hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
芸術領域のおける模写制作の実践的研究-韓国通度寺霊山殿彩色・壁画を対象として-

当研究の成果発表として三カ国による模写作品の競作を主たる目的としており、平成21年8月台湾東海大学に、古色復元模写の進行状況の確認と平成21年12月本学において開催のシンポジウムの打合せを行った。また、9月には韓国通度寺聖宝博物館に現状模写完成作品の確認を行うと共に上記シンポジウムへの協力要請と打合せを行った。本学担当の復元模写制作は、前年度に続き上段及び下段部分の制作を行い、全体の調子を整えて完成した。平成12年12月前年度予算繰り越し分及び本年度予算を用いて、「東アジアにおける古建造物彩色・壁画の保存と修復Vol.3-日本・韓国・台湾三国合同韓国通度寺霊山殿壁画模写成果発表-」と題して、本学ギャラリーにて、三カ国模写作品を展示すると共に、本学にてシンポジウムを開催した。講演者として、朝鮮時代仏教絵画が専門の韓国東亜大学教授朴銀卿氏を招聘し、基調講演として「朝鮮王朝の仏画の特色」の表題で講演して頂いた。また、成果発表として韓国の模写担当者である韓国伝統文化学校研修院講師金眠氏、台湾の模写責任者台湾東海大学助教授李貞慧氏、日本からは本研究共同研修者仲政明及び本学大学院修了生森本有佳が発表を行った。参加者150名弱と予想より少なかったことは、残念ではあったが、講演者によるパネルディスカッションでは各国の模写の考え方、韓国仏画の表現様式又その時代的変遷、それに伴う絵具等の画材の研究成果が討論され、一定の成果を上げることが出来たと考える。尚、開催に伴い、要旨集を発刊した。(別紙添付)また、本シンポジウム開催に伴い、朝日新聞、読売新聞、京都新聞三紙に掲載されており、平成22年度5月には韓国通度寺聖宝博物館においてシンポジウムが開催された。本年度中に台湾東海大学においても、本研究関連シンポジウムが開催される予定であり、一定の社会的還元が出来たと考えている。平成20年8月に韓国通度寺霊山殿研究対象壁画前に足場を設置し韓国・台湾・日本三国共同で詳細調査を行った。本調査において、写真資料からでは判断できない、絵具層の重なりや損傷状況を詳細に記録すると共に、構造体と絵画面の歪みとの関連等の調査を行った。その結果、壁面全面に緑土を下地として使用しており、多宝塔の壁面や扉には、盛り上げ技法を用いて、雲母が塗布されていることが判った。また、後補部分の検証においては、構造体から見ると壁画上部が後補の可能性も考えられたが、韓国建築の専門家との話し合いの中で、日本と韓国の建築方法の違いがあることが判り、再度、現状を調査した結果、当初彩色と断定した。また、一部顔料試料を採取し本国に持ち帰り顔料分析を行った。当初から緑色顔料として、アタカマイト・ムールアイトの使用の可能性が問題視されていたが、両者が銅の二次鉱物であるため、絵具として使用するだけの採取量が見込めない点や韓国において採掘箇所が特定できない等の絵具として単独で両者を使用するには疑問点が多く、偶然に混入していたか経年による変化により、生成されたと判断した。しかし、この問題については、今後も調査、検討が必要である。また通度寺伽藍内の大雄殿、大明光殿、龍華殿、観音殿の装飾彩色の意匠・技法素材の変遷を調査する上での基礎資料収集のための写真撮影を行い、類例調査として新興寺・無為寺の装飾彩色を調査した。本調査で判明した結果をもとに、当該年度は対象壁画中段の復元模写を行った。尚、平成20年9月に再度韓国通度寺に赴き、韓国側の現状模写の進行状況を確認すると共に、シンポジウムの開催を含め今後の進行について打合せを行い、平成21年度12月に本年度予算を繰越、本学にてシンポジウムを開催した。(別紙添付)

また、本シンポジウム開催に伴い、朝日新聞、読売新聞、京都新聞三紙に掲載されており、平成22年度5月には韓国通度寺聖宝博物館においてシンポジウムが開催された。本年度中に台湾東海大学においても、本研究関連シンポジウムが開催される予定であり、一定の社会的還元が出来たと考えている。
1型糖尿病と共にある生活世界-そこから見えてくる必要なソーシャルワークについて-

1型糖尿病当事者・親への面接調査及び質問紙による量的調査により、1型糖尿病者の生活課題を分析した。その過程で、一連の生活問題について当事者が主体となりクレイム甲し立て活動を行いにくい状況が以下の6点あることがわかった。1,当事者及びその親や医療職をはじめ関係者に「障害者」としてのアイデンティティを受け入れたくないという「健常者中心主義」が根強くある。そのため当事者は問題を抱えていない健常者のように振舞うことを選択しがちである。2,1型糖尿病者自身に支援ニーズがあると明確に自覚するころには合併症などが進みとてもクレイム申し立て活動が出来る余力が残っていない。3、糖尿病の場合、2型糖尿病が生活習慣病と名づけられているために1型糖尿病と表明しニーズがあることを主張すると受けて側に生活習憤病=自業自得と解釈され1型糖尿病者の主張が入口の段階でシャットアウトされることが多々あり、結局最初から社会に理解を求めることをあきらめざるをえない。4、1型糖尿病といっても病態、羅病歴、生活環境、などの違いによりその状態も幅が広い。しかし差異の根拠を膵臓機能評価指標の多寡で評価することに1型糖尿病者自身が陥りがちで、結果としてそれが糖尿病者内での細分化を生み、クレイムの内容の一致を見ることができない。5、もともと1型糖尿病当事者による社会啓発活動の歴史が浅いので、問題を当事者が感じたとしてもどこに何をどのように訴えていけばよいのかわからない。6、病院の経営上の都合などで診療報酬制度上では本来必要十分量支給されるはずの資材などが十分支給されなかったり、医師の指示が現代の医療の水準かちすると明ちかに間違っていたとしても他の治療環境を経験していない当事者にとってはそのこと自体が問題として自覚しにくく不適切な環境を受け入れてしまう。これらの知見を念頭においたソーシャルワーク支援の必要性があることがわかった。本年は、研究課題の1年目にあたり、1型糖尿病者の生活実態を明らかにするべく、1型糖尿病当事者、10人に面接調査を実施した。面接法は、病をめぐる生活史について自由に語ってもらう方法を採用した。また、インタビュー内容は録音し逐語記録をとった。さらに、可能な人には、事前に「病」にまつわる個人史年表の作成依頼をし、面接調査時に持参してもらった。今回の調査で明らかとなった知見は以下の項目であった。(1)本来医療保険でカバーされているはずの測定紙が必要十分量支給されていないケースと必要十分量支給されているケースとに分かれた。また、支給されていない人の対処法として、自己負担(月2万円の負担)をして不足分を補う、測らないで我慢するなどの方法があった。また、測定回数も、あまり測らなくても不都合をかんじない人から1日5回から8回測定が必要な人までばらつきがあった。(2)医師の療養指導が当事者の個別性を必ずしも考慮していないため、我流で習得した治療実践を日常生活に組み込む人が多かった。そのため実際治療実践を生活に組み込む際に苦労したあるいは苦労している人が多数存在した。(3)最新の治療が、医療機関側の都合により、受けられない。また、受けられたとしても支援体制が無いため思うほどの効果が上がらない。(4)数十年前と最近の治療法の変化や生活環境の変化(炭水化物カウントの普及、食品の成分表示、測定器の普及)により1型糖尿病の位置づけが変わってきている。(5)老人ホームでの医療行為に限度があり、ホーム入居を断られた。以上の知見から、性別、家族のサポートの有無、仕事の有無、発症の時期、障害年金など経済保障の有無、治療環境が適切か否か、など当事者がおかれている状況は多種多様であり、1型糖尿病とひと括りに理解・把握しようとすることは、当事者理解にはつながらないことが仮説として考えられた。

6、病院の経営上の都合などで診療報酬制度上では本来必要十分量支給されるはずの資材などが十分支給されなかったり、医師の指示が現代の医療の水準かちすると明ちかに間違っていたとしても他の治療環境を経験していない当事者にとってはそのこと自体が問題として自覚しにくく不適切な環境を受け入れてしまう。これらの知見を念頭においたソーシャルワーク支援の必要性があることがわかった。
CYP on a Chip ~銀チッブ電極によるCYPの薬物代謝迅速評価~

シトクロムP450(CYP)はヒト薬物代謝の中心的役割を演じる重要な酵素であるが、いくつかのアイソフォームがある上に基質特異性がきわめて低いため、CYPによる薬物代謝の理解がきわめて困難である。そこで本研究では、電気化学を利用したCYPの薬物代謝活性評価系の構築を目指した。CYPの還元に必要な電位において銀電極は酸化銀を生じたため、より安定な金電極を用いて実験を行った。種々のコーティング剤を試した結果、メルカプトウンデカン酸とメルカプトウンデカノールの混合溶液を用いたときにCYP2C9の酸化還元波を測定できることがわかった。シトクロムP450(CYP)はヒト薬物代謝の中心的役割を演じる重要な酵素であるが、いくつかのアイソフォームがある上に基質特異性がきわめて低いという特徴を持つ。このため、CYPと基質薬物とは多対多の関係にあり、CYPによる薬物代謝の理解をきわめて困難にしている。本研究では、申請者が確立した可溶性ヒトCYPの大量発現系を利用し、1)銀電極表面への活性型CYP固定化、2)電極を用いた酵素活性の評価、という2つのサブテーマを解決する。これらにより、銀チップ電極に固定化したCYPの表面増強共鳴ラマン効果による構造評価と、電極反応を利用したCYPの薬物代謝活性評価を行い、CYPと基質との対応関係を解明するとともに、CYPの構造・活性相関にかかるハイスループット測定系を確立する。23年度の研究結果により、銀電極は微量の溶存酸素により酸化され、酸化銀を生じてしまうことがわかった。そこで、銀より安定な金電極を用いた実験を平行して行った。銀電極と同様、酸化還元サイクル処理により金電極表面を凹凸化した後、p-メルカプト安息香酸、及びメルカプトウンデカン酸等に浸して電極表面をコーティングした。種々のメルカプト酸を試した結果、メルカプトウンデカン酸とメルカプトウンデカノールの混合溶液を用いたときに、CYP2C9の酸化還元波を測定できることがわかった。しかしながら、ピーク電流が小さかったため、CYP2C9の結合量を増やすべく、電極に共有結合でCYPを固定することを試みた。縮合剤としてEDCを用いた結果、わずかながら改善が見られた。本研究では、申請者が確立した可溶性ヒトCYPの大量発現系を利用し、❶銀電極表面への活性型CYP固定化、❷電極を用いた酵素活性の評価、という2つのサブテーマを解決する。23年度は銀電極の表面加工を中心に検討を進めた。まず、アルミナ研磨紙を使用して市販の銀電極表面を鏡面仕上げし、脱気した0.1 M KCl中で-1000 mVを5分間印加した後、+400 mV(酸化)を30秒、-400 mV(還元)を30秒印加した。この酸化還元サイクルを4回繰り返し、表面に凹凸を生じさせた。この電極をエタノールに溶解したp-メルカプト安息香酸、及びメルカプトウンデカン酸に浸し、電極表面をコーティングした。ここへ別途調製したCYP2C19を添加して吸着させて酸化還元電位を測定したところ、銀電極表面が黒化する様子が観測された。おそらくコーティングされなかった銀電極の露出部分が微量の酸素により酸化され、酸化銀を生じたものと考えられた。メルカプト酸を用いた電極表面のコーティングが予想以上に難しく、微量の酸素の影響が大きく出てしまったため。他のコーティング剤を用い、表面処理条件をさらに精査していく。また、銀に比べてより安定な金電極を用いてコーティングを行い、CYPの静電的な吸着を行った上で、ポテンシオスタットを用いて電極に定電圧を印加し、薬物を加えて酵素反応を開始する。反応にともない一定の電流値が観測されるが、薬物濃度を変えながらこの電流値を記録する。基質濃度に対して電流値をプロットし、Michaelis-Mentenの式を用いて最大反応速度Vmax(に相当する電流値)とミカエリス定数Kmを得る。これまでの研究課題で通常の酵素反応からすでに得ているVmaxやKm値と比較することにより、本手法の妥当性を評価する。計画に若干の遅れが見られるものの、研究費の使用計画に大きな変化はない。
窒化ケイ素およびサイアロンセラミックスの水熱腐食とその応用

常圧焼結窒化ケイ素セラミックスについては、Y_2O_3-Al_2O_3助剤系において、3種類の助剤組成の焼結体を作製し、従来と同様300°C、8.6MPa下での水熱腐食試験を行った。それらのICPによる液分析、腐食層断面のEPMA分析、表面のSEM観察結果より、助剤総量が多いほど減量が多く、耐食性は低下するが、SiO_2存在下でのAl_2O_3の添加が腐食を抑制していることが分った。また、サイアロン系においてもβ-サイアロン(Z=0.5、Y_2O_35wt%添加、Al/Si=0.09)>α-サイアロン(x=0.2、Al/Si=0.08)>α-サイアロン(x=0.5、Al/Si=0.23)の順に、Al/Si比が大きくなるほど、アルミノ・シリケート保護膜による耐食性の向上が認められた。この現象をさらに確認するために、助剤無添加HIP焼結の窒化ケイ素についても同様の検討を行った結果、この場合には、腐食層は形成せず、原料粉体表面に存在する極微量のシリカ成分が構成する粒界相が選択的に溶出するため、窒化ケイ素粒子の剥落による試片の細化現象が見られた。この結果は、粒子焼結法であるPLS、HP、HIP法では、その焼結体の耐食性は粒界相に大きく支配され、むしろAl_2O_3-SiO_2系のように、粒界相を構成する酸化物相の組成、量の積極的制御が有効であることを示している。また、粒子焼結法に対し、化学結合法であるRB法にHIP法を組合せた緻密焼結体の作製、あるいはガス圧燃焼焼結法等による窒化ケイ素焼結体の特性向上が示唆された。水熱腐食による機械的性質への影響については、室温曲げ強度の測定により、窒化ケイ素では、腐食初期に急激に低下し、その後210日腐食試料で一定値となる傾向を見い出した。また、水熱腐食後の窒化ケイ素については、大気中にて再加熱した結果、多孔質ではあるが基体の窒化ケイ素と良好な界面を有する酸化物表面が形成され、表面改質、接合界面へのこの現象の応用が可能である結果も得た。
海産新口動物幼生飼育装置の開発

研究の背景と目的:近年の海産無脊椎動物の分野は凄まじい速さで分子生物学的インフラの整備が成されているが、発生ステージの試料確保や飼育・維持が不備であり、この部分が緊急の課題となっている。飼育方法の確立と必要な装置等を現在最も必要としている動物は半索動物ヒメギボシムシ(Ptychodera flava)である。同種は専らハワイで採集されており、国内では和歌山県串本町での30年前の報告だけであり、飼育方法と串本町でのフィールド調査を平行して研究する事にした。研究方法:当初は幼生飼育装置の自作を目指したが、研究のグローバル化を見据え、装置をオーダーメイドではなく、誰でも利用できる市販品の組み合せで作製する事にした。串本町でのフィールド調査は現地での生息地の確認と採集及び産卵時期の特定を行った。得られた成果:まず串本産ヒメギボシムシは18S rDNA情報等からハワイ産と同種と考えられ、産卵時期は9月中旬頃(ハワイ産は12月)である事が判明した。放精刺激手法に関しては串本産ヒメギボシムシがハワイ産と異なる刺激(pH±2)でしか放精が見られなかった。串本産ヒメギボシムシは雄しか確認されず、性比のばらつき等に関しては更なるフィールド調査を必要とする。従って幼生はハワイ産ヒメギボシムシを国内で受精させて飼育した(国内初)。飼育容器中の海水の撹拌には、プラスチック製の羽やエアポンプ、ローテーター(シーソー式、波動式)を使用した。エアポンプによる撹拌は一つの容器で大量に飼育できるが、一日機械が不具合を起こすだけで胚が全滅したため、浮遊細胞培養容器を使ったローテーションが無難と考えられた(両者平行して行う事が望ましい)。餌は現在ホヤ等で実績を上げているCheatoeceroscalcitrans(サンカルチャー:日清マリンテック)を使用したが、この餌のみでは発生がハイダー期で停止する。これにRhodomonussp, Isocrysisを加えるとメチニコフ期への変態が誘導される事が初めて判明した。現在クローン期を経てシュペンゲル期に変態するかを観察中であり、これが成功すれば世界初の室内ライフサイクルの確立となる。本研究で飼育した胚はin situ hybridizationによって分子発生生物学的研究に利用可能な品質であることも確認した。
口腔領域腫瘍組織のSOD及びカタラ-ゼ活性に関する研究

活性酸素の消去酵素であるsuperoxide dismutase(SOD)およびカタラ-ゼは種々の組織に存在し、活性酸素の毒性から組織を保護していると考えられている。近年、bleomycin(BLM)やantracyclinなどある種の抗腫瘍剤は、細胞の活性酸素産生を増強する事により抗腫瘍効果を示す事が報告されている。そこでわれわれは抗腫瘍剤は腫瘍細胞の活性酸素産生に及ぼす影響およびそのメカニズムについても検討を行った。腫瘍細胞は、当教室で樹立し継代維持している口腔扁平上皮癌由来のNA細胞およびHeLa S3細胞を用いた。用いた抗腫瘍剤はBLM、mitomycin C、cisplatinおよび5ーfluorouracilで、これらの抗腫瘍剤を添加するといずれもSOD活性の上昇がみられた。一方、カタラ-ゼ活性については上昇はみられず、むしろ減少する傾向を示した。次にBLMをNA細胞に添加し、濃度による影響を観察した。その結果、6時間のincubationでは細胞障害性を示さない30μg/ml以下の濃度では、濃度依存性にSOD活性の上昇がみられた。次に2μg/mlのBLMを用いてSODの経時的変化について検討を行ったところ、6時間まではSOD活性は経時的に上昇し、それ以後は徐々に減少する傾向がみられた。これらの結果より、抗腫瘍剤により培養細胞のSOD活性が上昇する事が明らかになった。そこで、抗腫瘍剤によるSOD活性の上昇が細胞の代謝に関与するか否かについて検討を行った。すなわち、NA細胞にNaFおよびKCNを添加し、さらにBLMを加えた。その結果、KCNを添加するとSOD活性の上昇はみられず、NaFを添加するとBLMのSOD上昇効果を促進する傾向がみられた。また、NaF単独でも腫瘍細胞のSOD活性は若干上昇した。以上の結果より、抗腫瘍剤によるSOD活性の上昇は、細胞の代謝が阻害され、おそらく細胞内のSOD代謝における排泄あるいは不活化が阻害される事になるのではないかと考えられた。活性酸素の消去酵素であるsuperoxide dismutase(SOD)およびcatalaseは、ほとんどすべての細胞に分析し、生理的に生じた活性酵素の毒性から細胞を保護していると考えられている。とくに、腫瘍細胞においては、これらの酵素と放射線あるいは抗腫瘍剤に対する感受性とのあいだに密接な関係があることが示唆されている。そこで今回、抗腫瘍剤の腫瘍細胞に対する効果を解明する目的で口腔扁平上皮癌由来の株細胞を持ちいて、これらの酵素と抗腫瘍剤の添加による影響について検討を行なった。方法として、用いた抗腫瘍剤は、bleomycin,cisplatin,mitomycin C,5-FUおよびadriamycinで、これらの薬剤を添加培養した後、細胞をホモジネ-トし、SODおよびcatalaseの活性をxanthine-xanthine oxidase系によるNBTの還元で測定した。その結果、これらの抗腫瘍剤の添加により、SOD活性の上昇が見られたがcatalaseには変化が認められなかった。そこで、抗腫瘍剤の添加によるSOD活性の上昇のメカニズムについて更に検討を行なった。すなわち、培養細胞をホモジネ-トした後、イオン交換クロマトグラフィ-により分離を行ない、各フラクションのSOD活性に対する影響について検討を行なった。その結果、一部のフラクションにSOD活性を抑制する因子の存在することが明らかになった。SOD自体を抑制する物質は現在までほとんど報告がなく、今後このSODの抑制因子のcharacterizationを行ないたいと考える。

近年、bleomycin(BLM)やantracyclinなどある種の抗腫瘍剤は、細胞の活性酸素産生を増強する事により抗腫瘍効果を示す事が報告されている。そこでわれわれは抗腫瘍剤が腫瘍細胞の活性酸素産生に及ぼす影響およびそのメカニズムについても検討を行った。腫瘍細胞は、当教室で樹立し継代維持している口腔扁平上皮癌由来のNA細胞およびHeLa S3細胞を用いた。用いた抗腫瘍剤はBLM、mitomycin C、cisplatinおよび5ーfluorouracilで、これらの抗腫瘍剤を添加するといずれもSOD活性の上昇がみられた。一方、カタラ-ゼ活性については上昇はみられず、むしろ減少する傾向を示した。そこで、抗腫瘍剤によりSOD活性が上昇するメカニズムについて検討した。まず、抗腫瘍剤によるSOD活性の上昇が細胞の代謝に関与するか否かについて検討を行った。すなわち、NA細胞にNaFおよびKCNを添加し、さらにBLMを加えた。その結果、KCNを添加するとSOD活性の上昇はみられず、NaFを添加するとBLMのSOD上昇効果を促進する傾向がみられた。また、NaF単独でも腫瘍細胞のSOD活性は若干上昇した。次に、培養細胞をホモジネ-トし、その上清をDEAE sepharoseカラムにて分離したところ、SOD活性を抑制する分画の存在が確認された。以上の結果より、抗腫瘍剤によるSOD活性の上昇は、細胞の代謝が阻害され、おそらく細胞内のSOD代謝における排泄あるいは不活化が阻害されたか、あるいはSOD抑制物質の増加によるものと思われた。
癌発生機序の解明を目指した酸化還元酵素を基盤とするタンパク質ネットワークの理解

癌幹細胞を得る手段として、初代培養細胞以外では、多くの研究者は薬剤による耐性獲得細胞株を癌幹細胞として調製しているが、これはあくまでも“薬剤耐性株"であり、真の癌幹細胞なのかはわかっていない。癌幹細胞は通常の癌細胞内にわずかに含まれると考えられる。申請者は複数の手法を組み合わせ、癌細胞株中にごく微量存在する癌幹細胞様細胞を単離することに成功した。申請段階では、微量すぎて培養することが困難であった、乳癌細胞などにおける癌幹細胞様細胞を効率的に培養する手法を開発した。これにより、複数種類の癌幹細胞様細胞を用いて、開発したHE-Iのミトコンドリアにおける機能を解析することが可能となった。加えて、細胞形態、細胞表面タンパク質variant解析などを複合することで、癌幹細胞様細胞の不均一性が明らかとなり、シングルセルとして単離することで、3段階に癌幹細胞様細胞の性質をランク分けし、今後の研究で使用するためクローン化を行った。これらについては、さらなる解析として、ERO1やPDIなどの酸化還元調節酵素、HIF-1などの転写因子に関して発現解析を行なった。さらに、当初計画以上に研究が進展し、次年度行う予定であったミトコンドリア遺伝子異常解析の予備実験を行なっており、条件検討の後、改善が必要な点を検討中である。さらに、HE-Iの癌細胞、癌幹細胞様細胞における作用ミカニズムの違いに近く新たな知見を得ることに成功し、今後、その知見を広げることで癌の成り立ちについての理解に貢献することが期待できる。初年度は癌幹細胞様細胞の調製に当たる。申請段階では微量すぎ、それのみでは生存性が低く培養に不向きであった癌細胞において、それらを改善する手法を開発し、効率的に癌幹細胞様細胞を調整することに成功した。また、シングルセル分取対応した、セルソーターSH800(Sony Japan)を用いてシングルセル解析を行ったところ、現在までの癌幹細胞様細胞では不均一であり、クローン化する必要があることが判明し、大腸癌由来の癌幹細胞様細胞をクローン化し、4株の状態の違う癌幹細胞様細胞を単離した。また、上皮間葉転換の指標としてある細胞表面タンパク質のvariantを解析する手法を用いて調製した癌幹細胞様細胞を解析したところ、大腸癌由来の癌幹細胞様細胞では元の癌細胞で発現していた長さのものとより短くなっているものが見られた。このことから細胞接着が弱くなった、つまり間葉転換が促進された結果であると考察される。また、上述の様に細胞をそれぞれ単離することで、より均一化された癌幹細胞様細胞を調製し、同様の解析を行ったところ、比較的、扁平に増殖する細胞ではタンパク質鎖長が長いものが含まれており、細胞接着が弱く垂直方向に増殖する細胞では最も短い鎖長のタンパク質が発現している事が判明した。元の癌細胞と比較すると、形態の違い、タンパク質鎖長から、癌幹細胞様細胞として3種類に分類し、現在、ERO1aおよびPDI、さらにHIF-1などのタンパク質発現量の確認を行っている。すでに来年度から開始予定であったミトコンドリア遺伝子異常解析について予備実験を行っており、試薬、機器について十分な検討を行った。そのことからも当初計画以上に進展していると判断した。癌幹細胞株2系統を用いることで、ミトコンドリア電子伝達系で機能するタンパク質の発現量変化、機能にあたえる効果を普遍的に解析する。蛍光プローブを用いて、HE-I添加時、非添加時のミトコンドリアにおける活性酸素種(ROS)の種類をそれぞれ特異的に検出することで、そのROSを生み出す電子伝達系における機能不全部位の同定を目指す(オールインワン顕微鏡BZ-X700, Keyence)。また、同時にミトコンドリアを抽出し、ミトコンドリア全ゲノム解析(次世代シーケンサーGS Junior, Roche)を行うことで、遺伝子的に不全しているか解析を行い、ミトコンドリア異常による癌幹細胞形成の道筋の解明を目指す。HE-Iを用いることで細胞内でのタンパク質の酸化還元に影響があり、ミトコンドリア以外でROS発生の可能性がある。そこで、所有するハイコンテンツイメージング解析(Operetta, Perkin Elmer)を用いて、細胞内のミトコンドリア部位に限定して空間的分布解析を行い、データの取捨選択を行う。ミトコンドリア遺伝子異常解析以外にも、エピゲノム解析、発現量解析、CAGE法を計画しており、電子伝達に関与するタンパク質を網羅的に解析する。

さらに、当初計画以上に研究が進展し、次年度行う予定であったミトコンドリア遺伝子異常解析の予備実験を行なっており、条件検討の後、改善が必要な点を検討中である。さらに、HE-Iの癌細胞、癌幹細胞様細胞における作用ミカニズムの違いに近く新たな知見を得ることに成功し、今後、その知見を広げることで癌の成り立ちについての理解に貢献することが期待できる。初年度は癌幹細胞様細胞の調製に当たる。申請段階では微量すぎ、それのみでは生存性が低く培養に不向きであった癌細胞において、それらを改善する手法を開発し、効率的に癌幹細胞様細胞を調整することに成功した。また、シングルセル分取対応した、セルソーターSH800(Sony Japan)を用いてシングルセル解析を行ったところ、現在までの癌幹細胞様細胞では不均一であり、クローン化する必要があることが判明し、大腸癌由来の癌幹細胞様細胞をクローン化し、4株の状態の違う癌幹細胞様細胞を単離した。また、上皮間葉転換の指標としてある細胞表面タンパク質のvariantを解析する手法を用いて調製した癌幹細胞様細胞を解析したところ、大腸癌由来の癌幹細胞様細胞では元の癌細胞で発現していた長さのものとより短くなっているものが見られた。このことから細胞接着が弱くなった、つまり間葉転換が促進された結果であると考察される。また、上述の様に細胞をそれぞれ単離することで、より均一化された癌幹細胞様細胞を調製し、同様の解析を行ったところ、比較的、扁平に増殖する細胞ではタンパク質鎖長が長いものが含まれており、細胞接着が弱く垂直方向に増殖する細胞では最も短い鎖長のタンパク質が発現している事が判明した。元の癌細胞と比較すると、形態の違い、タンパク質鎖長から、癌幹細胞様細胞として3種類に分類し、現在、ERO1aおよびPDI、さらにHIF-1などのタンパク質発現量の確認を行っている。すでに来年度から開始予定であったミトコンドリア遺伝子異常解析について予備実験を行っており、試薬、機器について十分な検討を行った。そのことからも当初計画以上に進展していると判断した。癌幹細胞株2系統を用いることで、ミトコンドリア電子伝達系で機能するタンパク質の発現量変化、機能にあたえる効果を普遍的に解析する。蛍光プローブを用いて、HE-I添加時、非添加時のミトコンドリアにおける活性酸素種(ROS)の種類をそれぞれ特異的に検出することで、そのROSを生み出す電子伝達系における機能不全部位の同定を目指す(オールインワン顕微鏡BZ-X700, Keyence)。また、同時にミトコンドリアを抽出し、ミトコンドリア全ゲノム解析(次世代シーケンサーGS Junior, Roche)を行うことで、遺伝子的に不全しているか解析を行い、ミトコンドリア異常による癌幹細胞形成の道筋の解明を目指す。HE-Iを用いることで細胞内でのタンパク質の酸化還元に影響があり、ミトコンドリア以外でROS発生の可能性がある。そこで、所有するハイコンテンツイメージング解析(Operetta, Perkin Elmer)を用いて、細胞内のミトコンドリア部位に限定して空間的分布解析を行い、データの取捨選択を行う。
液胞プロセシング酵素による高等植物の細胞内分解の制御機構

様々な液胞の機能分子の活性発現を支配している液胞プロセシング酵素(VPE,Vacuolar processing enzyme)には,貯蔵器官タイプと栄養器官タイプが存在し,それぞれの遺伝子は器官特異的また時期特異的に発現する.各液胞内プロセシング系について下記の結果を得た.登熟期の種子細胞にはタンパク質蓄積型液胞が存在するが,この液胞へのタンパク質の輸送機構を明らかにし,この細胞内輸送に関与する小胞をPAC(Precursor-Accumulating)小胞と命名した.PAC小胞に含まれている100kDaのタンパク質(PV100)の液胞内プロセシングの様式を詳細に解析した結果,貯蔵器官タイプVPEがPV100中の6箇所のAsn-Gln結合を切断し,生体防御因子であるTrypsin inhibitorやCytotoxic peptideそしてVicilin様貯蔵タンパク質といった複数の機能分子を生成していることが分かった.PV100分子はtrypsin inhibitor活性を持たないことから,VPEによるプロセスがTrypsin inhibitorの活性発現に必須であることも確認された.VPE分子自体も不活性な前駆体として合成されるが,自己触媒的にC末端側のプロペプチドの除去とそれに続くN末端側のプロペプチドの除去が酵素の活性化に必須であることを酵母の発現系を用いて解明した.栄養器官型のVPE遺伝子は老化組織や傷害を受けた組織で強く発現する.このVPEの細胞内局在性と機能について解析した.シロイヌナズナのγVPEの特異抗体を用いた免疫電顕より,傷害葉の液胞にシグナルを認めた.また,酵母細胞で発現させたγVPEが活性を示した.以上の結果より,栄養器官型VPEが活性を持った分子として液胞で機能していることが明らかになった.様々な液胞の機能分子の活性発現を支配している液胞プロセシング酵素(VPE,Vacuolar processing enzyme)には,貯蔵器官タイプと栄養器官タイプが存在し,それぞれの遺伝子は器官特異的また時期特異的に発現する.各液胞内プロセシング系について下記の結果を得た.登熟期の種子細胞にはタンパク質蓄積型液胞が存在するが,この液胞へのタンパク質の輸送機構を明らかにし,この細胞内輸送に関与する小胞をPAC(Precursor-Accumulating)小胞と命名した.PAC小胞に含まれている100kDaのタンパク質(PV100)の液胞内プロセシングの様式を詳細に解析した結果,貯蔵器官タイプVPEがPV100中の6箇所のAsn-Gln結合を切断し,生体防御因子であるTrypsin inhibitorやCytotoxic peptideそしてVicilin様貯蔵タンパク質といった複数の機能分子を生成していることが分かった.PV100分子はtrypsin inhibitor活性を持たないことから,VPEによるプロセスがTrypsin inhibitorの活性発現に必須であることも確認された.VPE分子自体も不活性な前駆体として合成されるが,自己触媒的にC末端側のプロペプチドの除去とそれに続くN末端側のプロペプチドの除去が酵素の活性化に必須であることを酵母の発現系を用いて解明した.栄養器官型のVPE遺伝子は老化組織や傷害を受けた組織で強く発現する.このVPEの細胞内局在性と機能について解析した.シロイヌナズナのγVPEの特異抗体を用いた免疫電顕より,傷害葉の液胞にシグナルを認めた.また,酵母細胞で発現させたγVPEが活性を示した.以上の結果より,栄養器官型VPEが活性を持った分子として液胞で機能していることが明らかになった.
言語性記憶と非言語性記憶の側頭葉内メカニズム

右側頭葉前部の損傷により非言語性記憶障害が生ずるとされている(Smith1989)。しかし、デ-タは少ない(Taylor1969,Milner1975)。われわれは、非言語性記憶課題として用いられているレイーオステライト複雑図形の想起課題ウェクスラ-記憶検査(改訂版1987年)の3つの非言語性記憶課題を右側頭葉前部切除術の前後に検査し、術後に障害が生ずるかどうか検討した。難治性てんかんのため、右側頭葉前部を切除した5例と左側頭葉前部を切除した4例を対象とした。症例は9例ともすべて右利きで、アミタ-ルテストにより左半球が言語優位半球であった。右側頭葉前部を切除した5例のうち、4例では上・中・下側頭回、紡錘回、海馬傍回が側頭極から後方へ約5cm切除され、海馬、扁桃核も切除された(症例1、2、3、4)。残る1例は、海馬・海馬傍回・扁桃核のみが切除された症例であった(症例5)。一方、左側頭葉前部を切除した4例のうち、1例は海馬・海馬傍回・扁桃核が切除され(症例6)、2例は症例6の切除部位の加え紡錘回と下側頭回が切除された(症例7、8)。また、残る1例は症例7、8の切除部位にさらに上側頭回先端と中側頭回が切除された(症例9)。レイーオステライト複雑図形の想起課題右側頭葉前部を切除した5例すべてで、術前に比べ術後に明かな低下は認められなかった。また、左側頭葉前部切除例4例もすべて術前と比較して、術後に低下を認めなかった。ウェクスラ-記憶検査の視覚性記憶指標被覚性記憶指標が術後16(2SD)以上低下した場合を視覚性記憶の低下と考えると、右側頭葉前部切除例5例と左側頭葉前部切除例4例のいずれの症例にも視覚性記憶の低下はみられなかった。このことは、右側頭葉前部損傷によって非言語性記憶障害が生ずるとする従来の説を支持せず、障害が生じないと考えられる。難治性てんかんの治療のため右側頭葉前部を切除した症例については、従来、音の記憶、音色の同異判断(Milner,1962)や顔の記憶(Miler,1968)などの障害が報告されている。我々は、このような障害が実際に生じるかどうかを検討した。音の記憶とは、35音からなる音のパタ-ンが二回続けて提示され、1回目に提示された音のパタ-ンのうち1音だけが二回目の提示の際に変化し、その変化した音が何番目の音であったかを指適摘する課題である。また、音色の同異判断とは、連続する二つの和音を比較し、はじめの和音と二回目の和音が同じであったか、異なっていたかを判断する課題である。右側頭葉前部切除4例(男2名/女2名)、左側頭葉前部切除4例(男3名/女1名)を対象とした。切除範囲は右側頭葉前部切除例が側頭極から後方へ56cmであるのに対して、左側頭葉前部切除例では失語症を避けるためにそれより狭い範囲がいろいろなパタ-ンで切除された。

対象は全て右利きで、アミタ-ルテストにより左半球が言語の優位半球であった。その結果、右側頭葉前部の切除では、4例とも音の記憶、音色の同異判断について障害を認めなかった。左側頭葉前部切除4例について、いずれの検査でも障害は認められなかった。顔の記憶では、縦3枚、横4枚に配置された12枚の顔写真と縦横5枚づつ配置された25枚の顔写真が用いられた。12枚の顔写真が45秒間提示された90秒後に、それを25枚の顔写真の中から選び出すように求められた。右側頭葉前部切除7例(男5名/女2名)、左側頭葉前部切除4例(男4名)を対象とした。切除範囲は実験Iの対象と同様であった。全ての対象が右利きであり、アミタ-ルテストにより左半球が言語について優位半球であった。その結果、術前、術後の成績に差はなかった。従って、右側頭葉前部の切除によって顔の記憶障害は生じないと考えられる。
コンビナトリアルモレキュラーインプリンティングによる分子認識高分子の創製

本研究では、モレキュラーインプリンティング(MI)法のための自動化ポリマー合成・評価システムを構築し、系統的に自動合成されたMIポリマーライブラリーを評価することによって、認識しようとする鋳型分子に最適な機能性モノマー、溶媒、反応条件などを簡便かつ迅速に見出すコンピューター支援コンビナトリアルMI法を開発することを目的とした。平成11年度は,モデル化合物としてトリアジン除草剤(アトラジン・アメトリン)を用い、機能性モノマーはメタクリル酸と2-(トリフルオロメチル)アクリル酸の2種類を用いて、それぞれの量比を鋳型分子に対し06当量の範囲で変化させ、49種類のポリマーからなるライブラリーの調製を,自動化ポリマー合成・評価システムで行った。その結果、アトラジンのインプリントにおける機能性モノマーにはメタクリル酸が適しており、またアメトリンにおいては2-(トリフルオロメチル)アクリル酸が適することが明らかとなった。この結果は、これまでに確立されている手法による実験結果と合致するものであり、ポリマー合成・評価ロボットの作製が可能であることが示された。平成12年度は,蛍光をもつシンコニジシ(CD)をモデル認識対象分子とし、CDインプリントポリマーライブラリーの合成を行い、評価の迅速化を目的として,ポリマーへのCDの結合を蛍光マイクロプレートリーダーを用いて定量することを検討した。結合量と蛍光強度の関係より、結合量-蛍光強度の間には直線関係があり、マイクロプレートリーダーを用いた蛍光測定により結合量を見積もることが可能であることが示された。また、従来10時間掛かったポリマー評価を数秒で行うことが可能になり,評価の迅速化も達成された。本研究では、モレキュラーインプリンティング(MI)法のための自動化ポリマー合成・評価システムを構築し、系統的に自動合成されたMIポリマーライブラリーを評価することによって、認識しようとする鋳型分子に最適な機能性モノマー、溶媒、反応条件などを簡便かつ迅速に見出すコンピューター支援コンビナトリアルMI法を開発し、実際にその有用性をモデル化合物を用いて実証することを目的とする。モデル化合物としてトリアジン除草剤(アトラジン・アメトリン)を用い、機能性モノマーはメタクリル酸と2-(トリフルオロメチル)アクリル酸の2種類とした。これらの機能性モノマーを用いて、それぞれの量比を鋳型分子に対し06当量の範囲で変化させ、49種類のポリマーからなるライブラリーの調整を行った。すなわち、バイアル瓶中に機能性モノマー、架橋性モノマー、鋳型分子、溶媒、重合開始剤などをリキッドハンドラー(合成ロボット)で分注した後、紫外光を照射することによってバイアル瓶の底にポリマーを合成した。その後リキッドハンドラーを用いて、ポリマーから鋳型分子を除去した。各々のポリマーの結合能・選択性を評価するため、アトラジンをインプリントしたポリマー(49種類)及びアメトリンをインプリントしたポリマー(49種類)それぞれに、アトラジン溶液、アメトリン溶液を分注し、1時間放置した後、リキッドハンドラーに直結したフローインジェクション分析システムで、上清中の未結合鋳型分子の定量を行った。この結果は、これまでに確立されている手法による実験結果と合致するものであり、ポリマー合成・評価ロボットの作整が可能であることが示された。本研究では,モレキュラーインプリンティング法のための自動化ポリマー合成・評価システムを構築し,系統的に自動合成されたモレキュラーインプリントポリマーライブラリを評価することにより,認識しようとする鋳型分子に最適な機能性モノマー,溶媒,反応条件などを簡便かつ迅速に見出すコンピュータ支援コンビナトリアルモレキュラーインプリンティング法を開発し,実際にその有用性をモデル化合物を用いて実証することを目的とした。

昨年までに、コンビナトリアルケミストリーの概念を応用した、「コンビナトリアルモレキュラーインプリンティング法」の有用性を示せたので,本年度は、さらに効率の高い人工レセプター合成・評価システムを確立することを目的として、蛍光をもつシンコニジン(CD)をモデル認識対象分子とし、CDインプリントポリマーライブラリーの合成を行い、ポリマーへのCDの結合を蛍光マイクロプレートリーダーを用いて定量することを検討した。すなわち、CD溶液と反応させたポリマーについて蛍光マイクロプレートリーダーによる蛍光強度測定を行うと同時に、反応後の上清をフローインジェクション分析(FIA)することにより結合量を算出し、蛍光強度-結合量間にどのような関係があるのか比較し、新規のポリマー評価法として用いることができるか検討を行った。結合量と蛍光強度の関係より、CDの結合量が0-0.02・molの領域では、結合量-蛍光強度の間には直線関係があり、マイクロプレートリーダーを用いた蛍光測定により結合量を見積もることが可能であることが示された。一方、結合量が0.02・mol以上の領域では濃度消光がおき、蛍光強度の減少が見られた。他のポリマーについても同様の結果が得られた。また、従来10時間掛かったポリマー評価を数秒で行うことが可能になった。
ゲノム機能の基盤となる染色体・核構造の分子生物学

平成6年度発足重点領域研究の申請準備を研究代表者と5名の班員によるワーキンググループでの討議、班員全体による班会議での検討という形で進めた。また、11月30日に公開シンポジウム「細胞核の機能と分子間コミュニケーション」を東京で開催した。これらの検討の結果、申請領域名を「細胞核の機能構造と基盤分子間コミュニケーション」とし、「細胞核」の諸機能を支える核内構造ならびに核と細胞質間で進行する諸反応に関与する核構造の分子構築、空間配置、それらの構成因子の分子レベルの機能と相互作用の実体を明らかにすることを目的と定めた。そして、このような細胞核の機能構造をめぐって、世界の研究状況とも見較べ、本質的に重要かつ最も緊急性を要すると考えられる次の3項目を設定して、計画研究班を組織することとした。1)核内コンパートメントの空間配置と分子動態2)核機能発現の分子的基礎3)核・細胞質間コミュニケーション計画研究班員には、分子生物学、細胞生物学、分子遺伝学の異なった方法論と技術をもった優れた、比較的小数の研究者を厳選し、核の機能構造に関するin situ molecular biologyを重視した研究体制を組むこととした。これに加えて、公募研究として、萌芽的段階であっても、ユニークな発見や技術を基礎として新しい視点から研究を進めている研究者を積極的に取り込む必要性を確認した。本研究は、細胞核の機能構造を総合的に追究する初めての組織的研究であり、その成果は真核細胞機能の生物学的理解を深めるのみならず、分子医療や物質生産などの応用生命科学分野にも大きく貢献するものと考えられることから、総括班の設置と4年の研究期間を希望して平成5月2月に文部省に申請した。
行政改革を契機とした、行政組織法の基礎理論の構想

行政組織に必須の構成原理は民主主義原理であり、この原理のみを基にすると、ヒエラルヒー型の組織が望ましいことになる。しかし民主主義原理は行政組織の唯一の構成原理ではなく、次のように、他の構成原理も考慮すると、むしろ一定の独立性を持ち、それぞれの特性に適合した異なる組織形態を備える、行政組織が望まれることになる。第1に、権力の濫用を防止するという意味の古典的権力分立原理に基づき、独立性を認められる機関(警察および公安委員会等)。第2に、機能分立原理に基づき、分立が要請され始めた、政策の企画立案部門と実施部門、および過度の分離の反省により整備され始めた、省庁間調整機構。第3に、国が社会の自律的領域を保全する、またはそれと協働するという意味の法治国原理に基づく、自治組織、委員会、審議会等。第4に、国と他の社会組織に共通する効率性の要請を、主要な行動原理とすべき行政組織、すなわち公企業等。近年の行政改革は、以上のような行政組織の多様な構成原理および組織形態を意識させた点で、行政組織法理論も改革する重要な契機といえるが、独立行政法人を巡る議論のように、異なった構成原理を混同した議論も見られる。さらに目下、行政組織に対応する公務員の制度について、行政組織改革に対応する形で、官民あるいは産官学の交流を促進する法改革が進行している。そこで今後は、公務員の「全体の奉仕者」性を考え直し、公務員の交流と身分の多様化について、意義と限界を研究したい。1.研究の当初は、行政組織の類型として、ヒエラルヒー型/非ヒエラルヒー型という対比を念頭に置いていた。しかし研究の過程で、上位機関が下位機関を個別の事項について指揮監督する、従来のヒエラルヒー型組織と対比させて、上位機関が下位機関に最終的な目標を提示させた上で、包括的に資源(予算)を分配する、新しいタイプのヒエラルヒー型行政組織をモデル化するに至った。このような組織は、経済学、特に経営学の影響を受け、最近ドイツの地方公共団体において、「新制御モデル」として盛んに導入・実験されている。この新制御モデルについては、民主主義的正統性が下位機関にまで十分伝導されるか、行政に課される公共善実現の任務が効率性・競争の犠牲にされないか、十分注意する必要がある。しかし他方、従来のヒエラルヒー型の行政組織は、個別の行政作用のコントロールにこだわるが、上位機関による個別の行政作用のコントロールは現実には困難であり、その上、下位機関の創造性や柔軟性のポテンシャルを活用しないため、却って、民主主義的正統性を十分伝導できず、公共善を実現できていない。こうした点にも注意する必要がある。非ヒエラルヒー型組織の研究と合わせて、ヒエラルヒー型組織についても、来年度さらに考察を深めたい。2.今年度から公務員法の研究会に参加し、公務員組織の独立性、公務員の地位の斉一性や安定性を重視した従来の法制度を、官民交流、勤務形態の多様化が要請される中で、根本的に見直す必要性を認識した。これは、行政組織法の改革とパラレルに考察すべき問題であり、来年度は法制度改革の具体的な指針を提示できるよう研究を進めたい。
角膜上皮細胞の細胞特性を規定するコア転写因子群の同定

本研究ではヒト角膜上皮細胞の特異的機能を維持している転写因子ネットワークについて検討を行った。マイクロアレイを用いてヒト角膜上皮細胞で高発現している転写因子を146因子選定した。さらにiPS干渉スクリーニングを用いて、ヒト角膜上皮細胞維持に関与が高い転写因子を20因子にまで絞り込んだ。その中から誘導因子を組み合わせて新生児皮膚繊維芽細胞に遺伝子導入を行ったところ、角膜上皮特異的マーカーであるケラチン3、ケラチン12を含む角膜上皮関連遺伝子の遺伝子発現の増加を認めた。このことは誘導可能であった転写因子セットがヒト角膜上皮細胞の機能を維持する転写因子ネットワークを形成している可能性を示した。1.ケラチン12遺伝子の転写制御領域を同定する。ウサギ角膜上皮細胞を用いてケラチン12遺伝子の転写開始点上流のプロモーター領域を解析した。まずウサギゲノムからPCRにてケラチン12遺伝子の上流の配列を様々な長さで増幅してルシフェラーゼアッセイ用のベクターに組み込んだ。ウサギ角膜上皮より角膜上皮細胞を酵素処理にてシングルセルまで分散処理して播種し、4時間後にルシフェラーゼアッセイベクターを遺伝子導入した。結果、翻訳開始点より350bpまでの間に転写活性化領域が存在することが示唆された。内因性にケラチン12遺伝子を発現しない虹彩ストローマ細胞や経代培養したウサギ角膜上皮細胞ではレポーター活性が著しく低下することから初代培養細胞におけるリポーターアッセイのシグナルは確かにケラチン12遺伝子のプロモーター活性を反映しているものと推測された。ゲルシフトアッセイも試みたが、TATA boxへの強いシグナルが得られた以外には強いバンドシフトは得られず、一つの転写因子というよりも複数の転写因子によって転写制御されている可能性を示唆した。2.培養過程におけるケラチン12遺伝子の発現変化ウサギ角膜上皮細胞を酵素処理して播種し、様々なタイムポイントでケラチン12の発現量を調べた。その結果、ケラチン12遺伝子は分散後24時間でもとの3%まで発現が低下し、さらに48時間ではもとの1%以下にまで低下した。コンフルエント到達後にも2週間程度培養維持するともとの30%まで発現が回復した。分散処理によるケラチン12遺伝子発現量の低下はPD98059(ERK阻害剤)によってある程度キャンセルされた。よって分散処理によるMAP kinaseシグナル活性化が原因であると考えられた。このため、自殺遺伝子による細胞選択は困難であることが強く示唆された。前年度にiPS干渉法(Hikichi et al:PNAS, 2013)を用いて、強干渉した20因子をもとに、どの因子の組み合わせが重要かを詳細に検討した。誘導前の細胞はヒト胎児皮膚繊維芽細胞を用いた。20因子をすべて導入するとインテグリンα6陽性、CD71陰性の細胞が数%得られた。インテグリンα6陽性、CD71陰性の細胞はサイズが小さく、またN/C比も大きく、幹細胞の特徴をもった形態を示した。この細胞群の導入効率が最も高い組み合わせで転写因子を導入すると、ケラチン15陽性細胞を高効率で誘導できることを免疫染色で確認した。そしてこの誘導細胞はKi67陽性であり、Ncadherin陽性細胞であった。これはすなわち、角膜上皮幹細胞様の細胞が誘導できたことを意味する。次に、これらの細胞を羊膜上にまいて角膜上皮分化誘導をおこなった。角膜上皮最終分化マーカーはケラチン12あるが、様々な分化誘導法を行ってもケラチン12の発現を認めることはできなかった。そのため、今度はケラチン12を指標に転写因子の組み合わせを検討した。新生児皮膚繊維芽細胞に様々な転写因子セットを導入し角膜培地で培養すると、10日目に上皮様の形態を示す細胞群を確認した。そして、誘導細胞のほとんどはpan-cytokeratin陽性細胞で上皮細胞であることを確認した。またそのうちの一部は角膜上皮特異的タンパクであるkeratin3陽性、keratin12陽性細胞であった。また、それらの細胞の遺伝子発現レベルをqRT-PCRで確認すると、keratin3, keratin12以外にも、ALDH3A1, TKT、CDH1, keratin15の発現が上昇していた。一方で、繊維芽細胞マーカーであるVIMの発現は誘導細胞で低下していた。このことから、繊維芽細胞における転写因子セットの強制発現によって、keratin12陽性細胞の誘導、すなわち角膜上皮細胞のダイレクトリプログラミングに成功した。角膜上皮細胞のコア因子の同定のためのスクリーニングのために、shRNAライブラリーを作成する予定であったが、様々な状況を勘案し、iPS干渉法(Hikichi et al:PNAS, 2013)を用いることとした。

まずマイクロアレイで、角膜上皮細胞を結膜上皮細胞、ES細胞、心筋細胞、皮膚繊維芽細胞の遺伝子発現レベルと比較し、角膜上皮細胞で高発現している転写因子、146因子を候補コア転写因子とした。それらの候補因子を1つずつ、Oct3/4、Sox2、KLF4、MYCとともに角膜上皮細胞に遺伝子導入を行い、iPS細胞へのリプログラミングの阻害効果を検討した。iPS干渉法を始める前に、角膜上皮細胞からiPS細胞へのリプログラミング効率について検討し、0.61.0%の効率で安定して角膜上皮細胞からのiPS化が可能であるプロトコールを確立した。次にiPS干渉法を行い、角膜上皮細胞からのiPS化効率を30%にまで低下させる因子を20因子同定した。強くiPS干渉した20因子を様々に組み合わせて、新生児繊維芽細胞に遺伝子導入を行い、角膜上皮細胞への分化転換が可能かどうかを細胞形態、遺伝子発現レベルにおいて検討した。いくつかの転写因子セットでは繊維芽細胞から上皮細胞様の形態に変化し、E-cadehrinの発現上昇を確認した。さらに、その中からp63α、Keratin15の発現が上昇している細胞群を同定した。今年度計画した2つの項目のうち、ひとつについては完了した。もう一つについては別の実験で、ケラチン12遺伝子の発現がトリプシン処理による分散処理や、長期間の培養によって著しく低下することがわかり、そのため自殺遺伝子による選択を行うと残存している細胞においてもケラチン12遺伝子の発現が低下することになり、選択は極めて難しいと判断された。25年度が最終年度であるため、記入しない。約2000個ある転写因子の中から146因子にまで絞り込むことができ、さらにiPS干渉法によって20因子にまで絞り込むことができた。そして、それらの転写因子セットを導入することで繊維芽細胞から少なくとも上皮系への分化転換を可能とした。ケラチン12遺伝子は細胞の置かれた状況などによって発現量が著しく変化するため、当初に考えていた方法では目標の達成は難しいと判断される。siRNAによるloss of functionのアプローチではなく、コア転写因子候補の強制発現によるgain of functionのアプローチへの変更を考えている。20の候補転写因子から最適な転写因子セットを絞り込むために、様々な組合わせで繊維芽細胞に遺伝子導入を行い、角膜上皮細胞への遺伝子プロファイルの再現を検討する。繊維芽細胞から角膜上皮細胞への分化転換はまだ成功しておらず、培養条件、培養期間、転写因子セットの組み合わせ、遺伝子導入時期、導入遺伝子の量比などの検討が必要である。また分化転換された細胞集団を濃縮するためにセルソーターを用いて検討する。