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ヒト肺腺がんの発がん初期に異常メチル化を示す発がん関連遺伝子の探索

肺腺癌の早期に過剰メチル化が起こる遺伝子を明らかにするために4-(methylnitrosamino)-1-(3-pyridyl)-1-butanone (NNK)投与A/Jmouseモデルにおける肺腺腫と正常肺から抽出したDNAの間でmethylated CpG island amplification(MCA)法、modified suppression subtractivehubridization (SSH)法、methylation-specific PCR (MSP)を行って解析している。SSHの結果930クローンを選別し、核酸のシークエンスを行ってホモロジー検索を行い、最終的に107つの異なったクローンを選別した。これをさらにBLAST検索するとこの中に4つの遺伝子が含まれていることが分かったが、その中でヒト相同遺伝子はKIF21A, SAMD14, VWAlの3つだった。そこで18例の小型ヒト肺腺癌と9例の非癌肺組織を用いて2遺伝子の発現量を解析すると腺腫では非癌肺組織に比して有意に発現量が減少していた。特にSAMD14遺伝子についてMSP法にてそのプロモーター領域のメチル化を検索すると、肺腺癌の33%(8/24)で過剰メチル化が起こっているのに対し、非癌肺ではメチル化を認めなかった(0/31)。また肺腺癌におけるSAMD14遺伝子の過剰メチル化がそのmRNA発現に関与していることを肺腺癌細胞株と不死化気管支上皮細胞株を用いて明らかにした。以上より、ヒト肺腺癌の初期にSAMD14遺伝子のプロモーター領域に特異的な過剰メチル化が起こることが明らかになった。今後、SAMD14の機能解析をさらに進めることによって肺腺癌の診断治療に応用していきたい。1)肺腺がんの前がん病変である異型腺腫様過形成(Atypical adenomatous hyperplasia)の腫瘍細胞から我々が樹立した培養細胞株(PL16T)および同一患者の末梢気管支上皮細胞から樹立した培養細胞株(PL16B)に対して、Methylated CpG island amplification法およびSuppressive subtractionhybridazation法を行い、PL16Tにのみメチル化がある2134個のDNA断片コロニーを作成し、塩基配列解析から29個の遺伝子を同定した。この29個の遺伝子のうち15個の遺伝子のDNA断片はCpG islandであったが、全てエクソンまたはイントロンの領域で、プロモーターは含まれていなかった。2)29個の遺伝子のうちアポトーシスに関連する遺伝子Apoptoticchromatin condensation inducer1(ACIN1)について直径2cm以下の初期ヒト肺腺がん手術症例37例を用いて臨床病理学的検討を行った。肺腺がんのがん部と非がん部のそれぞれから抽出したDNAを用いて、研究1)で見いだしたACIN1遺伝子メチル化領域のメチル化状態をbisulfite-sequencing法により検討した。37例中、がん部では30例(81%)にメチル化が見られたが、非がん部のメチル化は9例(24%)で、がん部と非がん部の間に有意差が認められた(p<0.01)。また肺胞上皮置換性増殖を示す肺腺がん症例(21例)と示さない症例(16例)では、非がん部のACIN1のメチル化状態は異なり、肺胞上皮置換性増殖を示す症例では2例(10%)で、肺胞上皮置換性増殖を示さない症例では7例(44%)でメチル化が認められ、両者の間に有意差があった(p<0.05)。以上本年度の研究では、見いだされた異常メチル化DNA断片にプロモーター領域はなく、29個の遺伝子は肺腺がんの発がんに直接関係するものとは考えられなかった。しかし検出された遺伝子の1つACIN1は肺腺がんで高率にメチル化されていることが明らかとなり、肺腺がん早期診断への応用の可能性が示された。また肺胞上皮置換性、非置換性肺腺がんの非がん部でのACIN1

メチル化頻度の相違は組織型の相違による発がん過程の差異を示唆している可能性もあり、興味深い結果と考えられた。平成18年度は以下の研究を行った。2)マウス肺腺系腫瘍で発現の低下していたこの3個の遺伝子についてヒト遺伝子のホモローグを解析したところKIF21AとSamd14の2個の遺伝子で相同な遺伝子がヒトに認められた。3)この2個のヒト遺伝子について、まず直径2cm以下のヒト初期肺腺がん手術症例23症例で腫瘍部と非腫瘍部からそれぞれmRNAを抽出し、Quantitative RT-PCRによる遣伝子発現解析を行った。KIF21AおよびSamd14ともに腫瘍部は非腫瘍部に比較して有意に遺伝子発現が低下していた(p<0.05)。4)ヒト初期肺腺がん23症例をその組織形態像から非浸潤がんと初期浸潤がんにわけて、KIF21A遺伝子発現の検討をおこなったところ、非浸潤がんに比べて初期浸潤がんでは有意な発現の低下を認めた(pく0.05)。このうちの15症例についてプロモータ領域のメチル化状態を検討したところ、非腫瘍部ではメチル化は殆ど見られないが、腫瘍部ではメチル化の頻度が高かった。以上、本年度の研究ではAJマウスのNNKによる肺腺系腫瘍で異常メチル化が見られ、発現の低下している遺伝子を3個明らかにし、ヒトの相同遺伝子KIF21AおよびSamd14の2個の遺伝子はヒト肺腺がんで発現の低下が認められ、かつ非浸潤がんより浸潤がんでより発現の低下が見られることからこれらの遺伝子のメチル化ががんの進行に関与する可能性が示唆され興味深い結果と考えられた。肺腺癌の早期に過剰メチル化が起こる遺伝子を明らかにするために4-(methylnitrosamino)-1-(3-pyridyl)-1-butanone(NNK)投与A/Jmouseモデルにおける肺腺腫と正常肺から抽出したDNAの間でmethylated CpG island amplification(MCA)法、modified suppression subtractivehubridization(SSH)法、methylation-specific PCR(MSP)法を行って解析している。SSHの結果930クローンを選別し、核酸のシークエンスを行ってホモロジー検索を行い、最終的に107つの異なったクローンが存在することが明らかになった。これをさらにBLAST検索するとこの中に4つの遺伝子が含まれていることが分かったが、その中でヒト相同遺伝子はKIF21A,SAMD14,VWA1の3つだった。そこで18例の小型ヒト肺腺癌と9例の非癌肺組織を用いて2遺伝子の発現量を解析すると腺腫では非癌肺組織に比して有意に発現量が減少していた。特にSAMD14遺伝子についてMSP法にてそのプロモーター領域のメチル化を検索すると、肺腺癌の33%(8/24)で過剰メチル化が起こっているのに対し、非癌肺ではメチル化を認めなかった(0/24)。また肺腺癌におけるSAMD14
スフィンゴ脂質情報伝達系による新規の血管機能制御機構に関する分子細胞生理学的研究

1.ウシ大動脈弁in situ内皮細胞の細胞質Ca^<2+>濃度([Ca^<2+>]i)に対する作用を調べるため、蛍光試薬fura-2を用いた[Ca^<2+>]i測定を行った。2.ウシ大動脈弁in situ内皮細胞のNO産生に対する作用を調べるため、2,3-diaminonaphthalene法を用いたNO測定を行った。3.ウシ大動脈弁in situ内皮細胞におけるeNOSおよびiNOSの発現を調べるため、抗eNOS抗体および抗iNOS抗体を用いてwestern blottingを行った。ウシ大動脈弁in situ内皮細胞にはeNOSの発現は認められたが、iNOSの発現は認められなかった。4.内皮依存性の弛緩に対する関与を検討するため、予めU-46619で収縮させたウシ冠動脈標本の血管張力に対する作用を調べた。内皮付の標本にsphingomyelinase(0.05U/ml)を作用させると、著しい弛緩がみられ、さらにNO合成阻害剤であるLNMMAを加えると弛緩が抑制された。sphingomyelinaseによる血管弛緩作用は、内皮を除去した標本では認められなかった。以上のことから、スフィンゴミエリナーゼはin situ内皮細胞においてカルシウム非依存性にNO産生を増加させ、内皮依存性血管弛緩反応を引き起こすことが明らかとなった。また、そのNO産生はeNOSによるものと考えられた。血管内皮細胞の生理機能を制御する新規の因子としてスフィンゴミエリナーゼが重要である可能性が示唆された。
セルロース系バイオマスの酵素分解によるリサイクルモデルの構築

(抄録なし)(抄録なし)セルロース系バイオマスであるセルロースアセテート(CA)の廃棄物を資源として有効利用するため、部分分解後この分解生成物を有効利用する技術の開発を目指す(CAのリサイクルモデルの構築)。今回はCA分解生成物を効率良く調製しこれを有効利用するため、CA分解活性が高く安定な酵素を大量調製することを試みた。好熱菌由来の酵素は耐熱性があると推測されるが、CA分解活性は低い可能性もある。そこで今回は、CA分解菌Neisseria siccaSB由来のCAエステラーゼの大量生産を試みた。この酵素は比較的活性が高いがその生産量は少ないので、大腸菌でこの酵素を生産し性質を調べた。CA分解菌由来のCAエステラーゼは触媒部位と糖質結合部位からなることをその相同性から推定している。2種類の組換え体CAエステラーゼ(A:[触媒部位+糖質結合部位]、B:[触媒部位])について遺伝子組換えを行い、大腸菌で発現させ、精製した。SDS-電気泳動での分子量およびN末端アミノ酸配列の結果から、CAエステラーゼ遺伝子の発現が確認できた。次に速度パラメーターについて調べた。2種類の組換え体CAエステラーゼの値はCA分解菌が生産したものと同等だったことから、CA分解菌のものと同等のCA分解活性を持っていることが確かめられ、またその触媒部位は、酵素活性からも確認できた。またセルロースに対する吸着性について調べた結果、本酵素の糖質結合部位はセルロースへの吸着能があることを明らかにした。今回大腸菌で組換え体CAエステラーゼを生産することで、培養期間は7日間が2日間に短縮でき、また培養液あたりの酵素活性は約4倍に向上でき、この生産系を用いてより効率よく酵素生産できると考えられた。今後、CAを酵素で処理し分解生成物を得る。次にこの生成物の変換を行い、化学工業の原料となるような有用物質の生産を試みる。セルロース系バイオマスであるセルロースアセテート(CA)の廃棄物を資源として有効利用するため、部分分解後この分解生成物を有効利用する技術の開発を目指す(CAのリサイクルモデルの構築)。CA分解生成物を効率良く調製しこれを有効利用するため、CA分解活性が高く安定な酵素を大量調製する必要がある。そこで、好熱菌由来エステラーゼを大腸菌で生産することを試みた。好熱菌由米の酵素は耐熱性があり安定性が高い。特に高温下ではポリマーの高次構造が崩れ、効率がよく分解が進むと推測される。好熱菌の遺伝子ライブラリーの中からCAエステラーゼと同じ働きをすると考えられる酵素遺伝子の検索を行った。まずゲノムDNAの解読が完了している好熱性菌11種の遺伝子情報からエステラーゼ類約100種を選び出した。これらの中から、N.sicca SB由来のCAエステラーゼやアセチルキシランエステラーゼと相同性があるもの7種類を選別した。選別したこれら7種類について、PCR用のプライマーを作製した。その際、ベクターにはpET22b(+)を用い、タンパクのN末端にはネイティブのシグナルペプチドに換えて大腸菌用であるPelB、C末端にはヒスチジンタグが融合するように設計した。次に、PCR法で遺伝子の増幅を行った。そのときの産物の大きさは、遺伝子から推定した大きさと一致していた。得られた産物をpET22b(+)ベクターと連結した。構築した組換えプラスミドを大腸菌に形質転換した。得られた各遺伝子を発現させるため、これらのプラスミドを精製し発現用の大腸菌株に形質転換した。この大腸菌を培養して酵素タンパク質を生産させることができた。このことにより、CAの酵素分解を高温で効率よく行うことができ、セロビオースなどの分解物の生産性も向上し、これらを原料とした工業材料の開発が可能となる。
顔認知コミュニケーションの神経基盤の臨床神経心理学的検討

前年度に引き続き、脳病変例を対象として顔認知における知覚過程と情動評価過程について検討を行った。posterior cortical atrophy(PCA)と呼ばれる変性疾患例において、進行性かつ顔の知覚的過程に障害がみられる症例について報告し、病巣と機能の関連について考察を行った。これまでのPCAに関する報告では相貌認知障害については随伴症状としての報告しかなく、今回のレポートでその詳細が報告されたのは重要である。とくに、顔の知覚的課程が脳の後方領域と深く関連することを指摘したことが意義深い。この結果からは、脳の前方領域と後方領域がそれぞれ顔認知の認知的過程と知覚的過程とに分けられるという、さらなる仮説を考えることができる。この仮説については今後さらなる検討が必要と考えられる。さらに、脳梗塞例を対象として人種の認識に関する検討を行った。これまでの機能イメージング研究からは、紡錘状回や海馬傍回が異なる人種の顔に対して反応することが知られていたが、これらの領域の損傷が人種認識にどのような影響をおよぼすかは明らかでなかった。そこで、紡錘状回および海馬傍回を損傷している症例を対象として人種の認識に関する実験を行った。実験では、モーフィングにより作成した刺激を用いることによって、人種の認識を心理物理学的に測定した。結果として、同部位の限局病変例において人種の弁別が選択的に障害されることを明らかにした。本検討ではさらに、顔写真のルミナンスを逆転したものを刺激として用いることにより、顔の陰影情報の影響を調べた。結果として紡錘状回・海馬傍回損傷例では人種の弁別がより困難となり、人種の弁別が顔表面の凹凸を手がかりとして行われている事が示された。24年度が最終年度であるため、記入しない。本研究の目的は顔を介したコミュニケーション能力の神経基盤を解明するため、認知症やパーキンソン病、筋強直性ジストロフィーなどの脳病変例を対象として顔認知障害の病態解明とその神経基盤を探ることである。今年度は、パーキンソン病における心理推測過程について、情動的な心理推測過程に関する検討を行った。検討には「まなざし課題」と呼ばれる課題を用いた。この課題では、視線から他者がどのような心的状態にあるかを推測する。結果として、パーキンソン病例では健常者に比べ、まなざし課題における成績低下がみられた。この結果について国際誌に公表を行った。また、同様の検討を、筋強直性ジストロフィーにおいても行った。検討の結果、筋強直性ジストロフィーでは、視線からの心の読取のほか、言語的文脈から心理を推測することも困難であり、両者の課題の成績間には相関がみられた。これは、同症例において他者の心理状態を推測する機能が低下しており、その機能不全が言語・非言語の両面に広がっていることを示唆するものと考えられた。また、本疾患では視線からの心理状態の読取と、全般性認知機能検査との相関がられたことから、何らかの認知機能低下が心理推測機能に影響していることが考えられた。この内容は、国際誌に公表された。また、相貌認知機能について左右半球の関与に関する検討を行うため、顔弁別が困難となる相貌失認症例を対象として症候の解析および剖検による病巣の精密な特定を行った。結果として、右紡錘状回が相貌失認の発生に強く寄与することが示され、この内容を国際誌に公表した。研究の目標の一つである顔

認知障害の評価について、国内外に公表する段階に至っている他、共同注意に関する実験や機能イメージングに関する検討は今のところ論文での公表には至っていないが、データの取得から学会発表といった段階に進んでおり、継続的な結果を出せることが期待できるため24年度が最終年度であるため、記入しない。顔認知に関する脳機能イメージングや、共同注意に関するデータの整理、および統計的分析などを含めて総合的な考察を進めていき、国内外での結果の公表を行なっていく。
生細胞表層イメージングで明らかにする核酸ナノ構造体の細胞内在化機構

ライブセル観察用高速原子間力顕微鏡と高分解能蛍光顕微鏡とを組み合わせた相関イメージング技術により,核酸ナノ構造体の細胞内在化に伴う一連のタンパク質の集積・解離と細胞膜の形状変化との関係を統合的に解析する.これにより,人工的な形状へとナノ構造化された核酸分子が生きた細胞とどのように相互作用し,どのような運命をたどるのかについて,分子機構レベルで明らかにする.ライブセル観察用高速原子間力顕微鏡と高分解能蛍光顕微鏡とを組み合わせた相関イメージング技術により,核酸ナノ構造体の細胞内在化に伴う一連のタンパク質の集積・解離と細胞膜の形状変化との関係を統合的に解析する.これにより,人工的な形状へとナノ構造化された核酸分子が生きた細胞とどのように相互作用し,どのような運命をたどるのかについて,分子機構レベルで明らかにする.
山椒由来アレルギー（脱顆粒）抑制物質の分子・細胞から生体レベルでの作用機序の解明

本研究では、花粉症などのI型アレルギー疾患の患者数は増加の一途を辿り、社会的な問題となっていることを理由として、これまでに明らかにした山椒由来脱顆粒抑制物質2種が、複雑なアレルギー反応機構に対してどのように作用しているかを分子・細胞レベルおよび生体レベルで解明することを目的としている.I型アレルギー治療薬として用いられている脱顆粒抑制薬はマスト細胞からのヒスタミン等の炎症物質の遊離(脱顆粒)を抑制することによって、I型アレルギーの諸症状を緩和する.これまでの研究から、山椒由来脱顆粒抑制物質2種はマスト細胞として扱われるラット好塩基球性白血病細胞株RBL-2H3のIgE介在性脱顆粒およびIgE非介在性脱顆粒をどちらも抑制することが明らかとなった.そこで本年度は、山椒由来脱顆粒抑制物質2種の脱顆粒抑制作用の作用機序を明らかにするため、タンパク質のリン酸化をウエスタンブロット法により検出し比較した.また、生体レベルでZP1とZP2が抗アレルギー効果を発揮するか調べるために、ZP1とZP2を大量に精製し、I型アレルギーモデル反応である受動皮膚アナフィラキシー(PCA)反応を抑制するかマウスを用いて調べた.さらに、Actin-GFPを安定発現させたRBL-2H3を用いたライブセルイメージング法の確立を目指した.本年度の研究から、ZP1およびZP2は、その作用機序として脱顆粒反応の起点であるLynの活性化を抑制すること、生体レベルでも脱顆粒反応を抑制する可能性があることを明らかにした.山椒由来脱顆粒抑制物質2種(ZP1とZP2)の脱顆粒抑制作用の作用機序を明らかにするため、脱顆粒反応に関与するタンパク質のリン酸化をウエスタンブロット法により検出した. IgE介在性脱顆粒のシグナル伝達の起点に位置しているSrc-family kinaseであるLynは、抗原刺激によりリン酸化されるが、ZP1およびZP2によりそのリン酸化が抑制されることが判明した.また、マウスを用いたPCA反応試験では、あらかじめ耳に抗原特異的IgE抗体を皮内投与することで感作しておき、試験サンプルを経口投与したのちに、尾静脈から抗原を投与することによりアレルギー反応を惹起し、サンプル投与群とvehicle投与群間でアレルギー反応の程度の比較を行った.アレルギー反応の程度評価は、抗原とともにエバンスブルー色素(EB)を投与することで、アレルギー反応により抗体投与部にEBが溶出するため、このEBを抽出し吸光度を測定することで比較した. PCA反応試験の結果、ZP1およびZP2の経口投与によりPCA反応が抑制されることが明らかとなった.本作用機序は、肥満細胞のトルイジンブルー染色から脱顆粒抑制によるものと示唆された.また、Actin-GFPを安定発現させたRBL-2H3のIgE介在性脱顆粒にともなう細胞形態変化を、共焦点レーザー顕微鏡により生細胞のまま観察するための手法を確立した.以上の進行状況から、当初の計画通りに進展していると考える。平成31年度は、山椒由来脱顆粒抑制作用を有するZP1およびZP2を用いて、Lynの下流に位置するシグナルを解析するする。さらに、Actin-GFP発現RBL-2H3を用いたライブセルイメージングによってリアルタイムに起こる脱顆粒反応とZP1とZP2の抑制効果を視覚的にとらえ、作用機序解明への手がかりとすることを目指す。さらに山椒中に含まれるZP1とZP2の季節推移や、その他の類似成分の脱顆粒抑制効果についても調査を実施する。本研究では、花粉症などのI型アレルギー疾患の患者数は増加の一途を辿り、社会的な問題となっていることを理由として、これまでに明らかにした山椒由来脱顆粒抑制物質2種が、複雑なアレルギー反応機構に対してどのように作用しているかを分子・細胞レベルおよび生体レベルで解明することを目的としている.I型アレルギー治療薬として用いられている脱顆粒抑制薬はヒスタミン等の炎症物質の遊離(脱顆粒)を抑制することによって、I型アレルギーの諸症状を緩和する.マスト細胞として扱われるラット好塩基球性白血病細胞株RBL-2H3を用いた試験から、山椒由来脱顆粒抑制物質2種はこのような抗原刺激によって起こる脱顆粒反応を抑制すること、マスト細胞内のCa2+濃度の上昇を抑制することが明らかとなっている.そこで本年度は、山椒由来脱顆粒抑制物質2種の脱顆粒抑制作用の作用機序を明らかにするため、抗原刺激の代替えとしてよく使用されるカルシウムイオノフォアを使用してマスト細胞内のCa2+濃度を上昇させることによる脱顆粒反応を抑制するかどうかを調べた。次に、ラット好塩基球性白血病細胞株RBL-2H3は通常のマスト細胞とは異なる性質を有することが知られているため、マウスの大腿骨から採取した骨髄細胞を分化刺激することによって通常のマスト細胞(BMMC: bone marrow-derived mast cell)を得た。このBMMCにおいても山椒由来脱顆粒抑制物質2種が脱顆粒抑制作用を有するか否かを確認した。さらに、ライブセルイメージングによる脱顆粒抑制作用機序解明に向けて、RBL-2H3のアクチンにGFPを付加することを試みた。山椒由来脱顆粒抑制物質2種(ZP1とZP2)の脱顆粒抑制作用の作用機序を明らかにするため、抗原刺激の代替えとしてよく使用されるカルシウムイオノフォアを使用してマスト細胞内のCa2+濃度を上昇させることによる脱顆粒反応を抑制するかどうかを調べたところ、ZP1とZP2どちらもカルシウムイオノフォア刺激による脱顆粒反応を抑制した。

すなわち、IgE非介在性刺激であっても脱顆粒が抑制されることから、作用機序解明への足掛かりが得られた。また、IgE介在性刺激による細胞内Ca2+濃度の上昇はZP1が強く、ZP2が中程度抑制したことに対し、IgE非介在性刺激による脱顆粒ではZP1よりもZP2が強く抑制したことから、ZP1とZP2の構造はよく似ているにも関わらず、これらの物質の抑制機序がことなることが予想された。次に、BMMCを用いてIgE介在性脱顆粒に対する抑制効果を検討した結果、ZP1とZP2どちらも脱顆粒反応を抑制することが明らかとなった。したがって、通常のマスト細胞に対してもZP1とZP2は抑制効果が発揮されるとわかった。さらに、ライブセルイメージングによる脱顆粒抑制作用機序解明に向けて、RBL-2H3のアクチンにGFPを付加することを試み、安定的にActin-GFPを発現するRBL-2H3を得ることに成功した。以上の進行状況から、当初の計画通りに進展していると考える。本研究では、花粉症などのI型アレルギー疾患の患者数は増加の一途を辿り、社会的な問題となっていることを理由として、これまでに明らかにした山椒由来脱顆粒抑制物質2種が、複雑なアレルギー反応機構に対してどのように作用しているかを分子・細胞レベルおよび生体レベルで解明することを目的としている.I型アレルギー治療薬として用いられている脱顆粒抑制薬はマスト細胞からのヒスタミン等の炎症物質の遊離(脱顆粒)を抑制することによって、I型アレルギーの諸症状を緩和する.これまでの研究から、山椒由来脱顆粒抑制物質2種はマスト細胞として扱われるラット好塩基球性白血病細胞株RBL-2H3のIgE介在性脱顆粒およびIgE非介在性脱顆粒をどちらも抑制することが明らかとなった.そこで本年度は、山椒由来脱顆粒抑制物質2種の脱顆粒抑制作用の作用機序を明らかにするため、タンパク質のリン酸化をウエスタンブロット法により検出し比較した.また、生体レベルでZP1とZP2が抗アレルギー効果を発揮するか調べるために、ZP1とZP2を大量に精製し、I型アレルギーモデル反応である受動皮膚アナフィラキシー(PCA)反応を抑制するかマウスを用いて調べた.さらに、Actin-GFPを安定発現させたRBL-2H3を用いたライブセルイメージング法の確立を目指した.本年度の研究から、ZP1およびZP2は、その作用機序として脱顆粒反応の起点であるLynの活性化を抑制すること、生体レベルでも脱顆粒反応を抑制する可能性があることを明らかにした.山椒由来脱顆粒抑制物質2種(ZP1とZP2)の脱顆粒抑制作用の作用機序を明らかにするため、脱顆粒反応に関与するタンパク質のリン酸化をウエスタンブロット法により検出した. IgE介在性脱顆粒のシグナル伝達の起点に位置しているSrc-family kinaseであるLynは、抗原刺激によりリン酸化されるが、ZP1およびZP2によりそのリン酸化が抑制されることが判明した.また、マウスを用いたPCA反応試験では、あらかじめ耳に抗原特異的IgE抗体を皮内投与することで感作しておき、試験サンプルを経口投与したのちに、尾静脈から抗原を投与することによりアレルギー反応を惹起し、サンプル投与群とvehicle投与群間でアレルギー反応の程度の比較を行った.
複雑な細胞集合構造体（ウシ卵丘卵子複合体・ラット膵島）の保存技術開発

ラット膵ランゲルハンス島(膵島)の超低温保存に関する研究を重点的に展開した。新規凍害保護物質(CPA)としての可能性が示唆されているカルボキシル基導入ポリリジン(CPLL)のラット膵島に対する効果を調べ、その限定的有効性を示す実験結果をとりまとめた論文がCryobiology誌に受理された(Nakayama et al., 2019)。CPLLのラット膵島に対する凍害保護効果に関する研究成果の概要は以下の通りである。30%エチレングリコール(EG)を細胞膜透過型CPAとして含有するラット膵島用のガラス化保存液(Yamanaka et al., Cryobiology誌, 2016)において、細胞膜非透過型のCPLLを20%の濃度で添加すると、加温後の膵島蘇生率が有意に改善された。EGの一部たりともCPLLで置換することはできず、15% DMSOと15% EGからなるガラス化保存液に対してCPLLを添加しても蘇生率改善には無効だった。一度に10個の膵島をガラス化するクライオトップデバイスだけでなく、50個の膵島を一括処理できるナイロンメッシュデバイス(Yamanaka et al., Biopreservation & Biobanking誌, 2017)を用いたときもCPLLが持つ凍害保護の補填効果は発揮された。ウシ卵丘卵子複合体のガラス化保存に関する研究テーマの進捗においては、平成28年度に大きな飛躍(第57回日本卵子学会における優秀発表賞の受賞、ならびにTheriogenology誌への投稿論文の一発アクセプト)があったものの、本年度は学会発表1件にとどまった。しかし、ラット膵島の超低温保存に関する研究テーマにおいては、平成28年度(凍結保存法よりもガラス化保存法が膵島の超低温保存に向いていることを実証)、平成29年度(大容量ガラス化保存用のナイロンメッシュデバイスの開発に成功)に続き、本年度も膵島に対してCPLLが持つ限定的凍害保護効果を論文として公表することに成功した(Cryobiology誌)。この結果は、第66回日本実験動物学会(2019年5月、博多)において発表する予定になっており、膵島移植による糖尿病モデルラット治癒効果の結果も第56回国際低温生物学会年会(2019年7月、サンディエゴ)に発表エントリーしている。この他にも共著論文3編、連名著書(MIMB) 1編を残した。よって、「おおむね順調に進展している」と言える。ウシ卵丘卵母細胞複合体(COC)のガラス化保存に関する研究テーマでは次年度(最終年度)、大容量化用デバイスの開発においてナイロンメッシュの至適孔径を決定し、汎用性の高い卵子保存プロトコールの作成を行う。さらに、抗酸化作用を持つポリフェノール類の一種、レスベラトロールが、加温後の回復培養液へ添加することによって、体外受精や発生培養を経て作製できる胚盤胞の量ならびに質を改善できるかについて、結論を出す。ラット膵ランゲルハンス島(膵島)のガラス化保存に関する研究テーマでは、ストレプトゾトシン投与によって糖尿病誘発したモデルラットの腎皮膜下へ膵島移植を行い、ラット血糖値の正常化度合いに基づき、ガラス化デバイスごと移植する膵島の糖尿病治癒に対する機能を調べる。このとき用いるナイロンメッシュに代わるデバイスとは、生体適合性の高い材料(シルクフィブロインフイルムあるいはシルクフィブロインシート)を指しており、移植膵島の生着を助ける血管新生作用を期待して、血管内皮増殖因子(Vascular Endothelial Growth Factor:VEGF)あるいは真空加圧含浸法により調製した肝臓の脱細胞化組織(Acellular ECM:aECM)を共移植する。肝臓由来あるいは膵臓由来のaECMの存在下でラット膵島のガラス化耐性が変化するかという点も興味深く、In vitroでの生存率評価やインスリン分泌能評価を行う。ウシ卵核胞期(GV)卵丘卵母細胞複合体(COC)、ならびにラット膵ランゲルハンス島(膵島)の超低温保存に関する研究を開始した。未成熟なウシ卵母細胞については、成熟裸化卵母細胞で最適化されていたガラス化保存法をそのままGV-COCに適用し、加温後に体外成熟(IVM)、裸化処理、体外受精(IVF)、発生培養(IVC)の順で処理しても、胚盤胞発生率は10%程度と低かった。さらにGV-COCから卵丘細胞層を完全に除去してしまうと、IVM後に核成熟はできても細胞質成熟が不完全となり、ガラス化保存には適さないことがわかった。そこで卵丘細胞層を薄くするダウンサイズ処理をGV-COCに施してから、ガラス化・加温、IVM、IVF、IVCに供したところ、世界最高水準の30%を超える胚盤胞発生率を達成することに成功した。ラット膵島については、一般的な培養細胞の保存に汎用されているBicell凍結法とダウンサイズCOCに有効だったCryotopガラス化法の直接比較を行った。凍結・融解直後とガラス化・加温直後の膵島生存率はそれぞれ、50%と57% (新鮮対照は90%)で、アポトーシス関連遺伝子(Bax/Bcl2)の発現量も変わらなかった。新鮮対照区の膵島におけるSI値(グルコース応答性インスリン分泌能の指標)は6.7だったのに対して凍結区のそれは1.9、ガラス化区のそれは3.9であり、β細胞機能関連遺伝子の発現量は凍結区でのみ有意に減少した。このように、ラット膵島の超低温保存にはBicell凍結法よりもCryotopガラス化法の方が適していた。

ウシ卵核胞(GV)期、すなわち未成熟な卵丘卵母細胞複合体(COC)のCryotopをデバイスとしたガラス化保存においては、加温・IVMFC後の胚盤胞までの発生率にとってガラス化保存に先立って卵丘細胞層をダウンサイズしておくことが有効であると見出し、Theriogenology誌Vol.95, Pages 1-7 (2017)に原著論文として発表した。また、本結果を第57回日本卵子学会で発表した研究協力者は、学術奨励賞(口演部門)受賞の栄誉に輝いた。ラット膵ランゲルハンス島(膵島)の超低温保存に関する研究では、ES細胞などの各種培養細胞の保存に汎用されているBicell凍結法と、ウシCOCで有効性が実証されたCryotopガラス化法を直接比較したところ、インスリン分泌能を含むIn vitroのいくつかのパラメーターにおいてCryotopガラス化法の優越性を示した。この結果は、Cryobiology誌Vol.73, Pages 376-382 (2016)に原著論文として発表した。よって、当初の計画以上に進展していると言える。成果の主たる概要は、1辺1cmの三角形シート(ナイロンメッシュ製)を三角錐展開図状に折り込んだデバイスを作製し、一回のガラス化行程で最大10個程度の膵島しか処理できなかったクライオトップというデバイスの代わりに用いて、最大100個の膵島をガラス化保存できるようになったことである。ガラス化保存液に含まれる凍害保護物質(CPA)の組成や前処理時間等は前年度にCryobiology誌に報告したものと同条件とした。個々の膵島をガラスキャピラリーによって移動させるのではなく、ナイロンメッシュデバイスの網目構造を利用して、搭載面の裏から前処理用CPA培地を吸引除去した後に新しいガラス化用CPA培地にデバイスごと移せることを特徴とする。加温後の生存率はクライオトップをデバイスとしたときの対照区の値と同等だったが、膵島をナイロンメッシュデバイスに50個、あるいは100個載せてガラス化・加温してもインスリン分泌能の指標であるStimulus Index (SI)値が、膵島移植に供し可能なレベル(2.8-3.8)を保った。ウシGV期COCのガラス化保存に関する研究テーマにおいては、前年度に大きな飛躍があったものの、本年度は学会発表・論文公表に至る成果を上げるには至らなかった。しかし、ラット膵島の超低温保存に関する研究テーマにおいては、大容量ガラス化保存用のナイロンメッシュデバイスの開発に成功し、一回のガラス化行程で最大10個程度の膵島しか処理できなかったクライオトップというデバイスの代わりに用いて、最大100個の膵島をガラス化保存できるようにした。この結果は、Cryopreservation Conference 2017という国内会議(2017年11月、つくば)においてポスター発表し、Biopreservation & Biobanking誌Vol.15, No.5, Page 457-462に原著論文(Yamanaka et al., 2017)として発表した。また、ラットES細胞株樹立に関する共同研究成果として、雄性単為発生胚盤胞と雌性単為発生胚盤胞のそれぞれから半数体のES細胞株を樹立することに成功した。しかし、同株を半数体のまま維持するには、面倒なフローサイトメトリー・セルソーターを用いた精製工程が必要なこともわかった。
小学校入学に向けた幼児期からの慢性疾患患児への支援プログラムの開発

本研究は、学校生活において配慮が必要な慢性疾患患児とその親を対象として、小学校入学に向けた幼児期からの慢性疾患患児への支援プログラムを開発することを目的としている。しかし、ここ数年で対象者である慢性疾患患児に対応するための小学校等でのガイドラインなどが変更されつつあることがわかり、状況を踏まえて研究を推進する必要性が生じた。研究者会議での検討の結果、親が主体となって学校関係者と連携を取っていける能力を支援する方法として、支援ツールと援助指針の開発というように具体的な支援方法に修正を加えることとした。そこで平成30年度は、支援ツールの作成に向けて不足している情報を収集・分析するため、面接調査を計画・実施した。調査の対象者は、食物アレルギーのために学校生活において配慮が必要な子ども(小学1年生3年生)の親で、小学校入学時の学校関係者との相談時期と相談内容、入学時の子どものセルフケアの状況等について半構成的面接を実施した。また、アレルギーの状況など基本情報については質問紙を用いて調査した。調査結果から入学時の具体的な経験が明らかになり、アレルギー症状の程度によって、適切な相談時期や相談の内容・回数などに違いがあることが示唆された。今回の調査結果は、支援ツールの作成において、これまでの研究成果に加えて活用できることが確認された。慢性疾患患児に対応するための小学校等でのガイドラインなどが変更されつつあることがわかり、状況を踏まえて研究計画に修正を加えながら推進する必要性が生じた。平成30年度は、支援ツールと援助指針の開発というように具体的な支援方法に修正を加えることとし、支援内容の資料を得るために面接調査を行った。計画していた支援の試行には至っておらず研究推進計画より遅れている。平成30年度の研究者会議において修正スケジュールが検討されており、今年度は支援ツール・援助指針の作製を行い、対象者を募り支援ツール試行を実施する予定である。本研究は、学校生活において配慮が必要な慢性疾患患児とその親を対象として、小学校入学に向けた幼児期からの慢性疾患患児への支援プログラムを開発することを目的とし、次のことに取り組む計画である。1小学校入学に向けた、慢性疾患患児の幼児期におけるアセスメント指標を開発する、2アセスメントを含めた支援指針を作成し、支援プログラムを作成する、3慢性疾患患児の事例に対し支援プログラムによる支援を試行し評価する。平成28年度は、関連文献の検討による研究枠組みの推敲と質問紙調査に関する準備を行う計画であった。関連文献の検討による研究枠組みの検討の途中であり、質問紙調査の準備は開始できなかった。質問紙調査の準備が進められている予定であったが、具体的な作業に入っていない。大学内での業務が予想よりも過重になり、研究時間が不足した。平成29年度は前年度に取りかかれなかった質問紙調査の準備と実施を行う予定であった。しかし、調査およびプログラムの対象者を具体的に検討する中で、平成29年度において、対象者である慢性疾患患児に対応するための小学校等でのガイドラインなどが変更されつつあることがわかり、状況を踏まえて研究を推進する必要性が生じた。そのため、質問紙調査は準備の段階であり、実施を進めていくことができなかった。慢性疾患患児に対応するための小学校等でのガイドラインなどが変更されつつあることがわかり、状況を踏まえて研究を推進する必要性が生じたため、質問紙調査については準備の段階である。研究推進計画より遅れている。

計画していた支援の試行には至っておらず研究推進計画より遅れている。研究者会議において質問紙調査実施の検討をする。対象となる慢性疾患患児に対する学校での対応が変化してきている情報もあり、対象者の再検討も必要である。調査の研究計画を推敲し、所属機関および協力医療施設の倫理審査に研究計画を申請し、承認を得る計画である。研究以外の業務の遂行も、効率よく実施していくことが必要である。研究者会議において、学校での対応の変化を踏まえて研究の方向性に修正が必要かどうかを検討し、質問紙調査の準備・実施を行う予定である。協力を依頼する対象候補者は研究者会議では検討済みであり、所属期間の倫理審査の承認が得られたら速やかに調査を開始する予定である。平成30年度の研究者会議において修正スケジュールが検討されており、今年度は支援ツール・援助指針の作製を行い、対象者を募り支援ツール試行を実施する予定である。予定していた質問紙調査の作業が具体的に進められなかったために、作業に伴う費用としていた物品費、旅費、謝金等が残った。予定していた質問紙調査が進められなかったために、使用予定であった物品費、旅費、謝金等が残った。平成30年度は質問紙調査の実施とプログラム作成を進めていく予定であり、平成29年度分の残金を含めて平成30年度分として請求した助成金を使用する予定である。研究計画に修正を加えながら推進する必要性が生じたため、使用予定であった物品費、旅費、謝金等が残った。今年度は支援ツールの作成作業と支援の試行を進めていく予定であり、平成30年度分の残金を含めて令和元年度分として請求した助成金を使用する予定である。翌年度は遅れた作業を進めていくために残金を使用する予定である。また、質問紙調査の実施にあたり、翌年度分として請求した助成金を使用する予定である。
HIVアクセサリー遺伝子VPRによる細胞周期異常とHIV-LTR活性

テトラサイクリン反応性プロモーターによる遺伝子発現系を用いて、VPRの機能を自由に調節できる細胞株MIT-23に、HIV-LTR EGFP遺伝子を導入し、HLEG-29を得た。HLEG-29は、DOX添加によるVPRの発現が誘導され、細胞周期異常と共に、2Nより4N/8Nの細胞集団でより高いEGFPの発現が認められた。VPRによりDNA量の増大した細胞集団にHIV-LTR活性を上昇させる因子が存在していることを示唆する。2)VPRよるHIV-LTR活性を上昇させる因子の解明3)VPR発現に伴うNF-kBの核内移行のメカニズムの解明VPRによって誘導される細胞周期異常として、M期の遅延やhyperploidyが認められる。VPR発現細胞で、サイクリンB1と結合すること、M期でのサイクリンB1の核内移行の遅延やmitosis promoting factor(MPF)活性の増大に加えて、I-kB alphaのリン酸化型蛋白の発現が見い出された。さらに、VPR発現細胞から調整したMPFがI-kB alphaのリン酸化を誘導することが確認された。以上のことより、VPRによって誘導されるNF-kBの核内移行は、MPF活性によるI-kBalphaのリン酸化が密接に関連していることが示唆された。5)今後の課題これまで、VPRの役割は細胞周期異常やアポトーシスを誘導することとして報告されてきたが、それら生物学的意義は明らかになっていなかった。細胞周期異常によるHIV-LTR転写機序は今回初めて明らかになった。今回得られた知見は、分子病態の理解にとどまらず、抗VPR因子探索の理論的基盤を提供すると考えられる。1)細胞周期異常とHIV-LTRテトラサイクリン反応性プロモーターによる遺伝子発現系を用いて、VPRの機能を自由に調節できる細胞株MIT-23に、HIV-LTR EGFP遺伝子を導入し、HLEG-29を得た。
血流刺激に反応する血管内皮ミトコンドリアのバイオエナジェティクス

血管内皮細胞は血流や血圧に起因する力学的刺激であるせん断応力や伸展張力を常に受けている。内皮細胞には力学的刺激をセンシングし、血行動態の情報として細胞内部に伝達することで細胞応答を起こす働きがあり、循環系の恒常性維持に重要な役割を果たしているが、その仕組が障害されると、様々な心血管病の発生に繋がる。最近、せん断応力依存的に血管内皮ミトコンドリアでATPが産生することを見出し、力学的刺激が細胞のエネルギー代謝に直接関与する事を示した。本研究では、血流刺激に反応するミトコンドリアでのATP産生メカニズムに焦点を当て、力学的刺激受容オルガネラとしてのミトコンドリアの役割とATP代謝経路を解明する。
C_<60>薄膜の半導体としての性質の解明とその応用

本研究では,C_<60>薄膜およびC_<70>薄膜おける光照射下での影響を主に電気伝導、光ルミネッセンス、一定光電流法、光熱偏向分光法および電子スピン共鳴法によって調べた。また、炭素に関連した物質について光熱偏向分光法を用いて、低エネルギー光吸収スペクトルを測定した。得られた結果は以下のようになった。1.フラーレン薄膜成膜時に光照射を行うことによって、均一な光重合フラーレン薄膜を作製することが出来た。この薄膜の光吸収スペクトルを測定した結果、2.12.4eVに吸収の増加が観測された。これは、すでに報告されている光重合C_<60>固体の吸収スペクトルの結果と一致する。また,光重合C_<60>薄膜はC_<60>薄膜と比べてエネルギーギャップが小さいことが分かった。2.スパッタ法によって作製したa-CNxについて、光吸収スペクトルを測定した。この結果、Cのπ結合によると思われる。エネルギーギャップは1.4-1.9eVと見積もられ、アーパックテイルエネルギーは150meVであった。この物質にはσとπ結合の二種類が存在していると考えられる。3. C_<60>内包ゼオライトについて、光熱偏向分光法を用いて光吸収スペクトルを測定した。この結果、新たに0.65および0.9eVに吸収ピークが見られた。これはゼオライト自身による吸収だと考えられる。C_<60>内包ゼオライトのエネルギーギャップはほぼ、C_<60>薄膜のものと等しく、アーバックテイルエネルギーも同じであった。本研究では、C_<60>薄膜およびC_<70>薄膜おける大気中および光照射下での影響を主に電気電導、光ルミネッセンス、一定光電流法、光熱偏向分光法および電子スピン共鳴法によって調べた。得られた結果を要約すると、1.フラーレン薄膜は酸素のインターカレーションによって、電気伝導、光ルミネッセンス強度が大きく減少する。この現象は、エネルギーギャップ内に酸素が局在準位を作り、それがキャリアに対してトラップ準位として働くためである。また、C_<60>薄膜の場合、この局在準位は非幅射再結合中心として働き、これがサブバンドギャップ吸収として現れる。2.C_<70>薄膜では、酸素のインターカレーションによってサブバンドギャップ吸収およびア-バックエネルギーが減少する。したがって、酸素は結晶構造の乱れを緩和させると考えられる。3.酸素がインターカレートされたフラーレン薄膜に光照射するサブバンドギャップ吸収が増加し、光ルミネッセンス強度が減少する。したがって、光照射によって新たに局在準位が形成され、それが非幅射再結合中心として働くと結論づけられる。C_<60>薄膜の場合は、この局在準位の一部は室温において準安定であり、アニール処理によってこの準位は減少しない。4.酸素がインターカレートされていないフラーレン薄膜に光照射するとサブバンドギャップ吸収が減少し、光ルミネッセンス強度が増加した。酸素がない場合は、光照射によって薄膜内に存在する欠陥が減少する。この現象は、光誘起ポリマーや光誘起酸化とは別の新しい事項である。以上、得られた結果から特に重要な点は、(1).フラーレン固体を研究する上で、酸素のインターカレーションを考慮する必要性が示唆されたこと、(2).光照射によるフラーレン薄膜への影響の一つとして、光照射による準安定な準位の形成または欠陥の減少を見い出したことである。
白金族元素（燃料電池用）の資源循環・金属触媒調製のためのバイオメタラジーの創出

(1)金属イオン還元細菌Shewanella algae (ATCC 51181株)を利用するPtナノ粒子の室温合成において、最適操作条件を確立した(原料溶液の初期Pt(IV)濃度2.0mol/m3、pH 7.0、電子供与体HCOONaの初期濃度50 mol/m3、細胞濃度5.0 ×1015cells/m3)。60 minの回分操作において、Pt粒子の収率は80 %であり、その生成量は乾燥細胞1 gあたり0.21 g-Ptであった。また、バイオ合成Pt粒子(1次粒子)は、平均径が3 nmのシングルナノサイズであり、細胞ペリプラズム(ナノ領域)に生成した。(2)S. algae細胞に対する化学的処理(NaOH添加・加熱)および物理的処理(超音波照射)により、バイオ合成Ptナノ粒子を液相に単離できることがわかった。バイオ合成Ptナノ粒子は、液相で凝集することなく、安定に均一分散して存在することがわかった。これは、S. algae細菌の破砕によって、Ptナノ粒子の保護剤として作用する生体物質が液相に溶出し、ナノ粒子の凝集が抑制されたためと推測される。(3)バイオ合成Ptナノ粒子の懸濁液にカーボン担体粒子を添加し、溶液pHを調整するだけの簡便な操作により、バイオ合成Ptナノ粒子をカーボン粒子表面に付着・担持できることを明らかにした。(4)バイオ調製Pt触媒の酸素還元反応(ORR)活性を回転ディスク電極法によって評価した結果、そのORR質量活性は市販Pt電極触媒(燃料電池用)の60%に達することがわかった。(5)食品分野の普及品であるパン酵母Saccharomycescerevisiaeを利用しても、金属イオン還元細菌の場合と同様に、Pd(II)イオンやAu(III)イオンを還元して貴金属ナノ粒子を細胞表面に室温合成できることを見出した。金属イオン還元細菌Shewanella algaeを用いてバイオ合成したPt粒子は、市販Pt電極触媒の場合と同程度のシングルナノサイズであることを高分解能電子顕微鏡による観察によって確認することができた。一方、バイオ合成Ptナノ粒子を担持したPt/C電極触媒に対して酸素還元反応(ORR)活性を回転ディスク電極法によって評価した結果、そのORR質量活性は市販Pt電極触媒(燃料電池用)の60%にまで達することが明らかになった。室温での微生物反応を活用してPt電極触媒を調製する革新的な本研究においては、研究開始から1年目の段階で目標値の60%もの触媒活性が達成できたことから、現在までの研究進捗状況は「おおむね順調」であるとポジティブに受け止めている。バイオ調製Pt/C触媒のORR質量活性が市販触媒の60%に留まった要因としては、カーボン担体に担持する際にバイオ合成Ptナノ粒子の一部が凝集した点が考えられる。この点を改善するために、バイオ合成Ptナノ粒子とカーボン担体とのゼータ電位の測定・評価とともに、コロイド科学の学術的基盤を踏まえたアプローチを次年度に実施する。(1)使用済み電極触媒からの白金族金属(PGMs)の溶解操作では、環境負荷の少ない溶解液(酸性溶液+酸化剤など)を選定するとともに、PGMs溶解に最適な操作条件を探索する。(2)PGMs電極触媒のバイオ調製に関しては、Pt単一金属触媒に加えて、二成分金属(Pt/Ru、Pt/Pd、Pd/Auなど)の合金触媒およびコアシェル触媒のバイオ合成にも着手し、電極触媒の金属組成の観点から触媒活性・耐久性の向上をめざす。また、金属イオン還元微生物としては、Shewanella algae(野生株)やSaccharomyces cerevisiae(野生株)に加えて、その類縁微生物等からPGMsナノ粒子の生産性に優れた高機能微生物を開発する。(3)微生物細胞の物理的・化学的破壊によるPGMsナノ粒子の液相への剥離方法、またPGMsナノ粒子のカーボン担体への担持方法についてはコロイド科学の学術的基盤を踏まえて、各工程をブラッシュアップする。また、PGMsナノ粒子を担持した微生物細胞自体の導電性を高める方策として、微生物細胞の炭化処理方法(濃硫酸溶液による加熱処理など)を検討し、微生物の最適な炭化方法を確立する。(4)バイオ調製PGMs電極触媒に対して電気化学的測定(回転ディスク電極法によるCV測定、酸素還元活性測定など)を行い、PGMs電極触媒のバイオ調製条件と触媒活性の関係を把握するとともに、その触媒活性を市販電極触媒と比較検討する。その評価結果を踏まえて、使用済み電極触媒からPGMs電極触媒の調製に至る一連の工程について実験結果を解析し、電極触媒の調製条件を総合的にブラシュアップすることによってバイオ調製触媒の活性と耐久性の向上を図る。(5)研究成果の情報発信に関しては、上記の研究結果を取りまとめ、学会発表を行うとともに、研究論文を投稿する。(1)金属イオン還元細菌Shewanella algae (ATCC 51181株)を利用するPtナノ粒子の室温合成において、最適操作条件を確立した(原料溶液の初期Pt(IV)濃度2.0 mol/m3、pH 7.0、電子供与体HCOONaの初期濃度50 mol/m3、細胞濃度5.0 ×1015cells/m3)。

(2)S. algae細胞に対する化学的処理(NaOH添加・加熱)および物理的処理(超音波照射)により、バイオ合成Ptナノ粒子を液相に単離できることがわかった。バイオ合成Ptナノ粒子は、液相で凝集することなく、安定に均一分散して存在することがわかった。これは、S. algae細菌の破砕によって、Ptナノ粒子の保護剤として作用する生体物質が液相に溶出し、ナノ粒子の凝集が抑制されたためと推測される。(3)バイオ合成Ptナノ粒子の懸濁液にカーボン担体粒子を添加し、溶液pHを調整するだけの簡便な操作により、バイオ合成Ptナノ粒子をカーボン粒子表面に付着・担持できることを明らかにした。(4)バイオ調製Pt触媒の酸素還元反応(ORR)活性を回転ディスク電極法によって評価した結果、そのORR質量活性は市販Pt電極触媒(燃料電池用)の60%に達することがわかった。(5)食品分野の普及品であるパン酵母Saccharomycescerevisiaeを利用しても、金属イオン還元細菌の場合と同様に、Pd(II)イオンやAu(III)イオンを還元して貴金属ナノ粒子を細胞表面に室温合成できることを見出した。金属イオン還元細菌Shewanella algaeを用いてバイオ合成したPt粒子は、市販Pt電極触媒の場合と同程度のシングルナノサイズであることを高分解能電子顕微鏡による観察によって確認することができた。一方、バイオ合成Ptナノ粒子を担持したPt/C電極触媒に対して酸素還元反応(ORR)活性を回転ディスク電極法によって評価した結果、そのORR質量活性は市販Pt電極触媒(燃料電池用)の60%にまで達することが明らかになった。室温での微生物反応を活用してPt電極触媒を調製する革新的な本研究においては、研究開始から1年目の段階で目標値の60%もの触媒活性が達成できたことから、現在までの研究進捗状況は「おおむね順調」であるとポジティブに受け止めている。バイオ調製Pt/C触媒のORR質量活性が市販触媒の60%に留まった要因としては、カーボン担体に担持する際にバイオ合成Ptナノ粒子の一部が凝集した点が考えられる。この点を改善するために、バイオ合成Ptナノ粒子とカーボン担体とのゼータ電位の測定・評価とともに、コロイド科学の学術的基盤を踏まえたアプローチを次年度に実施する。(1)使用済み電極触媒からの白金族金属(PGMs)の溶解操作では、環境負荷の少ない溶解液(酸性溶液+酸化剤など)を選定するとともに、PGMs溶解に最適な操作条件を探索する。(2)PGMs電極触媒のバイオ調製に関しては、Pt単一金属触媒に加えて、二成分金属(Pt/Ru、Pt/Pd、Pd/Auなど)の合金触媒およびコアシェル触媒のバイオ合成にも着手し、電極触媒の金属組成の観点から触媒活性・耐久性の向上をめざす。また、金属イオン還元微生物としては、Shewanella algae(野生株)やSaccharomyces cerevisiae(野生株)に加えて、その類縁微生物等からPGMsナノ粒子の生産性に優れた高機能微生物を開発する。(3)微生物細胞の物理的・化学的破壊によるPGMsナノ粒子の液相への剥離方法、またPGMsナノ粒子のカーボン担体への担持方法についてはコロイド科学の学術的基盤を踏まえて、各工程をブラッシュアップする。