hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
臓器をシングルセルに３次元分解する空間分画技術の創出

本研究は、臓器を物理的に切断し、1細胞サイズまで微小分割することで、立体的な臓器を空間的に「3次元分解」する新たな解析技術の確立を目指す。これまでにシリコンナノ加工技術により実現した独自技術であるシングルセルの一括切断技術をベースに、脳・腎臓等の様々な臓器を細胞レベルまで空間的に分割することで、多様な組成をもった微小臓器断片を得る(臓器空間分画技術)。得られた空間画分を網羅解析することにより従来の方法では到達できなかった臓器内の生体分子の定量的な3次元空間分布「臓器内生体分子3次元マップ」の解明に繋げ、医学・生命科学研究に革新的な解析技術を提供することを目的としている。臓器空間分画技術による臓器微小断片の大量取得を期間内に実現するため、以下の項目について実験技術の構築と検証を行っている。(1)生体から摘出した臓器を物理的に分割する刃状構造体(ナノブレード)を有した空間分画デバイスの製作、(2)臓器サンプルへの正確なアプローチと確実な切断を実現する切断・送り機構の構築、(3)モデル臓器であるマウス脳・腎臓スライスを利用した、空間分画の原理実証とイメージングによる分画状態の検証。本年度はナノブレードアレイデバイスの微細化に加えて、切断効率を高めるための先端先鋭化や高機能化に向けた微小電極の統合に取り組んだ。また、有用性を評価するためマウス脳スライスをサンプルとして次世代シーケンサーを用いた解析を行った。また、有用性を評価するためマウス脳スライスをサンプルとして次世代シーケンサーを用いた発現解析を行った。ブレードアレイデバイスおよび解析に関する進展は順調に得られている。一方で、臓器切断送り機構に関しては引き続き技術的課題が残っている。現在、切断を確実にすることを目的にブレード形状や電圧印加による切断、樹脂によるサポート層の形成に関して検討を行っている。今後の方策については、引き続き臓器空間分画技術による臓器微小断片の大量取得を期間内に実現するため、次の課題に並行して取り組む。解析可能であることが確かめられたことから、現在解析に必要なサンプル回収の高速化に取り組んでいる。それに必要な確実な臓器スライスサンプルの切断に向けて、結晶異方性エッチングと組み合わせたブレード先端先鋭化や、金属膜をパターニングすることで形成した微小電極との統合に引き続き取り組む。また、3次元化に関しては、送り機構に技術的課題が多く存在するため、解決に向けて要素技術を確立していく。具体的には臓器形状を保ち、かつ凍結乾燥時のサポートとなる新たな樹脂レイヤーを利用した空間分画手法の開発を計画している。シリコンナノ加工技術により実現した独自技術であるシングルセルの一括切断技術をベースに、脳・腎臓等の様々な臓器を細胞レベルまで空間的に分割することで、多様な組成をもった微小臓器断片を得る。本年度以下の2項目について実験技術の構築と検証を行った。(1)生体から摘出した臓器を物理的に分割する刃状構造体(ナノブレード)を有した空間分画デバイスの製作:超高精度電子線描画装置・マスクレス露光装置とICP-RIE装置を利用したシリコンナノプロセスにより、10020000 nmサイズの幅を持つ刃状構造(ナノブレード)を有した空間分画デバイスを作製した。物理的な切断によって、サブセルあるいはシングルセルレベルの空間分布を一度に得るため、1区画が1辺500nm200μm角程度の格子となっており、それが20 mm×20 mm以上の領域にアレイ状に並ぶ構造を設計した。その結果、良好にデバイスは作製され、100μm角を超えるサイズの区画に関しては貫通孔が形成された。(2)臓器サンプルへの正確なアプローチと確実な切断を実現する切断・送り機構の構築:押圧時に空間分画デバイスを臓器に確実にコンタクトさせるために、ゲルを支持基板にコートした柔軟で、かつ支持基板自体が破壊しない強度を持つ臓器サンプル保持担体を作製し、ナノブレードを押圧できる構造とし、臓器分画を実証した。研究目的である、臓器空間分画技術による臓器微小断片の大量取得を期間内に実現するため、以下の4つの項目について実験技術の構築と検証を行う計画である。(1)生体から摘出した臓器を物理的に分割する刃状構造体(ナノブレード)を有した空間分画デバイスの製作、(2)臓器サンプルへの正確なアプローチと確実な切断を実現する切断・送り機構の構築、(3)モデル臓器であるマウス

脳・腎臓スライスを利用した、空間分画の原理実証とイメージングによる分画状態の検証を行う。最終的に、(4)3次元立体的臓器を(3)の切断操作とスライド操作の繰り返しによって、「臓器丸ごと」切断回収する機構を実現する。本年度以下の2項目について実験技術の構築と検証を行った。(1)臓器用空間分画デバイスの製作:生体から摘出した臓器を物理的に分割する刃状構造体(ナノブレード)を有した空間分画デバイスの製作:超高精度電子線描画装置・マスクレス露光装置とICP-RIE装置を利用したシリコンナノプロセスにより、10020000 nmサイズの幅を持つ刃状構造(ナノブレード)を有した空間分画デバイスを作製した。物理的な切断によって、サブセルあるいはシングルセルレベルの空間分布を一度に得るため、1区画が1辺500nm200μm角程度の格子となっており、それが20 mm×20 mm以上の領域にアレイ状に並ぶ構造を設計した。その結果、良好にデバイスは作製され、100μm角を超えるサイズの区画に関しては貫通孔が形成された。(2)切断機構の開発:押圧時に空間分画デバイスを臓器に確実にコンタクトさせるために、ゲルを支持基板にコートした柔軟で、かつ支持基板自体が破壊しない強度を持つ臓器サンプル保持担体を作製し、ナノブレードを押圧できる構造とし、臓器分画を実証した。本研究は、臓器を物理的に切断し、1細胞サイズまで微小分割することで、立体的な臓器を空間的に「3次元分解」する新たな解析技術の確立を目指す。シリコンナノ加工技術により実現した独自技術であるシングルセルの一括切断技術をベースに、脳・腎臓等の様々な臓器を細胞レベルまで空間的に分割することで、多様な組成をもった微小臓器断片を得る。本年度以下の3項目について実験技術の構築と検証を行った。(1)生体から摘出した臓器を物理的に分割する刃状構造体(ナノブレード)を有した空間分画デバイスの製作:マウス臓器スライスをターゲットとして貫通孔を有したナノブレードアレイの作製条件、及び構造解析により強度に関する検討を行った。結果として、シングルセルサイズの貫通孔を有した様々なブレードアレイデバイスを完成させるとともに市販容器との適合性を考慮したチップ形状を実現した。(2)臓器サンプルへの正確なアプローチと確実な切断を実現する切断・送り機構の構築:押圧時に空間分画デバイスを臓器に確実にコンタクトさせるため、ナノブレードを保持する機構について開発を行った。また、操作性向上のためアタッチメント式で交換が容易なブレードデバイス脱着機構を考案した。(3)モデル臓器であるマウス脳・腎臓スライスを利用した空間分画の原理実証とイメージングによる分画状態の検証:マウス脳スライスをサンプルとして、空間分画を行い、各区画への薬液吐出時に隣接区画にリークがないことを確認し、それぞれの区画が独立した溶液層として利用できることを示し、細胞ライセートの逐次回収を実現した。研究目的である、臓器空間分画技術による臓器微小断片の大量取得を期間内に実現するため、以下の4つの項目について実験技術の構築と検証を行う計画である。
アルファ平滑筋アクチン発現抑制線維芽細胞を用いた癌細胞間質細胞相互作用モデル

ヒト消化管癌における被膜形成傾向を検討するため、胃癌および大腸癌腫瘍辺縁部における活性化した線維芽細胞様細胞の実際の分布を、CD34を静止期線維芽細胞、アルファ平滑筋アクチンを活性化線維芽細胞(筋線維芽細胞)マーカーとして、免疫組織化学的に検討し、アルファ平滑筋アクチン発現抑制線維芽細胞株を試みた。(1)胃癌においては、充実型のうち、粘膜固有層から粘膜下組織に限局する症例および粘膜固有層から漿膜下組織まで浸潤する合計6病変では、浸潤先端部に被膜様の筋線維芽細胞束がみられた。腸型(管状腺癌および乳頭状腺癌)では粘膜下組織までに限局する21病変中3病変(14%)、漿膜下組織に達する14病変中11病変(77%)で浸潤先端部に被膜様の筋線維芽細胞束がみられたが、固有筋層までに限局する8病変では浸潤先端部に被膜様の筋線維芽細胞束は認められなかった。一方、びまん型35病変(低分化腺癌非充実型)ではいずれの病変にも被膜様の筋線維芽細胞束はみられなかった。(2)大腸高分化腺癌では、粘膜下組織までに限局する23病変中18病変(78%)、漿膜下組織に達する23病変中19病変(83%)で浸潤先端部に被膜様の筋線維芽細胞束がみられたが、固有筋層までに限局する36病変中13病変(36%)にのみ先端部に被膜様の筋線維芽細胞束が認められた。一方、低分化腺癌では、充実型15病変では、全病変いずれにも浸潤先端に被膜様の筋線維芽細胞束はみられ、非充実型2病変では、いずれにも認められなかった。(3)アルファ平滑筋アクチン発現抑制線維芽細胞株は現在のところ樹立できていない。以上のごとく、癌組織型および臓器によって被膜の形成傾向が明らかに異なることが明らかにされた。このような結果を踏まえ最終年度となる来年は、アルファ平滑筋アクチン発現抑制線維芽細胞株の樹立、種々の分化度の胃癌および大腸癌培養細胞株と共培養およびヌードマウスへの移植実験を進めたい。
メゾスコピック構造で用いられる電圧プローブの意味

GaAs/AlGaAs変調ドープ構造に形成された高移動度を持つ2次元電子ガス層に高エネルギーGa集束イオンビーム直接描画により、幅5μm、長さ120μmの細線構造を作製した。この細線の途中に電圧測定のためのプローブを間隔15μmで、プローブ幅は2または5μmの2種類のものを形成したが、前者は基板の電子の平均自由行程とほぼ同程度、後者はそれよりも広くとってある。4端子法によりこれら15μmの長さの細線の電気抵抗の垂直磁場依存性を測定した。磁場をかけていくことにより電気抵抗は零磁場での値から減少していくが、これはシュブニコフ・ドハース振動が観測されるまで続いた。つまり、磁場によるサイクロトロン運動によって電子が細線の壁に沿って運動するようになると、細線による閉じ込めの効果がなくなり2次元の系と同等になるが、そうなると細線にしたことによる有限の幅のため抵抗が高かったものが、磁場により幅の効果がなくなって抵抗が低い状態へと移行する過程が見られたものと考えられる。さらに試料に光を当てて電子密度を多くすると、零磁場のごく近傍に弱局在効果による正の磁気抵抗が見られるようになるが、このあたりの状況にプローブ幅の違いによる差は見られなかった。しかし、磁場により抵抗が下がっていく過程において、ごく弱いが幅の広いピークが重畳されており、その現れかたはプローブ幅により異なることが観測された。このピークの原因についてはまだ明らかにされていないが、磁場をかけることにより1次元から2次元へと系が移り変わるのに伴い、電圧プローブへの電子の入りかたに何らかの規則性があることは予想されたが、本年度の結果だけではこの現象の説明に必要な実験事実がまだ足りないため、今後細線幅やプローブ間隔依存性など、基本的な実験をさらに続けて行っていく必要があると思われる。
テレビ会議システムを用いた外国語活動におけるコミュニケーション活動開発

本研究において、和歌山市立A小学校と、和歌山県にある紀の川市立B小学校との間で、インターネットの無料テレビ会議システムを用いて、外国語活動のコミュニケーション活動を展開することができた。しかも、文部科学省が作成した外国語活動教材「Hi, friends」の単元に合わせて、自己紹介を行ったり、自分の好きな食べ物や動物について英語で伝えたり、尋ねたりすることができた。開発した活動では、お互いのことを十分に知らないというインフォーメーションギャップが存在し、知ってみたいという必然性を高めることに成功した。両校とも各学年単学級の小規模校であり、必然性が高いコミュニケーション活動を持つことに課題があった。無料テレビ会議システムを通した外国語活動のコミュニケーション活動を行うことは、この課題を克服する方策の一つであることが明らかとなった。事後の5段階尺度を用いた質的調査で両校に共通する以下の肯定的な意見が示された。・テレビ会議システムを使ったコミュニケーション活動への満足度が高い。・英語で活動をすることができたという自信を有している児童が多い。・引き続きテレビ会議システムを使ったコミュニケーション活動を希望している。この質的調査で「テレビ会議システムを使った授業と使っていない通常の授業との満足度比較」の項目で異なる傾向を示した。A小学校はテレビ会議システムを使った授業の方が満足度が高く、B小学校はその反対であった。B小学校は、担任とALTとのティームティーチングを行う回数が3倍もあり、児童にとってテレビ会議システムを使っていない授業でも満足感を得ていることが推察される。無料テレビ会議システムの問題点として、情報機器等の整備状況や情報セキュリティーポリシーの違いにより実施できない学校が存在することである。
Ｘ線自由電子レーザーを用いたコヒーレントＸ線溶液散乱法の開発

本研究の目的は、「スペックルを利用したX線溶液散乱法」というアイデアをもとにX線自由電子レーザー(XFEL)、SACLAを用いて結晶化不要のタンパク質構造解析を実現することにある。スペックルを利用したX線溶液散乱法とは、タンパク質溶液からのスペックル状の散乱像を解析(方位角方向の散乱強度の相関を計算)して分子の構造情報を引き出す手法である。近年の理論的な研究の進展によってXFELのパルス幅と同程度の時間スケールで測定試料へのX線ダメージが起こり得ることが明らかになってきた。そのため、高強度のX線を利用した構造解析を行うためには、X線ダメージの影響を考慮にいれる必要がある。このX線ダメージ過程を実験的に明らかにするために、今年度は、10フェムト秒を切る時間分解能を持つX線ポンプ・X線プローブ法を開発し、フェムト秒の時間スケールで起こるX線ダメージ過程の観測を可能にした。そしてダイヤモンドを試料として、ポンププローブ実験を行なった結果、X線照射後20フェムト秒からクーロン爆発による原子移動が顕著になることが明らかになった。本研究の最終目的であるスペックルを利用したX線溶液散乱法は、2年間の特別研究員の期間内に実現できなかったが、XFELの光特性評価や高強度X線が物質に及ぼすフェムト秒ダメージの観測といった、要素技術を確立することに成功した。これらの技術をもとにして、結晶化不要のタンパク質構造解析の実現に向けて研究を発展させていきたい。27年度が最終年度であるため、記入しない。「スペックルを用いたX線溶液散乱法」とは、XFELのパルス光がタンパク質溶液に入射した際のスペックル状の散乱像を解析(方位角方向の散乱強度の相関を計算)して分子の構造情報を引き出す手法である。今年度は、スペックル状の散乱像の測定に必要である高い空間コヒーレンスがSACLAからのX線パルスに備わっているかどうかを検証した。具体的には、大小大きさの異なる金コロイドからの散乱波の干渉縞のvisibilityを測定・解析することでXFELの空間コヒーレンスを測定する、generalized Young's experimentを考案した。この方法をSACLAからのX線パルスの診断に応用した結果、SACLAのX線パルスがほぼ完全な空間コヒーレンスを持っていることが明らかになった。このことは集光XFELを利用した場合でも、試料からのスペックル状の散乱像が測定出来ることを意味している。「スペックルを利用したX線溶液散乱法」の実現には高強度のX線を利用する必要であるが、SACLAからのX線パルスの高い空間コヒーレンスを活かすと集光XFELを利用した場合でも、問題なく試料からのスペックル状の散乱像が測定できそうだという見通しが立ったと言える。コヒーレンス計測の成果は論文としてまとめ、現在、投稿中である。XFELのビーム診断については順調に進展した。来年度予定しているスペックルを利用したX線溶液散乱法の実現に向けて、SACLAからのX線パルスの質が問題にならないことを確認出来た。一方で、これまでの研究からXFELのパルス幅の中での試料へのX線ダメージが無視できないほど大きいことがわかってきた。このことは、適切な実験条件がスペックルを利用したX線溶液散乱法の実現のために必要であることを意味している。当初予定していなかった、XFELによる試料へのダメージのメカニズムの解明が新たに必要であることが明らかになった。今後は、まず、高強度のXFELによる試料へのダメージ過程を調べる。具体的にはSACLAからフェムト秒の時間差をつけたダブルパルスのXFELを利用したX線X線ポンププローブ実験を行う。

これは1つ目のパルスで試料にダメージを与え、様々な遅延時間をつけた2つ目のパルスによって試料へのX線ダメージの時間発展を調べるものである。集光したXFELを用いて、この方法をコロイド溶液やタンパク質溶液に応用することでXFELのパルス幅程度の時間スケールでのX線ダメージを実験によって調べる。XFELによる試料へのX線ダメージ過程を解明した後に、本研究の最終目的であるX線自由電子レーザー(XFEL)、SACLAを用いた結晶化不要のタンパク質構造解析の実現を目指す。具体的には、SACLAから試料へのX線ダメージを無視できる程度にパルス幅を短くしたX線パルスを出射する。そして出射したX線パルスを10 nm程度に集光し、集光点にappoferitinというタンパク質の溶液を液体ジェットを利用して導入する。タンパク質からのスペックル状の散乱像を測定し、散乱像における方位角方向の散乱強度の相関からappoferitinの原子分解能の構造を決定する。得られた構造がX線結晶構造解析から決定された構造と一致していることを確認して、スペックルを利用したX線溶液散乱法の妥当性を示す。27年度が最終年度であるため、記入しない。
抗体陽性・血液型不適合肺移植を目指すための、抗体関連拒絶に対する研究

脳死ドナー不足のため、本邦では生体肺移植の占める役割が大きいが、血液型不適合やドナー特異的抗体(DSA)陽性により実現できないことも多い。従って、腎臓や肝臓移植にならい、血液型不適合やDSA陽性症例での生体肺移植の実現を目指した研究が急務である。近年、肺移植後のDSAや抗体関連拒絶が世界的に注目され始めたが、治療法を含め確立した概念がない。こうした状況の中、本研究では、肺移植後のDSA産生や抗体関連拒絶の頻度、治療につき、多角的に検討した。本研究の解析結果から、de novo DSAの頻度、出現時期、検出期間、そのタイプについて、生体肺移植と脳死肺移植に違いがあることが判明した。本研究では、肺移植後のDSA産生や抗体関連拒絶の頻度、治療につき、多角的に検討することを行う。同研究は、肺移植における抗体の意義を確認するとともに、血液型不適合やDSA陽性肺移植の臨床実施への足がかりとなる。また、HLAの観点から、生体と脳死肺移植のデータを比較することで、「本邦で生体肺移植が脳死肺移植より良好な予後を示す」謎を解く鍵となる。さらに、肺移植における術後DSAおよびAMRの頻度については、調査を行うだけでも情報の蓄積という意味で価値がある。さらに、同一基準の医療における比較検討を行うという意味で信頼性の高いデータとなる。実際的には、これまでに京都大学で行われた肺移植症例に加え、今後京都大学で行われる肺移植症例全例を対象に、術前および術後3-6カ月ごと、および、AMRが疑われる移植肺機能不全時に、HLA抗体のスクリーニングとImmuKnowなどの新技術を用いた各種バイオマーカーの測定を行う。HLA抗体陽性時には、DSAか否かの精査を行い、DSA陽性の場合には、生体肺移植では、ダイレクトクロスマッチとC4d染色を含む肺生検を行う。脳死肺移植では、C4d染色を含む肺生検のみ行う。AMRを強く疑う際には、ガンマグロブリン大量療法などによる治療を行う。その後、DSA、各種バイオマーカーの推移を経過観察し、定期的に登録データを網羅的に解析し、成果を報告する。こういった状況の中、本研究は、肺移植後のDSA産生や抗体関連拒絶の頻度、治療につき、多角的に検討することを目的として考案された。実際には、京都大学で2015年3月末までに行われた、肺移植112例(生体58例、脳死54例)について、術前後にHLA抗体を定期的に、また必要時に測定し、臨床経過と比較検討を行った。術前後のHLA抗体のデータが揃っている症例は、78例(生体43例、脳死35例)であった。術後に、新しくDSAが出現した(de novo DSA)症例を9例(11%)に認め、生体3例(7%)、脳死6例(17%)であり、脳死肺移植に多い傾向であった。特筆すべきは、生体肺移植では、全例で、術後10か月以降に、初めてde novo DSAが検出されているのに対し、脳死肺移植では、全て術後3か月以内に検出されていた。また、生体肺移植では、全例でclass II抗体が検出されていたが、脳死肺移植では、全例でclass Iが検出されていた。また、脳死肺移植の6例中4例で、de novo DSAは一過性であった。このように、これまでの解析結果から、de novo DSAの頻度、出現時期、検出期間、そのタイプについて、生体肺移植と脳死肺移植に違いがあることが判明した。今後のさらなる検討で、肺移植における抗体の意義を確認するとともに、血液型不適合やDSA陽性肺移植の臨床実施への足がかりとしたい。呼吸器外科肺移植

京都大学で平成26年3月末までに肺移植を行った92例(生体46例、脳死46例)において、京都大学輸血部の協力を得て、予定通り、術前および術後3カ月ごとに、LABScreen Mixed Class I and IIを用いてHLA抗体のスクリーニングを行った。なお、術後2年以上経過した移植患者に関しては、無症状であれば、一年ごとの当院来院時にスクリーニングを行った。さらに、当初予定していた通り、種々のバイオマーカーの測定も行った。バイオマーカーとしては、LDH, CRP,血漿アミロイドタンパクA(SAA),ImmuKnow値(Cylex社),IL-6, IL-10, TNF-αなどのサイトカインを測定する予定である。なお、これらの測定においては、京都大学で現行で行われている検査については、経費節減のために、該当研究費用からは検出する必要のない分に関しては捻出せず、新規の検査項目(ImmuKnow値、IL-6, IL-10, TNF-αなどのサイトカインなど)のキット購入などに充当するようにした。HLA抗体の測定結果としては、17例に術後HLA抗体を検出した。このうちDSAは7例で、生体肺移植で3例、脳死肺移植で4例であった。なお、DSAの検出時期は、生体肺移植では術後1年以降に検出し、2例では持続的に検出、1例では、検出されてから1年で消失したが、グラフト機能は根絶し再肺移植を要した。一方、脳死肺移植では、術後3か月以内に全例検出されたが、数か月以内に全例消失し、全例でグラフト機能は維持された。このような生体肺移植と脳死肺移植において、特徴的な経過を示したため、現在、症例の蓄積を続けるとともに、術前の因子(たとえば、HLAのミスマッチ数など)についても、さらなる追加の検討を開始した。脳死肺移植のみならず生体肺移植が一定数行われている京都大学において、肺移植後のDSA産生やAMRの頻度、およびその対処法につき多角的に検討し、その成果を世界に発信する。これまでに京都大学で行われた肺移植症例に加え、今後京都大学で行われる肺移植症例全例を対象に、術前および術後3-6カ月ごと、および、AMRが疑われる移植肺機能不全時に、HLA抗体のスクリーニングと各種バイオマーカーの測定を行う。なお、各種バイオバイオマーカーの測定を充実して行うが、バイオマーカーとしては、LDH, CRP,血漿アミロイドタンパクA(SAA),ImmuKnow値(Cylex社),IL-6, IL-10, TNF-αなどのサイトカイン以外のものについても適宜追加検討をしていく予定である。HLA抗体陽性時には、DSAか否かの精査を行い、DSA陽性の場合には、生体肺移植では、ダイレクトクロスマッチとC4d染色を含む肺生検を行う。脳死肺移植では、C4d染色を含む肺生検のみ行う。AMRを強く疑う際には、ガンマグロブリン大量療法による治療を行う。その後、DSA、各種バイオマーカーの推移を経過観察し、定期的に登録データを網羅的に解析し、成果を報告する。平成26年度も、平成25年度と同様なタイミングでの各種検討とさらなる詳細な経過観察を行う。なお、年度末に、全登録移植患者のデータを集積し、DSA、AMRの頻度、その対処策の効果、移植肺機能の経過、DSAの消失率、予後、およびバイオマーカーとの関係につき検討を行う。C4d染色の有効性についても評価する。最終結果を国内および国際学会で報告後、論文化する。
タイ国の教師教育-教育資格制度改革に関する研究

1.第1年次の調査研究において得られた知見は以下の通りである。(1)タイ国の教員養成は、教員採用試験の受験資格から教育学部卒業生に限定される実質閉鎖制度となっている。(2)教員養成カリキュラムの構造は日本のそれと類似しているが、教育実習が1セメスターであるように、極めて実践志向が強い。(3)教員の定数措置や人事が制度的に確立されておらず、時々の政策や財政事情によって極めて不安定である。2.第2年次の調査研究において得られた知見は以下の通りである。(1)実質閉鎖制による計画養成が行われているにもかかわらず、教員養成行政の二元化や養成機関と採用側の連携の不十分さから、日本以上の供給過剰が続いており、教員養成と教員採用の結合が不可欠である。(2)中央集権システムによって教育行政がなされているにもかかわらず、実質的な定数措置がなされていないために学級編制基準(現行30名)が有名無実化している。3.第3年次の調査研究において得られた知見は以下の通りである。(1)1999年7月に成立した「国家教育法」において、教員のみならず学校管理職者及び教育行政官の免許制度の導入が定められた。(2)だが教育の質的向上を図る教育改革、教師教育改革の財政的裏付けは明確ではなく、地方分権化の推進と併せて教育行政制度の改革が同時に必要とされている。4.全体を通じて、タイ国の教師教育-教員資格制度が「国家教育法」とそれによる教員免許制度の確立等による制度運営の安定を見ることにより、教師教育の問題がその量から質へと転換されつつあるといえる。1.本年度は本研究の第1年度として、研究実施計画・組織の策定、先行研究の整理・検討から着手し、研究代表者の派遣(3回)と相手国研究者の日本への招聘(1回-2名)を行い、以下の研究・調査を実施した。(1)日タイ研究者の相互訪問による研究協議と両国の教師教育制度・実態に関する情報交換、またチュラロンコン大学、スコタイタマチュラ公開大学の意見交換、情報収集。タイ国教育省関係局の担当者との意見交換、情報収集。(2)タイ国における教員養成、教員研修の主翼を担っている地域総合大学(ラジャパット・インスティチュート-RIチャンカセム他4校)及び一般大学(チュラロンコン大学)、放送大学(スコタイタマチュラ公開大学)における教員養成の実際把握(カリキュラム等の資料収集-分折、教員・学生への面談調査、授業参観)。(3)教員資格、教員採用を中心としたタイ国の教員制度に関する資料収集、面談調査-タイ国教育省初等教育委員会(同アユタヤ県事務所)、普通中等教育局(同左)、教育公務員人事委員会に対する質問紙調査)。2.上記の調査から得られた知見として、以下の諸点を提示できる。(1)タイ国の教員養成制度は、制度的には「開放制(学士号の所持と1セメスターの教育実習修了者は教員採用試験を受けられる)」を取っているが、実質的には旧教育大学の地域総合大学及び一般大学の教育学部卒業者のみが教員になっている。(2)教員養成カリキュラムは日本のそれに類似しているが、教育実習は1セメスター(日本の16単位に相当)と長く、その意味もより実践的に理解されている。(3)公務員法制としての教員制度は職位職階制として定まっているが、その定数措置や人事行政は極めて不安定であり、政治的・財政的要因によって変動させられる。1.本年度は前年度の調査研究の成果を踏まえて、教師教育に関わる具体的・特定的な問題の実態的解明を中心にタイ国における調査を4回にわたって実施した。また併せて現在タイ国国会に上程され審議中であるタイ国の最初の体系的な教育法-National Education Actについて、その法案を入手するとともに、教員制度や教師教育制度について関係者の意見聴取をおこなった。

2. 1998年4月の現地調査は、この時期に小中学校の教員採用試験がおこなわれることから、チャセンサオ県に出向いてその寒施の実際を観察調査し、併せて受験者を含む関係者から意見聴取をおこなった。タイ国の教員需給状況は、出生率の低下により供給過剰が続いていたが、とりわけ現在に至る経済危機による政府の教員数削減施策により日本以上に深刻な状態となっている。採用試験は国家初等教育委員会と中等普通教育局が同じ期日に実施しているが、小学校教員についてはバンコクを除く75県のうち28県のみで採用試験が行われ、当初の採用予定数は全体で700名に過ぎない。チャセンサオ県では20名の募集に対して1407名、70倍の受験者があり、その多くが臨時的職業に従事し待機状態にある。3.タイ国における教員政策は、それが法律に基づかないがために極めて可変的であり、学級定数も経済危機により20名から25名、更に30名に引き上げられたが、実質は必要教員定数に見合う予算措置がなされないため都市部においては50名を越える学級編制がまれではなく有名無実化している。4.「国民教育法」は全9章、66条から成るもので、12年間の無償基礎教育の規定(10条)とともに、第4章「教員及び教育行政官」において両者の免許制度の導入が規定されている(23条)ことが注目される。1.本年度は本調査研究の最終年度として、これまでの現地調査で明らかにした知見に基づき、本研究全体を取り纏めることを課題としている。また本研究課題にとって極めて重要な位置を占める「国家教育法-National Education Act」が1999年7月1日に成立(8月19日施行)したことから、その規定内容の実施に向けての取組みと検討課題を明らかにするために、67月と11月の2度の現地調査を行った。2.同法は9年間の義務教育と12年間の無償教育の実現や教育行政の地方分権化を含む大胆な教育改革を志向するものであり、10の緊急立法を含む32の下位立法を予定している。3.そして同法は、その第53条において、教員のみならず学校管理職者及び教育行政官の免許制度を別途の法律によって導入することを定めている。法施行後、国家教育委員会、教育省内部に各種のタスク・フォースが設置され、2002年の全面的な教育改革実施に向けた検討が始められた。具体的な免許制度は明らかにされていないが、主要な論議として5年の期限免許と各種の教員の報償制度により、教職の質的向上を促すことが企図されている。4.だが経済危機からの脱却が十分に見通せず、教育の質的向上を図る教育改革、教師教育改革の財政的裏付けは明確ではない。また法の制定がその執行一実質的効力を意味するわけではなく、地方分権化の推進と併せて教育行政制度の改革が同時に必要とされている。5.また教師教育を担う各機関の相互連携が極めて不十分であり、中央省庁(教育省と大学省の統合が予定され、教員養成政策の一元化は期待できる)、地方行政機関、養成機関の協力体制が必要とされている。
南極内陸域への水蒸気輸送メカニズムの解明

東南極域では、数十年に一度の降雪といわれる降雪が頻出するようになり、その原因解明が課題となっている。本研究では、砕氷船「しらせ」を使って豪州南極昭和基地間の水蒸気同位体の連続観測を実施し、大雪を引き起こす水蒸気が南極大陸へ輸送されるメカニズムの解析を行った。大雪は、北風によって海洋域から湿った水蒸気が大陸内部に流れ混み発生する。本研究では、海洋性気団の流入を水蒸気同位体データから検出できることを指摘し、昭和基地周辺が海洋性気団に覆われる際には大規模循環場によって北風が強化されていることを明らかにした。近年観測される大雪は、南半球の大気循環場の変化を反映していると解釈できる。自動で水蒸気同位体を計測するシステムの構築を行った後に、そのシステムを砕氷艦「しらせ」に搭載し、南極海、および昭和基地周辺域にて、約3ヶ月間観測を行った。【自動分析システム開発】米国ロスガトス社製の水蒸気同位体分析計を標準水蒸気発生装置を組み合わせて用い、1時間毎に自動で同位体既知の水蒸気(標準湿潤空気)を発生させて、装置の検定を行うシステムを構築した。また、計測データの品質管理を行う検定プログラムを開発し、観測したデータを毎日検定してその結果を自動でメール転送するシステムの開発も行った。【室内実験】標準水蒸気発生装置を使って、500ppmから10000ppmまで濃度を変えて標準湿潤空気を発生させ、装置の濃度依存性を確認するとともに、検出限界濃度の特定を行った。【南極観測】2013年11月に開発した水蒸気同位体計測システムを砕氷艦「しらせ」に搭載し、豪州パフリーマントル出航後から自動観測を開始し、豪州から昭和基地に至る航海上、および昭和基地周辺域(2013年12月中旬2014年2月上旬)にて水蒸気同位体データを1秒間隔で観測を行った。また、同観測期間中に観測した降水・降雪をイベント毎に採取してその同位体比分析を実施した。【研究概要】第55次南極地域観測隊(夏隊)の観測から得られた水蒸気同位体データを使って、昭和基地で観測された温暖イベントの成因について解析を行い、その成果を国際誌に投稿した。また、昨年に引き続き、水蒸気同位体計測システムを砕氷艦「しらせ」に搭載し、豪州から昭和基地までの海洋上、および昭和基地周辺の海氷上で水蒸気同位体比の連続観測を実施した。【投稿論文の要旨】昭和基地の夏期に観測される日平均気温が0度を越える温暖イベントの成因を調べる目的で、第55次南極地域観測(夏隊)期間中、地表水蒸気の同位体の連続観測を行った。水蒸気の同位体比の時間変化は、気団変化に応答していることが明らかとなり、同位体データを使って、昭和基地に移流してくる気団は以下の3タイプに分類することができた:(1)海氷のない海洋から移流してくる気団、(2)大陸内部の氷床から移流してくる気団、(3)沿岸域から氷床を越えて昭和基地に移流してくる気団。このうち、温暖イベントは、(3)の気団に昭和基地が覆われた時に観測された。昭和基地沖に低気圧が停滞し、南極沿岸にそって吹く北東風が氷床を越えて昭和基地まで運ばれてきており、フェーン現象が起きていたと考えられる。このことを裏付けるように、温暖イベント発生時には湿度の低下が観測された。2000年以降に発生した温暖化イベント21事例についても解析を行ったところ、同様に南極沿岸で北東風が卓越していることが明らかとなり、昭和基地における温暖イベントにはフェーン現象が重要な役割を果たしていることが明らかとなった。【研究概要】昨年度に引き続き、本研究を通じて開発した自動水蒸気同位体計測システムを砕氷艦「しらせ」に搭載し、豪州-昭和基地間の航路上にて水蒸気同位体比を2015年12月2016年3月まで連続観測を行った。また、第55次、および第56次南極地域観測隊(夏隊)の観測から得られた豪州ー昭和基地間の水蒸気同位体データを使って、南太洋上における表層水蒸気の起源解析を行った。現在、国際誌に投稿する論文を準備している。【水蒸気起源解析】2011年の夏に、グリーンランドにおいて中緯度から輸送された暖気移流が大規模な氷床融解を引き起こしたことが報告され、同様な事例が南極でも起こりえるかどうか注目されている。そこで、中緯度から極域への水蒸気輸送過程を調べるため、豪州-昭和基地間における洋上大気の水蒸気起源解析を行った。まず、水の起源や輸送過程の履歴を反映する安定同位体トレーサーの分布特徴から、南太洋上の大気は以下の3地域でその起源が大きく異なることを明らかにした:(1)海水温度5度以上の比較的温暖な地域、(2)海水温度が5度未満の海洋域、(3)海氷に覆われた地域。海水温度が5度を超える地域では、洋上蒸発モデルを使って観測値を再現することが可能であり、洋上からの蒸発水が主な起源(海洋性気団)であった。しかしながら、海水温度が5度未満の地域では、数値モデル結果よりも顕著に低い同位体比で特徴づけられており、氷床気団の影響を強く受けていた。

海氷域では、どの海洋域よりも顕著に低い同位体比を示しており、海洋性気団の影響が予想よりも小さいことが明らかとなった。総観規模擾乱の通過に伴って強い北風移流が卓越した事例においは海洋性気団の影響が検出できたが、どの事例でも同位体組成は南極周辺域から蒸発した水蒸気の組成とよく一致しており、中緯度からの水蒸気移流を示す痕跡は見られなかった。東南極域では、数十年に一度の降雪といわれる降雪が頻出するようになり、その原因解明が課題となっている。本研究では、砕氷船「しらせ」を使って豪州南極昭和基地間の水蒸気同位体の連続観測を実施し、大雪を引き起こす水蒸気が南極大陸へ輸送されるメカニズムの解析を行った。大雪は、北風によって海洋域から湿った水蒸気が大陸内部に流れ混み発生する。本研究では、海洋性気団の流入を水蒸気同位体データから検出できることを指摘し、昭和基地周辺が海洋性気団に覆われる際には大規模循環場によって北風が強化されていることを明らかにした。近年観測される大雪は、南半球の大気循環場の変化を反映していると解釈できる。本年度の目的は、昨年度に引き続き、第56次南極地域観測隊(夏隊)に参加して水蒸気同位体観測を実施するとともに、第55次観測で得られた成果を投稿論文としてまとめることである。南極観測においては、砕氷艦「しらせ」に分析装置を搭載し、豪州から昭和基地間の水蒸気同位体比を連続して採取することができた。さらに、昨年の経験を活かして補正プログラムを修正し、昨年度よりも高精度のデータを修得できた。また、成果報告においても、第55次観測で採取したデータを使って昭和基地に移流してくる水蒸気の起源を同定し、その結果を国際誌に投稿するなど、着実に成果を出すことができた。環境学(環境動態解析)申請書では、今年度は第57次南極地域観測隊(夏隊)に隊員として参加し、「しらせ」と南極大陸内部の2地点で同期観測を行う事を計画していたが、南極地域観測計画の変更に伴い、内陸観測は中止となった。今年度は昨年と同様に、「しらせ」を使った昭和基地周辺での水蒸気同位体比観測を実施する予定である。また、これまでの研究成果から、「昭和基地における温暖イベントはフェーン現象によって引き起こされている」という作業仮説を立てることができたので、第56次観測で採取したデータを使ってこの仮説を立証していきたい。平成25年度は、自動で水蒸気同位体計測を行える計測システムの開発を行うとともに、その装置を砕氷艦「しらせ」に搭載して、第55次南極地域観測隊(夏隊)の観測期間中、連続で水蒸気同位体データを収集することを目的としており、今回、計画通りの観測を行うことが出来た。さらに、本申請書には含んでいなかったが、昭和基地にて、地吹雪の影響を受けにくい降雪採取法の検討を行うと同時に、降雪イベント毎に同位体分析用の試料採取を行う事ができた。降雪の同位体比は、境界層よりも上空の水蒸気同位体比を反映しており、直接観測した地表面付近の水蒸気同位体比と比較することで、より正確に南極大陸への水蒸気輸送メカニズム解明を行う事ができると期待できる。申請書では、今年度は内陸旅行に参加し、南極沿岸部と内陸部の2箇所で同期観測を行うことを計画していたが、南極地域観測計画が変更に伴い、今年度の内陸旅行は中止となった。今年度は、昭和基地周辺で行われる気象観測と同期して観測を行い、気象イベント毎に同位体比がどのように変化するのか明らかにすることを通じて、南極内陸部への水蒸気輸送メカニズムの解明に繋げていきたい。平成25年度に予定していた北海道大学での室内実験を東京工業大学で行うことに変更し、かつ、室内実験を平成26年度に実施することとなった東京工業大学への出張費、およびその室内実験で用いる消耗品の購入を行う。
肺腺癌のリネジ特異的生存シグナルの“ウェット”と“ドライ”の統合による全貌解明

肺腺がん細胞において、ROR1がカベオラの形成に重要な役割を担うのみならず、カベオラ依存的なエンドサイトーシスにも関わることを明らかとして来た。本年度は、ROR1によるカベオラ依存的なエンドサイトーシスの制御に関するさらに詳細な解析を行った。その結果、ROR1のCAVIN3への結合部位が、キナーゼドメインのN末側3分の1の領域であることを見出した。また、肺腺癌細胞株においてROR1をノックダウンし、CAVIN3結合部位を欠失させたROR1変異体による再構成すると、野生型ROR1による再構成と異なり、CAVIN3がカベオラから消失すること、及び、カベオラ依存的なエンドサイトーシスの指標であるコレラトキシンの取り込みが有意に阻害されることを見出した。ROR1の肺腺がん発生における役割の個体レベルにおける検討に関しては、昨年度までに引き続き、樹立したRor1コンディショナルノックアウトマウスと末梢肺特異的に変異型EGFRを発現するSP-C-EGFRトランスジェニックマウスとの交配を進めて、マイクロCTを用いた経時的な肺腺がん発生への影響について検討を加えた。本年度は、十分な数の個体数を得て、肺腺がんの発生前よりタモキシフェンを投与してRor1をノックアウトし、マイクロCTを用いて肺腺がんの発生について経時的に検討を加えた結果、Ror1のノックアウトによって変異型EGFRの発現による肺腺がんの発生が有意に抑制され、また生存期間も非常に有意な延長を示すことが明らかとなった。また、Ror1のノックアウトによって、細胞周期と深く関わる転写因子の発現が低下し、細胞周期が著しく低下していることを見出した。また、我々はこれまでに、ROR1がキナーゼ活性依存的にSRCを活性化することを明らかにしてきたが、本年度は、肺腺がん細胞株を用いてROR1によるSRCを介した細胞死の制御に着目した検討を行った。その結果、ROR1がSRCを介してASK1のチロシンリン酸化を促進し、ASK1を不活性化することを見出した。ROR1とCAVIN3との蛋白質間結合がカベオラ依存的なエンドサイトーシスにおける重要な役割をもつことを、その分子機構の詳細とともに明らかとすることができた。また、Ror1コンディショナルノックアウトマウスと変異型EGFRトランスジェニックマウスを用いた解析から、肺腺がんの発生においてRor1が果たす機能的な重要性を個体レベルで証明することができた。さらに、ROR1による細胞死制御の分子機序についても、SRC-ASK1軸の制御に関する新知見を明らかとすることができた。本研究で得られた知見は、ROR1の分子機能を解明するものであるとともに、ROR1を分子標的とする今後の創薬開発などにも道を拓くものである。ROR1の分子機能に対して、in vitroにおける分子細胞生物学的な解析と、コンディショナルKOマウスを用いた個体レベルの検討の両面からの追求を続ける。肺腺がんの発生におけるRor1の機能的重要性については、多角的な病理組織学的検討を加えるとともに、コンディショナルノックアウトマウスの利点を生かし、肺腺がんの生存維持と増殖・進展におけるRor1の重要性について、腫瘍形成後にRor1をノックアウトして病理組織学的及び分子生物学的な側面から個体レベルでの研究を展開する。さらに、リネジ生存シグナルTTF-1の諸刃の剣のような二面性についても、TTF-1の共役因子であるFOXA2の共発現との関連性に着目し、網羅的発現解析と分子生物学的な検討を加える予定である。

ROR1とCAVIN3との蛋白質間結合がカベオラ依存的なエンドサイトーシスにおける重要な役割をもつことを、その分子機構の詳細とともに明らかとすることができた。また、Ror1コンディショナルノックアウトマウスと変異型EGFRトランスジェニックマウスを用いた解析から、肺腺がんの発生においてRor1が果たす機能的な重要性を個体レベルで証明することができた。さらに、ROR1による細胞死制御の分子機序についても、SRC-ASK1軸の制御に関する新知見を明らかとすることができた。本研究で得られた知見は、ROR1の分子機能を解明するものであるとともに、ROR1を分子標的とする今後の創薬開発などにも道を拓くものである。昨年度に引き続き、肺腺がん細胞におけるROR1によるカベオラ依存的なエンドサイトーシスの制御に関わる分子機構についての詳細な解析を行った。生化学的な検討を加えることによって明らかとしたROR1とCAVIN3との相互作用に加えて、共焦点レーザー顕微鏡等を用いた免疫蛍光法による形態学的観察によって細胞内における共局在を明らかとした。そこで、さらにROR1とCAVIN3の細胞内における共局在部位について超高解像度顕微鏡を用いた検討を加えた。その結果、カベオラ依存的なエンドサイトーシスにおける機能的役割との関連性を示唆する、アクチンフィラメント上におけるROR1とCAVIN3との共局在を認めた。ROR1の肺腺がん発生における役割の個体レベルにおける検討に関しては、Ror1コンディショナルノックアウトマウスを樹立し、SP-C肺サーファクタント蛋白遺伝子のプロモーターによって末梢肺特異的に変異型EGFRを発現するSP-C-EGFRトランスジェニックマウスとの交配を進めた。得られた変異EGFRトランスジーンを持ち、ROR1をコンディショナルにノックアウト可能な個体を用いて、肺腺がんの発生前よりタモキシフェンを投与してRor1をノックアウトし、マイクロCTを用いて肺腺がんの発生に対する影響を経時的追う詳細な検討を開始した。これまでに得られた予備的な解析結果は、ROR1のノックアウトによって顕著に肺腺癌の発生が抑えられることを示している。より精密な検討を加えるべく、さらに個体数を増やして解析を加えつつある。新たに見出したROR1とCAVIN3との蛋白質間結合が持つ機能的役割について、そのカベオラ依存的なエンドサイトーシスにおける重要性を明らかとすることができた。また、Ror1コンディショナルノックアウトマウスと変異型EGFRトランスジェニックマウスを用いた解析から、肺腺がんの発生におけるRor1の機能的重要性について個体レベルにおいても迫りつつある。本研究で得られた知見は、これまでほとんど分かっていなかったROR1の分子機能の解明につながるばかりでなく、ROR1を分子標的とする今後の研究開発に道を拓くものである。リネジ生存癌遺伝子TTF-1によって転写活性化されるROR1が、カベオラ構成分子のCAV1とCAVIN1のスキャフォールド蛋白質として機能して、カベオラの形成とカベオラに集積する様々な受容体からの生存シグナル維持に関与することを明らかにしてきた。今年度はさらに、ROR1が、CAVIN3と結合してカベオラ依存的なエンドサイトーシスを制御することを見出した。
遺伝子発現誘導可能な神経変性疾患モデル霊長類の家系作出と疾患バイオマーカーの開発

本研究の目的は、発現誘導可能な遺伝子システム(TET-onシステム)を持った、ポリグルタミン病モデルマーモセットの家系を作出することである。TET-onシステムを搭載した、ポリグルタミン病変異遺伝子のコンストラクトを作成し、マーモセット受精卵へと遺伝子導入をおこなった。結果、計7頭の産仔獲得に成功し、全てトランスジェニックで、Dox投与試験をおこなった結果、遺伝子発現誘導が確認された。さらに、計5頭の第二世代の獲得に成功し、1頭がトランスジェニックであった。以上より、TET-onシステムを導入したトランスジェニックマーモセットの家系を作出し、人為的な導入遺伝子の発現誘導に成功した。本研究の目的は、第一に発現誘導可能な遺伝子システム(TET-onシステム)を用いて、ヒト疾患モデル霊長類(マーモセット)の家系を作出することである。特に、難治性神経変性疾患であるポリグルタミン病をターゲットとする。第二にポリグルタミン病の病態と運動失調との相関を明らかにし、疾患の生物学的指標(バイオマーカー)を開発する。この目的を達成するため、平成26年度は「異常伸長ポリグルタミン鎖をもつ変異遺伝子のデザインと発現ベクターの作製」と「変異遺伝子導入した遺伝子改変マーモセットの作出」をおこなった。ポリグルタミン病のうち世界的にも最も高頻度に発症する脊髄小脳失調症3型(SCA3)の原因遺伝子について、ポリグルタミン鎖をコードするCAGリピート配列を異常伸長(>120)させた変異遺伝子を合成した。この変異遺伝子を、TET-onシステムを有するベクター(RIKEN)に挿入し発現ベクターを構築した。293細胞を用いて、この発現ベクターの動作を確認した結果、Dox存在下で遺伝子発現が認められ、Western解析により目的タンパクの生産も確認された。トランスジェニックマーモセットを作出するため、レンチウィルスを介して発現ベクターを導入した計34個のマーモセット受精胚を、18頭の仮親に移植した。その結果、8頭の仮親より12頭のマーモセットが生まれ、7頭が成長した。現在、この7頭の遺伝子解析をおこなっており、全てのマーモセットに導入遺伝子が挿入されていることが確認されている。本研究の目的は、発現誘導可能な遺伝子システム(TET-onシステム)を用いて、ヒト疾患モデル霊長類(マーモセット)の家系を作出することである。最終的にポリグルタミン病の病態と運動失調との相関を明らかにし、疾患のバイオマーカーを開発する。この目的を達成するため、昨年度までに異常伸長ポリグルタミン鎖をもつ変異遺伝子のデザインと発現ベクターの作製と変異遺伝子導入した遺伝子改変マーモセットの作出をおこなった。本年度は獲得したトランスジェニックマーモセットより線維芽細胞を樹立し、体外培養系において導入遺伝子の発現解析を実施した。さらにTET-onシステムの動作確認のため、各個体より樹立した線維芽細胞をDox添加培地で培養し、その前後で遺伝子発現誘導解析をおこなった。その結果、Dox添加前と比較してDox添加後の線維芽細胞は3.8倍から5.7倍程度の遺伝子発現誘導が確認された。さらに、個体レベルでもTET-onシステムの動作を確認するためトランスジェニックマーモセットにDox添加した飲み水を与え、遺伝子発現誘導をおこなった。Dox投与前後で血液を採取し、血液よりRNAを抽出し遺伝子発現量解析に用いた。その結果、Dox添加前と比較し1.5倍から3倍程度の遺伝子発現誘導が確認された。以上より、作出したトランスジェニックマーモセットのTET-onシステムが正常に作動することが示された。昨年度までに、CAGリピート配列を異常伸長させたポリグルタミン病の変異遺伝子を有するTET-onシステムの発現ベクターを構築し、ウィルスを用いて受精卵に導入した結果、7頭のトランスジェニック個体が得られた。本年度は、得られた個体より線維芽細胞を樹立し、Doxを添加し培養することで導入遺伝子の発現誘導に成功した。さらに、トランスジェニック個体にDoxを飲水に混ぜて投与することで、導入遺伝子の発現誘導に成功した。以上より、TETシステムを導入したトランスジェニックマーモセットの作出に成功した。以上より、順調に進展している。本研究の目的は、発現誘導可能な遺伝子システム(TET-onシステム)を用いて、ポリグルタミン病モデル霊長類(マーモセット)の家系を作出し、将来的に疾患バイオマーカーの開発につなげることである。初年度に、異常伸長ポリグルタミン鎖をもつ変異遺伝子のデザインと発現ベクターの作製と変異遺伝子導入した遺伝子改変マーモセットの作出をおこなった結果、次年度にかけて、計7頭の産仔(TET1TET7)の獲得に成功した。

次年度に、獲得したマーモセットの線維芽細胞を樹立しゲノム遺伝子解析を実施した結果、全ての個体に導入遺伝子が確認され、トランスジェニックマーモセットであった。また、TET-onシステムの動作確認のため、樹立した線維芽細胞をDox添加培地で培養し、その前後で遺伝子発現誘導解析をおこなった結果、3.8倍から5.7倍程度の遺伝子発現誘導が確認された。さらに、個体レベルでもTET-onシステムの動作を確認するため、トランスジェニックマーモセットにDox添加した飲み水を与え、Dox投与前後で血液を採取し遺伝子発現量解析に用いた。その結果、1.5倍から3倍程度の遺伝子発現誘導が確認された。最終年度に、2頭のファウンダーマーモセット(TET1とTET4)から、顕微授精(ICSI)および自然交配により第二世代の獲得をおこなった。その結果、TET1からは1頭の、TET4からは4頭の産仔作出に成功した。遺伝子解析より、TET4の産仔4頭のうち1頭がトランスジェニックマーモセットであることが分かった。以上より、TET-onシステムを導入したトランスジェニックマーモセットの家系を作出し、人為的な導入遺伝子の発現誘導に成功した。本モデルは発症を人為的にコントロールできるため、進行症状の詳細な解析や疾患バイオマーカー開発のための有力なツールとなり、様々な神経変性疾患の研究に貢献するものである。平成26年度の計画は、CAGリピート配列を異常伸長させたポリグルタミン病の変異遺伝子を有するTET-onシステムの発現ベクターを構築し、5頭を目標に産仔を獲得することであった。研究は順調に進んでおり、Doxで制御可能なTET-onシステム導入発現ベクターの構築に成功し、タンパクレベルでも制御可能であることが確認された。個体作出実験においては、TET-onシステムにより胎仔期の細胞毒性を回避でき、高い妊娠率が実現でき、流産も非常に少なかった。結果的にトランスジェニック個体が7頭得られたことは、予想以上の進捗であった。今後はトランスジェニックマーモセットの第二世代を作出する。Dox投与前後で遺伝子発現誘導率の高かった個体を優先的に、自然交配あるいは体外受精を用いて第二世代を作出する。第二世代が得られ次第、発症試験を実施し、ポリグルタミン病の病態と運動失調との相関を明らかにし、疾患のバイオマーカーを開発する。将来的に、この動物を広く世界へ供給できる繁殖体制を整えていく。発生工学作出されたトランスジェニックマーモセットについて、耳より線維芽細胞を樹立し、Dox添加培地で培養することで遺伝子発現誘導解析をおこなう。また、個体レベルでもDox添加した飲み水を与えることで、遺伝子発現誘導をおこなう。その前後で各個体の遺伝子発現誘導効率を調べ、誘導効率の高かったマーモセットを選抜し、自然交配あるいは体外受精を用いて第二世代を作出していく。おおむね計画通りの支出であったが、計画していた学会旅費を使用しなかったため次年度使用額が生じた。トランスジェニック個体の作出実験において、想定以上の効率で妊娠・出産・個体作出が可能であったため、実験期間が大幅に短縮された。