hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
カタユウレイボヤの転写制御領域に関する情報学的モデル構築とその検証

モデル化の方法は、まずWeeder, MEMEなどの共通モチーフ抽出プログラムを併用して、頻出モチーフを抽出し、各々のモチーフの中で、異なる位置の間で塩基出現に相関が認められた場合は、その効果もとりいれたスコア行列を作った。次にそれらのモチーフモデルが、便宜上、近接側、遠方側の二つにわけた上流領域中で各々どのような順序で出現するかを、マルコフ連鎖を用いた確率遷移モデルで表現した。各々の組織特異的プロモーター群について得られたモデルを、ゲノム中の全遺伝子の上流配列に適用し、それぞれがモデルに適合する確率を計算して、高確率が得られた上位50遺伝子を選び出した。それらの中にはモデル構築に用いた既知遺伝子が高頻度で含まれていたことを確認し、その他の遺伝子の機能を、コードされたタンパク質配列をデータベースでBLAST検索することで推定してみたところ、それぞれ、有望な新規特異的発現遺伝子候補が含まれていた。とりあえず、筋肉特異的発現遺伝子候補の中から5つを選んで、in situハイブリダイゼーション実験を行ったところ、筋肉だけで発現がみられたわけではないが、そのうち3つについては、筋肉での発現が観察された。残りの組織の候補についても現在、検証実験を進めている。また、モデル構築法の改良についても、線虫などのデータも併用することでさらに努力を重ねているところである。
高脂肪食誘導性の非肥満糖尿病発症メカニズム

食物からの脂肪の過剰摂取は糖尿病を惹起するが、そのメカニズムは多くが不明である。我々はインスリン抵抗性だが耐糖能は正常であるインスリン受容体変異マウスに、高脂肪食を負荷すると顕性の糖尿病を発症することを見いだし、そのメカニズムを解析した。解析の結果、このマウスでは脂肪組織での脂肪分解が亢進し、産生されたグリセロールが肝臓で糖新生に利用され、高血糖が誘発されることが明らかになった。平成24年度には、mIRマウスが高脂肪食下で糖尿病を発症する機序として肝臓と脂肪での代謝異常が原因であることを明らかにした。意外なことにmIRマウスはインスリン受容体に機能喪失変異が導入されているにもかかわらず、絶食/再摂食時に、有意な血中インスリン増加が見られ、肝臓と脂肪のインスリンシグナルもAkt1のリン作家シグナルは正常であった。また、このマウスでは糖代謝のみならず、エネルギー代謝にも異常がなかった。一方、高脂肪食下mIRマウス(mIR/HFD)では糖新生酵素であるPEPCKは高脂肪食下野生型マウス(WT/HFD)と同様、絶食、再摂食によるリズムが見られなかったものの、G6Pase発現は再摂食後著明に増加した。そこで、mIR/HFDに、PEPCKの基質であるピルビン酸とG6Paseの基質であるグリセロールを腹腔内に投与し、血糖値の変化を調べた結果、ピルビン酸による血糖の上昇はWT/HFDと同じであったが、グリセロールによる血糖上昇は著明に増加し、グリセロールからの糖新生がmIRマウスでは多いと考えられた。そこで、脂肪での脂肪分解酵素の活性を調べた結果、再摂食でもその活性が抑制されないことが明らかになった。また、脂肪分解酵素・脂肪合成酵素のmRNA発現量を調べた結果、mRNAでは野生型と有意な差は認められなかったことから、高脂肪食負荷mIRマウスでは脂肪分解酵素の活性のみが増加していたことが明らかになった。以上の結果から、脂肪でのグリセロールの供給増加が肝臓でのG6Paseの発現量を増加させ、糖尿病を発症したことが示唆された。本年度は引き続き、肝臓でのインスリンシグナルとグリセロールの供給によるG6Pase発現量変化を詳細に解析するとともに、肝臓でインスリン抵抗性を示す他のマウスモデルを用い、脂肪でのグリセロールの供給増加が糖代謝に与える影響を検討する予定である。平成25年までの研究から高脂肪食負荷mIRマウスの糖尿病発症には、当初予想していた膵β細胞の脂肪毒性ではなく脂肪組織と肝臓での代謝変化が重要であることが明らかになった。特に、脂肪組織の脂肪分解が高脂肪食負荷により亢進することが判明し、脂肪分解により産生されたグリセロールが肝臓に取り込まれ、糖新生に利用され、高血糖が惹起されることが解明された。そこで、最終年度の平成25年度には、高脂肪食負荷により脂肪組織での脂肪分解が亢進する分子機構を解析した。その結果、mIRマウスの脂肪組織では、通常食下ではPPARγの発現が低下し脂肪分解が抑制されているものの、高脂肪食負荷時にはこの抑制がマスクされ、脂肪分解が過剰になることが明らかになった。そこで、mIRマウスに野生型マウスの皮下脂肪を移植したところ、高脂肪食負荷時の高血糖は有意に抑制され、脂肪組織のインスリン作用障害が高脂肪食負荷mIRマウスの糖尿病発症に重要な役割を果たすことが証明された。一方、マウスにグリセロールを投与すると肝臓での糖新生酵素の発現が誘導されることから、糖新生の亢進は肝細胞内の解糖系基質の量によって規定されることが明らかになった。本研究により、インスリン抵抗性マウスを用いて高脂肪食負荷時の糖尿病発症の1つのメカニズムが解明された。すなわち、脂肪組織での脂肪分解の亢進によりグリセロールが過剰産生され、肝臓で糖新生が亢進し糖尿病を発症するというメカニズムである。我々アジア人では肥満は軽度であるが糖尿病を発症する例が多く、mIRマウスと同様の機序が関与している可能性がある。脂肪細胞での脂肪分解抑制や肝臓での糖新生の抑制が新たな糖尿病治療標的となる可能性も示唆された。平成23年度は、高脂肪食負荷mIRマウスで糖尿病が発症する機序についてまず、膵β細胞の脂肪毒性の影響を検討した。その結果、意外なことに高脂肪食負荷mIRマウスでは膵β細胞量が著増しており、血中インスリン濃度も野生型の40倍以上と極めて高値であった。従って、膵β細胞が障害されて糖尿病が発症しているのではないことが明らかになった。そこで、高脂肪食負荷mIRマウスのインスリン作用を検討する目的で、各臓器の糖・エネルギー代謝を評価した。すると、高脂肪食負荷マウスでは、mIRマウスと野生型マウスの両者で、肝臓でのグリコーゲン利用が減弱しており、むしろ中性脂肪を利用していることが明らかになった。

一方、糖新生酵素であるPEPCKの肝臓での発現は、mIRマウスで異常が認められたが、高脂肪食負荷の処理でも同様の変化が認められ、PEPCKの発現変化だけでは糖尿病発症を説明することはできないと考えられた。そこで、エネルギー代謝状態を評価する目的で酸素消費量とその際の呼吸商を測定したところ、mIRマウスのみで暗期の脂肪利用が亢進していることが明らかになった。これらの結果に基づき、脂肪組織での脂肪酸合成や中性脂肪分解を評価したところ、mIRマウスでは摂食状態での脂肪分解がほとんど抑制されないことが明らかになった。既に視床下部のインスリンシグナルが白色脂肪組織での中性脂肪分解を制御することも報告されていることから、視床下部のインスリンシグナル異常が高脂肪食負荷mIRマウスの糖尿病発症の原因となっていることが示唆された。来年度は引き続き、代謝が変化しているステップを詳細に解析するとともに、視床下部のインスリンシグナルが糖代謝に与える寄与度を検討する予定である。インスリン受容体変異マウスを用いた実験で当初インスリン標的臓器である肝臓・脂肪・筋肉でのインスリンシグナルが障害されていると予測した。ところが普通食飼育下mIRマウスではインスリンシグナルの障害はほとんど見られず、むしろ代償的に膵臓からのインスリン分泌が増加し、肝臓と脂肪での脂肪合成などの経路は亢進していた。mIRマウスは高脂肪食飼育下のみ糖尿病を発症するマウスモデルであるが、シグナル全体の障害よりはむしろ脂肪代謝が選択的に障害され、糖尿病を発症することが判明した。現在は、mIR/HFDの糖尿病を治療する治療標的分子の絞り込みと、介入治療の実験を進めている。当初、β細胞と視床下部の脂肪毒性を評価し糖尿病発症を解析する予定であったが、β細胞の細胞傷害は予想外に軽度であり、糖尿病の主たる原因とは考えにくかった。ところが興味深いことに、高脂肪食負荷mIRマウスでは肝臓や脂肪組織の代謝調節の大きな障害が同定され、糖尿病の原因となっていることが判明した。既に脂肪組織の特定分子のシグナル異常が同定できており、糖尿病病態の分子レベルでの解析を進める根幹が捕らえられたと考えている。来年度はまず、肝臓でインスリンシグナルとG6Pase発現量がグリセロールによりどのように調節されているのかを詳細に解析する。また、グリセロールの供給源である脂肪での脂肪分解酵素の活性抑制による糖尿病治療の可能性も分子レベル、個体レベルで検討する。来年度はまず、各臓器における糖・エネルギー代謝関連分子の発現と活性が、高脂肪食負荷mIRマウスでどのように変化しているかを詳細に検討する。さらに、mIRマウスではインスリンシグナルのどの経路が障害されているかを各経路について検討する。さらに、視床下部の関与を検討する。平成25年度の研究費は上記の研究を推進するため、試薬等の消耗品購入にあてる予定である。平成24年度の研究費は上記の研究を推進するため、試薬等の消耗品購入にあてる予定である。
光挙動の系統的解明による逆フォトクロミック分子の確立

光照射によって2つの異性体間で物性変化が生じるフォトクロミック分子は機能性材料への応用が研究されているが、光照射時に消色する“逆フォトクロミズム"を示す分子は報告例が少ない。その一因として、逆フォトクロミック分子は現状、分子設計段階で逆フォトクロミズムを示すことが明確に予測できる分子骨格が確立されていないことが挙げられる。本研究では、ボルボルナジエン(NBD)誘導体を用い、明確に逆フォトクロミズムを示す分子としてそのフォトクロミック挙動を系統的に明らかにすることで、今までのフォトクロミック分子では不可能であった新たな物性を発現する分子を開拓し、これまでにない機能性材料への応用へと展開させることを目的とした。ノルボルナジエン(NBD)誘導体は光照射により二重結合部位の結合組み換えが起こることで、クアドリシクラン(QC)誘導体と呼ばれる多環状炭化水素へと変化し、触媒または熱的に元のNBDに戻ることが報告されている。この系では、光照射によりNBDの2つの二重結合が開裂してQCが形成される際、共役長が減少するために逆フォトクロミズムが生じることが期待される。これまでの研究結果から、これまで合成したNBD誘導体は、(1)NBDからQCへの光異性化率が低い、(2)NBD誘導体の長波長領域の吸光係数が小さく色変化が乏しい、(3)合成が難しく収率が低いと言った課題が挙げられる。平成30年度は、前年度に量子化学計算(DFT:B3LYP/6-31G (d))によって分子設計を行ったNBD骨格の片側の二重結合部位にドナーおよびアクセプター性置換基を導入した目的化合物の合成を試みたが、シクロペンタジエン誘導体とのDield-Alder反応がうまく進行せず、目的物合成には至らなかった。目的の物性発現を主体に分子設計を行ったが、合成法も考慮した分子設計が必要であった。本研究では、ノルボルナジエン(NBD)誘導体の置換基効果によるフォトクロミック挙動を系統的に明らかにし、新たな逆フォトクロミック分子を確立することを目的とする。光照射によって着色体から消色体に変化する逆フォトクロミック分子は、現状、分子設計段階で逆フォトクロミズムを示すことが明確に予測できる分子骨格が確立されていない。本研究では、NBD誘導体を用い、明確に逆フォトクロミズムを示す分子としてそのフォトクロミック挙動を系統的に明らかにすることで、今までのフォトクロミック分子では不可能であった新たな物性を発現する分子を開拓し、これまでにない機能性材料への応用へと展開させることを目的とする。そこで平成29年度は、合成の簡便化を図るため、片側の二重結合部位にドナーおよびアクセプター性置換基を導入した分子を新たに設計し、その合成を試みた。また、量子化学計算(DFT:B3LYP/6-31G (d))を行って適切な置換基を検討した結果、片側の二重結合部位にドナーおよびアクセプター性置換基を導入した系でも、比較的振動子強度の強い吸収が可視光領域に現れることがわかり、逆フォトクロミズムを示す可能性を裏付ける結果が得られた。平成29年度は年次計画に従い、片側の二重結合部位にドナーおよびアクセプター性置換基を導入した新規逆フォトクロミック分子の開発を試みた。この分子設計では、市販されている試薬を前駆体として用いることが可能なため、合成が簡便になるという利点があり合成過程は減らすことができた。しかし、各段階での目的化合物を単離・精製が計画どおりにいかず、現時点で目的とする化合物は得られておらず、平成29年度計画で目標にしていた新規逆フォトクロミック分子の開発まで至っていないため。

この系では、光照射によりNBDの2つの二重結合が開裂してQCが形成される際、共役長が減少するために逆フォトクロミズムが生じることが期待される。これまでの研究結果から、これまで合成したNBD誘導体は、(1)NBDからQCへの光異性化率が低い、(2)NBD誘導体の長波長領域の吸光係数が小さく色変化が乏しい、(3)合成が難しく収率が低いと言った課題が挙げられる。平成30年度は、前年度に量子化学計算(DFT:B3LYP/6-31G (d))によって分子設計を行ったNBD骨格の片側の二重結合部位にドナーおよびアクセプター性置換基を導入した目的化合物の合成を試みたが、シクロペンタジエン誘導体とのDield-Alder反応がうまく進行せず、目的物合成には至らなかった。目的の物性発現を主体に分子設計を行ったが、合成法も考慮した分子設計が必要であった。平成30年度は合成方法の再検討を行って、目的化合物の合成を試みる。また、目的化合物を合成次第、フォトクロミック特性の検討を行う。紫外可視分光光度計を用い、光照射前後の溶液の吸収スペクトル、および光照射によって生成する異性体の熱戻り反応過程の経時変化を測定して、フォトクロミック挙動の大枠をとらえる。また、光照射によって生成する異性体クアドリシクランの熱戻り反応速度が高速であった場合は、レーザーフラッシュフォトリシス測定や低温条件での分光測定を行って、フォトクロミック特性を明らかにする。当該年度は、分子設計・合成を行った目的分子が合成できず、フォトクロミック分子の物性評価を行うことができなかったため、当初購入を予定していた物性測定に必要な装置の購入を見送った。そのため、翌年度分として助成金の請求を行う。30年度は目的化合物合成のための試薬や必要となる物品の購入を検討している。また、測定を行う際に必要となる物品の購入も検討している。
学びでつながる国際交流

<研究目的>姉妹校である韓国春川教育大学校附設初等学校(以下、春川小)との毎年の文化交流にとどまらず教授法の交流によりその差違を明らかにする。互いの効果的な教授法を検証し、本校の授業改善に役立てると共に教育の国際化という観点から新たな国際交流の一形態になり得ると考え本研究に取り組んだ。<研究方法>1韓国美術教育の実際(文献分析、春川協力教員との情報交換)2授業実践による教授法の交流1春川教員の鑑賞授業(韓国の現代作家、水墨画鑑賞)を参観2春川6年生児童と図画工作科の一領域「造形遊び」の授業を実施3両校それぞれの水墨画鑑賞授業の指導案を交換し授業を実施<研究成果>本校では児童の主体性を重んじ、児童が授業を作り上げるという観点で授業を構成する。そのため授業の導入を熟慮すると共に児童自らが思考・判断等できるよう支援・指導を工夫する。一方、春川小では教師主導型の傾向が強い。春川6年生対象の造形遊びの実践では、導入で掲示物を使い児童と教師の言葉のやりとりの中で目標や活動内容等を把握し、その後児童が自由に考え活動する授業展開を行った。しかしこれは春川小児童には未経験の授業であった。授業を交換し実践することで初めて具体的な授業構成・展開等の重点や工夫の違いが見えた。美術鑑賞授業でもその違いは大きい。本校では作品提示後自由に感じたこと等を発言させ、目標に迫る展開をする。児童の感じ方を重視しようとする考え方である。しかし、春川ではまず作品説明(作者、テーマ等の情報)をする。必要な情報がなければ、鑑賞は深まらないという考え方である。鑑賞の主体の捉えが、作品か児童かという違いからくるものであろう。授業中の児童の発言や授業の感想を分析すると共通の感性を持ち得ていることもわかった。これは、文化のルーツを同じにしていることも理由の1つとして挙げられるだろう。情報交換だけでなく、実践することでより深く互いの教授法の特徴やよさを捉えることができた。
アンチザイムの心特異的ホメオボックス因子による転写制御と心形成異常への関与

本年度はAZ1ノックアウトマウスの胎生致死の究明を中心に解析を行った。解析当初観察された心室中隔欠損やその他の心発生異常は心特異的ホメオボックスNkx2.5欠損マウスと類似していた。またAZ1遺伝子周辺に複数存在するNkx2.5結合配列は、胎生致死との関連性を強く疑わせるものと思われた。しかし解析の結果、成体AZ1ホモ欠損マウスでは心室中隔欠損は観察されず、発育遅延に伴うものであることが明らかとなった。以後、心低形成のない胎仔にも高頻度に観察された肝低形成、全身蒼白に着目し解析を続けた。胎生13.5日(E13.5)の肝臓を構成する肝細胞、造血細胞、内皮細胞について、特異的分化マーカーを用いタンパク質発現解析を行った結果、ヘモグロビン(造血細胞)の発現はホモ欠損型で著明に低かった。胎児肝で造血細胞の分化ないし増殖異常が存在することが明らかとなり、貧血により全身蒼白を呈することが予測された。E15.5胎児血管に存在する有核赤血球率、多染性赤血球率がホモ欠損体で増加することより、貧血の存在を明らかにした。ホモ欠損体は卵黄嚢造血(一次造血)時に異常はないが、肝造血(二次造血)が盛んとなる時期に一致して、肝低形成、貧血が観察された。光顕、電顕を用いた組織学的、免疫学的観察により、E12.0以降、肝細胞索内で増殖中の二次造血赤芽球系に特異的にアポトーシス陽性細胞が観察された。前年度に報告したオルニチン脱炭酸酵素、ポリアミンが著明に増加することと、造血細胞の分化能、アポトーシス像との関連を分子レベルで解析中である。さらに血球分化能についてコロニーアッセイを用いて解析中である。造血細胞増殖の足場となる内皮、間質細胞には、電顕上形態異常は認められなかった。しかし血球分化因子を発現する間質細胞は、造血異常の原因となりうるため、血球細胞との共培養系を用いて解析中である。1.初代培養細胞系の確立:胎生10.5日生後3日のマウスの心臓より初代心筋細胞の培養を行った。拍動は12ケ月持続し、心発生過程にある胎生10.5日由来の細胞では心筋細胞の分裂像が1週間にわたって観察された。しかしその後分裂は持続せず、導入したレポーター遺伝子の発現効率も悪かった。そこで現在、温度感受性SV40 Large T導入トランスジェニックマウスから継代可能な心筋培養細胞を調製中である。2.Nkx2.5強制発現によるAZ1転写への影響:NIH3T3細胞にCAGプロモーター下でNkx2.5遺伝子を発現させたが、AZ1の転写レベルは変化しなかった。しかしNkx2.5によるAZ1の発現調節には心筋細胞固有の因子を要する可能性があるので、上記1の不死化心筋細胞で再検討を予定している。3.Nkx2.5ノックアウトによるAZ1転写への影響:DMSOを用いてマウス胎仔奇形腫由来P19細胞を心筋細胞へ分化誘導し、Nkx2.5を高発現するための培養条件を設定した。この細胞を用いてNkx2.5アンチセンスオリゴ(Morpholino)を用いたNkx2.5発現抑制がAZ1発現に与える影響を検討している。4.AZ1ノックアウトマウスの解析:ホモ欠損マウスの部分胎生致死の原因を調べる目的で胎仔解析(E13.518.5)を行った。ホモ欠損マウスで発育遅延による心低形成を一部に、肝低形成をほぼ全例に認めた。さらに心臓、肝臓、脳の生化学的検討で、致死直前(E13.5)の肝臓で特にオルニチン脱炭酸酵素活性と、細胞内プトレッシン濃度が著しく高値を示すことが明らかとなった。多機能臓器である肝臓の低形成は胎生致死の原因となる可能性が高く、ここに注目して肝細胞分化の指標となるアルブミン、肝内造血の指標としてグロビンなどの発現を解析するとともに、肝発生と心発生の相互の関連を検討していく予定である。ホモ欠損体は卵黄嚢造血(一次造血)

時に異常はないが、肝造血(二次造血)が盛んとなる時期に一致して、肝低形成、貧血が観察された。光顕、電顕を用いた組織学的、免疫学的観察により、E12.0以降、肝細胞索内で増殖中の二次造血赤芽球系に特異的にアポトーシス陽性細胞が観察された。前年度に報告したオルニチン脱炭酸酵素、ポリアミンが著明に増加することと、造血細胞の分化能、アポトーシス像との関連を分子レベルで解析中である。さらに血球分化能についてコロニーアッセイを用いて解析中である。造血細胞増殖の足場となる内皮、間質細胞には、電顕上形態異常は認められなかった。しかし血球分化因子を発現する間質細胞は、造血異常の原因となりうるため、血球細胞との共培養系を用いて解析中である。
新規血中miRNAによる糖尿病進行ステージと合併症リスクの迅速早期診断と治療応用

平成30年度は血中miRNAに注目し、(1)糖尿病とその合併症に関わる種々の病態を迅速・高感度・低侵襲で診断できるmiRNAマーカーの開発と治療応用を行った。並行して、(2)ゼブラフィッシュを用いて飼育条件や動脈硬化の評価法の確立をめざした。平成30年度は平成29年度に引き続き、(1)として、以下の(a)及び(b)を行った。(a)インフォームドコンセントの得られた被験者の追加を行った。追加した被験者について、1血液及び尿の生化学検査により、インスリン分泌能を推測し分類した。さらに、2糖尿病性網膜症検査、糖尿病性腎症検査及び糖尿病性神経障害検査により糖尿病の合併症について病態を評価した。そして、計15名の被験者を、「インスリン抵抗性であるが、糖尿病でない」群と「糖尿病であるが、合併症の併発はみられない」群と「糖尿病であり合併症も併発している」群の3群に各群5名ずつ分類した。各被験者について採血を行い、血清を分離して(b)のmiRNA精製に用いた。(b)(a)で得られた血清から、血清中の全分泌型miRNAを精製した。定量的RT-PCRの条件決定済みのインスリン抵抗性特異的に発現上昇しかつ発現絶対量の多い9種類のmiRNAについて、(a)の15名の被験者血清中の発現量を定量中である。これと並行して、平成30年度は、(2)として、以下を行った。ゼブラフィッシュ野生型に高脂質食を摂取させ、動脈硬化を発症していると考えられる肥満モデルを作出した。インドシアニングリーンをこのモデルの背側大動脈に注入して血管造影を行った結果、高脂質食摂取群では、普通食摂取群に比べ、動脈硬化巣と考えられる特定部位が高S/N比で検出された。さらにこれらの部位は、血管の動画造影により、1020μm程度の蛍光として散在性に観察され、ゼブラフィッシュの動脈硬化過程の高精細なリアルタイムイメージングが可能となった。糖尿病とその合併症に関わる種々の病態を迅速・高感度・低侵襲で診断できるmiRNAマーカーの開発に向け、平成30年度は平成29年度にひきつづき、「2型糖尿病患者の病態と分泌型miRNA発現との相関解析による診断用miRNAマーカーの絞込と最適化」と「診断用miRNAマーカーに対する阻害分子等設計とエクソソームデリバリーによる病態改善効果の検証」を行うため、主に次の3点を重点項目として研究を行った。1被験者数を増やすため、インフォームドコンセントを得たうえで、インスリン抵抗性のみで糖尿病を発症していない被験者と様々な糖尿病の進行ステージにある被験者にさらに本研究に参画いただき、生化学的・生理学的検査データからその分類をすること、2既に平成29年度に定量的RT-PCRの条件決定済みであったインスリン抵抗性特異的に血中発現量が増加するmiRNA9種類について、1の被験者血清中での発現量を定量すること、3ゼブラフィッシュを用いたインスリン分泌能と動脈硬化の改善効果検証を行うためのシステム構築を行うこと。1については、平成30年度は、インスリン抵抗性のみで糖尿病を発症していない被験者と進行ステージが初期の被験者に本研究に参画いただくことができ、被験者数が大幅に増加した。今後、健常者の被験者数を増やす必要がある。2については、1の被験者血清中の全分泌型miRNAの精製を行い、上述の9種類のmiRNAについて、定量的RT-PCRによる発現量定量を行っている。3については、ゼブラフィッシュ飼育条件やインドシアニングリーンを用いた動脈硬化の評価法が確立できた。従って、平成30年度は、被験者数はほぼ目標に達し、健常者の被験者数が少ないものの、おおむね順調に研究が進展していると考えられた。平成30年度の課題は、「健常者、インスリン抵抗性であるが糖尿病でない被験者、様々な糖尿病進行ステージにある被験者に本研究に参画いただき、生化学的・生理学的検査データからその分類をする」という重点項目について、健常者の被験者数が少なく、規定数に達しなかったことである。従って、平成31年度は、インフォームドコンセントに基づき、本研究に参画いただけるよう、健常者に対して引き続き依頼を行っていく。被験者数確保と合わせて、より少ない血液から高感度でmiRNA定量ができるRT-PCR条件を検討するとともに、発現量変化が糖尿病とその合併症の病態と高い相関性をもつmiRNAを選抜して、標的遺伝子を予測する。予測された遺伝子群に対して、機能別分類(GO解析)を行い、情報を統合して、診断用miRNAマーカーを決定する。一方、平成30年度は、「ゼブラフィッシュを用いたインスリン分泌能と動脈硬化の改善効果検証」のためのゼブラフィッシュ飼育条件やインドシアニングリーンを用いた動脈硬化の評価法が確立できたので、平成31年度は、発現量変化が糖尿病とその合併症の病態と高い相関性をもつmiRNAまたは、その阻害分子をゼブラフィッシュに導入して、動脈硬化への影響を評価する。インスリン抵抗性はインスリン分泌低下の要因であり、正常血糖状態でも血管障害を惹起し糖尿病三大合併症も誘発する。しかしこれらを数値で早期診断できれば、進行度や合併症リスクを評価でき、予防や予後改善に直結する。申請者は膵β細胞の小胞体ストレスでmicro(mi)RNA発現が攪乱されインスリン分泌が低下すること、インスリン抵抗性が特定のヒト血中miRNAの発現を増加させ、インスリン分泌低下や動脈硬化に関与する可能性を見出した。

そこで平成29年度は血中miRNAに注目し、以下の(1)により、糖尿病とその合併症に関わる種々の病態を迅速・高感度・低侵襲で診断できるmiRNAマーカーの開発と治療応用をめざした。(1) 2型糖尿病患者の病態と分泌型miRNA発現との相関解析による診断用miRNAマーカーの絞込と最適化平成29年度は(1)として、以下の(a)及び(b)を行った。(a)インフォームドコンセントの得られた糖尿病患者について、1血液及び尿の生化学検査により、血糖値関連及びインスリン分泌関連の各検査を行い、インスリン分泌能を推測し分類した。2眼底検査及び視力検査による糖尿病性網膜症検査と、3血液及び尿の生化学検査による糖尿病性腎症検査、4腱反射検査と知覚検査による糖尿病性神経障害検査、により糖尿病の合併症について病態を評価し、糖尿病患者を分類した。各患者について採血を行い、血清を分離して(b)のmiRNA単離・濃縮に用いた。(b)(a)で得られた糖尿病患者血清から、血清中の全分泌型miRNAを単離・濃縮した。同定済みのインスリン抵抗性特異的に発現変動する49種類のmiRNAのうち、インスリン抵抗性特異的に発現上昇しかつ発現絶対量の多い9種類に注目し、定量的RT-PCRの条件を確立した。糖尿病とその合併症に関わる種々の病態を迅速・高感度・低侵襲で診断できるmiRNAマーカーの開発に向け、平成29年度は、「2型糖尿病患者の病態と分泌型miRNA発現との相関解析による診断用miRNAマーカーの絞込と最適化」を行うため、主に次の2点を重点項目として研究を行った。1インフォームドコンセントを得たうえで様々な糖尿病の進行ステージにある被験者に参画いただき、生化学的・生理学的検査データからその分類をすること、2既に同定済みであったインスリン抵抗性特異的血中miRNA49種類について、その発現変動パターンや発現絶対量、予測された標的遺伝子機能等を指標に、解析に優先順位づけを行った後、定量的RT-PCRの条件を確立すること。1については、平成29年度は、糖尿病の進行ステージが進み合併症を併発している被験者に参画いただくことができたが、進行ステージが初期の被験者数が少なかった。2については、インスリン分泌低下や動脈硬化発症に関わると機能予測されたmiRNAはインスリン抵抗性特異的に血中発現量が増加し、その発現絶対量が多い傾向にあったことから、9種類のmiRNAを選抜し、定量的RT-PCRの条件が確立できた。従って、平成29年度は、被験者数に課題があるものの、おおむね順調に研究が進展していると考えられた。平成30年度は血中miRNAに注目し、(1)糖尿病とその合併症に関わる種々の病態を迅速・高感度・低侵襲で診断できるmiRNAマーカーの開発と治療応用を行った。並行して、(2)ゼブラフィッシュを用いて飼育条件や動脈硬化の評価法の確立をめざした。平成30年度は平成29年度に引き続き、(1)として、以下の(a)及び(b)を行った。(a)インフォームドコンセントの得られた被験者の追加を行った。追加した被験者について、1血液及び尿の生化学検査により、インスリン分泌能を推測し分類した。さらに、2糖尿病性網膜症検査、糖尿病性腎症検査及び糖尿病性神経障害検査により糖尿病の合併症について病態を評価した。
近接場光プローブによる有機微結晶表面のナノスケール光誘起アブレーション

ペリレン微結晶の近接場光による表面加工に関して、以下のことが明らかになった。前年度の研究で、室温において、ペリレン微結晶の励起子吸収帯付近の紫外線を近接場光プローブにより局所的に照射すると、結晶表面に穴が生じること、光誘起構造変化が100nm程度のスケールで起こることを明らかにした。1.光誘起構造変化の効率が励起子吸収ピークでなく、少し高エネルギー側の表面励起子エネルギー付近で最大となる。光弾性変調器により偏光特性を精密に測れる測定系を整備し、励起子吸収の偏光選択則に従うことを示した。2.光誘起構造変化が単なる熱分解ではなく、表面励起子の生成(電子励起)によって生じることから、光誘起分子乖離が起こっていることが示唆された。同時に分子の部分分解による沸点低下も候補と考えられる。3.光誘起構造は光照射停止後に、表面エネルギーを下げるようにナノスケール構造を変える。その速度は数nm/分であることが求められた。4.以上の結果を踏まえて、光誘起構造変化が特異な表面分子移動及び表面脱離により生じていることが現象論的に明らかとなった。5.光アブレーションがどの様な有機物で可能かを調べる目的で、フィブロイン、ナノタレンについてレーザー照射下での発光スペクトル変化を調べた。6.今後は光照射時の生成物の同定などを通じて、ペリレンの光加工の原理を明らかにするとともに、同様の現象が他の有機微結晶でも実現するかを探索し、光加工後の安全性を追求する。ペリレン微結晶の近接場光学顕微鏡観察により、以下のことが明らかになって。1.室温において、ペリレン微結晶の励起子吸収帯付近の紫外線を局所的に照射することによって結晶表面にくぼみが生じること、光誘起の構造変化が100nm程度のスケールであることを明らかにした。2.光誘起構造変化の励起光エネルギー依存性、偏光依存性の測定から、構造変化の効率が励起子吸収ピークでなく、少し高エネルギー側の表面励起子エネルギー付近で最大となること、励起子吸収の偏光選択則に従うことを示した。光弾性変調器により偏光特性を精密に測れる測定系を整備した。3.光誘起構造変化が単なる熱分解ではなく、表面励起子の生成(電子励起)によって生じることから、光誘起分子乖離が起こっていることが示唆された。4.光誘起構造は光照射停止後に、表面エネルギーを下げるようにナノスケール構造を変えることが明らかになった。5.以上の結果を踏まえて、来年度は光照射時の生成物の同定などを通じて、光誘起構造変化、表面分子移動のメカニズムを明らかにする。
ナノメータ分解能を有する小型卓上の3次元透過X線顕微鏡の開発

本研究は、卓上-走査電子顕微鏡(SEM)をベースに「ナノメータ分解能を有する小型卓上の3次元透過X線顕微鏡(3D-TXM)の開発」である。先行研究[1]において研究開発した多層カーボンナノチューブ(MWNT)の冷陰極電界放出電子源(CFE)を搭載した卓上-SEMでは分解能10 nmを記録したが、高倍率観察時に60 HzのノイズがSEM像に現れる問題点があった。このノイズは、ターボ分子ポンプなどから発生する電磁場に対する電磁シールドが不足していたことが明らかになってきた。現在、電磁シールド対策を行った卓上-SEMにおいて、タングステンの熱電子源を用いて分解能約20 nmを得ることができている。したがって、MWNTのCFEを搭載することにより、更に、分解能の改善が見込まれる。本研究で開発するTXM装置では、SEMの電子ビームによりX線を発生させ、TXM像を観察するものである。それゆえ、TXM像は電子ビームのスポットサイズ、電流量と安定性に依存するため、これらを考慮し引続き電子源を検討したいと考えている。また、TXM装置の開発は、現在、作製した部品を組上げ大気圧下で試料観察が可能となった。具体的には、X線が透過できる窒化シリコンメンブレンX線用窓を取り付けたコネクターの設計作製を行い、X線を大気圧下に取り出せる様に改造を行なった。まだ、観察を開始した直後であり、分解能の評価については、もう少しデータを集め定量的な評価を行うことが必要である。申請時に開発ベースに検討していた卓上-SEMが利用できず、他の卓上-SEMをベースに研究開発することとなった。そのため、装置と共に各種部品の再設計を行うことに時間を要したが、現在、設計を完了し本学内の技官さんと相談の上、作製を行なっている。作製できた部品から装置に搭載し、研究開発を進めている。その中で、これまで問題だったSEM像に含まれていたノイズの特定と電磁シールドによる改善ができた。予定としていた、1大気圧下で試料を観察できるようにTXMを改造することは、達成できた。次に、2大気圧下におけるTXM像の観察と分解能評価について、作製したTXM装置を用い大気圧下で試料観察できることを確認した。分解能評価については、まだ、観察を開始した直後であり、もう少しデータを集め定量的な評価を行うことが必要である。引続き、大気圧下でのTXM像の分解能評価を行うと共に、計画していた3電子ビームを安定化し分解能の改善する43D-TXM像の観察と評価を実施する。3に関しては、上述の電磁シールドにより、より安定した電子ビームが得られる様になった。TXM装置に最適な電子源を検討選定する。研究計画上、翌年度に予算を使用することを予定しているため。
大気光多波長イメージング観測による中層大気波動現象の研究

昨年度に製作した多波長全天撮像装置については、イメージインテンシファイアー直前の結像レンズのピント位置が、観測波長によって微妙に異なるという問題があることがわかっていた。昨年度まではその調整をマイクロメータを使用して手動で行っていたが、本年度、ステッピングモーターを組み込んでピント調整を自動化した。これによって観測開始から終了まで完全自動観測が可能となり、観測効率が向上するとともに観測モードの選択の自由度も増した。蛍光シートを貼った半球プラスチックドームと標準光源を用いて、観測毎に装置の絶対キャリブレーションと感度むら補正を行った。その結果装置の視野全体にわたって絶対値測定の精度が向上した。特にOH大気光の観測からOHの回転温度を導出するためには、この絶対値キャリブレーションは不可欠であり、今回の改良がOHの回転温度の導出を成功に導いた。このような改良を施した多波長全天撮像装置を使用して酸素原子557.7nm及び630.0nm、OH大気光の観測を東北大学蔵王観測所において実施した。酵素原子630.0nmの観測からは地磁気活動の活発化に呼応して電離層を伝播する擾乱(TID)や大気重力波に伴う増光が捉えられた。またOH大気光の観測からは回転線の強度化の温度依存性を利用して、OH(8-3)バンド回転温度の2次元分布の時間変動を導出することに成功した。
事業者間取引における不公正取引と経済法：欧州における法規制との比較

フランチャイジー,一人親方,農家,フリーランサー,自営的就労者等,小規模・零細事業者であって取引上,劣位におかれがちな者に対して取引上の地位を濫用する行為の実態と規制の状況を踏まえて,このような問題を競争法又はこれを補完する各種のルールを通じて解決する方法を検討した。また,これらの者の取引上・経済上の地位を向上させるために可能な方策として,競争法上の団体交渉適用除外制度,協同組合制度とその活動に対する競争法の適用除外,労働組合法上の労働者性を承認することについて検討した。これらの問題については,今年度中に,EUにおいて食品及びプラットフォームに関係して,不公正取引(unfair trading practices)問題を解決するためのルール構築の動きがあり,EU加盟国においては競争法その他法令によりこの種の行為を規制するようになる動きがみられる。また,競争法上,団体交渉及びボイコットの適用除外制度を備えるオーストラリアに比較法的に重要な先例及び議論が蓄積している。韓国・台湾は優越的地位濫用を活発に規制してきたことで知られている。このようなことから,オーストラリア労働法研究者及びオランダの競争法研究者と日本において共同調査・研究を実施し,共著論文の執筆に向けた準備を進めるとともに,東アジア圏における規制の状況に関する情報収集に努めた。また,市場メカニズムに過度な介入を行うことなく公正で効果的なエンフォースメントのあり方を,上記研究者と英国を拠点とする研究者とともに議論し,英国研究者とはこの角度からの研究の端緒としてカルテルにかかる競争法執行のあり方にかかる共著論文を完成させた。これらの一連の研究・調査から,日本独禁法の特徴である不公正な取引方法の規制について考察を進めることができた。この考察を踏まえて,日本の独禁法全体を説明する英書を執筆して刊行した。平成27年度においては,EU及び英国並びにオーストラリアについて食品分野における事業者間不公正取引にかかる規制の状況について調査した。さらに,この問題を理解し分析する上での前提となるEU競争上の「支配的地位」の概念について調査し,研究結果を論文として公表した。米国についても同様の観点から食品分野において競争効果分析がどのように行われるかを調査・検討し,関連する事例について研究会で報告した。また,これら調査結果を踏まえ示唆を得つつ,日本における優越的地位濫用規制についての理論的考察を行い,この結果を共著論文として公刊するとともに,研究会において報告を行った。公共調達分野における不公正取引の規制のあり方を検討し,EU及び英国(イングランド及びスコットランド)における状況をEU不公正取引指令,これを国内法化する英国・スコットランド法令及び最低生活賃金の公契約における採用状況についての研究論文をまとめた。競争法ないし事業者間取引規制上の不公正取引規制を検討する上では,そもそも事業者とは何であるのかの検討が必要となる。この課題について示唆的なEU競争法上の労働者と事業者の境界ないし労働者概念について関連する欧州裁判所判決について研究報告し結果を公表した。平成27年度中に予定したことは,ほぼ行うことができ,加えて当初予定しなかった支配的地位及び労働者・事業者概念についても射程を広げて研究を行うことができた。また,とくに公共調達分野におけるEU法及び欧州加盟国法における公正性確保については,関連する法令の解析にとどまらず英国を中心とした実態調査を行ったり,加盟国法化の状況を英国,ドイツ,フランス及びこれらの国の自治体についてもある程度調査するなど広がりと厚みのある研究を実施することができた。他方で,英国の食料雑貨品分野における綱領審判官制度に関しては,同制度の運用面で目立った進展が平成27年度中の相当な期間内にみられなかったため,論文執筆・公表等を行うには至らなかった。本年度においては,平成27年度の研究調査成果を踏まえて欧州・英国における公共調達司令等の法令及び公契約条例に関する論文を公表した。あわせて公共調達・公契約にかかる諸問題の中でも,建設・医療・介護分野における不公正取引の状況について観察した。これらの調査・検討を通じて,形式的には自営業者でありながらも特定の事業者との取引に依存する経済的従属状態にある者に対する不公正取引の問題が明らかとなったことから,これらの者に対する法的保護及び経済的地位の強化のあり方を労働法(なかでも労働組合法)上のルールとの関係も考慮しつつ考察し,その結果を論文にまとめた。あわせて,この観点から特徴ある法制度を有するオーストラリアに着目し,同国における競争法上の事業者間団体交渉適用除外・認可制度の調査検討に着手した。食料品ないし流通分野における不公正取引問題については,英国の食料雑貨品分野における綱領審判官制度を含めてEU競争法及び加盟国法の動きを検討した。英国については年度半ばまでにまとまった論文を作成するに値するといえる程度の動きが観察されなかったことから,不公正取引について比較法的に興味深い規制制度を有するフランス法について調査を行った。また,この中で,電子消費者向取引分野において有力なプラットフォーム事業者が用いる取引慣行に競争政策ないし不公正取引の観点から問題となる行為が存在していることが明らかとなった。これらの調査研究を踏まえて,オンライン上のプラットフォーム事業者による最恵待遇条項について研究し論文を公表するとともに,特にフランス法上の執行事例についてディスカッションペーパーの共同執筆に着手した。昨年度中に着手したEU法上の「目的による制限」の研究結果を論文等において用い,競争政策・競争法執行上の公正性概念の位置づけにかかわる諸問題について日本内外の学会等において報告・議論した。平成27年度末において平成28年度中に推進を予定した事項については,ほぼ計画通り達成することができた。

さらには,昨年度末には研究課題として適切であるかどうかについて必ずしも確信のなかったオンライン取引上の取引慣行について論文を完成公表することができ,また事業者間団体交渉制度をはじめとする研究事項についても研究を着手することができた。フランスにおける事業者間不公正取引規制の運用状況をオンライン取引(プラットフォーム)における同等性(最恵待遇)条項にかかる事例を通じて明らかにするディスカッションペーパー(共著)を完成し公表した。事業者間団体交渉について,オーストラリア競争消費者法上の団体交渉適用除外制度の運用・利用状況を調査し,この結果を踏まえつつ,日本・オーストラリアにおける団体交渉・団体行動にかかる独禁法・協同組合法及び労働組合法上の規律のあり方について,同国研究者との共同研究及びディスカッションペーパーの執筆に着手した。交渉力格差があるために不公正取引ないし優越的地位濫用行為が問題となりやすい小事業者,なかでもフリーランス,一人親方等,自営的就労者(self-employed worker)ないし人的役務供給者と発注者・使用者との取引関係の実態を把握しつつ,この種の取引関係においてみられる発注者側の単独・共同行為に対する独禁法及び下請法上の規制のあり方,並びに,独禁法と労働法の関係について研究し,その成果を論文,研究会,公正取引委員会競争政策研究センター内に設置された検討会等において公表した。電子取引・プラットフォーム事業分野でみられる事業者間の取引慣行について調査研究し,その成果の一部を研究会で報告した(なお,本問題については,プラットフォームのもつ経済的特徴等を踏まえ排除・搾取行為に関する規制のあり方について総合的に把握する必要があることが明らかになったため,別の研究プロジェクトの一環として研究を実施することとした。)。これらの諸行為に対する独禁法の執行のあり方について,日本,英国,フランス,オーストラリアにおける競争法執行制度及び運用状況と比較することにより検討を行った。平成28年度末において,平成29年度中にはフランスにおける事業者間不公正取引規制の運用状況をオンライン取引(プラットフォーム)における最恵待遇条項にかかる事例を通じて明らかにするディスカッションペーパーの完成と公表,オーストラリアにおける事業者間団体交渉制度についての研究を行うこと,労働集約性の高い事業分野における取引実態の把握と規制のあり方の研究を行う予定であったところ,前記5記載の通り,この計画を超える内容の研究調査を実施することができた。フランチャイジー,一人親方,農家,フリーランサー,自営的就労者等,小規模・零細事業者であって取引上,劣位におかれがちな者に対して取引上の地位を濫用する行為の実態と規制の状況を踏まえて,このような問題を競争法又はこれを補完する各種のルールを通じて解決する方法を検討した。また,これらの者の取引上・経済上の地位を向上させるために可能な方策として,競争法上の団体交渉適用除外制度,協同組合制度とその活動に対する競争法の適用除外,労働組合法上の労働者性を承認することについて検討した。
活性酸素により活性化するATMキナーゼのシグナル伝達経路の解明

ATMタンパク質はDNA損傷や活性酸素に応答して活性化するリン酸化酵素(キナーゼ)の一つであるとされているが、DNA損傷応答と活性酸素応答でのATM下流シグナルの差異については明らかにされていない。そこでこれらを明らかにするために、まずは抗体を用いたATM特異的な基質の検出を行った。その結果、活性酸素応答時のみに観られるATM基質の検出に成功した。以上の成果から、DNA損傷応答時と活性酸素応答時でのATM活性化経路が異なることが明白となった。今後はリン酸化プロテオーム解析を行うことで、ATMキナーゼが関与するシグナル経路が明らかになることが大いに期待できる。本研究では超高感度プロテオーム解析システムにより、活性酸素依存的に活性化するATMキナーゼのシグナル伝達経路を明らかにすることを目指している。本研究で得られる新規経路と既知の活性酸素シグナル経路との情報統合から得られる知見は、生体がもつ活性酸素応答機構の包括的理解に寄与することが強く期待できる。平成25年度は主として、1)野生型、変異型ATM発現細胞株の構築、2)大規模プロテオーム解析法の改良、3)抗体によるATM基質のリン酸化検出、を行った。1)について、FLAGタグ融合ATM発現プラスミドを培養細胞株に導入したところ、内在性ATMと比較してFLAG-ATMの発現量が非常に低く、異なる発現システムの必要性が示唆された。2)については、プロテオームサンプル調製における前分画法として、高pH緩衝液を用いた逆相クロマトグラフィーによるトリプシン消化物分画法の開発を行い、全プロテオーム解析では7,000以上のタンパク質同定、リン酸化プロテオーム解析では25,000以上のリン酸化部位の同定に成功した。3)では、ATM基質上のリン酸化モチーフに対するモノクローナル抗体を用いたウエスタンブロット解析を行った。0.01 mg/mlブレオマイシン処理(DNA二本鎖切断誘発)ではATM(自己リン酸化)、Chk2(ATM基質)及びH2AX(DNA二本鎖切断マーカー)のリン酸化が、0.25 mM過酸化水素処理(酸化ストレス付与)ではATM及びChk2のみのリン酸化が期待された通りに観られた。この条件下で、過酸化水素処理ではブレオマイシン処理と比較して、有意に少ないATM基質のリン酸化が検出された。このことから同程度のATM活性化状態下でも、酸化ストレス処理によるリン酸化シグナル経路はDNA二本鎖切断時と比較して大いに異なる動態によって制御されていることが示唆された。これまで、ATMタンパク質はDNA損傷に応答して活性化するリン酸化酵素(キナーゼ)の一つであるとされていたが、DNA損傷非依存的に活性酸素によっても活性化することや、2種の活性型ATMの基質に違いがあることが示唆されているが、活性酸素応答リン酸化ATMの下流シグナルについてはほとんど明らかにされていなかった。そこで活性酸素依存的(DNA損傷非依存的)に活性化するATMのシグナル伝達経路を明らかにするために、まずは抗体を用いたATM特異的な基質の検出を行った。本研究ではヒト培養細胞株からATM欠損細胞株を樹立し、ATMキナーゼの基質のリン酸化検出を、ATMリン酸化モチーフに対する複数のモノクローナル抗体を用いたウエスタンブロット解析により行った。0.01 mg/mLブレオマイシン処理(DNA損傷誘発)ではATM(自己リン酸化)、Chk2(ATM基質)及びH2AX(DNA二本鎖切断マーカー)のリン酸化が、0.25 mM過酸化水素処理(酸化ストレス付与)ではATM及びChk2のみのリン酸化が期待された通りに観られた。この条件下で、過酸化水素処理ではブレオマイシン処理と比較して、有意に少ないATM基質のリン酸化が検出され、さらに過酸化水素処理時のみに観られるATM基質の検出に成功した。またこれらのATM基質のリン酸化は、遺伝子破壊細胞株を用いることでATM特異的なものであることが確認された。今後は、本研究で樹立した遺伝子破壊株を用いたリン酸化プロテオーム解析を通して、各リン酸化部位の質的・量的変動を網羅的に解析すること、さらに全プロテオーム解析により、遺伝子発現変動を網羅的に観ることで、ATMキナーゼが関与するシグナル経路が明らかになることが大いに期待できる。分子生物学当初の予定では、プロテオーム解析に用いる発現細胞株の構築及びそれらを用いたプロテオーム解析の実施までが平成25年度の計画であったが、発現細胞株の構築の難航により計画が遅れている。本研究ではFLAGタグ融合タンパク質として、野生型及び変異型の外来ATMを発現する細胞株の利用が必須であるが、生理的条件を考えた上で、それらの発現量は内在性ATMタンパク質と同程度である必要性がある。そこで、導入プラスミドからの発現とは異なる発現システムの構築の立案に至った。

細胞株樹立と並行して、プロテオーム解析法の改良やモチーフ抗体による基質リン酸化の検出を行ったが、これらの技術開発や異なるアプローチでのリン酸化タンパク質の検出法に目処がついた点は、平成26年度の研究計画の推進に大いに役立つことが強く期待される。細胞株の樹立として、CRISPR/Casシステムの導入を行う。これにより、マウス細胞でのnull細胞と同様に、ヒト培養細胞でのATM-null細胞の樹立が期待される。さらにゲノム中のATM遺伝子領域に、N末端FLAGタグの挿入、及び点突然変異の導入を行い、細胞株の樹立を行っている。樹立が完了次第、これら細胞株を用いて、当初計画のプロテオーム解析を実施する。また多段階の経時変化を観るために、6-plexもしくは10-plexのTMTラベル法(平成25年度に検討済み)を用いてプロテオームサンプル解析のハイスループット化を図る。また、モチーフ抗体による免疫沈降物の定量的な質量分析も行い、ショットガンプロテオーム解析よりもさらに高感度な基質リン酸化の経時変化を解析する予定である。
活性ホウ化物前駆体からのホウ化チタン粉末の固相合成と評価

ホウ化チタン(TiB_2)は、高融点・高硬度であり、化学的安定性に優れ、電気伝導性をもつので、その焼結体は耐摩耗材料、電極材料、耐食容器材料への応用が期待されている。TiB_2の生成反応熱は極めて大きいので、固相反応による易焼結性の微細な活性粉末を合成するためには、TiB_2生成反応の制御が必要である。本研究では、出発原料の適切な選択と雰囲気前処理によりホウ化物前駆体を形成し、これを加熱処理して急激なTiB_2生成反応を制御した。さらに、合成粉末からホットプレスによりTiB_2単相焼結体を作製し、その焼結性を評価した。1.金属チタンと非晶ホウ素からのTiB_2粉末の合成:金属チタンと非晶質ホウ素との混合粉末をAr気流中で600°C、60minの前処理すると、低結晶性の少量のTiB_2が生成した。この試料をAr気流中で900-1500°Cの加熱処理することにより、粒径15-20μmのTiB_2粉末が生成した。合成粉末は、粒子内部に空洞を含み、焼結には適していなかった。2.水素化チタンと非晶質ホウ素からのTiB_2粉末の合成:B/Ti=2.0組成の混合粉末を、H_2+Arの混合気流中で600°C、60min前処理するとTiH_2が生成した。続いて700-800°Cで加熱処理するとTiH_2が分解し、水素を固溶したチタンが生成した。これを1000°C、360minの条件でさらに加熱処理すると空洞のない単一相TiB_2粉末が得られた。3.窒化チタンと非晶質ホウ素からのTiB_2粉末の合成と焼結体の評価:粒径0.5-3μmのTiN粉末と非晶質ホウ素粉末をB/Tin=2.2の組成で混合し、Ar雰囲気中で、1400°C、360min加熱処理すると、TiB_2生成反応が適度に制御されて、微細な活性TiB_2粉末が合成できた。合成粉末(TiB_2+0.2B)に10mol%の金属Ti粉末を添加した定比組成の混合粉末を20MPa、1800°C、30minの条件でホットプレスすると、相対密度98%、ビッカ-ス微小硬度2850kg/mm^2のTiB_2単相焼結体が得られた。ホウ化チタンは、高融点、高硬度をもち、化学的にも安定であり、電気伝導性をもつことから、耐摩耗性、電極材料、耐食容器材料への応用が期待される。しかし、ホウ化チタンは難焼結性であり、助剤を含まない高純度焼結体の諸性質はまだ明らかにされていない。本研究では、固相反応により活性なホウ化物前駆体から易焼結性のホウ化チタン粉末を合成することを目的としている。