hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
視覚的フィードバックによる呼吸訓練法の検討

我々のこれまでの研究では健常人において胸式呼吸と横隔膜呼吸の呼吸パターンの違いについて比較を行った.換気量,呼吸運動による酸素消費量の面で横隔膜を主動作筋とする横隔膜呼吸の方が効率のよい呼吸法であるという結果が得られた.今回は横隔膜呼吸を学習するために呼吸筋のフィードバックを用い,呼吸筋の筋活動様式の変化を観察した.実験は次の2点について検討された.1)健常人において安静時の呼吸筋の筋活動を表面筋電図にて記録し,目的とする筋が正しく導入され,かつ再現性がある位置を決める.2)呼吸筋の筋電図上に観察される心電図の影響及び深層に存在する横隔膜の筋活動が導出できるかを検討する.健常な男女11名(1923歳)を対象として,筋電図,呼吸曲線を測定した.その結果,横隔膜の筋電図は季助部において再現性があった.吸気における横隔膜の純粋な筋電図を採ることが困難であり,腹斜筋をはじめ,腹部の筋の収縮による影響を除くことが困難であった.このことから,視覚的フィードバックの方法として,呼吸筋による方法ではなく,腹部・胸部の拡張や,換気量の変化等を指標とることにより横隔膜呼吸の学習がより効果的と考えられた.また,横隔膜呼吸の指導は,COPDの患者のみではなく,開胸・上腹部の開腹手術を受ける患者に対して,術前の肺理学療法の一環として行われている.この様な症例にも従来より行われている理学療法と視覚的フィードバックを用いた新しい呼吸訓練法について比較検討して行きたい.我々のこれまでの研究では健常人において胸式呼吸と横隔膜呼吸の呼吸パターンの違いについて比較を行った.換気量,呼吸運動による酸素消費量の面で横隔膜を主動作筋とする横隔膜呼吸の方が効率のよい呼吸法であるという結果が得られた.今回は横隔膜呼吸を学習するために呼吸筋のフィードバックを用い,呼吸筋の筋活動様式の変化を観察した.実験は次の2点について検討された.1)健常人において安静時の呼吸筋の筋活動を表面筋電図にて記録し,目的とする筋が正しく導入され,かつ再現性がある位置を決める.2)呼吸筋の筋電図上に観察される心電図の影響及び深層に存在する横隔膜の筋活動が導出できるかを検討する.健常な男女11名(1923歳)を対象として,筋電図,呼吸曲線を測定した.その結果,横隔膜の筋電図は季助部において再現性があった.吸気における横隔膜の純粋な筋電図を採ることが困難であり,腹斜筋をはじめ,腹部の筋の収縮による影響を除くことが困難であった.このことから,視覚的フィードバックの方法として,呼吸筋による方法ではなく,腹部・胸部の拡張や,換気量の変化等を指標とることにより横隔膜呼吸の学習がより効果的と考えられた.また,横隔膜呼吸の指導は,COPDの患者のみではなく,開胸・上腹部の開腹手術を受ける患者に対して,術前の肺理学療法の一環として行われている.この様な症例にも従来より行われている理学療法と視覚的フィードバックを用いた新しい呼吸訓練法について比較検討して行きたい.
光計測用0.6μm波長帯半導体レーザの研究

1.GaInAsP/AlGaAsレーザの活性層となるGaInAsP結晶のGaAs基板上への格子整合成長条件を調べ、波長0.650.69μmの組成範囲で成長条件を明らかにした。活性層とクラッド層の格子整合条件を詳細に調べて、実際に格子整合系でレーザを試作し、クラッド層の不純物濃度の最適化を行い、活性層厚が0.26μmの場合に5.6KA/【cm^2】までの低しきい値化を達成した。2.このレーザの利得係数およびキャリアの寿命時間のキャリア濃度依存性を理論的に明らかにするとともに、理論では決定できない非発光再結合時間の温度および注入電流依存性をGaInAsP/AlGaAsLEDを試作し発光効率を測定することで求めた。これらの結果をもとにしきい値電流密度の活性層厚依存性を計算し実測値との比較を行って計算値と実測値が良く一致することを示した。この理論曲線よりみると活性層厚を0.1μm程度にすればしきい値は2KA/【cm^2】まで低減化できることが判明した。3.GaInAsP/AlGaAsレーザの自然放出光スペクトルを測定し理論曲線にフィティングすることで、バンド内緩和時間の推定を行った。現時点では活性層内のキャリア濃度の算定精度が良くないためバンド内緩和時間の正確な値が判明していないが少なくとも0.61×【10^(-13)】secの範囲内にある。この値は他の材料系で分っている【10^(-13)】secとほぼ同程度である。4.以上の結果をもとにしてしきい値電流の温度依存性を計算し実測値と比較したところ良く合うことが明らかとなった。温度依存性の決定要因は現時点では十分に把握していないが、250Kの温度を境に高温側と低温側で再結合寿命時間のキャリア濃度依存性に明らかな差異があることが分った。5.埋め込み型構造のレーザを試作し室温パルス動作下でのレーザ発振に成功した。発振波長は674nmで、しきい値電流が80mAと低く、微分量子効率は25%、光出力は5mWであった。
ナノメーター領域の精密構造解析法の開発とその基礎的応用

ナノメータースケールでの精密構造解析を行うための電子顕微鏡を開発した。精密構造解析に最も有害なプラズモン散乱を除去するためのオメガフィルターを新たに設計し作製した。加えて従来の電顕にあった像観察室や蛍光スクリーンをなくし、画像は全てテレビ画面で観ることができるようにし全ての電気的および機械的な操作をコンピューターで遠隔操作できるようにした。インターネットで電顕を操作し、画像もインターネットで配信できるような未来型電子顕微鏡への第一歩を踏み出した。この成果はテレビ、新聞でとりあげられ、世界の注目を集めており、今夏の国際電子顕微鏡学会で正式に発表する。電子回折の動力学理論に基づいた精密構造解析用ソフトウェアを作成した。初期にはSrTiO_3の低温での構造を題材にして、生データの解析および処理用ソフトウェアの作成、計算の高速化などの改良を行った。1次元的ラインプロファイルの解析を完成させた後2次元パターンのフィッティングを可能にするプログラムへと進化させ、より信頼性の高い解析プログラムを完成させた。非中心対称結晶であるCdSについて解析を行った結果、Sの位置u=0.379、CdとSの温度因子Bとして、常温でB(Cd)=1.35、B(S)=1.14を得た。X線回折での値u=0.3772、B(Cd)=1.39、B(S)=1.13とよく一致しており、収束電子回折での精密構造解析が実用になることを示した。今後この方法を、現在注目を浴びている諸問題に応用してゆきたい。基礎的応用として準結晶(デカゴナル相)の構造の解明に着手したが、従来の報告を修正するいくつかの重大な事実を発見した。すなわち、Al-Cu-Co準結晶において従来基本クラスターが10回対称であると報告されていたが、真実は5回対称であること、Al-Cu-Co準結晶は2nmの10回対称の基本クラスターをもつと報告されていたが、0.4nmの2種類の基本クラスターに分解できることを発見し、準結晶の構造の基本的見直しをせまった。これらの知見をもとに高次元結晶学に基づいた構造解析用のソフトウェアを作成し、真の構造の説明に取り組んでいる。1)精密構造解析用電子顕微鏡のためのオメガ型エネルギーフィルターの仕様を検討し、既存のフィルターの性能を調査した。それらのデータを基礎として、電子光学技術者にオメガフィルターの設計と、それに必要な入射側、出射側のしンズ系、電子線検出系の設計を依頼した。設計された系の性能について検討し、必要な改善点を明らかにし、より高性能なオメガフィルターシステムの設計を行った。2)精密構造解析用ソフトウェアはすでに初歩的、試験的なものは作成済みであるが、ルーチンワークに耐えられるようなソフトウェアの作成に着手した。計算の高速化をはかるために、非線型最小ニ乗法に摂動法を導入した。フィッティングパラメーターの数を任意に増やせるよう改良した。このようにして改良したソフトウェアの動作テストをかねてSrTi0_3の19Kでの構造パラメーターの決定を行った。イメージングプレートに記録されたデータの解析および処理用のソフトウェアの性能テストおよび改良を行った。

3)精密構造解析を行おうとするデ力ゴナル準結晶の空間群を収束電子回折法によって決定し、高分解能電子顕微鏡法によって原子クラスターの構造を調べた。その結果、AI-Cu-CoおよびAI-Ni-Co系で従来報告されている構造が誤りであることを発見した。この結果は今後、これらの準結晶の精密解析をするために重要な知見である。1)精密構造解析用電子顕微鏡のためのオメガフィルターを作製した。その性能テストを行いエネルギーフィルターとして十分働くことを確認した。一層の性能向上のためにさらに改良を行った。オメガフィルターを電子顕微鏡に組み込んで動作させるための電顕本体の改造およびオメガフィルターを稼働するためのソフトウェアを作成した。2)精密構造解析を妨げる最大の原因であるプラズモン散乱を異なる元素から成る多種の物質についてオメガフィルターを用いて調べた。軽元素からなる物質ほどプラズモン散乱の効果が大きいことを見出した。3)構造解析用ソフトウェアの改良を引き続き行った。非中心対称結晶であるCdSについて決定すべき構造パラメーターを増して予備的構造解析を行った。準結晶の構造解析のために高次元空間での断面法による構造因子計算のプログラムを作成した。それを用いてAl-Cu-Coの収束電子回折強度の計算を開始した。1)平成7年度に作成したエネルギーフィルターを装着した電界放出型電子銃付電子顕微鏡について改良を加えた。エネルギーフィルターの磁場対称性を向上させ、対物レンズ及び中間レンズ設定を改良した。これにより加速電圧100kVにおいてエネルギー幅10eVで散乱角6.4度という高角までの取り込みを3%以下の小さな歪みで実現することに成功した。これによって精密構造解析用電子顕微鏡として実用的な段階へと入ることができた。2)高速なワークステーションを購入し、構造解析用ソフトウェアを移植して稼働させ、改良を引き続き行った。非中心対称結晶であるCdSおよびAlNについて、上記の精密構造解析用電子顕微鏡を用いて非弾性散乱電子を除去した収束電子回折図形を撮影し、この改良したソフトウェアを用いて構造解析を行った。3)中心対称のAl-Ni-Rh系、非中心対称のAl-Ni-Fe系について構造解析に着手した。上記の電子顕微鏡を用いて非弾性散乱を除去した収束電子回折図形を撮影した。また高次元空間での断面法を用いてこれら中心対称及び非中心対称デカゴナル相の構造モデルを作成した。開発したソフトウェアを用いて各構造モデルから収束電子回折強度を計算・実験値を比較することにより各構造モデルの検討を行った。1)昨年度に引き続き、電子顕微鏡のエネルギーフィルターの性能の向上に努めた。すなわち、球面収差の小さい対物レンズを装着し、オメガフィルターの外部への漏れ磁場を均一化し、さらに回折図形の歪補正回路を導入した。その結果、加速電圧100kVでエネルギー巾8eVで散乱角9度までの回折図形を取り込み、その歪を1%以下にすることができた。上記の9度という値の実現によって、物性的に重要なペロブスカイト型物質群の構造の研究が可能になった。2)構造解析用ソフトウェアの改良を行った。すなわち、昨年度までは回折図形の1次元データの解析しかできなかったが、本年度は2次元データを解析できるプログラムを開発した。計算の高速化をはかり、回折図形の2次元フィッテングが実用になるようにした。
中世英国写本と僧院

交付された科学研究費補助金「基盤C一般(2001年、2002年)」に基づく実績は、たとえば、「中世英国写本と僧院」という研究テーマにしたがって、イギリスとフランスの縁の地を訪れ、とりわけカルトージオ派の母院であるグランド・シャルトルーズ修道院辺の実見踏査、写真による現地の記録、出版物やマイクロフィルムをはじめとする関連資料の入手、等々、多数の成果はあるが、最大の成果と実績は研究成果の一端を出版物として公にしたことである。15世紀前半に英国はヨークシャーのカルトージオ派修道院Mount Grace Priory(ヘンリー八世の修道院解体政策のため1539年以来廃墟となっている)においてニコラス・ラヴ(Nicholas Love, d.1424)によって作成されたMyrrour of the Blessed Lyf of Jesu Christ(『イエス・キリストの祝福されし生涯の鏡』、早稲田大学図書館蔵、NE3691)のルーツをたどりながら、世界に散在残存する50を越える同種写本との比較考証を行ないながら、同書に含まれる「土曜日の章」の校訂本,"Saturday" in Waseda MS(NE3691)(A4版、pp.xviii+36,早稲田写本からの5葉とエジンバラのスコットランド国立図書館写本からの2葉を含むカラー写真20枚、早稲田大学事業部、2003年02月25日)を研究出版した。この書は「金曜日の章」(1999)、「サクラメントの章」(2000)に次ぐ3巻目の出版物となる研究書である。資金不足の関係から、成果の一端しか公表できなかったことは心残りであるが、これは機会をとらえての将来の実践目標にする。1.平成13年8月20日(月)成田発英国航空(BA-006)にてLHRで乗り継ぎ(BA-318)、同日パリ(CDG)着から9月6日(BA-007)までの15日間の海外研究で以下の成果を上げた。(1)フランスにて:仏国立中世博物館外壁撮影。13世紀建立のサン・ジュリアン・ル・ポーヴル教会実見、仏国立図書館訪問、古書購入(Stendahal : La Chartreuse de Parme ; Stendhale et Grenoble)、TGVでパリからグルノーブルへ。タクシーでMonastere de lagrande Chartreuse修道院へ、外壁撮影、Musee(La Correrie)再訪、書籍等資料収集、グルノーブル市立図書館、『舘蔵特別資料集』購入、スタンダール記念館、要塞を実見、市立美術館訪問、仏国立中世博物館内展示物実見、資料収集、ルーブル美術館再訪。(2)英国にて:ロンドン旧カルトージオ派英国総本山Charterhouse、聖バーソロミュー・ザ・グレイト教会、S. T.コールリッジ滞在記念家屋(High Gate No.3)、Ely大聖堂、Walshingham聖地、英国国立美術館、SimonFinch古書店、チャリング・クロス古書店街(資料収集)、ウェストミンスター寺院、セントポール大寺院、大英博物館、英国図書館、国立肖像美術館歴訪。2.11月25日27日にかけ、東西僧院の修行生活の場の将来の比較研究の重要要素とするために、国内では京都の妙心寺、東寺、東福寺を訪れ、その塔頭および伽藍の配置を実見し、資料の収集に努め有意義であった。尚、これまでに発表してきた古写本およぴ寺社跡地廃墟に関する少数の小論・随想を一巻にまとめて自費出版し、今後の研究の手掛かりのひとつとした。今期研究実績は、研究成果の一端を出版物のかたちで公にしたという事実に集約される。

「中世英国写本と僧院」という研究課題のもとに、15世紀前半に英国ヨークシヤーはカルトージオ派修道院Mount Grace Priory(ヘンリー八世の修道院解体政策のため1539年以来廃墟となっている)においてニコラス・ラブ(Nicholas Love、1424年没)が作成したMyrrour of the Blessed Lyf of Jesu Christ(『イエス・キリストの祝福されし生涯の鏡』、早稲田大学図書館蔵、分類記号番号NE 3691)のルーツをたどりながら、イギリスとフランスの縁の地を訪れ、とりわけ、1084年に仏グルノーブル山中にSt Brunoが創始したカルトージオ派のその母院であるグランド・シャルトルーズ修道院辺の実見踏査、写真による現地の記録、出版物やマイクロフィルムをはじめとする関連資料の入手、等々、多数の成果を踏まえての出版物である。世界に散在残存する50を越える同種写本との比較考証を行ないながら、上掲書に含まれる「土曜日の章」の校訂本,"Saturday"in Waseda MS (NE 3691)(A4版、pp.xviii++36、早稲田写本からの5葉とエジンバラのスコツトランド国立図書館蔵写本からの2葉を含むカラー写真20枚、早稲田大学事業部、2003年02月25日)を研究出版した。この書は「金曜日の章」(1999)、「サクラメントの章」(2000)に次ぐ3巻目の出版物となる研究書である。
Ash dieback病原菌の起源地周辺での生態、多様性と移入病原菌リスク評価

ヨーロッパでセイヨウトネリコにAsh diebackを引き起こしているHymenoscyphus fraxineusは、起源地に近いと考えられる日本においては、落葉葉軸上の子嚢盤より飛散した子嚢胞子が7月から9月にヤチダモを始めとするトネリコ類の生葉に感染後、静止状態でとどまり、落葉期に近づくと増殖することが分かった。特に北海道では、本菌はヤチダモを主な宿主とし広範囲に分布し、その他の日本産、外国産トネリコ類にも感染可能であるが、一部のビロードトネリコ以外に被害は確認できなかった。本菌の宿主茎部への移動を抑制する宿主の抵抗性反応、越冬環境などの生育環境が発病に影響していると考えられる。Hymenoscyphus fraxineusの生活環を解明するため、筑波大学菅平高原実験センター樹木園に植栽されたヤチダモを対象に、通年の野外観察、およびヤチダモの葉、枝、芽組織からの本菌の分離・培養と、特異的プライマーによるDNA検出ならびに定量PCRを行った。その結果、本菌の子嚢盤は前年に落葉したヤチダモ葉軸上で7月から9月にかけて大量に発生した。7月から10月に採取したヤチダモ生葉からは本菌のDNAが検出され、特に10月は検出量が多かった。また、生立木上でash diebackと類似した病徴は観察できなかった。以上のことから,本菌の子のう胞子がヤチダモ生葉に感染後静止状態となり、落葉期以降に増殖していると推測された。北海道において、セイヨウトネリコ、アメリカトネリコ、ヤチダモ、トネリコ、アオダモの被害調査、ならびに本菌とその類縁種と考えられる菌の子実体発生を調査した。セイヨウトネリコでは病徴も落葉上での子実体発生も確認できなかったが、アメリカトネリコで衰弱している成木が見られた。ヤチダモ、トネリコ、アオダモでは病徴は見られなかったが、落葉上で子実体発生を確認した。子実体を採取し、そこから得た菌株のDNA解析を実施した結果、これまでのところ分離した菌は全てH. fraxineusであった。ヤチダモとセイヨウトネリコの苗に本菌の含菌寒天を用いた有傷接種した場合、接種部周辺に病斑が形成され、両植物に対し本菌は病原性を示すことが分かった。子のう胞子の接種では、セイヨウトネリコの複葉に壊死病斑を形成したが、ヤチダモに対しては、複葉上に抵抗性と思われる病斑が多数形成され、本菌に対する反応が両植物で大きく異なった。本研究課題では、本年度、(1)日本におけるH. fraxineusの生態の解明、(2)トネリコ属植物の病害発生調査と菌類相調査、およびトネリコ属植物と関係するH. fraxineusとその類縁種の多様性、(3)H. fraxineusの病原性および病原毒素生産能力の評価、の3つのサブ課題を設けているが、いずれの課題もほぼ当初予定した成果を上げている。また、北海道での調査中に、外国産トネリコ属植物の病害発生調査で、次年度以降の研究のために非常に重要な材料を発見することができたことなど、予想以上の成果も上げられた。総合的に判断して、(2)おおむね順調に進展していると評価した。ヤチダモ上におけるHymenoscyphus fraxineusの生活環を野外調査ならびにDNA検出と分離・培養を併用して調査したところ、本菌は、前年に落葉した葉軸上に形成した子嚢盤から子嚢胞子を放出し新葉に感染後、展葉期には内生的に生葉組織内に生息し、落葉期後に活発に増殖することが分かった。また、落葉した葉軸上では、12月までには分生子(不動精子)を形成し交配が可能となり、その後、偽菌核層が発達し葉軸が偽菌核化することが分かった。北海道で植栽されているセイヨウトネリコ、アメリカトネリコ、ビロードトネリコの中に、Ash diebackに類似した症状を示している樹木と示していない樹木を発見した。これらの樹木がH. fraxineusの感染を受けているかを確認するため、各樹木から採取した生葉をリターバックにいれ、次年度子嚢盤形成させるため試料を設置した。また、これらの生葉から内生菌の分離を行い、主要な菌類の同定を行った。ヤチダモとRaywood ash (F. augustifolia subsp. oxycarpa)の苗を、野外でH. fraxineusの子嚢胞子に暴露接種したところ、ヤチダモでは病徴は見られなかったが、Raywood ashの苗では、翌年6月には新葉の展開がなく、冬期中に枝が枯死し、両者で本菌に対する感受性に明らかに差があることが分かった。ヤチダモ上での本菌の生態についてほぼ明らかにすることができ、ヨーロッパのセイヨウトネリコ上での本菌の挙動との差異が明確になった。また、海外での報告、本研究での生態調査、接種試験の結果から、樹種による本菌に対する抵抗性反応の差異が、Ash diebackの発病に大きく影響していることが示唆された。一方、今回の調査の中で、国内に植栽されている外国産トネリコ属の中にはAsh diebackと類似の症状を示している樹木と示していない樹木が生存することが分かった。

今後、本菌の感染の有無、本菌の感染に対する反応の差異、内生菌類相の差異を明確にするとともに、ヤチダモとRaywood ashの苗を用いた接種試験による抵抗性発現パターンの違いを調査することにより、本病の発病のメカニズムを解明するとともに、新たの防除法の指針を示すことができると考える。トネリコ属植物に寄生しているH. fraxineusと関連種の多様性については予想より低いという結果を得ている。北海道に於いては、外国産の種も含めてヤチダモ以外のトネリコ属に、本菌が広く感染している可能性が示唆されており、確認するための試験設定を行った。これまで、viridiolが病原毒素と考ええられてきたが、それを否定する報告も出された。そのため、より広範囲の化合物を対象とできるよう現在バイオアッセイ系を再構築している。北海道において、健全なヤチダモとセイヨウトネリコおよび枝枯れ症状を示すビロードトネリコの展葉期から落葉期までの生葉から本菌に特異的なプライマーを用いてDNAを定量した。その結果、ヤチダモでは9月以降に菌体量が顕著に増加したのに対し、外国産2種ではより早い時期にから菌体増加が認められたが、セイヨウトネリコでは一度減少した。北海道における病害発生調査の結果、ビロードトネリコの1集団で顕著な枝枯れ症状が認められた。また、落葉期の複葉から種特異的プライマーを用いた菌体DNA検出を行った結果、ヤチダモ、セイヨウトネリコ、ビロードトネリコ、アメリカトネリコ、チョウセントネリコ、アオダモ、トネリコおよびコバタゴ(Fontanesia)の7種から本菌が検出された。本研究で採集された菌株および近縁種のITS領域を用いた系統解析の結果、H. fraxineusは良くまとまったグループを形成するとともに、シオジを基質とするH. linearisと姉妹群を形成した。H. fraxineusとH. linearisをホソバトネリコ苗の茎に有傷接種した結果、両菌とも皮層部に壊死病斑を形成した。筑波大学菅平高原実験所敷地内のH. fraxineus子実体発生地にヤチダモとホソバトネリコの苗を移植し、子のう胞子暴露接種試験を行った。苗は秋に回収し筑波大学構内で管理したが、春に新葉が展開し、前年度までの接種試験結果とは異なる結果を得た。北海道と菅平のトネリコ属植物の生葉から内生菌の分離、同定を進め、複数の種から共通して分離される菌やこれまでに内生菌として報告のない菌種が検出された。しかし、H. fraxineusに対し拮抗生を示す菌はこれまでのところ生葉からは検出されなかった。また、H. fraxineusが生産するviridiolがXylaria sp.に拮抗的に作用している可能性が示唆された。ヨーロッパでセイヨウトネリコにAsh diebackを引き起こしているHymenoscyphus fraxineusは、起源地に近いと考えられる日本においては、落葉葉軸上の子嚢盤より飛散した子嚢胞子が7月から9月にヤチダモを始めとするトネリコ類の生葉に感染後、静止状態でとどまり、落葉期に近づくと増殖することが分かった。特に北海道では、本菌はヤチダモを主な宿主とし広範囲に分布し、その他の日本産、外国産トネリコ類にも感染可能であるが、一部のビロードトネリコ以外に被害は確認できなかった。本菌の宿主茎部への移動を抑制する宿主の抵抗性反応、越冬環境などの生育環境が発病に影響していると考えられる。ヤチダモ上でのH. fraxineusの生活環を解明するため、ヤチダモの葉、枝、芽より本菌に特異的なDNAプライマーを用いた本菌の検出、ならびに組織学的観察を行い、樹木内での存在形態を明らかにする。前年度に引き続き、トネリコ属植物の発病状況を調査、H. fraxineusとその類縁種と考えられる子実体の採集、菌類の分離、ならびに分離菌の分子系統解析を行う。
糖代謝能研究に適した高度分化型培養筋管細胞系の確立

電気パルス刺激により培養筋細胞に収縮活動を負荷できる特殊培養系を作製し、代謝能の研究に適した高度発達型培養筋管細胞系を確立することを目的としている。昨年度までの成果をさらに発展させ、電気パルスにより誘導されるサルコメア構造の新規構築の分子機構と細胞内カルシウムの影響について基礎的な検討を行うことを本年度の目的とした。【実績1】電気パルス刺激に完全に依存して細胞内カルシウム濃度が変動(Ca2+オシレーション)することを確認し、このCa2+オシレーションの周期(周波数)がサルコメア構造の新規構築に重要な役割を果たすことを明らかにした。さらに、Ca2+オシレーションにより、カルシウム依存性蛋白分解酵素であるカルパインの活性化が誘導され、このカルパインの活性化がサルコメア構造の新規構築に必須であることを明らかにした。この過程において、活性化されたカルパインは、細胞膜のIntegrinとアクチン細胞骨格を連結する役割を果たすTALINを分解すること、integrinを修飾するコラーゲン添加によりサルコメア構築が影響受けることから、筋管細胞の細胞接着班様領域を構成する蛋白複合体のCa2+-カルパイン依存性の分解と再構築が、新規サルコメア構造の形成に関与していることが示唆された。【実績2】本特殊培養系で作製された収縮型培養筋管細胞では、収縮に伴い(1)エネルギー代謝の亢進(2)糖の取り込み亢進(3)インスリン反応性GLUT4膜移行の改善が確認され、生体に非常に近似な高度発達型培養細胞系を確立することに成功した。【計画1】エネルギー代謝亢進に必須である収縮能力の獲得、すなわちサルコメア構造の発達を指標として、培養筋細胞の発達に適した培養条件を決定する。【実績1】電気パルスの刺激パターンおよび培養液の組成(アミノ酸と糖濃度)を至適化することにより、サルコメア構造を有し活発に収縮活動する高度発達型培養筋管細胞を作製することに成功した。(1)細胞外糖濃度は筋分化と糖輸送システムに非常に大きな影響をおよぼすことを明らかにした。また、(2)アミノ酸は分化後の筋管細胞の発達を促すことを明らかにした。【計画2】培養筋細胞においてインスリン反応性糖取り込みを高感度で検出できる測定方法を開発する。【実績2】遺伝子工学的にタグを導入したmyc-GLUT4-ECFPを恒常的に発現する筋芽細胞株(C2C12)を樹立した。この遺伝子改変筋細胞を用いることにより、抗myc抗体によりGLUT4の膜移行を生化学的(western blotting法)に簡便に測定することに成功した。実績1で作製した「運動負荷培養系」により培養筋細胞の収縮活動を誘導すると(1)それに伴いGLUT4の膜移行が増加すること、(2)インスリン反応性GLUT4膜移行が増強された。(3)本研究により、これまで存在しなかった「運動効果」を観察できる特殊培養筋細胞系の確立に成功した。
結晶中での選択的分子移動と不斉反応

1)N-アルキルフラン-2-カルボキシアニリド(1)の不斉光反応光学活性なホストと1との包接結晶に光照射すると、光学活性なトランスージヒドロフラン誘導体が得られた。包接結晶中でのN-アリルフラン-2-カルボキシアニリドの不斉反応機構は、包接結晶のX線結晶構造解析及びCDスペクトルにより検討した。光学活性ホストと1の包接結晶の調製法によって、その光反応生成物のキラリティーの逆転が見られた。2)N-メチル-N-フェニル-3-アミノ-2-シクロヘキセ-1-オン誘導体(2)の不斉光反応光学活性なホストと2の1:1包接結晶は、プリズム晶と針状晶の二種類が得られた。針状晶は固相で100時間光照射しても反応しなかった。プリズム晶は固相で19時間光照射すると、87%eeの(+)-N-メチルヘキサヒドロ-4-カルバゾロンが54%の収率で得られた。この2種類の結晶のX線結晶構造解析を行った。プリズム晶の方が針状晶より反応部位であるフェニル基とシクロヘキセノン環の二重結合がより近づいた構造をとっていた。3)N,N-ジメチルフェニルグリオキシルオキソアミド(3)の不斉光反応、3と光学活性ホストの再結晶法による包接結晶に光照射すると(-)-β-ラクタム誘導体が得られるが、3と光学活性ホストの固相混合法による包接結晶に光照射すると(+)-β-ラクタム誘導体が得られた。固相混合法による包接結晶を融点以下で加熱することで再結晶法と同じ包接結晶が得られた。4)光学活性ホストとの包接化による炭化水素およびsec-アルコールの光学分割光学活性ホストとの包接化による炭化水素およびsec-アルコールの光学分割を行い、それぞれ光学活性な炭化水素およびもec-アルコールが得られた。5)無溶媒有機合成法の開発無溶媒でエステルのけん化、ロビンソン環化反応、およびファボルスキー反応が能率よく進行した。1) N-アルキルフラン-2-カルボキシアニリド(1)の不斉光反応光学活性なホストと1との包接結晶に光照射すると、光学活性なトランス-ジヒドロフラン誘導体が得られた。光学活性ホストは酒石酸から誘導したホストなどを用いた。光学活性ホストとN-アリルフラン-2-カルボキシアニリドの包接結晶の調製法によって、その光反応生成物のキラリティーの逆転が見られた。2) N-メチル-N-フェニル-3-アミノ-2-シクロヘキセ-1-オン誘導体(2)の不斉光反応光学活性なホストと2との包接結晶に光照射すると、光学活性なN-メチルヘキサヒドロ-4-カルバゾロン誘導体が得られた。光学活性なホストと3-(N-メチルアニリノ)-2,5,5-トリメチル-2-シクロヘキセ-1-オンの1:1包接結晶は、プリズム晶と針状晶が得られた。

プリズム晶の方が針状晶より反応部位であるフェニル基とシクロヘキセノン環の二重結合がより近づいた構造をとっていることがわかった。3) N,N-ジメチルフェニルグリオキシルオキソアミド(3)の不斉光反応3と光学活性ホストの再結晶法による包接結晶に光照射すると(-)-β-ラクタム誘導体が得られるが、3と光学活性ホストの固相混合法による包接結晶に光照射すると(+)-β-ラクタム誘導体が得られた。固相混合法による包接結晶を融点以下で加熱することで再結晶法と同じ包接結晶が得られ、これに光照射すると(-)-β-ラクタム誘導体が得られた。1)N,N-ジメチルフェニルグリオキシルオキソアミド(1)の不斉光反応1と光学活性ホストとの包接結晶を固相で光照射すると、光学活性なβ-ラクタム誘導体が得られた。1と光学活性ホストとの1:1包接結晶のX線結晶構造解析を行い、1がキラルに配列していることがわかった。2)N-アルカノイル-β-エナミノン(2)の不斉光反応2と光学活性ホストとの包接結晶を固相で光照射後、アルミナ処理すると光学活性な生成物が得られた。光学活性ホストは(-)-ビス-β-ナフトールを用いた。2のと光学活性ホストとの1:1包接結晶のCDスペクトルを固相で測定すると、結晶中で2の分子がキラルに配列していることがわかった。3)光学活性ホストとの包接化による炭化水素およびsec-アルコールの光学分割光学活性ホスト化合物との包接化による炭化水素およびsec-アルコールの光学分割を行い、それぞれ光学活性な炭化水素およびsec-アルコールが得られた。光学活性な炭化水素の合成は容易でなく報告例が少ない。酒石酸から誘導したホストとの包接化により光学分割を用い、光学活性な炭化水素が得られた。ケトンを水中で水素化ホウ素ナトリウムを用いて還元すると、ラセミ体のsec-アルコール(13)が定量的に得られた。それを単離せずに、水中で光学活性ホストと包接化すると、光学活性なsec-アルコールがワンポットで得られた。4)無溶媒有機合成法の開発無溶媒での有機合成法を開発している。無溶媒でエステルのけん化、ロビンソン環化反応、およびファボルスキー反応が能率よく進行した。
非線形性に基づく人工物システムの強化

平成29年度の研究実績を踏まえて、今年度研究実績を以下にまとめる。(1)非線形性を指標とした人工物システムの自己診断:様々な環境下で自己判断できる半導体ガスセンサについて実験を行った。具体的には、異なる流速下で、周期的な温度摂動に対するセンサ電導度を測定したところ、ガス種に依存して特長的なセンサ応答と流速応答を示した。得られたセンサ応答を時間軸でフーリエ解析し、ガス種の特異的応答を評価した。これによりセンサ応答とセンサを取り巻く環境の両方を識別することに成功した。(2)人工物システムをやさしく使用するためのリミットサイクルの活用:周期的な充放電をバッテリーに与え、その時に発生する温度をモニターした。その結果、温度上昇を抑制する適切な充放電の周期または変調が存在することを見い出した。また周期的充放電に対する温度上昇の数値計算を行ったところ、実験結果と同様の結果を定性的に再現することに成功した。(3)同期による人工物システムの自励チューニング:一端のみ固定した、粘弾性と長さを持つ非線形振り子をカップリングさせた。その結果、振り子間の距離に依存して、同相、同相と逆相の共存、非同期の3つのパターンが生じることを見い出した。また共存領域では初期位相差が同じであれば同相、反位相であれば逆相が生じた。この実験結果を反応拡散方程式で訂正的に再現することに成功した。(4)時空間パターンを利用した人工物システムの強化:化学振動樹脂系で、周期的電圧と同期したパターン応答についても動的双安定の存在を見い出した。またこれまで時間情報でのみ同期現象を評価していなかったが、パターン形成を指標とした同期現象の評価の実験結果を見い出した。当初の計画と現在の実験成果を比較して次のように進捗状況をまとめる。(1)非線形性を指標とした人工物システムの自己診断:これまで半導体ガスセンサの非線形応答の特徴である、センサ温度vs.センサ電導度のヒステリシスループが、流速条件により、リミットサイクルが崩壊するかループの特徴が失われると予想したが、実際には、ガス種により特徴的な流速応答を示した。これはセンサ応答がガス種の識別だけでなくセンサを取り巻く環境も同時に識別することを意味するので順調に進捗している。(2)人工物システムをやさしく使用するためのリミットサイクルの活用:周期的な充放電をバッテリーに与え、その時に発生する温度をモニターしたところ、温度上昇を軽減する適切な電圧周期と変調が存在することを見い出すとともに、数値計算による定性的再現に成功したことから順調に進んでいると考えられる。(3)同期による人工物システムの自励チューニング:同期現象を活用して、自励チューニングが行える実験系として、粘弾性高分子系を提案し、数理モデルでも現象をできたところは進捗しているといえる。化学振動ゲル系を行う前に、樹脂系で周期的電圧摂動に対して同期現象が発現することを見い出したところも貴重な進展と考えられる。(4)時空間パターンを利用した人工物システムの強化:マイクロレベルの化学振動樹脂ビーズ系で、周期的電圧と同期してパターンも変化するとともに、従来とは異なる「動的双安定」の存在を見い出したことは学術的にも価値がある。またこれまで時間情報でのみ同期現象を評価していなかったが、パターン形成を指標とした同期現象の評価実験系を見い出したことは今後の研究の発展につながる。今度の研究の推進方策を以下にまとめる。(1)非線形性を指標とした人工物システムの自己診断:流速以外の妨害パラメータ(例えば湿度や老朽化)について実験を行う。そしてこれらの妨害パラメータをセンサの交換時期の自己診断の指標とする。(2)人工物システムをやさしく使用するためのリミットサイクルの活用: (1)や周期的充放電システムでは温度または電圧を外部から強制的に加えていたが、逆にリミットサイクルを活用して、適切な温度摂動または電圧摂動を自動的にフィードバック制御できるシステムを作成する。(3)同期による人工物システムの自励チューニング:粘弾性高分子系では同期の自励チューニングが可能であるが、柔らかさを失うため、短時間の測定しかできない問題がある。人工物強化のための実践的なシステムには至っていないので、より安定で寿命が長い材料の選定と条件の最適化を行っているところである。化学振動樹脂ビーズ系においては外部電圧に強く依存するため、自励チューニング力が弱いので、より高い実験系へと改良することを計画している。(4)時空間パターンを利用した人工物システムの強化:化学振動樹脂ビーズ系で、周期的電圧と同期してパターンも変化することを見い出すと共に、従来とは異なる「動的双安定」の存在を見い出したことは学術的にも価値がある。今後はこの発見を活用して、振動パターンに基づく「動的安定性」を利用した人工物システムの強化を行う。生体系や自然界で見られるリズムやパターン形成は、生命活動を営む上でも重要であり、私達はこのような現象と向きあって生活してきた。一方、これまでの人工物システムは、限られた条件下、定められた交換時期や消費期限の中で使用されている。そして、その安全性や機能性を確認するために定期検査が行われる。しかし多くのシステムは自律性がないために、不測の環境変化に対して本来の機能を失っても自己修復することができないばかりか、自発的に自身の状態を外部に伝える術もない。つまり、不完全環境情報問題に至る。

それに対して多くの生物は、環境変化に対して柔軟に応答することが可能であり、時には人間社会に対して、異常繁殖のように異常現象として自身の状況に関してメッセージを送ることができる。その中で、リズムやパターンに関する学問である「非線形科学」は国内外でも進展してきた。そして複数の要素が複雑に関わる生体系や自然界で見られるリズムとパターンについて、本質的要素の抽出と基本原理の解明が進んでいる。そこで本研究では、非線形科学に立脚して、情報次元、自律性、及び応答の柔軟性を高めることで人工物システムを強化することを目的とする。具体的には、味覚・嗅覚に学び、膜界面の非線形性を活用したセンシングシステムを設計した。これまでのセンシングシステムは線形情報だけであったが、非線形性を指標とした高次元情報型のセンシングシステムを構築した。また時空間発展現象として時空間パターンを自律的に形成する系を活用する実験系を構築・最適化した。システムの自律性を高めることで、環境の変化に対してより特徴的勝柔軟な応答をすることができるシステムを実験的に構築しているところである。特にリズムやパターンの活用は、生物と同様により効率よく応答することから、従来の人工物を強化する有力な観点になると考えている。センシング部門ではバッテリーやセンサ等、具体的な題材について研究成果が見えている。時空間パターン部門については、時空間パターンをフィードバックさせて新たなパターンを形成するシステムが構築されている。自律運動系については研究成果を複数報告した。平成29年度の研究実績を踏まえて、今年度研究実績を以下にまとめる。(1)非線形性を指標とした人工物システムの自己診断:様々な環境下で自己判断できる半導体ガスセンサについて実験を行った。具体的には、異なる流速下で、周期的な温度摂動に対するセンサ電導度を測定したところ、ガス種に依存して特長的なセンサ応答と流速応答を示した。得られたセンサ応答を時間軸でフーリエ解析し、ガス種の特異的応答を評価した。これによりセンサ応答とセンサを取り巻く環境の両方を識別することに成功した。(2)人工物システムをやさしく使用するためのリミットサイクルの活用:周期的な充放電をバッテリーに与え、その時に発生する温度をモニターした。その結果、温度上昇を抑制する適切な充放電の周期または変調が存在することを見い出した。また周期的充放電に対する温度上昇の数値計算を行ったところ、実験結果と同様の結果を定性的に再現することに成功した。(3)同期による人工物システムの自励チューニング:一端のみ固定した、粘弾性と長さを持つ非線形振り子をカップリングさせた。その結果、振り子間の距離に依存して、同相、同相と逆相の共存、非同期の3つのパターンが生じることを見い出した。また共存領域では初期位相差が同じであれば同相、反位相であれば逆相が生じた。この実験結果を反応拡散方程式で訂正的に再現することに成功した。(4)時空間パターンを利用した人工物システムの強化:化学振動樹脂系で、周期的電圧と同期したパターン応答についても動的双安定の存在を見い出した。
実践的英語音声指導力の向上をはかる連携英語教員養成カリキュラムの開発、運用、評価

研究は教育学部教員養成課程において実践的英語音声指導力の質的向上をはかる初・中等英語教員養成カリキュラムの開発・運用・評価を実証的に行うものである。研究では(1)英語の教員免許を取ろうとする学生のほぼすべてが中学・高校では、「聞いて、ひたすら、聞こえた英語を真似する」以外の英語の発音指導、音声指導を受けていないこと、一方で(2)英語の発音力、英語の音声指導力の向上を強く願いながら、(3)具体的にどうすれば英語の発音力、英語の音声指導力の向上がはかれるか具体的な解決策が見えない現状が明らかになった。研究ではこれらの課題の解決をはかる教員養成カリキュラムの開発・運用・評価を進めた。本年度は、引き続き、教育学部教員養成課程で初・中等英語科教員を目指す学生を対象に、「将来の英語科教員が備えるべき実践的英語指導力、授業力」の基礎を作る教育プログラムの構築に向けた研究を進めた。具体的には、1)学生自らの英語の発音力の向上をはかる、(1)学生が大学のネットワークの内外から利用できる、英語発音力向上のために開発したe-learning教材の運用、(2)学生の英語の発音力向上をはかるために開発した教育プログラムの運用と運用面での課題の検討を進め、2)学生の実践的英語音声指導力向上をはかる上で、(1)教育実践の場である中学・高等学校の教室での、学生の実践的英語音声指導力向上教育プログラムの運用で明らかになった課題の検討、(2)実践的英語音声指導力向上教育プログラムの本格的な運用に向けての、中学・高等学校の教室での試験的授業の実施をすすめた。本年度は、小学校外国語活動(英語)から中学校英語への橋渡しをはかる音声指導についても研究を進めた。さらに「将来の英語科教員が備えるべき実践的英語指導力、授業力」の基礎を養ううえでの基礎資料となる脳の音声処理についての研究も進めた。研究成果の還元としては、滋賀大学主催公開講座「英語の発音をまなぼう」を学生と共同開催した。主な研究成果は次のとおりである。2.椙本はる香、田附弘和、大嶋秀樹(2013)「小学校外国語活動と中学校外国語の滑らかな接続を図る英語指導プログラムの開発」『地域教育連携年報』(滋賀大学教育学部地域教育支援室)第8号, pp.42-43.本研究の目的は、教育学部教員養成課程と実習学校が連携して、実践的英語音声指導力の質的水準の向上をはかる英語科教員養成カリキュラムの開発、運用、評価を実証的に行うことであった。具体的には、教員養成課程で初・中等英語科教員を目指す学生を対象に、1)学生自らの英語の発音力の向上と、2)学生の実践的英語音声指導力の向上をはかる英語科教員養成カリキュラムの開発、実施を進め、「将来の英語科教員が備えるべき実践的英語指導力、授業力」の基礎をつくる教育プログラムの構築に向けた検証を行うことを目的として研究を進めた。研究の初年度から最終年度は、教員養成課程で英語の教員を目指す学生の、1)学生自らの英語の発音力の向上をはかる学部での授業カリキュラムの構築とそのための調査、2)学生の実践的英語音声指導力の向上をはかる英語科教員養成カリキュラムの構築とそのための調査を行い、2年目から最終年度にかけて、3)「将来の英語科教員が備えるべき実践的英語指導力、授業力」の基礎をつくる教育カリキュラムの構築に際し、運用上の検証を進めていった。研究の検証では、受講学生の英語の発音力、発音指導力の2点について、量的な調査、質的な調査による成果データ、検討のための資料データを中心としたデータを収集、解析し、その検証を進めていった。研究の成果として、1)学生自らの英語の発音力の向上をはかる学部での授業カリキュラムの構築に向けた授業プログラムづくりがほぼ完成し、2)学生の実践的英語音声指導力の向上をはかる英語科教員養成カリキュラムの構築に向けた基礎研究が完成し、実践への応用による検証(実習校での成果の検証)を途上段階まで進めることができた。本研究は、教育学部教員養成課程の教員、学生のおかれた環境を最大限生かし、英語の発音力、英語の音声指導力の実質的な向上をはかる、実践的、実証的研究として今日的意義を持つものといえる。本年度は、教育学部教員養成課程で初・中等英語科教員(外国語活動・英語)を目指す学生を対象に、1)学生自らの英語の発音力の向上、2)学生の実践的英語音声指導力の向上をはかる英語科教員養成カリキュラムの開発と試験的運用を進め、「将来の英語科教員が備えるべき実践的英語指導力、授業力」の基礎を作る教育プログラムの構築に向けた研究を進めた。

具体的には、1)学生自らの英語の発音力の向上をはかるために、(1)学生が大学のネットワークの内外から利用できる、英語発音力向上のためのe-learning教材の開発と試験的運用、(2)学生の英語の発音力向上教育プログラムの開発と運用を進め、2)学生の実践的英語音声指導力向上をはかるために、(1)教育実践の場である中学・高等学校の教室での、学生の実践的英語音声指導力向上教育プログラム運用に向けた基礎的資料収集のためのフィールドワーク調査、(2)実践的英語音声指導力向上教育プログラムの開発と運用に向けての、中学・高等学校の教室での試験的授業の実施をすすめた。本年度の主な研究成果は、次のとおりである。1.多良静也、大嶋秀樹、柳澤佳代子(2011)「訛り英語を再考する」『発表要旨集』(全国英語教育学会第36回全国研究大会), pp.330-331.2.多良静也、大嶋秀樹(2011)「日本語訛り英語発音が中国人の英語聴解力に及ぼす影響」『紀要』(四国英語教育学会)第31号, pp. 37-46.3.大嶋秀樹(2011)「英語教育と情報教材」『情報学教育研究』(情報学教育研究会)2011年号, pp.25-32.4.大嶋秀樹、疋田恭子(2012)「中学・高等学校一貫教育における、英語音声指導プログラムの開発、運用、評価」『地域教育連携年報』(滋賀大学教育学部地域教育支援室)第7号, pp.39-49.本研究の目的は、教育学部教員養成課程で初・中等英語科教員(外国語活動・英語)を目指す学生を対象に、1)学生自らの英語の発音力の向上、2)学生の実践的英語音声指導力の向上をはかる英語科教員養成カリキュラムの開発、実施をはかり、「将来の英語科教員が備えるべき実践的英語指導力、授業力」の基礎を作る教育プログラムの構築に向けた研究を進めることである。本年度の研究計画は、1)英語発音力向上のために開発したカリキュラの運用と運用上の課題の検討、2)実践的英語音声指導力向上のために開発したカリキュラムの運用と運用面での課題の検討、3)実践的英語音声指導力向上のためのカリキュラム導入前・導入途上の英語発音力の実態の基礎的データ収集の3点を進めることであった。1)については、(1)学生が大学のネットワークの内外から利用できる、英語発音力向上のために開発したe-learning教材の運用、(2)開発した学生の英語の発音力向上教育プログラムの運用、(3)学生の英語発音力向上とその成果の評価のための英語発音力向上のためのソフトウェアの利用とその成果の検証を進め、2)については、(1)教育実践の場である中学・高等学校の教室での、学生の実践的英語音声指導力向上教育プログラムの運用と運用面で明らかになった課題の検討、(2)実践的英語音声指導力向上教育プログラムの運用に向けての、中学・高等学校の教室、中学生・高校生対象の公開講座での試験的授業の実施をすすめ、3)については、主として、英語音声指導を受ける学習者(中学・高等学校)の、音声指導を受ける前、受けた後の伸びについての調査を進め、本研究の実施に必要な基礎的データを得ることができた。本研究の目的は、教育学部教員養成課程で初・中等英語科教員(外国語活動・英語)を目指す学生を対象に、1)学生自らの英語の発音力の向上、2)学生の実践的英語音声指導力の向上をはかる英語科教員養成カリキュラムの開発、実施をはかり、「将来の英語科教員が備えるべき実践的英語指導力、授業力」の基礎を作る教育プログラムの構築に向けた研究を進めることである。
癌リプログラミングによる大腸発癌モデルにおけるエピジェネティクス修飾の役割解明

microRNAは癌研究の分野で近年注目されており、その制御異常が癌関連分子の発現異常を引き起こすことが知られている。当教室ではmiR-200c, 302, 369の3つのmiRが、iPS細胞に代表される細胞の若返りを誘導し、癌細胞では悪性度を低下させることを報告した。本研究では大腸腫瘍自然発生マウスを用いて、腫瘍が発生する途中の段階で上記miRを投与すると、腫瘍の発生数が抑制された。また、また大腸粘膜において細胞死に関与するp53遺伝子を誘導するMAF遺伝子の発現が増加していた。家族性大腸腺腫症の患者へのこのmiRの導入によって腫瘍発生が抑制される可能性があり今後の治療への応用が期待される。CPC-Apcマウスに、8週齢から15週齢まで週3回のペースで合計24回、上記7種類のmicroRNAを25ugずつ尾静脈より投与した。Drug delivery systemとしては、2015年に我々が報告したSuper carbonate apatiteを使用した。癌化の過程の観察として、小動物用大腸内視鏡検査を9週齢、13週齢の時点で施行し、15週齢で解剖して大腸の正常粘膜、腫瘍を摘出した。造腫瘍能の評価として腫瘍個数を比較したところ、microRNA投与群はmicroRNA非投与群と比較して有意に少なく、7種類のmicroRNAを投与することによる腫瘍抑制効果が明らかになった。現在、microRNA投与群、microRNA非投与群それぞれの正常粘膜と腫瘍のRNAを、遺伝子発現マイクロアレイ、microRNAマイクロアレイに提出し、現在解析を行っている。microRNAによる腫瘍抑制効果は、家族性大腸腺腫症患者の癌の予防、発症時期の遅延や、散発性大腸癌の予防に繋がる可能性があり、実地臨床への発展も視野に入れて、今後メカニズム解析を含めた研究をさらに進めていく。CPC-Apcマウスに、miR-200c, 302, 369を週3回、8週間の合計24回尾静脈から投与した。発生した腫瘍個数は、control群と比較してmiR投与群のマウスで有意に抑制された。そこで、miR投与群とcontrol群の背景粘膜、および腫瘍部について、遺伝子発現マイクロアレイで網羅的に解析を行った。Gene Set Enrichment Analysis(GSEA)を行ったところ、control群の腫瘍部では、背景粘膜と比べると腫瘍発生や増殖に関連する遺伝子群が変動していた。また、miR投与群の背景粘膜では、control群と比べるとES細胞に関連する遺伝子群が変動していた。なお、両群間の腫瘍部の比較では、遺伝子プロファイルは類似しており、miRによって背景粘膜の遺伝子プロファイルが変動することで、APCノックアウト誘導性の腫瘍発生が抑制されたと考察された。具体的に変動する遺伝子として、miR投与群の背景粘膜とcontrol群の背景粘膜、control群の腫瘍部で、段階的に発現が増加、あるいは減少する遺伝子として68個を同定した。そのうち、miRマイクロアレイで変動するmiRとseed配列で一致する遺伝子を7個認め、既存の報告で転写因子として知られるMAF遺伝子について研究を進めることとした。当教室で切除した大腸癌患者の臨床検体において、MAFの発現は正常部と比較して癌部で発現が低下していることが示され、癌抑制遺伝子としての機能を有している可能性が示唆された。ラットの小腸上皮細胞株IEC18においてMAFをノックダウンすると、細胞増殖能が増加し、大腸癌細胞株HCT116とLS174T(P53 +/+)でMAFを強制発現すると、p53, p21の発現が増加し、細胞増殖能が低下した。CPC-Apcマウスに対するmicroRNAの投与は、我々の報告をベースに、リプログラミングを誘導するmicroRNA-302a, microRNA-302b, microRNA-302c, microRNA-302d, microRNA-369-3p, microRNA-369-5p, microRNA-200cの7種類で行った。当初平成26年度に予定していたin vitroの「マウス大腸癌細胞における癌リプログラミング療法の検討実験」は行っていない。8週齢から15週齢までの8週間、週3回の合計24回、マウスへの投与を行い、現在解析中である。平成26年度の研究成果として、腫瘍形成に関する評価、遺伝子発現マイクロアレイ(解析中)、microRNAマイクロアレイ(解析中)が完了している。マイクロアレイについては、大阪大学微生物病研究所と共同研究契約を締結し、マイクロアレイを専門に取り扱う部門とタイアップすることによって、効率的に解析を進めていくこととした。解析が終了し次第、validationの実験に取り掛かる予定である。

エピゲノム変化はDNAメチル化、ヒストン修飾、クロマチン構造の変化、microRNAの網羅的な解析を予定しており、具体的には、まずメチル化DNAシーケンスによるエピゲノム解析を平成27年度に予定している。研究の順序こそやや前後しているものの、着実にデータが蓄積されつつあり、おおむね順調に進展していると考えられる。消化器癌リプログラミング誘導microRNAの投与による腫瘍抑制効果は、腫瘍発生個数の抑制として示すことができたが、腫瘍サイズが小さいため、腫瘍重量や腫瘍径などの評価は行うことができなかった。再度同様の実験系を行うことにより、同様の変化がみられるかの確認とともに、評価できなかった項目についても検討することが必要と考えている。現在、microRNA投与群、microRNA非投与群それぞれの正常粘膜と腫瘍に関して、遺伝子発現マイクロアレイ、microRNAマイクロアレイに提出し、解析を行っている。まず前述の7種類のmicroRNAを投与したことによって変動する遺伝子を同定することとした。変動した遺伝子のQuantitative RT-PCR、その遺伝子が標的とするタンパクの発現について免疫組織学的染色を行い、マイクロアレイのvalidationを行う。その結果に基づいてUpstream解析を行うことで、どのようなpathwayが変動しており、投与したmicroRNAがそのpathwayに対してどのように作用したかを明らかにする。また、その遺伝子がヒト大腸癌においてどのような発現パターンを示すかについても、当教室で前向きに採取、保管しているヒト臨床サンプルを用いて解析することを予定している。エピゲノム変化の評価については、ここまでの過程で得られた遺伝子発現の結果に基づいて行うこととした。エピゲノム変化はDNAメチル化、ヒストン修飾、クロマチン構造の変化、microRNAを網羅的に解析することを予定しており、DNAメチル化についてはメチル化DNAシーケンス、ヒストン修飾は次世代sequencing技術によりゲノムワイドにヒストンメチル化やアセチル化修飾パターンを調べることを予定している。