hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
血液網膜バリアに着目したVEGFを標的としない加齢黄斑変性の治療法の開発

加齢黄斑変性(AMD)は先進国の視力障害の主原因にもかかわらず、有効な根治療法がない。私たちはオメガ3脂肪酸とそのチトクロームP450代謝産物(CYP)により接着因子が減少して免疫細胞浸潤が抑制され、滲出型AMDに特徴的な脈絡膜新生血管が縮小することを証明した。さらにオメガ3脂肪酸はT細胞浸潤を抑制して眼内炎症を沈静化することを報告した。これらの研究成果から、網脈絡膜への免疫細胞浸潤が滲出型AMDの病態に重要であるとの仮説に至った。本研究ではマウス加齢黄斑変性モデル(CNV)の脈絡膜血管新生の発生における血液網膜バリアの調節因子を同定することを第一の目的とする。血液網膜バリアの調節因子を解析するため、網脈絡膜への免疫細胞浸潤に対するADAM12、ADAM17およびbasiginの役割をCNVおよび自己免疫性実験的ぶどう膜炎(EAU)モデルを用いて評価する。本年度は実験モデルマウスの確立が主目的であり、概ね予定通りに研究が進行している。今年度は,モデルマウスの確立に主眼をおいて研究を進めたため,薬品購入費や検査費,出張費や出版費などへの支出がなかったため,これらの経費は次年度に使用する予定である。
大学コミュニティにおける留学生と日本人の待遇コミュニケーション

本研究では、理工系大学の留学生と日本人構成員で構成されるゼミ等のコミュニティを対象に、場面や相手に合わせた「丁寧さ」と「親しさ」の待遇コミュニケーションに注目し、1)理工系大学の留学生と日本人構成員による、所属ゼミでの公的・私的な待遇コミュニケーションの実態を明らかにし、2)留学生・日本人双方の待遇コミュニケーションに関する意識・評価の調査から、留学生・日本人の接触場面で現れる課題を明らかにすることで、3)待遇コミュニケーション教育のための教材化に向けた学習内容を検討することを目的とする。これらの研究により、留学生と日本人が共にコミュニティを構築するための支援となる会話教育に寄与する。
人力自転車発電機を中核としたエネルギー変換分野のカリキュラム開発と効果の検証

<研究の意義>平成20年3月に公示された新学習指導要領では,エネルギー変換に関わる学習内容が中学校技術・家庭科で必修の学習内容になった。そこで,「人力自転車発電機」を中核にしたカリキュラムを考え実践した。<研究の具体的内容と成果>希望教員20名が集まり,休日の一日を使い人力自転車発電機の製作を行った。この教具を持ち帰り,それぞれの学校で授業実践をした。以下は授業の様子である。(1)「人力自転車発電機」が回転したところで,負荷のスイッチを入れる。(2)この瞬間に急にペダルが重たくなる。負荷は,20W白熱電球,40W白熱電球,60W扇風機の順にスイッチを入れていった。(3)その都度重たくなるペダルから,発電の大変さを身をもって体験することができた。(4)白熱電球2つと扇風機を回すために120W以上の電力を出そうとすると,ほとんどの生徒は7秒くらいしか連続して漕ぐことができなかった。以下は,研究のまとめ報告会で示された生徒の感想の一部である。「扇風機をつけるには,とても力がいった。急にペダルが重たくなり,私は5秒つけるのがやっとだった。自分で発電するって大変なんだと実感した。電気を生み出すのはとても大変なことなので大切に利用しなければならないと感じた。」これは,具体物を用い体を使った実験を行ったからこその成果だと言える。中学校技術・家庭科では,生活の中での電気利用をイメージしながら,実践的・体験的な学習を繰り返していくことが重要であると再確認した。また,エネルギー変換分野の指導計画を作成し,希望者に配布した。さらに多くの学校で実践が広がることを期待している。
ヒトT細胞白血病ウイルスがコードするTaxによる細胞の増殖制御機構の解析

ヒトT細胞白血病ウイルス(HTLV)はヒトT細胞白血病(ATL)の原因ウイルスである。本ウイルスがコードするTaxは感染細胞の種々の機能を制御し細胞を不死化する。生体内においてはHTLV感染細胞は潜伏状態にあり、ウイルス遺伝子発現は抑制されている。おそらく宿主が持っている防御機構によると考えられるが、詳細は不明である。一方、ウイルス側に宿主のそのような防御機構を排除する機能が存在すると考え、Taxによるメチル化プロモータからの転写制御について解析した。Taxが標的とする本来の転写プロモーター(LTR)はメチル化されている場合が多い。その際でもTaxはLTRからの転写活性を低いながらも示した。しかし、Taxにより転写活性化される他のプロモーターからの転写は活性化しない。その原因を調べ以下のことを明らかにした。(1)Taxが転写活性化するメチル化されているプロモーターはCRE配列を持っている。(2)その際CREBの存在は必要としない。(3)Taxによる転写活性化にはメチル化DNA結合タンパク質MBD2が必要である。他のメチル化DNA結合タンパク質はその活性を示さない。(4)TaxはMBD2のC端を介して結合する。(5)MBD2のメチル化DNA結合には塩基配列の選択制は低いにもかかわらず、Taxによるメチル化プロモーターからの転写は配列特異性が高い。以上のことから、配列を認識する他の細胞性因子が存在し、それが介在することによりプロモーター選択性が生まれると考えられる。以上の結果は、HTLV感染細胞において、ウイルスLTRがメチル化された場合においてもTaxにより転写が起こることを示唆するばかりでなく、細胞内においてすでにメチル化されている、あるいは感染により新たにメチル化されたある種の転写プロモーターからの転写をTaxが担う可能性が考えられ、HTLV感染による新たな転写制御機構の存在を示すものである。ヒトT細胞白血病ウイルス(HTLV-1)感染による成人T細胞白血病(ATL)の発症にはTaxの密接な関与が示唆されている。特にTaxによるNF-kB, CREBなどによる転写活性化はウイルス自身の増殖だけでなく、細胞の不死化に重要な働きを果たすといわれている。それ以外にHTLV-1感染細胞およびATL細胞においてはサイクリン阻害因子p21^<Waf>が恒常的に発現が亢進している。これまでの研究から、p21^<waf>がTaxによるNF-κBの転写活性を亢進するだけでなく、HTLV-1遺伝子の発現が見いだされないATL腫瘍細胞においても発現亢進していることから本細胞の腫瘍状態を維持して増殖する機構に抗アポトーシス作用を賦与していると考えた。そこで、Taxによるp21^<Waf>発現が細胞の増殖にどのような効果を示すかを調べた。既にp21^<Waf>がNF-κBを活性化することが知られているので、その活性化機構を調べた。その結果、Taxとp21^<Waf>が共存すると新たにNF-κBのひとつであるp100の発現が亢進され、そのプロセス産物であるp52も増えた。すなわちTax単独の時に比べp21^<Waf>が共存在するとNF-κBの活性シグナルが多様化することを見いだした。発現が多様化したNF-κBの下流遺伝子の中から、Bcl2の活性化が観察された。このことはp21^<Waf>の発現亢進は細胞をアポトーシスから守ることが強く示唆される。ヒト

T細胞白血病ウイルス(HTLV)はヒトT細胞白血病(ATL)の原因ウイルスである。本ウイルスがコードするTaxは感染細胞の種々の機能を制御し細胞を不死化する。生体内においてはHTLV感染細胞は潜伏状態にあり、ウイルス遺伝子発現は抑制されている。おそらく宿主が持っている防御機構によると考えられるが、詳細は不明である。一方、ウイルス側に宿主のそのような防御機構を排除する機能が存在すると考え、Taxによるメチル化プロモータからの転写制御について解析した。Taxが標的とする本来の転写プロモーター(LTR)はメチル化されている場合が多い。その際でもTaxはLTRからの転写活性を低いながらも示した。しかし、Taxにより転写活性化される他のプロモーターからの転写は活性化しない。その原因を調べ以下のことを明らかにした。(1)Taxが転写活性化するメチル化されているプロモーターはCRE配列を持っている。(2)その際CREBの存在は必要としない。(3)Taxによる転写活性化にはメチル化DNA結合タンパク質MBD2が必要である。他のメチル化DNA結合タンパク質はその活性を示さない。(4)TaxはMBD2のC端を介して結合する。(5)MBD2のメチル化DNA結合には塩基配列の選択制は低いにもかかわらず、Taxによるメチル化プロモーターからの転写は配列特異性が高い。以上のことから、配列を認識する他の細胞性因子が存在し、それが介在することによりプロモーター選択性が生まれると考えられる。以上の結果は、HTLV感染細胞において、ウイルスLTRがメチル化された場合においてもTaxにより転写が起こることを示唆するばかりでなく、細胞内においてすでにメチル化されている、あるいは感染により新たにメチル化されたある種の転写プロモーターからの転写をTaxが担う可能性が考えられ、HTLV感染による新たな転写制御機構の存在を示すものである。
HSV-TK遺伝子をターゲットとした紫外線による遺伝子変異機構の解析

日光に含まれる紫外線は、露光部皮膚に発生する皮膚腫瘍(日光角化症、有棘細胞癌、基底細胞癌、悪性黒色腫など)の発生原因として、最も重要である。上記の皮膚腫瘍が多発する高齢者の皮膚の紫外線の変異原性に対する感受性を調べ、更に紫外線の変異作用を抑制できる薬剤の検定システムの作成を目的とした。5例の顔の日光角化症の手術材料より繊維芽細胞を採取し、培養を行った。表皮角化細胞のfeeder layerや器官培養法、無血清培地などの培養を試みたが十分な細胞数を確保、維持できなかった。線維芽細胞は紫外線B、紫外線Cを照射し、致死率を求めたが、同年令の顔の母斑細胞母斑の手術材料の線維芽細胞と明らかな差を認めなかった。人線維芽細胞を安定して培養することが難しく、今年度は、HSV-TK遺伝子の導入を試みることができなかったが、今後、培養条件を検討し、HSV-TK遺伝子を導入し、紫外線による遺伝子変異誘導率の検討を行う予定である。遺伝子変異抑制作用物質の検討については、すでにラット線維芽細胞株にHSV-TK遺伝子を導入して樹立したLTK-15/CREF細胞を使用した。変異原として、50J/m^2の紫外線B単独照射と5μMの8-METHOXYPSORALEN(Sigma;M3501)で1時間インキュベート後3kJ/m^2の紫外線A照射を行った。変異抑制物質として1μMのalltrans-Retinoic Acid(Sigma;R2625)を紫外線照射3日前より照射後1週間まで投与した。その後アシクロヴィルとG418でセレクションを行い、変異細胞のコロニー数をカウントしたところ、UVB単独の時も8MOP+UVAの時もレチノイン酸による変異抑制効果が観察された。今後、人細胞での実験、変異の遺伝子変化の同定、他の変異抑制物質の検討を行う予定である。
人工現実感に関する基礎的研究-仮想空間の生成と人間との相互作用に関する研究-

本研究の目的は、平成7年度に発足する重点領域研究「人工現実感に関する基礎的研究」の計画案を策定することである。本重点領域には、人間と仮想世界の関わり方に応じて4つの研究分野を設けている。これらの分野ごとに研究分担者の会合が開催され研究項目の設定や具体的な研究の進め方について議論が行われた。本重点領域では、各分野において専門的議論を進展させると同時に横断的視点を総合することで、基礎学問としての体系化を図ることを目指している。このため現在までに4つの分野の研究班の代表者による打ち合わせ会を開催し、各分野の分担と連携に関する意見交換を行なった。ここでは本重点領域が申請された時点以来の技術的展開も踏まえた議論が行なわれ、分担領域相互の再度の調整が行なわれた。この結果に基づいて、各分担領域の研究計画調書が起草され提出されている。さらに、本重点領域研究の総括班に参加予定の研究者を招いた研究会合を開催し、学際的な視点からの情報提供を受け、新たな研究項目の洗い出しも行なっている。これらの結果を総合して、本重点領域全体についての研究計画書が作成された。また、本重点領域研究が発足した後の全体会議の開催予定や、研究成果の公開の方法等についても、既に議論を開始している。その中で主要な会合や公開シンポジウムについての具体的な日程の調整や、研究予算の管理事務の方針などの運用面の検討も行なわれた。これらの結果により、重点領域研究の円滑な推進のための最終的なグランドデザインがまとめられている。
超臨界流体反応場における有機金属化合物の分解反応解析と薄膜堆積プロセスへの応用

本研究では、超臨界流体中における無機化合物(金属酸化物)形成反応の進行に適した有機金属化合物(有機金属錯体およびアルコキシド誘導体)の分子構造ならびにその反応条件を解明・実証すること、ならびにそれらの知見を金属酸化物薄膜堆積プロセスへ応用することを最終目的とした。研究進行の結果、反応場温度の上昇および酸化剤の添加による金属酸化物反応の促進、ならびに配位子構造に依存した有機金属錯体の反応場に対する溶解度の増減、等の現象が確認された。更に、それらの知見を利用した薄膜材料堆積の実験により金属酸化物キャパシタ薄膜の試作し、その電荷蓄積に係る機能を評価した。本年度活動においては以下3項目の研究課題に着手し、幾つかの知見を得ることができたので報告する。(1)有機金属錯体の分解→金属酸化物形成反応の解析:昨年度に引き続き、超臨界二酸化炭素(scCO2)反応場中における有機金属化合物の分解・重縮合反応をモニタリングすることで無機化合物(金属酸化物)生成の機構を調査した。本年度の研究においては主として、酸化剤や触媒等の添加による反応の促進効果を評価対象として調査を実施した。その結果、過酸化水素水や酸素ガスなどの酸化剤を反応系に添加することにより金属アルコキシドを始めとする有機金属の分解反応が促進されることが明確化された。(2)有機金属錯体の溶解挙動の解析:同じく昨年度に引き続き、scCO2反応場における有機金属化合物の溶解・分散挙動を調査した。その結果、scCO2に対する化合物の溶解性は配位子(特にβ-ジケトン配位子)数に依存することが分かった。しかしながら、溶解性の向上は金属酸化物形成反応の進行とは直接的に関連せず、薄膜材料堆積のためにはそれらを担保するための官能基(アルコキシド等)の導入が必須であることもあわせて判明した。(3)無機材料合成に適した有機金属化合物の設計と実証:これまでの課題進行により得られた知見に基づいた無機材料薄膜の堆積実験を実施し、合成物の材料物性を評価検証した。Si、Ti、Zrなどを中心元素とした金属アルコキシド(あるいはアルコキシド/β-ジケトン複合錯体)を原料、過酸化水素水を添加剤としたscCO2反応場中での材料堆積実験の結果、各種電極付シリコンウェハ(Al/Si, Pt/Si等)上に100300°Cの反応温度で金属酸化物薄膜(SiO2, TiO2, ZrO2など)を堆積することに成功した。あわせてそれらの試料に対する特性評価を実施し、各種金属酸化物に相当する誘電特性の発現を確認した。本年度活動においては以下2項目の研究課題に着手し、幾つかの知見を得ることができたので報告する。(1)有機金属錯体の分解→金属酸化物形成反応の解析:超臨界二酸化炭素(scCO2)反応場中における有機金属化合物の分解・重縮合の挙動をモニタリングすることで無機化合物(金属酸化物)生成機構の解析を試みた。従来法では熱エネルギー(加熱)を基に進行した各種反応が、超臨界流体反応場中においてどのような過程を経て促進されるかを調査することが本項の目的である。本年度の研究では主として金属アルコキシド原料からの二酸化ケイ素SiO2および二酸化ジルコニウムZrO2の合成反応を評価対象とし調査を実施した。その結果、いずれの材料においても200oC以下の比較的低温領域で金属酸化物の形成に係る反応が進行することを確認すると同時に、それらの副生成物が気化膨張を伴わずscCO2流体を介した抽出により合成物中から除去されることを確認した。(2)有機金属錯体の溶解挙動の解析:同じくscCO2反応場における有機化合物の溶解・分散挙動を調査することで反応場中での物質輸送および堆積メカニズムの解析を試みた。本年度の研究では、配位子/側鎖構造が異なる幾つかのTiおよびZr錯体群を観察対象とし、有機溶媒ならびにscCO2に対する溶解挙動を比較評価した。その結果、先ず錯体配位子と類似の分子構造や電子・極性構造を有する有機溶媒に対してそれらの金属錯体は良好な溶解性を示すことが明らかとなった。加えてscCO2はヘキサン等の非極性溶媒と類似した溶媒特性を以てそれらの金属錯体を溶解する傾向を示すことが確認された。初年度終了時において、研究目的は概ね順調に達成されたものと判断される。本研究申請時に示された2件の課題「(1)有機金属錯体の分解→金属酸化物形成反応の解析」および「(2)有機金属錯体の溶解挙動の解析」がそれぞれ計画通りに進行したことに、各課題においていくつかの有用な知見を得ることができた。続く本年度の研究進行においても、申請時に提示された研究計画に沿った活動が実施されれば研究の最終目的達成を十分に達成することが可能であると期待される。

本年度は主として「無機材料合成に適した有機金属化合物の設計と実証」といったテーマに基づき研究を進行する。本テーマでは超臨界流体反応場での材料合成反応に適した有機金属化合物の分子構造を検証し、それらの知見に基づいた原料化合物の選定・設計、ならびにそれらを利用した材料合成を実施する。昨年度(平成24年度)の課題進行により得られた情報を元に、材料合成に適した化合物、すなわち分解→金属酸化物形成の能力に優れ、かつ超臨界流体に対して十分な溶解能を示すことのできる有機金属化合物の分子構造を選定・設計する。各側鎖/配位子構造の役割が予め明確化されることで両者の特性を調和良く内包する有機金属化合物の構造が設計可能になるものと判断される。また、選定・設計された化合物の特性を実証するため、化合物の合成ならびそれらを原料とした無機材料合成を実施し、無機材料の低温合成や多成分系酸化物の形成など、対象化合物の無機材料合成への適性を評価する。これらの実験は既に当グループにより作製が完了した自作のフロー式薄膜堆積装置を利用して実施する。主として、実験実施に係る試薬および装置部品の購入に対して本予算を使用する。また、昨年度研究成果の一部を公開するための活動(学会発表および論文作成)、ならびに実験作業補助者への謝金に予算の一部を使用する予定である。
声帯瘢痕に対する細胞移植による再生医療に関する研究

細胞移植を用いた声帯の再生医療を確立することを目的とした。細胞ソースとして、MSC(骨髄由来間葉系幹細胞)とASC(脂肪由来間葉系幹細胞)が有効で、ラットおよびイヌ声帯瘢痕モデルを用いた検証では、ASC, MSCともに組織学的、機能的に良好な再生効果を示したが、遺伝子発現においてはASCがHAS, HGF発現において有効であった。また、再生土台の開発として増殖因子を徐放可能なコラーゲン・ジェラチン複合土台を開発し、声帯線維芽細胞との組織親和性が良好で、イヌ声帯瘢痕への移植により良好な再生効果を確認した。今後ハイブリッド移植による声帯再生の向上が期待される。幹細胞を用いた声帯再生の実験を遂行している1.細胞ソースの確立:ラット、イヌを用いて、単核球(MNC)、脂肪由来幹細胞(ASC)、骨髄由来幹細胞(MSC)の抽出を行った。MNCについては専用遠心分離機を用いて効率よく抽出することができた。ASCは腹部脂肪より、MSCは大腿骨骨髄から効率よく抽出し、培養系を確立した。これらの細胞を用いて以下の移植実験をおこなった。2.上記細胞を用いて、ラット、イヌにおける声帯瘢痕の再生実験を遂行した。(1)ラット慢性期瘢痕モデルにおけるASC, MSCの移植実験:ラットの2カ月瘢痕声帯に細胞を移植(50万個)し、1カ月、3カ月後に再生効果を組織、遺伝子レベルで検出した。現在分析中であるが、いずれの細胞群においても良好な再生効果が期待されている。遺伝子レベルにおいてはASCのほうがHGFなどの細胞増殖因子の活性化においてより良好な結果がでた。現在さらなる解析を続行中である。(2)イヌ急性期瘢痕モデルにおける移植実験:イヌにおいて、1カ月瘢痕声帯に対し、ASC, MSCを蛍光ラベルして移植した。6カ月後に組織学的、機能的な検討を行う予定である。(3)ラット慢性期瘢痕におけるMNC移植の効果:上記と同様に細胞移植を施行。現在解析中である。MNCにおいては組織再生効果とともに、血管再生因子を検討中である。(4)ラットにおける慢性期声帯瘢痕に対するASC, MSC移植実験:ラットにおいて2カ月慢性瘢痕を作成、ASC, MSCの移植を行った。現在解析中である。声帯の再生に関する研究を初年度より引き続き継続中である。1.再生に必要な細胞ソースの検討:ラットを用いて、脂肪由来間葉系幹細胞(ASC)、骨髄由来間葉系幹細胞(BM-MSC)についての検討を行った結果、ASCはBM-MSCに比較して肝細胞増殖因子(HGF)などの増殖因子やサイトカインの産生能力が高いことが確認された。2.細胞移植による声帯再生の効果についての検討: ASC, BM-MSCを用いて、ラットおよびイヌの声帯瘢痕モデルを用いて細胞移植による再生効果の検討を行った。いずれの細胞も移植後1か月まで声帯内に留まること、3か月目には消失することを確認し、その残存効果については優位な差を認めなかった。ラットの声帯瘢痕に細胞移植後1,3か月目に喉頭を摘出し組織学的検討を行ったところ、いずれもヒアルロン酸の回復、コラーゲンの正規化が認められ再生効果が確認された。これらの効果に有意な群間差を認めなかった。一方、遺伝子発現をみると、ASCでヒアルロン酸合成酵素(HAS)1-3の発現亢進、FGF, HGFの発現亢進を認めた。BM-MSCにおいてはHAS3, procollagen type III, FGF, HGFの発現亢進を認めた。HAS、HGFにおいてはASCの発現亢進のほうが強い傾向があった。イヌについては同様にASC, BM-MSCにGFPラベルして移植し、再生効果を組織および吹鳴実験による機能評価を行っているところである。3.再生と増殖因子の相乗効果についての検討: Collagen-gelatin scaffold (CGS)を用い、声帯線維芽細胞を播種し、細胞親和性、活動性を検討した結果、CGS上で細胞の増殖は良好である、FGFやHGFの遺伝子発現が認められた。次にイヌ声帯瘢痕モデルを用い、CGSのみの移植、CGS+FGF移植による再生効果の検討を行った。その結果、CGSの移植のみでもある程度の声帯再生効果が認められたが、FGFを添加することにより声帯振動機能に有意な効果が認められ、両社の相乗効果が確認された。目的:細胞移植を用いた声帯の再生医療を確立することを目的とした。細胞ソースの樹立:細胞ソースとしては、iPS, MSC(骨髄由来間葉系幹細胞、ASC(脂肪由来間葉系幹細胞), MNC(単核球)を候補としたが、自家幹細胞であるMSC, ASCに絞られ、両者の細胞樹立系を確立した。再生効果の検証:ラット声帯瘢痕を作成し、GFP標識したMSCおよびASCを声帯へ移植した。1か月後の細胞生着は良好で、3か月後の組織所見で細胞移植におり声帯のヒアルロン酸の回復とコラーゲンの消化が認められ良好な再生効果が確認された。投与後1か月の声帯内における遺伝子発現では、ASC群でHGF、ヒアルロン酸合成酵素(HAS)の遺伝子発現が強いことを確認した。次に、イヌ声帯瘢痕にMSC, ASCの移植実験を行った。

6か月後の振動機能検査で、両細胞群はSham群より有意に振動機能の改善が確認されたがASCのほうがより声門閉鎖が良好で、かつ声帯内のヒアルロン酸の回復とコラーゲンの消化において優れていた。再生土台、増殖因子を用いたハイブリッド効果の検証:再生土台として増殖因子を徐放可能なコラーゲン・ジェラチン複合土台(CGS)を開発した。声帯から抽出した線維芽細胞をCGS上で3次元培養した結果、線維芽細胞はCGS上でよく生着し、bFGF存在下において有意に細胞増殖が促進された。またbFGF存在下において細胞からの内因性bFGF, HGF、HAS-1, 2の遺伝子発現が亢進された。次に、CGS+bFGFのイヌ声帯瘢痕への移植実験を行った結果、ハイブリッド移植は声帯振動の改善、ヒアルロン酸の回復などにおいて有意に良好な再生効果をもたらした。考察:今回の成果より、細胞移植による声帯再生においてはASCが最も至適と考えられ、bFGFやCGSとのハイブリッドでより強力な再生効果が確認できた。細胞移植を用いた声帯の再生医療を確立することを目的とした。細胞ソースとして、MSC(骨髄由来間葉系幹細胞)とASC(脂肪由来間葉系幹細胞)が有効で、ラットおよびイヌ声帯瘢痕モデルを用いた検証では、ASC, MSCともに組織学的、機能的に良好な再生効果を示したが、遺伝子発現においてはASCがHAS, HGF発現において有効であった。また、再生土台の開発として増殖因子を徐放可能なコラーゲン・ジェラチン複合土台を開発し、声帯線維芽細胞との組織親和性が良好で、イヌ声帯瘢痕への移植により良好な再生効果を確認した。今後ハイブリッド移植による声帯再生の向上が期待される。細胞ソースについては、当初計画していたiPS細胞については、他施設において直接声帯への投与により腫瘍形成を認めたことが判明し、中断している。iPSをまず分化導入する必要があり、実際、iPSから間葉系幹細胞(MSC)へ分化する技術は京大再生研において確立しているが、このMSCを用いるのであれば、自家脂肪あるいは骨髄由来のMSCを用いるほうがより簡便かつ安全と考えられ、現在ASCとBM-MSCを主体に研究をすすめている。単核球については分離方法は確立しており、次の段階への準備中である。また、今年度は、ASC, BM-MSCを用いてラット声帯瘢痕の再生効果を検討してきた。いずれも声帯瘢痕の組織学的再生効果(ヒアルロン酸の回復、コラーゲン線維の吸収など)を認めたが、各治療群における声帯内の遺伝子発現をみると、ASCのほうがヒアルロン酸合成酵素や肝細胞増殖因子(HGF)などの声帯再生に重要な遺伝子の発現をより効果的に認めた。また、ASCはin vitroにおいてもHGF産生が強力であり、採取のしやすな、抽出効率の高さなどからBM-MSCより優れた点が多く、声帯再生への応用もしやすいものと考えられた。また、再生土台、細胞ソース、増殖因子を組み合わせた至適再生手法の確立をめざし、まず再生土台であるCollagen-gelatin scaffold (CGS)と線維芽細胞増殖因子(FGF)との相乗効果を検討した。CGSはFGFを補足する効率に優れ、生体内での徐放効果に優れることがin vitro, in vivoの検討で確認された。今後ASCを細胞ソースとして、再生土台、増殖因子との相乗効果を検討していく予定である。耳鼻咽喉科1.ASCの声帯再生効果をイヌ声帯瘢痕モデルを用いて引き続き検討する。2.再生土台+ASC、さらにこれにFGFあるいはHGFの増殖因子を導入することによる再生効率の検討をすすめる。
慢性偽性腸閉塞症に対する新たな診断モダリティーの確立および病態解明

難治性の消化管蠕動障害である慢性偽性腸閉塞症(CIPO)において、CTや単純レントゲンなど従来の方法では、消化管蠕動低下の様子をダイレクトに描出することができなかった。今回我々は、臓器の運動を細かな時間的・空間的分解能で把握できるシネMRIを用いて、CIPO患者蠕動低下をダイレクトに描出することに成功した。本モダリティは、本疾患の新たな診断モダリティとして今後有用と考える。さらに本疾患にて結腸切除術を行った患者の手術標本を病理学的に解析し、本疾患の病態解明を試みた。慢性偽性腸閉塞(CIPO)は生涯にわたりそのQOLを低下させる重篤な難治性疾患であるにもかかわらず、疾患認知度が低く正確な診断がつかないまま不適切な治療が繰り返される症例も多い。我々は世界で初めて診断基準を作成し、その妥当性を報告してきたが、本疾患の腸管蠕動をダイナミックに視覚化しうるモダリティの開発が急務であった。本研究は、非侵襲的で放射線被曝の伴わない「シネMRI」の新たな腸管蠕動評価方法としての妥当性を検討し、最終的には従来にはない「直接的に」腸管蠕動異常を評価できる新たな診断モダリティーとしての確立を目的とするものである。平成25年度は東海大学工学部医用生体工学科高原太郎教授との協力体制のもと1.5 Teslasystem , b-TFE sequenceという撮影条件を考案し、シネMRIを施行した。CIPO患者12名、対照として健常者12名、類似症状を有するIBS患者12名をエントリーした。この結果、CIPO患者の腸管径は健常者やIBS患者と比べて有意に拡張し、逆に収縮率は有意に低下していた。これにより、シネMRIはCIPOの腸管蠕動低下を明瞭・視覚的かつ定量的に描出できる新たなモダリティであることが示され、CIPOの診断ツールとしての有用性が証明された。以上の結果は論文化し、American journal of Gastroenterology誌にアクセプトされた。慢性偽性腸閉塞(CIPO)は重篤かつ生涯にわたりそのQOLを低下させ、時に死に至る難治性疾患であるにもかかわらず、疾患認知度が低く明確な診断基準が存在しないなどの理由で正確な診断がなされず不適切な管理を余儀なくされた患者も多かった。我々はこの現状を憂慮し世界で初めて明確な診断基準を提唱し、国内において診断における高い感度を示すことを報告してきた。一方でその病態を理解するために、従来のCTやレントゲンといったモダリティにはない、ダイナミックな画像評価方法の確立が急務であった。我々は平成25年、26年を通じ、「シネMRI」という動画として小腸運動を視覚化しうるモダリティを開発し、対照として健常者やIBS患者と比較することでCIPO患者の小腸蠕動低下を科学的に証明することができた。この成果はOhkubo H, Nakajima A, et al. Assessment of small bowel motility in patients with chronic intestinal pseudo-obstruction usingcine-MRI. Am J Gastroenterol. 2013; 108: 1130-9.として米国一流誌に報告した。さらに平成26年度には全国規模で症例集積を重ね、CIPO患者データベースを作成した(現在も作成中である)。CIPO患者の腹部臨床症状とシネMRIによる収縮率・腸管径の関連などを解析することは、まさに病態解明そのものに迫るものであり、今後その成果を学会発表・論文などを通して世に公表し、医学・社会への還元を行う予定である。消化器内科学全小腸をダイナミックかつ再現性を持って何度でも評価できる「シネMRI」を、難治性かつ重篤な当該疾患の新たな診断モダリティとして確立することを平成25年度の最大の目標としていた。前述のように、厚労省診断基準を満たすCIPO患者、RomeIII基準を満たすIBS患者、健常者に対してそれぞれシネMRIを施行し、CIPOの小腸蠕動評価に対するシネMRIの有用性を証明することができた。これによりシネMRIは新たなCIPO診断ツールとなりうることが示されたと言える。本疾患は、患者のQOLを大きく損ない時に致命的となりうる重篤な難治性疾患である。しかし極めて稀少疾患であるため十分な疾患データベースがなく、また病態解明もほとんどなされていない。シネMRIのCIPO蠕動評価に対する有用性が証明された後は、より大規模に全国より症例を集積し、シネMRIにより得られた情報をデータベース化する。手術標本がある症例に対しては病理学的所見(筋原性、神経原性、カハール間質細胞性)とシネMRIでの蠕動パターンの関連も検証することで、暗黒とされてきた本疾患の病態解明を目指す。

また、病勢評価、治療前後での比較、手術適応検討や類似症状を持つ機能性疾患(IBS等)との鑑別など、様々な臨床応用を通じて新たな蠕動評価モダリティとしての確立を目指す。
地域産業による木材資源の持続的利用からみた需給不均衡に関する調査研究

1.研究活動実績木の国、山の国と言われ森林が面積の82%を占める岐阜県を対象とした。特に全国各地で問題となっている拡大造林時に植林された人工スギが最も高い構成比を占める長良川流域に比重を置いて調査を行った。我が国の特微を把握する為、米国ワシントン州で資源と産業の関係、社会制度を調査した。この米国北西部から輸入される米松等の工業製品が、我が国の木造住宅建築で大量に消費されている。2.研究成果実績岐阜県を構成する5流域(長良川、揖斐川、木曽川、飛騨川、宮・庄川)で、森林資源と木材地場産業の関係を考察した。河川流域は当該地域の生態系に深く影響を与え、その結果、流域毎に森林資源に特徴が見える。そしてその森林資源を利用して育まれた木材地場産業の文化に個性が生じている事が分かり、また自然災害の発生状況にも特徴が見られた。行政区域ではなく自然条件により境界をなくす河川流域を調査対象地域とし、実態を標本からの推計ではなく、実数の積み上げにより、木材供給、流通量とその経路、木材需要について把握した点が、従来研究にはない本研究の特長の一つである。長良川流域では伐採すべき量の5分の1程度しか生産されておらず、この数値がいかに山林が放置されているかを裏付ける。材価の高いものが県外に出される傾向があり、製材加工の段階では、流域で算出された木材の市場規模は県外で大きくなる。流域は広樹林をひく小規模な製材所が多く、さらにスギはヒノキに比べ乾燥が難しく、製材技術や施設が発達していない。また東濃檜のように流通銘柄化なども進んでいない。また製品市場がない。木造住宅建築における木材需要量を流域内の森林資源で供給できるが、総需要量14万m^3に対し、国産材使用量は4万m^3程度であった。長良川流域の森林資源のサステナビリティに対する木材地場産業の寄与率を試算すると13.5%程度であり、非常に低いことが分かった。1.研究活動実績・国内調査では市売事業者を始め現場従業者や研究者等、35名に対してインタビューを実施した。また木材流通に関する実態調査では、この他に多数の素材生産事業者や製材事業者等からアンケート調査に対するご回答を得た。・海外調査ではドイツ4都市6箇所13名の専門家・研究者、行政担当者に対してインタビューを行った。また実態把握の為、帰国後も資料提供等の協力を得ている。・国の情報公開手続きを経て、建築着工統計調査票・除却届を閲覧し、岐阜県の建築着工の実態について調査している。この他、農林水産省、林野庁、東海農政局、岐阜県庁等、多数の関係各課における担当者ベースの資料を入手、それらの分析を通して、実態調査を進めている。2.研究成果実績○ドイツとの比較・ドイツには、林業に対する公的補助は、一部の例外を除いてない。森林と産業の関係が成熟しており、例えば事業者が、その木材販売収益の一部を、所有山林が急峻で生産性が低い事業者へ配分する等、結果的に自らの産業が自立できる仕組みが出来ている。一方、我が国では潤沢な補助金を得ながら、それが地域間における材価の下等競争を招く等、森林や産業全体の為にはなっていない事が調査から分かった。・さらに我が国では治山・治水や砂防事業費、また販売木材による収益が、森林手入れを怠った事による半ば人為的な一災害の被害額と同程度となっている。産業による森林の持続的利用どころか、巨額な公的な保護にもかかわらず、森林はバランスを崩している。○調査対象とした長良川流域について・岐阜県の流域毎の特徴を把握し、その中でも問題の多い長良川流域で産出される杉の素材生産量や流通量、流通経路等をほぼ把握した。また下流域の木材需要について調査中であり、来年度には、森林資源、木材流通、木材産業等から得られる森林資源と地域産業の関係、需給バランス等の実態が明らかになる。

流域は広樹林をひく小規模な製材所が多く、さらにスギはヒノキに比べ乾燥が難しく、製材技術や施設が発達していない。また東濃檜のように流通銘柄化なども進んでいない。また製品市場がない。木造住宅建築における木材需要量を流域内の森林資源で供給できるが、総需要量14万m^3に対し、国産材使用量は4万m^3程度であった。長良川流域の森林資源のサステナビリティに対する木材地場産業の寄与率を試算すると13.5%程度であり、非常に低いことが分かった。
抗腫瘍因子ＰＰ２Ｃδの機能制御の解明による新規分子標的創薬のための基盤研究

PP2Cδ/ILKAPはプロテインホスファターゼであるPP2Cファミリーの一つであり、細胞のアポトーシスにおいて促進的な機能を担っていると考えられているが、詳細は不明である。我々はPP2Cδ/ILKAPが細胞のアポトーシス誘導刺激時にcaspase3によってAsp39において切断されることを報告しているが、本研究において、PP2Cδ/ILKAPが切断によってアポトーシス抑制性に機能し、ネガティブフィードバックループを形成している可能性を示した。本研究では,翻訳後修飾のひとつである切断を介したPP2Cδの活性および発現量の調節とこれによる細胞機能の制御機構を解明することにより,口腔癌の分子標的創薬に資することを目的とした.当該年度は、内在性のPP2Cδの機能解析に研究をすすめた。アポトーシス誘導刺激下の細胞において、PP2Cδはcaspase-3によって限定分解をうけることが報告者のこれまでの結果からわかっている.製品化された内在性のPP2Cδを認識する抗体のうち、内在性の切断型PP2Cδを十分に検出できるものはほとんどないため、内在性の全長型PP2Cδのタンパク量を指標に解析を行った.アポトーシス誘導刺激下において少なくとも全長型のタンパク量はほとんど減少しないことがわかった。つまり、アポトーシス誘導刺激下において、PP2Cδの合成量が増加していることが考えられた。これは、PP2Cδがアポトーシス誘導刺激下の細胞において、何らかの機能を担っていることを示唆するものである。そこで、細胞に3種類のPP2Cδ(野生型・切断型・非切断型)を発現させ、アポトーシス誘導刺激下での細胞の生存率を比較したところ、野生型と非切断型に有意差は見られなかったが、切断型を発現させたものはそれらよりも有意に生存率が高かった。これらの結果は、PP2Cδがアポトーシス誘導刺激下の細胞において、切断を受けることによって、アポトーシスに抵抗する方向へ機能している可能性を示している。タンパク合成量の増大はその結果と思われる。これらの結果は、細胞のアポトーシスのメカニズム解明に貢献し、癌をはじめとしたアポトーシスに起因する疾患(エイズ、糖尿病、アルツハイマー病)に対する創薬に資するものである。当該年度は、PP2Cδの切断と、その機能的意義に関する解析をすすめた。これまでの研究成果からPP2Cδはアポトーシス誘導刺激下において活性化したcaspase-3によりAsp39において切断されることがわかっている。しかし、この切断部位はcaspase-3の典型的な切断モチーフDXXDとは異なるSTDSであった。この配列が切断モチーフに近づくためには切断の前段階としてSer36のリン酸化が起こる必要があると考えられ、点変異体を用いて解析したところ、Ser36の擬似リン酸化変異体であるS36Dで、切断量が亢進することが示された。PP2CδのAsp39がcaspase-3によって切断を受けるためには、その前段階として何らかのキナーゼによってSer36のリン酸化が起こる可能性が示唆された。また、PP2Cδ切断の機能的意義を調べるために切断型PP2Cδのリコンビナントタンパクを精製し、脱リン酸化活性の測定を行ったところ、切断が起こった後も、少なくとも全長型と同程度の脱リン酸化活性を有することが確認された。すなわち、PP2Cδは切断によって、活性を失うことなく、局在変化あるいは標的タンパクの変化によってその機能を変化していることが示唆される。これまでの成果よりPP2Cδはp53とMDM2の会合を抑制していることがわかっていることからPP2Cδの酵母ツーハイブリッド法を行いピックアップされたタンパク質の中で、MDM2と結合するRPL11に注目して解析を行ったところ、PP2Cδの発現量に反比例してRPL11のタンパク量が減少することがわかった。全長型PP2Cδがアポトーシスを促進するのに対して、切断型はその逆の機能を有する可能性があり、アポトーシスに対して負のフィードバックループを形成していることを示唆するものである。内在性の切断型PP2Cδを認識可能な抗体がないために、内在性PP2Cδの解析に困難があったため。25年度が最終年度であるため、記入しない。引き続き、プロテインホスファターゼPP2Cδの機能解析を行うが、今後の研究の推進方策として、翻訳後修飾としてのcaspase-3による切断前後のPP2Cδの機能変化に焦点を絞った解析を進めていく。すなわち、大腸菌を用いて精製したPP2Cδ(野生型・切断型・非切断型)を用いて、ホスファターゼ活性や局在の変化等についての解析を中心に行なっていく。プロテインホスファターゼPP2Cδの切断前後で、A)ホスファターゼ活性や局在等の機能変化が認められた場合には、caspase-3による切断によってPP2Cδが次のように活性の変化が起こる可能性がある。すなわち、1活性化、2不活性化、3結合タンパク質との結合能の変化、の可能性である。これらの可能性をふまえて、基質となるタンパクを介したシグナル伝達への影響について解析をすすめる。

B)変化が認められない場合には、ユビキチン化等の修飾を受けて、分解促進へ向かっている可能性がある。この場合には、caspase-3による切断に引き続いて、PP2Cδがユビキチン化等の二段階の翻訳後修飾を受けている可能性がある。切断前後で機能変化が起こらない場合には、タンパクの安定性についての解析をすすめていく。細胞のアポトーシスにおいてPP2Cδが担う役割のメカニズムは現在不明であり、本研究において明らかにしていく。25年度が最終年度であるため、記入しない。
共有型社会のためのヒューマンセントリックメカニズム設計理論の構築

本研究課題では,限られた資源を人々の間で共有し有効活用するためのメカニズム設計技術を確立することを目的とし,共有型社会に向けたシェアサービスの主な例としてクラウドソーシングとライドシェアリングを対象に人々へ適切なインセンティブを与えるためのメカニズム設計の検討を行う.本年度は,まず,クラウドソーシングにおける主要な研究課題の一つとして位置づけられている,作業品質保証において重要な要素である,ワーカの能力推定に関して研究を行った.具体的には,機械学習の手法と協力ゲームの解概念の一つであるシャプレイ値を組み合わせた推定方法の研究を行った.その研究成果として国際会議に採録され,論文発表を行った.また,クラウドソーシングにおいて複数のワーカらでググループを構成し複雑なタスクを行う場合,ワーカらの適切なグループ分割が必要となる.このようなワーカのグループ分割問題を最適化問題として定式化すると共にMaxSAT符号化を行い,計算機実験を行った.その研究成果を2019年6月の国内学会にて論文発表を予定している.さらに,2019年1月にオーストラリアに渡航し,アデレード大学にて海外共同研究者と共同研究を開始した.特に,クラウドソーシングにおけるインセンティブ設計を対象に,機械学習の手法を応用した自動メカニズム設計の検討を行い,基盤技術の開発に着手した.クラウドソーシングにおけるワーカの能力推定に関する研究について国際会議に採択された.また,渡航以降,クラウドソーシングのためのメカニズム設計の自動化技法を主に,海外共同研究者との研究も順調に進んでいる.クラウドソーシングのためのメカニズム設計の自動化技法について検討を進めると共に,ワーカの意見統合手法の提案についても着手する.2019年度内の国際会議投稿及び国際論文誌投稿を目指す.内定年度:2017本研究課題では,限られた資源を人々の間で共有し有効活用するためのメカニズム設計技術を確立することを目的とし,共有型社会に向けたシェアサービスの主な例としてクラウドソーシングとライドシェアリングを対象に人々へ適切なインセンティブを与えるためのメカニズム設計の検討を行う.本年度は,まず,クラウドソーシングにおける主要な研究課題の一つとして位置づけられている,作業品質保証において重要な要素である,ワーカの能力推定に関して研究を行った.具体的には,機械学習の手法と協力ゲームの解概念の一つであるシャプレイ値を組み合わせた推定方法の研究を行った.その研究成果として国際会議に採録され,論文発表を行った.また,クラウドソーシングにおいて複数のワーカらでググループを構成し複雑なタスクを行う場合,ワーカらの適切なグループ分割が必要となる.このようなワーカのグループ分割問題を最適化問題として定式化すると共にMaxSAT符号化を行い,計算機実験を行った.その研究成果を2019年6月の国内学会にて論文発表を予定している.さらに,2019年1月にオーストラリアに渡航し,アデレード大学にて海外共同研究者と共同研究を開始した.特に,クラウドソーシングにおけるインセンティブ設計を対象に,機械学習の手法を応用した自動メカニズム設計の検討を行い,基盤技術の開発に着手した.クラウドソーシングにおけるワーカの能力推定に関する研究について国際会議に採択された.また,渡航以降,クラウドソーシングのためのメカニズム設計の自動化技法を主に,海外共同研究者との研究も順調に進んでいる.クラウドソーシングのためのメカニズム設計の自動化技法について検討を進めると共に,ワーカの意見統合手法の提案についても着手する.2019年度内の国際会議投稿及び国際論文誌投稿を目指す.
抗癌剤治療に伴う卵巣機能障害の分子機構解明と予防療法確立

平成19年度初頭に大学動物実験室のマウス肝炎ウイルス汚染が発見され、飼育マウスを全頭屠殺した。半年間の観察期間後にもウイルス汚染が検出され、動物実験室閉鎖がまだ続いている。そこで、研究方向転換を余儀なくされ、今年度はin vitro解析を中心とした。(1)抗癌剤治療後の正常卵巣の臨床病理組織学的研究:術前抗癌剤治療を受けた未閉経の子宮癌・卵巣癌患者の正常卵巣組織を病理組織学的に検討し、抗癌剤の種類と卵巣障害の差異を証明した(論文執筆中)。(2)動物実験による抗癌剤誘発卵巣顆粒膜細胞傷害分子機序の解明:動物実験室閉鎖により研究が中断されたが、実験室解禁後ただちに実験を再開する。(1)CPT-11誘発卵巣顆粒膜細胞傷害時関連分子のスクリーニングから候補2分子を同定した。(2)Bcl-2 familyやp53の関与を各種抗癌剤投与マウスで比較した(論文執筆中)。(3)CPT-11以外抗癌剤につき、CPT-11様の卵巣顆粒膜細胞傷害関連分子の同定を行った。(4)遺伝子改変マウスを用いたCPT-11誘発卵巣顆粒膜細胞傷害機序の解析:実験室解禁後ただちに実験を再開する。(3)動物実験による抗癌剤誘発卵巣顆粒膜細胞傷害の予防法の確立:(1)偽閉経療法の至適投与条件の決定実験:マウスを用いてCPT-11投与時の卵巣顆粒膜細胞アポトーシスを最大限予防できるGnRHa製剤の投与量、投与回数、投与時期を決定した。(2)マウス抗癌剤誘発卵巣細胞傷害へのエストロゲン刺激療法による予防効果の検証:応用性が低いと判断し、計画を中止。(3)偽閉経療法による抗癌剤誘発卵巣細胞傷害の予防時における、卵巣機能障害関連分子の発現の検討:すでに中心的分子を同定した(論文執筆中)。実験室解禁後ただちに実験を再開する。(4)マウス卵巣器官培養による卵巣細胞傷害実験系確立:マウス卵巣器官培養系を用いて、各種薬剤の卵巣細胞傷害を検証する一般的な卵巣細胞傷害測定系を確立した。申請研究の目的は、抗癌剤による卵巣機能障害の分子機構を解明することでより効率的な予防方法の確立、偽閉経療法による予防法の至適投与条件確立、卵巣機能障害を直接的に測定する簡易アッセイ系の樹立、である。(1)抗癌剤治療を受けた正常卵巣の臨床病理組織学的研究:抗癌剤を術前投与された40歳以下子宮癌・卵巣癌患者の正常卵巣組織を病理組織学的に詳細に検討した結果、抗癌剤の種類による卵巣障害の差異を明らかにした。(論文執筆中)(2)動物実験による抗癌剤誘発卵巣顆粒膜細胞傷害の証明とその分子機序の解明:(1)分子スクリーニング:CPT-11誘発卵巣顆粒膜細胞傷害時関連分子候補をあげる。既に2分子を同定した。(2)既に予備実験で関与が明白になっているBcl-2 family分子やp53 family分子を再確定した。CPT-11刺激マウス卵巣組織を用いた確認実験も行った。(3)CPT-11以外の卵巣障害性抗癌剤についても、CPT-11と同様の卵巣顆粒膜細胞傷害時の関連分子の同定を行った。(4)遺伝子改変マウスを用いたCPT-11誘発卵巣顆粒膜細胞傷害機序の解析:個体レベルでの検証実験を行っている。現在、最終確認段階にある。(2)マウス抗癌剤誘発卵巣細胞傷害へのエストロゲン刺激療法による予防効果の検証:応用性が低いと判断し、計画を中止した。(3)偽閉経療法による抗癌剤誘発卵巣細胞傷害の予防時における、卵巣機能障害関連分子の発現の検討:すでに中心的分子を同定した。論文執筆中。(4)マウス卵巣器官培養による卵巣細胞傷害実験システムの確立:マウス卵巣器官培養系を用いて、各種薬剤の卵巣細胞傷害を検証する一般的な卵巣細胞傷害測定系を確立した。

(3)CPT-11以外抗癌剤につき、CPT-11様の卵巣顆粒膜細胞傷害関連分子の同定を行った。(4)遺伝子改変マウスを用いたCPT-11誘発卵巣顆粒膜細胞傷害機序の解析:実験室解禁後ただちに実験を再開する。(3)動物実験による抗癌剤誘発卵巣顆粒膜細胞傷害の予防法の確立:(1)偽閉経療法の至適投与条件の決定実験:マウスを用いてCPT-11投与時の卵巣顆粒膜細胞アポトーシスを最大限予防できるGnRHa製剤の投与量、投与回数、投与時期を決定した。(2)マウス抗癌剤誘発卵巣細胞傷害へのエストロゲン刺激療法による予防効果の検証:応用性が低いと判断し、計画を中止。(3)偽閉経療法による抗癌剤誘発卵巣細胞傷害の予防時における、卵巣機能障害関連分子の発現の検討:すでに中心的分子を同定した(論文執筆中)。実験室解禁後ただちに実験を再開する。(4)マウス卵巣器官培養による卵巣細胞傷害実験系確立:マウス卵巣器官培養系を用いて、各種薬剤の卵巣細胞傷害を検証する一般的な卵巣細胞傷害測定系を確立した。
細胞内膜輸送系を利用したE型肝炎ウイルスの放出機構の解明

本研究では、細胞内でエンドソーム膜を獲得したE型肝炎ウイルス(HEV)の放出機構について、エクソソーム分泌経路の役割を中心に解析した。Small interfering RNAまたは薬剤を用いてエクソソームの形成ならびに放出を阻害した結果、ウイルスの放出が抑制された。電子顕微鏡による解析の結果、感染細胞のmultivesicular body (MVB)内腔に、膜に覆われた直径約50 nmのHEV粒子が観察された。以上の結果から、HEVはMVB内腔へと出芽し、成熟ウイルス粒子がエクソソーム分泌経路を利用して細胞外に放出されることが明らかとなった。E型肝炎ウイルス(HEV)の感染細胞からの放出には、multivesicular body (MVB) sortingが重要であり、粒子表面の膜成分がエンドソーム膜に由来していることを明らかにしてきた。本年度は、エンドソーム膜を獲得した成熟ウイルス粒子の放出機構について、エクソソーム分泌経路の役割を中心に解析した。siRNAまたは薬剤を用いてエクソソームの形成ならびに放出を阻害した結果、ウイルスの放出が抑制された。一方、薬剤処理によりエクソソームの放出を促進すると、ウイルスの放出が促進されることが明らかとなった。電子顕微鏡による解析の結果、感染細胞外に膜に覆われた直径約50 nmのHEV粒子が観察された。さらに、感染細胞のMVB内腔にも、膜に覆われたウイルス粒子が認められた。以上の結果から、HEVはMVB内腔へと出芽し、成熟ウイルス粒子がエクソソーム分泌経路を介して細胞外に放出されることが明らかとなった。E型肝炎ウイルス(HEV)の感染細胞からの放出には、エクソソーム分泌経路が関与していることを明らかにしてきた。本年度は、HEVのエンドソーム内腔への出芽機構ならびにMVB(multivesicular body)と細胞形質膜との融合によるウイルス粒子の放出機構を、電子顕微鏡標本を用いた形態学的な解析により検討した。また、HEV感染細胞から放出されたエクソソームの性状について解析を行った。電子顕微鏡を用いてHEV感染細胞を観察した結果、MVB内腔に膜に覆われたウイルス粒子が認められた。さらに、免疫電子顕微鏡法ならびに蛍光抗体法による解析により、これらのウイルス粒子がHEVであることが明らかとなった。また、詳細な電子顕微鏡観察を行った結果、エンドソーム膜から内部に出芽中のウイルス粒子像が観察された。さらに、MVBと細胞形質膜が融合している像が観察され、そこから膜内小胞(エクソソーム)と共に、膜に覆われたHEV粒子が細胞外に放出される像が観察された。以上の結果から、HEVはエンドソーム膜に出芽することにより膜成分を獲得することが明らかとなった。また、エクソソーム分泌経路を利用したHEVの放出機構が形態学的に示された。HEV感染細胞から放出されたエクソソームの性状解析では、精製したエクソソーム中に、エクソソームのマーカー蛋白質であるCD81に加え、ウイルスのORF2およびORF3蛋白質が存在していることが明らかとなった。そこで、感染細胞に由来するエクソソームを新たなPLC/PRF/5細胞に接種した結果、細胞内においてウイルス蛋白質の発現が認められ、培養上清中にHEV粒子が産生された。このことから、感染細胞に由来するエクソソームが、HEVの感染を媒介していることが示唆された。ウイルス学HEVはエンドソーム内腔へと出芽することにより、粒子表面に膜成分を獲得することが明らかとなった。さらに、膜に覆われたHEV粒子は、エクソソーム分泌経路を利用することにより細胞外へ放出されるという重要な知見が得られた。また、HEV粒子表面に存在する膜成分の抗原については、すでに論文として発表し、次年度の研究を進展させることが可能である。以上のことから、研究は当初の計画通り進捗していると考えている。HEVの粒子表面に存在する抗原の解析は、HEVの生活環を理解する上で重要であると考え、今後はエクソソームおよびエンドソームの膜表面に存在する抗原を中心に、網羅的な解析を予定している。研究の実験方法はこれまでに当研究室で用いられているため、迅速かつ確実に行うことができる。最近、ウイルス感染細胞に由来するエクソソームが、ウイルスの感染を媒介していることが報告されている。そこで、HEV感染細胞から放出されたエクソソームの性状についても解析を進める予定である。また、すでに作製した電子顕微鏡標本を用いた詳細な解析により、ウイルス粒子のエンドソーム膜への出芽ならびにMVBと細胞形質膜との融合によるウイルス粒子とエクソソームの放出を形態学的に明らかにすることができると考えている。