hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
ダイズにおけるカルコンシンターゼ遺伝子の発現調節と紫外線耐性機構の分子的解析

その結果、第1遺伝子のプロモーターは表皮組織で働き、かつ地上部に特異的なプロモーター機能をもつことが判明した。しかしながら、紫外線応答機能や、第5遺伝子のプロモーター機能に、mRNAの蓄積量による昨年度の解析と一見矛盾するような点もあり、今後の検討を要する。遺伝子の発現量を増大するための方法にはプロモーター機能を強化する方向と供にプロモーターに作用して遺伝子発現を促す分子的機構を改変する方向が考えられる。そこで、CHS遺伝子の転写開始に直接関わる転写因子に注目した。特に、トウモロコシにおけるMYB相同性因子Pはフラボノイド合成経路の酵素遺伝子群を活性化する因子であり、プロモーターDNA上の配列CC (T/A) ACCを認識することが明らかにされているが、丁度これと同じ配列をもつH-boxが紫外線によって発現調節を受けるCHS遺伝子のプロモーター領域にも共通して見い出される。本実験ではP因子に相当するMYB相同性因子をダイズにおいて探索した。その結果、16種の関連分子種の存在が同定され、その中には紫外線UV-Bにより発現量の増大する遺伝子の断片とみられるものがいくつか見つかった。これらのMYB相同性因子がUV-BによるCHS遺伝子の発現調節に関わっている可能性があり、その機能を解決することが今後の検討課題である。
幹細胞スフェロイド間相互作用と細胞分化特性の関係性

これまでの研究ではスフェロイド間相互作用の影響によってスフェロイド近傍の酸素環境が変化し、iPSスフェロイドの分化特性が変動することを明らかにしてきた。さらに、この現象のメカニズムを探索すると、自己分泌タンパク質であるWnt5aの発現が分化特性の調節に関与している可能性を見出した。当年度は独自のマイクロウェルチップ技術を利用して幹細胞スフェロイド近傍の酸素環境を変化させ、酸素環境の変動と幹細胞分化特性の相関性について評価した。酸素非透過性基板と酸素供給量がおよそ15倍向上する酸素透過性基板を用いて神経幹細胞(NSC)および間葉系幹細胞(MSC)スフェロイド培養を行った。両基板における分化特性を比較したところ、どちらの幹細胞スフェロイドにおいても酸素透過性基板で分化速度が向上した。このことから幹細胞スフェロイドの酸素応答性には違いがあり、iPS細胞は酸素環境変化に敏感な幹細胞種であることが考えられる。また幹細胞スフェロイドの酸素応答現象の発展研究として肝細胞と脂肪組織由来幹細胞(ADSC)を共培養させた共培養化スフェロイドにおける機能発現と酸素環境の相関性について評価した。その結果、酸素供給性の違いによって向上する肝特異的機能発現に違いが生じた。この現象は肝細胞のみで構築されたスフェロイドでは発生しなかったことから、ADSCの存在が共培養化スフェロイドにおける酸素応答現象に関与していることが推測される。そこでこの現象のメカニズムを探索したところ、WntタンパクならびにTGFβ1の発現が肝細胞の機能発現に関与している可能性を見出した。これらの結果より、酸素応答性に違いは生じるものの、スフェロイド近傍の酸素環境に応じたWntタンパク発現の発現はあらゆる幹細胞分化特性を支配する共通のメカニズムである可能性を本研究によって明らかとした。平成30年度が最終年度であるため、記入しない。独自のマイクロウェルチップ技術を利用してiPSスフェロイド近傍の酸素環境を変化させ、酸素環境の変動と幹細胞分化特性の相関性について評価した。まず、スフェロイド近傍の酸素濃度と細胞特性の関係性を評価する予備検討として、肝細胞スフェロイドのマイクロパターニング培養を用いて隣接するスフェロイド間距離と酸素濃度の関係を評価した。その結果、隣接するスフェロイド間距離が狭まるにつれてスフェロイド近傍の酸素濃度は徐々に低下していき、その距離が500μm以下になると細胞内の嫌気的代謝が増大するとともに細胞増殖能が抑制されることを見出した。つまり隣接するスフェロイド間で発生する酸素濃度勾配によってスフェロイド特性に違いが乗じることが考えられる。そこでiPSスフェロイド近傍の酸素環境と分化特性の関係性を更に詳細に明らかにするため、酸素非透過性基板(ポリメチルメタクリレート:PMMA)と酸素供給量がおよそ15倍向上する酸素透過性基板(ポリジメチルシロキサン;PDMS)を用いてiPSスフェロイド培養を行った。両基板における分化特性を比較すると、PDMS基板条件のiPSスフェロイドは血管系細胞への分化が促進されたのに対し、PMMA基板条件では肝細胞系への分化が促進されることが明らかになった。さらに、この分化スイッチング現象を起こす細胞内シグナル伝達を探索した結果、細胞が自己分泌するタンパク質であるWnt5aの発現に変動がみられ、その下流に位置する細胞内酵素であるAKTの作用が血管系細胞と肝細胞への分化を調節している可能性を見出した。以上の結果より、スフェロイド間相互作用の本質は近傍の酸素濃度であり、この酸素環境の違いによって発生するWnt5a/AKTシグナル伝達によってiPSスフェロイドの分化スイッチング現象を支配している可能性を見出した。本年度の目標は、スフェロイド間相互作用の本質が酸素であることの実証ならびに酸素環境に依存した細胞分化スイッチング現象のメカニズムを解明することであった。本年度の取り組みにおいて、スフェロイド近傍の酸素濃度と細胞特性の関係性を評価し、iPSスフェロイドの分化スイッチング現象を引き起こす細胞内シグナル経路を明らかにすることができた。具体的には隣接する肝細胞スフェロイド間では酸素濃度が低下していき、細胞増殖能(増殖性や基礎代謝活性など)に影響をもたらした。さらに、iPSスフェロイド近傍の酸素濃度変化は細胞内シグナル経路の一つであるWnt5a/AKT-1シグナルの活性に関与しており、このシグナルによって肝細胞と血管系細胞分化の分化スイッチング現象を引き起こす可能性を明らかにした。すなわち、この結果から、幹細胞スフェロイド分化スイッチング現象は周辺酸素環境の変化によってあらゆるスフェロイド(iPS細胞と肝細胞)において発生する共通な現象であることを実証した。特に、酸素環境とWnt5a/AKTシグナル伝達の関係性を明らかにした点は大きな収穫であり、これらの結果は幹細胞スフェロイド近傍の酸素環境制御の重要性と本研究の発想である酸素環境依存した共通の細胞シグナル伝達の手掛かりを示すものである。これらの実施内容は当初の計画通りに進行しており、本研究目標の第1段階をクリアした。

両基板における分化特性を比較したところ、どちらの幹細胞スフェロイドにおいても酸素透過性基板で分化速度が向上した。このことから幹細胞スフェロイドの酸素応答性には違いがあり、iPS細胞は酸素環境変化に敏感な幹細胞種であることが考えられる。また幹細胞スフェロイドの酸素応答現象の発展研究として肝細胞と脂肪組織由来幹細胞(ADSC)を共培養させた共培養化スフェロイドにおける機能発現と酸素環境の相関性について評価した。その結果、酸素供給性の違いによって向上する肝特異的機能発現に違いが生じた。この現象は肝細胞のみで構築されたスフェロイドでは発生しなかったことから、ADSCの存在が共培養化スフェロイドにおける酸素応答現象に関与していることが推測される。そこでこの現象のメカニズムを探索したところ、WntタンパクならびにTGFβ1の発現が肝細胞の機能発現に関与している可能性を見出した。これらの結果より、酸素応答性に違いは生じるものの、スフェロイド近傍の酸素環境に応じたWntタンパク発現の発現はあらゆる幹細胞分化特性を支配する共通のメカニズムである可能性を本研究によって明らかとした。平成29年度の成果をもとに、MSC/NSCスフェロイドの分化特性と酸素環境の相関性、ならびにiPS/MSC/NSCスフェロイドに共通した酸素応答性細胞内シグナル経路の探索を試みるため、以下の2つの検討を実施する。(1)MSC/NSCスフェロイドの分化特性と酸素環境の相関性の評価:iPSスフェロイド培養で確立した培養基板条件を利用してMSC/NSCスフェロイドを培養し、酸素環境と細胞分化の関係を遺伝子解析及びフローサイトメトリーを用いて定量解析する。また、スフェロイド内部の分化状態およびスフェロイド近傍の酸素環境の測定を行い、酸素環境と分化特性の関係性も明らかにする。(2)iPS/MSC/NSCスフェロイドに共通した酸素応答性細胞内シグナル経路の探索:iPS/MSC/NSCスフェロイドに共通した酸素応答性細胞内シグナル経路の探索として、まずはWnt5a/AKTシグナル経路を中心にその発現状態を解析するとともに、阻害剤添加実験によってその効果を実証する。もしWnt5a/AKTシグナルとの相関性が低い場合は、他のシグナル系(MAPKシグナルやPI3Kシグナルなど)へと評価対象を拡張し、酸素環境の違いによって変動する細胞内シグナル経路を同定する。平成30年度が最終年度であるため、記入しない。
非侵襲で高精度な診断治療ナノデバイスの開発と腎排泄機構の解析

尿や血中に存在するcell freeDNAは、がん等の疾患のバイオマーカーとして注目を集めている。そこで、本研究では、粒子を利用して体液中に存在するcfDNAの高効率な回収法の開発を行った。多数のリン酸基を有することから負電荷を帯びているDNAを効率的に回収するために、様々な正電荷を有する粒子を調製し、DNAの回収を試みた。その結果、ポリリジン、トリアミン、トリメチルアミンなどを修飾した粒子でDNAが効率的に回収できることが分かり、実際に、尿からcfDNAの回収にも成功した。疾患の完治の点で、早期発見は極めて有効な手段である。病気によって変動する生体内物質(バイオマーカー)を非浸襲で早期に検出することは、治療や予防の観点で極めて重要である。DNAは、生命の設計図であると共に、DNAの損傷は病気を引き起こすことから、様々な疾病のバイオマーカーとして注目を集めている。既にがんの診断のバイオマーカーとしてDNAが利用されているが、正確な診断を行うのに十分な量のDNAを生体から簡便に採取するのが難しいため、より効率的なDNAの採取法が望まれている。尿は、非浸襲で採取できる生体液であり、健常人は一日に3Lの尿を排泄するので、試料の入手が容易である。そして尿の中にはDNAを始めとする多数の生体物質が含まれている。したがって、尿内DNAを簡便に回収できれば、診断技術として有望であると考えられる。シリカ粒子は、研磨剤や添加剤など幅広い分野で利用され、大きさや形状の異なったものが容易に入手できる。さらにマイクロメートルサイズの粒子であれば、容易に沈降するので、回収が容易である。本研究では、シリカ粒子を用いて尿中のDNA回収を試みた。シリカ粒子の表面にDNAを認識する構造を導入することで、DNA回収用粒子を作製した。本粒子を用いることで、DNAを添加した精製水や人尿中からDNAを回収することに成功した。今後は、本手法で回収したDNAを解析し、本手法ががんの診断への応用を試みる予定である。粒子を用いた尿からDNAの回収に成功した病気によって変動する生体内物質(バイオマーカー)を非浸襲で早期に検出することは、病気の予防の観点で重要である。生体物質の中でもDNAは、がん等の疾患によって変化することが知られているため、有効なバイオマーカーとして注目されている。尿は、非浸襲で採取できる生体試料であり、健常人は、一日に3Lの尿を排泄するので、試料の入手が容易であることから、我々は、シリカ粒子を用いた尿から血中循環DNA (circulating cell-free DNA: cfDNA)を効率的に抽出する手法を開発した。DNAが多数のリン酸基を有することから、シリカ粒子にポリカチオンであるpoly-Lysineを修飾することで、DNAに対する親和性を付与した。シリカゲルとpoly-Lysを水溶液中で混合することで、シリカゲル表面にpoly-Lysineが導入され、DNAに対して強い親和性を示すDNA抽出用シリカゲルが調製された。Poly-Lysの導入量が増加するほど、回収可能なDNAの量は増加し、またグルタミン酸のようなカチオン化合物の存在下でもDNAを効率的に捕捉した。本粒子によって、50mL尿から高純度のcfDNAが大量(1.3マイクログラム)に回収された。cfDNAはガン等の疾患に関与していることが報告されているため、本手法は被浸襲な病気の早期診断への応用が期待される。また本粒子は、20塩基対程度の非常に短い鎖長のDNAに対して強い親和性を示したことから、短いDNA断片の回収法として非常に有用であると考えられる。生体から非侵襲でcfDNAを大量に回収する方法を開発した。前年度までに開発した尿中cfDNA回収用粒子は、高効率にcfDNAを回収するものの、鎖長の短い数10bpのcfDNAが大量に回収される傾向が見られた。回収されたcfDNAから疾患による変異を解析するには、より長い鎖長のcfDNAの回収が必要であると考え、粒子の表面官能基、粒子径、細孔径を変更させた粒子を調製し、回収されるcfDNAについて調べた。始めに表面修飾したLysの鎖長を変化させた。LysのみではDNAは捕捉されず、重合体であるpoly-Lysを修飾することでDNAが効率的に回収された。Lysの重合度を変化させても、捕捉されるDNAの量や鎖長には大きな変化が見られなかった。つまり、poly-Lysは、短いDNAを効率的に回収するのに適していると考えた。次に、表面修飾基としてアミンを選択し、DNAの捕捉能を評価した。アミンとして、アミン、トリアミン、ジメチルアミン、ジエチルアミン、トリメチルアミンを用いた。いずれのアミンもDNAを効率的に捕捉した。アミンの塩基性が強くなるほど、アミン修飾粒子で捕捉したDNAを粒子から脱離させるのが難しくなった。またアミン修飾粒子は、鎖長の長いDNAも効率的に回収した。さらに粒子自身の大きさや細孔径がDNAの回収に与える影響を調べた。

粒子径を小さくするほど、粒子の比表面積が増大することから、DNAの回収量の増加が期待されたが、大きな変化は見られなかった。また細孔径もDNAの回収量や回収されるDNAの鎖長には大きな影響を与えないことが分かった。計画に従って行う。がんの早期診断への有効性を検証する。分析化学、ナノバイオ研究の過程で、粒子径についての検討が必要なことが分かり、粒子径に関する研究を行ったため。非侵襲で収集できる尿から大量なcfDNAを回収できることが明らかとなり、尿中cfDNAを用いたがんの早期診断の可能性について詳細に検討したため。粒子径の検討によって、効率的な評価が行えるようになったことから、残りの期間で計画通り研究を遂行する。がんの早期診断の有効性を検証する。
臓器線維化をもたらす線維芽細胞活性化の転写ネットワーク制御

線維化病態は、細胞間基質の過剰な沈着に伴う組織構造の破壊・臓器機能不全をもたらす重大な病態である。細胞間基質の主要な産生源である線維芽細胞は、線維化病態における最終エフェクター細胞であると考えられている。本研究では、肺線維症における線維芽細胞活性化を制御している転写制御ネットワークの実体、及びその肺線維症病態に対する意義解明を狙いとした。肺線維症マウスモデルを用いた、肺線維芽細胞の経時的トランスクリプトーム解析により、急性・慢性・寛解期特異的に変動する遺伝子クラスターの中心に位置する17個の新規ハブ転写因子が見出された。肺線維芽細胞は脂肪滴を豊富に有しているが、17個の新規ハブ転写因子の中には、脂質代謝のマスターレギュレーターであるSrebf1や、その上流に位置するLXRalphaが含まれており、それらの発現は線維芽細胞活性化とともに低下していた。肺線維芽細胞の経気道的養子移入法と、時期特異的Srebf1過剰発現系を組み合わせ、マウス生体の線維症肺中の線維芽細胞におけるSrebf1の役割を解析した。その結果、in vivoにおいてSrebf1は線維芽細胞の増殖・活性化を抑制することが見出された。さらに、移入した線維芽細胞のトランスクリプトーム解析により、Srebf1は線維化を増悪させる遺伝子群の発現変動を広範に抑制していることが明らかとなった。実際に、Srebf1を全身で欠損したマウスにおいては線維芽細胞の活性化が増強され、線維化病態も増悪することが見出された。さらに、Srebf1の上流のLXRに対するアゴニストを治療的に投与すると、線維芽細胞の活性化および線維化病態の抑制が認められた。これらの結果より、Srebf1は線維化肺線維芽細胞の転写制御ネットワークにおいて防御的なハブ遺伝子として機能しており、新たな治療ターゲット候補転写ネットワークとなりうることが示唆された。平成30年度が最終年度であるため、記入しない。本研究では、いまだ不明な点が多いin vivoにおける線維芽細胞の転写制御ネットワークの分子的実体の解明、その肺線維化病態への寄与の解明を目的とした。H28年度は、これまでに見いだした17個の新規ハブ転写因子のうち、線維化病態の進行に応じて発現が低下する転写因子Srebf1の役割につき詳細に解析した。In vitroにおいて、活性化型のSrebf1を過剰発現させた肺線維芽細胞は、その細胞周期がG1期で停止することが、Fucciトランスジェニックシステムにより見出された。次に、肺線維芽細胞の経気道的養子移入法と、時期特異的Srebf1過剰発現系を組み合わせ、マウス生体の線維症肺中の線維芽細胞におけるSrebf1の役割を解析した。さらに、Srebf1の発現を増強することが知られている上流のパスウェイを、そのアゴニストの治療的投与により増強すると、線維芽細胞の活性化および線維化病態が抑制されることも明らかとなった。これらの結果より、Srebf1はin silicoで示唆されたのと同様に、線維化肺線維芽細胞の転写制御ネットワークにおいて防御的なハブ遺伝子として機能していることが示唆された。今後、Srebf1やその他のハブ転写因子による、肺線維芽細胞活性化制御のより詳細な分子機構の解明、Srebf1の薬剤による間接的増強法の開発を通じ、新規肺線維症治療法の開発を目指す。当初の研究計画において、新規ハブ転写因子による、急性・慢性・寛解という3つの肺線維芽細胞活性化スペクトルの制御機構、およびその肺線維症病態に対する意義の解明を目的として設定していた。H28年度までに、ハブ転写因子の一つであるSrebf1が、in vivoにおいて線維芽細胞の活性化、線維症病態の進展に対して防御的に働くこと、ハブ遺伝子として慢性的な肺線維芽細胞活性化スペクトルに含まれる線維化関連遺伝子群の発現変動を広範に抑制していることの解明に成功した。これらの結果は、当初設定した目標を満たすものであることから、本研究は当初の計画通り、順調に進展していると考えられる。H28年度までの研究により、脂質代謝のマスターレギュレーターであるSrebf1が肺線維芽細胞活性化に対して防御的に働いていることが明らかとなった。またH29年度の研究により、Srebf1の直接の上流因子であるLXRに対するアゴニストの投与により、ブレオマイシン・シリカ両肺線維症モデルにおいて、肺線維芽細胞でのSrebf1の発現が上昇し、線維芽細胞活性化が抑制され、肺線維化の進展が抑制されることが見出された。さらに、ブレオマイシンモデルにおけるLXRアゴニストの肺線維症治療効果はSrebf1ノックアウトマウスでは減弱することも見出された。さらに、Srebf1に対するChIP-seq解析により、活性化型Srebf1の過剰発現により発現変動が見られた遺伝子である、Cdkn1a, Ptges, Serpine1といった遺伝子のプロモーター領域とSrebf1が相互作用していることが見出された。さらに、理研の有田教授との共同研究により、LXR/RXR複合体のリガンドの一つであるレチノール類がブレオマイシン・シリカ線維化

肺の活性化線維芽細胞で減少していることも見出された。現在、本学生支援採択者の所属研究室において、新規の線維芽細胞特異的Cre発現ノックインマウスの作成に成功し、Srebf1の活性化に必須なタンパク質であるSCAPのfloxedマウスをC57BL/6と戻し交配している段階である。また、共同研究先ではSrebf1のアイソフォームであるSrebf1a, Srebf1cのfloxマウスが作成中であり、それらとの掛け合わせを通じてより詳細なLXR-Srebf1c axis下流の分子機構について解明する予定である。当初の研究計画において、新規ハブ転写因子による、急性・慢性・寛解という3つの肺線維芽細胞活性化スペクトルの制御機構、およびその肺線維症病態に対する意義の解明を目的として設定していた。H29年度までに、ハブ転写因子の一つであるSrebf1および、その上流因子であるLXRアゴニストの治療的投与が、in vivoにおいて線維芽細胞の活性化、線維症病態の進展に対して防御的に働くこと、ハブ遺伝子として慢性的な肺線維芽細胞活性化スペクトルに含まれる線維化関連遺伝子群の発現変動を広範に抑制していることの解明に成功した。さらに、ChIP-seqプロトコルの最適化により、活性化肺線維芽細胞中においてSrebf1により制御されていた因子のうち、PtgesやCdkn1aのプロモーター部位とSrebf1が直接相互作用していることが見出された。さらに、線維芽細胞特異的なin vivo介入実験のため、新規線維芽細胞特異的GFP-Creノックインマウスの作出に成功した。これらの結果は、当初設定した目標を満たすものであることから、本研究は当初の計画通り、順調に進展していると考えられる。線維化病態は、細胞間基質の過剰な沈着に伴う組織構造の破壊・臓器機能不全をもたらす重大な病態である。細胞間基質の主要な産生源である線維芽細胞は、線維化病態における最終エフェクター細胞であると考えられている。本研究では、肺線維症における線維芽細胞活性化を制御している転写制御ネットワークの実体、及びその肺線維症病態に対する意義解明を狙いとした。肺線維症マウスモデルを用いた、肺線維芽細胞の経時的トランスクリプトーム解析により、急性・慢性・寛解期特異的に変動する遺伝子クラスターの中心に位置する17個の新規ハブ転写因子が見出された。肺線維芽細胞は脂肪滴を豊富に有しているが、17個の新規ハブ転写因子の中には、脂質代謝のマスターレギュレーターであるSrebf1や、その上流に位置するLXRalphaが含まれており、それらの発現は線維芽細胞活性化とともに低下していた。肺線維芽細胞の経気道的養子移入法と、時期特異的Srebf1過剰発現系を組み合わせ、マウス生体の線維症肺中の線維芽細胞におけるSrebf1の役割を解析した。その結果、in vivoにおいてSrebf1は線維芽細胞の増殖・活性化を抑制することが見出された。さらに、移入した線維芽細胞のトランスクリプトーム解析により、Srebf1は線維化を増悪させる遺伝子群の発現変動を広範に抑制していることが明らかとなった。
老化に伴う骨組織再生能低下と脈管再生との関連性の解明

老化による骨再生能低下における血管新生の役割ついて探索するために、長期培養によって細胞老化を誘導した間葉系幹細胞および血管内皮細を用いて、細胞老化に伴う骨分化能と血管新生能低下の関連性について評価を行った。また、老化マウス(20ヶ月齢)と若年マウス(10週齢)から採取した間葉系幹細胞および脂肪由来幹細胞を用い、骨分化能と血管新生因子発現比較を行い、老化によって起こる骨再生能の低下には、間葉系幹細胞自体の機能低下と、血管新生誘導効果の低下の両面によって起こる可能性を見出した。加齢に伴い骨再生能の低下が起こることが知られている。組織の再生には再生部位への血管の誘導が最も重要であるが、加齢により血管新生能も低下することが報告されている。我々は、老化による骨再生能低下における血管新生の役割ついて探索するために、長期培養によって細胞老化を誘導した間葉系幹細胞、および血管内皮細を用いて、それぞれの機能変化について評価を行った。間葉系幹細胞を20継代することによって、βガラクトシダーゼで染色される老化細胞の出現が確認され、細胞老化に伴い細胞増殖能・骨分化能が有意に低下してくることが認められた。次に間葉系幹細胞から分泌される血管新生因子および細胞遊走因子について評価を行ったところ、VEGF, bFGFの発現に関しては20継代目と3継代目の細胞において、有意な差は認められなかったが、老化細胞においてはSDF-1αの発現が有意に低下していることが確認された。また、20継代目と3継代目の間葉系幹細胞の培養上清を用いて、血管内皮細胞の遊走効果、管腔形成効果について評価を行ったところ、老化細胞の培養上清を用いた群においては血管内皮細胞の遊走・管腔形成効果が低下することが明らかとなった。次に、血管内皮細胞を同様に長期培養によって細胞老化を誘導すると、SDF-1αのレセプターであるCXCR4の発現が低下することも明らかとなった。以上の結果から、老化によって起こる骨再生能の低下には、間葉系幹細胞自体の機能低下と、血管新生誘導効果の低下の両面によって起こる可能性を見出した。培養細胞を用いた系において、骨再生能の低下と血管新生との関連連性について明らかにすることができ、その機序についても見出すことができたため。これまで我々は、老化による骨再生能低下における血管新生の役割ついて探索するために、長期培養を行うことによって強制的に細胞老化を誘導した間葉系幹細胞(MSC)を用いることによって、老化に伴う骨再生能の低下と血管新生能との関連性について評価を行ってきた。H28年度は老化マウス(20ヶ月齢)と若年マウス(10週齢)を用いてそれぞれのマウスからMSCを採取、培養し、増殖能および骨分化能の評価を行った。老化マウスおよび若年マウスのいずれのマウスからもMSCの採取に成功した。MSCマーカー発現については老化マウスおよび若年マウスMSCにおいて有意な差は認められなかった。次に、増殖能の比較を行ったところ、老化マウス由来MSCは若年マウスMSCに比べ、増殖能が1/5程度に低下していることが明らかとなった。また、骨分化能を比較したところ、老化マウス由来MSは骨分化誘導4日目、7日目、10日目のアルカリフォスファターゼ活性が有意に低下していることが明らかとなった。また、分化誘導2週目および3週目において、老化マウス由来MSCは有意に石灰化能が低下していることが明らかとなった。また、血管新生因子発現について評価を行ったところ、老化マウス由来MSCにおいてVEGF発現が有意に低下していることが明らかとなった。老化マウスおよび若年マウス由来MSCを移植することによる、生体内での骨再生能および血管新生能の評価ができなかったため。H29年度は前年度に引き続き、老化マウス(20ヶ月齢)と若年マウス(10週齢)を用いて、それぞれのマウスから骨髄由来MSC、さらに皮下脂肪より脂肪由来幹細胞(ADSC)を採取し、培養を行った。老化マウスおよび若年マウスのいずれのマウスからもMSC、ADSCの採取・培養に成功した。細胞表面マーカーに関しては、MSCおよびADSCいずれの細胞においても老化マウス、若年マウス間で有意な差は認められなかった。細胞増殖能において、MSCおよびADSCの両細胞において老化マウス由来細胞は若年マウス細胞に比べ、顕著な増殖能の低下が確認された。骨分化能に関しても老化マウス由来MSC、ADSCはアルカリフォスファターゼ活性および石灰化能が顕著に低下していることが確認された。また、angiogenic protein arrayを用いて血管新生因子発現について評価を行ったところ、老化マウス由来MSCにおいて複数の血管新生因子発現が低下していることが明らかとなった。

現在、老化MSCおよび若年MSCをβ-TCPと混和し、SCIDマウス頭頂骨部へ移植を行い、老化細胞による血管新生因子発現低下と生体内での骨増生効果との関連性の評価を継続中である。老化による骨再生能低下における血管新生の役割ついて探索するために、長期培養によって細胞老化を誘導した間葉系幹細胞および血管内皮細を用いて、細胞老化に伴う骨分化能と血管新生能低下の関連性について評価を行った。また、老化マウス(20ヶ月齢)と若年マウス(10週齢)から採取した間葉系幹細胞および脂肪由来幹細胞を用い、骨分化能と血管新生因子発現比較を行い、老化によって起こる骨再生能の低下には、間葉系幹細胞自体の機能低下と、血管新生誘導効果の低下の両面によって起こる可能性を見出した。老化マウス(20ヵ月齢)と若年マウス(8週齢)から間葉系幹細胞を採取し、細胞増殖能、分化能の比較を行う。また、それぞれの細胞の血管新生誘導効果についても評価を行う。同時にマウスへの移植実験を行い、生体内での骨増生効果と血管新生能の関連性についても評価を行う。老化マウスおよび若年マウス由来MSCをangiogenic protein arrayにかけ血管新生因子発現を網羅的に解析する。また各MSCをマウス頭頂骨部へ移植し、生体内での骨増生効果と血管新生能の関連性についても評価を行う。再生医学細胞培養にかかる消耗品の使用が当初の予定よりも少なかったため。細胞培養にかかる消耗品の使用が当初の予定よりも少なかったため。細胞培養に必要な培養液などの購入によって適切に使用する。
OFF-ON-OFF蛍光スイッチ原理を持つ蛋白質標識プローブの開発

本研究では、蛋白質の一生を生細胞蛍光イメージングするため、独自開発したPYPタグ蛋白質ラベル化法と新たな化学原理「OFF-ON-OFF蛍光スイッチング」に基づき蛋白質ラベル化プローブを開発した。このプローブは、分子内会合の制御により、遊離状態では非蛍光性で、蛋白質ラベル化後、蛍光性となり、蛋白質分解により非蛍光性となる。このプローブを用いて、生細胞内蛋白質の発現及び分解を可視化した。蛋白質の分解は、細胞周期やシグナル伝達の制御において重要な役割を担っている。蛋白質を標識する技術は、蛋白質の分解を生細胞で可視化する有用な手法である。これまでに多くの蛋白質標識技術が開発されてきた。現在最も利用されているものは、蛍光蛋白質であるが、あるタイミングで発現している蛋白質の分解を見るうえで、新たに発現してきた蛋白質と区別がつかないという問題がある。そこで、この問題を解決できると考えられるものが、合成蛍光プローブとタグ蛋白質を用いる手法である。しかしながら、この手法でも、蛋白質分解後も蛍光プローブが蛍光を放ち続けるため、蛋白質の分解をリアルタイムで見ることが困難であった。そこで、本研究では、この問題を解決するため、PYPタグを融合した蛋白質の発現を蛍光強度の増大で検出し、分解を蛍光強度の減少で可視化する新たなOFF-ON-OFF蛍光標識プローブを開発した。まず、リガンド部位を7-hydroxycoumarin (7-HC)、蛍光色素部位をフルオレセイン、ジニトロベンゼンを消光基とした新規プローブを開発した。蛋白質の発現・分解の検出原理は、次の通りである。プローブは、遊離状態ではフルオレセインとジニトロベンゼンの会合により消光し、標識されるとジニトロベンゼン部分が解離し蛍光性となり、蛋白質分解後にフルオレセインと7-HCの会合により再び消光する。実際に、蛍光測定実験から、PYPタグと結合すると蛍光強度が上昇し、トリプシンを作用させると蛍光強度が抑制された。また、SDS-PAGEの実験から、蛋白質が分解されていることが確認された。以上の結果より、開発したプローブは、蛋白質の発現・分解を検出することのできるOFF-ON-OFF蛍光標識プローブであることが示された。本研究では、PYPタグラベル化技術に用いるプローブ開発を行い、特に、蛋白質のラベル化時に蛍光強度が上昇し、蛋白質分解に伴い蛍光強度が低下するプローブを開発することを目的とした。化合物の合成も完了し、実際の蛍光測定実験も実施した。更に、分子設計の段階で予測した通りの、OFF-ON-OFF応答が確認され、当初の目的は概ね達成されているといえる。蛋白質の分解は、細胞周期やシグナル伝達などの様々な生命現象を制御しており、その異常は癌や神経疾患などの原因となることが知られている。このため、蛋白質の分解を可視化する技術の開発は極めて重要である。これまでに、我々は、PYPタグと合成蛍光プローブを用いた蛋白質のラベル化・蛍光イメージング技術の開発を行ってきた。この技術では、遊離状態では非蛍光性でラベル化すると蛍光性となる発蛍光プローブを用いて、細胞内の蛋白質を洗浄操作なしで蛍光イメージングすることが可能である。一方、蛋白質が分解されるとラベル化したプローブが蛍光を発し続けるため、蛋白質の分解を生細胞でリアルタイムに検出することが困難であった。この問題を解決すべく、昨年度までの研究において、PYPタグのリガンドを7-ヒドロキシクマリンとしたプローブを開発した。このプローブは、遊離状態では非蛍光性で、ラベル化すると蛍光性となり、トリプシンで蛋白質が分解されると再び蛍光強度が抑制される性質を示した。一方、プローブの蛋白質ラベル化に20時間近くかかることから、ラベル化速度の改良が必要であった。本年度は、ラベル化速度を改良すべく、プローブ及びPYPタグの改変を行った。まず、ラベル化時にプローブからチオフェノールが脱離することに着目し、脱離能の高いチオフェノール誘導体をプローブに導入した。次に、リガンドと蛍光色素の間のリンカーに着目し、最適なリンカー長を分子力学計算でシミュレーションした。最後に、静電相互作用を最適化したPYPタグ変異体を開発した。その結果、30分程度でラベル化できるまでに、本技術を改良した。更に、この改変したプローブとタグを用いたとき、蛋白質の分解に伴いプローブの蛍光強度が減少することを確認した。以上により、迅速に蛋白質をラベル化し、蛋白質分解を検出する技術の開発に成功した。試験管レベルで、蛋白質のラベル化に伴う蛍光強度の増大、分解に伴う蛍光強度の減少を示すプローブの開発に成功した。今後は、細胞膜上の蛋白質をラベル化し、その蛋白質のエンドサイトーシス及びリソソームでの分解の可視化を行う。また、プローブの膜透過性を向上させる分子構造の改変を行い、細胞内蛋白質のイメージング及びその蛋白質の分解をイメージングする。更に、プローブに導入した蛍光色素を変更し、マルチカラープローブを開発する。

ケミカルバイオロジー、蛍光イメージングOFF-ON-OFF蛍光プローブを開発するうえで、分子力学計算を実施したところ、プローブに導入するリンカーがラベル化速度に大きな影響を及ぼすというデータが新たに得られた。このことは、タンパク質のラベル化において極めて大きな発見であり、更なるプローブの開発と検証を実施する必要が生じた。このため、次年度の実験経費が生じた。プローブの合成試薬及び溶媒に、77,031円を支出する予定である。
交差電磁界制御型パルスレーザデポジション法による大面積均一薄膜の作製

本研究は,アブレーションプルーム中微粒子の外部電磁界による発生・成長・挙動の制御を目的としている。昨年度までに、以下のことを明らかにし、大まかなPLDプロセスの制御が可能であること明らかにした。1)磁界を用いたパルスレーザデポジション(PLD)法により,プラズマプルームが変化すること。2)それによってドロップレットの減少が可能であること。3)3インチ以上の大面積基板上に、不均一度2%以下の均一な薄膜が作製可能であること。本年度は、この方法の精度を向上させるため、パルスレーザデポジション法中のプラズマプルームの観測、及び発生した微粒子の挙動を観測した。また、ドロップレット、およびそのもととなるターゲットから飛び出した微粒子の帯電量変化と挙動と、プラズマ中で帯電した微粒子のシース通過中の帯電量変化を軌道制限理論を用いた計算によって検討した。その結果、以下のことが明らかになった。1)飛び出した微粒子は、そのサイズが大きいほど、壁電位がより負であるほど、シースを通過するには大きい初期運動エネルギーが必要である。2)プラズマ中での微粒子の帯電量を、微粒子をプラズマ外に取り出して測定する場合、準中性領域とイオンシース領域において帯電量は大きく変化する。また、これらの結果を用いて、様々な高品質薄膜の作製を行い、以下のことを明らかにした。1)H_2やCH_4などの可燃性ガスセンサに用いられるSnO_2薄膜やNOxガスセンサーとして注目されているWO_3薄膜の作製を試みた。この結果、PLD法により高い結晶性を持つ薄膜ガスセンサの作製に成功した。これを用いたセンサーの感度は十分に大きく、ガスセンサーとして十分利用できることがわかった。2)光触媒として用いられる2酸化チタン(TiO_2)薄膜の作製を試みた。この結果、PLD法によりアナターゼ型TiO_2薄膜の作製が可能であり光触媒反応による脱色が可能であることが判った。本年度は,磁界を用いたパルスレーザデポジション(PLD)法により,プラズマプルームが変化すること,それによってドロップレットの減少が可能であること,3インチ以上の大面積基板上に均一な薄膜が作成可能であること等を明らかにした。さらにこの方法を用いて様々な薄膜の作製を行った。本年度作製した薄膜は,SiC,cBN,CN,SnO_2など様々など多岐にわたった。SiC薄膜の作製では,これまで困難であった基板温度800度における結晶性SiC薄膜の作製に成功した。cBN薄膜の作製では,イオンビームやバイアス電圧を加えることにより,hBNターゲットを用いた場合でもcBN薄膜の作製が可能であることを明らかにした。CN薄膜の作製でも同様に,イオンビームやバイアス電圧を加えることにより,Cターゲットを用いて,C-N結合を含む薄膜の作製が可能であることを明らかにした。ガスセンサに用いられるSnO_2薄膜の作製にも成功し,高い結晶性を持つ薄膜ガスセンサの作製に成功した。また,この薄膜を用いてセンサ特性の計測も行っており作製条件によっては十分な感度が得られることが分かった。以上の成果は,JJAP(日)やThinSolidFilms(米)等のジャーナルに報告し,従来得られなかった重要な知見を得たものとして,世界的に高い評価を得た。今後はプラズマプルーム中の発光種やラジカル分布,微粒子の発生・成長・挙動の様子をプローブ,分光器,ICCDカメラによりin-situ測定し,その発生・成長機構を定量的に解明すること,および膜質の測定も行い,均一均質な大面積薄膜の作製を目指す予定である。昨年度は、磁界を用いたパルスレーザデポジション(PLD)法により,プラズマプルームが変化すること,それによってドロップレットの減少が可能であることを明らかにした。本年度は、まず大面積化に着目し、3インチ以上の大面積基板上に、不均一度2%以下の均一な薄膜が作製可能であること等を明らかにした。また、本年度は、この方法を用いて、下記の様な様々な薄膜の作製を行った。1)cBN, CNなどの高硬度薄膜の作製を行った。磁界を用いた方法で、硬度の低減につながるドロップレットを減少させ、高硬度化を図った。この結果、結晶性の向上が確認され、薄膜の硬度向上がみとめられた。2)H_2やCH_4などの可燃性ガスセンサに用いられるSnO_2薄膜の作製を試みた。この結果、高い結晶性を持つ薄膜ガスセンサの作製に成功した。このことは、酸素含有量が高い、ストイキオメトリックな薄膜の作製に成功したことを示唆している。これを用いたセンサーの感度は、最大9程度であり、純粋なSnO_2薄膜では、十分大きい値であった。3)NOxガスセンサーとして注目されている、WO_3薄膜の作製を試みた。これを用いたセンサーの感度は、NOガスに対して最大100程度であり、ガスセンサーとして十分利用できることがわかった。以上の成果は,JJAP(日)やThin Solid Films(米)等のジャーナルに報告し,従来得られなかった重要な知見を得たものとして,世界的に高い評価を得た。

今後はプラズマプルーム中の定量的な計測を行い、高品質薄膜の作製との関連を詳しく行うとともに、上記薄膜の高品質化を図る予定である。本研究は,アブレーションプルーム中微粒子の外部電磁界による発生・成長・挙動の制御を目的としている。昨年度までに、以下のことを明らかにし、大まかなPLDプロセスの制御が可能であること明らかにした。1)磁界を用いたパルスレーザデポジション(PLD)法により,プラズマプルームが変化すること。2)それによってドロップレットの減少が可能であること。3)3インチ以上の大面積基板上に、不均一度2%以下の均一な薄膜が作製可能であること。本年度は、この方法の精度を向上させるため、パルスレーザデポジション法中のプラズマプルームの観測、及び発生した微粒子の挙動を観測した。また、ドロップレット、およびそのもととなるターゲットから飛び出した微粒子の帯電量変化と挙動と、プラズマ中で帯電した微粒子のシース通過中の帯電量変化を軌道制限理論を用いた計算によって検討した。その結果、以下のことが明らかになった。1)飛び出した微粒子は、そのサイズが大きいほど、壁電位がより負であるほど、シースを通過するには大きい初期運動エネルギーが必要である。2)プラズマ中での微粒子の帯電量を、微粒子をプラズマ外に取り出して測定する場合、準中性領域とイオンシース領域において帯電量は大きく変化する。また、これらの結果を用いて、様々な高品質薄膜の作製を行い、以下のことを明らかにした。1)H_2やCH_4などの可燃性ガスセンサに用いられるSnO_2薄膜やNOxガスセンサーとして注目されているWO_3薄膜の作製を試みた。この結果、PLD法により高い結晶性を持つ薄膜ガスセンサの作製に成功した。これを用いたセンサーの感度は十分に大きく、ガスセンサーとして十分利用できることがわかった。2)光触媒として用いられる2酸化チタン(TiO_2)薄膜の作製を試みた。この結果、PLD法によりアナターゼ型TiO_2薄膜の作製が可能であり光触媒反応による脱色が可能であることが判った。
一様大気泡雲式高速水中水噴流ピーニングの効果向上に関する流体工学的研究

一様大気泡雲式水中水噴流ピーニング用ノズルの特性改善を目指して,既存ノズルの中では最優秀とされているホーンノズルの高速出口側から通気するという改良ノズルから噴出する大気泡雲内のキャビテーション衝撃圧分布を感圧紙法により組織的の解明した。その結果,この様な出口側の通気によって,気泡雲内の衝撃圧分布の一様性を損なう渦輪キャビテーションの影響が大幅に弱められ,衝撃圧分布の一様性が大幅に向上するという事実が判明したので,この種のピーニング法を大幅に改善出来るという明るい見通しを得た。したがって,今後は,最適通気量に関する総合的研究が必要と考えている。また,ノズル出口高速側ホーンの微小形状変化によっても大気泡雲内のキャビテーション衝撃圧分布が著しく変化する事実も確認し,この様な微小形状変化によっても衝撃圧分布を大幅の改善出来るという見通しも得た。よって今後は,一様大気泡雲式水中水噴流ピーニング法を確立するためには,ノズル出口側ホーンの最適形状に関する組織的研究も必要となる。この様な気泡雲に関する画期的に高速(露出時間は5ns)の写真観測の結果,液体の局所的破壊すなわちホールキャビテーションの徴候を明りょうに認めた。この結果は,最も破壊的なキャビテーションと理論的に考えられていたホールキャビテーションの存在を実証したもので,この種のピーニング法を画期的に改善出来る見通しを与えるばかりでなく,新しいキャビテーション学の発展に繋がるものとして注目に値する。さらに,この種のピーニング法を用いてハスバ歯車の表面をピーニングした.X線回折法を用いて,ピーニングした歯車表面の残留応力を測定した結果から,均一的に歯車表面の強度を向上させることが確認できた.一様大気泡雲式水中水噴流ピーニング用ノズルの特性改善を目指して,既存ノズルの中では最優秀とされているホーンノズルの高速出口側から通気するという改良ノズルから噴出する大気泡雲内のキャビテーション衝撃圧分布を感圧紙法により組織的の解明した。さらに,この種のピーニング法を用いてハスバ歯車の表面をピーニングした.X線回折法を用いて,ピーニングした歯車表面の残留応力を測定した結果から,均一的に歯車表面の強度を向上させることが確認できた.
重水素同位体シフトを用いるタンパク質側鎖間水素結合ダイナミクス解析

NMRシグナルに対する重水度同位体シフトを利用して,プロリン異性化酵素Pin1の酵素ドメインであるPPIaseドメインの活性部位に形成される水素結合ネットワークのダイナミクス解析を行った.重水素同位体シフトの変化から,ネットワーク中の水素結合強度の変化を簡便かつ明瞭に計測することに本研究の特徴がある.PPIaseドメインの活性残基C113に対して3つの異なるアミノ酸変異を導入し,それぞれの変異体の異性化速度変化と,活性部位の水素結合ネットワーク変化の相関を解析した.同様に,活性部位から離れた位置にあるS138残基についても変異を導入し,活性と水素結合ネットワーク安定性の相関を解析した.Pro異性化酵素Pin1を対象として,活性部位にある保存された2つのHis(H59, H157)間の水素結合強度と活性の相関を重水素同位体効果を使って解析した.NMR解析の結果,H59とH157それぞれがepsilon-tautomer,delta-tautomerであることを明らかにし,C113-H59-H157-T152の水素結合ネットワークが溶液中のPin1でも保持されていることを確認した.重水素同位体効果を用いて,H59-H157の側鎖間には安定な水素結合が形成されていることを明らかにした.C113D変異体は,異性化活性が低下していることが示されていたが,本研究ではNMRを用いて直接C113D変異体の異性化速度が野生型の約1/50に低下していることを定量的に観測した.さらに,重水素同位体効果をもちいて,C113D変異体ではH59-H157の側鎖間水素結合が低下し,かわってD113-H59の間での水素結合強度が増加したことを明らかにした.H59に対する水素結合強度バランスの変化がPin1の活性部位の構造安定性を変化させ,異性化活性を低下させる機構を明らかにした.当該研究から,Pin1活性部位に形成される水素結合ネットワークが微妙な水素結合強度のバランスで活性構造を維持していることを明らかにした.重水素同位体効果を使って初めて明らかにすることができた成果である.本研究で開発した手法は,タンパク質構造研究全般に利用可能である.Pro異性化酵素Pin1を対象として活性部位に保存されたH59,H157間の水素結合状態と異性化反応活性の相関を解析した.今期は,活性部位にあるC113をALAおよびSERに置換した2種類の変異体と,Pin1タンパク質の熱安定性を向上させるS138A変異体についても活性部位の水素結合に摂動を加え,活性残基間の過渡的水素結合と異性化活性の相関解析を進めた.C113側鎖は,スルフォネートイオン状態でH59と水素結合を形成し,H59はさらにH157と側鎖間で水素結合を形成するネットワークを形成している.C113A変異体では,C113-H59の水素結合を切断する状態を模している.一方で,C113S変異体はC113側鎖がプロトン化されてチオールの状態を形成した状態を模している.いずれの状態もPro異性化反応過程の中間状態として生じる状態と考えられている.興味深いことに,反応中間体を模したいずれの状態においても,H59-H157の間の水素結合は破壊され,2つのHisのイミダゾールリングの互変異性状態に大きな違いが生じることが明らかになった.この状態変化の解析には本研究で開発した重水素同位体シフトを用いた計測が必要であったことを強調する.C113との水素結合状態の変化により誘導されるHisの互変異性状態変化が,H59-H157側鎖間の水素結合形成を阻害する機構を明らかにした.アロステリックな水素結合摂動機構が,Pin1活性部位の水素結合ネットワーク中には存在する.S138A変異体では,逆にH59-H157の側鎖間の水素結合強度が野生体型より強まることが観測され,これまでとは異なるアロステリック摂動機構を見いだした.これまでの研究から,活性部位にある活性残基間での水素結合強度が強くても弱くても異性化活性は弱くなるため,水素結合強度のバランスが異性化活性には重要であることが明らかになった.NMRシグナルに対する重水度同位体シフトを利用して,プロリン異性化酵素Pin1の酵素ドメインであるPPIaseドメインの活性部位に形成される水素結合ネットワークのダイナミクス解析を行った.重水素同位体シフトの変化から,ネットワーク中の水素結合強度の変化を簡便かつ明瞭に計測することに本研究の特徴がある.PPIaseドメインの活性残基C113に対して3つの異なるアミノ酸変異を導入し,それぞれの変異体の異性化速度変化と,活性部位の水素結合ネットワーク変化の相関を解析した.同様に,活性部位から離れた位置にあるS138残基についても変異を導入し,活性と水素結合ネットワーク安定性の相関を解析した.初年度に計画した研究は順調に終了し,すでに論文発表している.2年目のテーマについては,すでにデータ集積を終わっており現在解析中である.また,研究の過程で,酵素反応速度に対する重水素同位体効果を応用した方法を思い至り.新しい同位体効果応用研究を進めている.生物物理化学1)ドメイン間コミュニケーションの変化による活性調節機構を同位体効果を使って解析する.具体的にはPin1の2つのドメインをつなぐ10残基のリンカー長を換えることで変化する異性化速度の違いと水素結合ネットワークの関係を上記と同様の方法で解析する.2)基質ペプチドの活性が重水素置換率で変化することを見いだした.

重水素置した基質の構造異性化における活性化自由エネルギーを解析し,異性化過程における基質分子内の水素結合の寄与について解析する新たな同位体効果利用法を構築する.初年計画していた実験が予定よりもスムーズに進行したために,予定していた高価な重水素試薬代が予定よりも少なくすんだため.初年度予定より少なく少なく抑えることができた消耗品費を使って,合成基質の種類を増やすことができる.異なるアミノ酸配列をもつ合成基質を購入し,研究の幅を広げる計画.
山片蟠桃の経済理論とその政策論の再検討

本研究では、山片蟠桃の経済学的叙述を一貫した理論として復元し、その政策面での有用性を示すことによって、わが国の忘れられた学術的遺産を再考する。近世日本の経済論が主に交換面での議論で構成されているのに対し、古典派経済学の創生・成熟期にあたる同時期の西欧では、生産・分配面での議論が主な構成要素であり、そうした面での経済厚生や救貧対策が論じられている。蟠桃の著作には、西欧古典学派において重要なキーワードが散見している他、分配に関する図解をも看取できる。彼の経済論を合理的に再構成し、それを日本経済史固有の文脈で復元することは、これまで十分に試みられることがなかった学術的に大きな意義をもつ作業である。
海洋プレートの沈み込みに伴う特殊深海生態系の学際的研究

相模湾初島沖,水深約1100mの地点に見いだされたシロウリガイを主体とした高密度の深海生物群集は,大洋底の沈み込みに伴う力学場で絞り出される遺留水に含まれる化学物質によって維持される生態系とみなされる.本年度も潜水艇「しんかい2000」による当該海域への潜降調査が11月に実現し,生物・微生物・化学・生化学の研究者の合同で実現し,以下のような主な成果が挙げられた.また,東京大学海洋研究所の研究船も3航海にわたって生物・化学・地質学グループで当該海域の調査を行った.なお,潜水艇の研究調査作業においては,他研究機関との協力が図られた.1)地中温度と熱流量解析から,地下からの湧水は疑問の余地が無い,2)メタン含量その他の化学組成の測定項目と精度を向上させた, 3)シロウリガイの呼吸量を実測し,その大きな生物活性結果からも化学合成的なエネルギー機構を支持するものであった,4)シロウリガイ以外の生物,例えばハナシガイ,ツキガイモドキ,キヌタレガイにも化学合成型の共生細菌が発見もしくは示唆された,5)新たなハオリムシ(チューブワーム)が発見された,6)シロウリガイに寄生する撓脚類や多毛類等が多数発見され,その生物学的研究が着目された,7)シロウリガイ・ハオリムシの血液と蛋白質の生化学的研究が開始され,比較進化学的研究に発展した.これらの成果は別掲の諸学術雑誌に出版もしくは投稿中であるほか,日本海洋学会,地球化学学会,微生物生態学会などでも紹介された.その後,ソ連邦およびカナダ太平洋岸にも湧水生態系が発見され,国際的な研究連絡が活発に行われ始めた.なお,現在も活発な研究作業が継続されているが,当該研究海域に潜水艇によりトランスポンダーを設置したため,潜水艇のみなず研究船からもアクセスできるようになり,今後の研究の便宜にも大きく寄与するであろう.相模湾初島沖、水深約1100mの地点に見いだされたシロウリガイを主体とした高密度の深海生物群集は、大洋底の沈み込みに伴う力学場で絞り出される遺留水に含まれる化学物質に維持される生態系と見なされている。この仮説を実証すべく、潜水艇「しんかい2000」による当該海域の潜航調査は、科研費の支給される以前の5月から6月にかけて実施された。調査研究に必要な消耗品類は予め都合し、採水器・間隙水採取装置・地中温度計・呼吸量測定器等を準備した。当初予定された4潜航は、海況不良による1潜航の割愛により3潜航となったが、生物・微生物・化学・生化学・地質学・鉱物学の研究者の合同で行われ、下記のような成果を挙げた。なお、潜水艇の研究調査作業においては、他研究機関との協力が図られた。また、海洋研究所の研究船も3航海にわたって当該海域の調査を行った。1)地中温度が周辺水温より常に約0.5°C高い、2)生物群集の直上で採取した海水に10000μcc/kgと異常に高濃度のメタンが検出された、3)生物現存量が10kg/【m^2】以上あり、通常の深海底の23桁高い値である、4)メタン細菌・硫黄細菌・水素細菌等が検出された、5)間隙水および堆積物中の化学物質の分布に異常が見られる、6)この群集に卓越した生物であるシロウリガイの特殊化した鰓の細胞には、硫黄細菌の共生と硫黄結晶の像が見られた、7)深海湧水域に特徴的なVESTIMENTIFERAと呼ばれる巨大な管棲の蠕虫(西太平洋域で初報告の未記載種)が採集された、8)シロウリガイ、管棲蠕虫のいずれにも炭素・窒素の同位体比に異常がみられ、地中からの化学物質の供給があると考えるべきであることなど、湧水に支えられた特殊な生態系であることが実証された。成果は海洋学会、分析化学学会、日仏「海溝計画」国際シンポジウム、「しんかい2000」研究シンポジウム等で公表され、現在も活発に研究作業が継続されている。相模湾初島沖,水深約1100mの地点に見いだされたシロウリガイを主体とした高密度の深海生物群集は,大洋底の沈み込みに伴う力学場で絞り出される遺留水に含まれる化学物質によって維持される生態系とみなされる.本年度も潜水艇「しんかい2000」による当該海域への潜降調査が11月に実現し,生物・微生物・化学・生化学の研究者の合同で実現し,以下のような主な成果が挙げられた.また,東京大学海洋研究所の研究船も3航海にわたって生物・化学・地質学グループで当該海域の調査を行った.なお,潜水艇の研究調査作業においては,他研究機関との協力が図られた.1)地中温度と熱流量解析から,地下からの湧水は疑問の余地が無い,2)メタン含量その他の化学組成の測定項目と精度を向上させた, 3)シロウリガイの呼吸量を実測し,その大きな生物活性結果からも化学合成的なエネルギー機構を支持するものであった,4)シロウリガイ以外の生物,例えばハナシガイ,ツキガイモドキ,キヌタレガイにも化学合成型の共生細菌が発見もしくは示唆された,5)新たなハオリムシ(チューブワーム)が発見された,

6)シロウリガイに寄生する撓脚類や多毛類等が多数発見され,その生物学的研究が着目された,7)シロウリガイ・ハオリムシの血液と蛋白質の生化学的研究が開始され,比較進化学的研究に発展した.これらの成果は別掲の諸学術雑誌に出版もしくは投稿中であるほか,日本海洋学会,地球化学学会,微生物生態学会などでも紹介された.その後,ソ連邦およびカナダ太平洋岸にも湧水生態系が発見され,国際的な研究連絡が活発に行われ始めた.なお,現在も活発な研究作業が継続されているが,当該研究海域に潜水艇によりトランスポンダーを設置したため,潜水艇のみなず研究船からもアクセスできるようになり,今後の研究の便宜にも大きく寄与するであろう.