hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
非同期セルオートマトン神経系モデルとその動的再構成回路実装による神経補綴の基礎

昨年度に非同期セルオートマトンでモデル化した神経細胞によるネットワークを用い,生体及び既存の精緻なモデルによる神経組織の活動を少ない計算量で電子回路上に実装することに成功した.本年度はさらに既存モデルを様々な条件下で検討することで丁寧に比較し,提案手法の優位性を確固たるものとした.特にラットの生体神経の活動パターンについて,既知のデータのみならず検証のための未知のデータについても良い再現性を示している.これは生体神経の活動を単に記録し再生するわけではなく,内在的なダイナミクスまで再現出来ていることを示唆している.このような静的な神経系のダイナミクスの再現は,研究目的である神経歩鉄機器の開発の基礎に最も重要な点の一つである.また脳情報通信融合研究センターとの共同研究として行っていたfMRIを用いた大規模脳活動のモデル化においても,昨年度提案した数理モデルを根本的に改良し,より高い再現精度及び予測精度を実現した.またシナプス可塑性の実装にも取り組んだ.やはり効率的な実装が可能であると示唆された.神経系は日々変化し新しい昨日を獲得しており,生物の知能や記憶を司っていると考えられており,その変化を司るシナプス可塑性の再現及び実装は重要である.しかし,昨年度の報告書でも述べた通り未だ数理モデル化されていない現象が多数存在する.そのためシナプス可塑性のモデル化にも取り組んだ.特に神経回路の結合の強さが活動の強度に依存する点に着目しモデル化を行った.これにより様々な生体実験データを説明できるのみならず,シナプス可塑性が神経活動に対しある種の安定化や正則化を行っていることが示唆された.当初の目的であった生体神経の活動及び可塑性の実装にみならず,大規模神経系のダイナミクスのモデル化やシナプス可塑性のモデル化にまで踏み込んだ.このため当初の予定を上回る成果を得ている.なお申請者の就職に伴い本年度を持ってこの研究課題は完了となった.申請者の就職に伴い本年度を持ってこの研究課題は完了となったため記入しない.単体の神経細胞をセルオートマトンで精緻に再現し,その特徴的な波形パターンや応答特性について再現できることを確認した.またそのセルオートマトンによる神経細胞モデルを回路上に実装し,従来用いられてきた神経細胞モデルよりも同等の再現性であれば少ない回路面積で実装できることを確認した.学習アルゴリズムを開発し,これにより生体神経細胞やその数理モデルの応答特性を与えることで,自動的に応答特性やその内部のダイナミクスまで模倣出来ることを確認した.学習アルゴリズムを動的再構成回路A上に実装し,動的にパラメータを変更できることを確認した.次に,前述のセルオートマトンによる神経細胞モデルを単純に結合させ,小規模神経回路ネットワークを形成した.また神経細胞ネットワークの学習アルゴリズムを用いて,複雑な樹状突起構造を持つ神経細胞モデルのスパイク発火列の入出力関係を学習させることに成功した.これによりマルチコンパートメントモデルが実装出来たと考えられる.また小規模な神経細胞ネットワーク,ラットの生体脳の粗い粒度においても同様の結果を得た.スパイク発火列は生体の神経系で使われている情報符号化法であり,神経補綴機器を作成する上で必要である.既存の神経補綴機器と比較し,より高い精度でスパイク発火列が再現できることを確認した.また動的再構成回路実装を活用することで,実装に必要な計算量(回路面積,計算時間)が少ない事を確認した.大規模な神経系の活動,ダイナミクスにはまだ不明な点が多い.このため脳情報通信融合研究センターと協力し, fMRIを用いて脳活動を計測し,そのモデル化に取り組んだ.特に視覚刺激に対する視覚野の応答に注目し,神経系の研究で培われた非線形数理モデルへの知見を応用することで,いくつかの既存手法より高い精度でモデル化することに成功した.昨年度に非同期セルオートマトンでモデル化した神経細胞によるネットワークを用い,生体及び既存の精緻なモデルによる神経組織の活動を少ない計算量で電子回路上に実装することに成功した.本年度はさらに既存モデルを様々な条件下で検討することで丁寧に比較し,提案手法の優位性を確固たるものとした.特にラットの生体神経の活動パターンについて,既知のデータのみならず検証のための未知のデータについても良い再現性を示している.これは生体神経の活動を単に記録し再生するわけではなく,内在的なダイナミクスまで再現出来ていることを示唆している.このような静的な神経系のダイナミクスの再現は,研究目的である神経歩鉄機器の開発の基礎に最も重要な点の一つである.また脳情報通信融合研究センターとの共同研究として行っていたfMRIを用いた大規模脳活動のモデル化においても,昨年度提案した数理モデルを根本的に改良し,より高い再現精度及び予測精度を実現した.またシナプス可塑性の実装にも取り組んだ.やはり効率的な実装が可能であると示唆された.神経系は日々変化し新しい昨日を獲得しており,生物の知能や記憶を司っていると考えられており,その変化を司るシナプス可塑性の再現及び実装は重要である.しかし,昨年度の報告書でも述べた通り未だ数理モデル化されていない現象が多数存在する.そのためシナプス可塑性のモデル化にも取り組んだ.特に神経回路の結合の強さが活動の強度に依存する点に着目しモデル化を行った.これにより様々な生体実験データを説明できるのみならず,シナプス可塑性が神経活動に対しある種の安定化や正則化を行っていることが示唆された.年次計画において, 1年目はシナプスモデルとケーブルモデルを提案し,マルチコンパートモデルを構築する予定であった.

しかしシナプスモデルを用いずともより簡易な結合方式でマルチコンパートメントモデルを構築できた.また2年目の予定であった小規模ネットワークの模倣やネットワークのパラメータ最適化にも同時に成功している他,また大規模ネットワークへの布石として, MRIを用いた粗い粒度のモデル化にも取り組んだ.シナプスモデルを作成していないことを差し引いても当初の計画以上の成果が得られたものと考える.当初の目的であった生体神経の活動及び可塑性の実装にみならず,大規模神経系のダイナミクスのモデル化やシナプス可塑性のモデル化にまで踏み込んだ.このため当初の予定を上回る成果を得ている.なお申請者の就職に伴い本年度を持ってこの研究課題は完了となった.1年目の課題であったシナプスモデルについては今後シナプス可塑性と同時に開発する.しかし,シナプス可塑性については未だ生理学的・数学的にも議論が尽きておらず,この観点での研究を同時に遂行する必要性がある.これは年次計画になかった課題であるが,しかし1年目の研究が計画以上に進んだため,その時間は十分にあると考えられ,研究計画に変更は必要ない. 2年目3年目をあわせ,小規模大規模ネットワークのダイナミクスの模倣と神経補綴機器の開発に従事する.申請者の就職に伴い本年度を持ってこの研究課題は完了となったため記入しない.
敗血症性急性肺傷害に対するＨＤＡＣ阻害剤の効果に関する研究

エピジェネティクスは、DNAの塩基配列によらない遺伝子発現の多様性を生み出す機構であり、そのひとつにヒストンのアセチル化がある。本研究では、敗血症におけるヒストン脱アセチル化酵素(HDAC)の役割、HDAC阻害剤の敗血症に対する有用性について検討した。新規HDAC阻害剤であるCG200745の投与は、敗血症におけるアポトーシスを抑制したが、炎症性サイトカインの抑制や炎症病理像の改善は認めなかった。同じくHDAC阻害剤のバルプロ酸も抗アポトーシス効果を示したが、炎症は抑制しなかった。HDAC阻害剤によるヒストンアセチル化は、敗血症における細胞のアポトーシスを制御していることが示唆された。エピジェネティックスとはDNA塩基配列の違いによらない遺伝子発現の多様性を生み出す機構であり、その一つにヒストンのアセチル化がある。敗血症に起因する炎症とアポトーシスにおけるヒストン脱アセチル化酵素(HDAC)の役割を明らかにし、新規HDAC阻害剤CG200745の敗血症に対する有用性について検討した。雄性BALB/cマウスに盲腸結紮穿孔(CLP)を施し敗血症マウスを作成、CG200745投与群はCLP施行の3時間前に10 mg/kgを腹腔内投与した。敗血症マウスにおけるHDACレベル、組織学的変化、炎症性サイトカイン・ケモカインの発現、アポトーシス関連分子の発現について検討し、CG200745投与群と比較した。HDAC1, 2, 3は敗血症マウスで有意に減少し、アセチル化ヒストンH3, H4は有意に増加した。敗血症マウスで肺および脾臓組織は炎症病理像を呈し、投薬群でも同等であった。敗血症マウス肺組織中のTNFαとIL-1β、MCP-1のmRNAも著明に上昇して投薬・非投薬群間で差がなく、血清中でも同様であった。敗血症においてエピジェネティックな制御を受ける遺伝子が存在し、CG200745は敗血症において炎症には影響を与えずアポトーシスのみを抑制するという結果が得られた。敗血症に起因する炎症とヒストン脱アセチル化酵素の役割を明らかにすることを目的とし、新規HDAC阻害剤CG200745の敗血症に対する有用性について検討した。敗血症マウスにおけるHDACレベル、組織学的変化、炎症性サイトカイン・ケモカインの発現ついて検討しCG200745投与群と比較した。以上より、敗血症においてエピジェネティックな制御を受ける遺伝子が存在し、CG200745は敗血症において炎症には影響を与えないという結果が得られた。今後はアポトーシスが臓器不全の発症、死亡率の増加に大きくかかわるという観点から、HDAC投薬群におけるアポトーシス抑制について検討していく。雄性BALB/cマウスに盲腸結紮穿孔(CLP)を施し、敗血症マウスを作成,、CG200745投与群はCLP施行の3時間前に10 mg/kgを単回腹腔内投与した。敗血症マウスにおける肺組織中HDACレベルの変化、肺・脾臓の組織学的変化、肺組織および血清中炎症性サイトカイン・ケモカインの発現、アポトーシス関連分子、アポトーシス阻害因子の発現について検討し、CG200745投与群およびバルプロ酸投与群と比較した。HDAC1, 2, 3は敗血症マウスで減少し、アセチル化ヒストンH3, H4は増加した。敗血症マウスで肺および脾臓組織は炎症病理像を呈しCG200745投与群とバルプロ酸投与群でも同等であった。敗血症マウスのTNFαとIL-

1β、MCP-1のmRNAが著明に上昇し、投与・非投与群間で差がなく、血清中でも同等であった。一方、肺・脾臓組織のTUNEL陽性細胞は敗血症マウスで著明に増加し、投与群で有意に減少した。アポトーシス関連分子であるcleaved caspase 3、cleaved PARPが投与群で有意に減少し、アポトーシス阻害因子であるBcl-2、Bcl-xLは投与群で減少した。HDAC阻害剤であるCG200745の投与は、敗血症におけるアポトーシスを抑制したが、炎症性サイトカインの抑制や炎症病理像の改善は認めなかった。同じくHDAC阻害剤のバルプロ酸も抗アポトーシス効果を示したが、炎症は抑制しなかった。HDAC阻害剤によるヒストンアセチル化は、敗血症における細胞のアポトーシスを制御していることが示唆された。敗血症CG200745は、敗血症における炎症には影響を与えなかったが、アポトーシスに注目し研究を進めたことで、想定される結果が得られた。敗血症マウスにおいて、炎症性サイトカイン・ケモカインの発現が投薬・非投薬群間で差がなく、予想された結果と異なったことから、今後の方向性についてじっくり検討する必要があり時間を要した。敗血症の病態では炎症とアポトーシスは、互いがその発症に必須ではない可能性が示唆された。今後は、CG200745と同様にHDAC阻害剤であるバルプロ酸について検討を行う。また、HDAC阻害剤と抗炎症薬との併用により、敗血症による多臓器不全の治療に有用となる可能性を探っていく。今後はアポトーシスが臓器不全の発症、死亡率の増加に大きくかかわるという観点から、HDAC阻害剤投与群における肺と脾臓組織でのアポトーシスに関して検討する。敗血症マウスで投薬・非投薬群間におけるTUNEL陽性細胞の変化、アポトーシス関連分子であるcleaved caspase 3、cleaved PARP、アポトーシス阻害因子であるBcl-2、Bcl-xLの変化について検討していく。実験試薬、動物の費用は十分に使用したが、当初予定していた実験装置の購入を控えたため。本年度の消耗品費をふまえて次年度はあらたな実験装置の購入などを予定する。平成26年度の研究費限度額は、計831千円(平成26年度分700千円+繰り越し分131千円)となる。したがって、消耗品費で600千円(実験用動物150千円、実験試薬200千円、実験器具150千円、情報処理機器100千円)、旅費で231千円(資料収集旅費150千円、研究打ち合わせ旅費81千円)、すなわち831千円使用する予定である。<本年度の研究費に繰越金が生じた理由>実験試薬、動物の費用は十分に使用したが、当初予定していた実験装置の購入を控えたため。<次年度の研究費の使用計画>本年度の消耗品費をふまえて次年度はあらたな実験装置の購入などを予定する。平成25年度の研究費限度額は、計1142千円(平成25年度分700千円+繰り越し分442千円)となる。したがって、消耗品費で900千円(実験用動物200千円、実験試薬400千円、実験器具200千円、情報処理機器100千円)、旅費で240千円(資料収集旅費200千円、研究打ち合わせ旅費40千円)、すなわち計1140千円使用する予定である。
マルコフ連鎖を用いた中国の地域間格差と収束性に関する研究

本研究では、中国の地域間格差の収束性について、(1)マルコフ連鎖を用いた所得分配アプローチを用いて、中国全体の将来的な所得分配構造を明らかにする。(2)収集可能な各省別データを用いて、同様のアプローチを適用し、類似点、相違点を明らかにする。(3)さらに可能であれば、マルコフ連鎖を用いたアプローチを応用し、所得以外の格差分析への応用を試みる。以上3つの方向で研究を進めてきた。まず(1)について、データを2005年まで拡張し、改訂後のデータを使用して再計算した成果を完成させた。改訂後のデータを用いた場合でも省間所得格差は拡大傾向となり、所得分配構造は2極分化となる傾向を持つことが判明した。また、マルコフ連鎖を用いた収束分布の計測においては、貧しい所得階層に分布が集中する形で、弱い2極分化構造となっている。次に(2)について、19902005年までの上海市、江蘇省および浙江省といったいわゆる長江デルタ地域の市、県レベルのデータを用いて研究を行った。この結果、中国で最も経済発展が進んでいる長江デルタ地域の域内においても所得格差が拡大していることが記述分析で判明したが、マルコフ連鎖を用いた収束分布の計測においては、豊かな所得階層に分布が集中する結果となっている(3)について、過去の人口センサスなどにおける地域間の人口移動表のデータを用いて、地域間の人口移動の将来予測を、マルコフ連鎖を用いて計測した。人口移動により、過度に人口が集中する省(主に広東省)と減少する省とに分かれることが判明している。本研究では、中国の地域間格差の収束性について、(1)マルコフ連鎖を用いた所得分布アプローチを用いて、中国全体の将来的な所得分布を明らかにする。(2)収集可能な各省別データを用いて、同様のアプローチを滴用し、類似点、相違点を明らかにする。(3)さらに可能であれは、マルコフをいたアプローチをし、日夕の格差分析への応用を試みる。上3つの方向で研究を進めてきた。まず(1)について、申請時に発表したSakamoto and Islam(2005)のワーキングペーパーが、China Economic Review誌に掲載することが決定した。現在ウェブページで閲覧可能だが、平成19年度中には具体的に発表の形になるものと思われる。この研究において、中国の所得分布は、将来的に豊かな地域(省)と貧しい地域(省)の二極(ツインピーク)に分かれると結論付けている。また、この内容を上海(9月)と南京(3月)の2箇所でセミナー報告している。現在、データを2005年まで拡張することが課題となっている。特に、中国の省別データは現在、大掛かりな改訂が行われており、改訂後のデータを使用することが急務となっている。次に(2)について、当初全国レベルで市、県レベルのデータを収集する予定であったが、過去のデータについてはかなり不完全で収集が困難な状態に陥っている。そこでいくつかの省に焦点を絞って収集を行うようにしている。現在、江蘇省と浙江省の市、県レベルのデータが1990年から利用可能で、この2省について分析を開始している。初期の結果としては、全国のようなツインピークとは異なる分布が得られている。平成19年度中に成果の一部を報告する予定である。(3)について、過去の人口センサスのデータを用いて、地域間の人口移動についてマルコフ連鎖による予測を試みている。

(3)さらに可能であれば、マルコフ連鎖を用いたアプローチを応用し、所得以外の格差分析への応用を試みる。以上3つの方向で研究を進めてきた。まず(1)について、現在、データを2005年まで拡張し、改訂後のデータを使用して再計算した成果(初稿)を完成させた。結果はChina Economic Review誌に掲載されたものを補完するものとなっている。つまり、この研究においても、中国の所得分布は、将来的に豊かな地域(省)と貧しい地域(省)の二極(ツインピーク)に分かれると結論付けている。また、この内容は10月の日本地域学会(九州大学)で報告し、現在『地域学研究』に投稿中である。次に(2)について、現在、1990年以降の江蘇省と浙江省の市、県レベルのデータを用いて研究を行っている。この2省および上海市を加えた長江デルタの地域内格差について統計分析をしたものを12月の応用地域学会(鳥取大学)で報告し、現在『応用地域学研究』に投稿中である。(3)について、過去の人口センサスのデータを用いて、地域間の人口移動についてマルコフ連鎖による予測を試みている。人口移動により、過度に人口が集中する省(主に広東省)と減少する省とに分かれることが判明している。5月にPRSCO(バンクーバー)で報告したが、2005年の1%抽出調査が出版されたので、データを再構築して研究中である。本研究では、中国の地域間格差の収束性について、(1)マルコフ連鎖を用いた所得分配アプローチを用いて、中国全体の将来的な所得分配構造を明らかにする。(2)収集可能な各省別データを用いて、同様のアプローチを適用し、類似点、相違点を明らかにする。まず(1)について、データを2005年まで拡張し、改訂後のデータを使用して再計算した成果を完成させた。改訂後のデータを用いた場合でも省間所得格差は拡大傾向となり、所得分配構造は2極分化となる傾向を持つことが判明した。一方、このデータによ菌マルコフ連鎖を用いた収束分布の計測においては、貧しい所得階層に分布が集中する形で、弱い2極分化構造となっている。これらから、中国の省間所得格差は、格差の拡大といった問題をしばらく抱えることになると指摘した。なお、この内容は『地域学研究』に掲載された。次に(2)について、19902005年までの江蘇省と浙江省の市、県レベルのデータを用いて研究を行った。この2省および上海市を加えた長江デルタの地域内格差について統計分析をした結果、中国で最も経済発展が進んでいる長江デルタ地域の域内においても所得格差が拡大しており、地域間格差と市内格差が主要であることを示した。この内容は『応用地域学研究』に掲載された。について、過去の人口センサスのデータを用いて、地域間の人口移動についてマルコフ連鎖による予測を試みている。人口移動により、過度に人口が集中する省(主に広東省)と減少する省都に分かれることが判明している。データを再構築した成果を5月にPRSCO(ダッカ)で報告した。
神経アクチン細胞骨格制御に関わるRhoならびにCa2+シグナル伝達機構の解明

1)Rho標的分子mDiaの軸索伸展における役割の解明神経回路網におけるシグナル伝達分子の空間的制御の背景には、細胞膜や分子局在の非対称性を生み出すダイナミックな細胞骨格再編成が存在するが、その詳細は明らかではない。そこでわれわれは、最も数多く存在する神経細胞である小脳顆粒細胞に着目して、まず極性が生じ、2本の軸索がまず伸展し始め、その後に細胞体周辺に数多くの樹状突起が発生する過程で、低分子量G蛋白質Rhoを介したシグナル経路の役割を探索した。マウス生後一日令小脳より小脳顆粒細胞初代培養を起こし、Lipofection法による遺伝子導入により、試験管内軸索形成・突起伸展におけるRho標的分子ROCK、mDiaの機能解析を行った。その結果、変異体cDNAのトランスフェクションにより、1)ROCKのRho結合キナーゼとしての活性を阻害すると軸索形成が促進され、成長円錐ダイナミクスが亢進すること、さらに2)mDia1は、Rho下流のアダプター分子として軸索形成・突起伸展を促進させる活性を有することが明らかになった。これらの実験の結果、細胞骨格再編成による軸索伸展にはRho GTPaseの下流にある複数のエフェクターの協調が必要であることが示唆された。これらの解析を発展させることにより、分化神経細胞を目的部位に移動させ、軸索伸展やシナプスを促進させるという、生理的分子機序に基づく機能的な神経再生という新たな治療戦略が期待できる。2)新規CREBキナーゼ候補遺伝子CLICK-IIIの同定・クローニング転写因子CREBは、記憶学習などの長期的現象の際に遺伝子発現を介して神経細胞における長期的な変化を誘導すると考えられている。CaM kinase IV類似の新規CREB kinaseのクローニングを試みCREB kinase候補遺伝子CLICK(CaMK-like CREB kinase)-IIIを同定し全長塩基配列を決定した。CLICK-IIIはin vitroにおいてCa2+/CaM依存性に活性化され、CREBSer133をリン酸化することを明らかにした。興味深いことにCLICK-III mRNAは神経系で強く発現しており、脳内では大脳辺縁系、間脳の限られた神経核で特に多く存在することがin situ hybridization法により明らかとなった。このような発現パターンは他のCaM kinaseと異なっており、高次脳機能における新たな働きを担っている可能性が示唆される。成熟した神経回路網において、シグナル依存性にシナプスの形態的特徴が修飾されたり、情報伝達分子の局在が変化する。シグナル伝達分子の空問的制御の背景には、細胞膜や分子局在の非対称性を生み出すダイナミックな細胞骨格再編成が存在すると予想されているが、その詳細は明らかではない。そこで、神経細胞が突起進展を最初に引き起こす局面と、成熟したシナプス形成をし終えた後に活動依存的にアクチン再編成を起す局面に絞って、どのようなシグナリングが重要な役割を果たすのかをあきらかにしたいと考え以下の実験を行った。1)シナプス活動によるアクチン細胞の制御GFPとアクチン分子の融合蛋白を作製し、adenovirusを用いて神経細胞に導入し、生きた海馬培養神経細胞の形態やアクチン細胞骨格を可視化した。

その結果、神経活動依存的に発生する異なるタイプ(電位依存性カルシウムチャンネルとNMDA受容体)のCa^<2+>流入の組み合わせにより細胞骨格再構築の分布が制御されることを明らかにした。NMDA受容体を介したカルシウムの局所流入がスパイン形態調節に大きく寄与している機構を解明した(古屋敷ら、投稿中)。2)成長円錐ダイナミクスと突起進展におけるRhoシグナリングの役割我々は前にRho/ROCKシグナリングが、突起進展開始を決定するゲート機構を形成していることを明らかにした。このゲートの前後において、ゲートの機能を調節するシグナルに興味を持ち、現在探索中である。ゲートの前でsrcファミリーtyrosine kinase活性が、さらにゲートの後でROCK非依存的Rhoシグナルが重要であるという予備結果を得ている。1)Rho標的分子mDiaの軸索伸展における役割の解明神経回路網におけるシグナル伝達分子の空間的制御の背景には、細胞膜や分子局在の非対称性を生み出すダイナミックな細胞骨格再編成が存在するが、その詳細は明らかではない。そこでわれわれは、最も数多く存在する神経細胞である小脳顆粒細胞に着目して、まず極性が生じ、2本の軸索がまず伸展し始め、その後に細胞体周辺に数多くの樹状突起が発生する過程で、低分子量G蛋白質Rhoを介したシグナル経路の役割を探索した。マウス生後一日令小脳より小脳顆粒細胞初代培養を起こし、Lipofection法による遺伝子導入により、試験管内軸索形成・突起伸展におけるRho標的分子ROCK、mDiaの機能解析を行った。その結果、変異体cDNAのトランスフェクションにより、1)ROCKのRho結合キナーゼとしての活性を阻害すると軸索形成が促進され、成長円錐ダイナミクスが亢進すること、さらに2)mDia1は、Rho下流のアダプター分子として軸索形成・突起伸展を促進させ葦活性を有することが明らかになった。これらの実験の結果、細胞骨格再編成による軸索伸展にはRho GTPaseの下流にある複数のエフェクターの協調が必要であることが示唆された。これらの解析を発展させることにより、分化神経細胞を目的部位に移動させ、軸索伸展やシナプスを促進させるという、生理的分子機序に基づく機能的な神経再生という新たな治療戦略が期待できる。2)新規CREBキナーゼ候補遺伝子CLICK-IIIの同定・クローニング転写因子CREBは、記憶学習などの長期的現象の際に遺伝子発現を介して神経細胞における長期的な変化を誘導すると考えられている。CaM kinase IV類似の新規CREB kinaseのクローニングを試みCREB kinase候補遺伝子CLICK(CaM-like CREB kinase)-IIIを同定し全長塩基配列を決定した。CLICK-IIIはin vitroにおいてCa2+/CaM依存性に活性化され、CREBSer133をリン酸化することを明らかにした。
宇宙論的加速器物理学に基づくインフレーション宇宙を構成する素粒子の探索

「インフレーションシナリオ」は様々な宇宙観測事実に自然な説明を与える魅力的な初期宇宙モデルであるが、物理機構の詳細は未だ定かではない。本研究では、素粒子固有の性質である「スピン」を指標として、インフレーションの構成粒子の特定を行う。そのために、粒子のスピンに対する様々な宇宙論統計量の応答を予測し、最新の多波長宇宙観測データを用いてそれを比較検証していくという、理論、観測双方向からのアプローチを行う。本研究により、インフレーションのダイナミクスや真空構造に対する理解が飛躍的に進み、宇宙の始まりという人類史上最大級の謎が解明される。
スナップショット構造を基にしたメチオニンガンマリアーゼの酵素反応機構の解明

ピリドキサルリン酸(PLP)を補酵素に持つ赤痢アメーバ由来メチオニンγリアーゼ(EhMGL1)の酵素反応機構の解明を目指し、リガンドフリー体、ミカエリス複合体およびEhMGL1結晶内にトラップした一連の酵素反応中間体(中間体-1中間体-4)のX線構造を決定した。これらの構造から、PLP-酵素間(Lys205)のシッフ塩基がPLP-基質メチオニン間のシッフ塩基へ変化することで始まる酵素反応機構を中間体構造に基づいて実証できた。この機構は従来の研究で予想されていた機構と一致する。一方、反応の最終段階が[1,5]-シグマトロピー転移によって非酵素的に進むことを新たに明らかにできた。タンパク質X線解析ではほとんどの場合、安定で静的な構造の決定が行われている。一方、実際に機能している酵素では、基質が結合した後に時々刻々と構造変化しながら一連の中間体を経て酵素反応が進行する。従って、酵素の機能を真に理解するには、動的に変化する中間体構造を捉える必要がある。幸いなことに、結晶中でも酵素反応が起こるので、結晶中で反応を開始させ、次に反応を止めてX線解析すれば様々な反応中間体構造を捉えることができる。本研究ではメチオニンγリアーゼについて、2つのアイソザイム、1と2(MGL1、2)の反応中間体構造を決定して、酵素反応機構とアイソザイム間での基質に対する特異性の違いを解明することを目的とする。MGL1の結晶にメチオニンをソーキングして結晶中で酵素反応を開始させてから、液体窒素温度で結晶を凍結して酵素反応を停止させた。ソーキング時間を変える(数秒数十秒)ことで、平成23年度までに様々な酵素反応中間体構造をトラップし、それらの構造を明らかにすることができた。さらに、MGL2結晶についても同様の方法で反応中間体構造のトラップを試みた。しかし、MGL2結晶をメチオニンにソーキングすると、結晶がひび割れる等の問題が発生したので、ソーキング液の組成を検討することから開始した。その結果、結晶が安定に保たれ、かつメチオニンが結合した複合体結晶を調製するための方法を確立し、MGL2とメチオニン複合体構造を決定することができた。また、MGL2については、メチオニンに引き続き他の基質(システイン、ホモシステイン)についても酵素反応中間体構造を明らかにするため、ソーキング条件の検討とX線回折実験を行った。本研究は、X線解析で決定した酵素反応中間体構造に基づいた反応機構の解明を目的とする。研究対象にはピリドキサル3リン酸(PLP)を補酵素に持つ赤痢アメーバのメチオニンγリアーゼ1(EhMGL1)やEhMGL2、Pseudomonas putida由来メチオニンγリアーゼ(PpMGL)、好熱菌由来シスタチオニンγシンターゼ(CGS)とともに、アメリカトリパノソーマ由来アスパラギン酸トランスカルバモイラーゼ(TcATCase)を取り上げた。中間体結晶は、酵素結晶を基質含有溶液にソーキングして酵素反応を結晶内で開始させ、次に液体窒素温度で凍結して反応を停止させるまでの時間を変えることで、酵素反応の様々な段階をトラップすることができた。EhMGL1については、Michaelis複合体以外に6種類の中間体構造を決定した。それらの構造を詳細に検討することで、一つの中間体から次の中間体に変化して行く様子が明らかになり、反応初期段階では従来から提案されている反応機構が妥当であることが実証できた。しかし、最終段階のメタンチオールが脱離する機構については、従来の予想を超える新規反応機構を明らかにできた。さらに、カルバモイルリン酸(CP)とアスパラギン酸(Asp)をそれぞれ第一、第二基質としてカルバモイルアスパラギン酸合成反応を触媒するTcATCaseについては、リガンドフリー体の構造に加えて、TcATCase-CP、TcATCase-CP-Asp、TcATCase-PALA、TcATCase-カルバモイルアスパラギン酸の5つの複合体構造を決定できた。幸いなことに、酵素反応は結晶中でも起こるので、結晶中で反応を開始させ、次に反応を止めてX線解析すれば様々な酵素反応中間体構造を捉えることができるはずである。本研究ではメチオニンγリアーゼについて、2つのアイソザイム、1と2(MGL1、2)の反応中間体構造を決定して、酵素反応機構とアイソザイム間での基質に対する特異性の違いを解明することを目指した。

MGL1や2の結晶をメチオニン等の基質を含む抗凍結剤にソーキングして結晶内で酵素反応をスタートさせ、数百ミリ秒数十秒後に結晶を窒素気流で100 Kに凍結して酵素反応を止め、SPring-8やPFで中間体との複合体構造を解析するために必要な高分解能・高精度データを測定した。MGL1については、すでに7種類の中間体構造を捉えることに成功しているが、MGL1よりもKmが大きくkcatが小さいMGL2ではメチオニンが結合した複合体構造が得られているだけで、反応が進行した中間体構造の解明には至っていない。今後、ソーキング条件をさらに検討する必要がある。一方、MGL1の解析から酵素反応に関わっていると考えられるアミノ酸残基について、それらの役割を実証するために、変異体(Y108F、C110S、C110G、S113E、S113Q)の発現・精製・結晶化を行い、野生型MGL1と同様に酵素反応中間体構造の解析を行うための体勢を整えた。26年度が最終年度であるため、記入しない。構造生物学26年度が最終年度であるため、記入しない。MGL1については、酵素反応中間体構造を結晶中にトラップしその構造決定ができている。しかし、MGL2は基質であるメチオニンのソーキングによって結晶が壊れるという問題が発生した。そのため、ソーキング条件を確立し問題解決するために少し時間を要したので、当初の予定よりやや遅れている。しかし、MGL2についても当メチオニンとの複合体結晶が得られるようになったので、今後、スピードアップできる。EhMGL1については、Michaelis複合体と6種類の中間体構造を検討することで、酵素反応機構を立体構造に基づいて解明することができた。本研究で取り上げているPLP酵素以外にも多くの類縁酵素があり、アミノ酸配列にも高い相同性が見られる。従って、EhMGL1について得られた知見は、PLP酵素一般について酵素反応に関わっているアミノ酸残基の役割等、構造機能相関を理解する上で有用である。一方、PpMGL等については、全ての中間体構造の決定には至っていないが着実に進んでいる。しかし、中間体を結晶内でトラップするために、ソーキングを低温で行ったり、pHを至適pHからずらす等の工夫を行う必要がある。一方、TcATCaseについても、全ての酵素反応中間体構造を決定することができた。CPとAspの2種類の化合物を基質とするこの酵素は、CPの結合に続いてAspが結合するという定序機構で進行することが知られているが、本研究によってCPの結合がもたらすTcATCaseの構造変化がAspの結合に必要であることが実際の構造として示された。MGL2は基質であるメチオニンのソーキングによって結晶が壊れるという問題が発生した。そのため、ソーキング条件を確立し問題解決するために少し時間を要し、それによる遅れは完全に取り戻すことができていない。しかし、MGL1については酵素反応に関わっていると考えているアミノ酸を変えた変異体の発現・精製・結晶化ができたので、今後、それらの役割を実証していくことが可能になった。「現在までの達成度」に記した通り、問題点が発生したものの、それを解決して申請書通りの研究計画・方法で推進することが可能となった。平成24年度は、まず、MGL2とメチオニンとの酵素反応中間体構造の決定にまず重点をおいて研究を進める。
複合材料積層板と圧電素子を用いたスマートストラクチャーの基本要素開発

構造物の中に,センサー機能とアクチュエータ機能を組み込んだスマートストラクチャーの考えを,複合材料と融合し,より高度なスマートストラクチャーが構築できるような基本要素を開発しようとする本研究で,以下の様な研究を実施してきた.(1)複合材料引張試験において初期破損,層間剥離などの材料特性の評価実験,解析を行った.(2)センサ機能として優れたインテリジェント材料の中でも,より大きな圧電性をもつ圧電フィルム(フッ化ビニリデン/トリクルオロエチレン;VDF/TrEF)をセンサー材料として選定し,ひずみゲージとの比較評価実験を行った.その結果,アルミ材一軸引張試験での分極処理工程による圧電異方性の存在の発見とその定量的評価,片持梁の振動試験での振幅,周波数-圧電特性の定量的評価などVDF/TrEFフィルムの圧電特性と周波数特性のデータを得た.(3)アクチュエータ材料としては,当初計画では圧電セラミックを使用する予定であったが,複合材料への組み込み特性の評価研究で,形状記憶合金(SAM)がより適当であると評価し,Ti-Ni合金を選定し,一軸引張負荷-除荷試験で,形状記憶効果の定量的評価,製作した恒温槽を利用し,変態点温度前後の形状記憶特性の把握など評価試験を行った.この研究の中で形状記憶合金が変態点前後で電気抵抗変化をおこすことを発見し,センサー機能として利用できることも確認した.又,(2)で評価したVDF/TrEFフィルムも振動-圧電特性が優れていることから,購入した圧電素子制御装置(KDG-1028型)を用いて,複合材料梁に接着したVDF/TrEFに最大にAC1kVの高電圧をかけ,複合材料梁の制振特性に関する評価試験を行い制振梁に関するデータを得た.これらの成果を元に現在,複合材料とVDF/TrEF, SAMとを融合化する技術の習得,種々の制御則の開発などを行っている段階であり、完全な基本要素の開発までには至らなかった.構造物の中に,センサー機能とアクチュエータ機能を組み込んだスマートストラクチャーの考えを,複合材料と融合し,より高度なスマートストラクチャーが構築できるような基本要素を開発しようとする本研究で,以下の様な研究を実施してきた.(1)複合材料引張試験において初期破損,層間剥離などの材料特性の評価実験,解析を行った.(2)センサ機能として優れたインテリジェント材料の中でも,より大きな圧電性をもつ圧電フィルム(フッ化ビニリデン/トリクルオロエチレン;VDF/TrEF)をセンサー材料として選定し,ひずみゲージとの比較評価実験を行った.その結果,アルミ材一軸引張試験での分極処理工程による圧電異方性の存在の発見とその定量的評価,片持梁の振動試験での振幅,周波数-圧電特性の定量的評価などVDF/TrEFフィルムの圧電特性と周波数特性のデータを得た.(3)アクチュエータ材料としては,当初計画では圧電セラミックを使用する予定であったが,複合材料への組み込み特性の評価研究で,形状記憶合金(SAM)がより適当であると評価し,Ti-Ni合金を選定し,一軸引張負荷-除荷試験で,形状記憶効果の定量的評価,製作した恒温槽を利用し,変態点温度前後の形状記憶特性の把握など評価試験を行った.この研究の中で形状記憶合金が変態点前後で電気抵抗変化をおこすことを発見し,センサー機能として利用できることも確認した.又,(2)で評価したVDF/TrEFフィルムも振動-圧電特性が優れていることから,購入した圧電素子制御装置(KDG-1028型)を用いて,複合材料梁に接着したVDF/TrEFに最大にAC1kVの高電圧をかけ,複合材料梁の制振特性に関する評価試験を行い制振梁に関するデータを得た.これらの成果を元に現在,複合材料とVDF/TrEF, SAMとを融合化する技術の習得,種々の制御則の開発などを行っている段階であり、完全な基本要素の開発までには至らなかった.
皮膚アレルギー炎症における肥満細胞の関与に関する研究

ヒト臍帯血より単核細胞を分離した後,stem cell factorとinterleukin-6共存下に液体培養し,純度100%のトリプテ-ス陽性肥満細胞を得た。得られたヒト培養肥満細胞を抗IgE抗体により刺激すると,抗IgE抗体の濃度,および反応時間に依存して明らかなヒスタミン遊離が認められた。カルシウムイオノフォアA23187により刺激すると,イオノフォアの濃度,および反応時間に依存して明らかなヒスタミン遊離が認められた。一方,コンパウンド48/80,あるいはサブスタンスP刺激では,明らかなヒスタミン遊離は認められなかった。そこで,ヒト皮膚肥満細胞と同様にサブスタンスPにより活性化されることが明らかにされているラット腹腔肥満細胞を用い,サブスタンスP刺激による肥満細胞からのヒスタミン遊離に及ぼす紫外線療法の効果について検討した。その結果,中波長紫外線(UVB)は照射量に依存して,また,8-メトキシソラレンと長波長紫外線(UVA)の併用(PUVA)は,UVAの量に依存して,細胞内カルシウムイオン濃度上昇を抑制することにより,ヒスタミン遊離を抑制した。肥満細胞症の1つである色素性蕁麻疹の皮疹部で増加する肥満細胞は,健常人皮膚に存在するトリプテ-スとカイメ-スのいずれにも陽性の肥満細胞であった。無症候性全身性肥満細胞症の健常皮膚に認められる肥満細胞もトリプテ-スとカイメ-スに陽性の肥満細胞であったが,皮疹部では肥満細胞の増加を認め,増加する肥満細胞はトリプテ-ス陽性,カイメ-ス陰性の肥満細胞であった。一方,進行性全身性肥満細胞症では,皮膚をはじめとして,リンパ節,骨髄,気道,鼻粘膜,胃粘膜に増加する肥満細胞は,トリプテ-ス陽性,カイメ-ス陰性の肥満細胞であった。また,血中および尿中メディエーターを測定したところ,血中ヒスタミン,トリプテ-ス,ロイコトリエンC_4量および尿中メチルヒスタミン,ロイコトリエンE_4量が増加していた。ヒト臍帯血より単核細胞を分離した後, stem cell factorとinterleukin-6共存下に液体培養した.この培養細胞を用いて,トリプテ-スとカイメ-スに対する二重免疫染色を行うと,培養100日以上を経過するとほぼ100%の細胞がトリプテ-ス陽性となり,肥満細胞であることが確認された.さらに培養を継続すると,トリプテ-スおよびカイメ-スに陽性の細胞が20%程出現した.こうして得られたヒト培養肥満細胞を各種刺激剤により刺激し,遊離するヒスタミンをHPLC法により測定した.まず,ヒトIgEにより培養肥満細胞を感作し,ついで抗ヒトIgE抗体により刺激すると,抗IgE抗体の濃度,および抗IgE抗体との反応時間に依存して明らかなヒスタミン遊離が認められた.

ついで,カルシウムイオノフオアA23187により刺激すると,同様にイオノフオアの濃度,および反応時間に依存して明らかなヒスタミン遊離が認められた.しかし,コンパウンド48/80,あるいはサブスタンスP刺激では,明らかなヒスタミン遊離は認められなかった.すなわち,ヒト培養肥満細胞は刺激により異なった反応を示すことが明らかとなった.つぎに,皮膚肥満細胞症の患者の皮疹部組織を採取し,トリプテ-スとカイメ-スに対する二重免疫染色を行ったところ,皮膚肥満細胞症の肥満細胞はトリプテ-ス,カイメ-ス陽性細胞で,肥満細胞は脱顆粒を呈していた.ついでその組織を用いて,パーコール不連続密度勾配法によりヒト皮膚肥満細胞を分離し,サイトカインの共存下に培養を試みたが,成功に至らなかった.ヒト臍帯血より単核細胞を分離した後,stem cell factorとinterleukin-6共存下に液体培養した。この培養細胞を用いて,トルプテ-スとカイメ-スに対する二重免疫染色を行うと,培養100日以上を経過するとほぼ100%の細胞がトリプテ-ス陽性となり,肥満細胞であることが確認された。さらに培養を継続すると,トリプテ-スおよびカイメ-スに陽性の細胞が20%程出現した。こうして得られたヒト培養肥満細胞を各種刺激剤により刺激し,遊離するヒスタミンをHPLC法により測定した.まず,ヒトIgE抗体より刺激すると,抗IgE抗体の濃度,および抗IgE抗体との反応時間に依存して明らかなヒスタミン遊離が認められた.ついで,カルシウムイオノフォアA23187により刺激すると,同様にイオノフォアの濃度,および反応時間に依存して明らかなヒスタミン遊離が認められた.しかし,コンパウンド48/80,あるいはサブスタンスP刺激では,明らかなヒスタミン遊離は認められなかった.全身性肥満細胞症の患者より,同意の下に各種組織の生検標本を採取し,免疫組織化学染色を行った.その結果,皮膚をはじめとして,リンパ節,骨髄,気道,鼻粘膜,胃粘膜に増加する肥満細胞は,トリプテ-ス陽性,カイメ-ス陰性の肥満細胞であることが分かった.血中および尿中メディエーターを測定したところ,血中ヒスタミン,トリプテ-ス,ロイコトリエンC_4および尿中メチルヒスタミン,ロイコトリエンE_4が増加していた.また,背部を紫外線により非特異的に刺激し,血中および尿中メディエーターの変化を検討したところ,血中ヒスタミン,トリプテ-ス,ロイコトリエンC_4および尿中メチルヒスタミン,ロイコトリエンE_4と血中プロスタグランジンD_2の増加を認めた.ヒト臍帯血より単核細胞を分離した後,stem cell factorとinterleukin-6共存下に液体培養した。培養100日以上を経過するとほぼ100%の細胞がトリプテ-ス陽性となり,肥満細胞であることが確認された。その後,トリプテ-ス陽性肥満細胞を皮膚線維芽細胞と,あるいは皮膚線維芽細胞由来サイトカインと共生培養したが,トリプテ-スとカイメ-スのいずれにも陽性のヒト皮膚型肥満細胞を純培養することは出来なかった。そこで、ヒト皮膚肥満細胞と同様にサブスタンスPにより活性化されることが明らかにされているラット腹腔肥満細胞を用い,サブスタンスP刺激による肥満細胞からのヒスタミン遊離に及ぼす紫外線療法の効果について検討した。その結果,中波長紫外線(UVB)は照射量に依存して,ヒスタミン遊離を抑制した。
高分子ナノ構造設計を基盤とする新規DDSキャリアーの開発に関する研究

コラーゲンの熱変性体であるゼラチンは、低毒性で生体適合性に優れていることから、医療材料として古くから検討されている。しかし、ゼラチンゲルは生体内で任意の形状に保持させることが難しいという問題点を有している。一方、近年、光反応は、化学分野だけでなく、眼科や皮膚科などの医療分野においても侵襲度の低い効果的な治療法として用いられている。これまでに当研究グループでは、光増感性を有するエオシンをゼラチン側鎖に導入した光反応性ゼラチン(エオシン化ゼラチン)に3級アミンを側鎖に有する高分子を架橋補助剤として共存させることにより、数十秒の可視光照射にて高効率で硬化(ゲル化)させる光ゲル化の開発に成功している。本年度は、その技術を医療材料として応用することを目的として、脳外科における脳動脈瘤の液体塞栓剤として利用することを検討し、生体外実験により評価した。既存の動脈瘤塞栓術は、外科的手法により瘤部をクリップで挟む「クリッピング術」或はカテーテルを用いて瘤部にコイルを充填する「コイル充填術」が行われている。しかしながら、いずれの手法を用いた場合も脳内に金属が半永久的に残るため、医療機器に制限が設けられる場合がある。そこで、生分解性を有するエオシン化ゼラチンを液体塞栓剤として使用することとした。生体外実験として、ガラス製の動脈瘤モデルを作成し、ガラス管内に水を流した状態でエオシン化ゼラチン水溶液をカテーテルで誘導し、瘤部に充填した。その後、開口部より可視光を照射したところ、瘤口をゲルで塞栓することに成功した。本成果により、穏和な条件下かつ簡便な操作により塞栓可能であることを明らかとし、新しい医療材料としての可能性を見出した。また、熱反応が起こらないことから、ゲル内に薬剤を包埋させたDDS材料としての用途拡大の可能性が期待された。今後、動物実験等により、その可能性を追求する予定である。当研究室では、多分岐構造を有するスター型カチオン性高分子をスターベクターと名付け、遺伝子導入ベクターの基本骨格として極めて有望であることを示してきた。スターベクターを感温性化することによって基材表面から遺伝子導入することをめざし、培養基材から遺伝子導入できる新しい導入方法をDeposition Transfection法と名付け、有効性を報告してきた。具体的には、ジチオカルバミル基を導入した4官能性ベンゼン誘導体をイニファタとし、N,N-ジメチルアミノプロピルアクリルアミド、N-イソプロピルアクリルアミドの順でブロック共重合を行い、感温性スターベクターを合成し、水溶液から高効率で遺伝子導入させることが可能となった。感温性スターベクターは、水溶液中でDNAとポリプレックスを形成し、体温付近では疎水性化した。疎水性化に伴ってポリプレックスは粒径約1μmの凝集体となり、凝集体は高分子基材表面に吸着し、37°C下では剥がれなかった。培養基材に凝集体をコーティング後、COS1細胞を播種するとCA比が増加するにつれてLuciferase活性が増加した。しかしながら、さらなる発現効率を獲得するにはポリプレックス表面を覆うポリ(N-イソプロピルアクリルアミド)が細胞への導入を僅かながら阻害しているのではないかと考えられた。そこで、感温性とカチオン性の両方の機能をもつポリ(N,N-ジメチルアミノエチルメタクリレート)を用いて新規の感温性スターベクターを合成し、Deposition Transfection法による遺伝子導入を行った。既報のブロック体の感温性スターベクターと比較したところLuciferase活性が約10倍増加した。さらに鎖長が長い程、導入活性が向上したことから、Deposition Transfection法のための感温性スターベクターの最適化に成功した。

また、熱反応が起こらないことから、ゲル内に薬剤を包埋させたDDS材料としての用途拡大の可能性が期待された。今後、動物実験等により、その可能性を追求する予定である。
細胞間隙経路を介したA群レンサ球菌の上皮バリア突破機構の解析

A群レンサ球菌(GAS)劇症型感染症等の侵襲性疾患は,病原性細菌が宿主組織内に侵入し,増殖することにより発症すると考えられている.本研究では,GASが細胞間隙を通過し,組織内へ侵入する経路に関与する因子の同定を行い,GASの上皮バリア突破機構を解析した.その結果,GASは細胞間結合タンパクの分解により上皮バリアを突破し,その機序にはGASの溶血毒素であるストレプトリジンS,および宿主のプロテアーゼであるカルパインが関与することが明らかにした.A群レンサ球菌(GAS)劇症型感染症等の侵襲性疾患は,病原性細菌が宿主組織内に侵入し,増殖することにより発症すると考えられている.本研究では,GASが細胞間隙を通過し,組織内へ侵入する経路に関与する因子の同定を行い,GASの上皮バリア突破機構を解析した.その結果,GASは細胞間結合タンパクの分解により上皮バリアを突破し,その機序にはGASの溶血毒素であるストレプトリジンS,および宿主のプロテアーゼであるカルパインが関与することが明らかにした.多数の病原性細菌において,宿主上皮の細胞間結合との選択的な相互作用が結合組織への侵入および病態発症に関与することが報告されている.しかし, A群レンサ球菌(GAS ; Group A streptococci)の組織侵入機構と宿主細胞間接着因子の関連性については,莢膜を介する細胞間隙侵入経路しか報告されておらず,詳細な機序は明らかとされていない.本研究では,細胞間隙経路を介したGASの組織内への侵入に関与する因子の同定を目的とした.ヒト腸粘膜上皮細胞(Caco-2)をトランスウェルシステムで培養し,これを上皮細胞バリアのin vitroモデルとして用いた.この上皮バリアモデルに,劇症型GAS感染症由来のNIH35株(M28型),およびその莢膜欠失株を感染させ, GASの上皮バリア通過能を測定した.その結果, NIH35株は莢膜の有無に関わらず,上皮バリアモデルに対する高い通過能を示した.また, GAS感染時の細胞間結合タンパクとGASの相互作用について,共焦点レーザー顕微鏡による観察およびウエスタンブロット法により解析した. NIH35株感染細胞では、細胞間隙部位にGASの局在が認められ,細胞間結合タンパクであるオクルディンおよびカドヘリンの分解も確認した.さらに, NIH35株のトランスポゾン挿入変異ライブラリーを用いたスクリーニングから,溶血毒素であるストレプトリジンS(SLS)をコードするsagAが, GASの上皮バリアモデル通過能に関与することが示された.以上の結果より,本研究において, GASは細胞間結合タンパクの分解により上皮バリアを突破し,その機序にはSLSが関与することを明らかにした.劇症型レンサ球菌感染症などのA群レンサ球菌(GAS ; Group A streptococci)が惹起する侵襲性疾患は、物理バリアである上皮細胞層を突破したGASが宿主組織内に侵入し,増殖することにより発症すると考えられている.昨年度までの当該研究において,溶血毒素であるストレプトリジンS(SLS)がGASの上皮バリア突破機構に関与することを見いだした.本年度は,SLSが誘導する宿主細胞間相互作用に着目し,GASの上皮バリア突破機構に宿主プロテアーゼが関与するか否かを検討した.ヒト大腸粘膜上皮細胞(Caco-2)をトランスウェルシステムで培養し,上皮細胞バリアのin vitroモデルとして用いた.宿主細胞内システインプロテアーゼであるカルパインに対する阻害剤で処理した上皮バリアモデルに,劇症型GAS感染症由来のNIH35株(M28型),およびそのSLS欠失株を感染させ,GASの上皮バリア通過能および感染細胞の経上皮電気抵抗値(TER)を測定した.SLS欠失株の上皮バリァ通過能は,カルパイン阻害剤の有無に関係なく一定であった.一方,野生株の上皮バリア通過能は,カルパイン阻害剤の添加により低下し,感染細胞におけるTERの低下は抑制された.また,GAS感染が誘導する宿主細胞間相互作用を,共焦点蛍光レーザー顕微鏡による観察により解析した.その結果.野生株感染細胞では,細胞内プロテアーゼであるカルパインの細胞間隙部位における局在が認められ,オクルディンおよびE-カドヘリンの分解も観察された.以上の結果より,SLSが誘導するGASの上皮バリア突破機構には宿主プロテアーゼであるカルパインが関与することを明らかにした.