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日本古代における市司の経済的機能-京職財政との関わりを中心に-

本年度は、正倉院文書から「市司」の経済的機能を考察することを目的として、主に写経所帳簿の分析を行った。東京大学史料編纂所は、『正倉院古文書影印集成』(八木書店、1988)で刊行されていない、「続々修」の写真帳を所蔵しているので、今年はほぼ毎日、東京大学史料編纂所に通った。膨大な写経所帳簿のうち、まず「布施申請解案」(経師などの給料を造東大寺司に請求する文書の案文)の整理を行った。その際、それぞれの断簡の接続関係の考察、断簡の年代の推定、他の帳簿(「告朔解案」「上秩帳」など)との比較を行った。その結果、例えばこれまで数種類の布施申請解案が存在し、それぞれの支給基準が異なっていたため、布施支給基準は不明とされてきた宝亀年間の布施支給基準の変遷をあきらかにすることができた。また帳簿に記載される経師数や写経巻数などの検討から、『大日本古文書』十人ノ二五六に収められる「続々修25帙4裏<2・3>」の断簡が、六ノ一三〇の断簡(続修後集三十(23)裏)と接続することがあきらかになった。さらに「布施申請解案」と「上帙帳」(経師たちが提出した手実を貼り継いだもの)を比較することで、奉写一切経所は、上帙帳をもとに布施申請解案を作成していたこと、そして「布施申請解案」に名前のない経師にまで、作業の実態にあわせて、布施を支給していたことをあきらかにした。これらの成果については、すでに論文「宝亀年間の布施申請解案の考察」としてまとめており、今後投稿する予定である。今後は、奉写一切経所財政と東西市の関わりについて検討し、「市司」の役割をあきらかにしたい。本年は、五月に「京戸に関する一試論」を『日本律令制の構造』にて公表し、これまで京の居住者と捉えられてきた「京戸」が、「京職の戸籍に附される人々」であったこと、「京戸」は本来、多様な階層を含み、王権の近くにいるべき存在として位置づけられていたことを指摘した。そして長岡・平安両京への遷都以降、下級官人の京への移貫が進んだことにより、「京戸」が特権的な身分になったことを論じた。また本年度は律令制研究会において、『唐令拾遺』『唐令拾遺補』における唐関市令前半部分の復原の再検討を担当した。「関」については、唐関市令第三条が関の通過方法の規定であることから、日本令3条の対応令文より後に規定されていた可能性が高いことを指摘した。また「貿易」については、近年発表された榎本淳一氏の論文「律令貿易管理制度の特質-日唐関市令の比較を中心として-」で提示された、関市令貿易管理制度関連条文の日唐令文の対応関係を、『唐令拾遺補』の対応関係と比較・検討した。そして榎本氏は、具体的な交易禁止品を列挙するという点において、唐関市令第四条が日本令6条に対応するとしたが、一方は皇帝が蕃客に与える回賜品、一方は兵器であることから、この対応関係は考えにくいこと、また唐令第四条と日本令9条が対応しないとの指摘も、両条とも蕃客への賜物への規定であることから、対応関係にあると考えた。さらに榎本氏は日本令6条に唐令四条、日本令8条に唐令補四条を対応させたことから、唐令の排列を「四条・補二条・補四条・五条・日本令9条の対応令文」とするが、私見では、唐令四条の後に補四条が続くと考え、排列は「補一条・補二条・四条・補四条・五条」であると考えた。本年は、関市令前半部分を担当したため、主に「関」と「貿易」が中心になったが、今後は、日唐における東西市の運営・管理規定の意図とその実態を明らかにしたいと考える。平成十六年度は、八世紀の正倉院文書にあらわれる物品の価格を、パソコンに入力する作業を重点的に行った。まず、その作業の前提として、平成十六年度科学研究費で、近年出版された写経所関係の書籍、山下有美著『正倉院文書と写経所の研究』、栄原永遠男著『奈良時代写経史研究』、同氏著『奈良時代の写経と内裏』、東野治之著『正倉院文書と木簡の研究』等を購入し、さらに雑誌掲載論文を収集することで、最新の研究を把握し、写経の経緯や、写経所の運営や実態の把握を行った。そして入力作業をする上では、『大日本古文書』掲載文書の考察、特に年代未詳の文書の年代特定や、重複文書の削除、案文と正文の対応関係を把握するとともに、数々の物品の名称の考察と、写経所内での使用用途を検討し、さらにその単位や数量の分析を行った。また写経所の購入物品の物価調査とともに、写経生によって売却された物品の価格も含めて登録した。物品によっては、価格が数日おきに追えるものも存在し、極めて短時間の変動を見ることも可能である。また中には同一物品に対して、物価が短期間に著しく上昇する等の興味深い例が存在するが、詳細な分析は、データの収集が終了した後の課題としたい。まだ中途であるが、データ数はすでに二〇〇〇件を超えている。

また平成十六年十二月に、平成十六年度科学研究費にて第二十六回木簡学会に参加し、平成十六年に出土した木簡の情報を得た。木簡に記載された物品の価格を分析する上で、非常に有益であった。物品の価格の入力作業が終了した後は、八世紀における、それぞれの物品の価格変動の経緯を明らかにし、さらに新銭発行の影響や、新銭・旧銭の関係等を考察したいと考える。本年度の、物品価格のデータ収集は、そのための基礎的作業である。本年度は、正倉院文書から「市司」の経済的機能を考察することを目的として、主に写経所帳簿の分析を行った。東京大学史料編纂所は、『正倉院古文書影印集成』(八木書店、1988)で刊行されていない、「続々修」の写真帳を所蔵しているので、今年はほぼ毎日、東京大学史料編纂所に通った。膨大な写経所帳簿のうち、まず「布施申請解案」(経師などの給料を造東大寺司に請求する文書の案文)の整理を行った。その際、それぞれの断簡の接続関係の考察、断簡の年代の推定、他の帳簿(「告朔解案」「上秩帳」など)との比較を行った。その結果、例えばこれまで数種類の布施申請解案が存在し、それぞれの支給基準が異なっていたため、布施支給基準は不明とされてきた宝亀年間の布施支給基準の変遷をあきらかにすることができた。また帳簿に記載される経師数や写経巻数などの検討から、『大日本古文書』十人ノ二五六に収められる「続々修25帙4裏<2・3>」の断簡が、六ノ一三〇の断簡(続修後集三十(23)裏)と接続することがあきらかになった。さらに「布施申請解案」と「上帙帳」(経師たちが提出した手実を貼り継いだもの)を比較することで、奉写一切経所は、上帙帳をもとに布施申請解案を作成していたこと、そして「布施申請解案」に名前のない経師にまで、作業の実態にあわせて、布施を支給していたことをあきらかにした。これらの成果については、すでに論文「宝亀年間の布施申請解案の考察」としてまとめており、今後投稿する予定である。今後は、奉写一切経所財政と東西市の関わりについて検討し、「市司」の役割をあきらかにしたい。
糖転移酵素C2GnTによる絨毛細胞の浸潤機序の解明と治療への応用

糖転移酵素C2GnTは、絨毛癌細胞株、絨毛癌及び侵入奇胎組織では強発現していたが、胞状奇胎では低発現であった。次に、絨毛癌細胞を用いてsiRNAを遺伝子導入することによりC2GnTの発現を抑制して実験を行った。C2GnT発現抑制により、遊走能及び浸潤能が抑制された。さらにC2GnTの発現抑制により、細胞外基質であるfibronectin, Collagen I, Collagen IVへの接着も抑制された。また、血管内皮細胞HUVECへの接着も抑制された。糖転移酵素C2GnTの機能の究明は、絨毛細胞悪性化メカニズムの解明につながると考えられる。臨床検体を用いた絨毛性疾患及び胎盤組織におけるC2GnTの発現を検討した。胞状奇胎、侵入奇胎及び絨毛癌での発現量の変化を確認し、本酵素が絨毛性疾患の悪性化や胎盤形成(EVT浸潤)に関与する分子となり得るかを検討した。1、患者からのインフォームドコンセントを得て集積した絨毛性疾患(胞状奇胎10例、侵入奇胎4例、絨毛癌8例、PSTT3例)より組織切片を作成した。抗C2GnTポリクローナル抗体を用いてC2GnTの免疫組織染色を施行し、絨毛癌で発現が強い傾向にあることを確認した。2、絨毛癌細胞株Jar, Bewo, JEG-3, CC1, CC3, CC4, CC6およびEVT細胞株HTR-8/SVneo、さらに絨毛性疾患組織と胎盤検体の一部から蛋白およびmRNAを抽出し、それぞれウエスタンブロットおよびRT-PCRにて発現量を評価した。絨毛癌細胞株、絨毛癌組織においてC2GnTの蛋白、mRNAは強発現していた。また、細胞株の培養上清におけるregular hCGとセリン結合型H-hCG値を測定するH-hCG値を測定した。絨毛癌細胞株Jar, Bewo, JEG-3のmRNA発現強度とH-hCGのhCGにおける割合は相関していた。3、上記結果より、C2GnTが絨毛性疾患の悪性化に関与していると考えられたため、C2GnTの機能解析を行うために発現抑制モデルを作成した。絨毛癌細胞株JarにC2GnT siRNAを導入し、C2GnTの発現量をウエスタンブロットで解析し、発現が抑制されていることを確認した。C2GnTの機能解析を行うために発現抑制モデルが必要であり、絨毛癌細胞株JarにC2GnT siRNAを導入した。これらのsiRNA導入細胞株におけるC2GnTの発現量のスクリーニングをウエスタンブロットで解析し、発現が抑制できていることを確認した。2、C2GnT発現抑制Jar細胞のin vitroでの機能解析上記で得られた細胞モデルのin vitroにおける増殖能、遊走能、及び浸潤能を増殖アッセイ(MTS assay)、運動能アッセイ(トランスウエルチャンバー法)、及び浸潤アッセイ(マトリゲルトランスウエルチャンバー法)にて評価した。コントロールsiRNA導入細胞と比較したところ、C2GnT発現を抑制した細胞では増殖能に変化はなかったが、遊走能、浸潤能が抑制された。さらにFibronectin, Collagen I及びCollagen IVがコーティングされた96 well plateを用いて細胞外基質への接着能を評価した。Fibronectin, Collagen I及びCollagen IVへの接着能はC2GnT発現抑制により有意に低下した。siRNAを用いたin vitroでの機能解析を行うことができ、今後のin vivo実験につながる結果を得た。絨毛性疾患及び胎盤組織におけるC2GnTの発現を検討した。臨床検体を用いて、免疫染色を行った。絨毛癌及びPSTTでは、胞状奇胎に比較して2GnTの発現は増強していた。また、絨毛癌細胞株Jar, Bewo, JEG-3, CC1, CC3, CC4, CC6およびEVT細胞株HTR-8/SVneo、さらに臨床検体の絨毛性疾患組織と胎盤検体の一部から蛋白およびmRNAを抽出し、それぞれウエスタンブロットおよびRT-PCRにて発現量を評価したところ、絨毛癌細胞株でC2GnTは強発現していたが、正常胎盤および胞状奇胎では発現が弱かった。また、細胞株の培養上清におけるregular hCGとC2GnTが付加する糖鎖が修飾されたhCGであるH-hCGを測定した。絨毛癌細胞株JarにC2GnT siRNA遺伝子導入を行い、C2GnT発現抑制が及ぼす機能変化を解析した。増殖能はMTSassayで、運動能をトランスウェルチャンバー法で、浸潤能をマトリゲルトランスウェルチャンバー法で評価した。運動能は変化はなかったが、C2GnT発現抑制により、運動能および浸潤能は抑制された。また、Fibronectin, CollagenI, Collagen IVへの接着能はC2GnT発現抑制により有意に低下した。siRNAを用いたC2GnT発現抑制細胞を用いて、血管内皮への接着能を確認した。HUVECへの接着はC2GnT発現抑制により有意に低下した。

次に、絨毛癌細胞を用いてsiRNAを遺伝子導入することによりC2GnTの発現を抑制して実験を行った。C2GnT発現抑制により、遊走能及び浸潤能が抑制された。さらにC2GnTの発現抑制により、細胞外基質であるfibronectin, Collagen I, Collagen IVへの接着も抑制された。また、血管内皮細胞HUVECへの接着も抑制された。糖転移酵素C2GnTの機能の究明は、絨毛細胞悪性化メカニズムの解明につながると考えられる。平成26年度に予定していた絨毛性疾患組織切片のレクチン染色は、トマトレクチン抗体の購入が遅れたため行うことができなかったが、平成27年度予定のC2GnT siRNA作成を先に始めることができたため、研究の進行としてはおおむね順調に進展している。婦人科腫瘍絨毛性疾患C2GnT発現抑制した絨毛癌細胞株Jarを用いて機能解析を行う。また他の絨毛癌細胞株にもsiRNAを導入して実験を行う。
肝癌エピゲノム異常の多様性を形成するヒドロキシメチルシトシン修飾異常の解明

肝癌のメチル化プロファイルより、癌特異的な異常高メチル化と低メチル化、およびこれによって形成される4つのサブグループが明らかとなったが、肝癌における異常低メチル化の意義はわかっていない。そこで、我々はTET1高発現肝癌において、シトシンメチル化およびヒドロキシメチル化の網羅的プロファイリングを行った。その結果、ゲノムワイドにヒドロキシメチル化が癌特異的に分布することが明らかとなった。TET1の阻害によって肝癌細胞の増殖が抑制された。このメチル化シトシンの酸化酵素であるTET1はがん関連遺伝子のエピゲノム異常を介して細胞増殖を促進している可能性が考えられた。本研究の目的は、肝癌にみられる異常メチル化の生成メカニズムとその意義を、近年同定されたDNA脱メチル化経路の観点から明らかにすることである。肝癌における新たなエピゲノムの制御異常を解明することは、肝癌発癌過程における分子生物学的機序の理解につながるだけでなく、このパスウェイを標的とした治療法の開発など、臨床応用にも重要な意味をもつ。そこで、本研究では、ヒドロキシメチルシトシン(以下、hmC)を定量的かつゲノムワイドに検出できる系を確立したうえで、具体的に以下のことを明らかにすることを目的とする。初年度(平成25年度)1)肝癌組織のどの程度の領域にhmC修飾がみられるか。正常肝臓組織との比較において、異常なhmC修飾領域はどのような遺伝子にみられるか。発癌母地である肝硬変の段階からhmC修飾に変化がみられるか。癌組織のTET1発現レベルは、異常なhmC修飾の程度と関連しているか。2) mC修飾の分布とはどのような関係にあるか。特に、正常肝臓組織と比較して異常低メチル化状態にある領域と関連しているか。CpGアイランドを有するプロモーター領域との関連はどうか。また、遺伝子の発現状態に対する影響はみられるか。次年度以降(平成26年度以降)3) TET1の発現上昇を示す肝癌細胞株で、TET1遺伝子の発現を抑制、あるいはTET1の酵素活性を阻害した場合に、どのような遺伝子にシトシン修飾(mCおよびhmC)状態の変化が見られるか。シトシン修飾に変化がみられる領域に、ヒストン修飾には変化が見られるか。また、標的となっている遺伝子の発現は変化しているか。4)上記のようなTET1の機能阻害により、細胞増殖や細胞形態などの癌細胞株の特性に変化はみられるか。1)肝癌臨床組織には、どの程度異常なhmC修飾領域が存在するか。2)hmC修飾は、メチルシトシン(以下、mC)修飾の分布や遺伝子発現に影響を与えているか。3)mCをhmCに変換する酵素TET1の発現抑制あるいは、酵素活性を阻害することで、肝癌細胞の増殖活性を抑制できるか。本研究では、ヒドロキシメチルシトシン(以下、hmC)を定量的かつゲノムワイドに検出できる系を確立したうえで、以下のことを明らかにした。1) hMeDIP-seq法を肝癌細胞株および肝癌臨床組織で応用し、hmC修飾領域のプロファイルを作成した。高発現遺伝子のgenebody、特に転写開始点よりやや下流の領域およびエンハンサー領域に優位に存在するし、逆に低発現遺伝子周囲ではほとんど認めない。また、遠位エンハンサー領域に癌特異的なhmC修飾領域を認めた。2)メチルシトシン(以下、mC)修飾も高発現遺伝子のgenebodyに分布するが、転写開始点希望には集積は認めず、転写停止点付近にかけて増加する傾向がみられた。3)mCをhmCに変換する酵素TET1の発現抑制あるいは、酵素活性を阻害することで、肝癌細胞の増殖活性を抑制効果を認めた。発現解析とエピゲノム解析を比較することで、増殖にかかわる癌関連遺伝子がhmC修飾によって異常に活性化している可能性が示唆された。

肝癌組織および正常肝臓組織のhmC分布を明らかにし、異常なhmC修飾領域を有する遺伝子を同定した。発癌母地である肝硬変の段階からhmC修飾に変化が見られた。癌組織のTET1発現レベルは、異常なhmC修飾の程度と関連していた。mC修飾の分布とはプロモーター周囲において、明らかに異なる分布を認めた。gene bodyのhmC修飾は遺伝子の発現レベルに正に相関し、転写開始点近傍のmC修飾は負の相関を認めた。TET1の発現上昇を示す肝癌細胞株で、TET1遺伝子の発現を抑制した際に、hmCレベルの広範な低下がみられた。また、これに伴って癌細胞株の細胞増殖が顕著に低下したため、TET1の高発現とhmC異常修飾が癌細胞の悪性形質に関与している可能性が示唆された。肝臓病学TET1の高発現とhmC異常修飾が癌細胞の悪性形質に関与する候補領域を同定したため、この領域における転写制御メカニズムを詳細に検討する。また、この領域のエピゲノム修飾のヒト細胞における調節機構についても検討を行う。肝癌組織および正常肝臓組織のhmC修飾の分布を明らかにし、異常なhmC修飾領域を有する遺伝子を同定した。発癌母地である肝硬変の段階からhmC修飾に変化がみられた。2) mC修飾の分布とはプロモーター周囲において明らかに異なる分布を認めた。gene bodyのhmC修飾は遺伝子の発現状態に正に相関し、転写開始点近傍のmC修飾は負の相関を認めた。実験条件の最適化などにより必要コストが低減されたため、未使用額が発生した。TET1の発現上昇を示す肝癌細胞株で、TET1遺伝子の発現を抑制、あるいはTET1の酵素活性を阻害した場合に、どのような遺伝子にシトシン修飾(mCおよびhmC)状態の変化が見られるか。シトシン修飾に変化がみられる領域に、ヒストン修飾には変化が見られるか。また、標的となっている遺伝子の発現は変化しているか。などを検討する。上記のようなTET1の機能阻害により、細胞増殖や細胞形態などの癌細胞株の特性に変化はみられるかについても検討を行う。未使用額については、論文投稿を含む成果公表に必要な額に使用する。本年度は分子生物学実験が効率よく進行したため、当初の予定より物品使用が少なく終了した。26年度に必要分を追加購入を行う予定である。
系統樹にもとづく種間比較法による共進化と性的二型の解析

寄主植物と植食者の共進化,兵隊アブラムシを含む社会性昆虫における社会行動,性配分と性的二型について,系統樹を用いた種間比較による解析を進めた。寄主植物と植食者の共進化については,マメ科植物とマメゾウムシ類の関係を中心とし,両生物群の分子系統樹を作成した。次に寄主利用に関する野外調査により,植物種あたりの植食者側の種数では,分岐の古い2亜科の種子はマメ亜科より多い昆虫種を保有していたが,木本は草本より昆虫種数が多いという効果を除去すると分類群の効果はなくなった。植物の分布範囲等は中間スケールで昆虫種数が最大となったが,昆虫側の生理的適応や植物側の食害に対する防御の進化などに起因すると考えられる。また,アカシジミ属の分子系統解析に基づく単食性の進化と種分化過程の再検討やラン科植物と菌根菌の関係の種間比較による腐生性の進化の分析も行なった。性的二型の進化については,ミトコンドリアDNA上の遺伝子を用いたトンボ類の分子系統樹の作成がほぼ完了した。コドン座位によって塩基組成および置換率に偏りのある配列データであると考えられたため,各コドンポジションへの重み付けを伴う一般化最節約法を用いて系統推定を行なった。植物での性配分・性表現の進化に関しては,シンク-ソース関係を組み込んだ理論モデルの予測を独立対比法により検証し,予測と矛盾しない結果を得た。また,社会性昆虫の進化については、アリの女王数およびゴールを作るアブラムシに関しておもに研究を進めた。アリの女王数については、繁殖スキューの理論と生活史戦略によるモデルが異なった予測をもたらす。両者を識別するには,分岐関係がほぼ完全に明らかになる系統樹が必要であることがわかった。分析を支える方法の検討の結果,系統樹の枝の長さがわからず樹形のみがわかることがどの方法を採用するかを制約することが明らかになった。離散的データの取扱には十分な注意が必要であることもわかった。系統樹を用いた種間比較を集中的に取り組むテーマを設定して解析を進めた。合わせて,方法上の問題点についても検討した。今年度とくに集中的にとりくんだテーマについては以下の通りである。マメ科植物とマメゾウムシの寄生植物-植食者の系の共進化については,マメ科植物利用についてマメゾウムシ各種のニッチと群集構造が明らかになった。マメ科・マメゾウムシ科の双方の分子系統樹を作成するための試料の収集も進んでいる。トンボ類の性的二型については,形質の調査を約3分の2の種で終え,試料が得られている種での分子系統樹も作成した。両性花を着ける植物ではFisherの1対1資源投資比からメス側へと偏った資源投資がみられる。その理由について、送粉量・受粉量の確率的な変動を取り入れた資源投資モデルを開発し、進化的に安定な性投資比の予測ができるように分析を進めた。また,ユリ科植物等を用いて種間比較を行うこと準備をすすめた。社会性進化に関する血縁選択説の難題として昨今とりあげられているアリ類の多女王制について、生活史戦略の観点から再検討し、多女王制は世代時間の短縮を伴うために、密度非依存的な個体数制御のある個体群では有利になるという結果を得た。ここからは個体群密度と単女王制の相関という検証可能な仮説が得られた。

アブラムシ類に見られるコロニー防衛の進化については,構築中の系統関係を用いた予備的な検討から、兵隊アブラムシの産出は、必ずしも捕食者への適応ではなく、系統の制約による非適応現象が多いことが明らかになりつつある。兵隊アブラムシを含む社会性昆虫における社会行動,寄主植物と植食者の共進化,植物の繁殖戦略,動物における性的二型について,系統樹を用いた種間比較による解析を進めた。あわせて,とくに分岐点における祖先形質状態の復元方法や種間比較の基礎となる分子系統樹の作成の際の各コドンポジションへの重み付けなどの問題点についても検討した。寄主植物と植食者の共進化や動物における性的二型については,形質データはそろいつつあるが,系統関係の情報に不十分な点があった。また,メキシコ産ステビア属の種間の系統関係をITSで推定し、同種の有性型と無性型の枝の長さには差がなく無性型では弱有害遺伝子が蓄積され進化速度が速くなるという予測はあてはまらないこと,無性生殖は木本に比べ、多年草で進化しやすいという有意な傾向があることが明らかになった。後者は,木本ではパラサイト圧が高いために有性生殖が有利であるという仮説を支持するものである。分岐点における形質状態の推定には,最節約法に基づくものやブラウン運動に基づくものがある。系統樹の枝の長さがわからず樹形のみがわかる場合には,ブラウン運動に基づく方法ではデータから得られる情報量の減少がおおきいことがわかった。また,どれを使うかによって種間比較の結果が異なるのはどのような場合であるかについても検討した。植物の花や社会性の動物における繁殖の偏りや生存率のちがい,キンラン属植物と菌根菌の対応関係と腐生性の進化,アカシジミ属の分子系統解析に基づく単食性の進化と種分化過程の再検討など,系統樹を用いた種間比較が適用しやすい問題をリストアップし,使用可能な系統樹がすでにあるか,信頼できる形質データはそろっているかどうかなどの研究遂行上の問題点を分析・討論した。植物とそれをホストとする生物の共進化については,マメ科植物とこれを餌とする昆虫であるマメゾウムシ類の関係を中心に研究を行なった。植物種あたりの昆虫側の種数を見ると,まず分類群との関係では,分岐年代の早い2亜科の種子はマメ亜科より有意に多い昆虫種を保有していたが,木本は草本より昆虫種数が有意に多く,この効果を除去すると分類群の効果はなくなることがわかった。また,植物の分布範囲と植物の時間的・空間的分布がいずれも中間スケールで昆虫種数が最大となった。これは,昆虫側の生理的適応・地理的分散と植物側の食害に対する防御の進化に起因すると考えられる。また,この調査と並行して,マメ科植物ならににマメゾウムシの分子系統樹を作成した。また,ラン科植物と菌根菌の関係の種間比較から腐生性の進化を分析した。性的二型の進化については,トンボ類での解析の基礎となるミトコンドリアDNA上にコードされるチトクローム酸化酵素のサブユニットI領域(COI)を用いた分子系統樹の作成が数種を除いて完了した。コドン座位によって塩基組成および置換率に偏りのある配列データであると考えられたため,一般化最節約法を用いて系統推定を行なった。植物での性配分・性表現の進化に関しては,シンク-ソース関係を組み込んだ性的な配分の理論モデルの予測を,すでに先行研究により判明していた系統関係を用いて,Felsensteinの独立対比法により検討した。また,社会性昆虫の進化については,アリの女王数およびゴールを作るアブラムシに関しておもに研究を進めた。
淋菌の感染細胞における細胞周期の分子機構と病原性に関する研究

淋菌感染細胞にて引き起こされるG1停止の普遍性について検討した。系統の異なる様々な株(MLST解析において)のG1停止能について確認した。宿主細胞はHeLa細胞を用いた。異なる40系統の菌株において、有意にG1期停止を起こした株はなかった。僅かに有意差が認められた2株についてサイトカイン産生の量的変化を調べたが、菌株間における有意差は認められなかった。これらのことは淋菌感染細胞におけるG1停止は、淋菌感染時における一般的な現象ではなくある特定な株によって引き起こされる可能性を示唆した。淋菌感染症は、世界で年間6300万症例と推定される性感染症である。近年、我か国でも、その罹患者の低年齢化が指摘されている。淋菌の宿主細胞に対する影響という視点では、未だに未解明な部分が多い。本研究では、宿主細胞に対する影響を淋菌感染細胞の細胞周期停止という視点より解明をめざしている。先にJonesらの報告で淋菌感染HeLa細胞は感染24時間後にサイクリンB1、サイクリンD1、サイクリンEの量的な減少を伴い、G1停止をおこす事が示された。しかし、淋菌と同属である髄膜炎菌感染HeLa細胞ではG1停止は認めらなかった。これは、近縁種における宿主細胞に対する反応性の相違性を示唆しており、G1停止は淋菌特異的な現象と考えられる。淋菌感染症の病態を考えた上で特続感染が持つ意義は完全に理解されていないが、宿主細胞の細胞周期停止という視点より研究を推進する事は新しい知見を提供することが期待できる。本年度は、淋菌感染によって引き起こされるG1停止の普遍性について検討するために、系統的に異なる(MLSTによる解析)20株についてG1停止能につて検討した。宿主細胞は、HeLa細胞を用いた。G1期停止の確認はcdk2リン酸化状態を指標にウエスタンブロットにて確認した。感染条件はMOI=100を中心に検討した。G1期停止の陽性コントロールは、thymidine処理した細胞を用いた。今回調べた20株では、有意にG1期停止を起こした株はなかった。この事は、Jonesらが実験に用いた菌株と本研究に用いた株が全く異なる(系統)であるか、もしくは実験条件が異なっていた事が考えられる。次年度では、初年度と異なる系統による菌株を用いた実験の再試及び感染条件の検討を行なう。その結果得られたG1停止能を示す株を用いて、当初の計画に基づいた淋菌感染細胞におけるG1期停止のメカニズムの解明に努める。Jonesらの報告(The FASEB Journal. 2007 ; 21 : 345-355)で淋菌感染HeLa細胞は感染24時間後にサイクリンB1、サイクリンD1、サイクリンEの量的な減少を伴い、G1停止をおこす事が示されているが、そのメカニズムについては不明な部分が多い。淋菌感染症の病態を考えた上で持続感染が持つ意義は完全に理解されておらす、宿主細胞の細胞周期停止という視点で研究を推進する事は新しい知見を得ることが期待できる。昨年度までに、淋菌感染によって引き起こされるG1停止の普遍性について検討するために、系統的に異なる(MLSTによる解析)株についてG1停止能について検討した。その結果、検討した20株では、有意にG1期停止を起こした株は認められなかった。この事は、Jonesらが実験に用いた菌株と本研究に用いた株が全く異なる系統であるか、もしくは実験条件が異なっていた事が推察された。本年度は、初年度と異なる感染条件の検討及び系統別の淋菌感染時おけるサイトカイン産生の量的変化の解析を行った。感染条件をMOI=10, 50, 100, 500とし、感染時間は1時間から3時間まで一時間単位で検討した。感染に用いた淋菌株は、前年度の20株と更に系統の異なる20株について検討した。G1期停止の確認はcdk2のリン酸化状態を指標にウエスタンブロットにて確認した。サイトカイン産生の量的変化はELISAにょりIL-8, TNF-α及び、BMP-RIAを調べた。その結果、新たに検討した20株中の2株は他の18株と比べて僅かにcdk2のリン酸化状態に差がみられた。しかし、G1期停止の陽性コントロールとしてthymidine処理した細胞と同程度の株は今回検討した40株の中にはみられなかった。また、上記の2株を含む系統の異なる10株について淋菌感染時におけるサイトカイン産生の量的変化を調べたが、菌株間における有意差は認められなかった。
CRISPR/Cas9を用いたゲノム編集による新しい歯周組織再生分子標的薬の探索

CRISPR/Cas9を用いて歯周組織構成細胞のゲノムを編集することにより、歯周組織再生機構に重要な役割を担う遺伝子の同定・単離を試みた。まず、歯根膜機能に様々な役割を担っている遺伝子(PLAP-1、Decorin、Biglycan)を機能欠失させるsgRNA-CRISPR/Cas9発現プラスミドを構築した。歯根膜細胞株(MPDL22)を用いた遺伝子導入実験の結果、各遺伝子特異的sgRNA-CRISPR/Cas9発現プラスミドの導入効率が低いことが明らかとなった。そこで、複数のゲノム領域編集を容易にするため、現在、PLAP-1遺伝子ノックアウトマウスからの歯根膜細胞株樹立を行っている。歯周組織の恒常性維持遺伝子特異的sgRNAの設計:歯周組織の恒常性維持に重要な機能を果たしている細胞外基質タンパク(ECM)に関連する既知遺伝子群(PLAP-1、Decorin、Bigycan)のゲノム配列に特異的な遺伝子ノックアウト用のsgRNA合成プライマーを設計した。設計時には、アプリケーションにより、sgRNAの非特異的な効果(バイスタンダード効果)が起きにくい部位を選択した。同プライマーを用いたPCR法により、各遺伝子特異的sgRNAシークエンスを増幅した。次に、ゲノム編集タンパクであるCRISPR/Cas9発現用プラスミドに同sgRNAを組み込み、一つのプラスミドにてCRISPR/Cas9と遺伝子特異的sgRNAを同時に発現出来るよう遺伝子組換えを行った。歯根膜細胞におけるゲノム編集:まず、293細胞に同プラスミドを電気的遺伝子導入法を用いてトランスフェクションしたところ、ほぼ100%の遺伝子導入効率が観察された。同上プラスミドをマウス歯根膜細胞株(MPDL22)を用いて遺伝子導入し、培養後、蛍光顕微鏡にて組換えタンパクであるOFP(オレンジ蛍光タンパク)の発現を観察したところ、遺伝子導入効率の低下が認められた。現在は、遺伝子導入効率の向上と、同一の細胞におけるゲノム配列に対して、PLAP-1、Decorin、Biglycanのゲノム領域に対して同時にゲノム編集を行い、同遺伝子群の発現を抑制するダブルノックアウト、トリプルノックアウト解析を試みている。マウス歯根膜細胞株における遺伝子導入効率の低下が観察され、現在、遺伝子導入法の至適条件の検討を行っている。本研究は、第3世代ゲノム編集ツールであるCRISPR/Cas9エンドヌクレアーゼを用いて歯周組織構成細胞の遺伝子をin vitroにおいて機能欠失させることにより、歯周組織の恒常性維持や再生機構に関わる遺伝子群を解析し、それら遺伝子・分子群をターゲットとした歯周組織再生分子標的薬の開発に繋げることを目的とした挑戦的萌芽研究である。新しい歯周組織再生分子標的薬の候補分子として、歯根膜組織の恒常性維持、骨芽細胞・破骨細胞分化、および炎症反応に重要な役割を担っている細胞外基質タンパク(ECM)に着目した。ECMのなかでも、歯根膜組織において高い発現が認められるPLAP-1、Decorin、Biglycanに焦点を向け、同分子をコードするゲノム領域をCRISPR/Cas9により遺伝子編集することを試みた。その結果、同一細胞においてダブルおよびトリプルのゲノム編集が起きる確率は、非常に低いことが明らかとなった。そこで、まず、PLAP-1遺伝子KOマウスの歯根膜組織から、歯根膜細胞株(単一クローン株)を樹立し、同細胞株において、DecorinおよびBiglycanのゲノム編集を行うことを計画した。68週齢PLAP-1KOマウスの上顎臼歯を抜歯し、歯根表面の歯根膜組織をスケーリングにより採取した。同組織をコラゲナーゼ処理することにより、構成細胞を遊離させ、同細胞を96マイクロウエルに単離播種した。培養培地に細胞増殖誘導作用を持つFGF-2(10ng/ML)を添加し、長期間、単離培養し、増殖してきた細胞を選択的に継代培養することでPLAP-1KOマウス歯根膜細胞株の樹立を試みた。マウス歯根膜細胞株への遺伝子導入効率の向上と、同一の細胞におけるゲノム配列に対して、PLAP-1、Decorin、Biglycanのゲノム領域に対して同時にゲノム編集を行い、同遺伝子群の発現を抑制するダブルノックアウト、トリプルノックアウト解析を試みる計画である。歯周病学細胞培養実験に使用する細胞培養用のプラスティック器具の購入を計画していたが、当該の実験は、次年度以降に行うこととなったため。次年度に実施する細胞培養実験に必要な細胞培養用プラスティック器具の購入に使用する計画である。
肺癌細胞の無限増殖を抑制する新たな分子標的の策定

肺癌細胞株の網羅的発現解析により、肺癌の無限増殖を抑制する新たな分子標的候補を絞り込むと同時に、遺伝子導入により、その評価に有用な正常と不死化がん細胞の中間に位置すると考えられる気道上皮細胞を樹立した。これらは癌幹細胞にも有効な無限増殖を抑制する新たな抗癌剤の開発への展開が期待された。さらに、p16/RB経路の不活化のないテロメラーゼ活性化が幹細胞に由来する肺癌のマーカーである可能性を示した。1、気道上皮がん化不死化規定遺伝子の解析不死化規定遺伝子候補gene G発現ベクターを作製しテロメラーゼタンパク(TERT)発現ベクターとともに正常気道上皮に導入し、薬剤選択により安定クローンの樹立を試みた。TERT・SV40EA導入延命トランスフォーム気道上皮細胞ではgene Gは全クローン高発現しており、SV40+gene G共導入クローンも得られ10^6まで増殖したが、延命のみで不死化には至らず、gene GにTERT誘導能はないと考えられた。2、気道上皮がん化不死化抑制遺伝子の解析不死化抑制遺伝子候補gene S発現ベクターを不死化トランスフォーム肺線維芽細胞に導入し強制発現させたところ、クローン化効率が低下し、得られたクローンも早期にアポトーシスに陥ったが、不死化正常肺線維芽細胞に導入してもクローン化効率も形質も変化せず、gene Sはトランスフォーム細胞特異的不死化抑制遺伝子である可能性が示された。別の不死化抑制遺伝子候補gene D発現ベクターを複数の肺がん細胞株に導入し強制発現させたところ、細胞が腫大して扁平化し、増殖抑制が認められる株が存在した。この遺伝子は、肺癌細胞株の一部でメチル化されており、癌抑制遺伝子である可能性が考えられた。3、肺腺癌のテロメラーゼ活性・TERT発現、p16/RB経路不活化解析より、肺腺癌においては不死化のポテンシャルをもつ"幹細胞"由来の癌と、分化した体細胞からp16/RB経路不活化を経てがん化した癌が存在する可能性が新たに得られた。ゆえに、不死化抑制遺伝子の作用も両者で異なることが予想されるため、肺腺癌細胞株を追加購入し、がん化、不死化、増殖に関わる遺伝子の発現レベルおよび増殖速度を解析した。今後は、候補遺伝子の作用をそれぞれの群で評価してゆく必要性が考えられた。1、気道上皮不死化細胞の樹立テロメラーゼタンパク(TERT)発現ベクターとSV40early antigenを共導入しても気道上皮は不死化しないとされてきたが、150PDL以上増殖し続けるクローンを樹立した。colony fbrmation assay withssoft agarにより足場依存性は維持されていることを確認し、不死化しているが完全にがん化はしていないモデル細胞が確立し、不死化がん細胞形質を規定する遺伝子の同定にさらに有用なクローンと考えられた。2、気道上皮不死化規定遺伝子の探索がん細胞の普遍的不死化規定遺伝子候補として抽出した遺伝子群を発現するベクターを構築し、テロメラーゼ活性化分裂寿命延長気道上皮(足場依存性維持、テロメラーゼ活性陽性、造腫瘍性なし)に導入し、それぞれの安定強制発現クローンを得た。それらの機能解析を行い、遺伝子G強制発現細胞は足場依存性の消失は得られないものの発現レベルに一致する増殖促進が得られ、この遺伝子は悪性度増強に関わる可能性が示された。3、肺腺癌臨床検体および細胞株において、p16/RB経路を不活化しなくてもテロメラーゼ活性・TERT発現を有する不死化がん細胞となり得る、生来不死化のポテンシャルをもつ“幹細胞"由来の癌の存在が得られた。一方、扁平上皮癌および小細胞癌では不死化がん細胞はすべてp16/RB経路を不活化していることが判明した。以上、昨年度の研究成果と合わせ、肺癌の無限増殖を抑制する新たな分子標的候補を絞り込むと同時に、その評価に有用な不死化気道上皮を樹立することができ、これを用いてさらに同定する予定である。肺腺癌の治療戦略においては“幹細胞"由来癌とそうでない癌を区別して対応すべきであり、p16/RB経路の不活化のないテロメラーゼ活性化が前者の指標となると考えられた。
フランス革命期の美術館政策に見る中央集権化の実態―地方美術館の創設と美術品の移動

フランス革命期にパリのルーヴル宮に創設された共和国美術館(後に中央美術館、ナポレオン美術館)の展示には、封建制のしるしの排除をはじめとする革命の論理を読み取ることができる。だが、1801年のシャプタル令により各地方に地方美術館が創設され、中央から地方に美術品が送られるネットワークが形成されると、中央の展示の論理は地方美術館との相関によって作られるものとなっていく。美術館における展示は、中央・地方とも、必ずしも政治性に支配されていたわけではなく、美的配慮や地域性も考慮された。また展示方法等は革命によって必ずしも刷新されたわけではなく、伝統や慣習の残存も認められた。研究者はこれまで、パリのルーヴル美術館の創設の経緯に関わる研究を行ってきた。それらの成果を踏まえ、本研究は1793年8月10日の美術館開館以降、フランス革命政府が共和国の理念の浸透に向けてフランス全土でどのような文化政策を展開していくかを、美術館をめぐる政策を中心に検討するものである。とりわけ、これまで手薄だった地方における美術政策の実態に注目し、中央と地方の関係を検討することで、最終的には文化の中央集権化がどのように進められたかを明らかにすることを目指している。研究期間の初年度である本年度は、次年度以降の本格的な研究に向けた準備を整える期間と位置づけ、先行研究の収集と整理と精査、刊行済みの一次史料の入手、各地方および地方美術館に関わる一次史料の特定とアクセスの可能性についての予備調査を行うことを優先させた。これらの調査を手持ちの研究文献のほか、日本国内の図書館(一橋大学附属図書館、日本大学芸術学部図書館等)およびインターネットにて行い、今後の本格的な現地調査において閲覧すべき史料が、史料番号のレベルまで確認された。一方、先行研究を精査する段階で、地方美術館の中にはアンシァン・レジーム期に前身を持つものや、すでに計画されていたものが存在することが分かり、時代を多少遡って、それぞれの地方における美術活動のあり方を把握する必要が生じた。また美術館の創設に際しての美術品の移動についての調査に着手したところ、これまでには指摘されてこなかった政治性も浮かび上がってきた。とりわけ中央の共和国美術館の最初の展示作品を詳細に分析してみると、旧体制を否定したとは到底言いがたい特徴が確認された。当初の予想以上に旧体制との繋がりに注目することが重要であることが理解されたため、今後の調査はこの点を意識しながら進めていきたい。1、昨年度の研究によって、パリのルーヴル美術館の開館(1793年8月10日)は、王権停止一周年記念という政治性を多分に帯びながらも、展示においては、否定したはずのアンシァン・レジームから継承した面も確認されたため、まずはこの点の精査に注力した。フランス国立図書館や国立美術史研究所図書館、ルーヴル美術館資料室等で、文献資料調査と作品実見調査を行い、開館時の展示作品の図版と資料を収集し、来歴を明らかにした。その結果、538点の展示絵画中481点分の図版が得られ、残りの作品の半数については作品情報を得ることができた。これらについて、主題、作家、流派、大きさ、来歴等の観点から分析し、開館時の展示作品として選択された理由とその意味について考察を深めた。その成果は、平成28年度中に複数の学会や研究会において報告される予定である。2、フランス国立図書館や国立美術史研究所図書館における文献資料調査で、ブザンソン、ボルドー、カン、ディジョン、リール、ナンシー、オルレアン、カンペール、レンヌ、サン=テティエンヌ、ヴァランシエンヌの各地方美術館について、設立の詳細な経緯に関する資料を収集した。これによって、昨年度浮かび上がった、各地方におけるアンシァン・レジーム期の美術活動と革命期の美術館設立との関係も把握できるようになった。さらに、革命期からナポレオン期にかけての美術品の移動に関する資料を得ることができた。地方の事例の中では、ディジョンが、パリに先行して、革命前から美術館設立への動きを見せている重要な事例であり、今後、いっそう踏み込んだ研究を行う対象の候補である。その他の地方についても、収集した資料の分析を進め、政治が美術品の移動、美術館の設立とどのように連動しているか(あるいはしていないか)を考察し、注目すべき地方の事例を絞って、一次史料の調査へと進めていきたい。1、ルーヴル美術館開館時の展示については、当時の記念物委員会や美術館委員会等の議事録からは作品の選定理由が明らかにならず、作品をとりまくさまざまな側面を分析して考察する必要が生じた。また、今日では特定できなくなっている作品もあり、図版の入手にも労力と時間を費やした。これらの点に予想外の時間がかかったが、当該課題の研究には必要な段階であり、成果は小さくないと考える。2、また平成27年度中に地方美術館での調査を開始する予定であったが、上記の点に時間を取られたことと、国際情勢の変化をかんがみて、春期休業中の渡航調査を控えたことから着手できなかった。しかし、パリの図書館での文献調査で、昨年度には入手できなかった各地方美術館の歴史に関する資料を収集できた。それによって、昨年度に新たな課題として浮かび上がった、革命前の地方における美術活動の把握もある程度可能となったため、今後の大きな足がかりを作ることはできたと考える。28年度は、以下の二つの柱に沿った研究活動を行った。1、ルーヴル美術館開館時の展示に関する研究前年度までに行っていたルーヴル美術館開館時(1793年8月10日)の展示絵画作品に関する作品の基本情報と図版の収集を取りまとめた。

前年度までに見つかっていなかった情報を追加収集することができ、全538点の絵画のうちの497点分の図版を集め、残りの作品(破壊、焼失13点分を含)についても大方の情報が判明した。これらの作品の来歴や移動の経緯の調査、作家やジャンル、主題などの分析を行い、展示全体の特徴を導き出した。さらに、これらの調査を基に、当時の展示理論や美術館関係委員会の議論なども踏まえて、美術館の開設場所となったルーヴル宮のグランド・ギャルリーにどのように展示されたかの展示再現案を作成した。これらの成果を日本西洋史学会大会(ポスター発表)および関西フランス史研究会にて報告した。2、地方美術館への作品移管に関する研究夏のフランスでの調査において、革命政府下で行われた中央から地方への作品の移管に関する資料を収集した。移管政策全体に関する研究について調査し、概要をまとめたうえで、その中でも作品数において重要な位置を占めていたディジョンとリヨンに焦点を絞り、個別研究の調査を行った。調査の過程で、ディジョンについてはコート=ドール県文書館に、リヨンについてはリヨン市立文書館に関係史料があることが判明し、史料番号も特定できたため、各文書館を直接訪問して史料を調査した。ディジョンは美術館が改装工事中で叶わなかったが、リヨン美術館では主要な移管作品の実見調査も行うことができた(ただし開室日時の関係で、リヨン美術館の資料室での調査は叶わなかった)。これらの成果は、29年度に行う調査と合わせてとりまとめたい。27年度まではルーヴル美術館開館時の展示に関する研究に時間を費やさざるを得ず、地方美術館の研究調査まで手が回らなかった。しかし調査が進んで情報が蓄積されたことで、28年度に開館時の展示の全体像が把握でき、成果を取りまとめることができたことで、地方美術館の研究も進めることができた。地方といっても、フランス革命期に美術館が開設されたすべての地方を一度に扱うことは困難であり、対象を絞る必要があったが、今回、ディジョンとリヨンという二つの地方美術館に狙いを定め、主要な先行研究と基礎史料を収集できたことで、29年度にそれらの分析に専念する準備が整った。研究課題の解明にとっての大きな一歩である。ディジョンでもリヨンでも、文書館で一次史料を調査できたことは大きな成果ではあるが、いずれも体系的な形で保存されていたわけではない。今後、美術館での保管史料や中央のパリ側の史料と照合させていく必要がある。とはいえ、現地の史料の特定までに時間を要したため、これらの作業は次年度の課題としたい。平成29年度は、以下の二つの柱に沿った研究活動を行った。1、ルーヴル美術館の開館時の展示に関する研究前年度までに行っていたルーヴル美術館(共和国美術館)開館時(1793年8月10日)に展示された絵画作品に関して、フランス国立美術史研究所およびルーヴル美術館絵画資料室、フランス国立図書館にて追加の文献・作品資料調査を行い、前年度までに見つかっていなかった情報をさらに収集することができた。フランス国立美術史研究所の図書館の大幅な開架が進んだため、これまで未見であった各作家のカタログ・レゾネや展覧会カタログ、各地の美術館の所蔵作品カタログを網羅的に調査することができた。
タ-ピリジン架橋ピレン分子のゲスト添加に伴う配座変化に関する研究

1.テルピリジンの錯形成に基づく配座変化を蛍光スペクトルの変化として取り出す目的で,2,2'-6'2"-テルピリジンの6位と6"位を1-ピレニル基で置換した化合物(1)を合成した.また,対照化合物として6,6"-ジメチル置換テルピリジン(2),及び6位に1-ピレニル基を置換したビピリジン(3)の合成を行った.2.吸収・蛍光スペクトルより,1の基本的な電子構造を理解した.1は3と同様のスペクトルを示し,基底状態,励起状態で分子内でのピレン部位間に相互作用はない.また,標準蛍光物質として硫酸キニ-ネを用い,1の相対蛍光量子収率が0.59という比較的大きい値であることを得た.3.種々のアルカリ,アルカリ土類金属イオン,遷移金属イオンを添加し,種々スペクトル測定より錯形成について測定した.アルカリ,アルカリ土類金属イオンの添加ではそのスペクトルに変化は現れなかったが,2価の銅イオンやニッケルイオンの添加において,420nmに新たな吸収がみられ,蛍光スペクトルの消光が見られた.また,通常,2,2'-6'2"-テルピリジンと1:2錯体を形成するルテニウムイオン添加において,吸収・蛍光スペクトルに影響が現れなかった.4.電子アクセプター分子であるDDQを有機ゲストとして用い,ピレン部位との電荷移動相互作用による,エキシプレックス形成を試みたが,大きなスペクトル変化は見られなかった.5.テルピリジン部位との酸・塩基反応後の陰イオン・陽イオン間の水素結合相互作用による包接体形成を期待し,ベンゼンスルホン酸を添加し,各種スペクトル測定を行った.吸収スペクトルでは420nmに新たな吸収が得られ,蛍光スペクトル測定においてモノマー発光の消光とエキシプレックス発光と考えられる520nmの新たなる発光を示した.この発光強度は対照化合物である3でも得られたが,その強度は1の方がより顕著であった.6.会合形態について調査するため,ゲストでベンゼンスルホン酸のパラ位の置換基を変化させ,その立体効果の違いによるスペクトル変化を測定した.顕著な違いが現れなかったことより,ゲストを挟み込んだサンドイッチ構造をとっている可能性は低いことが確認された.1.テルピリジンの錯形成に基づく配座変化を蛍光スペクトルの変化として取り出す目的で,2,2'-6'2"-テルピリジンの6位と6"位を1-ピレニル基で置換した化合物(1)を合成した.また,対照化合物として6,6"-ジメチル置換テルピリジン(2),及び6位に1-ピレニル基を置換したビピリジン(3)の合成を行った.2.吸収・蛍光スペクトルより,1の基本的な電子構造を理解した.1は3と同様のスペクトルを示し,基底状態,励起状態で分子内でのピレン部位間に相互作用はない.また,標準蛍光物質として硫酸キニ-ネを用い,1の相対蛍光量子収率が0.59という比較的大きい値であることを得た.3.種々のアルカリ,アルカリ土類金属イオン,遷移金属イオンを添加し,種々スペクトル測定より錯形成について測定した.アルカリ,アルカリ土類金属イオンの添加ではそのスペクトルに変化は現れなかったが,2価の銅イオンやニッケルイオンの添加において,420nmに新たな吸収がみられ,蛍光スペクトルの消光が見られた.また,通常,2,2'-6'2"-テルピリジンと1:2錯体を形成するルテニウムイオン添加において,吸収・蛍光スペクトルに影響が現れなかった.4.電子アクセプター分子であるDDQを有機ゲストとして用い,ピレン部位との電荷移動相互作用による,エキシプレックス形成を試みたが,大きなスペクトル変化は見られなかった.5.テルピリジン部位との酸・塩基反応後の陰イオン・陽イオン間の水素結合相互作用による包接体形成を期待し,ベンゼンスルホン酸を添加し,各種スペクトル測定を行った.吸収スペクトルでは420nmに新たな吸収が得られ,蛍光スペクトル測定においてモノマー発光の消光とエキシプレックス発光と考えられる520nmの新たなる発光を示した.この発光強度は対照化合物である3でも得られたが,その強度は1の方がより顕著であった.6.会合形態について調査するため,ゲストでベンゼンスルホン酸のパラ位の置換基を変化させ,その立体効果の違いによるスペクトル変化を測定した.顕著な違いが現れなかったことより,ゲストを挟み込んだサンドイッチ構造をとっている可能性は低いことが確認された.
日和見感染菌におけるシデロフォアの病原学的意義とその作用機構に関する研究

日和見感染菌であるアシネトバクター・ヘモリティカスは鉄欠乏状態に応答してシデロフォアとしてアシネトフェリンを産生する。本研究において、アシネトフェリンの生合成及び輸送に関与する遺伝子群としてacbABCDとactBCADをそれぞれ同定した。これらの遺伝子群はオペロンを形成しており、acbAの上流に存在するFurboxを介して鉄制御を受けることを示した。各種変異株と相補性試験の結果からAcbAがアシネトフェリンの生合成に関与していることを明らかにし、その生合成経路について示した。さらに、ActAがアシネトフェリンに対する外膜受容体として、また、ActDがアシネトフェリンの排出に関与していることを明らかにした。Acinetobacter baumanniiは抗生物質多剤耐性化が問題となっている日和見感染菌の一つである。本菌の生存、増殖にも鉄(イオン)は必須であり、鉄欠乏ストレスに応答してシデロフォア(三価鉄輸送キレーター)を産生する。本菌臨床分離株の解析から数種類のシデロフォアを産生していることが明らかとなり、多様な鉄獲得機構の存在が推定された。本研究では感染成立の過程、特に宿主細胞への本菌の定着や増殖段階におけるシデロフォアの役割とその分子機構を解析し、本菌感染症におけるシデロフォアの病原学的意義の解明を目的とする。今年度はA. baumannii臨床分離株が産生するシデロフォアの構造決定を目的として以下の検討を行った。慢性腎炎患者より単離されたA. baumannii臨床分離株H277-I-aを鉄欠乏条件下培養し、培養上清中のシデロフォアについて各種呈色反応を行った。Csaky assayは陽性であったが、Arnow assayは陰性でありcatechol構造を持たないhydroxamate構造を持つシデロフォアの存在が示唆された。本シデロフォアの構造を決定するために、その単離を試みた。0.15μM塩化鉄を含む合成培地で37°C、36時間培養し、培養液4Lから遠心分離で培養上清を得た。培養上清をpH6.8に調整後Dowex1x8を加え、撹拌後、樹脂を3Mギ酸に浸し、再ろ過液を水洗液と合わせて減圧下、60°Cで濃縮乾固した。得られた残渣を水に溶解し、BioGel P-10カラムで分離した。5mM過塩素酸溶液で呈色する画分を集めて濃縮乾固した。このフラクションはsilica gel60 TLCで塩化鉄溶液で呈色する2つのバンドを生じた。またHPLC分析により2つの活性フラクションに分割できた。精製純度を上げるために、分画方法についてさらに条件検討を行っている。Acinetobacterbaumanniiに代表されるAcinetobacter属菌は抗生物質多剤耐性化が問題となっている日和見感染菌の一つである。本菌の生存、増殖にも鉄(イオン)は必須であり、鉄欠乏ストレスに応答して三価鉄キレート分子であるシデロフォアを産生する。本研究ではAcinetobacter属菌などの日和見感染菌による感染成立の過程で細菌の定着や増殖段階におけるシデロフォアの役割とその分子機構を解析し、日和見感染症におけるシデロフォアの病原学的意義の解明を目的とする。Aclnetobacter属菌のうちA.haemolyticusATcc17906は鉄欠乏条件に応答してシデロフォアacinetoferrinを産生する。本菌よりacinetoferrinの生合成及び輸送に関与すると推測された約13.1kbpの遺伝子領域をクローニングし、全塩基配列を決定した。相同性検索の結果、acinetoferrinと構造が類似したrhizobactin1021の生合成酵素や外膜受容体と相同性を示した。85kDaの鉄制御外膜タンパク質のN末端アミノ酸配列はactA遺伝子から推測されるアミノ酸配列10残基と完全に一致し、actA変異株の解析からActAがferricacinetoferrinに対する受容体として機能していることを明らかにした。また、AcbAはrhizobactin1021の生合成酵素RhbCと相同性を示し、acbA変異株の鉄欠乏条件下での培養上清からはacinetoferrinは検出されなかったことからAcbAはacinetoferrin生合成酵素として機能していると考えられた。クローニングした8つのORFsはRT-PCRによる解析からオペロンを形成しており、acbA上流に存在するプロモーター領域からの転写は鉄制御を受けることを明らかにした。Acinetobacter属菌は抗生物質多剤耐性化が問題となっている日和見感染菌の一つである。