hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
尋常性白斑発症と色素細胞環境,特に表皮細胞のILー1とメラノサイト成長因子分泌能

その結果pigment spreadをきたし治癒にむかうものと移植表皮が白斑化するものが見られた。IL-1の測定はマウス胸腺細胞によるcon-A-Co stimulator assayにて行い、表皮乾燥重量当たりの単位を得た。白斑病巣表皮で斑点IL-1活性の低下している群と低下していない群を見い出した。同時に施行した健常皮膚移植部の白斑の再発はIL-1活性の低下していない症例群に多く認められた。また同一病巣内の異なる時期の白斑についても同様傾向をみた。II)白斑病巣表皮内Langer hans細胞の形態をATPase法、HLA-DR、OKT6法で検索した。ステロイド、PUVA治療後ではこれらのマーカー陽性細胞の密度は著効群で大きく減少し、逆に難治群では減少は少なかった。特に急速拡大中の白斑病巣において治療によるLangerhans細胞の減少率は低かった。以上の所見より白斑難治部や急速拡大部ではantigen-presentationを行うと考えられるLangerhans細胞の各種マーカーが治療によっても低下しないことが推察される。III)Langerhans細胞の標識活性がステロイド外用とPUVA療法後にはっきり減少を示すnon-progressive phaseの病変部では、吸引剥離表皮移植療法(SBT)の予後の良好であった。逆にあまり減少を示さないprogressive phaseの病変部では、SBTの予後が悪く移植皮膚が再び白斑となった。尋常性白斑発症機序におけるメラノサイト細胞環境因子として、1.Interleukinー1(II,ーI)、2.ランゲルハンス細胞(LC)、3.メラノサイト増殖因子(MGF)、4.色素拡大現象、5.メラニン生成機構の解明について研究を行った。1.PUVAと外用ステロイド療法著効の白斑病巣ではILー1活性は低下せず、無効群の多くはILー1活性の低下がみられることを見いだした(Horikawa,Mishimaら、ESDRーJSIDーSID Triーcontinental Meeting,Washington,D.C.,April26ー30,1989)。2.PUVAと外用ステロイド治療に抵抗性の白斑病巣では、HLAーDR,OKT6,ATPase陽性の治療抵抗性LCの増加を見いだした(Jimbo,Mishima,FSDRーJSIDーSID Tricontinental Meeting,Washington,D.C.,April26ー30,1989)。治療抵抗性LCの増加は白斑の表皮移植療法の治療効果を低下させることを報告した(神保、三島、日皮会誌,99:307、1989)。3.培養メラノサイトを用いたbioassayによってヒト正常皮膚にメラノサイト増殖因子が存在することを見いだした。この因子はヘパリン新和性があり、抗bFGF抗体にて抑制されることを明らかにした(堀川、三島ら、第5回日本色素細胞学会総会、福岡、12月8ー9日、1989、要旨集p15)。4.白斑病巣の表皮移植治療後、分節型では色素拡大が著明にみとめられるが、汎発型では必ずしも見られず、両型の病因は異なることを示唆した(荒木、三島ら、第297回日皮会大阪地方会、大阪、2月17日、要旨集p4,1990)。また限局性白皮症患者では確実に色素拡大が見られることを発表した(西野、三島ら、皮膚、31:491、1989)。
ポジトロン核種を用いたヒト新鮮脳組織切片の機能解析法の開発と核医学診断への応用

(1)ヒト脳組織切片の摘出と運搬方法の検討ヒト脳組織を摘出場所(東京医科歯科大学医学部)から当研究所まで運搬する為の装置を開発した。運搬容器には携帯用クーラーボックスを当て、携帯用酸素ボンベから酸素を供給し、切片のATPレベルの回復のため34度preincubateしながら運搬するシステムとした。運搬容器は34±0.5度で制御でき、位置による温度むらも認められなかった。切片の細胞の生存率などを[^<18>F]FDGを用いたダイナミックオートラジオグラフィで評価した結果、実験に利用できることが示された。(2)リアルタイムで画像化、観察する装置の開発アロカ(株)が開発中のプラスチックシンチレータ/CCDカメラを利用したイメージング技術の提供を受け、暗箱の作成と放射線によってプラスチックシンチレータ内に発生した光をCCDカメラまで送達する部分の作成を試みた。暗箱は温度制御ができ、外部から酸素ガスを導くことができる。β線のプラスチックシンチレータによる発光を効率的に取る込む為、高原子番号のプラスチックシンチレータを採用するなどした結果、計数効率の上昇を達成した。(3)ヒト生切片を対象とした検討は平成14年7月に第1例目を実施し、これまで7例のデータが蓄積した。その内1例は、正常な脳組織と思われる組織で、他のてんかん病巣の糖代謝とは明らかに異なったパターンを示した。事前に実施したFDG-PET、MRIに検討結果が加わり、個体、組織レペルから細胞一個までが同じ土俵で、同じ材料で比較することができる体制が整った。運搬容器には携帯用クーラーボツクスを当て、携帯用酸素ボンベから酸素を供給し、切片のATPレベルの回復のため34度preincubateしながら運搬するシステムとした。切片の細胞の生存率などを[^<18>F]FDGを用いたダイナミツクオートラジオグラフィで評価した結果、実験に利用できることが示された。β線のプラスチツクシンチレータによる発光を効率的に取る込む為、高原子番号のプラスチックシンチレータを採用するなどした結果、計数効率の上昇を達成した。ラジオルミノグラフィープレートの代わりに鏡面加工したシート状固体シンチレータを用い、放射線により発生した微弱光をフォトンカウンティングカメラで撮像する装置を開発した。本装置はシート状個体シンチレータ、超高感度フォトンカウンティングカメラ、温度制御が可能な暗箱と画像処理装置から構成される。片面にアルミニウムを蒸着したシート状個体シンチレータを作製した。色調の異なる2種類の寒天スライス(300μm)を作製して、[^<18>F]fluorodeoxyglucose(FDG)溶液に浸して模擬線源として用い、固体シンチレータの放射線計数効率特性、試料の色調の計数効率に対する影響などを鏡面処理の有無で比較した。シート状固体シンチレータを用い放射線計測する場合、試料の色調によって計数効率が大きく影響され正確な放射能分布を評価することが不可能であることが分かった。固体シンチレータの試料側を鏡面加工することで以下に示す効果が確認された。(1)放射線計測効率の向上(2)試料の色調の計数効率に対する影響を排除(3)チェレンコフ光、生物発光などに起因する暗発光(バックグラウンド)の影響を排除

これにより、切片上の放射能分布をリアルタイムで精度よく画像化、解析することができる可能性が示された。ヒト生切片を対象とした検討は平成14年7月に第1例目を実施し、これまで7例のデータが蓄積した。その内1例は、正常な脳組織と思われる組織で、他のてんかん病巣の糖代謝とは明らかに異なったパターンを示した。事前に実施したFDG-PET、MRIに検討結果が加わり、個体、組織レベルから細胞一個までが同じ土俵で、同じ材料で比較することができる体制が整った。
北宋軍事政策の展開と東部ユーラシア情勢

本年度は、研究実施計画に基づき、以下の研究を進めた。昨年度に引き続き、2016年8月、北宋の対西夏軍事前線地域であるオルドス地域において現地調査を行い、寧夏回族自治区・銀川固原陝西省・西安までのルートを南下しながら、各地の景観や軍事施設址の実見調査、各地の博物館などでの文物の調査を行った。このような現地調査の成果も踏まえながら、本年度は北宋・陝西地域の軍事体制・統治体制の検討を進めた。その結果、11世紀半ばに北宋と西夏との間に勃発した軍事衝突(宋夏戦争)を契機として成立した「経略安撫使体制」は、1西夏軍の侵攻を前提とした防衛戦略に基づいていたこと、2西夏軍の動向を察知するために多様な情報収集・情報伝達手段が整備されたこと、3各地に点在する堡寨およびそこに駐屯する指揮官が防衛の中核となっていたこと、などを明らかにした上で、末端の軍事施設や指揮官から経略安撫使に至るまでの全体像を提示した。次に、北宋期に陝西地域(オルドス地域)の果たした歴史的意義を考察した。当該地域は、農耕(民)と牧畜・遊牧(民)の混淆する地域であり、歴史上、軍事力の供給源としての役割も有していたことが近年注目されている。本研究では、北宋期において、対西夏前線地域であった陝西地域の軍事力が、蕃兵や弓箭手などの在地の集団から構成されており、その指揮官も陝西地域出身者が多くを占めているなど、当該地域が軍事力の供給源となっていたことを指摘した。さらに、陝西地域の軍事力は、北宋を取り巻く情勢の中で、対西夏のみならず対契丹、対ベトナムの軍事行動にも動員されていることから、陝西地域が北宋の軍事情勢において中核を担っていたことが明らかとなった。翌年度、交付申請を辞退するため、記入しない。今年度は、研究実施報告に基づき、以下の研究を進めた。まず、北宋の軍事情勢や軍事体制と、北宋を取り巻く当時の国際情勢との関わりを検討した。その結果、北宋一代を通じて北方の契丹(遼)、西北方のタングート・西夏、南方の大越(ベトナム)との関係の推移が北宋の軍事政策の展開に大きな影響を与えており、各地域の情勢も連動していたと概括することができた。このうち、北宋の中期以降に軍事的重要性を増していく西北辺地域の軍事体制と国際情勢との関わりについて、2015年5月にシンガポールで開催された第3回アジア世界史学会(AAWH)において報告した。また、北宋の太祖・太宗期(960997年)における軍事行動を担った指揮官に着目し、その伝記史料を通じて彼らの出自や経歴を整理した。その結果、当該時期に軍事行動を担った指揮官は、1.唐末五代期以来の「沙陀軍団」の系譜につらなること、2.農牧接壌地帯である河北地域の出身者が多いこと、3.遊牧系や非漢人が多く見えること、4.太祖・太宗と個人的紐帯を形成していること、などの共通点が確認された。これらのことは、太祖・太宗が自らの側近・親信集団を通じて軍事力を掌握しようとしていたことや北宋軍事力の起源が唐末五代期の遊牧集団に遡ることを意味していると考えられる。このほか、2015年8月に、北宋の対西夏軍事前線地域であるオルドス地域(中国内蒙古自治区陝西省)の現地調査を行い、北宋時代の城塞址や文物、あるいは景観の調査を行った。また2015年89月に、ロシア科学アカデミー東方文献研究所(サンクトペテルブルク)にて、宋代の貴重な一次文書史料である「宋西北辺境軍政文書」の実見調査を行った。オルドス地域の現地調査によって、北宋の対西夏軍事前線における防衛戦略の具体像に迫る手がかりを得ることができた。また、「宋西北辺境軍政文書」の実見調査により、すべての文書の精確な録文を提示することが可能となった。また、北宋の軍事政策の展開と国際情勢との関わりについて通時的な見通しを得ることができた点、太祖・太宗期の軍事力の基盤について解明できた点などから、おおむね順調に進展していると考える。

当該地域は、農耕(民)と牧畜・遊牧(民)の混淆する地域であり、歴史上、軍事力の供給源としての役割も有していたことが近年注目されている。本研究では、北宋期において、対西夏前線地域であった陝西地域の軍事力が、蕃兵や弓箭手などの在地の集団から構成されており、その指揮官も陝西地域出身者が多くを占めているなど、当該地域が軍事力の供給源となっていたことを指摘した。さらに、陝西地域の軍事力は、北宋を取り巻く情勢の中で、対西夏のみならず対契丹、対ベトナムの軍事行動にも動員されていることから、陝西地域が北宋の軍事情勢において中核を担っていたことが明らかとなった。今年度に得られた成果を順次報告・論文化していく予定である。また、現地調査の成果も必要に応じて発信していく。さらに、現時点では部分的な分析にとどまっている、北宋の軍事政策の展開と国際情勢との関わりや、北宋軍事力の基盤となる武人の個別分析を、通時的に進めていく予定である。翌年度、交付申請を辞退するため、記入しない。
フローサイトメータによるウエルシュ菌エンテロトキシン蛋白分子の作用機作の解析

1.ウエルシュ菌エンテロトキシン(ET)の精製。既報の方法でETを100mg精製した。前年までに得たハイブリドーマから、4種類のMCAを調整した。3.Vero細胞を用いたフローサイトメトリー(FCM)によるET活性の測定法の開発。ETを作用させたVero細胞をfluorescein diacetateとpropidium iodideで二重染色後、FCMで解析することによる、ET活性の測定法を開発した。同法は、従来の、色素を取り込んだVero細胞を光学顕微鏡下で肉眼でカウントする方法に比べて測定時間、測定精度、手間等において格段に優れていた。4.FCMによるET活性の測定に用いる浮遊状細胞の検索。3.で開発した方法の欠点は、Vero細胞を調整する際にtrypsin処理を要することである。trypsin処理は細胞のレセプター及びETの構造あるいは活性に影響を与えることが知られているので、ET活性の精密な解析にはtrypsinの使用は避けたい。そこでtrypsin処理の不要な浮遊状培養細胞を探索した。維持の容易な5種類の浮遊状培養細胞を検討した結果、唯一FM3AがVero細胞に匹敵する感度を有し、Vero細胞に代わり得る細胞であることを明らかにした。5.ETの分子構造と生物活性に関する仮説の提示。既報及び14を適用した実験の結果をまとめ、ETは、分子量1万5千のC末ドメインがET表面の大部分を占め、この部分で標的細胞へ結合することを図を用いて提示した。なお、分子量2万のN末のドメインの作用上の役割りを明らかにすることはできなかった。N末ドメインの作用機作の解析が今後の課題として残された。
六方晶系スピントロニクス材料の電圧スピン操作への応用検討

近年、超低消費電力にスピンを操作する方法として、スピンの電圧制御が注目を集めている。本研究では、従来精力的に研究されてきた立方晶系のスピントロニクス材料に代わり、六方晶系スピントロニクス材料に注目し、そのスピンを電圧で高効率に操作できるかを検討する基礎研究を行う。MgOに代わる六方晶Coと格子整合性の良い新規酸化物ゲート材料の開発とCo系強磁性材料の開発を通して、六方晶系材料の特性を見極める。
脳微小循環障害時のアストロサイトの役割

くも膜下出血、脳出血、脳梗塞などの脳卒中、脳血管障害では、物理的圧迫による脳損傷を除くと、脳血流低下が生じてアストロサイトやニューロンが障害され、脳機能が低下する。くも膜下出血と同時に脳血流が低下し、アストロサイトやニューロンへの血流障害が発生する。その時、白血球の毛細血管内pluggingが関与しており、細動脈の自動調節能も消失する。アストロサイトの突然のpH低下の関与と、脳循環自動調節能低下は、可逆性の反応であるが、くも膜下出血などで急激な強い障害が生じた場合には、回復の見込みは低い。アストロサイトの急激はCa濃度変化が、病態に関わり研究テーマとして継続している。くも膜下出血(SAH)直後の脳損傷の原因のひとつは、脳微小循環障害と考えられるが、くも膜下出血後の脳微小循環に関する研究は、ほとんどなく、脳表の血管の観察がわずかにあるのみである。脳表だけでなく、脳実質内の微小循環を観察するために、2光子顕微鏡を用いて、病態解析を行った。脳表から100μm弱の深さのprecapillaryとpenetrating arteryの血管径変化をSAH直後から観察し、さらにprecapillaryの赤血球速度をline scan法により測定した。Rhodamine 6Gの持続投与により、血小板と白血球を蛍光染色し、染色されない血球を赤血球として、血小板、白血球、赤血球と、血球の種類を分けてそれぞれの血球速度を脳表から約100μmの深さの毛細血管内でline scan法によって測定した。SAH直後、penetrating arterioleやprecapillary arterioleは、血管径15.1+/-3.3μm, 6.0+/-1.1μmからそれぞれ約20%拡張したが、その後は収縮傾向を示し、precapillary arterioleの赤血球速度は1.0mm/s以下まで著明に低下した。Rhodamine 6G静脈内持続投与により測定したSAH1ー2時間後の毛細血管内血球速度は、血小板、赤血球、白血球ともに正常から約50%有意に低下した。白血球が毛細血管内に接着して、白血球だけでなく、赤血球や血小板の流れも遮断する現象も観察され、白血球の毛細血管内接着は、脳微小循環悪化の原因の一つとであった。この脳微小循環の観察は、くも膜下出血だけではなく、すべての病態に応用できる。くも膜下出血(SAH)1ー2時間後には、白血球や血小板が脳細静脈内にローリング、接着する炎症が進行する。くも膜下出血直後の1分では、脳圧が上昇し、脳虚血がもっとも強いことは、1980年代の犬、ウサギ、猫の実験により証明され、ラットやマウスでも同様であることは、その後報告されている。いままで、この研究で行ってきたマウスSAHモデルに2光子励起レーザー顕微鏡を用いた研究では、脳表ではなく脳内微小循環を観察することで、SAH直後の血流変化に対して、次の3つのことが明らかとなった。1)SAHと同時に脳圧が血圧の70ー80%まで上昇する。SAH1分で、細動脈内の血流があるのは、全体の60%、残りの20%のマウスは血流もとまるか、流量の著明な低下。2)血流のある60%のマウスでは、細動脈血流速度と細動脈内血流量は、SAH前の10ー20%まで低下する。(脳循環調節能)3)その後60分までの観察で、細動脈血流は回復せず、細動脈の拡張も2分後には、維持できなくなり、収縮してしまう血管もある。(脳循環調節機能の障害)SAH発症瞬時の血流低下が著明で、その後調節機能消失、脳循環障害。60分後も脳血流の回復が50%以下の理由として、毛細血管内での白血球の停滞がある。(no-reflow phenomenon)GFAP-GFPマウスの緑色蛍光強度が、SAH直後から低下し、pH変化に注目、SNARF1を用いたが、実験系が合わず難しかった。細動脈血管の拡張収縮のコントロールとして、一酸化炭素(CO)に注目。脳では主に神経細胞内のheme oxigenase(HO)により産生されると考えられる。HOによりCOと同モルビリルビン測定を試みた。方法は、ビリルビンと結合して蛍光を発するUnaGを用いた定量法で髄液中のビリルビン測定を行うと、血中ビリルビンの1/100以下の量が髄液中に存在した。アストロサイトのpH測定が困難であった。ビリルビン測定が、安定せず、時間を要した。FAP-GFPマウスのアストロサイトの形態は、2光子顕微鏡により鮮明に観察され、MCA perforation modelによるくも膜下出血や塞栓子による中大脳動脈閉塞モデルでは、GFPの蛍光は消退した。中大脳動脈閉塞後の再灌流により蛍光強度は再上昇し可逆性のある変化と考えられた。この両モデルでの障害中の血流低下は著明で、くも膜下出血直後には20%以下に低下していることが、line scan法で観察された。毛細血管内line scan法による血球染色後の観察において、白血球のローリングと接着をとらえ、白血球の毛細血管内接着時には同血管の全血球の流れが停止することがわかった。

くも膜下出血時、超急性期の脳損傷の原因として、白血球による脳全域の毛細血管血流低下の意義が示唆された。くも膜下出血直後は、いったんは細動脈拡張を認めるものの、その後は脳血流が低下しているにもかかわらず、血管拡張反応は消失し、脳血流低下の状態が継続した。中大脳動脈閉塞モデルでも、脳表血管血流が維持されているにもかかわらず、脳内細動脈と毛細血管血流の著明な低下を認め、血流がほぼ消失するところでは虚血時の細動脈拡張はすでに観察されなかった。内頚動脈閉塞モデルにおいて、アストロサイト内のCa濃度上昇も観察され、傷害の程度、虚血の程度とCa濃度との関連性とその機能についての解析が今後の課題のひとつである。くも膜下出血、脳出血、脳梗塞などの脳卒中、脳血管障害では、物理的圧迫による脳損傷を除くと、脳血流低下が生じてアストロサイトやニューロンが障害され、脳機能が低下する。くも膜下出血と同時に脳血流が低下し、アストロサイトやニューロンへの血流障害が発生する。その時、白血球の毛細血管内pluggingが関与しており、細動脈の自動調節能も消失する。アストロサイトの突然のpH低下の関与と、脳循環自動調節能低下は、可逆性の反応であるが、くも膜下出血などで急激な強い障害が生じた場合には、回復の見込みは低い。アストロサイトの急激はCa濃度変化が、病態に関わり研究テーマとして継続している。脳表灌流実験を早急に進め評価してゆく。新しい理研との共同研究との関連性を考えて、早急に進める。in vivoでのビリルビン測定法を理研で開発中で、完成した時点で、検討する。脳微小循環脳微小循環の評価として、血管径を主に考えていたが、血流速度も重要であり、今回の実験系で測定可能であること、また、予定していた測定よりもさらに細かく、各血球ごとの速度測定が可能であることから、それらの正常値と、脳微小循環障害時の変化を観察した。結果の評価方法を細かくし時間を要したために、目的達成が遅れているが、GFAP-GFPマウスをもちいることで、細動脈の確認ができることは非常に有用であり、平成25年度は、そのメカニズムの追求への発展には至らなかった。In vovoの実験系での一酸化炭素測定が困難なことから、間接測定としてラット髄液微量ビリルビン測定法の確立に時間を要しました。UnaGを用いた測定法で、測定再開しております。また、アストロサイトと脳血流観察を行う方法として、2光子生体顕微鏡の高精度化、また、血管拡張物質の相互作用のデータ採取に時間を要しております。実験動物、血管反応データ採取、データ解析、蛍光物質などの購入に使用する予定です。最初に予定していることを変更すべき点はないと考えられ、予定通り、少しずつ進めてゆく。研究計画の中で、結果評価のための方法論的実験に時間を要したため、knock out mouseやQdotなどの消耗品の使用が少なかった。今後の実験進行により、くりこした研究費も必要となる予定である。神経刺激記録に関する消費、蛍光色素、knock out mouseなど、すでに使用用途がきまっており、26年度の研究結果に反映される予定である。
血管新生因子に着目した卵巣癌のベバシズマブ耐性機序とPAI-1阻害の有効性の検討

卵巣癌において血管新生は極めて重要である。しかしながら、血管新生因子VEGFに対する抗体であるベバシズマブ(BEV)の臨床への導入にも関わらず、いまだ抜本的な生存率の改善を認めていない。本研究の目的は、卵巣癌におけるBEV耐性化のメカニズムを解明することである。2018年度はその原因をmicroRNA(miRNA)に焦点をあてて解析することにした。具体的には、C57BL/6マウスにマウスの卵巣癌細胞株ID8にルシフェラーゼで標識したID8-LUC2細胞2×10^6個を200mlのPBSに溶解し腹腔内投与を行った。投与2週間後からcontrol IgG 5mg/kgおよびBEvil 5mg/kgをそれぞれ週に2回計6週間腹腔内投与を行った。腫瘍の発育を評価するために1週毎にルシフェリン150mg/kgを腹腔内投与し約15分後にIVISで測定した。6週間投与後、それぞれのマウスを安楽死させた後に腫瘍を摘出しその腫瘍からTRIzolを用いてRNAを抽出し、3D-GeneマイクロRNAチップを用いてmiRNAmicroarrayを行い、BEV投与により発現が変動するmiRNAの網羅的解析を行った結果、BEV投与により、卵巣癌腫瘍内でmiR-7, miR-195, miR-497などの発現が有意に低下していることを見出した。以上BEV耐性化に関与しうる候補miRNAを抽出することができた。BEVに対する耐性化を検討することは動物実験以外不可能である。そのため、本研究ではマウスの卵巣癌細胞株ID-8にルシフェラーゼを安定発現させたID8-LUC2細胞を用いたが、その導入手続きにやや時間を要した。そのため、当初の研究計画よりやや進捗が遅れている。ただし、動物実験は遂行されBEVの継続投与を行い、BEV耐性化を起こした卵巣腫瘍組織を摘出し、解析することができた。今後は、研究のSpeed Upを図り、BEV抵抗性に関わる分子を特定し、臨床検体でのValidationを行っていく。上述した通り、卵巣癌モデルマウスにBEVを持続投与することにより、BEV耐性化腫瘍マウスを作成した。それより腫瘍を摘出しmiRNAmicroarrayを行い、、BEV投与により、卵巣癌腫瘍内でmiR-7, miR-195, miR-497などの発現が有意に低下していることを見出した。2019年度はこれらのmiRNAがPlGFやPAI-1などのVEGF以外の血管新生因子の発現を制御していないかの検討を行う。具体的には腫瘍組織におけるこれらの血管新生因子の発現をReal time RT-PCR法および免疫組織染色を行う。さらにこれらの候補miRNAを卵巣癌細胞に遺伝子導入することにより前述の血管新生因子の発現が変動するかの検討を行う。一連の検討を経て候補分子が確定すれば、実際の臨床でBEVに対して抵抗性を示した卵巣癌検体を用いて免疫組織染色によるValidationを行う。以上の検討を通じて、卵巣癌におけるBEV抵抗性のメカニズムを明らかにする。

具体的には腫瘍組織におけるこれらの血管新生因子の発現をReal time RT-PCR法および免疫組織染色を行う。さらにこれらの候補miRNAを卵巣癌細胞に遺伝子導入することにより前述の血管新生因子の発現が変動するかの検討を行う。一連の検討を経て候補分子が確定すれば、実際の臨床でBEVに対して抵抗性を示した卵巣癌検体を用いて免疫組織染色によるValidationを行う。以上の検討を通じて、卵巣癌におけるBEV抵抗性のメカニズムを明らかにする。
インスリンの肝内クリアランスおよび肝内脂質代謝に対するシグナルに関する検討

Portocavalshunt(PCS)モデルは、門脈本幹と下大静脈の間にシャントを造設したモデルであり、肝に本来流入する門脈血流のすべてが下大静脈に流入する。一方、Mesocaval shunt(MCS)モデルは、脾静脈の遠肝側の上腸管膜静脈と下大静脈の間にシャントを造設したモデルであり、膵臓、脾臓から還流する門脈血流だけが肝に流入する。生後8週から12週のウイスター系ラットに対して、PCS造設手術、MCS造設手術、Sham Operation手術を施行し、通常食で飼育して経過させた。以上から、PCSばかりでなく、MCSだけで肝萎縮が起こることが示された。インスリンを除く肝再生因子は、肝に由来する因子だけでは再生に不十分であった。中性脂肪の分泌速度が肝体重量比と有意に相関しており、FFAを始めとする中性脂肪分泌促進因子が、肝再生に重要な役割を持つことが示唆された。門脈血インスリンの肝内脂質代謝に対する作用を明らかにする目的で以下の動物群を作製した。(c)試験開腹のみ行ったコントロール群。(3)肝臓・脂肪・筋肉における脂肪含量を測定した。今後、糖脂質代謝関連酵素の遺伝子発現(ノーザンブロッテイング)と、これを制御する転写因子の活性評価を行う予定である。また、膵臓ベーター細胞の病理、インスリン染色も行う予定である。以上の評価から、新たな動物モデルとして膵臓移植モデルによる体循環系・門脈系高インスリン血症モデルを作製し、同様の検討を行いたい。昨年度に引き続き、門脈血インスリンの肝内脂質代謝に対する作用を明らかにする目的で以下の動物群を作製した。(4)肝組織内のTG,TC,Glycogen含量を測定した。以上の評価から、新たな動物モデルとして膵臓移植モデルによる体循環系・門脈系高インスリン血症モデルを作製し、同様の検討を行うにあたっての基礎的なデータが検討されたと考えられる。また今回のモデルを用いて、インスリンシグナル以外にアデイポサイトカインとしての遊離脂肪酸の役割も検討可能であった。つまり、空腹時に腸間膜をはじめとする内臓脂肪から分泌された門脈内の遊離脂肪酸は、それ自身で中性脂肪分泌を促進する可能性がある。
セボフルラン、プロポフォール麻酔時のエストロゲン、プロゲステロンの脳保護効果

セボフルランまたはプロポフォール麻酔下に、エストロゲンとプロゲステロンの脳血管径に対する作用をクラニアルウインドウを用いて、正常時と虚血・再灌流時について検討した。セボフルランとプロポフォールの麻酔至適量はバイスペクトラルインデックスを用いてそれぞれ3.9%、100 mg/kg/hrと決定した。セボフルランまたはプロポフォール麻酔下において、エストロゲン、プロゲステロン10-1110-5 mol/Lは正常時の脳血管径に対して影響を与えなかった。脳虚血再灌流時にも、エストロゲン10-6 mol/L、プロゲステロン10-6 mol/Lは、脳血管径に対して影響を与えなかった。ウサギの頭部を開頭して、クラニアルウインドウを作成し、脳血管を直接観察した。エストロゲンまたはプロゲステロンを10-11, 10-9, 10-7, 10-6, 10-5 mol/Lに人工髄液で希釈して、クラニアルウインドウに6 mL/hrで灌流し、その前後で脳血管径、脳血流量を測定した。エストロゲン、プロゲステロンともに脳血管径、脳血流量に影響を与えなかった。しかし、エストロゲン、プロゲステロンともにプロドラッグであり、製剤をそのまま人工髄液で希釈しても、エストロゲンまたはプロゲステロンとして脳血管径や脳血流量に影響しないのではないかと疑われた。そこで、メーカー(ファイザー株式会社)に製剤を粉末として提供してもらえないかと依頼したところ、アメリカ本社の許可が必要とのことであった。ファイザー本社に依頼状を提出し現在審査の最中である。薬剤が届き次第研究を再開する予定である。ニホンシロウサギにペントバルビタールで全身麻酔を施行し、頭部にクラニアルウインドウを作成して、脳血管を直接観察できるようにした。エストロゲンとプロゲステロンを人工髄液に溶解させ体温程度に温めた。温めたエストロゲンまたはプロゲステロンをクラニアルウインドウに灌流させて脳血管径の変化を、薬剤投与前と投与後で比較した。エストロゲン、プロゲステロンは脳血管径に影響を与えなかった。エストロゲン、プロゲステロンは脳血管に対する直接作用はないものと考えられた。ウサギの耳から静脈路を確保し、大腿動脈より動脈ラインを確保して、気管切開を行い人工呼吸した。麻酔は、セボフルラン3.7%の吸入かプロポフォール36 mg/kg/hrの持続静注で行なった。頭部を開頭してクラニアルウインドウを作成した。エストロゲン(E群)10-11, 10-9, 10-7, 10-6, 10-5 mol/L、プロゲステロン(P群)10-11, 10-9, 10-7, 10-6, 10-5 mol/L、または人工髄液(C群)を6 mL/hrで灌流し、その前後で脳血管径を計測することで、それぞれの薬剤の脳血管への直接作用を観察した。全ての計測の後、脳を固定して切り出した。切り出された脳は、冷凍庫で凍結させた。新たに購入した高性能ミクロトームで凍結脳を切って標本を作成し、ヘマトキシリンエオジン染色をして脳傷害の程度を評価した。エストロゲンとプロゲステロンは脳血管に有意な効果を示さなかった。E群P群C群ともに脳傷害は認められなかった。しかし、使用したエストロゲンとプロゲステロンはプロドラッグであり、それぞれの薬剤の直接作用は、今回使用した薬剤では評価できないことが判明した。エストロゲンとプロゲステロンの直接作用は、それぞれの粉末製剤を溶解して使用しないと検討できないのではないかと考えられた。現在製薬会社にエストロゲンとプロゲステロンの粉末を提供してもらえるように申請している最中である。ウサギにセボフルランかプロポフォールで全身麻酔を行なった。セボフルランとプロポフォールはウサギでの至適麻酔量が不明であったため、バイスペクトラルインデックスを用いて、セボフルランとプロポフォールのウサギでの至適投与量を決定した。頭部にクラニアルウインドウを設置した。クラニアルウインドウ内にエストロゲンかプロゲステロンを10-11, 10-9, 10-7, 10-6, 10-5 mol/Lを6 mL/hrで灌流し、その前後で脳血管径を計測した。エストロゲンとプロゲステロンは、どの濃度においても脳血管に直接作用を示さなかった。脳虚血・再灌流は、腕頭動脈、左総頸動脈、左鎖骨下静脈を15分遮断し遮断解除することで作成した。脳虚血開始後10分より再灌流から2時間後までエストロゲン10-6 mol/L、プロゲステロン10-6 mol/L、または人工髄液をクラニアルウインドウ内に6 mL/hrで灌流し、脳血管径を計測した。

エストロゲン、プロゲステロンともに脳虚血・再灌流時の脳血管径に対して有意な影響を与えなかった。エストロゲン、プロゲステロンともに薬剤の入手が困難であったため、現在研究は続行中である。研究結果が出そろったところで、論文化する予定である。エストロゲン、プロゲステロンの入手にてまどったため、薬剤がない時期に、本研究で使用する機器を使用して、ローキナーゼ阻害薬やJM-1232(-)の脳血管に対する影響を検討した。麻酔薬と脳微小循環エストロゲン、プロゲステロンの脳血管径、脳血流量に対する作用はないと結論付けたが、その後の検証で、薬剤がその効力を発揮していない可能性が考えられた。そこで、薬剤をアメリカから取り寄せて再度研究を行う予定としている。現在の状況は、まだ研究の目的をほとんど達成していない状況である。本来なら、脳虚血・再灌流時のエストロゲン、プロゲステロンの脳血管への作用を観察し、研究を終える予定であったが、なかなかエストロゲンとプロゲステロンが手に入らなかったため、現在虚血実験を施行している最中である。エストロゲン、プロゲステロンの脳血管への効果と脳傷害の程度を検討し、両薬剤ともに脳血管へは直接作用せず、脳傷害もきたさないとの結果を得た。しかし、使用した薬剤が適当でないのではないかと考えられた。薬剤を見直し、最初からやり直す予定である。新たに薬剤を取り寄せて、研究を行っていく予定である。薬剤が手元に届いたら、週2回の研究を行うなどして、研究の遅れを取り戻す予定である。エストロゲン、プロゲステロンの、脳虚血・再灌流にさらされた脳血管への作用と脳組織の状態を研究する予定である。再度、エストロゲン、プロゲステロンの脳血管への効果を検討し、その後脳虚血時のエストロゲン、プロゲステロンの脳血管への効果と脳保護効果を検討していく予定である。該当なし。研究計画に遅れが出て、虚血・再灌流にさらされた脳血管に対する、エストロゲンとプロゲステロンの作用を検討しなければならなかったため次年度使用額が生じた。実験動物であるウサギの購入、成果発表にための旅費等に使用予定である。繰越金の400,000円と次年度の研究費は、消耗品および成果発表のための旅費に当てる予定である。
多孔性ヒドロキシルアパタイト修飾電極による酵素の直接電気化学

ヒドロキシルアパタイト(HAP)を修飾した多孔性電極を用いて酵素(シトクロムc)の直接電気化学を検討し以下の成果を得た.(1)極間電圧50Vでの電解還元析出により得たヒドロキシアパタイト(HAP)の等電点はpH=7.6で市販品(太平産業)の等電点,pH=7.5(球形HAP)pH=7.8(HAP200および300)とほぼ同じであった.(2)上記市販のヒドロキシアパタイト(HAP)微粉末塗布電極において,基体電極としてPt,Au,GC(グラッシーカーボン)を選び,シトクロムcの直接電気化学を検討した.直接電気化学が可能であったのはGCのみで,基体電極とヒドロキシアパタイト微粒子との境界領域でシトクロムcの電極反応が進行すること,ならびにヒドロキシアパタイトが固体プロモータとして機能しうることが明らかとなった.(3) HAP微粉末塗布GC電極(塗布量35μg/cm2)の表面被覆率を中性の1,1'-フェロセンジメタノールを用いた電位ステップ法により測定した.被覆率は1020%,有効表面積は8090%であった.(4) 0.04Mリン酸二水素カルシウム水溶液中でのパルス電解(-9.5V(vs.Ag|AgCl)x20秒,0Vx20秒の繰り返し)によるヒドロキシアパタイトの析出挙動を購入した水晶振動子化学計測装置(Pt電極(表面積0.2cm^2))を用いて追跡した.析出量は電解時間に比例し,1200秒の電解で64.5μgの析出を確認した.(5)定電圧電解(陰極GC,陽極Pt)で析出したHAPの微粉末塗布GC電極(塗布量35μg/cm^2)でのシトクロムcの直接電気化学では,還元ピーク電位と酸化ピーク電位との差(ΔEp)がHAPの結晶性の向上とともに低下し,50V電解析出物で可逆的電子移動を意味する65mVが得られた.ヒドロキシアパタイト修飾電極として、市販の種々のヒドロキシアパタイト粉末を塗布した電極を作製した。このときのヒドロキシアパタイト粉末として太平化学産業製HAP200(柱状結晶)、HAP300(板状結晶)、球形HAP(球状結晶)およびカラムクロマトグラフ用(板状結晶、カルシウム欠損ヒドロキシアパタイト)を用いた。これらのヒドロキシアパタイト粉末の等電点を塩酸-水酸化ナトリウムの系での滴定によって求めたところ、pH=7.8、7.8、7.6および6.2であった。カラムクロマトグラフ用ヒドロキシアパタイトで等電点が酸性側にあるのはカルシウム欠損により正電荷が減少したためと思われる。これらのヒドロキシアパタイト粉末をグラッシーカーボン電極上に種々の量(平均値は35μg/cm^2)、塗布後乾燥してヒドロキシアパタイト修飾電極を作製し、シトクロムcの電極反応を調ベたところすベての修飾電極で電子移動反応の促進効果が認められた。等電点の影響が明確に現れなかった理由として、グラッシーカーボンが測定電位範囲で正に帯電しているため、ヒドロキシアパタイトの負電荷面(c面)が電極上に配向し、正電荷面(a面)とシトクロムcの負電荷サイトが静電的に相互作用することにより、電子移動に有効な配向が可能になったためと考えられる。電解法によるヒドロキシアパタイト修飾電極を(1)塩化カルシウムとリン酸二水素アンモニウムの混合液および(2)リン酸一水素カルシウムの溶液を利用して作製した。白金電極、金電極、グラッシーカーボン電極を基体電極として電気化学QCMにより析出重量を求めたところ、いずれの電極に置いても電気量と析出重量との間には良い相関が認められた。64.5μg/0.20cm^2の電極についてシトクロムcの電極反応を調べたところ電極との間での速い電子移動が認められず、今後析出量を低下させ電極反応への影響を明らかにする予定である。また、析出物のX線解析結果はアモルファス様の結晶を与える時があるので、結晶性の向上のための電解条件を探る予定である。ヒドロキシルアパタイト(HAP)を修飾した多孔性電極を用いて酵素(シトクロムc)の直接電気化学を検討し以下の成果を得た.(1)極間電圧50Vでの電解還元析出により得たヒドロキシアパタイト(HAP)の等電点はpH=7.6で市販品(太平産業)の等電点,pH=7.5(球形HAP)pH=7.8(HAP200および300)とほぼ同じであった.(2)上記市販のヒドロキシアパタイト(HAP)微粉末塗布電極において,基体電極としてPt,Au,GC(グラッシーカーボン)を選び,シトクロムcの直接電気化学を検討した.直接電気化学が可能であったのはGCのみで,基体電極とヒドロキシアパタイト微粒子との境界領域でシトクロムcの電極反応が進行すること,ならびにヒドロキシアパタイトが固体プロモータとして機能しうることが明らかとなった.(3) HAP微粉末塗布GC電極(塗布量35μg/cm2)の表面被覆率を中性の1,1'-フェロセンジメタノールを用いた電位ステップ法により測定した.被覆率は1020%,有効表面積は8090%であった.(4) 0.04Mリン酸二水素カルシウム水溶液中でのパルス電解(-9.5V(vs.Ag|AgCl)

x20秒,0Vx20秒の繰り返し)によるヒドロキシアパタイトの析出挙動を購入した水晶振動子化学計測装置(Pt電極(表面積0.2cm^2))を用いて追跡した.析出量は電解時間に比例し,1200秒の電解で64.5μgの析出を確認した.(5)定電圧電解(陰極GC,陽極Pt)で析出したHAPの微粉末塗布GC電極(塗布量35μg/cm^2)でのシトクロムcの直接電気化学では,還元ピーク電位と酸化ピーク電位との差(ΔEp)がHAPの結晶性の向上とともに低下し,50V電解析出物で可逆的電子移動を意味する65mVが得られた.
江戸時代の文人画と題画文学の研究-大雅・蕪村・高陽を中心に

文人画の基礎研究としてのデータベース作りを行った。美術史の分野において、画と賛の総合的研究は、その重要性が指摘されながらも、とくに日本文人画の大成者とされる池大雅(1723-76)・与謝蕪村(1716-84)、および、同時代に江戸でも活躍した中山高陽(1717-80)作品におけるそれについては未だ基礎研究が十分ではなかった。本研究により、大雅、蕪村作品については、既に刊行された文献をベースに題画文学のデータベースを作成、特に重要な作品については作品調査を実施した。また大雅、蕪村に比べて基礎研究がたちおくれている中山高陽については、画賛のあるなしに関わらず、全貌をつかむための作品の実地調査、基礎文献の調査、粉本調査を実施した。研究期間中に論文発表はできなかったが大雅は、珍しい画題や賛であっても、狩野派にもある画題とそれに伴う賛が記される場合が多く、版本で流布していたであろう漢詩などからとった賛が多い。これに比して蕪村は、例えば「移石動雲根」など、同時代や前後の時代を見回しても、類例のない画題や題画詩が記された事例が散見される。また、中山高陽については一方で真景図についての自画賛が作品数の割合から考えると量があるが、総じて言えることは、故事人物において珍しい画題が多い。また、同じように自画賛の作品が多いといえるかとおもわれる。本研究の基礎となる資料はほぼ集めることができたが、ひきつづき、地道に画賛と作品をつけあわせてゆくことで、文人画研究の基盤づくりができるものと考える。20年度は研究課題のうち、他の二人に比べ基礎研究が遅れている中山高陽について集中的に作品調査、関連資料、文献調査を行った。主な調査地は、高陽の出身地である高知県内の機関(高知県立美術館、土佐山内家宝物資料館、佐川町立青山文庫、高知市民図書館)、関西所蔵家、都内関連機関である。高陽については細野正信氏の研究以降あまり進展がなかったが、この度の作品調査で、高知県内の旧家に所蔵され、所在不明であった作品などが発見されたほか、高知市民図書館所蔵の粉本について全作品の写真撮影をすることができ、中山高陽研究に必要な基礎資料をある程度収集することができた。粉本については他に高知県内の個人所蔵のものがあるようだが、これについても今後調査の機会をもてればと考えている。これらを分析することにより、研究課題の「題画文学」の問題のみならず、それ以前の大前提である高陽研究にとって意義があると考える。また、現在、『高陽山人自画題語』『高陽山人詩稿』『高陽山人名印一夕方話』などと作品に記された画賛について校合作業を含めデータベースを作成中である。大雅、蕪村、についてはカタログレゾネ的要素を持った『池大雅作品集』『蕪村全集』などを中心に既に知られている作品の画讃を収集、データベース作成中であり、作品調査についてはリストアップし21年度に行う予定としている。これらの画賛(題画文学)については、可能なかぎり出典調査もすすめたいと考えており現在調査途上である。21年度は研究課題のうち基礎研究が遅れている中山高陽について20年度の調査した作品資料の整理をするとともに、在外作品の調査を実施した。特に文人画研究において、ある時期、ある意味において文人画研究(中国絵画研究の一環であったとおもわれるが)のメッカであった、アメリカ・ミシガン大学、カンサス大学の付属美術館の所蔵品および、メトロポリタン美術館など、アメリカの文人画研究において主要な機関の所蔵品調査を行った。特に大雅については近年大規模な展覧会が行われた後であったこともあり、際立った成果はなかったが、高陽については新出作品に出合うことができた。

なお、中山高陽の粉本については、20年度の調査で、他に高知県内の個人所蔵のものがあることは掴んでいたが、諸事情により未調査におわった。同時にすすめている大雅、蕪村、についてはカタログレゾネ的要素を持った『池大雅作品集』『蕪村全集』などを中心に既に知られている作品の画讃を収集、データベース作成中によって、おおまかではあるが、題画文学とともに、画題について、それぞれの特徴がうかびあがってきた。ただし、課題の一つにあげた、画賛(題画文学)の出典調査については思うようにすすまなかった。いずれにしても、研究の基礎となる資料はほぼ集めることができた。ひきつづき、地道に画賛と作品をつけあわせてゆくことで、文人画研究の基盤づくりができるものと考える。
内リンパ水腫耳における歪成分耳音響放射の研究

メニエール病の病態とされる内リンパ水腫を動物において作製し,その歪成分耳音響放射(DPOAE)を測定することによって同疾患におけるDPOAEの臨床応用について主として検討し,またDPOAEの発生に深くかかわっている蝸牛外有毛細胞の虚血再灌流障害を軽減させる薬剤についてもあわせて検討した。実験動物としてPreyer反射陽性のハートレー系白色モルモットを用いた。まず、内リンパ水腫を手術により作製する前の左耳DPOAEの音圧レベルを測定した。次に内リンパ嚢を全身麻酔下に閉塞し、その2週後のDPOAEレベルを測定したところ、有意に術前と比較して低下していた。そこで、浸透圧利尿剤であるイソソルビド(2ml/kg/day)を2週間連日経口投与し、再度DPOAEのレベルを測定したところ回復傾向が認められた。また骨胞を開放して蝸牛内リンパ電位(EP)を測定すると,イソソルビドを投与した群のEPは投与しない群よりも有意に高い値を示した。さらに聴覚閾値と考えられている蝸牛神経複合活動電位をイソソルビド投与群と非投与群間で比較ずると,投与群で有意に低値を示し,イソソルビド投与は内リンパ嚢閉塞による聴覚の低下を軽減する働きがあることが認められた。今後論文として発表する予定である。また,DPOAEが蝸牛虚血後の再灌流によって低下することから外有毛細胞の障害があり,それを軽減させる物質として鉄イオンキレート剤やNO合成阻害薬が有効であったことを報告した。歪成分耳音響放射(DPOAE)は他覚的かつ非侵襲的な内耳蝸牛機能検査法であり、内リンパ水腫が病態とされるメニエール病など、様々な内耳性難聴の診断や治療法に応用さるれことが期待されている。本研究では内リンパ水腫動物のDPOAEを測定し、メニエール病におけるDPOAEの臨床応用について、また、その他の蝸牛機能の指標との関連について検討した。まず、内リンパ水腫を手術により作製する前の左耳のDPOAEの音圧レベルを測定した。また、骨胞を開放して蝸牛内リンパ電位(EP)を測定した。イソソルビドを投与した詳のEPは投与しない群よりも有意に高い値を示した。今後はさらに実験データを増やし、さらに聴覚閾値と考えられている蝸牛神経複合活動電位をイソソルビド投与群と非投与群間で比較検討する予定である。
核磁気共鳴画像(MRSI)法による脳の加齢および脳血管性痴呆の病態生理学的研究

1.サルを用いた海馬体領域の慢性脳梗塞モデルの開発開頭による方法では侵襲が大きく術後死亡率が高いので、血管内手術法による慢性脳梗塞モデル作製を試みた。大腿動脈よりトラッカー(血管内手術用カテーテル)を挿入し、内頸動脈経由で後大脳動脈まで到達しうることをX線透視および血管造影により確認した。2.無麻酔ラットを用いたMRSI装置用脳定位固定法の開発無麻酔ラットをMRSI装置を用いて解析するため、金属を使用しない以下の脳定位固定法を開発した。1)ラット頭骨に、強化プラスチック性のビスとデンタルセメントを用いて、脳定位固定装置に無痛的に固定するためのキャップを取付ける。2)上記の手術回復後、ラットを無麻酔下で無痛的に、本研究で開発した強化プラスチック性特殊脳固定装置に固定する。3.脳虚血によるサル海馬体神経細胞壊死の作製と記憶障害の予防的治療薬の検討本研究では、1)サルの両側の外頸,内頸,総頸,および椎骨動脈の計8動脈を閉塞して13-15分間血流遮断すると、海馬体CA1領域の選択的破壊を起こすことできること、2)この方法による選択的海馬体損傷モデルでは、手順記憶は障害されないが、海馬体に特徴的な陳述記憶が障害されること、3)Ca拮抗剤の投与は、海馬体CA1領域の神経細胞壊死および記憶障害に対して予防的効果のあることが示唆された。4.ラット海馬体損傷による記憶障害とその治療薬の検討本研究では、1)当初ACh作動薬として開発されたT-588は、ラット海馬体錐体細胞の膜電位に対して脱分極作用を有し、海馬体CA1領域の神経細胞壊死により学習が障害されたラットに対して学習改善作用のあること、2)T-588の経口投与により、学習に重要な海馬体、頭頂葉、および扁桃体において、機能的MRIで血流増加を示唆するMRI信号強度が増強することなどが明らかになった。一過性脳虚血あるいは加齢など様々な病態における脳の代謝性変化を核磁気共鳴画像法(MRSI)で解析するため、本年度では、1.サルを用いた一過性脳虚血法の開発、2.無麻酔ラットを用いた一過性脳虚血法の開発、3.サルを用いた海馬体領域の慢性脳梗塞モデルの開発、および4.現在建設中のMRSI装置の稼働を行なった。1.サルを用いた一過性脳虚血法の開発ハローセン麻酔下でサルの両側総頸動脈および椎骨動脈の4本の動脈、あるいはさらに両側の外頸および内頸動脈を加えた計8本の動脈の血流を一定時間遮断し、5日後に脳を灌流固定した。その結果、4本の動脈の5分間血流遮断では、脳内に虚血性変化は認められなかった。4本および8本の動脈の10分間血流遮断では、海馬体CA1領域の1/2-1/3の錐体細胞に虚血性変化がみられた。8本の動脈の18分間血流遮断では、海馬体CA1領域と海馬体以外にも皮質や線状体などに細胞壊死が認められた。これらの結果から、脳虚血による記憶障害モデルサルの作製、すなわち、海馬体CA1領域の選択的細胞壊死を起こすためには、両側総頸、椎骨、外頸および内頸動脈の計8本の動脈の13-15分間血流遮断が最適な条件であると考えられる。2.無麻酔ラットを用いた一過性脳虚血法の開発1)MRSI装置により解析するため金属を使用しない脳虚血法を開発した。

まず、側副血行路を遮断するため、麻酔下でラットの両側椎骨動脈を焼却する。その後、両側総頸動脈にナイロン糸を掛け、糸はポリエチレンチューブに通して体外に出す。チューブは皮下を通して頭部に固定する。ラット頭骨には、強化プラスチック性のビスとデンタルセメントを用いて、脳定位固定装置に無痛的に固定するためのキャップを取付ける。2)上記の手術回復後、ラットを無麻酔下で無痛的に特殊脳固定装置に固定する。その状態で両側チューブ内のナイロン糸を牽引し、総頸動脈の血流を10-15分間遮断する。この方法による血流遮断の効果は、レーザー血流計により確認した。3.サルを用いた海馬体領域の慢性脳梗塞モデルの開発開頭による方法では侵襲が大きく術後死亡率が高いので、血管内手術法による慢性脳梗塞モデル作製を試みた。大腿動脈よりトラッカー(血管内手術用カテーテル)を挿入し、内頸動脈経由で後大脳動脈まで到達しうることをX線透視および血管造影により確認した。本年度は、1)一過性脳虚血発生直後の神経細胞壊死発生前における予防的治療薬に関する研究(研究1)、および2)神経細胞壊死発生後における記憶障害改善薬に関する研究(研究2)を行った。1.一過性脳虚血によるサル海馬体神経細胞壊死と記憶障害に対する予防的治療法前年度は、1)サル海馬体CA1領域の選択的神経細胞壊死を起こす血流遮断方法を開発し、2)Ca拮抗剤(NC-1100)の投与によりこの神経細胞壊死をほぼ阻止できることが明らかとなった。本年度では、このモデルを用い、1)10分および15分血流遮断による選択的海馬体損傷モデルでは、手順記憶は障害されないが、海馬体に特徴的な陳述記憶が障害されること、および2)10分間血流遮断によるサルの脳虚血モデルにおいて、Ca遮断薬の投与により、実際に記憶障害に対して予防的効果のあることが示唆された。以上により、1)サルの一過性脳虚血による海馬体損傷モデルがヒトの臨床例における記憶障害の動物モデルになること、および2)Ca拮抗剤が記憶障害の予防的治療薬として有効であることが示唆された。2.ラット海馬体損傷による記憶障害とその治療法その結果、1)当初ACh作動薬として開発されたT-588はラット海馬体錐体細胞に対して脱分極作用を有すること、2)T-588は海馬体CA1領域の細胞壊死により学習が障害されたラットに対して学習改善作用のあること、3)T-588の経口投与により、学習に重要な役割を果たしている海馬体、頭頂葉、および扁桃体において、機能的MRIで血流増加を示唆するMRI信号強度が増強することなどが明らかになった。これらのことから、T-588は海馬体、頭頂葉、および扁桃体などの領域の活動を上昇させることにより、学習能力を向上させると考えられる。