hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
唾液モデルを用いた補綴材料の細胞毒性試験法の開発について

その結果,いずれの金属においてもEagle MEM単独による培養結果と比べて細胞回復度がわずかに低下した.Au-Ag-Pd合金,Ag-Sn合金,Co-Cr合金ならびにTiではこの傾向は少なかったが,Ag-In合金,Ni-Cr合金では細胞回復度は大きく低下した.以上のことから,歯科材料の細胞毒性を評価する際に,重要な口腔内環境因子である唾液を導入した環境における試験の可能性を拡く上での示唆が得られた.In vitroでバイオマテリアルの細胞毒性試験を行う場合に,材料が用いられる環境に近似した環境である唾液をモデルとした細胞毒性試験を目的として,人工唾液とヒト安静唾液の2種類と組織モデルとを組み合わせて補綴材料に対する細胞回復度を調べた.歯科用金属材料8種,すなわちAu-Ag-Pd合金(以下KP),Ag-In-Zn合金(S1),Ag-Sn合金(S2),Ti(TI),Co-Cr合金(WC),Ni-Cr合金(DM),Ni-Cu合金(FC)およびCu(CU),ならびに常温重合レジン2種,加熱重合レジン1種を調べた.実験方法として,組織モデルならびにGin-1細胞を用いて人工唾液2種またはヒト安静唾液をDMEに50v/v%で混合した培養液で作用させ,48時間細胞回復させて呼吸酵素活性阻害を比色定量した.その結果,金属材料ではいずれの培養液でもTIは最も大きな細胞回復度を示した.WC,KP,S1は中等度の細胞回復度,DM,FC,CUはいずれも小さな細胞回復度であった.レジン材料では試料形態によって細胞毒性に差が認められた.培養液に硫化成分を添加した影響については,いずれの試料においても無添加のものと比較して細胞回復度が低下する傾向が認められた.また,唾液因子を添加した培養液の細胞回復度の結果は純粋な培養液の場合と比較してバラツキが若干大きかった.これらの培養条件ではpH緩衝能が低いために試料成分の溶出も不安定であったためと推測される.本研究は唾液の特長ある要素を加味した組織培養液下で補綴材料の腐食,溶解や咬摩耗などの物理化学現象について,従来より適切に表せ得る唾液モデルの確立を目指した.唾液因子を添加した条件において,細胞毒性が従来の結果とは必ずしも一致しなかったことは,口腔内の硫化による影響もin vitro細胞毒性の研究には是非考慮されるべきであることを示唆する成果が得られた.
多様な新規ジアシルグリセロールリン酸化経路群の探索・同定とその分子マシナリー

新開発の独自手法を用いて,ジアシルグリセロール(DG)キナーゼ(DGK)のα, δ, ηアイソザイム等が利用するDG分子種は,従来の定説に反し「ホスファチジルイノシトール(PI)代謝回転とは独立し,それぞれが異なる脂肪酸を利用する未知の経路群」により供給されることを示した.しかし,それらの経路の構成因子や分子マシナリーは未だ不明な点が多いので,DGKα,δ,η,βの基質DGの産生系や産生産物ホスファチジン酸(PA)の標的の同定を含め解明することを目的とした.今年度は以下の成果が得られた.1.DGKαが癌細胞において産生するPA分子種を明らかにした(論文発表済み).2.DGKαの高次構造を決定するための準備として,可溶性モノマーの酵素を高収量で生成することに成功した(発表済み).3.DGKαのEF-ハンドの結晶構造を明らかにし,カルシウム依存性の高次構造変化を解析した(発表済み).4.ミリスチン酸がDGKδの蛋白質量を上昇させる分子メカニズムを明らかにした(発表済み).5.DGKδが骨格筋で産生するPA分子種に対する結合蛋白質を複数検出・同定し,その内クレアチンキナーゼ(筋型)のPA分子種結合について明らかにした(発表済み).6.DGKδは筋芽細胞の分化を制御することを報告した.7.DGKδは,脳内ではセロトニントランスポーターと相互作用し,ユビキチン-プロテアソーム系を介して不安定化すること,更に,DGKδが脳において利用するDG分子種が明らかになった(投稿中).8.DGKη欠損によって引き起こされる様々な転写の変化を明らかにし,更に,DGKηが脳において産生するPA分子種を明らかにした(投稿中).9.DGKβがβカイメリンと相互作用して糸状仮足の形成を制御することを示した(発表済み).研究実績の概要で述べたように,研究目的・計画に即して研究を行い,全ての項目において進捗が見られた.また,研究項目に関して,既に幾つかは論文を発表済みであり,また,幾つかは論文投稿中あるいは論文投稿準備中である.今後も,研究目的・計画に即して研究を行う.また,進捗のあった項目については更に前に進める.新開発の独自手法を用いて,ジアシルグリセロール(DG)キナーゼ(DGK)のα, δ, ηアイソザイムが利用するDG分子種は,従来の定説に反し「ホスファチジルイノシトール(PI)代謝回転とは独立し,それぞれが異なる脂肪酸を利用する未知の経路群」により供給されることを示した.しかし,それらの経路の構成因子や分子マシナリーは未だ不明な点が多いので,DGKα, δ, ηの基質DGの産生系や産生産物ホスファチジン酸(PA)の標的の同定を含め解明することを目的とした.今年度は以下の成果が得られた.1.DGKαが癌細胞において産生するPA分子種を明らかにした(投稿準備中).2.DGKαの高次構造を決定するための準備として,可溶性モノマーの酵素を高収量で生成することに成功した(投稿中).3.DGKδの上流のホスファチジルコリン特異的ホスホリパーゼC(PC-PLC)を同定するための準備として,PC-PLCの高感度・高定量性の測定法を開発した(論文発表済み).4.DGKδの発現量を上昇させる脂肪酸が個体レベル(2型糖尿病モデルマウス)で血糖値を低下させることを明らかにした(論文発表済み).5.DGKδが骨格筋で産生するPA分子種に対する結合蛋白質を複数検出・同定した.6.DGKδ欠損によってセロトニン機能の減弱が起こり,その結果, OCD様行動を引き起こすことが示唆され,また,DGKδはセロトニントランスポーターと相互作用することが明らかになった(論文発表済み).7.DGKη欠損によって引き起こされる様々な転写の変化を明らかにし,更に,DGKηが脳において産生するPA分子種を明らかにした(投稿準備中).研究実績の概要で述べたように,研究目的・計画に即して研究を行い,全ての項目において進捗が見られた.また,研究項目に関して,既に幾つかは論文を発表済みであり,また,幾つかは論文投稿中あるいは論文投稿準備中である.新開発の独自手法を用いて,ジアシルグリセロール(DG)キナーゼ(DGK)のα, δ, ηアイソザイム等が利用するDG分子種は,従来の定説に反し「ホスファチジルイノシトール(PI)代謝回転とは独立し,それぞれが異なる脂肪酸を利用する未知の経路群」により供給されることを示した.しかし,それらの経路の構成因子や分子マシナリーは未だ不明な点が多いので,DGKα,δ,η,βの基質DGの産生系や産生産物ホスファチジン酸(PA)の標的の同定を含め解明することを目的とした.今年度は以下の成果が得られた.1.DGKαが癌細胞において産生するPA分子種を明らかにした(論文発表済み).2.DGKαの高次構造を決定するための準備として,可溶性モノマーの酵素を高収量で生成することに成功した(発表済み).3.DGKαのEF-ハンドの結晶構造を明らかにし,カルシウム依存性の高次構造変化を解析した(発表済み).4.ミリスチン酸がDGKδの蛋白質量を上昇させる分子メカニズムを明らかにした(発表済み).

5.DGKδが骨格筋で産生するPA分子種に対する結合蛋白質を複数検出・同定し,その内クレアチンキナーゼ(筋型)のPA分子種結合について明らかにした(発表済み).6.DGKδは筋芽細胞の分化を制御することを報告した.7.DGKδは,脳内ではセロトニントランスポーターと相互作用し,ユビキチン-プロテアソーム系を介して不安定化すること,更に,DGKδが脳において利用するDG分子種が明らかになった(投稿中).8.DGKη欠損によって引き起こされる様々な転写の変化を明らかにし,更に,DGKηが脳において産生するPA分子種を明らかにした(投稿中).9.DGKβがβカイメリンと相互作用して糸状仮足の形成を制御することを示した(発表済み).研究実績の概要で述べたように,研究目的・計画に即して研究を行い,全ての項目において進捗が見られた.また,研究項目に関して,既に幾つかは論文を発表済みであり,また,幾つかは論文投稿中あるいは論文投稿準備中である.今後も,研究目的・計画に即して研究を行う.また,進捗のあった項目については更に前に進める.今後も,研究目的・計画に即して研究を行う.また,進捗のあった項目については更に前に進める.
木部通水機能の評価による接ぎ木親和なわい性台木系統の選抜とわい化機構の究明

既存のユスラウメ系統は、一部のモモ品種に対して接ぎ木不親和である。親和品種と不親和品種の通水性を比べると、両者には差が認められ、樹液流速は幹径の日変化と良く対応した。そこで、簡易で多数固体を扱えるひずみ計を用いて、水ストレス前後の幹径のひずみ回復度を求めた。しかし、ひずみ回復度と形態的な接ぎ木親和性との間には明瞭な関係が見出せなかった。したがって、選抜は形態的評価によって行い、500以上のユスラウメ個体群から25系統を一次選抜した。本年度は,主にインタクトな鉢植え個体での通水機能を解析した.既存のユスラウメ系統台木に接ぎ木した鉢植えの1年生モモ苗樹,すなわち接ぎ木親和性の良否を含む3品種を用いた.環境要因をモニタリングしながら,灌水を控えた水ストレス下での樹液流速と水ストレス解除後の樹液流速の回復機能を調査した.樹液流速の測定では,グラニエー法とヒートバランス法とを比較したところ,いずれも昼夜の気孔開閉に伴う蒸散速度の増減に呼応した概日リズムを示したが,前者の方が明らかに設置が容易でデータが安定していた.樹体の水ストレス状態は,デンドロメーターとひずみ計で経時的にモニタリングした.灌水前後の日には携帯式光合成・蒸散速度計やプレッシャーチャンバーでも2,3時間ごとに光合成・蒸散速度および木部水ポテンシャルを計測した.デンドロメーターやひずみ計は水ストレス状態を極めて鋭敏に検知し,蒸散が盛んな日中は幹が収縮し,夕方から夜間には回復した.土壌水分の低下によって水ストレスが加わり日中の樹液流速が次第に低下すると,幹径の概日パターンに著しい変化が生じ,夜間の回復がみられなかった.しかし,この異常パターンは灌水の翌日には正常パターンに回復した.また,樹液流速や幹径のひずみは接ぎ木親和性の良否と比較的良好に対応していた.したがって,幹のひずみを指標として水ストレス状態を把握し,接ぎ木親和な系統を選抜することは可能であると推察された.平成19年度は,接ぎ木部における通水機能のより詳細な解析と圃場レベルの計測,および台木系統の一次選抜を行う予定である.なお,土壌水分はテンションメーター,電子天秤およびTDCセンサーで計測したが,圃揚での適用には土壌水分の容積パーセントを実測した上でのTDCセンサーの適用が推奨されよう.露地植えのユスラウメ実生個体群については、台木の栄養繁殖をはかり、接ぎ木を行って繁殖率や生育の良否を計測し、接ぎ木部の形態を観察している。また、水ストレスを与えた前後の通水性の良否をひずみセンサーによって計測し、幹径回復率を算出し、台木の選抜を進めている。'おはつもも'実生1年生樹を用いて、通水機能の計測におけるひずみセンサーの有用性を確認した。人工気象室において、'おはつもも'の幹径とひずみ、および樹液流速は、水ストレスが強くなると低下し、再かん水による土壌水分の増加やランプ点灯数による光強度の増加に反応して回復した。既存のユスラウメ選抜台木とそれに接ぎ木した親和性の異なるモモ3品種(親和性の良い順に'白鳳'、'紅清水'、'天女')の鉢植え樹を用いて、かん水管理による水ストレス前後の樹液流速、幹径および幹のひずみ、木部水ポテンシャル、日射強度、土壌水分、鉢の重量を経時的に計測した。土壌水分が豊富なとき、'天女'の樹液流速は他の2品種より劣った。再かん水による幹径の回復も'天女'が劣った。再かん水日をはさんだ3日間の木部水ポテンシャルと幹径の変位や幹のひずみは類似した経時変化を示し、これらの値の間には高い相関関係があった。以上のことから、接ぎ木親和性は木部通水機能と密接に関係しており、幹の径やひずみを指標として台木を選抜することが可能であると確認された。ブドウ台木においては、'リパリア・グロアール'の四倍体台木に接いだ'巨峰'は既存の二倍体台木樹よりも木部水ポテンシャルが小さく、新梢の断面積あたり、および根の重量あたりの通水速度が小さく、果実の着色が優れた。このことから、プルヌスと同様に、ブドウにおいても通水機能の計測によって優良なわい性台木の選抜が可能であると確認された。ユスラウメ実生群に接ぎ木したモモ樹に対し、かん水を控えて水ストレスを与えた。土壌水分を初めとする各種の環境測定センサーを設置すると共に、接ぎ木上部の幹にひずみセンサーを接着し、ひずみ量の変化を計測した。再かん水直後からのひずみ量や幹径に対するひずみの回復程度の経時変化をグラフ化し、再かん水3時間および5時間後のひずみ回復度を求めた。

これらの値と目視鑑定による接ぎ木親和性評価点との関係を精査したところ、一定の関係が見出せなかった。したがって、おもに樹の生育、接ぎ木部の形態、主幹や側枝の葉芽の形成など、わい性台樹として具備すべき形質に主眼を置いてユスラウメ台木系統の一次選抜を行った。300固体以上のユスラウメ実生群から25系統を一次選抜した。これらの系統については、今後、形質の安定性、他の穂木品種との親和性、増殖の難易などを検討し、選抜系統を絞り込む必要がある。なお、将来の遺伝的研究試料として接ぎ木不親和であろうと思われる数系統も保存した。関連した他の研究から、「樹液流速に基づく果樹の水分制御技術」と題して共同研究者の所属機関である広島県を通じて特許を申請中である。ブドウのわい性台木に関する研究では、既存のブドウ台木の染色体をコルヒチンで倍化した固体群を用いた。これらの木部構造と通水性、根系の通水性、露地栽培樹の水分生理および木部樹液流速の台木間差を調査した。木部構造には違いがみられなかったが、通水性は二倍体四倍体をで大きく異なり、後者の方が小さかった。根系の水コンダクタンスにも違いがみられ、その原因は四倍体樹の根系の分布が小さいことによると考えられた。露地栽培樹では四倍体樹の方が水ストレスを受け易く、果実の糖度が用意に高かった。これらのことから、四倍体ブドウ台木系統は四倍体ブドウ品種の樹勢調整や果実品質の改善に有効な台木であると考える。
江戸明治期漢文笑話集の訳読と研究―江戸後期から明治初期の漢文笑話集を中心に―

本研究は、江戸後期から明治初期の漢文笑話集および漢文小説に収められた漢文笑話の所蔵・書誌の調査、訳読と作品の分析を行い、各話の特色、パロディ化された出典の変遷を導くものである。これにより、江戸後期および明治の漢文笑話が、江戸前期笑話の特徴であった小咄の翻案や中国『笑府』の模倣の枠を超えて、風刺性・物語性がより増加していくことを導き、その背景を考証する。同時に、作品の使用語彙から、江戸後期文人の中国文学等の書籍受容の多様性を明らかにする。一方、江戸前期漢文笑話集の一部に見られた「長文で物語性ある笑話」が、後期笑話本では更に増え、同時に、笑いを内包しつつも一つの漢文による短文説話的なジャンルを形成していったことを検証する。以上により、江戸後期漢文学の「日本化」、明治の、漢学衰退後の漢文体文学再興に際して漢文笑話がもたらした役割についても言及する。最終的には、日中笑話比較の視点から日本的笑いの特質を明らかにする。今年は、『奇談一笑』、『奇談新編』について版本調査を行ない、作者、作品年代、所蔵状況、版本状況、出版に至る経緯の書誌的な整理を行った。また、作品集ごとに訳読を行い、『江戸小咄辞典』『江戸小咄類話事典』、『噺本大系』などによりつつ、漢文体笑話の典故と影響関係の検討をした。一方、漢文体笑話集の作家についての検討し、個別の作品集ごとに作家の履歴、出版とのかかわりについての調査を行った。加えて、これまで訳読した江戸時代の漢文笑話集『笑堂福聚』について、論文にまとめて投稿した。また、作品集ごとに訳読を行った。作品は、やや難解なものもあるが、訳読は順調に進んでいることからおおむね順調であると判断した。本年訳読し、『江戸小咄辞典』『江戸小咄類話事典』、『噺本大系』などを参考にしつつ、漢文体笑話の典故と影響関係の検討をしたものについて、次年度は公開する予定である。昨年度は、訳読に時間を費やしたため、調査出張に十分な時間を割くことがかなわなかった。次年度は出張費を活用し、テキスト調査、作品の作者の調査に傾注するとともに、謝金を利用した入力作業とその公表に努めたい。
聴覚障害児・者の遠隔地通信ならびに遠隔地協同作業に関する基礎的検討

ネットワークのブロード・バンド化ならびに画像圧縮技術の進歩に伴い,今後,聴覚障害児・者によるテレビ電話やテレビ会議システムを用いた遠隔地同士の画像通信ならびに協同作業が可能になってくるものと思われる.聴覚障害者は日常,手話や口形の読み取りなどで主にコミュニケーションを行っているために,画像通信などでは,健常者の場合と違った問題が生じるものと予想される.そのため,より効果的なシステムの構築ならびに利用方法の検討を目的として,NTSC信号による画像劣化の無い画像通信ならびに遠隔地協同作業実験を,聴覚障害学生を対象に実施して,聴覚障害者特有の問題などの検討を行った.今回の実験結果より,以下の内容がわかった.1テレビ並みの画像が確保されるような状況では,聴覚障害者は特にストレスを感じることも無く,十分にコミュニケーションが可能である.2遠隔地からの手話通訳や協同作業時には,通訳者と聴覚障害者ならびに聴覚障害者同士の視線が外れた場合に,相手へのコンタクトが難しく,コミュニケーションが非常にとりにくい.3相手との視線が外れるような状況では,相手へ注意を喚起しコンタクトを取るために,連絡用のライトなどの利用が非常に有効である.4遠隔地同士の協同作業の場合では,カメラやモニタの配置などの「作業のやりやすさ」と,連絡用ライトの利用などによる「連絡のとりやすさ」の問題が複雑に絡み合っており,どちらかを優先されるというような単純なものではない.ネットワークのブロード・バンド化ならびに画像圧縮技術の進歩に伴い,今後,聴覚障害児・者によるテレビ電話やテレビ会議システムを用いた遠隔地同士の画像通信ならびに協同作業が可能になってくるものと思われる.聴覚障害者は日常,手話や口形の読み取りなどで主にコミュニケーションを行っているために,画像通信などでは,健常者の場合と違った問題が生じるものと予想される.そのため,より効果的なシステムの構築ならびに利用方法の検討を目的として,NTSC信号による画像劣化の無い画像通信ならびに遠隔地協同作業実験を,聴覚障害学生を対象に実施して,聴覚障害者特有の問題などの検討を行った.今回の実験結果より,以下の内容がわかった.1テレビ並みの画像が確保されるような状況では,聴覚障害者は特にストレスを感じることも無く,十分にコミュニケーションが可能である.2遠隔地からの手話通訳や協同作業時には,通訳者と聴覚障害者ならびに聴覚障害者同士の視線が外れた場合に,相手へのコンタクトが難しく,コミュニケーションが非常にとりにくい.3相手との視線が外れるような状況では,相手へ注意を喚起しコンタクトを取るために,連絡用のライトなどの利用が非常に有効である.4遠隔地同士の協同作業の場合では,カメラやモニタの配置などの「作業のやりやすさ」と,連絡用ライトの利用などによる「連絡のとりやすさ」の問題が複雑に絡み合っており,どちらかを優先されるというような単純なものではない.今後、聴覚障害児・者がテレビ電話などを活用した遠隔地同士の通信ならびに協同作業が可能になってくると期待される。そのためのより効果的なシステムの構築ならびに利用方法の検討を目的として、本年度以下の検討を行った。1実験用システムの構築と予備実験実際に評価実験を行うためのシステムを構築し、簡単な予備実験を実施した。その結果を基に、評価実験を行う際の注意点、システム上の問題点、評価実験時に記録する内容やその評価方法などに関する検討を進めて、評価実験のためのシステム改良を行った。2聴覚障害者同士の日常会話場面での実験とその評価実験用システムを用いて日常会話場面での聴覚障害者同士の遠隔地通信の評価実験を行った。評価は、実験前後に行った被験者へのアンケートの変化ならびに実験で交わされた会話の内容、手話表現の変化、会話時の表情やしぐさなどで行った。3聴覚障害学生への教師指示場面での実験とその評価実験用システムを用いて教師が聴覚障害学生へ指示・指導を行う場面での遠隔地通信の評価実験を行った。評価内容は日常会話場面での実験と同じ形式で行った。4聴覚障害者の遠隔地通信に関する評価分析日常会話場面での評価実験ならびに教師指示場面での評価実験の結果を比較検討し、聴覚障害者が遠隔地通信を行う際の問題点や注意点などの評価分析を行った。ネットワークのブロード・バンド化ならびに画像圧縮技術の進歩に伴い,今後,聴覚障害児・者によるテレビ電話やテレビ会議システムを用いた遠隔地同士の通信ならびに協同作業が可能になっていくものと思われる.そのためのより効果的なシステムの構築ならびに利用方法の検討を目的として,本年度以下の実験や検討を行った.1聴覚障害者の協同作業実験(1)聴覚障害者5人による遠隔地協同作業実験を行った.作業内容は「折り紙の製作」で,片方の被験者が指導書・解説書を見て実際に折りながら,もう一方の被験者に折り方を指導するものである.実験では,カメラやモニタの位置・台数,連絡用ライトの有無などを変えて作業環境の違いによる評価を行った.2聴覚障害者の協同作業実験(2)聴覚障害者5人による遠隔地協同作業実験を行った.作業内容は「競技用紙飛行機の製作」で,片方の被験者が指導書・解説書を見ながら,もう一方の被験者に作り方を指導するものである.実験では,カメラやモニタの位置・台数,連絡用ライトの有無などを変えて作業環境の違いによる評価を行った.3昨年の画像通信実験の結果との比較ならびに遠隔地協同作業に関する評価分析

昨年度行った聴覚障害者同士の画像通信実験での結果と比較し,画像通信時に指摘された問題点と今回の遠隔地協同作業時に指摘された問題点を比較検討した.その結果,聴覚障害者の遠隔地協同作業に内在する特徴や問題点には、作業性と連絡性が複雑に絡み合っていることが明らかになった.
喫煙の血管新生に対する影響 -アリルハイドロカーボン受容体の役割の解明-

タバコの粒子相成分の1つであるベンツピレン等が結合するアレルハイドロカーボン受容体(Ah受容体)に着目し、喫煙に起因する疾患発症や進展過程における分子メカニズムの解明を行った。Ah受容体が欠損すると、Ah受容体と2量体を形成するARNTが低酸素反応性因子であるHIF1Aとの2量体形成に移行し、血管内皮細胞増殖因子の転写活性を高めることにより、血管新生を促進することを見出した。タバコが及ぼすヒトの健康への影響として、慢性閉塞性肺疾患や種々の癌の発症の他に、虚血性心疾患や脳血管障害が喫煙者に多いことが疫学研究で明らかにきれている。喫煙による心血管系疾患の発症メカニズムを解明し、発症予防の早期確立を目指すことが医学的・社会的に重要であるという観点から、タバコの粒子相成分の1つであるベンツピレン等が結合するアレルハイドロカーボン受容体(Ah受容体)に着目し、喫煙に起因する疾患発症や進展過程における分子メカニズムの解明を行った。まず、AHR遺伝子欠損マウス(AHR-/-)マウス(n=8)と野生型マウス(n=8)に対し、大腿動脈結紮を施行し下肢虚血モデルを作成した。手術後1週間後より、AHR-/-マウスにて血流の著しい改善がレーザードップラー法にて確認され、血管内皮細胞増殖因子(VEGF)のタンパク発現はAHR-/-マウスにて有意に増加していた。さらに、HIF1A-ARNT複合体のDNA結合活性は、野生型マウスに比べ、AHR-/-マウスにて有意に増加し、クロマチン免疫沈降法でも、AHR-/-マウスにおけるVEGFのプロモーター領域へのARNTの結合活性の増加が確認された。以上の結果から、Ah受容体が欠損すると、Ah受容体と2量体を形成するARNTが低酸素反応性因子であるHIF1Aとの2量体形成に移行し、血管内皮細胞増殖因子(VEGF)の転写活性を高めることにより、血管新生を促進することを見出し、米国心臓病学会(AHA)で発表した。さらに、成長因子投与による血管新生促進効果を確認した(ATVB 2006・2007)。また、低酸素ストレスや酸化ストレス応答に関連する転写因子の活性化と心血管系疾患の発症や病態進展への関与を報告した(JMCC BBRC 2006)。Ah受容体遺伝子欠損マウスを用いて,(1)虚血による低酸素ストレス下でのAh受容体の機能や発現調節機構の変化を解析し,(2)ベンツピレンによる血管新生に対する影響を検討した。その結果,Ah受容体が欠損すると,Ah受容体と2量体を形成するARNTが低酸素反応性因子であるHIF-1αとの2量体形成に移行し,血管内皮細胞増殖因子(VEGF)の転写活性を高めることにより,血管新生を促進することを見出した(Ichihara Setal.Arterioscler.Thromb.Vasc.Biol.2007)。また,Ah受容体欠損マウスでは,ベンツピレン投与後のメタロチオネインの発現が減弱していることを米国心臓病学会(AHA)で発表した(Ichihara S et al.2007)。本研究では,低酸素ストレスやベンツピレン投与におけるAh受容体の発現調節機構を明らかにすることにより,喫煙が関与すると考えられる心血管系疾患の発症進展過程のメカニズムを解明することに寄与した。また,これまでベンツピレンの毒性機序として理解されてきたDNA付加物形成に加え,ベンツピレン暴露に起因するHIF-1αを介したVEGF転写活性の抑制という別の毒性機序も探求した点に学術的な特色がある。さらに,環境因子として,Ah受容体に結合する環境化学物質と生活習慣に関連する喫煙を同時に視野に入れたAh受容体を介する混合暴露として毒性を総合的に評価する点に本研究の意義がある。ダイオキシン類や内分泌撹乱化学物質の環境汚染問題やタバコの成分による健康への影響に社会的関心が高まり、毒性リスク評価や環境基準値の設定が求められている。ダイオキシン類はアレルハイドロカーボン受容体(Ah受容体)と結合し、薬物代謝酵素P450 1A1の発現が誘導された結果、増加した中間代謝物が発癌を促進することが明らかになっている。Ah受容体にはダイオキシン類だけではなく、タバコの粒子相成分であるベンツピレン等も結合するため、環境化学物質だけではなく、喫煙などの生活習慣を視野に入れたAh受容体を介する混合暴露として毒性を総合的に評価しなければならない。喫煙は、虚血性心疾患やバージャー病をはじめ末梢血管障害の危険因子であるため、2008年度は、Ah受容体遺伝子欠損マウスを用いて、タバコの粒子相成分の1つであるベンツピレンによる血管新生に対する影響とAh受容体を介する喫煙の血管新生に及ぼす影響を検討した。その結果、ベンツピレン投与により、血管新生は減弱したが、Ah受容体遺伝子欠損マウスにおいて、その血管新生の減弱が有意に軽減していた。

Ah受容体遺伝子欠損マウスでは、ベンツピレン投与後のサイトカインや成長ホルモンの発現の減少が抑制されているため、血管新生が維持されたと考えられた。これまでベンツピレンの毒性機序はP450 1A1によって代謝された後のDNA付加物形成によるものと理解されてきたが、ベンツピレン暴露に起因するHIF-1αを介したVEGF転写活性の抑制という別の機序を明らかにしたことに、本研究の意義がある。Ah受容体を介するタバコの成分の直接的な血管新生への影響を解明したことにより、喫煙を原因とする生活習慣病の病態解明や発症予防に貢献できると考えられる。
縫線核５－ＨＴ／ＧＡＢＡ共存細胞の機能発達―幼若期ストレスとエピジェネティクス

児童虐待が成人後のうつ病発症のリスク・ファクターになることが知られており、そのメカニズムの解明と治療法の開発が急務である。そのメカニズムを解明するために、生後3週齢のラットにストレスを負荷した。その結果、成熟後のラットにうつ様行動が観察され、セロトニン神経の起始核である背側縫線核においてセロトニン合成酵素TPH2のタンパク量増加が観察された。その影響は選択的セロトニン再取り込み阻害薬の繰り返し投与によって部分的に改善することが見出された。このように、選択的セロトニン再取り込み阻害薬の投薬によって虐待による悪影響が部分的に緩和できる可能性が示された。児童虐待が成人後の精神疾患発症のリスク・ファクターになることが知られており、そのメカニズムの解明と治療法の開発が急務である。これまで我々は生後3週齢の幼若期ラットにストレスを負荷すると中脳の縫線核5-HT/GABA共存細胞数が減少し、成熟期に異常行動が出現することを明らかにしてきた。本研究の目的は、GABA合成酵素であるglutamicacid decarboxylase (GAD)のプロモーター領域メチル化に焦点を当て、幼若期ストレスが縫線核5-HT/GABA共存細胞数を減少させ、異常行動を出現させる原因を追究することにある。しかし、我々のこれまでの知見を発表、論文投稿をした際に、1)我々が用いた細胞数をカウントする手法はやや定量性に乏しい、2)行動学的検討が不十分で行動異常に対する解釈が難解である、という批判を受けた。これらは我々の仮説の出発点となるものであるから、我々はまずこれらの批判に答え、研究の足場を固めることにした。具体的には幼若期ストレスを負荷したラットのうつ様行動を調べ、その後脳を摘出し、背側縫線核および正中縫線核のTPH2、GAD67のタンパク量を定量の高い方法であるウェスタンブロッティング法を用いて調べた。我々の仮説ではTPH2, GAD遺伝子プロモーターのメチル化を想定しているが、そもそもこれらの酵素のタンパク量が幼若期ストレスによって減少することを確認する必要があるため、5-HT, GABAそのものではなく、それらの合成酵素を対象とした実験を行った。その結果、幼若期ストレスは無力感を増大させるが、無快感症には影響しなかった。ウェスタンブロッティング法の立ち上げにも成功し、選択性の高い抗体の入手にも成功した。現在幼若期ストレス負荷ラットのTPH2, GAD67タンパク量測定を行っているところである。本研究の目的は、GABA合成酵素であるGADのプロモーター領域メチル化に焦点を当て、幼若期ストレスが縫線核5-HT/GABA共存細胞数を減少させ、異常行動を出現させる原因を追究することにある。具体的には幼若期ストレスを負荷したラットのうつ様行動を調べ、その後脳を摘出し、背側縫線核および正中縫線核のTPH2(5-HT合成酵素)、GAD67のタンパク量を定量の高い方法であるウェスタンブロッティング法を用いて調べた。その結果、幼若期ストレスはうつ症状の一つとされる無力感を増大させるが、無快感症には影響しなかった。また、予想に反して幼若期ストレス負荷ラットのTPH2タンパク量はコントロール群と比べて増加傾向にあり、GAD67タンパク量については全く違いが無かった。以上の結果を踏まえ、GADプロモータ領域メチル化の研究は中止し、別の観点から研究を進めることにした。幼若期ストレス負荷後にセロトニン再取り込み阻害薬(SSRI)を2週間に渡り経口投与し、幼若期ストレスによる引き起こされる行動異常が改善されるかどうかを検討した。その結果、SSRIの投与によってうつ様行動が若干改善されることが見出された。本研究の目的は、GABA合成酵素であるglutamic

acid decarboxylase(GAD)のプロモーター領域メチル化に焦点を当て、幼若期ストレスが縫線核5-HT/GABA共存細胞数を減少させ、異常行動を出現させる原因を追究することにある。まず、我々は幼若期ストレスが成熟後の無力感を増大させることを繰り返し確認することに成功した。しかし、幼若期ストレスが背側縫線核もしくは正中縫線核のDNAメチル化を引き起こしたことがこの無力感増大の原因であるとすれば、DNAメチルトランスフェラーゼの発現が縫線核で上昇しているはずである。特に我々のこれまでの研究からは正中縫線核での異常が予測される。そこで我々はDNAメチル化を維持するために必須のDNAメチルトランスフェラーゼ1(DNMT1)のmRNA発現を定量PCR法を用いて調べた。正中縫線核で測定した結果、幼若期ストレスを負荷された群のDNMT1のmRNA発現量はコントロール群と比較して有意な差は無かった。つまり、当初の予測とは異なり、正中縫線核でのDNAメチル化が上記の無力感増大に関与している可能性は低い。今後は背側縫線核でのDNMT1 mRNA発現レベルを測定し、幼若期ストレスによる無力感増大の原因を探っていく。H23年度はDNAメチル化を測定する技術を確立することを当初予定していたが、上記のようにこれまでの研究結果を多角的に再検証する必要があったため、当初の予定を先送りにした。しかし、変更・追加された研究は順調に進み、良い結果を得ることができた。このように、当初とは変更された計画は順調に進展したが、当初の予定を含む形にまでは進行できなかったため、やや遅れている、と判断した。25年度が最終年度であるため、記入しない。H24年度はDNAメチル化を複数の脳部位で測定することを当初予定していた。しかし、上記のように最も仮説の中心となる脳部位での測定で予測と異なる結果が得られたため、他の脳領域での測定を一旦停止し、仮説を再度立て直している。そのため、やや遅れている、と判断した。今後は幼若期ストレス負荷ラットのTPH2, GAD67タンパク量測定を完了させる。仮説通りTPH2もしくはGAD67タンパク量の減少が確認された場合、減少が確認されたタンパクの遺伝子のプロモーター領域におけるメチル化の測定を行う。さらにメチル化の増加が確認された場合、DNAメチル化阻害剤を投与することにより幼若期ストレスに起因する行動学的、組織学的、神経化学的変化が改善されるかどうかを検証する。当初の予測とは異なり、正中縫線核でのDNAメチル化が上記の無力感増大に関与している可能性は低いことが示された。ここでもDNMT1 mRNA発現レベルに変化が無い場合は、細胞死、樹上突起のスパイン数減少など、DNAメチル化以外の可能性を探っていく。
刺激の3次元的位置が視片的時間現像に及ぼす効果についての心理物理学的研究

3次元空間中の様々な位置に複数の視覚刺激を提示し、刺激の位置特性と時間特性との関係を心理物理実験によって検討してきた.奥行位置についての情報の提示には主に両眼視差を用いた.瞬間的な輝度変化を引き起こす刺激に関しては、相対的に観察者に近い位置に提示される刺激はより遠方の刺激より遅れて知覚されることを見出した,近方法刺激のこの主観的遅延の程度は、刺激間の両眼視差手がかりの量ではなく、刺激間の視差勾配に依存していた.すなわち、視差勾配が大きいほど,この遅延の程度は著しくなり、比較的大きな視差勾配の刺激に対しては、遅延はほとんど認められなくなった.これらの結果は、人間の視覚系には、突然に空間中に出現した刺激を、頭部に衝突する危険のある接近物として処理する傾向があることを示唆している.3次元空間中に複数の視覚刺激を提示するとともに間欠的な聴覚刺激を提示すると、聴覚刺激提示と同じ回数だけ視覚刺激が知覚されるという錯覚が知られている.通常、この現象は、視覚刺激提示よりも多くの聴覚刺激提示を行った場合に生じるものとして報告されている.しかしながら、3次元空間中で様々な方向への仮現運動が生じるような形で視覚刺激を提示した場合、視覚刺激よりも少ない聴覚刺激を提示した場合にも、実際より少ない、聴覚刺激と同じ回数の視覚刺激提示が知覚されることを見出した.また、見かけの運動の距離も聴覚刺激の回数に対応して変化することも見出した.これらの結果は、3次元空間位置に関して多様な可能性を持つ視覚刺激に対しでは、単位時間あたりの提示回数に関しての知覚が聴覚による影響を被り易くなることを示唆している.パーソナルコンピュータを用いてディスプレーに複数の刺激を様々な奥行位置に異なるSOA(Stimulus Onset Asynchrony)で提示し,2つの刺激が同時に生じたと知覚されるために必要なタイミング条件を特定する実験を行った.刺激を異なる奥行位置に提示するために両眼視差手がかりを用いた.複数の刺激を異なる奥行位置に瞬間的に提示したいくつかの実験においては、相対的に観察者に近い奥行位置に提示された刺激出現はもう一方の刺激の出現よりも遅れて知覚されることが見い出された.また、その遅れの程度は刺激と注視点との奥行方向の距離が大きくなるほど顕著になった.他方、異なる奥行位置に予め提示していた刺激の前額平行面場での位置を変化させたり、等輝度のまま色彩を変化させた実験条件においては、相対的に観察者側の刺激変化の知覚が遅れるという傾向はまったく認められなかった.これらの結果は,刺激を瞬間提示した場合に相対的に観察者側の刺激の知覚が遅れるという現象が,奥行軸上での運動信号の処理過程の特性に基づくものであることを示唆している.また、刺激が前額平行面上で移動する事態に関して、観察者のマウス移動と刺激運動を対応付けた場合、知覚の時間的精度が大きく向上することを見い出した.同様の知覚の時間的精度の向上は、観察者によるマウスの移動と刺激の明度変化を対応付けた場合にも認められた.これらの結果は、自動的に変化する刺激を受動的に観察する場合と,観察者が能動的に刺激変化に関与する場合とでは,視覚の時間的特性が異なることを示唆している.今年度の研究では,刺激の運動と連動させたのはマウスの位置のみであったが、3D空間における視覚の時間特性を明らかにするためには、運動視差手がかりを提示する際に伴われる観察者の視点移動にも同様の効果があるのか検討する必要がある.3次元空間中の様々な位置に複数の視覚刺激を提示し、刺激の位置特性と時間特性との関係を心理物理実験によって検討してきた.奥行位置についての情報の提示には主に両眼視差を用いた.瞬間的な輝度変化を引き起こす刺激に関しては、相対的に観察者に近い位置に提示される刺激はより遠方の刺激より遅れて知覚されることを見出した,近方法刺激のこの主観的遅延の程度は、刺激間の両眼視差手がかりの量ではなく、刺激間の視差勾配に依存していた.すなわち、視差勾配が大きいほど,この遅延の程度は著しくなり、比較的大きな視差勾配の刺激に対しては、遅延はほとんど認められなくなった.これらの結果は、人間の視覚系には、突然に空間中に出現した刺激を、頭部に衝突する危険のある接近物として処理する傾向があることを示唆している.3次元空間中に複数の視覚刺激を提示するとともに間欠的な聴覚刺激を提示すると、聴覚刺激提示と同じ回数だけ視覚刺激が知覚されるという錯覚が知られている.通常、この現象は、視覚刺激提示よりも多くの聴覚刺激提示を行った場合に生じるものとして報告されている.しかしながら、3次元空間中で様々な方向への仮現運動が生じるような形で視覚刺激を提示した場合、視覚刺激よりも少ない聴覚刺激を提示した場合にも、実際より少ない、聴覚刺激と同じ回数の視覚刺激提示が知覚されることを見出した.また、見かけの運動の距離も聴覚刺激の回数に対応して変化することも見出した.これらの結果は、3次元空間位置に関して多様な可能性を持つ視覚刺激に対しでは、単位時間あたりの提示回数に関しての知覚が聴覚による影響を被り易くなることを示唆している.
精神疾患予測マーカーとしての脳内ペリサイトイメージング

精神疾患の生涯有病率は高く、統合失調症では約1%、うつ病等の気分障害では10%以上に至り、社会的関心は極めて高い。精神疾患では、アルツハイマー病/パーキンソン病でのような目立った脳器質的所見(神経細胞脱落)は観察されない。また、ゲノム解析単独では精神病態の解明には至らず、分子-細胞-システム-回路など、複雑な素因の絡まりが最終的な精神病態を規定することが予想され(精神病態=複雑要因間の恒常性破綻)、病態メカニズムの生物学的解明はほとんど進んでいない。ペリサイトは、血管内皮細胞を取り巻くように存在し、血液脳関門(BBB)形成に重要である。申請者らの事前研究成果により、ペリサイトの数的制御が破綻(ペリサイトロス)することが、脳微小血管恒常性の破綻につながり、精神機能の恒常性破綻を招く可能性がある。したがって、ペリサイトロスが精神疾患の前兆や、病態の進行を示す客観的指標となり得る可能性がある。本研究では、精神疾患病態としてペリサイトロスを取り上げ、ペリサイトを可視化させる技術を開発すること(可視化=ペリサイトイメージング)で、疾患の早期診断への将来的応用を指向する。本目的を達成するために、本年度は、脳血管ペリサイトのマーカーであるPDGFRβに高親和性な化合物である1-{2-[5-(2-methoxyethoxy)-1H-benzo[d]imidazol-1-yl]quinolin-8-yl}piperidin-4-amine (CP-673451, IQP)を母体化合物として、IQPへの125I標識の最適化と、76Br標識の最適化、および標識後の親和性/選択性の解析を行った。その結果、PDGFRβへ高親和性を示すPET/SPECTイメージングプローブを開発することができた(Sci. Rep. 8, 10369., 2018)。今後は脳への集積に関する最適化を実施するともに、その集積の程度をBmal1欠損マウス脳組織にて検討する予定である。精神疾患の社会的関心の高さに比して、その病態メカニズムの生物学的解明はほとんど進んでいない。このため、客観的かつ明確な診断指標が存在せず、疾病発症や病態進行の予測を行うことは現状では不可能である。一方、ほとんどの精神疾患には睡眠障害が併発し、実際に睡眠障害との関連性が深い体内時計システムが破綻したマウスでは数々の行動異常がみられる。注目すべきことに同マウスでは、行動異常に先立ち、血液脳関門(Blood Brain Barrier; BBB)の破綻がみられ、BBBの形成に重要なペリサイト(周皮細胞)が顕著に減少(=ペリサイトロス)していることを見出した。つまり、ペリサイトロスが精神疾患の前兆や、病態の進行を示す客観的指標となる可能性がある。本研究では、精神疾患病態としてペリサイトロスを取り上げ(同定)、その分子メカニズムを体内時計の切り口から解析し、症状との因果関係を解明する。さらに、ペリサイトを可視化させる技術を開発させること(可視化=ペリサイトイメージング)で、疾患の早期診断への将来的応用を指向する。本年度は、ペリサイトロスによる精神行動異常メカニズムの解明を目的に各種実験を行った。体内時計マウス脳組織では、Desmin陽性細胞(ペリサイト)は減少し、BBBは破綻していることを見出しているが、PDGFRβ(ペリサイトマーカー、BBB形成に必須)も同様に減少していた。さらに培養ペリサイトを使用した解析では、時計遺伝子を人工的にsiRNA法により発現抑制させた場合、PDGFRβの発現の抑制が確認された。つまり、時計遺伝子がPDGFRβを直接的に制御していることが強く示唆される。本年度は、大学間の異動によるマウスコロニーの維持が一つの重要な課題であったが、事前に回収してあったサンプル等を利用することで、効率的にデータを取得することができた。我々の解析結果より、睡眠障害等の精神疾患との関連性が深い体内時計システムが破綻したマウス(Bmal1欠損マウス)では、脳・脊髄組織でのアストロサイトの異常活性化が認められた。同マウスにて行動学的解析を実施した結果、多動といった精神行動異常が観察されただけでなく、神経障害性疼痛モデルを実施した結果、神経障害時におけるアロディニアが消失していた。更なる解析の結果、この病態は、血管周囲に存在するアストロサイト-ペリサイトアセンブリ異常による血液脳関門(BBB)破綻に起因することを見出した(J Neurosci.37:10052-10062,2017)。つまり、BBB恒常性は体内時計システムによるグリアネットワークの上に成り立ち、そのシステム破綻は、アストロサイトの異常活性化という段階を経て、精神/疼痛機構を共に破綻させることが示唆される。ペリサイトの破綻のメカニズムが分子レベルで理解することができただけでなく、ペリサイトをイメージングするためのイメージング剤の開発も合成段階に進んでいる。

精神疾患では、アルツハイマー病/パーキンソン病でのような目立った脳器質的所見(神経細胞脱落)は観察されない。また、ゲノム解析単独では精神病態の解明には至らず、分子-細胞-システム-回路など、複雑な素因の絡まりが最終的な精神病態を規定することが予想され(精神病態=複雑要因間の恒常性破綻)、病態メカニズムの生物学的解明はほとんど進んでいない。ペリサイトは、血管内皮細胞を取り巻くように存在し、血液脳関門(BBB)形成に重要である。申請者らの事前研究成果により、ペリサイトの数的制御が破綻(ペリサイトロス)することが、脳微小血管恒常性の破綻につながり、精神機能の恒常性破綻を招く可能性がある。したがって、ペリサイトロスが精神疾患の前兆や、病態の進行を示す客観的指標となり得る可能性がある。本研究では、精神疾患病態としてペリサイトロスを取り上げ、ペリサイトを可視化させる技術を開発すること(可視化=ペリサイトイメージング)で、疾患の早期診断への将来的応用を指向する。本目的を達成するために、本年度は、脳血管ペリサイトのマーカーであるPDGFRβに高親和性な化合物である1-{2-[5-(2-methoxyethoxy)-1H-benzo[d]imidazol-1-yl]quinolin-8-yl}piperidin-4-amine (CP-673451, IQP)を母体化合物として、IQPへの125I標識の最適化と、76Br標識の最適化、および標識後の親和性/選択性の解析を行った。その結果、PDGFRβへ高親和性を示すPET/SPECTイメージングプローブを開発することができた(Sci. Rep. 8, 10369., 2018)。今後は脳への集積に関する最適化を実施するともに、その集積の程度をBmal1欠損マウス脳組織にて検討する予定である。ペリサイトマーカーのPET/SPECTイメージングプローブを開発し、in vivoでのペリサイト可視化(ペリサイトイメージング)を指向する。病態メカニズムとの因果関係の証明や、動物実験レベルでのイメージングを成功させ、将来的な同プローブ投与によるヒトでのペリサイトイメージングを目指し、その前段階として実験動物での有用性の有無を検証することが目的である。動物実験レベルでのイメージングを成功させ、将来的な同プローブ投与によるヒトでのペリサイトイメージングを目指し、その前段階として実験動物での有用性の有無を検証することが目的である。化合物の合成を集中的に行ったため、放射性核種や実験動物など高額な消耗品の購入に至らなかったため。平成28年度に計画していた放射標識、動物実験を平成29年度に行うため消耗品として使用する。
サイズと表面状態を規定した金属クラスター触媒の合成法の開拓

金属クラスターの触媒作用を分子レベルで理解していく上では、サイズおよび表面の結合状態や電子状態を明確にすることが必要である。本年は、1nm程度のポリマー保護金クラスターをサイズ選択的に合成する方法を開発し、アルコール酸化に対する触媒作用を対象として、クラスターの電子状態と活性の相関を明らかにした。マイクロミキサーを用いて、クラスター生成時の反応条件を微視的レベルで均一化することによって、これまで報告のない1.0nm程度のPVP保護金クラスターの合成に成功した。このクラスターは、通常のバッチ式の混合で得られていたもの(1.3nm)に比べ、約40%程度高い活性を示すことがわかった。さらに14nmの金クラスターの電子状態を調べ、活性との相関について考察した結果、(1)ポリマーからの電子供与によってコアが負電荷を帯びること、(2)コアサイズが十分に小さく,供与された負電荷のエネルギー準位が高いことが触媒活性に重要であることがわかった。したがって高活性な触媒を得るためには、電子供与性の配位子の選定およびコアサイズを十分に小さくする必要があることがわかった。
消化管腫瘍形成におけるmTORシグナルの役割の解明及び阻害剤を用いた治療

申請者は昨年度までの研究により、ヒト家族性大腸ポリープ症のモデル動物であるApcΔ716ノックアウトマウス(Wntシグナルの異常な活性化がポリープ形成を引き起こす)の腸管ポリープにおいてmTORシグナル経路が活性化していること、mTOR阻害剤投与群のApcΔ716ノックアウトマウスのポリープ形成がプラセボ投与群に比べ有意に抑制されたことを確認した。また腫瘍上皮細胞の増殖をサイクリンの発現阻害を介し抑制している事を示唆した。一方ポリープでの血管新生も阻害剤投与群で減少していたことから、阻害剤による腫瘍形成抑制は上皮だけでなく間質、特に血管に対しても作用していることを示した。本年度は以下の2点に重点を置き消化管腫瘍形成におけるmTORシグナルの役割の解析を行った。1)WntシグナルによるmTORシグナル活性化の誘導機序の解析WntシグナルがmTORシグナルに与える影響を確認するために、Wntシグナルが活性化している大腸癌細胞株にβ-カテニンsiRNAを処置しWntシグナルを遮断した。Wntシグナルを遮断した細胞ではmTORの発現がmRNAレベルで低下していることを確認した。この結果はWntシグナルがmTORの発現を調節しmTORシグナルの活性化を引き起こすことを示している。2)mTOR阻害剤による腫瘍形成抑制機序の解明間質系の細胞に対するmTOR阻害剤の影響を検討するため、組織中のVEGFやCOX2等の血管新生や炎症に関係する因子の変動をタンパク質及びmRNAレベルで確認したが、プラセボ投与群と比べ有意な差は認められなかった。しかしながら正常組織中の血管内皮細胞では認められなっかたmTORシグナルの活性化が、ポリープ内の新生血管において活性化していることが確認できた。この新生血管におけるmTORシグナルの活性化はmTOR阻害剤の標的となる可能性を示唆している。消化管腫瘍形成におけるmTORシグナルの役割を検討するために、ヒト家族性大腸ポリープ症のモデル動物であるApcΔ716ノックアウトマウスやmTOR阻害剤を用いて、以下の2点に重点を置き解析を行った。1)Wntシグナルの活性化によるmTORシグナル活性化の誘導機序の解析正常腸管粘膜とポリープにおけるmTORシグナルの活性比較した結果、正常部に比べポリープでmTORシグナルの活性が顕著に増大していた。またポリープでmTORシグナルが活性化している殆どが腫瘍上皮細胞であった。続いてこのマウスのポリープ形成はWntシグナルの活性化によって引き起こされていることから、大腸癌細胞株等を用いてWntシグナルとmTORシグナルの関係について検討したところ、mTORシグナルの活性化はWntシグナルの活性化に依存することを確認した。2)mTOR阻害剤による腫瘍形成抑制機序の解明mTOR阻害剤をApcΔ716ノックアウトマウスに投与したところ大きなサイズのポリープ(1.5mm以上)が顕著に減少していたことから、mTORシグナルの活性化は「発生」よりも「進展」に重要である事を示唆した。また腫瘍上皮細胞の増殖及びアポトーシスを阻害剤投与群と対照群で比較したところ、アポトーシスの頻度は各群で差は認められなかったが、増殖細胞数が阻害剤投与群で有意に減少していた。またポリープでサイクリンE及びAの発現が阻害剤投与群で有意に減少していた。阻害剤による腫瘍形成抑制はこれら細胞周期に関わるタンパクの発現を低下させ、細胞増殖を抑制している事を示唆した。一方ポリープでの血管新生も阻害剤投与群で減少していたことから、阻害剤による腫瘍形成抑制は上皮だけでなく間質、特に血管に対しても作用していることが示唆された。
神経可塑性関連蛋白分解酵素・ニューロプシンの結合タンパク質の同定とその機能

扁桃体キンドリング・長期増強(LTP)などの記憶形成のモデルを用いて、新しい神経回路の形成を電気生理学的に証明しようと試みられている。一方で、新しく作られた回路において、シナプスの数や大きさにおける形態学的変化が観察されている。しかしながら、総括的な面から回路形成を知るには、生理学的な機能変化と形態学的な観察を結びつける分子レベルでの解析が非常に重要である。ニューロプシンは記憶形成のモデル動物内で誘導される一方(1995J.Neurosci.15:5088-5097)、ファイブロネクチンのような形態保持に重要であると考えられている細胞接着因子を切断する(1998JBC.273:11189-11196)。従って生理学的、及び形態学的にも重要であると示唆される本蛋白質の結合タンパク質、及びその基質やインヒビターを検索することは、回路形成のカスケードを知る上で、極めて重要である。本研究の目的は、ニューロプシン,蛋白質の結合蛋白質及び、標的となる基質及びインヒビターを同定し、神経回路形成及びその発達に関わる一連のカスケードを明らかにする事である。平成9年度は、マウス海馬の可溶性画分内で2種のニューロプシン結合蛋白質の検出に成功し、これらはSDS耐性の結合状態を示した。今年度は、これら結合タンパク質の精製に成功し、SDS電気泳動-銀染色で単一バンドとした。現在、ペプチドシークエンスを行っているところである。今後、これをもとに遺伝子のクローニングを行い、同時に抗体の作製、新しく得た遺伝子今用いて、バキュロウイルスによるrニューロプシン蛋白質を作製し、ニューロプシンとの結合機構及び、タンパク分解酵素活性への影響を解明する。