hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
一般化した分極イオンモデルの構築とその応用

溶融塩、電解質溶液、ガラスなどのイオン性物質の構造と性質を記述する目的で、第一原理計算に基づいた分極イオンモデルの開発が進められている。本研究では、特に多価イオンを含む溶融塩の構造や性質の記述に支配的な影響を及ぼす双極子分極のモデルを主要な酸化物ガラスに適用してその限界を明らかにするとともに、より高次の分極および斥力の異方性を導入することによってこれらの限界が克服できることを明らかにした。これによって、より広範なイオン性の物質群に対して分極イオンモデルが有用であることが示された。また、イオン性の酸化物全般の記述に必要なパラメーターの最適化によってモデル関数の構築とモデルの一般化が達成された。純粋なホウ酸の結晶状態、すなわち常圧相ならびに高圧相の2種類の平衡構造について第一原理計算を行い、系の全エネルギーを評価した。また同じ結晶構造に、分極イオンモデルを適用し、第一原理計算によるエネルギー値をなるべく再現するよう、ポテンシャルパラメーターを最適化した。このとき、分極イオンモデルには、引力項に従来の双極子相互作用のみを考慮した分極イオンモデル、引力項のイオン分極に四重極相互作用を追加導入したモデル、さらに引力項の四重極相互作用に加えて斥力項に異方分極性を導入したモデルの、計3種類を用いて、それぞれ平衡構造で最適化したポテンシャルパラメーターを用いて結晶の体積を変化させた場合のエネルギーを評価し、第一原理計算によるエネルギー値の体積変化の結果と比べて、その再現性を比較した。その結果、引力項に従来の双極子相互作用のみを考慮した分極イオンモデルでは、常圧相ならびに高圧相ともに第一原理計算によるエネルギー値を十分に再現できなかったが、引力項のイオン分極に四重極相互作用を追加導入したモデルでは常圧相のエネルギー値が良く再現できるようになること、さらにはこれに加えて斥力項に異方分極性を導入することによって高圧相のエネルギー値までもが十分な精度で第一原理計算によるエネルギー値を再現できるようになることが明らかになった。一方、酸化ナトリウムと酸化アルミニウムを含む珪酸ガラスについては、分極イオンモデルを用いた分子動力学計算を実行し、幅広い組成において、最近のNMR実験による非架橋酸素を中心とした種々の三原子クラスター(すなわちNa-O-Siなど)の存在割合の組成依存性を極めて高い精度で再現できることを明らかにした。リチウムおよびセシウムホウ酸ガラスについて、第一原理計算に基づいて新たに得られた分極イオンモデル関数を用いて分子動力学計算を行った結果、電荷を部分イオン性として定式化することで4配位ホウ素の割合が実験値と比較可能な組成領域において良い一致を示す結果が得られた。また、B-O-Bの角度分布は120度から130度付近にピークが観測され、六員環の形成する上でより妥当な構造が得られていると結論した。一方、3配位ホウ素と4配位ホウ素の各ユニット中に存在する非架橋酸素の割合では、アルカリ酸化物の濃度が増加するにつれて、4配位ホウ素ユニット中に存在する割合が増加した。また、90度付近にも小さなピークが観測され、これらの系においても四員環構造が生成していると推測された。四員環について構造を詳しく解析した結果、角度分布、配位数から四員環中のホウ素の4配位構造が正四面体から大きく歪んでいることが示された。さらに、四員環を構成するO-O、B-B間距離の分布をみると全粒子と比較し平均して10%程度近い位置にあることがわかった。以上の結果から四員環構造はMD計算による人工的構造であることが示唆された。そこで、四員環を生成する要因として冷却速度の可能性を検討した結果、ガラス転移点直上の温度において、より長時間、緩和のための時間発展を行うことで四員環の生成する割合が減少する傾向が判明した。以上の結果から、得られた相互作用関数は有望であるものの、その妥当性を確立するために、ガラス転移点直上での構造緩和を進めることが重要であると結論した。純粋な珪酸ガラス、および酸化ナトリウムと酸化アルミニウムを混合した珪酸ガラス、また酸化カリウムと酸化アルミニウムを混合した珪酸ガラスについて、それぞれ第一原理計算を行い、その結果に基づいて、組成に依らずに適用可能な分極イオンモデル(PIM)と異方的斥力モデル(AIM)をそれぞれ構築した。それらを用いて分子動力学計算を行い、高温状態から冷却させてガラス構造を作成した。まず得られた構造を用いて静的構造因子を評価し、X線および中性子回折実験の結果と比較したところ、どの組成でも実験値を良く再現することができた。そこで各イオンの配位構造、特にガラスの主鎖を形成する酸素周りの構造について、X線および中性子回折実験やNMR実験に基づく解析結果と比較した。

その結果、結合距離は実験値よりもやや過大評価されているものの、その配位数、主鎖数、および酸素の結合種分布は実験値と良く一致を示した。特にAIMで得られた結合距離においては、実験値と同様の組成依存性が確認できた。またPIMでは、溶融状態や高圧下で現れる5配位珪素や5配位アルミニウムが一定量存在したが、AIMを用いた冷却緩和ではそれらの割合が有意に減少し、より実験結果の再現性が良くなった。また、それに応じてガラス中の非物理的な結合角分布が大きく減少したことから、異方的な斥力はガラスの冷却過程に重要な役割を果たすことが分かった。さらに、純粋な酸化チタンに対しても第一原理計算を実施して、PIMレベルのみではあるがモデルの構築を行った。その結果、結晶の多形に対する平衡構造を正確に再現することに成功した。以上の結果から、これらの主要な酸化物の相互作用関数の一般化を達成することができた。溶液化学、溶融塩化学ホウ酸の結晶について、広範な圧力状態で通用する一般性の高いポテンシャルモデルを構築できたと評価できる。また、珪酸ガラス混合系においては、現時点で非常に有望な相互作用関数が得られており、おおむね順調であると評価できる。ホウ酸ガラス系について、実験結果との比較において妥当性が示唆される相互作用関数を求めることができた。これをさらに確実にするために、今後さらにガラス転移点直上での長時間に及ぶ構造緩和を進めることが必要であるが、現時点で有望な相互作用関数が得られており、おおむね順調であると評価できる。今後は、ホウ酸ガラス混合系について、一般性の高い高度な分極イオンモデルを用いた分子動力学計算を実行し、NMRなどによる実験結果との比較を試みる。また、珪酸ガラス混合系についても、より幅広い組成へと分子動力学計算の適用を進めて、アルカリ金属イオンの拡散性の解明へと発展させて行く。今後はさらにガラス転移点直上での構造緩和を進めて、4員環のような人工的構造物の形成が減少することを確認する。また同様の手法を、ケイ酸ガラス系へ適用することを進めて、その普遍的有効性を確認する。この観点から、さらにアルミナを添加した系についても検討を進める。当初、研究協力者であるオックスフォード大学のMadden教授およびパリ第六大学のSalanne博士と研究打合せの旅費を計上していたが、25年度はSalanne博士が別の研究助成を利用してオックスフォード大学ならびに新潟大学を訪れて研究打合せを行なえることになったため、旅費としては改めて26年度に執行することが有効な活用につながると判断したため。また、高速演算装置に関しても、25年度に複数台購入するよりも、より計算負荷の高い演算を実行する予定の26年度に執行することが原価損失の観点から装置の有効活用につながると判断したため。26年度は、4ー5月期に高速演算装置を追加購入し、計算負荷の大きな演算の実行に役立てる。また、9月期にオックスフォード大学とパリ第六大学の訪問を通じて研究打合せを行い、研究の推進に役立てる。国際協力のための海外出張によってパリ第6大学のSalanne博士およびオックスフォード大学のMadden教授と結果について討議し、共同発表の準備を進める。長時間の構造緩和の計算のため、物品費によって高速演算装置1台を追加購入して活用する。
インターロイキン6の間脳下垂体卵巣系におよぼす影響

近年免疫系と神経内分泌との関連が注目されている。本研究はインターロイキン6(IL-6)の間脳下垂体卵巣系における関与を明らかにする目的で検討を加え、これまでに下記のことが明らかとなった。まず視床下部においてIL-6が産生されており、エストロゲンやTNE等で産生が促進されること、そしてIL-6投与によりGnRH分泌を促進すること等から性周期のフィードバック機構にIL-6を含むサイトカインのネットワークガ関与している可能性が示唆された。また、下垂体でIL-6が産生されTNFやインターフェロンで促進されること、IL-6と特異的に結合する受容体が存在することをレセプターアッセイ、免疫組織化学、分子生物学的手法を用いて明らかにした。さらに、IL-6がホルモン非分泌細胞、folliculo-stellate cell(FS細胞)で産生され、パラクライン的に下垂体細胞の増殖を促進している可能性について、FS細胞のcell lineや下垂体腫瘍細胞を用いて検討を加えた。その結果、IL-6はGH_3細胞のプロクラチン産生及び細胞増殖を促進した。また、FS細胞からのIL-6はcAMPを上昇させるVIPやPACAPの投与にて有意に亢進した。またエストロゲンがこれらの刺激を抑制する予備実験の成績も得られた。以上の成績より、IL-6がホルモン非分泌細胞であるFS細胞で産生され、IL-6はパラクライン的に下垂体細胞の増殖を促進している可能性が示唆された。免疫反応物質であるインタ-ロイキン6(ILー6)の視床下部への影響を中心に検討を加えた。すでに我々はラットの視床下部ニュ-ロンの初代培養系を確立しておりLHーRH分泌やド-パミンの分泌機構を検討するに有利な系を有している。まずILー6の視床下部LHーRH分泌を検討するに先だちLHーRHニュ-ロンの初代培養系を確立した。抗LHーRH抗体を用いてLHーRHニュ-ロンの存在を確認し,カルシウムイオノフォアを用いてLHーRHニュ-ロンからのLHーRH分泌を証明し、これらの実験系がLHーRHニュ-ロンからのLHーRH分泌を検討するのに適していることを初めて報告した。次いでこれらの実験系を用いてILー6のLHーRH分泌を促進することを明らかにした。またILー6が視床下部にて産生されていることならびに性ステロイド(エストラジオ-ル)がILー6産生を促進することも明らかにし、ILー6が性周期に関する視床下部調節に重要な役割を担ったいる可能性が示唆された。一方ILー6の産生を促進するとの報告のあるILー1やTNFーαが視床下部ILー6の産生およびLHーRHやド-パミン分泌にどのような影響をもたらすかも同時に検討を加えた。その結果TNFーαやILー1は視床下部よりILー6を産生させ、同時にLHーRH分泌に促進的に作用することが明らかとなった。一方TNFーαやILー6は視床下部ド-パミンには影響を与えなかった。さらにILー6の下垂体での作用についても若干の検討を加えた。すなわち下垂体の単離細胞の浮遊液を用いてILー6の受容体の存在を検討した。その結果受容体と放射性ヨ-ドでラベルしたILー6との間でのスキャッチャ-ドプロットは得られている。以上、今年度の研究によりインタ-ロイキン6が視床下部でのLHーRH分泌に関与していることが明らかになった。本年度は免疫反応物質であるインタ-ロイキン6(ルー6)の下垂体細胞における作用部位の決定を中心に展開した。すでに我々は下垂体でルー6が産生されていること、ルー6が下垂体細昶に作用してLHやプロラクチン分泌を促進していることを確認している。そこでまずヒト胎児において抗LH抗体、抗ルー6受容体抗体を用いて免疫組織化学的にLHとルー6受容体を二重染色した。

その結果ルー6の受容体がLH荘胞に存在することまたルー6産生細胞はLH細胞と共存しないことが判明し、パラクライン機構の存在が示唆された。またラット下垂体培養系においてレセプタ-解析を行なったところ単一の受容体の存在(Kd27×10^<-9>M、細胞あたり170個の結合部位数)を確認し、この受容体はルー1,ルー2そしてインタ-フェロンrとは結合しなかった。さらにマウスのルー6受容体のCDNAを用いてノフザンブロット解析を施行し、5.5kbのルー6R mRNAの存在を確認した。以上の成績より下垂体にはルー6と特異的に結合する受容体が存在することがわかった。また下垂体腫瘍細胞を用いてルー6の細胞増殖に及ぼす影響についても若干の検討を加えた。その結果ルー6は単にホルモン分泌を促進するのみならず下垂体腫瘍細胞の増殖をも促進する結果を得た。以上今年度の研究によりインタ-ロイキン6の受容体が下垂体細胞に存在し、この受容体はLH産生細胞上にみとめられルー6産生細胞とは共存しないことがわかった。このことから下垂体で産生されているILー6はパラクライン的にホルモン分泌細胞をコントロ-ルしている可能性が示唆された。近年免疫系と神経内分泌との関連が注目されている。本研究はインターロイキン6(IL-6)の間脳下垂体卵巣系における関与を明らかにする目的で検討を加え、これまでに下記のことが明きらかとなった。まず視床下部においてIL-6が産生されており、エストロゲンやTNF等で産生が促進されること、そしてIL-6投与によりGnRH分泌を促進すること等から性周期のフィードバック機構にIL-6を含むサイトカインのネットワークが関与している可能性が示唆された。また、下垂体でIL-6が産生されTNFやインターフェロンで促進されること、IL-6と特異的に結合する受容体が存在することをレセプターアッセイ、免疫組織化学、分子生物学的手法を用いて明らかにした。そこで今年度は、IL-6がホルモン非分泌細胞、folliculo-ste llate cell(FS細胞)で産生され、パラクライン的に下垂体細胞の増殖を促進している可能性について、FS細胞のcell lineや下垂体腫瘍細胞を用いて検討を加えた。その結果、IL-6はGH_3細胞のプロラクチン産生及び細胞増殖を促進した。またFS細胞からのIL-6はcAMPを上昇させるVIPやPACAPの投与にて有意に亢進した。またエストロゲンがこれらの刺激を抑制する予備実験の成績も得られた。以上の成績より、IL-6がホルモン非分泌細胞であるFS細胞で産生され、IL-6はパラクライン的に下垂体細胞の増殖を促進している可能性が示唆された。
江戸時代人の歯からのDNA抽出と解析の試み

前年度は,主に現代人の歯を用いて,歯からDNAが抽出できるのか,また抽出したDNAからどのような遺伝子の解析が可能なのかについて,技術的に検討した.今年度は実際に江戸時代人骨の歯の試料を用いて,DNAの抽出と解析を試みた.青森県八戸市新井田遺跡から発掘された人骨から,異なる個体のものと判断できる36本の歯の試料を得た.前年度に,現代人の試料で試みた方法と同様に,それぞれの歯根部を切断して,破砕し,EDTA溶液中にてしばらく脱灰した後,プロテイナーゼ処理して,フェノール法にてDNAを抽出した.土中にて長時間を経た試料からの抽出であることもあり,DNAを定量分析したり,電気泳動での確認は不可能であったが,ミトコンドリアDNA(mtDNA)のPCR増幅は,36個体中30個体で可能であった.増幅したのは,mtDNAの中で長さの変異のみられる,領域V(non coding region V)を含む120塩基の部分である.2回の増幅により,予想される長さの断片を得ることが確認された.長さの変異は,9塩基対の欠失として報告されているが,今回増幅が認められた30個体中,3個体で増幅された断片が短く,欠失の変異があると考えられた.性別判定は,Y染色体特異的反復配列の部分をPCRで2回増幅し,断片の有無を確認した.36個体中,断片が検出されたのは10個体であった.X染色体中に1箇所しかない配列の増幅による,X染色体の検出は未だに成功していない.細胞中,多くのコピー数のあるmtDNAや,反復回数の多いY染色体特異的配列ではPCR増幅が可能であったが,ゲノム中に1箇所しかないDNA部分の増幅については,さらに技術的な改良が必要と思われる.日本人の遺伝的構成の時代的な変化を探ることを目標として,まず時代的に比較的新しい江戸時代の試料を対象にDNAの抽出と解析を試みるのが本研究の目的である.今年度は,予備実験として,現代人の材料を用い、歯からのDNA抽出の試行と抽出されたDNAを用いての解析実験を行った.歯は,青森県および東京都の歯科医院で,歯科治療のため,抜歯されたものである。抽出には,歯根部の一部を切断して使用することにしたが,これは,歯冠部が,計測値や特徴などで形態人類学的な重要な情報を有するためであり,極力そのままでの保存を心掛けている.切断した歯根部は,液体窒素で凍結後,乳鉢内で乳棒を用いて破砕し,EDTA溶液に1日浸して,脱灰後,プロテナーゼKを反応させ,フェノール抽出によりDNAを抽出した.1本の歯の歯根部よりμg単位のDNAが抽出され,PCR法による解析には十分な量が回収されていることがわかった.得られたDNAを用いて,ミトコンドリアDNAのV領域の長さの変異,制限酸素HincIIによるRFLPsを,それぞれPCR法を応用して検出したが,どの試料でも良好な結果を得ることができた.また,性別判定やALDH2のタイピング,ABO血液型のタイピングなど,核DNAを用いての解析も試み,結果を得ている.来年度は,江戸時代人の歯よりのDNA抽出とその解析を行う予定である.青森県八戸市の新井田古館遺跡から出土した人骨の歯を用いる予定である.調査にあたっては,八戸市教育委員会と新潟県企画部の藤田尚氏の協力を仰いでいる.前年度は,主に現代人の歯を用いて,歯からDNAが抽出できるのか,また抽出したDNAからどのような遺伝子の解析が可能なのかについて,技術的に検討した.今年度は実際に江戸時代人骨の歯の試料を用いて,DNAの抽出と解析を試みた.青森県八戸市新井田遺跡から発掘された人骨から,異なる個体のものと判断できる36本の歯の試料を得た.前年度に,現代人の試料で試みた方法と同様に,それぞれの歯根部を切断して,破砕し,EDTA溶液中にてしばらく脱灰した後,プロテイナーゼ処理して,フェノール法にてDNAを抽出した.土中にて長時間を経た試料からの抽出であることもあり,DNAを定量分析したり,電気泳動での確認は不可能であったが,ミトコンドリアDNA(mtDNA)のPCR増幅は,36個体中30個体で可能であった.増幅したのは,mtDNAの中で長さの変異のみられる,領域V(non coding region V)を含む120塩基の部分である.2回の増幅により,予想される長さの断片を得ることが確認された.長さの変異は,9塩基対の欠失として報告されているが,今回増幅が認められた30個体中,3個体で増幅された断片が短く,欠失の変異があると考えられた.性別判定は,Y染色体特異的反復配列の部分をPCRで2回増幅し,断片の有無を確認した.36個体中,断片が検出されたのは10個体であった.X染色体中に1箇所しかない配列の増幅による,X染色体の検出は未だに成功していない.細胞中,多くのコピー数のあるmtDNAや,反復回数の多いY染色体特異的配列ではPCR増幅が可能であったが,ゲノム中に1箇所しかないDNA部分の増幅については,さらに技術的な改良が必要と思われる.
神経細胞の分化調節におけるリン脂質代謝の役割

イノシトールリン脂質(PI)のD-3位水酸基をリン酸化するPI3-キナーゼ(PI3-K)は、その調節サブユニットに存在するSrc homology2領域を介して、増殖・分化因子受容体あるいは非受容体型キナーゼによってチロシンリン酸化された基質蛋白質と結合する。先に我々は、真菌代謝産物のワ-トマニンがPI3-Kを特異的に阻害すること、また走化性因子などのG蛋白質連関型受容体の刺激を介した速い細胞応答にもPI3-Kが関与することを見い出した。本研究では、NGFによるPC12細胞の分化におけるPI3-Kの関与に加えて、チロシンキナーゼ型とG蛋白質連関(7回膜貫通)型という異なるタイプの受容体刺激によって活性化されるPI3-Kについて検討し、以下の知見を得た。1.PC12細胞において、NGFやスフィンゴミエリナーゼはPI3-Kを活性化し、突起進展を促進したが、両者の作用はともにワ-トマイニンと別のPI3-K阻害薬であるLY294002によって抑制された。2.インスリンと走化性因子の両者で無傷好中球を刺激した際には、相乗的なPI3-Kの活性化が観察され、2種の異なる受容体刺激の制御を受けるPI3-Kが生理的にも機能していることが示された。3.CHO細胞においても観察され得る上記の増強作用は、アクチン線維の再形成による膜ラッフリングの増大を伴った。4.ラット肝臓より種々のタイプのPI3-Kを精製して検討を加えた結果、チロシンリン酸化ペプチドとGβγによって相乗的に活性化される特性をもつPI3-Kは、βタイプを触媒サブユニットにもつファミリーであることが明らかにされた。
α７ニコチン受容体の経時的発現動態解析と炎症応答抑制機序の解明

α7nAChRは、海馬に多く発現し記憶を司るため、アルツハイマーの標的分子として着目されてきた。近年、α7nAChRはマクロファージ等の免疫担当細胞にも発現し、同受容体の活性化が炎症やアレルギー応答を抑制することが多数報告されており、α7nAChRは様々な疾患の病態生理機能を担う可能性がある。しかし、α7nAChRには良質な抗体がなく、発現解析に統一した見解がないため、報告の多くは現象論に留まっている。そこで、共同研究者の協力の下、α7nAChRにFLAG-tagを付加したレポーターマウスを作製し、抗FLAG抗体を用いてα7nAChRの発現解析を行った。申請者の所属する研究室では、術後イレウスに関する研究を長く行ってきた。術後イレウスは消化管筋層におけるマクロファージを主体とした炎症が主な病態であり、α7nAChR欠損マウスにおいて炎症が悪化するデータは既に得られていた。しかし、消化管筋層に存在するマクロファージにおけるα7nAChR発現の有無は、良質な抗体がないことから不明であった。そこで、レポーターマウスを用いて筋層マクロファージにおけるα7nAChR発現について蛍光免疫染色を用いて解析したところ、常在型マクロファージ・浸潤型マクロファージの両者においてα7nAChR発現が確認された。また、in vivoの病態モデルにおけるα7nAChRの機能解析も並行して行い、野生型マウス、α7nAChR欠損マウスの両者で肝臓の線維化モデルを作製したところ、α7nAChR欠損マウスで肝臓の線維化が緩和されることが明らかとなった。今後は、肝臓の線維化を担う肝星細胞、クッパー細胞などにおけるα7nAChRの発現と線維化シグナルへの関与をウエスタンブロットやreal-time PCRを用いて検討していく予定である。当初、第1年度では全身におけるα7nAChRの発現解析を行う予定であったが、FLAG-tagを用いた免疫染色およびFACSは良質な抗FLAG抗体を見つけられていないことから、難航している状況である。他研究機関からの助言もいただき、実験手法などの改善を試みている。その結果、前年度の終わりでは打開策が見えた。第2年度ではさらなる改良を重ね、全身における発現解析を完了させたい。また、第3年度に行う予定であった病態モデルに対するα7nAChRの機能解析を前倒しにして行っており、こちらが順調に進展している状況である。機能解析に関する今後の研究方針もすでに固まっている。この研究結果は新規性が大きく、より実験を重ね結果を深めていくことで、インパクトのある論文・学会発表として世に公表していきたいと考えている。以上を総合的に考慮すると、順調に進展しているという評価が妥当ではないかと考えられる。α7nAChRの発現解析においては、発現レベルがマウスの週齢を重ねるごとに減少しているという見解があり、第1年度では8-12週齢のマウスで発現解析を行っていたところ、第2年度では4週齢以下のマウスを用いて発現解析を行う。また、免疫染色のプロトコルにおける各段階の細かな条件設定(ホルマリン固定の時間や温度など)に関して第1年度にて改良を重ねたので、そのプロトコルを用いて解析していきたい。また、病態モデルにおけるα7nAChRの機能解析では、肝臓の線維化を担う肝星細胞、クッパー細胞などにおけるα7nAChRの発現と線維化シグナルへの関与をウエスタンブロットやreal-time PCRを用いて検討していく。第1年度の終わりでも本検討は行っていたのだが、肝星細胞、クッパー細胞などといった細胞の単離に成功していなかった。これは、肝臓からの単離段階における細胞の生存率の低さに依るものであった。この問題点は、単離に用いるコラゲナーゼの濃度、処理時間の改良により解決され、現在では高生存率で回収できるようになっている。今後は、これらの細胞を用いて線維化シグナルの分子メカニズムを追跡していく予定である。

また、in vivoの病態モデルにおけるα7nAChRの機能解析も並行して行い、野生型マウス、α7nAChR欠損マウスの両者で肝臓の線維化モデルを作製したところ、α7nAChR欠損マウスで肝臓の線維化が緩和されることが明らかとなった。今後は、肝臓の線維化を担う肝星細胞、クッパー細胞などにおけるα7nAChRの発現と線維化シグナルへの関与をウエスタンブロットやreal-time PCRを用いて検討していく予定である。当初、第1年度では全身におけるα7nAChRの発現解析を行う予定であったが、FLAG-tagを用いた免疫染色およびFACSは良質な抗FLAG抗体を見つけられていないことから、難航している状況である。他研究機関からの助言もいただき、実験手法などの改善を試みている。その結果、前年度の終わりでは打開策が見えた。第2年度ではさらなる改良を重ね、全身における発現解析を完了させたい。また、第3年度に行う予定であった病態モデルに対するα7nAChRの機能解析を前倒しにして行っており、こちらが順調に進展している状況である。機能解析に関する今後の研究方針もすでに固まっている。この研究結果は新規性が大きく、より実験を重ね結果を深めていくことで、インパクトのある論文・学会発表として世に公表していきたいと考えている。以上を総合的に考慮すると、順調に進展しているという評価が妥当ではないかと考えられる。α7nAChRの発現解析においては、発現レベルがマウスの週齢を重ねるごとに減少しているという見解があり、第1年度では8-12週齢のマウスで発現解析を行っていたところ、第2年度では4週齢以下のマウスを用いて発現解析を行う。また、免疫染色のプロトコルにおける各段階の細かな条件設定(ホルマリン固定の時間や温度など)に関して第1年度にて改良を重ねたので、そのプロトコルを用いて解析していきたい。また、病態モデルにおけるα7nAChRの機能解析では、肝臓の線維化を担う肝星細胞、クッパー細胞などにおけるα7nAChRの発現と線維化シグナルへの関与をウエスタンブロットやreal-time PCRを用いて検討していく。第1年度の終わりでも本検討は行っていたのだが、肝星細胞、クッパー細胞などといった細胞の単離に成功していなかった。これは、肝臓からの単離段階における細胞の生存率の低さに依るものであった。この問題点は、単離に用いるコラゲナーゼの濃度、処理時間の改良により解決され、現在では高生存率で回収できるようになっている。今後は、これらの細胞を用いて線維化シグナルの分子メカニズムを追跡していく予定である。
緑色レンサ球菌群の代謝物質の組織障害作用に関する研究

ヒト臍帯静脈内皮細胞(HUVEC)ないしはヒト単球、単球由来マクロファージを用い、ECPないしはS.Mitis加熱死菌体でこれら細胞を刺激し、刺激後の転写因子NF-χBの活性化を蛍光抗体法とゲルシフトアッセイ法で検討すると共に、培養上清中に出現するTNF-α、IL-β、IL-6の濃度をELISA法で測定し、また、mRNAの発現レベルを定量的RT-PCR法で測定した。その結果、ECPはHUVECを活性化せず、サイトカイン誘導能も認められず、むしろHUVECに対しては細胞障害性に作用した。また、単球、マクロファージに対してはNF-χBの直接的な活性化を介さず、上記のサイトカインの産生が誘導された。一方、加熱死菌体での刺激では単球、マクロファージのNF-χBは活性化され、次いで上記サイトカインのmRNAの発現とその産生を認めた。今回はヒト臍帯静脈内皮細胞(HUVEC)ないしはヒト単球を用い、ECPでこれら細胞を刺激し、刺激後の転写因子NF-χBの活性化を蛍光抗体法とゲルシフトアッセイで検討すると共に、培養上清中に出現するIL-1,IL-6,TNF-αの濃度をELISA法で測定し、また、mRNAの発現レベルを定量的RT-PCR法で測定した。その結果、ECPはHUVECを活性化する能力はなかったが、強い内皮細胞障害性を示した。また、単球のNF-χBの直接的な活性化を介さずに、上記のサイトカインの産生が認められた。一方、死菌全菌体での刺激では単球のNF-χBは活性化され、上記のサイトカインの遺伝子発現が明確に認められた。緑色レンサ球菌群の一部の菌株による実験的血管炎の成立にECPによる血管内皮細胞障害やサイトカインによる内皮細胞の活性化が関与していることが示唆された。これまでに、ヒト臍帯静脈内皮細胞(HUVEC)ないしはヒト単球を用い、ECPでこれら細胞を刺激し、転写因子、NF-κBの活性化を蛍光抗体法とゲルシフトアッセイで検討すると共に、培養上清中に出現するIL-1,IL-6,TNF-αをELISA法で測定し、またmRNAの発現を定量的RT-PCR法で測定してきた。引き続き以下の実験が行われた。ECP並びにECPをDEAEカラムクロマトグラフィーを用い、食塩濃度勾配法により得られた各分画は単球、単球由来マクロファージに対しNF-κBの活性化、核移行を誘導し得なかった。しかし、ECP並びにDEAEによる分画の内、Fraction 37と9はNF-κBの活性化を介さずにTNF-αなどの炎症性サイトカインを誘導した。一方、菌体表層からフェノール抽出したリポタイコ酸(LTA)は単球、単球由来マクロファージにNF-κBの活性化をもたらしたが、高度に精製したLTAでは活性化されなかった。なお、A群レンサ球菌から抽出されたペプチドグリカンはNF-κBの活性化を誘導した。S.mitis死菌体での単球、単球由来マクロファージ刺激により、NF-κBの活性化、核移行を誘導し、引き続いてIL-1α,IL-1β,IL-6,TNF-αがメッセージのレベルで確認されると共に、上記のサイトカインが培養上清中に認められた。しかし、この死菌体はHUVECに対しNF-κBの活性化、サイトカインの遊離のいずれも認めることは出来なかった。
歯肉縁下細菌叢内での歯周病関連細菌に影響を及ぼすバクテリオシンに関する研究

バクテリオシンは細菌から産生され,同菌種あるいは異菌種の発育を阻害する拮抗因子の一つであり、細胞叢に影響すると考えられている。歯周疾患の発症と進行には、歯肉縁下に存在する細菌が重要な働きをしており,プラークを構成する細菌叢に変化がみられる。したがって、歯肉炎から歯周炎に移行する段階において細菌間の相互作用を検索し歯肉縁下細菌叢への影響を検討することは,歯周病の病態を知るとともに,将来的には歯周病の治療に役立つと思われる。そこで、歯肉炎において主に分離される細菌のひとつであるActinomyces viscosusのバクテリオシン活性を検索するとともに,その分離・精製を試みた。穿刺法によるスクリーニングにおいて強い活性のみられた組み合わせを選択し、産生菌を嫌気的に培養後、培養上清からバクテリオシンの精製を行なった。精製は、硫安塩析、イオン交換クロマトグラフィー、疎水クロマトグラフィー、逆相クロマトグラフィーにより行ない、逆相クロマトグラフィーにて細いピーク、またSDS-PAGEで単一バンドが得られた。精製したバクテリオシンの性状を調べたところ、その活性は易熱性、プロテアーゼ感受性、糖分解酵素耐性で、分子量はゲル濾過により58kdaと求められた。さらに蛋白、全糖量、全脂質を定量し、アミノ産分析を行った。なお、本バクテリオシンは,若年性歯周炎患者より多く分離されるActinobacillus actinomycetem comitans、及び成人性歯周炎患者より多く分離されるPorphyromonus gingivalisに対し強い抗菌活性を示した。本研究により精製されたActinomyces viscosusの産生するバクテリオシンは、蛋白質と考えられ、それは歯周病原菌に抗菌活性を持つことが明かにされた。今後さらに広い範囲における抗菌活性を検討するとともに、歯肉炎から歯周炎に移行する段階におけるバクテリオシンの役割を検討したい。
ラット慢性進行性局所脳虚血モデルの新規作成と酢酸PETを用いたグリア代謝

10-12週齢の雄ラットを1.5%イソフルレン吸入麻酔により全身麻酔をかけ、Pulsinelliの4 vessel occlusion (Ann Neurol 11, 49 9-509, 1982)の方法に準じて、ラットを腹臥位とする。後頸部を切開し、手術用実態顕微鏡と双極電気凝固装置を用いて両側椎骨動脈を第一頚椎と後頭骨の間で確実に凝固、切断する。その後麻酔から一旦覚醒させ2,3日間を置いたのち二回目の手術を行った。イソフルレン吸入麻酔下でラットを背臥位としヒートパッドにより体温は36.5-37.5度に維持する。頸部正中切開を行い、両側総頸、内頸、外頸動脈を露出する。外頸動脈を凝固切断すると、中大脳動脈領域への血流は両側総頸動脈のみとなり、側副血行路は前交通動脈による対側からの血流のみとなる。猪原の論文(J Neurosci 2015)に準じて総頸動脈に様々な口径のアミロイドコンストリクター(AC:マウスでは内径0.5 mmを使用、Tokyo Instruments)ないしはマイクロコイル(MC:マウスでは内径0.18 mmを使用、Samini)を留置する。本年度はモデルの作成を主に行った。しかしマウスと異なりラットで椎骨動脈を処置した後に両側頚動脈を処置すると80%近い致死率を呈することがわかった。本研究では慢性進行性の両側頸動脈高度狭窄モデルの作成に留まった。10-12週齢の雄ラットを1.5%イソフルレン吸入麻酔により全身麻酔をかけ、Pulsinelliの4 vessel occlusion (Ann Neurol 11, 499-509, 1982)の方法に準じて、ラットを腹臥位とする。猪原の論文(J. Neurosci 35:3915&#8211;28, 2015)に準じて総頸動脈に様々な口径のアミロイドコンストリクター(AC:マウスでは内径0.5 mmを使用、Tokyo Instruments)ないしはマイクロコイル(MC:マウスでは内径0.18 mmを使用、Samini)を留置する。当初の計画を修正し、片側の頚動脈にアミロイドコンストリクターを装着することで慢性進行性脳虚血を生じさせることを計画している。本年度はモデルの確立に努めた。そこで片側内頸動脈を結紮し、対側内頸動脈のアミロイド今ストリクターを挿入して進行性脳虚血ラットを作成した。アミロイドβ蛋白、タウタンパク、リン酸化タウ蛋白の発現を免疫組織学的に検討しており、リン酸化タウの発現が上昇している所見が得られつつある。モデルの作成に難渋したため。

その後麻酔から一旦覚醒させ2,3日間を置いたのち二回目の手術を行った。イソフルレン吸入麻酔下でラットを背臥位としヒートパッドにより体温は36.5-37.5度に維持する。頸部正中切開を行い、両側総頸、内頸、外頸動脈を露出する。外頸動脈を凝固切断すると、中大脳動脈領域への血流は両側総頸動脈のみとなり、側副血行路は前交通動脈による対側からの血流のみとなる。猪原の論文(J Neurosci 2015)に準じて総頸動脈に様々な口径のアミロイドコンストリクター(AC:マウスでは内径0.5 mmを使用、Tokyo Instruments)ないしはマイクロコイル(MC:マウスでは内径0.18 mmを使用、Samini)を留置する。本年度はモデルの作成を主に行った。しかしマウスと異なりラットで椎骨動脈を処置した後に両側頚動脈を処置すると80%近い致死率を呈することがわかった。本研究では慢性進行性の両側頸動脈高度狭窄モデルの作成に留まった。慢性進行性脳虚血モデルを作成し、アポトーシス関連タンパクや再生関連タンパクの発現を免疫組織学的にも検討する。本モデルを用いてアミロイド、タウなど認知症関連蛋白の発現解析を行う予定である。計画していた実験が予定の個体数に達せず、材料費や試薬代が余った。理由:当初の計画より物品を安価で購入できた為。使用計画:次年度は研究最終年度であるため成果発表の旅費として使用する。次年度にくりこして使用する予定である
変分的アプローチによる非線型問題の総合的研究

非線型問題の研究を変分的手法により行った.特に(1)非線型シュレディンガーおよびその連立系に対する特異摂動問題に関して凝集解の変分的構成を行い,非常に一般的な設定の下でその存在を示した.(2)非線型楕円型方程式(系)の解の存在を種々の設定の下で扱い,解の新しい変分的構成を与えた.また解の安定性,不安定性の研究を行った.(3)空間次元1の特異摂動問題においては高振動解の特徴付けと存在結果を与えた.非線型微分方程式は数理物理学,微分幾何学に現れ,その解の存在,多重性,安定性は重要な問題である.ここでは変分的アプローチにより次の問題に取り組む.(1)特異摂動問題.非線型シュレディンガー方程式を中心として,凝集解のプロファイルおよびその存在.(2)非線型楕円型方程式系.変分構造をもつ方程式系の解の存在問題および特異摂動問題.(3)天体力学に関連するハミルトン系に対する周期軌道の存在問題.非線型問題の研究を変分的手法により行った.特に(1)非線型シュレディンガーおよびその連立系に対する特異摂動問題に関して凝集解の変分的構成を行い,非常に一般的な設定の下でその存在を示した.(2)非線型楕円型方程式(系)の解の存在を種々の設定の下で扱い,解の新しい変分的構成を与えた.また解の安定性,不安定性の研究を行った.(3)空間次元1の特異摂動問題においては高振動解の特徴付けと存在結果を与えた.本年度得られた結果のうち主要なもの2つについて述べる.非線型Schrodinger方程式系に対して特異摂動問題を考察し,凝集解の存在証明を行った.従来凝集解の存在証明は単独方程式に対して行われることが多く,ポテンシャル関数V(x)の極小点に集中する解の存在等が議論されていた.ここでは方程式系について議論を行い,変分的手法により系としての非自明な凝集解の存在を示すことに成功した.方程式系を扱う際の難しさとして1成分が恒等的に0となる半自明解とすべての成分が0でない系としての非自明解が共存し,これらの識別が必要であること,非線型項がべき関数である比較的単純な場合であっても極限方程式の解構造が未知である点等にある.ここではlocal mountain pass typeの議論を発展させることによりその困難を克服した.またscalar field方程式に関しても研究を行いBerestycki, Lions, Gallouet, Kavianによる存在結果を若干拡張することに成功した.Berestyckiらによる証明は制限問題を導入することにより行われており,次元が3以上の場合と2の場合の証明はかなり異なっていた.ここでは制限問題を導入することなく,symmetric mountain pass theoremを適用することにより次元に関して統一的な証明を与え,また2次元の場合に結果を拡張した.証明においては対応する汎関数のscaling propertyを考慮した補助関数を導入し,Palais-Smale条件がない状況においても無限個の臨界点を得ている.scalarfield方程式は種々な問題の極限問題として現れ,ここでの拡張は他の問題の(若干の)拡張をも可能としている.本年度得られた結果のうち主要なものについて述べる.まず比較的弱い相互作用をもつ2本の非線型シュレディンガー方程式に対する特異摂動問題を考察し,従来知られていないプロファイルをもつ凝集解の存在証明に成功した.ここで得られた解はrescaleすると非自明なベクトル解に収束し,また凝集点は2つのポテンシャルから定まるある種のエネルギー関数の最小点として特徴づけられる.この存在定理の証明のために,極限問題-ホテンシャルが定数関数の方程式系-の詳細な解析から始め,エネルギー最小ベクトル解の従来とは異なった2次元ミニマックス法による構成法を与え,最小エネルギーレベルの性質の性質を詳細に調べた.また特異摂動解の構成においては無限次元manifold上でのlocal mountain pessタイプの議論を発展させ用いている.この研究以前に知られていた凝集解のプロファイルは半自明解(1成分は0でないが,他の成分は恒等的に0の解)を極限としてもち,今回得られたものとは全く異なるものである.なお,今回の結果より非線型シュレディンガー方程式系は単独の非線型シュレディンガー方程式と比較すると非常に豐かな構造を持つことも分かる.また単独の非線型シュレディンガー方程式に対しても特異摂動問題を研究を行った.特にポテンシャルの位相的に非自明な臨界点に凝集する特異摂動解の存在を研究し,その存在を非常に一般的な設定の下で示した.証明では対応する汎関数に対して通常とは異なるdeformation flowの構成が本質的な役割を果たしている.さらに,ここで用いられた方法はclustered peakをもつ凝集解の構成等においても有功と思われ,現在さらなる発展を目指して研究が進展している.本年度得られた結果のうち主要なものについて報告する.非線型シュレディンガー方程式に対する特異摂動問題に関しては一般的な非線型項をもつ方程式を扱い,ポテンシャルV(x)の極大点に複数個のピークが集中するプロファイルをもつ解の存在証明を行った.

従来このような解は非線型項がべき関数であるときにKang-Wei(2000)により示されていたが,その方法は極限問題の解の一意性,非退化性を強く用いたLyapunov-Schmidt法を用いるものであり,極限問題の解の一意性,非退化性を期待できない一般的な非線型項をもった非線型シュレディンガー方程式に対しては適用できない.本研究では方程式に対応する汎関数のgradientを無限次元空間での期待される解の近傍において詳細に調べ,ポテンシャルV(x)の性質を直接反映するR^Nでのflowを合わせ,Trotter formulaにより構成される通常とは異なるdeformation flowを用いることにより解の存在証明を与えることに成功した.さらにポテンシャルV(x)の鞍点に複数個のピークが集中するプロファイルをもつ解の存在についても研究を行い,ある種のミニマックス法により特徴付けられる鞍点に対して,その存在を示した.ここで扱われる鞍点はやや特殊な特徴付けをもつ必要があるが,非退化鞍点に対して適用可能であり,Dancer-Yan(2001)らによる先行結果を大きく拡張するものである.ここで用いた方法は極限問題の非退化性を要求せず,有限次元へのreductionを行わなわず,より直接的に無限次元の関数空間で解を求めることを可能としている.他の問題,特に非線形楕円型方程式系に対しても応用が可能であると期待される.非線形楕円型方程式に関してはexpanding tubular領域における正値解の多重性の研究を行った.この問題は従来,領域が対称性をもつ円環領域の場合および,極限問題(帯状領域での非線形楕円型方程式)の解の一意性および非退化性の仮定の下での考察されている.特に後者は空間次元が2のとき仮定がみたされていることが知られている(Dancer-Yan(2002)).ここでは対称性および極限方程式の解の一意性,非退化性の仮定をおかずにmulti-peak解の存在を議論し,領域が拡張してゆくと共に正値解の個数が無限大へと増加してゆくことを示した.この結果はすべての次元Nで解の存在とその個数の増加を保証し,Dacer-Yanの結果を拡張している.ここで用いられている方法は昨年度までに非線形シュレディンガー方程式に対して開発した無限次元空間での局所的なdeformation理論をさらに発展させたものであり,従来Lyapunov-Schmidt法を用いて研究されている様々な問題に適用でき,さらなる発展が期待される.ハミルトン系に関しては天体力学に関連する問題に関してはあまり進歩が得られなかったが,forced pendulumに対する特異摂動問題についてはhighly oscillatory解のadmissibleなプロファイルを決定し,さらに与えられたadmissibieなプロファイルをもつ解の構成に成功した.ここでプロファイルはadiabatic invariantに関連した関数により記述され,それはある種の微分積分方程武をみたしている.現段階では証明は変分法により変分構造を必要としているが,このような結果は変分構造のない問題に対しても成立することが期待され,今後のさらなる発展が望まれる.
Pd-系合金による水素同位体の吸収-放出の動力学的研究

当センターで開発した室温作動型水素同位体分離用ガスクロマトグラフの一層の改良・改善をはかるために,Pd-Pt合金における同位体効果を検討した.研究開始当初においては,上記の室温作動型水素同位体分離用ガスクロマトグラフの操作温度の改善に有効と考えられるPd-4at%Pt合金による水素吸収の動力学同位体効果を重点的に評価する計画であったが,この系においてはその動力学的側面のカウンターチェックとして熱力学的同位体効果の評価が必要であることが判明した.この事情を踏まえ,水素同位体の吸収及び脱離等温線を測定することにより,熱力学的同位体効果も合わせて評価した.これにより,水素同位体分離用ガスクロマトグラフの性能向上に不可欠のカラム材の開発に重要なデータと知見を,より広範に得ることができた.以下に本研究によって得られた知見を略記する.・水素同位体の吸収過程は表面での水素分子の解離吸着,吸着原子の会合脱離及び内部への拡散により記述できる.・Pd-4at%Pt合金では,室温付近での軽水素の吸着速度は重水素よりも約1.5倍大きい.逆に脱離速度は重水素のほうが軽水素よりも約2倍速い.・拡散の活性化エネルギーは軽水素及び重水素とも28kJ/molであるが,重水素に対する頻度因子は軽水素よりも約1.5倍程度大きい.・一方,室温付近における平衡圧は重水素の方が軽水素より5倍ほど大きい.当センターで開発した室温作動型水素同位体分離用ガスクロマトグラフの一層の改良・改善をはかるために,Pd-Pt合金における同位体効果を検討した.研究開始当初においては,上記の室温作動型水素同位体分離用ガスクロマトグラフの操作温度の改善に有効と考えられるPd-4at%Pt合金による水素吸収の動力学同位体効果を重点的に評価する計画であったが,この系においてはその動力学的側面のカウンターチェックとして熱力学的同位体効果の評価が必要であることが判明した.この事情を踏まえ,水素同位体の吸収及び脱離等温線を測定することにより,熱力学的同位体効果も合わせて評価した.これにより,水素同位体分離用ガスクロマトグラフの性能向上に不可欠のカラム材の開発に重要なデータと知見を,より広範に得ることができた.以下に本研究によって得られた知見を略記する.・水素同位体の吸収過程は表面での水素分子の解離吸着,吸着原子の会合脱離及び内部への拡散により記述できる.・Pd-4at%Pt合金では,室温付近での軽水素の吸着速度は重水素よりも約1.5倍大きい.逆に脱離速度は重水素のほうが軽水素よりも約2倍速い.・拡散の活性化エネルギーは軽水素及び重水素とも28kJ/molであるが,重水素に対する頻度因子は軽水素よりも約1.5倍程度大きい.・一方,室温付近における平衡圧は重水素の方が軽水素より5倍ほど大きい.・真空マイクロバランスシステムを整備し,Pd-4 at%Pt合金による水素の吸収過程を測定・解析した.・その結果,初期吸収速度は温度080C,水素圧0.110Torrの範囲で,圧力の一次に比例するが,吸収曲線全体は単純な速度式では記述できないことが明らかとなった.・この原因は表面での吸着と脱離反応と内部への水素の拡散のいずれもが互いに無視できない速度で生じているためで,吸収曲線全体は以下の式で再現できることが知られた.但し,M(H_<ab>)は水素吸収量,Cは試料内での水素濃度,C_8は表面での水素濃度,C_<eq>は平衡水素濃度,またk_<ab>及びk_<des>は吸収及び脱離の速度定数,Dは拡散係数である.・この式より,動力学的同位体効果の評価には平衡論的同位体効果に関する知見が不可欠であることが明らかとなった.・よって年度途中より,焦点を熱力学的同位体効果に移して,この合金による水素及び重水素の吸収平衡時の圧力ー濃度ー温度図を重点的に測定した.・その結果によれば,30Cでの平衡圧が20Torrの場合の溶解度は軽水素の方が重水素より約4倍も高い.・これらの知見により,動力学的同位体効果(軽水素及び重水素に対するk_<ab>,k_<des>,D)を定量的に比較検討できる見通しが得られた.・昨年度の熱力学的同位体効果の定量的記述の検討結果を受けて,動力学的同位体効果の検討を進めた.・その手始めとして,昨年度中断したPd-4 at%Pt合金による軽水素の吸収等温線の真空マイクロバランス法による測定を再開し,その結果を解析した.・なお,測定は,温度0,20,40,60,80C,水素圧0.1,0.2,0.5,1.0,2.0,5.0,10Torrで行った.・その結果,溶解吸収の初速度は水素圧に比例するが,吸収曲線全体は表面での水素の解離吸着と吸着原子の会合脱離で制限される拡散過程としてで記述できることが知られた.但し,M(H_<abs>)は水素吸収量,Cは試料内での水素濃度,C_sは表面での水素濃度,C_<eq>は平衡水素濃度,またk_<ads>及びk_<des>は吸着及び脱離の速度定数,N_sは単位面積あたりの吸着席数,Dは拡散係数である.・なほ,溶解平衡常数,K,はK=k_<ads>/

k_<des>の形で,動同力学的同位体効果と関連している.・解析の結果,軽水素の解離吸着及び吸着原子の会合脱離反応の活性化エネルギーはそれぞれ4.6及び9.0kcal/molと求められた.・また,拡散係数の活性化エネルギーは7.1kcal/molで,見掛けの頻度因子は2×10^<-4>cm^2/secと求められた.アルゴンアーク炉でPd-4at%Pt合金を調製したインゴットを鑢で削り落として得た200メッシュ以下の粉体を試料とし,軽水素及び重水素の吸収速度を10TorrのAr雰囲気下,温度0100Cの範囲で測定した.なお水素同位体の測定圧は0.110.0Torrとした.吸収曲線は,いずれの気体でも,温度,圧力に関係なく,水素分子の解離吸着,吸着水素原子の会合脱離及び拡散を含むで記述できた.上のモデルによる解析により以下の知見が得られた.・軽水素の解離吸着の活性化エネルギー(ΔE_<ads>)は28,重水素では31kJ/molであるが,室温付近での吸着速度は軽水素の方が約1.5倍大きい.・脱離の活性化エネルギー(ΔE_<des>)は軽水素47,重水素で46kJ/molであるが,室温付近での脱離速度は重水素の方が約2倍大きい.・拡散の活性化エネルギー(ΔE_<dif>)は軽水素及び重水素とも28kJ/molであるが,重水素に対する頻度因子は軽水素よりも約1.5倍程度大きい.・前報に比べると,ΔE_<ads>(H)及びΔE_<des>(H)とも約8kJ/mol程大きいが,ΔE_<dif>(H)はほぼ一致した.表面分析の結果,試料表面の炭素及び酸素による被毒が前者の原因であると結論した.・他方,拡散係数は本法により正しく評価されていると結論した.得られたΔE_<dif>(H)の値は純Pdに比べ約7kJ/mol程大きく,室温付近での拡散係数はPdの1/100程度ときわめて小さい事が知られた.
ヒトiPS細胞から膵β細胞の分化誘導とその再生医療への応用に向けた基盤技術開発

本研究ではヒトiPS細胞から十分な機能を持つ膵臓β細胞を作成するために、分化誘導の促進化合物の同定、作用機序の解明を目指した。また、代謝による分化促進の利用により成熟度の高い膵臓β細胞の作成を目指した。その結果、新規にWntシグナルがβ細胞の分化に対して促進効果があること、マウスES細胞の系で見られたVMAT2-モノアミンによる分化抑制効果はヒトiPS細胞の分化誘導系にも存在することを見出した。また、成体膵島におけるドパミンD2受容体を介した膵臓内分泌β細胞の量を負に制御する機序が存在し、この機序は、Gタンパク共役受容体であるアデノシン受容体A2Aの抑制にもカップルしていることが分かった。マウスES細胞の膵臓分化を促進する化合物として、小胞型モノアミントランスポーターVMAT2の阻害剤がヒットした。様々な解析により、VMAT2ーモノアミンシグナルが膵臓β細胞への分化を抑制するシグナルであることが分かった。本研究において、マウスES細胞を用いたスクリーニング系で得られた化合物がヒトiPS細胞の膵臓分化にも効果があることを確認した。さらに、ヒトiPS細胞の分化誘導系の構築を行なった。ヒトiPS細胞の分化誘導系は、マウスよりも長く時間がかかり、約28日分化誘導後にインスリン陽性細胞が約8%程度得られた。各ステップの分化誘導条件を検討した結果、糖応答性インスリン分泌能を示す活性をもつ分化細胞を得ることが出来た。ヒトiPS細胞の分化誘導系においても同様に、VMAT2阻害剤がβ細胞分化を促進する効果があることを明らかにした。現在引き続きその作用機序について解析中である。一方、成体マウス膵島を用いた分散培養系において、膵β細胞の増殖再開が見られることを利用して、膵β細胞の増殖を促進する化合物のスクリーニング系を構築した。これを用いて、薬理作用が既知の化合物ライブラリーを加えて培養したときに、膵β細胞の増殖を促進する化合物のスクリーニングを行なった。ヒット化合物を得、その作用機序について解析を進めた。マウスES細胞を用いた評価系において、新たに分化誘導促進化合物を取得でき、その作用機序を解析することが出来た。また、マウスES細胞の分化誘導系のみでなく、ヒトiPS細胞の分化誘導系においても有効であったことが分かった。一方、成体マウスの膵島を用いた評価系も順調に進み、有効な膵β細胞増殖促進化合物を得ることが出来た。マウスES細胞を用いた新たな化合物スクリーニングを行なった結果、新たにmycophenolic acid(MPA)を同定した。MPAの分化促進効果は、培養系に混在している神経細胞を減少させるため、神経細胞から分泌されるWnt抑制タンパク質を減少させた結果によるものであることを明らかにした。Wntシグナルの促進がβ細胞の分化に対して促進効果があることを見出した。また、前年度に成体膵島の分散培養系を用いた膵β細胞の増殖促進作用を示す化合物を得たが、その作用は、膵β細胞の増殖を促進すると共に、膵β細胞死を抑制する作用を持っていることを明らかにした。また、膵β細胞の分散培養系において、インスリンを発現しない細胞が増えているため、β細胞の脱分化が疑われた。それを測定するために、インスリンプロモーター下にCreリコンビナーゼを発現するマウスと、ROSAーloxP STOP loxPーeYFPが挿入されているマウスと交配させたマウスを用いて、一旦インスリンを発現したβ細胞がeYFPで恒久的に標識されるようにした。この培養系において、eYFP陽性細胞においてインスリン陰性細胞は脱分化したβ細胞として同定できる。膵β細胞の分散培養系において、長く培養することにより膵β細胞の脱分化が起きることを見出した。今回見つけた膵β細胞の増殖を促進する化合物と一緒に培養することにより、膵β細胞の脱分化が抑制された。VMAT2遺伝子強制発現や遺伝子ノックアウト解析については、順調に進めている。マウス成体膵島を用いた評価系により、得られた化合物が膵β細胞の脱分化を抑制できる、という予想しなかった効果が得られた。この結果より、モノアミンが膵島β細胞の分化維持に重要な機能を持っていることが考えられた。膵島の恒常性維持のメカニズムの解明に迫ることが期待される。本研究では、ヒトiPS細胞から十分な機能を持つ膵臓β細胞を作成するために、分化誘導の促進化合物の同定、作用機序の解明を目指した。また、代謝による分化促進の利用により、成熟度の高い膵臓β細胞の作成を目指した。