hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
初期発生における心筋および心筋組織幹細胞の分化動態と機構の解明

現在までに予定心臓領域、神経板、血島領域に発現している遺伝子を同定した。(2)クローン#94の局在と機能阻害実験:クローン#94はニワトリ胚遺伝子発現データベースに登録されている未知遺伝子であり、ISHで心筋に強く発現していることが判明した。文献検索でこの遺伝子産物に対する抗体が作製されていることが判明したので、分与された抗体を用いて免疫染色を行ったところ、後方胚盤葉、前方原条、予定心臓領域に発現していることが判明した。現在、クローン#94に対する各種siRNAを作成し、胞胚の無血清培養系と全胚培養系を用いて機能阻害実験を開始した。(3)胞胚初期に発現する既知遺伝子の心筋分化に対する作用:胚盤葉上層に発現しているNodalと胚盤葉下層に発現しているFGFが協調的に作用することによって予定心臓中胚葉が発生することが判明した。この際、FGFはNodalの下流でシグナル伝達にかかわる転写因子smad2のリン酸化を促進し、またBMPは心筋分化を抑制するが、FGFはこの抑制効果を解除することが分かった。【今後の展望】胞胚初期に特異的に発現している遺伝子の発現プロファイルの作成を継続して行い予定心臓領域に発現している遺伝子を明らかにする。またクローン#94については詳細な発現局在と機能阻害実験による機能解析を行う。【研究の目的】胞胚期の予定心臓領域は胚盤葉上層の外側後方に存在し、胚盤葉下層との組織間相互作用によって予定心臓中胚葉に分化する。本研究の目的はディファレンシシャルディスプレイ法によって初期胚盤葉に特異的に発現し、心臓中胚葉形成に関わる遺伝子を明らかにし、既知遺伝子とともに心臓中胚葉形成との関係を検討し、心臓中胚葉分化機構を解明することである。【研究実績】昨年度に引き続きクローン94の機能解析を進めた。siRNAを用いた機能阻害実験でクローン94は心臓中胚葉用形成に関わらないことが判明した。また今年度はクローン78についても検討を行った。インシリコでの検索の結果、本遺伝子はendothelial monocyte activating peptideであることが判明した。インサイチュハイブリダイゼーションの結果、本遺伝子は胚盤葉下層に強く発現しており,無血清培養系を用いた機能獲得実験で本遺伝子が予定心臓中胚葉細胞の移動に関係していることが示唆された。既知遺伝子としてFGF8に注目し、心臓中胚葉形成との関係を検討した。FGF8は後方胚盤葉下層に発現しており、種々の機能解析実験の結果、FGF8はNodalと協調的に作用し心臓中胚葉を誘導することが示された。さらにFGF8はBMPによる心臓中胚葉形成抑制効果を抑制した。この際FGF8はChordinの誘導とSmad2のリン酸化を増強していることが明らかになった。
酢酸菌呼吸鎖の新規末端オキシダーゼ(CIO)の解析とそのエネルギー代謝工学的応用

酢酸菌は糖やアルコールを糖酸・有機酸に急速に酸化変換して培地中に高濃度蓄積する。「酸化発酵」と呼ばれるこの反応は細胞膜表層に結合した酸化還元酵素とそれにリンクした呼吸鎖末端オキシダーゼによって行われる特徴的な酸化反応系である。この「酸化発酵」呼吸鎖の末端には,チトクロムbo_3オキシダーゼとシアン非感受性オキシダーゼ(CIO)の2つの末端オキシダーゼが存在し,それらが複数の初発脱水素酵素と複雑に関連して機能している。本研究では,CIOの精製とその機能解析,およびケトグルコン酸発酵に関与するグリセロール脱水素酵素(GLDH)とグルコン酸脱水素酵素(GADH)と両末端オキシダーゼとの相互作用を解析することで,「酸化発酵」の機能解析も検討し、以下にまとめるような成果を得た。1) CIO過剰発現株とCIO欠損株の細胞膜のスペクトル分析,EPR分析,さらにヘム分子のHPLC-マス分析の比較解析を行うことによって,CIO分子には3種のヘム分子(b558,b595,d)が存在することが明らかになった。2) CIO過剰発現株の細胞膜からシアン耐性ユビキノール酸化活性をドデシルマルトシド(DM)で可溶化し,DEAE-ToyopearlおよびHydroxyapatiteを用いて、bo_3オキシダーゼとCIOを分離精製した。この精製CIO標品はSDS-PAGEで,53kdのブロードなバンドと33kdのバンドのメインバンドを示し,ヘムd由来の627nm付近のピークを示した。3)ケトグルコン酸発酵において,CIO欠損株では5ケトグルコン酸の生産性が向上し,CIO過剰発現株で2-ケトグルコン酸の生産が増加することが示唆され,2つの初発脱水素酵素,GLDHとGADH,が関与するグルコン酸酸化反応のシアン(アジド)耐性能などの比較から,それぞれbo_3オキシダーゼとCIOにより強くリンクして機能していることが示唆された。酢酸菌「酸化発酵」呼吸鎖の末端には、ユビキノールbo3オキシダーゼと最近その遺伝子が特定されたシアン非感受性オキシダーゼ(CIO)の2つの末端オキシダーゼが存在し、それらが複数の初発脱水素酵素と相互に複雑に関連して機能している。本研究では,そのCIOの構造と機能を明らかにするとともに、CIOを操作することで「酸化発酵」の生産能および産物を制御することを目指している。1)CIOの細胞膜上での機能解析:CIO過剰発現株とCIO欠損株の細胞膜を調製し、そのスペクトル分析およびEPR分析を行った。また,それらの細胞膜からヘム分子を抽出し、そのHPLC-マス分析を行った。これらのデータの比較から、CIO分子には3種のヘム分子(b558,b595,d)が存在することが明らかになった(J.Biochem.In press)。2)CIOの可溶化精製:CIO過剰発現株の細胞膜からシアン耐性ユビキノール酸化活性をドデシルマルトシド(DM)で可溶化し、DEAE-Toyopear1クロマトグラフィーを行うことで、bo3オキシダーゼからCIOを分離することが可能となった。しかし、そのCIO活性はそのクロマトグラム後に短時間で完全に消失したため、現在、その安定化を種々の界面活性剤やクロマトグラクで試みている。3)ケトグルコン酸発酵におけるCIOの役割:CI0欠損株とCIO過剰発現株を用いたケトグルコン酸発酵を試みた結果、pHを制御することで、CIO欠損株で5-ケトグルコン酸(5KGA)の生産性が向上しCIO過剰発現株で2-ケトグルコン酸の生産が増加することが明らかとなった。また、これらの菌株におけるグルコン酸酸化反応のシアン感受性およびエネルギー生成能(H+/O比)の解析から、CIOが5KGA生成に関与するグリセロール脱水素酵素とリンクしていることが示唆されている。

3)ケトグルコン酸発酵において,CIO欠損株では5ケトグルコン酸の生産性が向上し,CIO過剰発現株で2-ケトグルコン酸の生産が増加することが示唆され,2つの初発脱水素酵素,GLDHとGADH,が関与するグルコン酸酸化反応のシアン(アジド)耐性能などの比較から,それぞれbo_3オキシダーゼとCIOにより強くリンクして機能していることが示唆された。
受粉におけるRNaseを介した自他識別機構のライブセル解析

ペチュニアの花粉管を観察する上での最大の障害は花粉管が伸長するめしべの組織が非常に厚く、自家蛍光が強いため観察が非常に困難であることである。花粉管は培地中でもある程度伸長するため、透明な培地の中での観察も有効であると考えられたが、培地には厚さがあるため花粉管が上下に伸長してしまい顕微鏡で観察する際に焦点がずれてしまうという問題があった。そこで東山ERATOナノ工学グループとの話し合いを行ったところ、マイクロチップを用いることでこの培地の厚さの問題を解決できると考えられた。マイクロチップは透明なシリコン樹脂(PDMS)を型に流し込むことで作製することができる。型は縦、横、高さをマイクロメートル単位で精密に設計できるため、高さを花粉管1本が通れる高さに設計することで花粉管の焦点を合わせたまま観察できるようになった。実際に花粉管がこのマイクロチップ内の通路を通過するかどうかを通路内にペチュニア用の培地で満たした状態で観察したところ、通路内を花粉管が伸長する様子が観察された。本研究の目的はS-RNase型の自家不和合性を制御する花粉側の因子であるSLFとめしべ側因子であるS-RNaseの局在を明らかにすることである。SLFとTagRFPが融合したペチュニア形質転換体に続いて本年度ではS-RNaseとGFPが融合した形質転換体を得た。これらの形質転換体のコンストラクトが正常に機能すれば同じタイプの花粉を拒絶するはずであり、自己のタイプを解毒できるSLFをもつ花粉を受粉すると花粉が伸長するはずである。まず自己のタイプの花粉を人工授粉した。その結果、果実部分が肥大せずに枯れることが確認された。これは受精が失敗した時に特有の形態である。今後例数を増やしこの現象が本当に起きているかを確認する。〈ペチュニアのin vitro受精系の確立に向けて〉S-RNaseを介した自家不和合性では、和合、不和合に関わらず花粉は正常に発芽することが知られている。自己花粉管の伸長拒絶が雌ずい内でどのように行われているのかを観察するためには、いつ、雌ずいのどの地点で花粉管伸長が止まるかを把握する必要がある。Petunia hybridaにおける授粉後の花粉管の伸長を経時的に調べるために、和合もしくは不和合授粉後、酢酸エタノールによって組織を固定し、アニリンブルーによって花粉管を可視化した。その結果、和合授粉後では12時間後に雌ずいの1/2まで伸長し、24時間で子房に到達した。一方で、不和合授粉後では、7時間前後では和合授粉と変わらない花粉管伸長が観察されたが、その後は明らかに花粉管伸長速度が低下し、雌ずいの1/2程度まで到達した時点で完全に伸長が停止した。この観察により不和合花粉の拒絶反応は12時間までには完了していると考えられた。次に雌ずい内のS-RNaseの局在を解析するためにS-RNaseの抗体を作製した。特定のSハプロタイプのS-RNaseを検出する目的で、S3L-RNaseの可変領域17残基のペプチドを抗原とした。作製された抗体を用いてウェスタン解析を行ったところ、S3Lハプロタイプをもつ雌ずいでのみバンドが検出された。S3L-RNaseを特異的に検出できる抗体が作製できたため、今後は免疫染色を行い雌ずい内での局在を明らかにしていく。またこの抗体を用いて、S3L-RNaseと相互作用する因子も明らかにしていきたい。花粉S遺伝子の候補であったSFBBが花粉S遺伝子であるかどうかを明らかにする目的で、SFBBを1クローン欠失した変異ハプロタイプ「S^<4sm>」の花粉側の認識機能を解析した。解析結果の(1)SFBBが非自己のS-RNaseに対して抑制的に作用する、(2)複数のSFBBが自己/非自己の認識に関与する、という性質は同じバラ科のサクラ亜科で提唱されているモデルよりもナス科のペチュニアで提唱されたモデルに適合した。これらの結果をまとめ、PlantJournal誌に投稿したところ、「掲載の可能性あり」との返信があった。レフェリーの要追加解析事項として、個々のSFBB遺伝子が連鎖しているか確認すること、SFBBが花粉で特異的に発現しているのか解析すること、S4mの欠失領域に自家不和合性に関わりそうな遺伝子がないかどうか確認すること、との指摘があった。連鎖解析に関してはまず、各SFBBを個別に増幅するプライマーを作製し、特異的なSFBBを検出できる系を確立した。その結果、SFBB6-S4以外のSFBBはS-RNaseと連鎖していることが明らかになった。前述の連鎖解析で確立したSFBB検出法を用いてニホンナシの各器官から抽出したcDNAを鋳型にRT-PCRを行ったところS4smハプロタイプでは欠失領域に含まれるSFBB1-S4遺伝子の発現はなく、その他のSFBBは葯で発現していることがわかった。最後にS4sm欠失領域にSFBB1-S4以外の自家不和合性に関連しそうな因子があるかどうか解析を行った。S4

sm欠失領域配列をFGENESH,Genemark,Genscanを用いてORFを検出したところ、自家不和合性に関連する既知の配列は存在しなかったため、S4smの誤認識の原因はSFBB1-S4の欠失によるものであると考えるのが妥当であると考えられた。これらの解析結果を追加し、再度投稿したところ、受理された。ペチュニアの花粉管を観察する上での最大の障害は花粉管が伸長するめしべの組織が非常に厚く、自家蛍光が強いため観察が非常に困難であることである。花粉管は培地中でもある程度伸長するため、透明な培地の中での観察も有効であると考えられたが、培地には厚さがあるため花粉管が上下に伸長してしまい顕微鏡で観察する際に焦点がずれてしまうという問題があった。そこで東山ERATOナノ工学グループとの話し合いを行ったところ、マイクロチップを用いることでこの培地の厚さの問題を解決できると考えられた。マイクロチップは透明なシリコン樹脂(PDMS)を型に流し込むことで作製することができる。型は縦、横、高さをマイクロメートル単位で精密に設計できるため、高さを花粉管1本が通れる高さに設計することで花粉管の焦点を合わせたまま観察できるようになった。実際に花粉管がこのマイクロチップ内の通路を通過するかどうかを通路内にペチュニア用の培地で満たした状態で観察したところ、通路内を花粉管が伸長する様子が観察された。本研究の目的はS-RNase型の自家不和合性を制御する花粉側の因子であるSLFとめしべ側因子であるS-RNaseの局在を明らかにすることである。SLFとTagRFPが融合したペチュニア形質転換体に続いて本年度ではS-RNaseとGFPが融合した形質転換体を得た。これらの形質転換体のコンストラクトが正常に機能すれば同じタイプの花粉を拒絶するはずであり、自己のタイプを解毒できるSLFをもつ花粉を受粉すると花粉が伸長するはずである。まず自己のタイプの花粉を人工授粉した。その結果、果実部分が肥大せずに枯れることが確認された。これは受精が失敗した時に特有の形態である。今後例数を増やしこの現象が本当に起きているかを確認する。前述ように論文をまとめ受理された。また、ライブセル解析のための花粉側因子に蛍光タンパクを付加した融合タンパクの作製に現在成功している。S-RNaseとの相互作用をBiFC法やpull down assayなどを用いて解析している花粉側因子の融合タンパクは作製することができたが、その因子とS-RNaseとの相互作用をBiFC法やpull down assayで検定しているが今の所相互作用をするという結果は得られていない。解析条件をさらに精査し、相互作用するかどうかを明らかにするとともに、yeast two hybrid法を用いる等、他の方法も用いて相互作用解析を進めて行く。
水環境における院内感染原因菌の薬剤耐性獲得・伝達ポテンシャルの評価

水環境におけるVREならびに薬剤耐性腸球菌の分布状況と拡散実態を把握し,環境中に存在するVREから耐性遺伝子の伝播の可能性を検討した。バンコマイシン耐性遺伝子の一つであるvanC2/C3を保有するVREが都市河川(八重川)流域の全調査地点から検出され,広範囲に拡散していることが確認された。想定されうる環境を模擬したin virto実験によって,vanA保有VREの耐性遺伝子の伝播ポテンシャルを評価した。その結果,河川底質と活性汚泥の条件においてvanA遺伝子の伝播が確認され,伝播率はそれぞれ10-7と10-8であった。コマイシン耐性腸球菌(vancomycin-resistant enterococci, VRE)は,現存するほぼ全ての抗菌薬に耐性を示すため,有効な抗生物質が存在せず,院内感染において最も注意すべき薬剤耐性菌の一つである。一方で,腸球菌は水環境に普遍的に存在している。したがって,薬剤耐性腸球菌は医療現場に限らず,人々の生活と密接に関わる水環境に存在している可能性がある.そこでH26年度は,河川上流から河口・沿岸域に至る調査地点を設定し,腸球菌の各抗生物質に対する薬剤感受性を評価し,薬剤耐性化について調査した。河川流域から単離した腸球菌222株は,エリスロマイシン,シプロフロキサシン,およびテトラサイクリンに対して耐性を示し,その割合はそれぞれ,55%(121株),36%(80株),14%(32株)であった。全ての調査地点から,薬剤耐性腸球菌が検出され,河川流域全体へ耐性菌の拡散していた。薬剤耐性腸球菌の割合は,上流から下流へ流下するに従って,減少する傾向を示した。バンコマイシンに中度耐性以上を示した菌株の割合はそれぞれ,75%(3株/4株),7.9%(8株/101株)であった.vanC2/C3を保有する腸球菌は,都市河川の上流から下流に至る流域全体に拡散しているものの,バンコマイシンに対して耐性を示す菌株の割合は低いことが明らかとなった。H27年度は,日本の地方都市の河川流域を対象として,VREと薬剤耐性腸球菌の拡散実態を調査した。都市河川におけるVREの存在割合を調査した結果,0.9%(2株/223株)であり,諸外国と比較して,低い割合で存在していた。スクリーニング培地を使用して検出されたVREは,全てがvanC1あるいは,vanC2/C3遺伝子を保有するVREであり,高度にバンコマイシンに耐性を示すvanAとvanBの遺伝子保有株は検出されなかった。スクリーニング培地から単離したvanC2/C3遺伝子を保有するVREについて,PGFE法によって遺伝子型を取得した。その結果,複数の遺伝子型が検出され,河川に分布するvanC2/C3型のVREの発生源は複数存在し,河川流域に点在していると示唆された。取得した遺伝子型の類似性を河川流域間で評価したところ,上流域で検出された遺伝子型が下流地点から検出された。一部のVREの汚染源は,上流域であることが推察された。河川流域から単離した333株の腸球菌のうち,主に耐性を示した抗菌薬は,エリスロマイシン,シプロフロキサシン,およびテトラサイクリンであった。河川水に分布する腸球菌の大部分は,感染症治療薬として汎用性の高い抗菌薬に耐性を獲得しいることがわかった。薬剤耐性腸球菌の存在割合は,上流域で高い傾向を示し,下流域に流下するに従い減少する傾向を示した。上流域では,生活排水流入の影響によって耐性菌の割合が増加し,流下するに伴い,その他起源の腸球菌が増加したため,耐性菌の割合は減少したと考えられた。薬剤耐性菌による感染リスクを低下させるためは,河川流域の社会基盤整備の徹底が重要であり,環境中における薬剤耐性菌に関する更なる情報の蓄積が必要である。平成27年度の計画は,水環境における薬剤耐性菌の実態調査において河川の上流から下流における継続的な細菌学的調査を実施し,河川からの腸球菌の単離・同定と菌株の薬剤耐性試験を行うこととなっている。計画通りに研究を遂行し,都市河川における薬剤耐性腸球菌の実態を明らかにした。都市河川には,特にバンコマイシン耐性菌の存在実態は,国内において新知見である。したがって,現在までの研究の進捗状況は順調に進展している。本研究では,水環境におけるバンコマイシン耐性腸球菌(VRE)と薬剤耐性腸球菌の存在実態を調査し,環境中を模擬したin vitro伝達実験から薬剤耐性遺伝子の伝播する可能性を評価した。以下に,平成26年度-28年度に得られた知見をまとめる。(1)流入下水と河川流域から単離した全1,200株の菌株から,VREは検出されなかった。しかしながら,バンコマイシンに中度耐性を示す腸球菌は,下水と河川水からそれぞれ,8.4%と2%検出された。(2)水環境に分布する腸球菌の大部分は,ヒトのみならず畜産や養魚場で使用される汎用性の高い抗菌薬であるエリスロマイシン,あるいはテトラサイクリンのいずれかに耐性を示した。(3)河川の上流から下流の全地点からvanC2/C3保有VREが検出され,河川中に分布する一部のVREは,上流が汚染源となり,下流域に至る広範囲で拡散していた。(4) in vitro伝達実験を実施した結果,腸球菌が高濃度で集積する条件では,薬剤耐性遺伝子の伝播が確認された。

水環境に存在するVREから腸球菌にvanA遺伝子が伝播する可能性は極めて低いと考えられる。本研究では,水環境中のVREならびに薬剤耐性腸球菌の拡散実態を明らかにし,環境中に存在するVREからの耐性遺伝子の伝播ポテンシャルを定量的に評価した。本研究で得られた知見・情報は,薬剤耐性菌の拡散防止対策の考案に繋がり,人々の生活環境における公衆衛生の向上に大きく貢献できる。水環境におけるVREならびに薬剤耐性腸球菌の分布状況と拡散実態を把握し,環境中に存在するVREから耐性遺伝子の伝播の可能性を検討した。バンコマイシン耐性遺伝子の一つであるvanC2/C3を保有するVREが都市河川(八重川)流域の全調査地点から検出され,広範囲に拡散していることが確認された。想定されうる環境を模擬したin virto実験によって,vanA保有VREの耐性遺伝子の伝播ポテンシャルを評価した。その結果,河川底質と活性汚泥の条件においてvanA遺伝子の伝播が確認され,伝播率はそれぞれ10-7と10-8であった。都市河川における薬剤耐性腸球菌の実態調査を実施し,薬剤耐性を有する腸球菌が拡散している事実を明らかにすることができた。また,重要なバンコマイシンの耐性遺伝子も検出することに成功した。これらの知見は,国内外で最新のものである。以上のように,計画通りに,研究が遂行している,実態調査にも基づいて,発現・集積エリアを模した人工的環境を設定し,in vitro実験による継体培養を継続しつつ,薬剤耐性菌の発現をチェックする。さらに,Filter Mating法を応用し,各環境条件におけるドナー株(バンコマイシン耐性株)からレシピエント株(非耐性株)への薬剤耐性遺伝子の伝搬率を比較し,伝搬ポテンシャルを評価する。環境保全学水環境に広範囲で分布する腸球菌をターゲットとし、中規模都市「宮崎」を経由する都市河川を対象として、薬剤耐性腸球菌の拡散と分布を明らかにする。また、下水処理プロセスの活性汚泥や河川底泥などの水環境を模擬して、VREの主要な耐性遺伝子(vanA)を対象としたin vitro伝達実験を行い、耐性遺伝子の伝播ポテンシャルの評価を行う。
中国イスラーム「道学」思想の発展とジャーミー思想の思想系譜学的研究

革命前の回族の社会には伝統的な経堂教育が行われていた。この経堂教育では13種類の教科書を学習することになっていた。これらの教科書の最終段階では倫理・道徳に関する著作が学ばれた。それはイスラームのシャリーアの学習に始まり、ついで倫理・道徳的完成を目的とするタリーカの修行をする。この修行を終えるとアッラーに近づく修行をする。この修行がハキーカの修行である。この修行を終えるとアッラーに限りなく近づいた人間とみなされる。アッラーに近づきアッラーとほぼ一体となった人間が「全人」と呼ばれる。経堂教育においてはこの「全人」の養成が教育目的となっていた。この内容は『馬徳新哲学研究序説』において明らかにした。本年度は研究プロジェクトの第一年度であるので主として資料の収集と現地調査および資料の解読と分析を中心に研究を進めた。資料の収集としてはアメリカのイスラーム思想研究に関する博士論文のコレクションを購入した。このコレクションの購入により「イスラーム存在-性論」系統の思想の思想的系譜を鳥瞰することができるようになった。現地調査は中国天津の天穆村の回民地区を訪問し、この地区の経堂教育においては現在もなお十三本経の学習を根幹とした伝統的経堂教育が行われていることを確認することができた。天穆村の経堂では文化大革命中には十三本経の学習は途絶えていたが文化大革命後これら伝統的な教科書の学習が復活したということである。天津市内の清真寺の教長の大多数は天穆村の経堂の出身者であり、この十三本経の学習により養成された人たちである。天津以外の地区では河北省の穆庄子と丁庄子という二つの回民村でこの十三本経の学習が継承されているということである。これは中国の他の回民地区の教長が現代アラブ・イスラーム世界のアラビア語学習の方法で養成されるのと際立った特徴を示している。済南の楊宝泉阿衡は十三本経のカリキュラムの最終段階におけるペルシャ語文献の学習のことを「道学」と呼んでいるが、この場合のカリキュラムの最終段階にジャーミーの『アッシアトッラマアート』が置かれている。この書物は愛の存在-性論が述べられているものである。このためジャーミーの愛の説の理解に資するのでジャーミーの愛の叙事詩『ユースフとゾレイハー』について研究し、論文二編を発表した。今年度は中国イスラーム経堂教育の「道学」の教育目標、その到達目標を明らかにするために、その学習および修行過程の模範が記してあると考えられる馬復初の『漢訳道行窮竟』を詳細に分析し、その原本であるアジーズ・ナサフィーのMaqsad-eAqsaとの対比研究を中心に研究を進めた。『漢訳道行窮竟』は二つの巻から成り立っている書物である。第一の巻がアジーズ・ナサフィーのMaqsad-e Aqsaの翻訳になっている。馬復初はこの翻訳のなかで儒教的な言葉をちりばめながら、人間が礼乗の人からはじまり道乗の人にいたり、次いで真乗の人にたどりつく道程を説き明かし、最終的に全人という完成された人間に到達することを説明している。これは霊魂の浄化の修行を実践し最終的にfana'(自我消滅)に到達するスーフィーの修行と対応している。第二の巻は劉智の『天方性理』に示される世界生成と人間形成の理論を縮約して紹介し、この世界内で人間が占める位置および果たすべき役割を説明している。この研究を通じて中国イスラームの伝統的経堂教育が西アジアイスラーム世界のスーフィズムに強く影響されていることが明らかになった。ただし、イランへの調査旅行で伝統的なイスラーム神学校教育を受けたことがあるマシュハド自由大学のイスラーム学の教授ムハンマド・レザー・アターイー氏に経堂教育十三本経を検討してもらった結果、ペルシャ語世界にはそれの模範となるカリキュラムは存在せず、経堂教育の十三本経の起源が西アジアにはなく中国独自のものであるとの結論に到達した。中国イスラーム思想史上最重要の思想家の一人であり、近代中国イスラーム思想への橋渡し的役割を果たした雲南の馬徳新(馬復初、経名ルーフッディーン・ユースフ1794ー1874)が中国イスラーム思想の発展過程で確立した「道学」の目的を彼の主著『漢訳道行究竟』および『大化総帰』の分析により明らかにすることができた。『漢訳道行究竟』のなかで示される人間完成の過程の説明は、人は礼乗から出発し、道乗を全うし、真乗に至り、その結果として全人の境地に至ることが明らかにされている。

この考え方は『漢訳道行究竟』の原本であるアジーズ・ナサフィーの『遥かな目的地』のなかに見えるものであるが、『漢訳道行究竟』のなかにみえる礼乗の完成者、すなわちシャリーアにより人間完成を成し遂げた人、道乗の完成者、すなわちタリーカによる人格完成者、そして真乗の完成者、すなわちハキーカによる人間完成者の観念はそれぞれペルシャ語原本にみえる観念と異なる相貌を示している。また真乗を経て「全人」の境に到達する人間は道教における神仙を彷彿させるものとなっている。西アジアのイスラーム思想においてはこの「全人」は「完全人間」と呼ばれるものであるが、西アジアにおいては「完全人間」は世界の存在を支える世界軸としての働きに重点がおかれた説明になっているが馬徳新は「全人」を道徳的な働きを行う者としての側面に重点が置かれた説明になっている。『大化総帰』において、とくにその序文のなかで馬徳新は人間完成の旅を終えた人格の完成者が真実在者の懐に抱かれて永生を楽しむというイスラームの死生観の真髄を明らかにしている。彼の弟子の馬開科の言うように中国イスラーム思想において馬徳新が初めて明確にイスラームの死生観が仏教や道教のそれとことなることを明確に説いたのである。こうした内容を松本耿郎著『馬徳新哲学研究序説』(駱駝舎、2014年3月刊行)のなかで詳述した。イスラーム思想は森羅万象の一つ一つが唯一の真実在者アッラー(真主)に起原し、最終的にはその真実在者のもとに帰ってゆくという新プラトン哲学的世界観を枠組みとして人間存在のあり方を模索する。この思想的枠組みの中で発達した思想の中でもイブン・スィーナー(アヴィケンナ)の存在論、アブー・ハーミド・ガザーリーの人間学、イブン・アラビーの神智学は特に重要であるが、これ等の諸思想を総合するアブドッラフマーン・ジャーミーの存在一性論思想はその後の中国イスラーム世界を含むイスラームの信徒の世界観、人生観の思考様式を決定している。とりわけイブン・スィーナーのあらゆる被造物は完成を目指す途上的存在であるという存在者理解は生命尊重と暴力嫌悪の意識をイスラーム信徒に植え付けている。ここから、イスラーム人間存在論では生命尊重思想と表裏一体となる愛の思想が発達してくる。この愛の思想の起原をアッラーの世界創造の原因であるアッラーの自己愛にもとめる神=世界関係理解が中国イスラーム思想においては完成の方法を定式化する道学の骨格を形成している。中国イスラーム世界の宗教指導者を養成する経堂教育における伝統的カリキュラムにおいては十三本経の学習を中心にしているがこのカリキュラムの最終段階ではアブドッラフマーン・ジャーミーの宇宙論的愛に関する作品『アシッアト・アル・ラマアート』(光の輝き)の修得が義務付けられている。しかしながら現代中国においてはこの明末に始まるカリキュラムは重視されず僅かに天津および河北省の中国イスラーム教徒たちの間でのみ守られている。この事実は前年度の現地調査で確認した。以上がこれまでの研究調査で明らかにしえた研究内容の概略である。最終年度に当る今年の研究においては十三本経のカリキュラムを貫通する思想とその展開相を特に馬復初の思想を中心に探求する計画である。この一年ほどの間に中国国内情勢の影響で少数民族である回族にたいする締め付けが厳しくなり、これまで研究に協力してくれた回族の人々に迷惑をかけないようにするため、研究協力を得にくくなってきたため。25年度が最終年度であるため、記入しない。
ゼブラフィッシュを用いた特異的シナプス形成機構の解析

われわれは脊椎動物で最も単純な中枢神経系をもつ魚類(ゼブラフィッシュ)を用いて、神経回路網の構築過程において関与する新たな分子の同定、そしてその機能解析をめざしている。能瀬(基生研)らはショウジョウバエにおいて、少数の筋肉繊維で発現し、脊椎動物のF-Spondinと高い相同性をもつ遺伝子AN34を発見した。F-Spondinは、Floor plateで特異的に発現する分泌タンパク質で、in vitroにおいて神経繊維伸長を促進することが示されている。我々は、今回相同性が見い出された領域が、神経繊維誘導に基本的な役割を果たすためのドメインと期待し、ゼブラフィッシュから、このファミリーに属する遺伝子断片の単離を試みた。その結果、複数のクローン(約100bpの断片)を単離することができた。本年度計画では、これら遺伝子群の構造解析、発現様式の解析、そして予備計な異所発現実験を行った。(1)構造解析:このファミリーに属する4つの遺伝子予想遺伝子産物の全構造を決定した。うち2種はゼブラフィッシュのF-Spondinとみられる分子であり、ラットのF-Spondinとほぼ同様の構造を示す(F-Spondin1,F-Spondin2とする)。他の2つは互いに良く似ており、配列的にも、また、全構造的にもAN34により関連した分子であった(AN1,AN2とする)。(2)発現様式:4遺伝子すべてが、基本的にはfloor plateで発現していた。(3)異所発現:AN2にmycタグを導入して胚全体に発現させたところ、産物は基底膜に濃縮することがわかった。このことから、AN2は野性型の胚ではfloor plateの底の基底膜に濃縮して存在し、そこで何らかの機能を果たすことが示唆された。
オーキシン代謝不活性化経路の同定を目的としたケミカルバイオロジー研究

申請者は、オーキシン代謝酵素の一種であるGH3の阻害剤を探索中に、GH3酵素による代謝が主要なオーキシンの不活性化を担うと示唆される結果を得た。本研究では、有機合成による構造展開から得られた複数のGH3阻害剤候補の選択性を評価し、高活性かつ高選択的なGH3阻害剤を創製する。また、創製した阻害剤を活用するケミカルバイオロジーの手法を駆使し、オーキシン不活性化経路の主要な分子基盤の解明に挑む。
北太平洋中緯度海域で発見されたウィルス・ホットスポットの形成機構の解明

外洋域においてウィルス数が局所的極大を示す層、すなわち「ウィルス・ホットスポット(VHS)」、の分布の実態把握と形成機構の究明を行った。観測の結果、VHSは中部および西部北太平洋において広範に見られ、その分布が溶存酸素アノマリーの分布と関連することが明らかになった。観測・実験データを基に、VHSの形成には、宿主依存的なウィルス生産、鉛直混合、紫外線影響の3要因が関与しているという新たな仮説を提案した。海洋において、ウィルスの大規模な空間分布パターンの解析を行うとともに、そのようなパターンが現れる機構を、観測と実験的な解析から追及することで、海洋生態系の重要な構成員であるウィルスの空間分布の支配機構に関する理解を深化させることを目的として研究を進めた。学術研究船白鳳丸KH-10-01次航海(平成22年5月18日6月4日)及び海洋地球研究船みらいMR10-06次航海(平成22年10月18日11月16日)において、西部北太平洋におけるウィスルの空間分布と、関連する環境パラメータの観測を行った。また、得られたサンプルをフローサイトメトリー法を用いて詳細に解析した。更に、紫外線影響の少ない中深層水を用いてウィルスの自然減衰率を推定するための長期培養実験を行った。その結果、海水中のウィルスの自然減衰率が、2段階の一次反応式で近似できることが明らかになった。このデータは、ウィルス集団の中に、比較的速やかに減衰する亜集団と、減衰速度が遅い亜集団が存在することを示唆しており、ウィルスの海水中での動態をモデル化するうえでの重要な知見である。また、以上の観測で得られた結果を含めてウィルスの空間分布の支配要因に関する統計解析を進めた結果、観測海域においてウィルス数の鉛直分布が溶存酸素濃度の分布と密接な関係があることが明らかになった。以上の結果は、先行研究において中部北太平洋で明らかにされた現象と類似しており、ウィルス数の亜表層極大(ホット・スポット)は、広範な海域において見られる一般的な現象であることを示唆している。平成23年度は、学術研究船白鳳丸KH-11-10次航海(平成23年12月24日平成24年1月25日)において、南太平洋亜熱帯海域におけるウィルスの空間分布と、関連する環境パラメータの観測を行った。また、紫外線照射によるウィルスの消滅率を測定する実験を4定点において実施した。表層、亜表層および深層において採取した海水の濾過液を石英管につめ、甲板水槽で12時間培養を行い、明暗条件下でのウィルス消滅率の比較を行った。ウィルス計数のためのサンプルを経時的に採取し、グルタルアルデヒドで固定後、冷凍保存した。陸上研究室においては、サンプルをサイバーグリーンIで染色後、フローサイトメータによる解析を行い、培養期間中のウィルス数の変化を精査した。得られた結果に一次反応モデルをあてはめ、ウィルス消滅率を算出したところ、表層サンプルにおいては、ウィルス消滅率は、明瓶と暗瓶で有意に異ならなかった。それに対して、15003000mの水深から採取した深層サンプルにおいては、明瓶におけるウィルス消滅率が、暗瓶におけるウィルス消滅率を有意に上回ることが明らかになった。以上の結果は、表層のウィルスが、紫外線照射に対する「抵抗性」を有している可能性を示唆しており、本研究の仮説を支持するものである。また、この結果は深層におけるウィルスの分布の理解のうえで重要な意義を有する。本研究において得られた、海洋における大規模なウィルスの分布パターンに関する知見は、海洋生態系・生物地球化学に関する国際研究プログラムであるIMBERの日中韓シンポジウムにおいて報告した。
効果的な観察学習を促進させる手本の検討とその背景因子 －手本の習熟度に着目して－

本研究の目的は、高齢者の効果的な手本を検証することである。実験では、まずこれまで得た「若年者において習熟した手本の観察より未習熟な手本の観察の方が運動学習に有効であった」という結果の背景を、視線と脳活動の観点から検証した。現在、実験の継続中であるが、これまでのデータから両手本間の違いは認めらなかった。その他、高齢者に対して両手本の運動学習効果の違いを検証した。その結果、若年者の結果と同様に、未習熟な手本の観察の方が習熟した手本の観察より運動学習が促進した。これらのことは、背景因子は今後の検討課題であるが、運動学習には未習熟な手本を観察させた方より効果的であること示している。本研究は、運動観察を用いた運動学習過程において、より運動を促す手本を明らかにすることを目的としている。具体的には、習熟した理想的な運動を観察した場合より、未習熟な(拙劣さが残るが観察者よりスキルの高い、取り組みによって比較的短期間に到達可能な)運動を観察した方が運動学習が促進されるのではないかという仮説を持って検討を試みた。H27年度は、2種類の手本を見ている最中の視線行動の違いについての検討および、高齢者を対象として2種類の手本を観察することによる運動学習効果の違いについての検討を行った。第一の成果は、2種類の手本を観察している最中の視線行動には違いが認められないという結果を得たことである。視線行動分析装置を用いて、2種類の手本観察中の視線が指か球あるいは掌のどこを観察しているかについて割合を分析したが、両者に違いを認めることがなかった。一方で、観察後に内省を聴取したところ、未習熟な手本を観察した方が、手本として有用であると答える人数が有意に多かった。本研究成果は、了德寺大学研究紀要にて発表された。第二の成果は、高齢者を対象とした場合、未習熟な手本を観察した方が運動学習が促進されるということが明らかになった点である。球回し課題を用いて、未習熟な手本と習熟した手本を観察した後の球回し速度および落下回数の改善度を分析した。その結果、未習熟な手本を観察した際は、習熟した手本を観察した場合よりも、球回し速度が有意に改善した。一方で、落下回数については手本間の違いを認めなかった。以上の事から、未習熟な手本を観察することは、球回し速度に表される運動の円滑性の向上に寄与するということが示唆された。本研究成果は、理学療法科学学会主催の国際学術大会で発表し、現在は国際誌に投稿中である。当初の研究計画であった、手本観察中の視線行動分析、脳活動分析、高齢者での検討の内、視線行動分析と高齢者での検討を終えた。現在は脳活動解析のプレ実験を行っているところであり、計画通りに伸展していると考えている。本研究は、高齢者に効果的な観察学習の手本は習熟済みの手本(完璧に近い手本)なのか、あるいは未習熟な手本(拙劣さの残る手本)なのかを明らかにすることを最終目的としている。実験では、これまで得た「若年者において未習熟な手本の観察が運動学習に有効であった」という結果についての背景因子の検討を行った。具体的には、まず手本観察中の視線計測を行った。その結果、未習熟な手本を観察している最中と習熟済みの手本を観察している最中では、注視点の大きな違いを認めることはなかった。これは、未習熟な手本が有効となる理由として、注視点などに表されるような注意以外の認知的な影響が関与している可能性を示唆した。次の実験として、両手本を観察している最中の脳活動の計測を核磁気共鳴画像法を用いて計測した。現在、実験を継続しており、結論を出すことは困難であるが、これまで得られたデータからは、両手本間の脳活動の大きな違いは認められていない。この実験に関しては、引き続き被験者を増やして検証を重ねる予定である。上記の脳活動計測実験と並行し、高齢者を対象とした行動実験として、両手本の運動学習効果の違いの検証を行った。この結果、若年者の結果と同様に、未習熟な手本の観察の方が習熟した手本の観察より運動学習が進みやすいという結果を得た。以上の結果から、未習熟な手本がなぜ運動学習に有効になるのかについての背景の解明は未だ十分ではないが、未習熟な手本自体の有効性については、確固たる結果を得た。このことは、リハビリテーション対象者の多くを占める高齢者の運動学習を促す場合、運動観察に用いる手本は、学習者のパフォーマンスに近い未習熟な手本が効果的であることを明らかにし、リハビリテーション現場への応用可能性を示したといえる。

これらのことは、背景因子は今後の検討課題であるが、運動学習には未習熟な手本を観察させた方より効果的であること示している。脳活動分析を今年度一年かけて行う予定である。実験にはfMRIを使用して脳活動の計測を行うことがメインとなるが、皮質のボリュームを解析手法なども駆使していきながら、運動観察の特性を明らかにしていきたいと考えている。リハビリテーション研究を遂行するにあたって物品(文具などの消耗品)の購入が当初予定より抑えられたため。次年度への繰り越し金は今年度は所属施設外での実験が増えるため、消耗品などの物品購入に充てる予定である。次年度の助成金の使用は、脳活動データ解析用ソフト、筋電位測定機器、英文校正、旅費が主な支出となる予定である。
糖尿病に対するシロスタゾールによる血栓症・動脈硬化予防効果解析

シロスタゾール投与前後においてコラーゲン刺激による血小板凝集能、ウェスタンブロット法によるHSP27のリン酸化レベル、血小板から遊離されるplateletfactor 4および、soluble CD 40ligandをELISA法にて解析を行った。血小板凝集能および細胞内情報伝達におけるHSP27のリン酸化は低下傾向が見られた。血小板から放出されるplateletfactor 4、soluble CD40ligandは抑制傾向がみられた。以上の結果からシロスタゾールはコラーゲン刺激における血小板内におけるHSP27のリン酸化を抑制し生理活性化物質の放出を抑制する可能性が示唆された。糖尿病患者のうちシロスタゾールによる抗血小板剤導入された7名を対象にシロスタゾール投与前後においてコラーゲン刺激による血小板凝集能を測定した。また採取した血小板を可溶化後,細胞内情報伝達についてウェスタンブロット法にてHSP27のリン酸化レベルを解析した。また遊離される生理活性化物質についてはplatelet factor 4および、soluble CD 40ligandを指標としELISA法にて解析を行った。投与後のコラーゲン刺激(0.1、0.3、1.0 mg/ml)による血小板凝集能は投与前と比し低下傾向が見られ、コラーゲン0.3 mg/mlにおいて有意に抑制した。細胞内情報伝達においてはシロスタゾール投与後のコラーゲン刺激による血小板凝集能は投与前と比しHSP27(Ser-78、82)のリン酸化について有意差は認められないが、低下傾向が見られた。血小板から放出される生理活性化物質についてplateletfactor 4はシロスタゾール投与前と比し抑制傾向がみられ、soluble CD 40ligandについてはコラーゲン0.1および0.3mg/ml刺激において有意に低下が認められた。動脈硬化の指標につてFMD(flow mediated vasodilation)による解析を予定していたが本機材を導入後から現状までにおいてシロスタゾールが導入となる対象患者が数名しかいないため統計手技を用いた解析ができていない。今後症例の蓄積を行い血小板凝集能と血管内皮機能との関連、シロスタゾールの効果の有無について解析を行う予定である。血小板凝集能や付随する項目についてはこれまでの結果や保存検体を用いた解析が進みある程度の結果が得られている。動脈硬化の指標であるFMD(flow mediated vasodilation)については解析数がシロスタゾール導入患者に依存するため現状、解析に十分数が得られていない。動脈硬化の指標につてFMD(flow mediated vasodilation)による解析を予定していたが本機材を導入後から現状までにおいてシロスタゾールが導入となる対象患者が数名しかいないため統計手技を用いた解析ができなかった。これまでの研究結果をまとめて論文作成の予定である。同意が得られた対象患者に対し滞りなく検査行い症例を蓄積していく予定である。これらの結果が出そろえば、論文作成・投稿を行う予定である。症例の追加が伸び悩む場合はすでに結果の出ている血小板凝集能についての結果をまとめ論文を作成する予定である。脳神経外科次年度使用額が生じているが、少額であり、ほぼ予定通りであったと考えている。次年度も予定通りに刺激薬、抗体などの試薬および血小板凝集能検査に要する消耗品に使用する。
グリオーマの移動・浸潤時に起こる細胞内イオン変化の可視化とその応用性の検討

細胞内イオンイメージング法を用いて、グリオーマ細胞の移動時における自発的な細胞内Ca^<2+>とCl^-濃度の変化を可視化してその役割を検討した。グリオーマ細胞では細胞内Ca^<2+>濃度の頻度の変化は著しい加速を示す移動細胞の指標と成ったが、移動速度との関連性は無かった。細胞内Cl^-イオン濃度をFRET型インディケーターで測定し、細胞内におけるCl^-の局在性について検討した。また、細胞内Cl^-イオン濃度を変化させるとグリオーマ細胞の移動速度を変化させることが分かった。1.細胞移動の速度・形態変化における時空間的な[Ca^<2+>]_i・[Cl^-]_iの変動の役割申請者らは、複数のヒト由来のグリオーマ細胞において長時間タイムラプス観察・Ca^<2+>イメージングの同時観察を行ったところ、MonopolarあるいはBipolarな形態を示すグリオーマ細胞が静止状態から移動速度を著しく促進する過程において高頻度に[Ca^<2+>]_iの変動が見られることが分かった。グリオーマ細胞の転移の開始時に特異的なカルシウムシグナリングが関与する可能性が示唆され、よりグリオーマ細胞の移動をより選択的(特異的)に抑える治療法(薬)を見出すストラテジーへの開発に期待がもてる。2.グリオーマ細胞移動の薬理学的解析;細胞内[Ca^<2+>]_i・[Cl^-]_iの変動を起こしうる薬剤を用いてグリオーマ細胞の移動に与える影響を調査した。Cl^-トランスポーターの阻害剤であるBumetanideを添加すると、有意にグリオーマ細胞の移動速度を促進させることを見出した。Cl^-の内部変化を乱すこともグリオーマ細胞の移動状態を変化させる要因となりうることが示唆された。3. FRETイメージング法によるグリオーマ細胞における細胞の移動・動態観察グリオーマ細胞に[Cl^-]_iの変動のセンサーであるClomeleonを発現させた後に、長時間FRETタイムラプス観察を行った。グリオーマ細胞で認められるClomeleonのFRET効率は細胞外Cl^-を変化させることで変化するが、ランダム方向に移動するグリオーマ細胞の細胞内に顕著なFRET効率の変化は見いだせなかった。1.細胞移動の速度・形態変化における時空間的な[Ca^<2+>]_i・[Cl^-]_iの変動の役割研究実施者らは、昨年に引き続きヒト由来のグリオーマ細胞において長時間タイムラプス観察・Ca^<2+>イメージングの同時観察を行った。グリオーマ細胞は、未熟な神経細胞の移動と異なり、より多様な細胞内Ca^<2+>イオンの変動が見られ、単純に移動速度と自発的な細胞内Ca^<2+>イオンの振動数の変動に直接的な関係性は見出せなかった。しかし、細胞移動時にはより高頻度に細胞内Ca^<2+>イオンの変動が見られることから、細胞移動に関与する細胞内Ca^<2+>イオンの変動のより詳細なパターン解析を要することが分かった。Cl^-トランスポーターやCl^-チャネルの薬剤の投与は有意にグリオーマ細胞の移動速度を変化させることが分かった。3.FRETイメージング法によるグリオーマ細胞における細胞の移動・動態観察昨年度に引き続き、ヒト由来のグリオーマ細胞の移動動態と細胞内Cl^-の内部変化の関係性を調査するために、FRET型[Cl^-]_iの変動のセンサーであるClomeleonをグリオーマ細胞に発現させて、経時変化解析を行ってきた。発現効率の向上など技術的な進展はあったものの、移動するグリオーマ細胞に特徴的な細胞内Cl^-の変化を依然として見いだせていない。そこで、グリオーマ細胞の細胞内Cl^-の局在を乱すツール(NKCC1の強制発現系・阻害系)などを作成した。グリオーマ培養細胞にFRET型インディケーターであるClomeleon遺伝子を導入後、スペクトラムコンフォーカル顕微鏡を用いて移動グリオーマ細胞を観察することで、細胞内において細胞内塩素イオンレベルに局在があることが見いだされてきた。このような塩素イオンの局在化は部分的な細胞容積の変動を伴わせ、細胞移動時の細胞形態変化に関与する可能性が出てきた。このような塩素イオンの局在化を形成するメカニズムとして、容積依存性塩素イオンチャネルなど塩素イオンを汲み出す仕組みについては比較的よく調べられているが、集積させる仕組みについては、よく分かっていなかった。そこで、本年度は新たに塩素イオンを組み入れる輸送体であるNKCC1の分布と機能について、NKCC1を特異的に認識する新規の抗体とsiRNAを用いて研究を行った。新規のNKCC

1抗体は、脳組織を用いたウェスタンブロッティングで約140kDaの単一のバンドを示し、市販の抗体に比べて特異性が非常に高いことが分かった。この抗体を用いて細胞の免疫染色を行うとpunctateな染色パターンが認められた。ヒトグリオーマ細胞におけるsiRNAの効果を調べるために、siRNAを細胞株に導入2日後にウェスタンブロッティングを行った結果、siRNA導入株ではNKCC1の発現レベルが低下していることが分かった。siRNA導入株における細胞増殖・細胞死に対する影響をMTT法により調べたが、有意差は得られなかった。このsiRNAを導入したグリオーマ細胞株における移動動態の変化とNKCC1の局在性の相関性について現在解析中である。
走査プローブ顕微鏡を用いたニアフィールド2光子時間分解蛍光分光法の開発

1)2光子時間分解蛍光SNOMの開発と評価昨年度開発した先鋭化光ファイバーチップの無電解ニッケルめっきを用いて,更にその表面を金めっきする事により,表面電場増強用のチップを作製する事を試みた。このチップを用いシェアフォース法により試料-チップ間の距離制御を行なった試料として導電性共役高分子MEH-PPVを用い,2光子励起による蛍光測定を試みた。フェムト秒Ti:サファイアレーザーの基本波(820nm)を励起光に用い,偏光面をp偏光として斜照射する光学系を組み立てた。試料表面で発生した2光子励起による蛍光を透過用対物レンズを用いて集光し,分光器,MCP光電子増倍管により時間分解単一光子検出を行なった。その結果,以下に示すことが明らかとなった。a)2光子励起によると考えられる試料からの発光が観測されるが,著しい空間分解能の改善は見られなかった。b)励起光強度に著しく依存するが,レーザー光強度を上げるとチップの金表面が加熱され,その影響が観測像に現れると共に,背景光としての2光子蛍光が干渉した。c)金めっきしたSNOMファイバーは先端部が脆く,剛性を持たせる工夫が必要である。d)検出系にピンホールを用い,また高感度なアバランシェフォトダイオードを用いる等して,分解能の改善が可能である。2)ポリイオンコンプレックス薄膜の2光子時間分解蛍光SNOWによる研究アニオン性のチアシアニン色素とカチオン性高分子PDDAとの相互作用によるJ-会合体薄膜を作製し,そのメゾスコピツク構造と励起状態ダイナミクスを2光子時間分解蛍光SNOMを用いて解析した。その結果,PDDAの濃度に依存して,J-会合体のメゾスコピツク構造がファイバー状から岩状に変化すると共に,ファイバー状の構造と蛍光像の相関を解析した。ニアフィールド2光子時間分解蛍光分光法を開発するためには,まず2光子励起にふさわしい試料の1光子での時間分解蛍光SNOMを測定し,そのメゾスコピック構造と蛍光ダイナミクスを明らかにしておく必要がある。この為に,導電性高分子MEH-PPVを用いそのスピンコート膜をクロロホルム溶液およびキシレン溶液から作製し,Ti:Sapphireレーザーの第二高調波(420nm)を励起光として時間分解蛍光SNOMによる解析を試みた。その結果,クロロホルム溶液による薄膜では環状構造が観測され,その中心部の蛍光強度は極めて弱いが,環状構造の周辺部は蛍光強度が強く,トポ像との良い対応を示した。また,蛍光ダイナミクスを場所毎に計測したところ,環状中心部に比べ周辺部の寿命が非常に短く,環状周辺部ではMEH-PPVの会合体形成による励起子の移動と消光が起こっている事が示唆された。キシレン溶液による薄膜ではこのような構造は観測されず,この構造形成は溶媒の蒸発過程に依存した2次元ガスバブルモデルで説明できた。今後,2光子励起による構造解析を行う。2.SNOMチップの先鋭化と無電解メッキニアフィールド光を用いた2光子時間分解蛍光SNOMを展開するためには,SNOMチップ先端の電場増強を用いる必要がある。この為に,単一モードファイバーのtube etchingによる先鋭化と先端部のメッキを試みた。ガラスファイバーへのメッキとして無電解ニッケルメッキを試み,メッキ液の脱酸素化,ファイバー表面の活性化,およびメッキの最適条件を見いだした。今後,さらに表面を金メッキし,電場増強が可能な先鋭化SNOMファイバーチップを作製する。