hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
癌関連網膜症発症機序における関連因子の細胞内ネットワークの検討

癌患者の一部に腫瘍組織と神経組織に共通抗原が生じるためこれらに自己免疫を獲得し、種々の神経障害を呈するparaneoplastic syndrome(PNS)が知られている。このうち癌関連網膜症(CAR)では、同様の機序で網膜に対する自己免疫を獲得し、網膜色素変性様の進行性の網膜変性をきたす疾患であり、未だ有効な治療のない難病である。CAR患者血清中には網膜視細胞に特異に発現し、明暗順応を制御するCa2+結合蛋白質リカバリン(Rec)等の網膜抗原に対する自己抗体が報告されている。以前我々は、細胞中でRecがG蛋白共役受容体キナーゼ(GRK)およびカベオリンー1(Cav-1)と共役していることを見出した。中でもCav-1は癌細胞の増殖、転移および薬物抵抗性の制御にかかわる重要な因子である。興味深いことに視細胞中でRecと共役するロドプシンキナーゼはGRKファミリーに属する(GRK-1)ことからRecが視細胞では明暗順応に働き、一方でRecが癌細胞中で他のGRKおよびCav-1と共役することで癌細胞自体の増殖、転移および薬物抵抗性に影響を与えることが示唆された。これらの事実は、一方でRecがもともと存在する視細胞の中で単にロドプシンキナーゼを介した明暗順応の制御以外にCav-1を介した別の機序にも係わる可能性を示唆するものである。従って癌関連網膜症(CAR)では腫瘍に異所性発現した視細胞特異蛋白リカバリン(Rec)に対する自己抗体が産生され、血液循環で網膜まで運ばれ最終的に視細胞に取り込まれることで発症すると考えられている。我々は先にこれらの機序にG蛋白共役受容体キナーゼ(GRK)およびカベオリンー1(Cav-1)の関与が強く考えられる。しかし細胞内でRec、GRKおよびCav-1がどのような分子機構でCARを発症させるかは不明である。そこで本研究課題では以下の2点に的を絞り検討を行った。(1)腫瘍細胞におけるRec、GRKおよびCav-1の相互作用(2)網膜視細胞におけるRec、GRKおよびCav-1の相互作用癌関連網膜症(CAR)では腫瘍に異所性に発現した視細胞特異蛋白リカバリン(Rec)に対して血液中に自己抗体が産生され、これが視細胞に取り込まれることで発症すると考えられている。我々は先にこれらの機序にG蛋白共役受容体キナーゼ(GRK)およびカベオリンー1(Cav-1)の関与を示唆した。しかし細胞内でRec、GRKおよびCav-1がどのような分子機構でCARを発症させるかは不明のままである。そこで本研究課題では以下の2点に的を絞り検討を行う。1)腫瘍細胞におけるRec、GRKおよびCav-1の相互作用2)網膜視細胞におけるRec、GRKおよびCav-1の相互作用すでに応募者らの研究グループは、パイロット的な検討により、Recを異所性発現していない肺腺癌由来のcell lineであるA549細胞にヒトRec cDNAを発現させたA549R細胞を調整し、両者の細胞増殖能を比較検討したところA549RがA549に比べて増殖のスピードが約半減することを見出した(Cancer Res 2000;60:1914-1920)。さらに両者の細胞を持いて種々抗がん剤に対する感受性を比べたところやはりA549RがA549に比べて抗がん剤に対する感受性が高まっていることを見出した(Ophthalmic Res. 2010;43:139-144)。今回これらの現象がRec、GRKおよびCav-1のネットワークのどのステップで生じる現象であるかについて検討する目的で、Recを異所性発現している種々のcell lineを用いてRec、GRKまたはCav-1の機能をそれぞれのSiRNAを用いてknockdownさせ細胞増殖能および抗がん剤への感受性を検討した。おおむね順調に進展しているのでこのまま計画通り研究進める。癌関連網膜症(CAR)では腫瘍に異所性に発現した視細胞特異蛋白リカバリン(Rec)に対して血液中に自己抗体が産生され、これが視細胞に取り込まれることで発症すると考えられている。そこで本研究課題では1)腫瘍細胞におけるRec、GRKおよびCav-1の相互作用および2)網膜視細胞におけるRec、GRKおよびCav-1の相互作用について研究を行っている。すでに応募者らの研究グループは、パイロット的な検討により、Recを異所性発現していない肺腺癌由来のcell lineであるA549細胞にヒトRec cDNAを発現させたA549R細胞を調整し、両者の細胞増殖能を比較検討したところA549RがA549に比べて増殖のスピードが約半減することを見出した(Cancer Res 2000;60:1914-1920)。

今回これらの現象がRec、GRKおよびCav-1のネットワークのどのステップで生じる現象であるかについて検討する目的で、昨年度までに網膜視細胞においてRecはカルシウム依存的にロドプシンリン酸化を触媒するロドプシンキナーゼの活性を制御することにより視細胞の光感受性を変える、即ち光順応の機構がもたらされると考えられている。これらRecが本来持つ光情報伝達機序に対してGRKやCav-1がどのように係わるかについて検討するもの目的でGRK-2欠損マウスおよびCav-1欠損マウスを用いて以下に示す視細胞ロドプシンサイクルの各段階の反応がどのようになるかについて生化学的手法を用いて検討した。本研究で使用するGRK-2欠損マウスおよびCav-1欠損マウスの入手に時間がかかっているため別の方法による検討方も考慮しているため。癌患者の一部に腫瘍組織と神経組織に共通抗原が生じるためこれらに自己免疫を獲得し、種々の神経障害を呈するparaneoplastic syndrome(PNS)が知られている。このうち癌関連網膜症(CAR)では、同様の機序で網膜に対する自己免疫を獲得し、網膜色素変性様の進行性の網膜変性をきたす疾患であり、未だ有効な治療のない難病である。CAR患者血清中には網膜視細胞に特異に発現し、明暗順応を制御するCa2+結合蛋白質リカバリン(Rec)等の網膜抗原に対する自己抗体が報告されている。以前我々は、細胞中でRecがG蛋白共役受容体キナーゼ(GRK)およびカベオリンー1(Cav-1)と共役していることを見出した。中でもCav-1は癌細胞の増殖、転移および薬物抵抗性の制御にかかわる重要な因子である。興味深いことに視細胞中でRecと共役するロドプシンキナーゼはGRKファミリーに属する(GRK-1)ことからRecが視細胞では明暗順応に働き、一方でRecが癌細胞中で他のGRKおよびCav-1と共役することで癌細胞自体の増殖、転移および薬物抵抗性に影響を与えることが示唆された。これらの事実は、一方でRecがもともと存在する視細胞の中で単にロドプシンキナーゼを介した明暗順応の制御以外にCav-1を介した別の機序にも係わる可能性を示唆するものである。従って癌関連網膜症(CAR)では腫瘍に異所性発現した視細胞特異蛋白リカバリン(Rec)に対する自己抗体が産生され、血液循環で網膜まで運ばれ最終的に視細胞に取り込まれることで発症すると考えられている。我々は先にこれらの機序にG蛋白共役受容体キナーゼ(GRK)およびカベオリンー1(Cav-1)の関与が強く考えられる。しかし細胞内でRec、GRKおよびCav-1がどのような分子機構でCARを発症させるかは不明である。そこで本研究課題では以下の2点に的を絞り検討を行った。(1)腫瘍細胞におけるRec、GRKおよびCav-1の相互作用(2)網膜視細胞におけるRec、GRKおよびCav-1の相互作用おおむね順調に進展しているのでこのまま計画通り研究進める。平成30年度の実験計画として網膜視細胞におけるRec、GRKおよびCav-1の相互作用の検討を行う。癌関連網膜症では血清中にRecに対する自己抗体が産生されそれが視細胞に取り込まれることで上記で示すようにRecのもつ生理機能を遮断することで視細胞死に至ることが知られている。しかしこの抗Rec抗体がどのような機序で視細胞に取り込まれるか不明である。今回作業仮説として細胞外からexocytosisで物質の取り込みに関連するCav-1とRecが相互作用することで抗体が取り込まれる可能性が最も考えられる。
平均化法によるサブバンド適応フィルターとマイナー成分分析アルゴリズムの解析

サブバンド適応フィルタを用いたシステムではレート変換や分析フィルタが存在するため、時間領域において平均化法を直接適用し解析することは難しい。そこで適応アルゴリズムに離散フーリエ変換を適用し、アルゴリズムを周波数領域表現に変換した後平均化法を適用する解析手法を新たに開発した。本手法を、アダマール変換を用いた遅延のないサブバンド適応フィルタ(DLSADF)およびPradhanとReddyにより提案された新しい構成のサブバンドフィルタ(SADF)に適用しそれぞれのアルゴリズムの基本的な性質を調べ以下の結果を得た。1.アダマール変換を用いたDLSADFの安定条件を調べたところ、遅い収束の原因となるモードが存在することがわかった。2.アダマール変換を用いたDLSADFにおける誤差信号の分散を評価する式を理論的に導出した。3.同様の解析方法をPradhanのSADFに適用し、そのアルゴリズムは常に安定であることを示した。また、フルバンド適応フィルタと比較して誤差信号の分散が減少することを示した。また、Douglasらにより提案された単一マイナー成分分析のアルゴリズムを基に、デフレーションとグラムシュミットの直交化法を組み合わせることにより、複数のマイナー成分を抽出するアルゴリズムを提案し、その性能解析をODE法を用いて行った。その結果以下のことが明らかになった。1.提案アルゴリズムは常に安定であることを示した。2.抽出されたマイナー成分の共分散行列を理論的に評価した。このときリャプノフ方程式を解く必要があるが、不定項が現れる。そこで適切な拘束条件を導入することにより解が得られることを示した。以上の結果をまとめて現在専門誌に投稿中である。以下2つの場合に分けて研究実績の概要を述べる.1アダマール変換を用いた遅延なしサブバンド適応フィルタの収束解析サブバンド適応フィルタにはレート変換や分析フィルタなどが含まれており,通常のフルバンド適応フィルタに比較して複雑な構成である.このため直接時間領域で解析することは一般に難しい.そこで離散フーリエ変換行列を適応フィルタのタップベクトルに作用させ,周波数領域表現に変換しその後平均化法を適用するという手法を開発した.その解析結果から,適応アルゴリズムの安定条件,ステップサイズの上限,誤差信号の分散等,アルゴリズムの基本的な特性を理論的に明らかにすることが出来た.これらの結果は国際会議ICASSP2000にて発表された.2複数のマイナー成分分析アルゴリズムの性能解析Douglasらにより提案されている単一のマイナー成分を抽出するアルゴリズムを基に,デフレーションとグラムシュミットの直交化法を組合せ複数のマイナー成分を抽出する適応アルゴリズムを提案した.提案手法に対し,ODE法を適用し解析を行った.その結果本手法は常に安定なアルゴリズムであることが明らかになった.また抽出したマイナー成分に対する共分散行列を理論的に評価しその正当性をシミュレーションにより確認した.これらの結果は国際会議EUSIPCO2000にて発表された.サブバンド適応フィルタはマルチレート系であるので平均化法を直接適用し解析することは難しい。そこで離散フーリエ変換を用いて適応アルゴリズムを周波数領域表現に変換した後、平均化法を適用する手法をすでに発表した(Proc.ICASSP2000)。今年度は本手法をPradhanとReddyによって提案された新しい構成のサブバンドフィルタに適用し、その性能解析を行った。その結果、分析フィルタと適応フィルタを更新するときに用いる各サブバンド信号に対する重み係数の効果により、従来の手法と比較して入力信号が有色であっても定常状態における誤差信号の分散が減少することを理論的に示すことができた。また昨年度に引き続き遅延のないサブバンド適応フィルタの解析も行い、これらのアルゴリズムについて性能比較を行った結果をまとめて現在専門誌に投稿中である。さらに本手法は従来ほとんど解析されていないフィードバック型ANCシステムなどに適用可能であり、これについては現在検討中である。昨年度に引き続き、複数のマイナー成分を抽出するアルゴリズムの性能について検討した。

昨年度の研究より単一のマイナー成分分析のアルゴリズムとしてDouglasらにより提案されたアルゴリズムが有効な手法の一つであることがすでにわかっている。このアルゴリズムを基礎にして、デフレーションとグラムシュミットの直交化法を組み合わせることにより複数のマィナー成分を抽出するアルゴリズムを提案した。提案されたアルゴリズムを用いて抽出されたマイナー成分の共分散行列をODE法により理論的に解析する際リアプノフ方程式を解く必要があるが、単一マイナー成分分析の場合と異なり不定項が現れる。そこでマイナー成分に対する拘束条件を適切に導入することにより、見通しのよい解法となるように工夫した。これらの結果をまとめて現在専門誌に投稿中である。
先史時代から国家成立期における暴力の文化的背景

ここでは、文献調査及び実見調査から古人骨データおよび埋葬のデータを集成し、これに基づいて、暴力の規模と受傷者の取り扱いについて定量的に分析・検討にする。文献からのデータ集成は、すでに縄文時代・弥生時代の古人骨についてはおおよそ目途がついているため、残る古墳時代の文献からのデータ集成を1年目に行う。加えて、実見での調査も同時並行で行う。これらのデータがそろい次第、分析・検討を進める。2年目は暴力の性格と暴力の生成要因についての検討を行う。国内外の研究を整理したうえで、自身の分析結果と照合し、国内資料の暴力の性格・生成要因を考察する。これらの研究成果は適宜論文や関連学会で発表する。
刑事司法制度における再犯防止概念の再検討と福祉的ダイバージョンの研究

福祉が起訴猶予や執行猶予になった者の更生支援を担うようになると、その監督的役割を刑事司法にも求める主張がでてくる。しかし、福祉が本人の任意性を前提としている限り、刑事司法が福祉へ介入することは自ずと制限され、また、福祉が再犯防止という刑事司法的視点を自らに取り込むことにも慎重でなければならない。再犯防止の概念は本人支援と社会防衛の両者を内包しており、その用い方によっては、視点が本人支援から社会防衛へと容易に転換しうるからである。それゆえ、福祉の刑事司法化をもたらさないためにも、福祉は刑事司法との関係において対等性・独立性を失ってはならない。(1)理論的検討ダイバージョンの中で福祉的支援を活用することが求められるようになった。従来のダイバージョンは被害者への慰謝や本人の反省といったものが重視されてきたが、むしろ近時は本人の社会復帰や生活再建が重視される傾向にある。再犯防止概念の再検討も踏まえ、本人の立ち直りに資するようなダイバージョンの在り方を検討する必要がある。実際の事例では、福祉機関が再犯防止を担うような状況もみられる。例えば、福祉関係者の中には保護観察付執行猶予で福祉を受けることを義務付けてもらった方がよい、といった見解も見られる。南高愛隣会の研究成果等も参照しつつ、福祉的ダイバージョンの「あるべき方向性」を示すことの必要性を確認した。そのための文献収集を行った。(2)地域生活定着支援センター等の実態調査(1)国内調査長崎、栃木、大阪、滋賀の各定着支援センターを訪問し、質問票に基づいてヒアリングを行った。この中で、定着支援センターの業務は出所者支援が中心とされているが、被疑者・被告人段階から支援を行っていくことの重要性が明らかになった。また、高齢者・障害者による事件で福祉との連携を考慮した事例を経験した弁護士からヒアリング調査を行った。(2)国外調査フランスのトゥールーズ管区保安病院、ミュレ拘禁センター、トゥールーズ刑罰センター、矯正研修所、依存症アソシエーション、刑罰センター、2年以下の短期刑務所、Maison d'arret、Mission Localeなどの訪問、刑罰適用判事、SPIPへの聞き取りなどを行った。本研究の最終年度である平成25年度においては、これまでの研究及び調査を総括し、順次その成果を公表した。1刑事司法と福祉の連携のあり方について研究成果を発表した。犯罪社会学会のシンポジウム「更生保護:社会復帰支援の現状と課題」を企画・報告し、国立のぞみの園でも講演した。福祉が本人の任意性を前提としている以上、刑事司法が福祉へ介入することは自ずと制限され、また、福祉が再犯防止という刑事司法的視点を自ら取り込むことにも慎重でなければならない。再犯防止の概念は本人支援と社会防衛の両者を内包しており、その用い方によっては、視点が本人支援から社会防衛へと容易に転換しうるものであることから、福祉の刑事司法化をもたらさないためにも、福祉は刑事司法との関係において対等性・独立性を失わないようにすべきだと主張した。2刑の一部執行猶予制度の運用上の問題点に関する大阪弁護会主催のシンポジウムにおいて研究成果を報告した。猶予期間を無事経過した場合に刑の言渡し自体の効力がなくなる本来の執行猶予と、今回導入された一部執行猶予制度との決定的相違を明らかにしたうえで、再犯防止を謳うこの制度に社会復帰のためのグランドデザインが欠けていることを指摘した。3外国調査として、スウェーデンの刑事司法及び関連機関等の調査報告を「龍谷法学」に公表した。また、韓国の保護観察付き起訴猶予について検討した。国内の実態調査として、秋田県地域生活定着支援センターの聞き取り調査を行った。また、定着支援センターの現状と問題点について検討した。4定着支援センター、単位弁護士会、法テラスに対して、ダイバージョンと福祉的措置の関係に関するアンケート調査を実施し、その分析を行った。今年度は、ダイバージョン制度と福祉政策との連携という観点で、非拘禁的措置を拡大する制度や試みについて調査・検討した。刑事司法と福祉、刑事司法と監視(社会防衛、保安処分化)、福祉と監視などの相互関係を意識し、「刑事司法の福祉化」と「福祉の刑事司法化」を区別しつつ、あるべき方向を模索することを目的とした。その際、対象者の監視ではなく、生活支援(物的、精神的サポート)を基軸においた。具体的には、以下の研究及び調査を実施した。1刑の一部執行猶予制度について意見書を取りまとめ、パブリックコメントを提出した。また、第39回日本犯罪社会学会のテーマセッションにおいて、「刑の一部猶予制度」をオーガナイズし研究成果の報告をおこなった。2アメリカ、イギリス、ドイツ、オーストラリアのダイバージョン制度及びフランスの刑罰修正手続について検討した。また、外国調査として、フランス調査及びスウェーデンの刑事司法及び関連機関等の調査を実施した。スウェーデンの調査結果については、次年度の早い時期に大学紀要に公表する予定である。

3国内の実態調査として、滋賀県地域生活定着支援センター、同栃木県定着センター、京都弁護士会、京都シェルター、のぞみの園、ヒューマンハーバー、福岡県就労支援事業者機構、福岡刑務所等の視察および聞き取り調査を実施した。4アンケート調査として、定着支援センター、単位弁護士会、法テラス合計168か所に対して、ダイバージョンと福祉的措置の関係についてプレアンケート調査を実施した。その分析と本調査は次年度の課題とした。理論的・制度的研究では、一定の文献及び資料収集を行うことができた。また、実態調査については、国内の地域生活定着支援センターのヒアリングを行い、また、外国調査として、フランスの調査を行うことができた。本研究に密接に関連する、前年度までの科研費による研究成果として、『非拘禁的措置と社会内処遇の課題と展望』(現代人文社、2012)を出版できたことも考慮すると、おおむね順調に進展しているといえよう。25年度が最終年度であるため、記入しない。1ダイバージョンの制度研究については、比較法的研究として、アメリカ、イギリス、ドイツ、フランス、オーストラリア、スウェーデンについて行うことができた。制度については概要を把握することができたので、その運用実態についてできる限り最新の情報を収集し、論文としてまとめる作業に取りかかっている。2刑事司法と福祉の連携に関する国内実態調査については、上記の通り、視察および聞き取り調査を実施した。これを記録としてまとめるとともに、収集した情報の整理・分析を進めている。また、全国の地域生活定着支援センター、各単位弁護士会、法テラス合計168か所に対してプレアンケート調査を実施した。回収率は43%であった。既にその集約整理と分析を始めている。さらに詳細な情報を得るために、ヒアリング調査を行う機関の選定を行った。3外国の実態調査については、スウェーデンとフランスについて関連機関の視察および聞き取り調査を実施した。そのまとめを行い、公表の準備をしている。4理論的研究としては、再犯防止概念とその施策について、歴史的分析と現状分析に取りくんでいる。この点については、予定よりやや作業が遅れているが、次年度に取り組みを強化する予定である。以上により、本研究の目的に照らして、おおむね順調に進展しているといえる。(1)理論的・制度的研究引き続き、文献及び資料収集を行い、再犯防止概念を再検討するとともに、各国のダイバージョン制度についての調査を行う。(2)実態調査(1)国内調査では、更生保護施設、自立更生促進センター(福島・北九州)、就業支援センター(沼田・茨城)、その他、A-Unit、ほっとポット等の民間団体のヒアリングを行う。(2)外国調査では、昨年のフランスに続き、北欧、ドイツ、イギリス、オーストラリア、アメリカなどのダイバージョンと福祉的支援の関係について調査を行う。(1)実態調査と情報収集・整理
アドレノメデュリン-RAMP2システムの血管内皮細胞での病態生理学的意義の解明

アドレノメデュリン(AM)は、全身の組織で広範に産生され、多彩な生理活性を有するペプチドである。AMノックアウトマウスのホモ接合体(AM-/-)は、心血管系の発生異常により胎生致死となる。我々は、AM-/-が致死となる胎生中期において、GPCR活性調節タンパクであるRAMP2の発現が亢進している事に着目し、RAMP2ノックアウトマウス(RAMP2-/-)を樹立した。その結果、RAMP2-/-では、AM-/-の血管系の発生異常が再現されると共に、AMの代償性の発現亢進が見られることを見出した。このことから、血管におけるAMの主要な機能は、RAMP2により制御されている事が予想される。本研究では、Cre-loxPシステムにより、血管内皮細胞特異的RAMP2ノックアウトマウスを作成し、血管におけるAM-RAMP2系の病態生理学的意義を検討した。血管内皮細胞特異的RAMP2ノックアウトマウス(E-RAMP2-/-)の殆どは出生直前に致死であり、胎生18.5-19.5日にかけて全身性の浮腫とともに、血管の構築異常と出血性変化を認めた。一方で、約5%のE-RAMP2-/-は、正常に生まれ、成体が得られた。成体のE-RAMP2-/-では、血管内皮細胞のRAMP2発現は、野生型の2割程度残存していた。E-RAMP2-/-では、肺、肝臓、腎臓などの主要な臓器の血管周囲に炎症細胞浸潤を認めた。更に、E-RAMP2-/-では、糸球体硬化症の自然発症が認められ、電顕像からは、足突起の融合、基底膜の肥厚、内皮細胞と基底膜の部分的離開などが認められた。以上の結果から、AMの発生における血管新生作用が、RAMP2によって規定されていること、成体においても、AMによる血管保護作用、臓器保護作用がRAMP2によって制御されていることが明らかとなった。
イマチニブ耐性克服にむけた多面的アプローチ

AIDがPhl+ALLにおけるイマチニブ耐性に関与するか否かを検討するため、AIDがレトロウィルスを用いたマウスPhl+急性リンパ性白血病モデルにおいて発症する白血病細胞にAIDが発現されるか否かを検討した。具体的にはBalbcマウスオスより骨髄細胞を採取し、レトロウィルスにてbcr-ablを導入し、同系統のメスに移植した。2-3週後、移植されたマウスは白血病を発症した。解析した3匹のマウスの白血病のうち、2匹に発症したB細胞白血病細胞にAIDの発現をRT-PCRにて確認した。そこで、AIDの発現をなくした場合に、マウスPhl+急性リンパ性白血病がどのような発症変化、および薬剤耐性を示すか否かを検討する目的で、徳島大学ゲノムセンターよりAIDノックアウトマウス骨髄細胞の供与を受け、マゥスPhl+急性リンパ性白血病モデルを作成し、野生型の骨髄細胞を移植した場合との比較を行った。現在までのところ、解析数は少ないが野生型と異なる表現型を示している。今後は解析数を増やして、この表現型の確認実験を行うと共にきその発症機序を解析し、さらにはイマチニブを、腹腔内投与にて行い、AIDノックアウトマウス由来のB細胞白血病と、野生型由来のB細胞白血病において、イマチニブ耐性発症に差を認めるか否かを検討する。更には、差を認める場合、AIDの突然変異誘発作用が関与しているのか否かを含めた、イマチニブ耐性発生メカニズムに対する包括的な解析を行う。
東アジアにおけるリウマチ性疾患の疾患感受性遺伝子の民族差についての研究

日本、韓国、タイ、台湾のリウマチ性疾患の遺伝子要因の共通性と差違を検討する事から疾患の遺伝子背景を明らかにしていく国際共同研究を企画調査する事を本研究は目的とする。そのための共同研究調整会をバンコク、台北、ソウルで各一回行なった。調整会では、1.予定している国際共同研究の目的と概要の説明を行なった。そして2.対象疾患をRA、SLE、PSS、PM/DM、Sjs、Werner症候群と決定した。又、3.臨床像把握のための共通臨床カードの概要を決定した。4.対象遺伝要因としては、既報のものを検討する事とし、HLA、TNF、TAP、DM、CTLA-4既報のマイクロサテライトマーカーをまず検討する事とし、今後協議しながら対象遺伝子を増やしていく事とした。5.自己抗体は、抗DNA、抗Scl-70、抗RNP、抗Sm、抗Jo-1、抗SS-A、抗SS-B、抗RNA polymerase、抗核抗体をまず検討し、標準サンプルを作成し、手法を共通化する事とした。さらに6.データーべースの共通化をはかり、共同利用環境を整えるために、情報技術の専門家に加わってもらう事とした。情報技術専門家との共同研究として、データーの統合システムをパイロット的に開発した、7.サンプルの収集法、DNAバンクの樹立、サンプルの輸送法についても協議し、共通の手法を用いる事とした。更に8.今後の国際共同研究のためのスケジュールについて協議した。初年度は基本手技の完成、標準サンプルの作成、サンプリング開始とし、5年間をめどに結果をまとめる事とした。9.研究資金調達法として、国内の研究補助金を得る事と、国際共同研究のための補助金に応募する事とした。10.成果の公表法としての成果は、各国で順に発表していく事とした。各国の専門家とも、国際共同研究に賛同した。尚上記4、5のためにHLA、CTLA-4、自己抗体測定についてパイロット研究を行なった。その結果の一部の発表とWerner症候群の紹介を調整会で行ない、説明の補助とした。
ユビキチンとプロテアソームによる蛋白質分解研究

プロテアソーム(真核生物のATP依存性プロテアーゼ複合体)はユビキチン(蛋白質分解のマーカー分子)で修飾された蛋白質を選択的に分解する大掛かりな細胞内装置であり,多様な生体反応を迅速に、順序よく、一過的にかつ一方向に決定する合理的な手段として生命科学の様々な領域で中心的な役割を果たしている。当該研究グループはユビキチン・プロテアソームシステム(UPS)について、分子から個体レベルまで四半世紀以上の長期間に亘り、包括的に研究してきた。さて本課題の"ユビキチンとプロテアソームによる蛋白質分解研究"におけるプロテアソーム研究にっいては、巨大な多成分複合体としての立体構造の解析、分子集合機構の解明(プロテアソーム会合シャペロンPAC1/2複合体の発見とHsp90の役割の解明)、活性化因子PA28αβγの免疫遺伝学的解析等をメインテーマとして行った。またユビキチン研究としては、細胞機能制御を司るユビキチン連結酵素(リガーゼ)についてParkin(家族性パーキンソン病の原因遺伝子産物),CHIP(シャペロン依存性リガーゼ),SCF^<Fbs>ファミリー(ERADに関わる糖鎖識別リガーゼ)に焦点をあて、その詳細な機能解析を行った。さらにオートファジー(自食作用)の発生工学的解析やユビキチン関連モディファイヤーシステムであるNEDD8・Ufm1に関する研究も併せて推進してきた。これらの研究成果は,生命の謎を解くためのヒントとなるばかりでなく、新しい生命科学の創成に連なることが期待される。そして細胞内におけるUPSの破綻が、21世紀の高齢化社会に入り急増している様々な重篤疾病(癌・神経変性疾患・自己免疫病等)の発症と関係する知見が増加の一途を辿っている現状を踏まえると、本研究成果は病気から健康を守る研究の基盤となると考えられる。本研究はユビキチン(タンパク質に分解シグナルを付与する翻訳後修飾分子)とプロテアソーム(真核生物のATP依存性プロテアーゼ)に関する包括的研究を行うものである。ユビキチンプロテアソームシステムによる選択的なタンパク質分解は、生物における「高次機能の制御」や「環境ストレスに応答した恒常性の維持」に必須な役割を果たしている。本年度のプロテアソーム研究における主な研究成果としては、γ型インターフェロンで誘導されるプロテアソーム活性化因子PA28(αとβのヘテロ多量体)をコードするαとβの遺伝子を同時に欠失させたダブルノックアウトマウスを作製して解析した結果、内在性抗原のプロセシング提示機構がPA28に依存する経路と依存しない経路に大別できることが世界ではじめて明らかになったことが挙げられる。一方のユビキチン研究では,細胞内タンパク質の代謝的安定性の鍵を握るユビキチン連結酵素(E3)を中心に多面的に解析した。中でも代表的なRING-finger型E3であるSCF(Skp1-Cul1-F-box protein-Roc1複合体)リガーゼ(細胞周期やシグナル伝達を調節するキー酵素)についてNEDD8(ユビキチンに類似したモディファイヤー分子)による活性化機構を解明すると共にNEDD8システムの発生工学的解析を行い高等動物(マウス)における生理的重要性を明らかにした。また、U-box(E3の触媒部位であるRING-fingerドメインと類似の構造)をもったCHIPが分子シャペロン(Hsc70やHsp90)と連携して変性(異常)タンパク質を選択的にユビキチン化することを見出し、"品質管理リガーゼ"という不良品の処理に携わるE3の概念を提唱した。

これらの研究成果は、ユビキチンプロテアソームシステムが免疫病・癌・神経変性疾患などの様々な病気の原因解明と発症阻止に向けた新しい創薬研究の有力な手段となる可能性を示唆しており、人間の健康を守る新しい生命科学の発展に大きく寄与する研究成果と考えられる。我々はユビキチン・プロテアソームシステムの包括的研究を進めており、本年度における研究成果の概要を記す。(1)高等動物における20SプロテアソームのX線結晶構造解析により、立体構造を解明した。この結果から、免疫プロテアソームの機能変換機構が解明できた。(2)内在性抗原のプロセシング提示経路にプロテアソーム活性化因子PA28と分子シャペロンであるHsp90が代償的に作用していることを突き止めた。(3)糖蛋白質のN-型糖鎖を識別してユビキチン化するユビキチン連結酵素SCF^<Fbx2>を世界で最初に発見し、この酵素がERAD(小胞体関連分解)経路を介した蛋白質の品質管理に関係していることを証明した。またごく最近、Fbx2(基質識別サブユニット)とN-GlycanのX線結晶構造解析に成功し、N-Glycanが分解シグナルとして作用する機構について分子レベルでの解明に成功した。(4)パーキン(常染色体劣性若年性パーキンソン病の原因遺伝子産物)のN末端に存在するユビキチンと相同性の高いUBLドメインの立体構造をNMRで解明すると共に、パーキンがこのドメインを介して26Sプロテアソーム(真核生物のATP依存性プロテアーゼ)のRpn10サブユニットに会合することを突き止めた。さらにAR-JP患者において変異のあるArg42は、この相互作用の中心領域に位置することから、プロテアソームとパーキンとの相互作用の喪失、即ちパーキンによってユビキチン化される基質蛋白質の分解異常によってAR-JPが発症することが示唆された。(6)プロテアソームの細胞内レベルを人為的に制御できるDT40細胞株の樹立に成功した。PET-offシステムの発現プラスミッドを持たせて、染色体のZサブユニットを相同組み換え法で破壊した。その結果、プロテアソームの発現レベルを低下させると細胞周期がG2/M期で停止すると共にアポトーシスが誘導され、さらに分子シャペロンHsp70-40系の高い誘導が観察された。本年、ユビキチン・プロテアソームシステムの機構解明と病態生理に関する包括的研究を進め、以下の結果を得た。(1)巨大な多成分複合体であるプロテアソームの分子集合機構解明は、プロテアソーム研究に残された最重要課題の一つである。ATP依存性の活性型酵素である26Sプロテアソームは、触媒ユニットである20Sプロテアソームと調節ユニットから構成されている。今回、20Sプロテアソームの新奇アセンブリ因子α,β,γ複合体を発見すると共に26Sプロテアソームのエネルギー依存的会合に分子シャペロンであるHsp90が関与していることをはじめて突き止めた。(2)病態生理に関する研究では、主に蛋白質の品質管理に関するユビキチンリガーゼCHIP, Parkin, SCF(Fbs)について分子レベル・遺伝学レベルでの解析を進めた。シャペロン依存性リガーゼCHIPのノックアウト(KO)マウスを作製したところ、CHIP欠損マウスが失調性歩行異常を呈することを見出した。常染色体劣性パーキンソン症候群(AR-JP)の原因遺伝子産物であるParkinが26Sプロテアソームと会合することを突き止めた。
幼児期から児童期に至る身体の動きと空間変換との関連性に関する発達的研究

それまで身体的な行為はイメージの内化とともに減少していくことがわかってきたが、どのようにして内化が進むのか解明されていない。そこで、対象の空間変換をイメージする際に現れる身体的な動きを捉えて、身体がどのようにイメージ上の変換を担っているのか、発達的変化を明らかにすることを目的とする。本研究は、身体の動きが収束し安定することが表象系へ影響するという考えに基づいている。空間変換の内化プロセスを、イメージ操作の指標を用いて、身体の動きから定量的に捉えようとする試みである。これにより空間変換における認知発達と身体利用との関係性を明示し、身体的動きの認知発達への過程を解明しようとする研究である。
触媒制御のための電圧印加型MIS/MIM構造デバイスを目指した脱離研究

MOS(蒸着金属ナノ薄膜層・酸化膜・半導体基板)構造にゲート電圧を印加し、リーク電流を担う(エネルギーの高い電子や正孔、即ち)ホットキャリアを酸化膜側から金属層に注入し、その電子励起エネルギーを用いて金属表面に吸着した分子の解離・会合・脱離などの触媒反応を誘起させるという独自のアイデアに基づき、「触媒反応を制御する電子デバイスの動作原理の実証実験」を行ったところ、電子励起による電圧印加脱離分子の観測に初めて成功した。市販の熱酸化膜付きSi試料を用いてMOSの作製条件の最適化を行った。酸化膜厚100nmのp型高ドープ(001)表面に銀ペーストにて電極ワイヤーを2箇所(E1、E2)固定し、かつ、裏面の酸化膜を削りSi基板にオーミックに電極(E3)を取り付けた。数mm間隔をあけたE1、E2領域のみが蒸着可能となるマスクを設置し、超高真空中でE1、E2間の導通が確認できるまでFeを蒸着した(平均膜厚3.5nm)。室温及び低温(130 K)にて、この系にN2Oガスを暴露し、E3に対してE1-E2にゲート電圧Vgを印加した際の、E1-E2の間の領域からの脱離を調べた。Vgに-15V印加するとH2、CO、CO2などの脱離が観測され、Vg印加後0Vに戻しても数分以上脱離が見られた。一方、Vgが正バイアスのときは何の脱離も観測されなかった。E1-E2とE3との間のリーク電流は両バイアス極性ともμAオーダーであった。複数の試料においてこれらの再現性が確認された。両バイアス極性による投入電力は同程度であったため、負バイアスのみ脱離するという結果は、この脱離が加熱に起因するものではなく、Siの多数キャリアである正孔が酸化膜を通してFe電極へ移動した結果、生じたものと言える。酸化膜中をトンネルする、あるいは酸化膜の価電子帯に近い欠陥準位にトラップされながら移動する、ホットな正孔が、電極膜厚を弾道的に透過し、Fe表面でのガス反応(Fe + N2O →FeNx + FeOyと残留COなどとの反応)に脱励起しながら影響を与えた結果、生じたと考えることができる。本年度は、現象の再現性の確認に加え、酸化膜中にトラップされた高励起キャリアが脱離に寄与する可能性を見出した。昨年度までに超高真空中にて、1) p-type Si基板の酸化膜上に金属層(Fe)を数nm蒸着し(パーコレーション電気伝導の確認)、2)次に室温及び低温(130 K)でこの系にN2Oガスを暴露し、3)更に表面金属層と裏面Si電極(オーミック)間にゲート電圧Vgを印加すると、4) Vgが負電圧の時(Si中の多数キャリアの正孔が金属層に移動する方向)にH2、CO、CO2などが脱離した(正電圧の時は脱離しなかった)ことを報告してきた。これは硫酸過水など溶液処理により作製された酸化膜が中心であった。本年度、市販の熱酸化膜で同様な試料作製、及び測定を繰り返し行ったところ、脱離は観測されなかった。リーク電流を絶縁破壊により増大(1 nA以下→10 μA程度)させても同様であった。しかし、熱酸化膜を一旦、酸素プラズマ処理したところ、負電圧Vgにて脱離が観察された(リーク電流10 μA程度)。これらのことから、酸化膜中の欠陥や酸化膜表面の終端などの調整が、電圧印加脱離に効いてくるファクターの一つであることが分かった。本研究の狙いは、触媒反応を制御する半導体デバイスの動作原理を実証することである。そのためにMOS(蒸着金属層・酸化膜・半導体基板)構造をもつSiにゲート電圧Vgを印加し、リーク電流を担う(エネルギーの高い)ホットキャリアを酸化膜側から金属層に注入し、電子系の励起エネルギーを用いて金属表面吸着分子の脱離を含む化学反応を誘起させることを試みた。実験では、超高真空中にてp型Si基板の酸化膜(10100 nm)上にFeを数nm蒸着し、Vg印加時の脱離ガス測定を行った。10 nm酸化膜試料においては、N2Oガス暴露前では正負Vg印加で脱離ガスは観測されなかった。暴露後の正Vg印加でも観測されなかったが、負Vg印加で、脱離ガスが観測された。100 nm酸化膜試料においても同様に、N2Oガス暴露後の負Vg印加でのみ脱離が観測されたが、印加後1000 sにわたって脱離が観測された。算出ジュール熱は脱離観測時の方が小さかったこと等から、脱離は(非熱的な)電子励起過程によることが分かった。最終年度は10 nm酸化膜試料におけるN2O暴露時、及び脱離時のガス詳細分析(四重極質量分析器のクラック・イオン化)を中心に行った。N2O暴露はN2Oに由来するガス分圧上昇の他、H2OやCを含む残留ガス(CO等)の減少、即ち、これらのガスのFe表面への吸着を導くことが判明した。一方、脱離ガスの主な成分はCO, CO2, CH4などであった。電子励起により吸着残留ガス(主成分はCOとCO2)が脱離したと結論付けることができた。

しかし、CH4は非吸着性分子であるので、吸着CH4の脱離は考え難く、吸着COとH2Oのメタン化反応が誘起された可能性があることが示唆された。本成果は、半導体デバイスが触媒制御デバイスとしても動作し得ることを示した。MOS(蒸着金属ナノ薄膜層・酸化膜・半導体基板)構造にゲート電圧を印加し、リーク電流を担う(エネルギーの高い電子や正孔、即ち)ホットキャリアを酸化膜側から金属層に注入し、その電子励起エネルギーを用いて金属表面に吸着した分子の解離・会合・脱離などの触媒反応を誘起させるという独自のアイデアに基づき、「触媒反応を制御する電子デバイスの動作原理の実証実験」を行ったところ、電子励起による電圧印加脱離分子の観測に初めて成功した。本年度も、引き続きMOS-Siの作製条件の最適化を目標にしていた。今回得られた、酸化膜の質が電圧印加脱離を左右するという知見は大きい。デバイスシミュレーターによる計算では、正極・負極のVgを印加した際の酸化膜界面付近のSi中の電子・正孔濃度や、バンド端から金属フェルミ準位までのエネルギー差には大きな違いはなかった。従って、Vg負電圧の時のみ脱離が観測される現象は、ホットな正孔が酸化膜中をトンネルする際、何らかの要因で効率よくそのエネルギーを金属層に吸着したガス系に伝え脱離反応を誘起していることを意味している。ここで当然、酸化膜中の欠陥準位がその過程で大きく寄与しているものと予想され、このパートは今後の指針の一つとなる。今回、最適化条件の一つとして酸化膜質に注視できたことは、最適化がおおむね順調に進展していると言える。表面科学当初の計画通り、引き続き作製条件の最適化を行う。今回、酸化膜質が一つの制御すべき要因であることが判明した。そこで、酸素プラズマ処理の条件、あるいは電子線照射処理を行うなど熱酸化膜の処理条件を変える、更には、液中酸化処理での調整を行ったり、また他種絶縁層で比較するなど、この酸化膜質依存性を詳しく調べる方針とする。更に、注入キャリアーの種類とメカニズムに重要なヒントを与える、基板種類(p型、n型)と印加電圧極性の関係を明確にする方針である。昨年度報告したガス反応(Fe + N2O →FeNx + FeOyと残留COなどとの反応)による脱離は一種の還元反応であり、正孔注入が直接寄与しているとは考えにくく、FeクラスターなどにMieプラズモン等を誘起している可能性もある。従って、メカニズム解明のアプローチの一つとして、プラズモンからの発光測定も検討する。本年度は、MOSの作製条件の最適化(基板種類、酸化膜条件、電極金属・薄膜金属材料の組合せ種類や厚さ、等)、電極の接続方法、曝露ガスの種類、などの基本的な試料系構築のための条件出し、を目標にしていた。今までの酸化膜厚10nmのみならず、100nmでも同様な結果が得られた点、銀ペーストという簡便な電極接続方法でも確認が得られた点など、最適化がおおむね順調に進展していると言える。年度終了1-2カ月前に測定用PCが故障したため、年度内に新規に測定用PCを購入する予定であった。しかし、短期で入手可能なPC(Windowsバージョン)が、測定に用いている計測用ハードウェア、ソフトウェアに対応していないことが判明したため、年度内の購入ができず次年度使用額が生じた。当初の計画通り、引き続き作製条件の最適化を行う。特に、基板種類(p型、n型)と印加電圧極性の関係(注入キャリアーの種類の特定)について注視する。また現在、吸着ガスとしてN2O、薄膜金属としてFeを想定してるが、より適切な組合せについても検討を行う。脱離収量と印加電圧との相関(メカニズムへの考察)についても同様に検討を行う。脱離メカニズムについては、この系においては電圧印加によるMOS-Siの金属(ゲート)ナノ薄膜へのホットキャリア注入脱離を想定している。
GFP誘導体を利用した生細胞におけるイオンチャネル動態可視化法の確立

イオンチャネルに関しては質的調節(機能変化)が広く研究されてきたが、そればかりでなく量的調節(数の変化)も受ける。本研究は、近年注目されている量的変化を生細胞において観察する方法を確立する目的で行った。1.pH感受性蛍光蛋白質フルオリンをチャネルの細胞表面側に融合させたものを作製した。具体的には、PCR法により電位依存性カリウムチャネルKCNQ1の細胞外領域(1-2ループ)に、レシオメトリック・フルオリン(酸性化により488nm励起で515nmの蛍光が増加する)を挿入した(rpH-KCNQ1)。rpH-KCNQ1をHEK293細胞に発現させ、共焦点レーザー顕微鏡により観察したところ、rpH-KCNQ1が正常に細胞膜表面に移行していることが認められた。2.rpH-KCNQ1を発現させたHEK293細胞株に塩化アンモニウム10mMを投与し、酸性負荷を行ったところ、約40%の(細胞5個の平均値)蛍光強度の増加が観察された。融合したフルオリンは正常に機能しているものと思われた。3.これまでの生化学的検討でα1Aアドレナリン受容体(α1AAR)の活性化により、KCNQ1がエンドサイトーシスされることを観察していたため、α1AARとrpH-KCNQ1を共発現させたHEK細胞においてフェニレフリン1μMによる刺激を行い検討した。その結果、フェニレフリン投与後90秒で約15%(細胞10個の平均値)の蛍光量の増加が観察された。以上の結果から、原理的に今回の方法によってチャネルのエンドサイトーシスが測定可能であると考えられた。測定方法を確立させるには、ポジティブコントロール(β2アドレナリン受容体とフルオリンとの融合蛋白)との詳細な比較検討が必要である。また、電気生理学的な調節機構の確認も必要である。これらの検討に加え、蛍光測定装置での2波長の測定によるS/N比の向上を計り、方法を確立したい。
肝内微小循環改善と脾機能制御による肝硬変症に対する革新的集学的治療法の確立

肝内微小循環障害の改善と脾機能制御による肝硬変に対する治療法の開発を目的とした。(1)類洞内皮細胞機能障害におけるEndothelial-mesenchymal transition (EndMT)の関与:Tie-2 GFP、Tie-2LacZマウスを用いた肝硬変モデルにて、EndMTの関与の可能性は少ないと考えられた。(2)類洞内皮細胞へのshearstress増加によるNO分泌の改善:シャント閉鎖による門脈血流増加により肝静脈NO濃度が増加した。(3)血管新生からみた脾機能制御:VEGF受容体阻害剤により肝硬変において脾サイズは縮小し、血管新生制御による脾腫改善の可能性が示された。類洞内皮細胞機能障害におけるEndothelial-mesenchymal transition(EndMT)の関与:内皮細胞由来の細胞が生涯にわたりLacZを発現するトランスジェニックマウスの肝硬変モデルにて、初代培養された線維芽細胞の多くがLacZを発現しており、肝硬変由来の線維芽細胞には内皮細胞由来の細胞が含まれていることが確認できた。しかし、FACSでは、EndMTを来したと考えられる(LacZ陽性かつCD31陰性)細胞の増加がTie2-LacZマウスでは認められなかったが、Tie2-GFPマウスではEndMTを来たしたと考えられる(GFP陽性かつCD31陰性)細胞の増加が微量だが確認することができ、EndMTを少ないが確認できた。血管新生の点からみた肝硬変症における脾腫大のメカニズム解明と制御:肝硬変の脾の腫大には、VEGFを介した血管新生が関連していると考え、VEGF受容体のチロシンキナーゼ活性を阻害することが知られているソラフェニブを投与された肝硬変症において、CTによる脾サイズおよび脾静脈系の変化を検討した。脾サイズは平均64.6cm2→53.4と17.0%縮小し(p=0.05)、脾静脈系は平均8,7mm→7.8と11.4%縮小し(p<0.01)、VEGFなど血管新生シグナルの制御が脾腫を改善させる可能性が示された。摘出した肝硬変脾において、ARFIイメージによる非侵襲的な組織硬度測定を行ったところ、脱血後に脾硬度は著明に低下し、組織還流実験にて脾静脈圧と脾硬度は正の相関を認めた。脾硬度とうっ血が関連することが示され、脾のうっ血が脾硬度や脾腫大と関連していることが示された。C型肝硬変のT細胞疲弊化における脾の関与:肝硬変脾ではCD4・CD8陽性細胞の疲弊化が進行し、大量の疲弊化リガンドを含む脾の摘出により末梢CD4・CD8陽性T細胞の疲弊化は改善した。非代償性肝硬変の生命予後の改善のためには、食道胃静脈瘤出血・門脈血栓・腹水貯留・肝性脳症・脾機能亢進症などの門脈圧亢進症の制御が重要である。門脈圧亢進症の成因として、肝内微小循環障害による肝内血管抵抗増大、門脈流入血流増大、肝脾相関が考えられおり、本研究では、肝硬変における微小循環障害ならびに肝脾相関の分子機序を解明し、肝内微小循環障害の改善のための脾機能制御を含めた革新的治療法や薬剤の開発することで、門脈圧亢進症だけでなく肝硬変症をも改善することを目的としている。類洞内皮細胞機能障害におけるEndMTの関与についての研究:本年度は、内皮細胞由来の細胞が生涯にわたりLacZを発現するトランスジェニックマウスの肝硬変モデルにて、肝硬変由来の線維芽細胞には内皮細胞由来の細胞が含まれていることが確認できた。さらに、Tie2-LacZマウスおよびTie2-GFPマウス肝硬変から採取した類洞内皮細胞のFACSでは、EndMTは少数であるが起こっていることが判明した。以上のように、EndMTが肝硬変で起こりうる可能性を確認することができたので、ほぼ予定通りの進捗状況である。血管新生の点からみた肝硬変症における脾腫大のメカニズムの解明と制御についての研究:肝臓癌のためにVEGF阻害剤を使用した臨床検体を用いた研究や臨床検体を用いた還流実験による脾うっ血から脾硬度が増すという実験より、VEGFなどの血管新生シグナルの制御が脾腫を改善させる可能性が示された。しかし、これを裏打ちするための肝硬変症ラットを用いた、門脈圧上昇→脾うっ血→VEGF発現増加の分子機序の解明実験が当該年度で終わらなかった為、来年度に実験モデルを用いた研究を行うことになったた。C型肝硬変症のT細胞疲弊化において脾が関与していることが判明し、脾摘により改善することが示され、ほぼ予定通りの進捗状況である。本研究では、肝硬変における微小循環障害ならびに肝脾相関の分子機序を解明し、門脈圧亢進症だけでなく肝硬変症をも改善する治療法を開発することを目的としている。類洞内皮細胞機能障害におけるEndothelial-mesenchymal transition (EndMT)の関与:内皮細胞由来の細胞が生涯にわたりLacZを発現するトランスジェニックマウスの肝硬変モデルにて、初代培養された線維芽細胞の多くがLacZを発現しており、肝硬変由来の線維芽

細胞には内皮細胞由来の細胞が含まれていることが確認できた。しかし、Tie2-GFPマウスにおいて、EndMTは起こっていても少数であると考えられた。さらに、免疫細胞においてもGFP陽性となることも判明し、それを除去するためにWtの骨髄をTgに移植したところ、GFP陽性細胞の発現が殆どなかったため、in vivoではEndMTは殆ど起こらない可能性が判明した。血管新生からみた肝硬変症における脾腫大のメカニズム解明と制御:(1)摘出した肝硬変脾において、ARFI imagingによる非侵襲的な組織硬度測定を行ったところ、組織還流実験にて、脾静脈圧と脾硬度は正の相関を認め、脾硬度には脾のうっ血が関連することが示され、脾のうっ血が脾硬度や脾腫大と関連していることが示された。(2)血管新生に関与するVEGF受容体やPDGF受容体の阻害剤であるソラフェニブを投与された肝硬変症11例において、CTによる脾の最大断面積は平均50→43cm2と有意に縮小し、脾静脈径も平均9.0→7.8mmと有意に縮小した。また、脾サイズの縮小とともに、収縮期血圧および拡張期血圧も有意に増加した。以上より、VEGF受容体やPDGF受容体などの血管新生シグナルが肝硬変症における脾腫の原因の一つであり、血管新生の制御により脾腫は改善し、全身の循環亢進状態の改善の可能性も判明した。非代償性肝硬変の生命予後の改善のためには、食道胃静脈瘤出血・門脈血栓・腹水貯留・肝性脳症・脾機能亢進症などの門脈圧亢進症の制御が重要である。門脈圧亢進症の成因として、肝内微小循環障害による肝内血管抵抗増大、門脈流入血流増大、肝脾相関が考えられおり、本研究では、肝硬変における微小循環障害ならびに肝脾相関の分子機序を解明し、肝内微小循環障害の改善のための脾機能制御を含めた革新的治療法や薬剤の開発することで、門脈圧亢進症だけでなく肝硬変症をも改善することを目的としている。血管新生の点からみた肝硬変症における脾腫大のメカニズムの解明と制御についての研究:肝臓癌のためにVEGF阻害剤を使用した臨床検体を用いた研究や臨床検体を用いた還流実験による門脈圧から脾うっ血を来し脾硬度が増加するという実験系の症例数を蓄積することで、VEGFなどの血管新生シグナルの制御が脾腫を改善させる可能性が高いことが示された。本研究では、肝硬変における微小循環障害ならびに肝脾相関の分子機序を解明し、門脈圧亢進症だけでなく肝硬変症をも改善する治療法を開発することを目的とした。類洞内皮細胞機能障害におけるEndothelial-mesenchymal transition (EndMT)の関与:内皮細胞由来の細胞が生涯にわたりLacZを発現するトランスジェニックマウスの肝硬変モデルにて、初代培養された線維芽細胞の多くがLacZを発現しており、肝硬変モデルの線維芽細胞には内皮細胞由来の細胞が含まれていることが確認できた。Tie2-GFPマウスではEndMTを来たしたと考えられる細胞の増加が微量だが確認できたことより、類洞内皮細胞障害の原因の一つとして、EndMTによる機能的欠損が考えられた。類洞内皮細胞へのshearstress増加によるNO分泌の改善:肝硬変症におけるシャント閉鎖により門脈血流が増加し、肝静脈NO濃度が上昇し、肝機能が改善した。血管新生の点からみた肝硬変症における脾腫大のメカニズム解明と制御:(1)摘出した肝硬変の脾において、ARFI imagingによる組織硬度測定を行ったところ、脱血後に脾硬度は低下し、組織還流実験にて脾静脈圧と脾硬度は正の相関を認め、脾うっ血が脾硬度や脾腫大と関連していた。
外傷性ショックの免疫組織化学的診断法の開発

法医解剖で得られた臓器のうち、敗血症による遷延死の例、刺創および銃創による失血による急死の例、の肺と臓器を用いて、腫瘍壊死因子(TNFα)の発現を免疫組織化学的に調べた。TNFαは肺胞マクロファージに発現していたが、急死例にもみられ、死因を推定させるものでなかった。一方、サイトカインによってその発現が誘導されるセレクチンファミリーでは、凍結標本が必要なE-セレクチン(ELAM-1)を後に回し、パラフィン切片で染色可能なP-セレクチンの発現を調べた。P-セレクチンは銀増感を行って肺胞内皮に検出されたが、死因との関連はつかめなかった。これはP-セレクチンがE-セレクチンに比して血小板に比較的特異的で、放出も早期に起こり、細胞に残りにくいためと思われた。腐敗による組織構造の乱れも目立ち、銀の非特異的吸着も解釈を困難にした。また、TNFαは早期に血中に放出され、レセプターとともに遊離するため、血中TNFαおよび可溶性TNFレセプターI濃度を測定した。腐敗の影響を調べるため、前実験に新鮮血にTNFα標準品を一定濃度加え、恒温槽で20°Cに保ち、毎日サンプリングして濃度の減少をみた。その減少曲線をもとに、実際の法医解剖で得た血液の資料から血清を分離して死亡時の測定値を換算した。しかし、法医試料は腐敗がひどく、測定値はほとんど限界以下であった。以上、法医試料を用いての測定は予想以上に腐敗による影響を受け、今年度は成功しなかった。しかし、死後経過時間の短い新鮮な試料が得られる病理解剖の臓器および血液から、凍結切片を含めた分析を来年以降もさらに継続して、ショックという病態を少しでも具体的に理解したいと考えている。