質ミネラルの流出・流入に与える影響、である。(1)骨細胞特異的に死滅させるTgマウスの解析を前年度から引き続き行ったところ、骨細胞の死滅により骨基質ミネラルの流出を確認した。骨細胞は酸ホスファターゼやMMP-1ではなく、DMP-1やFGF23などのミネラル調節因子を過剰産生することで骨基質ミネラルの流出・流入を調節すると推測された。本研究の一部は論文掲載(次頁)であり、一部は現在、作成中。(2)鍍銀染色にて骨細胞・骨細管系の分布を検索すると、骨代謝回転が高い部位ではその分布が乱れており、骨代謝回転が低い部位では規則的な幾何学配列を示した。後者ではリン調節に関するFGF23の発現が高く機能的な骨細管系を構築していると考えられた。論文掲載済み(次頁)(3)PTHによってosteocytic osteolysis(骨細胞性骨溶解)が報告されていることから(Belanger,1967)、PTHを野生型マウス(骨改造あり)、また破骨細胞の存在しないc-fos^<-/->マウス(骨改造なし)に投与し、骨細胞骨溶解の有無とその微細メカニズムを解析した。その結果、野生型マウスでは骨小腔の拡大を示したが、c-fos^<-/->マウスでは骨小腔の拡大を示さなかった。また、野生型マウスでは骨細胞におけるsclerostinの産生が低下した。従って、PTH投与における骨細胞性骨溶解は、骨細胞のみで調節されているのではなく、sclerostinなどを介して骨芽細胞に作用し、骨芽細胞・骨細胞系として機能することが示唆された。本研究は新知見が多く、引き続き、検索を行っている。平成18年度では、実験(1)「骨細胞ネットワークと骨リモデリングとの関係」、実験(2)「骨細胞ネットワークが除去された場合の骨代謝・骨質の変化」、および実験(3)「副甲状腺ホルモン(PTH)による骨細胞性ネットワークの調節機構」について解析を行い、現在、実験(3)は研究の継続中である。実験(1)については、骨細胞・骨細管系(骨細胞ネットワーク)が、骨リモデリングの進行とともに幾何学的に秩序だった構築を示すことを明らかにしたものであり、骨細胞ネットワークにおける本研究の基盤を構成する。従って、本実験系を順序として最優先し、現在、論文のrevise中である。実験(2)は、骨細胞特異的プロモーターであるDMP-1にDT受容体を組み込み、DT投与することで骨細胞を死滅させたマウス(国立長寿医療センター・池田部長よりご供与)を用いて解析した。その結果、骨細胞が除去された場合には骨ミネラルの流出が見られるが、力学負荷のかかる部位ではその程度が低く、骨芽細胞の活性状態も骨細胞除去に影響されにくいことを明らかにしている(現在、論文作成中)。実験3はPTH投与により、骨細胞性骨溶解(osteocytic osteolysis)を検討したものであるが、骨芽細胞・骨細胞系ばかりでなく破骨細胞の関与が考えられることから、破骨細胞の存在しないc-fos^<-/->マウスを用いて解析を継続している。現在のところ、PTHは破骨細胞または破骨細胞性骨吸収を介することなく、骨芽細胞の増殖ならびに骨基質合成を亢進させること、また、PTH投与により骨細胞の骨小腔(osteocytic lacunae)の拡大を観察している。

従って、PTHの作用は単に骨表面上の破骨細胞と骨芽細胞のカプリングだけではなく、骨細胞性ネットワークを介して骨ミネラルの維持や骨芽細胞あるいはカップリング調節を行う可能性が推測される。本年度の解析目標は(1)骨細胞のミネラル調節の微細メカニズム、(2)骨細胞・骨細管系が骨質に与える影響、(3)PTHが骨細胞および骨基質ミネラルの流出・流入に与える影響、である。(1)骨細胞特異的に死滅させるTgマウスの解析を前年度から引き続き行ったところ、骨細胞の死滅により骨基質ミネラルの流出を確認した。骨細胞は酸ホスファターゼやMMP-1ではなく、DMP-1やFGF23などのミネラル調節因子を過剰産生することで骨基質ミネラルの流出・流入を調節すると推測された。本研究の一部は論文掲載(次頁)であり、一部は現在、作成中。(2)鍍銀染色にて骨細胞・骨細管系の分布を検索すると、骨代謝回転が高い部位ではその分布が乱れており、骨代謝回転が低い部位では規則的な幾何学配列を示した。後者ではリン調節に関するFGF23の発現が高く機能的な骨細管系を構築していると考えられた。論文掲載済み(次頁)(3)PTHによってosteocytic osteolysis(骨細胞性骨溶解)が報告されていることから(Belanger, 1967)、PTHを野生型マウス(骨改造あり)、また破骨細胞の存在しないc-fos^<-/->マウス(骨改造なし)に投与し、骨細胞骨溶解の有無とその微細メカニズムを解析した。その結果、野生型マウスでは骨小腔の拡大を示したが、c-fos^<-/->マウスでは骨小腔の拡大を示さなかった。また、野生型マウスでは骨細胞におけるsclerostinの産生が低下した。従って、PTH投与における骨細胞性骨溶解は、骨細胞のみで調節されているのではなく、sclerostinなどを介して骨芽細胞に作用し、骨芽細胞・骨細胞系として機能することが示唆された。本研究は新知見が多く、引き続き、検索を行っている。
インフルエンザ感染と重症化に及ぼす口腔細菌の影響とその予防に関する基礎的研究

インフルエンザウイルス表面のノイラミニダーゼ(NA)は、ウイルス放出時に重要な役割を果たしている。口腔からはNA産生細菌が検出されることから、本研究では、細菌由来のNAがウイルスのNAの働きを助長し、ウイルス放出を促進するか否か検討した。その結果、NA活性を認める細菌培養上清を添加しMDCK細胞にウイルス感染を行うと、ウイルスの放出量が著しく増加した。さらに、細菌由来のNAが抗インフルエンザ薬(NA阻害薬)処理時のウイルス感染に及ぼす影響を検討した。その結果、NA産生細菌培養上清の添加によりNA阻害薬の効果が減弱した。毎年流行するインフルエンザにより小児や高齢者を中心に多くの命が失われている。また、新型インフルエンザの流行も危惧されており、インフルエンザの予防対策は喫緊の課題である。インフルエンザは口腔と密接に関連しており、口腔ケアがインフルエンザの予防に有効とされているが、その分子メカニズムは不明である。そこで本研究では、ウイルスの宿主細胞感染機構に注目し、口腔細菌がウイルスの感染性に及ぼす影響を検討した。本年度は口腔細菌由来のノイラミニダーゼがウイルスの放出に及ぼす影響について検討した。口腔細菌培養上清のノイラミニダーゼ活性をスクリーニングした結果、Streptococcus mitisとStreptococcus oralisの活性が高かった。そこで、S. mitisおよびS. oralisの培養上清存在下でウイルス感染実験を行った所、ウイルスの放出が促進された。さらにノイラミニダーゼ阻害薬のひとつであるザナミビル処理時に細菌由来のノイラミニダーゼがウイルス感染に及ぼす影響について検討を行った。ザナミビルがウイルスおよび細菌のノイラミニダーゼ活性に及ぼす影響を検討したところ、ウイルスの活性を阻害するものの、S. mitisおよびS. oralisの活性に影響を及ぼさなかった。ザナミビル処理時にS. mitisおよびS. oralisがウイルス感染に及ぼす影響を検討した結果、S. mitisおよびS. oralisの上清存在下において、ザナミビルによるウイルス放出量の抑制効果が減弱した。以上の結果から、口腔内からノイラミニダーゼ産生細菌を減らすことができる口腔ケアはインフルエンザウイルス感染予防に著しい効果があることが示唆された。毎年流行するインフルエンザにより高齢者を中心に多くの命が失われている。そこで本研究では、ウイルスの宿主感染機構に注目し、口腔内細菌がウイルスの感染性に及ぼす影響を検討した。インフルエンザウイルスが感染性を獲得するには、ヘマグルチニン(HA)がプロテアーゼによりHA1とHA2に開裂しなければならない。このプロテアーゼは主に宿主由来と考えられているが、黄色ブドウ球菌によっても開裂する。口腔ケアはインフルエンザ発症のリスクを低下させる事実から、口腔内細菌由来のプロテアーゼがHAを開裂し、インフルエンザウイルス感染に関与している可能性がある。そこで本年度はPorphyromonas gingivalisがインフルエンザウイルス感染に及ぼす影響について検討した。P. gingivalis培養上清がHAを開裂するか否か検討した結果、開裂が確認された。つぎにP. gingivalis培養上清によりインフルエンザウイルスが感染性を獲得したか否かを細胞感染実験により検討した結果、P. gingivalis培養上清非添加群ではほとんど感染が成立しないものの、添加群においては多くの細胞に感染した。以上の結果から、P. gingivalisが産生するプロテアーゼがHAを開裂し、インフルエンザウイルスは感染性を獲得することが示唆された。口腔微生物学ノイラミニダーゼ産生口腔細菌がインフルエンザウイルスの放出促進に働くことを明らかにし、学術論文として国際誌に投稿中である。さらに、今年度行った予備実験により、口腔細菌由来のプロテアーゼがインフルエンザウイルスの宿主細胞侵入にも関わっている可能性が示唆された。したがって、口腔細菌がウイルスの細胞侵入機構に及ぼす影響を、今後、詳細に検討する必要がある。今年度行った予備実験により、口腔細菌由来プロテアーゼがウイルスの宿主細胞侵入機構に影響を及ぼしている可能性が示唆された。そこで今後は、口腔細菌プロテアーゼ特異的阻害薬および当該プロテアーゼ欠損細菌株を用いて、口腔細菌がウイルスの細胞侵入機構に及ぼす影響について詳細に検討する。さらに、口腔細菌がインフルエンザウイルス感染症の重症化に及ぼす影響について検討を加える。研究を遂行して行く上で、必要に応じて研究費を執行した。本年度は、口腔細菌がウイルスの宿主細胞侵入機構に及ぼす影響についての解析が遅れたため、抗体等試薬使用量が見込みより少量で済み、当初の見込額と執行額は異なった。研究計画に変更はなく、口腔細菌がインフルエンザウイルス感染へ及ぼす影響を検討するため、研究試薬等に繰越した研究費も含めて使用する。