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新星からIa型超新星へ--連星系理論の精密化

新星の光度曲線にはさまざまなタイプがあり、減光が遅いもの、速いもの、なめらかでないもの、ダスト形成があるものなど種々多様である。理論的には共通点があり、我々が提案した普遍側であらわされる。キーとなる物理量は白色矮星の質量とガスの元素組成である。新星の光度曲線解析により、回帰新星では白色矮星が非常に重いことがわかっており、Ia型超新星の親天体候補として重要視されている。本年度のもっとも重要な成果は、新星爆発をくりかえして重くなった白色矮星の表面にはシリコンなどを含む薄い層が形成されることをはじめて示したことである。このような白色矮星が超新星爆発をすると、観測されるシリコンの高速度吸収線をよく説明できる。シリコンの高速度成分は多数のIa型超新星で観測されるので、Ia型超新星候補として回帰新星(SD説)を強く支持するものとなる。次に新星爆発時の共通点について。これまで多種多様な新星爆発にわたる共通の性質を探求してきたが、本年度は早い新星と局所銀河群にあわられた新星について解析を行った。また新しく色ー補正等級図を提案し、その図の上で、個々の新星がどのように進化するかを詳しく解析した。これまで新星のサブタイプによりばらばらだとおもわれてきた新星の進化がこの研究で、わずか2つのグループに分類できることを明らかにした。これは新星の爆発後の物理状態にタイプによらない共通機構があることを意味する。この色ー等級図を使えば、星間吸収や新星までの距離、白色矮星の質量などが、整合的かつ定量的にもとめることができる。これまで解析した新星とあわせ、同一方法で解析した均質な新星のデータベースを作ることができた。またアンドロメダ銀河の1年周期の新星(M31N 2008-12a)の解析も引き続きおこなった。国際的な大観測グループとともに、理論面での詳しい解析を担当した。私の研究分野は新星の理論とそれに関連する連星系の進化である。私が確立した新星風理論は、新星の光度曲線(極大から暗くなるまで)を計算することができる世界で唯一のものである。これまで、さまざまな違う特徴をもつ新星を理論的な視点から定量的に分類し、系統的に研究してきたが、今年度は特に回帰周期が非常に短い回帰新星を重点的に研究した。回帰新星の白色矮星は質量が非常に重く、チャンドラセカール質量に近いため、Ia型超新星の有力な親天体候補である。そこでまず回帰周期と不安的核融合反応の安定性の条件を求めた。また、爆発時の観測データから色色図上での進化について、新星のタイプによらない共通な道筋があることを発見し、回帰新星もそれに従うことを発見した。またアンドロメダ銀河に出た新星M31N 2008-12aについて内外の観測家と共同研究を行い理論面からの解析を行い、光度曲線を計算した。これらは回帰新星が超新星爆発に至る道筋を精密化するもので、今後の研究の発展のさらなる足掛かりとなる。国内外の研究者とは議論や情報交換を積極的に行い、今後、さらに可視光・赤外線やX線の研究者たちとの共同研究をいろいろなタイプの新星についても広げるような体制を作ったことも大きな成果である。具体的には8月にイタリアのアジアゴ天文台に滞在し、Iijima教授らと新星の議論を深めたこと、9月にはパレルモで開催された「激変星と関連天体」の国際会議で新星理論のレビュー講演をし、各国の研究者と交流を深めた。10月にはなよろ天文台(北海道)で講演し新星の観測者と交流した。1月には新星の研究会を慶応大学で開催した。2月から3月にかけてはスペインのバルセロナ大学で新星のWSで講演し、Henze博士らと共著論文の執筆の深くつっこんだ相談をした。本年度の第一の成果である色色図上の進化は、新星の理解を大きくすすめ、私の提案している新星風理論を観測的に支持する結果となっている。また質量降着する白色矮星表面での核反応の不安定性の理論的解明は、新星の白色矮星の質量がどのように増えていくかという連星系の進化にとって一歩前進であり、競合する外国の理論グループの理解が正しくないことも明らかにした。そして周期が非常に短い回帰新星M31N 2008-12a)については、爆発周期が1年であり、毎年秋ごろに爆発するので、つねに進行形で観測と理論研究が進んでいる。昨年の爆発ではX線と紫外線の良質な観測データが得られたので、これまでになくいろいろな新しい視点から、理論モデルを構築中である。もっとも重要な課題である多波長の光度曲線作成についてはいまのところ、数値計算が難しい点があり、理論的な問題点を洗い出しつつ進行中である。まず新星爆発時の色ー等級図上の時間変化について詳細に検討し、新星には典型的な道筋があることを示した。これは多数の新星について過去に出版されたデータを網羅したうえで詳細に吟味しなおし、距離と星間吸収を独自に提案する方法で求めて再検討を加えたもので、62ページにわたる76個の図を含む集大成といえるものである。次に短い周期の新星が最近観測されていることをふまえ、理論的にもっとも短い回帰周期をもとめた。これは核融合反応が安定であるような場合の新星(強制的に質量降着がスイッチオンオフされたもの)も含んでいる。

また、アンドロメダ銀河に出た1年周期の回帰新星M31N 2008-12aの2015年の爆発時には、国際プロジェクトとして、ごく初期のX線で明るい時期(X-ray flash)の観測を試みたが、観測開始が少しおそかったため、未検出に終わった。この観測報告とともに、X-ray flashの理論的な研究(光度曲線など)を計算した。また、M31N 2008-12aの2015年の爆発の多波長観測をまとめた長い論文を出版した。これは大規模国際研究で、観測家と理論家(申請者を含む)の共同研究である。この新星は過去に何度も爆発しているが、今回は時間的に細かいデータがとれ、可視光の光度曲線がピークを含めて初めてはっきりした。また詳細な可視光のスペクトルも得られ、膨張速度や減速など連星系の状況を知るパラメターが求まった。X線の観測でも細かい変動などの貴重なデータが得られた。この新星は白色矮星が非常に重いことがわかっており、Ia型超新星の親天体候補である。連星系のパラメターやガスの様子がわかったことは、今後のIa型超新星のモデルを考えるうえで貴重なデータを提供する。新星の爆発モデルの理論的研究は斉尾氏、蜂巣氏との共同研究として順調にすすんできた。M31N 2008-12aについての共同研究では、直接スペインを訪問して詳細に議論したり、スペインで開かれたWSで議論した。回帰新星は白色矮星の質量が非常に重いことから、Ia型超新星の有力な親天体候補である。その光度曲線を爆発初期から終わりまで通して計算することは数値計算上の困難があり、これまで誰も成功しなかった。本研究で今年はじめて無矛盾に求める計算方法を開発した。これは進化計算コードと定常的質量解を連続させる方法で、かなり手間がかかるが、回帰新星ではとりあえず成功した。それによりIa型超新星の最有力候補天体である、アンドロメダ銀河の新星M81N 2008-12aの光度曲線モデルを計算し、白色矮星の質量などの連星パラメタを決定した。また、アンドロメダの1年周期の新星は何度も新星爆発をくりかえしているので、いずれヘリウムがたまり、ヘリウム新星爆発を起こすことが予想される。そこでヘリウム新星の爆発の数値計算を行い、どのようなことが観測可能かを調べた。それによると白色矮星の上にあらかじめヘリウムが全くない場合から出発しても、1400年のちには爆発し、非常に明るい新星となる。ただし、事前にヘリウム新星の爆発の兆候は全くない。次にいろいろな新星の光度曲線と色の進化を系統的に調べて分類する仕事も継続している。本年は減光が早い古典新星と回帰新星に注目し、色等級図の進化が新星のタイプごとにどのように異なるかを調べて分類した。また観測家グループとの共同研究では、M31N 2008-12aの昨年度の爆発の特徴を精査し、回帰周期と爆発のピーク光度の関係を理論的に明らかにした。また超軟X線の期間が短かったことと、ピーク光度が明るいことも、質量放出率が大きかったためだと理論的に解釈できることを示した。これらの観測事実は、本研究の土台となっている新星風理論をうらづけるものである。連星系の長時間変化を求めるためには、新星爆発をくりかえし計算することが必要である。数値計算法については、これまで開発してきたコードを用い、新星風理論と合体させる方法を開発したので、とりあえずできるようになったが、反復計算が必要で手間がかかりすぎるため、簡単な方法を模索中である。また核反応のネットワークを増強したことで、SiやMgまでの核合成までは問題なく計算できるようになった。
電場駆動型デジタル分子デバイスの開発

(1)電場に応答して一方向へデジタル的にステップ移動する分子移動体(電場駆動型ロコモーション)と(2)電場に応答して繰り返し演算が可能な分子計算素子(電場駆動型分子計算素子)を開発することを目標として,DNAナノ構造の電場応答に関する研究を行った.(1)DNAオリガミの手法を用いて,わずかな非対称性をもつ6つの接地点(足)をもった回転運動体を作製し,水平電場を印加しながら一分子蛍光観察が可能な系を開発し,運動体の移動を観測した.(2)金ナノ粒子を修飾したDNA2重らせんを,電場をかけることにより引きはがす実験系を構築し,電場をかける方向により特性が全く異なることを定量的に明らかにした.本研究では,DNAナノ構造の電場応答を駆動原理として(1)電場に応答して一方向へデジタル的にステップ移動する分子移動体(電場駆動型ロコモーション)と(2)電場に応答して繰り返し演算が可能な分子計算素子(電場駆動型分子計算素子)を開発することを目標としている.平成27年度の実績としては,(1)について,DNAオリガミの手法を用いて,わずかな非対称性をもつ6つの設置部(足)をもった回転運動体を作製した.またこの移動体に水平電場を印加しながら全反射顕微鏡による一分子蛍光観察が可能な系を開発した.顕微鏡によるリアルタイム観察を可能とするために,専用のホルダーを設計・作製するとともに,さまざまな基盤の材質について検討した結果,最終的にはDNA分子移動体と基盤表面の吸着性を脂質分子の組成で調整可能な脂質2重膜を用いる系を構築した.(2)について,電気力を発生する粒子として,金ナノ粒子を選定し,これが電場の方向に力を発生することで,DNA2重らせんが外れるようなデバイスを考案,作製した.デバイス自体としては電場に抗するように,アクリルアミドゲルにアンカーリングすることにより電場に応答してデハイブリゼーションが起こることが確認できた.DNA2重らせんのはがれ方には2種類あるため,より外れやすいと考えられるアンジッピングの形式を採用した.また電流によるジュール熱発生を抑えるため,電極間の距離やDNAの塩基配列を最適化した.(1)については,一分子の運動をリアルタイムで追跡できる観察系ができた.また,(2)については,電場駆動の原理の確認ができた.(1)電場に応答して一方向へ移動する分子移動体の開発については,平成27年度から移動体と基板素材との非特異的な吸着が問題となっており,マイカ以外の素材として,基板上の脂質2重膜などを検討したが,結果として望みの特性は得られず,適切な吸着特性をもつ基板素材の選定が課題として残った.(2)電場に応答して繰り返し演算が可能な分子計算素子の開発については,平成27年度に構築した系(アクリルアミドゲルに,金ナノ粒子をつけたDNAをアンカーして電場をかけてハイブリダイゼーションを制御する系)の改良および精密化に取り組んだ.具体的にはキャピラリーにゲルとバッファーを満たした系を開発した.この系では,キャピラリーの両端のリザバーに電極を配置して電圧をかけることで,通電による加熱やPHの変化を最小限に抑えることが可能となった.また,電圧をかけた状態におけるDNAの位置は,ゲル中の金ナノ粒子の分布(赤く見える)をCCDカメラにより画像化することにより定量化した.この系をもちいた実験の結果,さまざまな電圧条件および異なる大きさの金ナノ粒子による引っ張りの下でデハイブリダイゼーション(2重らせんがほどけるプロセス)の時間発展特性が定量的に明らかにされた.特に,ゲル中に固定された一本鎖DNAに対して,金ナノ粒子を付けた一本鎖をハイブリダイゼーションさせるときの結合の向きがUnzippingかShearingかにより,全く異なる挙動を見せることが分かった.以上の結果を論文にまとめ,論文誌に受理された.(1)電場に応答して一方向へデジタル的にステップ移動する分子移動体(電場駆動型ロコモーション)と(2)電場に応答して繰り返し演算が可能な分子計算素子(電場駆動型分子計算素子)を開発することを目標として,DNAナノ構造の電場応答に関する研究を行った.(1)DNAオリガミの手法を用いて,わずかな非対称性をもつ6つの接地点(足)をもった回転運動体を作製し,水平電場を印加しながら一分子蛍光観察が可能な系を開発し,運動体の移動を観測した.(2)金ナノ粒子を修飾したDNA2重らせんを,電場をかけることにより引きはがす実験系を構築し,電場をかける方向により特性が全く異なることを定量的に明らかにした.(1)については,一分子の運動をリアルタイムで追跡できる観察系ができたが,マイカ基板上ではほとんどの場合,移動体が完全に固着してしまうことが観察された.今後は基板としてより吸着力の小さい材質を検討していく.(2)については,原理は確認できたが,印加電圧が高くジュール熱が発生することが問題となっている.今後はより低電圧でかい離するような分子設計をすすめていく.分子ロボティクス
エピタキシャル成長表面のモルフォロジーと成長機構

Si(111)表面の7x7超格子構造上にSi膜を成長させ、その表面に形成される原子状ステップ構造を推定し、成長過程における構造組み替え過程の役割を明らかにすることを目的とする。そのために表面からの低速電子回折強度(LEED)の半値幅(FWHM)の入射電子線のエネルギー(Ep)依存性の観測、走査型トネンル顕微鏡(STM)による観察から原子状ステップの構造を調べた。なお、Si膜は基板温度を300°C以下にして成長させた。この条件では、成長初期はエピタキシャル成長するが、成長とともに構造階層化が起こる条件であるので、構造組み替え過程を検討することに適している。高さdoのモノステップのa倍からなる原子状ステップをもつ表面では、それらを介して隣合うテラスからの反射の際に生じる位相差が、2πの整数倍になると回折強度のFWHMが極小になる。位相差は、Ep^<1/2>adoに比例するので、Ep^<1/2>doを変数としてFWHMをプロットしなおすと2πの1/n(nは整数)と整数倍を満足するときにFWHMが極小値をとる。これはn原子ステップ形成を意味する。成長表面から観測したFWHMは成長速度を小さくするほど小さくなること、およびそれを解析すると、2、3原子ステップからなることを見いだした。作製したSi膜のLEEDを観測後に、ステップ構造を直接確認するために、本研究で製作したポータブル式超高真空装置に格納し、STM装置に転送して観察を試みた。しかし、トンネル電流が安定化せず明瞭な像を得る段階に達していない。格納・転送の際に10^<-9>Torr台に真空度が悪くなるために表面が汚染される、あるいは成長温度が低いために表面構造が安定平衡に達していないためである、と考えられる。直接STM装置内で成長させる研究あるいは600°C以上の基板温度で成長させたSi膜のSTM観察を行う必要があり、その準備を行っている。
アルツハイマー病におけるCD40関連分子の役割の解析

アルツハイマー病をはじめ筋萎縮性側索硬化症(ALS)、パーキンソン病などの神経変性疾患の病態に炎症機転が重要な働きをしていることが徐々に明らかとなってきた。我々はこれらの神経変性疾患を免疫・炎症機転から、immuno-inflammatory diseaseとして捉えこれにCD40のシグナルおよびこれを制御することの予想されるCD100シグナルが関与することを検証してきた。まず免疫補助刺激分子であるCD40は培養系において神経細胞、アストロサイト、ミクログリアに発現し、神経細胞においては分化にともない誘導されることを確認した。正常中枢神経系組織では主に神経細胞のみに発現し特に脊髄組織においては運動ニューロンに高発現が認められた。外傷モデルを作成し反応性グリアに発現誘導されることを確認した。アルツハイマー病モデルのAPPトランスジェニック(Tg)マウスの老人斑周囲の反応性グリアおよびALSモデルのSOD-Tgマウス脊髄の反応性グリアにおいてもCD40が高発現していることを確認した。培養グリア細胞をCD40刺激することによりTNF-α, iNOS, COX-2などの炎症関連分子が産生されることを確認した。さらにこれらの産生がCD100ノックアウト(KO)マウスを利用することによりCD100による調節を受けていることも明らかにした。COX-2に関しては神経細胞にも発現しているがCD40との共発現は特にグリア細胞で認められた。グリアー神経細胞混合培養系においてCD40刺激により運動神経細胞死が誘導されたがこれはCOX-2阻害剤により抑制され、さらにCD40欠失培養系では神経細胞死は認められず、正常型グリア細胞を加えた時のみに神経細胞死が誘導された。純神経細胞培養系では同様の刺激で神経細胞死は見られなかった。以上より病的状態においては反応性グリア細胞にCD40が高発現しその下流で誘導されたCOX-2を介した神経細胞死が来されていることが示唆された。本研究の目的であるアルツハイマー病における免疫・炎症機転の解明に向けてCD40のシグナルを制御すると予想されるCD100について、同分子のノックアウト(KO)マウスとアルツハイマー病モデルマウスのAPPトランスジェニック(Tg)マウスの遺伝的バックグラウンドの均一化を終え交配を開始した。CD100KO-APPTgマウスの生化学的、免疫学的評価は1018ヶ月齢のマウスを使用するため現在成長を待っているところである。この間にCD40,CD40Lの中枢神経系での発現を半定量的RT-PCR,ウェスタンブロット、免疫細胞組織化学にて検討した。CD40の発現は生後より増加し始め6ヶ月頃にピークとなり老齢までやや減少しながら持続する。生理的な発現は主に神経細胞に認められるが実験的に反応性グリオーシスを作成したところ反応性グリアに発現が誘導されることがわかった。驚いたことにそれまで活性化T細胞に発現すると考えられていたCD40Lが神経細胞に高発現しておりこれは神経細胞の分化に伴って増加することも判明した。また反応性アストロサイトの一部にも誘導される。つまりCD40L-CD40は中枢神経系に広く発現しておりCD40Lは主に神経細胞にCD40は神経細胞、および病的状況下におけるグリア細胞に発現しアルツハイマー病をはじめとする免疫・炎症機転の関与する神経変性疾患における重要性がますます確信された。同時にこのカスケードを調節することが予想されるCD100についてもアルツハイマー病などの神経変性疾患においてその重要性がより推測されるところである。

現在はin vitroでまず炎症反応に及ぼす影響を検討中である。アルツハイマー病の病態を免疫・炎症機転から、つまり同病をimmuno-inflammatory diseaseとして捉えこれにCD40のシグナルおよびこれを制御することの予想されるCD100シグナルが関与することを検証してきた。まず免疫補助刺激分子であるCD40の発現であるが培養系において神経細胞、アストロサイト、ミクログリアに発現し、神経細胞においては分化にともない誘導される。正常中枢神経系組織では主に神経細胞のみに発現するが外傷モデルを利用し反応性グリアにも発現誘導されることを確認した。アルツハイマー病モデルのAPPトランスジェニック(Tg)マウスの老人斑周囲の反応性グリア及び同じく反応性グリアをきたすALSモデルのSOD-Tgマウス脊髄においてもCD40が高発現していることが確認された。培養グリア細胞をCD40刺激することによりTNF-α,iNOS, COX2が産生されることを確認した。さらにこれらの産生がCD100ノックアウト(KO)マウスを利用することによりCD100による調節を受けていることも明らかになった。なかでもCOX2はその下流のプロスタグランジンを介した神経細胞障害の重要性が神経変性疾患で示唆されているがCD40KOマウス、COX2インヒビターを利用し反応性グリア細胞に誘導されたCD40の下流でCOX2が誘導されさらに神経細胞死を引き起こすことが培養系を用い確認できた。CD100KOマウスとAPP-Tgマウスの交配は10か月令まではサンプリングがすみ18か月令を待っているところである。サンプリング終了と同時に海馬のグリオーシスおよび残存神経細胞数の評価、タウの異常リン酸化を免疫組織学的、および生化学的に解析する予定である。
酵母におけるステロールホメオスタシスの分子メカニズムの解明

オルガネラ間のステロールの輸送機構は未解明である。本研究では、出芽酵母を用い、形質膜から小胞体へのステロールの輸送をin vitroで解析する系を構築し解析を行った。その結果、形質膜から小胞体へのステロールの輸送にオキシステロール結合タンパク質が関わることが示唆された。また、これまで解析が困難であった小胞体から液胞および小胞体からミトコンドリアへのステロール輸送機構を解析する系を構築した。1.出芽酵母Saccharomycescerrvisiaeのステロールアシルトランスフェラーゼ遺伝子の破壊株において、細菌由来のステロールアシルトランスフェラーゼと液胞膜タンパク質の融合タンパク質を発現させることにより液胞にステロールアシルトランスフェラーゼを局在させた株を用い、小胞体膜から液胞膜へのステロール輸送を解析する系の構築を進めた。小胞体で合成されたステロールの液胞への輸送をin vivoで解析するため、融合タンパク質の発現系の改良を行った。また、ステロールの標識条件などについて検討を行った。さらに、小胞体から形質膜へのステロール輸送機構を解析するため、同様にステロールアシルドランスフェラーゼ欠損株においてステロールアシルトランスフェラーゼと形質膜タンパク質の融合タンパク質を発現させることにより、ステロールアシルトランスフェラーゼを形質膜に局在させた株の構築を進めている。2.酵母の形質膜画分と小胞体膜画分を用いたステロール輸送のin vitro再構成系を用いて、ステロールの輸送メカニズムに関する解析を行った。ステロール輸送は細胞質の添加により促進されたが、細胞質画分の代わりに大腸菌で合成させ精製したオキシステロール結合タンパク質を添加した場合にもステロール輸送が見られたことから、細胞膜から小胞体へのステロールの輸送にオキシステロール結合タンパク質が関与することが強く示唆された。1.ステロールは生体膜の主要構成成分の1つであり、細胞内の様々なオルガネラに存在する。ステロール合成は主に小胞体で行われるが、合成されたステロールの各オルガネラへの輸送機構には不明な点が多い。その理由の一つは、オルガネラ間のステロール輸送を定量的に評価・解析することが難しいためである。そこで、小胞体からミトコンドリアへのステロール輸送に焦点をあて解析を行った。出芽酵母Saccharomyces cerevisiaeのステロールアシルトランスフェラーゼ遺伝子の破壊株において、細菌由来のステロールアシルトランスフェラーゼにミトコンドリア輸送シグナルおよび膜貫通領域を付加した融合タンパク質を発現させることによりステロールアシルトランスフェラーゼをミトコンドリアに局在させ、ステロールのエステル化を指標に小胞体からミトコンドリアへのステロール輸送を解析する系の構築を進めた。また、小胞体で合成されたステロールの他のオルガネラへの輸送を解析するため、in vivoおよびin vitroでのステロールの標識条件について検討を行った。オキシステロール結合タンパク質変異株の細胞質画分を用いた解析から、オキシステロール結合タンパク質のステロール輸送への関与が示唆された。また、ステロール輸送への小胞体膜タンパク質の関与について、遺伝子破壊株を作製し解析を行った。1.ステロールはミトコンドリア膜の主要構成成分の1つであり、その合成欠損株ではミトコンドリアの形態に異常が生じることから、ミトコンドリアでも重要な役割を果たすと考えられる。しかし、小胞体で合成されたステロールのミトコンドリアへの供給・輸送機構は不明である。その理由の1つはミトコンドリアへのステロール輸送を定量的に評価・解析することが難しいことである。そこで、小胞体からミトコンドリアへのステロール輸送を解析する系の構築を行った。出芽酵母のステロールアシルトランスフェラーゼ遺伝子破壊株において、細菌由来のステロールアシルトランスフェラーゼにミトコンドリア輸送シグナルを付加した融合タンパク質を発現させた。発現させたステロールアシルトランスフェラーゼはミトコンドリアに局在したこと、アシルトランスフェラーゼの発現に依存してステロールエステルの生産が見られたことから、実際に小胞体で合成されたステロールがミトコンドリアへ輸送され、エステル化されること明らかとなった。本系を用い、ステロールのエステル化を指標にミトコンドリアへのステロール輸送を解析できると期待される。2.オルガネラ間の脂質輸送の特異性について解析を行うため、ミトコンドリアの機能に必須なリン脂質ホスファチジルエタノールアミン(PE)のミトコンドリアへの供給・輸送機構についても同様に解析系の構築を行った。細菌由来のPEメチル化酵素をミトコンドリアに局在させ、PEのボスファチジルコリンへの変換を指標にミトコンドリアへのPE輸送を評価する系を構築した。ミトコンドリアの形態・機能に重要な2つの脂質の輸送を比較することが可能となった。
海域特性を示す食物連鎖の同位体効果に基づいた海洋生態系モデルの構築

生物の安定同位体比は、捕食者自身の代謝系の駆動様式や行動変化、食物網が存在する地域性によって決定される。本研究では北太平洋亜寒帯海域(K2)及び亜熱帯海域(S1)において、動物プランクトン及び海水試料を季節・鉛直層別に採集し検証した。動物プランクトンを含めS1の15Nが全体的に低くなっている事から、窒素固定系が中深層の食物連鎖まで大きく影響していることが示唆された。更に食物連鎖全体が持つΔδ13C、Δδ15Nの傾度を統計的に解析を行った結果、生態系や生物種によらず傾度に大きな差が見られない事が分かった。即ち、中間代謝過程を通し統一的な規則性が食物連鎖内で維持されている事が強く示唆された。近年、生態系の食物連鎖構造を知る手段として、安定同位体比(δ^<15>N、δ^<13>C)を用いた研究が広く使われてきている。代表者らが見出した、陸域、海域、水域など異なる生態系間でδ^<15>N/δ^<13>Cの傾きに共通性があるという新たな知見(Aita et al.,2011)に加え、「窒素・炭素の同位体効果は、一次生産者の代謝過程が上位のTLにまで影響を与える重要な役割を果たしている」という事実のもと、本研究課題では、観測・モデル・検証の統合による次世代海洋生態系モデル構築のためのブレークスルーを目指すこと目的としている。本研究では、生態系モデルを窒素・炭素安定同位体比の変動によって検証できる基盤技術や、それを用いた方法論の進展を意図した。このために、(1)西部北太平洋域亜熱帯、亜寒帯域における食物連鎖と同位体効果の比較、(2)海洋生態系数値モデルをSI(Stable Isotope)法によって検証する方法を確立することを軸に、食物網と物質循環を含めた同位体海洋生態系モデルの構築と、上記統合に新しい視座(パラダイムシフト)を提起する。本年度は、(1)について亜寒帯循環域観測定点K2及び亜熱帯循環域観測定点S1において、春季及び夏季の動物プランクトンの採集を実施した。前年度から採集保存を行っていた試料を含め、本年度は特にK2の種分類及び群集構造解析、高次分類群組成解析に着手、さらに表層200m深における動物プランクトンの窒素・炭素安定同位体比の測定を実施した。一方、(2)の海洋生態系モデルについては、簡単なNPZDタイプから複雑な2N2P3Z2Dタイプの2層モデルを使って、SI-海洋生態系モデルのフレームワークの比較検討を実施した。更に、微生物によるN_20生成メカニズムを検証するために、N_20生成過程を導入した海洋N_20安定同位体モデルの構築を行い、K2付近に適用したボックスモデルからモデル構築に一定の見通しを与える結果を得た。近年、生態系の食物連鎖構造を知る手段として、安定同位体比(δ15N、δ13C)を用いた研究が広く使われてきている。代表者らが見出した、陸域、海域、水域など異なる生態系間でδ15N/δ13Cの傾きに共通性があるという新たな知見(Aita et al., 2011; Wada et al., 2013)に加え、「窒素・炭素の同位体効果は、一次生産者の代謝過程が上位のTLにまで影響を与える重要な役割を果たしている」という事実のもと、本研究課題では、観測・モデル・検証の統合による次世代海洋生態系モデル構築のためのブレークスルーを目指すこと目的としている。このために、1.西部北太平洋域亜熱帯(S1)、亜寒帯域(K2)における食物連鎖と同位体効果の比較、2.海洋生態系-数値モデルをSI(Stable Isotope)法によって検証する方法を確立することを軸に、食物網と物質循環を含めた同位体海洋生態系モデルの構築と、上記統合に新しい視座を提起する。平成25年度は、1.について、これまでに季節的に採集を行ったS1(表層1,000m深)の生物試料の種分類作業と、窒素・炭素安定同位体比及び炭素・窒素全量測定を実施し概ね終了した。平成25年度はメソ動物プランクトン群集を中心に群集構造と動態の季節的な違いについて、同位体比を使って動物プランクトン群集の栄養動態が時空間的にどのように変動をするのか解析と検証を行った。その結果、S1で窒素固定の影響を受けていることが示唆された。

一方、2.の海洋生態系モデルについて、1.で得られた実海洋観測の知見と同位体比の結果から、低次生態系モデルフレームの作成を行った。また平成26年度に実施する数値実験に向け、3次元海洋大循モデル(物理モデル)の開発と改良を実施した。近年、生態系の食物連鎖構造を知る手段として、安定同位体比(δ15N、δ13C)を用いた研究が広く使われてきている。代表者らが見出した、陸域、海域、水域など異なる生態系間でδ15N/δ13Cの傾きに共通性があるという新たな知見(Aita et al., 2011; Wada et al., 2013)に加え、「窒素・炭素の同位体効果は、一次生産者の代謝過程が上位のTLにまで影響を与える重要な役割を果たしている」という事実のもと、本研究課題では、観測・モデル・検証の統合による次世代海洋生態系モデル構築のためのブレークスルーを目指すこと目的としている。本研究では、生態系モデルを窒素・炭素安定同位体比の変動によって検証できる基盤技術や、それを用いた方法論の進展を意図した。このために、1.西部北太平洋域亜熱帯、亜寒帯域における食物連鎖と同位体効果の比較、2.海洋生態系-数値モデルをSI(Stable Isotope)法によって検証する方法を確立することを軸に、食物網と物質循環を含めた同位体海洋生態系モデルの構築と、上記統合に新しい視座(パラダイムシフト)を提起する。平成24年度は、1.について、これまでに採集を行った亜寒帯循環域観測定点K2(表層1,000m深)及び亜熱帯循環域観測定点S1(表層150m深)の生物試料の窒素・炭素安定同位体比を実施した。S1については、K2と比べ生物種が多く存在すること、また亜熱帯域における生物の同位体分布について季節的な研究が過去になされていないことなどから、特に生物分類に重点を置いた作業を実施した。一方、2.の海洋生態系モデルについては、海洋で生成するN2Oの生成プロセスを定量的に調べるために、海洋低次生態系ーN2Oアイソトポマーモデルの改良を実施した。感度実験の結果から、K2のN2Oは、ほぼ硝化によって生成していることなどを明らかにした。生物の安定同位体比は、捕食者自身の代謝系の駆動様式や行動変化に起因するものと、食物網が存在する地域性に起因するものの2つの要因によって決定される。そこで本課題では栄養塩や水温などの海洋環境の違いによって、特に低次生態系にどのような違いがあるのかを、西部北太平洋域亜熱帯(S1)及び亜寒帯域(K2)において窒素炭素安定同位体比から比較検証した。また食物網と物質循環を含めた海洋生態系モデルの構築に対し、本課題で得られる成果から新しい視座を提起することも意図した。K2、S1で季節および鉛直別に採集した動物プランクトンについて、表層と中深層の群集構造の比較から、1.表層動物プランクトン群集には海域間で異なる基礎生産者を起点とする食物網構造があること、2.中深層動物プランクトン群集でも表層の食物網構造の影響を引きずっていること、3.また中深層動物プランクトン群集では肉食化傾向が強くなること、が示唆された。更にK2及びS1の結果に、南極海、アラスカ湾、親潮水塊、黒潮系暖水塊の4海域における生物の同位体比データを合わせ、自然界の食物連鎖中の摂餌プロセスの同位体分別について比較を行った。その結果、我々がこれまで調べた限られた食物連鎖の範囲では、生態系や生物種によらずΔδ15N/Δδ13Cに大きな差が見られないことが分かった。この傾きの類似性は、アミノ酸代謝や脱炭酸を中心とするエネルギー代謝等によって決定されることにより、統一的な規則性が低次から高次まで維持されていることが強く示唆された。これらの結果を現在投稿論文(Aita et al.; Kobari et al)として纏めている。
妊娠期における座位行動減少を目的とした介入の効果検証

本研究は、妊娠期の座位行動減少を目的とした介入を行い、座位行動の変化および周産期関連指標への影響を検証する。本研究の介入プログラムは、ウェアラブル活動量計に搭載されている1時間以上の座位行動を振動通知する「座位行動中断アラート」機能の使用、専用アプリを通した「セルフモニタリング」、研究者らが作成したリーフレットによる「情報提供」を組み合わせたもので構成した。本介入は妊娠期から出産まで継続的に行う。座位行動の変化の評価は活動量計による客観的測定で行う。平成30年度は、介入プログラムの効果検証の第一段階として、予備調査における妊婦の身体活動データをヒストリカルコントロールとした単群試験を開始した。研究実施施設の産科外来および集団指導の場において、妊娠初期の初妊婦の中から研究参加希望者を募り、69名が研究に参加した。得られたデータより、平均座位時間、座位から立位への姿勢変換回数等を算出し、これらのデータを予備調査の身体活動データと比較し、介入プログラムの効果を評価する。平成31年度は、引き続き研究対象者の追跡とデータ収集を行い、同時並行して分析を行う予定である。これらの結果は取りまとめて随時学会発表および論文投稿を行う。予定していた対象者数に達するまでに時間を要した。対象者追跡と、収集されたデータの抽出作業を随時行う。その後、分析、論文執筆と投稿準備を進める予定である。
ヌクレオチド除去修復におけるクロマチン制御とDDBの機能

ヌクレオチド除去修復におけるクロマチン構造変換機構とDDBの機能を明らかにするために、主に以下の点について解析を行った。まず、DDBとクロマチンリモデリングに関わるタンパク質との関連性を調べるために、免疫沈降法によりDDBと共沈降するタンパク質をウェスタンブロッティングにより解析した。その結果、今までDDBと相互作用することが知られていなかったタンパク質が含まれることがわかったので、細胞内で共発現することによりDDBとの相互作用を確認した。また興味深いことには、細胞に紫外線を照射した時に、そのタンパク質がDNA損傷部位に集積することがわかり、紫外線によるDNA損傷応答において何らかの役割を担っていることが示唆された。現在、ヌクレオチド除去修復反応に及ぼす影響についてさらに詳細な解析を進めている。一方、ニワトリDT40細胞を用いて作成したDDB1のコンディショナルノックアウト細胞で、紫外線以外のDNA傷害剤に対する応答についても解析を行った。その結果、DNA複製を介して二本鎖切断を生じるcamptothecin(CPT)を処理すると、野生型DT40細胞はG_2/M期に停止するのに対し、DDB1を欠損させた場合にはG_2/M期まで進まず、S期の初期で停止することがわかった。さらに、ミトコンドリアの還元酵素活性を指標にCPTに対する感受性について検討したところ、DDB1を欠損させると感受性が有意に増加することがわかった。したがって、DDB1がCPTによるDNA損傷応答において何らかの役割を担っていることが推察され、このDDB1の新しい機能に注目して解析を行っている。ヌクレオチド除去修復反応におけるクロマチン構造変換機構とDDBの機能を明らかにするために、以下の点について解析を行った。まず、ATP依存性クロマチンリモデリング因子の修復反応への関与について検討するために、局所的紫外線照射法により正常細胞の核の一部にDNA損傷を誘起し、蛍光免疫染色によりSWI/SNF複合体のサブユニットの局在性を解析した。しかし、ヌクレオチド除去修復の基本修復因子やDDBとは異なり、DNA損傷部位への集積は観察されなかった。また、ヌクレオチド除去修復を欠損した種々のXP細胞およびDDB2を強発現することにより修復能を亢進させた正常細胞を用いて同様に検討したが、DNA損傷部位に集積することはなかった。また、DDBの機能を明らかにするために、ニワトリDT40細胞を用いて作成したDDB1のコンディショナルノックアウト細胞のDNA損傷応答について解析を行った。まず、ヌクレオチド除去修復能について調べたところ、DDB1の欠失により(6-4)光産物の修復に遅れが見られたが、シクロブタン型ピリミジン二量体の修復に変化は見られなかった。また、ヌクレオチド除去修復以外のDNA損傷応答に関与する可能性について検討するために、DNA損傷を誘起させた後の種々のチェックポイント関連因子の量的および質的な変化を解析した。その結果、DDB1の欠失により紫外線照射後のChk1タンパク質の量が変化することはなかったが、345番目のセリンのリン酸化がDDB1欠失時に弱く、その消失も早かった。また、エトポシド処理によるChk1タンパク質のプロテアソーム依存的な分解が報告されていたが、DDB1欠失時では、その減少が有意に低下することがわかった。したがって、DNA損傷の種類によって反応は異なるものの、DDB1がChk1の制御に関与している可能性が示唆された。
NASH由来肝細胞癌における腸内細菌の役割を検討する

非アルコール性脂肪肝炎(NASH)由来肝細胞癌(HCC)の病態進展機序における腸内細菌及び腸管由来エンドトキシン(ET)の役割を検討する。1)ヒトNASH類似HCCモデルマウスの便メタゲノム解析:NASH由来HCCモデルマウスの便及び非HCCマウスの便検体を用いて、NGS(Illumina MiSeq)を用いたメタゲノム解析を行ったところ、ヒトHCC患者同様、HCCモデルマウスの便中では非HCCマウスに比しFaecalibacteriumの占拠率が低下していた。2)ヒトNASH類似HCCモデルマウスへのFecalibacterium投与による検討;NASH由来HCCモデルマウスに対してゾンデを用いて経口投与を行ったところ、腸管透過性が改善し、HCCの個数の減少及び大きさの低下を認めた。本年度では、NASH由来HCCモデルマウスにおける糞便のメタゲノム解析を行い、NASH由来HCCモデルマウスではヒト同様、Faecalibacteriumが減少することを示した。また、Faecalibacterium投与によりHCCの発生及び進展が抑制できる可能性が示唆された。当初の計画でも平成29年度に、NASH由来HCCモデルマウスにおける便メタゲノム解析及びFaecalibacterium投与実験を予定としていた。ほぼ計画通りに進捗していると考える。NASH由来HCCモデルマウスにおけるFaecalibacterium投与によるHCC抑制効果の機序を解明する;NASH由来HCCモデルマウスに対してゾンデを用いた経口投与によるHCCの抑制効果が腸管透過性の改善によるものかを検討していく。1)NASH由来HCC患者における便メタゲノム解析:NASH由来HCC患者の便検体を用いて、NGS(Illumina MiSeq)を用いたメタゲノム解析を行い、HCC患者の便中には非HCC患者及び非NASH由来のHCC患者に比しFaecalibacteriumの占拠率が低下していた。2)ラクツロース・マンニトール試験による腸管透過性の評価;NASH由来HCC患者に対してラクツロース・マン二トール試験を10例で行った。非HCC患者及び非NASH由来のHCC患者に比し、腸管透過性亢進が示唆された。また、血中ET活性は腸管透過性と相関していた。本年度では、ヒトNASH由来HCC患者における糞便のメタゲノム解析を行い、NASH由来HCC患者では特定の腸内細菌の異常、特にFaecalibacteriumが減少することを示した。Faecalibacteriumは腸管壁のバリアに関与しており、Faecalibacteriumが低下することで腸管透過性が亢進し、血中ET活性が亢進することで炎症などを開始、HCCを増悪させる可能性が示唆された。当初の計画でも平成29年度に、NASH由来HCC患者における便メタゲノム解析及びラクツロース・マンニトール試験による腸管透過性の検討を予定としていた。NASH由来HCCモデルマウスとして, high fat diet(HFD)及びdiethylnitrosamine(DEN)をB6マウスへ投与したモデル及び遺伝子改変マウス[レプチン欠乏fatty liver shionogi(FLS)マウス]を用いる.これら二つのマウスモデルは肥満及びHCCを呈し、ヒトNASHに類似することが報告されている。平成30年度はこのヒトNASHに近いマウスモデルに対して便メタゲノム解析を行い、非発がんマウス(HFD単独マウス及び普通食マウス)と比較することで便中細菌叢の分布の違いを検討する。また、平成31年度にはヒトNASH類似HCCモデルマウスにおける腸管透過性の検討も行う予定である。
ペプチド・ビルトイン型キノン補酵素の生合成機構と触媒機能

本研究は、水溶性ビタミンに由来する従来の補酵素と異なり、タンパク質の翻訳後修飾反応により形成されるビルトイン型キノン補酵素に焦点を当て、チロシン残基から生成するトパキノン(TPQ)補酵素と銅イオンとを活性部位に含む銅アミン酸化酵素の触媒機能、並びにキノヘムプロテイン・アミン脱水素酵素(QHNDH)における新規キノン補酵素、システィントリプトフィルキノン(CTQ)の生合成機構の解明を目的とした。銅アミン酸化酵素の触媒機構に関しては、トパキノンの構造変化を伴う前半の還元的半反応機構の詳細を明らかにした。QHNDHの生合成に関しては、酵素サブユニット遺伝子の近傍にコードされている[Fe-S]クラスター含有タンパク質とズブチリシン様プロテアーゼが必須の役割を担うことを証明した。本研究では、酵素タンパク質中の芳香族アミノ酸残基がキノン化合物に酸化修飾されて生成するペプチド・ビルトイン型補酵素に焦点を当て、それらを含む酵素の精密構造や触媒機能、並びにタンパク質の翻訳後にどのような機構で生合成されるか(cofactor biogenesis)を立体構造に立脚して明らかにすることを主な目的としている。(1)トパキノン補酵素の触媒機能解析トパキノン補酵素を含有する銅アミン酸化酵素の触媒反応機構の詳細を明らかにするため、立体特異的に安定同位体標識したアミン基質を用いた還元的半反応の立体化学的解析、微量ストップトフロ-分光光度計を用いた前定常状態の反応速度論的解析、各種の変異型酵素の機能解析、反応中間体の精密立体構造解析などを行う。(2)キノヘムプロテイン・アミン脱水素酵素の補酵素生成機構の解析キノヘムプロテイン・アミン脱水素酵素に含まれるビルトイン型キノン補酵素、システイントリプトフィルキノン(CTQ)並びに分子内チオエ-テル架橋構造の形成機構を解明するため、オペロン中に含まれる各遺伝子の破壊とプラスミド導入による機能回復、各種変異型酵素の作製と質量分析計を用いる各サブユニット・ポリペプチドの翻訳後修飾の解析などを行う。1.銅/トパキノン含有アミン酸化酵素の触媒機能解析土壌細菌由来の銅/トパキノン含有アミン酸化酵素の活性部位アミノ酸残基の機能を、部位特異的変異導入と変異型酵素のX線結晶構造や反応速度論的・分光学的性質に基づいて解析し、(1)活性部位のAsp298残基が基質-補酵素間シッフ塩基のα-プロトンを引き抜く触媒塩基であるとともに、同反応中間体の形成や生成物シッフ塩基の加水分解にも関与することを証明し、(2)還元的半反応における反応中間体のX線結晶構造を銅含有アミン酸化酵素で初めて決定し、基質のα-プロトン引き抜きの立体特異性を反応中間体の構造から説明できることを明らかにした。さらに、(3)活性部位近傍の疎水性ポケットを構成するアミノ酸残基への変異導入によりトパキノン補酵素の自己触媒的生成の反応速度が低下し、この領域は酸素チャンネルとして機能していると推定した。2.キノヘムプロテイン・アミン脱水素酵素の活性発現機構グラム陰性細菌由来のキノヘムプロテイン・アミン脱水素酵素は、ヘテロ三量体構造を有し、最も小さなγ-サブユニット中に新規キノン補酵素のシステイントリプトフィルキノン及びCys残基とAsp残基あるいはGlu残基間の分子内チオエーテル結合を含んでおり、これらの複雑な構造はタンパク質の翻訳後修飾により生成するがそれらの生成機構は未解明である。本研究では、これらの翻訳後修飾に関与すると考えられる新規な鉄硫黄タンパク質に着目し、その役割について生化学的・分子生物学的な方法を用いて検討を加えた。その結果、この鉄硫黄タンパク質がγ-サブユニットの翻訳後修飾に必須の役割を果たしていることを明らかにした。また、詳細な質量分析の結果から、このタンパク質が欠損するとγ-サブユニットは全く翻訳後修飾を受けないことが明らかになった。銅含有アミン酸化酵素は、種々の一級アミン類の酸化的脱アミノ反応を触媒する酵素であり、多くの動植物、微生物に存在している。本酵素の活性中心には2価銅イオンとビルトイン型キノン補酵素TPQを含有する。我々はこれまでに、前駆体タンパク質中のTyr残基が銅イオンの存在下で自己触媒的に酸化されてTPQに変換されることを明らかにしてきた。一方、コラーゲンやエラスチンなどのタンパク質中のLys残基を酸化して分子間架橋反応を触媒するペプチジルリジン酸化酵素にも、Tyr残基由来のキノン型補酵素(LTQ)が見いだされている。LTQは、キノン環のC-2位に同一タンパク質内のLys残基のアミノ基が共有結合して分子内架橋構造をとっている点でTPQと異なる。

本年度は、LTQの生成機構を解明する手がかりを得ることを目的として、銅アミン酸化酵素の触媒基であるAsp残基(D298)を部位特異的変異導入によりLys残基に置換し、キノン補酵素生成に及ぼす影響を検討した。均一に精製したD298K変異型酵素の前駆体タンパク質を中性pH、好気的条件下で銅イオンと反応させたところ、反応の初期過程ではTPQに由来する485nmの吸収ピークを示す野生型酵素と同様のスペクトルを生成したが、時間とともに吸収ピークは短波長側(450nm)にシフトした。また、pH10以上の溶液中では、長波長側(525nm)に吸収ピークをもつ発色団が生成した。450nmの発色団は、キノン染色で検出されることから何らかのキノン化合物であると考えられた。さらに、共鳴ラマンスペクトルはTPQとかなり異なり、むしろLTQに近かった。これらの結果より、D298K変異型酵素ではK298のε-アミノ基がドパキノン中間体またはTPQのC-2位を攻撃してLTQもしくはLTQに類似したキノン体を生成すると考えられた。銅アミン酸化酵素はビルトイン型キノン補酵素の一種、トパキノン(TPQ)と2価銅イオンを活性部位に含有し、一級アミン類の酸化的脱アミノ反応を触媒する。本酵素の触媒過程はping-pong機構で進行し、前半の還元的半反応においては、基質アミンはTPQのC-5位のカルボニル炭素に結合し、基質-TPQシッフ塩基(SSB)を形成する。次いで、活性部位の触媒塩基(保存性Asp残基)により基質のα位炭素から立体特異的にプロトンが引き抜かれ、生成物-シッフ塩基(PSB)が形成される。我々は、これまでに土壌細菌Arthrobacter globiformis由来の銅アミン酸化酵素(AGAO)を用い、本酵素反応における基質アミンのα-水素の引き抜きに対する立体特異性について検討し、本酵素反応ではpro-S水素が立体特異的に引き抜かれることを明らかにした。本年度は、大きな遠位部分をもたない基質であるエチルアミンの2個のα-水素を立体特異的に重水素標識し、AGAOによるα-水素引き抜きの立体選択性を解析した。その結果、フェニルエチルアミンやチラミンなど大きな遠位部分(ベンゼン環)をもつ基質の反応においては、α-水素の引き抜きがいずれも99%以上の高い立体選択性でpro-S水素特異的に進行するのに対し、エチルアミンではpro-S水素選択性が86%にまで低下していた。また、エチルアミンを用いて得られたSSBのX線結晶構造では、SSBに相当する部分の電子密度が非常に低く、コンフォメーションが一定ではないことが示唆された。以上の結果より、銅アミン酸化酵素によるα-水素の引き抜きの立体選択性はSSBのコンフォメーションにより一義的に決定されると考えられた。1.銅アミン酸化酵素の精密触媒機構の解析トパキノン補酵素を含有する銅アミン酸化酵素の触媒反応はPing-Pong機構で進行し、第一生成物のアルデヒドと基質由来のアミノ基がキノン環に結合した2電子還元型のアミノレゾルシノール型トパキノンが生成する前半の還元的半反応と、還元型トパキノンと分子状酸素との反応により過酸化水素とアンモニアが生じ、酸化型トパキノンが再生される後半の酸化的半反応とから成り立っている。
ステロイドのヒスタミンH1受容体遺伝子発現抑制の分子機構解明

H1R遺伝子発現シグナルとステロイドシグナルに共通のシグナル分子としてヒートショック蛋白90(Hsp90)を同定した。本課題では、ステロイド及びH1R遺伝子発現抑制化合物マーキアインのH1Rシグナル及びステロイドシグナルへの影響について検討した。その結果、ステロイドのH1Rシグナル抑制効果は動物実験での結果ほど明確ではなかった。一方、マーキアインはステロイドシグナルを介した抗炎症性遺伝子発現を増強した。以上の結果から、ステロイドのH1Rシグナル抑制効果は間接的であり、また、マーキアインはヒスタミンシグナルの抑制に加えステロイドの抗炎症作用の増強により抗アレルギー効果を示すことが明らかとなった。(1) H1R遺伝子発現抑制化合物のHsp90阻害機序の解明Hsp90阻害薬のゲルダナマイシンは、Hsp90のATP結合部位に結合することで、Hsp90を阻害する。(-)マーキアインはHsp90とゲルダナマイシンの結合に対し競合したが、そのIC50値(IC50 = 11 μM)はATP結合部位に結合することが知られている別のHsp90阻害薬の17-AAGのIC50値(IC50 = 0.64 μM)よりも17倍大きかった。このことから、(-)マーキアインがHsp90のATP結合部位ではなく、その近傍に結合することが明らかとなった。また、(-)マーキアインはHsp90のATPアーゼ活性を阻害しなかった。以上の結果から、(-)マーキアインはゲルダナマイシンや17AAGとは異なる結合様式でHsp90に結合し、PKCδとHsp90との相互作用を阻害することが明らかとなった。(2) Hsp90を標的とする天然物由来H1R遺伝子発現抑制化合物のステロイドシグナルへの影響ステロイド受容体(GRα)は刺激のない状態ではHsp90と結合して細胞質に安定に存在する。この結合をHsp90阻害薬の17-AAGにより阻害するとGRαは分解される。しかし、(-)マーキアイン処理によりHsp90は分解されなかった。また、ステロイド刺激に伴い、GRα/ステロイド複合体は核内へ移行するが、(-)マーキアインは、GRαの核内移行を抑制しなかった。さらに、GREを組み込んだレポータープラスミドをHeLa細胞にトランスフェクションし、デキサメタゾン刺激に伴うルシフェラーゼ活性上昇への(-)マーキアインの影響を検討した結果、(-)マーキアインはGRαの転写活性を促進することが明らかとなった。(-)マーキアインはHsp90とPKCδの相互作用を阻害する。このことから、(-)マーキアインはHsp90とGRαとの結合を阻害することが予想され、(-)マーキアイン処理により、ステロイドシグナルが抑制されると言う仮説を立てていた。しかし、本年度の成果により、(-)マーキアインがGRαの転写活性を促進し、ステロイドシグナルを活性化することを見出した。ステロイドは、様々なアレルギー疾患の治療に用いられているが、その副作用が問題となっている。(-)マーキアインがステロイドの効果を増強することから、(-)マーキアインとステロイドを併用することで、ステロイド投与量を減少でき、より副作用の少ない治療薬の開発につながるものであると考えた。デキサメタゾンのヒスタミンH1受容体遺伝子発現への影響を検討したところ、ステロイドの濃度により遺伝子発現を抑制したり上昇させるという二面的な効果があることがわかった。しかし、動物実験で得られたヒスタミンH1受容体遺伝子発現効果と比較してその効果は顕著でなかった。これは、in vivoにおいてはステロイドがヒスタミンーサイトカインネットワークなどにおいてヒスタミンH1受容体遺伝子だけでなく、サイトカイン遺伝子の発現にも影響した相乗効果が見られているためと考えられた。また、ステロイドシグナルの抗アレルギー効果は大きく分けて(1)ステロイド受容体・ステロイド複合体の2量体がGREに結合し転写活性を上昇または抑制するシグナル、(2)単量体ステロイド受容体・ステロイド複合体がAP-1などの転写活性を抑制することによる。本年度の成果により、(2)に対してはマーキアインの影響はないことが明らかとなった。ステロイドシグナルの抗アレルギー効果は大きく分けて(1)ステロイド受容体・ステロイド複合体の2量体がGREに結合し転写活性を上昇または抑制するシグナル、(2)単量体ステロイド受容体・ステロイド複合体がAP-1などの転写活性を抑制することによる。今後(1)に対するマーキアインの効果について明らかにしていきたいと考える。ヒスタミン/PMA刺激に伴うヒスタミンH1受容体(H1R)遺伝子発現亢進を抑制する和漢薬苦参由来抗アレルギー性化合物として(-)マーキアインを単離・同定し、その分子機構が(-)マーキアインがヒートショックタンパク90(Hsp90)と結合し、H1R遺伝子発現のキーとなるPKCδとHsp90の相互作用の阻害であることを明らかにした。この結果は、(-)マーキアインがHsp90により調節されるステロイドシグナルにも影響を及ぼす可能性を示唆した。実際、アレルギーモデル動物において、ステロイドはH1R遺伝子発現を抑制し、アレルギー症状を改善することを見出している。これまでに、ルシフェラーゼアッセイにおいて、デキサメタゾン刺激に伴うグルココルチコイド応答配列(GRE)の活性化を(-)マーキアインが増強することを見出した。そこで、GREにより調節される遺伝子としてステロイドによる抗炎症作用を引き起こすタンパクの一つであるDUSP