hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
SEREX法を応用したハイリスク甲状腺腫瘍の血清学的スクリーニング法の開発

Clinical Endocrinology (2013) 79; 35-42.にて報告したSEREXの結果と総合し、患者血清によりエピトープのスクリーニングを実施する対象分子を決定した。さらにその分子の立体構造を専用コンピューターソフトにて検討し、抗原性が高いと思われる領域を対象にペプチドライブラリーの作成を行った。1.抗WDR1抗体価の甲状腺癌血清診断マーカーとしての確立抗WDR1抗体のエピトープを特定することまでは実施可能であった。しかし、患者血清を用いて既に報告した結果と同様の再現性が得られるかどうかを多数の患者血清により検討することができなかった。2. Stage 1の甲状腺乳頭癌スクリーニングに優れた血清診断マーカーの同定甲状腺乳頭癌のスクリーニングに優れた血清診断マーカーに用いる候補分子を決定することと、対象領域を網羅するペプチドライブラリーの作成までは実施可能であった。しかしエピトープの決定および多数の患者血清による検討まで実施出来なかった。本研究課題では、甲状腺癌の90%以上を占める甲状腺乳頭癌(PTC)のハイリスク者を、超音波検査(US)や穿刺吸引細胞診(FNAC)に依存せず、安価かつ正確に診断する手法を開発するための基礎的研究を行った。我々が甲状腺未分化癌患者の腫瘍組織と患者血清にてクローニングしたWD repeat domain 1 (WDR1)とFibronectin 1 (FN1)に着目し、患者血清中の自己抗体と特異的に反応し予後不良のPTCを検出する12アミノ酸のペプチドを人工合成した。合成したペプチドにて癌特異的自己抗体の検出を行うことで、予後を反映したPTCの診断マーカー開発を進める予定である。1.抗WDR1抗体価の甲状腺癌血清診断マーカーとしての確立当初、Clinical Endocrinology (2013) 79, 35-42においてクローニングした領域のGSTタグを切断したり、Hisタグを用いた合成系を検討したが、いずれにおいても安定した大量の抗原の合成、ELISA系における固相化は困難であると判断した。そこで新たな手法としてWDR1全長をカバーする12アミノ酸からなるペプチドのライブラリーを作成し、エピトープマッピングにて検討する方針とした。安定した測定系の確立が完了していないため、当初予定していた多数患者での検討への移行が困難となった。2. StageIの甲状腺乳頭癌スクリーニングに優れた新規診断マーカーの同定クラスタリング解析やgene ontology解析を実施し、新規診断マーカーの絞り込みを行い、WDR1と同様の手法で検討することを目指した。しかしWDR1で経験された問題から、GST結合蛋白など大腸菌や酵母を用いた系で研究を進めるのか、あるいはペプチド合成を応用するのかのできていないため、WDR1で進行中の知見を元に進める方針とした。1.抗WDR1抗体価の甲状腺癌血清診断マーカーとしての確立本年度の検討に用いた高純度のエピトープを有する12アミノ酸からなるペプチドを用いて、多数の患者血清によりClinical Endocrinology (2013) 79; 35-42.に報告した知見の再現性を検討し、臨床応用可能な状態とすることを目指す。
合金組織形成ダイナミクスの原子論的理解に向けた分子動力学解析の時間スケール加速

本研究では合金組織のさらなる高精度制御に向けて,時間スケールの限界から現行のMD法では到達不可能な組織形成に係るスローダイナミクス現象の原子論的描像を明らかにすることを目的とする.具体的には,Hyperdynamicsを基にした時間加速化MD法を導入し,粒界偏析や時効硬化など固相拡散に由来する動的現象の全原子解析を試みる.純物質を想定したモデル系のみならず実用合金の典型例も取り扱い,加速化MDの有用性を金属材料学的視点から確立する.これらの知見を俯瞰的に統合し,原子スケール計算研究に立脚した合金組織高精度制御実現を目指す.本研究では合金組織のさらなる高精度制御に向けて,時間スケールの限界から現行のMD法では到達不可能な組織形成に係るスローダイナミクス現象の原子論的描像を明らかにすることを目的とする.具体的には,Hyperdynamicsを基にした時間加速化MD法を導入し,粒界偏析や時効硬化など固相拡散に由来する動的現象の全原子解析を試みる.純物質を想定したモデル系のみならず実用合金の典型例も取り扱い,加速化MDの有用性を金属材料学的視点から確立する.これらの知見を俯瞰的に統合し,原子スケール計算研究に立脚した合金組織高精度制御実現を目指す.
実形状に基づく血管内物質輸送の解析と動脈硬化局在化機構の解明

粥状動脈硬化症や内膜肥厚が循環系に限局的に発症する流体力学的メカニズムを解明するために,血管の実形状を計測するシステムを開発し,実際に肥厚が生じた血管の実形状に基づく血流および肥厚性血管病の誘因物質である低密度リポ蛋白(LDL)の輸送解析を行った.本研究で得られた成果は以下のとおりである.1.1次元変位センサを取付けた3軸の並進ステージと試料を載せた回転ステージの位置をコンピュータで制御することにより,測定に適した試料との距離を保ちながら変位センサを上下・左右方向に走査させ,血管内腔を型取りした樹脂の3次元表面形状を高精度に計測するシステムを開発した.2.分岐を含む血管の内腔形状から効率的にCFD用のメッシュモデルを構築する方法を確立し,それを狭窄を施した家兎総頸動脈や,分岐部と合流部を含むバイパス手術を施したイヌ総頸動脈,剖検により採取したヒト冠動脈の分岐部の血管に適用し,病理組織標本から得た動脈硬化の病変部位と直接的に対応が可能な実形状モデルを構築した.3.人為的に狭窄を施した家兎総頸動脈やバイパス手術を施したイヌ総頚動脈について,低壁せん断応力域に好発すると言われている内膜肥厚の発症部位と流れおよびLDLの壁面濃度との関係について調べた.その結果,病変が生じていた部位において,単純化された形状モデルを用いた数値流体解析では示すことができない壁近傍の複雑な流れ場の構造を明らかにすることができた.また,こうした壁近傍の流れはLDLの壁面濃度に大きく影響を及ぼすことがわかり,流れが乱されて壁近傍の流れが合流する低壁せん断応力域でLDLの壁面濃度が局所的に高くなり,そのような部位で内膜肥厚が生じていることがわかった.このように,肥厚性血管病の局在化と血流との関係において,血行力学的因子を血管構成細胞への力学的刺激源と捉える従来の考え方とは異なる物質輸送面からの新しい観点を示すことができた.粥状動脈硬化症や内膜肥厚が循環系に限局的に発症する流体力学的メカニズムを解明するために,血管の実形状を計測するシステムを開発し,実際に肥厚が生じた血管の実形状に基づく血流および肥厚性血管病の誘因物質である低密度リポ蛋白(LDL)の輸送解析を行った.本研究で得られた成果は以下のとおりである.1.1次元変位センサを取付けた3軸の並進ステージと試料を載せた回転ステージの位置をコンピュータで制御することにより,測定に適した試料との距離を保ちながら変位センサを上下・左右方向に走査させ,血管内腔を型取りした樹脂の3次元表面形状を高精度に計測するシステムを開発した.2.分岐を含む血管の内腔形状から効率的にCFD用のメッシュモデルを構築する方法を確立し,それを狭窄を施した家兎総頸動脈や,分岐部と合流部を含むバイパス手術を施したイヌ総頸動脈,剖検により採取したヒト冠動脈の分岐部の血管に適用し,病理組織標本から得た動脈硬化の病変部位と直接的に対応が可能な実形状モデルを構築した.3.人為的に狭窄を施した家兎総頸動脈やバイパス手術を施したイヌ総頚動脈について,低壁せん断応力域に好発すると言われている内膜肥厚の発症部位と流れおよびLDLの壁面濃度との関係について調べた.その結果,病変が生じていた部位において,単純化された形状モデルを用いた数値流体解析では示すことができない壁近傍の複雑な流れ場の構造を明らかにすることができた.また,こうした壁近傍の流れはLDLの壁面濃度に大きく影響を及ぼすことがわかり,流れが乱されて壁近傍の流れが合流する低壁せん断応力域でLDLの壁面濃度が局所的に高くなり,そのような部位で内膜肥厚が生じていることがわかった.このように,肥厚性血管病の局在化と血流との関係において,血行力学的因子を血管構成細胞への力学的刺激源と捉える従来の考え方とは異なる物質輸送面からの新しい観点を示すことができた.粥状動脈硬化症やその初期病変である内膜肥厚が循環系に限局的に発症する流体力学的メカニズムを解明するために,血管の実形状を計測するシステムを開発し,実際に肥厚が生じた血管内の血流および肥厚性血管病の誘因物質である低密度リポ蛋白(LDL)の輸送解析を行った.1.3次元血管形状計測システムの開発1次元変位センサを取付けた3軸の並進ステージと試料を載せた回転ステージの位置をコンピュータで制御することにより,測定に適した試料との距離を保ちながら変位センサを上下・左右方向に走査させ,血管内腔を型取りした樹脂の3次元形状を高精度に計測するシステムを開発した.2.バイパス手術を施したイヌ総頸動脈の実形状計測イヌの片方の総頸動脈を摘出し,その両端をもう一方の総頸動脈の側部に吻合するバイパス手術を行った.3ヵ月後,血管に樹脂を注入して血管の鋳型を作製し,その形状を開発したシステムで計測した.その結果,CFD解析には十分な精度でバイパス血管の実形状を得ることができた.3.狭窄を施した家兎総頸動脈内の物質輸送解析家兎総頸動脈に縫合糸を緩く巻きつけて狭窄を施す手術を行った.一定期間飼育後,血管に樹脂を注入し,血管の鋳型と血管壁の組織標本を作製した.樹脂鋳型から血管の実形状モデルを作成してLDLの輸送計算を行い,組織標本から血管軸方向に沿った内膜の厚さを測定した.

その結果,狭窄の頂点から約1mm下流でLDLの壁面濃度が流入部に比べ28%も局所的に高くなり,その部位は組織標本から得られた内膜肥厚が生じていた部位にほぼ対応することがわかった。また,LDLの壁面濃度と内膜の厚さとの関係を調べた結果,LDLの壁面濃度が高くなっている所ほど内膜が厚くなっている傾向があることがわかった.粥状動脈硬化症やその初期病変である内膜肥厚が循環系に限局的に発症する流体力学的メカニズムを解明するために,実際に病変を起こした種々の血管に対して,前年度に開発した形状計測システムを用いて血管の実形状を計測し,それに基づく流れおよび肥厚性血管病を誘発する低密度リポ蛋白質(LDL)の輸送の解析を行うとともに,同一試料に対して血管壁の組織標本の作製および肥厚部位の計測を行い,肥厚部位と流れおよび物質輸送との直接的な関係について検討し,以下の研究成果が得られた.1.分岐を含む血管の内腔形状から効率的にCFD用のメッシュモデルを構築する方法を考案し,それを剖検により採取したヒト冠動脈の分岐部の血管に適用し,病理組織標本から得た動脈硬化の病変部位と直接的に対応が可能な実形状モデルを構築した.2.人為的に狭窄を施した家兎総頸動脈に対して,内膜肥厚が生じた部位とその壁近傍の流れおよびLDLの壁面濃度との関係について調べた.その結果,狭窄により流れが乱され,壁近傍の流れが合流する低壁せん断応力域でLDLの壁面濃度が局所的に高くなり,そのような部位で内膜肥厚が生じていることがわかった.3.バイパス手術を施したイヌ総頚動脈について,低壁せん断応力域に好発すると言われている吻合部内膜肥厚の発症部位と流れおよびLDLの壁面濃度との関係について調べた.その結果,病変が生じていた部位において,単純化された形状モデルを用いた解析では示すことができない壁近傍の複雑な流れの構造を明らかにし,それが個々の血管における内膜肥厚の発症部位の分布に関与していることを示した.また,こうした壁近傍の流れはLDLの壁面濃度に大きく影響を及ぼすことがわかった.このことから,一見同様に見える壁せん断応力が低い領域においても流れの構造が異なり,そのような局所的な流れ場の違いが,病変の発症・進展に影響を及ぼしている可能性が示唆された.
胚性分泌因子ＷＮＴ１１がウシ着床前期胚発生に果たす役割の解明

今年度は、前年度までに確立した高力価のウイルスの作製技術をもとに、実際にウシ胚へのレンチウイルス媒介性遺伝子導入を行った。体外受精後の1細胞期において囲卵腔に高濃縮ウイルス液を注入した胚を胚盤胞期まで体外培養し、ゲノムDNA抽出を行い、外来遺伝子のPCRを行うことで、高効率の遺伝子導入を確認した。また、ウシ胚よりクローニングしたWNT11遺伝子のcDNAを発現する発現ベクターを哺乳類細胞に導入し、RT-PCR、およびウエスタンブロッティングで高レベルの導入遺伝子の発現を確認している。また、胚盤胞期以降の胚発生を評価するためには前提として、胚盤胞期以降の急速な胚の退行を抑えるような培養系の開発が必要であると考えた。そこで、培地や培養基質を数種類検討することにより、従来の培養法と比べ大幅に胚の生存日数を延長することに成功した。この培養法により生存を延長した胚が、胚としての性質を維持していること、および分化が進行していることを評価するために、マーカー遺伝子の免疫染色、定量PCR等を行い、これを灌流により得られたvivo胚と比較することで、新規に開発した培養法により作出した胚における分化が、大部分vivoを反映していることが明らかとなった。胚盤胞期以降のウシ胚発生では、ICMから原始内胚葉、胚盤葉上層が分化し適切に配置されることが重要である。本研究では、原始内胚葉の適切なマーカー遺伝子も同定することができた。今後は、これらの材料を組み合わせることにより、WNT11が胚盤胞期胚以降のウシ胚発生における役割を評価することができる。平成30年度が最終年度であるため、記入しない。今年度は、本研究の遂行上重要となる、ウイルスベクターによる培養細胞および胚への遺伝子導入の条件について詳しく検討した。ウシにおいてウイルスベクターによる遺伝子発現を行った知見は少なく、目的のcDNAを安定的に発現させるための適切なプロモーターの選択から行う必要があった。そこで、哺乳類で頻用される各プロモーター下で蛍光タンパク質Venusを発現するウイルスを作製し、ウシ胎子線維芽細胞に感染させ、蛍光観察によりプロモーターの活性を評価した。この結果、汎用プロモーターであってもウシ細胞における活性には違いがあることが明らかとなった。また、胚への遺伝子導入の手技を習得するために、受精卵を得ることが容易なマウスを用いて、ウイルスの感染方法の検討を行った。ウイルス感染による胚への遺伝子導入では、透明帯を除去しウイルス粒子を含む培地中で培養する方法と、高度に濃縮されたウイルス液をマイクロインジェクションにより透明帯と細胞質の間隙(囲卵腔)に直接注入する方法の2つが報告されていた。この二つの方法を比較検討した結果、ウイルス液の囲卵腔注入のほうが遺伝子の導入効率が高いこと、さらに、ウイルス液は体積比で少なくとも100倍以上濃縮したものを用いる必要があることが分かった。ウイルスベクターへの目的遺伝子のクローニングは完了しており、来年度はじめにウシ体細胞および胚への遺伝子導入と解析を開始する予定である。一方、ウシ初期胚発生のメカニズムをより広範に理解することを目的に、胚盤胞期胚のTEで高発現するTEAD4およびCCN2遺伝子の機能解析も行った。ノックダウン等の手法を用いることにより、ウシ初期胚においてはこれら二つの因子が相互に制御しあいながら、TEの分化に貢献していることが分かった。本年度は、主としてレンチウイルスによるウシ体細胞および胚への遺伝子導入系の確立に注力した。関心遺伝子の機能解析まで取り掛かる準備段階として、標的遺伝子のクローニング、レンチウイルスの作製およびその感染系の確立に取りかかった。ウイルスを用いた遺伝子導入は本研究室初の試みであり、熟練者に手技を教わる必要があった。これにかかわる出張、さらには当研究室における実験系の立ち上げに予想以上の時間を要した。特に、胚への遺伝子導入において必須とされるウイルス粒子の濃縮に関しては、超遠心法のほか、低速で長時間遠心する方法、PEGをもとにした試薬による方法、フィルターを用いた方法など多岐にわたる方法が提唱されており、再現性と効果の2点でこれらの方法の比較検討を行わなければならなかった。フローサイトメーターなどの機器が容易に使用できない環境にあるため、別の方法で力価を定量的に評価する方法の探索も綿密に行った。しかし、詳細な検討の結果、簡便に高力価のウイルスを得る系が確立され、遺伝子導入効率の低さに対する懸念は払拭されたと考えている。系の確立の後に、胚が容易に準備することができるマウスにおいて予備試験を行い、感染および発現を確認し、来年度の予定を円滑に開始できる土台が固まったと考えている。一方、並行して行っていた胚盤胞期胚の分化機構に関する研究では、これまでに培われた手法を駆使することによりインパクトのある成果が得られた。これをもとに国内外で学会発表を行い、さら論文が国際科学誌Reproductionに受理され、掲載が決定している。多少の遅れはあるものの、設定したテーマに基づき着実に研究が遂行されており、一定以上の成果が見込まれる。また、ウシ胚よりクローニングしたWNT11遺伝子のcDNAを発現する発現ベクターを哺乳類細胞に導入し、RT-PCR、およびウエスタンブロッティングで高レベルの導入

遺伝子の発現を確認している。また、胚盤胞期以降の胚発生を評価するためには前提として、胚盤胞期以降の急速な胚の退行を抑えるような培養系の開発が必要であると考えた。そこで、培地や培養基質を数種類検討することにより、従来の培養法と比べ大幅に胚の生存日数を延長することに成功した。この培養法により生存を延長した胚が、胚としての性質を維持していること、および分化が進行していることを評価するために、マーカー遺伝子の免疫染色、定量PCR等を行い、これを灌流により得られたvivo胚と比較することで、新規に開発した培養法により作出した胚における分化が、大部分vivoを反映していることが明らかとなった。胚盤胞期以降のウシ胚発生では、ICMから原始内胚葉、胚盤葉上層が分化し適切に配置されることが重要である。本研究では、原始内胚葉の適切なマーカー遺伝子も同定することができた。今後は、これらの材料を組み合わせることにより、WNT11が胚盤胞期胚以降のウシ胚発生における役割を評価することができる。本研究は胚性分泌因子の機能を解明することを目的としている。そのためまず、遺伝子導入を行った細胞から、目的のタンパク質が分泌されていることを確認しなければならない。培養上清についてウエスタンブロッティングを行い目的タンパク質の発現を定量的に評価する。培養上清中に十分量の目的分泌タンパクが含まれていることを確認してから、胚との共培養を行う。この時、当初予定していた古典的、非古典的経路の作動を関係分子の免疫染色等により検証するという実験のほか、胚に起こる全体的な遺伝子発現の変化をとらえるためのマイクロアレイ解析の実施も検討している。ウシにおいては着床周辺期発生の体外培養モデルが存在しないことから、胚盤胞期以降の発生を主導する分化メカニズムの大部分が不明である。そのため、伸長期において発現が亢進する分泌因子がどのような機序で胚の生存や発生に関与するかを完全に予測することができない。これまでマウスで提唱されてきたモデルによらないウシ独自の発生機構を導き出すため、このような網羅的な解析が有効であると考えている。このほかに、死細胞の検出による生存性の評価や、分化関連タンパク質の免疫染色などによって、分泌因子の感作による胚の変化の定性的な評価も行う必要があると考えている。最終的には、分泌因子の存在下で培養した胚盤胞期胚を子宮に移植し、母体内における生存性や着床、受胎に与える影響についても検討したい。平成30年度が最終年度であるため、記入しない。
培養神経系における情報処理機能の人為的制御と再生医療への応用

最終年度においても引き続き微小流路内におけるラット大脳皮質神経細胞のパターニング培養法の開発と改良を主に行い、パターニング培養神経回路の形成とその機能制御について解析を行った。特にこれまでの実験で不十分であった,形成神経回路網のシナプス極性や軸索伸展方向の定量解析のための免疫染色法・活動計測のためのカルシウムイメージング法を重点的に行った。また、マイクロウェル部のアレイ構造と化学パターニング構造のデザインを変更することで,多種多様な構造と機能を有した培養神経回路の形成制御を試みた。これらの結果はJournal of Bioscience and Bioengineering雑誌に投稿し、受理・掲載されている。また研究課題に取り組む中で得られた微細加工技術・その培養細胞への応用法を、研究課題の中心となる大脳皮質神経細胞のみでなく、他の細胞種(C2Cl2筋芽細胞等)に応用することで様々な培養組織の形態・機能制御についても検討を行い、これらの実験についても外部発表の準備を行っている。これ以外にも該当研究者の有する実験技術・知見を研究室内外の研究者と協力することで多数の研究業績を発表するに至っている。本研究で提案した実験手法の今後の発展により、回路網構造・情報伝達経路を人為的・任意に構築した培養神経回路網を形成し、その情報処理機能を制御・応用することが可能となると考えている。また、その先には構築した実験系の特徴を用いて、脳神経系のある局所神経回路構造の形態・機能を再現した人工培養神経チップによる損傷脳機能の修復・代替法の開発という目標を持って今後の研究進展を行いたい。本年度の研究では,ラット大脳皮質神経細胞を用いて微小流路内でのパターニング及び培養を行った.一方向に流れる細胞懸濁液内の神経細胞を特定個所にトラッピングし局在化するために,U字型のマイクロウェル構造を有した鋳型構造をシリコンウェハ上に作製し,シリコンゴムの1種であるPDMSに転写することで細胞トラップ構造を有したマイクロ流路チャンバーを作製した.この際,U字型マイクロウェル構造に培養基板表面から45umの隙間を設けることで,マイクロウェル構造において水圧が高まり,高い再現性で神経細胞をトラップすることが可能となった.次に,トラップした神経細胞から伸展する軸索・樹状突起の方向制御を行うために,マイクロ流路内に化学物質を用いた細胞パターニングを組み合わせることを試みた.特定の凹凸パターンを備えたPDMS加工物表面に細胞の基板表面接着を促進するPEI(ポリエチレンイミン)溶液を浸し,培養基板上にPDMS加工物を接着することで凹凸パターンに沿ってPEIのパターニングを行った.更にPEIパターニング以外の領域をPluronic F-127を用いて細胞非接着コーティングを行うことで,神経突起の伸展方向制御を行った.以上の化学物質による細胞パターニングとマイクロ流路構造とを組み合わせることで,神経突起の成長方向制御を含めた培養神経回路網の形態制御を試みた.現状,マイクロウェル構造部にトラッピングした神経細胞から,PEIパターンに沿って神経突起を形態的に制御することが可能となった.今後は,マイクロウェル間で複数の神経細胞間が機能的結合を行っているか,どのような細胞活動の相互作用があるかを電気活動計測,もしくは光学計測によって評価を行い,情報伝達の方向性を含めた培養神経回路の形態・機能制御を行う予定である.本年度の研究は,昨年度に引き続き,微小流路内におけるラット大脳皮質神経細胞のパターニング培養法の開発と改良を主に行った.今年度は特に,細胞をU字型のマイクロウェル部に効率的にトラッピングさせるための流体条件の最適化を行うことを目標として,流体シミュレーションソフトウェアを用いたマイクロウェル構造部における流体挙動のシミュレーションを行った.シミュレーションの結果より,作製したマイクロウェル構造は細胞トラップ前はディッシュ底面との間のギャップ部に高い圧力が発生することで神経細胞のトラップが促進され,細胞トラップ後はマイクロウェル側面部から背面部に向かう圧力が高くなることで神経突起の伸長をマイクロウェル構造の背面方向に選択的に誘導する原理となることが推察された.このシミュレーション結果を踏まえたうえで流速条件を最適化した結果,PDMSマイクロ流体チャンバへの神経細胞トラップ時は100μl/minの流速を使用し,細胞トラップ後の細贈培養時には0.51μl/minの流速が適当であるとの結果を得た.この培養液流速条件下で培養を行うことで,マイクロウェル構造部にトラップされた神経細胞群が80%超の高い割合で培養流れ方向に神経突起を伸長することを確認した.この培養法により神経細胞の軸索が隣接のマイクロウェル部へと信号を投射することになり,電気信号が一方向に伝達制御された培養神経回路網形成に大きな前進となることが示唆された.現在,免疫染色法を用いた軸索,樹状突起,シナプス形成部位の同定を行うことを考えており,PDMS流路内で信号伝達がどのような様式で行われているのかを観測することを目指している.これにより,提案手法の形態・機能を制御した培養神経回路網の形成という目標に対する優位性・限界点について更に検討することを考えている.最終年度においても引き続き微小流路内におけるラット大脳皮質神経細胞のパターニング培養法の開発と改良を主に行い、パターニング培養神経回路の形成とその機能制御について解析を行った。

これらの結果はJournal of Bioscience and Bioengineering雑誌に投稿し、受理・掲載されている。また研究課題に取り組む中で得られた微細加工技術・その培養細胞への応用法を、研究課題の中心となる大脳皮質神経細胞のみでなく、他の細胞種(C2Cl2筋芽細胞等)に応用することで様々な培養組織の形態・機能制御についても検討を行い、これらの実験についても外部発表の準備を行っている。これ以外にも該当研究者の有する実験技術・知見を研究室内外の研究者と協力することで多数の研究業績を発表するに至っている。本研究で提案した実験手法の今後の発展により、回路網構造・情報伝達経路を人為的・任意に構築した培養神経回路網を形成し、その情報処理機能を制御・応用することが可能となると考えている。また、その先には構築した実験系の特徴を用いて、脳神経系のある局所神経回路構造の形態・機能を再現した人工培養神経チップによる損傷脳機能の修復・代替法の開発という目標を持って今後の研究進展を行いたい。本年度の研究において,流体シミュレーションによる培養液灌流速度の最適化に基づいた培養手法の改善を行うことで,PDMS流体チャンバ内において高い効率で神経細胞をマイクロウェル部にトラップさせ培養を行うことが可能となり,神経突起の伸長方向を制御した環境での培養が可能となった.細胞体を特定個所に局在化した上で,神経突起の伸展方向・極性を流体環境により制御する手法は本研究が初の試みであり,その新規性・有用性は高いと考えている.しかし,現状では構築したパターニング神経回路における電気活動伝播等の細胞活動の観測は行えておらず,回路構造を制御することによる神経機能制御が最終目標である本研究においては今後の神経活動計測と解析が重要な課題となると考えている。本年度の研究において確立した培養手法により構築されたパターニング培養神経回路におけるシナプス伝達方向・極性の同定を行うために,まず免疫染色法による特定蛋白質の可視化を行う予定である.次に,PDMS培養チャンバーを配置するガラス基板上にマイクロ電極配線を予め行うことで,構築したパターニング培養神経回路における電気活動の計測と解析を行う予定である。更には,マイクロウェル部のアレイ構造と化学パターニング構造のデザインを変更することで,多種多様な構造と機能を有した培養神経回路の形成制御を行うことを目指している.
インターネット・コミュニティで医療人が起こしうるモラルハザード問題を考える

スマートフォンやインターネットに代表されるICTサービスが急速に発達する一方でこれらを使用した道徳観・倫理観の欠如による問題行動(モラルハザード)が発生している。医療職による不適切な問題も発生しており新たに教育すべき内容と考えられる。しかしながら医療人がインターネットを介して発信した倫理観の欠如によると考えられる問題を報道から抽出し、事例をカテゴリー化した報告は少ない。本研究では問題行動がいくつかのカテゴリーに類型化できること、日本では悪ふざけが動機となった行動が少なくないことを明らかにした。さらに、医療人教育への教育活用をはかるためソーシャルメディア利用に関するチェックリストの作成を行った。近年、若者のモラルハザード(倫理観の欠如)による問題が頻発しており、医療職を目指す学生や医療従事者の不適切な行為も発生している。そこで、医学生を含む医療人が起こしうるインターネット・コミュニティ上でのモラルハザード問題の発生に及ぼす要因を明らかにする目的で本研究を開始した。平成26年度は、医学教育関連の学会、研究会に参加し、医療人の倫理教育に関する情報を収集した。さらに、医療系学生および医療人がインターネット上で引き起こしたモラルハザード問題を、新聞記事データベースおよびインターネットニュース報道記事から収集し、収集した事例について、事例を引き起こした人の属性、内容、受けた処分、媒介メディア、画像の有無について分類した。同時に、医学生を含む医療人がインターネットをどのように活用しているか、どのようなモラルハザード問題を起こしうるかを網羅的に把握するためのインタビュー調査実施について検討している。そこで、医学生を含む医療人が起こしうるインターネット・コミュニティ上でのモラルハザード問題の発生に及ぼす要因を明らかにすることを目的として本研究を開始した。平成27年度は、医学教育関連の学会、研究会に参加し、医療人の倫理教育に関する情報を収集した。新聞記事データベースから医療系学生および医療専門職がインターネット上で引き起こしたモラルハザード事例を収集し、医療人が起こしやすい問題を分類した。収集した事例から、問題の発生を防ぐための医療人教育に特化した、ソーシャルメディア利用の際のチェックリストを検討し作成した。研究成果公表として、第47回日本医学教育学会大会で口頭発表を行った。学術雑誌「医学教育」に論文を投稿し、掲載予定である。医療系学生、医療専門職、教員を対象とした聞き取り調査の実施に向けて、本学倫理委員会の承認を得て、準備を進めている。これらより、おおむね順調に進展していると判断した。平成28年度は、医学教育関連の学会、研究会に参加し、医療人の倫理教育に関する情報を収集した。また、新聞記事データベースから収集した、医療系学生および医療専門職がインターネット上で引き起こしたモラルハザード事例から、医療人教育に特化した、ソーシャルメディア利用の際のチェックリスト作成し、問題の発生を防ぐための教育活用について検討した。研究成果公表として、第48回日本医学教育学会大会、amee2016(ヨーロッパ医学教育学会)にて口頭発表を行った。学術雑誌「医学教育」に論文を投稿し、掲載された。1990年以降、携帯電話やインターネットに代表されるICTサービスが急速に発達した。その拡充と多様化の一方で、これらを介した倫理観の欠如による問題行為(モラルハザード)が発生している。これらの行為は社会問題になっており、医療職による不適切な行為も発生している。診療上の守秘義務を課せられた医療人にとって、業務上知り得た情報を不特定多数の対象に向けて安易に発信する行為はモラル上の問題だけでなく、法的にも厳しい処分を伴うが、この問題に対して医療人が有効かつ効果的な教育の機会を得ているとは言い難い。そこで、本研究では医学生を含む医療人が起こしうるインターネット・コミュニティ上でのモラルハザード問題の発生に及ぼす要因を明らかにし、医療に関するモラルハザード問題の発生を未然に防止するための教育方略を検討することを目的として開始した。日本国内において、医学生を含む医療人がインターネットを介して発信した倫理観の欠如によると考えられる問題を、新聞記事データベースおよびインターネット検索エンジンにより抽出した。抽出した事例を引き起こした人の属性、内容、受けた処分、媒介メディア、画像の有無について分類してカテゴリー化し、海外のモラルハザードに報告されていない、悪ふざけによる行為が少なくないことを明らかにした。さらに、これらの事例から、医療人教育に特化したソーシャルメディア利用に関するチェックリストの作成を行い、教育への活用化を検討した。今後は、具体的な教育プログラムを開発し、国内外の医療人への教育活用化を試みる計画である。事例収集と併せて、医学生、看護学生、研修医、医師、教員、病院職員等を対象にしたインタビュー調査の実施について検討した。

本学倫理委員会に申請をして承認を得る等の準備を進めており、おおむね順調に進展していると判断できる。平成28年度は、作成したチェックリストの教育活用化にむけて、医学生、研修医、指導医、教員を対象に聞き取り調査を実施する。聞き取り調査では、インターネットの利用行動状況、インターネットを介した医療倫理に関するモラルハザード問題に関する自己認識について調査し、医療倫理にかかわるモラルハザード問題の発生要因を検討する。最終年度である平成29年度は、作成した医療人向けソーシャルメディア利用のためのチェックリストの教育活用化を実施するとともに、教育関連学会を通して研究成果を国内外に発信する。プロフェッショナリズム平成27年度は、インタビュー調査を実施する予定である。調査項目は、インターネットの利用行動状況、および、インターネットを介した医療倫理に関するモラルハザード問題に関する自己認識とする。得られた結果より医療倫理にかかわるモラルハザード問題の発生要因を検討する。聞き取り調査に必要な録音機器等の購入と対象者への謝金を、次年度の計画に合わせて実施する計画とした。研究成果を社会に発信することを目的として、昨年度までに得られた研究成果を国内外の学会にて公表すること、および、学術雑誌への論文投稿を行う計画とした。インタビュー調査の実施に必要な録音・録画機器等の購入と対象者への謝礼支払いを、次年度の実施に合わせて行う計画とした。当初の計画に沿って、聞き取り調査で利用する機器購入と謝金、調査データ入力の人件費を見込んでいる。また、研究最終年度となるため、国際学会を含む複数の学会での成果公表を予定しており、学会発表にかかわる旅費、参加費、および、論文投稿料、英文校正費に使用する計画である。研究最終年度となるため、国際学会を含む複数の学会での成果公表を予定している。学会発表にかかわる旅費、参加費、および、論文投稿料、英文校正費に使用する計画である。当初の計画に沿って使用する。具体的には、インタビュー調査に必要な機器購入と謝礼支払い、調査データ入力のためのアルバイト人件費を見込んでおり、旅費に関しては学会発表、モラルハザード問題事例の発生した施設、および関連研究を実施している施設からの情報収集を検討している。
都市の変容と都市型サービス産業の課題-消費・生活文化の視点もふまえて-

調査に基づく共同研究の結果、研究論点として、ドイツの各都市でNPO法人によって推進されている都市マーケティング(Stadtmarketing)の重要性を析出した。また都市マーケティングは、都市型サービス産業が直面している課題の解決の一視点でもあると結論づけた。この点を具体的に明らかにするために2005年2月および9月に、マンハイム及びケルンの都市マーケティングNPO及び商工会議所、市役所(スポーツ局、文化局)、地域スポーツNPO等関連団体へのインタビューと資料収集を実施した。都市マーケティングのより深い究明については、今後も継続して研究する課題である。各メンバーによる研究としては、(1)齋藤雅通は、ドイツにおける都市型の小売商業集積であるパサージュの実態調査に基づいて理論的可能性と限界を明らかにした。(2)土居靖範は、ドイツのケルンおよびカールスルーエの都市交通経営体や運輸連合の調査を行い、財源調達のしくみを主に解明した。またLRTの国内への導入を、具体的にJR富山港線のLRT化の経緯と課題を調査研究した。(3)近藤宏一は、主にドイツにおける都市公共サービス、とりわけ文化・芸術関連サービス(オーケストラ、歌劇場、美術館)と観光および公共交通にかかわる組織の現状と課題について調査と資料収集を行った。(4)棚山研は、サッカーの日韓W杯開催時から開催地である新潟の継続調査と調査データの整理を行った。併せて、2度にわたるドイツのスポーツクラブの調査を通じて、日独のスポーツクラブの運営、生活文化への定着度についての比較を試みた。(5)池田伸は、現代都市における消費者研究およびそれに係わる調査方法論について、社会統計学や文化人類学などの周辺領域の成果を含めて検討した。その結果,現代都市のポストモダニティをマーケティング(消費者行動)の社会学として構想するにいたった。(6)谷口知弘は、京都市出町地域の取り組みの現地調査に基づいて、市民参加のまちづくりについて論究した。本年度は、メンバーが研究テーマについて各分野の研究を深める形式で進めた。ドイツの都市計画と小売商業・交通については、外部から講師を招く等、共同研究会を持った。また2005年2月にはドイツに共同調査に出かけ、マンハイム市、ケルン市等を対象に市役所、商工会議所、スポーツクラブ等を訪問し、都市計画や小売商業、コンサートホールや管弦楽団などの音楽事業、都市交通事業、地域スポーツ事業など、現代ドイツの都市が取り組んでいるサービス事業の現状と課題を聞き取り調査した。各メンバーによる中間的な研究成果としては、(1)都市の活性化との関わりで小売サービス事業を位置付けて、スイス連邦のチューリヒ市における都市内再開発事業へのミグロ生協の参画を事例にとりあげて、都市における小売サービス事業の果たす役割と可能性について検討した。さらに都市サービス事業全体の内的関連を探求した。(2)都市型サービス事業全体の基盤となる交通サービス事業分野を調査・研究し、JR富山港線におけるLRT(新型路面電車)導入のケースを取り上げて、都市交通再生の主役としてLRT導入を評価するとともに市民参画型まちづくりとの関係を含めて論究した。(3)日本の交響楽団の現状について概括的に分析し、日独比較に向けて研究を深めた。(4)ドイツの都市交通サービス事業の実態調査を進めた。(5)新潟におけるサッカー・サポーター・グループの運営とメンバーの主体形成について、過去のインタビュー・データを参考にして考察した。現時点では、中間的な研究成果となっている。次年度には、個別分野の研究を総合することによって研究テーマである都市型サービス事業の全体像について研究成果を明らかにする予定である。

また都市マーケティングは、都市型サービス産業が直面している課題の解決の一視点でもあると結論づけた。この点を具体的に明らかにするために2005年9月に、マンハイム及びケルンの都市マーケティングNPO及び商工会議所、市役所(スポーツ局、文化局)、地域スポーツNPO等関連団体へのインタビューと資料収集を実施した。都市マーケティングのより深い究明については、今後も継続して研究する課題である。各メンバーによる研究としては、(1)齋藤雅通は、ドイツにおける都市型の小売商業集積であるパサージュの実態調査に基づいて理論的可能性と限界を明らかにした。(2)土居靖範は、ドイツのケルンおよびカールスルーエの都市交通経営体や運輸連合の調査を行い、財源調達のしくみを主に解明した。またLRTの国内への導入を、具体的にJR富山港線のLRT化の経緯と課題を調査研究した。(3)近藤宏一は、主にドイツにおける都市公共サービス、とりわけ文化・芸術関連サービス(オーケストラ、歌劇場、美術館)と観光および公共交通にかかわる組織の現状と課題について調査と資料収集を行った。(4)棚山研は、サッカーの日韓W杯開催時から開催地である新潟の継続調査と調査データの整理を行った。併せて、2度にわたるドイツのスポーツクラブの調査を通じて、日独のスポーツクラブの運営、生活文化への定着度についての比較を試みた。(5)池田伸は、現代都市における消費者研究およびそれに係わる調査方法論について、社会統計学や文化人類学などの周辺領域の成果を含めて検討した。その結果,現代都市のポストモダニティをマーケティング(消費者行動)の社会学として構想するにいたった。(6)谷口知弘は、京都市出町地域の取り組みの現地調査に基づいて市民参加のまちづくりの視点から、取り上げて論究した。
炭化珪素バイポーラトランジスタのデバイス特性モデル化と高周波電力変換回路の製作

本研究では炭化珪素(SiC)バイポーラトランジスタ(BJT)を用いた高周波電力変換回路の実現をめざした。まず、動作周波数1 MHzの高周波スイッチングに対応できる回路シミュレーション環境を構築した。構築したシミュレーション環境を活用し、高周波ベース駆動回路を製作した。BJTは電流駆動回路であるため、駆動回路に工夫を要する。この駆動回路を利用した100 W級の昇圧回路を製作した。製作した昇圧回路は1 MHzの高い動作周波数でも94%の変換効率を実現した。SiC BJTの高周波パワースイッチングデバイスとしての可能性を示すことができたと考えられる。本研究ではSiCバイポーラトランジスタを用いて高周波動作可能な電力変換回路の実現を目指している.本年度では,(1)高周波電力変換回路を設計するための回路シミュレーション環境の構築,および(2)高周波スイッチングを可能にする駆動回路の製作を行った.まず,1 MHzをこえる高周波電力変換回路においては,高速な電流変化がサージやリンギングを発生させ問題となるため,これらを精度よく計算するための回路シミュレーション環境を構築する必要がある.そこで,半導体のデバイスモデルが確立されつつあるSiC MOSFETを用いて,昇圧回路におけるスイッチング波形を考察した.その結果,受動素子の寄生成分や,回路パターンの寄生インダクタンスを適切にモデリングすることにより,5 MHzという高周波領域においても昇圧回路のスイッチング波形を回路シミュレーションにより再現できることを報告した.また,駆動周波数が向上してきたことにより,実験回路のスイッチング波形を取得する精度についても重要であり,大電力を扱う電力変換回路に適した遅延校正手法を提案した.次に,高周波スイッチングを実現するための駆動回路に注目した.従来用いられるSiをベースとした駆動回路であれば1 MHz以上で動作させた場合に発熱のため熱暴走する可能性がある.そこで,GaN HEMTのプッシュプル回路を用いた駆動回路を用いた.駆動周波数を制限している要因を解析し,適切な動作条件を与えることで20 MHzの高周波動作を実現することができた.本年度は高周波電力変換回路を設計するシミュレーション環境を構築した.現在の電力変換回路の駆動周波数は10-100 kHz程度であり,1 MHz以上の高周波電力変換回路を精度よくシミュレーションするためには工夫を要した.また,当初では翌年度に予定していた駆動回路の製作を本年度から開始した.従来の駆動周波数の限界を大幅に更新する駆動回路の製作に成功し,上記回路シミュレーション環境の構築とあわせて,高周波電力変換回路実現のための要素技術の検討が順調に進んでいる.本研究では炭化珪素(SiC)バイポーラトランジスタ(BJT)の高周波スイッチング特性に注目し、高周波電力変換回路の実現を目指した。昨年度は高周波スイッチングに対応した回路シミュレーション環境を構築した。1 MHzをこえる高周波領域では半導体デバイスモデルの見直しに加えて、回路の寄生インダクタンスを考慮することが重要である。今年度はこのシミュレーション環境を利用し、SiC BJTを用いた回路を設計した。SiC BJTは電流駆動素子であるため、スイッチングの際の瞬間的なベース充放電にくわえて、定常的にベース電流を供給できるように駆動回路を工夫する必要がある。本研究では、定常のベース電流をきめるベース抵抗にくわえて、スイッチング時の充放電をはやめるためにスピードアップキャパシタを追加した。抵抗を負荷とするスイッチング試験をおこなった結果、同程度の定格を有するSiC MOSFETに比べて速いターンオフ特性が得られた。SiパワーBJTではキャリア蓄積のためターンオフ特性が極めて遅いことが知られていたが、SiCではキャリア寿命が短いため、キャリアの蓄積時間が短く、速いターンオフが得られたのだと考えられる。次に、この駆動回路をもちいて昇圧回路であるBoost Converterを製作した。入力電圧を48 Vとし、出力100 V, 100 Wが得られるように設計した。動作周波数は1 MHzとした。SiC BJTの優れたスイッチング特性により、1 MHzという高い動作周波数においても、入出力電力の変換効率94%と極めて高い値が得られた。以上から、SiC BJTの高周波パワースイッチングデバイスとしての可能性を示すことができたと考えられる。本年度末よりSiCバイポーラトランジスタのデバイスモデリングを進めており,これを回路シミュレーション環境に組み込む.また,本年度に製作した駆動回路を改良し,バイポーラトランジスタの高速駆動を試みる.これらを総合し,SiCバイポーラトランジスタを用いた高周波電力変換回路の実現を目指す.29年度が最終年度であるため、記入しない。電子デバイス29年度が最終年度であるため、記入しない。
頭頚部血管奇形における圧縮センシングの応用

頭頚部血管奇形に対して適切な治療を行うには、病態の正確な診断と治療方法の選択が必要である。特に病変内部の血流速度の評価や支配血管の描出が重要となり、臨床ではMRI、CT、血管造影などによる術前検査が行われている。これまでMRIにより血流速度の評価は可能であったが、支配血管の詳細な描出及び特定などには血管造影などのさらなる侵襲的検査が必要であった。そこで今回圧縮センシングを用いたMR angiographyにより、従来の撮像法よりも短時間で高い空間分解能と時間軸分解能を持つ画像の取得を可能にし、血管奇形の支配血管の詳細な描出および血流速度の評価方法を確立することを目的とする。
遺伝子多型を有するヒト化β３アドレナリン受容体マウスの作製と関連疾患の解明

これまでに、beta3アドレナリン受容体(beta3AR)の活性化はマウスモデルにおいて、肥満・II型糖尿病における病態の改善効果があることが知られており、また、特異的アゴニストであるミラべグロンはヒトの過活動膀胱治療薬として使用されており、膀胱平滑筋を弛緩させ畜尿機能を促進させることが知られている。しかしながら、各種アゴニストによるヒトでの肥満・II型糖尿病に対する改善効果は極めて限定的であり、げっ歯類とヒトのbeta3ARには機能的な違いがあることが示唆されてきた。本研究では、ヒトbeta3ARのみをもつ遺伝子改変マウスを作製し、ヒトbeta3ARの機能解析をヒト化マウスを用いて行うことを目的としている。本年度は、ヒト化beta3ARのモデルの作製と、ヒト・マウスbeta3ARの機能調節の違いについて、研究を進めた。遺伝子組換えマウスの作製は現在進行中であるが、機能解析については種間の差について翻訳後修飾の一つであるパルミトイル化修飾に注目し解析した。1数の違い:ヒトbeta3ARでは4カ所、マウスでは1か所のパルミトイル化修飾を有する。2ヒトbeta3ARではパルミトイル化修飾数により受容体の活性化状態が異なるが、マウスでは影響を受けない。3パルミトイル化修飾は受容体の細胞質膜上発現を上昇させる:ヒトではパルミトイル化状態の有無により大きな影響があるが、マウスではその差は小さい。4細胞質膜上での受容体半減期への影響:ヒトではパルミトイル化されることで受容体の半減期が伸びるが、マウスでは影響をうけない。このように、ヒトbeta3ARでは、パルミトイル化状態により、受容体の活性化・発現量が調節されているが、マウスbeta3ARではその影響は少なかった。本研究ではbeta3ARのヒト化マウスを作製し、beta3ARの関連疾患(肥満・II型糖尿病・過活動膀胱)のメカニズムを明らかにすることを目的としている。2ヒット2オリゴ法を用いて、ヒトbeta3AR遺伝子をプロモーター領域ごとノックインした遺伝子改変マウスの作製を行い、PCRにてヒトbeta3ARポジティブの産仔を得た。しかしながら、現在までに、ヒトbeta3ARのタンパク質を発現している系統は得られておらず、継続して遺伝子組換えマウスの作製を行っている段階である。マウスの作製と並行して、本年度は培養細胞を用いてヒトとマウスbeta3ARの機能解明を進め成果を論文にて報告した(Adachi et al, 2019 JBC)。これらの解析結果は、遺伝子組換えマウスをもちいて関連疾患の解析を行うにあたり、非常に重要な情報をもたらした。本年度は、遺伝子組み換えマウスの作製を急ぎ、得られたヒト化beta3ARマウスを用いて、各種疾患に対する応答の違いを野生型と比較解析する。加えて、ヒト・マウスbeta3ARの機能解析を進めることで、マウス個体を用いた研究への限界を明らかにし、ヒト化beta3ARマウスの解析につなげる。本研究は野生型・遺伝子多型(W64R) beta3アドレナリン受容体(beta3AR)のヒト化マウスを作製し、遺伝子多型が肥満・II型糖尿病・過活動膀胱に及ぼす影響を明確にすることを目的としている。現在2ヒット2オリゴ法を用いて、ヒトbeta3AR遺伝子をプロモーター領域ごとノックインした遺伝子改変マウスの作製を行っている。現在は遺伝子導入に用いる組換えベクターを作製し、受精卵に注入後、仮親に移植して、得られた遺伝子組換えマウスの確認作業を行っている段階である。また、次年度以降に遺伝子組換えマウスを用いて研究を行うにあたって、本年度は培養細胞を用いてヒトとマウスbeta3ARの機能解明も進めた。以下の点について、ヒトとマウスのbeta3ARにおける種間の差を明らかにした。1パルミトイル化修飾の状態(ヒト4カ所、マウス1カ所)。ヒトbeta3ARにおいては、4カ所それぞれがbeta3ARの機能にどのような影響を与えるかについても解析を行った。2脱パルミトイル化による受容体への影響(ヒト:cAMP産生能低下、マウス:cAMP産生能に影響を与えない)。ヒトにおいてはC末端部位のパルミトイル化が特に重要であることが判明した。3細胞質膜上での半減期(ヒト:7.2時間、マウス:33.5時間)。ヒトbeta3ARにおいて、特にC末端部位のパルミトイル化が特に重要であることが判明した。さらに、アゴニストによる受容体の内在化を起こさないbeta3ARにおいて、どのようなメカニズムで受容体が細胞質膜上から取り除かれているのかを明らかにするために解析を行い、リソソームへの輸送経路を明らかにした。3年に渡り実験計画を組んでおり、初年度でヒトbeta3ARを持つ、遺伝子組換えマウスの作製を予定していた。この件はおおむね順調に進展している。また、次年度以降に遺伝子組換えマウスを用いた解析を行うにあたって、ヒトとマウスのbeta3ARの機能解析を行い、ヒトとマウスでは明らかに性質が異なることを証明した。これらの結果は、遺伝子組換えマウスの解析を行うにあたり、非常に重要な情報をもたらした。

しかしながら、各種アゴニストによるヒトでの肥満・II型糖尿病に対する改善効果は極めて限定的であり、げっ歯類とヒトのbeta3ARには機能的な違いがあることが示唆されてきた。本研究では、ヒトbeta3ARのみをもつ遺伝子改変マウスを作製し、ヒトbeta3ARの機能解析をヒト化マウスを用いて行うことを目的としている。本年度は、ヒト化beta3ARのモデルの作製と、ヒト・マウスbeta3ARの機能調節の違いについて、研究を進めた。遺伝子組換えマウスの作製は現在進行中であるが、機能解析については種間の差について翻訳後修飾の一つであるパルミトイル化修飾に注目し解析した。1数の違い:ヒトbeta3ARでは4カ所、マウスでは1か所のパルミトイル化修飾を有する。2ヒトbeta3ARではパルミトイル化修飾数により受容体の活性化状態が異なるが、マウスでは影響を受けない。3パルミトイル化修飾は受容体の細胞質膜上発現を上昇させる:ヒトではパルミトイル化状態の有無により大きな影響があるが、マウスではその差は小さい。4細胞質膜上での受容体半減期への影響:ヒトではパルミトイル化されることで受容体の半減期が伸びるが、マウスでは影響をうけない。このように、ヒトbeta3ARでは、パルミトイル化状態により、受容体の活性化・発現量が調節されているが、マウスbeta3ARではその影響は少なかった。本研究ではbeta3ARのヒト化マウスを作製し、beta3ARの関連疾患(肥満・II型糖尿病・過活動膀胱)のメカニズムを明らかにすることを目的としている。2ヒット2オリゴ法を用いて、ヒトbeta3AR遺伝子をプロモーター領域ごとノックインした遺伝子改変マウスの作製を行い、PCRにてヒトbeta3ARポジティブの産仔を得た。しかしながら、現在までに、ヒトbeta3ARのタンパク質を発現している系統は得られておらず、継続して遺伝子組換えマウスの作製を行っている段階である。マウスの作製と並行して、本年度は培養細胞を用いてヒトとマウスbeta3ARの機能解明を進め成果を論文にて報告した(Adachi et al, 2019 JBC)。これらの解析結果は、遺伝子組換えマウスをもちいて関連疾患の解析を行うにあたり、非常に重要な情報をもたらした。本年度は、得られたヒトbeta3ARを有するマウスとマウスのbeta3ARをノックアウトしたマウスを掛け合わせて、ヒトbeta3ARのみを持つ遺伝子組換えマウスの作製を行い、各種疾患と遺伝子多型の関連性について解析を行う。一方で、ヒトとマウスのbeta3ARの機能が様々な面で異なることが明らかとなったことから、ヒトbeta3ARとマウスbeta3ARを共に有するマウスを用いて、同一個体から採取した初代培養細胞を用いた機能解析を行うことで、種間の違いとマウス個体を用いた研究への限界を明らかにし、ヒト化beta3ARマウスの解析につなげる。本年度は、遺伝子組み換えマウスの作製を急ぎ、得られたヒト化beta3ARマウスを用いて、各種疾患に対する応答の違いを野生型と比較解析する。加えて、ヒト・マウスbeta3ARの機能解析を進めることで、マウス個体を用いた研究への限界を明らかにし、ヒト化beta3ARマウスの解析につなげる。