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明治時代の京都を訪れたイギリス人の京都観とその思想的背景に関する比較文化研究

当時のイギリス人の京都観には、日本への憧れと共に、彼らの文明観、都市観と時代のイデオロギーが明確に或いは暗示的に投影されている。そこで、彼らが京都に期待したこと、肯定的/否定的に評価したことを明らかにすることによって、日本文化受容の一端を歴史的に把握するとともに、京都学に国際的視点を加えることを目指した。イギリス関係と京都関係の資料を比較して、欧米からの需要と、それに応える京都からの供給の間に齟齬が生まれる経緯、例えば京都の輸出用工芸品が、ジャポニスムの流行に乗って大量消費された後、短期間のうちに衰微していった経緯なども明らかになった。本研究の最大の成果は、京都訪問に言及する多くのイギリス人による旅行記の存在が明らかになったことである。これは主に、精力的に資料調査を行った研究分担者長谷川雅世の功績である。3年間の研究成果を論文と公開シンポジウムという形で発信することができた。それらの成果を最終の成果報告書に再録してまとめた。明治時代の京都を訪れたイギリス人の旅行記や雑誌記事、絵画・写真等の図像は、当時の京都を知る上で貴重な資料だが、本研究はそれらと京都から発信された資料を用いて、イギリス人が形成した京都観に影響を与えた諸要素をも明らかにすることを目的とした。イギリスでの調査で、京都訪問に言及する多くの旅行記の存在を明らかにした。京都の伝統文化と近代化・観光地・神社仏閣・文化財・工芸品・演劇等への、イギリス人の肯定的/否定的評価とその変化を分析することによって、そこに彼ら自身の文明観・都市観・宗教観と時代のイデオロギーが明確に或いは暗示的に投影されていることを明らかにし、京都学に国際的視点を加えることができた。平成26年度は、予定通り資料の収集と分析を引き続き行い、研究代表者の野口がイギリスにおいて19世紀末から20世紀初期の旅行記・ガイドブック・ヴィジュアル資料等を収集した。その成果として、研究目的に記したテーマのうち「1京都の伝統文化と近代化へのまなざし」「2京都の景観へのまなざし」「4京都の美意識へのまなざし」について、論文3本と公開研究会において研究成果を発表した。平成27年度は「3京都の産業へのまなざし」に関して、明治時代の工芸品制作へのイギリス人のまなざしをテーマとするシンポジウムを予定している。また26年度も資料調査を行った「5京都の演劇へのまなざし」についても調査結果をまとめる予定である。比較言語文化平成27年度は引き続き研究代表者と分担者が資料の収集と分析に努める。代表者の野口が9月に行うロンドンでの調査で、旅行記・ヴィジュアル資料の他、主要輸出産業であった京都の工芸品についても調査し、27年度後半には、明治時代の工芸品制作へのイギリス人のまなざしをテーマとするシンポジウムを京都で開催する予定である。年度末には3年間の研究成果を冊子体の報告書にまとめる予定である。平成25年度は資料の収集と分析を重点的に行う予定であった。研究代表者の野口は国内で入手できる資料の収集に努めた。野口は部局長を兼務していたため、資料収集に当初予定していた時間をかけることができず、主にインターネットを利用した資料収集を行った。そのため、当初予定していた図書・文献・ヴィジュアル資料の収集にかかる予算のうち、一部を用いるにとどまった。演劇の研究を分担する佐々木は、まず基本的な調査を行ったために、現在資料の収集の途上である。
小径腎癌に対するロボット腎部分切除術における新しい手術法の開発

本研究では、3D画像構築技術、ロボット技術を利用し、低侵襲を維持したまま、癌の根治性と腎機能温存を達成する腎部分切除術式の開発を目的とした。成果として、術前臨床症例のCT画像から腫瘍、腎、血管が色分けされた3D模型作成システムを確立した。また、術前に3D構築ソフトをもちいて腎血管と腫瘍との関係につき細部の動脈まで描出し、さらに上述した3D模型をもちい、術前にあらゆる角度からの評価を行うシミュレーションシステムを確立した。さらにこの3D構築画像をもちい、術中に術者が計画通り切除できるようなイメージガイドによるナビゲーションシステムを確立し、実際のロボット支援腹腔鏡下腎部切除術に応用した。術前臨床症例のCT画像から3D構築画像を作成した。あわせて、腫瘍、腎、血管が色分けされた3D模型を3Dプリンタを用い作成した。CT画像から作成した3D画像を手術チームで評価し、画像からアプローチ方法(経腹膜、後腹膜)と温存する血管とクランプする血管を決定した。その結果をもとに腫瘍、血管、腎が色分けされた模型をもちいそのプランの妥当性を評価した。その後切除lineの検討を行った。クランプする血管、温存する血管の位置関係を確認しながら詳細な検討を行った。そうして3D画像、立体模型双方で確認し、最終の切除line、温存する血管、クランプする血管とその部位を決定した。各手術ごとにこの手順を繰り返し3D画像および立体模型を用いたシュミレーションシステムを構築すべく検討した。実際に作成した3D構築画像、立体模型、シュミレーションをもとにロボット腎部分切除術を行った。Osirixで作成した3D構築画像は術中にコンソール画面に挿入し、術者が計画通り切除できるようアシストした。適宜立体模型を参考に手術を遂行した。切除組織についてはまず肉眼的所見を観察し、シュミレーションで得られた模型と比較した。切除組織はstep sectionを行い、組織型、切除断端における癌の陽性の有無について検討した。術前に血中Cr、eGFR、レノグラム、レノシンチを施行しておき、術前の総腎機能、分腎機能を評価しておいた。術後、血中Cr, eGFRについては術後1W、1M、3M、6M、12Mに時点で評価した。レノグラム、レノシンチについては術後3M, 12Mで施行し、分腎機能、残存腎機能について評価した。術前腎機能と術後腎機能を評価し、Cr、eGFRの変動、CKDの状態の評価、分腎機能評価による切除側の腎臓における機能の変化を評価した。前年度に引き続き、術前臨床症例のCT画像から3D構築画像を作成し、さらに腫瘍、腎、血管が色分けされた3D模型を3Dプリンタを用い作成した。CT画像から作成した3D画像、3D模型を用い、手術チームで評価し、アプローチ方法(経腹膜、後腹膜)と温存する血管とクランプする血管を決定し、切除line等の詳細な検討を行った。このような手術チームによる術前シミュレーションシステムを確立した。3D作成ソフト、Osirixで作成した3D構築画像は術中にコンソール画面に挿入し、術者が計画通り切除できるようなimage guidanceによるnavigationsystemを確立し、今回のこのimage guidanceによるnavigation systemを用いたロボット支援腹腔鏡下腎部切除術を確立した。手術成績の評価を行った。術後の腎機能については、従来の腹腔鏡手術に比較し改善を認めた。また、レノグラムを用いた分腎機能の評価も行った。本研究で確立した、image guidanceによるnavigationsystemを用いて手術を行う事で、いわゆる高難易度の症例においても良好な腎機能が維持できる事が確認された。切除断端の検討においては、全例で切除断端癌陰性であり、癌手術として妥当である事が確認された。合併症についても従来の方法と比較し増加する事はなかった。6か月以上の中長期の腎機能についても増悪無く、本システムを用いて行ったロボット支援腹腔鏡下腎部分切除術が、長期の腎機能においても良好な成績が得られる事が確認された。さらに従来の開腹手術との比較検討も行ったが、本システムのロボット支援腹腔鏡下腎部分切除術が、癌の根治性、腎機能を障害する事無く、低侵襲手術を実現できる事が確認された。腎泌尿器科学平成25年度には1:3D画像構築と立体模型の作成、2:3D画像および立体模型を用いたシュミレーションシステムの確立、3:手術への応用、4:切除病理組織の検討、5:術後腎機能の評価、6:手術ビデオにおけるフィードバック、を予定していた。

CT画像から作成した3D画像を手術チームで評価し、画像からアプローチ方法(経腹膜、後腹膜)と温存する血管とクランプする血管を決定し、その結果をもとに腫瘍、血管、腎が色分けされた模型をもちいそのプランの妥当性を評価した。そうして3D画像、立体模型双方で確認し、最終の切除line、温存する血管、クランプする血管とその部位を決定した。実際に作成した3D構築画像、立体模型、シュミレーションをもとにロボット腎部分切除術を行った。Osirixで作成した3D構築画像は術中にコンソール画面に挿入し、術者が計画通り切除できるようアシストした。適宜立体模型を参考に手術を遂行した。現時点まで安全に手術が行えている。シュミレーションシステムの構築前年度同様、術前臨床症例のCT画像から3D構築画像を作成し、あわせて、腫瘍、腎、血管が色分けされた3D模型を3Dプリンタを用い作成しする。CT画像から作成した3D画像を手術チームで評価し、画像からアプローチ方法(経腹膜、後腹膜)と温存する血管とクランプする血管を決定し、その結果をもとに腫瘍、血管、腎が色分けされた模型をもちいそのプランの妥当性を評価し、その後切除lineの検討を行う。通常の手術での視野以上に様々な角度から評価可能であり、クランプする血管、温存する血管の位置関係を確認しながら詳細な検討を行う。そうして3D画像、立体模型双方で確認し、最終の切除line、温存する血管、クランプする血管とその部位を決定し、各手術ごとにこの手順を繰り返し3D画像および立体模型を用いたシュミレーションシステムを構築すべく検討を行う。さらに実施の手術所見と照らし合わせその妥当性を検討する。統計解析術後の腎機能の各種パラメータ(血中Cr, eGFR,レノグラム,レノシンチ)から術後腎機能の変化の評価を行い、従来の方法との比較を行う。比較の際には切除組織の体積、腫瘍体積の補正を行う。RENAL nephrometry score, PADUAscoreを評価し、腫瘍の切除における難易度をあわせて術後の腎機能の従来の方法との比較を行う。臨床例に即して使用したので予定していた額より少なくなった為。平成26年度と合算して使用する。
早産児・双胎児における乳児期の睡眠行動と幼児期の行動発達評価との関連について

出生体重が1,500g未満で生まれた極低出生体重児(VLBW児)では、正体重児(NBW児)に比べて、知的障害や自閉スペクトラム症の発症頻度が高いことが知られている。これらの児では2歳以降に言葉の遅れや行動上の問題を指摘されることが多い。1)2歳前後に施行した行動観察評価において、VLBW児ではNBW児に比べて他者の視線を追いかけたり、指差しに反応したりするには、より多くの手がかりを必要とすることが明らかとなった。2)VLBW児、NBW児各10例について、修正12カ月から24カ月までの間、特殊なピンマイクを用いて親と子どもの日常的なやり取りを3ヵ月毎に30-40分程度経時的に記録した。これらの記録物から子どもの音声のみを注意深く切り取り、フォルマント解析を行った。すべての児を対象に2歳時点において、行動評価スクリーニング試験(CBCL及びM-CHAT)を施行したところ、VLBW児3名、NBW中1名がスクリーニング試験をパスできなかった。スクリーニング試験通過群と非通過群の2群に分けてフォルマント解析結果をプロットした。スクリーニングを通過したVLBW児7名とNBW児9例では、月齢と共にF1、F2のフォルマント分布領域が有意に広がり、音声表出機能の発達が推測された。VLBWとNBW児間に有意な差は認めなかった。一方、スクリーニングを通過できなかった4名ではフォルマント分布領域の広がりが有意に少なかった。今回の結果より、早期からの音声(表出音)解析は、ASD児を早期に発見し支援するための有力な手法となる可能性が示唆された。3)双胎で生まれた5組(計10名)とその母親5名を対象に、アクチグラフ(加速度内臓の睡眠記録器)を母と児に装着し、3者間の睡眠比較を行った。月齢と共に双胎両児の睡眠パターンが同期するようになり、同期が進むにつれて母親の睡眠時間も増加することが明らかとなった。1.早産児を対象に2歳前後に行動発達を評価し、1500g未満の体重で生まれた児では、他者の視線を追いかけたり、指さしに反応したりするために、正常の体重で生まれた児より多くの手がかりを必要とすることを報告した。2.自閉症のある児では、通常の発達特徴を持つ子どもに比べて睡眠行動の異常を示がす頻度が高いことを報告した。3.子どものチェックリストを用いて、インドネシア及び日本において、自閉スペクトラム症のある子どもの特徴的な行動パターンを報告した。4.双胎で生まれた乳児5組とその母親5名を対象に、新生児期から乳児期にかけて経時的に睡眠パターンを計測した。睡眠計測には、睡眠日誌と共にアクチグラフ(加速度センサー内臓の睡眠記録器)を各児の足首並びに母親の手首に装着し、連続7日間の計測を行った。夜間の覚醒時間は、予定日より数えて(修正月齢)3ー6週(219.5分)から8ー15週(130.7分)にかけて急速に減少し、その後は、13ー15週(115.0分)、17ー20週(123.3分と)ほぼ一定であった。また、一日の睡眠時間全体の中で、夜間睡眠時間の占める割合は、修正月齢3ー6週(57.5%)、8ー15週(63.6%)、13ー15週(65.5%)、17ー20週(69.6%)と月齢とともに有意に増加した。1分ごとに双胎両児の睡眠状態を照合したところ、全5組とも月齢が進むにつれて、双胎両児の睡眠パターンが同期しするようになった。同室に眠る場合、両児が別々の睡眠行動をとる割合は月齢が進むにつれて減少した。さらに、同時に計測した母親の睡眠パターンより、双胎2児の睡眠の同期が進むに連れて母親の睡眠時間が増加することが明らかとなった。現在、この知見に関して論文にまとめている。本研究の目的は、1)極低出生体重(VLBW)児や双胎(TW)児などのハイリスク児と正常体重児(NBW)における睡眠リズムの差異を明らかにすること、2)睡眠リズムの異常と共同注意運動、表出性言語などを含めた発達予後との関係を明らかにすることの2点である。現在までの一連の研究を通じて、行動観察法の信頼性検討を行い、極めて信頼性の高い評価法を同定・確立してきた。これらの研究成果を自閉スペクトラム症(ASD)のリスクが高い極低出生体重児(VLBW)群、双胎(TW)児に応用していこうと計画している。これまでに、VLBW児における共同注意行動の特徴、ASD児の睡眠特徴については、国際誌に投稿し、受理されている。平成28年度には、双胎5組についても経時的な睡眠行動を終え、母親の睡眠行動に合わせてデータ解析を行っている。また、VLBW児52例、正常体重(NBW)児50例に関しても、共同注意行動に関する分析をほぼ完成しつつある。さらに、VLBW児10例に関しても経時的な音声収集を終えた。これらの進捗状況を考えると、まだ、結果の解析には至っていないものの、当初の計画通りほぼ順調に研究計画は進んでいるものと評価できる。一方で、平成28年度に、自閉スペクトラム症(ASD)評価のための半構造化観察検査(ADOS-2)の日本語版が開発され、日本でも利用できるようになった。国際的にも標準的な検査であるため、本研究の行動発達評価項目として新たに加えることとした。

今後、対象とする症例数の増加を諮るとともに、これまでに取得したデータ解析を進めていく予定である。乳幼児期の発達を評価し、予後を正しく予測することは臨床的に極めて重要である。1.1,500g未満の体重で生まれた早産児(極低出生体重児)を対象に、2歳前後における行動発達を評価したところ、これらの児では、正常の体重で生まれた児に比べて、他者の視線を追いかけたり、指さしに反応したりすることをスムースにできない割合が有意に高かった。2.これらの児を対象に3歳から5歳時にCBCL行動評価表を用いて行動発達を評価したところ、2歳時に行動上の問題が見られてなくとも3歳以降に顕在化する例や、逆に2歳時に問題を認めていても落ち着く例が見られた。今後、さらにフォローアップ症例を増やして、それらにの変化に関連する要因を明らかにしていく予定である。3.双胎で生まれた乳児5組と母親5名を対象に、アクチグラフィーを用いて新生児期から乳児期にかけて継時的に睡眠パターンを測定した。夜間における児の覚醒時間は、修正週齢とともに有意に減少し、睡眠時間は有意に増加した。一方、1分間ごとに睡眠行動を比較したところ、月齢とともに両児が同じ睡眠行動をとる割合が急激に増加した。また、双生児同士が同床で寝ている場合には、別床で眠っている場合に比べて両児の睡眠状態が同調する頻度が増えた。4.3歳から12歳までの定型発達児198人を対象に、立位バランス機能と手の巧緻運動における年齢に伴う変化及び両者間の相関について検討した。年齢に依存して立位時の動揺値は減少し、ボタン動作に要する時間は減少した。全年齢を通じた解析では、立位バランス機能と手の巧緻運動間に有意な相関を認めたが、年齢が同一の集団では両者間に有意な相関は認めず、直接の関連性は限定的であった。5.1歳前後の極低出生体重児及び定型発達児30名につき、2歳まで1年間にわたり継時的に音声を記録した。現在、独自に開発したソフトを用いて音声分析を進めている。乳幼児期には様々な機能が急速に発達する。一方で、発達上にリスクとなる要因のいくつかは既に判明している。これらのハイリスク児では、様々な観点から発達状況を評価し、将来の問題行動の可能性を予測することが極めて重要である。本研究では、発達上のリスクが高いとされている極低出生体重児、双胎児に焦点を当てて、バランス機能、巧緻動作、共同注意、睡眠、表出性言語能力という多様な能力について定量的に評価し、年齢に伴う変化を明らかにする。さらに、それらの発達の相互の関係性を検証しようとする新規性に富んだ創造的な研究である。現在までのところは、ほぼ順調に複数の発達指標データが獲得できており、その成果に関しては、随時、論文としてまとめてきた。今後は、よりデータ数を増やすとともに発達相互間の関連性について検討していく予定である。出生体重が1,500g未満で生まれた極低出生体重児(VLBW児)では、正体重児(NBW児)に比べて、知的障害や自閉スペクトラム症の発症頻度が高いことが知られている。これらの児では2歳以降に言葉の遅れや行動上の問題を指摘されることが多い。1)2歳前後に施行した行動観察評価において、VLBW児ではNBW児に比べて他者の視線を追いかけたり、指差しに反応したりするには、より多くの手がかりを必要とすることが明らかとなった。2)VLBW児、NBW児各10例について、修正12カ月から24カ月までの間、特殊なピンマイクを用いて親と子どもの日常的なやり取りを3ヵ月毎に30-40分程度経時的に記録した。これらの記録物から子どもの音声のみを注意深く切り取り、フォルマント解析を行った。
ラットMg^<2+>-依存性エンド/エキソヌクレアーゼのDNA修復機構に関する研究

DNA修復機構には、数種類の蛋白質が関与すると報告されており、これらのうちヌクレアーゼ相当の蛋白質は、損傷部位の除去過程を担うと考えられている。我々は、ラット肝クロマチンに結合して存在するMg^<2+>-依存性エンド/エキソデオキシリボヌクレアーゼを精製・単離し、その諸性質について多角的な調査・研究を進めてきた。これらの結果、本酵素が、紫外線あるいはシスプラチン損傷DNAに対して高い感受性を示し、その作用が損傷部位の認識・除去を担う蛋白質であることが明らかになり、本酵素のDNA修復系への関与が強く示唆された。また、本酵素の細胞核内での活性が、細胞培養時に培養液中に含まれるシスプラチン濃度の上昇に伴い増加し、1.5μM濃度下で、非投与時の約7倍の活性を示すことが明らかになった。現在、遺伝子としての構造および機能を明らかにするために、本酵素のcDNAをクローン化しつつある。一方、細胞核内に存在して、シスプラチン損傷DNAと特異的に結合する蛋白質について探索・調査した。これらの結果、シスプラチン損傷DNAは、ラット細胞核の0.42M食塩可溶画分中に含まれる蛋白質と複合体を形成すること、この形成に、紫外線損傷DNAが競合的に作用することなどが明らかになった。また、この複合体内には、少なくとも7種類のDNA結合蛋白質が確認され、これらのうち、22.5,23,96.5,112kDaの4種が強い結合能を、他の3種がこれに比べて弱い結合能を示した。さらに、この複合体形成能は、培養時に含まれるシスプラチン濃度の上昇に伴って増加し、特に、22.5,23kDa蛋白質との親和性が増大すること、この複合体内に上記Mg^<2+>-依存性エンド/エキソヌクレアーゼが存在することなどを確認した。以上の結果より、これら蛋白質が、シスプラチン損傷DNA以外の損傷DNAに対しても同様に作用すると考えられ、今後、損傷DNA-蛋白質,および、蛋白質間の相互作用を調査することにより、DNA修復機構のさらなる詳細を明らかにすることが可能になると考える。
神経性無食欲症に対するエイコサペンタエン酸の有用性の検討

神経性無食欲症(AN)では極度の低栄養状態、食行動異常(不食、偏食など)、肥満恐怖、身体感覚の異常、抑うつ、強迫症状などが臨床上認められる。最近、AN患者での炎症性サイトカインの分泌亢進が示され、食欲抑制との関連が注目されていることから、炎症性サイトカインの抑制作用を持つエイコサペンタエン酸(EPA)のこれらの症状への効果を検証する。本研究では、EPAまたはプラセボを8名の患者に任意に振り分けて12週間継続投与し、臨床症状評価(体重、Ham-D)、末梢血中のサイトカイン(IL-1β、IL-6、TNFα)の濃度を開始時と終了時に実施した。得られた結果から、EPAの臨床効果を判定し、さらに臨床効果とサイトカイン濃度の変化との関連をみた。結果では、EPAの脂肪酸重量%は、EPA投与群における開始時の平均0.64%であり、終了時には1.54%に増加した。これに対して、EPA非投与群では投与前後EPAの脂肪酸重量(開始時0.47%、終了時0.45%)には変化がなかった。平均体重の変化は、EPA投与群(開始時30.0kg、終了時32.5kg)とEPA非投与群(開始時30.2kg、終了時32.7kg)との間に差はなかった。抑うつ評価尺度(Ham-D)の平均得点についてもEPA投与群(開始時25/52、終了時22/52)とEPA非投与群(開始時27/52、終了時24/52)との間に差はなかった。また、臨床症状とEPAの脂肪酸重量の変化、サイトカイン濃度の変化には相関が見られなかった。神経性無食欲症では極度の低栄養状態,食行動異常(不食,偏食など),肥満恐怖,身体感覚の異常,抑うつ,強迫症状などが臨床上認められる。最近,この疾患患者での炎症性サイトカインの分泌亢進が示され,食欲抑制との関連が注目されていることから,炎症性サイトカインの抑制作用を持つエイコサペンタエン酸(EPA)のこれらの症状への効果を検証する。予備的な調査結果では神経性無食欲症患者におけるEPAの脂肪酸重量%は平均0.64%であり健常者の平均(0.9%)よりも低値であった。このことは神経性無食欲症患者では偏食による脂質の摂取不足があり,既にEPAの欠乏状態にあることを示している。また,抑うつ評価尺度(Ham-D)では25/52と中等度の抑うつ状態を呈していた。本研究では,二重盲検法のデザイン下にEPAまたはプラセボを40名の患者に任意に振り分けて12週間継続投与し,臨床症状評価(EDI,EAT,Ham-D,Y-BOCS),末梢血中のサイトカイン(IL-1β,IL-6,TNFα,TGF-β)および食欲調節ペプチド(レプチン、グレリン)の濃度測定を開始時と終了時に実施する。同時に頭部MRIを施行し,脳の形態学的領域別の容積の変化を測定する。得られた結果から,EPAの臨床効果を判定し,さらに臨床効果とサイトカイン濃度の変化および脳の局所の容積変化との関連を検証する。現在,東洋カプセル株式会社よりEPAおよびプラセボ製剤の提供を受けデータの取得を続けている。予備的な調査結果ではAN患者におけるEPAの脂肪酸重量%は平均0.64%であり健常者の平均(0.9%)よりも低値であった。このことはAN患者では偏食による脂質の摂取不足があり、既にEPAの欠乏状態にあることを示している。また、抑うつ評価尺度(Ham-D)では25/52と中等度の抑うつ状態を呈していた。本研究では、二重盲検法のデザイン下にEPAまたはプラセボを40名の患者に任意に振り分けて12週間継続投与し、臨床症状評価(EDI、EAT、Ham-D、Y-BOCS)、末梢血中のサイトカイン(IL-1β、IL-6、TNFα、TGF-β)および食欲調節ペプチド(レプチン、グレリン)の濃度測定を開始時と終了時に実施する。同時に頭部MRIを施行し、脳の形態学的領域別の容積の変化を測定する。得られた結果から、EPAの臨床効果を判定し、さらに臨床効果とサイトカイン濃度の変化および脳の局所の容積変化との関連を検証する。現在、東洋カプセル株式会社よりEPAおよびプラセボ製剤の提供を受けデータの取得を続けている。

得られた結果から、EPAの臨床効果を判定し、さらに臨床効果とサイトカイン濃度の変化との関連をみた。結果では、EPAの脂肪酸重量%は、EPA投与群における開始時の平均0.64%であり、終了時には1.54%に増加した。これに対して、EPA非投与群では投与前後EPAの脂肪酸重量(開始時0.47%、終了時0.45%)には変化がなかった。平均体重の変化は、EPA投与群(開始時30.0kg、終了時32.5kg)とEPA非投与群(開始時30.2kg、終了時32.7kg)との間に差はなかった。抑うつ評価尺度(Ham-D)の平均得点についてもEPA投与群(開始時25/52、終了時22/52)とEPA非投与群(開始時27/52、終了時24/52)との間に差はなかった。また、臨床症状とEPAの脂肪酸重量の変化、サイトカイン濃度の変化には相関が見られなかった。
集中系モデルを用いた生体硬さ計測技術の開発

乳がんや前立腺がんなどの診断,筋疲労の把握などにおいて,生体軟組織の硬さを定量的に求めることは重要である.この硬さ計測により,インターネットを利用した在宅の遠隔診断やスクリーニング診断などへの応用が考えられる.本研究では,生生体軟組織のヤング率を計測するために,軟組織をばね・質点で構成される1次元多自由度集中系にモデル化し,押込み試験を用いて柔軟物のヤング率を計測する方法を提案した.この手法では,多層の場合の各層のヤング率を求めることも可能である.シリコンを用いて本手法によるヤング率の計測を行い,レオメータで計測したヤング率を比較することにより,提案手法の妥当性を確認している.本研究では,生体組織のような柔軟物の硬さを計測するために,接触子の押込み試験を用いる方法と,横波の振動を与えて硬さを計測する方法を考案し,両手法の開発を進めていく.本年度は,両手法における動的挙動現象に対して,生体を1次元多自由度集中系にモデル化した.接触子押込みの方法では,固定壁で囲まれた弾性体の弾性論を参考にして,接触子を押し込み,静止させたときの内部の応力分布と圧子変位の関係から,質量・結合ばね・結合減衰・基礎支持ばね・基礎支持減衰で構成される1次元の集中系にモデル化した.ここで,各ばね定数は弾性率の関数になる.そして,押込試験時の接触子にかかる力・変位の計測結果と集中系モデルの解析結果が一致するように弾性率を同定する手法を提案した.さらに,シリコンの弾性率の測定を行い,レオメータの測定結果と比較した結果,弾性率がよく一致する結果となり,提案手法の妥当性を確認した.これにより,高価な機器を用いることなく,接触子を手で押すだけで,容易に柔軟物の弾性率を計測できる.また,測定した弾性率が接触子の押込み速度に依存することと,その傾向がレオメータの計測結果と一致することを明らかにした.横波加振の方法では,生体の横振動に対して,質量・結合ばね・結合減衰でモデルを行った.そして,生体を加振させたときの周波数応答計測結果と,モデルによる解析結果が一致するように弾性率を同定する方法を提案した.さらに,横波加振の方法を用いてシリコンの弾性率測定を行い,レオメータの測定結果と比較した結果,弾性率がよく一致する結果となり,横波加振による弾性率測定方法の妥当性を確認した.本研究では,生体組織のような柔軟物の硬さを計測するために,接触子の押込み試験を用いる方法と,横波を与えて硬さを計測する方法を考案し,両手法の開発を進めていく.1年目は,両手法における動的挙動現象に対して,生体を1次元多自由度集中系にモデル化し,1層柔軟物に対する弾性率の計測方法を提案し,妥当性を確認した.本年度は,生体内に異常組織がある場合に異常組織,正常組織それぞれの硬さと境界の位置を同定する手法を確立した.押込みの手法では,接触子を2層弾性体に押込んだときの応力分布を用いて,接触子下部の弾性体を質点,結合ばね,結合減衰,基礎支持ばね,基礎支持減衰で構成される多自由度集中系にモデル化した.そして,太さの異なる2本の接触子を用いて,弾性率が異なる2層柔軟物の下部弾性率と境界位置を同定する手法も提案した.そして,上下硬さが異なる2層シリコンの下部弾性率と境界位置の計測を行った.測定した下部弾性率とレオメータの測定結果を比較し,弾性率が定量的によく一致する結果となった.また,測定した境界位置も実際の境界位置とよく一致し,提案手法が妥当であることを確認した.横波の手法においても,2層弾性体におけるの集中系モデルを作成した.そして,生体を加振させたときの周波数応答計測結果とモデルによる計測結果が一致するように下部弾性率と境界位置を同定する方法を提案した.そして,上下硬さの異なる2層シリコンを用いた同定実験を行い,妥当性を確認した.本研究では,生体組織のような柔軟物の硬さを計測するために,柔軟物を1次元の多自由度集中系にモデル化し,押込み試験および加振応答を用いて柔軟物のヤング率を計測する方法を提案してきた.本年度は,実際の生体軟組織における計測可能性を検証した.昨年度までの研究では,固定壁で囲まれた弾性体の弾性論を参考にして,柔軟物を質量・結合ばね・基礎支持ばねで構成される1次元の集中系にモデル化した.そして,押込試験時の接触子にかかる力・変位の計測結果と集中系モデルの解析結果が一致するようにヤング率を同定する手法を提案した.さらに,シリコンのヤング率測定を行い,レオメータの測定結果と比較して提案手法の妥当性を確認した.しかしながら,解析モデルでは固定壁で囲まれている仮定があるものの,実際の生体の軟組織は固定壁で囲まれてはいないため,正確な測定ができない懸念があった.ただし,測定する軟組織にある程度の大きさがあれば,軟組織周囲の境界条件の影響は受けないはずであるため,ヤング率を正確に測定するにはどの程度の軟組織の大きさがあればよいかを検討した.その結果,軟組織の深さによって必要な大きさは異なるが,軟組織の深さが30mmの場合,半径35mm程度の表面積が必要であることが分かった.人体各部の軟組織で検討したところ,腕の筋肉,腹部,乳房など測定が必要な各部で測定可能であること確認した.また,腕の筋肉部分の硬さ測定を行い,力を入れたときと入れていないときにヤング率の違いが出ることを確認した.

さらに,触診指導用の乳がん模型の各部を測定し,しこりが有る部分と無い部分で測定したヤング率が異なることを確認し,乳がん検診の可能性を確認した.以上より,高価な機器を用いることなく,接触子を手で押すだけで,容易に柔軟物のヤング率の計測手法を提案し,人体の軟組織においても十分に測定可能であることを確認した.乳がんや前立腺がんなどの診断,筋疲労の把握などにおいて,生体軟組織の硬さを定量的に求めることは重要である.この硬さ計測により,インターネットを利用した在宅の遠隔診断やスクリーニング診断などへの応用が考えられる.本研究では,生生体軟組織のヤング率を計測するために,軟組織をばね・質点で構成される1次元多自由度集中系にモデル化し,押込み試験を用いて柔軟物のヤング率を計測する方法を提案した.この手法では,多層の場合の各層のヤング率を求めることも可能である.シリコンを用いて本手法によるヤング率の計測を行い,レオメータで計測したヤング率を比較することにより,提案手法の妥当性を確認している.当初の計画通り,生体内に異常組織がある場合を想定し,上下硬さが異なる2層弾性体におけるの集中系モデルを作成し,弾性率が異なる2層柔軟物の下部弾性率と境界位置を同定する手法を押込みの手法,横波の手法それぞれで提案した.それぞれに手法において,上下硬さの異なる2層シリコンを用いた同定実験を行い,妥当性を確認した.計画通りに研究は進展している.機械力学これまでは,硬さの異なる2層柔軟物の弾性率,境界位置の計測手法を提案したが,今後は3層以上の場合の計測手法を提案する.また,これまでは,円筒容器内の柔軟物という限定された条件における測定の妥当性を示したが,触診などの実際の診断条件における測定可能性の検証を行っていく.当初の計画通り,生体に接触子を押し込んだときの生体挙動解析モデルの作成と,生体を加振したときの振動解析モデルの作成を終えている.そして,その両モデルを用いた弾性率の同定方法を提案し,シリコンの弾性率測定を行い,接触子押込みの方法,振動加振の方法それぞれにおいて提案手法の妥当性を確認している.以上より,計画通りに進展している.2年目の計画を終えるにあたって25万程度の余りが生じたが,次年度の研究に有効に利用するため次年度使用に回した.生体内に異常組織がある場合に異常組織,正常組織それぞれの硬さと境界の位置を同定する手法を確立する.接触子押込みの方法と振動加振の方法それぞれにおいて,2層もしくは3層の硬さの異なる層が生体断面に存在するの場合を想定し,境界の位置,各層の硬さの同定方法を確立する.そして,断面内で硬さの異なる2層,3層のシリコンを用いた同定実験を行い,同定手法の妥当性を検証する.次年度はリアルタイムで生体硬さを計測するシステムを制作することになるが,そのための部材を購入する予定である.1年目の計画を終えるにあたって15万円程度の余りが生じたが,次年度の研究に有効に利用するため次年度使用に回した.次年度はリアルタイムで生体硬さを検出するシステムを制作することになるが,そのための部材を購入する予定である.
第一原理計算による電子・ホール分離過程の有機薄膜太陽電池シミュレーション

近年、有機薄膜太陽電池はシリコン等の無機系太陽電池を代替・補完するものとして注目を集めている。有機薄膜太陽電池はシリコン型太陽電池と比べると、製造コストも安く、ロール形状の太陽電池を製造する等の技術により大量生産も可能である。また、軽量かつフレキシブルな特性があることから、建築の屋根材や外壁材といった従来の無機系太陽電池とは異なった利用方法や、有機化合物の多様性を生かした新規なデバイス開発が期待されている。ただし、実用化にはエネルギー変換効率の一層の向上が望まれている。そのためにはメカニズムを解明し、開発・設計に生かす必要がある。変換効率を上げるためには、有機薄膜太陽電池のミクロスコピックな動作に基づいたシミュレーション手法の開発は不可欠である。有機薄膜太陽電池のメカニズムは大きく分類して、1太陽光吸収(Abs.)、2励起子のドナー・アクセプター界面への拡散(Diff.)、3アクセプター領域への電子移動(CT)、4ホールと電子の分離(CS)からなる。最終年度は有機薄膜太陽電池のバルクヘテロジャンクション構造が励起子の分離過程に与える影響について研究を行った。有機薄膜太陽電池でしばしば採用されているバルクヘテロジャンクションでは、ドナーとアクセプター領域が複雑に絡み合っている。例えば、ドナー材料で形成されるメゾスコピックスケールの島もしくは半島構造がアクセプタ領域の中に形成される。もしくは、ドナー領域がアクセプター領域まで伸びていることもある。このようなメゾスコピックサイズのドナー領域は、アクセプター領域での励起子の解離を妨げる。この効果をシミュレーションにより解析した。また、結果を国際ジャーナル誌上で発表した。近年、クリーンで安全なエネルギー供給に関する社会的な関心が高まっている。このような背景のもと本研究では、バンド構造の記述に優れた誘電率依存のscreened交換ポテンシャルを用い、有機薄膜太陽電池材料の解析・開発に必要なバンド構造を求める。さらに、第一原理計算よって得られたバンド構造等のパラメータから励起子がホールと電子に分離する確率(収率)を計算することを目的としている。これまでの研究結果により、ドナー・アクセプター界面に存在するバンドオフセットから過剰なエネルギーが与えられることによって電子がhot stateになることが、励起子分離過程においては重要な働きをすることが理論的に明らかになった。ただし、このhot stateだけでは励起子は十分に効率的に分離することは出来ない。効率的な分離のためには、hot stateに加えて有機薄膜太陽電池の次元性が重要であることが判明した。hot stateとデバイスの次元性による効果が協調して働くことが効率的な励起子の分離に不可欠であり、有機薄膜太陽電池の性能を向上させるために重要な要因となる。これまでの研究では、有機薄膜太陽電池の性能を向上させるために次の2つの事柄について研究を行ってきた。a)励起子分離過程をシミュレーションするための理論・プログラム開発、b)有機薄膜太陽電池のバンド構造の詳細なシミュレーション。a)については、hot stateとデバイスの次元性が協調的に働くことが効率的な励起子分離には必要であることを、実際にシミュレーションを実施することによって示した。b)については、screened HF exchange potentialを用いた電子状態シミュレーションプログラムの開発を行った。現在は有機薄膜太陽電池デバイスに実際に使われている分子に対して、開発したプログラムを用いることによりバンド構造のシミュレーションを行っている。有機薄膜太陽電池は、シリコンなどの無機太陽電池と比較して簡便かつ安価に作成できることに加え、軽量・フレキシブルなどの特性を生かした新たな太陽電池の活用が期待できるためである。ただし、エネルギー変換効率が低い(10%程度)のため、有機薄膜太陽電池の実用化にはエネルギー変換効率の向上が望まれている。エネルギー変換効率向上のためには、有機薄膜太陽電池のメカニズムを解明し、開発・設計に生かせるシミュレーション技術が必要不可欠となっている。本研究プロジェクトでは有機薄膜太陽電池の開発・設計に生かせるようなシミュレーション技術の開発を行う。特に、電荷分離過程の詳細なメカニズムが不明なことが、変換効率向上を妨げていた。これは、電荷分離過程をシミュレーションするための基礎的なシミュレーション法が整備されていなかったことが要因の1つとっている。有機薄膜太陽電池中では、ドナー・アクセプター界面のバンドオフセットから、電子に対して過剰なエネルギーが与えられ、電子は過剰エネルギーを持った状態(hot state)になると考えられる。このhot stateが有機薄膜太陽電池中で電子とホールが分離するために重要な寄与をする。しかし、OnsagerやFrenkelらの従来シミュレーション手法では、外部電場が電荷分離のためのドライビングフォースとして仮定されており、hot stateを適切に取り扱えていなかった。そこで、本研究では、hot stateを扱えるシミュレーション手法を新たに開発することによって、電子とホールの分離過程を詳細に調べた。さらに、有機薄膜太陽電池のエネルギー変換効率をシミュレートするための方法論とプログラムを開発した。昨年度は、有機薄膜太陽電池のエネルギー変換効率をシミュレーションするための方法論を構築し、そのためのプログラムを作成した。開発を行った手法は有機薄膜太陽電池のダイオードモデルをベースとしているが、hot Charge Transfer (CT)状態を扱えるようにモデルを拡張した。

さらに、有機薄膜太陽電池のミクロスコピックな現象とマクロスコピックな指標を結合できるように方法論を構築した。有機薄膜太陽電池のミクロスコピックなプロセスは次の4つのプロセスに大別できる:1)太陽光の吸収、2)光子吸収によって発生したエキシトンのドナー・アクセプター界面への拡散、3)界面での電子(電荷)移動、そして、4)電子と正孔(エキシトン)の分離。最後のエキシトン分離過程については、これまでプロジェクトにおいて、その収率をシミュレーションできる方法を開発してきた。本年度では、残りのミクロスコピックな過程についても収率を計算するための計算方法を開発し、マクロスコピックな現象を扱うためのダイオードモデルと組み合わせた。さらに、開発した手法を用いることによって、有機薄膜太陽電池のデバイス特性に関するシミュレーションを行った。結果、hot CT状態とアクセプター材料の次元性がデバイスの性能を向上させるために重要な働きをしていることを見出した。近年、有機薄膜太陽電池はシリコン等の無機系太陽電池を代替・補完するものとして注目を集めている。有機薄膜太陽電池はシリコン型太陽電池と比べると、製造コストも安く、ロール形状の太陽電池を製造する等の技術により大量生産も可能である。また、軽量かつフレキシブルな特性があることから、建築の屋根材や外壁材といった従来の無機系太陽電池とは異なった利用方法や、有機化合物の多様性を生かした新規なデバイス開発が期待されている。ただし、実用化にはエネルギー変換効率の一層の向上が望まれている。そのためにはメカニズムを解明し、開発・設計に生かす必要がある。変換効率を上げるためには、有機薄膜太陽電池のミクロスコピックな動作に基づいたシミュレーション手法の開発は不可欠である。特に、電荷分離過程の基礎的なシミュレーション法が整備されていなかったことが、有機薄膜太陽電池の全体のシミュレーションを行うことを妨げていた。Onsagerらの従来シミュレーション手法では、外部電場が電荷分離のためのドライビングフォースとして仮定されており、バンドオフセット(hot state)やデバイスの次元性の影響を適切に取り扱えていなかった。そこで、本プロジェクトではそれらを扱えるシミュレーション手法を開発することを目的としている。また、デバイス全体の動作を扱える方法論、シュミレータの開発を行うことを目的としている。これまでの研究結果により、当初目標としていた事柄は概ね達成されたと考えられる。これまでプロジェクトにおいて、その収率をシミュレーションできる方法を開発してきた。
イオンプレーティングによる半導体光触媒への可視光応答性の付与

本研究では、光エネルギーを化学エネルルギーに変換できる半導体光触媒に微少量の金属をイオン注入することでエネルギー準位に摂動を与え、可視光を吸収する光触媒を開発した。この可視光応答半導体触媒を利用して、太陽光によるNOxの直接分解技術などの有用な光触媒反応プロセスの確立を目指した。特に本研究では、酸化チタン超微粒子や薄膜などの半導体光触媒の表面層に、可視光応答に寄与できるCrやVイオンなどをイオン工学的技法を用いて添加し、半導体光触媒の改質を行った。CRやVイオンなどの金属イオンを均質に高分散状態に添加した半導体光触媒は可視光領域の光を吸収し、可視光照射下で光触媒活性を示した。開発した金属イオン注入光触媒を利用してNOxの直接分解を検討したところ、可視光照射下で光触媒的にNOxを分解し、窒素や酸素を生成することを見いだした。特に、照射光の波長域を変えて実験を行い、可視光応答を示すような注入金属イオン種および注入量の最適化を検討した。また、既存の装置を用いて、BET法による表面積測定、X線解析(XRD、EXAFS)、ホトルミネッセンス測定、UV吸収測定、FT-IR測定によりバルク構造および表面状態の評価を行ったところ、注入金属イオンはバルク内部に均一に高分散していることを見いだした。また、太陽光照射下で反応を行ったところ光触媒反応が進行し、空気中のNOx濃度を低減できることを見いだした。
配位結合と水素結合をもつ高機能性ホストの合成とその分子認識機構の解析

酵素のもつ重要な性質の一つである分子認識の様式について明らかにするために、そのモデル化合物として、水素結合部位と金属配位子を組み込んだホスト分子の合成を行った。まず、水素結合部位にナフトール環をもつサレンニッケル錯体を合成し各種アミノ酸誘導体との相互作用について調べた結果、ヒスチジンメチルエステルと僅かに相互作用していることが明らかとなった。しかし、その会合定数は小さく正確な値が求まらなかったため、中心金属をコバルトに変えた化合物について調べた。その結果、フェニルアラニンメチルエステルと会合することが電子スペクトルの変化からわかった。会合定数や会合様式については、今後さらに詳細に調べる予定である。一方、水素結合部位としてフェノール環を導入した大環状サレンニッケル錯体の合成も行った。この錯体は、各種のアミンやピリジン誘導体と会合することがNMRスペクトルの解析から明らかとなった。特にジアミン類とは1:1の錯体を形成し、その会合定数は10^3から10^4M^<-1>程度であった。中でも2,7-ジアミノフルオレンが最も大きな会合定数を示したことから、会合の様式はフェノールの水酸基と金属部位の2点でおこっていることが推定された。また、この化合物は中心金属をマンガンに変えると、オレフィン類のエポキシ化の触媒となることも明らかとなった。これらの結果より、先の分子認識能と組み合わせることにより、基質特異性をもつ人工酵素となる可能性が示された。この点についても今後検討する予定である。酵素の持つ重要な性質の一つである分子認識の様式について明らかにするために、そのモデル化合物として、水素結合部位と金属配位子を組み込んだホスト分子の合成を行った。目的化合物としては水素結合部位にソフトール基、金属配位部位にサレン型の金属配位子を組み込んだ系を設計し、まず、水素結合部位にあたる8-置換-2-ナフトール誘導体を2-ナフトールから合成した。これと_<p->ブロモフェノール誘導体とのカップリングにより得られた化合物のフェノールのオルト位へホルミル基を導入し、その後エチレンジアミン誘導体と縮合を行いシッフ塩基とした。これを酢酸ニッケルと処理することによりニッケルを配位させ目的の化合物を合成した。この目的化合物を用いて、各種アミノ酸類との溶液中での会合の様子をプロトンNMRスペクトルを用いて調べたが、ヒスチジンメチルエステル以外は殆どシフト変化が見られなかった。そこで、ヒスチジンとの会合様式について調べるため、ヒスチジンの官能基であるイミダゾールとの会合を調べた結果、イミダゾールと相互作用していることがわかり、イミダゾール環が重要であることがあきらかとなった。今後、アミン類の配位に対する中心金属の影響や、キラル配位子をもちいたアミン酸類のキラル認識について検討する予定である。

また、この化合物は中心金属をマンガンに変えると、オレフィン類のエポキシ化の触媒となることも明らかとなった。これらの結果より、先の分子認識能と組み合わせることにより、基質特異性をもつ人工酵素となる可能性が示された。この点についても今後検討する予定である。
オートファジーの膜形成を担うAtg8の脱脂質化の制御機構

オートファジーの膜動態に重要なタンパク質Atg8は,リン脂質によって修飾され膜に局在することによってオートファジーの進行に寄与することが知られている.Atg4は脂質化されたAtg8を脱脂質化する酵素でありAtg8のリサイクルにも寄与しているが,その制御機構は明らかになっていなかった.本研究ではAtg4の活性の制御について試験管内で検討した.その結果,Atg4の活性は他のAtgタンパク質との相互作用やAtg1によるリン酸化では影響を受けなかった一方、Atg4自身の領域で制御を受けることを示唆するデータを得た.Atg4は細胞内局在等の変化に応じて自身の活性を制御する能力を有しているのかもしれない.オートファジーは、栄養飢餓などに応じて、細胞が自身の構成成分である細胞質やオルガネラをリソソーム/液胞に輸送し、分解する現象である。ユビキチン様タンパク質Atg8は、リン脂質ホスファチジルエタノールアミン(PE)を可逆的に結合し、オートファジーの膜伸長に直接関わる重要な分子である。働き終わったAtg8-PE結合体はプロテアーゼであるAtg4によって脱PE化され再利用されるが、不思議なことに、働いている最中のAtg8-PE結合体はAtg4の基質にはならない。本研究の目的は、Atg8の脱PE化がどのように制御されているのか明らかにすることである。そのために1Atg8-PEとAtg4の間の相互作用解析、2Atg4の活性の制御因子の同定、3これら複合体のX線結晶構造解析、を行う。またレジオネラ菌のRavZはAtg4と異なる様式でAtg8-PE結合体の脱PE化を行いオートファジーを阻害するが、4Atg4とRavZの立体構造の比較によって、これらの膜認識機構を明らかにする。本年度はAtg8-PEとAtg4の間の相互作用解析に向けて、Atg8を各種人工膜上のPEに結合させたものを調製した。平面膜のモデルとしては脂質二重層を膜骨格タンパク質で囲むことで水溶性にしたナノディスクを調製した。調製に際しては膜脂質の組成の検討を繰り返した。その結果、In vitro Atg8結合反応系にナノディスクを用いることで、ナノディスク膜内のPEとAtg8を結合させる反応に成功した。引き続き、調製したAtg8-PE結合体含有ナノディスクについて、Atg4やRavZとの相互作用を詳細に解析する予定である。一方、RavZの結晶化は難航しており、今後もスクリーニング等を続けていく予定である。オートファジーは、栄養飢餓などに応じて、細胞が自身の構成成分である細胞質やオルガネラをリソソーム/液胞に輸送し、分解する現象である。本年度は主に、Atg4の活性制御因子の同定と、RavZの結晶化を行った。Atg4の活性制御因子の同定に関しては、前年度までに確立したin vitro Atg8結合反応系を用いて、先行研究などから想定した制御因子を単独、または様々な組み合わせで導入していき反応の進み具合を調べた。しかしこれまでのところ、Atg4の活性を制御していると思われる因子の同定には至っていない。また、RavZの結晶化も引き続き行っていたが、競合するグループによってRavZ単体の結晶構造が報告された。そこで今後はAtg4の活性制御因子の同定と、それら複合体の結晶構造解析を早急に進める予定である。上記の通り、本年度は主に、Atg4の活性制御因子の同定と、RavZの結晶化を行った。昨年度は先行研究などから想定した制御因子の調製を試みたが、活性を保持した制御因子候補を調製できた生物種と、in vitro Atg8結合反応系を確立できた生物種が異なっていた。本年度はさらに検討を重ね、同じ生物種で制御因子候補と結合反応系を確立することに成功した。しかし、予想に反して制御因子候補が活性を制御しておらず、今後も制御因子の同定を引き続き行うことになった。一方、RavZについては競合するグループによってRavZ単体の結晶構造が報告された。本研究の目的を明らかにするような構造ではなかったものの、今後はAtg4の活性制御因子の同定と、それら複合体の結晶構造解析を早急に進めるよう予定を変更する。オートファジーは,栄養飢餓などに応じて,細胞が自身の構成成分である細胞質やオルガネラをリソソーム/液胞に輸送し,分解する現象である.ユビキチン様タンパク質Atg8は,リン脂質ホスファチジルエタノールアミン(PE)を可逆的に結合し,オートファジーの膜伸長に直接関わる重要な分子である.

働き終わったAtg8-PE結合体はプロテアーゼであるAtg4によって脱PE化され再利用されるが,不思議なことに,働いている最中のAtg8-PE結合体はAtg4の基質にはならない.本研究の目的は,Atg8の脱PE化がどのように制御されているのか明らかにすることである.そのために1Atg8-PEとAtg4の間の相互作用解析,2Atg4の活性の制御因子の同定,3これら複合体のX線結晶構造解析,を行う.またレジオネラ菌のRavZはAtg4と異なる様式でAtg8-PE結合体の脱PE化を行いオートファジーを阻害するが,4Atg4とRavZの立体構造の比較によって,これらの膜認識機構を明らかにする.本年度は主に,Atg4の活性制御機構におけるAtg1によるリン酸化の影響を詳細に検討した.まずAtg4自身がAtg1にリン酸化されることによる活性化レベルの変化を検討したところ,Atg8のPE化には影響が見られなかった.次にAtg4およびAtg4の相互作用因子をAtg1によってリン酸化し,相互作用の変化を検討したが,リン酸化による影響はみられなかった.そこで,Atg4自身が活性を制御している可能性を検討したところ,Atg4のある領域が活性を制御していることが示唆されるデータが得られた.オートファジーの膜動態に重要なタンパク質Atg8は,リン脂質によって修飾され膜に局在することによってオートファジーの進行に寄与することが知られている.Atg4は脂質化されたAtg8を脱脂質化する酵素でありAtg8のリサイクルにも寄与しているが,その制御機構は明らかになっていなかった.本研究ではAtg4の活性の制御について試験管内で検討した.その結果,Atg4の活性は他のAtgタンパク質との相互作用やAtg1によるリン酸化では影響を受けなかった一方、Atg4自身の領域で制御を受けることを示唆するデータを得た.Atg4は細胞内局在等の変化に応じて自身の活性を制御する能力を有しているのかもしれない.本年度はAtg8-PEとAtg4の間の相互作用解析とRavZの立体構造の決定を計画していた。Atg8-PEとAtg4の間の相互作用解析に関しては、Atg8をin vitro結合反応によってリポソームやナノディスク等の各種人工膜上のPEに結合させたものを調製することに成功した。同時に平行して、Atg4の活性制御因子の同定を試みた。先行研究などからターゲットの制御因子の調製を試みたものの、活性を保持したタンパク質の調製に難航し、様々な種についてホモログの発現精製を検討した。同時に様々な種におけるin vitro Atg8結合反応系を構築した。その結果、活性を保持したターゲットとそれに対応するin vitro Atg8結合反応系を調製することに成功したので、今後はAtg8-PEとAtg4の間の相互作用解析と、ターゲットの活性制御因子が相互作用に与える影響を調べていく予定である。一方、RavZについては発現、精製系は確立したものの、結晶は得られていない。今後も当初から予定していたようにドメイン解析などを行って発現方法を検討する他、様々な精製方法も検討しながら、引き続き結晶化スクリーニングを行っていく予定である。Atg4の活性制御因子の同定に関して、これまでは大腸菌で精製したタンパク質を用いており、リン酸化等の翻訳後修飾の影響は考慮していなかった。しかし、リン酸化によって結合状態が変化し、Atg4の活性の制御が行われることは十分に考えられる。