hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
重症心身障害児(者)の疫学と予後

変数選択(ステップワイズ)法を用いると、「経管栄養の有無」の項目だけが取り込まれた。【展望】これらの結果に併せて、来年度は時期による死亡状況の差異の分析を行ないより詳細な予後の分析を行う予定である。【目的】重症心身障害児(者)の疫学と予後を研究するため、重症心身障害児(者)の死亡状況の分析を行って来た。昨年までは在宅の重症児の死亡状況の分析に引き続き、生存分析を行ったが、今年は更に、施設入所例について死亡状況の分析を行うため、国立療養所の死亡者のデータ分析を開始した。【対象・方法】1)在宅の重症心身障害児の生存分析:生存分析東京都は1979年2月から主として在宅重症児を対象として、重症心身障害児(者)の訪問健診事業を行っている。本研究は、これらの症例の当初から1993年までの全症例の分析である。症例数は690例(生存者523例、死亡者167例)である。分析方法は、重症児個人チェックリストを用いて、各項目別予後の検討を行った。分析はPC版SASを用いた。従来の先行研究では、食事の形態(経管栄養)の有無が予後を規定する因子であることを指摘して来た。しかし、その結果は全経過を通してのものであり、本年度はその項目がどの年齢に強く影響を及ぼすについて、検討を行った。【結果】生存者、志望者ともに、約15歳前後で死亡リスクが増加することが示唆された。【考察】今後は15歳前後の年代が抱えるリスクについて、より詳細に検討する予定である。2)施設入所例の重症心身障害児の死亡状況の分析:国立療養所における1982年から1995年までの15年間の死亡状況の分析を行った。例年100人前後の死亡があり、現在、集計中であるが、今後年齢別死亡率の算出の後、重症心身障害児の平均余命の算出を試みる予定である。「目的」重症心身障害児(者)(以下、重症児と略す)の疫学と予後を研究するために、重症児の死亡状況の分析にと生存分析を行ってきた。今年度は予後に影響を及ぼす要因として出生時体重を取り上げ、出生時体重が重症児の発生に如何に関連するかについて検討を行った、更に母子保健の視点から重症児の予防についての考察を行った。「対象・方法」東京都における在宅の重症児のデータに基づいて分析を行った。東京都は1979年2月から在宅の重症児を対象として訪問健診事業を行っている。本研究の対象者は当初から1993年1月までの間に把握された死亡者167例、最終年度生存者523例の計690例であるが、最終的には出生時体重の記載が不備なものを除外した総数283例を分析対象とした。出生時体重で3群に層別化した(1群:2,000g未満、2群:2,000-3,999g、3群:4000g以上)。1979年以降の出生者についてそれぞれの群別に生存分析を行った。生存分析はSPSS(PC Window版)を用いてKaplan Meier法を用いて行った。「結果」(1)出生時体重の分布:全体の平均は2,861g(460g4,600gの範囲)と低く、出生体重が2,500g未満の児は24.4%であった。一方、4,000g以上の児は3.2%であった。(2)群別の平均生存時間の比較:(1)1群:平均145ケ月、(2)2群:平均140ケ月、(3)3群:平均137ケ月であった。Log Rank Testの結果はSig(0.3632)で、群間に有意の差は見られなかったが、3群の中でも高出生体重児群において生存時間の平均値が低い傾向が見られた。しかし、少数例のため今後更に検討を加える予定である。「考察」
人格の商品化と民事責任の研究

民法の展開は、杜会における人々の行動様式及び規範意識の変化を基礎にするものであり、法形成は常に変動のなかにある。明治31年施行の民法典においては、財産法と家族(制度の)法の2本柱の下、個人の存在は財産主体(妻は制限的行為無能力)としての意味が中心であった。第2次大戦後の「個人」の進出は、財産主体たる地位にとどまらない個人の意義の承認・拡大を要請するものであった。しかしこのことは財産・市場と個人、家族と個人の関係の緊張のなかにあることによって、人格権・人格的利益の単線的拡大を意味するものでないとくに、大量生産・大量消費社会を押し進めてきた技術革新が情報及び医療分野で飛躍的展開を果たしてきていることによって、個人がその成果を享受するというだけでなく、人格の商品化に拍車がかり、そのことによって、個人と市場との緊張関係が新たな段階を迎えることになった。本研究はこの現象の損害賠償法での現れを、情報と医療それぞれにおける具体的問題を手がかりとして観察し、民法における人格保護の今後の方向を検討しようとしたものである。本研究は次の内容からなる。第1部人格権侵害と損害賠償法第3部補論(1)遺伝子組換え作物問題とドイツイミッシオーン法補論(2)末期がんの家族等への告知と個人の尊厳民法の展開は、杜会における人々の行動様式及び規範意識の変化を基礎にするものであり、法形成は常に変動のなかにある。第1部人格権侵害と損害賠償法第3部補論(1)遺伝子組換え作物問題とドイツイミッシオーン法補論(2)末期がんの家族等への告知と個人の尊厳人格の商品化と民事責任というテーマは、様々な角度からのアプローチが可能である。本年度は、まず、人格権侵害による損害の把握という問題から取り掛かった。以前、ドイツで侵害抑止的金銭賠償という考え方を示したBGH第6民事法廷判決(カロリーネ・フォン・モナコ事件)とそれを巡る学説の議論を整理し、我が国との比較を行ったことがあるが(法政理論33巻2号所収)、その後、BGH第1民事法廷が下したマルレーネ・ディトリッヒ事件判決は、第6民事法廷判決とは異なった方向(侵害者利得の剥尋)の可能性を承認し議論をひき起こしているので、前稿の補充を兼ねて、論文「人格権侵害と財産的損害」を執筆した(法政理論35巻1号所収)。そこでは、人格権がいわば無体財産的な保護を承認されているのに対して、学説においては、精神的損害と財産的損害を分離して、後者を財産法的問題としての処理を図るという方向が力を得つつあることを示した。我が国においてもマスメディアによる他者の人格を利潤目的で利用しているとみられる為によって人格権が侵害されているという共通の問題がある。勿論、ドイツにおけると同様、民主主義社会での表現の自由との調整という課題も同時に存在している。ここで我々に必要なのは、財産法的問題と人格権法的問題の区別と関連の明確化である。このことは、我が国の名誉侵害裁判例の中で顕著になりつつある慰謝料高額化の方向の理論的整理と修正のために不可欠である。そこで当面の次の予定は、一つには実際的問題としての我が国での現在の名誉侵害慰謝料の議論の不明確さを人格権と営業秩序の関係から整理すること、もう一つは基礎的概念の問題としてく民事責任の領域での「商品化」概念の意義の検討である。後者は,時間がかかりそうであるが、やがては人格権の射程と遺伝子情報や人体部分の利用との関係といった問題にまで及ぶ問題ではないかと推測している。本年度は、ドイツ民法学における人格権保護関係の文献の収集と検討を中心に行った。その際には、ドイツ法で用いられている意味での狭い人格権だけではなく、日本法でのそれに対応する領域をカバーできるように心掛けた。マスメディアによる人格権侵害に対する救済についてのドイツでの議論はやまを越えたいう印象を受けている。そこでは、マスメディアによる他者の人格の商業的利用が問題となっているが、ドイツの損害賠償法の枠組みの堅さが問題への対応のネックとなっていた。財産法領域へのシフトの傾向が強いようであるが、これは我が国裁判所の傾向とは異なる方向である。引き続き、この比較からの我が国での損害賠償法の役割を検討していく必要がある。人格権侵害と損害という問題は損害概念の検討を求めるものとしてあり、フランスのペリシュ判決が投げかけた問題の一つもここにある。この点については、次年度に論文をまとめる予定である。人格権保護の問題を考えるには、自己決定権の位置付けを避けて通れない。

本年度は、これに関係することがらとして、末期ガンの家族等への告知の義務の有無を扱った最高裁平成14年9月24日判決の判例評釈を執筆した(掲載誌の発行は次年度以降)。そこでは、この判決を、エホヴァの証人の最高裁判決で確認された意思(自己)決定権保護ルールの対極に位置して、意思決定が困難な状況な場合のために必要となる補助的ルール形成の積み重ねの一つとなるものと意義づけた。自己決定権保護の体系的位置付けの明確化が、例えば、人体部分の商品化の可能性と人格権保護の緊張の問題への対処につながっていくのだと考えている。この問題についても、引き続きドイツ民法学の文献の収集を行っている。本年度は、それ以外にセクハラ裁判例をやはり人格権保護の進展という角度から整理した原稿を執筆したが、掲載誌の発行は次年度以降になる。科研費交付の最終年となった平成16年度は、人格侵害に基づく非財産的損害の賠償可能性に焦点をあて、「wrongful life訴訟とドイツ損害賠償法」というテーマで研究会における報告をし、それを原稿として論文をまとめた。これは、主として出生前診断或いは妊娠前診断において誤診が存在することによって障害児が出生した場合に、その子が原告となって医療機関を訴えるという、日本ではまだ見られない訴訟類型であるが、アメリカにおける肯定裁判例の登場ののち、フランス、オランダで肯定裁判例があらわれ、イギリス法系の国では否定判決が支配的というように、いわゆる先進資本主義国では肯定否定の議論が広く行われている。ドイツにおいても裁判所は否定しているが、学説での議論は止まることなく行われている。現在における非財産的損害の賠償の限界に位置するこの問題を採り上げて、肯定説が根強く主張されていることの意味を検討した。ここでは財産の法としての性格を強くもってきた民法に対して人の保護がどこまで可能であるかが問われるものであり、そこに、財産保護にとどまらない保護要求の進展と民法の伝統的概念との軋轢が見られる。上記研究と平行して、遺伝子組み換え作物と民法上の損害賠償(広義)の関係についてEUとドイツにおける現状を調べ、とくにドイツ法につきわが国の現状との比較を行った。この問題は、環境汚染、農業経営、消費者保護といった広い問題に関わるが、民法の損害賠償制度がいわば世界的規模での対立の坩堝のなかで極めて大きな政治的役割を持つことになった背景と意味を検討した。これも、課題テーマである人格と損害賠償法制度の変遷と(間接的とはいえ)関連をもつものである。
日米証券市場の構造・機能・成果に関する理論的・実証的分析

(1)従来あまり理論的な分析が行われていなかった、証券発行の非加分性を明示的に考慮した証券の発行市場のモデルを構築し、証券発行市場における競争が資本形成に果たしている役割を分析した。長期資金調達の特殊性は連続性と不連続性の共存にある。長期資金が投下される生産活動は連続的である。つまり、資金量に応じて生産要素の投入量は連続的に調節できるのに対し、長期資金調達は一度に多額の資金を集めるために間隔をおいて行われ、不連続的(離散的)である。証券発行時のこのような非可分性は、発行市場を完全競争的組織とはなじまないものにしている。それにもかかわらず、欧米の証券市場では、企業間・投資家間の競争がかなりの程度まで働くように発行市場が組織されている。こうした特徴をふまえた発行市場のモデルを構築し、とくに、長期企業金融における日米比較に焦点をあて、日本的な排他的・固定的関係をつうじて資金調達がおこなわれる経済と欧米流の証券発行市場において資金調達が競争的におこなわれる経済が想定され、後者の経済の方が効率が高いことが示された。(2)これに対して、経営者のインセンティブの問題を重視した情報の経済学的な観点からは、株式持合い等は経済の効率に寄与するとの結論が得られた。合理的な株価形成を前提とすれば、株式持合いは効率的な経営をもたらは可能性が大きい。資本市場における「錯覚」によって株式が過大評価されている場合には、敵対的買収からの圧力を遮断することにより、過大な投資などの歪みは阻止され得る。(3)このような日米の証券市場についての対立する二つの理論的仮説のどちらが現実的であるかは、実証的にテストされねばならないが、現在までのところ日本について後者のような効果があることは部分的には支持されているが、まだ確定的な結論は得られていない。この点のついての実証研究を進展させることが今後の課題である。平成5年度においては、日米の証券市場の法的・制度的規制の実態についての情報を収集し、それらの証券市場への影響についての理論的・実証的分析を行うとともに、証券価格形成についての理論的分析について研究を進めた。具体的な成果としては、(1)情報の経済学の成果を用いた、非対称情報下の企業の投資の資金調達の理論分析および実証分析を行い、いわゆる資金調達に関する「pecking order theory」の理論的基礎付けを行い、その日本における成立を実証、(2)法の経済分析による時価発行増資の分析を行い、新株の第三者割り当ておよび時価発行増資が既存の株主の利益という観点から判断して問題があること、(3)敵対的買収と株式持ち合いの経済的機能の分析を行い、日本の金融の一つの特徴である株式持ち合いとメインバンク制と組み合わせが経済の効率性の観点からみて合理性をもつこと、(4)裁定機会が存在しないという弱い合理性を前提から出発する、同値マルチンゲール測度の概念に基づく利子率の期間構成に関しての一般的な分析、(5)株式市場におけるいわゆる「バブル」の実体経済への影響を理論的実証的に分析を行い、バブルが合理的であれば理論的には実体経済へは影響が無いこと、実証的には実体経済への影響が見られ、バブルは合理的なものではない可能性が大きいこと、などの成果が得られている。

長期資金が投下される生産活動は連続的である。つまり、資金量に応じて生産要素の投入量は連続的に調節できるのに対し、長期資金調達は、一度に多額の資金を集めるために間隔をおいて行われ、不連続的(離散的)である。証券発行時のこのような非可分性は、発行市場を完全競争的組織とはなじまないものにしている。それにもかかわらず、欧米の証券市場では、企業間・投資家間の競争がかなりの程度まで働くように発行市場が組織されている。こうした特徴をふまえた発行市場のモデルを構築し、とくに、長期企業金融における日米比較に焦点をあて、日本的な排他的・固定的関係をつうじて資金調達がおこなわれる経済と欧米流の券発行市場において資金調達が競争的におこなわれる経済が想定され、後者の経済の方が効率性が高いことが示された。(2)これに対して、経営者のインセンティブの問題を重視した情報の経済学的な観点からは、株式持合い等は経済の効率に寄与するとの結論が得られた。合理的な株価形成を前提とすれば、株式持合いは効率的な経営をもたらす可能性が大きい。資本市場における「錯覚」によって株式が過大評価されている場合には、敵対的買収からの圧力を遮断することにより、過大な投資などの歪みは阻止され得る。(3)このような日米の証券市場についての対立する二つの理論的仮説のどちらが現実的であるかは、実証的にテストされねばらないが、現在までのところ日本について後者のような効果があることは部分的には支持されているが、まだ確定的な結論は得られていない。この点についての実証研究を進展させることが今後の課題である。
アンモニアのオルソ・パラ比を用いた彗星分子の氷結温度決定に関する観測的研究

太陽系天体の中でも、低温で凍ったまま46億年間経過している彗星は原始太陽系の化石である。太陽に近づくと熱によりその成分を蒸発させることから、その成分分析によりどの程度の温度で氷結したかが推定できるが、一般に上限値に限られ、また揮発成分を失った短周期彗星には使えない。本研究では、低温領域で温度と明確な相関がある水素原子の核スピン状態の差:オルソ・パラ比によって彗星氷結温度を求めようとしたものである。水分子でこの方法を適用しようとすると、地球大気の水蒸気が邪魔となる欠点があったため、水素原子が三つあって彗星に含まれるアンモニアに注目した。アンモニアは蒸発後、光解離により、NH2という分子となって、母分子のアンモニアの情報を保ちながら、オルソ、パラそれぞれの輝線を発する。高分散分光で輝線分離ができれば、オルソ・パラ比を知ることができ、さらにはアンモニアのオルソ・パラ比を推定できる。平成16年度は、国立天文台ハワイ観測所の口径8mすばる望遠鏡の高分散分光器HDSを用いた観測結果をもとに、ヨーロッパのデータも用いながら、本研究のまとめを行った。これによって、7つの彗星についてのスピン温度がすべて30K前後に集中していることがはっきりした。この解釈としては、彗星が誕生した場所の温度を示しているという可能性の他に、元々アンモニア分子が誕生した原始太陽系星雲のもととなった分子雲の温度を示している可能性もある。これらの可能性のどちらが正しいかを検証するためには、アンモニア分子以外の観測を行う必要がある。そこでわれわれは急遽メタン分子のオルソ・パラ比を考慮に入れ、すばる望遠鏡などによる観測を行ったところ、これについてもアンモニア同様30Kの温度を示すことが判明した。現在、これらのデータを慎重に検討しているところであり、本研究によって、当初の目的よりも先に進んでしまったことは、望外の喜ばしい結果である。彗星は太陽系の中で最も揮発性物質に富む始源的な天体である。8割は水、残り2割に一酸化炭素、二酸化炭素などが含まれ、その氷結温度は数十度Kとされている。観測される彗星の大部分は太陽熱の影響を受けてしまっており、当初の低温での揮発性物質がそのまま保存されているのかは疑問である。われわれは彗星の氷結温度を推定する全く新しい、かつ今までよりもずっと簡便な方法を開発し、その実用化に成功した。低温領域で、温度と明確な相関がある水素原子の核スピン状態の差:オルソ・パラ比を求めて、その値から彗星分子の氷結温度を求めようとするものである。水分子では、地球大気の水蒸気が邪魔となる欠点があったため、アンモニアに注目した。アンモニアは蒸発後、光解離により、NH2という分子となって、これが母分子のアンモニアの情報を保ちながら、オルソ、パラそれぞれの輝線を発する。これらの輝線を分離する高分散分光ができれば、そのオルソ・パラ比を知ることができ、元のアンモニアのオルソ・パラ比を推定できる。そこで、すばる望遠鏡の高分散分光器HDSの調整期間中に出現したリニア彗星(C/1999 S4)を観測し、その解析からオルソ・パラの輝線を分離し、モデル計算から氷結温度を28K±2Kと求めることに成功し、その結果をサイエンスに発表している("The Spin Temperature of NH3 in Comet C/1999S4(LINEAR)"Science,Vol.294,pp1089-1091(2001))。本研究では、この方法をさらにいくつかの彗星に適用することで、それぞれの彗星が原始太陽系星雲のどのあたりで誕生したか、という彗星の真の起源に迫る萌芽研究として推進しつつある。起源が異なるとされる長周期彗星(木星海王星領域起源)と短周期彗星(太陽系外縁部領域起源)とを比較するべく、平成15年度にはガン彗星などのいくつか短周期彗星を観測した。また平成16年度に明るくなるニート彗星(C/2001 Q4)やリニア彗星(C/2002 T7)を観測し、氷粒子の直接検出などに成功した(研究発表参照)。

そこでわれわれは急遽メタン分子のオルソ・パラ比を考慮に入れ、すばる望遠鏡などによる観測を行ったところ、これについてもアンモニア同様30Kの温度を示すことが判明した。現在、これらのデータを慎重に検討しているところであり、本研究によって、当初の目的よりも先に進んでしまったことは、望外の喜ばしい結果である。
CCN2機能制御による慢性・急性腎障害の新規治療薬の開発

慢性腎臓病(chronic kidney disease: CKD)とは腎機能が低下した状態であり、糸球体硬化、尿細管萎縮、間質の線維化で特徴付けられる。この過程は原疾患を問わずCKDの進行に関わるfinal common pathwayであり、疾患横断的な治療ターゲットとして注目されてきた。我々はこれまでに活性化・障害尿細管上皮細胞が産生するCCN2がこの過程に重要であることを報告している。本研究の目的は「どのようにCCN2を機能制御してCKDの治療薬とするか」という点を、CCN2とFAK(focal adhesion kinase)および細胞内シグナル伝達系に注目して明らかにする事である。
戦前二大政党形成期における府県政治状況変化の研究

本研究は、戦前期に東京および関東地方各県で行われた衆議院議員選挙および県会議員選挙の投票データを用いて、各府県において地方選挙と国政選挙がどのような関係になっているかを、政党勢力の動向とその地域的地盤関係に着目して分析したものである。本研究で収集したデータは、インターネットのホームページ(http://www.reitaku-u.ac.jp/rsakurai/fuken.html)において公開するとともに、関東地方各県における事例は、『地方政治と近代日本』と題する書物に記載した。特に研究の柱となった東京については、衆議院議員選挙・府会議員選挙・市会議員選挙の競争状況の変化と党派別得票率の変化に注目して、これら3選挙相互の関係を各区における選挙地盤の様相の変化と関連させて分析した。その結果、衆議院選挙結果と府市会議員選挙結果の間には、日露戦争の時期に乖離が見られること、その乖離の原因は、候補者の地盤として各区に存在した公民団体の統制力の変化によるものであることが判明した。すなわち1890年代において各種選挙に及んでいた公民団体の規制力は、日露戦争前後から衆議院選挙には及ばなくなり、明治末・大正期初期以後には府会議員選挙・市会議員選挙においても弱まる。これに代わって政党の各区における影響力が増していくことがわかった。また普通選挙実施前後における2大政党勢力の拡大の背後には、公民団体の衰退と政党下部組織への変化があったことを明らかにした。そしてそれが大正末期以後における衆議院選挙結果と府市会議員選挙結果の同調となって現れることを確かめた。この東京市内における状況の変化は、他の大都市(たとえば大阪)にも共通する現象であり、他の関東各県に関しても、大正末期以後における両選挙の同調現象については確認することができた。研究計画にしたがって研究を進めたが、本年は東京市部のみについてしか、以下の作業を行うことができなかった。すでに入力の終わっている基礎的データをもとに東京市部レベルでの政党勢力の変化のパターンを抽出することを試みた。まず分析対象を府会議員選挙とし、分析単位を区とし、全投票数における2大政党占有率、政党所属不明者の割合、競争率あるいは当選者得票の全投票数に対する割合、2大政党の消長変化などのグラフを作った。第2に、府会議員選挙と衆議院選挙との比較を行った。そのために、分析の対象を衆議院選挙とし、分析単位を区として、府会選挙と同じような項目についてグラフ化し、それを対照して共通する傾向、あるいは連続する傾向の存否を検討した。第3の、以上の分析から得られた傾向を、府の固有の政治状況の変化に即して具体的に記述する事については、新聞史料を収集中であり、継続中である。またその作業中に、東京については市議会議員選挙のデータも必要なことが判明し、これについても約半分くらいデータを集めることがてきた。あわせて関東地方各県における政治状況の変化について研究会を2回開催した。本研究の基礎となるデータについては、1899年1940年の茨城県・栃木県会議員選挙の結果を発表した(これまで明らかではなかった部分がかなり判明した)。なお関東地方以外の府県における府県会議員選挙・衆議院議員総選挙データの収集および入力作業については、本年はできなかった。研究計画にしたがって研究を進めた。本年は東京および関東地方各県に関して、以下の作業を行なった。昨年以来開始していた市会議員選挙のデータ収集を完成させた上で、すでに入力の終わっている基礎的データと合わせて、東京市部における政党影響力の浸透の在り方について検討を加えた。特に衆議院議員選挙・府会議員選挙・市会議委員選挙の競争状況の変化と党派別得票率の変化に注目して、これらの3選挙相互の関係を各区における選挙地盤の様相の変化と関連させて分析した(研究成果として公刊されるのは来年度になる)。

その結果、衆議院選挙結果と府市会議員選挙結果の間には、日露戦後の時期に乖離が見られること、その乖離の原因は、府市会議員選挙には及んでいた各区における公民団体の候補者決定に関する規制力が衆議院選挙には及んでいなかったことによることが判明した。そしてこの公民団体の規制力は、日露戦前には衆議院選挙にも及んでおり最も強く発揮されていたのが、大正期以後になると府市会議員選挙においても弱まり、かわって政党の各区における影響力が増していくことが判明した。この東京市内における状況の変化は、他の大都市にも共通する現象であるか否かを、大阪市を題材にして検討中である。あわせて関東地方各県における政治状況の変化については研究会を2回開催し、それぞれ担当者を定めて各県の政党勢力の浸透について見直している。研究計画にしたがって研究を進めた。本年は東京および関東地方各県(千葉県・神奈川県)に関して、すでに入力の終わっている基礎的データをもとに以下の作業を行った。昨年以来開始していた東京市会議員選挙のデータ収集を完成させた上で、東京市部における政党影響カの浸透の在り方について、明治21年の自治制改正以来、普通選挙実施後まで検討を加えた。特に衆議院議員選挙・府会議員選挙・市会議員選挙の競争状況の変化と党派別得票率の変化に注目して、これら3選挙相互の関係を各区における選挙地盤の様相の変化と関連させて分析し研究成果として公刊した。さらに特に普通選挙実施前後における選挙戦の様相の変化と2大政党の進展の背後に存在した従来の選挙基盤であった公民団体の衰退と変化を明らかにすることによって、大正期以後における府市レベルにおける2大政党勢力の進展と衆議院(国政レベル)におけるそれとが平行して起こっている原因を確かめた。この部分については未発表であるが成果報告書には収録してある。また東京市内における状況の変化が、他の大都市にも共通する現象であるか否かを大阪市を題材にして検した結果、1890年代においては同様の傾向が存在することが判明した。第2の課題である関東各県に関しては、千葉県・神奈川県について県会議員選挙データを公開するとともに、残りの群馬県・埼玉県に関してもデータの収集を終えた。各県における政治状況の変化については、協力者による各県の政党的展開に関する論文をまとめて『地域政治と近代日本』と題して公刊した。なお2大政党勢力に関するデータを検討したところ、郡単位における分析は各郡の特殊事情がかなり異り一般化しない方がよいという感触を持つにいたった。しかし府県単位における衆議院選挙および府県会議員選挙における両選挙の同調現象については確認することができた。
脂質膜の構造変化に基づいたエアリフト型気泡塔のせん断速度分布と気泡表面電荷の測定

外部循環式エアリフト型気泡塔は,液相,気相及び固体粒子を温和な条件下で混合撹拌できるため,細胞やタンパク質が関わる分離・反応操作へ応用されている。気泡塔内のせん断ストレスや気泡の特性は,細胞の安定性や代謝活性に影響する。本研究では,脂質二分子膜小胞(リポソーム)を用いて,気泡塔における脂質膜の構造変化を定量化することにより,せん断ストレスと気液界面の特性を明らかにした。最終年度は,前年度見出した高分子修飾リポソームが気泡塔内の気泡群と強く相互作用する現象に着目して,リポソーム内または液本体において化学的に生成させた気泡が脂質膜の透過性に及ぼす効果を詳細に検討した。具体的には,酵素カタラーゼによる過酸化水素分解反応により生成させた酸素の微細気泡と脂質膜間の相互作用を色素の膜透過係数に基づいて定量的に評価した。研究期間全体では,体積,形状及び生成気泡径が異なるエアリフト型気泡塔に窒素ガスを通気して,蛍光色素を内包させた双性リポソームを懸濁した結果,適用した条件下では,色素の膜透過性が気泡塔の形状に由来する特徴や流動条件に依存して変化することを明らかにした。具体的には,生成気泡径が大きい場合あるいは塔高が大きく気泡の合一分散が促進される場合に懸濁ポソームの膜透過性が増大する傾向が認められた。これらの結果より,色素の膜透過係数に基づいて,気泡塔の平均せん断速度を定量化した。また,せん断速度の気泡塔形状依存性に基づいて,せん断速度の大きさに支配的な影響を及ぼす因子,気泡塔部位を推定した。さらに,負または正に帯電させたリポソームを懸濁させたところ,正電荷リポソームの膜透過が気泡塔内で促進されたことから,気泡が負に帯電していることが強く示唆された。以上は,気液接触型装置を用いる細胞やタンパク質が関与する分離・反応操作の合理的な設定において重要な知見となる。粒子径と表面電荷が既知の脂質二分子膜小胞体(リポソーム)を調製して,このリポソームを,各種気泡塔内で発生する液体せん断ストレスを実測するためのプローブとして応用する。平成28年度は,双性リン脂質から形成され,親水性蛍光色素を内包させたリポソームを調製使用して,形状とスケールが異なる外部循環式エアリフト型気泡塔内のせん断速度の実測を行った。本気泡塔は,ガス通気により気液混相流と液下降流がそれぞれ生じるライザー部とダウンカマー部が,気液分離部を含めてループ状に接続された装置構造をもつ。ライザー/ダウンカマー断面積比,塔高及びガス分散板の孔径が異なる気泡塔内にリポソームを一定濃度で懸濁させたときのリポソーム内水相から液本体への色素漏出速度を実測・解析することにより,気泡塔内の流動特性を規定する操作パラメータであるガス空塔速度と蛍光色素の脂質膜透過係数の定量的関係を得ることができた。これらの結果に対して,既に報告している同じタイプのリポソームについて決定した色素の膜透過係数とせん断速度の相関式を適用して,各気泡塔内の平均的な液体せん断速度を決定するとともに気泡塔の形状・スケールとせん断速度の関係を考察した。また,不飽和度や炭素鎖長が異なる種々の脂質から形成されるリポソームを用いて,気液流動場に対する脂質膜の応答性を調べ,せん断ストレス感受性に影響する脂質の性質について検討した。上述の結果に基づいて,装置特性が異なる任意のエアリフト型気泡塔内のせん断速度の測定において,リポソームが有効なプローブとして機能することを示した。リポソームをプローブとして,形状とスケールが異なる種々の外部循環式エアリフト型気泡塔内の平均液体せん断速度を実測できることを示した。また,脂質疎水部の構造が異なるリポソームを用いて,脂質分子の構造がリポソームのせん断速度感受性に及ぼす効果を検討した。得られた知見は,平成29年度に詳細な検討を予定している荷電状態が異なるリポソームを用いた気泡群の表面特性の推定において基盤となることから,おおむね順調に進展しているとした。平成29年度は,これまでに実験的な知見が少ないミリスケールの気泡群の表面荷電状態を推定するための検討を行った。荷電脂質の含有量が異なる種々のリポソームを調製して,外部循環式エアリフト型気泡塔で発生させた気泡の荷電状態を推定するために用いた。気泡塔は,平成28年度に用いた各種気泡塔のうちの一基を選定して使用した。リポソームは正及び負に帯電した2種類の脂質をそれぞれ双性脂質と種々のモル比で混合して調製した。各荷電リポソームの内水相には高濃度の親水性蛍光色素を内包させておき,実測した色素の漏出挙動を速度論解析することにより,気泡群との相互作用を定量的に評価した。その結果,負電荷リポソームからの色素漏出速度は負電荷脂質含有量に依存して種々変化することが明らかとなった。これは,リポソームと気泡群との接触や荷電脂質の導入によるリポソーム自体の安定性の変化に基づいて説明できることがわかった。一方,気泡群共存下における正電荷リポソームの安定性は,負電荷リポソームと異なることを明らかにした。

正電荷脂質の含有率と液相組成に依存して,気泡塔内においてリポソームがその形態を維持できなくなる現象も認められた。これらの結果に基づいて,気泡群の荷電状態を推定した。一方,高分子で修飾されたリポソームを用いると,気泡群共存下における脂質膜の安定性が著しく変化することを示した。このことは,微小なせん断速度の推定に適合したリポソームの開発に応用できる。当初の計画どおり,種々の荷電リポソームを調製して,気泡群共存下における安定性を実測・解析するとともに,得られた結果に基づいて気泡群の荷電状態を合理的に推定できたことから,おおむね順調に進展しているとした。外部循環式エアリフト型気泡塔は,液相,気相及び固体粒子を温和な条件下で混合撹拌できるため,細胞やタンパク質が関わる分離・反応操作へ応用されている。気泡塔内のせん断ストレスや気泡の特性は,細胞の安定性や代謝活性に影響する。本研究では,脂質二分子膜小胞(リポソーム)を用いて,気泡塔における脂質膜の構造変化を定量化することにより,せん断ストレスと気液界面の特性を明らかにした。最終年度は,前年度見出した高分子修飾リポソームが気泡塔内の気泡群と強く相互作用する現象に着目して,リポソーム内または液本体において化学的に生成させた気泡が脂質膜の透過性に及ぼす効果を詳細に検討した。具体的には,酵素カタラーゼによる過酸化水素分解反応により生成させた酸素の微細気泡と脂質膜間の相互作用を色素の膜透過係数に基づいて定量的に評価した。研究期間全体では,体積,形状及び生成気泡径が異なるエアリフト型気泡塔に窒素ガスを通気して,蛍光色素を内包させた双性リポソームを懸濁した結果,適用した条件下では,色素の膜透過性が気泡塔の形状に由来する特徴や流動条件に依存して変化することを明らかにした。具体的には,生成気泡径が大きい場合あるいは塔高が大きく気泡の合一分散が促進される場合に懸濁ポソームの膜透過性が増大する傾向が認められた。これらの結果より,色素の膜透過係数に基づいて,気泡塔の平均せん断速度を定量化した。また,せん断速度の気泡塔形状依存性に基づいて,せん断速度の大きさに支配的な影響を及ぼす因子,気泡塔部位を推定した。さらに,負または正に帯電させたリポソームを懸濁させたところ,正電荷リポソームの膜透過が気泡塔内で促進されたことから,気泡が負に帯電していることが強く示唆された。以上は,気液接触型装置を用いる細胞やタンパク質が関与する分離・反応操作の合理的な設定において重要な知見となる。既に特定の条件で調製を行っている荷電状態が異なるリポソームをプローブとして,エアリフト型気泡塔内で発生する気泡群の表面特性を推定する。また,塔高や液相体積が異なる気泡塔について実測したせん断速度に基づいて,気泡塔内のせん断速度分布を推定する方法を検討する。当初最終年度に予定していた気泡塔内におけるせん断速度分布の測定は,これまでに用いた種々の気泡塔の形状や液相体積などの操作条件に基づいて推定できると判断したため,平成29年度に明らかにした気泡群共存下における荷電リポソームの構造変化に関する詳細な検討を行い,そのメカニズムの解明を試みる。具体的には,正に帯電したリポソームと気泡との相互作用について,液相の高分子含有量等の組成を変化させて検討を行う。
TRAIL遺伝子導入による腫瘍細胞特異的アポトーシス誘導と癌の遺伝子治療

本研究では,アポトーシス誘導能を有する細胞外情報伝達分子,TRAIL,およびFAS-Lの遺伝子を用いた癌の遺伝子治療の系を開発することを目的とした.これらの遺伝子の発現ユニットを有する,EBVエピゾーマルベクター(EBVのEBNA1遺伝子とoriPを有する)とコンベンショナルなプラスミドベクターを作成した.腫瘍細胞として,ユーイング肉腫細胞株,A4573,肝細胞癌細胞株,HuH7と,前立腺癌細胞株,PC3とLNCapを標的とした.導入法としては,ポリアミドアミン・デンドリマー,またはEffecteneを用いた.in vitroの導入では,まずマーカー遺伝子の導入において,いずれの細胞でも有意な発現が認められたが,EBVエピゾーマルベクターとコンベンショナルなプラスミドベクターの比較では,前者により後者に比し数倍から数十倍高い発現が認められた.アポトーシス誘導分子の遺伝子の導入では,HuH7とPC3では著明な細胞死が見られ,導入後数日で生細胞が激減したのに対し,A4573細胞では導入後一過性な細胞死に引き続き,生き残った細胞の増殖が著明であった.細胞死はアポトーシスによることがTUNEL法により確認できた.in vivo導入実験では,LNCap,またはPC3をSCIDマウス皮下に移植し,担癌モデルマウスを作成した.腫瘍が形成されたのちに,腫瘍内にEBVエピゾーマルベクターとポリマー複合体を注入し,腫瘍の大きさとマウスの生存を観察すると,治療群で有意な腫瘍の増殖抑制とマウスの延命効果が得られた.切除した腫瘍を電子顕微鏡的に検索すると,核の濃縮,クロマチンの凝集といった典型的なアポトーシスの形態が検出された.以上から,アポトーシス誘導分子による癌の遺伝子治療の可能性がin vitro,in vivoの両方の系で示された.本研究では,アポトーシス誘導能を有する細胞外情報伝達分子,TRAIL,およびFAS-Lの遺伝子を用いた癌の遺伝子治療の系を開発することを目的とした.これらの遺伝子の発現ユニットを有する,EBVエピゾーマルベクター(EBVのEBNA1遺伝子とoriPを有する)とコンベンショナルなプラスミドベクターを作成した.腫瘍細胞として,ユーイング肉腫細胞株,A4573,肝細胞癌細胞株,HuH7と,前立腺癌細胞株,PC3とLNCapを標的とした.導入法としては,ポリアミドアミン・デンドリマー,またはEffecteneを用いた.in vitroの導入では,まずマーカー遺伝子の導入において,いずれの細胞でも有意な発現が認められたが,EBVエピゾーマルベクターとコンベンショナルなプラスミドベクターの比較では,前者により後者に比し数倍から数十倍高い発現が認められた.アポトーシス誘導分子の遺伝子の導入では,HuH7とPC3では著明な細胞死が見られ,導入後数日で生細胞が激減したのに対し,A4573細胞では導入後一過性な細胞死に引き続き,生き残った細胞の増殖が著明であった.細胞死はアポトーシスによることがTUNEL法により確認できた.in vivo導入実験では,LNCap,またはPC3をSCIDマウス皮下に移植し,担癌モデルマウスを作成した.腫瘍が形成されたのちに,腫瘍内にEBVエピゾーマルベクターとポリマー複合体を注入し,腫瘍の大きさとマウスの生存を観察すると,治療群で有意な腫瘍の増殖抑制とマウスの延命効果が得られた.切除した腫瘍を電子顕微鏡的に検索すると,核の濃縮,クロマチンの凝集といった典型的なアポトーシスの形態が検出された.以上から,アポトーシス誘導分子による癌の遺伝子治療の可能性がin vitro,in vivoの両方の系で示された.
べん毛蛋白質輸送におけるATPase複合体の動的構造および機能の解明

本研究ではべん毛蛋白質輸送装置におけるATPase複合体(FliH/I/J)の動的構造と機能の解明を目的とする。24年度は、ArPase複合体の輸送ゲートへの局在の際に中心的な役割を果たすFliHの分子機構についての解析を進め、共通の祖先から進化したと考えられているATP合成酵素と似た作動機構を提唱した(Hara et al.,J.Bacteriol,2012)。FliHはATP合成酵素の外周固定子と相同であるが、外周固定子はそのN末端でプロトンチャネルであるaサブユニットと相互作用している。そこで、本研究では、FliHのN末端が相互作用しているFlhAのイオン透過能について、検討を行った。まず、pH感受性GFPを用いて細胞内pHを測定したところ、FlhA発現時に顕著にpHが低下していることが明らかになった。これは、細胞内にプロトンが大量に流入していることを示し、FlhAがプロトン透過性を有していることが示唆された。また次にFlhAのイオン特異性を確かめるために、ナトリウムイオン指示薬を用いて同様な実験を行ったところ、驚くべきことに、FlhAがナトリウムイオン透過性も有していることが示唆された。これらの結果は、輸送装置とATP合成酵素の間には、ArPase複合体一膜構成要素の相互作用形式、さらには膜因子の性質といった点にも類似性があることを示しており、ArPase複合体(FliH/I/J)のさらなる機能的類似も示唆している。24年度に取り組んだArPase複合体一輸送ゲート間相互作用及びFlhAは、べん毛蛋白質輸送装置と高い相同性がある赤痢菌やペスト菌などの病原菌が宿主に侵入する際に中心的な役割を果たす病原性因子分泌装置でも、必要不可欠な働きをしているため、病原菌による感染症の予防に向け、新たな標的機構を提示したことで、医療分野への貢献も期待できる。さらに共通の祖先から進化したと考えられているATP合成酵素と似た作動機構が輸送装置に存在することを示すことができ、両者の動作・設計原理解明に向け新たな知見を与えることが出来た。23年度は、輸送装置のプロトン透過活性制御に重要な役割を果たすと考えられるFliH-FliI複合体-輸送ゲート間相互作用様式を、遺伝学的手法及び、高い空間分解能を有するin vivo部位特異的光架橋法を用いて解析した。その結果以下のことを明らかにすることが出来た。2.FliHのN末端が、輸送ゲート構成蛋白質のうちFlhAとのみ特異的に架橋すること、そしてこのFliH-FlhA間相互作用がFliIの輸送ゲートへの効果的なアンカリングに寄与し、その結果として効率的な蛋白質輸送を促進している。これらの成果は、今まで不明であった、輸送ゲート構成蛋白質間の相互作用ネットワークの一端を明かし、さらにはダイナミックな離合集散を繰り返すATPase複合体(FliH-FliI)と輸送ゲート間の相互作用がFlhAの機能発現に重要な役割を果たしていることを見出したもので、べん毛蛋白質輸送装置の分子機構の解明に向けて重要な知見を与えたといえる。また、23年度に取り組んだATPase複合体-輸送ゲート間相互作用は、べん毛蛋白質輸送装置と高い相同性がある赤痢菌やペスト菌などの病原菌が宿主に侵入する際に中心的な役割を果たす病原性因子分泌装置でも、必要不可欠な働きをしているため、病原菌による感染症の予防に向け、新たな標的機構を提示したことで、医療分野への貢献も期待できる。24年度に取り組んだArPase

複合体一輸送ゲート間相互作用及びFlhAは、べん毛蛋白質輸送装置と高い相同性がある赤痢菌やペスト菌などの病原菌が宿主に侵入する際に中心的な役割を果たす病原性因子分泌装置でも、必要不可欠な働きをしているため、病原菌による感染症の予防に向け、新たな標的機構を提示したことで、医療分野への貢献も期待できる。さらに共通の祖先から進化したと考えられているATP合成酵素と似た作動機構が輸送装置に存在することを示すことができ、両者の動作・設計原理解明に向け新たな知見を与えることが出来た。当初の目的の一つであるFliH-輸送ゲート間の相互作用解析は順調に進み、その機能的意義にまで迫ることが出来た。FliI-輸送ゲート間相互作用解析については、現在発現系の構築中ではあるが、実験系はFliH-輸送ゲート相互作用解析で確立しているため、迅速に行えると考えている。23年度では主にin vivoでの遺伝学的・生化学的解析を進めた。そこで得られた知見から、プロトン駆動型輸送ゲートとATPase複合体が巧妙な仕組みで、かつ協同的に働くことによってべん毛蛋白質輸送が行われていることが示唆された。このように多くの因子が関係している系の分子機構の解明には、系の再構成を行い、本質に迫る必要があると考えた。そこで、本年度では研究計画のうち、べん毛基部体を含む反転膜小胞の調整法の確立と、その再構成系を用いた解析に重点をおき、ATPase複合体-輸送ゲートの蛋白質輸送機能発現の分子機構の解明を目指す。さらに、輸送装置とATP合成酵素の進化的な関係に着目した実験も行い、輸送装置の動作・設計原理を進化的側面からも明らかにすることを目指す。
癌の臓器特異性を基盤としたヒト化マウスを用いた癌性幹細胞療法の開発

乳癌を対象に癌性幹細胞としての特徴である多分化能・抗癌剤体性能を持つ細胞分画を分離し、転移形成能をマウスへの移植で確認した。この幹細胞分画の維持・増殖に必須な因子としてHedgehogシグナルを同定し、同シグナルの制御により癌性幹細胞分画を制御可能であることを明らかにした。(目的)各臓器特異的な癌性幹細胞の制御法の開発。(材料と方法)大腸癌;大腸癌株よりcell sorterを用いCSCが想定されるSP分画を分離した。薬剤感受性と耐性遺伝子の発現変化、WNTシグナル活性の影響を解析した。乳癌;CSC分画と想定されているCD24-/low CD44+細胞(以下、CD24-細胞)をcell sorterで分離し、マウスへの移植による腫瘍形成能および多分化能、Hhシグナル系の活性化、Hh阻害剤の腫瘍形成能へ及ぼす影響を解析した。また新鮮乳癌組織中のCD24-細胞を解析した。(結果)大腸癌細胞中にはCSCに相当のSP分画が約1%存在し、Wntシグナル阻害によりSP分画細胞数は減少した。これはSPよりnon-SP分画(色素非排出性分画)への移行の結果であった。機序としてはWntシグナル阻害によるABC transporterの発現減弱の関与が示唆され、SP分画の抗癌剤感受性はWntシグナル阻害により亢進した。乳癌細胞中のCD24-細胞は25-35%であった。CD24-細胞およびCD24+細胞のin vitroにおける増殖能に有意の差に認めなかったが、マウス移植によりCD24-細胞のみが腫瘍を形成し、移植腫瘍組織でHh経路の活性化が確認された。m経路阻害はCD24-腫瘍形成能を有意に抑制した。乳癌組織中にはCD24-乳癌細胞が存在したが、その割合は症例により差が大きかった。(考察)大腸癌細胞中のCSCと想定されているSP分画の抗癌剤抵抗性にはWntシグナル活性化による薬剤排出能亢進が関与しており、Wntシグナル経路の制御が大腸癌の抗癌剤感受性亢進の一つの治療戦略となることが示唆された。乳癌細胞中には造腫瘍性のCSC様細胞が存在し、Hhシグナル系の造腫瘍性への関与が示唆され、Hhシグプル系はCSC制御の有望な治療標的となりうる可能性が示された。(目的)臓器特異的な癌性幹細胞(CSC)の制御法の開発。本年度は、乳癌を標的に課題研究を行った。乳癌細胞で想定されている2種のCSC分画の相関性を検討し、CSCをより純化する手掛かりを得ることを第一目的とした。また、分離されたCSCの制御法も検討した。(材料と方法)二種の乳癌細胞株(MCF-7、MDA-MB231)を用い、Hoechst非染色細胞(Side population:SP分画)の分離法、およびCD24-/low CD44+細胞の分離法の2種の方法によりCSC分画を選択的に採取した。cell sorterにより回収した2種の分画の細胞を用いて、1)コロニー形成能および多分化能(flow cytometry)、2)Hhシグナル系の活性化(real-time PCR法、免疫蛍光染色法)、2)PaclitaxelおよびHh経路阻害剤(cyclopamine、抗Shh抗体、Glil siRNA)の細胞増殖に与える影響(flow cytometry、cell count)を中心に解析した。(結果)両乳癌細胞株中のSP分画およびCD24-/10wCD44+分画は1-4%および6-10%であった。SP分画の多くはCD24-/lowCD44+分画中に存在し、CD24-/low CD44+分画のSP細胞率は20-25%と高かった。両分画ともに他の分画に比し高いコロニー形成能を示した。また、2種のCSC分画は非CSC分画への多分化能を示し、Hhシグナル系の活性化が強く、paclitaxelに抵抗性で、Hh経路阻害剤に感受性があった。(考察)乳癌細胞の2分画には多分化能とコロニー形成能を有し薬剤抵抗性であるCSC様分画が存在した。2法の併用によるCSCの純化が可能であると考えられた。また、CSC様分画の細胞増殖はHhシグナル依存性であり、有望な治療標的となりうる可能性が示された。(目的)乳癌を用いて癌性幹細胞制御の可能性を検討した。(材料と方法)我々が同定しているPatched1蛋白親和性ペプチドとMCF7を共培養し、乳癌幹細胞分画であるCD44+/CD24^<-/low>の変化をflowcytometryを用いて検討した。昨年の検討で使用した1μg/mlではペプチドの効果を認めなかったので、今回は濃度増加による効果を確認した。(結果)CD44+/CD24^<-/low>とCD44+/CD24^<high

>細胞分画の生着率は、1コロニー当たり細胞数2,000/20,000/200,000個を接種したところ、生着コロニー/接種コロニーは各々0/4,8/8,4/4(CD44+/CD24^<-/low>細胞分画)、0/4,1/8,2/4(CD44+/CD24^+細胞分画)であり、我々の手法で分離したCD44+/CD24^<-/low>細胞分画が実際に癌幹細胞を高濃度に含んだ分画であることが証明された。次に、以前我々が抗Hedgehogシグナル効果を持つことを示した新規Patched1親和性ペプチドを用いて、上記癌幹細胞分画の制御を試みた。Patched1親和性をMCF7細胞を共培養しflowcytometryで解析したところ、1μg/mlにでは明らかな効果を認めなかったが、10μg/mlではCD44+/CD24^<-/low>分画の割合が減少した。ペプチド濃度依存性にCD44+/CD24^<-/low>細胞分画が減少することが確認された。(考察)Patched1親和性ペプチドは、以前報告したMCF増殖抑制に加えて、MCF7癌幹細胞分画の制御が可能であることが示された。以上より、新たな癌幹細胞制御法による難治癌克服のための創薬の方向性が示された。
量子多体系における時間最適制御理論の構築

本研究は量子力学に支配される原子などの系が多く集まった量子多体系に対して、必要な制御を最短の時間で行うための制御法を明らかにする理論を構築する。またこの最短時間の制御を量子多体系に対する標準的な制御として位置付け、提案されている他の制御法との比較を行う。近年では量子計算や量子通信に代表されるように量子力学を工学的に役立てる研究が盛んに行われており、本研究は先に述べた応用的研究の基礎として位置づけられ、素早い計算やノイズ耐性のある計算の実現などのために役立つものとなると期待される。
モノADPリボシル化毒素に不可欠な2種類の特異性を理解する

ADPリボシル化酵素ScARPは、NAD+を利用してguanineにADPリボースを付加する。前年度に決定した酵素-基質複合体(ScARP-GDP-NAD+)構造において基質認識に関わっているアミノ酸残基の重要性を、生化学実験により検証した。まず、基質(GDP、NAD+)と生成物(ADPリボース、ADPリボシル化GDP、ニコチンアミド)、合計5つの化合物をHPLCで分離するための条件を決定した。その後、基質認識に関わるアミノ酸の変異体ScARPによる反応産物をHPLCにより確認した。その結果、複合体構造において基質を認識しているアミノ酸の重要性を支持する結果を得ることが出来た。また、基質認識に重要なアミノ酸Q165をE165に置換すると、guanineに対する活性は失われるにもかかわらず、ScARP自身がADPリボシル化されることが明らかになった。これは、GlnをGlnに変えたことで基質特異性が変化したことを示唆しており、本研究課題の本質であるADPリボシル化酵素の基質特異性を理解する上で重要である。今後、Q165E変異体においてどのアミノ酸がADPリボシル化されているのか、確認していく。Pierisinは、ScARPと異なり二本鎖DNAにADPリボースを付加する。特異的に結合する二本鎖DNA配列の探索を試みたが、配列の決定には至っていない。精製したPierisinが正しくフォールディングされていない可能性も含め、実験条件の再検討を行う。ScARPの基質認識機構を構造・生化学実験により明らかにすることが出来た。また、ScARP変異体により基質認識が変化する可能性が見出されたため、基質認識機構のさらなる理解につなげることが出来る。Q165E変異体ScARPにおいてADPリボシル化されているアミノ酸を、質量分析により明らかにする。また、二本鎖DNAのguaninieをADPリボシル化する酵素Pierisinについて、特異的に結合するDNA配列の解明を目指す。また、現在精製しているPierisinが正しくフォールディング出来ていない可能性もあるため、発現系の再構築を行う。病原性細菌が産生する毒素であるmono-ADPリボシル基転移酵素(mART)の基質は様々であるが、ADPリボシル基を付加する官能基もまた様々である。本研究では、mARTの2種類の特異性(基質特異性、付加する官能基特異性)の仕組みを理解することを目的としている。対象として、ScARPとpierisinを使用した。まず、近年発見されたguanine特異的ADPリボシル化酵素ScARPについて、酵素単独構造の解明および、酵素-基質複合体構造の解明を目指した。ScARPは大腸菌で発現させ精製した。ScARP単体で結晶化を試みた結果、単結晶の取得に成功し、1.5 angstromの分解能で構造決定することに成功した。次に、酵素-基質複合体の結晶化を試みた。基質として、guanineを持つ化合物の中で水によく溶け、またKm値が低いGDPを選択した。また、反応が進まないように、本来の基質であるNAD+ではなくNADHを使用した。その結果、ScARP-GDP-NADHの3者複合体のX線結晶構造を1.6 angstromの分解能で決定することに成功した。次に、近年発見された二本鎖DNA特異的ADPリボシル化酵素pierisinについて、大量発現系を構築し、pierisinに特異的に結合するDNAの配列決定を目指した。pieirisinの大腸菌による発現は、その毒性のため、不活性mutantのみ成功した。精製した不活性mutantを用いてSELEXを行ったが、残念ながら特異的に結合するDNA配列を決定することは出来なかった。交付申請書に記載した2つの実験計画「ScARP単体の結晶構造の決定」「ScARP-基質複合体の結晶構造の決定」を達成することが出来た。その一方で「Pierisinに特異的に結合するDNA配列の決定」は達成することが出来なかった。

また、ScARP変異体により基質認識が変化する可能性が見出されたため、基質認識機構のさらなる理解につなげることが出来る。ScARPについては、基質認識および反応に重要なアミノ酸残基の変異体を作製し、その重要性を活性測定により確認する。pierisinについては引き続き、SELEX法による特異的に結合するDNA配列の決定を試みる。Q165E変異体ScARPにおいてADPリボシル化されているアミノ酸を、質量分析により明らかにする。また、二本鎖DNAのguaninieをADPリボシル化する酵素Pierisinについて、特異的に結合するDNA配列の解明を目指す。また、現在精製しているPierisinが正しくフォールディング出来ていない可能性もあるため、発現系の再構築を行う。ScARPの結晶化が順調に進行したため、予定ほど多くの結晶化試薬を購入する必要がなくなった。次年度は、pierisinの活性測定に必要な蛍光物質修飾されたオリゴの購入や、ScARPの学会発表のための旅費に使用する。ScARPについての国際学会での発表を見込んで、本年度の支出を抑えた。次年度予算は国際学会での発表、パソコンの購入などに充てる。
組織骨格を利用した再生臓器におけるハイブリッド型血管ニッチの確立と移植研究

脱細胞化骨格に自己の細胞を生着させる技術は、臓器の微細構造を維持した臓器そのものを再生できる点で画期的である。しかしながら、この手法で作成された再生臓器は、血管網の再構築が完全でなく、血管網の再構築が、この研究の鍵となる。本研究はその問題点を克服するため、改良型Transwell&reg;による透過性の評価、ナノファーバーによるコーティング技術を駆使してin vitroで血管ニッチを伴う疑似肺胞壁を組織工学的に再構築する。そしてその条件で最終的に実験動物に再生臓器を移植し、in vivoで再生臓器の生着を評価して、臨床応用への可能性を探りたい。本研究では毛細血管の破綻が直接臓器障害に関与する肺を研究対象とした。