hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
バベシア原虫による宿主赤血球修飾分子の同定とその輸送機構の解析

細胞内寄生原虫はその宿主細胞を改変することにより、栄養の取り込みや免疫回避など寄生適応を行っているとされる。バベシア原虫はダニ媒介性の赤血球寄生原虫であり、ウシを始め家畜に多大な経済的被害を与えている。特にウシのバベシア原虫Babesia bovisは病原性が高く、感染赤血球表面に発現する原虫由来のVESAタンパク質がその病原性に関わるとされるが、それ以外の赤血球改変分子については殆ど分かっていない。本研究ではB. bovis感染赤血球表面に発現する原虫由来タンパク質を同定し、それら分子がどのように輸送され、どのような機能を担っているのか明らかにすることを目的としている。2017年度は初年度質量分析により同定された候補分子を基に過発現する原虫を作製し、実際に候補分子が赤血球側に局在するか確認を行った。まず、候補分子について陰性対照群との比較により非特異的に検出されたと思われる分子を除いたうえで、ドメインや膜貫通領域、シグナル配列の有無を推定し、赤血球側に発現が予想される分子の絞り込みを行った。その上で、合計17の候補分子について過発現原虫を作製し、その局在について過発現タンパク質に付加したタグ配列を間接蛍光抗体法により検出することで解析を行った。その結果、多重コピー遺伝子にコードされていることが知られているSMORFタンパク質が宿主赤血球側にも局在していることが明らかになったほか、これまで全く報告の無い新規タンパク質が少なくとも3種類、原虫感染赤血球の表面近傍に局在することが明らかとなった。現在、本研究で同定された新規赤血球改変分子について機能解析を進めている。29年度が最終年度であるため、記入しない。特にウシのバベシア原虫Babesia bovisは病原性が高く、赤血球表面に発現するVESAタンパク質がその病原性に関わるとされるが、それ以外の赤血球改変分子については殆ど分かっていない。初年度は、バベシア原虫寄生赤血球表面に存在する原虫由来タンパク質を解析するため、タンパク質の精製並びに質量分析を行った。具体的には原虫感染赤血球を濃縮した後に、赤血球表面タンパク質をビオチン化し、ストレプトアビジンビーズを使いビオチン化タンパク質を精製した。精製したタンパク質をLC-MS/MS液体クロマトグラフィー質量分析法にて解析し、宿主由来タンパク質を除外した結果、約50種の原虫タンパク質が検出された。この中には原虫感染赤血球表面に局在するとされるVESAタンパク質が含まれていたほか、機能未知のタンパク質も10種類以上含まれていた。検出されたタンパク質からBioinformatics解析等により、赤血球表面に局在する可能性があると考えた10種を選び、タグ付きタンパク質を発現する遺伝子改変バベシア原虫の作製を開始した。原虫寄生赤血球表面タンパク質の質量分析により、原虫分子を同定することができ、幾つかの同定した分子について遺伝子組換え原虫の作製を開始することができたため。タグ付きタンパク質を発現する遺伝子改変原虫を作製し、質量解析にて得られたタンパク質が感染赤血球表面に発現していることを確認する。さらに、赤血球表面の発現が確認された分子について、共通するモチーフを検索することで赤血球表面輸送に関わるモチーフを明らかにする。また、それら分子の遺伝子ノックアウト原虫を作製することで、得られた分子の機能を解析する。
歯周組織再生に関する研究:セメント質形成機構の分子生物学的解明

前年度までにセメント質細胞接着因子が(CAP)のモノクローナル抗体を作製し、CAPが歯胚中のセメント質およびセメント芽細胞に限局して存在することを見出してきた。またCAPは歯胚中で65kDaの蛋白質として存在し、歯小嚢細胞に対して細胞接着活性を示すことからセメント質形成のマーカー分子になる可能性も示唆した(現在投稿中)。今年度はCAPの発生過程のprocessingを調べる目的で、歯胚中と永久歯に存在するCAPの分子量を比較検討した。結果はCAPが歯胚中で65kDaの分子量として合成され、永久歯では56kDaに分子量が変化することを明らかにした。またCAPの蛋白質濃度は歯胚から永久歯へ成熟する過程で減少することからも、CAPはセメント質形成の初期過程に関与するマトリックスで、成熟過程において修飾を受け56kDa formとしてセメント質に存在することが示唆された。また65kDaCAPが従来報告されてきたようにコラーゲン様蛋白質であるか否かを調べるために、細菌性コラゲナーゼで処理したところ65kDa CAPが完全に消化されることが認められた。これらの結果より、CAPはコラーゲン性蛋白質でセメント質の形成過程で修飾を受けることが判明した。次にCAPの構造を決定するために、再度CAPの精製の効率化を試みるため、歯胚を酢酸とグアニジン塩酸を用いて蛋白質を抽出し、この可溶性画分をDEAE Sephacel,Q-Sepharose,Mono-Qと3種類の異なる陰イオン交換樹脂を用いて精製を行った。この方法により>1μgのCAP精製に成功した。現在は得られたCAPの内部アミノ酸配列の解析を実行中である。また一部得られたアミノ酸配列を基にウシ歯胚よりRNAを抽出し3'RACE cloningを行ない、cDNA配列の解析も試みている。今後はCAPのcDNA cloningを目的に、歯小嚢細胞からセメント芽細胞の分化誘導を行ない、CAPのcDNA cloningを効率よく行えるlibralyの作製を試みる予定である。セメント質由来細胞接着因子(CAP)は56kDaのセメント質中に存在するコラーゲン様細胞接着因子として報告されてきた。また最近の研究よりCAPは各種間葉系細胞に接着し、integrin receptorを介して線維芽細胞に細胞内情報伝達を誘導することが確認されている。今回の研究では抗CAPモノクローナル抗体を作製し、セメント質形成機構とCAPの関連性を調べた。歯根形成期ウシ歯胚を用いて免疫染色を行うと、抗CAPモノクローナル抗体:3G9はセメント質およびセメント芽細胞に特異的に染色することが判明した。CAPと相同性の高いI型collagenの抗体を用いて染色したところ、この抗体は歯胚全体に陽性反応を示した。またセメント質中に存在する非コラーゲン性タンパク質であるbone sialoprotein、osteocalcin、osteopontinの局在を免疫染色で調べると、これらはセメント質および歯槽骨のマトリックス中に存在することが確認された。しかし3G9はセメント質のみを認識し歯槽骨中には存在しなかった。歯胚中に存在するCAPを3G9を用いた抗体カラムを用いて精製したところ、65kDaのタンパク質が精製された。この65kDa CAPの生物学的特性を調べるため歯根形成期ウシ歯胚より歯小嚢細胞を分離培養し、細胞接着試験を行ったところ、65kDaCAPはタンパク質濃度2.5μg/mlでI型collagenおよびfibronectinと同程度の細胞接着活性を示した。これらの結果よりCAPはセメント質特異的に存在する接着因子で、また歯小嚢細胞の接着を誘導することによりセメント質形成に関与するものと思われる。次年度は歯小嚢細胞のCAP産生能力を調べる予定である。

また一部得られたアミノ酸配列を基にウシ歯胚よりRNAを抽出し3'RACE cloningを行ない、cDNA配列の解析も試みている。今後はCAPのcDNA cloningを目的に、歯小嚢細胞からセメント芽細胞の分化誘導を行ない、CAPのcDNA cloningを効率よく行えるlibralyの作製を試みる予定である。
常染色体優性視神経症患者由来iPS細胞を用いた病態解析

本研究では、Optic atrophy 1 (OPA1)遺伝子変異による遺伝性視神経症である常染色体優性視神経萎縮症(autosomal dominant optic atrophy: ADOA)患者からinduced pluripotent stem (iPS)細胞を作製し、立体網膜組織に分化誘導を行う。作製した立体網膜組織から網膜神経節細胞を単離し、網膜神経節細胞及びその軸索である視神経におけるOPA1遺伝子変異の影響を細胞分子生物学的手法で解析する。
地域スポーツの推進計画立案における多元的主体の相互補完的ガバナンスに関する研究

本研究は,総合型地域スポーツクラブの育成支援の役割を果たしたNPO型中間支援組織(以下,支援NPO)がスポーツの公共圏を創出していたことを明らかにした.これまでの公共圏は,スポーツ行政の施策を受容するだけの「受容的公共圏」であった.しかしながら,本研究では,支援NPOの活動が能動的な市民たちによる「市民的公共圏」を創出していたことを明らかにした.支援NPOは,既存の制度や慣習から自由に意見表出できる個人を生み出した.こうした個人の集合的行為が公共圏であった.さらに公益財団法人日本体育協会と支援NPOという民間スポーツ組織の相補的関係性が「市民的公共圏」の重要な創出要件であることを読み解いた.本年度の研究では、地域スポーツ推進計画の立案について、公的・民間非営利・民間営利の3セクターが理想的な補完体制を確立して、立案・策定すると想定した場合に現実的にそうした立案が実現可能なのか、その逆に不可能であれば、想定される阻害要因は何かを明らかにしておくことであった。研究方法は、公的セクターは地方行政のスポーツ推進担当スタッフ4名、民間非営利セクターは総合型地域スポーツクラブのスタッフ12名、民間営利セクターは企業のスタッフ3名のそれぞれからヒヤリング調査を実施し、上記目的の解明を試みた。こうした複数セクターといった多元的主体による推進計画の立案は、どのセクターにおいても共通して「実現可能」な条件には、時間的課題があげられた。つまり1年間や年度内に策定しなければならない、という制約があってはならず、立案過程には少なくとも2年以上の期間が必要で、理想的には3年程度の時間をかけて立案してことが必要であるという共通認識が得られた。また計画は5年、10年、30年、さらには50年先までを見越した具体的数値目標を定めることや計画実行のための予算的措置を、どのような手法と各セクターの協力体制のもとに実現させるのかを定めることが必要であった。こうした大枠的な推進計画の存在的意義が明らかにされないと各セクターが補完的協力体制を築けないということが判明した。つまり、多元的主体による立案のためには、(1)推進計画の大枠的な内容とその意義が事前に確認されること、(2)立案の時間はあらかじめ制約されていないこと、(3)多元的主体の各セクターの立案に係るスタッフコミュニティをつくるべく事務局体制を整えることを明らかにすることができた。本年度は、昨年度の研究成果を踏まえて、健康政策やスポーツ政策という領域に拘らずに、積極的に公共との恊働事業を展開してきたNPO代表者やNPO活動をサポートしているサポートセンターのスタッフ、また基金をとおして公共と民間の恊働事業を後押しし、新しい施策づくりを生み出そうとしている助成担当者らに対するヒヤリング調査を実施した。それらのヒヤリング結果から次のようなことが解明できた。地域住民の中で、計画づくりの目的に近い社会的課題の克服に関わっている、または少しでも関心をもつ住民が計画づくりそのものを有意義なことと思えるような仕掛けが大切であるということ。さらに、有意義だと思えることが住民にとって日常の活動でも感じられるような仕掛けも必要であること。つまり、「推進計画の立案の日常化」とでもいう仕掛けである。計画と評価と改善といったNPO等の組織内プロセスを普段のNPO活動のなかで管理業務および事業として組みいれ、活動による成果と成果による実態の変化や住民の意識変化を日常的に感じ取れるような組織内コミュニティをつくることであった。そのためには、さまざまな公共施策に対して、その施策の受益対象者から漏れている人たちが、なぜ施策対象から除外されてしまうのか、その理由をNPO活動のなかでつねに組織内コミュニティの関係性を構築する視点としてとらえておくことであった。さらに、このことは民間の非営利組織ばかりではなく、公共セクターも、民間(企業)セクターも、同じような組織内コミュニティを創発できる体制を整えておくことであった。そうしたコミュニティの恊働が補完されるときに質の高い恊働モデルが構築され、推進計画が常に成果に対して、厳しく評価をするしくみが各々のセクターに構築されていくものと考えられた。公的・民間非営利・民間営利の各セクターは、いったい各々にどのような公共の担保を組織内部で構築し、そして、それをどのようなスポーツ事業として立案・企画・実行することで、地域スポーツの公共性という評価につなげているのであろうか。このような問題関心のもとで、本年度の研究では、平成25(2013)年度と平成26(2016)年度の2年間にわたって実施してきた各セクターへのヒヤリング調査のデータを再分析した。と同時に、平成10(1998)年度から総合型地域スポーツクラブの中間支援を行っているスポーツNPOの活動実績を分析した。その理由は、過去2年間のヒヤリング調査の分析をつうじて、公共・民間非営利・民間の各セクターとも類似したスポーツ事業が実施され、ここで語られる公共の担保も類似したもので、差異がほとんど見られなかったからである。その一方で、総合型地域スポーツクラブの中間支援をおこなっているスポーツNPO(民間非営利セクター)の活動実績と公共の担保を分析していると、公共セクターや民間セクターの公共の担保の背後には、まだまだ隠された担保が存在をしており、それらが顕在化されていないということが判ってきた。本年度の研究では、スポーツ行政とスポーツNPOを比較検討の対象とし、総合型地域スポーツクラブの集合的行為を通じたスポーツ組織の補完的統治の可能性について検討した。まずスポーツ行政は、スポーツを推進するための公的な担保を、行政内部の意志決定構造と行政手続きの遵守性に求める論理構造が根強く残っていることを確認した。

一方で、スポーツNPOは、代表者らをはじめとして共通の関心をもった個人が職縁や地縁と無関係に集合的アソシエーションを創発し、市民社会として自立的展開をはかり、地域スポーツの理想的なあり方や総合型地域スポーツクラブの育成方針に関して、意見具申ができる言説的コミュニティを創発していた。本研究計画の最終段階にはいっている。すでに得られたデータや資料等の分析は済ませているので、これらのデータや資料を学術論文として成果報告することが大きな課題である。研究成果は、過去20年間にもおよぶスポーツNPOの活動実績を学術論文として整理する作業でもあるので、論点を明確にして、多くのスポーツ関係者がどのように自己の組織内活動について、自己再帰的形式をもちいて内省し、そして、新しい統治のあり方を組織内部の検討できるような実践的レベルにおいて報告することが重要である。さらに、平成29(2017)年度以降の継続的な研究計画についても、同時並行的に検討していく必要がある。本年度は公益財団法人日本体育協会の「外部」において,総合型地域スポーツクラブの育成支援を担ったスポーツNPOの実践を取り上げ,このスポーツNPOが創出した公共圏とは,どのような意味を持つのかを明らかした。本研究で取り上げたスポーツNPOは、総合型地域スポーツクラブの育成を支援する「中間支援ネットワークNPO」である。いわば政治や経済から独立したNPO法人型のアソシエーションは、人々の自己表出を制約することなく、共通の関心でつなげる自立的組織の役割を果たす仲介的領域の社会空間である。本研究では、こうしたNPO法人型アソシエーションが果たした役割を1998(平成10)年から2006(平成18)年までの約9年間におよぶ事業内容とネットコミュニティ内の言説空間の2つの領域に着目して、この領域から創出された公共圏の意義を論じた。なお,分析に際しては,市民社会論の理論的・方法論的フレームを提唱したメルッチの「新しい社会運動論」とラクラウとムフの「ラディカル・デモクラシー論」にもとづいて公共圏の特徴を描き出した。その結果、中間支援ネットワークNPOを通じて、スポーツ実践者らが政治や経済、地域や職域から自立した立場から自由な意思の表出を可能にしていたことがわかった.またこうした意思は中間支援ネットワークNPOの諸事業を通じて、数多くの人々に等価的に連鎖していくプロセスを確認することができた。さらに、このようなプロセスは、同時にスポーツ実践者らの私的な意思から公的な意思へ転換していく可能性をもっていることが明らかになった。以上のような考察を受けて,本研究が明らかにしたスポーツの公共圏は、既存のスポーツ政策の立案過程やスポーツ組織の再編プロセスを主体的に担うことができるスポーツ実践者らが発現でき集合的に結束していく重要な社会空間であることを明らかにすることができた。本研究計画の最終的な成果は2つの学術論文を公表することである.本年度はそのうちの1つを成果報告することができた。もう1つの学術論文は最終年度を跨いで平成29年度に成果報告する予定である。
危険運転致死傷罪の実証的点検-刑事立法の合理性評価方法の定立に向けて-

本研究は、危険運転致死傷罪の立法時に指摘されていた問題が、その運用上、はたして、また、いかなる形で生じているか、実証的に点検することを通じて、刑事立法の合理性の評価方法を探ることを目的とするものである。初年度の研究に引き続き、本年度も、研究代表者および研究分担者の主たる研究対象たる法領域について、文献調査による情報収集を行うとともに、国内各地の研究者、実務経験者との意見交換の機会を複数回設けた。さらに、研究代表者および研究分担者の参加する大学内部で研究会を開催した。交通事犯の被害者・遺族等からの要望を一つの契機に新設された危険運転致死傷罪は、悪質かつ危険な運転行為に即した処分および科刑を実現することを目的とするものであったが、構成要件上、その対象は相当に限定されており、裁判例においては、立法時の議論に忠実に、同罪の構成要件を厳格に解釈する傾向が強く、同罪では捕捉できない悪質な交通事犯にいかに対処するかという問題が生じていた。平成19年3月に、自動車の運転上必要な注意を怠り、人を死傷させた者に対する罰則を強化することを内容とする「刑法の一部を改正する法律案」が国会に提出されたことは、このような状況を受けたものであるが、危険運転致死傷罪によって捕捉されない悪質な交通事犯への対処の必要は、同罪新設の契機に照らして、当初より予想することが可能であったようにも思われ、上記のような事態の推移は、刑事立法の評価が、立法それ自体の内容とともに、ある事柄については当該時点においては立法の対象としない、とした判断に対しても、及ぼされるべきことを示しているといえよう。研究期間との関係から、上記「刑法の一部を改正する法律案」を含めた、危険運転致死傷罪に対する総合的評価は今後の課題とせざるを得ないが、上述した観点を含めた評価により、刑事立法の合理性をより精確に判定できるものと思われる。本研究は、危険運転致死傷罪に対して指摘される様々な問題のうち、主として、(1)重罰化によって被害者は慰謝されるか、(2)重罰化によって交通事故を抑止することができるか、(3)故意犯として構成される同罪規定は構成要件として明確といえるか、(4)運用に際し、処罰範囲の拡大、不明確化を招いていないか、(5)立法経緯や現実の被害者感情が、量刑実務上、(業務上過失致死傷など)他の犯罪との関係で不均衡な形での厳罰化をもたらさないか、という点をとりあげ、立法時に予想された問題が、その運用上、はたして、また、いかなる形で生じているか、実証的に点検することを通じて、刑事立法の合理性の評価方法を探ることを目的とするものである。今年度は、研究代表者および研究分担者の主たる研究対象たる法領域について、文献調査を中心に情報収集を行うとともに、国内各地の研究者、実務経験者との意見交換の機会を複数回設けた。さらに、研究代表者および研究分担者の参加する大学内部で研究会を開催して、近時の裁判例を素材として議論を重ねた結果、下級審裁判例は、立法時の議論に忠実に、同罪の構成要件を厳格に解釈する傾向が強く、同罪で捕捉できない悪質な交通事犯にいかに対処するかという新たな問題が生じていることも明らかとなった。次年度は、この点も含めて、危険運転致死傷罪の新設に対する総合的な評価を行う予定である。なお、研究初年度である今年度は、基礎的な資料収集および課題の抽出・共有作業を中心に行ったため、公刊された研究成果はまだない。
明治初年の高等教育-第一番中学から大阪専門学校まで

本年度テーマに関して得られた知見は、以下のとおりである。1.複数の外国語による教育の非能率・非生産性を改善するために、使用言語を英語に一元化する方針が採用され、外国人教師もその方向で漸次整理された。2.留学経験のある高学歴の教員が多かったこともあり、外国語の使用を制限し、邦語教育を重要視する方針とは裏腹に、教場内ではかなり遅くまで英語が多用された。3.初等教育を含めた予備・準備教育機関の絶対的不足、および未発達が入学生徒の極端な学力差となり、所定のカリキュラムの未消化をもたらした。そのため、一時期促進学級的な対応を余儀なくされている。4.生徒たちの入学目的は必ずしも明確でなく、東京大学に匹敵する高等専門教育という漠然たる期待を出ない。そのことが、学力不足とともに、学習意欲を著しく阻害することとなり、転・退学者の続出を結果したらしい。5.僅か8年の短期間に4つの校名変更という朝令暮改的な制度改革が、生徒側の事情を考慮した教育現場からのものでなく、常に文部省側の一方的な押し付けで行われており、その都度生徒は進路選択を迫られた。転・退学の恒常的な発生に見られる定着率の低さは、このこととも無関係ではない。6.学校当局者を含めた地元大阪に、大学予備門ではなく、むしろ東京大学を視野に入れた高等専門教育機関への上昇志向が一貫してあり、現に中央の指令を先取り、あるいは拡大解釈する形のカリキュラム案を機会あるごとに積極的に打ち出している。7.前述のカリキュラムの作成や運用などの随所に教育現場におけるかなり自由な裁量が見られるが、これを可能にしたのは、地元側の熱意だけでなく、おそらく文部省側に、この学校を西日本の代表的な高等専門教育機関たらしめようとする、つまりもう一つの大学化構想があったためであろう。
産業集積における「柔軟な連結」の動的達成メカニズム

本研究は、この3年間、産業集積における「柔軟な連結」の動的達成プロセスの解明に、「熟練」「コーディネーション」「相互学習」の3つの観点から、調査研究をとりおこなってきた。本年度は私の出産と重なり、自分自身が遠方の地域に積極的に赴くことが困難であったため、産業集積の関連領域の研究活動に取り組んでいる諸氏と連携を取りつつ、地域間比較に取り組んだ。具体的には、大田区(東京都)、広域多摩(東京都)、長岡(新潟県)、華南(中国の広東省)の工業集積、及び横山町(東京都)の商業集積の間の比較をおこないながら、歴史的な変化も含めて「柔軟な連結」の動的達成プロセスを考察した。例えば、これまで指示待ち型であった現場の人が、まわりの企業からの影響を受けつつ、いかに提案型・企画型の仕事人に転換していったのか、またこのような転換がなかなか起こらず停滞している地域では何が問題なのかといった問いを考察した。本研究の独自性は、企業の境界を超えた複数主体間の関係性の上で、熟練をとらえなおしたところにある。これまでも、第1の「熟練」の観点だけ、または第2の「コーディネーション」(ネットワーク)の観点だけに限定した産業集積の調査研究は多数存在したが、第1と第2の観点を関係付け、さらには第3の「相互学習」の観点まで有機的に関係付けた視野から、産業集積の動的メカニズムをとらえた研究は少ない。本研究の成果は、「日本の中小企業研究」に掲載されたレビュー論文の執筆に生きた。さらに、本年度秋の組織学会において、「大田区町工場群による『柔軟な連結』の達成プロセス」として発表し、貴重なコメントを受けた。地域間比較によるアプローチは、現在も進行中の取り組みであるため未発表であるが、「大田区、広域多摩、長岡、華南、及び横山町における産業集積実態報告書」としてまとめることができた。今後もさらなる研究の発展に尽力したい。
腫瘍環境の鉄およびROS代謝のリプログラミングにおけるABCB10の役割

本研究ではABCB10の発現変化により生じる細胞内の鉄の蓄積によって、フェントン反応が亢進するメカニズムを検討し、ABCB10の発現変化が鉄代謝のリプログラミングの制御にどのように関わるかを解明することを目的としている。また鉄、PPIXやROSは腫瘍細胞の生存や薬剤感受性、または腫瘍のさらなる悪性化に関連する因子であり、これらを制御することが腫瘍特異的な治療薬の開発につながる可能性が期待されるが、その動態や代謝機構は不明な点が多く、これらを標的とした特異的な治療法は確立されていないのが現状である。このことからまず、マウスメラノーマ細胞におけるAbcb10の発現変化が、腫瘍の増殖や様々な抗がん剤の感受性にどのような影響を及ぼすかを以下の研究方法に従って検討した。(研究方法)マウスメラノーマ(B16)のドキシサイクリン誘導性(DOX)のAbcb10発現抑制株(B10KD)を作製し、デキサメタゾン(DEX)、カンプトテシン(CPT)、パクリタキセル(PTX)など作用機序の異なる各種抗がん剤に対する感受性の変化を検討する。細胞毒性についてはMTTアッセイを行なう。またABCB10の発現変化が腫瘍の増殖や悪性化にどのように影響するかを検討するためにマウスに移植して腫瘍径の変化や転移の有無を調べる。細胞増殖についてはBrdUの取り込み、細胞死については活性型Caspase-3の免疫染色などによって評価する。その他ROS、ヘムやPPIXの定量的な解析を行なう。関連するシグナル因子の発現変化はリアルタイムPCRやウェスタンブロット法によって比較検討する。B10KDはDOX誘導時にB16に対して10パーセント程度のAbcb10の発現を認めた。このB10KD株を用いてAbcb10の発現変化による抗がん剤感受性がどのように変化するかを検討することを目的としてB16とB10KD株についてDEX、CPTやPTXに48および72時間暴露した際の細胞生存率を比較した。DEXはSmac/Diabloを介してXIAPを抑制することでアポトーシスを亢進する。またミトコンドリア膜電位の上昇をきたしRosを産生する。B10KDではAbcb10発現抑制することで細胞内Rosの蓄積を誘導し、DEX誘導性のRosの産生をさらに亢進することで細胞毒性が増感することを期待したが、B16とB10KD間で細胞毒性の感受性に変化は認められなかった。また、CPTはトポイソメラーゼIを阻害することでDNA複製を阻害し、P53依存性にアポトーシスを誘導する。P53はHeme依存性に分解されることが知られており、B10KDではHemeの合成不全からP53の安定性が増加し、アポトーシスが亢進することを予想したが、B16とB10KD間で細胞死に変化はなかった。一方PTXは微小管の脱重合阻害によりJNK依存性(P53非依存性)にアポトーシスを誘導する。JNK活性化によるアポトーシスはRosによっても活性化することが知られており、B10KDにおいてRosが産生されることでPTXの細胞毒性が亢進することを期待したが、B16とB10KD間で細胞の生存率に変化はなかった。Hemeを含む血清の存在下・非存在下に加えてHemeとPPIXの前駆体である5Alaを添加することでB16ではHemeの産生によるRosの消化とB10KDではPPIXの産生によるRosの蓄積を促すことで薬剤感受性が増感することを期待したが、これについてもAbcb10の発現に依存した薬剤感受性の変化は見られなかった。当研究室において先行して行なったB16とB10KD株のマウス移植実験ではB16に対してB10KDは腫瘍縮小を示した。B16はP53野生型であることから、このB10KDが縮小したメカニズムを理解するために作用機序の異なるアポトーシス誘導性の抗がん剤を用いて細胞毒性試験を行なったがB10KDが縮小する有効な手掛かりを得られなかった。一方、腫瘍細胞内のRosを直接増加させる鉄剤(ホロトランスフェリン)やアルテミシミン(抗マラリア薬)などを用いた細胞毒性試験をB16とB10KD間で比較した検証を未だ行なえていない。これに付随してin vitroやin vivoにおけるRosの測定を行なうことでAbcb10欠損によるRosの産生と代謝、あるいは感受性がどのように変化するかを明らかにできると考えている。またRos応答性の遺伝子発現変化とAbcb10の発現にどのように相関するかの検討が行えていない。これらの検証を重ねることでABCB10の発現変化により生じる細胞内のRosや鉄の蓄積によって、これらの代謝のリプログラミングが生じる可能性を示し、Ros代謝の制御によるがん治療法の開発へ繋がる研究成果を得ることができると考えている。

このことからまず、マウスメラノーマ細胞におけるAbcb10の発現変化が、腫瘍の増殖や様々な抗がん剤の感受性にどのような影響を及ぼすかを以下の研究方法に従って検討した。(研究方法)マウスメラノーマ(B16)のドキシサイクリン誘導性(DOX)のAbcb10発現抑制株(B10KD)を作製し、デキサメタゾン(DEX)、カンプトテシン(CPT)、パクリタキセル(PTX)など作用機序の異なる各種抗がん剤に対する感受性の変化を検討する。細胞毒性についてはMTTアッセイを行なう。またABCB10の発現変化が腫瘍の増殖や悪性化にどのように影響するかを検討するためにマウスに移植して腫瘍径の変化や転移の有無を調べる。細胞増殖についてはBrdUの取り込み、細胞死については活性型Caspase-3の免疫染色などによって評価する。その他ROS、ヘムやPPIXの定量的な解析を行なう。関連するシグナル因子の発現変化はリアルタイムPCRやウェスタンブロット法によって比較検討する。B10KDはDOX誘導時にB16に対して10パーセント程度のAbcb10の発現を認めた。このB10KD株を用いてAbcb10の発現変化による抗がん剤感受性がどのように変化するかを検討することを目的としてB16とB10KD株についてDEX、CPTやPTXに48および72時間暴露した際の細胞生存率を比較した。DEXはSmac/Diabloを介してXIAPを抑制することでアポトーシスを亢進する。またミトコンドリア膜電位の上昇をきたしRosを産生する。B10KDではAbcb10発現抑制することで細胞内Rosの蓄積を誘導し、DEX誘導性のRosの産生をさらに亢進することで細胞毒性が増感することを期待したが、B16とB10KD間で細胞毒性の感受性に変化は認められなかった。また、CPTはトポイソメラーゼIを阻害することでDNA複製を阻害し、P53依存性にアポトーシスを誘導する。P53はHeme依存性に分解されることが知られており、B10KDではHemeの合成不全からP53の安定性が増加し、アポトーシスが亢進することを予想したが、B16とB10KD間で細胞死に変化はなかった。一方PTXは微小管の脱重合阻害によりJNK依存性(P53非依存性)にアポトーシスを誘導する。JNK活性化によるアポトーシスはRosによっても活性化することが知られており、B10KDにおいてRosが産生されることでPTXの細胞毒性が亢進することを期待したが、B16とB10KD間で細胞の生存率に変化はなかった。Hemeを含む血清の存在下・非存在下に加えてHemeとPPIXの前駆体である5Alaを添加することでB16ではHemeの産生によるRosの消化とB10KDではPPIXの産生によるRosの蓄積を促すことで薬剤感受性が増感することを期待したが、これについてもAbcb10の発現に依存した薬剤感受性の変化は見られなかった。当研究室において先行して行なったB16とB10KD株のマウス移植実験ではB16に対してB10KDは腫瘍縮小を示した。B16はP53野生型であることから、このB10KDが縮小したメカニズムを理解するために作用機序の異なるアポトーシス誘導性の抗がん剤を用いて細胞毒性試験を行なったがB10KDが縮小する有効な手掛かりを得られなかった。一方、腫瘍細胞内のRosを直接増加させる鉄剤(ホロトランスフェリン)やアルテミシミン(抗マラリア薬)などを用いた細胞毒性試験をB16とB10KD間で比較した検証を未だ行なえていない。
ベロ毒素阻害活性を有するペプチド性RNAの合成研究

大腸菌O-157の産生するべ口毒素は,ヒト28S r-RNA4324番目のアデノシン残基からアデニンを解裂させるN-グリカナーゼ活性を有するタンパクであるとともに,本活性がベロ毒素による食中毒の原因であることが解明されている。しかし,これら毒素による食中毒に対する有効な治療法は無く,治療薬の開発が急がれている。そこで申請者らは構造一括性相関の視点から,ヒト28S r-RNAの4324番目付近の塩基配列G-A-Gコードを残基に有するペプチド性RNAおよびその誘導体をべ口毒素の阻害剤として合成することを研究目標とした。申請者らは,まず,核酸塩基をα-位に有するアセトアルデヒド誘導体とグリンシンをL-スレオニンアルドラーゼ(Candida humicola AKU 4586由来)の基質として反応させ,RNA塩基を残基に有するβ-ヒドロキシ-α-アミノ酸の大量合成法を確立した。得られたアミノ酸のβ-位水酸基をRNAのリボース2'-位水酸基に見立てて,これら合成アミノ酸とグリシンとを交互に結合させることによってG-A-Gコードを残基に有するRNA類似のへキサペプチド(ペプチド性RNA)を簡便に合成することに成功した。合成したペプチド性RNAは,poly(U)-directed polyPhe productionアッセイを指標にμMレベルでべ口毒素を阻害した。大腸菌O-157の産生するベロ毒素はヒト28s-rRNAの^<4323>G-^<4324>A-5^<4325>Gユニットからアデニンを解裂する酵素活性を有し,本活性が腸管出血など感染による重篤症状の原因である。最近著者らは,RNA塩基とRNAの2′-位水酸基に相当する水酸基を側鎖に有するα-L-アミノ酸の酵素的大量合成法を確立した。そこでベロ毒素に対する特異的阻害剤の開発を目標に,これらアミノ酸を用いてG-A-Gコードを持ったペプチド性RNAの合成を検討した。まず,アデニンならびに2-アミノ-6-クロロプリンをそれぞれα-ブロモアセトアルデヒドジエチルアセタールと反応させ,続く酸加水分解によりアデニルアセトアルデヒドおよびグアニルアセトアルデヒドを得た。著者の開発した酵素的(L-スレオニンアルドラーゼ)アルドール縮合により,これらのアルデヒドとグリシンとを縮合させ,アデニン(A)ならびにグアニン(G)残基を有するβ-ヒドロキシ-α-L-アミノ酸を合成した。次にこれらのアミノ酸のカルボキシル基をベンジル基で保護した後,N-Boc-グリシンとEDCでカップリングさせた。得られた2種のジペプチドを順次交互に,常法に従い縮合させ,最後にN-及びC-末端の脱保護を行って目的のG-A-Gコードを持ったペプチド性RNA(ヘキサペプチド)の合成を達成した。次年度は,合成したヘキサペプチドがRNA特有のループ構造をとり,ベロ毒素のより優れた阻害剤となるように誘導化し,阻害活性を検討する予定である。
ブタ肝臓ミクロソーム電子伝達系生物マシーナリーの立体構造と機能に関する研究

本研究では、集合型生物マシーナリーである肝細胞ミクロソーム電子伝達酵素群について、同一生物種(ブタ)由来の酵素群を用いてその電子伝達機能および分子間認識機構を解明することを目的としている。1.本マシーナリーの構成酵素のひとつであるブタ肝臓由来NADH-シトクロムb_5還元酵素(Pb5R)中に存在する、フラビン還元酵素ファミリーに共通に見られるフラビン結合モチーフ(RXY(T/S)+(T/S)モチーフ)アミノ酸残基置換変異体の電子伝達機能を解析して、本モチーフ中のArg^<63>側鎖正電荷およびSer^<99>側鎖水酸基が、FADのみならずNADHとの結合にも重要であること、および、Arg^<63>側鎖正電荷がシトクロムb_5への特異的電子伝達に関与していることを明らかにした。また、Thr^<66>置換変異体(T66A、T66S、T66V、T66N、及びT66D)のストップトフロー法による電子伝達機能の解析を行い、Thr^<66>の置換が電子伝達中に生じるFADセミキノン分子種とその酸化速度に影響を与え、酵素反応サイクルの律速段階を変化させることを見いだした。3.ブタ肝臓シトクロムP-450還元酵素可溶化ドメイン(PCPR)構造遺伝子のN末端領域への変異導入により、PCPRの大腸菌による大量発現に成功した。今後も引き続き、Pb5R変異体、ブタ肝臓シトクロムb_5-Pb5R複合体、Pb5-PCPR複合体の結晶化を進める。本研究ては集合型生物マシーテリーのひとつである肝細胞ミクロソーム電子伝達酵素群について、同一生物種(ブタ)由来の酵素群を用いてその電子伝達機能および構成酵素間の分子認識機構を解明することを目的としている。1.本マシーテリーの構成酵素のひとつであるブタ肝臓由来NADH-シトクロムb_5還元酵素(Pb5R)中のFAD近傍の保存性の高いアミノ酸残基を系統的に置換した変異体を作製し、その酵素機能変化を解析した。その結果、49位及びC末端近傍の静電的環境変化がNADH、および本酵素により特異的に還元されるシトクロムb_5との親和性を変化させること、変異導入によって引き起こされた還元型フラビン中間体の安定性の変化が電子伝達速度に影響を与えること、を明らかにした。作製した変異体のうちH49E及びH49Kについては、結晶化に成功し、X線結晶構造解析を進めている。また、フラビン還元酵素ファミリーに共通に見られるフラビン結合モチーフ(RXY(T,S)+(T,S)モチーフ)を構成するアミノ酸残基についても系統的改変と機能解析を進めている。これまでに、Pb5R中のFADのイソアロキサジン環のN5原子に近接して存在する保存性の高いThr^<66>置換変異体(T66A、T66S、及びT66V)のストップ・ト・フロー法による解析から、Thr^<66>側鎖水酸基がFADセミキノン中間体の制御に関与していることを見いだした。これらの変異体についても結晶化を試みている。2.既に大量発現系を構築したブタ肝臓シトクロムb_5(Pb5)に引き続き、Pb5からの電子受容体酵素のひとつであるフタ肝繊シトクロムP-450還元酵素(PCPR)の構造遺伝子をクローニングした。現在、大腸菌によるPCPRの大量発現系を構築中である。
泌尿器悪性腫瘍におけるルイス抗原の発現とその局在

細胞表面には糖鎖抗原が存在し、種々の臓器に存在している。その意義は明らかではないが、種々の疾患でその発現頻度が変化することが知られている。今回泌尿器系の悪性腫瘍において、ルイス抗原がどのように変化するかを免疫組織化学的に観察した。手術時に得られた腎および膀胱組織をただちにホルマリンにて固定した。これらの組織は各異型度の異なる悪性腫瘍の組織である。1次抗体としてのルイスモノクローナル抗体(a,b,x,y)を反応させ、2次抗体としてのABC法(アビチン・ビオチン)を行って検鏡した。腎組織では正常例にてはルイス-a,yは少数例に陽性であったが、ルイス-bおよびルイス-xでは半数以上に陽性所見が得られた。しかし、癌ではルイス抗体は1例も陽性にはならなかった。つぎに、電顕的免疫組織化学にて、ルイス-xの微細構造上の局在を観察した。方法は光顕組織と同様であるが、1次抗体反応、2次抗体反応後にオスミウム固定し、エポン包埋してから超薄切片を作製して電顕的観察を行った。その結果、ルイス-xは近位尿細管の微絨毛に存在していることが明らかとなった。また、腎細胞癌に出現する少数の微絨毛を観察したがルイス-xは陰性であった。このことは、癌化により、微絨毛が形態的機能的な変化も加わっているものと考えた。一方、膀胱では正常の移行上皮ではすべてのルイス抗原が存在した。しかし、移行上皮癌ではルイス-a,bはやや減少したが、ルイス-xは強陽性を示し、ルイス-yは陰性となった。その局在としてはルイス-bにおいて細胞質内にも認められ、これは細胞膜の陥入による取込みの部分としての小胞に相当する部位であった。以上より、膀胱の癌化に伴い、多くは減少、消失するがルイス-xが存在することより、膀胱癌の細胞膜には正常に近い機能が残っているものと推定した。細胞表面には糖鎖抗原が存在しており、種々の疾患でその発現頻度が変化することが確認されている。代表的なものに血液型抗原があり、ABO型に関しては組織学的検索がなされてきた。また、血液抗原の一つであるLewis抗原はその側鎖より、a,b,x,yの4系に分けられ、これと尿路悪性腫瘍との関係が研究されてきている。われわれは腎組織におけるLewis抗原の局在につき観察した。手術時に得られた正常腎組織および各gradeの腎細胞癌組織を用いた得られた組織はただちに凍結切片を作製した。同時に10%ホルマリンにて固定し、パラフィン包埋後、6μmの切片を作製した。これらを内因性ペルオキシダ-ゼを処理するため0.3%過酸化水素による処理を行っている。ついで1次抗体としてLewisモノクロ-ナル抗体を反応させ、2次抗体としてアビチン、ビオチン反応を行って検鏡した。結果として、クライオスタット標本およびホルマリン固定にて同様の染色体を得ることができた。正常腎組織においてはLewisーaは30例中3例に陽性、Lewisーyは1例のみであった。いずれも陽性反応は尿細管上皮にみられたが染色は軽度であった。一方、Lewisーbは43例中23例、Lewisーxは43例中30例に陽性反応を認めた。その局在は近位尿細管上皮に特異的に陽性反応がみられ、他にはみられなかった。

これらの染色性を強弱に分けてみると、高染色性では分泌型が多く、非分泌型では低染色性ないしは蔭性であり、このことからも組織中のLewis抗原は分泌、非分泌に大きく影響されていることが判明した。次に、癌組織26例を検討した。これらは分泌型、非分泌型を問わず一様に染色されなかった。すなわち、悪性化による組織のLewis抗原は形成されないか、または消失したものと考えた。細胞表面には糖鎖抗原が存在し、種々の臓器に存在している。その意義は明らかではないが、種々の疾患でその発現頻度が変化することが知られている。今回泌尿器系の悪性腫瘍において、ルイス抗原がどのように変化するかを免疫組織化学的に観察した。手術時に得られた腎および膀胱組織をただちにホルマリンにて固定した。これらの組織は各異型度の異なる悪性腫瘍の組織である。1次抗体としてのルイスモノクローナル抗体(a,b,x,y)を反応させ、2次抗体としてのABC法(アビチン・ビオチン)を行って検鏡した。腎組織では正常例にてはルイス-a,yは少数例に陽性であったが、ルイス-bおよびルイス-xでは半数以上に陽性所見が得られた。しかし,癌ではルイス抗体は1例も陽性にはならなかった。つぎに、電顕的免疫組織化学にて、ルイス-xの微細構造上の局在を観察した。方法は光顕組織と同様であるが、1次抗体反応、2次抗体反応後にオスミウム固定し、エポン包埋してから超薄切片を作製して電顕的観察を行った。その結果、ルイス-xは近位尿細管の微絨毛に存在していることが明らかとなった。また、腎細胞癌に出現する少数の微絨毛を観察したがルイス-xは陰性であった。このことは、癌化により、微絨毛が形態的機能的な変化も加わっているものと考えた。一方、膀胱では正常の移行上皮ではすべてのルイス抗原が存在した。しかし、移行上皮癌ではルイス-a,bはやや減少したが、ルイス-xは強陽性を示し、ルイス-yは陰性となった。その局在としてはルイス-bにおいて細胞質内にも認められ、これは細胞膜の陥入による取込みの部分としての小胞に相当する部位であった。以上より、膀胱の癌化に伴い、多くは減少、消失するがルイス-xが存在することより、膀胱癌の細胞膜には正常に近い機能が残っているものと推定した。
家族役割行動分類の作成と家族支援ツールとしての「役割バランスマップ」の開発

家族機能の維持・向上には、家族員の役割行動とその家族内バランスに注目する必要がある。そこで、本研究では、家族同心球環境理論を基盤とし、家族の役割をアセスメントできる家族支援ツールを作成することを目的とした。文献検討、半構成面接調査、質問紙調査から家族員の役割行動と家族の役割バランス、家族の役割に伴うストレスなどを明らかにし、家族員それぞれの役割行動の量と質、家族の役割バランスを可視化できるアセスメントツールを完成させた。本研究は,家族内外の広義の環境をアセスメントするために家族同心球環境モデルの視座から,現代家族の家族機能を規定する家族員の役割行動の内実を明らかにし,それらの分類を新たに作成することを目的としている.昨年度の文献検討と関連資料収集により,時代背景に合わせて役割行動の項目を追加,修正を実施した.さらに,以前からの課題であったこどもの生活行動についての項目を検討した.また,文献検討の結果,既存の研究では,家族システムユニット全体の役割を捉えているのではなく,家族員の療養管理や介護の役割,育児の役割のみに焦点が当てられているという課題が明らかとなった.そこで,今年度は,昨年度の役割行動についての項目を検証すること,家族システムユニット全体の役割を捉えることを目的とし,子育て中であり,家族員の療養管理や介護役割を担っている家族を対象とした半構成面接調査と質問紙調査を実施した.半構成面接調査については,長期入院を経験したこどもの家族(10家族16名)を対象として実施した.また,質問紙調査については,特別支援学校に通うこどもをもつ家族(90家族)を対象として実施し,35家族から回答を得た.これらの調査の結果,家族員の療養管理や介護役割も含め,それ以外に家族がどのような役割に負担を感じているのか,家族システムユニット全体の役割についての実態を調査し,その負担の原因は何であるのか,また,こどもの長期入院という家族イベントを経験した家族はどのように家族役割を調整しているのか,どのような家族内部・外部資源を使用しているのかについて明らかにし,家族役割のアセスメントツール開発の基盤資料とした.家族機能の維持・向上には、家族員の役割行動とその家族内バランスに注目する必要がある。本研究は,家族内外の広義の環境をアセスメントするために家族同心球環境モデルの視座から,現代家族の家族機能を規定する家族員の役割行動の内実を明らかにし,それらの分類を新たに作成することを目的としている.今年度は,次年度以降の調査のための準備段階として,国内外の家族の役割に関する文献検討,国内で実施されている生活時間に関する調査についての資料収集を実施した.“家族の役割"をキーワードに国内外の文献を検索し,抽出された文献を分析した結果,論文中に記述されている“家族の役割"の多くは,家族システムユニット全体としての役割を捉えているのではなく,疾患や障がいをもつ家族員の療養管理や介護の役割,育児役割のみに焦点が当てられており,それらの役割負担やストレス,ストレスコーピングについて調査されていた.それらの研究では,家族の役割分担や役割の調整が必要だという内容は考察されているが,看護職者が実際に家族内の役割を調整するような支援についての研究はなかった.以上より,家族システムユニット全体の役割の状況について看護職者がアセスメントするツールの必要性が確認された.次に,家族員の役割行動について検討するために,生活時間調査(NHK放送文化研究所),社会生活基本調査(総務省統計局),放課後の生活時間調査(Benesse教育研究開発センター)などの国内で実施されている生活時間に関する調査の資料を収集した.それらの調査を時系列で検討し,時代背景に合わせて追加・削除されている項目を明らかにした.さらに以前からの課題であったこどもの生活活動についても項目を追加した役割行動分類案を作成した.本年度は,昨年度実施した長期入院をしているこどもの家族を対象とした半構成面接調査の結果の結果の一部を2014年5月に35th International Association for Human Caring Conferenceで発表し,障がいをもつこどもの家族を対象とした質問紙調査の結果を2014年8月に日本家族看護学会第21回学術集会で発表し,それぞれ参加してる研究者と議論を深め,さらなる分析の方法や次の研究への示唆を得た.家族看護学初年度の達成度が当初の計画より遅れたことにより,全体的な達成度もやや遅れている.しかし,今年度は,その遅れを是正するために,計画を一部変更し,半構成面接調査と並行して質問紙調査のパイロットスタディを実施した.それにより,フィールド確保や質問紙内容の試作ができ,次に予定している大規模な質問紙調査がスムーズに実施できると考える.大規模な質問紙調査は次年度に繰越となり,今年度は実施に至っていない.昨年度は,国内外の文献検討から新しい役割行動分類案を作成し,あらゆる発達段階(こども期から老年期)にある家族員を対象とした半構成面接調査を実施することで役割行動分類案を洗練する予定であったが,年度の途中に休職者が出たため,教育に関わるエフォートが予想外に多くなり,計画通りに研究を進めるための時間が確保できなかった.

したがって,今年度は,国内外の文献検討から新しい役割行動分類案を作成したが,半構成面接調査まで至っていない.今年度までの結果から作成した家族役割のアセスメントシート案を用い,家族員の役割行動のバランスと家族機能との関係をみるために大規模な質問紙調査を実施する予定である.質問紙調査の結果から,家族機能を規定する家族の役割行動のバランスをアセスメントツールを完成させる.当初の計画では,あらゆる発達段階(こども期から老年期)にある家族を対象とする予定であったが,次年度は最終年度であり,研究遂行の現実可能性と研究の質を担保するために,対象を広げることより,研究計画時に課題としていたこどもの役割を含むことのできるこども期家族に対象を限定するなど,研究の進捗状況に合わせて修正案を検討をする予定である.次年度以降は,今年度文献検討等で作成した新しい役割行動分類案を洗練させるために,あらゆる発達段階(こども期から老年期)にある家族員を対象とした半構成面接調査を実施する.半構成面接調査の結果をうけて修正した役割行動分類を使用して,家族員間の役割行動のバランスと家族機能との関係をみるために質問紙を開発し,大規模な質問紙質問紙調査を実施する予定である.今年度は研究計画よりもやや遅れており,予定していた大規模な質問紙調査が実施できなかった.そのため,調査で使用する予定であった国内旅費,印刷費,郵送費予算が執行できていないため,研究費の80,158円が余剰となっている.次年度は,大規模な質問紙調査を実施する予定であるため,国内旅費,印刷費,郵送費などに研究費を使う予定である.また,次年度は最終年度であるため,研究結果を発表するための旅費や論文投稿に係る費用を使う予定である.今年度は研究計画よりもやや遅れており,新しい役割行動分類案を洗練するための半構成面接調査が実施できなかった.そのため,調査で使用する予定であった国内旅費予算が執行できていないため,研究費の29,315円が余剰となっている.次年度は,半構成面接調査も含め,大規模な質問紙調査を実施するため,印刷料や郵送料,記録メディア,分析のために使用するソフトウエアなどの消耗品に研究費を使う予定である.また,今年度の研究成果を国際学会で発表するために渡米のための旅費を使う予定である.