hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
細胞周期におけるサイクリンの機能制御因子

本年度の研究計画に沿って、日本側九州大学小林英紀が酵母と両生類ツメガエルサイクリン結合因子の遺伝的解析を、英国癌研究所のHunt博士が両生類ツメガエルのサイクリンの生化学的解析を、ケンブリッジ大学のCarrington博士が哺乳類マウスのサイクリン結合因子の機能解析を、それぞれ3研究室間で互いに研究連絡をとりあいながら、細胞周期におけるサイクリンの構造と機能に関する研究を行った。本年度は、小林は、2-ハイブリッド法を用いて同定したサイクリンAのN末端に結合する因子の機能解析を行った結果、ユビキチン類似配列を持った新規タンパク質がサイクリンAの分解を選択的に抑制した。そこで、この生化学的解析をツメガエルの細胞周期系を用いてHunt博士との共同実験を行った結果、本因子はサイクリンAに結合してその分解を特異的に抑制する新規因子であることを同定した。さらに、マウスのA型サイクリンの解析をおこなっているCarrington博士と共に、マウスから本因子のホモログを同定してその解析を進めた。同時に前年度及び、本研究結果について、13回臨床研国際会議(RIC International Conference,Tokyo)において小林とT.Huntが、それぞれの研究成果を発表するとともに、国際学術誌に論文として発表した。本共同研究はそれぞれの研究室間で極めて効率的に遂行され、今後、発展的に継続することを計画中である。本年度の研究計画に沿って、日本側九州大学小林英紀が酵母サイクリンを、英国癌研究所のHunt博士が両生類ツメガエルのサイクリンを、ケンブリッジ大学のCarrington博士が哺乳類マウスのサイクリンを用いて、3研究室間で互いに研究連絡をとりあいながら、細胞周期におけるサイクリンの構造と機能に関する研究を行った。小林は、サイクリンAの変異体を出芽酵母に導入して、その生育阻止を抑圧する酵母サプレッサーの分離同定し、出芽酵母の遺伝学的解析を利用してツメガエルサイクリンAと相互作用する制御遺伝子を分離した。そのうち、サイクリンと結合して細胞周期の進行に関るCDC28のドメインの解析を行った。Hunt博士は、サイクリンのプロテオリシスに関する研究をすすめ、サイクリンの分解機構が細胞周期のM期ばかりでなくG1期-S期日まで機能して、単にサイクリン蛋白の分解ではなく細胞周期進行に必要な他のタンパク質の分解にも関係して細胞周期を調節していることを示した。Carrington博士はマウスの新しいタイプのA型サイクリンをクローニングして、その解析をおこない、生殖細胞で特異的に働くサイクリンであることを示した。これらの研究結果について、細胞周期国際シンポジウム(Cold Spring Harbor Symposium)でそれぞれの研究成果を発表するとともに、国際学術誌に論文として発表した。また、Carrington博士が九州大学を、小林英紀がICRF癌研究所を訪問して、研究討議と今後の研究計画についての打ち合わせを行った。本年度の研究計画に沿って、日本側九州大学小林英紀が酵母と両生類ツメガエルサイクリンの遺伝的解析を、英国癌研究所のHunt博士が両生類ツメガエルのサイクリンの生化学的解析を、ケンブリッジ大学のCarrington博士が哺乳類マウスのサイクリンの機能解析を、それぞれ3研究室間で互いに研究連絡をとりあいながら、細胞周期におけるサイクリンの構造と機能に関する研究を行った。本年度は、小林は、サイクリンAのN末端に結合する因子を酵母の2-ハイブリッド法を用いて、ツメガエル卵母細胞cDNAから分離同定した。その遺伝子構造と機能解析を行った結果、ユビキチン類似配列を持った新規タンパク質であることがわかった。そこで、小林が大学院生の舟越稔をICRFのHuntの研究室に同行し、この因子の生化学的解析をツメガエルの細胞周期系を用いてHunt博士との共同実験を行った結果、本因子TH4はサイクりンAに特異的に結合する新規因子であることを同定した。さらに、マウスの新しいタイプのA型サイクリンをクローニングして、その解析をおこなっているCarrington博士と共に、マウスからTH4のホモログをクローニングしてその解析を進めた。本年度の研究計画に沿って、日本側九州大学小林英紀が酵母と両生類ツメガエルサイクリン結合因子の遺伝的解析を、英国癌研究所のHunt博士が両生類ツメガエルのサイクリンの生化学的解析を、ケンブリッジ大学のCarrington博士が哺乳類マウスのサイクリン結合因子の機能解析を、それぞれ3研究室間で互いに研究連絡をとりあいながら、細胞周期におけるサイタリンの構造と機能に関する研究を行った。

本年度は、小林は、2-ハイブリッド法を用いて同定したサイクリンAのN末端に結合する因子の機能解析を行った結果、ユビキチン類似配列一を持った新規タンパク質がサイクリンAの分解を選択的に抑制した。そこで、この生化学的解析をツメガエルの細胞周期系を用いてHunt博士との共同実験を行った結果、本因子はサイクリンAに結合してその分解を特異的に抑制する新規因子であることを同定した。さらに、マウスのA型サイクリンの解析をおこなっているCarrington博士と共に、マウスから本因子のホモログを同定してその解析を進めた。同時に前年度及び、本研究結果について、13回臨床研国際会議(RICIntemational Conference,Tokyo)において小林とT.Huntが、それぞれの研究成果を発表するとともに、国際学術誌に論文として発表した。本共同研究はそれぞれの研究室間で極めて効率的に遂行され、今後、発展的に継続することを計画中である。
敗血症性脳症誘発機序の基礎的解明

平成24年度は1敗血症性脳症(SE)誘発とMPTを介した脳内ミトコンドリア機能不全の連関解析と2敗血症性脳症(SE)誘発時の脳内ミトコンドリアCalcium Retention Capacity(CRC)の変動解析について検討を加えた。第8ー10週令の雄性Wister rat(体重250-300g)を用いて回盲部結紮+2回穿刺による(CLP)誘発敗血症性脳症モデル(SAEモデル)を作製し、モデル作製12時間後、1日後(各時間・両群とも5匹のラットを使用)にラット大脳ミトコンドリアを抽出してCa2+overloadをin vitroにて作り出し、ミトコンドリアの膨化(swelling)を計測、解析比較した。Ca2+ overloadに伴うMPTによるミトコンドリアの膨化率を測定したが、SAE群においてsham群に比較してswellingを起こしやすい傾向が認められた。また、第8ー10週令の雄性、第8ー10週令の雄性Wister rat(体重250-300g)を用いてSAEモデルを作製し、モデル作製1、6、12、24時間後に脳内ミトコンドリアを抽出してミトコンドリアのCa2+取りこみ(Calcium Retention Capacity:CRC)能を測定するために200nmolCaCl2を10mM/分で持続投与し、蛍光色素のFura6Fを懸濁液に加え509nmで励起してSEが脳内ミトコンドリアCa2+取りこみ能とMPTに与える影響についてSEとMPTに伴うミトコンドリア機能不全との連関をCRCに焦点を当てて評価した。CRCはSAE作製後より経時的に低下し、6、12,24時間で有意な取り込みの低下を示した。本年度に施行した解析結果から、従来不明とされていた敗血症性脳症の発症には脳内ミトコンドリアにおけるCa2+取り込み能の低下が原因が深く関与することが示唆された。25年度は、敗血症性脳症誘発時の脳内ミトコンドリア呼吸能の変動解析を行った。第8ー10週令の雄性Wister rat(体重250-300g)を用いてSAEモデルを作製し、モデル作製1、6、12、24、48時間後に脳内ミトコンドリアの呼吸能を測定し脳機能の観点から検討を行った大脳皮質を取り出して、諸田等の方法(Morota et.al J Neuro Chem 2007)に準じてIsolation Bufferにてhomogenize後に40,26,12%の濃度の異なるParcolを重層した溶液に重層して3回の超遠心後ミトコンドリアを分離する。蛋白定量後、25μg/mlのミトコンドリアをKCLbufferに加えてクラーク酸素電極を用いてミトコンドリアの呼吸基質である5mMマレイン酸とグルタミン酸を加えた後200μMADP添加して酸素消費量をADP添加前(state3)と添加後(state4)で計測して両者の比としてRespiratory Control Ratio(RCR)を計算し、SEが脳内ミトコンドリア呼吸能に与える影響を解析した。SAEモデル作成前、1、6、12、24時間後までをサンプリングした。理由として48時間までマウスが生存しないためである。state3はおのおの150.6±23.5, 145.2±25.5, 140.4±25.8, 120.9±26.2, 110.2±23.8 nmO2/min/mgであった。また、state4は30.2±3.5, 29.5±5.8, 27.6±6.5, 26.6±7.2, 27.4±3.9であった。RCR(state3/state4)は、4.9, 4.9, 4.5, 4.0(p<0.05)となり呼吸鎖における酸化的リン酸化は経時的に低下し、ミトコンドリア機能障害が誘発されることが明らかとなった。敗血症性脳症(Septic Encephalopathy:SE)の脳障害発症機序は特定されておらず、その標的分子も明らかではない。本研究では、虚血性神経細胞死解析実験で蓄積されたMPT(Mitochondrial Permeability Transition)に伴うミトコンドリア機能不全に対する成果を新規脳保護法確立のためにSEのメカニズム解析に展開し、神経細胞障害のみに着目した従来の脳障害の解析からグリア細胞までも包含した脳内ミトコンドリア機能不全と敗血症で特徴的な末梢循環不全(microcirculatoion dysfunction)に伴う組織低酸素に焦点を置き、SEの実態をMPTとInt6・HIF2α情報伝達系との連関解析に展開することを目的した。この試みは、SEのメカニズムに新しい解釈を加え、この解釈を基に、新規の防御法の開発、麻酔科学・蘇生学・神経集中治療医学領域での安全性と信頼性を高めることを目指す。本年は、敗血症性脳症誘発とMPTを介した脳内ミトコンドリア機能不全の連関解析を行った。(CLP)誘発敗血症性脳症モデル(SAEモデル)を用いて、24時間後に脳ミトコンドリアのswellingの状況をCa2+overloadによって分析した。SAEモデルでは、24時間後には脳はかなり浮腫状となっており、swellingもコントロールに比較して誘発されやすい状況であることが判明した。このことから、SAEモデルに伴うミトコンドリアの膨化が、SEの病態形成に重要な役割を担っていることが明らかとなった。

敗血症性脳症(Septic Encephalopathy:SE)の脳障害発症機序は特定されておらず、その標的分子も明らかではない。本研究では、虚血性神経細胞死解析実験で蓄積されたMPT(Mitochondrial Permeability Transition)に伴うミトコンドリア機能不全に対する成果を新規脳保護法確立のためにSEのメカニズム解析に展開し、神経細胞障害のみに着目した従来の脳障害の解析からグリア細胞までも包含した脳内ミトコンドリア機能不全と敗血症で特徴的な末梢循環不全(microcirculatoion dysfunction)に伴う組織低酸素に焦点を置き、SEの実態をMPTとInt6・HIF2α情報伝達系との連関解析に展開することを目的した。この試みは、SEのメカニズムに新しい解釈を加え、この解釈を基に、新規の防御法の開発、麻酔科学・蘇生学・神経集中治療医学領域での安全性と信頼性を高めることを目指す。これまでに、研究代表者は、1敗血症性脳症誘発時の脳内での経時的なHIF2α発現の分布、局在と脳血流の経時的変動解析2敗血症性脳症誘発とMPTを介した脳内ミトコンドリア機能不全の連関解析3血症性脳症誘発時の脳内ミトコンドリアCalcium Retention Capacity(CRC)の変動解析の観点から解析を施行して来た。これらのアプローチにより、これまで不明とされてきたメカニズムに一石を投ずる結果を得ることができたと考えている。その一方で、本研究計画が当初より遅れている理由として、SAEモデルを安定して作成することが難しいという局面もあり、結果が安定しないことがある。そのため、慎重な解析が必要となる。平成23年度は(1)敗血症性脳症誘発時の脳内での経時的なHIF2α発現の分布、局在と脳血流の経時的変動解析と(2)Int6-siRNA投与が敗血症性脳症誘発のapoptosis/necrosisと脳内神経栄養因子(Brain Derived Neurotrophic Factor:BDNF)の発現に及ぼす影響の解析を予定したが、SAEモデル作成が安定するまでに時間を要したため2つの実験家格遂行が遅れる形となった。また、抗体による免疫染色がうまく行えず、HIFならびにBDNFの変動において明らかな結果を見いだせなかった。そのため、平成24年度においてこの2つの研究課題を再度施行する。SAEモデルを安定して作成することが難しいという局面もあり、結果が安定しないことがある。これらの問題を克服するためにマウスSAEモデルを作成して同様実験を行う。ただし、個体が小さいため、一回の実験に必要なミトコンドリア量が十分に確保できないためかなりの数の個体を必要とする。今回の研究計画では、SE誘発に関与すると思われるMPTに伴う脳内ミトコンドリア機能不全とその役割を明確にするために以下の3点を出来るだけ解析を行う予定である。1SAEモデルを用いてSE発症と脳内ミトコンドリアにおけるCypDとの連関解析4SAEモデルに対してCypD抑制剤の効果と脳内ミトコンドリアの酸素代謝(RCR)を解析し、SEとMPTとの連関を検討5SAEモデルに対して脳内ミトコンドリアのCa2+取りこみ能(CRC)を測定し、SEがCRCに及ぼす影響を解析しSEとMPTとの連関を検討する予定である。(1)敗血症性脳症誘発時の脳内での経時的なHIF2α発現の分布、局在と脳血流の経時的変動解析第8ー10週令の雄性Wister ratを用いてCLP誘発敗血症性脳症モデル(SAEモデル)を作製する。モデル作製
心筋リモデリング時の間質細胞の動態を制御する分子機構に関する基礎的研究

心筋梗塞後、傷害を受けた部位に,骨髄由来間葉系幹細胞が動員され,もともと組織に存在する線維芽細胞とともに,組織修復に関わる。その際、骨髄由来間葉系幹細胞,および新筋線維芽細胞両方から産生される細胞外マトリックス分子tenascin-Cは,サイトカイン、ケモカインの産生をあげ,骨髄由来細胞の動員を促進することにより,組織修復を促進する可能性が示唆された。心臓の組織修復時に心臓外特に骨髄から動員された間質細胞の役割と、その際マトリックス分子、テネイシンCによる骨髄由来の間質細胞動態制御の可能性と分子機構を解明することを目的として、CAG-GFPマウスから骨髄細胞を分離し、そのうち間葉系幹細胞を培養増殖させた。syngenicな8週令マウスの心筋の一部に電気メスによる凝固壊死をおこした心筋傷害モデルを作成して、傷害1日後に尾静脈から注射して移植し、1,2,3,7日後に心臓を摘出し、抗GFP抗体を用いた免疫染色により骨髄由来細胞を追跡した。移植した骨髄由来幹細胞は、テネイシンCが沈着している傷害3日後には傷害心筋境界付近に分布し、組織修復にresidentialな間質細胞の他に骨髄由来の間質細胞も関与していること、テネイシンCがその動員を制御する可能性が示唆された。また、骨髄由来間葉系幹細胞は培養系でテネイシンC産生能を有すること明らかになり、組織修復のために動員される骨髄細胞の動態をautocrine的にも制御している可能性が考えられた。現在、傷害局所で産生されるテネイシンCの機能をより正確に解析するためCAG-GFPとテネイシンノックアウトマウスを交配して、テネイシン産生能がなくGFPによる追跡可能な骨髄間葉細胞を作成中である。さらに、テネイシンCによって誘導される可能性のあるhoming促進因子の同定するために野生型およびテネイシンCノックアウトマウスを用いて心筋傷害モデルを作製して組織解析をすすめるとともにRNAを抽出し、現在マイクロarrayによりテネイシンC欠損動物での分子の遺伝子発現プロファイルの変化について解析中である。心臓の組織修復時に骨髄から動員される間質細胞の役割と、テネイシンCによるその細胞動態制御の分子機構を解明することを目的として、平成21年度の成果に基づき、次の項目について検討を行った。IテネイシンCによる発現制御を受ける心筋修復時の骨髄由来間葉系細胞homing制御分子の同定(1)C57BL6バックグラウンド野生型およびテネイシンCノックトアウトマウスを用いて、冠動脈永久結紮モデルを作製した。BALB/cバックグラウンドのノックアウトマウスを用いて得られた我々の以前の結果と異なり、テネイシンCノックトでは梗塞後1週間の生存率が野生型より有意に低く、1週間後の組織で膠原線維形成が抑制されていた。テネイシン発現が最も強い3日目と組織所見に明らかな差がみられた7日目の梗塞境界部残心筋組織からRNAを抽出した。間葉系細胞のhomingに重要と考えられているいくつかの分子のリアルタイムRT-PCRによる解析とDNAマイクロアレイによる網羅的解析を行い、発現レベルに明らかな差がみられる複数の分子群を候補として抽出した。(2)テネイシンCノックアウト新生児マウスの心臓から心筋細胞および心臓線維芽細胞をそれぞれ培養し、精製テネイシンCを添加して遺伝子発現の変化をDNAマイクロアレイにより解析し、in vivoで得られた結果と比較し、homing制御分子のしぼり込みおよびその作用分子メカニズムの解析を試みている。II.テネイシンCを産生しないGFP標識骨髄間質幹細胞の作製昨年度の研究により、骨髄間質幹細胞がテネイシンCを産生することが明らかになったため、テネイシンCノックアウト/GFPマウスを作製し、骨髄間質幹細胞を得た。しかし、野生型GFP由来の細胞と増殖能に差がみられるという予備的結果が得られたため、現在、通常の野生型とテネイシンCノックアウトからそれぞれ骨髄間質幹細胞を培養し、比較を試みている.心臓の組織修復時に骨髄から動員される間質細胞の役割と、テネイシンCによるその細胞動態制御の分子機構を解明することを目的として、平成20,21年度の成果に基づき、次の項目について検討を行った。IテネイシンCに制御される心筋修復時の間質細胞動態に関わる分子の同定(1)C57BL6バックグラウンド野生型およびテネイシンCノックトアウトマウスを用いて、冠動脈永久結紮モデルを作製した。BALB/cバックグラウンドのマウスを用いて得られた以前の結果と異なり、テネイシンCノックトでは梗塞後1週間の生存率が野生型より有意に低く、生き残ったマウスでは急性期の炎症が強く、膠原線維形成が抑制されていた。モデルマウスの組織からRNAを抽出しDNAマイクロアレイ、PCRアレイによる網羅的解析を行ったところ、テネイシンノックアウトでは野生型よりサイトカイン,ケモカインの発現が高く、細胞外マトリックス遺伝子の発現レベルが低いと言う結果が得られたが、モデルにより状況依存的に逆の結果を示すことが明らかになった。(2)テネイシンCノックアウト

新生児マウスの心臓から心筋細胞、心臓線維芽細胞,血管平滑筋細胞をそれぞれ培養し、精製テネイシンCを添加して遺伝子発現の変化をDNAマイクロアレイにより解析したところ,特に,心筋細胞でサイトカイン,ケモカインの発現が上昇することが明らかになった。II.テネイシンCを産生しない間葉系幹細胞のcharacterization平成22年度に、テネイシンC欠損/GFPマウスを作製し、その骨髄間質幹細胞を得た。テネイシンC陽性GFPマウス由来の細胞と培養系で増殖能に差がみられるという予備的結果が得られた。そこで、野生型C57BL6系マウスの骨髄間葉系幹細胞を分離し、培養系で、テネイシンCを産生することをWestern Blottingおよび蛍光抗体法で確認した。次に、野生型およびテネイシンC欠損C57BL6から骨髄間葉系幹細胞を分離培養したが,単純な培養条件では,明らかな増殖能の差はみられなかった。
放射能汚染地域における甲状腺疾患の分子疫学調査

本研究課題によりチェルノブイリの小児甲状腺がん組織から核酸抽出をおこない管理・提供するチェルノブイリティシュバンク(CTB)の活動に協力をしてきた。チェルノブイリ周辺の機関施設であるロシア連邦オブニンスク放射線医学研究所、ベラルーシ共和国ミンスク甲状腺がんセンター、ウクライナ共和国キエフ内分泌代謝研究所、セミパラチンスク医科大学より、当該期間に研究者18名を受け入れ長崎大学にて被ばく医療の教育指導を実施した。ベラルーシ共和国ゴメリ医科大学とは、長崎からインターネットによる分子疫学の遠隔講義を行うことにより教育交流を推進してきた。また、現地の活動状況の支援、指導のために研究分担者高村らが毎年3週間ベラルーシを訪問し分子疫学、e-Learningについて直接指導を行なった。海外拠点と連携し研究活動も行ない、放射線刻印遺伝子の検索を目的としてチェルノブイリの甲状腺がん組織から抽出したミトコンドリアDNAおよびゲノムDNAを用い放射線刻印となる可能性のある遺伝子群の解析やDNA修復に関与する遺伝子群のSNPsについて放射線誘発甲状腺群と散発群との間で解析を行なった。その結果、ミトコンドリアDNAで放射線誘発の切断が増加していること、またp53、ATM、MDM2などの遺伝子のSNPs解析により放射線誘発癌では、特有の多型がみられることを報告した。この研究を介して、国際的な研究交流を介しながら共同で放射線誘発甲状腺がんの特徴について新たな知見をえた。今後、放射線照射による癌発症機序につき、さらに継続して大規模な解析を必要とする本研究課題によりチェルノブイリの小児甲状腺がん組織から核酸抽出をおこない管理・提供するチェルノブイリティシュバンク(CTB)の活動に協力をしてきた。今後、放射線照射による癌発症機序につき、さらに継続して大規模な解析を必要とする(1)チェルノブイリ原発事故周辺から得られた小児甲状腺がん組織バンクを維持運用し、新たに事故後16年を経過しその発症ピークが青年期以降にシフトしている現状を踏まえた詳細な病歴聴取と成人甲状腺がんの臨床かつ細胞診、病理データの収集保存を行った。特に細胞診標本からの遺伝子バンク作成を試み、現在までに遺伝子抽出してきた600例近い甲状腺がん症例の遺伝子再配列異常はret/PTC3からret/PTC1へと変化すプロフィールを明らかにした。臨床データ上は異常者の追跡調査の継続以外に、甲状腺がんのケース・コントロール調査を継続し、IARCとの共同研究で現在、線量モデル評価とリスク計算を行なっている。手術標本の病理診断に関しては、国際チェルノブイリ甲状腺がん病理組織診断パネルに参加し、特徴的な多様な病理組織標本に応じて、レーザーマイクロダイセクション顕微鏡下での細胞分取から遺伝子を抽出し、その標的遺伝子解析を受容体型チロシンキナーゼの各種標的遺伝子に着目し、再配列の異常の有無を解析している。その結果、Braf遺伝子異常を明らかにし、種々の解析を行なっている。これらの臨床データを基に新らしい甲状腺乳頭がんの分類を提案し、その遺伝子診断と分子標的治療の開発応用へ取り組んでいる。(1)チェルノブイリ原発の周辺地域に住む住民から発症した小児甲状腺がん患者より手術摘出された組織を有効利用するために国際的なチェルノブイリ組織バンクを設立し蓄積保管して分子疫学的な解析に役立てている。代表者は、チェルノブイリ組織バンクの委員として参画している。現在までに600例ちかい甲状腺がんの遺伝子の蓄積がなされ、遺伝子解析がなわれている。すでに事故後17年が経過したために、小児甲状腺がんから、思春期さらには成人甲状腺がんの発症頻度の増加がみられる。さらに遺伝子解析では、RET/PTCの遺伝子再配列異常の解析がおこなわれ、原発事故後、早期に発症した甲状腺がんでは、RET/PTC3の頻度が高かったが、徐々にRET/PTC1の頻度が増えてきていることがわかってきた。現在、甲状腺がんのケース・コントロール研究を持続し、IARCとの共同研究で、線量モデル評価とリスク計算を行っている。手術標本の病理診断には、国際チェルノブイリ甲状腺がん病理組織診断パネルに参加して国際的なレベルでの診断を統一している。レーザーマイクロダイセクションにて腫瘍部組織のみを分取して遺伝子解析を行っている。その結果、BRAF遺伝子は、成人甲状腺では約50%に活性型変異がみられた。組織型は、乳頭癌に限定してみられた。また、チェルノブイリ小児甲状腺がんでは、BRAF遺伝子変異が低頻度であり発症機序が異なることを報告した。

チェルノブイリの小児甲状腺がん組織から核酸抽出をおこない管理・提供するチェルノブイリティシュバンク(CTB)に協力をしている。チェルノブイリ周辺の機関施設であるロシア連邦オブニンスク放射線医学研究所、ベラルーシ共和国ミンスク甲状腺がんセンター、ウクライナ共和国キエフ内分泌代謝研究所、セミパラチンスク医科大学より、研究者7名を受け入れ長崎大学にて被ばく医療の教育指導を実施した。ベラルーシ共和国ゴメリ医科大学とは、長崎からインターネットによる分子疫学の講義などの教育交流を推進している。また、現地の活動状況の支援、指導のために高村らが3週間ベラルーシに行き分子疫学、e-Learningについて直接指導した。海外拠点と連携し研究活動も行ない、放射線刻印遺伝子の検索を目的としてチェルノブイリの甲状腺がん組織から抽出したDNAを用いDNA修復に関与する遺伝子群(TP53,ATMとMDM2遺伝子)について放射線誘発甲状腺群と散発群との間でSNPs解析を行なった。その結果、いくつかのSNPsにおいて、小児あるいは成人の放射線誘発甲状腺がんに優位な相関を認めた。TP53遺伝子では、コドン72の多型によりProかArgのアミノ酸のどちらかがコードされる。Arg72は、Pro72に比べてアポトーシスになりやすいことが報告されているが、成人の放射線誘発甲状腺がんでは、散発群に比べて有意にArg/Argの比が低いことが判明した(Oncology Report in press)。またATM遺伝子のIVS22-77C/Tの解析では、T/T群が散発性群で有意に少ないという結果を得た。したがって、このパイロット研究の結果、大規模なDNA修復遺伝子群を標的とした分子疫学的な研究を多量のサンプルを用いて行なうことにより、放射線誘発甲状腺がんを識別するための刻印を見出すことができることが示唆された。
リンパ浮腫次世代治療法-リンパ管新生遺伝子治療と外科治療のハイブリッド治療法

リンパ浮腫は有効な根治治療法がなく次世代治療法が望まれる。本研究では肝細胞増殖因子(HGF)のリンパ管新生作用を証明しリンパ浮腫への遺伝子治療効果を検討した。リンパ管内皮細胞にはHGF受容体が発現しHGF刺激で、ERKおよびAktの活性化を伴う増殖能、遊走能の増加が認められた。さらにラットリンパ浮腫モデルでHGF遺伝子治療効果が得られた。HGFがリンパ浮腫の次世代治療法となる可能性が示唆された。リンパ浮腫はリンパ管の形成不全、途絶、閉塞により発生し、患肢の高度の腫脹を特徴とし患者の′′Quality of life′′が著しく障害される難治性疾患である。これに対し有効な治療法が開発されないまま現在に至っている。本研究の目的は新しく発見されたHGF-リンパ管新生遺伝子と最も有効な外科治療法とされる"Enteromesenteric bridge法"を併用することにより新しいリンパ浮腫治療法を動物実験において開発・確立することにある。1、HGFによる遺伝子治療の安全性2、リンパ浮腫モデルの確立ビーグル犬を用い四肢の皮膚、軟部組織、リンパ管及びリンパ節を郭清することでリンパ浮腫モデルの確立を試みている。現在前肢、後肢でそれぞれ検討しているが面積で約15%程度の腫脹を認めており、今後近赤外線リンパ管撮影装置のよってリンパ流を評価する予定でいる。リンパ浮腫は有効な治療法が開発されないまま現在に至っている。本研究の目的はHGFによるリンパ管新生遺伝子と外科治療を融合することにより新しいリンパ浮腫治療法を動物実験において開発・確立することにある。1、HGFによる遺伝子治療の安全性マウス肺癌LL/2を用い検討した。LL/2ではHGF受容体c-Metが軽度発現していた。この細胞にHGFプラスミドDNAを遺伝子導入したところHGFの分泌を認めたが、LL/2そのものの増殖能には有意な変化がなかった。さらにLL/2を移植した担癌マウスモデルを作製し腫瘍に遺伝子導入を行った。移植21日後で腫瘍サイズ、肺転移で有意な変化はなかった。しかしHGF導入群ではヒトHGFの発現に続きendogenousなマウスHGFの上昇を認め、免疫染色にて血管内皮細胞の増加も認めた。HGFによる血管新生が腫瘍により惹起されるものとは機能的に異なっている可能性が示唆された。2、新たなリンパ浮腫モデルの確立と治療法の開発ラットの前肢に対し乳癌に準じた手術を施すことで乳癌術後リンパ浮腫モデルの確立に成功した。このモデルを利用しHGF遺伝子治療と、外科的にリンパ節を移植し機能的なリンパ管新生を目指した新たな遺伝子治療を比較した動物実験を施行中である。まだ検討中ではあるが、乳癌モデルにおいてもHGF遺伝子治療は有効であり、外科手術との併用群ではさらに効果が増加している傾向を認めている。今後近赤外線リンパ管撮影装置のよってリンパ流を評価し、免疫染色、ELISA、PCRなどの方法にてリンパ管新生の詳細を検討する予定でいる。さらに本研究後ビーグル犬を用いスケールアップした検討を予定している。【目的】リンパ浮腫は有効な治療法が開発されないまま現在に至っている。本研究の目的はHGFによるリンパ管新生遺伝子治療と外科治療を融合することにより新しいリンパ浮腫治療法を動物実験において開発・確立することにある。【本年度の成果】新たなリンパ浮腫モデルの確立と治療法の開発ヒト乳癌術後を想定したラット右前肢腋窩郭清によるリンパ浮腫モデル作製に成功した。これにヒトHGFプラスミドDNAを反復投与したところ、コントロール群に比べ有意に浮腫は改善した(P<0.05)。またリンパ流をICGによる近赤外線撮影装置で観察したところ、コントロール群ではリンパ流の遮断と残存リンパ管の拡張が遷延していたが、HGF遺伝子治療群ではリンパ流の回復とうっ滞の改善を認めた。さらにリンパ管内皮特異マーカー(Prox1)で組織免疫染色を施行したところ、HGF遺伝子治療群で染色陽性細胞の増加を認め、リンパ管新生の誘導が確認された。またリンパ管の機能的構造の再構築をめざしてソケイ部リンパ節を採取し腋窩郭清部のリンパ管新生誘導ルートに移植した後HGF遺伝子を導入し、遺伝子治療を施行した。これらでは移植リンパ節を経由したリンパ管ネットワークが形成されていた。これらの結果を踏まえ中、大動物での効果を確認するためビーグル犬モデルを作製した。このモデルでも同様の遺伝子治療効果を認めヒトでも効果があることが期待された。今後ビーグル犬モデルで対照群を設定した検討が必要である。【まとめ】ヒト乳癌術後を想定したリンパ浮腫モデルでHGF遺伝子治療の有効性を証明した。またリンパ節移植付加遺伝子治療はリンパ管内皮細胞の供給源を確保し、リンパ節による免疫学的機能も再構築可能な方法と考えられ、新たなリンパ管誘導法として有用であると考えられた。今後ヒトへの応用を目指し、前臨床研究を進める予定である。
次世代ヒト化マウスを用いた革新的HTLV-1感染症モデルの開発

本研究課題では、MHC分子の一致よる適切なヒトT細胞分化がもたらす免疫監視機構の下、感染細胞の増殖が制御され、ヒトと同様のHTLV-1感染状態を再現する革新的なHTLV-1感染ヒト化マウスモデルの構築を目指す。本モデルを確立することによりヒトではこれまで困難であった、生体内でのHTLV-1感染細胞と宿主免疫応答との相互作用の詳細な解析が可能となり、HTLV-1感染症治療戦略における重要な知見が得られるものと期待される。また本モデルは、ワクチンを中心とした免疫学的治療法の開発・評価にも有用であり、HTLV-1のみならず様々なウイルス感染症の個体レベルでの実験的検証に寄与するものと期待される。
ヒト巨核球の多倍体化機構における細胞周期関連蛋白の解析

ヒト巨核球の多倍体化における細胞周期関連蛋白の変動について検討した。ヒト巨核球系細胞株であるMeg-J細胞にインドロカルバゾール系化合物であるK-252aを添加して培養すると多倍体化し、血小板糖蛋白GPIIb/IIIa、GPIbの発現が増強した。また、トロンボポエチン(TPO)をK-252aに同時添加して培養すると、多倍体化がさらに促進され、GPIIb/IIIa,GPIbの発現もさらに増強した。形態的にも大型化し、偽足形成がみられるなど巨核球への分化傾向が認められた。K-252aによる多倍体化および巨核球系への分化誘導は、巨核球の形質を有する細胞株(Meg01,UT-7,CMK)、あるいは巨核球系への分化能を有する細胞株(HEL,K562細胞)において認められた。すなわち、K-252aによる多倍体化は造血細胞では巨核球系の細胞あるいは巨核球系への分化能力のある細胞に特有な現象であると考えられた。このMeg-J細胞による多倍体化モデルを用いて、サイクリンB1の変動の有無についてフローサイトメトリーにより解析した。Meg-J細胞がM期を経て通常の細胞分裂を行う場合には、G_2/M期にCyclin B1の高発現が認められた。一方、多倍体化過程における細胞周期、すなわちMeg-J細胞にK-252a、TPOを同時添加して培養した場合にみられるM期を完遂しない細胞周期においては、G_2/M期に相当する時期にCyclin B1の高発現が認められなかった。この結果より、Cyclin B1/CDC2キナーゼの量的な減少が、多倍体化に関連していると考えられた。正常の巨核球が多倍体化し、分化していく過程でもM期が完了しない細胞周期を回ることが知られており、このモデル系と同じ現象がおきている可能性が考えられる。今後、正常巨核球において同様な現象が認められるかについて検討する必要がある。
表面の局所電子プローブイメージングによるシリコンの機械的疲労損傷機構描像への挑戦

研究計画最終年度の平成22年度では、実際に疲労試験を行う試験片に電子的加工を施してEBIC(Electron Beam Induced Current)による観察を行った。シリコンからなる実際のMEMS(Micro Electro Mechanical Systems)構造は、通常エッチングにより成型加工された複雑な形状を有し、加工面のエッチング損傷を起点とする破壊が強度を決定する。このため、環境制御型電子顕微鏡(ESEM)内での疲労試験を行うべく昨年度に作製した試験片のエッチング面に対し、特殊治具を開発して用いることでイオンインプランテーションを行ってp-n接合を導入することに成功した。効率的なEBIC観察には電位勾配を試験片に組込むことが重要となるが、この工夫によりショットキ接合のために金属で表面を覆って疲労過程に大きな影響を与える可能性を回避し、かつ蒸着電極自体の疲労寿命に関する懸念を払拭することができた。これにより二次電子のコントラストを画像化する通常の電子顕微鏡では見ることのできなかった結晶欠陥の状態を、電子ビームの誘起する電流のパターンとして明瞭に観察することに成功し、上記のp-n接合の持つ優れた特徴とあわせて、機械的疲労過程における損傷の連続リアルタイム観察への道を拓いた。試験片へのp-n接合の導入が難航したため本格的な疲労試験は現在進行中の状況となっているが、EBIC観察に関する成果に関しては次頁の研究発表の項に記したように既に学会において公表されている。損傷の電子的観察自体に関する問題点は現在既にほぼ克服されたと考えられるため、間もなく環境制御型電子顕微鏡(ESEM)内での機械疲労試験に習熟することで観察データが加速度的に蓄積され、今後の大きな成果が期待される状況となっている。研究計画初年度の平成21年度は主に、環境制御型電子顕微鏡(ESEM)内での疲労試験を可能とする実験装置の開発と、EBICおよびSPMによる疲労過程の観察を可能とする試験片のデザイン・作製を行った。特にスペースの限られるESEM内において、観察のための電子ビーム系統に悪影響を及ぼすことなく試験片を破壊するに十分な負荷を与える機構を確立することは、困難を極める開発となった。いくつかの方法を検討した結果、最終的に曲げ試験片に対する負荷系を曲げに剛くねじりに柔かく設計された弾性ヒンジを介して途中で90度転向し、これを水平に設置したピエゾアクチュエータにより駆動することで、真空チェンバ内の空間に全ての装置を収納し、かつ曲げ試験片の引張負荷側を真上から電子ビームで観察するという実験系の製作に成功した。また、この装置に対応した試験片をファウンドリに依頼して作製した。予備的に行った実験では計画通りに試験片の破壊試験が出来ることが確認されており、次年度における世界に先駆けたEBIC観察下におけるシリコンの疲労試験の本格稼働とデータ取得に向けての準備がほぼ整ったと考えられる。試験装置の開発が予測以上に難航したため研究進捗状況が当初の計画より多少遅れているが、実験装置は既に良好な状態で動作しているため、次年度の1年間で当初予定通りの疲労過程のEBIC観察およびSPMによる観察は十分に可能と考えられ、今後の成果が期待される状況となっている。
Porphyromonas(Bacteroides)gingivalisにおける定着・侵入のheterogeneityについて

歯周ポケットから高頻度で分離されるPorphyromonas gingivalisは種々の病原性を有し成人の辺縁性歯周炎の発症と進行に密接に関わっている病原菌である。本菌は細胞への強い付着能を保有し,歯周局所に定着すると容易に排除されない。本研究はP.gingivalisが病原性を発揮するための第一歩である歯根膜等への付着機序を検討する事によって,実際subgingival siteでどのように歯周炎が進行しているのかそのメカニズムを解明するために検討を加えた。平成2年度の研究から同じP.gingivalisでも菌株によってbasemembrane component(collagen,fibronectin,laminin)への付着能が異なる事が判明した。しかもこの付着能は菌体表層の疎水性と相関性が認められた。さらに実験結果から非病原性株の方が付着しやすく病原性株の方が付着しにくい事がわかった。この付着性はproteinaseKや加熱によって消失してしまう事からタンパクであると考えられる。形態的な観察では多くの菌株には線毛が認められたがW83株だけには線毛が認められなかった。平成3年度は付着能の異なる菌株から線毛とvesicleを抽出して付着能について検討を加えた。その結度,各線毛の付着性は異なりしかもwhole cellと同様に疎水性とよく相関していることから,線毛がcollaen等への付着を担っていると考えられる。この事をin vivoに置き換えてみると一般に非病原性株は疎水性の高い線毛を保有し歯周局所に付着しやすい。しかしその一方で疎水性が高いためすぐにPMNに貧食されてしまう。対照的に病原性の高い菌株は疎水性の低い線毛を保有しているためなかなか宿主には付着しにくいがPMNに貧食されにくく歯周局所に居座り続け病原性を発揮すると考えられる。さらに,vesicleの付着性についても検討した結果,vesicle上には病原性,非病原性に関わりなく菌株共通なcollagenやpellicleへの付着因子が存在する事が判明した。この付着因子は易熱性であり,タンパクであると考えられる。このことから本菌の歯周局所への付着を予防するワクチンとしてはvesicle上の付着因子が有望だと考えられる。国内外からP.gingivalisの菌株を集めhydroxyapatite beadsを用いて結合組織構成成分(collagen,fidronectin,laminin)との付着性について検討した結果、付着能が菌株によって異なる事を確認した。その付着能は菌株保有の表層物質と関連があるかどうかをまず形態的にとらえて検討してみた。電顕観察によると、まったく付着性を示さなかった菌株には線毛構造がほとんど見られず付着に線毛が関与している事が示唆された。酸性多糖構造物についてはその厚さにはほとんど差は認られなかった。また、菌株固有の疎水性と付着性との間に相関性が認められた。さらに、この菌株表層の疎水性は病原性の強さにも関連するものと思われる。さらに,付着能は先天的なものでin vitroで長い間継代を燥返しても菌株固有の付着能や疎水性に変化は認められなかった。この付着能は表層物質であるvesicleやfimbriaeによって阻害された。

特にwhole cellでは付着能が認められなかった菌株由来のvesicleでもcollagenへの付着は50%近くも阻害された。この付着能はtrypsinやproteneise処理によっても抑制されなかった。非病原性株で付着能の高い株では加熱によって付着性が減少したが、病原性株では一向に付着能が減少しなかった。このことから本菌の結合組織への付着にはfimbriaeの関与ばかりでなくvesicle表層にも存在するタンパク以外の物質の強い関与が推定される。歯周ポケットから高頻度で分離されるPorphyomonas gingivalisは種々の病原性を有し成人の辺縁性歯周炎の発症と進行に密接に関わっている病原菌である。本菌は細胞への強い付着能を保有し,歯周局所に定着すると容易に排除されない。本研究はP.gingivalisが病原性を発揮するための第一歩である歯根膜等への付着機序を検討する事によって,実際subgingival siteでどのように歯周炎が進行しているのかそのメカニズムを解明するために検討を加えた。前年度の研究から同じP.gingivalisでも菌株によってbasemembrane component(collagen,fibronectin,laminin)への付着能が異なる事が判明した。しかもこの付着能は菌体表層の疎水性と相関性が認められた。さらに実験結果から非病原性株の方が付着しやすく病原性株の方が付着しにくい事がわかった。今年度は付着能の異なる菌株から線毛とvesicleを抽出して付着能について検討を加えた。その結果、各線毛の付着性は異なりしかもwhole cellと同様に疎水性とよく相関していることから,線毛がcollagen等への付着を担っていると考えられる。この事をin vivoに置き換えてみると一般に非病原性株は疎水性の高い線毛を保有し歯周局所に付着しやすい。しかしその一方で疎水性が高いすめすぐにPMNに貪食されてしまう。対照的に病原性の高い菌株は疎水性の低い線毛を保有しているためなかなか宿主には付着しにくいがPMNに貪食されにくく歯周局所に居座り続け病原性を発揮すると考えられる。さらに,vesicleの付着性についても検討した結果,vesicle上には病原性,非病原性に関わりなく菌株共通なcollagenやpellicleへの付着因子が存在する事が判明した。このことから本菌の歯周局所への付着を予防するワクチンとしてはvesicleの上の付着因子が有望だと考えられる。
活性種ハイブリッド型ラジカルカルボニル化反応の創生と環境調和型反応系への展開

潜在的に安価で豊富な炭素資源である一酸化炭素は、各種遷移金属触媒を用いたカルボニル化法やラジカルカルボニル化法により様々なカルボニル化合物の合成に活用されて来た。本研究においては、ラジカル反応条件下でのアセチレン類のカルボニル化反応について研究を行った。アルキニルアミンのラジカルカルボニル化反応により生成するα,β-不飽和アシルラジカルは、アミン窒素上の置換基にα-フェネチル基を用いるとラジカル置換型の反応が進行し、窒素上が無置換のラクタム環が得られた。この反応は、種々の5員環から7員環ラクタムの構築法に有用である事を見出した。次に、光学活性なラクタム環合成に取り組んだ。ジアステレオ混合物のアミンを合成し、このものを分割し、それぞれに対し本反応を適応した。その結果、双方の光学活性なラクタム環がそれぞれ高純度のエナンチオ過剰率で得る事に成功した。本反応は、基質の立体を損なう事なく進行する事も明らかとした。またこの反応を用いることで、アルカロイド(±)-sibirineの合成を達成した。さらに、飽和アルカンの直接的カルボニル化反応についても検討を行った。アルカンに直接炭素官能基を導入する手法の開発は重要な研究課題である。本研究では、sp^3炭素-水素結合のカルボニル化を伴ったエチニルケトンの合成法について検討を行った。アルカンとアセチレントリフロンを一酸化炭素を加圧し、ラジカル条件下で反応を行った。その結果、期待したエチニルケトンを良好な収率で得る事に成功した。
時空間制御型ナノキャリアによる革新的肝炎・肝硬変治療システムの創製

本研究では、HSC(肝星細胞)を標的とした後に、効率のよいsiRNAの細胞内動態を考慮した薬物送達キャリアの開発を行った。。HSCはコラーゲンの過剰な産生を介して肝線維化に寄与していると言われている。これまでに得られた知見を基に、構造内にリガンド機能とpH応答性を有する脂質様物質を用いた。当研究室の秋田らは、酸性環境と細胞内還元的環境に応答して活性化を受ける脂質様物質Palmの開発に成功している。さらに、HSCを標的とするためPalmの足場として脂溶性ビタミンであるビタミンAを骨格内に有するPalmA脂質を用いた。HSCは体内で多くのビタミンAを貯留する細胞と呼ばれており、ビタミンAを含有するPalmAを粒子化することにより、HSCへの薬物送達キャリアが創製可能であると期待される。PalmAの対照としてビタミンE、あるいはミリスチン酸を足場に持つPalmE、PalmMを用い、3種類のsiRNAナノ粒子化を行った。四塩化炭素の持続的投与により作成した肝線維化モデルマウスに対して、コラーゲン1a1に対するsiRNAを含む3種類のナノ粒子を投与し、遺伝子抑制効果を測定した。その結果、0.5 mg/kgにおいてPalmAにおいてのみ有意な抑制効果が認められた。また、HSCの培養細胞株を用いて3種類のナノ粒子のHSCへの細胞内取り込みを評価した。その結果、PalmM、Eと比較してPalmAではHSC細胞株に、より多く取り込まれることが明らかとなった。肝線維化モデルマウスを用いた治療実験では、siRNAによる遺伝子配列特異的な抑制効果が得られたとともに、PalmAを組み込んだナノ粒子で繊維化の改善が認められた。今後、さらなる遺伝子抑制効果の向上とともに製剤安定性の向上へも取り組んでいきたい。26年度が最終年度であるため、記入しない。肝硬変に対する根本治療は現在もまだ確立されてはいない。そこで、肝炎全般の治療を目的として標的遺伝子を特異的に抑制可能なsiRNAを用いた治療法を考えている。siRNAは疾患と深くかかわる原因遺伝子のみを直接抑制可能であるため、低分子化合物よりも優れた効果があると期待されている。しかし、核酸を用いた治療を行う上で、核酸デリバリーシステムは重要な技術である。特に、次の2つのシステムは効率の高い核酸デリバリーには欠かすことが出来ない。1つめは、疾患の治療部位を標的化出来るシステム。つまり、優れた体内動態を持つシステムである。そして、2つめは、細胞内の作用部位(細胞質)まで送達し、単位核酸分子の活性が高いシステムであり、細胞内動態を改善することである。本研究で提案する時空間制御型ナノキャリアとは、体内動態の改善を考慮した空間制御型システムと細胞内動態に着目した時間制御型システムの融合したキャリアである。しかし、近年になり肝臓血管内皮細胞が肝炎・肝硬変の原因であることが明らかになってきた。肝硬変の根治を目指すには、肝臓血管内皮細胞を標的とする治療が必要であると考えられるが、肝臓血管内皮細胞を標的とするキャリアは皆無である。そのため、空間制御システムの構築として、肝臓血管内皮細胞を標的可能なキャリアを作成した。これまで、行われていた肝臓の実質細胞を標的とする研究では、キャリアは肝臓血管内皮細胞に存在するフェネストラ(直径120nm前後)を通過可能な小径粒子であることが必須条件であった。一方、血管内皮細胞自体を標的化する場合は、肝実質細胞への移行性を低下させるためにむしろ粒径は150nm以上であり、かつ肝臓血管内皮細胞を選択的に標的可能なリガンドの搭載が必須となると考えられた。本研究の最終目標は、時空間制御型ナノキャリアを用いた肝炎・肝硬変の治療法の構築である。。

今後、さらなる遺伝子抑制効果の向上とともに製剤安定性の向上へも取り組んでいきたい。26年度が最終年度であるため、記入しない。siRNAを内部に封入した時空間制御型ナノキャリアの構築に成功した。肝硬変モデルマウスにおいて、siRNAの特定遺伝子に対する抑制効果を確認した。siRNA封入時空間制御型ナノキャリアの肝硬変に対する治療効果を評価する。評価は、標的遺伝子の抑制だけではなく、その他肝炎で指標となるALT、AST、病理組織学的にも評価する。
含窒素推進薬の気相燃焼モデルの包括的構築

宇宙機推進エンジンに用いられる含窒素自己着火性推進薬の燃焼機構を包括的に検討するため,着火初期で重要となる反応素過程の理論検討と詳細反応モデルの構築を行った.ヒドラジン誘導体の解離反応,NO2による水素引き抜き反応素過程は,ヒドラジンへのメチル基の置換基効果により説明可能であることを示し,非対称ジメチルヒドラジンの熱分解反応に関する詳細反応モデルを構築した.ヒドラジン誘導体に代わる低毒性推進薬の候補であるテトラメチルメチレンジアミン,テトラエチルメチレンジアミンの熱解離素過程においてH2協奏脱離及びC-C, C-N結合解離経路が重要となることを示した.人工衛星の姿勢制御用スラスタ燃料の一つとして知られる非対称ジメチルヒドラジン(UDMH, (CH3)2NNH2)の熱解離素過程を量子化学計算により探索した.得られた結果を基にRRKM理論,支配方程式解析による反応経路毎の速度定数の理論計算を行ったところ,主反応経路はN-N結合, N-C結合が単純解離しCH3NCH3 + NH2, CH3NNH2 + CH3が生成する経路であることが明らかになった.この結果はモノメチルヒドラジン(MMH, CH3NHNH2)と同じ傾向であった.UDMHの熱分解反応機構における主要後続反応と考えられるUDMH + CH3, UDMH + NH2, UDMH + H反応について,量子化学計算と遷移状態理論により反応速度定数の理論計算を行った.本課題で得られた速度パラメータと,MMH,ジメチルアミン(NH(CH3)2)熱分解反応モデルを組み合わせ,UDMH熱分解反応モデルを新たに構築した.構築した反応モデルと既往の流通式反応器,衝撃波管による実験結果(温度750-1400 K,濃度0.09-5%)を比較した.本モデルは総括熱分解反応速度定数の絶対値を一桁程度過小評価するが,速度定数の温度依存,UDMH濃度依存について実験値を良く再現することが明らかとなった.本モデルの反応解析により低温,高濃度条件において主にUDMH + CH3反応により総括のUDMH消費速度が促進されることが明らかとなった.UDMHの熱分解反応機構に関して,既往の実験結果を定性的に再現するモデルを構築することができた.構築したモデルにより総括のUDMH消費速度に対するUDMHの初期濃度が反応経路に与える影響を明らかにし,既往の異なる装置,条件による実験報告の差異の要因を解明した.上記のように,本課題は当初の計画に従いおおむね順調に進展している.人工衛星の姿勢制御用スラスタ推進薬の一つとして知られる非対称ジメチルヒドラジン(UDMH, (CH3)2NNH2)と四酸化二窒素(NTO, N2O4)の自燃性着火初期段階で重要となるUDMH +NO2反応素過程を量子科学計算により探索した.得られた結果を基にRRKM理論,支配方程式解析により各反応経路の反応速度定数の温度及び圧力依存性を検討したところ,主反応経路はアミノ基の水素原子をNO2が引き抜き(CH3)2NNH + HONOが生成する経路であること,メチル基の水素原子を引き抜きH2NN(CH3)CH2が生成する経路はエネルギー的に不利であることが示唆された.この結果はモノメチルヒドラジン(MMH, CH3NHNH2)と類似していることが明らかになった.発ガン性の高いヒドラジン誘導体に代わる推進薬の候補として,UDMHと類似したジメチルアミノ基(N(CH3)2)を有するテトラメチルメチレンジアミン(TMMDA, (CH3)2NCH2N(CH3)2)の熱解離素過程についても量子化学計算による検討を行った.TMMDAにおいてはメチレン側のN-C結合が解離して(CH3)2NCH2 + CH3NCH3が生成する経路と,メチル基側のN-C結合が解離して(CH3)2NCH2NCH3 + CH3が生成する経路が重要となることが示唆された.UDMHの自燃性反応機構の初期過程における反応経路と反応速度定数の温度,圧力依存を理論的に決定することができた.更にヒドラジン誘導体に代わる低毒性代替燃料の候補としてTMMDAの熱解離初期過程についても反応経路に関する知見が得られた.上記のように,本課題は当初の計画に従いおおむね順調に進展している.人工衛星やロケット推進エンジンに使用される含窒素自己着火性液体燃料の着火過程の理解のための気相着火反応モデルの理論的構築を行った.対象とした燃料は現在使用されているヒドラジン系燃料の一つである非対称ジメチルヒドラジンと,ヒドラジン系燃料の低毒性代替物質の候補としてアミン系燃料であるテトラメチルエチレンジアミン及びテトラエチルエチレンジアミンとし,化学構造の違いによる置換基効果の影響を考察した.対象とした燃料の熱分解の開始反応である熱解離素過程について量子化学計算,統計力学計算による理論検討を行い,非対称ジメチルヒドラジンについてはN-N及びC-N結合解離経路が主経路であること,テトラメチルエチレンジアミン,テトラエチルジメチルアミンについてはC-N及びC-C結合解離と同一のジメチルアミノ基からの水素分子脱離経路が競合することが示唆された.得られた知見をもとに構築した非対称ジメチルヒドラジンの熱分解反応モデルは,ヒドラジン,モノメチルヒドラジン,非対称ジメチルヒドラジンの高温熱分解反応速度に関する既往の実験値を良く再現した.計算結果の反応解析により,ヒドラジン誘導体の熱分解特性に与える燃料化学構造の影響が明らかになった.