hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
新規生活習慣病改善転写因子TFE3が骨格筋の代謝および運動能に与える影響の検討

そこで本年度はこのTgマウスの糖代謝について詳細な検討を行った。この結果、ベスラインの血糖やインスリン値は野生型と差はないものの、インスリン負荷試験(ITT)において、Tgマウスのインスリン感受性は野生型と比較して有意に高く、さらに1ヶ月の運動トレーニングを行うことによりインスリンの感受性は野生型以上に増強されることが明らかとなった。この要因として、先述のHK2やGYS1などの遺伝子発現に加え、Tgマウスでは、運動トレーニング後にInsulin receptor Substrate-2(IRS2)の遺伝子発現が上昇することが挙げられた。以上の結果より、骨格筋における転写因子TFE3は糖代謝を改善し、さらに運動耐容能を増強する作用を併せ持つことが明らかとなった。これらの効果は生活習慣病への治療に有効的な効果をもたらす可能性が期待される。さらに、既存の報告においてTFE3は、肝細胞において蛋白合成を亢進させ、細胞を肥大させることが報告されていることから、TFE3が筋肥大に与える影響について評価を行った。その結果、Tgマウスは野生型と比較しても筋重量に差はなく、運動負荷をかけても有意な差は認められなかった。しかしながら人為的に筋組織を挫滅し、その再生過程を評価したところ、Tgマウスではわずかながら再生筋が肥大を示す傾向を認めた。今後これらの点ついてさらに検討を進めていく予定である。
若年性関節リウマチの分子生物学的検討とTNF geneおよびHLAに関する研究

若年性関節リウマチ(以下JRA)の日本人患者111例(全身型50例、少関節型29例、多関節型32例)の末梢血よりDNAを抽出し、PCR法およびSSOP法の手法を用いて、DNAタイピングをクラスI(A遺伝子座)領域およびクラスII(DR,DQ,DP遺伝子座)領域について行なった。全身型JRAは成人型RAと同様にDRB1^*0405との相関を認め、この相関はステロイド剤の全身投与例や、慢性関節症状をきたす難治例により強かった。少関節型JRAは、A^*02との相関を認めたが、更に発症年齢により2群に分けてみると、6歳以上発症群では、DRB1^*0401との正の相関を認め、A^*02との共在でより強い相関を示した。これに対して、6歳未満発症群では、DQA1^*0503との相関がみられ、この相関も同様にA^*02との共在でより強くなることが解った。一方、多関節型JRAではDRB1^*0405の頻度が増加していた。以上より、HLAによる疾患感受性の遺伝的制御という観点から、全身型JRAで特に関節症状の強いもの及び多関節型JRAの発症に関わる遺伝要因は、成人型RAに類似するのに対し、少関節型JRAではこれらとは異なり、更に発症年齢によっても異なると考えられた。今後、同様の手法を用いたTNF遺伝子(特にプロモーター領域)に対する検討および、患者単核球のTNF-α産生能を測定し、JRAの発症メカニズムにおけるTNFの関与を明らかにして行きたい。
理科における「読解力」の育成のための学習指導のあり方

1研究目的PISA調査において学力では国際的に上位であるが,読解力においては低位傾向になっていることが話題となって久しい。本研究は,理科という教科を通して,「読解力」をつけるにはどうすればよいのかを中学校理科の実践を通して明らかにしていく。「読解力」のとらえ「読解力」とは,「自らの目標を達成するために情報(文章や資料)などを理解し,利用,熟考する能力と」と捉えられている。そこで理科における「読解力」を「自然事象を学習や日常と関連付けて解釈し,観察,実験に基づいて熟考し,科学的な知識を活用しながら自分の考えを表現する力」とし,研究を行っていく。2研究方法「読解力」をつけるには,各単元につけたい力を明確にし,それについてどう考えるかを毎時間明らかにしながら学習していくことが,単元全体をつらぬく力につながると考えた。単元指導計画を作成するにあたって,どの時間の力がどの時間につながっているのかを意識して作成したのが,単元構想図である。単元構想図を作成する上で大切にしたことは,(1)既習学習や生活経験を書く。(2)各時間においては,生徒で大切にしたい意識を書く。(3)単元でつけたい力を書く。(動物の生活と種類の場合,「多様性と共通性」「環境への適応」「巧みなっくりと仕組み」「生命活動の維持」「相互関連」「総合的な見方や考え方」)(4)他教科で関連する内容のものを→で入れる。(5)どの時間の生徒の意識がどの時間の生徒の意識につながるのかを→で結ぶ。以上の5点である。3研究成果単元前と単元後に生徒の授業後の感想から生徒がどのくらい日常や単元全体を関連付けて考えているか生徒の振り返りから調べたところ,既習学習や単元でつけたい力を関わらせて,単元を仕組み,授業を改善していくことで,全員の生徒が意識してまとめることができるようになった。また,まとめに書く文章も1000文字以上の長い言葉で書くことができるようになった。本研究では,理科でつけたい「読解力」を定義し,単元指導計画や学習活動の指導,集団の育成を行うことで,生徒のまとめ方や発言がかわったことが明らかになった。以上の5点である。
定量的バイサルファイト・シーケンシング法の開発

DNAにおけるシトシンのメチル化は発癌の一つのシグナルと見なされ、その検出定量は、発癌を予測する遺伝子診断技術へと応用展開が期待されている。メチル化シトシンの検出法は、バイサルファイト・シーケンシング法が一般的であるが、DNAを高温、強酸性条件下で、高濃度のバイサルファイト試薬と反応させるために起こる、最終的なメチル化の定量性が問題とされている。本研究では、DNAを低温、弱酸性、低濃度の試薬の存在下で反応させることによって、メチル化の定量性を改善しようと試みた。DNA配列の変化を伴うことなく後天的なDNA修飾に起因するエピジェネティクス的な遺伝子発現制御機構の研究が急速に進められており、癌などの疾患に対する診断や治療への展開が待望されている。癌抑制遺伝子を不活性化する重要な機構として、遺伝子の転写調節領域に多く存在するCpGアイランドのシトシンのメチル化が知られている。シトシンのメチル化は発癌の一つのシグナルと見なされ、その検出定量は、発癌を予測する遺伝子診断技術へと応用展開が期待される。メチル化シトシンの検出法は、バイサルファイト・シーケンシング法が一般的である。バイサルファイト法では、反応率を上げるために、ゲノムDNA一本鎖に融解した後、高温、酸性条件下、高濃度の亜硫酸水素ナトリウムと反応させる必要がある。その結果、反応後に回収されるDNA量が極端に低下するため、その増幅産物で評価したメチル化の割合がゲノムのメチル化を定量的に反映しているかどうかが問題視されている。本研究では、シトシン塩基のみと温和な条件下で反応が進行する試薬や触媒試薬の探索を行うことにより、バイサルファイト・シーケンシング法における、定量性を格段に向上させる方法の開発を目指している。DNAオリゴマー中のシトシンとバイサルファイトの反応時に、ヒドロキシルアミンの劇的な加速触媒効果を確認した。その後、コバルトイオン(二価)存在下での過酸化ベンゾイルとの反応により、シトシンのオキシムスルポネート誘導体を経由して、比較的温和な反応条件下でウラシルまで導けることを発見した。その後、コバルトイオン(二価)存在下での過酸化ベンゾイルとの反応により、シトシンのオキシムスルホネート誘導体を経由して、比較的温和な反応条件下でウラシルまで導けることを発見した。
微小管機能を制御する超分子形成とリガンド機能の解析

本研究は,微小管機能を制御する超分子形成について,チューブリン・阻害剤複合体の構造を解析して微小管機能を解明すること,作用機作に基づいた分子設計により新規生理活性物質の創製を図ることを目的としている.本年度は,リゾキシン/メイタンシン部位リガンドであるウスチロキシンAの接触還元により,最単純構造でしかも強い活性を持つウスチロキシンDに容易に変換できること,Dのエチルエステルも強い活性を保持していることを見出した.更に,Dのエチルエステルからの化学変換により,NHCH_3基およびフェノール性OH基のメチル化で活性を失われることを明らかにした.新規コルヒチン部位リガンドと報告されているキュラシンAの,絶対構造の推定と活性発現に必要な構造要因の解明を目指し,3個の不斉中心を含むメチルシクロプロパンチアゾリン部分の立体異性体を合成して,施光度とNMRデーターから天然配置を推定したが,その後の報告と一致した.しかし,これらは全て活性がない.現在,全合成が進行中であるが,その過程で,メチルシクロプロパンカルボン酸のキラル合成の有用な方法を考案した.海綿から得たアレナスタチンAは,強い微小管蛋白重合阻害活性を示した(IC_<50>;2.8μM).これのチューブリンへの結合はコルヒチンとは全く競合せず,ビンブラスチンで阻害されるがその程度は弱い.リゾキシンにより拮抗的に阻害される.日本産イチイから単離された5個の新規タキサン化合物に,タキソ-ルと同様な,Ca^<2+>による微小管脱重合を阻害する活性が認められた.これらが,タキソ-ルの抗腫瘍作用に重要とされているオキセタン環やアシル側鎖を有しないことは興味深い.本研究は,微小管機能を制御する超分子形成について,チューブリン・阻害剤複合体の構造を解析して微小管機能を解明すること,作用機作に基づいた分子設計により新規生理活性物質の創製を図ることを目的としている.本年度は,リゾキシン/メイタンシン部位リガンドであるウスチロキシンAの接触還元により,最単純構造でしかも強い活性を持つウスチロキシンDに容易に変換できること,Dのエチルエステルも強い活性を保持していることを見出した.更に,Dのエチルエステルからの化学変換により,NHCH_3基およびフェノール性OH基のメチル化で活性を失われることを明らかにした.新規コルヒチン部位リガンドと報告されているキュラシンAの,絶対構造の推定と活性発現に必要な構造要因の解明を目指し,3個の不斉中心を含むメチルシクロプロパンチアゾリン部分の立体異性体を合成して,施光度とNMRデーターから天然配置を推定したが,その後の報告と一致した.しかし,これらは全て活性がない.現在,全合成が進行中であるが,その過程で,メチルシクロプロパンカルボン酸のキラル合成の有用な方法を考案した.海綿から得たアレナスタチンAは,強い微小管蛋白重合阻害活性を示した(IC_<50>;2.8μM).これのチューブリンへの結合はコルヒチンとは全く競合せず,ビンブラスチンで阻害されるがその程度は弱い.リゾキシンにより拮抗的に阻害される.日本産イチイから単離された5個の新規タキサン化合物に,タキソ-ルと同様な,Ca^<2+>による微小管脱重合を阻害する活性が認められた.これらが,タキソ-ルの抗腫瘍作用に重要とされているオキセタン環やアシル側鎖を有しないことは興味深い.
非進学校高校生の地元地域に着目した学校から職業への移行に関する研究

本研究では、教育的課題を抱える非進学校高校生の進路形成に着目し、産業構造やライフスタイルなどといった地域の特性が進路形成とどのように関連しているのか検討するために、生徒調査と教員調査等から分析を行った。その結果、商業高校では進路の多様化が進んでいるが、地域特性によりその度合いに濃淡があることがわかった。そうした地域の特性は、生徒の進路形成に対し学校を介して影響を与えることもあれば、直接的に生徒の進路展望に影響することもある。それゆえ、これまで看過されてきた地元地域の社会的文脈に着目することにより、進路指導方法の改善が促進される可能性を示唆した。本研究は、教育的課題を抱える非進学校高校生がどのように進路形成し学校から職業へ移行していくのかを明らかにすることにある。一般的に学校から職業への移行は、学校における選抜・配分、社会化、正当化といった学校の社会的機能をベースに社会との対話により紡がれていく。それゆえ、高校生の進路形成を検討するためには、生徒個々の内的世界に加え、教師や生徒を取り巻く地域の社会的文脈にも目を向ける必要がある。平成28年度は、第1に、以前に行った工業科教師や生徒のインタビューデータとともに、管理職経験のある教師など複数の教師データを加えて再検討した。そこでの検討から、工業高校における社会化は、教育の市場化を背景とする教育改革によりカリキュラムトラックの維持が困難になりつつあることがわかった。以上の成果については、学外での研究会で報告した。第2に、商業高校卒業生に対しインタビュー調査を行い、高校時代の学習生活と職業とのレリヴァンスについて検討した。その結果、商業高校内部においても社会化の分化が生じており、多様な商業高校からの移行モデルの存在がわかった。第3に、非進学校が点在する地域の青年団を地域社会における移行についてインタビューを行った。その結果、青年団における高校生と大人とのかかわりは、地元に残って職業に就くロールモデルと接触できる場となっており、日頃の活動を通じて地元の文脈に沿った移行の方法が流通していた。当初予定していた高校生の量的調査については、本プロジェクトを進めていくなか、調査対象者を絞った質的調査の方が探索的に検討できると考え、対象を工業高校と商業高校の教師や生徒に限定して調査を行った。また、人事担当者調査については、先行調査から学校との実績関係による就職が必ずしも一般的ではなくなってきている状況を鑑み、地域社会における高校生の進路形成環境に着目し、青年団の調査を行った。これらの調査はすでに基本データの収集を終了し、次年度の成果発表に向けた見通しをつけることができた。その知見の一部は、海外における学会で報告できる見通しもついた。平成29年度は、全国的な視座から非進学校の進路問題を明らかにするため、質問紙を作成し全ての商業高校・工業高校(合計約1100校)を対象にアンケート調査を行った。回収後は、データを電子データ化するために入力作業を行い、統計処理のソフトウエアを使用して単純集計、クロス集計、T検定による平均値の比較などにより検討を行った。その結果、商業高校においては、進路状況によって重視する教育活動に違いがあり、同じようなカリキュラムの学科であっても、地域の高等教育機関の分布状況や地理的な要因により進路の形成過程に差異が生じる傾向が見られ、地域特性や教育課程が学校の指導(進路指導・生徒指導)との間に関連性があることがわかった。さらに、地域特性に関してインテンシブな分析を行うため、祭礼を通じて地域の特徴が表出しやすいと考えられる、ある地域の青年団を対象としたフィールドワーク調査のデータ分析を行った。昨年度の成果を踏まえ、詳細に青年団に所属する若者(10名)のインタビューでデータを読み解いたところ、彼らは地域の祭礼行事に関わる大人たちとの交流を通じて、高校での授業への取り組み方や部活動の参加などの学校生活に対して、地元の社会的文脈に沿った行動規範や価値を認識していることがわかった。それゆえ本調査からは、地域の文化的側面に着目した高校生研究の可能性とそれを変数に加える必要性を示唆することができた。以上の成果の一部は、中国四国教育学会、台湾教育社会学会での学会発表をはじめ、学会機関紙や学内紀要において報告した。今年度の調査・検討を続行するとともに、積極的な学会発表、論文化を予定している。第1に、工業高校における移行調査をさらに進め、その調査結果を海外の学会(台湾教育社会学会)で発表する。第2に、商業高校調査では協力者をさらに募集するとともに資料収集を行い、さまざまな調査結果を他の職業高校と比較することで、そこでの移行プロセスを整理し報告する。第3に、地元地域における移行調査についても継続して行い、調査結果を学外の研究会や学会発表で報告する。29年度が最終年度であるため、記入しない。教育社会学29年度が最終年度であるため、記入しない。
14族金属テルリドを利用する新しい有機分子変換法

本研究では、14族金属とテルル元素との動的な結合を利用する新しい反応試剤を設計・合成することを目的として研究を行っている。さらに、14族金属テルリドのユニークな反応性から生まれる反応生成物を利用した有機小分子の新しい構築法の開発を図っている。本年度は、シリルテルリドと反応する基質の設計や、シリルテルリドを用いた反応により得られた生成物の変換反応について重点的に検討を行ない、主に以下の2点を明らかにした。1.2,3-ジ置換インドールの合成これまでの研究により、トリエトキシシリルフェニルテルリドを用いたイミンとイソニトリルとのラジカルカップリング反応を報告している。イソニトリル基質として2-アルケニルフェニルイソニトリルを用いることで、2,3-ジアルキル置換インドールを高収率で合成できることを明らかにした。2.立体選択的な多置換アルケン合成トリメチルシリルフェニルテルリドとカルボニル化合物とアルケンの反応により得られるビニルテルリド構造を持つシリル化されたアリルアルコールに対し、テルル-金属交換反応を行ったところ、Z-体のビニルシランのみが単一の立体異性体として得られた。本反応の最大の特徴は、生成物の立体化学が出発基質の立体化学に依存していない点であり、E-体およびZ-体いずれのビニルテルリドを用いてもZ-体の生成物のみが得られた。さらに、ビニルシランからアルケンの立体化学を保ったまま様々な炭素置換基へと返還できることを明らかにした。金属とヘテロ元素との動的な結合を利用して新しい反応試剤を設計・合成することは、新しい反応開発の基礎となる重要な課題である。本研究では、シリルテルリドを中心とした14族金属テルリドと有機分子との反応性に着目して、ラジカルカップリング反応を中心に新しい有機分子変換法を開発すると共に、カップリング生成物の有効な変換反応についても検討を行った。トリメチルシリルフェニルテルリド、カルボニル化合物、およびアルキンとを混ぜて加熱することで、多成分ラジカルカップリング反応が起こり、ビニルテルル構造を持つシリルオキシ基を持つアリルアルコール誘導体が得られることを最近見出している。この生成物のビニルテルル官能基においてテルル-金属(主にリチウム)交換を行ったところ、ケイ素が酸素からビニル炭素へと転移を起こし、アリルアルコール構造を持つビニルシランが高収率かつ立体選択的にで得られることを見出した。出発ビニルテルリドのオレフィンの幾何異性によらず、単一の立体化学を持つ3置換および4置換のビニルシランが得られた。この反応の機構について解明したところ、テルル-金属交換に引き続くアルケンの異性化において、立体特異的にビニル金属種が分子内でケイ素を捕捉することで、生成物が得られることを明らかにした。さらに、このビニルシランを武田カップリングを用いて変換を行うことで、ビニルシランの立体化学を保ったまま炭素置換された多置換アルケンが立体選択的に合成できることを明らかにした。この方法は、現在合成的に困難な課題である、立体選択的多置換アルケンの合成法として有用であると考えている。
エピポーラ幾何による両眼視、運動視と物体認識の諸問題の統一

本研究は、人間の視覚において重要な両眼視、運動視、物体認識などの多重画像の諸問題をエピポーラ幾何を通じて統一し、共通の枠組みで扱うことを目的とする。研究助成期間中は、画像からエピポーラ方程式を抽出するアルゴリズム、それを用いた画像間対応アルゴリズムを完成させた。多重画像は、両眼で得られたものも、異なる時間(場所)で得られたものも、画像間に相違がある。即ち、同じ世界でも写っている画像は微妙に異なってしまう。その違いを用いて、三次元世界を二次元の画像から知覚することができると考えられているのである。ここで問題となるのは、異なる画像において、どの点とどの点が3次元世界の同じ点に対応しているのかということである。そして、この対応問題は、3次元知覚に不可欠とされている。従来は、両眼視、運動視と物体認識では、別々のやり方で対応をとっていると一般的にされていた。しかし、本研究で示すように、どの多重画像の問題でもエピポーラ幾何を通じて、共通の枠組みで扱うことができる。これにより、問題が簡略化され、定式化も容易になり、更に対応の高速化も可能となる。本研究は、世界においても初めての試みであり、研究の成果は本として出版されている。
Sirtuin遺伝子の抗老化作用による血管障害抑制機構の解明

今回、我々は実際臨床応用されているシロスタゾールやスタチンといった薬剤の投与により血管内皮細胞の老化を抑制出来ることを確認した。またSirt1あるいはeNOSの発現上昇が血管内皮老化抑制に大きな役割を演じており、それに伴うミトコンドリアの産生増加およびMnSODの発現上昇が重要であることを確認した。血管保護作用を有する薬剤(脂質低下薬、レズベラトロール、エストロゲンなどの性ホルモン)を細胞に加えた際のSirt1-eNOSによるそのメカニズム関与について検討を行った。PDE3阻害剤(シロスタゾール)、レズベラトロール、脂質低下薬(アトルバスタチン、ピタバスタチン)の血管老化抑制作用を確認した。またこれらの薬剤がeNOSの活性を優位に上昇させることもすでにNOS activation assayにて確認した。ヒト血管内皮細胞で、これら薬剤の処理によりSirt1、eNOSの発現が上昇、活性化し、血管壁細胞老化、障害を抑制しうることを確認した。薬剤による細胞老化に対する影響は、増殖能、形態学的変化、senescence-associated-βgalactosidaseの染色およびウェスタンブロットにより検討した。Sirt1またin vivoの系としてはパラコート投与マウスを用いた。パラコート25mg/kg腹腔内投与による大動脈血管内皮細胞老化をこれら薬剤の強制経口投与により抑制できることも確認した。これら検体についてSirt1、eNOS発現について組織免疫学的検討も行った。引き続き、Sirt1ノックアウトマウスで、血管老化が亢進されること、そしてeNOSノックアウトマウスではそれらの影響が軽減されることを来年度検討していく。またヒトの検体についても、これらの薬剤投与によるSirt1の発現の影響を検討していく予定である。血管保護作用を有する薬剤(降圧薬、脂質低下薬、インスリン抵抗改善薬、レズベラトロール、エストロゲンなどの性ホルモン、およびその誘導体(SERM)、骨粗鬆症治療薬)を細胞に加えた際のSirt1-eNOSによるそのメカニズム関与について検討を行った。すでにPDE3阻害剤(シロスタゾール)によるSirt1-eNOSの効果について確認し報告した(Ota H et al.ATVB 2008, JACC 2009)。脂質低下薬(アトルバスタチン、ピタバスタチン)の血管老化抑制作用も確認し報告した(Ota H et al.ATVB 2010)。具体的には、ヒト血管内皮細胞において、これらの薬剤がeNOSの活性を優位に上昇させること、またその活性化、発現上昇によりSirt1の発現が上昇、血管壁細胞老化、障害を抑制しえることを確認した。薬剤による細胞老化に対する影響は、増殖能、形態学的変化、senescence-associated-βgalactosidaseの染色およびウェスタンブロットを用いている。in vivoの系としては老化研究で汎用されているパラコート投与マウスやSTZ糖尿病マウスを用いて示した。更にはSirt1の発現上昇が、ミトコンドリアの産生増加を促し、抗酸化ストレス作用をしめすカタラーゼやSODの発現上昇をもたらすことが示せた。Sitr1-eNOSを介した抗老化メカニズムの関与について、PDE3阻害剤(シロスタゾール)、抗高脂血症薬(アトルバスタチン)やレズベラトロールについては確認できた。今後さらに他の薬剤についても検討中である。今回の我々の研究により、高齢者で重要な位置を占める循環器疾患、つまり血管老化、血管病変への予防、治療へとアプローチを進めていく過程の中で、血管障害、細胞老化という観点からのSirt1-eNOSを標的とした検討により、疾患の予防、治療法や普遍的な老化メカニズムを解明するためにも非常に重要であったといえる。
階層ベイズ法による人間行動のモデリング

本研究では多様な人間行動に含まれる潜在因子に着目した統計モデリング法に取り組んだ.本研究で構築した枠組みは,個別の行動データを別個にモデル化する従来のものとは異なり,複数人の行動データを俯瞰し,それらの関係性に着目して扱うものである.本研究ではディリクレ過程を利用しこの考えに沿った定式化を行い,実センサデータへの適用により枠組みの有効性を確認した.さらに,時々刻々と増加するセンサデータへの適用を踏まえた高速化アルゴリズムへ展開した.本研究では多様な人間行動に含まれる潜在因子に着目した統計モデリング法に取り組んだ.本研究で構築した枠組みは,個別の行動データを別個にモデル化する従来のものとは異なり,複数人の行動データを俯瞰し,それらの関係性に着目して扱うものである.本研究ではディリクレ過程を利用しこの考えに沿った定式化を行い,実センサデータへの適用により枠組みの有効性を確認した.さらに,時々刻々と増加するセンサデータへの適用を踏まえた高速化アルゴリズムへ展開した.(1)人間行動をプロファイル化する階層ベイズモデルのプロトタイプの実現:多様な状況での人間行動データを,個別ではなく同時に扱うグラフィカルモデルを構築した.多様な状況に動的に対応可能なベイズアプローチとして,ディリクレ過程に着目し定式化した.本年度構築したアルゴリズムの適用事例として,行動取得環境内で計測した人の生活行動を対象として,簡易なセンサでの実現を前提に,各日時の活動量を表現する統計モデルとして構築した.この統計モデルは,状況に応じて得られる最適パラメータが異なるが,本研究で構築したモデルは個別の状況をカテゴリ化する枠組みとして活動量モデルをクラスタ化するアルゴリズムである.構築した枠組みでは,従来問題とされてきたクラスタ数の自動調整を行えることが利点の一つとして挙げられる.また,クラスタリングの妥当性を検証するための高速なデータ可視化アルゴリズムを構築し,有効性を検証した.(2)行動モデリングの実証プラットフォームの構築:行動データのモデリングの検証には精密なリファレンス・アノテーションデータ不可欠である.本研究では検証用のデータ蓄積環境の構築によりこれに応ずる.本年度は,研究代表者の所属する研究室で既に開発されている行動計測装置を発展させ,実証プラットフォームの基盤となる無線センサ計測環境のプロトタイプを試作した.計測手段として焦電センサ・超音波センサを利用し,人間の活動量を計測するものであり,通信モジュールとしては設置場所の汎用性を高めるため簡易な通信技術であるZigBeeプロトコルを利用している.平成20年度に開発した人間行動モデリング手法のプロトタイプをベースに,人間行動のレスポンスを記述する回帰型の計算手法を構築した.これにより,生活パターンの推定だけでなく適用可能な対象が行動予測などへ展開できることを確認した.次に,行動モデリング計算手法の効率化・安定化・並列化を行った.平成20年度で開発したプロトタイプ計算法はモデルの定式化の妥当性検証を目的とするものであったが,今年度は構築した人間行動モデリング手法の計算効率性の向上に努めた.具体的には,大量データからのモデリングを考慮し,計算の実質に不要な特性として,事前にデータを量子化しておくことで,カテゴリ割り当てなどの計算の効率性を大幅に高める手法を開発した.データの量子化に加え,今年度より導入を行った変分近似アルゴリズムの適用により,平成20年度に開発した手法と比べ,約千倍程度の速度で計算が可能であることを確認し,大量データへの展開を容易なものとした.また,因子検出を動的に行うためのオンライン逐次学習アルゴリズムとして,十分統計量のみに基づくカテゴリ推定とパラメータ更新手法を開発し,実人間行動データにて,その有効性を検証した.上記のモデルをベースに,生活行動データにおける人間行動モデリングの検証も行った.平成20年度に開発中の計測環境を整備し,人間の活動量を計測しモデル化を行った.特にディリクレ過程に基づく効率的な人間行動モデモデリング手法により,週ごとの特定イベントの動的検出を実現し,得られた因子からのプロファイル技術の応用可能性を検討した.
生合成された蛋白質が構造を形成する「折り畳み」過程において、水分子の蛋白質鎖からの排出(脱水和)というダイナミクスが遷移状態の形成および遷移状態からの天然状態へ構造変化をする際に重要な働きをすることが計算機実験や速度論的実験から推測されている。しかし、水分子を分光学的に捉えることは非常に困難であり、脱水和の実験的証拠というのは限られてきた。平成17年度には、蛋白質の水和状態が部分モル体積に反映されることに着目し、反応速度の圧力依存性から得られる活性化体積を元に、折り畳み遷移状態が形成される際の脱水和をより直接的に検討できないか試みた。種々の圧力下での折り畳み反応追跡するために、光応答性還元剤であるNADHから酸化型チトクロムc`への電子移動反応を折り畳み反応のトリガーとして利用し、還元型チトクロムcの折り畳み反応を3.24.0Mグアニジン塩酸塩存在下、12000barの圧力下で追跡しました。その結果、グアニジン塩酸塩非存在下、常圧下における活性化体積は-14±8cm^3・mol^<-1>と求められた。この負の体積変化は疎水性基からの脱水和を直接的に示す実験結果である。本年度は、カリフォルニア工科大学へ渡航し、異なる形を持つ蛋白質について、常圧下での測定を行った。その結果、折り畳み過程における蛋白質の構造は単一なものではなく、複数の経路を通って折り畳むことが明らかとなった。また、異なる部分は異なる時間スケールをもって最終的な構造を形成していくことがわかった。この際、水分子が排出されすぎてしまうと、効率的な折り畳みができなくなると考えられた。蛋白質が折り畳む過程において、水分子に蛋白質鎖からの排出(脱水和)というダイナミクスが遷移状態の形成及び遷移状態からの天然状態へ構造変化をする際に重要な働きをすることが計算機実験や速度論的実験から推測されている。そこで、蛋白質の水和状態が部分モル体積に反映されることに着目し、反応速度の圧力依存性から得られる活性化体積を元に、折り畳み遷移状態が形成される際の脱水和をより直接的に検討できないか試みた。種々の圧力下での折り畳み反応追跡するために、光応答性還元剤であるNADHから酸化型チトクロムcへの電子移動反応を折り畳み反応のトリガーとして利用し、還元型チトクロムcの折り畳み反応を3.24.0Mグアニジン塩酸塩存在下、12000barの圧力下で追跡しました。その結果、グアニジン塩酸塩非存在下、常圧下における活性化体積は-14±8cm^2・mol^<-1>と求められた。この脱水和が遷移状態の形成においてどのような役割を果たしているのかを考察するために、遷移状態の熱力学的な特徴をあらわす活性化パラメータを検討すると、同じ折り畳み過程について、正の活性化エントロピーが報告されている。露出表面積の減少によって蛋白質鎖のエントロピーは減少しているにもかかわらず、正の活性化エントロピーが観察されるということは、蛋白質鎖に水和していた水分子が溶媒へ排出されたために溶媒のエントロピーが大きくなった結果だと推測された。つまり、折り畳み過程における脱水和というダイナミクスによって、構造形成に伴う蛋白質鎖のエントロピー減少が補填され、その結果、遷移エネルギー障壁が低くなり、効率的な折り畳みが実現されていると考えられた。
補因子組込型人工ラジカル金属酵素の合理的創出

近年、種々の酵素やタンパク質分子内で、従来の翻訳後修飾(リン酸化等)の枠組みを超える化学的に高度な修飾を受けたアミノ酸側鎖が相次いで発見されてきた(Chem. Biol., 7, 1R159 (2000))。中でも芳香族アミノ酸から生じる特殊な側鎖は配位子や補欠分子族(Protein-derived cofactor (PDC))として機能中枢を司るものが多く、その機能は多岐にわたる。TyrやTrpから派生したPDCはキノン型の求電子的な性質を始めとし、他の有機補因子にはない物理化学・触媒化学的に稀有な性質を示すことが分かっている。そこで、本研究では従来の酵素で達成できない化学反応触媒を志向したCPDCを補因子とする高活性なラジカル酵素の創出に挑戦し、この過程において高難度C-H結合の活性化やC-C結合形成における新規ケミストリーを発見を目指し、計画を実行した。具体的には、小さな分子量を持つキュピンタンパク質を土台とし様々な位置に導入したチロシンとシステイン間の架橋形成が可能であることを示した。すでに、3種類の変異体において、形成を結晶構造解析によって確認し、近傍のアミノ酸に変異導入することによって、その形成が促進されることも確認した。最も架橋形成が進行する変異体では、さらに、結晶を還元剤で処理することによって、さらなる酸化反応が進行することを確認し、新規PDCの形成を確認するとともに、この手法の有用性を明らかとした。申請者らはProtein Databaseから小型(10kDa)で金属結合部位があり、かつ基質結合場を備えたいくつかの土台タンパク質候補の中から、double stranded β-helixモチーフを持つキュピンファミリータンパク質を用いてきた。3つのヒスチジンからなる金属結合部位に鉄や銅を接合し、Tyrを結合部位から距離を変えて変異導入した(残基番号:Ile49, Ile60, Cys106, Ile108)。そのうちのI60Y, C106Y, I108Y変異体ではTyr-Cys結合を形成することを、UV-visスペクトルやESR、共鳴ラマンスペクトルおよび質量分析、X線構造解析によって確認した。また、さらに、結晶を還元剤で処理することによって、さらに酸化させることに成功し、天然では見られたことのないCPDC構築の可能性を見出した。今後は還元剤での処理条件を最適化し、天然にはないCPDC形成を進める。すでに、結晶構造解析では余分な電子密度が観測されており、システイニルチロシルキノンの形成が観測された。さらなる条件検討により、溶液状態でもこの新規PDCの形成を達成する計画である。また、このキノンへの求核付加反応を狙い、近傍にCys, His (Lys, Tyr)などの求核性アミノ酸を導入した変異体を作製し、架橋構造形成の有無を確認する。また、近傍にTyrやMetを追加導入し、別のCPDCの形成を試していく。上記方法を遂行する際に困難が生じた場合は、同様のキュピンタンパク質のホモログに加え、小型でかつ安定であるタンパク質モチーフ、(partly opened β-barrelモチーフのVOCタンパク質(PDB: 3rmu))を選択し順次、上記方法を試していく。

今後は還元剤での処理条件を最適化し、天然にはないCPDC形成を進める。すでに、結晶構造解析では余分な電子密度が観測されており、システイニルチロシルキノンの形成が観測された。さらなる条件検討により、溶液状態でもこの新規PDCの形成を達成する計画である。また、このキノンへの求核付加反応を狙い、近傍にCys, His (Lys, Tyr)などの求核性アミノ酸を導入した変異体を作製し、架橋構造形成の有無を確認する。また、近傍にTyrやMetを追加導入し、別のCPDCの形成を試していく。上記方法を遂行する際に困難が生じた場合は、同様のキュピンタンパク質のホモログに加え、小型でかつ安定であるタンパク質モチーフ、(partly opened β-barrelモチーフのVOCタンパク質(PDB: 3rmu))を選択し順次、上記方法を試していく。
金属間相乗作用を活かした多核金属クラスター反応場の創出

本研究は高難度触媒反応の達成を目指して、特異な反応場における触媒反応の開発を進め、従来の均一系触媒(単核金属錯体触媒)と質的に異なる「多核金属クラスター触媒」が有する、複数の同種・異種金属により囲まれた反応場、ならびに「シリカ担持触媒」が有する、シリカなどの担体により囲まれた反応場の反応特性の解明と触媒反応による実践的応用を目的とする。平成29年度は以下の2つの課題に対して集中的に取り組んだ。課題1:亜鉛と希土類金属を含有する異種多核金属錯体を用いた二酸化炭素とエポキシドの交互共重合反応課題2:シリカ表面に担持したモリブデンオキソ種を用いたオレフィンメタセシス反応課題1では、トリ亜鉛クラウンエーテル配位子に希土類金属を内包した異種4核金属錯体が二酸化炭素とエポキシドの交互共重合反応の優れた触媒となるばかりでなく、本錯体の亜鉛と希土類金属を架橋するアセテート配位子が、分子内ならびに配位圏外のアセテートアニオンと非常に速く交換することを活かし、反応系中にアセテートアニオンを添加することにより、交互共重合反応において連鎖移動反応が進行することを見出した。課題2では、シリカ表面上の水酸基が独立して存在する特殊なシリカを調整し、モリブデンオキソ錯体をシリカ表面上に担持することで、シリカ表面上に均一に単核のモリブデンオキソ種が分散したシリカ担持触媒を合成した。さらに、我々が独自に開発した有機ケイ素還元剤を用いて表面のモリブデンオキソ種を還元することで、室温においてもオレフィンメタセシス反応に高い活性を示す金属種が発生することを見出した。本研究を達成するにあたり、複数の金属を有する複核金属錯体、およびより実用的なシリカ担持触媒をいかにして反応場として活かすかが非常に重要な課題である。平成29年度の課題1では、亜鉛と希土類金属という異なる2種類の金属を同一分子内に導入することで、二酸化炭素とエポキシドの交互共重合反応において、効率的に二酸化炭素を活性化し、選択的なポリカーボネート合成を達成した。また分子内および配位圏外のアセテートアニオンが素早く交換する特徴を活かし、重合反応系中にカルボキシレートアニオンを添加することで、連鎖移動反応が進行すること、および対応するカルボキシレートがポリマー末端に導入された末端官能基化ポリカーボネートが得られることを明らかにした。課題2では、オレフィンメタセシス触媒において、高活性な触媒活性種が凝集し失活するという問題点を、シリカ上に触媒活性種を均一に分散させることで解決し、さらに、有機ケイ素還元剤を利用してモリブデンオキソ種を活性化することで、超高活性な触媒が発生し、これまでは400°Cといった高温条件が必要であった反応が室温で進行することを明らかにした。これらの知見は特異な反応場の構築に関する重要な知見であり、今後の触媒反応開発を大いに促進するものであるため、研究は順調に進んでいると判断している。平成30年度も引き続き種々の元素からなる複核金属錯体の合成に取り組むとともに、それらの錯体の示す特異な触媒機能の開発として以下の二つの課題に取り組む計画である。課題1:有機溶媒に可溶な酸素架橋多核金属クラスター錯体を用いた触媒機能開発課題2:精密に構造制御された異種多核金属クラスター錯体における異種金属間の相乗効果を活かした触媒機能開発課題1に関連して、これまでの研究において、酸素架橋多核金属クラスター錯体としてマンガンクラスター錯体を用いた場合、化学的安定性に優れたアミド結合の炭素ー窒素結合の切断反応が進行し、高難度反応である中性条件下でのアミド分解反応が速やかに進行することを見出している。通常、多段階の反応工程を経る必要のある官能基変換を直接的、かつ反応の副生成物が極めて少ない条件で達成しており、精密化学品の製造に対して極めて強力な手法であるとして、基質適用範囲が広く高活性な触媒の探索をさらに展開する。本年度は反応機構についての解明を進め、反応速度の測定、反応中間体の単離同定を行う計画である。課題2に関連して、メタロクラウンエーテル配位子を有する異種金属クラスター錯体のイモータル交互共重合への展開を進める計画である。大環状配位子を用いた選択的な異種金属錯体合成においては、亜鉛ー希土類金属、という組み合わせにより特異的に二酸化炭素とエポキシドの交互共重合が進行することが分かった。本知見は、異なる金属の組み合わせを適切に選択することで、単一金属では困難である反応を飛躍的に促進可能である金属間相乗作用の高度利用に向けた基盤的成果である。また、クラスター錯体上のアニオンと外圏に存在するアニオンの素早い交換反応を利用し、イモータル重合への展開を計画している。本研究は高難度触媒反応の達成を目指して「金属間相乗作用を活かした多核金属クラスター反応場の創出」を進め、従来の均一系触媒(単核金属錯体触媒)と質的に異なり、不均一系触媒(固体触媒)とも異なる「均一系多核金属クラスター触媒」が有する、複数の同種・異種金属により囲まれた特異な反応場の反応特性の解明と触媒反応による実践的応用を目的とする。平成27年度は以下の2つの課題に対して集中的に取り組んだ。課題1:有機溶媒に可溶な酸素架橋多核金属クラスター錯体を用いた触媒機能開発、課題2:精密に構造制御された異種多核金属クラスター錯体における異種金属間の相乗効果を活かした触媒機能開発課題

1では、すでに硝酸セリウムをカルボン酸と配位子の存在下で反応させることで多核セリウムクラスターが生成することを見出しており、特に酸素下で反応を進行させることで酸素原子によって架橋されたセリウム6核クラスターを選択的に合成することに成功している。さらに、種々の分光学測定によって合成したセリウム6核クラスターは6つのセリウム原子が8つの酸素原子によって架橋された構造であることを明らかにした。課題2では、亜鉛と希土類金属を有する異種4核クラスター錯体の合成に成功しており、X線単結晶構造解析によりその構造を明らかにした。さらに、得られた異種4核クラスター錯体を用いてシクロヘキセンオキシドと二酸化炭素の交互共重合を行ったところ、効率的に二酸化炭素を固定化出来ることを見出した。本研究を達成するにあたり「金属間相乗作用を活かした多核金属クラスター反応場の創出」をいかにして行うかは非常に重要な課題である。平成27年度の結果では、様々な条件下において金属がどのようにクラスター化するのか、いくつの金属からなるクラスターが生成するのかについての詳細な知見を得ることができた。また、得られるクラスターを溶液に溶けやすくさせ、解析を容易にする配位子についての知見を得た。これらの結果は特異な反応場の反応特性を利用した触媒反応への展開における反応場の構築に関する重要な知見であり、今後の触媒反応開発を大いに促進するものであるため、研究は順調に進んでいると判断している。本研究は高難度触媒反応の達成を目指して「金属間相乗作用を活かした多核金属クラスター反応場の創出」を進め、従来の均一系触媒(単核金属錯体触媒)と質的に異なり、不均一系触媒(固体触媒)とも異なる「均一系多核金属クラスター触媒」が有する、複数の同種・異種金属により囲まれた特異な反応場の反応特性の解明と触媒反応による実践的応用を目的とする。平成28年度は以下の二核錯体を用いた2つの課題に対して集中的に取り組んだ。課題1:ロジウム二核錯体を用いた単純オレフィンの不斉水素化反応課題2:チタン二核錯体を用いた架橋イミド配位子の炭素ー水素結合官能基化反応課題1では、これまでに塩素架橋イリジウム二核錯体が含窒素複素芳香環化合物の不斉水素化反応において、取扱が容易、かつ高活性かつ高エナンチオ選択的な優れた触媒前駆体となることを見出しており、今回、キラルジホスフィン配位子を有する塩素架橋ロジウム二核錯体を新規に合成し、触媒反応に用いることで、配向基を有さない単純オレフィンの不斉水素化反応が高選択的に進行することを見出した。課題2では、イミド配位子によって架橋されたチタン二核アルキル錯体と内部アルキンを反応させたところ、架橋イミド配位子のオルト位炭素ー水素結合が活性化され、新たに形成された金属ー炭素結合に炭素ー炭素三重結合が挿入することで、6員環チタナサイクルを2つ有する錯体が選択的に生成することを見出した。本研究を達成するにあたり、「複数の金属を有する複核金属錯体の持つ特徴」をいかにして反応場として活かすかが非常に重要な課題である。平成28年度の結果では、塩素架橋ロジウム(III)二核錯体を触媒前駆体として用いることで、これまで達成が困難とされてきた配向基を有さない単純オレフィンの触媒的不斉水素化反応を達成した。また、チタン二核錯体を用いた時には、単核錯体では達成困難な特異な反応性を示すことを見出しており、速度論解析および量子化学計算から本反応が二核錯体構造を保ったまま進行していることを明らかにした。
サイトカインLECT2の軟骨細胞に対する作用機序の解析

サイトカインLECT2について、軟骨細胞に対してどのような作用をおぼよすかを、Lect2ノックアウト(Lect2-KO)マウスおよび軟骨前駆細胞株を使って探索した。全身の骨形態学的解析および大腿骨の病理切片を作製し成長板軟骨の形態学的観測を行った結果、軟骨細胞の分化に差異が認められた。軟骨前駆細胞株の分化誘導時に、LECT2がどのように作用するかをDNAマイクロアレイで解析した結果、軟骨細胞分化に作用する因子を調整する可能性が見出された。これらから、LECT2が軟骨細胞の分化に関与する可能性が示唆された。長管骨の成長は、成長板軟骨の軟骨細胞に重要な役割があり、静止軟骨細胞、増殖軟骨細胞、肥大軟骨細胞へと分化・成熟する過程が必要となる。軟骨無形成症や骨端症などは、このメカニズムの破綻により起こる。これらの軟骨細胞の分化過程はサイトカインなどが作用して厳密に制御されている。肝臓で特異的に産生されるタンパク質であるleukocytecell-derived chemotaxin 2(LECT2)は軟骨細胞の成長刺激因子であるがそのメカニズムは不明である。これまでの結果からLECT2は様々な生物活性を有するサイトカインとしての性質を持っていることが考えられている。本年度は、1)LECT2遺伝子改変マウスを用いてアルシアンブルー/アリザリンレッドSによる透明骨格標本を作製し、全体の骨格形成の違いを検討した。2)軟エックス線写真による長管骨長の比較を行った。3)いくつかの週齢において大腿骨や脛骨から組織切片を作製し、局所的な解析を行った。4)培養細胞にLECT2を添加し、細胞分化に世ボス影響についてアルシアンブルー染色をして比較した。5)活性が安定しないケースが生じ、タンパク化学的にLECT2の構造情報を調べた。本年度は、未分化状態および分化誘導時におけるLECT2の役割解析を目標とし、in vitroの培養細胞をつかい、単純化した系において主に実験を実施した。1)培養細胞を用いた遺伝子発現解析軟骨前駆細胞ATDC5細胞に、CHO細胞由来のマウスリコンビナントLECT2を作用させて6時間後のRNAを調製し、アジレント社製のDNAマイクロアレイで解析を行った。全体の変化は少ないながらも1.5倍以上の変動を見せた遺伝子群の中に、軟骨細胞の分化・成熟に関与する遺伝子も含まれていた。2)培養細胞を用いたLECT2の生理活性の探索未分化状態および分化誘導中であるATDC5細胞に、CHO細胞由来のマウスリコンビナントLECT2を作用させてWST-8試薬およびBrdU取り込みによる細胞増殖率を測定した。軟骨細胞の増殖刺激因子であるLECT2存在下で、未分化状態のATDC5細胞では逆に増殖阻害が見られた。3)LECT2の機能に関する構造解析LECT2はアミノ酸配列の相同性から亜鉛イオンを活性中心にもつタンパク質であるペプチダーゼM23のグループに分類されている。しかしLECT2が亜鉛イオンを結合するかどうかは不明であった。そこで、LECT2の生理活性の探索の一環として、亜鉛イオン結合タンパク質であるか否かをelectrospray ionization mass spectrometryおよびX-ray absorption fine structureにより解析した。その結果、LECT2は亜鉛結合タンパク質であることを明らかとした。本年度は、昨年度明らかにしたLECT2に結合する金属イオンと構造的情報から、生理活性の探索を主に行った。また、昨年度に引き続き、in vitroの培養細胞をつかい単純化した系について研究を実施した。具体的にはリコンビナントLECT2を直接軟骨前駆細胞ATDC5細胞などに作用させ、転写因子に着目して検討した。LECT2はアミノ酸配列の相同性から亜鉛イオンを活性中心にもつタンパク質であるペプチダーゼM23のグループに分類されている。昨年度、LECT2は亜鉛結合タンパク質であることを明らかとした。本年度は、開始当初、LECT2の活性部位について探索を行うため、亜鉛イオンあり・なしの状態で活性に差異がみられるかどうかを探索した。しかし、亜鉛配位のアミノ酸と予測される3箇所のアミノ酸残基を点変異すると、哺乳細胞にトランスフェクションしても、LECT2のタンパク質発現が確認できなくなるアミノ酸残基があり、精製後の活性測定は実行できなかった。しかし、このアミノ酸残基は構造の安定化に重要であることが示唆された。2)培養細胞を用いた遺伝子発現解析軟骨前駆細胞ATDC5細胞に、CHO細胞由来のマウスリコンビナントLECT2を作用させて6時間後のRNAを調製し、アジレント社製のDNAマイクロアレイでの解析を昨年度に引き続き行った。変動がみられた遺伝子群について、どの転写因子の制御を受けているか調べることで、添加したLECT2のシグナル伝達の最終ポイントを探索した。その結果、ある転写因子の調節を受けている可能性が見出された。
富士川流域に発生したクロイツフェルドヤコブ病の家系および分子遺伝学的解析

学会、研究会などを通じ当教室でのプリオン遺伝子解析について各方面へ周知された結果、本年、6例のCJD患者の遺伝子解析をおこなうことが出来た。この6例はいずれも痴呆や視覚障害、片麻痺などの大脳巣症状などで初発し、精査中に急速に痴呆が進行し、ミオクローヌスや脳波上PSDも出現するなど、典型的なCJDが疑われた時点で、患者家族の同意のもとに患者末梢血を採取したものである。各々即刻当教室に送付され、白血球から迅速法を用いてDNAを抽出した。このDNAを、プリオンタンパク遺伝子(PRNP)領域をはさんだプライマーを用いてPCR法で増幅し、増幅したDNAフラグメントに制限酵素BsmAlを作用させた。その結果、山梨県出身で関東在住の2症例(内1例は河内、小田原ら;日本神経学会関東地方会)と、静岡県富士市在住の1例、計3症例はDNAフラグメントが2つに切断されず、コドン200にグルタミン酸がリジンとなる変異をもつとみられた。さらに診断を確実にするために、増幅されたDNAフラグメントがコドン200に変異がある場合のみ、制限酵素Bxtlで切断されるように設計したミスマッチプライマーを用いてPCRをおこない、やはり同様の変異を確認した(宮川、小田原ら;行動遺伝研究会)。この内の1例は兄がCJDで死亡している家族例であった。この地域と無縁の3例ではコドン200異常を認めなかった。なお、いずれの症例も解析中にも病状は進行し早期に失外套状態に至っている。今回関東在住のCJD症例でコドン200異常を有する2例はいずれも山梨県出身者であった。こんことはコドン200異常と富士川流域との強い相関を予想させるが、コドン200異常は同一家系内でもCJDの発症年齢に開きがあり、その日本における浸透率などさらに症例を蓄積し検討する必要があると考える。パラフィン包埋標本については現在解析中である。
染色体安定性の癌化への関わり(DT40細胞を用いた試み)

染色体の不安定性に関連する可能性を有する遺伝子(特に出芽酵母で相同DNA組換え機構に関与することが知られている遺伝子のホモログ)をトリDT40細胞においてノックアウトしその機能を解析し以下の諸点を明らかにした。1.RAD54欠損細胞は放射線照射、メチルメタンスルホン酸(MMS)処理に対して強い感受性を示した。ターゲットインテグレーションの効率も100倍以上低下し、RAD54遺伝子が高等真核細胞の相同DNA組み換え機構に大きく寄与していると共に、高等真核細胞のDNA2重鎖切断の修復が非相同DNA組換え機構だけでなく相同DNA組扱え機構でも修復されていることが判明した。2.RAD52はその変異株が出芽酵母で最も重篤な表現型を示し、また、生化学的に、出芽酵母とヒトと共にRAD51の相同DNA対合反応をRAD52が促進するのが報告されているにも関わらず、RAD52欠損DT40細胞はほとんど放射線照射やMMSに対する感受性を示さず、ターゲット・インテグレーションの効率のみ数倍低下した。3.RAD51欠損細胞は致死となったため、テトラサイクリン誘導プロモーターを用いたコンデイショナルノックアウトを樹立した。テトラサイクリンの添加によりRAD51の発現を抑制すると、ほぼ12時間後に細胞がG2/M期で静止しその後致死となる。致死となる前のカリオタイプの解析により、ほぼ1細胞あたり1つの染色体断裂(イソクロマチド型断裂)が観測され、通常の細胞増殖中のゲノム・インテグリテイーの保持機構に相同DNA組換え機構が重要であることが強く示唆された。
家蚕の神経ペプチドに関する遺伝学的研究

家蚕の発育・変態を支配する重要な遺伝子である前胸腺刺激ホルモン遺伝子と休眼ホルモン-PBAN遺伝子の二つについて,多型を発見し遺伝子の連関地図上での座位を調べた。(1)ポリメラーゼ連鎖反応(PCR)を利用し、前胸腺刺激ホルモン遺伝子Ptthの変異を探索した結果,第3・第4イントロンの長さに変異を発見し,Ptth^A,Ptth^B,Ptth^Cと名付けた。Ptth^Cは他よりも第3イントロンが約400塩基対ほど長く,Ptth^Bは第4イントロンが約150塩基対ほど長かった。Ptth^Cをもつw41系統にPtth^Aをもつw22系統を戻し交雑し,分離を調査した結果,Ptthが第22連関群の2.7に占座することをつきとめた。第22連関群には,PTTHの機能と関連する遺伝子はまだマップされていない。したがって,不眼蚕をはじめとする既知の発育異常突然変異は,PTTH遺伝子そのものの変異ではないことになる。(2)PTTH遺伝子と同様に休眼ホルモン-PABN遺伝子(Dh)の多型性をPCRによって検討した。その結果,第4イントロンには長さの変異があり,第5イントロンには長さの変異と制限酵素切断点の変異とがあった。Dh^Bは第5イントロンのRsaI切断点を一ヶ所欠き,Dh^Cは第4イントロンが数10塩基対,第5イントロンが約800塩基対他よりも長かった。Dh^Aをもつ東大E^<Kp>os-e q系統,Dh^Bをもつ蚕糸昆虫研No.912系統およびDh^Cをもつ九大w30系統を使って交配実験を行った結果,(No.912×w30)×w30の交配実験区において,Dhがw30が保有する黒蛹形質と連関関係にあることを認めた。調査した10数系統のうちw30系統と埼玉県産クワコだけがDh^Cをもち,その2系統だけが黒蛹を発現することから,w30系統のDh^Cは,クワコから,黒蛹の遺伝子と連関たまま導入されたと推定することができる。また,クワコの黒蛹は第11連関群所属のbp遺伝子によることが分かっているので,Dhも第11連関群に所属する可能性が大きい。