hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
S.mutansピルビン酸ギ酸リアーゼ(PFL)の活性化系に関与する遺伝子の検索

申請者はピルビン酸ギ酸リアーゼ(PFL)遺伝子を欠失したS.mutansより染色体DNAを分離し、制限酵素Sau3Alで完全分解した後、ベクターとしpVA891を用いクローンバンクを作成した.このクローンバンクでS.mutansを形質転換し、染色体DNAにランダム変異を導入した変異株を3,000株ほど分離したが,PFLの活性化系に関与する遺伝子のクローンを分離することは出来なかった.また,PFL activeting enzymeとしてはE.coliに続く2報目の報告がClostridium pasteurianumから本年度なされた為,両者のアミノ酸残基の配列から相同性の高い領域を選びPCR用のプライマーを数種合成し,S.mutans染色体DNAを鋳型としてPFL activeting enzyme遺伝子領域の増幅を試みた.プライマーの組み合わせとアニールの条件を細かく検討し,数種の増幅されたフラグメントをクローニングしたが,目的とするPFL activeting enzyme遺伝子領域と考えられるフラグメントは,今回クローニングしたもののなかには無かった.このことは,S.mutansのPFL activeting enzymeがE.coliやClostridium pasteurianumで報告されたものとは,かなり異なる(S.mutansではPFLの活性化系と嫌気的条件下で働くリボヌクレオチドリダクターゼ{PFLと同じラジカル酵素であり酸素感受性が強い}の活性化系が共通の系であることも考えられ)可能性があることを示唆している.さらに,既に申請者らによって報告されたようにS.mutansのPFL activeting enzyme遺伝子が,E.coliやClostridium pasteurianumのそれがPFLとオペロンを形成してはいないものの直後の下流に見いだされているのとは異なり,PFLの下流の領域には存在しなかったことからも示唆される.申請者はピルビン酸ギ酸リアーゼ(PFL)遺伝子を欠失したS.mutansより染色体DNAを分離し、制限酵素Sau3Alで完全分解した後、ベクターとしpVA891を用いクローンバンクを作成した.このクローンバンクでS.mutansを形質転換し、染色体DNAにランダム変異を導入した変異株を3,000株ほど分離したが,PFLの活性化系に関与する遺伝子のクローンを分離することは出来なかった.また,PFL activeting enzymeとしてはE.coliに続く2報目の報告がClostridium pasteurianumから本年度なされた為,両者のアミノ酸残基の配列から相同性の高い領域を選びPCR用のプライマーを数種合成し,S.mutans染色体DNAを鋳型としてPFL activeting enzyme遺伝子領域の増幅を試みた.プライマーの組み合わせとアニールの条件を細かく検討し,数種の増幅されたフラグメントをクローニングしたが,目的とするPFL activeting enzyme遺伝子領域と考えられるフラグメントは,今回クローニングしたもののなかには無かった.このことは,S.mutansのPFL activeting enzymeがE.coliやClostridium pasteurianumで報告されたものとは,かなり異なる(S.mutansではPFLの活性化系と嫌気的条件下で働くリボヌクレオチドリダクターゼ{PFLと同じラジカル酵素であり酸素感受性が強い}の活性化系が共通の系であることも考えられ)可能性があることを示唆している.さらに,既に申請者らによって報告されたようにS.mutansのPFL activeting enzyme遺伝子が,E.coliやClostridium pasteurianumのそれがPFLとオペロンを形成してはいないものの直後の下流に見いだされているのとは異なり,PFLの下流の領域には存在しなかったことからも示唆される.
新規モデルを用いた非自己免疫性肺胞蛋白症の病態解明と治療法の開発

Th1細胞の分化を司る転写因子であるT-betを高発現するマウス(T-bet-tgマウス)がGM-CSF非依存的に肺胞蛋白症を自然発症することを発見し、その発症機構の解析を行ってきた。昨年までの研究において、T細胞におけるT-bet高発現が持続的なTh1環境をもたらし、骨髄および末梢血単球系細胞の成熟を抑制し、肺組織におけるマクロファージのフェノタイプを変化させることが、同マウスにおける肺胞蛋白症形成の一因であることを明らかにした。骨髄の単球系前駆細胞から成熟単球への分化はM-CSFが司る。一方で、T-bet高発現によるインターフェロン(IFN)γの過剰は、単球系前駆細胞から異なるlineageである炎症性単球への分化を誘導する。すなわち、成熟単球と炎症性単球への分化の行方はM-CSFとIFNγのバランスで規定される。従って、T-bet高発現による単球系細胞分化障害はM-CSFで是正できるとの仮説に基づき、本年度はT-bet-tgマウスにおけるM-CSFの効果を検討した。M-CSF投与により同マウス骨髄単球系コロニーの未熟細胞は優位に減少し、M-CSFが単球系細胞の成熟を促進することが示された。さらに同マウスにM-CSFを連続投与することにより、肺組織炎症細胞数が減少し、肺胞蛋白症が抑制されることが明らかとなった。以上より、M-CSFがT-bet高発現による肺胞蛋白症を抑制する可能性が示唆された。昨年度報告書において、本年度はT-bet-tgマウスにM-CSFを投与し、骨髄単球系細胞の成熟、および肺胞蛋白症の抑制効果を検討すること、また同マウスの肺胞蛋白症がGM-CSF非依存的でありヒトの二次性肺胞蛋白症に類似することから、マウスと同様のメカニズムが二次性肺胞蛋白症で生じているかを検証することを挙げた。M-CSFを用いた動物実験は予定通り遂行したが、ヒト二次性肺胞蛋白症は非常に稀な疾患であり、十分な症例での検証が当該年度内にできなかったので、上記判断とした。マウスで解明した肺胞蛋白症発症メカニズムのヒト患者での検証までを本研究の範囲とした。上述したごとく、二次性肺胞タンパク症は非常に稀な疾患であり、研究期間を1年間延長することで、検体を確保した上で研究を完遂したいと考える。Th1細胞の分化を司る転写因子であるT-betを高発現するマウス(T-bet-tgマウス)が肺胞蛋白症を自然発症することを発見し、本年度の研究では同マウスにおける肺胞蛋白症発症機序を解析した。生後20週以降のT-bet-tgマウスの肺組織では、マクロファージ、リンパ球の高度の浸潤と共に、PAS、およびSP-A陽性の浸出物の沈着が見られ、ヒト肺胞蛋白症と類似する所見であった。同マウス肺組織におけるGM-CSF,および同受容体の発現は野生型マウスと差を認めなかった。同マウスの気管支肺胞洗浄液ではIFNγ、TNFα、MCP-1が増加しており、Th1型炎症が生じているものと思われた。野生型マウスのマクロファージの殆んどがCD11mid,CD11c陽性の肺胞マクロファージであったのに対し、T-bet-tgマウスのマクロファージはCD11b陽性、CD11c陰性であり、NOS2,IL-12,IFNγなどのM1関連遺伝子の発現亢進を伴う炎症性(M1)マクロファージであった。同マクロファージは実際に野生型マクロファージに比べ、イムノビーズの取り込みやPPARγ、およびABCG1の発現が低下していたことから、貪食能、脂質処理能の低下したマクロファージであることが示唆された。さらに単球系細胞を末梢血で調べてみると、T-bet-tgマウスではCD11b陽性、Ly6c陽性を示す未熟な炎症性単球が有意に増加していた。以上より、T-bet-tgマウスではGM-CSFシグナリングの異常を認めず、ヒト自己免疫性肺胞蛋白症と異なる機序で病態が形成されるものと思われた。T-bet高発現によってもたらされるTh1環境が末梢血単球の成熟を障害し、肺組織におけるマクロファージのフェノタイプを変化させることが肺胞蛋白症形成の一因と思われた。当該研究の研究期間は3年を想定し、1年目には肺組織、肺胞マクロファージ、骨髄・血球細胞に焦点をあて、T-bet-tgマウスのフェノタイプの詳細な解析を行うこと、加えて変動遺伝子の網羅的検索、クラスタリングを行うことで肺胞蛋白症に関わるT-bet標的遺伝子群を特定することを計画した。肺組織、肺胞マクロファージ、末梢血の解析、および変動遺伝子の網羅的解析を行い得たことより、上記判断とした。Th1細胞の分化を司る転写因子であるT-betを高発現するマウス(T-bet-tgマウス)がGM-CSF非依存的に肺胞蛋白症を自然発症することを発見し、その発症機序の解明を進めている。本年度研究では、まずT-bet-tgマウスの骨髄レベルの異常の検索、骨髄細胞のフェノタイプ解析を行った。T-bet-tgマウス骨髄の細胞数は野生型マウスと変わらなかったが、CD11b陽性細胞の割合がT-bet-tgマウスで有意に増加しており、同マウスではMyeroid系細胞の過形成が生じていることが示された。

骨髄細胞のコロニー形成アッセイでは、単球系細胞のコロニー形成は両マウスで同様であったが、T-bet-tgマウスの単球系細胞は未熟な形態を示すものが有意に増加しており、同マウスの骨髄において単球系細胞の成熟が抑制されていることが明らかとなった。我々の作成したT-bet-tgマウスにおけるT-bet高発現はリンパ球特異的であることより、続いてT-bet高発現リンパ球によって肺胞蛋白症が再現されるか検討した。T-bet-tgリンパ球をRag2欠損マウスに移植し、経時的な採血の後、50週後に肺組織を採取した。末梢血中にドナー由来のT細胞が安定して出現していることを確認した。移植マウスでは末梢血で炎症性単球の増加を認め、肺組織では肺胞蛋白症が形成されており、肺胞蛋白症がT-bet-tgリンパ球のみで再構成されることが明らかになった。T-bet-tgマウスのT細胞のみの移植でも同様に肺胞蛋白症が再構成された。昨年度結果と併せ、T細胞におけるT-bet高発現が持続的なTh1環境をもたらし、骨髄および末梢血単球系細胞の成熟を抑制し、肺組織におけるマクロファージのフェノタイプを変化させることが、同マウスにおける肺胞蛋白症形成の一因であるものと思われた。昨年度報告書において、本年度はT-bet-tgマウスの骨髄レベルの異常の検索および骨髄細胞のフェノタイプ解析を行うこと、T細胞特異的なT-bet発現系を作成し同モデルの肺胞蛋白症がT細胞レベルの修飾で起こり得るかを確認すること、さらに同モデルにおけるM-CSFの効果を検討することを挙げた。T-bet-tgマウスの骨髄レベルの異常の検索、骨髄細胞のフェノタイプ解析、およびT-bet-tgマウスT細胞のRag2欠損マウスへの移植による肺胞蛋白症の再構築を検証し得たことより、上記判断とした。Th1細胞の分化を司る転写因子であるT-betを高発現するマウス(T-bet-tgマウス)がGM-CSF非依存的に肺胞蛋白症を自然発症することを発見し、その発症機構の解析を行ってきた。昨年までの研究において、T細胞におけるT-bet高発現が持続的なTh1環境をもたらし、骨髄および末梢血単球系細胞の成熟を抑制し、肺組織におけるマクロファージのフェノタイプを変化させることが、同マウスにおける肺胞蛋白症形成の一因であることを明らかにした。骨髄の単球系前駆細胞から成熟単球への分化はM-CSFが司る。一方で、T-bet高発現によるインターフェロン(IFN)γの過剰は、単球系前駆細胞から異なるlineageである炎症性単球への分化を誘導する。すなわち、成熟単球と炎症性単球への分化の行方はM-CSFとIFNγのバランスで規定される。従って、T-bet高発現による単球系細胞分化障害はM-CSFで是正できるとの仮説に基づき、本年度はT-bet-tgマウスにおけるM-CSFの効果を検討した。M-CSF投与により同マウス骨髄単球系コロニーの未熟細胞は優位に減少し、M-CSFが単球系細胞の成熟を促進することが示された。さらに同マウスにM-CSFを連続投与することにより、肺組織炎症細胞数が減少し、肺胞蛋白症が抑制されることが明らかとなった。以上より、M-CSFがT-bet高発現による肺胞蛋白症を抑制する可能性が示唆された。昨年度報告書において、本年度はT-bet-tgマウスにM-CSFを投与し、骨髄単球系細胞の成熟、および肺胞蛋白症の抑制効果を検討すること、また同マウスの肺胞蛋白症がGM-CSF非依存的でありヒトの二次性肺胞蛋白症に類似することから、マウスと同様のメカニズムが二次性肺胞蛋白症で生じているかを検証することを挙げた。
エピジェネティック変異による男性不妊症の戦略的研究

ゲノム上にコードされた各遺伝子は,個体を形成する種々の細胞毎に選択的に遺伝子発現制御が行われている。活性化もしくは不活性化される遺伝子の組み合わせにより,その細胞の個性が決定され,その細胞独自の細胞機能を発現し個体全体としての生理機能を営むように調整制御されている。この制御機構のひとつとしてエピジェネティックス機構が深く関与しており,発生や発癌といった一連の生命現象の中でエピジェネティックス機構がその原因として重要であることが,近年の分子生物学の発展により明らかとされてきた。哺乳類の精子形成機構において精子形成細胞はその成熟段階に応じて種々の重要な遺伝子の発現を細かく制御しながら,減数分裂を行い妊孕性ある配偶子として機能するようになっていく。本研究の結果から,精巣特異的に発現するある特定遺伝子がDNAメチル化による制御機構を受けており,精子形成過程に影響していることが示唆された。ゲノム上にコードされた各遺伝子は,個体を形成する種々の細胞毎に選択的に遺伝子発現制御が行われている.活性化もしくは不活性化される遺伝子の組み合わせにより,その細胞の個性が決定され,その細胞独自の細胞機能を発現し個体全体としての生理機能を営むように調整制御されている.この制御機構のひとつとしてエピジェネティックス機構が深く関与しており,発生や発癌といった一連の生命現象の中でエピジェネティックス機構がその原因として重要であることが,近年の分子生物学の発展により明らかとされてきた.哺乳類の精子形成機構において精子形成細胞はその成熟段階に応じて種々の重要な遺伝子の発現を細かく制御しながら,減数分裂を行い妊孕性ある配偶子として機能するようになっていく.本研究の結果から,精巣特異的に発現するある特定遺伝子がDNAメチル化による制御機構を受けており,精子形成過程に影響していることが示唆された.ゲノム上にコードされた各遺伝子は,個体を形成する種々の細胞毎に選択的に遺伝子発現制御が行われている。
血液腫瘍に発現するCD226と血管内皮細胞に発現するそのリガンドとの相互作用

我々はT細胞、NK細胞に発現するヒトの新規の接着分子DNAM-1(2000年第7回HLDAワークショップにてCD226に認定)を見い出し、遺伝子クローニングによりその一次構造を決定した。さらに、これらの細胞上でCD226とLFA-1β2インテグリンの2つの接着分子が物理的に会合し、複合体を形成していることを初めて見いだし、CD226がLFA-1のシグナルトランスデューサーであることを明らかにした。申請者らはまた、多くのT細胞、NK細胞系腫瘍でCD226が発現しており、これらの腫瘍におけるCD226の発現の程度が高い程、患者の予後が有意に不良であることを見い出した。一方、CD226リガンドを同定する目的でCD226分子とヒト免疫グロブリンFc部分とのキメラ蛋白を作製し、種々の組織、細胞でCD226リガンドの発現をスクリーニングしたところ、血管内皮細胞で最も強く発現していることを見い出した。これらのことから、CD226とCD226リガンドはT細胞、NK細胞系腫瘍の活性化、血管外浸潤および転移機構に関与し、その悪性度を規定している可能性が考えられる。本研究ではT細胞、NK細胞系腫瘍の活性化、血管外浸潤および転移の分子機構を明らかにし、その制御法を開発することを目的として、血管内皮細胞に発現するCD226リガンドを同定することを目的とした。レトロウイルスベクターを用いて血管内皮細胞からのcDNAライブラリーの作製を行なった。CD226のキメラ蛋白をプローブに用いて陽性細胞をフローサイトメトリーにより回収し、cDNAを単離する発現クローニングを試みた。この結果、陽性クローンを単離し、現在その詳細な構造解析を行っている。
骨格筋分化を制御するコンドロイチン硫酸種の同定と機能の解明

コンドロイチン硫酸(CS)の骨格筋分化に対する制御能を明らかにするため、骨格筋の分化過程を再現できる筋芽細胞C2C12に5種類のCS(CS-A、B、C、Dおよ及びE)を添加し、一定期間分化誘導を行った。さらに、最も筋分化を抑制したCS種を使用し、濃度を変え分化誘導を行い。筋管中の核数から算出した筋管係数(FI)値を筋分化の評価指標とした。その結果、検索したすべてのCS種が筋管形成を抑制し、中でもCS-Eが顕著な抑制を示し、筋管の形成は濃度依存的であった。逆にCSプロテオグリカンのデコリンをC2C12でノックダウンすると、筋分化は逆に促進した。以上よりCSによる筋分化の制御機能が明らかとなった。コンドロイチン硫酸(CS)は、グリコサミノグリカンの一種で、二糖の繰り返し構造を持ち硫酸基の結合位置とその数から7種類に分類される。最近の研究で、CSは筋分化を負に制御する因子であることが見出された。しかし、どのCS種が筋分化制御能を具備しているかは解明できておらず、またCSがどのような機構で筋芽細胞から筋管や筋線維の分化や形成に関わっているかは未解明のままであった。研究初年度は、これらの不明点を明らかにするために以下の実験を行った。1)筋芽細胞株C2C12に様々な種類と濃度のCSを反応させて筋分化誘導を行った。誘導後、筋分化の特異的なマーカーである抗ミオシン重鎖抗体で免疫蛍光染色を行い、それを元にFusion index値を筋分化の評価とし、筋芽細胞から筋管への分化を最も制御するCSを決定した。2)筋管形成を有意に抑制するCSの特異性を確認するために、培地中にCSの分解酵素(コンドロイチナーゼABC;ChABC)を加え反応を観察した。得られた結果は以下のとおりであった。1)では、C2C12の分化培養中に各々の濃度が0.2mg/mlになるようにCS-A、B、C、DおよびEを添加すると、CS-Eが最も筋管形成を抑制した。また濃度の異なるCS-E(0.02、0.2および0.4mg/ml)を添加した結果、0.2および0.4mg/mlで筋管形成が抑制された。2)では、ChABCを加えた場合では、筋管形成は抑制されなかったことから、CS-Eが最も筋分化を抑制しその抑制は濃度依存的であることが考えられた。グリコサミノグリカンの一種のコンドロイチン硫酸(CS)は、二糖の繰り返し構造を持ち、硫酸基の結合位置とその数から7種類に分類される。近年CSは筋分化を抑制する因子であるとの報告がなされたが、その詳細は不明である。研究1年目は、骨格筋の分化過程を再現できる筋芽細胞C2C12に5種類のCS(CS-A、B、C、DおよびE)をそれぞれ添加し一定期間分化誘導を行った。いずれのCS種も筋管形成を抑制し、中でもCS-Eが顕著な抑制を示したことから研究2年目は、CS-Eを用いて実験を行った。CS-E(濃度はいずれも0.2ug/mL)が分化過程のどの時期に筋分化抑制を示すかを検討するため、分化培養期間を前期、中期、後期に分けCS-Eを添加した結果、中期(分化誘導開始後36日)でのCS-E添加で最も筋分化が抑制された。筋分化関連因子群であるPax7, Myf5, MyoD, Mrf4のmRNAレベルでの発現動態は、CS-Eの有無に関わらず実験期間を通じてほぼ同じであった。ただし、筋管形成を促進するMyogeninは、全ての期間においてCS-E処理によって発現の低下が認められた。細胞周期を比較すると、CS-Eの有無に関わらず、S期の細胞の割合が低下しG0/G1期の細胞の割合が増加したことから、CS-Eは細胞増殖から分化への移行を阻害しないと考えた。以上により、CSの筋分化抑制機能が細胞レベルで裏付けることができた。CSは筋分化の中期に必要量以上存在すると筋分化の進行に必要なメカニズムを直接的あるいは間接的に抑制すると考えられた。今年度は、CS-Eが骨格筋分化を強力に抑制する因子であることを、様々な解析によって明らかにすることを目的としており、それを達成することができたため。実験3年目は、筋芽細胞C2C12のコンドロイチン硫酸プロテオグリカンの1つであるデコリン遺伝子発現をノックダウンした細胞(DKm)を作製し、筋分化過程でのデコリンの役割を明らかにすることを目的とした。C2C12およびDKmを分化誘導して一定期間経過後、形成された筋管を抗ミオシン重鎖抗体で染め出した。筋管中の核数から求めた筋管係数(FI)値を筋分化の程度の指標とした。また、両細胞の筋分化や細胞増殖に関連する因子(myostatin、ActR-IIB、p21)のタンパク産生量を計測し、増殖性と細胞周期を検討、比較した。筋分化を誘導するとDKmでは幅の太い筋管が早期から多数出現した。また、C2C12と比較して有意に高いFI値を示し、分化が促進していた。

デコリンの筋管形成への作用部位を確認するためにデコリン(コアタンパクと糖鎖)、デコリン糖鎖のCS-B、酵素処理で糖鎖を除去したコアタンパクをそれぞれDKmに加えて分化させると、前二者では分化は抑制され低いFI値を示したが、コアタンパクと反応させたDKmの分化は抑制されなかった。このことから、筋分化の制御はデコリン糖鎖が担っていることが考えられた。さらに筋分化や増殖に関連する因子の産生量を両細胞で比較したところ、DKmでは検索したすべての因子がC2C12より低値を示した。また、増殖性および細胞周期のS期の割合がDKmで高くなっていた。これらのことから、デコリンはその糖鎖が筋分化の抑制因子であるmyostatinを直接的あるいは間接的に調節し、筋分化を負に制御する因子であることが示唆された。コンドロイチン硫酸(CS)の骨格筋分化に対する制御能を明らかにするため、骨格筋の分化過程を再現できる筋芽細胞C2C12に5種類のCS(CS-A、B、C、Dおよ及びE)を添加し、一定期間分化誘導を行った。さらに、最も筋分化を抑制したCS種を使用し、濃度を変え分化誘導を行い。筋管中の核数から算出した筋管係数(FI)値を筋分化の評価指標とした。その結果、検索したすべてのCS種が筋管形成を抑制し、中でもCS-Eが顕著な抑制を示し、筋管の形成は濃度依存的であった。逆にCSプロテオグリカンのデコリンをC2C12でノックダウンすると、筋分化は逆に促進した。以上よりCSによる筋分化の制御機能が明らかとなった。今年度は、骨格筋分化を強力に抑制するコンドロイチン硫酸種の同定と、その特異性の確認が目的であったが、ともに目的を達成することができた。CSと筋分化関連因子や受容体との結合能を解析しCSの作用機構を明らかにする。また、筋損傷を誘導した個体に、CSおよびCS分解酵素を投与し、筋修復の過程におけるCSの役割と機能の詳細を解明する。糖鎖生物学今後は、筋分化過程での筋分化関連因子およびCS、さらには筋分化関連因子の発現・産生動態の解析を行う。すなわち、CSを筋芽細胞に作用させて、筋分化を誘導し分化の各ステージで発現・産生する筋分化関連因子と糖鎖(CS)量の動態を比較、解析する。また、筋分化関連因子や受容体とCSとの結合能を解析し、CSの筋分化過程での作用部位を明らかにする。海外のオンデマンド試薬の購入を検討したが、予想以上に取り寄せ期間が必要であることが判明したため。使用予定であった試薬を現在注文中である。ただし、試薬の残余があるため、実験が停止することはない。
新しいモノクロナル抗体(HG1-219)を用いたEIA法の確立と肝癌診断への応用

ヒト胃癌患者より新しい培養細胞株(HuG-1)を樹立し、この細胞及びその培養上清を免疫原としてモノクローナル抗体(MoAb)を作成した。そのうちの1つであるHG1-219抗体(Ab)と命名したAbを用いてサンドイッチ型のEnzyme immunoassay(EIA)法を確立した。本測定法(EIA-219)で測定される抗原(HG1-219Ag)の正常人(21名)の血清中でのmean±SDは30.5±14.5U/mlであり、正常人のmean+3SDの値をcut-off値とすると、慢性肝疾患では慢性肝炎、肝硬変、原発性肝癌でそれぞれ4.3%(2/47)、9.1%(4/44)、37.5%(18/48)で肝癌で陽性率が高かった。その他胃癌では27.3%(3/11)、肺癌4.5%(1/22)であった。そこで肝癌例でHG1-219Ag陽性者18例についてHG1-219Ag量と腫瘍サイズの関係を調べると、腫瘍径2cm以下が3例、2-5cmが4例、5cm以上の単発例が1例、多発又はび慢性肝癌が10例であり、HG1-219Ag量も腫瘍サイズの増大と共に増加する傾向を認めた。又2cm以下の微小肝癌でも陽性例を認めたことから肝癌のスクリーニングにも有用である可能性を示唆した。次に治療効果とHG1-219Agの変化を調べると、治療前HG1-219Ag高値例(4例)では、治療後は同抗原量の減少を認めたので、本抗原は腫瘍細胞由来と考えられた。一方肝癌の代表的腫瘍マーカーであるAFP、PIVKA-IIの本研究での陽性率はAFP(>400ng/ml)では26.7%(12/45)、PIVKA-IIでは33.3%(12/36)で、両抗原とEIA-219との間には相関を認めなかった。そこでAFP、PIVKA-II、EIA-219のコンビネーションアッセイを行った。いずれの二者の組合せよりも三者(AFP+PIVKA-II+EIA-219)の組合せで陽性率は75%(27/36)で最も高く、この時の特異性は90%であった。HG1-219Agの性状については、本抗原が過ヨウ素酸処理で抗体との反応性が消失し、CA19-9(300units)で約90%阻害されたが、CA125(300units)やL-Fucose(40mM)では約50%程度しか阻害されなかったので、HG1-219AgはCA19-9に類似の糖鎖がそのepitope考えられ、現在糖鎖構造の解析を行っている段階である。

HG1-219Agの性状については、本抗原が過ヨウ素酸処理で抗体との反応性が消失し、CA19-9(300units)で約90%阻害されたが、CA125(300units)やL-Fucose(40mM)では約50%程度しか阻害されなかったので、HG1-219AgはCA19-9に類似の糖鎖がそのepitope考えられ、現在糖鎖構造の解析を行っている段階である。
サンゴ礁生物ライブラリーからのヘリケース阻害剤等の探索と作用の解明

主にC型肝炎ウイルスに対して選択的な薬剤の発見を目標に研究を行った。サンゴ礁生物のエキスライブラリーを材料にNS3ヘリケースを標的にした酵素アッセイ、および細胞レベルでのレプリコンアッセイでスクリーニングを行った。これらのアッセイでヒットしたエキスから活性を確認しながら化合物を分離し、活性物質の化学構造の決定・同定をした。さらにその作用メカニズム等について検討した。本研究テーマのうち、本年度はC型肝炎ウイルスのNS3ヘリケースに対する阻害作用物質の探索を中心に行った。当研究室で保存するサンゴ礁生物のエキスライブラリ539個を連携研究者・野田らによるアッセイ系で評価し、そのうちヒットしたエキスのいくつかを選んで活性成分の単離・同定を行った。海綿C-11のエキスがFRET/PETによるスクリーニングで阻害活性を示したことから、分画したところ、psammaplin Aとその関連化合物を活性成分として見い出した。psammaplin AはすでにHDAC阻害剤として知られている化合物であった。海綿00D39のエキスも活性を示したことから分離したところ、halenaquinol sulfateを阻害作用成分として同定した。次にウミシダの一種Alloeocomatellapolycladiaのエキスが活性を示したことからアッセイと並行して分画したところ、cholesterolsul fateと新規多環芳香族sulfate類を活性成分として見い出した。しかしながら、上記の化合物の多くは、山梨大学の山下によるrepliconアッセイにおいて有意な活性を示さなかった。その原因としては、膜透過性の問題や得られた活性成分にsulfateを含むものが多いことから、この官能基と酵素の間に何らかの関係があるのでは、と示唆された。現在はこの経過を踏まえ、エキスのrepliconアッセイを先に行い細胞レベルで効果を示す物質を探索している。テロメラーゼ賦活作用および翻訳阻害活性に対してもエキスのスクリーニングを行い、それぞれ活性を示したエキスから活性成分を同定している。平成23年度は主にC型肝炎ウイルス(HCV)のNS3ヘリケースを標的にする物質についての研究をさらに進めた。昨年度、北谷町で採集したウミシダの一種Alloeocomatellapolycladiaのエキスがヒットしたことから、いくつかの活性物質の単離につながった。このエキスレベルでの活性等について雑誌Marine Drugsに報告した。さらに、このエキスから見出した活性物質のうち、cholesterol sulfateについては、その活性メカニズムを評価し、論文を投稿している。他にもNS3ヘリケースに対する阻害活性で同定した化合物のうち、PLA2阻害活性で知られているmanoalideについて、活性メカニズムがATPase阻害とRNAヘリケース阻害であることを共同研究者とともに雑誌J.Nat.Prod.に報告した。渡嘉敷島で採集した海綿功DysideagranulosaのエキスがPETアッセイでヒットしたことからその主成分であるpolybrominated diphenylether (PBDE)を調べたところ、活性が確認された。現在、構造活性相関について検討している。西表島で採集した海綿Halisclonasp.のエキスがHCVのレプリコンアッセイでヒットしたことから、この分画についてアッセイと並行して化合物の同定を進めている。一方、恩納村で採集したコケムシの一種Calyptotheca sp.のエキスは、共同研究者のPelletierらが行うタンパク合成阻害活性でヒットした。アッセイと並行して分離したところ、A環にエノンの入った新規ステロイド化合物を2つ見出し、MTPAエステルを作成してその側鎖の立体配置を決定した。現在、論文投稿に向けて準備をしている。平成24年度も引き続きPET/FRETでのNS3ヘリケースアッセイとともに、レプリコンアッセイの結果を利用してC型肝炎ウイルス(HCV)を標的とする物質に関する研究を連携研究者らと進めた。昨年度、NS3ヘリケースアッセイでヒットした海綿由来のpolybrominateddiphenylether (PBDE)については、関連化合物を提供して構造活性相関に関する情報を得た。入手可能な合成品よりも海綿由来の天然品に活性が高いものが多く、さらに天然物を基に関連化合物を作成する必要があると思われた。先にcholesterol sulfateがPET/FRETアッセイでヘリケース阻害活性を示したことから、炭素骨格にsulfateがついている天然、合成品は酵素と何らかの相互作用をもつと推測された。そこで、cholesterol sulfateとは異なる炭素骨格を有する海綿由来のhalisulfate 3をテストしたところ、同等以上の活性を示した。レプリコンアッセイでヒットしていた西表島産の海綿Amphimedon sp.の成分を再採集してアッセイと並行して精査したところ、活性成分としてchlorophyllone aを同定した。同時に得たカロテノイドのmytiloxanthinも活性成分と思われるが、化合物が実験途中で分解したため純品での活性を評価できなかった。どちらの化合物も先に食用二枚貝類から分離・報告されており、その起源は餌として取り込まれた植物プランクトンではないかと想像される。食品の含有成分に抗ウイルス作用が見られることは興味深い。これらについても関連化合物のアッセイを通して、活性発現に必要な分子構造について検討している。本研究費は終了したが、今後上記の未発表部分の成果を論文として発表する予定である。

HCV NS3ヘリケースに関する研究では、スクリーニングの結果と特定した阻害剤について5件の学会発表と2報の論文を報告した。現在さらに投稿中の論文や進行している研究がいくつもあることから、今後も順調に成果報告できる予定である。一方、タンパク合成阻害活性では、ヒットしたサンプルから新規阻害物質を見出し、その最終的な構造と生理活性について検討している。また、さらに新規阻害剤を求めて探索も継続している。24年度が最終年度であるため、記入しない。今後も共同研究者とともに、新たなサンゴ礁生物ライブラリーの作成、探索、化学構造の決定、および生理活性の評価を通して論文と学会報告を着実に行っていく。また、見出した生理活性物質については、より詳細な評価(例:レプリコンアッセイでのウイルス部分の変更等)を通して今後の発展を検討する。
透水性・排水性舗装の目詰まり評価に関する基礎的研究

本研究では排水性舗装を直接の研究対象とした。排水性舗装の排水機能や交通騒音低減機能は、舗装体内に有する連続した空隙に起因している。しかし、供用後には車両の走行による空隙つぶれや、異物等が空隙内に堆積する目詰りが発生し、これらの機能は低下していく傾向にある。目詰まりの進行を阻止するための対策を効果的・効率的に実施するためには目詰まりの程度をなるべく簡便に評価できることが望ましい。本研究では、モデル路面を作成し、通常良く用いられている現場透水量試験装置による透水性評価および新たな電磁波レーダによる評価を試みた。得られた主要な結果を以下に示す。まず、現場透水量試験装置による透水性評価に関しては、通常のストップウォッチによる手動計時では評価結果の信頼性に問題があったため、水圧センサとデータロガーによる自動計測を試みた。モデル路面としては連続空隙率を2種類設定し、目詰まりのない初期状態および目詰まりした状態に対応させた。また排水層厚も5,7,10cmと3種類変化させた。これらのモデル路面に対して一連の現場透水量試験を試みた結果、空隙率の変化に対応した透水性を示したのは勿論であるが、同じ初期空隙率の路面でも試験時間間隔つまり空隙に占める水分の割合による影響を受け易いことを明らかにした。次に、電磁波レーダによる透水性評価を試みた。この方法は物質の示す比誘電率の差を利用して路面の空隙の状態を評価しようというものである。実験条件は上記現場透水量試験の場合と同様とした。結果的にほぼ現場透水量試験の場合と同様な結論が得られた。高速度で透水性を評価できるという意味で、今後有望な手法であることが判明した。排水性舗装における目詰まり現象を評価するためには、その評価手法により路面下構造の透水特性をある程度定量的に評価できなければならない。現在、路盤透水試験機と呼ばれる試験機を用いた方法が提案されているが、本研究でもこの試験機を用いた新たな手法を提案した。本研究での基本的アイディアは、2つの異なるサイズの透水パッドによる透水実験を実施することによって、表層の透水係数と厚さを同時に決定できるというものである。提案する透水係数および透水層厚決定法の妥当性を検討するため、まず室内において透水係数および透水層厚を種々変化させたモデル路面を作成した。モデル路面は、種々の粒径の砕石をエポキシ系接着剤によって固めることによって作成した。作成されたモデル路面は、通常の舗装面よりかなりポーラスであるため、まずそれらの透水特性を円柱供試体に対して確認した。次に、モデル路面に対して透水パッド面積を2種類変化させて、一連の透水試験を実施した。実験においては円柱内に所定の量の水を満たし、その水面の時間的変化を観測した。透水係数が大き過ぎる場合は透水パッドの面積の影響が現れにくいこと、目詰まり状態に対応した状態では透水パッドの面積の評価が明瞭であること,また水面の変化に非線形性が強まることなどが分かった。最後に、不飽和浸透流解析プログラムによってモデル路面に対する透水試験をシミュレートした。本プログラムによって透水試験結果を概略表現できることを確認できたが,一部のパラメータについてはその決定法などに関してさらに検討する必要のあることが分かった。
イシガイ科二枚貝殻体内の有機質薄膜の形成様式とその適応進化的解釈

殻の溶蝕現象は、淡水に生息する二枚貝にとって致命的ともなりかねない。一般に淡水の酸性化は、水中の二酸化炭素溶存量に依存し、その溶解度は水温が低いほど大きい。それゆえ、水温の低い高緯度の淡水ほどpHが低いと予想される。イシガイ超科に属する二枚貝は、極地域から熱帯地域の淡水環境に広く分布し、貝殻内層中に有機質薄膜を分泌することで、殻の溶蝕の進行を効果的に遅らせることができるが、pHの低い高緯度地域に適応した種ほど、有機質薄膜を効率良く形成していることが予想される。本研究では、高緯度地域の優先種であるドブガイ亜科に属するドブガイ、中低緯度地域に生息するイシガイ亜科に属するタテボシガイとササノハガイ、マツカサガイ、これら4種が同所的に生息する河川において定期的な採集を行い、殻体の真珠層を形成する結晶の厚みと、有機質薄膜の存在様式を調べた。その結果、ドブガイの真珠層を構築する結晶の厚みは、水温の変化に伴って増減し、有機質薄膜は結晶の厚みが最も薄くなるときに必ず形成され、幼貝の時期にも形成されることが明らかになった。これに対して、後者3種では、結晶の厚みの変化は見られるものの、ドブガイ程顕著ではなかった。また、有機質薄膜は、幼貝の時期には形成されない傾向があり、殻頂部の溶蝕が著しくなってから形成される個体が見られた。この結果は、ドブガイの有機質薄膜は、殻の溶蝕による刺激の有無にかかわらず形成され、イシガイ亜科に属する3種では、溶蝕による刺激があってはじめて形成されることを強く示している。また、この4種は同所的に生息していることから、有機質薄膜の形成様式に見られる多様性は、それぞれの遺伝的特性に反映されたものである可能性が高い。これらの有機質薄膜の形成様式に見られる多様性は、殻の溶蝕現象がイシガイ科二枚貝の適応進化において、選択圧として働いたという伝説を支持する有力な証拠となるであろう。
細胞内の脂質セカンドメッセンジャーの蛍光プローブ分子

細胞内の主要な脂質セカンドメッセンジャーであるホスファチジルイノシトール-3,4,5-三リン酸(PIP_3)を,蛍光顕微鏡下の単一細胞で可視化分析するために新規蛍光プローブ分子(fllip:フリップ)を開発した.FllipはPIP_3と結合するドメイン(LBD:Lipid binding domain)とオワンクラゲ由来の緑色蛍光蛋白質の2つの異色変異体(シアン色蛍光蛋白質と黄色蛍光蛋白質)からなる.このfllipは蛋白質からなる蛍光プローブ分子なので,まずfllipをコードするcDNAを作成し,培養細胞に導入したところ半日程度で細胞から蛍光が観察されfllipが蛋白質発現されたことが分かる.Fllipに特定の膜局在化アミノ酸配列を連結すると,fllipを細胞内の特定局所膜系にのみ配置でき,これによりそれぞれの特定の膜系におけるPIP_3の量的変化を可視化できる期待できた.本研究では細胞膜(形質膜)と,小胞体膜・ゴルジ体膜にfllipを配置し,PIP_3の濃度変化を追跡した.これにより,1)血小板由来成長因子(PDGF)などのペプチドホルモン刺激により,PIP_3が細胞膜のみならず小胞体膜やゴルジ体膜などendomembraneで大量に増加することを見いだした.また,2)このendomembraneでのPIP_3は,エンドサイトーシスにより細胞内に取り込まれたチロシンキナーゼ受容体に刺激されてendomembrane上で生合成されたものであることを明らかにした.本法はPIP_3のみならずその他の脂質セカンドメッセンジャーにも応用可能な一般的方法論である.例えば脂質セカンドメッセンジャーと結合するLBDを選ぶことにより,ジアシルグリセロールやホスファチジルイノシトール-3-一リン酸を検出する蛍光プローブへとテーラーメイドできる.また,fllipに連結した膜局在化アミノ酸配列を選ぶことにより,本研究で示した細胞膜,小胞体膜,ゴルジ体膜のみならず,核膜,ミトコンドリア膜など各種オルガネラ膜における脂質セカンドメッセンジャーを選択的に可視化検出できると期待される.多くの細胞内情報伝達過程は十万個以上の細胞をすりつぶして破壊分析されているため,生きた細胞に対する新しい分析手法として,時間的・空間的分解能の優れた蛍光プローブ分子の開発が興味深い.本研究では,細胞内情報伝達を担う主要な生体脂質分子(脂質セカンドメッセンジャー)であるジアシルグリセロール(DAG),およびホスファチジルイノシトール-3, 4, 5-三リン酸(PIP3)の蛍光プローブ分子(DAG-lipcusおよびPIP3-lipcus)を開発し,ペプチドホルモン刺激により産生されたこれら脂質セカンドメッセンジャーの細胞内での挙動について,蛍光顕微鏡下の生きた単一細胞で定量的解析を行った.DAGおよびPIP3をそれぞれ選択的に分子認識するリセプター(LBD : Lipid Binding Domain)として,それぞれプロテインキナーゼCのDAG結合ドメイン(Cys1ドメイン)とGrp1のPIP3結合ドメイン(PHドメイン)を用いた.その分子認識を蛍光シグナル変化として検出するために,緑色蛍光蛋白質(GFP)の異色変異体間の蛍光共鳴エネルギー移動(FRET)に基づくアプローチを行った.GFP変異体であるシアン色蛍光蛋白質(CFP)と黄色蛍光蛋白質(YFP)はFRETの優れたドナーおよびアクセプターであり,CFPとYFP間の相対的距離および配向の変化がFRET効率を変化させる.CFP-LBD-YFP融合蛋白質(lipcus)を不飽和脂質(ファルネシル基)修飾配列(FS)を介して細胞膜に結合させた.このlipcusには非常にフレキシブルなリンカー配列(Gly-Gly)が二カ所のみ含まれている.ペプチドホルモン刺激により産生されたDAG(PIP3)がDAG-lipcus(PIP3-lipcus)のLBDに結合すると,分子内のフレキシビリティーが大幅に減少し,CFPとYFP間の相対的距離および配向の固定化によりそのFRET効率が増加することを示した.本法はDAG, PIP3のみならず,細胞膜表面の生体分子一般に適用可能な方法論である.細胞内の主要な脂質セカンドメッセンジャーであるホスファチジルイノシトール-3,4,5-三リン酸(PIP_3)を,蛍光顕微鏡下の単一細胞で可視化分析するために新規蛍光プローブ分子(fllip:フリップ)を開発した.FllipはPIP_3と結合するドメイン(LBD:Lipid binding domain)とオワンクラゲ由来の緑色蛍光蛋白質の2つの異色変異体(シアン色蛍光蛋白質と黄色蛍光蛋白質)からなる.このfllipは蛋白質からなる蛍光プローブ分子なので,まずfllipをコードするcDNAを作成し,培養細胞に導入したところ半日程度で細胞から蛍光が観察されfllipが蛋白質発現されたことが分かる.Fllipに特定の膜局在化アミノ酸配列を連結すると,fllipを細胞内の特定局所膜系にのみ配置でき,これによりそれぞれの特定の膜系におけるPIP_3の量的変化を可視化できる期待できた.本研究では細胞膜(形質膜)と,小胞体膜・ゴルジ体膜にfllipを配置し,PIP_3の濃度変化を追跡した.これにより,1)血小板由来成長因子(PDGF)などのペプチドホルモン刺激により,PIP_3が細胞膜のみならず小胞体膜やゴルジ体膜などendomembraneで大量に増加することを見いだした.また,2)このendomembraneでのPIP_3は,エンドサイトーシスにより細胞内に取り込まれたチロシンキナーゼ受容体に刺激されてendomembrane上で生合成されたものであることを明らかにした.本法はPIP_3のみならずその他の脂質セカンドメッセンジャーにも応用可能な一般的方法論である.

例えば脂質セカンドメッセンジャーと結合するLBDを選ぶことにより,ジアシルグリセロールやホスファチジルイノシトール-3-一リン酸を検出する蛍光プローブへとテーラーメイドできる.また,fllipに連結した膜局在化アミノ酸配列を選ぶことにより,本研究で示した細胞膜,小胞体膜,ゴルジ体膜のみならず,核膜,ミトコンドリア膜など各種オルガネラ膜における脂質セカンドメッセンジャーを選択的に可視化検出できると期待される.
Ｓｕｆｆｉｘ　Ａｒｒａｙを用いた音声検索における高速アルゴリズムの研究とその検証

本研究ではコンパクトなデータ構造であるsuffix arrayを利用した高速で大規模メモリを要さない音声検索語検出システムを開発した.このシステムではsuffix arrayを木構造に見立て,ルートノードからDP(Dynamic Programming)マッチングを適用することによって,インデックスサイズの小さい高速音声検索語検出を実現している.本検索システムの性能を評価するため,N-gramインデックスを用いた基礎的な手法および他の高速検索法と,検索精度を比較した.その結果,本システムでは検索精度を損なうことなく他の手法と同程度の高速検索を実現できている事が確認できた.平成24年度に開発した分割キーワードへの閾値の付与方法について更に検討を進めた.閾値を付与する際には分割キーワードの検索結果の総数を推定し,総数が最も少なくなるであろう閾値を付与する.分割キーワードの検索結果の総数が少なくなると,その結果に基づいて実施するキーワード全体の正当性に関する照合時間が短縮されるため,全体として高速な検索が可能になる.平成25年度は分割キーワードに含まれる音素に関する統計データから検索結果の総数を推定する方法を検討した.実験の結果,推測の制度が大幅に高まり,前年度に提案した手法と比較して10%程度分割キーワードの検索結果の総数が削減でき,結果としてキーワード全体の検索が高速に実施できることが明らかになった.また,放送大学のコンテンツを対象とする検索システムについては,サーバ・クライアント型およびスタンドアローン型のプロトタイプシステムの開発にそれぞれ着手し,実証実験が可能な環境の整備を進めた.本研究ではコンパクトなデータ構造であるsuffix arrayを利用した高速で大規模メモリを要さない音声検索語検出システムを開発した.このシステムではsuffix arrayを木構造に見立て,ルートノードからDP(Dynamic Programming)マッチングを適用することによって,インデックスサイズの小さい高速音声検索語検出を実現している.本検索システムの性能を評価するため,N-gramインデックスを用いた基礎的な手法および他の高速検索法と,検索精度を比較した.その結果,本システムでは検索精度を損なうことなく他の手法と同程度の高速検索を実現できている事が確認できた.キーワード分割の妥当性について,分割キーワードに与える閾値の配分に関する理論的検討と証明を行った.また,それに基づき自動的に閾値を配分するアルゴリズムを検討し,実験を行った結果,20%程度の高速化が可能であることが確認できた.放送大学のコンテンツを対象とした検索性能の検証については,15回(各45分)の連続する講義を対象にラベリング作業を実施し,検索精度の評価を行った.実用的な検索システムに向けた機能の洗い出しについては,放送大学の青木教授,辻准教授,森本准教授と作業を進めている.本研究ではSuffix Arrayを用いた高速な音声検索システムにおいて,高速化のために導入しているキーワード分割に関して,最適な検索閾値を分割キーワードに与えるための理論的枠組みを検討した.従来の方法ではキーワードを分割した際に各分割キーワードに同じ検索閾値を与えていたが,分割キーワードによっては検索結果が多くなり,多大な検索時間が必要となる場合があった.これに対して本研究では分割キーワードに与える検索閾値を調整することにより,全ての分割キーワードを検索する時間の合計を最小化することを目指した.このために,本研究では検索時間の増加傾向を回帰分析によってモデル化し,合計の検索時間が最小になるよう検索閾値をモデルに基づいて解析的に求める方法を採った.この手法の有効性を検証するためにCSJコーパス(606時間)を対象に,NTCIR-9 SpokenDocテストコレクションのSTD(Spoken Term Detection)ALLタスク用キーワード50個のうち分割検索を行う長いキーワード(10音素から18音素)30個を検索したところ,検索時間を7.0%34.0%削減することができた.また,検索システムの開発については放送大学と共同開発を行うことで,サーバ・クライアント型およびスタンドアローン型のプロトタイプシステムを完成させた.放送大学で実施された20講義の音声データを用いた検索システムの評価を行ったところ,平均の最大F値が0.66であるとの結果が得られた.本研究と別途実施した市場調査ではF値が0.7程度であれば実用性があるとの結果が得られており,あと僅かな性能の向上で実用化に到達できる性能であることが確認された.最適な分割の検討については,分割キーワードに与える閾値について検討しており,分割数と分割長の検討は平成26年度に取り組む予定である.検索システムの構築については予定通りサーバの構築を進めており,平成26年度には実証テストが行えるよう準備している.目標に挙げた各事項は平成24年度内にほぼ達成している.今後,分割キーワードに与える閾値について更に制度を向上すると共に,最適な分割数と分割長の検討についても取り組みを始める.放送大学のコンテンツを対象とするシステムの構築については,引き続き実用化について開発を続けていく.検索高速化のためのアルゴリズム最適化を行うためには,更なる理論的検討が必要である.また,放送大学の講義を対象とした評価に関しても,講義数を増加して改めて検索性能を評価する必要がある.今後はこれらを進めた上で,放送大学における実働システムの構築に取り掛かりたい.平成25年度は既存設備を多く使用したため,残額が生じた.平成26年度は国際会議での発表を数件予定しており,予定通り執行する計画である.平成24年度は国際会議に参加しなかったことと,既存設備を多く利用したため,残額が発生した.次年度は国際会議に参加予定であるため,予定通り執行する計画である.
脂肪酸代謝の異常と肝癌リスクの増大―新しいNASHモデルによる生体防御機構の解明

本年度はNASH/肝癌マウスモデル(筑波大にて開発)において,肝発癌に対するNrf2とp62の抑止的役割を解明することを目的に研究を実施した.1. p62とNrf2遺伝子の組織細胞特異的ノックインマウスの作製:p62とNrf2遺伝子のイントロンに、LoxP配列で挟まれた転写終結シグナルおよびpolyA付加シグナル配列を挿入したノックインマウス(p62 KI/KI, Nrf2KI/KI)を作製し,このマウスとの交配により,Nrf2KI/KI/p62-/-マウスとp62KI/KI/Nrf2-/-マウスを得た.これらのマウスは,全身でp62とNrf2遺伝子が二重に欠損しており,NASHを自然発症する.次に,全身でのp62とNrf2遺伝子二重欠損下において,組織特異的にp62とNrf2の発現をノックインするために,Vill-Cre(腸管上皮),Albumin-Cre(肝細胞),Adipoq-Cre(脂肪細胞),Lyz2-Cre(Kupffer細胞)マウスとの交配を開始した.現在,マウスの交配掛け合わせと繁殖を実施している.マウスの数が揃った段階において,肝発癌促進のために高脂肪食投与を開始し,表現型の解析を予定している.また,p62とNrf2の肝細胞およびKupffer細胞における肝発癌シグナルへの関与を探索するために使用する細胞系については,肝細胞(Hepa1-6)とKupffer細胞(RAW264.7)のp62とNrf2をCRISPR/Cas9systemを用いてノックアウトし,p62とNrf2を欠失したHepa1-6細胞とRAW264.7細胞を得ることに成功している.今後p62とNrf2のノックアウトによる肝発癌シグナルの変化を解析する.腸管上皮,肝細胞,脂肪細胞,Kupffer細胞の組織細胞特異的遺伝子ノックインマウスが作製できた段階で表現型を観察する.32週齢で解剖し,全身p62とNrf2遺伝子二重欠損マウスと,特にNASHの肝臓の表現型を比較解析する.次に,60%高脂肪食を20週間にわたり自由摂餌させて,肝発癌の表現型(個数,病理学的悪性度など)について比較する.どの組織や細胞のp62あるいはNrf2が肝発癌の発生に重要であるか,どのように肝発癌を防御しているかを解明する.同時に,p62とNrf2CRISPR/Cas9systemを用いてノックアウトした肝細胞とKupffer細胞を用いて,p62とNrf2のノックアウトによる肝発癌シグナルの変化を解析する.さらに,マウスモデルの解析はヒトのNASH肝癌との相同性・類似性が問題になる可能性がある.そこで,本学消化器外科において収集されたヒトNASH肝癌の病理組織標本を用いてKeap1-Nrf2 pathwayとp62を中心とした免疫染色(p62, Nrf2, Keap1,p62が制御するautophagyの調節因子LC3A, LC3B, multiubiquitin)を実施し,NASH肝発癌と肝癌進行におけるNrf2とp62の役割を解明する.ヒト臨床検体の使用にあたり,本学と筑波大学附属病院の倫理委員会の承認を既に得ている.本年度はNASH/肝癌マウスモデル(筑波大にて開発)において,肝発癌に対するNrf2とp62の抑止的役割を解明することを目的に研究を実施した.1. p62とNrf2遺伝子の組織細胞特異的ノックインマウスの作製:p62とNrf2遺伝子のイントロンに、LoxP配列で挟まれた転写終結シグナルおよびpolyA付加シグナル配列を挿入したノックインマウス(p62 KI/KI, Nrf2KI/KI)を作製し,このマウスとの交配により,Nrf2KI/KI/p62-/-マウスとp62KI/KI/Nrf2-/-マウスを得た.これらのマウスは,全身でp62とNrf2遺伝子が二重に欠損しており,NASHを自然発症する.次に,全身でのp62とNrf2遺伝子二重欠損下において,組織特異的にp62とNrf2の発現をノックインするために,Vill-Cre(腸管上皮),Albumin-Cre(肝細胞),Adipoq-Cre(脂肪細胞),Lyz2-Cre(Kupffer細胞)マウスとの交配を開始した.現在,マウスの交配掛け合わせと繁殖を実施している.マウスの数が揃った段階において,肝発癌促進のために高脂肪食投与を開始し,表現型の解析を予定している.また,p62とNrf2の肝細胞およびKupffer細胞における肝発癌シグナルへの関与を探索するために使用する細胞系については,肝細胞(Hepa1-6)とKupffer細胞(RAW264.7)のp62とNrf2をCRISPR/Cas9systemを用いてノックアウトし,p62とNrf2を欠失したHepa1-6細胞とRAW264.7細胞を得ることに成功している.今後p62とNrf2のノックアウトによる肝発癌シグナルの変化を解析する.腸管上皮,肝細胞,脂肪細胞,Kupffer細胞の組織細胞