hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
ダイヤモンドアバランシェダイオード実現に向けた衝突電離機構の研究

本研究の目的はダイヤモンドの衝突電離機構を実験的に明らかにすることで、耐環境性・高内部利得を併せ持つダイヤモンドアバランシェダイオード実現のための指針を得ることである。原子炉過酷事故対応、核融合物理学、大強度加速器を用いた高エネルギー物理学等、幅広い分野において高温動作、放射線耐性、磁気耐性等の耐環境性に優れる放射線センサへの需要が高まっている。既存のプラナ型ダイヤモンド放射線検出器は耐環境性に優れるが、信号を増幅できないため、測定系全体の耐環境性はシリコンからなる読み出し用のエレクトロニクスにより制限されてしまう。この問題に対し、内部利得を持つダイヤモンド検出器が実現できれば、測定系全体のさらなる耐環境性向上が期待できる。平成30年度は平成29年度に作製した衝突イオン化係数評価用のpinダイオードに対し、EBIC、α線照射により、衝突イオン化係数評価を行った。直径250μmのメサ構造を有するpinダイオードのうちリーク電流の低いものを選定し、EBIC電流、α線誘導電荷量の電界強度依存性を評価した。平均電界強度を2MV/cmまで変化させたが、明瞭な増幅現象は観察されなかった。リーク電流増加に伴うS/N劣化により、それ以上の電界強度での測定を行うことができなかった。平成31年度はより高い電界強度下で観測ができるよう、フォトリソグラフィ法によりメサ直径の小さなpinダイオードを形成して室温から高温下での衝突イオン化係数導出を目指す。また、派生技術としてダイヤモンドpinダイオードの内蔵電位を利用した放射線検出器を試作し、外部電圧なしで放射線検出ができることを確認した。これに関連する成果について、国際学会発表1件、論文発表1件をおこなった。当初予定していたよりも、ダイオードの漏れ電流がα線照射や電子線照射による評価時の電流に対して大きく、高電界強度下での測定を困難にしている。これに対して、フォトリソグラフィにより電極直径の小さなダイオードを作製する予定であったが、研究代表者が重病となったため実験進捗が遅れている。フォトリソグラフィ法によりメサ直径の小さなpinダイオードを形成し、室温から高温下での衝突イオン化係数の評価を目指す。本研究の目的はダイヤモンドの衝突電離機構を実験的に明らかにし、耐環境性・高内部利得を併せ持つアバランシェダイオード実現のための要素技術を開発することである。期間中に1.衝突イオン化係数の実験的評価。2. pn接合を利用した電荷増幅機構試作の2つに取り組む。平成29年度は衝突イオン化係数評価用のpinダイオードの試作に取り組んだ。p, i, n層の気相成長条件を探索し、直径250μmのメサ構造を有するpinダイオードを試作した。作製したダイオードは整流比10桁の良好なダイオード特性を示した。作製したpinダイオードのうち最も良好なものは2MV/cm以上の絶縁破壊強度を持つことが確認された。また、この時のリーク電流はnAオーダーであり、紫外線を用いて衝突イオン化係数評価をする際の励起強度の目途がついた。平成30年度は本年に準備した試料と測定系を用いて室温での衝突イオン化係数測定に取り組む。当初の予定通りMV/cmの耐圧を持つpinダイオード作製に成功したため。また、並行して衝突イオン化係数の評価体系も構築できたことから予定通り研究が進捗していると判断した。

これに関連する成果について、国際学会発表1件、論文発表1件をおこなった。当初予定していたよりも、ダイオードの漏れ電流がα線照射や電子線照射による評価時の電流に対して大きく、高電界強度下での測定を困難にしている。これに対して、フォトリソグラフィにより電極直径の小さなダイオードを作製する予定であったが、研究代表者が重病となったため実験進捗が遅れている。平成29年度に得られた2MV/cm以上の絶縁破壊強度を持つ試料を用いて衝突イオン化係数評価を行う。紫外光に対して透明な入射窓を用いて、真空中でダイヤモンドに紫外光を照射し、光励起電流から衝突イオン化係数の評価を試みる。励起強度が不足する場合は、放射線源を用いたパルス波高分析法の使用も検討する。フォトリソグラフィ法によりメサ直径の小さなpinダイオードを形成し、室温から高温下での衝突イオン化係数の評価を目指す。研究代表者が重病となり,評価測定系構築の準備に遅れが生じたため。物品費は高温評価特性装置の構築に、旅費、その他の項目は国内・国際学会での研究成果発表、論文発表の英文校閲費として使用する予定である。
エアロゾルの大気中環境動態を解明するためのイオンビーム顕微動態分析法の開発

本研究では、荷電粒子誘起発光(Ionbeaminduced luminescence: IBIL)を利用した微粒子試料の化学組成分布分析技術を開発した。照射対象の化学組成により、IBILの波長に差異が生じる。このため、IBILを顕微分光することで、数マイクロメートル程度の試料の化学組成が分析できる。さらに、集束ビームの高速な走査時間に対応する光子検出器を開発することで、微粒子試料表面の化学組成分布を取得可能とした。実際の微粒子試料を大気取り出し集束イオンビームを利用して分析することで、通常大気環境下での微粒子表面の微量化学組成分布の可視化やその動態解析がIBIL顕微分光により可能となった。大気中の微小粒子状物質について、その環境動態解明につながる個別粒子表面の有機・無機化合物分布の可視化は極めて重要な課題である。本研究では、その解析に必要な化学組成分析・イメージング技術を、大気取出しイオンマイクロビームをプローブとした分析手法の開発により実現する。本年度は、計画通り主要な装置の開発までを達成することができた。特にイオン誘起発光(IBIL)顕微分光に必要な高分解能型検出器の設計及び開発が完了した。他方で、環境影響を有する有機物固着大気中微粒子(バイオエアロゾル)の指標となっているNADHやRiboflavinなどの有機物標準試料を利用した分析応用を試行した。有機物標準試料の分析視野内の存在量を調整しながら、大気取出窓用薄膜材料上に微量に散布することで分析試料を調整した。各標準試料から計測されたIBILスペクトル中には、有機物種ごとに特徴的な形状のピークが観察された。また、イオンビーム照射環境下での連続的なIBIL計測では、スペクトル構造が徐々に変化する様子が観察された。IBILスペクトルの構造に現れる差異は、照射により与えられるエネルギーから各有機物の化学構造変化が生じていると考えられる。微粒子に固着する有機物は種類ごとに異なる化学的性質を有しているため、IBILスペクトル中のピーク強度の変化量やスペクトル構造そのものの変化が生じていると考えられる。イオンビームによる有機物分析は前例が少なく、困難さが残るものの、本分析体系で同時分析が可能であるIBIL/PIXE分析法を複合的に利用することにより、個別粒子レベルでの粒子の詳細解析の可能性が示唆された。大気中の微小粒子状物質について、その環境動態解明につながる個別粒子表面の有機物・無機化合物分布の可視化は極めて重要な課題である。本研究では、その解析に必要な化学組成分析・イメージング技術を、大気取り出しイオンマイクロビームをプローブとした分析手法の開発により実現することを研究目的としている。本年度は、昨年度までに開発した光子計数レベルの高分解能型分光器を利用して、イオン誘起発光(IBIL)顕微分光による分析法の検討を行った。まず、IBILのイメージング範囲に適した数マイクロメートル程度の粒子状物質のうち、荷電粒子照射耐性の高い材料を標準物質として開発し、荷電粒子照射下においてイオン誘起発光のイメージングが適切に得られることを確認した。次いで、本装置を利用して微粒子関連材料の分析を行った。特に、有機物固着大気中微粒子(バイオエアロゾル)に関連する材料に着目し、NADHやリボフラビンさらにはPAHといった特定有機物を分析対象とした。各有機物標準試料がIBIL分析においてそれぞれ固有波長により検出可能であることを確認した。また、連続的な荷電粒子照射下では予想に反し、IBILは単純な減衰のみを示さず、化合物によっては新たなピークが発現することが確認できた。これはイオンビーム分析中に起こった化学変化をつぶさに観察していると考えられる。さらに、標準物質のみならず実大気中微粒子試料の分析を試行した。本分析応用においても、大気中微粒子試料からのIBILは波長ごとに変化する様子が確認された。IBIL分析では、従来のPIXE分析法で得られない変動を計測できていることから、PIXEでは捉えきれない化学変化を捉えた分析法となることが示唆された。本分析体系にPIXE分析法を複合的に利用することで、今後個別粒子分析レベルでの粒子の化学的性質の詳細解析を進めることが可能となると考えられる。当初の予定通り、現在までに、高分解能分光器をイオンビーム誘起発光の分析に応用することにより、時系列で粒子から得られる信号に起こる変化が抽出できている。また照射環境下でのIBIL計測の標準となるような蛍光材料や発光により荷電粒子照射量を計測する微粒子状標準物質を開発できている。しかしながら、他方で、本年度中に開発を完了する予定であった試料周辺のガス雰囲気を置換する試料ホルダならびにマイクロ分析チャンバについては、開発したものの、これを利用した分析について、大気及びその他の雰囲気の変更による差異を抽出することができなかった。この問題は、現在導入しているガス種類と大気中微粒子試料の関係に依存するものと考えられる。次年度の研究期間における追加作業として、複数のガス種導入ならびに試料ホルダの改良を行いながら、連続的なIBILスペクトルの計測に変化がみられるかを確認する。また、各雰囲気による影響が試料種に依存する可能性を念頭に、次年度に予定している実環境からの大気中微粒子の捕集場所を多様なものとするよう作業計画を変更する。大気中の微小粒子状物質について、その環境動態解明につながる個別粒子表面の有機物・無機物化合物分布の可視化は極めて重要な課題である。

本研究課題期間において、荷電粒子誘起発光(IBIL)顕微分光分析技術の高度化を行い、光子計数レベルの高分解能型分光器の開発により、波長分散型のIBILの分析・イメージングが実現した。本分析装置を微粒子関連材料の分析に応用した。とりわけ有機物固着大気中微粒子(バイオエアロゾル)に関連する材料に着目し, NADHやリボフラビン、さらには多環芳香族炭素(PAH)といった特定有機物を対象とした分析を実施した。各有機物について、標準試料を作成し、IBILの特徴量を取得した。各材料において固有波長や減衰特性にそれぞれ差異が生じることを確認した。また照射に従って異なる発光波長の有機物への変化が可視化できることが明らかとなった。同様のIBILスペクトルの変化は標準物質のみならず大気中微粒子試料からも確認できた。高分解能大気中微粒子の個別粒子レベルに起こる化学的性質変化の詳細解析が実現した。IBIL分析では、従来のPIXE分析法では捉え得ない化学形態を含めた試料中の構造変化を計測できていると考えられる。本分析系の実現により、大気中微粒子試料を含めた多様な対象の化学形態構造変化を可視化する技術としてIBILが活用可能と考えられる。本研究では、荷電粒子誘起発光(Ionbeaminduced luminescence: IBIL)を利用した微粒子試料の化学組成分布分析技術を開発した。照射対象の化学組成により、IBILの波長に差異が生じる。このため、IBILを顕微分光することで、数マイクロメートル程度の試料の化学組成が分析できる。さらに、集束ビームの高速な走査時間に対応する光子検出器を開発することで、微粒子試料表面の化学組成分布を取得可能とした。実際の微粒子試料を大気取り出し集束イオンビームを利用して分析することで、通常大気環境下での微粒子表面の微量化学組成分布の可視化やその動態解析がIBIL顕微分光により可能となった。当初の計画通り、主要な分析装置について設計及び開発までを達成することができた。他方で、イオン誘起発光(IBIL)用の顕微分光装置では、装置を利用してIBILの連続的な分析を試行することができた。連続的な照射ではスペクトル形状の変化が観察され、イオン照射の影響と思しき構造的変化までを連続的に観察可能であった。本内容については、2014年秋季に国内で開催されたPIXEシンポジウムにおいて発表し、大気中微粒子を専門とする研究者から、好意的なコメントを受けた。しかしながら現状では本研究課題は十分な成果報告ができているとは言えない。次年度以降にデータ解析や分析手法についての外部発表をより積極的に行いたい。現在、国内の研究機関に所属する連携研究者から実施の大気中微粒子試料について供給を受けており、これまでの測定結果とは異なるIBILスペクトルのピーク、構造を観察している。これらの内容については、連携研究者を交えながら十分に実験結果を精査し、慎重に議論を重ねながら成果報告につなげたいと考えている。
ツルクモヒトデ目(棘皮動物門 : クモヒトデ綱)の系統分類学的研究

本研究では、独特な生態や形態を持つため進化的に非常に興味深いが、深海性であるがゆえ後れていたツルクモヒトデ目の系統分類を明らかにし、その生物地理学的な進化の一端を解明した。これまで研究代表者が収集した、西太平洋海域・カリブ海・南極近海・アリューシャン列島産の83種のツルクモヒトデ目についてミトコンドリアの16S rRNA領域とCOI領域、および核の18S rRNA領域の部分配列を決定し、分子系統解析を行った。その結果、(1)これまでに知られている4科のうち、キヌガサモヅル科+テヅルモヅル科、およびユウレイモヅル科+タコクモヒトデ科がそれぞれ単系統となる、(2)タコクモヒトデ科は側系統群となり、それ以外の科はそれぞれ単系統となる、(3)ユウレイモヅル科+タコクモヒトデ科はこれまでの分類体系とは異なる3つのサブクレードに分かれる、(4)テヅルモヅル科は3つのサブクレードに分かれる、ということが明らかとなった。SEMなどを用いた詳細な形態観察によってこれらのクレードを支持する形態形質を認め、本目の科階級群の系統はほぼ確かめられたといえる。また、得られた系統樹と西太平洋海域に分布する種の生息情報を網羅的に精査・比較することで、深海起源の本目のうち、腕を分岐という特徴的な形態を派生的に獲得したものが浅海へ適応した可能性が新たに示唆された。また、これまでに研究代表者が訪問した6カ国8研究機関に所蔵されていた117種(現生種の約62%)のタイプ標本と、国内外併せて約2400個体の標本の観察情報を比較することで、これまで185種が知られている本目は、7種の未記載種と14種のシノニムを含み、少なくとも178種に整理されることがわかった。当初の予定であった種・属の分類の混乱は概ね解消し、科科階級群の分類については2科のみでなく全科についての系統をほぼ確かめられた。得られた成果の一部は既に論文として発表した。また、当初予定していた分子分岐年代の推定からは確固たるデータは得られなかったものの、西太平洋海域に生息する種の分布情報の網羅的な整理という新しい視点を取り入れることによって、予想しなかった生物地理学的成果を得ることができたため。本研究によって、ツルクモヒトデ目の科階級群の系統分類はほぼ確かめられたといえるが、その下の属の分類に関しては不明瞭な部分がみられた。これを解決するためには、骨片だけでなく筋肉などの柔組織の観察が必要となってくるだろう。また、本目が所属するクモヒトデ綱の系統分類は依然不明瞭なままである。日本近海はクモヒトデ綱の多様性が高く、本綱の系統分類学的研究を行う上で格好のフィールドである。そこで今後は、本目の研究で培った分子系統解析の手法や、クモヒトデ類の形態観察手法に基づくことで本綱を用いた網羅的な系統分類学的研究に発展していけると期待される。本研究では、独特な生態や形態を持つため進化的に非常に興味深い動物であるが、深海性のため系統分類学的な研究が後れていたツルクモヒトデ目の系統分類を明らかにし、その生物地理学的な進化を明らかにする基礎を築くことを目的とした。本年度内にヨーロッパの4つの博物館を訪問し、タイプを含む多数の所蔵標本の観察を行った。内部骨片を含めた詳細な形態観察の結果、これまで183種が知られていたツルクモヒトデ目は、8種の未記載種を含めて、少なくとも177種に整理されることが分かった。これら未記載種のうち、タコクモヒトデ科の1種とテヅルモヅル科の2種をそれぞれ新種として発表した。また、博物館の所蔵標本のうち、分子系統解析に適した標本の組織を持ち帰り、これまでに研究代表者が行ってきた日本近海・ニュージーランドおよびオーストラリア近海の種の研究結果とあわせて、4科67種のツルクモヒトデ目の、核の18S rRNA,ミトコンドリアの16S rRNA, COI領域を解析した。その結果、(1)これまでに知られている4科のうち、テヅルモヅル科とキヌガサモヅル科、タコクモヒトデ科とユウレイモヅル科はそれぞれ単系統となる、(2)キヌガサモヅル科とテヅルモヅル科はそれぞれ単系統となり,テヅルモヅル科は2つのクレードに分かれ、(3)タコクモヒトデ科とユウレイモヅル科は、これまでの系統分類とは異なる3つのクレードに分かれるということが明らかとなった。これにより、ツルクモヒトデ目の科階級の系統分類はほぼ確かめられたといえる。また、得られた系統樹を元に分子分岐年代推定を行うことで、これまで西テチス海起源と考えられていたユウレイモヅル科が、実際にはオーストラリア・ニュージーランド起源である可能性が新たに示唆された。

その結果、(1)これまでに知られている4科のうち、キヌガサモヅル科+テヅルモヅル科、およびユウレイモヅル科+タコクモヒトデ科がそれぞれ単系統となる、(2)タコクモヒトデ科は側系統群となり、それ以外の科はそれぞれ単系統となる、(3)ユウレイモヅル科+タコクモヒトデ科はこれまでの分類体系とは異なる3つのサブクレードに分かれる、(4)テヅルモヅル科は3つのサブクレードに分かれる、ということが明らかとなった。SEMなどを用いた詳細な形態観察によってこれらのクレードを支持する形態形質を認め、本目の科階級群の系統はほぼ確かめられたといえる。また、得られた系統樹と西太平洋海域に分布する種の生息情報を網羅的に精査・比較することで、深海起源の本目のうち、腕を分岐という特徴的な形態を派生的に獲得したものが浅海へ適応した可能性が新たに示唆された。また、これまでに研究代表者が訪問した6カ国8研究機関に所蔵されていた117種(現生種の約62%)のタイプ標本と、国内外併せて約2400個体の標本の観察情報を比較することで、これまで185種が知られている本目は、7種の未記載種と14種のシノニムを含み、少なくとも178種に整理されることがわかった。当初の予定であった種・属の分類の混乱は概ね解消し、科科階級群の分類については2科のみでなく全科についての系統をほぼ確かめられた。得られた成果の一部は既に論文として発表した。また、当初予定していた分子分岐年代の推定からは確固たるデータは得られなかったものの、西太平洋海域に生息する種の分布情報の網羅的な整理という新しい視点を取り入れることによって、予想しなかった生物地理学的成果を得ることができたため。本研究によって、ツルクモヒトデ目の科階級群の系統分類はほぼ確かめられたといえるが、その下の属の分類に関しては不明瞭な部分がみられた。これを解決するためには、骨片だけでなく筋肉などの柔組織の観察が必要となってくるだろう。また、本目が所属するクモヒトデ綱の系統分類は依然不明瞭なままである。日本近海はクモヒトデ綱の多様性が高く、本綱の系統分類学的研究を行う上で格好のフィールドである。そこで今後は、本目の研究で培った分子系統解析の手法や、クモヒトデ類の形態観察手法に基づくことで本綱を用いた網羅的な系統分類学的研究に発展していけると期待される。
内的表象の投影による意味の創発に関わる認知・神経メカニズムの解明

人は外的刺激に対して内的表象を形成することで新たな意味を創発する(例:雲の形から動物・人間の顔などを思い浮かべる)。そこで、本研究では抽象的な図形に対し他の概念(新たな意味:比喩)を用いて表現する「比喩生成」を対象とし、新たな意味(比喩)の生成における、内的表象の形成に基づく新たな意味の創発(比喩生成)の認知・神経メカニズムをMRI実験・計算機シミュレーションを用いて解明する。
3Dプリンターを用いたイヌiPSおよび体性幹細胞由来立体人工肝臓の構築

本研究の目的は、3Dプリンターでイヌの立体人工肝臓を構築することである。これまで我々は、生体外で長期間培養できる肝細胞の作製を試みてきた。しかしながら、肝細胞は単層で培養すると、本来の薬物代謝能を発揮できないばかりでなく、わずか数日しか生存維持ができない。そこで、本研究では3Dプリンター技術を用いて、薬物代謝能を持った生体外肝組織の構築を目指すことを最終目標とした。この目標を達成するためには、具体的な手法として、肝細胞やiPSを細胞ソースとして約500ミクロンの細胞凝集塊を作成し、凝集塊を3Dプリンター技術を用いて積層し、3次元構造を作成するという方法の検討が必要である。平成29年度は、細胞ソースとして肝がん細胞を用い、凝集塊作製のためには、犬肝がん細胞:1.0×104/well,ヒト臍帯静脈内皮細胞(HUVEC):0.5×104/well,イヌ間葉系幹細胞(MSC):3.0×104/wellでの共培養が最適であると考えられた。この条件をもとに、30年度は、細胞ソースを犬初代肝細胞(cHep)に変更し、3次元化する際に最適な球形細胞凝集塊の形成を試みた。その結果、cHep 1.0×10^4/well; HUVEC 0.7×10^4/well MSC 1.0×10^4/wellで混合した時に最も凝集塊が球形に近い形態を示した。そこで、この凝集塊を3Dプリンターを用いて積層した後、肝細胞、細胞凝集塊、人工肝組織に関して、Real time PCRにてアルブミン、CYP2E1、CYP3A12の発現を比較検討し、さらに3次元構造の組織切片を作成し、HE染色を行った。その結果、凝集塊の状態で、アルブミン、CYP2E1、CYP3A12の発現は見られるものの、肝細胞よりも発現が低下し、3次元構造では発現が認められなかった。3次元構造のHE染色では細胞死を呈する細胞が多かった。現在の問題点は、犬の初代肝細胞を細胞ソースとした場合に、細胞凝集塊の時点で肝細胞よりもアルブミン、CYP2E1、CYP3A12の発現が低下し、さらに3次元構造では生存する肝細胞数が少ないところである。研究の過程で、細胞を共培養する際に、MSCの比率を上げるとスフェロイドの形成能は高まり、球形の凝集塊が得られる利点があるものの、凝集塊の中の肝細胞の生存率が下がる重大な欠点があることも分かった。MSCの比率を下げると、肝細胞の生存率は上がるが、反面、凝集塊の球形が保てない。凝集塊が球形でない場合、3Dプリンターにおける積層に時間を要し、この時点で細胞の生存率が下がる可能性が考えられる。さらに、先行研究(Yanagi Y, 2017)における報告では、肝細胞が肝臓構造体の周囲にありHUVECやMSCが中心に集まるとあったが、本研究では肝細胞を取り囲むようにしてMSCが存在した。このことに関しては、人の細胞と犬の細胞の性質の違いなのか、それとも培養条件が原因であるかは不明である。しかし、肝細胞がMSCにとり囲まれた状態では、肝細胞への酸素および供給が低下し、細胞死に至る可能性が高まる。今後は、共培養の細胞の割合の検討に加えて、肝細胞用培地の割合を増やすなどの培地を混合する割合の検討、増殖因子の組み合わせの決定を行うことが、問題を解決する糸口であると考えている。今後は、初代肝細胞、HUVEC、MSCおよび各細胞に適した培地を混合する割合を決定すルことに加えて、現在使用しているHGFの他、bFGFを加える、またサイトカイン(IL1, 6など)を加えることで、500ミクロンの球形細胞凝集塊を作成できる最適培養条件を整える。同時に、現在取り組んでいる皮膚線維芽細胞に、ダイレクトリプログラミングを施して作製した肝様細胞から細胞凝集塊が形成できるか、また骨髄由来間葉系幹細胞にもダイレクトリプログラミングを検討し、最終目標である「犬体性幹細胞や犬iPS細胞から分化誘導した肝細胞様細胞をソースとした薬物代謝が可能な人工肝組織」の作製に近づくための検討を開始する予定である。作成した細胞凝集塊は、平成30年度と同様に、アルブミンに加えて、犬で報告されているCYP(CYP2E1、CYP3A12など)の発現を定量的PCRと免疫染色にて確認し、HE染色では形態観察(細胞配列の確認および細胞生存の確認)を行う。また、3次元構造(人工肝組織)に関しては、肝代謝を受ける薬物(ミタゾラム、フェノバルビタール、アセトアミノフェンなど)を人工肝に投与し、薬物動態をみる。今後順調に研究が進めば、犬人工肝組織は、創薬の毒性試験に応用が期待でき、動物実験代替法ともなる。「動物実験数の大幅削減」を求める現代社会の動きに対応するだけでなく、「信頼性の高い薬物動態や毒性試験の結果が求められる」という難題に直面している医学・創薬および獣医学研究における有力な解決策の一つになることを目標にして研究を遂行したい。

平成29年度はまず、細胞ソースと培養基材の検討を行い、3Dプリンターで三次元化するときに最適といわれる、直径500ミクロンの細胞凝集塊を形成するための細胞数を検討した。細胞のソースには、iPSや体性幹細胞を使用する前段階として、犬の初代肝細胞および犬肝がん細胞を用いた。これらの細胞との共培養に必要な細胞の選択として、三次元組織内への血管侵入を果たし、酸素供給が望めると考えられているヒト臍帯静脈内皮細胞(HUVEC)および各種サイトカイン産生を見込めるイヌ間葉系幹細胞(MSC)を選び、共培養も試みた。培養基材に関しては、96穴プレートに関して、「PrimeSurface 96U」(住友ベークライト)と、Nunclon Sphera 96U Bottom Plate (Thermo)の検討を行った。その結果、犬肝がん細胞の場合、犬肝がん細胞:1.0×104, HUVEC:0.5×104, At-MSC:3.0×104で混和して共培養する条件が、凝集塊を形成するために最適であると考えられた。500ミクロンという大型の凝集塊を安定して作成できれば、三次元組織化も順調に遂行することができることが予測できる。肝がん細胞に関してはこれらの条件が整ったことがわかった。現在の進捗状況がやや遅れている点は、犬の初代肝細胞に関して、500ミクロンという大型の凝集塊を作成する最適条件が定まっていない点である。本研究の最終目標は薬物代謝が可能な人工肝組織を作成することである。したがって、犬肝細胞もしくは犬体性幹細胞や犬iPS細胞から分化誘導した肝細胞様細胞をソースとして利用する条件検討を行う必要がある。現状では、犬iPS細胞の入手が簡単ではなく、入手が可能であった犬初代肝細胞を用いて、条件検討を行っている。以前の研究でも、初代肝細胞の生存維持は困難であることが明らかであり、三次元化する際にも、おそらく、肝細胞が生存・維持するためには主に増殖因子(HGF、bFGFなど)やサイトカイン(IL1, 6など)の最適な組み合わせを検討することが、問題を解決する糸口であると考えている。本研究の目的は、3Dプリンターでイヌの立体人工肝臓を構築することである。これまで我々は、生体外で長期間培養できる肝細胞の作製を試みてきた。しかしながら、肝細胞は単層で培養すると、本来の薬物代謝能を発揮できないばかりでなく、わずか数日しか生存維持ができない。そこで、本研究では3Dプリンター技術を用いて、薬物代謝能を持った生体外肝組織の構築を目指すことを最終目標とした。この目標を達成するためには、具体的な手法として、肝細胞やiPSを細胞ソースとして約500ミクロンの細胞凝集塊を作成し、凝集塊を3Dプリンター技術を用いて積層し、3次元構造を作成するという方法の検討が必要である。平成29年度は、細胞ソースとして肝がん細胞を用い、凝集塊作製のためには、犬肝がん細胞:1.0×104/well,ヒト臍帯静脈内皮細胞(HUVEC):0.5×104/well,イヌ間葉系幹細胞(MSC):3.0×104/wellでの共培養が最適であると考えられた。この条件をもとに、30年度は、細胞ソースを犬初代肝細胞(cHep)に変更し、3次元化する際に最適な球形細胞凝集塊の形成を試みた。その結果、cHep 1.0×10^4/well; HUVEC 0.7×10^4/well MSC 1.0×10^4/wellで混合した時に最も凝集塊が球形に近い形態を示した。
付着阻害活性天然物のメカニズム解明を目指した蛍光プローブの合成研究

本研究では、付着生物に対する付着阻害活性天然有機化合物をリードとし、蛍光プローブ合成を目的とする。阻害剤のリード化合物として、強い付着阻害活性と低毒性を併せ持つOmaezallene(含臭素化合物)とDolastatin 16(環状ペプチド)に着目した。これらの付着阻害メカニズムを解明をすることで、理想的な化合物開発の糸口となる。Omaezalleneでは、合成経路を応用することで、種々の誘導体を合成し、構造活性相関研究を進蛍光標識体を合成できた。Dolastatin 16では、合成経路を確立するとともに、強力な付着阻害活性を持つことが明らかにした。本研究では、付着生物に対する付着阻害活性天然有機化合物をリードとし、その蛍光プローブ合成を目的とする。既存の付着阻害剤は重金属を含んでおり、環境にやさしい化合物の開発が切望されている。そのツールとして、両化合物の蛍光プローブを合成、利用する。我々が独自に見出した全合成経路を応用することで、プローブを合成する。Omaezalleneでは、すでに合成経路を確立しているので、その経路を応用することで、種々の誘導体を合成し、構造活性相関研究を進めた。その結果、構造を簡略化しても若干の付着阻害活性の低下に留まることを明らかにできた。Dolastatin 16では、合成経路は確立できていなかったが、本研究によって効率的な合成経路を確立することができた。合成品の付着阻害活性試験の結果、天然から得られたサンプルと同様の強力な付着阻害活性を持つことが明らかにした。また、鎖状の合成中間体2種の付着阻害活性試験も試みたが、これらの活性はDolastatin 16よりも著しく低下した。このことから、Dolastatin 16の環状構造が活性発現に重要であることが示唆された。Omaezalleneでは、蛍光官能基導入に向けた構造活性相関研究を展開し、目途を立てることができた。Dolastatin 16では、蛍光官能基導入および構造活性相関研究を進めるうえ不可欠な合成経路を確立できた。本合成は、構造活性相関研究が容易な経路となっており、次年度ではそれらを進める。メカニズム解明のためのツールとして、両化合物の蛍光プローブを合成、利用する。Omaezalleneでは、すでに合成経路を確立しているので、その経路を応用することで、昨年度からさらに種々の類縁体の合成を推し進め、さらなる構造活性相関研究を進めた。その結果、各種蛍光プローブを合成するための共通中間体の合成経路を確立するとともに、蛍光誘導体を1種合成することができた。現在、その誘導体の付着阻害活性を検討している。Dolastatin 16では、昨年度効率的な合成経路を確立することができたので、蛍光誘導体の合成に向けて官能基化を検討した。これに関し、C-H活性化反応および4-ヒドロキシプロリンを用いることで、Dolastatin 16のそれぞれ3か所(1つの異常アミノ酸および2か所のプロリン)を官能基化することに成功した。また、それらの大量合成にも成功している。現在、それぞれの誘導体合成を進めている。Omaezalleneでは、27年度に見出した誘導体に各種蛍光官能基を導入した化合物を得た後に、付着阻害活性試験を行い、最適化合物を見出す。Dolastatin 16については、蛍光官能基導入の前段階である、構造活性相関研究を進める。具体的には、本化合物には芳香環を含む異常アミノ酸があり、その芳香環をさらに官能基化することで化合物を合成する。有機合成化学
ヒトの知覚における確率共振現象の生理学的メカニズムの解明

脳内で確率共振が起きる証拠を示すために、脳波から逆問題を解いて脳内ノイズレベルを推定することを試みたが、計算機シミュレーションの結果から正確な推定は困難であることが明らかになった。次に、経頭蓋ランダムノイズ刺激により脳内ノイズレベルを操作できる証拠を得るために、心理物理実験により脳内ノイズレベルを推定した。操作できることが示唆されたが、さらなる実験的裏付けが必要である。最後に、安静状態ネットワークのノードに経頭蓋磁気刺激を行い、誘発反応を脳波で計測した。脳波からアーチファクトを除去する方法を検討し、安静状態ネットワークに固有の神経振動周波数が存在するかどうかを調べた。経頭蓋ランダムノイズ刺激(transcranial random noise stimulation; tRNS)は、頭皮上からランダムノイズ波形の電気刺激を行うことで、大脳皮質にノイズを印加できるものと考えられている。しかし、実際にtRNSにより脳内ノイズ強度が変化したかどうかを検証した研究は存在しない。そこで、本研究では、tRNSにより脳内ノイズ強度を増やすことができるかどうかを実験的に検討する。昨年度の研究において、脳内ノイズ強度の評価を脳波などの生理学データから推定することは困難であることが示唆されたため、心理学的な方法で評価することにした。具体的には、刺激強度と反応(刺激検出確率など)の間の関係を表す心理測定関数は、一般にS字型になることが知られており、その傾きパラメータは脳内ノイズ強度を反映すると考えることができるため、これを利用することにした。予備実験では、tRNS刺激時とシャム刺激(最初の数秒だけ電流を流し、その後にオフにする;コントロール実験)時に、視覚コントラスト検出課題を行い、それぞれの刺激条件で心理測定関数を推定して、傾きパラメータを条件間で比較した。その結果、tRNS刺激時にはシャム刺激時と比較して脳内ノイズ強度が大きくなる傾向が示唆された。その後、先行文献の調査の結果、経頭蓋磁気刺激(transcranial magnetic stimulation; TMS)の効果(脳内ノイズに与える影響等)を調べた心理物理実験研究では、視覚方向識別課題が広く用いられていることが分かったため、本研究でも視覚コントラスト検出課題に代わって視覚方向識別課題を用いることにした。既に視覚刺激提示プログラムの作成は完了したので、今後、実験を行う予定である脳内で確率共振が起きる証拠を示すために、脳波から逆問題を解いて脳内ノイズレベルを推定することを試みたが、計算機シミュレーションの結果から正確な推定は困難であることが明らかになった。脳波(EEG)データから階層変分ベイズ推定に基づき大脳皮質電流を推定するソフトウェアであるVariational Bayesian MultimodalEncephaloGraphy (VBMEG)により、脳内ノイズ強度を正しく推定できるかどうか、計算機シミュレーションによる検討を行った。具体的には、大脳皮質上に二つの信号源があり、正規白色ノイズが大脳皮質上の各頂点とEEGの各センサに存在する(それぞれ、脳内ノイズ、センサノイズに相当する)という仮定の下で、構造MRIデータに基づくforward modelにより生成された模擬EEGデータから、VBMEGにより脳内ノイズ強度を推定した。実際の実験環境では、脳内ノイズ、センサノイズともに被験者間および実験日間で変動すると想定されるため、両ノイズ強度の組み合わせを複数通り用意してシミュレーションを行い、センサノイズ強度に依存せずに正しく脳内ノイズ強度が推定可能かどうか調べた。まず、センサノイズ強度を固定した場合、脳内ノイズ強度の真値と(VBMEGによる)推定値の間には単調増加関係が見られた。このことは、VBMEGにより脳内ノイズ強度を推定できるための必要条件である。しかし、脳内ノイズ強度を固定した場合、脳内ノイズ強度の推定値はセンサノイズ強度に対して単調増加することが明らかになった。このように、脳内ノイズ強度の推定値がセンサノイズ強度に依存していても、センサノイズ強度が既知であれば、脳内ノイズ強度を正しく推定することは可能である。しかし、実際の実験環境ではセンサノイズ強度が未知であるため、脳内ノイズ強度を正しく推定することは困難であることが示唆された。次年度以降の当初の研究計画は、VBMEGにより脳内ノイズ強度が正しく推定できることを前提としていたため、研究計画に修正を加える必要が生じた。安静時の脳には複数の同期活動するノードから形成されるネットワーク(RSN)が存在すると考えられている。一方、経頭蓋磁気刺激(TMS)を行うと脳波(EEG)に振動が誘発され、その周波数は刺激部位により異なることから、脳は部位毎に独自の自然周波数を持つことが示唆されている。本研究では、この知見を拡張して、各々のRSNは独自の自然周波数で同期振動しているという仮説を立てた。この仮説を実験的に検証するために、代表的なRSNであるデフォルトネットワーク(DMN)と背側注意ネットワーク(DAN)に着目し、TMS-EEG実験を行った。実験で得られたEEGデータにはTMS由来のアーチファクトが混入していた。自然周波数を正確に推定するためには、アーチファクトを適切に除去することが不可欠であるため、除去方法を検討した。

まず、主成分分析や独立成分分析(ICA)によりアーチファクト成分を推定、除去する方法では、TMS直後のスパイク状の成分を十分に除去できなかった。次に、TMS直後のスパイクを含む数十ミリ秒の区間を除去して補間する方法では、過不足が生じた。最後に、TMS直後の数ミリ秒の区間を除去してからICAを行い、アーチファクト成分を推定、除去した後、欠損区間を補間するハイブリッド手法では、アーチファクトをほぼ過不足無く除去できた。ハイブリッド手法でアーチファクトを除去したEEGデータに対し時間周波数解析を行った。DANノードである前頭眼野や頭頂間溝へのTMS刺激では共通して約10Hzのアルファ振動が誘発され、DANの自然周波数がアルファ帯域であることが示唆された。しかし、DMNノードの側頭頭頂接合部への刺激では、TMSにより頭皮筋が収縮したことに由来する大きなアーチファクトが十分には除去できず、正確に自然周波数が推定できなかった。以上から、仮説をサポートするのに十分な証拠は得られなかった。身体教育学年度途中で実験課題を視覚コントラスト検出課題から視覚方向識別課題に変更したため、実験開始が平成26年度となった。「研究実績の概要」に書いた通り、VBMEGにより脳内ノイズ強度を推定することが困難であることが、計算機シミュレーションの結果から明らかになり、当初の研究計画で予定されていた実験を行うことができなくなったため。経頭蓋ランダムノイズ刺激(tRNS)により脳内ノイズ強度が増える可能性があることが、視覚コントラスト検出課題を用いた心理物理実験のデータから推定した心理測定関数の傾きパラメータによる評価から示唆されたので、十数名程度の被験者に対して視覚方向識別課題を用いた同様の実験を行って検証する。また、経頭蓋直流電流刺激(transcranial direct current stimulation; tDCS)でも脳内ノイズ強度が変わる可能性があるため、実験的に検証する。並行して、tRNSなどの経頭蓋電気刺激(transcranial electric stimulation; tES)で安静時の脳内ネットワークの活動(resting state network; RSN)を制御できるかどうかを脳波(electroencephalography; EEG)あるいは脳磁図(magnetoencephalography; MEG)により実験的に評価する。さらには、RSNを制御することで行動にどのような変化が生じるかも検討する。脳内ノイズ強度をVBMEGにより推定することが困難であることが示唆されたため、当初の研究計画を大幅に修正する必要が生じた。本研究の目的は、脳の背景活動(ノイズや振動など)が知覚や運動にどのような影響を与えているのかを明らかにすることであるので、今後は、経頭蓋電気刺激(tES)や経頭蓋磁気刺激(TMS)のような脳刺激やニューロフィードバックなどの手段により、脳の背景活動を操作することで、この問題にアプローチしていくこととする。
カント『オプス・ポストゥムム』の研究-後期草稿群を中心に

本研究では、カントが晩年に書き残した一連の草稿群である『オプス・ポストゥムム』のうち、特に1800年以降に執筆された第7束と第1束の思想を、批判期のカントの思想との異同に留意するとともにフィヒテをはじめとする同時代の思想家からのカントへの影響を加味しながら究明した。具体的には、『オプス・ポストゥムム』で述べられる「物自体」、「空間と時間」、「自己定立論」、「超越論哲学」について、当時の書評等も含め、さまざまな文献の読解を通じて解明した。本研究の目的は、カントの『オブス・ポストゥムム』(以下『遺稿』)のうち1800年以降に書かれた草稿群の思想を、いわゆる批判期の思想とめ異同や強調点の違いに留意するとともにカントと同時代の思想家との関係を加味しながら、究明することにある。当年は『遺稿』第7束の主要テーラである「物自体」、「空間と時間」、「自己定立」を中心に研究を遂行した。具体的な成果としては、まず論文「カント『オプス・ポストゥムム』における同時代の思想家からの影響」がある。『遺稿』では物自体が「思考物(Gedankehding, ensrationis)とされ、現象と物自体が二つの観点から見られた同一の物である点が批判期より一層強調されるが、『純粋理性批判」には物自体を直接、Gedankendingとする用例はなく、物自体と現象の差異を二重の観点とする発想はフィヒテやシェリングには見られない。こうしたことを明らかにしたうえで、『遺稿』における物自体論が当時の思想家に対する反論的応答としての役割を持つことを示した。また、『遺稿』には「空間と時間」を「自発性」や「自己活動性」に関連づける議論が見られるが、これを当該論文ではカントの弟子であるJ. S.ベックとの関係において考察し、その影響の可能性を指摘した。「自己定立」に関しては、これまでカントとフィヒテの自己定立論の差異を詳しく論じた研究は殆どなされていない.そこで、「第24回日本フィヒテ協会大会」において両者の比較検討に関する口頭発表を行った。それにより、フィヒテの自己定立が「対自」という観点から展開されているのに対して、カントめ場合、悟性的・叡智的自我と感性的・経験的自我という「二重の自我」の概念を堅持しつつ、フィヒテと全く異なった自己定立論を展開していることを明らかにした。本研究の目的は、カントの『オプス・ポストゥムム』(以下『遺稿』)一のうち1800年以降に書かれた草稿群の思想を、「批判期」との異同に留意すると共に主としてカントと同時代の思想家との関係や影響を加味しながら、究明することにめる。当年は『遺稿』第7束の「自己定立」に加え、第1束における「超越論哲学」と「超越論的観念論」を中心に研究を遂行した。「自己定立」に関しては、カントとフィヒテの自己定立論の差異をテクストに即して詳しく論じた研究は殆どなされていない。そこで、フィヒテの自己定立論を「事行」「対自」等の観点から鮮明にし、カントの自己定立論の本質が悟性的・叡智的自我の自己感性化のうちにあることを明らかにした。「超越論哲学」と「超越論的観念論」に関して言えば、カントは『遺稿』において超越論哲学を実践哲学を含めた哲学の体系とするが、1790年代後半以降、他の思想家によって批判期のカントの用法を超えて理論かつ実践哲字の体糸といり形で、言わば拡大されるようになる。このことを当時の雑誌の「書評」なども活用しながら文献的に証不した。また「超越論的観念論」に関しては周知のように、フィヒテやシェリングをはじめ独自の意味で使われるようになるが、『遺稿』においてカントは「シェリング」のみならず、「スピノザやリヒテンベルクの超越論的観念論」とさえ述べるようになる。日本ではどの点に関する研究はないが、海外ではカントが彼らを積極的に評価したとする解釈が主流である。しかし『遺稿」には批判期と同様、スピノザに対するネガティヴな文言が散見され、リヒテンベルクの書物を実際に繙いても、彼は独断的な観念論に極めて近い考え方をしている。こうしたことから、カントか敢えて前記の表現をするのは、自分とは別種の観念論を批判するためであるといり解釈の可能性を探求した。
運動による脳容量向上と認知症予防に対する効果検証

本研究課題は、mild cognitive impairment (MCI)を有する高齢者に対する運動介入方法としてどのようなものが適しているのかを強度、内容、頻度などの観点から検討することを目的とした。平成27年度は、海外研究機関での研究活動を実施し、疫学調査結果の解析や脳画像解析を共同で実施した。その結果、本研究課題の中心的課題であるMCIの身体活動ならびに身体機能に関するいくつかの知見を得ることができた。MCIは認知症のリスクが高いことから着目されているが、認知機能だけでなく身体機能低下が加わることで、より認知症リスクが高まることが近年知られている。特に歩行能力の低下に着目が浴びており、MCIと組み合わさることでよりハイリスクとなることが解析により明らかになった。脳画像解析については、分割化ならびに標準化された画像を用い、灰白質と関連するパターンを解析するためにprincipal components analysisを用いた解析を行った。前述した認知機能低下に重要な役割を果たしている歩行能力との関連性を検討するためにprincipalcomponents analysisを実施し、関連する部位を明らかにした。また、前年度から着目しているdual-taskを行った際の運動パフォーマンスに関連する要因ついて、実験的に実施したdual-task歩行と脳画像指標との関連性を検討した結果、MCI高齢者のdual-task歩行と白質病変との関係性が明らかになり、dual-taskを用いた課題設定を行う際には脳画像評価を考慮することが重要であることが示唆された。27年度が最終年度であるため、記入しない。MCI高齢者を対象に運動介入が認知機能に及ぼす効果をランダム化比較試験により検証した研究は6つと少ない上に、その効果は限局的で一貫性をもった結論を得るまでには至っていない。これらの研究における問題点は、運動介入方法の定義が不明瞭な点であり、どのような時間・内容(強度)・頻度の運動介入がMCI高齢者の認知機能に影響を及ぼすかについて精査されずに実施されている点である。それらを明らかにすることが本研究の中心的課題である。そこで、本研究はまずMCI高齢者を対象に横断調査を実施し、身体活動の構成要素別に認知機能向上に寄与できる身体活動を特定し、具体的に明示することを課題とする。身体活動の各構成要素を客観的かつ定量的に評価するには、加速度計内蔵の活動量計が推奨され、活動量計を用いることで身体活動の運動強度別の活動時間や活動頻度を算出でき、身体活動の時間・内容(強度)・頻度について客観的に定量化することが可能になる。当該年度である、平成25年度においては、研究の第1段階を実施した。受入研究機関においてスクリーニングを実施し横断調査を実施した。横断的調査では、全ての対象者に身体活動や認知機能(MRIを含む)を中心に評価・測定を行った。その結果、脳画像指標と定量化された身体活動量との関係性を検討し、脳の萎縮の程度と身体活動の量が負の相関関係を持っていることが明らかになった。さらに、運動強度別には中強度以上の活動が強く関連していることが分かった。MCI高齢者を対象に運動介入が認知機能に及ぼす効果をランダム化比較試験により検証した研究は実施例が少ない上に、その効果は限局的で一貫性をもった結論を得るまでには至っていない。平成26年度の主な研究実績としては、平成25年度に実施した研究から得られた成果を論文化し、国際誌への投稿・掲載を行った。MRI画像指標と身体活動量から、脳萎縮の程度が身体活動の中でも、中等度以上の強度(3METs以上)で行われている活動に対し有意に関連性を示し、白質病変などの潜在的介在因子により調整を行っても、それらの結果は保たれていた。これにより、身体活動の中でも中強度以上の強度に設定されたプログラムの実施が望ましいと考えられる。さらに、介入研究のプログラム開発として行った検討から、運動時に認知課題を負荷することにより認知機能向上に効果があるかもしれない可能性を、dual-task(同時課題)を用いた実験により示した。軽度認知障害を有する高齢者を対象に、歩行時に計算課題を行い、dual-task歩行時の機能指標が認知機能と関連しているかについて検討したところ、遂行機能や記憶といった領域との関連性が認められた。これらの結果は、各介在因子により調整を行っても有意性が保たれていた。これらの結果から、プログラム内容としては強度と課題設定について注目すべき必要があり、かつ高齢者の人が持続的に取り組めるようなプログラムの開発が重要になると考えられる。

特に歩行能力の低下に着目が浴びており、MCIと組み合わさることでよりハイリスクとなることが解析により明らかになった。脳画像解析については、分割化ならびに標準化された画像を用い、灰白質と関連するパターンを解析するためにprincipal components analysisを用いた解析を行った。前述した認知機能低下に重要な役割を果たしている歩行能力との関連性を検討するためにprincipalcomponents analysisを実施し、関連する部位を明らかにした。また、前年度から着目しているdual-taskを行った際の運動パフォーマンスに関連する要因ついて、実験的に実施したdual-task歩行と脳画像指標との関連性を検討した結果、MCI高齢者のdual-task歩行と白質病変との関係性が明らかになり、dual-taskを用いた課題設定を行う際には脳画像評価を考慮することが重要であることが示唆された。平成26年度の進捗としては、平成25年度から実施している横断調査に加え、介入研究も順調に進み現在解析を行っているところである。横断調査より得られた知見においては、国際誌への投稿・掲載が完了していることから、研究の推進だけでなく成果発表の面においても順調に進められているものと考えられ、当初の計画通り研究を遂行できていることが考えられる。27年度が最終年度であるため、記入しない。継続して解析をを行うとともに、平成27年度には海外研究機関での研究実施も予定しており、可能な限り研究成果を論文化を中心に創出する方策である。計画段階にあった、横断調査のデータ測定ならびに解析がおおむね終了し、論文作成の段階に進んでいるため27年度が最終年度であるため、記入しない。計画通り遂行する。
急性肺障害の慢性化過程に動的な生体内レドックスリモデリングが果たす役割の追究

低酸素から酸素ホメオターシスの破綻まで解析対象を広げ、生体内レドックス制御因子であるチオレドキシン(TRX)を中核として、その結合タンパク質TXNIPと転写因子hypoxia-induciblefactor 1(HIF-1)との相互作用の解析を通して敗血症から急性肺障害への過程の理解と臨床への応用を指向した研究を遂行した。TXR1はHIF-1活性化を促進すること、HIF-1はTXNIPの発現を促進するが,TXNIPはTRX1の活性化を抑制するという関係が存在することが明らかになった。このことから細胞のレドックス環境が複数の分子の微妙なバランスの上に存在することが明らかになった。酸素環境が激しく変化する臓器である肺を特に取り上げて生体内レドックス環境が炎症反応の進展に果たす役割の解明を目指すことが本申請の目的である。生体内レドックス制御因子であるチオレドキシン(thioredoxin, TRX1)を中核として、その結合タンパク質thioredoxin-interacting protein(TXNIP)と低酸素誘導性因子1(hypoxia-inducible factor 1, HIF-1)との相互作用の解析を通して生体の炎症反応を敗血症から急性肺障害を経て肺線維症にまでいたる生体内機序を理解することが具体的な方策である。所期の実験計画に基づき研究初年度に以下の研究を行ったので報告する。#培養細胞を用いたin vitro実験の確立-細胞株(肺胞上皮由来樹立細胞株A549、ヒト末梢血単球由来THP-1細胞、ヒト単球様細胞U937、マウスマクロファージRaw264.7)を用いてplasmid,ウイスルベクターなどを用いてHIF-1α, TRX1, TXNIPの発現を操作する実験系を構築した。培養酸素分圧を20%から1%まで変化させて検討を行う。外因性物質であるPAMPsと内因性物質であるalarminsを含むDAMPs(damage-associated molecular patterns:傷害関連分子パターン)に暴露して以下の項目について検討を可能にする実験系を確立した。○細胞内レドックスバランスの指標としてGSH/GSSG, NAD+/NADPの測定○代謝モード推定のためのOxygen consumptionrate (OCR)の測定、ミトコンドリア機能のアッセイ#初代培養細胞(肺胞マクロファージ、腹腔マクロファージ、樹状細胞)をTRXトランスジェニック、TXNIP遺伝子破壊マウスなどから調整する準備を開始した。#一方動物モデルの構築には着手できなかった。培養細胞を用いた実験系がほぼ予定通りに確立できた。生体内レドックス制御因子であるチオレドキシン(thioredoxin,TRX1)を中核として、その結合タンパク質thioredoxin-interacting protein(TXNIP)と低酸素誘導性因子1(hypoxia-inducible factor 1, HIF-1)との相互作用の解析を通して生体の炎症反応を敗血症から急性肺障害を経て肺線維症にまでいたる生体内機序を理解することが具体的な目標である。当初の研究計画に沿って,昨年の成果に基づき今年度に以下の研究を行ったのでその成果を報告する。1培養細胞を用いたinvitro実験の確立-細胞株を用いての実験系の確立に続いて今年度は,初代培養細胞(肺胞マクロファージ、腹腔マクロファージ(チオグルタレート刺激)を用いた実験系の確立を行った。昨年度の研究成果と合わせて,TXR1はHIF-1活性化を促進すること,HIF-1はTXNIPの発現を促進するが,TXNIPはTRX1の活性化を抑制するという関係が存在することが明らかになった。このことより細胞のレドックス環境が複数の分子の微妙なバランスの上に存在することが明らかになった。肺線維症の原因となり得るタバコ抽出液により肺胞,気管支上皮由来の細胞において活性酸素依存的にTRXとHIF-1の活性化をもたらすことを見いだした。2動物モデル-昨年度は着手できなかった動物モデルを構築した。敗血症モデルと低酸素モデルをマウスを用いて構築してサンプルの採取に着手した。また肺線維症の原因となり得るタバコ煙の吸引が肺において活性酸素依存的にHIF-1の活性化をもたらすことを見いだした。培養細胞を用いたinvitro実験を確立しただけでなく、動物モデルについても着手できた。生体内レドックス制御因子であるチオレドキシン(thioredoxin, TRX1)を中核として、その結合タンパク質thioredoxin-interacting protein(TXNIP)と低酸素誘導性因子1(hypoxia-inducible factor 1, HIF-1)との相互作用の解析を通して敗血症から急性肺障害を経て肺線維症にまでいたる生体内機序を理解することが具体的な目標である。初期の実験計画に基づき今年度は以下の研究を行った。#培養細胞を用いたin vitro実験の確立-細胞株を用いての実験系の確立に続いて今年度は,初代培養細胞(肺胞マクロファージ、腹腔マクロファージ(チオグルタレート刺激))を用いた実験系の確立を行った。