hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
温熱誘導アポトーシスにおける細胞内シグナル伝達についての検討

LK-2細胞株で温熱によるp53の発現・誘導がみられたが、免疫染色で染色性を示した事からmutant typeと考えられた。一方、ヒト肺大細胞癌(LU65A)ではp53の発現・誘導は認められなかった。Bax,Bcl-2の温熱による発現・誘導は認められなかった。Caspase-3の活性は温熱後48時間で有意に上昇した。組織型の異なる2種類のヒト肺癌細胞株を用い、温熱処理後からアポトーシスが実行される間の細胞内カルシウムイオン濃度変化を検討することを足がかりとし、非小細胞肺癌における温熱によるアポトーシス・シグナル伝達経路を検討することを目的とした。1.用いた2種類のヒト肺癌細胞株(LK-2ヒト肺扁平上皮癌、LU65Aヒト肺大細胞癌)で、44°C・60分間の温熱によりアポトーシスの誘導を認めた。両細胞とも、温熱48時間後にアポトーシス誘導率は最大値を示した。2.ヒト肺癌細胞での温熱誘導アポトーシスにおいて、細胞内カルシウムイオン濃度が温熱後9時間前後に250-300nMに上昇・持続することを生きた細胞内でTime-lapse video-imaging法を用いて観察した。3.細胞内カルシウムイオン濃度との関係が報告されているアポトーシス関連タンパク質(p53,Bax,Bc1-2,Caspase-3,8,9)の温熱による発現・誘導をWestern blot法ならびに酵素活性法で確かめた。またp53の免疫染色を行なった。LK-2細胞株で温熱によるp53の発現・誘導がみられたが、免疫染色によるp53の局在は細胞質に優位であった。ヒト肺大細胞癌(LU65A)ではp53の発現・誘導は認めなかった。Bax, Bc1-2の温熱による発現・誘導はいずれの細胞ともに認めなかった。またCaspase-3,8,9の活性は温熱後48時間でいずれも有意に上昇した。LK-2細胞株で温熱により発現・誘導されたp53タンパクは機能を喪失していると考えられた。組織型の異なる2種類のヒト肺癌細胞株とも、温熱誘導アポトーシスはp53非依存性のミトコンドリア経路とデス・レセプター経路との`cross talk'によって誘導されると推測される。
抑うつ状態における心筋保護機構阻害因子の解明とその制御

抑うつ状態での虚血再灌流障害に対して心筋保護効果を得るためには、JAK-STAT系を介さずにPI3K-Aktを活性化させることが重要であると考えられている。本研究により、Rhoキナーゼ阻害薬である塩酸ファスジルはJAK-STAT、COX-2を介さずにm-KATPチャネルを活性化させて心筋保護効果を発揮することが明らかとなった。そのため、塩酸ファスジルは抑うつ状態において、心筋保護効果を発揮する可能性がある。抑うつ状態において虚血性心疾患患者の予後が悪化するという報告がなされるようになった。原因は明らかでないが、抑うつ状態における内在性臓器保護機構の障害が予後悪化の一因ではないかと考える。内在性心筋保護機構は様々な細胞内情報伝達経路を介しているが、その一つとしてJAK-STAT系が挙げられる。またJAK-STATを活性化した再灌流後早期の保護効果にはPI3K-Aktの活性化が必要であり、JAK-STATの下流においてPI3K-Aktが活性化されることが示唆されている。抑うつ状態では虚血ポスコンの作用が減弱し、STAT3とAktの活性が消失していたことを報告した。そのためJAK-STATの活性化を介さずにPI3K-Aktを活性化させることが、抑うつ状態において内在性臓器保護効果を発揮させるために重要な要素である可能性が高い。加えて、予測できない虚血イベントにも応用できるため、薬理学的ポストコンディショニング(ポスコン)法の開発は臨床的に非常に有用である。今回、抑うつ状態における内在性臓器保護機構抑制とその機序を明らかにし、抑うつ状態における有効な薬理学的ポストコンディショニングの確立を目的とし研究を行う。抑うつ状態における薬理学的ポスコン法の開発として、正常、抑うつ状態ラットのラット心筋虚血再灌流モデルを用い、再灌流後早期の短時間虚血、吸入麻酔薬であるセボフルラン、Rhoキナーゼ阻害薬である塩酸ファスジルの投与が心筋梗塞サイズに与える影響について検討する。現在、抑うつ状態ラットの作成を行っている。内在性心筋保護機構は様々な細胞伝達経路を介しているが、その一つとしてJAK-STAT系が挙げられる。またJAK-STATを活性化した再灌流後早期の保護効果にはPI3K-Aktの活性化が必要であり、JAK-STATの下流においてPI3-Aktが活性化されることが示唆されている。抑うつ状態では虚血ポスコンの作用が減弱し、STAT3とAktの活性が消失していたことが報告されている。そのためJAK-STATの活性化を介さずにPI3-Aktを活性化させることが、抑うつ状態において内在性臓器保護効果を発揮させるために重要な要素である可能性が高い。今回、抑うつ状態における内在性臓器保護機構抑制とその機序を明らかにし、抑うつ状態における有効な薬理学的ポスコンの確立を目的として研究を行う。抑うつ状態における薬理学的ポスコンの開発として、正常、抑うつ状態ラットのラット心筋虚血再灌流モデルを用い、再灌流後臓器の短時間虚血、吸入麻酔薬であるセボフルラン、Rhoキナーゼ阻害薬である塩酸ファスジルの投与が心筋梗塞サイズに与える影響について検討する。抑うつ状態ラットの作成が困難であったため断念した。現在代替として、本研究において内在性保護機構解明のターゲットであった、JAK-STAT系の活性を介さずにPI3K-Akt系を活性化させる薬理学的ポスコンの開発の実験を行っている。またJAK-STATの活性化を介さずにPI3-Aktを活性化させることが、抑うつ状態において内在性臓器保護効果を発揮させるために重要な要素である可能性が高い。加えて、予測できない虚血イベントにも応用できるため、薬理学的ポストコンディショニング法の開発は臨床的に非常に有用である。今回、抑うつ状態における内在性臓器保護機構抑制とその機序を明らかにし、抑うつ状態における有効な薬理学的ポストコンディショニング法の確立を目的として研究を行う。抑うつ状態における薬理学的ポストコンディショニング法の開発として、正常、抑うつ状態ラット心筋虚血再灌流モデルを用いて、再灌流後の短時間虚血、吸入麻酔薬であるセボフルラン、Rhoキナーゼ阻害薬である塩酸ファスジルの投与が心筋梗塞サイズに与える影響について検討しようとしたが、抑うつ状態ラットモデルの作成が困難であった。そのため代替として、内在性臓器保護機構のターゲットであった、JAK-STAT系の活性を介さずにPI3K-Aktを活性化させる薬理学的ポストコンディショニング法の開発を行った。塩酸ファスジルはCOX-2阻害薬であるNS398、JAK-2阻害薬であるAG490の投与下でも心筋保護効果を発揮した。

本研究において本来の目的であった抑うつ状態下での検討を行うことは出来なかったが、塩酸ファスジルがJAK-STATの活性化を介さずに心筋保護効果を発揮することが可能であることが明らかになった。抑うつ状態での虚血再灌流障害に対して心筋保護効果を得るためには、JAK-STAT系を介さずにPI3K-Aktを活性化させることが重要であると考えられている。本研究により、Rhoキナーゼ阻害薬である塩酸ファスジルはJAK-STAT、COX-2を介さずにm-KATPチャネルを活性化させて心筋保護効果を発揮することが明らかとなった。そのため、塩酸ファスジルは抑うつ状態において、心筋保護効果を発揮する可能性がある。先行研究をまねて実験を行ったが抑うつモデルを作成することができなかった。そのため抑うつモデルを用いた実験を断念し、本研究の2番目の目的である分子細胞機構の解明を行っている。医歯薬学JAK-STAT系を介さずにPI3K-Akt系を活性化させる薬理学的ポスコンとして、塩酸ファスジルを主体に研究を行っている。現時点でJAK-2、mito KATP、COX-2阻害薬を用いることで保護機序の推測ができており、今後各メディエーター、エフェクタを直接活性化させる薬剤を用いることでさらなる機序の解明を行う。抑うつモデルの作成に時間を要しており、本研究の主である抑うつモデルにおける心筋保護法の開発に関する実験を遂行出来ていない。実験の進捗が遅れているため抑うつ状態モデルの作成は継続しつつ、短時間虚血、セボフルラン、塩酸ファスジルの心筋保護効果におけるJAK-STATやPI3-Akt、COX-2など分子細胞機構の解明に関する実験を並行して行う。実験の進行が遅れていることから、当該年度の使用額が少なくなった。実験の遅れを改善させるため、抑うつ状態モデルの作成と、分子細胞機構の解明を並行して行う。そのため繰り越し分の研究費は研究進行に合わせて使用する予定である。
ビジュアルマジック隠消現実感の骨格形成と課題抽出

本研究は,現実世界の事物を視覚的に消し去る「Diminished Reality(DR)」を研究対象とし,その研究課題の抽出とオリジナル研究開発を実施した.しかるべき日本語訳がなかったDRの基本概念を明確化するため「隠消(いんしょう)現実感」という訳語を与えることから始め,徹底的な文献調査とそこからの基本要素の抽出を行う事で, DRの実現手順と発展的な課題についてまとめ, DR研究のロードマップとなるよう総説論文として公表した.抽出した課題は基本要素別に解決方法を開発し,国内外の学会で発表した.本研究は,現実世界の事物を視覚的に消し去る「Diminished Reality(DR)」を研究対象とし,その研究課題の抽出とオリジナル研究開発を実施した.しかるべき日本語訳がなかったDRの基本概念を明確化するため「隠消(いんしょう)現実感」という訳語を与えることから始め,徹底的な文献調査とそこからの基本要素の抽出を行う事で, DRの実現手順と発展的な課題についてまとめ, DR研究のロードマップとなるよう総説論文として公表した.抽出した課題は基本要素別に解決方法を開発し,国内外の学会で発表した.本萌芽研究が採択されたことにより,当該技術の体系的整理を行い,今後取り組むべき研究課題を抽出することに着手した.また,Deminished Reality (DR)の邦訳として「隠消現実感」が定着するよう,広報活動も開始した「隠消現実感」の対象となる現実世界は,除去したい事物,背景,体験(観察)者が静止しているか,移動しているか,その画像的な複雑さによって,処理手法がかなり異なる.そこで平成22年度は,改めて徹底した関連技術調査を行い,約80件の論文をベースとして技術課題を整理し,技術マップ第1版を作成した.同技術マップでは,DRの基本的技術要素を,(1)ユーザ視点カメラの移動,(2)遮蔽物の存在,(3)除去対象物体領域の決定、(4)隠背景の観測手法,(5)隠背景の幾何学形状のモデル化の5つに分け,関連研究を分類した.また,これら従来研究を調査した結果,よりリアリティの高いDRを実現するために今後必要な発展的な課題として,(1)幾何学的整合性,(2)光学的整合性,(3)Half-DR,(4)聴覚のDRを挙げた.本成果を,総説論文として学会論文誌に投稿したまた本研究では,これらの調査と並行して,関連技術のうち代表的な手法の追試を行った.また発展的課題(1)(2)(3)に着手し,(2)の光学的整合性に関しては,申請者らのオリジナル手法によるDR実験を行い,その成果を国内研究会にて発表した本研究の開始当時は,当初の目的として,下記3項目を挙げていた.(1)「隠消現実感(DR)」の対象となる現実世界は,除去したい事物,背景,体験(観察)者が静止しているか,移動しているか,その画像的な複雑さによって,処理手法がかなり異なる.本研究では,実行環境・条件を考慮した技術の体系的整理を行い,試験的研究実験を行ってこれを補強・更新する.(2)背景を上書きする隠蔽・消去する技術の他に,当該物体を「半隠消表示」する新規技法も研究する.(3)DRのための手法を体系的に分類したサーベイ論文を執筆する.この内,(3)に関しては,2年間の研究期間の最後の半年間で技術を整理し,サーベイ論文を執筆し学会投稿する予定であったが,初年度から体系的整理が進み,初年度末に論文誌投稿したところ,一発採択され,本年度第1四半期中に広く公開・衆知されるところとなった.このため,残る期間では,有力な手法の追試実験を予定以上に充実させることができ,初年度に作成した「技術マップ」をより精緻なものにすることができた.また,新手法による研究実験も進展し,学会発表できる水準に達した.(2)の「半隠消表示(Half. DR)」は,本研究独自の視点による研究であるが,これにも十分な時間を割くことが出来,その研究成果を国内外の学会に投稿・発表した.本萌芽研究は,DR研究全体を一挙に解決しようとするものではなく,その本格的な展開の第一歩として,技術体系の基本骨格や技術マップの作成,学術的に挑戦すべき研究課題の抽出を行い,その研究結果を広く当該分野の研究者に開示することを目指していたが,その目的は十二分に達成されたと言えよう.
ヌマチチブの繁殖成功と代替戦略の解明

ヌマチチブはハゼ科の淡水魚で,雄が石の下(産卵基質)などに巣を構えて卵塊を保護する習性をもつ。本研究は,産卵基質の質(サイズ)と雄の繁殖成功度の関係,「スニーカー」と呼ばれる代替戦略をとる小型雄の存在,卵塊を保護する雄(繁殖雄)と卵塊の血縁関係という視点より,雄の繁殖成功に影響を与える要因の解明ならびに代替戦略の砲認を試みた。調査では, 79月にヌマチチブが産卵基質として利用する素焼き深鉢を霞ケ浦湖岸帯の繁殖地に設置した。その後, 710日ごとにコドラートネット(1辺の長さ50cm)を用いて産卵床(素焼き深鉢)内およびその周辺に生息するヌマチチブを採集した。採集したヌマチチブは,全長および体重,生殖巣重量を計測した。産卵床内に卵塊が存在した場合,卵塊の大きさを計測し,一部の卵を採取した。雄の一部は精巣の組織切片を作成し,精子形成の組織学的な分析を行った。43個の産卵床のうち10個で産卵が確認された。産卵床が荒波で横転した2個と親魚の採集に失敗した2個を除く6個について分析を行った。1産卵床周辺に生息したヌマチチブは平均7.0個体(最大16個体,最小4個体),全体の性比は1.88(雄32個体,雌17個体)となった。体サイズ構成は卵塊を保護する繁殖雄(平均体長68.8mm, n=6)と非繁殖雄(平均体長35.7mm, n=26),雌(平均体長32.7mm, n=17)となった。卵塊は産卵床内に平均121mm×106mmの範囲で産み付けられていた。生殖腺重量指数(GSI)は繁殖雄0.98,非繁殖雄0.33,雌4.02となったが,雄2個体は小型でありながら精巣が非常に発達する現象が確認された(体長: 34.3cm/GSI : 3.33,30.3cm/4.75)。産卵基質をめぐる競争により,体の大きな雄が多くの卵を産み付けられる大きな産卵床を獲得し,高い繁殖成功を得ていた。また,小型雄の中に精巣の非常に発達した個体がみられ,サケ科やサンフィッシュ科でみられる雄の代替戦略がヌマチチブでも存在する可能性が強く裏付けられた。
哺乳類ホメオテイック遺伝子のマウス受精卵への導入

哺乳類の発生や形態形成の過程が遺伝子によってどのように調節されているかはほとんど明らかにされていない。ホメオティック遺伝子は発生や形態成過程において重要な働きをしていると考えられている遺伝子群であり、これらの遺伝子の発現機構や機能を明らかにすることを目的として以下の実験を行なった。1.新たにクロ-ン化したマウス遺伝子Hox3.6を含むHox3クラスタ-の遺伝子の発生過程における発現領域を、in situハイブリダイゼ-ション法によって調べた結果、Hox3グラスタ-の遺伝子も、他のクラスタ-遺伝子と同様な、遺伝子の配列順序に従った頭尾軸に沿った発現をしていることが明らかになった。しかし神経管や肢芽での発現領域は他のクラスタ-遺伝子と異なっており、Hox3クラスタ-に特異的な発現も観察された。2.ホメオティック遺伝子の非特異的発現とマウスの発生及び形態形成との関係を調べるため、gh13(ヒトHox3.5オメオボックスを含むcDNAクロ-ン)にβ-アクチンプロモ-タ-を結合したプラスミドを導入したトランスジュニックマウスを作製した。現在プラスミドの染色体への組み込みとマウス表現型との関係を調べている。3.ホソオティック遺伝子の時期及び組織特異的発現の特異性を変化させた時のマウス発生過程に与える影響を調べるための、発現調節領域が明らかになりつつあるHox1、3およびHox3.1の調節領域と、遺伝子部分の構造が明らかになった。Hox1.1、Hox1.3、Hox2.1、Hox2.3、Hox3.1Hox3.5などの構造遺伝子領域との間でキメラ遺伝子を作製した。現在これらの遺伝子を導入したトランスジェニックマウスの作製を試みている。
動揺病発現に関与する視覚入力と前庭入力(半規管および耳右)の相互作用に関する研究

1。視運動刺激により発現する動揺病症状を検討するために、中心窩刺激が主体となる広間隔の線条視標と、周辺視野刺激が相対的に優位となる小円形視標を無数に配置した視標(ランダム視標)の2種類の視標を使用した視運動眼振検査を正常被検者に施行した。その眼振反応と回転感覚などの動揺感との関係を分析した結果、周辺視野刺激の強弱が回転感覚の発現に大きく影響していることが確認された。また、視運動刺激(ランダム刺激)単独による回転感覚は、前庭性刺激として同速度の回転刺激を単独に与えた場合より被検者に対してより強い不快感を与えることが確認された。2。耳石刺激の関与した水平直線加速刺激に対する動揺病症状と視覚情報との関係を検討した。直接加速度に対する動揺病症状は回転刺激よりも強く、また、同一の回転加速度に対して視刺激の影響をより強く受けることが確認された。3。以上から、動揺病症状の発現に関して周辺視野刺激が有意となる状況で視運動性眼振が解発される視刺激が多大なる影響を与えること、半規管刺激よりも耳石刺激と視刺激が加算された場合にこの影響がより強いとの結論に達した。1。2。3。1。2。視運動刺激(ランダム刺激)単独による回転感覚は、前庭性刺激として同速度の回転刺激を単独に与えた場合より被検者に対してより強い不快感を与えることが確認された。3。温度刺激検査時の自律神経機能を調査した結果、眼振反応が発現し強いめまい感が発生しているときに心電図R-R間隔が特異な変化を示し、この変化を動揺病症状発現の評価法として使用できることが確認された。1。2。耳石刺激の関与した水平直線加速度刺激に対する動揺病症状と視覚情報との関係を検討した。直線加速度に対する動揺病症状は回転刺激よりも強く、また、同一の回転加速度に対して視刺激の影響をより強く受けることが確認された。3。
発達性ディスレクシアの英単語認知における音韻と正書法の相互作用分析と指導法の開発

事象関連電位(Event-related potentials, ERPs)において文字列に特異的な応答を示すN170成分を指標とし,文宇列処理における音韻と正書法の相互作用,および両者の相互作用への注意の関わりを検討した。N170は左半球優位性を示すが,これは文字列に対する自動的な音韻変換処理を反映すると考えられている。今年度の研究では, N170の左半球優位性は文字列が課題に関連する刺激であった時にのみ示されたことから,自動的とされる音韻変換処理は文字列への視覚選択的注意を必要とすることが示唆された。この知見は,発達性ディスレクシアにおいて視覚選択的注意の障害が読み困難をもたらすとする仮説を支持するものであり,障害メカニズムの理解に貢献すると考えられる。また, N170の左半球優位性は文字間隔が狭く,まとまりとしての処理が可能な文字列に限って生じたことから,音韻変換処理の生起は効率的な正書法処理に依存することも示唆された。これらは, N170の左半球優位性が自動的な音韻処理のみならず,正書法処理と音韻処理の相互作用を反映する可能性を示唆しており,それらを評価する電気生理学的マーカーとして利用できる可能性が示された点で有意義な結果と言える。指導法研究では,昨年度までの研究で発達性ディスレクシアのある生徒への有効性が示されたフォニックス法による英単語の読み書き指導が,より広範な学習上の困難がある生徒に対しても適用可能かどうかを検討した。その結果,全般的な軽度知的障害が認められる生徒,およびワーキングメモリの弱さを示す生徒に対しても有効であることが示唆された。英単語の学習困難は,発達性ディスレクシアの範疇に入らない生徒においても生じることが多いため,フォニックス法のより幅広い適用可能性が示されたことは重要な成果である。(抄録なし)単語認知における正書法と音韻の相互作用分析の基礎的な知見を得るため,文字列の正書法処理(視覚処理)と音韻処理の特性および時間経過を事象関連電位(Event-related potentials,ERP)を用いて検討した。その中で,英単語認知の評価にあたってベースラインとして必要になる日本語単語認知の過程と特性の検討も行った。実験参加者には単語,無意味文字列,記号列を提示し,それらの視覚的特徴または音韻的特徴に注意するよう求めた。その結果,正書法処理を反映すると考えられる文字列・記号列に対するERP反応の差異は,アルファベット言語の母語話者と同様の成分および時間帯で同定された。しかし,音韻処理に関わると考えられる読める文字列・読めない文字列に対する反応の差異は,異なる時間帯および頭皮上部位で同定された。このことから,単語認知における正書法と音韻の相互作用およびその基盤となる脳活動は,母語の書記体系・音韻体系に応じて変化し得ることが示唆された。これは,発達性ディスレクシアの単語認知における相互作用とその特異性を検討していく上で考慮すべき重要な知見である。指導法の研究としては,日本語の読み書きにおいて発達性ディスレクシアの特性を示し,英語学習に困難がある中学生,高校生に英単語の読み書き支援を行った。フォニックス法を用いて英語の音素と書記素の対応関係に基づく単語の音声化(デコーディング)と書き取りを指導した後,単語のライム(母音+語尾子音)のパターンに基づく読み書き指導を行った。その結果,フォニックスとライムはいずれも読み書きの学習と定着および正確性の向上に有効であったが,流暢性(読み速度)の獲得と向上には個人差があった。英語圏で一般的に用いられている指導方法が,英語を母語としない生徒に対しても有効であることが示された点に意義があるといえる。事象関連電位(Event-related potential, ERP)を指標とし,単語や文字列に対する特異的な神経応答と文字列の読みや音韻処理の関連を検討した。第1の成果として,高速提示された文字列に対するERPにおいて刺激提示後100ミリ秒以内に出現し,非語よりも単語に対して増強する陰性電位を同定した。この単語特異的な初期視覚誘発電位の読み速度の個人差と相関があり,単語と非語の振幅差は読み速度が遅い参加者ほど大きかった。この知見は,発達性ディスレクシアのアセスメントにおけるERPの応用可能性を示した点に意義がある。第2の成果として,文字列に対して特異的な増強を示すN1/N170は言語的処理が最少化された状況下でも惹起されるという結果から,自動的な正書法処理を反映するERP反応であることを示した。これに続く実験では,単語,非語,逆単語(右から左に書いた単語)に対して音韻課題を行っている際のN1が単語と非語とで異なることが示され,正書法処理を反映するERP反応が音韻処理に調整されることが示唆された。これらの結果は,文字単語認知における音韻と正書法の相互作用分析において,相互作用のマーカーとなり得るERP成分を示唆した点に意義がある。指導法研究では,発達性ディスレクシアのある生徒にフォニックス(音素と書記素の対応関係に基づく読み書き指導)とライム(母音+語尾子音)を用いた読み書き指導を継続した。その結果,フォニックスとライムの学習が進んだ生徒は英単語学習において,初めて見た語の読みを読みと綴りの対応規則に基づいて推測する,長い単語を読みやすいまとまりに区切る,単語の綴りを分かった部分から書いていく等の方略を使えるようになることが明らかになった。

これらの方略から,フォニックスおよびライムの学習は,ディスレクシアのある生徒における英単語認知の様相を変化させることが示唆された。事象関連電位(Event-related potentials, ERPs)において文字列に特異的な応答を示すN170成分を指標とし,文宇列処理における音韻と正書法の相互作用,および両者の相互作用への注意の関わりを検討した。N170は左半球優位性を示すが,これは文字列に対する自動的な音韻変換処理を反映すると考えられている。今年度の研究では, N170の左半球優位性は文字列が課題に関連する刺激であった時にのみ示されたことから,自動的とされる音韻変換処理は文字列への視覚選択的注意を必要とすることが示唆された。この知見は,発達性ディスレクシアにおいて視覚選択的注意の障害が読み困難をもたらすとする仮説を支持するものであり,障害メカニズムの理解に貢献すると考えられる。また, N170の左半球優位性は文字間隔が狭く,まとまりとしての処理が可能な文字列に限って生じたことから,音韻変換処理の生起は効率的な正書法処理に依存することも示唆された。これらは, N170の左半球優位性が自動的な音韻処理のみならず,正書法処理と音韻処理の相互作用を反映する可能性を示唆しており,それらを評価する電気生理学的マーカーとして利用できる可能性が示された点で有意義な結果と言える。指導法研究では,昨年度までの研究で発達性ディスレクシアのある生徒への有効性が示されたフォニックス法による英単語の読み書き指導が,より広範な学習上の困難がある生徒に対しても適用可能かどうかを検討した。その結果,全般的な軽度知的障害が認められる生徒,およびワーキングメモリの弱さを示す生徒に対しても有効であることが示唆された。英単語の学習困難は,発達性ディスレクシアの範疇に入らない生徒においても生じることが多いため,フォニックス法のより幅広い適用可能性が示されたことは重要な成果である。文字単語認知に関する基礎研究および英単語の読み書き指導に関する実践研究において,個々に成果をあげることが出来た。今年度の成果は,今後の研究において基礎研究の知見と読み書き指導を統合していく上で基盤となるものであり,研究はおおむね順調に進んでいると評価した。基礎研究において音韻処理や読みと関わる事象関連電位成分が示唆され,文字単語認知における音韻と正書法の相互作用を評価するマーカーの候補が得られた。指導法の研究では,発達性ディスレクシアのある生徒に有効な英単語の読み書き指導法は英単語認知の様相を変化させることが示された。これらの成果により,事象関連電位を指標として読み書き指導の成果を評価し,より有効な指導法の検討を進める準備が進んだことから,おおむね順調に進展していると評価した。引き続き事象関連電位を指標とし,提示刺激の種類や実験課題を変化させて文字単語認知における音韻処理をより詳細に検討していく。さらに,文字列から音韻情報を取得する処理には,読み方向に沿った空間的注意の移動が関連することが考えられたため,音韻処理と空間的注意の関係性の検討を研究計画に追加する。指導法の研究においては,ディスレクシアのある学習者の個人特性に応じた指導方法のバリエーションを拡大し,それらの効果を検討する。
音声制約の自動獲得に基づく高品質音声合成に関する研究

音声合成技術は,人工的に音声を合成する技術である.合成音声の品質を改善するために,本研究では,敵対的学習を用いた統計的音声合成法を提案した.音質劣化の主要因は,音声パラメータの過剰な平滑化により生じたものである.提案法の学習基準は,通常の基準と敵対基準の重み付き和で得られる.敵対的学習は,自然・合成音声の分布間距離を最小化するため,過剰平滑化を効率的に緩和できる.実験的評価から,(1)提案法はハイパーパラメータに対して頑健に働くこと,(2) Wasserstein距離最小化に基づく提案法が,もっとも音質改善効果に有効であること,(3)ボコーダフリー音声合成に展開できることを示す.本年度は,1基盤アルゴリズムの構築,2発話間変動を考慮した音声合成法の検討に取り組んだ.1基盤アルゴリズムの構築基本的な学習アルゴリズムを確立し,提案アルゴリズムによる品質改善効果を確認した.音声合成の学習時の目的関数は,ターゲット音声との距離とアンチ・スプーフィングの識別性能の2つから成る.まず,この目的関数の設計(モデル構造や制約重みなど)及び学習手順(学習速度や初期化)について,当該特徴量の補償度及び主観的な音質評価により評価した.当該分野は,当該分野最高峰の国際会議であるIEEE ICASSPにて,論文1編のみに与えられるStudent Grantを獲得した.また,最高峰の学術論文に1編投稿中である.2発話間変動を考慮した音声合成法の検討人間の音声生成はランダム性を有するため,同一のテキスト・感情を持つよう意図して発話したとしても,同一の音声を生成することは不可能である.典型的な音声合成は,入力テキストに対して合成音声を一意に定めるため,自然音声のようなランダム性を有さない(例えば,テキスト読み上げサービスは多々存在するが,同じテキストを入力すると完全に同一の音声を生成する.).ここでは,このランダム性を再現するように,moment-matching neural networkに基づく音声合成法を提案し,音質に関する評価を行った.その結果,従来の方法と比較して音質を劣化させるように,発話間変動を付与できるようになった.当初は,概要1のみの進捗を予定していたが,概要2の成果も報告できたため.H29年度は,ボコーダと呼ばれる従来の音声生成を用いないボコーダフリー音声合成における制約の獲得を実施した.音声合成の学習には,前年度に確立したアルゴリズム(以降,敵対的音声合成)を利用した.さらに,音声なりすましを利用した合成方式について検討した.・音声波形ドメインにおける特徴量の設計音声波形から得られる特徴量(例えば,スペクトル)は,音声パラメータ(例えば音高)から計算される制約よりも効果的であると予想される.しかしながら,スペクトルは高次元特徴量であるため,敵対的音声合成を直接適用することは困難であった.そこで,音声におけるフィルタバンク方式の考えを利用し,スペクトルを低次元圧縮することで,敵対的音声合成の適用を可能にした.敵対的音声合成の枠組みは,人間の自然音声と合成音声のパラメータ間の確率分布間距離最小化に相当する.本研究では,音声信号処理で利用されるKL距離・JS距離などの最小化を実験的に評価し,最終的に,Wasserstein距離最小化に基づく敵対的音声合成が最も高品質であることを明らかにした.・音声なりすましを利用した合成方式合成音声による音声なりすまし技術を利用して,音声合成の高度化を試みた.具体的には,自然音声と合成音声の識別に有効である変調スペクトル・動的特徴量を導入し,ボコーダフリー敵対的音声合成を高品質化した.その結果,音声なりすまし識別に有効な特徴量が,音声合成の高度化に有効とは限らないことを明らかにした.音声合成技術は,人工的に音声を合成する技術である.合成音声の品質を改善するために,本研究では,敵対的学習を用いた統計的音声合成法を提案した.音質劣化の主要因は,音声パラメータの過剰な平滑化により生じたものである.提案法の学習基準は,通常の基準と敵対基準の重み付き和で得られる.敵対的学習は,自然・合成音声の分布間距離を最小化するため,過剰平滑化を効率的に緩和できる.実験的評価から,(1)提案法はハイパーパラメータに対して頑健に働くこと,(2) Wasserstein距離最小化に基づく提案法が,もっとも音質改善効果に有効であること,(3)ボコーダフリー音声合成に展開できることを示す.平成29年度は,音声波形ドメインにおける制約の設計,及び,特徴量分析区間の自動獲得を実施する.音声合成の学習には,前年度に確立したアルゴリズムを利用する.29年度が最終年度であるため、記入しない。音声合成29年度が最終年度であるため、記入しない。
イソプロピルリンゴ酸脱水素酵素の基質認識機構の解析

1)鉄酸化細菌由来3-イソプロピルリンゴ酸脱水素酵素の構造解析Thiobacillus ferrooxidans(Tf)より化学合成独立栄養細菌として初めて3-イソプロピルリンゴ酸脱水素酵素(IPMDH)遺伝子を大腸菌にクローニングし、本酵素の一次配列、諸性質、立体構造及び基質認識機構を解明した。Tf-IPMDHはその構造骨格及び代謝機構において、イソクエン酸脱水素酵素(ICDH)と類似性を示し、脱炭酸を伴う脱水素酵素という独特なグループに分類される。両酵素の基質間で異なるのは2R-リンゴ酸についているγ位の部分のみである。結晶構造解析の結果から本酵素が二量体を形成し、活性部位はサブユニットのドメイン1と2の狭間に存在することが判明した。活性部位を形成する残基は、ICDHの残基と基質のγ位を認識する部分を除き相同性が非常に高い。また、親水性残基であるGlu88が基質のイソプロピル基を認識する疎水性ポケットの形成に関与していた。我々はTf-IPMDHのγ位認識部位(Ala72Leu92)をEc-ICDHのγ位認識部位(Pro102Val116)に変換させることによって、イソクエン酸に対して活性のある変異酵素が作製できるのではないかと考えた。この実験では十数アミノ酸残基を置換するので、まず立体構造上、変異酵素が高次構造を形成できるのかを検討した。その結果、多少のループ構造のずれは生じるが、許容範囲内であったので研究を開始させた。現在変異酵素は大腸菌内で発現され、可溶性画分に回収することができている。Thiobacillus thiooxidans由来のNAD依存型ICDHの遺伝子を単離し,酵素の一次構造を明らかにするとともに,補酵素認識機構を解析した。本酵素のアミノ酸配列は、細菌由来NADP-ICDHまたはIPMDHと全般にわたり高い相同性を有し、Ec-ICDHと59.2%、Tf-IPMDHと22.6%の相同性を示した。また、α-ヘリックスやβ-ストランド等の推定二次構造を構成する領域がよく一致することから、Tt-ICDHが立体構造的にもこれらの酵素と非常に類似していることが予想される。一方、補酵素認識部位のアライメントの結果は、Tt-ICDHが、NADの認識に重要なAsp357を有する一方、NADP-ICDHに特徴的なNADP^+のリン酸を認識するチロシン残基を欠くことを示し、本酵素がIPMDHに類似の補酵素認識部位を有することが示唆された1)鉄酸化細菌由来3-イソプロピルリンゴ酸脱水素酵素の構造解析Thiobacillus ferrooxidans(Tf)より化学合成独立栄養細菌として初めて3-イソプロピルリンゴ酸脱水素酵素(IPMDH)遺伝子を大腸菌にクローニングし、本酵素の一次配列、諸性質、立体構造及び基質認識機構を解明した。一方、補酵素認識部位のアライメントの結果は、Tt-ICDHが、NADの認識に重要なAsp357を有する一方、NADP-ICDHに特徴的なNADP^+のリン酸を認識するチロシン残基を欠くことを示し、本酵素がIPMDHに類似の補酵素認識部位を有することが示唆された改変に用いるイソクエン酸脱水素酵素遺伝子(ICDH)にはE.coli K-12株由来と同一であるE.coli W3110株由来のICDHを用いた.基質認識部位を交換するにあたり,先ず基質複合体のX線結晶構癒解析の結果より示唆された3-インプロピルリンゴ酸脱水素酵素(lPMDH)の基質認識部位Ala72Leu

92,ICDHの基質認識識部位Pro102Val1116の直前直後に制限酵素(ScaI、BqlII)サイトを導入するために,T.ferrooxdans由来3-IPFMDHを挿入したプラスミドpKKleuBl(kawaguti11995),E.coliW3110由来ICDHを挿入したブラスミドpElC15を鋳型として,増幅用プライマー,変異導入用プライマーを用いたPCRにより各遺伝子に変異を導入した.ここで得た制限酵素部位を導入した酵素遺伝子をLeuB SB mutant,ICDH SB mutantとした.次に先に作成したLeuB SB mutantを大腸菌内で発現させるために,ベクターpKK223-3MCSのEccR1,Pst1サイトにライゲーションを行い,JM109を形質転換した.形質転換体から抽出したプラスミドをpKKleuB1 SB mutantとした.また交換のためのICDHの基質認識部位を得るために,ICDH SB mutantを鋳型として変異導入用プライマーを用いたPCRにより増幅させ,目的断片を獲得した。次にpKKleuB1 SB mutantを制限酵素ScaI,BalIIで処理することによりleuB遺伝子から基質認識部位を除去し,先に作成したICDHの基質認識部位と,ライゲーションを行い,同様にJM109を形質転換した.この形質転換体から得たプラスミドをpKKleuB1SIE mutantとした。確認のシーケンスはまだ行っていない.以上のことから基質認識部位を交換したことにより,pKKleuB1 SIE mutantから作られる変異酵素の基質特異性は3-IPMからICへと大きく変化したことが示唆された。今後,シーケンスによる変異導入の確認,変異酵素の精製及び結晶化,X線結晶構造解析を行っていく予定である.昨年、本研究室で作成したプラスミドpKKleuB1 SIE mutantを含む大腸菌に変異活性があり、基質特異性が3-IPMからICへ変化したと報告したがあのデータには再現性が無かったためもう一度変異酵素遺伝子を作ることにした。その方法にはleuBと4つのプライマー(増幅用;P1,P4変異導入用;P2,P3)を必要とし、まずP1,P2を用いてイソクエン離脱水素酵素(ICDH)の基質認識部位とその上流断片を作成した。このような断片を作成できたのは、P2の3'側がICDHの基質認識部位(Pro102Val116)をコードしているためである。同様に、P3,P4を用いてICDHの基質認識部位とその下流断片を作成し、その2つのPCR産物を基質認識部位でアニーリングさせ伸長・増幅を行い、変異酵素遺伝子(leuB mut)を作成した。leuB mutは確認のシーケンスにより間違いなく作成されていた。形質転換体HB101-pKKleuB1 mut及びJA221-pKKleuB1 mutは共に宿主がleuB^-であるため、leucine^-の培地でコロニーが得られるかどうか試してみた。同様に形質転換体EB106-pKKleuB1 mutは宿主がicd^-であるから、glutamic acid-の培地でコロニーが得られるか試してみた。結果は両者とも1つもコロニーが得ることができなかったので活性が無いのではと示唆された。さらに、作成した形質転換体の3-IPMDH活性,ICDH活性を調べた所、共に予想通り活性は全く見ることができなかった。そこでSDS-PAGEを行い、pKKleuB
複合汚染環境における微生物遺伝子応答の網羅的解析と環境評価に関する研究

本研究では、複合汚染の現場生態系に及ぼす影響をより総合的に評価するため、環境微生物群の汚染物質暴露に対する遺伝子発現応答を網羅的に診断する手法の開発を目的とした。ヒ素等を含む汚染環境サンプルの解析では、汚染物質の毒性に対応して重金属耐性や代謝機能遺伝子の発現が検出された。それら遺伝子群の多くは複数の重金属類の輸送に関与しており、汚染に対応する指標マーカーとして有用である可能性が示唆された。汚染環境での物質動態や浄化には、環境中に存在する多種多様な微生物の活動が深く関わっており、汚染による現場生態系への影響を適切に評価するには、それら微生物群集の機能や応答を生態系レベルで解析することが必要である。そこで本研究では、環境微生物群の汚染物質暴露に対する遺伝子応答を網羅的に検出するため、最新の分子学的解析手法(メタトランスクリプトーム解析)を確立し、複合汚染の生態系に及ぼす影響をより総合的に評価する新たな手法としての有用性を検討する。21年度はヒ素などの有害物質を含む環境サンプルからのPyrosequencingによるシークエンス解析量の妥当性の検討、Bioinformatic解析手法の確立、そして特定されたターゲット機能遺伝子の環境中での発現定量手法の検討を行なった。初期解析の結果、比較的微生物群集構造の単純な環境サンプルの場合、およそ4Mb程度のシークエンス解析量で、現場において優位に発現している機能遺伝子群の特定が可能であった。また、得られた全トランスクリプトームのおよそ93%がリボソーマルRNAであり、機能遺伝子発現解析の効率化には、試料調製段階におけるリボソーマルRNAの特異的除去が効果的である事が示された。環境サンプル中で発現の確認された機能遺伝子グループとしては、エネルギー生成・代謝や鞭毛タンパク質など微生物の生命維持活動に関わる機能に加えて、重金属耐性や代謝のような暴露に対する特異的応答と考えられる機能も検出された。これらの結果より、メタトランスクリプトーム解析を用いた汚染環境生態系における機能の特異性及び多様性解析手法としての有用性が示された。本研究では、環境微生物群の汚染物質暴露に対する遺伝子応答を網羅的に検出する手法(メタトランスクリプトミクス)を確立し、複合汚染の現場生態系に及ぼす影響をより総合的に評価することを目的としている。22年度は、新規に採取したヒ素やセレン等の有害元素を含む塩湖の底泥及び周辺土壌を用いて、メタトランスクリプトーム解析用試料調整の検討を行った。環境サンプルを現場でLifeGuard(MoBio)とRNAlater(ABI)のRNA保存剤に採取し、室温で約7日間保存後RNA抽出時まで-20度で冷凍保存したところ、同一サンプルの比較においてLifeGuardで保存したサンプルは約10倍高いRNA収量を示した。環境RNAをランダムプライマーにより逆転写し、次世代シーケンサーで直接解読したところ、得られた全配列(約30Mb)のおよそ94.5%はリボソーマルRNAであった。rRNAの系統解析により、現場環境ではBacteriaが優位に存在し特に好塩・好アルカリ菌であるHalomonasやBacillusの活性が高いことが示されたが、機能遺伝子発現解析の効率化にはrRNAの特異的除去に向けてさらなる工夫が必要である。データベース解析により、全トランスクリプトーム中3.5%の配列が機能遺伝子として特定された。環境サンプル中で発現の確認された機能遺伝子グループとしては、エネルギー生成・代謝やタンパク質合成など微生物の生命維持活動に関わる機能に加えて、重金属耐性や代謝のような暴露に対する特異的応答と考えられる機能も検出された。21年度に解析したヒ素等の重金属を含む高温温泉群のトランスクリプトーム比較解析においても同様の機能遺伝子群の特異的発現が検出されたことから、これらの遺伝子群は有害元素複合汚染特有の毒性に対応する指標マーカーとして有用である可能性が示唆された。
交渉過程における決定分析の適用とそのコンピュータ・ソフトの利用

交渉過程の論理を決定分析によって構造化し、パソコンを用いて実際に適用できるような試みを行うこがこの研究の目的である。その前提として、交渉をグループの意思決定と考えて論を進める。「交渉はグループ間に存在する問題を何らかの形で解決すること」であり、グループ間に合意が得られたとき問題は解決したと考える。その意思決定における論理として決定分析を用いる。まず、問題解決をどのような価値観および価値の基準に基づいて考えているかを引き出す。その方法として価値焦点思考により価値の木を描く。それによって、交渉当事者として問題をどのような関心事項に基づいて解決したいと考えているのかが明確になる。ついで、交渉に当たって相手方に提示する提案を作成する。これは、先に求めている関心事項を満足させる形として捉えられねばならない。また、関心事項をどれぐらい満足させるものであるかによって、最も望ましい提案から限界として許容できるものまで表わすことが求められる。そうすれば、交渉に当たって提案していく順序を把握しておくことが可能となるからである。また、相手方の行動も、その価値観を想定し、当方と同様の手順で交渉を進めてきているとするなら、妥協点を推定することができることになる。このコンピュータ・ソフトとしてHIVIEWおよびLogical Decisionsがよい。交渉にあったっては合意に至らないときのことも考えておくことが重要である。いわゆる代替案で、それらもさきの関心事項を満たす必要がある。そのなかで最も大きい満足感を与えてくれるものをBATNAという。これに対してのソフトはDPL、Tree Age等が用いられる。交渉は対峙する2以上の個人,グループ,組織が相互に共有する問題を,各々の観点から解決する過程である.従って,意思決定の論理を考える決定分析によって交渉の論理を考察することは,交渉の論理を構築する1つの方法になると考えられる.また,決定分析の領域で近時開発されてきたパソコン・ソフトを適用することは,その論理を現実の問題解決への適用と結びつける方法への糸口にもなると考える.この観点から,第1年度の研究は,決定分析の論理を交渉とどのように結びつけていくかを考えること,および,コンピュータ機器の設置と決定分析用のパソコン・ソフトの一部(今年度はHIVIEW)に習熟することにあてられた.交渉を処方箋的意思決定(prescriptive decision making)として考えるとき,実際的に行われた意思決定を記述する研究を行っても得られるものは多くない.また,教育の場で交渉を考えるとき重要なことは,いかに十分な準備をするかを教えることにある,とハ-ヴァード大のライファ教授は述べている.ここに,システム的に交渉をとらえることとして決定分析を適用する意義があると考え研究は進められている.交渉の準備に当っては,考えられなければならない7つの要因がある.(1)関心事,(2)選択案,(3)代賛案,(4)正当性,(5)コミュニケーション,(6)良き関係,(7)コミットメント,である.このうち交渉の論理の核となるのは(1)(3)であり,そこには論理的な考え方が要求される.決定分析の適用もここにあるという立場から,問題の関心事はどこにあるのかを「価値の木分析」によって把握し,「多属性効用理論」によってそれを計量化することを試みる.それを基にして,いかに選択率を作っていくかを考える,という段階までを第1年度の研究として行っている.交渉は対峙する2以上の個人,グループ,組織が相互に共有する問題を,各々の観点から解決する過程である.従って,意思決定の論理を考える決定分析によって交渉の論理を考察することは,交渉の論理を構築する1つの方法になると考えられる.また,決定分析の領域で近時開発されてきたパソコン・ソフトを適用することは,その論理を現実の問題解決への適用と結びつける方法への糸口にもなると考える.この観点から,第1年度の研究は,決定分析の論理を交渉とどのように結びつけていくかを考えること,および,コンピュータ機器の設置と決定分析用のパソコン・ソフトの一部(今年度はHIVIEW)に習熟することにあてられた.交渉を処方箋的意思決定(Prescriptive decision making)として考えるとき,実際的に行われた意思決定を記述する研究を行っても得られるものは多くない.また,教育の場で交渉を考えるとき重要なことは,いかに十分な準備をするかを教えることにある.とハ-ヴァード大のライファ教授は述べている.ここに,システム的に交渉をとらえることとして決定分析を適用する意義があると考え研究は進められている.交渉の準備に当っては,考えられなければならない7つの要因がある.(1)関心事,(2)選択案,(3)代替案,(4)正当性,(5)コミュニケーション,(6)良き関係,(7)コミットメント,である.このうち交渉の論理の核となるのは(1)(3)であり,そこには論理的な考え方が要求される.決定分析の適用もここにあるという立場から,問題の関心案はどこにあるのかを「価値の木分析」によって把握し,「多属性効用理論」によってそれを計量化することを試みる.それを基にして,いかに選択案を作っていくかを考える.という段階までを第1年度の研究として行っている.交渉過程の論理を決定分析によって構造化し、パソコンを用いて実際に適用できるような試みを行うこがこの研究の目的である。

その意思決定における論理として決定分析を用いる。まず、問題解決をどのような価値観および価値の基準に基づいて考えているかを引き出す。その方法として価値焦点思考により価値の木を描く。それによって、交渉当事者として問題をどのような関心事項に基づいて解決したいと考えているのかが明確になる。ついで、交渉に当たって相手方に提示する提案を作成する。これは、先に求めている関心事項を満足させる形として捉えられねばならない。また、関心事項をどれぐらい満足させるものであるかによって、最も望ましい提案から限界として許容できるものまで表わすことが求められる。そうすれば、交渉に当たって提案していく順序を把握しておくことが可能となるからである。また、相手方の行動も、その価値観を想定し、当方と同様の手順で交渉を進めてきているとするなら、妥協点を推定することができることになる。このコンピュータ・ソフトとしてHIVIEWおよびLogical Decisionsがよい。交渉にあったっては合意に至らないときのことも考えておくことが重要である。いわゆる代替案で、それらもさきの関心事項を満たす必要がある。そのなかで最も大きい満足感を与えてくれるものをBATNAという。これに対してのソフトはDPL、Tree Age等が用いられる。
個体への簡便で効率的な遺伝子導入法の確立

[序論]我々は簡便なtransgenicマウスの作製を目的に、マウス精巣へDNAを直接注入し、このDNA注入♂マウスと♀マウスとの交配により外来性DNAが精子を通じ、胎仔へ伝達されるかどうかを検討して来た。その結果、外来性DNAが受精を通じ、高率(50-90%)に卵側(F0世代)へ伝達されるものの、外来性DNAは1細胞当たり1copy以下であり、また、その遺伝子発現も検出されなかった。今回、幾つかの市販されている遺伝子導入試薬を検討することにより、本法における導入遺伝子コピー数の増加、遺伝子発現の可能性を検討した。<序論>トランスジェニックマウス(Tg)の作製及びその解析は、遺伝子の生体における機能の探索、疾患モデル動物の作製、等の観点から、分子生物学の分野において今や必須のテクノロジーとなっている。このTgを得る方法としては、micropippeteを用いた受精卵核へのDNAの顕微注入法(MI法)が最も広く採用されている。しかし、この方法は、効率性が低く、しかも操作性は決して容易ではない。我々は、このMI法に代わる簡便で且つ効率的な方法を探索して来たが^1、今回、マウス精巣へ直接外来性DNAを注入することにより、精巣内精子に外来性DNAを取り込ませ、その形質転換を受けた成熟精子が受精を通じ、卵側へ外来性DNAを伝達し、最終的にTg卵、ひいてはTg個体の作製が可能ではないかと考え、以下のような実験を組み、その可能性を検討した。<方法>外来性DNAとして大腸菌由来β-galactosidase遺伝子(β-gal)あるいはヒトアミロイド前駆体蛋白C末端側をコードするcDNA(NORβと呼ぶ)を内蔵するプラスミドの2種を用いた。いずれの遺伝子あるいはcDNAもその発現は、cytomegalovirus enhancer/ニワトリβ-actin promoter[宮崎純一博士(阪大)からの供与]により制御されている。これらDNAを環状のままLipofectin^<TM>reagent(GIBCO BRL社)と複合体(1個の精巣当たり40μl)を作らせ、これを30ゲージの注射針にてICR雄マウス(生後10-15週齢)精巣の深部へゆっくり注入した。注入後、2日目から5日目まで連続して発情期ICR雌と交配させた。発生した妊娠中期胚からgenomic DNAを単離し、PCR-Southern法にて外来性DNAの存在を調べた。<結果/考察>注入後2日目で交配して得られた胎仔の最高で91%が外来性DNAを保持していた。しかし、注入後の時間経過に従い、胎仔の外来性DNA保持率は低下した。外来性DNAは、1細胞当たり1copy以下であった。妊娠中期胎仔における外来性DNAの発現は残念ながらRT-PCR法、lacZ発現検出のための組織化学的検索をもってしても見られなかった。以上の結果から、1)1回のDNA注入でマウス子孫への遺伝子伝達が可能であること、2)外来性DNAはマウス胎仔組織では、キメラ状に存在している可能性があること、等が結論として得られた^2。<展望>今後の課題としては、導入遺伝子の発現を現出させるための条件(多コピーの遺伝子を導入出来る条件等)を探索すること、次世代への遺伝子の伝達性を調べること、導入遺伝子の組織局在性を調べること、等が挙げられる。〈序論〉我々は簡便なtransgcnicマウス作製を目的に、マウス精巣へDNAを直接注入し、このDNA注入♂マウスと♀マウスとの交配により外来性DNAが精子を通じ、胎仔へ伝達されるかどうかを検討して来た。その結果、リポソーム(Lipofection;GIBCO BRI.社)/DNA複合体をマウス精巣へ単回注入することにより、外来性DNAが受精を通じ、高率(50-90%)に卵側(FO世代)へ伝達されることを明らかにした。しかしながら、外来性DNAは1細胞当たり1 copy以下であり、また、その遺伝子発現も検出されなかった(昨年度報告)。そこで今回、他の市販リポソームを検討することにより、導入遺伝子コピー数の増加、遺伝子発現の可能性を検討した。また、F0マウスへ導入された外来性DNAがF1,F2世代へ伝達されるかどうかも検討した。〈方法〉外来性DNAとしてpCAGGS-lacZ plasmidを用いた。遺伝子導入試薬としては、非リポソーム系のFuGENE6(BeohringerMannheim社)及びSuperFect(Qiagen社)の2種を用いた。DNAと遺伝子導入試薬との複合体作製及びDNAと遺伝子導入試薬との比率は、おおよそ製造元のprotocolに従った。1個の精巣当たり6μgの直鎖状DNAを43μgの容量にて精巣の深部へ注入した。具体的な精巣へのDNA導入方法は昨年度の報告に依った。〈結果/考察〉1)初期胚盤胞(F0世代)のX-Gal(lacZ遺伝子の基質で、細胞内にlaeZ活性があると基質が青く変化)による組織化学的染色では、FuGENE6及びSuperFectいずれを用いた場合でも20-70%の率で弱い染色性が認められた。Lipofectinの場合、染色性は上記2種の試薬に較べ、10%以下と低率で、しかも染色性は非常に弱かった。2)しかし、妊娠巾期胚(F0)では、どの遺伝子導入試薬を用いても明確なlacZ活性は認められず、また、RT-PCR解析によるmRNA発現も認められなかった。