hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
慢性内耳虚血の病態解明および治療法開発

本研究では、加齢性難聴の新しい動物モデルとして、「内耳慢性虚血モデル」動物を作製し、その病態を解明し、新たな予防医療や治療の開発に寄与することを目的とする。これまでの疫学調査で、加齢性難聴は、遺伝的要因の他に心血管系疾患、脳血管障害といった虚血に関連する疾患との関連が示唆されており、内耳血流障害も加齢性難聴の一因と考えられている。しかし内耳慢性虚血の病態に適したモデル動物はこれまでになかった。我々がこれまで確立してきた内耳一過性虚血モデルを応用することで、新たな加齢性難聴のモデル動物が確立し、加齢性難聴に対する新規予防法や新規治療につながる可能性がある。
口腔粘膜疾患の遺伝子治療の開発に関する基礎的研究

口腔粘膜疾患の多くは難治性で経過が長く、原因の明らかでないものが多い。これらの病態の発症機構の解明と、治療法の確立を目指して、疾患局所における遺伝子導入によるサイトカインの発現、あるいはアンチセンス遺伝子導入による発現の抑制のための基礎的研究を行った。in vitroにおいては、口腔扁平上皮癌細胞に、RSV-LTRを配置したβ-galactosidaseおよびCAT遺伝子の発現プラスミドを脂質二重膜法によって導入し、酵素活性測定による遺伝子産物の発現を確認した。しかし、免疫染色法では、ディッシュ上の全細胞中の25%程度でしか発現していなかった。これは、プラスミド系での導入効率の低さに起因するものであると思われた。そこで、LacZ遺伝子を組み込んだアデノウィルスベクターの感染実験を行ったところ、100%の細胞でLacZの発現が確認できた。また、TPA、IFN-β、TNF-γの刺激による、扁平上皮癌細胞におけるI-CAM1の誘導を、抗ヒトI-CAM1抗体を用いて確認した。この発現はヒトI-CAM1遺伝子に対する20merのアンチセンスDNAを処理することで抑制されることを明らかにした。しかし、マウス舌による実験では抑制効果は十分には認められなかった。これはヌードマウス舌に脂質二重膜とともに粘膜下注射したβ-galactosidaseおよびCAT遺伝子の発現が低いことと同様であった。そこで、扁平上皮癌細胞をヌードマウスに移植した腫瘍に、アデノウィルスLacZ遺伝子ベクターの注射実験をおこなったところ、局所におけるLacZ蛋白の発現が確認できた。さらに、この系を用いて、表皮で発現するPKCηを口腔扁平上皮癌細胞で過剰発現させ、TPA処理をおこなうことによる増殖抑制作用を見出した。扁平上皮癌を含む口腔粘膜疾患の新しい知見が得られた。1.遺伝子導入研究in vitro:口腔扁平上皮癌細胞に、RSV-LTRを配置したβ-galactosidaseおよびCAT遺伝子の発現プラスミドを脂質二重膜法によって導入し、酵素活性測定による遺伝子産物の発現を確認した。また、AP-1結合配列を上流に持つCAT遺伝子の発現プラスミドを導入後、細胞をTPA処理し、CAT遺伝子の誘導を確認した。さらにIacZ遺伝子を組み込んだアデノウィルスベクターを細胞に感染させ、LacZの一過性の発現を確認した。in vivo:ヌードマウス舌にβ-galactosidaseおよびCAT遺伝子の発現プラスミドを脂質二重膜とともに粘膜下注射し、それぞれの酵素活性を測定した。また、扁平上皮癌細胞をヌードマウスに移植した腫瘍に、アデノウィルスLacZ遺伝子ベクターを注射し、LacZ蛋白が発現することを明らかにした。2.アンチセンスDNAによる遺伝子発現制御研究in vivo:TNF-γで刺激したヌードマウス下におけるI-CAM1の誘導を抗マウスI-CAM1抗体を用いて確認した。同時にマウスI-CAM1遺伝子に対するアンチセンスDNAの処理によるI-CAM1の誘導の抑制の検討をおこなっている。3.まとめ発現ベクターの導入およびアンチセンスDNAによる制御研究とも、遺伝子軟膏としての開発をめざしており、in vivoにおける注射、直接塗布(滴下)および混合軟膏などの投与法と導入効率の比較、組織学的にどの深さまで導入し得るかを検討している。これらの病態の発症機構の解明と、治療法の確立を目指して、疾患局所における遺伝子導入によるサイトカインの発現、あるいはアンチセンス遺伝子導入による発現の抑制のための基礎的研究を行なった。

しかし、免疫染色法では、ディッシュ上の全細胞中の25%程度でしか発現していなかった。これは、プラスミド系での導入効率の低さに起因するものであると思われた。そこで、LacZ遺伝子を組み込んだアデノウィルスベクターの感染実験を行なったところ、100%の細胞でのLacZの発現が確認できた。また、TPA、IFN-β、TNF-γの刺激による、扁平上皮癌細胞におけるI-CAM1の誘導を、抗ヒトI-CAM1抗体を用いて確認した。この発現はヒトI-CAM1遺伝子に対する20merのアンチセンスDNAを処理することで抑制されることを明らかにした。しかし、マウス舌による実験では抑制効果は十分には認められなかった。これはヌードマウス舌に脂質二重膜とともに粘膜下注射したβ-galactosidaseおよびCAT遺伝子の発現が低いことと同様であった。そこで、扁平上皮癌細胞をヌードマウスに移植した腫瘍に、アデノウィルスLacZ遺伝子ベクターの注射実験をおこなったところ、局所におけるLacZ蛋白の発現が確認できた。さらに、この系を用いて、表皮で発現するPKCηを口腔扁平上皮癌細胞で過剰発現させ、TPA処理をおこなうことによる増殖抑制作用を見出した。扁平上皮癌を含む口腔粘膜疾患の新しい知見が得られた。
多成分連結反応のためのポリメタル化ペプチド錯体触媒の開発

多数の金属原子の組成や配置、相互の距離を制御して集積化することにより、従来の単核錯体触媒では不可能な高度な分子変換を行うことができる高機能型触媒の開発を目的とした研究を行った。天然由来のアミノ酸であるグルタミン酸の側鎖に金属が化学結合したメタル化アミノ酸をデザインし、それらを連結することによって、ペプチド上に金属が集積化されたポリメタル化ペプチドの合成に成功した。特に、金属としてパラジウムおよび白金の結合したペプチドでは、金属部位とペプチド主鎖の相互作用によって、わずか4残基のペプチドが安定なα-ヘリックス構造を形成し金属がらせん状に配置された3次元構造を実現することに成功した。また、得られたペプチドの有機溶媒溶液に超音波照射を施したところ、溶液が流動性を失いゲル状の固体を与えることを見出した。Spring-8を利用した小角および広角X線散乱実験、走査型電子顕微鏡および原子間力顕微鏡を利用した解析によって、得られたゲル状物は長さ200μm、幅150nmの微小繊維が集合体であり、これらの繊維は上述のペプチド分子が自己集合することによってβ-シート型集積体を形成した結果生成したものであることが明らかとなった。得られたβ-シート集積体では触媒金属となるパラジウムや白金がシート状に規則正しく配列しており、金属同士の共同効果やペプチド集合体の表面状態を利用した高度な触媒反応が可能となると考えられる。申請者はこれらのゲル状繊維を触媒としてπ-アリルを経由する辻-トロスト反応の検討を行った結果、水中で高い触媒活性を示すことを見出した。申請者らは自在に相互連結が行える遷移金属錯体を用いて構成触媒金属の種類、個数、配列の制御された多核錯体触媒を創出に関する研究を行った。その結果、アミノ酸に遷移金属錯体が化学結合したメタル化アミノ酸の開発に成功し、それらを相互に連結・伸長することによって、ペプチド主鎖上に金属が多数配列したポリメタル化ペプチド錯体触媒を合成する手法、および連結するメタル化アミノ酸の順列・組合せを変化させることによる触媒金属の精密配列制御に成功した。また、それらのメタル化アミノ酸およびメタル化ペプチドの自己組織化によって金属原子の多数配列した超分子構造体を合成することに成功した。具体的にはグルタミンの側鎖にイミノ配位子とPd,Pt,Ru,Ir等の種々の遷移金属を結合させたメタル化アミノ酸の開発に成功し、これらのメタル化アミノ酸からジメタル化ペプチドやトリメタル化ペプチドを合成することに成功した。また、NMR、CDスペクトルおよびX線結晶解析等の各種測定手法と分子科学計算によって、得られたポリメタル化ペプチドの溶液内での立体構造解析と会合挙動に詳しい検討を行った結果、希薄溶液中では高いヘリックス性を示しているが、高濃度領域および固体状態では顕著なβ-シート様式をとり、アミロイド繊維に類似の繊維原性物質を与えることを見出した。また、これらは超音波を照射することで、溶液を瞬時にゲル化するという特徴を示すことを明らかにし、ゲル中においてもアミロイドおよびコラーゲンに類似の繊維状超分子集合体を与えることを発見した。また、粉末X線回折および電子線回折、AFMを用いた測定によってゲルのミクロ構造について詳細な知見を得ることに成功した。
ヒルシュスプルング病における腸管壁内神経節細胞局在の二光子レーザー顕微鏡観察研究

Hirschsprung病は、先天的な腸管神経節細胞の欠損が病因として判明している。治療としては経肛門的腸管切除術(経肛門大腸Pull through)を要するが、正確な正常神経節腸管の肛門への引きおろしが患児の一生の排便機能に影響する。この研究は、二光子レーザー顕微鏡により、腸管漿膜面から腸管神経節細胞の同定が可能かどうかを検討するものである。この検討により同顕微鏡で腸管神経節細胞の局在などが確認できることが証明されると、術中に腸管漿膜面からの神経節細胞の確認が可能となるため、確実な切除ラインの決定により、再手術症例の減少や術後排便障害などの合併症の発症を軽減できる可能性がある。
高強度・円偏光レーザー場による原子・分子内環電流・誘起磁場の実証と解明

高強度レーザー場による新規な原子・分子制御法の開発を目指し、エタノール分子の短パルス・近赤外レーザー(790nm)照射によるイオン化を対象として、以下のことを明らかにした。(1)生成する電子-イオンの同時計測を行い、イオン種ごとの光電子スペクトルが偏光楕円率に依存して変化する。(2)より長波長(1.3μm)の赤外レーザーを合わせて照射した条件下では、2つのレーザー照射タイミングおよび相対的偏光方向に依存して、各イオン種の生成比が変化する。高強度レーザーによる新規な原子・分子制御法の開発を目指し、高強度レーザー場によって誘起される電子波束および磁場ダイナミクスの解明を行う。理論予測されている高強度・中赤外(10μm)円偏光レーザー照射による原子・分子内環電流および磁場発生を実証することを目標とする。本年度は、中赤外レーザー光源の整備、および中赤外ポンプ-近赤外プローブによる時間分解光電子分光計測システムの構築を行った。まず、中赤外レーザー光を発生する光パラメトリック増幅器の購入・整備を行った。発生した中赤外光の波長・時間幅を評価するために、光パラメトリック増幅器の励起光(800nm)との和周波発生による交差相関測定システムを構築し、510μmの波長領域で時間幅が約100フェムト秒と決定した。その後、中赤外ポンプ-近赤外プローブの光学システムを構築し、エタノール分子のイオン化を対象とした予備実験を行った。中赤外レーザー出力が、10μm付近では低く(4μJ)、エタノール分子をイオン化するには充分ではないため、高出力が出せる1.3μm(150μJ)で行った。エタノール蒸気を導入した光電子-光イオン分光用チャンバーに、1.3μmおよび800nmのレーザー光を放物面鏡を利用して集光しながら導入し、2色のレーザーパルスが時間・空間的に重なった時に親イオンおよび解離生成イオンの量が増大することを確認した。また、2色のレーザーの偏光関係の変えた場合、イオン種ごとに生成量の変化が異なることを確認した。前年度までに、中赤外レーザー光源の整備、中赤外光ポンプー近赤外光プローブによる時間分解光電子分光計測システムの構築、およびその動作確認までの作業を完了した。本年度は、整備した計測システムを利用して、時間分解イオン生成観測を試みた。レーザー光強度に基づく見積りによれば、中赤外光と近赤外光を集光して照射すれば、2つのレーザーパルスが時間的-空間的に重なる条件でイオン生成量の増大が確認できるはずである。しかしながら、現時点ではイオン生成量の増大を観測できていない。その原因としては、中赤外光と近赤外光の、時間的-空間的重なりが最適化できていないことにあると考えている。既存の光電子-光イオン分光用チャンバーは、内部構造が複雑なため、イオン化領域での2つのレーザー光の空間重なりを確認する事が出来ない。そのため、チャンバー内で空間重なりを最適化することが困難である。その困難を解消するため、覗き窓やピンホールを設置するなど、空間重なりを容易に確認するための改修作業を行う事にしたが、光電子-光イオン分光用チャンバーは構造上の問題により改修することが出来なかった.そのため、別のイオン計測用チャンバーを使用することとし、その改修作業を開始した。高強度レーザーによる新規な原子・分子制御法の開発を目指し、高強度・円偏光レーザー場によって誘起される電子波束および磁場ダイナミクスの解明を行う。前年度までに、中赤外レーザー光源の整備、中赤外光ポンプー近赤外光プローブによる時間分解光電子分光計測システムの構築と動作確認までの作業を完了した。また、本実験のためのイオン計測用チャンバー改修作業を開始した。本年度は、イオン計測用チャンバーの改修作業を引き続き行った。具体的には、主に以下の3つである。1チャンバーの差動排気化や、イオン質量分析システムの開発、2中赤外光と近赤外光のチャンバー内での空間ー時間重なりを確認するための、和周波発生ー観測システムの構築、3低蒸気圧液体試料を効率良く導入するための、ガス導入部の加熱用ヒーターの設置。その後、以下の2種類の分子群を対象として、中赤外ー近赤外レーザー照射による時間分解イオン生成観測実験を進めた。1低いイオン化ポテンシャル(7eV)を有する分子群、2中赤外光波長(410μm)に振動吸収を有する分子群。

その結果、中赤外レーザー光の集光強度が充分でなく、イオン生成量の増大がうまく観測できない、という問題点が明らかになった。現在、集光光学系の改良など、実験システムの更なる改良を進めている。当初想定していたより、真空チャンバー内で中赤外レーザー光と近赤外レーザー光の空間重なりを最適化することが困難であり、既存の真空チャンバーの改修作業を行う必要が出てきたため。24年度が最終年度であるため、記入しない。既存の真空チャンバーの改修作業を行うことで空間重なりの最適化を容易にする。さらに、時間重なりの自由度を減らすため、中赤外光の波長を対象分子の振動エネルギーに合わせた実験を行うことで、実験の効率化を図る。
細胞内情報伝達路におけるプロテインホスファターゼの意義

セリン/トレオニンホスファターゼ(PP)の研究では、武田がヒトPP2Aの74kDa調節サブユニットB^<11>のA-キナーゼによるリン酸化部位を決定し、リン酸化により基質特異性が変化することを明らかにした。菊池はヒト肝癌細胞HepG2を同調させ、正常肝細胞に比し、PP1のbasalレベル(酵素量)の上昇とG1/S期での一過性上昇(酵素の活性化)を認めた。久野は分裂酵母を用いてPP2B遺伝子破壊による機能異常を相補する因子としてPmPlを発見した。PmPlは新規MAP kinase phosphataseであることを明らかにした。田村はCOS細胞を用いて,PP2Cは共発現させたp38のストレス依存性の活性化を抑制した。p38の上流のMKK3及び6,さらにJNKの上流のMKK4及び7の活性がPP2Cによって抑制されたがERKの上流のMKKlは影響されなかった。一方,PP2CのDN型はMKK3,4,6を活性化させた。PP2Cが生理的にSAPKシステムの制御因子として機能すると示唆された。宮本は海馬CAl領域における長期増強が,カリクリンA感受性PP活性(PPl,PP2A)の減少を伴い,PP2C活性は変化がなかった。藤本はトウトマイシン(TA)がオカダ酸(OA)と異なり発がんプロモーション活性を示さないことから,NIH/3T3細胞のシグナル伝達,細胞周期,TNF-α産生に及ぼすTAの作用をOAと比較した。チロシンホスファターゼ(PTP)の研究では,春日はチロシンホスファターゼSAP-2/SHP-2の基質SHPS-1の細胞外,内ドメインに結合する分子の検索を行い,細胞外リガンド候補蛋白質を肝臓,脳に認めた。日野田はSHP-2がIL-2によって増殖シグナルとは異なる伝達経路を介して活性化されることから,T細胞のcytotoxin活性に寄与する可能性を考え,SHP-2過剰発現リンパ球を確立した。矢倉はB細胞抗原受容体を介するシグナルを制御する新たな分子として,PEST領域を含む細胞内型PTPのPEPを同定し,この過程における必須な役割を明らかにした。渡辺は造血幹細胞の発生起源であるAGM領域の分散培養系を用い,造血発生時のPTP発現パターンを明らかにした。セリン/トレオニンホスファターゼ(PP)の研究では、武田がヒト赤血球PP2Aの74kDa調節サブユニットB"のcDNAをクローン化した。B"はB'サブユニットと分子中央の400アミノ酸残基配列に相同性が高くB'ファミリーを形成し、第3のサブユニットとしてPP2Aの活性、細胞内局在を制御すると推定した。菊池は腹水肝癌細胞でPP1αの転写が亢進する機構を解明するため、PP1α遺伝子を単離し、その転写機構を解析した。久野はPP2Bが記憶のモデル系である長期増強現象を抑制的に制御することを明らかにした。田村はPP2Cβ遺伝子の構造解析とRT-PCRによる転写産物の解析を行った。アルツハイマー病脳の神経原線維変化には燐酸化タウ蛋白質が著名に蓄積する。

燐酸化部位はC末端側にプロリンを持つ特徴がある。宮本はこの燐酸化タウ蛋白質を脱燐酸化するPPを同定した。藤木はPP阻害剤であるオカダ酸がマウス皮膚でTNF-αmRNAの発現を誘導し、発癌プロモーション活性を示し、一方、PP阻害剤であるトウトマイシンではこれらの活性が見られないことを示した。チロシンホスファターゼ(PTP)の研究では、春日がSH2ドメインを有するPTP、SAP-2の基質蛋白質、SHPS-1(pp120)の遺伝子をクローン化した。渡邊は、受容体型PTPβ2の全長cDNAをクローン化し、人為的に発現させたPTPβ2がMEL細胞の赤血球分化を誘導することを示した。矢倉は、未熟B細胞のCD45がLynを不活化する機構を解析し、LynのC末の負野制御部位Tyrと自己燐酸化部位Tyrを脱燐酸化することを明らかにした。日野田はHPTPδの細胞外ドメインのトランスフェクトーマを免疫原として抗体の作製に成功した。セリン/トレオニンホスファターゼ(PP)の研究では,武田がヒトPP2Aの74kDa調節サブユニットB"(δ_1)のスプライシング変異体δ_2,δ_3を見い出した。ラットB"は72kDaであり,広い組織分布を示し,特に脳に多く分布した。菊池は腹水肝癌細胞AH13で,翻訳開始点上流2ケ所の領域で著しいPP1α遺伝子のプロモータ活性の上昇を認め,PP1αの転写上昇が悪性度と平行することを観察した。久野はPP2B遺伝子破壊による機能異常を相補する因子として新規MAPKホスファターゼ,pmp1を発見した。田村はCOS細胞でのPP2Cの発現系を用いて,PP2Cはストレス依存性キナーゼ,p38システムを抑制すること,その作用点がp38を活性化するキナーゼか,その上流にあることを明らかにした。宮本は長期増強誘導時にPP2Aの55kDa触媒サブユニットのリン酸化をみとめた。藤木はPP阻害剤,ノジュラリンが強力なラット肝発癌プロモーターであり,TNF-αmRNA,初期応答遺伝子の発現をmRNAの安定化によって持続的に誘導することを見い出した。チロシンホスファターゼ(PTP)の研究では,春日はSH2を有するPTP,SAP-2/SHP-2の基質SHPS-1の過剰発現により,CHO細胞でのインスリンによるMAPKの活性化の増強を観た。SHPS-1-SAP-2複合体の形成が,この経路のほかにインテグリンを介した細胞接着刺激や,リゾホスファチジン酸によるMARKの活性化にも重要なことを明らかにした。日野田はIL-2Rβ鎖遺伝子導入BAF-BO3細胞において,IL-2刺激によりSHP-2のチロシン残基のリン酸化を観察した。矢倉は同一のPTPが細胞の分化段階が異なると全く逆の作用を示すことを,チロシンキナーゼやMAPKのメンバーのCD45による制御を解析することにより明らかにした。渡辺はPTPεがPC12D細胞の神経分化時に一過的に発現されることを明らかにした。セリン/トレオニンホスファターゼ(PP)の研究では,武田がヒトPP2Aの74kDa調節サブユニットB′′のA-キナーゼによるリン酸化部位を決定し,リン酸化により基質特異性が変化することを明らかにした。菊池はヒト肝癌細胞HepG2を同調させ,正常肝細胞に比し、PP1のbasalレベル1(酵素量)の上昇とG1/S期での一過性上昇(酵素の活性化)を認めた。
巨大ウイルスの構造からみるウイルス多様性と系統進化の研究２

本研究では、前回の公募研究の成果を踏まえて、以下に示すさらに詳細な巨大ウイルスの比較形態学に挑む。そして、複製可能な最小構造体であるはずのウイルスが何故このように巨大化して多様化したか、細胞性生物との間にどのような相互関係があるのかを、ゲノム系統樹およびその生息分布と照らし合わせることで考察する。
太平洋戦争の時代における自衛権概念の考察

平成29年度は、太平洋戦争開戦直前の時期のアメリカに焦点を当て、アメリカが自国の連合国援助を正当化するために主張した国際法上の根拠を検討した。当初の研究計画を変更したのは、計画していた研究遂行のために十分な資料が入手できなかったためである。1939年、欧州で開始した戦争についてアメリカは中立の立場をとることを表明した。当時、一般的には、中立国は交戦国を公平に扱う義務があると解釈されていた。したがって、アメリカが連合国とりわけイギリスを援助するためには、それを正当化するための国際法上の根拠が必要であった。本研究では、この根拠を検討した。その結果、アメリカは次のような二つの根拠で自国の行動を正当化したことが分かった。第一に、第一次世界大戦後に戦争が違法とされたのに伴って、伝統的中立制度が変容したとする。そして、中立国は、不戦条約に違反して開始した戦争の交戦国を差別的に扱うことができるとするものである。第二に、自国や西半球を防衛するための自衛権の行使として援助が可能であるというものである。前者の根拠については、主として当時の司法長官の発言を、また後者の根拠については、主として当時の国務長官の発言を分析した。その上で、あらかじめ調査した戦間期の学説や国家実行と比較しながら、アメリカが展開した根拠の問題的も検討した。本研究結果は、平成30年7月に開催される第180回九州国際法学会例会で報告し、その概要は『九州国際法学会年報』に掲載される予定である。29年度が最終年度であるため、記入しない。本研究は、全体として、太平洋戦争の時代の日本および外国の自衛権の捉え方を精査することによって、当時の自衛権概念を明らかにすることを目的とするものである。平成27年度は、日本およびアメリカに焦点を当て、当時これら二か国が、自衛権を、「自国領土が武力攻撃された場合に反撃する権利」というように制限的に解釈していたのかを検討する計画であった。まず、日本について、太平洋戦争の戦争目的を説明する際に使用された「自存自衛」という用語や、外交交渉などで用いられた「自衛」「自衛権」といった用語に着目し、これらの用語が用いられた文脈やその意味を明らかにした。「自存自衛」については、主として、太平洋戦争重要国策の決定過程、政府や大本営内部における議論を、「自衛」「自衛権」については、主として外交交渉過程を検討対象とした。次に、アメリカについては、太平洋戦争開戦前の時期、とりわけ既に勃発していた欧州戦争に対する態度決定の文脈で自衛権が盛んに議論された1941年に着目した。そして、同年の大統領や国務長官などが表明した国家政策、外交交渉過程における自衛権に関連する発言などを中心として現在も分析を続けている。本研究の成果は、2016年3月に開催された九州国際法学会例会において報告した。平成28年度は、この研究成果の公表準備を進めるのと並行し、日本およびアメリカ以外の国家の自衛権の捉え方にも焦点を当てることにより、当時の自衛権概念の全体像を明らかにする。当初の予定通り、日本およびアメリカの二か国を対象として検討を進めることはできた。ただし、3ヵ月間の研究中断期間があっため、アメリカについての研究は完了しておらず現在も継続している。本研究は、「太平洋戦争の時代における自衛権概念の考察」と題した三か年計画の研究であり、全体として太平洋戦争の時代の自衛権についての各国の主張を精査することを目的としている。2016年度は、その2年目にあたる。2016年度は、欧州において第二次世界大戦が始まった1939年から、太平洋戦争が始まった1941年までの時期に、イギリスおよびフランスが、戦争や武力行使を正当化するために用いた概念を分析する作業を行った。この作業は、主としてイギリスおよびフランスが残した外交文書集・政策文書集を用い、補助的に、アメリカが残した外交文書集も使用した。調査の結果、当時のアメリカが、将来の第二次世界大戦への参戦を「自衛権」を以て正当化したのに対して、イギリスとフランスは、対独開戦に際して、管見の限り、「自衛権」を援用した主張はしていなかったことが明らかになった。イギリスとフランスが対独参戦に際しては「自衛権」という用語を用いなかったものの、日本やアメリカの自衛権の主張に対して行った評価が存在する。このような評価の中から、イギリスとフランスが当時自衛権をどのような概念として捉えていたのかを分析した。また、英仏両国が、同時期に、自衛権に近接する概念を用いて自国の将来のあるいは現在の行動を正当化している箇所があり、これらの用語がどのような意味で用いられているのかにも着目しながら、当時の自衛権概念を検討した。第二次世界大戦開戦に至るまでのイギリスおよびフランスの外交文書が、研究計画を作成した際に予測したよりも大量に存在し、計画より多くの時間を要したため。

その結果、アメリカは次のような二つの根拠で自国の行動を正当化したことが分かった。第一に、第一次世界大戦後に戦争が違法とされたのに伴って、伝統的中立制度が変容したとする。そして、中立国は、不戦条約に違反して開始した戦争の交戦国を差別的に扱うことができるとするものである。第二に、自国や西半球を防衛するための自衛権の行使として援助が可能であるというものである。前者の根拠については、主として当時の司法長官の発言を、また後者の根拠については、主として当時の国務長官の発言を分析した。その上で、あらかじめ調査した戦間期の学説や国家実行と比較しながら、アメリカが展開した根拠の問題的も検討した。本研究結果は、平成30年7月に開催される第180回九州国際法学会例会で報告し、その概要は『九州国際法学会年報』に掲載される予定である。日本とアメリカ以外の、イギリスやフランスといった国家にも焦点を当て、当時の自衛権概念の全体像を明らかにする。引き続き、イギリスおよびフランスを対象とし、2016年度に収集した外交文書の分析を進める。その際、昨年度以前に検討したアメリカの自衛権の主張とイギリス・フランスの主張との相違や、英仏両国が援用した「対抗措置」「復仇」といった概念にも着目しながら、研究を進める。29年度が最終年度であるため、記入しない。
炎症性腸疾患治療ターゲットとしての腸炎惹起性メモリーT細胞ILー7受容体の解析

炎症性腸疾患(IBD)の病態解明および画期的な根治療法の開発を最終目標として、疾患フェノタイプを"記憶"し、生涯にわたり生体内に潜在し続ける"腸炎惹起性メモリーT細胞"に着目し、その維持機構におけるIL-7/IL-7受容体(IL-7R)シグナルの重要性を証明してきた。本研究においてIBDに対するIL-7/IL-7Rシグナルターゲット療法の実現化のために、1)腸炎惹起性メモリーT細胞におけるIL-7R発現制御機構の解明(より有効な治療標的分子の網羅的検索)、2)腸炎モデルT細胞および非T細胞におけるIL-7/IL-7Rシグナル重要性の比較検討(より有効な治療標的細胞の検索、より安全で確実な治療法の開発)を行った。正常マウスおよび腸炎マウスにおいてIL-7RαはCD4+T細胞に最も高発現しており、腸炎の発症とともにCD4+T細胞ではIL-7Rαの発現が亢進した。IBDの遷延性における重要な因子であるIL-7/IL-7RシグナルにはCD4+T細胞におけるIL-7Rα発現が必須であり、炎症性腸疾患の分子ターゲット療法としてCD4+T細胞におけるIL-7/IL-7Rシグナル阻害が有力な標的となり得ることが示唆された。炎症性腸疾患(IBD)の病態解明および画期的な根治療法の開発を最終目標として、我々はこれまでに疾患フェノタイプを"記憶"し、生涯にわたり生体内に潜在し続ける"腸炎惹起性メモリーT細胞"に着目し、その維持機構におけるIL-7/IL-7受容体(IL-7R)シグナルの重要性を証明してきた。本期間において我々はIBDに対するIL-7/IL-7Rシグナルターゲット療法の実現化のために、腸炎モデルCD4^+T細胞およびCD4^-細胞におけるIL-7/IL-7Rシグナル重要性の比較検討を行った。1)正常マウスおよび腸炎マウスにおいてIL-7Rαはナチュラルキラー細胞、樹状細胞、マクロファージ、好中球等血球系細胞に広く発現していたが、CD4^+T細胞に最も高発現していた。さらに腸炎の発症とともに他の血球系細胞ではIL-7Rαの発現が低下するのに対してCD4^+T細胞ではIL-7Rαの発現が亢進した。2)CD4^+T細胞のみIL-7Rα^<-/->マウス脾臓よりCD4^+CD25-T細胞あるいはCD4^+CD44-CD62L-T細胞をRAG-2^<-/->マウスに移入したところ腸炎の発症が見られず、腸管粘膜におけるCD4^+T細胞のアポトーシス亢進が見られた。3)IL-7Rα^<-/->x RAG-2^<-/->マウスに正常マウスのCD4^+CD25-T細胞を移入したところRAG-2^<-/->マウスをレシピエントに用いた群と同等の腸炎を発症した。以上の結果からIBDの遷延性における重要な因子であるIL-7/IL-7RシグナルにはCD4^+T細胞におけるIL-7Rα発現が必須であり、他の細胞におけるIL-7Rαの発現は必須ではない事がわかった。炎症性腸疾患の分子ターゲット療法としてCD4^+T細胞におけるIL-7/IL-7Rシグナル阻害が有力な標的となり得ることが示唆された。さらに腸炎の発症とともに他の血球系細胞ではIL-7Rαの発現が低下するのに対してCD4+T細胞ではIL-7Rαの発現が亢進した。

2)CD4+T細胞のみIL-7Rα^<-/->マウス脾臓よりCD4^+CD25^-T細胞あるいはCD4^+CD44^-CD62L^-T細胞をRAG-2^<-/->マウスに移入したところ腸炎の発症が見られず、腸管粘膜におけるCD4^+T細胞のアポトーシス亢進が見られた。3)IL-7Rα^<-/->xRAG-2^<-/->マウスに正常マウスのCD4^+CD25^-T細胞を移入したところRAG-2^<-/->マウスをレシピエントに用いた群と同等の腸炎を発症した。4)同数のLy5.1^+IL-7Rα^<-/->CD4^+CD25^+T細胞およびLy5.2^+IL-7Rα^<+/+>CD4^+CD25^-T細胞をRAG-2-N^<-/->マウスに移入したところ6週後に大腸炎を発症するもののLy5.1^+IL-7Rα^<-/->細胞の著明な減少を認めた。5)4)の実験において腸炎マウス大腸粘膜由来IL-7Rα^<-/->CD4^+T細胞はIL-5.1^+IL-7Rα^<+/+>細胞と同等のIFN-γ/IL-17産生能を有し、IL-7/IL-7Rシグナルはエフェクター能の発現には必須ではない事が分かった。以上の結果からIBDの遷延性における重要な因子であるIL-7/IL「7RシグナルにはCD4+T細胞におけるIL-7Rα発現が必須であり、他の細胞におけるIL-7Rαの発現は必須ではない事がわかった。炎症性腸疾患の分子ターゲット療法としてCD4+T細胞におけるIL-7/IL-7Rシグナル阻害が有力な標的となり得ることが示唆された。炎症性腸疾患(IBD)の病態解明および画期的な根治療法の開発を最終目標として、疾患フェノタイプを“記憶"し、生涯にわたり生体内に潜在し続ける“腸炎惹起性メモリーT細胞"に着目し、その維持機構におけるIL-7/IL-7受容体(IL-7R)シグナルの重要性を証明してきた。本研究においてIBDに対するIL-7/IL-7Rシグナルターゲット療法の実現化のために、1)腸炎惹起性メモリーT細胞におけるIL-7R発現制御機構の解明(より有効な治療標的分子の網羅的検索)、2)腸炎モデルT細胞および非T細胞におけるIL-7/IL-7Rシグナル重要性の比較検討(より有効な治療標的細胞の検索、より安全で確実な治療法の開発)を行った。正常マウスおよび腸炎マウスにおいてIL-7RαはCD4+T細胞に最も高発現しており、腸炎の発症とともにCD4+T細胞ではIL-7Rαの発現が亢進した。IBDの遷延性における重要な因子であるIL-7/IL-7RシグナルにはCD4+T細胞におけるIL-7Rα発現が必須であり、炎症性腸疾患の分子ターゲット療法としてCD4+T細胞におけるIL-7/IL-7Rシグナル阻害が有力な標的となり得ることが示唆された。(1)腸炎モデルT細胞および非T細胞におけるIL-7/IL-7Rシグナル重要性の比較検討に関しては十分な成果を得て、複数の国際学会発表およびトップジャーナルへの報告が可能であった。一方腸炎惹起性メモリーT細胞におけるIL-7R発現制御機構の解明に関してはin vitroの培養系の確立までは可能であったが、(2)IL-7Rを制御する特異的因子の同定には至らなかった。これは(1)の実験結果で予想以上の良い結果が得られたためpriorityを(1)にシフトしたためである。24年度が最終年度であるため、記入しない。(1)に関しては既に終了しており、トップジャーナルに報告済みである。(2)に関しては(1)の結果からも更に実験の重要度が高くなったと考えられるため今後他機関の研究奨励金などを用いて実験を継続する予定である。
臨床膵島移植成功へのブレイクスルー:グラフト機能障害の制御に関する研究

インスリン依存糖尿病の根治的治療法として、膵島移植の臨床応用が開始されている。膵島移植はインスリン産生細胞(膵島)を移植に用いる細胞移植療法で、膵臓器移植に代わる、侵襲の少ない安全な治療法として、今後の発展が切望されている。膵島移植が直面する最も重要な課題は、一人の糖尿病レシピエントの治療成功に2-3回の膵島移植、すなわち2-3人分のドナー膵臓を必要とする事が挙げられる。この問題は移植した膵島が種々の原因で障害、破壊され、一回の移植のみでは機能する膵島数が不足し、レシピエントをインスリン治療から離脱するためには、結果として複数回の膵島移植を要することに起因している。この問題が現在の膵島移植の最大障壁となっており、解決法が見出され、一人のドナーより一人のレシピエントへの移植が可能となればブレイクスルーとなり、臨床膵島移植の一層の発展が期待できる。移植膵島障害の制御にはその機序の解析が必須である。本研究では膵島移植直後の生着に関連した膵島障害に着目、その機序を解析し、制御法の開発を行った。その結果、新に発見された免疫担当細胞、ナチュラルキラーT(NKT)細胞が移植後早期の生着に伴う膵島障害に必須の役割を担っていることが明らかになった。また、NKT細胞を標的にした治療法により、マウスでは1匹のドナーから2匹のレシピエントへの移植成功が達成できた(JEM202:913-918,2005)。本研究で得られた新規知見の臨床応用により、一人のドナーより一人のレシピエントへの膵島移植成功が達成できる可能性が示唆された。臨床膵島移植に於ける現在の最も重要な課題は、一人のレシピエントへの移植を成功させるためには2-3人のドナー膵臓より単離した膵島を必要とする事、すなわち一人のドナーより一人のレシピエントへの移植では成功しないことが挙げられる。この問題の解決が臨床膵島移植の急務となっている。本研究では移植膵島の生着(engraftment)に着目し、移植後のグラフト障害メカニズムを解析、その制御法を見出すことがこの問題の解決になると考え、実験を行い、以下の新しい知見を得た。#1.肝内移植後の膵島細胞障害にNKT細胞が必須の役割を担っている。C57BL/6マウスをドナー、レシピエントに使用した。レシピエントはストレプトゾトシン(STZ)を静注、糖尿病とし、単離膵島(isografts)を経門脈的肝内に移植した。このモデルでは400個の膵島を移植すると、レシピエントの血糖は移植後1-2日で正常化するが200個の移植では高血糖で推移した。NKT細胞ノックアウトマウスをレシピエントに使用した場合、200個の単離膵島移植でマウスの血糖は正常化した。更に、NKT細胞の関与を明にする目的で、細胞移入実験を行った。NKT細胞ノックアウトマウスに200個の膵島を移植、同時にマウス肝臓より単離した単核球(5x10^5)を門脈内に移入した。野生型肝単核球の移入した場合は、レシピエントの血糖値は移植後に正常化しなかったが、NKT細胞またはINF-γノックアウトマウスの肝単核球移入では正常血糖となった。上記知見は膵島肝内移植に発現するグラフト障害にNKT細胞が必須の役割を担い、その作用にINF-γが関与していることを示している。今後は他のサイトカイン等を含め、臨床応用可能な制御法を見出すべく、研究を進める。

この問題の解決が臨床膵島移植の急務となっている。本研究では移植膵島の生着(engraftment)に着目、移植後のグラフト障害メカニズムを解析し、以下の知見を見いだした。#1.肝内移植後の膵島細胞障害に炎症性サイトカインが必須の役割を担っている。C57BL/6マウスをドナー、レシピエントに使用した。レシピエントはストレプトゾトシン(STZ)を静注、糖尿病とし、単離膵島(isografts)を経門脈的肝内に移植した。一匹のマウス膵臓より単離可能膵島数は200個である。このモデルでは400個の膵島を移植すると、レシピエントの血糖は移植後1-2日で正常化するが200個の移植では高血糖で推移した。抗IFN-γ抗体を移植後に投与すると、200個の単離膵島移植でマウスの血糖は正常化した。抗TNF-α抗体または抗IL-1β抗体の単独投与でも同様の結果が得られた。さらにドナー膵島数を100個にした場合、それぞれの抗体の単独投与では移植後に糖尿病レシピエントの血糖は正常化しなかったが、3抗体同時に投与すると、正常血糖となった。同種移植でも免疫抑制剤の使用による拒絶反応の制御下で、同様の所見が得られた。このことは一匹のドナーより2匹のレシピエントマウスへの移植が可能となることを示している。上記知見は膵島肝内移植後に発現するグラフト障害に炎症性サイトカインが必須の役割を担っており、その制御によりone donor-one recipientの膵島移植が可能となることを示唆している。インスリン依存糖尿病の根治的治療法として、膵島移植の臨床応用が開始されている。膵島移植はインスリン産生細胞(膵島)を移植に用いる細胞移植療法で、膵臓器移植に代わる、侵襲の少ない安全な治療法として、今後の発展が切望されている。膵島移植が直面する最も重要な課題は、一人の糖尿病レシピエントの治療成功に2-3回の膵島移植、すなわち2-3人分のドナー膵臓を必要とする事が挙げられる。この間題は移植した膵島が種々の原因で障害、破壊され、一回の移植のみでは機能する膵島数が不足し、レシピエントをインスリン治療から離脱するためには、結果として複数回の膵島移植を要することに起因している。この問題が現在の膵島移植の最大障壁となっており、解決法が見出され、一人のドナーより一人のレシピエントへの移植が可能となればブレイクスルーとなり、臨床膵島移植の一層の発展が期待できる。移植膵島障害の制御にはその機序の解析が必須である。その原因としては臓器移植とは異なった細胞移植特有の因子、特に膵島単離、移植直後の生着、拒絶反応による移植膵島障害、さらには免疫抑制剤による膵島β細胞障害を考慮する必要がある。本研究では膵島移植直後の生着に関連した膵島障害に着目、その機序を解析し、制御法の開発を試みた。その結果、新に発見された免疫担当細胞、ナチュラルキラーT (NKT)細胞が移植後早期の生着に伴う膵島障害(JEM 202:913-918,2005)ならびに同種膵島移植拒絶反応(Diabetes56:34-39,2006)に必須の役割を担っている事を見出した。いずれも新たな視点より移植膵島障害機序を明らかにしたもので、その制御法の臨床応用により一人のドナーより一人のレシピエントヘの膵島移植成功が達成できる可能性が示唆された。
Antisense Display-新しい機能性遺伝子スクリーニング法開発の試み

本研究の目的は、ゲノム機能解析のための一手段として、“Antisense Display"法という新しい遺伝子スクリーニング技術を確立することである。本法は、(1)ほぼ総てのmRNA分子種をカバーする-アンチセンスDNAレパートリーの作製-(2)細胞の機能/表現形質変化を来すアンチセンス配列の同定→(3)5′センスプライマーと3′アンカー型プライマーを用いたRT-PCRによるcDNAクローニング→(4)構造決定(5)当該遺伝子の機能検定の計5ステップからなる。平成9年度は、(3)と(4)のステップの検証のため、新規血管新生制御因子の分離に本法を適用した。1.内皮細胞の増殖を指標としてアンチセンスDNAレパートリースクリーニングを行い、最終的に内皮細胞増殖を抑制する単一のアンチセンス配列を同定した。2.同定されたアンチセンス配列に対応するセンスプライマーとアンカー型オリゴ(dT)プライマーを用いヒト微小血管内皮細胞ポリA^+RNAを鋳型にてRT-PCR法を行い候補cDNAを3種分離した。3.得られたcDNAの塩基配列を決定した結果、cDNAの一つ(clone2)は10merアンチセンス配列と100%マッチする配列を有し、残りの二種(clone30,32)はアンチセンス配列と10塩基中9塩基が一致する配列を有していた。4.DNA配列データベースでの相同性検索の結果、clone2はミトコンドリアNADH-ubiquinone oxidoreductase chain 3をコードするcDNAであることが判明した。また、clone30,32は新規遺伝子で、それぞれ酵母のMIC1 cDNA、マウスのNck interacting kinase(NIK)cDNAと相同性を示した。次に、10mer領域を含む各mRNAに特異的な1618塩基のアンチセンスオリゴヌクレオクドを作製し、各アンチセンスがヒト微小血管内皮細胞DNA合成に及ぼす影響を解析した結果、clone2とclone30に相補的なアンチセンスがDNA合成を阻害した。コントロールのセンスオリゴヌクレオチドおよびclone32に対するアンチセンスは内皮細胞DNA合成に影響を及ぼさなかった。以上より、ミトコンドリアNADH-ubiquinone oxidoreductase chain3遺伝子と酵母MIC1と相同性を示す新規遺伝子clone30が内皮細胞増殖に関与することが示された。MIC1蛋白は酵母転写因子Maclpに結合する蛋白質で、関連遺伝子が脊椎動物で分離されたのは初めてである。5.本法の有効性を他のモデルで検証するため、新規がん抑制遺伝子の分離を目的にNIH3T3細胞の足場非依存性増殖を指標にアンチセンスDNAレパートリーの一次スクリーニングを行った。その結果、足場非依存性増殖を促進する数種の候補サブプールを得た。以上、本年度研究により機能性遺伝子スクリーニング法として“Antisense Display"法が有効であることが示された。
非アルコール性脂肪性肝疾患の肝臓におけるインスリンシグナル関連遺伝子発現の解析

肝臓におけるインスリンシグナルは糖新生を抑止し、脂肪合成を促進する。脂肪肝モデル動物では肝糖新生の亢進、肝脂肪合成の促進という「肝選択的インスリン抵抗性」が認められる。非アルコール性脂肪肝疾患(NAFLD)は糖代謝異常と密接な関連があることが広く知られている。しかしながら、ヒト脂肪肝疾患においても「肝選択的インスリン抵抗性」が存在するかどうかについては不明であるため、本研究では9名の健常者、42名のNAFLD患者から得られた肝生検組織を用いて、インスリンシグナルに関係する遺伝子を中心に発現量を測定した。NAFLDではIRS-2の遺伝子発現が低下するとともに、糖新生に関連するPEPCKやG6Paseの遺伝子発現の増加を認めたことから、NAFLDではインスリンシグナルの減弱が示唆された。一方で、FASなどの脂肪合成に関連する遺伝子発現はNAFLDで増加し、さらにFASの発現はIRS-1の発現と正相関を認めたことから、脂肪合成においてはNAFLDにおけるインスリンシグナル亢進が示唆された。以上のことから、ヒト脂肪肝の病態においても「肝選択的インスリン抵抗性」という現象が認められ、インスリンの糖新生抑制経路または脂肪合成促進経路への調整にはIRSが関与していることを見出した。インスリン受容体には2つのアイソフォームがあり、「インスリン受容体タイプA」は細胞増殖に、「インスリン受容体タイプB」は糖代謝に強く関連することが知られている。本研究において、NAFLD(特にNASH)ではインスリン受容体タイプAとタイプBの発現比率が高いことが見いだされ、NASHにおける癌化における機序の一つである可能性が示唆された。NAFLDは糖尿病ともに世界的に増加している疾患であり、その病態基盤における共通性も認められることから、インスリンシグナルを介した「肝選択的インスリン抵抗性」をヒトで明らかにしたことは、今後の脂肪肝診療に重要な意義があると考える。非アルコール性脂肪性肝疾患(NAFLD)及びその進行型である非アルコール性脂肪性肝炎(NASH)は近年、肥満や糖代謝異常との関連について注目を浴びている。肝臓はインスリンシグナルを介した糖代謝および脂肪代謝を制御している臓器であることから、同疾患における肝臓のインスリンシグナルに関連する分子や糖代謝や脂肪代謝に関する分子の発現を検討することとした。2005年以降にNASH疑いにて肝生検(針生検)が施行された44例と生体肝移植のドナーとして肝生検(楔状生検)が施行された9例のパラフィン包埋ブロックからRNA抽出を行った。抽出したRNAを用いて、肝臓におけるインスリンシグナルに関連する分子、糖代謝や脂肪代謝に関わる分子の遺伝子発現を定量的リアルタイムPCR法にて解析を行った。各症例の肝組織切片を再度、肝臓病理専門医により連続的に再評価した。Matteoni分類で非脂肪肝群、単純性脂肪肝群、NASH群に分類、NAFLD activity scoreにより脂肪化(0-3点)、炎症(0-3点)、肝細胞風船様変化(0-2点)、線維化(0-4点)に点数化した。カルテから以下の臨床指標を抽出した(年齢、性別、身長、体重、Body Mass Index、血圧、脈拍、HbA1c、血糖値、インスリン値、AST、ALT、γGTP、総コレステロール、中性脂肪、HDLコレステロール、LDLコレステロール、4型コラーゲン、ヒアルロン酸、CT scanによる内臓脂肪面積)。脂肪肝の程度が悪くなるにしたがい、年齢が高く、Body Mass Indexが高く、HbA1cとインスリン値が高く、AST、ALT、4型コラーゲンが高値であった。申請時の平成28年度研究実施計画どおり、過去に保存されている検体からのRNA抽出および肝臓におけるインスリンシグナルに関連する分子、糖代謝や脂肪代謝に関わる分子の遺伝子発現を定量的リアルタイムPCR法解析が遂行できた。また、解析に必要な病理医による肝臓病理情報や基本的臨床情報や生化学的情報や服薬情報なども概ね収集できたことから、研究はおおむね十丁に進展していると評価した。本研究では、NAFLD患者の肝生検組織標本を用い、肝インスリンシグナルにおける糖新生抑制経路や脂肪合成経路に関わる鍵分子の遺伝子発現を包括的に定量化するとともに、病理学的重症度や臨床的データとの関連性を検討することで、実際にヒトでのNAFLDにおけるインスリンシグナルの状況とその病態における関連を明らかにすることである。健常対照群、単純性脂肪肝群、NASH群の3群間で肝臓のinsulin受容体、IRS-1、IRS-2、PEPCK、G6Pase、GCK、FASの各遺伝子発現量を定量化した。さらに、各遺伝子発現量と臨床指標との関連およびNAFLDの病理学的重症度スコアとの関連を解析した。その結果、以下の3点が明らかとなった。1IRS-2遺伝子発現量が健常対照群と比較し、単純性脂肪肝群・NASH群において有意に低値であり、PEPCK、G6Pase遺伝子発現量は有意に高値であった。さらにIRS-2遺伝子発現はPEPCKおよびG6Pase遺伝子発現と負の相関を認めた。さらに、病理学的重症度との関連の解析から、IRS-2遺伝子発現抑制はNAFLD進行過程における比較的早期の段階で惹起されていた。2FAS遺伝子発現量が健常対照群と比較し単純性脂肪肝群で上昇傾向、NASH群で有意な上昇を認めた。糖代謝にむけたインスリンシグナルは抑制されているものの、それとは対象的に脂肪合成に向けたインスリンシグナルは亢進していることが示唆された。3insulin受容体遺伝子の発現は健常対照群と比較し、単純性脂肪肝群・NASH群において有意に高値で、さらに、insulin受容体遺伝子発現が病理学的重症度と有意な正相関を認めた。

ヒト肝生検試料を用いた研究で、NAFLDでインスリンシグナルに関係する分子の変化について明らかにすることができ、本研究の骨格は示すことができたから。肝臓におけるインスリンシグナルは糖新生を抑止し、脂肪合成を促進する。脂肪肝モデル動物では肝糖新生の亢進、肝脂肪合成の促進という「肝選択的インスリン抵抗性」が認められる。非アルコール性脂肪肝疾患(NAFLD)は糖代謝異常と密接な関連があることが広く知られている。しかしながら、ヒト脂肪肝疾患においても「肝選択的インスリン抵抗性」が存在するかどうかについては不明であるため、本研究では9名の健常者、42名のNAFLD患者から得られた肝生検組織を用いて、インスリンシグナルに関係する遺伝子を中心に発現量を測定した。NAFLDではIRS-2の遺伝子発現が低下するとともに、糖新生に関連するPEPCKやG6Paseの遺伝子発現の増加を認めたことから、NAFLDではインスリンシグナルの減弱が示唆された。一方で、FASなどの脂肪合成に関連する遺伝子発現はNAFLDで増加し、さらにFASの発現はIRS-1の発現と正相関を認めたことから、脂肪合成においてはNAFLDにおけるインスリンシグナル亢進が示唆された。以上のことから、ヒト脂肪肝の病態においても「肝選択的インスリン抵抗性」という現象が認められ、インスリンの糖新生抑制経路または脂肪合成促進経路への調整にはIRSが関与していることを見出した。インスリン受容体には2つのアイソフォームがあり、「インスリン受容体タイプA」は細胞増殖に、「インスリン受容体タイプB」は糖代謝に強く関連することが知られている。本研究において、NAFLD(特にNASH)ではインスリン受容体タイプAとタイプBの発現比率が高いことが見いだされ、NASHにおける癌化における機序の一つである可能性が示唆された。NAFLDは糖尿病ともに世界的に増加している疾患であり、その病態基盤における共通性も認められることから、インスリンシグナルを介した「肝選択的インスリン抵抗性」をヒトで明らかにしたことは、今後の脂肪肝診療に重要な意義があると考える。今後は、非脂肪肝群、単純性脂肪肝群、NASH群の3群における肝臓におけるインスリンシグナルに関連する分子、糖代謝や脂肪代謝に関わる分子の遺伝子発現の差異について検討を行う。さらに、NAFLD activity scoreにより脂肪化(0-3点)、炎症(0-3点)、肝細胞風船様変化(0-2点)、線維化(0-4点)に点数化された指標における各遺伝子発現の差異についても検討する。基本的臨床情報や生化学的情報などの脂肪肝と各遺伝子との関連における関与などについても詳細に検討する予定である。IR遺伝子発現がNAFLDで高いことが本研究で分かったが、今後はIRのisoformについても検討したい。IRのisoformについてはIR-AとIR-Bがあり、IR-Bは完全長でIR-Aはexon11がないためα-subunitが短縮している。
活性酸素によるDNA損傷の定量化とその防御機構の解析

活性酸素による細胞障害、なかでも酸化的DNA損傷は老化及び成人病の発症と深く関わっている。酸化的DNA損傷の定量的把握・損傷誘発・防御・予防機構解明のための指標として、代表的な酸化的DNA損傷である8ヒドロキシデオキシグアノシン(80HdG)並びにDNA鎖切断量の測定系を確立した。活性酸素負荷により細胞内DNAにおける80HdGの増加が、定量的に検出できた。DNA鎖切断はパルスフィールドゲル電気泳動で検出できたが、定量性及び処理時間に問題があった。活性酸素に高感受性のFanconi貧血症患者由来の細胞は、高濃度過酸化水素負荷で、正常者由来細胞より多くの80HdGを生成した。その原因として、カタラーゼ活性の低下が示唆された。活性酸素を産生させると報告されているアスベストの実験では、好中球あるいはマクロファージに分化し得るヒト前骨髄球性白血病細胞(HL60)を用いた。好中球様に分化したHL60に、オプソニン化したアスベストを添加することにより活性酸素(02-)の発生がESRで確認できた。しかし、80HdGはほとんど誘発されなかった。マクロファージ様に分化したHL60に、アスベストを添加すると、活性酸素の産生増加は認めなかったが、細胞はアスベストを貧食し、80HdGの増加が認められた。このアスベストによる80HdGの増加は、カタラーゼやSOD(活性酸素を除去するに十分量の)では抑制されず、貧食抑制剤のサイトカラシンBで抑制された。これらの結果から、活性酸素が発生すれば必ず酸化的DNA損傷が生じるのではなく、活性酸素の発生する場所もDNA損傷誘発に重要な要因であることが解った。すなわち、アスベストが貧食により核の近傍に取り込まれ、そこで活性酸素を産生し、80HdGを生成すると考えられる。ヒトにおける酸化的DNA損傷を把握する目的で、健常者集団における末梢血白血球中の80HdGを定量した。活性酸素産生能の高い好中球は、単核球とほぼ同量の80HdG値を示した。白血球調整時に赤血球が残存すると、DNA抽出過程で80HdGが生成した。年齢やライフスタイル要因と80HdG値間に相関が認められなかったが、これは80HdG値の分布が80HdG測定誤差に比べ小さいためと考えられた。活性酸素による細胞傷害、なかでもDNA損傷は、老化及び発がんと深く関わっている。しかし、その損傷がどのようにして発生するか、どのような防御・修復機構が働くか、どのようにすれば予防できるかについては、ほとんど解明されていない。本研究では、DNA損傷の指標として、DNA鎖切断及び、それ自身が変異を誘発し、しかも活性酸素に特異的な損傷である8ヒドロキシデオキシグアノシン(80HdG)を用いることとし、細胞内DNA中のこれらの損傷の測定法を検討した。更に、活性酸素の1つである過酸化水素が、ヒト由来細胞内DNAにこれらの損傷を誘発するか、またその誘発感受生を決定する要因を検討した。