hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
プレB細胞レセプターのB細胞分化における役割

骨髄中で未分化なB細胞が文化成熟して行くのに、ストローマ細胞のサポートが必要であるが、この分子メカニズムはよく分かっていない。我々はこのサポートに関与する分子としてマウスCD9とOB-カドヘリンをクローニングし、その機能について検討した。マウスCD9は従来マウスプレB細胞に発現していると報告されていたが、我々は新たにストローマ細胞と未熟B細胞に発現しているのを見出した。遺伝子の細胞への導入でCD9が接着に関与していることが分かり、ストローマとプレB/未熟B細胞間の接着に重要な機能を果たしていることが考えられる。OB-カドヘリンはストローマに発現する特異的なカドヘリンとしてクローニングされたものであるが、ヒトOB-カドヘリンには膜貫通部に変異のある別の変異OB-カドヘリンが存在し、この変異体は骨肉腫に優先的に存在する。マウスL細胞への遺伝子導入の結果、この変異体は細胞接着能がなく、癌転移に機能していることが考えられる。更にストローマ細胞株をBMP-2で処理することにより骨芽細胞に分化誘導でき、ストローマは骨芽細胞の前駆体であることが証明された。また新しくクローニングされたBMPファミリーの1つ、GDF5はその精製蛋白を筋肉内に投与することにより、筋肉中に骨形成を誘導した。
鉄筋腐食によるRC構造部材の耐力性能低下に関する研究

鉄筋の腐食程度とRC構造部材の耐力性能との関係を定量的に把握するとともに、炭素繊維シートによる補強工法の鉄筋が腐食したRC構造部材への適用について検討した結果をまとめると以下のようになる。1、有限要素解析の結果、鉄筋の腐食形態によってかぶりコンクリートのひびわれ方向は異なり、局部的な腐食ほどひびわれ発生に必要な腐食量が大きくなることがわかった。2、孔食及び全面均一腐食それぞれについて、鉄筋の力学的性能を腐食減量率を変数として定量化し、有限要素解析に必要な鉄筋の構成則に導入するとともに規格降伏点を基準として鉄筋の許容腐食量を算定した。3、鉄筋を数段階に腐食させて引抜き付着実験を行い、鉄筋腐食に伴う付着強度及び付着剛性の変化を腐食減量率を変数として定量化した。4、上記2と3で求めた腐食鉄筋の構成則及び付着の構成則を用いて、鉄筋が腐食したRC梁の有限要素解析を行い、その結果を実際に鉄筋が腐食したRC梁の載荷実験結果と比較検討することによって腐食鉄筋及び付着の構成則の妥当性を検証した。5.炭素繊維シートによる補強は、鉄筋が腐食したRC梁の曲げ・せん断耐力補強工法として有効であり、炭素繊維シートによる補強効果を決定する要因はシートの付着特性であるため、十分な定着を設けることによって梁の曲げ・せん断耐力および最大耐力時の変形能力が向上することを示した。6.柱の帯筋の腐食減量率が30%を越えると横拘束効果はなくなり、腐食ひびわれによる付着破壊、かぶりコンクリートの剥落、帯筋破断による拘束効果の低下及び鉄筋自体の耐力低下によって柱の耐力は低下した。1.鉄筋腐食により鉄筋およびコンクリートに現れる変状の把握塩分を含有したコンクリート中に鉄筋を埋め込み、電食試験および乾湿繰り返し試験により,鉄筋の腐食を促進させて,鉄筋の腐食形態・腐食量がコンクリートのひびわれ発生時期,ひびわれ形態などに及ぼす影響を明らかにした。それらには,鉄筋の直径,コンクリートのかぶり厚さ,配筋状態なども関与することが明らかとなった。2.腐食した鉄筋の応力ひずみ関係および鉄筋の腐食量と許容応力度との定式化腐食した鉄筋の断面欠損量と鉄筋の降伏点・引張強度・伸び性能との関係を,孔食の程度をパラメータとして明らかにし,腐食鉄筋の構成方程式を導いた。3.腐食した鉄筋とコンクリートとの付着性状および鉄筋の腐食量と許容付着応力度との関係の定式化鉄筋径,かぶり厚さおよび配筋状態を因子として,腐食鉄筋の引き抜き付着試験体を作製した。現在,乾湿繰り返し養生により,鉄筋の腐食を促進中である。4.鉄筋の腐食したRC構造部材の構造性能把握のためのRC構造部材の作製および腐食促進実施コンクリート中に塩分を含んだ鉄筋比の異なるRC梁試験体を作製し,電食により腐食を促進させ,劣化状態の異なる試験体について単純曲げ試験を行い,耐力・変形性能の低下現象を明らかにするとともに,有限要素解析に用いることができるように,鉄筋とコンクリートとの付着,コンクリートのひびわれ・剥離現象を考慮した付着およびコンクリートの構成方程式を導き出した。5.RC構造部材の耐久設計手法における適用性検討今年度までの研究結果をもとに,RC構造部材の耐久設計の基礎となる耐用限界状態(寿命)の算定手法について検討中である。本年度得られた知見を以下にまとめて示す。1)平成6年度に腐食促進養生を開始した付着試験体を腐食程度の異なる4材齢で引き抜き付着試験に供し、腐食量およびコンクリートの強度・かぶり厚さが腐食鉄筋とコンクリートとの付着性状に及ぼす影響を検討した。その結果を基に、鉄筋の腐食減量・鉄筋径およびコンクリートの強度・かぶり厚さをパラメータとした腐食鉄筋の付着特性に関する構成方程式を導出した。2)導出した鉄筋のモデルおよび鉄筋とコンクリートの付着モデルを用いて、単純梁の曲げ変形挙動を非線形有限要素解析により検討した。その結果、主筋の定着が充分に確保された場合には、鉄筋の断面欠損が耐力低下の主原因となるが、定着が不充分な場合には付着破壊が生じ、一層の耐力低下が生じることが分かった。

3)鉄筋の腐食をモデル化した梁試験体を作製し、曲げ試験および曲げせん断試験を行った。また、さらにそれらの試験体に炭素繊維シートによる補強を施し、耐力の回復状態について検討した。その結果、腐食により鉄筋に断面欠損が生じた状態を想定した試験体では、最大耐力および靱性の低下が生じ、炭素繊維シートによる補強を施した試験体では、シートの貼付量に応じて最大耐力の回復・増大がなされるが、シートがコンクリートとの接着面で破壊するため、炭素繊維の材料特性を有意義に活用できず、靱性の面でも向上は認められなかった。5)上記3)と同一寸法で健全な鉄筋が埋め込まれた梁試験体を作製し、高温乾燥繰り返しによる腐食促進養生は供した。また、柱試験体の作製を行った。1、鉄筋の腐食グレードを3段階に設定し、柱試験体の軸力を受けた状態での正負繰り返し水平加力試験を行い、鉄筋の腐食に伴う柱のせん断耐力性能の低下について検討した結果、また、腐食劣化したRC柱を炭素繊維シートによって補強した場合の耐力・変形能力の回復について検討した結果、以下の知見が得られた。(1)帯筋が局部的に腐食した場合には、帯筋の破断と主筋座屈による脆性的なせん断破壊が生じる。(2)鉄筋の腐食したRC柱の耐力性能および変形性能の低下は、鉄筋の腐食による鉄筋の力学的性能の低下、鉄筋の局部腐食による鉄筋の破断、繰り返し加力による鉄筋のコンクリートとの付着破壊、およびかぶりコンクリートの剥離による拘束力の低下が原因である。(3)炭素繊維シートによるせん断補強は付着割裂ひびわれおよびせん断ひび割れの拡大防止に役立ち、拘束効果を向上させるため、鉄筋の腐食したRC柱の補強方法として非常に適している工法である。2、腐食のかなり進行したRC梁に対して、炭素繊維シートによる補強を施した結果、以下の知見が得られた。(1)載荷時に炭素繊維シートが剥離しないように、炭素繊維の能力を十分に発揮できる方向に貼付することによって、鉄筋が腐食したRC梁の曲げ耐力およびせん断耐力を回復させることができる。(2)炭素繊維シートの物性と付着性能を組み込むことで、有限要素法により、炭素繊維シートによる補強効果を表現できる。3、以上の検討に基づき、RC構造物の耐久設計における寿命算定のあり方およびRC構造物の耐力診断・耐震診断における鉄筋腐食の評価方法について検討した。
インテグリンα9β1を介したα-シヌクレインの細胞間伝播と病態形成の機序解明

脳内に豊富に存在するα-シヌクレインはシナプス小胞の形成や維持、神経伝達物質の放出制御などに関わっていることが知られるタンパク質で、特にパーキンソン病における細胞質封入体(レビー小体)の主要構成要素であることで知られる。α-シヌクレインは興味深いことに細胞から細胞に移行するが、そのメカニズムは未だ不明な部分が多い。我々はこれまでにα-シヌクレインがインテグリンα9β1のリガンドであること、さらにこの結合はミクログリアのα-シヌクレイン取り込みに働くことを、同阻害抗体を用いて確認している。この発見は、脳におけるα-シヌクレインの細胞間伝播にインテグリンα9β1が関与している可能性を強く示唆している。そこで本研究では、ミクログリアのα-シヌクレイン取り込みの詳細を解析するとともに、オリゴマー化やS129リン酸化などの修飾を受けたα-シヌクレインのインテグリンα9β1との結合性の変化の検討、さらにはα-シヌクレインの蓄積を特徴とするパーキンソン病に対してα9β1が治療標的となり得るかを、遺伝子改変マウスを用いて検討する。本年では、低pH応答性蛍光プローブを用いることで、初代培養ミクログリアにおけるα-シヌクレイン取り込みはごく短時間(数分程度)で急速に進行するエンドサイトーシスであることを示した。また、インテグリンα9遺伝子改変マウスにおけるパーキンソン病病態の解析をするにあたり、ノックアウトマウスの作製を開始している。年度の途中で研究者の異動があり、異動の準備や異動後の研究環境のセットアップに時間を要したため。セットアップが終了し次第、時間のかかるモデルマウスの作製を先行させる。具体的には、α-シヌクレインを強発現させたトランスジェニックマウスに神経細胞もしくはミクログリア特異的にインテグリンα9β1を失わせたマウス(CaMKIIa-Cre;あるいはIba1-Cre; ITGA9flox/flox)をかけ合わせる。モデルマウスを作製する間に、in vitroの実験を行う。
首都の中心業務地区における観光空間形成に関する計画学的考察

本研究は、中心業務地区におけるビジネス空間と観光空間の相互補完的な結合が、東京だけでなく世界各地のグローバル都市で進展する現代的な現象であり政策・計画的課題であることを、実地踏査、インタビューおよび文献調査を通して検証した。調査の過程において本研究が学術的貢献として掲げた都市計画学と観光学の融合を試みた結果、「文化消費」あるいは「文化経済」の概念がそのために一つの枠組みを与えるものとの確証を得た。平成26年度は、研究課題に関する基礎文献・資料の収集を進め、首都の中心業務地区における観光空間形成に関する海外での関連事例を把握するとともに、理論的枠組みの構築に必要な概念整理を行った。主要な情報源が、海外の文献や学会・研究会などによる資料であるため、ブリティッシュ・コロンビア大学の図書館においてその収集を行った。効率的に情報収集を進めることができたが、今年度の訪問だけでは調査・収集が不十分であるため、次年度においても同図書館において関連文献の収集を継続する。一次情報については、関係者インタビューと現地フィールドワークを繰り返し行い、印刷物資料では得られない現場情報や即地的情報を入手した。また、研究対象地区に関するシンポジウムにおいて、主要な利害関係者の公的見解を確認し、上記インタビューおよびフィールドワークによる情報を検証することができた。インタビュー調査については、より多様なキー・インフォーマントを獲得できたので、次年度さらに入念なインタビューを行う予定である。上記ブリティッシュ・コロンビア大学のアジア研究所日本研究センター(Centre for Japanese Studies, Institute of Asian Research)では本研究について発表する機会が与えられ、海外研究者との意見交換や情報交換を通して首都と観光のより密接な関係についての考察を深めるとともに、本研究課題がアジア研究のトピックとしても重要であるという認識を広めることができた。また、地域への社会還元活動として、所属大学の主催により開催された一般市民を対象とするセミナーにおいて本研究の発表を行い、中心業務地区の観光化という現代の都市現象についての理解を促した。昨年度のブリティッシュ・コロンビア大学における関連資料収集が順調に進んだため、今年度は、本研究の対象である東京中心部との比較検討のためロンドン中心業務地区においてフィールドワークを行った。研究計画に基づきThe CityとLondon Docklandsにおける都市再開発および観光空間形成の現状を把握する共に、上記大学で入手した情報に基づきその周辺地区を訪れ、歴史的建造物の保存、新たな都市観光資源の開発、文化やアートの役割、公共空間の再デザインなどについて把握した。また、ロンドンのBrunel UniversityおよびエジンバラのDundee Universityを訪れ、大学研究者や実務家と貴重な意見交換を行うことができた。ロンドンおよびエジンバラでのフィールドワークは本研究に関する重要な情報を得る機会となり、また今後の情報収集ネットワークを拡大するものとなった。また、上記ブリティッシュ・コロンビア大学における研究では、大学図書館での資料収集の継続および都市計画分野の研究者との交流を通じて、グローバル都市の再開発や観光空間形成などについての最新の情報を収集することができた。同大学が所在するバンクーバー市では、中心業務地区周辺における文化的消費を中心とする観光都市空間の形成が進んでおり、観光空間化の進展において文化的な「首都性」の重要性を観察することができ、本研究を進めるうえで重要な示唆を与える都市であることを確認した。国内では、本研究の応用として、Japan Studies Association of Canadaの東京大会における研究発表および東京大学社会科学研究所ISS Research Seriesと日本都市計画学会誌「都市計画」においてオリンピックと観光都市についての論文発表を行い、今後の研究の応用と発展性について思考を深めることができた。国外フィールドワークでは予想した以上の情報を収集するだけでなく、研究ネットワークの構築を進めることができた。研究内容については、国際学会および学術雑誌において本研究を応用する形で発表することができた。その結果、本研究が、当初想定していた以上に広範な社会科学的課題と関連することが分ってきた。国内での情報更新は適宜行っており、新たな情報源の構築を進めることができた。最終年度は、本研究が意図する国際比較研究をより拡大・深化するため、北米の代表的グローバル経済都市の一つであるトロント市の中心業務地区に焦点をあて、そこでの観光空間の形成を探るためフィールドワークを実施した。その結果、同市の中心部においてグローバル・ビジネス空間とグローバル観光空間が互いに隣接するかたちで存在し、企業や人々のグローバルな活動を支え、促進するための大規模でユニークな都市空間が形成されていることを確認した。これまでの調査に加えこのトロントでのフィールドワークにより、グローバル都市の中心業務地区における観光空間の形成は世界的な傾向として多様なかたちをとりながら進行しており、都市間競争および持続可能性の観点から政策的、計画的な取り組みが必要となっていることを確認した。本研究の中心的な学術的意図は、グローバル都市中心部の観光地化という近年の都市現象を対象に都市計画学と観光学の学際的研究を推進することであるが、その実現手法として昨年度は観光系と都市計画系の学会において本研究についての報告を行った。その結果両学会において、中心業務地区の観光空間形成が都市計画学と観光学を融合する新しい研究対象として成立する可能性を確認するに至った。さらに両学会での議論を通して「文化的消費」あるいは「文化経済」の概念が、東京だけでなく世界のグローバル都市の中心業務地区における観光空間形成について理解するための理論的枠組みとして用いることが有効であるとの示唆を得た。この概念的アプローチの有効性は海外文献の調査からも読み取れるものであり、今後のより発展的な研究のための座標軸となることを確認した。以上のように、本研究最終年度ではフィールドでの実証的研究と文献調査および学会等での理論的研究を相互に連携させて進め、中心業務地区における観光空間の形成を新たな学際的研究の対象として位置づけることができた。

本研究は、中心業務地区におけるビジネス空間と観光空間の相互補完的な結合が、東京だけでなく世界各地のグローバル都市で進展する現代的な現象であり政策・計画的課題であることを、実地踏査、インタビューおよび文献調査を通して検証した。調査の過程において本研究が学術的貢献として掲げた都市計画学と観光学の融合を試みた結果、「文化消費」あるいは「文化経済」の概念がそのために一つの枠組みを与えるものとの確証を得た。計画的なフィールドワークにより、対象地区の空間特性に加え、異なる季節、異なる時間帯、異なる曜日など多面的な空間利用の実態を把握した。また、対象地区の隣接地区についてもフィールドワークを行うことにより、中心業務地区における観光化の多様性を検証することができた。観光空間のガバナンスについては、各主体の政治的あるいはビジネス戦略上の事情が絡むため非公式情報の入手がやや難しいが、本研究の課題である観光空間の形成の説明に必要な情報はおおむね収集できた。ただし、本地区の再開発はダイナミックに進行中であるためそのガバナンスも固定的ではなく、引き続いての情報収集が必要である。観光行動の支援とコントロールについては、おおむね把握できたが、現場での工夫や社会実験が継続中であり、今後の調査が必要である。海外事例との比較は次年度の課題であるが、文献・資料収集は順調に進んでいる。以上、本研究が目指す、都市研究と都市観光研究の理論的融合についての準備はおおむね順調に進展していると考えられる。今後は、引き続き国内での情報収集を継続するとともに、これまで構築した国際ネットワークを活用して最新の情報や事例の更新に努める。同時に、国外フィールドワークも継続し、現場での最新の動向把握を進める。また、国際比較を有効に行うための調査手法を検討していく。さらに、国内、国外での研究発表をさまざまな形で行い、本研究をグローバル都市論あるいは21世紀のメトロポリス計画論として位置づけていく。都市計画本研究では情報収集手法として調査票の利用を想定していたが、当該地区の再開発に関する異なる利害関係者からのニュアンスに富んだ情報が有効であることが分ったため、少なくとも利害関係者に関しては調査票を利用せずに情報収集を進める。情報収集にあたっては、むしろ、より多様な利害関係者に対するインタビューや関連文献資料の収集・精査、都市再生に詳しい海外研究者との情報交換などが有効であり、それらを次年度の課題としたい。
造血器腫瘍にみられる染色体転座に関連した蛋白群の機能解析

造血器腫瘍にはしばしば染色体転座が認められるが、その転座自体の生じる機構に関しては、未だ不明な点が多く残されている。我々はこれまでに、転座の発生に関与する可能性を秘めた新規因子を単離しTranslinと命名した。しかし、種々の解析によっても、この蛋白の生体内での生理活性や染色体転座機構への関与の詳細は不明のままであった。我々はその解決のために、トランスリンのゲノム構造と詳細なその制限酵素地図を基にして、相同組換えによりトランスリン遺伝子を欠損させるためのTarget Vectorを作成した。これをマウスのES細胞に形質導入した後に選別を行い、生き残ったクローンを培養増殖させてゲノムDNAを抽出してサザンブロットを行った。これにより、目的とする遺伝子領域が相同組換えを起こしたと思われるクローンを選別し、これをマイクロインジェクション法により借り親の胚盤胞に注入し融合させた。生まれ出たキメラマウス中で、生殖細胞において目的とする遺伝子が欠損しているマウスを選別し、このキメラマウスと別のマウスと交配して作成したF1マウスの中から、トランスリン遺伝子がヘテロに欠失しているマウスを選別した。次に、これらのマウス同士で交配してF2マウスを作成し、そのマウスのDNA解析を行った結果、確かにその1/4がトランスリンKOマウスであることを確認した。その一方、TranslinをbeitとしたYeast Two-hybrid systemにより単離された新規Translin関連遺伝子RP58(転写抑制因子と想定されている)においても、同様の手法によりKOマウスの作成を行った。これにより生まれ出たF2マウスのうち1/4は、生後すぐに呼吸不能のため致死的となり、DNA解析によりこれがRP58 KOマウスであることが判明した。現在、これらマウスについての詳細な解析を進めている。造血器腫瘍にはしばしば染色体転座が認められ、それに起因する遺伝子変化が癌化の直接の原因となっているが、その転座自体の生じる機構に関しては、未だ不明な点が多く残されている。我々はこれまでに転座の発生に関与する可能性を秘めた新規因子を単離し、Translinと命名した。しかしこの蛋白は、種々の解析によっても、生体内での生理活性や染色体転座機構への関与の詳細は未だ不明のままである。我々はその解決のために、マウスのTranslin遺伝子を単離し、そのcDNAとゲノムDNAの構造と塩基配列を調6べつのエクソンと5つのイントロンよりなることを解明した。さらに、このゲノム構造と詳細なその制限酵素地図を基にして、相同組換えにより目的の遺伝子を欠損させるためのTarget Vectorを、遺伝子工学的手法を用いて作成した。これをマウスのES細胞にElectoroporationにより形質導入し、同時に組み込まれたNeo耐性遺伝子を利用して、Neomycin(G418)で選別を行った。生き残ったクローンを培養し、増殖してきた段階でゲノムDNAを抽出した後、適切な制限酵素とプローブを用いサザンブロットを行った。この結果、目的とする遺伝子領域が相同組換えを起こしたと思われる1クローンを選別した。得られた組換えクローンを増殖させて一部凍結保存した後、その一部をマイクロインジェクション法により、借り親の卵細胞に注入し融合させた。現在は、生まれ出たキメラマウス(体毛で識別)の中で、生殖細胞において目的とする遺伝子が欠失しているマウスを選別中である。今後は、このキメラマウスと別のマウスと交配し、F1マウスを作成する。次に目的の遺伝子が欠失しているマウスを選びだし、これらのマウス同士でさらに交配してF2をつくり、その中から産まれてくるKOマウスを選別し、解析を行う予定である。

造血器腫瘍にはしばしば染色体転座が認められるが、その転座自体の生じる機構に関しては、未だ不明な点が多く残されている。我々はこれまでに転座の発生に関与する可能性を秘めた新規因子を単離し、Translinと命名した。しかしこの蛋白は、種々の解析によっても、生体内での生理活性や染色体転座機構への関与の詳細は未だ不明のままである。我々はその解決のために、マウスのTranslin遺伝子のゲノム構造と詳細なその制限酵素地図を基にして、相同組換えにより目的の遺伝子を欠損させるためのTargetVectorを作成した。これをマウスのES細胞に形質導入し、選別されたクローンを培養増殖させた後、得られたDNAを適切な制限酵素とプローブを用いサザンブロットを行って、目的とする遺伝子領域が相同組換えを起こしたと思われるクローンを選別した。その一部をマイクロインジェクション法により、借り親の卵細胞に注入し融合させ、生まれ出たキメラマウス(体毛で識別)の中で、キメラ率の高いマウスを選別した。現在、このキメラマウスと別のマウスと交配してF1マウスを作成し、目的の遺伝子がヘテロに欠失しているマウスを選別中である。今後、これらのマウス同士でさらに交配してF2をつくり、その中から産まれてくるKOマウスを選別し、解析を行う予定である。その一方、TranslinをbeitとしたYeast Two-hybrid systemにより単離された新規遺伝子rp58(転写抑制因子と想定されている)においても、同様の手法によりKOマウスの作成を行った。この結果、生まれ出たF2マウスのうち1/4は、生後すぐに呼吸不能のため致死的となり、DNA解析によりこれがrp59 KOマウスであることが判明した、現在、このマウスについての解析を同時に行っている段階である。我々はこれまでに、転座の発生に関与する可能性を秘めた新規因子を単離しTranslinと命名した。しかし、種々の解析によっても、この蛋白の生体内での生理活性や染色体転座機構への関与の詳細は不明のままであった。我々はその解決のために、トランスリンのゲノム構造と詳細なその制限酵素地図を基にして、相同組換えによりトランスリン遺伝子を欠損させるためのTarget Vectorを作成した。これをマウスのES細胞に形質導入した後に選別を行い、生き残ったクローンを培養増殖させてゲノムDNAを抽出してサザンブロットを行った。これにより、目的とする遺伝子領域が相同組換えを起こしたと思われるクローンを選別し、これをマイクロインジェクション法により借り親の胚盤胞に注入し融合させた。生まれ出たキメラマウス中で、生殖細胞において目的とする遺伝子が欠損しているマウスを選別し、このキメラマウスと別のマウスと交配して作成したF1マウスの中から、トランスリン遺伝子がヘテロに欠失しているマウスを選別した。次に、これらのマウス同士で交配してF2マウスを作成し、そのマウスのDNA解析を行った結果、確かにその1/4がトランスリンKOマウスであることを確認した。
電子顕微鏡像にみられる準結晶の異常コントラストの研究

Al_<66.3>Cu_<20.4>Fe_<13.3>付近の組成で生じる準結晶相は1002K951Kの温度領域で変態し,高完全性準結晶から近似構造の複雑なドメイン構造に変化する。その低温相(近似構造)は疑似正20面体対称の電子線回折像を示し,又電子顕微鏡像にはドメイン構造に関係すると思われる強い異常コントラストが観察された。本研究においては,この異常コントラストの有無を構造完全性の指標として用い高構造完全性を持ったミリメ-トルサイズの単準結晶の作製方法を確立した。単準結晶を得るための条件を以下に記す。(1)Al_<66.3>Cu_<20.4>Fe_<13.3>の母合金組成を用い,粉砕した試料を原材料とすること。(2)熱処理は,はじめ1143Kに保持し,次に非常にゆっくり(24K/h)で1095Kとt、この温度で焼鈍する。除冷及び1095Kにおける焼鈍中に準結晶粒の成長が生じるものと推定された。(3).1095Kから水焼入れなどの急冷処理を行なうこと。これは、上記の構造変態を妨げる為に不可欠の処理である。以上の方法で作製された単準結晶は最大約3mmの大きさをもち.インゴットの一部に目視できる状態で存在している。又、単準結晶の構造は、いわゆるFタイプであり、高い構造完全性を保持していることが.X線回折及び電子顕微鏡実験によって確認された。この結果は、1990年秋の日本物理学会(予稿集,3ー19p,3ー208p),日中準結晶セミナ-(1990年11月710日,北京)日本電子顕微鏡学会研究部会(1990年12月1214日埼玉)などにおいて発表した。又、単準結晶試料を用いたX線回折(散漫散乱)実験及び磁気測定の結果も得られつつあり,1991年春の日本物理学会分料会において発表の予定である。
酵素のコンホメーションを認識する分子:阻害剤開発への新しいアプローチ

癌をはじめとする難治疾患の多くは細胞情報伝達にかかわる酵素、特に蛋白質のリン酸化や脱リン酸化を触媒するプロテインキナーゼやホスファターゼの機能の異常に起因している。従ってそれぞれの酵素の特異的阻害剤はその疾病の原因究明の為のプローブとして有用であるばかりでなく、画期的治療薬となりうる可能性をもつ。阻害剤の探索研究は活発に行われているが、これまでに見いだされた化合物のほとんどは活性中心に結合するタイプであり、類縁酵素間の選択性が常に問題となった。そこで申請者らは、それぞれの酵素に固有の活性調節のしくみに着目した全く新しい阻害剤創製のための方法論の開発を目指して研究を行っている。本研究では、具体的なターゲットとして、プロテインキナーゼC(PKC)を取り上げ、その阻害剤の開発をめざしている。昨年度までに、PKCの調節領域に結合する新しい分子であるイソベンゾフラノン誘導体の光学活性体を効率良く合成する方法を確立することができた。本年度は、イソベンゾフラノンを基本骨格とするさまざまな誘導体を合成し、PKCαに対する結合能、ならびに活性化/阻害能の評価を行った。その結果、ホルボールエステルに迫る非常に強いPKCα結合能をもつ化合物の開発に成功した。また、同じイソベンゾフラノンを基本骨格とする化合物で、強い活性化能を示す化合物と、阻害能を示す化合物を見出す事ができた。また、合成した誘導体の中から、癌細胞増殖抑制作用を示す化合物も見出す事ができた。本年度は、PKCの調節領域に結合する新しい分子であるベンゾラクトン誘導体の光学活性体を効率良く合成する方法を確立することができた。また、これら誘導体が目的とするPKC結合能を有することも確認した。さらに、コンビナトリアルアプローチにより、最適の誘導体を合成するための新しい方法論として、固相担持N-ヒドロキシスクシンイミドを用いた効率のよいカーバメートライブラリー構築法の開発にも成功した。
抗原によるT細胞活性化にともなう遺伝子発現の誘導制御機構

1、T細胞活性化にともなうGM-CSF遺伝子の活性化に必要な領域として転写開始点より-41塩基(bp)から-49bpの領域が必要であることが示され、CLEOと命名した。2、Jurkat細胞核抽出液を用いたIn Vitro転写系においてもCLEOが転写活性に必要であることが示された。ゲルシフトアッセイにより、-42bpから-49bpの領域に結合する蛋白質(NF-CLEOa)と-46bpから-53bpの領域に結合する蛋白質(NF-CLEOb)を同定した。これらの蛋白質の完全精製には至っていない。T細胞の活性化に伴い、NF-CLEObは増大するが、NF-CLEOaの発現量は変化しない。3、T細胞で誘導される他のリンフォカインであるIL-4とIL-5や、サイトカインであるG-CSFのプロモーター領域にもCLEOと相同性を持つ配列が見いだされた。さらに転写因子Ets1およびEts2の結合配列として見いだされた、ポリオーマウイルス、MSV、T細胞受容体α鎖のエンハンサー内の配列とも相同性を持つ。これらの配列の中で、ゲルシフトアッセイにより、IL-4、IL-5およびポリオーマの配列には、NF-CLEOa及びNF-CLEObが結合することが示され、NF-CLEOa及びbがT細胞活性化の際のリンフォカインの発現誘導に共通に働く転写因子であることが示唆された。Ets familyの蛋白質の共通部分を認識する抗体はCLEOa及びCLEObのDNAに対する結合を阻害することからEts familyの蛋白質であると考えられる。ヒトEts1およびEts2をCMVプロモーターにつないだプラスミドとGM-CSFプロモーターにCATをつないだプラスミドをJurkatなどのT細胞に導入したが、残念ながらどちらの転写因子もプロモーターへの影響は見られなかった。4.T細胞ハイブリドーマ2B4にEts1遺伝子を導入しstable transformantを樹立したが、活性化に伴うリンフォカインの産生には変化が見られなかった。今後Ets familyの他の転写因子を用いて、同様の実験をする必要がある。またNF-CLEOa及びbの精製とcDNAクローニングをおこなう。
ナノポーラス複合機能材料を用いた電気化学エネルギーデバイスに関する研究

1)陽極酸化アルミ(AAO)を鋳型として用いて、メソポーラス構造を持つ1次元(1D)配列したカーボンナノワイアを作製し、その高い被表面積を利用して、スーパーキャパシタへ展開した、良好な電気化学キャパシタ性能が確認されている。本研究成果を纏めて、合成について、イギリス化学会誌Journal of Materials Chemlstry,Vol.113,(2009),1093-1097に掲載されている。また、電気化学キャパシタ性能について、アメリカ化学会誌Journal of Physical Chemistry C,Vol.113,(2009),1093-1097,に掲載されている。2)産総研エネルギー界面グループのほかのメンバーと一緒に、ナノ構造を有するリチウムイオン電池の電極材料を開発した、その中に、正極材料として、カーボン層に被覆されているLiFePO_4の成果について、Angewandte Chemie International Edition,Vol.47,(2008),7461-7465に掲載されている。VO_2の成果について、Journal of Materials Chemistryに採用されている。ポリマーをソフトテンプレートとして、陽極酸化アルミをハードテンプレートとして、用いて、3次元的に規則正しい構造を有するナノ複合構造材料を合成し、溶媒撮出方法で、テンプレートを除去し、ポーラスカーボンを合成している。不活性ガス雰囲気で、熱処理して、炭化させてから、X線回折、ガス吸着等温曲線、走査電子顕微鏡、透過電子顕微鏡を利用して、基礎物性を評価したうえで、リチウムイオン電池の負極材料、或いはスーパーキャパシタ用電極材料として、電気化学容量と充・放電レートの関係を調べている。
耐熱性古細菌由来のシャペロニン蛋白質の性質決定

本研究では耐熱性を持つ細菌内における蛋白質の構造形成反応に関する知見を得るため,超好熱性古細菌Pyrococcus furiosus由来のシャペロニン蛋白質の均一精製及びその性質の解明を試みた。なお,本蛋白質の遺伝子はすでに得られており,今回の研究では大腸菌内でその遺伝子を発現させたものからシャペロニンを均一に精製し,その基本的な性質決定を行った。Pyrococcus furiosus由来のシャペロニン蛋白質は大腸菌内で可溶蛋白質として発現され,90°Cの熱処理,硫安分画,及び数種類のカラムクロマトグラフィーにより均一に精製された。電気泳動分析によりPyrococcus furiosus由来のシャペロニンはサブユニット分子量約5万6千のポリペプチド鎖からなり,またゲル濾過カラムクロマトグラフィー分析から室温では本蛋白質は6から8量体のオリゴマーを形成していることが明らかになった。不思議なことに,本蛋白質は精製途中にN末端部分がプロテアーゼの作用を受けやすいことがアミノ酸配列分析から明らかになり,好熱性細菌由来の蛋白質にしては意外にも不安定な一面が明らかになった。更に興味深いことに今回精製されたシャペロニンは,シャペロニンの基礎的な性質の一つであるATPアーゼ活性は観測されなかった。今後の実験の方針として,実際の蛋白質の構造形成反応における効果の有無を確かめること,更にシャペロニンとしての効果を発現する際に今回精製されたシャペロニン蛋白質が他の補助因子を必要とするかどうかを明らかにしていく予定である。
情報技術の博物館展示への応用

平成14年度行った主な研究は以下の3点である。1)海外の博物館における事例調査。ア)北欧における例。コペンハーゲン、オスロ、ストックホルムの主要な博物館・美術館など25カ所を調査した。来館者に対する情報提供の電子化はそれほど進んでいない。唯一コペンハーゲンの国立博物館の民族資料室において、部屋全体の棚配置から、各陳列棚、その中の資料へと徐々にタッチパネルを使って接近していき、その資料の写真と情報を得るシステムがよくできていた。またストックホルムの動物園で子供達に動物の場所などをタッチパネルで見せるシステムは簡単ではあるが、面白い試みである。イ)東南アジアにおける例。台湾、タイ、シンガポールにおける博物館・科学技術館など15カ所の調査を行った。科学技術館などでは情報機器を使った仕掛けは多数あるが、それは展示をよりよく見せるための工夫というよりはゲーム感覚で楽しませるための仕掛けである。2)国内における博物館等の事例調査。臨海都心の博物館ではシアトルの実験音楽館を進めたな仕掛けがあった。こちらでは市販のPDA端末を用いて文字音声のみならず動画も可能になっている。また自分が見聞きした履歴を後日インターネットで再確認ができる。3)情報技術の展示への応用に対する総合的考察。ビデオによる解説、音声によるガイド、に狙ったものが全面に出て、内容そのものをしっかりとマルチメディアデータベース化し、モノと情報によって展示内容をよりよく理解させようとする機関は皆無であった。今後はまずコンテンツを充実させ、それを反映するにふさわしい情報技術を導入することによって、新しい技術開発にもつながる問題が生じてくる。ア)北欧における例。平成13年度に行なった主な研究は以下の2点である。1)ヨーロッパにおける博物館、美術館等の情報化の実態調査。園田はフランスとイギリスの博物館・美術館における所蔵資料検索システムについて調査をした。一つはフランスにおけるヨーロッパ規模でのプロジェクト、NARCISSE, CRlSTAL, EROS等についての調査である。それぞれ数万点の絵画や考古品の画像をデジタル化しコンピュータに入力している。特に興味があるのはCRlSTELにおける超高精細画像データベースの作成で、12000×20000ピクセルの入力装置を使って画像入力を行っている。又立体作品の入力には2000×3000ピクセルの入力装置を自動回転させることによって行う立体画像デジタル化の手法について詳細に調査を行った。またイギリスの大英博物館の所蔵資料検索システムCOMPASSをCD-ROM化した展示案内の資料を手に入れ、それによって低学年から高齢者に至る様々な階層の観覧者に対する情報提供の仕組みを調査した。2)米国・カナダにおける博物館、美術館等の情報化の実態調査。杉田は米国西海岸の都市(ロスアンジェルス、ポートランド、シアトル)の幾つかの博物館、美術館を訪れ情報技術の応用について調査した。美術館においては音声ガイド以上の新しい工夫は見られなかったが、シアトルの音楽関係の実験博物館において携帯端末を用いた展示案内が興味を引いた。これは展示面のある一角に携帯端末を向けるとそこから発している展示番号を受信してそれに関する一般的な説明が音声によってイヤホンから聞こえる。さらにその展示面にある個々の展示物のリストが表示されそれをキーで選ぶとその解説が聞こえてくる。このような携帯端末の応用は参考になる。ア)北欧における例。

科学技術館などでは情報機器を使った仕掛けは多数あるが、それは展示をよりよく見せるための工夫というよりはゲーム感覚で楽しませるための仕掛けである。2)国内における博物館等の事例調査。臨海都心の博物館ではシアトルの実験音楽館を進めたな仕掛けがあった。こちらでは市販のPDA端末を用いて文字音声のみならず動画も可能になっている。また自分が見聞きした履歴を後日インターネットで再確認ができる。3)情報技術の展示への応用に対する総合的考察。ビデオによる解説、音声によるガイド、に狙ったものが全面に出て、内容そのものをしっかりとマルチメディアデータベース化し、モノと情報によって展示内容をよりよく理解させようとする機関は皆無であった。今後はまずコンテンツを充実させ、それを反映するにふさわしい情報技術を導入することによって、新しい技術開発にもつながる問題が生じてくる。
「配偶子の分化制御」に関する研究

雄性配偶子の分化・発育についての人為的制御を目的として以下の研究成果を得た。(1)減数分裂の機構解析:減数分裂細胞における遺伝子発現には分裂特異的なプロモ-タ-の存在が必要であり、例えば分裂酵母の減数分裂誘導に関与するmei2プロモ-タ-が高等植物の系でも利用可能であることがわかった。また、ユリの減数分裂前期に転写が特異的に誘導される遺伝子クロ-ンを多数単離したが、その中には遺伝子組換えや組換え修復、あるいは花粉形成などに関与すると考えられる遺伝子も含まれていた。これらの遺伝子を活用した組換えの人為的制御が次の課題となろう。一方、細胞膜系の脂質組成やATPase活性についての生化学的解析を通じて、雄性配偶子の形成に伴い、リン脂質が不飽和化することも見出した。これは配偶子分化過程における遺伝子発現の調節機構を研究する上で重要な知見である。(2)雄性不稔の機構解析:コムギとテンサイの細胞質雄性不稔系統において、ミトコンドリア遺伝子の突然変異を見出し、特にテンサイのatpA、coxII両遺伝子は転写調節領域に広範な構造変異を起こしており、転写パタ-ンも正常型とは著しく異なっていた。また、雄性不稔性を担うミトコンドリアゲノムの物理・遺伝子地図がイネとテンサイでそれぞれ完成し、正常型と雄性不稔型ゲノム間の多型域の同定やゲノム再編成の機構解明へと研究が進展した。配偶子を利用した形質転換系を確立するために、パ-ティクルガンを用いて花粉細胞や葉緑体への遺伝子導入を試みた。さらにイネのプロトプラストの非対称融合法により、ミトコンドリアゲノムに再編成が起こり、細胞質雄性不稔性を安定的に伝達させることにも成功した。その外、イネでは同一の稔性回復核遺伝子がある細胞質には配偶体的に、別種の細胞質には胞子体的に働く作用機構が見出され、育種的に重要な知見となった。
多色光応答光電変換デバイス創出へ向けた半導体/金属電極の高機能化

多色光応答光電変換デバイス創出を志向し、導電性高分子の電解重合反応を用いたプラズモニック光電変換電極における反応メカニズムの解明を目的として研究を行った。酸化チタン表面にAuナノ構造体を修飾すると、Au近傍に誘起される局在プラズモン誘起により、本来酸化チタンが光応答を示さない波長領域で光電変換能が付与される。この系では、光照射に伴うプラズモン誘起により電子/正孔対が形成し、生成した電子が酸化チタンの伝導帯へと注入され、Au表面では正孔による酸化反応が進行することで光応答が発現すると考えられている。しかしながら、未だ電荷移動反応の詳細は明らかとなっておらず、半導体/金属電極の高機能化に向けては更なるブレイクスルーが求められている。本研究では、プラズモン誘起酸化反応により進行する導電性高分子であるポリピロールの酸化重合反応過程を詳細に観察することで、多色光応答光電変換デバイス創出へ向けた基礎的知見を得ることを目指した。トップダウン手法を用いて作製した種々のAuナノ構造体への近赤外光照射により重合析出したポリピロールを、走査型電子顕微鏡や原子間力顕微鏡等の種々の分析手法を用いて評価した。その結果、Au構造近傍に誘起されるプラズモン増強電場におけるポリピロールの選択的析出を確認し、Au構造と半導体界面付近の空間的活性サイトの特定に成功した。それと同時に、半導体/金属電極の電気化学電極電位を変調することで、電極表面上で誘起されるプラズモン誘起酸化反応において、半導体と金属界面に正孔が捕捉されることである種の反応活性準位が形成していることを実験的に明らかにした。本成果により得られた事実は、多色光子応答に基づく光エネルギー変換を可能とする系を構築するための基礎的知見であると言える。27年度が最終年度であるため、記入しない。
鉛直力と水平力を受けせん断破壊するRC及びSRC構造物の崩壊判定に関する研究

兵庫県南部地震では、RC, SRC柱にせん断破壊が生じた後、軸力により崩壊する被害が多く発生した。本研究では、これらの被害を防ぎ、耐震補強を行うことを目的として、1)従来提案してきた軸力とせん断を受けるRC柱、SRC柱の崩壊判定法を用いて、兵庫県南部地震で被害を受けた建物の柱の崩壊判定を行い、被害状況との比較を行った。2)軸力を受けるRC柱、SRC柱付RC耐震壁の崩壊判定法の提案を行い、実験結果との比較を行った。3)柱、壁のせん断破壊を取り入れたRC、SRC構造物の弾塑性解析法の提案を行った。4)RC、SRC構造物の耐震診断法の提案を行い、現行の日本建築防災協会の方法との比較を行った。これらの解析の結果、1)兵庫県南部地震によりせん断破壊を生じたRC, SRC構造物の被害状況と崩壊判定結果は概ね一致した。ただし判定の際、壁や編心の影響を考慮すると、さらに精度は向上する。2)RC柱の実験結果と崩壊判定結果は概ね一致した。3)せん断破壊を生じる耐震壁付きRC柱の崩壊判定結果は、兵庫県南部地震の被害状況や実験結果と比較して、妥当である。4)せん断破壊するRC柱の崩壊に対する安全率を2としたとき、RC建物の診断結果は現行の診断法と同等の結果が得られた。SRC建物については安全率が4のとき、同等の結果が得られた。5)せん断破壊するRC、SRCの柱、耐震壁を便宜的に曲げモデルに置換して解析した結果、実験結果と概ね一致した。1.提案した崩壊判定法を用いて、兵庫県南部地震により被害を受けたSRC造建物10ケース、RC造建物14ケースの柱の崩壊判定を行った。その結果、SRC柱の被災度、被害状況が柱の崩壊解析による判定とほぼ一致することを確認した。2.RC柱のせん断崩壊曲線に基づいた比較的簡便なRC構造物の耐震診断法を提案した。提案した耐震診断法による結果と現行の診断法の結果の比較を行うとともに、提案した診断法では鉛直力の再配分を考慮し、より正確に変形能力の評価を行うことができることが分かった。3.鉛直力とせん断力を受けせん断破壊を生じるRC柱の実験結果に対し、本崩壊判定法を適用し、判定法の妥当性の検討をした。その結果本解析法により概ね崩壊点が予測できることが分かった。4.柱のせん断破壊を取り入れたRC構造物の解析法の提案を行い、実験結果との比較・考察を行って、解析法の妥当性を検討した。提案した解析法は、せん断破壊するRC柱の崩壊するまでの挙動を良好に追跡することが分かった。また、せん断破壊後に水平耐力が0となり崩壊するRC柱を含むRC構造物の解析を行い、構造物全体の変形能力とせん断破壊するRC柱の変形能力との関係について調べた。1.せん断破壊を生じる耐震壁付きSRC及びRC骨組の比較的簡便な有限要素解析法を提案して解析を行った。本解析は主に耐震診断に用いることを目的としており、せん断破壊を取り入れた比較的簡便な解析である。既往の様々な実験結果との比較・考察をおこなった結果、解析は実験を概ね良好に追跡することを確認した。またせん断破壊を生じる柱を有するRC骨組の解析を行い、せん断破壊を生じる柱と骨組の変形能力の関係について検討した。2.崩壊メカニズムを仮定したRC耐震壁・柱の崩壊解析を取り入れたRC構造物の崩壊判定法を提案した。昨年は1本の柱の崩壊判定法を示したが、今年はこれを発展させて、層全体の崩壊判定法を開発した。この崩壊判定法を用いてまず既往の周辺骨組を有するRC耐震壁の実験に対する解析を行い、比較的良好に崩壊点を予測できることを確認した。またさらに、兵庫県南部地震により層崩壊した市庁舎のRC構造に対する崩壊判定を行った結果、判定結果は被害状況と概ね一致した。

3.SRC構造物やRC構造物のせん断崩壊メカニズムを仮定した崩壊解析により構造物の崩壊点求め、これに対する安全率を設定して耐震診断における靭性指標を得る方法を提案した。この方法を取り入れた耐震診断法を示して、耐震壁付きSRC骨組及びRC骨組の診断を行い、現行の診断法による診断結果との比較をした。崩壊点に対する安全率を3種類設定して現行の診断結果との比較・検討を行った。SRC構造では安全率を8、RC柱からなる構造では安全率を4、RC耐震壁を有する構造では2としたとき、現行の診断結果と概ね一致した。1.柱のせん断破壊を取り入れた鉄筋コンクリート(RC)構造物の解析法の提案を行うとともに、構造物全体の変形能力とRC柱の変形能力の関係について調べた。解析では、せん断破壊現象をマクロにとらえた曲げモデルを用いている。曲げモデルの鉄筋の応力度-ひずみ度関係は、せん断破壊後のPΔ効果による耐力低下を考慮して劣化形と仮定しているが、劣化勾配の算定方法については示していなかった。そこで、本研究では解析で用いる鉄筋の劣化勾配の算定法を示し、実験と解析の比較を行って、算定法の妥当性を検討した。また、この解析法を用いてせん断破壊を生じるRC柱を含む骨組の変形能力について調べた。解析により得られた結論は以下の通りである。1)せん断破壊モデルを鉄筋の応力劣化を考慮した曲げモデルに置き換えることにより、せん断破壊するRC柱の崩壊に至るまでの挙動を有限要素解析により良好に追跡できる。2)せん断柱が早期に崩壊する骨組の変形能力に、せん断柱の負の抵抗力を考慮する必要がある。2.鉄筋コンクリート(RC)柱がせん断破壊時に崩壊するときの軸力と水平変位の関係を用いて靭性指標を定め、RC構造物の耐震診断を行なう方法を提案した。靭性指標は水平耐力が0となる時の崩壊点から安全率を考慮して定められている。現行の耐震診断では、せん断破壊するRC柱の種類ごとに靭性指標が定められているが、本診断法では統一的に靭性指標を決定することができる。また、診断で用いる変形角については実験結果と比較して、安全性を確認している。本報では、耐震壁のせん断による崩壊を考慮した耐震診断法を提案し、診断例の計算を行い、現行の耐震診断との比較、検討を行った。せん断破壊により崩壊する時の耐震壁の層間変形角を柱の場合と同様に求め、耐震壁を有するRC構造物の耐震診断を行った。RC柱からなる構造物の安全率を4とした時に、現行の診断法と対応していたのに対し、耐震壁を有する構造物では安全率を2とした時、現行の診断結果に近い値を示した。
再生心筋組織構築のための蛍光タンパク質を用いた評価系の確立

我々は三次元的に細胞を培養できるapatite-fiber scaffold (AFS)を用いて心筋細胞を培養している。本研究では三次元環境下での心筋の機能を評価するため、カルシウム濃度に依存して蛍光強度が変化するGCaMP5Gベクターを心筋特異的に発現させることを試みた。使用したコンストラクトはdish上で培養した心筋様細胞P19.CL6の拍動と同期して蛍光強度が変化した。AFS内で培養した細胞について、遺伝子発現等で心筋への分化が促進されることが確認できたが、蛍光強度の変化は見られていない。三次元環境では多様な細胞分化が同時並行で起こることが予想され、今後詳細な解析が必要である。ES細胞の樹立やiPS細胞の開発に伴い再生医療への応用が広がりつつある。三次元化した組織の分化状態や機能性の評価は、従来とは異なる手法で迅速化することが求められている。本申請では、心筋組織再生の基盤技術として、繊維状のアパタイトからなるアパタイトファイバースキャフォルド(AFS)をモデル材料として使用し、また蛍光タンパク質を用いて心筋の拍動性を可視化できる細胞株を作製し、実際に三次元培養環境で評価することを目的としている。本年度は、ラットの心筋に特異的なプロモーター下流にカルシウ濃度依存的に蛍光強度が変化するpG-CaMPを購入し、心筋特異的プロモーターを使用予定の培養細胞に合わせてマウスのゲノムから短離後、目的の位置にサブクローニングした。上記コンストラクトが正常に機能するかを確認するため、一過的にP19.CL6細胞に導入し、細胞分化に伴う蛍光強度の変化を調べた。その結果、期待通りに細胞の分化に伴って蛍光強度が増大し、明視野で心筋の拍動が確認されるのと同時に蛍光が明滅する様子が確認できた。現在はAFS内で培養することでどのように分化状態を観察できるのかを調べるとともに、上記コンストラクトを安定導入した細胞株の作製を進めている。さらに、ギャップジャンクションを構成するコネキシン(Cx43)についても、Cx43特異的抗体を購入し、細胞の分化状態でどのように存在量が変化するか、タンパク質レベルで評価した。またcDNAレベルで発現量が変化するのかもPCRにより解析した。その結果、細胞の分化に伴う明確な量的変化は見られなかったが、翻訳後修飾が関与する可能性などが示唆される結果が得られてきた。今後はリン酸化を中心に解析を進めていく予定である。本申請では、簡単に心筋の拍動を可視化できるモデル臓器を開発することを目的としている。昨年度までに、ラットの心筋特異的なトロポニンTプロモーター下流にカルシウム濃度依存的に蛍光強度が変化するpGCaMPを導入したベクターを作製し、さらに心筋モデル細胞として知られるP19.CL6細胞にこのベクターを一過性導入した。その結果、細胞の分化に伴って蛍光強度が増大し、明視野で心筋の拍動が確認されるのと同時に蛍光が明滅する様子が確認できた。本年度は、上記コンストラクトを安定導入した細胞株の単離を目的として、細胞へのコンストラクトの導入と限界希釈法によりスクリーニングを実施した。しかし、細胞分化を指標としているため、早期の継代が難しく、単クローンの単離には至っていない。今後は、複数のベクターの同時導入またはタンデムでマーカーとなる遺伝子を乗せたベクターを作出し、効果的にスクリーニングを進める計画である。一方、ギャップジャンクションを構成するコネキシン(Cx43)については、関連因子を含め、P19.CL6がin vitroで分化する際の発現プロフィールをRT-PCRとReal-time PCRの二つの手法から明らかにした。さらに、心筋組織再生の基盤技術として有用と考えている、繊維状のアパタイトからなるアパタイトファイバースキャフォルド(AFS)を用いて細胞を培養し、Cx43の発現に関しても解析した。その結果、AFS培養ではdish培養とは異なる発現様式を示すことが明らかになっている。本年度はさらに長期培養のための準備として、AFS内にP19.CL6を播種し、バイオリアクター内での細胞の増殖性について評価した。播種数や培養条件が安定化した後、pGCaMPの導入された細胞についても評価を行う予定である。当初申請では目的を8項目掲げ実験をスタートしている。そのうち、4項目までが昨年度までにほぼ終了している。今年度は5モデル細胞への安定的遺伝子導入、6培養皿上でのモデル細胞の蛍光測定、7生体材料上でのモデル細胞の蛍光測定、8Cx43の発現解析が残されている。5については新しい手法を考案しなくては目的が達成しないと考えている。6については当初の目的は達成している。7に関しては、本格稼働を前に準備を開始した。8については順調に進行中である。上記のとおり、一項目を除き、本実験は当初の予定通りに進行してる。昨年度、マウストロポニンプロモーター(Tnnt2)とその下流にカルシウム濃度依存的に蛍光強度が変化するpGCaMPを導入したベクター(Tnnt2::GCaMP)を用いて、心筋様細胞として知られるP19.CL6への一過性導入実験を実施し、さらにクローニングを開始した。昨年度の問題点としてTnnt2の発現時期が遅いためスクリーニングに時間がかかることを挙げた。本年度は常時発現する35Sプロモーターの下流に蛍光タンパク質を繋いだベクターと二つ並べたベクターを構築した。タンデムベクターによるスクリーニングは現在も続けている。