hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
分裂酵母を材料としたTORシグナル経路の制御機構と細胞機能の遺伝学的研究

TORは免疫抑制剤ラパマイシンの標的タンパク質(TORはTarget Of Rapamycin)で、ヒトを含め生物に広く存在し、栄養状況に応じて細胞の増殖と成長を制御する。モデル生物、分裂酵母のTORにはTor1とTor2がある。今回、Tor2の遺伝子に変異を導入し、ラパマイシン感受性変異株を作った。この株はラパマイシンで増殖が止まり、窒素源飢餓と同様の挙動を示したことから、Tor2は窒素源を感知し、細胞の増殖を制御することが示唆された。また、Tor2の下で働くと思われる転写因子、およびアミノ酸トランスポーターを特定した。TORはヒトから酵母まで広く存在するタンパク質キナーゼであり,栄養状況に応じて細胞の増殖と成長を制御する新たなシグナル経路の中心を担う。最近,腫瘍抑制遺伝子の産物(TSC1,TSC2)がTORを制御することがわかり,癌治療の視点からも注目を集めている。分裂酵母は遺伝学が使える上に,TORの上流がヒトと似ているので,TOR経路の制御機構を研究する良いモデル生物である。分裂酵母にはTOR1とTOR2があり,TOR1は生育に非必須なのに対し,TOR2は必須である。しかし,TOR2の詳細な機能はまだよく分かっていなかった。また,不思議なことに分裂酵母の増殖はラパマイシンで阻害されない。その理由はまだ分かっていなかった。そこで,TOR2のラパマイシン受性変異株を取得し,解析した。この株は,ラパマイシン無添加では正常に増殖したが,ラパマイシン存在下では増殖しなかった。この細胞は丸くて小さく,G1のものが大半であり,また窒素源飢餓特異的に起きる性分化も見られた。このことは,ラパマイシンによるTOR2の不活性化が窒素源飢餓応答を引き起こすことを示唆した。ラパマイシンによる阻害にはFKBP12というタンパク質が必要だが,このラパマイシン感受性株もFKBP12が存在しないとラパマイシンによる阻害が起きなかった。次に,ラパマイシン感受性変異株にゲノムライブラリーを導入し,ラパマイシン耐性を示すコロニーを選択し,そこからプラスミドを抽出して,ラパマイシン耐性を与える遺伝子を解析した。その一つは核タンパク質であったが,この核局在はラパマイシンによって細胞質へと変化することが分かり,TOR2の下流に位置するものであることが示唆された。
牧草地から近縁雑草集団への遺伝子流動様式の解明

遺伝子組換え牧草が世界的に普及しつつあるなか、組換え体由来の遺伝子が牧草地周辺の雑草に逸脱することへのリスク評価を行った。牧草地から10m以内の場所に生育している雑草は、牧草の花粉を特に受けやすく、牧草の遺伝子を持った種子を形成する傾向にあった。ただし、撹乱が弱く、新しい個体が発生しにくい場所では、雑種の種子が形成されても、それが個体として雑草群落に入り込む可能性は低いと考えられた。遺伝子組換え牧草が世界的に普及しつつあるなか、わが国においても近い将来その栽培が行われると見込まれている。遺伝子組換え作物を栽培するにあたっては、組換え体由来の遺伝子が花粉放散により圃場外へ逸脱した際の生態系に及ぼす影響について把握しておく必要がある。本研究では、牧草-雑草間の遺伝子流動様式を解明し、花粉放散による牧草地からの遺伝子逸脱に対するリスク評価を行った。十勝館内に存在する牧草地から、オーチャードグラス、およびアカクローバを栽培しており、かつ周辺域に両植物種の雑草集団が存在するものを2箇所選び、調査サイトとした。雑草集団内に方形区を設置し、植物の齢構戒を調べた。オーチャードグラスに関しては、成植物体の割合が高く、本年度に新たに集団に参入したと思われる個体がほとんど見つけられなかった。オーチャードグラス集団内では世代交代率が極めて低いことを示唆している。一方、アカクローバに関しては、本年度に新たに集団に参入したと思われる個体が全体の15%程度を占めていた。アカクローバ集団内では頻繁な世代交代が行われていることを示唆している。これらの結果から、遺伝子組換え体と雑草との間で自然交雑が生じた場合、形成された雑種が自然集団内に参入する可能性はアカクローバの方が高いと考えられる。方形区内のオーチャードグラス、およびアカクローバからDNAを抽出した。マイクロサテライトマーカーの多型性から集団の遺伝構造を解析したところ、両植物種とも牧草地に近い方形区内の個体ほど牧草地内の個体との遺伝子型の類似性が高い傾向を示した。牧草地からの距離が近い雑草集団ほど、牧草からの遺伝子流動の程度が高いことが示唆される。多くの作物において遺伝子組換え品種の普及が進んでいる。わが国においても将来的に遺伝子組換え作物が一般耕地で栽培される可能性がある。遺伝子組換え作物の栽培にあたっては、組換え体由来の遺伝子が花粉放散により圃場外へ逸脱することが懸念される。特にそのほとんどが他殖性である飼料作物においては、その問題が重要となる。平成19年度は昨年度に引き続き、牧草-雑草間の遺伝子流動様式を解明することで、花粉放散による牧草地からの遺伝子逸脱に対するリスク評価を行った。帯広畜産大学実験圃場内にアカクローバ草地を造成した。草地内ではアカクローバ5品種を4プロットずつ、等しい距離を隔て無作為に配列した。各品種のプロットのうちひとつについては刈取り等の栽培管理を行わず(粗放栽培)、アカクローバが自然界で雑草として生育する場合と同様の条件にした。アカクローバに自然交配をさせた後、各プロットから種子を採集した。種子とその種子親個体の遺伝子型をマイクロサテライトマーカーによって同定した。そして、種子の遺伝子型、および親個体の遺伝子型をもとにプロット間の遺伝距離をそれぞれ算出した。いずれのプロットについても、近隣プロットとの間の遺伝距離は、種子の遺伝子型をもとに算出した場合の方が親個体の遺伝子型をもとに算出した場合よりも小さくなった。ただし、10m以上の距離を隔てたプロット間ではこの傾向が認められなかった。これにより、アカクローバが10m以内に隣接して存在する場所では、花粉放散により遺伝子流動が生じることが分かる。一方、粗放栽培を行ったプロットでは、他の雑草との競合のため、落下種子による新規アカクローバ個体の出現が少なかった。野草として生育する環境下では、異なる品種との交雑が起きた場合も、その雑種が個体として集団内に参入する頻度は低いと考えられる。遺伝子組換え作物を一般耕地で栽培するにあたり、組換え体由来の遺伝子が圃場外に逸脱した際の生態系への影響を評価する必要がある。多くの草種が他殖性である牧草では、組換え品種を栽培した場合に花粉放散によって組換え遺伝子が圃場外へ逸脱することが懸念される。平成20年度は昨年度に引き続き、牧草一雑草間の遺伝子流動様式を解明することで、花粉放散による牧草地からの遺伝子逸脱に対するリスク評価を行った。平成19年度同様、帯広畜産大学内に造成したアカクローバ草地を用いて試験を行った。この草地には、アカクローバ5品種が4プロットずつ、等しい距離を隔て無作為に配列されており、各品種のプロットのうちひとつについては刈取り等の栽培管理を行わず(粗放栽培)、アカクローバが自然界で雑草として生育する場合と同様の条件にしてある。

平成20年度は、各プロット内に枯死個体が出始め、欠株が生じた場所には新たなアカクローバの実生が確認できた。ただし、粗放栽培を行ったプロットでは多年生雑草の侵入が激しく、アカクローバの実生はほとんど確認できなかった。プロット内に新規参入した実生からDNAを抽出し、マイクロサテライトマーカーによる遺伝子型同定を行った。そして、それぞれの実生の遺伝子型と昨年度同定した既存個体の遺伝子型のデータをもとに、プロット間、およびプロット内の異世代個体間の遺伝距離を算出した。各プロットの実生と近隣プロットとの遺伝距離は、異品種の既存個体間の遺伝距離よりも低い値となった。この傾向は、実生発生数の多いプロットほど顕著であった。発生した実生には品種間雑種が多く含まれていると考えられる。世代交代率の高い環境ほど集団が花粉媒介による遺伝子流動が生じやすいことが示唆された。
黄体のGnRHによる黄体退行機序の解明とこれを利用した黄体の寿命の人為的調節

ラットでは、黄体形成後2日半以内にプロラクチン(PRL)の刺激を受ければ黄体は機能化するが、それ以降ではPRL刺激を受けたとしても黄体は退行してしまう。本研究は、この時期特異的な黄体の運命決定機構について調べた。その結果、卵巣局所に発現するゴナドトロピン放出ホルモンが黄体のPRL受容体アイソフォームの発現比率を変化させていること、この発現比率を人為的に調節すれば、黄体の運命を変えられることが示された。黄体の機能化不全や退行遅延による繁殖障害の改善にむけて、研究代表者はラットをモデル動物にして研究を行っている。ラットでは、黄体形成から3日目にあたる発情休止期2日目(D2)の午前までに、プロラクチン(PRL)の刺激があれば黄体は機能化するが、それ以降にPRL刺激があったとしても速やかに退行することが知られている。しかし、この変化が何によってもたらされているのかはわかっていない。本年度は、黄体局所に発現するゴナドトロピン放出ホルモン(GnRH)がPRLの黄体機能化作用に及ぼす影響について検討した。D2午前の卵巣から摘出した黄体を用いて器官培養を行った。GnRHのアゴニスト(GnRHa)もしくはアンタゴニスト(Cetrorelix)を前処理したうえでPRLを加え、48時間後に黄体および培養上清を採取した。Cetrorelixを前処置した場合、PRLの添加によって、黄体組織中のプロジェステロン産生酵素転写活性と培養上清中のプロジェステロン濃度が増加し、アポトーシスシグナルであるBaxおよびCleaved caspase 3のタンパク質発現が減少した。しかし、GnRHaを前処置した場合には、それらの変化はどれも消失した。次に、浸透圧ミニポンプを用いて、成熟雌ラットの卵巣嚢内にGnRHaを連続的に投与した。このラットに、D2の午前からPRLを1日2回投与して、その後の血中プロジェステロン濃度を測定したところ、PRL投与2日目以降に本来みられるプロジェステロン分泌の増加が観察されなかった。以上の結果より、ラット性周期黄体においてGnRHは黄体に直接作用し、PRLの黄体機能化作用を抑制することが明らかになった。来年度は、本研究で明らかになった機構を利用した黄体の寿命の人為的な制御に挑戦し、卵巣周期不順の治療法確立につなげる。研究代表者らはこれまでに、卵巣内に発現するゴナドトロピン放出ホルモン(GnRH)が黄体の退行因子として働くことを明らかにした。また、GnRHが性周期黄体において、主たる黄体刺激因子であるプロラクチン(PRL)受容体の発現を抑制し、黄体のPRL感受性を低下させる可能性も見出した。これらの結果はGnRHとPRLが黄体機能に拮抗的に作用する可能性を示している。本年度の研究では、PRLがGnRHの黄体退行作用に及ぼす影響について明らかにすることとした。まず、Wistar-Imamichiラットの偽妊娠各時期の黄体から総RNAとタンパク質を抽出し、偽妊娠中の発現動態を調べた。GnRH、GnRHシグナルのバイオマーカーであるアネキシンA5(Anxa5)、PRL受容体の発現量をRealtime RT-PCRおよびウェスタンブロット法を用いて測定した。GnRH、Anxa5のmRNA発現およびタンパク質発現は偽妊娠中期に低下し、後期に増加した。対照的に、PRL受容体の発現は中期に増加して後期に低下した。次に、PRLのGnRH発現に対する作用を調べるために、偽妊娠5日目のラットにドーパミン作動薬CB-154を連日投与して内因性のPRL分泌を阻害した。CB-154投与より2日後、血中プロジェステロン濃度の低下がみられるとともに、偽妊娠黄体におけるGnRH、Anxa5のmRNA発現は増加し、PRL受容体の発現は低下した。一方、偽妊娠5日目のラットの卵巣嚢内にGnRH作動薬を局所投与した場合には、血中プロジェステロン濃度の低下はみられたが、PRL受容体の転写量の減少はみられなかった。以上より、偽妊娠黄体において、GnRHは黄体退行期に増加してプロジェステロン分泌能を低下させる作用を持つが、PRL受容体発現低下作用についてはPRLによって抑制されることが示された。本成果は2011年9月に開催された第152回日本獣医学会学術集会にて報告した。
新規の表皮内ライブイメージング法を用いたメラニン色素輸送の解析

表皮の色素細胞で産生されたメラニン色素は、のちに隣接する角化細胞へと輸送されることで表皮に沈着して全身を紫外線から守る。本研究では、新規表皮ライブイメージング法により見出した"メラニン色素が色素細胞の細胞膜に包まれて放出されたのち角化細胞に輸送される"という観察結果に基づいて、メラニン色素輸送の3過程: 1)膜小胞出芽、2)放出そして3)膜小胞が角化細胞に取り込まれる過程について理解を深めた。表皮組織内の色素細胞で産生されたメラニン色素は、隣接する角化細胞へと輸送されることで表皮に沈着して全身に色を与え、紫外線防御などの機能を果たす。申請者は、独自に立ち上げた表皮内ライブイメージング法を用いて、色素細胞内で合成された色素顆粒(メラノソーム)が、色素細胞の細胞膜に包まれて角化細胞に輸送されることを初めて明らかにした。本研究では申請者の観察結果に基づき、色素輸送メカニズムの解明を目指して1)膜小胞が色素細胞から出芽するメカニズム、2)膜小胞が放出されるメカニズム、そして3)膜小胞が角化細胞に輸送されるメカニズム、の3過程の分子メカニズムを明らかにする。本年度は、交付申請に記した通り、これらの3過程のうち1)膜小胞が色素細胞から出芽するメカニズムについて解析を行った。申請者は、はじめに正常な色素細胞における膜小胞の出芽頻度を統計的に解析し、機能解析を行うための基盤を整えた。次に、研究実施計画に則り、色素細胞内におけるメラノソーム輸送と出芽の関係を探るために、細胞内輸送を停止させるなどの操作を行い、膜小胞の出芽に及ぼす影響を調べた。この結果、メラノソームの細胞内輸送を停止させた場合においても、出芽が抑制されないことが分かってきた。そこで次に、細胞骨格を制御する因子に注目して出芽メカニズムの探索を行った。この結果、低分子量Gタンパク質(RhoA)の機能を阻害することにより、膜小胞の出芽が抑制されることが明らかとなった。加えて、RhoAの下流分子であるRockの阻害においても出芽抑制が観察された。以上、本研究期間内に膜小胞の出芽メカニズムの一端が明らかとなった。表皮の色素細胞において産生されたメラニン顆粒は、のちに周囲の角化細胞に輸送されることにより表皮に沈着する。本研究は申請者が立ち上げた表皮ライブイメージング法により見出した、1)色素細胞が膜ブレッブを起こす、2)メラニン顆粒が色素細胞の細胞膜に包まれて放出される、3)膜小胞が角化細胞に取り込まれるという一連の輸送過程のメカニズムを明らかにする。平成22年度に行った1)膜ブレッブのメカニズムの解析に続き、平成23年度は主に2)膜小胞の放出および3)角化細胞による取り込みについて解析を進めた。1)膜小胞の放出膜;小胞の放出機構を明らかにするため、周囲の角化細胞との相互作用に注目して解析を進めた。初めに移植などの手法を用いて、色素細胞の成熟度合やメラニン合成量に関わらず、膜小胞の放出タイミングが周囲の環境に依存する可能性を見出した。表皮に発現する遺伝子を探索した結果、ヒトの日焼け時の表皮において発現する分子群が、トリ胚表皮においても発現することが明らかになった。さらにこれらの遺伝子の発現は、色素輸送が開始する胚発生10日目に向けて上昇することが示されるなど、膜小胞の放出に関わる分子の実態が徐々に明らかになりつつある。2)角化細胞による膜小胞の取り込み;膜小胞が貧食および膜融合のどちらによって取り込まれるのかを明らかにするために、膜小胞を緑蛍光(膜局在型EGFP)によって、そして表皮細胞を赤色蛍光により染色して膜小胞の取り込みを観察した。もしも、膜融合の場合は両蛍光が混ざり、貪食の場合は緑色の膜小胞が角化細胞の中に観察されると予想される。共焦点顕微鏡により光学断層撮影を行った結果から、膜小胞が貪食により取り込まれることを明らかにした。以上、本研究の目的であった色素輸送過程について理解を深めることができた。これらの結果は、細胞間輸送の基本原理を理解するために重要であるのみでなく、化粧品開発や医療分野への応用が期待される。
肺のプリオン蛋白質を分子標的としたインフルエンザ重症化予防の確立

プリオン蛋白質(PrP)は細胞表面に局在する糖蛋白質であり,全身で発現し,特に中枢神経系でその発現は高い。脳ではPrPは神経細胞の保護に関与するとの報告があるが,他の組織におけるPrPの機能は不明である。我々は, PrPが脳組織に次いで肺で高く発現していることを見出した。また,抗PrP抗体による免疫染色から, PrPはI型及びII型肺胞上皮細胞とクララ細胞で発現していることが分かった。そこで,肺でのPrPの機能を解析するために, PrP遺伝子欠損(Prnp0/0)マウスにインフルエンザAウイルス(IAV)を鼻腔に感染させた。その結果, Prnp0/0マウスはIAVに高感受性を示し,高い致死率を示した。逆に, PrP過剰発現マウスはIAV感染に対して抵抗性を示した。これらの結果は,肺で発現するPrPがIAV感染に対して防御的に機能することを示す。次に, PrPの機能領域を解明するため,銅イオン結合領域であるオクタペプチドリピート(OR)領域を欠損したPrPを発現するTgPrPdelOR/Prnp0/0マウスにIAVを感染させた。その結果, TgPrPdelOR/Prnp0/0マウスはPrnp0/0と同等の致死率を呈した。この結果は, OR領域がPrPの抗IAV活性に重要な領域であることを示した。OR領域は銅イオンと結合し,銅依存的抗酸化酵素SOD1の酵素活性を調節することが報告されている。そこで,肺の銅イオン量を定量した結果,野生型マウスと比べてTgPrPdelOR/Prnp0/0マウスでは肺の銅イオン含有量が低下しており, SOD1酵素活性も低下していた。以上の結果は, PrPが肺内の銅イオンを保持することでSOD1の酵素活性を調節し,その結果IAV感染により産生される活性酸素を不活化し,抗IAV活性を発揮している可能性を示した。正常プリオン蛋白質(PrP)は細胞膜表面に局在する糖蛋白質であり、全身で発現し、特に中枢神経系でその発現は高い。PrPの構造変異体(PrPSc)は凝集体を形成して「プリオン病」を引き起こすことが知られている。しかし、PrP遺伝子欠損(PrP-KO)マウスは正常に発育成長することから、PrPの生体機能はこれまで不明であった。PrP-KOマウスは野生型マウスと比べて、インフルエンザAウイルス(IAV)感染に対して高感受性を示すことが、最近の我々の研究で明らかになってきた。また、マウスへの抗PrP抗体の前投与で、野生型マウスではインフルエンザの重症化を予防できること、PrP-KOマウスではその予防効果が認められないことから、肺で発現するPrPはIAVの重症化を予防する治療標的となる可能性が高いことを見出した。平成28年度は、インフルエンザ重症化の発症機序を解明するために、1.肺でのPrPの生体機能を明確にする、2.IAVの感染防御に必要なPrPの分子内領域を決定する、3.PrPの凝集体形成能の有無を明らかにすることを目標とした。その結果、PrPは肺を構成する上皮細胞やII型肺胞(クララ)細胞、I型細胞で発現することを組織染色により確認した。1.PrPはこれらの細胞に「銅」を運搬する役割があることを明らかにした。IAV感染肺では大量の活性酸素(ROS)が産生されこれが細胞死の引き金となるが、PrPはSOD(Superoxide dismutase)に銅を運搬することでROSを無毒化していることを突き止めた。さらに、2.種々のPrP部分欠損トランスジェニックマウスを用いたIAV感染試験により、PrPに特異的な繰り返し配列(OR)領域が銅運搬に関与していることを明確にした。他にも、3.肺で発現するPrPには凝集体形成能は無いことを確認した。平成28年度の計画予定であった、インフルエンザ重症化の発症機序の詳細を解明するために、1.肺でのPrPの生体機能を明確にする、2.ウイルスの感染防御に必要なPrPの分子内領域を決定する、3.PrP結合分子を同定するは既に終了した。さらに、平成29年度の計画である野生型マウスへのPrP抗体投与試験を行い、4.PrP抗体の作動機序を解明する研究にも既に着手している。平成30年度の研究計画である5.PrPを分子標的とするリード化合物の探索し関しても、いくつかの候補分子を既に同定している。従って「当初の計画以上に研究が進展している」ものと判断する。

これらの結果は,肺で発現するPrPがIAV感染に対して防御的に機能することを示す。次に, PrPの機能領域を解明するため,銅イオン結合領域であるオクタペプチドリピート(OR)領域を欠損したPrPを発現するTgPrPdelOR/Prnp0/0マウスにIAVを感染させた。その結果, TgPrPdelOR/Prnp0/0マウスはPrnp0/0と同等の致死率を呈した。この結果は, OR領域がPrPの抗IAV活性に重要な領域であることを示した。OR領域は銅イオンと結合し,銅依存的抗酸化酵素SOD1の酵素活性を調節することが報告されている。そこで,肺の銅イオン量を定量した結果,野生型マウスと比べてTgPrPdelOR/Prnp0/0マウスでは肺の銅イオン含有量が低下しており, SOD1酵素活性も低下していた。以上の結果は, PrPが肺内の銅イオンを保持することでSOD1の酵素活性を調節し,その結果IAV感染により産生される活性酸素を不活化し,抗IAV活性を発揮している可能性を示した。平成29年度の計画予定であった, 1.肺におけるPrPの生体機能の解明, 2.ウイルスの感染防御に必要なPrPの分子内領域の決定, 3. PrPの凝集体形成能とウイルス感染能の関連性についての検証は既に終了した。さらに, 4. PrP結合分子の同定/PrP抗体の作動機序の解明についても,研究が進展している。平成30年度の研究計画である, 5. PrPを分子標的とするリード化合物の探索に関しても,いくつかの候補分子を既に同定しており,それらの分子の効果について評価中である。従って「当初の計画以上に研究が進展している」ものと判断する。プリオン蛋白質(PrP)は細胞表面に局在する糖蛋白質であり,全身で発現し,特に中枢神経系でその発現は高い。脳ではPrPは神経細胞の保護に関与するとの報告があるが,他の組織におけるPrPの機能は不明である。我々は, PrPが脳組織に次いで肺で高く発現していることを見出した。また,抗PrP抗体による免疫染色から, PrPはI型及びII型肺胞上皮細胞とクララ細胞で発現していることが分かった。そこで,肺でのPrPの機能を解析するために, PrP遺伝子欠損(Prnp0/0)マウスにインフルエンザAウイルス(IAV)を鼻腔に感染させた。その結果, Prnp0/0マウスはIAVに高感受性を示し,高い致死率を示した。逆に, PrP過剰発現マウスはIAV感染に対して抵抗性を示した。
ヒト骨格筋および中枢神経におけるカルシウム(Ca)ポンプ蛋白の分布と病態

筋小胞体(SR)が骨格筋の興奮収縮連関において中心的役割を担うことは既に確立されている。筋ジストロフィー、悪性高熱、Brody病などの疾病で、SRの機能異常が指摘されてきた。SRの主要な生理的機能の1つはCa摂取であり。Ca-ATPaseが関与している。本研究ではCa-ATPase蛋白に焦点を絞り、正常および病的状態におけるCa-ATPase蛋白の分布を解析した。また神経組織などの非筋組織におけるCa-ATPase蛋白については若干の検討を加えた。ヒト骨格筋よりSR・CaーATPase蛋白を精製し、これを抗原としてポリクローン抗体を作製した。この抗体を使用して、各種の筋疾患につきimmunoblotおよび免疫組織化学を行った。(1)Duchenne型筋ジストロフィー(DMD)やndxマウスの筋肉ではSR・Ca-ATPase免疫染色の低下が観察された。ただDMDのopaque fiberの一部は濃染された。(2)周期性四肢麻痺にみられたtubular aggregatesは免疫染色され、SR起源が推定された。(3)筋緊張性ジストロフィ、悪性高熱、多発筋炎では正常の免疫染色を呈した。(4)中枢神経や末梢神経には交叉反応を呈する100KDの蛋白は存在しない。36KDの未同定の蛋白が淡染された。ヒト血小板および培養血管内皮細胞には交叉反応を呈する蛋白はみとめられなかった。今回の結果は、DMDにおいてSR・Ca-ATPase蛋白の量的減少を示唆しており、従来の報告を支持している。本症では細胞骨格蛋白、ジストロフィンの欠損が最近発見され、これとの関連が問題となろう。ジストロフィンの欠損のための筋細胞の分化・成熟が障害され、その結果の一部として、Ca-ATPase蛋白の低下を生じた可能性を考慮している。1.Caポンプ蛋白に対する抗体(ポリクローナル)の作製ラット骨格筋(主として白筋)より超遠心法にて筋小胞体(SR)分画を調製した。Meissnerらの方法にしたがい、SRを0.05%(W/V)deoxy-cholateで2度抽出し、Caポンプ蛋白を精製した。この分画はSDS-PAGEにより、分子量100Kの単一バンドを呈した。この蛋白を抗原として、家兎を免疫し抗血清を作製した。Outcherlony二重拡散法によると、SR分画との間に一本の明瞭な沈降線とその外周にかすかな線の形成をみた。免疫ブロット法によると、MW、100KのCaポンプ蛋白との間に反応をみた。その他に70Kと30Kにあわい反応がみとめられた。筋原線維蛋白との間には交叉する抗体はみとめられなかった。70Kと30Kは分解産物の可能性が考えられた。このように抗血清は特異性に問題が残ったため主として生理的実験に応用するにとどめた。2.筋小胞体のCa摂取とCa遊離スキンドファイバーを10倍命釈抗血清と12時間incubationした。この必理によりCa摂取能は影響されなかった。またカフェインによる筋拘縮も影響されなかった。抗体のCa輸送に対する影響は分離SRを使用して検討されてきたが、まだ結論には至っていない(MartonosiとFortier1974,SumidaとSasaki 1975)。主題とは別に細胞内pHの張力発生と興奮収縮連関への影響を分析した。正常静止筋の細胞内pHは7.0附近といわれる。代謝ミオパチーや筋ジストロフィーでは7.2以上に上昇するといわれる。この際筋収縮系のCa感受性は増加し、収縮力の増強がみられた。

またCa誘発性Ca遊離は著増した。この現象はこれらの疾病における筋拘縮と筋破壊の原因となると推定した。Duchenne型筋ジストロフィー(DMD)や悪性高熱では筋小胞体(SR)の機能が問題となっている.SRのCa輸送の異常が指摘されてきたが,その分子レベルの異常に関する知見はきわめて乏しい.今回Ca pump蛋白に対する抗体を作成し, Immunoblottingや免疫組織化学を行った.対象とした疾病はDMD,周期性四肢麻痺,悪性症候群,多発筋炎などである.ヒト剖検筋あるいはラット白筋より筋小胞体分画を作製し,更にdeoxycholateで処理してCa pump蛋白を精製した.これを抗原として,家兎でポリクローナル抗体を作製した.抗体は免疫拡散法やimmunoblot法で確認した.筋凍結切片を使用して免疫組織化学を行った.二次抗体にはVecstainABCキットとを使用した.Deoxycholateで抽出したCa-pump蛋白は主として100KDよりなり,少量の51KD, 30KDの蛋白を混じていた.Immunoblotでは, 100KDの主バンドが濃染し,これより,高分子領域, 70KD, 53KD, 27KDに淡染するバンドをみとめた.免疫組織化学により筋線維タイプとCa pump蛋白の分布を検討した.タイプ2はタイプ1に比し濃染した.この差は抗ラット抗体でより著明であった.タイプ2Aと2Bでは染色性に差はない.タイプ2Cには種々の程度の染色性があった.周期性四肢麻痺にみられたtubulur aggregatesは濃染し,この構造物のSR起源が示唆された.DMDでは全ての筋線維タイプでCa pump蛋白の染色体の低下がみられた.硝子化線維では分節性に濃染した. Ca pump蛋白の合成は細胞内Ca濃度により調節されるとの仮説がある.DMDにおけるCa pump蛋白合成の調節異常を示唆する所見と考えている.なお今回使用した抗Ca pump蛋白抗体は筋肉以外では血管内皮あるいは神経軸索を認識したことを付記する.1)mdxマウスmaxマウスの骨格筋に対して上記抗体を使用して免疫組織化学を行った。Duchenne型筋ジストロフィー(DMD)の場合と同様に白筋線維においても、免疫染色の低下をみとめた。組織化学的にmyosinATPase (pH10.4 preincubation)を比較すると、mdxでは対照より活性低下を呈した。このようにmdxの骨格筋には複数の形質に異常が観察される。おそらく筋細胞の分化に問題があるものと推定している。mdxのスキンドファイバーを使用して、caffeine拘縮を分析した。mdxにおいてもDMDの場合と同様にcaffeine拘縮の亢進を観察した。SR変性に随伴する非特異的現象かあるいは筋ジストロフィー特有な現象かを決定する必要がある。2)神経組織のCa-ATPase蛋白の分布抗SR・Ca-ATPase蛋白抗体を使用して、神経組織における共通抗原の分布をimmunablotにより検討した。対象とした組織はマウス大脳・小脳・脊髄・末梢神経である。100KDのCa-ATPase蛋白はいずれにも存在しなかった。36KDのバンドが免疫染色された。
液相乱流中の物質拡散・反応過程の解明と確率モデルの構築に関する研究

本研究では,液相における反応性乱流拡散場の状態を明らかにすることを目的として,吸光スペクトル法による多成分濃度同時測定システムの開発を行った。さらに,反応性乱流拡散場の確率モデルを構築するために,確率密度関数(PDF)法により格子乱流中におけるマルチプルーム拡散場を対象とした数値計算を行い,その有効性を検証した。本研究では,基本的なせん断乱流である噴流を対象として,吸光スペクトル法による多成分濃度同時測定を行い,液相における反応性乱流拡散場の状態を明らかにすることを目的として,実験および数値計算を行った。本年度はまず,高時間・高空間分解能の2成分濃度同時測定システムの開発を行った。分解能を向上させるために,今回新たに光ファイバープローブを本研究費により製作した。従来の直径0.5mmの光ファイバーをまず50μmにすることにより,検査体積を約1/100に小さくすることができる。しかし,検査体積を小型化すると光量も減少するため,従来のハロゲンランプでは,高精度な濃度測定は不可能である。そこで本研究では,光源として固体レーザーやレーザーダイオードを用いた2成分の濃度測定システムを開発した。開発した濃度測定システムにより,染料であるアシッドブルー9とエリスロシンBの混合液の濃度を測定した結果,最大約5%の誤差で濃度測定が可能であることがわかった。誤差の原因を検討したところ,受光系のフィルターが2種のレーザーダイオードの光を完全に分離できていないことが原因と考えられた。来年度は,受光系のフィルターを見直すことにより,より高精度な濃度測定システムに改良する予定である。また,数値的研究では,フィルター化密度関数による反応性拡散場のモデリングを行うために,まず平均せん断のない格子乱流中におけるマルチプルーム拡散場を対象とした数値計算を行った。本年度は,現在提案されているIEMモデルを液相反応性乱流に適用し,これまでの実験と比較することにより,その有効性を検証した。本年度は昨年度に引き続き,高時間・高空間分解能の2成分濃度同時測定システムの開発を行った。昨年度は,分解能を向上させた光ファイバープローブを製作し,光源として緑色の固体レーザーと赤色のレーザーダイオードを用いた2成分の濃度測定システムを開発した。そのため,本年度は受光系のフィルター光学系を見直し,2種のレーザーダイオード光の分離効率を高めた。さらに,測定対象である染料も見直し,エリスロシンBからアシッドオレンジ20に変更した。その結果,濃度の誤差を約3%程度まで小さくすることが可能となった。また,数値的研究では,フィルター化密度関数による反応性拡散場のモデリングを行うために,引き続き平均せん断のない格子乱流中におけるマルチプルーム拡散場を対象とした数値計算を行った。IEMモデルに加え,修正Curlモデルを液相反応性乱流に適用し,これまでの実験と比較することにより,その有効性を検証した。
安定同位体トレーサー法によるヒスチジンの体内動態とヒスチジン血症の診断法開発研究

Histidine ammonia-lyase (ヒスチダーゼ)はL-ヒスチジン(His)からウロカニン酸(UA)への非酸化的脱アミノ化反応を解媒する。ヒスチジン血症は本酵素の欠損により、この過程が障害されている先天性代謝異常症である。安定同位体トレーサー法によるヒスチジン血症の診断法確立過程で安定同位元素(SI)標識HisおよびUAの合成法を開発した(昭和61年度)。投与用の候補として2種類のSI標識His (〔β、β、5-^2H_3、3-^<15>〕Hisと〔β、β-^2H_2、1、3-^<15>N_2〕His)、GC-MS分析の内部標準物質として〔α、β、5-^2H_4、1、3-^<15>N_2〕His、さらにSI標識UAとして、〔β、5-^2H_2、β-^<15>N〕UAおよび〔α、β、5-^2H_3、1、3-^<15>N_2〕UAをそれぞれ合成した。次にヒトへのSI標識Hisの投与を前提に、血中のHisとUAいずれも注入量で50pgであり、Hisの分析においてはintraassayとしてCV=2.53.9%、interassayとしてCV=1.11.4%また予測値との相対誤差は5%以内という高い分析精度を提供した。さらに血中からのHisとUAの抽出・精製、GC誘導化法の一連操作を共通化することができたことから、HisとUAの両者について、投与由来(標識体)と内因性由来のものとを区別しながら同時定量できることを明らかにした。次に投与用のSI標識Hisを基質としてヒスチダーゼ(Pseudomnas fluorescens)による(in vitro)、Hisのアミノ基脱離反応機構を明らかにした(昭和63年度)。〔β、β、5-^2H_3、3-^<15>〕Hisを基質とした時、代謝物UAの5位重水素が4050%程度脱落したことから、本代謝反応はβ5位に非局在化したカルバニオン中間体を経るstepwise機構で進行することが明らかとなり、従来の協奏反応機構説は否定された。この知見は、ヒスチジン血症患者におけるheterogeneityの問題をヒスチジンの速度論的体内動態のみならず、代謝機構の両面からアプローチすることができることを示しておりヒスチジン血症の診断法確立に際し、重要な手がかりが得られるものと考えられる。この点は今後の研究課題である。
きょうだいは心理的バランスをとりあうか～同胞葛藤に関する新たな査定法の開発

きょうだい関係,なかでも,きょうだい間の葛藤は,心理臨床相談の上で重要な意味をもっている。そのことは経験上は知られているが,これを査定する有効な方法は確立されていない。本研究は,きょうだい葛藤に関する新しい査定法を開発することをめざした。基礎的なモデルを確立するために,同性2人のきょうだいに焦点を絞り,3人の研究者がそれぞれ専門とする領域からのアプローチを行った。研究成果として,きょうだい間葛藤をとらえるために有効な軸が抽出された。対比性,同調性,操作性,支配性,両義性,依存性などである。今後これらを臨床仮設の中に構造的に位置づけ,査定法を確立することが必要である。従来,主として2者関係ーとりわけ親子関係ーを前提として理論的にも実践的にも展開してきた心理臨床相談において,きょうだい関係という「ななめの関係」を考慮に入れることは重要な意味をもっており,不登校,障がい児,DVなど,さまざまな臨床場面においてその重要性が経験的には知られている。一方,これらを実証的に検討・検証する際に欠かせない「きょうだい関係をとらえる指標」についての研究は非常に少ない。本研究は「きょうだい間に仮定される心理的バランス」に着目し,その査定法を新たに構築するべく取組みを続けてきた。複雑な関係性を指標化して評定(可能な範囲で数値化)する試みなので,初期モデルとしては,2人同性きょうだい間の「対比性と同調性」という単純化した仮定から出発している。平成24年度においては,次の3つの研究を組織的に進め,それぞれに一定の成果が得られた。A)サブカルチャー領域の嗜好に基づく査定法の開発(主に研究分担者/岩宮恵子担当)多くの面接相談事例を通じ,漫画や音楽などで,きょうだい間での嗜好の違いや同調がみられる事例の収集を行った。サブカルチャー領域以外(ex.生活習慣や学習における志向性など)にも注目した方が有益であることが示唆された。B)描画や箱庭を用いた査定法の開発(主に研究分担者/三宅理子担当)描画や箱庭の記録等から,きょうだい間の対比性や同調性の指標が得られるかどうかについて検討を重ねた。しかしながら,査定法に活かせるような指標を見出すことは非常に困難で,またそのための同一課題をきょうだいに同時に課す方法も査定法としては実施が難しいとの結論に至った。C)文献からの指標収集に加えて,これまでに開発された親子関係を中心とする本邦の査定法を精査し,きょうだいというななめの関係を加えた親子関係査定の可能性について検討を行った。保育所における予備調査が終了した段階である。心理臨床相談の文脈において「きょうだい関係」の重要性について経験的に知られてはいたが,これを実証的に検討・検証するための指標は開発されていない。本研究は「きょうだい間に仮定される心理的バランス」に注目し,その査定法を新たに開発することを目標に,次のACの3つの研究を組織的に進めた。その際,個人内指標ではなく,「関係性」を測定する指標の開発をめざした。初期モデルとして同性2人のきょうだい関係に単純化した形で指標開発に取り組んだ。A)サブカルチャー領域を中心とした事例データ収集に基づく指標の開発:多くの面接相談事例を通じ,漫画,音楽,アイドルグループ等に対するきょうだい間での嗜好の違いや同調がみられることに着目し,事例の収集・分類・分析を試みた。結果的には,より広い生活習慣や学習における志向性を取り込んで指標化した方が,臨床上,有益であることが明らかになった。B)描画や箱庭を用いた指標の開発:描画や箱庭の記録等から,きょうだい間の葛藤などの関係性が読み取れることが多くあることから,何らかの指標が可能と考えた。しかし投影法指標は各枠組み内で固有の意味を付与されているため,その切り取りは極めて困難であることがわかった。最終年度に研究分担者が転出したため,研究Bは研究A(ケース研究)に含めて考察することとした。C)質問紙や臨床観察のための指標の開発:きょうだい間葛藤を扱った文献及び保育所での観察等を通して,客観的測度を得ることを試みた。以上3つの取組を通じ,きょうだい関係に関する臨床的に有意味な指標を列挙することができた。しかしいずれも一定の状況・関係性・臨床構造の中でしか意味をもたないため,その枠組みの構築を試みた。たとえば「対比性」「同調性」「操作性」「支配性」「両義性」「依存性」などである。これらを全体的に構造化された臨床仮説の中に位置づける作業が課題として残った。何らかの心理的問題を抱えた子どもの"きょうだい"に対する心理臨床的支援の必要性・重要性は多くの心理臨床家の認識するところである。

その一方,臨床心理学領域では,こうした膨大な臨床経験上の事実とは対照的に,これらを実証的にとらえ理論化し検証する研究は少なく,当該事例のセラピーを進める上で,きょうだい関係にどのようにアプローチすることが適切か(あるいは効果的か)を示唆してくれる査定法ーすなわち「きょうだい関係をとらえるための査定法」は見当たらない。本研究は以上のような問題意識に基づき「きょうだい間の対比性と同調性に関する査定法」の開発をめざしており,平成23年度は次の3つの研究を進めた。A.サブカルチャー領域の嗜好に基づく査定法の開発(主に研究分担者/岩宮恵子担当):思春期の子どもの相談の中で,漫画やドラマあるいはアイドル等の嗜好が当該事例ときょうだいとの間で相違したり一致したりする例を収集し,分析を開始した。サブカルチャー的素材(漫画等)は,そのときどきの流行によって左右されるため,査定法として適切な次元及び検査刺激(図版等)をどう抽出・設定するか,という課題が明らかになった。B.描画や箱庭を用いた査定法の開発(主に研究分担者/三宅理子担当):相談事例の中から,問題を理解する重要な要因として"きょうだい間の葛藤"が想定される事例を抽出し,その箱庭や描画について分析を進めた。その上で相談事例に加え,きょうだいの描画等を収集するし,対比性と同調性の視点からきょうだい間葛藤の解釈が可能かどうか検討する段階に進む準備が整った。C.質問項目及び臨床観察項目による査定法の開発(主に研究代表者/肥後功一担当):当初予定していた発達心理学,社会心理学領域に加え臨床心理学領域の文献も加え,当該領域の研究史を整理し「きょうだい関係に関する査定尺度項目・観察項目」の収集を行った。3つの研究のうちAにおいては,多くの知見が得られる事例が豊富に収集されており,概ね順調である。ただし指標を得るべき領域について,当初予定していた「サブカルチャー」を超えて,より広範に捉えた方が有益であるとの分析結果が得られたため,当初よりも指標の絞り込みが遅れている。またBは,描画法・箱庭などの制作過程や作品から,きょうだい間で比較可能な指標を得ていく試みであるが,2年間,膨大な分析を行ったにもかかわらず,有効な指標が得られなかった。もちろん,研究的な対比を目的として,きょうだいの双方に同じテーマの描画を求めた結果を比較したり,異なる時期に制作を求めた箱庭を比較したりすることによって,きょうだい関係のダイナミクスが理解されたり,あるいは同胞葛藤のテーマを見出すことができたり,といった経験は少なからずあり,こうした手法の有効性は十分にうかがえた。しかしながら一方,指標が絞り込めない以上,描画法・箱庭などを(簡略化した方法にせよ),きょうだいに同じように適用していこうとする査定法は,研究的には取り組めても,現実的な臨床場面での適用は非常に困難であると考えられた。この点が「遅れている」と評価せざるを得ない1つの背景となっている。Cについては,概ね予定どおりに進捗しているが,研究代表者が平成24年度から大学理事に就任したため,当初のように保育現場への観察・データ収集に向かうことが困難となり,試作した指標の有効性を検証するためのデータ集積が不十分であり,その点で計画に遅れを生じている。平成23年度は研究の取りかかりの年であり,3つの研究それぞれの目標は概ね達成されている。
ポルフィリン―ヘテロポリ酸複合集積体の構築と機能開発

1.4つのメソ位にp-メトキシフェニル基を導入した新規サドル型ドデカフェニルポルフィリン(H_2DPP)誘導体、H_2(TMDPP)及びそのスズ(IV)錯体([Sn(TMDPP)(OMe)_2])を合成した。その[Sn(TMDPP)(OMe)_2]と、ケギン型ヘテロポリ酸(POM)である(NBu_4)_3[PW_<12>O_<40>]がPhCN中で1:1の錯形成を行った後、[Sn(TMDPP)]から[PW_<12>O_<40>]^<3->への光誘起電子移動が進行することを、フェムト秒過渡吸収スペクトル測定により明らかにした。2.[Mo^V(DPP)(O)(H_2O)]ClO_4は、PhCN中でのケギン型ヘテロポリ酸[SW_<12>O_<40>]^<2->とのアニオン交換により、アクア配位子とヘテロポリ酸の末端オキソ配位子との間の水素結合による1:1超分子を形成することがわかった。結晶中では、ポルフィリン環同士の分子間π-π相互作用によりポルフィリンナノチューブが形成され、チューブ状の親水性空間に、[SW_<12>O_<40>]^<2->が水素結合により包接された複合超分子構造が観測された。3.ルテニウム置換POMと2つの[Mo^V(DPP)(O)]^+からなる複合集積体を合成し、PhIOを酸化剤とするベンジルアルコール類のベンズアルデヒド類への触媒的酸化反応を開発した。この触媒反応は、ベンジルアルコールと触媒とのアダクト形成を経由して、ベンジル位の水素引き抜きが律速段階となっていることを明らかにした。光誘起電子移動反応において電子供与体となる、非平面性ドデカフェニルポルフィリン(H_2DPP)及びその誘導体を配位子とするスズ(IV)錯体を合成した。酸化電位を低下させるため、メソ位フェニル基及びβ-位フェニル基のパラ位にメトキシ基を導入したH_2DPP誘導体、H_2TMPPh_8P及びH_2DMPPを合成した。合成したスズ(IV)-DPP錯体について、吸収、発光、及びNMRスペクトル測定等によるキャラクタリゼーションを行った。特に、H_2TMPPh_8Pを有する[Sn(TMPPh_8P)(OCH_3)_2]については、元素分析、電気化学測定、X線結晶構造解析によるキャラクタリゼーションも併せて行った。ケギン型ヘテロポリ酸であるリンタングステン酸[PW_<12>O_<40>]^<3->と[Sn(TMPPh_8P)(OCH_3)_2]が、アセトニトリル中で1:1錯体を形成することを明らかにした。さらに、フェムト秒及びナノ秒過渡吸収スペクトル測定により、スズポルフィリンからヘテロポリ酸への光誘起電子移動反応の光ダイナミクスについて明らかにした。励起波長430nmにおけるフェムト秒過渡吸収スペクトル測定の結果、ポルフィリン錯体の励起一重項の減衰過程でへテロポリ酸への電子移動は観測されず、ポルフィリン錯体内での項間交差が進行する事が分かった。しかし、励起波長430nmにおけるナノ秒過渡吸収スペクトル測定の結果、ポルフィリン部位の三重項励起状態の減衰の速度定数が、添加するへテロポリ酸濃度増加に伴って飽和挙動を示した。このことからポルフィリン部位の三重項励起状態からの電子移動に先立って錯形成平衡が存在することが示唆された。すなわち、ポルフィリン部位からへテロポリ酸への分子内光誘起電子移動が進行している事が強く示唆された。この結果は、ポルフィリン錯体からヘテロポリ酸への分子内光誘起電子移動が速度論的に明確に示された初めての例である。3.ルテニウム置換POMと2つの[Mo^V(DPP)(O)]

^+からなる複合集積体を合成し、PhIOを酸化剤とするベンジルアルコール類のベンズアルデヒド類への触媒的酸化反応を開発した。この触媒反応は、ベンジルアルコールと触媒とのアダクト形成を経由して、ベンジル位の水素引き抜きが律速段階となっていることを明らかにした。
トランスジェニックマウス由来の胃表層粘液細胞株はどのようにムチンを合成分泌するか

温度感受性SV40ラージT抗原遺伝子を持つトランスジェニックマウスの胃から樹立された細胞株、GSM06、が合成するムチンの解析を目的に、以下に示す実験を行った。先ず、GSM06細胞を放射性グルコサミンの存在下で培養し、合成された放射能標識高分子の性質を調べた。細胞内と培養液の両方にセファロースCL-4Bクロマトグラフィーでボイド画分に溶出される放射性高分子の存在が確認された。この高分子はCsTFA密度勾配遠心法においてムチンよりも高密度の画分に移動した。また、セファロースCL-2Bクロマトグラフィーでもボイド画分に溶出され、その分子量が1千万以上であることがわかった。そのサイズは、トリプシン消化や還元剤であるDTT処理でも変化しなかった。さらに、グリコサミノグリカン分解酵素による分解実験を行なった結果、ヒアルロナン特異的分解酵素により消化された。以上の結果から、標識高分子はムチンではなくヒアルロナンであると同定された。次に、温度感受性SV40ラージT抗原遺伝子の発現とヒアルロナン合成との関係について検討した。GSM06細胞は、SV40ラージT抗原遺伝子産物が機能せず細胞増殖が起こらない高温(39°C)において、増殖が起こる33°Cよりもヒアルロナンを多く合成・分泌した。以上、得られた結果は、当初めざしたGSM06細胞が合成するムチンの解析という目的には適わないものとなったが、GSM06細胞の分化とヒアルナン合成の関係という興味深い研究課題を提供した。今後の発展が期待される。粘液産生細胞株GSM06の培養系を確立し、以下に示す実験を行った。先ず、通常のホルマリン固定および粘液固定法であるカルノア固定を行った細胞をPASで染色し、培養時間による染色の変化を検討した。PAS陽性物質は細胞がコンフル-エントになると出現し時間とともに増加したが、予想に反し大部分はカルノア液では固定されなかった。PAS陽性物質の同定を目的に、細胞をグアニジン塩酸/トリトン溶液で抽出し、抽出物をゲルろ過クロマトグラフィーにかけドットプロット法で分析したところ、PAS陽性物質の大部分は低分子物質(おそらくは糖脂質)であることがわかった。しかし、ムチンの溶出位置にもわずかではあるがPAS陽性物質が認められ、この細胞のムチン産生が用いた培養条件で抑えられていると考えた。一方、平行して行った放射性グルコサミンによる標識実験では、培養液に放射性高分子物質の分泌が確認された。分子量が1千万以上であり、ムチンである可能性が考えられたが、グリコサミノグリカン分解酵素で分解されることからこの可能性は否定された。そこで次にGSM06細胞がムチンを産生する条件の検討を行った。種々の条件下で細胞を培養し標識実験を行った結果、コラーゲンゲル浮遊培養において培養液中に分子量200-300万の放射性物質が分泌されることが明らかとなった。この物質の同定は現在進めているところであるが、培養条件を変えることによりGSM06細胞がムチン産生を大きく増大させる可能性が生じてきた。この結果は、本実験が当初目的とした粘液細胞における粘液の合成・分泌の制御機構の解明に加え、ムチン産生発現機構(分化機構)をも明らかに出来る可能性を示しており、次年度に期待したい。

細胞内と培養液の両方にセファロースCL-4Bクロマトグラフィーでボイド画分に溶出される放射性高分子の存在が確認された。この高分子はCsTFA密度勾配遠心法においてムチンよりも高密度の画分に移動した。また、セファロースCL-2Bクロマトグラフィーでもボイド画分に溶出され、その分子量が1千万以上であることがわかった。そのサイズは、トリプシン消化や還元剤であるDTT処理でも変化しなかった。さらに、グリコサミノグリカン分解酵素による分解実験を行なった結果、ヒアルロナン特異的分解酵素により消化された。以上の結果から、標識高分子はムチンではなくヒアルロナンであると同定された。次に、温度感受性SV40ラージT抗原遺伝子の発現とヒアルロナン合成との関係について検討した。GSM06細胞は、SV40ラージT抗原遺伝子産物が機能セズ細胞増殖が起こらない高温(39°C)において、増殖が起こる33°Cよりもヒアルロナンを多く合成・分泌した。以上、得られた結果は、当初めざしたGSM06細胞が合成するムチンの解析という目的には適わないものとなったが、GSM06細胞の分化とヒアルナン合成の関係という興味深い研究課題を提供した。今後の発展が期待される。
腫瘍塞栓性肺微小血管障害（ＰＴＴＭ）における血行動態ならびに背景因子の解明

研究代表者らは肺動脈腫瘍塞栓症の特殊型とされるpulmonary tumor thrombotic microangiopathy (PTTM)の病態生理ならびに肺高血圧発生条件の一端を明らかにすることを目的として、剖検例を用いた系統的解析を遂行した。その結果、極めて予後不良な病態とされるPTTMの発生頻度や血行動態への影響の一端を明らかにすることに成功した。本研究を通じて得られた知見は臨床医への注意喚起に活用できると同時に、将来的なガイドライン等の作製において有益な情報基盤を提供し得る。Pulmonary tumor thrombotic microangiopathy (PTTM)は肺動脈の腫瘍塞栓、内膜肥厚、フィブリン血栓を特徴とする肺動脈腫瘍塞栓症の重篤な特殊型であり、その予後は極めて不良とされる。特に、肺動脈の改築が肺高血圧を招来すると推測されているが、両者の関連について詳細な研究は行われていない。本研究ではPTTMによる、肺動脈の構築および血行動態に与える影響を解明すべく、胃癌剖検例を用いて詳細な病理組織学的解析を遂行した。(東邦大学医学部倫理委員会承認済、承認番号: 23002、課題名:剖検例を用いた肺腫瘍塞栓性微小血管(PTTM)における血行動態の解析)。肺動脈内に癌細胞が確認される症例を集積した結果、最終的に収集し得た剖検例は51症例であった。この内、約40%の症例で胃癌細胞の定着・増殖による線維性内膜肥厚ならびにフィブリン血栓が確認でき、PTTM症例であることが判明した。次いで、研究代表者らは本例がどのように血行動態へ影響するか明らかにすべく、渉猟し得た51症例の右心室厚を計測し、PTTM症例では有意に右心室が厚くなることを明らかとした。肺動脈内腔に認める胃癌細胞を循環している状態と理解するならば、胃癌細胞は肺動脈内腔を循環するだけでは肺動脈狭窄を招来せず、肺動脈に定着、増殖し間質を誘導することにより血管を狭窄させるものと推測される。以上、ひとたび胃癌細胞が肺動脈に定着、増殖することで肺動脈狭窄が起こり肺高血圧を招来するものと推測された。本研究では、極めて予後不良な病態とされるPTTMの発生頻度や血行動態への影響の一端を明らかにする事に成功した。得られた知見は臨床医への注意喚起に活用できると同時に、将来的なガイドライン等の作製において有益な情報基盤を提供し得る。本研究はPTTMの病態解明を目的としており、研究代表者らは東邦大学医療センター大森病院で保管する剖検例を対象とし、胃癌に由来する肺動脈腫瘍塞栓症例の集積を試みた(東邦大学医学部倫理委員会承認済、承認番号: 23002、課題名:剖検例を用いた肺腫瘍塞栓性微小血管(PTTM)における血行動態の解析)。その結果、胃癌に由来する肺動脈腫瘍塞栓症例を53症例集積することに成功し、その内PTTM症例は24症例であった。さらに、本例がどのように血行動態へ影響するか明らかにすべく、渉猟し得た53症例の右心室厚を計測し、PTTM症例では有意に右心室が厚くなることを明らかとした。今後は肺動脈に対する二次元形態学的解析ならびに3DマイクロX線CTによる病変分布の立体的な解析を行い、肺動脈病変に由来する血行動態の詳細な変化ならびに病態情報の明確化を試み、本症の早期診断ならびに治療法確立に貢献したい。平成24年度はpulmonary tumor thromboticmicroangiopathy (PTTM)症例を含めた胃癌に由来する肺動脈腫瘍塞栓症例を53症例集積し得た。この結果は当初の計画以上の症例集積数である。さらに、右心系の血行動態に対する客観的指標として右心室厚を用いて計測したところ、PTTM症例では有意に右心室厚が厚くなる事が判明し、これまでに報告の無いPTTMと血行動態の関係の一端を明らかにすることができた。一方、当初予定されていた肺動脈の二次元形態学的解析(肺動脈内径ならびに狭窄率の測定)に関しては渉猟し得た症例の約1/4の達成に留まっており、免疫組織学的解析ならびに3DマイクロX線CTによる病変分布の立体的な解析に関しては十分なデータが得られていない。今後は得られた結果を基に肺動脈病変に由来する血行動態の詳細な変化ならびに病態情報の明確化を試みるが、総じて予定計画年数の半分が経過した時点の達成度としてはおおむね順調であることから、上記達成度とした。平成24年度はPTTM症例を含めた胃癌に由来する肺動脈腫瘍塞栓症例を53症例集積し、当初の計画以上の症例集積に成功した。しかしながら、肺動脈に対する二次元形態学的解析が十分でないこと、免疫組織学的検索ならびに3DマイクロX線CTによる病変分布の立体的な解析に関しては十分なデータが得られていないことから、今後これらの解析に着手する。