hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
人工ヌクレオタンパクを用いたRNAウイルスの高感度検出系の開発

RNAウイルスは細胞に感染すると、子孫ウイルスを構成するためのゲノムと蛋白質を複製する。その際、複製されたウイルスRNAは細胞内で分解されないように蛋白質と複合体を形成している。今回、インフルエンザウイルスのゲノムRNAに会合するヌクレオペプチドのRNA結合ドメインの配列を模倣した人工ペプチドを合成した。そして、人工ペプチドに金コロイドを修飾して、ウイルスゲノムを検出できるかを評価した。その結果、インフルエンザウイルスゲノムをラテラルフローストリップ上に捕獲後、金コロイド修飾人工ペプチドを加えたところ、インフルエンザウイルスをより高感度に検出することができた。当初の計画通り、インフルエンザウイルスの核蛋白質のアミノ酸配列を模倣して、その塩基性アミノ酸をすべてリシン、酸性アミノ酸をグルタミン酸、中性アミノ酸をアラニン、芳香族アミノ酸をフェニルアラニンにした擬核蛋白質を複数合成した。それら末端にビオチンを修飾し、金コロイド修飾の抗ビオチン抗体を結合できるように設計した。次いで、インフルエンザウイルスのゲノム配列に核酸塩基相補的なペプチド核酸を合成した。そして、水晶発振子(QCM)の金基盤表面上にペプチド核酸をジチオジプロピオン酸によって架橋して固定化した。QCMのセンサーグラムから、金基板上にペプチド核酸が固定化されたことを確認した。ここにインフルエンザウイルスをLysis bufferにて溶解させ、ウイルス由来のゲノムを基盤上のペプチド核酸と作用させ、センターグラムの変化を確認することに成功した。そして、ペプチド核酸ーウイルスゲノム会合体に擬核蛋白質を作用させ、その会合体に擬核蛋白質が結合し、この三者会合体の質量が大きくなることにより、振動数がわずかに減少することが確認された。しかしながら、既にインフルエンザウイルスのゲノムには核蛋白質が結合している為、擬核蛋白質が競合してゲノムに結合しにくいか、結合した場合であっても分子量が小さなため顕著な振動数変化としては現れない結果となった。そこで、前記三者会合体の擬ペプチドの結合を明確に検出するため、擬核蛋白質のペプチド末端にあるビオチンをターゲットとした金コロイド修飾型ー抗ビオチン抗体を作用させる方向で実験を進めている。さらに、ニトロセルロースメンブレン上にペプチド核酸を固定化して、ゲノムを捕獲後、そのゲノムを擬核蛋白質、および金コロイド修飾型ー抗ビオチン抗体を使って目視検出することを目指している。前年度、ペプチド核酸(PNA)を水晶発振子の金基板上に固定化した後、インフルエンザウイルスのゲノム(vRNA)を捕獲することに成功した。一方、vRNAにRNA結合性のある人工ヌクレオタンパク質の全ての塩基性アミノ酸をリシンに、全ての酸性アミノ酸をグルタミン酸に、全ての中性アミノ酸をアラニンに置換した人工アミノ酸を合成した。この人工ヌクレオプロテインを金基板上のPNA/vRNA複合体に作用させたところ、PNA/vRNAに人工ヌクレオプロテインが作用して、水晶発振子の振動が減少することを確認した。本年度は、人工ヌクレオタンパク質の末端にビオチンを結合させ、これに金コロイド修飾型抗ビオチン抗体を作用させ、目視で検出することを目指した。しかしながら、人工ヌクレオプロテインの末端にビオチンを修飾したまま固相合成を進めると、ビオチンが酸化型構造をとり、金コロイド修飾抗ビオチン抗体との相互作用が弱まってしまうという課題が生じた。そこで、人工ヌクレオタンパク質の末端にシステインを導入し、直接的に金コロイドと結合するように設計した。システイン修飾人工ヌクレオタンパク質は効果的に金コロイドと反応することを確認した。この金コロイド修飾人工ヌクレオタンパク質をラテラルフローストリップに導入すると、PNA/vRNAにこの金コロイド修飾人工ヌクレオタンパク質が反応し、インフルエンザウイルス由来のvRNAを検出することができた。今後は、人工ヌクレオタンパク質の配列をインフルエンザウイルスのヌクレオタンパク質の実際のアミノ酸配列に近づけ、vRNAをより高感度に検出する技術を開発する。当初の計画通り、インフルエンザウイルスの核蛋白質の配列を模倣した擬核蛋白質ペプチドを合成した。それらを用いて、QCM基板上のウイルスゲノムの検出感度をわずかながらも向上させることができた。この検出感度をさらに金コロイド修飾型ー抗ビオチン抗体により増感できれば、さらに感度が向上すると期待される。さらに、ペプチド核酸をクロマト上に固定化して、擬核蛋白質の末端にビオチンを導入することで、金コロイド修飾型ー抗ビオチン抗体を作用させて、ウイルス検体を目視検出するまでの実験準備を整えることができた。以上のことから、研究は当初の計画通りおおむね順調に進展している。ゲノム医科学擬核蛋白質そのもののウイルスゲノムに結合は、QCM上でのインフルエンザウイルスゲノムの検出感度を格段に向上させるものではないが、擬ペプチド核酸に金コロイド修飾型ー抗ビオチン抗体を作用させて、ウイルスゲノムの検出感度を格段に向上させることを目指す。人件費として当初140万円の使用することを予定していた。しかしながら、技術補佐の懐妊後の体調の変化により、休暇日数が多くなったために実際の人件費は大幅に減額となった。次年度は技術補佐員の出勤日数を増やして、加速的に研究を進める予定である。
ゲノムを異にする絹糸虫の交雑と器官発生分化に関する細胞学的研究

この研究は、テンサン飼育において技術的にネックとなっている2課題について基礎的な調査を行った。虫質に優れるサクサン(P、n=49)とテンサン(Y、n=31)との交雑育種(Y×P、P×Y)を試みる一環として、不妊とされるF_1精巣の発育と精子形成を細胞学的に比較した。つぎに、テンサン卵の卵殻除去による胚子培養が可能となったので、随時ふ化法に資する休眠打破と昆虫ホルモンとの関係を調査した。1)幼虫期における精巣の発育には、両親とF_1との間には形態学的な相違はなかった。しかし、精子形成の副核出現期になると、F_1においてのみ細胞間橋を介して隣接細胞との間に核融合がみられた。核融合の結果と推定される、鞭毛内に軸糸を複数持つ精子が観察され、この異常精子は運動機能に支障を来すものと考えられた。2)F_1の成熟分裂中期の染色体の形は、両親のものと同様8の字形と、0の字形の両者から構成されていた。3)第一分裂中期の染色体の構成は、両親との比較から、平均数でY×P:2価10.0、1価60.0、P×Y:2価8.8、1価62.4であった。つぎに、第二分裂中期では、8の字形のものが明確でなく、大伴が0の字形であった。構成は、Y×P2分染色体9.9、1分染色体59.6、P×Y前者9.1、後者62.6となり、染色体の数や組合せの異なる精子細胞ができる可能性が示唆された。以上のことから、F_1の成熟分裂時の染色体対合の有無が異常精子を形成する原因と断定できないが、正常な個体発生を低下させているものと考えられた。(4)培養胚子の発育と添加ホルモンとの関係は、初期胚子および産卵後144時間胚子ともに、対照区、ecdysterone区(2μg/μl)では胚子を頭部着色期まで発育させた。一方、KKー86S区(10μg/μl)では、両胚子に異常発生が認められた。添加ホルモンと休眠打破との関連では結論は得られなかったが、胚子が卵黄を飲み込む前に卵殻を1/3程度除去した方法でホルモン処理すると、その効力の判定に使える可能性が示唆された。ゲノムの異なる天蚕と柞虫の種間雑種(F_1)の器官発生分化を知る目的で、正逆交雑種(Y×P,P×Y)を育成し、産卵性、ゲノムDNA量および微細形態学的にみた精子形成を調べた。また、前幼虫越冬の休眠機構を調べる一端として、天蚕培養胚子の発育に及ぼす昆虫ホルモンの影響についても調べた。結果1.産卵性:天蚕と柞虫の飼育第1期(56月)終了後、蛹を同一条件で保護して、二化柞虫と天蚕との種間雑種を作成した。供試蛾の受精蛾歩合、受精蛾の産卵数および受精卵のふ化歩合を算出した。受精蛾歩合は天蚕より低かったが、産卵数およびふ化歩合は、Y×P、前者が225±76.45個、後者が74.20±17.73%、P×Y、前者が366±44.79個、後者が96.50は、±2.70%と、とくにP×Yが高かった。2.ゲノムDNA量:染色体数の異なる天蚕(n=31)と柞虫(n=49)の雑種における細胞のフロ-サイトメトリ-を計測し、そのゲノム量は天蚕の量より15%程度少ないこと、F_1のそれが天蚕と柞虫のDNA量の中間値でなく、むしろ天蚕に近いことが判明した。3.精子形成:F_1の幼虫期における精巣発育は、原始精原細胞より成長して精母細胞における減数分裂終了時までの間に、両親のそれと形態学上に相違が無かった。しかし、分裂終了後ネ-ベルケルン出現時に、細胞間橋を介して2細胞の核が融合する特異像を、F_1で認めた。また、F_1の染色体数が両親の総和でなく、Y×Pではその数が70、71、73、76を、P×Yでは65、66、68、76を確認し、この対合不完全がF_2発生の阻害要因となっているものと推定した。4.培養胚子の発育に及ぼす昆虫ホルモンの影響:産下後24および120時間の卵殻除去胚子をテスタ-にして、Graceの塩液に天蚕体液を添加した培養液を対照区に、ecdysteroneとKK-86Sの発生分化に及ぼす影響について検討した。ecdysteroneは胚子発生に対し、対照区とほぼ同程度の促進効果がみられたが、KK-86Sは異常発生を来した。

1)幼虫期における精巣の発育には、両親とF_1との間には形態学的な相違はなかった。しかし、精子形成の副核出現期になると、F_1においてのみ細胞間橋を介して隣接細胞との間に核融合がみられた。核融合の結果と推定される、鞭毛内に軸糸を複数持つ精子が観察され、この異常精子は運動機能に支障を来すものと考えられた。2)F_1の成熟分裂中期の染色体の形は、両親のものと同様8の字形と、0の字形の両者から構成されていた。3)第一分裂中期の染色体の構成は、両親との比較から、平均数でY×P:2価10.0、1価60.0、P×Y:2価8.8、1価62.4であった。つぎに、第二分裂中期では、8の字形のものが明確でなく、大伴が0の字形であった。構成は、Y×P2分染色体9.9、1分染色体59.6、P×Y前者9.1、後者62.6となり、染色体の数や組合せの異なる精子細胞ができる可能性が示唆された。以上のことから、F_1の成熟分裂時の染色体対合の有無が異常精子を形成する原因と断定できないが、正常な個体発生を低下させているものと考えられた。(4)培養胚子の発育と添加ホルモンとの関係は、初期胚子および産卵後144時間胚子ともに、対照区、ecdysterone区(2μg/μl)では胚子を頭部着色期まで発育させた。一方、KKー86S区(10μg/μl)では、両胚子に異常発生が認められた。添加ホルモンと休眠打破との関連では結論は得られなかったが、胚子が卵黄を飲み込む前に卵殻を1/3程度除去した方法でホルモン処理すると、その効力の判定に使える可能性が示唆された。
動脈硬化病変における酸化変性リポタンパクの動態の解明

申請者は高速液体クロマトグラフィ(HPLC)を用いてヒト、ウサギ、ラット及びマウスのリポタンパク及び変性リポタンパクの簡便な定義法を開発を試み、以下の知見を得た。1.カラムはDEAE-グルコマンナンゲルを、移動相はEDTAを含む50mMリン酸緩衝液(pH7.0)及び500mM NaClを用いた。流速は1ml/min、カラム温度は25°Cで行った。溶出液にコレステロール検出用酵素試薬にてポストカラム反応を行い、励起波長325nm、蛍光波長420nmで検出し、コレステロール含量で各リポタンパク値を算出した。勾配溶出法では、リポタンパク画分(HDL、LDL、VLDL)の部分的な分離しか得られなかったが、段階溶出法ではHDL、LDL、VLDLの完全な分離が得られた。本法により得られた各リポタンパク濃度は沈殿法及び超遠心法で得られた結果とよく一致した。本法では、1検体あたり20分以内でのリポタンパクの定量分析が可能で、再現性も良好であった。また、3種類のリポタンパクが完全に分離しているため、同一検体内のリポタンパク濃度が50倍以上異なる場合でも同時に定量可能であった。2.ウサギより得たLDLを5μM CuCl_2と1、3及び24時間と変えて培養し、変性度の異なるOx-LDLを得た。作製したOx-LDLは培養時間の長くなるほど過酸化脂質値が増大しアガロースゲル電気泳動法においても陽極側に強く移動していた。これらのOx-LDLをHPLCを用いて勾配溶出法で検討したところ保持時間が長くなり、段階溶出法においても変性度の強いものほど溶出に高濃度のNaClが必要であった。これらOx-LDLはいずれもN-LDLとの分離検出が可能であった。以上の結果より、申請者はHPLCによるリポタンパク及び変性リポタンパクの分離・定量法を開発することができた。本法は各リポタンパク及び変性リポタンパクを完全に分離定量することができるため、今後in vivoに応用することが可能であると考えられる。
戦争期のメディア編成と文学-大正・昭和の言説分析

近代日本が国民国家として成立し、定着してゆく過程で、どのような言説の論理が編成されたのか、戦争期のメディアの言語と文学的言語の関係に焦点を当てて考察しようとするのが、本研究の目的である。科学研究費の交付期間内には、とくに第一次世界大戦前後を中心とする時期の日本語一次資料の収集を進める予定であるが、本年度は、大正初期の資料を集めた前年度に引き続き、大正期を中心にして、新聞・雑誌等のメディア言説、文学的言語、法的言語、学問的言語(人類学・民族学・民俗学・歴史学・教育学等)、衛生学・医学的言語、外交文書などの一次資料を収集・分析した。また、関係一次資料についてのデータ化作業を開始するとともに、韓国の研究者の助力も得て、韓国語の新聞資料を翻訳する作業にも着手した。本年度は特に、新聞資料を中心に資料を集め、新聞連載小説を仲立ちとするかたちで、言説空間にいかなるかたちで明治期の論理との連続性、あるいは断絶があるのかを検証した。具体的には、天皇制をめぐる論理と、資本主義の論理が、帝国主義を不可視にしながら言説の論理を編成するさまを、徳田秋聲のテクストに焦点をあてるかたちで考察し、その成果を、新聞メディアの言語と徳田秋聲の文学作品との関連を明らかにするかたちで、論文にまとめた。大正期の言説論理の特徴として、明治期のように、「近代」「帝国」といった大次元の出来事を直接的に物語化するのではなく、いわば不可視の物語を構成しつつ、国民主義の論理が再編成されているという言説の様式を明らかにした。科学研究費の交付期間内には、とくに第一次世界大戦前後を中心とする時期の日本語一次資料の収集を進める予定であるが、本年度は、大正初期を中心に、新聞・雑誌等のメディア言説、文学的言語、法的言語、学問的言語(人類学・民族学・民俗学・歴史学・教育学等)、衛生学・医学的言語、外交文書などの一次資料を収集・分析した。メディアの言語のなかでも特に、新聞資料を中心に資料を集め、明治期の言説空間といかなる連続性、あるいは断絶があるのかを中心に検証を行なった。具体的には、天皇制をめぐる論理の差異と、物語やスキャンダルの語られ方に注目して、大正初期の言説編成が、明治期の物語を引用する仕方に特徴を持つことについて考察し、その成果を、新聞メディアの言語と谷崎潤一郎や夏目漱石らの文学作品との関連を軸にして、論文にまとめた。大正初期の言説論理の特徴のひとつが、明治期の歴史的事件を記述した物語を反復的に引用する形式にあることを明らかにした。
アポトーシスを誘導する新しいエンドヌクレアーゼ(AN34)のクローニング

アポトーシスの際に活性化されるエンドヌクレアーゼとして、従来よりNuc18,DNase I, DNase II, DNaseγなどが報告されてきたが、1998年にEnariらはCaspase-3により直接的に活性化される新しいエンドヌクレアーゼCAD(Caspase activated DNase)を発見した。我々はヒト白血病細胞HL-60のアポトーシスの際にcaspase-3により活性化される34kDaのMg^<2+>依存性ヌクレアーゼを精製・同定しAN34(Apoptotic Nuclease 34kDa)と命名した。この酵素の生化学的な性質について検討を加えた。3'末端または5'末端を^<32>Pで標識した20 mer oligo DNAを基質として、精製した蛋白を作用させたのち変性アクリルアミド電気泳動で分析したところendonuclease活性のみならず、3'-5' exonuclease活性をもつことがわかった。AN34をQ-sepharose, Heparine-sepharose, Hydroxyapatite, Mono-S, Superose-12の5種類のカラムを用い精製した後、SDS-PAGEにて精製蛋白を分離した。目的の蛋白をトリプシンで消化後、蛋白のアミノ酸配列をMALDI-MSおよびES-MSを用いて分析したところ、精製された蛋白はAP-endonucleaseであることが判明した。精製した蛋白がAP-endonuclease活性を有しているかどうか検討したところ、有していることが確認された。AP-endonucleaseに対するポリクローナル抗体を用いて免疫染色により細胞内の局在を調べたところ通常のHL-60細胞では細胞質に存在することが分かった。さらに、アポトーシスの際にcaspase-3によりAP-endonucleaseが活性化されることが判明した。アポトーシスの重要な生化学的なマーカーとして、アガロースゲル電気泳動上のDNAラダー(DNAの梯子状断片化)が幅広く知られている。このDNAの梯子状断片化という現象は、細胞内のエンドヌクレアーゼの活性化の結果であると考えられているが、エンドヌクレアーゼの実体に関しては、未だ充分には解明されてはいない。このエンドヌクレアーゼの活性化という現象はアポトーシスを誘導を決定する鍵となる現象のひとつであり、このメカニズムを解明することは、アポトーシスを考察するうえでも極めて重要であると考えられる。アポトーシスの誘導過程においてCaspase 3はアポトーシス実行の中心的役割を果していると考えられている。一方、今日までに、アポトーシス誘導に関与するエンドヌクレアーゼの候補としてDNase I,DNase II,Nuc 18など幾つものヌクレアーゼが、報告されてきた。最近になり、Caspaseによって制御され、アポトーシスの際に特異的な活性化されるという興味深い特徴をもったヌクレアーゼとして、CADが報告された。アポトーシスの誘導過程においてCaspase 3はアポトーシス実行の中心的役割を果たしていると考えられている。最近になり、Caspaseによって制御され、アポトーシスの際に特異的に活性化されるという興味深い特徴をもったヌクレアーゼとして、CADが報告された。

我々は、ヒト急性骨髄性白血病細胞HL-60より、アポトーシスの際に活性化されるエンドヌクレアーゼAN34を分離精製した(Yoshida A et al.,Cancer Res)。このAN34のcaspaseによる活性化のメカニズムを検討するために以下の検討をおこなった。まず、無処理のHL-60細胞の細胞質を分離し、recombinant casapse 3を加えincubate後、このmixtureをGel filtration columnに添加し分析した。さらにQ-sepharose,Heparine-sepharose,Mono Sに添加し検討した。その結果AN34はCaspase 3によって活性化されることがわかった。さらに、AN34はendonuclease活性のみならず、3'-5'exonuclease活性をもっていることが判明した。アポトーシスの際に活性化されるエンドヌクレアーゼとして、従来よりNuc18, DNase I, DNase II, DNase γなどが報告されてきたが、1998年にEnariらはCaspaze-3により直接的に活性化される新しいエンドヌクレアーゼCAD(Caspase activated DNaze)を発見した。我々はヒト白血病細胞HL-60のアポトーシスの際にcaspaze-3により活性化される34kDaのMg^<2+>依存性ヌクレアーゼを精製・同定しAN34(Apoptotic Nuclease 34kDa)と命名した。この酵素の生化学的な性質について検討を加えた。3'末端または5'末端を^<32>Pで標識した20mer oligo DNAを基質として、精製した蛋白を作用させたのち変性アクリルアミド電気泳動で分析したところendonuclease活性のみならず、3'-5'exonuclease活性をもつことがわかった。AN34をQ-sepharose, Heparine-sepharose, Hydroxyapatite, Mono-S, Superose-12の5種類のカラムを用い精製した後、SDS-PAGEにて精製蛋白を分離した。目的の蛋白をトリプシンで消化後、蛋白のアミノ酸配列をMALDI-MSおよびES-MSを用いて分析したところ、精製された蛋白はAP-endonucleaseであることが判明した。精製した蛋白がAP-endonuclease活性を有しているかどうか検討したところ、有していることが確認された。AP-endonucleaseに対するポリクローナル抗体を用いて免疫染色により細胞内の局在を調べたところ通常のHL-60細胞では細胞質に存在することが分かった。さらに、アポトーシスの際にcaspase-3によりAP-endonucleaseが活性化されることが判明した。
BIAを用いたJ鎖と免疫グロブリン分子との特異的相互作用の解析

ニワトリJoining Chain(J鎖)cDNAを発現ベクターpET32(a)に組み込み融合タンパク質を発現させた結果、約25kDaのヒトJ鎖抗体と反応するタンパク質の存在を認めた。これをセンサーチップに固相化しBIA CORE3000にてニワトリIgA(α鎖)とIgM(μ鎖)に対する融合蛋白との反応性を調べた結果、高い親和定数及び解離定数が得られた。しかし、ヒトα鎖とμ鎖に対する反応性は弱かった。J鎖は系統発生学的に保存された特殊な蛋白質の一つであり、抗ヒトJ鎖抗体と異なる動物種のJ鎖との間に交叉反応が報告されている。この反応性をニワトリJ鎖に対して検討した結果、有意な反応性は認められなかった。つまり、BIA core 3000を使用した定量的な検索から、ニワトリに対する、抗ヒトJ鎖抗体の反応性は弱いものであると考えられる。また、ヒトやマウスでJ鎖と免疫グロブリンとの結合に必要とされているC末端システインをセリンに置換し融合蛋白を作製しニワトリα鎖およびμ鎖との反応性を調べた結果、有意な相互作用の減少は認められなかった。つまり、ニワトリの多量体型免疫グロブリンは、ヒトやマウスと異なる構造を有していると考えられる。ニワトリGenomic DNAライブラリーより約14kbのJ鎖遺伝子をクローニングし、その全塩基配列を決定した。その結果、ニワトリJ鎖は、ヒトおよびマウスと高い相同性を示す4つのエクソンより構成されていた。しかし、5'上流の3.8kbの塩基配列についての相同性は、ほとんど認められなかった。ニワトリJ鎖エクソン1を含む5'上流域4.8kbを含む様々な大きさのDNA断片をベクターpGL-3にサブクローニングした後、ルシフェラーゼアッセイにてプロモター活性を測定した。その結果、5'上流域を含むすべてのクローンに強い活性が認められた。さらにルシフェラーゼアッセイにてエンハンサー領域と思われる500bpを同定し、Data Baseを利用した解析によりNF-E2,USF-1,MyoD, CdxA and GATA3などの転写因子結合配列を同定した。このようなことよりニワトリJ鎖は、哺乳動物のものとは全く異なる発現調節機構を有していると考えられる。分泌型IgAに代表される多量体型免疫グロブリンの構成成分であるJ鎖は免疫グロブリン分子のポリメリゼ-ションと分泌に重要な役割を演じているポリペプタイドである。また,系統発生学的にも異なる動物種間で多くのアミノ酸配列が保存されている蛋白でもある。J鎖には8個のシステイン残基が存在しておりそのうち2個が免疫グロブリン分子(IgAとIgM)に結合することが明らかにされている。しかしJ鎖と免疫グロブリンの分子間の相互作用については全く不明である。本年度の研究計画は,現在進行中であり,ヒトおよびニワトリJ鎖に対するIgAおよびIgMの相互作用,反応速度,結合力あるいは解離度をBIAcore3000にて測定し,異なる動物種間で比較検討することである。J鎖はその精製過程で使用される変性剤により本来の構造が失われる可能性がある。

そこで,当教室所有のヒトとニワトリJ鎖cDNAをベクタ-pET32aに組み込んで大腸菌内で発現させたJ鎖融合蛋白質により計測する。現在,そのためのJ鎖融合蛋白を精製中である。また,ヒトとニワトリJ鎖cDNAの塩基配列からsite-direct mutagenesisによりシステイン残基をスレオニンに置換した変異型J鎖cDNAも現在pET32aにサブクロ-ニングした状態にある。J鎖の融合蛋白の精製ができ次第IgAおよびIgMをセンサ-表面に固定化し,これらの分子間における相互作用についてBIAcore3000により検索する予定である。ニワトリJoining Chain(J鎖)cDNAを発現ベクターに組み込み融合タンパク質を発現させた結果、約25kDaの位置にヒトJ鎖抗体と反応するタンパク質の存在を認めた。これをセンサーチップに固相化し血清から精製したヒト単量体型IgAとIgMとの反応性を調べた結果、明らかなニワトリJ鎖とヒト免疫グロブリン分子間での反応性は認められなかった。今回、融合タンパク質を使用した理由は、精製過程で高濃度の変性剤を使用しなければ多量体型免疫グロブリン分子から分離精製が困難であり、本来のものと比較して変性剤により抗原性が異なることからであった。しかし、実際にBIAを用いて検索した結果、分離精製したニワトリJ鎖に対しての反応性が弱いながら認められたことより今後、J鎖については精製標品を固相化抗原として動物種間の免疫グロブリン分子との反応性を検討する。また、site-directed mutagenesisによりシステインを欠失させたニワトリJ鎖cDNAについては現在、2種類作成済みであるが融合タンパク質との反応性を効率良くBIAで検討するためHis-Tagをリガンドとして固相化できるセンサーチップを使用してシステインが欠失したJ鎖融合タンパク質との反応性を検討する予定である。すでに我々はエンハンサー領域を含むと思われる約14kbの遺伝子をクローニングしており、当教室所有のMega Base 1000にて全塩基配列を決定した。その結果、5'上流域4.1kbを含む4つのエクソンより構成されていた。エンハンサー領域を含むと思われる5'上流域については他の哺乳動物のものとは相同性はなくNF-1,IRE,SDRE,LBP-1,ER,CSSといった転写調節因子の結合配列が存在し哺乳動物のJ鎖とは全く異なる発現調節機構を有していると考えられる。今後、ルシフェラーゼアッセイにて転写活性に関与している部位を同定するとともに調節因子結合配列と核内タンパク質の反応性をBIAにて検索する予定である。発現ベクターpET-32a(+)を使用してニワトリJ鎖融合蛋白質を作製しBIA core 3000にてニワトリ抗J鎖抗体に対する融合蛋白との反応性を調べた結果、高い親和定数及び解離定数が得られた。しかし、ヒトJ鎖蛋白に対しては低い反応性しか認められなかった。また、ニワトリJ鎖融合蛋白に対するIgAとIgMとの反応性についても同様に検討した結果、ニワトリIgAとIgMについては高い反応性を示したけれども、ヒトでは低い反応性であった。J鎖は系統発生学的に保存された特殊な蛋白質の一つであり、ヒト抗J鎖抗体と異なる動物種のJ鎖蛋白との間に交叉反応が報告されている。
HLA-A26陽性がん患者に対するペプチドワクチン療法の基盤的研究

(目的)昨年度は安全性を確認済みのペプチドの合計30種類から、3種類のHLA-A2-結合ペプチド(ppMAPkkk-432,HNRPL-501,およびWHSC2-103)と1種類のHLA-A24-結合ペプチド(SART3-109)がHLA-A26拘束性に細胞傷害性Tリンパ球(CTL)を誘導することを明らかにした(Cancer Sci)。本年度は、新たにSART3、Lck、サバイビン(survivin)、およびWilms腫瘍遺伝子産物WT1を対象とし、がん患者末梢血の抗体およびT細胞に認識されるペプチドを選別する。(方法)抗体の測定はルミネックスを用いたフローメトリ-法で、細胞傷害性T細胞はELISPOTで行った。(結果)in silico analysisによりHLA-A26結合性のペプチドをそれぞれ55、35、26、および20種類合成し、がん患者血漿でスクリーニングし、抗体が認識するペプチドを選択した。SART3由来のペプチド55種類を前立腺がん患者44名の血漿でスクリーニングを行ったところ90%以上の患者で陽性になったペプチドは7種類(SART3-162,-171,-287,-377,-416,-717,および-837)であった。Lck由来ペプチドはそれぞれ18例ずつの膵がん、乳がん、および肝がんの患者血漿でスクリーニングを行ったところ、90%以上の患者で陽性になったペプチドは35種類のうちそれぞれ6、7、および5種類同定された。これらのうち3種類のがん種で共通に高頻度で検出されたペプチドはLck-258,-417,-467、および-488の4種類であった。サバイビンは6種類(SUR-b4、-b13,-b53,-b118,-v53,-v57)、WT1は2種類(WT1-230,-478)のペプチドが認識された。一方、これらのペプチドによるCTL誘導能を調べた結果、陰性対照と比べて有意(p<0.05)に陽性となったペプチドとしては、SART3-416,-703,-731,SUR-v53,-b20,-b118,-b153,WT1-313,-343が検出された。(考察)CTL誘導能が認められたペプチドはがん患者末梢血に高頻度(それぞれ93、73、70、96、65、96、83、78、および80%)に抗体が認められるものが多いことが示唆された。HLA-A26の患者は日本人で約20%存在し、HLA-A2,-A24,-A3スーパータイプとのペプチドと合わせると日本人の約99%をカバーできることになる。世界的に見ても欧米人では10%、アジア人では5-20%、黒人では5-10%と低い頻度ながら相当数のがん患者がHLA-A26陽性であり、がんワクチンを待望している。そこで当該研究をもってHLA-A26陽性がん患者用のペプチドワクチン分子を複数同定し(試験管内試験)、かつ臨床試験附随研究にて生体内免疫賦活効果を検証し、臨床的にテーラーメイドペプチドワクチンとして使用可能なペプチド分子群を決定することにした。

一方、これらのペプチドによるCTL誘導能を調べた結果、陰性対照と比べて有意(p<0.05)に陽性となったペプチドとしては、SART3-416,-703,-731,SUR-v53,-b20,-b118,-b153,WT1-313,-343が検出された。(考察)CTL誘導能が認められたペプチドはがん患者末梢血に高頻度(それぞれ93、73、70、96、65、96、83、78、および80%)に抗体が認められるものが多いことが示唆された。HLA-A26の患者は日本人で約20%存在し、HLA-A2,-A24,-A3スーパータイプとのペプチドと合わせると日本人の約99%をカバーできることになる。
高選択的物質変換に向けたコア－シェル型ゼオライト触媒の精密設計

本研究の目的は、コア-シェル構造ゼオライトを基軸とし、コア部とシェル部に様々な活性点を付与した新規な高機能性触媒の開発である。昨年度はコア部に新たな酸性質を付与するために異種元素置換ゼオライトの合成に取り組んでおり、その内のGe導入ゼオライトに関して国際学会で今年度発表した。また、異種元素置換ゼオライト関連で、Fe導入したBEA*型のゼオライトの合成に成功し、弱い酸性質を見出した。そのFeを導入したBEA*型ゼオライトに関する論文も今年度発表した。異種元素置換ゼオライトに加えて、今年度は、白金ナノ粒子を内包した新規なコアーシェル型ゼオライトの開発に成功した。その白金ナノ粒子を内包したコアーシェル型ゼオライトは、嵩の大きさが異なる分子に対して、形状選択的な水素化反応を実現した。この内容も今年度論文として発表した。この他のコアーシェル型ゼオライト関連の研究として、コアーシェル型ゼオライトの水熱安定性の評価も行った。その結果、コアーシェル型ゼオライトは、通常のコーティング前のゼオライトに比べて、水熱安定性が向上することが明らかになった。これは、今までの形状選択性の向上とは異なり、コアーシェル型ゼオライトの新たな機能を開拓したといえる。水熱安定性に関する内容も国際および国内学会で発表した。翌年度、交付申請を辞退するため、記入しない。本研究では、コアーシェル構造体のゼオライト触媒をベースにさまざまな活性点を付与することで、高選択的な物質変換を目指すことを目的としている。本年度は、その付与する活性点の開発を中心に研究を行った。特に、ゼオライトの固体酸性質の制御を行った。ゼオライトの固体酸性質を制御するための具体的なアプローチとして、酸点の発現に大きく寄与する元素を他の元素での置換を行った。まず、SiとAlで構成される最も一般なゼオライトであるアルミノシリケートでは、3価のAlが酸点の発現に大きく寄与するので、3価の異種元素であるFeによる置換を行った。Feに置換することで、ゼオライトの酸強度が弱くなることを見出した。中程度の細孔の大きさを有するMFI型および大細孔を有するBEA*型ゼオライトに対して、Feで置換することに成功し、弱酸化を確認した。そして、そのFeで置換したMFI型ゼオライトは、メタノールから低級オレフィンを合成するMethanol to Olefins (MTO)反応において、エチレンい比べてプロピレンが選択的生成することが分かった。また、Feで置換したBEA*型ゼオライトでは、アセトンから低級オレフィンを合成するAcetone to Olefins (ATO)反応において、高いイソブテン収率を示すことが明らかになった。続いて、Si, Al, PからなるSAPO系ゼオライトにも同様のストラテジーで酸強度の制御を試みた。SAPO系のゼオライトでは4価のSiが酸点の発現に大きく寄与するので、そのSiを同様の4価のGeで置換したGeAPO型ゼオライトを開催した。このGeAPO型ゼオライトはSAPO型ゼオライトに比べて、酸強度が弱いことが確認された。このGeAPO系ゼオライトの合成は小細孔のAEI型において成功した。GeAPO型ゼオライトは、MTO反応において、寿命が向上することが見出された。当初の計画通り、ゼオライトの骨格に異種元素を導入することに成功した。そして、そのゼオライト触媒が非常に優れた触媒特性を見出すことができため。用途を更に拡大するために、金属ナノ粒子などの触媒活性点を内包したコアーシェル構造体ゼオライトの開発を行う。そして、その開発したコアーシェル構造体ゼオライトを様々な反応に適応する予定である。
新しい降圧ペプチド"アドレノメデュリン(AM)"と"PAMP"の研究

“アドレノメデュリン(AM)"と“PAMP"は1993年にヒト褐色細胞腫より発見された共通の前駆体より生合成される強力な血管拡張性の降圧ペプチドである。AM・PAMPは副腎髄質以外の生体内の幅広い組織で生合成され、新しい生理活性ペプチドとして循環調節を始め生体内で重要な機能を果たしている可能性が示唆されている。本研究では新規生理活性ペプチドであるAMとPAMPの生体内での役割を解明し、病態生理学的意義を解明するための研究を行っている。AMの慢性投与すると、高血圧自然発症ラット(SHR)および正常血圧ラット(WKY)投与後2日目より、降圧が認められ2週間安定した降圧を示した。さらに、WKYにおいては、血漿レニン活性が有意に抑制されていたが、SHRでは血漿レニンの抑制は見られなかった。また、AMの新たな作用として、AMは心筋の蛋白合成を著明に抑制することが明らかにした。AMは心筋細胞で生合成されオートクリンやパラクリン的にレニンアンジオテンシン系に拮抗する形で、心筋肥大等の病態に関与している可能性が示された。現在、AMの蛋白合成抑制の機序やAM受容体との関連について検討している。ヒト血中を循環しているAM免疫活性は成熟型AM(mAM)が合成される前の中間体のAM-Gly(iAM)であることを証明した。さらに、mAMの測定系を確立、心不全患者の血中AM免疫活性を検討したところ、mAMは心不全の重症度に従い有意に増加した。本結果を元に、mAMとtotalAM(mAM+iAM)の両方を無抽出で測定可能な測定キットの開発がされた。今後各種疾患でのmAMとtotalAMの血中濃度が明らかにされてくると思われる。一方PAMPに関しては、今までに知られていた20個のアミノ酸よりなるPAMP[1-20](PAMP-20)以外に降圧活性を有したPAMP[9-20](PAMP-12)を単離構造決定した。PAMPの生合成機序として、生体内ではPAMP-20以外にPAMP-12が新たな降圧ペプチドとして生合成されていることが示唆され興味深い。“アドレノメデュリン(AM)"とはヒト褐色細胞腫抽出液より発見された協力な血管拡張性の降圧ペプチドである。AM前駆体は185個のアミノ酸よりなり、AM以外に、20個のアミノ酸よりなる全く新しい降圧ペプチド“PAMP"が生合成される。本年度は基礎的研究として、AMの慢性投与実験を行い、AMが生理的血中濃度のレベルで降圧およびレニン活性を抑制することを明らかにし、将来AMもしくはAM受容体作動薬やAM分解抑制剤が新しい薬物となりうる可能性が示せた。また、AMやPAMPの生合成・代謝をみる研究では、PAMPが心房性ナトリウム利尿ペプチド(ANP)を分解する中性エンドペプチダーゼで速やかに分解されることを証明し、その分解部位も明らかにした。さらに、AMとPAMPが生体内の幅広い組織で生合成・分泌されていることが明らかになり、循環調節以外の多くのAMの作用が明らかになりつつある。AMの臨床的研究に関しては、ヒト血漿中AMとPAMP濃度を測定可能なラジオイムノアッセイを確立し、正常人の血漿中にAMとPAMPが循環していることを明らかにした。

さらに、各種疾患における血中AMとPAMP濃度を検討したところ、心不全,腎不全,高血圧などの患者では血中AMと同様PAMPが重症度にしたがって増加していた。現在、AMやPAMPが新しい降圧ペプチドとして循環調節に重要な機能をしていることを示すデータが得られつつあり、本研究を継続することで、今後2-3年のうちに、ANPやエンドセリンに続く、新しい循環調節機構の全貌が解明できると思われる。“アドレノメデュリン(AM)"と“PAMP"はヒト褐色細胞腫より発見された共通の前駆体より生合成される強力な血管拡張性の降圧ペプチドである。AM・PAMPは副腎以外に心血管系の主要な組織で広く産生され、新しい降圧ペプチドとして循環調節に重要な機能を果たしている可能性が示唆されている。本研究では新規循環調節ペプチドであるAMとPAMPの循環器疾患における意義を解明するための基礎的・臨床的研究を行った。昨年までに報告していた、AMの急性投与実験に追加し、慢性投与実験を行った。浸透圧ミニポンプを用いて、AMを腎血管性高血圧モデル(2K1C)ラットおよび正常血圧コントロールラットに経静脈的に慢性投与したところ、2K1Cラットおよび正常血圧コントロールラットともに投与後2日目より、降圧が認められ2週間安定した降圧を示した。さらに、血漿レニン活性およびアルドステロン活性が有意に抑制されていた。また、このときの血中AM濃度は生理的AM濃度であった。また、PAMPのC末近傍を認識する高感度かつ特異的RIAを確立した。ブタおよびヒトにける生体分布を検討したところ、高濃度のPAMP免疫活性が副腎髄質に認められ、その他の組織にも低濃度であるが、広く分布していた。また、免疫活性を検討したところ、副腎髄質には今までに知られていた20個のアミノ酸よりなるPAMP[1-20]以外に別の免疫活性が認められ、この免疫活性を単離構造決定し、降圧活性を有したPAMP[9-20](PAMP-12)であることを明らかにした。ヒト血中を循環しているAM免疫活性は成熟型AMが合成される前の中間体のAM-Glyであることが判明した。さらに高血圧患者におけるAM-Glyの増加であることが判明した。“アドレノメデュリン(AM)"と“PAMP"は1993年にヒト褐色細胞腫より発見された共通の前駆体より生合成される強力な血管拡張性の降圧ペプチドである。AM・PAMPは副腎髄質以外に心血管系の主要な組織で広く産生され、新しい降圧ペプチドとして循環調節に重要な機能を果たしている可能性が示唆されている。本研究では新規循環調節ペプチドであるAMとPAMPの病態生理学的意義を解明するための研究を行った。各種高血圧患者(本態性高血圧、腎血管性高血圧、原発性アルドステロン症)におけるAMおよびPAMP血中濃度について検討した。特に、腎血管性高血圧では患者背景に関係なく一様にAM、PAMPの増加がみられた。ヒト血中を循環しているAM免疫活性は成熟型AM(mAM)が合成される前の中間体のAM-Gly(iAM)であることした。さらに、mAMの測定系を確立し、心不全患者の血中AM免疫活性を検討したところ、mAMは心不全の重症度に従い増加していた。PAMPの研究ではPAMPのC末近傍を認識する高感度かつ特異的ラジオイムノアッセイ(RIA)を確立し、生体内分布を検討した。高濃度のPAMP免疫活性が副腎髄質に認められ、その他の組織にも低濃度であるが、広く分布していた。
敗血症性脳症の病態解明

敗血症動物作成後PBS緩衝液で全身灌流後、脳を摘出し病理組織学的評価を行った。また脳におけるTLRサブタイプの局在に対して免疫組織染色を行った。RT-PCR法を用いてRNAの解析を行った。免疫組織化学的検討では, TLR2, TLR4およびTLR9の有意な脳内組織発現は認められなかった。敗血症病態の24時間でも,これらの発現は認められなかった。このため,敗血症病態の脳内炎症の進展には,菌体リガンドの直接的な関与ではない炎症性受容体の関与が考えられた。当研究は、敗血症病態で進行する意識傷害や発熱の原因として、炎症性物質が脳内で生産される機序を明らかとし、脳における急性相反応の評価と敗血症性脳症の新たな病態生理学的評価を加えることを研究の目的としている。具体的には敗血症で誘導される炎症性シグナルの脳内での局在を同定すると共に、どのような炎症性受容体(Toll-like受容体)を介して炎症が進展するのかを病理組織学的に探究する。敗血症性脳症における病態生理学的評価を行うことにより、脳内で最も炎症が進行しやすい部位を時間的・空間的に特定が可能になり、ひいては敗血症に対する治療法の確立に役立つものと考えられる。研究には雄性マウス(20-25g)を用いて行った。盲腸結紮による腹膜炎モデルの敗血症動物モデルを作成した。モデル作成時にはエーテル吸入及びペントバルビタール腹腔内投与を行い、十分な苦痛軽減に配慮しながら行った。十分な鎮静下に左下腹部に約1cmの皮膚切開を加えて、続いて腹膜も切開する。その後盲腸を検索し一度体外へ脱出させる。盲腸先端部を2重結紮した後に20G針で盲腸先端部を穿刺する。その後、脱出させた盲腸を腹腔内へ還納し、腹膜・皮膚を縫合して手術を終了とする。シャムoperationでは同様に肓腸を脱出させて、2重結紮を行うが肓腸先端の穿刺をすることなく盲腸を腹腔内へ還納し、腹膜・皮膚を縫合して手術を終了とする。つまりマウス自身の便により、腹膜炎を惹起させそれによる敗血症モデルを作成するものである。敗血症動物作成の6時間後、24時間後、48時間後に、エーテル麻酔下にPBS緩衝液で全身灌流を行い、脳摘出し、組織学的評価を行った。さらに脳におけるTLRサブタイプの局在に対して免疫組織染色を行い、現在評価が進行中である。また、一部は液体窒素により瞬時に凍結させ、-80°Cで冷凍保存した。この冷凍保存したものを用いて、平成20年度にはRNA解析や蛋白発現定量を行う予定である。具体的にはRT(Real time)-PCR法やin situ hybridization法を用いてTLRmRNAの発現を時間的空間的に評価する予定である。昨年度同様、雄性マウスを用い、マウス自身の便により、腹膜炎を惹起させそれによる敗血症モデルを作成し実験を引き続き行った。この冷凍保存したものを用いて、RNA解析や蛋白発現定量を行う。具体的にはRT(Real time)-PCR法やin situ hybridization法を用いてTLR mRNAの発現を時間的空間的に評価していくものである。また、一部は液体窒素により瞬時に凍結させ、-80°Cで冷凍保存した.この冷凍保存したものを用いて、RNA解析や蛋白発現定量を行う。現在までのところ敗血症病態が強く惹起される部位としては第三脳室周辺の基底核あるいは深部大脳白質ではないかと考えており、定量的解析を急いでいるところである。更に敗血症病態におけるサイトカインのバランス機構を詳細に解析することによって敗血症病態における標的遺伝子を同定し、それに対する遺伝子治療を確立するものである。敗血症病態に対する治療として特効薬は現在までのところ存在せず、前回の研究に関連し非常に重要なテーマであると考えている。

定量的なRelative mRNAについてはTLR2においてコントロールに比べ24時間後に高い傾向を示したが、有意差は確認できなかった。またTLR4についてはコントロールに比べ有意に高値を示した(p<0.05)。そしてTLR9についてはコントロールに比べ48時間後に高い傾向を示したが、有意差は確認できなかった。病理組織学的な結果であるが、第三脳室周辺の基底核あるいは深部大脳白質周囲に炎症反応が強く出現することを期待していたが、各種免疫組織学的染色においても有意な結果が得られなかった。逆に言うと、敗血症性脳症では空間特異性がなく全脳性に炎症反応が急激に拡散する可能性が考えられた。今後、更なる追加実験において解析を進めて行きたいと考える次第である。
腸上皮化生を主眼とした消化器がんのスキルス化機構に関する研究

難治性消化器癌の多くは腸上皮化性を介することに着目し、腸上皮分化システムによる悪性形質獲得機構を解析することで、臓器横断的な共通の難治化機構を解明することを目的とする。申請者が独自に解明したIBD付随大腸癌における腸上皮形質とスキルス化・癌幹細胞誘導機構を基盤として、膵癌・バレット食道癌など近年増加している消化器難治癌全般にまで発展させることで、癌難治化を「癌遺伝子」ではなく「癌細胞形質」から繙くことにより新しい共通の難治化機構の同定を試みる。臓器間共通難治化機構の解明はこれまでと異なる機序の治療薬開発のみならず腸上皮化性抑制による発がん予防まで期待できる。具体的には、1)ヒト大腸オルガノイドを用いた腸形質維持スキルスがんモデル構築、2)ヒト消化器がんの腸上皮形質発現によるスキルス化解析を行う。1)ヒト大腸オルガノイドを用いた腸形質維持スキルスがんモデル構築に関しては、ヒト正常大腸及びIBD病変大腸由来のオルガノイドから長期炎症刺激を行い、体外にてIBD罹病環境を再現することによりIBD発がんまでの経時的な解析を行った。さらに、P53遺伝子変異オルガノイドを作成し、IBD付随大腸癌の再現を試みると共に腸形質維持との関連性を解析した。2)ヒト消化器がんの腸上皮形質発現によるスキルス化解析に関しては、腸上皮化生を主眼とした消化器癌形質解析を行った。膵癌に関しては、発生母地であるIPMNの腸形質発現機構を明らかにすると共に、膵癌での腸形質発現と悪性度との関連を解析した。大腸オルガノイドモデルにおいては、Crisper/CAS9システムにてP53変異の導入に成功し、炎症発がんを模倣したモデルの構築は順調に進められている。膵癌解析においては、倫理審査に承認され外科、病理部の協力のもと手術検体を用いた解析に着手している。さらに膵臓癌細胞株を用いた腸上皮形質誘導にも成功していることから本研究は概ね順調に進展していると判断した。1)ヒト大腸オルガノイドを用いた腸形質維持スキルスがんモデル構築に関しては、正常及びIBD患者由来オルガノイド長期炎症モデル、遺伝子編集モデルの癌化確認。具体的には培地からWntリガンド(Wnt3a, Rspondin-1)を除去しても継続培養が可能か検討する。不可能な場合は、マウスモデルで樹立した方法を用い、GSK3阻害剤を短期間同時刺激し、Wntリガンド非依存性オルガノイドを樹立する。in vitroにてこれまで構築した悪性形質評価法により腸上皮形質・難治化・スキルス化を評価する。また、PDXマウスを樹立しin vivoにて転移能、増殖能を評価すると共に、抗がん剤耐性を評価する予定である。2)ヒト消化器がんの腸上皮形質発現によるスキルス化解析に関しては、樹立した腸形質動揺膵癌細胞株を用いてマイクロアレイを行い、難治化・スキルス化に関与する遺伝子群を抽出する。具体的には候補遺伝子群を強制発現、欠損された際に難治化に影響するものを抽出する。さらに前年度の病理標本を用いてその分子の発現を確認する。分子発現と患者情報を照合し難治化・予後に関連する因子を同定する予定である。

具体的には培地からWntリガンド(Wnt3a, Rspondin-1)を除去しても継続培養が可能か検討する。不可能な場合は、マウスモデルで樹立した方法を用い、GSK3阻害剤を短期間同時刺激し、Wntリガンド非依存性オルガノイドを樹立する。in vitroにてこれまで構築した悪性形質評価法により腸上皮形質・難治化・スキルス化を評価する。また、PDXマウスを樹立しin vivoにて転移能、増殖能を評価すると共に、抗がん剤耐性を評価する予定である。2)ヒト消化器がんの腸上皮形質発現によるスキルス化解析に関しては、樹立した腸形質動揺膵癌細胞株を用いてマイクロアレイを行い、難治化・スキルス化に関与する遺伝子群を抽出する。具体的には候補遺伝子群を強制発現、欠損された際に難治化に影響するものを抽出する。さらに前年度の病理標本を用いてその分子の発現を確認する。分子発現と患者情報を照合し難治化・予後に関連する因子を同定する予定である。
マイクロアーク酸化法によるアルミニウム合金の摩擦摩耗特性の向上に関する研究

平成12年度は耐摩耗性材料であるTiN薄膜をアークイオンプレーティング(AIP)法によって被覆し,アルミニウム合金の摩擦摩耗特性の向上を試みた.摩擦摩耗試験の結果,TiN被覆材の摩耗量は基材に比べて著しく低下するが,条件によっては摩擦摩耗試験中にTiN薄膜が破損・剥離し,一定のすべり距離後,耐摩耗性が著しく低下することが明らかになった.これを踏まえ,平成13年度はCrN薄膜を採用し,TiNとの比較からその有用性を検討した.基板材料としてはCu-Mg系アルミニウム合金JIS A2024を用い,AIP法によって,同じ膜厚となるようにCrNおよびTiN薄膜の被覆を行った,摩耗試験はボールオンディスク方式により行った.その際,相手材はベアリング鋼球で,すべり速度250mm/s,垂直荷重1-5Nとした.摩擦摩耗試験の結果,CrN薄膜の摩耗量はTiN被覆材に比べて改善され,相手材であるベアリング鋼の摩耗量もCrN薄膜の方が少なくなっていた.さらに,CrN薄膜ではTiN薄膜で問題となっていた膜の破損・剥離を大きく抑制することが可能となり,TiN薄膜では1Nが限界であったのに対してCrNでは3Nまで耐えうることが明らかになった.薄膜の破壊,はく離過程を明らかにすべくスクラッチ試験を行った結果,CrN薄膜はTiN薄膜よりも剥離しにくいこと,き裂の発生が生じにくいことが明らかになった.さらに,摩耗痕の連続的な観察および摩耗部の元素分析の結果,CrN薄膜とTiN薄膜とも相手材であるFeが凝着しやすく,その凝着量はCrN薄膜の方が多い傾向が見られた.ボール側の摩耗痕の観察を所定のすべり距離ごとに行ったところ,相手材がTiN薄膜の場合はアブレッシブ摩耗の痕跡が生じているのに対して,CrN薄膜を相手材とした場合はすべり距離の増大にしたがって摩耗痕がなめらかになっている様子が観察された.前述のボール摩耗量の結果とあわせて考えるとCrN薄膜では,ボール材と硬度の高い薄膜とのアブレッシブ摩耗が生じがたいため,TiN薄膜よりも摩耗量が減少したと考えられる.平成12年度は耐摩耗性材料であるTiN薄膜をアークイオンプレーティング(AIP)法によって被覆し,アルミニウム合金の摩擦摩耗特性の向上を試みた.摩擦摩耗試験の結果,TiN被覆材の摩耗量は基材に比べて著しく低下するが,条件によっては摩擦摩耗試験中にTiN薄膜が破損・剥離し,一定のすべり距離後,耐摩耗性が著しく低下することが明らかになった.これを踏まえ,平成13年度はCrN薄膜を採用し,TiNとの比較からその有用性を検討した.基板材料としてはCu-Mg系アルミニウム合金JIS A2024を用い,AIP法によって,同じ膜厚となるようにCrNおよびTiN薄膜の被覆を行った,摩耗試験はボールオンディスク方式により行った.その際,相手材はベアリング鋼球で,すべり速度250mm/s,垂直荷重1-5Nとした.摩擦摩耗試験の結果,CrN薄膜の摩耗量はTiN被覆材に比べて改善され,相手材であるベアリング鋼の摩耗量もCrN薄膜の方が少なくなっていた.さらに,CrN薄膜ではTiN薄膜で問題となっていた膜の破損・剥離を大きく抑制することが可能となり,TiN薄膜では1Nが限界であったのに対してCrNでは3Nまで耐えうることが明らかになった.薄膜の破壊,はく離過程を明らかにすべくスクラッチ試験を行った結果,CrN薄膜はTiN薄膜よりも剥離しにくいこと,き裂の発生が生じにくいことが明らかになった.さらに,摩耗痕の連続的な観察および摩耗部の元素分析の結果,CrN薄膜とTiN薄膜とも相手材であるFeが凝着しやすく,その凝着量はCrN薄膜の方が多い傾向が見られた.ボール側の摩耗痕の観察を所定のすべり距離ごとに行ったところ,相手材がTiN薄膜の場合はアブレッシブ摩耗の痕跡が生じているのに対して,CrN薄膜を相手材とした場合はすべり距離の増大にしたがって摩耗痕がなめらかになっている様子が観察された.前述のボール摩耗量の結果とあわせて考えるとCrN薄膜では,ボール材と硬度の高い薄膜とのアブレッシブ摩耗が生じがたいため,TiN薄膜よりも摩耗量が減少したと考えられる.アルミニウム合金の摩擦摩耗特性を向上させるため,まず,耐摩耗性材料であるTiN薄膜の適用を試みた.供試材は工業用純アルミニウムJIS A1050およびCu-Mg系アルミニウム合金JIS A2024の硬度の異なるアルミニウムを用いた.これらアルミニウム合金上にアークイオンプレーティング(AIP)法によって,TiN薄膜の被覆を行った.摩耗試験は,ボールオンディスク方式により行った.その際,相手材はベアリング鋼球で,すべり速度250mm/sec,垂直荷重1Nとした.摩擦摩耗試験の結果,TiN被覆材の摩耗量は基材に比べて著しく低下し,耐摩耗性が顕著に改善されることが明らかとなった.しかしながら,TiN薄膜の被覆条件を変化させた場合,被覆条件によっては摩擦摩耗試験中に膜が破損・剥離し,一定のすべり距離後,摩耗量が低下するものがあった.TiN被覆によって耐摩耗性を向上させたアルミニウムを,実用化する上で,このような膜の破損・剥離を防止することが重要となる.そこで,摩耗過程中におけるTiN薄膜の剥離条件・機構について検討を行った.その結果,膜の破壊は,(i)成膜後の基板硬度が低い,(ii)膜厚が薄い,(iii)