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人工DNAシャペロンを用いた植物遺伝子NiRの発現制御に関する研究

「人工DNAシャペロン」によって植物の硝酸代謝系の亜硝酸還元酵素(NiR)遺伝子を制御することを目的に、本研究を行っている。「人工DNAシャペロン」を植物体中で発現させ、硝酸代謝系を変化させる形質転換体を作製する場合、植物の硝酸還元能がどの程度変化しても植物が生育可能であるのかを予め知っておく必要がある。そこで、^<15>NラベルしたNO_2ガス(植物体中で水に溶け、NO_3^-とNO_2^-に変化する)を217種類の植物に吸収させ、有機体窒素への還元同化能力をin vivoで調べた。その結果、植物種によって、最高600倍以上の差があることが明らかとなった(H.Morikawa et al.,1998)。この結果は、植物の硝酸代謝系の硝酸還元同化能力は、非常に大きな差があり、「人工DNAシャペロン」によって遺伝子工学的に植物の硝酸還元系を改変しうることを示している。現在、「人工DNAシャペロン」発現ライブラリーよりスクリーニングした、亜硝酸還元酵素(NiR)遺伝子のプロモーターおよびその上流のDNA配列に特異的に結合する「人工DNAシャペロン」遺伝子を、植物体(シロイヌナズナ)にパーティクルガン法によって導入し、形質転換体を作成中である。今後、形質転換体の亜硝酸還元酵素(NiR)活性、硝酸還元同化能力を^<15>Nラベルした硝酸もしくはNO_2を用いて、解析してゆく予定である。「人工DNAシャペロン」発現ライブラリーを構築するために、大腸菌DNA結合蛋白質HUのDNA結合領域のアミノ酸配列(19アミノ酸残基)をランダムペプチド配列に変換した。ランダムペプチド配列の導入には、HU遺伝子のDNA結合領域をコードしているDNA領域をランダムオリゴヌクレオチドに置換する方法とミューテーター大腸菌内でHU遺伝子を含むプラスミドDNAを複製させランダム変異を導入する方法(Iwaki et al.,1996)を用いた。当初の予定に加えてミューテーター大腸菌法を変異導入法として用いたのは、人工DNAシャペロン発現ライブラリーの中に含まれるランダムペプチド配列の種類を偏らせないためである。こうして作製された「人工DNAシャペロン」発現ライブラリーをHU欠損大腸菌内で発現させ、サウスウェスタン法によってNiR遺伝子断片(プロモーター領域およびコーディング領域)に特異的に結合する人工DNAシャペロンを、現在、スクリーニング中である。一方、この人工DNAシャペロンを用いてNiR遺伝子の発現調節を行う究極の目標として、硝酸同化代謝の流れを返えることを考えている。この遺伝子の発現制御を行った際に期待される現象として、生体内の硝酸イオン、亜硝酸イオン、アンモニウムイオン(硝酸同化代謝の中間代謝物)の濃度変化がある。そこで、植物細胞中の各イオン濃度の迅速、高感度分析を行う方法としてキャピラリー電気泳動イオン分析法を確立した(Kawamura et al.,1996)。6種類の植物において細胞内各イオン濃度を測定したところ、各イオン濃度が細胞種によって大きく異なっていることが分かった。このことは、人工DNAシャペロンによってNiR遺伝子の発現を制御することによって、生体内の各イオン濃度を変化させることが可能であることを示唆している。
二核鉄ペルオキソ錯体のコア構造による反応性の制御

生体系では,メタンモノオキシゲナーゼ(MMO)やトルエンモノオキシゲナーゼ(TMO)が二核鉄中心により酸素分子を活性化して,アルカンやアレーン類の水酸化をいとも簡単に行っている.本研究では,MMOやTMOのペルオキソ中間体の機能モデルとなる二核鉄(III)ペルオキソ錯体を創製し,コア構造によるペルオキソ錯体の反応性の制御を目指して,外部基質との酸化反応性の検討を行った.本年度取り組んだ研究は下記の通りである。1)プロパンジアミン骨格を有する二核化配位子(Me4-tpdp,Ph4-tidp)のトリフェニル酢酸架橋の二核鉄(III)ペルオキソ錯体の酸化反応性の検討を行った.Me4-tpdpのペルオキソ錯体は,78 92kcal mol-1のBDEを持つ9,10-DHA,fluorene,tetralin,tolueneなどの様々な外部基質に対して酸化能を持つことが明らかとなった。一方,Ph4-tidpのペルオキソ錯体は,上記の外部基質と反応しなかったが,ベンジルアルコールを酸化することがわかった。このことは,二核化配位子のサイドアームの変化により,ペルオキソ錯体の酸化反応性が制御できることを示唆しており,これについて今後明らかにする計画である。2)ヒドロキソおよびオキソ架橋を含む二核鉄(III)ペルオキソ錯体の外部基質に対する酸化反応性の検討を行った.トルエンやDHAなどの外部基質と反応しなかったが,PPh3やbenzyl alcoholとの反応性を示すことがわかった.速度論的研究により,これらの酸化反応の律速段階は,ペルオキソ基のO-O結合の開裂を含んでおり,これにより生成する高原子価オキソ種が,反応活性種であることが示唆された.また,ペルオキソ基のO-O結合は,ヒドロキソ架橋のペルオキソ錯体よりも脱プロトン化したオキソ架橋のペルオキソ錯体の方が,約100倍切れ易く,架橋基の違いによりO-O結合の活性化を制御できることがわかった.3)単核鉄(III)過炭酸錯体の酸化反応性の検討を行った.その結果,酸化反応性は低いが,cycloocteneに対するエポキシ化やcis-ジオール化の選択性をCO2の濃度や水などの反応条件によりコントロールできることがわかった.本年度取り組んだ研究は下記の通りである。1)酸素分子活性化非ヘム二核鉄酵素であるトルエンモノオキシゲナーゼのペルオキソ中間体のモデルとなるキシリル架橋骨格を有する二核化配位子を含む二核鉄(III)ペルオキソ錯体の合成とキャラクタリゼーションおよび酸化反応性の検討を行った。兵庫県立大学の小倉教授のグループとの共同研究により行ったラマン測定の結果,合成したペルオキソ錯体はオキソ-ペルオキソコアを有することが明らかとなった。また,この種の分解により,配位子のキシリル基の水酸化と溶媒のアセトンの酸化が起こり,前者の反応活性種は,酸素ー酸素結合が開裂して生成する高原価鉄(IV)オキソ種であり,後者の反応は,アセトンのペルオキソ付加物を経由して起こることが明らかとなった。2)非ヘム二核鉄酵素であるメタンモノオキシゲナーゼのペルオキソ中間体のモデルとなるプロパンジアミン骨格を有する二核化配位子(Me4-tpdp)のトリフェニル酢酸架橋型二核鉄(III)ペルオキソ錯体の酸化反応性の検討を引き続き行った。その結果,78 92kcal mol-1のBDEを持つ9,10-DHA,fluorene,tetralin,toluene,adamantaneなどの様々な外部基質に対して酸化能を持つことを明らかにした。速度論的実験や同位体ラベル実験から,これら外部基質との反応は,ペルオキソ錯体による水素引抜き反応で進行する事を明らかにした。また,styreneのエポキシ化も起こることを見出した。3)塩化物イオンを含む二核鉄(III)ペルオキソ錯体の外部基質に対する酸化反応性を速度論的解析やプロダクトアナリシスにより引き続き検討した。その結果,上記のペルオキソ錯体とは異なり,tolueneやstyreneなどの外部基質に対して酸化反応性を示さないが,ベンジルアルコールを酸化することがわかった。キシリル架橋骨格を有する二核化配位子を含む二核鉄(III)ペルオキソ錯体は,配位子のキシリル基の水酸化と溶媒のアセトンの酸化を引き起こすことを明らかにした。キシリル基の水酸化の反応活性種は,酸素ー酸素結合が開裂して生成した高原価二核鉄(IV)オキソ種であり,これはこの種がアレーン類の酸化を起こすことを示した初めての例である。またこのペルオキソ種は,求核的にアセトンと反応してアセトンのペルオキソ付加物を生成し,この種が分解して酢酸が生成することも見出した。また,トリフェニル酢酸架橋型二核鉄(III)ペルオキソ錯体は,C-H結合だけでなくC=C結合も酸化できることを見出した。さらに,トリフェニル酢酸架橋を持たない類似の塩化物イオンを含む二核鉄(III)ペルオキソ錯体は,tolueneやstyreneなどの外部基質に対してほとんど酸化反応性を示さないが,ベンジルアルコールを酸化することがわかった。以上のように,ペルオキソ錯体のコア構造と酸化反応特異性の関連が明らかになりつつある。これらの反応機構を調べるための速度論的実験や同位体ラベリング実験の進捗が少し遅れていると感じられるが,本計画はおおむね順調に進展していると考えられる。

前年度に継続して二核鉄(III)ペルオキソ錯体の反応性の検討を行った。1)プロパンジアミン骨格を有する二核化配位子(Ph4-tidp)のトリフェニル酢酸架橋型二核鉄(III)ペルオキソ錯体について,配位子の水酸化およびベンジルアルコール酸化を速度論的実験,同位体ラベリング実験により調べた。その結果,このペルオキソ錯体は,酸化反応に直接関与せず,酸化活性種は酸素ー酸素結合が開裂した高原価鉄(IV)オキソ種であることが明らかとなった。また,ペルオキソ錯体の結晶構造から,二核鉄コアは,配位子のフェニル基で形成されるキャビティーに埋もれており,トルエンやスチレンなどの非配位性外部基質は,コアに近づくことができずに酸化されないが,配位性のベンジルアルコールは,二核鉄中心に配位することで酸化されることがわかった。2)上記の二核化配位子のサイドアームを2-フェニルイミダゾリル基から6-メチルピリジル基に変換した二核化配位子(Me4-tpdp)のトリフェニル酢酸架橋型二核鉄(III)ペルオキソ錯体について,トルエン,スチレン,ベンジルアルコールなどの外部基質との酸化反応を速度論的に調べた。この錯体では,ペルオキソ錯体が直接外部基質を酸化していることが明らかとなった。また,ベンジルアルコールとの反応では,ベンジルアルコールがペルオキソ錯体に配位して酸化反応が進行していることも明らかとなった。二核化配位子のサイドアームの変換によるペルオキソ錯体の反応性の違いを,今後,DFT計算などにより明らかにする。3)サイドアームにキノリル基を有する二核化配位子(tqdp)のトリフェニル酢酸架橋型二核鉄(III)ペルオキソ錯体を新規に合成し,分光学的性質を調べた。その結果,上記の錯体と同様の二核鉄(III)ペルオキソコアを有することが明らかとなった。この錯体の外部基質に対する酸化反応性は,現在検討中である。生体系では,メタンモノオキシゲナーゼ(MMO)やトルエンモノオキシゲナーゼ(TMO)が二核鉄中心により酸素分子を活性化して,アルカンやアレーン類の水酸化をいとも簡単に行っている.本研究では,MMOやTMOのペルオキソ中間体の機能モデルとなる二核鉄(III)ペルオキソ錯体を創製し,コア構造によるペルオキソ錯体の反応性の制御を目指して,外部基質との酸化反応性の検討を行った.様々なコア構造を有する二核鉄ペルオキソ錯体の合成と酸化反応性の検討に成功しているが,酸化反応性の速度論的研究では-70°Cでの実験など困難な実験が多く,データの完成度が不満足であり論文の作成が遅れているため。トリフェニル酢酸架橋型二核鉄(III)ペルオキソ錯体の結晶化と構造解析を行い,すでにX線結晶構造解析に成功している類似の塩化物イオンを含む二核鉄(III)ペルオキソ錯体と比較することにより,これらの酸化反応性の違いを明らかにする。また,これらの酸化反応メカニズムを明らかにするための同位体ラベル実験や速度論的研究を引き続き行う。さらに,これらペルオキソ錯体の二核化配位子(Me4-tpdp)のサイドアーム部分を変化させた配位子とそのペルオキソ錯体の合成も継続して行い,サイドアームの変化がペルオキソ錯体の物性や酸化反応性に与える影響を検討する。
歯の移動時における骨代謝のメカニズムの解明

本研究の目的は、矯正的力を与えられた歯の移動時における骨代謝のメカニズムを解明することであり、特に骨吸収時に骨芽細胞により産生されるCollagenase活性とTIMP量の変化を測定することによって生理的な骨代謝における反応とを比較することであった。そのために、培養骨芽細胞に矯正力と類似した圧力が加えられる装置を開発し、Collagenaseの産生を測定するためにFSCの入っていない培養液で培養し、メカニカルストレスのコラゲナーゼ産生とTIMP産生に対する影響を検索した。さらに、臨床応用として、矯正治療中の患者の歯肉溝からの浸出液を採取し、その中のコラゲナーゼ活性とTIMP量の産生を定量することとした。コラゲナーゼ活性は、活性型のコラゲナーゼの活性とトータルの活性に分けて測定するために、サンプルをそのまま測定したものと、サンプルに4APMAを加えて未活性型のコラゲナーゼを活性化したものとを測定した。培養実験では、培養皿の床を押し上げることによって細胞を周期的に機械的に変形させる装置を作製した。その結果、メカニカルストレス群は対照群に較べ、活性型の高いコラゲナーゼの活性値を示したが、トータル型コラゲナーゼおよびTIMPの産生量には差がなかった。歯肉溝浸出液中のコラゲナーゼ活性は、矯正治療群は活性型およびトータルの値とも対照群に較べて高かった。TIMPの産生量には差がなかた。従って、培養細胞においても臨床的にもメカニカルストレスは局所のコラゲナーゼ活性を促進することにより、骨代謝を促進することが解明された。培養細胞にストレスを加える装置としてFlexer Stress Unitを用い、Gingival FibroblastであるGin-1 cellとOsteoblast-like cellであるUMR-106に伸展力を加えて細胞から産生されるCollagenaseとTIMPの量を定量した。さらに、再現性のある装置として、スポンジ状の培養器に細胞を培養し、そん上より重りによって加圧する実験系を考案した。このスポンジ状の培養器として1、cell snow(KIRIN),2 Microcarrier(旭化成),3.Collagen sponge(K.K.),4.海綿の4種類を選択し、この4種に対して樹立細胞株を培養し、Confluent時の細胞数、DNA量、またMedium中のCollagenaseの活性とTIMPの量を定量し比較した。その結果、Flexer Stress Unitを用い、Gingival FibroblastであるGin-1 cellとOsteoblast-like cellであるUMR-106に伸展力を加えた実験から、メカニカルストレスは、これらの細胞の活性を上げ、細胞数の増殖に関与しており、細胞から産生される活性型Collagenaseの量を増加させるが、TIMPの産生量には影響を与えないことが分かった。スポンジ状の培養器としては、Microcarrier(旭化成)が加圧実験には適していることがConfluent時の細胞数、DNA量の定量から判明した。次に、臨床的応用として歯肉溝浸出液中のCollagenaseとTIMPの量を定量し、歯の移動とこれらの産生との関係を検討した。その結果、矯正治療を行っている移動中の歯肉溝浸出液中に含まれるCollagenaseは培養実験における場合と同様に活性型Collagenaseの量を増加させるが、TIMPの産生量には影響を与えないことが分かった。
有機非線形結晶DASTを用いた広帯域波長可変テラヘルツ波光源

テラヘルツ波帯は光と電波の間に位置し、開発が遅れている技術の谷間であるが、未知の事象が眠る宝庫でもあるといわれている。この帯域の研究にとって広帯域波長可変コヒーレント光源は必要不可欠であるが、いまだ実用性の高いものは実現されていない。各種テラヘルツ光源の中で、原理的に最も広い波長可変性を有しているのは差周波光混合である。我々は、極めて非線形光学係数の大きい有機結晶DASTの大型結晶成長に世界に先駆けて成功し、さらにDAST結晶を用いた差周波光混合による波長可変テラヘルツ波発生を行った。その中でDAST結晶を代表的な非線形光学結晶(LiNbO_3,LiTaO_3,GaP, KTP)と比較したところDASTが特異的に光波からテラヘルツ波への高い変換効率を示すことが判明した。この際用いた2波長光源は800nm帯であり、DASTのコリニア位相整合条件を満たしていないにも関わらず他の結晶に比べて極めて高い変換効率を示した点に我々は着目し、コリニア位相整合条件を満たす波長1.3μm帯の光源を用いてさらなる高効率化を図った。我々は、1.3μm帯の2波長光源として、シグナル2波長擬似位相整合光パラメトリック発振器(DSW-QPM-OPO)を試作した。この2つのシグナル波をDAST結晶に入射し、差周波光混合による高効率なTHz波発生に成功した。さらに、結晶の温度を変化させることにより、THz波の波長を120μmから160μmまで同調することが可能となった。また、DSW-QPM-OPOの励起光源であるNd:YAGレーザーの繰り返し周波数を高くすることにより平均出力の増大が可能であり、最高で5kHzまでの動作を確認した。その中でDAST結晶を代表的な非線形光学結晶(LiNbO_3,LiTaO_3,GaP,KTP)と比較したところDASTが特異的に光波からテラヘルツ波への高い変換効率を示すことが判明した。この際用いた2波長光源は800nm帯であり、DASTのコリニア位相整合条件を満たしていないにも関わらず他の結晶に比べて極めて高い変換効率を示した点に我々は着目し、コリニア位相整合条件を満たす波長1.3μm帯の光源を用いてさらなる高効率の実現を目指している。昨年度、1.3μm帯の2波長光源として、シグナル2波長擬似位相整合光パラメトリック発振器(DSW-QPM-OPO)を試作した。従来の単一周期ドメイン反転LiNbO3結晶を用いた擬似位相整合光

パラメトリック発振によって波長7μm以上の遠赤外光を発生させることは、結晶中での吸収が大きいため困難である。本研究では、遠赤外光THz波の発生を目的として、2周期ドメイン反転モノリシック結晶を新たに考案した。このシグナル2波長発振を光源として、有機非線形結晶DAST中の差周波光混合による波長可変THz波発生に初めて成功した。励起光路上に二つの周期を含んだ直列型PPLNを用いると、2つの異なるエネルギー保存則と位相整合条件が成り立つため、2組のシグナル波、アイドラ波が発生可能となる。今回の実験に用いた励起光源はNd : YAGレーザー(波長:1.064μm、パルス幅:120ns、繰り返し周波数:1kHz)である。周期が29.5μm、29.3μmの直列型PPLN(温度150°C)から発生した2つのシグナル波(1.546μm、1.529μm)をDAST結晶中で差周波光混合した結果、波長139μmのTHz波が発生した。また、PPLNの温度を100°Cから200°Cまで変化させることで、THz波長は120μmから160μmまで変化した。なお、THz波の最大出力は52fJ/Pulseであり、今後PPLN共振器の出力ミラー反射率の最適化、およびDAST結晶長の増大により高出力化が可能である。また、励起光源であるNd : YAGレーザーの繰り返し周波数を高くすることにより平均出力の増大が可能である。今回は、THz波測定用Siボロメータの応答速度上限である5kHzまでの動作を確認した。
歯周靭帯機能を有する「インプラント/歯周靭帯一体型の人工歯周組織ユニット」の創製

現在の歯科治療において、歯科インプラントは欠かせない治療法の一つであるが、歯科インプラント治療はインプラントを歯槽骨に直接埋入して結合させるため、本来の歯と歯周組織が有する歯周靭帯の機能が欠如している。歯周靭帯は骨と歯を繋ぐ靭帯であるが、力学的に歯を支えるだけでなく、多くの血管や神経を含み、歯への栄養供給や噛みごたえの感覚を司る役割、また、細菌感染の予防などの役割も担っている。そのため、インプラント材料と歯槽骨の間に歯周靭帯様の軟組織を再構築し、歯周靭帯の機能を付与させることが期待されている。しかし現状では、歯周靭帯の特徴的な配列を有する構造や、硬いインプラント材料と軟組織の結合の困難さから実現には至っていない。そこで、生体の歯周組織構造を模倣することで、歯周靭帯の機能を有する歯科インプラント治療の実現を目指した。本研究課題では、歯周靭帯を再構築するための材料としてシート状に加工した脱細胞化靭帯を用いた「インプラント/歯周靭帯一体型の人工歯周組織ユニット」の創製を目的とし、脱細胞化靭帯のインプラント材料表面との結合の検討、および脱細胞化靭帯の生体骨との結合の検討を実施する。具体的には、1歯周靭帯マトリックス様の脱細胞化靭帯組織シートの作製、2インプラント材料表面/歯周靭帯マトリックスの結合のための評価モデルの作製、3-1 in vivo移植実験による脱細胞化靭帯のインプラント材料表面との結合の検討、3-2 in vivo移植実験による脱細胞化靭帯の生体骨との結合の検討の3つの要素技術に関する検討を実施する計画である。2018年度は1、2を実施し、さらに3-1の初期検討を行った。1歯周靭帯マトリックス様の脱細胞化靭帯組織シートの作製に関して、靭帯組織を構成するコラーゲン繊維の配向を確認したところ、靭帯の長軸方向にコラーゲン繊維が配向していることがわかった。靭帯組織をコラーゲン線維束の配向と直交する向きにシート状に加工した。靭帯シートを種々の界面活性剤および高静水圧印加による脱細胞化処理方法にて処理した。組織学的評価の結果、コラーゲン繊維の配向性は脱細胞化処理後も維持されていた。また。脱細胞化処理後の一部の条件では細胞核が観察されず、脱細胞化が達成されていることがわかった。以上より、三次元的な細胞外マトリックス構造を有する歯周靭帯様のマトリックスからなるシートを調製できたことが示された。2インプラント材料表面/歯周靭帯マトリックスの結合のための評価モデルの作製に関して、歯周靭帯様シートをインプラント材料表面に密着させることで、インプラント材料表面/歯周靭帯マトリックスの結合のための評価モデルを作製した。本年度は、インプラント材料の簡易的なモデルとして、高分子材料のプレートに交互浸漬法にてリン酸カルシウムを沈着させた材料を調製した。脱細胞化靭帯組織シートと表面をリン酸カルシウムコーティングされた材料を合わせることで、評価モデルを作製した。3in vivo移植実験による脱細胞化靭帯のインプラント材料表面との結合の検討に関して、作製したモデルを用いて、in vivoにおける細胞の再配置および機能発現により、インプラント材料表面と歯周靭帯マトリックスの結合能について明らかにすることを目指した。本年度は、初期検討として脱細胞化靭帯組織シートの細胞外マトリックス構造の安定性を評価した。移植4週間後に顕著な炎症反応は観察されず、細胞外マトリックスも維持されていることがわかった。以上より、当初の計画に対しておおむね順調な進捗状況である。2019年度は以下の項目に関する検討を実施する。3-1 in vivo移植実験による脱細胞化靭帯のインプラント材料表面との結合の検討に関して、ラットへの皮下埋植を行い、脱細胞化歯周靭帯シートとインプラント材料表面の生体内での反応を評価することで、結合に必要な材料の表面特性を明らかにする。各種染色法により、細胞浸潤の浸潤性、配向性、組織再構築能、歯周靭帯に特徴的な神経細胞の再配置や毛細血管網の構築について評価する。また、引張試験により、移植後のインプラント材料表面と脱細胞化歯周靭帯シートとの結合強度を評価する。上記の検討で良好な結果が得られなかった場合は、計画2のインプラント材料表面の処理方法を改良し、材料表面との結合力の向上を図る。また、移植部位を皮下ではなく骨領域に変更する。3-2 in vivo移植実験による脱細胞化靭帯の生体骨との結合の検討に関して、ラット大腿骨に欠損を作製し、欠損部への評価モデルの移植を行う。microCTおよび各種染色法により脱細胞化歯周靭帯シートと骨の結合部を観察し、評価モデルの骨への安定的な生着について検討する。良好な結果が得られなかった場合は、脱細胞化歯周靭帯シートの骨接触面側のコラーゲン線維へのカルシウムの複合化や、骨形成因子の添加により改善を図る。研究協力者として大学4年生1名および修士2年生1名が本研究に参画し、本研究の一部を卒業論文および修士論文のための研究テーマとする。

そのため、インプラント材料と歯槽骨の間に歯周靭帯様の軟組織を再構築し、歯周靭帯の機能を付与させることが期待されている。しかし現状では、歯周靭帯の特徴的な配列を有する構造や、硬いインプラント材料と軟組織の結合の困難さから実現には至っていない。そこで、生体の歯周組織構造を模倣することで、歯周靭帯の機能を有する歯科インプラント治療の実現を目指した。本研究課題では、歯周靭帯を再構築するための材料としてシート状に加工した脱細胞化靭帯を用いた「インプラント/歯周靭帯一体型の人工歯周組織ユニット」の創製を目的とし、脱細胞化靭帯のインプラント材料表面との結合の検討、および脱細胞化靭帯の生体骨との結合の検討を実施する。具体的には、1歯周靭帯マトリックス様の脱細胞化靭帯組織シートの作製、2インプラント材料表面/歯周靭帯マトリックスの結合のための評価モデルの作製、3-1 in vivo移植実験による脱細胞化靭帯のインプラント材料表面との結合の検討、3-2 in vivo移植実験による脱細胞化靭帯の生体骨との結合の検討の3つの要素技術に関する検討を実施する計画である。2018年度は1、2を実施し、さらに3-1の初期検討を行った。1歯周靭帯マトリックス様の脱細胞化靭帯組織シートの作製に関して、靭帯組織を構成するコラーゲン繊維の配向を確認したところ、靭帯の長軸方向にコラーゲン繊維が配向していることがわかった。靭帯組織をコラーゲン線維束の配向と直交する向きにシート状に加工した。靭帯シートを種々の界面活性剤および高静水圧印加による脱細胞化処理方法にて処理した。組織学的評価の結果、コラーゲン繊維の配向性は脱細胞化処理後も維持されていた。また。脱細胞化処理後の一部の条件では細胞核が観察されず、脱細胞化が達成されていることがわかった。以上より、三次元的な細胞外マトリックス構造を有する歯周靭帯様のマトリックスからなるシートを調製できたことが示された。2インプラント材料表面/歯周靭帯マトリックスの結合のための評価モデルの作製に関して、歯周靭帯様シートをインプラント材料表面に密着させることで、インプラント材料表面/歯周靭帯マトリックスの結合のための評価モデルを作製した。本年度は、インプラント材料の簡易的なモデルとして、高分子材料のプレートに交互浸漬法にてリン酸カルシウムを沈着させた材料を調製した。脱細胞化靭帯組織シートと表面をリン酸カルシウムコーティングされた材料を合わせることで、評価モデルを作製した。3in vivo移植実験による脱細胞化靭帯のインプラント材料表面との結合の検討に関して、作製したモデルを用いて、in vivoにおける細胞の再配置および機能発現により、インプラント材料表面と歯周靭帯マトリックスの結合能について明らかにすることを目指した。本年度は、初期検討として脱細胞化靭帯組織シートの細胞外マトリックス構造の安定性を評価した。移植4週間後に顕著な炎症反応は観察されず、細胞外マトリックスも維持されていることがわかった。以上より、当初の計画に対しておおむね順調な進捗状況である。2019年度は以下の項目に関する検討を実施する。3-1 in vivo
磁区構造モデルの集合を用いた電磁鋼板のマルチフィジックスモデルの開発

集合磁区モデルはエネルギー極小化に基づいて電磁鋼板の特性を表現するモデルである。本研究では集合磁区モデルに基づき、結晶ごとの磁歪や内部応力、ピンニングサイトの分布などの影響を考慮して電磁鋼板の特性を再現するマルチフィジックスモデルの開発を行った。初めに、応力の分布を考慮した集合磁区モデルの開発を行った。集合磁区モデルでは静磁エネルギーや磁気弾性エネルギーなどの和である全体のエネルギーが極小となるように磁化状態を決定しており、応力が一定であると仮定し磁気弾性エネルギーの計算を行っていたが、実際には結晶磁化容易軸の分布や各結晶内部での磁歪の影響によって、応力は分布している。そこで、集合磁区モデルにおいて内部応力を基に磁気弾性エネルギーを計算するモデルを開発した。このモデルを用いて解析を行うことで、方向性、無方向性電磁鋼板の磁化曲線をより精度よく再現できることを示した。続いて、ピンニングサイトの影響の表現方法についての考察を行った。電磁鋼板を含む鉄心材料の内部には不純部、結晶欠陥、結晶粒界などのピンニングサイトが分布しており、このピンニングサイトによって磁壁の移動が妨げられることによってピンニング型のヒステリシスが発生している。従来の集合磁区モデルではこのピンニングサイトの影響を、各セル内の平均磁化ベクトルの変化の逆向きに一定の大きさのピンニング磁界が発生すると仮定することで、表現している。しかし、実際にはピンニング磁界は一定ではなく電磁鋼板内部のピンニングサイトの分布に依存すると考えられる。そこで、ピンニングサイトの分布を考慮してピンニング型のヒステリシスを表現する手法を提案した。この手法を用いることで従来の集合磁区モデルでは表現困難であった初磁化曲線や各振幅毎のヒステリシスループ幅の違いを表現することが可能となった。翌年度、交付申請を辞退するため、記入しない。
血清アミロイドAアイソタイプの種類による動脈硬化症に対する影響

申請者は,現在まで動脈硬化症易形成性であるApoEノックアウト(ApoE-/-)マウスの口腔内に,歯周組織で産生される炎症性サイトカインの一つであるIL-6を注入した場合,肝臓での血清アミロイドA(Serum Amyloid A: SAA)SAAmRNA発現上昇,血中SAAタンパクの増加に伴い動脈硬化病変が増悪することを明らかにした.このことから,歯周病により産生されるSAAのアイソタイプ別の病変部血管内皮における接着因子(ICAM-1,VCAM-1),遊走因子(MCP-1),およびTLR2の発現亢進の比較を行い,SAAの経路を介した歯周病による動脈硬化症の発症,および増大の詳細なメカニズム解明を本研究の目的とする.このために当該年度は,歯周炎誘導性動脈硬化亢進モデルとして,ApoE-/-マウスの口腔内よりIL-6を毎週投与し,1日,1,2,3,4週で血液,肝臓,大動脈を採取し,肝臓および病変部でのSAA (SAA1,SAA2,SAA3)遺伝子発現,大動脈での動脈硬化程度,病変部における接着因子(ICAM-1,VCAM-1),遊走因子(MCP-1) ,SAAレセプター(TLR2)遺伝子発現を観察,計測した.その結果,肝臓および病変部ともにSAA3と比較してSAA1,SAA2のmRNA量が有意に発現上昇し,病変部でのICAM-1,VCAM-1,MCP-1,TLR2のmRNAも発現が上昇した.さらに血管内壁の脂肪沈着量も増大した.以上より,歯周病により産生されるIL-6刺激で,肝臓でのSAA1,SAA2産生が上昇し,動脈硬化発症を誘導することが確認された.現在までに歯周病と動脈硬化性疾患の多様な相互メカニズムが示唆されている.しかし,詳細な機序は未だ不明である.申請者は,現在まで動脈硬化症易形成性であるApoEノックアウト(ApoE-/-)マウスの口腔内に,歯周組織で産生される炎症性サイトカインの一つであるIL-6を注入した場合,肝臓での血清アミロイドA(Serum Amyloid A: SAA)SAAmRNA発現上昇,血中SAAタンパクの増加に伴い動脈硬化病変が増悪することを明らかにした.このことから,歯周病により産生されるSAAのアイソタイプ別の病変部血管内皮における接着因子(ICAM-1,VCAM-1),遊走因子(MCP-1)およびTLR2の発現,亢進の比較を行い, SAAの経路を介した歯周病による動脈硬化症の発症,および増大の詳細なメカニズム解明を本研究の目的とする.このために当該年度までに,歯周炎誘導性動脈硬化亢進モデルとして, ApoE- / -マウスの口腔内よりIL-6を週1度投与し,1日,1,2,3,4週で血液,肝臓,大動脈を回収し,肝臓および病変部でのSAA (SAA1,SAA2,SAA3)遺伝子発現,大動脈での動脈硬化程度,病変部における接着因子(ICAM-1,VCAM-1),遊走因子(MCP-1) ,SAAレセプター(TLR2)遺伝子発現を観察,計測した.その結果,肝臓および病変部ともにSAA 3と比較してSAA1,SAA2のmRNA量が有意に発現上昇し,病変部でのICAM-1,VCAM-1,MCP-1,TLR2のmRNAも発現が上昇した.また,免疫組織染色にて病変部の血管内皮でICAM-1,VCAM-1,MCP-1,TLR2の発現上昇を確認した.以上より,歯周病により産生されるIL-6刺激で,肝臓でのSAA1,SAA2産生が上昇し,動脈硬化発症を誘導することが確認された.現在まで動脈硬化症易形成性であるApoEノックアウト(ApoE-/-)マウスの腹腔内に,歯周組織で産生される炎症性サイトカインの一つであるIL-6を注入した場合,肝臓でのSAAmRNA発現上昇,血中SAAタンパクの増加に伴い動脈硬化病変が増悪することを明らかにした.このことから,歯周病により産生されるSAAのアイソタイプ別の病変部血管内皮における接着因子(ICAM-1,VCAM-1),遊走因子(MCP-1)およびTLR2の発現,亢進の比較を行い, SAAの経路を介した歯周病による動脈硬化症の発症,および増大の詳細なメカニズム解明を目的とする.当該年度は,ApoE-/-マウスの口腔内にIL-6を投与し,血中SAAアイソタイプの濃度,大動脈のSAA1,SAA2,SAA3の濃度比率の解析を行ったが,個体差が大きいため,個体数を増加して現在対応している.また,大動脈血管内皮細胞のSAAアイソタイプによる遺伝子発現の検討を行う予定であったが,血管内皮細胞の抽出が困難であるため,現在抽出法を検討している.歯周治療系歯学血管内皮細胞にmouse recombinant SAA (SAA1,SAA2,SAA3)を2.5μg/mlの濃度で添加し24時間培養を行い,AIIPrep DNA/RNA/Protein Mini Kit (QIAGEN)にてタンパクとRNAを抽出する.抽出したRNAはcDNAに変換し,リアルタイムPCR法,タンパクはウエスタンブロッティング法にてICAM-1,VCAM-1,MCP-1およびTLR2の解析を行う.現在までの結果を含めて,SAAアイソタイプの動脈硬化症への影響の相関性を解析し,発症および増大のメカニズムを解明する.

平成25年度は,ApoE-/-マウスの口腔内にIL-6を投与し,肝臓,血中,病変部大動脈のSAAアイソタイプによる動脈硬化発症の影響程度を解析することを計画した.当初の計画では,血中SAA蛋白量において,SAA1,SAA2,SAA3濃度比率を比較する予定であったが,個体ごとに発現がばらつくため,抗体を変更し解析予定である.また,免疫染色による病変部のICAM-1,VCAM-1,MCP-1,TLR2発現も個体によるばらつきを認めたため,抗体を変更し順次解析を行っている.肝臓および病変部大動脈の遺伝子発現は確認できているため,予定されている実験の遂行に支障はないと考える.大動脈血管内皮細胞のSAAアイソタイプによる遺伝子発現の検討を行う予定であったが,血管内皮細胞の抽出が困難であるため,現在抽出法を検討している.そのため,予定薬品などを購入していないため,次年度へ移行した.上記より動脈硬化症に対するSAAアイソタイプの同定,作用機序および影響程度が解明されると,動脈硬化症に対する歯周病の直接的な因果関係が明らかにできると考える.血管内皮細胞の抽出を的確に施行し,リアルタイムPCR法,タンパクはウエスタンブロッティング法にてICAM-1,VCAM-1,MCP-1およびTLR2の解析を行い,SAAアイソタイプの動脈硬化症への影響の相関性を解析し,発症および増大のメカニズムを解明する.研究予定が遅延していることから予定物品を購入しなかったため.平成25年度の遅延している研究計画を平成26年度にて順次遂行する予定である.
プロスタグランジンE2およびそのEP4受容体情報伝達系のガン化への関与の解明

非ステロイド性抗炎症薬(NSAID)の長期服用により、大腸癌による死亡率が4050%低値を示す事や、家族性大腸腺腫症患者のポリープの大きさが、NSAIDにより有意に減少する事が知られている。前回我々はLS174T細胞をPGE2で刺激することでセカンドメッセンジャーであるcAMPが産生されることを確認した。このcAMP産生を正に調節しているPGE2受容体は主にGsに共役しているEP2あるいはEP4受容体であることが考えられる。そこでRT-PCR法を用いてLS174T細胞に発現しているEP受容体サブタイプを確認したところ、EP4受容体ではなく、EP2受容体のmRNA発現が確認された。このことから、LS174T細胞はEP2受容体刺激を介して、cAMP産生を増強している事が示された。また、このPGE2刺激によるcAMP産生は、NSAIDの一つであるインドメタシン前処理により抑制される事を明らかにした。さらに、このcAMPの産生抑制は、インドメタシン処理によるEP2受容体の発現が減少することに起因する事も明らかにし、学術論文として報告した(Biochem. Biophys. Res. Commun. (2007) 359:568)。NSAIDの作用機序としてCOX活性抑制によるPGE_2産生量の減少が、cAMPなどのセカンドメッセンジャー産生を始めとする情報伝達系の活性化抑制の原因であると考えられている。しかしながら、細胞表面の受容体絶対量が減少すると言う事は、細胞外のPGE_2濃度に関わらず細胞内情報伝達系の活性抑制が起こりうる事を示唆している。これらのことから、癌化の進行あるいは改善には、従来のCOX/プロスタノイドの産生量の調節だけではなく、プロスタノイド受容体の発現調節も重要な因子である可能性が示唆された。これまで筆者は、プロスタグランジンE2(PGE2)受容体EP2あるいはEP4サブタイプを発現させたHEK293細胞のモデルシステムを用いて、PGE2刺激による受容体の細胞内情報伝達系を明らかにし、大腸癌発現のメカニズムを示唆して来た。また、ヒト結腸癌細胞株LS174T細胞において、プロスタグランジンE2(PGE2)刺激による細胞増殖、細胞移動にEP4受容体の関与などが報告されていることから、モデルシステムで得られた結果を踏まえ、実際の癌細胞であるLS174T細胞の情報伝達系を明らかにする事を目的とし研究を行っている。今回我々はLS174T細胞をPGE2で刺激することでセカンドメッセンジャーであるcAMPが産生されることを確認した。また、このPGE2刺激によるcAMP産生は、NSAIDの一つであるインドメタシン前処理により抑制される事が明らかとなった。さらに、このインドメタシン前処理により、プロスタノイド生成過程の前駆物質であるアラキドン酸(AA)のLS174T細胞への取り込みが阻害される事も見いだされた。インドメタシンによるシクロオキシゲナーゼ(COX)抑制作用とAAの取り込み抑制作用との関連の解明も今後進めて行く予定である。またAAは生体膜のグリセロリン脂質の構成成分である事から、細胞膜のリモデリングが、EP2受容体の細胞内情報伝達系を調製している可能性が示唆され、今後さらなる検討を行い癌化への機序を解明して行きたいと考えている。

しかしながら、細胞表面の受容体絶対量が減少すると言う事は、細胞外のPGE_2濃度に関わらず細胞内情報伝達系の活性抑制が起こりうる事を示唆している。これらのことから、癌化の進行あるいは改善には、従来のCOX/プロスタノイドの産生量の調節だけではなく、プロスタノイド受容体の発現調節も重要な因子である可能性が示唆された。
マグネシウム活性化流動床を用いた固相領域におけるアルミニウム表面窒化

アルミナ(Al_2O_3)/アルミニウム・マグネシウム(Al-Mg)合金粉末を充填した流動床窒化炉を用いて,Al基材表面を活性化させAlの融点以下でのガス窒化処理を可能とし,流動床内における窒化メカニズムの検討,および流動床によるAl表面の窒化プロセスの最適条件の検討を行った.処理温度が高いほど改質層生成速度は大きいが,昇温時の置換ガスとしてN_2ガスを用いているため,処理開始温度が高いほど昇温中に流動床内でAl_3Mg_2や,AlNが生成される.843Kを越えると,流動化直後にAlとNの発熱反応が急激に起こり,基材溶解または充填粉末が溶解・焼結してしまう.Al-Mg配合比1.0mass%以上では改質層はAIN+Al_2O_3混合層とAlN浸透層とに分かれ,処理後の表面は粗れている.Al-Mg配合比0.4mass%までは混合層は確認されない.Al-Mg配合比0.53.0mass%では流動床中のAlがNと反応し,AlN粉末となりAl_2O_3粉末と共に基材に堆積する.充填粉末が流動化され基材と粉末との接触により表面酸化膜が破壊される.その時,Alを露出させることで基材表面は反応しやすい状態,つまり活性化されていると考えられる.Al-Mg粉末が無い場合は処理後の基材表面に変化は観られない.流動床を用いたAl基材の窒化プロセスにおいてN_2ガス流量は流動化に必要なガス量より決められている.そのためAlN生成反応に必要なガス量より非常に多い.基材を回転させればN_2ガス流量によらず,流動床と同等の基材と粉末との接触衝撃力を得ることができる.よって,窒化性ガスであるN_2ガス流量を任意に変化可能であり,使用ガス量の低減と共に,流量変化による窒化制御も可能となる.流動床の40%のN_2ガス流量でも基材を回転させればAlN改質層の生成が認められる.Al_2O_3粉末を熱媒体とした流動床中にAl基材を保持し窒素を導入して加熱したところ基材形状をほとんど損なわずAINを創製することに成功した.これまでの実験により以下の結果が得られている.(1),流動床内での基材の保持方法(ガス流に対する設置方向)による基材表面粗さには顕著な差は観られない.(3),自作した流動床において,平均粒径100μmのAl-Mg合金粉末とAl_2O_3粒子お用いた際に,500°Cで流動化を開始する最低窒素ガス流量でも窒素が行われる.(4),AIN皮膜中にはほとんどAl_2O_3粒子は混入されていない.また,以下の問題が発生し,対処を行った.(1),窒素流量を増加させるとAl-Mg合金粉末の窒化反応が活発となるために炉内温度が上昇し,Al-Mg合金粉末とAl_2O_3粒子が焼結される.炉内温度が上昇した際には窒素流量を減少させるとAl-Mg合金粉末の窒化反応は制御され,炉内温度は下がるが,流動床内の流動が停止するため焼結が促進されてしまう.(対策)流動床内温度モニタし,炉内温度が処理温度より急激に上昇した際には,窒素流量を減らしそれに見合うだけの不活性ガス(実験ではArを使用)を導入し,流動を保持しつつ炉内温度を処理温度まで低下させ,焼結を防止した.引き続き,実用Al合金への適用,および耐摩耗性等の機械的性質の評価を行う.アルミナ(Al_2O_3)/アルミニウム・マグネシウム(Al-Mg)合金粉末を充填した流動床窒化炉を用いて,Al基材表面を活性化させAlの融点以下でのガス窒化処理を可能とし,流動床内における窒化メカニズムの検討,および流動床によるAl表面の窒化プロセスの最適条件の検討を行った.処理温度が高いほど改質層生成速度は大きいが,昇温時の置換ガスとしてN_2ガスを用いているため,処理開始温度が高いほど昇温中に流動床内でAl_3Mg_2や,AlNが生成される.843Kを越えると,流動化直後にAlとNの発熱反応が急激に起こり,基材溶解または充填粉末が溶解・焼結してしまう.Al-Mg配合比1.0mass%以上では改質層はAIN+Al_2O_3混合層とAlN浸透層とに分かれ,処理後の表面は粗れている.Al-Mg配合比0.4mass%までは混合層は確認されない.Al-Mg配合比0.53.0mass%では流動床中のAlがNと反応し,AlN粉末となりAl_2O_3粉末と共に基材に堆積する.充填粉末が流動化され基材と粉末との接触により表面酸化膜が破壊される.その時,Alを露出させることで基材表面は反応しやすい状態,つまり活性化されていると考えられる.Al-Mg粉末が無い場合は処理後の基材表面に変化は観られない.流動床を用いたAl基材の窒化プロセスにおいてN_2ガス流量は流動化に必要なガス量より決められている.そのためAlN生成反応に必要なガス量より非常に多い.基材を回転させればN_2ガス流量によらず,流動床と同等の基材と粉末との接触衝撃力を得ることができる.よって,窒化性ガスであるN_2ガス流量を任意に変化可能であり,使用ガス量の低減と共に,流量変化による窒化制御も可能となる.
センサ技術を応用した泳動作ビジュアルフィードバックシステムの開発

クロール泳中の身体動作の加速度および角速度をセンサにより計測することで、泳動作をアニメーション化することを目的とした。前腕部を対象とした計測により、センサデータから前腕部の向きが再現できることを確認した一方で、位置推定の精度に課題があることが明らかとなった。アニメーションによる動作の再現は、一般的な水中映像よりも見やすく、あらゆる方向から観察できることから、効果的なフィードバック手法として応用できるものと考えられた。本研究課題は,センサ技術を応用した泳動作分析手法を発展させ,泳動作を視覚的にフィードバックするシステムを提案するものである。動作の周期性を利用し,測定するセンサの情報のみで身体各部位の変位や各関節の角度を自動かつ連続的に算出することが当面の目的となる。平成19年度は水泳中の四肢動作を計測するために,3軸加速度および3軸角速度を計測・記録する防水仕様のワイヤレスセンサデータロガーの製作を実施した。トレーニング現場における実用を考慮すると,泳動作中にデータを連続的に採取し,解析、処理した結果を即時に出力可能とすることが望ましいものと考えられる。製作したセンサロガーの制御および計測データの取得は,Bluetoothによる無線通信で行うようにした。これによって,センサによる泳動作中の四肢動作計測を比較的簡便に実施できるようになった。一般に,Bluetoothによる無線通信(2.4GHz帯)は水に吸収されるため,機器水没時の通信は困難である。このため,センサ部とロガー部とを分離し,無線送信部を内蔵するロガーを常に水面上に設置するデザインとすることで,水泳中であっても連続したデータの採取が可能となった。また,センサロガー制御のためのソフトウェアは,ビデオカメラ等の映像撮影システムとの同期計測を行うために,独自に開発を行った。同期撮影した映像は関節角度推定結果の精度検証の際に,比較対象として用いられる。本研究課題はセンサ技術を応用した泳動作分析手法を発展させ、泳動作を視覚的にフィードバックするシステムを提案することを目的とした。男子競泳選手6名を対象にクロール泳中の前腕部の加速度および角速度をセンサにより計測した。また、泳動作を5台のカメラで撮影し、画像による三次元動作分析を実施することでセンサ情報による泳動作推定の結果を検証した。計測したセンサデータから、ストローク局面の時刻情報を推定し、腕入水後の1ストローク時間の自動抽出を実現した。センサによって計測した部位の姿勢角を四元数で表すものとし、計測によって得られる加速度および角速度に対する、姿勢角と並進変位との関係を数理モデルによって定式化した。1ストロークごとに上腕部の姿勢角および並進変位を推定し、三次元画像分析から得られたものと比較したところ、姿勢角はほぼ一致していることが確認されたが、並進変位については計算の際に与える初期速度によって差が生じた。今後、泳時間測定などの速度に関する簡易計測を付加することによって、より確実な泳動作の推定が可能となるものと考えられた。センサデータから推定した姿勢角と並進変位を使用し、コンピュータグラフィックスにより、泳動作をアニメーション化するプログラムを作成した。手掌部と前腕部が一体の剛体であると仮定し、泳者座標系で記述した腕動作をアニメーションにより再現した。センサから得られた並進変位の推定結果に誤差があるものの、手掌および前腕部の回転運動が視覚的に再現された。一般的な水中映像では比較的視認しづらい細かい動作を高い時間分解能で再生できることから、トレーニングにおける効果的なフィードバック手法として応用できるものと考えられた。これらの成果は身体の各部位に適用可能であり、下肢や体幹部において同様の計測を実現ことで全身のキネマティック情報を推定し、視覚的フィードバックが可能となる。
電子顕微鏡シーケンサーに用いるDNA/RNAナノアレイの作成

研究代表者らは、電子顕微鏡を利用して、大量のDNA配列を1分子観察により高速・高精度でシーケンスする技術の開発をすすめている。すでに20merのオリゴヌクレオチドを塩基特異的にAuナノクラスターで修飾し、その電子顕微鏡観察を実現しているが、今後のアプリケーション開発には、さらに定量性を考慮した観察試料調整法の確立が不可欠である。そこで、薄膜側面という微細構造を利用して、観察対象分子を自己組織的に1nmオーダーのスケールでパターン化させ、電顕観察時に試料を探す領域を限定する技術を開発し、効率的な観察を実現する、という課題に取り組んだ。マイカ基板上に、DLC膜をプラズマ蒸着する。この上にAuを膜厚1nm程度で蒸着させる。その後、DLC膜/Au膜の積層を繰り返す。DLC膜の厚みは30^-100nm程度に調製することが可能である。この基板をエポキシ樹脂で固めた後、イオンスライサー(JEOL)で超薄切片化することにより、側面を露出させる。目的通りに、Auの線幅1nm程度の極細線パターンが30^-100nm間隔のDLC層ではさまれた薄切片が形成できた。DNA(dT20U)の5'-末端にDTTPによりチオール基を、また3'-末端にウンデカゴールドクラスターを標識したものを調製し、これを用いて自己組織的にAu薄膜側面に結合させる事を試みた。TEM観察を行なったが、1nmのAu極細線パターンに沿ったウンデカゴールドクラスターは検出できなかった。今後、AFM探針をペンのように用いるディップペンナノリソグラフィーの手法を応用して、DNAナノアレイを形成する手法などを検討する。
アルケノン生産性藻類の物質生産性向上のための基盤技術の研究

これまでに量子科学技術研究開発機構高崎量子応用研究所(TIARA)において、数回の円石藻Tisochrysis lutea株への照射を行った。その結果、アルケノン生産量が野生株(元株)に比べて約2倍大きい株を取得することができた。この株のアルケノン高生産の原因を確かめるため、光合成活性を測定した。当初は光合成能、すなわちカーボンのインプットの速度は変わらずに、最終産物としてアルケノンへの配分が増加していると想像していたが、光合成速度の解析の結果、野生株より2倍近く活性が高いことがわかった。現在、この光合成能の上昇のメカニズムについて解析を試みている。光合成能は多様な光合成生物で共通性の高い仕組みが保存され、ほぼ最適に制御されていると考えられているので、変異の導入により光合成活性を向上できることは非常に驚くべき結果であった。アルケノンは一部の円石藻が蓄積する特殊な脂質で、それらの円石藻にとっては、固定した炭素を貯蔵する形態であると考えられている。細胞を暗所におくとアルケノンは数日かけて分解され蓄積量が減少する。共同研究者の新家博士は、アルケノンの分解速度に着目し、アルケノン蓄積量が増加した株の中から暗所でのアルケノン蓄積量の減少がみられる株をスクリーニングし、複数のアルケノン分解能を低下させた株を得ている。現在はこれらの変異に関わる遺伝子の同定を行っており、それらが明らかにできれば、それら候補遺伝子の過剰発現、発現抑制により、さらに生産性を向上した株を取得するとともに、原因遺伝子を明らかとしたい。円石藻Tisochrysis luteaへの重イオンビーム照射により複数のアルケノン生産量の高まった株を得ることに成功している。その中には光合成活性の増加したもの、アルケノン分解速度が低下したものが含まれていることがわかりつつある。光合成は多様な光合成生物種に保存される機能で、生物が獲得してから非常に長い年月を経ており、最適に進化していると考えられているので、光合成機能そのものがさらに向上できることは驚くべきことであった。その原因遺伝子を特定できればそれを他の植物、藻類へ応用することにより、増産増収が可能となり、社会に大きな貢献をできると考えられる。また、アルケノンはユニークな物質で、炭素数37ー40の枝分かれのない長鎖不飽和ケトンで末端にメチル基を持つ構造を有する。通常trans型の不飽和結合を2ー4つ含み、低温条件で不飽和度が増加することがわかっている。アルケノンは環境中で分解を受けにくく、海底の堆積物から同定され、その不飽和度からそのアルケノンが堆積した当時の海洋の水温を同定するために地球古生物学分野で利用されている。このことは通常の海洋性の細菌や微生物はアルケノンを分解できないが、その生産者である円石藻は分解して炭素源として利用する事が可能である。これまでその分解の経路は明らかにはなっていないが、昨年度同定した変異株の解析により、新規なアルケノン分解の機構が解明できる可能性がある。アルケノンは末端のカルボキシル基を除けは、アルケン状の分子であるため、その分解経路はアルカン・アルケンの分解に利用できる可能性があり、新規なバイオリメディエーションへの展開も考えられる。これまでの研究で、光合成機能の向上とアルケノン分解の抑制の少なくとも2系統のアルケノン産生能向上の機構が考えられたので、引き続きTIARAのマシンタイムが確保できる場合は、野生株あるいはこれまでえられている変異株への重イオンビーム照射を行い、複数の優良形質を持つ株の取得に努める。並行してこれまでに得られている変異株の原因遺伝子の特定に努め、その原因を明らかにするとともに、Tisochrysis lutea株への遺伝子改変により、それら機能の増強または欠失抑制により、その機能を確認し合わせて優良な株を得ることを目指す。我々は既にこの株の遺伝子導入技術、特異的に遺伝子機能を抑制する技術を取得しており、その技術を利用できる。量子科学技術研究開発機構高崎量子応用研究所のタンデム加速器を用いて、ハプト藻のTisochrysis luteaと従属栄養性のAurantiochytrium sp.に炭素およびHeのイオンビーム照射を行い、ハプト藻については貯蔵脂質で長鎖のメチルケトンであるアルケノンの含量が1.5倍まで増加した株を2株得ることができた。また、このハプト藻株のオイル蓄積量上昇の原因を明らかにするため光合成活性を測定したところ、アルケノン高蓄積株は光合成活性の増加が見られた。特にその傾向は光強度が強い条件でより顕著であり、光強度を高めて培養することで、さらに高収量を得られる可能性が示された。引き続き、これらの株について細胞内の炭素配分を調べ、高い光合成活性により固定された炭素がアルケノンおよびその他の貯蔵形態、例えば多糖やタンパク質、水溶性の低分子有機物にどの程度配分されているかを明らかにする。一方で、イオンビーム照射の結果、アルケノンを全く合成できない株も単離できている。これらの株は未だ未同定のアルケノン合成に関わる因子の同定につながる可能性を秘めており、現在ゲノム解析を行っており、有望な候補遺伝子が同定できることが期待される。もし候補遺伝子が見つかれば、上記のアルケノン高生産株でその遺伝子の発現が変化しているかどうかを確認したい。また我々の研究室で開発した当該藻類の形質転換法を用いて過剰発現させることにより、アルケノン含量に影響が出るかどうかを検討する。