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Wnt5aシグナルによるがんの悪性化の分子機構の解明とその分子標的薬の開発

がんをはじめとする種々の疾患において分泌蛋白質Wnt5aの高発現と病態の悪性化との関連が示唆されている。本研究において1)上皮細胞におけるWnt5aとその受容体の輸送機構とWnt5aによる細胞-基質接着の制御機構、2)Wnt5aによる新規がん細胞増殖機構、3)Wnt5aシグナルを高感度に検出するスクリーニング系の開発ならびにWnt5aシグナル阻害化合物の同定、4)腸管炎症病態におけるWnt5aシグナルによる増悪化機構の四点を明らかにした。これらの研究成果はWnt5aが関与する成体の様々な疾患の分子機構の解明に貢献し、Wnt5aシグナルを標的とする阻害剤開発に寄与すると考えている。平成25年度は、平成25年10月21日に内定通知があり平成26年7月末まで繰り越して、交付申請書に記載した研究計画にしたがって実験を遂行し、下記の成果を得た。1)Wnt5aの分泌機構を明らかにするために、精製Wnt5aタンパク質の翻訳後修飾を質量分析法により同定した。Wnt3aやWnt11と同様に、Wnt5aも244番のセリンにパルミトレイン酸が付加されていた。また、Wnt5aの114番と326番の高マンノース型、312番のNに混成型糖鎖が付加されていた。2)Wnt5aの分泌阻害化合物の探索において、Wnt5aを検出するハイスループットのELISAアッセイ系を構築し、15,000化合物のスクリーニングを実施した。その結果、細胞毒性が低く濃度依存性にWnt5a分泌を抑制する4化合物を同定した。Wnt5a-受容体結合阻害化合物の探索では、受容体の細胞外領域にIgGのFc領域を融合させたタンパク質を固相化し、Wnt5aと受容体の結合を検出するELISAアッセイ系を構築した。このアッセイ系をハイスループット化し、2,000化合物についてテストスクリーニングを行った。その結果、濃度依存性にWnt5aと受容体の結合を阻害する3化合物を見出した。3)塩野義製薬との共同研究による抗Wnt5aモノクローナル抗体の作製については、ファージディスプレイ法により8種類のFab抗体クローンを選別した。ELISAおよびウエスタンブロット法により、7種類のFab抗体クローンがWn5aを認識することを確認した。さらに、その中からin vitroにおいて胃癌細胞の浸潤能を阻害するFab抗体クローンを1種類選別した。昨年度私共はWnt5aの翻訳後修飾を質量分析法によって明らかにした。本年度は、極性化した上皮細胞においてWnt5aはクラスリンとAP-1を介して側底部へ分泌されることを見出した。また、Wnt5aの発現抑制によるMDCK細胞のシストにおける内腔形成の遅延に対して、頂端側に分泌されるWnt5a変異体(Wnt5aL68N)の発現ではレスキューできないが、側底側に分泌される野生型のWnt5aによってレスキューされた。さらに、極性化されたMDCK細胞においてWnt5a受容体のFz2とRor2受容体が側底側に局在することを見出し、側底側においてWnt5aシグナルが活性化されるとFAKとPaxillinのリン酸化やRac1の活性化が促進されることを明らかにした。昨年度、Wnt5aと受容体の結合を阻害する3種類の化合物を見出したが、これらの化合物のIC50は0.92.8 μMであった。Wnt5a高発現胃癌細胞であるKKLS細胞に対して化合物による浸潤能への抑制効果をinvasion assayを用いて検討したところ、10μMの濃度において3種類の化合物はいずれも浸潤能を抑制した。Wnt5a/Ror2のシグナルを検出するS/B比の高いレポーターシステムを構築するため、Ror2-LRP6キメラ遺伝子およびSuperTopflash遺伝子を安定に発現するCHO細胞株を樹立した。この細胞株で内在性に発現するWnt5a受容体であるFz2をsiRNAによりノックダウンすることにより、Wnt5a依存性レポーター活性は有意に減弱した。塩野義製薬と共同研究した抗Wnt5aモノクローナル抗体もついては、エピトープ部位をペプチドアレイ法により同定し、モノクローナル抗体がWnt5aによる受容体エンドサイトーシスを阻害することを明らかにした。さらに、本抗体は胃癌細胞のマウスでの転移能を抑制することを示した。昨年度に塩野義製薬と共同研究した抗Wnt5aモノクローナル抗体に関して、本年度はその抗腫瘍効果に関して検討を行った。私共の研究から、Wnt5a高発現子宮頸癌細胞株HeLaS3細胞ではWnt5aが転移・浸潤能に加えて細胞増殖を制御することが判明している。そこで、Wnt5aモノクローナル抗体をHeLaS3細胞に作用させ、上述の細胞現象に対するその中和活性を検討した。その結果、抗Wnt5aモノクローナル抗体はWnt5aによる転移・浸潤能は減弱させる一方、細胞増殖には中和活性を示さなかった。この原因を解析した結果、Wnt5aによる細胞増殖制御には受容体エンドサイトーシスを介さないことが判明し、その下流でSrc familyの活性化が関与することが明らかになった。したがって、昨年度の研究成果とあわせて、Wnt5a依存性の受容体エンドサイトーシスを介する経路が癌細胞の細胞運動を、介さない経路が細胞増殖を制御することが判明した。

また、Wnt5aシグナルと種々の炎症病態との関連が示唆されているが、私共は薬剤誘発性腸管炎症モデルにWnt5aとその受容体Ror2の様々なコンディショナルノックアウトマウスを導入し、腸管炎症におけるWnt5aシグナルの機能を個体レベルで解析した。その結果、炎症時に線維芽細胞から分泌されたWnt5aが樹状細胞に作用することでIFN-γシグナルの応答性が増強し、樹状細胞のIL-12産生が促進することが判明した。IL-12はTh1細胞への分化を誘導し炎症応答を促進することから、Wnt5a-Ror2シグナルが腸管炎症病態の増悪化に関与することが明らかになった。本研究課題によって、Wnt5aによる細胞極性と癌細胞増殖の新規制御機構が明らかとなり、さらに個体レベルでのWnt5aによる炎症応答制御機構が明らかになった。がんをはじめとする種々の疾患において分泌蛋白質Wnt5aの高発現と病態の悪性化との関連が示唆されている。本研究において1)上皮細胞におけるWnt5aとその受容体の輸送機構とWnt5aによる細胞-基質接着の制御機構、2)Wnt5aによる新規がん細胞増殖機構、3)Wnt5aシグナルを高感度に検出するスクリーニング系の開発ならびにWnt5aシグナル阻害化合物の同定、4)腸管炎症病態におけるWnt5aシグナルによる増悪化機構の四点を明らかにした。これらの研究成果はWnt5aが関与する成体の様々な疾患の分子機構の解明に貢献し、Wnt5aシグナルを標的とする阻害剤開発に寄与すると考えている。線維芽細胞を用いた解析から、Wntは小胞体からゴルジ体への輸送にTMED5(transmembrane emp24 protein transport containing domain 5)、ゴルジ体から細胞外への輸送にはWntlessが関与することは報告されているが、詳細な分泌機構は明らかにされていなかった。一方、極性化された上皮細胞において膜タンパク質や分泌タンパク質がトランスゴルジ網(TGN)から頂端部、あるいは側底部へ異なる機構で選別輸送される。これまでに、Wntシグナルが細胞極性の制御に重要な機能を果たしていることは示されてきたが、Wnt自身が極性化された上皮細胞において頂端部または側底部のいずれに分泌されるかは解析されていない。また、Wntはアスパラギン結合型糖鎖が付加されるが、Wntの糖鎖構造と細胞内輸送との関連は不明であった。私共はこれまでにWnt3aとWnt11の脂質修飾ならびに糖鎖修飾の上皮細胞の極性分泌における役割を明らかにした。本年度に、Wnt5aの翻訳後修飾を決定できたので、脂質修飾と糖鎖修飾Wnt5aの分泌機構を解明できると考えている。また、すでに構築していた分泌されたWnt5aを定量するHTPアッセイ系を用いて、化合物ライブラリーからWnt5a分泌阻害候補分子を4化合物同定した。さらに、Wnt5a-受容体結合を検出するELISAアッセイ系を構築し、濃度依存性にWnt5aと受容体の結合を阻害する3化合物を同定できた。これまで、Wnt5aモノクローナル抗体を作製できなかったが、本年度ファージディスプレイ法を用いてFab抗体クローンを1種類選別できたことは大きな進歩であった。これまでにWnt5aタンパク質の翻訳後修飾の実体やその生理機能の詳細は明らかにされていなかった。本研究により、Wnt5aに付加される脂質や糖鎖修飾を同定して、上皮細胞におけるWnt5aとそれらの受容体の極性輸送の上皮細胞における意義が明らかになった。
p27^<Kip1>新規分子種の同定とがん抑制因子としての機能解明

細胞間接触により増殖を停止したブタ大動脈由来培養内皮細胞からサイクリン依存性キナーゼ阻害因子p27^<Kip1>の新たなアイソフォーム(p27^<Kip1R>)をクローニングした。p27^<Kip1R>のがん抑制因子としての機能を、細胞および個体レベルで明らかにすることを目的として、核移行、細胞周期制御及び分解抵抗性に関わる構造を明らかにした。また、自然高血圧発症ラット(SHR)と正常ラットの大動脈における2つのアイソフォームの発現解析から、組織増殖性とアイソフォーム発現の相関を、個体レベルで明らかにした。1.p27^<Kip1R>は、領域153-168が有意な核移行に必要な配列であることが明らかになった。この領域には塩基性アミノ酸は一残基(K168)しか含まれない。不足する塩基性アミノ酸に代わり疎水性アミノ酸が機能を果たすという点で非典型的な2分裂型核移行シグナルであることを明らかにした。2.GFP発現系を用いて細胞増殖に及ぼす影響を解析し、p27^<Kip1R>の増殖抑制作用を明らかにした。増殖抑制には、p27^<Kip1>と共通のN末端領域が必要である。3.6週齢SHRの大動脈にはp27^<Kip1>が、正常ラットではp27^<Kip1R>が、主なアイソフォームとして発現する。週齢を重ねると、SHRにおいてもp27^<Kip1R>発現が優位になる。正常ラット大動脈を培養するとp27^<Kip1R>が消失し、p27^<Kip1>が主に発現する。個体レベルで、組織増殖性とp27^<Kip1R>発現に逆相関が示唆された。4.Kip1遺伝子全長を決定した。p27^<Kip1R>特異的コード領域がエキソン3に含まれることを明らかにした。プロモーター活性が、細胞間接触により亢進することを明らかにした。この活性増加には、翻訳開始点より上流2000-2350bpの領域が必要であった。
エナメルマトリックスによる歯根吸収抑制メカニズムの解明とその制御

エナメルマトリックスは、歯のエナメル質形成に必須なマトリックス蛋白である。しかしながら、近年遺伝子変異マウスを用いた解析から、これらエナメルマトリックスはエナメル質形成のみならず、細胞の分化や増殖を調節する可能性が示唆されてきた。エナメルマトリックス蛋白の1つである、アメロジェニン欠損マウスでは、歯根表面の吸収が認められる。このことからエナメルマトリックスは、歯根吸収に大きな役割を演じていることが考えられる。実際、エムドゲインと呼ばれるブタのエナメル蛋白抽出物は、歯周組織再生の為に臨床で応用されてきている。しかしながら、その分子メカニズムは全く理解されていない。そこで、本年度は、エナメルマトリックス(アメロジェニン、アメロブラスチン)の破歯(骨)細胞に及ぼす影響についての分子メカニズムの解明を試みた。In vtroの破骨細胞誘導実験により、アメロジェニン分子はその形成に抑制する作用を有していることが明らかとなった。具体的には、アメロジェニンは、破骨細胞の前駆細胞に直接作用する訳でなく、骨芽細胞におけるRANKLおよびM-CSFの発現を抑制した。さらに、骨芽細胞におい細胞外マトリックスの一つであるフィブロネクチンの発現を制御し、その結果、間接的にRANKLおよびM-CSFの発現を誘導していることが判明した。また、アメロブラスチンに関しては、その欠損マウスの解析から、歯槽骨自体の形成が十分に行われないことが分かった。これらの結果から、エナメルマトリックスは破骨細胞の分化のみならず、骨芽細胞の機能維持や分化制御に積極的に関わっている重要な分子であることを明らかにした。そこで、本研究ではエナメルマトリックスの歯根吸収に及ぼす役割を解明することを目的し、エナメルマトリックス(アメロジェニン、アメロブラスチン)の破歯(骨)細胞に及ぼす影響を検討した。マウス歯胚より完全長のアメロジェニン遺伝子をクローニングし、発現ベクターに組み込んだ後、大腸菌システムをもちいてリコンビナント蛋白の合成および精製を行った。マウスの大腿骨骨髄細胞をセファロースG-10カラムを通過させ破骨細胞前駆細胞を調整し、細胞をRANKLおよびM-CSF存在下で、in vitroで破骨細胞形成を行った。この培養上清中にリコンビナントアメロジェニンを添加し、破骨細胞形成能をTRAP染色にて、培養3日目、5日目で評価した結果、アメロジェニンは破骨細胞の分化に全く影響を及ぼさなかった。一方、アメロジェニン蛋白を初代培養骨芽細胞に添加し、この細胞を破骨細胞前駆細胞と共培養を行った結果、アメロジェニン処理群で、破骨細胞の分化が著名に抑制された。以上の結果から、アメロジェニンは破骨細胞前駆細胞に直接作用するのではなく、骨芽細胞を介して破骨細胞の分化抑制に関わっていることが明らかとなった。アメロジェニンを添加した際の、細胞内シグナル分子の一つMAPKinaseのリン酸化を検討した結果、アメロジェニン添加後15分でリン酸化され、このリン酸化を抑制すると、骨芽細胞からのフィブロネクチンの発現抑制が認められ、破骨細胞形成が促進される結果を見出した。このことは、アメロジェニンが増殖因子用の作用を有することを示唆した。

しかしながら、近年遺伝子変異マウスを用いた解析から、これらエナメルマトリックスはエナメル質形成のみならず、細胞の分化や増殖を調節する可能性が示唆されてきた。エナメルマトリックス蛋白の1つである、アメロジェニン欠損マウスでは、歯根表面の吸収が認められる。このことからエナメルマトリックスは、歯根吸収に大きな役割を演じていることが考えられる。実際、エムドゲインと呼ばれるブタのエナメル蛋白抽出物は、歯周組織再生の為に臨床で応用されてきている。しかしながら、その分子メカニズムは全く理解されていない。そこで、本年度は、エナメルマトリックス(アメロジェニン、アメロブラスチン)の破歯(骨)細胞に及ぼす影響についての分子メカニズムの解明を試みた。In vtroの破骨細胞誘導実験により、アメロジェニン分子はその形成に抑制する作用を有していることが明らかとなった。具体的には、アメロジェニンは、破骨細胞の前駆細胞に直接作用する訳でなく、骨芽細胞におけるRANKLおよびM-CSFの発現を抑制した。さらに、骨芽細胞におい細胞外マトリックスの一つであるフィブロネクチンの発現を制御し、その結果、間接的にRANKLおよびM-CSFの発現を誘導していることが判明した。また、アメロブラスチンに関しては、その欠損マウスの解析から、歯槽骨自体の形成が十分に行われないことが分かった。これらの結果から、エナメルマトリックスは破骨細胞の分化のみならず、骨芽細胞の機能維持や分化制御に積極的に関わっている重要な分子であることを明らかにした。
高度技術社会における安全問題

高度技術社会が、技術が社会の隅々にまで浸透している社会であるとするなら、技術的所産と人間との関係こそ着目しなければならない重要な要因になる。安全問題においてヒュ-マン・フアクタ-問題が浮上する由縁でもある。本研究では、人間の挙動を航空事故(アクシデント)及びそれに準じる事態(インシデント)[以下「事故関連」という]から捉え返し、高度技術社会における安全問題への対応の指針とする。具体的な研究手順としては、航空事故関連デ-タを収集し、ヒュ-マン・ファクタ-問題を媒介に事例解析を行ったほか、これらデ-タを系統的に集積・管理すべく、航空事故関連デ-タベ-スの構築について、本年度はデ-タベ-スを実現するハ-ドウェアや関連するソフトウェアの導入手続きを進めた。メイン・プロセッサは、MicroVAXで内部メモリの初年度の容量は28MBで、ハ-ドディスクは同じく550MBである。デ-タベ-ス用の情報検索システムには、マルチ・ユ-ザ型のBASISを用いる。使用するデ-タは、主としてNASA(FAA)やNTSBからのものを用いるので、デ-タ構造等のコンパチビリティに留意している。先端技術事故論の展開については、マクロエンジニアリング学会大規模輸送研究委員会と共催で「大規模輸送における安全問題」をテ-マにしたミニ・シンポジウムを開催し、地下構造物、鉄道、宇宙システム、道路交通などにおける事故解析や諸対策について、議論を深めた。技術の発展の中で、技術システムの外部の人間は云うまでもなく、内部の人間についても、その存在については、取り扱いが困難であるがゆえ後回しにされるか、無視されてきた。しかし、高度技術の進展の中で安全問題は技術システム内外の人間の存在をクロ-ズ・アップする。ヒュ-マン・ファクタ-問題は避けて通ることができないのである。安全問題も結局は「人に始まり、人に終わる」という事なのである。
脳磁計を用いた自閉症スペクトラム障害におけるモラル判断時の脳活動の解明

発達障害があるとモラル判断がうまくできないことが指摘されることから、発達障害の有無でどのようにモラル判断が脳活動として異なるのかを明らかにすることと、どのようにしてモラル獲得がされるのかを明らかにすることが必要であることから、発達障害のある大人と子ども、さらに、発達障害の無い大人と子どもがモラル判断をしている時の脳活動を計測した。現在のところ、発達障害のある大人と子ども、発達障害の無い子どものデータは集め終わり、発達障害の無い成人のデータを集めているところである。まだ、データの解析中であるが、今後は、得られたデータからより良いモラル獲得の方法を教育現場と共に探っていくことを目指している。今回の研究では、道徳的判断における(1)発達的変化と(2)自閉症の有無での違いを脳活動面から明らかにすることが重要である。(1)発達的変化を明らかにするには、就学前のこどもから成人までが被験児・者として存在する必要がある。被験児に関しては、プールが大きくないこと、また、被験児の負担を減らすためにも、他の実験者と被験児および実験時間を共有する必要があるため、被験児・者のリクルートおよび実験方法の集約などを行い、5月からの実験に向けて、準備が整いつつある。また、MEGにおいては、正確な脳活動部位を同定する方法として磁場源推定法がある。これを行うためには、脳の解剖学的情報を得ることが必須であり、MRIを用いて脳構造を撮像する必要がある。MRI撮像は倫理的な問題があるために子どもには適用できないが、成人では必須であるにもかかわらず、MRI装置が壊れたため、修理が必要となり、成人の実験を行えていない。さらに、発達変化を見るためには、子どもと成人が共通する課題を行うことが求められる。そのために、こどもを対象として予備実験を行った結果、呈示された刺激の中に文字(特に漢字)がある場合、こどもは呈示時間内に読みきることが出来ず、結果として、課題遂行が難しいことが分かった。そのため、文章による刺激をあきらめ、就学前のこどもでも理解できるように、文字なしの3コマ漫画による刺激を作成を行っている。(2)自閉症児・者に関するリクルートは、順調に行われているため、比較データが揃うと考えられる。モラルは成長に従って獲得していくものであるが、発達障害を持つ場合、その獲得がうまくできないことが指摘される。その獲得不全の原因を脳機能計測の視点から明らかにするには、定型発達の小児と成人、さらに発達障害のある小児と成人を対象として、モラル判断時の脳活動を計測し、障害の有無と発達変化という二つの要因について比較・検討することが必要である。そして、今回の研究で使用した計測機器はミリ秒単位の時間分解能を持つ脳磁計(MEG)であるが、小児用のノイズが少ない全脳型MEGは日本では金沢大学のみが所有しており、これを小児用計測には使用した。基本的には呈示される3コマ漫画が終わるたびに、その内容に関する善悪判断を行ってもらっていたが、小児には実験中では無く、実験後に内容の確認を行い、成人では実験中のボタン押しによって、内容の確認および反応時間を取得した。最終年度は特に、データの不足している定型発達成人を中心にリクルートし、データの蓄積を行っている。また、先行研究によりオキシトシン投与でモラル判断に変化が起きる可能性が示唆されていることから、発達障害を持つ成人に関しても、金沢大学子どものこころの発達研究センターが行っているオキシトシン投与実験参加者にも参加して貰い、本来の対象であるオキシトシン投与前だけでなく、投与後に変容が見られる可能性を検討するために、データを蓄積している。今回はデータ収集が主になってしまったことから、今後はこのデータを分析・発表していくとともに、モラル獲得が必要な教育現場に応用して貰うために、附属小学校などと連携して、適切な形でデータをフィードバックしていくことを考えている。認知神経科学(1)就学前の児童を対象として予備実験を行った結果、呈示された刺激の中に文字(特に、漢字)があると児童には課題遂行が難しいことが分かったため、就学前児童でも理解できるイラストによる3コマ漫画を作成した。(2)他の実験者と実験時間等を共有するため、進みが遅い。(3)成人用の解剖学的情報を集めるためのMRIが故障したため、成人のデータが集められなくなっている。他の実験と小児被験者を共有しているため、夏休み前後で小児のデータを取り、秋以降に成人のデータをとるように、計測の順序を変更する。初年度において、前述の諸事情により予定していた具体的な実験が行えず、人件費・謝金として計上していた予算を使えなかったことや、予定していた国際学会が4月になったために年度内に計上できなかったことで、結果的に次年度使用額が生じた。予定していなかった被験者共通のイラスト刺激作成費用が発生したので、そこに使えなかったお金を充てる。
『西洋家作ひながた』における建築用語の翻訳とそこに見られる西欧建築概念の受容

初年度は主に『西洋家作ひながた』(玉山堂版)に記載されている建築用語の抽出、および翻訳方法の検討をおこなったが、記載中の訳語については西欧圏にその概念があるとみなされる建築用語に対して、現在の意味から比較してやや持異な訳語があてられている事例を確認できた。たとえば計画的分野に相当する語句living-roomに対応する訳語としては「住居部屋(すまいべや)」があてられており、「居間」という語句は翻訳文中にはいっさい確認できなかった。この他にも建築構造、材料、設備等の建築用語においても同様な形跡が確認できた。また、翻訳方法に関して和語、漢語からの建築用語の翻訳方法の検証を行うための語句整理を行った。その結果訳文中の漢字の語句に対して音読みと訓読みの併記のかたちで左右にルビが振られている事例を約170確認した。またルビの活用の他に訳注をつけて説明を付加している事例を約110確認できた。このようにひとつの語句に対する翻訳方法に違いがみられることから、日本社会の建築用語の知識の実像や訳者の興味の範囲に注目して精査をすることを次年度課題に付加した。最終年度はこれまで抽出した建築用語を整理・分類したうえで原文の建築用語との比較を行い、そして『西洋家作ひながた』刊行当時とその後の英和辞書等に着目することで西欧近代起源の建築用語の移入過程について考察する予定であったが、研究代表者の研究継続不可能事由により補助事業廃止が決定したため、具体的成果創出の機会は見送られた。西欧近代の建築用語のわが国における翻訳実態を精査し、翻訳語を一つの「分析指標」とみることにより西欧建築文化の移入過程の特徴ならびにその受容の特質を明らかにするものであり、その中でも明治5年という突出して早い時期に刊行された翻訳書である村田文夫、山田貢一郎訳『西洋家作ひながた』(原著C.Bruce.Allen, Cottage Building (副題省略))を対象とするものである。本年度は、おもに『西洋家作ひながた』に記載されている建築用語の抽出、および翻訳方法の検討をおこなった。結果、記載中の訳語については、西欧圏にその概念があるとみなされる建築用語に対して、現在の意味から比較してやや特異な訳語があてられている事例を確認できた。この他にも建築構造、材料、設備等の建築用語においても同様な形跡が確認でき、現在これらの訳語を整理・分類して原文との比較作業を行っている。また、翻訳方法に関しては、和語、漢語からの建築用語の翻訳方法の検証を行うための語句整理を行った。その結果、訳文中の漢字の語句に対して音読みと訓読み併記のかたちで左右にルビが振られている事例を約170確認した。このようにひとつの語句に対する翻訳方法に違いがみられることから、日本社会の建築用語の知識の実像や訳者の興味の範囲に注目しながら検証をおこなっていく。次年度は抽出した建築用語を整理・分類したうえで原文の建築用語との比較を行う。そして『西洋家作ひながた』刊行当時とその後の英和辞書等に着目し、西欧近代起源の建築用語の移入過程について明らかにしていく予定である。本年度計画内容については、1)訳者の経歴を含む翻訳環境の再検証、2)『西洋家作ひながた』の書誌学的検討の精緻化、3)翻訳方法の検討、の3項目をあげた。1)と2)の項目に関しては、おもに以下の既往研究調査および内容の整理をおこないつつ現在検討作業を継続している。

(丹羽和彦、「村田文夫と『西洋家作ひながた』について」、日本建築学会大会学術講演梗概集F-2,1999年, pp.339-340.藤田治彦、「明治5年刊「西洋家作雛形」の建築用語」、待兼山論叢33(美学), pp.1-24, 1999年.)3)に関しては文献および史料等の収集を終え、『西洋家作ひながた』掲載中の建築用語の抽出、訳注およびルビの確認等の作業を完了した。現在、同書から抽出した訳語と原著"Cottage Building"掲載中の建築用語との比較作業を行っている段階である。具体的な研究成果の発表にまでは至っていないものの、全体としては次年度の成果のまとめへ向けておおむね順調といえる。原文との建築用語の比較作業および辞書等による検証作業は膨大であることから、一部学生(大学院生)による助力を検討中である。大きくは以下の項目で研究費使用を計画している・翻訳作業の精密化(関連辞書、文献の購入)・学会研究発表関連経費および論文発表投稿費
多様な在地・在野の野外研究者による水田生物多様性変容の謎解き-普通種激減の危機-

まずはカメ類、両生類、畔畔の高等植物、昆虫等について現状の生息状況を在地の多様な研究者と検討した。その結果から、トノサマガエル、イシガメ、チガヤ、ススキ、ヒメゲンゴロウなどの水生昆虫などの水田普通種が地域的に減少傾向であった。これらの普通種減少について、激減仮説(新農薬・侵入生物・栽培環境・圃場整備など)のそれぞれが減少要因に関与していた。減少傾向の種のうち、とくに減少傾向の顕著な種群に悪影響を及ぼす要因について影響評価実験を行った。メソコズムとマイクロコズムを考案し、半致死濃度を求め、ある殺虫剤の悪影響をつきとめた。昆虫種の中には地域個体群の激減に一部の普及農薬の化学成分が影響していた。減少種とその要因の関係性は多様であり、在地の研究者の役割は大きい。本研究は大まかに3段階からなり、第1段階は「疫学的調査」であり、激減が生じている水田普通種の選定を多方面からの調査データから検討する。第2段階は「要因解析」であり、それらの種個体群が激減した原因に関する原因の仮説を複数取り上げ、第3段階の「原因究明実験と成果公表」では検証していくというものであり、初年度は以下のような成果を得ている。1)研究計画書の重点項目にあげていている第1段階の「疫学的調査」と一部の激減種について、第2段階の「要因解析」の段階に研究を進展できる種を選定する作業を進めた。とくに減少傾向が著しかったのは、日本に広く分布する水田の水生昆虫普通種について、近年激減している普通種群の減少傾向の把握ができたともに、第2段階、第3段階について調査・実験を進め、学会でシンポジウムを3件開催し公表を行うことができ、現在投稿論文を執筆中である。2)また、第2段階の要因解析の激減5仮説(新農薬・侵入生物・栽培環境・圃場整備・温暖化)の検証が可能な題材については、多様な在地の調査研究者との交流を進め、チーム編成ができてきたので、データの整理、GIS等による解析を行い、第3段階の原因究明実験を予備実験段階で進めている。具体的には、影響力の大きい侵入種スクミリンゴガイ、水稲害虫防除薬剤の水生昆虫への影響、冬期湛水水田への水田普通種への個体群抑制事例が新たに認められ、最終段階の影響評価実験について、計画2年目は本格的な着手・遂行が期待される。第2段階は「要因解析」であり、それらの種個体群が激減した原因に関する原因の仮説を複数取り上げ、第3段階の「原因究明実験と成果公表」では検証していくというものであり、2年度は第2,第3段階へ移行を進め、以下のような成果を得た。1)研究計画書の重点項目にあげていている第1段階の「疫学的調査」と一部の激減種について、第2、3段階の「要因解析」の段階に研究を進展できる種を選定する作業を進めた。とくに減少傾向が著しかったのは、日本各地に広く分布する水田の水生昆虫普通種であった。近年激減しているこれら普通種群に悪影響を及ぼす要因について、地域に広く普及している農薬成分を特定化し、その影響評価方法としてメソコズムとマイクロコズムを考案し、半致死濃度のデータ収集を進める予備実験を進め、影響評価データを順次生産できる準備ができた。学会でシンポジウムを3件開催し多数の公表を行うことができ、現在投稿論文を執筆中のものがある。CRCからの洋書の一章を担当執筆出版できた。2)また、第2段階の要因解析の激減5仮説(新農薬・侵入生物・栽培環境・圃場整備・温暖化)の検証が可能な題材については、多様な在地の調査研究者との交流を進め、第1段階については学術論文として公表できるものが農薬、圃場整備について4報生産できた。計画最終年度に向けて、影響評価実験の本格的な着手・遂行が期待される。多様なモニタリング主体の協働を進めるためのパタラクソノミスト図鑑を作成し、本研究の推進だけでなく成果の還元の道も開けた。第2段階は「要因解析」であり、それらの種個体群が激減した原因に関する原因の仮説を複数取り上げ、第3段階の「原因究明実験と成果公表」では検証していくというものであり、最終年度はとりまとめの段階へ移行を進め、以下のような成果を得た。

1)第1段階の「疫学的調査」と一部の激減種について、第2、3段階の「要因解析」の段階に研究を進展できる種を選定したところ、とくに減少傾向が著しかったのは、日本各地に広く分布する水田の水生昆虫普通種であった。近年激減しているこれら普通種群に悪影響を及ぼす要因について、地域に広く普及している農薬成分を特定化し、その影響評価方法としてメソコズムとマイクロコズムを考案し、半致死濃度のデータ収集を進め、ある殺虫剤の影響の大きさをつきとめた。学会でシンポジウムを3件開催し(1件は東日本大震災のため中止されたが、24年度に実施)、公表を行うことができ、現在投稿論文を執筆中のものがある。2)また、第2段階の要因解析の激減5仮説(新農薬・侵入生物・栽培環境・圃場整備・温暖化)の検証が可能な題材については、多様な在地の調査研究者との交流を進め、第1段階については学術論文として公表できるものが農薬仮説以外にも、圃場整備と栽培環境について論文を生産できた。3)学会発表以外にも、影響評価実験の本格的な着手・遂行のための現地ワークショップを開催し、多様なモニタリング主体の協働を進めるためのパタラクソノミストの育成や図鑑の作成など、研究の推進だけでなく、多様なモニタリング主体と協働し、激減種の保全に結びつける成果の社会的還元方法についても模索し学会などでアオウトプットした。
１本の毛髪によるストレスの「日輪」の可視化

本研究は、日々成長する毛髪に含まれると推定されるストレス・ホルモンを毛髪の断面により分析することで言わばストレスの変遷(日変化)を可視化しようとする試みである。結論から述べれば、毛髪断面からのストレス・ホルモンの分析における技術的課題をクリアするには至らなかった。しかしながら、今後の課題について明確になるとともに、毛髪断面のアガロース固着によるタンパク質染色方法やストレス・ホルモンの終夜分泌パターンなど、今後、研究を継続する上で有用な技術および科学的知見が得られた。しかしながら、新たに明らかになった課題のいくらかは解決し、また今後の課題について明確になったため、今後、研究を継続する上で有用な成果が得られた。以下にその概要を述べる。第一に、毛髪断面の作成において当初予定していたクリオスタットは毛髪資料の包埋材料に対する毛髪の外側のケラチン構造が固く、断面化することができなかった。しかし、これに対しては後に別の物理的手段を用いて解決し、生体の毛髪を3cm以上作成することが出来るようになった。次に、生体のあらゆる物質の概日変化が毛髪内に記録されているという想定の元、毛髪断面のタンパク質染色を実施した。これについては、当初は染色の効果が認められなかったが、検討を重ねた結果、最終的には断面をアガロース等のゲルで固着することで解決した。しかしながら、断面の染色結果について当初期待していた程、明確な周期的パターンは確認されなかった。この為、特定のタンパク質の概日変化自体を再検証する為の終夜睡眠実験を行ったところ、特定のタンパク質は起床時においてのみ特異的な分泌を示す事が判明し、これはやはり毛髪中にある種の周期的パターンの存在を強く示唆するものであった。現在は抗体による特定のホルモンの蛍光定量分析に取り組んでいるが、両実験を通じて最も困難な課題は、毛髪断面からのターゲット物質の流出を抑制しつつ、可視化する為の染色物質や蛍光抗体物質を毛髪断面まで届ける、というある意味で矛盾した操作を実現しなければならない点である。これについては、今後もいくつかのアイディアを実施する。
ファンデルワールス支持されたナノスライダーの形成とその駆動特性

原子オーダの摩耗を活用した高精度トライボプロセッシングにより、ナノトライボエレメントを試作し、その動作特性を実験的に検討した。(1)層状結晶材料のナノ加工:ナノスライダーを試作するためマイカ(白雲母)、二硫化モリブデンについてナノスケール格子溝の加工実験を行った。加工条件を適正化し、マイカ、二硫化モリブデン結晶の積層単位を加工単位としたナノ加工を実現した。この結果マイカおよび二硫化モリブデンについては、数十nmオーダの平面からなるファンデルワールス力で支持されたナノスライダーを形成した。一方、グラファイト(HOPG;高配向熱分解黒鉛)の加工を行ったが、底面の結合力が大きく、積層単位のナノ加工は困難であった。このため劈開面の積層ステップを活用し、それを起点としたナノスケールの面加工を実現した。(2)ファンデルワールス支持されたナノスライダーの動作確認:格子溝加工により形成されたマイカ、二硫化モリブデンのナノスライダーの中心部に低荷重でチップを作用させ、スライダーを構成する原子のクラスターがファンデアワールス結合部で移動することを確認した。また、HOPGについてはステップにチップを作用させると底面を折り畳むように変形することが明らかになった。(3)トライボケミカルナノ加工の実現:ナノスケールの微細形状創成技術として原子間力顕微鏡(AFM)を用いた加工を発展させ、トライボケミカル反応を活用した新しいナノ加工の可能性を検討した。シリコンについて原子間力顕微鏡(AFM)によるシリコンの隆起と除去現象を取り上げ,隆起高さと除去深さに対するチップ先端半径および荷重依存性を明らかにした。さらにナノ隆起加工特性及びそのメカニズムを追求し、隆起が雰囲気の水または酸素とトライボケミカル反応し、表面に酸化シリコンが形成されるモデルを提案した。本研究では各種の層状結晶材料の原子間結合の異方性を活用し、ファンデアワールス支持されたナノスライダーを試作する。さらにファンデルワールス支持された部分でスライダーが移動することを確認し、その動作時の駆動力および移動距離、変形状態を原子像などの基準スケールと比較することにより定量的に評価する。この結果として各種ファンデルワールス結合を有したナノトライボエレメントの特性を実験的に解明することを目的としている。本年度の成果を次に示す。(1)超硬質膜形成チップの試作:ナノスライダーを加工し、評価する各種硬質膜を形成した原子間力顕微鏡(AFM)用チップを試作した。具体的には立方晶窒化ホウ素(c-BN)、ダイヤモンドライクカーボン(DLC)膜など超硬質膜の製造装置および形成技術を活用し、シリコンを基材として超硬質材料からなる鋭利なチップを実現した。この時、薄膜形成時の条件を適正化し、複雑形状を有するチップに形成された。(2)ナノスライダーの試作:マイカ、二硫化モリブデンの原子オーダの格子溝の加工試験を行った。加工条件を適正化し、層状結晶材料の積層単位を加工単位とした機械加工を実現した。具体的には、マイカを取り上げ層間距離である1nm深さを加工単位とし、深さ1nm,2nm,3nmの格子溝加工を実現した。さらに、二硫化モリブデンについても積層単位である0.616nm深さを単位とする格子溝の加工を実現し、層間のファンデルワールス力で支持されたナノスライダーを形成した。(3)マイカおよび二硫化モリブデンの格子溝加工により形成されたファンデルワールス支持されたスライダーの動作確認:格子溝加工により形成されたナノスライーダーの中心部に低荷重でチップを作用させ、スライダーを移動させた。その後、荷重ゼロでスライダー部の形状を測定し、スライダーの動きを確認した。(4)上記の結果を発展させ、同一チップでシリコン上にナノメータスケールの隆起と溝を形成する条件を明らかにした。
中世書状史料論の展開

1署名・花押総覧の作成:『実隆公記紙背文書花押署名総覧(僧侶女性編)』の刊行に向けての作業を続け、署名・花押の抽出および名寄せの作業を完了し、編集作業を残すのみとなった。ただし、後掲の『実相院文書』の刊行準備を優先したため、2019年度後半の刊行となる予定である。2女房奉書を中心とする仮名消息の読解のための入門的な自習教材の作成:東京大学史料編纂所所蔵『山科家断簡』所収の女房奉書について教材を作成し、研究代表者・末柄のホームページから公開した。今回取り扱ったものは、折紙のものもあり、女房奉書の多様性を示している。また、7月に昨年度の成果にもとづく著書『戦国時代の天皇』を刊行し、天皇自身の筆になる消息や女房奉書を多数活用したが、その研究成果を講演においても発信した。3群としての書状・仮名消息の翻刻:2010年に調査した実相院門跡の所蔵文書について検討をすすめた。従来活字化されていないため、その重要性にもかかわらず十分活用されていないことにかんがみ、当初予定していなかったものの、報告書『実相院文書』として200通を超える文書群の翻刻を刊行することとし、その準備をすすめた(近刊)。4特定の人物の書状の収集など:近衛家基の書状を対象に作業をすすめた。また、三条西実隆・公条の受給文書の一例として『除秘鈔』紙背文書の翻刻作業をおこなった。また、『土佐家文書』に収められた室町幕府奉行人諏方貞通の書状を読み解き、やまと絵の絵師土佐光信が錦の御旗の製作に関与する様相を明らかにし、小論を公表した。研究実績の概要の項に記したとおり、当初の研究実施計画に沿って研究を遂行し、おおむね順調な進捗をみている。ただし、本年度に報告書『実隆公記紙背文書花押署名総覧(僧侶女性編)』を刊行する予定であったが、当初予定していなかった報告書『実相院文書』の刊行準備を並行してすすめたために、刊行に及ばなかった。後者は2019年度前半、前者は2019年度後半に刊行を見込んでおり、総体としては、順調な進捗と評価できる。1署名・花押総覧の作成:2019年度後半に報告書『実隆公記紙背文書花押署名総覧(僧侶女性編)』を刊行する。2女房奉書を中心とする仮名消息の読解のための入門的な自習教材の作成:入門という性格から、これまで文字数の少ない文書を対象として選定してきたが、文字数の多いものも対象として教材を作成し、研究代表者・末柄のホームページで公開を行う。3群としての書状・仮名消息の翻刻:三条西本『除秘鈔』紙背文書の翻刻について詳細な解題を付して公表を行う。それ以外にも書状を対象として史料紹介を行いたい。4特定の人物の書状の収集など:甘露寺親長・白川資氏の書状などを活用した研究を公表したい。交付申請書に記載した「研究実施計画」にそいつつ研究をすすめ、下記のような進捗をみた。1署名・花押総覧の作成:『実隆公記紙背文書花押署名総覧(僧侶女性編)』の刊行に向けて作業をすすめた。具体的には、東京大学史料編纂所がホームページ上で公開する所蔵史料目録データベースによって検索可能な当該文書群の文書画像と高橋隆三氏の手になる刊本『実隆公記』(続群書類従完成会刊行)との突合をおこない、人物ごとに署名花押の画像を確認し、標本となるものを選定した。今後さらなる整理および検討を加えたうえで、2018年度中に報告書を刊行する目処が立った。2女房奉書を中心とする仮名消息の読解のための入門的な自習教材の作成:大和文華館所蔵双柏文庫に所収されている2通の三条西実隆の消息について、釈文・通釈・解説を含み込んだ論文「双柏文庫の三条西実隆消息二通」を執筆し、『大和文華』誌において公表した。3群としての書状・仮名消息の翻刻・検討:禁裏文書(東山御文庫所蔵文書のみならず、元来禁裏文書であったが江戸時代に禁裏の外に流出したものを含む)を中心にすえ、後柏原・後奈良・正親町という戦国時代の天皇自身の手になる書状・消息に注目し、戦国時代の天皇のあり方を検討し、リブレット『戦国時代の天皇』(近刊)をまとめた。4特定の人物の書状の収集:量的には三条西本の紙背文書に残されたものを中心として、若狭武田氏や大内氏の被官の手になる書状を探索し、そこからうかがえる戦国武士の文芸活動について検討をすすめた。ただし、今年度は、論文「双柏文庫の三条西実隆書状」やリブレット『戦国時代の天皇』(近刊)など、紙媒体による成果の公開は、当初考えていた以上に順調にすすんだ。一方で、史料調査やホームページによる情報発信については、当初考えていたところに比して、いささか遅れ気味である。その都度の研究の力点の置き方により、若干の遅速が出ることは当然であって、総体としては、おおむね計画どおりという評価が可能であると考えている。1署名・花押総覧の作成:

『実隆公記紙背文書花押署名総覧(僧侶女性編)』の刊行に向けての作業を続け、署名・花押の抽出および名寄せの作業を完了し、編集作業を残すのみとなった。ただし、後掲の『実相院文書』の刊行準備を優先したため、2019年度後半の刊行となる予定である。2女房奉書を中心とする仮名消息の読解のための入門的な自習教材の作成:東京大学史料編纂所所蔵『山科家断簡』所収の女房奉書について教材を作成し、研究代表者・末柄のホームページから公開した。今回取り扱ったものは、折紙のものもあり、女房奉書の多様性を示している。また、7月に昨年度の成果にもとづく著書『戦国時代の天皇』を刊行し、天皇自身の筆になる消息や女房奉書を多数活用したが、その研究成果を講演においても発信した。3群としての書状・仮名消息の翻刻:2010年に調査した実相院門跡の所蔵文書について検討をすすめた。従来活字化されていないため、その重要性にもかかわらず十分活用されていないことにかんがみ、当初予定していなかったものの、報告書『実相院文書』として200通を超える文書群の翻刻を刊行することとし、その準備をすすめた(近刊)。4特定の人物の書状の収集など:近衛家基の書状を対象に作業をすすめた。また、三条西実隆・公条の受給文書の一例として『除秘鈔』紙背文書の翻刻作業をおこなった。また、『土佐家文書』に収められた室町幕府奉行人諏方貞通の書状を読み解き、やまと絵の絵師土佐光信が錦の御旗の製作に関与する様相を明らかにし、小論を公表した。研究実績の概要の項に記したとおり、当初の研究実施計画に沿って研究を遂行し、おおむね順調な進捗をみている。ただし、本年度に報告書『実隆公記紙背文書花押署名総覧(僧侶女性編)』を刊行する予定であったが、当初予定していなかった報告書『実相院文書』の刊行準備を並行してすすめたために、刊行に及ばなかった。後者は2019年度前半、前者は2019年度後半に刊行を見込んでおり、総体としては、順調な進捗と評価できる。1署名・花押総覧の作成:2018年度中に『実隆公記紙背文書花押署名総覧(僧侶女性編)』の刊行を果たしたい。引き続き、東京大学史料編纂所架蔵『言継卿記』を対象として、同様の作業をすすめたい。2女房奉書を中心とする仮名消息の読解のための入門的な自習教材の作成:東京大学史料編纂所所蔵『実隆公記』の貼継文書および紙背文書、あるいは同所所蔵『山科家断簡』などのなかから、適宜の女房奉書や仮名消息を選定して、教材を作成し、研究代表者末柄のホームページで公開を果たしたい。3群としての書状・仮名消息の翻刻・検討:禁裏文書および近衛家や三条西家などの旧蔵史料を中心に、翻刻や検討をすすめ、史料紹介や論文のかたちにまとめる。4特定の人物の書状の収集:甘露寺親長・三条西実隆あるいは若狭武田氏や大内氏の被官などに加え、細川氏(京兆家)被官の書状などを収集・検討の対象としたい。3・4については、適宜、京都府や愛知県などへの出張を行なうことになる。1署名・花押総覧の作成:2019年度後半に報告書『実隆公記紙背文書花押署名総覧(僧侶女性編)』を刊行する。2女房奉書を中心とする仮名消息の読解のための入門的な自習教材の作成:入門という性格から、これまで文字数の少ない文書を対象として選定してきたが、文字数の多いものも対象として教材を作成し、研究代表者・末柄のホームページで公開を行う。3群としての書状・仮名消息の翻刻:三条西本『除秘鈔』紙背文書の翻刻について詳細な解題を付して公表を行う。それ以外にも書状を対象として史料紹介を行いたい。4特定の人物の書状の収集など:甘露寺親長・白川資氏の書状などを活用した研究を公表したい。
能動機能要素のネットワークの創製とその非線形ダイナミクスの研究

今年度は、要素間の結合強度が動的に変化する系を構築し、そこでのダイナミクスを調べることを目的として研究を行った。更に、結合強度を一定に保った場合の振る舞いと比較・検討することで、動的な結合の有用性について調べた。実験では、ベルーゾフ・ジャボチンスキー(BZ)反応の自己触媒過程を組み込んだマイクロゲルを作製し、能動機能要素として利用した。BZ反応は光感受性を有しており、照射光強度に応じて反応の活性・抑制を制御できる。この特徴を利用し、各要素の反応情報を光学的な方法でフィードバック制御することで、要素間の結合を実現した。反応の状態に応じて結合強度が変化するようにフィードバック関数を決定し、動的結合系を構築した。この系で実験を行ったところ、逆位相で振動する二つのクラスタが形成された。更に、結合強度の変化の度合いを変えると、120度の位相差で振動する三つのクラスタが形成された。一方、結合強度を一定に保った場合には、クラスタの形成が系の一部でのみ起こった。このことから、動的に結合した系でクラスタの形成が促進されることが明らかになった。更に、結合が空間的な秩序形成に重要な役割を果たしていることが示唆された。前年度までの研究で、要素間相互作用や外部擾乱によって時間的な秩序度を制御できることを明らかにしている。このことと今回得られた結果から、能動機能要素から成る集団における時空間秩序構造の形成を自在に制御できる可能性が示唆された。ベルーゾフ・ジャボチンスキー(BZ)反応を微小要素に局在させ、それを格子状に配置して能動機能要素のネットワークを創製した。要素の高い光感受性を利用した遅延フィードバックによって、斯かるネットワークの集団ダイナミクスの制御を試みた。自励振動要素からなるネットワークの場合、フィードバックの遅れ時間に依存して、時間的・空間的な秩序度が周期的に変化することを見出した。これは、遅れ時間の増減によって、系の秩序化の度合いを自在に制御できることを示している。更に、秩序化を促進するのに最適な遅れ時間と、BZ反応の振動周期や不応期の時間など反応の固有な性質との間には、ある関係が成り立つことが分かった。例えば、遅れ時間が反応の不応時間と等しいとき、あるフィードバック利得以上で大域的な位相同期が起きることが明らかになった。更に、興奮性要素からなるネットワークでは、ノイズにフィードバックを重畳することによる効果を調べた。ノイズのみを印加した場合には要素の集団化によって発火のコヒーレンズが促進される現象array-enhanced coherence resonance(AECR)が起きることが知られているが、ノイズ強度を一定に保ったままフィードバック利得を大きくすると、AECR現象や位相同期現象がより顕著になることが分かった。逆に、フィードバック利得を一定に保ったままノイズ強度を変化させると、あるノイズ強度以上で位相同期が観測されなくなった。更に、振動系だけでなく興奮系でも、フィードバックの遅れ時間の変化によって系の秩序度の制御が可能であることが明らかになった。
リコンビナントBMPを用いた顎骨および歯周組織再生の分子機構

顎骨欠損に対する治療法には骨移植などが用いられている。しかしながら,成長因子を用いた骨誘導法は確立されていない。BMP(骨誘導蛋白)は骨芽細胞の分化や細胞外マトリックスの合成を促進しており,骨形成において中心的な役割を果たしているものと考えられている。BMPの骨誘導は先ず軟骨が形成され,次に骨組織によって置き変わる。軟骨から骨組織に置換される過程はBMPと拮抗作用を持つNogginが関係しているものと考えられる。そこで,TGF-βスーパーファミリー、collagen合成に至る蛋白の局在と遺伝子発現を比較検討した。ラットの皮下組織にBMP1mgを含む脱灰骨を埋入し,経時的にBMP等の反応を切片標本を用いて観察した。TGF-βおよびBMPとその特異的receptorの局在も一致していた。埋入後1日目では,脱灰骨移植片周囲にリンパ球が多数集合した炎症像がみられた。移植後3日目では移植片周囲の炎症像は消失し,多数の毛細血管および細動脈が新生された。移植後5日目では移植片周囲には軟骨組織が新生された。移植後710日目では軟骨組織は骨組織に置換され,移植後14日目では骨髄に相当する組織が現れ,骨の改造も観察された。TGF-βおよびBMPとその特異的receptorの局在および遺伝子発現は一致していた。反応は埋入後1日目では,リンパ浸潤,軟骨が新生される部位では前軟骨細胞,骨形成部位では前骨芽細胞に最も強かった。骨芽細胞TGF-βの反応はBMPよりも強かった。NogginおよびCBFA-1の反応は前骨芽細胞および骨芽細胞にみられた。骨誘導において、CBFA-1およびNogginの発現はBMP-4によって促進され骨芽細胞や軟骨細胞の分化を調節し,signalはSmad familyによって仲介されているものと考えられた。BMP(骨誘導蛋白)は骨芽細胞の初期分化や細胞外マトリックスの合成を促進しており,骨形成において中心的な役割を果たしていることが示唆されている。またBMPは頭蓋や体肢の骨の形態を決定するHox,CBFA-1などのホメオボックス遺伝子の発現を促進し,顎骨の形態形成を制御しており,骨形成においてBMPを中心にした,細胞の分化増殖,骨の形態形成,細胞外マトリックスに至る遺伝子カスケードを形成しているものと考えられる。BMPの遺伝子発現は,骨折後1日目では凝結組織周囲の結合組織のfibroblast-like cellおよび筋組織の結合組織細胞に観察され,この発現は骨折後2日目ではより強かった。骨折後3日目では線維化が開始され,線維芽細胞の発現は最も強かった。骨折後4日目以後では,軟骨形成とともに軟骨芽細胞,増殖期および休止期軟骨細胞に認められたが,肥大期軟骨細胞には発現は認められなかった。また骨吸収部では破骨細胞にも強い発現が観察された。骨折後714日目では骨形成が盛んに行われ,骨芽細胞は強い発現を示したが,ほぼ骨性治癒が得られた骨折後21日目以後では,細胞成分はほとんど反応を示さなかった。BMPR-IBを用いた発現は,BMPR-IAとほぼ同様の局在を示したが,骨折後3日目まではBMPR-IBを用いた発現は-IAによる反応よりも弱く,骨形成期,軟骨形成期に一致して-IBの発現が強く認められた。TGF-βとそのreceptorは同じ局在を示した。骨形成部位においては前骨芽細胞よりも骨芽細胞に強い発現芽観察された。CBFA-

1およびNogginはBMPよりも遅い時期に発現した。CBFA-1の発現は骨形成部位とくに骨芽細胞,Nogginは間葉細胞や軟骨細胞にみられた。以上のことから,BMPは骨折治癒過程においてreceptorを介し,骨芽細胞や軟骨細胞の初期分化を促進するのみならず,破骨細胞を刺激して,骨吸収においても重要な役割を果たすものと考えられた。またCBFA-1およびNogginの遺伝子発現はBMPによって誘導されるものと考えられた。顎骨欠損に対する治療法には骨移植などが用いられている。しかしながら,成長因子を用いた骨誘導法は確立されていない。BMP(骨誘導蛋白)は骨芽細胞の分化や細胞外マトリックスの合成を促進しており,骨形成において中心的な役割を果たしているものと考えられている。BMPの骨誘導は先ず軟骨が形成され,次に骨組織によって置き変わる。軟骨から骨組織に置換される過程はBMPと拮抗作用を持つNogginが関係しているものと考えられる。そこで,TGF-βスーパーファミリー,collagen合成に至る蛋白の局在と遺伝子発現を比較検討した。ラットの皮下組織にBMP1mg含む脱灰骨を埋入し,経時的にBMP等の反応を切片標本を用いて観察した。TGF-βおよびBMPとその特異的receptorの局在も一致していた。埋入後1日目では,脱灰骨移植片周囲にリンパ球が多数集合した炎症像がみられた。移植後3日目では移植片周囲の炎症像は消失し,多数の毛細血管および細動脈が新生された。移植後5日目では移植片周囲には軟骨組織が新生された。移植後710日目では軟骨組織は骨組織に置換され,移植後14日目では骨髄に相当する組織が現れ,骨の改造も観察された。TGF-βおよびBMPとその特異的receptorの局在および遺伝子発現は一致していた。反応は埋入後1日目では,リンパ浸潤,軟骨が新生される部位では前軟骨細胞,骨形成部位では前骨芽細胞に最も強かった。骨芽細胞TGF-βの反応はBMPよりも強かった。NogginおよびCBFA-1の反応は前骨芽細胞および骨芽細胞にみられた。骨誘導において,CBFA-1およびNogginの発現はBMP-4によって促進され骨芽細胞や軟骨細胞の分化を調節し,signalはSmad familyによって仲介されているものと考えられた。