hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
放射線還元によって5-フルオロウラシルを遊離するプラドラッグの活性化機構

α位にカルボニル基をもつ各種1-(5FU)置換化合物について、放射線還元を経る活性化機構、ならびに5-フルオロウラシル(5FU)脱離反応の選択性および反応速度に及ぼす構造因子を調べ、下記の成果を得た。(1)電解合成した5FUホモ二量体およびヘテロ二量体の放射線還元反応に及ぼす還元剤(芳香族アミンまたは低原子価遷移金属イオン)の添加効果を調べ、5FUホモ二量体のラジカルアニオン中間体からF^-の脱離が優先的に起こり、酸化性の5-イルラジカルが生成した後、加水分解を経て5FU遊離に至る活性化機構を明らかにした。(2)5FUを脱離基とする2-オキソ化合物を系統的に合成して、放射線還元過程を含むS^1_<RN>機構による求核置換反応を調べ、5FU脱離に至る活性化機構との関連を明らかにした。(3)1-(5FU)置換化合物のX線結晶構造解析を行い、カルボニル基の反結合性π^*軌道とC-N結合のσ^*軌道との重なりの度合いを評価することにより、一電子還元電位ならびに一電子還元を経る5FU脱離反応活性に及ぼす構造因子を明らかにした。(4)N (1)-C (5)結合5FU二量体の構造論的知見に基づいて合成した4-置換シクロヘキサノン構造をもつ5FU遊離性2-オキソ化合物では、シス形とトランス形でカルボニル基における反結合性π^*軌道とC-N結合のσ^*軌道との重なりが大きく異なる結果、5FUの脱離反応性が顕著に変化するという実験事実を得た。(5)5FU二量体の放射線還元反応によって生成する脱フルオロヒドリン型のピリミジン二量体の超音波分解による5FU脱離反応を調べ、超音波環境下での分子変換機構を明らかにした。(6)各種1-(5FU)置換化合物の放射線活性化における構造-活性相関を定量化するとともに、一電子還元を経る5FU脱離反応を理論有機化学的に解析し、高活性プロドラッグ合成のための分子設計指針を得た。5-フルオロウラシル(5FU)水溶液の電解酸化反応によって合成したN(1)-C(5)結合5FU二量体(1)の放射線還元反応に及ぼす還元剤(芳香族アミンまたは低原子価遷移金属イオン)の添加効果を調べ、5FU遊離に至る活性化機構を明らかにした。還元剤を添加しない場合、1の放射線還元により、5FUを遊離するとともに、2量体からフルオロヒドリンが脱離した1-(ウンシル-5′-イル)-5-フルオロウラシル(脱OHF体)が生成することを見いだした。この場合、両生成物の生成比は約1:2であったが、還元剤共存系では還元剤の酸化電位の減少とともに5FUの選択率が減少し、脱OHF体の選択率は逆に増大した。この結果から、1のラジカルアニオン中間体からF-の脱離が優先的に起こり、酸化性の5-イルラシカルが生成した後、加水分解を経て5FUが遊離する活性化機構が明らかになった。1のX線結晶構造解析結果によればα位のカルボニル基とC-N結合とはほぼ直交しているにもかかわらず、分子内電子移動が不利なC-F結合からのF-脱離がほぼ選択的に進行することから、5FU^-に比べてF^-の脱離能が著しく高いことが明らかになった。

そこで、F基をCH_3基で置換した構造をもつチミンと5-フルオロウラシルのN(1)-C(5)結合二量体(2)を電解合成し、この化合物が放射線還元によって高収率(60%)で5FUを遊離することを確認した。上記の知見に基づき、5FUを1位置換基としてもつ2-オキソ化合物の合成を試み、新しい放射線活性化プロドラッグとしての可能性について検討するとともに、これらの化合物における5FUの脱離反応機構について考察した。この結果、4-置換シクロヘキサノン構造をもつ5FU遊離性2-オキソ化合物の場合、シス形とトランス形でカルボニル基における反結合性π^*軌道とC-N結合のσ^*軌道との重なりが大きく異なり、5FUの脱離反応性に顕著な影響を及ぼすことが明らかになった。α位にカルボニル基をもつ各種1-(5FU)置換化合物について、放射線還元を経る活性化機構、ならびに5-フルオロウラシル(5FU)脱離反応の選択性および反応速度に及ぼす構造因子を調べ、下記の成果を得た。(1)平成7年度に合成した新規化合物を対象として、パルスラジオリシス法を用いてラジカル中間体の動的挙動を速度論的に研究し、従来の5FUホモ二量体およびヘテロ二量体の結果と併せて放射線活性化機構を考察した。(2)5FUを脱離基とする2-オキソ化合物を系統的に合成して、放射線還元過程を含むS_<RN>^1機構による求核置換反応を調べ、5FU脱離に至る活性化機構との関連を明らかにした。(3)1-(5FU)置換化合物のX線結晶構造解析を行い、カルボニル基の反結合性π^*軌道とC-N結合のσ^*軌道との重なりの度合いを評価することにより、一電子還元電位ならびに一電子還元を経る5FU脱離反応活性に及ぼす構造因子を明らかにした。(4)N(1)-C(5)結合5FU二量体の構造論的知見に基づいて合成した4-置換シクロヘキサノン構造をもつ5FU遊離性-2オキソ化合物では、シス形とトランス形でカルボニル基における反結合性π^*軌道とC-N結合のσ^*軌道との重なりが大きく異なる結果、5FUの脱離反応性が顕著に変化するという実験事実を得た。(5)各種1-(5FU)置換化合物の放射線活性化における構造-活性相関を定量化するとともに、一電子還元を経る5FU脱離反応を理論有機化学的に解析し、高活性プロドラッグ合成のための分子設計指針を得た。
機能性多糖高含有カラスビシャクの選抜と高効率生産を目指した基礎研究

本申請課題では、重要生薬半夏の原料植物カラスビシャクの育種と植物工場での大量育苗を目的とした基礎研究を実施した。特に、本研究課題の成果としては、品質評価が困難なカラスビシャクについて多糖を対象とした免疫化学的分析手法を構築した。カラスビシャク含有多糖を極めて特異的に認識するモノクローナル抗体を作製し、本抗体を用いて迅速簡便なELISAを構築した。続いて、本ELISAをスクリーニング法として活用し、全国40か所以上から採取したカラスビシャクを精査し、収量が高く、かつ多糖を豊富に含んだ優良品種の選抜に成功した。また、植物工場でのカラスビシャクの育苗における最適条件も設定することに成功した。半夏は上焦の水滞によっておこる悪心、嘔吐を緩解する利水薬であり、唾液分泌促進作用、拘束水浸ストレス潰瘍の抑制作用、腸管蠕動運動の促進作用などの消化器系に対する作用が報告されている。様々な薬効解析結果の中でも、臨床的に確認されている鎮吐作用は半夏の主要薬理作用といえるもので、その有用成分としてアラバンを主体とする水溶性多糖が知られており、半夏の品質を左右する最も重要な指標といえる。平成25年度は、カラスビシャク由来水溶性多糖を認識するモノクローナル抗体(MAb)の作製を中心に行った。半夏水性エキスから多糖画分(PT-PS)を調製し、これを免疫原としてマウスに免疫感作を行った。数度の免疫感作の後、十分な抗体価が得られた段階で、脾臓を摘出し、脾細胞を調製した。続いて、ポリエチレングリコール(PEG)法により細胞融合を行い、複数のハイブリドーマの中でPT-PSに対して特異的な反応性を有するMAbを産生する候補を1種を見出した。クローニングの後、ハイブリドーマを大量培養し、続いて培養上清中に分泌されたMAbの精製を行った。本MAbの反応性、特異性を精査した結果、十分な反応性を有しており、カラスビシャクに極めて高い特異性を有していることを確認した。環境制御施設を用いたカラスビシャク養液栽培法の確立については、気温・湿度が一定に制御されたファイトトロンガラス室(3室:気温20、25、30°C)で試験栽培を行ない、カラスビシャクの生育に対する地下水位、気温の影響を調査して、制御環境下における基礎的な栽培条件の検討を行った。25、30°C栽培区で良好な生育を確認した。また、地下水位を検討した結果、地下水位が高い(培地下ー4cm)の方が生育もむかごの収量も優れていた。以上のように、植物工場でカラスビシャクを栽培する基本的な条件を見極めることができた。本年度は、カラスビシャクに含まれる水溶性多糖(PTP)に対するモノクローナル抗体の作製と免疫化学的分析手法の開発について検討した。既に作製していたモノクローナル抗体は、非加熱のカラスビシャク由来水溶性多糖に対する高い選択性を有しており、カラスビシャクや半夏の鑑別には有用なものであったものの、加熱処理した水溶性多糖には反応しないことが判明した。そこで、PTPを加熱処理したのち、ウサギを用いてPTPに対する特異性を有する抗体が産生されるかどうかを確認した。その結果、カラスビシャクの熱水抽出液を高い特異性を持って認識するポリクローナル抗体の産生を確認することができた。本抗体を用いて、共同研究者である江口博士により栽培されたサンプルの測定を行った。山科と雲仙で採取したカラスビシャクを20,25,30°Cの3条件で、自然日長により栽培したサンプルを用いた。熱水抽出した後、適切に希釈して直接的ELISAにより定量的な評価を行った。その結果、25,30°Cの条件で栽培したサンプルが有為にPTP含量が高いことが判明した。また、夏と冬の二期栽培し、収穫したサンプルについて測定した結果、夏に栽培したものが有為に含量が高いことが判明した。また、全てのサンプル中のPTP含は、市販品の中のPTP含量よりも高く、品質面で問題がないことが明らかとなった。また、収量については、以下水位4cmの条件で15週間の栽培した場合に、鮮重量で3倍に増加していた。今回の成果から、日長を制御することによりカラスビシャクの植物工場での周年栽培が可能なことを示すことができた。PTPに対するモノクローナル抗体(MAb)の作製は、現在PTPを特異的に認識するMAbを産生する3種類のハイブリドーマを得ることに成功した。現在ハイブリドーマのクローニングを行っており、今後、MAbを用いた上述のカラスビシャクサンプルの分析を進める。申請者は、熱処理した半夏由来水溶性多糖を免疫原とすることにより、半夏由来多糖に極めて高い特異性を有するモノクローナル抗体の作製に成功した。さらに、本モノクローナル抗体を活用することで、優良品種の選抜研究を展開した。栽培研究に関しては、全国約50か所から採取した半夏の原料植物を人工的な環境下で栽培し、評価を行った。本研究、栽培期間中の積算日射量は夏期で1,571 MJ/m2,冬期で829 MJ/m2であり、冬期は夏期の52.7%の日射量であった。日照時間は、夏期4.7時間/日、冬期3.8時間/日で,冬期は夏期の81%であった。

地上部の生育については、いずれの系統も、夏期に比べ、冬期の葉数およびむかご形成数が少なかった。夏期の気温30°C条件を除いて、京都府産カラスビシャクの肥大率が優れており、その系統間差は特に冬期において顕著であった。夏期・冬期とも、いずれの気温条件においても京都府産が優れていた。多糖含量に関わらず、重さでの評価がなされているが、京都府産のものは夏期においては特級,冬期においても甲級と評価できる塊茎が得られている。塊茎の多糖成分含量は、事前に調査した市販品の含量は21.4μg/mg DWであり、これを下回ったのは気温20°C下で生育させた長崎産カラスビシャク(夏期・冬期とも)のみである。夏期・冬期とも,京都府産の含量が高く、夏期においてその系統間差がより顕著であった.以上のように、カラスビシャクの生育温度は、その生育と塊茎の有用成分含量に影響するが、日射量の違い、および系統の違いが、塊茎の収量・品質により大きな影響を及ぼすことが明らかとなった。今回の調査では、京都府産カラスビシャクが市販品に大きく優る品質を持ち、高い収量をもたらすことが明らかとなり、この系統が園芸施設での周年生産に利用可能であることが示唆された。本申請課題では、重要生薬半夏の原料植物カラスビシャクの育種と植物工場での大量育苗を目的とした基礎研究を実施した。特に、本研究課題の成果としては、品質評価が困難なカラスビシャクについて多糖を対象とした免疫化学的分析手法を構築した。カラスビシャク含有多糖を極めて特異的に認識するモノクローナル抗体を作製し、本抗体を用いて迅速簡便なELISAを構築した。続いて、本ELISAをスクリーニング法として活用し、全国40か所以上から採取したカラスビシャクを精査し、収量が高く、かつ多糖を豊富に含んだ優良品種の選抜に成功した。また、植物工場でのカラスビシャクの育苗における最適条件も設定することに成功した。本年度は、カラスビシャク由来多糖(PTP)に対する抗体の作製を達成した。ポリクローナル抗体を用いた免疫化学的分析手法であるELISAを開発し、九州大学生物環境利用推進センターの人工気象設備で栽培されたカラスビシャクの分析を行った。その結果、当初計画したカラスビシャクの品質評価を可能とする新規な手法を開発することができたことから、当該研究は順調に進んでいると判断できる。モノクローナル抗体の作製も、近々完了することから、より抗原選択性が高い抗体を得た後、より精度の高いカラスビシャク品質評価法を構築していきたいと考えている。高品質な半夏の生産を目指した本研究では、多数の野生のカラスビシャクを採取する必要があるが、すでに24か所からサンプルを得ており、九州大学生物環境利用推進センターで栽培管理している。これまでに山科と雲仙で採取したサンプルについて分析した結果、同一採取地から得られたものでも、PTP含量がかなり異なっていることを確認しており、この結果はPTPを高濃度に蓄積するサンプルが得られる可能性は高いものと考えている。栽培手法についても、既に周年栽培が可能であることを示すことに成功しており、今後は日長などの制御を行うことで、更に最適化された栽培法が確立できるものと考えている。以上のような理由により、本研究課題はおおむね順調に進展していると考えている。生薬学、薬用植物学今後は、近々得られるカラスビシャクPTPに対するモノクローナル抗体の評価を行い、PTPやカラスビシャクサンプルに対する反応性、特異性を明らかにした後、高品質カラスビシャクの選抜に適用できる特性を有しているかどうかを検証する。
ACC合成酵素のリン酸化制御によるエチレン生合成調節機能の解析

エチレンは果実の追熟、野菜・花卉の鮮度保存など園芸作物に大きな影響を与えるため、エチレンを人為的に制御することは、園芸分野において重要な課題である。現在、エチレン生合成に関する研究の中で明らかになっていない点は、エチレン生合成経路の鍵となるACC合成酵素のリン酸化状態による翻訳後制御機構である。本研究は、ACC合成酵素のリン酸化状態を制御するProtein Phoshatase(PPase)を同定し翻訳後制御機構を解析する。この成果によってエチレン生成調節機構を明らかにし、園芸作物の品質向上に資するための基盤的知見を得ることを目的にしている。質量分析計を使って解析した結果、ACC合成酵素を脱リン酸するprotein phosphatase PP2AのサブユニットA, B, Cをいくらか絞り込めてきた。特にBサブユニットの中のサブファミリーB型(2種類)、B'型(9種類)、B''型(5種類)に分かれており、これまでの解析からB''型が候補と考えられる。各サブユニットのcDNAをクローニングして、発現量を解析したが、特に著しく増減することはない。PP2Aは様々なリン酸化タンパク質を脱リン酸して生理現象を制御する機能があり、ACC合成酵素を脱リン酸することはその機能の一つに過ぎない。従ってACC合成酵素の制御と関わって発現量が増減しなくても違和感はない。だからこそ、どのPP2AのサブユニットがACC合成酵素とタンパク質間相互作用することを明らかにする意味は大きい。本来の予定ではAlphaScreen法により解析する計画だったが、まだ十分に解析できていない。PP2AとACC合成酵素のタンパク質間相互作用を解析するために、AlphaScreen法を用いる計画だったが予定通りの成果がでなかった。考えられる原因の一つは、相互作用すると想定していたいくつかのサブユニットB''型が、元々相互作用しない可能性である。しかし、これまでの結果からその原因を考えられない。ACC合成酵素がうまくリン酸化されていないために相互作用しなかったためではないかと考えている。別の観点から考えると、リン酸化タンパク質とPP2Aが相互作用するポジティブコントロールがなかったために、実験自体を検証できなかったかも知れない。今年度は再度、PP2AとACC合成酵素のタンパク質間相互作用をAlphaScreen法で解析する。ACC合成酵素タンパク質のリン酸化を確認すると共に、リン酸化されるアミノ酸残基をアスパラギン酸に変換して疑似リン酸化にしたACC合成酵素と相互作用を解析する。また、PP2A各サブユニットのタンパク質の発現量と、ACC合成酵素タンパク質の発現量を定量するためには、典型的にはそれぞれの抗体が必要になるが、この研究ではMRM (multiple reaction monitoring)法を使って質量分析計でタンパク質を定量する。そのために、各サブユニットを小麦胚芽抽出液を用いた無細胞タンパク質合成系で合成し、トリプシンで消化後、MRM法に適したペプチドを同定し、化学合成したペプチドを用いてMRM法でタンパク質を定量する。リン酸化されたACC合成酵素を認識するPP2AのBサブユニットが同定された場合は、生体内・組織内でも役割を検証する。但し、シロイヌナズナの場合、これまでにPP2Aの特定のBサブユニットに変異があるために、エチレン生成が過剰になった変異体は、T-DNAタグラインを含め一つも見つかっていない。このことは複数種類あるBサブユニット遺伝子が互いに重複して働いているために、一つの遺伝子の変異では表現型がでない可能性がある。従って、特定のBサブユニットは複数同定されるはずであり、Bサブユニットの変異体も単独ではエチレン生成過剰にはならず、交配によって二重あるいは多重の変異体にする必要があると推測できる。同様にトマトの場合も、単独の変異ではエチレン生成過剰にならないかもしれない。そのために各Bサブユニットの発現を、CRISPR/Cas9システムを用いて目的遺伝子を改変することにより抑制し、実際にエチレンの生成量が増加することを生体内で確認する。

PP2AとACC合成酵素のタンパク質間相互作用を解析するために、AlphaScreen法を用いる計画だったが予定通りの成果がでなかった。考えられる原因の一つは、相互作用すると想定していたいくつかのサブユニットB''型が、元々相互作用しない可能性である。しかし、これまでの結果からその原因を考えられない。ACC合成酵素がうまくリン酸化されていないために相互作用しなかったためではないかと考えている。別の観点から考えると、リン酸化タンパク質とPP2Aが相互作用するポジティブコントロールがなかったために、実験自体を検証できなかったかも知れない。今年度は再度、PP2AとACC合成酵素のタンパク質間相互作用をAlphaScreen法で解析する。ACC合成酵素タンパク質のリン酸化を確認すると共に、リン酸化されるアミノ酸残基をアスパラギン酸に変換して疑似リン酸化にしたACC合成酵素と相互作用を解析する。また、PP2A各サブユニットのタンパク質の発現量と、ACC合成酵素タンパク質の発現量を定量するためには、典型的にはそれぞれの抗体が必要になるが、この研究ではMRM (multiple reaction monitoring)法を使って質量分析計でタンパク質を定量する。そのために、各サブユニットを小麦胚芽抽出液を用いた無細胞タンパク質合成系で合成し、トリプシンで消化後、MRM法に適したペプチドを同定し、化学合成したペプチドを用いてMRM法でタンパク質を定量する。リン酸化されたACC合成酵素を認識するPP2AのBサブユニットが同定された場合は、生体内・組織内でも役割を検証する。但し、シロイヌナズナの場合、これまでにPP2Aの特定のBサブユニットに変異があるために、エチレン生成が過剰になった変異体は、T-DNAタグラインを含め一つも見つかっていない。このことは複数種類あるBサブユニット遺伝子が互いに重複して働いているために、一つの遺伝子の変異では表現型がでない可能性がある。従って、特定のBサブユニットは複数同定されるはずであり、Bサブユニットの変異体も単独ではエチレン生成過剰にはならず、交配によって二重あるいは多重の変異体にする必要があると推測できる。同様にトマトの場合も、単独の変異ではエチレン生成過剰にならないかもしれない。そのために各Bサブユニットの発現を、CRISPR/Cas9システムを用いて目的遺伝子を改変することにより抑制し、実際にエチレンの生成量が増加することを生体内で確認する。
劇症型GAS感染症と好中球,筋細胞表面ADPリボシル転移酵素活性との因果関係

ヒト好中球,T細胞,B細胞および筋細胞表面でのADP-ribosyltransferase(ADPRT)の存在の有無及びその機能を確認するとともにNADaseとNADをいれた時の筋細胞の変化およびA群レンサ球菌(GAS)の筋細胞への付着の変化について検討した.ヒト好中球,T細胞,B細胞および筋細胞表面でのADP-ribosyltransferase(ADPRT)の存在の有無及びその機能にいて:T細胞,B細胞及び筋細胞表面のADPRT活性は存在しなかったが,好中球表面にその活性を見出した.またその活性によって好中球表面のLFA-1のα鎖がADP-riboseと結合することも明らかにした.しかしその活性の存在がそのまま好中球にNADをかけた時の好中球の運動性や貧食能に大きな変化をあたえることはなかった.NADaseとNADをいれた時の筋細胞の変化およびA群レンサ球菌(GAS)の筋細胞への付着の変化:NADaseによる好中球の活性の抑制はみられず,NAD及びNADaseを筋細胞にいれた場合においても筋細胞がアポトーシスを誘導させるなどといった傾向もみられなかった.また筋細胞にGASを感染させてもNAD, NADaseの有無による菌の筋細胞への付着能に有意な変化はみられなかった.その他明らかとなった事項:ヒトT細胞でみることができなかったADPRT活性は,マウスのT細胞ではみられるが,この活性によってその活性を失うT細胞はどうなっていくのかについて検討した.その結果,マウスにNAD添加によってマウス体内のT細胞はT細胞活性物質による刺激に無反応になり,その後まもなくapoptosisに陥って肝臓に集積し,そこで破壊されることを明らかにした.本年度は,ヒト好中球とヒト筋細胞を用いて,細胞上に存在するADPRTの活性能力及びADPRと結合する細胞表面分子の同定を試みた.ヒト末梢血から分離した白血球に放射性同位元素で標識したNADを加えて培養し,ADPRと結合する細胞表面分子を検討したところ,好中球細胞表面分子の幾つかがADPRと結合していることがわかった.またそのひとつがLFA-1のα鎖であった.しかし,LFA-1も含めた好中球細胞表面分子マーカーのNAD添加による発現の変化はみられず,好中球のNAD添加による運動性や貪食能の抑制も有意にはみられなかった.このことは,好中球細胞表面上にADPRTが存在するものの,その活性による機能変化がみられないことを示したものである.また,好中球以外の免疫担当細胞表面にADPRTが存在するか現在検討中であるが,今のところ,T細胞およびB細胞について検討したが,NAD分解能がみられるもののADPRの接着分子への結合について確認はできておらず,その可能性の是非は,次年度の研究課題である.最近,Stevensらの報告(J.Infect.Dis.182:1117-1128,2000)で一部のGAS菌株にNADaseを産生すること,そして精製したNADaseが好中球の活性を抑制することが明らかになった.GASの産生するNADaseの感染における役割については不明であるが,これが好中球や筋細胞の破壊になんらかの関与を示していることが考えられる.そこで研究最終年度は,塩基配列が明らかになっているこのNADaseのリコンビナント蛋白を作成する.そして,筋細胞にこのリコンビナントNADaseとNADを与えたときの筋細胞の変化および,GASの筋細胞への付着の変化を検討する.ヒト好中球,T細胞,B細胞および筋細胞表面でのADP-ribosyltransferase(ADPRT)の存在の有無及びその機能を確認するとともにNADaseとNADをいれた時の筋細胞の変化およびA群レンサ球菌(GAS)の筋細胞への付着の変化について検討した.ヒト好中球,T細胞,B細胞および筋細胞表面でのADP-ribosyltransferase(ADPRT)の存在の有無及びその機能にいて:T細胞,B細胞及び筋細胞表面のADPRT活性は存在しなかったが,好中球表面にその活性を見出した.またその活性によって好中球表面のLFA-1のα鎖がADP-riboseと結合することも明らかにした.しかしその活性の存在がそのまま好中球にNADをかけた時の好中球の運動性や貧食能に大きな変化をあたえることはなかった.NADaseとNADをいれた時の筋細胞の変化およびA群レンサ球菌(GAS)の筋細胞への付着の変化:NADaseによる好中球の活性の抑制はみられず,NAD及びNADaseを筋細胞にいれた場合においても筋細胞がアポトーシスを誘導させるなどといった傾向もみられなかった.また筋細胞にGASを感染させてもNAD, NADaseの有無による菌の筋細胞への付着能に有意な変化はみられなかった.その他明らかとなった事項:ヒトT細胞でみることができなかったADPRT活性は,マウスのT細胞ではみられるが,この活性によってその活性を失うT細胞はどうなっていくのかについて検討した.その結果,マウスにNAD添加によってマウス体内のT細胞はT細胞活性物質による刺激に無反応になり,その後まもなくapoptosisに陥って肝臓に集積し,そこで破壊されることを明らかにした.
パソコンによる言語地現学データと諸データの統合に関する研究

研究代表者は、昭和58年パソコンを利用した最初の言語地図作成システムSEAILを開発、その後もMS-DOS版BASICのコンパイラ版、Windows対応版等、機器の進歩に対応した改良版を開発公開してきた。本研究では、このSEALシステムの改訂・整備を継続するとともに、日本語方言資料への応用分析を進めた。3年間の研究成果は次の通りである。1 SEALシステムの改訂・整備13年度にSEAL英語版6.0E、14年度にWindows xpと多言語に対応したSEAL6.1Jと6.1E、およびその改訂版の6.2Eと6.3E、15年度に新機能を付け加えたSEAL7.0Jを発表した。SEAL7.0Jは、新潟県出身学生の複数年調査データのような、調査地域が同して地点が異なる調査資料を同時処理できる「グループ地図」作成機能の追加等SEALを大幅改定したものである。13年度末にSEAL Version 6.0Eの英文マニュアルを、15年度末にSEAL Version7.0Jの日本語版マニュアルを作成、出版した。英語版SEALは、英語版Windowsをはじめ各言語版のWindowsでの動作が可能な多言語対応版である。SEALの公開と情報公開の場としてホームペーシ「言語地理学のへや」(http://www.nicol.ac.jp/fukusima/)を活用し、英語版ホームページも開設した(http://www.nicol.ac.jp/fukusima/english)。日本語版・英語版のシステムとサンプルデータのインストールファイルやPDF版マニュアルのダウンロードが可能になっている。現在、国内外の中国語・韓国語等の方言研究者に活用されている。2 SEALを使った言語地理学的研究奄美徳之島の方言や新潟県の方言についてのデータ分析を継続し、様々な機会をとらえて、研究成果を発表、出版した。フィンランドでの第11回方言学の方法国際会議およびラトビアでの第4回方言学者国際会議にて発表した。研究代表者は、昭和58年パソコンを利用した最初の言語地理学的データ処理システムSEALを開発、その後も機器の進歩に対応したシステムの改良を進め、平成6年度にMS-DOS版BASICのコンパイラ版、平成9年度にWindows95対応版、平成12年にWindows98/Me/2000対応版を発表した。SEALの特徴である精緻なカラー地図の作成、複数項目の総合、他ソフトとの連繋が容易となった。本研究では、このSEALシステムの改訂・整備を継続するとともに、日本語方言資料への応用分析を進めている。1年目の研究実績は次の通りである。1 SEALシステムの改訂・整備2 SEALを使った言語地理学的研究奄美徳之島方言について文法に焦点をおいた調査を継続し、日本方言研究会における共同発表で、その一部を発表した。また、短大学生に行ったアンケート調査結果を地図化し、新潟県の若年層の方言実態についてまとめた。来年度、第11回方言学の方法国際会議(フィンランド)において発表を予定している。研究代表者は、昭和58年パソコンを利用した最初の言語地図作成システムSEALを開発、その後も機器の進歩に対応した改良を進めている。平成6年度にMS-DOS版BASICのコンパイラ版、9年度にWindows95対応版、12年度にWindows98/Me/2000対応版SEAL 6.0J、13年度にSEAL英語版6.0Eを発表した。2年目の研究実績は次の通りである。1 SEALシステムの改訂・整備言語地図作成システム

SEALのWindows XP対応版の作成と多言語対応化を目的として、以下のように改定を行った。平成14年5月、インストール方法を変更したSEAL6.1Jと英語版6.1Eを発表、ホームページ(http://www.nicol.ac.jp/fukusima/)でダウンロードできるようにした。SEAL6,1Eは英語版Windowsだけでなく、韓国語版、中国語版など多言語のWindowsで動くことが確認された。6月に、英語版6.2Eの英文マニュアルをPDFファイル化し、ホームページ上で公開した。12月に、Windows XP搭載のPCのモバイル使用に対応し、詳細な印刷設定が可能になるよう改定した6.2Eを発表した。中国語方言および韓国語方言研究者の英語版SEAL活用を支援した。一方、2で述べる新潟県出身学生の複数年調査データなど、白地図が同じで地点が異なる調査資料を同時処理できるようSEALを大幅改定し、SEAL6.3Jとした。このシステムの公開に向けて、日本語版マニュアルを作成中である。2 SEALを使った言語地理学的研究奄美徳之島方言について文法に焦点をおいた研究分析を継続している。また、新潟県出身の短大学生に行ったアンケート調査結果を地図化し、新潟県の若年層の方言実態についてまとめ、第11回方言学の方法国際会議(フィンランド)および新潟県ことばの会研究集会において発表した。研究代表者は、昭和58年パソコンを利用した最初の言語地図作成システムSEALを開発、その後も機器の進歩に対応した改良を進めている。平成6年度にMS-DOS版BASICのコンパイラ版、9年度にWindows95対応版、12年度にWindows98/Me/2000対応版SEAL6.0J、13年度にSEAL英語版6.0E、14年度にWindows xpと多言語に対応したSEAL6.1Jと6.1E、その改訂版の6.2Eと6.3Eを発表した。本研究では、このSEALシステムの改訂・整備を継続するとともに、日本語方言資料への応用分析を進めている。3年目の研究実績は次の通りである。1 SEALシステムの改訂・整備前年度の改定でSEALの日本語版および英語版について、以下のように改訂作業を進めた。平成15年度は、4月に韓国語対応版のSEAL6.3Eを発表、7月にはんこ指定の数を増やしたSEAL6.16Jを発表、9-10月にWindows xp Professionalでのトラブルに対応してSEAL6.17Jと6.18Jを発表し,ホームページ(http://www.nicol.ac.jp/fukusima/)でダウンロードできるようにした。さらに15年度末にSEAL日本語版7.0Jを発表した。これは、新潟県出身学生の複数年調査データなど、白地図が同じで地点が異なるような調査資料を同時処理できるようSEALを大幅改定したものである。このシステムの公開に向けて、日本語版マニュアルを作成印刷した。
脳・網膜の発生分化に関与するG蛋白質共役型受容体システムの機能解明

G蛋白質共役型受容体(GPCR)は動物ゲノムの中で最大の遺伝子ファミリーを構成し、神経伝達物質の受容体の多くがGPCRであること、現在使用されている薬剤の標的分子として最多であることなどから、成体脳におけるその機能について多くの知見が蓄積されている。本研究課題では,GPCRシグナル系の脳と網膜の発生分化における役割をニワトリ胚、マウス胚を用いて明らかにすることを目的とした。本年度は,脂質をリガンドとするGPCRシグナル,特に,リゾリン脂質(アシル基が1つで細胞膜間を移動しやすい性質をもつ)であるリゾホスファチジン酸(LPA)の合成酵素であるautotaxin(ATX)のニワトリ脳発生における役割について解析した。ニワトリ胚でのRNA干渉法は、長鎖2本鎖RNA導入法、短鎖RNA導入法、ヘアピンDNAベクター導入法などが報告されているが、我々はニワトリ胚で特に有効なDNAベクターを電気穿孔法により導入することで、脳や眼で効率よくRNA干渉をおこすことに成功した。その方法を用いて、ATXのニワトリ間脳形成における役割を調べたところ、ホメオ蛋白質であるPax6と関係のあることが明らかになった。並行して網膜GPCRであるオプシンに着目し、ニワトリ発生期網膜における非典型オプシン(視細胞オプシン以外のオプシン)遺伝子の発現様式について調べた。その結果、X型メラノプシン(Opn4x)以外にも、M型メラノプシン(Opn4m),VA opsin様分子が発生途上の視細胞以外の特定の網膜細胞、あるいは脳や神経管に発現すること、Opsin5が発生後期の大型神経節細胞およびGAD陽性アマクリン細胞の一部に発現することを明らかにした。視細胞オプシン(ロドプシン、錐体オプシン)遺伝子は、眼の病気や色覚多型に深く関係しており、非典型オプシン遺伝子も未知の眼の病気に関与しているかもしれない。脳や感覚器の機能において重要な役割を担っているのは,G-protein coupled receptor(GPCR)に属する7回膜貫通型受容体を介するシグナル伝達である。GPCRは線虫からヒトまで存在する最も大きな受容体ファミリーであり,約800個のGPCR遺伝子がヒトゲノムにコードされている。しかし,約150個のGPCRが未だリガンドの不明なオーファン受容体であり脳神経系の発生分化におけるその役割についてはまだ未解明である。そこで本研究課題では,発生途上の脳・網膜において発現するGPCRについてその発現パターンを調べ,脳・網膜の発生分化における機能を明らかにすることを研究目的とした。本年度は,マウスのゲノムプロジェクトから同定されたGPCRの中で,生理活性物質として近年注目されている「脂質」がリガンドと予想されるGPCRに着目した。なかでも,リゾリン脂質(アシル基が1つで細胞膜間を移動しやすい性質をもつ)であるスフィンゴシン1リン酸(S1P)受容体,リゾボスファチジン酸(LPA)受容体,LPA/S1Pの合成酵素リゾホスホリパーゼD(autotaxin : ATX)のマウス胚における遺伝子発現パターンを解析した。これらの遺伝子のうち,ATXおよびATXとの関連性が示唆されたLPA/S1P受容体についてはニワトリホモログを単離して,ニワトリ胚におけるその発現パターンをマウス胚における発現様式と比較した。その結果,ATX遺伝子は哺乳類と鳥類の脳神経系の発生過程で,発現様式が異なることがわかった(Ohuchi et al.,2007)。さらにニワトリ胚を用いたATX機能喪失実験を行うためにニワトリ胚卵内電気穿孔法によるRNA干渉法を試みたところ,神経管および間脳においてATX遺伝子の発現をノックダウンすることに成功した。
鳥類の概日時計に制御された光周反応メカニズムの解析

生物が日の長さ(日長)に反応して示す性質(光周性)の背景には概日時計の存在が古くから示されているがその関係性はわかっていない.光周性のモデル生物であるウズラは日長が延長されると性腺刺激ホルモンが分泌され,精巣が肥大する.鳥類においては,この現象のマスターコントロール遺伝子TSHBが同定され,後に哺乳類においても機能することが明らかになった(Nakaoら,Nature,2008.Onoら,PNAS,2008).そこで,私は近年急速に研究が進んでいるエピジェネティクスによる転写制御に着目し,短日条件の下で育てたウズラの日長を延長したときのピストンの翻訳後修飾の変化を組織学的もしくは生化学的な二つの方向性で調べ,光周性と概日時計との関係性を見いだそうとした.まず,短日条件もしくは長日条件に供したウズラの脳を凍結切片にし,抗ピストン修飾抗体により免疫組織化学を行った.その結果,鳥類の光周性中枢である視床下部内側基底部(MBH)において陽性細胞を検出できた.また,脳からMBHを採集し,ウェスタンブロットを行ったところ,ヒストンの修飾バンドを特異的に検出できた.さらに,長日条件を与えたウズラのピストンの翻訳後修飾を調べ,特異的に変化する時間帯を同定した.哺乳類では一日の特定の時刻に光パルスを与えた場合,概日時計の中枢SCNではヒストンH3のリン酸化が時計遺伝子mPer1の転写を促進することが報告されている(Crosioら.,Nat Neurosci,2000).この事実は,ウズラの光周性において,TSHBの発現制御にエピジェネティクスが関与している可能性を示している.よって,TSHBの上流領域でのクロマチン構造の変化をとらえるためにChIP解析の系の確立を進めた.また,バクテリアの概日時計による転写出力の新たなpathwayを明らかにした(TaniguchiとTakai., PNAS, 2010).鳥類の光周性において,TSHBがマスターコントロール遺伝子である(Nakao et al.,Nature,2008)。しかし,概日時計との関係はまだわかっていない。そこで,4週齢のウズラを短日条件(明期6時間,暗期18時間)のサイクルで4週間飼育し,長日条件(明期20時間,暗期4時間)に移した時のヒストンの翻訳後修飾の変化を免疫組織化学,ウェスタンプロットにより調べた。まず,これら日長条件の異なるウズラから採集した脳を凍結切片にし,抗ヒストン修飾抗体により免疫組織化学を行った。当初は免疫陽性細胞の検出に蛍光法を用いたが,光周性中枢である視床下部内側基底部(MBH)において陽性細胞を検出できなかった。しかし,DAB染色法を用いたところ,検出に成功した。また,研究を始めた当初,免疫組織化学の実験系がうまく稼働しなかったため,ウズラ脳からMBHを採集し,そこから全蛋白質を抽出し,ウェスタンプロットを行った。その結果,ヒストンの修飾バンドを特異的に検出することができた。また,長日条件と短日条件を比較すると,ヒストンの翻訳後修飾が特異的に変化する時間帯を特定できた。現在,再現性の確認,および脳内MBHのどの神経核で発現が局在しているのかを免疫組織化学により確認している。また,哺乳類において,一日のある特定の時刻に光パルスを与えた場合,概日時計の中枢SCNではヒストンH3のリン酸化が時計遺伝子mPerlの転写を促進することが報告されている(Crosio et al.,Nat Neurosci,2000)。この事実は,TSHBの発現制御にヒストンの修飾が関与している可能性を示している。よって,TSHBの上流配列における日長の変動によるヒストンの翻訳後修飾の変化を調べる必要があり,現在準備を進めている。生物が日の長さ(日長)に反応して示す性質(光周性)の背景には概日時計の存在が古くから示されているがその関係性はわかっていない.光周性のモデル生物であるウズラは日長が延長されると性腺刺激ホルモンが分泌され,精巣が肥大する.鳥類においては,この現象のマスターコントロール遺伝子TSHBが同定され,後に哺乳類においても機能することが明らかになった(Nakaoら,Nature,2008.Onoら,PNAS,2008).そこで,私は近年急速に研究が進んでいるエピジェネティクスによる転写制御に着目し,短日条件の下で育てたウズラの日長を延長したときのピストンの翻訳後修飾の変化を組織学的もしくは生化学的な二つの方向性で調べ,光周性と概日時計との関係性を見いだそうとした.まず,短日条件もしくは長日条件に供したウズラの脳を凍結切片にし,抗ピストン修飾抗体により免疫組織化学を行った.その結果,鳥類の光周性中枢である視床下部内側基底部(MBH)において陽性細胞を検出できた.また,脳からMBHを採集し,ウェスタンブロットを行ったところ,ヒストンの修飾バンドを特異的に検出できた.さらに,長日条件を与えたウズラのピストンの翻訳後修飾を調べ,特異的に変化する時間帯を同定した.哺乳類では一日の特定の時刻に光パルスを与えた場合,概日時計の中枢SCNではヒストンH3のリン酸化が時計遺伝子mPer1の転写を促進することが報告されている(Crosioら.,Nat Neurosci,2000).

この事実は,ウズラの光周性において,TSHBの発現制御にエピジェネティクスが関与している可能性を示している.よって,TSHBの上流領域でのクロマチン構造の変化をとらえるためにChIP解析の系の確立を進めた.また,バクテリアの概日時計による転写出力の新たなpathwayを明らかにした(TaniguchiとTakai., PNAS, 2010).
道徳教育における公共性意識の形成に関する日独比較研究

第1章「日本とドイツにおける公共性の概念」では、日本とドイツにおける公共性の概念を、哲学、社会学の文献により整理した。公共性概念の指標としては、(1)自律志向か他律志向か、(2)一元的価値志向か多元的価値志向か、(3)国家志向的か非国家志向的か、という三種類が得られた。また、日本とドイツの公共性概念の異同として、以下の点が明らかとなった。(1)いずれの国においても、公共性は伝統的に国家と結びついてイメージされる。(2)ドイツにおける伝統的な国家的公共性は、個人の自律が基礎となっているのに対し、日本におけるそれは、個々人を超えたものとしてイメージされ、個々人を従属させる性格をもつ。(3)いずれの国においても、今後目指されるべき公共性概念として、自律性、多元性、社会的共同性などを特徴とする「市民連合的公共性」が挙げられ、実際にもその端緒が現れている。第2章「道徳授業における道徳性と公共性意識の形成の理論」では、コールバーグとハーバーマスの理論を対照させながら、道徳授業における公共性意識の形成の方向性について考察した。ハーバーマスの理論にもとづく「討議型アプローチ」の道徳授業は、コールバーグの理論にもとづく「モラル・ディスカッション・アプローチ」の道徳授業に比べ、「市民連合的公共性」意識の形成に、より理論的に対応するものであることを確認した。第3章「道徳授業における公共性意識の形成についての調査」では、日本とドイツの教員と生徒を対象としたアンケート調査の結果を分析した。分析の結果、討議型アプローチを取り入れた道徳授業は、日本の生徒では「社会共同性」や「自律性」の側面で、またドイツの生徒では、「社会共同性」「自律性」の側面ではなく「多元性」の側面で、公共性意識の形成に影響を与えていることが明らかとなった。1.日独の公共性概念に関する文献資料の収集と分析日本とドイツの公共性概念に関する文献を、特に思想的、社会学的な分野を中心に収集した。それをもとに、双方の概念を分析・整理し、次のような結果を得ることができた。(1)日本では伝統的に、政治体への帰属意識、ならびに世間への帰属意識という二点が公共性概念の特徴であるのに対し、ドイツでは、自律的な教養市民層の自由な活動空間がその基礎にある。(2)日独ともに、第二次世界大戦後、個人主義的な意識が拡大している。同時に、個人主義を基礎にした社会参加の動きも生じつつある。2.日独の学校教育における公共性意識形成についての予備的調査日本とドイツの小・中学校段階において、明示的あるいは潜在的に、どのような公共性意識が形成されているかを調べるため、予備的な調査を行った。学習指導要領の検討や教員へのインタビューなどを通して次のような結論を得ることができた。1(1)日本では「社会性の形成」と「個人の自律」が別々に考えられているのに対し、ドイツでは、「個人を基礎とした社会規範」という考えが一般的である。(2)日本では、規則や規範は所与であり変更しがたいと捉えられる傾向があるのに対し、ドイツでは一般に、規則は個々人相互の関係を規制する最低限の取り決めと捉えられている。次年度は、以上のような暫定的な結果をより精緻に規定するとともに、それを踏まえて、討議を中心とする公共性意識形成論の可能性について考察する予定である。1.日本とドイツにおける公共性概念とその類型化日本とドイツにおける公共性の概念を、哲学、社会学の文献により整理した。

また、日本とドイツの公共性概念の異同として、以下の点が明らかとなった。(1)いずれの国においても、公共性は伝統的に国家と結びついてイメージされる。(2)ドイツにおける伝統的な国家的公共性は、個人の自律が基礎となっているのに対し、日本におけるそれは、個々人を超えたものとしてイメージされ、個々人を従属させる性格をもつ。(3)いずれの国においても、今後目指されるべき公共性概念として、自律性、多元性、社会的共同性などを特徴とする「市民連合的公共性」が挙げられ、実際にもその端緒が現れている。2.道徳教育において目指されるべき公共性意識の形成のあり方コールバーグとハーバーマスの理論を対照させながら、道徳授業における公共性意識の形成の方向性について考察した。ハーバーマスの理論にもとづく「討議型アプローチ」の道徳授業は、コールバーグの理論にもとづく「モラル・ディスカッション・アプローチ」の道徳授業に比べ、「市民連合的公共性」意識の形成に、より理論的に対応するものであることを確認した。また、日本とドイツの教員と生徒を対象としたアンケート調査から、討議型アプローチを取り入れた道徳授業は、日本の生徒では「社会共同性」や「自律性」の側面で、またドイツの生徒では、「社会共同性」「自律性」の側面ではなく「多元性」の側面で、公共性意識の形成に影響を与えていることが明らかとなった。
加速進化により多様性を獲得したハブ毒遺伝子の発現と毒分泌の分子メカニズムの解明

ハブ毒は、有毒な低分子化合物の集合体ではなく、タンパク質分解酵素やリン脂質分解酵素等ユビキタスな(至るところに存在する)タンパク質群からなる。それらは、唾液腺が進化した毒腺組織で産生されるが、その産生の分子メカニズムは、ほとんど明らかとなっていない。そこで、本研究は、ハブ毒成分の発現(特に転写)の分子機構と毒タンパク質分泌の分子メカニズムを明らかとすることを目指した研究である。
microの解剖学的位置に注目した前立腺肥大症の炎症の病態の研究

前立腺肥大症は中高年男性に非常に多くみられる疾患の一つである。炎症は前立腺肥大症の病態形成、臨床症状に密接に関連していることが解明されているが、その詳細なしくみについてはわかっていない部分が多い。当研究では、ヒトの前立腺組織を使用し、炎症が前立腺肥大症に及ぼす影響を最先端の機器を使用して詳細に解析・検討し、病態の解明、治療法、予防法の確立を目指す。
中枢神経系由来培養細胞株における神経伝達物質の放出とシナプス形成機構の解析

キイロショウジョウバエ幼虫の中枢神経系より継代培養細胞株を樹立し、そこからクロ-ン細胞株をすでに得ている。正常な神経細胞からの継代培養細胞株は末だ報告がなく、この株が初めての例である。したがって、この細胞株は神経系の情報伝達およびシナプス形成機構を細胞分子レベルで解析するための良いモデル系となり得ると考えられる。しかしそのためには、これらのクロ-ン株の神経細胞としての性質を明らかにしなければならない。これらは昆虫の神経細胞のマ-カ-として用いられている抗HRP抗体に対する抗原を保持しているということがわかっている。今年度は、特に神経細胞の重要な性質の一つである神経伝達物質の検索をHPLCを用いることによって詳細に行なった。その結果、1.アセチルコリンが、11株中8株で検出された。2.LーDOPAが、11株中7株で検出された。3.ド-パミン、ノルアドレナリン、アドレナリンは調べたすべての株で検出限界以下であった。4.アセチルコリンとLーDOPAの両者が、11株中5株で検出された。5.プロクトリン、サブスタンスP、ソマトスタチン等のペプチド性神経伝達物質候補も検出された。ソマトスタチンがショウジョウバエの神経系に存在するという報告はまだなく、興味深い。6.ほ乳類における興奮性、および抑制性アミノ酸性神経伝達物質候補であるアスパラギン酸、グルタミン酸、およびグリシンも同定された。以上の神経伝達物質候補の含有量は、培養下で昆虫の変態ホルモンを投与することによって変化することが確認された株もあり、変態時に生体内で起こる変化を反映していると予測させる結果を得ている。またこれらの物質の合成酵素の有無を免疫組織学的に調べるとともに、神経刺激によって細胞外へ放出されるか否かを現在検索しており、伝達物質として作用している可能性を確実にしたい。さらに、培養下でシナプスが形成されているかどうかについても、電顕的に検討を行なっている。
トナカイ放牧と自然保全の持続可能な関係：エヴェンキ人のローカルナレッジの再評価

本研究は1年間の研究期間延長を除き、ほぼ計画通りに実行、終了した。本研究の主な成果は2つある。1エヴェンキ語による人類学的調査を通じた、エヴェンキ人のトナカイ放牧に関するローカルナレッジを再構築した。2エヴェンキ人の自然理解に基づくトナカイ放牧実践の理解を通じ、彼らが持続的な生存基盤を構築してきたのか再評価した。本研究結果をロシア語、中国語、エヴェンキ語でまとめ、出版することができたことは、研究計画以上の成果として挙げられる。さらに、これまでで研究代表者は、中国エヴェンキ自治旗旗長賞(重要貢献賞)を受賞したほか、エヴェンキ語による研究手法の開発においてロシア北方少数民族協会から表彰された。本研究の目的は、エヴェンキ人のトナカイ放牧に関するローカルノレッジを、エヴェンキ語による人類学的調査によって再構築する。エヴェンキ人の内在的な自然理解にもとづくトナカイ放牧の実践を理解することにより、彼らがどのように持続可能な生存基盤を築いてきたのかを再評価する。生活の画一化を迫る市場化の流れのなかで、ローカルノレッジの多様性を明らかにすることにより、トナカイ放牧と自然保全の持続可能な関係について新たな提言をすることである。この目的に沿って、平成25年度は、文献による理論的検討とIT技術を利用し、実践者とロシア及び中国の研究者と意見交換を行い、また、日本など他の地域の事例との比較研究を行った。具体的には以下の研究活動及び成果を実施した。1日本語など環境、ローカルナレッジや先住民に関する文献を収集し、環境保全や地域の持続性の観点から文献検討を行った。2ロシア語によるエヴェンキ研究を、トナカイ飼育、狩猟と自然環境の文化-信仰的利用に分けて、再検討を行った。3ロシアの協力者と一緒にロシア・ブリヤード共和国のエヴェンキ文化センターのホームーページーに「エヴェンキ人の失った文化と生活」のコーナーを設けて、「トナカイの命名式」や「エヴェンキ式橇を作る技術」などを紹介した。4エヴェンキ研究文献の翻訳、出版を進めた。5日本などほかの地域の状況や事例と比較するため、東北大学の研究者や日本のマタギの名人などを訪問し、インタビューを行った。中央シベリア高原のエヴェンキ人は、社会・生活の画一化を迫る市場化の流れの中で、いかに自然環境を保全しつつトナカイ放牧を継続できるのかという課題に直面している。これまで、エヴェンキ人のトナカイ放牧に関する知識は、帝政ロシア時代以降、ロシア語に翻訳され、蓄積されてきた。これに対して本研究では、以下のことを目的としてきた。1エヴェンキ人のトナカイ放牧に関するローカルナレッジをエヴェンキ語による人類学的調査によって再構築する。2エヴェンキ人の内在的な自然理解に基づくトナカイ放牧の実践を理解することで、彼らがどのように持続可能な生存基盤を構築してきたのかを再評価する。以上を目的としたこれまでの主な研究成果は以下の通りである。・現地調査および現地資料収集作業は計画通りに実行している。・研究成果は中国語、ロシア語、英語、日本語など多言語で書籍出版、翻訳が進められ、いくつかの国際会議の場でその成果が公表されてきただけでなく、エヴェンキ語およびロシア語のホームページを開設し、研究内容や成果を発信した。・現地で収集されたデータおよび分析を重ね、大阪大学大学院生対象の開講科目『環境問題への回路I・II・III』の教材として研究成果を一部活用している。・主に科研を通じた研究業績が認められた結果、サンクトペテルブルグ大学の特任研究者に選任されたほか、中国エヴェンキ研究会の名誉会長に選出された。・ローカルナレッジの研究が方法論として確立されてゆくことで、基盤Cから国際高等研究所共同代表へ発展したほか、GLOCOL企画の中国・雲南省における環境保護教育、実践活動に貢献している。・ローカルナレッジに関する理論的研究、現地調査に基づく実証的研究を推進、様々な形でローカルナレッジを再評価した結果、地域文化保護、継承や普及活動に成果が見られる。2エヴェンキ人の内在的な自然理解に基づくトナカイ放牧の実践を理解することで、彼らがどのように持続的な生存基盤を構築してきたのかを再評価する。・研究成果は中国語、ロシア語、英語、日本語など多言語で書籍を出版、翻訳を進め、いくつかの国際会議の場でその成果が公表されてきただけでなく、エヴェンキ語およびロシア語のホームページを開設し、研究内容や成果を発信した。・現地で収集されたデータの分析を重ね、大阪大学大学院の院生を対象とする開講科目「環境問題への回路I・II・III」の教材として研究成果を一部活用している。・主に科研を通じた研究業績が認められた結果、サンクトペテルブルグ大学の特任研究員に選任されたほか、中国エヴェンキ研究会の名誉会長に選ばれた。