hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
Doped Graphene Foam as a Model Oxygen Reduction Reaction Electrocatalyst System

窒素ドープカーボンフォームを調製し、Ptフリー電極触媒の酸素還元反応のためのモデルシステムとして用いた。メタルフリー窒素ドープカーボンフォームを合成後、このカーボンフォームに鉄を含浸させたものと物性比較を行った。酸性溶媒中のFe-N-C触媒は、大きなポアによる拡散性の高さから市販のPtフリー触媒よりも優れた性能を示したが、Pt / Cには劣った。アルカリ性溶媒中のFe-N-C触媒は、Pt/Cを上回る性能を示した。活性部位での反応メカニズムを明らかにした。また耐久性評価の結果からアルカリ性溶媒中でのPtフリー触媒の優れた安定性が明らかとなり、劣化メカニズム解明を透過電子顕微鏡観察を用いて行った。
廃棄構造の発展経路に関する経済学的研究

本研究は廃棄構造の発展経路に関し、主に日本、アメリカ、中国を比較する。対象はデータや記録が豊富な自動車である。2年度目の2018年度は中古車市場の発展に重点を置いた。1960年代を中心とした日本の中古車市場の発展経路については、既存の資料、記事等から整理をした。その結果、下取り競争により新車販売会社の経営がひっ迫し、1960年代半ばにその是正の方向に動いたこと、生産者など動脈産業が中古車を商品として認識し、中古車市場の健全化に動いたことなどがわかった。また、中古車登録台数等の統計整理を行い、その課題を提示しつつ、中古車市場が新車市場を上回る時期を特定した。一方、首都圏を事例に都県別の抹消登録台数(廃車台数)の時系列的な算出を試みた。算出に用いるデータによって車種の範囲が異なり、地域別の抹消登録台数の算出は難易度が高いことなどの課題が提示された。また、都県別の関連データが揃うのは最も古くて1983年であり、使用済自動車の発生のタイミングの地域差を明確に示すには十分ではないこともわかった。海外調査については、中国の自動車静脈市場を調査した。同国の自動車リサイクル市場、中古車市場について、先行研究を整理しつつ、日本の発展経路を踏まえ、中国の現状はどこに位置づけられるかを聞き取り調査により確認した。他の新興国・途上国についても二輪車から四輪車への転換が日本とは異なることを問題意識とし、そのデータを整理した。さらにカーシェア市場により保有構造が変わるかどうか、ハイブリッド車等次世代車の中古車輸出やリサイクルの動きは既存のものとは異なるかどうかを文献、データにより整理した。1960年代の日本の中古車市場の発展経路や関連統計の整理、地域別抹消登録台数の推計についておおむね順調に進めることができた。国際共同研究会、国際学会、関連業界の国際会議が2019年4月、5月になったため、その意味で遅れが生じたが、全体的には大きな影響はない。最終年度として、学術的、理論的な位置づけに焦点を当てて研究を進める。自動車の成果をもとに他物品との比較を行う。初年度である平成29年度は、自動車を中心とした廃棄構造の発展経路を定量的に示すため、日本、アメリカおよび東南アジア諸国の自動車保有台数や販売台数データより、抹消登録台数を算出し、その推移を示した。そして、それらを比較し、東南アジア各国がどの段階に位置しているかを特定した。また、二輪車や貨物車など車種別に抹消登録台数を示すことで、その発展経路に違いがあることを示した。加えて、これら車種別の近年の抹消登録台数における中古車輸出の割合を示し、これまで認識されていた数値との違いを示した。次に日本やアメリカの静脈市場の発展経路について自動車を中心に定性的に整理した。日本はこれまでの研究蓄積があり、その再整理を中心に行った。アメリカは先行研究サーベイ、資料・記事整理を中心に行った。この結果、日本とアメリカでは時期は異なるものの、形成段階、発展段階の産業の変化やメーカー、ディーラーの関与など全く同じような発展経路を辿っていることがわかった。一方で環境政策や資源政策などは大きなタイムラグがないこともわかった。二輪車については日本の歴史からその市場の拡大、縮小が四輪車市場よりも早かったことがわかった。アメリカの静脈市場においては現地調査を行い、中古車販売店、自動車リサイクル企業を訪問し、日本との違いに焦点を当てつつ、市場構造について聞き取り調査を行った。また、関連業界の国際会議に出席し、関係者と意見交換を行った。二輪車、貨物車の静脈市場を個別に見ることにより、当初の計画よりも作業が増えたが、より正確に市場の発展について把握することができた。引き続き研究計画に沿って作業を進めていく。

1960年代の日本の中古車市場の発展経路や関連統計の整理、地域別抹消登録台数の推計についておおむね順調に進めることができた。国際共同研究会、国際学会、関連業界の国際会議が2019年4月、5月になったため、その意味で遅れが生じたが、全体的には大きな影響はない。シェア経済の進展の程度を考慮に入れつつ、基本的には研究計画に沿って作業を進めていく。最終年度として、学術的、理論的な位置づけに焦点を当てて研究を進める。自動車の成果をもとに他物品との比較を行う。2018年度中の開催を想定していた国際共同研究会、国際学会、関連業界の国際会議が2019年4月、5月になったため、その分の繰り越しを行った。2019年度に使用する予定である。
SCIDマウスの長期的特性調査-胸腺腫発症とleaky現象の関連性について

SCIDマウスは、成熟T・B細胞を欠損するため、無免疫グロブリン血症と異種細胞拒絶能の低下を示している。しかし、このマウスでは加齢に伴ない特異的に多発する胸腺腫により、多数の個体が比較的早期に死亡したり、原因不明の免疫グロブリンの産生が起こり(leaky現象)、実験の障害となる。本実験では、多数の個体を長期飼育し、経時的に血中Ig量および腫瘍発生頻度を観察することによって、胸腺腫やleaky現象の発育傾向や両現象間の関連性を検討した。マウスはCB-17-scid/scid255匹(♀131 ♂124)と、対照群としてCB-17-+/+225匹(♀114 ♂111)を使用し、バリア動物舎内で飼育した。SCIDマウスは、生後6ケ月頃より漸次死亡し、21か月齢時には、生存率は43.9%となった。一方、対照群では生存率は75.6%であり、SCIDマウスの死亡数は有意に多かった。SCIDマウスでは初期の12か月齢頃までは胸腺腫による死亡が大半を占め、それ以降21か月齢までは非胸腺性リンパ腫がなどが増加し、逆に胸腺腫の発生が減少した。ただし、後期の胸腺腫以外での死亡個体数の増加は、対照群でも同様の傾向で見られたので、SCIDマウス特有の現象ではなかった。また、leaky現象については、生後3か月齢時にはほとんど見られなかった(7%)が、徐々に増加してゆき、21か月齢時にはほとんど(90.9%)の個体がleakyを示した。Bosmaらの報告によると、leaky現象と、胸腺腫の発生との間には関連性があるとされている。一方今回の検討では、leakyマウスの死因は胸腺腫と非胸腫瘍でほぼ1対1(27:33)であった。また、死亡時にleaky現象を起こしていなかった個体においては、むしろ胸腺腫による死亡が多かった(胸腺腫:非胸腺腫=42:26)。よって、われわれはleaky現象の発生が胸腺腫の発症と直接関連していないとの結論を得た。
新しい実験動物としてユウレイボヤのストレインを確立するための基礎研究

初年度の研究成果をもとに、各地で更に継代飼育を試みると共に、餌料・飼育法の改良、野外の分布状況の調査やマーカーとなる形質の検討を行なった。本年度得られた結果は次の通りである。1.初年次に第2代個体を得、その継代飼育の結果兄妹交配で第5世代、自家授精で4世代目の個体を得ることが出来た。この継代飼育は数ケ所で行なわれており、餌料及び飼育の省力化に問題が残されてはいるが、実験室内での飼育が可能になったと言える。2.餌料としては浮遊硅藻Chaetoceros gracilisが最適であり、この餌料を培養液と共に飼育海水中に与えて、水温約23°C下では12ケ月で成熟個体となることがわかった。最初予定していたTetracermisは大量培養法が確立し、凍結保存により一年中供給できる。人工餌料と共に補助餌料として用いた。3.東北・関東・中部・中国・南四国地方の海域の分布状況の調査が進み、夏場を除き年中野生の材料を採集する事が可能になりつつある。また、夏に海中の残存個体が激減することは、消える前に室内に引きあげて飼育することで解決できた。この際表面海水より底層海水を与える方が成育の良い事もわかった。各海域での採苗に良好な時期・場所の把握も進んだ。4.アイソザイムのパターン解析には、デンプンゲル泳動法が有効であることがわかり、更に改良を加えて、検討中である。5.カタユウレイボヤのジーンライブラリーを作製できたが、まだ十分と言い難い為更に高分子量のDNAを得ることを検討中である。6.個体別に得たDNA制限酵素分解断片を電気泳動後、rRNA28Sをコードする領域付近のDNAプローブを用いてサザンブロッティングを行い多型を解析した。その結果個体差・地域差が認められ、rDNA28Sは遺伝マーカーとして使用できる事が明らかになった。本年は3ケ年計画の初年次にあたるので、飼育法ならびに野外採苗法の確立、野外における分布状況などの調査、マーカーにすべき形質の検討に重点を置いて研究するとともに、各地で独立に継代飼育を試み、次のような成果を得た。1.本研究の主眼である継代については、第2代個体での卵・精子の形成が確認されながら斃死してしまい、3代目を得るには至らなかった。死滅の原因を探る為に、水質(pH、比重、窒素量、リン酸量等)の変化を詳細に検討するとともに、各地で継代に努力中である。3.関東周辺の海域につき分布状況などを重点的に調査し、新たに良好な採取場所を発見した。又、各地での情報収集、現地調査などにより、それぞれの海域で、採集・採苗の適地を見出すとともに人工魚礁について検討した。4.自然状態での放卵・放精のパターンを把握し、卵・精子の人為的誘導のための光条件についても一応の結論を得た。5.血管系・鰓を中心に、形態上の地域差について検討を開始した。6.一個体から得たDNAを制限酵素で処理後、電気泳動することによって明瞭なバンドを得ることができた。この方法を個体差、地域差などの検討に応用することを開始した。H-2遺伝子に対するプローブを用いた実験については結論を得るには至らなかった。班員間の情報交換の為、各班員の得た成果・情報等を班長の下に集約・整理し「Ciona通信」と銘打ち、既に5度班員に配布すると共に2回の班会議で各々の研究を批判・討論した。また飼育装置等の備品は予定通り購入し、継代飼育・形態研究・データ解析等に活用している。
生体力学モデルによる胸郭出口症候群の病態解析

胸郭出口症候群の発症には動的因子、殊に姿勢、筋の緊張などが密接に関連していると考えられている。しかし、胸郭出口症候群における症状出現の機序は充分に解明されているとは言い難い。その主たる要因は、胸郭出口症候群の構成要素の姿勢、運動などに伴う三次元的変化が解明されていない殊にある。また、野球などの上肢を極度に使用するスポーツ選手にもこの症候群が発症することがある。そこで、ジョンズ・ホプキンス大学で作製した生体力学モデル(骨格をコンピューター上で三次元再構築し、その骨が他動的に動かされた軌道を正確に再現するモデル)にて、肩関節の動きを解析した。解凍した凍結新鮮屍体の鎖骨、上腕骨、および肩甲骨にFlock of Birdsのセンサーを設置した。次に屍体標本をジグ(ジグにはFlock of Birdsのソースを設置)に固定した後、上腕を他動的に動かし、その位置変化(運動軌跡情報)を記録した。そして、骨や疑似ソース、センサー(ソースやセンサーが設置されていたところに造影剤が満たされたプラスティック製の箱)をX線CTにて撮影し画像情報を得た。その後、画像情報から骨や疑似ソース、センサーを再構成して三次元骨格モデルを作り、そのモデルに運動軌跡情報を与えて骨で構成された生体力学モデルをコンピュータ上で動かしデータを解析した。肩関節の運動に連動した肩甲骨や鎖骨の再現性のある動きを解析できた。特に、肩甲骨の動きは肩関節の運動平面の違いによって異なり、また、鎖骨の動きは肩甲骨の動きと密接に関係していることがわかった。前年までの結果を含めて推察すると、肩関節を90度以上挙上しての競技中、胸郭出口部の面積変化は他と比較して著しく大きかった。初年度は、ジョンズ・ホプキンス大学で生体力学モデル(骨格をコンピューター上で三次元再構築し、その骨が他動的に動かされた軌道を正確に再現するモデル)を作製した。モデルの作製は、まず解凍した凍結新鮮屍体の鎖骨、胸骨、および肩甲骨にFlock of Birdsのセンサーを設置した。次に屍体標本をジグ(ジグにはFlock of Birdsのソースを設置)に固定した後、胸郭出口症候群の誘発試験となで肩姿勢を他動的に再現して、それぞれのセンサーのソースを基準とした位置変化(運動軌跡情報)を記録した。その後、画像情報から骨や疑似ソース、センサーを再構成して三次元骨格モデルを作り、そのモデルに運動軌跡情報を与えて骨で構成された生体力学モデルを完成させた。胸郭出口症候群の病変部位のひとつである肋鎖間隙の胸郭出口症候群の誘発試験、なで肩姿勢における面積を計算した。結果として、誘発試験であるWrighttestでの肋鎖間隙面積の減少は、なで肩姿勢でのそれに比較して有意であった。またEden testではなで肩姿勢と比して有意差はでなかったが、肋鎖間隙面積の減少を認めた。

ジョンズ・ホプキンス大学で生体力学モデル(骨格をコンピューター上で三次元再構築し、その骨が他動的に動かされた軌道を正確に再現するモデル)を作製した。モデルの作製は、まず解凍した凍結新鮮屍体の鎖骨、胸骨、および肩甲骨にFlock of Birdsのセンサーを設置した。次に屍体標本をジグ(ジグにはFlock of Birdsのソースを設置)に固定した後、胸郭出口症候群の誘発試験となで肩姿勢を他動的に再現して、それぞれのセンサーのソースを基準とした位置変化(運動軌跡情報)を記録した。そして、骨や疑似ソース、センサー(ソースやセンサーが設置されていたところに造影剤が満たされたプラスティック製の箱)をX線CTにて撮影し画像情報を得た。その後、画像情報から骨や疑似ソース、センサーを再構成して三次元骨格モデルを作り、そのモデルに運動軌跡情報を与えて骨で構成された生体力学モデルを完成させた。胸郭出口症候群の病変部位のひとつである肋鎖間隙の胸郭出口症候群の誘発試験、なで肩姿勢における面積を計算した。結果は、誘発試験であるWrighttestでの肋鎖間隙面積の減少は、なで肩姿勢でのそれに比較して有意であった。Edentestではなで肩姿勢と比して有意差はでなかったが、肋鎖間隙面積の減少を認めた。さらに、鎖骨-第1肋骨間距離でも肋鎖間隙面積と同様の結果を得た。最小となる鎖骨-第1肋骨間距離は神経の圧迫を起こしうる程度に小さいと考えられた。胸郭出口症候群の発症には動的因子、殊に姿勢、筋の緊張などが密接に関連していると考えられている。しかし、胸郭出口症候群における症状出現の機序は充分に解明されているとは言い難い。その主たる要因は、胸郭出口症候群の構成要素の姿勢、運動などに伴う三次元的変化が解明されていない殊にある。また、野球などの上肢を極度に使用するスポーツ選手にもこの症候群が発症することがある。そこで、ジョンズ・ホプキンス大学で作製した生体力学モデル(骨格をコンピューター上で三次元再構築し、その骨が他動的に動かされた軌道を正確に再現するモデル)にて、肩関節の動きを解析した。解凍した凍結新鮮屍体の鎖骨、上腕骨、および肩甲骨にFlock of Birdsのセンサーを設置した。次に屍体標本をジグ(ジグにはFlock of Birdsのソースを設置)に固定した後、上腕を他動的に動かし、その位置変化(運動軌跡情報)を記録した。その後、画像情報から骨や疑似ソース、センサーを再構成して三次元骨格モデルを作り、そのモデルに運動軌跡情報を与えて骨で構成された生体力学モデルをコンピュータ上で動かしデータを解析した。肩関節の運動に連動した肩甲骨や鎖骨の再現性のある動きを解析できた。特に、肩甲骨の動きは肩関節の運動平面の違いによって異なり、また、鎖骨の動きは肩甲骨の動きと密接に関係していることがわかった。前年までの結果を含めて推察すると、肩関節を90度以上挙上しての競技中、胸郭出口部の面積変化は他と比較して著しく大きかった。
NO-cGMP系情報伝達システムの分子機構

可溶性グアニル酸シクラーゼの研究に関しては、ヘム結合ドメインの大量発現系および精製法を確立したが、結晶化条件を最適化するまでには至らなかった。ヘムオキシゲナーゼ(HO)の反応機構については詳細に迫ることができた。今年度の実績は以下の通りである。ヘムオキシゲナーゼの活性中心には効率的なプロトン供給チャネルが存在し、特にパーオキシ型活性種の生成に必要なプロトン移動は、酵素の構造緩和が起きえない4Kにおいてさえ速やかに進行することを明らかにした。同様なプロトン供給チャネルを有する他の酵素と比べても、ヘムオキシゲナーゼにおけるプロトン移動は非常に速く、ヘム分解という特異な反応に必須の要素ではないかと考えられる。なお、本研究は酵素中のプロトン移動を液体ヘリウム温度で観測した初めての例である。ベルドヘム開環はヘム分解の律速段階にあたる重要な反応であるが、その反応機構などはほとんどわかっていない。詳細な反応解析の結果、従来から知られていた酸素のみでなく、過酸化水素によってもベルドヘム開環が進行することを見いだした。いずれの反応においても反応中間体の直接観測に初めて成功し、反応機構の解明に向けて重要な知見が得られた。また、過酸化水素による反応は生体内でも起きうる可能性があり、ヘムオキシゲナーゼは二つの機構を使い分けによって、酸化ストレスに迅速に応答すると考えられる。ほ乳類のヘムオキシゲナーゼには二種類のアイソザイム(HO-1,HO-2)が存在する。結晶構造に基づいた薬剤デザインにより、一方のアイソザイムのみに作用する阻害剤の開発を進めている。現在までに、薬剤候補分子の骨格デザインを終え、HO-1に対して約15倍の選択性を示す分子を得ている。また、4つの反応中間体や基質が結合していないヘムオキシゲナーゼの原子レベルの結晶構造解析に成功し、反応を制御する構造的な要因を明らかにした。本年度は、構造生物学的研究を行なうために、大量の試料が継続的に供給されうるという基本的条件の確立を目的とした研究を行なった。可溶性グアニル酸シクラーゼについては、はじめに大腸菌での大量発現系の構築を目指した。酵素全長の大腸菌での発現は、確認されてはいたものの、収量が著しく低く実用に適しているとは思われなかった。そこでより発現が容易であると考えられているヘム部位のみについての発現系の作成を最初に行なうことにした。ウシ肺可溶性グアニル酸シクラーゼベータサブユニットのN末端アミノ酸385残基分のDNAを発現ベクターpMWに組み込み、大腸菌にトランスフォームして培養した。途中で培養温度を37°Cから25°Cに下げることにより比較的多量の試料を得ることができた。これをイオン交換カラムおよびゲルろ過カラムにより精製し、電気泳動的に単一な試料を得た。精製試料の電子吸収スペクトルおよび共鳴ラマンスペクトルは天然型の酵素のものと同一であった。またヘムの吸収に由来するソーレー帯の吸収極大である430nmの吸光度と芳香族アミノ酸の吸収に由来する280nmの吸光度の比はおよそ2対1であり、アミノ酸含有量から予測される値と一致した。またCO付加体の赤外吸収スペクトルではCO伸縮振動が天然型のものとほぼ同一の1984cm-1に観測された。これらのことから、今回精製された試料は構造生物学の研究に使用して差し支えないと考えられる。ただし、天然型酵素でみられるような基質や生成物の結合効果はヘムドメインのみでは全く見られなかった。本年度は可溶性グアニル酸シクラーゼのヘムドメインの結晶化を中心に研究を進めた。昨年度の研究結果より、可溶性グアニル酸シクラーゼのヘム周囲の構造を形成するヘムドメインが存在することが明らかになり、そのヘムドメインは大腸菌による大量発現系を用いることによって比較的容易に調製することが可能になった。まずはじめに精製タンパク質を用いて簡単な結晶化条件のスクリーニングを行ったが、全く結晶化につながるような兆候を得ることはできなかった。その原因を探るため、試料の分光学的性質を再度子細にわたって検討を重ねることにより、ヘムの構造が明らかに異なっているものがわずかに混入しているとの結論に達した。そこで改めて精製法を検討することにした。その結果、以前のものよりも不純物の含有量が低い試料を調製することができるようになった。現在、本年度開発した方法で精製したタンパク質を用いて結晶化条件のスクリーニングを行っている。このタンパク質は疎水性の高い領域をもっているために凝集しやすいので、今後は界面活性剤を加えた結晶化条件のスクリーニングも実行する予定である。本年度はさらにいくつかのセンサーヘムタンパクの研究も行った。近年グアニル酸シクラーゼ以外にも、ヘムが気体分子のセンサーとして働いている例が続々と報告されている。酸素センサータンパク質FixLとそのホモログおよび可溶性グアニル酸シクラーゼのホモログなどの新しいヘムタンパク質について試料を調製し、それらの分光学的性質を調べ、タンパク中のヘムの構造と役割について議論した。可溶性グアニル酸シクラーゼは生体内で一酸化窒素(NO)のレセプターとして機能している。NOが直接結合するのはタンパク中のヘムであるので、これらの相互作用について詳細に調べるために、可溶性グアニル酸シクラーゼのヘムドメインを大腸菌の大量発現系を用いて高純度に調製した。精製試料の生化学的性質をさらに詳しく調べると、精製当初は2量体であった試料が、時間が経つにつれて単量体へと変化していることが判明した。この2量体から単量体の変化はヘムの配位構造と同期していることが明らかとなった。

すなわち、2量体構造ではヘムの配位構造は天然型のものと同じ還元型5配位高スピンであるのに対し、単量体構造においては、ヘムの配位構造は還元型6配位低スピンであり、この変化は不可逆的であった。したがって、このヘムの配位構造の変化をともなう2量体から単量体への変化を抑制することが結晶化を成功させるにあたり非常に重要な要因を占めることが示唆された。バクテリア由来のヘムオキシゲナーゼに関しては、既に昨年度の研究において、精製法および結晶化法のみならず、酸化型ヘムとの複合体の結晶構造解析が実行されている。本年度においては野生型酵素の結晶構造に加え、ヘム近傍に存在し、酵素反応に重要な役割を果たしていると考えられているアスパラギン酸136を他のアミノ酸に置き換えた変異体酵素の構造解析を行った。変異ヘムオキシゲナーゼを大腸菌における大量発現系を利用して大量に発現させ、これより高純度に試料を精製した。精製試料の結晶化スクリーニングの結果、アスパラギン置換体・グルタミン酸置換体の結晶が得られたので、これらのものについてX線結晶構造解析を実行した。またアスパラギン酸136変異体の酵素化学的性質については反応速度論的解析を行い、変異の導入によって酵素活性に著しい影響が見られることを明らかにした。可溶性グアニル酸シクラーゼは生体内で一酸化窒素(NO)のレセプターとして機能している。そのNOによる活性化機構を明らかにするために、NOが直接結合するヘムを含むドメインを大腸菌の大量発現系を用いて高純度に調製した。精製タンパクは2量体であったが、時間が経つにつれて単量体へと不可逆的に変化し、同時にヘムも天然型と同じ5配位高スピン型から6配位低スピン型に変換されることが判明した。したがって、このヘムの配位構造の変化をともなう2量体かち単量体への変化を抑制することが結晶化を成功させるにあたり非常に重要な要因を占めることが示唆された。バクテリア由来のヘムオキシゲナーゼに関しては、昨年度までの研究において、野生型の酸化型ヘムおよび還元型ヘム複合体の結晶構造解析を終えている。本年度は生成物阻害を引き起こす一酸化炭素結合型ヘム複合体などの阻害剤結合型ヘムオキシゲナーゼの構造解析を行うとともに、反応のカギとなる中間体である酸素結合型の結晶構造を解明した。これらの構造から、ヘムオキシゲナーゼが生成物阻害を回避する分子機構を明らかにすると共に、酸素活性化反応に関する多くの構造学的知見が得られた。また、酵素反応に重要と考えられているヘム近傍のアスパラギン酸136を置換した変異型酵素の構造解析も行った。この結果、酸素の活性化にはアスパラギン酸136自身ではなく、これによって活性中心に固定されている水分子こそが重要であることを見出した。変異体の反応解析や酸素活性化の素過程における同位体効果の測定などの結果もあわせて、ヘムオキシゲナーゼの酸素活性化機構をかなり踏み込んだ点まで解明した。可溶性グアニル酸シクラーゼの研究に関しては、ヘム結合ドメインの大量発現系および精製法を確立したが、結晶化条件を最適化するまでには至らなかった。ヘムオキシゲナーゼ(HO)の反応
ハイドレート利用の高含有率・高速貯蔵可能な水素貯蔵マテリアルの開発

本研究は,ハイドレート利用の水素貯蔵プロセスの開発を行う上で重要となる,水素分子の固定化能力と移動促進能力の支配因子を特定し,この双方の観点から貯蔵マテリアルとして最適化する方法論を確立することを目的とする. 24年度の検討に引き続き, tetra-n-butyl ammonium bromide (TBAB)やtetra-n-butyl ammonium chloride (TBAC), tetra-n-butyl ammonium fluoride (TBAF)を用いたセミクラスレートハイドレート粒子への水素の平衡吸着挙動に関する研究を行った.その際,水素吸着量の経時変化に対して,新規速度論モデルによる解析を行い,水素吸着速度および拡散速度の観点から膜状ハイドレートの有用性を評価した.さらに,バイオガス利用の水素精製プロセスでは,高濃度二酸化炭素を含んだ水素混合ガスとなるため,ガス分離および水素貯蔵一体型の高効率貯蔵プロセスについても検討を行った.平成25年度の検討にて, TBAFセミクラスレートハイドレートの平衡水素吸着量は形成条件により変化することを確認した. 24年度における結果と合わせると,吸着量の観点から2.6mol% TBAB添加時にHS-I構造, 3.7mol% TBAB, 3.2mol%TBACおよび3.0mol%TBAF添加時にTS-I構造, 3.3mol%TBAF添加時にてSCS-I構造のセミクラスレートハイドレートが形成されると考えられる.新規速度論モデルによる解析を行った結果,吸着速度はガス吸着可能なサイトの数密度が減少するほど増大するが,拡散速度はその数密度が増大するほど増大することを明らかにした.膜状ハイドレートの貯蔵特性に関して,平衡吸着量および拡散係数を用いて透過性を推算し評価を行った.温度269Kにおいて, HS-I構造のTBABセミクラスレートハイドレートは水素貯蔵量および透過性ともに優れていることを示唆した.しかしながら, H_2/CO_2選択率は10程度と低い値が推算された,一方, SCS-I構造のTBAFセミクラスレートハイドレートは, H_2/CO_2選択率は100以上と高く,また,高い分解温度や水素透過性を有することから,ガス分離および水素貯蔵一体型プロセスに適していることが示唆された.(抄録なし)本研究は,ハイドレート利用の水素貯蔵プロセスの開発を行う上で重要となる,水素分子の固定化能力と移動促進能力の支配因子を特定し,この双方の観点から貯蔵マテリアルとして最適化する方法論を確立することを目的とする.具体的には,熱力学安定性の観点から重水素化合物を含めた,種々のホスト分子・ゲスト分子により構成されるハイドレートの水素貯蔵速度を測定した.その際,まず断熱圧縮の影響を緩和させ,初期段階における水素吸着量の測定精度の向上させることを目的に装置開発を行った.また,形成速度の挙動から新規速度論モデルを構築し,定量的解析を行った.加えて,XRDの回折データをリートベルト解析し,構造を精密化することでハイドレートのケージサイズを算出し,安定性や吸着速度との関連付けを試みた.平成23年度の検討より,まず装置開発により測定データの再現性の向上や初期過程における形成速度測定が可能となった.ホスト分子である水の重水素化は熱力学安定性への影響は大きいものの,形成速度への影響は小さく,ホスト分子よりゲスト分子の影響が大きいことを確認した.特に水素-furan混合ハイドレートの形成速度はtetrahydrofuran(THF)やcyclopetane,tetrahydrothiopheneのものに比べ非常に速く,ゲスト分子の操作により水素ガスの高速貯蔵化が可能であることが示唆された.また,ケージサイズの縮小に伴い,平衡水素吸着量および形成速度は増加傾向であった.続いて,新規に構築した速度論モデルを用いて解析を行った結果,THFを用いた親水性溶媒系のハイドレートとそれ以外の疎水性溶媒系のハイドレートと傾向が異なったものの,ケージサイズの縮小に伴い拡散速度は増加傾向にあり,ケージサイズを縮小させることで水素分子の固定化能力と移動促進能力を共に向上させられる可能性が示唆された.平成24年度の検討にて,セミクラスレートハイドレートは添加物である第4級アンモニウム塩の濃度や形成温度により形成される構造を制御可能であることをラマン分光分析により確認した,特にTBABセミクラスレートハイドレートに関しては,TBAB濃度を2.6mol%,形成温度を274Kとした際,濃度3.7mol%,温度282K時に形成したTBABハイドレートに比べて水素吸着量は3倍程度増加した.水素の吸着速度に関しては,平衡吸着量の半分に達する時間を用いて評価を行なった.THFハイドレートに比べてTBABハイドレートは若干遅い傾向にあったが,TBACハイドレートに関しては吸着速度が向上した結果も得られた.第4級アンモニウム塩のアニオンの影響は顕著に観測されなかったが,形成温度や攪拌速度,添加物濃度など,ハイドレートの形成方法に応じて吸着速度が変化する傾向にあったことから,水素ガスの吸着速度を向上させるためにはハイドレートの形成法が重要であることが示唆された.本研究は,ハイドレート利用の水素貯蔵プロセスの開発を行う上で重要となる,水素分子の固定化能力と移動促進能力の支配因子を特定し,この双方の観点から貯蔵マテリアルとして最適化する方法論を確立することを目的とする. 24年度の検討に引き続き, tetra-n-butyl ammonium bromide (TBAB)やtetra-n-butyl ammonium chloride (TBAC), tetra-n-butyl ammonium fluoride (TBAF)を用いたセミクラスレートハイドレート粒子への水素の平衡吸着挙動に関する研究を行った.

その際,水素吸着量の経時変化に対して,新規速度論モデルによる解析を行い,水素吸着速度および拡散速度の観点から膜状ハイドレートの有用性を評価した.さらに,バイオガス利用の水素精製プロセスでは,高濃度二酸化炭素を含んだ水素混合ガスとなるため,ガス分離および水素貯蔵一体型の高効率貯蔵プロセスについても検討を行った.平成25年度の検討にて, TBAFセミクラスレートハイドレートの平衡水素吸着量は形成条件により変化することを確認した. 24年度における結果と合わせると,吸着量の観点から2.6mol% TBAB添加時にHS-I構造, 3.7mol% TBAB, 3.2mol%TBACおよび3.0mol%TBAF添加時にTS-I構造, 3.3mol%TBAF添加時にてSCS-I構造のセミクラスレートハイドレートが形成されると考えられる.新規速度論モデルによる解析を行った結果,吸着速度はガス吸着可能なサイトの数密度が減少するほど増大するが,拡散速度はその数密度が増大するほど増大することを明らかにした.膜状ハイドレートの貯蔵特性に関して,平衡吸着量および拡散係数を用いて透過性を推算し評価を行った.温度269Kにおいて, HS-I構造のTBABセミクラスレートハイドレートは水素貯蔵量および透過性ともに優れていることを示唆した.しかしながら, H_2/CO_2選択率は10程度と低い値が推算された,一方, SCS-I構造のTBAFセミクラスレートハイドレートは, H_2/CO_2選択率は100以上と高く,また,高い分解温度や水素透過性を有することから,ガス分離および水素貯蔵一体型プロセスに適していることが示唆された.水素ガスの貯蔵速度はfuranハイドレートを用いた際に大幅に向上することや,水素混合ハイドレート形成速度の傾向とケージサイズとの関係を示すことができたことから,おおむね順調に進展していると判断した.一方で,furanの揮発性が高いため気相の水素純度を低下させてしまうことや,当初の予想に反し重水の影響が小さく,微小であるもののケージサイズの拡大に繋がった.また,低圧で不安定となるハイドレートの表面構造解析手法の確立も達成していないため,これらを考慮して次年度の研究計画を立てる必要がある.課題であった添加物の揮発性を改善するとともに,セミクラスレートハイドレートの課題であるガス吸着量を構造制御により,3倍程度増加させることができたことから,おおむね順調に進展していると判断した.しかしながら,水素吸着速度に関しては速度論モデルを用いた定量的な解析を行えておらず,ハイドレート形成条件が吸着速度に与える影響の要因を特定できていないため,本系に適用可能なモデルの構築および水素分子の移動促進方法を検討する必要がある.セミクラスレートハイドレートを用いた水素吸着実験において,ハイドレート形成法が水素吸着速度に影響を及ぼすことが判明したため,速度論モデルを用いて定量的に解析し,その要因について検討を行う.
微生物の機能タンパク質に関する分子細胞学的研究

1.微生物の生産する特異的な糖質分解酵素の機能を解析するとともに酵素を利用して有用物質の生産を企てた。(a)糖質分解酵素の糖転移活性を利用して生理活性を持つ糖ペプチドを酵素合成した。得られた糖ペプチドは分解酵素に対して強い抵抗性を示した。(b)タンパク質の糖鎖修飾が機能に及ぼす影響を糖質分解酵素を用いて調べ、タンパク質の安定化などに大きな影響を与えていることを明らかにした。2.大腸菌K-12株においてシステイニルグリシナーゼ活性を持つペプチダーゼは、基質特異性が広いとされるアミノペプチダーゼA,B,NとジペプチダーゼDであり、これら以外にシステイニルグリシナーゼがないことを明らかにした。これら4つのペプチダーゼのうち、これまで精製酵素について研究の行われていなかったペプチダーゼBについて、その酵素的諸性質を調べた。また、γ-グルタミルトランスペプチダーゼの活性中心残基が、小サブユニットN末端のThr残基であることを明らかにした。3.出芽酵母Saccharomyces cerevisiaeにおいて、グルコース依存的に細胞内cAMPレベルを制御するレセプターGpr1の遺伝子を見いだし、その機能解析を行った。GPR1遺伝子破壊株を構築しその表現型を調べたところ、出芽酵母2倍体を高グルコース、低窒素源状態においた場合に認められる偽菌糸形成が、野生株と比較した場合起こりにくくなっていることが明らかとなった。また、その原因が偽菌糸形成において細胞の接着に関与する細胞表層タンパク質をコードするFLO11遺伝子の転写減少によることを明らかにした。大腸菌のグルタチオン代謝:システイニルグリシナーゼ活性を持つアミノペプチダーゼB(PepB)の持つ金属イオンの同定を目的とした精製、様々な金属イオンのPepBに対する影響、またその基質特異性について検討した。PepBはMn^<2+>によって活性化されたが、本精製酵素はZn^<2+>をMn^<2+>の10倍以上含有していた。しかし、高濃度のZn^<2+>の添加によって酵素は失活するため、PepBにおけるZn^<2+>の働きは不明である。また、PcpBにはMn^<2+>の結合しやすい場所とCo^<2+>,Ca^<2+>,Fe^<2+>の結合しやすい場所があると考えられ、これらの金属イオンの相互作用によって高い活性化がみられた。Mn^<2+>,Co^<2+>についてはPepBの熱に対する安定化効果も得られた。また、PepBのCys-Glyに対する活性は極めて高く、Cys-Glyが最も良い基質であったことから、グルタチオン分解系においても、PepBがCGaseとして機能していると考えられた。:大腸菌K-12株において、ジペプチドを細胞質内に取り込む系として、OppAオペロンの産物によるもの、OppEオペロンの産物によるもの、Dppオペロンの産物によるものが知られている。これまでにdppA::Tn10とOppE欠損株を準備できていたので、まずoppPA::kan変異株の作製を遺伝子破壊法によって行った。また、3種類のペプチド取り込み系欠損変異を組合わせた株(いずれか1つの取り込み系を欠損したもの3つ、2つを欠損したもの3組、3つすべてを欠損したもの)をP1ファージを用いた一般形質導入法により作製した。大腸菌のγ-グルタミルトランスペプチダーゼの結晶構造解析:重原子置換体の作成条件を検討し、これまで1本につながっていなかった主鎖を1本にすることに成功した。また、セレノメチオニンを用いた置換体の作成も検討した。Erwinia herbicola由来チロシンフェノールリアーゼ(TPL)の立体構造: PEG6000を用いて野生型のTPLの結晶化を行い、X線結晶解析が可能な結晶を得ることができた。電子密度図を作製しリファインメントを行っている。Micrococcus

luteusのモノアミン酸化酵素: M.Iuteusのモノアミン酸化酵素(MAO)の遺伝子をクローニングしその一次配列を決定した。また、クローニング株から効率よくMAOを精製する方法を確立し、2量体構造を取っていることを明らかにした。出芽酵母の栄養源認識リセプター: GPR1遺伝子破壊株におけるグルコースや発酵性炭素源の添加によるcAMPレベルの変化を調べたところ、一過的な上昇は全く認められなかったことから、Gpr1タンパク質はグルコース依存的にcAMPレベルを調節するレセプターであることが考えられた。γ-グルタミルトランスペプチダーゼ(GGT):AspergillusoryzaeよりGGTを初めて単離し、その酵素化学的諸性質を明らかにした。チロシンフェノールリアーゼ(TPL):3,4-Dihydroxyphenylalanine(L-DOPA)合成酵素であるTPLはチロシンによる誘導酵素である。その誘導発現を調節するレギュレータータンパク質TyrRの遺伝子にランダム変異を導入した。その結果、ある変異型遺伝子を保持する株では、チロシン非存在下においてもTPLを発現するようになり、それは野生株をチロシン存在下で誘導培養した場合と同等以上の発現量であった。L-DOPA実用生産において極めて有用な株を取得することに成功した。アミン酸化酵素:FADを補酵素として持つ、チラミン酸化酵素をMicrococcus luteusから単離し、その酵素的諸性質を明らかにした。また、N末アミノ酸配列に基づくプローブを用いて、同菌のゲノムDNAより、同酵素遺伝子をクローニングし、その塩基配列を決定した。そのアミノ酸配列に基づいて、チラミン酸化酵素の3次元立体構造を予測した。グルコース受容体(GPR1):出芽酵母Saccharomycescerevisiaeでは、細胞内cAMPレベルが上昇するとcAMP依存的キナーゼの活性化が起こり細胞がG1期に停止できなくなるため熱に対して感受性となることが知られている。そこで、cAMP経路に関与する因子の遺伝子破壊株の構築を行い、熱に対する感受性を調べた。その結果、GPR1遺伝子破壊株では、野生株と比べて熱に対して耐性となり、逆に多コピープラスミドにて遺伝子を導入した場合には熱感受性となった。さまざまな遺伝学的、生化学的解析の結果Gpr1からのシグナルは、3量体Gタンパク質であるGpa2を介してアデニル酸シクラーゼの活性化を促していることが明らかになった。γ-グルタミルトランスペプチダーゼ(GGT):グルタミン酸アナログである新規なアフィニティーラベル化剤を用いて,これまでに1次構造の分かっているGGTおよび類似の酵素において完全に保存されている小サブユニットN末端のThr残基が活性中心であることを明らかにした。GGTの新機能の開発を検討した。苦味を呈するアミノ酸をγ-グルタミル化すると呈味性が改善されることを見出した。大腸菌由来のGGTを用いて、苦味を呈するL-Pheを効率的にγ-グルタミル化する方法を開発した。
腎臓形成におけるネフロン前駆細胞の動態制御

腎臓は後腎間葉と尿管芽という2つの組織の相互作用によって発生する。我々は、核内因子Sall1が腎臓発生に必須であること、Sall1を高発現する間葉中に多能性の前駆細胞が存在し、これから糸球体、尿細管など腎臓の機能単位(ネフロン)を構成する多系統の細胞が分化してくることを明らかにした。本計画では、Sall1欠失によってネフロン前駆細胞が維持されない変異マウスと、前駆細胞を蛍光追跡できるマウスを組み合わせて、ネフロン前駆細胞の動きとその制御機構を解明することを目的とした。Sall1の欠失によって、前駆細胞は自己複製能が低下して早期に分化し、さらに細胞死によって消失した。マイクロアレイと全ゲノムクロマチン免疫沈降シーケンス(ChIP-seq)から、Sall1が、ネフロン前駆細胞においては下流遺伝子の転写を促進して未分化状態を維持し、分化中の初期ネフロンでは異常な転写を抑制して正常な状態を保つことが明らかになった。さらにネフロン前駆細胞においてSall1はSix2とともに、重要な腎臓形成遺伝子群の制御領域に直接結合する一方、Six2が存在しない初期ネフロンにおいては、Sall1はMi2/NuRD複合体と結合して転写を抑制することも見出した。これらの過程において、前駆細胞が枯渇することをSix2GFPのタイムラプス観察で同定したものの、その細かい動態は、腎臓組織の厚さと蛍光の弱さに阻まれて解明できなかった。器官培養法及び使用する遺伝子改変マウスの工夫で今後も改善を目指したい。26年度が最終年度であるため、記入しない。本計画では、Sall1欠失によってネフロン前駆細胞が維持されない変異マウスと、前駆細胞を蛍光追跡できるマウスを組み合わせて、ネフロン前駆細胞の動きとその制御機構を解明することを目的とする。ネフロン前駆細胞特異的なSall1ノックアウトマウスは、出生直後に死亡し、腎臓は小さくなり、ネフロンもほぼ消失した。前駆細胞の自己複製能が低下して早期に分化し、さらに分化ネフロンも細胞死を起こすためと考えられた。これは胎生期腎臓の器官培養において前駆細胞の存在を示すSix2GFPをタイムラプス観察することでも明瞭に確認された。またマイクロアレイ解析から、Sall1が、ネフロン前駆細胞においてはactivatorとして下流遺伝子の転写を促進し、分化中の初期ネフロンではinhibitorとして異常な転写を抑制することが明らかになった。またクロマチン免疫沈降によってSall1が前駆細胞で発現する主要な遺伝子群の制御領域に結合する知見を得た。その結合部位の多くはSix2と重なっていることも判明し、Sall1がSix2と協調してネフロン前駆細胞を維持している可能性が示唆された。腎臓組織の厚さと遺伝子改変マウスの蛍光の弱さによって、明瞭なタイムラプス撮影が困難なため。クロマチン免疫沈降後のシークエンスを行い、全ゲノム中のSall1の標的を明らかにする。またネフロン前駆細胞の動態観察に適する培養法の改善を行う。
高専におけるLSI設計教育カリキュラムに関する研究

平成10年度は,LSI設計教育への導入段階として基礎的なハードウェア教育のための環境整備と教育用テキストの準備,および全国の高専におけるハードウェエア教育の現状と問題点,さらにLSI設計を行うための環境,問題点などをアンケート調査した.ハードウェア教育の環境は,昨年設計した教育用FPGAボードを評価用として10セット購入し,大学や高専のハードウェア教育での利用を検討するために貸与した.本研究に関する研究会は,豊橋技術科学大学と共同で『高専におけるLSI設計教育高度化』と題して平成11年2月に開催し,各高専の担当者との討論を行った.平成11年度は,LSI設計教育カリキュラムの試行段階として,HDLを用いた回路設計の講義,演習を行うためのPC環境と教育用テキストの整備を行った.HDLの講義には,PC環境で動作するシミュレータを用いて演習で機能検証を行うことにより,効果的な学習が可能となった.また,教育用テキストは,LSIの概要,HDLの設計,演習から,応用としてのマイクロプロセッサの設計までを解説しており,LSI設計のためのより実践的な回路設計が可能となった.平成12年度は,昨年作成した教育用テキストを利用して,VHDLによるマイクロプロセッサの設計からFPGAへの実装までの実験を行った.また,最近の組み込みシステムに利用されているLSIは,マイクロプロセッサを中心に周辺回路を含むシステム全体をチップに実装するシステムLSIのため,LSI設計以外のマイクロプロセッサや組み込みソフトウェアの教育,実験が必要である.そこで,パソコンと連携して,組み込みのソフトウェアからハードウェアを設計し評価するための組み込みシステム用FPGAボードを試作した.このようなハードウェア教育は,これまでソフトウェア中心で行ってきているため,全員がLSI設計の教育や実験を行うことは非常に有効である.研究の結果,LSI設計教育カリキュラムとしては,VHDLによる回路設計の教育,および実際にFPGAへの回路実装の実験を通して,LSI設計のための入門用教育・実験が可能となった.平成10年度は,LSI設計教育への導入段階として基礎的なハードウェア教育のための環境整備と教育用テキストの準備,および全国の高専におけるハードウェエア教育の現状と問題点,さらにLSI設計を行うための環境,問題点などをアンケート調査した.ハードウェア教育の環境は,昨年設計した教育用FPGAボードを評価用として10セット購入し,大学や高専のハードウェア教育での利用を検討するために貸与した.本研究に関する研究会は,豊橋技術科学大学と共同で『高専におけるLSI設計教育高度化』と題して平成11年2月に開催し,各高専の担当者との討論を行った.平成11年度は,LSI設計教育カリキュラムの試行段階として,HDLを用いた回路設計の講義,演習を行うためのPC環境と教育用テキストの整備を行った.HDLの講義には,PC環境で動作するシミュレータを用いて演習で機能検証を行うことにより,効果的な学習が可能となった.また,教育用テキストは,LSIの概要,HDLの設計,演習から,応用としてのマイクロプロセッサの設計までを解説しており,LSI設計のためのより実践的な回路設計が可能となった.平成12年度は,昨年作成した教育用テキストを利用して,VHDLによるマイクロプロセッサの設計からFPGAへの実装までの実験を行った.また,最近の組み込みシステムに利用されているLSIは,マイクロプロセッサを中心に周辺回路を含むシステム全体をチップに実装するシステムLSIのため,LSI設計以外のマイクロプロセッサや組み込みソフトウェアの教育,実験が必要である.そこで,パソコンと連携して,組み込みのソフトウェアからハードウェアを設計し評価するための組み込みシステム用FPGAボードを試作した.このようなハードウェア教育は,これまでソフトウェア中心で行ってきているため,全員がLSI設計の教育や実験を行うことは非常に有効である.研究の結果,LSI設計教育カリキュラムとしては,VHDLによる回路設計の教育,および実際にFPGAへの回路実装の実験を通して,LSI設計のための入門用教育・実験が可能となった.本年度は,LSI設計教育への導入段階として基礎的なハードウエア教育のための環境整備と教育用テキストの準備,および全国の高専におけるハードウェア教育の現状と問題点,さらにLSI設計を行うための環境,問題点などをアンケート調査した.ハードウェア教育の環境は,昨年設計した教育用FPGAボードを評価用として10セット購入し,大学や高専のハードウェア教育での利用を検討するために貸与した.また,ハードウェア設計のテキストは,豊田高専の情報工学科の講義で利用した内容に説明を補足し,教育用テキストとして出版することを現在検討中である.アンケート調査は,全国の高専の情報,電子,電気,制御の148学科,専攻科に対して行い,現状のカリキュラムの状況を把握するとともに,その内容,問題点,今後のLSI設計教育への考え方などを集計した.さらに,今後の技術動向を把握するために,またインターネットを利用した情報交換,情報公開,アンケート調査を行うために,ハードウェア担当教官のメールアドレスの取りまとめを行った.本研究に関する研究会は,豊橋技術科学大学と共同で「高専におけるLSI設計教育高度化」と題して平成11年2月に開催し,各高専の担当者との討論を行った.本年度は,LSI設計教育カリキュラムの試行段階として,HDLを用いた回路設計の講義,演習を行うためのPC環境と教育用テキストの整備を行った.HDLの講義には,PC環境で動作するシミュレータを用いて演習で機能検証を行うことにより,効果的な学習が可能となった.また,教育用テキストは,LSIの概要,HDLの設計,演習から,応用としてのマイクロプロセッサの設計までを解説しており,LSI設計のためのより実践的な回路設計が可能となった.

さらに,このマイクロプロセッサは,昨年作成した教育用FPGAボードに配置配線し,LSI設計の前段階として実装の演習と動作確認を行うことが可能となった.ハードウェア教育の環境は,教育用FPGAボードを評価用として各大学,高専で利用し,LSI設計教育に利用するために各研究室で評価を行った.本年度は,昨年作成した教育用テキストを利用して,VHDLによるマイクロプロセッサの設計からFPGAへの実装までの実験を行った.また,最近の組み込みシステムに利用されているLSIは,マイクロプロセッサを中心に周辺回路を含むシステム全体をチップに実装するシステムLSIのため,LSI設計以外のマイクロプロセッサや組み込みソフトウェアの教育,実験が必要である.そこで,パソコンと連携して,組み込みのソフトウェアからハードウェアを設計し評価するための組み込みシステム用教育ボードを試作した.このようなハードウェア教育は,これまでソフトウェア中心で行ってきているため,全員がLSI設計の教育や実験を行うことは非常に有効である.研究の結果,LSI設計教育カリキュラムとしては,VHDLによる回路設計の教育,および実際にFPGAへの回路実装の実験を通して,LSI設計のための入門用教育・実験が可能となった.
ホスファチジルイノシトール3リン酸5ーキナーゼの機能解析

生体膜を構成するイノシトールリン脂質は、細胞内シグナル分子として機能することが知られている。イノシトールリン脂質はそのイノシトール環の3カ所の水酸基におけるリン酸化の有無により、8種類存在している。これらの分子の存在量比が、数十種類以上に及ぶイノシトールリン脂質代謝酵素によって、時間的、空間的に厳密に制御されることによりシグナル分子として有効に機能している。本研究では、この中でもホスファチジルイノシトール3, 5.ニリン酸(PI(3,5)P2)を産生する酵素であるホスファチジルイノシトール3リン酸5-キナーゼ(PI3P5K)に着目して、機能解析を行っている。今年度の研究ではPI3P5K遺伝子欠損胚性幹(ES)細胞に認められる酵母の液胞に似た巨大化小胞(空胞)の出現機構を明らかにする目的で、質量分析法により同定したPI3P5K結合分子の一つ、mFig4の機能解析を行った。mFig4のアミノ酸配列からは、PI(3,5)P2ホスファターゼであることが予測されていた。しかしながら、HeLa細胞株において、RNA干渉法により、mFig4の発現mRNAレベルで抑制すると、PI3P5K遺伝子欠損細胞と同様の空胞が細胞内に生じるという、一見矛盾する結果を得た。そこで、イノシトールリン脂質ホスファターゼに共通するモチーフ中の、酵素活性に必須であるCys残基をAlaに置換した変異体を作製し、詳細な解析を行った。その結果、mFig4はPI(3,5)P2ホスファターゼ活性を持つ一方で、細胞内では、PI3P5Kの活性化因子としての役割が非常に大きいことが明らかとなった。本研究により、PI(3,5)P2を産生するキナーゼと分解するホスファターゼが複合体を形成し、協調して機能するという興味深い知見が得られた。イノシトールリン脂質は、そのイノシトール環の3カ所の水酸基におけるリン酸化の有無により、8種類存在している。本研究では、この中でもホスファチジルイノシトール3,5-二リン酸を産生する酵素であるホスファチジルイノシトール3リン酸5-キナーゼ(PI3P5K)に着目して、機能解析を行っている。今年度の研究では、独自に作製したPI3P5K遺伝子ホモ欠損胚性幹(ES)細胞及び、PI3P5K遺伝子ホモ欠損マウスを用いて、以下に示す興味深い知見を得た。PI3P5K遺伝子ホモ欠損ES細胞は、著明な細胞内小胞輸送の異常を来たし、細胞内に酵母の液胞に似た巨大化小胞(空胞)を生じた。この空胞膜上には、初期エンドソームマーカーであるホスファチジルイノシトール3リン酸と、後期エンドソームマーカーであるLAMP1が共局在していた。このことから、初期エンドソームから多胞体形成を経て、後期エンドソームヘと至る輸送経路においてPI3P5Kが重要な役割を担っていることが明らかとなった。PI3P5K遺伝子ホモ欠損マウスは、胎生致死であった。胎生致死機構について詳細な解析を行った結果、PI3P5K遺伝子ホモ欠損マウスは、円筒胚(胎齢5.5日頃)において、胎仔本体を包む臓性内胚葉(visceral endoderm)に巨大な空胞が生じており、9.5日胚までに全例が致死となることが明らかとなった。臓性内胚葉は胎仔の栄養吸収、不要物の排泄に重要な役割を担っていると示唆されているが、その詳細な機構は長らく不明であった。個体発生時の臓性内胚葉細胞小胞輸送の必要性を分子レベルで示した本知見は、重要なものと考えられる。その結果、mFig4はPI(3,5)P2

ホスファターゼ活性を持つ一方で、細胞内では、PI3P5Kの活性化因子としての役割が非常に大きいことが明らかとなった。本研究により、PI(3,5)P2を産生するキナーゼと分解するホスファターゼが複合体を形成し、協調して機能するという興味深い知見が得られた。