hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
KLHL2/3 を標的とした新規WNKキナーゼシグナル阻害法の確立

KLHL2およびKLHL3をターゲットとしたWNKシグナル制御の可能性は、細胞培養系での評価としては、その可能性は十分あると考えられた。一方、今後生体内でどのような細胞や臓器で上記戦略が有効かどうかを探るため、KLHL2およびKLHL3のノックアウトマウスを作成し解析することが出来た。結果として、KLHLによるWNKの制御は、やはり腎臓での役割が大きいことが判明したが、多臓器ではKLHL2とKLHL3の両方にWNKキナーゼが支配されている細胞もあると思われ、今後のKLHL2/3トランスジェニックマウスおよびダブルノックアウトマウスの解析が必要と思われた。KLHL蛋白は、Cullin3(Cul3)との結合に関与するBTBドメインをN末に持ち、C末にはKelchリピートと呼ばれるドメインがヘリコプターのプロペラのような構造を形成し、この部分がKLHL3-Cullin3複合体がユビキチンE3リガーゼとしてユビキチン化する基質を捕捉する。我々はKLHL3がWNKキナーゼを基質としている事、その分解の障害がWNK-OSR1/SPAKキナーゼシグナル系を恒常的に活性化し、腎臓遠位尿細管ではSlc12a3(Na-Cl共輸送体:NCC)がリン酸化され活性化し、NaCl再吸収が亢進して塩分感受性高血圧症を引き起こすことを発見した(Cell Reports 2013, Hum Mol Genet 2014)。また、KLHL3ときわめて相同生の高いKLHL2も同様にWNKキナーゼのE3リガーゼをCul3とともに形成できることも明らかにし、KLHL2/3が細胞によって役割を分担して、その細胞におけるWNKキナーゼ(1から4まで)を制御している可能性を報告した(BBRC 2013)。また、未発表ながらKLHL2/3自身の分解はp62という分子との会合によって選択的オートファジーと呼ばれる機構にて分解されることも明らかになってきた。これらの結果を受けて、まずWNKシグナル阻害薬創出のため、KLHL2/3による過剰発現がWNKシグナル系を実際に抑制できるかをまず培養細胞系にて確認する。動物を使った検討では、KLHL2/3のトランスジェニックマウスを作成し、実際に生体内でKLHL2/3の発現増加がWNKシグナルを阻害できるかを検討する。薬剤のスクリーニングは、KLHL2/3の発現増強薬およびp62とKLHL2/3の結合阻害薬のスクリーニング系の立ち上げて行う。KLHL2/3過剰発現によるWNKシグナル系制御の試みとして、培養細胞系においては、すでにKLHL2/3の強制発現によって、同時に発現させたWNKキナーゼの蛋白減少作用は確認できた。よって、次の段階として、内因性のWNKシグナル系に対しての抑制効果を確認したところ、強制発現系のWNKに対する作用よりはその効果が軽度であった。そのため、KLHL2/3とともにE3リガーゼを構成するCullin3も同時に強制発現させたが、効果の増強は得られなかった。これらの結果を受けて、一過性のKLHL2/3の強制発現では蛋白としての半減期の比較的長いWNKキナーゼの長期間の抑制は困難と考えられ、KLHL2/3蛋白をテトラサイクリン感受性のプロモーターで安定発言できる細胞株を樹立し、現在この細胞によって、KLHL2/3発現増強による、内因性WNKシグナル抑制の効果を確認中である。一方、KLHL2/3トランスジェニックマウス作製と、KLHL2/3プロモーター解析のために、KLHL2/3遺伝子の単離が必要であるため、適当なBACクローンの選定と、そこからの全エクソンを含んだ遺伝子領域と、プロモーター領域の単離を、それぞれ、その後のトランスジーン作成と、リポーターコンストラクト作成を視野にいいて、行っている。我々は遺伝性高血圧症の解析を通じてWNKキナーゼ-OSR1/SPAKキナーゼ-SLC12a輸送体シグナル伝達系を発見した。この系は、腎臓でのNaCl出納調節のみならず、血管平滑筋のトーヌス調節や腫瘍細胞の遊走・浸潤を制御している事も明らかとなり、よってこのWNKシグナルカスケード阻害は、降圧利尿のみならず、抗腫瘍作用をもつ可能性がある。最近、我々はこのWNKキナーゼの分解を担う分子(E3ユビキチンリガーゼ)、KLHL2/3ーCullin3複合体を明らかにした。本研究では、このKLHL2/3着目し、この分子を標的としたWNKシグナル伝達系阻害法の可能性を探索した。まず、細胞培養系において、KLHL2/3の強制発現によって、同時に発現させたWNKキナーゼの蛋白減少作用を確認することが出来た。次に、内因性のWNKシグナル系に対しての抑制効果を確認したところ、強制発現系のWNKに対する作用よりはその効果が軽度であった。おそらく、一過性のKLHL2/3の強制発現では蛋白としての半減期の比較的長いWNKキナーゼの長期間の抑制は困難と考えられ、KLHL2/3蛋白を安定発現できる細胞株を樹立し、KLHL2/3発現増強による、内因性WNKシグナル抑制の効果を確認中である。一方、KLHL2/3トランスジェニックマウス作製を並行して行っている。一方、KLHL2/3の生体内での役割の確定のため、KLHL2,KLHL3ノックアウトマウスを作成し、各臓器におけるWNKキナーゼの発現蛋白量の評価を行った。

その結果、KLHL3に関しては腎臓でのWNK1,WNK4のタンパク分解に関わっている事、ヘテロのKOではWNKの蛋白量に変化を及ぼさないこと、KLHL2のKOでは腎臓髄質と肺のWNK4量に変化を認めた。今後ダブルKOの解析をすすめ、KLHL2/3発現増加によって効果の期待できる細胞・臓器を特定する。KLHL2およびKLHL3をターゲットとしたWNKシグナル制御の可能性は、細胞培養系での評価としては、その可能性は十分あると考えられた。一方、今後生体内でどのような細胞や臓器で上記戦略が有効かどうかを探るため、KLHL2およびKLHL3のノックアウトマウスを作成し解析することが出来た。結果として、KLHLによるWNKの制御は、やはり腎臓での役割が大きいことが判明したが、多臓器ではKLHL2とKLHL3の両方にWNKキナーゼが支配されている細胞もあると思われ、今後のKLHL2/3トランスジェニックマウスおよびダブルノックアウトマウスの解析が必要と思われた。当初想定していなかった点としては、内因性のWNKキナーゼに対しては、同時に強制発現させたWNKに対するよりKLHL2/3蛋白の分解作用が弱いことであった。これは、単にKLHL2/3の発現が一過性である事だけに起因するのみならず、一度すでに細胞内で合成されたWNKキナーゼが、あとから強制発現したKLHL2/3リガーゼと細胞内で結合し分解系に導かれにくい細胞なの別なコンパートメントに移動している可能性も考えられた。この場合、当初の目的を達成するために、種々の方法も考案したが、結局はKLHL2/3により分解しずらいWNKに対してはその自然の分解をまち、新規に合成される部分に関しては強制発現した場合と同様にKLHL2/3の発現で分解できると考え、KLHL2/3の発現を安定的に長期で行った際のWNK蛋白の挙動を検証する事で解決可能と判断している。実際、上記の方策により、予想される予備実験のデータが得られており、このデータの確認を得てのち、すでに並行しておこなっている、KLHL2/3トランスジェニックマウスの作製のためにコンストラクトの準備と、KLHL2/3プロモーターの解析とそれを用いた薬剤スクリーニング系の確立を加速し、研究を進めていく予定である。腎臓内科学
CD40リガンド遺伝子導入マウスを用いた末梢B細胞選択機構の解析

ヒトSLE患者やSLEのモデルマウスBXSBでは、通常T細胞が発現するCD40リガンド(CD40L)がB細胞上に異所的に発現することが報告されている。これら異所性のCD40Lの発現が自己免疫病発症の原因となるのかを明らかにするために、我々はB細胞上にCD40Lを発現するトランスジェニック(Tg)マウスを作成した。また、このようなマウスでトレランスの破綻が起き、自己免疫病の発症が誘導されるかについて検討した。生後12ヶ月令のCD40L遺伝子導入マウスでは、血清中の抗DNA抗体や、尿中の蛋白質などが、同週令の正常マウスと比較し高値で検出された。また、これらのCD40L遺伝子導入マウスの腎の糸球体にはIgmや補体C3成分などからなる免疫複合体の沈着を認めた。これらのことから、CD40Lの異所性の発現は、腎炎をともなう全身性自己免疫疾患を引き起こすことが明らかとなった。また、抗DNA抗体遺伝子(56R)Tgマウスとの交配により得た56RCD40Ldouble Tgマウスでは、56R Tgマウスと比較し末梢の成熟B細胞の顕著な増加を認めたことから、末梢の自己反応性成熟B細胞除去の阻害、または移行期B細胞から成熟B細胞への分化阻害の解除が,CD40L TgマウスでのSLE発症の機構であることが考えられた。これらの可能性について検討するため、CD40L Tgマウスの末梢自己反応性B細胞の寿命を、BrdU標識法で測定したどころ、56RTgマウスと比較し56RCD40LTgマウスでは成熟B細胞の寿命が長いことが明らかとなった。以上の結果から、B細胞上のCD40Lの発現は、通常では末梢で除去される自己反応性成熟B細胞の生存を促進することが明らかとなり、このことがCD40Lの異所的発現によるSLE発症の原因であることが示唆された。B細胞上のCD40分子を介した刺激は、抗原受容体刺激により誘導される末梢B細胞の細胞死を阻害することが知られている。このことから、過剰なCD40刺激は末梢の自己反応性B細胞のクローン除去を阻害し、自己免疫疾患発症の原因となる可能性が考えられている。この可能性を証明するため、CD40のリガンド(CD40L)をB細胞上に過剰発現する遺伝子導入(TG)マウスを作成し、このマウスで自己免疫疾患が発症するかについて検討した。生後1年のCD40LTGマウスでは、尿中タンパク量、血清中の抗DNA抗体量が、同週令のlittermateマウスと比較し有意に上昇していることが明らかとなった。また、CD40LTGマウスの腎臓の糸球体に、IgG,IgMや補体C3成分などからなる免疫複合体の沈着を認めた。これらのことから、CD40Lの過剰発現が腎炎をともなう全身性自己免疫疾患を引き起こすことが明らかとなった。この自己免疫疾患がどのような機序によって誘発されるかを明らかにするため、CD40L TGマウスと抗DNA抗体遺伝子TGマウスとを交配し、B細胞の大部分が自己反応性を持ちCD40Lを過剰発現するマウスを作成した。このマウスでは、骨髄中の自己反応性B細胞の除去は正常であったが、末梢での自己反応性B細胞の除去が阻害されていることが明らかとなった。また、この自己反応性B細胞の除去の阻害は未梢の移行期B細胞から成熟B細胞への分化過程で誘導されることが示唆された。以上から、過剰なCD40を介する刺激は、末梢での自己反応性B細胞のクローン除去を阻害する事によって自己トレランスを破綻させ、自己免疫疾患を発症させることが明らかとなった。ヒトのSLE患者では、B細胞でCD40Lが過剰発現されている例が報告されており、ヒトにおいても過剰なCD40を介する刺激が自己免疫病の病因となっていることが考えられる。

これらの可能性について検討するため、CD40L Tgマウスの末梢自己反応性B細胞の寿命を、BrdU標識法で測定したどころ、56RTgマウスと比較し56RCD40LTgマウスでは成熟B細胞の寿命が長いことが明らかとなった。以上の結果から、B細胞上のCD40Lの発現は、通常では末梢で除去される自己反応性成熟B細胞の生存を促進することが明らかとなり、このことがCD40Lの異所的発現によるSLE発症の原因であることが示唆された。
ラマン分光法による脊髄伸張時の脊髄内水分量の経時的変化の観察

非常に鋭敏な検査ゆえに,血圧,呼吸の安定,などの全身状態の維持に訓練を要し,さらに,脊髄摘出に際して,血液成分の混入が許されず,なおかつ,脊髄にいっさいダメ-ジを与えることなく標本とすることに多大な時間を費やした.3回行う計測で一定の値を示すようになることに困難を極めた.テクニックが落ち着きコントロールをとることが可能となってきたのは,平成8年に入ってからであった.これによれば,各水分量は脊髄前索白質は50.4【+-】4.8%,側索白質48.1【+-】6.7%,後索白質50.2【+-】5.1%,白質全体では49.6【+-】5.6%,中心管近傍灰白質71.7【+-】3.6であった.白質各部位間では統計学的有意差は認められなかった.一方,白質各部位,白質全体においては灰白質とその組織内含水量において有意の差を認めた.他のこれまでの報告と比較して矛盾するところはなく,さらに,従来の測定法では白質灰白質を区別して測定することは不可能であり,同一の侵害に対する反応様式が明らかに異なる白質灰白質を明瞭に区別することは,現在のところラマン分光法によってのみ可能と考えられた。そこで,過去の実験データーとの相関性を確認する意味で,10g-cmでweight dropを行ったところ,外傷部位においては著しい出血が生じ,データー測定が不可能であり,ふたたび,本実験の精巧さに困難を極めた.何回も各条件を変えて実験を施行していたが,一定の値はweight dropでは困難と考え,最終目的である脊髄伸張損傷へ移行を考えていた時期に,レーザー光の出力不安定,出力不足にみまわれ,時間的制約と共に実験が継続できなかった.非常に残念ではあったが,本法は今後各種脊髄損傷病態の解明に役立つものと確信し,今後も研究を継続して行くつもりである.非常に鋭敏な検査ゆえに,血圧,呼吸の安定,などの全身状態の維持に訓練を要し,さらに,脊髄摘出に際して,血液成分の混入が許されず,なおかつ,脊髄にいっさいダメ-ジを与えることなく標本とすることに多大な時間を費やした.3回行う計測で一定の値を示すようになることに困難を極めた.テクニックが落ち着きコントロールをとることが可能となってきたのは,平成8年に入ってからであった.これによれば,各水分量は脊髄前索白質は50.4【+-】4.8%,側索白質48.1【+-】6.7%,後索白質50.2【+-】5.1%,白質全体では49.6【+-】5.6%,中心管近傍灰白質71.7【+-】3.6であった.白質各部位間では統計学的有意差は認められなかった.一方,白質各部位,白質全体においては灰白質とその組織内含水量において有意の差を認めた.他のこれまでの報告と比較して矛盾するところはなく,さらに,従来の測定法では白質灰白質を区別して測定することは不可能であり,同一の侵害に対する反応様式が明らかに異なる白質灰白質を明瞭に区別することは,現在のところラマン分光法によってのみ可能と考えられた。そこで,過去の実験データーとの相関性を確認する意味で,10g-cmでweight dropを行ったところ,外傷部位においては著しい出血が生じ,データー測定が不可能であり,ふたたび,本実験の精巧さに困難を極めた.何回も各条件を変えて実験を施行していたが,一定の値はweight dropでは困難と考え,最終目的である脊髄伸張損傷へ移行を考えていた時期に,レーザー光の出力不安定,出力不足にみまわれ,時間的制約と共に実験が継続できなかった.非常に残念ではあったが,本法は今後各種脊髄損傷病態の解明に役立つものと確信し,今後も研究を継続して行くつもりである.今回の急性実験において、脊髄微小循環の変化は脊髄内代謝、水分含有量に関して重要な要素となりますので、vital signの安定確保はessentialなものと考えており、この確保に技術的問題があり、時間を要しておりますが、今後も慎重に行いたいと思っております。当初のコントロール実験は、下部頚髄および胸髄を露出後に、脊髄を摘出し、水分含有量をラマン分光法を用いて測定を行うことでした。測定個所は、ラマン分光法の利点でもある空間分解能の高さを利して、左右の灰白質(前角、中心管付近、後核)、左右の白質(前索、側索、後索)において測定し、左右差の有無、測定箇所による相違を検討する予定でした。具体的実験を行うにあたり、技術的に安定したコントロールを得るための脊髄摘出に困難があることがわかりました。具体的には、これまで比較的大動物に使用していたdental drillを用いて、脊髄をatraumaticに摘出することが非常に困難であり、拡大にて硬膜外組織に多大な出血等を認めたため、ラマン分光法による計測が不可能な状態にありました。このコントロール実験に10匹近くのratで行いましたが、測定を安定して行うことができませんでした。その後には硬膜より出る脊髄神経根を十分に確認できるまで脊椎管を側方まで切除することの必要性が生じたため、新規ドリルの購入をし、神経根レベルよりataumaticに摘出する技術を身につけつつあります。昨年度、実験系の精密度を向上するために、技術的に解決しなくてはならない多くの問題があることがわかり、実験の進行に大きな遅れが出ておりました。

最近になり、全身状態、循環動態も極めて安定したなかで、実験動物の脊髄を取り出すことが可能となってきました。しかし、大学の都合もあり、ラマン分光器が遠方の施設に移転してしまったため、実験動物の移動、測定等に非常に時間がかかる状態であることが判明しました。しかし、極力頻回に実験施行を行う努力を続けております。なにぶんにも、他施設のため、実験器具の不備等もあり、思うように測定が捗らないのが現状です。しかし、安定した測定結果を10例程で得ることが出来ております。これによると、脊髄灰白質は、水分量は85%前後であり、脊髄白質はそれよりやや少ないもののようです。白質は前索、側索、後索各々で行っており、ほぼ同様の結果を得ています。この検証は、今後の実験系に対して重要な結果と考えています。つまり、次のステップとして、硬膜外より凍結損傷を加えるときに、その損傷程度の空間的広がりを正確に灰白質のみでなく各白質で捕えることが出来ます。これが、これまで行われていた各種脊髄内水分測定法では不可能であった、空間的広がりの観察と思います。今後コントロールを十分に行い、まずは過去の実験データーと相関が得られる凍結損傷を行い、その後に、脊髄伸張実験を行いたく存じます。非常に鋭敏な検査ゆえに,血圧,呼吸の安定,などの全身状態の維持に訓練を要し,さらに,脊髄摘出に際して,血液成分の混入が許されず,なおかつ,脊髄にいっさいダメ-ジを与えることなく標本とすることに多大な時間を費やした.3回行う計測で一定の値を示すようになることに困難を極めた.テクニックが落ち着きコントロールをとることが可能となってきたのは,平成8年に入ってからであった.これによれば,各水分量は脊髄前索白質は50.4±4.8%,側索白質48.1±6.7%,後索白質50.2±5.1%,白質全体では49.6±5.6%,中心管近傍灰白質71.7±3.6であった.白質各部位間では統計学的有意差は認められなかった.一方,白質各部位,白質全体においては灰白質とその組織内含水量において有意の差を認めた。他のこれまでの報告と比較して矛盾するところはなく,さらに,従来の測定法では白質灰白質を区別して測定することは不可能であり,同一の侵害に対する反応様式が明らかに異なる白質灰白質を明瞭に区別することは,現在のところラマン分光法によってのみ可能と考えられた。そこで,過去の実験データーとの相関性を確認する意味で,10g-cmでのweight dropを行ったところ,外傷部位においては著しい出血が生じ,データー測定が不可能であり,ふたたび,本実験の精巧さに困難を極めた.何回も各条件を変えて実験を施行していたが,一定の値はweight dropでは困難と考え,最終目的である脊髄伸張損傷へ移行を考えていた時期に,レーザー光の出力不安定,出力不足にみまわれ,時間的制約と共に実験が継続できなかった。非常に残念ではあったが,本法は今後各種脊髄損傷病態の解明に役立つものと確信し,今後も研究を継続して行くつもりである。
RNA動的機能の分子基盤

本特定領域研究(A)の目標は、最近明らかにされつつあるRNAの触媒機能や高次の情報発現調節機能などの分子機構の解明、新規反応を触媒するリボザイムの探索と人為的創製、などからRNA動的機能を体系化し、その生命現象における分子基盤を確立することである。これに基づいてRNAが関わる、発生、分化、疾病など高次生命現象の分子機構を追求し、さらに機能未知の多くのRNA機能を解明する。これと並行してRNA動的機能の新しい解析法を開発する。このために総括班のもとに3研究班と1特別チームを組織した。第1班「RNA触媒機能」班は、スプライシング可能なグループlイントロンの最少機能領域の同定と、それに基づいたミニマルリボザイムの発現、配列認識とRNA鎖切断という別個の機能部位を備えた2量体ハンマーヘッドリボザイム(マキシザイム)の構築と、ヘリケースを結合した複合体の細胞内発現などに成功し、リボザイムの基礎と応用に新たな道を開いた。第2班の「RNA情報機能」班は「翻訳因子によるtRNA分子擬態の発見」という世界的に高い評価を得た成果を挙げ、リボソームにおける翻訳反応の基盤原理解明への道を開いた。蛋白質によるRNA認識機構の研究では、スプライシング過程でのsxl蛋白質の1本鎖RNA認識機構のNMR解析やアミノアシルtRNAシンテターゼによるtRNA認識のX線構造解析などで顕著な成果を挙げた。「RNA高次機能」班では疾病発症や老化の機構解明に有力なミトコンドリア遺伝子導入マウスの作成に成功した。またミトコンドリア脳筋症がtRNAアンチコドン1字目の塩基のタウリン側鎖の修飾欠損に起因することを見出した。tmRNAの機能構造の解明にも大きな成果を得た。研究は概ね順調に進展し、目標達成度は75%と評価している。本特定領域研究の実施期間中に、本研究グループを母体として、日本RNA学会が設立され、我が国におけるRNA研究の支援体制を囲めることができた。本重点領域研究はリボザイムなどRNAの触媒機能やmRNAレベルでの発現調節など高次の情報発現調節機能、などの分子機構の解明を通して、RNA動的機能を体系化し、その生命現象における分子基盤を確立することである。更にRNAが係わる発生、分化、疾病など高次生命現象の分子構造を追求し、機能未知のRNA機能を解明する。並行してRNA動的機能の新しい解析法を開発する。本総括班は3研究項目+1特別研究項目を掲げているが、各研究項目に従事する研究班員は年1度の合同班会議のほか、年数回発行するサ-キュラーおよび本重点領域研究のホームページ(http://LABSTRG-1.lab.nig.ac.jp)により常時緊密な連携をとれる体勢にあり、班員相互の共同研究、人的交流が初年度から活発に開始されている。総括班は年2回の会議(初年度は昨年7月の合同班会議と同時開催、本年1月シンポジウムと同時開催)およびE-mailでの連絡により、スムーズな運営を行っている。シンポジウムは原則として年1回東京で行うこととし、第1回は1998年1月30日に虎ノ門パストラルで開催し、各班長およびグループリーダと各班代表の計8名が講演したが、170名の参加者を得て好評であった。

グループIイントロンのドメイン構造の機能、リボソームRNA単独でのペプチド結合形成反応触媒機能、tRNAを分子擬態する解離因子、神経系の発生に関わるRNA結合蛋白質、、ミトコンドリア病におけるtRNAの役割などのトピックスに関して、独自の発想による新しい知見が見られ、今後の進展が期待された。本特定領域研究はリボザイムなどRNAの触媒機能やmRNAレベルでの発現調節など高次の情報発現機能、などの分子機構の解明を通して、RNA動的機能を体系化し、その生命現象における分子基盤を確立することである。更にRNA関わる発生、分化、疾病など高次生命現象の分子機構を追求し、機能未知のRNA機能を解明する。並行してRNA動的機能の新しい解析法を開発する。本総括班は3研究項目+1特別研究項目を掲げているが、各研究項目に従事する研究班員は年1度の合同班会議のほか、年数回発行するサーキュラー及び本特定領域研究のホームページ(http://LABSTRG-1.lab.nig.ac.jp)により常時緊密な連携をとれる体勢にあり、班員相互の共同研究、人的交流が活発に行われている。総括班は年2回の会議(2年度は昨年8月弘前での合同班会議と同時開催、本年2月1日のシンポジウムの前日に開催)及びE-mailでの連絡により、スムーズな運営を行っているシンポジウムは原則として年1回東京で行うこととし、第2回は1999年2月1日に東京国際フォーラムで開催し、昨年中に得られたトピックについて班員計8名による講演を行ったが、200名以上の参加者を得て好評であった。グループIイントロンのドメイン構造の機能、リボソームやtmRNAの機能構造、tRNAアンチコドン領域を標的とする新奇ヌクレアーゼトキシン、酵母の減数分裂の制御や神経分化を誘導するRNA結合蛋白質、悪性遺伝子mRNAを選択的に切断する人工リボザイムなどのトピックに関して独自の発想による新しい知見が見られ、世界的なジャーナルに発表される論文も増えており、今後の益々の進展が期待される。更にRNAに関わる発生、分化、疾病など高次生命現象の分子機構を追求し、機能未知のRNA機能を解明する。総括班は年2回の会議(3年度は昨年8月京都での合同班会議と同時開催、本年2月7日のシンポジウムの前日に開催)及びE-mailでの連絡により、スムーズな運営を行っているシンポジウムは原則として年1回東京で行うこととし、第3回は2000年2月7日に東京国際フォーラムで開催し、昨年中に得られたトピックについて班員計8名による講演を行ったが、約250名以上の参加者を得て好評であった。tmRNAやリボソームRNAを機能化するリゾームタンパク質の調節機能、新しい概念であるペプチド・アンチコドン、RNAプロセシングや輸送、分泌に関わるRNAの分子機構、RNA結合蛋白質の発現異常に伴う遺伝病などのトピックに関して独自の発想による新しい知見が見られ、その内のいくつかが世界的なジャーナルに論文として発表されている。
富栄養浅海域における生態系の復元-人工干潟現地実験場での環境と生物の動態-

・本人工干潟は,造成3ヶ月後は窒素生成の場(5.4kg/day)となっていたが,造成から12年経過した時点では窒素固定の場(1年目:-4.7kg/day,2年目:-3.6kg/day)に変化した.さらに,造成3年後には再び窒素生成の場(1.2kg/day)に転じた.人工干潟が栄養物質のSourceかSinkかについては,優占動植物の動態に依存しており,生物相が安定しない若い人工干潟では不安定であると推察された.なお,造成から12年経過した本人工干潟の総窒素固定量(2001年:735mg/m^2/day,2002年:554mg/m^2/day)は,同じ大阪湾に位置する甲子園浜のそれの(356mg/m^2/day)の1.62.1倍であった・小型底生動物の個体数,種類数,湿重量はL.W.L.0-2.0mの水深帯で高い値を示した.L.W.L.0mより上部については干出時間が長くなることや砕波による底質攪乱の影響で生物相が貧困になると考えられた.また,L.W.L.-2.0m以深の生物相が貧困になることについては,地盤高が低くなるにつれて底質悪化していることや貧酸素化の影響が考えられた.したがって,浚渫土砂を活用して大阪湾東部沿岸域に人工干潟を造成する場合,底生動物の生息から見た地盤高としてはL.W.L.0-2.0m帯の面積を多くすることが望ましいと考えられた.・本人工干潟は,造成3ヶ月後は窒素生成の場(5.4kg/day)となっていたが,造成から12年経過した時点では窒素固定の場(1年目:-4.7kg/day,2年目:-3.6kg/day)に変化した.さらに,造成3年後には再び窒素生成の場(1.2kg/day)に転じた.人工干潟が栄養物質のSourceかSinkかについては,優占動植物の動態に依存しており,生物相が安定しない若い人工干潟では不安定であると推察された.なお,造成から12年経過した本人工干潟の総窒素固定量(2001年:735mg/m^2/day,2002年:554mg/m^2/day)は,同じ大阪湾に位置する甲子園浜のそれの(356mg/m^2/day)の1.62.1倍であった・小型底生動物の個体数,種類数,湿重量はL.W.L.0-2.0mの水深帯で高い値を示した.L.W.L.0mより上部については干出時間が長くなることや砕波による底質攪乱の影響で生物相が貧困になると考えられた.また,L.W.L.-2.0m以深の生物相が貧困になることについては,地盤高が低くなるにつれて底質悪化していることや貧酸素化の影響が考えられた.したがって,浚渫土砂を活用して大阪湾東部沿岸域に人工干潟を造成する場合,底生動物の生息から見た地盤高としてはL.W.L.0-2.0m帯の面積を多くすることが望ましいと考えられた.本研究では、大阪湾阪南2区整備事業の人工干潟造成に先立ち、当該海域に2000年5月に造成された幅80m、奥行き100mの人工干潟現地実験場(浚渫土部と浚渫土の上に厚さ1mで覆砂した部分より成る)において干潟と浅場の生物生息機能や水質浄化機能を明らかにすることを目的として、造成初期の底質、底生動物ならびにバクテリアフローラなどについて調査した。その結果、2000年612月にかけての人工干潟の地盤高は潮上帯でやや低下し、砂泥の沖合への移動が認められたものの、干潟全体の変位は-6.1cmと小さかった。この場合、粒子の細かい泥分域よりも粒子の粗く重い砂分域で地盤変化が大きかったことから、地盤高の変化は干潟外への底土の流出よりも圧密沈下などに起因するものと考えられた。底質や底生動物については、干潟や浅場の造成に伴い好気的環境が創出されたことから底質の酸化還元電位がプラスの値をとる領域が増大し、底生動物の種類数や現存量はまだ充分に豊かとは言えないものの、覆砂部とりわけ潮位観測基準面(DL)下1-2mの水深帯で多数の小型底生動物が生息するようになった。大型底生動物(メガベントス)については造成後1ヶ月の間にガザミやイシガニなどがこの浅場に蝟集し、生活の場として利用するようになることがわかった。細菌群集の時空間的変動と底泥の酸素消費速度に関して特徴的であったのは、潮間帯底泥の硫酸還元細菌数であり、9月では6月の1/1000に減少した。硫酸還元細菌は偏性嫌気性であるので、これは、干潟の造成により極めて好気的な環境が水際に形成されたことを示す。9月の昼夜観測の結果、硫化物などによる化学的酸素消費速度(2.7mgO_2/m^2/h)に時間的な変化がなかったのに対し、生物的酸素消費速度(微生物群の呼吸活性)は、明け方に比べ夕方では40倍以上高い値を示した(いずれも満潮時)。これは、干潟の好気的呼吸活性が時間レベルで変動していることを示し、従来報告されたことのない新しい知見と言える。

造成当初,阪南2区人工干潟現地実験場にはマクロベントスはほとんど生息していなかったが,次第に増加し,2000年9月から2001年9月までの1年間でその現存量は3.1倍増加した.浚渫土砂部と覆砂部を比較すると覆砂部の方が現存量が多いものの浚渫土砂部でも増加傾向がみられ,特にDL-1.0m付近で最も生物量が多かった.また,アオサなどの大型海藻類も2000年6月の造成当初はほとんど分布していなかったが,2001年10月には人工干潟現地実験場内での現存量はアナアオサが5422kg,オゴノリが2464kgに達していた.ボックスモデルにより干潟・浅海域内の窒素の生成・消失量を検討してみると、2000年9月はDTNとPNがそれぞれ3.9kg/dayと1.1kg/dayの生成となり、窒素が干潟・浅海域から排出されていたことが判明した。しかし,2001年9月には、底生動物量が増加するとともに大型海藻類が大量に繁茂したためか、DTNとPNがそれぞれ-3.5kg/dayと-1.1kg/dayの消失となり、窒素が干潟・浅海域に固定され、優れた浄化機能を持っていたことがわかった.優占海藻であるアナアオサとオゴノリの比成長速度μはそれぞれ最大0.2/day、0.07/dayと報告されている.また、アナアオサとオゴノリの窒素含量はそれぞれ31mgN/g dry,40mgN/g dryであった.これらの値と現存量から人工干潟現地実験場の1日当たりの窒素固定量を測定したところ1日あたりの固定量は4.5kgと0.86kgと試算された.これらの結果から、海藻によって大量のDTNが固定されたことが推察される.窒素収支から得られたPN除去量(2001年9月:1.07kg/day)と同程度の処理能力を持つ下水道の二次処理施設の建設費などを「標準活性汚泥法」の費用関数を用いて試算した.その結果ポンプ施設の建設費Cpが2314万円,維持管理費Mpが19万円,二次処理施設の建設費Csが1.8億円,維持管理費Msが256万円,用地面積Asが2013m^2となった.したがって,現地実験場と同様の機能を持つ下水処理施設は,建設費がCp+Cs=2.0億円,維持管理費がMp+Ms=275万円と推定することができた.1.生物生息機能:人工干潟における底生動物の種類数・個体数・シャノン・ウイーバ関数式を用いた種多様度指数などは時間の経過とともに増加し、2002年以降、種類数が11種前後、個体数が約4000個体/m^2、種多様度指数が2.0前後の一定値を示すようになり、小型底生動物相は約3年でほぼ安定すると考えられた。養浜材料別に検討すると、底生動物の種類数・個体数・種多様度ともに覆砂区の方が高い値を示したが、浚渫土砂区の種多様度も覆砂区の8割程度の値であり、覆砂区よりはやや劣るか、ほぼ同程度の生物生息機能が確認された。地盤高別の種多様度指数はLWL(朔望平均干潮面)0-3.0mにおいて高く、また個体数はLWL0-1.0mで最大値を示した。このことは生物生息のための地盤高としてはLWLO-1.0mが望ましいことを示唆している。2.浄化機能:2000年9月に窒素生成の場(source)であった人工干潟は、2001年9月には固定の場(sink)に変化した。そして、2002年の人工干潟は溶存態窒素が生成、懸濁態窒素が固定の場となった。このように人工干潟における窒素の収支は3年間で大きく変動し、未だ不安定であった。これには優占海藻や底生動物の個体群動態が深く関与すると考えられる。例えば、2001年9月の優占海藻であるアオサとオゴノリの日間窒素吸収量は、ボックスモデルより推定したその時の干潟域における溶存態窒素の固定量の約80%に相当した。また、懸濁態窒素の固定量の増加は、干潟域における二枚貝類の増殖に対応した。3.呼吸活性の変動と細菌群集:潮汐に合わせて時間レベルで干潟試料を採取し、干潟表層の呼吸活性と細菌数を測定した。呼吸活性の月毎の平均値を季節レベルで比較すると、現場温度に制御されていた。しかし、時間レベルで比較すると、現場温度が一定レベル(24°C前後)以上になると、温度より呼吸活性に強く影響する環境要因が存在することを確認した。
魚類の生殖腺刺激ホルモン受容体の機能と発現調節機構に関する研究

硬骨魚類(アマゴOncorhynchus rhodurusとティラピアOreochromis niloticus)の卵巣と甲状腺から2種類の生殖腺刺激ホルモン受容体(FSH受容体とLH受容体)とTSH受容体がクローニングされた。哺乳類のCOS細胞に発現させたこれらの受容体は、FSH受容体はサケFSHに、LH受容体はサケLHに、またTSH受容体はBovineTSHに対してそれぞれもっとも強く反応し、細胞内cAMPを上昇させた。従って、ここで単離されたFSH、LH、TSHの受容体はいずれも機能的な受容体であると結論された。卵巣でのFSH受容体遺伝子の発現は、卵黄形成が始まる頃の卵胞で強くなり、卵黄形成盛期に最大となり、以後漸次減少し、卵成熟期の卵胞ではほとんど消失した。しかし、卵成熟が完了した濾胞組織で再び発現がみられるようになった。これとは対照的に、LH受容体遺伝子は、卵黄形成期の卵胞での発現は非常に弱く、卵成熟期が近づくにつれて発現量が増大し、卵成熟中の卵胞で最大となった。また、LH受容体遺伝子が卵成熟期の卵胞の顆粒膜細胞で強い発現がみられた。一方、精巣では、FSH受容体の発現は、精子形成期の精巣で強く、精子成熟期にはほとんど認められなかった。また、精巣における発現細胞はセルトリ細胞であった。一方、LH受容体遺伝子は、FSH受容体遺伝子にやや遅れて発現し、精子成熟期の精巣で非常に強い発現が観察された。また、その発現細胞は間質組織に位置するライディッヒ細胞に限局された。さらに、TSH受容体受容体を含む3種類の下垂体糖タンパク質ホルモンの染色体上での局在位置をRFLP解析により調べたところ、哺乳類とは異なり、いずれの受容体も異なる染色体に局在することが明らかになった。また、ティラピアのFSH受容体、LH受容体のプロモーター領域を含めた基本的ゲノム構造は哺乳類と非常に似ていることが明らかとなり、これら受容体遺伝子の発現調節における性ステロイドホルモンの重要な役割が示唆される。1)卵巣:FSH受容体遺伝子の発現は、卵黄形成が始まる頃の卵胞で強くなり、卵黄形成盛期に最大となり、以後漸次減少し、卵成熟期の卵胞ではほとんど消失する。しかし、卵成熟が完了した濾胞組織で再び発現が見られるようになる。これとは対照的に、LH受容体遺伝子は、卵黄形成期の卵胞での発現は非常に弱く、卵成熟期が近づくにつれて発現量が増大し、卵成熟中の卵胞で最大となる。また、LH遺伝子は卵成熟期の卵胞の顆粒膜細胞で強い発現が認められた。しかし、in situ hybridization法による解析では、アマゴ卵巣におけるFSH遺伝子の発現は確認することはできなかった。2)精巣:FSH受容体の発現は、精子形成期の精巣で強く、精子成熟期にはほとんど認められない。一方、LH受容体遺伝子は、FSH受容体遺伝子にやや遅れて発現し、精子成熟期の精巣で非常に強い発現が観察される。3)TSH受容体:TSH受容体遺伝子は、卵巣や精巣ではまったく発現がみられず、甲状線の上皮細胞にのみ明確な発現が認められた。

生殖腺刺激ホルモンは脊椎動物生殖腺の種々の活動を制御する主要な因子であり、その作用は生殖腺に局在する生殖腺刺激ホルモン受容体の働きにより仲介される。本研究の目的は、これまでほとんど研究がなかった魚類の生殖腺刺激ホルモン受容体の構造と機能を明らかにするとともに、遺伝子の発現調節機構を明らかにすることである。まず、ティラピアを用いて2種の生殖腺刺激ホルモン受容体の発現パターンと発現細胞についてRT-PCR、ノザーンブロツト、in situ hybridizationにより解析した。その結果、FSH受容体は卵巣では卵黄形成期、精巣では精子形成期に強い発現が認められ、一方LH受容体は卵巣では卵成熟期、精巣では精子成熟期に強い発現が認められた。ただ、FSH受容体は卵成熟が完了した卵巣で再び急激に発現が強まることがわかった。また、発現細胞に関しては卵巣ではFSH受容体、LH受容体ともに卵黄形成期の卵胞の顆粒膜細胞で認められた。精巣ではFSH受容体はセルトリ細胞に、またLH受容体はライディッヒ細胞に発現が認められた。さらに、ティラピアを用いてTSH受容体を含む3種類の下垂体糖タンパク質ホルモンの染色体上での局在位置をRFLP解析により調べたところ、哺乳類とはことなりいずれも受容体も異なる染色体に局在することが明らかになった。また、ティラピアのFSH受容体、LH受容体のプロモーター領域を含めた基本的ゲノム構造は哺乳類とよく似ていることが明らかになり、これらの受容体遺伝子の発現調節における性ステロイドホルモンの重要な役割が示唆される。現在、FSH受容体、LH受容体遺伝子の発現制御に果たすアンドロゲンとエストロゲンの役割をin vitroの実験系により解析している。
合成クロロフィル類縁体の自己集積化

緑色光合成細菌には、湖泥の深いところ(通常約1020m)で成育している種があり、その光合成アンテナ部内の色素分子はバクテリオクロロフィル-e(BChl-e)である。このBChl-eは、従来の緑色細菌のアンテナを構成する色素分子BChl-cの7-メチル基を酸化して7-ホルミル基にした分子構造を取っているが、自己集積に重要な3^1位の水酸基と13位のケトカルボニル基と中心マグネシウムとは保存されている。成育している水深が10m以下であるために、太陽光はわずかしか届かず、かつその波長領域も500600nm付近に限定される。このために、この菌は400600nmに大きな吸収帯をもっていて、その限定された可視波長領域の弱光をなるべく効率的に吸収するようになっている。通常の緑色細菌は、500600nm付近には大きな吸収帯をもたず、あってもカロテノイドによる小さな吸収帯であることが多い。そのため、この>500nmに見られるピークもカロテノイドによるものと当初は思われていたが、カロテノイド合成を阻害した菌でもほぼ同じ吸収帯が見られたことや、色素のみを自己会合させても同様の吸収帯が見られたことから、>500nmに見られるピークはBChl-eの自己会合体によるものであることが判った。つまり、限定された500600nmの波長の光を吸収するために、菌が環境応答して、アンテナ色素分子の構造を一部改変(7-CH_3→7-CHO)したものと考えられる。さらに、以上のような物性は、モデル色素分子を用いた人工系でも確認された。7-CH_3→7-CHOへの分子構造の変化が、その自己会合体の超分子構造に大きな影響を与えず、(BChl-c)_nと同様の構造を取っていることも我々のモデル実験から明かになった。
特異な酵素反応系を利用した新規細胞内ATPモニターリングシステムの開発

ビオチン化反応は、ビオチン化酵素(BPL)が、その基質タンパク質(BCCP)のリジン残基にビオチンを固定化する反応である。古細菌のSulfolobustokodaii由来のビオチン化反応は、反応後酵素であるBPLが、その反応生成物であるビオチン化されたBCCPと安定な複合体を形成するという特異な性質を有している。本研究では、この特異なビオチン化反応を利用した細胞内のATP検出システムの構築について検討を行なった。本研究では、特異なビオチン化反応を利用したATP検出システムの構築を目的としてるが、これにはまずBPL酵素並びにBCCPタンパクに関して、蛍光タンパクとの融合体を作成する必要がある。そこで今年度は、まず大腸菌系での各融合タンパクの発現系の構築について検討を行った。まずBPLに関して蛍光タンパクとの融合体の構築について検討を行ったところ、BPLのC末端には蛍光タンパクは導入できないが、N末端には導入できることがわかった。さらにBPLと蛍光タンパク間を繋ぐリンカーの長さが融合タンパクの発現に大きく影響することがわかった。また蛍光タンパクと融合させたBPLが酵素活性を維持しているかどうかを確認するため、BCCPに対するビオチンの付加活性を確認した。その結果、反応生成物の質量分析により、酵素活性を維持していることがわかった。さらに、ビオチン化反応に伴うBCCPとの複合体形成能も維持していることが確認できた。また、このBPLに関する検討と平行して、BCCPと蛍光タンパクとの融合体の構築についても検討を行った。BCCPに関しては、全長が167残基からなるタンパク質であるが、ビオチン化に必要なのはC末端側の70残基程度であることがわかっている。そこで、BCCPのC末端側ドメインと蛍光タンパクの融合体を構築した。このBCCPの融合タンパクが、BPLに対する基質として機能し得るかどうかの確認を行ったところ、実際にBPLによってビオチンの付加が起こり、基質活性を維持していることが確認できた。さらに、BPLとBCCPの融合タンパク同士を使ってビオチン化反応を行ったところ、反応に伴い両タンパクが会合することが確認できた。特異なビオチン固定酵素反応を利用したATP検出システムの構築を目指し、酵素であるBPLと基質タンパクであるBCCPに関して、それぞれEGFPとEBFPとの融合タンパクを構築した。BPLはそのN末端にEGFPを導入しても酵素活性を維持しており、またビオチン化反応に伴う基質タンパクとの複合体形成能も維持していることがわかった。一方で、BCCPに関しても、EBFPとの融合体として発現させてもその基質活性を維持できることが確認できた。またBPLとBCCPの両融合タンパクの系について、蛍光発光スペクトル及び励起スペクトルを測定したところ、蛍光タンパク単独の場合と同様の発光能を有することが確認できた。両融合タンパクを混合し、ビオチン添加後の蛍光スペクトル変化を観察した。その結果、BPLとBCCP間の複合体形成反応に伴う、EBFPからEGFPへの蛍光エネルギー移動(FRET)が確認できた。この反応の温度依存性を確認したところ、室温付近でも迅速にFRETが起こり、非常に速やかにビオチン化反応が起こることがわかった。よりFRET効率の高い系の構築を目的として、BCCPとEBFPの融合タンパクに関して、その融合部位や両タンパク間をつなぐリンカーの長さについて検討を行った。その結果、リンカーの長い方がFRET効率が高く、またBCCPをEBFPのN末端に導入した方が同じく効率が高いことがわかった。一番FRET効率の高かった系に関して、様々なATP濃度条件下におけるEGFPとEBFPの蛍光強度比を測定し、ATPの検量線を作成した。その結果、少なくとも0.1μM10μMの濃度範囲のATPが検出可能であることがわかった。前年度までに構築した、BPLとEGFPの融合タンパク質、及びBCCPとEBFPの融合タンパク質を用いて、細胞破砕溶液中に含まれるATPの検出を試みた。細胞破砕溶液中にATPを添加して、BPLとBCCPのそれぞれの融合タンパク質を用いて、ビオチン化反応を行なったところ、EBFPからEGFPへの蛍光共鳴エネルギー移動(FRET)が確認できた。このことより、細胞成分が共存する条件下でも特異的にビオチン化反応が起こり、FRETを指標とした、ATPの検出が可能であることがわかった。次に、ヒト細胞系におけるATPの検出系の構築を目的として、まずBCCPとEGFPのヒト細胞中での発現系を構築した。この際、元々の古細菌由来のBCCPに関してコドンの使用頻度を確認したところ、ヒト細胞系での発現が困難であることが推測されたため、ヒト細胞での発現に最適化したコドンを有するBCCP遺伝子を作製した。このコドンを最適化したBCCPを、EGFPのN末端に連結した融合タンパク質の発現プラスミドを作製し、HEK293細胞に対してトランスフェクションを行なった。細胞を蛍光顕微鏡で観察したところ、EGFP由来の蛍光が観察でき、ヒト細胞内においても目的の融合タンパク質が発現することが確認できた。同様にBPLに関してもコドンを最適化した遺伝子を作製し、ヒト細胞系での発現系を構築した。

さらに、HEK293細胞の表層におけるビオチン化反応の確認を行なった。すなわち、膜タンパク質とBCCPの融合タンパク質をHEK293細胞上に発現させ、蛍光標識化したBPLを用いて、ATP共存下ビオチン化反応を行なった。その結果、期待通り細胞表層から蛍光色素に由来する蛍光が観察できた。一方でATP非共存下ではこのような蛍光は観察できなかったため、細胞表層においてもATPを検出することが可能であることがわかった。
車載用デュアルロータ型永久磁石リラクタンスジェネレータの開発

2010年度は,有限要素法(FEM)を用いて,デュアルロータ型永久磁石リラクタンスジェネレータ(PMRG)の解析を行った。その結果,外側と内側のロータを電気角で180度位相をずらした構成にすると,トルクの高調波成分が打ち消しあって,コギングトルクが約1/2になることが明らかになった。ただし出力の向上は認められなかった。そこで2011年度は, PMRGと磁気ギアを組み合わせた小型高出力な発電システムの構築を目指し,高速でも高効率な磁気ギアの解析・設計を行った。その結果,極異方性ボンド磁石を用いた磁気ギアが非常に優れた特性を有することを明らかにした。平成22年度においては、まずデュアルロータ型永久磁石リラクタンスジェネレータ(PMRG)の基礎特性について、有限要素法(FEM)を用いて解析を行った。解析に用いたデュアルロータ型PMRGは、固定子12極、回転子16極の2相機とした。このPMRGにおいて、外側のロータに対して内側のロータを電気角で180度位相をずらした構成にすると、トルクの高調波成分が打ち消しあって、コギングトルクが約1/2になることが明らかとなった。今後、回転子極形状の一部を切り欠くなどの加工を施すことにより、さらなるコギングトルクの改善が期待できる。一方、出力については、一般的なシングルロータ型PMRGと比較して大幅な向上は認められなかった。この原因について検討を行うため、シングルロータ型PMRGの相数を種々変えて比較をしたところ、2相機の出力電圧波形は、基本的に単相機と同じになるため、脈動が大きく、整流後の電力が3相機と比較して、ほとんど変わらないことが明らかとなった。デュアルロータ型PMRGにおいて、相数を増やすと配線数はその2倍で増加するため、ワイヤハーネスの大型化につながる。車載用を目指すためには、PMRGの小型・軽量化は必要不可欠である。そこで新たな取り組みとして、PMRGと磁気ギアを組み合わせることで、装置の小型・軽量化が実現できないか検討を行った。一般に、発電機の動作回転数を高くすると、体格は小さくなる。従って、磁気ギアを用いて所望の回転数まで増速すれば、PMRGを小型化できる。ここでは、表面磁石型と埋込磁石型の2種類の磁気ギアについて、FEMを用いて比較・検討したところ、埋込磁石型にすることで、磁石損失の大幅な低減が実現できることが明らかになった。この結果に基づき埋込磁石型の磁気ギアを試作した。来年度以降は、本試作機を用いてPMRGと磁気ギアを組み合わせた実験を行う予定である。平成23年度においては、前年度からの検討に引き続き、永久磁石リラクタンスジェネレータ(PMRG)と磁気ギアを組み合わせることで、発電システムの小型・軽量化を目指すべく検討を行った。すなわち、一般に発電機の動作回転数を高くすると、体格は小さくできるため、磁気ギアを用いて所望の回転数まで増速すれば、PMRGを小型化できる。ただし、高速化に伴い、磁気ギアの損失、特に永久磁石の渦電流損が増大する。昨年度は、表面磁石型と埋込磁石型の2種類の磁気ギアについて、有限要素法(FEM)を用いて比較・検討したところ、埋込磁石型にすることで磁石渦電流損の大幅な低減が可能であることを明らかにした。今年度は、さらなる高効率化を目的として、物性上、渦電流がほとんど生じないボンド磁石を用いた磁気ギアについて検討を行った。ただし、ボンド磁石の磁気特性は、一般的な焼結磁石に対して劣ることが知られており、単純な置き換えでは所望のトルクを得ることはできない。そこで、極異方性着磁に着目した。一般的なラジアル異方性着磁に対して、極異方性着磁は磁石磁束が一方の面に集中するため、磁石磁束が増加し、また回転子ヨークが不要などの特長を有する。まず初めに、簡単な磁気回路を用いて、極異方性着磁の優位性を解析的に明らかにするとともに、極異方性ボンド磁石を用いた磁気ギアの特性について、FEMを用いて比較・検討を行った。その結果、ボンド磁石の磁気特性は、焼結磁石の約6割程度であるにもかかわらず、極異方性着磁を採用することで、同等以上のトルクを達成できることが明らかになった。また、損失は従来のラジアル異方性焼結磁石を用いた磁気ギアに対して、8割程度削減できることが明らかになった。以上の検討により、極異方性ボンド磁石を用いた磁気ギアを用いて所望の回転数まで増速し、小型のPMRGによって発電するシステムについて、おおよその目途が立ったと言える。
三次元多光子レーザープロセシングによる機能因子放出スキャフォールドの実現

初年度である平成30年度は、金属微細構造をソフトマテリアル内部に作製する技術の研究を行った。支持体となるソフトマテリアルに金属イオンを含有させ、内部に超短パルスレーザーを集光・走査することで三次元の金属微細構造を作製した。ソフトマテリアルはポリエチレングリコール(PEG)によるハイドロゲルとpNIPAMを使用した。金属イオンは硝酸銀と塩化金酸を使用し、PEGハイドロゲル内部にそれぞれ銀微細構造と金微細構造を作製できることを実証した。また、ハイドロゲルの架橋時にはモールドを用いているが、ハイドロゲルの形状を保持したままモールドから取り出すことを目的として、モールドの材料について検討も行った。特に微小寸法のものを扱う際に生分解性ポリマーを用いることを検討した。さらに、ハイドロゲルの液体浸透性に着目することで、同一PEGハイドロゲルの内部に異種の金属微細構造を空間選択的に作製できることをはじめて実証した。作製した金属微細構造の電子顕微鏡観察ならびにエネルギー分散型X線分析を行った結果、構造はナノ粒子から構成されていること、また、条件によって銀と金のコアシェル構造が作製できることを明らかにした。銀ナノ粒子と金ナノ粒子、ならびにコアシェル構造はそれぞれ異なる光吸収特性を示すことから、成果技術によりハイドロゲルに波長選択的な機能を付与することが期待できる。同時並行でpNIPAMを使用した実験にも取り組み、多光子還元によりその内部に金属微細構造を作製できることを確認した。また、二光子吸収を利用してハイドロゲル内部に異なる分子量のハイドロゲルを局所的に重合させる研究に着手した。当初計画していた金属微細構造作製を進め、条件最適化実験、異種金属の構造作製、作製構造の分析を行った。これらの成果の一部は現在原著論文として投稿中である。また、計画よりも前倒しで局所的重合の研究に着手した。以上より、若干ではあるものの、当初の計画以上の進展がみられた。当初の計画から大きな変更はない。金属微細構造の作製を進めるとともに、ハイドロゲル内部に光特性を変化させるための構造を作製する研究にも取り組む。
ステロイド性抗炎症薬による肥満細胞の脱顆粒抑制機序解明のための新しいアプローチ

ステロイド性抗炎症薬の薬理作用は蛋白質合成を介して発現されるという従来の仮説に対し、サイトカインの産生抑制作用は蛋白質合成を介さない転写阻害作用に基づくことが明らかにされた。本研究では、ステロイド性抗炎症薬の肥満細胞脱顆粒抑制作用が転写阻害作用による蛋白質合成阻害によって発現されている可能性について検討した。1.ステロイド性抗炎症薬の脱顆粒抑制作用:ラット好塩基性白血病細胞RBL-2H3を抗原、ionomycinあるいはthapsigarginで刺激したときに生じるヒスタミン放出反応は、ステロイド性抗炎症薬dexamethasoneにより抑制されたが、その作用発現には6時間以上前処理することが必要であった。またこのとき、dexamethasoneは各刺激で誘発される持続的な細胞内カルシウムの上昇を抑制した。2.蛋白質合成阻害剤の肥満細胞脱顆粒抑制作用:蛋白質合成阻害剤cycloheximide(CHI)を各刺激剤と同時にRBL-2H3細胞の培養系に添加した場合にはヒスタミン放出反応は全く抑制されなかったが、CHI存在下で2時間以上培養した後に刺激した場合には、いずれの刺激剤によるヒスタミン放出も用量依存的に抑制された。一方、CHIを培養系から除去することにより蛋白質合成を再開させると、CHIの抑制効果は4時間で完全に消失した。CHIは、dexamethasoneと同様に、各刺激による持続的な細胞内カルシウム濃度の増加を抑制した。3.考察と結論:Dexamethasone及びCHIはいずれも数時間のlag timeの後に各刺激剤によるヒスタミン放出、及び持続的なCa^<2+>濃度の上昇を抑制したことからdexamethasoneもその転写阻害作用に基づく蛋白質合成抑制作用によってヒスタミン放出反応を抑制している可能性が示唆された。この結果はまた短半減期の機能蛋白質が脱顆粒反応,特に細胞外からのCa^<2+>流入に関与していることを示唆するが、その分子機作についてはさらに検討が必要である。