hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
アレルギー性鼻炎における上皮産生サイトカインの役割とその調節機構の解明

近年,アレルギー疾患発症の起点や増悪因子としてThymic stromal lymphopoietinやIL-25,IL-33といった,上皮細胞が産生するサイトカインが注目されている.なかでもIL-1ファミリーサイトカインのIL-33は,Th2型のアレルギー疾患への関与が指摘されており,これまで,気管支喘息やアトピー性皮膚炎での役割について数多くの報告がある.我々は今回、IL-33とその特異的レセプターであるST2に着目し、鼻粘膜上皮におけるIL-33とST2の役割について検討した。結果,鼻粘膜上皮はIL-33とST2遺伝子の発現を認めており,アレルギー性鼻炎の鼻粘膜においてそれらの発現が増加していた.また,アレルギー性鼻炎患者の血清IL-33値は正常コントロールと比較して有意に増加していた.次にIL-33が鼻粘膜上皮細胞に作用し、上皮産生サイトカインの発現誘導に関与しているという仮説をたて,IL-33を鼻粘膜上皮細胞に処理し,検討を行った.結果,IL-33処理により鼻粘膜上皮細胞からIL-8,GM-CSFの産生が有意に増加した.以上の結果から,IL-33とそのレセプターのST2はアレルギー性鼻炎の病態形成に関与している可能性が示唆された.また,アレルギー性鼻炎患者の鼻粘膜上皮では正常コントロールと比較して,IL-33由来の炎症反応が起こりやすい状態にあることが示唆された,今回の知見はIL-33/ST2経路が粘膜上皮細胞由来の炎症反応を制御するためのターゲットとなり得ること示している.近年,アレルギー疾患発症の起点や増悪因子としてThymic stromal lymphopoietinやIL-25,IL-33といった,上皮細胞が産生するサイトカインが注目されている.なかでもIL-1ファミリーサイトカインのIL-33は,Th2型のアレルギー疾患への関与が指摘されており,これまで,気管支喘息やアトピー性皮膚炎での役割について数多くの報告がある.我々は今回、IL-33とその特異的レセプターであるST2に着目し、鼻粘膜上皮におけるIL-33とST2の役割について検討した。結果,鼻粘膜上皮はIL-33とST2遺伝子の発現を認めており,アレルギー性鼻炎の鼻粘膜においてそれらの発現が増加していた.また,アレルギー性鼻炎患者の血清IL-33値は正常コントロールと比較して有意に増加していた.次にIL-33が鼻粘膜上皮細胞に作用し、上皮産生サイトカインの発現誘導に関与しているという仮説をたて,IL-33を鼻粘膜上皮細胞に処理し,検討を行った.結果,IL-33処理により鼻粘膜上皮細胞からIL-8,GM-CSFの産生が有意に増加した.以上の結果から,IL-33とそのレセプターのST2はアレルギー性鼻炎の病態形成に関与している可能性が示唆された.また,アレルギー性鼻炎患者の鼻粘膜上皮では正常コントロールと比較して,IL-33由来の炎症反応が起こりやすい状態にあることが示唆された,今回の知見はIL-33/ST2経路が粘膜上皮細胞由来の炎症反応を制御するためのターゲットとなり得ること示している.
カトマンズバレーによって形成される大気安定成層と大気汚染の動態調査および解明

峡谷内の大気汚染現象を水槽実験により解析する場合を想定して,水槽模型の数値実験から峡谷内の流場・拡散場に支配的なパラメータの導出を行なった.Chenが示した山谷風の流れ場に支配的な無次元パラメータ、地表面部の流体塊が断熱的に上昇する理論上の高さと斜面の高さの比、ならびに地表面の冷熱が地表面冷却期間に大気に伝達される高さと斜面の高さの比が、峡谷内の気象場・拡散場の両方に支配的であることを示すことが出来た.導出した,無次元パラメータを用いてカトマンズ峡谷を模擬した水槽模型実験を行った結果,数値実験とほぼ符合する結果が得られた.乾式測定器によるNOx濃度の連続測定、β線によるTSP濃度の連続測定、オキシダント濃度の連続測定をTribhuwan Universityで実施した。また、キャニスタで捕集したカトマンズ市10箇所の大気のVOC成分分析を実施し、VOCの成分ごとの発生量をこの分析結果から推定した。また、カトマンズからの窒素酸化物、TSP、VOCの発生量は、文献データから交通量の増加量を考慮して推定した。これらの発生源データを入力値とし、カトマンズの大気汚染濃度の時間変動を、2層1ボックスモデルを用いて計算し、観測値を再現した。カトマンズバレーの大気汚染濃度の現況を把握するために、乾式の窒素酸化物濃度自動モニタリング装置、オキシダント濃度自動モニタリング装置、β線によるTSP濃度自動モニタリング装置、湿式の窒素酸化物濃度自動モニタリング装置、湿式の硫黄酸化物濃度自動モニタリング装置をTribhuwan大学に設置した。また、風速、風向、気温、日射の連続測定装置も、同様に、Tribhuwan大学に設置した。一部の機器に問題があるため、データは完全ではないが2003年12月から測定を開始している。データはデータロガを介してコンピュータに取り込まれ、e-mailで日本に送付されてきている。また、本研究グループは、2003年10月カトマンズを訪れ、大気中のVOC濃度を調査する目的でキャニスタで大気捕集を実施した。VOCの化学分析は未着手であるが、次年度以降も継続的に実施する計画である。ネパール環境省はカトマンズ市内5ヶ所でハイボリュームサンプラーを用いてTSPの捕集を実施し、濃度測定を実施している。環境省と交渉し、TSPの成分分析を行う目的で捕集後のTSPろ紙を日本に送付してもらうことで同意した。カトマンズでの大気汚染濃度測定環境の整備をほぼ完了したことが本年度の実績であり、本格的な解析は次年度に実施する予定である。1.峡谷内の大気汚染現象を水槽実験により解析する場合を想定して,水槽模型の数値実験から峡谷内の流場・拡散場に支配的なパラメータの導出を行なった.Chenが示した山谷風の流れ場に支配的な無次元パラメータ、地表面部の流体塊が断熱的に上昇する理論上の高さと斜面の高さの比、ならびに地表面の冷熱が地表面冷却期間に大気に伝達される高さと斜面の高さの比が、峡谷内の気象場・拡散場の両方に支配的であることを示すことが出来た.導出した,無次元パラメータを用いてカトマンズ峡谷を模擬した水槽模型実験を行った結果,数値実験とほぼ符合する結果が得られた.2.乾式測定器によるNOx濃度の連続測定、β線によるTSP濃度の連続測定、オキシダント濃度の連続測定をTribhuwan Universityで実施した。また、昨年度キャニスタで捕集したカトマンズ市10箇所の大気のVOC成分分析を実施した。カトマンズからの窒素酸化物、TSP、VOCの発生量は、文献データから交通量の増加量を考慮して推定した。またVOCの成分ごとの発生量は、キャニスタの分析結果から推定した。以上の発生源データを入力値とし、カトマンズの大気汚染濃度の時間変動を、2層1ボックスモデルを用いて計算した。計算結果は、概ね観測値とよく一致した。カトマンズ峡谷の大気汚染物質は、一年間パッシブサンプラー法によって測定された。冬季に汚染物質が最も高くなることが確かめられた。

また、冬季の大気汚染物質の日変動と温度の鉛直分布も測定され、冬季の大気汚染が、典型的な日変動を示すことが明らかになった。NO2とTSPの濃度レベルは、午前に最高になり、日中に最低になった。また、温度の鉛直分布により求めた温位勾配から、汚染レベルが最大になる時に大気が最も安定であり、汚染レベルが最低になる時、不安定であることが示された。また、風速は日中に最大となり、夜間はほとんど無風であることが明らかになった。カトマンズ峡谷の10ヶ所で、VOC濃度が測定され、Tridevi Marg Royal Place(交通量が最も多い)で濃度レベルは最大となった。VOCの成分分析結果より、カトマンズ峡谷のVOCの内40%がガソリンの寄与、20%が排気ガスの寄与であることが示された。カトマンズ峡谷の大気汚染濃度を、2層ボックス・モデルを用いてはシミュレーションした。輸送部門および産業部門のTSP、窒素酸化物、硫黄酸化物および炭化水素の排出量は、既存のデータを基に近年の自動車登録台数の増加率から評価し、炭化水素の成分毎の排出量は、2003年にカトマンズ峡谷の測定データから評価した。水槽模型実験から得られた混合層高さを、モデルパラメータとして用いた。モデルによって計算されたTSP濃度、NO2、NOとO3濃度は、観測結果をかなりよく再現した。このモデルを、TSP濃度の将来予測に用いた。将来シナリオとして、交通量の増加、排ガス規制をクリアした車比率の増加、車税による道路舗装率の増加を考えた。その結果、車税による道路舗装率を高めない限り、TSP濃度は将来にわたり増加し続けることが示された。このことは、道路舗装率を高めない限り、健康への悪影響が増加することを示唆しており、早急な自動車対策の実施が必要であることを意味している。
環境保全を主眼としたムラサキイガイを用いた新しい観点からの化学生態学的研究

著者らは,ムラサキイガイ(Mytilus edulis galloprovincialis)を用いた付着誘引物質および忌避物質を探索するユニークな試験法を確立した.足糸形成に対する,形,撹拌,空気の存在,塩濃度,カルシウム,マグネシウム濃度,温度など各種物理的,化学的要素について研究されている.今回,足糸形成に影響する各種化合物について調べた.その結果,Fe (III) EDTA,コウジ酸,L-アスコルビン酸,安息香酸ナトリウムおよびフェノールは,100μmol/lで,足糸数がコントロール(8±1本を100%とする)より,49, 44, 19, 16および4%増加した.Fe (III) EDTAは,200μmol/lで2倍になったが,コウジ酸は50200μmol/lでそれ以上増加しなかった.MgCl_2およびCaCl_2は6および24%の足糸数の減少を示し,硫酸銅とニコチン酸アミドは10および5umol/lで完全に足糸の形成を阻害した.従来のムラサキイガイの固定する試験法にかえて,貝を自由にさせた新試験法を考案した.塩ビの筒の底をふさぎ,細かい砂を入れ,貝1個体を置いた.筒の内側にウェブロン紙を巻き,それを4等分し,交互に試験する物質を塗った.3日間海水に漬け,貝がどこに移動するかで判定するものである.この試験で,クルクミン,インディゴカ-ミン,α-トコフェロールおよび鉄粉が1.0μmol/cm^2で誘引活性を示した.ノニルフェノールは,0.1μmol/cm^2で忌避活性を示した.試料の必要量は,固定化法とほぼ同じで,結果も一致し,従来の試験法の有効性も確認できた.著者らは,ムラサキイガイ(Mytilus edulis galloprovincialis)を用いた付着誘引物質および忌避物質を探索するユニークな試験法を確立した.足糸形成に対する,形,撹拌,空気の存在,塩濃度,カルシウム,マグネシウム濃度,温度など各種物理的,化学的要素について研究されている.今回,足糸形成に影響する各種化合物について調べた.その結果,Fe (III) EDTA,コウジ酸,L-アスコルビン酸,安息香酸ナトリウムおよびフェノールは,100μmol/lで,足糸数がコントロール(8±1本を100%とする)より,49, 44, 19, 16および4%増加した.Fe (III) EDTAは,200μmol/lで2倍になったが,コウジ酸は50200μmol/lでそれ以上増加しなかった.MgCl_2およびCaCl_2は6および24%の足糸数の減少を示し,硫酸銅とニコチン酸アミドは10および5umol/lで完全に足糸の形成を阻害した.従来のムラサキイガイの固定する試験法にかえて,貝を自由にさせた新試験法を考案した.塩ビの筒の底をふさぎ,細かい砂を入れ,貝1個体を置いた.筒の内側にウェブロン紙を巻き,それを4等分し,交互に試験する物質を塗った.3日間海水に漬け,貝がどこに移動するかで判定するものである.この試験で,クルクミン,インディゴカ-ミン,α-トコフェロールおよび鉄粉が1.0μmol/cm^2で誘引活性を示した.ノニルフェノールは,0.1μmol/cm^2で忌避活性を示した.試料の必要量は,固定化法とほぼ同じで,結果も一致し,従来の試験法の有効性も確認できた.海水中でのムラサキイガイの足糸の数によって付着忌避および付着誘引活性を検索する方法を開発した.この方法は海水中に溶け込んでいる物質の活性の判定ができることから,従来研究が難しかった生態における化学物質の簡便な検索にも応用可能であった.1.ムラサキイガイの足糸数を用いる付着忌避および付着誘引物質探索法の開発---ムラサキイガイを厚紙に4-5cmの間隔でゴム片を介して固定した.それを各種化合物(100μmol/l)を添加あるいは無添加の海水で充した水槽に沈め,止水状態で,エアレーションさせながら暗所にて,4時間(水温22±2°C)放置した.無添加のムラサキイガイの平均足糸数は8±1本であった.これを100とすると,コウジ酸,EDTA-Fe,KC1,クルクミンでは足糸の増加が観察され,それぞれ160,147,134,125であった.逆に,dl-DOPA,ノニルフェノール,ニコチン酸アミドでは,それぞれ38,20,0であった.2.ムラサキイガイの付着行動による付着忌避および付着誘引物質探索法の開発---内径5.5cmの塩ビのパイプを適当な長さに切り,その内面にサンプルを塗った厚紙をはめ込んだ.パイプの底を塞ぎ,砂(サンゴ砂,粒径0.2-0.3mm)を1cmの厚さに入れ,海水の流れる水槽に入れた.そのパイプの中央にイガイ一個体を静置した.2日間流水中に放置し,イガイの付着状態を観察した.イガイは壁面に移動し付着した.クルクミン(1μmol/cm^2)を塗布したゾーンは誘引活性を示し,ノニルフェノール(1μmol/cm^2)は付着忌避活性を示した.

これらの成果を第4回マリンバイオテクノロジー研究発表会(1995年5月,東京)およびThe First Asia-Pacific Marine Biotechnology Conference(APMBC'95,1995,9,Shizuoka)において発表した.以上のように,平成7年度は初期の目的が達成できた.クルクミンが海洋浸漬試験で付着誘引効果を示したことから,この化合物を用いて,従来のムラサキイガイを固定するムラサキイガイアッセイ法を改良した.(平成7年度)さらに,ムラサキイガイを固定し,足糸数の増減をみるアッセイ法も考案した.このアッセイ法では,従来の方法でアッセイできなかった水溶性の物質に適用可能である.(平成7年度)昨年度アッセイに供した化合物に,さらにMgCl_2,CaCl_2,CuSO_4,L-ascorbic acid,sodium benzoate,phenolを追加し,アッセイを行い,Fe(III)EDTA,kojic acid,L-ascorbic acid,sodium benzoateおよびphenolに足糸増加が観察され,MgCl_2,CaCl_2,CuSO_4およびnicotinamideに足糸減少が観察された.また,ムラサキイガイを1個体自由にしておくアッセイ法(昨年開発)に,indigo carmine,α-tocopherol,鉄粉,18-crown-6,BHTについて今年度検討し,curcumin,indigo carmine,α-tocopherol,鉄粉,18-crown-6,BHTに誘引効果があること,nonylphenolに忌避効果があることが分かった.以上の結果から,2つの新しいアッセイ法が確立できた.さらに,従来のムラサキイガイアッセイにおける同じ化合物の結果との比較から,ムラサキイガイの固定化法も付着忌避および誘引物質探索法として適当であることも明らかにした.
末梢神経損傷に対する遺伝子治療の基礎的研究〜生体内局所的遺伝子発現による神経再生促進効果の解析〜

培養神経細胞および培養シュワン細胞においてシナプス小胞関連蛋白および神経栄養因子の遺伝子を導入し各遺伝子の神経伸長効果を解析し、再生軸索およびその支持機構で神経栄養因子の産生において中心的役割を果たしているシュワン細胞への遺伝子の発現効果および神経再生機構における相互作用をマーカー遺伝子に対する免疫組織化学およびウェスタンブロット法にて確認した。PC12細胞にシナプス開口分泌関連タンパク質(VAMP-2,SNAP-25A, syntaxin1A)とGFP(green fluorescent protein)の融合タンパクを発現させ神経突起の伸長効果を解析した。24時間培養したPC12細胞にGFP, GFP-VAMP-2,GFP-SNAP25A, GFP-syntaxin1Aの遺伝子をリポフェクション法を用いて導入した。導入後nerve growthfactor添加培地にて72時間培養し、それぞれのタンパクを発現している50細胞において個々の神経突起長、各細胞の総神経突起長および神経突起数を計測した。また、ウェスタンブロット法にて導入したタンパクの発現を検索した。GFP-VAMP-2発現群は各神経突起長および総神経突起長においてGFP発現群に比べ有意に大きかった。一方、GFP-SNAP-25A発現群は各神経突起長では変化はなかったが、総神経突起長および神経突起数で有意に大きかった。GFP-syntaxin1A発現群については有意差を認めなかった。また、導入したタンパクの発現を全群で認めた。シナプス開口分泌関連タンパク質は小胞側にVAMP、付加する膜側にSNAP-25,syntaxinがそれぞれ存在し複合体を形成することで膜付加が可能となることが知られている。これまでにも、SNAP-25が神経突起の伸長を促進、またsyntaxin1A、VAMPは伸長に関与しているという報告はあるがいまだ不明な点も多い。今回VAMP-2およびSNAP-25A発現群ともに総神経突起長を増加させた。しかし促進様式については、VAMP-2発現群は個々の神経突起長を増加し、一方SNAP-25A発現群は神経突起数を増加することで伸長効果に寄与していると考えられた。培養シュワン細胞への遺伝子導入については現在進行中である。(1)本研究では、PC12細胞にシナプス開口分泌関連タンパク質(VAMP-2,SNAP-25A,syntaxin1A)とGFP(green fluorescent protein)の融合タンパクを発現させ神経突起の伸長効果を解析した。24時間培養したPC12細胞にGFP,GFP-VAMP-2,GFP-SNAP25A,GFP-syntaxin1Aの遺伝子をリポフェクション法を用いて導入した。これまでにも、SNAP-25が神経突起の伸長を促進、またsyntaxin1A,VAMPは伸長に関与しているという報告はあるがいまだ不明な点も多い。今回、VAMP-2およびSNAP-25A発現群ともに総神経突起長を増加させた。しかし促進様式については、VAMP-2発現群は個々の神経突起長を増加し、一方SNAP-25A発現群は神経突起数を増加することで伸長効果に寄与していると考えた。(2)(3)現在進行中である。

これまでにも、SNAP-25が神経突起の伸長を促進、またsyntaxin1A、VAMPは伸長に関与しているという報告はあるがいまだ不明な点も多い。今回VAMP-2およびSNAP-25A発現群ともに総神経突起長を増加させた。しかし促進様式については、VAMP-2発現群は個々の神経突起長を増加し、一方SNAP-25A発現群は神経突起数を増加することで伸長効果に寄与していると考えられた。培養シュワン細胞への遺伝子導入については現在進行中である。
遺伝子発現調節領域におけるSNPの定量的検索とそのデータベース化

遺伝子上流領域には遺伝子発現制御に関わる極めて重要な配列が多数散在しており、この領域の多型は遺伝子発現の量的個体差をもたらす可能性がある。そこで本研究では、様々な遺伝子発現制御領域のSNPをゲノムワイドに収集し、同時に特定集団でのアレル頻度を算出することで、量的・多因子性遺伝形質を支配する遺伝的背景の解析に資する情報基盤を確立することを目的とし、実験を進めた。本研究期間(平成13年度15年度の前半)は主に解析方法の改良に重点を置いた。その結果、1)市販のキャピラリーアレイ電気泳動装置を用いたPLACE-SSCP法の開発、2)簡便で安価にPCR産物を蛍光標識することができる新しいポストPCR蛍光標識法の開発、3)SSCPピークによるジェノタイピング及び多型頻度算出を容易にするHemi-stranded SSCP法の開発に成功し、国内外の学会及び学術雑誌に発表した。また、上記開発と平行して、ヒト完全長cDNA配列(東京大学医科学研究所で収集)を基に予想された遺伝子転写開始点上流1kb及び下流200bpの領域上に存在するSNPの解析を行ってきた。これまでに943領域のシーケンシング解析から1302個の候補SNP(過半数は新規)を検出した。これらのSNPに対して人種ごとでの多型頻度を調べるためにコーカソイド集団(78人)のDNAと、日本人集団(100人)のDNAを、それぞれプールし、前述した改良版PLACE-SSCP法にて解析を行っている。現在のところ795個のSNPに対して両集団での多型頻度を算出しているが、その差は著しく、194個のSNPではDNAプール間で20%以上の多型頻度差を認めている。今後さらに詳細な解析を行い、多型頻度など遺伝形質の解析に役立つ情報を備えたSNPデータベースを構築していく予定である。そこで本研究では、様々な遺伝子発現制御領域のSNPをゲノムワイドに収集し、同時に特定集団でのアレル頻度を算出することで、量的・多因子性遺伝形質を支配する遺伝的背景の解析に資する情報基盤を確立することを目的としている。第二年度はSSCP法を基にしたSNPのジェノタイピング及びアレル頻度解析法の改良を行い、蛍光ddNTPを用いるPCR産物標識法と既知SNPを含む短いDNA断片の解析に適したHemi-stranded SSCP法を開発した。この新しい標識法では、PCR産物を二種類のDNAポリメラーゼ(Klenow酵素とThermoSequenase)と蛍光ddNTPを含む標識液中で反応させる。蛍光プライマーを用いる場合と異なり、プライマーを再合成することなく複数の蛍光色素でPCR産物を標識することができ、多重解析に適している。Hemi-stranded SSCP法では蛍光標識PCR産物をラムダエキソヌクレアーゼで一本鎖にした後、SSCP法により解析する。相補鎖の再会合による偽ピークを除くことができ、アレルピークによるジェノタイプ判定が容易である。この成果は第25回日本分子生物学会年会及び学術雑誌Bio Techniques(2報)に発表した。また、上記新しく開発した方法とシーケンシングを用いて、ヒト完全長cDNA配列を基に予想された遺伝子転写開始点上流1kb及び下流200bp(東京大学医科学研究所で収集)のSNP解析を行っている。これまでに743領域の解析から968個の候補SNP(60%は新規)を検出した。これらのSNPに対しては日本人及びコーカソイド集団それぞれを別々にプールしたDNAの解析から各集団でのアレル頻度を算出していく予定である。
光・電子機能性非天然アミノ酸を導入した蛋白質の作製と電子移動経路の構築

本研究は電子授受に関与する機能側鎖を持つ種々の非天然アミノ酸を部位特異的に蛋白質に導入し、蛋白質中で人工的な電子移動を行わせる事を目的とする。本年度は、ストレプトアビジン、シトクロームb5、およびリプレーサー蛋白質(CRO)に電子の授受に関与する非天然アミノ酸、すなわち光増感基としてのアンスリルアラニンや電子受容体としてのアンスラキノニルアラニンを導入した。(1)ストレプトアビジンにアンスリルアラニンを導入した。一方、種々の電子受容基をビオチンに結合させ、ストレプトアビジンに導入した。前者から後者への光誘起電子移動速度を求め、電子移動の推進力(-ΔG)に対してプロットするとMarcus理論に沿った依存性が現れ、蛋白質中でも通常の電子移動が起こっていることが明らかになった。(2)シトムロームb5にアンスリルアラニンを導入し、励起アンスリル基からヘミンへの光誘起電子移動およびエネルギー移動を観測した。これらの効率は蛋白質中の距離がにしたがって低下し、アンスリル基が予想どうりの部位に導入できていることが確認された。(3)リプレッサー蛋白CROのアンスラキノニルアラニンを導入し、この蛋白質の結合部位でのDNAの光切断を試みた。アンスラキノニルアラニン導入CROの多くがDNA結合能を減少させていたが、56位に導入したものは結合活性を保存していた。現在この変異蛋白質を用いて部位特異的DNA光切断を試みている。まず、側鎖に電子受容基や電子供与基をもつ光学活性非天然アミノ酸の合成を行い、新たにビオローゲン基をもつアミノ酸の合成に成功した。さらに種々の長さのスペーサーでアンスラキノニル基やフェロセニル基を結合した非天然アミノ酸も合成した。これらのアミノ酸と以前から合成していた電子機能性非天然アミノ酸を転移RNAに担持させ、それらを大腸菌、あるいはウサギ網状赤血球細胞の細胞外蛋白質生合成系に導入して蛋白質を作製した。蛋白質としてはストレプトアビジンとチトクロームb_5を用い、それらの中の特定の部位に上のアミノ酸を導入した。その結果、アンスラキノニルアラニンおよび長いスペーサーでフェロセニル基を結合したアミノ酸については蛋白質に導入できることが明らかになった。しかし、フェロセニルアラニンについては導入できなかった。作製した変異ストレプトアビジンの活性をビオチン結合活性から評価したところ、アミノ酸導入部位に依存して活性が大きく変化した。すなわち、導入部位によっては蛋白質が変性したり、あるいはビオチン結合活性を失ったりすることが明かになった。以上の結果より、蛋白質の特定の部位に光・電子機能性アミノ酸を導入できる事が明かになった。しかし蛋白質の活性を保つためには導入部位を慎重に検討する必要があることも分かった本研究は電子授受に関与する機能側鎖を持つ種々の非天然アミノ酸を部位特異的に蛋白質に導入し、蛋白質中で人工的な電子移動を行わせる事を目的とする。
高転移性乳癌細胞は転移抑制性miRNAsをexosomeに内包して細胞外に捨てる

BJMC338はほとんど転移しないが、BJMC3879はBJMC338から確立された高転移性のマウス乳癌細胞である。今回、VEGF-Cを調節するmiRNAに注目した。BJMC3879ではVEGF-Cを抑制的に調節するmiR-27bをMVsにて排出していると想定された。乳癌などの固形癌では、低酸素状態であると想定されている。そこで、通常酸素濃度と低酸素濃度で細胞内およびMVsに内包されるVEGF-C, miR-27bを比較検討した。miR-27bの発現はBJMC338では低酸素濃度で細胞内の発現量が有意に増加するが、BJMC3879で通常酸素濃度と低酸素濃度では差がなかった。一方、低酸素でMVs内のmiR-27bの発現は両者で通常酸素濃度と比較して有意に増加おり、BJMC3879で高かった。しかし、BJMC338では通常酸素濃度と比較して増加率はBJMC3879よりも大きかった。VEGF-Cの細胞内発現は通常酸素濃度と低酸素濃度では差がなかった。しかし、MVsにおける発現は通常酸素濃度よりも強くなっていた。HIF-1αの発現を検討すると、BJMC3879では通常酸素濃度でBJMC338よりも高く、低酸素濃度で増強していた。また、VEGFR3の発現も低酸素濃度で増強していた。以上の結果は「高転移性のマウス乳癌細胞ではVEGF-Cを抑制的に調節するmiR-27bをMVsにて排出している」と言う想定を支持し、miR-27b排出による抑制の減少、HIF-1αによるVEGF-Cの発現誘導により、VEGF-Cの発現が増強、さらにautocrineによるMVs内包VEGF-Cの利用と相まって、低酸素濃度下でも増殖していると考えられた。両細胞株における差異は、microvesiclesを取り込んで細胞膜が発現しているVEGFR-3を介してmicrovesicle内のVEGF-Cをオートクリン的に利用できるかであった。すなわち、VEGF-Cについては高転移性乳癌細胞ではautocrineによるVEFG-Cの取り込みの関与が強いと考えられた。転移には増殖のほかにも種々の要素が関わっている。miR-27bのターゲットであるST14 (Suppression of tumorigenity)、E-NPP1 (Ectonucleotide pyrophospatase-1)は腫瘍の悪性度、薬剤耐性、転移能にかかわっていることが報告されているのでこれらについても検討が必要であると考えた。また、足を骨折してしてしまい、一時的にラボワークが困難っであったため。さきの研究で、高転移性のマウス乳癌細胞ではVEGF-Cを強く発現してリンパ管新生が盛んであるために転移が促進されていた。Microvesicles (MVs)の一種shedding bodyに内包される分泌型CEACAM-1が、またMVsにprecursor VEGF-Cが内包放出されリンパ管新生に寄与していた。今回、miRNAに注目したところ高転移性の乳癌細胞ではVEGF-Cを抑制的に調節するmiR-27bをMVsにて排出していると想定された。乳癌などの固形癌では、中心部には血管が少なく低酸素状態であると想定されている。そこで、normoxiaとhypoxiaで細胞内およびMVsに内包されるVEGF-C, miR-27bを計測し、Western blotおよびRT-PCRで比較検討した。normoxiaでVEGF-Cの発現は高転移性の乳癌細胞(BJMC3879)において、細胞内、MVsともに高かった。hypoxiaでBJMC3879の細胞内VEGF-C発現はnormoxiaと変わらなかった。低転移性の乳癌細胞(BJMC338)では細胞内の成熟型VEGF-C発現は低く、MVs内のprecursor VEGF-Cも低かったが、hypoxiaではBJMC3879と同程度に発現していた。miR-27bの発現はBJMC338ではhypoxiaで細胞内の発現量が有意に増加するが、BJMC3879では差がなかった。一方、MVs内のmiR-27bの発現は両者の乳癌細胞でnormoxiaと比較して有意に増加おり、BJMC3879で高かった。しかしながら、BJMC338ではnormoxiaと比較して増加率はBJMC3879よりも大きかった。以上の結果は「高転移性のマウス乳癌細胞ではVEGF-Cを抑制的に調節するmiR-27bをMVsにて排出している」と言う想定を支持する。VEGF-CをターゲットとするmiRNAが高転移性の乳癌細胞では、hypoxiamicrovesiclesに内包されて分泌されていた。また、細胞内のVEGF-Cは高転移性の乳癌細胞では変化しないことが確認されたから。高転移性のマウス乳癌細胞(BJMC3879)と低転移性(BJMC338)のMVsには、ともにprecursor VEGF-Cが同程度発現していた。BJMC3879ではVEGF-Cの受容体であるVEGFR3を発現しているため、autocrine的にMVsのVEGF-Cを利用でき、増殖していると考えられた。そこで、normo.とhypo.で細胞内およびMVsに内包されるVEGF-C, miR-27bを比較検討した。

normo.でVEGF-Cの発現はBJMC3879において、細胞内、MVsともに高かった。Hypo.でBJMC3879の細胞内VEGF-C発現はnormo.とほとんど変わらなかった。BJMC338では細胞内の成熟型VEGF-C発現は低く、MVs内のprecursor VEGF-Cも低かったが、hypo.では成熟型VEGF-Cが減少していた。MVsにおける発現はBJMC3879と同程度に認められた。miR-27bの発現はBJMC338ではhypo.で細胞内の発現量が有意に増加するが、BJMC3879では差がなかった。一方、MVs内のmiR-27bの発現は両者でnormo.と比較して有意に増加おり、BJMC3879で高かった。しかし、BJMC338ではnormo.と比較して増加率はBJMC3879よりも大きかった。HIF-1αの発現を検討すると、BJMC3879ではhypo.で増強していた。また、VEGFR3の発現もhypo.で増強していた。以上の結果は「高転移性のマウス乳癌細胞ではVEGF-Cを抑制的に調節するmiR-27bをMVsにて排出している」と言う想定を支持し、miR-27b排出による抑制の減少、HIF-1αによるVEGF-Cの発現誘導により、VEGF-Cの発現が増強、さらにautocrineによるMVs内VEGF-Cの利用と相まって、hypoxia下でも増殖、転移していると考えられた。miR-27bとVEGF-C発現の変化が一致していたので,仮定は正しく研究は進んでいると言えるが、miR27bの遺伝子導入ができていないから。BJMC338はほとんど転移しないが、BJMC3879はBJMC338から確立された高転移性のマウス乳癌細胞である。今回、VEGF-Cを調節するmiRNAに注目した。BJMC3879ではVEGF-Cを抑制的に調節するmiR-27bをMVsにて排出していると想定された。乳癌などの固形癌では、低酸素状態であると想定されている。そこで、通常酸素濃度と低酸素濃度で細胞内およびMVsに内包されるVEGF-C, miR-27bを比較検討した。miR-27bの発現はBJMC338では低酸素濃度で細胞内の発現量が有意に増加するが、BJMC3879で通常酸素濃度と低酸素濃度では差がなかった。一方、低酸素でMVs内のmiR-27bの発現は両者で通常酸素濃度と比較して有意に増加おり、BJMC3879で高かった。しかし、BJMC338では通常酸素濃度と比較して増加率はBJMC3879よりも大きかった。VEGF-Cの細胞内発現は通常酸素濃度と低酸素濃度では差がなかった。しかし、MVsにおける発現は通常酸素濃度よりも強くなっていた。HIF-1αの発現を検討すると、BJMC3879では通常酸素濃度でBJMC338よりも高く、低酸素濃度で増強していた。また、VEGFR3の発現も低酸素濃度で増強していた。
高温高圧変形実験による岩石の流動・破壊・再結晶の研究の限界と可能性の追求

1.高温高圧下で、石英の粒界移動の研究を行った。メタチャートとカルセドニーの試料を接合させて行ったアニーリング実験では、両者の境界がカルセドニー側に移動しているのが確認された。これは、カルセドニーの細粒石英が消費され、メタチャート中の石英粒子に組み込まれることによって起こっている。粒界移動距離(M)は、アニーリング時間(t)とはM=1.9t^<0.29>という関係あることが明らかになった。粒界移動を引き起こした駆動エネルギーは、カルセドニー中の石英の表面エネルギー(P)である。表面エネルギーと粒界移動速度(V)の間には、V=14(P/3g)^<4.4>という関係があることがわかった。ただしここで、gは単位表面エネルギーである。また、カルセドニー粒径(D)はアニーリング時間とは、D=2.1t^<0.16>という関係にあることがわかった。2.上記の粒界移動実験を偏圧下で行った。この実験は1回成成した。単なるアニーリング実験と異なっているのは、粒界の形態である。偏圧下での粒界移動は均一に起こらず、結果として、ギザギザした境界が観察された。移動量については、アニーリング実験と同様の結果を得た。また、移動する方向による違いは無いことが確認された。3.カルセドニーの圧縮実験をおこなった。最大圧縮量として、どのくらいまで実験可能なのかを調ベるベく、従来よりも肉厚のヒーターを使用し、基礎実験を行った。この改良により、60%まで圧縮が可能であることがわかった。4.メタチャートの褶曲実験をおこなった。十分褶曲を作り出すことが出来ることがわかった。本年度は、高温高圧実験装置内で、静的な条件下で再結晶作用が実際に起こせるかどうかを調べた。特に石英について検討した。試料として利用したのは、カルセドニ-、石英片岩、メタチャ-ト、珪質マイロナイトである。実験した条件は温度800度C、封圧2,4,8Kb(200,400,800MPa)、継続時間として30分ー200時間である。主な結果は次の通り。(1)実験前に、粒径が1μm以下の隠微晶質石英集合体であるカルセドニ-は、実験後粒径が最大30μm程度になった。このことは通常結晶成長(normal grain growth)が起こって、粒径が大きくなったことを意味している。(2)カルセドニ-と他の石英岩(石英片岩、メタチャ-ト)を接触させて高温高圧下に置いたところ、石英片岩やメタチャ-トの石英粒子が、明らかにカルセドニ-側へ進入して成長していることが確認された。移動速度は、1ー3μm/hourであった。このことは、石英の結晶粒界移動(grain boundary migration)が起こったことを意味している。(3)石英片岩やチャ-ト中の組織変化は著しいものではなかったが、一部で、再結晶粒子が確認された。(4)組織変化、結晶成長、粒界移動に体して、2から8Kbの間の封圧の違いはほとんど影響していないことがわかった。(5)normal grain growthによる結晶粒成長速度は、結晶粒界移動速度の約10分の1である。実験と平衡して行なっている鉱物中のH2Oの検討は、基本的作業がほぼ完了し、実際に高変成度の岩石中の石岩のH2Oを定量化できたところである。

また、石英中の転位密度の基本的検討も順調に進んでいる。これらの方法は来年度には実験試料について適用できる見込みである。(1)石英の粒界移動の温度依存性について検討するための実験を行なった。昨年度に、温度800度、封圧800Mpaでの静水圧実験で、人工的に作った細粒石英集合体(メノウ)と粗粒石英の粒界では、メノウ側に粒界が移動すること、又メノウは粗粒化することが確認されている。今年度は、同様の実験を1000度、800MPaで4回行ない、やはり粒界が移動し、メノウは粗粒化することを認め、粒界移動量を測り、移動速度を求めた。その結果粗粒化速度と粒界移動速度では温度依存性が異なっていることがわかった。粗粒化の方が粒界移動よりも温度依存性は大きい。(2)粗粒の石英(0.1mm程度)同志を人工的に接合させ、上記と同一条件で粒界移動が起こるかどうかを調べた。結果として、粒界移動は起こらなかった。(1)と併せて考えると、粒径が小さいことが、粒界移動には必要条件であり、粒界エネルギ-が駆動エネルギ-となっていることがわかった。(3)上記の実験とは別の実験アセンブリを用いて、粒界移動を差応力下で起こさせる実験を試みた。実験そのものは差応力を発生させる前に終了してしまい、当初の目的を達成できなかった。しかし、技術的にはこのような目くろみが実現可能であることを確認した。(4)差応力下で石英の粗粒化を起こさせる実験を行なった。特に同一温度、封圧、歪速度(800度、400MPa、10^<ー5>/sec)で、変形に要する時間だけ(すなわち歪)を変えて6回実験した。歪がある程度大きくなると(40%以上)石英組織は、あまり変化しなくなることを確認した。1.昨年度に引き続き、高温高圧下で、石英の粒界移動の研究を行った。メタチャートとカルセドニーの試料を接合させて行ったアニーリング実験では、両者の境界がカルセドニー側に移動しているのが確認させた。これは、カルセドニーの細粒石英が消費され、メタチャート中の石英粒子に組み込まれることによって起こっている。粒界移動距離(M)は、アニーリング時間(t)とはM=1.9t^<0.29>という関係あることがあ明らかになった。粒界移動を引き起こした駆動エネルギーは、カルセドニー中の石英の表面エネルギー(P)である。表面エネルギーと粒界移動距離の間には、M=4.5(P/3g)^<3.9>という関係があることがわかった。ただしここで、gは単位表面エネルギーである。また、カルセドニーの粒径(D)はアニーリング時間とは、D=1.7t^<0.18>という関係にあることがわかった。2.上記の粒界移動実験を偏圧下で行った。この実験は1回成功した。単なるアニーリング実験と異なっているのは、粒界の形態である。偏圧下での粒界移動は均一に起こらず、結果として、ギザギザした境界が観察された。移動量については、アニーリング実験と同様の結果を得た。また、移動する方向による違いは無いことが確認された。3.カルセドニーの圧縮実験をおこなった。最大圧縮量として、どのくらいまで実験可能なのかを調べるべく、従来よりも肉厚のヒーターを使用し、基礎実験を行った。その結果、従来の最大値は45%だったが、この改良により、90%まで圧縮が可能であることがわかった。
パプリカキサントフィルによる慢性炎症疾患の改善作用機構の解明

キサントフィルはカロテノイドの一種であり、近年は抗酸化や抗がん、抗肥満作用を示す機能性が注目されている。パプリカは緑黄色野菜の中でも特にキサントフィル類が多い。本研究ではパプリカに含まれる機能性の高いキサントフィルの同定とその作用機序の解明を目的とした研究をおこなった。これまでの検討で脂肪細胞での炎症関連遺伝子の低下作用を示したパプリカ含有キサントフィルのうち、含有量の比較的高いカプサンチン、ククルビタキサンチンの機能について更に検討をおこなった。マウス由来3T3-L1脂肪細胞に対して、マクロファージ細胞から分泌される炎症性サイトカインの一種であるTNF-αを添加し、脂肪細胞での炎症を抑制する作用を評価した。その結果、カプサンチン、ククルビタキサンチンはTNF-α添加によって誘導された炎症促進因子のMonocyte Chemotactic Protein-1(MCP-1)、Interleukin-6(IL-6)のmRNAの発現を抑制した。また培地中のMCP-1、IL-6の濃度も有意に低下した。更に炎症の関連遺伝子の発現調節に関与するp38、ERK、JNKタンパク質のリン酸化について分析した。その結果、特にJNKタンパク質のリン酸化を抑制する結果を得た。また超高速液体クロマトグラフィー(UHPLC)を用いて、従来の分析法の約半分の時間でキサントフィル類とカロテン類を同時に定量する分析条件を確立した。現在、パプリカカロテノイドを肥満モデルマウスに投与し、in vivoでの脂肪細胞での慢性炎症抑制作用を評価する実験をおこなっている。パプリカキサントフィルの肥満に伴う慢性炎症の改善効果を評価するため、動物実験を進行中である。投与するカロテノイドの準備に時間を有してしまったため実験飼育を年度中に終了できなかったが、終了後は迅速に各種分析を進める。現在おこなっている動物実験終了後、血糖値や血漿脂質成分、各種臓器重量の変化について評価する。また、白色脂肪組織や肝臓組織での炎症関連因子のmRNA発現量の変化についてRT-PCR法にて評価する。特に変化が認められた場合、炎症関連因子の発現調整に関わる転写因子のタンパク質の発現量の変化やリン酸化の割合の変化について分析する。また実験終了後の各種臓器中のカロテノイド代謝物の分析し、in vitro試験の結果で強い効果を示したカロテノイドの蓄積量を評価する。また糞中の代謝物や盲腸内容物を評価することで腸内環境に対する作用についても評価できるように準備を進めている。また、パプリカ色素混合物による肥満における脂肪細胞での慢性炎症改善作用が報告されている。パプリカに含まれるキサントフィルによる慢性炎症の改善作用について、脂肪細胞とマクロファージ様細胞の共培養系にて評価した。パプリカから抽出した各種カロテノイドを細胞に添加し、炎症関連遺伝子の発現とタンパク質の発現量の変化を測定した。その結果、いくつかのカロテノイドでInterleukin-6やMonocyte Chemotactic Protein-1などの炎症関連遺伝子の発現が有意に低下する結果を得た。またマクロファージ様細胞での抗炎症作用について検討した結果、炎症関連遺伝子の発現調節に関与するタンパク質のリン酸化の阻害作用が示された。よってパプリカに含まれるキサントフィルには、肥満が原因で発生する脂肪細胞での炎症を緩和するキサントフィルが含まれることが明らかとなった。また、細胞に取り込まれた後のこれらのキサントフィルの蓄積の度合いや代謝物の分析もおこなった。その結果添加したキサントフィルの細胞内への蓄積が確認され、細胞の種類により蓄積の度合いに違いがあることが確認された。肥満による慢性炎症のモデル実験系を使い、パプリカに含まれるキサントフィルによる慢性炎症の抑制作用を見出すことができた。また、強い活性をもつキサントフィルを明らかにし、細胞内への取り込みやその代謝物の蓄積も確認が進んでいる。

現在、パプリカカロテノイドを肥満モデルマウスに投与し、in vivoでの脂肪細胞での慢性炎症抑制作用を評価する実験をおこなっている。パプリカキサントフィルの肥満に伴う慢性炎症の改善効果を評価するため、動物実験を進行中である。投与するカロテノイドの準備に時間を有してしまったため実験飼育を年度中に終了できなかったが、終了後は迅速に各種分析を進める。細胞実験で特に効果の強かったパプリカに含まれるキサントフィルを精製し、肥満を誘導したマウスに投与して、生体での機能性について評価を行う。特に肥満による体内の各種臓器での慢性炎症の抑制作用や、脂質代謝改善作用をもつホルモン様物質の高分子アディポサイトカインの調節に着目して検討する。また、in vivo試験で確認されたキサントフィル代謝物の同定、キサントフィル以外の生体内脂溶性物質の変動についても分析をおこなう。現在おこなっている動物実験終了後、血糖値や血漿脂質成分、各種臓器重量の変化について評価する。また、白色脂肪組織や肝臓組織での炎症関連因子のmRNA発現量の変化についてRT-PCR法にて評価する。特に変化が認められた場合、炎症関連因子の発現調整に関わる転写因子のタンパク質の発現量の変化やリン酸化の割合の変化について分析する。また実験終了後の各種臓器中のカロテノイド代謝物の分析し、in vitro試験の結果で強い効果を示したカロテノイドの蓄積量を評価する。また糞中の代謝物や盲腸内容物を評価することで腸内環境に対する作用についても評価できるように準備を進めている。
食品由来脂溶性成分の腸管吸収における経上皮輸送に関わるタンパク質の同定

脂溶性食品成分が摂食後小腸管腔から吸収上皮細胞を経て血管あるいはリンパ管へと輸送される経路に関わる種々のタンパク質分子について検討した。フラボノイドおよびビタミンEの腸管吸収機構について、小腸管腔における脂質消化酵素、細胞内代謝酵素、細胞内におけるカイロミクロン合成に関わるタンパク質の吸収における寄与を明らかにした。また、食事性脂肪酸の細胞膜輸送担体について、その吸収への関与を解析するための培養細胞を用いた実験系確立を行った。本課題の目的は、食品中の脂溶性成分について刷子縁膜通過に関わるタンパク質を同定すること、および粘膜通過後の血管あるいはリンパ管への選択的輸送について新たな知見を見出すべく再検討することである。本年度の研究成果は以下の通りである。1.ヒト小腸Caco-2細胞における脂溶性食品成分の膜輸送に関わるタンパク質の発現調節ヒト小腸培養細胞モデルであるCaco-2を用いたRNAiによる膜輸送担体候補タンパク質の発現抑制を行うための条件を検討した。Caco-2細胞は遺伝子導入効率が低いため、Caco-2に対しても高い導入効率を示すことが期待される導入試薬を用いたところ、コントロール試験において発現抑制がかかることが示唆されたため、現在FATP4の発現調節を検討中である。また、転写因子に対するアゴニスト・アンタゴニストを用いた候補タンパク質発現量の調節についても検討し、PPARアゴニストであるフィブレート類がFATP4の発現を増強することが強く示唆された。現在は、その他に発現が増強されるタンパク質を検討中であり、また、発現増強後の細胞において脂肪酸その他の成分の細胞取り込みが増加するのか検討している。2.ラットを用いたリンパ液/血液同時採取系による食品由来脂溶性成分吸収経路の検討胸管リンパカニュレーションラットを用い、尾部採血によるリンパ液/末梢血同時採取系を確立した。本系において、長鎖脂肪酸によるトリグリセリドおよび中鎖脂肪酸によるトリグリセリドではリンパ液へのカイロミクロン流入量が異なることが確認できたことから、本系は食品成分のリンパ管/血管輸送の選択性を検討するのに適切であると考えられる。これを用いて両親媒性食品成分であるフラボノイドの腸管吸収後の輸送経路の検討を行ったところ、ケルセチンとイソフラボンでは、リンパ液と血液への分配比率が異なることを示唆する結果を得た。本課題の目的は、食品中の脂溶性成分について腸管吸収過程における粘膜輸送に関わるタンパク質を明らかにし、さらに粘膜通過後門脈あるいはリンパ管への選択的輸送が起こる機序を解明することである。本年度は、前年度に行ったPPARアゴニストによるFATP4の発現増強について追試を行い、アゴニスト処理後のCaco-2細胞において脂肪酸吸収評価を行ったが、脂肪酸取り込みへの影響を見出すには至らなかった。また、ビタミンEについて吸収評価を行ったところ、細胞への取り込みは充分にみられたが基底膜側への輸送が非常に低く、フラボノイドの場合とは大きく異なっていた。すなわち、フラボノイドは抱合代謝物へと変換され、その細胞外輸送には第二相代謝酵素および薬物排出ポンプが関与するがCaco-2において発現しているこれらタンパク質により充分な基底膜輸送がみられること、一方ビタミンEは脂溶性が高くカイロミクロンへの局在が吸収に必須であるもののCaoc-2ではその能力が不十分であることが示された。このように、Caco-2細胞はがん細胞由来のヘテロな細胞株であって正常小腸細胞とは異なること、また種々の操作に対して感受性が低いという不利な性質を有することから、今後はより適した細胞株を見出すことが重要であるといえる。一方、リンパ液/血液輸送の選択性については、リンパへ主に輸送される長鎖脂肪酸トリグリセリド(LCT)と門脈へ主に輸送される中鎖脂肪酸トリグリセリド(MCT)を用いてフラボノイドの吸収経路に与える影響を検討したところ、LCTの共存によりリンパ輸送が促進される傾向がみられたが、カイロミクロンへの局在は観察されず、またリンパ液中のフラボノイドは殆どが水溶性の高い代謝物であった。すなわち、アポリポタンパク質はフラボイノド輸送には関与していないが、リンパ輸送の促進に伴うリンパ壁の透過性亢進が影響している可能性がある。
包括的遺伝情報プロファイル創生に向けた分析技術と数学的解釈の実践的融合

キャピラリー電気泳動法(CE法)の結果から混合資料の解析をコンティニュアス法にて行うソフトウェアが完成し、ウェブ上で公開され他機関での試用も行われた。また、H31年4月から本格的に実務利用となるSTR21ローカス検査に対応するため、ソフトウェアの大幅な変更を開始した。具体的にはローカス毎の増幅効率やスタター比、ヘテロ接合体のアリルバランスなどのパラメターの設定などを実験データより導入するため、実験データの解析を進めている。また、次世代シークエンス(NGS)による混合資料の応用実験を行った。STR型がCE法で既知の個人DNA試料2人分あるいは3人分をいろいろな割合で混合して、NGSによってどれほど解読できるのかをおこなった。現行のSTR検査ローカスを含めた36のローカスを対象とした。その結果、ローカス毎に得られるリード数にばらつきがみられ、Penta Dなど殆ど読めないローカスもみられたが、少量のDNA提供者のアリルドロップアウトは少なく、検出感度はCE法に比べて上がった。しかし、膨大な塩基配列データから対象となるSTR配列を抽出してくる段階で、目的とするアリルデータを正しく抽出できず、異なる配列のようにみえてしまうエラーがみられた。このため、シークエンシングの改良とともに、プラグインソフトウェアの改良または、別のソフトウェアの利用によって再検討する必要があると考え、現在別のソフトウェアで検討を続けている。平成30年度が最終年度であるため、記入しない。法医鑑識領域で最近対象となるDNA試料は複数人のDNAが混合していたり微量である場合が多い。これらの微量混合試料について、何人のDNAが含まれるか、被疑者等のDNAは含まれるかを評価する必要があるが、現在のDNA検査法(CE法)では15か所のマイクロサテライト(STR)の多型性しか調べておらず、多人数が混合した試料を判定の精度に限界があると考えられる。また、微量混合試料ではアリルが微量なため検出されなかったり、環境因子によるDNA変性のため、結果の評価方法にも確率を用いた工夫が必要となる。このため、本研究では、次世代シークエンス(NGS)の技術を利用した多領域の同時判定法と、DNA量やDNA変性の程度等の多くのパラメータを計算に組み入れた確率的評価法(continuous model)の開発による、微量混合試料の実践的プロファイリング手法の開発を目標としている。本年度は、CE法におけるcontinuous modelによるソフトウェアを完成させ、その精度について実験的混合試料により検証した。2人から4人までのDNAを様々な量や比率で混合した計72試料を作製してマイクロサテライト15領域のDNA型のタイピングを行い、検査結果を作成したソフトウェアで解析した。その結果、2人、3人の混合試料ではDNA量が微量であっても何人のDNAが含まれるかを高い精度で推定できた。また、実際に試料中にDNAを含む個人では正しくその混入を支持するような確率が得られ、DNAを含まない個人では混入を支持しない結果となった。ただし、4人の混合試料で微量試料の場合は何人のDNAが含まれるか、ある個人がDNAを含むか否かの判断が難しいことも示した。よって、ソフトウェアは高い精度を有しているが、現行DNA検査法は3人の混合試料までが有効な識別の限界であることも示唆した。本年度は、continuous modelによる確率的評価のできるソフトウェアを完成できた。また、実験的混合試料の検査結果をこのソフトウェアで解析して、その精度の検証も行うことができた。さらに、ソフトウェアの解析結果から現在のDNA検査法における識別能力の限界を探ることができた。現在、既にこのプログラムのウェブ上の公開の準備が終わり、研究成果の論文もほぼ完成している。一方、NGSを利用したSTRタイピングなどは今年度からの研究計画となるが、確率的評価法の基盤はほぼ完成されているため、NGSの分析結果を適用させる準備は整っており、より円滑な研究遂行が期待される。本年度は、CE法におけるcontinuous modelによるソフトウェアKongohの解析能力の検証を、米国のSWGDAMのガイドライに従いおこなった。その結果、Kongohは自動的に最適な関与者人数を判断し、尤度比を算出するソフトウェアとなった。また、算出された尤度比は実験的に作成した2人から4人の混合試料の分析において、真の関与者や非関与者を尤度比の値で殆ど的確に判断できた。この結果を論文にし、掲載された。現在は他の研究者の利用をはかるため、ソフトウェアをWeb上(GitHub)に挙げ、無料のライセンス利用を付ける準備をしている。また、次世代シーケンシング(NGS)による混合試料の解析を行った。CE法でSTR型を確認したDNA試料(5検体)について、数種類のDNA量比で混合した混合試料を作成後、シークエンスを行い結果を解析した。解析領域は来年度より実務利用されるSTR21ローカスのキットの領域を含むSTRパネルを選択し、プロトコールに従ってライブラリーを作成後、Ion PGM Sequencerにてシーケンシングを行った。その結果、単一試料ではCE法で決定した型判定はNGSでも一致したが、variantアリルのシークエンスを検出したものや、D21S11ローカスではアリルの命名が11塩基分ずれていた。また、CE法ではホモ接合体と判定されたローカスが16ヶ所あったが、そのうち2つは塩基配列が異なるヘテロ接合体であった。