hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
マイクロ RNA 情報ネットワークに基づく癌幹細胞の包括的制御

肝臓癌において、網羅的マイクロRNA解析を行い、癌幹細胞が血管新生とヒストンの脱メチル化を行う特徴的なマイクロRNAを発現していることを同定した。また、大腸癌において、活性酸素種(ROS)の代謝が低い細胞で、特徴的にエクソゾーム包埋型のマイクロRNAが産生され、その中に、let7 familyを含む特徴的なマイクロRNA発現を同定した。さらに、これらの因子が周囲環境の代謝機構を変化させる可能性について見出し、現在、これらの解析を進めている。研究目的:従来、癌幹細胞を標的化することにより癌の根治が可能であると考えられてきた。しかし、癌幹細胞が生み出す細胞学的多様性、癌幹細胞への再移行現象、癌幹細胞自身の特性と周囲環境が絡み合って形成された治療抵抗性メカニズムを考慮すると、一過的な癌幹細胞を標的とした治療法では癌の根治は難しいと考えられる。意義と重要性:癌幹細胞が産生する分泌型microRNAを介した情報ネットワークに注目し、その機能とターゲットを明らかにすることは、癌幹細胞を中心とした癌社会の維持に必須となっている情報伝達経路を解明することにつながり、さらにその制御を行うことにより癌幹細胞を中心とした社会構築を破綻させるという、革新的な癌幹細胞包括的治療法の開発につながると考えられる。研究成果:肝臓癌において、網羅的マイクロRNA解析を行い、癌幹細胞が血管新生とヒストンの脱メチル化を行う特徴的なマイクロRNAを発現していることを同定した。現在、泌型マイクロRNAのデーターベースとの複合的解析を行っている。一方、大腸癌において、従来報告されている大腸癌幹細胞マーカーであるALDHに代わる新規癌幹細胞マーカーを同定した。この細胞集団では、非癌幹細胞と比べると特徴的な代謝機序が働いることが明らかとなった。さらに、この機構を制御する遺伝子およびマイクロRNAを同定した。さらに、これらの因子が周囲環境の代謝機構を変化させる可能性について見出し、解析を進めている。爆研究目的とその意義・重要性:従来、癌幹細胞を標的化することにより癌の根治が可能であると考えられてきた。そこで、本研究においては、癌幹細胞が産生する分泌型microRNAを介した情報ネットワークを解明し、その制御を行うことにより癌幹細胞を中心とした癌の社会構築を破綻させる新しい癌幹細胞標的治療法を開発することを目的とした。さらに、これらの因子が周囲環境の代謝機構を変化させる可能性について見出し、これらの解析を進めている。肝臓癌におけるマイクロRNAの網羅的解析より、癌幹細胞が血管新生とピストンの脱メチル化を行う特徴的なマイクロRNAを発現していることを同定した。現在、分泌型マイクロRNAのデータベースと組み合わせることにより、情報伝達をつかさどるマイクロRNA群の同定と、その標的遺伝子、機能について検索を行っている。24年度が最終年度であるため、記入しない。肝臓癌の臨床検体はマウスに生着させるのが困難であり、解析が細胞株だけでの検討になることが危惧される。そこで、大腸癌を標的に、新規の癌幹細胞マーカーを同定し、この遺伝子発現データとマイクロRNAデータを取得した。大腸癌の場合は、臨床検体からの解析、マウス生着も可能であり、標的分子を用いたマウス治療モデルの確率も可能である。そこで、確実な研究推進と革新性を追求すべく、研究提案した癌腫を大腸癌に置き換えた検討も行っている。
Dual-color CISH法の骨軟部肉腫の病理診断,予後因子検出への応用

肉腫の病理診断は治療の基礎となり極めて重要性が高い。しかし、実際の診断はその希少さや種類多さから困難な場合が多い。本研究では光学顕微鏡下で染色体、遺伝子異常と病理組織像あるいは細胞診像を同時に観察可能な手法を新たに確立し、その有効性を明らかにした。本法は、高度な分子生物学的な分析機器を必要とせず、病理検査室で実施可能であるため肉腫の診断精度の向上に寄与できる。染色体相互転座は肉腫特異性の高い細胞遺伝学的異常であり、その遺伝子異常の検出は、肉腫の病理学的診断の大きな助けとなる。本研究の目的はホルマリン固定パラフィン包埋(FFPE)材料を用いたChromogenic In Situ Hybridization (CISH)法を確立し、組織像と細胞遺伝学的異常を同時に光学顕微鏡下で認識可能な精度の高い骨軟部肉腫診断法を構築することである。材料として滑膜肉腫(SS)12例及びSSと鑑別が問題となる軟部肉腫(Non-SS;4種類9例)のFFPE材料を用いた。SS特異的染色体相互転座t(X;18)の結果生じるSYT遺伝子の再構成に関して、TexasRed及びFITCの二色で標識したbreak-apart probeを作成し,dual-color FISH法及び抗Texas Red, FITC抗体を用いたdual-color CISH法を確立しシグナルの検出を試みた。また,同時にFFPE検体からRNAを抽出し,RT-PCR法によりSS特異的な融合遺伝子SYT-SSX1,SYT-SSX2の検出を行った。これらの3つの検出方法を比較検討した結果、60個の核の計測により,CISH法によりSSの全例でSYTの遺伝子再構成を示す解離シグナルが検出された一方,Non-SSはほぼ陰性であり、2つの群の区別が可能であった。この結果はFISH法と同様であり,RT-PCR法の結果(SSではSYT-SSX1;10例、SYT-SSX2;2例、Non-SS;いずれも陰性)の結果と一致した。結論として、CISH法は、FISH法の蛍光顕微鏡の操作の煩雑さや、蛍光シグナルの減衰の問題、RT-PCR法のプライマー設定やPCR法の再現性の問題などを克服可能で、さらに細胞形態と遺伝子異常を同時に可視化できる点で、実際のSSの病理診断に応用可能な精度の高い新たな手法と位置付けられた。組織細胞形態と細胞遺伝学的異常を同時にホルマリン固定パラフィン包埋切片上で解析可能な手法であるdual-color Chromogenic in situ hybridization (CISH)法を用いた骨軟部腫瘍の診断法を確立する目的のうち、遺伝子増幅を有する腫瘍へのCISH法の応用について検討した。高分化型脂肪肉腫(WLPS)は頻度の高い低悪性度軟部肉腫であり、この10%は高悪性度の脱分化型脂肪肉腫(DLPS)に転化する。病理診断学的にはWLPSは良性脂肪腫,DLPSは多形型悪性線維性組織球腫(PMFH)との鑑別が問題となる。DLPS, WLPSに特徴的な細胞遺伝学異常としてMDM2遺伝子の増幅が知られている。WLPS6例及びDLPS6例の脱分化巣(DD)、高分化型成分(DW)で、MDM2、CEN12プローブを用いたCISH法を施行、WLPS及びDWの脂肪細様細胞(A)、非脂肪細胞類似細胞(N)、DDの腫瘍細胞(D)の3群の増幅シグナル陽性細胞(MDM2/CEN12>2.0)の60個中の割合を測定し、MDM2の免疫組織化学的陽性率と比較した。全例でMDM2増幅細胞が認められ、異常細胞の陽性率はWLPS : A46%/12%、N66%/29%、DLPS : A34%/8%, N54%/30%,D : 75%/42%(CISH/免疫組織化学)であった。以上よりCISH法は免疫組織化学より高率に陽性であるため、脂肪肉腫の診断の新しい診断手法として有用であることが明らかにされた。CISH法は骨軟部腫瘍の染色体相互転座の検出のみではなく、遺伝子増幅の検出にも適用可能であった。また、脂肪肉腫細胞の遺伝子異常及びタンパク過剰発現は一様ではなく、腫瘍の分化傾向の減弱と遺伝子増幅陽性細胞の増加の相関性が示唆された.組織細胞形態と細胞遺伝学的異常を同時にホルマリン固定パラフィン包埋切片上で解析可能な手法であるdual-color Chromogenic In Situ Hybridization(CISH)法の骨軟部腫瘍診断への応用を目的として次の検討を行った。(1)染色体相互転座、融合遺伝子を有する肉腫への応用に関しては、粘液型脂肪肉腫3例でのCHOP遺伝子再構成、胞巣型軟部肉腫7例でのTFE3遺伝子再構成、明細胞肉腫1例でのEWS遺伝子再構成の検出を試み、全例で遺伝子再構成を示す当該遺伝子の解離シグナルの検出が可能であった。

(2)遺伝子増幅を有する肉腫への応用に関しては、高分化型脂肪肉腫(WLPS)及びその約10%の高悪性度転化で生じる脱分化型脂肪肉腫(DLPS)の両者にみられるMDM2の遺伝子増幅のMDM2-p53経路の制御への関与を知ることを目的として、p53特異性の高い発現制御を受けるmicroRNA(miR)-34aの相対的発現量を定量的RT-PCR法を用いて検索し、p53の機能状態を推定した。その結果、WLPS(n=5),DLPS(n=5)におけるmiR-34aの発現はMDM2遺伝子増幅のない脂肪腫(n=6),正常脂肪組織(n=3)よりも有意に上昇していた。一方、WLPSとDLPSの脱分化巣の発現レベルには有意な差がなかった。一般には遺伝子増幅の結果、過剰発現したMDM2がp53の分解を促進し、p53の機能が抑制されると信じられているが、本研究の結果はMDM遺伝子増幅がp53の機能を必ずしも抑制していないことを示しており、脂肪性腫瘍のMDM2-p53経路の意義を考える上で重要な知見である。
絶対的遺伝子発現解析による造血幹細胞・ニッチ間分子コミュニケーションの全貌の解明

申請時から1年で標準的な遺伝子発現解析方法はマイクロアレイからRAN-seqへと大きく変わった。そのため本研究でも遺伝子発現解析方法をRNA-seqへと変更する方針とし、1)測定プロトコールの策定と最適化、2)Gene Expression CommonsをRNA-seqへと対応させる、の2点にまず取り組んだ。1)についてはSmart-seq法に準拠してシングルセルレベルへの作業手順の検討・最適化を行い、その結果、シングルセルレベルでRNA-seqを行うプロトコールについてはほぼ策定が終わり現在最適化の最終段階を行っている。また2)についてはまずRNA-seqに基づいた遺伝子発現ダイナミックレンジのデータベースを作成するとこととし、全世界で公開されているRAN-seqデータ(ヒト約50000件、マウス約100000件、合計3兆リード)を収集し、その生データを処理するパイプラインソフトウェアを作成し、一元的に解析を行った。その結果ヒトおよびマウスの全遺伝子の発現ダイナミックレンジを推定することに成功し、データベース化した。つぎにGene Expression Commonsがその発現ダイナミックレンジ・データベースを参照できるようにソフトウェアを拡張し、また実際の観測データを登録するインターフェースなども作成し、Gene Expression CommonsをRNA-seqへと対応させる作業はほぼ完了した。現在限定されたユーザによって試験運転中である。遺伝子発現解析方法をマイクロアレイからRNA-seqに変更したために、実験プロトコールの再設定とGene Expression CommonsのRNA-seqへの対応が必要になったため、実際の細胞を使った測定が遅くなっているが、このRNA-seqの利用は世界的流れであり初年度に対応できたことは今後大きな意味を持つと考えられる。RAN-seqの測定パイプラインが完成し次第、予定の細胞種に対するRNA-seqを施行する予定である。試薬の消費が予定よりも少なかったために次年度使用額が発生した。翌年度の試薬費用とする。
情報通信機器に電磁障害をもたらす静電気放電の発生電磁界のレベル予測と障害低減策

高度情報通信社会においては,小型軽量かつ高速大容量のマルチメディア携帯情報端末が必需品となる半面,これらのハイテク機器は電磁ノイズに対して極めて脆く,その誤動作の多くは静電気放電(Electrostatic discharge:ESD)で発生する過渡電磁界によって引き起こされている.特に,金属パイプ椅子,搬送ロボットなどの帯電金属体のESDは強い電磁界を発生することが知られており,例えば,米国のWilsonとMaは,金属平板近くで起こした金属球間のESDから1.5m離れた場所において150V/mという強い電界を測定している.このようなESDによる強電磁界の発生機構を解明するにはESD電流を定量的に把握することが不可欠であるが,放電経路を流れる電流の測定は一般には極めて困難である.本研究の申請者は,点波源としたESDによる発生電磁界を,Rompe-Weizelの火花抵抗則から誘導される火花電流のダイポールモデルで解析し,界の距離依存性,放電ギャップ長依存性を既に解明した.本研究課題の目的は,上述成果に基づきESD界のシミュレーションコード開発とESD電磁障害策の確率にある.研究結果の概要はつぎのとおりである.平成10年度においては,帯電金属体の火花放電がつくる過渡電磁界の時間領域差分(Finite-difference time-domain:FDTD)法による数値解析から発生電磁界の伝播状況,距離特性,金属体形状などの依存性を明らかにし,帯電金属体形状が発生電磁界に及ぼす影響を事前予測するためのFDTD法に基づく数値コードを開発した.しかしながら,同解析法では放電開始前の静電界は計算できず,それ故に帯電金属体によるESD界の全容を把握することができないと云った欠点があった.平成11年年度においては,火花電圧を励振源とするFDTD数値解析アルゴリズムを開発し,金属球体間の火花放電による発生電磁界を解析,数値結果を火花電流を波源としたそれと比較・検討した.その結果,電界波形は,火花電流を波源とした解析法では静電界が計算されないが,火花電圧を波源とした場合には金属球体面を同電位とするイメージ電荷対による解析結果とほぼ一致し,静電界の計算が可能であることがわかった.一方,金属球間の火花放電に伴う電界波形を1.5GHzの広帯域ディジタルオシロスコープで観測し,それが火花電圧を波源とした計算波形にほぼ一致すること,イメージ電化対による解析結果とは球体サイズが大きい場合には一致しないこと,なども確認できた.現在,任意形状の帯電金属体によるESD界に適用可能なFDTD解析用アルゴリズムを構築する一方,ESD電磁障害の低減策を目的としたフェライトコア装着金属体間ESDの界レベル低減効果をFDTDシミュレーションと火花実験の両側面から調べている.高度情報通信社会においては,小型軽量かつ高速大容量のマルチメディア携帯情報端末が必需品となる半面,これらのハイテク機器は電磁ノイズに対して極めて脆く,その誤動作の多くは静電気放電(Electrostatic discharge:ESD)で発生する過渡電磁界によって引き起こされている.特に,金属パイプ椅子,搬送ロボットなどの帯電金属体のESDは強い電磁界を発生することが知られており,例えば,米国のWilsonとMaは,金属平板近くで起こした金属球間のESDから1.5m離れた場所において150V/mという強い電界を測定している.このようなESDによる強電磁界の発生機構を解明するにはESD電流を定量的に把握することが不可欠であるが,放電経路を流れる電流の測定は一般には極めて困難である.本研究の申請者は,点波源としたESDによる発生電磁界を,Rompe-Weizelの火花抵抗則から誘導される火花電流のダイポールモデルで解析し,界の距離依存性,放電ギャップ長依存性を既に解明した.本研究課題の目的は,上述成果に基づきESD界のシミュレーションコード開発とESD電磁障害策の確率にある.研究結果の概要はつぎのとおりである.平成10年度においては,帯電金属体の火花放電がつくる過渡電磁界の時間領域差分(Finite-difference time-domain:FDTD)法による数値解析から発生電磁界の伝播状況,距離特性,金属体形状などの依存性を明らかにし,帯電金属体形状が発生電磁界に及ぼす影響を事前予測するためのFDTD法に基づく数値コードを開発した.しかしながら,同解析法では放電開始前の静電界は計算できず,それ故に帯電金属体によるESD界の全容を把握することができないと云った欠点があった.平成11年年度においては,火花電圧を励振源とするFDTD数値解析アルゴリズムを開発し,金属球体間の火花放電による発生電磁界を解析,数値結果を火花電流を波源としたそれと比較・検討した.その結果,電界波形は,火花電流を波源とした解析法では静電界が計算されないが,火花電圧を波源とした場合には金属球体面を同電位とするイメージ電荷対による解析結果とほぼ一致し,静電界の計算が可能であることがわかった.一方,金属球間の火花放電に伴う電界波形を1.5GHzの広帯域ディジタルオシロスコープで観測し,それが火花電圧を波源とした計算波形にほぼ一致すること,イメージ電化対による解析結果とは球体サイズが大きい場合には一致しないこと,なども確認できた.現在,任意形状の帯電金属体によるESD界に適用可能なFDTD解析用アルゴリズムを構築する一方,ESD電磁障害の低減策を目的としたフェライトコア装着金属体間ESDの界レベル低減効果をFDTDシミュレーションと火花実験の両側面から調べている.

急速に発展しつつある情報通信社会においては,小型軽量かつ高速大容量のマルチメディア携帯情報端末が必需品となる.しかしながら,これらのハイテク機器は電磁ノイズに対して極めて脆く,その誤動作の多くは静電気放電(Electrostatic discharge:ESD)で発生する過渡電磁界によって引き起こされている.特に,金属パイプ椅子,搬送ロボットなどの帯電金属体のESDは強い電磁界を発生することが知られており,例えば,米国のWilsonとMaは,金属平板近くで起こした金属球間のESDから1.5m離れた場所において150V/mという強い電界を測定している.このようなESDによる強電磁界の発生機構を解明するにはESD電流を定量的に把握することが不可欠であるが,放電経路を流れる電流の測定は一般には極めて困難である.本研究では,帯電金属体の浮遊容量と放電ギャップ長並びに放電電圧からESD電流を推定する申請者提案の計算手法の妥当性を検証し,ESDのシミュレーションコード開発とESD電磁障害策を確立する.今年度においては,(1)帯電金属体の火花放電がつくる過渡電磁界の時間領域差分(Finite-difference time-domain:FDTD)法による数値解析から発生電磁界の伝播状況,距離特性,金属体形状などの依存性を明らかにし,(2)帯電金属体形状が発生電磁界に及ぼす影響を事前予測するためのFDTD法に基づく数値コードの開発を目的とした.結果の概要はつぎのとおりである.金属平板上における金属球体間の火花放電を間接ESDの数値解析の対象モデルとした.過渡電磁界のFD-TD法による数値アルゴリズムを構築し,金属平板に対する放電経路の方向,球体サイズが電磁界分布や伝播状況に及ぼす影響を現有ワークステーションと購入パーソナルコンピュータとで可視化し得るプログラムを開発した.このシステムによるシミュレーションの結果,金属体の存在がそのサイズに応じて界レベルを増大させることが判明し,同知見の妥当性をつぎのように検証した.金属球体面が同電位を保つ条件をイメージ電荷で満たし,同電荷対のダイポールモデルによる電磁界を重ね合わせることで発生電磁界を求めたところ,発生磁界の計算値はFDTD法による計算結果と大略一致し,FDTD法で得られた上述の知見の妥当性が確認できた.つぎに,金属平板上で金属球体間の火花実験を行い,発生電界を市販のESD検出器で観測距離との関係において検出頻度を統計的に測定した結果,50%検出距離は金属球体サイズを増加させるほど延びることが確認できた.現在,火花実験で発生磁界波形を購入の広帯域プリアンプと現有のディジタルオシロスコープとで測定を行い,シミュレーショシ結果との対照を行っている.この実験を次年度も引き続き行う一方,ESD電磁障害の低減策を目的としたフェライトコア装着金属体間ESDの界レベル低減効果の解明を目指す.近年の半導体技術の飛躍的な進歩に伴い計算機の小型・高速化が進み,その性能は著しく向上した半面,集積回路の高密度・低圧化で電磁雑音に対する機器耐性が大幅に劣化し,問題となっている.特に,身近に起こる静電気放電(Electrostatic Discharge:ESD)で生ずる過渡的な電磁雑音はマイクロ波帯にも及ぶ広帯域の周波数スペクトルを含むとされ,機器誤動作の大きな要因の一つとされている.
犯罪人引渡法の研究

平成2年度には,犯罪人引渡法の基礎理論の研究をすることに心がけた。その成果の一部として,「犯罪人引渡法における相互主義」と「犯扱人引渡法における政治犯罪の概念」とを雑誌で公表した。前者は,わが国では未開拓の研究テ-マであったと思われる。後者は,最近における立法例や条約に現れた政治犯罪の概念について考究したものであって,従来,主として国際法学者が研究してきたものを大きく修正するものである。両論文とも,わが国の学界と実務界に寄与するところは大きい思われる。平成3年度には,「犯罪人引渡法における仮逮捕」と「自国民不引渡しの原則」という二つの論文を書いた。前者は,これまでわが国に全く知られていなかった問題点を扱ったものであって,わが国の逃亡犯罪人引渡法の改正に役立つであろう。外国では,「仮逮捕」が活発に行われている。国際犯罪の国際的防止のためには,わが国も先進諸外国と歩調をそろえる必要がある。後者は,これまで伝統的に支持されてきた自国民不引渡しの原則につき、その合理的理由のないことを論述し,あわせて近時の条約や立法例が不引渡しの原則を修正していることを指摘したものである。このほかにも,犯罪人引渡法については,考究すべき問題点は,実に多い。比較法的な基礎研究が欠如しているわが国では,このような地味な研究を進展させることは,困難である。わが国における外国人犯罪が急激に増加し,また,国際犯罪防止のために国際的連帯性の強化の必要性が叫ばれている現在,より多くの研究者がこの分野の研究につき力をあわせることが強く要請される。平成2年度に引き続き,犯罪人引渡法の理論的研究と比較法的研究を続けた。1991年9月23日,イギリス内務省を訪れ,C7課(国際協力課)のゴ-ルドスミス課長に会い,約2時間にわたり,1989年のイギリス犯罪人引渡法について意見交換をした。この意見交換は,有益であった。というのは,わが国では,イギリスの犯罪人引渡法の研究がほとんどなされていなかし,他方,イギリス法は,イギリス連邦に属する45か国にも,基本的には当てはまるからである。この意見交換の様子については,拙稿「イギリスの新しい犯罪人引渡法」判例時報1399号(1991年12月21日号)に書いた。理論的な研究として,二つの論文を書いた。第1は「犯罪人引渡法における仮逮捕」である。「仮逮捕」は、現実には重要な役割を果たしている制度であり,しかも多くの国でつとに実施されている。しかるに,わが国は,この制度を採用していないのみならず,この制度の研究をもしていない。拙稿は、問題の所在を明らかにしつ,条約や立法例に現れた「仮逮捕」の制度をかなり詳述した。第2は,「自国民不引渡しの原則」である。コモン・ロ-の国は,伝統的に自国民を引き渡してきた。これに対し,シヴィル・ロ-国(大陸法系の国)は,自国民不引渡しの原則を堅持してきた。これでは,両法系の国相互写における犯罪人引渡しが円滑に進むはずがない。犯罪防止の国際的連帯性を強化する見地では,不引渡の原則を廃止すべきであり,少なくとも大きく緩和修正すべきである。世界の新しい動向を,そこに見ることができる。拙稿は,その点を指摘した。
体外増幅赤芽球移植を用いた血管新生治療の長期予後と治療効果の予測因子の検討

重症虚血肢に対する体外増幅自己赤芽球移植(EVEETA)による血管新生治療の第I/II相臨床試験を開始しその急性期効果および中長期予後について検討した。局所麻酔下に採取した少量の骨髄細胞を2段階培養法にて未熟赤芽球を体外増幅・培養し虚血下肢に筋肉内投与した。全13症例に対し施行し、すみやかな下肢痛の軽減、難治性皮膚潰瘍の縮小、局所組織酸素分圧や皮膚灌流圧の上昇といった非常に良好な結果を得ることができた。本法は局所麻酔下で採取骨髄も平均71.2 ±20.1 mLと少量ですみ、赤芽球細胞の増幅効率も平均64.5 ±41.3倍と安定していた。いずれの症例においても明らかな有害事象は認めなかった。体外増幅自己赤芽球移植(EVEETA)による血管新生治療の第I/II相臨床試験の良好な結果を踏まえ、急性期効果だけでなく中長期予後の点からもEVEETAの有用性を実証すべく、さらに症例数を増やしてきた。応用治療として、効果不十分であった症例に対し繰り返しEVEETAを追加治療することも積極的に行った。新たな展開として本研究では従来法である「骨髄単核細胞移植(BMI)」と「体外培養法によるEVEETA」、この2つの血管新生治療の治療効果および安全性を、無作為化並行群比較試験において前向きに直接比較する臨床試験として進めるべく、平成25年度は厚生労働省のヒト幹細胞を用いる臨床試験に関する指針の承認を目指し院内倫理委員会でも検討・協議を進めてきた。結果、平成25年11月25日、ヒト幹細胞を用いる臨床試験に関する指針に準拠したヒト幹細胞臨床研究として厚生労働省に承認された。新たな展開として本研究では従来法である骨髄単核細胞移植(BMI)と体外培養法によるEVEETA、この2つの血管新生治療の治療効果および安全性を、無作為化並行群比較試験において前向きに直接比較する方向で進めるべく、平成24年度後半は院内の倫理委員会でも検討・協議を進めてきた。院内プロトコールデータセンターの立ち上げの後、先進医療Bへ申請予定である。医歯学系症例数はさほど増えなかったが、今後、本研究では従来法であるBMIと体外培養法によるEVEETA、この2つの血管新生治療の治療効果および安全性を、単施設無作為化並行群比較試験として前向き試験のかたちで検討する方向で進めるべく、院内の倫理委員会で協議し、ようやく、平成25年11月25日、ヒト幹細胞を用いる臨床試験に関する指針に準拠したヒト幹細胞臨床研究として厚生労働省に承認された。症例数はさほど増えなかったが、今後、本研究では従来法であるBMIと体外培養法によるEVEETA、この2つの血管新生治療の治療効果および安全性を、単施設無作為化並行群比較試験として前向き試験のかたちで検討する方向で進めるべく、現在院内の倫理委員会で協議中。当施設では重症虚血肢に対するBMI等の細胞治療の実績が46例あり、これら従来の細胞移植症例をhistorical controlとする後ろ向き研究として、統計学的にBMIとEVEETAを比較検討し、EVEETAの有用性を実証する予定であったが、今後、本研究では従来法であるBMIと体外培養法によるEVEETA、この2つの血管新生治療の治療効果および安全性を単施設無作為化並行群比較試験において前向き試験として検討する方向で進めていく。

また本試験では当初「末梢性動脈疾患(閉塞性動脈硬化症)・難治性血管炎[ビュルガー病・膠原病に伴う血管炎など]により安静時痛または虚血性潰瘍・壊死を有する患者で、著しくQOLが障害されており血行再建術の適応が無く将来切断が予想される患者」のみが治療対象であったが、EVEETAとBMIの比較試験においては「血行再建術後も血流の改善に乏しく(皮膚灌流圧40mmHg未満)、重症虚血状態から離脱できない患者」も対象とする予定で進める。平成25年11月25日、ヒト幹細胞を用いる臨床試験に関する指針に準拠したヒト幹細胞臨床研究として厚生労働省に承認され、平成26年度は先進医療Bへの申請作業をすすめる。当施設では重症虚血肢に対するBMI等の細胞治療の実績が46例あり、これら従来の細胞移植症例をhistorical controlとする後ろ向き研究として、統計学的にBMIとEVEETAを比較検討し、EVEETAの有用性を実証する予定であったが、今後、本研究では従来法であるBMIと体外培養法によるEVEETA、この2つの血管新生治療の治療効果および安全性を単施設無作為化並行群比較試験において前向き試験として検討する方向で進めていく。計画していた「重症虚血肢患者に対する体外増幅自己赤芽球移植と自己骨髄単核細胞移植による血管新生治療の比較試験」が厚生労働省ヒト幹細胞を用いる臨床研究に関する指針に承認されるまで時間がかかり、試験開始が遅れたため。上記無作為化並行群比較試験における細胞培養費用、細胞移植に関連した諸費用だけでなく、臨床試験保険などの費用や事務局費などに必要です。上記無作為化並行群比較試験における細胞培養費用、細胞移植に関連した諸費用だけでなく、臨床試験保険などの費用や事務局費など。
血管新生抑制を指向した低酸素誘導因子阻害剤の創薬研究

本研究では、がん細胞の増殖や浸潤・転移を促進を誘導する病的血管新生を抑制する血管新生阻害剤の開発とその作用機序の解明を行った。低酸素条件下でGN26361化合物はHSP60を阻害することより低酸素誘導因子の発見を低下し血管新生誘導因子の産生を抑制することが明らかになった。血管内皮増殖因子の受容体VEGFR阻害剤は血管内皮細胞の増殖を抑制し血管新生を阻害する。そこでVEGFRとHIF-1αを同時に阻害できるマルチターゲッティング阻害剤は従来のVEGFやVEGFR阻害剤より強力的な病的血管新生阻害活性を示す可能性が考えられる。そこで本研究では、既知VEGFR阻害剤であるアントラニルアミドAAL993によるHIF活性化抑制作用及びその作用機序について解析した。ヒト子宮がん細胞HeLaを低酸素(1%O_2)条件下で培養後、細胞内各種蛋白のレベルをWestern blot法により、HIF-1α及びVEGF mRNAレベルをRT-PCR法により検出した。また、HIFの転写活性はHRE-Lucを安定発現させたHEK293細胞を用いてレポーターアッセイにより、培養液上清中のVEGFの量をELISA法により測定した。さらに、HIF-1αの細胞内局在を蛍光免疫染色法により解析した。低酸素条件下でALL993はHIF-1αレベルの亢進を濃度依存的に抑制した。また、AAL993は低酸素によるHIFの転写活性化を阻害し(IC_<50> ; 6.53μM)、VEGF産生を抑制した(IC_<50> ; 4.17μM)。さらに、AAL993は低酸素によるHIF-1αの分解経路を影響せずにHIF-1αmRNAのレベルを低下することによりHIF-1αの発現を抑制した。このようなAAL993のHIF-1αの発現抑制作用にはERKの活性化抑制が大きく関与しており、VEGFRの非依存的な作用であることが分かった。これらの結果から、AAL993はVEGFRの阻害作用だけではなく、低酸素によるHIF-1αの活性化経路を抑制することにより血管新生を抑制する作用があることが示唆された。【研究の目的】固形腫瘍内の低酸素領域においてHIFは、血管誘導因子の発現を亢進することにより病的血管新生を誘導する。このような経路を介してがん細胞の増殖や浸潤・転移を促進することからHIFはがん治療の標的分子として最近注目されている。我々は以前、カルボラン化合物GN26361が低酸素によるHIF-1の活性化を抑制することを見出した。そこで本研究では、ケミカルバイオロジー的アプローチでGN26361の作用機序の解明を行った。【方法】GN26361の化学構造を基に、光反応により標的タンパクと共有結合を形成する光反応性官能基ベンゾフェノンを導入し、さらにアジド含有蛍光剤とのクリック反応ライゲーションのために末端アセチレンを導入したGN26361プローブ分子を合成した。【結果と考察】プローブ分子と反応させたHeLa細胞ライセートをSDS-PAGEを行い、蛍光イメージングにてプローブ分子と共有結合した蛋白質の可視化に成功した。さらに、2次元電気泳動を行い、ゲル内トリプシン消化法で断片化し、ゲルから抽出されたペプチドは質量分析装置(ESI-TOF-MS)を用いてペプチドマスフィンガープリンティング法により解析したその結果、標的分子であるHSP60の同定に成功した。また、プローブとリコンビナントHSP60の結合はGN26361によって抑制された。既知HSP60阻害剤であるETBはGN26361と同様にHIF-1レベルを抑制し、HIF転写活性を阻害した。以上のことからGN26361のHIF-1阻害作用機序を明らかになり、HSP60はHIF阻害剤開発の新たなターゲットになると思われる。
軸不斉と有機触媒で修飾されたナノ細孔の構築と不斉認識・不斉反応

(+)-樟脳酸の銅塩のピラジン、ビピリジン、およびDABCO錯体はチャンネル構造を持つ三次元の無限格子構造を有し、これらのチャンネル内部は二次元シート状の(+)-樟脳酸部位によりホモキラルな環境となっている。また、いずれの錯体も、その細孔はバルクでもホモキラルである。(+)-樟脳酸は容易に入手できる光学活性ジカルボン酸であるが、直線構造ではないため、その遷移金属塩の結晶構造を予測しにくい。剛直で直線状の光学活性ジカルボン酸を使えばナノ細孔の精密分子設計が可能になると期待できる。剛直な直線構造と不斉を両立させるために、軸不斉カルボン酸を考え、また、触媒性官能基となりうるフェノール性ヒドロキシ基を有するビナフトールを基本骨格として用いることにした。(S)-ビナフトールを原料として用い、4段階で4,4′-位をジブロモ化した。この直接カルボキシかを検討したが、ブチルリチウムで処理すると分解したため、鈴木-宮浦反応あるいはStille反応でビニル化した後、酸化して直線構造を有する軸不斉カルボン酸を得た。一方、光学活性アレン-1,3-ジカルボン酸の合成も検討した。アレン-1,3-ジカルボン酸を3-ブチン-1-オールから2段階で合成し、キニーネによる光学分割を検討したが、アレン-1,3-ジカルボン酸は熱的に不安定性で分解してしまった。そこで、アセトン-1,3-ジカルボン酸エチルから2段階でアレン-1,3-ジカルボン酸のメンチルエステルを合成し、そのジアステレオマー分離を経て光学活性なアレン-1,3-ジカルボン酸を得た。さらに、直線構造を有してはいないものの、軸不斉を有するジカルボン酸として2,2′-ジヒドロキシ-1,1′-ビナフチル-3,3′-ジカルボン酸を用いて銅塩を作成した。ラセミのジカルボン酸を用いたところ、二次元無限シート構造を有し、細孔を持つ結晶が得られた。それぞれのシートはホモキラルであった。細孔径は4.4Åであり、単結晶X線構造解析の結果とよく一致した。我々は様々なジカルボン酸が種々の遷移金属イオンと塩を形成する際、二核錯体状態を取ることで無限格子状の結晶構造を作り、また、適切な軸配位子を利用することで、その格子を三次元的に拡張できることを明らかにしてきた。さらに、このような多孔性錯体が、天然ガスの貯蔵、高分子包接化合物、高機能触媒など、多彩な機能を有するナノ細孔物質となることを明らかにしてきた。本研究では、光学活性ジカルボン酸を用いた光学活性ナノ細孔錯体の合成とその応用について検討した。光学活性ジカルボン酸として樟脳酸を用いた。樟脳酸銅(II)の結晶構造解析を行なったところ、ナノ細孔は認められなかった。しかし、軸配位子として、DABCO、ピラジン、および、4,4'-ビピリジンを用いたところ、元素分析から対応する樟脳酸銅(II)錯体が得られ、X線結晶構造解析から、錯体はナノ細孔を有していることが明らかになった。錯体の磁化率測定と熱分析からも錯体が二核構造を有していることが確認された。いずれのナノ細孔も極めて大きな比表面積を有し、低温で気体を吸蔵することを明らかにした。得られたナノ細孔で2-ブタノールなどの不斉点を有する化合物の光学分割を検討したところ、わずかに不斉認識能が見られた。より高度の不斉認識能を実現するために、軸不斉を有するジカルボン酸および軸配位子を合成して利用することを検討した。軸不斉を有する基本構造として2,2'-ビナフトールに着目し、(S)-2,2'-ビナフトールから4段階で6,6'-位に塩素を、3,3'-位に臭素を置換したビナフトールを合成した。従来はここから多段階で期待されるジカルボン酸およびビピリジンへと導いていたが、直接誘導することを検討し、ハロゲン-金属交換した後二酸化炭素で処理することによってジカルボン酸を、鈴木カップリング反応を利用することによってビピリジンを、それぞれ合成した。

アレン-1,3-ジカルボン酸を3-ブチン-1-オールから2段階で合成し、キニーネによる光学分割を検討したが、アレン-1,3-ジカルボン酸は熱的に不安定性で分解してしまった。そこで、アセトン-1,3-ジカルボン酸エチルから2段階でアレン-1,3-ジカルボン酸のメンチルエステルを合成し、そのジアステレオマー分離を経て光学活性なアレン-1,3-ジカルボン酸を得た。さらに、直線構造を有してはいないものの、軸不斉を有するジカルボン酸として2,2′-ジヒドロキシ-1,1′-ビナフチル-3,3′-ジカルボン酸を用いて銅塩を作成した。ラセミのジカルボン酸を用いたところ、二次元無限シート構造を有し、細孔を持つ結晶が得られた。それぞれのシートはホモキラルであった。細孔径は4.4Åであり、単結晶X線構造解析の結果とよく一致した。
被災地の民族誌－東日本大津波の被災者とそのコミュニティに関する人類学的研究

本研究では、東日本大震災の津波被災地において人々の生活再建や地域の復興がどのように進むのかを明らかにするために、複数の調査地で長期にわたる文化人類学的調査を行い、被災者の移動に伴う生活相の変化や、被災者をとりまく社会的環境の変化、さらには彼らのコミュニティに生じた再生や変容を詳細に記録した。再建や復興のプロセスは一様かつ直線的なものではなく、被災の程度、行政による施策の影響、震災前から家族やコミュニティに内在していた諸条件、外部からのボランティアとの関わり方等々といった様々なファクターにより多様かつ複雑に展開するのだが、その全容を民族誌的に記述するためのデータを蓄積することもできた。東日本大震災から2年を経た今も津波被災地では復興のプロセスは遅々として進まず、その影響で地域のコミュニティや被災者の生活は分断され、再建の方向性にもばらつきが生まれ、時にはコミュニティ内に軋礫が生じてきている。被災地を「局地的異文化」と見ることで、被災者と彼らを取り巻く環境を被災地固有の文脈で捉えようとする本研究としては、まずはそうした現状をさまざまな立場から記録することに重点を置き、参与観察や聞き取り調査を進めた。今年度は特に、被害の大きかった宮城県石巻市の沿岸部および北上川河口部を重点調査地域とし、そこにあった5つの地区コミュニティの全容をおさえるために精力的に現地に通い、ほぼすべての住民に関する基礎的データを収集することができた。個人情報を含むデータであるため、その整理・保管に関しては細心の注意を払わなければならないが、今後の調査活動の土台ともなる基本資料を得られたことは意義深い。また、計画になかった2つのコミュニティにも調査に入れたことは本研究にとって大きな進展であり(そちらに注力した分、岩手県内での調査にほとんど手をつけられなかったが)、被災地の再建・復興プロセスを追いながらコミュニティごとの差異や共通点を明らかにしていくための比較調査の基盤を広げることができた。石巻市内に作られた仮設住宅での調査は、上記5地区の住民が入居している箇所に対象を限定したが、現地で行われる諸活動を参与観察しながら多様な人々に話を聞いたり、外部からのボランティアへの聞き取り調査も重ねた。震災から時間が経つにつれボランティアの数は減り、定期的に支援に訪れる組織や人々が絞られてくる中で、被災者との間で築かれる信頼関係や協力関係がどのように変容していくのか、またそうした変容が被災地に何をもたらすのか、徐々に明らかになりつつある。本研究の主な調査地は、東日本大震災の津波によって甚大な被害を被った宮城県ならびに岩手県の複数の臨海地区と、石巻市内や仙台市内に多数建設された仮設住宅である。震災後の早い時期から調査に入ったこともあり、どの地区においても震災後の地域のキーマンとなっているような人々に調査協力を仰ぐことができ、各地区で開かれる復興委員会や地区総会などでの参与観察や仮設住宅での聞き取り調査をスムーズに行えた。その結果、震災によるコミュニティの人口移動や人間関係の組み替えがどのように生じていったかを詳細に記録することができた。また、本年度は特に、調査協力者のライフヒストリーを聞き取ることに注力し、震災前の地域の姿も同時に明らかにすることを目指した。そこからは高齢化の進む過疎地域に共通する諸問題が予想通り浮かび上がった。そして、そうした地域特性と、以前からコミュニティに伏在していた様々な脈絡や関係性とが相互作用しながら、被災後の人々の移動やコミュニティの変容に大きく影響していたことも分かってきた。さらに、震災がそうしたコミュニティに部分的にではあるが風穴を開け、新たな人の往来や外部とのつながりを呼び込んだことも跡付けることができた。こうした震災による変化は、操業を再開した沿岸部の水産業や硯・スレート石といった伝統工芸の分野でも生じていることが、生業の現場でのフィールドワークから確認されている。本年度は他にも、被災した子どもたちの通う学校や地域の様々な小集団などで参与観察や聞き取り調査を行った。中でも、繰り返し報道された大川小学校をめぐる問題に関しては特に慎重に調査を進めた。遺族、地域住民、行政、支援ボランティア、マスコミなどの想いや思惑が複雑に絡み合い、それぞれの動きが影響し合って、被災地固有の社会現象となっていく過程を様々な角度から記録に残しつつある。東日本大震災から4年がたち、津波被災地でも復興や再建が目に見える形を伴って進みつつある。しかし、その陰でほとんど復興の進まないところもあり、また復興・再建支援の本格化が地域コミュニティに変形や歪みをもたらしているケースも少なくない。本研究は、そうした被災地の変容過程の全体を被災地固有の文脈で捉えながら重層的に記録することを試みてきた。そこから見えてくるのは、4年という歳月の中で被災地はおそらく未曾有の速さで様々に変化してきたのだが、その変化は必ずしも地域の再生に結びついていないという現実である。本年度は、調査研究のいっそうの精緻化を図るために思い切って調査地を絞り込んだ。集中的な調査を継続させたのは宮城県石巻市の沿岸部3地区、および宮城県内の2箇所の仮設住宅である。ほとんどの調査地区で全世帯調査を行い、参与観察や聞き取りによって地区の全体像とその変容過程が立体的に浮かび上がりつつある。前年度まではあまり動きが見られなかった仮設住宅も今年度は退去者が予想外に急増し、その移動先を含めた調査を行うことで被災地の人口移動の実際を記録することができた。その他、一昨年度より継続して調査を進めてきた水産(加工)業や伝統工芸、あるいは大川小学校をめぐる問題群なども時間と共に変化していく姿を記録し続けた。

本年度はさらに、調査対象地区に支援を続ける外部のコミュニティにも調査の範囲を広げ、長野県諏訪地域での聞き取り調査を行った。そこでは被災地とつながることで自らのコミュニティの結束が強まり、それがまた支援活動の原動力になっていたが、そのサイクルにも限界があると予想された。また、この一年の間に相次いだ被災地におけるコミュニティ・センター設立の動きも追い続けた。どの設立主体も被災地支援のNPOなどだが、被災地内部の団体か外部の団体かによってすでに大きな違いが生じていることも確認できた。最終年度に当たる本年度は、これまでに得られた調査データの不足を補ったり、研究期間中の変化を追うための補足調査や追加調査を主として行った。中でも、これまで調査を進めてきた津波被害が甚大な地区に隣接する、被害のほとんどなかった地区に対して行った補足調査は、隣接し合う両地区の古くからのつながりや交流を浮き上がらせると同時に、そうしたものを一瞬にして奪った大津波が被災者やそのコミュニティに与えた目に見えない疵痕の深さを明らかにすることができた。また、仮設住宅から復興住宅等へと被災者が移転する過程を追跡調査することによって、どのような機縁や理由で人と人のネットワークがつながるか、もしくは切れてしまうかを具体的な形で記録に残せた。他にも墓地の再整備や祭りの再興を通じて、ばらばらになったコミュニティが物理的な空間を越えて活性化される姿や、ボランティアの援助によって仮設住宅で始まった手仕事の集まりが人々の新たな紐帯を生み出すプロセスも、追加調査によって捉えることができた。本年度はまた、補足や追加の域を越えるような調査を行う必要も生じた。その一つは、これまでの聞き取り調査では滅多に語られなかった津波被災直後の体験や状況を、数多くの被災者がまるで堰を切ったかのように語り始めたためである。予想外のことであったが、民族誌的データとしては非常に価値の高いものであり、あえて多くの時間を割いて聞き取り調査を行った。もう一つは、多くの犠牲者を出した大川小学校の遺族らと韓国史上最悪の海難事故とも言われるセウォル号沈没事故の遺族ら(亡くなった300名近くの高校生の保護者)が交流を持つようになり、その動きを同行調査することができた。大勢の子どもが同時に亡くなるという痛ましい経験を共有する遺族らの国際交流が互いに癒しをもたらすと同時に何を生み出せるか、今後の展開を見守っていきたい。大震災の被災地では次々に新たな変化が生じており、5年が経った今もそれは変わらない。今年度は特に、数多くの被災者が被災直後の経験を問わず語りに語り始めたり、主たる調査対象にしていた大川小学校関連で大きな動きがあったりと、調査の進行に影響を及ぼすような変化が生じたため、当初予定していた補足調査や追加調査のスケジュール変更を余儀なくされた。そのため、科研費の補助事業期間延長制度を利用して、調査の一部を次年度に回すことになった。ただ、調査の主要部分はすでに完了しており、被災地の民族誌を記述するという研究目的に必要な資料とデータはほぼ十分なまでに得られている。
ネットワーク上への流失情報に対する対策技術に関する研究

P2Pシステムで発生する情報流出の対策となる基本技術を検討した。具体的に、代表的なP2Pシステムの一つであるBitTorrentに着目し、流出情報を制御するためのダミーデータ等を効率的に拡散できるデータ配布技術、および、流出情報の拡散速度を低減させる技術を開発した。シミュレーション実験により、提案した拡散速度制御技術を評価した。その結果、従来技術よりも効果的にデータ拡散を制御可能なことが明らかになった。P2Pシステムの急激な普及や悪意をもつプログラムの登場などにより、多くの情報がネットワーク上に同意なく流失する事態が続いている。その結果、個々のコンピュータに情報のコピーが分散するので、いったん流出すると、その回収や無効化は極めて困難である。また、流出情報には、著作権のあるコンテンツ、個人のプライバシー情報、企業の内部情報、公的機関の内部情報など、本来外部に流出すべきでないものが含まれている場合があるため、個人レベルから国家レベルの広い範囲に甚大な影響が出る可能性がある。このようなほぼ回収不可能な情報の無効化を目指した技術として、ダミーファイル等を拡散させるポイゾニング技術が、2005年ごろから注目されている。しかしながら、単純なポイゾニングは、ネットワーク全体に対して、大きな副作用があり脅威になることが指摘されている。本年は、先ず、ネットワーク上への流出情報に対する対策技術の整理を行った。次に、P2Pシステムにおける効率的なデータ転送技術に関する考察を行い、P2Pシステムにおける冗長トラヒックを削減可能な新たなデータ収集技術を提案した。この成果の一部は国際会議(ADSN2008)で発表予定である。P2Pシステムにおけるデータ収集とデータ配布は表裏一体のものであり、効率的なデータ収集はデータ提供元から見た場合、効率的なデータ配布(拡散)と見なすことができる。よって、効率的なデータ収集および配布(拡散)技術は、制御対象のファイル情報に似せたダミーファイル等をP2Pシステムに効率的に拡散する際に重要となる。その結果、個人レベルから国家レベルの広い範囲に甚大な影響が出る可能性がある。このようなほぼ回収不可能な情報の無効化を目指した技術として、ダミーファイル等を拡散させるポイゾニング技術が注目されている。本年は、P2Pシステムにおける効率的なデータ収集技術について研究を進めた。また、得られた成果の一部を国際会議で発表した。効率的なデータ収集および配布(拡散)技術は、制御対象のファイル情報に似せたダミーファイル等をP2Pシステムに効率的に拡散する際に重要となる。また、米国などでソフトウェア配信等に利用されている代表的なP2PシステムであるBitTorrentシステムに注目し、そのシステムにおけるファイル拡散速度の制御について考察した。現在、学会発表の準備中である。本年は、P2Pシステムにおける効率的なデータ収集技術、および、ファイル拡散制御技術について研究を進めた。得られた成果の一部を、学術雑誌、国際会議、学会研究会で発表した。このようなデータ収集および配布(拡散)技術は、制御対象のファイル情報に似せたダミーファイル等をP2Pシステム内に効率的に拡散する際に重要となる。最近、通信回線の効率的な利用を目指すP2Pシステムとして、スーパーシードモードをもつBitTorrentシステムが注目されている。このBitTorrentシステムを抽象化したP2Pシステムを対象として、効率的なデータ収集技術に関しては、ファイル転送手続きを動的に切換える方式であるエンドゲームモードを効果的に用いる技術、および、複数のストリームを利用する技術について考察した。また、ファイル拡散制御技術に関しては、制御ノードを用いることでファイル拡散を妨害する技術を提案した。
細菌染色体の複製開始と制御の分子機構とその進化に関する研究

1.DnaA蛋白とDnaA-boxの普遍性とその進化の解明(吉川担当):(1)大腸菌・枯草菌に加えて、Pseudomonas・MicrococcusにもdnaA遺伝子が保存されており、さらにその近傍には多くのDnaA-boxが存在し、複製開始点として機能していることが示唆された。(2)自律的に増殖する細菌として最小のゲノム構造を持つMycoplasmaについてもdnaA遺伝子のクロ-ニングに成功し、DnaA蛋白とDnaA-boxの真正細菌における普遍性を確かなものにした。(3)下等真核生物である酵母について、相同遺伝子単離の試みを行いその候補となるクロ-ンを得た。DnaA相同蛋白が真核性生物にも存在するか、今後重要な問題である。2.枯草菌DnaA蛋白の機能と発現調節機構の解明(守家担当):(1)枯草菌DnaA蛋白とDnaA-boxが魅製開始とその制御に関与していることを分子遺伝学的に明らかにした。(2)DnaA蛋白を精製し、それがDnaA-boxへ特異的に結合することを証明し、その結合様式を生化学的に解析した。(3)抗DnaA抗体を作成し、DnaA蛋白の細胞内の量を測定する方法を確立し、ある条件下ではそれが複製開始量を決めることを示した。(4)しかし、dnaA遺伝子の発現を人為的に調節できる系を開発し、染色体複製に対する影響を調べたところ、通常はDnaA蛋白量の増加が即複製開始につながらず、他の律速因子の存在が示唆され、その因子の解明が今後重要になった。3.枯草菌複製装置の構造と機能の解明(小笠原担当):(1)枯草菌dnaG、dnaN遺伝子の構造を明らかにし、それがそれぞれ大腸菌dnaN、dnaZX遺伝子と相同であり、DNAポリメラ-ゼのサブユニットをコ-ドしていることを示した。(2)枯草菌の第2の開始遺伝子dnaBの構造を明らかにし、その産物の精製・抗体作製を終了した。現在のところ、精製蛋白はin vitroでDNA結合等の活性を示さず、その機能の解析が今後の課題である。細菌染色体の複製開始と調節の分子機構を解明するため、細菌に普遍的に存在することを私達の従来の研究から提唱した開始たん白(DnaA)とその作用配列dnaA-Boxを中心に以下の研究を行った。1。枯草菌DnaA-dnaA-Boxの機能の解析(守家)。dnaA-Boxを含む種々の断片を開始領域からクローニングし、細胞に導入して複製開始に対する効果を調べた。その結果一定の数と高構造を備えた時、dnaA・Boxが染色体の複製開始を負に制御することを証明した。この現象を利用して、開始調節の分子機構を明らかにすることができる。又dnaA遺伝子を大腸菌中で発現させることに成功し、現在枯草菌中で発現調節可能なプラスミドを調整中である。2。複製開始複合体の解析(小笠原)。枯草菌において遺伝的手法で開始遺伝子であることが同定されているdnaB遺伝子とその近傍の遺伝子群の塩基配列を決定した。2種類のdnaB変異がそれぞれ1個のアミノ酸置換であることを示し、DnaBたん白が単1のシストロンから合成されることを証明した。

全体の配列からはdnaBは4個のシストロンから成るオペロンの最上流のシストロンである。他のシフトロンには細胞膜たん白の性質をもつものもあり、今後開始複合体形成及び膜結合との関連を明らかにする。3。DnaAdnaA-Boxの普遍性と進化(吉川)。サザンブロット法を用いて、Pseudomonas putidaとMicrococcus luteusの染色体に大腸菌のdnaA遺伝子と相同性の高い配列が存在することを確認した。次いでP.putidaよりその断片をクローニング,塩基配列を決定し、大腸菌のdnaAと極めて相同性が高いことを明らかにした。現在その前後の配列のクローニングを行いdnaA-Boxを含む近傍領域の類似性を検討中である。染色体複製の開始反応の調節は,細胞増殖制御の中心であるにもかかわちず,その詳細は不明である.我々は,枯草菌染色体の複製開始領域の構造と機能を解析し,大腸菌で知られていた,複製開始遺伝子dnaAとその産物の作用配列(DnaAーbox)が保存されていることを見出した.本研究は枯草菌染色体複製開始における,両者の役割を明らかにすると共に,dnaA遺伝子とDnaAーboxが原核生物に普遍的に保存されている可能性の検証を目ざした.第1の課題については,枯草菌でDnaAーboxが複製開始の制御に関与していることを明確に示すことに本年度成功した.昨年度までの研究より,枯草菌dnaA遺伝子の前後に存在するDnaAーboxクラスターを含む領域を多コピー数プラスミドに挿入すると,枯草菌への導入が阻害され,それは染色体複製との不和合性が原因であることが示されていた.こうしたプラスミドよりDnaーboxの一部を欠失させると,導入可能となるが,菌の増殖速度を低下させることが見出された.その時,菌中のDNA量は低下しており,複製開始が特異的に抑制されていた.更に,増殖速度が低下した菌より得られた,元の増殖速度への復帰株に含まれるプラスミドでは,挿入されたDnaAーbox中に塩基置換が生じており,プラスミド上のDnaAーboxが染色体菱製開始を抑制することが証明された.第2の課題については,シュードモナス菌より,大腸菌dnaA遺伝子DNAと相同なDNA断辺を単離しその塩基配列を決定することにより,シュードモナスにもdnaA遺伝子はDnaAーboxが保存されていることを明らかにした.興味深いことに,シュードモナスDnaA蛋白のアミノ酸配列は枯草菌より大腸菌に相同性が高く進化系統樹と一致するが, dnaA遺伝子の上流にDnaAーboxクラスターが存在し, DnaAーboxの配置は枯草菌型であった.枯草菌・シュードモナスでの配置が原核生物の原型であり,大腸菌oriC配列はそれより転座したものであろう.1.DnaA蛋白とDnaAーboxの普遍性の検証;本年度は新たにミクロコッカス(Micrococcus luteus)のdnaA遺伝子の単離に成功し、その塩基配列の決定を終了した。その結果、ミクロコッカスマにおいてもdnaA遺伝子の上流及び下流の非翻訳配列中にはDnaAーboxクリスターが存在することが明らかにされた。従って、グラム陽性の大腸菌・シュードモナス、同陰性の枯草菌・ミクロコッカスにおいて、dnaA遺伝子とDnaAーboxの存在が検証されたことになり、両者の相互作用が真性細菌において普遍的に染色体複製開始反応の中心であるという、我々の提唱が基本的に証明されたと考えられる。同時に、dnaA遺伝子に対するDnaAーboxの配置及びその数が、予想以上に細菌毎に異なることも明らかになった。