hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
HPV関連癌に対する新規樹状細胞ワクチン治療の有効性の検証

我々は、近年注目されているヒトパピローマウイルス(HPV)関連頭頸部癌に対する新たな治療戦略として樹状細胞(Dendritic cell;以下DC)免疫ワクチン治療の開発を目的とした研究を行っている。抗原特異的なDCワクチンを作製するために、細胞性免疫応答(主として細胞障害性Tリンパ球;CTLによる)を規定する重要な因子であるヒト適合抗原(以下HLA)として日本人に最多のHLA A*2402陽性者を対象に、適合する血液ドナーを探索し、現在まで目的とする適合者として健常ボランティア2例(全7例中)を抽出した。In vitro下のDCワクチンの作製方法として、Miltenyi社の磁気ビーズを用いたPositive selection法により、CD14陽性細胞およびCD8陽性細胞(CTL分画)の分離を行い、CD14陽性細胞においては、IL-4/GM-CSFやその他各種サイトカイン(TNFα,IL-1β,IL-6,PGE2)を用いて維持培養しDCへの分化・成熟化を誘導した。また、Jangらが報告したHPVE6,E7蛋白のうちHLA A24拘束性を有するペプチド(計6種)を合成し、これを各々DCに曝露することで抗原特異的DCワクチンを作製した。現在継続して、本DCワクチンを当科にて所有しているHLA A*2402陽性頭頸部癌細胞株(HSC4細胞)にCTLとともに混合培養し、細胞障害性試験での解析を行っている。また、今後これらをin vivoや臨床研究へ継続していくことを目的としている。現在HLAA*2402陽性の頭頸部癌細胞株であるHSC4細胞に対し、in vitro下に各種のペプチド抗原で刺激した特異的樹状細胞(DC)を作製し併せてCTL(CD8陽性T細胞)を共培養し、HSC4細胞に対する細胞障害活性・腫瘍増殖抑制効果を検討している。当初はDCとCD8陽性細胞を別途で同時にHSC4細胞へ曝露、共培養して行っていたが有効性は認められなかった。そのため、あらかじめDC細胞の抗原提示、成熟化培養に併せてCD8陽性細胞を共培養しておき、抗原特異的なCTLを増殖させ、これを癌細胞(HSC4細胞)に曝露したうえでの細胞障害性試験での検討をする旨実験プロトコールの変更を行い検討を行った。その結果、HPV関連癌におけるHPVE6,E7の各癌遺伝子産物中、HLA*A2402拘束性ペプチドとして6種類の配列につき検討した結果、細胞障害性試験(Cytotoxic assay)において、E6(49-57)およびE6(98-106)の2種のペプチド刺激下においてCTLによるHSC4細胞での細胞障害活性が示唆される結果となった。現在、さらに再現性などをみて検証を加えているため、当初より研究に時間を要している。上記細胞障害性試験で有意性が確認されれば、免疫不全マウスを使用し上記癌細胞株を皮下に移植したモデルを作製し、動物実験における有効性についても検討したいと考えている。また、in vitro下においては特異的CTLの曝露に併せて、PD-L1抗体薬などを併用することで細胞障害活性を増強させることができるか否かについての検討も予定している。本DCワクチンを当科にて所有しているHLA A*2402陽性頭頸部癌細胞株(HSC4細胞)にCTLとともに混合培養し、Cytotoxic assayを用いた細胞障害性試験での解析を行っている。また、CTL活性を増強すべく、PD-L1抗体試薬での処置を追加し細胞障害試験での有用性を検討する予定である。今後これらをin vivoや臨床研究へ継続していくことを目的としている。細胞障害試験での有効性確認について複数回の実験を行っているが、有意な効果が立証されておらず、サイトカインや腫瘍:癌細胞株の細胞数割合などの条件検討を加えながら検討を行っている。そのため、研究進行はやや停滞・遅れが生じている。上記につき有効性を立証すべく検討を継続していく我々は、近年注目されているヒトパピローマウイルス(HPV)関連頭頸部癌に対する新たな治療戦略として樹状細胞(Dendritic cell;以下DC)免疫ワクチン治療の開発を目的とした研究を行っている。抗原特異的なDCワクチンを作製するために、細胞性免疫応答(主として細胞障害性Tリンパ球;CTLによる)を規定する重要な因子であるヒト適合抗原(以下HLA)として日本人に最多のHLA A

*2402陽性者を対象に、適合する血液ドナーを探索し、現在まで目的とする適合者として健常ボランティア2例(全7例中)を抽出した。In vitro下のDCワクチンの作製方法として、Miltenyi社の磁気ビーズを用いたPositive selection法により、CD14陽性細胞およびCD8陽性細胞(CTL分画)の分離を行い、CD14陽性細胞においては、IL-4/GM-CSFやその他各種サイトカイン(TNFα,IL-1β,IL-6,PGE2)を用いて維持培養しDCへの分化・成熟化を誘導した。また、Jangらが報告したHPVE6,E7蛋白のうちHLA A24拘束性を有するペプチド(計6種)を合成し、これを各々DCに曝露することで抗原特異的DCワクチンを作製した。現在継続して、本DCワクチンを当科にて所有しているHLA A*2402陽性頭頸部癌細胞株(HSC4細胞)にCTLとともに混合培養し、細胞障害性試験での解析を行っている。また、今後これらをin vivoや臨床研究へ継続していくことを目的としている。現在HLAA*2402陽性の頭頸部癌細胞株であるHSC4細胞に対し、in vitro下に各種のペプチド抗原で刺激した特異的樹状細胞(DC)を作製し併せてCTL(CD8陽性T細胞)を共培養し、HSC4細胞に対する細胞障害活性・腫瘍増殖抑制効果を検討している。当初はDCとCD8陽性細胞を別途で同時にHSC4細胞へ曝露、共培養して行っていたが有効性は認められなかった。そのため、あらかじめDC細胞の抗原提示、成熟化培養に併せてCD8陽性細胞を共培養しておき、抗原特異的なCTLを増殖させ、これを癌細胞(HSC4細胞)に曝露したうえでの細胞障害性試験での検討をする旨実験プロトコールの変更を行い検討を行った。その結果、HPV関連癌におけるHPVE6,E7の各癌遺伝子産物中、HLA*A2402拘束性ペプチドとして6種類の配列につき検討した結果、細胞障害性試験(Cytotoxic assay)において、E6(49-57)およびE6(98-106)の2種のペプチド刺激下においてCTLによるHSC4細胞での細胞障害活性が示唆される結果となった。現在、さらに再現性などをみて検証を加えているため、当初より研究に時間を要している。今後は現行の細胞障害試験において有意な抗腫瘍効果が確認されうるかを実験回数を重ねて解析検討する。併せて上記のPD-L1阻害薬の使用による上乗せ効果を検証し、少なくともin vitro assayでの有意な有効性につき結果を得ることを目標とする。上記細胞障害性試験で有意性が確認されれば、免疫不全マウスを使用し上記癌細胞株を皮下に移植したモデルを作製し、動物実験における有効性についても検討したいと考えている。また、in vitro下においては特異的CTLの曝露に併せて、PD-L1抗体薬などを併用することで細胞障害活性を増強させることができるか否かについての検討も予定している。主として研究備品、試薬などの経費として使用。
一人暮らし高齢者の孤独死予防のためのスクリーニング方法と支援プログラムの開発

高齢者の孤立予防の視点から、高齢者の世帯構成を一人暮らし、夫婦のみ、同居に区分して、要介護状態発生に関連する要因を明らかにした。また、ソーシャルネットワークの概念を整理し、一人暮らし高齢者の孤独死予防に向けた支援について考察した。その結果、一人暮らし高齢者の要介護状態発生に関連する要因では、預貯金の出し入れ不可、過去1年間の転倒経験あり、抑うつ傾向ありの3項目に統計的な有意差があった。また、高齢者のソーシャルネットワークの充実は、孤立を予防するための有用な方法であることを考察した。平成20年度は、一人暮らし高齢者の社会的な孤立のリスクをスクリーニングできる項目を明らかにすることを目的として、文献検討により社会的孤立を予防するための一つの観点として、ソーシャルネットワークについて整理した。文献検討では、ロジャースの概念分析の過程にそって、地域に居住する高齢者のソーシャルネットワークの概念について分析した。文献のデータベースとして、看護学はCINAHL、公衆衛生学はPubmed、心理学はPsycINFO、社会科学はScopusを使用した。収集期間は、1999年から2008年の10年間として、論文のタイトルでは「social network」、キーワードとしては「older adults or elderly」を設定して検索した。その結果、看護学34件、公衆衛生学49件、心理学38件、社会学86件が検索され、そのうち重複した文献を除き、合計126件の文献が得られた。126件の20%の件数として、無作為に26件を抽出した。さらに分析の過程で書籍と理論構築に関する論文4件を追加し30件を分析対象とした。属性は、「相互につながる線」「強弱のあるつながり」「肯定的・否定的側面を含む対人関係」「接触の頻度と密度」が抽出された。先行因子は、人、状況、場の3つの条件に整理された。帰結については、「家族介護者の生活の質が向上する」「日常生活の抑うつや痛みが減少する」「認知機能の低下を緩やかにする」「貧困による問題解決を可能にする」が抽出された。これらのことから、ソーシャルネットワークの概念は、高齢者の生活を支え、社会的孤立を予防するための一つの方法として有用であることが明らかとなった。平成21年度は、高齢者の家族構成(一人暮らし世帯、夫婦のみ世帯、同居世帯)別に、要介護状態発生割合と、関連要因(リスク)を明らかにすることを目的として、高齢者健康診査(以下、高齢者健診と略す)対象者のデータを解析した。解析対象者787人中、同居世帯高齢者672人、夫婦のみ世帯高齢者81人、一人暮らし高齢者34人であった。要介護認定発生状況を36か月間追跡した結果、家族構成別の要介護認定発生割合は、同居世帯高齢者12%夫婦のみ世帯高齢者6%、一人暮らし高齢者18%であり、一人暮らし高齢者の割合が最も高く、夫婦のみ世帯高齢者と比較して、発生割合が統計的に有意に高かった。また、要介護認定を予測する要因として、年齢、糖尿病の既往、脳梗塞の既往歴、生活体力、生活機能、抑うつ傾向、健診受診(有無)の項目に統計的に有意差がみられたが、家族構成では有意差はみられなからた。研究目的は、地域に居住する70歳以上の高齢者を対象として、家族構成別の要介護・要支援認定(以下、要介護認定)発生状況を明らかにすることとした。調査対象は、A県B村在住の70歳以上高齢者1523人中、要介護・要支援認定者、入院中の者を除く1347人とし、高齢者健康診査時に、事前郵送した質問紙に基づく聞きとり調査を行い、56年後の新規の要介護認定の発生をエンドポイントとした。初回調査の項目は、要介護の原因とされる生活機能の低下を評価する基本チェックリストの項目を参考に、基本属性、日常生活自立度(IADL)、社会的役割、運動器の機能(階段昇降、椅子からの立ち上がり、30分以上歩行)、過去1年間の転倒経験、咀嚼能力、食品摂取多様性、外出頻度、もの忘れ、抑うつ状態とした。新規認定者は262人(20.3%)、死亡は136人(10.5%)、転出者は12人(0.9%)であった(平均観察期間1786.9日)。高齢者の家族構成を、三世代で同居798人(61.9%)、その他の家族と同居307人(23.8%)、夫婦のみで同居131人(10.2%)、一人暮らし54人(4.2%)の4群に分類し、初回調査時の日常生活自立度(自立・非自立)を共変量として調整したCox回帰分析を行った。統計的な有意差があった項目は、夫婦のみ世帯高齢者では、バスや電車で外出不可、日用品の買い物不可、預貯金の出し入れ不可、友人の家を訪問(なし)、家族や友人の相談にのる(なし)、階段昇降不可、過去1年間の転倒経験ありの7変数であった。一人暮らし

高齢者では、預貯金の出し入れ不可、過去1年間の転倒経験あり、抑うつ傾向ありの3変数であった。高齢者の家族構成によって、要介護認定発生に影響する要因が異なっていた。高齢者の家族構成は、単身世帯の増加など家族成員数が減少し多様化しつつあるため、家族構成に着目した介護予防の視点が重要である。
孤立系における希土類錯体の酸化還元を伴う反応

Eu-151メスバウアー分光法やレーザー励起蛍光寿命測定などの手法をユウロピウム化合物の反応や構造解析に適用した。主に、(1)レーザー励起蛍光分光法による溶液中のユウロピウム(III)の結合構造解析、(2)シュウ酸ユウロピウム(III)及びガトリニウム(III)混晶の熱分解、(3)ユウロピウム(III)クリプタンド錯体及びクラウンエーテル錯体の溶液中または凍結溶液中での光反応などについて、成果を得た。(1)レーザー励起蛍光寿命測定から溶液中のユウロピウム(III)の水和数に関する情報が得られる。ユウロピウム(III)ポリカルボン酸錯体、並びに、イオン交換樹脂上に吸着したユウロピウム(III)について水和構造を推定した。ポリカルボン酸の種類、pH、支持電解質濃度を系統的に変え、ユウロピウム(III)の残存水和数の変化を調べた。溶液内の高分子錯体のコンフォメーション変化が残存和水数の変化に良く対応していることが明らかとなった。強酸性イオン交換樹脂と弱酸性イオン交換樹脂の場合とで残存和水数のpH変化を比較すると、大きな相違が見い出された。これは熱力学的データとも良く対応するものであり、微量のユウロピウム(III)について、溶液または固液界面での存在状態に関する詳細な情報が得られた。(2)Eu-151メスバウアー分光法を用いて、シュウ酸ユウロピウム(III)のランタン(III)との混晶系を対象に、光または熱により進行する反応を追跡した。ガドリニウム(III)との混晶とは、ユウロピウム(II)の生成量が大きく異なることが示された。これは、光照射により生成したラジカル量の相違関与しているものとみられる。(3)ユウロピウム(III)クリプタンド錯体及びクラウンエーテルdq錯体の光反応について、ユウロピウム(II)が生じる割合と照射時間との関係などを検討した。これらのデータから光誘起反応の機構を詳細に解明した。
実験的ウイルス性心筋炎における心臓刺激伝導系の微細構造ならびに機能に関する研究

実験的急性コクサッキーB3ウイルス性心筋炎マウスモデルにおいて,無麻酔下14日間連続心電図記録による不整脈の解析と,心臓とくに刺激伝導系特殊心筋の光顕・電顕的検索を行い,両者の関係を詳細に検討,以下の結論を得た. 1.心筋炎マウスに多彩な不整脈がみられ,その内訳は,洞停止80%,2度または3度房室ブロック30%,上室性期外収縮30%,心室性期外収縮20%,心室頻拍10%,であった. 2.一般に不整脈の多くは一過性であったが,これは組織病変がより顕著な固体で病変が高度な時期(6-13日)に一致してみられた.なお洞停止は洞結節の病変が明かでない心筋炎早期から出現した. 3.心筋病変の部位と不整脈の種類との間に関連が認められた.すなわち,心室性期外収縮,心室頻拍をきたした固体では心室筋病変が高度で,上室性期外収縮例では心房病変が強かった.房室ブロック例では房室伝導系に,洞停止例では洞結節に病変が認められた. 4.房室伝導系の電顕的検索により,(1)特殊心筋細胞の変性,壊死, (2)間質細胞の浸潤,(3)神経終末の変性,(4)間質の浮腫,出血, (5)リンパ管の拡張などがみられ房室伝導障害への関与が示唆された.実験的ウイルス性心筋炎における無麻酔下連続心電図記録による不整脈の解析とそれら不整脈の病理組織学的背景に関する検討は今まで報告されていない.また,心筋炎の刺激伝導系の病理学は,ヒトと動物モデルを問わず,従来,光顕的検索にとどまり,特殊心筋の微細構造病変と機能障害との関連については知られていない.今回,電顕的観察により房室伝導系における種々の微細構造病変が明かとなり新たな知見と考えられる.以上の結果の一部は第11回国際電顕学会,第6および7回国際心臓研究学会日本部会,第10回心筋代謝研究会,第51回および52回日本循環器学会学術集会,昭和61,62および63年度厚生省特定疾患特発性心筋症調査研究班総会,第2回特発性心筋症,心筋炎国際シンポジウムに於て報告した.実験的急性コクサッキーB3ウイルス性心筋炎マウスモデルにおいて,無麻酔下14日間連続心電図記録による不整脈の解析と,心臓とくに刺激伝導系特殊心筋の光顕・電顕的検索を行い,両者の関係を詳細に検討,以下の結論を得た. 1.心筋炎マウスに多彩な不整脈がみられ,その内訳は,洞停止80%,2度または3度房室ブロック30%,上室性期外収縮30%,心室性期外収縮20%,心室頻拍10%,であった. 2.一般に不整脈の多くは一過性であったが,これは組織病変がより顕著な固体で病変が高度な時期(6-13日)に一致してみられた.なお洞停止は洞結節の病変が明かでない心筋炎早期から出現した. 3.心筋病変の部位と不整脈の種類との間に関連が認められた.すなわち,心室性期外収縮,心室頻拍をきたした固体では心室筋病変が高度で,上室性期外収縮例では心房病変が強かった.房室ブロック例では房室伝導系に,洞停止例では洞結節に病変が認められた. 4.房室伝導系の電顕的検索により,(1)特殊心筋細胞の変性,壊死, (2)間質細胞の浸潤,(3)神経終末の変性,(4)間質の浮腫,出血, (5)リンパ管の拡張などがみられ房室伝導障害への関与が示唆された.実験的ウイルス性心筋炎における無麻酔下連続心電図記録による不整脈の解析とそれら不整脈の病理組織学的背景に関する検討は今まで報告されていない.また,心筋炎の刺激伝導系の病理学は,ヒトと動物モデルを問わず,従来,光顕的検索にとどまり,特殊心筋の微細構造病変と機能障害との関連については知られていない.今回,電顕的観察により房室伝導系における種々の微細構造病変が明かとなり新たな知見と考えられる.以上の結果の一部は第11回国際電顕学会,第6および7回国際心臓研究学会日本部会,第10回心筋代謝研究会,第51回および52回日本循環器学会学術集会,昭和61,62および63年度厚生省特定疾患特発性心筋症調査研究班総会,第2回特発性心筋症,心筋炎国際シンポジウムに於て報告した.心筋炎の心臓刺激伝導系の病理学は、ヒトと動物モデルを問わず、従来、光顕的検索にとどまり、特殊心筋の微細構造病変と機能障害との関連については知られていない。申請者は、以前から、実験的コクサヮキ-B3ウイルス性心筋炎マウスの作業心筋につき、光顕的、電顕的検索を行ってきた。今回の研究ではさらに房室部刺激伝導系特殊心筋の急性期の病変について同様に精査し、同時に心電図により房室伝導障害の有無を検討した。結果は、1.ウイルス接種群ICRマウス35匹中3匹(8.6%)に房室伝導障害(完全房室ブロック1匹、1度房室ブロック2匹)がみられた。2.光顕的観察では第5日以後、ほぼ全てのマウスに心筋炎がみられたが、房室部特殊心筋の病変の程度は作業心筋に比較し軽度であった。

3.電顕的観察では、(1)傷害された特殊心筋細胞の形質膜が断裂し、筋原線維が著しく融解、多くのミトコンドリアが膨化し、内部に電子密度が中等度の無定形封入体を認め、また、心筋細胞内にカルシウムと思われる高電子密度の針状構造物を認める所見、(2)傷害された特殊心筋細胞の基底膜下に間質細胞が侵入し、崩壊した細胞内構造物を貧食する所見、(3)間質腔にリンパ球やマクロファージなどの著しい浸潤を認める所見がみられ、さらに(4)染色質が濃縮した核を有する特殊心筋細胞、(5)房室部のリンパ管の拡張などがみられた。これらの房室部特殊心筋の微細構造病変については今まで報告されておらず、新たな知見と考えられる。なかでも心筋炎の房室部刺激伝導系においてリンパ管の拡張を認めたことは、極めて興味ある所見でありその意義につき今後さらに検討を要する。以上の結果の一部は、第11回国際電顕学会および第6回国際心臓研究学会日本部会に於て報告し、第51回日本循環器学会学術集会に於て報告する予定である。前年度は,実験的急性コクサッキーB3ウイルス性心筋炎マウスの房室刺激伝導系特殊心筋病変の光顕,電顕的観察を行った.今年度は,同モデルにおける連続心電図記録(ホルターモニター)による不整脈の解析と刺激伝導系を含む心臓の病理組織学的検索を行い,両者の関係につき詳細に検討した.結果は, 1)心筋炎における不整脈の対くは一過性のため,心電図の連続記録により初めて明かにされた.2)不整脈は高頻度にみられ,洞房ブロックまたは洞停止80%, 2または3度房室ブロック30%,上室性期外収縮25%心室性期外収縮10%,心室頻拍5%であった.3)急性心筋炎に際して臨床上とくに重篤と考えられている房室ブロックや心室性期外収縮は,心筋組織病変がより強い個体に,病変が最も高度な時期にほぼ一致して認められた.4)心筋組織病変の部位と不整脈の種類に関連が認められた.すなわち,心室性期外収縮,心室頻拍をきたした個体では心室の病変が広汎かつ高度で,上室性期外収縮例では心房病変が強かった.また,房室ブロック例では房室伝導系特殊心筋(房室結節, His束,左脚,左脚)に病変認め,洞停止例の洞結節に壊死がみられた.さらに,電顕的観察により,これらの刺激伝導系特殊心筋に分布する神経終末に種々の変性所見を認めた.上記のごとき実験的ウイルス性心筋炎における連続心電図記録(ホルターモニター)による不整脈の解析を用いた不整脈の病理組織学的背景に関する検討については今まで報告されておらず,新たな知見と考えられる.また心筋炎の刺激伝導系において電顕的に神経終末の変性を認めたことは極めて興味ある所見でありその意義につき今後さらに検討を要する.以上の結果の一部は,第10回心筋代謝研究会および第7回国際心臓研究学会日本部会に於て報告し,第52回日本循環器学会学術集会に於て報告する予定である.
樹木の二次木部直接誘導系における細胞分化制御機構の解析

ポプラやトガサワラなどの培養細胞を用い、培地条件などを検討することにより、有縁壁孔やらせん肥厚をもつ管状要素が観察され、培養細胞から二次木部様細胞を直接誘導することに成功した。また、スギの針葉由来の懸濁培養細胞から管状要素をin vitroで誘導することに成功した。さらに、培養細胞内に存在する微小管およびアクチンの配向や局在をGFP融合タンパク質発現法で観察したところ、微小管の局在が壁孔の形成位置と良く一致していた。細胞分化の制御に細胞骨格の立体的な配向が密接に関与しているといえる。本研究では、厚い二次壁とともに壁孔やせん孔など複雑な修飾構造を形成する仮道管や道管要素などに類似した二次木部細胞を樹木の培養細胞(カルス)から高頻度で直接誘導する新規モデル系を確立し、二次木部細胞の形態形成機構や細胞壁形成機構に関する新知見を得ることを主目的としている。平成21年度は、交雑ポプラやカキノキの培養細胞を用いて、二次木部様の細胞を直接誘導することを目的とした。交雑ポプラ培養細胞を用い、誘導培地条件、光条件、誘導期間を検討し、二次木部様細胞の誘導条件を検討した。交雑ポプラ培養細胞をブラシノライド添加培地で誘導したところ、誘導開始から10日目に一次木部の特徴をもつ管状要素と混在して、偏光顕微鏡下で複屈折を示し、有縁壁孔の存在など二次木部の特徴をもつ管状要素が観察された。一方、16時間明条件における培養により、植物成長調節物質無添加の培地においても管状要素の誘導が認められた。培養期間の延長により、観察される管状要素量に増加する傾向がみられ、特に誘導開始から3週から4週にかけて管状要素の誘導量が顕著に増加することが分かった。カルス細胞内に存在する微小管を蛍光抗体染色法で観察したところ、微小管の配向や局在の連続的な変化が認められた。ブラシノライド添加はカキの培養細胞にも有効であり、カルスをブラシノライトを添加した培地に移した結果、濃度に関わらず管状要素が多く観察された。また、暗条件より明条件において管状要素が多く観察され、誘導された管状要素は二次木部の特徴をもっていた。交雑ポプラやカキ培養細胞から一次木部タイプだけでなく、二次木部タイプの管状要素を直接誘導できることを明らかにした。平成22年度以降、誘導率と同調性の向上を行い、誘導系を確立する予定である。本研究では、厚い二次壁とともに有縁壁孔など複雑な修飾構造を形成する仮道管や道管要素などに形態が類似した二次木部細胞を、樹木の培養細胞から高頻度で直接誘導する新規モデル系を確立し、二次木部細胞の分化制御機構に関する新知見を得ることを主目的としている。平成22年度は、ポプラやイチョウなどの培養細胞を用いて、二次木部様の細胞を直接誘導する条件を確立することと細胞内の細胞骨格を可視化することを目的とした。交雑ポプラ培養細胞を用い、二次木部様細胞の誘導条件を検討した。ブラシノライド添加など植物ホルモンの添加条件や培養期間を変化させることにより、有縁壁孔をもつ管状要素が観察され、培養細胞から二次木部細胞の特徴をもつ細胞の誘導に成功した。また、イチョウ、トガサワラ、ヌマスギなど裸子植物の培養細胞を共焦点レーザ走査顕微鏡などで詳細に観察したところ、らせん紋肥厚型の細胞壁肥厚をもつ一次木部様の細胞が誘導された。トガサワラの培養細胞からは、有縁壁孔など修飾構造が発達した二次木部様の管状要素も誘導され、細胞分化を解析する上で良いモデル系に使用できるといえる。培養細胞内に存在する微小管を蛍光抗体染色法およびGFP融合タンパク質発現法で観察したところ、微小管配向の連続的な変化が認められた。微小管の配向は、細胞の分化が進むにつれて、ランダムな配向から方向性を有した配向に変化した。微小管の配向や局在の動的変化は、細胞分化の開始に密接に関係しているといえる。また、培養細胞内に存在するアクチンフィラメントを蛍光抗体染色法およびGFP融合タンパク質発現法で可視化する方法も確立した。平成23年度は、培養細胞からの細胞分化に伴う微小管とアクチンフィラメントの相互作用に関する知見を得る予定である。本研究では、厚い二次壁と有縁壁孔やらせん肥厚など複雑な構造を形成する仮道管や道管要素などに形態が類似した二次木部様細胞を、樹木の培養細胞から高頻度で直接誘導する新規モデル系を確立し、生体イメージング技術を駆使して二次木部細胞の分化制御機構に関する新知見を得ることを主目的としている。

本年度は、ポプラやスギなどの培養細胞から誘導した二次木部様細胞の形態や細胞壁構造の詳細な解析を行うとともに、細胞内の細胞骨格を可視化し、最終報告を作成することを目的とした。ポプラの培養細胞を用い、二次木部様細胞の誘導条件を検討した。植物ホルモンの添加条件などを検討することにより、有縁壁孔をもつ管状要素が観察され、培養細胞から二次木部様細胞の直接誘導に成功した。培養細胞内に存在する微小管をGFP融合タンパク質発現法で観察したところ、微小管は細胞の分化が進むにつれて方向性を有した配向に連続的に変化した。また、微小管が部分的に消失する場所が認められ、微小管の局在が壁孔の形成位置の決定に関与していると考えられる。また、培養細胞内に存在するアクチンフィラメントを蛍光抗体染色法およびGFP融合タンパク質発現法で可視化する方法も確立した。一方、異なる針葉樹の培養細胞を詳細に解析したところ、培養細胞中に管状要素に類似した特徴をもつ細胞が存在していた。樹種によっては、有縁壁孔やらせん肥厚など二次木部様の管状要素も誘導されていた。さらにスギの針華由来の懸濁培養細胞から管状要素をin vitroで誘導することに成功し、分化中細胞の形態形成と表層微小管の配向との関連性を解析した。以上の成果から、二次木部様の管状要素を樹木の培養細胞から直接誘導させるモデル系を新規に確立できたといえる。また、細胞形態や細胞壁構造の制御に細胞骨格の立体的な配向が密接に関与していると結論づけられる。
メアリ・ウルストンクラフトにおける国家と女性の進歩の概念の研究

フェミニズムの鼻祖とされるウルストンクラフトのテクストから、「進歩」を共通項として成立する国家と女性の類似性を抽出して、その意味と相互の影響関係を分析した。未開状態から文明社会への「進歩」は、豊かで不安のない生活と高度な精神活動による文化を生み出す。しかし、『北欧紀行』に見られるように、スウェーデンやデンマークの自然と接したことで、彼女は、単純な進歩史観には疑問を呈するようになる。彼女の逡巡は、近代国家の成立と自らの女性としての表象とを重ね合わせつつ、「進歩」の功罪を問い直す懐の深い思索を重ねたことの証であり、ラディカルな女権論者としてのウルストンクラフト像の別な側面を示している。6月30日から7月8日にかけてチューリッヒ大学において、ウルストンクラフトと進歩の概念に関する資料収集を行った。また、ウルストンクラフトの『北欧からの手紙』(Letters Written during a Short Residence in Sweden, Norway, and Denmark)の翻訳の最終校正を終え、8月28日に法政大学出版局から『ウルストンクラフトの北欧からの手紙』のタイトルで出版した。この旅行記では彼女は、人類、社会、女性は「進歩」が必要であるという進歩主義を展開している。文明とはその進歩の跡をたどったことのない人には、その恩恵が十分に評価されないものだと述べ、獣のような自然状態からの文明社会への進歩を人間に不可欠なものと捉えている。だが同時に、社会全体の「進歩」について彼女は、北欧諸国の社会のそれを願う一方で、産業革命以降急速に工業化と近代化が進む社会に対する漠然とした不安も表明している。『北欧からの手紙』ではスウェーデンやデンマークの自然と接したことで単純な進歩史観には疑問を呈している。彼女のこのような躊躇は、文明と自然の二元論における両義的な所見や、北欧の自然描写から恋人との愛の葛藤の超越を願う苦悩の心象風景描写へと連なる展開の背景ともなっている。北欧の人間と自然に触れながら、人類、女性、社会の進歩について思索を深め続けた彼女は、自己の進歩を模索してさまよう精神の軌跡を描写しており、当時の読者の心を広く掴んだのは、このような理性と想像力、信念と感性のはざまでさまよう彼女の心情の揺れ動きである。フェミニズムの鼻祖とされ、当時の知識人に「ペチコートをはいたハイエナ」と揶揄されたウルストンクラフトの理性の裏に隠れた想像力豊かな人間性を、そして愛の葛藤に苦悩する一女性の姿を生々しく見せてくれる本書を、日本の読者に紹介できたことは意義深い。昨年出版したウルストンクラフトの『北欧からの手紙』(Letters Written duringa Short Residence in Sweden, Norway, and Denmark)の分析を中心にして、彼女の国家と女性の進歩の概念についての考察を加えた。そこに見られる彼女の内省の痕跡は、紀行文の大きな特徴である自然描写にも刻み込まれている。北欧の荘厳で荒涼とした大自然の様相を、彼女は「ピクチャレスク」を頻繁に用いて描写している。だが、やや感傷的過ぎる筆致で彼女が描いているのは、大自然だけではなくそれを見つめる自分自身の心の風景でもある。第1の手紙では、初めてスウェーデンの地を踏んだ名も知らない入り江の美しい自然に触れて、その景観を叙述するだけではなく、それによって自身の失意がいかに癒され慰められたかを情緒豊かに記している。また、夜も日の光が残る白夜の美しさに感極まって、眠りについている森羅万象とさまざまな思いに耽る自分とを比べて、いつもより強く生を実感している。彼女を襲った失意、苦悩そして憂慮の要因は恋人イムレイとのいきさつによる葛藤に他ならない。苦境の渦中であえて旅立った北欧で、その酷烈、優美、壮大な自然は、人間存在にまつわる苦悶を乗り越えようとしている彼女の目には、現実の風景と同時に心の内なる心象風景として映っている。ウルストンクラフトにおける国家の進歩思想は、原始社会への性善説的憧憬と進歩史観の間で揺れ、女性の地位向上への願いは、一女性としての現実的苦難と恋愛における葛藤によって普遍と個別の間をさまよい続けている。現実と私心を完全には超克できなかった彼女のこのような二面性こそが、直情と力感に溢れた思索を生むと同時に、感情に流れすぎる筆致をももたらし、そのことで多くの批判も招いたと考えられる。9月20日から29日にかけてジュネーブ大学において、ウルストンクラフトと進歩の概念に関する資料収集を行った。また、ウルストンクラフトの『北欧からの手紙』(Letters Written during a Short Residence in Sweden, Norway, and Denmark)の翻訳を完成し、法政大学出版局からの出版の準備を進めた。旅程表と旅行地図を口絵に加えることとし、その作成を行った。2012年夏頃の出版予定である。

また、公開講座においてロマン主義による近代的自然観が日本に伝播した様相をたどって以下のように論じた。ワーズワスを崇拝しヨーロッパ・アルプスを称賛したラスキンは、明治期の日本で広く読まれ、「日本アルプス」を世界に広めた英国人登山家ウェストンも彼に心酔した。日本のラスキンと呼ばれた志賀重昂に導かれて登山を始めた小島烏水は、ウェストンを訪ねてラスキンを知り共鳴する。英国詩人ワーズワスに大きな影響を受け山岳紀行を多く残した英文学者田部重治は若い頃烏水の愛読者だった。ロマン主義的近代自然観は、これらの著述家・登山家によって、ワーズワスの愛でた湖水地方からラスキンの賛美したヨーロッパ・アルプスを経て日本アルプスへと伝わり、彼らの作品を読む我々にも継承されている。平成24年度はウルストンクラフトに関連する図書・資料を購入して考察を加え、スイスへ出張して資料を収集した。また『北欧旅行記』の翻訳を出版し、以下のような訳者解説を付した。『北欧からの手紙』(1796)は恋人ギルバート・イムレイに宛てた書簡形式の旅行記である。イムレイはアメリカの軍人で1793年にパリでメアリに出会う。1795年、彼女はロンドンに戻ってイムレイの心変わりを知り絶望するが、そのわずか二週間後、彼の貿易事業の代理人として6月末から3か月半スウェーデン、ノルウェー、デンマークの三国を巡る。彼女が旅立った理由は、転地療養、フランス革命に中立姿勢を取る北欧諸国への関心、イムレイとの関係修復への希望、彼への感情依存からの脱却などに加えて、旅行記出版による経済的自立という意味合いもあったと思われる。荘厳で荒涼とした大自然を「ピクチャレスク」という当時の流行語を頻繁に用いて描写し、後進国の社会と風俗を鋭い観察眼で紹介する本書は、彼女の自伝であり内省の記録でもある。出版当時好評を博した理由は、自らの思考の二律背反をめぐる思索の軌跡の赤裸々な告白にある。彼女はルソーの称揚する黄金時代を退けて、人類、社会、そして女性の「進歩」を説く。しかし、北欧の未開の風習を先進国の基準で計ることを避け、進歩を拙速に求めることを戒めもする。進歩に関する思索は、北欧での観察を経て『擁護』に見られる未熟な急進主義を超克している。女性の権利についても、「男性は万物の専制君主」と旧来の社会観念に反駁するが、イムレイとの間に生まれた自分の幼い娘に、男性と同等の権利を持つ「信念」を授けることが、理知に走った感情のとぼしい性格を生み出しはしないかと恐れて、微妙な揺らぎを見せる。これらの書簡には、『擁護』の居丈高な調子が再吟味されて、理性と想像力、信念と感性のはざまで揺れる彼女の心情が読み取れる。平成23年度はウルストンクラフト、英国ロマン主義と自然観、環境批評などに関連する図書・資料を購入して考察を加えた。また、スイスへ出張して資料を収集した。資料整理に必要なポータブルパソコンと関連機器を購入した。また『北欧旅行記』の翻訳を完成、次のような解説を添えた。ウルストンクラフトは「文明とはその進歩の跡をたどったことのない人には、その恩恵が十分に評価されないものだ」と述べ、獣のような自然状態からの文明社会への進歩を人間に不可欠なものと捉えている。
外来遺伝子防御の定量的可視化に基づく遺伝子導入メカニズムの解明と高効率化

本研究では生細胞内における外来遺伝子の拡散・分解などの運命を定量的に可視化することを目標に掲げ、その達成のためにラスター画像相互相関分光法(ccRICS)の測定系を新たに構築した。次にこの測定系を用い、生細胞内における外来遺伝子の分解を可視化した。その結果、DNA分解酵素活性が細胞種によって異なることを直接観測し動画として表現することに成功した。これは、細胞が持つ外来遺伝子の侵入に対する防御機構とその強さを新たに定義付けする画期的な成果であり、遺伝子治療や核酸医薬の発展に寄与することが期待される。本研究では、生細胞内における外来遺伝子の分解機構をコントロールすることによる、外来遺伝子に対する防御機構の理解と外来遺伝子発現の高効率化を目的とする。外来遺伝子が核に至ることは「侵入」であり、厳重に防御する機構が存在すると考えられる。本研究では、1生細胞内における外来遺伝子の拡散・分解などの運命を空間相関解析で定量的に可視化2単一細胞内における外来遺伝子発現のアウトプット(発現タンパク質の量)の定量化3防御に関与するヌクレアーゼの同定と制御による外来遺伝子発現の高効率化、を目指している。本年度は昨年度までに完成した画像相互相関分光法ccRICS (Cross-correlation raster-scan image correlation spectroscopy)の測定系を利用し、HEK293細胞ならびにMEF細胞における外来遺伝子の細胞内分解を時空間的に可視化した。その結果、DNA分解酵素活性が細胞種によって異なることを直接観察することに成功した。また、単一細胞内の遺伝子発現効率の解析に関し、環状プラスミドと直鎖状DNAをそれぞれ細胞導入した際のEGFP遺伝子発現効率をフローサイトメトリーによって単一細胞レベルで解析した。これらの結果は、細胞が持つ外来遺伝子の侵入に対する防御機構とその強さを新たに定義付けする画期的な成果である。現在、外来遺伝子発現プロセスの中で発現効率に重要な影響をもたらすDNA分解酵素活性の同定と制御に向けた準備を進めている。具体的には、次世代シーケンサーを利用し様々な細胞内における種々のヌクレアーゼの発現レベルを明らかにし、制御対象となる候補ヌクレアーゼを絞り込むための検討を行っている。外来遺伝子を体内に導入し、タンパク質を発現させたり目的遺伝子をノックダウンしたりする「外来遺伝子発現システム」の全体像を理解するには、細胞内における外来DNAの運命を定量化することが不可欠である。しかし、生細胞内で動的に変化する外来DNAの局在や分解を時空間的かつ定量的に表現することは未だ実現されていない。本研究の目的は、生細胞内における外来DNAの拡散・分解などの運命の可視化ならびに単一細胞内のタンパク質発現量の定量的測定を通じ、外来遺伝子に対する防御に関与するヌクレアーゼの同定を行い、それらを制御することで外来遺伝子発現を高効率化することである。今年度は、生細胞内における外来DNAの分解を可視化するための蛍光標識DNA分解プローブを作成し、それらを生細胞内にマイクロインジェクションによって導入する実験系を構築した。また、導入したDNAプローブの動態を解析するための手法として、ccRICS(Cross-correlation raster-scan image correlation spectroscopy)法の確立を行った。ccRICS解析プログラムを新規に開発し、生きた細胞内におけるDNAプローブの分解を時空間的にマッピングすることに成功した。今までの蛍光イメージング測定から、導入された外来DNAは時間が経過すると核に移行する現象が観察されていたが、本解析によって核に移行したDNAは細胞質ですでに分解を受けた断片が大半であることが新たに明らかになった。今後は、種々の細胞株においてヌクレアーゼの活性を可視化し比較することで細胞種によるヌクレアーゼ活性の違いを評価する。また、RNAi等を駆使してヌクレアーゼ活性を阻害することによってDNA分解速度が変化するかどうか、また、DNA分解活性と遺伝子発現効率の相関を明らかにしていく予定である。本研究では、生細胞内における外来遺伝子の分解機構をコントロールすることによる、外来遺伝子に対する防御機構の理解と外来遺伝子発現の高効率化を目的とした。本研究では、1生細胞内における外来遺伝子の拡散・分解などの運命を空間相関解析で定量的に可視化2単一細胞内における外来遺伝子発現のアウトプット(発現タンパク質の量)の定量化3防御に関与するヌクレアーゼの同定と制御による外来遺伝子発現の高効率化、を目指し鋭意研究を行った。2013年度までに完成した画像相互相関分光法ccRICS (Cross-correlation raster-scan image correlation spectroscopy)の測定系を利用し、HEK293細胞ならびにMEF細胞における外来遺伝子の細胞内分解を時空間的に可視化した。その結果、DNA分解酵素活性が細胞種によって異なることを直接観察し動画として表現することに成功した。単一細胞内の遺伝子発現効率の解析に関し、環状プラスミドと直鎖状DNAをそれぞれ細胞導入した際のEGFP遺伝子発現効率をフローサイトメトリーによって単一細胞レベルで解析した。

これらの結果は、細胞が持つ外来遺伝子の侵入に対する防御機構とその強さを新たに定義付けする画期的な成果である。最終年度には、以上の研究データを蓄積し再現性を確認するとともに定量的な解析を進め、論文として投稿した。今後は、外来遺伝子発現プロセスの中で発現効率に重要な影響をもたらすDNA分解酵素活性の同定と制御に向け、次世代シーケンサー等を利用し様々な細胞内における種々のヌクレアーゼの発現レベルを明らかにし、制御対象となる候補ヌクレアーゼを発見することが求められる。生物物理学本年度までに新たな画像相関解析法のプログラムを完成し、実際の細胞測定に供した。その結果、想定通り細胞種の違いによるヌクレアーゼ活性の差を可視化することに成功した。また、細胞種によるヌクレアーゼ活性の発現効率への影響を単一細胞レベルで明らかにすることを試みた。当初予定していたMEMSを利用した方法から測定手法を変更し、フローサイトメトリーによって発現効率を定量化した。以上の結果をもとに論文をまとめる段階に入っており、2年度目までに想定していた研究はおおむね達成されている。今年度の当初達成目標はDNA分解経路の定量的可視化法、すなわち測定系の確立であった。具体的な課題としては、1蛍光標識DNA分解プローブの作成、2外来DNAを細胞内に定量的に導入する方法としてのマイクロインジェクション、3ccRICS解析プログラムの開発、4条件の最適化と測定である。蛍光標識DNA分解プローブは、修飾する色素の選択と鎖長、配列をデザインし作成した。作成したDNAプローブを水溶液中において蛍光相互相関分光法(FCCS)で測定したところ、高い相互相関値が得られ、プローブとして利用可能であることが示された。次に、細胞へのマイクロインジェクションを試みた。装置の安定性にやや難がありスループットは高くないもののDNAプローブの細胞内導入が可能な段階まで手技を向上した。同時にccRICSの画像相関解析プログラムを作成した。ccRICS法は一般的な使用法であればすでに顕微鏡メーカー等からソフトウェアが入手可能である。しかし、本研究は画像の任意の空間における相互相関度を時間方向に解析することを目的としており、そのような解析手法は自分で作成する必要があった。このプログラムによって、蛍光タイムラプス測定を相互相関タイムラプスに変換することが可能になった。実際にCOS7細胞にDNAプローブをマイクロインジェクションし、1時間程度のタイムラプス測定を行いその間にDNAプローブが分解されていく様子を動画として可視化することに成功した。
ゾル-ゲル法によるゲル細孔内光誘起プロトン移動反応に及ぼす遷移金属の影響

ゾル-ゲル法により-O-M-O-ネットワークを持つゲル細孔内にカプセル化されたアントロンからアントロールへの光誘起プロトン移動反応(励起状態ケト→エノール互変異性)等の機構とこれに伴う発光スペクトル、その強度変化、反応挙動に及ぼすゲル組成、特にSiとAl比、R=Si(Si+Al)の影響について検討した。R=00.5、酸及び塩基触媒と無触媒の条件下でゾル-ゲル反応の進行に伴う蛍光スペクトル変化を観測した。各系のスペクトル変化はRの違いに依存するが、スペクトル変化の原因は以下のように解釈できる。溶液調整直後ではエタノールがかなり存在するためにアントロールとの水素結合種が多い。反応が進行すると、エタノールよりも極性の小さいシラノール基が多くなりそのために反応はケと型に移動し発光強度が弱くなる。さらに反応が進行すると細孔表面との相互作用が強まり錯体種の形成が進む。キセロゲル状態の試料に光照射すると、Rが小さい場合蛍光強度の増加とともに480nm付近から長波長発光の寄与が増した。この強度変化を各試料について1次反応としてプロットすると直線になり、各系の反応速度定数,k,を得た。これは、ゲル試料中のアントロンが光照射によってアントロールと変化することを示している。kはR=0.1の場合最大を示し、発光強度は光照射前後で約2桁違う系もあり、アントロンからアントロールへの互変異性が起こりやすいことを示す。Rが大きい場合やTiを含むと光照射前から錯体種の寄与が大きいためにフォトクロミズム的挙動は起こりにくい。従って、フォトクロミズムを生じるためには最適なRが存在することが明らかになった。
行動異常誘発性ニトリル中毒マウスでの中枢神経系のアポトーシスと行動との関連

1.ニトリル投与動物における神経毒性発生機序・行動異常発生機序(1)ニトリル投与動物ではImmediately early gene c-fos産物のFos蛋白質が、前庭神経核を含む若干の神経核に投与1.5時間後から30日後まで免疫組織化学的に確認された。特に30日後までFos発現が認められた神経核は前庭破壊後に観察されるFos発現神経核に一致していたので、ニトリルの前庭傷害作用が推定され行動異常発生との関連が示唆された。2.培養PC12細胞におけるアポトーシスカスケードの解析アリルニトリル(5mM)は培養12時間後に核濃縮とDNAの断片化をもたらした。ヘキスト33258染色で評価された、アリルニトリル誘発性アポトーシスはcaspase-3阻害剤で抑制された。アポトーシス出現に一致して、caspase-3活性の増加、活性型caspase-3(p17)の増加、ミトコンドリアからのcytochromecの遊離の増加、内在性caspase-3の基質poly(ADP-ribose)polymeraseの分解の増加が確認された。これらの結果からアリルニトリルはcytochromec-caspase-3経路を介してアポトーシスをもたらすことが示された。今後、cytochrome cの遊離を調節するbcl-2familyに焦点をあてた研究が必要である。行動異常誘発性ニトリルの細胞内情報伝達機構及びアポトーシスカスケードへの作用を調べ、以下の成績を得た。1.ニトリル投与動物における神経毒性発生機序・行動異常発生機序(1)Immediately earlygene c-fos産物のFos蛋白質は神経系では神経細胞活性化あるいは細胞死の指標として用いられている。ニトリル投与動物では、前庭神経核を含む若干の神経核に投与1.5時間後から30日後までFosの発現が免疫組織化学的に確認された。特にFosの発現が30日後まで認められた神経核は前庭破壊後に観察されるFos発現神経核に一致していたので、ニトリルの前庭障害作用が推定され行動異常発生との関連が示唆された。2.培養細胞(PC12細胞)におけるアポトーシスカスケードの解析神経栄養因子(NGF)はニトリルがもたらす、形態学的な核の断片化及びDNAの断片化を指標としたアポトーシスを高めた。また、in vivoでの成績と一致してニトリルはcaspase-3活性を高めた。今後、caspase-3、cytochromec及びpoly(ADP-ribose)polymeraseのwestern blotを行い、caspase-3に至るカスケードと下流のカスケードの双方を検索する予定である。行動異常誘発性ニトリルの細胞内情報伝達機構及びアポトーシスカスケードへの作用を解析し、以下の成績を得た。今後、cytochromecの遊離を調節するbcl-2 familyに焦点をあてた研究が必要である。
エンテロトキシンファミリーのプレッシャーによる黄色ブドウ球菌感染戦略の解明

黄色ブドウ球菌が産生するスーパー抗原のTSST-1の新機能の観点から,黄色ブドウ球菌と宿主の攻防機序について解析し,以下の成果を得た。(1)飢餓誘導上皮細胞においてTSST-1はLC3-IIの蓄積とLC3B遺伝子の発現阻害によりオートファジーを抑制した。(2) TSST-1のオートファジー抑制はスーパー抗原活性非依存性であった。(3)オートファジーは上皮細胞内での黄色ブドウ球菌の生存・増殖に関与していることが示唆された。(4)スーパー抗原欠損TSST-1免疫で獲得される黄色ブドウ球菌感染抵抗性はIL-17A依存性であり,長期記憶免疫応答はIL-10によりマスクされた。本研究では、TSST-1のスーパー抗原以外の機能を実証し、黄色ブドウ球菌感染における役割を細胞レベル及び生体レベルで解明し、黄色ブドウ球菌と宿主の攻防メカニズムを解明することを目的とし、平成23年度は以下の検討を行った。1.TSST-1のスーパー抗原によらない上皮細胞感染への役割を知るために、TSST-1分子のアミノ酸置換による変異タンパク質のスーパー抗原活性の欠損する変異タンパク質をT細胞レセプターあるいはMHCクラスII結合部位を中心に作製に成功した。2.TSST-1遺伝子を欠損させた黄色ブドウ球菌株(△tstについて、マウスにおける感染力と上皮細胞におけるオートファジー誘導について検討したところ、マウスにおけるビルレンスが低下する一方、上皮細胞において野生株に比べオートファジー誘導が促進されていた。3.上皮細胞(HeLa229株)をTSST-1で処理し、オートファジー誘導時のオートファジーマーカー(LC3)、リソソームマーカー(LIAMP2,LysoTracker)の分布と発現量について共焦点レーザー顕微鏡を用いて解析したところ、TSST-1処理細胞でオートファジー誘導が著明に抑制された。同様な結果は、ウエスタンブロット法によるLC3-II定量結果でも得られた。4.TSST-1処理上皮細胞におけるオートファジー関連各種遺伝子の発現を定量的PCRで評価したところ、TSST-1はLC3の発現を抑制することが示唆された。5.スーパー抗原欠損TSST-1で免疫したマウスでは黄色ブドウ球菌感染に対し抵抗性を獲得することのメカニズムとして、特異抗原であるTSST-1刺激によりγδT細胞及びCD4陽性T細胞から産生されるIL17が必須な役割を果たしていることが示唆された。本研究では、TSST-1のスーパー抗原以外の機能を実証し、黄色ブドウ球菌感染における役割を細胞レベル及び生体レベルで解明し、黄色ブドウ球菌と宿主の攻防メカニズムを解明することを目的としている。その目的に沿って平成25年度は以下の検討を行った。1.TSST-1遺伝子を欠損した変異株をHeLa細胞に感染させると、野生株感染と比較して栄養飢餓やラパマイシンにより誘導されるオートファゴソーム数が多かった。一方、細胞内の生菌数は野生株に比べ変異株で少なく、オートファジーは上皮細胞内での黄色ブドウ球菌の生存・増殖に関与していることが示唆された。2.TSST-1のスーパー抗原活性を欠損したTSST-1変異タンパク質のオートファゴソーム形成に対する影響を検討したが、スーパー抗原活性を有するTSST-1と同様にオートファゴソーム形成を抑制した。この結果から、TSST-1のオートファジー抑制はスーパー抗原火依存性であることが示唆された。3.スーパー抗原欠損TSST-1で免疫したマウスでは、黄色ブドウ球菌のみならずリステリアやカンジダに対しても感染抵抗性が付与された。しかし、免疫後の長期記憶の時期に各菌を感染させた場合、感染抵抗性は見られなくなった。その原因を探求したところ、記憶細胞が消失したわけではなく、IL-17の代わりにIL-10を産生するため感染抵抗性が抑制されること、抗IL-10抗体の投与により各菌の感染抵抗性とIL-17産生が回復することを見いだした。4.高脂肪食肥満マウスにおいて、黄色ブドウ球菌皮下感染に対する抵抗性が減弱するが、リステリア感染では獲得抵抗性が減弱することが示唆された。その目的に沿って平成24年度は以下の検討を行った。1.TSST-1の各部位のアミノ酸をアラニンやグリシンに置換した変異遺伝子組換え標品を作製し、スーパー抗原活性とT細胞レセプター及びMHCクラスIIへの結合親和性を測定した結果、T細胞レセプターへの結合はN末端135番目のヒスチジン、MHCクラスIIへの結合は37番目のアスパラギンが必須であることが明らかとなった。

2.TSST-1のオートファゴソーム形成抑制作用において、TSST-1はLC3-IIの蓄積のみならず、LC3-Iの量とLC3B遺伝子の発現を阻害することが示された。3.TSST-1とは異なり、SEAやSEBにはオートファゴソーム形成抑制作用が認められなかった。4.スーパー抗原欠損TSST-1で免疫したマウスでは、黄色ブドウ球菌のみならずリステリアやカンジダに対しても感染抵抗性が付与された。しかし、他感染に対する感染抵抗性は、TSST-1あるいはTSST-1産生黄色ブドウ球菌刺激後にみられることから、TSST-1特異的に産生されたIL-17によるバイスタンダー効果である可能性が示唆された。5.高脂肪食肥満マウスにおいて、黄色ブドウ球菌皮下感染に対する抵抗性が減弱していた。肥満マウスの皮下脂肪由来マクロファージにおけるIL-1β産生、NLRP3 mRNA発現およびカスパーゼ-1の活性化が低下していたことから、感染防御能の低下は皮下脂肪由来マクロファージの機能の低下に起因することが示唆された。本研究では、TSST-1のスーパー抗原活性以外の機能を実証し、黄色ブドウ球菌感染における役割を細胞レベル及び生体レベルで解明し、黄色ブドウ球菌と宿主の攻防メカニズムを解明することを目的とした。その目的に沿って、平成26年度は以下の検討を行った。具体的には、これまでの研究でTSST-1がHeLa細胞においてautophagosomeの形成を阻害し、そのメカニズムについて検討してきた。そこで、黄色ブドウ球菌感染におけるオートファジーの役割を明らかにするために、主要な病原遺伝子を保有しない黄色ブドウ球菌Staphylococcus aureus RN4220株にtsst-1遺伝子あるいはスーパー抗原活性を欠損させたtsst-1 (mtsst-1)遺伝子を導入し過剰発現させた株を作製して検討を行ったところ、以下の結果を得た。2.これらの株のHeLa細胞内での増殖を測定すると、RN4220野生株感染に比べ、RN4220/tstとRN4220/mtstはともに、細胞内での増殖が低下していた。これらの結果から、autophagosome数が多いほど増殖が高く、黄色ブドウ球菌にとってautophagosomeは増殖あるいは生存の場である可能性が示唆された。26年度が最終年度であるため、記入しない。医歯薬学26年度が最終年度であるため、記入しない。実験計画はおおむね順調に進展しているが、現在ものづくりが主体であったため、データとしては次年度に持ち越されている部分もある。分子、オートファジー、免疫の各研究は段階的にデータが蓄積されている。本研究課題の計画に従って平成24年度以降の研究を遂行していくことには変更はない。ただ、TSST-1変異遺伝子の過剰発現株の作製には難渋しており、この部分が現在の大きな課題となっている。本研究課題の計画に従って平成26年度以降の研究を遂行していく予定である。特にTSST-