hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
内耳障害におけるグルタメート-Ca-一酸化窒素(NO)仮説の解明

グルタメート暴露による細胞死は一様でないと考えるが、シスチンの存在下で、細胞死が抑制されたことは、細胞死にフリーラジカルの関与があることが〓〓〓〓〓示唆された。今回の検討で、NOが蝸牛毒性を有し、感覚細胞にネクローシス、およびアポトーシスの両変化を与えることが判明した。グルタメートにも蝸牛外有毛細胞にネクローシスを与えることが判明したが、これらの因子と細胞死が臨床上、どのように結びつくかが次年度の検討課題である。内耳に対するN0毒性の関与をみるために、モルモット内耳正円窓に100mMのグルタメートを留置し、6、24、72時間後に内耳での一酸化窒素合成酵素(NOS)の誘導をNADPHダイホラーゼを用いて検討した。その結果、NOSは蝸牛外有毛細胞下部の神経接合部に時間経過と共に強く誘導されるが72時間後にはほとんど認められなかった。一方、外有毛細胞は時間経過と共に細胞死が誘導され、グルタメート投与72時間後には100%の細胞死が確認された、内有毛細胞には細胞下部のシナプスの膨化が認められたが、内有毛細胞自身には変化は認められなかった。尚、この外有毛細胞の細胞死はネクローシスの様相を呈した。モルモットにストレプトマイシンを投与したところ、前庭感覚上皮にNOSの誘導が確認された。このNOSの誘導は時間、および濃度依存性に増えており、それとともに感覚細胞死が確認された。この細胞死はネクローシスではなく、アポトーシスの様相であった。NOS合成酵素の抑制剤を投与したところ、これら感覚細胞のアポトーシスは抑制された。これらの事実はNOは、条件の違いにより同じ感覚細胞に対し、ネクローシスあるいはアポトーシスの両細胞死を誘導しうることが判明した。NOによる内耳感覚細胞の細胞死を考えるとき、これらの事実を考慮に入れることが必要である.どのような機転でアポトーシスおよびネクローシスが制御されているかを知ることが今後の検討課題である。グルタメートレセプターによる神経細胞毒性以外に、グルタメート/シスチン交換輸送系におけるグルタメート神経細胞毒性が報告されている。細胞外の多量のグルタメートによりシスチンの細胞内輸送が障害され、結果として細胞内のグルタチオン枯渇が生じ、レドックス刺激に対しての対応ができず、細胞死が生じるというものである。モルモット蝸牛をシスチンの濃度を変えて培養してみたところ、シスチンの濃度依存性に蝸牛有毛細胞死の回避を認めた。これは、上記、細胞外大量のグルタメートによる蝸牛感覚細胞死はグルタメート/シスチン交換輸送系を介した細胞死と推察された。モルモット内耳正円窓にグルタメートを留置すると、感覚細胞に一過性の一酸化窒素(NO)の上昇をみた。また、内有毛細胞下部のシナプスに変性を認めた、これは、グルタメートによる内耳感覚細胞障害がNOによる可能性を示唆している。モルモットにアミノ配糖体薬物を負荷すると、前庭感覚細胞にNO合成酵素の誘導がこり、前庭感覚細胞がアポトーシスにおちいる。NO合成酵素阻害剤や、サイクロヘキサミドがNO合成酵素阻害を惹起させ、また、前庭感覚細胞死も著明に抑制された。このことは、アミ御配糖体による前庭感覚細胞死にNOが関与していることを示すものである。
拡張現実と機械学習を用いた演奏時サイレントコミュニケーション訓練システムの開発

本研究では、機械学習やAR技術を応用し、居ながらにして音楽演奏における合奏技術向上を図れる、インテリジェントなサイレント・コミュニケーションの訓練支援システムの開発を目的としている。本システムは、指揮者や器楽演奏者から取得した映像から、機械学習により、特徴となる動作や表情を抽出し、データベースや判別器を構成する部分、取得した演奏の多視点映像を基に、演奏者に装着したMR/VRゴーグル上に、実際の演奏者配置に近いAR映像を生成する部分、トレーニング中の演奏者の演奏音や動作を取得し、構成したデータベースおよび判別器を基に、演奏音や動作が適切であったかどうかの評価を行う部分から構成されている。
水溶液中で機能する水素結合性超分子の評価と制御

(1)水素結合配置設計の可能性の提示:多くの超分子系の成功が報告されているがその多くは水溶液系ではなく、有機溶媒系である。それは、水溶液中では溶媒水の水素結合が存在するために設計通りに作用させることが難しく評価がままならないからである。申請者は「水」と「運動性=柔軟性」をkeywordsと確信し研究を進めてきた。申請者がこれまでの研究で基盤分子として用いてきたCDは疎水性相互作用のみ注目されてきたが、申請者は規則正しく並んだ多数の水酸基を水素結合テンプレートとして着目した。「動きのある修飾CD」を合成し、1)誘導適合類似挙動を伴う不斉分子認識(K.Takahashi,Chem.Lett(1990))、2)修飾基による誘導適合挙動の依存性と定量評価、3)包接疑似重合体形成(第9回CD国際シンポジウム・スペイン)、4)水分子クラスターの近接制御による酸-塩基平衡の移動、5)CDと単糖との不斉選択的集合体形成(Supramolecul.Chem.投稿中)を実現し、ミクロ疎水場であるCD空洞の近辺で水素結合の配置設計が可能である実例を示した。(2)異種・同種の複数のCDの自己組織化の制御:研究成果(1)-2)の研究の進展に伴い、疎水性基として脂肪族化合物を修飾した.6-mono-N-tert-butoxycarbonylglycylamino-β-CDの修飾基が自らのCD空洞に包接されず、他のCD空洞に包接されることを発見した。類縁体をいくつか合成して構造解析を行った結果、Boc基が他のCD空洞に包接され線状分子集合体を形成することが判明した。また、未修飾CDを組み合わせてCD2量体、3量体を形成できることが判明した。(第16回・17回シクロデキストリンシンポジウムにて発表、第15回機能性ホスト・ゲスト研究会、日本化学会第76春季年会で発表、Polymer Journal in press)。異種のCDの自己組織化としてまず空洞の小さいCDと大きいCDにそれぞれ異なる修飾基を導入し、NMR分光法により常に大小2CDが集合し、通常のCD疎水性空間より強い疎水性を示すことや、溶媒添加により集合体が解離の傾向を示す結果も得た(1)水素結合配置設計の可能性の提示:多くの超分子系の成功が報告されているがその多くは水溶液系ではなく、有機溶媒系である。異種のCDの自己組織化としてまず空洞の小さいCDと大きいCDにそれぞれ異なる修飾基を導入し、NMR分光法により常に大小2CDが集合し、通常のCD疎水性空間より強い疎水性を示すことや、溶媒添加により集合体が解離の傾向を示す結果も得たシクロデキストリン(CD)を規則正しく並んだ多数の水酸基を水素結合テンプレートとして着目し、これまで集積しつつあるCDの合成手法とデータを基盤として、数個の水素結合をCDの立体構造に反映させた水溶液中での分子認識系を創製する。さらにNMRあるいは分光光度計で水素結合を定量的に評価することを目的として研究を遂行した。研究成果次の2点である。(1)修飾基の選択による線上分子集合体形成の発見:疎水性基として脂肪族化合物を新たに修飾したCDをいくつか合成した。溶液状態でのホスト分子のCD空洞と修飾基との相対的位置関係、および自由度について、高分解能NMR(1D、2D)、円偏光二色性スペクトル等で検討した結果、6-mono-N-tert-butoxycarbonylglycylamino-β-CDの修飾基は自らのCD空洞に包接されず、他のCD空洞に包接されることを発見した。未修飾β-

CDとは840M^<-1>なる会合定数で2分子のCDからなる錯体を形成している。複数のCD分子で形成された環境を機能に結びつけるべくさらに光吸収基を導入したCDを合成し、もっかその構造と光増幅機能について検討中である(98/6 9th CD Symposiumin Spainで発表予定)。(2)単糖-CD集合体の解析:フコースがr-CDと組成比8:1程度で集合体を形成し、沈殿する事がわかった。この現象はCD空洞に他のゲスト分子が存在していても同様に起こり、CD空洞の水酸基との相互作用が働いていることが推測されている。(98/6 9th CD Symposiumin Spainで発表予定)。現段階では雑誌論文での発表はないが、現在上記2点に関してそれぞれ投稿準備中である。シクロデキストリン(CD)を規則正しく並んだ多数の水酸基を水素結合テンプレートとして着目し、これまで集積しつつあるCDの合成手法とデータを基盤として、数個の水素結合をCDの立体構造に反映させた水溶液中での分子認識系を創製する。さらにNMRあるいは分光光度計で水素結合を定量的に評価することを目的として研究を遂行した。研究成果は次の2点である。(1)線状分子集合体の一般化と構造解析:昨年度、疎水性基として脂肪族化合物を修飾した6-mono-N-tert-butoxycarbonylglycylamino-β-CDの修飾基が自らのCD空洞に包接されず、他のCD空洞に包接されることを発見した。類縁体をいくつか合成して構造解析を行った結果、Bocアミノ酸であれば、芳香族アミノ酸(Tyr,Phe)でもBoc基が他のCD空洞に包接され線状分子集合体を形成することが判明した。これらの光吸収基は分子集合体の外部に位置しており、目下、その光増幅機能について検討中である。(第16回シクロデキストリンシンポジウム(秋田)にて発表、第15回機能性ホスト・ゲスト研究会、日本化学会第76春季年会で発表予定)。(2)集合体形成による不斉認識:フコースがγ-CDと組成比8:1程度で集合体を形成し、沈殿する事を昨年発見したが、さらにL-フコースのみを選択的に沈殿させることが判明した。CD空洞の水酸基との相互作用が働いていることが推測されている。これに関連して現在特許申請中である。(1)水素結合配置設計の可能性の提示:多くの超分子系の成功が報告されているがその多くは水溶液系ではなく、有機溶媒系である。それは、水溶液中では溶媒水の水素結合が存在するために設計通りに作用させることが難しく評価がままならないからである。申請者は「水」と「運動性=柔軟性」をkeywordsと確信し研究を進めてきた。申請者がこれまでの研究で基盤分子として用いてきたCDは疎水性相互作用のみ注目されてきたが、申請者は規則正しく並んだ多数の水酸基を水素結合テンプレートとして着目した。「動きのある修飾CD」を合成し、1)誘導適合類似挙動を伴う不斉分子認識(K.Takahashi,Chem.Lett(1990))、2)修飾基による誘導適合挙動の依存性と定量評価、3)包接疑似重合体形成(第9回CD国際シンポジウム・スペイン)、4)水分子クラスターの近接制御による酸-塩基平衡の移動、5)CDと単糖との不斉選択的集合体形成(Supramolecul.Chem.投稿中)を実現し、ミクロ疎水場であるCD空洞の近辺で水素結合の配置設計が可能である実例を示した。
フォンテーヌブロ-派研究

王と市民、そして王と市の聖職者の間で交わされる相互契約としての性格の成立が確認されるのは、14世紀中葉になってからのことである。市門を通過した入市式の行列は市の主要な聖堂に向かい、入市式は、教会の権利の擁護を宣誓した王が〈テ・デウム〉の儀式に参列し、神への賛歌に重ねて王権の神性が謳われる中で幕を閉じたのであったが、この定式は、16世紀の〈異教的な〉宮廷祭礼においても基本的には変化することなく継承されたのであった。〈聖史劇〉は、1380年のその誕生と同時に祭礼にも登場し、王と王国に擬えることのできるテーマが上演されていた。しかし祭礼は、領域国家を目指していた体制が中央集権体制をも目指すに及んで、王国の重要な政治的契機となり、聖史劇も次第に華麗な政治的寓意劇へと転身していった。イタリア戦役以来、祭礼にも新たな異教的主題が登場し、フランソワ1世の到来とともに、祭礼の空間は〈古代風の〉建築的舞台装置に覆われるようになるが、入市式は依然として、伝統的な行程を辿り、聖堂における〈テ・デウム〉によって完結し、さらには中世以来の病を癒す王の奇蹟の力を開示する儀式さえ行われていたのであった。人市式における王と王権称揚のための舞台が、フォンテーヌブロ-派の芸術にも深く浸透していたことは、王の神格化で終わる「フランソワ1世のギャラリー」のプログラムや、凱旋門形式で建立されているルイ12世、フランソワ1世、アンリ2世の墓廟に顕著に反映されている。宗教戦争の時代の宮廷祭礼を司ったのは、カトリーヌ・ド・メディシスであったが、アントワーヌ・カロンの「アウグストゥス帝とティブルのシビュラ」(v.1580)は、王国の聖なる系譜とともに、王によって実現されるはずの、戦争の脅威が消え去り統一された未来の王国が予表され、ヴァロワ朝末期の祭礼においてなお政治的聖史劇が上演されていたことを証言している。すでに報告した通り、本年度は、16世紀フランスのフォンテーヌブロー派の活動は、当時の、すなわちヴァロワ朝末期の宮延祭礼への彼らの関与の詳細や動機を全体史的な視野から考察することによってより明確に把握し得る、という観点に立って研究を進めることにした。アントワーヌ・カロンは、第1次フォンテーヌブロー派(1530-1571)と第2次フォンテーヌブロー派(1589-1619)とを隔てる宗教戦争による混乱の時期に、カトリーヌ・ド・メディシスに寵愛されて活躍した宮延画家である。カトリーヌの夫君アンリ2世、そして彼女の息子たちであるフランソワ2世、シャルル9世、アンリ3世というヴァロワ朝末期の国王たちに仕えたカロンの作品は、ほぼすべてが当時の宮延で挙行された祭礼の諸舞台を描いたものであった。本年度は、このカロン代表作であり、パリで挙行されたある祭礼の舞台を表した『アウグストゥス帝とティブルのシビュラ』(1580頃)についての論文を執筆したが、この作品には、カトリーヌとアンリ3世も登場しており、カトリーヌが推進する旧教派諸侯と改革派諸侯の政治的宥和政策と、それによってアンリ3世が実現するはずの,宗教戦争の脅威が消え去り、統一され、平和がもたらされた未来の王国の幻影を示されていると考えられるのである。

この論文では、初期キリスト教が古代世界を理解し、それを継承するための、もしくはそれと混淆するための理念であり方法論であったキリスト教的タイポロジー(予表論)が、宗教戦争の時代に再び、聖母とキリストに遡る王国の聖なる系譜のみならず、王権の望む王国の未来を予表する役割を担うもとのして、すなわち王権のイデオロギーを媒介するものとして機能しているという、本研究の大枠を提示したつもりである。来年度は、さらにマイクロフィッシュによる史料解読を進め、フォンテーヌブロー派と宮延祭礼についての論文を執筆の予定である。フォンテーヌブロー派の宮延画家たちの最も重要な任務のひとつは、宮延のイデオロギーを媒介する祭礼の舞台(ページェント)を企画・演出することであった。伝統的な宗教的主題に政治的意図を織り込んだ華麗な舞台において、王権への忠誠と信仰との混淆が目論まれ、ひとときの仮設舞台であった祭礼の舞台の影響は、これまでに指適されている以上に諸々の芸術分野に浸透していると考えられる。本研究は、画家、彫刻家、建築家、ユマニスト、詩人、音楽家、舞踏家たちが協力した祭礼に関する文献史料及び版画という視覚史料を渉猟し、ヴァロワ朝末期の社会と芸術活動について考察することを目的とした。研究方法は、第一次史料、即ちパリ国立図書館が所蔵するルイ12世からアンリ3世に至る祭礼関係の史料の解読を中心としたが、刊本とは言え、16世紀中葉までの活字は手稿とほぼ変わらぬものが多く、それ自体現在の活字に変換して出版する価値があるのではないかと思われた。多くは稀覯本もしくは現存する唯一の刊本であり、注文したものの中、何点かについては保存上の理由のためマイクロフィッシュ化が不可能であった。本年度は、前年度に発表された、カトリーヌ・ド・メディシスの宮延画家アントワーヌ・カロンの代表作であり、当時の祭礼で上演された聖史劇の舞台を描いた「アウグストゥス帝とティブルのシビュラ(1580頃)」(『名画への旅』講談社、1992)についての内容を取り入れながら、16世紀フランスの宮延祭礼を、その形態的起源と考えられる<王の入市式>にまで遡り、そこからアンリ3世の暗殺によるヴァロワ朝断絶に至る展開を、国家体制の変容と宗教戦の時代の政略との関連において概観する原稿を執筆した。この原稿は、宮延祭礼の文献史料の翻訳とともに、来年度の富山大学人文学部紀要に掲載される予定である。
高頻度取引による証券市場変革と資産運用へのインパクト

世界の証券市場は高速化の進展で劇的な変革期を迎えている。高頻度取引業者(HFT)の存在感の上昇は、市場の価格形成や流動性にとってよい影響があるのか、悪い影響なのか、多様な視点から分析した。本研究の結果を総合すれば、日本の株式市場においてもHFTの影響は、価格発見や流動性にプラスの効果を発揮している。取引所外取引の発展や東京・大阪両証券取引所の合併などで市場間競争が促進され始めた。金融危機時にどのマーケットでも経験する流動性の枯渇は、日本の株式市場も例外でなく、この緩和についてなにができるかの検討が必要である。また、証券市場多様化のひとつの方向として、クラウドファンディングについて分析した。昨年度は前年度に引き続き、主に、高頻度取引による影響に関する分析、金融危機や震災など危機における投資家行動と高速化の関係を検証を行った。また、昨年度から研究開始を予定していた私設市場の台頭によるインパクトの分析に関しては、私設市場の立ち上がりが想定よりもやや遅れている一方、クラウドファンディングという市場外による資金調達手段が発達してきたことにより、クラウドファンディングの可能性の分析を開始した。市場取引の高速化と参加者へのインパクトの分野では、12013年5月23-24日に発生した株価の乱高下と高速取引の関係を、市場流動性に及ぼした影響という視点から分析し、研究会で報告した。高速取引者が市場の乱高下に積極的に関与したという事実はなかったが、流動性供給から一時的に離脱した影響とみられる流動性悪化が観察された。これは、高頻度取引業者による流動性供給を維持するために、メイカーフィーのような制度を導入する必要性があるという根拠のひとつとなる。株価下落に驚いた投資家からの売り注文の受け皿が薄くなり、価格変動性を高める遠因になった。2取引の高速化の影響については、欧州国債の市場についての分析を行い、国債のインターディーラー市場と国債先物市場の価格形成の関係を分析した。どのような市場構造が金融危機の発生時に、市場機能の頑健さを維持できるか制度比較研究を行った。流動性供給義務を負わせることの効果を計測し、流動性を向上させる仕組みとしての特徴を明らかにした。3東京証券取引所と大阪証券取引所が株式市場を統合した効果を分析した。(1)市場取引の高速化と参加者へのインパクト、(2)証券取引所外での取引の拡大による市場分断の可能性、(3)証券会社機能の低下の影響、の3つテーマについて実証研究を進めた。(1)高頻度取引による証券取引の流動性へのインパクトについては、2010年から2012年前半までの期間に広げて影響を追跡し、高速化による流動性やボラティリティへの顕著な影響がないことを確認した。さらに、欧米における研究結果と比較し、日本における変化の特徴として流動性供給競争の激化を指摘した。(2)証券取引所外での取引の拡大による市場分断の可能性については、PTS市場のシェア拡大による取引所の流動性変化を分析した。日本のPTSのシェア拡大は呼値の違いがトリガーになっていること、取引所市場の流動性はデプスが厚くなるというプラス効果が観察されることを報告した。(3)日本市場における証券会社の機能低下の影響の分析として、インターネットを活用したクラウドファンディングの研究に着手した。本年3月にクラウドファンディングに関する公開セミナーを開き、アカデミック界、実務界の両方から関係者の意見を集約する機会を設けた。また、クラウドファンディングの事業者とも意見交換をしている。すでにいくつかの事業者からは彼らのデータを用いた実証分析を実施することに合意を得ている。今年度(2014年度:2014年4月1日2015年3月31日)における研究成果市場取引の高速化と流動性供給システムの関係について、1文献調査、2東京証券取引所データによる実証分析、3金融危機による欧州国債市場の流動性, 4市場外取引を証券市場改革の視点から検討した。1では、高頻度取引業者はなぜ「スピード」に投資するのか、これが市場全体の流動性に大きく貢献していることを欧米の研究からサーベイし、最近、導入された規制強化策が市場の流動性にマイナスの影響を与えているという実証研究を紹介した。2我が国株式市場における高速化の影響について、取引開始前の発注行動を詳細なデータで分析し、ミリ秒単位(1秒の1000分の1)でみた価格や注文の動きを通して高速化の実態を明らかにした。高速化の価格形成に与える影響はプラスとマイナスが混在するが、2010年の高速化以前に比べて、新規注文やキャンセルのタイミングが遅くなっているものの、これが価格形成をゆがめていることはないという結論をくだした。3欧州金融危機に直面したイタリア国債市場の流動性を分析し、マーケットメイク義務を負ったプライマリーディーラーのリスク回避行動が市場の流動性枯渇のトリガーとなっていることを明らかにした。

4では、証券市場改革の視点から市場外取引の可能性を検討するため、クラウドファンディングについての分析を行った。企業が実施するクラウドファンディングについては過渡期であるため、自治体が実施するクラウドファンディングであるふるさと納税について、自治体からデータを提供してもらい分析を行った。結果、株式市場と同様、クラウドファンディングの世界でもエクイティストーリーが重要であることが明らかとなった。証券市場改革においては、制度面の改革も重要だが、投資家へのストーリー訴求は引き続き重要である。金融昨年度までに実施しようとしていた研究内容に関しては、ほぼ順調に進んでおり、成果発表も順調である。日本株における証券会社の機能低下の影響の分析は今年度の研究発表の中で含めて行く予定である。24年度前半は証券市場の変貌に関する(1)(2)のテーマの研究を集中的に進め、研究成果の期間延長などを通して、結果の頑健性を確認した。後半は、各人が次のテーマへ向けての準備を進め、一部、研究活動に着手した。全体として順調に推移しており、公開セミナーや雑誌等への原稿執筆を行い、情報発信もさまざまな形態を使って行っている。これは次年度以降の研究を進めるうえで、事業者等からの協力を得るうえで支援材料になると考えているこれまでの研究内容の成果発表を主に行う。市場の高速化と流動性の問題については、流動性供給システムの変遷を整理し、株式市場に限定せず、国債市場の流動性供給システムとの比較なども検討する。政権交代、金融政策の大幅な変更を踏まえて、研究テーマに幅を持たせる。証券会社の機能低下につえては、クラウドファイナンスを使った資金調達に成功する案件、および、資金提供者のプロフィールに関して実証分析を行い、この新たに登場しつつある資金調達手段の有効性と発展性、そしてそれによる証券会社の機能低下に関して検討する。前年度のデータ購入を次年度にずらしたことによるもの。データ購入に充当予定第1年度の研究成果の発表と第2年度の研究推進のため、研究者との交流を拡大する。株式以外の市場を分析するためのデータ取得を進める。クラウドファイナンスの実証研究を行うためのデータ提供先と交渉し、具体的な研究プロジェクトを開始する。クラウドファンディングのいくつかの事業者からは彼らのデータを用いた実証分析を実施することに合意を得ている。
K+の電気化学ポテンシャル依存的チャネル開閉機構の研究

心臓ポンプ機能を担う心室筋の深い静止膜電位(約-90mV)を決めるのは強い内向き整流性カリウムチャネル(Kir2)である。Kir2チャネルは細胞内外のカリウムイオン(K+)濃度比で決まるK+の平衡電位(EK)付近で開口しており、脱分極によって閉じる性質を有する(強い内向き整流性)。EKに近い深い静止膜電位には、心筋組織を興奮が伝播する際に発生する電位依存性ナトリウム電流を増大させる働きがあり、興奮の伝播速度を速めて心筋組織全体の同期した収縮を可能にして、心臓内圧を効果的に上昇させる。さらに脱分極によるKir2チャネルの閉鎖は、心筋活動電位の長い持続時間をつくり、これは心臓の収縮と弛緩のリズムをつくるのに不可欠な要素である。この内向き整流性は電位依存性チャネルの様な膜電位センサー構造を介するのでは無く、不透過の細胞内陽イオン(ポリアミン)による電位依存性ブロックによって引き起こされるが、その電位依存性は細胞外K+濃度が変化するとEKと共に移動することが知られている。これは心筋の静止膜電位の制御のみならず、本チャネルが発現する多くの細胞組織において生理学的に重要な性質であるが、これまでの先行研究において細胞内K+濃度との関係は十分に解明されておらず、この現象の詳細なメカニズムは未だ不明である。今年度は、内向き整流性の無いKir2チャネルの実験から、先行研究において細胞内K+濃度を変化させても内向き整流性の電位依存性が変化しないとされてきたのは、K+を置換する陽イオンの効果がオーバーラップしているためであることが明らかとなった。細胞内ポリアミンによる膜電位依存性ブロックが真にK+の電気化学的ポテンシャル勾配に依存することが明確になり、同時に、細胞内のK+はポリアミンによるブロックと競合する作用もあることが分かった。強い内向き整流性K+チャネルの外向き電流抑制にみられる膜電位依存性が、細胞外K+濃度だけでなく、細胞内K+濃度を変化させた場合においても、K+の平衡電位と膜電位との差に依存することを明確に示せた。これまでの先行研究において、強い内向き整流性K+チャネルの外向き電流抑制の膜電位依存性が、細胞内K+濃度を変化させた場合には移動しないとされてきた理由も明らかにすることができた。平成30年度は最終年度であったが、事業期間を1年延長し、強い内向き整流性K+チャネルの膜電位依存性が細胞外K+濃度の変化によって移動するメカニズムについて、細胞内陽イオン種との詳細な関係について電気生理学的な実験を追加し、これまでの成果を論文として投稿する予定である。心筋静止膜電位を決定する代表的な強い内向き整流性カリウム(K+)チャネルであるKir2.1を哺乳動物培養細胞株に遺伝子導入によって発現させ、イオンサイドアウト・パッチクランプ法を用いた膜電位固定法によって巨視的チャネル電流を記録し、細胞内スペルミン(ポリアミン)によって引き起こされる開閉機構の膜電位依存性が細胞内K+濃度の変化によってどの様に変化するか検討を行った。細胞内K+濃度を生理的な濃度(150mM)よりも減少させると開閉機構の膜電位依存性は電流の逆転電位と共にシフトした。これまでの先行研究では強い内向き整流性K+チャネルの開閉機構の膜電位依存性は、細胞外K+濃度を変化させるとK+の平衡電位の変化分だけシフトするが、細胞内K+濃度を変化させた場合には変化しないとされてきたが、これまでと異なる結果が得られた理由について今後さらに詳細に検討を行う予定である。本研究の成果は虚血などによって細胞内K+濃度の変化が生じた際の心筋細胞の静止膜電位の挙動を理解する上で生理学的に重要な知見となるものと考えられる。本年度の研究計画において予定していたKir2.1チャネルの開閉機構の細胞内K+依存性について電気生理学的な実験を行い、明確な結果を得ることが出来た。心筋の静止膜電位を決定する内向き整流性カリウムイオン(K+)チャネルのK+透過性が、細胞外K+濃度の平方根に比例して増大する現象のメカニズムが明らかになった。すなわち、これは細胞外ナトリウムイオン(Na+)が内向き整流性K+チャネルを細胞膜外側から比較的浅い位置でブロックし、このブロックは細胞外K+と競合するために、細胞外K+の増加はブロックを抑制して電流が増加することで生じる。さらにこのNa+によるブロックは見かけ上単一チャネルコンダクタンスの変化となって現れることも明らかになった。上記の現象は心筋の静止電位や活動電位終盤の再分極を決定する生理的に重要な外向きK+電流が、細胞外K+濃度の増加によって増加し、細胞外K+濃度の減少によって減少するという一見不思議な現象を分かりやすく説明でき、これが細胞外K+自身の作用によらないことを示す。本研究成果は高カリウム血症によって心筋の再分極が急峻となり活動電位の持続時間が短縮(心電図T波の増高とQT時間の短縮)、低カリウム血症によってその逆の現象がみられる理由に関わる医学的に重要な知見である。内向き整流性K+チャネルの開口チャネルコンダクタンスの細胞外K+濃度依存性のメカニズムを明らかにする事が出来た。さらに、研究課題の主題である内向き整流性K+チャネルの開口率を決める細胞内ポリアミンによるブロックの膜電位依存性が細胞外K+濃度の変化によって見かけ上K+の平衡電位と共にシフトする現象についても、細胞内K+濃度との関係性について重要な結果を得ている。

心臓ポンプ機能を担う心室筋の深い静止膜電位(約-90mV)を決めるのは強い内向き整流性カリウムチャネル(Kir2)である。Kir2チャネルは細胞内外のカリウムイオン(K+)濃度比で決まるK+の平衡電位(EK)付近で開口しており、脱分極によって閉じる性質を有する(強い内向き整流性)。EKに近い深い静止膜電位には、心筋組織を興奮が伝播する際に発生する電位依存性ナトリウム電流を増大させる働きがあり、興奮の伝播速度を速めて心筋組織全体の同期した収縮を可能にして、心臓内圧を効果的に上昇させる。さらに脱分極によるKir2チャネルの閉鎖は、心筋活動電位の長い持続時間をつくり、これは心臓の収縮と弛緩のリズムをつくるのに不可欠な要素である。この内向き整流性は電位依存性チャネルの様な膜電位センサー構造を介するのでは無く、不透過の細胞内陽イオン(ポリアミン)による電位依存性ブロックによって引き起こされるが、その電位依存性は細胞外K+濃度が変化するとEKと共に移動することが知られている。これは心筋の静止膜電位の制御のみならず、本チャネルが発現する多くの細胞組織において生理学的に重要な性質であるが、これまでの先行研究において細胞内K+濃度との関係は十分に解明されておらず、この現象の詳細なメカニズムは未だ不明である。今年度は、内向き整流性の無いKir2チャネルの実験から、先行研究において細胞内K+濃度を変化させても内向き整流性の電位依存性が変化しないとされてきたのは、K+を置換する陽イオンの効果がオーバーラップしているためであることが明らかとなった。細胞内ポリアミンによる膜電位依存性ブロックが真にK+の電気化学的ポテンシャル勾配に依存することが明確になり、同時に、細胞内のK+はポリアミンによるブロックと競合する作用もあることが分かった。強い内向き整流性K+チャネルの外向き電流抑制にみられる膜電位依存性が、細胞外K+濃度だけでなく、細胞内K+濃度を変化させた場合においても、K+の平衡電位と膜電位との差に依存することを明確に示せた。これまでの先行研究において、強い内向き整流性K+チャネルの外向き電流抑制の膜電位依存性が、細胞内K+濃度を変化させた場合には移動しないとされてきた理由も明らかにすることができた。これまで強い内向き整流性K+チャネルの開閉機構の膜電位依存性は、細胞外K+濃度を変化させるとK+の平衡電位の変化分だけシフトするが、細胞内K+濃度を変化させた場合には変化しないと考えられてきたため、開閉機構は膜電位と細胞外K+濃度によって制御されるものと考えられてきた。本研究によって得られた結果は有機陽イオンであるポリアミンによって引き起こされるKir2.1の開閉機構がK+の電気化学ポテンシャルに依存する事を示唆しており、引き続きKir2.1とその変異体を用いた電気生理学的な実験を重ね、そのメカニズムの解明を目指す予定である。研究課題の主題である内向き整流性K+チャネルの開口率を決める細胞内ポリアミンによるブロックの膜電位依存性が細胞外K+濃度の変化によって見かけ上K+の平衡電位と共にシフトする現象に関してさらに電気生理学的な実験を積み重ね、チャネルを透過する細胞内外のK+がチャネルの開閉(ブロック)とどの様に関わっているのか、結論を得たいと考えている。
糖鎖・Toll様受容体アゴニスト固定化金ナノ粒子を用いたがんワクチンの開発

本研究は、Toll様受容体(TLR)アゴニストと糖鎖抗原を固定化した金ナノ粒子を用いたがんワクチンを開発することを目的としている。2年目は、合成低分子TLR7リガンドの1V209と免疫細胞に輸送するためのαマンノースを固定化した金ナノ粒子(1V209-αMan-GNP)の1)in vitroでの免疫増強活性(アジュバント活性)評価と2)細胞毒性評価及び3)in vivoでのアジュバント活性評価を行った。1V209-αMan-GNPのin vitroでのアジュバント活性をJ774A.1とマウス骨髄由来樹状細胞(BMDC)を用いて評価したところ、マンノース受容体を発現しないJ774A.1ではほとんどサイトカインが産生されず、マンノース受容体を多く発現するマウス骨髄由来樹状細胞(BMDC)では、1V209誘導体単体に比べ、高いサイトカイン産生能を示した。したがって、マンノース受容体が1V209-αMan-GNPの細胞内移行に重要な受容体の一つであることが示唆され、1V209誘導体のGNPへの固定化によりサイトカイン産生能が向上することを見出した。次いで、ヒト細胞でのアジュバント活性を、末梢血単核細胞を用いて評価したところ、1V209誘導体単体に比べて高いサイトカイン産生能を示したことから、ヒトにおいても有用であることが示唆された。また、いずれの細胞でも細胞毒性は認められなかった。モデル抗原にオボアルブミン(OVA)を用いて、in vivoでのアジュバント活性を評価したところ、IgG2c抗体の産生価が1V209単体に比べて10,000倍高い一方で、脾臓が全く腫れない等、炎症性が低かった。即ち、1V209-αMan-GNPはin vivoでも高いアジュバント活性を有しており、安全に利用できることが示された。2年目は、糖鎖・TLR7アゴニスト固定化金ナノ粒子のin vitroでの免疫増強活性(アジュバント活性)評価と金ナノ粒子上に固定化する糖鎖抗原・TLR7アゴニストの固定化量・比率の最適化について検討する予定であったが、初年度に計画が順調に進展し、前倒しで研究が実施できたため、最終年度に実施予定であった、in vivoでのアジュバント活性評価を前倒しで実施することができた。これらの成果で、特許の優先権主張出願を行い、第24回日本エンドトキシン・自然免疫研究会にて口頭発表を行うことで、成果を公表した。最終年度は、アジュバントとなる1V209とモデル糖鎖抗原となるシアリルTn抗原等の糖鎖抗原を固定化したGNPを調製し、in vivoでの糖鎖抗原に対する抗体産生能やワクチン活性の評価を計画している。本研究は、糖鎖抗原・Toll様受容体(TLR)アゴニストを固定化した金ナノ粒子を用いたがんワクチンを開発することを目的としている。初年度は、1)ジスルフィドリンカーを有するTLR7アゴニスト及び糖鎖の合成と金ナノ粒子への固定化方法の検討に引き続き、2)TLR7アゴニスト固定化金ナノ粒子のin vitroでの免疫増強活性を評価した。まず、免疫活性化剤となるTLR7アゴニストを金ナノ粒子表面に固定化するために、スペーサー化合物を介してジスルフィドリンカーを修飾した3種類のTLR7アゴニスト誘導体を合成した。合成したTLR7アゴニスト誘導体は、いずれも親水性が低いため、金ナノ粒子に固定化する際には、親水化剤が必要となる。そこで、親水化剤としての役割だけでなく、免疫誘導に重要な役割を果たす樹状細胞をターゲティング可能なマンノースを有する糖鎖を共固定化し、金ナノ粒子を親水化した。この際、TLR7アゴニスト誘導体と糖鎖の固定化密度が、金ナノ粒子の親水性と免疫活性化能に影響を与えることが考えられたため、これらの化合物の固定化密度の異なる複数の金ナノ粒子を合成した。TLR7アゴニスト誘導体と糖鎖の固定化は、MALDI-TOF MSにより確認した。金ナノ粒子の粒径は、透過型電子顕微鏡で測定し、平均710 nmであった。また、動的光散乱法により水中での粒径を測定したところ、透過型電子顕微鏡で測定した粒径と類似していたことから、水中で単分散していることが示唆された。金ナノ粒子の免疫増強活性をin vitroで評価したところ、TLR7アゴニスト誘導体の濃度依存的にサイトカインが産生され、TLR7アゴニスト誘導体単体に比べて免疫増強活性が向上していた。また、TLR7アゴニストの固定化密度やTLR7アゴニストを固定化するためのリンカー化合物の構造は、免疫増強活性に大きな影響を与えないことが示された。初年度は、ジスルフィドリンカーを有するTLR7アゴニスト及び糖鎖の合成と、金ナノ粒子への固定化方法について検討する予定であったが、計画が順調に進展したため、平成30年度の計画を前倒しして、TLR7アゴニスト固定化金ナノ粒子のin vitroでの免疫賦活化能の評価まで行うことができた。これらの成果で、特許を出願(発明の名称:免疫増強作用を有する金ナノ粒子)し、2017年度生命科学系合同年次大会にてポスター発表(演題:TLR7リガンド固定化金ナノ粒子の調製と免疫増強活性評価)を行い、成果を公表した。

本研究は、Toll様受容体(TLR)アゴニストと糖鎖抗原を固定化した金ナノ粒子を用いたがんワクチンを開発することを目的としている。2年目は、合成低分子TLR7リガンドの1V209と免疫細胞に輸送するためのαマンノースを固定化した金ナノ粒子(1V209-αMan-GNP)の1)in vitroでの免疫増強活性(アジュバント活性)評価と2)細胞毒性評価及び3)in vivoでのアジュバント活性評価を行った。1V209-αMan-GNPのin vitroでのアジュバント活性をJ774A.1とマウス骨髄由来樹状細胞(BMDC)を用いて評価したところ、マンノース受容体を発現しないJ774A.1ではほとんどサイトカインが産生されず、マンノース受容体を多く発現するマウス骨髄由来樹状細胞(BMDC)では、1V209誘導体単体に比べ、高いサイトカイン産生能を示した。したがって、マンノース受容体が1V209-αMan-GNPの細胞内移行に重要な受容体の一つであることが示唆され、1V209誘導体のGNPへの固定化によりサイトカイン産生能が向上することを見出した。次いで、ヒト細胞でのアジュバント活性を、末梢血単核細胞を用いて評価したところ、1V209誘導体単体に比べて高いサイトカイン産生能を示したことから、ヒトにおいても有用であることが示唆された。また、いずれの細胞でも細胞毒性は認められなかった。モデル抗原にオボアルブミン(OVA)を用いて、in vivoでのアジュバント活性を評価したところ、IgG2c抗体の産生価が1V209単体に比べて10,000倍高い一方で、脾臓が全く腫れない等、炎症性が低かった。即ち、1V209-αMan-GNPはin vivoでも高いアジュバント活性を有しており、安全に利用できることが示された。2年目は、糖鎖・TLR7アゴニスト固定化金ナノ粒子のin vitroでの免疫増強活性(アジュバント活性)評価と金ナノ粒子上に固定化する糖鎖抗原・TLR7アゴニストの固定化量・比率の最適化について検討する予定であったが、初年度に計画が順調に進展し、前倒しで研究が実施できたため、最終年度に実施予定であった、in vivoでのアジュバント活性評価を前倒しで実施することができた。これらの成果で、特許の優先権主張出願を行い、第24回日本エンドトキシン・自然免疫研究会にて口頭発表を行うことで、成果を公表した。初年度に引き続き、合成したTLR7アゴニスト固定化金ナノ粒子の免疫増強作用をin vitroで評価し、最適なTLR7アゴニストの構造や固定化方法について検討する。その後、TLR7アゴニストとモデル糖鎖抗原を共固定化した金ナノ粒子を合成し、最適なTLR7アゴニスト・糖鎖抗原の固定化量・比率について検討する。また、in vitroでの細胞毒性についても検討し、安全性を評価する。最終年度は、アジュバントとなる1V209とモデル糖鎖抗原となるシアリルTn抗原等の糖鎖抗原を固定化したGNPを調製し、in vivoでの糖鎖抗原に対する抗体産生能やワクチン活性の評価を計画している。
新しく発見した細胞接着蛋白質のSmith-Magenis症候群発症における役割

Smith-Magenis症候群は、染色体17p11.2に部分的欠失があり、全身奇形とともに精神遅滞を主症状とする。最近Smith-Magenis症候群における欠失遺伝子が、私共が発見した細胞接着蛋白質(MAGP-36)をコードしていることが判明した。そこで、Smith-Magenis症候群の発症機転においてMAGP-36がいかなる役割を果たしているのかを明らかにすることを目的とした。MAGP-36の機能を調節する分子プローブを開発し、これを利用してMAGP-36の機能を明らかにすることを企画した。その結果、Anthranilic acid誘導体、Cinnamic acid誘導体の中から強いMAGP-36結合活性を持つ物質を発見した。そのうち、2種はCa^<2+>依存性にMAGP-36と相互作用を持ち、他はCa^<2+>の存否に関らず強くMAGP-36と結合する。これら、分子プローブをアフィニティー担体化し、生体組織から一段階でMAGP-36を単離する方法を開発することに成功した。第2に、血管以外の組織にも分布し、免疫組織化学技法によりMAGP-36のElastin繊維化形成における役割を組織分布等について検討した。MAGP-36は、elastin-microfibrilと考えられる構造物に局在している。また、組織の修復過程において重要な役割をしていることが明らかになった。MAGP-36はビトロネクチン等と同様に細胞接着を促進し、N末端領域に存在するRGD配列、QAGDV配列が細胞接着に関与し、C末端領域がElastinとの結合性を持つとの結果を得た。最近Smith-Magenis症候群における欠失遺伝子が、私共が発現した細胞接着蛋白質(MAGP-36)をコードしていることが判明した。そこで、Smith-Magenis症候群の発症機転においてMAGP-36がいかなる役割を果たしているのかを総合的に明らかにすることを目的とした。まず、MAGP-36の機能を調節する低分子化合物(分子プローブ)を開発し、これを利用してMAGP-36の機能を明らかにすることを企画した。MAGP-36との結合メカニズムについて検討を行っている。分子プローブをアフィニティー担体化し、生体組織から一段階でMAGP-36を単離する方法を開発することに成功した。第2に、MAGP-36抗体を用いて、免疫組織化学技法によりMAGP-36の組織分布等について検討した。また、組織の修復過程において重要な役割をしていることが推定された。更に、細胞接着におけるMAGP-36の役割について研究した。MAGP-36はビトロネクチン等と同様に細胞接着を促進し、末端領域に存在するRGD配列が細胞接着に深く関与しているとの結果を得た。

MAGP-36の機能を調節する分子プローブを開発し、これを利用してMAGP-36の機能を明らかにすることを企画した。その結果、Anthranilic acid誘導体、Cinnamic acid誘導体の中から強いMAGP-36結合活性を持つ物質を発見した。そのうち、2種はCa^<2+>依存性にMAGP-36と相互作用を持ち、他はCa^<2+>の存否に関らず強くMAGP-36と結合する。これら、分子プローブをアフィニティー担体化し、生体組織から一段階でMAGP-36を単離する方法を開発することに成功した。第2に、血管以外の組織にも分布し、免疫組織化学技法によりMAGP-36のElastin繊維化形成における役割を組織分布等について検討した。MAGP-36は、elastin-microfibrilと考えられる構造物に局在している。また、組織の修復過程において重要な役割をしていることが明らかになった。MAGP-36はビトロネクチン等と同様に細胞接着を促進し、N末端領域に存在するRGD配列、QAGDV配列が細胞接着に関与し、C末端領域がElastinとの結合性を持つとの結果を得た。
マイクロ波放射観測による広域の雲水量の研究

気候変動など地球環境の変化について、現在残された大きな課題の一つは、地球規模の水の分布と循環及びその変動の研究である。本研究は、マイクロ波放射観測による広域の雲水量の評価の可能性と問題点とを整理すると共に、衛星デ-タを用いて、実際の大気環境下の広域の雲水量の分布と変動を調べることを目的としている。今年度は、航空機による雲水量の雲内直接観測との比較を行った。雲内では雲水量の空間的、時間的変化は激しく、マイクロ波放射計以外の手段で雲水量を正しく測定することは難しい。このため、マンクロ波放射計は雲水量の測定手段として最も有効であるにもかかわらず、世界的にみて、実際の雲について測定された雲水量の検証は未だになされてない。観測は、バンド状の積雲列と層状雲に対して行われた。その結果、マイクロ波放射計から推定した鉛直積分雲水量は、雲粒スペクトロメ-タ-の直接測定から推定した鉛直積分雲水量とほぼ一致する場合と、2倍以上異なっている場合とがあった。これらの値の違いは、雲内観測の方法及び測器そのものが持つ誤差の両方に起因しており、今後観測例を増やし、さらに検討していく予定である。人工衛星マイクロ波デ-タから評価される雲水量の検証に関しては、WCRPの観測の一環として、1991年1月南西諸島海域で、上空を通過するMOSlによる観測と同時に、マイクロ波放射計を搭載した航空機による雲の観測を2回行った。この他に、島の上で雲粒子ゾンデ、地上設置マンクロ波放射計などによる雲の観測も行われた。現在、これらのデ-タも用いて、人工衛星マイクロ波デ-タから評価される雲水量の妥当性を検討中である。又、衛星デ-タを用いて解析していく上で、どのような空間スケ-ルで、広域の雲水量を評価するのが妥当か、またそのような平均値は、空間的変動度を考慮してどのような意義を持つのかなどを今後検討することが必要である。次年度は、このような研究も行う予定である。
寄生胞膜に着目した肝内型マラリア原虫-宿主間“鬩ぎ合い”機構の解明

代表者らは、肝内型マラリア原虫に特異的な分子のスクリーニングを行い、新たな特異分子“B9"を見出した。△b9を用いた詳細な解析から、一遺伝子欠損により複数の寄生胞膜(PVM)タンパク質の局在性を失わせ、不完全なPVMを形成する表現型を示すことが明らかとなった。この表現型は、齧歯類マラリア原虫および熱帯熱マラリア原虫において共通であった。様々な解析から、b9は転写後制御により発現調節される分子であることが明らかとなり、plasma membraneに局在する事が明らかとなった。さらに推定立体構造解析からB9は6-Cys family proteinに類似の構造をとる事を明らかとなった。マラリア原虫は宿主細胞内において寄生胞膜(PVM)を作り、宿主と隔たりを設けることで寄生を成立させる。マラリア原虫(スポロゾイト)が感染する肝細胞は、様々な免疫応答等が可能な細胞であることから、侵入後は宿主内に潜むため特に巧妙な隠れ蓑が必要になると考えられるが、肝内型原虫のPVMやそれに対する宿主応答に関する報告は極めて乏しい。そこで本研究では肝内型原虫PVMと宿主応答の“鬩ぎ合い"を明らかにするため、肝内型原虫PVMに対する宿主オートファジー(Atg)応答などを明らかにし、肝内型原虫特異的なPVM分子、PVMと相互作用する宿主分子、宿主Atg応答と相互作用する原虫分子の同定を試みることで、原虫-宿主間の新規相互作用の解明に迫る。本研究計画では、齧歯類特異的マラリア原虫(P. berghei)を用いて、以下の計画実験を遂行した。肝内型原虫に対する宿主Atg応答を解明するため、in vitroにおいてAtg関連分子の詳細な解析を行った。宿主肝細胞としてHuh-7細胞を用いて、RNAiの原理によりAtg5、TECPR1、FIP200の宿主Atg関連分子を各々一過性にノックダウンさせ、野生型(Wt)スポロゾイトを感染させた。感染24時間後に感染細胞を回収し、免疫蛍光抗体法により宿主LC3の原虫への集積を観察したところ、Atg5ノックダウン感染細胞ではLC3の原虫への集積は認められなかったが、TECPR1、FIP200をノックダウンさせた場合には引き続きLC3の原虫への集積が認められた。これらの結果から肝内型原虫に対する宿主LC3の集積応答は、ULK1複合体やPI3K複合体の機能に依存的しない集積である可能性が示され、生体の恒常的なAtg応答とは異なることが示唆された。マラリアは、死亡者数が年間60万人以上にもおよぶ世界最大の感染症の一つであり、マラリア原虫の感染により生じる疾患である。マラリア原虫が感染する肝細胞は、様々な免疫応答等が可能な細胞であることから、侵入後は宿主内に潜むため特に巧妙な隠れ蓑が必要になると考えられるが、肝内型原虫のPVMやそれに対する宿主応答に関する報告は極めて乏しい。そこで本研究では肝内型原虫PVMと宿主応答の“鬩ぎ合い"を明らかにするため、肝内型原虫特異的なPVM分子、PVMと相互作用する宿主分子などの同定を試みることで、原虫-宿主間の新規相互作用の解明に迫る。これまでに我々は、肝内型マラリア原虫特異的な分子のスクリーニングを行い、新たな特異分子“B9"を見出した。△b9を用いた詳細な解析から、本株は肝内型原虫特異的に不完全なPVMを形成する表現型を示し、一遺伝子欠損により複数のPVMタンパク質の局在性を失わせることが明らかとなった。この△b9の表現型は、齧歯類マラリア原虫および熱帯熱マラリア原虫を用いた解析で共通であった。RT-PCRおよび抗B9抗体を用いた解析から、b9は転写後制御により発現調節される分子であることが明らかとなり、免疫蛍光抗体法により原虫plasma membraneに局在する事が明らかとなった。さらに各種構造解析などから、B9の推定立体構造は6-Cysfamily proteinに類似している事が明らかとなった。このような原虫-宿主の接点であるPVMを形成する分子を明らかにすることで、原虫の宿主内生き残り戦略を明確にすることで将来のワクチン開発などにつながる分子基盤情報を得ることが期待される。原虫本研究計画では、肝内型原虫PVMと宿主の相互作用メカニズムを明らかにするために、主に以下の2つの異なるアプローチによる計画実験を遂行している。

まず、1)肝内型原虫に対する宿主Atg応答を詳細に解明し、次に2)肝内型原虫のPVM分子、PVMと相互作用する宿主分子、宿主Atg応答に相互作用する分子の同定を試みる。初年度は、1)の計画実験からin vitroにおいてRNAiの原理により宿主Atg関連分子を各々一過性にノックダウン後、Wtスポロゾイトを感染させ肝内型原虫に対する宿主LC3応答を観察した。その結果、Atg5、TECPR1、FIP200各々のノックダウン条件下において、宿主LC3の局在性が異なることが明らかとなった。すなわち肝内型原虫への宿主LC3集積はULK1複合体やPI3K複合体の機能に依存せず、原虫により宿主LC3に伴う一連の分解応答は遮断されている可能性(ハイジャック?)が示唆された。このような見解を明らかに出来た意義は大きく、今後RNAiによるin vitro解析を詳細に行い、また必要に応じてin vivo実験を並行して行うことで、肝内型原虫が宿主Atg応答をコントロールしている分子の同定を試みる。また一方で、2)の研究計画を遂行するためPVM形成に必須な因子であるnewgap1のタグ付加発現コンストラクト作製の準備を行った。newgap1のC末端に3xMYCをタグ付加したコンストラクトを作製後、内在性のnewgap1遺伝子と置換する原虫を作製し、その細胞内局在性と機能の解析を試みた。その結果、興味深いことにC末端タグ付加原虫は、Δnewgap1(遺伝子欠損)と同じ表現型を示し、newgap1のC末端は機能に必須な役割を担うことが明らかとなった。興味深い結果が得られたRNAiによるin vitro解析をさらに進め、肝内型原虫がハイジャックする候補分子の絞り込みを試みる。具体的には、Atg応答の異なる段階で作用する分子を各々ノックダウンし、宿主LC3の原虫への集積や肝内型原虫の生育などを比較する。LC3の活性化に必須であるAtg7、ULK1複合体非依存の確認のためにBeclin1やUVRAG、PI3K複合体非依存の確認のためにWIPI2、リソソーム融合との有無の検証のためにStx17やLAMP1などのノックダウンを予定している。また必要に応じて各種ノックアウトマウスを入手しin vivoによる解析も展開する。肝内型原虫のPVM分子、PVMと相互作用する宿主分子を網羅的に同定するため、新たにnewgap1タグ付加コンストラクトをし、内在newgap1遺伝子とは異なるニュートラルローカス部位に遺伝子導入し肝内期原虫にて発現させ、免疫沈降法により相互作用するタンパク質を回収する。現在newgap1のORF内部にタグ付加配列を挿入し、推定機能ドメインを部分的に欠損したコンストラクトを複数作製中であり、これらを比較検討する事で実験の精度を高める。LC-MS/MSなどによる質量分析により陽性タンパク質の同定を試みることで、PVMを中心とした原虫-宿主間の“鬩ぎ合い"におけるPVMの役割など機能解明に迫る。初年度は、申請者が所属する講座研究費などを用いて消耗品を購入し研究を行ったため、多大な費用を使用せずに研究を推進する事ができた。しかし次年度は、これらの結果をふまえ研究を展開するため初年度よりも多くの研究費を必要とする可能性が高い。特に分子間相互作用を解析する実験、LC-MS/MS解析、in vivo解析などは比較的高価な物品や消耗品などを必要とするので、初年度に計上した研究費を次年度に繰り越し使用する予定である。RNAiによるin vitro解析を行い、肝内型原虫がハイジャックする候補分子の絞り込みを試みる。Atg応答の異なる段階で作用する候補分子Atg7、Beclin1、UVRAG、WIPI