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尿細管性機序に基づく食塩感受性・高血圧症の分子病態の解明と展開

遺伝性家族性高血圧症の遺伝子解析によって、腎尿細管におけるナトリウム再吸収機構に高血圧症の一次的な異常が存在する可能性が示唆された。研究代表者はアルドステロン感受性遠位尿細管上皮細胞(ASDN)の上皮性ナトリウムチャンネル(ENaC)に特異的なユビキチン化酵素であるNedd4L/Nedd4-2に着目して、本態性高血圧症・食塩感受性の成因を解明してきた。Nedd4L/Nedd4-2によるENaCの制御機構に着目した分子病態モデルの解析により、緻密班以後のASDNのナトリウムチャンネルであるENaCにより、Na再吸収を食塩感受性に亢進に至らしめる、逆説的な分子病態があることが明らかになった。これまでの研究によって、高血圧症・食塩感受性の病態をもたらす尿細管性機序には、AGT in PT (近位尿細管細胞でのアンジオテンシノーゲン)、Renin in CNT (結合尿細管細胞でのレニン)から構成される尿細管レニン・アンジオテンシン系(tubular RA系)による、アルドステロン感受性遠位ネフロンにおけるENaC-Nedd4L系によるナトリウム再吸収機構による恒常性の維持と破たんに由来する分子病態があることが明らかになった。本研究では、こうした分子レベルでの病態を、さらに追求するとともに、分子病態モデルをヒトに応用する。ヒトの高血圧症・食塩感受性を尿細管細胞に着目して制御することで、疾病・病態の克服を目指すTR(トランスレーショナル・リサーチ)を展開した。平成26年度は、不死化したヒトRPTECについての解析を進めた。immunoblotting解析にて、培養上清、細胞中のAGTの発現、分泌を確認した。また、培養上清中のAGTの定量のhigh throughput化に必要なsandwitch ELISAを応用した、新規のアッセイ系を確立することに成功した。現在、10cm dishから、small scale 96 wellの培養系の微量検体に対する、高感度のアッセイ系による分泌アンジオテンシノーゲンの測定プロトコールの固定化を目指している。尿細管RA系を構成する、重要な因子である結合尿細管レニンについて、昨年新規のalternative transcriptを発見し、報告した。(Ishigami T, etal. Hypertension, 2014)昨年度は、尿細管特異的に発現するKspIプロモーターを使った、(P)RR TGマウスの作製に成功し、現在系統維持、繁殖、表現型解析を行っている。今年度は、研究代表者が独自に作製したNedd4-2 C2KOマウスを用いた検討をすすめた。代謝ケージでの飼育、観血的テレメトリ法によるマウス血圧の直接的観察、腎臓の分子生物学的解析、免疫組織学的解析により、Nedd4-2 C2KOマウスが経口食塩摂取量に応じて血圧の上昇(食塩感受性高血圧)を呈すること、代謝ケージによる観察で飲水量・尿量の増加に先行して、尿中ナトリウム排泄量が低下すること、アルドステロン感受性遠位ネフロンでの上皮性ナトリウムチャネル(ENaC)の発現が亢進することを明らかにした。Nedd4-2は、ENaCのユビキチン化酵素であり、本研究からNedd4-2 C2 isoformが腎尿細管特異的にENaCのユビキチン化を通じた翻訳後修飾制御に主要な働きをしていることが明らかになった。Laser Micro Dissection法によって単離したASDN上皮細胞の解析から、遺伝子レベルで発現が亢進している未知の病態が存在することも明らかになった。今後は、食塩感受性・高血圧症の成因を分子レベルで解明し、分子病態に基づいた理論的整合性のある診療(診断・治療)にむけたトランスレーショナル・リサーチを目指した研究を進める。ENaC-Nedd4-2系、尿細管レニン・アンジオテンシン系を統合した食塩感受性病態モデルから、ヒト近位尿細管細胞におけるアンジオテンシノーゲン分泌の制御を目指した低分子化合物探索の研究を進めている。ヒト近尿細管細胞の不死化に成功し、アンジオテンシノーゲンの分泌を確認し、高感度でスループット性の高いαLISA法による定量法の開発に成功している。Nedd4-2 C2KOマウスの表現型の解析に成功し、食塩感受性・高血圧の分子病態を明らかにすることができた。尿細管レニン・アンジオテンシン系の基質である、近位尿細管細胞から分泌されるアンジオテンシノーゲンを、ヒト由来の培養細胞で証明することができて、創薬研究につながる実験系を構築することに成功している。in silico的手法を用いて、マウスNedd4-2遺伝子の分子多様性を明らかにし、Nedd4-2 C2ドメインをコードする新規エクソンの発見に成功し、Nedd4-2 C2ドメイン特異的なKOマウスを作製し表現型を解析した。(Minegishi S,Ishigami T, et al.Scientific Reports, 2016)本研究では、代謝ケージを使った観察によって、正常食塩食下ではKOマウスと野生型マウスは、尿中ナトリウム排泄量・尿浸透圧・尿量・飲水量がすべて同等の変化を示すのに対して、高食塩食下においてKOマウスでは、食塩感受性に血圧上昇を来すとともに、尿中ナトリウム排泄・尿浸透圧の低下が先行する形で、尿量・飲水量が増加していく病態が明らかになった。

さらにNedd4-2 C2 KOマウスのASDN細胞におけるαγENaCの発現を検討した結果、食塩感受性かつ、線形性にαγENaCの発現が増強することを明らかにしただけでなく、遺伝子発現が、amiloride投与によって正常にまで抑制されることが判明した。アミロライドを投与することで正常化するこの病態は、ENaC自身が尿細管中のナトリウムのセンサーとして働いて、細胞中のナトリウムの変化がENaC遺伝子の発現を亢進させる、未知の食塩感受性の分子メカニズムであると考えられた。こうしたこれまでの研究の概要は、平成28年度に行われた第39回日本高血圧学会シンポジウム(仙台)で、『Hypothesis DrivenApproachによる食塩感受性・高血圧の成因としてのENaC-Nedd4L/Nedd4-2系の役割の検討』と題して発表した。遺伝性家族性高血圧症の遺伝子解析によって、腎尿細管におけるナトリウム再吸収機構に高血圧症の一次的な異常が存在する可能性が示唆された。研究代表者はアルドステロン感受性遠位尿細管上皮細胞(ASDN)の上皮性ナトリウムチャンネル(ENaC)に特異的なユビキチン化酵素であるNedd4L/Nedd4-2に着目して、本態性高血圧症・食塩感受性の成因を解明してきた。Nedd4L/Nedd4-2によるENaCの制御機構に着目した分子病態モデルの解析により、緻密班以後のASDNのナトリウムチャンネルであるENaCにより、Na再吸収を食塩感受性に亢進に至らしめる、逆説的な分子病態があることが明らかになった。近位尿細管上皮細胞(RPTEC)からの、アンジオテンシノーゲンの発現、分泌制御を解明する研究では、1不死化RPTECの確立とCharacterの確認。2RPTECからのアンジオテンシノーゲン分泌、産生の確認。3ELISA系のHTS化の3点について、ほぼ結果を得ることができた。今後は、具体的な分子や、化合物による制御を明らかにするとともに、in vivoでの系での検証にすすめていきたい。遺伝子改変動物の確立に成功し、表現型の解析に着手している。また、従来よりすすめていたNedd4LC2KOマウスの解析については、論文作成し、revisionのプロセスに入っており、引き続き論文受理を目指す。今後は、さらに食塩感受性・高血圧症の成因を分子レベルで解明し、分子病態に基づいた理論的整合性のある診療(診断・治療)にむけたトランスレーショナル・リサーチを目指した研究を進める。独自に開発したNedd4-2 C2KOマウスを対象にして、in vivoでのASDNにおけるENaCのparadoxicalな転写調節機構を明らかにすると同時に、ヒト不死化近位尿細管細胞(immortalized RPTEC)を用いたアンジオテンシノーゲン分泌機構の解明を目指している。高血圧・食塩感受性immortalized RPTECおよび、新規ELISAを使って、ヒト近位尿細管細胞におけるアンジオテンシノーゲンの発現、分泌制御を解明していく。遺伝子改変動物を使った、食塩感受性・高血圧症の分子メカニズムを解明していく。これらの研究成果を統合して、ベッドサイドでのトランスレーショナルリサーチの実現を目指す。
ユリ科山菜の増殖と栽培に関する研究

1.ギョウジャニンニクの種子発芽(1)種子の発芽適温。種子の発芽は17°Cと21°Cで他の温度より良好であったが、17°Cと21°Cとの間には発芽率、発芽速度(初期発芽)、光感性で著しい差異がみられた。すなわち、17°Cでは発芽率が21°C(ほとんど100%)に比べるとかなり低かったが、発芽速度が21°Cより速かった。また、21°Cでは光りの有無は発芽にほとんど影響しなかったが、17°Cでは著しい暗発芽性を示した。種子の実用的な発芽適温は系統間で若干差異がみられ、山形県に自生していた系統'山形'では発芽速度と発芽率とを総合的に考慮した場合、発芽適温は21°Cとみなされたが、北海道に自生していた系統'北海道'ではそれが17°Cとみなされた。(2)種子の休眠期間。個体変異が著しく大きいが、約50%の種子は自然開莢後約1ケ月で休眠が覚醒するようである。(3)採種後の種子の保存方法。少なくとも5ケ月以内の貯蔵の場合は、中温や涼温の恒温貯蔵より室温貯蔵のほうが発芽速度や発芽率の点で優れていた。種子を6ケ月以上貯蔵する場合は低温・多湿貯蔵が発芽速度、発芽率の低下抑制に効果があった。(4)種子の発芽促進法。ジベレリン処理は発芽を著しく促進させた。高温処理も発芽促進に効果があり、毎日あるいは1日おきの変温処理として与えても、前処理として先に一括して与えても効果があった。2.オオナルコユリの種子発芽。採種後の種子は深い休眠状態にあり、この休眠は種子が約13°C以下の温度を経過しないと、260日以上経過しても打破されなかった。種子の低温経過後の発芽適温は13-21°Cであった。3.アサツキの生長力の季節的変動と休眠アサツキの葉と根の生長力は夏期休眠期を除く全生育期を通じて月単位でかなり大きく変動した。晩秋初冬期に生長力が1ケ月強の期間著しく低下したが、この生長力の低下は自発休眠によるものとみなされた。
病的血管新生に働くVEGF下流分子を標的とする副作用のない未熟児網膜症治療の試み

本研究の目的は、申請者が病的血管新生に関わることを見出した、VEGF下流分子であるT-cell specific adaptor (TSAd)が未熟児網膜症(ROP)の病的血管新生にも関わることを明らかにする。更に、TSAdのノックアウトマウスやノックダウンを利用し、ROPの治療標的としての可能性を検証する。現在、TSAd阻害因子のスクリーニングを並行して進めており、そこから得られた低分子化合物を用い、最終的にROPの創薬を目指す。研究の方法は以下の4つのパラグラフで進めていく。1ROPモデルにおけるTSAdの発現状況:TSAdのRNAとタンパクの発現を明らかにする。2TSAd欠損マウスを用いたROP発症の検討する。3TSAd阻害剤のROPへの有効性の検討する。4その他のROP発症に関わる因子の探索する。上記1の検討のため、ROPのマウスモデルを作製し、網膜の血管新生の程度をレクチン染色で確認したところ、確かに中枢側の血管の退縮と硝子体側への血管新生が観察された。ここで得られた網膜を用い、TSAd分子の転写レベルでの動態をreal-time PCRで比較検討した。ROPモデルにおいて、TSAd分子の上流であるVEGFの網膜における有意な上昇が確認できた。また、同マウスにおいてTSAd分子の上昇も観察された。現在、上記1についてはサンプル数を増やし継続しており、それに加え、2について解析を開始している。高濃度酸素下での母および仔マウス飼育において、十分な数の同胎マウスが得られておらず、サンプル数の集積が遅れている。今回示した実験について引き続きサンプル数を増やし、その再現性の確認と統計学的な部分について検討を進める。また、実験計画書通り、ノックアウトマウスを用いたROPモデルの検討を行い、TSAdのROP発症への実際の関与を確かめていく。ノックアウトマウスでは代償起点が働いていることも十分考えられるため、実験計画にあるように、今後、TSAd KOマウスにおいて網膜症発症時に野生型マウスと異なる動態を示す分子を質量解析を用いて探索していく。また、これらの代償因子の影響を受けずに検討を行うために、後天的KOである内皮細胞特異的TSAd KOマウスを用い、同様の検討を行っていく。この時、KOを起こす時期により、網膜症のphenotypeの変化が予想され、薬剤としてのTSAd阻害剤の有効性や投与時期についての検討に役立つと考えられる。次年度は引き続きマウスを用いROPモデルを作製し研究を進めていくため、マウスの購入・飼育費および高濃度酸素環境を維持するための酸素ボンベの購入費用が必要となる。さらには、実験計画に示している試薬の購入と、今後必要となるin vitroの実験系のために、培養内皮細胞株の購入費用に充てる。
ホルモン依存性乳癌の自律増殖能獲得機構の解明

ホルモン依存性乳癌(TP DMT-4;T4と略)のエストロジェン(E)とプロジェステロン(P)存在下での長期継代及び酵素処理遊離細胞移植により、自律性亜株を樹立した。亜株にはE受容体(ER)とPRの両方を消失しているものとERを所持しPRを消失したものがあった。臨床的に見られるER陽性内分泌療法抵抗性乳癌でのERの意味を解明する目的で、T4とER陽性自律性亜株の間でERの機能・物理化学的性質を比較研究した。細胞質ERのステロイド特異性プロフィルは両株で同じで、ERからのEの解離と分子サイズの変化の追求から、活性化過程にも差がみられなかった。ERの貯蔵部位とも考えられているミクロソームERについても、Eとの結合特異性に関して差がなかった。ERの機能発現には活性化ERの核内でのクロマチントの相互作用が必須であることを考慮して、核内ERの性質を比較した。活性化ERとDNAセルロースの結合及びクロマチン結合ERの分子サイズに両株間で差がなかったが、活性化ER-クロマチン複合体とEの結合力はT4よりも自律性亜株で2倍以上強く。これを支持して、上記複合体からのEの解離が自律性株で有意に遅かった。E作用の1つとして、T4乳癌ではEによりPR合成が誘発されるが、ER陽性自律性亜株では、誘発されないことを考えると、この自律性乳癌では、ERとDNAの相互作用以降の段階に障害があり、Eによる調節が起らないと推察される。このことはヒト乳癌でもERの有無だけでなく、ERの機能も含めて検査することの重要性を示しているので、その技術の開発が望まれる。なお、このようなER機能の障害と自律増殖の関係は今後の課題である。現在までの成果では、乳癌ウイルス(MTV)情報のDNAへの組み込みやプロMTVの発現状態、さらに自律増殖能の獲得に伴なう染色体の変化との間で一定した関係が見つかっていない。
Ｖａｖ３遺伝子を治療標的としたホルモン抵抗性前立腺癌治療法の開発

低酸素培養前立腺癌に対する低酸素誘導遺伝子Vav3ノックダウンによるドセタキセル(DTX)作用増強効果を解析した。siRNAによるVav3ノックダウンによりAkt、ERKリン酸化抑制を認め、さらにARリン酸化抑制によってDTX誘導アポトーシス効果は増強した。DTXによるBcl2リン酸化亢進に加えVav3ノックダウンによるBad脱リン酸化がアポトーシス誘導効果を増強した。動物モデルにおいてもDTX投与による抗腫瘍効果はsi-Vav3/アテロコラーゲン複合体を腫瘍内注入により増強された。以上の結果からVav3遺伝子は去勢抵抗性前立腺癌の治療標的となりDTX治療効果を増強する可能性が示唆された。高増殖・高遊走-浸潤能を有するLNCaP/CH細胞の転移能および致死性をin vivoにて検討した。Luciferase cDNAを遺伝子導入したLNCaP -Luc細胞あるいはLNCaP/CH -Luc細胞をヌードマウスにそれぞれ50万個心臓内注入し、経時的に全身転移巣の出現および生存率を検討した。全身転移巣の検出はCCDカメラで経時的に解析定量し、また骨転移巣はX線にて評価し、死亡した時点で解剖し多臓器転移巣を検索した。さらに切除した転移組織におけるEMT関連分子(E-cadherin、N-cadherin、Vimentin)およびSnailを免疫染色し、その発現様式を投与した培養細胞と比較した。LNCaP/CH -Luc細胞群ではコントール群と比較して骨転移巣出現率が高く、また有意な生存率の低下を認めた。X線解析では骨転移巣は両群とも造骨性変化が強く、Vav3高発現による影響は認めなかった。剖検結果は、LNCaP/CH -Luc細胞群においてコントロール群と比較して多臓器転移(肝臓、肺、皮下)を有意に多く認めた。骨転移巣における免疫染色の結果はLNCaP/CH -Luc細胞群においてE-cadherin発現低下、N-cadherin発現亢進、Vimentin発現亢進およびSnail発現亢進を認め、その発現様式は培養細胞に類似していた。しかしコントロール群においても同様の傾向があり、さらなる検討が必要である。次にLNCaP/CH細胞のドセタキセル感受性およびアポトーシス誘導効果が、Vav3 siRNA処理した際に増強されるか解析した。LNCaP/CH細胞にVav3 siRNAを遺伝子導入した24時間後にドセタキセル投与開始し、併用効果についてドセタキセル濃度および経時的に細胞増殖速度、さらにはFacsによるアポトーシス細胞定量化を行った。さらにCaspase活性に加え、Caspase-3,8,9、PARPについて免疫ブロット法にて解析した。LNCaP/CH細胞ではVav3 siRNAによるVav3ノックダウンによりドセタキセル感受性亢進を認め、さらにはアポトーシス誘導効果(sub G1数、TUNEL染色およびCaspase活性、Caspase3,9分断化、PARP分断化)の増強を認めた。一方、Caspase-8の変化は認めなかった低酸素培養前立腺癌に対する低酸素誘導遺伝子Vav3ノックダウンによるドセタキセル(DTX)作用増強効果を解析した。6ヶ月間以上低酸素環境下で継代培養した長期低酸素培養前立腺癌細胞(LNCaP/CH)の高遊走-浸潤能はEMTに由来する可能性があるため、まずEMT関連分子のうちE-cadherin、N-cadherin、Vimentin遺伝子をreal-time PCR法さらに蛋白発現量を免疫ブロット法にて解析し定量した。LNCaP/CH細胞において遺伝子および蛋白レベルでのE-cadherin発現低下、N-cadherin、Vimentin発現亢進を認めた。次にEMT関連分子の転写因子として知られるSnailの発現を遺伝子および蛋白レベルで解析した。Snail発現はLNCaP細胞およびLNCaP/CH細胞とも同程度であったが、細胞質分画と核分画における発現量を定量する必要がある。Snailは転写因子として作用するシャトル蛋白であり、細胞内局在を免疫染色法で評価した。LNCaP/CH細胞においてSnailの核移行が著明であり、EMTに関与する可能性が示唆された。胚細胞においてSnail活性化にStat3-LIV1シグナル伝達系の関与が報告されており、LNCaP/CH細胞におけるStat3活性化状態についてリン酸化Stat3抗体を用いた免疫ブロット法で解析した。LNCaP/CH細胞においてStat3リン酸化の亢進を認め、前立腺癌細胞においてもStat3-LIV1-Snailシグナル伝達系活性化がEMTに関与する可能性が示唆された。LIV1遺伝子発現もLNCaP/CH細胞において亢進しており、Stat3-LIV1-Snailシグナル伝達系活性化を支持する結果が得られた。長期低酸素培養前立腺癌細胞(LNCaP/CH細胞)に対する低酸素誘導腫瘍遺伝子Vav3ノックダウンによるドセタキセル(DTX)作用増強効果を動物モデルにおいて解析した。

LNCaP/CH-Luc細胞をヌードマウスに皮下移植し、移植後21日後からDTX10mg/kg、1回/週、経腹腔投与およびVav3 siRNA-アテロコラーゲン複合体1回/週、腫瘍内投与した。腫瘍径およびluciferase発光強度の変化をin vivoイメージングシステムで計量し、無治療コントロール群、Vav3 siRNA単独治療群、DTX単独治療群、DTX+siRNA治療群において比較した。同時に体重変化を測定し、有害事象の発生を検討した。まず予備実験によりVav3 siRNA-アテロコラーゲン複合体の投与量を2.5μgに決定した。Vav3 siRNA単独治療群は無治療群と比較して有意に腫瘍増大速度の低下を認めたが腫瘍縮小効果はなかった。DTX単独治療群およびDTX+siRNA治療群では移植後42日目から腫瘍縮小効果が現れ、またDTX+siRNA治療群においてDTX単独治療群と比較して有意に腫瘍径の縮小を認めた。luciferase発光強度に関しても概ね腫瘍径の変化と同様であったが、腫瘍内部壊死による発光強度の減弱を認めた。移植後70日目に腫瘍を採取し、TUNEL法に加えKi67、Bcl-2、pAR、Vav3による免疫染色を施行し、腫瘍増殖およびアポトーシスを定量化した。siRNA治療群ではpAR発現量が低下しており、DTX治療によるアポトーシス誘導効果(TUNEL陽性増加、Bcl-2発現低下、Ki-67 index増加)に加えARを不活化することによる細胞死の誘導を認めた。以上の結果からVav3遺伝子を治療標的とすることでAR活性が抑制されDTXのアポトーシス誘導効果を増強する可能性が示唆された。前立腺癌治療平成25年度研究予定ではLNCaP/CH細胞の悪性化をin vivoで証明することを主に計画していた。LNCaP/CH細胞群での高転移率(特に骨)および生存率の低下は遊走・浸潤能亢進を認めるVav3高発現細胞の特性が生体内でも反映される結果であった。また摘出病変の分子学的解析からは転移巣でのMET変化はないことから、転移巣での細胞定着よりもさらなる浸潤傾向が示唆された。さらに治療法確立のためにドセタキセルとVav3 siRNAの併用処理によるアポトーシス誘導効果の増強について解析した。この分子学的機序の解析まで十分に研究は進んでいないため、達成度としては上記と考える。平成24年度の研究予定においてはLNCaP細胞とLNCaP/CH細胞におけるEMTの分子生物学的解析を計画していた。LNCaP/CH細胞で観察される浸潤・遊走能の亢進は形態的には特記すべき変化を認めなかったが、分子学的にはEMT関連分子の発現および転写因子であるSnailの細胞内局在の変化に由来している可能性が示唆された。
酸化ストレスや金属毒性等に耐性や誘導性を示す野生植物の遺伝子群の解析と応用

メリケンカルカヤは、Al、Zn、diamideなどの金属ストレスや酸化ストレスに耐性を示す野生植物である。本研究では、他のイネ科植物と対比しながら、その高い金属耐性機構を解析した。1)一酸化窒素(以下、NO)は、植物の環境ストレス等でシグナル伝達物質として機能することが報告されているが、メリケンカルカヤや他の3種類の植物ではAl、Cd、Cr、Cu、Znなどの金属ストレスで生成されるのか、またどのような役割を持つのかを検討した。その結果、NOはAlストレス下で顕著に発生したが.このような生成は他の植物では見られなかった。また、メリケンカルカヤでは、CdとZn処理でNO生成が見られたが、Cr、Cu処理では生成が認められなかった。さらにNOの生成を誘導させる前処理を施した後にAl処理してみたところ、脂質過酸化の発生はある程度抑制できたものの、核DNAの断片化に変化が無かったし、根の伸長阻害も変わらなかった。以上のことから、NO自体の耐性機構での効果は限定的だと思われた。2)これまでにメリケンカルカヤから、Alストレス誘導遺伝子ABC transporter (AP18-2-1)を、またAl耐性遺伝子S-adenosyl methionine syntase (SAMS)(AL3A-4)をコードする遺伝子を得ている。酵母形質転換体では、イネのSAMSはAl、Cd、Znに対して耐性を示した。一方、トウモロコシ由来のABC transporterはdiamideに対しては耐性を示したものの、Cu、Znには逆に感受性を示すという結果となり、両遺伝子は金属ストレスや酸化ストレスの耐性機構や毒性機構に関連することが示唆された。さらに詳細な機能解析のために、両者の完全長cDNAをメリケンカルカヤより単離し、これらをシロイヌナズナへの導入した。現在、ホモザイゴートを得るための継代中である。1)重金属集積植物の解析重金属を高集積するような耐性植物を選抜、検索するために、メリケンカルカヤ、ススキ、イヌビエなどの6種の野生植物に対してCd,Cu,Znなどの重金属ストレスを付加し、植物体内への集積の状況や同時に発生する酸化ストレス(脂質酸化物の蓄積)の状況を経時的に測定している。現在も継続して解析中である。2)メリケンカルカヤの示す多種のストレス耐性機構の解明メリケンカルカヤは、Al,Znなどの金属ストレスやH_2O_2、diamideなどの酸化ストレスに対して耐性を示す。そこでこの多種耐性機構に関連すると考えられる遺伝子群の単離と解析を試みた。まずAlストレスを付与したメリケンカルカヤから全RNAを抽出し、逆転写によりcDNAを調製しcDNA libraryを構築した。さらにlibraryからAl,Cd,Zn,diamide,H_2O_2等に耐性を示すクローンの単離を行った。その結果、其々のストレスに対していくつかのクルーンが得られたので、さらにその耐性について再現性を確認した。さらに挿入されていたcDNA断片に関して塩基配列を決定し、その機能の推定を行ったところ,AL3A-4クローンについては、SAMS(S-adenosyl methionine synthetase)遺伝子であることが明らかとなった。しかし、残りのクローンついてunknown proteinであった。SAMS遺伝子の完全長cDNAを得て、これを導入した酵母形質転換体についても感受性試験を行った。その結果、この形質転換体も金属ストレス、酸化ストレスに広範囲に耐性を示した。Kottapali博士は、この江崎の研究の一部を今回担当した。メリケンカルカヤは、Alストレス、重金属ストレス、酸化ストレス等に広く耐性を示す野生植物である。その耐性機構を解明し、他の植物に応用できれば問題土壌への作付けが可能となり農業上、大変有益である。このような観点から野生植物を用いて、Kottapalli博士と共同研究を進めた。1)メリケンカルカヤでのAlストレスでの耐性機構まずAlストレス処理したメリケンカルカヤの根と地上部の中のAl含有量を測定した。その結果、土壌から吸収した毒性Alを根に過剰蓄積しないように地上部へ輸送することが耐性となる要因の1つであることが示された。また、地上部に輸送されたAlは、葉の表面のトライコームに集積しやすいことも明らかにし、葉の表面から外界へ排出される可能性を示唆した。また、メリケンカルカヤなど5種類の野生植物を用いてAl、Zn、Cr金属ストレスにおける根から地上部への毒性金属の輸送についての比較実験にも博士は参加した。その結果、メリケンカルカヤでのみ、高い地上部へのAl輸送活性が見られた。2)メリケンカルカヤでのストレス特異的なNO(nitric oxide)の生成についてAlを含めた金属ストレスや温度ストレス下にある植物はNOを生成するが、これが毒性機構の現われなのか、耐性機構の1種なのかは不明である。まずKottapalli博士はNO特異的な蛍光指示薬であるDAF-FMを用いて、メリケンカルカヤの根でもNOが発生することを確認した。ところで、Alストレスは2次的に酸化ストレスを誘引する。そこでNOの発生阻害剤で予め処理した後にAl処理し、酸化ストレスの発生状況を検討した。その結果、Al処理したにも関わらずNOの発生や酸化ストレスの生成が抑制された。これらは、Alストレス、NOの生成、酸化ストレスの2次的発生の間の強い関連性を示している。我々はNOの生成が毒性機構の現われであると同時に、抗酸化作用を引き起こすことにも役立っていると考えており、毒性機構から耐性機構へ繋がる重要な現象と考えた。

メリケンカルカヤは、Al、Zn、diamideなどの金属ストレスや酸化ストレスに耐性を示す野生植物である。本研究では、他のイネ科植物と対比しながら、その高い金属耐性機構を解析した。1)一酸化窒素(以下、NO)は、植物の環境ストレス等でシグナル伝達物質として機能することが報告されているが、メリケンカルカヤや他の3種類の植物ではAl、Cd、Cr、Cu、Znなどの金属ストレスで生成されるのか、またどのような役割を持つのかを検討した。その結果、NOはAlストレス下で顕著に発生したが.このような生成は他の植物では見られなかった。また、メリケンカルカヤでは、CdとZn処理でNO生成が見られたが、Cr、Cu処理では生成が認められなかった。さらにNOの生成を誘導させる前処理を施した後にAl処理してみたところ、脂質過酸化の発生はある程度抑制できたものの、核DNAの断片化に変化が無かったし、根の伸長阻害も変わらなかった。以上のことから、NO自体の耐性機構での効果は限定的だと思われた。2)これまでにメリケンカルカヤから、Alストレス誘導遺伝子ABC transporter (AP18-2-1)を、またAl耐性遺伝子S-adenosyl methionine syntase (SAMS)(AL3A-4)をコードする遺伝子を得ている。酵母形質転換体では、イネのSAMSはAl、Cd、Znに対して耐性を示した。一方、トウモロコシ由来のABC transporterはdiamideに対しては耐性を示したものの、Cu、Znには逆に感受性を示すという結果となり、両遺伝子は金属ストレスや酸化ストレスの耐性機構や毒性機構に関連することが示唆された。さらに詳細な機能解析のために、両者の完全長cDNAをメリケンカルカヤより単離し、これらをシロイヌナズナへの導入した。現在、ホモザイゴートを得るための継代中である。
腎癌細胞におけるVHL癌抑制タンパク依存性シグナル伝達制御機構の解明

VHL癌抑制タンパクはユビキチンリガーゼとして細胞内タンパク分解系で作用するが、上皮細胞の細胞極性の制御に関与するシグナル伝達タンパクであるaPKCの分解制御に関わることが本研究において明らかとなった。ヒト腎由来細胞株を用いたin vivo ubiquitination assayにより、PKCλがVHL依存的にユビキチン化されプロテアソームで分解されることが示された。さらに野生型PKCλは血清刺激により誘導される活性型への変化により、ユビキチン化が強く促進された。この時、PKCλのユビキチン化にはPKCλの調節ドメインの存在が必須であり、直接リン酸化を受けるキナーゼドメイン単独ではユビキチン化しなかった。これらの結果は、VHLが非活性型とは分子の構造の異なる活性型のaPKCを特異的に認識しユビキチン化することでプロテアソームにより分解するという、これまで不明であったaPKCのdown regulation機構を初めて明らかにするものであった。またVHL中のaPKC、elonginの各結合領域のいずれを欠失させてもユビキチン化活性が失われること、elongin結合領域を欠失させた変異型VHLの発現が野生型VHLのもつユビキチン化活性をdominant negativeに阻害することから、これらの領域が機能上不可欠であることが証明された。さらに、細胞骨格形成と細胞極性制御には密接な関係があると推定されているが、VHL変異癌細胞株では細胞骨格形成や細胞形態等に異常が認められ、aPKCを介するシグナル伝達系の異常が癌化に関与することが示唆された。従来より言われてきたHIFを介したVEGFの高発現による血管新生の促進だけでは腎癌初期の癌化のメカニズムは説明できなかったが、本研究により、VHLによるaPKCの分解制御の乱れが、細胞癌化の過程に関与している可能性が示唆された。VHL癌抑制遺伝子産物であるpVHLはユビキチンリガーゼとして細胞内タンパク分解制御機構で作用するが、細胞癌化の直接的要因となりえる、細胞の増殖および極性決定関連シグナル伝達タンパクであるatypical Protein Kinase C(aPKC)の分解制御に対するpVHLの関与を検証した。ヒト腎由来細胞株を用いてpVHL、aPKCλ、ubiquitinを発現させin vivo ubiquitinationassayを行ったところ、PKCλはpVHL依存的にユビキチン化されプロテアソームで分解を受けることが明らかになった。また、野生型のPKCλは血清刺激による活性化にともなってユビキチン化を強く受けるようになることから、pVHLが活性型のaPKCを特異的に認識しユビキチン化することで分解系に送るというaPKCのdown regulation機構が初めて明らかになった。またPKCλのユビキチン化には、その分子中のregulatory domainの存在が必要であり、これはpVHLとPKCλの結合領域に関する知見とも一致した。さらに、pVHL中のaPKC、elonginの各結合領域のいずれを欠失させてもユビキチン化活性が失われ、これらの領域が機能上必須の領域であることが裏付けられた。elongin結合領域を欠失させた変異型pVHLを共発現させたところ、野生型pVHLのもつユビキチン化活性をdominant negativeに阻害した。精製タンパクを用いたin vitro ubiquitination assayにおいてもpVHLによるPKCλのユビキチン化が確認された。これらの結果から、細胞内の活性化型aPKCの量的制御がpVHLを介した系により行われていることが示唆され、その乱れが腫瘍組織において見られる異常な細胞増殖や上皮構造形成をひき起こすものと予想された。

VHL癌抑制遺伝子産物であるpVHLはユビキチンリガーゼとして細胞内タンパク分解系で作用するが、上皮細胞の細胞極性の制御に関与するシグナル伝達タンパクであるaPKCの分解制御に関わることが本研究において明らかとなった。ヒト腎由来細胞株を用いたin vivo ubiquitination assayにより、PKCλがpVHL依存的にユビキチン化されプロテアソームで分解されることが明らかになった。さらに野生型PKCλは血清刺激により誘導されるリン酸化をともなう活性型への変化により、ユビキチン化が強く促進された。この時、PKCλのユビキチン化にはPKCλの調節ドメインの存在が必須であり、直接リン酸化を受けるキナーゼドメイン単独ではユビキチン化しなかった。これらの結果は、pVHLが非活性型とは分子の構造の異なる活性型のaPKCを特異的に認識しユビキチン化することでプロテアソームにより分解するという、これまで不明であったaPKCのdown regulation機構を初めて明らかにするものであった。またpVHL中のaPKC、elonginの各結合領域のいずれを欠失させてもユビキチン化活性が失われること、elongin結合領域を欠失させた変異型pVHLの発現が野生型pVHLのもつユビキチン化活性をdcminant negativeに阻害することから、これらの領域が機能上不可欠であることが証明された。さらにpVHLの機能領域に点突然変異を導入した変異体pVHL発現細胞株を用いたマイクロアレイ解析によりTGFBI等複数の遺伝子に発現変動が認められた。従来より言われてきたHIFを介したVEGFの高発現による血管新生の促進だけでは初期の癌化のメカニズムは説明できなかったが、本研究により、aPKCのVHLによる分解制御の乱れが、腎癌における初期の細胞癌化の過程に関与している可能性が示唆された。
キリシタン版辞書・字書類のデータベースに基づくキリシタン語彙の計量的研究

本研究では、16世紀末から17世紀初頭に掛けて、日本での布教の為にイエズス会によって生産された、イエズス会辞書・字書(ラテン語関係を除く)の全文を電子データ化してデータベースとし、研究代表者(豊島)が従来から維持しているキリシタン文献総合データベースとの付き合わせを行って、キリシタン文献辞書・字書中の語彙と、実際の文献の使用語彙との計量的な研究を行う事で、キリシタン辞書項目の十全な理解に資する事とした。具体的には、ローマ字綴り「日葡辞書」、漢字字書「落葉集」、について、全掲出語のデータベース化を行ない、これを、既に研究代表者(豊島)がキリシタン文献総合データベースとして維持している文語文ローマ字本キリシタン文献全種(「サントスの御作業」、「ドチリナキリシタン」、「ヒイデスの導師」、「コンテンツスムンヂ」、「サカラメンタ提要日本語附録」「スピリツアル修行」)、及び国字本キリシタン文献(「ぎやどぺかどる」、「おらしょの翻訳」)の全語彙との付き合わせを行った。代表者の従来の研究からも、ローマ字本・国字本の語彙の差が顕著である事が知られていたが、辞書・字書に於てもこの差は顕著であって日葡辞書に多い口語語彙を除いても、辞書同士、又、文献・辞書/字書の付き合わせのそれぞれに、多くの特徴的な独自語彙を含む結果が得られた。これらの付き合わせ結果の全体は膨大な量となるため、この報告書では、国字本最大の文献である「ぎやどぺかどる」全語彙を国字本字書「落葉集」本篇と照合した結果を示す事とする。ここでは、「落葉集」の持つ仏教(特に禅宗)関連の特徴的な語彙が、国字本文献では殆ど忌避されて利用されない事から、「落葉集」の全13,781語中、「ぎやどぺかどる」に現れるのは僅かに異なり1,543語である事が分かるが、この異なり語の延べ使用数は27,943回と、収載語彙の使用効率が極めて良い事が知られる。本研究は、16世紀末から17世紀初頭に掛けて、日本での布教の為にイエズス会によって生産された、イエズス会辞書・字書のうち、「日葡辞書」、「和らげ類」の全項目について、それぞれポルトガル語語釈部分を含む全文を電子データ化してデータベースとし、ポルトガル語語釈からの自由な探索をも許して、これらの辞書項目の十全な理解に資する事を目的としている。今年度は、研究第一年度であるので、最も大部の「日葡辞書」のデータ整備(入力・校正)を集中的に行った。併せて、有力写本「スピリツアル修行」の調査を、写本の共同発見者である石塚晴道(北海道大学)教授の助言を得つつ行った。1.有力写本「スピリツアル修行」(天理図書館)の調査を、写本の共同発見者である石塚晴道(北海道大学)教授の助言を得つつ行った。この成果は、2000年5月に石塚教授との共著論文として刊行予定である。2.関連文献の写真焼き付け入手済みの「スピリツアル修行」天理本・マニラ本等のフィルムの他、関連文献の撮影・デジタル画像化を行った。(現像・焼付費)3.入力済データの原本照合上記のデジタル画像と過年度の研究で作成済の電子化データとを相互参照可能な状態に加工した。4.「日葡辞書」のデータ入力

補助作業者を雇用する事としていたが、適切な人材が見出せなかったので、申請者自らで「日蘭辞書」のデータ入力を進め、全体の1/3を完了した。校正も、申請者自身が行った。5.入力済の「日葡辞書」データと、既存のキリシタン語彙データベースとの突き合わせ「日葡辞書」の入力済部分から、データから語を切り出し、申請者が過年度の研究によって維持しているキリシタン語彙データベースとの突き合わせを行って、データベースの更新を進めた。今年度は、昨年度の成果である有力写本「スピリツアル修行」の調査結果の公表と、「日葡辞書」入力結果の整備、及び国字本字書である「落葉集」のデータ整備(入力・校正)を集中的に行った。1.昨年度行なった有力写本「スピリツアル修行」(天理図書館)の調査結果を、写本の共同発見者である石塚晴通(北海道大学)教授と共同で、共著論文として公刊した。(尚、論文題目は、所蔵元の表記に従って「スピリツアル修業」とした)。2.入力済データの校正昨年度入力済の「日葡辞書」の結果の校正を行なった。補助作業者を雇用して校正に当らせる事としていたが、適切な人材が見出せなかったので、申請者自らで校正した。3.「落葉集」のデータ入力・校正入力外注を計画していたが、原本は、独特の癖を持った行草体漢字・仮名活字であり、これを入力する業者を探索したが、適切な業者が見当たらなかったため、申請者自らが入力し、校正した。4.入力済の「日葡辞書」「落葉集」データと、既存のキリシタン語彙データベースとの突き合わせ「日葡辞書」及び「落葉集」の入力済部分から、データから語を切り出し、申請者が過年度の研究によって維持しているキリシタン語彙データベースとの突き合わせを行って、データベースの更新を進めた。5.研究結果の報告書執筆上記の研究結果を報告書に作成し、関係研究者に頒布する予定である。
音楽科カリキュラム開発過程における教師の能力形成に関する歴史的研究

本年度は主に、1.大正新教育期の唱歌科におけるカリキュラム開発の背景に関する資料収集と分析、2.唱歌専科教師によるカリキュラム開発とそれに伴う専門的な専門性形成に関する事例研究に取り組んだ。1.大正新教育期の唱歌科におけるカリキュラム開発の背景に関する資料収集と分析本研究で扱う個別事例の位置づけや、大正新教育期の唱歌科におけるカリキュラム開発の背景的要因を検討するために、昨年度に行った教育関係雑誌および音楽教育関係雑誌の悉皆調査を基に、記事の分析を行った。また、引き続き『教育関係雑誌目次集成』などの目録や、大学などの図書館に所収されていない音楽教育関係雑誌を収集した。その結果、全国の図書館からは全号を収集できなかった『唱歌と遊戯の研究』(後の『音楽と遊戯』)の全号を入手することができた。2.唱歌専科教師によるカリキュラム開発とそれに伴う専門性形成に関する事例研究次の(1)(3)の事例について、唱歌科カリキュラム開発に携わった教師の著書や雑誌記事などの個人資料、および彼らが所属していた学校の関係資料を収集した。特に(1)では、全校のカリキュラム研究態勢における、低学年教育担任教師と唱歌専科教師との協働の実態を検討し、その成果の一部を論文にまとめた。また、(2)については、唱歌専科教師による生活単元カリキュラム開発の特質を全校での研究課題との関連で検討し、学会で報告した。さらに(3)についても論文を執筆し、現在、学会誌に投稿中である。(1)東京女子高等師範学校附属小学校で唱歌専科教師を務めた玉村なみ、(2)岡崎師範学校附属小学校で主に唱歌科の実践研究に取り組んだ山田信義、(3)長野県および兵庫県の公立学校で唱歌専科教師を務めた北村久雄27年度が最終年度であるため、記入しない。27年度が最終年度であるため、記入しない。本年度は、主に1.大正新教育期の唱歌科カリキュラム論の全体動向および欧米音楽教育情報の受容状況に関する予備調査、2.唱歌専科教師によるカリキュラム開発の事例研究を行った。1.大正新教育期の唱歌科カリキュラム論の全体動向および欧米音楽教育情報の受容状況に関する予備調査本研究で扱う個別の訓導の事例の位置づけや、カリキュラム開発の前提条件を検討するために、教育関係雑誌および音楽教育関係雑誌の悉皆調査を通して、関連記事のリストアップを行った。また、当時の欧米教育情報の受容状況に関しては、上記の作業の中で、欧米の音楽教育に関する記事をリストアップした。さらに、ハーバード大学教育学部図書館(Monroe C. Gutman Library)にて、欧米の教育雑誌に掲載された音楽教育関係記事を収集した。このうちコロンビア大学ティーチャーズ・カレッジのリンカーン・スクールで教師を務めていたサティス・コールマンが提唱した「創造的音楽」の日本への受容、特に唱歌専科教師のカリキュラム開発へ与えた影響について検討した。その成果は論文にまとめ発表した。2.唱歌専科教師によるカリキュラム開発の事例研究次の(1)(3)の事例について、大正新教育期に唱歌科カリキュラム開発に関わった教師の著書や雑誌記事などの個人資料、および訓導が所属していた学校関係の資料を収集した。さらに、事例(1)は学校全体の研究態勢、事例(1)・(2)は唱歌専科教師のカリキュラム開発の特質を検討し、その成果の一部を学会報告および論文に発表した。(1)東京女高師附小の作業教育カリキュラム開発における唱歌専科訓導玉村なみの実践、(2)北村久雄の「音楽生活の指導」にみるカリキュラム論の形成、(3)岡崎師範学校附属小学校の山田信義における音楽題材を中心とした生活単元開発本年度は主に、1.大正新教育期の唱歌科におけるカリキュラム開発の背景に関する資料収集と分析、2.唱歌専科教師によるカリキュラム開発とそれに伴う専門的な専門性形成に関する事例研究に取り組んだ。(1)東京女子高等師範学校附属小学校で唱歌専科教師を務めた玉村なみ、(2)岡崎師範学校附属小学校で主に唱歌科の実践研究に取り組んだ山田信義、(3)長野県および兵庫県の公立学校で唱歌専科教師を務めた北村久雄本年度に予定していた資料収集は、ほぼ予定通りに完了し、事例の分析についても充分に行えた。さらに、次年度に予定していたアメリカでの資料調査を繰り上げて行うことができた。

27年度が最終年度であるため、記入しない。引き続き、唱歌専科教師のカリキュラム開発の事例研究を進めていくとともに、これらの事例を大正新教育期のカリキュラム開発や唱歌教育論の全体的な動向に位置づけるために、教育関係雑誌の悉皆調査を重点的に行っていく。
非クラマース系の多極子自由度が誘起する強相関電子現象（国際共同研究強化）

多極子が活性となる希土類の非クラマース系PrT2Zn20 (T=Ir, Rh)における結晶場や四極子秩序,四極子が関与する非フェルミ液体的挙動について調べるために,フランスのレオン・ブリルアン(LLB)研究所にて中性子散乱実験を行い,ドイツのアウグスブルグ大学で熱膨張・磁歪を測定した。中性子散乱実験は,LLB研究所のJ.-M. Mignot博士との共同研究として行った。3He-4He希釈冷凍機と超伝導マグネットを用いて,PrIr2Zn20の四極子秩序の秩序変数を調べた。[110]方向の磁場下で,磁場誘起の磁気反射を観測した。磁気構造解析により,磁場誘起の磁気双極子が[111]方向に整列していることを明らかにし,秩序変数は四極子のO22型であることを同定した。なお,同型構造をとるPrRh2Zn20では磁場誘起の反強磁性ピークは観測されなかった。PrIr2Zn20とは秩序変数が異なっていると考えられる。また,4f3配位をとるNdIr2Zn20の粉末中性子回折実験を行い,転移温度以下で反強磁性秩序による磁気反射を観測した。アウグスブルグ大学では,P. Gegenwart教授との共同研究として,PrIr2Zn20とPrRh2Zn20の熱膨張・磁歪を測定した。磁場に対して平行方向と垂直方向で熱膨張・磁歪を測定し,磁場中で大きな異方性を発現することを見出した。結晶場と四極子相互作用を考慮した計算により,高磁場・高温の常磁性相における振る舞いを再現した。一方,低磁場・低温領域で観測した異常な温度・磁場依存性は上記モデルでは再現できず,四極子を介した異方的なc-f混成が関与している可能性を指摘した。これらの実験では,3He-4He希釈冷凍機と超伝導マグネットを用いた。アウグスブルグ大学の大学院生と技術職員の支援のもと,実験を計画通りに遂行できた。内定年度:2015本研究課題の対象物質である非クラマース系PrIr2Zn20の反強四極子秩序の秩序変数に関して、磁場[100]方向における中性子回折実験をフランスのレオン・ブリルアン研究所にてJean-Michel Mignot博士と行った。前年度に行った磁場[110]方向における中性子回折実験の結果と合わせ、反強四極子秩序相の主要な秩序変数はO22型の四極子であることを同定した。一方、磁場に誘起される反強磁性の成分はO22型から予想される[1-10]方向ではなく[1-11]に近い方向を向いており、磁場で誘起される四極子以外の多極子の寄与が示唆される。また、構造解析から明らかになった四極子の配列は、最近接で強的、全体としては反強的な複雑な構造をとる。Prイオンがダイヤモンド格子を組んでいるため、四極子のフラストレーション効果が関与している可能性がある。平成29年2-3月に、イギリスのラザフォード・アップルトン研究所において、関連物質PrRh3の非弾性中性子散乱実験を行い、結晶場効果による複数の磁気励起を観測した。平成28年6月と12月にフランスのILL研究所にて中性子回折実験を行った。PrIr2Zn20の単結晶を用いて、熱膨張と磁歪の測定をドイツのアウグスブルグ大学のPhilipp Gegenwart教授の研究室にて行った。熱膨張係数は反強四極子秩序を示す温度付近で異常を示し、また磁場中では符号の反転を伴う異常を観測した。また、磁場[100]方向での磁歪は磁場5テスラ付近で極小値をとり、磁場依存性は熱電能や弾性定数の振る舞いとよく対応することが分かった。磁場によって反強四極子秩序が抑制され、四極子と伝導電子の相互作用に起因する格子異常が発現していると考えられる。研究対象である非クラマース系のPrIr2Zn20の反強四極子秩序の秩序変数に関して、磁場[100]と[110]方向での磁場中中性子回折実験から四極子秩序の秩序変数を同定した。微視的手法によりこの系の秩序変数を同定したのは初めての例である。これらの成果に関する原著論文をPhys. Rev. Bに投稿し、平成29年度に掲載された。実験としては3He-4He希釈冷凍機と超伝導マグネットを用いた難しい実験であったが、レオン・ブリルアン研究所のJ.-M. Michel博士と専門技術員の支援により、順調に実験を遂行できた。PrIr2Zn20の熱膨張と磁歪の測定では、磁場5テスラ付近で異常を観測した。これは比熱や電気抵抗率で磁場誘起の重い電子状態が見出された領域に近い。また、熱電能や弾性定数の異常な振る舞いとよく対応している。この原因については未だ不明であるが、格子異常が検出されたことは四極子が強く関与していることを示唆する重要な結果である。こちらも3He-4He希釈冷凍機と超伝導マグネットを用いた実験であったが、アウグスブルグ大学の研究室の大学院生と技術職員の支援で、実験を順調に遂行できた。

多極子が活性となる希土類の非クラマース系PrT2Zn20 (T=Ir, Rh)の四極子が関与する低温物性に関して、フランスのレオン・ブリルアン研究所にて中性子散乱実験を行い、ドイツのアウグスブルグ大学で熱膨張・磁歪の測定を行った。中性子散乱実験は、J.-M. Mignot博士との共同研究として行った。昨年度までの共同研究でPrIr2Zn20の四極子秩序の秩序変数を同定したので、その結果を参考にして、PrRh2Zn20の磁場[100]と[110]方向での磁場中中性子回折実験を行った。波数空間の主要な軸に沿ってラインスキャンを行ったが、磁場誘起の反強磁性ピークは観測されなかった。PrIr2Zn20とは秩序変数が異なっていると考えられ、高温での構造相転移による対称性の低下が秩序変数に関係している可能性がある。また、同型構造をとるNd化合物の粉末中性子回折実験を行った。実験は3He-4He希釈冷凍機と超伝導マグネットを用いた難しい実験環境であったが、レオン・ブリルアン研究所のMignot博士と専門技術員の支援により、順調に実験を遂行できた。アウグスブルグ大学では、P. Gegenwart教授との共同研究として、PrIr2Zn20の熱膨張と磁歪の測定を行った。磁場に対して平行方向と垂直方向で熱膨張・磁歪を測定し、磁場中で大きな異方性を発現することを見出した。結晶場と四極子相互作用を考慮した計算により、高磁場・高温の常磁性相における振る舞いを再現できたが、低磁場・低温領域で観測した異常な温度・磁場依存性は再現できなかった。この原因は未だ不明であるが、四極子を介した異方的なc-f混成が格子異常に関与している可能性がある。これらの実験では、3He-4He希釈冷凍機と超伝導マグネットを用いたが、アウグスブルグ大学の研究室の大学院生と技術職員の支援のもと、実験を順調に遂行できた。これまで、多極子が活性となる非クラマース系PrT2Zn20 (T=Ir, Rh)の反強四極子秩序に関して、中性子散乱実験ならびに熱膨張・磁歪の測定を行ってきた。レオン・ブリルアン研究所で行った磁場中中性子回折実験により、PrIr2Zn20の秩序変数を同定することに成功し、その測定・解析結果を原著論文にまとめた。また、同型構造のPrRh2Zn20については、これまでのところ四極子の秩序変数の同定には至っていない。転移温度が3He-4He希釈冷凍機の最低温度と近いため、秩序変数の発達が不十分であったか、秩序ベクトルが異なっているか、のいずれかが考えられる。また、4f3配位のNdIr2Zn20の粉末中性子回折を行い、反強磁性秩序に伴う超格子反射の観測に成功した。アウグスブルグ大学でのPrIr2Zn20の熱膨張と磁歪の測定では、磁場に対して平行方向と垂直方向で大きな異方性が観測された。結晶場と四極子相互作用を考慮したモデル計算を行い、実験結果について考察した。また、四極子秩序温度以下で、熱膨張係数の発散的な振る舞いが観測され、四極子揺らぎの関与が示唆された。また、PrRh2Zn20の熱膨張・磁歪の測定を開始した。これまでの測定で、PrIr2Zn20とよく似た振る舞いを示すことを確認した。多極子が活性となる希土類の非クラマース系PrT2Zn20 (T=Ir, Rh)における結晶場や四極子秩序,四極子が関与する非フェルミ液体的挙動について調べるために,フランスのレオン・ブリルアン(LLB)研究所にて中性子散乱実験を行い,ドイツのアウグスブルグ大学で熱膨張・磁歪を測定した。中性子散乱実験は,LLB研究所のJ.-M. Mignot博士との共同研究として行った。3He-4He希釈冷凍機と超伝導マグネットを用いて,PrIr2Zn20の四極子秩序の秩序変数を調べた。[110]方向の磁場下で,磁場誘起の磁気反射を観測した。