hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
固液界面における準束縛溶媒分子の配向緩和ダイナミクス

水分子と物質のあいだに働く親水性・疎水性相互作用は周りの水分子の構造とダイナミクスに影響を与え、分子の反応性や機能性を支配している。昨年度、我々は疎水性のテトラアルキルアンモニウムイオン(R_4N^+)に電場をかけて疎水分子で修飾した電極表面に押しつけると、イオンの疎水性水和殻が破壊され、同時に界面の水分子が追い出される現象をはじめて観測した。本年度は、親水性イオンを用いて親水性-疎水性、疎水性-疎水性物質が接近するとき、間にある水分子の特異的な挙動について調べた。COが吸着したPt電極表面の水分子は、3670cm^<-1>に疎水界面に特有なFree OHに帰属されるバンドを与える。この表面に親水性イオン(Na^+,Mg^<2+>,Zn^<2+>,Me_4N^+)が近づくと、このFree OHが容易に追い出され、代わりにカチオンに配位した水が3600cm^<-1>に新しいバンドを与えることを観測した。一方、Pr_4N^+などの疎水性イオンが接近した場合、疎水性水和殻に帰属される強く水素結合したバンドが35003000cm^<-1>に現れた。このとき、Free OHはある閾値の電位より低い領域ではほとんど減少しないことから、疎水性イオンが疎水表面の水を押しのける過程にはエネルギー障壁があることが分かった。これらの違いは、イオンの水和構造の違いにある。親水性イオンの場合、第一水和圏の水分子はOHを外側に向け、第二、三水和圏へと水素結合が発展するのに対して、疎水性イオンの場合、水素結合は第一水和殻内の水分子同士を結合させる方向に向いているため、第二水和圏との相互作用は小さい。これらの水素結合の方向の違いが、表面に接近した際に表面の水分子の構造に異なる影響を与えると考えられる。また、固体表面へのイオンの接近はイオンそのものの水和殻を破壊することを観測した。水分子と物質のあいだに働く親水性・疎水性相互作用は周りの水分子のスタティックな構造とダイナミクスに影響を与え、分子の反応性や機能性の発現機構を支配している。疎水性相互作用を研究するモデルとして、溶液化学の分野ではテトラアルキルアンモニウムイオン(R_4N^+)の水和構造が調べられている。水分子はアルキル基との反発を避けるために水分子同士で水素結合を作り、疎水性水和と呼ばれる水和殻を形成する。電気化学の分野において、R_4N^+は電解質として良く用いられるが、その水和構造と電極表面での構造変化について調べられた例はない,そこで、本研究では、電極界面におけるR_4N^+の水和構造とその構造変化を赤外分光法を用いて調べた。テトラエチル、プロピル、ブチルアンモニウムイオン(Et_4N^+, Pr_4N^+, Bu_4N^+)を含む電解液の中で、COが吸着したPt電極を負に掃印すると、これらのイオンの界面濃度が増加し、アルキル基のバンド強度が増加し、同時に32003500cm^<-1>に疎水性水和殻に帰属される強く水素結合したバンドが増加した。さらに電位を負に掃印すると、COの上にある水のバンド(3650cm^<-1>)が減少し、Pr_4N^+とBu_4N^+の場合、アルキル基のバンドは増加するにもかかわらず、水素結合のバンドは減少した。これは、電場強度が強くなることによって、イオンが表面に押しつけられて、水和殻が破壊されることを示している。水和殻が破壊されると、吸着COのスペクトル形の非対称性がおおきくなった。これは、水和殻が破壊されることでイオンとCOが直接相互作用するようになり、COの不均一性が増したためであると理解できる。一方、イオン半径が小さいEt_4N^+の場合には、水和殻は安定であり、測定した電位領域で水和殻は破壊されなかった。

このとき、Free OHはある閾値の電位より低い領域ではほとんど減少しないことから、疎水性イオンが疎水表面の水を押しのける過程にはエネルギー障壁があることが分かった。これらの違いは、イオンの水和構造の違いにある。親水性イオンの場合、第一水和圏の水分子はOHを外側に向け、第二、三水和圏へと水素結合が発展するのに対して、疎水性イオンの場合、水素結合は第一水和殻内の水分子同士を結合させる方向に向いているため、第二水和圏との相互作用は小さい。これらの水素結合の方向の違いが、表面に接近した際に表面の水分子の構造に異なる影響を与えると考えられる。また、固体表面へのイオンの接近はイオンそのものの水和殻を破壊することを観測した。
終末糖化産物による血管障害防御因子に関する研究

生活習慣病の1つである糖尿病は、発症しても自覚症状がほとんどないため、合併症の重症化によって死に至る危険性も大きい。糖尿病の合併症に共通する重大なイベントとして血管障害があり、その起因物質の1つに終末糖化産物(advanced glycation end-products; AGEs)が挙げられる。AGEsによる血管障害は、血管内皮細胞死や炎症反応、血栓形成、粥腫内での血管新生など様々な過程を経て引き起こされるため、関与する細胞は血管内皮細胞、マクロファージ、壁細胞、血小板など多岐にわたる。血管内皮細胞の研究については、様々な面から解析が行われ、酸化ストレスの惹起から始まる障害のメカニズムが解明されつつある。一方で、その治療薬やAGEsの形成阻害剤などは未だ開発されておらず根本的な解決に至っていない。本研究においては、重症化予防の観点からAGEsによる血管障害において、血管内皮細胞におけるras guanyl nucleotide releasing protein 2(RasGRP2)の防御因子としての機能を追求することを目的としている。大血管障害や細小血管障害を最大限に模倣し、評価できるように、大血管由来及び微小血管由来(HUVEC:大血管由来、HDMEC:微小血管由来)の不死化血管内皮細胞を用いて、RasGRP2安定過剰発現株を樹立した。また、樹立した不死化HUVECのRasGRP2安定過剰発現株およびそのMock株にグリセルアルデヒド由来AGEs(Glycer-AGEs)を添加したところ、RasGRP2安定過剰発現株でGlycer-AGEsによる血管透過性の亢進が有意に抑えられた。今後は、Glycer-AGEsが引き起こす生理的変化に対して、RasGRP2がどのように防御因子として働くか詳細に検討する予定である。本年度では、不死化HDMECを用いたRasGRP2安定過剰発現株の作製の一環として、限外希釈法によるシングルセルクローニングを行い、RasGRP2安定過剰発現株およびそのMock株を樹立することに成功した。また、既に樹立済みである不死化HUVECのRasGRP2安定過剰発現株におけるGlycer-AGEs添加による影響を解析した。その結果、蛍光標識デキストランを用いた血管透過性解析において、RasGRP2安定過剰発現株はGlycer-AGEsが引き起こす血管透過性の亢進をMock株と比較して有意に抑えた。また、Mock株ではreactive oxygen species (ROS)スカベンジャーであるN-acetyl L-cysteine (NAC)の前処理によってGlycer-AGEsの透過性亢進が一部抑制されたが、RasGRP2安定過剰発現株のレベルまでは抑制されなかった。さらに、RasGRP2安定過剰発現株はNAC前処理によってGlycer-AGEsの透過性亢進をさらに抑制することはなかった。これらのことから、RasGRP2安定過剰発現株はROS産生を抑えることによって、Glycer-AGEsが引き起こす透過性亢進の一部を抑えていることが示唆された。Glycer-AGEsが引き起こす血管透過性亢進のメカニズムは良く知られていない。また、RasGRP2による抑制メカニズムも詳しく検討されていないため、これらのシグナルの詳細な解析を行う予定である。具体的には、RasGRP2のターゲットとして良く知られているsmall GTPaseのひとつであるRap1シグナルを介した抑制メカニズムの検討、およびその他のターゲットsmall GTPaseの探索や、阻害剤を用いたシグナル経路の特定を中心に検討する。また、新たに樹立した不死化HDMECのRasGRP2安定過剰発現株に対しても同様の解析を行い、Glycer-AGEsが引き起こす影響や防御因子としてのRasGRP2の影響を検討したい。本年度では、不死化HDMECを用いたRasGRP

2安定過剰発現株の作製の一環として、限外希釈法によるシングルセルクローニングを行い、RasGRP2安定過剰発現株およびそのMock株を樹立することに成功した。また、既に樹立済みである不死化HUVECのRasGRP2安定過剰発現株におけるGlycer-AGEs添加による影響を解析した。その結果、蛍光標識デキストランを用いた血管透過性解析において、RasGRP2安定過剰発現株はGlycer-AGEsが引き起こす血管透過性の亢進をMock株と比較して有意に抑えた。また、Mock株ではreactive oxygen species (ROS)スカベンジャーであるN-acetyl L-cysteine (NAC)の前処理によってGlycer-AGEsの透過性亢進が一部抑制されたが、RasGRP2安定過剰発現株のレベルまでは抑制されなかった。さらに、RasGRP2安定過剰発現株はNAC前処理によってGlycer-AGEsの透過性亢進をさらに抑制することはなかった。これらのことから、RasGRP2安定過剰発現株はROS産生を抑えることによって、Glycer-AGEsが引き起こす透過性亢進の一部を抑えていることが示唆された。Glycer-AGEsが引き起こす血管透過性亢進のメカニズムは良く知られていない。また、RasGRP2による抑制メカニズムも詳しく検討されていないため、これらのシグナルの詳細な解析を行う予定である。具体的には、RasGRP2のターゲットとして良く知られているsmall GTPaseのひとつであるRap1シグナルを介した抑制メカニズムの検討、およびその他のターゲットsmall GTPaseの探索や、阻害剤を用いたシグナル経路の特定を中心に検討する。また、新たに樹立した不死化HDMECのRasGRP2安定過剰発現株に対しても同様の解析を行い、Glycer-AGEsが引き起こす影響や防御因子としてのRasGRP2の影響を検討したい。製造業者に発注した製品が、クオリティーチェックを通らず納品が30年度までに間に合わなかったため、31年度に改めて発注する予定である。
自然公園地域における入域料徴収システムに関する社会調査研究

平成28年度は、屋久島における赤外線カウンターの時系列データの比較分析、そして富士山保全協力金への支払意志に関する順序プロビット分析を行った。その結果、火山噴火等の災害の風評被害と代替観光地の影響が明らかとなった。富士山について、順序プロビット分析を用いて分析を行った結果、妥当性と支払意志への回答に与える要因として、訪問経験や入山料の使途が影響していることが明らかとなった。平成29年度は、日本と中国における調査及び分析を行った。その結果、入域料課金システム構築時の強制性が、制度設計に重要な要素であることが明らかとなった。富士山を対象としたベスト・ワースト・スケーリング評価において、任意性と強制性という2種類の仮想シナリオを用いた実験を行い、強制性のある入山料では、入山料の使途が個人に直接還元される場合の評価額が高かった。訪日経験のある中国人への調査結果からも、適切な入場料とサービスの対価として国立公園整備を行うことの重要性が明らかとなった平成30年度は、徴収率向上と徴収費用に相関があり、高徴収率を達成するには限界費用増加が顕著であるため、強制性の高い制度への移行を関係自治体等に提言し、社会実装へ向けた研究を行った。強制性の高い入山料制度の導入が各地で検討されることとなった。屋久島では、強制性の高い入域料が導入された後、不正な資金管理の実態も表面化した。自然公園を有する自治体における資金管理と予算使途が、今後の入域料政策の課題となることが明らかとなった。また、中国及びインドネシアの世界遺産等における現地調査からは、フリーアクセス可能な湖沼等の観光地における入域料徴収制度の制約条件に関する知見が得られた。自然公園と入域料は、世界各国の共通課題であるが、フリーアクセス、徴収費用、資金管理、消費者意識に与える使途の影響等が、計量分析及びヒアリング等から明らかとなった。平成28年度は、屋久島における赤外線カウンターの時系列データの比較分析、そして富士山保全協力金への支払意志に関する順序プロビット分析を行い、研究成果を学会報告するとともに学会誌に登載した。平成28年度は、主要な調査対象地域である屋久島において入域料に関する大きな制度改革が実施され、強制力を持たせた入域料の収受が開始された。そのため、今後の研究期間における比較研究の基礎資料として用いるため、平成18年度以降10年間のデータ収集と分析を先行実施した。今後、旧制度から新制度への変更が周知されるに従い、その影響が訪問者数や訪問者行動に影響すると予想される。赤外線カウンターの日別データ等を分析した結果、火山噴火等の災害の風評被害、そして近隣の代替的観光地におけるLCC就航等の影響が明らかとなった。次に、過去に実施したインターネット社会調査のデータにおいて、富士山を対象としたデータのみを取り出し、順序プロビット分析による解析を行った。富士山保全協力金の金額である1,000円の回収率は約50%であり、フリーライダーが発生している。回収率の向上をはかるには、より多くの人件費が必要であり、費用効率性が低下する。そのため、登山者を含む一般市民が、入山料の金額の妥当性と支払意志の観点からどのように評価しているかを検証することが重要である。順序プロビット分析を用いて分析を行った結果、妥当性と支払意志への回答に与える独立変数として、訪問経験や入山料の使途に関する変数が強く影響していることが明らかとなった。また、奄美大島や沖縄県北部等における実態調査に基づく、入域料徴収の可能性について質的調査を行い、今後の研究対象地選択を行うための予備的検討を行った。当初、本研究課題を開始する以前より蓄積してきた赤外線カウンターデータ及びアンケート調査データの予備的解析を行うとともに、社会調査の候補地選択を主に行う計画であった。しかしながら、平成26年度と27年度において、屋久島の観光客動向に大きな変化があり、その要因が既存の統計データ及び赤外線カウンターデータの組み合わせにより接近可能であることが検証できた。当初は、予備的解析にとどまると想定された研究アプローチであったが、学会誌に掲載される分析結果を得たことは、当初の予想を超える進捗状況である。また、過去に実施したアンケート調査データの中から、未解析であった富士山登山に関するデータについて、現地調査を踏まえた新たな計量分析を実施することができた。その結果、妥当性と支払意志という観点から、順序プロビット分析により、回答者の行動と意識の乖離を明らかにする手がかりが得られ、今後の調査に向けての研究課題が明らかとなった。それらを踏まえて、年度末に富士山登山者を対象とするアンケート調査を実施できた。新規性及び信頼性の高いデータを得ることができ、今後の研究成果蓄積に向けて重要な進歩があったと判断される。平成29年度は、日本と中国におけるアンケート調査の計量分析、及び現地でのヒアリング調査を中心として研究を実施した。日本では、屋久島において、強制性の強い募金である屋久島山岳部環境保全協力金が平成29年3月に導入され、金額も日帰り客が2倍、山中宿泊客が4倍に値上げされたものの徴収率は飛躍的に向上した。平成28年度におけるWTP調査分析結果と比較しても、協力金の金額は同等程度であったため、入域料課金システム構築時の強制力が、制度設計において重要な要素であることが明らかとなった。平成29年度は、強制性の低い任意の募金方式により徴収を実施している富士山を対象として、ベスト・ワースト・スケーリング及び支払意志に関する計量分析を行った。

ベスト・ワースト・スケーリングを適用した調査においては、入山料において任意性と強制性という2種類の仮想シナリオを用いた実験を行った。その結果、強制性のある入山料においては、入山料の使途が個人に直接還元される使途の評価が高くなることが明らかとなった。また、全ての使途について限界支払意志額が異なることが示されたことは重要な研究成果である。環境経済評価の分野では、ベスト・ワースト・スケーリングへの注目度が高まっているが、私的財に近いマーケティング分野への適用が中心であり、準公共財・サービスへの適用は、重要な学術貢献の蓄積であると考えられる。また、中国国内における世界自然遺産等の入域料を調査した結果、日本円で5,000円以上の入域料が課されるとともに、特に重要性の高いスポットへの追加課金もされていることが明らかとなり、その意思決定や法的根拠等について調査を行った。日本国内を訪問した経験のある中国人へのアンケート調査に基づく計量分析結果からも、適切な入場料とそのサービスの対価として国立公園整備を行うことの重要性が明らかとなった。主要な調査対象地である屋久島において、任意性の高い従来型の協力金から強制性の高い協力金へと制度変更がなされ、いわば社会実験が実施された結果、実際に徴収率が急増した。他方、富士山に関連するヒアリング等から、富士山において外国人登山客の増加が徴収率の低下につながっていることを示唆する結果が得られた。また、中国における入域料の実態及び日本での国立公園訪問への分析結果が得られた。日本と中国において、適用事例の少ないベスト・ワースト・スケーリングを適用した調査分析が実施でき、学会等において公表できたことは重要な研究成果であると考えられる。平成28年度は、屋久島における赤外線カウンターの時系列データの比較分析、そして富士山保全協力金への支払意志に関する順序プロビット分析を行った。その結果、火山噴火等の災害の風評被害と代替観光地の影響が明らかとなった。富士山について、順序プロビット分析を用いて分析を行った結果、妥当性と支払意志への回答に与える要因として、訪問経験や入山料の使途が影響していることが明らかとなった。平成29年度は、日本と中国における調査及び分析を行った。その結果、入域料課金システム構築時の強制性が、制度設計に重要な要素であることが明らかとなった。富士山を対象としたベスト・ワースト・スケーリング評価において、任意性と強制性という2種類の仮想シナリオを用いた実験を行い、強制性のある入山料では、入山料の使途が個人に直接還元される場合の評価額が高かった。訪日経験のある中国人への調査結果からも、適切な入場料とサービスの対価として国立公園整備を行うことの重要性が明らかとなった平成30年度は、徴収率向上と徴収費用に相関があり、高徴収率を達成するには限界費用増加が顕著であるため、強制性の高い制度への移行を関係自治体等に提言し、社会実装へ向けた研究を行った。強制性の高い入山料制度の導入が各地で検討されることとなった。屋久島では、強制性の高い入域料が導入された後、不正な資金管理の実態も表面化した。自然公園を有する自治体における資金管理と予算使途が、今後の入域料政策の課題となることが明らかとなった。
素材の流動特性活性化による木質系材料のみを用いた成形技術の開発

H30年度に得られた成果は以下の通りである.(a)流動性の調査:前年度までに,木粉の流動性を活性化する成分として,糖類およびクエン酸に着目し,それらを混合した木粉の流動性について調査を行ってきた.本年度は,木粉の粒子サイズが流動性に及ぼす影響について,より詳細な検討を行った.その結果,木粉の流動性を高めるにあたっては,適正な粒子サイズが存在し,粒子サイズを流路径の1.5倍程度に設定すると,高い流動性を示すことがわかった.さらに,木粉が流路に流入する際の様子を観察することによって,粒子が流動時に破砕している様子を確認した.(b)射出成形性の調査:前年度までに,バインダとして糖類およびクエン酸を混合した木粉の射出成形を実施し,成形が可能であることを確認した.本年度は,成形性,強度および耐水性を最大限に高めるための適正条件(バインダ混合率,およびバインダ成分配合比[S(糖):C(クエン酸)])を調査した.その結果,成形性,強度および耐水性を両立可能な適正バインダ成分配合比S:Cは75:25程度,適正バインダ混合率は40 50 wt%程度であることがわかった.上記の条件にて作製したプレートの密度は1.41.5 g/cm^3,曲げ強度は2837 MPa,吸水厚さ膨張率は710 %であり,JISに規定されている木質プラスチックやファイバーボードの値に匹敵した.(c)高圧蒸煮プレス:前年度までに,改質木質ビレットを作製するための高圧蒸煮プレス用の金型の作製を完了した.本年度は作製した金型を用いた実験を実施した.高圧蒸煮プレスによって作製した改質木質ビレットの流動性を調査したところ,大幅な流動性の向上は認められなかった.高圧蒸煮プレス時の金型温度,保持時間および水分量が重要であると考えられ,より適正な高圧蒸煮プレス条件の検討や,改質木質ビレットの成分分析を進めている.当初の研究計画に基づき,平成28年度は,木質系粉末の流動性および成形性を評価するにあたっての実験設備の整備を行った上で,木質系粉末の流動・成形性に関する検討を行った.(a)高圧蒸煮プレス金型および流動・成形性評価のための金型作製木質系粉末の流動・成形性を評価にするための金型の設計・作製や,金型を加熱・冷却するための温度調節システムを構築した.金型は,部品交換により,キャピラリ流動試験,プレス成形および射出成形が行える構造とした.高圧蒸煮プレス金型に関しては,流動・成形性評価金型を用いた予備実験により,適正な構造に関して検討を行い,金型設計を進めている.(b)高圧蒸煮プレス条件の検討および任意形状部材の成形適正な高圧蒸煮プレス条件を明らかにするため,高圧蒸煮プレス時に生成し,流動性に対して大きく影響すると考えられる糖類の熱的特性や流動性について詳細な検討を行った.代表的な糖類であるスクロースに対して,示差熱熱重量同時測定(TG-DTA)およびキャピラリを用いた流動性を行い,融解や揮発が生じる温度域を明らかにした.さらに,スクロースを木質系粉末に添加し,その際の流動性および成形性の変化を調査した.試料はスクロースの融点近傍の180°C以上にて良好に流動することがわかった.また,試料を流動させるにあたって必要なスクロースの含有率は30 %以上であった.射出成形を行ったところ,適正な条件下において,表面に光沢のある良好な成形品を得ることが可能であった.流動・成形性評価のための金型や設備導入が完了し,高圧蒸煮プレス用の金型に先立ち,流動特性活性化に影響する木質系素材由来の成分に関して詳細な検討を進めた.そのため,高圧蒸煮プレスに関しては現在金型の設計段階であり,実験に進むことができていない.H29年度は,H28年度に整備した機器を用いて木質系粉末の流動・成形性評価を実施した.また,高圧蒸煮プレス金型の設計・製作を進めた.得られた成果は以下の通りである.(a)糖類およびクエン酸を混合した木粉の流動性および成形性に関する検討を行った.高圧蒸煮プレスによって生成されると考えられる糖類(流動特性活性化成分)に対して,クエン酸を混合することによって,両者が結合し,成形品の強度および耐水性の向上が期待できる.金型温度が180°Cにて試料は良好に流動し,添加剤の配合比(糖:クエン酸)は流動性に大きく影響しないことがわかった.試料を流動させるにあたって必要な加圧力は適正条件下にて30 MPa程度であり,一般的な木質プラスチックと同程度の流動性を有していることがわかった.また,試料の粒子サイズは流動性に大きく影響し,粒子サイズが大きいほうが高い流動性を示すことがわかった.このメカニズムに関しては現在検討中であるが,素材の粉末化に必要なエネルギが削減できるため,有益な情報である.(b)糖類およびクエン酸を混合した木粉の射出成形を行ったところ,試料は金型温度が180°Cの時に,金型内を良好に流動し,プレートの作製が可能であった.得られたプレートを24時間水に浸漬した結果,成形品は崩れることなく,厚さの膨張率も10 %以下であった.本結果より,成形品は実用に耐えうる耐水性を有していることがわかった.また,蒸煮プレス後の木粉にクエン酸を添加することによって,成形品の耐水性を向上できる可能性が示唆された.

(c)高圧蒸煮プレス金型を設計するにあたって,適正な上記排出弁の位置や,金型内部を密閉しつつ材料をプレスするための構造に関して検討を進めた.必要な部品の加工および金型の組み立てが完了し,高圧蒸煮プレス実験を行う準備が整った.高圧蒸煮プレス用の金型の作製が完了したことによって,本研究に必要な設備を全て整えることができた.また,流動特性活性化に影響する成分を添加した木粉の流動性・成形性に関しても当初の計画以上の知見が得られている.H30年度に得られた成果は以下の通りである.(a)流動性の調査:前年度までに,木粉の流動性を活性化する成分として,糖類およびクエン酸に着目し,それらを混合した木粉の流動性について調査を行ってきた.本年度は,木粉の粒子サイズが流動性に及ぼす影響について,より詳細な検討を行った.その結果,木粉の流動性を高めるにあたっては,適正な粒子サイズが存在し,粒子サイズを流路径の1.5倍程度に設定すると,高い流動性を示すことがわかった.さらに,木粉が流路に流入する際の様子を観察することによって,粒子が流動時に破砕している様子を確認した.(b)射出成形性の調査:前年度までに,バインダとして糖類およびクエン酸を混合した木粉の射出成形を実施し,成形が可能であることを確認した.本年度は,成形性,強度および耐水性を最大限に高めるための適正条件(バインダ混合率,およびバインダ成分配合比[S(糖):C(クエン酸)])を調査した.その結果,成形性,強度および耐水性を両立可能な適正バインダ成分配合比S:Cは75:25程度,適正バインダ混合率は40 50 wt%程度であることがわかった.上記の条件にて作製したプレートの密度は1.41.5 g/cm^3,曲げ強度は2837 MPa,吸水厚さ膨張率は710 %であり,JISに規定されている木質プラスチックやファイバーボードの値に匹敵した.(c)高圧蒸煮プレス:前年度までに,改質木質ビレットを作製するための高圧蒸煮プレス用の金型の作製を完了した.本年度は作製した金型を用いた実験を実施した.高圧蒸煮プレスによって作製した改質木質ビレットの流動性を調査したところ,大幅な流動性の向上は認められなかった.高圧蒸煮プレス時の金型温度,保持時間および水分量が重要であると考えられ,より適正な高圧蒸煮プレス条件の検討や,改質木質ビレットの成分分析を進めている.平成28年度に得られた知見を踏まえ,高圧蒸煮プレス用の金型を作製し,高圧蒸煮プレス条件のさらなる検討や,成形性の評価を進める.[流動特性活性化に影響する成分を添加した木粉の流動性・成形性評価]射出成形品の力学試験を行い,強度を調査する.特に,H29年度の調査にて木質系粉末の粒子サイズが大きい条件にて流動性が高くなったが,流動性のみならず,強度に及ぼす影響も明らかにすることによって,適正な粒子サイズを提案する.[高圧蒸煮プレスに関する検討]高圧蒸煮プレスによって,改質ボードを作製し,その成形性に関する検討を中心に行う.主な高圧蒸煮プレス条件は,処理時における温度・水分量および圧力であり,これらの条件が改質ボードの成形性に及ぼす影響を明らかにする.平成28年度中に当初予定していた論文投稿を完了することができなかったため,論文投稿料を支払うことがなくなり,次年度使用額が生じた.当初予定していた学会発表を見送ったため,旅費を中心に残額が生じた.次年度では,今年度に発表できなかった成果を,学会や学術雑誌への論文投稿によって発表するために,当該年度に生じた残額を使用する.次年度使用額は,平成28年度中に完了できなかった論文の投稿料を賄うために使用する.平成29年度分の予算については,当初の計画通りに使用する.
プレセニリン断片の細胞生物学的解析

アルツハイマー病の主要原因遺伝子プレセニリン1の機能については神経病変である老人斑分子(Aβ1-42/43)の高進やあるいは細胞死を誘起する可能性が議論されているが、実際にヒト脳組織を用いた検索は少ない。これまで細胞内蛋白分解の視点からアルツハイマー病を検討してきたが、プレセニリン1突然変異によってプレセニリン1自身の蛋白分解が変化するという議論に明瞭な研究成果を得ることができた。プレセニリン1自身はヒト脳組織内では大きく2つの断片の複合体として存在しているが、プレセニリン1異常である早期発症型家族性アルツハイマー病でもその代謝に変化がなかった。すなわちプレセニリン1自身の代謝異常ではなく、その機能変化が痴呆発症を引き起こすことが結論された。また、この家族性をしめす脳組織の初期病理変化がAβ1-42/43であることを確定することができた。最近議論され始めたアポトーシスとの関連が特に重要視され始めているが、この問題について、脳組織内のプレセニリン1のカスパーゼ断片と調べると共に、カスパーゼ-3ノックアウトマウスを用いた研究を進行させてきている。その結果、細胞内プレセニリン蛋白の95%以上は26kの安定な断片として存在していることを見出した。さらに最近、断片化が2種類あることがハーバード大学のグループによって提唱されているが、この新しい断片化はCaspase-3による分解であることから、アポトーシス細胞死に関連することが示唆されてきた。われわれは現在この結論を支持する結果をカスパーゼ-3ノックアウトマウスから得ていないが、さらに検討をすすめることを計画している。
経口薬剤に代わる結晶性制御セルロースを用いた経皮薬剤徐放貼付製品の創製

平成29年度(初年度)は結晶化度を「臼式粉砕」で制御したセルロースを用い、対象薬剤(サルチル酸メチル)のセルロースへの吸収/放出とセルロースの結晶化度の関係を解析し、適切な結晶化度の指標化を明確化する検討をおこなった。フィルム内での薬剤サルチル酸メチル含有量の定量的評価には、UV・可視光の吸収スペクトル法を用いた。フィルムの厚み方向でのサルチル酸メチルの拡散挙動解析のために、薄膜PE積層法でフィルム各層の薬剤濃度を経時的に測定する手法を確立した。サルチル酸メチルのポリエチレン(PE)内での薬剤濃度測定からフィルム表面に薬剤が一定量・一定時間拡散するには、初期拡散量を抑えるためにPE樹脂の結晶化度が60%以上であることが必要であることを見出し、拡散量と結晶化度の相関性を明確にした。平成30年度(2年目)では、薬剤のフィルム内拡散機構について検討した。小角X線散乱からPEの結晶/非晶の長周期構造を求め、非晶領域(非晶の道)と薬剤拡散量に相関性があることを見出した。また、臼式粉砕で結晶化度が制御されたセルロース粉を10%ブレンドしたPEフィルムにサルチル酸メチル水溶液を含浸させた薬剤層とLDPEフィルム(50μ)5枚のフィルムを重ね合わせた系を作製した。この組み合わせフィルムを常温で72時間放置し、各フィルム表面に拡散した薬剤量を測定することで継時的に薬剤拡散挙動が評価できる方法を確立した。更には、当研究室で所有している小型の2軸混練押出機(テクノベル社製KZWとULT)を用い、2種3層のフィルムが共押出しできるダイスを設計し製造した。この装置を用い中心部は薬剤含浸セルロースブレンドフィルムで内外層に薬剤拡散速度制御PEの多層フィルムが製造できるようになった。経口薬剤は、患部までの距離が遠く、経口後血液中の薬剤濃度が急上昇すること、効力が短時間で失われるなどの課題がある。この課題を解決するには、システム的には薬剤を患部に近い皮膚に貼付する方法が有効であり、かつ貼付するシートからの薬剤量が一定量長時間フィルム表面にブリードすることが必須である。そのため薬剤のフィルム表面への拡散機構について検討した。フィルム内での薬剤拡散を阻害する因子としてはポリマーの結晶化度と結晶粒子径がある。結晶構造の解析のために、小角X線散乱を用いPEの結晶/非晶の長周期構造を求めた。その結果、結晶でない非晶領域(非晶の道)と薬剤拡散量に相関性があることを見出した。また、PEに臼式粉砕で結晶化度が制御されたセルロース粉を10%ブレンドすることで作製したフィルムにサルチル酸メチル水溶液を含浸させた薬剤層とLDPEフィルム(50μ)5枚のフィルムを重ね合わせたものを作成した(「薄膜フィルムの多層化評価法」)。この組み合わせフィルムを常温で72時間放置し、各フィルム表面に拡散した薬剤量を測定して継時的かつ厚み方向での薬剤拡散量が評価できる方法を確立した。1年目に見出した結晶化度60%以上のPEフィルムを用いるとフィルム表面に継時的かつ定量的に薬剤がブリードする製品開発の指針が見えた。更には、当研究室で所有している小型の2軸混練押出機(テクノベル社製KZWとULT)を用い、2種3層のフィルムが共押出しできる「改造ダイス」を設計し製造した。以上の成果からおおむね順調に進展していると評価した。2019年度は最終年度にあたるので、「経口薬剤に代わる結晶性制御セルロースを用いた経皮薬剤徐放貼付製品の創製」をめざし、臼式粉砕装置を用いたセルロースの最適な結晶化度と粒子径領域の確立とPEの最適結晶化度領域の確立を進める。セルロースの結晶化度と薬剤の吸収・放出挙動に、セルロースの結晶粒子径依存性と結晶化度依存性が混在する様子を把握したい。臼による粉砕の条件でセルロースの結晶化度制御が可能なこと、および粉砕品の再結晶化処理で同一粒子径品の結晶化度を高めることが可能ということまで確認できているが同一粒子径で結晶化度を変更し検討を続行する。さらには理論的な展開として粒子径から表面積が算出できるので、単位表面積あたりの吸収量・放出量を測定算出し、セルロースの結晶化度への依存性を理論構築していく。これらの結果を踏まえ、マトリックス樹脂であるPEの結晶化度・結晶粒子径を「改造ダイス」の混練・成形条件で制御し、3次元的モルフォロジー設計(厚み方向の結晶構造制御)により材料・プロセス・製品の構築を行う。平成29年度(初年度)は、研究計画記載のとおり「結晶化度を制御したセルロースを用い、対象薬剤のセルロースへの吸収/放出とセルロースの結晶化度の関係を解析し、適切な結晶化度の指標化」を明確化する検討をおこなった。セルロースの結晶化度は連携研究者西岡が開発した「臼式粉砕」で制御した。この臼式粉砕は臼を温度制御し、粉砕時の温度によって粉砕物の結晶化度を制御するものである。セルロースの粉砕温度を10°Cから80°Cまで変更し結晶化度0-50%のものを得た。吸収・放出を検討する薬剤としては消炎剤であるサルチル酸メチルを選択した。サルチル酸メチルのセルロース単独への吸収・放出の実験では、結晶化度が低いと吸収しやすいが、放出しにくい傾向にあった。

粒子径の検討が必要だが、粉砕後のセルロースの放出性も含めた適切な結晶化度領域は25-40%であった。フィルム内でのサルチル酸メチル含有量の定量的評価法は、UV・可視光の吸収スペクトル法で確立した。フィルムの厚み方向でのサルチル酸メチルの拡散挙動解析は、厚み方向の薄膜切削が困難という課題に対し切削せずに50μのPE薄膜を5枚積層しフィルム各層の薬剤濃度を経時的に測定する手法をも確立した。サルチル酸メチルのPEフィルム内での薬剤濃度の測定から、低密度PE(低結晶)においては初期にサルチル酸メチルが大量に拡散してしまう挙動が明らかとなった。フィルム表面に薬剤が一定量・一定時間拡散するには、初期拡散量を抑えるためにPE樹脂の結晶化度として60%以上が必要であることを見出し、拡散量と結晶化度の相関性を明確にした。セルロースの結晶化度制御は、臼式粉砕法の温度制御で可能なことを確認した。フィルム内サルチル酸メチルの濃度評価は、UV・可視光吸収スペクトル法で実施した。また従来厚み方向の薄膜化が困難とされていたが、「薄膜フィルムの多層化評価法」で切削せずに厚み方向の濃度の経時変化を定量化できる方法を確立した。これはサルチル酸メチル含有水溶液を片面に塗布したモデルで評価することができた。この評価法とUV・可視光測定との併用で、サルチル酸メチルの定量的拡散制御には、初期に表面に拡散しすぎないようPEフィルムの結晶化度として60%以上が必要であることを見出した。PE結晶の粒子径を小角X線散乱で解析し、粒子径依存性はあまり大きくないことも確認した。厚み方向の濃度の経時変化を定量化する方法の確立やPEフィルムの結晶化度の目安を見つけたことなどを、最適な非晶性セルロースの指標化を行うという平成29年度の研究実施計画を考慮した上で、おおむね順調に進展していると評価した。平成29年度(初年度)は結晶化度を「臼式粉砕」で制御したセルロースを用い、対象薬剤(サルチル酸メチル)のセルロースへの吸収/放出とセルロースの結晶化度の関係を解析し、適切な結晶化度の指標化を明確化する検討をおこなった。フィルム内での薬剤サルチル酸メチル含有量の定量的評価には、UV・可視光の吸収スペクトル法を用いた。フィルムの厚み方向でのサルチル酸メチルの拡散挙動解析のために、薄膜PE積層法でフィルム各層の薬剤濃度を経時的に測定する手法を確立した。サルチル酸メチルのポリエチレン(PE)内での薬剤濃度測定からフィルム表面に薬剤が一定量・一定時間拡散するには、初期拡散量を抑えるためにPE樹脂の結晶化度が60%以上であることが必要であることを見出し、拡散量と結晶化度の相関性を明確にした。平成30年度(2年目)では、薬剤のフィルム内拡散機構について検討した。小角X線散乱からPEの結晶/非晶の長周期構造を求め、非晶領域(非晶の道)と薬剤拡散量に相関性があることを見出した。また、臼式粉砕で結晶化度が制御されたセルロース粉を10%ブレンドしたPEフィルムにサルチル酸メチル水溶液を含浸させた薬剤層とLDPEフィルム(50μ)5枚のフィルムを重ね合わせた系を作製した。この組み合わせフィルムを常温で72時間放置し、各フィルム表面に拡散した薬剤量を測定することで継時的に薬剤拡散挙動が評価できる方法を確立した。更には、当研究室で所有している小型の2軸混練押出機(テクノベル社製KZWとULT)を用い、2種3層のフィルムが共押出しできるダイスを設計し製造した。
出芽酵母オートファジーにおける小胞輸送ネットワークおよび膜融合機構の役割

出芽酵母のタンパク質分泌経路を人為的に遮断すると、オートファジーが阻害されることが分かった。このことから、オートファジーに必要なオートファゴソームと呼ばれる膜構造体の形成にタンパク質分泌経路を介した膜脂質の供給が重要であることが示唆された。一方、タンパク質分泌経路に必要な複数の膜融合因子(SNARE)がオートファゴソーム形成に特異的にはたらくタンパク質Atg9と相互作用することを示し、これらの因子がオートファゴソーム形成のマシナリーとして機能している可能性を示した。昨年度は輸送小胞の膜融合に関わるSNAREタンパク質のpre-autophagosomal structure (PAS)への局在を生化学的手法により解析した。その結果、ゴルジ体、エンドソーム、細胞膜で働くSNARE群がPASに局在すること、その内のいくつかはオートファゴソーム形成に必須なAtg9と物理的相互作用していることが示唆された。そこで、本年度は二分子蛍光相補性試験によってゴルジ体SNARE (Tlg1、Tlg2、Vti1)とAtg9の相互作用を解析した。二分子蛍光相補性試験はタンパク質ータンパク質相互作用解析法の一つで、蛍光タンパク質VenusのN末端領域とC末端領域をそれぞれ解析したいタンパク質に融合させ、それらを共発現させることにより、in vivoにおけるタンパク質相互作用、さらには細胞内における相互作用部位を解析できる。ゴルジ体SNARE (Tlg1、Tlg2、Vti1)とAtg9の相互作用解析にこの手法を適用した結果、いずれのSNAREもAtg9との結合性を示した。PASマーカーであるCFP-Ape1との共局在を解析した結果、ゴルジ体SNAREとAtg9はPAS上で複合体を形成していることが明らかとなった。これらの結果から、Atg9がSNAREをPASへリクルートしている可能性が考えられた。そこで、野生株とAtg9過剰発現株におけるゴルジ体SNAREのPASへの局在を蛍光顕微鏡で観察・比較したところ、Atg9を過剰発現することによりSNAREがPASに局在する割合が上昇した。このことから、Atg9はSNAREをPASへリクルートする働きがあることが示唆された。オートファゴソーム(AP)形成因子Atg9と輸送小胞の膜融合に関わるSNAREタンパク質との物理的相互作用を解析した。Atg9およびSNAREの多くは膜貫通ドメインを有するタンパク質であるため、split-ubiquitin based membrane yeast two-hybrid (MYTH) systemを用いた。この実験系は、膜タンパク質同士の相互作用を酵母細胞内で再構築・評価できる系である。ゴルジ体SNARE(Vti1、Tlg1、Tlg2)のほか、Ykt6、Use1(小胞体局在)、Sso1(細胞膜局在)とAtg9との相互作用を解析したところ、いずれのSNAREとも結合性が認められた。特にTlg1との相互作用が強いことが明らかとなった。次に、これらの相互作用が細胞内のどの部位で起こっているか明らかにするために、二分子蛍光相補性試験を行った。この手法では、蛍光タンパク質VenusのN末端領域とC末端領域をそれぞれ解析したいタンパク質に融合させ、それらを共発現させることにより、タンパク質相互作用および細胞内における相互作用部位を解析できる。Atg9はatg1Δ株でpre-autophagosomal structure (PAS)呼ばれるAP前駆構造に蓄積し、atg11Δatg17Δ二重破壊株ではPASが形成されず、Atg9はゴルジ体などのオルガネラに局在することが知られている。atg1Δ株ではVti1、Tlg1、Tlg2、Use1、Sso1との結合性が観察され、いずれもPAS上で複合体を形成していることが示唆された。atg11Δatg17Δ株でもこれらのSNAREとの結合性は観察されたが、それらの相互作用部位はatg1Δ株におけるそれとは異なっていた。今後、相互作用部位の詳細な解析は必要であるが、多様なオルガネラからAPへ膜脂質が供給されていることが示唆された。出芽酵母を用いて、オートファジーの過程で形成されるオートファゴソームの形成に、小胞輸送における膜融合装置であるSNAREが関与するか解析した。また、オートファゴソームの前駆膜構造体であるPASの単離を試みた。出芽酵母に存在する24のSNAREのうち、19のSNAREの機能不全変異株を入手し、オートファジー活性の低下が見られるか解析した。大部分の変異株において、オートファジー活性の低下が確認された。特定の輸送経路に関わるSNAREの変異株においてオートファジー欠損が見られた訳ではないことから、小胞輸送ネットワークの不全による脂質膜のPASへの供給の低下がオートファジー不全に繋がったと考えられた。次に、オートファゴソームの膜脂質の起源を解析するため、PASの単離を行い、同構造体に含まれるタンパク質の解析を行った。オートファジーに必須なAtgタンパク質群の大半はPASに局在する。

その中から、膜貫通タンパク質であるAtg9を選び、エピトープタグを融合したHA-Atg9を発現させた。細胞抽出液から、抗HA抗体でコーティングした磁気ビーズを用いて、HA-Atg9を含む膜構造体を分離した。対照実験として、エピトープタグを融合していないAtg9を発現する細胞を用いて、同様の実験を行った。分離した膜構造体から、非イオン性界面活性剤(Triton X-100)、イオン性界面活性剤(SDS)順を用いて順次タンパク質を溶出した。この画分に対して、種々のオルガネラマーカータンパク質に対する抗体を用いて、ウェスタンブロット解析を行ったところ、主に、ゴルジ体やエンドソームのマーカータンパク質が存在することが明らかとなった。このことから、ゴルジ体やエンドソームが主要なオートファゴソームの膜起源であることが示唆された。電子顕微鏡観察は出来なかったが、相互作用解析などは順調に進展している。当初の予定通り研究は進んでいる。ほかのSNAREについても二分子蛍光相補性試験によるAtg9との相互作用解析を行う。SNAREのPASへの局在がオートファジーに必要か解析する。そのためにSNAREやAtg9に変異を導入することによりSNAREがPASに局在しない変異株を作製し、その株におけるオートファジーの解析を行う。膜構造体(PAS)の単離実験を繰り返して行い、再現性よくPASを分離できる方法、手技を確立する。PAS画分に含まれるタンパク質、リン脂質の網羅的解析を行う。変異株取得実験に使用する予定である。主に、プロテオーム解析、リピドーム解析並びに電子顕微鏡観察(研究計画通り)に経費を使用する予定である。
バイオ3Dプリンターを用いた胆管構造を有する大型肝組織作製法の開発

肝細胞、HUVEC、骨髄由来幹細胞を用いて96well非接着性丸底プレート内で、高機能かつ、90%以上の成功率を持ってバイオ3Dプリンターによる積層が可能な、再現性の高いスフェロイド形成法を確定した。バイオ3Dプリンターを用いた立体的肝組織の大型化のため、効率的に組織培養を実施できるようスフェロイド固定用の剣山の大型化や還流培養装置の開発・改良を行い、これまでより数倍大きな組織が作成可能となった。還流培養装置の開発・改良により肝細胞、HUVEC、MCより作成した立体肝組織の1か月の培養に成功した。作成した立体肝組織は血管様構造、さらに胆管様構造の構築が見られた。肝細胞、HUVEC、MSCを96well非接着性丸底プレートに播種し、細胞凝集塊(スフェロイド)を作成した。スフェロイドの形成期間、大きさ、形状およびアルブミン産生能を解析し、90%以上の成功率を持ってバイオ3Dプリンターによる積層が可能な、再現性の高いスフェロイド形成法を確定した。バイオ3Dプリンターを用いて、スフェロイドを積層・癒合させ小さな肝組織を作製した。還流培養装置の開発・改良により肝細胞、HUVEC、MSCより作成した立体肝組織の1か月の培養に成功した。作成した立体肝組織は血管様構造を認め、さらに胆管上皮細胞を含まない場合でも組織内での細胞分化によりCK19+の細胞がみられ(originの細胞の詳細は現在解析中)、この細胞に囲まれた内腔を要する胆管様構造の構築が見られた。立体肝組織の大型化技術の開発は進んでおり、これまでより数倍の大きさの立体組織が作成可能となった。また、1か月の培養後、立体組織内での胆管様構造の構築が確認でき、胆管構築の可能性が示唆された。一方、歯髄幹細胞からの胆管上皮細胞の分化誘導法の確立にはまだ至っていない。作成した立体肝組織は血管様構造を認め、さらに胆管上皮細胞のマーカーであるCK19+の細胞がみられ胆管様構造の構築が見られた。この肝組織を培養1週間後にヌードラットに移植したところ、ラット内でもCK19+の細胞がみられ胆管様構造の構築が見られた。現在、胆管上皮細胞に分化した細胞の特定のため、免疫染色や遺伝子解析を進めている。肝細胞、HUVEC、骨髄間葉系幹細胞を96wel l非接着性丸底プレートに播種し、細胞凝集塊(スフェロイド)を作成した。種々の免疫染色からこの細胞は成熟肝細胞から胆管上皮に分化していることがわかった。これらの成果をScientific Reportsに報告した。

作成した立体肝組織は血管様構造、さらに胆管様構造の構築が見られた。組織培養法の改良をさらにすすめ、立体組織同士の癒合によるさらなる組織の大型化技術の開発を行っていく。胆管上皮細胞の培養法の確立を進め、胆管上皮細胞を含む立体構築による胆管構築について検討する。一方で、胆管上皮細胞を含まない場合でも細胞分化による胆管上皮細胞の出現と胆管形成が見られているため、胆管構築のメカニズムについて解析していく。大型組織の培養に酸素供給の課題などがあり、組織培養法の改良をさらにすすめ、組織の大型化技術の開発を行っていく。肝再生九州大学孝橋賢一先生のH28年度分担金100,000円を使用しなかったため、H29年度に配当いたします。物品購入費として使用予定
エルニーニョ・南方振動に伴う重力波及び成層圏準2年振動の変調

非定常重力波パラメタリゼーションを組み込まず水平解像度120km、鉛直解像度550mに設定した気候モデルMIROC-AGCMを用いたENSOーQBO実験を行った。本モデルで表現される降水・対流圏循環・重力波とQBOが陽に連動する為、重力波パラメタリゼーションによる不確実性が無い。MIROC-AGCM実験では、ラニーニャ期に比べて、エルニーニョ期にQBO周期が短くなる特徴が再現された。モデルで表現されるエルニーニョ時とラニーニャ時の基本的な物理量の差異を検証する為、全球降水データ、再解析データの解析も行った。ラニーニャ期に比べて、エルニーニョ期では熱帯対流圏ウォーカー循環に伴う東西風の鉛直シアーが弱いこと、赤道上での帯状平均降水量が15%程度多いこと、対流圏から成層圏の中緯度で西風が強いことなど、モデルと観測に基づくデータの整合性を確認した。更に、非定常重力波パラメタリゼーションを組み込んだ、水平解像度312km、鉛直解像度700mに設定した気候モデルMIROC-ESMを用いたENSO-QBO実験も合わせて行った。MIROC-ESM実験では、エルニーニョ期とラニーニャ期の周期に有意な差が見られなかった。両者で重力波ソースが不変であることが影響していると考えられ、詳細な解析を続けている。また、TRMM降雨レーダ観測により、赤道域の対流と結合したKelvin波とRossby波に伴う降水の特徴の相違を解析している。Kelvin波に伴う降水は、対流性の降水から層状性の多い降水への位相変化がみられるのに対し、Rossby波に伴う降水は、全体に層状性降水が多いという、降水特性の違いが示された。予定していた気候モデル実験が滞りなく行われ、基礎的な解析を行うことができた。初年度の研究計画以上に進展している。交付申請書に沿って、引き続きENSOに伴う赤道準2年振動の変調メカニズムを解明する為の詳細な解析を行い、各種観測データ解析と合わせて成果をまとめ、論文化していく。
スタチンによる横紋筋融解症の発症機序の解明

高コレステロール血症治療薬スタチンの骨格筋毒性の発症機序を調べた。(1)スタチンは小胞体-ゴルジ体輸送系の制御蛋白質Rab1Aを阻害した。小胞体-ゴルジ輸送阻害薬ブレフェルジンAで、スタチン同様に筋空胞化と細胞死を生じた。スタチンのRab1A阻害が筋空胞変性に関与すると考えられる。(2)スタチンによる筋力低下を調べた。スタチンによる、筋小胞体Ca2+貯蔵量と細胞内ATP低下が原因だった。低分子量G蛋白質不活性化の関与が示唆された。(3)スタチン筋毒性と筋の薬物トランスポーターの関連を調べた。筋には有機アニオン輸送体(Oatp)1a4/2b1が発現しており、これらが毒性に関与した。スタチンは、Oatpで筋に取込まれ、Rab1A等の低分子量G蛋白質を阻害し、筋空胞変性や筋力低下を招く。スタチン系コレステロール低下薬は、世界で数千万人の服用者がおり、年間売上高は約3兆円である。横紋筋融解症、脱力、腱断裂といった有害作用があるが、その機序は良く分かっていない。我々は高脂血症治療薬スタチンによる筋力低下のメカニズムを調べた。初代培養ラット骨格筋線維はフルバスタチン・シンバスタチン処理で、筋小胞体Ca^<2+>遊離剤による収縮が時間・濃度依存的に抑制された。スタチンは細胞内Ca^<2+>濃度を上昇させても筋収縮を抑制したが、収縮蛋白機能に異常はなかった。一方、細胞内ATP量はスタチン処理(10μM, 72時間)で非処理群の約20%に低下しており、これが筋力低下の一因と考えられる。我々はまた、水溶性スタチンの筋毒性発症機序も解析した。プラバスタチンは水溶性であり、骨格筋細胞膜非透過と考えられる。従って、理論上筋肉への副作用は低いはずだが、臨床試験では他の脂溶性スタチンと有害事象発生率に差は無い。我々はラット骨格筋線維にプラバスタチンを投与すると臨床血中濃度に近い濃度で筋毒性を示すことを見出した。一方、従来の骨格筋モデルとされるL6ラット骨格筋芽細胞では臨床濃度の1万倍の高濃度でも毒性は無かった。ラット骨格筋にはプラバスタチンを細胞内へと輸送する薬物トランスポーター、有機アニオントランスポーティングポリペプチド(Oatpla4, Oatp2b1)が発現していたが、L6細胞では発現が見られず、このトランスポーターによるプラバスタチンの取り込みが毒性に関与することが示唆された。本研究成果は、より副作用の少ない高脂血症治療薬やスタチンの有害作用対処法の開発につながる有益な知見である。スタチン系高コレステロール血症治療薬は横紋筋融解症や筋脱力といった骨格筋障害をひきおこす。本研究はこれらの解明を目指した。フルバスタチン(0.1-10μM)存在下でラット骨格筋線維を培養すると、3日間で筋の空胞変性がはじまり、5日間で細胞死が観察される。この現象はスタチンがメバロン酸の代謝産物ゲラニルゲラニルピロ燐酸(GGPP)を枯渇させ、小胞輸送蛋白Rabのゲラニルゲラニル化(GG化)を阻害することが原因である(Sakamoto et al., FASEB J2007)。今回さらに、この原因となるRabアイソフォームと膜輸送経路の同定を試みた。Rab1は小胞輸送系の根幹である小胞体(ER)-ゴルジ輸送に必須のアイソフォームである。フルバスタチン処理した筋線維を調べたところ、Rab1蛋白の膜移行(活性化)が阻害されていた。これはスタチンがER-ゴルジ輸送を抑制することを示唆する。さらにER-ゴルジ輸送阻害薬ブレフェルジンAは、スタチン様の空胞変性と細胞死を呈した。よって、Rab1の阻害がスタチンの毒性に関与すると考えられる。スタチンの筋収縮力低下について調べた。フルバスタチン・シンバスタチン存在下で3日間培養した骨格筋線維は筋小胞体Ca^<2+>放出薬カフェインによる収縮が低下した。小胞体からのCa^<2+>放出量はスタチン処理により低下した。しかし、イオノマイシンで細胞外からのCa^<2+>流入による収縮も抑制したことから、この他に筋収縮を抑制する機序が存在すると考えられた。さらに検討したところ、スタチンは筋線維のATP量を約1/5に減少させており、これも収縮抑制に関与すると考えられる。

スタチンによるATPの低下は、GGPPで回復したが、ユビキノンでは回復しなかった。またGGTI-298やペリリルアルコールといった蛋白質GG化阻害薬もATPを低下させた。よってスタチンによるなんらかの蛋白質のGG化抑制がATPの減少に関与すると考えられる。