hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
大腸癌悪性度評価における分子マーカー発現に関する研究

264.5±125.0pg/mlに比べ有意に高値であった(p=0.0024)。3)EGFでは再発13例の術前値は506.2±247.0pg/ml、非再発59例の術前値は434.5±227.2pg/mlであり、再発症例の方が術前より高値を示していた。4)術前より血中に高発現するものは、浸潤能、転移能などの悪性度が高い腫瘍であることが疑われた。次年度には因子間相互の関連ネットワークをさぐり、どのような因子が重なり合って転移事象を生じさせているか、深く掘り下げてゆきたい。大腸癌悪性度評価における分子マーカー発現の研究において、初年度に引き続き、細胞接着および細胞増殖に関する責任因子の同定に取り組んだ。初年度は腫瘍細胞の増殖に関するサイトカインとしてEGF、HGFについて、17年度はTGF-β1と細胞外マトリックス構成分子のうちfibronectinについても対象として検討進めた。その結果、1.TGF-β1の大腸癌組織内における発現はリンパ節転移例および静脈侵襲高度例において有意に高率であった(各々P=0.006、およびP=0.0001)。2.癌症例の血清TGF-β1値は、非癌症例に比べ有意に高値を示した(P=0.0014)。3.染色陽性群の血清TGF-β1値213.1±72.3ng/mlは、染色陰性群の血清TGF-β値169.7±56.5ng/mlより有意に高く(P=0.0196)、両者の発現に正の相関を認めた。4.fibronectin発現に関しては尿中定量法により、悪性度との関連を検討重ねている。最終年度には遺伝子発現プロファイル解析に進み、深く掘り下げてゆきたい。大腸癌悪性度評価における分子マーカー発現の研究にて、18年度はlamininの臨床データとの関連を総括的に解析した。大腸癌手術症例205例、非癌症例88例を対象にELISA法にて術前末梢静脈血の血清値を測定した。内訳は109人結腸癌、96名直腸癌(肝転移52例、非肝転移153例)であった。【結果】1.コントロール群の血清lamininレベルは258.0±92.0ng/mlであり、大腸癌群では606.3±260.2ng/mlと有意差を認めた(p<0.0001)。2.陽性率はlaminin89.3%であるのに対し、CEA38.0%、CA19-919.5%であった。3.異時性を含む肝転移陽性症例668.0±274.7ng/mlは肝転移陰性症例585.2±252.5ng/mlに比べ有意に高値であった(p=0.0472)。4.生存率においてlaminin値520ng/ml以上の群はIaminin350ng/ml以下の群に比べ有意に不良(p=0.0451)であった。5.性別、年齢、腫瘍径、肝転移、肺転移、腹膜転移、血清laminin値をもとに単変量解析行なったところ、血清laminin値が肝転移、肺転移、腹膜転移とともに有意な予後因子であった。続いて行なった多変量解析では血清laminin値は肝転移、肺転移、腹膜転移と同様に独立した予後因子であった。【考察】大腸癌と血清lamininとの関係について、手術症例を対象に血清レベル定量行い、肝転移陽性群の1amininは術前より血中に高発現していることが判明した。さらに予後との関係を追うと肝転移、肺転移、腹膜転移と同様に独立した予後因子であることが判明した。遺伝子発現プロファイル解析についても検討着手した。【結論】癌の浸潤・転移メカニズム探究において血清laminin発現は大腸癌の独立した予後因子であることが判明した。
藍色細菌生物時計分子装置の構造変化と時間発振の解明

藍色細菌は生物時計を持つ唯一の原核生物である。藍色細菌生物時計分子装置は時計タンパク質KaiA、KaiB、Kaicで構成されており、それらのタンパク質が複合体形成を変化させることで時計を刻んでいると考えている。タンパク質の複合体がいつ形成され、どこで相互作用するかを検証することで、生物時計を原子レベルで解明できる。私は、KaiBに注目し、KaiBとKaiAの相互作用部位を同定し、KaiBの構造変化について解析を行った。まず、KaiBにラジカルを持ったスピンラベル(MTSSL)を導入し電子スピン共鳴(ESR)法でKaiAやKaiCとの相互作用を調べた。スピンラベルを導入するためにCys残基導入KaiB変異体を25種類作製した。作製したKaiB変異体を精製し、それぞれにMTSSLを導入した。KaiAはC末端ドメインでKaiBと相互作用することがわかっている(Mutoh et al.,2010)。そこで準備したKaiB変異体のうち、18種類とKaiAのC末端ドメインタンパク質(KaiAc)と反応させたところ、2種類のKaiB変異体でESRスペクトルに大きな変化が認められた(KaiB_<E56c>、KaiB_<D57c>)。このうち、KaiB_<E56c>を用いてKaiA、KaiCと反応させたところ、KaiB-KaiA相互作用は反応開始後10時間目以降から起き始めることが分かった。次に、KaiBの構造変化について検証した。KaiBの2つの2量体境界面と表面にそれぞれMSLを導入したところ、4°CでのESRスペクトルには、速い成分と遅い成分の二成分が含まれ、スペクトルは4°Cでは24時間保温しても変化しなかったが、40°Cで24時間保温すると速い成分に収束した。一方、KaiBの表面にラベルを導入した変異体では、4°Cでも40°Cでもスペクトルは変化しなかった。したがって、KaiBの構造は温度によって2量体境界面で大きく変化すると考えられた(Mutoh et al.,2011)。藍色細菌生物時計分子装置は時計タンパク質KaiA、KaiB、KaiCで構成されており、それらのタンパク質が複合体形成を変化させることで時計を刻んでいると考えている。まず、KaiBにラジカルを持ったスピンラベルを導入し電子スピン共鳴(ESR)法でKaiAやKaiCとの相互作用を調べた。作製したKaiB変異体を精製し、それぞれにスピンラベルを導入した。KaiAはC末端ドメインでKaiBと相互作用することがわかっている(Mutoh et al., 2010)。そこで準備したKaiB変異体のうち、18種類とKaiAのC末端ドメインタンパク質(KaiAc)と反応させたところ、3種類のKaiBへ似たいでESRスペクトルに大きな変化が認められた。次にリン酸化状態を固定した2種類の変異体KaiCを用いてKaiB-KaiC間相互作用を調べた。KaiCのリン酸化サイトをグルタミン酸残基に置換した疑似リン酸化変異体KaiC_<DD>と、アラニン残基に置換した疑似脱リン酸化変異体KaiC_<AA>を用いた。KaiBはKaiC_<DD>に対して高い親和性があることが知られているため、KaiBをKaiC_<DD>と反応させるとESRスペクトルに変化が生じることが期待される。調べた18種類のうち、8種類のKaiB変異体でKaiC_<DD>によるESRスペクトル変化が検出された。KaiC_<AA>との反応では、調べた11種類のうち3種類のKaiB変異体でのみスペクトル変化が検出された。これまでの研究で、KaiC_<AA>はKaiBと相互作用しないとされていたが、実は弱い相互作用をすることが判明した。

このうち、KaiB_<E56c>を用いてKaiA、KaiCと反応させたところ、KaiB-KaiA相互作用は反応開始後10時間目以降から起き始めることが分かった。次に、KaiBの構造変化について検証した。KaiBの2つの2量体境界面と表面にそれぞれMSLを導入したところ、4°CでのESRスペクトルには、速い成分と遅い成分の二成分が含まれ、スペクトルは4°Cでは24時間保温しても変化しなかったが、40°Cで24時間保温すると速い成分に収束した。一方、KaiBの表面にラベルを導入した変異体では、4°Cでも40°Cでもスペクトルは変化しなかった。したがって、KaiBの構造は温度によって2量体境界面で大きく変化すると考えられた(Mutoh et al.,2011)。
脳とがんを標的とするエストロゲンシグナルの共通性と特異性の解明ならびに臨床応用

エストロゲンは脳機能に関与している一方で、乳がんなどの増殖を促進する。本研究では、独自のエストロゲン応答遺伝子に加え、新規のエストロゲン応答遺伝子を探索し、脳とがんにおけるエストロゲンシグナルの共通性と特異性を明らかにし、臨床への応用を探ることを目的とした。マウスの海馬、視床下部、脳幹に特異的なエストロゲン応答遺伝子を同定し、それらは乳がんとも関連していることが明らかになった。また、転写因子FOXA1、FOXP1がエストロゲン応答遺伝子であり、乳がんの予後予測因子となることを明らかにした。以上の成果により、脳とがんにおける新たなエストロゲン応答遺伝子とその役割が示唆された。エストロゲンは性行動をはじめ記憶・学習・情動などの脳機能に関与しているが、そのメカニズムの解明は十分ではない。一方、がんでは、エストロゲンは乳がんなどの増殖を促進することが判明している。本研究では、独自のエストロゲン応答遺伝子に加え、新規の脳におけるエストロゲン応答遺伝子を探索することで、脳とがんにおけるエストロゲンシグナルの共通性ならびに特異性を明らかにし、臨床への応用を探ることを目的とした。脳におけるエストロゲン応答遺伝子を探索するため、卵巣除去マウスにエストロゲンを投与し、海馬、視床下部、脳幹に分けてRNAを採取し、マイクロアレイ法にてエストロゲン応答遺伝子を網羅的に探索した。その結果、これらの3部位で特異的に発現上昇および発現減少を示す遺伝子が同定された。また、これら3部位に共通して発現上昇または発現低下する遺伝子も検出された。これらの遺伝子の中で、海馬に特異的なエストロゲン応答遺伝子としてRAMP2が同定された。RAMP2は、アドレノメデュリンレセプターとして機能することが知られている。アドレノメデュリンは血管拡張作用を示すペプチドホルモンであるが、脳でも機能している。特に、ノックアウトマウスの解析から運動協調性、多動、過剰不安に関与することが示されている。このように、本研究で同定された新しいエストロゲン応答遺伝子は脳の機能に深く関与することが示唆された。また、エストロゲン応答遺伝子として独自に単離し、乳がんなどにおいて解析を行っているEfpおよびCOX7RPの脳における機能については明らかではない。これら遺伝子のノックアウトマウスを用いて一連の行動解析バッテリーによる検討を行い、不安行動、活動量、社会行動、協調運動、学習・記憶などとの解析を行った。以上の解析により、脳とがんにおける新たなエストロゲン応答遺伝子とその役割が示唆された。このエストロゲン応答遺伝子を検証するため、エストロゲン受容体(ERα)ノックアウトマウスの海馬、視床下部、脳幹を用いてマイクロアレイ法を行い、発現抑制されている遺伝子を探索した。その結果、海馬ではアドレノメデュリンレセプターとして機能することが知られているRAMP2が同定された。また、視床下部では乳がんで過剰発現していることが知られているGREB1が同定され、脳とがんに共通のエストロゲン応答遺伝子である可能性が示唆された。本研究で同定された新しいエストロゲン応答遺伝子は脳の機能に深く関与することが示唆された。これら遺伝子のノックアウトマウスを用いて一連の行動解析バッテリーによる検討を行い、不安行動、活動量、社会行動、協調運動、学習・記憶などとの解析を引き続き行った。

脳におけるエストロゲン応答遺伝子を探索するため、卵巣除去マウスにエストロゲンを投与し、海馬、視床下部、脳幹に分けてRNAを採取し、マイクロアレイ法にてエストロゲン応答遺伝子を網羅的に探索した。その結果、これらの3部位で特異的に発現上昇および発現減少を示す遺伝子が同定された。このエストロゲン応答遺伝子を検証するため、エストロゲン受容体(ERalpha)ノックアウトマウスの海馬、視床下部、脳幹を用いてマイクロアレイ法を行い、発現抑制されている遺伝子を探索した。その結果、海馬ではRAMP2が同定され、視床下部では乳がんで過剰発現していることが知られているGREB1が同定された。さらに、シナプス形成、膜受容体などの遺伝子が新たにエストロゲン応答遺伝子として同定された。また、転写因子FOXA1、FOXP1がエストロゲン応答遺伝子であり、乳がんの予後予測因子となることを明らかにした。さらに、エストロゲン応答遺伝子として独自に単離し、乳がんなどにおいて解析を行っているEfpおよびCOX7RPの脳における機能については明らかではない。これら遺伝子のノックアウトマウスを用いて脳におけるエストロゲン応答遺伝子の探索を行った。以上の解析により、脳とがんにおける新たなエストロゲン応答遺伝子とその役割が示唆された。エストロゲン投与したマウスの脳を用いたエストロゲン応答遺伝子の探索が順調に進んでおり、がん細胞と共通性ならびに特異性を示す候補遺伝子を絞り込んでいる。また、独自のエストロゲン応答遺伝子に関してはノックアウトマウスを用いた行動解析を進めており、脳における作用を明らかにしつつある。以上の解析により、当初計画通りに解析は進展している。24年度が最終年度であるため、記入しない。引き続き、脳のエストロゲン応答遺伝子の探索と機能解析を行う。今後はエストロゲン受容体ノックアウトマウスも用いて、脳機能における新たなエストロゲン応答遺伝子の機能を解析する。この解析で注目している遺伝子にかんして乳がん、子宮がん、前立腺がんなどのがんにおける発現を検証し、過剰発現またはノックダウンの実験を行いがんにおける作用を明らかにする。独自の応答遺伝子についてはノックアウトマウスの解析を進め、脳とがんの2つの視点からその作用を明らかにする。
日本人に適した遺伝性眼疾患の系統的な迅速ゲノム診断法の構築

1.錐体桿体ジストロフィ(CORD)は錐体、桿体視細胞が障害される進行性の遺伝性疾患である。今回、日本人adCORD患者に遺伝子型タイピングチップによる変異スクリーニングを試みた。また、GUCY2Dの全エキソンのダイレクトシークエンスを行った。チップ解析で、AIPL1、RPGRIP1、GUCY2D遺伝子中に計5個の遺伝子多型を認めた。この結果は全てダイレクトシークエンスと一致した。GUCY2D遺伝子解析では、発端者および父親にチップ上にスポットされていない新規のミスセンス変異(2540A>T、2541G>C、2542A>C)を認め、3塩基変異とも同一のアリル上に存在した。本研究により、適切な変異部位を網羅した遺伝子型タイピングチップを作成すれば、疾患原因遺伝子変異と疾患修飾遺伝子を同時にスクリーニングできる可能性が示唆された。2.小口病は金箔様眼底を特徴とする先天停止性夜盲の一つで、常染色体劣性遺伝形式をとる。原因遺伝子としてこれまでSAGとGRK1が知られており、なかでもSAG遺伝子の926delA変異が日本人小口病の好発変異(創始者変異)である。今回、Rea1-timePCR法を用いてSAGの好発変異の迅速診断システムの構築を試みた。特異的蛍光プローブとのハイブリッドの融解曲線解析により、遺伝子型を同定した。本アッセイ系では各遺伝子型(926delAホモ、926delAヘテロおよびワイルドタイプ)は異なる融解ピーク温度によって明確に区別でき、ダイレクトシークエンスによる結果と一致した。1回の検査所要時間は約90分であった。本研究によりSAGの好発変異の迅速診断法を確立した。本法は正確、迅速で、小口病患者においてSAGやGRK1遺伝子の変異同定を加速する一助になると考えた。【目的】錐体桿体ジストロフィ(CORD)は錐体、桿体視細胞が障害される進行性の遺伝性疾患である。遺伝的異質性が高く、常染色体優性(ad)CORDではこれまでにCRX、GUCY2D、GUCA1Aなどの原因遺伝子が知られており、効率的な原因遺伝子同定法の確立が望まれる。今回、日本人adCORD患者に遺伝子型タイピングチップによる変異スクリーニングを試みたので報告する。【方法】対象はadCORDと診断した日本人発端者とその父親である。インフォームドコンセントを得た後に患者末梢血からゲノムDNAを抽出後、adCORDと原因遺伝子が部分的に合致するレーバー先天盲の変異部位を網羅した遺伝子型タイピングチップ(LCAチップ)による変異スクリーニングを行った。【結果】チップ解析で、AIPL1、RPGRIP1、GUCY2D遺伝子中に計5個の遺伝子多型を認めた。錐体ERGでは反応は消失し、桿体ERGの振幅も低下していた。【結論】日本人adqORD患者でGUCY2D遺伝子の新規変異を同定した。適切な変異部位を網羅した遺伝子型タイピングチップを作成すれば、疾患原因遺伝子変異と疾患修飾遺伝子を同時にスクリーニングできる可能性が示唆された。

1.小口病は金箔様眼底を特徴とする先天停止性夜盲の一つで,常染色体劣性遺伝形式をとる。原因遺伝子としてこれまでSAGとGRK1が知られており,なかでもSAG遺伝子の926delA変異が日本人小口病の好発変異(創始者変異)である。今回,Real-timePCR法を用いてSAGの好発変異の迅速診断システムの構築を試みた。小口病患者の末梢血からDNAを抽出し,SAGのエクソン11内の変異好発部位を含む領域をライトサイクラー(ロシュ社)を用いてPCRにより増幅し,特異的蛍光プローブとのハイブリッドの融解曲線解析により,遺伝子型を同定した。本アッセイ系では各遺伝子型(926delAホモ,926delAヘテロおよびワイルドタイプ)は異なる融解ピーク温度によって明確に区別でき,ダイレクトシークエンスによる結果と一致した。1回の検査所要時間は約90分であった。本研究によりSAGの好発変異の迅速診断法を確立した。本法は正確,迅速で,小口病患者においてSAGやGRK1遺伝子の変異同定を加速する一助になると考えた。2.色素失調症はX染色体優性の遺伝性疾患で,周辺無血管帯などの網膜血管異常や網膜色素上皮異常を合併する。白人では患者の約7080%にNF-κBシグナルに関与するNEMO遺伝子の変異が報告されており,その約9割がエクソン4-10の欠失であるが,日本人患者での遺伝的背景は明らかではない。今回,色素失調症の日本人母子例に遺伝子解析を行った。同意を得て末梢血からゲノムDNAを抽出し,multiplex PCR法を用いたNEMO遺伝子欠失の解析を行ったところ,母子ともにNEMO遺伝子のエクソン4から10の欠失を同定した。色素失調症の日本人母子例においてNEMO遺伝子異常を確認し,NF-κBシグナル伝達経路がヒト生理的網膜血管新生に関与していると考えた。
血液凝固制御因子レジスタンスを検出する新規検査法の開発

はじめに:我々は遺伝性血栓症患者におけるアンチトロンビン抵抗を示す異常プロトロンビン(p.Arg596Leu)を報告した。患者血漿由来トロンビンのアンチトロンビン抵抗性を検出するためのアンチトロンビンによるトロンビンの不活性化の動態を分析する新規の臨床検査法を考案した。材料および方法:プロトロンビンアクチベータ成分(リン脂質、塩化カルシウム、およびヘビ毒由来プロトロンビンアクチベータ)とのインキュベーション後、試料中のトロンビンをヘパリンの存在下あるいは非存在下で十分量のアンチトロンビンを用いて不活化した。続いて、HD-Phe-Pip-Arg-pNAを添加し、405nmにおける吸光度変化率(ΔAbs/min)・残存トロンビン活性を測定した。結果および結論:アンチトロンビンおよびヘパリンを用いて5分間不活化した場合の残存トロンビン活性は、596Leu変異型プロトロンビン(40%)では、野生型(0.5%)よりも高かった。アンチトロンビンのみで30分不活化した場合の残存トロンビン活性は、596Leu変異型プロトロンビン(99%)では、野生型(20%)よりも高かった。本測定系は、596Leu変異型プロトロンビンのアンチトロンビン抵抗性を検出することができた。リコンビナントプロトロンビンとプロトロンビン欠乏血漿より再構成した患者血漿モデルにおいてもアンチトロンビン抵抗性を検出できた。ワルファリン服用596Leu変異型プロトロンビン患者血漿を用いた場合は、初期のトロンビン活性は低いが、健常人血漿と比較すると残存トロンビン活性率を比較することでアンチトロンビン抵抗性を検出できた。結論:アンチトロンビンを用いたトロンビンの不活性化の動態を解析することにより、血漿中のアンチトロンビン抵抗性を検出する臨床検査法を考案した。本測定系はワルファリン服用患者においても、アンチトロンビン抵抗性を検出できる。アンチトロンビンとの反応性が低い変異トロンビンの存在が示唆された血栓症患者に検出された変異型プロトロンビンを分子生物学的・細胞生物学的手法を用いて合成し、変異型プロトロンビン分子の活性化法、検出法など基本的性状を解析した。ヒトプロトロンビン(野性型)の全長cDNAをヒト肝臓由来cDNAライブラリーよりPCR増幅し、クローニングベクターpBluescript II KS+にクローニング後、塩基配列を確認した。クローニングした野生型ヒトプロトロンビン全長cDNAを鋳型として変異導入PCR法を用いて変異型ヒトプロトロンビン全長cDNAを作成した。さらに、野生型および変異型プロトロンビンcDNAを哺乳動物細胞用の発現ベクターpDNA3.1および精製用のHisタグ付き発現ベクターpcDNA3.1 myc-Hisに組み込んだ。野生型および変異型プロトロンビン発現ベクターをヒト胎児由来培養細胞株HEK293に遺伝子導入後、G418によりネオマイシン耐性および培養上清のウェスタンブロッティンブ解析により野生型および変異型プロトロンビン高発現HEK293細胞株を樹立した。健常人血漿および健常人血漿由来精製プロトロンビンを用いて、Oxyuranus scutellatus蛇毒由来プロトロンアクチベータによるプロトロンビン活性化法についてpH、イオン強度、第V因子・リン脂質の必要性および至適濃度、反応時間などのプロトロンビン活性化至適条件を検討設定した。トロンビン測定法としては、高感度・高精密度が期待できる発色性合成基質を用いた比色分析法について至適条件を検討設定した。野生型および変異型プロトロンビンを至適条件下に活性化して生成されたトロンビンにアンチトロンビン(ヘパリン存在下および非存在下)を加えて、経時的にトロンビンの不活化動態を解析する測定法を考案した。

家族性血栓症患者家系より検出された変異型プロトロンビン(生理的な抗トロンビン・アンチトロンビンとの反応性が極めて低い変異トロンビンを形成する)を分子生物学的・細胞生物学的手法を用いて合成し、人工的に再構成した健常人血漿および患者血漿モデルおよび患者血漿を用いて検討・考案したトロンビン不活化動態解析法の評価を実施した。健常人血漿および健常人血漿由来精製プロトロンビンを用いて、プロトロンビン活性化法の至適条件を検討設定した。トロンビン測定法は、高感度・高精密度が期待できる発色性合成基質を用いた比色分析法とし至適条件を検討設定し、両者を組み合わせてトロンビン不活化動態解析法を確立した。ヒト肝臓由来cDNAライブラリーより野生型ヒトプロトロンビン全長cDNAをクローニングし、それを基に野生型および変異型プロトロンビンの発現ベクターを構築し、野生型および変異型プロトロンビン高発現HEK293細胞株を樹立した。至適ビタミンK(+)条件下で培養した後、ウシ胎児血清(-)培養液とし、培養液中に分泌される野生型および変異型リコンビナントプロトロンビンを回収した。免疫学的プロトロンビン除去健常人血漿に各リコンビナントプロトロンビンを添加して作成した再構成健常人血漿、再構成ホモおよびヘテロ患者血漿モデルを検体として用い、トロンビン不活化動態解析法を評価した。人工的再構成患者血漿モデルにおいてもトロンビン不活化不良を明確に検出することができた。また、静脈血栓塞栓症患者がしばしば服用するビタミンK拮抗薬の影響を検討した。ビタミンK拮抗薬の影響を受ける多くの血液凝固検査と異なり、ビタミンK拮抗薬服用時においても相対的トロンビン不活化動態を測定することで、トロンビンのアンチトロンビン抵抗性を検出することができた。臨床検査法として実用化する上で有利と考えられる。我々が提唱した新規静脈血栓塞栓症発症リスク「アンチトロンビン抵抗性」の検査法として開発したトロンビン不活化動態の解析法の改良と評価を実施した。改良点の1つ目は、プロトロンビン活性化反応系で、プロトロンビンアクチベータとして使用してきた蛇毒が野生動物保護の観点から入手困難になってきたため、安定して入手可能なウシ由来の凝固因子(活性型第X因子および活性型第V因子)を用いた解析法への改良を実施した。すなわち、反応系のpH、イオン強度、リン脂質濃度、塩化カルシウム濃度、活性型第X因子および活性型第V因子の濃度とプロトロンビン活性化時間、アンチトロンビン濃度とトロンビン不活化時間などの至適条件を検討設定した。改良法においても、アンチトロンビンによるトロンビンの不活化動態を蛇毒由来プロトロンビンアクチベータを用いた場合と同様にアンチトロンビン抵抗性を検出可能な解析法が開発できた。しかし、アンチトロンビン・ヘパリン複合体を用いたトロンビン不活化動態解析法においては、蛇毒プロトロンビンアクチベータを用いた場合に比してアンチトロンビン抵抗性に対する検出感度が低下する傾向にあった。
小児肺細葉バイオメカニクスの創成

本研究は,実験的手法では解明が難しい小児肺細葉の形態学的特徴の変化およびそこで生じる様々な力学現象を,「計算幾何学と最適化を用いた数理形状モデル」・「マルチスケール計算力学解析手法」を土台とした理論・解析によって明らかにするものである.さらに構築する研究プラットホームから,小児肺疾患の診断支援・治療法開発支援への展開を目指す学問領域“小児肺細葉バイオメカニクス"を創成するものである.本年度は,小児肺細葉解析のベースとなる,計算幾何学と最適化手法を組み合わせた肺微小構造の数理形状モデルのコード開発の効率化を進め,放射光マイクロCTにより撮影されたマウス肺細葉画像から再構築した実形状モデルを基に,肺細葉の均質構造モデル,不均質構造モデルを構築した.これらのモデルを用いて,表面張力効果を考慮した肺細葉膨張シミュレーションを行い,膨張に伴う肺組織の非等方変形を解析した.これより,実形状モデルで得られる力学場の再現には,不均質構造モデルが有効であることを確認した.また,肺細葉変形に関する表面張力効果を検討し,肺胞表面における非等方変形が促進されることを見出した.この結果を含めた肺細葉解析結果を小児の臨床医を含む医学系研究者の前で発表し,情報交換を行った.本研究の実行にあたり,小児肺細葉構造構築および力学解析を行うための計算機環境,および力学解析に用いるための肺組織の力学特性を得るための引張試験装置を構築した.さらに,小児内科の臨床医と意見交換をし,小児肺細葉モデリングにおいて重要なヒト肺発生に関わる資料,および小児肺疾患に関する知見を収集した.数理モデリング解析コードの可読化を進め,コード開発効率がよくなっているため,おおむね当初の計画通り進展している.数理モデリング解析コードの効率化をさらに進めると共に,小児内科医とのミーティングを重ねることで診断支援や治療法開発へと繋がるようにポイントを押さえてモデルの構築,解析を進める.本研究は,実験的手法では解明が難しい小児肺細葉の形態学的特徴の変化およびそこで生じる様々な力学現象を,「計算幾何学と最適化を用いた数理形状モデル」・「マルチスケール計算力学解析手法」を土台とした理論・解析によって明らかにするものである.さらに構築する研究プラットホームから,小児肺疾患の診断支援・治療法開発支援への展開を目指す学問領域“小児肺細葉バイオメカニクス"を創成するものである.本年度は,小児肺細葉解析のベースとなる,計算幾何学と最適化手法を組み合わせた肺微小構造の数理形状モデルのコード開発の効率化を進め,放射光マイクロCTにより撮影されたマウス肺細葉画像から再構築した実形状モデルを基に,肺細葉の均質構造モデル,不均質構造モデルを構築した.これらのモデルを用いて,表面張力効果を考慮した肺細葉膨張シミュレーションを行い,膨張に伴う肺組織の非等方変形を解析した.これより,実形状モデルで得られる力学場の再現には,不均質構造モデルが有効であることを確認した.また,肺細葉変形に関する表面張力効果を検討し,肺胞表面における非等方変形が促進されることを見出した.この結果を含めた肺細葉解析結果を小児の臨床医を含む医学系研究者の前で発表し,情報交換を行った.本研究の実行にあたり,小児肺細葉構造構築および力学解析を行うための計算機環境,および力学解析に用いるための肺組織の力学特性を得るための引張試験装置を構築した.さらに,小児内科の臨床医と意見交換をし,小児肺細葉モデリングにおいて重要なヒト肺発生に関わる資料,および小児肺疾患に関する知見を収集した.数理モデリング解析コードの可読化を進め,コード開発効率がよくなっているため,おおむね当初の計画通り進展している.数理モデリング解析コードの効率化をさらに進めると共に,小児内科医とのミーティングを重ねることで診断支援や治療法開発へと繋がるようにポイントを押さえてモデルの構築,解析を進める.本年度計画した研究に必要なスペックを満たした計算機器類が当初の見積もりより若干安く購入できたため.本年度実施した予備計算により,解析するためのデータ量が増えることが予想されるため,本年度本助成金は翌年度分助成金と合わせて,翌年度の研究執行に必要な物品購入に充てる計画である.また,計算用サーバが3月に納品となり,支払いが完了していないため次年度使用額が生じたが,4月に支払いが完了する予定である.
経済学と実験心理学の協働による景観の経済的価値に関する研究

本研究では景観に含まれる要素をVR(仮想現実)上で任意に変化させ、それが景観の経済的価値に与える影響を明らかにする手法を開発し、今後の景観保護に向けた合意形成や政策の策定に資することを目指す。具体的には、VRモニターを用い、心理学の実験手法に基づいたランダム化比較試験により、景観の要素(色彩等)の違いおよび時間的変化に対する被験者の選好、心理的評価と支払意思額を明らかにする。さらに、色彩選好についての認知心理学的理論等を踏まえ、景観要素が景観の経済的価値を左右するプロセスを検討し、経済的価値の推定精度を向上させる。
母乳育児予測スケールの開発とその有用性の検証

本研究の目的は,平成15年度16年度科学研究費補助金(基盤研究(C))で得られた結果から,母乳育児継続を予測するためのツール(母乳育児予測ツール)を開発し,そのツールの臨床的有用性を検証することである。BFPTは,平成15年度16年度科学研究費補助金(基盤研究(C))の研究成果を基に作成した。BFPTは,1)乳汁分泌に影響する基本的条件付け要因(5項目),2)乳房の形態的要因(3項目),3)母乳育児制限(心理・社会的)要因(13項目)の3領域,合計21項目から構成された。回答の選択枝は,1)の基本的条件要因5項目と2)の乳房の形態的要因の3項目は,「あてはまる」を4点とし,「あてはまらない」を1点とした。3)の母乳育児制限要因13項目は,「あてはまる」を4点として,「ややあてはまる」を3点,「あまりあてはまらない」を2点,「あてはまらない」を1点とする4段階評価を用いた。母乳育児制限(心理・社会的)要因(13項目)のCronbach'sαは0.81であり,下位尺度は0.58から0.83であった。BFPTの得点範囲は,21点から84点であり,得点が高いほど母乳育児継続を阻害する要因を有していることをあらわしている。2.母乳育児予測ツール(BFPT)の検証(平成18年度)作成したBFPTが,産後1カ月時の母乳育児継続をどの程度予測するのかを調査した。調査方法は,産褥退院時の母親を対象に,BFPTを用いて調査を行い,同じ対象の産後1カ月時での母乳育児形態を調査した。BFPSの得点範囲は,21点から84点の範囲にあり,本調査者の得点範囲は,23点から57点であった。全体の平均点は41.4±8.2であった。1カ月健診時母乳育児群の平均点は37.5±7.2,混合・人工乳育児群の平均点は46.1±6.7であり,両群には有意(p<0.0001)な差を認めた。産褥1カ月時に混合・人工乳育児が予測されるCut off pointを42点以上と設定した場合,感度74.4%,特異度76.1%であった。以上の結果より,BFPSは,産後1カ月までの母乳育児継続が困難な母親を,産褥退院時にスクリーニングすることが可能であり,個別的継続的な支援が行えるスケールである。

BFPTは,1)乳汁分泌に影響する基本的条件付け要因(5項目),2)乳房の形態的要因(3項目),3)母乳育児制限(心理・社会的)要因(13項目)の3領域,合計21項目から構成された。回答の選択枝は,1)の基本的条件要因5項目と2)の乳房の形態的要因の3項目は,「あてはまる」を4点とし,「あてはまらない」を1点とした。3)の母乳育児制限要因13項目は,「あてはまる」を4点として,「ややあてはまる」を3点,「あまりあてはまらない」を2点,「あてはまらない」を1点とする4段階評価を用いた。母乳育児制限(心理・社会的)要因(13項目)のCronbach'sαは0.81であり,下位尺度は0.58から0.83であった。BFPTの得点範囲は,21点から84点であり,得点が高いほど母乳育児継続を阻害する要因を有していることをあらわしている。2.母乳育児予測ツール(BFPT)の検証作成したBFPTが,産後1カ月時の母乳育児継続をどの程度予測するのかを調査した。調査方法は,産褥退院時の母親を対象に,BFPTを用いて調査を行い,同じ対象の産後1カ月時での母乳育児形態を調査した。現在,41名のデータが収集され,次年度継続して調査する計画である。産後の母乳育児継続を予測するスケールを開発し,その有用性を検証した。本スケール(BFPS)は,母乳育児率が著しく減少する産後1カ月時点までの,母乳育児継続を予測するスケールであり,3領域21項目(母乳育児に影響を与える心理,社会的要因:14項目,母乳育児に影響を与える乳房の形態的要因:3項目,母乳育児に影響を与える母子の基本的条件要因:5項目)からなる。BFPSの得点範囲は,21点から84点の範囲にあり,本調査者の得点範囲は,23点から57点であった。全体の平均点は41.4±8.2であった。1カ月健診時母乳育児群の平均点は37.5±7.2,混合・人工乳育児群の平均点は46.1±6.7であり,両群には有意(p<0.0001)な差を認めた。産褥1カ月時に混合・人工乳育児が予測されるCut off pointを42点以上と設定した場合,感度74.4%,特異度76.1%であった。以上の結果より,BFPSは,産後1カ月までの母乳育児継続が困難な母親を,産褥退院時にスクリーニングすることが可能であり,個別的継続的な支援が行えるスケールである。今後,母乳育児の継続のために,産後1カ月時に産後4カ月の育児形態を予測するスケール,さらにその後を予測するスケールへと発展して行く予定である。
Ga系ペロブスカイト型酸化物を用いた高酸素イオン伝導体の開発

従来、酸素イオン伝導体としては主に4価の金属酸化物が検討されてきたが、本研究ではAlまたはGaをBサイトに用いたペロブスカイトが高い酸素イオン伝導性を有する点に着目し、主にBサイトにGaを用いたペロブスカイト酸化物について酸素イオン伝導性を検討し、極めて高い酸素イオン伝導性を有する酸化物を開発することを目的とする。従来の研究において、LaGaO_3系ペロブスカイトが極めて高い酸素イオン伝導性を有することを見い出したので、本研究ではLa_<0.8>Sr_<0.2>Ga_<0.8>Mg_<0.2>O_3を中心に、A又はBサイトの複合化及び、A又はBサイトの欠損を行い、その影響を検討した。まずLaサイトへ9:1の組成で種々の希土類元素を添加したところ、添加する希土類元素により、イオン伝導度及びイオン輸率が変化し、Ndを添加した系では電気伝導度はほとんど低下することなく、イオン輸率が大きく向上することがわかった。一方、BサイトへAl又はInを添加し、その複合化を行ったところ、Bサイトへ、Al又はInを添加するとイオン伝導度は低下するので、Bサイトの複合化は望ましくないことがわかった。次にA又はBサイトカチオンの欠損効果を検討したところ、Aサイトカチオンを欠損すると電気伝導、イオン輸率ともに低下するが、Bサイトカチオンを欠損すると電気伝導はわずかに向上し、イオン輸率も向上することがわかった。この結果、La_<0.8>Sr_<0.2>(Ga_<0.8>Mg_<0.2>)_<0.95>O_<3.8>の組成の試料は、ほぼ1のイオン輸率を示すとともに950°Cでlogσ=-0.4程度という従来の材料に比べても十分高い酸素イオン伝導性を有する材料であることがわかった。本研究ではさらに高い酸素イオン伝導性を有する材料の開発を目的に、Ba_3Ga_2O_6系の材料の電気伝導についても検討を行った。Ba_3Ga_2O_6は結晶構造が十分明らかにされていないが、立方晶系に属し、高い酸素イオン伝導性が期待された。電気伝導及び、ガス濃淡電池による測定からBa_3Ga_2O_6はほぼ完全な酸素イオン伝導体であることが確認されたが、電気伝導度は950°Cでlogσ=-3.0程度と低く、今後添加物等を用いることで、さらに高い酸素イオン伝導性を有する材料が見い出される可能性が示唆された。
卵巣癌における内分泌(GnRHa)療法の臨床導入に対する基礎的・臨床的研究

GnRH受容体を発現している卵巣癌腺癌由来細胞株では、GnRHaがその増殖を抑制した。また当科にて樹立した化学療法抵抗性のclear cell carcinoma由来細胞株は、GnRH受容体を発現しており、GnRHaは単独でもその増殖を抑制し、さらに化学療法剤Cis-platinumの抗腫瘍効果をも増強した。以上よりGnRHaは上皮性卵巣癌の細胞増殖をその受容体を介して抑制し、化学療法抵抗性の改善に関与する可能性が示唆された。次に我々は近年癌の発生・増殖に関与することが報告されているtelomerase活性へのGnRHaの影響について検討した。GnRH受容体を発現している卵巣癌株では、telomerase活性が検出され、その活性はGnRHa添加により抑制された。telomere長もGnRHaにより短縮した。また長期間のGnRHa添加によりM_1 senescenceが誘導された。GnRHaのこれらの作用は可逆性であり、またGnRHa受容体陰性の細胞株では認められず、GnRHaによるtelomerase活性の抑制とM_1 senescenceの誘導はGnRHa受容体を介することが示唆された。一方、ヒト上皮性卵巣癌20症例の原発巣、転移巣の検討では、follicule stimulating hormone(FSH)受容体は転移巣において高率に発現しており、FSH受容体の獲得とFSHが転移に関与することが示唆された。またin vitroMatrigel invasion assayでの卵巣癌株の浸潤能はFSHにより促進され、GnRHaで抑制された。以上より、GnRHaは上皮性卵巣癌の増殖や浸潤・転移を直接的、間接的に抑制することが示唆され、化学療法の補助療法として、あるいはsalvage療法として長期間使用することが有効である可能性が示された。現在までに、3例の上皮性卵巣癌進行期症例(IIIc期:2例,IV期:1例)に患者のinformed consentを得てGnRHa(Buserelin)を化学療法の補助療法として用いており、12-26ケ月間NCを維持している。卵巣癌の進行におけるGonadotropin Releasing Hormone(GNRH)の意義を検討した。すなわち培養細胞とくに臨床的に化学療法に抵抗するclear cell carcinomaの樹立をおこない(3株:OVHS-1,2,3)これらにおけるGNRH受容体の発現、GNRH analoge投与による増殖の変化、さらにはGNRHとCis-platinumの併用効果についてin vitroで検討している。現在までに得られた結果では、(1)これらの卵巣癌株ではいずれもGNRH受容体のmRNAが発現している(mRNA)。(2)培養系への添加では75μg/well以上の濃度で有意な増殖抑制を認めた。(3)Cis-platinumとの併用ではID50の約10分の1の低下をみとめた。以上の結果より、clear cell carcinomaにおいてはGNRH analogeを投与することでCis-platinumの抗腫瘍効果を増強させることが可能であると考えられた。20例のヒト上皮性卵巣癌の検討について、原発巣に比て転移巣で高率にFSH受容体の発原を認め、FSH受容体の獲得とその促進が卵巣癌の浸潤・転移機構に関与することを明らかにした。

GuRH受容体の発現には、原発巣・転移巣に有意の差を認めなかったが、これまでの我々の研究成果より、GuRHaがFSH受容体を介して浸潤・転移巣に作用する可能性が得られたため、さらにin vitroの浸潤モデルを用い検討した。すなわち、FSHは癌細胞のabrosionとmigration機構を促進し、GuRHが抑制する可能性が示唆され、GuRHa療法が進行卵巣癌患者の補助療法として有用であることが示された。現在これまでの研究成果に基づいて、臨床導入にあたってのprofocalを作製する試みを行っている。
光および超音波の外部刺激により誘発される不活性結合切断反応の開発

本研究では、高度に酸化された天然資源分子への自在な官能基の導入・置換反応の開発を目指します。特に、C-O/C-N結合切断型変換反応の開発と活用に焦点を絞り、1)これまでにない天然資源分子をテンプレートとする機能性分子の創製と2)生体内活性物質/機能性分子の直接的な変換・修飾に挑みます。詳細を以下に示します。1) C-N、C-O切断型クロスカップリング反応を用いた重縮合反応。本研究では、アリールハライド(Ar-I, Br, Cl)を求電子剤として用いる従来型の方法に代わり、ニッケル触媒存在下、フェノール類(Ar-OH)やアニリン類(Ar-NH2)に由来するアリールエーテル(Ar-OR)とアンモニウム塩(Ar-NMe3+)を用いるクロスカップリング反応を開発してきました。今回、この反応をOLEDや有機電界トランジスタなどの光学材料素子として重要なπ共役ポリマーの合成に展開しました。本反応は、高分子の新たな精密合成法を拓く重要な知見であり、さらなる展開が期待されます。2)アニリンからアリールエーテルへの変換反応。アミノ基は天然物をはじめとして様々な機能性分子にあまねく存在する官能基です。そのため、アミノ基を簡便に他の官能基に変換する方法を確立することができれば、新たな有用化合物の探索がより容易になると考えられます。本研究では、遷移金属触媒を用いない条件下で、カリウムアルコキシド(ROK)が速やかにアリールアンモニウム塩の炭素ー窒素結合を炭素ー酸素結合に組み替える反応を進行させることを見出しました。本手法はグラムスケールでの運用も可能であり、複雑な構造を有する医薬品あるいはその誘導体の合成にも非常に有用なプロセスです。2018年度は新規C-O/C-N結合切断型変換反応の開発とその応用に集中します。その為に、昨年度は1) C-N、C-O切断型クロスカップリング反応を用いた重縮合反応や2)アニリンからアリールエーテルへの変換反応などを達成し、Nature Commun.やAngew. Chem. Int. Ed.などを含む重要国際学術誌に7報の論文を発表しました。昨年度の計画に基づいて、現在までの研究は予想以上に順調に進展しています。2019年度の研究は、昨年度に引き続きC-O/C-N結合切断型変換反応の開発を継続する予定で、新手法及び新規反応機構の導入を一層重視することにします。特に、従来の遷移金属触媒反応の問題点の克服を志向し、可視光などの外部刺激に基づくクリーンなエネルギー利用を基盤とし、合成の最終段階での使用にも耐えうる高選択反応を生み出すことで、天然物や医薬品など多官能基化された分子の合成・誘導体化のための新たな合成手法を確立することを目標とします。

特に、従来の遷移金属触媒反応の問題点の克服を志向し、可視光などの外部刺激に基づくクリーンなエネルギー利用を基盤とし、合成の最終段階での使用にも耐えうる高選択反応を生み出すことで、天然物や医薬品など多官能基化された分子の合成・誘導体化のための新たな合成手法を確立することを目標とします。2018年度は、本課題における重要な進展とする「C-N、C-O切断型クロスカップリング反応を用いた重縮合反応」および「アニリンからアリールエーテルへの変換反応」の開発に成功しました。これらの研究を遂行するために、当年度の研究費は予定通りに使用されました。また、当研究室の別予算により本研究における費用(消耗品など)の一部が支払われたこともあります。未使用金額(15,022円)は、2019年度の物品費(実験器具や他の消耗品)に繰越します。
FGFシグナル伝達機構の解析

FGFの生体内での機能解析は、FRS2を同定しても、その固有のシグナル伝達解析の良い細胞系がなく、また遺伝子ノックアウトを作成しても発生初期に方向性が決定してしまうため、そこから細胞株を作成し機能解析をする方法論がとれず解析が困難であった.最近FGFシグナル異常が後天的に膵臓β細胞に作用を及ぼし、糖尿病を起こすことが明らかになった.FGFとインスリンはそれぞれ独立した成長因子であり,また歴史的にコンピテンスの概念は、IGFとの関連に起源があることから、FGFの働きを解明する糸口になりうる現象である.これらの原因を分子レベルで解明するため、FGFシグナル伝達機構の解析手段として、in vivoの膵細胞分化系の構築を行ない膵幹細胞を分離する.その後膵幹細胞にどのようなFGFシグナル伝達系が機能するかを検討する.我々はこのため経胆嚢的膵肝導入法を完成した。遺伝的、免疫学的、生化学的に確立された純系マウスの腹部切開後、胆嚢を穿刺し、ここより細いカテーテルを挿入した.先端を胆嚢管に固定後、造影剤を注入した.造影剤は総肝管を逆流し肝臓へ、また総胆管から膵管を逆流し膵臓へ流入し、効率良く物質を移送することが確認された.次に未分化胎児幹細胞株を導入した.末端にまで流入した細胞は導管栓塞後,導管上皮内へ侵入し外側へ移動した.細胞は各臓器に播種後腫瘍性増殖した.このことより細胞移植が可能であることがわかった。次に膵臓由来線維芽細胞を導入したところ膵臓に分化した.移植細胞は導管周囲の細胞環境の影響を受け再分化したことがわかった。これらの細胞群は培養開始後2週間であり、まだアミラーゼ、インスリン陽性細胞を含むので、これらを除外後、膵幹細胞が存在するかどうかを解析する.この膵幹細胞同定後に遺伝子操作等を行い、FGFシグナルを解析する.FGFの生体内での機能解析は、FRS2を同定しても、その固有のシグナル伝達解析の良い細胞系がなく、また遺伝子ノックアウトを作成しても発生初期に方向性が決定してしまうため、そこから細胞株を作成し機能解析をする方法論がとれず解析が困難であった.最近FGFシグナル異常が後天的に膵臓β細胞に作用を及ぼし、糖尿病を起こすことが明らかになった.FGFとインスリンはそれぞれ独立した成長因子であり,また歴史的にコンピテンスの概念は、IGFとの関連に起源があることから、FGFの働きを解明する糸口になりうる現象である.これらの原因を分子レベルで解明するため、FGFシグナル伝達機構の解析手段として、in vivoの膵細胞分化系の構築を行ない膵幹細胞を分離する.その後膵幹細胞にどのようなFGFシグナル伝達系が機能するかを検討する.我々はこのため経胆嚢的膵肝導入法を完成した。これらの細胞群は培養開始後2週間であり、まだアミラーゼ、インスリン陽性細胞を含むので、これらを除外後、膵幹細胞が存在するかどうかを解析する.この膵幹細胞同定後に遺伝子操作等を行い、FGFシグナルを解析する.1) FRS2の機能解析;FRS2がどのようなシグナルを伝えるかどうかを明らかにするためFRS2の燐酸化ミュータントを作成し,これをPC12細胞に導入FGFにて刺激後FRS2と複合体を作る蛋白群及び下流のMAPK活性に与える影響を調べた.Grb2と同様Shp2もFRS2に結合するが,FGF依存性にShp2は燐酸化されGrb2-Sosと結合する.このことよりFGF依存性にFRS2-Shp2-Grb2-Sos複合体を形成することが判明した.FRS2の5つの燐酸化部位のうちMAPK活性はShp2結合部位より主に伝達される.他の4箇所のGrb2結合部位からはMAPKへのシグナルは伝達されにくく,これらの部位からはMAPKと異なる経路のシグナル伝達の可能性を示唆した.2) FGFシグナルの質的差異を解析するため,FGFファミリーによる質的な分化変化を示す細胞株を検索した.膵前駆細胞株であるAR42J細胞のFGF1及びFGF7に対する反応を解析したところFGF1では膵外分泌細胞様,FGF7では膵管細胞様と異なる分化能を示した.AR42J細胞上にはFGFレセプターが存在し特にFGF7はFGFR2のみ特異的に活性化する.この性質を利用しFGFレセプターシグナル下流の因子に及ぼす質的な差を解析中である.3) FRS2ノックアウトマウスの作成;現在へテロマウスまで得られこれらを交配中である.

ヘテロマウスに変異はなく,FRS2の遺伝子量が半分でも表現型に差異はない.FGFの生体内での機能解析は、FRS2を同定しても、その固有のシグナル伝達解析の良い細胞系がなく、また遺伝子ノックアウトを作成しても発生初期に方向性が決定してしまうため、そこから細胞株を作成し機能解析をする方法論がとれず解析が困難であった.最近FGFシグナル異常が後天的に膵臓β細胞に作用を及ぼし、糖尿病を起こすことが明らかになった.FGFとインスリンはそれぞれ独立した成長因子であり,また歴史的にコンピテンスの概念は、IGFとの関連に起源があることから、FGFの働きを解明する糸口になりうる現象である.これらの原因を分子レベルで解明するため、FGFシグナル伝達機構の解析手段とし〓in vivoの膵細胞分化系の構築を行ない膵幹細胞を分離する.その後膵幹細胞にどのようなFGFシグナル伝達系が機能するかを検討する.我々はこのため経胆嚢的膵肝導入法を完成した。遺伝的、免疫学的、生化学的に確立された純系マウスの腹部切開後、胆嚢を穿刺し、ここより細いカテーテルを挿入した.先端を胆嚢管に固定後、造影剤を注入した.造影剤は総肝管を逆流し肝臓へ、また総胆管から膵管を逆流し膵臓へ流入し、効率良く物質を移送することが確認された.次に未分化胎児幹細胞株を導入した.末端にまで流入した細胞は導管栓塞後,導管上皮内へ侵入し外側へ移動した.細胞は各臓器に播種後腫瘍性増殖した.このことより細胞移植が可能であることがわかった。次に膵臓由来線維芽細胞を導入したところ膵臓に分化した.移植細胞は導管周囲の細胞環境の影響を受け再分化したことがわかった。これらの細胞群は培養開始後2週間であり、まだアミラーゼ、インスリン陽性細胞を含むので、これらを除外後、膵幹細胞が存在するかどうかを解析する.この膵幹細胞同定後に遺伝子操作等を行い、FGFシグナルを解析する.
ATP-オートクリン/パラクリン物質としての放出とその細胞内シグナリング

ATPはそれ自身のP2XおよびP2Y受容体を介した細胞外情報伝達物質として、筋収縮、痛み、免疫および炎症反応など、多彩なオートクリン/パラクリン作用を示すことが明らかにされてきたが、依然として、ATPの細胞外放出とその細胞内シグナル機構については不明のままである。本研究は、引き続き、アゴニスト刺激によるATP放出に関与する細胞内シグナルがいかなるものであるかを明らかにする目的で行われた。平成13年度は、モルモット結腸紐からの培養平滑筋細胞の灌流実験で、Angiotensin II(Ang II)によるATP放出に関与する細胞内シグナルについて検討された。Anf II(0.3-1μM)によるATP放出がAT_1受容体刺激により引き起こされること、また、この放出がU-73122、thapsigargin、BAPTA/AMなどの細胞内シグナル伝達阻害薬によって拮抗されること、さらにはAng IIが本培養細胞内のIns(1,4,5)P_3産生を促進し、これは、AT_1受容体を介していることなどの知見から、Ang IIによる結腸紐細胞からのATP放出には小胞体のIns(1,4、5)P_3受容体を介した細胞内Ca^<2+>シグナルが関与していることが明らかにされた。(Biochem. Biophys. Res. Commun.,293,686-690,2002)平成14年度は、同精管の培養平滑筋細胞からのcaffeineによるATP放出とその細胞内シグナルについて検討が行われた。Ca^<2+>除去Krebs液による灌流実験で、3mM caffeineは、速やかで著明なATP放出を引き起こし、これは、thapsigarginやBAPTA/AMにより拮抗され、さらに30μM ryanodineおよび100μM tetmcaineなどのryanodine受容体拮抗薬によりほぼ完全に抑制された。本培養細胞中の[Ca^<2+>]iはfluo 4を示標とした測定実験でcaffeineにより著しく上昇し、これはtetracaineによって完全に拮抗された。また、RT-PCR実験で精管平滑筋にはRyR2のmRNAの発現が明らかにされた。これらの結果から、caffeineによる精管平滑筋からのATP放出には、小胞体のryanodine受容体(恐らくRyR-2)を介した細胞内Ca^<2+>遊離の関与が明らかとなった。(Mol. Pharmacol. in press)ATPはそれ自身のP2XおよびP2Y受容体を介した細胞外情報伝達物質として、筋収縮、痛み、免疫および炎症反応など、多彩なオートクリン/パラクリン作用を示すことが明らかにされてきたが、依然として、ATPの細胞外放出とその細胞内シグナル機構については不明のままである。(Mol. Pharmacol. in press)桂木らは、従来より主に平滑筋細胞において、angiotensin IIおよびα,β-methylene ATP(α,β-mATP)などのアゴニスト刺激によるオートクリン/パラクリン物質としてのATPの放出に関与する細胞内シグナル伝達について検討を行い、IP_3産生増加とATP放出との関連を示すいくつかの知見を報告してきた。本研究では、特にα,β-mATPによるモルモット精管平滑筋細胞からのATP放出メカニズムを回腸におけるそれとの比較により検討した。