hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
CFDを用いた大気環境影響評価手法の標準化に関する研究

Computer Fluid Dynamics(CFD)モデルは、近年の計算機科学の発展に伴い汎用ソフトとしていろいろな分野へ応用されている。大気環境影響評価においても応用される例が増えてきているが、その使用に対するガイドラインが無く、結果の信頼性に問題が残っている。本研究では大気環境学会関東支部予測計画評価部会の下に「CFDモデル環境アセス適用研究会」を設け、CFDモデル相互の比較や風洞実験データベースとの比較を通してCFDを大気環境影響評価に用いる際の問題点を整理しガイドラインを検討したComputer Fluid Dynamics(CFD)モデルは、近年の計算機科学の発展に伴い汎用ソフトとしていろいろな分野へ応用されている。本研究では大気環境学会関東支部予測計画評価部会の下に「CFDモデル環境アセス適用研究会」を設け、CFDモデル相互の比較や風洞実験データベースとの比較を通してCFDを大気環境影響評価に用いる際の問題点を整理しガイドラインを検討した本年度は、大気環境学会関東支部予測計画評価部会の下に「CFDモデル環境アセス適用研究会」を設け、6回研究会を行った。この中で、実用的CFDはRANS型であり、特にk-ε型乱流クロージャーを用いた手法についてガイドラインを作成することとした。まず平板上の境界層を対象として数社の参加を得て、境界層の発達と点源からの拡散計算について点源の位置と流入風速プロファイルのみを指定して行ったところ、結果にかなりの差異が生じた。これらの結果を分析するとともに、建築学会ガイドラインを参考とし、流入条件について、風速、乱流エネルギー、粘性消散率のプロファイルと地面粗度長を指定することにより、ほぼすべてのモデルで結果が一致することを確認した。これらの結果についてガイドラインに示すことにより、パラメータの設定ミス等を防げることを確認した。風洞を使用し、k-εモデルとの比較ができるようにまず平板上で1/7および1/3乗則を満たす流入風速プロファイルを設定し、風速、レイノルズ応力3成分および粘性消散率を計算するためのスペクトルのプロファイルを取得した。また、1辺H(=10cm)の立方体を1つ置き、そのまわりの風、レイノルズ応力、スペクトルデータを取得した。また煙突高を1/2Hとして煙源を立方体上流側1/2HおよびHに置いて拡散実験を行い、データを取得した。これらのデータを用いて20年度に各CFDモデルの比較実験を行う。平成20年度は、大気環境学会関東支部予測計画評価部会「CFDモデル環境アセス適用研究会」で、4回研究会を行った。今年度は昨年度に実施した平板上の点源拡散計算について、計算スキームやオイラー型・ラグランジュ型拡散計算の差異についてまず検討した。平板上の点源拡散では流れは平板に並行であるが、そのような条件下では計算スキームの差はあまり現れないことがわかった。また点源近傍ではオイラー型拡散モデルでは風洞実験結果について大きな拡散幅を与えてしまうことが明らかとなった。これを抑えるためには乱流シュミット数を大きくする必要があり、通常言われているような0.70.9の程度ではなく、4以上の値を与えなければならないこと、また乱流シュミット数が煙源からの距離に依存することがわかった。次に一辺がHの単一立方体周りの流れと立方体上流側1H、高さ0.5Hに煙源を置いた拡散計算を各機関で実施した。この場合、立方体をまわる3次元的な風が生成されるが、拡散計算の結果には計算スキームへの依存性が現れた。計算結果はる立方体から拡散計算CFDモデルを用いて各機関で計算を行った。結果は立方体の後流側2H程度までは実験値よりピーク濃度が低い傾向が得られたが、それより後流側では風洞実験とよく一致し、METI-LISなどのガウス分布モデルに基づく手法にくらべて良好な結果が得られた。これらの結果については中間報告書として21年度内に大気環境学会より公開する予定である。
外部磁場存在下における多価イオンによる電子捕獲過程の理論的研究

1.磁場の方向と入射イオンの速度ベクトルの方向が任意の場合に使える磁場存在下での電子捕獲断面積を求める緊密結合方程式を定式化すると共にプログラムの開発を行った。(B^<4+> +H),(He^<2+> +H), (Be^<2+> +H), (Be^<3+> +H)系の電子捕獲過程に対し、このプログラムを適用してさまざまな結論を得たが、そのうちの主なものは次のとおりである。(1)状態により、磁場による効果は断面積を増加させるだけでなく減少させることもある。(2)磁場方向が衝突平面と垂直である場合に磁場の影響が最も大きくなる。これは磁場が回転結合と相乗的に働くためである。また磁場の向きによっては磁場の項と回転結合が互いに打ち消し合うため、断面積が減少する場合もある。(3)磁場方向と速度ベクトルの方向の間の角度に関し積分した全断面積は磁場の強さと共にゆるやかに増加する。またこの影響は低エネルギー程大きい。内殻電子の影響を調べるため、現在(B^<4+> +H)系と電荷が同じ(N^<4+> +H)系に対して同様の計算を実行中である。2.イオンの運動によって生じる標的の分極と磁場との相互作用が電子捕獲過程にどのような影響を与えるか調べるため、この相互作用を含んだ緊密方程式の定式化を行い、プログラムを作製した。このプログラムを用いて断面積のモデル計算を行ったところ、その影響は特殊な場合を除きかなり小さいことがわかったので当面この項は無視することにした。3.He^<2+>イオンをH原子に衝突させたときに起こるHe^+ (21)+H^+状態への遷移は共鳴的過程のため磁場の影響がカオス的になる可能性がある。この系の電子捕獲断面積を計算したところ衝突対が非常に離れた所でシュタルクミクシングによる遷移が起こることがわかった。この遷移だけなら状態間の乗り移りが起こらないとして通常のg-u遷移の扱いをすればよいが、この系ではそれと同時に回転結合による遷移が起こっており、衝突計算をしなければならない。この項を取り入れたプログラムを作製し、現在実計算を行っている。4.偏極した光を観察するなど対称性をうまく利用した測定をすれば、磁場の働かない時は遷移しない状態が観測できるようになる。どのような実験をやればよいか実験家に提案するため、いくつかの系を選んで計算を実行中である。(1)磁場の方向と入射粒子の速度ベクトルが平行な場合に使える磁場存在下での電子捕獲断面積を求める緊密結合方程式を定式化すると共にプログラムの開発を行った。(2)(B^<4+>+H)系の電子捕獲過程に対し、上記のプログラムを適用したところ次のことがわかった。(1)ゼーマン分裂によりB^<3+>(1s3p_<-1>)状態は4Σ,5Σ,6Σ状態(始状態から最初にフラックスを受け取る)に近づくがB^<3+>(1s3p_<+1>)状態は遠ざかる。

このためB^<3+>(1s3p_<-1>)状態の方がB^<3+>(1s3p_<+1>)状態よりかなり大きな断面積を持つ(磁場10^4TでB^<3+>(1s3p_<-1>)状態の断面積はゼロ磁場の約4倍になるがB^<3+>(1s3p_<+1>)状態は2倍弱にしかならない)。(2)B^<3+>(1s3d_0)状態は主にR=1020auにおけるB^<3+>(1s3d_<±1>)状態からの遷移により生じ、強い磁場領域で大きい断面積を持つようになる。(3)磁場の影響は衝突エネルギーが小さいほど大きい。(4)全断面積は磁場と共に単調に増加する。(3)(He^<2+>+H),(Be^<2+>+H),(Be^<3+>+H)にも(1)のプログラムを適用したところ(B^<4+>+H)系の場合とほぼ同じ結論を得た。またこれらの系でR=∞でエネルギー的に近い(Be^<2+>+H(2l))状態間の励起断面積を求めたところ1/100の磁場の強さで基底状態からの電子捕獲過程と同程度の磁場効果があった。(4)磁場による結合項は断熱近似の破れの項と異なる対称性を持っている。つまり分極した光を観測するなど対称性をうまく利用した測定をすれば、磁場の働かない時は遷移しない状態が観測できるようになる。どのような実験をやればよいか実験家に提案するため、いくつかの系を選んで計算を実行中である。1.衝突方向と角度が任意である外部磁場存在下で電子捕獲断面積を計算することは膨大な計算量を必要とする。そこで最初にプログラムの改良を行い、高速化を実現した。このプログラムを用い、(B^<4+>+H)系に対して磁場の強さが10^4テスラまで断面系を計算した。その結果(1)磁場方向が衝突平面と垂直である場合に磁場の影響が最も大きくなる。これは磁場が回転結合と相乗的に働くためである。また磁場の強さによっては磁場の項と回転結合が互いに打ち消し合うため、断面積が減少する場合もある。(2)磁場方向と衝突方向の角度に関し積分した全断面積は磁場の強さと共にゆるやかに増加する。またこの影響は低エネルギー程大きい。などがわかった。内殻電子の影響を調べるため、現在(B^<4+>+H)系と電荷が同じ(N^<4+>+H)系に対して同様の計算を実行中である。2.イオンの運動によって生じる標的の分極と磁場との相互作用が電子捕獲過程にどのように影響を与えるか調べるため、この相互作用を含んだ緊密方程式の定式化を行い、プログラムを作成した。更にプログラムを用いて断面積のモデル計算を行ったところ、その影響は特殊な場合を除きかなり小さいことがわかったので当面この項は無視することにした。3.He^<2+>イオンをH原始に衝突させたときに起こるHe^+(2l)+H^+状態への遷移は共鳴的過程のため磁場の影響がカオス的になる可能性がある。この系の電子捕獲断面積を計算したところ衝突対が非常に離れた所でシュタルクミクシングによる遷移が起こることがわかった。この遷移だけなら状態間の乗り移りが起こらないとして通常のg-u遷移の扱いをすればよいのだが、この系ではそれと同時に回転結合による遷移が起こっており、衝突計算をしなければならない。この項を取り入れたプログラムを作成し、現在実計算を行っている。
生体高分子のためのマルチレベル統合フラグメント分子軌道法の開発

フラグメント分子軌道(FMO)法と有効フラグメントポテンシャル(EFP)法や古典力場(MM)との融合法、さらに溶媒の連続誘電体モデル(PCM)とを融合したマルチレベル統合FMO法を開発した。この方法により、水溶液中のタンパク質やタンパク質-リガンド複合体の高速な計算が可能になり、生体高分子のシミュレーション研究に貢献するすることが期待される。本研究では、私たちが開発した生体高分子をまるごと量子化学計算できるフラグメント分子軌道法に基づいて、低レベル(高速)から高精度(低速)までの様々なレベルの量子・古典融合法を開発する。これにより、対象とする系とプロパティに応じて、適切な計算方法を選択して用いることができるようになる。本年度は、マルチレベル統合FMO法の開発に向けて、力場部分のパラメータを決定するための参照となるデータを収集するために、クランビンなどの小タンパク質の構造最適化計算を行った。このために、まず、静電ポテンシャル近似を用いて高速化したFMO法で、エネルギー勾配の計算の精度を向上させ、構造最適化計算を効率化した。一方、タンパク質中のランダムコイル部分や非極性の側鎖のように、構造が水素結合で強固に保持されていない場合は、簡便なハートリ・フォック(HF)レベルの計算では精度不足で、妥当な構造を得るには電子相関を考慮したMoller-Plesserの2次摂動論(MP2法)レベルの計算が必要なことが判明した。しかし、このレベルの計算は膨大な時間がかかり、力場パラメータ作成で参照するための十分な数の最適化構造を計算するのが困難であるため、電子相関を簡便な形で考慮することができるHF+経験的分散力(HF-D)をFMO法と組み合わせた方法とプログラムを開発した。この方法で妥当な構造が得られることが確認できたので、今後、FMO-HF-Dによる構造最適化を用いることにし、次年度も引き続き、FMO-HF-Dによるタンパク質とタンパク質-リガンド複合体の構造最適化を行ってデータを蓄積する。本研究では、私たちが開発した生体高分子をまるごと量子化学計算できるフラグメント分子軌道法に基づいて、低レベル(高速)から高精度(低速)までの様々なレベルの量子・古典融合法を開発している。この方法により、対象とする系とプロパティに応じて、適切な計算方法を選択して用いることができるため、生体高分子の研究のための有用な計算手法となることが期待される。本年度は、マルチレベル統合FMO法の開発に向けて、力場部分のパラメータを決定するための参照となるデータを収集するたあに、Trpケージミニプロテインなどの小タンパク質の構造最適化計算を行った。この方法で妥当な構造が得られることが確認した。今後、FMO-HF-Dによる構造最適化を用いることにし、これによるタンパク質とタンパク質-リガンド複合体の最適化構造データを蓄積し、マルチレベル統合FMO法で用いる力場部分のパラメータを決定する。本研究では、私たちが開発した生体高分子をまるごと量子化学計算できるフラグメント分子軌道法に基づいて、低レベル(高速)から高精度(低速)までの様々なレベルの量子(QM)・古典(MM)融合法を開発している。本年度は、前年度までに開発したFMO法と古典力場(MM)との融合法であるFMO/MU計算プログラムを用いて、FMO領域MM領域の妥当な設定法を検討した。その結果、最も高速な計算を実現するために当初想定していた、官能基単位でFMO領域とMM領域を設定するやり方は精度が著しく低下するため実用的ではないことが判明した。そこで一つのタンパク質系中で、アミノ酸残基を単位として任意にFMO領域とMM領域の設定を可能にすることで高速化を達成した。最終的に、タンパク質をアミノ酸単位でフラグメントに分割し、任意のフラグメントをFMOとMMで扱い、系を取利囲む数層の溶媒和分子を有効フラグメントポテンシャル(EFP)で、さらにその外側を連続誘電体モデル(PCM)で扱うマルチレベル統合FMO法を完成させた。一方、FMO法のエネルギー勾配は従来は近似的な計算を行っていたが、これは構造最適化計算に適用可能であったが、分子動力学シミュレーションを行うためには精度が不足していることが判明した。

本研究では、FMO法の完全解析微分を開発し、マルチレベル統合FMO計算全体として分子動力学シミュレーションに適用できる精度の高いエネルギー勾配計算法を開発した。これらの成果は、生体高分子のシミュレーション研究において有用な手法となることが期待される。
理想的観賞者説の改訂・展開による、複合文化的な美的経験論の構築

本研究は、従来の理想的観賞者説を改良することで、現代における多様な美的経験や多元化した価値観を説明するための、新たな美的経験論を構築する。まず、1)価値観の多様性、2)理想的な美的経験を想定する意義、3)美的主張の規範性、の3つの点に着目しつつ、従来の美的経験論の論点整理を行い、改良すべき点を明らかにする。それをふまえ、現代の多様な美的ふるまいを説明するための分析枠組みを提出する。目標は、美的判断の正当性/不当性を明確に説明すること、数ある美的経験の中からより尊重に値する美的経験を弁別する基準を提出すること、そして、その美的経験をどのていど尊重すべきかの度合いを明示化すること、である。
エピジェネティクス解析によるビオチンの摂食抑制機構の解明と糖尿病改善への応用

本研究では、ビオチンによる摂食抑制効果と白色脂肪及び視床下部における摂食関連タンパク質遺伝子発現調節機構について検討した。摂食量はビオチンにより有意に抑制されたが、末梢組織由来関連タンパク質の血漿濃度と遺伝子発現量には変化が認められず、ビオチンの作用部位は視床下部と判断された。視床下部では、摂食抑制物質であるマロニルCoAへの変換酵素アセチルCoAカルボキシラーゼ2(ACC2)の遺伝子発現量とACC2をコードするDNA領域ヒストンのビオチニル化頻度が有意に増加した。以上の結果から、ビオチンはヒストンビオチニル化を介しACC2遺伝子発現量を増加することで摂食行動を抑制することが強く示唆された。平成25年度は、摂食抑制作用におけるビオチンの作用部位としての末梢での可能性の再検討と視床下部におけるACC-βの遺伝子発現調節におけるエピジェネティクス制御機構について検討した。末梢での検討では、摂食調節ホルモンであるグレリン、コレシストキニン、レプチン、インスリンの血漿濃度には、ビオチンによる摂影響は観察されなかった。これらの遺伝子発現量についてもビオチンによる変動は認められなかった。視床下部におけるエピジェネティクス制御機構についての検討では、まずはじめにヒストン間を結合するリンカーDNAに特異的に作用するMicrococcal Nuclease(MCN)によりヒストン45個のクロマチン断片を回収するための切断条件を決定した。その結果、MCN濃度6.4×10-6U/μgDNA、消化時間15分間(37°C)が最適条件と決定した。この条件をもとに視床下部を消化し、アビジンビーズによるクロマチン免疫沈降(ChIP)法により、ビオチニル化ヒストンを含むクロマチン断片を分離し、DNAを回収した。その後、回収したDNAよりビオチニル化されたACC-β及び対照遺伝子であるGAPDHのプロモーター領域のDNA量をRT-PCR法を用いて測定した。その結果、GAPDHではビオチン負荷の有無にかかわらず検出限界以下を示し、GAPDHプロモーター領域ではヒストンはビオチニル化を受けないことが示された。一方、ACC-βでは、ビオチン負荷によって約5倍の増加を示し、ACC-βプロモーター領域におけるヒストンビオチニル化の増加が明らかにされた。以上の結果から、ビオチンは視床下部においてACC-βプロモーターをコードするDNA領域におけるヒストンのビオチニル化とそれに伴うACC-βの遺伝子発現量の増加によってマロニルCoA合成を亢進し、摂食を抑制すると示唆される。平成24年度は、実験動物としてC57BL/6jマウスを用い、ビオチンによる摂食抑制効果を再検討すると共にビオチンの体内分布と摂食関連ホルモンの血中濃度を測定し、ビオチンの作用部位について検討した。さらに、標的臓器として示唆される白色脂肪及び視床下部における関連タンパク質の遺伝子発現について検討した。摂食量はビオチン摂取3-4日目から有意に減少した。しかし、摂食関連ペプチドホルモンの血漿中濃度については変化は認められなかった。qRT-PCRの検討においても、白色脂肪でのレプチンの発現量には変化はみられなかった。これらの結果から、ビオチンは白色脂肪を含めた末梢組織には作用部位を持たず、脳中枢系で機能することが示唆された。視床下部における検討では、アセチルCoAカルボキシラーゼ-β(ACC-β)の発現量がビオチンによって有意に増加した。摂食行動は視床下部のマロニルCoAによって抑制されることが知られている。ACCにはACC-αとACC-βの2種のアイソザイムが存在し、共にアセチルCoAからマロニルCoAへの変換を触媒する。特に、視床下部においてACC-βはマロニルCoAを介して脂肪酸代謝を阻害し、摂食を抑制すると考えられている。従って、ビオチンは視床下部においてACC-βの発現量を増加し、マロニルCoA合成を亢進することで摂食を抑制するものと推察される。平成25年度は、ビオチンが視床下部においてACC-βをコードするDNA領域のヒストンビオチニル化を増加させることを示唆する結果を得た。しかし、ビオチニル化ヒストン領域に在るDNAの回収量に不足を生じ、測定結果の信頼性に若干の疑義を残した。平成26年度は、ビオチニル化ヒストン回収条件を再構築し、マロニルCoA合成酵素(ACC-β)とコントロール遺伝子(GAPDH)、ネガティブコントロール遺伝子(SMVT)プロモーター領域でのヒストンのビオチニル化頻度を再検討した。さらに、ビオチンによるマロニルCoA代謝調節について、合成酵素ACC-βと分解酵素マロニルCoAデカルボキシラーゼ(MCD)の遺伝子発現量についても併せて検討した。クロマチンの抽出は、従来の核抽出に加え、新たにクロマチン抽出キットにより検討した。ヒストン34個のクロマチン断片化条件は、Micrococcal Nuclease(MCN)濃度(1.0×10-13U1.0

×10-1U)と消化時間15分(37°C)の組み合わせで検討し、断片化状態をアガロースゲル電気泳動で確認した。従来の核抽出では目的クロマチン断片の回収は認められなかったが、新たなクロマチン抽出方法ではヒストン34個のクロマチン断片を効率良く回収することができた。この条件で視床下部からクロマチン断片を回収し、ヒストンのビオチニル化修飾を受けたクロマチン断片のDNAを採取し、ACC-β、GAPDH、SMVT遺伝子のプロモーター領域におけるヒストンビオチニル化頻度を確認した。その結果、GAPDHとSMVTではビオチン添加の影響を受けないことが示されたが、ACC-βではプロモーター領域でのヒストンビオチニル化の有意な増加が再確認された。さらに、MCDの遺伝子発現量がビオチン添加で変化しなかったことから、ビオチンは視床下部においてヒストンビオチニル化によりACC-βの遺伝子発現を増加し、マロニルCoA合成の亢進と摂食抑制を誘導することが示唆された。栄養生理学平成25年度の計画では、ビオチンによる視床下部でのマロニルCoA調節機構についての検討を予定していた。具体的には、視床下部でのマロニルCoA量をLC/MSを用いて定量すること、ACCとマロニルCoAデカルボキシラーゼ(MCD)の遺伝子発現をリアルタイムPCRで測定することを計画していた。さらに、ACC、MCD、AMPKの発現部位と活性状態(リン酸化型)を組織蛍光免疫染色にて観察し、ビオチンによるマロニルCoA代謝調節を検討する予定であった。しかし、マロニルCoAのLC/MSによる定量では、機器提供先の研究機関での使用が不可能となり平成26年度へ延期せざる得なくなった。しかし、MCDの遺伝子発現量についてはRT-PCRビオチンによる変化を受けないことを確認した。さらに、平成26年に予定していたビオチンの遺伝子発現様式に注目し、ヒストンのビオチニル化に焦点を絞り、CpIP法によりヒストンビオチニル化の標的遺伝子についての検討を推進した。そのため、組織染色については検討することができず、マロニルCoA量の測定と同様に次年度へ持ち越すこととなった。これらの結果から、平成25年度は次年度に繰り越した検討項目があるものの前倒しで実施し、着実に成果を上げた項目もあり、これらの点からおおむね順調に進展していると考えられる。本年度は、ビオチンによる摂食抑制効果と作用部位を再検討し、さらに標的臓器における関連タンパク質の遺伝子発現量を測定し、その作用機序の一端を解明することを目的とした。本年度は、C57BL/6jマウスを用い、ビオチンによる摂食抑制を確認することができた。また、摂食関連ペプチドホルモンの血中濃度及び分泌臓器での遺伝子発現量を測定し、作用部位が視床下部にあることを確認することができた。さらに、視床下部においてビオチンがアセチルCoAカルボキシラーゼ-β(ACC-β)の発現量を有意に増加することを明らかした。
自殺予防戦略の国際比較共同研究の企画調査

国家的レベルで自殺予防戦略を確立し実行しているフィンランド、イギリス、アメリカ、中国の自殺予防対策責任者と直接面談し、どのように対策を進めているか、困難要因あるいは促進要因は何かについて、キーインフォーンマントインタビューを実施した。フィンランドの自殺予防対策は一次予防を重視した協働プロセスモデルをもとに着実な成果を挙げたことが明らかになった。中国では北京市の支援のもとに自殺予防研究センターが立ち上げられ、科学的根拠に基づく対策が実施されつつあった。アメリカでは、国家自殺予防戦略をもとに各団体でうつ病対策を中心にした施策が実施され成果を挙げていた。イギリスでは国家的健康増進施策の「我らがより健康な国」において自殺予防が取り上げられ、民間を巻き込んだ自殺予防啓発活動が効果を挙げていた。国家的取り組みと同時にNPO団体の役割についても調査を実施し、フィンランドとイギリスでは「いのちの電話」に相当するNPO団体が民間資金を得て、自由な立場から活動を行っている実態が明らかにされた。フィンランドでは国立社会福祉保健開発研究所(STAKES)の自殺予防プロジェクトチーム、英国では保健省とサマリタンズの担当者、中国では北京の自殺予防研究センター及び北京大学精神保健研究所の担当者と学術交流を行うことができ、将来の共同研究ならびに国際シンポジウム開催へ向けた人的交流ネットワークを確立することができた。今回の研究成果は平成17年1月29日に秋田市で開催されたシンポジウム「海外の自殺予防対策をいかに我が国に活かすか」で発表され、180名を超える多数の市民とマスコミ関係者の参加を得た。研究成果は平成17年1月30日のマスコミ各社で配信された。
バイオインフォマティクスによるがん化学療法の新規創薬ターゲット遺伝子の探索

がん化学療法の新規ターゲットとなりうる遺伝子を同定するために、我々はこれまでに、多数のヒトがん細胞株をモデルに、バイオインフォマティクスを用いてがん細胞の抗がん剤感受性を決定する遺伝子群の抽出を試みてきた。本研究では、我々が独自に開発したヒトがん39細胞株パネル(JFCR39)におけるに遺伝子発現・薬剤感受性統合データベース(DB)に加え、アメリカ国立がん研究所(NCI)が開発した60細胞株パネル(NCI60)の遺伝子発現・薬剤感受性統合DBを利用して、抗がん剤感受性に関連を示す遺伝子群を抽出した。また、これらの遺伝子群のうち機能的に抗がん剤感受性への関与を示す遺伝子を同定することを目的に、RNA干渉法を利用したスクリーニング系を確立した。その結果、これまでに検討した15種類以上の遺伝子の中から、発現ノックダウンによりDNAトポイソメラーゼI阻害剤への感受性が低下する遺伝子(PLK1)、上昇する遺伝子(SFN)を同定した。このことから、これらの遺伝子はDNAトポイソメラーゼI阻害剤感受性へ機能的な関与があることが示唆された。以上のように、ヒトがん細胞株パネルを用いたモデル解析とRNA干渉法を利用したスクリーニング系を組み合わせることにより、抗がん剤感受性関連遺伝子を効率的に同定することができた。これらの遺伝子は、抗がん剤感受性診断マーカーやがん化学療法の新たなターゲットとして期待される。また、これらの遺伝子の機能解析を行うことにより、抗がん剤の作用メカニズムについて未知の部分が解明されることが期待される。
図的推論を用いた人の自然な論理推論の解明と促進：論理学及び認知科学の統合的研究

本研究は、図的推論を手段として、人間に自然な推論様式の解明を行うことを目的とする。採用第3年度目の本年では、条件法の推論を支援する図的表現について検討した。これまでの図的推論研究では、現実物と仮想現実物のどちらか一方だけが使用されてきたが、両者を時間的・空間的に同時に使用する拡張現実環境(Augmented Reality: AR)を導入した。それらを用いた条件法推論を行わせる実験を実施することで、現実物が推論を阻害するのに対して、AR環境における仮想現実物はその阻害を回避していることを示した。この結果は、現実物が他の可能性を含まない一つの状況だけを過剰に特定しているのに対して、AR環境における仮想現実は複数の状況を表現し得ることを示唆する。以上の研究について、準備段階の成果を、日本認知科学会第32回大会において発表を行った。さらに英語論文をジャーナルに投稿、現在査読中である。採用者のこれまでの研究は、標準的量化子(All, Some)に関する集合(個体)同士の包含・排他関係に範囲が限定されていた。そこで、非標準的量化表現(Most)に関する集合同士の比率関係に分析を拡張し、その図的表現と推論についての研究をDiagrams-2016国際会議論文にまとめ、今後の研究の見通しを得ることもできた。27年度が最終年度であるため、記入しない。本申請研究の目的は、人間が自然に実行する論理を理論的・実証的に明らかにすることである。主に図的推論を手段として、人間に自然な推論様式の解明を試みる。本年は第一に、認知モデリングにおける実装と形式化について研究を実施した。計算認知モデリングは、計算プログラムによる認知理論の実装であり、認知理論における心的表象やプロセスを具体化することができる。しかし、そのような実装は認知理論における仕様を含むものではない。実際、Johnson-Lairdらによるメンタルモデル理論のモデリング実装においても、その仕様はこれまで適切な形では与えられていなかった。さらに重要なことに、この実装には「メンタルモデル」の定義は暗黙的に行なわれており、明示的な仕様になっているわけではない。これは、実装によるモデリング以前から,メンタルモデル理論の曖昧さとして従来指摘され続けてきた問題であった。こうしたモデル実装と認知理論のギャップを埋めるために、形式仕様記述に親和的な強い静的型付き言語を用いた認知理論(メンタルモデル理論の三段論法推論)の実装を提案した。研究成果は、2013年Artificial Intelligence and Cognition国際会議に査読付き国際会議論文としてまとめ、また2014年人工知能学会全国大会において発表予定である。第二に、図的推論において人間がどのような図形操作を行っているかを解明することを目指した。特に、これまであまり研究がなされてこなかった推論の重要な側面のひとつ、与えられた前提から妥当な結論が何も導かれないということを判断する、いわゆるNVC課題に注目した。実験では、量化文から成る三段論法推論課題を解くための推論者のオイラー図の動かし方を観察した。本研究では、NVC課題における複雑な認知プロセスを明示化するために、PC画面上での図形の画像移動軌跡を記録する方法を新たに提案した。研究成果は、2014年Diagrams国際会議に査読付き国際会議論文として出版予定である。本年は、第一に、前年に導入した画像移動軌跡の記録による図的推論の戦略記述の研究を、さらに展開した。前提から導かれる妥当な結論がないことをオイラー図等を用いて判断する場合、図のオブジェクトレベル(幾何学的)情報だけでなく、メタ的な意味論的(位相的)情報を扱う必要が明確にある。このような帰結関係を考える際に、同時にオイラー図をPC画面上で動かすことを求める実験を実施した。その際の円画像移動軌跡を計測した結果、適切に大きさが固定された円の時だけでなく、不適切な大きさの円が与えられた時でも、ユーザは円の大きさを変更することで、同様の合成図の複数列挙戦略をとっていた。これは、図の視覚的な性質を偶然利用できただけでなく、図を意味論的なモデルとして認識し反例構築を行っていたことを示す。研究成果は、Cognitive Science Society 2014年大会(CogSci 2014)に査読付き国際会議論文としてまとめ、またアイトラッカーを用いた分析を日本認知科学会2014年大会において発表した。第二に、前年に引き続き、Johnson-Lairdのメンタルモデル理論に基づく三段論法推論を題材に、認知理論のモデリングを進めた。特に、認知モデリングにおいて軽視されがちだった、仕様(specification)を与えることを目指した。タルスキ流意味論による論理学的形式化を、慶應義塾大学の研究報告書に論文としてまとめた。また、抽象的な形式化と通常のプログラム実装によるモデリングの中間様式として、強い静的型付き言語Haskellを用いた実装を行った。この研究成果は、2015年Cognitive Modeling国際会議(ICCM 2015)に査読付き国際会議論文としてまとめた。

それらを用いた条件法推論を行わせる実験を実施することで、現実物が推論を阻害するのに対して、AR環境における仮想現実物はその阻害を回避していることを示した。この結果は、現実物が他の可能性を含まない一つの状況だけを過剰に特定しているのに対して、AR環境における仮想現実は複数の状況を表現し得ることを示唆する。以上の研究について、準備段階の成果を、日本認知科学会第32回大会において発表を行った。さらに英語論文をジャーナルに投稿、現在査読中である。採用者のこれまでの研究は、標準的量化子(All, Some)に関する集合(個体)同士の包含・排他関係に範囲が限定されていた。そこで、非標準的量化表現(Most)に関する集合同士の比率関係に分析を拡張し、その図的表現と推論についての研究をDiagrams-2016国際会議論文にまとめ、今後の研究の見通しを得ることもできた。査読付き国際会議論文としては研究成果をまとめることができた。27年度が最終年度であるため、記入しない。第一の研究について、図的表現に関する論理学的形式化における扱いと実際の実験や認知における扱いのギャップを埋めることに焦点をあて、英語学術論文としてまとめる。さらに、図的表現を現実の物や仮想現実の物に拡張して考え、条件文や連言文の理解において、それらがどのような影響を与えるのかについて研究を進める。新たな環境で研究や実験を実施し、査読付き国際会議論文の形で研究成果をまとめることができた。第一の研究については、認知理論の形式化として研究をスタートさせたが、計算認知モデリングの研究文脈の中でそれがどのような意義を持ちうるのかを考えていきたい。第二の研究については、図形の持つ大きさなどの偶然的性質に着目して研究を進めていく計画である。これは、哲学の文脈で知られてきた図形の一般性・特殊性の問題とも関連し、実験哲学的な興味深い知見を得ることが期待される。また、さらにアブダクションなどのいわゆる拡張的推論へも研究を進めたい。
破骨細胞関連生物学的因子の解析に基づいた,口腔癌増殖に伴う顎骨破壊機序の解明

13年度では、予備実験である「シクロオキシゲナーゼ阻害剤による口蓋発癌抑制実験」について、交付科学研究費で購入された画像処理ソフトウェアを用いて数量的データーを得るなどして、第60回日本癌学会総会において発表し、今回の研究で行うラット口腔発癌惹起の方法の有効性、すなわち、20ppm 4ニトロキノリン1オキサイド水溶液を飲料水として投与する我々の口腔癌誘発方法では顎骨破壊を伴う口腔癌が60%のラットに発生できることを確認した。それに基づき平成13年10月より、F344ラットを用いて、20ppm濃度の4ニトロキノリン1オキサイド水溶液を飲料水として投与する口腔発癌実験を開始した。このラット口腔癌発癌実験によって生じた癌組織を材料として、14年度にはまず、細胞内水輸送に関わる分子であるアクアポリンの癌組織内局在を観察した。その結果、正常口腔扁平上皮の基底層細胞見られたアクアポリン3の局在が、扁平上皮癌胞巣の最外層細胞においては消失していることを見いだし、この新知見を第44回歯科基礎医学会学術大会にて発表した。他方、発癌実験で生じたラット口腔癌組織の培養を試みた。ラット舌癌組織・ラット口蓋癌組織を採取して培養したところ、培養開始から4ないし5ヵ月後に、2個の口蓋癌組織より、上皮様細胞のみからなる細胞集団が各々の組織より一つずつ、計2種得られた。さらに、顎骨吸収を伴わない舌癌に由来する培養細胞の特性と、顎骨破壊をきたす口蓋癌由来の培養細胞との特性を比較して、口腔癌増殖に伴う顎骨破壊との関連を解明するために、ラットと4ニトロキノリン1オキサイドを用いる舌癌誘発実験を今年度秋より開始した。今後は、舌癌由来培養細胞の株化と口蓋癌由来培養細胞の株化を行い、両株化細胞と脾臓細胞とハイドロオキシアパタイト上で、共存培養して、口腔癌と破骨細胞関連因子と関連を明らかにしていく予定である。本年度ではまず、予備実験である「シクロオキシゲナーゼ阻害剤による口蓋発癌抑制実験」について、交付科学研究費で購入された画像処理ソフトウェアを用いて数量的データーを算出して、第60回日本癌学会総会において発表し、今回の実験で行うラット口腔発癌惹起の方法の有効性、すなわち、20ppm4ニトロキノリン1オキサイド水溶液を飲料水として投与する我々の口腔癌誘発方法では、顎骨破壊を伴う口腔癌が、20ppm4ニトロキノリン1オキサイド水溶液を飲料水として投与されたラットの60%に発生することを確認した。それに基づき平成13年10月より、13頭のF344ラットを用いて、20ppm濃度の4ニトロキノリン1オキサイド水溶液を飲料水として投与する口腔発癌実験を開始した。すでに、実験開始から15週以上が経過し、一部のラットには体重増加停止・血液の混じった唾液の流失など口腔癌発生の兆候が認められている。この発癌実験で生じた口腔癌は次年度で行う、免疫不全マウスへの移植実験ならびにラット口腔癌由来培養細胞株確立のための細胞培養に用いる予定である。また、細胞培養を行うために、既存設備の点検・整備を行うとともに細胞培養に必要な器材および試薬・血清などを購入し、ラット口腔上皮細胞およびラット歯肉線維芽細胞ならびにヒト口腔癌由来細胞の培養を今年度内に開始する準備を整えた。来年度においてはさらに、マウス口腔癌誘発実験も行う予定である。

これは、マウス由来細胞を解析するための市販薬剤・市販抗体の数が、ラット由来細胞を解析するためのそれら薬剤・抗体の数よりも多いので、マウス由来口腔癌細胞株を樹立すれば、ラット由来口腔癌細胞の解析よりも精細な解析をマウス由来口腔癌培養細胞に対して行えるからである。昨年度より始めたラット口腔癌発癌実験によって生じた癌組織を材料として、まず、細胞内水輸送に関わる分子であるアクアポリンの癌組織内局在を観察した。その結果、正常口腔扁平上皮の基底層細胞見られたアクアポリン3の局在が、扁平上皮癌胞巣の最外層細胞においては消失していることを見いだし、この新知見を第44回歯科基礎医学会学術大会にて発表した。この知見を紙上発表すべく、論文作成準備中である。他方、発癌実験で生じたラット口腔癌組織の培養を試みた。ラット舌癌組織・ラット口蓋癌組織を採取して培養したところ、培養開始から4ないし5ヵ月後に、2個の口蓋癌組織より、上皮様細胞のみからなる細胞集団が各々の組織より一つずつ、計2種得られた。そのうちの一つはヒーラ細胞様の敷石状配列をとりながら増殖しており、もう一つは角化傾向をうかがわせるような増殖様式を示していた。なお、クリーンベンチの改修のために、増殖したそれら細胞は液体窒素中に凍結保存した。さらに、顎骨吸収を伴わない舌癌に由来する培養細胞の特性と、顎骨破壊をきたす口蓋癌由来の培養細胞との特性を比較して、口腔癌増殖に伴う顎骨破壊との関連を解明するために、ラットと4ニトロキノリン1オキサイドとを用いる舌癌誘発実験を今年度秋より開始した。すでに実験開始から20週が経過し、舌癌発生の兆侯が見いだされている。今後は、得られた口蓋癌由来培養細胞の株化を行い、株化細胞と脾臓細胞とを、ハイドロオキシアパタイト上で共存培養して、口腔癌と破骨細胞関連因子との関連を明らかにしていく予定である。
原核細胞の磁気オルガネラの生細胞イメージングー形成・機能メカニズムの解明ー

本研究では、磁性細菌がもつナノサイズの原核細胞オルガネラ「マグネトソーム」を構成する蛋白質を蛍光蛋白質で標識することで、生細胞内でマグネトソームを可視化し、その細胞内動態を解析した。蛋白質発現ベクターを作成し、マグネトソーム局在蛋白質と蛍光蛋白質の融合蛋白質を発現させ、マグネトソームの生細胞イメージングを行った。その結果、マグネトソームが細胞分裂後に娘細胞へ伝搬される様子が観察された。原核細胞は、原核細胞オルガネラと呼ばれる細胞内構造物を形成し、細菌に特徴的な反応(CO_2固定やアンモニア酸化、バイオミネラリゼーションなど)の場として機能させている。しかし、原核細胞オルガネラの動態・機能発現のメカニズムはほとんど未知である。本研究では、磁性細菌Magnetospirillum magneticum AMB-1の原核細胞オルガネラ「マグネトソーム」を構成する蛋白質を蛍光ラベルすることで、"生きだ細胞内でマグネトソームを可視化し、その動態の解明を目指す。平成22年度は、まず磁性細菌における蛋白質発現系の構築を行った。広宿主域プラスミドベクターpBBB由来のプラスミドにtacプロモーター配列をクローニングすることで、tacプロモーター依存的に蛋白質を発現させる広宿主域ベクター(pBBR-tac)を作製した。tacプロモーター下にGFP遺伝子をクローニングし、接合により磁性細菌に形質転換したところ、磁性細菌細胞内でのGFP発現を蛍光顕微鏡下で確認した。また、マグネトソーム形成に関わる膜蛋白質ManPをコードする遺伝子をクローニングし、磁性細菌に形質転換した。その結果、イムノブロットによりMamPの発現量を調べたところ、野生株のおよそ5倍多く発現しており、本発現ベクターがマグネトソーム形成に関わる蛋白質の大量発現にも使用できることを確認した。一方、生細胞を蛍光顕微鏡下で長時間観察するための細胞の固定方法を検討した。開発した固定方法を用いて液体培地中で培養しながら顕微鏡観察を続けたところ、スライドグラス上で細胞分裂を確認することができた。現在、蛍光蛋白質とマグネトソーム局在蛋白質の融合蛋白質を発現させるプラスミドベクターを構築しており、これにより蛍光顕微鏡下でのマグネトソームの可視化を行う予定である。原核細胞は、原核細胞オルガネラと呼ばれる細胞内構造物を形成する。本研究では、磁性細菌Magnetospirillum magneticum AMB-1の原核細胞オルガネラ「マグネトソーム」を構成する蛋白質を蛍光ラベルすることで、生細胞内でマグネトソームを可視化し、その動態の解明を目指す。本年度は、平成22年度に構築した本細菌で機能する蛋白質発現ベクターを用いて、細胞骨格蛋白質MamKおよびマグネトソーム小胞局在蛋白質MamCのGFP融合蛋白質を発現するプラスミドベクターを構築し、接合により磁性細菌細胞を形質転換させた。形質転換した磁性細菌を蛍光顕微鏡下で観察したところ、MamK-GFPは細胞極間を結ぶ直線的な繊維状構造として、MamC-GFPは細胞の長軸に沿ったパッチ状の斑点としてそれぞれ観察され、細胞骨格およびマグネトソーム小胞の可視化に成功した。GFP融合蛋白質を発現させた磁性細菌を、ポリリジンコートした灌流培養用スライドに固定し、培養液中で長時間蛍光顕微鏡観察した。その結果、10時間までGFPの蛍光を検出でき、その局在の観察ができた。さらに、複数のマグネトソーム局在蛋白質を同時に細胞内で観察する為、GFPとは異なる蛍光波長をもつ蛍光蛋白質の発現を試みた。蛍光蛋白質Keima-Red,Azami-Green,Kusabira-Orange,およびHalotagの発現を試みたが、これらの蛋白質の蛍光シグナルを確認することはできなかった。一方でmCherryの発現を行ったところ、蛍光シグナルが確認された。今後は、mCherryを使用もしくは、使用コドンを本細菌での発現に最適化した蛍光蛋白質遺伝子を用意し、マグネトソーム微細構造の多重蛍光ラベルし、微細構造同士の相互作用の観察を試みる。1、昨年度発現が確認できなかったHalotagによるマグネトソーム局在蛋白質の標識を行った。発現ベクターを広宿主域ベクターpBBR111に変更したところ、磁性細菌におけるマグネトソーム膜蛋白質MamC-Halotag融合蛋白質の発現が確認できた。発現条件を検討し、蛍光顕微鏡下でHalotag標識されたマグネトソーム小胞を観察することに成功した。本研究により、蛍光蛋白質GFP、mCherry及びHalotagを用いたマグネトソーム微細構造の標識に成功した。2、マグネトソーム小胞をMamC-Halotagで標識した細胞を灌流培養用スライドに固定し、タイムラプス観察を行った。その結果、細胞分裂の様子が観察できた。

3、マグネトソームは、細胞膜が貫入し形成される構造体である。そこで、細胞表面からマグネトソームの観察が可能かを確かめるため、高速原子間力顕微鏡を用いて、生きた磁性細菌の細胞表面を観察した。磁気ビーズによるラベルなどを試みたが、細胞表面にマグネトソームに関連する構造は確認できなかった。一方で、細胞表面がポーリン分子より構成される網目状構造によって覆われていること、またその分子動態を明らかにした。本技術は、生細菌の表層構造の動態観察への応用が期待でき、その成果を論文発表した。4、本研究で開発した蛋白質発現ベクターを用いて、マグネトソームの細胞骨格を構成するMamK蛋白質をmamK遺伝子欠損株に発現させ、その表現型を調べた。その結果、mamK欠損株は、相補株より走磁性が弱いこと、対数増殖期の細胞中の磁鉄鉱結晶数が少ないことが分かった。また、生細胞イメージングの結果、MamK細胞骨格は細胞周期を通じて細胞極間を結ぶ直線状に分布していた。これらの結果から、MamK細胞骨格が、細胞分裂時のマグネトソーム分配に関わっていることが示唆された。交付申請書の「研究の目的」のうち、本年度までに「生細胞蛍光イメージング技術の確立」が完了し、マグネトソーム小胞および細胞骨格の蛍光蛋白質ラベルによる可視化に成功した。平成23年度から24年度にかけて「マグネトソーム微細構造の動態観察」および「マグネトソーム構成蛋白質遺伝子の変異株の作製」が進行中であり、おおむね計画どおり進展している。24年度が最終年度であるため、記入しない。マグネトソーム微細構造の動態観察については、平成23年度に構築した組換え磁性細菌を用いて、細胞分裂時のマグネトソーム小胞、および細胞骨格の動態を観察し、娘細胞への伝搬機構を検討する。また、細胞に磁場をかけ、細胞内のマグネトソームの局在の変化を観察する。これにより磁気応答中の細胞内のマグネトソームが観察できないかを検討する。マグネトソーム局在蛋白質に多重ラベルを目指した研究では、特に任意の蛍光色による多重ラベルに有効であるHalotagの発現に重点をおく。Halotag遺伝子のコドンの改変を行い磁性細菌細胞内での発現を検討する。マグネトソーム関連遺伝子欠損株(mamA,mamK,mamJ遺伝子欠損株)において生細胞内で、MamKもしくはMamC局在を可視化し、そのマグネトソームの細胞内動態、磁気応答を観察する。これにより、これまでの電子顕微鏡による観察では見逃されてきた生きた細胞中におけるマグネトソーム関連蛋白質の機能に迫る。
固体燃料の燃焼による水溶性有機酸とカルボニルの放出とそれらの都市および海洋大気へのインパクト

本研究では、大気中の微粒子、特に有機物からなるエアロゾルに着目し、その組成解析を行うことを目的にする。特に、都市における有機エアロゾルをガスクロマトグラフ・質量分析計を使って解析し、主要な燃料に違いによって大気中のエアロゾル成分にどのような違いが生ずるのかを明らかにする。中国では、石炭が重要な工業的エネルギー源であり、家庭においても石炭・木材の双方が燃料源として広く使われている。一方、ニュージーランドでは、両方のエネルギーが使われており、特に、クライストチャーチでは家庭の暖房に薪を多用するために大気汚染が問題となっているのに対し、オークランドでは石油が一般的につかわれている。二つの主要都市は、冬期に使用するエネルギーの種類において対照的である。そこで、本研究では、ニュージーランドの2つの都市で採取されたエアロゾル試料を分析し、その化学成分の特徴から化石燃料とバイオマスの燃焼の寄与を明らかにすることを目的とした。エアロゾル試料中の有機炭素、黒色炭素、水溶性炭素の濃度を測定するとともに、主要イオン成分を測定した。その結果、冬季の暖房に薪を多用するクライストチャーチでは、有機炭素・黒色炭素の濃度がオークランドにくらべて著しく高いことがわかった。更に、エアロゾル試料から有機成分を分離し、GC/MSによる詳細な解析を行った。その結果、バイオマス燃焼に由来する有機物がクライストチャーチの冬のサンプルで高い濃度を示すことが明らかになった。特に、セルロースの燃焼生成物であるレボグルコサンは最も高い濃度をしめす有機物として検出され、薪の使用が有機エアロゾルの生成に大きく寄与していることを明らかになった。一方、オークランドで採取したエアゾル試料では、原油や石炭など化石燃料の燃焼に起因する有機物(例えば、ホパノイド炭化水素)が高い濃度で検出された。日本から南極大陸のまでの太平洋・南大洋・南極海洋上で採取した海洋エアロゾル26試料から低分子ジカルボン酸、ケトカルボン酸、ジカルボニルを分離・誘導体化の後、ガスクロマトグラフおよびGC/MSにて測定した。これら水溶性有機物の海洋大気中での空間分布を明らかにするとともに、ジカルボン酸の安定炭素同位体比を測定し、以下の研究成果を得た。すべての海洋エアロゾル中でシュウ酸が最も高い濃度で存在し、マロン酸、コハク酸がそれに続いた。低分子ジカルボン酸の濃度は東アジアに近い北太平洋とニュージーランドおよびオーストラリアに近い南大洋で高い濃度を示した。この結果は、水溶性有機物が陸上の人間活動や植生に起源があることを意味している。一方、南極海ではきわめて低い濃度を示すことがわかった、バックグラウンド濃度に相当することを提案した。エアロゾル中の全炭素に占めるジカルボン酸炭素の割合は0.6-14%の間で変動したが、北太平洋で高い値を南大洋で低い値を示した。データの主成分分析(PCA)をしたところ、これらジカルボン酸の分布は3つの因子、すなわち、(1)光化学反応による生成、(2)陸のソースからの長距離大気輸送、(3)より大きな有機物の光化学的変質で説明されることがわかった。さらに、ジカルボン酸などの安定炭素同位体比を測定した結果、それらは大きな変動を示すとともに緯度的な特徴を示すことがわかった。たとえば、シュウ酸の安定炭素同位体比は赤道などより低緯度で重い傾向を中緯度で軽い傾向を示した。この結果は、光化学的変質の結果、水溶性有機物は同位体的に重くなることを示唆し、ジカルボン酸の安定炭素同位体比が大気中での光化学的変質のトレーサーとして使える可能性を示した。また、ニュージーランドの二つの都市(オークランド、クライストチャーチ)で冬季に採取したエアロゾル試料中の有機炭素、黒色炭素、イオン成分を測定し、その分布の特徴をエネルギー使用の違いの観点(槙などバイオマスの燃焼と石油の違い)で議論した。その結果、冬季の暖房に槙を多用するクライストチャーチでは、有機炭素・黒色炭素の濃度が著しく高いことがわかった。

一方、オークランドで採取したエアゾル試料では、原油や石炭など化石燃料の燃焼に起因する有機物(例えば、ホパノイド炭化水素)が高い濃度で検出された。
廃用性筋萎縮の新たなメカニズムの解明：体内時計の乱れは筋肉をも壊してしまうのか？

体内時計と筋萎縮の関与を調べるために、筋萎縮モデルマウス(坐骨神経切除マウス)における時計遺伝子発現の日内リズムを解析した。坐骨神経を切除した骨格筋においても時計遺伝子は日周発現したが、概日リズムのパラメーター(位相、振幅、発現量)は対照肢と比較して異常が見られた。また、これらのパラメーターの変動の様子は各遺伝子によって異なっていた。筋萎縮の進行に伴い発現リズムが乱れた時計遺伝子が多かったことから、骨格筋の量・機能の維持が「筋時計」の日内リズムの維持に重要であると考えられた。骨格筋代謝(特に筋タンパク質代謝)における体内時計遺伝子の機能を明らかにするために、平成24年度に野生型マウス、時計遺伝子Bmal1欠損マウスを用いて坐骨神経切除試験を実施した。これらのマウスでは筋重量減少率、筋萎縮マーカー遺伝子発現誘導に差が見られなかったことから、除神経による筋萎縮の機構は時計遺伝子の制御が弱いことが示唆された。この結果に基づき、平成25年度は、他の筋萎縮モデルであるグルココルチコイド剤投与、加齢のモデルを用いて当該マウスの筋重量を比較する実験を計画した。グルココルチコイド剤は抗炎症・免疫抑制作用を持つ薬剤として使用されるが、慢性的な高濃度の投与は、筋萎縮の副作用を引き起こすことが知られている。一方、副腎からの内在性グルココルチコイドホルモンの分泌には、活動期直前にピークとなる日内変動が存在する。そこで予備試験として、グルココルチコイド剤誘導性の筋萎縮に対する投与時刻の影響について検討を行った。マウスにグルココルチコイド剤を1日1回、朝(内在性グルココルチコイドが低値になる時刻)または夕方(内在性グルココルチコイドが高値になる時刻)に10日間腹腔内投与した。すると、グルココルチコイド剤投与による筋萎縮マーカー遺伝子(MAFbx)の発現誘導や筋重量の減少については、朝の投与でその影響が大きく見られた。これらの結果から、筋肉のグルココルチコイド剤に対する感受性には時刻依存性があり、投与時刻を工夫(内在性グルココルチコイドホルモンのリズムに合わせて投与)することで投与による筋萎縮を軽減させることが可能であると考えられる。この成果をChronobiology International誌に発表した。申請者は、廃用性筋萎縮モデルの1つである坐骨神経切除マウスを用いて、筋萎縮の分子メカニズムを明らかにしてきた。その中で、坐骨神経切除により萎縮した筋肉では時計遺伝子Bmal1の発現位相がずれるという結果を得たことから、筋萎縮のメカニズムには体内時計分子の働きが関連する可能性があると考えた。平成24年度は、筋特異的Bmal1遺伝子欠損マウス(以下、M-Bmal KOマウス)と野生型マウスの坐骨神経を切除し、それぞれのマウスの筋肉の萎縮度を評価した。具体的には、坐骨神経切除7日後のZT1(飼育室の照明点灯1時間後)、ZT13(飼育室の照明消灯1時間後)にマウスを解剖し、腓腹筋重量を比較した。他の研究グループから、Bmal1遺伝子欠損マウスは高齢になると筋重量が減少するとの報告があったことから、M-Bmal1 KOマウスの筋重量は野生型マウスに比べて減少し、坐骨神経切除による萎縮が重篤化すると予想していた。しかし、野生型マウス、M-Bmal1 KOマウスの腓腹筋重量は坐骨神経切除によりどちらも約30%減少し、減少率に差は見られなかった。萎縮した筋肉では、筋萎縮遺伝子と呼ばれるatrogin-1, MuRF-1のmRNA発現が誘導されるが、これらの遺伝子の発現量も野生型マウス、M-Bmal KOマウスで差が見られなかった。時計遺伝子Bmal1は筋代謝機構とは独立して機能するか、他の分子による代償機構が存在する可能性が考えられる。体内時計の中枢である視交叉上核(SCN)が、どのような制御機構を介して末梢組織の概日リズムシステムを同調させているか明らかになっていない。平成26年度は、骨格筋への神経入力を遮断する坐骨神経切除モデルにおける体内時計遺伝子の変動について解析し、各時計遺伝子の発現に対する神経制御、筋萎縮の程度の影響の強さを考察した。マウスの左肢の坐骨神経を切除し、右肢には偽手術を行った廃用性筋萎縮モデルを用いた。対照として、処置を行わないマウスを用いた。坐骨神経切除から0, 3, 7, 9, 11, 14日後の2時刻、また7、28日後の6時刻にマウスを解剖し、摘出した腓腹筋における時計遺伝子の発現量を測定した。坐骨神経切除を行っても深部体温、血中コルチコステロン量、肝臓における時計遺伝子発現の概日リズムには変化がなく、個体の概日リズムは維持されていた。