hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
氷とアンモニアのメガバール領域での融点計測

氷の超イオン相も氷惑星内部で安定であることが既に確認されているので、これと本研究結果を合わせて考慮すると、水とアンモニアの惑星比率で構成された混合物は氷惑星マントル中で超イオン相として存在していることが考えられる。この超イオン状態の混合物はマントル深部で安定成層を形成し、この安定成層が天王星と海王星で観測されている多重極磁場の生成に関与している可能性が高い。研究目的であるアンモニアの超イオン相と融解を含めた実験的な相図解明に成功した。さらに、もう一つの研究目的である氷をターゲットにした実験も既に始動しているため、当初の計画以上の進展がみられる。天王星と海王星といった氷惑星の磁場は、地球を含めた他の太陽系惑星とは形態が大きく異なっていて、多重極磁場であることが知られている。このような異質な磁場は構成物質の水やアンモニアの対流によって生成されているため、これらの物質の相関係と対流に関わる物性は磁場生成メカニズムと密接に関連している。本研究では、CO2レーザー加熱装置とブリュアン-ラマン散乱分光計測を組み合わせた複合計測システムを開発し、惑星内部環境下におけるアンモニアの弾性波速度計測とラマン分光分析を行った。高温高圧下のアンモニアのブリュアンスペクトル中に出現する、液体に由来する音速ピークの観察を基にして60 GPaまでのアンモニアの融点計測に成功した。約2000 K、40 GPa以上の温度圧力条件で低い音速を持つ新しい相を発見した。ラマン分析からその新しい相は、イオン化していることがわかり、この相が超イオン相に相当することがわかった。超イオン相の縦波速度は液体と同等であることが示されたため、超イオン相は液体と同程度の弾性特性を持っていることがわかった。惑星内部の温度圧力環境にアンモニアの超イオン相が存在することが本研究で決定した融解曲線から明らかになった。したがって、超イオンアンモニアは天王星、海王星内部に存在しているが、この物質が液体と同等の弾性特性を持っていることから、超イオン物質は惑星深部の対流抑制に寄与していないことがわかった。氷惑星のもう一つの主要物質であるメタンは深部で水素とダイヤモンドに分解することがわかっている。この分解生成されたダイヤモンドがマントル深部に沈殿してダイナモ生成を妨げるような安定成層を形成している可能性が考えられる。本研究から、氷惑星の磁場生成メカニズムと関連する、重要な内部構造が明らかになった。研究計画に盛り込まれたラマン分析は試料の分子構造の決定に必要不可欠であるが、水素が無秩序になることが予想される超イオン相の構造は、液体と区別がつかないことが最近の研究によって指摘された。したがって、本研究では研究実績の概要にもあるように新たにブリルアン散乱計測を導入し、分子構造のみならず弾性特性の両方の変化を同時に追うことで超イオン相への相転移及び、融解挙動の決定を試みる。氷やアンモニアの超イオン相はプロトンが高速で拡散するため、高圧発生装置のダイヤモンドアンビルにプロトンが侵入し、アンビルが破損する恐れがあることがわかった。今年度は、ダイヤモンドの表面にチタンコーティングを施し、長時間の超イオン相の生成を保持したまま計測を行うことを試みる。計画していた研究打ち合わせが次年度に変更したため。予定していた実験が次年度に変更したため。
日本とフィリピンのＫ１２教育課程における理科教材としての地域海洋資源の探索

本研究計画では、地域の海洋資源を教材化することを中心に据え、地域の海洋資源調査、理科カリキュラムの見直し、現場教員のインタビュー、教材の動画説明の制作、指導案づくり、研修会の開催、受講した生徒の学力調査、成果の発表などを行う。特に、教材開発では、地域特性を生かした海洋資源の選択と、安価もしくはリサイクル素材を積極的に採用して、世界的な普及を視野に研究開発をすすめる。
超音波の異常負圧効果に関する研究

超音波の場の中に物体を置くと,媒質流体の流れが存在しない場合でも,この物体には一方向性の力が働く.これを音響放射圧といい,この力の向きは通常は超音波の入射方向と一致する.しかしながら球面波や平面定在波の超音波ではこの力は時に音源に物体を引き寄せる向きに働くことがある.これを異常負圧効果と呼ぶ.理想的な平面進行波の超音波では決して負の放射圧は発生しないことが証明されているものの,異常負圧効果の成因は従来明らかにされていない.本研究ではまず,従来提唱されたいくつかの典型的な放射圧理論を原理的レベルにまで遡って検証し,音響放射圧の本性を明確にし,統一的な理論体系を確立した.ついで,球面波音場における異常負圧効果がベルヌーイの定理そのものに起因すること,平面定存波で異常負圧効果が発生するための条件を明らかにした.さらに本研究ではこの現象が,有限の大きさの音源から発生される超音波の場合にも生起することを初めて明らかにした.すなわち,円形平面振動子から放射される超音波の場を,直交関数系を用いて展開することにより,球による超音波の散乱問題を厳密に解く方法を考案し,これを用いて球に作用する音響放射圧を計算することによって,異常負圧効果の発生を予言しその成因を解明したものである.解析の結果によれば音源の比較的近傍では,音源自身の回折効果によって,音圧の勾配が局所的に著しく急峻になるために,比較的小さな物体にはある程度の空間的規則性をもって異常負圧効果が生起するのである.その発生条件は音源の大きさ,音源からの距離,物体と媒質との密度比,物体の大きさと波長の比に依存し,本質的には物質の弾性率にはあまり依存しないことが理論と実験により示された.本研究の副産物として,従来の数多くの音響放射圧の理論の同一性が証明され,結局音響放射圧は波動運動量の吸い込みとして理解すべきものであることが明らかにされた.超音波の場の中に物体を置くと,媒質流体の流れが存在しない場合でも,この物体には一方向性の力が働く.これを音響放射圧といい,この力の向きは通常は超音波の入射方向と一致する.しかしながら球面波や平面定在波の超音波ではこの力は時に音源に物体を引き寄せる向きに働くことがある.これを異常負圧効果と呼ぶ.理想的な平面進行波の超音波では決して負の放射圧は発生しないことが証明されているものの,異常負圧効果の成因は従来明らかにされていない.本研究ではまず,従来提唱されたいくつかの典型的な放射圧理論を原理的レベルにまで遡って検証し,音響放射圧の本性を明確にし,統一的な理論体系を確立した.ついで,球面波音場における異常負圧効果がベルヌーイの定理そのものに起因すること,平面定存波で異常負圧効果が発生するための条件を明らかにした.さらに本研究ではこの現象が,有限の大きさの音源から発生される超音波の場合にも生起することを初めて明らかにした.すなわち,円形平面振動子から放射される超音波の場を,直交関数系を用いて展開することにより,球による超音波の散乱問題を厳密に解く方法を考案し,これを用いて球に作用する音響放射圧を計算することによって,異常負圧効果の発生を予言しその成因を解明したものである.解析の結果によれば音源の比較的近傍では,音源自身の回折効果によって,音圧の勾配が局所的に著しく急峻になるために,比較的小さな物体にはある程度の空間的規則性をもって異常負圧効果が生起するのである.その発生条件は音源の大きさ,音源からの距離,物体と媒質との密度比,物体の大きさと波長の比に依存し,本質的には物質の弾性率にはあまり依存しないことが理論と実験により示された.本研究の副産物として,従来の数多くの音響放射圧の理論の同一性が証明され,結局音響放射圧は波動運動量の吸い込みとして理解すべきものであることが明らかにされた.本研究は2か年計画で実施されているものである。その初年度にあたる平成3年度の研究は、当初の計画通り進捗している。まず理論面の成果として、球面波音場に置かれた球に働く異常負圧効果に関する理論を開発し、異常負圧効果の生じる条件と、その発生機構を明らかにしたことである。球面波音場の場合は、異常負圧効果はとくに音源近傍に置かれた直径の小さい球において顕著に現れることを定量的に示し、その閾値を球径と音源からの距離の関数として与えることに成功した。また球面波音場で異常負圧効果を生じる原因は、物理的にはベルヌ-イの定理を2次の微小量まで拡張するこさにより説明できることが明らかとなった。以上の理論を検証するために、固体球に作用する音響放射圧が、超音波の振動数、音源と球との間の距離、球径、球の材質とどのように関係するかを調べる実験を、無響大水槽中の球面波音場において行った。この過程において、定在波音場(完全な定在波でなくともよい。いわゆる準定在波)においても、大きさは小さいが、負の音響放射圧が現れることが実験的に確認された。この実験の成功は当補助金設備備品費で購入した、広帯域電力増幅器およびファンクション・ジェネレ-タに負うところが大きかった。現在、理論と実験結果を比較中であるが、いままでのところ、理論と実験の重大な不一致は見出されていない。すなわち、本研究は順調に進捗していると考えられる。

本年度は、現在超音波の工学的・医学的応用に最も多用されている、円形平面振動子から放射される音場における超音波の異常負圧効果について理論的・実験的に研究を進める予定である。この場合の異常負圧効果の発生機構は、球面波音場の場合とは全く異なり、また関係する要因も格段に増える筈である。本研究は2か年計画で実施されたもので,本年度はその最終年度に該当する.前年度では主として球面波音場に置かれた球に働く異常負圧効果に関する研究を行い,その生成の原因がベルヌーイの定理を2次の微小量まで拡張することにより説明できることを明らかにした.本年度は,現在超音波の工学的・医学的応用に最も多用されている,円形平面振動子から放射される音場における超音波の異常負圧効果について理論的・実験的に研究を行った.まず,超音波の異常負圧効果を理論的に記述できるようにするため,従来提案されている種々の音響放射圧理論を原理的レベルまで遡って検証し,放射圧のいかなる成分が異常負圧効果に寄与する可能性があるかを検討した.ついで円形平面振動子の近距離音場に置かれた球に作用する音響放射圧を計算するための理論を開発した.この理論にもとづいて,まず剛体球について負の放射圧が発生する条件を数値解析によって明らかにし,球物質と媒質の密度比,音源からの音響学的距離,球の音響学的大きさ,円形振動子の直径の関数として,その生成領域図を作製した.一般的に軽い物質の小さい球において,音源に近い領域において顕著な異常が発生し,音源の大きさはあまり関係がないことが明らかとなった.ついで有限の弾性をもつ固体球について同様の解析を行った結果,弾性振動の共振に対応して,放射圧の周波数特性に一連の極大および極小を生ずるものの,異常負圧効果が生じる条件は,剛体の場合と基本的には変わらないことが判明した.実験は無響水槽で,振動数0.23MHz,球として種々の材質からなる直径0.53mmのものをナイロンの単繊維で二本吊りにすることによって行われ,理論との良い一致を見た.超音波発生用プリアンプの電源として申請備品の直流電源を用いた.
第一原理計算とモデル計算の融合による遷移金属酸化物界面の物質設計と物性制御の研究

報告者の研究目的は遷移金属酸化物の示す多彩な物性を利用し、界面でのドープ量制御・物性制御の方法論を理論的に提案し、新奇な物性の可能性をモデル計算・第一原理計算両面の手法を駆使して提示することである。昨年度は、遷移金属酸化物界面のより高精度な低エネルギー有効模型の導出、およびその方法論の開発を行った。また、ダウンフォールディング法では、高エネルギー領域の遮蔽を繰り込む段階と低エネルギー領域の有効模型を解く段階とで相互作用の種類を分け、段階的に計算に導入している。しかし、DFT/LDAの性質上、各段階で考慮する相互作用が一部重複してしまい、低エネルギー有効模型の精度を低下させる要因となっている。そこで報告者はLDAを超えたGW近似に基づいてダウンフォールディング法を再定式化し、相互作用の二重計算を除いた有効模型の導出法を導いた。二重計算のない定式化は、界面・表面系に限らず、バルクも含めたダウンフォールディング法全体の改良となる。また、界面・表面系はバルクに比べ1次元方向に非常に長い単位格子を計算上扱わなければならず、ダウンフォールディング法での各計算の過程、特にcRPAでの高エネルギー領域からの分極の計算コストが莫大になる。さらに、真空領域のある計算では、遮蔽の効果によりLDAに比べCoulomb相互作用の減衰の大きいGW計算においても、真空領域を十分に取らない限り有効模型の計算結果に多大な影響を与える。以上の留意点に注意しつつ、LAO、STOおよび真空層が十分に厚いLAO/STO界面の格子緩和およびその系での低エネルギー有効模型の導出を行った。昨年度は、遷移金属酸化物界面LaAlO3/SrTiO3(LAO/STO)の物性を明らかにするために、LAO/STOの低エネルギー有効模型を第一原理的に導出した。まず、DFT/LDAに基づきLAO/STOの低エネルギーから高エネルギー領域にわたる広いバンド構造を決定した。次にバンドを高エネルギー領域と低エネルギー領域に分け、高エネルギー領域の効果をRPAの範囲で低エネルギー領域へ繰り込む。しかし、LAO/STOのバンド構造は、物性を担う界面のTiのt2gバンドからバンド絶縁体であるバルクSTO領域のTiのt2gバンドまでがフェルミ面付近に連続的に分布し、さらにLDAの範囲ではLa 4fバンドが界面のTiのt2gバンドと混成しており、低エネルギー領域を指定することが困難である。そこで、まずLDAで考慮されていない自己エネルギー補正をGW近似で導入し、La 4fバンドをより相応しい高いエネルギー準位にし、界面のTiのt2gバンドとの混成を解いた。次に、界面近傍の最局在ワニエ軌道で低エネルギー領域を定義して、そこから軌道別のトランスファー積分および化学ポテンシャルを求めた。さらに、一般の絡み合ったバンドから最局在ワニエ軌道による低エネルギーバンドと他のバンドを分離する手法をLAO/STOに適用し、界面のTiのt2gバンドとバルク領域のt2gバンドなどその他高エネルギーバンドとを分離した。制限RPA法によって界面のTiのt2gバンドに対する遮蔽されたCoulomb相互作用、および交換相互作用を計算し、LAO/STOの低エネルギー有効模型を決定した。界面のバンド構造はバルクSTOと大きく異なるが、得られたパラメーターはバルクSTOのものと概ね変わらないことが分かった。また、界面のxy軌道が他のt2g軌道よりも数十meV程度エネルギーが低いなど、界面における空間反転対称性の破れが各種パラメーターに現れていた。本研究は表面・界面系へダウンフォールディング法を導入した初めての成果である。
カルバゾール分解プラスミドpCAR1と宿主染色体との相互作用の可変性・普遍性の解明

本研究では,含窒素芳香族化合物カルバゾールの分解プラスミドpCAR1を保持する3種のゲノム既知宿主の転写レベル・形質レベルでの比較によって,プラスミドと宿主染色体間の相互作用が異なる宿主でどのように変化するのか,またその差異を生みだす鍵となる因子は何か,を解析することで,多剤耐性菌の蔓延防止や分解菌による環境修復など実環境中でプラスミドを制御する技術の確立に欠かせない基礎情報を得ることを目的としている.本年度は,昨年度までの転写レベル・表現型レベルの解析によって見出されたpCAR1を保持した宿主に起こる様々な変化が,pCAR1固有のものなのか,それともプラスミド一般に共通のものなのかを明らかにするため,pCAR1とは異なる不和合性群に属するプラスミド2種(多剤耐性プラスミドRP4,ナフタレン分解プラスミドNAH7)をPseudomonas putida KT2440株に保持させ,プラスミド保持株と非保持株のトランスクリプトーム比較を行った.その結果,プラスミドを保持した際に転写変動する遺伝子の数はRP4・NAH7のほうがpCAR1よりも多いこと,pCAR1では抑制される遺伝子よりも誘導される遺伝子の方が多いのに対しRP4・NAH7では抑制される遺伝子のほうが多いこと,が明らかになった.しかし興味深い点として,pyrroloquinoline quinone(PQQ)合成遺伝子とPQQ含有酵素遺伝子を含む1領域が3種のプラスミド保持株で共通に転写誘導されており,全く種類の異なるプラスミドでも宿主に共通の反応を引き起こすことが示された。プラスミドが宿主に及ぼす影響,-すなわち薬剤耐性能や難分解性物質分解能など新規形質の獲得や生育の遅れ-,に宿主ごとにどれだけの差が出るのかということは,多剤耐性菌の蔓延防止や分解菌による環境修復など実環境中でプラスミドを制御する技術の確立に欠かせない基礎情報となる.本研究では含窒素芳香族化合物カルバゾールの分解プラスミドpCAR1をモデルとして,pCAR1を保持する3種のゲノム既知宿主の転写レベル・形質レベルでの比較によって,プラスミドと宿主の相互作用が異なる宿主でどのように変化するのか,またその差異を生みだす鍵となる因子は何か,を解析することを目的としている.本年度は,pCAR1を保持することで転写変動した遺伝子を,タイリングアレイを用いて3株それぞれで経時的かつ網羅的に抽出した.その結果,1株ではファージ由来の領域の誘導が顕著だった一方で,他の2株では本来は定常期初期に転写が抑制される遺伝子の転写が定常期初期でも若干続くという傾向が見られた.TCA回路,ATP合成系,リボソームタンパク群といった生命維持に必須の代謝経路でも2株共通に上記の傾向が見られることから,本年度はこれら遺伝子の転写調節に関わると考えられるシグナル分子ppGppを定量することで,pCAR1を保持することで対数期から定常期への転写の切替えが鈍くなっているという仮説を検証しようと考えている.また,表現型アレイ(1穴ごとに異なる組成の培地が充填された96穴プレート)を用いて,190種類の化合物をそれぞれ唯一の炭素源としたときのプラスミド保持株と非保持株の生育(呼吸量)を比較したところ,両者の生育に差が見られる基質は宿主によって異なることが示された.今後,表現型アレイの結果とタイリングアレイの結果を代謝マップ上に可視化することで,プラスミド保持の影響を受けやすい代謝経路の絞り込みを行いたいと考えている.本研究では,含窒素芳香族化合物カルバゾールの分解プラスミドpCAR1を保持する3種のゲノム既知宿主の転写レベル・形質レベルでの比較によって,プラスミドと宿主染色体間の相互作用が異なる宿主でどのように変化するのか,またその差異を生みだす鍵となる因子は何か,を解析することで,多剤耐性菌の蔓延防止や分解菌による環境修復など実環境中でプラスミドを制御する技術の確立に欠かせない基礎情報を得ることを目的としている.昨年度のタイリングアレイ解析によって,2宿主ではpCAR1を保持することで対数期から定常期への転写の切替えが鈍くなっているという傾向が見出された.今年度はまずこの転写レベルの変化が宿主菌体内のタンパク質レベルの変化に結びついているのか調べるため,大腸菌で定常期に形成されることが知られている100Sリボソームの定量を行った.しかし,そもそもPseudomonas属細菌では100Sリボソームが形成されていないことが明らかになり,仮説の検証は行えなかった.別のアプローチとして,定常期初期に多くの遺伝子の転写調節に関わると考えられるシグナル分子ppGppの定量を,慶應大学先端研との共同研究によって行った.測定には成功したものの,菌体数を正確に測定できないことが原因となって標準化が行えなかった.

また,表現型アレイ(1穴ごとに異なる組成の培地が充填された96穴プレート)を専用の培養装置を用いて実施した.浸透圧・pH耐性については,pCAR1を保持した際にいくつかの条件で呼吸量の低下(耐性の低下)が見られた点は3宿主で共通していた.C源,N源,P源,S源をそれぞれ変化させた場合では,pCAR1を保持した際に呼吸量の変化が見られた条件の数の大小関係は,KT2440株>PAO1株>Pf0-1株となり,タイリングアレイ解析において転写変動した遺伝子の数の大小関係と一致した.本研究では,含窒素芳香族化合物カルバゾールの分解プラスミドpCAR1を保持する3種のゲノム既知宿主の転写レベル・形質レベルでの比較によって,プラスミドと宿主染色体間の相互作用が異なる宿主でどのように変化するのか,またその差異を生みだす鍵となる因子は何か,を解析することで,多剤耐性菌の蔓延防止や分解菌による環境修復など実環境中でプラスミドを制御する技術の確立に欠かせない基礎情報を得ることを目的としている.本年度は,昨年度までの転写レベル・表現型レベルの解析によって見出されたpCAR1を保持した宿主に起こる様々な変化が,pCAR1固有のものなのか,それともプラスミド一般に共通のものなのかを明らかにするため,pCAR1とは異なる不和合性群に属するプラスミド2種(多剤耐性プラスミドRP4,ナフタレン分解プラスミドNAH7)をPseudomonas putida KT2440株に保持させ,プラスミド保持株と非保持株のトランスクリプトーム比較を行った.その結果,プラスミドを保持した際に転写変動する遺伝子の数はRP4・NAH7のほうがpCAR1よりも多いこと,pCAR1では抑制される遺伝子よりも誘導される遺伝子の方が多いのに対しRP4・NAH7では抑制される遺伝子のほうが多いこと,が明らかになった.しかし興味深い点として,pyrroloquinoline quinone(PQQ)合成遺伝子とPQQ含有酵素遺伝子を含む1領域が3種のプラスミド保持株で共通に転写誘導されており,全く種類の異なるプラスミドでも宿主に共通の反応を引き起こすことが示された。
粘液細菌由来のファルネシルトランスフェラーゼ阻害物質の探索とその化学的研究

ファルネシルトランスフェラーゼ(FTase)はG蛋白質など機能性蛋白質をファルネシル化する酵素で、本酵素の阻害物質は新規抗癌剤の有力な候補として近年注目されつつある。本研究では希少細菌である粘液細菌を材料にして新規FTase阻害物質を探索し、化学的・生化学的研究を行うことを目標としているが、まず第一段階として、現在汎用されているラジオアイソトープ法に代替しうる安全ユニークな二種のアッセイ法を立案し、その有用性について検討した。1.担子菌酵母を用いた生物検定法:担子菌酵母の一種Tremella mesentericaの有性世代に見られる接合管は性フェロモンにより誘導される。その本体がファルネシル化ペプチドであることに着目し、接合管の誘導活性をFTase活性の指標にしたアッセイ系を確立した。即ち、本菌のA型株を検体存在下で培養後、培養液中に分泌される性フェロモンの量的変化を同菌a型株の接合管伸長度の観察により検出し、接合管誘導の阻害活性を観察した。これまでに土壌から分離した粘液細菌の培養液約150検体をアッセイしたが、現在のところ活性のある検体は見つかっていない。本方法については今後、感度・定量性の向上、検体中の抗菌物質の影響の低減などの問題を解決する必要がある。2.非アイソトープin vitro酵素阻害検定法:酵母のFTase大量発現変異株からFTaseを抽出・精製し、得られた酵素と基質(ファルネシルピロリン酸、合成ペブチド)を用いて酵素反応を行った後、反応混合物をそのままLC-MSで分析する条件を樹立した。この方法により生成物であるファルネシル化ペプチドの検出は1pmolレベルまで可能となり、簡便かつ安全で高感度に酵素阻害アッセイができることが解った。今後、本方法を用いて上記粘液細菌培養液のスクリーニングを行う予定である。
SAILタンパク質を用いる全自動化NMR構造システムの開発

SAIL-FLYA法は、NMR法でのタンパク質の三次元立体構造を、人手による介在をまったく必要とせずに高精度に決定できる全自動解析システムである。SAIL-FLYA法を用いれば、従来法で必要とされるNMRスペクトルより格段に少ないデータ数でも、正確な構造決定が可能となる。本研究では、このシステムを開発、改良を加え、比較的低分子量のタンパク質であるユビキチンを例としてその性能評価を行った。加えて、さらなる性能向上のために、CYANA計算法の改良、及びFLYA法に適用可能な新たな自動化学シフト帰属法の開発等も行った。また、従来難しいかったタンパク質にSAIL-CYANA法を適用し、その構造決定に成功した。申請者らが開発を進めている完全自動構造解析手法(FLYAプログラム)と立体整列同位体標識法(SAIL法)は、NMRを用いた溶液タンパク質構造決定における効率性、信頼性を高め、その適応範囲を飛躍的に拡大することができる。FLYAは、多次元NMRスペクトルデータから、人手を介さずに自動的に、タンパク質の立体構造を決定するように設計されたプログラムである。SAIL法は、化学および酵素学的合成法によって、基本的に同一炭素上に1つの水素のみが結合するように、アミノ酸に重水素を導入し、タンパク質を調製する方法である。SAIL法は、スペクトルをより単純化させつつ、かつ最大の構造情報を得ることができる。SAIL法では、帰属に必要な主鎖・側鎖の共有結合情報を保持したまま、シグナルの重なりを軽減し、立体特異的帰属の曖昧さを除き、スピン拡散を軽減させ、3-7倍のS/N比を実現させている。こうして、巨大タンパク質でもこれまで以上に鋭敏なスペクトルを得ることができ、小さいタンパク質にはより短い測定時間でのデータ収集が可能となる。SAILタンパク質から得られる、少ないシグナル数、鋭敏でかつ強い強度のスペクトルは、自動シグナル識別や自動帰属にも高い信頼性で適応することができる。また、スピン拡散の減少によって、NOEをより定量的に解析することも可能となる。SAIL-FLYAシステムは、これらの特徴を生かすことで、20kDaを超えるタンパク質のNMR自動構造決定を可能にした。2006年度には、これらの最初の詳細な報告として、SAIL法はNature誌の「Article」記事に、FLYAアルゴリズムはJ.Am.Chem.Soc.誌にそれぞれ掲載された。また、SAIL-FLYA法のさらなる改良を進めるために、新たに3種類の異なったSAILタンパク質を調製し、NMRスペクトルデータを収集した。Stereo-Array Isotope Labeling(SAIL)法は、安定同位元素2H、13C、15Nを位置・立体選択的にタンパク質構成アミノ酸に導入することにより、必要な構造情報を失うことなくタンパク質のNMRスペクトルを簡略化し、シグナルのS/N比を大幅に高めることができるNMR試料の最適化技術である。SAIL法により従来のNMR法では不可能であった高分子量タンパク質・タンパクし複合体の構造解析が可能となった。SAIL法がもたらす単純かつ高品質なNMRスペクトルは、NMR法の信頼性の向上、及び構造解析の自動化という観点からも大きな効果が期待できる。本課題において、溶液タンパク質の構造解析プログラムCYANAを基に我々が開発した完全自動構造解析化アルゴリズムFLYAの、SAIL法との融合を主たる目標としている。SAIL-CYANA法の詳細はNature誌のArticleとして、FLYAアルゴリズムはJ.Am.Chem. Soc.誌にそれぞれ掲載された。また、SAIL-CYANA法の応用としては、SARS coronavirus nucleocapsid蛋白質C末端ドメイン(28KDa)の二量体構造を決定し、タンパク質-核酸相互作用によるRNAパッキング機構に関する知見が得られた(J. Mo1. Bio1.印刷中)。さらに、ミロシナーゼ結合蛋白質と推定される32kDaのシロイズナズナ由来の仮想蛋白質(At3g16450.1)の溶液構造をSAIL-NMR法により決定した(投稿中)。一方、SAIL-FLYA NMR法の低分子量タンパク質への実験は予期した成功を収め、既にNature Protocols誌に掲載された。引き続き実施したSAIL-FLYA法による全自動構造解析法の体系的評価により、従来の均一13C、15N二重標識蛋白質試料にFLYAを適用する場合に比べ、立体構造解析に必要十分なNMRデータセットは著しく減少し、従って高価な測定装置の占有時間を大幅に短縮されることが示された。このことから、SAIL-FLYA法は少なくとも分子量25kDa程度までのタンパク質の溶液内立体構造を、全自動構造解析できる可能性が示され、実証実験を進めている。今年度は、初めに、比較的低分子量のタンパク質を例に、SAIL-FLYA法の性能評価を行った。

この結果から、SAIL-FLYA法ではより少数のNMRデータセットを用いても全自動で正確な構造決定が可能であることを確認できた。SAILユビキチン(分子量8kDa)の場合であれば、二つの2D13C,15N-HSQCと二つの13C,15N-edited3D NOESY、および一つの3D triple resonanceデータセットのみで、従来の人手による方法のものとほぼ同一の正確な構造決定が全自動解析可能であることが示された。この成果は、論文としてJ.Bio.NMR誌に投稿中である(Ikeya et al.)。一方で、SAIL-FLYA法への応用可能な自動化学シフト帰属法であるDYNASSIGNアルゴリズムを新たに開発した。この方法はピークを粒子として表現し、予測した帰属とピーク位置の差をエネルギー関数に変換して、分子動力学法よりこれを最小化するユニークな方法であり、その成果をJ.Bio.NMRに発表した。さらに、SAIL-CYANA法の応用として、シロイヌナズナ由来At3g16450.1SAILタンパク質の構造決定を行い、その内容をFEBS Journalに発表した。このタンパク質は比較的分子量が大きく(299残基、32kDa)、配列上に二つの高い相同性をもつ領域があり、N、C末端の二つのドメインが独立で運動するといった特徴を持つ。このため、多くのシグナルの重複や一部の領域での線幅の広がりなど、NMR解析には困難な試料であったが、SAIL-CYANA法を用いることにより高精度に構造決定することができた。また、生きたままの細胞の中でのタンパク質の三次元構造をCYANAを用いて世界で初めて決定し、Nature誌に発表した(Sakakibara et al.,Nature458,102-105)。
哺乳類における卵母細胞の成熟と退行の調節因子について

1.成熟の調節因子卵母細胞の成熟について、主として減数分裂の休止と再開始に焦点をあてて検討しているが、顆粒膜細胞から減数分裂休止因子を分離するとともに、減数分裂の休止と再開始の機構に関し一つの仮説を提起している。本年度においては休止因子の遺伝子の同定に向けた実験を進展させるとともに、仮説を実証するいくつかの実験を行なった。a.減数分裂休止因子の遺伝子顆粒膜細胞から休止因子を分離し、高速液体クロマトグラフィ-により単離されたと考えられる3種のピ-クを同定した。また顆粒膜細胞や黄体細胞からのmRNAを分離する方法を確立し、それぞれに対するcDNAライブラリ-を作製した。b.仮説の実証仮説を組織学的に検証した。グラ-フ卵胞の卵丘は数層の細胞層からなり、卵丘・卵母細胞複合体と顆粒膜細胞層とは10-15個の細胞面で接触している。LHの影響を受けると卵丘と顆粒膜細胞層との接触面は減少し始める。また細胞間質の発達には局在性があり、卵丘周辺および卵丘と顆粒膜の接触面で顕著であった。細胞間質はコロイド鉄に濃染された。細胞間質の発達により卵母細胞と卵丘細胞との形態的連絡は消失するとともに減数分裂は再開始した。このような観察は仮説の基本を支持するものであった。2.退行の調節因子卵胞液から卵母細胞の退行抑制因子をすでに分離していたが、本年度においてその理化学的性状についての検討を進め、活性因子はグリコスアミノグリカンの一種、特にヒアルロン酸様物質であることを明らかにした。
文化の伝播とその変容に関する中国福建省と沖縄における比較研究

沖縄と福建の民俗文化の諸相について、多角的な比較研究が行われた。両地域の民俗文化は、その歴史的背景と地理的状況を考慮すると、沖縄における中国あるいは福建文化の受容と変容が一つの重要な視点となる。文化移動の歴史的背景を明確にしつつ、両地域の社会構造や信仰体系と対比して、家譜と族譜、門中と宗族、洗骨改葬、祖先祭祀儀礼、建築儀礼と風水、樹木信仰、琉球瓦と中国瓦などについて比較研究が行われた。本研究の1年目は、8月30日から9月7日の日程で福建省泉州市及び福州市において本研究参加者全員による調査を実地した。泉州市では、研究協力者である泉州海上交通史博物館館長の王連茂氏の案内で、磁〓鎮の龍竈跡調査と安渓の茶葉業調査を行った。さらに、泉州市内の祠堂調査を実施し、中琉交易の拠点である遠来駅跡を確認した。福州においては、福建師範大学中琉歴史関係研究所と学術交流を行った。その後は、各自の研究テーマに沿った調査を実地した。福建と沖縄における祖先祭祀の比較研究の一環として、3月3日から8日の日程で、粟国島の正月十六日祭の実地調査を行った。粟国島では、旧暦正月十六旧に墓参りを行う習慣がある。沖縄における墓参りの慣習は、本来旧暦十六日に行われており、18世紀頃から琉球士族が中国の慣習を受け入れて清明祭が行われるようになったと言われている。沖縄本島では、一部を除いてほとんどが清明祭の墓参りを行うようになっているが、本島北部や勝連半島、沖縄本島周辺離島、さらに宮古、人重山では今でも正月十六日の墓参りが行われている。粟国島では、正月十六日の他にも清明に墓参を行っている。正月十六日には、島の旧家は午前中に島の古い墓と言われているウヘージをお参りする。お昼から午後にかけて各家ごとに島の西にある墓地に供物をもって墓参りに出かける。この1年以内に葬儀があった家は、新十六日といってとくに丁寧に墓参りを行う。また、粟国島では、まだ火葬場がなく、現在も洗骨習俗が残っている。福建における洗骨習俗の比較のために、粟国島の洗骨習俗調査を行った。さらに、粟国島では、祖先が首里士族であるという門中が数多く存在し、祖先祭祀における首里士族系門中との関連と9月15日のグージーといわれる首里への遙拝儀礼は特徴的で、今後継続して調査を行う予定である。本研究の2年目の実績を報告する。本年度の中国調査は、個人の研究計画に基づいて個別に行われた。何彬は、旧暦七月十五日の中元節の調査を泉州周辺で行った。潘宏立は、8月23日から9月6日に厦門市、石獅市、福州市で宗親会の調査を行った。蔡文高は、9月2日から11日福建西部の長汀で葬式儀礼及び女性信仰について調査した。周星は、8月31日から9月10日に泉州周辺で、建築儀礼と風水について調査した。沖縄側は、田名、萩原と小熊が、2月24日から1週間、蔡文高とともに福建西部の長汀で、客家の土楼や囲龍屋などの民間建築、宗族の祠堂群、養豚、風水などのテーマで調査した。沖縄での調査は、何彬が石垣島における正月十六日祭の墓参り調査を行った。また、周星も、3月7日から11日に、石垣市において建築儀礼と風水に関する調査を行った。本研究の目的は、沖縄と福建の民俗比較である。研究分担者が、それぞれのテーマで研究を進めつつあるが、お互いの研究成果について情報交換することが重要で、各自の調査概要を小熊が集約して、それを全員に送付することにしている。次年度は、研究のまとめに入るわけで、本土中国人研究者の沖縄調査に関しては沖縄側からコメントを出し、逆に沖縄側研究者の中国福建調査に関しては本土中国人研究者からコメントを出すという研究協力関係を構築して、お互いの比較研究の深化に努めている。本研究の3年目の実績を報告する。本年度の中国調査は、福建省長汀県を中心に行った。平成21年9月、小熊と上原に加えて研究協力員の蔡文高が長汀県において、風水、家譜、葬送儀礼などの調査を行った。長汀県は、内陸の省鏡に位置し、福建沿海部に比べて経済発展とそれに伴う民俗の変貌が遅れており、ちょうど変化が始まる時期で、伝統的な民俗とその変化の両方を調査することが可能である。薬は、3月にも当地で補足調査を行った。沖縄での調査は、石垣島を中心に行った。調査協力者の何彬は、石垣の旧盆儀礼の調査を行った。

2月10日から13日まで、小熊と研究協力者の周星、潘宏立、蔡文高は、石垣島で正月六日蔡の墓参り、風水、士族家譜などを査した。3年間の最終年度において、研究分担者と研究協力者は、それぞれのテーマの最終的な調査を行い、まとめにはいる。その成果の一端を還元するため、平成21年2月9日には、沖縄国際大学南島文化研究所にて公開の研究報告会を行った。
二次元ポリマーの固液界面合成

本課題では、固液界面での自己集合と化学反応性が設計された有機分子を用いて、(1)異分子間のイミン形成反応を利用した二次元ポリマーの合成と、(2)ジアセチレン間の橋掛反応による共有結合形成の二つのテーマに取り組んだ。課題(1)では、固液界面で形成される多孔性二次元分子ネットワークにアミノ基を、空孔に吸着される分子にホルミル基を導入し、酸触媒の添加によりそれらが連結さたことを示唆する結果を得た。課題(2)では、ジアセチレンを含む分子新たに合成し、その多孔性ネットワークにおける共有結合形成を試みたが反応の進行は見られなかった。この知見に基づき、目的達成のための新たな分子を設計指針が確立された。本課題では、固液界面での自己集合と化学反応性がプログラムされた有機分子を用いて、二次元ポリマーを合成することを目的としている。具体的には、(1)「イミン形成反応を利用した二次元ポリマー合成」と、(2)「ジアセチレン間の橋掛け反応による共有結合形成」の二つの課題に取り組んでいる。計画に従い、課題(1)ではイミン形成反応の実施のため、デヒドロベンゾ[12]アヌレン(DBA)の長鎖アルキル鎖の先端に、反応点となるアミノ基を備えたを合成し、その固液界面における自己集合をSTMにより調査した。その結果、ハニカム構造を形成することが分かった。また、前年度に合成した六つのホルミル基を有するハブ型架橋分子をゲストとして用いて上述のDBAが形成した配列に対して加えた。イミン形成反応をトリフルオロ酢酸の存在化で実施したところ、一部のゲスト分子が固定されることが分かった。また、空孔サイズの分析により、イミン結合が一部で形成されていることが示唆された。課題(2)では新たに合成したジアセチレン部位を含むアルキル鎖により置換されたDBAが固液界面においてハニカム型の構造を形成することを確認した。この自己集合膜に対して、光照射を行ったが、反応は生起しなかった。溶媒が光を吸収したため、反応が進行しなかったと考え、溶媒を除去しドライフィルムの作成を行った。ドライフィルムのAFM観察により、溶媒を除去した後も、DBAのハニカム構造が形成されることが分かった。具体的には、(1)「イミン形成反応を利用した二次元ポリマーの合成」と、(2)「ジアセチレン間の橋掛反応による共有結合形成」の二つの課題に取り組んだ。課題(1)については、固液界面におけるホストネットワークとゲスト分子のイミン形成反応を利用して、部分的に連結された分子ネットワークの形成がSTM観察により示唆される結果が得られた。この際、酸触媒の添加が必須であった。続いて、固液界面で作成したフィルムを、溶媒で洗浄し乾燥してドライフィルムを作成し、その構造をSTMとAFMによって明らかにした。ドライフィルムについてはXPS測定を行い、窒素の1s電子の結合エネルギーから、イミン形成の有無の確認を試みたが、ピーク強度が弱く明確な結果は得られなかった。課題(2)については、設計したジアセチレン部位が含まれるアルキル基を持つ分子が大気下安定な多孔性ネットワークを形成することを明らかにした。予想外の成果として、この分子がグラフェン上でも多孔性ネットワークを安定に形成することを見出した。一方、光照射や熱による共有結合形成を試みたが、反応の進行は見られなかった。そこで、ドライフィルムを超高真空条件に導入し、電子線照射で重合反応を試みたが、こちらも反応の進行は見られなかった。そこで、ジアセチレン部位の反応性を向上させることを目的として、片方のジアセチレン部位のアルキル基を水素原子で置換した分子の合成を開始した。上記の結果は固液界面における二次元ポリマーの合成という挑戦的な課題について、有機合成化学の知見をもとに取り組んだものであり、これらは最終目的達成に必要不可欠な知見であり重要な成果である。本課題では、固液界面での自己集合と化学反応性がプログラムされた有機分子を用いて、明確な二次元ポリマーを合成することを目的としている。申請書に記載された計画に従い、課題(1)ではイミン形成反応の実施のため、デヒドロベンゾ[12]アヌレン(DBA)の長鎖アルキル鎖の先端に、反応点となるアミノ基を備えたを合成した。この分子の合成には、交互に異なるアルキル鎖を導入する必要がある。

そのため、ベンゼン環上の二つの水酸基が異なる保護基(R1 = methoxymethyl, R2 = tert-butyldimethylsilyl)によって保護されたDBAを用いた。なお、アルキル基の導入は、直鎖のアルキルハライドと別途合成したアミノ基を有する側鎖ユットとの段階的なアルキル化反応により行った。同時に、ゲストとして用いる六つのホルミル基を有するハブ型架橋分子も合成した。H19-21年採択の若手研究(B)において、側鎖にジアセチレン部位を含むDBAの合成を行った。この分子は固液界面においてハニカム型に配列した。しかし、この構造に対して紫外光を照射すると、重合反応そのものは進行しているが形成されるオリゴアセチレン部位の歪みから、生成した分子が表面から脱着していることがこれまでに分かっていた。そこで課題(2)では、光照射後の生成物の脱着の防止を目的に、ブタジイン部位を含むより長いアルキル側鎖を持った新たなDBAを合成した。課題(1)および(2)で合成した化合物が有機溶媒と固体表面の界面で形成する二次元分子配列について調査した。次年度でも大きな問題もなく、順調に研究が進展している。具体的には、課題(1)では、ホスト化合物の固液界面における自己集合を調査した。また、ゲストを添加すると、それが空孔に共吸着されることも明らかにした。さらに、系中に触媒として酸を加えると、固液界面でイミン結合が形成されたことを示唆する結果を得られた。課題(2)についても、より長いアルキル基を有するDBAが想定どおりにハニカム型の配列を形成することを見出した。固液界面での光照射では反応の生起が見られなかったが、溶媒を除きドライフィルムを作成することが出来たので、次年度に超高真空下での光照射による二次元ポリマーの合成に関する足掛かりが得られた。このような進捗状況から、おおむね順調に進展していると判断した。初年度では大きな問題もなく、順調に研究が進展している。具体的には、課題(1)においては、アミノ基をアルキル側鎖の末端に導入したデヒドロベンゾ[12]アヌレンの合成に成功するとともに、ハブ型のゲスト分子についても合成することができた。また、課題(2)についても、より長いアルキル側鎖を有する分子を合成した。新たに合成した分子について、有機溶媒とグラファイトの界面でその配列について検討したところ、課題(1)で合成した分子がハニカム型に配列しないことが分かった。これについては、分子設計を変更して現在検討をおこなっている。課題(2)で合成した分子については望み通りにハニカム型の配列を形成することを見出した。課題(1)では、STMによる反応生成物の更なる同定を行う。また、溶媒を除いたドライフィルムを作成し、ポリマーの表面ラマン分光法やX線光電子分光法により、反応の進行について確証をえることを目的とする。最後に、合成した二次元ポリマーの転写と溶媒を用いた洗い流しによる表面からの剥離も試みる。種々の溶媒を用いて検討する。剥離が起こらない場合には、表面の電位の制御により脱着を促進させる。脱着させたポリマーは各種分析法によりその基礎物性を調べる。課題
萌芽期における日本の国際私法ー穂積文書の検討を中心として

本研究は,現代の日本の国際私法の基礎が形成された萌芽期(江戸時代末期の日本の開国以降,法例(明治31年法律第10号)の立法がされた前後の時期)の日本の国際私法の全容を解明することを目的とする。中心的には,法例の起草者の一人であった穂積陳重所蔵の文書(以下「穂積文書」という。)の法例関係部分を解読し,従来不分明であった明治31年法例の各条文の成立の経緯・基礎となった議論を解明する。また,開国以降の日本の国際私法に関する議論・明治31年法例立法後のハーグ国際私法会議への日本の加盟に関する議論についても,外交史料等の分析に基づき,明治31年法例立法との関連性を含め,検討する。
各種ストレス反応に及ぼすβ遮断薬およびCa拮抗薬の影響について

各種ストレス反応に及ぼすβ遮断薬およびCa拮抗薬の影響について、ハロタン麻酔(1%)およびフェンタニル麻酔(初回25μg/kg、以後12.5μg/kg/時を持続投与)の下で、イヌを用いて研究した。対照群とβ遮断群(血漿プロプラノロール濃度50100ng/ml)、Ca拮抗薬群(血漿ベラパミル濃度50100ng/ml)を作成し、高炭酸ガス(PaO_2=75,100mmHg)、低酸素(PaCO_2=60,40mmHg)および出血(平均動脈圧=60、40mmHg)のストレスを負荷し、循環系ならびに代謝系の変化を経時的に測定した。1.高炭酸ガスによって、循環系では心拍数と心拍出量が著増した。これはストレスホルモンであるカテコラミンの分泌増加によるもので、変化の程度はフェンタニル麻酔の方が大であった。代謝系ではとくに、呼吸性アシドースに伴う血漿Kの上昇が著明でハロセン麻酔で著しかった。β遮断薬とCa拮抗薬は循環系の変化を抑制するが、フェンタニル麻酔での抑制は軽度である。血漿K上昇はβ遮断薬・Ca拮抗薬両者で増強するが、ハロタン麻酔下のβ遮断時に最も著しかった。2.低酸素によっても、軽度ではあるが同様の変化が認められた。β遮断薬・Ca拮抗薬ともにこれらの変化を抑制した。しかし、乳酸はわずかしか上昇しなかったので、十分な負荷となっていなかった可能性が高い。3.出血負荷では、著しい心拍出量の減少とカテコラミン・心拍数の増加、乳酸・血漿Kの上昇を認めた。β遮断薬・Ca拮抗薬、対照時の1/3程度の出血で同様な状態をもたらした。β遮断薬・Ca拮抗薬は高炭酸ガス・低酸素・出血などのストレス負荷に対する反応を抑制する。抑制の程度はハロタン麻酔の方が強い。しかし同時に、高K血症の増強や出血に対する予備力の低下をもたらすので、慎重な対応が必要である。平成4年度においては、各種ストレス反応に及ぼすβ遮断薬の影響について研究した。イヌを対象に、ハロタン麻酔(1%)およびフェンタニル麻酔(初回25μg/Kg、以後12.5μg/Kg/時を持続投与)の下に、対照群とβ遮断群(血漿プロプラノロール濃度50100ng/ml)を作成し、炭酸ガス蓄積(PaC0_2=75mmHg、100mmHg)、低酸素(PaO_2=60mmHg、40mmHg)および出血(平均動脈圧=60mmHg、40mmHg)のストレスを負荷し、循環系ならびに代謝系の変化を経時的に測定した。1.炭酸ガス蓄積によって、循環系では心拍数増加、血圧上昇、心拍出量増加などの、代謝系では血糖上昇、血漿K上昇などの著しい変化がおこる。これはストレスホルモンであるカテコラミンの分泌増加によるが、フェンタニル麻酔の方がハロタン麻酔よりも変化が大である。β遮断はこの変化を抑制するが、フェンタニル麻酔下での抑制の方が軽度である。しかし、血漿K上昇に関してはβ遮断の方が著しく、その程度はハロタン麻酔でより著明である。2.低酸素負荷によっても、上記と同様な変化がみられ、やはりフェンタニル麻酔の方がハロタン麻酔よりも大きな変化を認める。

β遮断による抑制も炭酸ガス蓄積の場合と同様にハロタン麻酔でより強く認められる。3.出血負荷に関してもほぼ同様な変化を認める。しかし、ハロタン麻酔とフェンタニル麻酔との間、および対照群とβ遮断群の間には脱血量に差があり、これが結果に大きな影響を与えていると考えられるため、なお検討が必要である。平成5年度においては、各種ストレス反応に及ぼすCa拮抗薬の影響について研究した。イヌを対象に、ハロタン麻酔(1%)およびフェンタニル麻酔(初回25μg/kg)、以後12.5μg/kg/時を持続投与)の下に、対照群とCa拮抗薬群(血漿ベラパミル濃度50ng/ml前後)を作成し、炭酸ガス蓄積(Pco_2=75mmHg,100mmHg)、低酸素(PaO_2=60mmHg,40mmHg)および出血(平均動脈圧=60mmHg,40mmHg)のストレスを負荷し、循環系ならびに代謝系の変化を経時的に測定した。測定結果を前年度に行ったβ遮断時と比較した。1.炭酸ガス蓄積によって、ストレスホルモンであるカテコラミンの分泌増加がおこり、循環系では心拍数増加、血圧上昇、心拍出量増加などの、代謝系では血糖上昇、血漿K上昇などの著しい変化がおこる。この変化はフェンタニル麻酔の方がハロタン麻酔よりも大である。Ca拮抗薬はこの変化を抑制するが、フェンタニル麻酔下での抑制の方が軽く、しかもβ遮断時よりも軽度である。血漿K上昇は、ハロタン麻酔下のβ遮断時に最も著しくCa拮抗薬の影響は比較的軽度である。2.低酸素負荷によっても、上記と同様な変化が、フェンタニル麻酔下の方でより強く認められる。Ca拮抗薬の影響はハロタン麻酔でより強く認められたが、β遮断薬よりは軽度である。3.出血負荷に関してもほぼ同様な傾向を認めた。しかし、麻酔方法や薬剤投与により脱血量の差が著しく、とくにβ遮断薬・Ca拮抗薬投与群では少量の脱血によって容易に低血圧に陥った。結論として、β遮断薬・Ca拮抗薬は炭酸ガス蓄積・低酸素・出血などのストレス負荷に対する反応を抑制する。抑制の程度はβ遮断薬がCa拮抗薬よりも強く、ハロタン麻酔の方がフェンタニル麻酔よりも著しい。またβ遮断薬・Ca拮抗薬投与下での出血負荷は早期に危険なレベルに達することが判明した。
アダプター分子STAP-2によるT細胞活性制御機構の解明

これまでに、アダプター分子Signal-transducing adaptor protein-2(STAP-2)がさまざまな細胞内シグナル伝達経路において機能的に働き、サイトカイン刺激による免疫細胞応答を調節する重要な分子であることを申請者は多数報告している。特にT細胞においてSTAP-2が重要な働きをしていることを数多く示してきた。本申請研究において、STAP-2によるT細胞の活性制御機構の更なる解明と、アポトーシスシグナル経路におけるSTAP-2の機能解析を行った。1.STAP-2によるアポトーシス促進メカニズムの解明これまでの研究では、Fas刺激時のCaspase活性がSTAP-2により亢進することを明らかにしており、本年度の研究によりアポトーシス促進メカニズムの解明を行った。STAP-2自身は酵素活性を持たないことから、Caspaseを活性化する分子とSTAP-2との複合体形成が一つのメカニズムとして考えられた。アポトーシスのイニシエーターであるCaspase-8は、刺激によるFasの活性化によりFADDというアダプター分子を介してレセプターへリクルートされ、DISCと呼ばれる複合体の中で活性化する。そこでSTAP-2がCaspaseの活性化を促進するメカニズムを解明するため、ヒト白血病T細胞株Jurkat細胞、STAP-2 KO T細胞、ヒト胎生腎癌細胞株293T細胞を用いて、免疫沈降実験などによりDISC形成分子とSTAP-2の相互作用解析等を行った。その結果、STAP-2はFasやCaspase-8と会合し、DISC形成を促進することを明らかにした。これよりSTAP-2によるアポトーシス促進は、DISC形成亢進によることが明らかになった。2.STAP-2限定分解酵素の同定これまでに申請者は、Jurkat細胞においてFas誘導性アポトーシス時に切断されたSTAP-2産物の分子量から、切断部位を推測しアミノ酸に変異を導入することで限定分解されないSTAP-2点変異体の作製に成功していた。この切断配列は、アポトーシス時に活性化するシステインプロテアーゼ、Caspaseファミリーによって認識される配列と相同性が高く、また、広範なCaspaseインヒビターとして知られるzVAD処理により、STAP-2の限定分解が抑制されることも予備実験により明らかにしていた。これら知見からCaspaseファミリー分子がSTAP-2の限定分解酵素であると考えられた。本年度の研究ではCaspaseファミリー特異的インヒビターを用いた解析、siRNAによるノックダウン実験によって、Caspase-8がSTAP-2切断酵素であることを同定した。今後は、STAP-2が切断されることとアポトーシス促進の関連性、及びSTAP-2切断阻害剤の作製によりアポトーシスへの影響を解析していく予定である。アポトーシス時におけるSTAP-2限定分解の詳細な解析が、STAP-2限定分解の調節による自己免疫疾患の治療薬開発の手がかりになることを期待する。今後は、STAP-2が切断されることとアポトーシス促進の関連性、及びSTAP-

2切断阻害剤の作製によりアポトーシスへの影響を解析していく予定である。アポトーシス時におけるSTAP-2限定分解の詳細な解析が、STAP-2限定分解の調節による自己免疫疾患の治療薬開発の手がかりになることを期待する。
麻酔薬の血管内皮細胞表面トロンボモジュリンへの影響に関する研究

炎症性サイトカイン(TNF-α)により血管内皮細胞表面のトロンボモジュリンはダウンレギュレートされる。本研究ではリドカインが上記ダウンレギュレーションにどのような影響を及ぼすか検討した。内皮細胞表面のトロンボモジュリン抗原量をEnzyme Immuno Assayにて測定した(吸光度測定:492mm)。内皮細胞表面のトロンボモジュリン抗原量は、薬物未処理の値を100%としたときの相対的割合で示した。結果は以下の3点である。(1)TNF-α(100ng/ml)の刺激で内皮細胞表面のトロンボモジュリン抗原量は経時的に減少した。8,16,24時間のTNF-α(100ng/ml)の刺激でトロンボモジュリン抗原量はそれぞれ50,35,20%に減少した。(2)リドカイン(0.01-3.0mM)単独では内皮細胞表面のトロンボモジュリン抗原量は変化しなかった。(3)TNF-α(100ng/ml)によるトロンボモジュリンの減少をリドカイン(>0.3mM)は抑制した。考察として、リドカインはトロンボモジュリンの炎症性サイトカインによるダウンレギュレーションを抑制することによって、敗血症やDIC時の血栓準備状態の治療薬となりうる可能性があり、結論としてリドカインはTNF-αによるトロンボモジュリンのダウンレギュレーションを抑制することを本実験ではじめて証明した。