hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
植物病原細菌の染色体マッピング

Pseudomonas属細菌について遺伝子ライブラリーの作成を目指した結果、当初期待していたP.syringae pv.phaseolicolaとP.s.glycineaのほか、P.s.maculicola、P.s.tabaci、P.s.syringae、P.s.actinidiaeなど多くの種類のPseudomonas属細菌についてライブラリーを得ることができた。hrp遺伝子については各種Pseudomonas属細菌から相同性のあるクローンおよびその近傍に存在するクローンを拾い上げ、両側にウォーキングを行ってさらに連続した区間のクローンを得、順番に並べて整列化するとともに、全体の地図を作成した。その結果、約120kbにおよぶ長大な領域にわたって地図を作成することに成功した。さらに、それぞれのクローンの間の相同領域は従来知られていたhrp領域のさらに左右に10数kbにわたって続いており各病原型間でよく保存されているが、その外側には菌種間に違いのある領域が存在することがわかった。phaseolotoxin生産遺伝子については、P.s.glycineaより左右の境界領域をもつクローンが得られ、約40kbにわたる地図を作成し、P.s.phaseolicolaのそれと比較した結果、やはり両側はつながっているが、その間に存在する領域は約12kbの長さであり、この領域はP.s.phaseolicolaとは相同性がないことを明らかにした。しかし、PCRやパルスフィールド電気泳動を用いたクローンの並べ替えは条件設定が解明できず、成果をうるにいたっていない。よって、この2年間で必ずしも予想どうりではなかったが、このように長大な領域のクローンの整列化と地図の作成、菌種間の違いを大きな領域の並び方のレベルで明らかにするという大きな成果を得ることができた。本年度は本研究計画の初年度にあたる。まず、数種Pseudomonas属細菌について遺伝子ライブラリーの作成を目指した。その結果、当初期待していたP.syringaepv.pyaseolicolaとP.S.glycineaのほか、P.S.maculicola、P.S.lachry-manns、P.S.tabaci、P.S.phaseolicolaのnoクズ系統など多くの種類のPseudomonas属細菌についてライブラリーを得ることができた。現在さらに多くの菌種についてライブラリーの作成をすすめているとともに、ライブラリー中のクローンが一様に分布しているか、また組み替えなどが起きていないかについて検討中である。パルスフィールド電気泳動については現在着手したところであり、泳動条件を決定するために予備実験を行っているところである。さらに各種遺伝子の収集も進んでおり、hrp遺伝子およびphaseolotoxin産生遺伝子については各種Pseudomonas属細菌から相同性のあるクローンおよびその近傍に存在するクローンを拾い上げることができた。これらのクローンをもとに、限られた領域ではあるが、整列化したクローンのつながりを菌種間で比較することができた。これにより、例えばP.s.phaseolicolaとP.s.glycineaでは、prp領域の周辺でかなり長い区間にわたり相同性が保持されている他、phaseolotoxin遺伝子の両端でも相同区間があるが、それらに挟まれた部分では特異的な領域が介在していることを明らかにした。本年度は本研究計画の2年目にあたる。まず、前年度に引き続いてPseudomonas syringae群細菌の遺伝子ライブラリーの製作を継続して行った。その結果、P. s. syringae、P. s. actinidiaeについてもライブラリーを作成することに成功した。これらのライブラリーより、hrp相同領域を含むクローンを前年度拾い上げたが、その両側にウォーキングを行ってさらに連続した区間のクローンを得、順番に並べて整列化するとともに、全体の地図を作成した。

phaseolotoxin生産遺伝子については、P. s. glycineaより左右の境界領域をもつクローンが得られ、約40kbにわたる地図を作成し、pv. phaseolicolaのそれと比較した結果、やはり両側はつながっているが、その間に存在する領域は約12kbの長さであり、この領域はpv. phaseolicolaとは相同性がないことを明らかにした。しかし、PCRやパルスフィールド電気永動を用いたクローンの並べ替えは条件設定が解明できず、成果をうるにいたっていない。よって、この2年間で必ずしも予想どうりではなかったが、このように長大な領域のクローンの整列化とマッピングを行い、菌種間の違いを大きな領域の並び方のレベルで明らかにするという大きな成果を得ることができた。
eラーニングによる教員研修を融合した理解深化を図る気象デジタル教材の開発

本研究では,eラーニングによる教員研修システムを融合した,気象に対する児童生徒の科学的な思考力を育成し,理解の深化を図るデジタル教材を開発することを目的とした。前線の通過に伴う天気の変化などの学習に適した気象事例の調査,雨音や気候,地球温暖化に関する気象デジタル教材の開発,雲の形と動きの観測とそれらの出現特性の解析,雲の観察に関する小学校教員向けeラーニング教材の開発,小学校教員対象の公開講座を行った。本研究の目的は,eラーニングによる教員研修システムを融合した,気象に対する児童生徒の科学的な思考力を育成し,理解の深化を図るデジタル教材を開発することである。具体的な研究項目は,(1)学習に適した気象事例の調査,(2)気象デジタル教材の開発,(3)eラーニングによる教員研修システムの構築,である。平成27年度は,研究項目(1)に関連して,小学校第5学年「天気の変化」における気象衛星の雲画像を利用した台風の進路の調べ学習に適した事例の調査を行った。2005年から2015年までに発生した255個の台風のうち,日本本土に接近または上陸し,さらに各日9時の気象衛星の雲画像で48時間以上眼が持続した台風は8個で,調べ学習に適した事例が非常に少ないことがわかった。続いて,同単元における雲の観察について調査を行った。2015年10月から11月にかけて,大阪教育大学柏原キャンパスにおいて雲の形と動きを微速度撮影により観測した。天気毎に雲の形の出現頻度を調べると,晴れの日には巻雲と積雲が多く,くもりの日には層積雲と高層雲が多く現れた。雲の動きでは,上層雲の巻雲は概ね西から東へ移動していたが,下層雲の積雲や層積雲は様々な方向に移動していた。雲の形と動きの特徴を教員が予め知ることによって,より適切な雲の観察ができると期待される。研究項目(2)に関連しては,デジタル立体地球儀「ダジック・アース」の小学校向けコンテンツの制作を行った。コンテンツの内容は世界の気候とし,1月と7月の月平均気温と月降水量の分布図を制作した。気候の変化をとらえやすくするために,表示する地点数を13地点に絞り,またイラストを用いてわかりやすく表現した。その結果,地球が丸いことや大陸と海洋の分布に対する興味・関心の喚起や日本の気候に対する理解確認や理解深化に活用できるコンテンツを制作することができた。平成27年度の研究内容の(1)小学校理科の気象分野における既存のデジタル教材の特長と課題の比較検証,(2)学習内容に関連する気象事例の調査,および学習に適した事例の収集,(3)対面型教員研修の実施,については概ね順調に進展している。(1)では,台風の進路,雲の観察,および天気の変化の規則性についてデジタル教材の特長と課題の比較検証を行った。(2)では,台風の進路,雲の観察,および前線の通過と天気の変化について事例の調査を行った。(3)では,対面型教員研修を4回実施し,デジタル教材について教員から意見を収集した。具体的な研究項目は,1学習に適した気象事例の調査,2気象デジタル教材の開発,3eラーニングによる教員研修システムの構築,である。平成28年度は,研究項目1について以下の成果を得た。小学校第5学年「天気の変化」の単元における雲の観察に関する学習に関連して, 2016年4月と5月の2ヶ月間,大阪教育大学柏原キャンパスにおいて雲の形と動きを微速度撮影により観測した。天気毎に雲の形と動きの観測頻度を調べたところ,晴れのときには巻雲と積雲が多く,くもりのときには積雲と高層雲が多く現れた。また,雨のときには乱層雲,層雲,積雲が多く現れた。雲の進行してくる方向(雲の向き)は,上層雲と中層雲は概ね西であったが,下層雲はばらつきが大きく,顕著な方位はなかった。また,中学校第2学年「天気の変化」の単元における「前線の通過と天気の変化」に関連して,2016年2月から5月までに近畿地方を通過した寒冷前線の事例を解析した。その結果,教科書にモデルとして示されている急激な気温の低下と強い雨を伴う事例の観測頻度が少ないことがわかった。研究項目2については,デジタル立体地球儀「ダジック・アース」の小学校向けコンテンツの制作を行った。コンテンツの内容は地球温暖化とし,海面水温の変化と海面水位の変化について,イラストを用いて視覚的に捉えやすいコンテンツを制作することができた。研究項目2と3については,雨について学べるWebページを制作し,公開した(http://www.osaka-kyoiku.ac.jp/yoshimo/rain.html)。音声ファイルを再生すれば,雨滴の大きさによって雨音の大きさが異なることを捉えられる。研究項目の1学習に適した気象事例の調査,2気象デジタル教材の開発,3eラーニングによる教員研修システムの構築,について進捗状況を評価する。1については,雲の観察,天気の変化の規則性,台風,寒冷前線について事例調査を行っており,概ね順調に進展している。2については,世界の気候と地球温暖化に関する小学校向け「ダジック・アース」コンテンツ,及び雨についてのWebページを制作し,概ね順調に進展している。3については,平成27年度に引き続いて平成28年度も対面型教員研修を4回実施し,デジタル教材について教員から意見を収集した。

したがって,概ね順調に進展している。本研究の目的は,eラーニングによる教員研修システムを融合した,気象に対する児童生徒の科学的な思考力を育成し,理解の深化を図るデジタル教材を開発することである。具体的な研究項目は,1学習に適した気象事例の調査,2気象デジタル教材の開発,3eラーニングによる教員研修システムの構築,である。平成29年度は,研究項目1について以下の成果を得た。小学校第5学年「天気の変化」の単元における雲の観察に関する学習に関連して,2010年ー2016年の7年間について,東京,大阪,福岡における天気ごとの雲形の出現頻度とその季節変化を調べた。何れの地点においても,積雲と高積雲の出現率が天気によらず高く,また巻雲の出現率が雨以外の天気で高かった。これらの主要な結果は,季節によって変化しないものの,快晴や晴れでは,高積雲の出現率が4月よりも10月の方が高く,薄曇りでは,巻層雲の出現率が10月よりも4月の方が高いことが明らかになった。研究項目2と3については,平成27年度の研究成果である大阪教育大学における雲の観測結果に基づき,小学校教員向けの雲の観察に関するeラーニング教材の開発を行った。教材の開発に当たっては,インストラクショナルデザインのADDIEモデルを用いた。晴れとくもりについて,出現頻度の高い雲形の組み合わせを示し,教材で学習した内容を授業実践に生かしやすいように配慮した。また,平成27年度,平成28年度に制作したデジタル立体地球儀「ダジック・アース」の小学校向けコンテンツを,小学校教員を対象とした研修に活用した。本研究では,eラーニングによる教員研修システムを融合した,気象に対する児童生徒の科学的な思考力を育成し,理解の深化を図るデジタル教材を開発することを目的とした。前線の通過に伴う天気の変化などの学習に適した気象事例の調査,雨音や気候,地球温暖化に関する気象デジタル教材の開発,雲の形と動きの観測とそれらの出現特性の解析,雲の観察に関する小学校教員向けeラーニング教材の開発,小学校教員対象の公開講座を行った。平成28年度の研究計画は(1)中学校理科の気象分野における既存のデジタル教材の特長と課題の比較検証,(2)多様な事例を扱った気象デジタル教材の制作,(3)対面型教員研修の実施,である。(1)では,Web上で公開されている中学校理科の気象デジタル教材,および平成28年度に改訂された中学校理科のデジタル教科書の気象コンテンツについて,その構成を調査し,教員と生徒の双方の観点からデジタル教材の授業への活用についてその特長と課題を比較検証する。(2)では,平成27年度に調査・収集した学習に適した気象事例について画像と映像のコンテンツを制作する。(3)では,対面型教員研修を4回実施し,学習に適した気象事例について教員から意見収集を行う。平成29年度の研究計画は,(1)多様な事例を扱った気象デジタル教材の制作,(2)対面型教員研修の実施,(3)eラーニングによる教員研修システムの構築,である。(1)では,平成27年度及び平成28年度に調査・収集した学習に適した気象事例について,画像と映像のコンテンツを制作する。(2)では,対面型教員研修を3回実施し,学習に適した気象事例について教員から意見収集を行う。
過去500万年間の北西太平洋の気候変化

四国沖のDSDPsite 296(29゚20.4'N,133゚31.5'E.,2,920m)で掘削された海底コア(長さ:180m)は、比較的その回収率が良く、石灰質の半遠洋性堆積物で生層序学的年代も比較的詳しく明らかにされている。本研究では、このコアについて、有孔虫殻の酸素同位体比層序の確立とミランコビッチ年代への変換、浮遊性有孔虫群集の変換関数による古水温・古塩分の算出、さらには底生・浮遊性有孔虫殻の炭素同位体比による海洋生物生産性の変遷を、約1万年間隔という分解能で解析し、北西太平洋における過去500万年間の気候変化に伴う海洋環境変遷を復元することを目的としている。申請者は、これまでに約50層(約10万年間隔)について古水温を算出しているので、平成10年度は、その間隔を細かくするように240サンプルについて次の解析を行っている。1.浮遊性有孔虫(Globigerinoides ruber)の殻の酸素・炭素同位体比を同位体比質量分析計(Finnigan MAT 251)で測定した。その結果、酸素・炭素同位体比共にこれまで以上に大きな変動が見られ、過去の気候変化に対応した変化が明らかになるつつある。浮遊性有孔虫の化石種については、その酸素・炭素同位体比を現生種と比較して生息環境の推定も行っている。2.浮遊性有孔虫の群集解析と変換関数による古水温・古塩分を算出するために、1サンプルにつき無作為に200個体の浮遊性有孔虫群集の拾い出しを行っている。3.底生有孔虫と浮遊性有孔虫の炭素同位体比の差および底生有孔虫でも海底表面に生息している種(Epifauna)と泥の中に生息している種(Infauna)の炭素同位体比の差から、過去の海洋表層の生物生産性の強弱を推定するために、これらの有孔虫の拾い出しを行っている。
歯髄炎におけるパルブアルブミン及びカルシトニン遺伝子関連ペプチドの役割

正常ラットの臼歯では、parvalbuminを含む線維が、根部歯髄や冠部歯髄に観察された。parvalbumin陽性線維は、太くて平滑な形態を呈しており、象牙芽細胞層の直下にまで認められ,時には象牙芽細胞層に侵入していたが,象牙前質や象牙質には全く観察されなかった。免疫電顕により、根部歯髄におけるparvalbumin陽性線維は,太い有髄線維であことが明らかとなった。さらに象牙芽細胞層では,parvalbumin陽性神経線維が、象牙芽細胞の細胞体や、突起に隣接していた。これらの神経線維と象牙芽細胞との間に特殊な接着様式は観察されなかった.露髄後,1ー3日後の歯髄では,parvalbuminを含む神経線維がほとんど認められなかった.しかし,露髄5ー7日後においては,parvalbumin線維は著明に増加し,炎症組織直下で神経網を形成していた.これらのparvalbumin線維の多くはvaricose状を呈していた.露髄後14日では,炎症が歯髄全体に波及していた.この時期,parvalbumin線維は露髄後5ー7日と比較して漸次減少し,根部歯髄にのみ観察されるようになった.露髄後30ー60日では,根管内及び根尖周囲に膿瘍が形成されていた.parvalbumin線維はこれらの組織内或いは周囲に認められなかった.二重染色の結果,露髄後の歯髄においても正常歯髄と同様,CGRPとparvalbuminが共存しないことが明らかとなった.また,露髄後5ー7日におけるCGRP線維の動態はparvalbumin線維のそれと非常によく似ており,炎症組織直下で神経網を形成していた.しかし,露髄後30-60日における膿瘍の周囲にはCGRP線維が密に観察された.以上の結果から,CGRPと同様に,parvabuminは歯髄炎において重要な役割を演じている事が示唆された。歯髄炎におけるカルシウム結合蛋白の役割を調べた。parvalbumin(PV)・calbindin D-28k(CB)・calretinin(CR)・S100を含む神経線維は、正常ラット臼歯歯髄に豊富に観察された。根部歯髄においては、PVとCBを含む線維は平滑で太く、CRとS100を含む線維は平滑なものと念珠状のものとが観察された。根部歯髄における神経線維の分布密度はS100>PV=CB>CRであった。これらの線維は根部歯髄内を上行し、髄室へと進入していた。PV,CR,S100を含む線維は、天蓋付近や髄角部における象牙芽細胞層直下で枝分かれし、それらの一部は象牙芽細胞層にも侵入していた。これらの象牙芽細胞層における神経線維はほとんど全て念珠状であった。象牙芽細胞層における神経線維の分布密度は、S100>PV>CRであった。CB線維は象牙芽細胞層には、全く認められなかった。象牙前質・象牙質ではS100線維が観察されたが、他のカルシウム結合蛋白を含む神経線維は全く認められなかった。歯髄内におけるS100線維の微細構造を免疫電顕により調べると、根部歯髄におけるS100の免疫活性は全ての有髄線維と太い無髄線維に存在することが明かとなった。細い無髄線維はS100の免疫反応が陰性であった。象牙芽細胞層

直下では、ほとんどのS100陽性線維は無髄であった。象牙芽細胞層における軸索終末は象牙芽細胞の細胞体や突起と接していた。また、象牙前質や象牙質でもS100陽性軸索終末が象牙芽細胞の突起と接しているのが観察された。露髄5日後の炎症根部歯髄では、これらのカルシウム結合蛋白を含む線維の数は正常根部歯髄と比べ増加していた。これらの神経線維の継時的な変化については、現在研究中である。歯髄炎におけるカルシウム結合蛋白とカルシトニン遺伝子関連ペプチド(CGRP)の役割を調べるために、Parvalbumin(PV)・Calbindin D-28k(CB)・Calretinin(CR)・S100とCGRPの共存を、ラットの臼歯歯髄や歯髄を支配する三叉神経節細胞で調べた。根部歯髄においては、平滑で太い神経線維にこれらの物質が認められた。一方、念珠状の神経線維はCR-S100-CGRPのみを含んでいた。これらの線維は根部歯髄内を上行し、髄室へと進入していた。PV・CR・S100・CGRPを含む線維は、天蓋付近や髄角部における象牙芽細胞下層付近で枝分かれし、象牙芽細胞層において、ほとんど全て念珠状となり、それらの一部は象牙芽細胞層にも侵入していた。二重染色法により、一部の神経線維では、カルシウム結合蛋白とCGRPが共存することが明かとなった。歯髄における神経線維のうち、PV・CB・CRとCGRPが共存するものは非常にまれであったが、CGRPとS100が共存しているものは多数認められた。歯髄を支配する三叉神経節細胞の約20%では、S100とCGRPが共存していた。露髄3・5・7日後の炎症歯髄では、炎症は歯髄内で継時的に拡大し、その最も表層においては組織の壊死像が観察された。この壊死組織の下層では、カルシウム結合蛋白やCGRPを含む線維が豊富に観察され、正常歯髄と比べ増加していた。炎症歯髄におけるこれらの神経線維は、さまざまな大きさのvaricosityを不規則な間隔で有しており、時に神経網を形成していた。これらの神経線維においては、S100・CRとCGRPとの共存がしばしば観察された。炎症歯髄におけるカルシウム結合蛋白とCGRPを含む神経線維の微細構造については、現在研究中である。正常ラットの臼歯では、parvalbuminを含む線維が、根部歯髄や冠部歯髄に観察された。parvalbumin陽性線維は、太くて平滑な形態を呈しており、象牙芽細胞層の直下にまで認められ,時には象牙芽細胞層に侵入していたが,象牙前質や象牙質には全く観察されなかった。免疫電顕により、根部歯髄におけるparvalbumin陽性線維は,太い有髄線維であことが明らかとなった。さらに象牙芽細胞層では,parvalbumin陽性神経線維が、象牙芽細胞の細胞体や、突起に隣接していた。これらの神経線維と象牙芽細胞との間に特殊な接着様式は観察されなかった.露髄後,1-3日後の歯髄では,parvalbuminを含む神経線維がほとんど認められなかった.しかし,露髄5-7日後においては,parvalbumin線維は著明に増加し,炎症組織直下で神経網を形成していた.これらのparvalbumin線維の多くはvaricose状を呈していた.露髄後14日では,炎症が歯髄全体に波及していた.この時期,parvalbumin線維は露髄後5-7日と比較して漸次減少し,根部歯髄にのみ観察されるようになった.露髄後30-60日では,根管内及び根尖周囲に膿瘍が形成されていた.parvalbumin線維はこれらの組織内或いは周囲に認められなかった.
地形・植生数値情報による多摩丘陵の環境・景観復元

本研究の目的は、住宅地開発による環境への影響の大きさや特性を景観的側面および生態的側面から把握することである。景観的側面については「地形景観」と「視認領域」という観点から検討を行った。前者は地形の単位スケ-ルの変化および地形の複雑さの変化について、後者は可視領域のパタ-ンの変化について考察を行った。また生態的側面については生態ポテンシャルという観点から、その指標として「樹木活力度」を設定し、その変化についての検討を行った。以下がその結果である。住宅地開発が地形の単位スケ-ルに与える影響を捉えるために「高度成長曲線」を用い、その増分が抵減し始める点の明瞭さ、つまり地形単位スケ-ル認識の明快さがどの程度損なわれるかについて検討を行った。その結果、開発規模が大きくなるにつれてスケ-ルの読み取りが困難になる傾向が確認された。また「標高値の共起行列の対角線に対する慣性モ-メント」を用い、地形の形状、特に、丘陵地形を対象としたことから、起状の複雑さに与える影響についても検討した。ここでも開発規模が大きくなるほど地形の複雑さが損われる傾向があった。視認領域に与える影響についてはセンタ-地区造成・大規模住宅地区造成ともに視認領域が増加し、視覚的な一体化が進む。しかし住宅地の場合周囲の自然環境の保全等に関する配慮も図られており、視認パタ-ンはセンタ-地区ほどは変化しない。中規模住宅地区造成では、視認領域の増加も視認パタ-ンの変化も少なくなっている。生態的側面に関する樹木活力度区分の変化については、景観的側面ほど明快な変化は確認されなかったが、開発規模が大きくなるにつれて活力度の大きく低下する頻度が増加する傾向が見られた。
ナノ・ミクロ構造を応用した新規骨補填材の開発

骨補填材は歯周組織再生治療やインプラント治療において欠かせない材料である。骨補填剤の主な目的はスペースメイキングであり、再生を促す重要な要素である。これまでにも様々な骨補填材が歯周組織再生治療・インプラント治療に利用されているが、いまだに最適な骨補填材の発見には至っていない。その主な理由として、長期経過にて骨補填剤が残存していること、残存した骨補填剤による影響が不確かなことがあげられる。そこで、近年では骨への完全な置換を期待し、細胞・細胞増殖因子等を骨補填材と併用することが多くなっている。つまり、再生に関わる因子を活かすための骨補填材、という新しい視点からのアプローチが必要である。本研究課題では従来の顆粒状の骨補填材とは異なる形状を駆使し、理想的な時期に骨への置換を誘導し、その作用機序を解明することを目的として実験を行った。ウシ脱灰皮質骨は歯科領域において広く使用されている。しかし上記のように、長期経過にて残存することが報告されている。そこで従来のウシ脱灰皮質骨とは異なる構造を持つウシ脱灰皮質骨を使用し、インプラント治療に対する骨再生への影響を調べた。また歯周組織再生治療において有効であるエナメルマトリックスデリバティブを液状にした成長因子を併用した際の付加的影響についても調べた。結果としてエナメルマトリックスデリバティブリキッドはインプラント周囲の骨再生における効果を促進させる可能性があることが分かった。さらに、トンネル状骨補填剤の長期経過における組織学的評価ならびに他構造との比較に対する評価を行っている。今後、これまでの実験結果から細胞・細胞増殖因子や薬物徐放に効果的な骨補填材の配列・構造の探索に取り組む。本研究では、適切な期間で骨へ完全に置換されるための骨補填材と細胞増殖因子や抗菌薬などの薬物との併用ならびに骨補填材の3次元的構造の違いによる骨再生への有効性を明らかにすることを目的に実験を行っている。これまで従来のウシ脱灰皮質骨とは異なる構造を持つウシ脱灰皮質骨およびエナメルマトリックスデリバティブリキッド併用によるインプラント周囲の骨再生への効果について調べた。さらに、トンネル状骨補填剤の長期経過における組織学的評価ならびに他構造との比較に対する評価を行っているが、これまでの結果から適切な期間での完全な骨への置換は認められなかった。今後、骨類似または薬物徐放に有効なナノ構造を有する骨補填剤の開発を行っていく予定であるが、適切な構造が未だに不明であるため、さらなる実験が必要であると考えている。骨類似のナノ構造を基盤としたβ-TCP顆粒を凝集させ、3次元的に異なる多孔性管腔構造を有する骨補填材の開発を試みる。これまでの研究で、同一材料でも幾何学的構造を変化させることによって組織分化・成長・吸着に影響を与えることが報告されているため、従来の骨補填剤をもとに、3次元的に異なる構造にした際の有効性について細胞実験モデル・動物実験モデルで明らかにし,得られた結果を取りまとめ,成果の発表を行う.骨補填材は歯周組織再生治療やインプラント治療において欠かせない材料である。

今後、骨類似または薬物徐放に有効なナノ構造を有する骨補填剤の開発を行っていく予定であるが、適切な構造が未だに不明であるため、さらなる実験が必要であると考えている。骨類似のナノ構造を基盤としたβ-TCP顆粒を凝集させ、3次元的に異なる多孔性管腔構造を有する骨補填材の開発を試みる。これまでの研究で、同一材料でも幾何学的構造を変化させることによって組織分化・成長・吸着に影響を与えることが報告されているため、従来の骨補填剤をもとに、3次元的に異なる構造にした際の有効性について細胞実験モデル・動物実験モデルで明らかにし,得られた結果を取りまとめ,成果の発表を行う.研究実施が遅延したため、次年度に合わせて骨補填剤の開発をおこなう
腫瘍脊椎骨全摘術後の骨欠損に対する自己脂肪由来幹細胞を用いた骨再生

脊椎腫瘍切除後の動物モデルで、脂肪由来幹細胞を脊椎骨欠損部での再建材料として用い、移植骨の骨形成への関わりを評価した。その結果、移植骨内に占める線維性結合組織面積、新生骨に占める層板骨の割合、骨形成速度の比較検討で、いずれも脂肪由来幹細胞群は対照群と比較して高値となった。移植骨の骨形成は線維性結合組織の増生に始まり、リモデリングを経て骨癒合に至るとされる。脂肪由来幹細胞群では対照群より早期の段階で層板骨が形成され、骨形成を促進させることができると考えられた。前年度に引き続き、脊椎骨切除後の動物モデルに対して自己脂肪由来幹細胞を用いた脊柱再建を行い、骨癒合に関する有効性を検証する実験を行った。成犬に対し、全身麻酔下で脊髄神経を温存しつつ第13胸椎の切除を行い、欠損部をチタンケージにて再建できる全摘術モデルを作成した。椎体の再建時には第11、12胸椎および第1、2腰椎の椎体にスクリューを挿入し、チタンケージを上下椎体で挟んで圧迫固定を行った。6週以上の観察した場合、椎体骨折を生じやすいことがわかった。そこで骨折の原因と考えられる圧迫力の左右不均衡を対側に金属プレートとスクリューを用いることで、術後6週以上経過したモデルの作成が可能となった。この脊椎全摘術を施行した動物モデルを、椎体再建のチタンケージ内に自家骨とフィブリン糊を充填したコントロール群と、抽出した幹細胞を含む組織を自家骨に染み込ませた脂肪幹細胞群に分け、それぞれ術後2週、4週で摘出した検体をVillanueva bone染色し、チタンケージごと正中矢状面の研磨切片を作製した。完成した標本に対し、蛍光偏光顕微鏡下に骨形態計測を行った。その結果、骨形成が盛んに行われている上下椎体に接した領域において、類骨面に並ぶ骨芽細胞数が各週脂肪幹細胞群で多く、2週モデルより4週モデルで多い傾向を示した。また、新生骨量に占める層板骨の割合では、2週の時点でコントロール群ではほとんど0であったのに対し、脂肪幹細胞群では21.6%の層板骨が形成されていた。これらの結果から、脂肪幹細胞を含ませることで成熟した骨構造である層板骨を早期から形成するようになる、すなわち骨形成を促進すると考えられた。今回脊椎骨切除後の動物モデルに対し、自己脂肪由来幹細胞を用いた脊柱再建を行い、骨癒合に関する有効性を検証する実験を行った。まず成犬を用い、全身麻酔下での背側正中切開後、チタンロッド及びスクリューによる脊椎固定を行った。その後、脊髄神経を温存しつつ第13胸椎の切除を行い、欠損部をチタンケージにて再建できる全摘術モデルを作成が可能であった。次に背部の脂肪組織を4g採取し、組織破砕、コラゲナーゼ処置、フィルター、遠心分離を行うことで、幹細胞を含む間質細胞を得ることができた。これを切除した椎体の骨片に染み込ませ、フィブリン糊と混合しチタンケージに充填した。このチタンケージ骨欠損部に移植した。術後2週および4週に検体を摘出、Villanueva bone染色し、チタンケージごと正中矢状面の研磨切片を作製した。術後2週モデルでは上下椎体に隣接した領域に、4週モデルではさらにケージ中央脊髄側に線維性組織の増生を認めた。線維性組織周辺では新生骨の形成、移植骨の吸収、血管の増生など、骨形成に関連する反応性変化を認めた。反応領域面積/ケージ内組織量の平均:脂肪幹細胞群2週27.5%、脂肪幹細胞群4週57.1%、コントロール群2週20.1%、コントロール群4週43.9%と各群4週で増加し、脂肪幹細胞群で反応領域が広い傾向を示した。各群反応領域内の骨形成量や骨吸収量に優位差は認められなかった。椎体隣接領域では新生骨/移植骨比:脂肪幹細胞群4週2.11、C群4週1.12と差を認め、組織像で脂肪幹細胞群4週の新生骨にlamellar構造を多く含む傾向があった。脊椎全摘術後の巨大欠損部への自己脂肪由来幹細胞投与により、血管を含む線維性組織が増加し、骨形成優位なリモデリングが誘導される可能性が考えられた。【目的】腫瘍脊椎骨全摘術の動物モデルにおいて、脊椎骨欠損部に自己脂肪由来幹細胞(adipose-derived regenerative cells: ADRCs)を用いた脊柱再建を行い、早期の骨形成が得られるか検討を行った。【方法】成犬の腫瘍脊椎骨全摘モデル12例をADRCs群と対照群に分けた。対照群は移植骨とフィブリン糊を、ADRCs群は移植骨と背部脂肪組織から抽出したADRCsをフィブリン糊と混合したものを用いた。移植後に骨標識剤を皮下投与し,各群術後2週と4週にそれぞれ3例ずつ移植骨部を摘出した。

標本をVillanueva bone染色し、正中矢状断の非脱灰研磨切片を作製した。また光学偏光顕微鏡下に骨形態計測を行い比較検討した。【結果】対照群、ADRCs群ともに上下隣接椎体周囲では骨形成、骨吸収に先行して血管を多く含む線維性組織の増生を認めた。移植部位内に占める線維性組織面積は、2週対照群22.8%/ADRCs群38.0%、4週対照群43.9%/ADRCs群62.9%で、同領域の血管数もADRCs群で多い傾向があった。新生骨に占める層板骨の割合は2週対照群0.6%/ADRCs群21.6%、4週対照群37.9%/ADRCs群40.1%であり、骨形成速度(μm/year)は2週対照群0/ADRCs群143、4週対照群311/ADRCs群958といずれもADRCs群で高値を示し、早期の骨形成が促進されていることが示された。【結論】脂肪幹細胞は線維性組織を誘導し、より多くの層板骨を形成、骨形成を促進し、早期の移植骨の骨癒合を促進することが期待できる。医歯薬学成犬を用いた脊椎全摘モデルを改良し、必要に応じて長期観察を可能としたため。また、術後2週、4週でのチタンケージ内部の移植骨の骨形態計測を行い、脂肪幹細胞による骨形成促進効果が確認されたため。成犬を用いた脊椎全摘モデルの作成、及び脂肪由来幹細胞の抽出、移植が実験的に可能であったため。また、術後4週でのチタンケージ内部の移植骨の組織評価を行い、移植骨周囲からの骨形成が確認されたため。2425年度の実験において、術後4週までの脊椎全摘モデルの評価は可能であり、脂肪幹細胞移植の骨形成に関する良好な結果が出ている。一方、手技の改良により、術後6週以降の長期モデルにおいて生じていた椎体骨折を抑制できるようになり、今後の必要性応じて長期モデルでの検討が可能となった。脂肪幹細胞の短期的な骨形成促進効果が長期的に最終的な骨癒合に対して影響するのか否かについて更なる検討が必要である。24年度の実験において、術後4週での脊椎全摘モデルの評価は可能であり、脂肪幹細胞移植の骨形成に関する良好な結果が出ている。一方、術後8週以降の長期モデルにおいて、移植骨内の感染併発による骨癒合評価不能例も散見され、より注意深い無菌操作の徹底が必要と思われる。平成25年度は効率的な予算執行により端数が生じ、13411円が未使用額となった。実験動物の購入、動物実験用の麻酔薬、病理切片作成、免疫組織化学染色、細胞の培養、分化誘導に必要な培養液やプラスチック製材の購入。また論文の校正及び投稿費、日本整形外科学術集会の学会参加費に使用予定である。平成24年度は効率的な予算執行により端数が生じ、5620円が未使用額となった。25年度は脊椎全摘モデルの作成、脂肪幹細胞の採取、移植に必要な実験動物の購入。動物実験用の麻酔薬(プロポフォール、ミタゾラム、ドルミカム等)、維持輸液生剤などの試薬や分子生物測定試薬、病理切片作成、免疫組織化学染色、H-E染色、細胞の培養、分化誘導に必要な培養液やプラスチック製材の購入。また日本整形外科基礎学術集会、アメリカ整形外科学会の学会参加費、論文の校正及び投稿費に使用予定である。
温暖化が樹木の木部構造に与える影響とその地理変異

富良野、苫小牧、愛媛のミズナラについて幹木部構造の35年間の変化を調べた。その結果、孔圏道管の数を介して早材幅が変化すること、また、年輪幅・晩材幅・早材幅ともに長期的な変化が起きていることが明らかとなった。さらに、これらの変化は分布域によって異なることがわかり、分布の北方では春先の温暖化が早材幅の成長を促進する一方で、分布の南方では温暖化に伴う乾燥化によって光合成生産や成長が低下することが示唆された。落葉広葉樹林における優占樹種の一つであるミズナラは、孔圏道管とよばれる大径の道管を持ち、一年輪内における早材(孔圏)と晩材(孔圏外)との区別がつけやすい。この孔圏道管の大きさや頻度などについてばらつきを調べることで、木部形成における長期的・短期的変化について知る事ができ、樹木の炭素獲得や炭素利用の変化とそのメカニズムを明らかにする事ができる。北海道の苫小牧演習林で採取したミズナラ成木の木部を用いて年輪幅と孔圏道管の長期変化を調べた結果、孔圏道管が存在する早材の幅が1970年から2004年までの30年間に増加している事が明らかとなった。また、愛媛大学演習林内のミズナラ成木を用いて孔圏道管形成の生理的メカニズムとしての個葉光合成と幹の木部形成の季節変化を2014年の春から夏にかけて調べた結果、これらのミズナラでは木部の早材を形成し終わった後に葉の光合成能力が最大化することが示された。この結果は木部の安定同位体比の季節変化の結果とも合致しており、早材形成は葉での光合成産物ではなく貯蔵養分に依存することがどちらからも示唆された。これら全ての結果をあわせると、ミズナラは前年の光合成産物である貯蔵養分を主な炭素資源として大径の孔圏道管(早材)形成を行い、光合成が最大化する夏前には早材形成を終了する。よって、前年の光合成期間である前年夏の気象条件および当年の早材形成期間である当年春の気象条件によって早材形成が影響を受けると考えられ、これらの気象条件が長期的に変化することで木部形成が長期的に変化している可能性がある。木部構造の長期的な変化およびその地理変異を明らかにするため、東京大学北海道演習林(富良野)および愛媛大学農学部附属演習林(愛媛)のミズナラを用いて測定と解析を行った。これらの地域はミズナラの分布の北方と南方にあたり、遺伝的にも異なることがわかっている。各地域において成熟したミズナラの幹の胸高部位から木部試料を採取し、薄片にしたのちに軟X線写真撮影を行うか、もしくはミクロトームにより切片を作成した後に光学顕微鏡を用いて写真を撮影した。得られた画像を画像解析ソフトを用いて解析し、年輪内の早材(孔圏)幅、晩材(孔圏外)幅、孔圏道管の大きさと数について1970年以降の35年間における長期的な傾向を調べた。その結果、愛媛のミズナラでは晩材幅に減少傾向がみられ、年輪幅と早材幅についても90年代から減少傾向にあることがわかった。一方、富良野のミズナラは、早材が35年間で増加傾向にあった。どちらの地域についても早材の変化は孔圏道管の大きさではなく数によって決まっていることが示唆された。今回得られた富良野のミズナラの傾向は、北海道苫小牧のミズナラで明らかにされた結果(Nabeshima et al. 2015)と同じであり、分布の北方では春先の温度上昇によって早材幅が増大していることが支持された。富良野では春先の気温上昇に加え、夏場の降水量も増加傾向にあり、気候変動の負の影響がなかったものと思われる。一方で、分布の南方にある愛媛では、気温の上昇だけでなく夏場の降水量と湿度の減少があり、このような夏場の乾燥により、光合成や晩材の成長が抑制された可能性がある。今回の結果から、ミズナラの年輪幅・晩材幅・早材幅は長期的に変化していること、この変化は分布域によって異なり、南方で負の影響となって表れる可能性が示唆された。平成26年度中に予定していた個葉光合成測定および木部構造の顕微鏡観察は終える事ができ、木部構造の長期変化に関する結果が論文として受理された。一方、予定していた木部の材密度の測定および青森でのサンプリングは、測定を行う機関やサンプリング場所が遠方のため日程調整がうまくいかず、終える事ができなかった。樹木生理生態地理変異としてはこれまでにサンプリングを終えている北海道二地域と愛媛の比較から明らかにする。北海道と愛媛とでは遺伝的に異なる事がすでにわかっており、地理変異を明らかにする上で問題ないと考える。今後はすでに採取した試料の分析と測定を中心に行い、木部の安定同位体比や材密度について長期的・短期的変化と場所間での違いを明らかにする。これまでの結果については論文作成作業を同時に進めていき、測定が終わり次第、得られた結果を学会や論文として発表する。
3次元心臓超音波機器を用いた健常人の運動中における心臓機能の検討

長時間運動をし続けることによる心機能の変化を、3次元心臓超音波機器を用いて明らかにする。
心の自立性の発生

基盤研究(S)「心の自立性の獲得ー環境から解放された心の進化と発達」(16H06301)が採択されたので、本課題は5月30日付けで辞退することとなった。以下には事業開始より2ヶ月間の成果を記す。藤田は、フサオマキザルを対象に、将来の必要性を予期した準備的行動の分析を開始した。遅延時間明示型の遅延見本合わせ課題において、比較刺激選択直前に見本刺激が再掲される「review」キーを遅延時間の初期にだけ準備的に選択しておくことができるように設定し、遅延の長さや課題の難度を操作して、低正答率が見込まれるときに予備的なreviewキー選択が増加するかを分析する予定である。本期間内には、遅延時間が明示される条件でサルの記銘/保持方略がいかに変化するのかを予備的分析としておこない、サルは遅延の明示が記銘時であるか保持時であるかによって、この方略を柔軟に切り替えるという事実を得た。またこの方略の選択には大きな個体差があった。また同期間にネコが容器を左右に振ったときのノイズから、物体の存在/不在を推理できることを明らかにした論文を公刊した。具体的には、動きに同期した音がしたにもかかわらず、容器を逆さにしたときに物体が落ちてこない、あるいは音はしなかったにもかかわらず、物体が落ちてくる矛盾した事態を見せると、ネコは驚いて、注視時間の延長と探索行動の増加が生じることを示した。板倉は、他者理解に関する発達的研究を実施した。アニメーション刺激を用いた期待違反法の実験により、16カ月児において、他者の援助の必要性の理解と自身の援助行動の発現のリンクを示した。またこのようなリンクは、微細運動の発達と社会的スキルによって影響されることがわかった。28年度が最終年度であるため、記入しない。
アジア・北欧諸国のセイフ・コミュニティにおける自助－共助の仕組みに関する研究

本研究はWHO(世界保健機関)およびスウェーデンのカロリンスカ研究所によって展開されている認証活動セイフ・コミュニティへ参加した自治体の活動内容・コミュニティプランニングの実態把握を通じて、我が国において、災害発生時の災害時要援護者救助などにも機能する自助ー共助の仕組みを検討するものである。特に近年認証申請が進んでいる我が国の自治体および、この活動の発祥地であるスウェーデンの自治体の活動概要について、アンケート調査およびインタビュー調査によって、その活動概要の把握につとめた。地域事情を反映させながら多様な活動が展開していることが明らかになった。平成22年度においては、次年度以降の調査項目を定めるため(1)文献調査、(2)日本およびスウェーデンにおいてセイフ・コミュニティの認証を受けている(あるいは目指している)自治体へのヒアリング調査、(3)長野県小諸市における住民の安全・安心およびセイフ・コミュニティ活動の評価に関するアンケート調査、などを実施した。詳細は以下の通りである。(1)文献調査:WHOおよびカロリンスカ研究所によって発行されたセイフ・コミュニィティ活動関連の文献、公衆衛生領域研究者の論文、各自治体の活動状況などに関する文献を収集し、その内容を把握した。(2)自治体へのヒアリング調査:京都府亀岡市、長野県小諸市、スウェーデンのFalun市およびFalkoping市のセイフ・コミュニティ活動担当職員へのヒアリング調査を実施し、活動の概要について伺った。(3)小諸市のアンケート調査:これより認証を目指している小諸市において、住民4000名に対し、市内の安全・安心の現状、およびセイフ・コミュニティ活動の認知状況などに関するアンケートを実施した。上記の研究を踏まえ、平成23年度は調査内容の確定およびアンケートの集計・分析を行う。平成23年度においては、以下の研究作業を実施した。1.平成22年度末2月3月に実施した、長野県小諸市内住民を対象としたセイフ・コミュニティ活動(以下SF活動とする)に関するアンケート調査のデータ-入力および解析作業2.上記、小諸市におけるアンケート調査結果の成果公表3.北欧におけるセイフ・コミュニティ自治体へのケーススタディ調査依頼の実施研究作業1.に関しては、当初の研究計画には位置づけられていない作業であるが、平成24年度にセイフ・コミュニティへの認証を目指している自治体において、住民の地域コミュニティへの評価、SF活動の認知渡、SF活動への要望などの把握を目的とした調査であり、認証後にも同様の調査を実施し、SF活動の地域社会への効果を評価する予定である。研究作業2.では、現段階における小諸市民のSF活動への意向などの集計・分析作業を実施し、関連学会において報告を実施した。発表学会は、スウェーデンにおいて開催されたSafe Community Conference 2011、および日本セーフティ・プロモーション学会大阪大会である。研究作業3.に関しては、上述の平成23年9月、スウェーデンのファールン市で実施された、国際学会へ参加し、北欧諸地域におけるセイフ・コミュニティ認証自治体との懇親を深め、次年度以降のケーススタディ調査の依頼を実施した。上記研究作業を通じて得た知見は以下の通りである。1.我が国を初めとしたアジア諸国でのセイフ・コミュニティ認証申請数は急激に増加している一方、その発祥国であるスウェーデンをはじめとした北欧諸国では、申請研修が現象しており、活動の次の段階への展望が求められている。2.小諸市において実施したアンケート調査からは、認証前の自治体において、セイフ・コミュニティ活動への認知度は低い一方、多くの市民が活動の必要性を感じており、効果的な活動を展開するための普及啓発の必要性が確認された。平成23年度においては、埼玉県秩父市における、セイフ・コミュニティ申請前の時点における住民の安全・安心への意向およびセイフ・コミュニティ活動への評価に関するアンケート調査および、スウェーデン・オランダにおける追跡調査を実施した秩父市におけるアンケート調査に関しては、一昨年度に実施した小諸市での調査との比較から、住民全般的に今後の高齢化や病気などになった際の生活保障に対する不安が強い状況が明らかになった。また、住民サイドとしては、地域内での安全・安心の確保に対して、公助に期待すると同時に、より一層の地域のつながり、すなわち共助の必要性を実感している状況が明らかになった。さらには、行政区域内の地域ごとに、基本的にはそれぞれの地域の人口構造や産業構造などに応じて、不安の内容が異なっている状況も明らかになった。この調査結果は平成26年度、論文などによって公表する予定である。一方、スウェーデン・オランダにおいてはセイフ・コミュニティ認証自治体には限定しなかったが、高齢者が最期まで安心して、地域・在宅において居住継続する、その仕組みについての調査を実施した。スウェーデンでは、在宅医療を所管するストックホルム県および終末期の高齢者へ緩和ケアを提供する医療機関の活動実態、オランダにおいては、高齢者住宅およびその周辺地域との関連に関する調査を実施した。いずれの国においても、住宅ー在宅ケアサービスー在宅医療サービスの連携が有効に機能し、多くの高齢者が最期まで在宅生活を実現している状況が明らかになった。平成24年度においては、前年度までに実施した長野県小諸市におけるアンケート調査の調査結果の公表および北欧スウェーデンにおけるセイフコミュニティ活動に関する調査活動を展開した。

調査活動に関しては、主として、スウェーデンの首都ストックホルム市に隣接するナッカ市における高齢者の安全・安心活動の推進状況を把握した。ナッカ市は、市内の高齢者住宅における事故予防活動を重点的に展開しており、WHOから「高齢者の安心安全活動の推進(Safety Elderly)」の認証を受けている。具体的には、市内に所在するナッカ市立高齢者センター「エクトロップ」における、職員、高齢者およびその家族による協働でのPDCAサイクル活動の展開によって、高齢者の安全が推進されている。本研究においては、その活動の実施状況を、職員へのヒアリング調査および「エクトロップ」への訪問調査によって、把握した。最終年度においては、海外調査および国内調査として以下のものを実施した。1.海外調査:北欧、スウェーデンにおいて開催された、セイフ・コミュニティのヨーロッパ地域カンファレンスに参加し、特に開催地であると同時にセイフ・コミュニティとして一番最初に認証された自治体である、リドシェーピン市の持続的な試みに内容についてヒアリング調査を実施した。特に、単身居住高齢者の安全・安心を維持するための試みとして、地域にアクティヴシニア向けの交流施設を設置し、そこにおいて、平時からの交流促進を図ると同時に、家庭内事故予防のための運動プログラムなどを展開している状況は明らかになった。2.国内調査:国内調査はさらに以下の3調査によって構成される。1埼玉県北本市の依頼により作成した高齢者転倒予防リーフレットの効果に関する調査を実施:前年度において調査・作成した高齢者の転倒予防リーフレットを、健康増進センターなどにおいて高齢者に閲覧していただき、情報の有効性、普及啓発の効果などを検証する調査を実施した。リーフレットを通じた普及啓発に関する有効性は高く評価された一方、その内容について、より異なった情報提供を求める声が聞かれた。2埼玉県秩父市の依頼により高齢者の家庭内事故発生実態を把握する調査を実施:秩父市における高齢者家庭内事故予防に資する基礎的なデータ取得を目的として、自治体内の老人会などを通じてアンケート調査を実施した。具体的に事故が発生する場所やそのメカニズムに関する傾向が読み取れた。3同様に、埼玉県秩父市の依頼により子どもの家庭内事故発生実態を把握する調査を実施:高齢者に次いで、家庭内事故の犠牲者が多い乳幼児の事故実態把握を行うため、市内の保育施設・幼稚園を通じて、アンケート調査を実施した。26年度が最終年度であるため、記入しない。生活科学26年度が最終年度であるため、記入しない。
赤痢菌エフェクターによる新規標的タンパク質認識、感染機構の構造生物学的解析

赤痢菌などの腸管系病原細菌は感染時にエフェクターと呼ばれるタンパク質を宿主細胞に分泌し、宿主の持つ防御機構を妨げることで感染を拡大する。本研究では赤痢菌エフェクターによる宿主標的タンパク質の認識および感染メカニズムを構造生物学の手法を用いて解析し、赤痢菌OspIによる宿主ユビキチンリガーゼ阻害機構、IpaH9.8による基質認識機構を明らかにした。また、新規モチーフによりユビキチンリガーゼ活性を示すことが報告されたYopMの構造解析を行った。病原性細菌はエフェクターと呼ばれるタンパク質を宿主細胞に分泌し、宿主の持つ防御機構を妨げることで感染を拡大している。エフェクターは免疫系や細胞接着などに関連する宿主内タンパク質を標的として働いており、赤痢菌ではこれまでに48種類のエフェクターが報告されている。IpaHファミリーは赤痢菌に10種類存在するユビキチンリガーゼ活性を有するエフェクターであり、その一つIpaH9.8は宿主細胞の炎症性サイトカイン遺伝子の発現に必要な転写因子NF-κBの活性化に関わるNEMO(NF-kappa-B essential modulator)をユビキチン化修飾し、分解へと導く。IpaH9.8を介した感染機構解明を目指し、IpaH9.8の基質認識ドメインおよびNEMOのIpaH9.8との相互作用部位を含むドメインの結晶化を行い、それぞれの結晶よりX線回折データの収集に成功した。IpaH9.8基質認識ドメインは空間群P212121、C2221の2種類の結晶からそれぞれ分解能1.8Aと2.0Aで立体構造を決定した。しかし、NEMOは分解能が不十分であり、IpaH9.8との相互作用領域の構造は決定できなかった。IpaH9.8基質認識ドメインは8個のLeucin rich repat(LRR)から形成されており、立体構造既知のIpaH3との比較から、分子表面の電荷の違いにより基質認識特異性を獲得している可能性を示唆した。また、IpaH9.8 LRRの特徴的な分子表面形成に関与するアミノ酸残基変異体を作製し、NEMOとの相互作用解析を行った。赤痢菌エフェクターであるIpaH9.8の基質認識ドメインの立体構造をX線結晶構造解析により決定し、特異的な基質認識に関する知見を得た。また、その成果を論文として報告した。その他の赤痢菌エフェクターの発現、精製系を構築した。赤痢菌は粘膜上皮細胞を介して感染・定着し炎症性下痢を引き起こす病原体である。赤痢菌は感染に際し、エフェクターと呼ばれる病原因子を宿主細胞に分泌することで感染を成立する。赤痢菌ではこれまでに48種類のエフェクターが見つかっており、それらは免疫系や細胞接着に関連する宿主内タンパク質を標的として働くことが報告されている。赤痢菌エフェクターのひとつOspIは宿主のユビキチン結合酵素Ubc13を脱アミド化することにより、TRAF6を介した炎症応答を阻害している。OspIによる宿主防御経路の阻害機構の理解を目指し、これまでの研究により決定した脱アミド化型Ubc13の立体構造に基づいた機能解析を行った。それによりUbc13の脱アミド化によるTRAF6活性化機能の喪失は単純な表面電荷の変化によるものではないことを明らかにした。赤痢菌に10種類存在するユビキチンリガーゼ活性を有するエフェクターIpaHファミリーにおいて、これまで機能未知であったIpaH1.4とIpaH2.5が炎症性サイトカイン遺伝子の発現に必要な転写因子NF-κBの活性化に関わるユビキチンリガーゼ複合体LUBAC(linear ubiquitin chain assembly complex)の構成サブユニットの一つHOIL-1Lを標的とすることが報告されたことから、IpaH1.4の基質認識領域の発現系作製、精製、結晶化を行った。また、ユビキチンリガーゼ機能を持つことが新規に見出された、NLRP3を標的とするサルモネラ属のエフェクターであるYopMにおいて、報告されたものと同じ株が持つYopMの単独状態の結晶化に成功すると共にNLRP3の大腸菌発現系を構築した。赤痢菌において、新規に宿主内標的タンパク質が見出されたエフェクターIpaH1.4の基質認識領域の精製系構築に成功した。またサルモネラにおいて、新規ユビキチンリガーゼとして報告されたYopM単独状態の結晶化に成功した。さらに、YopMの基質として報告されたNLRP3の発現系を構築した。赤痢菌エフェクターOspIの研究では昨年度の研究成果にもとづき機能解析を行い、新たな知見を得た。赤痢菌は粘膜上皮細胞を介して感染・定着し炎症性下痢を引き起こす。赤痢菌は感染に際し、エフェクターと呼ばれる病原因子を宿主細胞に分泌し、それにより宿主の免疫系や細胞接着に関連する宿主内タンパク質の機能を阻害している。赤痢菌エフェクターOspIは宿主のユビキチン結合酵素Ubc13を脱アミド化することにより、TRAF6を介した炎症応答を阻害する。しかし、OspIにより修飾を受けた脱アミド化型Ubc13による、宿主機能の阻害がTRAF6に対してのみかどうかは不明であったことから、Ubc13によりユビキチンリガーゼ(E3)機能を獲得する酵素に対する、脱アミド化型Ubc13の効果を解析した。その結果、Ubc13により機能を獲得する宿主E3の多くが脱アミド化型Ubc13により阻害を受けないことが明らかとなった。赤痢菌