hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
炭疽病菌への非宿主抵抗性に必要な植物因子の研究

シロイヌナズナlic1変異体は,不適応型菌によって壊死斑を形成し、その原因遺伝子はMACPFドメインを有する機能未知タンパク質をコードする。本研究では、本変異体の壊死斑形成は菌の侵入を伴っておらず、lic1変異体が非宿主抵抗反応において不適切な細胞死を引き起こすこと、そして、LIC1による細胞死制御には、PEN2による抗菌物質合成が関与することを明らかにした。また,LIC1が細胞膜に局在すること、LIC1ホモログと協調して機能することを示した。さらにEDR1およびGSH1が非宿主抵抗性に関与することを発見した。非宿主抵抗性は、植物種生存を根幹で支える種レベルの強固かつ安定な抵抗性である。申請者は、シロイヌナズナと炭疽病菌を用い、非宿主抵抗性を支える分子機構の解明に取り組んでおり、これまでに、シロイヌナズナが細胞死に依存しない侵入阻止型抵抗反応により非宿主炭疽病菌を撃退していることを明らかにしている。さらに、申請者は、この非宿主抵抗性が部分的に崩壊した、独自のシロイヌナズナ変異体(lic変異体)の分離に成功しており、そのうちのlic1変異体に対するポジショナルクローニング解析により、原因遺伝子であるLIC1遺伝子の同定に成功している。申請研究において、(1)LIC1遺伝子がコードする機能未知のタンパク質の生理機能の解明、(2)LIC1タンパク質の分子機能の解明、(3)lic2変異体の原因遺伝子の同定および機能解析、(4)lic1変異体を用いた非宿主抵抗性の多層構造解析、を提案する。これらの研究を通じて、非宿主抵抗性に必要なLIC遺伝子の機能を解明するとともに、非宿主抵抗性の多層構造の背景にある分子的アウトラインを明らかにする。研究代表者のグループが同定したシロイヌナズナの非宿主抵抗性に関与する遺伝子LIC1を中心に、研究を推進した。シロイヌナズナを宿主としない炭疽病菌(不適応菌)は、野生型シロイヌナズナに対しては見た目上、何の変化も引き起こさないのに対し、lic1変異体に対しては明確な壊死斑を形成する。本年度は、まず、lic1変異体上における不適応菌の感染行動の詳細を調査した。その結果、不適応型菌は、本変異体において侵入率の上昇を示さなかった。この結果は、抗菌物質生産に関わるPEN2遺伝子の変異体において、顕著な侵入率の上昇が見出されるのとは対照的であった。したがって、lic1変異体の壊死斑は、菌侵入に依存するのではなく、抵抗反応時の細胞死の抑制能の欠損によると推定された。この考えは、lic1変異体にPAMPsの一つであるキチンを処理すると壊死斑形成が誘導された結果により、さらに支持された。また、lic1変異体における壊死斑形成(細胞死)は、pad4やesd16変異の導入によって部分的に抑制され、lic1変異依存的な細胞死には、サリチル酸経路が関与していることが判明した。また、驚くべきことに、lic1変異体に対して、pen2変異を導入した結果、lic1変異依存的な細胞死が部分的に抑制されることが明らかとなった。このことは、PEN2がその合成に関与する抗菌物質が、lic1変異体における細胞死に関与していることを強く示唆している。LIC1がコードするタンパク質は、MACPF(membrane attack complex and perforin)と呼ばれる膜挿入ドメインを有している。現在、LIC1が、細胞膜上に局在し、抗菌物質などの輸送に関わっているという仮説をたて、検証を開始している。さらに、欠損することによりlic表現型を示す新たな遺伝子として、EDR1と呼ばれる遺伝子の同定に成功している。不適応型炭疽病菌を野生型シロイヌナズナに接種した場合、その非宿主抵抗反応により、菌の侵入行動は完全にブロックされ、見た目上、シロイヌナズナには明確な変化は引き起こされない。研究代表者は、この不適応型炭疽病菌によって、明確な壊死斑が形成されるlicl変異体、およびその原因遺伝子LIC1 (NSL1)の同定に成功している。昨年度までの研究により、licl変異により、病原菌攻撃時における細胞死が誘導されること、さらに、このlicl変異依存的な細胞死誘導が、pen2変異導入によって抑制されることを明らかにしていた。今回、PEN2関連抗菌物質を排出すると推定されているABCトランスポーター遺伝子PEN3の変異をlicl変異体に導入した。その結果、licl pen3二重変異体においては、licl単独変異体と比較して、さらに壊死斑形成が激しくとが判明した。この結果より、licl変異により、PEN2がその合成に関与する抗菌物質が細胞内に蓄積され、この蓄積が細胞死を誘導するという仮説が更に支持された。

また、LIC1とGFPの機能的な融合タンパク質をシロイヌナズナに発現させた結果より、LIC1の細胞膜への局在が示唆された。さらに、LIC1の2種類の相同遺伝子について、欠損変異体を分離し、不適応型炭疽病菌を接種したが、licl表現型は観察されなかった。一方で、lic表現型を示す新たな遺伝子として、EDR1と呼ばれる遺伝子の同定に成功している。今回、このedr1変異体に対し、マイクロアレイ解析を実施した結果、ディフェンシンと呼ばれる抗菌タンパク質をコードする遺伝子の発現が、このedr1変異体において著しく低下していることが明らかとなった。不適応型炭疽病菌を野生型シロイヌナズナに接種した場合、その非宿主抵抗反応により、菌の侵入行動は完全にブロックされ、見た目上、シロイヌナズナには明確な変化は引き起こされない。研究代表者は、この不適応型炭疽病菌によって、明確な壊死斑が形成されるlic1変異体、およびその原因遺伝子LIC1(NSL1)の同定に成功してしる。昨年度までの研究により、lic1変異依存的な細胞死誘導が、PEN2が関与する抗菌物質合成と関連することを明らかにしていた。今回、lic1変異体および関連変異体について、代謝解析をおこなった結果、lic1変異によって、その蓄積が増大する2種類のインドール系化合物の同定に成功した。lic1変異体におけるこれらの物質の蓄積増大は、pen2の変異を導入することで、抑制された。pen2変異の導入は、同時にlic1変異体の細胞死を抑制することから、同定した2種の物質が、lic1変異体における細胞死誘導に関わっていると推定された。また、EDR1遺伝子の変異は、lic表現型を引き起こすこと、さらに、ディフェンシン遺伝子の発現が、このedr1変異体において著しく低下していることを明らかにしているが、このedr1変異体におけるデフェンシンの発現が、MYC2と呼ばれる転写因子をコードする遺伝子の変異を導入した場合、復帰することを発見した。このedr1 myc2二重変異体においては、edr1変異体と比較して、非宿主抵抗性が回復していることを明らかにした。さらに、ディフェンシン遺伝子をedr1変異体において恒常的に発現させた場合も、その抵抗性の回復が起きることを見出した。これらの結果より、炭疽病菌への非宿主抵抗性には、抗菌タンパク質であるディフェンシンの発現誘導が必要であることを明らかにした。研究代表者は、不適応型炭疽病菌(ウリ類炭疽病菌)によって、明確な壊死斑が形成されるシロイヌナズナlic1変異体、およびその原因遺伝子LIC1(NSL1)の同定に成功している。昨年度までの研究により、lic1変異依存的な細胞死誘導には、PEN2が関与するグルコシノレート系抗菌物質の合成が必要であることを明らかにしている。PEN3がコードするABCトランスポーターは、flg22処理時のカロース合成に必要であることが報告されており、PEN3がPEN2関連抗菌物質を排出することにより、カロース合成が誘導されることが示唆されている。今回、flg22処理時のカロース合成を1fo1変異体で調べた結果、pen3変異体とは異なり、そのカロース合成は誘導され、LIC1はflg22処理時におけるPEN2関連抗菌物質の排出には必須ではないことが示唆された。
新規器官培養法によるヘルトビッヒ上皮鞘形成過程のイメージングと発生機序の解明

臼歯の歯根形成にはヘルトヴィッヒ上皮鞘(HERS)が重要な役割を果たすことが知られているが、その中で理解が乏しいHERS発達のメカニズムについて今回検討した。我々は2つのオリジナルな器官培養系を用いて上皮成長因子epidermalgrowthfactor、インスリン様成長因子insulin-like growthfactor-Iが、それぞれ歯冠形成からHERS形成の移行時期、HERSの伸長・発達に重要な作用を示すことを明らかにした。ヘルトヴィッヒ上皮鞘(HERS)の形成過程を観察するためのSlice cultureの培養条件の検索を行った。その結果、歯胚は生後(P)01日齢のマウス下顎臼歯歯胚、厚さは200μm、包埋材は5%寒天とすること、またスライスした切片はTrowell法にて培養することが培養中の組織の立体構築の維持やその後の発達過程を観察するのに適していることが分かった。現在、この条件で生体色素をマイクロインジェクションする実験を試みている。成長因子のHERSの発達に与える影響に関しては、特にepidermal growthfactor(EGF)において著しい変化が見られた。免疫組織化学的な検索において、EGF receptorは胎生期歯胚から生後HERS形成が開始されるまでのサービカルループに発現していたが、HERSが形成されると、この部位からしだいに減少し、最終的に消失した。この歯冠形成期から歯根形成に至る過程で見られるEGFの効果を検討するために、我々が独自に考案した器官培養系と従来からのTrowell法を用いて、さまざまな発達段階の歯胚の器官培養を行った。EGFを添加して培養することによって、歯冠形成期(P0-3)の歯胚では星状網の領域が拡大し、HERS形成期(P5-7)の歯胚でも内外エナメル上皮の間に細胞層が残存しHERS形成が阻害されることが判明した。これは星状網細胞の増殖促進作用により生じた結果であることも分かった。またEGF receptorの阻害剤を添加して培養したHERS形成期歯胚では正常なHERSの発達を示した。一方で、歯根形成期(P9-)の歯胚ではEGFの影響は見られず正常なHERS形成が観察された。以上のことからHERSの発達・形成にはEGFが重要な調節因子として機能していることが判明した。昨年度確立したslice culture法を用いてヘルトヴィッヒ上皮鞘(HERS)細胞の動態に関して2つの実験を行った。まずGFP(Green Fluorescence Protein発現)マウスの生後臼歯歯胚を用いてサービカルループの先端部、別の系では外エナメル上皮細胞に生体色素DiIをマイクロインジェクション後のサービカルループ付近、それぞれをリアルタイムイメージングにより観察した。その結果、サービカルループ周辺でDiIを保持した外エナメル上皮細胞が、HERSの形成過程と共に先端方向へ移動していく様子、内エナメル上皮細胞の移動はその反対方向への流れを示すことを動画映像として捉えることができた。成長因子のHERSの発達に与える影響については、ここではepidermal growthfactor(EGF)に関してのみ記載する。昨年度行ったEGFと星状網の関係を検証するため切歯を用いた。切歯は舌側に歯根様のHERS唇側にapical budが存在し、apical budは星状網を維持していることが知られる。切歯歯胚にEGFを添加して培養すると、EGF添加群はHERSの内外エナメル上皮間で、本来ほとんど観察されない星状網の領域が拡張した。一方EGF receptorの阻害剤の添加群では、HERSはもとよりapicalbudの星状網も退縮する傾向が観察された。昨年度の結果と併せ、EGFは星状網の維持、さらにはHERS形成に関わっていることが追証できた。本研究課題において、独自の培養法を確立することができ、また我々の立てたHERS形成に関する仮説を検証することができた。中でもHERSの発達・形成にはEGFとIGF-Iが重要な調節因子として機能していることが判明した。
腫瘍血管へ免疫細胞動員活性を誘導する生体プログラムの賦活化と抗腫瘍免疫監視の強化

【1】腫瘍組織へ向かう免疫細胞の動員制御機構の解析:免疫細胞の腫瘍組織への動員制御機構を明らかにするために、リンパ球を効率的に動員する高内皮細静脈(HEV)、非HEVおよび腫瘍血管に由来する血管内皮細胞の遺伝子発現の比較解析をマイクロアレイ法で行った。HEVあるいは腫瘍血管に選択的に発現する遺伝子に注目して解析をすすめ、腫瘍血管で高発現するがHEVで発現が強く抑制されている30種の遺伝子群を特定した。この遺伝子群は細胞接着分子や特定のサイトカインを含み、その発現パターンより、免疫細胞動員に対して抑制的に働く可能性が示唆された。【2】血管系を介する免疫細胞動員を促進する細胞接着制御系の機能的な意義:nepmucinはIgドメインとムチンドメインをもつ新しい細胞接着分子である。nepmucinは血管内皮細胞の管腔面ばかりでなく、ジャンクション部位にも分布する。野生型および変異nepmcuinを発現する細胞を用いてnepmucinの細胞接着制御における意義について解析したところ、nepmucinがホモフィリックな細胞接着を媒介することが示された。またこの細胞接着にはnepmucinのIgドメインが必須であり、Ca^<2+>要求性であることが示された。さらにnepmucinを発現させた血管内皮細胞とリンパ球との相互作用を解析した結果、nepmucinはリンパ球のtransmigrationを促進することが示された。リンパ球はnepmucinを発現しないことから、リンパ球にはnepmucinと結合してtransmigrationを促進するnepmucinとは異なる受容体が発現することが示唆された。一方、種々の腫瘍細胞とnepmucinの結合を解析した結果、特定の白血病細胞がnepmucinのIgドメインに結合することが示された。これら結果は、nepmucinがホモフィリックあるいはヘテロフィリックな細胞接着を制御し、リンパ球の動員とともに特定の白血病細胞の血行性浸潤に関与する可能性を示唆している。【目的】腫瘍血管内皮細胞に適切な免疫細胞動員シグナルを誘導できれば、抗腫瘍エフェクター細胞の選択的ながん組織への動員が可能になる。本年度は発生過程で二次リンパ組織に特異的に誘導される高い免疫細胞動員活性をもつ特異な小静脈(高内皮細静脈:HEV)の誘導プログラムの解明とその人為的な制御を目的として解析を進め、以下の成果を得た。【結果と考察】1.腫瘍血管へ免疫細胞動員活性を誘導する内因性プログラムの解析:血管系への免疫細胞動員活性の誘導機構を明らかにするために、ES細胞を用いたin vitro分化誘導系の樹立を試みた。その結果、ES細胞からFlk-1^+中胚葉系細胞を分取したのち、リンパ組織由来ストロマ細胞と共培養すると、一部の細胞にVE-cadherinとともに発生過程のHEVに発現しリンパ球動員に重要な役割をはたすMAdCAM-1が誘導できることが示された。また、MAdCAM-1^+HEVの機能的な成熟は胎生後期から新生仔期に急速に進行する事に着目してcDNAアレイ解析を行い、新生仔期のHEV内皮細胞に高い発現を示す遺伝子群を特定した。2.血管系を介した免疫細胞動員を促進する新しい細胞接着制御系の同定:血管系へ免疫細胞動員活性を誘導するシグナル伝達系の新しい標的分子の特定を目的として、血管内皮細胞とリンパ球の相互作用を制御する細胞接着分子を探索し、ムチンドメインとIgドメインの両者をもつシアロムチンnepmucinを新たに同定した。nepmucinはムチンドメインへL-セレクチン結合性糖鎖修飾を受けてリンパ球ローリングを制御するとともに、Igドメインを介してICAM-1と協調しケモカイン依存的なずり応力抵抗性のリンパ球接着を促進することを初めて明らかにした。またnepmucinはIgドメインを介して特定の造血系腫瘍を接着することから、がんの血行性転移の制御にも関与する可能性が示唆された。

一方、種々の腫瘍細胞とnepmucinの結合を解析した結果、特定の白血病細胞がnepmucinのIgドメインに結合することが示された。これら結果は、nepmucinがホモフィリックあるいはヘテロフィリックな細胞接着を制御し、リンパ球の動員とともに特定の白血病細胞の血行性浸潤に関与する可能性を示唆している。
自律学習を基盤とした個別対応型日本語授業の基礎的研究および実践モデルの構築

私立中規模大学における「自律学習を基盤とした個別対応型日本語授業」の実践を分析・考察することをとおして、「意識する→計画する(学習目標を決める→学習計画を立てる→評価方法を決める)→実行する→振り返る」という実践の流れがモデル化された。また、研究期間に行われた実践者グループによる振り返りや議論の成果として、「柔軟な意識をもった教師」の存在という要素の重要性も今後の検討課題として浮かび上がってきた私立中規模大学における「自律学習を基盤とした個別対応型日本語授業」の実践を分析・考察することをとおして、「意識する→計画する(学習目標を決める→学習計画を立てる→評価方法を決める)→実行する→振り返る」という実践の流れがモデル化された。また、研究期間に行われた実践者グループによる振り返りや議論の成果として、「柔軟な意識をもった教師」の存在という要素の重要性も今後の検討課題として浮かび上がってきた本科研は、「自律学習」を基盤とする個別対応型日本語授業(以下、実践機関での名称にならい「チュートリアル」と呼ぶ)について、実践をもとにさまざまな角度から検討し、実践モデルを構築することを目的としている。自律学習についてはさまざまな研究が行われているが、その多くが理論をもとにした研究であり、真に実践をもとにした研究は少ない。本科研においては、研究に関わる者がそれぞれの教育実践の場で自律学習を常に念頭において、自分の実践を振り返り、データ化し、それを分析するという方法を中心としている。平成18年度は科研の初年度であることから、まず、自律学習の基本理念および実践例について調査し、研究の基礎を作ることに力を注いだ。主に国外の学会において、自律学習に関連する発表を行った研究者、実践者へのインタビュー調査を行い、結果をまとめた。また、チュートリアルの実践に関わる多くの教員の協力を得て、実践者の視点による研究テーマを提案してもらい、それぞれのテーマによる小規模な研究プロジェクトを科研内に発足させた。18年度に発足したプロジェクトは以下のとおりである。「チュートリアルに関するイメージのPAC分析」、「日本語の自律学習を支援するPC環境に関する調査研究」、「チュートリアル授業における教師の役割」。これらのプロジェクトは、19年度にも継続研究が行われる予定である。授業の記録は、1年にわたって2つの授業を録音、録画し、データの文字起こしを進めている。本格的な内容の分析は19年度に行う予定である。さらに、情報交換、意見交換を目的として、自律学習に関する研究者を招いての講演会(1回)を行った。また、「学習者の自律を重んじた日本語活動・実践研究会」という名称の研究会を9月と3月に行い、いずれも学内外から30名前後の参加者を得、活発な意見交換の機会とすることができた。平成19年度は(1)自律学習の実践に対して妥当性のある評価方法を見出すこと、(2)大学のみならず日本語学校等の多様な日本語教育現場において自律学習が実践されることを目指して汎用的な実践モデルを構築すること、の2つの目的をかかげて研究を行った。具体的には、プログラムで行っている個別対応型授業に関わった学習者と教師を対象として、研究協力者が複数の調査を行った。調査タイトルは、「学習支援者としての教師の意識の変化」「自律的な学習を目指した教室授業における自己評価シートの役割」「自律学習を目指す授業に対する学習者の態度-学習者は変わったのか-」である。また、個別対応型授業におけるリソースに関して、「教室内と教室外活動を繋げる試み-個人プロジェクトを通して-」という調査を行った。調査結果を参考に、現状の実践内容の問題点を洗い出し、よりよいモデルの構築に結びつける予定である。これらの調査結果については、19年度に2回開催した研究会にて発表し、内容を評価する機会をもった。1回目の研究会では、「チュートリアルをとおして『学習者の自律』を考える」というテーマで、学内で個別対応型授業に携わっている教師による意見交換を行った。2回目の研究会は、「自律を目指す学習によって何が変わったか/変わるか-学習者・教師・学習活動-」というテーマで行った。学外講師による講演「自律外国語学習を考える-定義・分類・構成要素」により理論的枠組みを学んだ後で、実践をとおして学習者および教師は変わったのか、というテーマにそった研究発表および実践報告を行い、学内外の参加者とディスカッションを行った。以上の調査結果および、考察、ディスカッションから得られた結果をさらに検討して、自律学習実践プログラムの汎用的なモデルの構築に向けて整理していく予定である。本年度はこれまでの実践結果を踏まえ、以下の2つの目的をかかげて研究を行った。(1)本科研においてこれまでに得られた研究結果をまとめ、多様な日本語教育現場において自律学習が実践されることを目指して汎用的な実践モデルを構築すること。(2)前記(1)で得られた結論を記述し、研究成果をまとめること。具体的には、本年度の計画にしたがって以下のことを行った。自律学習を基盤とした個別対応型授業がはじまった平成15年から現在までの実践の内容や実践にかかわる会議の議事録を時系列に並べ、年表としてまとめた。当授業にかかわる教師のほぼ全員を対象に、インタビュー調査を行い、結果を分析した。自律学習を基盤とした個別対応型授業の実践から生じてきたと思われる、自律学習を基盤としたさまざまな形の実践について、実践者自身が分析して結果をまとめた。学内の研究協力者および実践にかかわる教員による研究会を3回実施し、本実践における自律学習の定義を実践者自身が見直し、共有する試みを行った。

さらに、学内外の研究者を対象とした公開研究会を1回開催し、平成15年度から現在までの実践記録の年表をポスターとして発表して、これをもとに参加者とディスカッションを行った。また、「自律・自律学習・自律的な学習」という3つの視点に分けて実践を分析した。これまでに得られた調査結果、研究成果、実践内容をまとめて、本実践の所属するプログラムのウエブサイト上に順次公開している。
園芸作物におけるウイルス誘導性ジーンサイレンシングの汎用化

進展するゲノム関連研究の園芸生産への貢献度が必ずしも高くない理由の1つとして,遺伝子の機能を証明するファンクショナルゲノミクスの手法が,多様な種を含む園芸学において確立していないことが上げられる.そこで本研究では,多様な種を含む園芸作物における遺伝子の機能解析に適用可能なウイルス誘導性ジーンサイレンシングの汎用化を目的として計画を遂行し,その技術開発と適用遺伝子に関する有益な情報を得た.進展するゲノム関連研究の園芸生産への貢献度が必ずしも高くない理由の1つとして,遺伝子の機能を証明するファンクショナルゲノミクスの手法が,多様な種を含む園芸学において確立していないことが上げられる.そこで本研究では,多様な種を含む園芸作物における遺伝子の機能解析に適用可能なウイルス誘導性ジーンサイレンシングの汎用化を目的として計画を遂行し,その技術開発と適用遺伝子に関する有益な情報を得た.ウイルス誘導性ジーンサイレンシング(VIGS)は、宿主範囲の広いウイルスをベクターとして用い、培養を経ずに、任意の時期と部位を選んで遺伝子の発現の抑制が可能であることから、従来の形質転換における問題点を解決し得るファンクショナルゲノミクスの手法である。しかし、トマトを除くと園芸作物へのVIGSの適用は少ない。また、従来の対象遺伝子は、VIGSが植物病理学の分野で開発された背景と関連して、耐病性に関わるものが多く、園芸作物の品質等に資する研究は希少である。そこで初年度は、種々の主要園芸作物におけるVIGSの汎用化によるファンクショナルゲノミクスの推進を目的として、主に感染マーカー遺伝子のVIGSによる導入を行って,その汎用性を検証した。現在利用されているVIGS用のベクターの中では、Cucumber mosaic virus (CMV)およびTobaccorattlevirus (TRV)を利用したベクターが汎用性が高いと考えられる。特にCMVは100科以上1,000種を超える幅広い宿主範囲をもつといわれており、ナス科、アブラナ科、キク科など園芸学的に重要な科を含む様々な植物に感染し得ることが実験的に報告されている。そこで初年度はまず、いくつかの科に属する主要園芸作物において、CMVベクターの利用の可否を調べて汎用性の検証を行うことを中心として研究を進めた。対象遺伝子はマーカー遺伝子として実績のあるフィトエン不飽和化酵素を用い、接種は傷接種法(CMV)によって行った。その結果、ウイルスを増殖するためのタバコへの感染と移行、さらにはそのタバコから抽出したウイルスを利用してナス科に属する野菜への感染と移行が、ウエスタンブロットによって確認された。またサイレンシングの対象とする有用遺伝子の検討も行った。ゲノムプロジェクトが進展し、園芸作物においてもゲノム関連情報が充実しつつある。また、種々の園芸学上有用な生理学的知見も分子レベルでの解釈が進んでいる。しかし、これらの研究の成果の園芸生産への貢献度は必ずしも高くないと考えられる。その理由の1つとして、遺伝子の機能を証明するファンクショナルゲノミクスの手法が、多様な種を含む園芸学において確立していないことが上げられる。そこで本研究では、多様な種を含む園芸作物におけるウイルス誘導性ジーンサイレンシング(VIGS)の汎用化によって、ファンクショナルゲノミクスを推進し、充実しつつあるゲノム関連情報や分子レベルでの生理学的情報の有効活用を図ることを目的とした。本年度も引き続き、いくつかの科に属する主要園芸作物において、CMVベクターの利用の可否を調べて汎用性の検証を行うことを中心として研究を進めた。さらに、フィトエン不飽和化酵素のかわりに緑色蛍光タンパク質遺伝子を組込んだベクターを利用して比較対象とすることができた。また、サイレンシングの対象とする有用遺伝子の検討も行った。サイレンシング対象遺伝子として、園芸学的に有用な果菜や果樹の果実形成に関わるオーキシン輸送遺伝子や日長に反応して花芽形成の制御を行なう花成関連遺伝子の解析を行い,知見を得ることができた。基礎研究におけるゲノムプロジェクトが飛躍的に進展し、応用研究としての園芸学においても種々の主要園芸作物におけるゲノム関連情報が充実しつつある。また、園芸学上有用な生理生化学的な知見も分子レベルでの解釈が進んでいる。しかし、これらの知見や研究成果が実際に園芸生産に利用された事例は必ずしも多くないと考えられる。その要因の1つに、有用遺伝子の機能を証明するファンクショナルゲノミクスの手法が、多様な種を含む園芸作物において確立していないことがあげられる。そこで本研究では、多様な園芸作物においてウイルス誘導性ジーンサイレンシング(VIGS)の汎用化を推進することによって、充実しつつあるゲノム関連情報や分子レベルでの生理生化学的情報の有効活用を図ることを目的とした。VIGSは培養等の特殊な過程を経ることなく、植物ウイルスをベクターとして利用することによって、植物の様々な部位や発育段階を選んで遺伝子の発現の抑制が可能な植物バイオテクノロジーの技術であるが、これまでのVIGSの研究は限られた植物種と目的において行われており、多様な園芸作物の発育、生産あるいは品質に関わるものは非常に少ないのが現状である。Cucumber mosaic virus(CMV)は非常に幅広い宿主範囲をもつウイルスで、園芸学において重要な科を含む多様な植物種に感染し得るとされている。そこで、多様な宿主への利用の可能性を検討するため、Nicotiana benthamianaに感染させてウイルス粒子を増幅させた後に数種の野菜および花きへ接種し、ウエスタンブロットによって感染とウイルスの動態について解析した。対象遺伝子にはマーカー遺伝子として実績のあるフィトエン不飽和化酵素を用い、接種は傷接種法によって行った。
新産業時代における集積の本質とその将来展望

本研究は平成15年度から17年度の3年間をかけた研究である。15年度と16年度の2年間、国内の産業集積の実態調査、中国とタイでの産業集積の実態調査、ラオスでの基本的産業集積資料の作成と収集を行った。そこからの含意の把握を17年度の課題とした。研究会、さらには各自による補足調査を通し、国内では、機械金属産業での誘致工場を中心に形成された産業集積、産地型産業集積および大分における一村一品運動を中心に、東アジア化のなかでの構造変化と新たな産業集積の形成に関し、いくつかの論点の解明に努めた。産業集積再編成が、個別の産業集積それ自体のあり方を越えた形で、より広域に、特定製品や特定地域内に限定されないものに転換し、新たな展望を見いだしていることを明らかにした。また、タイの日系企業進出を核とする産業集積の形成、タイの一村一品運動を核とする集積の形成、中国天津での国有企業解体のなかで形成された産業集積の発展等について調査の成果を分析した。分析を通し、国内の産業集積との競合性がより強化されつつあることと同時に、国内産業集積地域が、その持つ特性、高度かつ迅速な物作り能力を活かすことにより、東アジアの産業集積の発展のなかで、補完的な関係として発展可能性を持つことも明らかにした。東アジアの集積動向を、国内と中国やタイという形で、双方向から見ることで、今生じている東アジアでの産業集積の変化の流れの把握に一定程度成功した。それにより、東アジア化という枠組みのなかで、国内産業集積の構造変化と新たな産業集積の形成に関し、理論的かつ実体的に、中間的総括としての報告書を完成しえた。本年度は、初年度として、産業集積に関する現地調査を中心に研究を進めた、具体的には、8月初旬の岩手県南部の機械金属産業中小企業集積の実態調査(20件余の政策関連機関と企業での聴取り)、9月中旬における福井県繊維関連産業中小企業の実態調査(10件の政策関連機関と企業での聴取り)、同じく9月中旬における福井県眼鏡枠産業中小企業の実態調査(10件の政策関連機関と企業での聴取り)、11月下旬における中国天津市における産業集積予備調査(南開大学中小企業研究者との意見交換、天津市での政策担当者と企業からの聞き取り)、04年2月のタイ国バンコク・アユタヤでの日系自動車部品メーカー等からの聴取りおよびチェンマイでの1村1品運動(OTOP)関係者と企業からの聴取りとチェンマイ大学研究者との1村1品運動(OTOP)についての意見交換、04年3月中旬の熊本県機械金属産業中小企業集積の実態調査(20ほどの政策関連機関と企業での聴取り)、04年3月下旬における大分県での1村1品運動関連企業からの聴取り、これらの実態調査を行った。これらの調査の対象は、大きくみて、国内の産地型産業集積、機械金属産業を中心とした誘致型産業集積、1村1品運動による新産業創成と、それと対になる中国やタイでの新たに形成されつつある産業集積ということになる。本年度は、このようないくつかの産業集積形態について、日本と中国・タイとの対比を念頭に置きながら、専らその実態を把握することに重点を置いた。このような調査究から、次年度に向けての課題も具体的に見えてきた。1つはより一層の実態調査研究を積み重ねる必要がある対象についてであり、今1つは、アセアン・中国を含む東アジアの中での産業集積の棲み分けの可能性とその具体的内容についてである。本年度は、3年計画の第2年度目になり、初年度における日本国内とタイ・中国での産業集積の現地調査をふまえ、さらに多くの現地調査を重ねた。具体的には、8月初旬における山形県での機械金属関連産業中小企業の実態調査(20件余の政策

関連機関と企業での聴取り)、8月末から9月初めにかけての中国天津市での実態調査(10件余の自転車産業関連の政策担当機関・自転車産業協会と企業等での聴取り)、11月下旬の熊本県の機械金属関連産業中小企業の実態調査(6件の企業での聴取り)、2月末から3月初めにかけてのタイ国のバンコクおよびその周辺での自動車関連現地企業への聴取り調査、3月中旬における中国瀋陽市での機械金属関連中小企業の実態調査、同じく3月中旬における大分県での一村一品運動関連企業・機関に対する調査、このような調査を行った。これらの調査は、初年度に手がけた産業集積調査のうちの、機械金属関連の産業集積の同一地域での追加調査と新たな地域での調査、国内産地型産業集積に多大な影響を与えている中国での産地型産業集積の調査、タイでの新たな自動車産業をめぐる産業集積の形成の追加調査、一村一品運動による産業集積形成にかかわる追加調査、これら4つのタイプのものに分けられる。さらに本年度は、タイと同じアセアンに属するが、その中での最後発発展途上国であるラオスでの調査も手がけた。特にそのために基礎的資料となるビエンチャンでの工業事業所の個票データを入手する等の、次年度での分析のための基礎的準備作業を行った。これらを通し、次年度の報告書作成に向けて、部分的ではあるが、密度の濃い調査により、アセアン・中国を含む東アジアにおける産業集積の新展開と、国内産業集積の将来展望について検討に有効な重要な資料を作成・入手した。本年度は3年間の研究期間の最後の年度であった。過去2年間、国内の産業集積の実態調査、中国とタイでの産業集積の実態調査、およびラオスでの基本的産業集積資料の作成と収集を行ってきた。この調査の結果として、そこからの含意の把握を今年度の課題とした。研究会、さらには各自による補足調査を通し、国内では、機械金属産業での誘致工場を中心に形成された産業集積と、産地型産業集積および大分における一村一品運動を中心に、東アジア化のなかでの構造変化と新たな産業集積の形成に関して、いくつかの論点の解明に努めた。そこから、産業集積の再編成が、個別の産業集積それ自体のあり方を越えた形で、より広域なものとなり、産地型の産業集積でも従来のように特定製品や特定地域内に限定されないものへと転換することで、新たな展望を見いだしていることを明らかにした。また、同時にタイの日系企業進出を核とする産業集積の形成、タイの一村一品運動を核とする集積の形成、中国天津での国有企業の解体のなかで形成された産業集積の発展等について聴取り調査の成果を分析した。この分析を通して、一方で日本国内の産業集積との競合性がより強化されつつあることが確認された。それと同時に、日本国内の産業集積地域の持つ特性、高度かつ迅速な物作り能力を活かすことにより、東アジアの産業集積の発展のなかで、補完的な関係として発展可能性を持つことも明らかにできた。このように、東アジアの集積動向を、日本国内と中国やタイという形で、双方向から見ることで、今生じている東アジアにおける産業集積の大きな変化の流れを把握することに一定程度成功した。それをもとに、7名の研究者を中心に、東アジア化という枠組みのなかで、国内産業集積の構造変化と新たな産業集積の形成について理論的かつ実体的に解明に関して、その中間的な総括としての報告書を完成することができた。
配向固定した超分子系における長距離相互作用と光励起ダイナミクス

生体内および人工合成分子系において、電子移動・エネルギー移動を初めとする長距離ダイナミクスがどのような要因に支配されるのかは極めて重要である。これまで長距離相互作用によるダイナミクスは直線的な架橋部をもつ分子系について精力的に研究がなされてきたが非直線的経路をもつ分子系についてはほとんど研究がなされていなかった。本研究では、ポルフィリン錯体を末端クロモフォアとして選び、架橋子で配向固定されるように連結した分子系において、長距離相互作用によるダイナミクスの経路結合依存性や経路形状依存性を、系統的実験により明らかにした。超交換機構における経路上の分子軌道の関与が重要であることを示した。亜鉛ポルフィリンーフリーベースポルフィリン二量体において架橋部を直線型・非直線型とした場合のエネルギー移動速度を比較した。すなわちp-ビスフェニレンエチニレンベンゼンとm-ビスフェニレンエチニレンベンゼンを架橋部としてそれぞれにもつポルフィリンへテロ二量体のおいてドナー(亜鉛ポルフィリン)からアクセプター(フリーベースポルフィリン)へのエネルギー移動速度は、直線型の架橋部をもつp体において非直線型の架橋部をもつm体に比べて1.5倍速かった。この違いの要因について量子化学に基づいた解析を行った。2つの二量体系においてHOMOおよびLUMOはそれぞれ末端ポルフィリンに局在したπ軌道であり、そのエネルギーレベル、電子分布に大きな違いはなかった。しかし、HOMOポルフィリン軌道の下にある架橋部に局在した分子軌道には両者に違いが見られた。すなわち、m-体ではp体よりも架橋部に局在した軌道がHOMOであるポルフィリン軌道とエネルギー差が大きく、さらに、電子密度をもたない炭素原子があり、原子上に節が存在した。また、LUMOよりもエネルギーの高い軌道について調べると、LUMOであるポルフィリン軌道のすぐ上にある軌道について、HOMOの場合と同様の現象がみられた。これらから、架橋部のフロンティア軌道が、超交換機構によるエネルギー移動に大きく関与していることが明らかとなった。また、配向固定した亜鉛(II)ポルフィリンー銅(II)二量体ポルフィリンにおいて可逆なエネルギー移動により、銅(II)ポルフィリンの発光寿命が10倍に伸張することを見出した。室温溶液中では無発光の亜鉛ポルフィリン三重項状態がリザーバーとなり、短寿命発光種の長寿命化するメカニズムが明らかとなった。銅(II)ポルフィリンは近赤外領域に発光をもち、室温溶液中でブロードな燐光を発する。しかし、Cu(II)はd不対電子をもつため常磁性であり、Cu(II)ポルフィリンからの発光の強度は弱く、寿命は短い。そこで、Cu(II)ポルフィリンにZn(II)ポルフィリンを配向固定する架橋子を用いて連結したポルフィリンへテロ二量体において、主に時間分解発光測定、過渡吸収、他の分光学的手法とそれらの温度変化の実験から、Cu(II)ポルフィリンの発光を10倍長寿命化するメカニズムを見い出した。Zn(II)ポルフィリンはその励起三重項がCu(II)ポルフィリンの最低励起状態よりも相対的にエネルギーの低い。Zn(II)ポルフィリンーCu(II)ポルフィリン二量体は、Zn部またはCu部から光励起されると、速い項間交差とエネルギー移動を経て、最低励起状態であるZn部三重項に分布する。Cu部からZn部へのエネルギー移動は三重項間で起こる。ここでZn部三重項はリザーバーとして機能する。Cu部三重項とのエネルギーレベルが近接しているため、熱励起によりCu部三重項へ再分布し、基底状態へ緩和、発光する。このメカニズムにより銅ポルフィリンの近赤外発光はの寿命は、参照単量体と比べ、10倍の長寿命化した。また、二量体のZn部三重項から、Cu部からの近赤外発光は、エネルギー障壁400 cmー1を経た発光であることが明らかとなった。熱励起エネルギー障壁の大きさや発光寿命は、異なる架橋子をもつ類似二量体でも同程度となり、架橋子への依存性は小さく、長寿命化のメカニズムが広く成り立つことを明らかになった。室温溶液中では無発光の亜鉛ポルフィリン三重項状態がリザーバーとなり、短寿命発光種の長寿命化の足がかりとなることが明らかとなった。これらを明らかにすることは自然科学の根本原理を解き、また、新しい物質系、反応系の構築理念を導くものでもある。しかし、これまで長距離相互作用によるダイナミクスは直線的な架橋部をもつ分子系について精力的に研究がなされてきた。本研究では経路結合依存性や非直線的経路をもつ連結分子系におけるダイナミクスを系統的実験により明らかにし、その長距離相互作用のメカニズムの深化を目的とした。

ポルフィリンは大きな環状π電子系をもつ化合物で、周辺置換基の修飾により、あまり大きな電子状態の変化がない。したがって、ポルフィリン錯体をドナー、アクセプターとして、架橋子を連結した分子システムは、架橋部経路の違いのみを議論するのに適している。末端ドナー部に亜鉛ポルフィリン錯体、アクセプター部にフリーベースポルフィリン錯体をもち、架橋部を直線的、非直線的とした2種のポルフィリン二量体における一重項-一重項エネルギー移動速度を比較した。時間分解蛍光測定により、亜鉛ポルフィリンの減衰とフリーベースポルフィリンの立ち上がり時間からエネルギー移動速度を見積もった。さらにフェルスター機構によるエネルギ移動速度を差し引き、through-bond機構によるエネルギー移動速度を求めた。その結果、距離が短く経路数はほぼ同じであるが経路形状が非直線的な分子系のほうが、thourgh-bond機構の寄与分としても、エネルギー移動速度が格段に遅くなっていることがわかった。その理由として、経路上の分子軌道の性質が大きく、長距離相互作用に関与していることが明らかとなった。亜鉛ポルフィリンーフリーベースポルフィリン二量体における架橋部形状に違いによるエネルギー移動速度の大きな違いについては、量子化学計算の結果も加えて、解釈することができた。しかし、これを一般性をもたせた概念・理論として提示するところまで、達することができればよりよいと思う。また、新しい系としてリバーシブルエネルギー移動による短寿命種の発光の長寿命化という現象を見出すことができた。亜鉛ポルフィリンーフリーベースポルフィリン二量体において、架橋部をm(メタ)とp(パラ)のフェニルエチニルベンゼンとした2つの二量体のエネルギー移動を比較することにより、純粋なthroughbond機構の寄与における経路形状の違いを明らかにすることができた。また、この結果を国際学術論文に公表することができた。一方、装置の開発の方は、まだ完全ではないので24年度へと継続していく。長距離相互作用の化学結合依存性の観点から、不対電子種との超交換相互作用による交換交差速度増加について、明らかにする。一重項ー一重項エネルギー移動だけでなく、不対電子種がある系における多重項間のエネルギー移動における交換相互作用の役割について明らかにする。特に長波長側(近赤外領域)の発光測定について、装置を立ち上げ整備する。これにより、ポルフィリン三重項エネルギー移動を発光によりモニターすると共に、エネルギー移動をもちいた新しい近赤外発光メカニズムの開拓を行う。一重項ー一重項エネルギー移動だけでなく、長距離相互作用の化学結合依存性について、不対電子種とのlong-range相互作用による項間交差速度増加過程について発展させる。また、不対電子があるシステムにおける三重項ー三重項エネルギー移動についても調査していく。一方、装置開発面では引き続き過渡吸収測定装置および時間分解ESR装置の改良を行っていく。このことにより、三重項ー三重項エネルギー移動系や項間交差系において、速度の測定と相互作用の絶対値の抽出を可能にすることを目指す。長距離相互作用のメカニズムの理解について深化させる。
地域社会における化学物質過敏症看護外来システムの構築

三重大学医学部看護学科内で継続運営してきた化学物質過敏症看護相談室(NCR-CS)を地域社会に移設し、看護職の役割に関する社会的実験を行った。その結果、NCR-CSの利用者は減少し、クリニック内では、NCR-CSの看護師の役割を明らかにすることは出来なかった。これらの結果について検討したところ、(1)自由診療における患者の医療費負担の増大、(2)患者の持つ医師が看護師よりも優位であるとするステレオタイプ、(3)看護師の社会的役割の不明瞭さに基づくNCR利用の阻害、という3つの要因が明らかになった。よって、地域社会において看護師がNCR-CSを独立運営していくには、日本社会における医師・看護師間のパワーバランスのステレオタイプを解消することやCS患者への社会的医療保障のシステムの整備が必要である。本年度は、化学物質過敏症看護相談室の環境(物理的環境と人の環境)を整えることに重点を置いて研究を進めた。まず、4月6月にかけては、津市内にあるトータルヘルスセンター(診察と講演が可能な施設)において、研究協力者である医師および医療機材開発業者と、看護外来で使用する機器の選定と相談室の開業に関するミーティングを行い、8月までに機材を設置し終えた。7月より、看護外来で使用する電子カルテの設計および開発と、看護外来を利用する患者がweb上で使用できる自己診断サイトの開発に着手し、現在も設計と開発は進行中(改修を繰り返す状態)である。また、3月現在では、化学物質過敏症看護外来のホームページの更新に着手している。さらに、今年度は、地域社会における患者支援ネットワークの確立の基礎を築くために、化学物質過敏症看護相談室と連携できる各種専門家(医師:シックハウス症候群および化学物質過敏症外来担当、助産師:開業助産施設、建築士:建築企業、保健師、社会福祉士、看護師)への研究協力依頼を行った。その中で、シックハウス症候群患者への対応として、実際のヘルシーハウス(天然素材の住宅)内の化学物質濃度測定を行った。本年度に予定していた一般市民や医療従事者を対象とした講演活動(化学物質過敏症の予防と治療に関する講演)は、新型インフルエンザの流行の拡大という社会的問題に配慮して行わなかったため、来年度に実施する予定である。本年度は、地域社会における化学物質過敏症に関する知識の普及を目的とし、一般市民を対象とした勉強会をクリニックに併設した多目的スペースで開催した。この勉強会はメディカル・カフェという形式で、「化学物質と過敏症」、「シックハウス症候群」、「シックスクール」、「体に優しい生活洗うということ」というテーマで計4回行った。いずれの回も、患者または家族、看護学生、地域住民が5名10名参加し、講義とディスカッションが行われた。当該疾患の持つ社会的意味は、患者や家族という当事者でないと理解が困難なことを考えると、健康な人々の参加があったことが評価できる点であった。さらに、6月より、クリニック内において、医師やその他の専門職者とミーティングを行い、化学物質過敏症の診療システムについての話し合いを繰り返した。これにより、診察料、診察時間、クリニックの宣伝活動、医師の診察と看護師による相談の兼ね合い等に関した課題が浮上した。今年度は、クリニックを窓口として相談者を募ったが、実際の相談者(受診患者)は5名であり、いずれの患者も他県からの相談者であった。地域社会における看護支援活動の展開のあり方を考える必要性や、患者に関するデータの収集目的においては、今後の研究期間内に看護相談のシステムに修正を加える必要があることが明らかになった。56月にかけて、化学物質過敏症看護相談室(NCR-CS)を三重大学内に再移設し、学内での化学物質過敏症患者の相談活動を再開した。これは、H22年度に、学外クリニックへNCR-CSを移動させてからの患者相談件数の減少の原因をアセスメントした上での対処であったが、結果として、相談件数は増加せず、電話によるものが3件とカウンセリングが1件のみであった。11月、これらの研究結果を、第20回日本臨床環境医学会(千葉)において、「化学物質過敏症患者への看護支援の限界と臨床環境看護学の必要性」として報告した。また、日本におけるNCR-CSの展開の現状と問題点を、1stNUS-NUH International Nursing Conference(シンガポール)において報告した。これらの報告内容は、今後、論文として発表する予定である。このように、今年度は、地域社会におけるNCR-CSの展開の問題点と課題が明確になったため、化学物質過敏症患者の心理社会的健康調査を行うことによって実態を把握し、それに伴ってNCR-CSの必要性を再度確認することとなった。

この健康調査は、調査用紙にNo VOCの紙を使用し、デモグラフィックデータ,QEESI(スクリーニング),MUIS-C(不確実性),QUIK-R(QOL),自由記載という5つの項目内容からなるアンケートを作成して、9月末までに行った。アンケート調査の結果、自由記載項目における患者らの訴えは大量且つ深刻であり、相談室の必要性を再確認することができた。また、本調査内容の一部を質的に分析し、上記同国内学会において「化学物質過敏症患者の病気に関する思いの分析」として報告した。当報告は研究室に所属する学生が行ったため、同学会における学生部門優秀賞を受賞した。その他の調査結果は、現在データ分析中であり、今後、論文報告予定である。
新しい薬物治療を目指した神経性食欲不振症の病態でのグレリンとCRFの役割の解明

本研究では視床下部のストレス応答における副腎皮質刺激ホルモン放出ホルモン(CRF)とグレリンの役割について明らかにするとともに神経性食欲不振症の病態におけるこれらペプチドの関与をあきらかにすることを目的とした。ストレスによる摂食抑制はストレス後にグレリンを投与することで阻止されることが明らかとなったが、その神経機構を明らかにするまでには至らなかった。また内因性にグレリン受容体遺伝子発現を抑制したラットでは摂食量の低下や活動性の亢進といった神経性食欲不振症と類似した表現型を示すことが明らかとなり、今後の研究の発展によりストレスによる摂食抑制におけるCRFとグレリンの役割や神経性食欲不振症の病態生理が明らかとなることが期待される。本研究では非ストレス時やストレス負荷に対する視床下部の反応性におけるCRFとグレリンの役割について明らかにするとともに神経性食欲不振症の病態におけるこれらペプチドの関与を明らかにすることを目的としている。本年度はストレスがグレリンの摂食促進作用へ影響を及ぼすか否かについて明らかにすることを目的とした。ウィスター系オスラットの脳室内へあらかじめ薬物投与用のカニューレを留置し、実験当日90分の拘束ストレスを与えた後にそのカニューレを介してグレリンを脳室内へ投与した。その後30分毎、投与から90分間の摂食量を測定した。生理食塩水を脳室内へ投与した群を対照群とし、ストレスの有無やグレリン投与の有無による摂食量の差を解析した。ストレスの有無に関わらずグレリン投与群の摂食量は生理食塩水投与群と比較して有意に多かった。ストレス負荷後生理食塩水を投与した群では摂食行動は認められなかった。CRF過剰発現マウスでは絶食による弓状核でのFos発現増加が抑制されていることから、ストレス負荷がグレリンによる摂食促進作用を阻害することが期待されたが、上述の通りストレスによるこれに対する阻害効果は認められなかった。神経性食欲不振症では慢性心理ストレスが発症の背景にあり、脳脊髄液中のCRFの濃度が上昇していることが明らかとなっている。同患者の血中グレリン濃度は高値を示すことからグレリンの作用が障害されている可能性が示唆されてきたが、同患者へのグレリンの投与は摂食促進効果を持つことから、同患者の病態におけるCRFやグレリンの関与様式については未だ明らかではない。今後グレリンの摂食促進作用がストレスにより障害されなかった機序についてさらに研究を進めて行く予定である。本研究では非ストレス時やストレス負荷に対する視床下部の反応性におけるCRFとグレリンの役割について明らかにするとともに、神経性食欲不振症の病態におけるこれらペプチドの関与を明らかにすることを目的としている。本年度は内因性のグレリンの作用を阻害し、摂食行動の変化について検討を行った。グレリン受容体拮抗薬を脳室内へ投与し、投与後90分間の摂食量を測定したところ、生理食塩水投与群と拮抗薬投与群との間に差は認められなかった。グレリンの血中濃度は摂食前に上昇し、摂食により低下することが知られており、体内のエネルギー容量に依存して摂食を調節すると考えられることから、この結果は非ストレス下においてグレリンは摂食を持続的には調節していないことを示唆している。次に昨年度行ったストレス下におけるグレリンの摂食促進作用について更なる検討を行った。ストレス後にグレリンを投与した群では、ストレスによる摂食抑制が解除されており、さらに非ストレス下にグレリンを投与した群と比較しても有意に摂食量が増加していたことが明らかとなった。これは予想された結果とは異なっており、この機序を明らかにする目的で90分の拘束ストレスの後、グレリンを脳室内へ投与し90分後に灌流固定して脳内のFos発現について解析した。ストレス後にグレリンを投与した群の視床下部室傍核におけるFos発現は、非ストレス下にグレリンを投与した群と比較して有意に増加していた。しかしながらストレス後に生理食塩水を投与した群と比較するとFos発現は少ない傾向を示したことから、ストレスにより活性化するニューロンの活動をグレリンが抑制する可能性が推測された。この結果は神経性食欲不振症患者ではグレリンによる摂食促進作用が認められることと一致しており、ストレスによる摂食抑制をグレリンが解除する機序を解明することで、神経性食欲不振症の病態の一部が明らかになることが期待される。神経性食欲不振症(AN)では、摂食促進作用を持つグレリンの血中濃度は高いにも関わらず摂食が抑制されていることから、視床下部においてグレリン受容体の機能が障害されている可能性が考えられる。そこでグレリン受容体の機能を抑制することでANの病態を示すか否かを明らかにすることを目的とした。グレリン受容体発現抑制トランスジェニックラットとグレリン拮抗薬を投与したラットの行動解析を行ったところ、トランスジェニックラットの摂食量は野生型ラットと比較し少なく、運動活動量も増加していた。

しかしながらグレリン拮抗薬を投与したラットの摂食量は生理食塩水を投与した対照群と同程度であり、投与後の行動は抑制されていた。内因性のグレリン受容体を抑制したトランスジェニックラットでは程度は弱いものの、摂食抑制、運動活動量の増加といったANの病態に近い摂食行動を示したが、外因性にグレリン受容体発現を抑制したラットではANに類似した行動は示さなかった。ANでは脳脊髄液中のCRF濃度が上昇しており、病態の一因としてCRFが過剰に分泌していることが示唆されていることから、トランスジェニックラットにおいてもCRFの遺伝子発現および機能障害が存在することが推測される。そこでグレリン受容体発現抑制ラットにおいて視床下部室傍核のCRFのmRNA発現量と血中ACTHおよびコルチコステロン濃度の解析を行った。グレリン受容体発現抑制トランスジェニックラットのCRF mRNA発現量は野生型ラットと比較し減少していたが、血中ACTHおよびコルチコステロン濃度には差が認められなかった。本結果はグレリン受容体発現抑制トランスジェニックラットのCRFの機能が野生型ラットと異なることを予想させる結果であると考えられるが、ANの病態におけるグレリンとCRFの役割を解明するためには今後さらなる解析が必要である。予想されていた結果と異なる結果が得られたため、研究の進展に必要な文献検索や予備実験に時間を費やしてしまったことが遅れている理由であると考える。24年度が最終年度であるため、記入しない。これまでの研究結果からグレリンはストレスを緩和する作用があることが推測されるので、グレリンがどのようにしてストレスによる神経活動を抑制するのかについて明らかにするため、グレリン受容体の機能を抑制した動物を使用してストレスによる摂食行動の変化やニューロン活動の変化について検討し、これらに変化が認められた場合にはCRFファミリーペプチドやその受容体の遺伝子発現について解析を行う。以上のことを遂行することが本研究課題の目的の達成へ繋がると考える。