hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
肝癌におけるTIMPsの役割に関する研究

本研究は,新たなTIMPsファミリーであるTIMP-3,-4の肝癌における発現を検討するとともに,肝癌培養細胞におけるTIMPsの細胞内シグナルについて解析した。肝細胞癌患者から切除された肝癌組織の癌部及ぴ非癌部より全RNAを抽出し,random hexamerを用いて,逆転写酵素によりcDNAを合成した。TIMP-3,-4に特異的なprimerを用いたPCRにより、肝癌組織でのそれぞれの遺伝子の発現レベルを調べたところ,癌部においては,TIMP-3,-4の発現を認めたが,非癌部においては,いずれも発現を認めなかった。培養液中にrecombinantTlMP-1,-2を添加して肝癌培養細胞を刺激した後,細胞を溶解してSDSポリアクリルアミド電気泳動を行い,抗ホスホチロシン抗体を用いて,ウェスタンプロッティング法にて,チロシンリン酸化蛋白を検出した。recombinantTIMP-1,-2未添加でもチロシンリン酸化蛋白を認めたが,添加することにより,チロシンリン酸化蛋白は有意に増強した。MAPキナーゼの関与が示唆されたが,会合する蛋白については解析中である。TIMPsは,MMPsの特異的な阻害剤であるが,MMPsと独立して機能しうるため,in vivoにおける役割に関しては,MMPsの他の阻害剤も含めて検討する必要がある。ヒト肝癌細胞株は,いずれも無血清培養液未刺激下において,TIMP-3の発現を認め,TNF-α,あるいはTPAによりTIMP-3の発現が増強した。PLC/PRF/5は、無血清培養液未刺激下において、MT-MMP及びTIMP-4の発現を認め,MT-MMPに関しては、TNF-αあるいはTPAを添加することによりその発現が増強した。MMP-2及びMMP-9の発現はTNF-αあるいはTPAを添加しても認めなかった。肝癌培養細胞株において,未刺激下でもTIMP-3,-4の発現が認められ,肝癌に対しても,TIMP-3,-4が機能している可能性が示唆された。
担持合金触媒による一酸化炭素の水素化反応

(1)鉄-コバルト-ニッケル系金属触媒は複合化により高い活性と連鎖成長確率を示す。複合金属触媒上の吸着NOのIRスペクトルは金属組成により顕著に変化し、各触媒系のBent型NOの吸収強度とCO水素化活性はよい相関を示すことを見出した。複合金属系ではBent型NOの吸収強度は大きいので複合化によって電子密度が増加し、【H_2】及びCOの活性化が促進されると思われる。(2)水素の昇温脱離実験において、触媒反応温度付近(150-200°C)に脱離する水素量はTi【O_2】担持触媒の方がSi【O_2】担持触媒よりも多く、このことはTi【O_2】担持触媒が高いCO水素化活性を有することと対応している。異なる合金組成の触媒についても、CO転化率は(150-200°C)における水素脱離量が多い触媒ほど高いので、触媒活性は水素の活性化に強く依存すると理解される。(3)COの吸着は活性よりむしろ生成物分布や炭化水素の連鎖成長確率に大きな影響を及ぼすと考えられる。吸着COのIR測定結果との比較によってCOの水素化反応においてはBridge型CO吸着種が反応に関与することが明らかになった。また、各組成の金属触媒において金属上の吸着COと吸着水素の比によって連鎖成長確率が決定されると思われる。高級炭化水素収率を増加させるためには、COが吸着し易く、かつ水素が吸着し難い、Fe-Ni系触媒を使用すればよい。(4)Si【O_2】担持及びTi【O_2】担持触媒で最も高い活性を示した50Co50Niを種々の酸化物に担持した触媒を用いてCOの水素化反応の活性及び選択性を調べた。使用した各担体の中ではTi【O_2】担体の場合に最も高いCO転化率及び含酸素化合物収率が得られた。MnO担持では高い活性と高い連鎖成長確率が得られ、【V_2】【O_5】担持では最も連鎖成長が進行した。H-ペンタシル型ゼオライト担持触媒では【C_5】以下のパラフィンと少量の芳香族炭化水素が生成するが、【C_(10)】以上の高級炭化水素は全く生成しない。以上のように担持複合金属触媒の活性及び生成物分布は担体によっても強く影響を受ける。
大腸癌に対する新規腫瘍抗原遺伝子

【方法】癌抗原を同定する方法として,SEREX (serological identification of antigens by recombinant expression cloning)法をもちいて新規のCT antigenを同定し,その大腸癌における発現を検討した.【方法】glioma細胞株U87MGおよびT98GよりmRNAを精製し,逆転写により合成したcDNAをλZap Expressファージベクターに組み込んでcDNA libraryを作製した.ファージより誘導したrecombinant蛋白はニトロセルロース膜に転写後,glioma患者血清と反応させスクリーニングした.陽性クローンを単離後,ファージに組み込まれたcDNAインサートをPCRで増幅,塩基配列を決定しDNAデータベースを検索した.また,単離された抗原の遺伝子発現を正常組織,各種癌細胞株および大腸癌臨床検体をもちいたRT-PCR法により解析した.【結果】52個の陽性クローンを単離,遺伝子データーベースで解析し,新規癌抗原KU-GB-1を同定した.KU-GB-1 mRNAは正常組織では精巣のみに発現していた.KU-GB-1 mRNAは癌細胞株(glioma,肺癌,食道癌,膵癌,膀胱癌,前立腺癌,胃癌,大腸癌)に広く発現を認めた.Northern Blot解析でも同様の結果が得られた.大腸癌臨床検体を用いたRT-PCR法では癌部にKU-GB-1 mRNAの強発現を認めた.【結語】新規CT antigen KU-GB-1は大腸癌に広く発現を認めた.今後更に遺伝子および蛋白レベルの発現解析を進め,新たな大腸癌診断法への応用を検討していく.【方法】癌抗原を同定する方法として,SEREX (serological identification of antigens by recombinant expression cloning)法をもちいて新規のCT antigenを同定し,その大腸癌における発現を検討した.【方法】glioma細胞株U87MGおよびT98GよりmRNAを精製し,逆転写により合成したcDNAをλZap Expressファージベクターに組み込んでcDNA libraryを作製した.ファージより誘導したrecombinant蛋白はニトロセルロース膜に転写後,glioma患者血清と反応させスクリーニングした.陽性クローンを単離後,ファージに組み込まれたcDNAインサートをPCRで増幅,塩基配列を決定しDNAデータベースを検索した.また,単離された抗原の遺伝子発現を正常組織,各種癌細胞株および大腸癌臨床検体をもちいたRT-PCR法により解析した.【結果】52個の陽性クローンを単離,遺伝子データーベースで解析し,新規癌抗原KU-GB-1を同定した.KU-GB-1 mRNAは正常組織では精巣のみに発現していた.KU-GB-1 mRNAは癌細胞株(glioma,肺癌,食道癌,膵癌,膀胱癌,前立腺癌,胃癌,大腸癌)に広く発現を認めた.Northern Blot解析でも同様の結果が得られた.大腸癌臨床検体を用いたRT-PCR法では癌部にKU-GB-1 mRNAの強発現を認めた.【結語】新規CT antigen KU-GB-1は大腸癌に広く発現を認めた.今後更に遺伝子および蛋白レベルの発現解析を進め,新たな大腸癌診断法への応用を検討していく.
消化器各種再建物合法における表層粘液層ならびに粘液産生細胞の細胞動態の研究

臨床研究:ヒト残胃6例(平均年齢59歳(4176歳),男3例女3例,胃癌5例腹部食道癌1例,胃切除後経過年数平均24.3年(1241年),初回手術対象は全例良性胃十二指腸潰瘍, B-I再第3例B-II再建3例).並びに対照として亜全摘ないし全摘された切除胃20例を用い表層粘液層を検討した.結果)対照群の表層粘液層の厚さは幽門粘膜21.0±10.0μm,胃体部粘膜54.4±26.1μmであった.表層粘液層はGOCTS陽性の表層粘液細胞型粘液とPCS陽性の腺粘液細胞型(噴門腺ー副細胞ー幽門腺型)粘液による数層十数層の層構造を示した残胃では6例全例に吻合部近傍の逆流性胃炎が見られた.表層粘液層は対照群の胃体部粘膜に部位がほぼ一致する吻合近傍において46.0±12.5μm,胃体上部で71.0±37.7μmと対照群と有意差の無い厚さの粘液層が見られた.一方,表層粘液層は吻合部に近づくにつれ菲薄化し吻合部で途絶する所見が認められた.組織化学的に粘液層は対照と同じく2種の粘液の多重層構造を示したが,腺萎縮の見られる吻合近傍でPCS陽性粘液の比率が減少していた.実験研究:雑種成犬24匹に胃切除BillrothII法再建術を行い,術後1週, 2カ月, 6カ月の群分けを行い, BrdU1g静注60分後に屠殺し臨床例と同様の検討並びにBrdU染色による細胞動態の解析を行った.結果および結論)術後早期には吻合部近傍の粘液産生細胞(特に腺粘液細胞)の増殖は促進しており,活発な粘液産生が見られたが粘液層は菲薄であった.経時的に腺は萎縮に傾き,細胞分裂は正常化し充分な厚さの粘液層が見られた.結論)残胃において表層粘液層が組織学的に第認され, 2種の粘液の多層構造を示す事が明かとなった.吻合近傍で粘膜防御能の低下を示す粘液層の菲薄化がみられ残胃逆流性胃炎発生の要因であることが示唆された.吻合部腺粘液細胞は術後早期に増殖し6カ月以上経過して萎縮に傾くことが明かとなった臨床研究:ヒト残胃6例(平均年齢59歳(4176歳),男3例女3例,胃癌5例腹部食道癌1例,胃切除後経過年数平均24.3年(1241年),初回手術対象は全例良性胃十二指腸潰瘍, B-I再第3例B-II再建3例).並びに対照として亜全摘ないし全摘された切除胃20例を用い表層粘液層を検討した.結果)対照群の表層粘液層の厚さは幽門粘膜21.0±10.0μm,胃体部粘膜54.4±26.1μmであった.表層粘液層はGOCTS陽性の表層粘液細胞型粘液とPCS陽性の腺粘液細胞型(噴門腺ー副細胞ー幽門腺型)粘液による数層十数層の層構造を示した残胃では6例全例に吻合部近傍の逆流性胃炎が見られた.表層粘液層は対照群の胃体部粘膜に部位がほぼ一致する吻合近傍において46.0±12.5μm,胃体上部で71.0±37.7μmと対照群と有意差の無い厚さの粘液層が見られた.一方,表層粘液層は吻合部に近づくにつれ菲薄化し吻合部で途絶する所見が認められた.組織化学的に粘液層は対照と同じく2種の粘液の多重層構造を示したが,腺萎縮の見られる吻合近傍でPCS陽性粘液の比率が減少していた.実験研究:雑種成犬24匹に胃切除BillrothII法再建術を行い,術後1週, 2カ月, 6カ月の群分けを行い, BrdU1g静注60分後に屠殺し臨床例と同様の検討並びにBrdU染色による細胞動態の解析を行った.結果および結論)術後早期には吻合部近傍の粘液産生細胞(特に腺粘液細胞)の増殖は促進しており,活発な粘液産生が見られたが粘液層は菲薄であった.経時的に腺は萎縮に傾き,細胞分裂は正常化し充分な厚さの粘液層が見られた.結論)残胃において表層粘液層が組織学的に第認され, 2種の粘液の多層構造を示す事が明かとなった.吻合近傍で粘膜防御能の低下を示す粘液層の菲薄化がみられ残胃逆流性胃炎発生の要因であることが示唆された.吻合部腺粘液細胞は術後早期に増殖し6カ月以上経過して萎縮に傾くことが明かとなった
沖縄の社会福祉に関する歴史的研究

本年度は、文献・史料の収集ならびに収集した文献・史料の分析をおこない、研究成果を論文ならびに報告書としてまとめた。文献・史料の収集は、四国学院大学図書館の協力を得たほか、日本社会事業大学附属図書館、法政大学沖縄文化研究所、琉球大学附属図書館、沖縄県立図書館郷土資料室、浦添市立図書館、浦添市美術館、石川市立図書館、石川市歴史民俗資料館、具志川市立図書館、那覇市立図書館中央図書館、糸満市立図書館、名護市立中央図書館、名護博物館、沖縄市立図書館、沖縄市立郷土博物館、宜野湾市民図書館、などを訪れ、閲覧・複写を行った。収集および分析した史料について、主なものは次のとおりである。1,1950年代沖社協関係資料2,1950年代沖縄群島関係資料3,各市町村史および各市社協関係年史4,社会福祉施設・団体年史5,その他、『琉球史料』『資料沖縄問題』『叢書わが沖縄』など基礎資料文献・資料の分析にもとづいて、戦前の沖縄における窮民救助のしくみとして、罹災救助、県独自の備荒貯蓄、間切共同貯蓄、一般窮民救助などを考察した論文「明治・大正期の沖縄における窮民救助に関する研究」を執筆し、日本社会福祉学会学会誌『社会福祉学』45巻2号に掲載された。文献・資料の分析にもとづいて、1945年から1951年までの沖縄における救済のしくみについて、先行研究の整理とともに独自の考察を行い、報告書『沖縄の社会福祉に関する歴史的研究』を作成、関係研究者・図書館等に配布した。本年度は、文献・史料の収集ならびに収集した文献・史料の分析を主におこなった。文献・史料の収集は、四国学院大学図書館の協力を得たほか、香川県立図書館、高松市立図書館、香川大学附属図書館、岡山大学附属図書館、大阪府立大学総合情報センター、大阪府立大学社会福祉学部資料室、沖縄県立図書館、沖縄公文書館、琉球大学附属図書館、沖縄キリスト教短期大学図書館、沖縄国際大学図書館、沖縄国際大学南島文化研究所、などを訪れ、閲覧・複写を行った。1,占領期に琉球政府厚生局や沖縄社会福祉協議会などから刊行された社会福祉関係の報告書ならびに年史。2,占領期の社会福祉関係の法令ならびに公文書。3,戦前の社会事業関係の法令ならびに公文書。4,戦前に沖縄県から刊行された『沖縄県統計書』(1880年1940年)、『沖縄県勢要覧』(1916年1940年)、『沖縄県歳入歳出決算報告書』(1925年1941年)。5,戦前に沖縄県社会課から刊行された『沖縄県社会事業要覧』1934年版、1935年版。6,『沖縄県史』『沖縄県史料』所収の関連史料。調査および考察した先行研究について、主なものは次のとおりである。1,占領下の沖縄の社会福祉に関する先行研究。2,戦前の沖縄の社会事業ならびに窮民救助に関する先行研究。3,明治期の間切内法に関する史料と先行研究。4,戦前・戦後の模合に関する調査報告と先行研究。5,その他、戦前・戦後の沖縄社会に関する先行研究。
ノックアウトマウスを用いた匂い学習記憶の研究

雌マウスは、交尾刺激を引き金として交尾相手の雄の尿中フェロモンに対する記憶を副嗅球において形成し、妊娠に対する保障を獲得している。副嗅球の中継ニューロンである僧帽細胞は副嗅球に内在する顆粒細胞との間に、樹状突起同士の双方向性シナプスをつくっている。フェロモン受容により興奮した僧帽細胞はグルタミン酸を放出して顆粒細胞を興奮させる。興奮した顆粒細胞はGABAを放出して僧帽細贈を抑制する。われわれは、この僧帽細胞から顆粒細胞への興奮性シナプスこそが可塑性の場であることを種々の角度から示すとともに、最近このシナプスの形態学的変化も捉えた。本研究の目的は、ジーンターゲティング法により特定遺伝子を欠失させたマウスを用いて、この匂い学習記憶の分子メカニズムを明らかにすることであった。副嗅球のメタボトロピックグルタミン酸受容体(mGluR)のサブタイプの一つであるmGluR2を刺激することによって、交尾のときに形成される記憶の特徴を備えた記憶が形成されることをわれわれはすでに示している。そこで、mGluR2欠損マウスの嗅覚情報処理能を野生型マウスのそれと比較検討した。鋤鼻器を電気刺激すると、副嗅球の外叢状層において大きな陰性フィールド電位が記録される。同じ強度のペアパルスで刺激すると、初発に比較して2発目の刺激に対する反応は小さくなる。この現象はペアパルス抑圧(paired-pulse depression)と称し、副嗅球内情報処理機構の主軸をなすものとして重要視されている。野生型マウスに比較してmGluR2欠損マウスのペアパルス抑圧率が有意に小さく、mGluR2がペアパルス抑圧機構に重要な役割を果たしていることが明らかとなった。
初期プラーナ文献のシヴァ神話におけるパールヴァティー像の拡張

1.初期シヴァ教プラーナの代表作である原『スカンダプラーナ』(67世紀成立)中のヴィンディヤ山女神神話サイクル全18章すべての暫定的な校訂テキストとシノプシス(最終版は2008年度に完了、2010年出版予定)を作成した。その3分の2は2004年12月に提出した博士論文の資料部とした。また7世紀までの戦闘女神の成立過程について、この資料の分析を核として博士論文の研究部分にまとめた。この資料はヴィンディヤ山女神神話を詳しく語る最古のものであるが、これまで学会に知られておらず、博士論文はこの資料に基づく初期女神信仰史の再構築を目的とする。2.原『スカンダプラーナ』に登場する女神たちは主として、シヴァ神話においてすべての女神の最高位に位置するシヴァ妃パールヴァティー、ヴィンディヤ山女神等の戦闘女神、動物や鳥の頭などの恐ろしい姿をもつ母神群の三グループに分類できる。同文献中の上記1の資料、第32章のダクシャ神話、第171章後半のコーティーヴァルシャ縁起譚において、この3グループの女神がどのように階層化され、体系化されているかを検討し、その結果パールヴァティーを頂点として、当時民間で進行されていた戦闘女神と母神群という異なる種類の女神たちを彼女の二次的、三次的顕現とする神話の語りを通して包括することで、シヴァ教内に多様な女神信仰を取り込んでいく戦略を明らかにした。3.コーティーヴァルシャはシヴァ教資料から、中世に初期のシヴァ教の主要な聖地の一つであったことが知られている。上記のこの地の縁起譚を叙事詩の関連部分、碑文資料と比較検討した結果、この地方(北ベンガル)で信仰されていたブラフマプトラ河の娘とされる女神が母神タイプの恐ろしい女神として次第にシヴァとパールヴァティーに関連付けられ、パーラ期には信仰の焦点は女神からHetukaと呼ばれるシヴァ/バイラヴァに移行するという、女神信仰がシヴァ教に取り込まれていくおおよその過程を明らかにした。1.原Skandapurana第32章のダクシャ祭祀の破壊神話には,Parvatiから2柱の母神,BhadrakaliとKalakarni(=Mrtyu)が出現するエピソードが含まれる.Bhadrakaliは戦闘女神タイプの美しく猛々しい女神であり,KalakarniはCamundaタイプの醜く怖ろしい女神として描かれる.一方,ヴィンディヤ山女神神話サイクルの中では,Parvatiから戦闘女神タイプのVindhyavasiniが出現し,さらにVindhyavasiniからCamundaタイプの動物・鳥の頭をもつ女神群(母神群)が出現する。この両者の比較から,(1)後者の女神神話サイクルに現れる3グループの女神は,当時既に神話上の存在であったParvatiと,民間の信仰対象であった他の2グループの女神に2大別されること,(2)後者の2グループの女神が,ダクシャ神話では並列されるのに対し,ヴィンディヤ山女神神話サイクルでは戦闘女神を上位として階層化されることが判明した.この階層化がその後の戦闘女神の最高女神化への重要な契機となった思われる.また,第171章後半のKotivarsa-Mahatmyaには,Parvatiの威力の下に男性神たちから標準的な7母神を初めとする母神群が生まれるという,現存最古の7母神誕生神話が語られる.

この母神群のうち,CamundaタイプのBahumamsaは,Kotivarsaの守護女神として,前述の女神神話サイクル中の第3グループの女神(母神群)に含まれている.Bahumamsa以外の,男性神から出現した女神たちはすべて男性神の名から派生した名前をもち,いわば理論的に作られた女神たちと考えられ,ここではCamundaタイプの女神を上位として,男性神に対応する名をもつ理論的な母神群をその下位に位置づける,新たな階層化が行われている.2.以上の成果を含めて,原Skandapuranaのヴィンディヤ山女神神話サイクルの校訂研究を中核とする,これまでの女神研究の成果を博士論文としてまとめて,グロニンゲン大学(オランダ)に提出した.1.原スカンダプラーナ中のヴィンディヤ山女神神話サイクル全18章のうち,未校訂であった60,61,62後半の章について校訂を行った.また,近年新たに獲得されたA系統の3写本につい,同系統の他の4写本と比較し,7写本の相互関係を確定した.2.原スカンダプラーナ第171章後半に含まれるKotivarsa-Mahatmyaについて,Mahabharata, Harivamsaの関連部分,及び碑文資料との比較研究を行った.その結果,以下の点が明らかとなった.(1)Kotivarsa-Mahatmyaにおいて,Kotivarsa(別名Devikota等)の守護女神とみなされるBahumamsaは,Mahabharataに現れるLohita河(ブラフマプトラ河)の娘Lohitayaniを原型とする.Harivamsaに魔神バーナの都(おそらくDevikotaと同定される)の守護女神として現れるKotaviも同女神の別名と考えられる.シヴァ派及び仏教のタントラ文献では,この女神はKarnamotiという名前で知られている.(2)Mahabharataではこの女神はスカンダ神と関連付けられてはいるが,特にシヴァ信仰とは関係せず,またHarivamsaにおいては,バーナの都はシヴァ派の地とみなされているが,Kotavi女神自身がシヴァ派の女神とみなされていた形跡はみつからない.原スカンダプラーナにおいて,この女神ははじめて明確にシヴァ信仰に包摂され,シヴァとパールヴァティーの下位に位置づけられる.また,シヴァがHetukaという名で(おそらくバイラヴァの姿で)この地を守護することが,はじめて述べられる.(3)原スカンダプラーナの改訂版であるRA本及び911世紀の碑文資料によると,この時期にはKotivarsaの信仰の中心は,この地の守護女神からシヴァであるHetukaに移行している.一方タントラ文献では,守護女神の信仰は重要な位置を占め続ける.以上について,10月に東京大学東洋文化研究所で開催された国際タントラ・ワークショップにて,報告を行った.3.原スカンダプラーナの写本のうち,S2,S3,S4の3本について,マイクロフィルムのコンピュータへの画像取り込みを行った.1.原スカンダプラーナ中のヴィンディヤ山女神の神話サイクルのうち、未校訂であった53、54、65章を校訂した。ただし、昨年度から始めた、新しく手に入れたA7写本との校合については、すべての章について終えることができなかった。2.デーヴィーマーハートミャ(DM)の女神神話と原スカンダプラーナ(SP)のヴィンディヤ山女神の神話サイクル,及びこの神話サイクル外の女神関連の神話を比較した結果、DMの中の第3の女神神話に、SPが大きな影響を及ぼしていることが明らかとなった。
ゲルの微細構造を応用した多孔質材料創製

本研究ではゲルの微細なネットワーク構造を固体へ転化する方法により、分離機能性材料の創製法に寄与することを企図した。この基礎段階として主として以下の二点に関して、本研究助成の協力を得、知見を得た。(1)ゲルの固体転化の際に、ゲル母体中での物質移動の移動度(拡散の時定数)を予め把握しておくことは、固体転化のレゾルーションを決定する重要な物理的因子である。ゲル中での物質の自己拡散係数の決定因子は従来殆ど検討されたことがなかったが、ゲル膜内透過実験・ゲル構造観察・ブラウニアンダイナミクス法による計算機実験を平行して行うことにより、ゲル中での自己拡散係数を決定する要因としてゲルのメッシュによる立体障害効果と、ゲル内に存在する電気的チャージによる引力的相互作用の存在を指摘し、更にそれらの間の量的関係を単純なゲルの立法格子モデルを用いて予測した。(2)稀薄領域ではゾル構造をとり、乾燥が進行するに連れてゲル化が進行するような系に、金属アルコキシドを導入し、自発的に形成されるゲルの秩序相構造をテンプレートとして、分子レベルでの分離機能性材料として期待が大きい、無機金属酸化物性ナノポーラス材料を創製することに成功した。従来注目されてこなかったゲル化速度とアルコキシドの加水分解の反応速度の相互相関が構造形成上の有利・不利にどのように影響を与えるかを、乾燥速度や水の転化条件の変化によって明らかにした。その結果、乾燥過程を出来るだけ低温で行い、更に低水含有率で反応を起こすことが重要であることが明らかになった。高温は分子集団であるゲルの形成上不利であり、また、過剰の水はゲル構造の過剰の膨潤を誘引するからである。申請者はゲルの微細構造を化学的手段によって固体ヘと転化することが出来れば分離機能性材料・触媒などに応用できる魅力的な多孔材料を創製出来ると考えた。界面活性剤の分子集合体が形成するゲルにシリコンなどの金属アルコキシドを導入し、自発的に進行する加水分解・縮合重合反応・凝集更には乾燥工程・熱処理によって多孔質材料を得ることができた。それらの材料の多孔構造は反応開始前に指定する界面活性剤の濃度によって影響を受けることが明らかになった。現象論的には界面活性剤濃度が上昇するにつれて多孔構造がより微細化する。当初これは界面活性剤濃度上昇に伴なうゲルネットワーク構造の微細化が直接に凝集、乾燥或いは焼成過程に影響するためと考えられたが、構造形成過程を静的光散乱・動的光散乱によって時系列で追跡したところ、界面活性剤ゲルのネットワーク構造は多孔構造の前駆体構造としての微粒子の径を決定する因子であることが判った。自発形成する金属酸化物微粒子は初期段階ではゲルネットワーク構造による幾何学的拘束をそれ程受けないため衝突を繰り返して成長するが、今回実験的に検討した系では反応開始後約200時間ほどで成長を停止する。この最終粒子径はゲルのネットワーク構造の網目のサイズに関連していると考えられ、網目構造が微粒子の成長に必要な並進運動を幾何学的にブロックする為にある時点で微粒子の成長が停止するとの物理化学的描像を提案した。この知見はゲル構造が静的に転化される固体構造の形態に影響するのではなく、動的側面においてメソポーラス分子鋳型として機能することを示している。
ラット肝脂肪酸結合蛋白に見いだされた新しい翻訳後修飾とその生理的意義

脂肪酸結合蛋白は長鎖脂肪酸の細胞内転送に関わるものと考えられているが、この蛋白質が等電点電気泳動などで多数の分子種に分離されることから、翻訳後の修飾が多型の原因となっているとともに、これが機能と密接な関係にあること予想された。我々はラット肝脂肪酸結合蛋白について、今回アラキドン酸を特異的に結合しているもっとも酸性な分子種は、アスパラギン105がイソアスパラギン酸となった新規の修飾であることを構造解析の結果同定した。また、この修飾をうけた蛋白質のリガンド結合能・プロテアーゼ感受性などの機能変化を検討し、その生理的意義の解明とこの翻訳後修飾反応に関わる細胞内因子の検索をおこなった。まず、試験管内でのイソアスパラギン酸の生成を試み、0.5M炭酸ナトリウム緩衝液中で保温するとイソアスパラギン酸105をもつ分子種が高収率で生成することがわかった。蛋白質の内部で生じるこのイソアスパラギン酸結合の検出のためメチル化とLiBH_4による還元でこれをイソホモセリンとして同定する方法を考案し、さらに、PTC化による高感度化を検討し一定の成果をえた。また、この蛋白質を細胞内因子検索のための基質とするため抗体を作成し、等電点電気泳動とウェスタンブロットの組み合わせによる検出方法を確立した。また脂肪酸をはずした蛋白質を炭酸イオン存在下で保温すると別の酸性の分子種が定量的に生成することが観察された。この分子種を分取し構造解析した結果、N末端から2番目のアスパラギンが脱アミドしたものであることが明らかになり、リガンド結合と脱アミド反応との関連を示唆する結果を得た。一方、ラット肝脂肪酸結合蛋白のシステイン69に遊離のシステインが混合ジスルフィドを形成した新しい分子種を見いだし、機能の解析を行った。また、ラット皮膚から新規に単離した脂肪酸結合蛋白質は分子内に5個の半シスチン残基をもつこれまでに見られないものでSS結合と脂肪酸結合能との関連を検討した。ラット肝脂肪酸結合蛋白にはイオン交換クロマトグラフィや電気泳動で分離される、多数の分子種の存在することを明らかにしてきたが、最近、アスパラギン105が脱アミドし続くグリシンとのペプチド結合がβカルボキシル基へ転位したイソアスパラギン酸105をもつ蛋白を見い出した。この酸性の分子種がアラキドン酸をはじめとする高度不飽和脂肪酸に対し、より高い親和性をもつため、この一般には自発的に起こると考えられていた、脱アミド・ペプチド転位反応が、生理的に意味のある翻訳後修飾である可能性が示された。本研究では、この可能性を検討するため、肝実質細胞にこの反応を触媒・促進する蛋白性の因子の存在を検索することを目的とした。この脱アミド、ペプチド転位反応の追跡を可能とするために、イソアスパラギン酸をもつ蛋白の高感度検出定量法の検討をおこなった。また、この分子種の脂肪酸に対する親和性、タンパク質分解酵素に対する感受性などを定量的に検討するため、イソアスパラギン酸105をもつ分子種を試験管内で生成させることを試みた。電気泳動後ウェスタンプロットによりイソアスパラギン酸をもつ分子種の検出を検討した。また、イソアスパラギン酸をメチルエステル化し水素化ホウ素リチウム環元によりイソホモセリンに導き、塩酸加水分解後アミノ酸分析による定量を試みた。いずれも、さらに若干の改良を必要とするが、充分目的に合致することが示された。様々な条件を検討した結果、イソアスパラギン酸105をもつ分子種は、炭酸イオン存在下37°Cで保温することにより、定量的に生成することが明らかになった。

また、この過程で、さらに酸性の分子種の生成が見いだされた。これは構造解析からアスパラギン2が脱アミドしたものと考えられ、最近発見された、プロテインN-末端アスパラギン脱アミド酵素の反応が非酵素的にも起こりうることを示しており大変興味深い。また、脂肪酸など疎水性のリガンドが結合した蛋白は、タンパク質分解酵素に対し強い抵抗性を示すのに対し、脂肪酸結合蛋白そのものは容易に分解されることを発見した。この現象は細胞内の生理的条件とタンパク質代謝との関連を示唆しており、今後更に検討したい。Asn-Gly結合において、アスパラギンが脱アミドするとともに,C末端側のグリシンとのペプチド結合がβカルボキシル基へ転位する反応は、従来水晶体・赤血球・硬組織など生合成されてから、長時間代謝されない蛋白質に見られる自発的で非酵素的な過程と考えられてきた。われわれは、ラット肝脂肪酸結合蛋白質のアラキドン酸を結合する分子種のAsn-Gly(105-106)にこの転位を見いだした。この蛋白質の半減期は三日程度であり、研究者によっては10倍に及ぶ日内変動があるとされている。このように活発に合成され、かつ分解されている蛋白質にこの種の修飾がみいだされたことは、これが生理的にも意義のあるプロセスであることを強く示唆している。また、細胞内ではこの修飾をなんらかの因子が加速しているはずである。本研究ではこの観点からこの修飾の生理的意義の解明とそれに関わる細胞内因子の検索を目的とした。まず蛋白質の内部で生じるこの結合の検出のためメチル化とLiBH4による還元でこれをisohomoserineとして同定する方法を開発した。またこの検出の高感度化のため、phenylisothiocyanteによる誘導体化を検討し一定の成果をえたが、更に分析条件を検討している。また、この蛋白質を細胞内因子検索のための基質とするため抗体を作成し、等電点電気泳動とウェスタンブロットの組み合わせによる検出方法を確立し、実際に細胞質画分に応用した。また、別の修飾された脂肪酸結合蛋白の分子種を見いだし、その修飾の本体を明らかにすると共に今回の修飾との機能的関連を検討した。
生体軟組識の力学的性質と構成法則に関する研究

1.家兎膝蓋腱の力学的性質に及ぼすひずみ速度の影響家兎膝蓋腱の高速引張試験を行い,その力学的性質に及ぼすひずみ速度の影響について検討を行った。ひずみ速度が約2000倍に増大すると,弾性係数は変化しなかったが,引張強度は50%,破断伸びは70%増大した。以上の実験結果から,膝蓋腱の力学的性質に及ぼすひずみ速度の影響は比較的小さいことがわかった。2.負荷の増減による腱および靭帯の力学的性質の変化膝蓋骨と脛骨結節の間にポリエステル製の人工靭帯をかけて,家兎の膝蓋腱に作用する荷重を正常の約30%に減少させた。以上の手術を施した家兎を一定期間飼育した後,膝蓋腱の力学的強度を測定した。引張強度や弾性係数はかなり低下し,引張強度は6週後には正常群の約50%になった。しかし断面積が増大したので,膝蓋腱全体が破断するときの荷重(最大荷重)は変化せず,正常なレベルに維持されていた。膝蓋腱または前十字靭帯の一部を切除して断面積を減少させることにより,負荷(応力)を増大させて、その力学的強度に及ぼす負荷の増大の影響について検討を行った。膝蓋腱では,弾性係数,引張強度,破断伸びなどの材料特性に変化は現れなかったが,断面積が増大したので腱全体が破断するときの荷重は増大した。一方,前十字靭帯では,作用する負荷を正常の1.31.5倍に増大させても材料特性や断面積に変化は現れず,また48倍に増大させると弾性係数と断面積がかなり減少した。以上の実験結果から,膝蓋腱はある程度の力学的環境の変化に対しては断面積や材料特性を変化させることにより適応することができるが,前十字靭帯は負荷の増大に対して十分に適応することができないと考えられる。
熱帯アフリカ産樹木抽出成分の化学特性及び有用生理機能の解明

昨年度までに高い抗酸化能を示すことが明らかにされたガーナ産樹木(Denya)心材の70%アセトン水抽出物を溶剤分画して検定を行ったところ、酢酸エチル可溶部に高い活性が確認された。酢酸エチル可溶部から2つの抗酸化成分(isookanin及びokanin)を単離同定した。これらの物質は共に抗酸化成分として知られている緑茶カテキンよりも高い活性を示すものであった。Denyaからはカテキンとほぼ同等の抗酸化能を有する縮合型タンニンオリゴマーの存在も明らかにした。また、昨年度までに木材の白色腐朽菌(カワラタケ)に対して高い抗菌活性を示すことが明らかにされたタンザニア産樹木(Commiphora mollis)心材のメタノール抽出物から、二つの抗菌性成分(isosakuranetin及びsakuranetin)を単離同定した。これらの化合物は、共に分子中のフェノール性水酸基の一つがメチル化されたフラボノイド化合物である。同樹木心材の抽出物からは、フェノール性水酸基がメチル化されていないフラボノイド化合物も多く見出されたが、これらはいずれも抗菌性を示さなかった。従って、フェノール性水酸基のメチル化が抗菌性に大きく寄与していることが示された。さらに、これまでにアフリカ産樹木心材から単離されたフラボノイド化合物の抗酸化能を比較・検討した結果、2個の隣接するフェノール性水酸基(カテコール型)の存在が活性に大きく寄与することを明らかにした。以上の結果を含み、全研究期間で得られた成果を基に現在、4報の研究論文を纏めているところである。また、これまでに単離された化合物のメラニン色素生成阻害作用及び男性ホルモン過多症に関与する酵素(5α-リダクターゼ)阻害活性については、引き続き検討を行う。ガーナ産樹木3種、タンザニア産樹木6種及び南米産樹木1種の木材試験片を入手し、試料とした。試料をウィリーミルで粉砕し、0.5mmスクリーン通過分の木粉を調製した。ガーナ産樹木(Dahoma、Wawabima、Essia)及び南米産樹木(Ipe)の4種の試料木粉を70%アセトン水及びメタノールで抽出し、抽出物重量を測定するとともに、Folin-Ciocalteu法により抽出物中のポリフェノール量を定量した。抽出物量、ポリフェノール量ともに、70%アセトン水抽出物の方がメタノール抽出物より高い値を示した。Dahoma、Wawabima、Essia及びIpe材の70%アセトン水抽出物量は各々、材重量に対して11.26、4.18、13.40及び13.37%であった。また各々の材中のポリフェノール含有量は、各々4.75、1.56、3.18及び3.24%であった。4種の70%アセトン水抽出物の木材白色腐朽菌(カワラタケ)に対する抗菌性試験を行ったところ、Dahoma及びIpe材抽出物に活性が認められた。次にDahoma及びIpe材の70%アセトン水抽出物をn-ヘキサン、酢酸エチル及び水で分画し、ヘキサン可溶画分、酢酸エチル画分及び水可溶画分を得た。各画分の抗菌性試験を行ったところ、Dahomaの水可溶画分及びIpeの酢酸エチル画分に強い活性が認められた。現在、強い活性が認められた上記2画分中の活性成分本体を精査中である。上記10種の樹種の他に17種のガーナ産材をガーナ森林局より入手した。現在、木粉試料を調製中である。これまでに調製した22種のアフリカ産樹木(ガーナ産16種、タンザニア産6種)の心材メタノール抽出物の生理機能性(抗菌性、抗酸化性、チロシナーゼ阻害活性、メラニン色素生成制御活性)の検定を行った。抗菌性は、白色腐朽菌(カワラタケ)に対する生育阻害を測定して検定した。抗酸化性は、DPPH(ジフェニルピクリルヒドラジル)のラジカル消失率を測定することによって検定した。チロシナーゼ阻害活性は、抽出物存在下でジヒドロキシフェニルアラニンから着色物質が生成する速度を測定することによって検定した。メラニン色素生成制御活性は、抽出物を添加してB16メラノーマ細胞を培養した時のメラニン色素生成量を測定することによって検定した。以上の検定により、チロシナーゼ阻害活性を示す樹種1種(Odum)、抗酸化能を示す樹種2種(Denya、Emire)、抗菌性を示す樹種2種(Commiphola mollis、Mailkara discolor)、メラニン色素生育促進活性を示す樹種1種(Nesogordona parviflora)を選別した。Odum心材メタノール抽出物のチロシナーゼ阻害活性は非常に高く(阻害率96.0%)、市販のチロシナーゼ阻害剤であるコージ酸(93.7%)を上回った。抽出物中の主成分であるChlorophorinがチロシナーゼ阻害活性有効成分であった。Denya及びEmire心材メタノール抽出物は粗抽出物であるにもかかわらず、茶葉の抗酸化成分であるカテキンと同等あるいはそれ以上の高い抗酸化活性を示した。抗酸化活性成分として、2種のフラボノイド化合物、1種のカルコン化合物及びガリック酸三量体を単離同定した。C.mollis心材抽出物からは、抗菌性成分として3種のフラバノン化合物を単離同定した。N.parviflora心材抽出物はメラニン色素の生成を促進するだけでなく、細胞毒性を全く示さなかった。

昨年度までに高い抗酸化能を示すことが明らかにされたガーナ産樹木(Denya)心材の70%アセトン水抽出物を溶剤分画して検定を行ったところ、酢酸エチル可溶部に高い活性が確認された。酢酸エチル可溶部から2つの抗酸化成分(isookanin及びokanin)を単離同定した。これらの物質は共に抗酸化成分として知られている緑茶カテキンよりも高い活性を示すものであった。Denyaからはカテキンとほぼ同等の抗酸化能を有する縮合型タンニンオリゴマーの存在も明らかにした。また、昨年度までに木材の白色腐朽菌(カワラタケ)に対して高い抗菌活性を示すことが明らかにされたタンザニア産樹木(Commiphora mollis)心材のメタノール抽出物から、二つの抗菌性成分(isosakuranetin及びsakuranetin)を単離同定した。これらの化合物は、共に分子中のフェノール性水酸基の一つがメチル化されたフラボノイド化合物である。同樹木心材の抽出物からは、フェノール性水酸基がメチル化されていないフラボノイド化合物も多く見出されたが、これらはいずれも抗菌性を示さなかった。従って、フェノール性水酸基のメチル化が抗菌性に大きく寄与していることが示された。さらに、これまでにアフリカ産樹木心材から単離されたフラボノイド化合物の抗酸化能を比較・検討した結果、2個の隣接するフェノール性水酸基(カテコール型)の存在が活性に大きく寄与することを明らかにした。以上の結果を含み、全研究期間で得られた成果を基に現在、4報の研究論文を纏めているところである。また、これまでに単離された化合物のメラニン色素生成阻害作用及び男性ホルモン過多症に関与する酵素(5α-リダクターゼ)阻害活性については、引き続き検討を行う。
マグネタイトコロイド希薄懸濁液の磁場下での分光学的挙動の解明と分子認識への応用

マグネタイト微粒子(径10mmに程度)にオレイン酸等の脂肪酸を付着させ溶液に分散させたものを磁性流体というが、この磁性硫体をさらに10100倍希釈した溶液に磁場(1.1T)を加えた場合の磁気複屈折性を調べた.このマグネタイト希薄懸濁液の磁場に誘起される複屈折性が、各磁性硫体粒子のクラスター生成に起因すると仮定すると、溶液内で平均1.3個の粒子が磁場方向へクラスターを作って配列することを、吸光法から明かにした。一方こうした硫性流体溶液へ様々なケイ光分子を共存させると、硫性流体コロイドの磁場に対する挙動の変化によって、特定のケイ光分子も偏光性のあるケイ光を発することを見い出した。すなわちコロイド粒子と親和性の高い分子は、クラスター形成に伴って特定の配向をもつのに対し、親和性の低い分子は溶液内を自由運動する。この差によって分子の特定の構造を認識することを研究の最終目的とする。この研究目的には、分子認識に活用できる磁性流体用の活面活性剤の検討も含まれる。市販の脂溶性磁性流体(活面活性剤:オレイン酸、エリカ酸、ステアリン酸)及びオレイン酸の上へ第二層としてポリエチレングリコールラウリルエーテルをのせて水溶性にした磁性流体を研究室で試作した。A^+_rレーザーの488nmの発振線を光源として12種類のケイ光色素の挙動を調べた。又印加磁場によるケイ光強度変化は、溶媒、磁性流体濃度に対して最適条件を検討した。この結果自作した水溶性磁性流体を用いた場合、ローダミン骨核をもつケイ光色素が大きく変化することを見い出した。特にKiton Red620は硫場と平行の偏光ケイ光が、硫場を加えない時の2.5倍以上に増大した。この偏光ケイ光の強度変化は、ローダミン核につく炭素鎖の長さと対応していることがわかった。ケイ光のスペクトル変化はそれ程認められなかった。
竹炭砥石の開発に基づくシリコンウエハのナノレベル鏡面研磨

地球環境の保全と資源の有効活用が現在ほど叫ばれた時代は無い.この問題に対して天然資源を有効に活用した炭砥石を開発し,シリコンウエハの研磨加工の可能性を見出した.炭は容易に粉砕でき微細化でき,数μm程度の大きさになると寸法効果により破砕は起こりにくくなる傾向を示した.同時に破砕を繰り返し細かくなっていっても,形状のシャープさが保持される特長を示した.この2つの性質(破砕しにくさ,破面の鋭利さ)を有する炭を砥粒とし,天然資源のゼラチン(結合材)と混合させ,ペレット状に成形した.これを単一炭砥石として縦型平面研削盤に装着しシリコンウエハの研磨を実施したところ,数ナノレベルの鏡面仕上げに成功した.シリコンウエハの研磨加工用の炭砥石の開発を行った。炭は明治時代から研磨剤としての可能性が指摘されてきた。本研究では現在の精密研削盤に適用可能な炭砥石を製作し、シリコンウエハの研磨加工を実施っした。特に炭には竹炭を用い、パウダー状まで粉砕させ砥粒(研磨材)とした。この炭砥粒をゼラチンで焼き固め、固定砥石を製作した。この砥石を研削盤に装着し、6インチのシリコンウエハを加工したところ粗さが2ナノレベルまで鏡面することができた。これによりエッチング加工に代わる研磨加工が可能になった。地球環境の保全と資源の有効活用が現在ほど叫ばれた時代は無い.この問題に対して天然資源を有効に活用した炭砥石を開発し,シリコンウエハの研磨加工にその可能性を見出した.炭は容易に粉砕でき微細化が図れるが,ある程度に小さくなると寸法効果により破砕は起こりにくくなる傾向を示した.同時に破砕を繰り返し細かくなっていっても,形状のシャープさが保持される特長を示した.この2つの性質(破砕しにくさ、破面の鋭利さ)を有する炭を砥粒として用い、これに天然資源のゼラチン(結合材)とを混ぜ、ペレット状に成形したものを単一炭砥石として製作し、これを縦型平面研削盤に装着しシリコンウエハの研磨を実施したところ,数ナノレベルに研磨ができた。以下の理由で、区分を当初計画以上に進展していると判断した。(a)工具全体が天然資源から成る炭砥石を試作した。(b)シリコンウエハの表面研磨を行ったところ、エッチングのによるレベルには劣るが数ナノレベルに到達できた。(c)加工後の切り屑にシリコンが含まれており、機械的除去作用がみとめられた。(d)炭は粉砕時間の経過で小さくなるが,その後粒径は一定値に近づくようになる.しかも炭は破砕(細かくなる)を繰り返しても,そのシャープさが保持される.地球環境の保全と資源の有効活用が現在ほど叫ばれた時代は無い.この問題に対して天然資源を有効に活用した炭砥石を開発し,シリコンウエハの研磨加工にその可能性を見出した.炭は容易に粉砕でき微細化が図れるが,ある程度に小さくなると寸法効果により破砕は起こりにくくなる傾向を示した.同時に破砕を繰り返し細かくなっていっても,形状のシャープさが保持される特長を示した.この2つの性質(破砕しにくさ,破面の鋭利さ)を有する炭を砥粒として用い,これに天然資源のゼラチン(結合材)とを混ぜ,ペレット状に成形したものを単一炭砥石として製作した.粉砕した平均炭粒子径は,長径:4.1μm,短径:2.5μmであり,製作したペレット状炭砥石は,外形寸法φ8mm×14mm,密度0.55 g/cm^3,ヤング率1.1×10^8 Pa,硬さが36.8N(デュロメータ使用)であった.実験は,縦型平面研削盤に装着しシリコンウエハの研磨を実施した.このとき,押し込み速度を50150um/min,スピンドル回転数10003000/minと変えて実施したところ,2000/min以上で数ナノレベルの鏡面仕上げに成功した.このとき,シリコンウェハ表面を洗浄後X線光電子分光法(XPS)で調べたところ, SiO2以外の化合物は見当たらず,シリコンウェハ表面での生成物形成は見られないかった.また,EPMA(日本電子(株))により加工くずの定量分析を行ったところ,シリコンの存在が確認できたことから,炭砥石による研削現象を確認した.地球環境の保全と資源の有効活用が現在ほど叫ばれた時代は無い.この問題に対して天然資源を有効に活用した炭砥石を開発し,シリコンウエハの研磨加工の可能性を見出した.炭は容易に粉砕でき微細化でき,数μm程度の大きさになると寸法効果により破砕は起こりにくくなる傾向を示した.同時に破砕を繰り返し細かくなっていっても,形状のシャープさが保持される特長を示した.この2つの性質(破砕しにくさ,破面の鋭利さ)を有する炭を砥粒とし,天然資源のゼラチン(結合材)と混合させ,ペレット状に成形した.これを単一炭砥石として縦型平面研削盤に装着しシリコンウエハの研磨を実施したところ,数ナノレベルの鏡面仕上げに成功した.シリコンウエハの鏡面加工ができた。粗さは2ナノメートル程度であり、加工時間は5分程度で到達できた。砥粒加工学会誌(2015年2月号)に掲載された。昨年度までは、6インチシリコンウェハについて、炭による鏡面加工を実現した。今後は、現在主流の10インチ以上のウェハに対して鏡面研磨を可能にする。

工学・加工後のシリコンウエハのダメージ評価。・ガラス研磨への適用・実用化砥石としての評価小口径シリコンウェハの研磨機を使用予定であったが、現在の主流が大口径ウェハの研磨に変化している。また、製作している砥石の性能がやや満足できるものではなかった。そこで、研究の発展性を考慮し、無理に本年度使用せず、次年度の砥石製作消耗品費および大口径シリコンウェハ研磨用機械使用料として効率的に利用するため次年度に繰り越した。発注したが物品の在庫ないことが、年度末にわかり、購入ができなかった。大口径シリコンウェハ研磨用機械使用料(1利用約5万円)購入予定の品を変更予定
自然選択の影響を受けた遺伝子に着目した病原体と宿主との相互作用の解明

未だに感染症は人類にとって脅威でありながら、病原体の感染メカニズムや感染症の重症化要因についてはほとんどわかっていない。病原体と相互作用を示す分子の遺伝子は、遺伝子欠損などの特徴的な遺伝子配列を示す場合がある。そこで本研究では、機能未知かつ特徴的な遺伝子配列を示す分子は病原体と相互作用する可能性は高いと考え、様々な病原体と宿主分子との相互作用を網羅的に調べた。その過程において、特定の活性化レセプターが細菌感染によって分解された宿主タンパク質を認識する事が明らかとなった。この結果は、活性化レセプターによって細菌の侵入を感知する宿主の新たな生体防御機構が存在することを示唆している。病原体と相互作用を示す分子の遺伝子には自然選択の影響を受けて欠損型などの機能的な差異が存在することが多い。本研究ではこの点に着目して、遺伝子多型として機能的な差異が存在する分子の組換えタンパク質(Ig融合タンパク質)を作製し、様々なウィルス感染細胞および細菌・原虫との結合性を調べ、宿主分子と相互作用する病原体分子の同定を試みた。その結果、特定の活性化型レセプターが細菌感染細胞に結合することが見出された。免疫沈降法および質量分析により細菌感染細胞上に発現するリガンドを同定したところ、予想に反して宿主由来の分子であった。さらに、ウェスタンブロッティングによって細菌感染細胞上のリガンドを調べたところ、活性化型レセプターが認識するリガンドは細菌プロテアーゼによって切断された宿主分子であることが明らかとなった。また、活性化型レセプターが発現するNFAT-GFPレポーター細胞を作製してintactなリガンドおよび細菌と共培養すると、レポーター細胞が活性化されGFPの発現が誘導された。実際に細菌をマウスに感染させると、in vivoにおいても宿主分子は細菌プロテアーゼによって切断され、その分解産物と活性化型レセプターが相互作用することが明らかとなった。ある種の細菌は宿主の免疫から逃れるためにプロテアーゼによって宿主分子を切断するような免疫逃避機構を保有していることが知られている。本研究の結果は、このような細菌の免疫逃避機構の分解産物を宿主の活性化型レセプターが認識することで、細菌に対する生体防御機構として働いている可能性を示唆している。その結果、特定の活性化型レセプターが細菌プロテアーゼによって切断された宿主分子をリガンドとして認識することが明らかとなった。実際に細菌をマウスに感染させると、in vivoにおいても宿主分子は細菌プロテアーゼによって切断され、その分解産物に活性化型レセプターが結合することが明らかとなった。肺炎球菌が原因の中耳炎患者由来の膿汁中のリガンドをウェスタンブロッティングにより調べたところ、リガンドが切断されている事が明らかとなった。また、リガンドに結合するとGFPが発現するようなレポーター細胞と膿汁を共培養すると、レポーター細胞は活性化レセプターを介して活性化した。このことから細菌感染局所で活性化レセプターは細菌によって壊されたリガンドを認識し、細菌の侵入を感知して生体防御反応に関わっていることが示唆される。ヘルペスウィルスやマラリア原虫などに加えて様々な細菌・ウィルス感染細胞に関して、Ig融合タンパクの結合性をフローサイトメトリーにより網羅的に解析したところ、特定の活性化型レセプターが細菌感染細胞に結合することが見出された。さらに、免疫沈降法および質量分析を行ったところ、細菌感染細胞上に発現するリガンドを同定した。

また、細胞レベルで活性化型レセプターがリガンドを認識できるかどうかを調べるために、活性化型レセプターが発現するNFAT-GFPレポーター細胞を作製して、プレートに固相化したリガンドおよび細菌と共培養すると、レポーター細胞が活性化されGFPを発現することが明らかになった。一方で、活性化型レセプターのリガンドへの結合およびレポーター細胞によるリガンドの認識は細菌非感染では認められなかった。これらの結果は同定した活性化型レセプターがリガンドを介して細菌と相互作用する事を示唆し、これまでに明らかにされていなかった新たな生体防御機構の存在が考えられる。平成24年度に、細菌に対するヒト活性化型レセプターのリガンドの同定を行い、その結果を基に細菌に対する生体防御機構の解明を行う予定であったが、予想外にも細菌のタンパク分解酵素によって壊された宿主分子がリガンドとなる可能性が生じたため、新たに細菌のタンパク分解酵素の精製が必要となった。このため、当初の計画通りに十分に進める事ができなかった。平成23年度は様々な組換えタンパク質(Ig融合タンパク質)を作製し、様々なウィルス感染細胞および細菌・原虫との結合性を調べ、リガンドを同定することを計画していたが、Ig融合タンパク質の精製後にタンパク質が分解してしまうという現象がみられたため、保存方法等の検討に時間がかかった。そのため、様々な種類のIg融合タンパク質を作製することができなかった。また、Ig融合タンパク質を作製することができた特定の活性化型レセプターが細菌感染細胞に結合することを見出し、リガンドの同定まで行うことはできたが、その分子メカニズムまで明らかにすることができなかった。本研究で同定した活性化型レセプターは単球、マクロファージ、好中球などに発現しているので、これらの細胞をリガンドで刺激する事によりどのような免疫応答を示すのかを調べる。さらに、細菌をマウスに感染させることで活性化型レセプターを介した免疫応答をin vivoの面から解析する。平成23年度に同定した活性化型レセプターが細菌感染によってどのようにリガンドを認識するようになるのかの分子メカニズムに関して、ウェスタンブロッティングや遺伝子変異導入法により明らかにする。また、本研究で同定した活性化型レセプターは遺伝子型による機能的な差異が存在している。遺伝子型によってリガンド認識が異なるのかをNFAT-GFPレポーター細胞を用いて明らかにし、当初の研究計画通りに推進する。細菌に対する生体防御機構の解析を行うための消耗品として、組換えタンパク質の作製に必要な試薬、器具、病原体分子を同定するための質量分析等、機能解析するための細胞培養液、器具、DNA実験に必要な試薬等が必要である。研究を進めていく過程でタンパク質の分解などの予定外の問題が生じ、その検討に時間がかかったため当初の見込み額と執行額は異なったが、研究計画に変更はなく、前年度の研究費も含め、当初予定通りの計画を進めていく。本研究では、下記に列記するような各種試薬、培養器具等が必要である。