hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
ランダムリボザイム法によるマーモセットES細胞の分化誘導関連遺伝子同定と解析

小型霊長類コモンマーモセットのES細胞培養系において初期分化に関わる遺伝子群の検出を試みた.まず,ランダム発現制御ライブラリーの未導入の条件下では,ES細胞継代培養520日の間に胚様体形成後,赤血球,ニューロンへの分化を示す色調,形態の変化を認めるコロニーが発生を観察した.血球系に分化したと思しきコロニー群で初期分化に関わる遺伝子群を探索し,Tall/scl geneの発現が分化誘導に関わる知見を得た.さらにレンチウイルスベクター発現系を用いてこのTall/scl geneを強制発現させることで効率的にES細胞に血球系分化を促せることを確認した(投稿中).一方,胚様体形成後神経様細胞に形態変化した細胞はコロニー系性能が低く,単離解析が困難であった.また,表面抗原の探索でも,神経系特異的なマーカーの発現確認には至らなかった.ランダム発現制御ライブラリーの導入によりES細胞の分化を追跡する実験では,ライブラリーの安定した導入,発現が得られず,一定の知見が得られなかった.そこで,全く別の観点からのES分化誘導も試みた.細胞分化の際にtelomerase発現が低下するという報告があることに着目して,telomerase阻害剤存在下でES細胞培養を行い,発生したコロニーのアルカリフォスファーターゼ発現により分化が促進されるかどうかを確認したが,予想に反して,分化は抑制される傾向にあった.また,マウス胎児脳を直接解析し,神経系の分化,発達にゲノム構造変化が伴う可能性を示唆する知見を得ることができた.(in press)小型霊長類コモンマーモセットのES細胞培養系において初期分化にかかる遺伝子群の検出を試みている.まずランダム発現制御ライブラリー未導入の条件下で,継代培養中にES細胞のいくつかが血球系もしくは神経細胞への分化を思わせる形質変化を示すかどうかを追跡している.培養5日から20日の間に胚様体形成後,赤血球やニューロンへの分化を思わせる,色調,形態の変化を認めるコロニーの発生を認め,これらについて血球系,神経系の初期分化において発現するとされる一連の遺伝子群の同定を進めている.神経系の分化を思わせる細胞群は,ニューロンの形態を思わせる様な紡錘形の細胞体様構造から細胞質の一部が軸索様に細長く伸びる細胞である上に,他の紡錘形細胞に軸索様構造物がanchoringしているように伺える像があるが,コロニー形成能が低く,当該細胞群のみを単離解析するには至っていない.一方,血球系分化方向を伺わせる細胞群では,CD34,GATA2,c-kitなどの発現を確認しているが,これ以外の遺伝子について,これまでヒトや他の霊長類,げっ歯類などから得られた知見から,すでに発現するとされている遺伝子群の発現は必ずしも確認できておらず,現行のES細胞培養条件下での分化は不完全なもので,さらにいくつかの遺伝子群が発現することがin vivoでの分化の再現に必要であると考えられた.これは,初期分化段階で発現するとされる遺伝子群の発現を更に上流で制御している上位の遺伝子発現を誘導することで達成される可能性があると考えられる.小型霊長類コモンマーモセットのES細胞培養系において初期分化に関わる遺伝子群の検出を試みた.まず,ランダム発現制御ライブラリーの未導入の条件下では,ES細胞継代培養520日の間に胚様体形成後,赤血球,ニューロンへの分化を示す色調,形態の変化を認めるコロニーが発生を観察した.血球系に分化したと思しきコロニー群で初期分化に関わる遺伝子群を探索し,Tall/scl geneの発現が分化誘導に関わる知見を得た.さらにレンチウイルスベクター発現系を用いてこのTall/scl geneを強制発現させることで効率的にES細胞に血球系分化を促せることを確認した(投稿中).一方,胚様体形成後神経様細胞に形態変化した細胞はコロニー系性能が低く,単離解析が困難であった.また,表面抗原の探索でも,神経系特異的なマーカーの発現確認には至らなかった.ランダム発現制御ライブラリーの導入によりES細胞の分化を追跡する実験では,ライブラリーの安定した導入,発現が得られず,一定の知見が得られなかった.そこで,全く別の観点からのES分化誘導も試みた.細胞分化の際にtelomerase発現が低下するという報告があることに着目して,telomerase阻害剤存在下でES細胞培養を行い,発生したコロニーのアルカリフォスファーターゼ発現により分化が促進されるかどうかを確認したが,予想に反して,分化は抑制される傾向にあった.また,マウス胎児脳を直接解析し,神経系の分化,発達にゲノム構造変化が伴う可能性を示唆する知見を得ることができた.(in press)
大脳辺縁系における異種感覚情報の統合機構

本研究では,異種感覚の統合における大脳辺縁系の役割を明らかにするため,サル海馬体およびラット視床背内側核(MD)からニューロン活動を記録し,外界の各種感覚刺激に対するニューロンの応答様式を解析した。I.サル海馬体における空間(場所)-対象物の包括的認知機構i)場所を条件とし,多数の情報の符号化が必要とされる条件連合課題(場所依存性条件連合課題:PCA課題),およびii)場所を条件としない,比較的少数の情報の符号化だけが要求される条件連合課題(場所非依存性単純条件連合課題:ISA課題)遂行中の海馬体ニューロンの応答性を比較・解析した。その結果,サル海馬体の応答ニューロンは,i)PCA課題に選択的に応答し,自発放電頻度が低く,応答潜時が長いニューロン群(67%)と,ii)課題選択性がなく自発放電頻度が高く,応答潜時が短かいニューロン群(33%)に分類された。同一物体で同一の連合課題(Go/Nogo課題)を用いているにも関わらず,PCA課題に選択的に応答する海馬体ニューロンの存在は,場所と対象物体の連合,および情報の符号化における複雑性が海馬体ニューロン応答の重要な支配因子となることを強く示唆する。このことは,海馬体神経回路網ににおけるニューロンの機能的分化(錐体ニューロンvs抑制性介在ニューロン)を示唆する。II.ラット視床背内側核ニューロンの異種感覚統合機構ラットMDからニューロン活動を記録し,1)単一の感覚刺激からなる要素条件刺激,および2)要素条件刺激の組み合わせにより,要素条件刺激とは報酬随伴性が逆転する構成条件刺激を用いて,条件刺激-強化刺激連合学習課題に対するMDニューロンの応答性を解析した。本課題では,ラットは,条件刺激を認知し,条件刺激終了時に口直前に突き出されたチューブを舐める(リック)ことにより,報酬性非条件刺激(蔗糖液,脳内自己刺激)は獲得し,嫌悪性非条件刺激(電気ショック)は回避することができる。その結果,MD内側部には報酬と連合した感覚刺激の認知,および感覚刺激と報酬の連合形成に関与するニューロンが,MD外側部には行動学習(リック運動)に関与するニューロンが局在することが明らかになった。これまでの神経生理学ならびに神経解剖学的な所見を考慮すると,扁桃体基底外側核-MD内側部-前頭葉眼窩皮質系は,多感覚刺激の統合による刺激-報酬間の連合に関する認知記憶システムとして,前部帯状回皮質-線条体背内側部-MD外側部系は運動学習システムとして機能している可能性が示唆される。
化学反応システムのマイクロチップ集積化に関する研究

化学システムをマイクロチップ上に集積化する「化学反応の集積化」の応用として、細胞を利用したシステムを実現することを着想した。マイクロチップ内で細胞を用いる研究のほとんどは、細胞を分析するもので、細胞の機能を利用するという例はほとんどない。そこで、代謝のさかんな肝細胞を用いたシステムの開発を目指した。肝細胞を生体外で生命維持することは困難であるが、マイクロ流体制御技術を用いてこれを解決した。しかし、流れによる剪断応力やガラス表面などが細胞に対してストレスになると予想されたため、今回は剪断応力や表面処理の条件について検討を行い、マイクロチップ内で肝機能を良好に維持できる細胞培養条件を最適化した。マイクロチャネル壁面の修飾では、コラーゲンでは細胞がよく生着し、機能も高く維持できたが、ポリリジンやフィブロネクチンでは、形態異常や機能低下が確認された。剪断応力についても培地の流速や粘度を変化させることで検討し、剪断応力を大きくすると、細胞の形態が伸展したり、はがれたりするうえ、物質合成能が低下していくことが確認できた。これらの結果より、細胞の機能を良好に維持してマイクロチップ内で培養する条件を最適化した。このようにして良好に維持された細胞の機能を利用し、医療分野で実現が期待されている薬剤感受性評価システムのモデル系として、癌細胞を用いた抗がん剤の感受性アッセイを行い、従来の100分の1の少量細胞でのバイオアッセイがほぼリアルタイムで可能であることを示した。これにより、臨床現場では必要な細胞量が多いために実現できなかった薬剤選択のためのアッセイが可能となった。生体触媒や細胞を用いたバイオリアクターは、温和な条件下での高効率な反応や選択性の高い合成能などにより、注目を集めている。そこで本研究では、細胞の機能を利用し、より高機能な化学システムを実現することを目的とした。そこで我々は、細胞の機能を利用したより高機能なマイクロ化学システムを実現することを着想し、高い物質代謝能を示す肝細胞を利用したバイオリアクターチップの実現を目的とした。通常、肝細胞はその機能を維持したまま生体外で培養することが非常に困難とされているため、本研究では、マイクロチップ内での最適な培養条件について検討し、細胞の活性について物質合成能などの点から評価を行った。マイクロチャネル中の培養槽は、体積が非常に小さいため、細胞からの放出物を高濃度のまま検出できるという利点がある反面、溶存酸素量などが限られているために、長時間培養するには適さないという問題点があった。肝細胞は特に酸素要求性が高いため、培養開始後、数十分で培養槽内の酸素が消費されてしまうと見積もられた。そこで、培地を培養槽に潅流しながら培養するシステムを構築した。流体の制御に電気泳動ではなく圧力を用いているため、細胞に影響を与えず潅流することが可能である。細胞を導入してから約1時間で細胞がガラス表面に接着するため、その後シリンジポンプを用いて培地を0.21μL/minの速さで培養槽中に潅流した。潅流しなかった場合は、培養開始してから2時間経過後、細胞の活性が低下する様子が観察されたが、潅流した場合には、3日後も細胞が良好に生存している様子が観察され、この細胞のアルブミン産生能や尿素合成能も通常のバルク培養系とほぼ同程度であった。この結果より、培地を潅流させることで、細胞の機能を維持したまま長時間培養できることが示された。今後、この結果を利用したバイオリアクターシステムを構築して、実際に細胞に物質生産を行わせる予定である。
マイクロレンズアレイを用いた近赤外線三次元分光器の製作

マイクロレンズアレイによって生じる色収差を補正するための光学系の製作を行い、赤外線マイクロレンズアレイ分光器を完成させた。マイクロレンズアレイは、今回の研究目的である、多瞳を利用した分光器製作のための、多瞳をつくる部分、つまり光学系の心臓部にあたる。この心臓部の性能が充分に発揮されるように、マイクロレンズアレイ後方に置く色収差補正系の製作を、今年度行ったわけである。近赤外線における全ての波長城をカバーする分光器を製作するために、この色収差補正は不可欠なものであった。この補正系の成功により、色収差が充分におさえられるようになったことは言うまでもなく、さらに、望遠鏡やコリメータ系(平行光をつくる光学系)によって生じる幾何学的収差の影響もおさえることができた。また、マイクロレンズアレイにとっての出射瞳と、コリメータ系の入射瞳の間に共役関係が成立せず、収差やけられが発生するのを、この補正系によって解決することができた。これらの問題点は、天体の像と瞳の像の両者ともを充分な性能で得ようとすることにより発生する困難であり、多瞳分光器独特のものであるが、今回、マイクロレンズアレイの色収差補正系を製作することにより、この困難を克服したのである。このことにより、多瞳分光により空間2次元におけるスペクトル(波長情報:合計3次元)を同時に得るという画期的なシステムを、赤外線において完成させるという本研究の目的が達成された。データ取得の同時性の実現により、空の変動の影響の大きい赤外線観測においても信頼性の高い3次元データが効率良く得られるようになったのである。可視光におけるマイクロレンズアレイ分光器製作の経験と、赤外線観測機器開発の経験を活かし、赤外線マイクロレンズアレイ分光器を実現するというのが、この研究の課題である。本年度は、目的天体の種類や狙う波長域の検討から、それに最適化したパラメータの決定を行い、さらに詳細設計を行った。マイクロレンズアレイを用いた三次元分光器の心臓部であるマイクロレンズアレイのタイプ/材質の選定や、その設計もこれに含まれる。マイクロレンズアレイ、グレーティング、アクロマートレンズ等の購入も済み、現在、分光器の組み立て・調整を行っている。我々の分光器は汎用性を備えるため、つまり手軽に様々な望遠鏡に取りつけられる機動性を備えるため、コンパクトにまとめるための工夫が施されている。とくにリトロー系の導入が独創的であると考えている。分散素子であるグレーティングに対する入射光と出射光が同じレンズ系を通るシステムを採用したため、コンパクトな構造になっている。これにより、入射光と出射光のなす角度を小さくすることにもなり、高い効率の実現にも役立っている。今後の課題としては、冷却実験を含めた光学系調整が大事になる。マイクロレンズアレイ分光においては、多瞳の位置の安定性が重要となるからである。分光器完成後には、HII領域等銀河系内ガス雲の観測を実行し、こられの構造を理解した後、最終目標である、活動銀河の観測を行う予定である。
哺乳類tudor関連遺伝子群の生殖細胞における機能の解析

Tdrd1遺伝子改変マウスは雄性不妊であり雄生殖細胞の減数分裂および半数体成熟過程で異常を示す。一方、雌の妊性は正常である。同遺伝子改変マウスは雌雄生殖細胞のintermitochondrial cementを欠損する一方、雄生殖細胞に特徴的なchromatoid body構造は形成する事が明らかとなった。この事からintermitochondrial cementは雌生殖細胞の発生と妊性には必須では無い事、chromatoid bodyはintermitochondrial cementとは異なる起源を持つ事が明らかとなった。TDRD1、6、7の生殖顆粒への局在を詳細に検討し、Tudorドメインが生殖顆粒への局在に必要である事、同ドメインの繰り返し構造が生殖細胞分化に重要な役割を持つ事を明らかにした。抗TDRD抗体を用いて生殖顆粒の濃縮分画を調製し複数の特異的な蛋白質バンドを得た。また同分画に対するマイクロアレイ解析により構成RNAの同定を行った。Tdrd9遺伝子は生殖細胞に発現する。同蛋白質は上述のTDRD1、6、7とは異なり細胞質および核に検出され、Tudorドメインと共にRNA helicaseドメインを持ちMVHと複合体を形成する。Tdrd9遺伝子改変マウスを作製した所、雄性不妊を示し雄生殖細胞の減数分裂に異常を示した。同遺伝子改変マウスはレトロエレメントの発現およびゲノムDNAのメチル化に異常が観察される事から、Tdrd9は生殖細胞のエピジェネティックス制御に関わる新たな分子で有る事が明らかとなった。Tdrd1/Mtr-1、Tdrd6、Tdrd7/TRAPは生殖細胞の分化過程で発現し、同蛋白質群は何れも生殖顆粒に局在する。本研究課題はこれらマウスtudor関連遺伝子群の機能解析を行い、哺乳類生殖顆粒構造が持つ機能の手掛かりを得る事を目的とする。本年度は下記実験を進めた。Tdrd6、Tdrd7/TRAP遺伝子は複数のTudorドメインをコードし、特定のドメインの短い欠失では機能欠損を起こさない可能性が有る事から、loxP配列を含む相同組み換えベクターにより遺伝子領域全体に長い欠失を導入する必要がある。両遺伝子に関してBACシステムを利用した相同組み換えベクターを作成し、Tdrd7/TRAPに関しては組み換え体ES細胞株を得て、胚盤胞への導入、キメラマウスの作出を行った。Tdrd6に関しては組み換え体ES細胞株を得る事が困難であった事から、新たなベクターを作出してスクリーニングを進めている。2.TDRD結合候補分子の探索生体精巣に対する電気穿孔法を用いる事で、Tudorドメインが生殖顆粒の局在モジュールとして機能する一方、同ドメインの繰り返し構造が生理機能に必要である事を明らかにした。TDRD1/MTR1、TDRD6、TDRD7のTudorドメイン、tandem Tudorドメイン、MYNDドメインとGSTの融合蛋白質を発現、精製し、精巣の抽出液からのプルダウン実験を進め、蛋白質成分の電気泳動により特異的結合バンドの同定を行った。一方、哺乳類生殖顆粒のより包括的な解析を行う為、精巣からの細胞分取、細胞内構造分画、免疫沈降法によりTDRD複合体精製の詳細な条件検討を進めた。
植物におけるエチレンガス感知機構の構造生物学的研究

微生物の酸素センシングの分子機構を解明するために、自身で同定した酸素の結合や酸化還元によって制御される新たなセンサータンパク質の構造と機能相関に関する研究を行った。特に、センサードメインであるグロビンやヘムエリスリンドメインの結晶化及び、高分解能での構造決定に成功した。ヘムエリスリンをセンサードメインとして持つセンサーヒスチジンキナーゼに関しては、昨年度に引き続き、ヘムエリスドメインの結晶化スクリーニングを行った。N末端を削ることによってヘムエリスドメインの結晶化に成功し、1.5 Åの分解能で結晶構造を決定することができた。酸素の結合部位及び酸化還元中心と考えられる鉄二核中心には、2個の鉄の間に酸素原子が架橋しており、一方の鉄には塩化物イオンが配位していた。次の目標として、鉄の酸化還元状態でどのような構造変化が起こるのかを原子レベルで明らかにする必要がある。また、グロビンドメインをセンサードメインとして持つセンサーヒスチジンキナーゼに関しては、結晶化スクリーニングの結果、ヘムFe(III)にイミダゾールが結合した結晶化条件を見つけることができた。また、結晶を還元剤溶液へソーキングし、酸素結合(Fe(II)-O2)型、及び還元型(Fe(II))の構造を決定した。その結果、生化学や分光学的な実験結果から示唆されていたヘム遠位にあるTyrが酸素と直接水素結合していることが明らかとなった。このTyrは、Fe(II)型、イミダゾール結合型ではヘムと離れる方向に配座しており、酸素結合に伴う構造変化により、シグナルをヒスチジンキナーゼドメインに伝播させる役割をしていることが示唆される。これらの結果より、微生物の酸素センシングの分子機構について原子レベルでの議論が可能となった。29年度が最終年度であるため、記入しない。緑膿菌は嫌気下では嫌気呼吸の一種である脱窒を行い生育している。この脱窒過程に関わる一酸化窒素還元酵素cNOR (Nitric Oxide Reductase)、亜硝酸還元酵素NiR (Nitrite Reductase)、チトクロムc551 (Cyt c551)の三者複合体の結晶構造解析を目的とし、今年度は以下の研究成果を得た。1. Cyt c551の発現系の構築C末端のHisタグ融合タンパク質として、大腸菌における発現系を構築した。ヘムc合成遺伝子を導入した大腸菌BL21(DE3)に、ヘム前駆体としてアミノレブリン酸の存在下で、目的タンパク質を大量発現させた。その結果、緑膿菌由来のネイティブタンパク質と同程度の純度で精製することができた。cNORへの電子伝達能も確認した。したがって、緑膿菌由来のネイティブタンパク質と同様に、機能的なタンパク質を得ることに成功した。cNORとのクロスリンカーを用いた実験において、Cyt c551には、N末端のGlu1, Val5を選び、Cysを導入した。2. cNOR変異体の調製cNOR変異体は、NorBサブユニットにおけるC末端のHisタグ融合タンパク質として、緑膿菌で発現させ、精製した。分子表面にあるNorBサブユニットにおけるCys86をSerに変異したcNOR変異体を野生型とし、このcNORの予想されるCyt c551との相互作用部位近傍にCysを導入した。Cyt c551と相互作用すると推測されるcNORのNorCサブユニットにおけるGlu88, Glu89, Lys144、及び、NorBサブユニットにおけるAla419, Gly421, Thr425, Ala428を選んだ。得られたタンパク質は、野生型と同様な吸収スペクトルを示したことから、ヘム周辺構造には影響を与えていないと考えられる。すでに本研究室で得られているcNOR-NiR二者複合体構造中で確認された塩橋の重要性を調べるために、cNORのE119R変異体以外に、ファンデールワールス相互作用に重要と考えられるAla97の変異体(A97R, A97W)、シミュレーションから予測された塩橋の架け替えに重要なLys100の変異体(K100E, K100L)のプラスミドを導入した緑膿菌を用いた、成長速度を測定した。その結果、cNOR-NiR二者複合体における相互作用に関わるアミノ酸の重要性について明らかにすることができた。本年度は、微生物のゲノム中にヘムエリスリンを酸素結合部位として持つ、全く新しい酸素センサーヒスチジンキナーゼを同定することに成功した。この遺伝子は当初、機能が未知であったが、そのアミノ酸配列を調べたところ、N末端側にヘムエリスリンドメインを、C末端側にヒスチジンキナーゼドメインを持つことがわかった。ヘムエリスリンは、もともと海洋無脊椎動物の酸素運搬タンパク質として知られているが、近年、微生物がヘムエリスリンを酸素(及び、酸化還元)を感知するためのセンサードメインとして利用していることが明らかとなってきた。そこで、このタンパク質をBhr-HK (Bacterial hemerythrin Histidine Kinaseの略)と名付けた。Bhr-HKタンパク質の大量発現系、及び精製法を確立させた。そして、精製タンパク質の構造機能相関について詳細に調べた。精製されたBhr-HKは、ヘムではなく、鉄二核中心を持ち、黄色のタンパク質として得られ、自己リン酸化活性を示した。Bhr-HKは、センサードメインに存在する鉄二核中心の酸化還元変化によって、自己リン酸化活性を制御していることが示唆された。

したがって、Bhr-HKは酸素の結合(または、外界の酸化還元変化)に伴い、酵素活性が上昇するという新しいタイプのセンサーヒスチジンキナーゼであることが明らかとなった。これらの結果は、将来的には病原菌に対する治療に応用できる重要な情報を含む可能性があり、多剤耐性菌の撲滅などにも貢献できる可能性があるものである。本年度、新たに同定した二成分情報伝達系のヒスチジンキナーゼとレスポンスレギュレーターについて、精製タンパク質の大量調製法を確立できた。ヒスチジンキナーゼに関しては、嫌気条件下での吸収スペクトルの測定や自己リン酸化の活性測定系を確立できた。また、X線結晶構造解析に向け、予備的な結晶を得ることができた。微生物の酸素センシングの分子機構を解明するために、自身で同定した酸素の結合や酸化還元によって制御される新たなセンサータンパク質の構造と機能相関に関する研究を行った。特に、センサードメインであるグロビンやヘムエリスリンドメインの結晶化及び、高分解能での構造決定に成功した。ヘムエリスリンをセンサードメインとして持つセンサーヒスチジンキナーゼに関しては、昨年度に引き続き、ヘムエリスドメインの結晶化スクリーニングを行った。N末端を削ることによってヘムエリスドメインの結晶化に成功し、1.5 Åの分解能で結晶構造を決定することができた。酸素の結合部位及び酸化還元中心と考えられる鉄二核中心には、2個の鉄の間に酸素原子が架橋しており、一方の鉄には塩化物イオンが配位していた。次の目標として、鉄の酸化還元状態でどのような構造変化が起こるのかを原子レベルで明らかにする必要がある。また、グロビンドメインをセンサードメインとして持つセンサーヒスチジンキナーゼに関しては、結晶化スクリーニングの結果、ヘムFe(III)にイミダゾールが結合した結晶化条件を見つけることができた。また、結晶を還元剤溶液へソーキングし、酸素結合(Fe(II)-O2)型、及び還元型(Fe(II))の構造を決定した。その結果、生化学や分光学的な実験結果から示唆されていたヘム遠位にあるTyrが酸素と直接水素結合していることが明らかとなった。このTyrは、Fe(II)型、イミダゾール結合型ではヘムと離れる方向に配座しており、酸素結合に伴う構造変化により、シグナルをヒスチジンキナーゼドメインに伝播させる役割をしていることが示唆される。これらの結果より、微生物の酸素センシングの分子機構について原子レベルでの議論が可能となった。さらに、植物のエチレン受容体と関係した新規の二成分情報伝達系を微生物のゲノムデータベースより、同定することに成功した。このタンパク質の構造機能相関についても研究を進めて行く。引き続き、新規に同定した二成分情報伝達系の構造機能相関研究を行う。この二成分情報伝達系は全体として、外界環境の酸素濃度や酸化還元の変化に応答して、微生物の形態を制御するシステムである可能性がある。ヒスチジンキナーゼに関しては、初期的なキャラクタリゼーションは完了しているので、今後はレスポンスレギュレーターについて、重点的に研究を行っていく。そして、この新規の二成分情報伝達系の生理的意義について、分子レベルでの解明を目指す。
ダイヤモンド欠陥の同定と低減に関する研究

次世代省エネパワーデバイス、量子応用デバイスで新たに研究の進むダイヤモンドにおいて「欠陥」が重要課題に浮上している。軽元素及び高対称性結晶に起因する本質的な問題があり、欠陥が詳しく同定できていない。本研究では主に放射光X線トポグラフィを駆使して、深さ方向情報の取得と幾何解析による欠陥解析手法の確立に取組み(A)、欠陥の同定を行う(B)。これにより平衡(HPHT)及び非平衡(CVD)合成結晶の欠陥の違いを明確にすると共に、これら同定された欠陥と既知の発光欠陥等との相関関係を明らかにする。さらに欠陥の低減、無害化を目的として欠陥終端手法の開発に取り組む(C)。
間質性膀胱炎の病態における膀胱上皮由来伝達物質に関する研究

本研究の目的は、難治性疾患である間質性膀胱炎の病態に上皮由来の各種伝達物質が如何に関与しているかを解明することにあり、そのために、患者の尿と膀胱組織を用いて伝達物質の測定と遺伝子発現の定量を行い、治療後の変化も検討してきた。また、併せて間質性膀胱炎の動物モデルを作成してその排尿生理学的・分子細胞学的な特徴の評価を行ってきた。臨床症例を用いた研究では、尿中マーカーの測定系の条件設定を検討してきた。尿中のNGFCXCL10,TNFSFの測定の至適条件を適宜調整し、間質性膀胱炎に対する治療前後での評価、自覚症状との相関について検討してきた。結果、症状との有意な相関を認めていないのが現状である。膀胱組織を用いた検討では、サンプルの収集と免疫組織染色を行い、データを検討してきた。その結果、間質性膀胱炎の中でも潰瘍の有無でCD11b陽性細胞、VEGF-Aなどに違いを認め、またSjogren症候群に合併した間質性膀胱炎ではCD4ならびにCD8陽性細胞の増加をみとめ、それぞれ病態解明の鍵となることが期待される。動物モデルを用いた研究では、アクロレインを用いた動物モデルの膀胱粘膜組織におけるTRPM8の発現を検討したが、現時点では投与前後でその発現に差を認めていない。また、ケタミン乱用者における間質性膀胱炎様症状を参考に、ケタミンを用いた動物モデルの作成を試みたが、頻尿や潰瘍形成を認めず、現時点では間質性膀胱炎モデルとは言いがたい。今後も、さらに研究を進め、病態解明を目指していく。1)臨床症例を用いた研究これまでに東京大学医学部附属病院泌尿器科にて診療を行っている患者から文書による同意を取得の上でその治療前後で質問票による間質性膀胱炎の重症度の評価、尿サンプルの回収・保管を行ってきた。22年度は尿中のNGF、8-OHDGの測定を行い、いずれも間質性膀胱炎の症状マーカーとして有用である可能性が確認されている。2)動物モデルを用いた研究これまでに、cyclophosphamide,protamineを用いた動物モデルの作成を行い、その排尿状態、膀胱組織の評価まで完了している。これまでの検討では少なくとも排尿状態、組織学的所見においては、モデル作成後の時間の経過とともに、炎症が治癒傾向を示すことが確認されており、長期的な評価を行う上では必ずしも適切なモデルでない可能性が示されている。今後は、モデルの膀胱機能、膀胱組織の分子生物学的・免疫組織学的検討を進める予定である。また、平行してこれらのモデルに対するレジニフェラトキシンやA型ボツリヌス毒素を用いた治療研究を23年度中に開始する予定である。ketamineモデルについては予備実験を経て、2mg/body/weekにて12週間連続で腹腔内投与を行い排尿状態を確認しているところであるが、長期間のketamine投与によりcontrolに比べて1回排尿量の減少、1回排尿量の減少を認めており、今後組織学的検討を行う予定である。平成23年度は、引き続き(1)尿中の伝達物質の測定、(2)ヒト間質性膀胱炎膀胱粘膜組織における伝達物質の発現の検討を行ってきた。尿中の伝達物質の測定は、尿の保存状態、測定条件など種々の因子によって同一のサンプルであっても測定結果が変わることが今年度に判明し、尿中マーカーの測定には相当厳密な条件設定が求められていることが判ってきている。今後、尿中伝達物質の測定に関しては、更なる検討を行っていく。また、組織における伝達物質の発現の検討は、膀胱粘膜組織の免疫染色など組織学的検討を終えており、24年度中にデータを解析し、学会発表する予定である。

動物実験では、当初予定していた浸透圧ポンプを用いたCyclphosphamideモデルは持続投与に伴う副作用で致死率が高く、モデルとしての実用性に乏しく、またProtamineモデルでは長期間浸透圧ポンプ内に溶液があることでProtamineの析出・管閉塞がおこり、やはりモデルとしての再現性に乏しいことがわかった。そこで、本研究では、CycloPhosPhamide、Protamineモデルをそれぞれ従来どおりの方法で作成し検討を進めている。いずれも長期に炎症が持続せず、間質性膀胱炎のような慢性炎症性疾患のモデルとしては適していない可能性が本研究でわかり、今後の研究課題であると認識している。23年度中にヒト膀胱組織同様にモデル動物膀胱の組織学的検討を終えており、24年度に各種機能検査を行い、これらの結果をまとめて論文発表する予定である。本研究の目的は、難治性疾患である間質性膀胱炎の病態に上皮由来の各種伝達物質が如何に関与しているかを解明することにあり、そのために、患者の尿と膀胱組織を用いて伝達物質の測定と遺伝子発現の定量を行い、治療後の変化も検討してきた。また、併せて間質性膀胱炎の動物モデルを作成してその排尿生理学的・分子細胞学的な特徴と、ヘパリンの膀胱内注入とA型ボツリヌス毒素の膀胱壁内注入を行った効果を詳細に検討してきた。臨床症例を用いた研究では、尿中マーカーの測定系の条件設定を検討してきた。尿中のNGF CXCL10, TNFSFの測定の至適条件を適宜調整し、間質性膀胱炎に対する治療前後での評価、自覚症状との相関について検討してきた。結果、症状との有意な相関を認めていないのが現状である。膀胱組織を用いた検討では、サンプルの収集と免疫組織染色を行い、データを検討してきた。結果、間質性膀胱炎の中でも潰瘍の有無でCD11b陽性細胞、VEGFーAなどに違いを認めた。また、間質性膀胱炎患者と対照となる膀胱がん患者の非癌部から採取した組織におけるmRNAの発現を検討したところ、とくに潰瘍型の間質性膀胱炎ではTRPM2、NGF、CXCL9などの発現が有意に増加していることがわかり、今後の病態解明につながる研究成果として期待される。動物モデルを用いた研究では、確立されつつある動物モデルを用いた各種機能実験のうち、時間的制約にて行えていなかった膀胱内圧測定および、摘出膀胱条片の機能実験を行い、機能評価を行い、現在集積したデータの解析を行っている。予定されていた摘出膀胱条片の機能実験は至適な膀胱条片を確保することが出来なかったため,今後の検討課題となっている。また、併せてヘパリン・リドカイン混合液やヘパリン、レジニフェラトキシンの膀胱内注入を動物モデルに行う治療研究は現在準備が完了し、今後進めていく予定である。動物モデル作成実験は順調に進捗しているが、尿中マーカーの測定については、条件設定が困難を極めており、測定系の確立に時間を要している。CXCL10、NGFについては、条件が整いつつあるが、間質性膀胱炎と健常例との比較が十分になされておらず、これらは平成24年度の課題である。24年度が最終年度であるため、記入しない。間質性膀胱炎は、原因がわからず、また現在疾患の状態を定性・定量的に評価できるマーカーが存在しないのが現状である。本研究では、尿中マーカーの測定において系の確立に難渋しているが、問題点を一つ一つ解決しつつあり、CXCL10、NGFなど一部のマーカーについては再現性のある測定系が確立されつつある。今後は、これらのマーカーでの測定ノウハウを活かして、系の確立を進めていく。
組み換えアストロサイト移入によるSCID-hu-MSの脱髄機構の解明

severe combined immunodeficiency(SCID)miceは成熟したTおよびB細胞がなく中枢神経系でのサイトカインネットワークを研究するためには良いシステムである.私どもはサイトカインのみで中枢神経系の脱髄が生じうるという仮説のもとに本研究を行った.SCIDマウスよりアストロサイトを分離しそれにIL-1β,IL-6,TNF-α,IL-2のcDNAを導入しneomysin抵抗性の株を選択した.それぞれのサイトカインの発現はRT/PCRにて確認し,蛋白レベルの発現はELIZAと感受性細胞のバイオアッセ-を行った.それらの細胞を単独および種々の組み合わせでSCIDマウスの脳内に移入し,2週間後にマウスを屠殺し神経病理学的に検討した.その他ヒトIL-2とマウスinterferon-γ(INF-γ)のリコンビナントを脳内に注射し,同様の実験を行った.コントロールにはそれぞれのリコンビナントを加熱により不活化したものを用いた.単独で上記アストロサイトのトランスフェクタントを移入した場合,IL-2のトランスフェクタントでのみ壊死と脱髄が高頻度に観察された.これら病変は細胞移入部からかなり離れた白質にもみられた.その他のサイトカイントランスフェクタント単独および組み合わせでは刺入部の変化以外は病変を認めなかった.IL-2のリコンビナントをSCIDマウスの白質に注射した場合もIL-2トランスフェクタントの場合と同様の結果を得た.INF-γのリコンビナントの場合は白質に限局したvacuolation(脱髄)が高頻度に観察された.IL-2やINF-γはSCIDマウスのNK細胞を活性化する.活性化されたNK細胞は再びINF-γを放出しグリア細胞からTNF-αやinducible NO synthase(iNOS)を誘導しオリゴデンドロサイトに障害を与えると考えられる.severe combined immunodeficiency(SCID)miceは成熟したTおよびB細胞がなく中枢神経系でのサイトカインネットワークを研究するためには良いシステムである.私どもはサイトカインのみで中枢神経系の脱髄が生じうるという仮説のもとに本研究を行った.SCIDマウスよりアストロサイトを分離しそれにIL-1β,IL-6,TNF-α,IL-2のcDNAを導入しneomysin抵抗性の株を選択した.それぞれのサイトカインの発現はRT/PCRにて確認し,蛋白レベルの発現はELIZAと感受性細胞のバイオアッセ-を行った.それらの細胞を単独および種々の組み合わせでSCIDマウスの脳内に移入し,2週間後にマウスを屠殺し神経病理学的に検討した.その他ヒトIL-2とマウスinterferon-γ(INF-γ)のリコンビナントを脳内に注射し,同様の実験を行った.コントロールにはそれぞれのリコンビナントを加熱により不活化したものを用いた.単独で上記アストロサイトのトランスフェクタントを移入した場合,IL-2のトランスフェクタントでのみ壊死と脱髄が高頻度に観察された.これら病変は細胞移入部からかなり離れた白質にもみられた.その他のサイトカイントランスフェクタント単独および組み合わせでは刺入部の変化以外は病変を認めなかった.IL-2のリコンビナントをSCIDマウスの白質に注射した場合もIL-2トランスフェクタントの場合と同様の結果を得た.INF-γのリコンビナントの場合は白質に限局したvacuolation(脱髄)が高頻度に観察された.IL-2やINF-γはSCIDマウスのNK細胞を活性化する.活性化されたNK細胞は再びINF-γを放出しグリア細胞からTNF-αやinducible NO synthase(iNOS)を誘導しオリゴデンドロサイトに障害を与えると考えられる.
金属による呼吸器炎症発生機序の究明とエピジェネティック制御の関与の検討

近年有毒性が注目されている酸化インジウム(In_2O_3)を用いて、カタラーゼの活性が失活しているアカタラセミアマウスと野生型マウスにIn_2O_3の気管内投与を行ったところ、体重増加の抑制、肺相対重量増加、肺組織の変化に有意な差が認められた。In化合物の毒性研究において、遺伝子変異マウスを用いて酸化ストレスと肺障害の関係性を示唆する結果が得られたことにより、今後の研究の指針を示す重要な手がかりを得ることができたといえる。昨年度に実施した研究によって、アカタラセミアマウスと野生型マウスの間で、酸化インジウム(In_2O_3)の投与による体重増加の抑制、肺相対重量増加、肺組織の変化に有為な差が認められた。野生型、アカタラセミアマウス共にIn_2O_3の投与により体重増加が抑制されたが、アカタラセミアマウスの方がより少量で体重増加の抑制が引き起こされた。また、In_2O_3の投与により肺相対重量が増加したが、アカタラセミアマウスの方が増加の割合がより大きかった。さらに、肺組織標本を観察した結果も、アカタラセミアマウスのIn_2O_3投与群でより重度な障害を示した。遺伝子操作技術や遺伝子改変体が充実したマウスにおいて、In_2O_3気管内投与による肺傷害導入系が確立したことは、インジウム(In)化合物による肺疾患発症機構を解明するために有効な手段を獲得したとみなすことができる。また、カタラーゼ活性の欠損によりIn_2O_3への感受性が増加したことから、研究計画段階での予想通りIn_2O_3による肺疾患発症機序への酸化ストレスの関与が示唆された。In_2O_3は電子機器のフラットパネルディスプレイの材料であり、世界のIn消費の大半を占める我が国において高い産業的価値を有している。ここ十数年にかけて国内のIn需要も約6倍増加しているが、その流れの中でIn_2O_3曝露による健康阻害の実例が報告されだした。作業環境中の許容濃度が引き下げられたことにより、高濃度曝露による人体への影響は今後抑えられると考えられるものの、まだ明らかにされていない低濃度暴露の影響を検討することが喫緊の課題となっている。これまでの研究は様々なIn化合物の毒性検査が主体であったが、今回遺伝子変異マウスを用いて、酸化ストレスと肺障害の関係性を示唆する結果が得られたことにより、今後の診断法、治療法を考える上で重要な手がかりを得ることができたといえる。一昨年度にアカタラセミアマウスと野生型マウスを用いて酸化インジウム(In_20_3)の気管内投与を行い、体重増加の抑制、肺相対重量増加、肺組織の変化を調べたが、その際に採取した血清を用いてインジウム濃度を測定したところ、投与量の増加に伴い血清インジウム濃度(In-Se)が上昇したものの、アカタラセミアマウス、野生型マウスの間で有意な差は認められなかった。このことから、アカタラセミアマウスでより顕著に認められた肺組織の変化が、In-Seに依存せず遺伝子型の違いによるものであることが示された。アカタラセミアマウスはカタラーゼ活性が欠損しているが、野生型マウスと比べてIn_20_3による肺組織の損傷が生じやすい原因は、カタラーゼ活性の低下により活性酸素の除去能力が低下し、過剰に残った活性酸素が肺組織を損傷していると予想される。フラットパネルディスプレイの材料であるIn_20_3の産業的価値は、世界のIn消費の大半を占める我が国において非常に高く、In_20_3曝露による健康障害発生直後からインジウム化合物の毒性評価、製造工場やリサイクル工場などの職域を中心とした疫学調査が並行してなされ、作業環境の許容濃度が設定されたものの、一方でまだ明らかにされていない低濃度曝露の影響を検討することも継続して取り組むべき課題として残されている。In化合物の毒性研究において、今回遺伝子変異マウスを用いて、酸化ストレスと肺障害の関係性を示唆する結果が得られたことにより、これまでと異なる切り口から今後の研究の指針を示す重要な手がかりを得ることができたといえる。
衛星観測データのシナジー解析を活用した次世代型気候モデルの構築および改良

当該年度前半では、前年度までに開発を行ってきた、雨水の質量・数濃度を陽に予報する新しい雲・降水スキームを用いたシミュレーション結果を解析し、従来型モデルおよび衛星観測データを用いてエアロゾル・雲・降水相互作用の再現性の評価を実施した。降水を診断的に取り扱う従来型モデルでは、雲粒数濃度の関数であるautoconversionプロセスに強く依存し降水を形成する傾向があり、観測と比較しエアロゾル・雲相互作用を強く表現するバイアスの存在が、前年度までの解析により明らかになっていた。その一方、本研究課題において開発した予報型降水スキームでは、形成された雨水が複数時間ステップにまたがり大気中を落下していく過程を陽に計算しているため、雲粒と雨粒の衝突・併合によるaccretionプロセスが増加した。accretionはエアロゾル数濃度に依存しないため、従来型モデルで見られたエアロゾル・雲相互作用の過大評価を緩和する方向に機能することが確認された。autoconversionとaccretionのバランスが大幅に改善されたことにより、大陸西岸によく現れるドリズルを航空機観測データと整合的に表現することが可能になった。上記の特徴から、より現実的な雲・降水過程がモデル内で機能しているものと評価できる。当該年度後半は、これまでに開発を推進してきた予報型降水スキームを用いて、水雲の発生頻度および降水のフェーズの割合に着目したモデル間相互比較や、降水スキームの違いと雲・降水変換過程の関連性について調査するモデル間相互比較といった国際プロジェクトに参画し、データの提供を行った。また、さらなるモデルの精緻化のため、降水に加え降雪粒子の質量・数濃度を予報変数として導入するスキームへと改良を行い、降水・降雪が予報変数として機能する統合的な予報型スキームの枠組みを構築した。29年度が最終年度であるため、記入しない。気候モデルにおいて最も不確実性の大きい、エアロゾル-雲-降水相互作用のパラメタリゼーションスキームの評価を行った。気候モデルを用いた感度実験の結果を、複数の衛星観測データと比較・検証し、モデルのバイアスの原因を考察した。また上記で得られた気候モデルの不確実性に関する情報を元に、モデルを改良・再構築する作業に取り組んだ。現状の国内外ほとんど全ての気候モデルは、雨水を診断変数として扱っているため、あるタイムステップで診断された雨水は、降水として次のタイムステップで全て地表へと落下させるスキームを採用している。そのため、モデルは観測と比較し降水のタイミングが早く、放射特性にも不確実性が残存している。そこで、より現実的な降水過程を実現するために雨水を予報変数として導入し、複数タイムステップにまたがって大気中を落下するスキームの実装に取り組んだ。作業の効率化のため、新スキームの実装は1次元モデルを用いた。雨水の予報変数化に伴い、雲水から雨水への変換プロセスを新たに定式化し直した。また、非線形性の大きい雲・降水過程の再現性を向上するため、標準タイムステップ内にさらに短いタイムステップを用いて積分する、サブタイムステップを雲微物理部分のみに導入した。これにより、モデル全体としての計算リソースをある程度確保したまま、雲・降水の微物理を表現するために理想的である、数分以内の積分間隔を実現することに成功した。さらに、CloudSat衛星観測データの取得・整理作業を実施した。このデータは、雲・降水の鉛直解像に特化しており、モデル開発における比較・検証に必要不可欠な材料となる。計5年分をアーカイブし、データの入出力・可視化スクリプトをまとめ、パッケージ化を完了した。上記を利用し、平成28年度以降も継続して、モデル・観測の両面から研究を推進していく予定である。1次元モデルを用いた新しいパラメタリゼーションの開発は当初の計画通り進み、またモデルの結果の比較・検証を目的とした衛星観測データの整理は、当該年度内に完了した。さらに、モデルの結果と衛星観測データを素過程レベルで複合的に解析した結果、エアロゾルのperturbationに対する雲特性の応答に、モデルと観測で系統的な差があることがわかった。これは、不確実性の大きいエアロゾル-雲-降水相互作用のパラメタリゼーションの改良に非常に有意義な結果であり、平成28年度以降の研究に大きく貢献する成果であると期待される。全球気候モデルが、エアロゾル・雲・降水相互作用プロセスに抱える不確実性の評価を、衛星観測データを用いて実施した。現状のモデルは、エアロゾルが雲・降水の微物理過程に与える効果を、観測事実よりも強く表現してしまう不確実性を抱えており、その本質的な原因が、モデル内における降水の取り扱いに起因することを示した。また、エアロゾルが雲・降水特性を変調するフィードバックは、微物理特性以外にも、熱力学的な条件や雲のタイプと強い相関を持つことが明らかになった。上記で得られた気候モデルの不確実性を改善するため、鉛直1次元モデル(SCM)を用いて、モデルの雲・降水過程を改良・再構築する作業を実施した。雨の落下は、鉛直方向のCFL条件から厳密に制御し、サブグリッドスケールでの雨の分布も表現した。雨の質量および数濃度を予報変数とした、2 moment法で実装を行った。性能の検証のため感度実験を多数実施し、モデル内で仮定している雨の粒径分布や雲水から雨水への変換式、およびサブタイムステップの長さへの感度を調査した。新スキームの特徴の把握や性能確認が進んだため、SCMで開発したスキームを全球モデルへと実装を拡張した。さらに、CloudSat衛星観測データの取得・整理作業を、前年度に引き続き実施した。

CloudSat衛星搭載の雲レーダーは、雲粒・氷晶・降水・降雪の鉛直解像に特化しており、本研究課題においてモデル開発を進めるにあたり、その比較・検証に必要不可欠な材料となる。平成27年度までに、低層の水雲を対象とした、計5年分(2006年6月2011年4月)のアーカイブが完了していたが、当該年度(平成28年度)はさらに氷雲および雪についてもパッケージ化を完了した。上記を利用し、平成29年度以降も継続して、モデル・観測の両面から研究を推進していく予定である。鉛直1次元モデルを用いたことで、新しい雲・降水スキームの開発が効率的に進み、多数の感度実験を実施することができた。感度実験の結果から、サブタイムステップの長さや雨の粒径分布および雲水から雨水への変換式などに対する感度を把握できたため、全球モデルへ実装を拡張する際に、スムーズにパフォーマンスの検証を実施することができた。当初の目標通り、開発した新しいスキームの導入により、エアロゾルの間接効果、とくに雲寿命効果の過大評価を低減することが可能になったほか、エアロゾルの摂動をキャンセルするプロセスが現れることが明らかになった。このように、雲寿命効果と逆センスにはたらく応答は、LESや雲解像モデルといったプロセスモデリングからは可能性が示唆されていたものの、気候モデルの枠組みで再現可能になることは、当初予期していなかった成果であり、今後の気候モデル開発に重要な示唆をもたらす結果であると期待される。また、モデルの比較・検証のために用いる衛星観測データについても、氷雲および雪に関するデータの整理を当該年度内に完了した。これは、今後開発を推進する降雪のプロセスの性能検証に用いられる予定であるため、効率的な開発につながることが期待される。当該年度前半では、前年度までに開発を行ってきた、雨水の質量・数濃度を陽に予報する新しい雲・降水スキームを用いたシミュレーション結果を解析し、従来型モデルおよび衛星観測データを用いてエアロゾル・雲・降水相互作用の再現性の評価を実施した。降水を診断的に取り扱う従来型モデルでは、雲粒数濃度の関数であるautoconversionプロセスに強く依存し降水を形成する傾向があり、観測と比較しエアロゾル・雲相互作用を強く表現するバイアスの存在が、前年度までの解析により明らかになっていた。その一方、本研究課題において開発した予報型降水スキームでは、形成された雨水が複数時間ステップにまたがり大気中を落下していく過程を陽に計算しているため、雲粒と雨粒の衝突・併合によるaccretionプロセスが増加した。accretionはエアロゾル数濃度に依存しないため、従来型モデルで見られたエアロゾル・雲相互作用の過大評価を緩和する方向に機能することが確認された。autoconversionとaccretionのバランスが大幅に改善されたことにより、大陸西岸によく現れるドリズルを航空機観測データと整合的に表現することが可能になった。上記の特徴から、より現実的な雲・降水過程がモデル内で機能しているものと評価できる。
バレット食道におけるバレット腺癌リスクマーカーの検討

米国人の検体を用いて、Long Segment Barrett's Esophagus(LSBE)および食道腺癌(EAC)発症に関連する遺伝子をマイクロアレイ解析により同定した。次に日本人の患者検体を用いて特定された遺伝子について遺伝子発現量を検討した。SERPINB7の過剰発現およびSCNN1Bの低発現が米国人同様、日本人のLSBEにおいても認められた。さらにEAC背景のBEにおいてもコントロール群のSSBEと比較して同様に遺伝子発現の差を認めた。日本人においてもSERPINB7がBEの伸長に関与しており、SCNN1Bが発癌の危険因子のバイオマーカーとして、有用である可能性が考えられた。これまでにNarrow Band Imaging(NBI)拡大内視鏡観察下に、バレット上皮よりブラッシング法および生検法により、バレット上皮あるいはバレット腺癌のリスクマーカーに関する網羅的遺伝子発現の検討を行い、CD55遺伝子を特定し、結果を論文にまとめ投稿し現在、査読後の論文改定中である。今回、米国メーヨクリニックフロリダMichael B Wallace医師の協力により研究協力施設での倫理委員会の承認後に、対照群:バレット上皮の長さが全周性に3cmを超えるバレット食道(long segment Barrett esophagus; LSBE)あるいは3cm未満のバレット食道(short segment Barrett esophagus;SSBE)を有する対照患者およびバレット腺癌群:SSBEあるいはLSBEを有するバレット腺癌患者のバレット上皮よりブラッシング検体の採取を行っている。すでに109例の検体採取を終えている。米国の検体(対照群のLSBE5例とSSBE5例のバレット上皮およびEAC群のLSBE5例とSSBE5例のバレット上皮部および癌部のブラッシングの検体計30検体)についてもGeneChip、Human Genome U133 plus 2.0 Arrayでのデータを取得し、現在、そのデータの解析を行っている。解析後にこれまで採取した検体を用いて、validationを行う予定である。米国でのデータの解析はほぼ終了している。バレット食道(BE)の腸型形質発現の検出および特殊腸上皮化生の診断に、NBI拡大観察下ブラッシング法が非侵襲的で有用であり(Murao T. et al. J Gastroenterol, 2012)、バレット腺癌背景のバレット粘膜においてCD55が高発現することを報告した(J Gastroenterol Hepatol. 2016;31(1):99-106)。Long segment BE(LSBE)およびバレット腺癌の頻度が本邦より多い米国の検体を用い、同様に再検討を行った。米国人のバレット腺癌の癌部および周囲のバレット上皮部さらに対照群のshort segment BE (SSBE)、LSBEよりブラッシングにより検体を採取し、得られたサンプルから抽出したRNAをマイクロアレイ(Affymetrix GeneChip)にて網羅的に解析し、有意差が認められた遺伝子について米国の検体を用いてその発現量を比較検討した。腺癌群と対照群のバレット上皮部での遺伝子発現量の比較では、腺癌群でCD55、MMP1、TRHDE、PDZK1の発現が有意に高く、SCNN1Bの発現が有意に低かった。次に日本人の検体を用いた検討では、2名のLSBE症例を含むEAC群の患者13名、コントロール群としてLSBE患者18名、SSBE患者41名を登録した。SCNN1BがLSBE群で有意に発現量の低下が認められ、TRHDE、PDZK1、SERPINB7ではLSBE群において有意な過剰発現が見られた。さらに4群比較においてコントロール群のSSBEと比較しEAC群のLSBEにおいてSERPINB7の有意な発現量の増加が認められた。米国患者の結果とほぼ同等の結果が得られた。日本人の症例においてもSERPINB7がBEの伸長に関与しており、発癌の危険因子のバイオマーカーとして、有用である可能性が考えられた。米国の検体採取が順調にすすみ、100検体を超える検査体が採取され、Human Genome U133 plus 2.0 Arrayの実験をすでに終えているため。今後vlidationを行い、米国人におけるバレット腺癌のリスクマーカーについて同定できる可能性が高いため。日本人のサンプルの増加は困難であり、すでに保存しているサンプルで解析を終了し、米国人のデータと比較する予定医歯薬学米国の検体採取の対象患者に、LSBE患者が不足しているためさらに症例を追加する予定。バレット腺癌の本邦の症例の集積が進んでいないため国内の研究協力施設に再度依頼し、症例集積の推進を行う。予定していた物品費用が安価になったために次年度使用額が生じた。28年度の研究費と合わせて、研究用消耗品、成果発表費用等に使用予定。