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海底下を支配する性状未知アーキアの特異的代謝の解明とその生物地球化学的意義

本研究は、海底下を支配する2大生物界の原核生物(表層を支配するバクテリア、深層を支配するアーキア)の代謝を解明し、特に優勢な性状未知アーキアが持つ新しい生物地球化学プロセスを明らかにした。海底下の原核生物を構成する「バイオマーカーの一次生成→初期続成→再利用」という一連のプロセスを分子レベルで追跡し、未知の生理・代謝機構の証拠を捉えることができた。特に、深海底に生息しているアーキアが、わずかなエネルギー源を有効に活用するために発達させたと考えられる新しい代謝経路の発見(Takano et al., Nature Geoscience, 3, 858-861)は、継続して調査研究していく方針である。本年度は、深海底に生息しているアーキア(古細菌)が、わずかなエネルギー源を有効に活用するために発達させたと考えられる新しい代謝経路を発見した(Takano et al.,Nature Geoscience,3,858-861)[1]。深海底のアーキアはエネルギーの低い深海底において、周囲の環境中に含まれる有機物をリサイクル(=再利用する)する究極のエコ戦略によって、エネルギーをセーブしながら暮らしているという微生物生態学的な特徴を明らかにした。「アーキア」と呼ばれる原核生物は、海洋や海底堆積物中におけるその分布や量が、従来考えられていたよりも大きいことが最近になって明らかになり(Lipp et al., Nature, 2008)、様々な分野から注目を浴びている。しかし、海洋性のアーキアは、培養が難しく、海水や海底堆積物中でどのような活動を行っているのか、またどれくらいの活性をもっているのか(どれくらいの速度で代謝しているのか)といった基本的な性状でさえも不明な点が多かった。そこで、世界で初めて海底の現場(最大405日)でアーキアを培養する新たな実験手法を応用し、精密なバイオマーカー解析により、アーキア由来膜脂質の分子内同位体比を評価した。また、アーキア(ユーリアーキオータ門、クレンアーキオータ門)の群集構造は、16SrRNAおよび定量PCRで解析した。本研究によって、従来の手法は、アーキアの活動度を過小評価しており、これまで推定されてきた活動度よりもかなり大きなアーキアの活動度が示唆される。つまり、アーキアが海底における物質循環に従来考えられていたよりも大きな役割を果たしていると推定される(日本学術振興会ニュースレターおいて、研究成果トピックスに掲載)。海底下の原核生物に焦点をあて、その微生物生態を分子レベルで追跡する研究を進めた。生物地球化学サイクルを炭素形態で見ると、海洋の基礎生産を担う光合成生物は、最も酸化的な炭素形態のCO_2を有機態炭素のCn(H_2O)mに変換される。そして、海底に堆積した有機態炭素は、海底下に優勢なアーキアのうちメタン生成菌によって最も還元的な炭素形態のCH_4に変換される。この炭素循環のうち、光合成独立栄養系と化学有機従属栄養系のリンケージを直接検証する目的で、^<13>C-Chlorella sp.をトレーサーとした難培養性アーキア群集の現場培養実験を行った。相模湾海底(水深:1453m)での長期間培養(405日間:cf.Nomaki et al.,MEPS,2011)を行った後、アーキア脂質分子の分子内炭素同位体組成から、^<13>C-光合成産物を追跡し、海底下に棲息するアーキアの生態について考察した。次に関連する室内培養実験を行うため、標品の生合成、化学合成(筑波大学・野本研究室との共同研究)、昨年導入した高速液体クロマトグラフィーによる精製を完了し、分子トレーサーの改良を行った。また、本研究で確立した分析法のアプリケーションとして、統合国際深海掘削計画(IODP)の第316次航海で採取された南海トラフ大断層帯(巨大地震発生帯)に棲息する未培養性アーキアについて、リピドミクス(包括的脂質解析)を行った(ブレーメン大学および高知コアセンターとの試料共有)。海底下の炭素循環の主役である原核生物の微生物生態に着目し、まず、海洋環境の光合成系と海底下の原核生物のエネルギー的なリンケージを証明するために、13C-海底現場培養法と13C-室内培養法による発展研究を進めた。一連のイソプレノイド合成系の化合物の新しい分子リサイクル過程の予察的実験に取り組んだ。次に、メタンハイドレート形成の主役であるメタン生成アーキアが、メタン生成するために必要な補酵素ファクター430 (F430)の分析方法の精度向上を行った。この分析法のアドバンテージは、メタン生成の一次情報としての補酵素分子レベルの多次元同位体比解析が可能になることである。この開発により、海底下でのメタン生成プロセスの「場」を評価することができるようになった。

メタン生成の補酵素ファクター430に関する一連の分析方法(抽出、分離、精製、飛行時間型質量分析計)を「ちきゅう」で採取された下北沖海底堆積物試料へ応用し、メタン生成の「場」の一次証拠を得た。ドイツ・マックスプランク研究所(マールブルグ)との共同研究の一環として、本分析法の確度検証を行った。そのF430濃度の定量結果に基づいて、海底下100m以深のメタン生成菌の密度を推定したところ、全原核生物のうち約10%が、メタン生成菌であることを示した。分子レベルで精密な評価を行う場合、抽出、分離、精製、同位体比の精度・確度保証などの一連の作業は、比較的時間と手間のかかるラボワークであるが、分析方法の最適化を含め、効率的に研究を進めている。また、論文への掲載を順次進めており、順調なペースである。代表的な研究結果は、新聞、インターネット配信記事、雑誌、機関誌でも紹介されている。24年度が最終年度であるため、記入しない。当初の研究計画に沿って、オリジナルなデータの蓄積と統合モデルの構築をさらに進めていく方針である。また、必要に応じて、パブリックアウトリーチ活動を展開する。
セルロース系サーモトロピック液晶ポリマーの分子設計

前年度の研究結果から、セルロース系サーモトロピック液晶ポリマーの構造一物性相関を研究するためには、まず位置特異的置換セルロース誘導体の調製法を確立することが必須であることが判明した。現在、セルロースの6位以外(2と3位)の水酸基にれ目的の官能基を位置特異的に導入することは不可能であり、これはセルロースの化学合成法が確立して成し得るものである。既に前年度セルロースの化学合成法を確立したが、本年度はまずその重合機構についての知見を得るために、種々の置換基効果について検討した。その結果、glucose 1,2,4-orthoesterの開環重合によるセルロースの合成では、3位のbenzyl基は重合の立体および位置特異規制に、また2位のpivaloyl基は重合の位置特異規制に必須の官能基であることが判明し多。また、段階的合成法によるcelloeicosaose誘導体(重合度20)の高収率合成にも成功した。すなわち、開環重合法および段階的合成法の両方によるセルロースの合成法を確立した。かくして、目的の位置特異的置換セルロース誘導体が調製し得る方法を確立し得た。次いで合成セルロース誘導体から、2位アルキル化セルロース誘導体の調製法を確立した。本法は2位アシル誘導体の調製にも適用される方法である。得られた2-propyl celluloseは180-200°Cで溶融し、酢酸、アルコールに可溶であること、またそのacetateの融点は125-131°C(CTAのそれは232-245°C)であり、CTAが不溶である酢酸、アルコールなどの溶媒に可溶であることが新たに判明した。確立された方法により一連の長鎖アルキル基も導入し得る。本研究によりセルロース誘導体の溶解性、熱溶融性および液晶性に関する基礎的知見が集積し得る手法が確立された。セルロースの熱流動化を研究計画に沿って検討した。1)内部可塑剤による熱流動化:可塑剤として、セルロースと水素結合で結合し長鎖アルキル基が導入し得ると考えられる長鎖アルキルグルコシドを選択し、種々の条件下(例えば、アルカリセルロースを調製した後、アルキルグルコシドで処理する)で熱溶融化を検討したが、いずれも望む結果は得られなかった。今後、均一系セルロース溶剤を用いた検討が必要である。2)主鎖液晶ポリマーの分子設計と調製:メソゲンとしてp-hydroxyphenyl 2,3,6-triacetyl-β-D-glucosideを選定し、glucoseacetateから調製した。その得られたglucosideはhexamcthylenediisocyanateと封管中、tolueneを溶媒をして130°Cで加熱して反応させ、重合度約45のポリマーを調製した。このポリマーは140°Cにて熱流動し流動複屈折現象が観察され興味深い。3)側鎖型液晶ポリマーの調製:この目的のためには、特定の置換基を特定の場所に位置特異的に導入する方法を確立する必要がある。しかしながら、天然のセルロースからの調製はC-6位以外は不可能である。そこで、このような分子の設計が可能なセルロースの化学合成法の確立が不可欠である。申請者は十数年来この研究う取り組み、平成7年に置換基効果を考慮して世界初の開環重合法によるセルロースの化学合成に成功した。そこで、予備実験としてまず2-methylcelluloseの調製に成功した。そして、セルロースの2-位のみにmethyl基を導入するとその溶解性など極端に変化するなど、極めて興味深い結果を得た。今後種々の長鎖アルキルエーテルおよびエステル基が特定の位置に導入されたセルロース誘導体を開発した開環重合法を用いて調製しその構造-物性相関を調べることが重要である。

前年度の研究結果から、セルロース系サーモトロピック液晶ポリマーの構造一物性相関を究明するためには、まず位置特異的置換セルロース誘導体の調製法を確立することが必須であることが判明した。現在、セルロースの6位以外(2と3位)の水酸基にれ目的の官能基を位置特異的に導入することは不可能であり、これはセルロースの化学合成法が確立して成し得るものである。既に前年度セルロースの化学合成法を確立したが、本年度はまずその重合機構についての知見を得るために、種々の置換基効果について検討した。その結果、glucose1,2,4...orthoesterの関環重合によるセルロースの合成では、3位のbenzyl基は重合の立体および位置特異規制に、また2位のpivaloyl基は重合の位置特異規制に必須の官能基であることが判明し多。また、段階的合成法によるcelloeicosaose誘導体(重合度20)の高収率合成にも成功した。すなわち、開環重合法および段階的合成法の両方によるセルロースの合成法を確立した。かくして、目的の位置特異的置換セルロース誘導体が調製し得る方法を確立した。次いで合成セルロース誘導体から、2位アルキル化セルロース誘導体の調製法を確立した。本法は2位アシル誘導体の調製にも適用される方法である。得られた2-propyl celluloseは180-200°Cで溶融し、酢酸、アルコールに可溶であること、またそのacetateの融点は125-131°C(CTAのそれは232-245°C)であり、CTAが不溶である酢酸、アルコールなどの溶媒に可溶であることが新たに判明した。確立された方法により一連の長鎖アルキル基も導入し得る。本研究によりセルロース誘導体の溶解性、熱溶解性および液晶性に関する基礎的知見が集積し得る手法が確立された。
Sr-Caを特異的に徐放する生体機能性セメントの開発

骨芽細胞を活性化し破骨細胞を抑制することが分かっているSr2+と骨芽細胞の分化を促進することが分かっているCa2+を溶出するセメントを作製し、歯周組織治癒促進が期待できるような歯科用セメントを開発すべく研究を行った。Henchらの開発したバイオガラス45S5をもとに、CaとSrの配合率を変化させたSiO2-P2O5-Na2O-CaO-SrO系生体活性ガラスを作製し、このガラス粉末を用いてセメントを作製した。ガラス粉末およびセメントからのSrとCaの溶出を検索したところ、Srはその配合量に比例した溶出量が増え、フィラーの組成率を変えることで溶出量をコントロールできることが分かった。試作バイオガラスの作製:SiO2-Na2O-CaO-P2O5-SrO系生体活性ガラスを作製する。Na2O 24.5wt%, CaO 24.5wt%, SiO2 45wt%, P2O5 6wt%の組成ガラスをcontrolガラスとして、Srを6wt%、12wt%をCaと代替した3種類の試作ガラスを作製した(Sr6, Sr12)。SiO2, Na2CO3, CaCO3, NaH2PO4・2H2O, SrCO3を白金るつぼに入れ、1200°Cにて2時間焼成を行ったのち、ステンレスの容器にて急冷し、バイオガラスを得ることができた。XRD分析:非結晶(ガラス)であることを確認した。蛍光エックス線分析:作製したバイオガラスの組成がおおよそ設計通りにできていることを確認した。遊星ボールミルによるバイオガラスの粉砕:ジルコニア容器にガラス粉末:ZrO2ボール=1 : 10にて投入、回転数150rpmにて5時間大気中で粉砕を行うと、SEM観察および粒度測定により、平均粒径510μmの市販の無機セメントと同レベルの細かさの粉末が得られることが判った。バイオガラスのイオン徐放特性の評価(ICP分析) :上記にて粉砕したバイオガラス(セメントさじ1杯)を蒸留水10mlに浸漬し、21日まで成分を溶出させる。回収した溶出液をICP発光分光分析法を用いて含有するSr, CaおよびSi濃度を測定した。その結果、日が経過するごとにイオン溶出濃度は高くなり、SrイオンはSr12>Sr6>controlの順で配合比率と溶出濃度に相関がみられた。試作セメントのイオン徐放特性の評価:試作バイオガラスと既成のGICを1 :4にて混和し、試作セメントを作製し、21日まで蒸留水に浸漬し、溶出するSr, CaおよびSiイオン濃度を測定したところ、初期の溶出濃度が高いものの、21日までイオンの持続的な溶出が確認できた。骨芽細胞を活性化し破骨細胞を抑制することが分かっているSr2+と骨芽細胞の分化を促進することが分かっているCa2+を溶出するセメントを作製し、歯周組織治癒促進が期待できるような歯科用セメントを開発すべく今回の研究を行った。XRD分析を行い、非晶質(ガラス)ができていることを確認し、蛍光エックス線分析を行い、ガラスの組成の分析を行い、値は少し設計とずれているものの、Srの配合率はSr12はSr6の2倍であることを確認した。バイオガラスを蒸留水に浸漬し、21日間成分を溶出させてICP発光分光分析を行ったところ、SrとSiは日が経過するほどイオン溶出量が増加し、Srの配合率が多いほど、Siの溶出が多くなり、Srの溶出も多くなった。これは過去の報告とも整合性が取れる結果となった。Caにおいては、溶液中内でハイドロキシアパタイトの形成が行われたためか、値はばらつく結果となった。バイオガラスを用いて、ポリアクリル酸と混合してセメント作製を試みたが、バイオガラスはイオン溶出量が多いため、硬化が早く、溶解度が高いため、セメントとしては用いられないことが分かった。そこで、市販のGICの粉末と混和し、セメントを作製し、イオン溶出量を測定したところ、21日目までイオン溶出はみられ、粉末の状態で差があったSiの溶出に関してはセメントでは差がなく、Srは配合率通り溶出量が変化し、Caは差は見られなかった。Srはフィラーの組成率を変えることで、溶出をコントロールできることがわかった。今年度は試作ガラスおよび試作セメントの作製方法の検索および作製に時間を割いた。立ち上げていく実験であるので、細かい方法の検索に時間を要した。バイオガラスの粉末まで作る過程の確立および、できたガラスの特性評価を主に行い、硬組織形成細胞を使用した実験はまだ行えていないので、少し遅れている。保存修復学試作セメントの作製に重点を置く。

さまざまな種類のガラスを設計し、作製し、それを組み合わせて、セメントとして使用でき、かつ、硬組織形成細胞の分化を促進する作用をもつ材料の組成を決定していく。バイオガラス粉末の作製手順は今年度確立できたので、滞りなく行えると考えられる。まず、今年度作製した既存のセメントと試作バイオガラスを組み合わせた試作セメントの硬組織形成細胞の増殖、分化、石灰化に対する影響を検索する。具体的には、細胞は、マウス由来の骨芽細胞様細胞であるMC3T3-E1を使用し、試作セメント上で細胞培養を行ったのち、MTTアッセイおよび付着細胞のSEM観察により細胞の増殖を評価し、ALP活性測定およびアリザリンレッド染色により細胞の分化を評価していく。そのデータをもとに、試作バイオガラスをすべて自分で設計したものを作製、試作無機セメントを作製する。万能試験機を用いて、セメント硬化体試料の圧縮強さを測定し、被膜厚さの測定:、ビッカース硬さを測定し、セメントの材料特性を評価する。また、今年度と同様に、セメント硬化試料を蒸留水に浸漬し、37°Cで静置し、1,3, 7, 14, 21日まで成分を溶出させ、回収した溶出液を直径0.22 μmのフィルターにて濾過し、ICP発光分光分析法を用いて含有するSr, CaおよびSi濃度を測定する。また、同様にMTTアッセイ、ALP活性測定およびアリザリンレッド染色を行い、試作セメントの細胞の増殖、分化、石灰化促進作用の検討を行い、硬組織形成細胞の分化を促進する生体機能性セメントの開発を行っていく。今年度は試作ガラスおよび試作セメントの作製方法の検索および作製、できた材料の確認実験を主に行ってきたので、他の研究室の協力を得られたので、材料費や材料作製、および分析にさほど費用がかからなかった。また、硬組織形成細胞を使用した実験は次年度にすることにしたので、細胞培養や細胞を使用した分析に必要な消耗品の費用を使用しなかった。これらのことが次年度使用額が生じた主な理由であると考えている。次年度は、今年度に引き続き、ICP発光分光分析を何度も行う必要が出てくると考えられるので、その分析にかかる費用が増えると考えられる。また、硬組織形成細胞を使用した実験を開始するので、細胞培養、細胞増殖試験、ALP活性測定、およびアリザリンレッド染色を行うための消耗品の購入が増えると予想される。学会発表を予定しており、かつ、論文投稿も予定しているので、成果発表の旅費および論文校正費用および投稿費用も必要となってくる。これら次年度の主な研究費の使用目的となると考えている。
神経膠腫の薬剤耐性機構:Akt-mTOR経路の関与に関する基礎的研究

神経膠腫は、成人脳腫瘍でもっとも頻度の高い疾患であるが、その治療成績はいまだ極めて不良である。脳という組織の特異性から手術による治療成績の向上には限界があり、今後治療成績を向上させるためには、これら細胞死誘導補助療法に対する抵抗性獲得のメカニズムを解明、克服することが急務である。腫瘍細胞に細胞死抵抗性を賦与する分子の中で神経膠腫において特に注目されるのがPI3Kである。しかしながらPI3Kは様々な細胞機能発現に関わっているためPI3Kを治療抵抗性克服の標的とすることは副作用の面から難しい。本研究においてPI3Kの下流のシグナル伝達を担うmTORが神経膠腫細胞の生存維持、治療抵抗性に関わるkey分子であるかどうかの検討を行った。神経膠腫培養細胞(U251,A172,T98G)にPI3K阻害剤(LY294002)、mTOR阻害剤(Rapamycin)前処理した後、抗がん剤(vincristine, etoposide, CDDP)処理を行ったところ、PI3K阻害剤にて前処理した場合、明らかに細胞死の増強効果が認められたが、mTOR阻害剤にて抑制した場合には、細胞増殖抑制効果は認められたものの、優位な細胞死の増強効果は認められなかった。各細胞株のPTENの変異やAkt経路の活性化状態と細胞死増強効果には相関は認められなかった。本研究結果は、第2回World Federation of Neuro-Oncologyにおいて発表した。最近になり、Rapamycinでは抑制されないmTOR経路が存在する(mTOR-Rictor)との報告があることから、上記の実験結果からmTORが薬剤耐性のkey moleculeでないと結論することは出来ないと考え、siRNAによるmTOR経路の阻害を試みている。神経膠腫における薬剤耐性機構にAkt-mTOR経路が関与しているのかを、神経膠腫培養細胞をもちいて検討した。最初に種々の細胞株のAkt-mTOR経路の活性化状態について、リン酸化抗体を用いたwestern blotにて検討したところ、U251,A172細胞において未処理の状態でリン酸化Aktが検出された。これらの細胞株にPI3K阻害剤(LY294002:LY)、mTOR阻害剤(rapamycin:Rap)処理したところ、リン酸化Akt、リン酸化mTOR、p70S6Kの抑制が確かめられた。LYでは、濃度依存性に細胞死が誘導されたが、Rapでは細胞死は誘導されなかった。LY,Rapとも細胞に細胞死を誘導しない濃度で前処置を行い、その1時間後CDDP,vincristine,etoposide等のanticancer drugにて細胞死を誘導した。処理後3日目の細胞死の割合をトリパンブルーdye exclusion assayにて検討したところ、LYで前処置を行った細胞では細胞死の増強効果が認められたものの、Rap前処理では細胞死増強効果はわずかであった。これらの結果から、Akt-PI3K経路は薬剤耐性に関与しているものの、その下流のmTOR経路が薬剤耐性に主要な役割を果たしていないことを示唆している可能性と、または最近になって報告されたRapamycinにて抑制を受けない経路(mTOR-rictor)が関与している可能性が考えられた。
日本の国内行政へ適用可能な調達行政理論の構築―主に国連システムとの比較を通して

本年度は本研究の最終年度として、様々な調達行政や関連の実務・先行研究を検討しつつ、調達行政に関してその基本構造の全般にわたって考察を深めた。この期間に発表した主要な業績は、日本国際連合学会編『国連研究の課題と展望』に所収された「国連システムにおける調達行政の意義と企業・NGOの役割」である。これは、先ず国連システムにおける調達行政の意義と重要性を行財政の観点から実証的に分析した上で、企業・NGOの役割について、(1)企業・NGOは物・サービスの供給を通して、国際機関の活動実施に不可欠な役割を果たしているが、(2)個々の企業・NGOの信頼性や履行能力等には、社分な注意が必要であり、(3)適切な主体の選定に加えて、癒着を防ぎつつ継続的な協力関係を維持していくことが重要である、ということを実証的に明らかにした。このような結論は、単に国連システムだけでなく、日本を含めた国内行政における調達行政にも、共通するものである。以上に加えて今年度は、基本的な諸事項、組織的側面、実施プロセスの側面、行政外部の主体との関係の側面という4つの視角から構成した調達行政の基本構造に関して、それぞれの視角ごとに、その要点・主要な要素等を取りまとめた。そしてこれを、東京大学行政学研究会での調達行政に関する発表において提示した。本研究で考察を深めた調達行政という概念は、日本の国内行政ではあまり重視されていない側面や、行政の実務上「調達」として明示的には認識されていない行政活動をも含むものであり、関連分野の研究・実務上、有意義なものと考える。標記の課題につき、本年度は第1に、日本の先行研究や実務に加えて、国連システムやアメリカ連邦政府の公共調達に関する先行研究や実務も踏まえて、調達行政理論の構築を目指した。その結果、基本的な諸事項、組織的側面、実施プロセスの側面、行政外部の主体との関係の側面という4つの視角から、一般性を持った形で、調達行政の基本構造の体系化を行うことができた。第3に、外務省からの依頼による委託調査「国連諸機関の活動評価」を久山純弘国連大学客員教授と共同で実施した。ニューヨークで国連事務局職員や各国国連代表部等の関係者からヒアリングを行い、日本で国連公式文書の分析を行い、その成果を「国連活動の効果促進・効率化のための基本枠組み分析と活動(事業)の見直し・整理問題」(及びその英語抄訳)として取りまとめた。本年度は、日本国内の調達行政の基礎調査を進めるとともに、比較対象として重要な国連システムの調達行政に関する研究の成果を様々な形で発表し、国連・公共調達・開発援助などの研究分野においてその意義を実績として残すことができた。具体的には、国連システムの調達行政について、基本的情報や機関間協力等を踏まえた上で、組織的側面と運用の側面との両面から分析を行い、その特徴・取組みを明らかにした論文が、公共調達に関する国際ハンドブックの第II部第11章に収録された。従来の各国レベルやEU等に加えて、国連システムも一つの公共調達システムと位置づけることができた。また、食糧援助を行うWFPの調達の概要、調達類型ごとの調達管理、外部アクターの重要性等を明らかにした論文を、アムステルダムで開催されたIPPC(国際公共調達会議)に提出し口頭発表を行った。国内学会等においては、政府の役割が重視される国連PKOの実施における物・サービスの供給という見地から、民間企業の役割も重要であることを明らかにし、多面的に論じた論文が『国際安全保障』に掲載された。そして、日本国際連合学会において「国連システムにおける調達行政の意義と企業・NGOの役割」という口頭発表を行った。更に、国際開発学会において「世界銀行のプロジェクト実施における調達管理」という報告論文を提出し、口頭発表を行った。加えて、東京財団の国連研究会においても、PKOを含めた国連の調達や行財政についての発表を行った。これらの研究成果から、基本的な諸事項における調達内容や調達規模などの調達関連情報、組織的側面における不正対策組織、実施プロセスの側面における多様な調達手法、行政外部の主体との関係の側面における企業・NGOとの関係などが、日本国内の調達行政にも妥当しうる一般的な調達行政理論において重要であることを明らかにできた。

本研究で考察を深めた調達行政という概念は、日本の国内行政ではあまり重視されていない側面や、行政の実務上「調達」として明示的には認識されていない行政活動をも含むものであり、関連分野の研究・実務上、有意義なものと考える。
胸部大動脈瘤手術患者の回復促進看護支援プログラムの開発と有効性の検証

本研究は、胸部大動脈瘤手術患者の術後の退院後の生活までを支える回復促進看護支援プログラムの開発と評価を目的とした。大動脈疾患患者のQOL尺度や先行研究成果を基に、回復状況を査定する評価項目を検討し、プログラムの実用性と有効性について検証した。疾患や療養に関する教育的支援だけではなく、手術に対する肯定的な意味づけが促進できるような傾聴に基づく情緒的支援を主軸とした看護ケア指針を明確化した。平成26年度は胸部大動脈瘤患者の回復過程を査定する評価票の導入可能性の検討を行った。先行研究の成果を基に、評価項目の構成を明確化するため、文献検討を行い、心臓手術後の回復を捉えた諸研究や、回復に関連する尺度も参考にしながら、評価項目と質問内容を中心に検討を行った。身体症状を捉えるセクションは、先行研究および文献検討の結果、体力低下、食欲低下、創痛、呼吸苦など10項目に加え、治療形態(外科的治療、ステントグラフト内挿術、ハイブリット手術など)によって特徴的な合併症による症状などをどのように加味するかについては検討を続けていく必要がある。評価票はその他、日常生活、回復感・回復状況、療養行動、治療・病気に対する受け止めを加えた、全5セクションから構成する方向性とした。またこれらに影響を与える要因としては、「医師への信頼」や「家族のサポート」、「家族・周囲には迷惑をかけたくない」などの思いがあるが、これらは49項目と多いため、質問紙ではなく、外来受診時に構造化面接を行うことにより捉えていけるかどうか検討を続けていく。以上の評価票に加えて、日本語版病気認知質問紙(J-IPQ)およびSF-36を併用することを検討しているが、胸部大動脈瘤患者は低侵襲治療が進んだことにより高齢患者も多く、より簡便かつ質問項目を抑えた評価票を作成することが必要である。日常生活の項目はSF-36の評価項目と重複する部分があり、加えて、治療形態に応じた回復過程を捉える必要が出てきたため、今後は退院した患者の現状を知るために外来受診時のフィールドワークを追加し、医師、看護師などの専門家による審議を経てパイロットスタディを行う予定である。平成27年度は、前年度に引き続き胸部大動脈瘤患者の回復過程を評価する評価票の検討および回復促進看護支援プログラムの内容、実施時期について検討を行った。患者にとって一番の問題として捉えられている身体症状については、治療形態(外科的治療、ステントグラフト内挿術、ハイブリッド手術)を考慮して汎用性のある評価ができるように、項目を精選した。これらの身体症状に対する対処として、先行研究から「内的帰属」(自分に原因があるなど)の傾向もみられ、自己対処や自分なりの意味づけて解決しようとしており、誤った療養や緊急時の受診の遅れにもつながると考えられた。その為、評価票には身体症状とその対処も項目として入れ、単なる身体の苦痛を捉えるだけではなく、療養上の指導につなげるようにすることで評価票そのものから支援が導き出せる構成を検討した。回復促進看護支援プログラムの構成は、退院後の支援を中心に外来での実施を検討していたが、文献検討と先行研究を踏まえ、退院前に「回復の見通しを示す」支援を入れることとした。この支援は、準備的感覚情報提供(preparatory sensory information)として重要な看護介入の一つであり、回復促進につながるkey careとして位置づけ、この支援の有無によってQOLを評価することとした。また、QOLは病気認知に影響を受けることが先行研究から示唆されており、退院前に対象者の病気認知を質問紙で捉え、個別的なケアに繋げられるようなプログラム構成を導き出した。回復過程を査定する評価票の検討が遅れているのに伴い、回復促進看護支援プログラムの内容と支援時期の検討も遅れており、当初の計画から全体的に進行が遅れている。先行研究から得られた結果をもとに、評価項目を明確化し全人的な視点から回復が評価できるか、患者の生活に即した回復状況が査定できるかどうかの汎用性の検討が重要となり、平成26年度から評価票の検討に時間を費やす必要性が生じた結果、平成27年度の計画も順次先送りになる形となった。平成28年度は前年度から課題となっていた、回復の見通しを示す支援と患者の病気認知との関連からのプログラム構成を検討した。また、治療形態(外科的治療、ステントグラフト内挿術、ハイブリッド手術)に依拠しない汎用性のある看護ケアの検討をするため、腹部大動脈瘤手術患者との差異と類似性の分析を行った。腹部大動脈瘤(以下、AAA)手術患者6名(男性5名、女性1名、平均年齢69.6歳)と胸部大動脈瘤(以下、TAA)手術患者6名(男性4名、女性2名、平均年齢は65.0歳)の退院前(Time 0)、退院後1か月目(Time 1)、3か月目(Time 2)に行ったQOL尺度であるSF-36と半構造化面接の内容を分析した。Time 02におけるSF-36の各項目のAAA群とTAA群の得点には有意差はなかった。AAA群は、日常役割機能(身体):RP、社会生活機能:SF、日常役割機能(精神):REがTime 0と2の間で有意差があった(p<0.05)。TAA群は体の痛み:BPがTime 0と1および2のそれぞれの間で、心の健康:MHにおいてもTime 0と2の間で有意差があった(p<0.05)。AAA群の面接からは、SF-36の結果から示されたRP、SF、RPに関する問題は直接的には示されておらず、体力の低下の訴えや血圧値に関することなど療養に関する内容が多かった。

TAA群の面接では、体の痛み(BP)を含む様々な身体的症状や変化に関する表出が多く、SF-36の結果と合致していた。AAA手術患者に対しては、日常役割機能や社会生活機能の回復を支援することが重要であり、TAA手術患者は様々な身体症状を呈しそれに伴う体の痛み、その痛みが影響していると思われる心の健康を回復する看護ケアがQOLの改善に重要であることが示唆された。研究の進行が全体的に遅れていたが、平成28年度は熊本地震があり、研究者の教育業務が「災害看護」であることから支援活動や多機関との調整等で業務多忙となり、更に研究遂行が難しくなった。研究全体の遅れに伴い、研究計画を見直し、当初の目的が達成できるように研究デザイン、研究実施場所の再検討を行う予定である。退院前に本人が懸念している身体的諸問題を把握し、症状の経過や回復の見通しについて、パンフレット等で視覚化したものを提示することとした。患者の病気に対する認識、回復に対する認識をIPQおよびAneurysm SRQを参考にした、独自の項目を面接形式で把握するが、見通しを含めた情報に対するニーズは、患者によって異なることが明らかになっており(Dubois et al, 2014)、その点を留意して教育的・認知的支援を行なう方向性とした。先行研究より、退院後13ヶ月目において身体機能の回復の高まりが、QOL尺度や面接の言語的データからも明らかになっており、介入時期は、退院前の次は、退院後1ヶ月目、3ヶ月目とした。対面による支援もしくは電話での支援、両方が可能なように教育的支援だけではなく、手術に対する肯定的な意味づけが促進できるような傾聴に基づく情緒的支援を主軸として、看護師が実施する独自性と意義を明確にした。これらの回復促進看護支援プリグラムは、看護職からの適切性、妥当性についての助言を得たが、患者への実施による有効性の検証は課題を残した。本研究は、胸部大動脈瘤手術患者の術後の退院後の生活までを支える回復促進看護支援プログラムの開発と評価を目的とした。大動脈疾患患者のQOL尺度や先行研究成果を基に、回復状況を査定する評価項目を検討し、プログラムの実用性と有効性について検証した。疾患や療養に関する教育的支援だけではなく、手術に対する肯定的な意味づけが促進できるような傾聴に基づく情緒的支援を主軸とした看護ケア指針を明確化した。平成26年度は、胸部大動脈瘤患者の回復状況を査定する評価票の導入可能性の検討を行う計画であった。先行研究から得られた成果をもとに、評価項目を明確化し全人的な視点から回復が評価できるか、患者の生活に即した回復状況が査定できるかどうかの汎用性を中心に行った。最新の文献検討を重ねる中で、現在、胸部大動脈瘤への治療形態が純粋な外科的治療からステントグラフト内挿術へとシフトしており、更には、これらの治療を組み合わせたハイブリット手術の症例も増えている。従って治療形態に応じた回復状況を細かく検討する必要が出てきたため、文献検討、評価票の検討により多くの時間を費やす必要が生じた。計画時の評価票のパイロットスタディの実施には至らなかったため、研究の達成度は遅れているとした。胸部大動脈瘤に対する低侵襲治療が発展し、治療成績も安定、向上しつつあり、症例数も増加している。
第一原理計算と量子多体計算のｈｙｂｒｉｄ法による多バンド系の超伝導機構

鉄系超伝導体FeSeが、他の鉄系とは異なる温度ー圧力相図を示すことで注目を集めている。超伝導転移温度は圧力を印加すると非単調に増大し続け、高圧側の反強磁性量子臨界点近傍で常圧の4倍近い転移温度を示す。本研究では第一原理計算に基づくFeSeのd-p模型に対して、動的平均場理論や乱雑位相近似といった手法を相補的に適用し、磁気・軌道揺らぎと電子状態、超伝導について調べた。まず、常圧のd-p模型に動的平均場理論を適用することで1粒子スペクトルを導出した。d軌道のクーロン相互作用に軌道依存性があるためにxy軌道のスペクトルに第一原理計算との差が生じ、結果として実験の電子状態が説明されることを明らかにした。次に、同様のd-p模型に乱雑位相近似を適用し、スピン・軌道揺らぎと超伝導の圧力依存性について調べた。その際、動的平均場理論で期待される遷移積分の補正を加えることで実験との不整合を解消することに成功した。圧力依存性の結果として、同一サイトのクーロン斥力に由来する反強磁性秩序は一重ドーム構造で安定化するが、サイト間(d-p間)クーロン斥力に由来する軌道秩序は単調に抑制されることを示した。超伝導は二重ドーム構造を示し、高圧側のほうが転移温度が高い。また、これらはnodal-s±波超伝導であることも明らかにした。本研究で得られた結果は実験の相図を良く説明するとともに、比熱測定、STMから予言されるギャップ構造とも良い一致を示している。鉄系超伝導体FeSeは複雑な電子状態を持ち、かつクーロン相互作用も大きいため、これまで現実的な電子状態と強相関・強結合効果の両方を考慮して超伝導まで議論した研究は数少なかったが、本研究における手法は第一原理計算に基づく強相関・強結合効果を考慮した量子多体計算を可能にしており、鉄系超伝導体の超伝導機構を明らかにする上で重要な計算手法であると期待される。翌年度、交付申請を辞退するため、記入しない。
DSAによる血流の定量的測定に関する研究

平均血流量は血管の2点間の通過時間とその間の血管容積により求めた。基礎実験はこの2点に分けて検討した。毎分100から500mlまで変化させた定常流回路より内径3.3mmの側管を導出させ、造影剤をボーラス状に注入して毎秒30フレームにてDSA画像を撮影した。通過時間計測は、2点の時間的濃度変化曲線を求め曲線上の隣切する2点間を線形補間し毎秒300フレームに変換させた曲線にて解析した。その解析方法としてpeak法、poak1/2法、面積重心法相互相関関数法を用いたが、後2者が実測値との間に0.96の相関係数が得られた。しかしノイズに影響されにくい相互相関関数法が臨床に適用できると考えられた。拍動流回路に相互相関関数法を適用したが、毎分100から290mlまでの変化に対して0.95の相関係数が得られた。我々が用いたシステムのマトリックスは512×512であり、その理論的最大空間分解能は0.15mmである。しかし種々の変動により空間分解能の低下が認められ、特に細い血管の正確な計測には問題がある。本システムでの血管径計測に最適な条件を求めるため、アクリル板で作成した血管ファントム(0.57mm径)にて径計測実験を行なった。その結果管電圧70kv前後、原液造影剤を用い、また装置の許す限り拡大画像で撮影することが必要である。基礎実験の結果を基に大動脈冠動脈バイパスグラフト(ACBG)の血流量測定を試みた。ACバイパス術後遠隔期の7症例(平均年令62±6歳)の7本のグラフトを対象とした。安静時平均血流量は40.7±11.5ml/min(ROI間距離1.7±0.3cm、血管径3.0±0.5mm)であった。さらに心房ペーシング(安静時の1.5倍の心拍数)によりグラフト血流量は64.9±14.7ml/minと有意に増加した。今後この方法が臨床的に広く適用されるための課題として更に基礎的、臨床的検討が必要なことは当然として、絶対流量測定としてDSA画像の空間分解能の向上が挙げられる。平均血流量は血管の2点間の通過時間とその間の血管容積により求めた.基礎実験ではこの2点に分けて検討した.定常流量を毎分100mlから500mlまで変化させ,冠動脈を想定した内径3.3mmの管に側管より造影剤をボーラス状に注入し毎秒30フレームでDSA画像を撮影した.「1.通過時間計測について」通過時間計測は,2点間の時間濃度変化曲線を求め解析した.時間分解能精度向上のために曲線上の2点間の線形補間を行い,毎秒300フレームに時間濃度曲線を変換させた.解析方法としてpeak法・peak1/2法・面積重心法・相互相関関数法を用い検討した.定常流基礎実験では面積重心法と相互相関関数法が実測値との間に0.96の相関係数が得られた.しかし,臨床ではノイズに影響されにくい相互相関関数法が適用できると考えられた.「2.血管容積計測について」

我々が用いたシステムのマトリックスは512×512ピクセルであり,その理論的空間分解能は0.15mmである.しかし,撮影系および記録系の種々の変動により空間分解能の低下が認められ冠動脈の様な細口血管の正確な血管容積,特に血管径計測には問題がある.そこでアクリル板にて作成した0.5mm7mm径のファントム血管に造影剤を満たし血管径計測に最適な条件を求めた.なお血管径の辺縁設定には1次微分法を用いた.実験結果から管電圧70Kv前後で,原液造影剤を用いることにより画像のコントラスト分解能が最もよく,また空間分解能を向上させるため装置が許す限りイメージインテンシファイアーと被写体をできるだけ離す拡大画像で撮像することが必要である.しかし血管径が1mm以下になると識別は可能であるが,定量的計測は困難で現在の装置では問題がある.今後の計画は電磁定量ポンプを用い拍動流回路を作成し定常流と同様な実験を行い,定常流基礎実験での結果を拍動流に対して応用し,臨床応用を行う予定である.前年度の基礎実験を拍動流に適応し、その有用性を検討した。電磁定量ポンプを用いた拍動流回路を作成し、pump pulseを60rpmに設定し流量を毎分100mlから290mlまで変化させた。相互相関関数法を用いれば実測値との間に0.95の相関係数が得られ、定常流の場合と同様適用できると考えられた。次に基礎実験にて確立された方法の臨床応用を試みた。対象血管として比較的直線的である大動脈冠動脈(A-C)バイパスグラフトを選んだ。A-Cバイパス術後遠隔期(平均1年2ケ月)の7症例(平均年令62±6才、男女比6:1)の大伏在静脈グラフト7本を対象とした。グラフトやグラフト遠位側冠動脈に有意な器質的狭窄を認めず、いずれの灌流領域も左室造影にて壁運動は保たれていた。安静時ならびに心房ペーシング負荷時におけるグラフト流量を測定した。撮影画像はI.I.6.5インチにて拡大撮影を施行し、また血管径(y:mm)は辺縁設定に1次微分(x)を用い基礎実験で得られた回帰式(y=x+0.31、α=0.999、p<0.01)より求めた。また心拍動の影響をなるべく除去するために得られたDSA画像にphase match subtractionという操作を加えた。すなわち造影剤注入前の一心拍の画像をphase matchさせた造影剤注入後の画像から差分した像を作成した。2点のPOI間距離は1.7±0.3cmに設定し、グラフト血管径は3.0±0.5mmであった。安静時のグラフト流量は40.7±11.5ml/minである。7症例の心拍出量は6.1±0.9l/minであり、心拍出量に対するグラフト流量は0.67±0.22%であった。次に心房ペーシングによりdouble productは10213±2386beat.mmHg/minから16982±2869beat.mmHg/minへと有意に増加した。その際のグラフト流量は64.9±14.7ml/minで、安静時に比して有意に増加したくp<0.01)。基礎実験で確認された様に比較的簡便に流量測定の臨床応用が可能であることが確認できた。
小児網膜疾患における網膜形態異常に対する多角的解析

これまでに8名の活動期未熟児網膜症患者、3名の家族性滲出性硝子体網膜症患者のSwept-source OCT撮影を行い、高解像度の断層(Bスキャン)画像、層別の平面(en face)画像、血管画像(OCT Angiography)の取得を目標として撮影を行った。未熟児網膜症ではNICUにて鎮静なしでの撮影を試み、数秒の眼球静止時間があれば画像の取得が可能であることが明らかになった。家族性滲出性硝子体網膜症においては手術加療の必要な児において手術室で全身麻酔下に検査を行い、鎮静していても眼球の向きのコントロールなどに工夫が必要であることが判明した。両疾患ともに0歳での活動期病変の撮影に成功しており、鮮明な網膜血管画像、黄斑形態の画像取得が可能であった。とくに、硝子体腔内へ滲出している新生血管のみをとりだして画像化することに成功しており、検眼鏡だけでは検出困難な増殖病変の検出に役立つと考えられた。一方、0歳児においては側臥位にして撮影する必要があり、短時間で効率よく撮影するための体位や撮影条件の工夫など今後さらに改善できる課題も明確となった。今後本検査が臨床に広く普及するためにはさらなる撮影の簡便化が必要であると思われる。今後は網膜血管の発育を追って経時的にSS-OCT、OCTAの撮像を同一児で複数回行いたいと考えている。また、未熟児網膜症と家族性滲出性硝子体網膜症の症例数を増やし、別の網膜血管疾患であるコーツ病や色素失調症などでも撮影し、黄斑構造の解析と共に、血管長や血管密度の測定を行う予定である。昨年度目標症例数は到達し、画像解析まで終了している。昨年度撮影した児の経時的変化を新たに撮影することと、新たな症例数の増加のため検査の効率化、短時間化を図る。そのために撮影時の体位固定のための固定具の導入などを行う。サイトカイン測定において、今年度は種類を限定して測定したためにプレートなどの費用が抑えられた。しかし、今年度はサイトカインの種類を増やしてkitを作成し、分子生物学的実験を行う計画としているため、次年度使用額をこの経費に充てる予定である。
ブタ横隔膜ヘルニアの家系確立とその発生学的成因の解明

新生児期の緊急疾患として最も重要なものの一つであるが、未だに治療成績の悪い先天性横隔膜ヘルニアの治療成績向上を最終目的として行われた研究である。これは実質的に我々が1980年より行ってきたブタ鎖坩肛モデルを用いた研究の一部分をなすと言ってもよい研究である。鎖肚ブタ家系の内に発生している横隔膜ヘルニア家系を確立するのが第一の目的であり、鎖肚ブタ家系を維持出来た事自体が大きな成果と言える。(外科53(1):93,1991)しかし残念ながら、13酸発生後の家系内の横隔膜ヘルニアの発生が無くなった事、救命したし成育した雌ブタも交配を繰り返しても異常仔を出生しなかったので、横隔膜へのヘルニア家系の確立には至らなかった。ブタ1家系に発生した横隔膜ヘルニア詳細な解剖学的、病理学的検討結果は(日本小児外科学会誌26(6):1118,1990)に報告した。いずれも14カ月余に発生した遅発性ヘルニアであることが特異でもあるが、その意義についても、検討を加えた。ここには遺伝学的解析も同時に報告したが、要に詳細な遺伝因子の統計学的な検討は本年太平洋小児外科学会に発表し、J. Pediatr. Surg.に報告する予定である。autosomaldouble recessive genesの存在が証明できた事が大きな成果である。我々の経験したヒト臨床例における家族性横隔膜へルニアを検討報告し(第26回日本新生児学会,1990)、ヒトでの発生例を検討したが文献的に未だに親子発生例は全く見られていない。ブタでもこれだけ多数例の発生は我々のファ-ム以外に報告を見ないが、残念ながら親子例は作成出来なかった。我々が横隔膜異常の胎児を手にしていない事より、正常の胸腹裂孔の閉鎖と腸管の腹腔内還納時期との関係は十分に示せたが、新しい成果を得るには至らなかった。三次元立体再構築法による結果は今回示すには至らなかった。1)われわれの確立した鎖肛ブタ家系(I-Farm)に横隔膜ヘルニア13例の発生をみたことよりこの研究が始まった。この鎖肛ブタ家系の維持自体が必須のことであり、これが出来たことは成果の一つである。2)横隔膜ヘルニアのブタ(雌)を手術的に治療し救命できたので、成育し同じFarmのブタを用いて実験的交配を行っているが、いまだこの奇形の再発を見ていない。モデル動物としての横隔膜ヘルニアを生産するための交配に関する検討を続けている。3)13例の横隔膜ヘルニアに関して詳細な解剖学的な検討を加えた。全例が遅発性であるが、先天性のヘルニアであることを病理学的にも確認出来た。4)正常の横隔膜の発生学的検討によって、胸腹裂孔の閉鎖機序より閉鎖の過程において、裂孔は背側方より閉鎖してゆき、中央に向かって裂孔が移動して行くことが示されている(Hamburg大学のD.Kluthとの共同研究による)。我々のブタの標本では裂孔が中央にあり、しかも小さいものが多いことより、この説明と合致することが確かめられた。ヒトの遅発例ではこの点が不確かである。鎖肛ブタの初期胎仔標本より横隔膜部分の検討を行っている。5)遺伝学的な検討がなされた。137同胞仔/

6出産の内に13の横隔膜ヘルニアが見られたわけであるが、各種遺伝形式に関して計算が繰り返され、このうち二重劣性遺伝が適合する事が確認された(放射線医学総合研究所安田徳一部長との共同研究による)。新生児期の緊急疾患として最も重要なものの一つであるが、未だに治療成績の悪い先天性横隔膜ヘルニアの治療成績向上を最終目的として行われた研究である。これは実質的に我々が1980年より行ってきたブタ鎖肛モデルを用いた研究の一部分をなすと言ってもよい研究である。鎖肛ブタ家系の内に発生している横隔膜ヘルニア家系を確立するのが第一の目的であり、鎖肛ブタ家系を維持出来た事自体が大きな成果と言える。(外科53(1):93,1991)しかし残念ながら、その後の家系内の横隔膜ヘルニアの発生が無くなった事、救命し成育した雌ブタも交配を繰り返しても異常仔を出生しなかったので、横隔膜ヘルニア家系の確立には至らなかった。ブタI家系に発生した横隔膜ヘルニア詳細な解剖学的、病理学的検討結果は(日本小児外科学会誌26(6):1118,1990)に報告した。いずれも14か月令に発生した遅発性ヘルニアであることが特異であるが、その意義についても検討を加えた。ここには遺伝学的解析も同時に報告したが、更に詳細な遺伝因子の統計学的な検討は本年太平洋小児外科学会に発表し、J.Pediatr.Surg.に報告する予定である。autosomaldouble recessive genesの存在が証明できた事が大きな成果である。我々の経験したヒト臨床例における家族性横隔膜ヘルニアを検討報告し(第26回日本新生児学会,1990)、ヒトでの発生例を検討したが文献的に未だに親子発生例は全く見られていない。ブタでもこれだけ多数例の発生は我々のファ-ム以外の報告を見ないが、残念ながら親子例は作成出来なかった。我々が横隔膜異常の胎児を手にしていない事より、正常の胸腹裂孔の閉鎖と腸管の腹腟内還納時期との関係は十分に示せたが、新しい成果を得るには至らなかった。
カルボニールレダクターゼの機能解析ー新たな機序による分子標的治療の開発に向けてー

【研究成果】子宮体癌細胞でCBRの発現抑制によって上皮間葉転換が誘導された。また、in vitroおよびin vivoにおいてもCBRの発現抑制によって腫瘍の増殖および腫瘍形成は有意に増大した。反対にCBRの過剰発現においては腫瘍の形成は有意に抑制されていた。【意義・重要性】in vitro実験において子宮体癌細胞でCBRの発現を増加させることによって、癌細胞の浸潤能を抑制した結果は画期的である。本研究の結果よりCBRを標的分子としてEMTを抑制し、癌の浸潤・転移の抑制、腫瘍増殖抑制を目的とした新規の分子標的治療の開発に結びつく可能性がある。in vivo実験において腫瘍形成能におけるCBR1の関与。以上より、CBR1の発現低下は、in vivoでも腫瘍の増殖能を亢進させることが分かった。さらに興味深いことにCBR1の発現増加によって、腫瘍の形成が著明に抑制されることが示された。【目的】子宮体癌におけるcarbonyl reductase(CBR)の機能解析とその分子機序を明らかにする。また、in vivoで腫瘍細胞にCBRを過剰発現させ、浸潤・転移の抑制を目指した新たな機序による分子標的治療の開発を目的とする。【方法】子宮体癌細胞SNG-MにCBRのセンス(CBR-S)およびアンチセンス(CBR-AS)cDNAを遺伝子導入し、in vitroにおいて1)細胞増殖、2)invasion assayおよびMMPの発現について検討した。EMTに関して、3)E-cadherinとその転写因子の発現4)上皮・間葉マーカーの発現を検討した。さらに、in vivoにおいて5)上記遺伝子導入細胞をヌードマウスの皮下に移植し、8週間後にautopsyし、腫瘍形成能を検討した。【結果】1)CBR-ASでは明らかに腫瘍細胞の増殖が亢進した。2)CBR-ASではMMPの分泌が亢進し、細胞浸潤能が有意に亢進した。3,4)上皮マーカーであるE-cadherinとcytokeratin 18の発現はCBR-Sで増加し、CBR-ASでは低下した。また、E-cadherinの転写抑制因子であるSnail、ZEBの発現はCBR-Sで低下し、CBR-ASでは増加した。一方、間葉マーカーであるfibronectinおよびSMAの発現はCBR-ASで増加した。5)in vivoで形成腫瘍はCBR-ASで有意に大きく、一方CBR-Sでは腫瘍の増殖が有意に抑制された。8週間後でも摘出腫瘍ではEMTが維持された。【意義・重要性】in vitro実験において癌細胞でCBRの発現を増加させることによって、癌細胞の浸潤能を抑制した結果は画期的である。1. in vitroでCBR1の強発現および発現抑制による細胞機能を検討する。1)細胞増殖能の変化:CBR1の発現抑制細胞ではコントロールと比較して、細胞増殖は有意に亢進されていた。反対にCBR1の強発現細胞では、細胞増殖は有意に抑制されていた。2)細胞形態の変化:CBR1の発現抑制細胞では細胞形態は線維芽細胞様に変化していた。CBR1の強発現細胞では敷石状の形態に変化していた。3)細胞浸潤能・移動能の変化:CBR1の発現抑制細胞ではコントロールと比較して、細胞浸潤能・移動能は有意に亢進されていた。反対にCBR1の強発現細胞では、細胞浸潤能・移動能は有意に抑制されていた。4)MMPの分泌:CBR1の発現抑制細胞ではコントロールと比較して、MMP分泌は有意に増加していた。反対にCBR1の強発現細胞では、MMP分泌は有意に抑制されていた。2. CBR1の発現低下が臨床的に予後不良となるメカニズムについて、上皮間葉転換EMTのメカニズムを中心に検討する。CBR1の発現抑制細胞で細胞形態は線維芽細胞様に変化していた。EMTのkey moleculeであるE-cadherinの発現はCBR1の発現抑制細胞では明らかに抑制されていた。E-cadherinの転写抑制因子であるSnail、ZEB1の発現はCBR1の発現抑制細胞では明らかに増加していた。さらに、上皮マーカーであるサイトケラチン18の発現葉低下し、間葉マーカーであるfibronectin及びalpha-smooth muscle actinの発現が亢進していた。よって、CBR1の発現抑制によってEMTが誘導されることが明らかとなった。以上の結果より、予後不良となるメカニズムはCBR1の発現低下によって細胞増殖能が亢進することに加えて、EMTが誘導され、細胞浸潤能が亢進する結果であることが明らかとなった。