hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
妊娠期・胎児期からの予防歯科啓発・支援モデルの構築

妊婦歯科健康診査の受診行動の実際及び影響を与える要因について調査を行った。対象は3歳以下の子どもを持つ母親とし、アンケート調査を行った。配布数2805部、有効回答1179部(42.3%)であった。受診率は57.5%であり、受診理由はう蝕症状の自覚のため37. 8%、公費助成29. 4%、健診のため28.9%を受診であった。受診をしなかった理由は、時間がなかった46.3%)、自覚症状がない30.8%、面倒21.3%であった。産婦人科勤務の看護者が妊婦を対象に実施する保健指導についての調査も行った。口腔に関する保健指導を実施していたものは27.6%で、そのうち助産師が77.8%であった。平成24年度において、全国の市町村の妊婦歯科健診の実施状況をもとに、実施状況マップを作成した。それより、我が国の妊婦への口腔衛生に関する支援は、いまだ発展途上であることが明らかになっている。平成25年度は、当初の予定を変更している。妊婦及びその子供の口腔の健康状態の把握及び健康管理の実態の調査に向けて、文献検討及び考察を実施して、準備を行った。市町村における妊婦歯科健診の実施状況の調査を実施した。方法は、段階を追って以下の通り行った。1:都道府県に市町村ごとの妊婦歯科健診の実施状況を確認した。2:1で回答が得られ、実施している市町村のHPを確認し、実施の概要を把握した。3:1で回答が得られなかったまたは、都道府県単位では市町村の実施状況を把握していないと回答があった地域については、該当都道府県内の市町村での妊婦歯科健診の実施状況をHPで確認した。結果は、都道府県より妊婦歯科健診の実施状況を把握できたのは47都道府県中30都道府県であった。その内訳は括弧内のように以下表記する(実施全市町村数/全市町村)平成24年8月末現在。【青森(5/40)、秋田(25/25)、岩手(14/33)、茨城(5/45)、千葉(12/54)、栃木(2/26)、埼玉(13/63)、東京(60/62)、群馬(12/35)、神奈川(11/33)、新潟(5/45)、山梨(7/27)、富山(8/15)、石川(8/19)、福井(2/17)、岐阜(31/42)、三重(4/29)、京都(10/26)、滋賀(5/19)、奈良(7/41)、兵庫(15/41)、鳥取(5/19)、岡山(8/27)、山口(6/19)、福岡(9/60)、佐賀(5/20)、大分(4/18)、熊本(10/45)、宮崎(4/26)、沖縄(4/41)】都道府県より回答がなかった及び把握していないとした都道府県のHPでの研究者が確認できた結果の内訳は、【北海道(9/180)、宮城(11/35)、山形(2/35)、福島(4/59)、静岡(6/35)、長野(4/39)、愛知(43/54)、大阪(17/43)、和歌山(2/30)、島根(3/19)、広島(16/23)、香川(6/17)、徳島(0/24)、愛媛(8/19)、高知(0/39)、長崎(1/21)、鹿児島(5/43)】であった。【研究の目的】口腔内の健康は,心身の健康維持に繋がり豊かな人生を送るための基礎である.研究者は生涯の中でも子供の口腔に問題がない妊娠期/胎児期から始める歯科保健に着目し研究を行う.背景として,妊婦の口腔衛生が小児う蝕予防の最先端のストラテジーである事や妊婦の生活習慣(喫煙,食事等)が子供の乳歯及び永久歯の形成不全に影響を与えることからも妊娠期/胎児期からの歯科保健対策が重要と考えた.よって本研究は妊娠期/胎児期出産(出生)1年間の母子の口腔健康観・管理方法を踏まえ家庭,地域,医療機関等の協働で行う生涯を通じた母と子の歯科保健対策の啓発・支援モデルのをすることを目的とする.【研究計画の実施】平成26年度は、1)産婦人科医院,助産所で行われている母子の口腔に関する健康教室の現状把握及び関係医療者の母子の口腔衛生に関する意識・認識を明らかにする.産婦人科医院は,妊娠中の女性に最も身近な存在であり,健康維持への牽引的役割となることからも必要な調査を実施した。2)妊娠期/胎児期から出産(出生)後1年間における母子の口腔の健康に関する項目の縦断的調査を行った.調査項目は,母子の口腔状態,口腔の健康意識・保健行動と関連が予測されるもの(身体・精神・社会的状況),生活習慣との関連を母子間及び時系列により検証しているところである.調査は、アンケートの配布及び回収の段階に入っており、結果が揃った段階で分析を開始する状況である。

口腔内の健康は,心身の健康維持に繋がり豊かな人生を送るための基礎である.研究者は生涯の中でも子供の口腔に問題がない妊娠期/胎児期から始める歯科保健に着目し研究を行う.背景として,妊婦の口腔衛生が小児う蝕予防の最先端のストラテジーである事や妊婦の生活習慣(喫煙,食事等)が子供の乳歯及び永久歯の形成不全に影響を与えることからも妊娠期/胎児期からの歯科保健対策が重要と考生涯を通じた母と子の歯科保健対策の啓発・支援モデルの構築をすることを目的として、研究に取り組んでいる。現在までの研究の取り組みとして、行政における取組として平成24年8月31日現在において妊婦歯科検診の実施されている都道府県別の自治体数のマップの作成を行い、都道府県もより差があることが分かった。また、未就学児を持つ母親を対象に自身及び子どもの妊娠期及び出産後の口腔の状態、健康管理及び健康意識について調査を行った。その結果、妊婦1055名、褥婦1079名、看護職者261名、施設36施設から回答を得た。妊婦による調査によると妊娠前の定期歯科検診受診率は30.3%、妊娠中は46.4%であった。産後の女性への調査では、妊娠期の歯科健診受診率は53.9%、産後は51.3%、子どもの歯科検診の受診率は、47.7%であり、受診をした理由及びしなかった理由が明らかになった。看護職者においては、口腔衛生における妊婦への指導状況及び知識を明らかにした。施設においては、口腔衛生における指導の実施状況を明らかにした。現在において、調査対象者へのアンケートは全て終了したが、その分析に時間を要しており、進捗状況としてはやや遅れていると言える。妊婦歯科健康診査の受診行動の実際及び影響を与える要因について調査を行った。対象はF県内の在園児が100名以上いる保育園及びF県K市主催の子育て支援事業に参加した3歳以下の子どもを持つ母親とし、アンケート調査を行った。アンケート配布数2805部、有効回答1179部(42.3%)であった。妊婦歯科健康診査の受診率は643人(57.5%)であり、齲蝕症状の自覚のため241人(37.8%)、公費助成があったため189人(29.4%)、口腔の症状はないが健診のため受診186人(28.9%)を受診の理由としていた。受診をしなかった理由は、時間がなかった248人(46.3%)、口腔の症状がないため受診しなかった165人(30.8%)、面倒であった114人(21.3%)であった。なお、健診への公費助成を受けている者、妊婦の歯科に関する保健指導を受けたことのある者は有意に妊婦歯科健康診査の受診率が高かった。産婦人科勤務の看護者が妊婦を対象に実施する歯科保健対策の実態についての調査も行った。対象は、日本産科婦人科学会医療改革委員会運営サイト『周産期医療の広場』掲載の九州及び沖縄の分娩取り扱い施設303施設(ハイリスク分娩の取り扱いが多い施設は除く)に調査依頼を行い、協力が得られた46施設の看護者422名であった。口腔に関する保健指導を実施を実施していたものは72人(27.6%)、その実施回数は1回が51人(70.8%)、妊娠前期のみが30人(41.7%)、実施場所は外来が46人(63.8%)でした。保健指導を実施していたものの職種は助産師56人(77.8%)であり、他の職種に比べ有意に多かった。口腔に関する保健指導の実施内容は、妊婦歯科健康診査の必要性65人(90.3%)、妊娠中の歯科治療59人(81.9%)、歯周病・低出生体重児のリスク46人(63.9%)の順で行っていた。口腔の保健指導を実施していない看護者の未実施の理由は自分の口腔に関する知識不足71人(37.6%)が最も多い理由であった。対象は3歳以下の子どもを持つ母親とし、アンケート調査を行った。配布数2805部、有効回答1179部(42.3%)であった。受診率は57.5%であり、受診理由はう蝕症状の自覚のため37. 8%、公費助成29. 4%、健診のため28.9%を受診であった。受診をしなかった理由は、時間がなかった46.3%)、自覚症状がない30.8%、面倒21.3%であった。産婦人科勤務の看護者が妊婦を対象に実施する保健指導についての調査も行った。
言語変化・変異における認知的要因を他要因との関わりの数量社会言語学的研究

本研究では、言語変異にはまず言語内的要因、言語外的要因の他に認知的要因が存在するということから始まっている。この3者の関連を見るためには、どうしても大量の自然談話データがひつようになり、さらにそれが文字化されている必要がある。調査者の既存自然談話データの整理(デジタル化、文字化)はアナログ90分テープにして100本ほどあるので、この自然談話データのデジタル化、文字化法の調査を行った。デジタル化については、文献調査と試行錯誤を繰り返した末、デジタルオーディオテープ(DAT)、コンパクトディスク(CD)そしてミニディスク(MD)をオリジナル録音用、長期保存用、コーディング・文字化用と、それぞれの持つ長所短所に応じて使い分けることが必要という知見が得られた。またそのための能率的手順を開発した(TALKS3に発表)。よって既存資料のデジタル化にはまずアナログテープをDATテープに移してから始めるべきである。同様に文字化についても試行錯誤の末、マイクロソフトエクセル(Microsoft Excel97)を用いた簡便にして漢字仮名交じり文と共にカナバージョンを作成する手順を編み出し、文字化作業の効率化に成功した。認知的要因については、そのヒントになる言語習得に目を向け、10代の言語変異データ(東京語「を」の変異)を分析し、その基礎部分が大人のそれと同様な具合に要因のコントロールを受けていることを示した(TALKS3に発表)。さらに、認知と言うことで関わりやすい終助詞の有無と格助詞変異の関連を分析し、これが表面的なもので、一見終助詞と関わりのあると見えるものが、実はスタイル差の反映に過ぎないことを確立した(KLS19に発表)。初年度の主要目的は、(1)既存データの部分的分析を通して、認知的要因のコーディング法の厳密な同定を行うこと、(2)平行してのフィールドワークによる補助的サンプル収集、の2点であった。まず、(2)のフィールドワークでは、東京城南地区に限定してフィールドワークを夏に行い、これまでのサンプルで手薄であった4050代話者5名の長時間インタビューに成功した。話者は区役所(世田谷、目黒)の文化関係の部署で事情を説明し、適当な話者の紹介をお願いした。それぞれのインタビューでは、DATレコーダによる録音を行い、極めて質の高い録音資料を得ることができた。既存データの部分的分析では、まずデータの収集からデータの基礎をなす録音資料の文字化に至る作業の流れを確立した。試行錯誤の末、DAT録音資料を、まずDATレコーダの上で一分ごとのプログラムに分割し、それからCD-Rと即に同時に焼き付け、CD-Rを保存用、MDを文字化作業用に回すのが最も効率的だと言うことが分かった。現在少なくとも日本語では統一的な文字化洋式というものは存在せず、各自の目的に応じて各様のフォーマットが行われているのが現状と思われる。ここでは、「大まかな文・一発話、さらに文節単位で区切られた漢字仮名交じり、およびカナ」という形で行うこととした。それぞれの文・一発話にはテープ番号、プログラム番号、そのプログラム内での発話通し番号、そして話者のイニシャルからなるIDを付してある。そしてカナと漢字仮名交じりの2バージョンを作成することで、可読性と検索性の二つを満たすことにした。なお、本文では、<L>(笑い)と、割り込みを示す'/'の2つの付属情報のみを付け加えてある。こうした流れを確立した後、今年度フィールドワークで得られた録音テープをほぼ文字化することに成功した。
分子認識における分子シンクロ -合成ペプチド/コンビケムによるアプローチ-

本研究の目的は、精密に分子設計されたホスト化合物のように堅い相互作用ではなく、ターゲット分子に応じてシンクロナイゼーションを行うフレキシブルな合成ペプチドを、コンビケムの手法により開発することである。さらにシンクロナイゼーションを情報変換することにより分子センサとしての機能を持たせる。情報変換部位として、p-ニトロフェノールを色素部位とする脂溶性ペプチド誘導体を7種類合成した。前年度はこれらの化合物を用いて、疎水場での有機アミン類との相互作用について検討した。その結果、脂溶性ペプチドの分子認識能は、そのアミノ酸配列によって大きく影響を受けることが分かった。脂溶性ペプチド17はモノプロトン酸(HL)であり、カチオン(Q^+)を水相から有機相へ抽出する能力があると考えられる。そこで今年度は、17による4級アンモニウムイオンの抽出挙動について検討した。テトラブチルアンモニウムイオンの場合、いずれの脂溶性ペプチドにおいても、水相のpHが高くなるにつれて、有機相に(QL)_oが生成し、431nm付近における吸光度が増大した。中でも脂溶性ペプチド4を用いたときには、その他の脂溶性ペプチドと比べて、pK_<ex>が約2小さくなり、テトラブチルアンモニウムイオンを効率よく有機相へ抽出することが分かった。抽出定数K_<ex>=([QL]_o[H^+]_a)/([HL]_o[Q^+]_a)は、水相のpHに対して、有機相の吸光度変化をプロットし、カーブフィッティングすることによって求めた。脂溶性ペプチド4、7を用いたときのみ、テトラメチルアンモニウムイオン、アセチルコリン、コリンを有機相へ抽出することができた。17の脂溶性パラメーターlogP_<o/w>はほとんど同じであるため、4級アンモニウムイオンとの結合・抽出能力には、Leu-Leu-Leuというアミノ酸配列が重要であることが示唆された。本研究の目的は、精密に分子設計されたホスト化合物のように堅い相互作用ではなく、ターゲツト分子に応じてシンクロナイゼーションを行うフレキシブルな合成ペプチドを、コンビケムの手法により開発することである。これらの化合物を用いて、疎水場での有機アミン類との相互作用を調べた。アミンは様々な長さのアルキルモノアミン、ジアミンを用い、さらに生体内ポリアミンであるスペルミン、スペルミジンについても検討した。アミンとの結合はコントロール化合物が最も弱かったが、Leu残基の数が増加するにつれて結合定数は大きくなった。特にLeu-Leu-Leu誘導体はスペルミン、スペルミジンに対しては、10^4M^<-1>オーダーの強い結合を示した。また、Leuのかわりに導入したβAlaの位置が色素部位に近いほど、アミンとの結合は弱くなった。これらの結果から、アミン結合能はN末端のLeu残基のみが関与しているのではなく、Leu-Leu-Leuという配列が重要であることが示唆される。Leuが一つだけβAlaに置き換わることにより、アミンとの親和性が大きく異なるという興味深い現象が見られた。このペプチド誘導体は、アミン以外にも多様な分子をターゲット分子とすることができ、極めて自由度が高い。今後ペプチドライブラリーをもっと増やせば、非常に高い選択性を持つペプチドを見つけだすことが可能であると思われる。
MPO-ANCA関連血管炎自然発症マウスの疾患感受性遺伝子の同定

多発性血管炎・半月体形成性腎炎及びMPO-ANCA産生に関連する遺伝的因子を同定するため、疾患モデルマウスSCG/Kjと正常マウスB6を用い、F2マウスを作成してQTL解析を行った。結果として、マウスの常染色体上に合計14個のE∂5以外の疾患感受性遺伝子座を同定した。糸球体腎炎関連遺伝子座は第1、10、13、16、17染色体上に、血管炎関連遺伝子座は第1、17染色体上に、MPO-ANCA産生感受性遺伝子座は第1、10染色体上にマップされた。SCG/Kj由来のQTLをScg-1Scg-5、B6由来のQTLをSxb-1Sxb-4と命名した。また、第1及び第10染色体上に存在し、MPO-ANCA高産生に関連するQTLをそれぞれMan-1及びMan-2と命名した。これらの結果はJ Immunolに掲載された。一方、血管炎,腎炎の免疫学的発症機構を明らかにするため、H17-18年を通してF2マウスの全個体において、4週ごとに末梢血を採取し、顆粒球、単球、T細胞、B細胞、樹状細胞の増多と自己免疫形質(自己抗体・MPO-ANCA・腎炎・半月体・腎血管炎・脾腫・生存週齢)との関連を解析した。その結果、顆粒球(r=0.211-0.606、p<0.0001)、単球(r=0.145-0.536、p<0.0001)、CD4-CD8-T細胞(r=0.134-0.629、p<0.0001)、樹状細胞(r=0.237-0.586、p<0.0001)が上記の形質全てと有意に相関することが判明した。特に樹状細胞については、classical dendritic cellの増多と自己免疫形質とがよく相関したため、末梢血中の樹状細胞細胞数を量的形質としてゲノム走査を行ったところ、34個のQTLを見いだした。興味深いことに、上記の細胞群増多症は、一部共通であるものの、これまでに同定した508-1508-5、Sxb-1Sxb-4等の自己免疫形質感受性遺伝子とは別個の遺伝子群により支配されており、多段階を経て最終的に形成される自己免疫形質に関連する修飾遺伝子としてそれらが機能している可能性が示唆された。ところで、これまでに同定したMPO-ANCA産生感受性遺伝子Man-1の本態に関して、染色体マーカーによる高解像度マッピングが進行中である。これまでに利用してきたD1MIT117、D1MIT191、D1MIT102に加え、この3者が規定する約14cMの区域に、今回新たに7マーカーを追加することにより12cM単位のマッピングが可能となった。これらの結果により位置的候補遺伝子の絞り込みが進行している。興味深いことに、上記の細胞群増多症は、一部共通であるものの、これまでに同定した508-1508-5、Sxb-1Sxb-4等の自己免疫形質感受性

遺伝子とは別個の遺伝子群により支配されており、多段階を経て最終的に形成される自己免疫形質に関連する修飾遺伝子としてそれらが機能している可能性が示唆された。ところで、これまでに同定したMPO-ANCA産生感受性遺伝子Man-1の本態に関して、染色体マーカーによる高解像度マッピングが進行中である。これまでに利用してきたD1MIT117、D1MIT191、D1MIT102に加え、この3者が規定する約14cMの区域に、今回新たに7マーカーを追加することにより12cM単位のマッピングが可能となった。これらの結果により位置的候補遺伝子の絞り込みが進行している。多発性血管炎・半月体形成性腎炎及びMPO-ANCA産生に関連する遺伝的因子を同定するため、疾患モデルマウスSCG/Kjと正常マウスB6を用い、F2マウスを作成してQTL解析を行った。結果として、マウスの常染色体上に合計14個のFas以外の疾患感受性遺伝子座を同定した。糸球体腎炎関連遺伝子座は第1、10、13、16、17染色体上に、血管炎関連遺伝子座は第1、17染色体上に、免疫グロブリン高産生関連遺伝子座は第1、2、4、6、7、11、13、17染色体上に、抗核抗体産生関連遺伝子座は第1、8、10、12染色体上に、MPO-ANCA産生感受性遺伝子座は第1、10染色体上にマップされた。これらの中で、permutation testにより統計学的有意でSCG/Kj由来のQTLをScg-1Scg-5、B6由来のQTLをSxb-1Sxb-4と命名した。また、第1及び第10染色体上に存在し、MPO-ANCA高産生に関連するQTLをそれぞれMan-1及びMan-2と命名した。この中で、Scg-1とScg-2は共に第1染色体上に存在し、糸球体腎炎・血管炎の発症や自己抗体の産生を含む様々な自己免疫現象に影響するが、これらは別個の遺伝子座であり、MPO-ANCA産生はScg-2のセントロメア側の一部分(Man-1)に強く促進されることが判明した。Man-1はFas以外にSCG/Kjゲノム内に同定された唯一の遺伝子座であるが、我々のこれまでの解析によりSCG/KjマウスにおいてMPO-ANCA産生がその後の糸球体腎炎発症の誘因となることが判明しており、今後Man-1の本態の解析がマウスやヒトの血管炎・糸球体腎炎の疾患感受性遺伝子の同定に情報をもたらすことが期待される。これらの結果はJ Immunolに発表した(in press)。そのため当該部分の詳細な遺伝子マップ作成を精力的に行っている。これらの結果はJ Immunolに掲載された。一方、血管炎・腎炎の免疫学的発症機構を明らかにするため、H17・18年を通してF2マウスの全個体において、4週ごとに末梢血を採取し、顆粒球、単球、T細胞、B細胞、樹状細胞の増多と自己免疫形質(血清IgG・IgM・抗ssDNA抗体・抗dsDNA抗体・抗クロマチン抗体・MPO-ANCA・腎炎・半月体・腎血管炎・脾腫・生存週齢)との関連を解析した。
哺乳類細胞の細胞の細胞複製調節に関与する遺伝子群の遺伝学的解析

1.細胞複製調節に関与する遺伝子が突然変異した変異細胞株の新たな相補群の分離に関する研究については、ラット3Y1細胞株よりGO期停止能力の優れた株を新たにクローニングして用いた。高温ではGO期からの増殖誘導のかからない温度感受性変異株を新たに12株得ることが出来た。現在、相補群についての検定を行っている。2.GO期からの増殖誘導機能に温度感受性変異性を持つ細胞株の解析に関する計画については、既に得られていたtsJT16株について行った。本細胞株の変異機能の働く時間は、増殖誘導後の初期(2-3時間)であった。c-fos、c-myc、ODCなどの遺伝子の発現誘導は正常であった。タンパク質の二字元電気泳動分析によって、ひとつのタンパク質スポット(p70)の合成誘導が温度感受性であることが判明した。p70の合成は増殖誘導直後から始まり、6時間くらい継続するが、S期進入前には消失した。p70の合成誘導は、プライマリーな転写上昇によるものであることが各種阻害剤を用いた実験から推定された。p70は核タンパク質で、半減期は比較的短かかった。これらの結果は、p70が遺伝子を二次的に活性化するエンハンサー結合タンパク質のグループに属するものであること、本細胞が高温で増殖誘導されないのはp70を合成誘導出来ないためであること、を示唆する。p70は非イオン性界面活性剤で核から容易に抽出され、これをイオン交換、ゲル濾過などのカラムで分画した後、本申請備品である高速液体クロマト装置によって更に精製を進めている。尚、本細胞の温度感受性変異遺伝子産物はp70の合成誘導に至る過程のシグナルトランスダクションに関与すると思われ、この様な変異株は哺乳類細胞では従来得られていないユニークなものである。3.変異遺伝子クローニングに関する計画は、現在も尚進行中であり、クローニングには至っていない。
細胞内構造分析用マイクロ光TAS構成法の研究

本研究は、先行する助成成果を引き継ぎ、透明樹脂をベースにマイクロ流路・導波路を一体構成してチップとし、細胞や微粒子にレーザ励起光を精密に照射することで、蛍光の指向性を得て、それらに内在する蛍光物質の分布を推定しようとするものである。ここでは3段階の開発ステップを想定した。まず、細胞サイズの流路や導波路において、極微弱な蛍光を高S/Nで観察すること、次に導波路を切り替えて照射し、蛍光を得ること、最後に励起光の照射角度を切り替えて蛍光を採取し、蛍光発光の指向性を得ることである。3段階の目標はほぼクリアでき、均一に蛍光体が分布した5μm径の樹脂粒子について、発生蛍光の指向性を得ることに成功した。本研究の狙いは、十数mm角のチップ上に形成した細胞サイズの断面寸法を有する流路に検体を流し、種々の物理刺激を与えたりあるいは化学反応を発現させることで、細胞の生理情報を採取するシステム(総合分析システム:TAS)構築に資する基盤技術を開発することにある。本研究の特長は、分析光の伝搬通路となる導波路を、流路周辺と同一材料によって一体構成とすることにより、光学測定を旨とする大型分析器であるフローサイトメータと同等の機能を、チップ上に凝縮して実現しようとすることにある。本助成の一期前の研究課題においては、L字流路と光導波路とを組み合わせ、細胞への光照射による前方および側方への散乱変調光を、チップ「面内」に限定して検出する技術を確立した。本助成期間の初年度においては、これまでに設計・試作した高アスペクト比の導波路コア(高さが幅の約1.5倍)を有するTASチップを用い、フローサイトメータではすでに一般的である蛍光物質を付着した微粒子の極微な前方および側方発生蛍光を、チップ面内に限定して光ファイバで収集するとともに、小型の光電子増倍管モジュールによって高感度に検出した。さらに本期の最終目的である細胞への蛍光励起光を、その全周囲にわたって照射角走査を行うことで指向特性を得る第一歩として、小型の積層型ピエゾアクチュエータをベースに、細径化した光ファイバを強制加振する光スキャナを設計・試作した。ここでは励起用光をチップに導入する光ファイバを加振することで、1020μmおきにチップ上に並列配置した導波路に短時間レーザ光を導入し、微粒子からパルス照射に伴う蛍光応答を採取する。現在、通常の側方散乱励起光の応答を確認しつつあり、近々には蛍光微粒子を用いた蛍光応答の検証と評価に進む。本研究の狙いは、十数mm角のチップ上に形成した細胞サイズの断面寸法を有する流路に検体を流し、種々の物理刺激を与えたり、化学反応を発現させることで、細胞の生理情報を採取する総合分析システム(TAS)構築に資する基盤技術を開発することにある。本研究の特長は、物理刺激として可視光を用い、光の伝搬通路となる導波路を、流路周辺と同一材料によって一体構成とすることにより、光学測定を旨とする大型分析器であるフローサイトメータと同等以上の機能を、チップ上に凝縮して実現することにある。助成期間の初年度においては、これまでに設計・試作した高アスペクト比の導波路コア(高さが幅の約1.5倍)を有するTASチップを用い、フローサイトメータではすでに一般的である蛍光物質を付着した微粒子からの極微な前方および側方発生蛍光を、チップ面内に限定して小型の光電子増倍管モジュールによって高/S/Nで光電変換した。本年度は、最終目的である細胞周囲にわたって励起光の角度走査を行うことで、発生蛍光の指向特性を得て細胞の内部構造を推定するための第一歩として、小型の積層型ピエゾアクチュエータと光ファイバに基づく光スキャナを用いて、樹脂微粒子(疑似細胞)をシーケンシャルに照射励する検討を、並列配置の導波路(間隔1020μm)を対象に行った。スキャナ駆動周波数が1.7kHz、微粒子の導波路交叉部通過速度が、30mm/s700mm/sの広範な速度域で、光照射動作に同期した蛍光応答を確認でき、角度走査実現に自信を得た。同時に、励起光の角度走査が可能な、流路との交叉部から導波路が放射状に広がる新たなTASチップを設計し、試作した。放射状導波路の幅が設計よりも小さめ(5μm→4.84.6μm)なため、光通過率が低く、またチップの歩留まり不良等の難題もあるが、既存の光スキャナを用い±45の範囲で角度走査が可能なことを確認した。平成27年度の進捗状況は、おおむね順調としたが、個別課題ごとには以下のように考える。前年報告においては、パーティクルリフタによる疑似細胞(微粒子)の交叉点近傍の斜め横断案は、加工誤差や加圧力変化による流れの調整、微粒子の流線に乗った正確な運動実現の可否、超扁平導波路の放射状構成など、多重な難度を抱える反面、個々の要因が敏感に全体に影響するので着実な成果を得るのが難しいと判断した。補助案として、検体の流れは従来通り水平流れとし、縦長の高アスペクト断面のコアを放射状に配することで、検体を「疑似縦切り」にしながら照射角走査を行い、発生蛍光の指向特性を得る手法に切り替えて進めることとした。小径化

光ファイバを圧電素子で加振し導波路に順次光源光を配分する「光スキャナ」は、前年度までにハードを完成させていたが、導波路を切り替えての蛍光採取は経験がなく、切り替えと微粒子通過のタイミング調整についても、実際の難度は不明であった。このため、放射状コアパターンを有するチップ試作に先行して、既存の複数の平行導波路を有するチップを用い、導波路を切り替えつつ流動速度タイミングに同期した粒子を、複数の交叉点を通過するごとに励起して蛍光を採取する予備検討を行った。これには粒子速度制御は導入せず、検体分散粒子の数密度を低めに設定しつつ、時間をかけて結果的に同期のとれた粒子の応答を選択抽出した。この結果、30mm/s700mm/sと1.5桁程度の速度域で、蛍光の同期応答を観察でき、角度走査方式への自信となった。これに基づき、放射状導波路コアパターンを形成したチップを試作し、コアを順次切り替えることで、±45°の範囲で角度走査が可能なことを確認した。なお、試作したコアのアスペクト比は、約2.3(幅4.8μm、高さ約11μm)である。本研究では、10mm角程度のチップ上に形成した血球程度の断面寸法をもつ流路に血液を流し、様々な角度から細胞に励起光を照射して蛍光を採取することで、細胞内の生理学情報を採取する総合分析システム(TAS)実現のための基盤技術を開発する。この技術的特長は、励起光の通路となる導波路を、周辺と同一材料で一体自在成形することにより、光測定を旨とする大型分析機であるフローサイトメータを凌ぐ機能を、ワンチップに実現することにある。当初の2年間では、蛍光の指向性を得て細胞の内部構造を推定するための予備段階として、極微弱蛍光を、チップ内形成の導波路およびこれに外部接続された光ファイバと蛍光分離光学系、およびセンサモジュールを用いて、所定のS/N比で観察できることを実証した。さらに、光源光伝搬用光ファイバを加振することで入射導波路を切り替え、細胞に対する励起光を異なる導波パスから順次照射できる手法も確立した。同時に、最終の照射角度走査達成に向けて、流路と導波路の交叉部において、ここを中心に導波路が放射状に配置されたチップを試作し、光透過性等の基礎特性を確認した。最終年度はこれら予備結果を踏まえ、実績のある高効率蛍光体を包含した直径5μmの蛍光微粒子を用い、光ファイバを1.7kHzで加振(光スイッチング)することで、微粒子が交叉部を約250mm/sの速度で通過する際の蛍光の指向性を、180度の走査範囲で得ることに初めて成功した。試作試料は、コア形状が幅4.8μm、高さ11μmと狭小の上に、困難加工の高アスペクト形状のため、透過率が格段に低く、導波路間の透過率のばらつきも大きいが、事前に評価した透過率によってばらつきを補正しており、a)採取信号のS/N比の向上、b)蛍光体の不均一分布性と指向性との対照等、次期課題に繋がる大きな足掛かりを得た。本研究は、先行する助成成果を引き継ぎ、透明樹脂をベースにマイクロ流路・導波路を一体構成してチップとし、細胞や微粒子にレーザ励起光を精密に照射することで、蛍光の指向性を得て、それらに内在する蛍光物質の分布を推定しようとするものである。ここでは3段階の開発ステップを想定した。まず、細胞サイズの流路や導波路において、極微弱な蛍光を高S/Nで観察すること、次に導波路を切り替えて照射し、蛍光を得ること、最後に励起光の照射角度を切り替えて蛍光を採取し、蛍光発光の指向性を得ることである。3段階の目標はほぼクリアでき、均一に蛍光体が分布した5μm径の樹脂粒子について、発生蛍光の指向性を得ることに成功した。平成26年度の進捗は、おおむね順調としたが、個別課題ごとには以下のように考える。予想以上に進展したのは、微粒子からの蛍光計測である。
中世の流通経済と渡来銭受容の影響

本研究では、「渡来銭の流通が社会にどのような影響を与えたのか」を明らかにする。中世手形文書は、11世紀に切符系文書として登場し、12世紀末の渡来銭流入開始を経て、13世紀に替銭が登場し、渡来銭が一般化する14世紀初頭に割符が登場する。それぞれの時期ごとの中世手形文書の信用の源泉を比較すると、切符系文書が財政的制度に、預かり手形系文書が荘園領主の家政機関に支えられていたが、渡来銭受容が一般化した後の割符では、商人たちの商業的利益がその信用を支えるようになってきた。渡来銭の受容は日本社会における商業流通を活発化させたのである。本研究は、中世日本貨幣経済の特徴である渡来銭の流通の開始が貨幣経済・流通経済に与えた影響を明らかにし、14世紀前後の流通経済の成長を促進したことを解明することを目的とする。そのために、価値所蔵手段としての受容の先行や、「米の売買のための貨幣」としての受容といった渡来銭受容のありようを示す史料を集め、それを中世の現実に沿った形であらたに解釈・検討し、渡来銭受容が中世日本の社会にもたらした変化と影響を明らかにすることをめざすものである。本年度はまず、渡来銭の受容がすすんだ13世紀、渡来銭受容自体と並行して、広く社会で小資本の蓄積があったことを史料から具体的に明らかにして、両者の関連性を指摘した。次に、14世紀の手形文書の信用が、手形の支払人の実績と手形の販売者の財力などにささえられていたことを明らかにし、商人たちの商業活動を通じて蓄積された財力にもとづく信用の存在を指摘した。最後に、14世紀の手形文書の信用が商人たちの蓄積された財力に支えられていたことと、11世紀の手形文書の信用が当時の国家的な財政機構に支えられていたことととを比較し、14世紀以降のいわゆる日本中世における商業の発展の前提としての、社会における流通小資本の蓄積が1214世紀に行われたことを指摘した。この時期は渡来銭流通の受容拡大期と重なる。渡来銭はそれ以前に流通していた米などの商品貨幣に比して、価値貯蔵手段機能の点で優れる。とすると、渡来銭流通と流通資本の蓄積との間には明確な関係性があることが明らかとなる以上が今年度の研究実績である。本研究は、中世日本貨幣経済の特徴である渡来銭の流通の開始が貨幣経済・流通経済に与えた影響を明らかにし、13世紀前後の流通経済の成長を促進したことを解明することを目的とする。そのために、価値貯蔵手段としての受容の先行や、「米の売買のための貨幣」としての受容といった渡来銭受容のありようを示す史料を集め、それを中世の現実に沿った形であらたに解釈・検討し、渡来銭受容が中世日本の社会にもたらした変化と影響を明らかにすることをめざすものである。研究二年度の今年は、手形文書のひとつである割符の信用に注目し、割符の信用が、直接には割符の発行者の財力と実績にささえられていたことを明らかにしつつ、割符の流通・利用の実態上それだけでは説明できないことを指摘して、割符の信用が割符の発行者の信用のみならず、割符取引という商業慣行自体の信用との二重構造からなることを明らかにした。以上の内容については、平成27年9月の古文書学会大会にて学会報告を行った。この学会報告に、昨年明らかにした、13世紀における渡来銭受容と並行する形で社会で進行していた小資本の蓄積についての議論を組み合わせて論文投稿を準備している。商業慣行に対する信用の存在は、すなわち商業者に対する信用が社会に存在していたことを示すものである。同様の信用をそれ以前の手形と比較した場合、その源泉が国家財政にあることは既に先行研究で指摘されている。すなわち14世紀においては、国家財政なみというと大げさだが、質的には同等の信用を得るまでに、商業者たちが成長していたことがうかがえるのである。この信用の成長というマクロ的な成長の証拠と、小資本の出現というミクロ的な成長の証拠をならべて論ずることで、渡来銭受容が中世の流通経済にもたらした経済成長の様子を明らかとした。以上が本年度の研究実績である。初年度は12世紀以降の流通小資本の出現と渡来銭受容について研究した。まず史料面での成果から述べる。14世紀の中世手形文書の信用が、支払人の商業収入とそれによって蓄積された財産であることを実証しうる史料と、13世紀における小資本の出現を示す史料をそろえた。さらに13世紀において、荘園の代官など徴税機構に寄生する人物が、土倉・借上といった金融業を営んでいる様子がわかる史料を発見した。

これにより、国家的・荘園制的徴税機構のなかから流通資本が発展してきた、といままで理論のみで説明されてきた流通資本発展の要因を、実証的に説明し、かつその時期を詳細に分析することが可能となった。次に作業状況を述べる。論文の執筆作業に入っている。勉強会での報告などで問題点の洗い出しを行い、骨子部分は完成している。文章化と先行研究への位置付けなどについての作業中である。今後早い段階で査読つき雑誌への投稿を行い、採用・掲載を目指す。なお、この間、二年目の渡来銭受容に伴う米市場の活性化につながる作業として、史料の検索も行った。15世紀の近江の荘園代官が京都や地元の市場の米相場を比較している史料を発見しており、議論を進めるにあたって重要な起点となりうる。以上、年度中に論文投稿に至らなかった点は不満だが、論文化のめどは立っており、二年目の分の史料検索が進んでいることをみても、本研究はおおむね順調に進展している、と評価できる。27年度が最終年度であるため、記入しない。日本史(初年度分について)初年度に作成する予定だった、価値貯蔵機能にすぐれた渡来銭の受容とそれによる流通小資本の蓄積という社会への影響にかかわる論文は現状骨子ができており、そのまま作成作業をつづける。9月に古文書学会(岡山)での発表を予定しておりその場で成果を発表する。順調にいけばそのまま論文化される予定である。(二年目分について)二年目に予定されていた渡来銭受容による米市場の活性化の論文については、有力とはいえ、対象の時期である14世紀より新しい15世紀の史料しか見つかっていない状況である。だがこのことは本研究の応募時にも書いたように、当初から予想していたことでもある。解決策は以下の通りである。断片的な史料ではあるが、14世紀ころの米市場活性化の状況証拠は存在するので、15世紀の状況を14世紀にさかのぼって適用する形で論じることとなる。とはいえ、より確実な史料を探索する必要があることはいうまでもない。よって今後の方策は以下の通りとする。910月ころまでは東京大学史料編纂所などで、史料の検索と収集を行う。そこまでの史料収集作業の結果によらず、11月からは論文化の作業に入る。論文化・雑誌投稿の時期は1月末をめざす。多少難航したとしても、年度内の完成・投稿は十分可能なスケジュールである。論文二本を並行して作業することになるが、スケジュールには余裕があり、期間内に完了し、成果を挙げることは十分に可能である。
高レイノルズ数乱流に対する局在解動力学に基づく力学系的描像の無限自由度系への拡張

この研究課題は空間的に非一様な乱流状態の強非線形なダイナミクスを力学系の枠組みから捉え直す事に挑戦するものである。そのために空間的に広がった乱流状態を局所的な構成要素の結合系とみなし、個々の構成要素(局所秩序構造)のダイナミクスを力学系に理解する事をもって全体の乱流を理解しようと試みる。この構成要素として、前年度に機能的と言える従来とは異なる種類の秩序構造が存在することを示した。Ejection-Jet cycleと名付けられたこの構造は層流状態の乱流状態の界面に相当する部分に存在し、層流状態を乱流状態に変換する役割を担っている。従来の秩序構造が自身の自己維持的な性質に注目していた事に対し、この例では自身を維持しつつ周囲の状態に影響を及ぼしている事がわかる。このような機能的な秩序構造は従来の方法では十分に把握できず、新たにフィルターシミューレションなる方法を開発し、系の解析を行った。本年度は上述した機能的秩序構造をどのように理解するべきかについて研究した。機能構造の発見は、空間局在解による乱流の理解という力学系的アプローチに対して新たな視点を与えるものであり、特に高レイノルズ数の強く乱れた乱流へこのアプローチを延長する上で避けて通れないものである。比較的低いレイノルズ数の流れにおいては局在構造の運動は実効的に低次元で実現できる状態もほぼ確定しており、反応拡散系と実効的に同等の扱いが可能となると期待されるが、高レイノルズ数の流れでは個々の局所状態が機能的な役割を果たすようになる。従来渦のダイナミクスとして定性的に議論されてきた内容を、このような機能的な秩序構造として理解することで定量的な評価に至る可能性がある。これは乱流の統計的性質を理解するだけでは不十分だった流体の制御・予測の分野において重要な進歩となるはずである。27年度が最終年度であるため、記入しない。従来、乱流における空間的な非一様性、あるいは間欠性は、乱流を構成する空間的に局在した自律的な構造(秩序構造)とその相互作用として理解されると考えられてきた。均質な構成要素間の相互作用により不均一な状態が出現するというこの予想は、しかしながら、代表的な非一様系である層流乱流境界で成り立たない事がこの研究により示された。さらに"機能的"な空間局在構造と呼ぶべきクラスの構造がある事を見出し、これにより2次元チャンネル流における層流乱流境界のダイナミクスが説明できる事を示した。これは一つの異質な構成要素によって、層流と乱流の混在という全体の非一様性が理解されている例となっている。機能的な秩序構造(機能構造)のアイデアは層流乱流境界のみでなく、より広い非一様系に対して成り立つと予想される。自立性に注目していた従来の秩序構造と異なり、機能構造においては乱流の生成やエネルギーや運動量の輸送過程を"機能"として取り込む事ができるため、表現の幅が格段に広がる。機能構造はその機能性のために他の秩序構造と独立に厳密解として抜き出す事は秩序構造の場合より困難であるが、この研究では本来秩序構造を切り出すための方法であったフィルター法を改良する事でこの困難を克服した。このアイデア及びここで開発された手法は異なるスケール間の協調現象、あるいは空間的な自己相似性を理解する上で必須の性質と言える。この内容をまとめた論文を執筆し、現在査読中である。また2014年5月と2015年1月に開催された国際学会において、それぞれ口頭とポスターで発表された。これは乱流の統計的

性質を理解するだけでは不十分だった流体の制御・予測の分野において重要な進歩となるはずである。初年度において、機能構造の概念の導入とそれを捉えるための数値的な処方箋を確立した。これは申請時には想定していなかった成果ではあるが、最終的な目標である空間的に局在した構造のダイナミクスを表現するために必須であるといえる。空間的に局在した現象をその自律性によって理解しようとしていた申請時の研究計画に比べ、機能性を取り入れる事に成功した事でこの研究の学術的な重要性は増大したと確信している。この点において当初の計画よりも進行していると言えるが、機能性を明かにするために最終的な目的である3次元の流れではなく2次元の流れを使用したため、3次元の流れへの適用が計画より遅れている。もっとも、3次元の場合に想定されるであろう困難の一部は機能性の導入により解決できると思われるので、結果的には適切な研究の順序であった可能性が高い。これらの点を加味すれば、現在までの研究は順調であると言える。27年度が最終年度であるため、記入しない。来年度は機能構造と相補的な概念に相当すると期待される、比較的緩い空間変動に着目する。上述した系において、機能構造の生み出す乱流状態は一様でなく、機能構造から離れるにつれ弱くなっている。この減衰過程を動力学的な視点から理解する事を試みる。これはエネルギーの空間的な輸送を力学系的アプローチに取り込むという点で非常に重要である。この試みの一部は既に実行され、2015年1月の国際学会において発表されている。この成果は来年度中に二度の国際学会(5月、8月)で発表される予定であり、現在論文を執筆中である。
神経活動の光学的イメージング法による蜂脳における嗅/視覚領域の機能マッピング

はたらき蜂の求餌行動において、中枢神経系では嗅覚系と視覚系からの情報が統合処理されていることが知られている。本研究は膜電位感受性色素を用いた「ニュ-ロン活動の光学的多領域同時計測法」をはたらき蜂の中枢神経系に適用し、嗅覚情報と視覚情報が、どのような機構で統合処理されているのかを時空間的にダイナミックに解析し、はたらき蜂脳の機能マッピングを行うことを目的に企画された。今年度は以下のような成果が得られた。1)脳摘出標本とsemi-in-vivo標本の作成:まずはじめに、吸光測定用の標本の作成を行った。脳摘出標本では、はたらき蜂(Apis Mellifera)を冷却麻酔し頭部を離断、実体顕微鏡下で頭部を覆う諸組織を丁寧に剥離除去し、antennal nerveをつけたまま脳全体を摘出した。semi-in-vivo標本では、はたらき蜂(Apis Mellifera)を冷却麻酔後、waxで体を金属製の小さなチューブに固定し、ウレタンで麻酔して、antenna基部から頭部を覆う諸組織を剥離除去し、最後にantennaをつけたまま頭部を離断した。作成した標本は、光透過性で、吸光測定に応用可能であった。2)膜電位感受性色素による染色法の検討:膜電位感受性色素による染色法として、oxonol系吸光色素NK3630 (RH482)を用い、染色法、染色時間、色素の濃度について検討した。染色法として脳摘出標本の場合、まずsemi-in-vivo標本を作成し体をつけた状態で染色した後に脳を摘出する方が標本の活性を保持でき、染色法として優れていることが分かった。また、染色条件を検討したところ、色素の濃度0.5mg/ml、染色時間30分で十分に染色できた。3)蜂脳からの光学シグナルの検出:上記の方法により染色した蜂脳で、antennal nerveの電気刺激により、antennal lobeから活動電位およびシナプス後電位に対応する光学シグナルを検出することに成功した。本研究は、膜電位感受性色素を用いた「ニューロン活動の光学的多領域同時計測法」をはたらき蜂の中枢神経系に適用し、嗅覚情報と視覚情報が、どのような機構で統合処理されているのかを時空間的にダイナミックに解析し、はたらき蜂脳の機能マッピングを行うことを目的に企画された。1)脳摘出標本およびsemi-in-vivo標本系の確立:まずはじめに、吸光測定用の標本の作成を行った。作成した標本は、光透過性で、吸光測定に応用できると考えられた。2)膜電位感受性色素による染色法の確立:膜電位感受性色素による染色法を確立するため、oxonol系吸光色素NK3630(RH482)を用い、染色法、染色時間、色素の濃度について検討した。染色法として脳摘出標本の場合、脳摘出後に染色するか、あるいは、まずsemi-in-vivo標本を作成し体をつけた状態で染色した後に脳を摘出するかを検討したところ、後者の方が標本の活性を保持でき、染色法として優れていることが分かった。次に染色条件を検討したところ、色素の濃度0.5mg/ml、染色時間30分で十分に染色できることがわかった。3)膜電位感受性色素のスクリーニング:膜電位感受性色素として、oxonol系吸光色素NK3630(RH482)とmerocyanine-rhodanine系吸光色素NK2761について上記の染色条件で検討した。両色素とも、蜂脳を十分に染色することができ、antennal nerveの電気刺激により、antennal lobeおよびmushroom bodyから光学シグナルを検出することができたが、それぞれ問題点があった。NK3630(RH482)の場合、色素の色が濃いために脳が濃く染まってしまい、十分なS/Nを得るためには加算平均する必要があった。この点では、NK2761の方が優れていたが、この色素ではEPSPを記録することができなかった。これについては色素の毒性によるものなのか、標本自体の問題なのかまだ解明できておらず、さらなる検討が必要である。

脳摘出標本では、はたらき蜂(Apis Mellifera)を冷却麻酔し頭部を離断、実体顕微鏡下で頭部を覆う諸組織を丁寧に剥離除去し、antennal nerveをつけたまま脳全体を摘出した。semi-in-vivo標本では、はたらき蜂(Apis Mellifera)を冷却麻酔後、waxで体を金属製の小さなチューブに固定し、ウレタンで麻酔して、antenna基部から頭部を覆う諸組織を剥離除去し、最後にantennaをつけたまま頭部を離断した。作成した標本は、光透過性で、吸光測定に応用可能であった。2)膜電位感受性色素による染色法の検討:膜電位感受性色素による染色法として、oxonol系吸光色素NK3630 (RH482)を用い、染色法、染色時間、色素の濃度について検討した。染色法として脳摘出標本の場合、まずsemi-in-vivo標本を作成し体をつけた状態で染色した後に脳を摘出する方が標本の活性を保持でき、染色法として優れていることが分かった。また、染色条件を検討したところ、色素の濃度0.5mg/ml、染色時間30分で十分に染色できた。3)蜂脳からの光学シグナルの検出:上記の方法により染色した蜂脳で、antennal nerveの電気刺激により、antennal lobeから活動電位およびシナプス後電位に対応する光学シグナルを検出することに成功した。
無腸動物ワミノアの共生藻「家畜化」開始プロセス観察技術の開発

サンゴの体表で生活する無腸動物ワミノアにはSymbiodiniumとAmphidiniumの微細藻類が共生しており、これらは卵母細胞に取り込まれて垂直伝搬する。卵巣成熟の進行に伴う共生藻獲得過程の観察手法を確立するためにワミノアをサンゴから分離して単独飼育する方法を模索した。ワミノアは冬期の海水温23°Cで飼育すると卵巣が発達する。卵巣の発達は卵巣の形成部位によって、I期、II期、III期の3つのステージに分けられる。II期の卵巣(初期卵黄形成域)内の卵母細胞には共生藻は含まれていない。III期の卵巣に形成される後期卵黄形成域で,共生藻は卵母細胞に取り込まれる。市販されている稚魚用の試料(冷凍ワムシ、アルテミア脱殻卵、アルテミア幼生)を与え、II期のワミノアが餌を取り込む様子を観察した。その結果、ワミノアはアルテミア卵を比較的良く取り込んだが、一旦体内に取り込んでもペレットとして吐き出した。ワムシの取り込みはアルテミア卵に次いで多かったが,こちらも吐き出されることが多かった。アルテミア幼生はアルテミア卵やワムシほどには取り込まれなかったが、一旦取り込まれると吐き出されることなく消化吸収された。このことから、餌として与えるにはアルテミア幼生が適していることが明らかになった。後期卵黄形成期の卵巣を持った個体を選び出し,Ca^<2+>/Mg^<2+>除去海水中で組織を解離し、組織細片を濾過飼育海水に戻してから、蛍光顕微鏡によりG励起で観察すると、共生藻を保持する細胞を生きたまま観察できることが明らかになった。また、酢酸グリセリン海水中でワミノア体組織をピペッティングにより細片化すると、卵巣の形態を保ったまま単離できることを見いだした。この手法を用いてII期の卵巣内の卵母細胞を観察した結果、卵巣の中で細長く円筒状に伸長した状態で卵の形態が保持されていることが明らかになった。以上の成果は、ワミノアの共生藻「家畜化」開始プロセスを研究する基盤となるものである。
メモリーB細胞の最終分化を促進する分子メカニズムの解析

メモリーB細胞の研究は,ハプテン抗原の投与により誘導した脾臓メモリーB細胞を主な解析対象としてきたが,病原体感染後に誘導されるメモリーB細胞は,これと質的に異なる可能性が示唆されている。ES4004分子がメモリーB細胞機能に果たす役割を評価するため,インフルエンザウイルスに対するメモリーB細胞応答をモニターするシステムを開発した。インフルエンザウイルスの主要な表面抗原であるヘマグルチニン組換えタンパクをプローブとして,ヘマグルチニン特異的B細胞数を定量したところ,ウイルス感染後の肺においてヘマグルチニン特異的IgA陽性B細胞が出現することが明らかとなった。この細胞群には,抗体産生細胞,胚中心B細胞,メモリーB細胞が含まれ,感染後長期間にわたり持続することが判明した。さらに,肺メモリーB細胞様の細胞をscidマウスへ移入すると二次抗体産生応答が再構築されることから,二次抗原刺激に対して迅速な抗体産生分化能を有することが確認された。この肺IgA陽性メモリーB細胞の感染防御能を調べるため,細胞移入したscidマウスを致死量のインフルエンザウイルスで経鼻感染させたところ,マウス生存率の改善が認められたことから,このメモリーB細胞にはインフルエンザ再感染を防御する機能のあることが明らかとなった。現在,ES4004欠損マウスにインフルエンザウイルスを経鼻感染させ,産生されるIgA陽性メモリーB細胞数,抗体産生細胞数を経時的に調べるとともに,scidマウスへの細胞移入システムを用いることによって,メモリーB細胞の最終分化能やウイルス感染に対する感染防御能に変化が生じるか否か検討中である。ES4004分子を過剰発現したB細胞では、抗原刺激後のERKのリン酸化が亢進し、IgG1抗体産生が有意に増加することをこれまで明らかにした。この原因メカニズムを探るため、ES4004分子過剰発現B細胞の増殖活性、アポトーシス抵抗性、クラススイッチ誘導能を調べたところ、対照B細胞と有意な差は認められなかった。これに対し、抗体産生細胞の指標となるCD138陽性細胞の頻度は有意に増加していたため、ES4004分子の過剰発現は、抗原刺激に対する抗体産生細胞への分化を促進し、これがIgG1産生量の増加に繋がると推察された。さらに、ES4004分子を過剰発現したB細胞の発現遺伝子を調べたところ、抗体産生分化を調節するいくつかの分子の発現量が増加しており、ES4004分子の発現量により抗体産生細胞への分化誘導シグナルが制御されている可能性が示唆された。生体内におけるES4004分子の機能的役割を明らかにするため、ES4004の機能エクソンを欠損したマウスの作製を試み、キメラマウスを得ることに成功した。ES4004欠損マウスでは、全身性のB細胞記憶に加えて、粘膜系のB細胞記憶に異常が生じる可能性が考えられたため、粘膜系メモリーB細胞を解析する新しいシステム開発を試みた。その結果、インフルエンザウイルス感染後に気道粘膜組織で産生されるメモリーB細胞を同定する技術開発に成功した。今後、このシステムを用いてES4004欠損マウスのB細胞記憶応答を解析する予定である。