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積分方程式理論に基づく揺らぎと水和の理解

生体分子系の理解においては二つの側面が重要である。一つは構造の柔軟性であり、今ひとつは水和である。本研究課題においては、各々に対して「構造揺らぎ」と「水和」を記述できる新しい統計力学理論を開発し、これらを用いて実際の蛋白質の持つ物理化学的な性質を明らかにすることを目的として研究を進めて来た。今年度までに、以前我々が開発した高効率並列化計算が可能なMC-MOZ法を用いて、バクテリオロドプシンの内部水やCoil-Serの表面の水和構造について計算し、これを解析する新しい方法を開発した。この成果はアメリカ化学会J.Phys.Chem.B誌に掲載されるとともに、表紙にも採用されるなど大きな注目を集めた。更にMC-MOZ理論を用いて得られる溶媒和自由エネルギーに関して、RBC(repulsive bridge correction)を加えると水溶媒中では高精度でエネルギーが得られることが分かった。一方で、四塩化炭素など分子サイズが比較的大きい溶媒の場合はこの限りでなく、更なる補正によって適切な値が得られることを明らかにしている。MC-MOZ理論は現在の計算機環境によく適合することから今後の更なる発展が期待されている。以上のように水和理論について当初の計画を十分に達成できたものと考えている。一方、構造揺らぎに関しては昨年度までに基盤となる理論を完成し、ペンタンやイオン液体などの計算に成功している。今後も水和理論との結合を目指して引き続きその拡張について検討を行う予定である。また、蛋白質の機能や溶液中分子の重要な性質に関わる分子の会合、認識に関して、最も簡単なモデルと考えられるホスト-ゲスト系を取り上げて、MC-MOZ法などを用いながらその会合機構についても明らかにした。先の特定領域研究「水と生体分子」の成果を踏まえ、「揺らぎ理論」と「水和理論」の整備を行い、当初の目的を達成した。「揺らぎ理論」に関しては、配座異性体を持つ分子からなる液体に対して、分子内・分子間構造を計算する新しい積分方程式理論を完成した。この理論では孤立分子に対する分子内相関関数をモンテカルロ法などで得たのち、分子間の多体相互作用に由来する部分のみに対する方程式を解く。二原子分子から直鎖デカンにいたる分子性液体に実際に適用し、散乱実験等より得られた結果とも良好な一致を示すことが分った。これらの結果は既にとりまとめて学術論文として発表済みである。一方、「水和理論」に関しては、以前に我々が開発した高効率並列化計算が可能なMC-MOZ法を用い、バクテリオロドプシンの内部水の分布やCoil-Ser表面の水和構造について計算を行った。さらに得られた三次元空間内における水の分布関数を整理・理解するために、(1)分布関数の極小面近くで区切って直方体を定義し、内部に含まれる水分子の数を数値積分することによって配位数を求める方法、あるいは(2)分布関数を三次元ガウス型関数でフィットし、揺らぎの方向性や大きさを解析する方法を提案した。また酸素と水素の分布関数を併せて解析することにより、水素結合のネットワーク構浩がMC-MOZ法で正しく計算されている事を確認できた。これらの結果は、結晶構造解析などの実験で得られている傾向とも良好な一致を示しており、学術論文として既に投稿している。
卵細胞質分裂における低分子量GタンパクRhoの発現制御とその役割

低分子量Gタンパクは多くの種類の細胞内で多様な機能を持っていることが知られており、受精直後からおこる卵細胞内のダイナミックな変化にもこの低分子量Gタンパク群が関与する可能性が考えられる。低分子量Gタンパクの中でRhoもまた細胞内の多くの機能を担っていると考えられている(Nature1996,383,177-179,Nature1996,384,427-432)。今回我々はRhoとRhoを制御するタンパクRhoGDIの卵発生初期における役割について検討した。そこで、マウス卵と精子を使った体外受精の系でRhoが細胞質分裂に特異的に働いていることを検討する目的で、分裂前後の卵にRhoのmRNAとタンパクが存在するかどうかをRT-PCR法およびウエスタンブロット法で確認したところ、検出は可能であった。現在、Rhoの細胞分裂時の細胞内分布とその変動を、抗Rho抗体を用いて染色し、レーザー共焦点顕微鏡を用いて調べている。次にRhoの擬能を阻害するC3トキシン酵素を受精前、受精直後、前核形成前、前核形成後のそれぞれの卵に微量注入し、前核形成、細胞質分裂、核分裂への影響をみたところ、その酵素の効果の一定の成績を得るに至っていない。そこでRho kinaseの阻害剤を用いて細胞分割への影響をみたところ、morulaからblast cystへの受精卵の成熟を阻害した。またこの阻害は、不可逆的なものでなかった。低分子量Gタンパクの中でRhoもまた細胞内の多くの機能を担っていると考えられている(Nature 1996,383,177-179,Nature 1996,384,427-432)。そこで、マウス卵と精子を使った体外受精の系でRhoが細胞質分裂に特異的に働いていることを検討する目的で、分裂前後の卵にRhoのmRNAとタンパクが存在するかどうかをRT-PCR法およびウエスタンブロット法で確認したところ、検出は可能であったが、Rhoの卵細胞質内分布が分裂前後での変化するか一定の成績に至っていない。次にRhoの機能を阻害するC3トキシン酵素を受精前、受精直後、前核形成前、前核形成後のそれぞれの卵に微量注入し、前核形成、細胞質分裂、核分裂への影響をみたところ、その酵素の効果の一定の成績を得るに至っていない。低分子量Gタンパクは多くの種類の細胞内で多様な機能を持っていることがしられており、受精直後からおこる卵細胞内のダイナミックな変化にもこの低分子量Gタンパク群が関与する可能性が考えられる。現在、Rhoの細胞分裂時の細胞内分布を、抗Rho抗体とともにレーザー共焦点法を用いて調べている。

Rho kinaseの阻害剤を用いて細胞分裂への影響をみている。低分子量Gタンパクは多くの種類の細胞内で多様な機能を持っていることが知られており、受精直後からおこる卵細胞内のダイナミックな変化にもこの低分子量Gタンパク群が関与する可能性が考えられる。低分子量Gタンパクの中でRhoもまた細胞内の多くの機能を担っていると考えられている(Nature 1996,383,177-179,Nature 1996,384,427-432)。今回我々はRhoとRhoを制御するタンパクRhoGDIの卵発生初期における役割について検討した。そこで、マウス卵と精子を使った体外受精の系でRhoが細胞質分裂に特異的に働いていることを検討する目的で、分裂前後の卵にRhoのmRNAとタンパクが存在するかどうかをRT-PCR法およびウエスタンブロット法で確認したところ、検出は可能であった。現在、Rhoの細胞分裂時の細胞内分布とその変動を、抗Rho抗体を用いて染色し、レーザー共焦点顕微鏡を用いて調べている。次にRhoの機能を阻害するC3トキシン酵素を受精前、受精直後、前核形成前、前核形成後のそれぞれの卵に微量注入し、前核形成、細胞質分裂、核分裂への影響をみたところ、その酵素の効果の一定の成績を得るに至っていない。そこでRhokinaseの阻害剤を用いて細胞分割への影響をみたところ、morulaからblast cystへの受精卵の成熟を阻害した。またこの阻害は、不可逆的なものでなかった。
視覚系の両眼立位情報処理に関する研究

本研究は、二眼式立体映像を刺激として用いて、同映像に対する視覚機能反応、視覚誘発脳波波形、心理評価測定を行ない、次の結果を得た。1.視覚機能測定による研究・二眼式立体映像観察後、焦点調節機能および瞳孔機能が、その視距離に依存しつつ、大きく変化した。またこの変化は両機能が互いを補う形であらわれた。・この結果から各視覚機能間で両眼情報が密接な関係で複合的に処理されていることが示唆された。2.視覚誘発脳波(VEP)による研究・二眼式立体映像提示後190msec付近、および270msec付近に両眼視および立体視と関連が示唆される波形のピークが視察され、両眼への映像のパラメータに対応して波形が変化した。・波形の主成分分析を行ったところ270msecのピークは視接の飛び出し量との関係が示唆された。3.心理評価による研究・立体映像に対する観察者の主観的評価では、「立体感」と「臨場感」は異なる印象次元である。・これらの評価が高くなる立体映像の条件として、さまざまな立体視要因が整全性を持っていることが必要である。本年度は二眼式立体映像システムを刺激として用いて,同映像に対する視覚系の各種反応から両眼立体情報処理機構を検討した.本年度行った測定および得られた知見を以下に述べる.(1)視覚機能測定による研究二眼式立体映像観察前後の眼球調節反応および瞳孔反応の変化を測定し,同映像が視覚機能に与える影響等を検討した.測定結果から,平面映像を観察した後に比べ調節機能の変化が大きいことがわかった.また,映像観察距離(視距離)により観察後の変化の様子が異なること,調節機能の変化を瞳孔反応が補うように反応していることがわかった.これらより,立体映像観察による視覚機能変化は単なる疲労ではなく,視覚システムそのものに影響を与えていることが示唆された.(2)視覚誘発脳波測定による研究二眼式立体映像観察中の視覚誘発脳波を測定した.大脳視覚野に近い後頭部を測定点とした.両眼視あるいは立体視に関係のある波形が立体像呈示後190msec付近に表れる結果を得た.得られた全体の波形を主成分分析法により詳細に解析し,その波形の意味をさらに明確にすることを来年度に行う予定である.(3)心理評価による研究立体映像における各種の条件を変えると,観察者の主観的評価がどのように変るかをしらべ,両眼立体情報処理における認知構造を検討した.観察者が評価に用いる言葉で,例えば「立体感」と「臨場感」は別の印象に対して用いられていた.これらの印象を与える映像条件を来年度の研究により明らかにする予定である.本研究は、二眼式立体映像を刺激として用いて、同映像に対する視覚機能反応、視覚誘発脳波波形、心理評価測定を行ない、次の結果を得た。本研究は、二眼式立体映像を刺激として用いて、同映像に対する視覚機能反応、脳波波形、心理評価測定を行い、人間の視覚系の両眼視立体情報の処理機構の基本的な特性を調べることを目的としている。昨年度までに得られた結果をもとに今年度はいくつかのパラメータを変化させる測定を行い、その特性をさらに調べた。また、これらの結果をもとに視覚系からみた二眼式立体映像の特徴・問題点を検討した。1.視覚機能測定により研究二眼式立体映像観察中の眼球調節反応および瞳孔反応を測定し、実物の場合の反応と比較した。その結果、実物を観察している場合に比べ、調節反応量は少なく、一方、瞳孔反応は多かった。昨年度までの結果も含め、各視覚機能間で両眼情報が密接な関係をもって複合的に処理されていることが示唆された。2.視覚誘発脳波による研究昨年度の得られた二眼式立体映像観察時の波形について主成分分析を行った結果、第1主成分として190msec付近にピークをもつ波形が抽出された。しかし、その波形の意味については明確な結果を得られなかった。また第3主成分として250msec付近のピークが抽出され、これは視標の飛び出し量との関係が示唆された。3.心理評価により研究立体映像においての観察者の主観的評価において「立体感」および「臨場感」が大きい映像の条件をさまざまな映像から検討した結果、さまざまな立体要因が整合性をもっていると立体感が大きい、運動物体の立体映像は臨場感が大きい、細かな立体構造をもつものは立体効果が強いなどいくつかの条件が抽出された。
ユビキノンのイソプレノイド側鎖合成酵素の多様性に関する研究

ユビキノンは補酵素Q(CoQ)とも称される脂溶性抗酸化物質であり、生体内において電子伝達系の必須成分として重要な機能を果たしている。本研究はユビキノン10の側鎖合成酵素であるデカプレニル2リン酸合成酵素の多様性に着目し、酵素の諸性質を解析し、最終的にはユビキノン10の生産へ利用していくことを目的としている。デカプレニル2リン酸合成酵素は細菌などでは単独で酵素活性を発揮するが、真核生物では必ずしも単独で活性はないことが、我々の研究から明らかになりつつある。分裂酵母由来のデカプレニル2リン酸合成酵素遺伝子を単独で大腸菌で発現させても酵素活性を得ることはできないことから、他のタンパク質因子とヘテロダイマーで機能するのではないかということ推測した。そこでデカプレニル2リン酸合成酵素の活性発現に必要な遺伝子をゲノム配上で探し、可能性のある遺伝子を推測し、その後に遺伝子破壊株を構築した。その結果dlp1と命名した新たな遺伝子がデカプレニル2リン酸合成酵素の活性に必須な遺伝子であることを見いだした。dlp1遺伝子はいわゆるプレニル2リン酸合成酵素に相同性が認められるが、典型的な共通な配列を一部欠いており、プレニル2リン酸合成酵素が変化したような形跡が認められる遺伝子である。dlp1遺伝子は先に同定したdps1と同様にユビキノン合成に必須であり、デカプレニル2リン酸合成酵素の活性にも必須な因子であることを見いだした。さらに大腸菌内でdlp1遺伝子とdps1遺伝子を共発現させるとユビキノン10を合成させることができた。その時の活性を調べたところ、確かにデカプレニル2リン酸合成酵素活性を保持しており、DLP1とDPS1は蛋白質レベルで相互作用していることが判明した。さらにその複合体はヘテロテトラマーを構成していることを証明した。従って真核型のデカプレニル2リン酸合成酵素はヘテロマーで機能していることが結論できた。ユビキノンは補酵素Q(CoQ)とも称される脂溶性ビタミンの1種であり、生体内において電子伝達系の必須成分として重要な機能を果たしている。デカプレニル2リン酸合成酵素は細菌などでは単独で酵素活性を発揮するが、真核生物では必ずしも単独で活性はないことが、最近の我々の研究から明らかになりつつある。分裂酵母由来のデカプレニル2リン酸合成酵素遺伝子を単独で大腸菌で発現させても酵素活性を得ることはできないことから、他のタンパク因子とヘテロダイマーで機能するのではないかということ推測した。そこでデカプレニル2リン酸合成酵素の活性発現に必要な遺伝子を探索した。まず、ゲノム配列の情報を利用し、可能性のある遺伝子を推測し、その後に遺伝子破壊株を構築し、ユビキノン合成との関連性を調べた。

ユビキノンは補酵素Q(CoQ)とも称される脂溶性抗酸化物質であり、生体内において電子伝達系の必須成分として重要な機能を果たしている。本研究はユビキノン10の側鎖合成酵素であるデカプレニル2リン酸合成酵素の多様性に着目し、酵素の諸性質を解析し、最終的にはユビキノン10の生産へ利用していくことを目的としている。デカプレニル2リン酸合成酵素は細菌などでは単独で酵素活性を発揮するが、真核生物では必ずしも単独で活性はないことが、最近の我々の研究から明らかになりつつある。分裂酵母由来のデカプレニル2リン酸合成酵素遺伝子を単独で大腸菌で発現させても酵素活性を得ることはできないことから、他のタンパク質因子とヘテロダイマーで機能するのではないかということ推測した。そこでデカプレニル2リン酸合成酵素の活性発現に必要な遺伝子をゲノム配上で探し、可能性のある遺伝子を推測し、その後に遺伝子破壊株を構築した。その結果dlp1と命名した新たな遺伝子がデカプレニル2リン酸合成酵素の活性に必須な遺伝子であることを見いだした。dlp1遺伝子はいわゆるプレニル2リン酸合成酵素に相同性が認められるが、典型的な共通な配列を一部欠いており、プレニル2リン酸合成酵素が変化したような形跡が認められる遺伝子である。dlp1遺伝子は先に同定したdps1と同様にユビキノン合成に必須であり、デカプレニル2リン酸合成酵素の活性にも必須な因子であることを見いだした。さらに大腸菌内でdlp1遺伝子とdps1遺伝子を共発現させるとユビキノン10を合成させることができた。その時の活性を調べたところ、確かにデカプレニル2リン酸合成酵素活性を保持しており、DLP1とDPS1は蛋白質レベルで相互作用していることが判明した。従って真核型のデカプレニル2リン酸合成酵素はヘテロマーで機能していることが結論できた。
トライボロジー損傷の生成機構に及ぼす熱衝撃の影響

摩擦熱を伴う繰り返し熱衝撃転がり接触を受けるときの疲労き裂の進展成長を破壊力学的に解析し、トライボロジー損傷に至るまでのき裂進展プロセスを数値シュミュレーションによって明らかに次の成果が得られた。1.上記のき裂進展プロセスを定量的に評価するための数値シュミュレーションプログラムを完成した。2.加熱が比較的小さい場合には、転がり進行方向に表面から約25°45°の方向の傾斜型表面き裂が発生するが、加熱が大きく熱衝撃のような場合には、表面に垂直なき裂が発生する。3.表面傾斜型き裂の進展に関しては、摩擦係数が小さい場合にはせん断モードの進展が支配的となり、最初はき裂線方向にまっすぐ進展するが、ある長さまでき裂が成長した後、き裂は転がり方向に屈折し始め、表面に平行な水平方向へと進展する。また、摩擦係数が大きい場合には引張りとせん断の混合モードの進展により深さ方向にき裂は屈折進展する。4.表面垂直型き裂の進展に関しては、垂直方向にそのまません断モードで進展するが、ある長さになると転がり進行方向に少し傾いた方向に混合モードで屈折進展する。5.表面傾斜型、垂直型、いずれの場合も、この屈折後のき裂進展速度は、次第に大きくなりある応力拡大係数を越えると進展速度が無限に大きくなる。これより破壊靱性値を数値的に推定することも可能である。今回はスポーリングやピッチング、スコーリング等といった最終的トライボロジー損傷までの定量的評価はできなかったが、今後は具体的なトライボロジー損傷までも含めた数値シュミュレーションを行なう予定である。
菌類の関与する「匂い」に対するニホンキバチの行動解析

共生菌の生育と密接な関係があるニホンキバチの宿主選好時に関与する「匂い」(揮発性成分)の分析とその誘引活性について調査した。その結果、ニホンキバチ宿主木からはα-ピネンを始めとするテルペノイド類が主な成分であることが明らかとなった。ニホンキバチの宿主選好性と揮発性成分の量には正の相関が認められた。しかし、材内への共生菌の存在はニホンキバチに誘引活性を持つ揮発性成分の揮散量、種類ともに変化していくことが明らかとなった。ニホンキバチの揮発性成分に対する誘引反応を明らかにするために、揮発性成分に対する生物検定法であるオルファクトメーターを用いた。ニホンキバチは宿主木であるスギ丸太を含む気流へと誘引され、宿主選好性に揮発性成分が関与していることが証明された。また、宿主木から発せられる揮発性成分の分析の足がかりとして、GC-MSを用いて宿主木由来の揮発性成分の分析を試みた。本年度は、宿主木(スギ丸太)由来の揮発性成分を分析するため、揮発性成分の捕集方法・抽出条件の検討およびGC-MS分析条件について検討を行った。揮発性成分の捕集にはSPME(固相マイクロ抽出法)を用いて、清浄な気流下において宿主木からの揮発性成分の捕集を試みた。その結果、宿主木に含まれる揮発性成分には、先にニホンキバチに誘引性があると報告したα-ピネンをはじめとして、針葉樹材に一般的に含まれる成分およびスギ丸太特有の揮発性成分が検出された。比較的揮発しやすい成分として、エタノールや酢酸エチル、アセトン、トルエン等が含まれている一方、針葉樹材に特有な成分であるテルペノイド類(モノテルペン・セスキテルペンを主とする)が数多く検出された。また、試験材を伐倒してからの経過時間が長くなると、これらの揮発性成分の量・種類ともに減少していく傾向が見られた。これは、ニホンキバチが比較的新しい伐倒木を好んで宿主探索を行う、という今までの知見と一致する結果であった。本装置を用いて誘引試験を行ったところ、ニホンキバチは宿主木(スギ・ヒノキ)に含まれているα-ピネンであるスギ丸太を含む気流へと誘引され、宿主選好性に揮発性成分が関与していることが証明された。揮発性成分の捕集にはSPME(固相マイクロ抽出法)とORBOチューブを用いて、揮発性成分の捕集方法による比較を行った。昨年度に引き続き、ニホンキバチの揮発性成分に対する反応を明らかにするために、オルファクトメータを用いて生物検定を行った。また比較として、ニホンキバチと同様に針葉樹材を利用するヒゲジロキバチに対しても試験を行った。その結果、ニホンキバチに誘引活性が認められたα-ピネンに対してヒゲジロキバチは誘引されなかった。同じ宿主を利用するキバチ類でも異なる揮発性成分を用いて宿主認識を行っていることが示唆された。また、宿主であるスギ材由来の揮発性成分を明らかにする為に、SPME(固相マイクロ抽出)法およびORBOチューブを用いて揮発性成分を捕集し、GC-MSを用いて分析を行った。揮発性成分の捕集装置を改良し、SPME法と同等に簡便であり、定量的捕集が可能なORBOチューブ捕集法を開発した。その結果、スギ材由来の揮発性成分のうち、α-ピネンが量的に多くを占めていたものの、モノテルペン・セスキテルペン類がほとんどであった。また、ニホンキバチ共生菌を人工接種すると、スギ材から得られる揮発性成分の量、質の両者が経時変化することが明らかとなった。
男性不妊症患者におけるエストロゲン受容体遺伝子の変異解析

特発性無精子症患者31例(22-44歳,平均35.6歳)について,末梢血リンパ球からDNAを抽出し,エストロゲン受容体α遺伝子(Chromosome 6 q25.1)のエクソン4の塩基配列をDirect sequencingで解析し,コドン325の多型性と本疾患との関連を検討した.また,この多型性と臨床データ(精巣容積,LH, FSH, Testosterone, Estradiol)との関連についても検討を加えた.患者群のエストロゲン受容体α遺伝子エクソン4コドン325の多型性は,ccc-ccc(c/c)が3例(10%),CCC-CCG(C/G)が17例(55%),CCG-CCG(G/G)が11例(35%)であったのに対し,コントロール群ではC/Cが34%,C/Gが44%,G/Gが22%であり,その頻度に有意差がみられた.血中FSH値(mean±SD)は,C/C群が3.1±0.6mIU/mL,C/G群が21.5±12.3,G/G群が11.5±8.2であり,C/C群とC/G群がG/G群と比較し有意に高かった.その他の臨床データについては各遺伝子型群の間に有意差はみられなかった.エストロゲン受容体αノックアウトマウスでは精子形成能が障害されることが報告されている.ヒトにおいてはエストロゲン受容体α遺伝子エクソン4コドン325の多型性と乳癌の関連については報告されているが,無精子症との関連はこれまで報告されていなかった.本研究により,この遺伝子の多型性が無精子症に関与している可能性が示唆された.しかしそのメカニズムは不明であり,今後の研究課題である.特発性無精子症患者30名と健常男子51名の末梢血リンパ球よりDNAを抽出し、アンドロゲン受容体およびエストロゲン受容体アルファ遺伝子の多型と変異を解析した。アンドロゲン受容体遺伝子のエクソン1のCAG反復長は特発性無精子症患者で23.4±2.9(平均±標準誤差)、健常男子で23.7±3.2と有意差を認めなかったが、前者ではCAG反復長が29以上の症例が2例(6.6%)存在したのに対し、後者では1例も認めなかった。エクソン1-8の変異解析では、両群ともに異常を認めなかった。また、エストロゲン受容体アルファ遺伝子のエクソン4(コドン325)は、特発性無精子症患者でCCC-CCC(C/C)が3例(10%)、CCG-CCC(G/C)が17例(55%)、CCG-CCG(G/G)が11例(35%)であった。健常男子では、C/Cが14例(30%)、C/Gが22例(48%)、G/Gが10例(22%)であり、両群間において有意差(p<0.05)を認めた。特発性無精子症においてアンドロゲン受容体遺伝子エクソン1におけるCAG反復長の延長およびエストロゲン受容体アルファ遺伝子エクソン4における多型が造精機能障害の一因である可能性が示唆された。特発性無精子症患者31例(22-44歳,平均35.6歳)について,末梢血リンパ球からDNAを抽出し,エストロゲン受容体α遺伝子(Chromosome 6 q25.1)のエクソン4の塩基配列をDirect sequencingで解析し,コドン325の多型性と本疾患との関連を検討した.また,この多型性と臨床データ(精巣容積,LH, FSH, Testosterone, Estradiol)との関連についても検討を加えた.患者群のエストロゲン受容体α遺伝子エクソン4コドン325の多型性は,ccc-ccc(c/c)が3例(10%),CCC-CCG(C/G)が17例(55%),CCG-CCG(G/G)が11例(35%)であったのに対し,コントロール群ではC/Cが34%,C/Gが44%,G/Gが22%であり,その頻度に有意差がみられた.血中FSH値(mean±SD)は,C/C群が3.1±0.6mIU/mL,C/G群が21.5±12.3,G/G群が11.5±8.2であり,C/C群とC/G群がG/G群と比較し有意に高かった.その他の臨床データについては各遺伝子型群の間に有意差はみられなかった.エストロゲン受容体αノックアウトマウスでは精子形成能が障害されることが報告されている.ヒトにおいてはエストロゲン受容体α遺伝子エクソン4コドン325の多型性と乳癌の関連については報告されているが,無精子症との関連はこれまで報告されていなかった.本研究により,この遺伝子の多型性が無精子症に関与している可能性が示唆された.しかしそのメカニズムは不明であり,今後の研究課題である.
コンドロイチン硫酸の減少と多核割球形成

コンドロイチン硫酸鎖は、コアタンパク質に共有結合し、コンドロイチン硫酸プロテオグリカンとしてあらゆる組織の細胞表面や細胞外マトリックスに存在する。コンドロイチン硫酸プロテオグリカンは、細胞増殖や分化、形態形成をはじめとする様々な生命現象を司ることが報告されているが、その機能の多くは、糖鎖部分であるコンドロイチン硫酸鎖の性質に依存することが知られている。以前我々は、コンドロイチン硫酸鎖の欠損胚は多核割球が形成され致死に至ることを報告した。本研究から、加齢によるコンドロイチン硫酸鎖の減少が卵胞の成熟に対し抑制的に働く可能性を見出した。コンドロイチン硫酸の欠損胚(GlcAT-1KOマウス由来)は、多核割球が形成され致死に至る。また、加齢に伴うコンドロイチン硫酸の減少は、変形性関節症などの加齢疾患の原因となる。本研究では、加齢による卵巣のコンドロイチン硫酸の減少が多核割球形成(不妊)の原因となるという仮説を検証している。加齢マウス(12ヶ月齢)及び若齢マウス(3ヶ月齢)の卵巣組織におけるコンドロイチン硫酸量を定量すると、卵巣のコンドロイチン硫酸は加齢に伴って減少していた。コンドロイチン硫酸鎖に対する抗体を用いた組織化学的解析から、マウスの卵巣では、卵細胞や顆粒膜細胞でコンドロイチン硫酸が強く発現していることが判明した。また、加齢マウスでは若齢マウスと比較して、コンドロイチン硫酸鎖に対する抗体の反応性が卵細胞や顆粒膜細胞で顕著に減少していたことから、加齢に伴って卵巣のコンドロイチン硫酸が減少することが明らかとなった。そこで、加齢によるコンドロイチン硫酸の減少の原因がコアタンパク質の減少によるのではないかと考え、主に卵巣組織に発現しているコンドロイチン硫酸プロテオグリカンとして知られているBamacan, Versican, Decorinの発現量を解析したが、有意な差は認められなかった。次に、コンドロイチン硫酸鎖を合成する酵素である、コンドロイチン合成酵素(ChSy-1, -2, -3)やコンドロイチン重合化因子(ChPF)、コンドロイチンN-アセチルガラクトサミン転移酵素(ChGn-1, -2)の発現量を解析したが、加齢に伴った変化は見られなかった。しかし、コンドロイチン硫酸鎖の結合領域の合成開始に係るキシロースをセリン残基に転移する酵素(XylT-1, -2)について解析したところ、XylT-2の遺伝子発現量に有意な差は見られなかったが、XylT-1では加齢マウスで発現量が顕著に低下していた。コンドロイチン硫酸鎖の欠損胚(GlcAT-1KOマウス由来)は、多核割球が形成され致死に至る。また、加齢に伴うコンドロイチン硫酸鎖の減少は、変形性関節症などの加齢疾患の原因となる。本研究では、加齢による卵巣のコンドロイチン硫酸鎖の減少が多核割球形成(不妊)の原因となるという仮説を検証している。初年度は、マウス卵巣において加齢に伴いコンドロイチン硫酸鎖の減少が生じることを明らかにした。卵胞内の細胞外基質にはヒアルロン酸やコラーゲンと共にコンドロイチン硫酸プロテオグリカンが多く含まれている。しかしながら、卵胞成熟過程におけるコンドロイチン硫酸鎖の機能は不明である。そこで本年度は、卵胞の成熟過程に着目した。GlcAT-1ヘテロ変異マウスから過排卵処理により得られた2細胞期胚を採取し24時間培養した後PCR法を用い着床前胚の遺伝子型判定を行ったところ、過排卵処理によってヘテロ変異体の着床前胚の数が野生型のものに比べ著しく減少することが明らかとなった(ホモ変異体の多くは多核割球が形成され致死に至る)。このことは、卵巣内においてGlcAT-1欠損によってコンドロイチン硫酸鎖が減少したことが排卵に影響を与えた事を示唆している。事実、卵巣のコンドロイチン硫酸鎖の二糖組成解析を行ったところ、野生型に比較してGlcAT-1ヘテロ変異マウスでは約半分程度にまでコンドロイチン硫酸鎖が減少していた。さらに、過排卵処理後の卵巣において実際に排卵されなかった卵胞の数をカウントすることで排卵に与える影響を調べたところ、野生型に比較してGlcAT-1ヘテロ変異マウスの卵巣では、胞状卵胞の数が増加し、排卵前胞状卵胞は減少傾向を示したが、一次卵胞及び二次卵胞の数に差は認められなかった。以上のことから、コンドロイチン硫酸鎖の減少は、卵胞の成熟過程の最終段階である胞状卵胞から排卵前胞状卵胞への進行を停滞させる可能性が示唆された。本年度は、コンドロイチン硫酸鎖の減少が卵胞の成熟過程の最終段階に影響を与える可能性を示す事ができたが、研究代表者の所属する大学の実験動物施設の全面的な改装工事が行われたため、本研究で必要なGlcAT-1ヘテロ変異マウスの飼育が十分にできず、研究遂行に支障がでてしまい、その機構に関しては明らかに出来なかったため。昨年度は、コンドロイチン硫酸鎖の減少が卵胞の成熟過程の最終段階である胞状卵胞から排卵前胞状卵胞への進行を停滞させることを明らかにした。卵巣は顆粒膜細胞が増加することで成熟する。顆粒膜細胞では、アンドロゲンがアロマターゼ(Cyp19)の働きによりエストロゲンとなり、成熟卵胞から分泌されるエストロゲンの増加により子宮内膜が肥厚する。

Cyp19は、卵胞刺激ホルモン(FSH)とインスリン様成長因子(IGF)のシグナルにより発現が誘導される。そこで本年度は、コンドロイチン硫酸鎖の減少が顆粒膜細胞によるエストロゲンの生合成に及ぼす影響を調べた。4週齢の野生型マウスおよびコンドロイチン硫酸の合成が減少しているマウスに性腺刺激ホルモンを投与したのち、卵巣を摘出し、顆粒膜細胞を単離した。得られたそれぞれの顆粒膜細胞を、FSHのみ、IGFのみ、および両方の存在下で培養し、RNA抽出後Cyp19の遺伝子発現量をリアルタイムPCR法によって解析した。コンドロイチン硫酸の合成が減少しているマウスでは野生型マウスと比べ、FSHのみの刺激やIGFのみの刺激によっては、Cyp19の遺伝子発現量に変化は見られなかった。しかしながら、FSH及びIGFを両方添加した場合においては有意にCyp19の発現量が減少していた。以上のことから、コンドロイチン硫酸鎖の減少が顆粒膜細胞活性化時のエストロゲンの生合成に負の影響を及ぼすことが示唆され、加齢によるコンドロイチン硫酸鎖の減少が卵胞の成熟に対し抑制的に働く可能性が示唆された。コンドロイチン硫酸鎖は、コアタンパク質に共有結合し、コンドロイチン硫酸プロテオグリカンとしてあらゆる組織の細胞表面や細胞外マトリックスに存在する。コンドロイチン硫酸プロテオグリカンは、細胞増殖や分化、形態形成をはじめとする様々な生命現象を司ることが報告されているが、その機能の多くは、糖鎖部分であるコンドロイチン硫酸鎖の性質に依存することが知られている。以前我々は、コンドロイチン硫酸鎖の欠損胚は多核割球が形成され致死に至ることを報告した。本研究から、加齢によるコンドロイチン硫酸鎖の減少が卵胞の成熟に対し抑制的に働く可能性を見出した。初年度の目標であった、マウス卵巣における加齢に伴ったコンドロイチン硫酸鎖の減少を明らかにすることができたため。実験動物施設の全面的な改装工事も終了したので、今後は卵胞の成熟過程の最終段階にコンドロイチン硫酸鎖の減少がどのように関与しているのかを明らかにしていきたい。生化学・分子生物学・糖鎖生物学多核割球形成機序の解明のためには、細胞分裂のいずれの段階(核の分配、分裂溝の進行、中央体の形成、細胞間の脱離)に異常を呈しているのかを明らかにする必要がある。卵割過程を詳細に観察するために、核及び紡錘体を蛍光タンパク質によって可視化しライブイメージングを行う。受精卵は2細胞期までは転写活性がないことから、mRNAをマイクロインジェクション法で1細胞期胚に導入し可視化を試みる。今後は、我々が所有するGlcAT-I KOマウス由来の胚を用い解析を行い、ライブイメージング系の構築を行う。さらに、初年度の結果から、加齢マウスでもXylT-1の発現量を増加させることができれば正常な割球が形成され、妊孕性の向上につながる可能性があるので検証する。次年度使用額が生じた理由は、研究代表者の所属する大学の実験動物施設の全面的な改装工事が行われたため、重要な遺伝子組換えマウスの飼育が十分にできず、研究遂行に支障がでたため。本年度は、他のプロジェクトと共通に使用している試薬の利用が多かったので、年度末にかけての試薬発注が多く次年度使用額が生じた。改修工事も終了したので、次年度は概ね順調に遂行できるものと考えている。次年度は、年度末に既に必要な試薬の発注および購入をしているので、計画的な運用ができるものと思われる。
マイクロ流路を流れる微粒子の慣性集約挙動に関する数値実験研究

マイクロ流路に懸濁液を高スループットで流すと,粒子は流路断面の特定領域に集約し,整列する.慣性集約挙動と呼ばれるこの現象を利用して,細胞などの粒子を分離・濃縮する技術の研究が注目されている.本研究では,粒子の集約挙動を模擬できる計算手法を開発し,集約挙動を左右するパラメータ依存を明らかにする.マイクロ流路に懸濁液を高スループットで流すと,粒子は流路断面の特定領域に集約し,整列する.慣性集約挙動と呼ばれるこの現象を利用して,細胞などの粒子を分離・濃縮する技術の研究が注目されている.本研究では,粒子の集約挙動を模擬できる計算手法を開発し,集約挙動を左右するパラメータ依存を明らかにする.
運動の個人差、環境の変化に対応できる移動支援ロボットシステムの開発

本研究では,個人差対応知能と環境認識知能の2つの知能を有する高齢者,障害者用の移動支援機器の開発手法を標準化することを目的とした.基礎となる人間の歩行特性等のモデリング研究と,個別の研究事例を包括する視点から,機器の移動範囲により「屋内・近距離・遠距離」と分類され行われた複数の機器開発を通して,身体的,認知的な個人差に対応するための手法,障害物などの環境の認識を行うための手法が体系的に構築された.本研究では,個人差対応知能と環境認識知能の2つの知能を有する高齢者,障害者用の移動支援機器の開発手法を標準化することを目的とした.基礎となる人間の歩行特性等のモデリング研究と,個別の研究事例を包括する視点から,機器の移動範囲により「屋内・近距離・遠距離」と分類され行われた複数の機器開発を通して,身体的,認知的な個人差に対応するための手法,障害物などの環境の認識を行うための手法が体系的に構築された.本研究では,個人差対応知能と環境認識知能の2つの知能を有する高齢者,障害者用の移動支援機器を複数開発し,その開発手法を標準化することを最終目的としている.初年度である特に,実機および知能アルゴリズムの開発を行った.具体的成果を下記に記す.1.人モデリング担当歩行運動中の足関節内返し軸の推定方法を提案し,歩行中の内返し方向モーメントを算出する手法を確立し,不整地路面歩行時の安定性を定量的に評価することができた.また,人間の足部と同等の足幅を持ち,アーチ構造をモデル化した人間形足部機構を開発し,2足ヒューマノイド・ロボットWABIAN-2Rによる人間らしい歩行に成功した.2.屋内移動担当(A)寝たきり支援機器:がん転移患者の寝返りを支援するロボットを開発し,EMGをもとに体幹回旋動作が抑制できることをX線画像により確認した.(B)転倒予防歩行訓練機器:転倒の原因と場所と年齢との相関性について調査し,制御工学の立場から予見機能と推論機能を考慮した転倒メカニズムを提案した.3.近距離移動担当(A)歩行機能拡大機器:個人差や環境パラメータの差異に対応できるよう,知的処理系を有する歩行移動・下肢動作支援システム,パラメータ調整アルゴリズムの開発を推進した.(B)車いす:脳性マヒ児を対象として,脚部動作の加速度を計測し,3動作の識別を可能とする自己組織化アルゴリズムを開発した.4.遠距離移動担当(A)移動範囲拡大機器:Tread-Walkを片麻痺患者に適用するために,個人の左右の歩行能力を定量化するトレッドミルを開発し,片麻痺模擬の健常者により効果を検証した.(B)電動スクータ:安全性と円滑性を両立する衝突回避を実現するため,ステレオカメラとレーザレンジセンサを用いて,将来の速度ベクトル変化を推定できる歩行者行動予測システムを開発した.本研究では,個人差対応知能と環境認識知能の2つの知能を有する高齢者,障害者用の移動支援機器を複数開発し,その開発手法を標準化することを最終目的としている.本年度は特に,初年度に開発した実機の知能制御のアルゴリズム化を行った.具体的成果を下記に記す.1.人モデリング担当歩行運動中,特に段差を乗り越える際の運動学的な解析を行い,歩行の進行方向と障害物の相対的角度が歩行へ与える影響を定量的に評価した.また,ウィンドラスメカニズムなど人間の足部と同等の機能を有する足部を2足ヒューマノイド・ロボットWABIAN-2Rに付加し,人間歩行の解析をした.また,リアルタイムに障害物を回避するオンライン歩行生成アルゴリズムを開発した.2.屋内移動担当(A)寝たきり支援機器:がん転移患者の寝返りを支援するロボットを開発し,寝返り動作を正確,かつ早期認識するアルゴリズムを開発した.(B)転倒予防歩行訓練機器:機器使用時の個人の重心のズレを考慮した適応制御アルゴリズムを開発し,その有効性を実験により示した.3.近距離移動担当(A)歩行機能拡大機器:環境の変化や個人差に対応できるようにするために,治験のプロセスを基にした人支援技術開発のための実験プロトコルの策定法などについて検討した.(B)車いす:個人特性に合わせてオンラインで自動的に操作インタフェースを構築する自己組織化アルゴリズムを提案した.4.遠距離移動担当(A)移動範囲拡大機器:環境の変化に安全に対応できるような機器旋回アルゴリズムを開発し,その有効性を示した.また,個人差に依存せず直感的操作が可能となるような操作系の開発を行った.(B)電動スクータ:安全についてリスクの概念から定量的な定義を行い,安全をもとにしたパーソナルモビリティの挙動についてバーチャルリアリティ技術を用いた実験的検証を行った.本研究では,個人差対応知能と環境認識知能の2つの知能を有する高齢者,障害者用の移動支援機器を複数開発し,その開発手法を標準化することを最終目的としている.最終年度である本年度は,開発した機器の評価を中心に行った.具体的成果を下記に記す.1.人モデリング担当(A)運動解析:属性の異なる被験者で歩行実験を行った結果,高齢者の場合には障害物に進入する角度によっては,側方支持面が狭くなって転倒の危険性が増大することが確認された.(B)歩行アルゴリズム:人間は着地時の力学的エネルギーに基づき歩行中の両足間隔を決定しているという歩行解析結果より,WABIAN-2Rは歩行制御の点からも人体運動の模擬が可能になった.2.屋内移動担当(A)寝たきり支援機器:外部環境が寝返り動作時の筋電信号に与える影響を評価し,開発したミクロマクロニューラルネットワークが外部ノイズに影響を受けにくいことを示した.(B)転倒予防歩行訓練

機器:これまでに開発した機器使用時の個人の重心のズレを考慮した適応制御アルゴリズムに対して,実際の対象となる高齢者などによる評価結果により,有用性が認められた.3.近距離移動担当(A)歩行機能拡大機器:残存能力に応じた制御アルゴリズムをもとにして,健康維持,歩行能力向上,快適な移動など使用目的の変化に対応できる評価関数をつくり,実験的に評価した。(B)車いす:個人の運動特性を考慮した追加学習型操作系構築アルゴリズムにより,重度脳性マヒ児の脚の動作による電動車いす操作を可能とする操作系を開発した.4.遠距離移動担当(A)移動範囲拡大機器:個人の歩行特性に応じて,最適な操作系を実現するトレッドミル制御を開発し,評価を行った.(B)電動スクータ:これまでの歩行者行動予測・障害物回避安全システムのアルゴリズムに加え,自己位置推定を単眼カメラで行うシステムを開発し,これらを統合した自律移動システムを検討した.
励起酸素の超音速流れに関する研究

本年度は,励起酸素の超音速流れにおける化学反応や気体の相変化の影響を数値シミュレーションによって検討した.・励起酸素を含む化学反応モデルの検討を行い,今まで計算モデルで考慮してきた化学種を減らしても結果には影響がないことがわかった.計算するべき化学種を減らせることができると計算時間が節約され,今後,2,3次元流れの解析を行う場合に有効となる.・励起酸素が生成される過程で一緒に生成される水蒸気は励起酸素を失活させる.しかし,気体の急激な膨張で冷却され,水蒸気は相変化を始める.即ち,凝縮を起きることが明らかになった.この凝縮でほとんどの水蒸気は凝縮し,励起酸素の失活効果は減少した.しかしながら,凝縮に伴う潜熱の放出によって温度上昇が認められ,超音速膨張の効果が薄れることが明らかになった.本年度は,励起酸素の超音速流れにおける化学反応や気体の相変化の影響を数値シミュレーションによって検討した.・励起酸素を含む化学反応モデルの検討を行い,今まで計算モデルで考慮してきた化学種を減らしても結果には影響がないことがわかった.計算するべき化学種を減らせることができると計算時間が節約され,今後,2,3次元流れの解析を行う場合に有効となる.・励起酸素が生成される過程で一緒に生成される水蒸気は励起酸素を失活させる.しかし,気体の急激な膨張で冷却され,水蒸気は相変化を始める.即ち,凝縮を起きることが明らかになった.この凝縮でほとんどの水蒸気は凝縮し,励起酸素の失活効果は減少した.しかしながら,凝縮に伴う潜熱の放出によって温度上昇が認められ,超音速膨張の効果が薄れることが明らかになった.
無脊椎動物における味覚情報変換の分子機構

1.ニクバエの唇弁味覚毛を糖で刺激したときに外腔を流れる受容器電流のゆらぎを解析した。その結果このゆらぎは感覚突起先端部の膜上に存在して、糖刺激によって開くトランスデュ-サ-イオンチャネルの開閉を反映しているものであると結論された。このイオンチャネルの開閉のダイナミックスが、同じ受容体を刺激する糖の種類によって異なること及び刺激後1ミリ秒以下の短い潜時で受容器電流が流れはじめることから、このイオンチャネルは、セカンドメッセンジャ-を介せずに糖によって直接開閉の制御される受容体・チャネル複合体型のものであると推定された2.羽化前23日のニクバエの蛹から唇弁を取り出して薄く切り、これをパパインとキチナ-ゼで処理することによって、単離味細胞を得た。これにパッチクランプ法を適用して成功した。多くの味細胞は自発的にインパルスを発生していた。全細胞クランプ下で潜時の短い内向電流が50mM蔗糖刺激によって発生し、電流のゆらぎが増加した。このゆらぎの性質は1で得られたものとよく似ていた。また細胞の可溶成分を含まないoutsideーoutのパッチを蔗糖刺激して開く単一チャネル電流が観察された。これは1の結論を確認するものである。3.福岡大学の谷村が分離したショウジョウバエの新しい糖受容変異体を解析した。この変異体はピラノ-ス部位受容体の数が減少しているものと推定された。4.モノクロ-ナル抗体法と光親和性ラベルによって、ヒドラからグルタチオン受容体の候補、R5、を単離した。この分子量は約20KDaである。5.ニクバエの塩受容細胞は、電荷を持たない糖アナログや、ジブチリルcGMPのレセプタ-を持つことが明らかになった。(1)センチニクバエの唇弁化学感覚細胞の糖作動性イオンチャネルa.受容器電流のゆらぎの解析を行ない,いままでにその存在が明らかになった糖作動性チャネルについてピラノース部位と複合体を作っていると考えられるイオンチャネルとフラノース部位に対応するイオンチャネルは単一チャネルコンダクタンスが3倍程度異なり,別のチャネルが対応していることが明らかになった.b.羽化前32日の蛹から摘出した唇弁をキチナーゼとパパインで処理すると神経束に接続した状態で化学感覚細胞を5個含む'さや細胞'をクチクラからインタクトの状態で分離でき,さらに酵素処理することによって感覚細胞が単離できた.現在この細胞にパッチクランプ法を適用して電気的な応答を記録する試みを行なっでいる.比較的インタクトな単離細胞が得られているので,単一チャネルレベルの測定ができる可能性が強い. C.塩受容細胞上にイオンとは関係のない有機分子の受容体が存在することが明らかになった.(2)ヒドラのグルタチオン受容:a.受容体候補タンパク質に対するモノクローナル抗体をさらに数種分離することができた.現在行動レベルの阻害を定量的に解析している.b.単離培養神経細胞にパッチクランプ法を適用し, Clーチャネルと思われる弱い電位依存性チャネルの単一電流を解析した.現在全細胞クランプの条件を検討している.c.腔腸動物の神経ペプチドであるAnthoーRF amideを合成し,その10^<-5>M10^<-7>Mを外液に与えるとヒドラの摂食行動が解発されることが明らかになった.グルタチオンの受容シグナルは, RFアミド系神経網を介して表皮筋細胞(効果器)に伝えられると考えられる.d.ヒドラを高張溶液で処理すると,自発的にインタクトな単一細胞に分離することが明らかになった.

この条件で神経細胞はネットワークを形成したままでmesoglea上に残る.本研究はハエとヒドラの味覚受容細胞における情報変換の分子機構をパッチクランプ法、受容器電流のゆらぎの解析法、モノクローナル抗体法、遺伝解析などの手法を用いて解明することを目的としている。本年度は計画の2年目に当たり、昨年行ったハエの受容器電流ゆらぎの解析結果明らかになった糖作動性イオンチャンネルの作動特性の解明とヒドラのモノクローナル抗体を利用したレセプター単離を中心とした研究を行い次の成果を得た。(1)羽化23日前のセンチニクバエの蛹から取り出した唇弁をキチナーゼとパパインで処理して得られた細胞群をポリリジンでコートしたガラス面に展開することにより、味細胞を支持細胞から単離して培養することに成功した。これにパッチクランプ法を適用して、数種のK^+チャンネル電流を記録できた。また全細胞クランプ法の適用にも成功した。(2)ヒドラのR5応答に対する抗原タンパク質(MW、約22万)を単離・精製し、このタンパク質がグルタチオンと相互作用を持ちかつ阻害剤Lーグルタミン酸に対する親和性が応答の解析から得られた値とよく一致することを見出した。(3)センチニクバエ糖受容細胞の受容器電流を解析して、ピラノース部位に対応するチャンネルとフラノース部位の対応するチャンネルは単一チャンネルコンダンタンスが約2.5倍異なる別種のイオンチャンネルであることを利らかにした。(4)センチニクバエの塩受容器は糖誘導体1.6ーアンヒドロガラクトースによって刺激されることが明らかになった。(5)腔腸動物から発見された2種の神経ペプチドAnthoRFamide及びPolyachtisRFamide Iがヒドラの摂食行動の全てのステップを開発することを見出した。このことからヒドラの抗RFアミド抗体染まる神経ネットワークは摂食行動を制御している可能性が示唆された。(6)ショウジョウバエのグルコース応答の低下している変異体の糖受容器の応答を解析し異常を見出した。本研究はハエとヒドラの味覚受容細胞における情報変換の分子機構を解明することを目的としている。本年は計画の最終年度に当たり、ハエの単離味細胞に対するパッチクランプ法を用いた解析を中心として研究を進め成果をまとめた。(1)羽化23日前のセンチニクバエの蛹から取り出した唇弁を酵素処理することによって単離味細胞を得ることができ、これにパッチクランプ法を適用することに昨年成功した。本年はこの方法を用いて、糖感覚のトランスダクション機構について受容器電流のゆらぎの解析から得られた推論を検証した。単離味細胞は約6×12μmで感覚突起と軸索の1部を持ち、その多くは自発的にインパルスを発生した。全細胞電圧クランプ下で50mM蔗糖を圧力噴出して与えると、潜時の短い内向電流を発生させる細胞が4例観察された。内向電流の発生に伴い、電流ゆらぎが増加した。さらに細胞内可溶成分を含まないoutside-outパッチで2例50mM蔗糖の圧力投与で開く単一チャネル電流が観察できた。この単一チャネルコンダクタンスは約10pSで開閉速度は電流ゆらぎの性質によく合っていた。この結果は糖感覚のトランスダクションは、糖によって直接開閉の制御される受容体・イオンチャネル複合体によって行われていることが確証された。(2)福岡大学の谷村が分離したショウジョウバエの新しい糖受容変異体を解析した。
半導体レーザを用いた微粒子の捕捉と変位の同時測定

光の放射圧を利用してミクロンオーダーの微粒子を操作する研究は生物試料へ応用することに期待される。そこで、液体中において粒子の形状、力学的な特性などを計測する必要がある。この研究は微粒子を半導体レーザで捕捉すると同時に、粒子からの散乱光による帰還効果を利用して、粒子の変位を高精度で計測し、運動特性から粒子の特徴抽出、認識を行う方法を開発することを目的とした。研究計画に基づき本研究の目的をほぼ達成し、以下の成果が得られた。・半導体レーザ電流変調による外部共振器の共振状態を利用する散乱光共振モード信号を用いた位相検出法を開発した。・レーザと微粒子の間の距離を圧電素子によりシフトさせる位相検出法を開発した。・粒子の高精度な変位検出、粒子の光強度による変調特性からその認識の可能性を明らかにした。そしてデジタル信号処理による結果をもとに、ロックインアンプによる位相検出の高速化を実現した。・変位検出によってトラッピングされた粒子の力学的特性、光と粒子で構成する系のバネ常数を求める手法を確立した。光の放射圧を利用してミクロンオーダーの微粒子を操作する研究はここ数年、生物試料への応用を中心に盛んに行われている。この研究は微粒子を半導体レーザで捕捉すると同時に、粒子からの散乱光による帰還効果を利用して、粒子の変位を高精度で計測し、運動特性から粒子の特徴抽出、認識を行う方法を開発することを目的としている。これまでの研究では、まず半導体レーザの光帰還効果を用いて変位を検出する方法を微粒子の変位計測に応用できることを明らかにした。また、トラップされた状態の粒子の微小な運動から、レーザと粒子との結合の強さがわかることから、液体中の粒子を非浸襲で操作、認識、計数できる可能性を示した。さらに、レーザの波長を注入電流により変化させる方法と、レーザと微粒子の間の距離を圧電素子によりシフトさせる方法を用いて、半導体レーザと粒子で構成する外部共振器の共振状態を変位計測に応用することを試みた。二つの変調法において、温度安定化によって、半導体レーザの周波数変動を5MHz以下にすることにより、60分の1波長の変位計測精度があることがわかった。特に距離をシフトさせる方法では、レーザから粒子までの距離を短くて済むので、光学系の安定性に優れている。今年度の研究によって、半導体レーザ電流変調法および位置シフト法について位相計測の原理を確かめることができ、半導体レーザの強度変調による粒子の駆動により、変位に対するトラップ力を表すばね常数を測定した。これからは、外部変調法との組み合わせにより、微粒子の認識への応用を実現していく予定である。この研究は微粒子を半導体レーザで捕促すると同時に、粒子からの散乱光による帰還効果を利用して、粒子の変位を高精度で計測し、運動特性から粒子の特徴抽出、認識を行う方法を開発することを目的とした。・変位検出によって、トラッピングされた粒子の力学的特性、光と粒子で構成する系のバネ常数を求める手法を確立した。
妊娠時の母体ストレスが児の高次脳機能発達に与える影響

1.慢性ストレス負荷による母体および胎仔の行動学的化妊娠10日目から10日間の反復寒冷ストレスを負荷した妊娠ラットおよびその妊娠19日目に帝王切開にて娩出した新生仔(ストレス群;S群)の行動学的変化を、ストレス負荷のない母体および新生仔(Control群;C群)と比較した。S群の新生仔の平均出生時体重は2.14±0.05gで、C群の2.34±0.05gに比較し有意に低かった(P=0.0011)。また、新生仔の体重1グラムあたりの脳重量は、S群0.0550±0.0008g、C群0.0616±0.0008gで、S群で有意に小さく(P=0.00000011)、妊娠中のストレス負荷が胎仔発育、とくに脳発達に影響を及ぼすことが示唆された。またS群母体においては、胸腺および脾臓重量の有意な減少と、副腎重量の有意な増加を認め、この変化率は、同様のストレスを非妊娠雌ラットに負荷した場合と比して有意に大きかった。妊娠により、ストレスに対する反応はより大きく発現することが示唆された。2.妊娠ラットでの慢性ストレス負荷による神経-免疫-内分泌相関の動態S群では視床下部室旁核でのIL-1βmRNA発現量はC群に比して有意に増加していた(RT-PCR法によるHPRT発現量に対する相対発現量、0.204±0.008vs.0.142±0.016,P=0.023)。一方、母体の血漿コルチコステロン濃度はS群267.5±22.8、C群193.0±13.0とS群で有意に高かった(P=0.038)。ストレスにより母体脳においてサイトカイン産生がおこり、神経系を介する副腎髄質刺激またはCRF-ACTHによる副腎皮質刺激を介しストレス反応が発現されたことが推察された。3.ストレスが胎児-胎盤系に与える影響の分子生物学的解析S群の子宮および胎盤におけるIL-1βmRNAの発現量はそれぞれ0.494±0.036,0.865±0.029で、C群におけるそれぞれの発現量0.340±0.042,0.642±0.087に比して増加していた(p=0.033,p=0.079)。母体で引き起こされたストレス反応が、免疫系メディエーターを介して胎児へ伝播される可能性も示唆された。4.ストレスが胎仔脳発達に及ぼす影響を分子生物学的解析胎仔脳におけるIL-1βmRNAの発現量は、S群の大脳皮質・辺縁系で0.0687±0.0046と、C群(0.0545±0.0043)に比して有意に増加していた(p=0.039)。胎仔脳にもストレス様反応が惹起され、脳発達に影響を及ぼす可能性が示唆された。

母体で引き起こされたストレス反応が、免疫系メディエーターを介して胎児へ伝播される可能性も示唆された。4.ストレスが胎仔脳発達に及ぼす影響を分子生物学的解析胎仔脳におけるIL-1βmRNAの発現量は、S群の大脳皮質・辺縁系で0.0687±0.0046と、C群(0.0545±0.0043)に比して有意に増加していた(p=0.039)。胎仔脳にもストレス様反応が惹起され、脳発達に影響を及ぼす可能性が示唆された。