hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
揮発性麻酔薬の腎虚血再潅流障害に対する保護効果とその分子細胞機構の解明

Wister系雄性ラット(250g300g)を、ペントバルビタールにて麻酔を行い、気管挿管した後、ベンチレーターにて呼吸管理を行った。両側側腹切開下に、両側腎動静脈を尿管も含めてマイクロクリップを用いて40分間のクランプを行う腎臓虚血再灌流モデルを用いて以下の3群に分けた。(1)揮発性吸入麻酔薬を投与せず、虚血も行わないシャム群。(2)揮発性吸入麻酔薬を投与せず、虚血のみ行う群。(3)揮発性吸入麻酔薬を投与し、虚血を行う群。それぞれの群で、24時間、48時間後に採血を行い血清クレアチニン値とBUN値を測定した。(1)のシャム群ではクレアチニン値とBUN値は変化がなかった。24時間後と48時間後のクレアチニン値は、(2)では、2.4±1.2mg/dl,2.9±0.9mg/dlであり、(3)では、1.2±0.7mg/dl,1.1±0.2mg/dlであった。BUN値は、(2)では、99±29mg/dl,187±31mg/dlであり、(3)では、62±19mg/dl,79±20mg/dlであった。腎臓虚血再灌流後、5分後、40分後、90分後に腎臓を摘出し、ホモジナイザーを使用しホモジナイズを行った。ウェスタンブロッティング法を用いて、p38,ERK, JNKのキナーゼ活性を測定した。虚血のみ行った群では、p38, ERK, JNKの各蛋白は、再灌流5分後より活性上昇を認めた。p38は、90分後にピークになった。ERKは、5分後に、JNKは、40分後にピークを認めた。ERK, JNKの活性は、90分後も高いレベルを保っていた。揮発性吸入麻酔薬を投与した群では、ERK, JNKの活性は40分後、90分後で有意に低下していた。揮発性麻酔薬(イソフルラン)は、腎虚血再灌流障害に対して抑制作用を持ち、その抑制作用は、ERK、JNKを介した作用であることが示唆された。Wister系雄性ラット(250g300g)を用いて、ペントバルビタール麻酔下に気管挿管した後、ベンチレーターにて呼吸管理を行った。マイクロクリップを用いて両側腎動静脈クランプによる腎臓虚血再灌流モデルを用いて以下の群に分けた。(1)揮発性吸入麻酔薬を投与せず、虚血も行わないシャム群、(2)揮発性吸入麻酔薬を投与せず、虚血のみ行う群、(3)揮発性吸入麻酔薬を投与し、虚血を行う群。24時間後と48時間後のクレアチニン値は、(2)では、2.4±1.2mg/dl,2.9±0.9mg/dlであり、(3)では1.2±0.7mg/dl,1.1±0.2mg/dlであった。腎臓虚血再灌流後、5分後、40分後、90分後に腎臓を摘出し、ホモジナイザーを使用しホモジナイズする。Western blotting法を用いて、p38,ERK,JNKのキナーゼ活性を測定した。虚血のみ行った群では、p38,ERK,JNKの各蛋白は、再灌流5分後より活性上昇を認めた。ERK,JNKの活性は、90分後も高いレベルを保っていた。揮発性吸入麻酔薬を投与した群では、ERK,JNKの活性は40分後、90分後で有意に低下していた。

BUN値は、(2)では、99±29mg/dl,187±31mg/dlであり、(3)では、62±19mg/dl,79±20mg/dlであった。腎臓虚血再灌流後、5分後、40分後、90分後に腎臓を摘出し、ホモジナイザーを使用しホモジナイズを行った。ウェスタンブロッティング法を用いて、p38,ERK, JNKのキナーゼ活性を測定した。虚血のみ行った群では、p38, ERK, JNKの各蛋白は、再灌流5分後より活性上昇を認めた。p38は、90分後にピークになった。ERKは、5分後に、JNKは、40分後にピークを認めた。ERK, JNKの活性は、90分後も高いレベルを保っていた。揮発性吸入麻酔薬を投与した群では、ERK, JNKの活性は40分後、90分後で有意に低下していた。揮発性麻酔薬(イソフルラン)は、腎虚血再灌流障害に対して抑制作用を持ち、その抑制作用は、ERK、JNKを介した作用であることが示唆された。
メタボローム分析とインフォマティクスによる漢方システム理論の包括的解析

漢方は、中国医学に由来する日本の経験的伝統医学である。また、漢方薬は生薬を組合わせて製され、患者を全身的に捉えた診断基準「証」に基づいて処方される。このように漢方薬は、近現代医学とは異なったアプローチによって処方される。本研究では、こうした漢方処方システムの複雑な全体像を、情報科学の手法を応用して解析した。そして、漢方方剤の構成生薬、およびメタボローム(含有化学成分の総体)と、虚/実(患者の体質)の「証」との相関理論を、PCA(主成分分析)とPLS(部分最小二乗)モデリングによって明らかにした。このように本研究は、「証」に基づいて個別化された漢方薬物治療システム理論の解明を目指したものである。生薬の組合せによって製される漢方薬は、漢方に独特の診断基準である虚/実(体質)、陰/陽(病気の進行状態)などの「証」に基づいて患者に処方される。本研究は、漢方方剤-「証」-多様な薬効化学成分の3者について、それらの複雑な相関理論を明らかにし、漢方処方システムの包括的理解を目指すものである。本年度は、主に以下の2点について研究を遂行した。(1)漢方方剤-「証」-多様な薬効化学成分の相関解析:漢方方剤(約1,200処方)の構成生薬量を変量としたPrincipal Component Analysis(PCA)を行い、方剤分類を行った。その結果、各グループ内の漢方方剤は、虚/実、陰/陽への適用に高い近似が認められた。更に、各漢方方剤の化学分析から得られたメタボローム(生物資源に含有されている代謝物の総体)データのPCAにおいても、同様の結果が示された。逆に、漢方方剤の構成生薬量の側から、その方剤の虚/実への適用を予測するため、Partial Least Squares(PLS)回帰分析を行った。その結果、98%以上の漢方方剤について正確に虚/実への適用を予測することができた。(2)漢方方剤データベース構築とデータの多変量解析:補血、強壮、鎮静、鎮痛などの「証」を治療する漢方方剤に配合されていることが多い生薬トウキに着目し、「君臣佐使(漢方方剤内における生薬の役割)」に軸を置いた漢方方剤データベース(約70処方)を構築した。データの多変量解析としてPCA、PLS-Discriminant Analysisを行い、トウキの「君臣佐使」を基に漢方方剤を分類した。また、その分類への構成生薬の寄与を、因子負荷量を基に整理した。更に、トウキの配合量を意図的に加減変化させた場合の漢方方剤の虚/実への適用変化が、PLS回帰分析によって予測されうることが示唆された。生薬の組合せによって製される漢方薬は、漢方医学に独特の診断基準「証」に基づいて処方される。本研究は、その漢方処方システム理論の包括的な理解を目指すものである。特に、漢方処方システムの基盤である漢方方剤-「証」-多様な薬効化学成分の3要素に着目し、それらの複雑な相関関係について解析を進めている。これまでに、「証」については虚/実(体質)、陰/陽(病気の進行状態)に焦点を当て、複数の漢方方剤とそれらのメタボローム(方剤を構成する生薬に含有されている化学成分の総体)との相関解析を行ってきた。また、漢方方剤内における構成生薬の役割・位置付けを表す概念である「君臣佐使」に着目した解析も進めてきた。そしてH26年度は、「証」については気・血・水の概念も含めて、まず初めに、複数の漢方方剤を対象としたデータベース構築を行った。このデータベースを用いることにより、漢方方剤の気・血・水などの「証」への適用や構成生薬について、目的とする情報を規則的に抽出することが可能になった。次に、データベース内の膨大な量の情報を解析するため、多変量解析を行った。ここでは特に、Principal Component Analysis(PCA)とPartial Least Squares Projection toLatent Structures(PLS)回帰分析を主体とした解析を行った。これらの多変量解析によって、漢方方剤のバリエーションを集約して可視化すると共に、そのバリエーションに寄与する因子について解析した。そして、漢方方剤の構成生薬量を意図的に増減させた場合の、その漢方方剤の「証」への適用変化をシミュレーションした。これらの結果から、漢方方剤-「証」-多様な薬効化学成分の3要素の相関関係を解析することによって、漢方処方システムに潜在している複雑な規則性の理論的考察が可能であることが示唆された。漢方薬は、漢方医学に独特の診断基準「証」に基づいて処方される。本研究は、その漢方処方システム理論の包括的な理解を目指して進められた。特に、処方システムの基盤となる漢方方剤-「証」-薬効化学成分の相関関係に着目した研究を行った。H27年度は、主に以下の研究を遂行した。(1)漢方方剤(構成生薬の量・比)-「証」-薬効化学成分(メタボローム)の相関関係について総括するため、本年度までに得られたデータの多変量解析を、Principal Component Analysis(PCA)とPartial Least Squares Projection toLatent Structures(PLS)回帰分析により行った。なお、「証」については虚/実(体質)に焦点を当てた。

その結果、漢方方剤が処方される「証」と、構成生薬の量・比との相関は、数理モデルによって表され得ることが示唆された。また、「証」とメタボローム(方剤を構成する生薬に含有されている化学成分の総体)との相関も、同様に表すことができた。そして、漢方方剤の構成生薬量・比やメタボロームの側から、その方剤の適用「証」が予測され得ることも確かめられた。なお、これらの解析結果は二次元または三次元のグラフによって可視化することが可能である。(2)漢方方剤の構成生薬量・比と、虚/実、気・血・水(生体の生理的因子)などの「証」について、研究期間を通して構築してきたデータベースの情報を追加・更新した。このデータベースに集約された情報は、上記(1)に使用した。(3)漢方方剤のメタボローム分析は、これまで主としてMS(質量分析)により行ってきたが、加えてNMR(核磁気共鳴)分析を一部進めた。これによって、漢方方剤の新しい化学フィンガープリンティングを確立するための予備的な知見を得ることができた。漢方は、中国医学に由来する日本の経験的伝統医学である。また、漢方薬は生薬を組合わせて製され、患者を全身的に捉えた診断基準「証」に基づいて処方される。このように漢方薬は、近現代医学とは異なったアプローチによって処方される。本研究では、こうした漢方処方システムの複雑な全体像を、情報科学の手法を応用して解析した。そして、漢方方剤の構成生薬、およびメタボローム(含有化学成分の総体)と、虚/実(患者の体質)の「証」との相関理論を、PCA(主成分分析)とPLS(部分最小二乗)モデリングによって明らかにした。このように本研究は、「証」に基づいて個別化された漢方薬物治療システム理論の解明を目指したものである。多変量解析やデータベース構築を主体としたインフォマティクスと、メタボローム分析により、漢方方剤-「証」-多様な薬効化学成分の3要素について、それらの複雑な相関関係を解析し、漢方処方システムに潜在している複雑な規則性の理論的考察を進めた。研究成果の公表については、これまで学会発表に留まっているものの、現在、学術論文の作成・投稿に着手している。総合的には、H25年度からの研究が進展し、漢方処方システム理論を包括的に理解するための知見がより蓄積された一方で、本研究の更なる進展と成果の公表が必要な状況であり、研究進捗はやや遅れているものと考えている。(1)漢方,伝統医学,和漢薬・生薬,薬用植物を対象とした実験情報科学(2)システム医薬学これまでの研究において、漢方処方システム理論を明らかにすることを目的に、漢方方剤-「証」-多様な薬効化学成分の3要素に着目した相関解析を進めてきた。今後も、本研究に必要な実験データや情報は、必要に応じて追加していく予定である。加えて、ハード・ソフトの両面からインフォマティクス研究環境の質をより高め、本研究により構築したデータベースに蓄積されている膨大な情報を解析するための技術力・応用力を向上させていく必要があると考えている。また、学会・シンポジウム発表、学術論文の公表を行っていく予定である。漢方方剤-「証」-多様な薬効化学成分の3者について、それらの複雑な相関を明らかにするために、漢方薬治療システムの多変量解析やデータベース構築を主体としたインフォマティクスと、漢方方剤のメタボローム分析を進めてきた。
地方都市の発展と都市近郊林の保全に関する基礎的研究

人口密度の変化に対応した人口一人当り林野面槓の変化を表現できる数式を求めるために、栃木県の統計年鑑資料(1960年から1995年までの市町村別人口、行政面積および林野面積)を用いて、ベキ乗式と指数関数式を比較した。その結果、過半数の市町村において、指数関数式よりもベキ乗式を用いた方が当てはめ結果が良かった。人口密度の増加に伴った人口一人当り林野面積の減少傾向をベキ乗式のパラメータの値と曲線形を用いて観察し、似た様な減少傾向をもつ市町村をグルーピングした結果、県内49の市町村は分類不能グループを含めて合計10のグループに分類された。各グループの社会・経済的条件や立地条件を調べるために、産業別就労者割合、総人口、主要交通網からの距離などを比較検討した結果、いくつかの例外はあるもののグループ間ではこれらの条件が異なる一方、グループ内ではこれらの条件がほぼ同じであることがわかった。また国土地理院の数値地図データを用いて、傾斜角度という地形条件から上記各グループ間の特徴を調べた結果、グループ毎の平均傾斜角度と各グループのべき係数の平均値の間には、ほぼ直線関係が認められた。ランドサットTMデータを用いて栃木県全域にわたる森林位置図を作成する一方、国土地理院の数値地図データを用いて栃木県の傾斜分布図を作成して森林の分布と地形の関係を調べた。一般的に森林は傾斜の急な山岳地にまとまって分布しているが、県北の那須町と黒磯市の北部及び今市市には比較的傾斜の緩い土地にも森林が分布していることが明かとなった。今後さらに地形条件、地理条件、産業構造などの経済条件をより適切な指数として表現する方法を究明する必要がある。過去のランドサットTM観測データ記録を調べた結果、雲量が少なくかつ栃木県全域をカバーする撮影記録が少ない事がわかった。1985年8月以降の観測データから、比較的雲量の少ない8シーンの観測データを購入し、とりあえず1985年8月と1995年5月に観測されたTMデータを用いて土地利用分類を試みた。観測季節の異なるデータ解析の結果では、田畑、草地、森林等の面積比にかなりの変動が見られた。検証データには県の統計資料を用いたが、統計資料の数値の信頼性に関して再検討する必要が認められた。また、同時観測データ内においても、同一植生の標高差による反射輝度の違いが認められ、一定の標高レベル毎に土地利用分類を行うなど、今後、ランドサットデータ解析方法になんらかの改善策が必要であることが判明した。栃木県全域をカバーする国土数値情報並びに数値地図を入手した。時間的関係で、詳しい分析は次年度以降の予定である。栃木県統計書(国勢調査資料)から人口、土地利用、農林業等に関する時系列統計資料を収集した。土地利用関係の資料には、集計方法の違い(課税台帳の集計と農林部調査集計)により整合性のない数値があり、今後その間の調整が必要であることが判明した。当初の計画に比べて初年度の計画は遅れている。初年度は次年度必要となる基礎資料の調査・収集が主体であったが、次年度以降これらの資料を用いた解析を行う予定である。栃木県内49市町村について、1960年の世界農林業センサスとそれ以降5年毎の栃木県統計年鑑から人口、市町村面積、林野面積、産業別就業者数に関するデータを抜き出し、人口密度と住人一人当りの林野面積の関係を調べた。人口密度の増加に従って一人当りの林野面積は減少する傾向が一般的に認められるが、その減少の仕方にはいくつかのパターンが認められ、栃木県内49市町村は全部で10のグループに分類された。なお、一人当りの林野面積の減少を表現する関数としては、指数関数よりもべき乗式の方が当てはめ誤差が少なかった。

次にこれら10グループに分けられた各市町村に関して、その地理条件、主要交通網からの距離で測られた立地条件、産業別就業者数の割合等を調べた結果、グループ間ではそれぞれこれらの条件が異なっていること、グループ内の市町村間ではこれらの条件がほぼ同じであることがわかった。今回の研究の結果、グループ毎に異なる減少曲線のパラメータを用いて、将来の人口増加による林野面積の減少予測が可能となり、また、他府県における市町村の地理条件や社会・経済条件がわかれば、その市町村の人口増加に伴う林野面積の減少を予測できる可能性が出てきた。10個のグループの中には、どのグループにも属さない単独の市町村をまとめたものがあるが、その中には一度人口密度が減少し、その後再び人口密度が増加すのに従って一人当り林野面積が減少するケースが認められた。グラフに表示するとローマ字のCのような軌跡を描くが、このグループに属する市町村の解析は最終年度に当たる次年度に行う予定である。前年度までの研究によって、栃木県内49市町村における一人当りの林野面積の時間変化が人口密度のべき乗に反比例して減少することが明らかになり、その減少の仕方によってこれらの市町村は合計10のグループに分類された。更にこれらのグループに属する市町村について産業別就労者数の割合や主要交通網からの距離で測定された立地条件を調べた結果、いくつかの例外があるもののグループ間ではこれらの条件が異なる一方、同じグループ内ではこれらの条件がほぼ同じであることが明らかになった。本年度は傾斜角度という地形条件から上記各グループ間の特徴を調べた結果、平均傾斜角度と各グループのべき係数の平均値の間には、ほぼ直線関係が認められた。さらにランドサットTMデータを用いて栃木県全域にわたる森林位置図を作成する一方、国土地理院の数値地図50メータメッシュを用いて栃木県の傾斜分布図を作成し、森林の分布と傾斜角の関係を調べた。栃木県は県西部に位置する日光連山と県東部に位置する八溝山地に夾まれで南北に平野が広がっており、一般的に森林は傾斜の急な山岳地にまとまって分布しているが、県北の那須町と黒磯市の北部である那須町との境界付近及び今市市には比較的傾斜の緩い土地にも森林が分布していることが明かとなった。本年までの研究から栃木県内の市町村について、産業別就労者割合、主要道路からの距離で測られた立地条件、土地の傾斜角度で測られた地形条件が判明すれば、人口密度の増加に伴う一人当りの林野面積の減少を、人口密度のべき乗式である程度予測できることが明らかになった。今後さらに地形条件、地理条件、産業構造などの経済条件をより適切な指数として表現する方法を究明する必要がある。
劣性型脊髄小脳変性症の遺伝子単離研究

常染色体劣性遺伝性小脳失調症(ARCA)は常染色体劣性遺伝性を示し、臨床的に運動失調症状を示す不均一な疾患の総称である。今回日本人ARCAの3家系を経験について、ホモ接合性マッピング・連鎖解析と次世代シーケンサーを使用したエクソーム解析を併用し、その疾患責任遺伝子の同定を試みた。その結果、1家系においてSynaptotagmin XIV遺伝子(SYT14)のホモ接合性変異がARCAの新規疾患責任遺伝子であることを同定した。本研究に用いた方法により小規模な家系においても疾患責任遺伝子同定が可能なことを示した。脊髄小脳変性症Spinocerebellar Ataxia(SCA)は、およそ60%は弧発性、30-40%は優性遺伝性、数%が劣性遺伝性である。劣性型のうち欧米で頻度の高いFriedreich失調症は本邦での報告はなく、Ataxia with Oculomotor Apraxiaの責任遺伝子、AprataxinやSenataxinの変異などが散見される程度で遺伝的背景が異なることが分かっている。劣性型SCAは一般的に優性型SCAに比し、若年発症で末梢神経障害や錐体外路症状等の神経症状を伴うことも多い。今回、5060歳前後で発症した高年発症SCAの劣性遺伝性家系3例を経験した。この家系を用いて連鎖解析を行いてホモ接合性マッピングにより遺伝子局在部位を明らかにし、責任遺伝子単離を行うことを目的して研究を開始した。平成22年度の1年間では、3家系ともホモ接合性マッピングを完了し、1家系においては次世代シーケンサーを用いた遺伝子変異同定を行い、責任遺伝子変異の候補を同定した。正常コントロール576アレルにおいて、その変異が認められないことを確認した。さらに候補遺伝子の野生型、変異型を培養細胞に強制発現させると、野生型と変異型で明らかに細胞内局在が変化することを確認した。また、候補遺伝子産物に対するポリクローナル抗体を作成し、免疫染色を行ったところ、候補遺伝子産物が小脳Purkinje細胞に発現していることを確認した。以上の結果から今回同定した遺伝子変異は病的である可能性が非常に高いことが確認できた。劣性型SCA1家系において責任遺伝子を同定できたと考えられるため、現在上述の内容の論文を作成し、投稿準備中である。平成22年度の1年間では、3家系ともホモ接合性マッピングを完了し、1家系においては次世代シーケンサーを用いた遺伝子変異同定を行い、SYT14のミスセンス変異p.Gly484Asp[c.1451G>A]を常染色体劣性遺伝性SCAの新たな責任遺伝子変異の候補として同定した。平成22年度から平成23年度にかけ、SYT1の野生型、変異型を培養細胞に強制発現させると、野生型と変異型で明らかに細胞内局在が変化することを確認した。また、TaqManリアルタイムPCR法を用いてSYT14のmRNAが脳で多く発現することを確認した。SYT14タンパク質に対するポリクローナル抗体を作成し、免疫染色を行ったところ、SYT14が小脳Purkinje細胞に局在していることを確認した。以上の結果からSYT14が新たな疾患責任遺伝子である可能性が非常に高いことが確認できた。劣性型SCAI家系において責任遺伝子を同定できたと考えられるため、平成23年度に上述の内容の論文を作成しThe American Journal of Human Geneticsに筆頭著者として報告した。
金属酸化物表面における吸着メカニズム-光電子・サテライト分光による研究

金属酸化物は様々な反応において触媒として用いられ、その表面反応性は実用的に極めて興味深い。しかし、一般に金属酸化物は絶縁体であるため、表面敏感な分析手法として表面反応素過程の研究に有用な電子分光法を適用することが難しい。本研究は、金属単結晶表面上に酸化薄膜を作成することによりチャージアップ効果を克服し、電子分光法により金属酸化物表面におけるCO吸着過程の解明を目指したものである。研究として、まず金属基板として様々な条件を勘案した結果Ni(100)単結晶を採択した。Ni(100)表面をAr^+イオン衝撃(1kv)及び加熱(800k)により清浄化し、LEED、AESによりチェックした後、サンプルを570kに加熱しつつ1×10^<-6>Torrの酸素に十数分間露出し、酸素を排気した後約650kまで加熱するというサイクルを繰返すことにより、Nio(100)/Ni(100)酸化表面の作成をめざした。実験は、真空系、He放電管、及びオージェ電子分光測定回路のトラブルが重なったため、現在Nio(100)/Ni(100)酸化膜作成の予備実験を行なったのみで、CO吸着実験の実施に至っていない。今後装置の修理、改良が修了しだい、CO吸着実験を行ない、紫外光電子スペクトルの解析により吸着機構の解明を行なう予定である。
運動が中枢性代謝調節に影響を与える経路の探索

本研究は、持久的運動後の視床下部におけるレプチン感受性の変化と、そのメカニズムについて検討した。トレッドミル走運動後にレプチンを投与すると、視床下部におけるSTAT3のリン酸化が増強した。また、免疫組織化学染色を用いた解析により、某神経ペプチドを産生する視床下部ニューロンの活性化が、トレッドミル走運動により増加することを認めた。その神経ペプチド受容体阻害薬をトレッドミル走運動前にマウス脳室内に投与しておくと、視床下部におけるSTAT3リン酸化の増強が見られなくなったことから、運動後のレプチン感受性増強には、その視床下部ニューロンの活性化が原因であることが示唆される。視床下部は摂食行動を司るとともに,生体内のエネルギー代謝をコントロールする中枢神経系として知られている。しかしながら、視床下部性代謝調節に対する運動の影響に関しては不明な点が多い。そこで本研究では、マウス視床下部におけるレプチン感受性に対するトレッドミル走運動の影響について調査した。15m/minの速度で45分のトレッドミル走運動を行ったマウスにレプチンを腹腔内投与し、45分後に脳サンプルを採取した。ウエスタンブロット法で視床下部腹内側基底部(MBH)におけるSTAT3のリン酸化を検出すると、運動によりSTAT3のリン酸化が増強する結果を得た。また、レプチンを脳室内投与した場合では、STAT3だけでなくERKのリン感化にも増強効果が見られた。これはMBHにおけるレプチン感受性の亢進を示唆する。一方、運動による覚醒効果に視床下部で産生される神経ペプチドであるオレキシンが関与する可能性が考えられる。そこで、運動前にオレキシン受容体の拮抗薬を脳室内に投与しておくと,上述した運動によるレプチン感受性増強効果は見られなくなった.さらに、オレキシンをマウス側脳室内に投与した45分後に、レプチンを腹腔内に投与すると、運動による効果と同様に、MBHにおけるSTAT3のリン酸化が増強した。以上より、MBHにおけるレプチン感受性は、短時間のトレッドミル走運動により増強することが明らかとなった。この一部にはオレキシンが関与することが示唆される。視床下部は接触行動をつかさどるとともに、生体内のエネルギー代謝を調節する脳部位として知られている。しかし、視床下部性代謝調節機構に対する運動の影響については不明な点が多い。本研究では、視床下部におけるレプチン感受性に焦点を当て、トレッドミル運動後におけるレプチン感受性の変化とそのメカニズムについて検討した。C57BL/6Jマウスに対して、15m/minで45分間の低強度トレッドミル運動後にレプチン(2mg/kg)を腹腔内投与すると、免疫組織染色法およびウエスタンブロット法により、STAT3のリン酸化を指標とする内側基底部の視床下部レプチン感受性が亢進することを見出した。免疫組織化学染色法により、トレッドミル運動により視床下部オレキシンニューロンが活性化していることが明らかになった。オレキシン受容体阻害薬を脳室内に投与し、トレッドミル運動後のレプチン感受性を調べると、運動によるレプチン感受性亢進作用が焼失した。その発端が骨格筋収縮にあると仮説を立て、麻酔下において体温を37度に維持したまま電気的に骨格筋を収縮させて、オレキシンニューロンの活性化を見たが、ほとんど変化が見られなかった。以上のことより、低強度運動により視床下部内側基底部のレプチン感受性が亢進することが明らかになった。また、その作用にはオレキシンが関与すると考えられる。アイソトープを用いた実験が施設の関係で実施できていない。また、カプサイシンを用いた求心性神経の機能欠失実験において、至適カプサイシン濃度の決定に時間がかかっている。応用健康科学アイソトープを用いた実験の代替法を取り入れ、早急に実験を進める。また、高脂肪食摂取によりレプチン抵抗性を引き起こしたマウスを作製し、運動によるMBHレプチン感受性増強において、同様のメカニズムが働いているのかについて調べる。すでに使用していた試薬などで追加購入が少なく、また、予定していた実験が施設の関係で延期になったため。予定していた実験の代替実験を新規に立ち上げて行うため、大きな費用が生じる。そこで、当該年度の予算を次年度へ繰り越して使用する。
人の生命に関わる意思決定の倫理的価値構造に関する研究

本年度の研究目的は、「患者の人権」「自己決定権」「患者と医療者の間の信頼権関係」「医療資源とリスク配分の正義」などの倫理的価値はどのように取り扱われているのかという現状分析を行うことであった。本年度は、生殖医療の意思決定において発生する倫理的価値の対立に着目し、その複雑な構造を分析した。また、難しい意思決定の構造分析において、関係者の思いや意見の背景にある理由(インタレスト)を深く分析するための「理由の来歴」という概念を導いて、この概念について研究し、その成果を第29回日本医学・哲学倫理学会で発表した。また、これらの研究成果をまとめた『産科医療と生命倫理-よりよい意思決定と紛争予防のために』(昭和堂)は、2011年4月に刊行の予定である。医療と合意形成の関係については、『合意形成学』(勁草書房、2011年4月刊行予定)に寄稿した。医療・看護領域での現場での倫理的価値の対立の解決の方法については、合意形成の観点から検討しつつ、医療現場の倫理教育の設計のあり方についても考察した。その成果は、第12回日本感性工学会で発表した。なお、複数の医療機関から倫理研修の依頼を受け、本研究の成果を踏まえて研修プログラムを組み、医療者に対する生命倫理・医療倫理・看護倫理の教育・研修を実施する一方、その方法論の構築の必要性を認識した。終末期医療、看取りの準備教育と合意形成との関係について関係者との意見交換を深め、生命に関わる倫理的価値構造の研究の視野を生殖と誕生から終末期の死、および災害や交通事故などの不慮の事故による死へも広げ、ライフサイクル・ライフステージの観点、および生命に対する多様なリスクとそれへの対応を「医療空間マネジメント」の観点から考察する必要があるということを認識し、この観点を「包括的ウェルネス(空間および平常時と非常時の時間を包括的にマネジメントするための考え方)」として展開する展望を得た。本年度の研究目的は、関係者の思いや意見にある理由を深く分析するための「理由の来歴」という概念を用いて、ライフサイクル・ライフステージ、災害、緊急時などの多様な状況によって、倫理的価値の扱われ方がどのように異なるのかを明らかにすることであった。本年度は、出生から死にかかわる領域まで範囲を広げて、1)沖縄県国頭村地域で共同の墓地を守る住民との意見交換、2)東日本大震災の被災地状況の視察、3)人が亡くなったあの世のことも想定した宗教団体との意見交換などを通して、人が元気なうちから、家族や地域の人との間で、生と死についての互いの意思を確認することの重要性を確認した。本人の意思の確認が難しい死に関する意思決定のケースでは、人がどのように生き、また死を迎えたいかという問題に関し、個々人の生と死に対する倫理的価値観の把握を行うために重要なものとして、「理由の来歴」の概念についての考察を深めた。さらに、緊急時における生死にかかわる行為の選択においては、すでに学会で発表している「包括的ウェルネス」の重要性を再確認し、本概念についての研究を深める必要性を認識した。本年度の研究成果としては、生殖医療行為を中心とした倫理的価値構造について、著書『生命倫理と意思決定-よりよい意思決定と紛争解決のために』(昭和堂)として出版した。また、「理由の来歴」の概念について、論文「医療の合意形成と理由の来歴」を「医学哲学・倫理学会」誌に投稿し、掲載された。実践面では、医療・看護領域での複数の医療機関からの倫理研修の依頼を受け、本研究の成果を踏まえて研修プログラムを組み、医療者に対する医療倫理・看護倫理の研修・教育をする一方、倫理的問題に対する「価値の対立の克服」のための支援システムの構築の必要性を認識した。来年度は、本研究の成果を組み込んだ倫理研修のためのテキストブックを執筆、出版する予定である。本年度は、合意形成における「理由の来歴」概念を展開させて、意思決定モデルの一つとして、「予期的合意形成モデル(Prospective Consensus Building)」を創出し、他のモデルとの比較、分析を行った。その成果として、意思決定の価値構造の分析において、理論面では、合意形成の概念を時間軸に焦点をあてて深く理解することができた。他方、実践面では、医療・看護領域での倫理研修の依頼を受けて、本研究の成果を組み込んで実践者を対象にした研修、教育を行った。本研究の成果の一つとして、合意形成における関係者間における情報提供・共有の方法の検討および情報にかかわる「正義」という倫理的概念の検討が必要不可欠であるという認識に至った。そこで、平成25年度科研費基盤研究(C)に「人の生命・健康に関わる医療情報の価値構造の研究」と題して申請し、採択された。それぞれの目標に対して、理論的考察および地域での調査を踏まえたものを総合しつつ、研究を進めることができている。また、研究成果を学会発表および投稿「医療の合意形成と理由の来歴」(医学哲学医学倫理学会)、出版『産科医療と生命倫理-よりよい意思決定と紛争予防のために』(昭和堂)という形にまとめることができている。24年度が最終年度であるため、記入しない。今後の研究は、すでに導出した重要な概念「理由の来歴」、「包括的ウェルネス」についての吟味をさらに深く行いたい。具体的には、最新の国内外の文献等の比較、現地調査などから、医療に関わる意思決定の多様な意見の背後にみえる風土性の考察も加えて、平常時・非常時の両者を含む人の生命の意思決定に関わる倫理的価値構造を明らかにする。

本研究全体の成果も踏まえる形で、これまで行ってきた研究成果を統合して理論化するために、医療機関での医療従事者に向けた倫理研修のためのテキストブック『倫理研修テキストブック(仮題)』を執筆予定である。24年度が最終年度であるため、記入しない。
IPv6インターネットにおけるハードウェア認証ICチップの開発とロボットへの適用

今後、インターネットには、自動車やゲーム機器、介護ロボット、家電、電子楽器など、様々なハードウェアがつながり、世界中の人々に新しいサービスを提供していくと考えられる。そこで我々は機器間の認証とアクセス制御のモデル化を行い、従来の認証システムに不足している機能を実現するための研究を実施した。本研究では人間を対象とした認証システムと機器を対象とした認証システムの違いを詳細に分析した上で機器のためのセキュリティシステムをモデル化した。更に,機器指向の認証及びアクセス制御のフレームワークを提案し、プロトタイプ実装を示すことでその実用性の高さを示した。本研究ではICチップで動作する独自のソフトウェアを開発し、ICチップの独立した安全な実行環境に機器の認証情報を格納し、尚且つ安全に電子署名、及び署名検証、ACL検証などを実行するシステムを提案した。本提案では公開鍵基板(Public Key Infrastructure)を機器に適用する方法を提示した。更に、開発したICチップを実際に利用する為に、我々はIPv6の標準セキュリティ機能であるIPsecを利用したミドルウェアシステムを開発し、ピアツーピアでの機器間の認証とアクセス制御、暗号化通信を実現するシステムを開発した。本研究により機器指向のセキュリティシステムのモデルを提案することができ、実用的な機器指向のICチップを用いた認証方式を提案した。平成17年度の研究では、ハードウェアを認証するための「ハードウェア認証ICチップ」のソフトウェアの基本処理部を開発した。具体的には、仏Schlumberger社のJavaCardAPI準拠のICチップ製品Cyberflex access32k e-gateに(1)公開鍵証明書による認証処理、(2)アクセス制御リスト(ACL)に基づくアクセス制御処理、(3)セキュリティプロトコルのポリシ及び設定情報を端末に提供する機能、の各機能をJavaCardAPIを用いて実装した。さらに、IPv6のセキュリティ機能であるIPsecの認証を実行するIKE(インターネット鍵交換)プログラムに対して、ICチップの(1)と(3)の機能を呼び出す処理を実装した。この研究成果は、電子情報通信学会の情報セキュリティ研究会にて「スマートカードを用いたIPセキュリティポリシと認証情報の配布機構」として対外発表した。(2)のACLによるアクセス制御処理については平成18年度に計画している「ハードウェア認証ICチップ」のロボットへの適用フェーズで利用する計画である。実証実験として「ハードウェア認証ICチップ」を2台のコンピュータに接続し、IKEプロトコルと連携させたときに認証に要する実行時間を計測した。詳細な測定結果は上記の研究会報告書に示した。結論として、認証処理は既存の「人」を対象とした認証トークンと変わらない実行性能を得ることができた。しかし、現在の対象プラットフォームにおいては、公開鍵証明書の検証(証明書データのバイナリ解析)、ACLの解析などはICチップ上で実行するには処理が複雑で高負荷であるため、実用的な速度を得るためには設計の改良が必要であることがわかった。平成18年度には、実用的な実行速度を得るためのシステムの改良、ロボットへの適用をおこなう計画である。
高温微粒子ピーニングによる構造用鋼の多機能化と効果発現メカニズム

金属間化合物は,優れた特性を有するものの加工性に乏しいため,利用が制限されている.本研究では,高周波誘導により加熱した金属に微粒子を高速投射することにより,被処理面を粒子と基材成分で構成される金属間化合物が創成されることを明らかにした.これにより,に,被処理面の耐食性,高温酸化性,耐摩耗性が向上すること,金属間化合物が短時間に創成されるメカニズムには燃焼合成反応が関与することを明らかにした.1.処理システムの改良:初年度はまず,砂時計型の疲労試験片にも適用可能になるよう,チャンバーと治具の設計と製作を行った.2.メカニカルミリングによる投射粒子の作製:投射粒子として初年度はまず,Ni/Al MM粒子を,遊星型ボールミル(フリッチュ製; P-6)により作製した.具体的には,ポット内に所定の量のNi粒子とAl粒子(Ni:Al=1:4)に加えて粒子の混練させる目的でジルコニアボールを,また,凝集して粗大化することを抑制する目的として,界面活性剤のイソプロパノールを同時に混入して,メカニカルミリングを行った.その際ミルポットは,ステンレス製の雰囲気置換用容器に挿入し,容器内をAr雰囲気に置換した状態で装置を稼働した.運転条件は,公転回転数200rpm,自転公転数360rpmとし,5分の稼働と15分の休止を1サイクルとし,これを72回繰返すことにより,投射に適した粒子の作製が可能になることが明らかとなった.3.被処理面の諸特性評価:被処理面に対しては,マクロ観察,SEM観察を行う.また,断面の表面近傍をEDXにより分析し,投射粒子元素の分布状況を詳細に調べた.さらにXRDによる分析を実施し,形成された化合物の状態を明確にした.また,同じ箇所のビッカース硬さ分析を行い,化合物の分布状況などについても検討を加えた.4.高周波誘導加熱窒素ガスブローによるTiN化合物層の創成:チタン合金表面に,Ti-N系の化合物層を創成することにチャレンジした.具体的には,真空置換型AIH-FPP処理システムを用いて窒素雰囲気に置換したチャンバー内で,チタンおよびチタン合金を700°C900°Cに加熱した状態で窒素ガスをブローし,それによりチタン表面をTiNなどの化合物が形成されることを明らかとした.メカニカルミリングによる投射粒子の作製に関しては,試行錯誤に時間を費やしたが,目標通り達成することができた.また,そこで得た知見は,今後,新しい金属間化合物創製に向けても有益なものとなる.したがって,この点に関しては順調に進捗していると評価できる.被処理面の特性評価に関しても,ノウハウの蓄積も含めて順調に実施できている.被処理材が構造用鋼の場合には問題なく金属間化合物の創製が達成できたが,素材をチタンに変更して同じ条件で処理を施すと,空洞が多数形成されるなどの問題点が浮き上がった.しかしこの点に関しては,投射粒子の成分の工夫や熱履歴の変更により解決可能であることを実験結果に基づき示した.当初予定していた,措置の改良に関してはほぼ終了しているが,コイルの設計に手間取ったこともあり,実際の処理の実施に関しては次年度に持ち越しとすることとした.別途,高周波誘導加熱窒素ガスブローによるTiN化合物層の創成にも取り組み,同じ処理装置を利用し簡便なプロセスにより表面改質が実現できることを明らかとしている.この点に関しては,多くの論文発表も行っている.金属間化合物創成メカニズムに関しては,提案した仮説の検証を実施している段階であり,次年度も継続して実施する予定である.金属間化合物が種々の優れた性質を有することは周知の事実である.しかし加工性に劣るという最大の欠点があり,これが幅広い実用化への妨げとなっている.本申請では,溶射やコールドスプレーなどに変わる新たな手法を提案し,それにより,構造用鋼の表面のみを短時間に金属間化合物化することを目的としている.具体的には,高周波誘導により加熱した金属に,高速(100150m/s)で微粒子を投射することにより,被処理面を投射粒子成分と基材成分で構成される金属間化合物に改質するプロセスを提案た.単に提案するのみならず,金属間化合物化した表面の耐食性,高温酸化性,耐摩耗性,摺動特性さらには疲労特性を調べ,その効果の検証を行っている.詳細は割愛するが,これまでに,基材はチタンおよびチタン合金(Ti-6Al-4V合金)を基材として,その表面に対して種々の粒子(Ti + Al,Ti + Al + Fe,Ti + Al + Ni)を投射して,金属間化合物を創成することを試みてきた.結果の詳細は後述するが,耐摩耗性や耐高温酸化性なの優れた特性を輸する表面の作成が可能なことを実証した.また,表面近傍に界面が発生することが,強度的観点から弱点として作用するため大きな問題となっているが,こ表面処理時の熱履歴を工夫することでこの解消ができる可能性を示した.被膜創成メカニズムに関しても学術的観点から仮説検証型の実験を実施してきた.その結果,空孔の無い緻密な金属間化合物を創成するためには,局所的に溶融することが必須であり,そのためには,粒子成分と基材成分間の燃焼合成反応が重要であることが明らかとなっている.これらの成果は,後述する通り,7件の雑誌論文(原著,査読付き)および9件の学会発表として公開されている.当該年度はまず,過年度までに作製した, Ni-Al金属間化合物層に対して高温連続酸化試験を行い,被処理面の耐酸化性を評価した.

その結果,AIH-FPP処理を施した部位は優れた耐酸化性を持つことが明らかとなった.これは,Ni-Al金属間化合物層が高温酸化雰囲気の下でAl2O3を連続的に生成し,それが保護被膜となるためである.つぎに,純チタン表面にAl元素を拡散させることによって基材表面をTi-Al金属間化合物化させることを試みた.まず,純チタンに対してFe/Al MM粒子を用いた雰囲気制御高周波誘導加熱微粒子ピーニング(AIH-FPP)処理を行った.具体的には,粒子投射条件,および加熱保持条件を種々に変更し,AIH-FPP処理による表面改質効果を調べた.その結果に基づき,Al元素の拡散とそれによる金属間化合物創成メカニズムについて検討・考察を加えた.さらに,摩擦摩耗試験を行い,被処理面の耐摩耗性を評価した.その結果,Fe/Al MM粒子を用いたAIH-FPP処理では,粒子混合比および粒子投射温度によって粒子の移着は抑制可能であり,基材表面に厚さ数ミクロンの移着層が形成されることが明らかとなった.さらに750°Cで粒子投射後,900°Cに昇温し加熱保持を行うことで,投射粒子成分のAlが基材へ,基材のTiが移着層へ拡散し,基材表面にTi-Al金属間化合物を含む厚さ10ミクロン程度の厚さのAl成分の拡散層が形成される可能性が示された.最後に,この表面対して,往復摺動型の摩擦摩耗試験を行い,未処理材の試験片に実施したところ,AIH-FPP処理を施した試験片の耐摩耗性が向上していることが明らかとなった.これは,試験片表面がTi-Al金属間化合物化し,硬さが上昇したためと考えている.金属間化合物は,軽量で耐食性や耐摩耗性に加えて耐熱性にも優れるが,靱性や延性に乏しく脆いため,バルク材を部品形状に機械加工して利用することは困難である.本研究では,この金属間化合物を鋼の表面に被覆する手法として,申請者らが開発した高周波誘導加熱微粒子ピーニング(AIH-FPP)処理に着目して研究を行った.以下に得られた成果をまとめる.(1)基材をチタンおよびチタン合金として,その表面に対して種々の粒子を投射して,金属間化合物を創成することを試みた.たとえばFeとAlを複合化した粒子を用いたAIH-FPP処理により,基材表面に厚さ数ミクロンの投射粒子の移着層が形成されることが明らかとなった.さらに750°Cで粒子投射後,900°Cに昇温し保持することで,投射粒子成分のAlが基材へ,基材のTiが移着層へ相互拡散し, Ti-Al金属間化合物を含む10ミクロン程のAl成分の拡散層が形成される可能性が示された.(2)耐酸化性,耐摩耗性など優れた特性を持ち,比較的共晶点の高いTi-Al金属間化合物に着目し,AIH-FPP処理を用いて炭素鋼表面に均質な化合物被膜を創成することを試みた.さらに創成された被膜に対して,往復摺動摩擦摩耗試験を行うことで,被膜の耐摩耗性について検討・考察を加えた.摩擦摩耗試験後は摩耗痕をSEMにより観察し,摩耗の状況について詳細に調べた.その結果,耐摩耗性に優れた表面が創成されることが明らかとなった.(3)粒子投射時の燃焼合成反応により,金属間化合物層が創成されるメカニズムを提案し,それによりすべての実験結果が矛盾なく説明されることをしめした.ここには一例を示したが,3年間の成果により,投射粒子や処理条件の制御により,様々な金属間化合物層の創成が可能となることが示された.
分子および分子集合体の動的挙動研究のための分子電子顕微鏡技術の開発

「3次元分子シミュレーションのような3次元動画を実際の分子で撮影できないか?」「有機分子に馴染みの薄い電子顕微鏡(電顕)の世界」を「電顕に馴染みの薄い有機化学の世界」に導入し,「分子電顕技術(molecular electron microscopy)」という新しい分子科学の手法を確立することでこの問いに答える.有機分子やその集合体の動きを3次元の動画により単一分子レベルでの絶対配置の決定,溶液中の極微量成分の一分子一分子の単離と構造決定,一つ一つの化学反応事象の「その場」観察というこれまで不可能と考えられてきた可能性を拓き,触媒,有機エレクトロニクス,生物科学に関わる基礎科学の革新を目指す.「3次元分子シミュレーションのような3次元動画を実際の分子で撮影できないか?」「有機分子に馴染みの薄い電子顕微鏡(電顕)の世界」を「電顕に馴染みの薄い有機化学の世界」に導入し,「分子電顕技術(molecular electron microscopy)」という新しい分子科学の手法を確立することでこの問いに答える.有機分子やその集合体の動きを3次元の動画により単一分子レベルでの絶対配置の決定,溶液中の極微量成分の一分子一分子の単離と構造決定,一つ一つの化学反応事象の「その場」観察というこれまで不可能と考えられてきた可能性を拓き,触媒,有機エレクトロニクス,生物科学に関わる基礎科学の革新を目指す.
免疫調節薬IMiDsにおける抗がん活性の分子機構の解明

本研究では免疫調節薬IMiDsの作用機構の解析を行った。IMiDsの中でもCC-885は多くの細胞に対して強力な細胞増殖阻害活性を有し特に急性白血病細胞に感受性がある。セレブロンはユビキチンリガーゼとして機能することから、研究代表者はCC-885依存的なセレブロンの基質探索を行った。結果として翻訳終結因子GSPT1を単離した。そして本研究で解析した結果、CC-885の急性白血病への効果はGSPT1の分解により引き起こされる事を証明し、またセレブロンのCC-885を介したGSPT1認識の構造基盤も明らかにした。本成果はGSPT1を標的とする新たな急性白血病薬の開発を実現するものである。本年度は研究実施計画に基づいて、強力な細胞殺傷性を持つサリドマイド誘導体の一種、IMiDA1によりセレブロン(CRBN)との結合が誘導されたタンパク質X1-X3について、これらがCRBNユビキチンリガーゼの基質なのかどうかについての検証を行った。質量分析の結果、X1,X3は同一因子で、X3はX1の分解産物か別のスプライス産物だったものと思われる。X2はX1結合因子として報告されているタンパク質であった。X1はレナリドマイドが誘導するCRBN基質として既に報告のある、転写因子Ikaros, Aiolosとは全く構造も生理的役割も異なる因子であることが報告されていた。過去の報告によるとX1をノックアウトしたりノックダウンすると細胞増殖抑制が生じることが判明している。申請者は、まずIMiD A1によりX1の分解が生細胞で誘導されているかを検証した。X1タンパク質の減少は確かに誘導されており、X2の分解は見られなかった。またE3阻害剤、MLN4924で処理したところ、IMiD A1によるX1減少は抑えらえた。CRBNをCRISPRでノックアウトしたところ、IMiD A1による効果は全て失われた。293T細胞にHA-CRBNおよびX1-Myc-FLAGをトランスフェクションにより今日発現させ、HA抗体で免疫沈降を実施したところ、細胞抽出液にIMiD A1を処理した場合のみ結合がみられた。申請者は、複数の欠損変異体を用いて、X1のC末領域にCRBNが結合し、その領域のみのX1変異体でもCRBNが発現している細胞ではIMiDA1処理で分解されることも示した。申請者はそのC末領域にあるすべてのリジンをアルギニンに置換したK-less変異体を作製し、それがIMiDA1でもはや分解されなくなることを確認した。そしてさらにIMiD A1に感受性のある細胞にそのK-lessを発現させたところ、IMiD A1にある程度耐性になった。本年度は研究計画に基づき、薬剤IMiD A1の誘導するCRBN基質たんぱく質X1の解析をさらにつづけ、またほかのIMiDsの基質候補解析も行った。X1がIMiD A1の薬効を担う真の標的であることを証明するためにCRBN非結合型X1変異体の作成を試み、最終的に一か所のアミノ酸をアスパラギンに置換するだけでCRBN結合能を失った変異体作成に成功した。この変異体を細胞に発現させ、IMiD A1を処理したところ、増殖阻害効果が抑制されることが判明した。よってIMiDA1の効果はX1の分解を解することが証明された。次に、IMiD A1にsensitiveに効くがん細胞の探索を行った。結果として急性骨髄性白血病(AML)細胞株においては、数十百pico molarで増殖抑制効果を発揮することが判明した。AML細胞株においてCRBNをCRISPR/Cas9でノックアウトしたところ、IMiDA1耐性になり、またCRBN非結合型X1変異体を発現させたAML細胞においてもA1耐性になっていた。以上より、IMiD A1はAML治療に有効であることが期待され、かつタンパク質X1を新たなAML治療における新薬標的として見出すに至った。そして、X1は幸運にも結晶化が報告されていることから、構造生物学的研究も実施することができ、CRBN-DDB1-A1-X1の複合体の解析にも着手するに至った。並行してPomalidomideおよびLenalidomideやさらに次世代のIMiDsでCRBN結合が誘導される基質候補X4の解析を行った。大変興味深いことに、X4はIMiDs依存的にCRBNに結合するが、分解されることはなかった。研究は非常に進展している。本年度で、もはやIMiDs A1がAMLに効果があることや、それが基質X1を分解することにより引き起こされることが証明できたので想定をはるかに超える大変な前進である。またX4はIMiDs依存的にCRBNと結合しながら分解されなかった。これは新しいタイプの結合因子である。こちらの解析もIMiD-CRBNの関係を明らかにするうえでは大変重要であると考える。本年度では、まずIMiD A1 (別名CC-885)および基質X1 (別名GSPT1)とCRBNの間の結合の構造基盤を明らかするために、米国セルジーン社と国際産学連携研究を行い、X線結晶解析を行った。生化学的な結合実験によりCRBNがCC-885存在下においては、GSPT1のC末(Domain 2/3)に結合することをまず明らかにし、そして次に解像度3オングストロームで結晶構造を明らかにした。CC-885は、CRBNとGSPT1の間をつなぐ分子接着剤の役割を果たしていた。

そして基質側には特定のグリシン(G575)がCC-885におけるイソインドリノンに結合しており、その部分はラマチャンドランプロットによると、グリシンしか許容されておらず、どのアミノ酸に置換しても相互作用が失われることが判明した。既知の基質であるIkarosはポマリドミドでCRBNとの結合が誘導されるが、この場合もIkarosのG151を別のアミノ酸に置換すると相互作用が失われていた。IkarosのGlycine周辺配列(degronに相当)をホモロジーモデルにより、GSPT1で得られたG575周辺のsurface-turn構造と比較すると、比較的類似していることが判明した。結局の所、IkarosとGSPT1のdegronに配列相同性はほとんどなかったがglycineが共通しているという、CRBN結合化合物を今後デザインする上で重要かつ有用な知見が得られた。本成果はNature誌のArticleに掲載された。並行して、新規のポマリドミドおよびレナリドミド誘導CRBN結合因子X4の解析を行った。X4をノックダウンして薬剤を処理すると、他の既知の基質の分解が促進されることが判明した。また既知の基質はヒトCRBNとのみ結合し、マウスCRBNとは結合しないことが示されていたが、X4はマウスCRBNとも結合した。本研究では免疫調節薬IMiDsの作用機構の解析を行った。IMiDsの中でもCC-885は多くの細胞に対して強力な細胞増殖阻害活性を有し特に急性白血病細胞に感受性がある。セレブロンはユビキチンリガーゼとして機能することから、研究代表者はCC-885依存的なセレブロンの基質探索を行った。結果として翻訳終結因子GSPT1を単離した。そして本研究で解析した結果、CC-885の急性白血病への効果はGSPT1の分解により引き起こされる事を証明し、またセレブロンのCC-885を介したGSPT1認識の構造基盤も明らかにした。本成果はGSPT1を標的とする新たな急性白血病薬の開発を実現するものである。IMiDA1の薬効の解析は大きく進んだ。IMID A1はCRBNユビキチンリガーゼにおいて細胞増殖に重要なタンパク質X1を分解する活性を誘導した。そして、X1が実際にIMiD A1の薬効と関わっているのかを明らかにするため、CRBNがX1のどこに結合するのかを明らかにし、さらにはその部分のリジンをアルギニンに全て置換することで非分解型変異体の作製に成功した。それを用いたIMiDA1耐性細胞の樹立も成功し、IMiD A1の薬効を担う主要な標的タンパク質がX1であることがほぼ判明したと言えるかもしれない。その点では、本年度だけで来年度、再来年度に計画していたデータもすでにいくつか出せたと言える。また今年度の意義は、申請者の考案した計画に基づいて解析を行うことで、確かにIMiDsの誘導するCRBN基質を単離・同定・証明できることが判明したことである。よってIMiD A1-X1研究という点では非常に卓越した成果をあげられていると言えるが、申請書にあるX4, X5のような別のIMiDsの基質候補の解析については、次年度以降に中心に行うこととなったので「おおむね順調」ということにした。IMiD