hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
腫瘍随伴性腎細胞癌のプロテオーム解析

単純性腎嚢胞と嚢胞随伴性腎細胞癌に由来する嚢胞から採取した嚢胞液を逆相液体クロマトグラフィーにより精製した後に二次元電気泳動による蛋白分離を施行した。両者で発現量の異なる274個のスポットにつき質量解析による蛋白同定を行った結果、腎細胞癌に由来する嚢胞液中に特異的に発現する新規の蛋白質として14-3-3 protein beta/alphaを同定した。同タンパク質は腎癌患者の尿中にも正常腎に比較して有意に高濃度に排泄されており、腎癌のバイオマーカーになり得るものと推察された。嚢胞随伴性腎細胞癌はしばしば良性病変との鑑別が困難なことがある。嚢胞性腫瘍であるため針生検による組織採取は難しく、また嚢胞液の吸引細胞診の感受性は低く偽陰性率が高いことが知られている。現在、これらの鑑別診断は超音波断層法やCT、MRIなどによる画像診断に依存している。本研究の目的は単純性腎嚢胞や多房性腎嚢胞、嚢胞随伴性腎細胞癌から採取した嚢胞液のプロテオーム解析を行い癌特有の蛋白質を同定することにより、より確実で迅速な鑑別診断法を確立することである。腎癌のマーカー探索は世界で研究が進められている最中であるが、診断に応用可能なマーカーの報告はない。嚢胞随伴性腎細胞癌の嚢胞液は直接癌組織に接しており、これまで腎癌患者血清から検出困難であった微量な蛋白質が多く含まれている可能性は高いと思われる。本研究の成果は嚢胞随伴性腎細胞癌の診断だけでなく、今まで血清成分では微量で発見されなかった腎癌に対する新規腫瘍マーカーや予後予見因子の発見も目指す。今年度は(1)胞液の処理法の確立。2)嚢胞液の分画を行い、もしくは前処理のみ施行し、嚢胞随伴性腎癌の嚢胞液と正常嚢胞液をそれぞれ2次元電気泳動を行い、嚢胞液中のタンパク質の比較を行った。3)嚢胞随伴性腎癌で有意に過剰発現しているタンパク質を同定した。嚢胞随伴性腎細胞癌には既存の腎嚢胞の内壁を淡明細胞癌が被覆する嚢胞由来腎細胞癌と、腫瘍の大部分が多房性の嚢胞により形成される嚢胞性腎細胞癌があり、しばしば良性病変との鑑別が困難なことがあり、複雑性腎嚢胞の経過観察は長期に及ぶことが多い。本研究の目的は単純性腎嚢胞や多房性腎嚢胞、嚢胞随伴性腎細胞癌から採取した嚢胞液のプロテオーム解析を行い癌特有の蛋白質を同定することにより、より確実で迅速な鑑別診断法を確率することである。(1)嚢胞液の処理法の確立:嚢胞液は個人差が大きく、前処理の方法も確立されていなかった。我々の施設で嚢胞液の成分を調査したところ血清の成分に非常に近いことから、前処理方は血清と同様にアルブミン・IgG除去カラムを使用した方法を採用した。(2)嚢胞液の比較:嚢胞随伴性腎細胞癌の嚢胞液、正常嚢胞液をALB-IgG除去、主要蛋白質除去後にHPLCにて分画し、その後アガロース2次元電気泳動を使用しタンパク質を展開した。その後、癌患者と正常患者の共通の蛋白成分の違いを比較し、蛋白同定を行った。(3)同定した蛋白質を、他の嚢胞液(嚢胞随伴性腎細胞癌の嚢胞液2例、正常腎嚢胞5例)を使用し抗体を使い評価したところ、14-3-3 protein beta/alphaというタンパク質が嚢胞随伴性腎細胞癌の嚢胞液で過剰発現を認めた。(4)腎癌患者の血清、尿検体でタンパク質量を調査したところ腎癌患者尿でも14-3-3 proteinの過剰発現を認めた。(5)多検体比較試験は、嚢胞随伴性腎癌の嚢胞液の数が不十分であったため本年度は行わず、代わりに腎癌患者尿を使用して多検体比較試験を行ったところ有意に14-3-3 proteinの過剰発現を認めた。1)ELISA法による定量検出した新規腫瘍マーカー候補蛋白をウェスターンブロッテイングで嚢胞随伴性腎細胞癌の腎嚢胞液、正常嚢胞液および腎癌患者血清と比較し、発現量が増加しているかを確認した。発現を認めた蛋白質について、嚢胞随伴性腎細胞癌の嚢胞液、正常嚢胞液、腎癌の患者血清、健常者決定での発現量をELISA法で定量し、臨床的有用性を検討した。腎癌患者血清については各病理学的ステージの患者血清で確認を行なった。2)嚢胞伴性腎細癌のペプチド領域での新規マーカー候補蛋白質の同定、評価嚢胞液中のペプチド成分を比較し,嚢胞随伴性腎癌患者と健常者嚢胞液でMSピークに違いの認められたものを探索して得たマーカー候補ペプチドMALDI-TOF/TOF MSを使ったタンデムMS(MS/MS)測定で同定。このペプチドの安定同位体

標識ペプチドを合成し、内部標準として用いて定量解析を行なった。これによってマーカーとしての可能性を多検体で評価、有効な結果が得られた。研究目的である嚢胞液の処理、成分検索、嚢胞随伴性腎癌の腫瘍マーカー候補タンパク質の発見は順調に進んでいる。また、腎癌腫瘍マーカー候補タンパク質の発見、多検体比較試験も行えている24年度が最終年度であるため、記入しない。嚢胞随伴性腎癌の嚢胞液が多検体比較試験を行うには十分な数が集まっておらず保留となっている。今後行う予定である。また腎癌患者尿に認める腎癌腫瘍マーカー候補タンパク質が嚢胞随性腎癌患者尿にも有効か今後調査してゆく。24年度が最終年度であるため、記入しない。
卵巣癌細胞株におけるHSV-tkとGCVを用いた遺伝子治療の抗腫瘍効果の検討

近年,単純ヘルペスウイルスチミジンキナーゼ(HSV-tk)を用いた遺伝子治療が前立腺癌や脳腫瘍などで試みられ始めたが,この治療法の可能性を卵巣癌に応用した研究を行っている。卵巣癌に対する抗腫瘍効果を確認するために,卵巣癌細胞株であるKF細胞株を使用し以下の順に研究を進めた。In vitroにおけるGCV至適濃度の決定:HSV-tk発現KF細胞株をRPMI1640medium中で培養後,ガンシクロビル(GCV)を0.5%,1%,3%,5%,10%の異なる濃度にて培養液中に投与した結果,細胞を死滅させる効果を認めたのは1%以上の濃度である事が確認でき,この実験系でのGCVの最低殺細胞濃度は1%であると決定した。また,HSV-tkを発現していないwild KF細胞株に対しては殺細胞効果を認めなかった。In vitroにおけるHSV-tkのbystander effectの確認:wild KF細胞株とHSV-tk発現KF細胞株を様々な比率で混合培養した培養液中に,GCVを1%の濃度で投与し2日間培養した後の細胞数はHSV-tk発現KF細胞株の割合が多い程減少する傾向が認められ,減少率は混合培養の際のHSV-tk発現KF細胞株数の比率をはるかに超えた結果が得られた。この結果は細胞間のgap junctionを通じ隣接するwild type細胞にも殺細胞効果をもたらすbystander effectの存在の可能性を示唆させた。現在上記のin vitroの効果をin vivoで確認するためにマウスを用いた研究を進行中である。
炎症を標的とした嗅覚障害治療法の確立

本研究は、炎症物質と嗅覚障害の新しい治療法確立を目的とし、まずは、生きたヒト嗅細胞を用いて、ホールセルパッチクランプ法による解析データを、既に多数報告されているイモリ嗅細胞のデータと比較した。そして、炎症物質の投与により、どのような影響を受けるかを確認した。また、炎症制御が外傷性嗅覚障害に対する効果もマウスを用いて検討も行った。その結果、ヒト嗅細胞の基礎的データを得ることが出来たが、炎症物質の影響を確認できなかった。これはヒト嗅細胞が他の動物種と比べて極めて極めて組織が脆弱であるためだろう。しかし、本研究は外傷性嗅覚障害マウスに有効な物質を複数見つけ、今後の臨床応用が期待される。三重大学医学部附属病院耳鼻咽喉・頭頸部外科の協力の下、入院または外来患者22名の同意書を得て、全身麻酔下で嗅粘膜を摘出し、その経過を「自覚重症度」「Visual Analog Scale(VAS)スコア」で障害の程度を調べた。結果、有意差を持って、双方改善傾向が認められたため、術後の障害の程度は無いことを明らかにした。その後、免疫組織化学染色によって単離された際のヒト嗅細胞を形状で同定した。その際に、既に実験が確立されたイモリ嗅細胞の形状と比較し、ヒト嗅細胞単離方法を確かめた。ヒト嗅細胞を嗅粘膜からコラゲナーゼを用いて単離を行い、パッチクランプ法にて電気生理実験を行った。その際、最適環境を明らかにするため、リンゲル培養液の組成を変化させると同時に、酸素によるバブリングを行った。電気生理実験を行う最適環境の探索を行ったが、著しい変化を認められず、イモリ嗅細胞実験で用いられる組成のリンゲル培養液を使用した。ヒト嗅細胞を用いてパッチクランプ法による実験を行い、得られた基礎的実験データをイモリ嗅細胞の実験データを比較した結果、電位依存性チャネルによる内向き電流、外向き電流に大きな違いは認められなかった。以上の結果から、ヒト嗅細胞における電位依存性チャネルは、両生類のそれと特性においては大きな違いがなく、既に確立されているイモリ嗅細胞を用いた予備実験を今後行いながら、ヒト嗅細胞との差異を明らかにする。昨年度は、三重大学耳鼻咽喉・頭頸部外科学協力の元、手術患者からの嗅粘膜の提供とその安全性について検討、免疫組織化学染色法を用いてヒト嗅細胞の形態学的同定を行い、パッチクランプ法にて電気生理実験を施行した。これらのヒト嗅細胞の基礎的データを解析し、他種、特に多くの実験結果が得られているイモリ嗅細胞の実験データと比較したところ、形態的特徴と電気生理学的機能の一部に関して類似性が認められたため、以上の基礎的データを論文にすべく、27年度から投稿論文を執筆している。また、同時に2016年に行われる国際学会ISOTにて本研究に関する基礎データの研究報告を予定しており、演題登録を行った。また、さらに実験を進ませるため、嗅細胞のEP2受容体の発現を調べた。まずはマウスを用いて予備実験を行った。マウスをホルマリン還流固定し、頭部を脱灰後、スクロース溶液に漬け、-20度にて凍結、クリオスタットにて水平断で切片標本にした。組織標本はEP2受容体抗体を用いて免疫組織化学染色を行った。その結果、嗅細胞層にEP2受容体の発現が認められ、哺乳動物の嗅細胞に対し、炎症物質が何らかの影響があることが示唆された。現在、その機能を明らかにするため、嗅細胞のEP2受容体と結合するプロスタグランジンを用意し、それを単離された嗅細胞に一時的に暴露させ、その際の匂いの応答と、電位依存性電流、特に内向き電流と外向き電流に対する影響を明らかにする準備を行っている。当初の計画ではEP2受容体の発現の有無と同時に、電気生理実験にて炎症物質プロスタグランジンの暴露を行い、その応答性を明らかにすることとしていたが、後者はまだ準備段階である。28年度では早々に施行する。この遅れは、26年度から27年度に、所属の変更と新業務によりエフォートを割くことが難しかったこと、また、実験室の使用に関して、所属変更による使用手続きに時間がかかってしまい、実験時間の確保ができなかったためだ。炎症物質の暴露には至っていないが、ヒト嗅細胞における基礎的研究データをまとめた。国際学会のISOT2016にて、一部報告したが、論文では未発表のため、具体的な数値は控えるが、免疫組織化学を用いた大きさや形状などの形態学的特徴と共に、電気生理実験におけるヒト嗅細胞の活動性を確認するため、電圧固定法による内向き電流と外向き電流を測定し、チャネルの構成と特性を明らかにした。また、先行研究で他の動物で行ってきた外向き電流のブロッカーであるTEAの暴露による抑制性を明らかにし、他の動物、特に本研究室で多く遂行してきたイモリ嗅細胞の特性と比較した。これらの結果から、ヒト嗅細胞の特性の一部の解明と、他の動物と差異や同様の特性を解析し、現在論文の初稿を書き上げ、共同研究者と討論を重ねて発表準備を行っている。2016年度に実験室の大幅な移動があり、進捗は遅れている。実験装置の移譲手続きや、引越し、設置などにより、研究環境が変わってしまったためか、なかなか実験の条件が揃わなかった。年度末に学会にて多くの助言をもらい、環境を整えて、再始動している。現在までには基礎的データの取得と解析、論文執筆までしか進んでおらず、次年度は既に選定した炎症物質いくつかの購入と共に、早急に嗅細胞暴露実験を行って、その効果をまとめる。

ヒト嗅粘膜から単離したヒト嗅細胞を用いてのパッチクランプ法による膜電流の解析は他の動物、例えばイモリやマウスと比べて、内向き電流を持たない細胞が多く認められた。外向き電流は全ての細胞で記録し、TEAによる抑制作用まで明らかにしたが、内向き電流を記録できた細胞は1つしか得られなかった。この1つの記録をI-V曲線に変換し、先行研究のResterpoらの記録や、イモリの電流と比較するとほとんど変わりはなく、正しい記録であることが推察された。この結果はヒト嗅細胞において、単離による実験法では、他の動物と違い、内向き電流が記録されない細胞が多く、実験法の問題なのか、ヒト嗅細胞特有のものなのかは、さらなる詳細な研究が必要であること示唆した。さらに、炎症関連物質としてプロスタグランジンの暴露を行ったが、有効な結果はみとめられず、外向き電流に変化はなかった。内向き電流、または匂い受容器電位であれば、その変化がみられたかもしれないが、上記の結果のため、いまだ実験を継続する必要がある。本研究は、炎症物質と嗅覚障害の新しい治療法確立を目的とし、まずは、生きたヒト嗅細胞を用いて、ホールセルパッチクランプ法による解析データを、既に多数報告されているイモリ嗅細胞のデータと比較した。そして、炎症物質の投与により、どのような影響を受けるかを確認した。また、炎症制御が外傷性嗅覚障害に対する効果もマウスを用いて検討も行った。その結果、ヒト嗅細胞の基礎的データを得ることが出来たが、炎症物質の影響を確認できなかった。これはヒト嗅細胞が他の動物種と比べて極めて極めて組織が脆弱であるためだろう。しかし、本研究は外傷性嗅覚障害マウスに有効な物質を複数見つけ、今後の臨床応用が期待される。当初行うべきELISA法によるヒト嗅粘膜のPGE2の存在を明らかにするはずだったが、その前段階のヒト嗅粘膜の保存が当初予想したよりも、難航しているためだ。所属の変更による新業務にも1年を通して慣れ、実験室の使用に関しても手続きが完了したため、次年度では実験時間の確保が可能となった。本年度までの遅れを取り戻すべく、早々に電気生理学実験の施行し、そのデータを解析、効果を明らかにする。実験環境の整備が整い、科研費最終年度に向けて、嗅細胞における炎症物質の暴露効果を明らかにする予定だ。共同研究者との打ち合わせから多くの問題点が浮上し、解決を進めているため、これまでよりも早いスピードで研究が進むよう手配した。また、現在所属している組織の教育業務も3年目に至り、授業準備も整ったため、研究に割く時間も増やすことが出来る。調査した薬品を直ちに購入し、データを収集、最終年度中には論文の投稿と研究成果の発表を目指す。生理学今回基礎的データと実験システムの検証と患者への安全性を確認し、既に確立されているイモリ嗅細胞の実験手法が使用でき、提供された組織を組織学的解析と電気生理学的解析に分け、それぞれ具体的な炎症関連物質とその受容体の存在を明らかにする。所属変更に伴い、予定していた研究実施が行えなかったため。2016年度に行う予定だった薬理実験を多く行うため。本年度に海外での学会発表と、専用のソフトを購入予定であり、それに充てる予定である。学会発表のための出張旅費等に充てるつもりである。2017年度に行う薬理実験に使用する炎症物質各種や実験器具に使用する。
児童虐待死亡事例について司法記録等の分析から効果的な介入のポイントを検証する

児童虐待死亡事例について裁判記録等を用いて検証を行い、分析した。従来の検証報告に、裁判記録等から得られた新たな情報を加味して、事例研究会資料を作成し、それらを用いて事例研究会を開き、虐待死予防の効果的な介入のポイントの発見について検証した。本研究の裁判記録等を用いる方法は従来の検証では見えづらかった加害親の状況に接近でき、新たな情報を得ることで、重要な介入ポイントの発見の手掛かりとなる。また、裁判記録を用いた検証結果を事例研究の資料にすることで、児童虐待に関わる専門職の職員研修に、活用する有効性を提案した。この方法は児童虐待死に関わる専門職の育成に大きな前進をもたらすものと考えられる。前年度(23年度)にA県の4つの検察庁に閲覧申請し、裁判記録の閲覧・複写が許可された児童虐待死亡事例4事例について、今年度(24年度)はパワーポイント資料を作成し事例研究を行った結果から、分析を行った。本事例4件についてはA県において「児童虐待死亡事例検証」をすでに実施しているため、県で実施している「行政への聞き取り調査」が中心の検証と、本研究で行っている「裁判記録等を用いた調査」との比較を中心として、上記資料を用いて有識者、関係職種の経験者、研究者などの協力のもと事例研究会を開催し結果から介入のポイントとソーシャルワークのあり方について分析した。裁判記録から詳細な家族構成や加害親の生育歴、事件に至る背景や時間の経過など、行政等の関係機関への聞き取り調査に比べると明確になったが、刑事事件の規範的解決を図るための裁判であるため、児童相談所の介入方法についての記載や児童相談所などの関係機関についての加害親の心情などの記載は少なく、本研究における目的にあるソーシャルワークのあり方を検討するためには、児童虐待について専門的な視点で弁護活動を行っている弁護士が加害親の弁護を行った裁判事例について、調査を進め2事件について閲覧申請の準備中である。課題であった海外の研究については、児童虐待死亡事例裁判やその記録を活用した取り組みについて調査し、文献や学会報告などから「司法ソーシャルワーカー」の配置が行われているイギリス、児童相談所がソーシャルワーカーを殺人罪の容疑で告訴した事例(2002年)を持つアメリカへの調査などを準備している。事例検討についても、A県の4事例を児童相談所などの児童虐待にかかわる専門職の研修体系に活用する方法論の模索のため、その準備段階として各関係機関に事例研究の参加依頼や関係した児童虐待死事例の事例検討について参加が可能かについて伺いに訪問調査した。わが国の児童虐待死の問題について、行政による検証が毎年報告され、法整備も進む中で、児童虐待死が一向に減少しない現状について分析し、検証方法に注目してきた。従来の児童虐待死亡事例に関する厚生労働省や地方公共団体による検証報告の方法では、介入した行政などの関係機関側からの一方的な調査やインタビュー対象であるという限界がある。その点について、児童虐待死について、より詳細に記されている裁判記録等を用いることで、加害親や被害児の状況に近づくことを可能とした検証、分析の方法論を提案し、さらにその方法を用いて事例検討会を実施し、児童相談所などの関係機関の介入のポイントを検証することで、裁判記録を用いる検証方法の有効性を明らかにする。今年度は、今まで実施してきたA県の4事例の裁判記録等の閲覧結果の分析、事例検討会について、総合的に考察し、従来の検証では見えてこなかった加害親と被害児の状況をとらえることができ、これまでにない当事者性を踏まえた児童虐待死の事例検討の提案ができ、インシデント・プロセス方式を応用した事例検討会を実施するという方法で介入のポイントを検証することで、児童虐待死に関わる専門職の研修に活かすことができるといった本研究の独創性と意義を確認した。また、前年度からの課題として残っていたアメリカにおける司法と児童虐待ソーシャルワークの連携について、ハワイ(オアフ島)において、児童虐待に通じている弁護士とCSW(チャイルド・ソーシャルワーカー)の2名にインタビュー調査を実施し、次年度にさらに裁判所への同行なども計画していく予定となった。わが国でも徐々に進みつつある司法機関との連携が、アメリカの事例の調査において、さらに日本の児童虐待の重篤な事例については司法機関との連携システムの構築を目指す必要性を提案した。本研究の目的は、子どもの虐待死をできるかぎり抑止するために、子どもの死亡事件について、警察や検察庁で作成された供述記録や公判記録などの司法の裁判記録を活用し、子どもの虐待対応ソーシャルワークのあり方を再検討するものである。

具体的な方法として、厚生労働省による社会保障審議会児童部会「児童虐待等要保護事例の検証に関する専門委員会」の報告や都道府県の「児童虐待による死亡事例検証委員会」による報告と、司法の裁判記録とを、時系列で整理し重ねて比較し、虐待死に至るまでのプロセスを再現し、事例検討を行うことで、行政は何を見落としているのか、または見間違ったのか、行政側の見えていなかった点を探り、なぜ虐待死亡事件を防ぐ効果的な介入ができなかったのか、加害者や関係者の心情について明らかにし検討するものである。本研究は、現在までにA県(関東圏内で調査がしやすく研究協力者による調査協力が得られる点で注出)で「児童虐待死亡事例」の検証を始めてから、現在に至るまでに行われた全件4事例(第1次平成17年2件、第2次平成21年2件)の全件について、インターネット等に公表されているものについて裁判記録等の閲覧申請をし、検察庁にて閲覧が許可された全4件について閲覧を行い資料を収集することが出来た。また、A県の検証方法や検討の具体的内容について、A県の検証委員となっている弁護士にもインタビュー調査を行い、裁判記録等を参考した「司法福祉的分析」との比較から、事例検討会を6回実施した。さらに加害親の弁護士(3件)4名にインタビューを行い、加害親の心情に近づく内容の資料を得ることが出来た。本研究の目的である児童虐待死亡事例について、新たに司法記録を活用することは、今後の虐待死亡事例検証においても、先駆的な意味を持つ研究となり、わが国の児童虐待防止のためのソーシャルワークについて有効な提言につながると考える。本研究は「児童虐待死亡事例について司法記録等の分析から効果的な介入のポイントを検証する」ことを目的として研究して来た。今年度は最終年度にあたり、研究該当の事例について、すでに検察庁へ裁判記録の閲覧申請中の事件について、閲覧許可が下りるのを待ちながら、調査を進めるとともに、研究成果をまとめるため、「研究成果の報告会」と「研究報告書」の作成に、重点を当て進めた。具体的な方法として、2つの方法を用いて児童虐待死亡事例を分析した。1従来の行政機関等の児童虐待死事例検証報告について、裁判記録等から得られた新たな情報を加味して、独自のフォーマットや表現方法を用いて資料を作成した。これは、従来の検証報告との違いを大きな視点として中核に据え、事例検討会の資料として用いることを重視し分析した。21つ目の方法で作成した資料を用いて事例検討会を開き、裁判記録の情報及びその表現方法が、事例検討会という場を通して、虐待死予防のソーシャルワーク実践の発見と開発に役立つかどうかということを検証した。この2つの方法から、裁判記録を用いることの有効性と、さらに事例検討会の開催は、今後の児童虐待に関わる専門職の職員研修にも生かすことができ、児童虐待死を予防することが出来る専門職の育成に大きな前進をもたらすことが出来ると考える。以上の研究成果について、研究報告会を開催し、社会福祉、司法福祉、法学等の各分野の研究者、児童相談所、子ども家庭支援センター、保健所、児童福祉施設職員などの実践者など35名の参加を得ることが出来た。報告会参加者からは、裁判記録を閲覧し、検証に用いることの有効性を認めて頂いた上で、申請許可が下り、閲覧が終わるまでにかなりの時間を要すること、また現在、実施されている厚生労働省や各地方自治体での検証などは様々な制約がある中で、多くの成果もあることを認識することを指導して頂いた。
白ネズミを用いての動因の交互作用とその機構の研究

本研究は、白ネズミ(ウィスター)を使って、行動水準と神経パルス活動の水準とでの測定実験を実施し、動因間の交互作用の行動上および神経生理上の機構の究明を目指すものである。飢餓と渇との動因の相対強度は、2バースキナー箱での石井の実験結果と、Wardenの障害箱での実験結果とは逆になっている。このスキナー箱での相対強度は、Y迷路で動因弁別学習を用いた石井の測定実験の結果と同方向になっている。障害箱でWardenの実験の追試を行なった石井の実験結果は、Wardenと同傾向になっている。行動レベルでのこれらの相反する安定した結果は、動因間の交互作用の存在の可能性を示すものと思われる。このような動因間の交互作用の機構を、中枢神経の活動のレベルでとらえるための基礎的な実験が行なわれた。結果の詳細の未整理のところが多いが、得られた成果の主なものは以下の通りである。神経活動レベルでの動因の交互作用の機構を行動との対応でとらえようとするので、まず2バースキナー箱でのフリーオペラント事態でのバー押し行動と中枢神経の対応する動因関連部位の活動とを同時並行的に測定し、その対応関係を確認することが必要となる。不動拘束事態での動因中枢の活動の測定実験は既にあるが、それはフリーオペラント事態ではないので、真の動因に対応したものであるかどうかが弱い。この対応をみるために、2バースキナー箱で飢餓動因下で餌バー押し行動の測定と並行して動因関連中枢部位の神経活動の測定を行なった。餌バー押し行動出現直前に外側視床下部野の神経パルス活動の増加の傾向がみられた。また、渇動因の下で水バー押し行動についても同様に測定を行なった。水バー押し行動出現直前に視床下部の視索上核の神経パルス活動の増加の傾向がみられた。動因よりも動きによる可能性も考えられるので、動因のないときの動きにおける神経パルス活動の対比測定も行ない、その可能性を除外した。
新規経口抗凝固薬における残存凝固能モニタリング検査の開発に関する研究

新規経口抗凝固薬(NOAC)はモニタリング検査が不要とされているが、有効な抗凝固療法を行うためには、NOACの過不足を判断できる検査が必要である。そこで、我々はトロンビン阻害薬では、エカリン凝固時間(ECT)を利用したTIRを開発した。また、Xa阻害薬では、希釈PTを利用したRITGを開発した。TIRおよびRITGが基準値以下のサンプルでは血栓マーカーが検出されるものが多く、これらの指標はNOACの過不足を反映する検査であった。特にRITGは3種類のXa阻害薬を横並びに検討できる指標と思われた。今後、この指標を用いて、より有効なNOAC療法の検討ができるものと考えられた。まず、1 vialEcarin(Sigma)をTris-HCL-CaCl2溶液(20 mL)にて希釈しEcarin溶液とする。被検血漿5μLはオーレンバッファー(20μL)および健常人血漿(75μL)で希釈された後、Ecarin溶液50μL添加し凝固時間(ECT)を汎用凝固時間測定装置STA-R(Roche社)で測定した。Dab粉末をPrecision Biological社製コントロール血漿(PB-CP)に混和し作成したDab血漿を用いて基礎検討を行った。本法の希釈直線性、同時再現性は良好で、測定限界はDab血漿12.5 ng/mLであった。さらに、換算式[(患者ECT-コントロールECT)/コンロールECTx 10 ]を用いて、Thrombin Inhibition Ratio (TIR)とした。TIRは、Hemoclot Thrombin Inhibitor (HTI; Hyphen社)を用いたDab血中濃度と相関した(R2=0.656)。Dab血中濃度との相関はAPTT(R2=0.418)よりも良好であった。健常人25人から得られたTIRを健常域とし、健常域より低いTIRの血漿は、血栓マーカーであるFMCが高値となるものが多く、TIRは抗凝固活性(残存凝固能)のみならず凝固亢進も判断できる測定方法である可能性が示唆された。現在、452名のDab服用患者のサンプルを用いて残存凝固活性を測定しており、この結果は日本血栓止血学会などで報告された。また、直接Xa阻害薬の残存凝固活性の確認試験も準備は整っている。まずリバーロキサバン、アピキサバン、エドキサバンを服用しておりインフォームドコンセントが得られた患者より血漿サンプルをそれぞれ600検体確保した。論文にする予定のみ遅れている。1.直接トロンビン阻害薬(dabigatran)の効果を確認する方法として、昨年より継続してきたEcarin clotting time (ECT)を応用したThrombin inhibition ratio (TIR)を確認試験として確立した。dabigatran服用患者約400名での検討を行なっている。様々な患者条件でも検討しているが、出血性の副作用をきたした症例や血栓再発例が少ないため、十分な検討ができなかった。しかし、TIRと血栓マーカーであるD dimerや可溶性フィブリンモノマー複合体(FMC)との相関は得られ、dabigatran効果の確認としての有用性は認められた。現在、その内容をまとめている最中である。2.平成28年度は、Xa阻害薬の効果を確認する検査として、希釈プロトロンビン時間(dPT)をベースとしたRatio of Inhibited Thrombin Generation (RITG)の基礎検討を主体に行った。人工的に作成した抗凝固薬添加血漿サンプルを用いて、dPTが全てのXa阻害薬(rivaroxaban, apixaban, edoxaban)で感受性良好であることを確認した。また各Xa阻害薬での検出限界は1020 ng/mLであり、各Xa阻害薬の血中濃度と正の相関を認めた。このdPTを利用し、同条件測定時における健常人のdPTとの差の比を求めたRITGも、各Xa阻害薬の血中濃度と正の相関を認めており、現在各Xa阻害薬を服用している患者検体の測定中である。RITGもTIRと同様に、健常人より得られた規準値より低い場合には血栓マーカーの結果より凝固亢進状態にあることが推定でき、凝固抑制に加え凝固亢進も同時に検出できる方法であることが判明した。大方、予定通りに進んでおり、現在論文作成中である。サンプルは予定数集まっているが、出血性及び血栓性のイベントを発症した際のサンプルを入手できず、効果の判定が難しい。そのため、論文化するだけの十二分な検討結果とは言えず、もう少しサンプル数の増加の必要性を感じている。今年度は、取集した3種類のXa阻害薬服用患者の血漿サンプルについて、Xa阻害薬血中濃度,RITG(ratio of inhibited thrombin generation)、プロトロンビン時間(PT)、活性化部分トロンボプラスチン時間(APTT)および血栓マーカー(D dimer,フィブリンモノマー複合体:FMC)を測定し解析した。Xa阻害薬の血中濃度は、テストチームヘパリン(積水メデイカル社)を利用してそ測定した。RITGは希釈PT(dPT)を用いて、RITG=(患者dPT-コントロールdPT)/コントロールdPTx 10で求めた。以上から、てXa阻害薬による抗凝固効果の過不足をRITGを用いてスクリーニングすることが可能と考えられた。

また、3種類のXa阻害薬の抗凝固作用をRITGを用いて横並びに検討することができた。RITGを確認試験として、より有効な抗凝固療法が可能となると思われた。今後、実臨床においてRITGを用いた抗凝固療法の有用性を検討したい。新規経口抗凝固薬(NOAC)はモニタリング検査が不要とされているが、有効な抗凝固療法を行うためには、NOACの過不足を判断できる検査が必要である。そこで、我々はトロンビン阻害薬では、エカリン凝固時間(ECT)を利用したTIRを開発した。また、Xa阻害薬では、希釈PTを利用したRITGを開発した。TIRおよびRITGが基準値以下のサンプルでは血栓マーカーが検出されるものが多く、これらの指標はNOACの過不足を反映する検査であった。特にRITGは3種類のXa阻害薬を横並びに検討できる指標と思われた。今後、この指標を用いて、より有効なNOAC療法の検討ができるものと考えられた。今後は、Dabigatran療法の効果判定にTIRを応用し、その有効性を検討する予定である。さらに、服用後の経過時間から残存抗凝固能の変動を検討し、有効な抗凝固療法への示唆を行う。また次年度は、直接Xa阻害薬に関する残存凝固活性の測定を中心に行う予定である。現在、各直接Xa阻害薬服用者のサンプルの収集はほぼ終了しているので、希釈PTをベースとした測定方法の基礎検討を行い、さらに実検体での応用を確認する予定である。対象サンプル数を増加する。可能なら、各直接経口抗凝固薬服用患者のサンプルを700800サンプルを目標としたい。集まったサンプルのTIR及びRITGを測定し、出血性または血栓性のイベントとの関連を確認するとともに、D dimerやFMCなどの血栓マーカーや従来の凝固時間検査(APTT, PT)などとも比較し、TIR及びIRTGの有用性を確認する。データ解析が終了次第、早急にまとめる予定である。血液内科必要物品がエカリンであり、1 vial約6万円するため、次年度で対処する予定でした。国際血栓止血学会などの海外での発表を予定し、渡航費を予算に計上していたが、平成28年度は使用しなかった。次年度予算に合わせて、エカリンを購入する。平成29年度では、国際血栓止血学会(ドイツ)、国際検査血液学会(アメリカ)に参加予定であり、その渡航費に使用予定である。
病変組織に沈着した免疫複合体の網羅的解析法の開発と自己免疫疾患の組織解析への応用

申請者はこれまでに循環免疫複合体中のすべての自己抗原を質量分析装置で一度に同定するイムノコンプレキソーム解析法を開発し、関節リウマチ患者と変形性関節症患者の解析でRA特異的な循環ICを形成する自己抗原を特定している。本研究ではこの解析法を応用し「沈着免疫複合体の網羅的解析法」の開発を目指した。最適化の結果、組織で変性している抗原の抗原賦活化が予想よりも効率が悪く抽出後の再構成が進まないことがわかった。今後は組織表面から直接分析する、liquid extraction surface analysisなどの表面MS分析を駆使した免疫複合体の組織解析を検討する。自己免疫疾患では血液中を循環する免疫複合体が組織に沈着し、炎症と組織障害を起こすと考えられてきた。しかし、「どのような自己抗原を含む免疫複合体が病変組織に沈着しているのか」を調べるには、自己抗原候補を1つ1つ対応抗体で免疫組織染色するしかなく、探索効率が非常に悪い。そのため、ほとんどの疾患で沈着免疫複合体の自己抗原は特定されていない。本研究では、沈着免疫複合体を形成する自己抗原と自己抗体を組織から抽出した後、免疫複合体を再構成させ、免疫複合体中の自己抗原を独自解析法で同定する、「沈着免疫複合体の網羅的解析法」を完成させる。平成27年度は、病原性の免疫複合体が組織に沈着し得るのかについて検証した。先の研究で関節リウマチ特異的な免疫複合体抗原として特定したトロンボスポンジン-1が患者関節組織に沈着しているのか調べたところ、患者組織への特徴的な集積が認められた。一方、トロンボスポンジン-1刺激に対する滑膜線維芽細胞からのtransforming growthfactor-beta1、interleukin-6、vascular endothelial growthfactorの産生の亢進は認められなかった。このことから、免疫複合体を形成していないトロンボスポンジン-1では、炎症が亢進しないことがわかった。来年度以降は、1)自己抗原と自己抗体を賦活化し、これらが試験管内で免疫複合体を再構成する条件を明らかにする、2)固定化組織試料から自己抗原および自己抗体を効率よく抽出できる条件を明らかにする、3)IgA腎症の病変組織をモデルとして、既知の自己抗原が本法で検出できるかを明らかにする。先に同定したトロンボスポンジン-1が患者組織に沈着していることが判明し、免疫複合体の病原性の一端が明らかとなった。自己免疫疾患では血液中を循環する免疫複合体(IC)が組織に沈着し、炎症と組織障害を起こすと考えられてきた。しかし、「どのような自己抗原を含むICが病変組織に沈着しているのか」を調べるには、自己抗原候補を1つ1つ対応抗体で免疫組織染色するしかなく、探索効率が非常に悪い。そのため、ほとんどの疾患で沈着ICの自己抗原は特定されていない。本研究では、沈着ICを形成する自己抗原と自己抗体を組織から抽出した後、ICを再構成させ、IC中の自己抗原を独自解析法で同定する、「沈着ICの網羅的解析法」を完成させる。昨年度の結果を受け、回収された抗原および抗体が試験管内で再度免疫複合体を形成する条件の検討を行った。モデルとして、Tumor-necrosis factor-alpha(抗原)とその抗体を用いて、抗原-抗体存在比やpH条件についての最適化を行った。また、再構成後の免疫複合体を回収する目的で、Fab抗体固定化ビーズを作製して期待通り回収し、検出可能であることを確認した。今後は実際の患者検体を用いて、方法の最終確認を行う予定である。免疫複合体の再形成、Fab抗体固定化ビーズによる回収と抗原の検出が確認された。皮膚組織にミオグロビン-抗ミオグロビン抗体複合体(モデル免疫複合体)を添加・乾燥した試料をホルムアルデヒドに一晩浸してモデル組織を作製した。これまでの検討結果をもとに、リン酸緩衝液に浸したモデル組織を電子レンジ(500W)で5分加熱して抗原賦活化し、液体窒素凍結と破砕を行った後、界面活性剤CHAPSで免疫複合体を含むタンパク質を抽出し、CHAPSを除去するために透析を行った。透析後、抗原賦活化されたミオグロビン抗原とミオグロビン抗体について試験管内で免疫複合体を再構成した後、Protein G固定化磁気ビーズ・トリプシン消化で得られたペプチドのMS/MS分析でミオグロビンが検出されるかを検証した。過去の検討で最適化された条件下でも、ミオグロビンを検出することはできなかった。本研究の結果から、組織で変性している抗原の抗原賦活化が予想よりも効率が悪く、抽出後の再構成が進まないことがわかった。今後は組織表面から直接分析する、liquid extraction surface analysisなどの表面MS分析を駆使した免疫複合体の組織解析を検討する方向で方針変更が必要と思われる。

申請者はこれまでに循環免疫複合体中のすべての自己抗原を質量分析装置で一度に同定するイムノコンプレキソーム解析法を開発し、関節リウマチ患者と変形性関節症患者の解析でRA特異的な循環ICを形成する自己抗原を特定している。本研究ではこの解析法を応用し「沈着免疫複合体の網羅的解析法」の開発を目指した。最適化の結果、組織で変性している抗原の抗原賦活化が予想よりも効率が悪く抽出後の再構成が進まないことがわかった。今後は組織表面から直接分析する、liquid extraction surface analysisなどの表面MS分析を駆使した免疫複合体の組織解析を検討する。1)自己抗原と自己抗体を賦活化し、これらが試験管内で免疫複合体を再構成する条件を明らかにする。2)固定化組織試料から自己抗原および自己抗体を効率よく抽出できる条件を明らかにする。3)IgA腎症の病変組織をモデルとして、既知の自己抗原が本法で検出できるかを明らかにする。沈着ICの自己抗原がすでに報告されているIgA腎症のFFPE試料について、前項で確立した前処理操作とイムノコンプレキソーム解析を行い、沈着ICを一斉に同定する。臨床化学当該年度は本研究の基礎知見となる実験を先行して行ったため、予定していた研究用物品の購入に至らなかったため。次年度は本研究におけるタンパク質同定の高感度化を目的とした、質量分析装置の購入資金の一部に充当する予定である。
プログラムスライシングによる特徴抽出を基礎とするプログラム検索法

本研究は,ソフトウエアシステムの効率的開発のため既存のプログラム集合中より所望の処理内容を有するプログラムを迅速に検索する"プログラム検索"技術の確立を目的とする.本研究の基本的な考え方は,対象とするプログラムにおいて中心的な役割を担う変数に着目し、これに影響を与える命令群とこれの影響を受ける命令郡を実行順序関係を保存したまま抽出し、これを内容検索のインデックス情報とすることにある.本年度は,プログラム中のデータ操作に関わる要素(変数の定義式,代入式)の時間的順序関係を保存する中間形式(Def/Useグラフ)から,着目変数に関するフォワード及びバックワードのスタテックスライスを抽出し,インデックス情報として統合する処理プログラムを開発した。さらに1クラス内にメソッドをただ一つ持つ幾つかの基本的なJavaサンプルプログラムを対象に、当該プログラムにより検索用インデックスを作成し,処理内容の検索に十分利用できることを確認した.今後は1クラス内に相互利用関係のある複数メソッドを持つより一般的な構造のJavaプログラムを対象に,その有効な検索用インデックスを生成する処理プログラムを開発する予定である.本研究の基本的な考え方は、プログラムにおいて中心的な役割を担う変数に着目し、これに影響を与える命令群とこれの影響を受ける命令郡を実行順序関係を保存したまま抽出すれば、これがプログラムの特徴を表すインデックス情報になり得る、という仮説にある。本年度は上記のインデックス情報をプログラムスライシング技術中のスタティックスライシング技術を利用して生成するという戦略に基づき検討を行なった。すなわち対象とするプログラムから着目する変数に関するスライスを直接抽出することは困難であるため、まず対象とするプログラムの構造をDef/Useグラフの形式により統一的に表し、次にこのDef/Useグラフから着目する変数に関するスタティックスライスを抽出するという2段階のアプローチをとることとした。ここでDef/Useグラフとは、プログラムの単位処理機能(C言語の関数、Java言語のクラスに対応するもの)間の相互利用関係と単位処理機能内の命令実行順序関係および各命令ごとの変数の定義/利用関係を有向グラフにより表現したものである。現在Java言語で記述された対象プログラムからDef/Useグラフを生成するアルゴリズムをJava言語を用いて実現した段階にある。今後このDef/Useグラフから目的とするスタティックスライスを抽出するアルゴリズムをJava言語により実現し、本方法の妥当性の評価ならびに問題点の抽出を行なう予定である。対象とするプログラムにおいて中心的な役割を担う変数に着目し、これに影響を与える命令群とこれの影響を受ける命令郡を実行順序関係を保存したまま抽出し、これを内容検索のインデックス情報とする、というのが本研究の基本的な考え方である。本年度は対象とするプログラムから着目する変数に関するスタテックスライスを抽出するため、まず対象とするプログラムの構造をDef/Useグラフの形式により変換し、次にこのDef/Useグラフから着目する変数に関するスタティックスライスを抽出するという2段階アプローチ法の具体的な処理手順を求めた。平成12年度は典型的なJavaプログラムのサンプル集合を対象に、上記手順により得られたスタティックスライスが検索用インデックスとしてどれほど有効かの評価を行う。さらに1クラス内にメソッドをただ一つ持つ幾つかの基本的なJavaサンプルプログラムを対象に、当該プログラムにより検索用インデックスを作成し,処理内容の検索に十分利用できることを確認した.今後は1クラス内に相互利用関係のある複数メソッドを持つより一般的な構造のJavaプログラムを対象に,その有効な検索用インデックスを生成する処理プログラムを開発する予定である.
地中海から西・南アジア地域の人々に関わる「名誉に基づく暴力」の文化人類学的研究

地中海から西アジア、そして南アジア北西部にいたる地域においては、名誉と恥が社会的に重要な観念とみなされてきた。本研究では研究期間を3年とし、こうした観念と密接に関係する「名誉に基づく暴力」(honor-based violence)について地域的文脈を尊重しつつ、包括的かつ体系的に分析することを目的とする。地中海-西・南アジア帯出身者が移住先の欧米で作っているディアスポラ(移民)社会についても研究対象とする。本研究では「名誉に基づく暴力」を、伝統主義の表出としてではなく都市化、市場化、グローバル化の影響を受けた極めて現代的な現象であるという観点から、その背景と実態の把握を行う。同時にこの種の暴力に注目することでこの地域の特色について考察する。地中海-西・南アジア地域出身者が移住先の欧米で作っているディアスポラ(移民)社会についても研究対象とする。その際「名誉に基づ暴力」をたんなる伝統主義の表出ではなく、都市化、市場化、グローバル化の影響を受けたきわめて現代的な現象であるという観点から、その背景の理解と実態の把握、そして解決の可能性を探求する。初年度は、研究会については2回開催した。1回目は趣旨説明、2回目は村上と研究協力員の和崎春日が発表を行った。調査や研究者との情報交換については、2013年夏に村上がトルコ、嶺崎が英国、冬から春にかけては、辻上がレバノン、ドバイ、アブダビ、田中がトルコ、アブダビ、イスラエル、赤堀がエジプト、レバノン、小牧がパキスタンで実施した。また和崎がウズベキスタンで調査を行った。研究成果についても各自学術雑誌や論文集に投稿・寄稿している。地中海から西アジア、そして南アジア北西部にいたる地域(以下地中海-西・南アジア帯と呼ぶ)においては、名誉と恥が社会的に重要な観念とみなされてきた。名誉に基づく暴力については、地中海-西・南アジア帯を中心に報告が相次いでいて、日本の新聞などでも取り上げられるようになり、社会的にも注目されている問題と言える。その際「名誉に基づく暴力」をたんなる伝統主義の表出ではなく、都市化、市場化、グローバル化の影響を受けたきわめて現代的な現象であるという観点から、その背景の理解と実態の把握、そして解決の可能性を探求する。2014年度は、本研究の実施2年目ということで、地中海-西・南アジア帯に加え、それを故地とする人々の移民先であるヨーロッパでも調査を実施した。研究会においては、メンバー以外にゲストスピーカーが、英国のパキスタン・コミュニティーでの調査報告やコソボの名誉と女性のセクシュアリティの管理についての報告を行った。2015年度は最終年度にあたるため、日本文化人類学会研究大会で分科会を組織し、本研究の成果の一部を発表する予定である(採択決定)。中東地域における政情不安のため、当初の予定を一部変更せざるを得なかったが、全体としては大きな変更はなく、順調に研究を進めている。地中海から西アジア、そして南アジア北西部にいたる地域(以下地中海ー西・南アジア帯と呼ぶ)においては名誉と恥が社会的に重要な観念とみなされてきた。本研究では研究期間を3年とし、こうした観念と密接に関係する「名誉に基づく暴力」(honor-based violence)について地域的文脈を尊重しつつ、包括的かつ体系的に分析することを目的としてきた。名誉に基づく暴力については、地中海ー西・南アジア帯を中心に報告が相次ぎ、日本でも新聞などで取り上げられるようになり、社会的にも注目されている問題と言える。同時にこの種の暴力に注目することでこの地域の特色について考察した。地中海ー西・南アジア帯出身者が移住先の欧米で作っているディアスポラ(移民)社会についても研究対象とした。具体的には、インド、パキスタン、ウズベキスタン、サウジアラビア、トルコ、ギリシャ(ロマ社会)、ドイツ(トルコ人社会)、ノルウェー(パキスタン人社会)、フランス(モロッコ人社会)などで調査を行った。研究会を実施し個別報告会を行うと同時に、2015年5月に日本文化人類学会研究大会(大阪)にて「名誉に基づく暴力」という分科会を組織した。11月には名古屋で研究会を行った。また12月に東京で公開講演会「名誉・暴力・ジェンダー」を開催した。さらに、12月に国際シンポDiversity of the Meaning of Being 'Single' on the Globe: Drastic Changes of the Way of Life, Human Relations, and Kinshipを東京外国語大学アジア・アフリカ言語文化研究所のプロジェクトと共催した。さらに、やはり共催で2016年1月には京都大学で著名な文化人類学者Veena Das教授のセミナーを企画、実現した。

地中海-西・南アジア帯出身者が移住先の欧米で作っているディアスポラ(移民)社会についても研究対象とする。本研究では「名誉に基づく暴力」を、伝統主義の表出としてではなく都市化、市場化、グローバル化の影響を受けた極めて現代的な現象であるという観点から、その背景と実態の把握を行う。2014年度には、本研究のメンバー二名が、中東社会とジェンダーについての単著を公刊した。これは、女性による日本語での研究ということで重要な学術的貢献である。フィールドワークについては、地中海-西・南アジア帯に加え、移民先であるヨーロッパでも調査を実施した。これは新しい試みであるが、順調に進んだ。ただし、イスラーム国の勃興や、アラブの春以後の情勢不安のため当初のフィールドワークの予定を一部変更せざるを得なかった。しかし、全体として当初の予定通り進んでいる。27年度が最終年度であるため、記入しない。人文学2015年度は最終年度のため、成果の公表とフォローアップを目的とするフィールドワークが主たる活動になる。前者については5月末に開催される第49回日本文化人類学会研究大会にて分科会を組織し、本研究の成果を公表する。また年度末には公開講演会を京都で開催し、広く一般の人々に名誉に基づく殺人(ならびに殺傷事件)、それに関係する性暴力などの実態を明らかにするとともに、その克服の動きについても紹介する。さらに、本研究成果を研究報告書としてまとめ、公刊する予定である。調査地の政情変化には臨機応変に対処し、危険を避けることを最優先課題にして調査地を選定し、フィールドワークを実施する。初年度は主としてフィールドワークや研究者とのネットワークなどを中心に活動を行った。政情不安のために予定地域を変更した場合もあるが、それによって大きな支障が生じた訳ではない。地中海や南西アジア地域における名誉殺人や欧米におけるイスラーム系のディアスポラ社会における女性への暴力は、世界的に注目されており、大規模なプロジェクトも発足している。こうしたプロジェクトと連携しさらに展開していく可能性があることを確信した。研究会は予定より少なかったが、研究発表は充実していた。またそれを補う形で、メールなどで緊密に連絡を取ることで個々の研究の進捗状況がわかるようにしている。全体に、順調に進展していると評価できる。分担者のうち、嶺崎氏は平成27年3月に出産を控えていたため、予定していた北米およびエジプトでの調査を取りやめた。また、岩谷氏についても平成27年6月に出産予定だが、経過が不安定だったため平成26年度冬に予定していたギリシアでの調査を取りやめた。このため、旅費予算となっていた分担金の一部が返金され、次年度使用額が発生した。
ゲノム連鎖とエピゲノムがもたらすA群レンサ球菌の系統進化機構の解明

A群レンサ球菌(Group A Streptococcus,以下GASと示す)は、幅広い症状を呈することが知られている。症状を全く引き起こさないこともあれば、咽頭炎、扁桃炎といった軽症(世界で年間6億人)、致死率が30%を超える劇症型感染症(世界で年間50万人)を引き起こすこともあり、臨床的にも重要な病原細菌である。本研究では従来考慮されてこなかった「非劇症型株」を合計259株用いて比較ゲノム解析を実施し、A群レンサ球菌の「株特異的病原性発揮機構」を情報学的に明らかとしてきた。具体的には、i)劇症型株に特異的に保存されている新規SNPsを多数同定し、ii)劇症型特異的に優占するファージと外来性病原因子や、iii)ファージ由来メチラーゼによるメチル化パターンが病原因子により異なることを見出した。また、本種の多様化においては、原核生物の獲得免疫システム(CRISPR)と病原因子の運搬役であるバクテリオファージの関わりが主要な役割を果たし、CRISPRの欠失が一つの種内を大きく2つのグループに分ける要因になっていることを明らかにした。各グループの特徴として、CRISPRを保有するグループはゲノムを構成する遺伝子数がほぼ一定で保守的であるのに対し、CRISPRを欠損したグループはゲノム上に多様なファージの出入りがあり、種としては多数の遺伝子種を保有するが、全株共有の遺伝子種はCRISPR保有型に比べ少なくなっていた。すなわち、「ファージを介したゲノム縮小という新規ゲノム進化機構」の存在を明らかにすることができた。平成30年度が最終年度であるため、記入しない。ヒトの重要な病原細菌である「A群レンサ球菌の株特異的病原性発揮機構の解明」を1,000株程度の比較ゲノム解析、ゲノム連鎖解析、トランスクリプトームとメチローム解析から明らかにし、これをモデルとして「細菌におけるエピジェネティック駆動型の適応進化」研究基盤を築くことを目的として研究を進めている。これまで、GASによる劇症型感染症の発症メカニズムを解明するために、本菌の全ゲノム解読および比較ゲノム解析、病原因子の機能解析、また、宿主側の免疫機構解析が進められてきた。こうした研究から、本菌はゲノムサイズが小さい割に多くの病原遺伝子を保有していること、また、病原関連遺伝子の二成分制御システムにおける一塩基多型(SNP)が劇症化の一因ではないかと報告されている(PLoS Pathog., 2009等)。しかし、本遺伝子のSNPだけでは劇症株のごく一部しか説明できていない。GASによる劇症型感染症の原因を究明するには、CRISPR欠損型においては劇症型株が多く含まれること、急速な単一クローンの拡散機構の解明が重要な課題として残されており、この解明を本課題の目的とする。すなわち、i)劇症型株特異的遺伝子は存在しないため、劇症型特異的SNPsの関与、ii)ファージによってもたらされる外来性の病原因子の組み合わせ、iii)ファージ由来メチラーゼによるメチル化に伴う病原遺伝子発現への影響、を明らかにする(病原性大腸菌では全遺伝子の1/3に影響を与えることが報告された; Nat Biotechnol. 2012)、ことを進めている。その成果として、本年度の比較ゲノム解析の結果、メチラーゼのゲノム間多様性は、GASの病原性やゲノム多様性をもたらすバクテリオファージによってもたらされていることが明らかとなった。予備データからA群レンサ球は、異なる種類・数の制限修飾系を有しており、その多くが可動性因子上に存在し、メチロームプロファイルが株ごとに異なっている。そこで、予備データの6株に加えて、近縁かつ可動性因子上のメチラーゼが異なる2菌株4セットの合計8菌株を選定し、メチローム解析を実施した。メチローム配列取得については、抽出したゲノムDNAについて、ライブラリの作製(インサート長20 kbp程度)、Pacific Biosciences PacBio RS II (P6C4 chemistry)での配列取得を1試料につき500 Mb以上の配列を取得する(5mCを含むメチル化部位の検出のため下記ゲノムサイズのx 250以上のシーケンスが必要)。特に単独で存在し、そのメチラーゼの種類と数に多様性が高いType II制限修飾系に着目する。全A群レンサ球菌株のファージ、Integrative and conjugative elements (ICE)についてコドン使用頻度等を用いて情報的に予測し、染色体上と可動性因子上の制限修飾因子をREBASEデータにより予測した(http://rebase.neb.com/rebase/rebase.html)。これらは、申請書に記載した内容であり、ほぼ同内容を実施できていることから、進捗は概ね順調であるといえる。本研究では、ヒトの重要な病原細菌である「A群レンサ球菌の株特異的病原性発揮機構の解明」を1,000株程度の比較ゲノム解析、ゲノム連鎖解析、トランスクリプトームとメチローム解析から明らかとし、これをモデルとして「細菌におけるエピジェネティック駆動型の適応進化」研究基盤を築くことを目的として研究を実施してきている。すなわち、i)劇症型株特異的遺伝子は存在しないため、劇症型特異的SNPsの関与、ii)ファージによってもたらされる外来性の病原因子の組み合わせ、iii)ファージ由来メチラーゼによるメチル化に伴う病原遺伝子発現への影響を明らかにする(病原性大腸菌では全遺伝子の1/3に影響を与えることが報告された, Nat Biotechnol. 2012)。