hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
日本人睡眠時無呼吸症候群患者に対する上下顎骨前方移動術の適用基準を確立する

顎骨形態ならびに咽頭気道形態は、コンビームCTのDICOMデータを三次元画像処理ソフトウェアINTAGE Realia、OsiriX ver.3.5.1を用いて、三次元的評価を行っている。また簡易型睡眠ポリグラフ検査からは、睡眠時無呼吸低換気指数(AHI)ならびに最低血中酸素飽和度、血中酸素飽和度が90%未満に低下した時間帯の比率を表すCT90を用いて睡眠呼吸動態を評価している。さらに、下顎前方位型口腔内装置(OA)を用いて治療を行った睡眠呼吸障害患者89名について、OA治療前後に施行した終夜睡眠ポリソムノグラフィ検査結果から、OA装着後のAHIが15回/h未満かつOA未装着時AHIの50%以下になった場合を有効と判定し、OAの治療効果と頭部X線規格写真分析による顎顔面形態との関連性を検討したところ、下顔面高ならびに上顎骨の大きさと治療効果との関連を認めた。今後、さらに症例を増やし、顎矯正手術に伴う顎骨形態ならびに咽頭気道形態の変化と睡眠呼吸動態との関連性を明らかにする。近年、睡眠呼吸障害と顎顔面形態との関連性が注目されている。本研究では、顎矯正手術施行患者の術前後に撮影したコンビームCT画像から顎骨ならびに咽頭気道形態の変化と術前後の睡眠呼吸動態との関連性について検討するとともに、睡眠呼吸障害に対する下顎前方位型口腔内装置の治療効果と顎顔面形態との関連性を検討し、睡眠呼吸障害患者に対する上下顎移動術の適用基準を明らかにすることを目的とする。顎矯正手術を施行した下顎前突症患者40名(下顎枝矢状分割法単独22例、下顎枝矢状分割法とLe Fort I型骨切り術の併用18例)を対象とし、術前と術後6か月時に顎顔面のコンビームCT撮影ならびに簡易型睡眠ポリグラフ検査を施行した。その結果、下顎枝矢状分割法単独群において気道容積の有意な減少を認めたが、下顎枝矢状分割法とLe Fort I型骨切り術の併用群では気道容積の有意な減少を認めなかった。また、両群ともに術後にAHIの有意な増加は認められなかった。さらに、下顎前方位型口腔内装置(OA)を用いて治療を行った睡眠時無呼吸症候群患者89名について、治療前後の終夜睡眠ポリソムノグラフィ検査結果から、OA装着後のAHIが15回/h未満かつOA未装着時AHIの50%以下になった場合を有効と判定し、OAの治療効果と頭部X線規格写真分析による顎顔面形態との関連性を検討したところ、下顔面高ならびに上顎骨の大きさと治療効果との関連を認めた。本研究では、顎顔面ならびに咽頭気道形態の変化を三次元的に評価する方法を確立するとともに、上下顎骨移動が咽頭気道形態に及ぼす影響を明らかにした。さらには、OAによる下顎前方移動が睡眠時無呼吸症候群患者の治療効果に及ぼす要因が明らかとなり、睡眠時無呼吸症候群患者に対する上下顎骨前方移動術の適用基準を検討する上で有用なデータになると考える。研究対象となる症例の資料を収集しているが、統計的な解析が可能な例数が集まってきている。24年度が最終年度であるため、記入しない。今後、さらに症例を追加して、顎矯正手術に伴う顎骨形態ならびに咽頭気道形態の変化と術前後の睡眠呼吸動態との関連性を解析するとともに、睡眠呼吸障害患者に対する下顎前方位型口腔内装置の治療効果と顎顔面形態との関連性を検討し、睡眠呼吸障害患者に対する上下顎移動術の適用基準を明らかにしたいと考えている。
立体構造に基づくＡＤＡＭプロテアーゼによるシェディング機構の解明

ADAMは増殖因子やサイトカインの前駆体、様々な膜タンパク質の細胞外ドメイン(エクトドメイン)を切断遊離(シェディング)する主に膜結合型のメタロプロテアーゼであり、発生分化や形態形成、あるいはがんやアルツハイマー病など様々な病態にも関わる。ADAMが切断配列には特異性が無く、どのように基質を認識しているか不明である。本研究では基質の明確な蛇毒ADAMに着目して構造解析を行った。Multactivaseはプロトロンビンを切断しトロンビンを産生する活性を持つ蛇毒ADAMである。Multactivaseの主要ドメインについて2.6Å分解能での結晶構造決定を行い、基質認識機構を考察した。ADAMファミリープロテアーゼは発生・分化、形態形成、あるいは癌やアルツハイマー病など様々な病態に関わる主に膜結合のプロテアーゼであり、HB-EGFなどEGFファミリー増殖因子前駆体、カドヘリンなどの接着分子、APPなどを切断遊離(エクトドメインシェディング)する。膜型ADAMは様々な基質をシェディングする一方、それらの基質タンパク質の切断配列にコンセンサスが無く、どのように基質認識を行うか不明である。これまでの研究で触媒部位とは別に存在するエキソサイトが基質認識に重要であるという知見が得られているが、本研究では基質が明確である蛇毒ADAMに着目してさらに研究を進める。前年度に引き続き、Echis multisquamatus由来のプロトロンビン活性化酵素Multactivaseの構造解析を進めた。以前よりMultacivase全体分子で3.3Åのデータを得ていたが、さまざまな取り組みにかかわらず位相決定に至らなかった。そこで本年度はMドメイン欠損フラグメント、重鎖のみ、軽鎖のみ、基質であるプロトロンビン断片との複合体、それぞれの分子から結晶を調整し、これらを用いた構造解析の可能性を模索した。これら部分フラグメントの結晶においてもなかなか高分解能の回折をしめす結晶が得られず、構造解析が難航している。最近になり、ようやくMドメイン欠損フラグメントより2.5Å分解能データの取得に成功し、その構造解析を進めている。ADAMファミリープロテアーゼは発生・分化、形態形成、あるいは癌やアルツハイマー病など様々な病態に関わる主に膜結合のプロテアーゼである。各種の増殖因子やサイトカインは膜貫通領域を持つ前駆体として細胞膜上に発現し、切断遊離(シェディング)されることで他の細胞へシグナルを伝える。この過程で働く主要なシェディング酵素がADAMファミリープロテアーゼである。本研究では、膜型ADAMによるシェディングの機構、特にどのように基質が選択されるか、その構造基盤を明らかにすることを目的に、蛇毒由来の遊離型のADAMであるmultactivaseをモデルとして研究を行った。Multactivaseは膜型ADAMの細胞外領域の大部分に相当するメタロプロテアーゼ(M),ディスインテグリン(D),システインリッチ(C)ドメインの3つのドメインからなる重鎖とC型レクチン様のドメインを持つ2本の異なる軽鎖からなるヘテロ三量体ADAMである。本研究ではMultactivase分子全体とMドメインを欠損したΔM分子の結晶構造解析を進めた。最終年度において、ΔM分子の2.55Å分解能での構造決定・精密化に成功し、分子全体モデルを構築した。同様なヘテロ三量体構造を持つ別の蛇毒ADAMであるRVV-Xとの比較から、軽鎖ドメインは長鎖のCドメインと結合することが予想されていたが、結晶構造では軽鎖ドメインは予想と異なり、DドメインのMドメイン側サブドメインと結合することが判明した。Multactivaseが基質であるプロトロンビンをどのように認識・切断するか、考察を進めている。ADAMの基質としてはTNFαやそのレセプター、HB-EGFなどEGFファミリー増殖因子前駆体、カドヘリンなどの接着分子、APPなどが含まれ、ADAMはこれらを切断遊離(エクトドメインシェディング)する主要な酵素群を構成する。我々は出血蛇毒に含まれるプロテアーゼ(SVMP)がADAMホモログであることに着目し、ADAMによるシェディング機構の理解を目的にそのX線結晶構造解析を進めてきた。これまで3種類のSVMPの構造決定を行い、哺乳動物膜型分子とも共通したADAM細胞外ドメインの基本立体構造を世界で初めて明らかにした。特にADAMに共通して含まれるシステインリッチドメインに配列の超可変領域(hyper-variable region, HVR)を見出し、それがADAMの基質認識のエキソサイト(触媒部位以外の基質結合部位)である可能性を提案している。本研究ではHVRがエキソサイトを形成するという仮説を検証すべく、基質が明確であるEchis carinatus

由来の2つのSVMP、ecarinおよびcarinactivaseおよび類縁のEchis multisquamatus由来のmultactivaseをADAMのモデルタンパク質として結晶構造解析に取り組む。H23年度はmultactivaseについて3.3Å分解能の回折データを得て構造解析に着手した。また、Mドメイン欠損フラグメントを得て、その結晶解析を始めると共にそれを用いた基質複合体の結晶化スクリーニングを開始した。蛇毒ADAMの一つMultactivaseについて、さまざまな結晶を得ることに成功したが、未だ一つも構造決定に至っておらず、目的の達成度としてはやや遅れてしまっている。高分解能データが得られる良質な結晶を得ることができないのがボトルネックとなっているが、これはリコンビナントではなく蛇毒由来の試料を用いる限界かもしれない。蛇毒から得た試料から様々な結晶が得られることからなかなか大量発現系の構築に踏み切る決断が出来なかったが、分子改変の必要性からやはり早期に大量発現系構築の可能性を模索する必要があったといえる。H23年度はmultactivaseに集中して取り組んだ。Multactivase単体について3.3Å分解能の回折データを得て構造解析に着手したが、得られた結晶は非対称単位に2分子のmultactivase分子を含むこと、ドメイン間の可動性により分子置換法による位相決定が出来ないこと、有効な重原子置換体が得られていないこと、などにより構造解析が難航している。残念ながら他の結晶系の結晶やさらに高分解能の結晶が得られなかったため、目的の達成度としてはやや遅れてしまっている。Mドメイン欠損フラグメントより得た2.5Å分解能の回折データの解析を進め、これより得られる部分構造と、機知の他のADAMのMドメインの結晶構造を元にMultactivaseの分子全体構造の解明を進める。一方で、蛇毒由来タンパク質を結晶化試料として用いることの限界も見えてきている。ADAMの機能をより深く理解するための構造生物学研究にはリコンビナントタンパク質の利用が必須であり、本年度はMultactivaseの構造解析と並行して昆虫細胞を用いた膜型ADAMのエクトドメインの発現も進める。Multactivase分子全体の構造解析が難航しているため、各ドメインを抽出して高分解能で構造決定をし、得られるドメインの立体構造を用いて再度分子置換法による構造決定を目指す計画をスタートした。現在までにMドメイン欠損フラグメント、長鎖部のみ、軽鎖部のみ、それぞれからなる結晶を得て構造解析を進めている。これらの構造解析を進める一方、基質複合体の結晶スクリーニングを進める。今年度は様々な試みにも拘らず良質の結晶が得られなかった。このため、昨年度までに購入した消耗品等でほとんどの実験が行われたこと、SPring8での放射光データ測定を行わなかったことなどで予定していた旅費や物品費に残額が生じた。
TーT細胞間相互作用におけるシグナル伝達物質の解析

本研究は、(1)in vivoでのT細胞の機能的サブセットの形成機序を解明すると同時に、(2)クロ-ン化したヘルパ-T(Th)・サプレッサ-T(Ts)細胞を用いて、TーB細胞間およびTーT細胞間相互作用を解析し、さらに(3)細胞間シグナル伝達物質を分離・同定し、調節性に作用するT細胞を中心とした免疫応答の調節機構をクロ-ン細胞レベル・分子レベルで明らかにすることを目的とした。3年間の解析によって以下の成果が得られた。(1)末梢の機能的T細胞レパ-トリ-の形成は、胸腺内での分化過程で規定されるものと、末梢での抗原感作によって規定されるものとの、2つの異なる機序があることが明らかになった。(2)CD4タイプおよびCD8タイプTs細胞は、サイトカイン産生パタ-ンおよび機能から、独立したサブセットのT細胞であることが明らかになった。(3)これらのTs細胞はMHCクラスII拘束性で、T細胞レセプタ-αβ鎖を使っていることが明らかになった。(4)Ts細胞は、Th細胞活性化初期過程を抑制する。この抑制はTs→Th細胞へと一方向性でかつ細胞のタイプに特異的である。(5)Ts細胞の最終的な抑制作用は可溶性抑制因子によることが明らかになった。CD8タイプTs細胞はIL10およびTNFαβによってTh細胞機能を抑制したが、CD4タイプTs細胞の産生する抑制因子は、既知のサイトカインとは異なることが明らかになった。すなわち、CD4タイプとCD8タイプTs細胞の作用機構が異なることが示された。TsーTh細胞間に作用する抑制因子およびその遺伝子の分離・同定は現在進行中である。これまでに解析してきた細胞間に働く抑制因子の作用が、どのような機構で細胞質内・核へのシグナルとして伝えられるかとという点は、今後の重要な課題である。放射線骨髄キメラマウスおよび遺伝子型やMHC拘束特異性の異なるT細胞クロ-ンを用いて、in vivoでのT細胞の機能的サブセットの形成機序を解明すると同時に、免疫応答の調節機構、特に抑制性T細胞の作用機序をクロ-ン細胞レベルで解析した。その結果、以下の知見が得られた。1.コグネイトタイプのヘルパ-T細胞・サプレッサ-T細胞・増強性T細胞のレパ-トリ-は、胸腺の影響下に分化する。一方、可溶性抑制性T細胞因子を産生するタイプのサプレッサ-T細胞は、末梢での抗原感作によって、そのレパ-トリ-を変え得る。すなわち、末梢の機能的T細胞レパ-トリ-は、2つの異なる機序によって形成されることが明らかになった。2.CD4タイプのヘルパ-T細胞は、サイトカイン産生パタ-ンによってIL-2・IFNγを産生するタイプ1と、IL-2-IFNγは産生せずIL-4を産生するタイプ2とに分けられる。CD4タイプのサプレッサ-T細胞クロ-ンは、いかなる条件下でもIL-2・IL-4は産生せずIFNγの産生が認められた。したがって、CD4タイプのサプレッサ-T細胞は、独立したサブセットのT細胞であることが明らかになった。3.サプレッサ-T細胞は、ヘルパ-T細胞活性化初期にみられる細胞内へのCa^<2+>イオンの流入を一方向性かつ細胞種特異的に阻止し、ヘルパ-T細胞のサイトカイン産生やヘルパ-機能を抑制することが明らかになった。

4.コグネイトタイプのMHCクラスII拘束性CD4タイプのヘルパ-T細胞・サプレッサ-T細胞クロ-ンはいずれも、T細胞レセプタ-αβ鎖を使っていることが明らかになった。安定なCD4^+ Ts細胞を得る方法はすでに確立されているが、安定なCD8^+ Ts細胞クロ-ンを得たとの報告はきわめて少ない。最近われわれは、安定なCD8^+ Ts細胞クロ-ンを得る方法を見い出した。この方法によって樹立した数株のCD8^+ Ts細胞クロ-ン株を用いて、ヘルパ-T(Th)細胞クロ-ンに対するTs細胞クロ-ンの抑制機序を解析した。(1)CD8^+ Ts細胞の全てにγIFNの産生が認められたが.一部のクロ-ンを除いてIL2,IL4の産生は認められなかった。細胞傷害活性も検出されなかった。いずれのCD8^+ Ts細胞も、B細胞による抗体産生・Th細胞の抗原刺激による増殖性反応およびIL2産生を、抗原非特異的に抑制したが、マイトゲンやIL2によるT細胞増殖性反応は抑制しなかった。(2)固相化した抗CD3抗体によってCD8^+ Ts細胞を活性化すると、可溶性抑制因子を産生することが明らかになった。T細胞増殖性反応に対する抑制活性は、分子量40K、前後の分画中に検出された。(3)T細胞をこの抑制因子で前処理してもその反応性は抑制されないが、抗原提示細胞(APC)を前処理すると強い抑制が認められた。さらに、抑制因子で前処理したAPCは、別の細胞群の反応を抑制することが示唆された。(4)増殖性反応やIL2産生に対する抑制活性は抗IL10抗体によって完全に吸収された。(5)ところが、抗体産生に対する抑制作用は抗IL10抗体では吸収されず、またリコンビナントIL10やγIFNが抗体産生を抑制しないことから、CD8^+ Ts細胞は、T細胞増殖生反応を抑制するIL10と、これとは異なる抑制因子(TsF)とを産生していることが示唆された。免疫応答の調節機構、特にサプレッサ-T細胞によるヘルパ-T細胞機能の抑制機序をクロ-ン細胞レベルで解析した。その結果、以下の知見が得られた。(1)ヘルパ-T細胞は、コグネイトおよびノンコグネイトTーB細胞間相互作用によってB細胞を活性化する。サプレッサ-T細胞はこのうちの、コグネイト経路によるB細胞活性化を抑制する。(2)CD4タイプとCD8タイプのサプレッサ-T細胞が得られている。いずれも、T細胞とレセプタ-の刺激によって可溶性抑制因子を産生する。(3)CD8タイプのサプレッサ-T細胞は、IL10およびTNFαβによってヘルパ-T細胞の抗原特異的増殖性反応および抗体産生を抑制していることが明らかになった。(4)ところが、CD4タイプのサプレッサ-T細胞は、抗体産生におけるヘルパ-T細胞活性を抑制するが、増殖性反応は抑制しない。さらに、CD4タイプサプレッサ-T細胞の産生する抗体産生を抑制する可溶性因子は、既知の抑制性サイトカインとは異なる未知の物質であることが明らかになった。(5)したがって、CD4タイプとCD8タイプのサプレッサ-T細胞の抑制機序に違いがあることが示唆された。これらの知見から、CD4タイプサプレッサ-T細胞の抑制因子の分離・同定およびその遺伝子の同定が、サプレッサ-T細胞機能の解明に重要であると考えられる。現在、活性化したCD4タイプサプレッサ-T細胞クロ-ンのcDNAライブラリ-を作製し、抑制因子の遺伝子クロ-ニングを行なっている。
作用素環上のHilbert moduleの構造とその応用

平成9年度-10年度の2年間に、下記のことを念頭において共同研究を行った。作用素論や作用素環において、不変部分空間の構造理論は、関数空間上のHilbert moduleの概念で捉えられるように、この研究には多くの問題が数多く残されている。この研究ではDouglas-Paulsenによる関数環上のHilbert moduleの理論を詳細に考察して、作用素環の中で、特に、自己共役でない作用素環(例えば、subdiagonal環、nest環、CSL環など)の研究において、作用素環上のHilbert moduleの構造と考えて調べることは重要なことである。まず、subdiagonal環の構造について調べた。冨田-竹崎理論を用いて、極大subdiagonal環がモジュラー自己同型群に関して不変であることを示すことにより、極大subdiagonal環の特徴付けを行った。その応用として、B(H)のsubdiagonal環はatomic nestを持っnest環以外にないことを示した。更に、作用素の分解定理として、関数環におけるinner-outer分解の一般化としての分解定理について考察した。一般のsubdiagonal環においては、いつもその分解定理が成立しないが、弱い形の分解定理がいつも成立することを示すとともに、強い形の分解定理が成立するための同値条件を与えた。これらの結果は今後の研究に重要なものであり、多くの発展性を持っている。関数環の立場からも、L^2(T^2)の不変部分空間の構造、commutatorの性質などの結果やDouglas環の構造について、moduleの立場で考察した。また、代数学や幾何学の研究者の協力により、代数学におけるmoduleの理論の把握に努め、今後の研究に大きな基礎を固めた。更に、凸解析学における最適化理論や情報理論におけるEntropy理論についても応用を試み、幾つかの成果を得ている。作用素論において、不変部分空間の理論が、関数空環上のHilbert moduleの概念で捉えられるように、この研究にはこれから研究が急務となる問題が数多くある。ここでは、Douglas-Paulsenによる関数環上のHilbert moduleの理論を詳細に考察して、作用素論の中で、特に、自己共約でない作用素論(例えば、subdiagonal環、Nest環、CSL環、解析的接合積等)上のHilbert moduleの構造について調べることは重要である。まず、subdiagonalの構造について調べた。富田-竹崎理論を用いて、極大subdiagonal環がモジュラー同型群に関して不変であることを示すことより、極大subdiagonal環の特徴付けを行った。その応用として、B(H)のsubdiagonal環はatomic nestを持つnest環以外にないことを示すとともに、可逆な作用素の分解定理に対しての結果を得た。これらの結果は、今後の研究に重要なものであり、多くの発展性をもっている。関数環の立場からも、L^2(T^2)の不変部分空間の構造、commutatorの性質などの結果及びDouglas環についての構造など多くの結果を得ている。また、代数学の研究者との共同研究により、純粋な代数学におけるmoduleの理論を詳細に研究している段階であるが、作用素環の中に新しい概念を導入し、更なる構造を調べる可能性が十分にあることが判明した。凸解析学における最適化理論及び情報理論におけるEntropyの理論についても応用を試みている段階である。作用素環において、不変部分空間の構造理論は、関数空間上のHilbert moduleの概念で捉えられるように、この研究には多くの問題が数多く残されている。冨田-竹崎理論を用いて、極大subdiagonal環がモジュラー

自己同型群に関して不変であることを示すことにより、極大subdiagonal環の特徴付けを行った。その応用として、B(H)のsubdiagonal環はatomic nestを持つnest環以外にないことを示した。更に、作用素の分解定理として、関数環におけるinner-outer分解の一般化としての分解定理について考察した。一般のsubdiagonal環においては、いつもその分解定理が成立しないが、弱い形の分解定理がいつも成立することを示すとともに、強い形の分解定理が成立するための同値条件を与えた。これらの結果は今後の研究に重要なものであり、多くの発展性を持っている。関数環の立場からも、L^2(T^2)の不変部分空間の構造、commutatorの性質などの結果やDouglas環の構造について、moduleの立場で考察した。また、代数学や幾何学の研究者のの協力により、代数学におけるmoduleの理論の把握に努め、今後の研究に大きな基礎を固めた。更に、凸解析学における最適化理論や情報理論におけるEntropy理論についても応用を試み、幾つかの成果を得ている。
脂肪幹細胞における細胞外カルシウムによる骨形成の検討

顎顔面骨は複雑かつ緻密に構成されており、その欠損の再建には審美的な要素のみならず、機能的な要素も要求される。現在主流となっている治療法である金属プレートは易感染性であり、自家骨を用いた再建は安定性に優れるが、塑造性の観点や採取部位に骨欠損を生じさせることが大きな欠点となる。そのため感染に強く侵襲の少ない再建方法の有力な候補として、脂肪由来間葉系幹細胞(ASCs)が挙げられる。ASCsの骨形成分化の促進には、骨形成因子(BMP-2)が有用であると提唱されているが、リコンビナントBMP-2 (rBMP-2)は生産性、コスト面から臨床応用は限定的である。さらに、生体由来のため抗原性の問題もある。私たちは以前の研究で、線維芽細胞へのCa2+刺激によりBMP-2が産生されることを示した。その結果を踏まえ、本研究では、ヒトASCs (hASCs)における細胞外Ca2+の影響を検討することにより、BMP-2によらない細胞外Ca2+のみを利用するhASCsの骨再生の可能性を探り、臨床応用へ展開していくことを目的とする。私たちはこれまでに、hASCsの細胞外Ca2+濃度を上昇させると細胞内Ca2+が一過性および持続性の増加を示すことを確認し、細胞外Ca2+濃度の上昇は、hASCsに自らBMP-2を分泌させ、autocrine /paracrine的に自ら骨形成分化を誘導活性化する可能性を示唆する結果を得ている。また、細胞外Ca2+刺激による細胞内Ca2+濃度上昇のメカニズムを探るべく、定量的real-time PCR、ウエスタンブロット法や各種選択的阻害剤を用いてCa2+イメージングや細胞培養を施行し、Calcium sensing receptor (CaSR)の関与を示唆する結果を得た。H30年度まで育児休業を申請しており、研究は中断していた。今年度4月より研究を再開している。現在、細胞内Ca2+上昇によるBMP-2産生までの細胞内シグナル伝達に関する因子を検索するために、定量的real-time PCR、ウエスタンブロット法や各種選択的阻害剤を用いて生理学的・分子生物学的に検討をおこなっている。当施設(九州大学大学院歯学研究院、口腔顎顔面病態学講座、口腔顎顔面外科学分野)は、研究を行うため必要な機器等の設備は利用できる状況にある。以前からの研究協力者である梶岡(臨床薬理学分野)、怡土(口腔顎顔面病態学講座歯科麻酔学分野)に協力を仰ぎ、また新たな研究協力者である哲翁(臨床薬理学分野)と共に研究を行っている。脂肪幹細胞より骨を形成するにあたり、まずCa2+誘導性BMP-2産生の科学的証明を行うこととした。具体的には1)hASCsにおける細胞外Ca2+刺激による細胞内Ca2+濃度上昇のメカニズムを探る、2)細胞内Ca2+上昇によるBMP-2産生までの細胞内シグナル伝達に関する因子を検索する、3)産生されたBMP-2と炎症メディエーターとの関係を探る、という研究計画を立てた。2)については、細胞外Ca2+刺激による細胞内Ca2+濃度上昇に誘導させるBMP-2産生までの細胞内シグナル伝達には、NFAT経路、PKCの関与が定量的real-time PCR、ウエスタンブロット法により示唆された。また、Ca2+以外のイオンではMg2+の相互作用も確認された。3)においては、培養中の培養液の各種炎症メディエーター(プロスタグランジン、ロイコトリエン、インターロイキン、TNF-α等)をELISA等を用いて検索したが、骨形成に有効な炎症メディエーターを明らかにできなかった。H28年度の研究計画はin vitroにおけるCa2+誘導性BMP-2産生の科学的証明であった。脂肪幹細胞に細胞外Ca2+刺激を加えるとCaSRを介して細胞内Ca2+濃度が上昇し、その結果自らBMP-2産生することで骨形成能を高めることが示された。脂肪幹細胞にBMP-2の刺激を加えることで骨形成を促す研究はこれまでにも報告されてきたが、大量に必要とされるリコンビナントBMP-2(rBMP-2)の製造コストが高価であることが臨床応用への課題であった。本研究でCa2+を作用させることでrBMP-2を加えた場合と同程度の骨形成能を得られる可能性が示唆され、我々が目的とるす副作用の少ない安全で安価な治療への足掛かりが得られた。本研究の最終目標は、Ca2+誘導性ヒト脂肪由来間葉系幹細胞(hASCs)の骨形成を確立し、より安全に効果的にかつ安価に骨を再生させることにある。これまでにAlizarin red S染色やreal-time RT-PCRを用いて誘導性骨形成因子(BMP-2)が脂肪由来間葉系幹細胞(ASCs)の骨形成を促進することを確認した。また、細胞外Ca2+濃度を上昇させると細胞内Ca2+が一過性および持続性の増加を示し、その細胞外Ca2+は濃度依存的(≧5.0 mM)にBMP-2の発現を増大することが示された。このことから細胞外Ca2+濃度の上昇はhASCsに自らBMP-2を分泌させ、autocrine /paracrine的に自ら骨形成分化を誘導活性化する可能性が示唆された。このことを踏まえ、まずCa2+誘導性BMP-

2産生の科学的証明と、in vivoでのCa2+刺激を加えたhASCsの骨分化再生能を解析することで、臨床応用可能であるか明らかにすることとした。Ca2+誘導性BMP-2産生の科学的証明として細胞外Ca2+刺激による細胞内Ca2+濃度上昇のメカニズムを、定量的real-time PCR、ウエスタンブロット法や各種選択的阻害剤を用いて検索した。その結果hASCsに細胞外のCa2+濃度を感知するシステムとしてCalcium sensing receptor (CaSR)が備わっていることが示された。また細胞外Ca2+刺激による細胞内Ca2+濃度上昇に誘導させるBMP-2産生までの細胞内シグナル伝達を検索した結果、NFAT経路、PKCが関わっていることが明らかになった。ここまでの研究成果を英文科学誌に投稿するべく現在論文を執筆中である。昨年10月に出産したため現在は育児休暇を取得し研究は中断している。顎顔面骨は複雑かつ緻密に構成されており、その欠損の再建には審美的な要素のみならず、機能的な要素も要求される。現在主流となっている治療法である金属プレートは易感染性であり、自家骨を用いた再建は安定性に優れるが、塑造性の観点や採取部位に骨欠損を生じさせることが大きな欠点となる。そのため感染に強く侵襲の少ない再建方法の有力な候補として、脂肪由来間葉系幹細胞(ASCs)が挙げられる。ASCsの骨形成分化の促進には、骨形成因子(BMP-2)が有用であると提唱されているが、リコンビナントBMP-2 (rBMP-2)は生産性、コスト面から臨床応用は限定的である。さらに、生体由来のため抗原性の問題もある。私たちは以前の研究で、線維芽細胞へのCa2+刺激によりBMP-2が産生されることを示した。その結果を踏まえ、本研究では、ヒトASCs (hASCs)における細胞外Ca2+の影響を検討することにより、BMP-2によらない細胞外Ca2+のみを利用するhASCsの骨再生の可能性を探り、臨床応用へ展開していくことを目的とする。私たちはこれまでに、hASCsの細胞外Ca2+濃度を上昇させると細胞内Ca2+が一過性および持続性の増加を示すことを確認し、細胞外Ca2+濃度の上昇は、hASCsに自らBMP-2を分泌させ、autocrine /paracrine的に自ら骨形成分化を誘導活性化する可能性を示唆する結果を得ている。また、細胞外Ca2+刺激による細胞内Ca2+濃度上昇のメカニズムを探るべく、定量的real-time PCR、ウエスタンブロット法や各種選択的阻害剤を用いてCa2+イメージングや細胞培養を施行し、Calcium sensing receptor (CaSR)の関与を示唆する結果を得た。H30年度まで育児休業を申請しており、研究は中断していた。今年度4月より研究を再開している。現在、細胞内Ca2+上昇によるBMP-2産生までの細胞内シグナル伝達に関する因子を検索するために、定量的real-time PCR、ウエスタンブロット法や各種選択的阻害剤を用いて生理学的・分子生物学的に検討をおこなっている。炎症メディエーターがin vitroにおいてhASCsの骨形成に明らかな影響を及ぼさなかったため、今後はin vivoでの検討を試みる予定である。また脂肪幹細胞を付着させたPGAをヌードマウスの皮下に移植し実際に骨が形成させるか確認する。PGAは数日の培養でその周囲に細胞が付着することが知られている。
反芻家畜のVFAによるGH分泌抑制機構の細胞生理学的解明

ヤギ下垂体前葉細胞を用いて以下の結果を得た。1.潅流した細胞単離直後の細胞をCRFやGHRPによって刺激した時のGH放出増加反応は、VFA(酢酸、プロピオン酸および酪酸、10mM)の潅流液への投与によって完全に抑制された。このVFAの抑制効果は、3日間培養した細胞でも確認された。2. GRF刺激によって開くヤギ・ソマトトロフの主なカルシウム・チャネルは、膜電位依存性のL型カルシウム・チャネルであることが示された。3. VFAの膜電位依存性カルシウム・チャネルに及ぼす効果を、ホールセル・クランプ法を用いて電気生理学的に解明した結果、以下のような結果を得た。1)細胞内電位を5mVずつステップ状に脱分極し、細胞内電位を約-20mV前後にすると、急激に内向きに電流が増大し、続いて、外向き電流が増大した。2)内向き電流は、ナトリウム・チャネルの抑制薬であるTetrodotoxinの投与で影響を受けなかったが、カルシウム・チャネルの抑制薬であるNifedipineの投与で完全に消失した。この結果から、内向き電流は、カルシウム・イオンの細胞内への流入によって起こることが示された。3)酪酸の添加は、Nifedipine投与の場合と同様に、内向き電流を完全に抑制した。この抑制効果は、オレイン酸の投与でも認められた。以上の結果から、VFAはGRF刺激によるGH放出増加を抑制すること、その細胞内機序として、VFAがソマトトロフの膜電位依存性L型カルシウム・チャネル活動を選択的に抑制する結果、GRF刺激時の細胞内カルシウム・イオン濃度増加が抑制される可能性が考えられること、が示された。反芻家畜の生産性(泌乳量や増体量)に及ぼす下垂体成長ホルモン(GH)の効果に関する研究が注目されている。しかし、反芻家畜では採食に伴ってGH分泌抑制が起こることが報告されており、申請者らはこの機構に反芻動物の主要なエネルギー源であるVFAの血液及び第一胃内の濃度増加が関与している可能性を報告している。本研究の目的は、反芻家畜にのみ特異的に見られるVFAによるGH分泌抑制機構を反芻家畜の下垂体細胞を用いて解明することである。本年度は、1)GH分泌細胞の大量採取法および培養法の確立、2)パッチクランプシステムのセットアップ、を目的とした。1)ヤギ(ザ-ネン種)から摘出した下垂体前葉部をコラゲナーゼ処理し、種々の分泌細胞からなる単離細胞標本を作成した。この方法の改善を検討し、従来の約三倍の前葉細胞を採取することに成功した。次に、GH分泌細胞を10%FCSを含むDMEMで3日間CO_2インキュベータ-で培養し、種々の刺激因子に対して充分に分泌反応を起こしうる細胞標本の作製に成功した。この培養細胞は、GRF刺激に対して、約4倍のGH分泌を起こし、VFA投与によってGH分泌は有意に抑制された。VFAの中では、酪酸による抑制効果が最も強かった。2)パッチクランプシステムのセットアップは、現在進行中であり、来年度から稼働しうるまでになっている。GRFやGHRPといったGH分泌刺激因子に対して十分に反応し、VFAの分泌機構解明に使用できる培養ヤギ下垂体前葉細胞を用いて、以下の結果を得た。1.前葉細胞に存在するカルシウム・チャネルの性質を検討した結果、GRF刺激によって開くヤギ・ソマトトロフの主なカルシウム・チャネルは、膜電位依存性のL型カルシウム・チャネルであることが示された。2.VFAのGRF刺激GH放出抑制効果を検討した結果、VFA(酢酸、プロピオン酸および酪酸、10mM)は、GRF刺激によるGH放出増加を有意に抑制した。3.VFAの膜電位依存性

カルシウム・チャネルに及ぼす効果を、ホールセル・クランプ法を用いて電気生理学的に解明した結果、以下のような結果を得た。1)細胞内電位を5mVずつステップ状に脱分極し、細胞内電位を約20mV前後にすると、急激に内向き電流が増大し、続いて、外向き電流が増大した。2)内向き電流は、ナトリウム・チャネルの抑制薬であるTetrodotoxinの投与で影響を受けなかったが、カルシウム・チャネルの抑制薬であるNifedipineの投与で完全に消失した。この結果から、内向き電流は、カルシウム・イオンの細胞内への流入によって起こることが示された。3)酪酸の添加は、Nifedipine投与の場合と同様に、内向き電流を完全に抑制した。この抑制効果は、オレイン酸の投与でも認められた。以上の結果から、VFAはGRF刺激によるGH放出増加を抑制すること、その細胞内機序として、VFAがソマトトロフの膜電位依存性L型カルシウム・チャネル活動を選択的に抑制する結果、GRF刺激時の細胞内カルシウム・イオン濃度増加が抑制される可能性が考えられること、が示された。
イネいもち病菌はいつどこで変異するのか

1.新たな遺伝子のクローニング新たに非相同末端再結合に関わる遺伝子であるKu70,Ku80のいもち病菌ホモログ,Khm70,Khm80をPCRにより,日本産イネいもち病菌Ina168株より取得した.これらはこれまでにクローニングしていた遺伝子と同様,アカパンカビ(Neurospora crassa)のホモログと最も高い相同性を示した.これまでにクローニングしたRhm52,Rhm54,Mhm11,Khm70,Khm80をハイグロマイシン耐性プラスミドベクターpCSN43-DESTに連結し,それぞれN.crassaの変異株mus-11,mus-25,mus-23,mus-51,mus-52に導入し,変異の相補により遺伝子の機能を確認した.その結果,Rhm52,Rhm54,Khm80は相補が確認され,機能を持った遺伝子であることが示唆された.Mhm11,Rhm70は相補が見られなかったが,これらは複合体を形成し機能する遺伝子であり,その複合体の形成に問題があることが考えられた.3.欠損変異株の作成昨年度開発したベクターをpDESTRと命名し,さらに同様の,ビアラフォス耐性遺伝子を選択マーカーとして持ったベクター,pBARSTを作成した.これらのベクターを使用し,Inverse PCR法によりRhm54,Rhm52,Khm70,Khm80破壊コンストラクトを作成した.10株の形質転換体から,欠損変異株を得ることができ,ベクターの有効性が証明された.1.遺伝子の基礎解析まず,Rhm54,Rhm52遺伝子について,cDNAのクローニングを行った.RT-PCRを用い,Rhm54,Rhm52のcDNAのクローニングに成功した.次に,各遺伝子のノーザン解析を行った.高温(37°Cおよび42°C),紫外線照射(100J/m^2,200J/m^2),メチルメタンスルホン酸(0.1%,0.2%),メチルヴィオロゲン(0.1mM,1mM,10mM)のストレスを与えた菌体からRNAを抽出し,Rhm54,Rhm52遺伝子の発現をノーザン解析により調べた.その結果,各遺伝子は定常状態でも一定の発現が見られるが,各ストレスによって転写量が増大していることが確認された.特に,メチルヴィオロゲンによる転写の活性化が顕著であった.メチルヴィオロゲンは細胞中で活性酸素を発生する.いもち病菌が非親和性の宿主に感染を試みた際にも過敏感反応としてオキシダティブバーストが起こり,活性酸素が発生する.活性酸素ストレスにより組換え修復遺伝子の転写の活性化が起こる事は,本研究の仮説を支持するものである.2.遺伝子破壊用ベクターの構築Invitrogen社のGATEWAYシステムを応用した糸状菌遺伝子破壊用ベクターの構築を行った.通常,遺伝子破壊用ベクターは目的遺伝子の上流および下流のDNA断片と,その間に選択マーカー遺伝子を挿入する複雑な過程が必要である.今回,我々がデザインしたベクターは,Inverse PCRにより目的遺伝子断片を増幅し,Topo反応により導入し,しかる後にハイグロマイシン耐性ベクターに組換えによって導入するものである.これにより,簡便に遺伝子破壊が行えるようになった.1.新たな遺伝子のクローニング新たに非相同末端再結合に関わる遺伝子であるKu70,Ku80のいもち病菌ホモログ,Khm70,Khm80をPCRにより,日本産イネいもち病菌Ina168株より取得した.これらはこれまでにクローニングしていた遺伝子と同様,アカパンカビ(Neurospora crassa)のホモログと最も高い相同性を示した.これまでにクローニングしたRhm52,Rhm54,Mhm11,Khm70,Khm80をハイグロマイシン耐性プラスミドベクターpCSN43-DESTに連結し,それぞれN.crassaの変異株mus-11,mus-25,mus-23,mus-51,mus-52に導入し,変異の相補により遺伝子の機能を確認した.その結果,Rhm52,Rhm54,Khm80は相補が確認され,機能を持った遺伝子であることが示唆された.Mhm11,Rhm70は相補が見られなかったが,これらは複合体を形成し機能する遺伝子であり,その複合体の形成に問題があることが考えられた.3.欠損変異株の作成昨年度開発したベクターをpDESTRと命名し,さらに同様の,ビアラフォス耐性遺伝子を選択マーカーとして持ったベクター,pBARSTを作成した.これらのベクターを使用し,Inverse PCR法によりRhm54,Rhm52,Khm70,Khm80破壊コンストラクトを作成した.10株の形質転換体から,欠損変異株を得ることができ,ベクターの有効性が証明された.
クライオ顕微質量分析によるリグニン生合成前駆物質の輸送と貯蔵の可視化

直径10 mm程度の凍結試料を用いて、高速液体クロマトグラフィーおよびイオンクロマトグラフィーによるリグニン前駆体および糖類の定量分析、樹脂法埋試料作製ならびに薄切片の紫外線顕微鏡・偏光顕微鏡・染色切片の顕微鏡観察、そして低温二次イオン質量分析/走査電子顕微鏡(cryo-TOF-SIMS/SEM)分析による各種生体成分のケミカルマッピングを行った。急速凍結されたイチョウの木口面および柾目面について、cryo-TOF-SIMS/SEM分析を行った。形成層から木部側に向かって1細胞ずつ、その細胞断面内におけるマススペクトルを抽出した。得られた各マススペクトルからコニフェリン、スクロース、カリウムのイオン量を評価した。細胞の木化段階については紫外線顕微鏡・偏光顕微鏡・光学顕微鏡・cryo-SEM観察結果を比較することで同定した。結果より、コニフェリン由来フラグメントイオンは、分化中木部において徐々に貯蔵量が増大し、複合細胞間層木化開始時に少し減少したが、その後も貯蔵される傾向にあった。また二次壁の木化開始と同時に急激に減少することが示唆された。放射性同位体ラベルされたコニフェリンの投与実験に関する過去の研究では、複合細胞間層形成期および二次壁形成期の細胞においてリグニンへのコニフェリン取り込みが起こると報告されている。本研究と既報の結果より、分化中木部の細胞内におけるコニフェリンの貯蔵量推移およびリグニンへの取り込み時期は、細胞壁の木化過程とよく一致しており、コニフェリンがリグニン前駆体の貯蔵・輸送形態であることを示唆した。26年度が最終年度であるため、記入しない。1)低温二次イオン質量分析(cryo-TOF-SIMS)によるリグニン前駆物質の分布可視化リグニン前駆物質であるコニフェリンについて、その局在状態をcryo-TOF-SIMS分析および低温-走査電子顕微鏡観察(cryo-SEM)により、細胞単位での分布可視化に成功した。コニフェリンは木部の形成段階に応じてその分布様式および存在量を変化させていたため、細胞壁の形成過程確認、リグニンの沈着状況評価、各細胞の同定、およびコニフェリンの定量分析などを行う必要があった。そのため同一のサンプルについて、cryo-TOF-SIMS/SEMに加えて偏光顕微鏡、UV顕微鏡、クロマトグラフィー分析などを適用して、総合的な分析を行うための実験・分析手順を確立した。2)凍結試料中に存在する分子の定量法開発各種標的化合物の水溶液を凍結させ、cryo-TOF-SIMS分析に供したところ、凍結されている標的化合物は、付近に存在する水分子および無機金属の影響を強く受け、乾燥状態とは大きく異なったイオン化挙動を示すことがわかった。植物中のコニフェリンやスクロースといった水溶性成分について、クロマトグラフィー分析による定量分析を行い、cryo-TOF-SIMS分析によって得られる二次イオン量との比較を行った。結果より、cryo-TOF-SIMS分析によって得られる二次イオン量は、相対的な存在量比較のための指標として利用できる可能性が示唆された。TOF-SIMS分析においては測定試料表面の立体形状がイオン化挙動に大きく影響を与えることがわかっており、樹木試料を対象とした場合には大きな課題となっていた。しかしながら凍結樹木試料を表面切削して平滑な表面を測定に供することにより、分析の安定性が大きく改善されているものと考えられる。リグニン前駆物質が局在していることについて、cryo-TOF-SIMS/SEM測定により、細胞レベルでのマッピングを作成することが可能であった。しかしながらそれらの細胞がどのような形成段階にあるのかについて、当該システムのみから判断することは難しかった。そのため、同一試料について、偏光顕微鏡、UV顕微鏡、クロマトグラフィー分析などを同時に行う必要が生じた。

この新たな課題について、他分野の専門家の助力を得ながら議論、実験を重ねた。結果より、様々測定法に試料を供するための実験・分析手順を確立することができた。凍結試料中の分子の定量法に関しては基礎的な検討を続けている。表面が平滑な凍結試料に関しては、乾燥状態の樹木試料と比較して、相対的な存在量比較が可能であることが示唆されており、当該システムのメリットを示すことができた。当該年度のこれらの結果に関して、国内学会誌へ技術報告論文を発表した。また様々な研究会から招待講演の要請を受けた。当該学術領域内で共同研究を前提として具体的な実験計画・議論を重ねることで、より応用力の高いシステムへと進展しつつある。以上の発展的状況を踏まえて、当該研究課題が順調に進展しているものと判断した。森林化学研究室ホームページ初年度に確立された実験系を、今年度のサンプルに対して適用し、細胞壁の形成とリグニン前駆物質との相関関係を包括的に可視化する。また第二年度では適用する樹種を増やし、「植物細胞壁」に関する幅広い知見を蓄積する予定である。具体的に、初年度はイチョウを用いて実験を行った。第二年度ではスギ、コブシについてサンプルを準備中である。また当該学術領域内での共同研究により、各種培養植物についても検討予定である。凍結試料中の特定化合物の定量法に関して、初年度までに明らかになった"凍結"マトリクス効果を最大限に活用するため、測定条件の再検討を行う。これまでcryo-TOF-SIMS分析における一次イオン源のパラメータは、乾燥試料に対して設定されてきたものをそのまま流用していた。しかしながら、周囲を水分子で覆われ、凍結されているという状態がマススペクトルに与える影響が非常に大きかったことを踏まえ、より凍結状態へと適した分析パラメータの探索を行う。具体的には一次イオンのパルス間隔あるいはエネルギー量の増減、クラスターイオン化などについて検討を進める。
難治性自己免疫性肝炎の病能に関与する免疫細胞内レドックス環境の解析

本年度は昨年度のマクロファージ内のレドックス環境解析に引き続き、AIH症例のT細胞内レドックス環境の解析を行なった。健常人、GC感受性、GC抵抗性AIH症例末梢血よりマグネチックビーズ法を用いT細胞を分離、細胞内の活性酸素種:スーパーオキシド、ヒドロキシラジカル、亜硝酸を補足法、液体クロマトグラフィー法により、抗酸化物質:GST、TRXをELISA法により測定し細胞内レドックス環境を解析した。酸化状態を反映する酸化型GST、還元状態を反映する還元型GSTおよびチオレドキシン(TRX)をそれぞれ測定した。健常人に比してAIH患者ではマクロファージ内の酸化型GSTが高値を示しTRXが低値を示す傾向が認められたが、T細胞ではこのような傾向は認められなかった。また血中AST値と酸化型GST、TRX間での有意な相関は認めなかったが、マクロファージにおける解析と同様にAST値が特に高値を示す活動性の高い症例では、酸化型GSTが高値を示した。また、T細胞内のレドックス動態とサイトカイン産生動態との関連を検討したところ、黒ファージではレドックス動態が還元状態に傾く症例ではTh2サイトカインが、酸化状態に傾く症例ではTh1サイトカインが優位に産生される傾向を認めたが、T細胞ではこうした傾向は認めなかった。以上より、AIHの免疫病態にはT細胞よりもマクロファージの細胞内レドックス環境変化強く影響を及ぼす可能性が示された。本研究の目的は、臨床上しばしば経験するグルココルチコイド(GC)抵抗性の難治性自己免疫性肝炎(AIH)の免疫学的病態を、免疫担当細胞の細胞内レドックス環境(酸化還元バランス)の観点から解明することである。患者さんに採取した血液サンプルの一部を本研究に用いることを説明し了解を得た後に実験に供した。今年度はAIH症例の末梢血より分離したマクロファージ中のレドックス動態とサイトカイン産生動態の関連、病態との関連を検討した。酸化状態を反映する酸化型GST、還元状態を反映する還元型GSTおよびチオレドキシン(TRX)をそれぞれ測定したところ、健常人に比してAIH患者ではマクロファージ内の酸化型GSTが高値を示しTRXが低値を示す傾向が認められたが、有意差は認めなかった。また血中AST値と酸化型GST、TRX間での有意な相関は認めなかったが、AST値が特に高値を示す活動性の高い症例では、酸化型GSTが高値を示した。一方、マクロファージ内のレドックス動態とサイトカイン産生動態との関連を検討したところ、レドックス動態が還元状態に傾く症例ではTh2サイトカインが、酸化状態に傾く症例ではTh1サイトカインが優位に産生される傾向を認めたが、病態との関連は明らかにされなかった。次年度にさらに症例を積み重ねて、解析を行う予定である。
病原性放線菌ノカルジアの生産するシデロフォアの生合成に関する研究

Nocardia farcinicaのゲノム解析により見出されたシデロフォア生合成に関与すると推定されたnbtクラスターによって、シデロフォアが生産されていることを遺伝学的手法等により証明し、さらに生合成経路の改変等による新規化合物の生産を目指している。結果、シデロフォア"Nocobactin NA"の生産を確認し、nbt遺伝子破壊株の解析によりnocobactin NAの生産性の減少、消失を確認した。以上の結果から、nbtクラスターがnocobactin生合成に関与していることを証明した。Nocardia farcinicaのゲノム解析によって,従来のスクリーニングでは見いだせなかった物質を二次代謝遺伝子群という形で推定し,その産物と考えられる化合物シデロフォア"nocobactin"を見出した。この二次代謝遺伝子群がnocobactinを生合成していることを明らかにするため解析を行った。第一に異種発現を行うために,全ゲノムを網羅した整列プラスミドライブラリーからnocobactin生合成遺伝子と推定される遺伝子クラスター(nbt遺伝子クラスター)を単離し,ベクターに連結した。このベクターをStrptomyces avermitilisに導入し,nbt遺伝子クラスター(nbtA-H,S,T)のを保持した株を構築することができた。この株を培養し,代謝産物をHPLCにより解析した結果,nocobactinの初発物質と考えられるサリチル酸の生産を確認した。nocobactinの生産に関しては解析中である。第二に,異種発現ではNocardia遺伝子の発現等に不都合等が生じる可能性を有しているため,我々のグループが開発したNocardiaの遺伝子操作系等を利用し,生合成遺伝子の欠失株等の作成を行った。本年度は,サリチル酸生合成酵素と推定されるnbtSの破壊株を作成した。この株の代謝産物をHPLCにて解析した結果,サリチル酸の生産は確認されなかった。またnocobactinの生産量に関しては,顕著に低下していることが判明した。またnbtSを相補した株およびサリチル酸を添加した場合では,nocobactinの生産は回復した。したがって,NbtSによってサリチル酸が生合成され,このサリチル酸がnocobactinの生合成の経路へ供給される主な経路であると考えられた。次年度以降は,異種発現および生合成遺伝子の破壊株を用いて生合成経路の解明を進める。Nocardia farcinicaのゲノム解析よりシデロフォア生合成遺伝子と推定されるnbtクラスターを見いだしており、また本菌株からシデロフォア"nocobactin"の生産を確認している。したがって、本研究ではnbtクラスターの最終産物がnocobactinであることを遺伝子解析により証明すること目的としている。前年度の研究にて構築したnbtクラスター(nbtA-H, S, T)を導入したStreptomyces avermitilis株を利用して異種発現を試みた。HPLCを用いて代謝産物の解析を行ったが、nocobactinの生産は確認できなかった。これは、非リボソーム依存型合成酵素(NRPS)がホスホパントテン酸転移酵素によって翻訳後修飾された活性型のホロ酵素になっていないと考え、この株にnocardiaのホスホパントテン酸転移酵素遺伝子を導入した株を構築したが、同様にnocobactinの生産は確認できなかった。nbtクラスターがnocobactin生合成遺伝子であることを証明するためのもう一つの方法として、我々のグループが開発したNocardiaの遺伝子操作系等を利用しnbt遺伝子の破壊株の作成を行った。結果、nbtAおよびnbtEの破壊株を作成することができた。相補株に関しては、Nocardia-E. coliのシャトルベクターを用いて作成した。破壊したnbtA遺伝子は、thioesteraseをコードしており、そのアミノ酸配列を用いた解析によりtype IIのthioesteraseであると予想された。nbtE遺伝子は、NRPSをコードしており、アデニル化ドメインの解析によりリジンを基質としていることが推定された。また、N末端側の縮合ドメインのアミノ酸配列中に異性化ドメインのモチーフ配列を見いだした。このことは、nocobactinのカプロラクタム環部位のリジンがD体である結果と一致することから、NbtEがこの部位の生合成に関与すること示唆された。今後、作成した破壊株の詳細な解析等を行いnocobactinの生合成経路の解明を進める。また、生合成経路の改変により新規化合物の取得を目指す。本研究では、Nocardia farcinicaのゲノム解析より見いだされた、シデロフォア生合成遺伝子と推定されるnbtクラスターによってnocobactinが生産されていることを遺伝子解析等により証明し、さらに生合成経路の改変等による新規化合物の生産を目的としている。nbtクラスターの解析に関しては、2008年度に作成したnbt遺伝子(nbtAおよびnbtE)の破壊株およびそれぞれの相補株におけるnocobactinの生産性の確認するために、これらの株の生産物をHPLCにて解析した。nbtAおよびnbtE破壊株では、野生株にみられるnocobactinのピークが検出されなかった。

さらに、nocobactin生合成の初発物質であるサリチル酸は、nbtAおよびnbtEの破壊株において検出され、野生株と比較して生産量の増加が見られた。また、これらの相補株では、nocobactinの生産が回復した。以上の結果から、nbtAおよびnbtE遺伝子は、nocobactinの生産に必要であることが示唆された。さらに、nbtE破壊株では、nocobactinとは異なる保持時間に、新たなピークが観察された。このピークのUVスペクトルはnocobactinと同じであり、HRMSおよびMS/MSの解析の結果からnocobactin生合成段階の中間体と考えられた。生合成経路の改変等による新規化合物の生産に関しては、サリチル酸の生合成酵素をコードするnbtS破壊株とサリチル酸アナログを用いたmutasynthesisを試みた。サリチル酸アナログのうち数種類の化合物は取り込まれ、新たな化合物の生産が確認された。それらの新たな化合物の分子量は、アナログ化合物が取り込まれた化合物の予想分子量と一致した。このことから、mutasynthesisを用いて、新たな化合物の生産が可能であるという知見が得られた。一方で、これらの化合物の生産性は、nocobactinの生産と比較して悪いことから、化合物自体の毒性やサリチル酸アナログ化合物の生合成酵素への取り込み効率等の改良が必要であると考えられた。