hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
低侵襲な放射線癌治療を可能にする次世代型DDSキャリアのin vivoへの応用

つまり、in vivoにおいても、この粒子の薬剤キャリアとしての有効性を示すことに成功した。III.「無機ナノ粒子とのハイブリッド化による新規治療法の開発」では、担癌マウスにおける無機ナノ粒子封入BNCの体内分布と放射線併用治療の効果を検証した。まず、担癌マウスの尾静脈から投与された粒子の体内分布を分析した結果、ZHER2-BNCを用いることで腫瘍への特異的な集積が確認された。また、粒子投与後に5 GyのX線を照射する併用治療を行うと腫瘍体積の増加が抑制された。さらに、この無機ナノ粒子による放射線増感効果は細胞のコロニーアッセイ(in vitro)でも優位な傷害性を示した。つまり、BNCによる腫瘍特異的な集積と、無機ナノ粒子による放射線増感効果が発揮され、抗腫瘍効果を示すことに成功した。申請者が開発してきたドラッグデリバリー用キャリア(B型肝炎ウイルス由来のバイオナノカプセル; BNC)は、in vitroにおいて一定の成果を挙げてきた。そこで、今後臨床応用を目指すために、in vivoでの有効性を検証した。担癌マウスを用いた抗癌剤ドキソルビシンの送達では、抗腫瘍効果が確認された。また、放射線増感作用のある無機ナノ粒子(PAATiOx)を送達したときの体内分布を測定すると、腫瘍への集積が確認された。そこで、X線照射との併用治療を行った結果、抗腫瘍効果が確認され、その有効性を示すことができた。つまり、in vivoにおいてもこのキャリアが有効であることが示唆された。I.「様々な癌細胞を標的化可能なBNCの開発」において、各種BNCの取得後は、それぞれの粒子の標的癌細胞においてその細胞特異性をin vitroで確認する。細胞特異性が確認されれば、IIやIIIのZHER2-BNCと同様にin vivoにおいて薬剤や無機ナノ粒子の送達を評価する。II.「各種Affibodyを提示したBNC/LP複合粒子によるin vivo薬剤デリバリーの検証」では、抗癌剤のドキソルビシンを封入したリポソーム製剤であるDoxil&reg;との比較を行う。評価項目は腫瘍体積の抑制はもちろん、正常細胞への影響として肝臓への傷害等を血液検査によって確認する。この比較によって、ZHER2-BNCの融合が腫瘍蓄積後の細胞内取り込みに与える影響を検討する。III.「無機ナノ粒子とのハイブリッド化による新規治療法の開発」では、放射線との併用によって抗腫瘍効果が期待できることが示された。そこで、治療プロトコールを確立するために、ZHER2-BNC/LP(PAATiOx)の標的組織への到達時間と集積率、非標的組織への分布を検証する。この治療法で最も重要なのは、腫瘍への粒子蓄積量であると考えている。PAATiOx単体の尾静脈投与における腫瘍への蓄積量は1日後で10%弱であった。この蓄積量では放射線との併用による抗腫瘍効果は確認されなかったので、局所投与で効果があった25%程度を目指さなければならない。また、標的組織への集積によって役割を終えた粒子は速やかに体外へ排出されることが望ましいため、排泄能の評価も行う。さらに、投与する粒子濃度とX線線量を検討する。
リビングラジカル重合法によるポリマーブラシの構築とその構造・物性に関する研究

乾燥時の高分子ブラシ(メルトブラシ)が同種の高分子(マトリクスポリマー)と接するときの相溶性は、高分子の重要なバルク物性であるのみならず、複合材料などの相溶化の観点からも重要である。本年度は、"超高密度"ポリマーブラシのマトリクスポリマーとの相溶性の評価を行った。具体的には、重水素化ポリメチルメタクリレート高密度高分子ブラシを表面開始原子移動ラジカル重合法により調製した。得られた重水素化高分子ブラシの表面に、様々な分子量の通常の(軽水素化)ポリメチルメタクリレートを充分な厚さコートし熱処理を施した。そのときの重水素化高分子ブラシの構造を中性子反射率測定法により測定し、相溶性の評価を行った。以下のことを明らかにした。(i)従来の低密度な高分子ブラシでは、マトリクスポリマーの分子量がグラフトポリマーの分子量とほぼ等しい値で相溶したのに対して、高密度高分子ブラシの場合、マトリクスポリマーの分子量がグラフトポリマーの分子量の1/10以下にならないと相溶は起こらなかった。(ii)高密度高分子ブラシは、マトリクスポリマーの分子量の広い範囲にわたってマトリクスポリマーがブラシ層内にほとんど侵入していない構造を形成していることがわかった。これは、従来の低密度な高分子ブラシでは見られない新しい構造である。以上のように、メルトブラシの相溶性と言う観点からも、高密度高分子ブラシの性質は従来の低密度な高分子ブラシとは大きく異なることを明らかにした。
環境汚染物質によるポルフィリン症の解析・ヘム合成と蛋白質合成の協奏とテンポ

栄養不足、ウイルス感染など様々な外的なストレスに依り蛋白質翻訳(合成)が停止する。赤血球には生体内の酸素の運搬に重要な働きをするヘモグロビンが多量に存在する。このヘモグロビンはヘムとグロビン蛋白質が1:1で存在しており、この濃度比が変化すると病態が発現する。このバランスを保持するために、赤血球には、ヘムの濃度をセンスして、もし、ヘム濃度が低下するとグロビンの合成を停止させる酵素、ヘム制御キナーゼ(HRI)が存在する。一方、ヘムの合成にはチトクロムP450が関わっており、その合成反応はPCBやハロエタンなどの環境汚染物質により阻害される。NOガスもその合成反応を制御する。本研究では、分光学や遺伝子工学の手法を用いて、環境汚染物質によるヘム合成・分解の阻害、ヘム分解物による蛋白質合成阻害、NO合成阻害、NO-ヘム相互作用、ヘムセンサー酵素、及びNOが関わるシグナル伝達などの機構を明らかにし、ポルフィリン症の基礎的な解明に寄与した。国際会議、及び国際雑誌に発表できた研究成果としては、#1,HRIのヘム環境を明らかにし、NOがHRIの活性を著しく上昇させることを示した。#2,NO合成酵素の細胞表面蛋白との相互作用やヘムが関わる電子伝達について興味ある結果を得た。#3,NOガスやCOガスをセンスしヘムの酸化還元状態で制御されるヘムセンサー酵素の構造・機能相関関係を解析した。さらに、最終年度においては、基盤(S)の研究と重複する形で、生物時計に関わるヘム制御転写因子とDNAとの相互作用、制御因子蛋白質とヘムとの相互作用、COガスとの相互作用の研究を行った。ヘムに制御される真核生物のイニシエーションファクターelf-2αキナーゼ(HRI)は網状赤血球においてヘムの濃度に依存してグロビンの合成を制御する。ヘム濃度が低いとHRIの活性化が誘導されelf-2のαサブユニットをリン酸化する。elf-2αがリン酸化されるとelf-2Bに恭子に結合してグニジン核の交換を阻害して、グロビンの合成を阻害する。HRいには2つのヘムが結合する。N末端には、ヘムは軸配位子が上下から強固に結合している。しかし、まん中のキナーゼドメインにはヘムが不可逆的に弱く結合しており、様々の条件でヘムは離脱する。この酵素のヘムによる活性調節はヘムの離脱によって制御されている。しかし、キナーゼドメインについてのヘムの研究は困難であり、ヘムが強固に結合しているN末端についての研究がまずヘムによる活性制御の機構を解明する第一段階として重要である。COがN末端結合ヘムへの結合速度及び解離速度は、非常に遅くそれぞれ2.0029μM-1s-1、0.003s-1であった。これらの値は、以前に報告されている6配位のヘモグロビンよりも遅かった。共鳴ラマンスペクトルよりCOはヘム平面から垂直に立っているが、COのOは遠位にアミノ酸とは弱い相互作用でしかないことがわかった。本研究は投稿中である。同じく、ヘムがセンサーになる大腸菌由来のプォスフォジエステラーゼのヘムの役割についても詳細に検討した。この酵素のヘムセンサーの機構を理解するために各種の物理化学的な手法を用いた。網状赤血球において、ヘム結合型ヘモグロビンの蛋白質の翻訳・合成はヘムの濃度に依存している。即ち、ヘムとグロビンの濃度比が常に1になるように調節されている。この調整は、ヘムに制御される真核生物のイニシエーションファクターelF-2αキナーゼ(HRI)によって行われる。このグロビン蛋白質の翻訳・合成は又、ヒートショックプロテイン、単鎖RNA, NOなどによっても調節されると報告されている。しかし、その調節の分子論的機構についてはこれまで正確に理解されていなかった。

平成15年度では、HRIのヘム結合部位(HRINTD)と全長の大腸菌での大量発現系の構築に成功した。又、NOがキナーゼ反応を活性化する機構について始めて構造的に決定的な知見を得た。今回大腸菌で大量発現して得た全長型HRIは確かにNOにより活性化されることを確かめた。HRINTDめヘムは鉄3価でも鉄2価でも6配位構造であり、軸配位子は共に窒素であることが、各種分光学から示唆された。又、NO結合型もNOの逆側に窒素が配位した6配位錯体であった。しかし、全長型HRIでは、特に、鉄3価では、6配位錯体ではあるが、1つの軸配位子がシステインの硫黄であることが、今回始めて示唆された。さらに、NOが鉄2価に配位することにより、NOの逆側の配位子は離脱し、5配位型NO錯体の生成が今回始めて示唆された。このNOにより活性化される機構は、可溶性グアニリルサイクレースにおいてNO添加により、5配位のNO錯体が生成されて活性化されるヘム構造変化と同じである。今回得られた結果より、ヘムに制御される蛋白質の翻訳・合成において、NOの関与が重要であることが示唆された。赤血球においては、ヘモグロビンが酸素分子の貯蔵に重要な働きをする。そこにおいては、ヘムとグロビンのモル比が常に1:1でなければならない。その比が、>1、又は<1にずれると重症な赤血球の病気になる。赤血球の前期発達段階である網状赤血球において、ヘム結合型ヘモグロビンのグロビン蛋白質の翻訳(合成)の開始と停止はヘムの濃度をセンスして行われる。ヘムをセンスして、蛋白質の翻訳(合成)する酵素は真核生物イニシエーションファクターelF2αキナーゼ(HRI)によって行われる。平成15年度において、HRIがヘムを介在してNOにより活性が上昇する機構の一部を解明した。平成16年度においては、ヘムが結合する軸配位子の同定を試みた。分光学的結果より、HisとCysが軸配位子であると推定されたので、これらのアミノ酸残基の部位特異的変異を行った。Tyr38,His75,His78,His80,Cys95,His120,K196,C208,C385,C464,C491などのアミノ酸を他のアミノ酸へ変異させた。いずれも、N-末端に(His)6-Tagが組み込まれているものであった。いずれの変異体も吸収スペクトルでも共鳴ラマンスペクトルでも野生型に比較して顕著な変化が認められなかった。又、ヘムの結合速度、ヘムの解離速度なども一部測定したが、野生型に比較して著しい差は認められなかった。(His)6-Tagの影響もあるのではないかと考えて、(His)6-Tagが除かれた変異体も合成して各種分光学的手法で調べたが、野生型と比べて著しい差がこの場合も認められなかった。この理由として、センサー酵素特有の蛋白構造の柔軟性プラスティシティーが考えられる。つまり、例え元来のヘムの軸配位子を他のアミノ酸に変異しても、近傍に存在する別のHis,Cysが配位する可能性も存在する。現在、構造のみならず、機能という意味でのヘムの役割についてさらに研究中である。さらに、NOがHRIを活性化するという結果から、NOが生体内でどのような機構で合成されるかという意味でも、NO合成酵素の活性発現の機構についても研究した。
全ての通常学級児童のための英語音声指導法構築と視覚的教材開発の統合的研究

本研究の目的は,2020年からの小学校外国語教科化から有用できる日本語を介さない英語音声指導法と視覚的補助教材を構築・開発し,健聴児童と聴覚障害児童が共存する小学校通常学級が増加していることを考慮して,全ての児童が等しく英語音声指導を受けられるユニバーサルな教育体制を確立することである。当該年度においては,具体的な研究計画のうち, (1)児童の英語音声の分節音について,健聴児童と聴覚障害児童の知覚と産出の困難度を特定する,(2)通常教室や聴覚障害学級(聞こえ教室)の外国語授業の音環境の実態を明らかにする,(3)聴覚障害児童の指導に関わる通常学級や聞こえ学級担任・支援教員・ALT教員(外国語指導助手)らにインタビューを行い,小学校英語や合理的配慮に対する意識について明らかにした。さらに、(4)研究代表者は,研究対象校の小学校教員(聞こえ学級担任)やALT教員に研修を行い,教員らは聴覚障害児童に視覚的ストラテジーや口形模倣を意識させる日本語を介さない音素認識を含む英語音声指導を実践した。その結果,教員の英語指導に対する態度や意識がポジティブに変容し,指導を受けた聴覚障害児童の英語分節音知覚・産出能力が向上した。研究対象校にて(1)(4)の研究課題に取り組むと同時に,視覚的教材(絵カードと動画)の構築を開始した。動画教材については,当該年度中に研究代表者所属大学において,英語母語話者教員と日本語母語学生に出演を依頼し,研究代表者と研究分担者が2名に研修を行った上で撮影を行い,動画のパイロット版を作成した。研究分担者は,セミナーにおいてそのパイロット版を紹介し,興味を持った自治体とのコンタクトを開始した。上記の研究課題が明らかになったことで,通常学級と聴覚障害特別支援学級のための英語指導法の具体的構築を進めることができた。研究計画のうち,初年度中に聴覚障害児童の英語分節音の知覚・産出能力,通常小学校の英語授業中の音環境,小学校教員の小学校英語や通常小学校に在籍する聴覚障害児童への合理的配慮に対する意識が明らかとなり,さらに,教員自身が口形模倣や視覚を意識させる音声指導を実践することによって聴覚障害児童の知覚・産出能力が向上した結果を得られた。聴覚障害児童への音声指導を録画し視線分析を行った結果,初習学習レベルの児童が英語音声を学ぶ上で視覚的ストラテジーが有効であることが明らかとなり,研究初年度に視覚教材を構築する根拠が得られたことは,本研究を推進していく上で大変意義深いと考える。本研究2年目については,動画教材の完成を目指し,その動画を使って研究対象校にて検証を開始する。当該年度において多くの研究課題が明らかになった一方で,通常担任教員と特別支援担任や支援員の小学校英語や合理的配慮の意識に差があることが明らかとなり,聴覚障害児童が在籍する通常学級と特別支援学級の英語指導の連携体制の構築があらたな課題であると位置づけ,その連携体制の中で,構築した音声指導法や視覚的教材の効果を検証する必要がある。視覚的教材が教員の指導を介助でき,児童の英語音声知覚・産出能力向上の一助になり得るのか,教員の英語指導に対する意識や児童の英語音声に対する意識の変化を調査し,児童の視覚ストラテジーの有効性について,視線分析を行う。また,音声指導の結果,児童の英語能力が向上しているかどうか,テストを実施して検証する。当該年度に実施した研究調査の成果については,学会や論文,セミナー等で発表し,通常学級に在籍する聴覚障害児童の実態について周知活動を行う。研修やセミナー等で英語音声指導法・教材を紹介し,普及を推進する。

研究計画のうち,初年度中に聴覚障害児童の英語分節音の知覚・産出能力,通常小学校の英語授業中の音環境,小学校教員の小学校英語や通常小学校に在籍する聴覚障害児童への合理的配慮に対する意識が明らかとなり,さらに,教員自身が口形模倣や視覚を意識させる音声指導を実践することによって聴覚障害児童の知覚・産出能力が向上した結果を得られた。聴覚障害児童への音声指導を録画し視線分析を行った結果,初習学習レベルの児童が英語音声を学ぶ上で視覚的ストラテジーが有効であることが明らかとなり,研究初年度に視覚教材を構築する根拠が得られたことは,本研究を推進していく上で大変意義深いと考える。本研究2年目については,動画教材の完成を目指し,その動画を使って研究対象校にて検証を開始する。当該年度において多くの研究課題が明らかになった一方で,通常担任教員と特別支援担任や支援員の小学校英語や合理的配慮の意識に差があることが明らかとなり,聴覚障害児童が在籍する通常学級と特別支援学級の英語指導の連携体制の構築があらたな課題であると位置づけ,その連携体制の中で,構築した音声指導法や視覚的教材の効果を検証する必要がある。視覚的教材が教員の指導を介助でき,児童の英語音声知覚・産出能力向上の一助になり得るのか,教員の英語指導に対する意識や児童の英語音声に対する意識の変化を調査し,児童の視覚ストラテジーの有効性について,視線分析を行う。また,音声指導の結果,児童の英語能力が向上しているかどうか,テストを実施して検証する。当該年度に実施した研究調査の成果については,学会や論文,セミナー等で発表し,通常学級に在籍する聴覚障害児童の実態について周知活動を行う。研修やセミナー等で英語音声指導法・教材を紹介し,普及を推進する。当該年度において、当初機械備品として児童(特に聴覚障害児童)の言語産出を音響分析できる専門機器(ソナスピーチ)を購入する予定で、約150万円程度の支出を見込んでいたが、当該年度中に購入する必要性が低いと判断し、購入を見送ったため、本研究初年度の予算と実支出額と差が生じたものである。本研究2年目においては、動画教材の構築の完成を目指すため、編集等に謝金の支出が予想されることと、児童が英語音声を知覚していく上で視覚的ストラテジーが指導において重要な鍵になることから視線分析をする計画で視線分析ソフトウェア購入に持ち越し予算額を充当する予定である。
アルカリ金属-貴金属系の作る表面バイメタル構造

Ag(001)上のナトリウム吸着では、(3×3),(4×4)構造が形成し、それらの構造はCu(001)-Li系の構造と同じであることがテンソルLEED法により決定した。従って、(3×3),(4×4)構造はリチウム吸着においてのみ形成するわけではないことが明らかになった。また、(3×3),(4×4)構造は銀表面においても形成することが我々の研究により明らかになったが、金表面にはできないことが報告されている。当初の計画では予定していなかったが、(3×3),(4×4)構造は貴金属表面だけでなく遷移金属表面においても形成するのではないかと考え実験をおこなった。遷移金属基板としては銅とほぼ同じ大きさのニッケルを選んだ。Ni(001)上のリチウム吸着においては(4×4),(5×5)構造が出現した。構造決定の結果、(4×4)はCu(001)-LiおよびAg(001)-Na系と同じであること、さらに(5×5)構造は、(3×3),(4×4)構造と類似の構造であることが判明した。(5×5)構造は、(4×4)より被覆率が大きくなっている。これらの研究から、(3×3),(4×4),(5×5)構造は貴金属表面だけにおいて形成するのではないことが確定された。Cu(001)-Li-(4×1)構造を決定した]。Cu(001)-Li-(3×3),(4×4)と類似の構造であった。基板表面の対称性の違いを反映していた。被覆率の増加によって出現する(5×1),(6×1)も(4×1)に類似の構造と考えられる。
バイオツールを用いた新規中皮腫治療法の開発

悪性中皮腫は極めて難治性であり現在有効な抗がん剤、分子標的剤はない。中皮腫に対する新規治療法の開発を目指し本研究を推進した。中皮腫で高頻度に不活性化しているがん抑制遺伝子p16INK4aに着目し、その機能を回復させる細胞膜透過性機能ペプチドを用いて検討を行った。その結果、中皮腫細胞特異的に細胞傷害性が誘導され、バイオツールを用いた新規治療法の有効性が確認された。さらに、中皮腫細胞で恒常的に活性化しているYAPがん遺伝子産物について解析した。YAPと結合する転写因子TEADファミリー分子の詳細が明らかになり、YAPを標的とする特異的な分子標的治療法の具体的戦略についての知見が集積した。悪性中皮腫は高頻度にNF2-Hippo腫瘍抑制シグナル伝達系が不活性化している。その結果、転写コアクチベーターであるYAPが恒常的に活性化し、細胞周期を促進する遺伝子(サイクリンD1など)や結合組織成長因子(CTGF)の転写が亢進し、悪性中皮腫の増殖や進展を引き起こしている。昨年度は中皮腫において高頻度に欠失しているCDKN2A(p16)遺伝子に着目し細胞膜透過性機能ペプチドを投与し、中皮腫細胞株に対する腫瘍抑制効果を明らかにした。本年度は、YAP転写コアクチベーターが結合する転写因子TEADについて解析し、中皮腫の細胞増殖亢進への関与を詳細に明らかにする目的で実験を進めた。TEAD転写因子はTEAD1-4の4つのホモローグが存在することが知られているが、中皮腫細胞における個々の分子の役割は明らかになっていない。24株の悪性中皮腫細胞株からRNAを抽出し、リアルタイムRT-PCR法にてTEAD1-4の遺伝子発現について検討し、発現レベルに差について検討した。次に、中皮細胞株(Y-MESO-27)および不死化中皮細胞株(MeT-5A)を培養し、培養開始期、対数増殖期、増殖停止期のそれぞれでセルライセイートを抽出して、YAPと結合するTEADを免疫沈降法にて比較検討した。その結果、TEAD3およびTEAD4が増殖停止期においてもYAPとの結合が持続することが明らかとなった。さらに、RNA干渉法によりTEAD1-4を個別にノックダウンしたところ、TEAD2, TEAD3のノックダウンで中皮腫細胞株の増殖が強く抑えられた。以上の結果は、YAPとTEAD転写因子の結合を阻止する上では、特定の(特にTEAD3)を抑制することが中皮腫細胞の増殖を阻止するためには最も効果的であることを示唆した。本研究計画の推進により、YAPの恒常的活性化にともなう細胞増殖・浸潤に際し、転写因子TEAD側でもその機能的な差を有することが明らかとなった。悪性中皮腫細胞株で高頻度のホモザイガス欠失が認められる、代表的な腫瘍抑制遺伝子であるCDKN2A/ARF遺伝子に着目してバイオツール(細胞膜透過性機能ペプチド)を用いたin vitroにおける検討を行った。CDKN2A (蛋白質はp16INK4Aおよびp14ARFをコードする)の不活性化した4つのヒト悪性中皮腫細胞株(NCI-H2052、NCI-H2373株、および当センターで樹立したY-MESO-12、Y-MESO-30株)および、p16INK4A/p14ARFのタンパク発現が正常である不死化正常中皮細胞株(MeT-5A)をコントロール細胞株として用いて実験を行った。蛍光標識タンパク(FITC)およびp16INK4Aの機能を回復させるために必要な最小の配列(p16 MIS)にD-鏡像異性体アルギニンを9つ付加したペプチド(r9、r9-p16 MIS)の2種類の細胞膜透過性機能ペプチドを作成して使用した。蛍光標識したポリアルギニンペプチド(r9)を培養した細胞株へ投与した。ペプチドを投与した48時間後にトリプシン処理をして細胞を回収し、蛍光顕微鏡で観察したところ、いずれの細胞でもペプチドが細胞内へ取り込まれていることが確認された。さらに、r9-p16 MISペプチドを投与し、形態学的な変化を観察したところ、20 micromol/Lの濃度のペプチドを投与した場合には顕著なアポトーシス様の形態学的変化を認めた。本年度の研究により細胞膜透過性機能ペプチドが複数の中皮腫細胞株に効率よく取り込まれ、またその腫瘍抑制性の機能を果たすことが明らかとなった。本年度は悪性中皮腫細胞において最も高頻度に不活性化しているCDKN2A/ARF遺伝子に着目して検討を進めた。

細胞膜透過性機能ペプチドはその配列によって、ヒトの癌の種類や組織型、増殖状況などの培養条件によって細胞内への取り込み率が著しく異なる場合があるが、今回用いたD-鏡像異性体アルギニンを9つ付加したペプチド(r9)が、検討した4つの全ての中皮腫細胞株に比較的効率よく取り込まれることが確認できた。さらに、p16INK4Aの機能が不活化している中皮腫細胞株にp16INK4Aに関する機能回復性の最小配列ペプチドを導入し、それぞれの中皮腫細胞株にアポトーシスを誘導できたことは、細胞膜透過性機能ペプチドを用いた本アプローチが新たな中皮腫治療戦略の候補として極めて有望であることを示したものと考えられた。本年度の検討ではポリアルギニンを付加したペプチドは中皮腫細胞にもよく取り込まれると共に、p16 MISの配列にポリアルギニンを付加することでp16INK4Aが不活性化した中皮腫細胞でアポトーシスを誘導できる可能性が示唆された。ただ、実際にp16INK4Aの機能が回復し、p16INK4Aが関与する腫瘍抑制性の細胞内シグナル伝達経路が実際に活性化されることによってアポトーシスを生じたかについてはより詳細な機能解析が必要であると考えられたのでこの点についての検討を加える。また、今回の実験では不死化正常中皮細胞でもペプチドの取り込みが確認され、アポトーシスを若干、誘導して正常細胞にも障害が認められたことからその点についての検討を加えることも必要と考えられた。さらに、他の腫瘍抑制機能を有するペプチドを導入して、その取り込み効率、細胞増殖抑制やアポトーシス誘導能に関する検討を加え、本研究計画で取り組んでいる細胞膜透過性機能ペプチドを用いた治療戦略が中皮腫の新規治療法として有望かどうか詳細に検討を加える。本アプローチ法により、NF2-Hippoシグナル伝達系の不活性化の結果、恒常的に活性化しているYAPがん遺伝子産物の機能を阻害することが可能かどうか検討を行う。細胞培養のための培地、血清、各種プラスチック培養器具、また細胞生物学的な検討のための各種試薬、キット類などの購入に主として充当する。
ヒト心筋ミオシン重鎖・軽鎖の遺伝子構造及び発現調節機構に関する研究

心筋は,外的刺激に応じて生化学的に適応する.つまり,圧負荷を受けた心房筋は,ミオシン重鎖アイソザイムをα型→β型に変換する.この機構について分子生物学的アプローチを行ってきた.すなわち,ヒト胎児心筋cDNAライブラリーより単離した重鎖cDNAクローンを用いて,圧負荷心房筋RNAに対して,ノーザンブロット法を行い,正常圧心房に比較し圧負荷心房では有意にβ型重鎖mRNAが増加し, α型重鎖mRNAが有意に減少していることを明らかにした.このことは,圧負荷による重鎖アイソザイムの変換がmRNAへの転写レベルで制御されていることを示すものである.軽鎖に関しては,その生理的機能は現在まで明らかではないが,発生段階による制御をうけるため,筋組織におけるアイソザイム変換機序の解明にとって良いモデルと考えられる.そこで,前年度までは単離した軽鎖cDNAクローンの解析を続け,心房筋,心室筋型軽鎖双方の全長を含むクローンの塩基配列分析,特異的な発現(組織,発生段階)を解析した.心房筋型は, 196個,心室筋型は194個のアミノ酸残基より構成され,両者のアミノ酸レベルの相同性は78.4%であり,骨格筋型との比較より高い相同性であった.このことは,心房筋型,心室筋型軽鎖が進化の比較的新しい時期に分岐したことを示し,進化速度・塩基置換率を〓にした計算より,約〓億年前に共通祖先遺伝子から派生したことが明らかとなった.また,これまで蛋白レベルで胎児心室筋に存在する軽鎖が報告されてきたが,今回我々は,それが心房筋型遺伝子の発現による軽鎖であることを明らかにした.また,圧負荷心房筋における心室筋型軽鎖の出現を認め,重鎖遺伝子と同様,軽鎖遺伝子も圧負荷による発現制御を受けることが明らかになった.現在,心房筋型・心室筋型軽鎖遺伝子の単離と構造解析を行い,発現調節領域の機能につきCATアッセイにて検討している.心筋は,外的刺激に応じて生化学的に適応する.つまり,圧負荷を受けた心房筋は,ミオシン重鎖アイソザイムをα型→β型に変換する.この機構について分子生物学的アプローチを行ってきた.すなわち,ヒト胎児心筋cDNAライブラリーより単離した重鎖cDNAクローンを用いて,圧負荷心房筋RNAに対して,ノーザンブロット法を行い,正常圧心房に比較し圧負荷心房では有意にβ型重鎖mRNAが増加し, α型重鎖mRNAが有意に減少していることを明らかにした.このことは,圧負荷による重鎖アイソザイムの変換がmRNAへの転写レベルで制御されていることを示すものである.軽鎖に関しては,その生理的機能は現在まで明らかではないが,発生段階による制御をうけるため,筋組織におけるアイソザイム変換機序の解明にとって良いモデルと考えられる.そこで,前年度までは単離した軽鎖cDNAクローンの解析を続け,心房筋,心室筋型軽鎖双方の全長を含むクローンの塩基配列分析,特異的な発現(組織,発生段階)を解析した.心房筋型は, 196個,心室筋型は194個のアミノ酸残基より構成され,両者のアミノ酸レベルの相同性は78.4%であり,骨格筋型との比較より高い相同性であった.このことは,心房筋型,心室筋型軽鎖が進化の比較的新しい時期に分岐したことを示し,進化速度・塩基置換率を〓にした計算より,約〓億年前に共通祖先遺伝子から派生したことが明らかとなった.また,これまで蛋白レベルで胎児心室筋に存在する軽鎖が報告されてきたが,今回我々は,それが心房筋型遺伝子の発現による軽鎖であることを明らかにした.また,圧負荷心房筋における心室筋型軽鎖の出現を認め,重鎖遺伝子と同様,軽鎖遺伝子も圧負荷による発現制御を受けることが明らかになった.現在,心房筋型・心室筋型軽鎖遺伝子の単離と構造解析を行い,発現調節領域の機能につきCATアッセイにて検討している.
成魚の雌雄生殖腺の性的可塑性の分子機構に関する研究

ヒトも含めて雌雄異体の全ての脊椎動物では、受精時に決定した性は生涯にわたり変わらないと考えられてきた。本研究では、メダカを用いて、成魚の雌雄生殖腺の性的可塑性について解析した。成熟雌魚の卵巣エストロゲン合成を阻害すると、卵巣部分は退化して精巣が形成され、精子形成が進行して妊性のある精子がつくられた。一方、生後3か月の成熟途上にある雄魚をエストロゲン処理すると、精巣部分は退化して卵巣が形成され、妊性のある成熟卵がつくられた。これら雌雄成魚の生殖腺周辺部には、生殖幹細胞とそれを取り囲む未分化生殖腺体細胞が存在し、これらがエストロゲンの有無に反応して生まれつきとは異なる性の生殖腺となると結論された。これまで、受精時に決定した脊椎動物の性は生涯を通じて決して変わらないと考えられてきた(雌雄異体)。ところが最近、研究代表者らは雌成熟魚(メダカ、テラピア)のエストロゲン量を低下させると、成熟雌は成熟雄へと性転換することを見出した。そこで本研究では、成魚の生殖腺(卵巣と精巣)に保持されていると考えられる性的可塑性の分子機構を主として形態学的研究手法を駆使して、細胞・遺伝子レベルではじめて明らかにすることを目指す。本研究の初年度である平成24年度はメダカの雌雄成熟魚を用いて、雄魚(XY)にはエストロゲン(E2)処理、雌魚(XX)にはエストロゲン合成阻害剤(芳香化酵素阻害剤、AI)処理を行い生殖腺の形態変化を調べた。3-60日間処理した後、E2やAIを含まない飼育水で120日まで育てた。E2-XY群では成熟精巣中に小型の卵母細胞が形成され、gsdfやsox9a2の発現が抑制された。また、精巣内周辺に存在する初期生殖細胞はE2処理により急速にmitosisを開始した。一方、AI群では15-30日処理群では卵母細胞の退行が起こり、60日処理群で機能的な精巣(精子の出現)が形成され、gsdfやsox9a2の発現は強く促進された。また、卵巣腔周辺に存在する初期生殖細胞でのmitosisはゆっくりと進行した。これらの結果から、メダカの成熟雌雄生殖腺における生殖幹細胞(GSC)の存在が示唆された。次に、成熟精巣でのGSCの存在をさらに明確にするために、パコール細胞分離法を用いて初期生殖細胞(GFR1a陽性)を単離した。これらの単離生殖細胞は幹細胞のマーカー遺伝子(oct4, nanog等)に陽性を示した。さらに、単離した生殖細胞をE2とともに細胞培養するとmitosisが促進され、前述した幹細胞マーカーの発現が減少した。以上の結果から、メダカの成熟精巣にはGSCが存在すると結論された。そこで本研究では、成魚の生殖腺(卵巣と精巣)に保持されていると考えられる性的可塑性の分子機構を主として形態的研究手法を駆使して、細胞・遺伝子レベルで初めて明らかにすることを目指す。本研究の第2年次にあたる平成25年度は、昨年度は成功しなかった、エストロゲン処理による雄から雌への性転換誘起を重点的に試みた。生後3か月と5か月のXYメダカ雄(QurtE, XY)をエストラジオール-17b(E2)(1 ug/l)を含む飼育水で3日8週間処理し、その間における生殖腺の形態変化を観察した。その結果、生後3か月のXY魚で処理開始3週間後に精巣卵、7週間後に卵巣腔、8週間後に卵黄形成を開始した卵母細胞が観察された。さらに、8週間のE2処理の後にさらにE2無添加の飼育水で30日間飼育したところ、卵黄形成を完了した卵母細胞が多数観察され、排卵も観察された。また、これらの性転換XY雌魚を正常の成熟XY雄魚と交配したところ、正常の受精卵が得られた。E2処理開始後にGsdf遺伝子(精巣関連遺伝子)の発現が減少したが、Rspondin1遺伝子(卵巣関連遺伝子)の発現が上昇した。一方、生後5か月の成熟XY魚を用いた同様の実験では、E2処理開始5週間後に精巣卵が、8週間後に卵巣腔が出現したが、その後30日間E2無添加飼育水で飼育しても成熟卵は得られなかった。

本研究により、生後3か月の精子形成を行っている雄魚の生殖腺でも性的可塑性が保持されていることが示されたことで、メダカ成魚の雌雄生殖腺に保持されている性的可塑性を細胞・遺伝子レベルで明らかにするための実験系が整った。本研究の最終年度(平成26年度)は、これまでの本研究ではじめて見出した、メダカ雄成魚におけるエストロゲン(エストラジオール-17b、E2)による機能的性転換機構を解析した。生後3か月の雄成魚にE2処理を開始して3日後には、雌生殖腺のマーカー遺伝子であるFig1aの発現が増加を示したが、雄マーカー遺伝子であるGsdfやSox9a2などの発現は減少した。また、未分化幹細胞マーカーであるKLF、SAL4、OCT4、NONOG等の発現が減少し、逆に細胞分化マーカーであるGFR1aやNOTCH等の発現は上昇した。一方、処理開始3日後から40日後まで精巣周辺で生殖細胞の増殖が起こった。この時、細胞分裂マーカーであるBRDUの発現は、E2処理開始前には散在的な発現を示したが、E2開始20日から40日後には、上記の精巣周辺の生殖細胞に限って強い発現が観察された。この間、E2処理によってBRDU陽性のクラスター数は変化せず、陽性細胞数のみが増加した。また、これらの細胞では、GFR1aタンパク質が上昇し、OCT4タンパク質は減少することが免疫細胞学的解析で明らかになった。次いで、これらの生殖細胞群をGFR1a coated magnetbeadsを用いて単離して、細胞培養を行った。その結果、これらの生殖細胞はE2処理を開始することにより細胞分裂を開始し、上記の幹細胞としての細胞特性を失う(OCT4遺伝子の発現が減少し、逆に、OLVAS遺伝子の発現が上昇する)ことが明らかになった。これらの結果を総合すると、上記の精巣周辺に局在する生殖細胞群は生殖幹細胞の特性を有し、E2処理により雌生殖細胞へと分化する生殖幹細胞群であると結論された。現在、これらの単離生殖幹細胞を生殖細胞欠如雌雄生殖腺に移植して卵や精子へと成熟するかを調べている。この結果が得られてから、論文として国際誌に投稿する予定である。26年度が最終年度であるため、記入しない。生殖生物学26年度が最終年度であるため、記入しない。当初計画していた、成熟雌魚をAI処理した後の生殖腺における3種のエストロゲン受容体(ER)遺伝子の発現変動の解析を行なうことができなかった。しかし、当初計画していなかった成熟精巣からの初期生殖細胞の単離に成功するとともに、細胞培養条件下でE2の影響を解析することができた。これまでの本研究で、成熟雌魚(XX)のみならず、精子形成が進行しつつある雄魚(XY)にも性的可塑性(生殖腺、性行動)が保持されていることが明らかになったことは大きな進展であると考えられる。また、当初に考えたように、この性的可塑性の保持には生殖腺におけるエストロゲンの有無が重要な役割を果たしていることが確認された。このことに関連して、本研究では、成熟雌魚を芳香化酵素阻害剤(AI)で処理することにより誘起される雄への機能的性転換時における3種のエストロゲン受容体(ER)(a, b1, b2)遺伝子の発現変動を詳しく調べる予定であったが、この解析はまだ実施されていない。ただ、平成25年度の予備的解析から、AI処理開始直後から卵巣におけるERb2の発現が急激に減少することが示された。したがって、成熟雌から雄への性転換時にエストロゲン量とエストロゲン受容体量の減少が起こると考えられる。
静電型リニアイオントラップを用いた準安定状態イオンの禁制遷移寿命測定の精密化

静電型リニアイオントラップを用いて準安定状態にある2価Krイオンの寿命の精密測定を行った。準安定状態の寿命は一般的にイオントラップを用いた分光測定によって決定されてきた。しかし、現状のイオントラップを用いた測定では、残留ガスとの衝突(中性化、散乱)による蓄積イオン数の減少を見積ることが難しい。この見積もりが寿命の測定精度に大きな影響を与える。本研究は、静電型リニアイオントラップを用いることで蓄積イオン数の減少を高精度でモニターし、準安定状態寿命の測定精度を向上させることに成功した。トラップに蓄積された準安定状態イオンからの脱励起光分光のための光学系を製作、設置した。光学系はビューポート、レンズ、バンドパスフィルタ、フォトマルチプライヤ、計測回路から成り、トラップへの1パルスビーム入射あたり0.1光子程度の脱励起光を測定できるように設計された。次に、製作した光学系に対して以下の試験を実施した。(1)イオンの蓄積位置にLEDを設置した。LEDからの光がフォトマルの検出面に最適に収束するように、光学系の微調整を行った。(2)トラップに蓄積されたKr2+の1S0準安定状態からの脱励起光(350nm)を光学系で実際に測定した。フォトマルチプライヤからの信号をモニターしながら、SN比が最大になるように、スレッショルドレベル等の計測回路の調整を行った。(3)Kr2+の脱励起光波長(350nm)と異なる近隣波長のバンドパスフィルタを用いて、バックグラウンド以上の光子数が検出されないことを確認した。これによって、目的波長の光子だけが確実に測定されていることを確認した。最後に、Kr2+の1S0準安定状態からの脱励起光を試験的に短時間測定した。このデータより、本実験装置で決定される寿命値の誤差を見積もった。結果は、トラップへのイオン入射と光子検出を14万回繰り返して測定することで(約80時間の測定時間に対応)、2%の測定誤差の寿命値を決定できることがわかった。この精度は、過去の他グループの測定精度を2倍以上上回る精度である。これらの研究より、準安定状態の放射寿命を高精度で測定できる実験装置の完成という本年度の実施計画を、年度内に遂行することができた。昨年度は、装置の開発と設置およびその試験測定を行い、実験装置を完成させた。本年度はこの装置を用いて1S0準安定状態Kr2+イオンの3P1状態への禁制遷移寿命測定実験を行った。脱励起光の波長は350nmである。測定は、データーの統計精度をあげることと測定の再現性を確認する目的で、3回行った。1回の測定あたりトラップへのパルスイオンビーム入射と光子検出を約10万回(約70時間の測定時間に対応)繰り返した。3回の測定結果はそれぞれ誤差の範囲で一致しており、実験の再現性が確認された。この3回の測定結果の平均より、1S0準安定状態Kr2+イオンの3P1状態への禁制遷移寿命は17.4±0.4 msと決定できた。測定誤差は2%であり、この精度は過去の他グループの測定精度を2倍以上上回る精度である。これにより、当初の研究目的であった『準安定状態にあるイオンの禁制遷移寿命の精密測定』を、一種類の準安定状態イオンに対してだけではあるが、達成できた。得られた結果は過去の他グループの測定結果と誤差を考慮しても一致せず、大きな値を示したが、過去の理論計算値とはよく一致している。過去の測定値と異なる理由を探るために、トラップ内残留ガスとの衝突によるイオン損失の補正法を他グループの実験と同じ方法にして、再度寿命測定をおこなった。しかし、得られた寿命値に変化はなかった。これまでの本研究課題の成果を論文にまとめ発表した。今年度は、トラップに蓄積された1S0準安定状態Ar2+の放射寿命を測定することを目指した。Ar2+の1S0準安定状態は519 nmおよび311 nmの光子を放出してそれぞれ1D2および3P1状態へ遷移する。実験は、311 nmの放出光子数の時間依存を計測することで寿命を求めることにした。すでに昨年度、Kr2+の1S0準安定状態の放射寿命測定には成功している。しかし、Ar2+は以下の理由でKr2+に比べて単位時間あたりの検出光子数が少ないために、測定が難しくなると予想された。1) Kr2+に比べて1S0状態の寿命が一桁長い、2) Ar2+の1S0→3P1の分岐比は56%であり、Kr2+の92%に比べて小さい。3)検出波長が変わるために光学系の検出効率の低下が生じる。そこで、光学系を改良することで光子の検出効率を高めることを試みた。具体的には、1)光学検出系(ビューポート、集光レンズ、バンドパスフィルタ、光電子増倍管)の対面に反射率の高いアルミ製の球面ミラーを設置し、光学検出系と反対方向に放出された光を検出できるようにした。2)311 nmの波長に対しても透過率の高いビューポートに交換した。これらにより、約5倍の検出効率の向上が図れた。統計を向上させるために測定を3回行った。それらの結果はすべて誤差の範囲で一致した。3回の測定の重み付き平均より得られたAr2+の1S0準安定状態の放射寿命は165 ±21 msであった。

結果には13%の誤差があり、目標としていた5%以内の誤差より2倍大きい。これは、光学系の改良を行ってもまだ光子の検出信号数が少ないためである。この改善のために、光子検出系を光源にさらに近づけることや光ファイバーの導入など、観測立体角を拡大するためのさらなる手段の検討を行った。これまでの本研究の成果を国内および国際学会で発表した。静電型リニアイオントラップを用いて準安定状態にある2価Krイオンの寿命の精密測定を行った。準安定状態の寿命は一般的にイオントラップを用いた分光測定によって決定されてきた。しかし、現状のイオントラップを用いた測定では、残留ガスとの衝突(中性化、散乱)による蓄積イオン数の減少を見積ることが難しい。この見積もりが寿命の測定精度に大きな影響を与える。本研究は、静電型リニアイオントラップを用いることで蓄積イオン数の減少を高精度でモニターし、準安定状態寿命の測定精度を向上させることに成功した。本年度の実施計画は、開発した装置を用いて1S0準安定状態Kr2+イオンの3P1状態への禁制遷移寿命の測定実験を行うことであった。この測定を年度内に遂行でき、過去の他グループの測定に比べより高い精度で測定できていることを示すことができた。原子・分子物理学引き続き、Kr以外の希ガスイオンの禁制遷移寿命測定を行い、本研究課題である精密測定が達成されていることを最終的に確認する。新たな測定結果を含め、これまでの研究成果をまとめて論文や国際学会で発表する。本年度の実施計画は、準安定状態にあるイオンの放射寿命を高精度で測定できる実験装置の完成であった。この計画を、試験測定も含めて、年度内に遂行することができた。平成26年度予定していた国際学会発表を,平成27年度開催の国際学会での発表に変更したため。製作した装置を用いて、1S0準安定状態Kr2+イオンの3P1状態への禁制遷移寿命測定実験を行う。この準安定状態に対する過去の他グループの測定誤差は5%程度である。本装置によって、誤差2%以下の精度で寿命値を決定し、過去の測定値、理論値との比較、検討を行う。イオン源ガスの購入、目的のイオンの発光波長に合わせたバンドパスフィルタの購入、および国際会議での発表のための旅費に用いる。本年度は、実験装置の製作、試験の段階のため、他研究で用いているフォトマルチプライヤとそのハウジング、ガス試料を適宜借用しながら、研究を行った。そのため、それら物品の購入に予定していた費用が、本年度中に使用されなかった。装置の完成が確認されたため、本研究は寿命値の長時間測定実験の段階に進む。そこで、これまで転用していたフォトマルチプライヤとそのハウジングを本研究専用のものに交換する。また、長時間測定に必要なイオン源ガス試料を購入する。あとは計画通り、中性粒子検出用のマイクロチャンネルプレートの交換、および研究成果の学会発表のための旅費に支出する。
喫煙者と非喫煙者における歯周炎の病態の相違に対する疫学的検討

一般的に、歯周疾患の進行に伴い、歯肉からの出血傾向が強くなると言われている。しかし、我々らは、「唾液潜血試験紙法」により、唾液中潜血反応の半定量化を行い歯周疾患の有病状況との関連性を調べたところ、喫煙群では歯周病の進行と潜血反応が大きくなる傾向が認められなかった。すなわち、喫煙者の歯周炎では、一般に考えられている歯周疾患の進行と異なり、炎症の進行に伴って必ずしも歯肉からの出血が増加しないと思われる。始めに、肉眼的な比色を行う「唾液潜血試験紙法」に比べ、ヒト血液に対して特異的に反応しかつ定量性に優れており、便潜血反応試験用に近年開発されたイムノクロマト法の唾液での実用性を検討し、可能性が示唆された。そこで、これを用い、唾液中の潜血濃度を測定した。また、喫煙からの影響を考える際には、1日あたりの喫煙本数を指標にすることが多かったが、今回はあわせて、喫煙曝露量を唾液中コチニン濃度で評価した。以上より、間接的に歯周組織の微小循環に対する喫煙の影響を調査し、喫煙者と非喫煙者間で歯周炎の病態の相違を明らかにするために、成人男性204名を対象とし検討を加えた。その結果、非喫煙群では歯周疾患の悪化に伴い唾液中の潜血濃度が増加する傾向にあった。しかし、歯周炎に進行した喫煙群ではむしろ潜血濃度低いものが増える傾向にあった。また、唾液中のコチニン濃度により喫煙曝露量を評価して、喫煙量と歯周疾患有病状況を比較検討したところ、喫煙が歯周疾患に有意な影響を及ぼすことが示された。さらに、喫煙群の歯周疾患重症のものでは唾液中コチニン濃度が高いほど潜血濃度が低下する傾向が認められた。したがって、歯周組織局所の血液循環に喫煙の影響を強く受けたものが、歯周疾患をより進行させている可能性が示唆された。唾液中潜血濃度の定量的測定を金コロイド凝集法を応用しようとしたが、試薬等の製造中止があった。そのため、新しく開発されたイムノクロマトグラフ法によって、簡便に定量化が可能かについて検討を加えた。この方法の原理は以下のようである。唾液に含まれるヘモグロビンは、反応試薬中の赤色ラテックス標識抗体ヒトヘモグロビンマウスモノクローナル抗体と結合し免疫複合体を形成し、シート上に固相化された抗ヒトヘモグロビンモノクローナル抗体に捕捉され赤色ラインを形成する。本原理を用いて唾液中ヘモグロビンを検出した。また、多くの簡易キットでは、肉眼で色調を判定する半定量的なものであるが、本法では、通常のフラットスキャナーで色調を取り込み、パソコンを用いての定量化も試み、成人から採取した安静唾液に標準血球を添加し、回収試験を行った。さらに、キットの感度と通常歯周疾患スクリーニングで要求される潜血濃度を考慮し、希釈率の検討もあわせて行った。その結果、保存用バッファーで10倍希釈した時に回収率、検量線ともに良好であった。ついで、10名の喫煙者をモデルに、喫煙時間をはさみ、連続的に唾液を採取し、潜血濃度の推移について、喫煙行動との関連性について検討を加えたが、被験者からの唾液潜血がほとんど得られず、再度実験方法の検討が必要となった。成人186人からの唾液採取と歯周疾患検診を実施したところ、非喫煙者では、潜血濃度と歯周疾患、特にポケット深さに正の相関が得られたが、喫煙者では得られなかった。

唾液中のコチニン濃度も並行して測定した結果、コチニン濃度が高いほど、相関性がなくなる傾向が示唆された。喫煙状況と歯周疾患罹患状態の関連性については、幾多の報告がある。しかし、疫学的に歯肉炎だけで評価した場合、喫煙者群と非喫煙者群には差がなく、むしろ喫煙者のほうが低い傾向にあることを申請者らも疫学的研究で得ている。さらに、申請者らは、「唾液潜血試験紙法」により、唾液中潜血反応の半定量化を行い歯周疾患の有病状況との関連性を調べたところ,喫煙群では歯周病の進行と潜血反応が大きくなる傾向が認められなかった。すなわち、喫煙者の歯周炎では、一般に考えられている歯周疾患の進行と異なり、炎症の進行に伴って必ずしも歯肉からの出血が増加しないと思われる。これらは、歯周組織における微小循環が、喫煙によって抑止され、その結果生じたものと考えられる。そこで、今回、肉眼的に比色を行う「唾液潜血試験紙法」に比べ、ヒト血液に対し特性が強くかつ定量性に優れており,便潜血反応試験用に近年開発され、昨年度検討を加えたイムノクロマト法も用い、喫煙者と非喫煙者で同程度歯周ポケットが存在する場合、どちらにどの程度唾液中の潜血があるかを測定し、間接的に歯周組織の微小循環に対する喫煙の影響を調査し、喫煙者と非喫煙者間で歯周炎の病態の相違を明らかにし、あわせて唾液中コチニン濃度など関連性について、成人男性204名を対象とし検討を加えた。その結果、非喫煙群では歯周疾患の悪化に伴い唾液中の潜血量が増加する傾向にあったが,歯周炎に進行した喫煙群ではむしろ潜血量の少ないものが増える傾向にあった。また,唾液中のコチニン濃度により喫煙量を評価して,喫煙量と歯周疾患有病状況を比較検討したところ,喫煙が歯周疾患に及ぼす有意な影響を示すことができた。さらに,歯周疾患が軽症なものでは,唾液中のコチニン濃度と潜血量の間に関連性はなかったが,重症のものでは唾液中コチニン濃度が高いほど潜血量が減少する傾向が認められた。したがって,歯周組織局所の血液循環に喫煙の影響を強く受けたものが,歯周疾患をより進行させている可能性が示唆された。
歯周組織におけるリゾリン脂質シグナルと歯根吸収メカニズムの解析

歯根膜は歯に加わる力学的負荷を感知し、歯の移動をコントロールする重要な組織である。歯根膜への力学的負荷はATPの放出、Ca2+流入など様々な細胞応答を示すが、脂質で合成される細胞膜でのリン脂質メディエーターの機能や力学的負荷との関連については明らかになっていない。シグナリング分子の働きをするリゾホスファチジン酸(LPA)は細胞膜外層の主成分であるホスファチジルコリンから合成され、また我々は歯根膜細胞には複数のLPA受容体が強く発現していることを明らかにした。そこで本研究では、力学的負荷によって誘導されたLPAが、歯周組織でどのような細胞内シグナルとクロストークするのかを解明する.歯根膜は歯に加わる力学的負荷を感知し、歯の移動をコントロールする重要な組織である。そこで本研究では、力学的負荷によって誘導されたLPAが、歯周組織でどのような細胞内シグナルとクロストークするのかを解明する.
血管付き神経移植による視神経再生促進作用の解析

視覚をになう網膜神経節細胞は、その軸索である視神経が傷害されると軸索を再生できず、細胞死に陥る。一方、切断端に末梢神経片を遊離自家移植することで軸索が再生することが知られていたが、その割合は数%にすぎず、未だ臨床応用が困難な状況であった。我々のグループは末梢神経を栄養血管つきで移植することで網膜神経節細胞の軸索再生を著しく促進出来ることを見いだした。また、再生軸索は組織学的にも正常に近い形態を回復していた。血管付きでの移植は従来の遊離神経移植よりも軸索再生能が高いことが明らかになった。以上から、血管付き神経移植片による視神経の再建は有望な手法であると考えられた。網膜神経節細胞は、その軸索である視神経を切断されると95%以上が細胞死に陥る。また細胞死を免れても、その軸索は再生しない。ところが、視神経切断端に末梢神経片を吻合・移植すると、細胞死は抑制され、一部の網膜神経節細胞は軸索を再生する。しかし、軸索を再生し、視機能再建にかかわる網膜神経節細胞は数%に過ぎない。従来の末梢神経移植は遊離神経移植であり移植片内のシュワン細胞の大半は死滅し線維化が起こる。一方、移植片となる神経を栄養血管とともに採取し、栄養血管を移植先付近にある血管と吻合すると、シュワン細胞の生存率がほぼ100%となり、移植片の線維化を完全に防止できることから、網膜神経節細胞の軸索再生を促進することが期待される。そこで、ラット・フェレットの視神経切断端に栄養血管付きの坐骨神経を移植し、生存・軸索再生の促進効果を従来の血管無し移植と比較する。増強された網膜神経細胞死阻止と視神経再生の分子機構を明らかにして、臨床応用に耐えうる「視神経再生」技術の確立を目指し研究を進めた。ラット網膜神経節細胞の軸索は殆どが上丘に投射する。移植神経片を、眼球と上丘の間を架橋するように移植することは、将来の視覚機能再建という目的には欠くべからざる手技であるが、従来、ラットでは採取しうる神経の長さやラットの解剖学的特徴により極めて困難であった。本年度の実験の中で、我々は、新たに開発した移植手法をもちいることで、この問題に取り組み、眼球と上丘とを架橋するような移植手法を開発できた。この手法を用いた場合における網膜神経節細胞の再生が、架橋しなかった場合との比較で増強しうるかを検討中である。平成21年度は、視神経切断端に血管付きで移植する末梢神経として、用いる神経の種類や術式について重点的に検討した。坐骨神経を用いた神経移植では該当肢の重篤な機能障害を残すため臨床への応用は困難である。そこで、それ以外の末梢神経についても検討した。(1)坐骨神経、(2)大腿神経、(3)顔面神経、(4)正中神経の4種の神経について検討した。坐骨神経と大腿神経は、神経片を栄養動・静脈付きで単離し、これを外頚動静脈と微細吻合術を施行した。顔面神経と、正中神経は、神経片の栄養血管を残した上で切断した。それぞれの神経の近位端を視神経切断端へ吻合移植する一方、遠位端は切断し、自由遊離片とした。坐骨神経・大腿神経を利用した場合は、血管吻合に長時間を要するため手術に10時間ほど要し、術者の労力が大きいばかりでなく、手術侵襲が大きく結果が安定しないことが判った。一方で、顔面神経、正中神経を用いた場合は、血管吻合に要する時間が不要となるため手術時間が約4時間となった。一方で、大腿神経、顔面神経は神経の直径が視神経の直径よりはるかに小さく、視神経全体を含むような吻合術が困難であった。また、顔面神経利用時には、特に涙腺の機能が侵されることが多く、角膜表面に障害が起こり、結果が安定しなかった。以上の結果より、視神経切断端への栄養血管付き末梢神経移植には、今のところ、正中神経を用いるのが最良と考えている。その他、視神経との吻合術や球後部の視神経へのアプローチ、正中神経の単離法等の条件検討を行い、ほぼその手法は確立できている。現在、栄養血管なし移植を陰性対照とし、血管付き移植による視神経軸索の再生促進効果を、網膜神経節細胞の逆行性標識やマーカー抗体C38による標識により慎重に評価している。【目的】平成21年度までの成果により、視神経切断端に血管付きで移植する末梢神経として、正中神経を用いるのが最良であるとの結果が得られた。