hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
血液脳関門形成血管内皮細胞におけるタイト結合構成分子クローディン５の発現制御解析

種々の難治性神経系疾患では、組織低酸素状態を誘因とする血液脳関門、血液網膜関門の破綻が起こり、病態悪化の要因となる。しかし、これら血管バリアー破綻機構の詳細は解明されていない。本研究では、低酸素状態における神経系血管バリアー破綻機構についてin vitroおよびin vivo実験系を用いて解析を行った。結果として、低酸素状態における血管バリアー破綻の責任因子として、血管内皮細胞に発現するM1およびM2を特定した。(特許取得申請中のため、M1, M2と称する)種々の難治性神経系疾患では、血管バリアー機能の破綻が病態の中枢をなす。我々は血管バリアー破綻の誘因として組織低酸素状態に注目し解析を進め、低酸素濃度下における血管バリアー機能の破綻が、内皮細胞の細胞膜からのclaudin-5の消失に依存することを明らかにした。さらに、昨年度、in vitroの実験では、低酸素濃度下におけるclaudin-5発現・細胞内局在に関わるmetalloproteinase遺伝子ファミリーに属する9分子中の2分子(特許出願準備中のため、M1とM2とする)が重要であることを特定した。本年度、in vivoの神経系血管バリアーモデルを用いて、この2分子の重要性を検証した。実験系としてはマウスの網膜を使用した。まず、マウスを4%7%酸素濃度下に2日飼育した。網膜伸展標本を作製する前、網膜の低酸素代謝状態を解析するために、マウスの腹腔内にpimonidazoleを投与した。続いて、上記に記載した2分子(M1とM2)をtargetとしたsiRNAをマウスの硝子体内に投与した後、マウスを正常酸素濃度下あるいは低酸素濃度下に2日飼育した。2日後、マウスの左心室内にFITC-dextran (10 kDa)およびHoechst stain H33252 (534Da)をトレーサーとして投与し、網膜の透過性を評価した。結果として、マウスを低酸素状態下に2日飼育すると、網膜が低酸素代謝状態に陥り、網膜血管バリアーの破綻が認められ、Hoechst stain H33252 (534Da)の血管外漏れが亢進した。しかし目的分子M1とM2のsiRNAを投与したマウスでは、Hoechst stain H33252の漏れが抑えられた。In vitroおよびin vivoの実験において、分子M1とM2は低酸素状態における血管バリアーの機能破綻の責任因子であることが特定された。H23およびH24年度,我々はマウスの脳血管内皮細胞株(bEND.3)またはマウス網膜を用いて,低酸素刺激に対する中枢神経系血管バリアー破綻の機構について解析を行った。低酸素条件に曝露するとマウス血管内皮細胞に発現するclaudin-5の減少を介して,中枢神経系血管バリアーの破綻をもたらし,また,この過程においてmetalloproteinase遺伝子ファミリーに属する蛋白質分解酵素活性を持つM1およびM2の2因子(特許出願中のため,M1とM2とする)が重要な役割を果たすという結果を得た。本年度,in vivoの実験モデルを用いて,引き続き,M1およびM2の役割について検討した。実験系として,マウスの網膜を用いた。まず,マウスの硝子体にM1またはM2のsiRNAを投与し,マウスが麻酔から覚醒した後,正常酸素または酸素濃度74%の低酸素条件で,2日間飼育した。2日後,マウスの網膜を摘出し,抗claudin-5抗体を一次抗体として,免疫染色を行った。結果として,正常酸素下で飼育したマウスに比較し,低酸素条件で飼育したマウスの網膜血管内皮細胞でのclaudin-5の発現が減少し,この減少はM1またはM2のsiRNAの投与によって抑制された。さらに,M2欠損マウスを用いてM2の役割を検証した。WTタイプのマウスとM2欠損マウスをそれぞれ正常酸素と酸素濃度74%の低酸素条件で、2日間飼育した。2日後,網膜血管の透過性(血液網膜関門機能の指標)を評価するためにHoechstおよびdextranをトレーサとしてマウスに投与した。結果,M2欠損マウスにおいて低酸素刺激を受けても,網膜血管の漏れを認められなかった。低酸素刺激による中枢神経系血管バリアー破綻の責任因子としてM1およびM2を特定し,これらの因子を標的にした難治性中枢神経系疾患の治療薬の開発が期待される。(特許取得申請中のため、M1, M2と称する)神経組織の血管バリアー機能は神経細胞の正常な機能に必須であり、その破綻は種々の神経疾患の原因となる。これまで我々は、血管バリアー機能が、脳血管内皮細胞にあるclaudin-5の発現に依存すること、claudin-5の発現が酸素濃度環境に依存すること、その局在調節にubiquitin-proteasome系とともにMMPなどのmetalloproteinase活性が関与することを示す実験結果を得ている。

但し、metalloproteinase遺伝子ファミリーに属する分子は数が多く、claudin-5の発現を制御するファミリーメンバーは特定されていない。本年度は、低酸素下におけるclaudin-5発現・細胞内局在に関わるmetalloproteinase分子の特定を試みた。実験系としてはマウス脳血管内皮細胞株bEND.3を使用した。まず、bEND.3に発現するmetalloproteinase遺伝子ファミリーメンバーとして9分子を見出し、claudin-5の発現を制御する候補分子とした。そして、それぞれ候補分子のsiRNA (small interfering RNA)を作製し、bEND.3に導入した。siRNAを導入した細胞に遺伝子の抑制効果を確認したうえで、claudin-5の発現を確認した。結果として、候補分子中の2分子がclaudin-5発現を酸素濃度依存性制御することが明らかになった。さらに、bEND.3細胞層の電気抵抗を測定した結果、低酸素刺激による血管バリアー機能の破綻がこれらの分子に対するsiRNA導入により抑制されることがわかった。血管内皮細胞におけるclaudin-5発現調節機構を解析することは、神経系血管バリアー機能の制御機構の一端を解明することにつながる。本実験にて得られた成果をもとに、神経系疾患の病態解明、新規治療法の開発を目指す。当初の実験計画通り、in vitro実験系の結果を踏まえて解析を進めた。つまり、低酸素濃度下における血管内皮細胞の細胞膜へのclaudin-5発現・局在調節に関わるmetalloproteinaseの重要性を、in vivo神経系血管バリアーモデルを用いて、解析した。以下の新たな結果を得た。1)マウスを4%7%酸素濃度下に2日飼育すると、網膜は低酸素代謝状態に陥り、網膜血管バリアーの破綻、色素Hoechst stain H33252 (534Da)の血管外漏れが亢進した。2)マウスを低酸素濃度下に飼育する前に、metalloproteinase遺伝子ファミリーに属する分子M1とM2(特許出願準備中のため、M1とM2とする)をtargetとしたsiRNAを投与されたマウスでは、低酸素濃度下飼育による網膜血管がこのHoechst stain H33252 (534Da)の漏れが抑えられた。M1、M2分子は神経系血管バリアーの機能破綻に関与することがin vivo系においても示された。当初の実験計画通り、血管内皮細胞の細胞膜へのclaudin-5発現・局在調節に関与するmetalloproteinaseの特定を行い、次のような新たな結果を得た。1.血管内皮細胞株bEND.3において、metalloproteinase遺伝子ファミリーに属する9種類の分子が発現していることが示された。2.この中の2分子が低酸素刺激による細胞膜からのclaudin-5消失及びバリアー機能の破綻に関与することがin vitro系において示された。in vivoの実験を中心にして、解析を行う。1)異なる酸素濃度下に飼育したマウスの網膜組織のclaudin-5発現・局在についての解析:マウスを正常酸素濃度下または低酸素濃度下に2日飼育する。
生体高分子アミロイド線維形成反応機構の可視化による分子機構の解明

さまざまな疾病に関与するアミロイド線維の分子機構の解明は、疾患の治療や予防方法を開発する上で重要なことである。本研究は、アミロイド線維の分子機構を明らかにするために、全反射蛍光顕微鏡を用いてアミロイド線維形成反応を可視化した。この方法により、アミロイド線維とそれ以外の凝集物との区別することに成功した。次に、アミロイド線維の伸長に着目した。すでに形成したアミロイド線維に異なる蛍光色素で標識したペプチドを添加して、伸長する様子を観察した。その結果、アミロイド線維は線維末端だけでなく線維側面からも伸長することが明らかになった。今年度は、主に研究実施計画に記述した、「アミロイド線維形成機構と無定形な凝集の形成機構の区別」でアルコール存在下におけるアミロイド線維形成の挙動について詳細に調べた。当研究室で独自に組み立てた全反射蛍光顕微鏡(TIRFM)と、モデルペプチドとして、II型糖尿病の発症に関係するとされているIslet amyloid polypeptide (IAPP)を用いた。TIRFMによるアミロイド線維伸長リアルタイム観察は、アミロイド線維形成機構およびアミロイド線維の特性を可視化することが可能である。アミロイド線維形成反応を直接観察することは、まだ明らかされていない線維形成分子機構の手掛かりや、現在提唱されている分子機構の直接的な証明となる。また、II型糖尿病の発症機構に関する知見を得て、将来的に新たな治療方法の開発に貢献することも期待できる。IAPPは疎水性に富んだアミノ酸からなり、非常に凝集性が高い。IAPPの粉末を水系の溶液で溶解させるとすぐに白濁した。これに対し、様々な濃度のヘキサフロロイソプロパノール(HFIP)を添加した溶液では、白濁することなくアミロイド線維を形成した。アミロイド線維と無定形な凝集を区別するための蛍光色素を用いて観察すると、水系の溶液では線維と無定形な凝集の両方が形成されたが、HFIP存在下ではアミロイド線維のみを形成したことが明らかになった。蛋白質・ペプチドの二次構造を調べる円二色性分散測定を行ったところ、線維を形成する初期の段階でIAPPの二次構造がHFIPの有無で異なっていることがわかった。HFIPは水系の溶液に添加するとクラスターを形成する。このクラスターは細胞表面の環境と似ており、今後より詳細な線維形成の分子機構に関する知見を得ることもできる。現在までに得られたデータをまとめて論文を投稿中である。今年度は、主に研究実施計画に記述した、「線維伸長末端で生じる反応の可視化」をアルコール存在下におけるアミロイド線維形成について詳細に調べた。当研究室で独自に組み立てた全反射蛍光顕微鏡(TIRFM)と、モデルペプチドとして、II型糖尿病の発症に関係するとされているIslet amyloidpolypep tide (IAPP)を用いた。初年度に行った「線維形成機構と無定形な凝集の形成機構の区別」で得られたIAPPがアミロイド線維を形成する最適な条件を用いて研究を行った。具体的には、すでに形成した未修飾のアミロイド線維に対して、蛍光色素Alexa532で修飾したIAPP(Alexa532-IAPP)のモノマーを添加した。加えたAlexa532-IAPPモノマーがすでに形成したアミロイド線維に対して、どのような相互作用をするかをリアルタイムで観察した。その結果、Alexa532-IAPPはアミロイド線維末端のみだけでなく、線維側面にも結合して新たな線維を形成している模様が観察された。この結果は、これまで線維の末端にモノマー分子が反応することより線維伸長が生じると考えられてきたことが、線維の側面にも着目して線維の形成機構を考えなければならないという新たな知見を得ることに成功した。現在さらに詳細な知見を得るために、対物型のTIRFMの観察システムを構築中であり、その観察から得られた結果をふまえて投稿論文としてまとめる予定である。
現代日本と沖縄をめぐる社会意識の動態に関する探索的研究

言説分析や定性的調査により、近年の沖縄の基地問題が自己責任論で語られる傾向が見られる一方で、ポジショナリティを基盤とした日本人の政治責任として議論されることが顕著になったこと、その具体的な運動化として「基地引き取り運動」がうまれたこと、日沖の若者への定量的調査により沖縄において日本社会への高い親密性と、基地問題での大きな意識差、基地集中を差別と捉える視点の存在、また日本に居住する沖縄系住民への聞き取りから、アイデンティティとポジショナリティの葛藤から、様々な相互作用が積み重ねられてきた経緯、等が明らかになった。これらより、ポストコロニアルな文脈で日本と沖縄の関係を捉え直す契機が提供可能である。1.文献研究については、日本と沖縄をめぐるポストコロニアリズムの諸側面について、戦後の文献を中心に検討を行った。とくに基地問題と原発事故等の公共性と関わる諸問題の比較検討、日本と沖縄の関係についての社会思想・社会意識の変遷、ジェンダーや親密性も視野に入れたより大きな枠組みでのポストコロニアリズムの文脈に沖縄と日本の関係を再配置する試み、等を中心に検討を行った。2.沖縄での若年層を対象とした沖縄の社会状況に関するアンケート調査については、本年度内の実施を目指して準備してきたが、年度内の実施を見送らざるを得なかった。その理由として、普天間基地の辺野古移設が25年末に沖縄県知事によって受け入れ表明されたことや26年1月には名護市長選挙が行われた等、基地の在り方をめぐる状況が流動的でめまぐるしく変化していたからである。これらを受けて現在でも沖縄では様々な議論が噴出しており、少なくともその渦中に調査を行うことは、直前の政治状況に大きく回答が影響される可能性が考えられた。よって、状況が落ち着くのを待ち調査を実施する方がより正確かつ的確な回答が期待できると考えた。3.一方でヒアリング調査については順調に進んだ。関西・沖縄地区を中心に様々な層の沖縄出身者ならびに沖縄県外出身者に対するヒアリングを行った。アンケート調査を2年目に実施することになったこともあり、ヒアリングについては当初の予定を超えて2年目に予定していた内容の一部も先行して調査することができた。とくに基地の沖縄県外移設論に対する様々な人々の意識を調査することができた。4.さらに、ヒアリング調査の機会と同時に、大阪市において、本研究の代表者と分担者を中心にシンポジウムが市民団体の手によって開催され、本研究の一端を社会に還元する機会も得た。5.初年度の年次報告書は年度内の発行は叶わなかったが、中間報告書として準備中である。1)文献研究については、日本の平和運動における沖縄基地問題の系譜、ならびに近年の保守派言説における基地問題と「沖縄問題」の概念の転換について、詳細に検討を行った。2)沖縄の若年層に対する社会意識のアンケート調査については、昨年度からの「持ち越し宿題」となっていたが、検討の結果本年度も行わなかった。理由は、H26年には基地問題を争点とした選挙が沖縄県内で5つもあり、調査結果に大きな影響が出ることが懸念されたためである。この調査については、H27年5月時点で、比較対照データとして沖縄県外での調査も同時に実施されているところである。3)一方で、ヒアリング調査は昨年度に引き続き順調に進んだ。一つは、主として沖縄県外に在住する沖縄出身者に対して行った。関西においては大阪在住沖縄出身者、兵庫県宝塚市在住の沖縄出身者に対して、沖縄への帰属意識、日本人との差異感覚、それらの世代間の異同などについて聞き取りを行った。関東においては東京在住の沖縄(および奄美群島)出身者に対して同様の聞き取りを行った。つぎに、大阪を中心として、基地の県外移設を進める運動体(日本人による運動)に継続的に聞き取り調査を行い、運動の変遷とそこに参加している人々の、沖縄と日本に対する社会意識の変化を詳細に聞き取った。4)本研究の成果の一部は、日本解放社会学会(第30回大会)において報告され(池田・桃原)、また掲載予定も含めて3本の論文にまとめられた(池田2本、桃原1本)。また5月には、大阪市において、関西在住の沖縄系住民組織が主催するシンポジウムに代表者が出席し、本研究の成果の一部を社会に還元する機会を得た。年次報告書の刊行を予定しながら、上記アンケート調査が実施できていないことから刊行が叶わなかった。早急に中間報告書を刊行する予定である。本研究は、主に以下の4点を中心に実施された。(1)現代沖縄をめぐる言説の分析では、研究期間を通じ、近年の沖縄・日本双方での言説の変化を検討した。最終年度には、基地問題を中心として「沖縄の自己責任論」が日本側において顕著になったこと、一方で県外移設論や基地引き取り論など日本側の集団責任を問う言説も注目を集めたこと、運動の現場や沖縄の言論界で「ポジショナリティ」概念が一般化しつつあること、等を明らかにした。次に、(2)沖縄と日本の若者達の社会意識について定量的調査を行った。2年目までにプレリサーチを行い、最終年度に沖縄県内外の大学生1111名を対象に、基地問題への意識、所属意識、文化意識等に関するアンケート調査を実施した。その結果、基地問題をめぐる沖縄と日本の意識差、所属意識の差が改めて浮き彫りとなった。さらに、(3)沖縄と日本の間の新たな社会意識の共有として、米軍基地の「県外移設論(沖縄)」と「引き取り論(日本)」の実態について、言論人、運動体、メディア関係者等に聞き取りを行った。

最終年度の引き取り運動の関係者等への聞き取りから、反差別運動、ポジショナリティをめぐる運動という側面が明らかになった。そして、(4)関東・関西に在住する沖縄系住民への聞き取りを通じ、沖縄系住民が沖縄と日本の社会意識に対して与えてきた影響と相互作用について検討した。最終年度は、とくに関西における沖縄系住民の生活史を通して、社会意識との相互作用を探った。以上の知見は、論文や学会報告(研究発表欄参照)、運動体や住民等への報告会等で社会に還元を試みた。また3年間の研究成果は2016年前半を目標に報告書としてまとめ、調査協力者やメディア関係者等に配布する予定である。またH28年度より継続的テーマによる科研が採択されたので(基盤(C)16K04132)、引き続き踏み込んだ研究を行う予定である。言説分析や定性的調査により、近年の沖縄の基地問題が自己責任論で語られる傾向が見られる一方で、ポジショナリティを基盤とした日本人の政治責任として議論されることが顕著になったこと、その具体的な運動化として「基地引き取り運動」がうまれたこと、日沖の若者への定量的調査により沖縄において日本社会への高い親密性と、基地問題での大きな意識差、基地集中を差別と捉える視点の存在、また日本に居住する沖縄系住民への聞き取りから、アイデンティティとポジショナリティの葛藤から、様々な相互作用が積み重ねられてきた経緯、等が明らかになった。これらより、ポストコロニアルな文脈で日本と沖縄の関係を捉え直す契機が提供可能である。「やや遅れている」と評価した理由は、主に2つある。1つは沖縄での若年層を対象としたアンケート調査が未実施であることである。H26年には(H25年に引き続き)、沖縄の基地問題が大きな争点となった選挙が沖縄県内で5つもあり、一年を通じて基地問題が論争的焦点となっていた。さらに日本(沖縄県外)からも基地問題について様々な議論が行われ、それぞれ直前に行われた選挙の結果が調査に直接的な影響を与えることが危惧された。また、沖縄在住の若者、さらには関東や関西に在住の沖縄県出身者への聞き取り調査の中から、追加的にアンケート調査に盛り込むべき論点が浮かび上がり(基地問題についての情報経路等)、それらの検討にも時間を要した。さらにアンケート調査設計の段階で、いくつかの論点については比較対照データとして、沖縄県外の若者達にもアンケート調査を行う必要性が確認され、その手順と調査票の設計が行われた。さらに、これらの調査を大妻女子大学と沖縄国際大学の研究倫理委員会に事前に審査を要請し、その審査結果を待つ期間も必要であった。この1年間の沖縄社会の異常ともいえる政治的状況の流動性、ならびに上記の追加的項目の検討、対照データとしての沖縄県外でのアンケートの設計、等の作業が重なり、実施は遅れている。しかし、H27年5月に沖縄県内で調査は実施されており、6月からは沖縄県外での調査も開始される。2つめとしては、中間報告書の刊行の遅れがある。この中間報告書には上記のアンケート調査の結果(速報)を掲載する予定であり、アンケート調査の遅れが中間報告書の刊行の遅れの原因となっている。一方で、聞き取り調査、文献調査は予定を超えて順調に進んでいる。むしろ、聞き取り調査から得られた知見をアンケート調査に生かすために、アンケート調査が遅れているという側面もある。
赤外線光弾性法による半導体単結晶の残留応力測定

1.異方性材料の赤外線光弾性効果光学的および機械的に異方性である単結晶の,一般的な光弾性則を導いたこの光弾性則より,光弾性実験のための条件を明らかにした.すなわち,単結晶塊よりいろいろの方向に薄板を切出した場合,その薄板の形状に適する座標で表わした圧光学係数が,一つの条件式を満足すると,光弾性実験のみで薄板内の応力分布が求められるということである.次に,シリコン単結晶塊より, 5種類の結晶方向をもったはりをつくり,赤外線光弾性法で単純曲げ状態でのしまを測定した.その結果,誘導した光弾性則が正しいことが証明された.同時に,シリコンはりの機械的異方性を数値計算より求めた.特に〈111〉方向を光の透過方向に選ぶと,シリコンは等方性材料と同じ挙動を示すことが,実験および理論から明らかになった.2.赤外線光弾性の精度の検討本研究では,赤外線ビジコンを用い,しま模様はパソコンを通して,フレームメモリに蓄積し,その後画像処理をした.画像の濃淡を256階調のデジタル量に変換するために,光源の強度,試料内の光の透過度,ビジコンの感度によって十分な階調が得られないことが,予備実験で明らかになった.そこで,しま模様が低階調となった場合に生ずる誤差について,シミュレーションを行った.その結果,整数次および整数次+0.5次の近辺のしま次数のとき,誤差が大きくなることが明らかになった.またシリコンはりの単純曲げ実験で,この誤差を検討した.実験とシミュレーションは一致を示した.3.GaAsの残留応力測定前述の1および2を基にして, GaAsの残留応力を測定した.特にしま次数が低いため,ビジコンの撮像管に起因する不安定さが問題となった.これを解決する方法を考案している.1.異方性材料の赤外線光弾性効果光学的および機械的に異方性である単結晶の,一般的な光弾性則を導いたこの光弾性則より,光弾性実験のための条件を明らかにした.すなわち,単結晶塊よりいろいろの方向に薄板を切出した場合,その薄板の形状に適する座標で表わした圧光学係数が,一つの条件式を満足すると,光弾性実験のみで薄板内の応力分布が求められるということである.次に,シリコン単結晶塊より, 5種類の結晶方向をもったはりをつくり,赤外線光弾性法で単純曲げ状態でのしまを測定した.その結果,誘導した光弾性則が正しいことが証明された.同時に,シリコンはりの機械的異方性を数値計算より求めた.特に〈111〉方向を光の透過方向に選ぶと,シリコンは等方性材料と同じ挙動を示すことが,実験および理論から明らかになった.2.赤外線光弾性の精度の検討本研究では,赤外線ビジコンを用い,しま模様はパソコンを通して,フレームメモリに蓄積し,その後画像処理をした.画像の濃淡を256階調のデジタル量に変換するために,光源の強度,試料内の光の透過度,ビジコンの感度によって十分な階調が得られないことが,予備実験で明らかになった.そこで,しま模様が低階調となった場合に生ずる誤差について,シミュレーションを行った.その結果,整数次および整数次+0.5次の近辺のしま次数のとき,誤差が大きくなることが明らかになった.またシリコンはりの単純曲げ実験で,この誤差を検討した.実験とシミュレーションは一致を示した.3.GaAsの残留応力測定前述の1および2を基にして, GaAsの残留応力を測定した.特にしま次数が低いため,ビジコンの撮像管に起因する不安定さが問題となった.これを解決する方法を考案している.
移動通信における地下街等の分岐及び空間をもつ地下構築物内の電波伝搬

移動体通信は、今日の情報化社会に加速度的に普及し、その重要性は益々高まりつつある。しかしながら、地下街、ビル構内などの構築物内では、電波伝搬特性によりそれらの使用が制限されている。特に分岐・折れ曲がり方向への電波伝搬特性はかなり悪化することが分かっている。遮蔽壁があるトンネル構造の地下構築物空間における電波伝搬におけるこれまでの研究は、一様なトンネル内における伝搬特性の解明、すなわち伝搬モードの減衰特性に関するものが主流であった。本研究では、地下街やビル構内等で基本的な分岐・折れ曲がりと空間をもつ地下構築物を取り上げ、実用的な観点から理論解析と実験的検討を進めようとするもので、従来の研究からの大きな前進を得ることが期待できる。理論的には構築物内の電波伝搬問題にFVTD法(任意の小さい多面体セルに対して、マクスウェルの方程式を体積積分することによって離散化される差分方程式)とレイ・トレース法の導入によるものである、我々は、このFVTD法の適用が2次元の一様トンネルに対して極めて有効であるとの知見を既に得ている。10年度は、円形2次元トンネル内、分岐のあるトンネル内及びビルの廊下等の電波伝搬解析、11年度は、複数のH形分岐をもつ方形トンネル内及び住宅における室内電波伝搬、12年度は、構築物内の任意の場所に線状波源をおいた分岐折れ曲がりをもつ2次元トンネル、すなわち、左右の壁のみの効果についてはFVTD法を適用し、同方形トンネル及びビル構内の伝搬についてはレイ・トレース法を適用して解析した。いずれの年度も理論的な数値計算と並行して、マイクロ波を用いた縮小模型の実験装置を開発してトンネル内伝搬実験を実施することにより、多数のデータを得て,設定問題におけるトンネル内の電界強度分布を明らかにし,理論解析の数値計算結果とよく一致することを実証した。また、コンクリート壁内部に電波伝搬についても理論的にFVTD法及びレイトレース法を適用し、実験ではコンクリート内部の伝搬状態の概略を知ることにより、両者を比較検討することができた。従って,地下構築物内の基本的な分岐折れ曲がりをもつトンネルに対して、FVTD法の有効性を明らかにすることができた.また、分岐折れ曲がりをもつ方形トンネルに対してはレイ・トレース法が有効であることを明らかにした.これらの研究成果については,学術論文,研究会及び学会講演等に発表している.今後は,実際の地下構築物をモデルとした複雑な形状のトンネル3次元問題を理論的及び実験的な両面からの解決を図る必要がある.移動体通信は、今日の情報化社会に加速度的に普及し、その重要性は益々高まりつつある。従って,地下構築物内の基本的な分岐折れ曲がりをもつトンネルに対して、FVTD法の有効性を明らかにすることができた.また、分岐折れ曲がりをもつ方形トンネルに対してはレイ・トレース法が有効であることを明らかにした.これらの研究成果については,学術論文,研究会及び学会講演等に発表している.今後は,実際の地下構築物をモデルとした複雑な形状のトンネル3次元問題を理論的及び実験的な両面からの解決を図る必要がある.携帯電話等の移動通信は,情報化社会に著しく普及し,益々その重要性は加速度的に高まりつつある.しかしながら,電波伝搬特性により地下街など、それに類似する地下構築物内では,その使用が制限されている。特に分岐折れ曲がり方向への伝搬特性はかなり悪くなっている.トンネル構造をなす地下構築物空間における電波伝搬におけるこれまでの研究は,一様なトンネル内における伝搬特性解明,すなわち伝搬モードの減衰特性に関するものが主流である.

本研究では,地下街等で基本的な分岐折れ曲がりと空間をもつ地下構築物を取り上げ,実用的な観点から理論解析と実験的検討を進めようとするもので、従来の研究からの大きな前進を得ることが期待できる。そのことを可能にしたのは,トンネル内の電波伝搬問題にFVTD法(任意の小さい多面体セルに対して,マクスウェルの方程式を体積積分することによって離散化される差分方程式)とレイ・トレース法の導入によるものである.我々は,このFVTD法の適用が2次元の一様トンネルに対して極めて有効であるとの知見を既に得ている.今回は,線状波源によるトンネル入口から見た横断面の電界強度分布及びトンネル壁が凹凸をもつ場合について、FVTD法を適用して理論的に解析した.また、地下街等をモデルとした分岐折れ曲がりについてはレイ・トレース法を適用して解析した.理論計算と並行して,マイクロ波を用いたモデル実験装置を開発して伝搬実験を行い,多くのデータを得て,設定問題のトンネル内の電界強度分布を明らかにし,理論解析の数値計算結果とよく一致することを実証した.従って,トンネル横断面及びトンネル壁面に凹凸がある場合にたいしてFVTD法の有効性を明らかにすることができた.また、分岐折れ曲がりをもつトンネルに対して、レイ・トレース法が有効であることを明らかにした.これらの研究成果については,学術論文,研究会及び学会講演等に発表している.今後は,実際の地下街をモデルとした複雑な形状のトンネル問題を理論的及び実験的に解決をすすめる.携帯電話等の移動通信は、情報化社会に加速度的に普及し、益々その重要性は著しく高まりつつある。しかしながら、地下街、地下道など、それに類似する地下構築物内では、電波伝搬特性によりそれらの使用が制限されている。特に分岐折れ曲がり方向への伝搬特性はかなり悪くなることが分かっている。トンネル構造をなす地下構築物空間における電波伝搬におけるこれまでの研究は、一様なトンネル内における伝搬特性解明、すなわち伝搬モードの減衰特性に関するものが主流である。本研究では、地下街等で基本的な分岐折れ曲がりと空間をもつ地下構築物を取り上げ、実用的な観点から理論解析と実験的検討を進めようとするもので、従来の研究からの大きな前進を得ることが期待できる。そのことを可能にしたのは、トンネル内の電波伝搬問題にFVTD法(任意の小さい多面体セルに対して、マクスウェルの方程式を体積積分することによって離散化される差分方程式)とレイ・トレース法の導入によるものである。我々は、このFVTD法の適用が2次元の一様トンネルに対して極めて有効であるとの知見を既に得ている。本年度は、トンネル内の任意の場所に波源をおいた分岐折れ曲がりをもつ2次元トンネルについてはFVTD法を適用し、同方形トンネル及びモデルハウス内の伝搬についてはレイ・トレース法を適用して解析した。理論的な数値計算と並行して、マイクロ波を用いた縮小モデル実験装置を開発してトンネル内伝搬実験を行い、多くのデータを得て、設定問題のトンネル内の電界強度分布を明らかにし、理論解析の数値計算結果とよく一致することを実証した。従って,複数の地下構築物内の基本的な分岐折れ曲がりをもつ2次元トンネルに対して、FVTD法の有効性を明らかにすることができた.
レーザー光による化学反応の直接制御

量子制御とは,原子・分子の波動関数を制御することにより,原子・分子の量子状態を制御しようとする試みであり,量子論的であるミクロな系における物質制御に対して飛躍亭な進展をもたらすと期待されている、既に種々の手法が考案されており,実際に数多くの検証実験が行われている。また工業的な応用を見据えた実験も始まっており,その一つが量子制御による同位体分離実験である。量子制御による同位体分離に適した手法の一つに,パルス波形整形法が考えられている。パルス波形整形法とは,レーザーパルスのもつコヒーレンスを利用して原子・分子の波動関数を量子干渉させることにより制御する手法である。パルス波形整形法による同位体分離を行うためには,Ti:S発振器のパルスエネルギーでは不十分であり,また工業的に要求される同位体分離の効率のためにレーザーの高繰り返し化が必要である。そこでTi:S増幅システムの開発を行った。開発したTi:S増幅システムの特徴としては,(1)Ti:S結晶を60Kに冷却することにより熱レンズ効果を抑制した結果,共振器安定化および高平均出力化を達成し,中心波長を760nmに短波長化させることができた。(2)リング型共振器の採用により励起光と増幅光のモードマッチングの最適化を行うことができた。また45度S偏光反射ミラーを使用することにより広帯域化を達成することができた。(3)ペリクルビームスプリッターにより増幅過程における狭帯域化を補償できたので,広帯域化を行うことができた。以上の特徴により繰り返し1kHz,パルスエネルギー1.6mJ,帯域720-800nm,パルス幅50fsの高繰り返し・高平均出力・短パルスのTi:S増幅システムを開発に成功した。このレーザーシステムは,量子制御による同位体分離のみならず,幅広い化学反応実験や工業的な応用に期待することができる。分子の光解離反応をレーザー光により直接制御する「量子制御」は、理論的に様々な手法が考えられているが、実験的な報告はまだ数少ない。そこで実験的に試みる場合は、先ず簡単な分子で行うべきであり、理輪的に、簡単な気相分子としてHI分子などハロゲン化水素からの光解離の量子制御が報告されている。我々はハロゲン化水素の光解離からの水素原子を画像分光法により直接観測することによって量子制御を試みる。しかし我々は画像分光法装置を所有しているが水素原子を観測するためには改良をする必要があった。改良した画像分光法装置を用いることにより水素原子の観測が可能であることを確認するため次の実験を行った。クラスターの光解離反応はクラスターの構造やファンデルワールス力のような弱い結合の反応ダイナミクスを明らかにすることができると考えられる。水分子は、186nm以下の近紫外域での吸収帯が古くから良く知られている。最近、理論的に水分子において、ダイマーは吸収帯が長波長側にレッドシフトし、他のトリマーなどのクラスターは反対に短波長側にブルーシフトすると報告されている。そこで水ダイマー以外の吸収が存在しない205nmにおける水クラスターの光解離反応の観測を試みた。(H_2O)_2ダイマーから光解離したH原子の観測を試みたが、信号のS/N比が非常に悪かったため、観測が難しかった。そこで(D_2O)_2ダイマーの205nmの光解離からのD原子の観測を試みた。その結果、(D_2O)_2ダイマーの205nmにおける光解離は二つの過程が存在することがわかった。これにより(D_2O)_2ダイマーの構造と反応ダイナミクスの知見を得ることができた。この成果はJournal of Chemical Physicsに投稿する予定である。以上の結果、HI原子の量子制御を観測することは困難であるが、DI原子では観測が可能であることがわかった。量子制御は、レーザー光と原子・分子の波束との相互作用により直接、化学反応を制御しようとする手法である。既に国内外において多くの理論研究や検証実験が盛んに行われている。さらに工業的な応用を見据えた実験も始まっており、現在、最も注目されているトピックスの一つである。市販されている波長可変なレーザーは、紫外・可視領域がほとんどであるため、量子制御実験は電子遷移で行われていることが多い。検証実験においては簡単な原子・分子で十分であるため、まだ問題はない。しかし今後、工業的に利用することを考えると分子数の大きな分子では、解離およびイオン化など破壊的な競合過程が多数、存在するため紫外・可視レーザー領域による量子制御は不利であると予想される。それゆえ今後は中赤外域のレーザー光による振動・回転遷移を利用した量子制御が要求される。しかし波長可変な中赤外光レーザーは、大規模な施設が必要な自由電子レーザーしか存在しない。そこでTi:サファイアレーザーにより発生させた760nmおよび830nmの可視レーザー光パルスを、非同軸に非線形結晶AgGaS2に入射し、差周波混合過程による中赤外光の発生を試みた。二つの可視レーザー光パルスを同軸に入射すると位相整合条件が厳しく、現在までに半値全幅50cm-1の中赤外光発生が報告されてい,る。一方、非同軸方向から二つの可視レーザー光パルスを入射すれば位相整合角の許容角が大きくなるため、非線形結晶の角度を固定したままで、帯域の全てを有効に利用することが可能である。今回、我々は非同軸入射によって8μmから12μmで、半値全幅200cm-1の中赤外光の発生に成功した。

これにより中赤外光による振動・回転遷移を利用した量子制御が可能となると考えられる。また広帯域の中赤外光が発生できるので、短パルス中赤外光の発生が可能であると考えられる。量子制御とは,原子・分子の波動関数を制御することにより,原子・分子の量子状態を制御しようとする試みであり,量子論的であるミクロな系における物質制御に対して飛躍亭な進展をもたらすと期待されている、既に種々の手法が考案されており,実際に数多くの検証実験が行われている。また工業的な応用を見据えた実験も始まっており,その一つが量子制御による同位体分離実験である。量子制御による同位体分離に適した手法の一つに,パルス波形整形法が考えられている。パルス波形整形法とは,レーザーパルスのもつコヒーレンスを利用して原子・分子の波動関数を量子干渉させることにより制御する手法である。パルス波形整形法による同位体分離を行うためには,Ti:S発振器のパルスエネルギーでは不十分であり,また工業的に要求される同位体分離の効率のためにレーザーの高繰り返し化が必要である。そこでTi:S増幅システムの開発を行った。開発したTi:S増幅システムの特徴としては,(1)Ti:S結晶を60Kに冷却することにより熱レンズ効果を抑制した結果,共振器安定化および高平均出力化を達成し,中心波長を760nmに短波長化させることができた。(2)リング型共振器の採用により励起光と増幅光のモードマッチングの最適化を行うことができた。また45度S偏光反射ミラーを使用することにより広帯域化を達成することができた。(3)ペリクルビームスプリッターにより増幅過程における狭帯域化を補償できたので,広帯域化を行うことができた。以上の特徴により繰り返し1kHz,パルスエネルギー1.6mJ,帯域720-800nm,パルス幅50fsの高繰り返し・高平均出力・短パルスのTi:S増幅システムを開発に成功した。このレーザーシステムは,量子制御による同位体分離のみならず,幅広い化学反応実験や工業的な応用に期待することができる。
植物ホルモン活性化/不活性化機構の分子基盤-ブラシノステロイド生合成・代謝酵素による制御-

今年度は、ブラシノステロイド不活性化に関わるP450を酵素化学的に解析することを中心として実験を進めた。これまでにトマトからブラシノステロイド生合成に関わるP450(CYP90A, B, C)と不活性化に関わる新規CYP72B2および72B3の全長cDNAを単離した。トマトをブラシノステロイド処理すると生合成遺伝子の転写量は減少したのに対し、CYP72B2および72B3の転写は増加した。また72B2cDNAをタバコで過剰発現させたところ矮性表現型を示した。内生ブラシノステロイド含量をGC-MSにより定量し野生株と比較したところ、組換え体においてカスタステロンが顕著に減少していたことから、過剰発現している72B2がカスタステロンを不活性化したために矮化していることが示唆された。昆虫細胞ムバキュロウイルス発現系により作製した72B2酵素を用いて生合成中間体に対する基質結合アッセイを行った結果、72B2はカスタステロンに対して強い親和性(6μM)を示したが、一方、活性型ブラシノライドや生合成前駆体6-デオキソカスタステロンはやや弱い親和性(11μM)しか示さなかった。そこで、72B2酵素を発現している昆虫細胞のミクロソーム膜を用いてNADPH-P450還元酵素共存のもとで代謝実験を行った。カスタステロンを基質として酵素アッセイを行った結果、GC-MSにより水酸化生成物を検出する事ができた。MS解裂パターンからカスタステロンの側鎖に水酸基が一つ導入されていることが示された。現在、生成物を分取してNMRによる構造解析を進めている。1.研究の目的:本研究では、BR活性化/不活性化に関与するP450酵素を単離同定し、その発現制御機構を解析することによりBR分子の作用部位における経時的消長を遺伝子、酵素レベルで解析しBRの生理機能の分子基盤を解明することを目的とする。2今年度の結果:今年度は、BR不活性化に関わるP450を酵素化学的に解析することを中心として実験を行った。シロイヌナズナ由来のBAS1(CYP72B1)、CHIBI2(CYP72C1)を過剰発現させた植物は矮性になることが報告されており、これらP450がBRを不活性化する可能性が示唆されているがその酵素活性は未だ不明である。そこでトマトからBAS1ホモログである新規CYP72B2および72B3の全長cDNAを単離した。72B3はBAS1とアミノ酸レベルで75%相同であり同じ活性を持つことが期待される。一方、72B2はBAS1および72B3に対して60%しか相同性を示さないことから、異なる酵素活性をもつことが示唆された。72B2遺伝子はトマトをBR処理すると発現が誘導し、一方BR生合成阻害剤で処理すると発現が減少した。72B2cDNAをタバコで過剰発現させたところ矮性表現型を示したことから、72B2もBRを不活性化すると考えられた。そこで、72B2の組み替え酵素を昆虫細胞ムバキュロウイルス発現系により作製し、酵素活性の同定を試みた。72B2の基質および生成物は不明であるので、BR生合成中間体を用いて組み替え酵素との基質結合アッセイを行った。72B2はカスタステロンに対して強い親和性(6μM)を示したが、一方、活性型ブラシノライドはそれよりも弱くしか結合しなかった。トマトではブラシノライドは全く検出されずカスタステロンが主要な活性型BRであることと良く一致している。現在、GG-MSを利用して72B2を過剰発現して矮性になった組み換えタバコの内生BR含量の定量を行うと共に、72B2組み換え酵素の活性同定、生成物の構造決定を進めている。同様に、シロイヌナズナBAS1、CHIBI2およびトマト72B3の酵素活性を同定するため、これらP450の組み替え酵素の発現も進めている。BRを不活性化するP450の基質特異性、反応特異性を詳しく解析することにより、植物体内でのBRレベルの調節機構を分子レベルで解明することが期待できる。

カスタステロンを基質として酵素アッセイを行った結果、GC-MSにより水酸化生成物を検出する事ができた。MS解裂パターンからカスタステロンの側鎖に水酸基が一つ導入されていることが示された。現在、生成物を分取してNMRによる構造解析を進めている。
経済・金融時系列の統計的モニタリング

本研究ではオンラインで観測される経済・金融時系列データに統計的逐次解析の手法を導入し,時系列モデルにおける統計的逐次解析の理論を構築する.特に、応用分野としては帰無仮説を単位根過程、対立仮説を発散過程とする単位根検定を用いて金融バブルの発生の早期検出に用いることが期待される。当面は、比較的取り扱いの簡単な自己回帰モデルで誤差項が独立で同じ分布に従う確率変数である場合について調べる。その後に、応用上より重要で適用範囲の広いARCHモデルやGARCHモデル、長記憶モデルなどを誤差にもつ時系列データを分析する際の逐次解析の理論を検討する。
ニューロン伸展と血球発生の共通細胞機能

造血系と血管系は、胎生中期大動脈・生殖腺・中腎(AGM)領域に存在する共通の中胚葉性前駆細胞へマンジオブラストに由来する。私はヘマンジオブラスト様の細胞株LOを新規に樹立して、そこに発現する分子群が造血幹細胞の発生や血管内皮細胞の分化にどう関与しているかを検討してきた。LO細胞に対する抗体を用いた発現クローニングにより、マウスPCLP1遺伝子を単離し、これを用いてAGM領域ヘマンジオブラスト集団を同定分離するのに成功した。PCLP1は骨髄の造血幹細胞にも発現しているが、神経幹細胞には発現していない。一方、酵母のシグナルトラップ法により、神経系軸索の誘導や反発に関与するEphリガンドやSemaphorinがAGM領域血球細胞や血管内皮細胞に発現することを見出した。血管内皮細胞は神経系と同様に、発生ステージと場所特異的に集合し、ネットワークを形成することで血管新生に寄与する。神経のガイダンス分子がここでも作用している可能性は興味深い。また、血流中に入れば全身に輸送される血球にはガイダンスは不要であるが、そこでもSemaphorinが発現しているのは、組織構築における血球の定着を示唆する新しい知見である。本研究ではSemaphorinDのノックアウトマウスにおける造血発生を解析したが、神経系同様に特定の発生不全は認められなかった。また、小脳膜蛋白質M6aついてはその機能を知るツールを作成中である。このように、研究自体はまさしく萌芽段階にあるが、造血系と神経系の発生を分子レベルで比較することは、今後両分野の発展に寄与するものと期待される。造血発生部位であるマウス胎仔AGM領域より樹立したオンコスタチン依存性細胞株LOは、血管内皮細胞様の特徴を有し、同時に血球を自発的に産む。これは、血球と血管系の発生が共通の前駆細胞へマンジオブラストから始まるという考えを支持する。本研究ではこのLO細胞の性状分析を、表面抗原に対するモノクローナル抗体の作製と発現クローニング、および酵母によるシグナルトラップクローニング法により行なった。その結果、小脳ニューロン膜蛋白質M6a、EPH受容体A4、SemaphorinEの発現を同定した。EPHとSemaphorinEとそれらに対するリガンドは、AGM領域で確かに発現しており、予想に反して造血前駆細胞にも発現が観察された。それらの分子はこれまでの解析で、ニューロン軸索誘導と反発をガイドすることがわかっていたが、造血系に対する生理作用は報告がない。神経系と異なり、血球細胞は浮遊して血流にのって移動するため、基本的には位置情報のセンサーと呼応遺伝子が存在しないと考えられてきた。しかし、造血発生を考えた場合、ヘマンジオブラストの発生は時期・場所特異的であり、また、一度AGM領域で発した造血前駆細胞はすぐに肝臓に移行し、さらに出生前に骨髄に移行する。本研究によれば、AGM領域の造血幹細胞が骨髄に定着するには一度肝臓の環境を通過することが必須であることが判明した。従って、ヘマンジオブラストからの血球新生過程や、その後の移動過程いずれかで、微小環境内のガイダンスを受けるステージがあることが示唆される。さらに、本研究では、新規膜蛋白質B61をクローニングした。B61はDrosophilaのToll受容体などに見られるロイシンリッチリピートを有する膜蛋白質で、やはり中枢神経系で構造的に類似した蛋白質の発現が報告されている。
表皮水疱症に対する骨髄移植による欠損タンパク発現療法の作用機序解明

表皮水疱症は先天的に皮膚構造蛋白に異常を有することで,皮膚の脆弱性をきたす難治性皮膚疾患である。本研究の目的は,もっとも頻度の高い表皮水疱症である,栄養障害型表皮水疱症に対する根本的治療法として,骨髄由来細胞および幹細胞移植療法の臨床治療の有用性を検討するものである。本研究において骨髄移植の施行およびtransdifferentiateed cellの検討し、骨髄由来表皮細胞の存在を確認した。電子顕微鏡での微細構造のにおいてもanchringfibrilの発現および臨床的改善を認めた。しかし分化細胞の同定および分化因子の推定:皮膚構成細胞およびCOL7産生細胞へ分化したドナー由来責任細胞を同定までにはいたらなかった。現時点で根本的かつ有効な治療法は確立されていない。本研究の目的は,もっとも頻度の高い表皮水疱症である,栄養障害型表皮水疱症に対する根本的治療法として,骨髄由来細胞および幹細胞移植療法の臨床治療の有用性を,ヒト化蛋白モデルマウスを用いて検討するものである。骨髄および末梢血中に含まれる幹細胞のtransdifferentiationを解析することで,有効な治療法の確立していない先天性難治皮膚疾患に対する治療法の確立に寄与する。本研究課題について以下について検討を行い、成果を得た。(i)骨髄移植の施行およびtransdifferentiateed cellの検討:骨髄移植後、正常部皮膚およびびらん上皮化部皮膚を採取し、COL7の発現を検討した。ドナー由来細胞の存在および頻度を検討するために免疫染色でGFP陽性皮膚構成細胞を解析した。結果、骨髄由来の表皮細胞の存在を確認した。頻度は、前基底細胞中1数%であった。加えて、表皮真皮境界部にCOL7の発現も認めた。発現度合いは、前基底膜の15%程度であった。(ii)移植後の臨床症状評価:実際の皮膚の強度への関与を評価するため、電子顕微鏡での微細構造の変化および臨床的な変化を観察した。長期予後解析のため、移植後最低1年間は有棘細胞癌の発生の有無を観察し、死亡率を検討した。超微細構造上、ヘミデスモゾームの数および形態的な改善が認められた。さらに粘膜部の潰瘍形成も著明な減少がみられた。また観察期間中、有棘細胞癌の発生は認められなかった。(iii)分化細胞の同定および分化因子の推定:皮膚構成細胞およびCOL7産生細胞へ分化したドナー由来責任細胞を同定までにはいたらなかった。引き続き検討を行う。
行動する動物からニューロン並列活動を計測する共焦点スキャンシステムの開発

本研究では,脳内のニューロン活動を単一レベルの分解能でしかも高速で計測する共焦点レーザー顕微鏡システムを開発した.開発したシステムは,ステージ固定式顕微鏡(オリンパスBX50WI)上に高速スキャンシステム(横河電機CSU10)を設置したものと,同じくステージ固定式顕微鏡に共焦点レーザーシステム(オリンパスFV-300)を組み合わせたものの2つである.前者はイメージ・インテンシファイヤー付きの高感度高速カメラ(フォトロンFastcam-Net I2)で撮像すれば,2ミリ秒ごとに1024×1024画素の画像を取り込むことができ,広い範囲に分布する多数のニューロン活動を高時間分解能で同時計測するのに適している.その反面,画像の輝度が弱いので微小な蛍光変化をとらえるには難しい.したがって,脳内の多数のニューロン群のうち,どのニューロンがいつ活動するかを調べるのに適している.一方,後者は高速スキャン(2100ミリ秒)するにはラインスキャンや限定した領域に限って測定する必要があるが,高画質なのでニューロン活動の微小な変化をもとらえることができる.後者のシステムを用いて,透明な頭部をもつゼブラフィッシュ稚魚の後脳ニューロンの活動をカルシウム指示薬によりカルシウム・イメージングした.なかでも抑制性シナプス活動を世界で初めてイメージングすることに成功し,国内外の注目を集めた.さらに我々は,ステージ固定式正立顕微鏡(オリンパスBX50WI)のコンデンサーレンズの位置に対物レンズと光学系および高速ビデオカメラ(フォトロンUtlima1024)を組み合わせた計測システムをつくり,ゼブラフィッシュの逃避運動とニューロン活動を同時に測定するに至った.本研究で開発した光学計測システムにより,行動中の動物の脳ニューロン群活動を単一ニューロンレベルでしかも活動電位やシナプス伝達のおこる時間分解能で調べることが可能になった.本研究では,脳内のニューロン活動を単一レベルの分解能でしかも高速で計測する共焦点レーザー顕微鏡システムを開発した.開発したシステムは,ステージ固定式顕微鏡(オリンパスBX50WI)上に高速スキャンシステム(横河電機CSU10)を設置したものと,同じくステージ固定式顕微鏡に共焦点レーザーシステム(オリンパスFV-300)を組み合わせたものの2つである.前者はイメージ・インテンシファイヤー付きの高感度高速カメラ(フォトロンFastcam-Net I2)で撮像すれば,2ミリ秒ごとに1024×1024画素の画像を取り込むことができ,広い範囲に分布する多数のニューロン活動を高時間分解能で同時計測するのに適している.その反面,画像の輝度が弱いので微小な蛍光変化をとらえるには難しい.したがって,脳内の多数のニューロン群のうち,どのニューロンがいつ活動するかを調べるのに適している.一方,後者は高速スキャン(2100ミリ秒)するにはラインスキャンや限定した領域に限って測定する必要があるが,高画質なのでニューロン活動の微小な変化をもとらえることができる.後者のシステムを用いて,透明な頭部をもつゼブラフィッシュ稚魚の後脳ニューロンの活動をカルシウム指示薬によりカルシウム・イメージングした.なかでも抑制性シナプス活動を世界で初めてイメージングすることに成功し,国内外の注目を集めた.さらに我々は,ステージ固定式正立顕微鏡(オリンパスBX50WI)のコンデンサーレンズの位置に対物レンズと光学系および高速ビデオカメラ(フォトロンUtlima1024)を組み合わせた計測システムをつくり,ゼブラフィッシュの逃避運動とニューロン活動を同時に測定するに至った.本研究で開発した光学計測システムにより,行動中の動物の脳ニューロン群活動を単一ニューロンレベルでしかも活動電位やシナプス伝達のおこる時間分解能で調べることが可能になった.本研究は,脳のニューロン群活動を単一ニューロンレベルでしかもミリ秒オーダーの時間分解能で計測するシステムを,共焦点レーザスキャンを用いて開発することを目的とする.本年度は,基本システムの設計と製作を行った.共焦点レーザスキャン装置(横河電機CSU10)をステージ固定式顕微鏡(オリンパスBX50WI-FV300)上に設置した.スキャナーシステムには,励起光としてArレーザとHeNeレーザを用い,それぞれに対応した検出器を組み入れた.現時点では,512×512画素のイメージを260ミリ秒ごとに取り込む高速スキャンに成功した.画素数を制限すれば100ミリ秒ごとに取り込むことも可能である.来年度,高速ビデオカメラシステムを導入すれば,これより10倍以上の速い取り込みも可能となる.また,光学的に計測したニューロン活動をパッチ電極により同時に電気記録するために,顕微鏡には透過光システムを搭載した.脳内の任意の場所から記録を行うために,動物標本と刺激電極・記録電極の位置を維持したまま,顕微鏡とスキャナーシステム全体を可動ステージの上に載せマニピューレーターで簡単に動かせるようにした(成茂科学特製).生きているゼブラフィッシュ稚魚の後脳網様体脊髄路(RS)ニューロン群をカルシウムイオンの蛍光指示薬であるCalcium Green Dextranで逆行性にラベルし,製作したシステムを用いてin vivoイメージングした.最大のRSニューロンであるマウスナー細胞の軸索を刺激したときの逆行性活動電位に対応する蛍光変化をとらえることに成功した.