hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
SLAPP訴訟における当事者救済に関する基礎的研究

本研究は、我が国において未だ学術的研究が十分に行われていないSLAPP訴訟(Strategic Lawsuit Against Public Participation)について、民事訴訟法学・憲法学の観点から実態を解明し、被告となった者の具体的な救済手段を理論的に明らかにすることを目的とする。研究計画の段階で、本研究の目的を達成するためには、SLAPP訴訟への対策が法制度・実務の両面で最も充実している米国カリフォルニア州にて調査・資料収集を行うことが有益であると考えた。平成30年度は、研究計画に基づき、カリフォルニア州において資料収集を行った。収集資料を分析の結果、カリフォルニア州の反SLAPP法の効果および運用に伴う実務的な課題を発見することができた。具体的には、1正式事実審理前協議(pretrial conference)を含む訴訟過程における訴訟技術上の問題、2裁判所における紛争解決の遅滞に関する問題、3被告の費用負担の問題、4判決書の送付に付随する手続上の問題などが存在することが明らかとなった。平成30年度は、4の問題に関連して、カリフォルニア州の民事訴訟における送達手続が事件の発端となった平成31年1月18日最高裁判所第2小法廷判決裁判所時報1716号1頁を題材に、民事訴訟における手続的公序について考察した論文を執筆した。4の問題を中心に論じたSLAPP訴訟に関する先行研究は乏しく、独自の視点を提供する論考を執筆することができたという点で、一定の意義のある成果を出すことができたと考える。研究機関の変更等の事情により論文の提出にやや遅れが生じたものの、本年度中に脱稿することができた。資料の収集と課題の検討について、研究計画どおり実施することができた。次年度は、上記問題の1から3についても考察を進め、米国におけるSLAPP訴訟の実態を明らかにするのみならず、我が国の民事訴訟手続において想定される問題を解決するための方法を理論化することを目指す。近年、我が国において、情報・資金・組織などの面で圧倒的な力を持つ者が原告となり、必ずしも訴訟上の勝利を目的とせず、個人などに対して訴訟を提起するという事態が生じている。原告の目的は、莫大な損害賠償請求をすることにより、被告の表現の自由や被告の原告に対する社会的活動を事実上封殺することにある。このような訴訟を、米国ではStrategic Lawsuit Against Public Participation(SLAPP訴訟)という。本研究は、我が国においては未だ学術的研究が行われていないSLAPP訴訟について、民事訴訟法学・憲法学の観点から実態を解明し、被告となった者の具体的な救済手段を理論的に明らかにすることを目的とする。平成29年度は、研究の第一段階として、国内判例の検討を行った。また、平成30年度に米国カリフォルニア州において実施を予定している研究調査に向けて、SLAPP訴訟に関する議論の基盤となる米国の判例・学説の分析を進めた。加えて、米国各州における反SLAPP法に関する資料の収集も行った。研究計画段階で予想したとおり、米国においては、SLAPP訴訟は「運動弾圧型」「言論制圧型」「運動予防型」「証拠収集型」のように目的や機能によって分類され、それぞれの型に対して個別の検討が行われていることが明らかになった。平成29年度は、この米国の分類方法を参考に、我が国における裁判事例を類型化し、本研究の遂行の基礎を確立することができた。所属研究機関の変更などの事情により、予定されていた論文の発表が次年度に持ち越されることになったが、研究そのものの進捗に問題はなかったため。研究計画どおり、平成30年度は、米国カリフォルニア州において研究調査を実施し、その結果を論文としてまとめる予定である。計画時よりも安価に購入することができた書籍があったため。次年度の物品費として使用する予定である。
局所損傷センシング技術に基づく被災建物の構造インテグリティ評価

建物の局所損傷の評価に基づいて,従来の建物全体の振動特性の変化による損傷推定と一線を画した精度の高い健全性判定システムの構築に取り組んだ.その開発環境として,地震による局所損傷の進行および微小振動に励起される固有振動,を同時に再現する実験装置を考案した.鋼骨組の梁端部の破断量を定量的に評価する損傷指標を定式化し、それに基づいて建物の数値モデルに損傷を反映するモデル更新手法を確立した。損傷を反映した建物モデルの数値解析を実施し,損傷による建物全体の耐力の低下度を精度良く推定できることを実証した.本研究の成果により,極大地震後の建物継続利用判定の精度と分解能の向上が期待される.建物内で日常的に観測される微小振動を利用して,柱梁接合部などの建築構造システムの部分構造(以下,サブストラクチャ)の局所損傷を追跡するセンシング技術の開発している.具体的な課題として,1)地震による局所損傷の進行および微小振動の変化,を同時に評価できる開発環境の整備,2)局所損傷評価指標の提案と実験的検証,3)損傷入り建物モデルの数値解析による残余耐震性能の定量化,を挙げている.初年度の本年度は,外国人特別研究員1名,大学院生3名および学部生1名の参画をえて,主に課題1)と2)に取り組んだ.具体的な成果を以下に報告する.課題1)に関連して,サブストラクチャにおいて,地震による局所損傷の進行および微小振動に励起される固有振動の関係を実験室内で簡易に評価する装置を製作した.本装置は,(a)系全体に地震による水平力を作用させ,破断などの局所損傷を再現する準静的載荷試験と,(b)系全体を振動させ,建物固有振動モードを励起する動的載荷試験を,交互に繰り返すことができる.中層鋼構造の柱梁接合部試験体を対象に,損傷評価振動試験を実施した.結果,柱梁接合部近傍では,動ひずみ応答により推定できる各部材の応力負担率が,局所損傷の進行とともに顕著に変化することを確認した.課題2)では,課題1)の結果に基づき,鋼部材の破断量を直接推定する局所損傷評価指標を提案した.提案指標は,適切に信号処理した動ひずみ応答の実効値(時間平均値)が鋼梁端部の破断に伴い単調的に低下することを利用し,実効値の低下度から破断面の断面欠損量を推定する.数値解析および試験結果において,その有用性と安定性を確認した.一方で,提案指標は対象端部の損傷のみならず,近傍の大きな損傷の影響を幾らか受けることがわかった.これについては,次年度の検討課題とする.建物内で日常的に観測される微小振動を利用して,柱梁接合部などの建築構造システムの部分構造(以下,サブストラクチャ)の局所損傷を追跡するセンシング技術の開発している.具体的な課題として,1)地震による局所損傷の進行および微小振動の変化,を同時に評価できる開発環境の整備,2)局所損傷評価指標の提案と実験的検証,3)損傷入り建物モデルの数値解析による残余耐震性能の定量化,を挙げている.最終年度の本年度は,外国人特別研究員1名,大学院生3名および学部生1名の参画をえて,主に課題2)と3)に取り組んだ.具体的な成果を以下に報告する.課題2)に関連して,初年度に提案した鋼部材の破断量を直接推定する局所損傷評価指標の検証においては,課題の一つとして,近傍の大きな損傷が評価の対象とする梁端の損傷評価指標への影響があがった.そこで複数の梁端破断が骨組内のモーメント分布に及ぼす変化を評価する相互影響行列を構築し,その逆行列を利用した各損傷の独立評価法を提案するとともに,数値解析と骨組の振動台実験を通してその妥当性を実証した.さらに課題3)に関連して,相互影響を取り除いた損傷指標に利用して数値解析モデルに梁端の損傷を反映し,更新した解析モデルの静的解析によって骨組の耐力低下度を推定した.本研究では,一連の課題1)3)への取り組みを通して,被災した鋼骨組の残存耐震性能を精度よく評価するシステムを構築し,実測データからでは同定が困難な,骨組の耐力低下度の推定を可能とした.建物の局所損傷の評価に基づいて,従来の建物全体の振動特性の変化による損傷推定と一線を画した精度の高い健全性判定システムの構築に取り組んだ.その開発環境として,地震による局所損傷の進行および微小振動に励起される固有振動,を同時に再現する実験装置を考案した.鋼骨組の梁端部の破断量を定量的に評価する損傷指標を定式化し、それに基づいて建物の数値モデルに損傷を反映するモデル更新手法を確立した。損傷を反映した建物モデルの数値解析を実施し,損傷による建物全体の耐力の低下度を精度良く推定できることを実証した.

本研究の成果により,極大地震後の建物継続利用判定の精度と分解能の向上が期待される.初年度の本年度は,当初の計画どおり,1)地震による局所損傷の進行および微小振動の変化,を同時に評価できる開発環境の整備,2)局所損傷評価指標の提案と実験的検証,に取り組んだ.いずれの課題も順調に進展しており,研究計画の変更はない.建築耐震工学最終年度では,昨年度に実施した課題1)と2)を継続するとともに、3)に取り組み本研究の結実を図る.また初年度の成果により,損傷評価の対象とする鋼梁端部の近傍に大きな損傷が存在する場合には,損傷評価指標として提案する動ひずみ実効値は対象断面の欠損のみならず,近傍の損傷の影響を少なからず受けることがわかった.最終年度では,鋼梁に床スラブが打設されている場合の柱梁接合部損傷の定量化,および複数の損傷がある場合に損傷度評価の精度を向上する手法の提案,にも取り組みたい.
応用演奏力を育むための即興表現教育プログラムの開発

即興演奏を身近な音楽表現行為の一つとして実践することにより、現代の音楽人、特に教育指導に携わる人材にとって必要不可欠な応用演奏能力とは何かを究明し、その教育プログラムを開発することを目的とする。特に、クラシックを中心に音楽を学んできた多くの人々に、その学習過程で身につけた技術や表現力を柔軟に用いて「音楽的に遊ぶ」楽しみと重要性を明らかにし、教育現場で使える導入的なものから段階的に応用的なものへと繋がっていくシステム構築を目指す。特に応用演奏能力の養成に関わる「即興演奏を生かした教育プログラムの提示」の内容を発展させ、それぞれの教育システムを構築し、演奏データを蓄積する。データー収集については、ニューヨーク市立図書館、ジュリアード音楽院、ニューヨークフィルハーモニー(以上、ニューヨーク)、バークリー音楽院(ボストン)等において行った。30年度の大きな成果としては、「応用演奏プログラム」における応用演奏力を磨くためのDuetによる実践を中心に、これまでの収集した資料から抽出・開発し、実践できたことである。(例:名曲の和声構造を引用した即興実践、Pandiatonic(旋法指定)による即興実践、モチーフによる即興実践等)。専門の演奏家や若手作曲家の協力を得て、実際に構築したシステムに基づいた即興演奏を行い、検証も順次初めている。この結果を日本音楽表現学会第16回大会にて発表し、継続検証している。自身の即興実践としては、演奏家との研究協議(相愛大学、東京音大、バークリー音楽院等)で行った即興演奏の収録、及び、文化庁大学を活用した芸術文化推進事業の企画コンサートにおいて即興演奏を含む自作品の自演発表を行った(批評が音楽表現学Vol.16 p.64-67に掲載された)。附属中校長、及び全国国立大学附属学校連盟理事長、日本教育大学協会副会長等を併任しており、その公務多忙の関係でスケジュール調整が付かず、当初予定していた第2回のドイツ出張(構築したシステムの試演・録音や補完データ収集)を、昨年度に続き31年度に回す結果となった。しかし、先行研究において得た情報網を通じて、ハンブルグ国際音楽大学、相愛大学、ヤマハ音楽研究所など多方面からの協力体制を確保してあり、データ収集等の補完作業は時間を要しても完了する事ができる。一方、ジャズ・ポピュラー音楽における即興演奏先進国であるアメリカにおける事例研究、及び実践討議を行い、ヨーロッパにおける比較という点で大きな成果を得た。なお、開発した即興演奏プログラムの実証実験(試演・発表)は、国内で予定している分については予定順調に進んでおり、今後も継続的に行う予定である。1)昨年度行うことができなかったドイツでの補完データ収集を行い、応用演奏プログラムの未完部分の構築を進める。2)昨年度アメリカにて得た研究事例を加味し、より応用力のある指導・実践システムとして可能な限り更新し、プログラム全体の精度を高める。3)「応答演奏プログラム」では、特にドイツ古典時代の即興指導実践例を研究し、それを2台のピアノによるトレーニング・プログラムに取り入れ、即興初心者にも効果的なシステムとして構築する。4)現代の演奏家(専門家)に自発的な即興表現を行う機会を増やすために、自作品における即興表現場面を含む政策の可能性を追求し、それに基づいた作品発表・演奏発表を行う。5)それぞれの即興システムの実践・検証結果を元に、「現代の教育における必要な即興指導プログラム」として纏め、学生の協力を得て、半期(15コマ)分のシステムを即興ゼミにおいて実践し、検討を行う。特に教育指導に携わる人材にとって必要不可欠な応用演奏能力の養成に関わる「即興演奏を生かした教育プログラムの提示」の内容を発展させ、「集団即興プログラム」「創作演奏プログラム」「応用演奏プログラム」に含まれるそれぞれの教育システムを構築し、演奏データを蓄積する。データー収集については、シェーンベルグセンター(ウィーン)、及びコダーイ博物館、バルトーク記念館(ハンガリー)等において行った。26年度の大きな成果としては、「創作演奏プログラム」の形式に基づく即興演奏の教育システムに「応用演奏プログラム」に含まれる《既成の作品を応用して(即興的に変化させて)音楽的流れに乗った演奏を即興的に試みる》をリンクさせたプログラムを開発し、試験的に実践できたことである(例:「野ばら」を既存のソナチネ等の作品を下敷きにして応用的に即興演奏するシステム)。この結果を日本音楽表現学会第14回大会(2016.6.4)にて発表し、さらに、音研スコープVol.5(ヤマハ音楽研究所)にも掲載された。自身の即興実践としては、「Metamorphosis III Stagea-Ver.」(2016,7,15、両国門天ホール、即興表現を内在させた自作品を発表)、及び「第2回tortueコンサート」(ヤマハなんばセンター「アルモニー」、音列によりピアノ即興演奏を自演)を行った。研究全般の進捗状況は予定通りである。当初予定していたドイツにおけるシステム構築やその試演・録音のためのデータ収集が、大学の重要委員会委員長の校務との関わり、及び先方とのスケジュール調整が付かず、29年度以降に回す結果となった。しかし、上述のようにウィーン及びハンガリーでのデータ収集は大変貴重な成果を得た(その分の出張旅費の差額を繰り越すこととなった)。

上述のシステム構築やその試演・録音は本研究の中で最も重要な作業である。計画では28年度から2年間を予定しており時間的余裕を充分確保してあるが、収集先の都合やデータ処理にかかる日数などの点で、現時点における時間的予測が明確ではない。しかし、先行研究において得た情報網を通じて、ハンブルグ国際音楽大学、相愛大学、ヤマハ音楽研究所など多方面からの協力体制を確保してあり、時間を要しても完了する事ができる。万一遅延が生じても、29年度計画の内容とは平行して行うことが可能であり、研究に支障は無い。学会発表や即興実践演奏等の発表は順調に行っており、今後も継続的に行う予定である。即興演奏を身近な音楽表現行為の一つとして実践することにより、現代の音楽人、特に教育指導に携わる人材にとって必要不可欠な応用演奏能力とは何かを究明し、その教育プログラムを開発することを目的とする。特に、クラシックを中心に音楽を学んできた多くの人々に、その学習過程で身につけた技術や表現力を柔軟に用いて「音楽的に遊ぶ」楽しみと重要性を明らかにし、教育現場で使える導入的なものから段階的に応用的なものへと繋がっていくシステム構築を目指す。特に応用演奏能力の養成に関わる「即興演奏を生かした教育プログラムの提示」の内容を発展させ、それぞれの教育システムを構築し、演奏データを蓄積する。データー収集については、バッハ博物館(ライプチヒ)、チェコ音楽博物館(プラハ)、及びベルリン楽器博物館(ベルリン)等において行った。29年度の大きな成果としては、「応用演奏プログラム」における応用演奏力を磨くためのトレーニングの手法を、これまでの収集した資料から抽出・開発し、実践できたことである(例:Beethoven《テンペスト》のモチーフ、Mozart《Pf.Sonata K.545 C-dur》第1楽章の終結素材、《Pf.Sinata K.457 c-moll》第1主題のモチーフによるDuet即興等)。この結果を日本音楽表現学会第15回大会にて発表し、継続検証している。自身の即興実践としては、ピアノ連弾による音列即興演奏(「第3回tortueコンサート」)、及び即興演奏を含む自作品の自演発表(「ドン・キホーテ」「コムソーヤの冒険」「Metamorphosis IV」)を行った。研究全般の進捗状況は予定通りである。附属中校長、及び全附連副理事長等を併任することになり、その関係でスケジュール調整が付かず、当初予定していた第2回のドイツ出張(システム構築やその試演・録音のためのデータ収集)を、30年度に回す結果となった。しかし、第1回(9月)におけるデータ収集は大変貴重な成果を得た(その分の出張旅費の差額を繰り越すこととなった)。このシステム構築やその試演・録音は本研究の中で最も重要な作業であり、当初は28年度から2年間を予定していた。
共鳴X線散乱法によるトロイダルモーメントの観測

K吸収端のプリエッジ領域は空間反転対称性の破れに対して敏感であることから、共鳴X線散乱によってプリエッジ領域のスペクトルを測定することにより、強誘電性分極やトロイダルモーメントなど空間反転対称性の破れた多極子の秩序構造を解明する手法に関して研究・開発を行った。本研究では、時間反転と空間反転が同時に破れている多極子であるトロイダルモーメントの観測をするため、共鳴X線散乱を用いた異方テンソル感受率(ATS)散乱法による測定手法の開発を目的としている。対象とする磁性イオンのK吸収端のX線エネルギーにおいて、プリエッジ領域に発現する禁制反射のアジマス角依存性を測定し、その対称性からトロイダルモーメントの検出を試みる。実際に観測される散乱強度のアジマス角依存性にはいくつも遷移過程による原子散乱因子が重畳してくるので、トロイダルモーメント由来の散乱因子のみを検出することは困難である。本研究では、磁場・電場下でATS乱法を行うことによってトロイダルモーメント由来の原子散乱因子を抽出することを試みた。反強的にトロイダルモーメントが秩序していると期待されるヘマタイトα-Fe2O3において共鳴X線散乱実験を行った。その結果、反転中心に破れに由来した共鳴X線散乱信号がFeのK吸収端でのプリエッジ領域に観測できた。散乱強度のアジマス角依存性を磁場の方位を変化させ測定することにより、測定された共鳴X線散乱信号から結晶場によるATS成分、共鳴磁気散乱成分を分離することで、トロイダルモーメントに由来した信号成分を測定することができた。これにより反強的に秩序したトロイダルモーメントを観測できたことになり、そのモーメント方向を決定できることを確認した。また、そのトロイダルモーメントが外部磁場によって制御できることも明らかにした。本研究では、時間反転と空間反転が同時に破れている多極子であるトロイダルモーメントの観測するため、共鳴X線散乱を用いた異方テンソル感受率(ATS)散乱法による測定手法の開発を目的としている。本年度は、特に強誘電性転移に伴う空間反転対称性をK吸収端のプリエッジ信号から検出し、その偏光依存性から強誘電性分極の方位を決定する測定手法の開発を行った。近年、磁性イオンが変位することによって発現する磁性強誘電体の研究が盛んに行われている。軌道秩序に伴って原子変位が起こり、強誘電性が発現するPSMO/LSAT薄膜において、共鳴散乱測定を行いMnのK吸収端でのプリエッジ領域に強誘電性転移に伴う異常が発現することを発見した。この共鳴X線散乱では、入射X線の偏光が電気分極と平行の場合に異常が起こることをスペクトル計算との比較から明らかにし、本測定手法によって強誘電性分極の方位を決定できることを明らかにした。従来、強誘電性転移に伴う空間反転対称性を検出にSHG測定が行われてきたが、この方法では強誘電性分極のドメインを分離することができなかった。しかし、本研究での測定手法はX線回折を使うことによりドメインを分離して測定できるため、より正確な電気分極の方位を解明できると期待できる。今後、本手法は薄膜試料などの精密構造解析が困難な物質での電気分極を測定する強力なプローブとしての展開が期待できる。
高コレステロール血症家兎を用いた血管形成術後の血管内視鏡および病理学的検討

43羽の10ケ月齢の遺伝性高コレステロール血症家兎を用い、血管形成術は、大腿動脈を切開、2.5mm PTCA用バルーンカテーテルを総腸骨動派へ挿入、10気圧・60秒3回、60秒間隔で総腸骨動派に施行した。血管形成術施行1時間前より高用量群(tPA(H))ではtPA 3mg/kg、低用量群(tPA(L))ではtPA 0.6mg/kgを4時間で注入後、高用量群ではtPA 2mg/kg/24h、低用量群ではtPA 0.6mg/kg/24hを耳介静脈へ7日間持続注入した。血管形成術28日後に静脈麻酔後、開腹、腹部大動脈より末梢ヘカニューレを挿入し、ホルマリン潅流固定、PTA部の総腸骨動脈より切片を採取、H-E染色、Elastica van Gieson染色を施行した。血管内視鏡による所見は、血管内視鏡による血管形成術(PTA)部の観察をPTA直前、PTA2時間後に行った。ファイバースコープによるPTA部の血栓を血栓量の最も多い部位の視野で35mmフィルムに写真撮影した。血栓量は血栓の全視野に対する割合でスコアにして評価(血栓スコア)した。結果:組織病理所見は、PTA28日後の内膜は対照群0.50±0.25mm^2に比べてtPA(H)群0.07±0.11mm^2、tPA(L)群0.11±0.07mm^2でtPA群での内膜が有意に小さかった(それぞれp<0.01,p<0.05)。中膜、外膜はそれぞれ差はなかった。しかし、内膜・中膜比は対照群1.24±0.73に比べてtPA(H)群0.10±0.13,tPA(L)群0.21±0.19と有意に小さく(それぞれp<0.05)、狭窄率も対照群53±14%に対してtPA(H)群3±3%,tPA(L)群10±5%(それぞれp<0.01)と対照群に比べてtPA群で有意に小さかった。血管内視鏡所見は、血管形成術2時間後の血栓スコアは対照群2.6±1.4に対してtPA(H)群0.8±0.4とtPA群で血栓形成が有意に抑制されていた(p<0.01)。結論:組織プラズミノーゲン・アクチベータ-(tPA)7日間持続静注は血管形成術後の内膜過形成を防止することを実証した。冠動脈疾患治療の方法として確立されている経皮的冠動脈形成術(PTCA)において現在の最大の問題は再狭窄である。PTCA後の再狭窄はPTCAを施行した病変の約30-40%において発生する。本研究の目的は、ヘパリン,t-PAの投与によって血栓の傷害部への付着を防ぎ、成長因子遊出を阻止することによってPTCA後の再狭窄予防法になり得るかを血管内視鏡および病理学的手法を用いて検討した。方法は遺伝性高コレステロール血症家兎腸骨動脈に対して血管形成術を行ない、再狭窄モデルを作製した。大腿動脈から血管内視鏡を挿入し、総腸骨動脈の血管内視鏡施行。ガイドロラーテルにそってPTCA用バルーンカテーテルを総腸骨動脈へ導く。バルーン(直径2.5mm)拡大を10気圧・60秒を3回行う(60秒間隔)。バルーン拡張直後および2時間後に血管内視鏡で血管形成術部を視察する。終了後、ガイドワイヤー、バルーンカラーテルを抜去。術後、大腿動脈の血管縫合、創部の消毒、4週間後、右〓動脈切開後、X線透視〓〓大動脈造影用カラーテルを挿入、総腸管動脈遺影施行後、〓〓。左右総腸〓動脈摘出。摘出した動脈を10%ホルマリン〓にて〓流固定する。傷害部位、非傷害部位の組識をH-E染色、Elartica Van Giesen染色にて観察する。tPA 7日間投与および非投与群を作製したところ、tPA 7日間投与群では内〓〓形成が阻止され、tPA長期投与がPTCA後の再狭窄防止に有効な方法と考えられていた。

結果:組織病理所見は、PTA28日後の内膜は対照群0.50±0.25mm^2に比べてtPA(H)群0.07±0.11mm^2、tPA(L)群0.11±0.07mm^2でtPA群での内膜が有意に小さかった(それぞれp<0.01,p<0.05)。中膜、外膜はそれぞれ差はなかった。しかし、内膜・中膜比は対照群1.24±0.73に比べてtPA(H)群0.10±0.13,tPA(L)群0.21±0.19と有意に小さく(それぞれp<0.05)、狭窄率も対照群53±14%に対してtPA(H)群3±3%,tPA(L)群10±5%(それぞれp<0.01)と対照群に比べてtPA群で有意に小さかった。血管内視鏡所見は、血管形成術2時間後の血栓スコアは対照群2.6±1.4に対してtPA(H)群0.8±0.4とtPA群で血栓形成が有意に抑制されていた(p<0.01)。結論:組織プラズミノーゲン・アクチベータ-(tPA)7日間持続静注は血管形成術後の内膜過形成を防止することを実証した。目的:tPA7日間投与により血管形成術後の傷害部への血栓付着を阻止することによって内膜過形成を予防できるかを検討することである。方法:43羽の10ヶ月齢の遺伝性高コレステロール血症家兎を用い、血管形成術は、大腿動脈を切開、2.5mmPTCA用バルーンカテーテルを総腸骨動脈へ挿入、血管形成術を総腸骨動脈に施行した。高用量群(tPA(H))ではtPA3mm/kg、低用量群(tPA(L))ではtPA0.6mg/kgを4時間で注入、注入終了後、高用量群ではtPA2mg/kg/24h、低用量群ではtPA0.6mg/kg/24hを耳介静脈へ7日間持続注入した。血管形成術28日後にPTA部の総腸骨動脈より2-4ヶの切片を採取、H-E染色、Elastica van Gieson染色を施行した。血管内視鏡による所見は、高用量tPA注入群5羽、対照群15羽を用いて、血管内視鏡による血管形成術(PTA)部の観察をPTA直前、PTA2時間後に行った。ファイバースコープによるPTA部の血栓を血栓量の最も多い部位で視野を35mmフィルムに写真撮影した。血栓量は写真における血栓の全視野に対する割合でスコアにして評価した。結果:組織病理所見では、PTA28日後の内膜は対照群0.50±0.25mm^2に比べてtPA(H)群0.07±0.11mm^2,tPA(L)群0.11±0.07mm^2でtPA群での内膜が有意に小さかった(それぞれp<0.01,p<0.05)。中膜、外膜は対照群それぞれ差はなかった。しかし、内膜.中膜比は対照群1.24±0.73に比べてtPA(H)群0.10±0.13,tPA(L)群0.21±0.19と有意に小さく(それぞれp<0.05)、狭窄率も対照群53±14%に対してtPA(H)群3±3%,tPA(L)群10±5%(それぞれp<0.01)と対照群に比べてtPA群で有意に小さかった。血管内視鏡所見では、血管内視鏡で血管形成術施行部の血栓を比べると、血管形成術2時間後の血栓スコアは対照群2.6±1.4に対してtPA(H)群0.8±0.4とtPA群で血栓形成が有意に抑制されていた(p<0.01)。結論:tPA7日間持続静注は血管形成術後の内膜過形成を防止することを実証した。
婦人科悪性腫瘍における血管新生の臨床的意義と治療への応用に関する基盤的研究

上皮性卵巣癌におけるmicrovessel density(MVD), vascular cuffing(VC)およびvascular endothelial growthfactor(VEGF)発現を免疫組織化学染色法で評価し、予後との関連について検討した。対象は1980年から1995年に当科で治療した上皮性卵巣癌105例について、抗CD34抗体、抗VEGF抗体を用いて兔疫組織染色をおこなった。MVDは染色された血管内皮が最も多い場所を弱拡大で探して、200倍1視野あたりの微小血管数として求め、1視野あたり70以上と70未満の2群に分けた。VCは微小血管が腫瘍胞巣を全周性に取り囲むように数珠状に配列する像を陽性とした。VEGF発現は腫瘍細胞の5%以上が染色されるものを陽性とした。それぞれについてprogression-free survivalとの相関について検討し、また年齢、進行期、組織型と各血管新生関連因子についてCox回帰解析法による多変量解析で予後因子を検討した。MVD値は21から244で中央値は77であった。VC、VEGF発現はそれぞれ陽性は31例、92例であった。I, II期ではMVD、VC、VEGFはいずれも予後良好な因子であった(各々P=0.003,0.077,0.005)が、III、IV期では予後との相関を認めなかった。I, II期症例について組織型別に解析すると、明細胞腺癌のみでMVDは有意に予後と相関した(P<0.0001)。多変量解析ではMVDと進行期、年齢が予後因子として見い出された。これらの結果より卵巣癌においても血管新生が予後に影響を与えていることが示され、卵巣癌の組織型により予後因子としての血管新生の意義が異なることが示され、血管新生が抗癌剤の局所の癌への移行に関与していることが示唆された。さらに子宮頸癌、子宮体癌の血管新生に関する成績から婦人科腫瘍において発生部位により血管新生の腫瘍の発育・進展への関わりが異なることが示唆された。子宮頸部扁平上皮癌122例でHE標本を全て再検鏡して、臨床進行期、病理組織学的に浸潤の深さ、脈管侵襲の有無、リンパ節転移の有無、炎症細胞浸潤などについても詳細に検討した。CD34抗原を用いて血管新生の免疫染色を行い血管内皮を染色して微小血管を同定し、特に腫瘍の微小血管密度および腫瘍周囲の微小血管の囲い込み像(VC)と転移および予後との相関性について、リンパ節転移の有無ならびに生存率との関連を解析した。VCが全周性のものは16例、部分的に囲い込んだものは49例、認められないものは57例であった。全周性に囲い込んだ群は部分的に囲い込んだ群あるいは囲い込みのない群より有意に予後不良であった(P<0.011,P<0.0001)。また他の臨床病理学的パラメーターと合わせて多変量解析を行ない血管新生が独立した予後因子であるかの検討を行って、予後因子であることを明らかにし誌上に発表した。これらの腫瘍でも血管新生が発育、進展に関連していることが明らかになった。卵巣癌108症例についてCD34抗原の免疫染色を行い血管内皮を染色して微小血管を同定し、200倍1視野当たりの微小血管数および微小血管密度を算出し、微小血管密度とさらに腫瘍周囲の微小血管の囲い込み像(vascular cuffing)について臨床事項および予後との関連について解析した。微小血管密度は1視野当たり21から244個で平均92個であり、5年生存率との関連は認められなかったが、腫瘍胞巣の周囲の微小血管の囲い込み像が全周性のものを完全型(complete)31例、一部のものを不完全型(incomplete)43例、囲い込みのないもの(none)34例の3型に分類すると完全型は不完全型および囲い込みのない型に比べ5年生存率が有意に良好であった。これらの結果から抗癌剤など薬剤の腫瘍への移行に血管新生が関与している可能性が示唆された。また子宮剄部扁平上皮癌では腫瘍周囲の微小血管の囲い込み像(vascular cuffing)が完全型のものが予後不良であり、微小血管密度とともに予後と関連していることが明らかとなり、これらの成果を誌上に発表した。婦人科腫瘍において発生部位により血管新生の腫瘍の発育・進展への関わりが異なることが示唆された。これらの研究のため多数のHE染色標本、免疫染色標本の解析行うために光学顕微鏡が備品として必要であった。

それぞれについてprogression-free survivalとの相関について検討し、また年齢、進行期、組織型と各血管新生関連因子についてCox回帰解析法による多変量解析で予後因子を検討した。MVD値は21から244で中央値は77であった。VC、VEGF発現はそれぞれ陽性は31例、92例であった。I, II期ではMVD、VC、VEGFはいずれも予後良好な因子であった(各々P=0.003,0.077,0.005)が、III、IV期では予後との相関を認めなかった。I, II期症例について組織型別に解析すると、明細胞腺癌のみでMVDは有意に予後と相関した(P<0.0001)。多変量解析ではMVDと進行期、年齢が予後因子として見い出された。これらの結果より卵巣癌においても血管新生が予後に影響を与えていることが示され、卵巣癌の組織型により予後因子としての血管新生の意義が異なることが示され、血管新生が抗癌剤の局所の癌への移行に関与していることが示唆された。さらに子宮頸癌、子宮体癌の血管新生に関する成績から婦人科腫瘍において発生部位により血管新生の腫瘍の発育・進展への関わりが異なることが示唆された。子宮頸部扁平上皮癌122例でHE標本を全て再検鏡して、臨床進行期、病理組織学的に浸潤の深さ、脈管侵襲の有無、リンパ節転移の有無、炎症細胞浸潤などについても詳細に検討した。CD34抗原を用いて血管新生の免疫染色を行い血管内皮を染色して微小血管を同定し、特に腫瘍の微小血管密度および腫瘍周囲の微小血管の囲い込み像(VC)と転移および予後との相関性について、リンパ節転移の有無ならびに生存率との関連を解析した。VCが全周性のものは16例、部分的に囲い込んだものは49例、認められないものは57例であった。全周性に囲い込んだ群は部分的に囲い込んだ群あるいは囲い込みのない群より有意に予後不良であった(P<0.011,P<0.0001)。また他の臨床病理学的パラメーターと合わせて多変量解析を行ない血管新生が独立した予後因子であるかの検討を行って、予後因子であることを明らかにし誌上に発表した。これらの腫瘍でも血管新生が発育、進展に関連していることが明らかになった。上皮性卵巣癌におけるmicrovessel density(MVD),vascular cuffing(VC)およびvascular endothelial growthfactor(VEGF)発現を免疫組織化学染色法で評価し、予後との関連について検討した。対象は1980年から1995年に当科で治療した上皮性卵巣癌105例について、抗CD34抗体、抗VEGF抗体を用いて免疫組織染色をおこなった。MVDは染色された血管内皮が最も多い場所を弱拡大で探して、200倍1視野あたりの微小血管数として求め、1視野あたり70以上と70未満の2群に分けた。VCは微小血管が腫瘍胞巣を全周性に取り囲むように数珠状に配列する像を陽性とした。VEGF発現は腫瘍細胞の5%以上が染色されるものを陽性とした。
初期瑜伽行派における実践論の形成過程に関する研究

中心的な作業は,『瑜伽師地論』声聞地の解読と初期経典あるいは有部系論書との比較検討を通して,実践論の形成過程あるいは瑜伽行派の起源に関わる考察を試みたことである。その作業の端緒として具体的に『瑜伽師地論』声聞地における瑜伽師yogacaraという語の用例に当たり,改めてその性格・意義を確認してきたが,以下のことが導き出された。従来,議論されてきた「瑜伽行」か「瑜伽師」かという問題に関説すれば,全用例において例外なく,瑜伽の主体者の意味で使用され,文法的には複合語の有財釈Bahubrihi(Possessive Compound)に解釈され「瑜伽師」が妥当である。それは,bhiksuあるいはyoginと併記されることからも伺われる。また梵文でのyogacaraの用例数は,実際には声聞地においても限られた箇所にしか見出されないが,使用される文脈のほとんどは所縁作意を主題とするもので,不浄観,奢摩他・毘鉢舎那あるいは心一境性の獲得とも深く結び付いている。また初修業の瑜伽師を前提に論述されている場合が目立つが,これは声聞地が作意に臨む初修業者への指南書的性格を持つことを意味すると思われる。さらに声聞地における瑜伽師の修行階梯が,基本的に有部系の実践階梯と同種の構造を共有しているが,その三賢位以降の修習者はその境位の深浅に関係なく瑜伽師と呼称されている点を確認した。また,声聞地制作者が,瑜伽師の在り方を世尊以来の初期経典の伝統の中に位置付けようとする意図も窺知された。また,瑜伽師をキーワードとして,筆者なりに国内での研究動向を逐一再検討してみたところ,瑜伽行派という学派名の由来でもあるこの一群が,単に瑜伽行派内の起源問題に留まらず,大乗仏教興起の事情に関わる従来の説に変更を与え得る存在として注目されることが,改めて確認された。これに関しては,さらに継続的な攻究を試みたい。二年計画の初年度としては,研究対象となる主要な文献類の収集、データベース構築へ向けて関連テキストデータの入力・その分析が主たる内容であった。特に『瑜伽師地論(Yogacarabhumi)』の「菩薩地」(Bodhisattvabhumi)、「声聞地」(Sravakabhumi)をはじめとする一次資料・註釈書類を中心として,さらに国内外の研究論文・翻訳等についても可能な限り収集した。一次資料の検討に関しては、最近刊行された『瑜伽師地論』の詳細な索引・CD-ROM版大蔵経も最大限に活用し、実践論形成の構造的解明に向けての分析を試みてきた。とりわけ、従来の問題点として注目してきた初期瑜伽行派における所縁観に関して、詳細な検討を進めることができた。また、有部系論書に見られる実践の体系と初期瑜伽行派の実践論とに見られる類似性は多くの研究者によって指摘されているが、報告者としてはさらに網羅的かつ独自の視点にを加えて考察を進めたつもりである。初年度の段階では、その作業の途上であるが、その考察に当たっては、A.Wayman博士の諸論文から多くの示唆を得ることができた。また、海外の研究成果の収集のため、米国学位論文の複写サービスを利用し,過去二十年くらいまで遡って初期瑜伽行派の実践論を扱った博士号取得論文を検索し、該当する二十篇ほどを入手できたことは、この研究を進めていくにあたって非常に有益であった。とくに未刊行である『瑜伽師地論』の部分的な校訂テキストや英訳は参考に資するところが大きかった。しかし、その一方では不備な点が散見されたことも否めなかった。引き続き、今年度に収集したテキストの体系的構造的な解析を進めるとともに、関連テーマのデータベース構築を図り、その成果を実りあるものとしたい。

さらに声聞地における瑜伽師の修行階梯が,基本的に有部系の実践階梯と同種の構造を共有しているが,その三賢位以降の修習者はその境位の深浅に関係なく瑜伽師と呼称されている点を確認した。また,声聞地制作者が,瑜伽師の在り方を世尊以来の初期経典の伝統の中に位置付けようとする意図も窺知された。また,瑜伽師をキーワードとして,筆者なりに国内での研究動向を逐一再検討してみたところ,瑜伽行派という学派名の由来でもあるこの一群が,単に瑜伽行派内の起源問題に留まらず,大乗仏教興起の事情に関わる従来の説に変更を与え得る存在として注目されることが,改めて確認された。これに関しては,さらに継続的な攻究を試みたい。
幹細胞を中心とした細胞供給システムの解明

神経変性疾患の一因は幹細胞供給システムの低下にあると仮説を立てヒト末梢血由来骨髄間葉系幹細胞(hPB-MSCs)の多分化能の評価を試みた。しかし質的量的に安定したhPB-MSCsが得られず検討中である。またMSCsの治療有効性をヒト骨髄由来MSCs(hBM-MSCs)と6-OHDA導入パーキンソン病(PD)ラットで評価した。MSCs静脈内投与より薬物誘発旋回運動が抑制され免疫組織学的解析にて中脳黒質,線条体共に6-OHDA誘導ドーパミン神経細胞死を改善し,更に線条体グリア活性抑制効果が認められた。hBM-MSCs静脈内投与がPDの病変形成を抑制する新規治療法としての可能性があることが示された。平成2324年度にかけ6-OHDA線条体導入片側パーキンソン病モデルラットを作製し2週間後、正常ヒト骨髄間葉系幹細胞(hMSC)を静脈内に投与してその効果を検討した。行動学的評価としてメタンフェタミンの腹腔内投与による異常旋回運動を確認し細胞投与群と非投与群で比較した所、投与2週間後よりメタンフェタミン誘導旋回運動の改善を認めた。また、経時的に行動解析を行い、この改善効果は少なくも細胞投与12週後まで持続していることを確認した。12週後のラットを灌流固定、脳凍結切片を作製し、中脳黒質に対してチロシンヒドロキシラーゼ(TH)染色を行った。ステレオロジーの手法を用いた免疫組織学的半定量解析では有意に細胞投与群のTH陽性細胞数が多かった。現在、細胞投与4週目のラットにおいても同様にTH免疫組織学的半定量解析を行うとともに、投与したhMSCの細胞動態やミクログリアの増生、シナプス密度などにも着目した免疫組織学的解析をすすめ、細胞投与群における改善効果の機序について研究をすすめる予定である。また、神経変性疾患(特にアルツハイマー病、パーキンソン病、筋萎縮性側索硬化症を対象とする)患者及び正常対象者の末梢血から骨髄間葉系幹細胞(PMSC)を得、これら3疾患を含んだ神経変性疾患以外の患者群のPMSCと比較を行うため、臨床研究審査委員会、倫理委員会から承認を得た。現在正常対象者のPMSC分離、培養中を行うために分離方法、培養液の組成などを調整中であるが質的量的に安定したPMSCが得られず検討を重ねている。6-OHDA線条体導入片側パーキンソン病モデルラットを作製し2週間後、正常ヒト骨髄間葉系幹細胞(hBM-MSC)を静脈内に投与してその効果を検討中であったが,今回は更にモデルラットを増やし検討をおこなった。行動学的評価としてメタンフェタミンの腹腔内投与による異常旋回運動を細胞投与群と非投与群で比較したところ、投与1週間後よりメタンフェタミン誘導旋回運動の改善を認めた。細胞投与4週目のラットにおいて灌流固定、脳凍結切片を作製し、中脳黒質に対してチロシンヒドロキシラーゼ(TH)染色を行い,ステレオロジーの手法を用いた免疫組織学的半定量解析を施行したところ有意に細胞投与群のTH陽性細胞数が多かった。線条体においてもTH免疫組織学的半定量解析を行ったところ細胞投与群では有意にTH光学濃度が高かった。また,6-OHDAの線条体投与部位においてIba1を用いたミクログリア免疫組織解析では細胞非投与群ではミクログリアは細胞体の肥大化,突起の退縮を認め、活性型を示した。一方で非移植群では突起を枝状に伸長させた、細胞体の小さい静止型を観察し、hBM-MSCは6-OHDAが誘導したグリア活性に対し抑制効果を示したと考えられた。このhMSCの行動薬理学的,免疫組織学的改善効果,グリア活性抑制効果の機序につき考察を深め,論文投稿準備中である。また、神経変性疾患(特にアルツハイマー病、パーキンソン病、筋萎縮性側索硬化症を対象とする)患者及び正常対象者の末梢血から間葉系幹細胞(hPB-MSC)を得、これら3疾患を含んだ神経変性疾患以外の患者群のhPB-MSCと比較を行うため、臨床研究審査委員会、倫理委員会から承認を得た。正常対象者のPMSC分離、培養中を行うために分離方法、培養液の組成などを検討重ねたが質的量的に安定したPMSCが得らなかった。平成23年度は、片側パーキンソン病モデルラットを作製後、正常ヒト骨髄間葉系幹細胞(hMSC)を投与しその効果を行動薬理学的、免疫組織学的に検討した。具体的な方法としては、6-OHDAを正常ラットの片側線条体に微量投与し、片側パーキンソンモデルラットを作製した。6-OHDA投与

2週間後に、メタンフェタミン腹腔内投与による異常旋回運動を確認しモデルラットを2群に分け、1群にhMSCを静脈内投与し(移植群)、他群には溶媒のみを投与した(非移植群)。経時的にメタンフェタミン誘発異常旋回運動を行った後、安楽死させ灌流固定した。凍結切片を作製し、中脳黒質に対してチロシンヒドロキシラーゼ(TH)染色を行った。移植群では非移植群と比較して、有意に薬物誘発異常旋回数は低下を示し、またステレオロジーの手法を用いた免疫組織学的半定量解析では有意にTH陽性細胞数が多かった。hMSCは6-OHDA導入片側パーキンソン病モデルラットの薬物誘発異常旋回運動に対して抑制的に働き、中脳黒質TH細胞に対して保護的に働いている事を確認した。今回、「神経変性疾患の一因は幹細胞供給システムの低下にある」と仮説を立て、神経変性疾患の病因を解明することを全体としての研究課題としているが、本研究の結果からhMSCは中脳黒質TH陽性細胞の脱落に対し抑制的に働くことを示唆するものである、仮説のもと投与したhMSCの細胞動態にも注目しこの機序について解析中である。また、神経変性疾患(特にアルツハイマー病、パーキンソン病、筋萎縮性側索硬化症を対象とする)患者の末梢血から骨髄間葉系幹細胞(PMSC)を得、これら3疾患を含んだ神経変性疾患以外の患者群のPMSCと比較を行うため、臨床研究審査委員会に書類を提出中である。上述したとおり、正常者対象者のPMSCの分離、培養し解析を行うために、色々な条件のもと試行を重ねているが困難な状態にある。パーキンソン病モデルラットにおける骨髄間葉系幹細胞の投与は効果がえられており順調にすすんでいる神経変性疾患患者と非神経変性疾患患者の末梢血を採取し骨髄幹細胞を分離・培養後、多角的に比較検討する実験計画を最初に予定していたが、自主臨床研究への書類の用意、研究室の整備等で予定より時間を要したため、平成24年度以後に予定していた計画を前倒して進めている。6-OHDA導入片側パーキンソン病モデルラットに対する正常ヒト骨髄間葉系幹細胞の静脈投与による行動薬理学的、免疫組織学的改善効果の機序に関して解析を進める。また、アルツハイマー病遺伝子改変マウスに対しても同様の方法で改善が得られるか検討を進める予定である。また、神経変性疾患患者(アルツハイマー病、パーキンソン病、筋萎縮性側索硬化症)の末梢血由来骨髄間葉系幹細胞(PMSC)と非神経変性疾患患者のPMSCを安定した分離・培養方法を探索し得られたPMSCから増殖能、神経系への分化能、遊走能や生着能(ケモカインの産生や接着因子の発現)、栄養因子の産生能に着目して多角的に比較解析を行う。また、神経変性疾患患者(アルツハイマー病、パーキンソン病、筋萎縮性側索硬化症)の末梢血由来骨髄間葉系幹細胞(PMSC)と非神経変性疾患患者のPMSCをそれぞれ分離・培養し、特に、増殖能、神経系への分化能、遊走能や生着能(ケモカインの産生や接着因子の発現)、栄養因子の産生能に着目して多角的に比較解析を行う。予定した末梢血由来骨髄間葉系幹細胞を採取・培養するための細胞培養試薬・器具や各種試薬が上記理由のため進んでおらず、次年度に使用する計画である。引き続き、実験動物の飼育料、細胞培養試薬、器具、試薬等の為の部品費に使用する計画である。
顧客価値の創造における企業内研究との相互作用に関する定性研究

初年度である平成30年度は、研究の題意1段階としてデータ収集ステージとして位置付け、4人の研究分担者がそれぞれの担当、すなわち、(1)長内「顧客価値の高い製品開発におけるR&Dの事例」、(2)川上「技術が機能的価値以上の顧客価値を創造している製品開発事例」、(3)「技術が顧客価値を規定する社会的プロセスのモデル化のための非構造化インタビュー」、(4)「多義的な価値がR&Dを規定する社会的プロセスのモデル化のための非構造化インタビュー」のおおまなか分担によって、それぞれの領域の事例研究、文献サーベイなどを行った。一部、各研究分担者の従前の研究と関連する研究成果については学会報告等で発表を行ったが、本研究プロジェクトとしての全体テーマとの統合、個々の研究成果の学会報告や論文による公開は次年度以降行っていく予定である。本プロジェクトでは、年12回程度、研究分担者やその他研究者を交えた研究会の開催を予定していたが、本年度は10月21日に京都大学において早稲田大学技術経営研究部会と京都大学大学院経済学研究科経営学セミナーとの共催の形式で実施し、研究分担者の宮尾准教授から、最近の研究動向について報告を得た。また、事例研究調査の一例として、研究代表者長内と研究分担者宮尾准教授による大企業におけるスタートアップ支援事業についてインタビュー調査や発表会の聴取などを行い、継続的に調査を進めている。ただし、データ収集に若干予定よりも時間を要諦しているため、残り2カ年の研究期間を考慮して、4人の研究分担者のより統合的な研究の進め方が今後の課題である。本研究は技術経営とマーケティングとの領域横断的で野心的な研究のため、収集する質的データが広範な企業、企業内組織に及ぶため、本プロジェクトの直接的成果に結びつくデータ収集は若干送れている。また、本年度は各研究分担者が自由なアイデアで多方面の企業事例の収集や文献サーベイを行ったているため、若干まとまりに欠けているところがあった。残り2カ年という研究期間を考えると、より統合的で効率的なプロジェクトの運営の見直しを行う必要があるかもしれない。ただし、定性的で探索的な研究においては必ずしも効率的なデータ収集が可能でないだけでなく、効率性を重んじる余りに、重要な新しい因果関係の発見を見落とす危険性もあり、データ集手段会でのある程度の冗長性はやむを得ないものと考えている。現在までの進捗状況でも述べたように、扱う事例の範囲の広さからややデータ収集に時間をかけすぎ、全体のまとまりが見えにくい状況がある。一方で、エスノグラフィックな手法を重んじる本プロジェクトにおいては、事前に調査対象やリサーチクエスチョンを限定的にしすぎることもかえって成果につながらないと考えており、ある程度の自由度はこれまで通り維持しながら、あと2カ年という期限も意識して、4人の分担研究の取りまとめを意識するよう、日々のコミュニケーションや研究会を通じて、4人の研究作業の統合化を進めたいと考えている。

一方で、エスノグラフィックな手法を重んじる本プロジェクトにおいては、事前に調査対象やリサーチクエスチョンを限定的にしすぎることもかえって成果につながらないと考えており、ある程度の自由度はこれまで通り維持しながら、あと2カ年という期限も意識して、4人の分担研究の取りまとめを意識するよう、日々のコミュニケーションや研究会を通じて、4人の研究作業の統合化を進めたいと考えている。
麻ひ性貝毒の起源に関する研究ーー特異抗体を用いる新たなアプローチ

本研究の目的は、これまで植物プランクトンが生産すると考えられてきた麻ひ性貝毒(PSP)がプランクトンに共生あるいは寄生する細菌生体成分の構成成分であるという筆者らの仮説の証明にある。本研究では筆者らが開発した毒に対する特異抗体を用い、毒を結合している生体成分を分離し、同成分が細菌RNAの一部であることを明らかにした。このことはPSPは細菌の生命維持に欠くことのできない物質の構成要素であることを示唆する。Alexandrium tamarenseより分離し継代培養しているPSP生産菌PTB-1を50リッター培養して菌体を集めた。次にこれをリン酸バッファーで抽出してタンパク抽出物を得、これを市販の非特異的proteaseで加水分解した。次に分解物を限外ろ過してproteaseおよび残存するタンパク画分を除き、低分子化した分解物を抗STXウサギ抗体を用いるELISAに付した。この際、分解ごとにELISAとの反応が異なり、安定した結果が得られなかったので、proteaseによる消化操作を繰り返し、安定した結果が得られる条件を検討し、3回のprotease消化で安定した値が得られることが判明した。次に、得られた分解物の一部を用い、フォトダイオードアレイ検出系付HPLCを用いてELISAに反応する成分の分離を試みた。カラムにはODSカラムを用いたが、UVで検出したところ予想したとおり、多くのピークが広い範囲に出現した。これはprotease消化により分解の程度が異なる種々のタンパク分解物が生成していることを示すものである。溶出液を1mlずつ分取しこれら全てをELISAに付したところ、一部の範囲の溶出部位に抗体反応のピークが認められた。抗体に反応を示す溶出部分には多くの物質が存在することがUV検出によるピークから明らかであり、本方法で抗体に反応する成分を単離することは困難と思われたので、同成分の精製にタンパク質の分離に用いられる免疫沈降法を導入したところ、一回の操作でHPLC上数成分にまで精製できることが明らかになった。以上の結果はPSP生産菌がSTXに対する抗体に結合する物質を構成成分とするタンパク成分を持つことを示唆する。前年度の研究で麻ひ性貝毒(PSP)生産菌PTB-1菌体のタンパク抽出物をprotease消化し、分解物中に生じる抗STXウサギ抗体と結合する低分子成分の分離を試みたが、効率的に生成することが出来なかった。これは菌体の全てのタンパク質を分解したため想像以上の多様な分解物が生成したためと考えられた。通常の方法では微量に含まれる抗体陽性成分は精製困難であると考えられたので、抗体と結合するタンパク質の精製から再スタートする計画を立て、STXに対する特異抗体をSTXを結合させたSepharoseカラムで精製し、精製抗体を市販のCNBr-activated Sepharase 4Bに結合させたaffinity colummを作成して上記タンパク質の精製を試みた。その結果、抗STX抗体を用いるwestern blot分析で単一のバンドを示す成分を分離することが出来た。本成分は抗体染色では明瞭なバンドを示すが、同時に分析したゲルをタンパク染色すると殆どバンドが検出されなかった。しかし染色を鋭敏な銀染色に変えると明瞭なバンドが検出されたことからタンパク質を成分とすることが明らかになった。本成分のUVスペクトルはタンパク質に特有の280nmのピークを示さず、タンパク量が著しく少ないか糖あるいは脂質と微量のタンパク質が結合した複合体の可能性が考えられた。そこで細菌をリゾチームで分解し分解物中に抗体と結合する成分を検索したところ、低分子化された成分に反応が認められ、一部は毒成分そのものと考えられた。以上の結果はPSPが細菌の膜成分と結合した高分子物質として存在すること、すなわちPSPが細菌の生存に必要な体成分の構成成分であることを示唆する。前年度までの研究により、麻ひ性貝毒(PSP)生産菌の抽出物中に抗STX(saxitoxin)抗体と反応するタンパク質成分の存在を明らかにした。本年度はまず本タンパク成分の性状解析を行い、本タンパクがRNAを結合した核タンパク質であり、STXに対する抗体はRNA部分と反応していることを明らかにした。次に、上記細菌およびPSPの発生海域である大船渡湾より分離した細菌のうち最も抗体と反応する菌株について、定法によりtotal RNAを分離し、抗体との反応性を調べたところ両者のRNAともに明瞭な反応を示した。そこでこれらRNAを抗体を結合したSepharoseを用いるaffinity columnに付し、columnに結合するRNAをagarose gel電気泳動分析したところ、rRNAの一部とその分解物と思われる低分子RNAが検出された。これらRNAをnuclease P1により分解し、分解物中の抗体結合成分を再びaffinity columnで精製し、STXに対する抗体と結合する2つの画分を得た。affinity columnで早く溶出する画分をHPLC分析に付したところPSPの成分であるgonyautoxin(GTX)2,3と一致するピークが観察された。これらピーク成分は標品毒と同様、チオールで処理することにより定量的にSTXに変換され、GTX2,3そのものであると考えられた。現在MS分析による確認を行っている。

以上の結果はPSPがある種の海洋細菌RNAの構成成分であることを示すもので、海洋生物毒として知られてきたPSPが、ある種の細菌の生命活動に重要な意味を持つ物質として働いていることを強く示唆する。この結果は、今後のPSPの起源に関する研究など、多く研究の方向を変える重要な知見であると考える。