hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
東南アジアにおけるマラリア疫学調査と遺伝子解析

タイ、ベトナム、インドネシア、ミャンマーにおいてマラリア疫学調査と共にG6PD欠損症の迅速診断法も実施し、得られたマラリア原虫や血液サンプルの遺伝子解析を行った。1)タイにおける調査はミャンマー国境のサンカブリとラノンにおいて実施した。ラノンでは、多数の四日熱マラリアと少数の卵形マラリア感染者が検出された。2)ベトナムにおける調査はラムドン省バロックにおいて実施した。従来と比較すると患者数の増大傾向が認められた。3)インドネシアの調査は、東ヌサテンガラ州フローレス島マウメレ、東ジャワ州バヌワンギ、パチタンおよびカンゲアン島において疫学調査を行なった。東ジャワ州ではマラリア感染者は少なかったが、バヌアンギではSERA抗原遺伝子が全て同一型を示し、一人の患者から感染が広まったものと考えられた。4)ミャンマーのマラリアの疫学調査は、モン州チャイトーンとタトーン、シャン州ムセ、ピンダヤおよびカーロー、ラカイン州タンドウェとシッドエで実施した。いずれの地域でも多数の四日熱マラリアと卵形マラリア感染者が検出された。特に、四日熱マラリア症例では、形態学的に従来型と異なる2種類の新型四日熱マラリア原虫が見い出された。これらの新型原虫の18SリボゾームRNA(SSUrRNA)遺伝子は、従来の四日熱マラリア原虫で報告された配列と異なっており、新型種と考えられた。タイ、ベトナム、インドネシア、ミャンマーにおいてマラリア疫学調査と共にG6PD欠損症の迅速診断法も実施し、得られたマラリア原虫や血液サンプルの解析を行った。1)タイにおける調査は8月にミャンマー国境のサンカブリ、平成12年1月にラノンにおいて実施し、総数88名のマラリア陽性患者が検出され、ほとんどの患者はミャンマー人であった。アクリジンオレンジ(AO)法によるこの診断結果はNested PCR法を用いた遺伝子診断法により再確認され、四日熱マラリアの検出率は約15%であった。2)ベトナムにおける調査はラムドン省バロックにおいて9月に実施し、503名を検査した結果、マラリア陽性患者112名が検出され、昨年と比較すると患者数の増大傾向が認められた。3)インドネシアの調査は、10月に東ジャワ州のカンゲラン島とインド洋に面したバヌワンギ村を訪問し疫学調査を行った。総数95名のマラリア感染者を検出したが、バヌアンギではSERA抗原遺伝子が全て同一型を示し、一人の患者から感染が広まったものと考えられた。4)ミャンマーのマラリアの疫学調査は、8月にモン州チャイトーン、11月には中国国境のシャン州ムセ、平成12年2月にラカイン州タンドウェとモン州タトーンで実施した。いずれの地域でも多数のマラリア感染者が検出され、多くの患者は熱帯熱・三日熱マラリアの混合感染であった。四日熱マラリア症例では、Nested PCR法のターゲット部位において4塩基短い新型の四日熱マラリア感染者が多数検出された。現在、これらの新型株のリボゾームRNA遺伝子の全解析を行っている。タイ、インドネシア、ミャンマーにおいてマラリア疫学調査を実施し、得られたマラリア原虫の遺伝子解析を行った。1)タイにおける調査はミャンマー国境のラノンにおいて実施した。多数の四日熱マラリア患者が検出された他、少数の卵形マラリアも見い出された。2)インドネシアの調査は、東ヌサテンガラ州フローレス島マウメレにおいて疫学調査を行なった。この島においても多数の四日熱マラリア患者が検出された。3)ミャンマーのマラリアの疫学調査は、モン州タトーン、シャン州ピンダヤおよびカーロー、ラカイン州タンドウェとシッドエで実施した。いずれの地域でも多数の四日熱マラリアおよび卵形マラリア感染者が検出されたが、四日熱マラリア症例では、形態学的に従来型と異なる2種類の新型四日熱マラリア原虫が見い出された。
中枢のホスファターゼ阻害による妊娠糖尿病および仔の代謝異常の治療法の開発

生活習慣の欧米化や晩婚化に伴い妊娠糖尿病は増加しており、適正な対策が必要となる。本研究により、妊娠の維持に重要なエストロゲンの中枢作用が、マウスでのインスリン作用と糖代謝の調節に重要なことが明らかとなった。また、リピッドホスファターゼSHIP2は、視床下部でのインスリン作用を特異的に制御することで、摂食と肥満に関わる。そこで、ligand-based drug designの手法により新規SHIP2阻害化合物をデザインし、合成して得られた候補化合物の中から、効果的にインスリン抵抗性病態での糖代謝を改善する新規SHIP2阻害化合物を見出し、今後の治療応用の可能性を示した。生活習慣の欧米化や晩婚化に伴い妊娠糖尿病は増加している。妊娠中の代謝異常は、周産期・新生児合併症の増加に加えて、将来母体や児の2型糖尿病の発症に影響することから適正な対策が必要となる。本研究により、妊娠の維持に重要なエストロゲンは、マウスでは中枢作用を介して、白色脂肪組織での脂肪分解の促進、褐色脂肪組織での熱産生の亢進、運動量の増加により糖代謝を調節することが明らかとなった。また、妊娠に伴う精神変調に関連して、マウスはエストロゲンの欠乏によりうつ症状を呈したが、中枢性のエストロゲンの投与はうつ症状を効果的に改善した。エストロゲンによる中枢性のインスリン作用の制御が糖代謝の調節に重要なことから、PI3-キナーゼを介したインスリンの代謝作用を特異的に制御する5'-リピッドホスファターゼSHIP2を過剰に発現したトランスジェニックマウスを用いて、インスリンの中枢作用の負の制御機構につき検討した。その結果、視床下部SHIP2は、レプチン作用に影響を与えずインスリン作用を特異的に調節することで、摂食調節機構に関与して体重を制御することが明らかとなった。そこで、中枢性のSHIP2の制御がエネルギー代謝の改善に繋がることから、in silico ligand-based drug designの手法により新規SHIP2阻害化合物をデザインし、合成して得られた候補化合物の中から、培養細胞でのin vitroとマウスでのin vivoでの検討により、効果的にインスリン抵抗性病態での糖代謝を改善する新規SHIP2阻害化合物CPDAを見出した。さらに、強制水泳試験によるマウスのうつ状態の評価により、SHIP2阻害は抗うつ作用を発揮した。以上の本研究により、中枢性のSHIP2阻害は糖尿病や脳高次機能障害の改善に効果的なことが明らかとなり、今後の治療応用が期待される。妊娠中の代謝異常は周産期・新生児合併症の増加に加えて将来母体や児の2型糖尿病の発症に影響することからも対策が必要とされる。本研究では、中枢のホスファターゼ活性を適切に制御することで、妊娠中の食欲亢進とインスリン抵抗性を改善するための新たな方策の確立を目的とした。全身のエネルギー代謝やインスリン感受性は視床下部により統合制御されており、末梢組織からインプットされる中枢でのレプチンやインスリン作用は視床下部でのホスファターゼにより調節されている。本研究により、チロシンホスファターゼPTP1Bが中枢でのレプチン作用を主に制御するのに対し、リピッドホスファターゼSHIP2は中枢のレプチン作用に影響を与えずにインスリン作用を制御することで、全身のエネルギー・糖代謝を調節する成績を得た。また、エストロゲン(E2)の中枢作用も検討した。E2は妊娠の維持に必要であるが、妊娠時に認められる高濃度のE2はインスリン抵抗性を誘導し、妊娠糖尿病の発症にも関わる。生理的なE2は中枢神経系を介して内臓および皮下脂肪の分解を促進し、肝糖新生を抑制し、エネルギー消費を亢進することで全身のエネルギー・糖代謝を亢進するとの知見を得た。さらにうつと不安の行動学的試験により、E2は中枢作用を介してこれらの精神症状に関わる可能性が示唆された。以上より、中枢のチロシンホスファターゼPTP1Bの制御により食欲を調節し、また、リピッドホスファターゼSHIP2の制御により全身のエネルギー代謝を調節することで、妊娠中の糖代謝やインスリン抵抗性を制御できる可能性が考えられる。今後、さらに中枢のE2作用における視床下部でのホスファターゼの役割を明らかにし、中枢選択的なホスファターゼ作用阻害による妊娠糖尿病への介入のための基礎的基盤を確立することを目指す。中枢のホスファターゼの阻害により、妊娠糖尿病および仔の代謝異常に対して新規治療法策の開発を目指して研究を推進した。

中枢のチロシンホスファターゼPTP1Bは、レプチン作用を制御するのに対し、中枢のリピッドホスファターゼSHIP2はレプチン作用には影響せず、インスリン作用を特異的に制御することで、全身のエネルギー・糖代謝を調節することを明らかにした。また、妊娠の維持と妊娠糖尿病に深く関わるE2の中枢作用は、全身投与した場合と同程度の糖代謝への影響を認めた。その機序として、中枢のE2は、脂肪分解の亢進、肝糖新生の抑制、エネルギー消費の亢進作用を強く有するとの知見を得た。さらに神経機能の評価のための行動学的試験として、うつ・不安の解析のために尾懸垂試験、強制水泳試験およびオープンフィールド試験、明暗箱試験、高架式十字迷路試験を行った。その結果、卵巣提出マウスにおいて、E2の中枢投与はうつと不安を改善する傾向が認められ、今後これらのE2作用とそのメカニズムにつき、ホスファターゼとの関連を含めて検討することとした。以上、本研究課題の達成に向けて、ホスファターゼの中枢作用の特徴と差異を明らかにし、妊娠の維持と妊娠糖尿病に関与するE2の中枢作用に関し、全身のエネルギー・糖代謝への影響と、精神神経機能として不安・うつへの影響を明らかにした。以上、本研究目的の達成に向けて研究は進展している。平成23年度には、ホスファターゼが中枢作用を介してエネルギー・糖代謝作用に及ぼす影響を調べ、妊娠の維持と妊娠糖尿病に関与するE2の中枢作用につき、全身のエネルギー・糖代謝作用への関与と機序、さらに、E2の中枢作用を介したうつ・不安への影響を明らかにした研究成果に基づいて、平成24年度はさらに研究を推進する。特に、中枢のホスファターゼ作用として、チロシンホスファターゼであるPTP1BとリピッドホスファターゼSHIP2の作用特性の差異に着目する。ホスファターゼの中枢での阻害が、妊娠糖尿病病態でのエネルギー・糖代謝に与える影響を解明するため、siRNAと特異的阻害剤を用いた手法により研究を推進する。また、中枢のホスファターゼの阻害によるE2作用への影響に着目して、エネルギー・糖代謝とうつ・不安に及ぼす影響を解明するための研究を強く推進する。以上より、本研究目的の達成を目指す。平成24年度の研究費は、継続して研究を遂行するための消耗品費と、研究成果の発表のための印刷費に使用する。消耗品費の明細としては、マウスの購入・飼育費、遺伝子解析用試薬(real-time PCR試薬など)費、ウエスタンブロット試薬費、組織学的検討試薬費、細胞培養(視床下部神経細胞や脂肪細胞など)費として使用し、研究を推進する。
新規可溶化法を用いたO-結合型糖タンパク質の合成研究

本研究では、新規可溶化保護基である4-ピコリル(Pic)基を利用して、難溶性領域を持つ糖タンパク質、インターロイキン-2(IL-2)の化学合成を行った。先行研究でIL-2のC末端領域は、高い難溶性を示し、合成することが困難であった。そこで、PicをC末端領域中に含まれるグルタミン酸側鎖に導入することで、溶解性の改善することができた。得られたC末端領域を、他のペプチドセグメントとチオエステル法により縮合することで、全長配列を構築し、続いて、脱保護とフォールディングをすることで、目的とした均一な糖鎖構造を持つIL-2の合成を達成した。(糖)タンパク質の化学合成途上、目的タンパク質の部分配列(ペプチドセグメント)の高い難溶性に見まわれ、合成が困難になってしまうことが頻繁にある。そこで、本研究では、難溶性領域の可溶化を促進する親水性保護基(ピコリル基)を開発し、先行研究で合成が困難であったインターロイキン(IL)-2の合成を通じて、より汎用性の高い糖タンパク質の効率的合成法を確立する目的で行った。まずは、難溶性ペプチドの可溶化を促す親水性保護基、ピコリル(Pic)エステルの開発を行った。市販の化合物から2工程でPic基を有するグルタミン酸誘導体を調製した。次に、難溶性部分配列のIL-2(66ー98)及び、(99ー133)の調製に用いた。その結果、高い親水性を持つPic基はペプチドの可溶化を助け、先行研究では困難であった高速液体クロマトグラフィー(HPLC)よる精製を可能にした。以上の方法により、従来では全く合成が不可能だった難溶性セグメントの調製に成功することができた。次に、別途調製したペプチドセグメント、IL-2(1ー27)、(28ー65)と、先ほど得られた難溶性セグメント2種を順次縮合した。連続的チオエステル法を用いることで、3つのペプチドセグメントをワンポットで縮合し、IL-2の全長配列を得ることに成功した。続いて、側鎖保護基、及びPic基を銀イオン、及び亜鉛により除去し、最後に酸化還元系緩衝液中にて、自発的ジスルフィド結合の形成を行った。これにより得られた糖タンパク質は質量分析、二色円偏光スペクトル、及びバイオアッセイにより、天然と同様の立体構造と生理活性を持つことが分かった。以上の結果から、均一な糖鎖構造を持つIL-2の化学合成の成功が証明された。本研究で開発した親水性保護基、Picエステルは想像以上に可溶化能力が高く、セグメント3と4の合成が迅速に行えた。次のペプチドライゲーション工程も、可溶化法をしっかりと施したため、効率よく全長ポリペプチド鎖の調製を行うことができた。インターロイキンー2の全合成において、一番の問題がセグメント難溶性であり、これを効果的に解決することができたため、予想を超える進行度で全合成を成功することができた。糖タンパク質の合成途上、目的タンパク質の部分配列(ペプチドセグメント)の高い難溶性に遭遇し、その合成が困難になることが頻繁にある。そこで、本研究では、難溶性ペプチドの可溶化を促進する親水性保護基、ピコリル基を開発し、先行研究で合成が困難であったインターロイキンー2(IL-2)の合成を経て、より汎用性の高い糖タンパク質の効率的合成法を確立する目的で行った。前年度で、4-ピコリル(Pic)基を用いることでIL-2の全合成に成功している。しかし、グルタミン酸側鎖に導入したPic基は、固相合成中のピペリジン処理時に若干ながら不安定であることが分かった。この保護基の安定性を向上するため、立体障害を高めたピコリン型保護基を開発した。得られたピコリン型保護基は、Pic基と同様にペプチドの溶解性を高めるだけでなく、ペプチド伸長途上に生じるピログルタミン化を抑制し、効率よく目的の可溶ペプチドを与えた。この保護基を応用することで、ヒトヒストンH4の化学合成に成功し、この成果を査読付き学術論文誌「Chemical Communications」に報告することができた。また、糖鎖構造の異なるIL-2の化学合成を行うべく、シアル酸含有糖アミノ酸ビルディングブロックの合成に挑戦した。酸性水溶液下で不安定なシアリル結合が、ペプチドの脱保護に用いられるトリフルオロ酢酸(TFA)カクテル条件下で安定であるか検証すべく、まずは、構造が単純なシアリルTn抗原(シアリルガラクサミン)を目的化合物として設定し、合成を進めた。種々検討の結果、シアル酸水酸基に4-メトキシベンジル基、及びガラクトサミン水酸基に4-メチルベンジル基で保護した糖アミノ酸を利用することで、効率良く無保護の糖ペプチドが得られることが分かった。Picエステルは高い可溶化能力を持っていることが見出された。

しかし、固相合成中にペプチド鎖の伸長を一部止めてしまう副反応が明らかになった。より効率のよい調製法を確立すべく、副反応を抑える脱保護条件、及び一部構造の改変等を検討したい。また、異なった糖鎖構造をもつIL-2を得るべく、これに対応した新規糖アミノ酸ユニットの合成を行っていく。糖タンパク質有機化学以前から当研究室でストックしていた有機溶媒、アミノ酸誘導体を使用したため、消耗品類を買う必要が当年度にはあまりなかった。また、計画が順調だったので、消耗品の使用量も少なかった。使用しているHPLCの調整、及び有機溶媒、アミノ酸誘導体などの消耗品の補充に当てる。また、今後の研究の推進方策で述べた、親水性保護基の副反応を抑える検討、及び糖鎖構造を変えた新たな糖アミノ酸合成とその糖ペプチド、糖タンパク質合成へと進めていきたい。
有機薄膜中の閉じ込め励起子と光とのコヒーレント結合による超高速輻射緩和

有機薄膜において光と閉じ込め励起子とのコヒーレント結合により生じる超高速な輻射緩和・光学非線形性(サイズ共鳴増大と呼ぶ)の観測を試み、無機薄膜と比較してサイズ共鳴増大現象の普遍性に迫った。具体的には、芳香族アントラセンの100nm台の良質単結晶薄膜の励起子発光の時間分解測定により励起子ゼロフォノン発光がバルク結晶に比べて12桁高速化し、250ps以下の寿命となることを発見した。発光効率の高い良質薄膜であることから、閉じ込めによる特異な構造は観測されないが、原因としてサイズ共鳴増大現象が有力である。また、無機半導体CuCl薄膜ではサイズ共鳴増大による励起子非線形光学信号の室温増強を確認した。第2年度は、アントラセンの100nmオーダーの良質の分子性単結晶薄膜の作製を継続し、併せてその線形・非線形光学測定を試み、光と励起子のコヒーレント結合によるサイズ共鳴増大現象(超高速輻射緩和と超高速光学非線形性)の確認のための実験を行った。1.石英基板上に気相成長法で作製した試料は、昇華によって膜厚が変化すると共にクライオスタット内を汚染するため、安定な測定に適さないことが分かった。前年度から試みていた2枚の石英板を貼り合わせ、その隙間にアントラセンの融液を毛管現象で浸み込ませて結晶薄膜を作製する毛管法成長法が、昇華を防ぎ安定した試料を提供するのに適していることが分かった。また、甲南大学の青木珠緒氏との共同研究により、一方の石英板の内側となる面にストライプ状に金薄膜を厚さを変えて蒸着しておくことで、膜厚の制御が容易となることを示した。2.気相成長法による良質試料と毛管法による試料の線形光学スペクトルを比較し、後者において自由励起子とその分子内振動を伴う励起子発光が良好に観測されることを確認した。しかし、励起子の共鳴領域で期待される励起子閉じ込め効果による振動構造については、スペクトル分解能の範囲内ではまだ明確には観測されていない。3.サイズ共鳴増大現象を直接観測可能な四光波混合信号スペクトルの測定に着手したが、レーザーの2光束を同時に照射すると信号強度が減少する現象(誘起吸収)が観測されたために、現在その解析と原因究明を行っている。4.比較のために、CuCl薄膜における励起子のサイズ共鳴増大現象を論文に纏めた。次年度は、発光・吸収スペクトルにおいて励起子閉じ込めの存在を確かめると共に、四光波混合信号の時間応答から超高速輻射緩和がアントラセン薄膜結晶で起こることを確認する。これらを総合して分子性結晶薄膜における励起子輻射緩和のサイズ共鳴増大現象の存在を明らかにする。初年度は、有機物芳香族のアントラセン分子性単結晶薄膜(100nmスケール)について、光と励起子のコヒーレント結合によるサイズ共鳴増大現象(超高速輻射緩和と超高速光学非線形性)の存在を確かめるための実験の前提となる薄膜試料作製と基礎的光学スペクトルの測定を行った。1、蒸留法で純化されたアントラセン分子性結晶を、毛管成長法と呼ばれる方法で、2枚の石英板を貼り合わせた隙間にアントラセンの融液を毛管現象により染み込ませて100nm台の厚さでテーパーの付いた試料を作製した。試料作製は、有機分子性結晶作製に詳しい甲南大学の青木珠緒氏との共同研究である。この試料は2枚のガラス板の隙間にテーパーが付いているため、光学スペクトルの厚さ依存性を測定するのに適していることが分かった。2、上記の薄膜試料に対して、反射、吸収、発光スペクトルの測定を行い、スペクトルの厚さ依存性から励起子量子化準位の存在を明らかにすることを試みた。薄膜に垂直な方向がc軸であることから励起子質量が大きいため、励起子量子化準位をスペクトル的に分解するためには、試料の光学的純度の良さ(励起子の減衰定数の小ささ)と、測定におけるスペクトル分解能が鍵であり、これらのパラメータに注目してスペクトルの詳細を検討中である。3、光学非線形性を確かめるための四光波混合実験に適した測定装置の整備を行った。まず、試料を低温に冷やすクライオスタットは、アントラセンが室温で昇華することから専用の装置として整備した。また、振動子強度が無機物に比べて1桁大きいことから更なる超高速応答が期待されるので、実験に用いる光源の短パルス化を図った。上記の試料に対して予備的な実験を行い、四光波混合信号を得ることに成功した。次年度は、これらの予備実験の上に立って、更に励起子量子化準位測定に適した良質の試料の作製と本格的な非線形光学現象の測定を進める予定である。

100nm台の厚さの無機半導体結晶薄膜(CuCl)において、我々が既に実証した光と閉じ込め励起子とのコヒーレント結合による超高速な輻射緩和と光学非線形現象(総称して「サイズ共鳴増大現象」と呼ぶ)と比較しながら、アントラセン有機半導体薄膜において同様の現象を観測することを目的とした。1.良質で厚さを制御した薄膜試料の作製、2.吸収・反射スペクトルにおいて励起子閉じ込め効果を示す振動構造の観測、3.光学非線形性増大を示す四光波混合信号の測定、4.輻射緩和高速化を示す励起子発光寿命の測定等を試みた。最終年は3,4.を重点的に行った。薄膜試料を用いて励起子共鳴近傍の四光波混合スペクトルの観測には成功したが、CuClのような励起子共鳴付近での振動構造は観測されず、サイズ共鳴増大を確証するには至っていない。吸収、反射スペクトルの振動構造も観測されず、これらは薄膜面に垂直なc軸方向の励起子有効質量が大きいため振動構造のエネルギー間隔が測定の分解能以下となったと解釈される。一方、励起子発光寿命については、バルク結晶では励起子ゼロフォノン線、分子振動を伴う発光線は共に46 nsの発光寿命を示したが、2枚の石英板で挟み厚さを制御した340nmの薄膜試料では分子振動を伴う発光線の寿命が2030 nsと長寿命化している中で、励起子吸収端近傍のゼロフォノン発光のみが250 ps(レーザーパルス幅で制限)と少なくとも12桁高速化していることが判明した。発光効率はバルク結晶よりも大きいことから、非輻射過程の比較的少ない良質な薄膜と推定される。発光スペクトルはバルク結晶よりもブロードでエネルギーシフトした複数の発光が重畳しているなど試料の不均質性の問題は残るが、ゼロフォノン発光寿命が高速化した原因としてサイズ共鳴増大の可能性が十分考えられ、今後は試料均質化、膜厚依存による発光寿命の変化を追究する。無機・有機半導体ナノ構造物質のレーザー光物性実験この研究の要となるのは、100nm台の膜厚を持った光学的に良質なアントラセン分子性単結晶薄膜の作製と膜厚制御。さらに励起子の量子閉じ込め効果の確認であるが、試料作製については手法がほぼ確立したが、励起子の量子閉じ込め効果については発光スペクトルにおいてまだ確認に至っていない。その理由としては、100nmオーダーの膜厚の試料では、ミクロンサイズの薄膜で観測される干渉縞に相当する振動構造が見られず、励起子共鳴領域で期待される励起子閉じ込め効果を示す振動構造への遷移については、膜面成長方向の励起子の有効質量が大きいこともあって、励起子共鳴近傍の極めて狭い光子エネルギー領域に現れることが予想されるため、現在のところ明確には観測されていない。励起子発光の均質幅を可能な限り狭くする良質試料を選択ことと、観測装置のスペクトル分解能を向上させる必要がある。現在は、サイズ共鳴増大現象を直接証明できる四光波混合信号の観測の方に注力している。初年度は、有機物芳香族のアントラセン分子性単結晶薄膜(100nmスケール)の薄膜試料作製と基礎的光学スペクトルの測定が目標であった。1、アントラセン分子性結晶を毛管成長法で100nm台の厚さでテーパーの付いた試料として作製できた。歪みのために多少の光学スペクトルの劣化は避けられないが、厚さ依存性を測定するのには適している。一方、気相成長法では、純度の比較的高い試料が作製可能であるが、測定に適した100nm台の試料を入手するのは現在の所困難である。
個体まるごと用いた4次元イメージングによる形態形成運動の定量的解析

脊索動物の形態形成過程を細胞レベルで理解するために、本研究では、個体を構成する細胞数が少なくシンプルな体制をもつホヤを用いて個体まるごとの1細胞レベルイメージングを行った。ホヤ幼生ひのう部における新規末梢神経ネットワーク構造の3Dイメージングや尾芽胚の3Dコンピュータモデル化、および神経管閉鎖過程の3Dライブ(4D)イメージングを行い、ホヤ胚発生におけるさまざまな形態形成過程を細胞レベルで明らかにすることができた。形態形成運動に関して2つの組織、脊索形成と神経形態形成に注目して以下のような研究を行った。まず脊索に関しては脊索形成に必要な最小遺伝子セットは何かを明らかにするために、カタユウレイボヤの脊索に特異的に発現する遺伝子を網羅的に調べ配列情報と引用文献とともにリスト化した。その結果、133遺伝子がカタユウレイボヤの脊索において特異的に発現していることがわかった。これらの遺伝子の配列情報をもとに分子進化的解析を行い、進化的に保存されている遺伝子とホヤの系譜で独立に存在している遺伝子とに分けるところまでを行った。神経形成に関しては、カタユウレイボヤ幼生アクチンを可視化したところ,被嚢部を取り囲むアクチン性ネットワーク構造が発見された.この被嚢内部のネットワーク構造を調べるために,蛍光ラベルされたファロイジンを用いて,ホヤ幼生のFアクチンを染色した.共焦点顕微鏡で断層像を約100枚取得し,得られた画像を3D化することにより,ホヤ幼生全体のアクチン繊維を可視化した.被嚢部全体においてネットワーク状構造を形成していた.このような体の外側に長く突き出たネットワーク構造はほとんど知られていない.これらの幼生を囲む構造全体を'ASNET'と名付けた.より詳細に頭部ネットワーク構造を解析すると,ASNET全体を6つのサブネット構造(付着器間ライン、付着器-頭部神経間ライン、左右対称体幹部網、左右非対称体幹部網、尾部末梢神経間網)に分けることができた.特に左右非対称体幹部網は,観察したすべての幼生において左側だけに存在する珍しい構造であった.また、このASNETは受精後2022時間の幼生期に最も発達し,その後消失することがわかった.このようなネットワーク構造は,他の亜目のホヤ(マボヤ,ヤワラカユウレイボヤ)でも見られたことから,ASNETはホヤではよく保存された構造であると考えられ,特に幼生期に重要な役割を果たしている可能性がある.本年度はホヤの神経管閉鎖という現象に対し、神経胚期から尾芽胚期までの細胞の幾何学的解析を行うために、神経特異的に発現を促すプロモーターの下流に蛍光タンパク質を組み込んだ遺伝子コンストラクトを作成し、ホヤ胚に導入した。これをDAPI染色と同時に共焦点顕微鏡撮影した後、ボリュームレンダリングを施すことで、全個体を細胞レベルでコンピュータグラフィック(CG)化した。このCG画像は実際の細胞の形態を反映しており、細胞の形態変化における定量的・幾何学的情報(細胞体積・表面積・扁平度・球形度・細胞数・位置・体軸角度)を多数得ることができた。これらの情報をもとに、記述された情報をスタンダードとして神経管閉鎖障害を模したSU4984による形態異常ミュータントを正常胚と比較した。その結果、興味深いことに、正常胚から得られた胚と比較し、異常胚では尾部表皮細胞の体積が大きくなっていること、脊索細胞の核位置の乱れが検出された。このミュータントはターゲットとなる遺伝子が既知であるため、この遺伝子が神経胚期においてこのような局面に寄与している可能性が示唆された。このように、小分子化合物を有効に用いることで最終的に神経管閉鎖というイベントは高分解能でさまざまなステップに分けることができ、遺伝子ごとに割り当てられた幾何学的役割を解明できると期待される。そのような高分解能な解析には細胞系譜と発生段階の情報を尾芽胚期のすべての割球にもたせる必要があるためにanatomical ontology階層構造情報をホヤの割球にもたせ、その情報をウェブサイトに掲載した(ホヤAnatomical ontologyに基づく細胞系譜情報: http://chordate.bpni.bio.keio.ac.jp/faba/cell_lineage2/)。このAnatomical ontologyを活用し、今後得られた形態形成異常ミュータントを細胞レベルで高精度に分類・登録していく予定である。器官形成期の動物胚の形態はどの動物も比較的よく似た形をもつ。尾索動物ホヤは器官形成期に脊椎動物と同様に尾芽胚という発生過程を経る。本研究では、カタユウレイボヤ尾芽胚のボディープランを知るために、尾芽胚を構成する全細胞形態をコンピュータ・モデルに変換し、全細胞の幾何学的な情報を抽出した。さらにコンピュータ・モデル上に再現された細胞の全てに細胞系譜情報を付加し、組織の3次元的な形態を観察した。

以上の解析を通じ、1.本研究で用いられた胚は1580細胞から構成されること、2.その内訳は、表皮836,神経系227、間充織219、筋肉36、脊索40、内胚葉203であること、3.内胚葉索は左右1対の細胞列が交互に並ぶことで構成されており生殖細胞はこれらに挟み込まれていること、4.これまでに同定されていない組織が体幹側に1対同定されたことを明らかにした(Nakamura et al., Submitted)。このような細胞レベルのホヤ尾芽胚の特徴を明らかにしたうえで、共焦点顕微鏡を用いた4Dメージングによって、神経管形成過程における細胞の分裂・動きを1細胞レベルで追った。その結果、尾部側から頭部に"ジッパー"が移動することで生じる閉鎖に加え、哺乳類と同様に、頭部側から尾部側に向かっていく閉鎖の2種類が観察された。さらに、阻害剤による実験から、ホヤの神経管閉鎖において、尾部から頭部へ表皮細胞がジッパーのように閉じる後方からの動きと、前方神経板の頭部から尾部側への分裂後の陥入が必要であることがわかり、それらは独立して制御されている可能性があることが示唆された。
超音波による3次元的地下空洞形状測定器の試作

初年度においては、超音波レ-ダ-法による測定精度の比較検討を行なった。超音波レ-ダ-法のうち、実用性の面からパルスエコ-法を採用した。この方法において、測定性能に対し最も大きな影響を及ぼすのは横方向の分解能を決定する指向性と最大測定範囲を決める到達距離である。これらはおもに使用する周波数によって支配されるが、測定範囲の増大と測定精度の向上は相反する関係にあるため、測定ニ-ズに応じた測定性能を実現するための周波数の選択を行った。さらに、指向性上のため、複数の発振素子を集積し、見かけの発振面積の増大に関する研究を行なった。また、温度の変化による距離測定誤差の変動に対処するため、基準用受振素子を配置する方法の開発を行なった。最終年度においては、前年度の検討結果に基づき可搬式の原型を試作し測定試験を行なった。原型は前年度までの検討をふまえ、一対の発受振素子を回転させて超音波ビ-ムを走査させ2次元断面計測を行なう方式とした。また、自然環境下での使用が前提となるので可搬式とし耐環境性を重視した構造とした。さらに、石炭鉱山抗内等、可燃性ガス存在下での使用を可能とするため、電気回路は日本工業規格に基づく本質安全防爆構造とした。計測の制御およびデ-タ処理のため、8ビットのマイクロコンピュ-タを使用した。室内で模擬岩石壁面を用いた測定試験の結果、種々の形状の模擬空洞について充分な精度をもって形状計測が可能であった。さらに、本研究の最終目的である3次元形状計測についての基礎試験を実施した。試作器の発受振素子取り付け部の改良により、超音波ビ-ムを空間内で仕意の方向を向けることが可能となった。立方体の模擬空洞による試験の結果、3次元形状につき充分な精度を持った計測値が得られた。本年度は地下空洞形状計測用超音波レーダーの仕様決定のため、測定方式、発振周波数、走査法などについての基礎実験を行った。基本的な測定方式として、パルス・エコー法について検討を行った。この方法は、発振器から短時間(数十波分)超音波を発振し、測定対象物で反射した波が受振器で検出されるまでの時間によって距離の測定を行うものである。超音波による測定距離、測定精度は周波数により異なり、周波数の増加にともない、減衰が大きくなる反面、指向性、分解能は向上する。したがって、測定距離と精度は一般的に相反する要素である。地下空洞形状測定に適する周波数を決定するため3種類の周波数について距離測定基礎実験を行った。実験を行った周数波は40kHz、70kHz、200kHzである。実験の結果40kHzでは指向性は約30度、分解能は約8mm、70kHzでは指向性が約15度、分解能は約5mm、両方の周波数とも、電池駆動の回路によって、約5mの距離の測定が可能であった。それに対し200kHzでは指向性約2度、分解能0.1mm、測定距離は1mm以下であった。上記の実験結果に基づき、超音波ビームの走査法として2種類の方法についての検討を行った。ひとつは数m程度の空洞を対象として、発受振器を空洞中央で回転させることにより走査を行い、空洞の2次元断面形状を得る方法である。70kHzの素子を用いて実験を行った。他の方法は200kHzの素子によって、空洞壁面の数mm程度の凹凸を計測する方法で、多関節マニピュレーター先端に発受振素子を取り付け、壁面をなぞるものである。いずれの方法も充分な精度で形状の計測が可能であった。

本年度においては、まず、2次元断面形状測定器の原型の設計・制作を行い、実験室内を中心とした性能試験を行なった。また、この試作器による2次元断面測定を重ね合わせて3次元空洞形状計測の基礎試験を行なった。原型は前年度までの検討をふまえ、一対の発受振素子を回転させて超音波ビ-ムを走査させる方式とした。また、自然環境下での使用が前提となるので可搬式とし耐環境性を重視した構造とした。さらに、石炭鉱山坑内等、可燃性ガス存在下での使用を可能とするため、電気回路は日本工業規格に基づく本質安全防爆構造とした。計測の制御およびデ-タ処理のため、8ビットのマイクロコンピュ-タを使用した。Ni-Cd電池により約4時間の連続使用が可能であり、また、30箇所の測定デ-タの記憶が可能である。これらのデ-タは他のデ-タ処理用電算機へ転送することができる。発受振素子が1回転する間に200回の距離測定が行われる。測定結果はまず200個の距離デ-タとして記憶されるが、その200点を結んだ多角形の面積、周辺長の計算結果も表示記憶される。室内で模擬岩石壁面を用いた測定試験の結果、最大測定範囲は5m、測定精度はおよそ1cmであった。種々の形状の模擬空洞について充分な精度をもって形状計測が可能であった。さらに、本研究の最終目的である3次元形状計測についての基礎試験を実施した。試作器の発受振素子取り付け部を可動式にし、回転軸に対し仰角をつけて回転走査を行なえるよう機構に改良を加えた。これにより、超音波ビ-ムの移動は2自由度を持つため空間内の任意の方向の距離測定が可能となった。
自己免疫疾患制御因子PD-1の分子機構の解明

1.PD-1欠損により発症する自己免疫疾患は、マウスの遺伝子背景により病態・病勢が大きく影響を受ける。BALB/c遺伝子背景においてPD-1欠損マウスが、高力価の心臓特異的自己抗体を産生し、拡張型心筋症を発症することを昨年報告した。今年度は、これらの自己抗体の拡張型心筋症発症発症における役割をより詳細に検討することを目的に、自己抗原の同定を試みた。(1)拡張型心筋症を発症したマウスの脾臓およびリンパ節から細胞を調整し、ミエローマ細胞株と融合することにより、目的の自己抗体を産生するハイブリドーマ株の樹立を試みた。合計10匹のマウスを用い、5,000以上のクローンを解析したが、認識する抗原の分子量、組織分布の両方を満たすものは得られなかった。(2)自己抗原の生化学的な精製を試みた。拡張型心筋症を発症したマウスの血清が、ラットの抗原も同様に認識したため、より大量に材料が得られる理由から以後の実験はラット心臓抽出液を用いて行った。陰イオン交換カラム、陽イオン交換カラム、および数種類の疎水性交換カラムを用いて分画したところ、陰イオン交換カラムおよび陽イオン交換カラムにより良好な分離が得られた。陰イオン交換カラムと陽イオン交換カラムの組み合わせにより、約1,000倍の濃縮が得られた為、現在これを用いて抗原の同定を試みている。2.PD-1の細胞内情報伝達機構の解析およびPD-1リガンドの同定により、PD-1による免疫制御機構を解析してきたが、今年度はPD-1リガンド;PD-L1およびPD-L2に対するモノクローナル抗体を作製し、PD-1リガンドの発現分布を検討した。PD-L1は広く免疫系細胞に発現が認められたが、PD-L2はほとんど発現が認められなかった。このことから、PD-L1とPD-L2が異なった免疫反応の制御に関わっていることが示唆された。
階層型確率モデルに基づく画像表現とその応用に関する研究

本研究では、画像特徴の生成過程を階層型の確率モデルを用いてモデル化し、これに基づいて画像認識を行う手法を考案した。本手法においては画像特徴発生確率を決定する"トピック"を考え、このトピックの分布により画像特徴生成過程を記述する階層型の確率モデルである確率的トピックモデルを用い、これに基づくパラメータ推論方式を示すと共に、このモデルを文書画像の領域属性認識等に用いるための基本手法を示した。さらに提案手法を情報量の少ない小領域認識に適用するための拡張法も示している。さらに本研究では、確率的トピックモデルを用いず、識別関数の階層構造により高速・高精度な識別を行うための手法についても検討した。なお、本研究の一部は文書画像解析に関する国際ワークショップ(IAPR International Workshop on Document Analysis Systems 2008)において論文賞(best paper award honorable mention)を受賞した。文書に対して確率的トピックモデルを適用する際には単語頻度に着目し語順を問わないbag of words型表現が用いられるが、これを画像に対して適用するためには画像特徴抽出に基づいて、文書における単語に相当するvisual wordを抽出する必要がある。本研究においては、visual word抽出のための画像特徴抽出手法としてHaar wavelet, SIFT,勾配ヒストグラムを実装し、画像のスケール変換や(微小)回転に対する不変性の観点から比較を行った。画像内容識別の性能を用いて比較を行い、SIFTを用いる画像表現方式とpLSAに基づくモデル化方式が良好な識別性質を有することを明らかにした。さらに本手法を文書画像の領域分割問題に適用し、文字認識手法を必要とせず文書内容に基づく領域分割が可能であることを示した。文書領域分割への応用については文書領域を再帰分割した階層型のモデルを考え、領域分割の詳細度を向上させるための手法及びEMアルゴリズムに基づく推論方式を示した本年度の研究においては、階層型確率モデルを用いた推論方式、階層型識別器を用いた識別方式に関する検討を行い、主として文書画像、文字を含む情景画像を対象として実際の識別性能の評価を行った。特に、階層型確率モデルについては、昨年度の研究結果を受けて、確率的トピックモデル(pLSAモデル)に基づく領域識別・分類手法に基づき、より詳細な領域分割・分類を行う手法の研究を行った。昨年度の研究に基づく手法の場合、安定した識別結果を得るためには、画像領域中にvisual wordsが十分な数だけ含まれている必要があり、このため領域の精密な分割は困難であった。本研究においてはこの難点を解決するため、小領域の属性識別を行うために、この領域を包含し、十分な量の特徴量を持つ領域を設定し、この領域の識別結果を事前分布(prior)として用いて小領域のトピックモデルのパラメータのMAP型推論を行うことにより小領域の識別の精度を向上させる階層型認識手法を考案した。英語、日本語、数式、手書き領域を含む文書画像データに考案手法を適用し、単純なpLSAモデルの小領域への適用と比較して識別精度の向上が実現できることを検証した。また、文字部分を含む情景画像から文字領域を識別するための手法の研究も実施し、boostingによる学習によって異なる特徴量に基づく単純な識別関数(decision stumps)をカスケード状に組み合わせる、階層型の識別方式により、識別精度と計算速度の向上が図れることも確認した。本年度の研究においては、階層型確率モデル(確率的トピックモデル)を用いた推論方式、階層型識別器を用いた識別方式に関する検討を行い、従来研究対象としていた文書画像分類に加えて、画像をその一部に含む文書を対象として、通常の文書及び画像に関する確率モデル構築および統合に関する研究とその有効性の検証を実施した。対象としては画像と文書(テキスト)から成るドキュメントとして、CG関連の学会であるSIGGRAPHの10年分の論文集合を用いた。これまでの研究で実施してきた画像特徴抽出とpLSAモデル学習に加え、文書(テキスト)部分に関してもpLSAモデルを学習して追加した統合モデルを用いてトピック比に基づく文書分類性能を、テキストのみのpLSAモデル等と比較した。分類結果は学習・モデル獲得には用いていない情報である論文のセッション分類との照合を通して行った。手法の優劣の明確な結論を出すのは困難であったが、少なくとも画像・文書の統合モデルは単純なテキストに基づくpLSAモデルと同等以上の分類性能を有し、いくつかの事例についてはテキストだけからは検出できなかった類似論文の検索が可能であったことを確認した。本研究ではこれまで定常的な確率的トピックモデル(pLSA)を想定してきたが、対象によっては、このトピックが動的に変化することが考えられる。

トピック変化には量的変化と質的変化が考えられるが、質的変化について、年次が隣接するコーパス間での各トピックに付随した単語出現確率の類似度計算に基づいてトピックが大きく変動している箇所を検出するとともに、どのような変化をもたらしているかを示す単語を提示するための手法を考案し、上述の論文集合を用いて検証実験を行った。
顎骨切除後の機能回復 -特に嚥下機能について-

顎骨切除後の実質欠損に対し、顎補綴物が装着された患者の口腔機能評価として、嚥下機能の評価を嚥下X線透視(ビデオ)による方法を用いて評価した。X線透視(ビデオ)による評価方法は、造影剤(硫酸バリウム)を一定量(10ml)口腔内に停帯させ指示により嚥下をさせた。このときの側面からの透視画像をビデオに記録し、再生画像にて造影剤口腔内保留状態、口唇閉鎖、舌運動、舌軟口蓋閉鎖、軟口蓋運動、舌根運動、舌骨運動を観察記録し、さらに造影剤の口腔内残留状態および嚥下の一相から二相にいたるいわゆる口腔期における口腔内内移動時間を計測した(時間計測はビデオ装置に接続したビデオタイマーにより1000分の1秒まで計測する)。その結果、正常人(顎機能に異常を有さない正常有歯顎者)5人の観察において上記項目の正常運動を充分に把握した。口腔内移動時間は平均1.565秒であった。一方、舌・口底癌患者10例における観察では、T1,T2の皮比較的小さな癌の場合は嚥下時の各種運動に異常所見はなく、口腔内移動時間は平均1.6秒と正常人と有意な差は無かった。しかし、舌癌T3、T4症例では、液体の嚥下は問題は無いが、食塊になると、舌運動による食物の移動に障害が生じる場合や、口底癌患者では口底軟組織欠損部分にバリウムが停滞し、嚥下がスムーズに行われないケースが認められた。本年度は正常人における嚥下動態の把握を中心に行い、さらに上顎欠損症例における顎補綴装着前後の嚥下機能を比較した。一方、上顎欠損症例5例における観察では、顎補綴物未装着状態では、欠損が大きくなるほど造影剤の口腔内保持が難しく、下顎を挙上させ一気に咽頭部に流し込む状態が観察された。口腔内移動時間は平均3.583秒であった。顎補綴物装着時は造影剤口腔内保留状態は良好であったが、補綴物の適合状態によっては造影剤の漏洩がみられ、やや粘調性の造影剤が義歯表面に吸着し舌運動が頻回になる症例も認められた。口腔内移動時間は平均3.234秒であった。今後は、舌口底癌による口腔組織欠損症例における検討および造影剤の量による変化、嚥下物の形態や性状による変化についても検討する必要があると思われる。
ホッグ、ロックハート、ウィルソンと初期『ブラックウッズ・マガジン』

19世紀初頭のエディンバラは「北のアテネ」として、その文化的な洗練を誇った。それをもっとも鋭角的に示しているのが英国(スコットランド+イングランド)の社会と文化のありように圧倒的な影響力を行使した『エディンバラ評論』(1802年創刊)である。1817年に創刊された『ブラックウッズ・マガジン』はその先行雑誌のホイッグ的なイデオロギーに対抗するトーリー主義を体現するが、これまでのこの時期における『季刊評論』を含めた雑誌研究の基本的な方向が、そうしたいわば高級文化のディスコースの枠内で捉えられていたのに対して、本研究は『ブラックウッズ』の錯綜した創刊事情を明らかにするために、背景に人気詩人/作家たるスコットをおいた場合の出版業界の人間関係-そこではブラックウッドとコンスタブルの対立が中心となる-を探りつつ、具体的には、創刊時に耳目を驚かせ、この雑誌の人気を決定づけた「カルデア文書」に注目し、そこにこめられた時事的なアリュージョンとトーリー・イデオロギーの関連を明らかにすることを目指した。そこで明らかになったのは、ロックハートやウィルソンの志向する洗練された都会趣味と、ホッグの体現するいわゆる「低級/大衆/庶民」と結びついたスコットランド土着文化との葛藤と融合の微妙な関係であり、それは同時に「文化都市」エディンバラとイングランドの文化覇権といかに向き合うかというスコットランドの問題の現れとして捉えることができる。本研究は伝統的な文学研究と新興の文化研究の領域という点にも自覚的であったつもりだが、上記の輻輳する問題点は1820年代後半から30年代にかけての『ブラックウッズ』の人気連載『アムブローズ館夜話』に鋭く前景化されており、その追求は今後の課題となった。本年度は連合王国における基礎的史料の収集と、『ウェルズリー・インデックス』などを参考にした、匿名記事の執筆者の調査、確定が研究実績の中心となった。とくに『ブラックウッズ・マガジン』初期の匿名記事は『ウェルズリー』ではカバーしていないため、筆者の特定は困難を極め、なおその作業が継続中である。そのため研究結果を公表する段階には至っていないが、本年度の調査過程で、以下の諸点が、英文学の正典形成のメカニズムの問題を強く意識する本研究の具体的な課題として設定された。(1)『エディンバラ・マンスリー・マガジン』としての創刊時期の編集者が、ブラックウッドによって解雇された経緯と、トーリー・イデオオロギーの関係。(2)上記(1)の事件において、編集者の推薦と変更に関与したジェイムズ・ホッグの位置。あわせてトーリー的でありながら、ウィルソンやロックハートとは一線を画していたホッグのイデオロギーの特質。(3)オックスフォード出のインテリとしてのロックハートによる『ブラックウッズ・マガジン』初期のロマン派批判に見られるイデオロギーと、後の伝記作家、『季刊評論』編集者としてのロックハートのイデオロギー上の差異。(4)『ブラックウッズ・マガジン』の看板連載となった『アムブローズ館』におけるウィルソン(実質的な執筆者)、ホッグ、ロックハートの表象と、エディンバラ文壇におけるその受容。(5)「英文学」の正典として認定されているスコットと『ブラックウッズ』陣営との関係。それぞれ相互に関係する以上の諸点から、さらに厳密かつ限定された史料収集とその解読が今後の研究となる。(1)『ブラックウッズ・マガジン』の初期ナンバーにおける、主として筆禍事件の結果としての、記事の異同についての調査は、イギリスおよび日本国内に収蔵されている諸版の照合により、かなりの程度まで確定することができた。(2)このマガジンのトーリー主義の論調にテーマ的なアプローチを試みる点については、スコットランド啓蒙主義運動の遺産という視点から自然科学に関連するディスコースに注目する方針を定めたが、さらに的を絞るためにデータベース化された資料の調査を行った結果、本研究では「光学」に着目することにより、興味深い知見が得られるのはないかとの見通しが得られた。

(3)ホッグ、ロックハート、ウィルソンのこの雑誌に対する貢献としては、連載架空座談会である『アムブローズ館夜話』の分析に着手しているが、匿名の執筆者を特定することは事実上不可能であり-19世紀刊行の雑誌についてのもっとも信頼すべき『ウェルズレー・インデックス』は1824年以降の記事についてしか利用できない-ウィルソンを筆者と考える通説の吟味とともに、それを妥当とした場合の『夜話』に登場するこの三者のペルソナとしての各人物の特性の解読は来年度の課題となる。(4)この雑誌の当時のエディンバラ知識人、文壇における地位を見極めるためのこれまで注目されてこなかったローカルなジャーナリズムの調査は、『エディンバラ・スター』や『エディンバラ・イーヴニング・ニュース』といった対象の特定まで行えたが、具体的な解読にはいたっていない。これも来年度の課題となる。19世紀初頭のエディンバラは「北のアテネ」として、その文化的な洗練を誇った。それをもっとも鋭角的に示しているのが英国(スコットランド+イングランド)の社会と文化のありように圧倒的な影響力を行使した『エディンバラ評論』(1802年創刊)である。1817年に創刊された『ブラックウッズ・マガジン』はその先行雑誌のホイッグ的なイデオロギーに対抗するトーリー主義を体現するが、これまでのこの時期における『季刊評論』を含めた雑誌研究の基本的な方向が、そうしたいわば高級文化のディスコースの枠内で捉えられていたのに対して、本研究は『ブラックウッズ』の錯綜した創刊事情を明らかにするために、背景に人気詩人/作家たるスコットをおいた場合の出版業界の人間関係--そこではブラックウッドとコンスタブルの対立が中心となる--を探りつつ、具体的には、創刊時に耳目を驚かせ、この雑誌の人気を決定づけた「カルデア文書」に注目し、そこにこめられた時事的なアリュージョンとトーリー・イデオロギーの関連を明らかにすることを目指した。そこで明らかになったのは、ロックハートやウィルソンの志向する洗練された都会趣味と、ホッグの体現するいわゆる「低級/大衆/庶民」と結びついたスコットランド土着文化との葛藤と融合の微妙な関係であり、それは同時に「文化都市」エディンバラとイングランドの分化覇権といかに向き合うかというスコットランドの問題の現れとして捉えることができる。本研究は伝統的な文学研究と新興の文学研究の領域という点にも自覚的であったつもりだが、上記の輻輳する問題点は1820年代後半から30年代にかけての『ブラックウッズ』の人気連載『アムブローズ館夜話』に鋭く前景化されており、その追求は今後の課題となった。
精巣の新生をも可能にするイモリPGCの運命決定とその維持機構

本研究は、(1)イモリの始原生殖細胞(PGC)の決定様式の解明、(2)成体精巣の隣接した組織に存在するPGC様細胞の性質と精巣新生に対する寄与の解明、さらにその結果を基にした(3)イモリPGCの性質を支える遺伝子ネットワーク情報の整備、を目標に行った。本研究では研究代表者自らが確立した、新規のモデル実験動物であるイベリアトゲイモリを使用した。そこで、本種を用いた研究を推進するために、複数のグループとの共同研究により、遺伝情報(トランスクリプトーム)の整備を行い、イベリアトゲイモリの持つタンパク質の98%以上をカバーすると考えられるデータベースを構築した(論文を投稿準備中)。次に、配偶子形成に関わることが期待される遺伝子を操作するためのゲノム編集技術を確立する目的で、広島大学のグループとともに、CRISPR/Cas9を介したイベリアトゲイモリの遺伝子KO法を構築した(論文を投稿中)。上述の成果をもとに、VASA遺伝子やDazl遺伝子のノックアウトイモリを作製して、配偶子形成に対する影響を調べた。その結果、Dazl遺伝子に重要な役割があることが示された。さらに、異分野との共同研究にも力を入れた結果、イモリの精子形成におけるカドミウムの毒性を明らかにする論文を発表することができた(鳥取大学獣医学科との共同研究)。本研究の成果である遺伝子のデータベースや実験手法などを広く普及させるために、イベリアトゲイモリ研究のためのポータルサイトとなるWebページのβ版を作成しており、関係する論文が受理されるのを待ち、一般に公開する計画である。今後は、本研究によって得た研究成果を基盤に、イモリをはじめとする有尾両生類のPGCや配偶子形成の機構が明らかにされていくことが期待される。29年度が最終年度であるため、記入しない。本研究の目的は、(1)イモリの始原生殖細胞(PGC)の決定様式の解明、(2)成体精巣の隣接した組織に存在するPGC様細胞の性質と精巣新生に対する寄与の解明、さらにその結果を基にした(3)イモリPGCの性質を支える遺伝子ネットワーク情報の整備である。これらを達成する為に、当該年度はPGCの形成に重要な役割を果たすことが予想されるVASA遺伝子について、人工ヌクレアーゼであるTALEN法を介したノックアウトイモリを作製した。得られたイモリについては、抗体染色により、VASAがノックアウトされたことを確認できたので、その表現型の解析に着手した。また、VASA遺伝子の発現制御機構の解析に必要な転写制御領域のクローニングを行い、その候補となる配列を得ることができた。PGC様細胞の性質と精巣新生については、研究を進める上で重要な基礎データを得ることを目指した。その結果、イベリアトゲイモリの精巣がどのような過程を得て発達して行くのか、生殖細胞が個体の生後のどの時期に分化するのかを示すことができた。また、PCG様細胞が精巣発達過程のどの時期に形成されるのかについても明らかにできた。これらに加えて、イモリPGCの決定機構やその性質を支える遺伝子ネットワークの情報を得る為に、イモリの配偶子や生殖巣のトランスクリプトーム情報の取得を行った。本研究の成果を基に学会等の発表を5件(全て招待演者または指定演者)行った。加えて、高校生を対象としたアウトリーチ活動を2件、市民公開講座を1件行い、研究の成果を広く紹介した。本研究の計画を推進する為には、他の動物において、PGCの形成に重要な役割を果たすことが知られている遺伝子のイモリホモログをノックアウトできるか否かが鍵となる。当該年度は、重要な解析候補であるVASA遺伝子に付いて、TALENを用いた破壊を行った。その結果、効率よくVASAノックアウトイモリを作製することに成功した。これらのイモリについては、抗体染色の結果からも、実際にノックアウトできていることが確認された。これにより、来年度以降のVASAノックアウトイモリの表現型の解析を進めることができる。VASA遺伝子の機能を解明する為には、ノックアウト個体の表現型解析と併せてVASA遺伝子の転写制御機構を知ることが重要である。その解析に必要なゲノム配列の候補を取得しつつある。また、これまではイモリの遺伝子ノックアウト法としてTALENを用いてきたが、より簡便なCRISPR/Cas9を介したノックアウト法に移行する為の基礎実験を行い、実験条件を確立することができた。現在はVASA以外の解析候補遺伝子のノックアウトに必要な準備を進めている。成体精巣の隣接した組織に存在するPGC様細胞についても、イモリ精巣の発生(発達)過程を始め次年度以降の研究に必要な基礎的な情報を集めることができた。イモリPGCの性質を支える遺伝子ネットワーク情報の整備に関しては、イモリ受精卵、発生中の胚、未成熟または性成熟した個体の精巣と卵巣から抽出したRNAのトランスクリプトームデータの収集を進めることができた。これら結果から、本研究の計画は概ね順調に進んでいると言える。