hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
感染病態形成におけるフリーラジカル病因論に関する研究

本年度の研究においては、特に、NOによる生体内での核酸ニトロ化反応に焦点をあて、ウイルス感染病態の解析を行った。具体的には、核酸塩基グアニンのパーオキシナイトライトなどの活性酸化窒素種によるニトロ化産物である8-ニトログアノシンの抗体を作製し、インフルエンザウイルス感染モデルにおける8-ニトログアノシン生成を検討した(Akaike et al.,PNAS,100:685-690,2003)。さらに、8-ニトログアノシンの生体内生成を介する毒性発現のメカニズムをその酸素ラジカル産生能に注目して解析を行った。研究成果は以下の通りである。(1)8-ニトログアノシンの大量有概合成法を確立し、抗体作成および8-ニトログアノシンの感染病態における生体内生成とその生物効果の解析に供した。常法により、8-ニトログアノシン特異的ウサギポリクローナルおよびマウスモノクローナル抗体を作成した。(2)本抗体を用いて、マウスインフルエンザウイルス肺炎モデルにおける8-ニトログアノシンの生体内生成を免疫組織化学的に解析した。その結果、インフルエンザウイルス感染マウスの肺組織において、誘導型NO合成酵素(iNOS)の発現に伴って、気管支・細気管支上皮細胞と一部の滲出マクロファージに濃染像が認められた。一方、正常マウスおよびiNOS欠損マウス肺では、染色像は確認出来なかった。また、抗8-ニトログアノシンのモノクローナル抗体を用いた免疫細胞化学染色により、サイトカイン刺激によりiNOSを発現したRAW 264細胞(マウスマクロファージ様細胞株)や、iNOS遺伝子を強制発現させたCOS-1細胞においても、著明な8-ニトログアノシン生成が確認された。これらの知見より、ウイルス感染病態における8-ニトログアノシンの生体内生成が明らかになった。(3)NO生成を介して産生される8-ニトログアノシンは、強力な化学的反応性(レドックス活性)を有していることも分かってきた。すなわち、8-ニトログアノシンは、生体内に豊富に存在するNADPH依存性還元酵素、例えば、P450 reductaseやiNOSを含めたすべてのNOSアイソフォーム(血管型eNOS,神経型nNOS)により-電子還元されることにより活性化され、8-ニトログアノシンラジカルに変換し、さらに、溶存酸素を-電子還元し著明なスーパーオキサイド産生をもたらすことが明らかになった。このことは、8-ニトログアノシンが感染病態における酸化ストレスのメディエーターであることを示唆している。
弱光環境下における光化学系Iサイクリック電子伝達の新たな生理学的役割

植物は太陽から光エネルギーを吸収して、電子伝達経路において還元力(NADPH)や化学エネルギー(ATP)を合成する。そして、それらのNADPHやATPを利用して、二酸化炭素を固定し糖やデンプンを生産する。光合成における電子伝達経路には、リニア電子伝達経路と光化学系Iサイクリック電子伝達経路系が存在する。光化学系Iサイクリック電子伝達は半世紀以上前に発見されたが、その生理機能は不明のままであった。本研究成果によって、NDH複合体に依存する光化学系Iサイクリック電子伝達経路は弱光環境下における光合成電子伝達反応の最適化に重要な役割を果たすことが明らかとなった。自然界では、植物の受ける光環境は晴れ/曇りという天候の影響を直接受けるし、晴れの日であっても植物体の葉や茎の相互被陰によって一日を通して常に変動している。過剰な光の受容は活性酸素の生成を介し光合成装置に障害を与えるが、この光阻害を回避するために、光化学系Iサイクリック電子伝達経路が重要な役割を果たすと提案され続けている。しかしながら、申請者のイネを用いた研究から、サイクリック電子伝達経路は強光ストレスよりも弱光環境下における電子伝達反応の最適化に重要な役割を果たす可能性が出てきた。そこで、本年度は、強光環境下と弱光環境下におけるNDH依存サイクリック電子伝達経路の役割を明らかにすることを目的として研究を行った。植物材料として、野生体イネ(Oryza sativa L. cv. Hitomebore)とNDH欠損変異体イネを用いた。植物を生育環境の制御が可能な人工気象室において、日長を12時間、相対湿度を60%、栽培温度を28/23°C(昼/夜)として、光強度を200 μmol photons m-2 s-1 (弱光)と800 μmol photons m-2 s-1 (強光)の2つの環境で栽培を行った。その結果、強光栽培時には、野生体と変異体の二種間で成長量に差は無かったが、弱光栽培時には、変異体が野生体よりも有意に成長量を減少させることが分かった。サイクリック電子伝達経路は強光などの酸化ストレス環境で重要だと信じられてきており、これまでに弱光環境におけるサイクリック電子伝達経路の重要性を議論した研究例は無い。申請者のデータは、従来の通説とは異なり、サイクリック電子伝達経路が弱光下における光合成の最適化に重要な役割を果たすことを示唆した。これらの研究成果は光合成効率向上のための技術基盤作りに確実に貢献すると考えられる。自然界では、植物の受ける光環境は晴れ/曇りという天候の影響を受けるし、晴れの日であっても植物体同士の相互被陰によって一日を通して常に変動している。強光ストレスに対する光合成の応答については多くの研究者が着目して研究を行っているが、弱光に対する光合成の応答に関してはまだまだ不明な点が多い。本申請課題では、“弱光環境"に注目して、サイクリック電子伝達経路の新たな生理学的役割を解明することを目的とした。野生イネ(Oryza sativa L.)とNDH欠損変異体イネを異なる二つの光強度(弱光: 200 μmol m-2 s-1、強光: 800 μmol m-2 s-1)において栽培した。その結果、強光栽培時には、野生体と変異体の二種間で成長量に差は無かったが、弱光栽培時には、変異体において成長量が有意に低下することが分かった。詳細な光合成解析の結果、変異体では、弱光下において光化学系Iサイクリック電子伝達活性が減少し、その結果として、炭酸固定速度の減少、および、植物成長の低下を引き起こしていることが明らかとなった。申請者のデータは、従来の通説とは異なり、サイクリック電子伝達経路が弱光下における光合成の最適化に重要な役割を果たすことを示した。これらの研究成果は基礎研究としての高い成果に加えて、光合成効率向上のための技術基盤作りに確実に貢献すると考えられる。26年度が最終年度であるため、記入しない。植物生理生態学、植物分子生理学26年度が最終年度であるため、記入しない。研究室を一からセットアップしなくてはいけずに、栽培装置や測定装置の準備が間に合わず、結果的に予定していた実験が思うように進まなかったため。栽培装置や測定装置の準備は着々と整ってきている。そこで、本年度の前半は、まず初年度に計画していた研究課題である「弱光環境下におけるNDH依存サイクリック電子伝達経路の役割」を明らかにする。本年度の後半に、人工気象器内で変動光環境を再現できるように、弱光と強光を繰り返す光環境の制御を行い、「変動光環境におけるNDH依存サイクリック電子伝達経路の役割」についても明らかにする。

様々な環境における植物成長量の比較だけではなく、ガス交換解析によるCO2同化速度の測定を基本に、クロロフィル蛍光による光化学系II (PSII)電子伝達速度の測定やP700吸光解析による光化学系I (PSI)の電子伝達速度の測定を行い、個葉レベルにおける光合成能力の評価を行う。
後天性表皮水疱症診断のための高感度ELISAシステムの開発

後天性表皮水庖症の原因蛋白であるVII型コラーゲン蛋白を抗原とした酵素結合免疫吸着定量法(ELISA)を作成するためには、精製したVII型コラーゲン蛋白が大量に必要となる。そのためにまずVII型コラーゲン蛋白を恒常的に発現する293A細胞を回転培養器により大量培養を行った。培養液の上清を硫安塩析し、透析した。次にVII型コラーゲン蛋白のNC-1domainに対する抗体であるLH7.2抗体を担体プロテインGに結合させたLH7.2抗体カラムを作成し、透析したサンプルを通したのちトリフルオロ酢酸にて抗体と蛋白の結合を切断しVII型コラーゲン蛋白を溶離した。しかしこの方法ではVII型コラーゲン蛋白以外の不純蛋白が混入してしまうことが判明したため、精製法をイオン交換アフィニティーに変更した。これで得られた290kDaの蛋白を選択し、それをさらにゲル濾過アフィニティーにて精製した。しかしこれは濃度が薄いため、アミコンを用いて濃縮した。しかし、大量精製用の1.2リットルのボトルの培養液から透析後に得られる蛋白量は23mgでそれがゲル濾過アフィニティー後は0.3mgとなり、濃縮後はさらにその半分の0.15mgで、回収率は0.65%である。ELISAの抗原として使用するためのVII型コラーゲン蛋白量が不足しているため、今後は回収率をあげるか、または培養器の数を増やすことが必要と考えている。そして十分量のVII型コラーゲン蛋白が準備できしだい、ELISAの作成を行なう予定である。
歯周病関連細菌の鉄獲得機構とその病原性における意義

Actinobacillus actinomycetemcomitansの鉄獲得様式を分析した。ヒトトランスフエリンを利用する菌株は観察されなかった。すべての菌株で染色体DNA上のトランスフェリン結合タンパク質遺伝子ホモログは偽遺伝子でした。また,サザンブロット解析から,機能しているトランスフェリン結合タンパク質遺伝子は存在しないことが示されました。これらの結果は,A.actinomycetemcomitansにとって、ヒトトランスフェリンからの鉄獲得が重要でないことを示唆している。血清型a, JP2クローン以外の血清型b,血清型c,血清型dの菌株はヒトヘモグロビンを利用することが観察された。これらの菌株は,ヘモグロビン結合タンパク質遺伝子が機能していました。ヘモグロビン結合タンパク質遺伝子の変異株では,ヒトヘモグロビンが利用できなくなることから,この遺伝子がヒトヘモグロビンからの鉄獲得に重要であることが示唆された。ヒトヘモグロビンを利用できないJP2クローンと血清型eの菌株では,ヘモグロビン結合タンパク質遺伝子の偽遺伝子でした。また,多くの菌株はヘムから鉄を利用できることから,ヘム結合タンパク質の存在も示唆された。以上のことから,菌株の違いによって異なる鉄獲得機構を有している可能性が示唆された。マウスを用いて,野生株,ヘモグロビン変異株,ヘモグロビン結合タンパク質遺伝子が機能していない株で病原性に違いが認められるか,現在解析中である。歯周病関連細菌Actinobacillus actinomycetemcomitans(以下Aaと略す)の鉄獲得機構を解明する目的で,鉄結合タンパク質遺伝子のAa染色体DNAデータベース上での検索,鉄制限培地上での宿主鉄原添加ディスク周囲の発育試験,鉄結合タンパク質遺伝子の塩基配列決定,ヘモグロビン結合タンパク質遺伝子変異株作成を行った.鉄結合タンパク質遺伝子のAa染色体DNAデータベース上での検索の結果,ヘモグロビン結合タンパク質遺伝子とトランスフェリン結合タンパク質遺伝子と相同性の高い領域があることが明らかになった.鉄制限培地上での宿主鉄原添加ディスク周囲の発育試験の結果,ヘモグロビン添加ディスク周囲に発育がみられるものが認められた.塩基配列決定の結果,これらの菌株のヘモグロビン結合タンパク質遺伝子のホモローグは,機能しているが,発育できない株では,翻訳レベルを障害する変異が認められた.トランスフェリン,ラクトフェリン添加ディスク周囲では,すべての株が発育できなかった.トランスフェリン結合タンパク質は2つのサブユニットから構成されるが,すべての株で1つのサブユニットの遺伝子が欠損していた.カナマイシン耐性遺伝子を含むトランスプライマーを用いて,Aaヘモグロビン結合タンパク質遺伝子ホモローダの変異株作成を試みた.トランスプライマーの挿入されたヘモグロビン結合タンパク質遺伝子ホモローグを含む一本鎖プラスミドをエレクトロポレーションでAa菌体に導入し,相同的組み換えによって,いくつかの変異株を得た.変異株の性状について,分析中である.Actinobacillus actinomycetemcomitansの鉄獲得様式を分析した。
銅硫化物超伝導体Cu_<1+x>Rh_<2-x>S_4の核磁気共鳴よる研究

1.はじめに銅酸化物高温超伝導体の研究がきわめて活発であることは言うまでもないが、その高温超伝導発現機構は依然として解明されねばならない課題である。そしてその解決の為には幅広く化合物伝導体の系統的な研究を行なう必要がある。最近銅硫化物伝導体の研究も行なわれて来た。その中でCuRh_2S_4系、CuCo_2S_4系の超伝導とCuIr_2S_4系の金属-絶縁体転移が非常に興味深い。そこで私達は超伝導体Cu_<1+x>Rh_<2-x>S_4系の物性をCu及びRhの核磁気共鳴により微視的に研究を行なった。2.研究経過測定する試料は愛媛大学の宮谷教授が物性研究所の石川研究室で作成されたCu_<1+x>Rh_<2-x>S_4を提供して頂いた。^<63>Cu NMRスペクトル、スピン-格子緩和確率1/T_1の温度変化を測定した。3.研究成果(1)NMRスペクトルは、Cuイオンは異なる2つの四面体位置と六面体位置を占めているにもかかわらず一対の^<63>Cuと^<65>Cu核の幅の狭いスペクトルである。これらは四面体位置のすべての核スピンレベル間の遷移による吸収線と六面体位置のセンター吸収線の重なったものと考えられる。(2)ナイトシフトは常伝導状態では-0.05%から-0.1%の間でわずかに温度低下と共に減少する。K-xプロットから超微細結合定数を-125kOe/μ_Bと見積もった。この値は非超伝導のCuOで報告されている値-146kOe/μ_Bに近い。高温超伝導体のCuO_2面ではこれらの値とは全く異なり、Oイオンを通しての超交換相互作用が重要である。超伝導状態では反磁性の為ナイトシフトの評価は難しい。Rossier and MacLaughlinの論文に基づき、ナイトシフトの評価を試みた。(3)核磁化の回復はNMRスペクトルが2つの四面体位置と六面体位置の異なる電場勾配を感じているCu核の信号が重なっているので、単一指数関数的ではない。スピン-格子緩和確率1/T_1は従って、長いT_<1L>と短いT_<1S>を評価した。それらは共に常伝導状態ではコリンハの関係に従う。超伝導状態では、T_cの直下でBCS理論の示すcoherence enhancementを示す。また更に低温では指数関数的な温度変化を示す。それらの温度変化から最小自乗法により常伝導エネルギーギャップを見積もると、ほぼBCS理論値に近いことが分かった。Cu_<1+x>Rh_<2-x>S_4はBCS超伝導体と結論される。(4)グルノ-ブルでの第4回超伝導国際会議で論文発表を行なった。またfull paperをPhysica Cに投稿中である。

また更に低温では指数関数的な温度変化を示す。それらの温度変化から最小自乗法により常伝導エネルギーギャップを見積もると、ほぼBCS理論値に近いことが分かった。Cu_<1+x>Rh_<2-x>S_4はBCS超伝導体と結論される。(4)グルノ-ブルでの第4回超伝導国際会議で論文発表を行なった。またfull paperをPhysica Cに投稿中である。
原核細胞でも機能する真核細胞由来のプロモーターの発現調製機構の解析

本研究において達成できた成果は以下の通りである。1。Candida tropicalisのイソクエン酸リアーゼ遺伝子の5'-上流領域(UPR-ICL)のcisacting elementの同定。以前に、UPR-ICL上で酵母Saccharomyces cerevisiae内で機能するproA領域と大腸菌Escherichiacoli内で機能するproBとを同定した。本研究では新たに、S.cerevisiae内でUPR-ICL上の2つの領域(region A1,-728 to-569;region A2,-370 to-356)が酢酸培養時に転写活性化能を有すること、それらが独立した情報伝達系によって制御されていることが明らかになった。特に、region Alを支配する情報伝達系(Snflp依存型、Cat8p非依存型、Miglp依存型)はS.cerevisiae内で未だに同定されていない新規な経路である可能性がある。また、UPR-ICLと同様な遺伝子発現能を有するリンゴ酸シンターゼ遺伝子の5'-上流領域についても同様な解析を行ったが、これもSnflp依存型、Miglp依存型であったが、意外なことに、global transcriptional activatorの1つであるRaplpの関与が示唆され、UPR-ICLとは異なった調節機構に支配されていることがわかった。2。Candida tropicalisのイソクエン酸リアーゼ遺伝子の5'-上流領域(UPR-ICL)を制御する細胞内調節因子の同定。invivoのアプローチを用いて、UPR-ICL-LacZ融合遺伝子を利用することにより、S.cerevisiae内でUPR-ICLが機能しない単一変異株の取得およびその相補遺伝子(FIL1,Factor for Isocitrate Lyase Induction 1)の単離に成功した。構造解析の結果、その遺伝子は原核細胞でしか同定されていなかったribosomereleasing factor(RRF)と高い相同性を示した。N末端領域が他のすべてのRRRFより突出していたことから、それがミトコンドリアに局在することが予想され、実験的に証明された。また、△fill破壊株ではミトコンドリア内のタンパク合成が異常であること、その異常がrho^0株やミトコンドリアのタンパク合成を特異的の阻害するクロラムフェニコールで処理した細胞でみられる異常と類似していたことを見いだした。さらに、△fill破壊株ではS.cerevisiaeに内在するICL1、FBP1などのグリオキシル酸回路や糖新生系酵素の遺伝子発現が特異的に抑制されていることも明らかとなった。これらのことから、glucose repressionによって発現が抑制されているいくつかの遺伝子の抑制解除にはミトコンドリアの正常な機能が必須であることが明らかになった。1。2。
現生大型類人猿の種内変異分析と種間比較によるヒト上科歯形態進化の検討

現生大型類人猿4種(Pongo pygmaeus,Gorilla gorilla,Pan troglodytes,Pan paniscus)の下顎大臼歯の形態について、種内変異の程度とそのパターンを分析した後、種独特の形態が存在するのかを検討した。また、現生種グループと、中新世化石ヒト上科属するインド・パキスタン出土Sivapithecusと、ケニア出土Proconsulとの比較分析を行った。形態情報としては、下顎第1大臼歯咬頭面の写真を画像解析して計測した咬頭面積およびそのプロポーションを使用した。現生種4種の種内変異の程度はさまざまで、Pongo pygmaeusでは,集団間変異が亜種間変異に相当する。使用したサンプルに観察された種内変異では、Gorilla gorillaが一番変異が著しく、Pan paniscusの変異が小さい。しかしながら、4種それぞれが、種独特の形態を示すことが明らかになった。即ち、サイズが大きく異なる雌雄で形態が類似し、また、亜種間の変異が大きい種も他種と比べて、一定の形態パターンを示す。これは、多変量解析(主成分分析、分散分析)の結果から明らかである。また、歯の部位によって、種内変異が大きい部分と種間変異が大きい部分が、異なることがわかった。この違いには、歯の発生・形成の時期と関係が影響している可能性がある。更に、現生種全体が、化石種グループとは異なる形態を示す。特に、その違いは近心部と遠心部の咬頭のプロポーションの差に顕著である。現生種は化石種にくらべ、いずれも、近心の咬頭の割合が大きい。この結果から、咬頭面の形態パターンが系統的関係をある程度反映することが示唆された。ゴリラ(Gorilla gorilla)、オランウータン(Pongo pygmaeus)の臼歯咬頭面の写真をフィルムスキャナーでコンピューターに取り込み、ハードディスクに保存。各咬頭の画像から、投射面積、咬頭プロポーションと咬頭の位置を計測し、その変異を集団、亜種、種レベルで比較した。データから、ゴリラの3亜種間の違い、特に、アフリカ西部低地ゴリラと東部の2亜種の違い、が著しいこと、オランウータンでも、2亜種の形態が有意に異なることが明らかになった。このパターンは、ミトコンドリアDNA遺伝子分析結果と一致する。すなわち、ゴリラ、オランウータンともに、初期集団の分岐、拡散後、早い時点で、亜種の祖先集団が遺伝的に隔離され、その間に形態的変化が蓄積されたものと考えられる。このような形態的変化とその固定には、環境・植生の違いに依存する異なる食性への適応が関係している可能性もある。この要素は、特に、現在の亜種間の環境、食性の著しく異なるゴリラの進化過程では、おそらく大きな役割を果たしたであろう。来年度は、チンパンジー(Pan)を含めてより詳細な歯冠形態についても種内変異分析をし、化石ヒト上科をの比較検討を行う。
植物における窒素欠乏シグナル受容と伝達機構の解明

窒素は、植物の生長を左右する重要な栄養元素である。窒素に関する研究としては、窒素量の増減に応じた遺伝子発現など、窒素量変化に伴う最終的な応答反応については良く理解されている。その一方で、窒素量の変化を、植物細胞がどの様な機構で感知しているのか、という点については、多くの制御系・実験系が複雑であるなどの理由で解明がなされていない。そこで本提案では、単純な制御系を持つと考えられる単細胞紅藻Cyanidioschyzon merolaeに着目し、実験材料として用い、窒素源欠乏シグナルの受容や、そのシグナル伝達機構の解明を目的としている。昨年度は、転写複合体の精製を目指して、エピトープタグ融合タンパク質として発現する株の取得を試みたが、大きなタグ(FLAG/Protein A/His)を付加した株を取得することができなかった。そこで、FLAGタグ融合タンパク質として発現する株の取得を行なった。本年度は、その株を用いて細胞から転写因子複合体の精製を試みた。FLAG抗体を用いた免疫沈降の各種条件検討を行ったのちに、目的タンパク質の精製に成功した。この精製画分をLC-MS/MS解析に供することで、転写因子自体の翻訳後修飾の可能性を検証した。その結果、興味深いことに、複数のリン酸化残基が同定され、そのリン酸化の程度は窒素源の有無によって変動する傾向が観察された。一方、転写因子自体の精製量が少なかったため、転写因子に結合する因子の同定には至らなかった。この問題を解決するために、細胞内でFLAG融合タンパク質が過剰に発現する形質転換体の取得を試みが、これまでに形質転換体の取得には至っていない。当初、転写因子複合体を構成する因子を同定し、その機能解析を開始している計画であった。しかし、エピトープタグの影響が想像以上に大きく、形質転換体の取得に時間を要してしまっている。しかし、目的転写因子の免疫沈降の精製に成功し、その翻訳後修飾が明らかとなったため、窒素量に応じた新たな制御機構に繋がる新規知見を得ることに成功していると言える。翻訳後修飾の情報を基にして、修飾に関与する因子の特定を行う。また、転写因子の過剰発現体の取得については、条件特異的な発現系を使用するなど、現在問題となっている課題を解決することを試みる。また、当初計画していなかった方法(酵母ツーハイブリットなど)を用いることでも問題解決をはかる。本年度は、窒素源欠乏シグナルの受容や、そのシグナル伝達機構解析の基盤として、窒素同化に関わる転写因子複合体を細胞内から精製するための実験基盤を整備することを試みた。まず、転写因子に3種のタグ(FLAG/Protein A/His)を付加可能な発現ベクターを構築した。その後、C. merolaeに形質転換するための配列を当該ベクター付加し、PCRにて目的断片を増幅後、C. merolaeに形質転換を行なった。その結果、形質転換体を多数取得することに成功し、PCR解析にて目的の断片がC. merolaeゲノム中に挿入されていることを確認した。しかし、3種のタグに対する抗体を用いたウェスタン解析の結果、細胞内での発現を確認することができなかった。このことから、ゲノム上の配列をシーケンスにて解析を行なったところ、変異が観察された。よって、当該転写因子に3種のタグを付加することが細胞にとって不都合であることが推測された。そこで、FLAGのみを付加した株の取得を試みたところ、FLAGに融合した当該転写因子の発現を観察することができている。当初の計画では、転写因子複合体を細胞内から精製することを目指していた。しかし、当該株の取得に時間を要しているため、複合体精製実験を行う段階になっていない。しかし、FLAG融合発現株が取得できたことから、今後の解析で今年度の遅れを取り戻すべく研究を遂行していく。

この精製画分をLC-MS/MS解析に供することで、転写因子自体の翻訳後修飾の可能性を検証した。その結果、興味深いことに、複数のリン酸化残基が同定され、そのリン酸化の程度は窒素源の有無によって変動する傾向が観察された。一方、転写因子自体の精製量が少なかったため、転写因子に結合する因子の同定には至らなかった。この問題を解決するために、細胞内でFLAG融合タンパク質が過剰に発現する形質転換体の取得を試みが、これまでに形質転換体の取得には至っていない。当初、転写因子複合体を構成する因子を同定し、その機能解析を開始している計画であった。しかし、エピトープタグの影響が想像以上に大きく、形質転換体の取得に時間を要してしまっている。しかし、目的転写因子の免疫沈降の精製に成功し、その翻訳後修飾が明らかとなったため、窒素量に応じた新たな制御機構に繋がる新規知見を得ることに成功していると言える。3種のタグを付加することが、当該転写因子の機能に影響を与えたことから、(1)FLAG単独発現株の取得を行う。また、精製実験に供するレベルのタンパク質量が存在しないことが想定されるため(2)各種タグ付き過剰発現株の取得も同時に行う。また、ゲノム上の位置効果によって3種のタグが影響をもたらしたことも考えられるため、(3)転写因子がコードされているゲノムとは異なる位置への遺伝子の挿入、についても検討する。これらの実験を行うことにより、確実に当該転写因子を細胞内から精製する実験系を確立して研究を遂行する。翻訳後修飾の情報を基にして、修飾に関与する因子の特定を行う。また、転写因子の過剰発現体の取得については、条件特異的な発現系を使用するなど、現在問題となっている課題を解決することを試みる。また、当初計画していなかった方法(酵母ツーハイブリットなど)を用いることでも問題解決をはかる。
進行肝臓病患者に対するMRIを用いた早期肝細胞癌スクリーニング手技の確立

ヒト肝細胞のEOB取り込み動態の解析に関しては、臨床例のEOB造影MRI画像を用い、肝細胞内へのEOB取り込み程度の変化を経時的に観察しヒト肝細胞のEOB取り込み動態(OATP8の反応速度)の実態を明らかにし、EOB肝細胞相画像不良の有無、程度を客観的に評価できる手法(評価チャート)を作成する目的でEOB投与直後から20分までの間2分間隔でイメージを撮像する肝のイメージングプロトコールを作成し30例の画像データを蓄積した。予備的検討として蓄積したデータをもとに時間-信号強度曲線の作成を開始し、ヒト肝細胞のEOB取り込み不良例における適切な反応時間の推定に関する検討の準備段階まで到達した。小動物モデルを用いた肝細胞膜トランスポーター分子イメージング手技の最適化に関する動物実験の一環として、マウスにEOBを投与してMRI画像の取得を試みたところ、しばしば撮像の際にマウスの体動が激しくなる事象が観察された。より詳細な検討によりEOBを尾静注(2ml/kg)することで、急性期(5-10秒)にマウスに体動が生じること、過量(100ml/kg)ではマウスが死に至ること、簡易的な呼吸モニタリングシステムを用いて評価したところマウスの呼吸波形が乱れる(呼吸の波形が画面から振り切れ拾えなくなる)ことなどが判明した。これは、ヒトEOB造影MRIの重大な欠点の一つである動脈相での一過性の画像不良の機序に大きく関与する知見と考えられ今後の研究の方向性を示唆する重要な新知見と考えられた。臨床症例の蓄積にやや時間を要したため解析の開始が遅れている。しかし、動物実験に関しては予備実験を開始し、造影剤投与によりマウスの体動が増強するという知見が得られた。これはヒトEOB造影MRIの欠点を克服する研究の端緒となる可能性を秘めた新知見と考えられ今後の新たな研究の方向性が見出された点は評価できる。以上の結果、研究全体としては概ね順調に進展していると判断した。臨床的検討においては、次年度は蓄積したデータをもとに時間-信号強度曲線の作成を開始し、ヒト肝細胞のEOB取り込み不良例における適切な反応時間の推定に関して検討を開始する。最終的には血管と肝臓の信号強度の比を用いてEOB肝細胞相画像の良否を容易に判定可能な客観的評価チャートを作成する予定である。また、動物実験で得られた知見を応用してヒトEOB造影MRIの欠点である動脈相での一過性の画像不良の機序を解明し欠点を克服する研究を進めていく予定である。具体的には他施設の報告にて、マウス呼吸モニタリングシステム使用下でEOB注入後に波形が乱れることが報告されている為、次年度は小動物用モニタリングシステムを購入し、その再現を試みる。その上で、生じる原因を探索しながら、その予防策を模索する。方針としては造影剤の投与量、濃度量依存の確認、筋注あるいは静注による効能の評価、向精神薬、抗てんかん薬、消化器官用薬、中枢性筋弛緩薬、カルシウム拮抗薬、抗不整脈薬、炭酸脱水酵素阻害薬、漢方薬、生薬が結果に及ぼす相互作用などを検討する予定である。

また、動物実験で得られた知見を応用してヒトEOB造影MRIの欠点である動脈相での一過性の画像不良の機序を解明し欠点を克服する研究を進めていく予定である。具体的には他施設の報告にて、マウス呼吸モニタリングシステム使用下でEOB注入後に波形が乱れることが報告されている為、次年度は小動物用モニタリングシステムを購入し、その再現を試みる。その上で、生じる原因を探索しながら、その予防策を模索する。方針としては造影剤の投与量、濃度量依存の確認、筋注あるいは静注による効能の評価、向精神薬、抗てんかん薬、消化器官用薬、中枢性筋弛緩薬、カルシウム拮抗薬、抗不整脈薬、炭酸脱水酵素阻害薬、漢方薬、生薬が結果に及ぼす相互作用などを検討する予定である。症例蓄積に時間を要したためデータ解析の着手に取りかかれなかった。そのため機器やソフトウエアなど物品の購入が次年度に持ち越された。また、初年度に得られた研究成果の発表学会が次年度に開催されるため旅費の使用を次年度に持ち越した。いずれも次年度分の計画と合わせて予算執行を行う予定である。
長期蓄熱を有する廃熱利用地域熱エネルギ システムの評価とシミュレ-ション解析

本研究は、都市の廃熱を有効に利用するための第一段階として、廃熱の特性と賦存量を調査し、利用の基本方針とシステム構成の在り方を検討し、札幌で検討された斬新な低温廃熱利用システムと長期蓄熱の実績を調査し、その性能を明らかにしたものである。(1)廃熱の賦存量と評価地方都市と大都市の都市廃熱の形態と賦存量の内訳を明らかにし、評価の方法を示した。ごみ焼却場,下水処理場,発電所の都市施設からの廃熱が有効であること、および今後は、低温廃熱利用の開発が課題になることを指摘した。(2)利用計画の基本方針とシステムの構成5項目からなる利用原則と基本方針を提案し、それを支援するシステムの構成の在り方を検討した。すなわち、都市のエネルギ-ネットワ-ク構想と蓄熱系との組合せが必要であり、特に季節間の蓄冷熱システムを組み込むことによって新しい利用の展開が拓かれることを示した。(3)低温廃熱システムの調査結果と考察低密度な廃熱利用の代表として、札幌市で実施した地下鉄廃熱利用地域暖房システムを取り上げて調査を行なった。システムの構成の特微は、新しいヒ-トポンプボイラシステムを採用していることであるが、その平均の廃熱寄与率は約25%に達している。今後の都市における低温レベルの廃熱の可能性について参考となる資料が得られた。(4)季節間蓄熱システムの調査結果と考察季節間蓄熱の方法には、帯水層蓄熱が有効である。札幌近郊に実験プラントが建設されている。そのシステムの熱回収率,温度変化を継続測定した。その結果、温水注入および汲み上げ量がおおよそ年間1万トンにおいて、季節感の熱回収率は約46%であった。温度降下は、6カ月の汲み上げ後8°C程度であり、季季節間蓄熱の有効性を示す結果が得られた。また、シミュレ-ションによる解析を行い実測値とよく一致することを示した。
自律学習者（学習者オートノミー）を育成する英語教育プログラムの研究と実践

外国語学習とは断片的な能力の獲得にとどまらず、全人格的な成長に繋がる過程であるという考え方へ変わりいく中で、学習者とその学びの過程に深く関わる学習者オートノミーの研究に、大きな関心が寄せられている。しかし、学習者オートノミーの概念自体は定着しつつあるもその定義や特徴、さらに自律学習の指導のあり方についての具体的方法は国内外を問わず広まっていない。本研究は国際基督教大学のリベラルアーツ英語プログラム(English for Liberal Arts/ELA)において、学習者オートノミーの育成を目標としたカリキュラム作成、教材開発、授業活動の考案と、その導入法を探ることを目的とした。A.二年目に入った。2013年も2012年同様、データ収集、及び、分析が主な課題であった。代表者、分担者ともに面談を行った。2013年は新たに新一年生の参加を募ったので、結果として、面談を行う回数が昨年の約2倍となった。それにより時間の調整が厳しかった。2013年度の研究参加者は12名ほどにとどまった。ただ、2年生の被験者の数がスタート時の半分近くになった。これは想定範囲だったので、研究全体には特に影響はない。総合的には参加者が増えたので、これに伴い、新しくデータの文字お越しをしてくれる院生を雇った。B. 2013年は昨年の一年生のデータをもとにpreliminary analysisを行った。質的研究なので、昨年同様、勉強会を定期的に開き、代表者が中心となり、文献を選び、全員で取り組んだ。又、勉強会の一環として、大阪大学大学院の青木直子先生を講師として招き、質的研究の講義、及び、今後の研究の進むべき方向性についてのアドバイスをいただいた。M-GTAアプローチをとることになった。(A)始動開始年である2012年度の大きな課題はデータ収集であった。これは膨大でこの研究のかなめでもあるので、代表者、分担者ともに行った。4月中頃、新一年生に本研究の意図と意義を書面に明記し、参加者を募った。予想に反し、多くの学生が関心をもち、28人の学生が研究に参加する運びとなった。色々な理由で途中脱退もあると予想していたので、28人という人数はすこし多いが5人の研究者で手分けし、面談する運びとなった。面談のスケジュールと内容を研究課題に照らし合わせ決定した。2012年度は当初の案通りに年間4回の面談と2回のフォーカスグループを実施した。5人の研究者、及び、28人の参加者とのデータ整理、保管をするため、研究代表者は本研究に関するウエブを立ち上げ、研究環境を整えた。又、面談の文字起こしのため、当大学の院生を雇い、面談の文字起こしを手伝ってもらうことにした。院生とやりとりする音声ファイルや文字ファイルのためには別ウエブを作成し、データの保管と管理を計った。(B)データ収集の他、次の学会で代表者が次の学会において報告を行った。1.JACET東北支部大会「大学英語授業における自律学習の促進」シンポジウムにて本研究の経過報告。「学習者オートノミーを育成する英語教育プログラムの研究と実践」と題して7月2012年、仙台於。(宮原)2.JACET第51回国際大会「学習者オートノミーを育む大学英語授業の実践と省察」シンポジウムにて中間報告。8月2012年、愛知県立大学於。(宮原)(C)本研究課題と関連のある施設見学として、神田外国語大学のセルフアクセルセンターを見学し、実際にオートノミーを基盤としている大学施設で先生、生徒、教材のかかわり方を見学。(渡辺泉、宮原)(D)本研究課題と関連のある国際学会、ILAに参加。[深尾](E)質的研究に関する勉強会を数回学内で行った。(代表者、分担者)1)2014年度は2013年度と同様にデータ集め、分析を中心に行った。データ集めは2つ目のグループを対象に行った。分析は一つ目のグループを実施したが、同時に2つ目のグループの分析も同時進行することができた。ただ、分析と言ってもその前の年とは違い、頻繁に研究者同士が集まり、自分たちの担当であった被験者の分析からみられる傾向について話し合い、総合的に見てどういうことがわかってきたか(同時に何がわかってきていないか)を討論した。2)又、学会発表はAILA Brisbaneに参加し、発表を行った。又、他にJACET、京大フォーラム等の学会に参加し、この分野での傾向を見た。3)研究方法についての研究会やワークショップに多く参加し、常に研究方法のup dateに努めた。本年度の主な実績はデータ分析、学会での発表、それから最後に報告書の発行であった。データ分析に関しては昨年からの継続で、4月から7月にかけて、頻繁に5人の研究者で集まり、データ分析の照らし合わせをし、話し合いが行われた。その結果を8月、鹿児島大学で行われた、JACET国際大会でシンポジウムという形で発表した。90分、時間をいただき、3年間の研究の成果を結果だけではなく、そのプロセスに焦点をおき、質的研究に見えてくる様々な課題も提示することができた。9月からは報告書の作成に時間を費やした。詳細は下記の通りである。題:「自律学習者(学習者オートノミー)を育成する英語教育プログラムの研究と実践」。目次一覧:題1部「自己の一付け:研究者ストーリー」。

第2部1章:研究について;2章本研究の理論的背景;3章研究手法と研究手順;第4章:参加者の背景とストーリー;第5章考察。第3部「研究者の省察、及び、課題」。第4部、学会発表一覧、その他の活動一覧。全96ページ。外国語学習とは断片的な能力の獲得にとどまらず、全人格的な成長に繋がる過程であるという考え方へ変わりいく中で、学習者とその学びの過程に深く関わる学習者オートノミーの研究に、大きな関心が寄せられている。しかし、学習者オートノミーの概念自体は定着しつつあるもその定義や特徴、さらに自律学習の指導のあり方についての具体的方法は国内外を問わず広まっていない。本研究は国際基督教大学のリベラルアーツ英語プログラム(English for Liberal Arts/ELA)において、学習者オートノミーの育成を目標としたカリキュラム作成、教材開発、授業活動の考案と、その導入法を探ることを目的とした。後述するが、一部被験者の健康上の理由、研究者とのスケジュールがうまく合わなかったなどの理由で、面談が延期になり、データが予定通りに集まらなかった。それに加え、インタビューの文字起こし作業を大学院生にお願いしていたが、締め切りに間に合わない者が多々あり、結果、大幅に予定よりデータ分析が遅れる理由となった。分析を完成させ、その結果を8月のJACET国際大会に発表し、かつ、小冊子にまとめることが最終年度の課題である。データ収集、分析作業等、概ね、予定通りに進んでいる。ただ、分析に関する作業が多少、遅れている。その理由として、青木直子先生(教授、大阪大学大学院)の講習会に参加した結果、本課題の分析方法を一部変更することになったという点が挙げられる。交付申請書に記載した研究計画通りに研究を進めることができた。データ収集がおもな目的であったが、これは計画通りに進んでいる。一部被験者の健康上の理由、研究者とのスケジュールがうまく合わなかったなどの理由で、面談が延期になり、データが予定通りに集まらなかった。さらに、インタビューの文字起こし作業を大学院生にお願いしていたが、締め切りに間に合わない者が多々あり、大幅に予定よりデータ分析が遅れる理由となった。分析を終わらせることが一番の目的である。M-GTAアプローチを基盤に各自、自分の担当の参加者の分析を引き続き行うこととする。お互いの分析状況を報告する機会を頻繁に設ける。2014年8月において、AILA国際大会で発表し、又、2014年3月頃にはこの研究をまとめた小冊子を出版し、広く内外に示す予定である。2013年度は研究の2年次に入るにあたり、昨年の参加者の2年目の面談に入るとともに、新たに一年生に呼びかけをし、参加者をつのり、昨年と同様に研究データを収集する。最終年度は分析を完了し、8月鹿児島大学で行われるJACET国際大会に参加し、研究の総まとめを発表する。残りの予算は旅費、及び、研究をまとめた小冊子の印刷に予算の多くが使用される予定である。海外視察、国外学会参加等、旅費に使用予定だった金額が研究分担者の都合により、取り止めになったこと。通年の文字起こしのための人件費、2014年8月に行わる
がん抑制タンパクp53のヌクレオソーム認識機構の解明

p53は、代表的ながん抑制タンパク質である。p53はヌクレオソーム中の標的DNA配列を認識可能であるという性質を有するために、ヌクレオソーム形成の有無に影響されずに機能し、それ故に、がん抑制遺伝子発現制御の最上流の転写因子として働く。本研究は、p53のヌクレオソーム結合メカニズムの解明を目的として行った。2017年度までに、p53のN末端側がヌクレオソームとp53の結合を促進すること、さらにp53のN末端側にヒストンH3-H4と結合する20アミノ酸の領域が存在することを見出していた。2018年度は、この領域がH3-H4と結合するメカニズムを明らかにするために、生化学的解析と立体構造解析を進めた。これらの結果、p53のN末端側が疎水性相互作用を介してH3-H4と結合することを明らかにした。また、この結果に基づいて設計したH3-H4との結合が弱いp53点変異体は、ヌクレオソームとの結合を保持していた。この結果はp53のN末端側によるヌクレオソーム-p53の結合促進と、p53-H3-H4の結合が独立したメカニズムによって担われている可能性を示唆している。また、がん細胞では、いくつかの特異的なヒストンの変異が報告されている。これらのヒストン変異は、ヌクレオソームの性質や構造に変化を引き起こし、p53との相互作用に影響を与えることで細胞のがん化を引き起こす可能性がある。そこで、まず、がん患者に高頻度にみられるヒストン変異を有するヌクレオソームの構造および性質を明らかにした(Nucleic Acids Res. 2018)。さらに、セントロメアに局在するヒストンバリアントであり、がん細胞での高発現が報告されているCENP-Aを含むヌクレオソームの構造解析およびヒストン翻訳後修飾(H4K20me1)導入機構解析を行った(Nature Commun. 2019)。本研究の目的は、がん抑制転写因子p53がヌクレオソーム中の標的DNA配列を認識し、結合するメカニズムを解明することである。しかし、なぜp53は他の転写因子と異なり、ヌクレオソーム中のDNA配列を認識可能なのかは理解されていない。申請者は、既にp53にヌクレオソーム結合を可能にする未知のドメインが存在することを発見している。こうした知見を活かし、本研究では、p53のヌクレオソーム結合メカニズムを生化学的・構造生物的解析によって解明する。p53がヌクレオソーム中の標的DNA配列を認識して結合するメカニズムを解明するため、生化学的解析と立体構造解析の2つのアプローチを併用して進めた。生化学的解析では、p53 N末端側のアミノ酸領域(1-93)に含まれる、ヌクレオソーム結合を可能にするドメインの絞り込みと、このドメインと直接相互作用するヌクレオソーム中の領域の同定を目指して生化学解析を行った。この解析の過程で、p53のN末端側にヒストンH3-H4を結合するドメインが存在することを見出し、この結合を担うドメインを20アミノ酸の領域にまで絞り込んだ。立体構造解析のためには、ヌクレオソームの結晶にヒストン結合を担うペプチドを浸潤させて、X線結晶構造解析データを取得した。加えて、Cryo-電子顕微鏡を用いた単粒子解析を目指して、Cryo-電子顕微鏡を用いた予備実験を行った。本年度の研究において、精製したH3-H4複合体及び、p53の断片を用いて、生化学解析をおこない、p53のN末端側にヒストンH3-H4を結合するドメインが存在することを見出した。さらに、p53とH3-H4結合を担うドメインを、p53のN末端に存在する20アミノ酸の領域にまで絞り込んだ。このp53とヒストンH3-H4の結合は、p53による転写活性化メカニズムにおいて重要な機能を有すると考えられ、p53を介した転写活性化メカニズムの解明に大きく貢献する成果である。さらに、構造解析に向けたサンプル調製及び予備実験も順調に進行している。また、平成29年度の成果によって、p53とヒストンの直接相互作用が見出されたので、p53がヒストンの翻訳後修飾や、ヒストンバリアントといった、ヒストン上にコードされるエピゲノム情報を直接認識する可能性や、がん細胞において、多く発現するヒストンの変異がp53とヒストンの相互作用に影響する可能性など、p53を介した転写活性化メカニズムの新たな仮説が想起された。これらの状況を鑑みて、予想以上の進展があったと判断した。

これらの結果、p53のN末端側が疎水性相互作用を介してH3-H4と結合することを明らかにした。また、この結果に基づいて設計したH3-H4との結合が弱いp53点変異体は、ヌクレオソームとの結合を保持していた。この結果はp53のN末端側によるヌクレオソーム-p53の結合促進と、p53-H3-H4の結合が独立したメカニズムによって担われている可能性を示唆している。また、がん細胞では、いくつかの特異的なヒストンの変異が報告されている。これらのヒストン変異は、ヌクレオソームの性質や構造に変化を引き起こし、p53との相互作用に影響を与えることで細胞のがん化を引き起こす可能性がある。そこで、まず、がん患者に高頻度にみられるヒストン変異を有するヌクレオソームの構造および性質を明らかにした(Nucleic Acids Res. 2018)。さらに、セントロメアに局在するヒストンバリアントであり、がん細胞での高発現が報告されているCENP-Aを含むヌクレオソームの構造解析およびヒストン翻訳後修飾(H4K20me1)導入機構解析を行った(Nature Commun. 2019)。平成29年度の研究において、p53がヒストンH3-H4結合することを明らかにし、この結合を担うドメインを20アミノ酸の領域にまで絞り込むことに成功した。平成30年度には、p53とH3-H4の結合が、p53の転写活性化においてどのような役割を果たすのか生化学的解析、細胞生物学的解析を並行して行い、明らかにする。また、平成29年度にp53内の、どの領域がヒストンと結合するのかを明らかにしたので、平成30年度においては、ヒストン内のどの領域がp53と結合するのかを生化学的解析によって明らかにする。加えて、平成29年度の成果によって、p53とヒストンの直接相互作用が見出されたので、p53がヒストンの翻訳後修飾や、ヒストンバリアントといった、ヒストン上にコードされるエピゲノム情報を直接認識する可能性や、がん細胞において、多く発現するヒストンの変異がp53とヒストンの相互作用に影響する可能性など、p53を介した転写活性化メカニズムの新たな仮説が想起された。これらの仮説についても生化学的手法を用いて解析を行う。さらに、平成29年度に引き続き、X線結晶構造解析、Cryo-電子顕微鏡解析によって、p53がヌクレオソームに結合するメカニズムを明らかにすることを目指す。
細胞接着因子claudinが大腸癌の増殖能、浸潤能に及ぼす影響の臨床病理学的解析

細胞間タイト結合蛋白であるclaudinの発現と局在について、大腸癌の手術症例及びヒト大腸癌培養細胞を用いて検討した。claudin-1の細胞膜での発現はリンパ管侵襲、深達度と逆相関を示し、claudin-3の核での発現は粘液癌において有意に増加した。また、claudin-1の発現は原発巣由来株Caco-2細胞と比較してリンパ節転移巣由来株SW620細胞において減少すること、claudin-1は細胞増殖や細胞遊走においてアップレギュレーションとして作用することが明らかとなった。大腸癌手術症例100例を用いて、claudin-1, 2, 4とclaudin-3, 7およびKi-67(MIB-1)の発現について免疫組織化学を行った。claudin-1, 4の膜での陽性率は58%と60%であった。claudin-3, 7は膜に陽性が58%と50%であり、核に陽性が22%と2%であった。claudin-1, 4およびclaudin-3, 7の発現と臨床病理学的因子との相関では、claudin-1の発現低下はリンパ管侵襲の有るものに多く認めた(P<0.01)。また、claudin-1の発現低下は深達度の進行したものに多く認めた(P<0.01)。claudin-1, 4の発現と他の臨床病理学的因子との相関は認めなかった。claudin-3とclaudin-7の膜における発現と臨床病理学的因子との間には有意な相関は認めなかった。また、核における発現と臨床病理学的因子との相関では、claudin-7においては有意な相関は認めなかったが、claudin-3において粘液腺癌では有意に核での発現が上昇していた。大腸癌におけるclaudinの発現は腫瘍の分子生物学的変化による可能性があり、今回の結果から、claudin-1, 3の発現は組織型や予後を推定する上で重要な指標となると推察された。また、claudinの発癌に関与する役割や局在、メカニズムなどは十分には解明されていないが、claudin-1, 3は大腸癌の病理組織学的な指標となる可能性を示した。本年度の研究計画にある免疫組織化学的検討と臨床病理学的解析については、ほぼ順調に進展しているが、概要に記載したようにclaudin-2の判定とKi-67のlabeling indexの計測は現在進行中である。また、Caco2およびSW620培養細胞株を用いたチャンバースライドによる発現部位の検討は、蛍光抗体法を用いずに酵素抗体法による免疫染色が可能であり、予備実験の進行中である。しかしながら、平成28年度研究計画にあるreal-time PCRを用いたclaudin-1. 4のm-RNAの解析およびwestern blotについては解析済みである。以上のように、実験計画が前後しているものの、全体的にはおおむね順調に推移しているものと考える。細胞間タイト結合蛋白であるclaudinの大腸癌における臨床病理学的役割を明らかにするために、大腸癌手術症例から得られた組織標本100例とヒト大腸癌培養細胞株Caco-2、SW620を用いて検討した。今年度の研究実績として、Ki-67(MIB-1)の発現と臨床病理学的因子との相関に関して検討したところ、Ki-67 labelingindexはリンパ節転移のあるものが、リンパ節転移のないものと比較して有意に高いという結果が得られた。Ki-67 labelingindexと組織型や深達度などの他の臨床病理学的因子との相関は認めなかった。また、今年度、claudin-2の発現と臨床病理学的因子との相関についても検討したが、臨床病理学的因子との相関では、有意な相関を認めなかった。昨年度に引き続き行った大腸癌原発巣由来細胞株Caco-2と大腸癌転移巣由来細胞株SW620を用いた免疫細胞化学による検討では、Caco-2細胞の免疫細胞化学で、claudin-1, 7は細胞膜に発現、claudin-3は核に発現し、claudin-2は細胞膜、細胞質、核に発現し、claudin-4は細胞質に発現していた。RT-PCRではCaco-2細胞、SW620細胞のいずれにもclaudin-1とclaudin-4の発現を認めた。リアルタイムPCRでは、claudin-1, 4, 7の発現は、Caco-2細胞と比較してSW620細胞で有意に減少していた。また、そのwestern blotによる解析においても、claudin-1, 4, 7の発現はCaco-2細胞と比較するとSW620細胞において発現が減少していた。一方、claudin-3の発現リアルタイムPCR、western blotによる解析において、SW620細胞はCaco-2細胞と比較して、有意に発現が上昇していた。平成27年度計画において、若干遅れていた大腸癌組織標本を用いた検討と解析に時間がかかり、研究計画に遅延を生じている。大腸癌培養細胞を用いたRT-PCRと免疫細胞化学による解析は実施できたが、増殖能、浸潤能のMTTアッセイ等の測定と細胞分画に応じた解析に遅れが生じている。細胞間タイト結合蛋白であるclaudinの大腸癌における臨床病理学的役割を明らかにするために、大腸癌手術症例とヒト大腸癌培養細胞を用いて検討した。今年度の研究実績としては、ヒト大腸癌リンパ節転移株SW620細胞の免疫細胞