hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
ベタレイン合成酵素遺伝子の探索と非ナデシコ属植物での発現解析

未解明のベタレイン生合成系に関わる酵素遺伝子を明らかにするため、オシロイバナ花被についてRNA-seq解析を行なった。特に生合成系の初発の酵素であるチロシンからL-DOPAを合成するステップに注目し、9つの候補酵素cDNAを得た。その中でも赤ビートにおいてL-DOPAからcyclo-DOPAを合成する酵素として報告されたCYP76AD1のホモログであるCYP76AD3について、そのゲノム構造を決定した。さらに黄色地に赤色の斑が入る品種においてCYP76AD3遺伝子にトランスポゾンdTmj1が挿入されていること、これが離脱することによって斑入り模様が生じることを明らかにした。ベタレイン合成系の全酵素遺伝子を同定するため、平成24年度に赤色花のオシロイバナ花弁において発現している遺伝子を次世代シーケンサーにより解析を行なった。その比較のために、平成25年度には黄色花の解析を行なった。両者を比較したところ、平成24年に赤ビートより報告されたL-DOPAからcyclo-DOPAへの反応を触媒する酵素遺伝子であるCYP76AD1と相同性のあるコンティグを9種見いだすことができた。その中からCYP76AD3遺伝子について、黄色花においてはその発現量が著しく低いこと、さらに黄色地に赤色の斑入りとなる個体において、そのイントロンに16,865 bpの挿入配列が見いだされ、その両端にはCACTACTACAAAからなる12 bpのterminal inverted repeatが、また挿入位置にはTACの3 bpからなるtarget siteduplicationが見いだされた。このことから、この挿入配列はEn/Spmスーパーファミリーに属するDNA型転位因子であることが明らかとなり、これをdTmj1と命名した。さらに黄色地に赤色の斑入りとなる個体から得られた16,865 bpの挿入配列が離脱した部分の挿入配列近傍をPCRによって増幅し、それを独立に大腸菌にクローニングして49クローン得て、その塩基配列を調べたところ、49クローンすべてにそれが離脱の際に生じる特徴的配列であるfootprintsが見られたこと、一方で安定な黄色の表現型を示す花においては、このfootprintが見られず、エキソンにおいて塩基配列は赤色花のものと完全に一致し、またイントロンにおいても99%の相同性を有していたことから、安定な黄色花になっているのはトランスポゾンの挿入が原因ではなくCYP76AD3遺伝子のプロモーターもしくはターミネーターかその転写調節因子に変異が入っていることが示された。ベタレイン合成系の全酵素遺伝子を同定するため、赤色花のオシロイバナ花弁において発現している遺伝子を次世代シーケンサーを用いて解析を行なった。まず予備実験として野生の赤色花オシロイバナからRNAを抽出してcDNAを合成し、これをプラスミドに導入して約1,000の独立クローンをランダムにピックアップして、その塩基配列を決定した。その結果、約30%のcDNAがウイロイドRNA由来であることが明らかになり、ウイロイド感染している個体を網羅的解析に用いると、このウイロイド由来のRNAが大きなノイズとなって、ベタレイン合成系酵素遺伝子由来のRNAに対するリード数が少なくなってしまうことが明らかになった。そこでウイロイドに感染していない野生の赤色花オシロイバナ個体の探索を行なった。その結果、ウイロイドに感染していない赤色花個体を1個体見いだすことができたので、この花弁からRNAを抽出し、次世代シーケンサーGenome Sequencer FLXシステム(GS FLX+)による網羅的塩基配列決定を委託した。その結果、平均リード長が約550 bp、670,000リード、40,800コンティグが得られた。この中には、すでに当研究者が見いだした4,5-DOPA dioxygenase遺伝子およびcyclo-DOPA配糖化酵素遺伝子が含まれていることが明らかになった。またチロシンからDOPAへの合成に関与していると考えられるシトクロムP450系酵素ならびに2-オキソグルタレート依存型オキシゲナーゼ酵素に対する遺伝子群も見いだすことができた。当初の研究計画において平成24年度において赤色花と白色花の2種類について次世代シーケンサーによる花弁において発現している遺伝子由来の網羅的RNA解析を行なうとしていた。赤色花と白色花の2個体ではなく2種類としたのは、各個体において遺伝子の塩基配列に見られるSNPsが、個々のリードにおける塩基配列の違いとなってしまうため、20個体以上の独立個体由来の花弁RNAを混合して集団化させることにより、網羅的塩基配列解析の中において、その違いが棄却できることを期待していた。しかし、研究計画を立案した時にはわからなかったこととして、オシロイバナの多くの個体がウイロイドに感染しており、個体によっては全RNAの約30%がウイロイドRNAであることが判明した。このウイロイドRNAが花弁で発現している遺伝子由来のRNAの網羅的解析において大きなノイズとなって、オシロイバナ由来のRNA解析リード数が低下してしまうことが予測された。そこで、次世代シーケンサーによる解析の前にウイロイドに感染していない個体を探し出す必要が生じてしまった。

今回のオシロイバナの材料は栽培したものではなく、野生において生育しているものを用いることとしていたため、ウイロイド感染している個体であるか否かは検定してみるしかなく、これに非常に長い時間がかかってしまった。この検定による非感染個体を探索している間に夏の終わりが近づき、オシロイバナの花期が終わりかけ、そこでようやくウイロイド感染していない1つの赤色個体を見いだせたので、独立個体の集団化はあきらめ、この個体についてのみ次世代シーケンサーによる解析を行なった。このため、当初予定していた白色花の解析には至らず、白色花については次年度の初夏から再スタートせざるをえなくなってしまった。平成24年度において、多くの野生オシロイバナがウイロイドに感染していることが明らかになり、それを材料として次世代シーケンサーによる網羅的塩基配列解析を行なうとウイロイド由来のRNA配列が大きなノイズとなることが判明したため、ウイロイドに感染していない個体を探し出すのに非常に時間がかかり、花期の最後になってようやくウイロイド感染していない赤色花個体を見いだすことができ、この個体の花弁で発現している遺伝子由来のRNA配列の網羅的解析を1回行なうことができた。当初の予定では、ベタレイン合成系酵素遺伝子が発現していない白色花についてもRNA配列の網羅的解析を行なうことにしていたが、ウイロイド感染していない白色花個体を見いだす前に花期が終わってしまい、解析に至らなかった。平成25年度においては、初夏の花期が開始すると同時に白色花個体に集中してウイロイド感染していない個体を探索することを行なう。ウイロイド感染していない個体を見いだしたところで、この花弁からRNAを抽出し、Genome Sequencer FLXシステム(GS FLX+)による網羅的塩基配列解析を委託する。得られた塩基配列データについて、平成24年度において得た赤色花のRNA塩基配列データと比較することによって、赤色花で発現していて白色花では発現していない遺伝子を探索することを行なう。さらに赤色花において発現しているRNA塩基配列データをもとにDNAアレイを作成し、赤色花、黄色花、白色花からRNAを抽出して、これらの間において発現していない、あるいは発現量の低下している遺伝子がどれであるかを探索することを行なう。平成24年度において、ウイロイド感染していない個体を見いだすために時間を費やしてしまったため、赤色花と白色花について各々次世代シーケンサーによる委託解析を予定していたが、赤色花についてのみウイロイド感染していない個体を見いだすことができたので、こちらのみを委託解析に出し、白色花の委託解析のために計上していた研究費について平成25年度に繰り越した。
生動物２光子イメージングとMEMS神経マシンによる迷走神経終末動態の解明

自律神経系は、全身に分布する求心性神経(感覚神経)が様々な生体情報を感知したり(求心性神経)、全身の臓器を個別に調節する(遠心性神経)ことによって、複数臓器を機能的に連関させて、循環・呼吸・エネルギー代謝・体温調節などの生体恒常性を維持する共に、生命を維持する、重要な生体制御機構です。しかし、計測技術の未発達のため、限られた臓器や神経種でしか自律神経の活動は明らかでありません。本研究では、これまで計測困難だった迷走神経の電気活動を記録すると共に、これまで測定されたことのない臓器内部における迷走神経活動の記録を行いました。迷走神経系は、臓器内の生体情報を感知して脳へ送り(求心路)、全身の各臓器の機能を調節する(遠心路)、生体恒常性の柱であるが、計測技術の不備のため、神経の個々の線維や終末の動態は理解されていない。本研究は、胸腹部臓器を支配する迷走神経の臓器内構造や細胞動態について、将来の医療開発に繋がる基盤的理解を得ることを目指す。平成28年度は、研究1「MEMS神経マシンによる迷走神経の線維別電気活動解析」として、胸腹部臓器に分布する遠心性迷走神経を計測し解析した。麻酔下で人工呼吸管理下の動物(ラット)を対象に、頚部迷走神経や臓器近傍の迷走神経に同マシンを装着し、種々の生理的刺激を加えた時の応答から、神経線維の由来臓器を特定すると共に、その神経応答特性を調べた。また、研究2「遺伝学的2光子イメージングによる迷走神経の可視化解析」として、新規開発した全身の遠心性迷走神経終末活動が緑に光るラット(ChAT-Cre::GCaMP6fflox)を利用し、麻酔下の生きた動物において神経活動を2光子顕微イメージングした。また、この生動物2光子イメージングの後、固定標本において免疫組織化学解析を行い、臓器組織内における遠心性迷走神経の3次元配置や構造(神経終末の空間分布等)を調べた。この際、活性の弱い内因性の迷走神経特異的マーカーに代わって、外因性の蛍光タンパク(およびその抗体)を用いることによって、より明瞭な画像や結果を得た。また、胸腹部臓器を従来よりも深部まで観察することを目指して、臓器透明化処理(Olympus等)を試した。この透明化処理の結果、固定標本の免疫組織化学解析の深度が向上し、蛍光標識した神経の臓器内の3次元配置や構造をより深く、高い解像度で観察した。難度の高い2光子イメージングについても、諸処の工夫の結果、計画の通りの神経イメージングを実現した。平成29年度は、研究1「MEMS神経マシンによる迷走神経の線維別電気活動解析」として、胸腹部臓器に分布する遠心性迷走神経および求心性迷走神経を対象として、神経活動を計測し解析した。麻酔下で人工呼吸管理下の動物(ラット)を対象に、頚部迷走神経や臓器近傍の迷走神経に同マシンを装着し、神経記録の部位や神経活動の特徴、測定された神経活動の由来臓器を特定すると共に、その神経発火特性を調べた。さらに、種々の生理的刺激を加えた時の応答から、その神経応答特性を解析した。また、研究2「遺伝学的2光子イメージングによる迷走神経の可視化解析」として、新規開発した全身の遠心性迷走神経活動が緑に光るラットを利用し、麻酔下の生きた動物において迷走神経活動を2光子顕微イメージングした。さらに、新規開発した全身の求心性神経活動が緑に光るラットを利用し、麻酔下の生きた動物において神経活動を2光子顕微イメージングした。また、この生動物2光子イメージングの後、固定標本において免疫組織化学解析を行い、臓器組織内における遠心性迷走神経および求心性神経の3次元配置や構造(神経終末の空間分布等)を調べた。計画の通りに、進める。複合領域
腎症候性出血熱ウイルスの実験動物での伝播様式並びに体内での消長に関する研究

動物実験に伴う腎症候性出血熱(HFRS)の要因である汚染動物、特にラット相互間のウイルス伝播様式を明らかにする目的で実験を行った。1、68週齢時にHFRS V Bー1株を接種し抗体価が1:16384倍に上昇したラットを飼育し経時的に抗体価の変動,Virusの消長を血清検査及び各臓器からのVirus分離を行い検索した。飼育3年経過のラットの脳肺からVirus分離は可能であり、特に脳からは高率に分離できた。HFRS V Bー1株感染ラットは、3年経過後も体内での持続感染の起っている事を認めた。2、HFRS Virus及びHFRS不活化Vaccine Bー1株接種マウス,ラットの新生仔にVirusを接種し成長を観察した。Normal control新生仔は23週で全て死亡したが,抗体保有母親により哺育された新生仔は順調に成育し,母体からの移行抗体が新生仔に接種したVirusの増殖を阻害したと考えられる。3、Virus及びVaccine接種後6ケ月経過したラットの維持した抗体価と新生仔に移行する経乳汁移行抗体を経時的に測定した。抗体価1:2048を保持した母親が哺育した新生仔の抗IgG抗体は8週齢,IgA抗体は4週齢迄検出したが,抗体価1:256を保育する母親から仔への移行抗体は13週において1:1632の低値に留まりIgA抗体は検出されていない。同抗体価を保有するラットの新生仔にVirusを接種し哺育させた。新生仔は3日後より抗体が上昇し,16週齢ではIgG1:4096,IgA1:512の抗体価を示した。この個体の脳肺脾よりVirus分離が可能であった。新生仔のVirus増殖阻止効果は母親の維持する抗体価が大きく影響,母親からの移行抗体が低値で且つ又短期間の場合,新生仔は死亡は免れるがVirusの増殖は阻止されない事が明らかとなった。わが国の動物実験に伴う賢症候性出血熱(HFRS)の発症は昭和60年以降停止した。本症発症の要因である汚染実験動物、特にラット相互間のウイルス伝播様式を明かにする目的で実験を行った。1.HFRS virus汚染ラット腫瘍(Malignant Fibrous Histiocytoma MFH)よりvirusの消去を行い、抗体陰性ラットの腫瘍のin vitro培養に成功した。培養MHF細胞にHFRS virus Bー1株を接種し感染細胞を確認後、ヌ-ドマウスに接種した。非感染細胞接種群では全個体に腫瘍形成を認めたが、感染細胞接種群では認められなかった。2.生後6週ー10週齢ラットにBー1株を接種し、間接蛍光抗体法による血清抗体価1:8192ー16384倍に上昇したラットを長期飼育し、抗体価の変動、virusの消長をを血清抗体検査及び各臓器からのvirus分離を行い検索し、2.5ケ年間では主として脳材料からvirusを分離し得た。3年経過ラットの脳、肺、脾、各臓器材料よりvirus分離を行い、脳より高率に、分離し得たが肺からも分離可能であった。脾臓材料の接種を受けた新生仔ラットに抗体上昇を認め成熟ラットBー1株を感染長期飼育すると、3年経過後もラット体内でvirusの持続感染を認めた。

3.HFRS抗体保有ラットの新生仔にHFRS virusを接種し哺育させ、また同日分娩抗体保有ラット、正常ラット、それぞれの新生仔にHFRS virusを接種、3日後に産仔交換を行い各群平均体重の推移、生残数を観察した。抗体保有母ラットより離乳時まで、又3日間のみ授乳された新生仔ラットは両群とも順調に成育した。母体からの移行抗体が新生仔に接種したvirusの増殖を阻害したと考えられる。不活化ワクチンBー1,Bー1株、KHF83ー61BL株をそれぞれ接種した母マウスからの新生仔に対する接種実験においても新生仔マウスは順調に成育した、。今後、不活化ワクチン接種母マウスについて母仔免疫の効果の持続性について検討する。動物実験に伴う腎症候性出血熱(HFRS)の要因である汚染動物、特にラット相互間のウイルス伝播様式を明らかにする目的で実験を行った。1.68週齢時にHFRS V Bー1株を接種し抗体価が1:16384倍に上昇したラットを飼育し経時的に抗体価の変動,Virusの消長を血清検査及び各臓器からのVirus分離を行い検索した。飼育3年経過のラットの脳肺からVirus分離は可能であり,特に脳からは高率の分離できた。HFRS V Bー1株感染ラットは、3年経過後も体内での持続感染の起っている事を認めた。2.HFRS Virus及びHFRS不活化Vaccine Bー1株接種マウス,ラットの新生仔にVirusを接種し成長を観察した。normal control新生仔は23週で全て死亡したが、抗体保有母親により哺育された新生仔は順調に成育し,母体からの移行抗体が新生仔に接種したVirusの増殖を阻害したと考えられる。3.Virus及びVaccine接種後6ケ月経過したラットの維持した抗体価と新生仔に移行する経乳汁移行抗体を経時的に測定した。抗体価1:2048を保持した母親が哺育した新生仔の抗IgG抗体は8週齢、IgA抗体は4週齢迄検出したが、抗体価1:256を保有する母親から仔への移行抗体は13週において1:1632の低値に留まりIgA抗体は検出されていない。同抗体価を保有するラットの新生仔にVirusを接種し哺育させた。新生仔は3日後より抗体が上昇し,16週齢ではIgG1:4096,IgA1:512の抗体価を示した。この個体の脳肺脾よりVirus分離が可能であった。新生仔のVirus増殖阻止効果は、母親の維持する抗体価が大きく影響し,母親からの移行抗体が低値で且つ又短期間の場合,新生仔は死亡は免れるがVirusの増殖は阻止されない事が明らかとなった。
ヒューマノイドによる全身を使った器用な物体の把持と操作の実現

本年度は、ヒューマノイドロボットの全身運動により対象物を動的に移動させて把持状態を遷移させるための運動計画法ならびに制御手法を明らかにし、実機によりその動作を実現した。具体的には、物体の把持状態を変える動作として、環境に接しながら重量物を把持する状態からロボットのみの接触による物体把持状態へ変えて動的に物体を操る動作を取り上げ、その動作生成法を検討した。まず、ロボットの関節の出力が均一でないことに着目して、低出力部の特異姿勢ならびに高出力部の操作性の高い姿勢を考慮した静的安定な初期・最終把持状態を導出する手法を開発した。次に、静的には関節駆動源の出力飽和が生ずる初期-最終間の不安定な領域を動的に移動させるために、高出力部による物体加速動作ならびに素早く物体の下に潜り込む動作を組み合わせた物体持ち上げ法を提案し、関節駆動源のトルク-角速度に関する出力限界、ZMPを規範とした安定性等を拘束条件として、駆動源の発熱量が最小となる持ち上げ動作を内点法に基づいた最適化法によって生成するアルゴリズムを開発した。また、ロボットや物体、環境とのそれぞれの間の接触点において、Effective Massの概念から導かれる運動方程式を反復法によって解くことにより接触力を高速に計算するアルゴリズムを開発した。さらに、そのアルゴリズムを川田工業株式会社製のヒューマノイドロボットHRP2のモデルを持つ動力学シミュレータに導入した。このシミュレータを用いてロボットの自重の60%以上の重量物を頭上の高さへ安定に持ち上げることができることを示した。また、触覚センサによる接触点の実時間検出動作を確認した。最後に、実機のロボットにより重量物体を5秒以内で持ち上げる高速な動作を実現した。得られた研究成果の一部を国内学会および国際会議にて発表した。本年度は、ヒューマノイドロボットを対象として系の安定性を考慮して全身運動によって物体を操作し、ある物体把持状態から他の把持状態へ遷移させるための運動計画法ならびに制御法を検討した。具体的には、まずロボットの手先における継続的な力を発生できる状態に関する評価指標として、静的安定な手先可動領域を提案した。これは、ロボットの足部接地位置を変えずに転倒しない状態(静的安定状態)でロボットの手先が静的に取りうる領域である。また、ロボットが把持した物体が床面に接した状態でのロボットの静的安定な手先可動領域も導出した。次に、物体が床面に接した状態からロボットの静的不安定状態を通過して物体を静的安定な把持状態へ到達させる方法を検討した。ロボットが静的に不安定な状態で物体を静的に操作する場合、転倒を防止することは不可能である。また、物体を動的に操作する場合でも、操作開始直後からロボットが不安定となる場合、転倒防止が極めて困難となる。そこで、人間の器用な全身運動を用いた物体操作に着目し、ロボットの全身運動によって事前に生成させる予備動作を利用する新しい物体操作法を提案した。一例として床面に接する物体を予備動作によって持ち上げ、物体が床面から離れた把持状態に物体を持ち替える作業を取り上げ、ロボットと対象物との幾何学的干渉、ロボットと物体の床面上での滑り・傾き・床からの浮上などを回避しながら、事前に生成したロボットの全身運動によって生ずる力積を使って物体を操作する運動計画法ならびに制御法を明らかにした。さらに、物体持ち上げ時に受ける衝撃を抑制するために支持多角形の中心点が撃心となるように持ち上げ姿勢ならびに目標運動を設定する方法を提案し、動力学シミュレータを用いて物体の持ち替え動作が可能であることを確認した。以上の提案手法をまとめ、特許出願し、国内学会に講演会論文として提出した。本年度は、ヒューマノイドロボット全身のダイナミクスを利用することによって対象物を動的に移動させて物体の把持状態を安定に遷移させる動作の制御アルゴリズムを確立し、実機によりその動作を実現した。

具体的には、まず、物体操作のための準備運動に相当する予備動作をロボットが行って全身の運動量を増加させ、その一部を物体に変換することによって瞬時に物体運動を生成し、継続的な力では物体を保持できない不安定な領域を動的に通過する方法を検討した。次に、エネルギー効率ならびに角運動量保存則を考慮して、運動量変換直後の系全体の角運動量を用いた足底中心まわりの回転運動によって物体を操作する方法を提案した。また、回転運動を実現するために倒立振子モデルを用いた系の重心軌道生成法を確立した。さらに、従来のシミュレータで用いられるペナルティ法が大きい衝突速度に対して過度の接触力を算出する問題に対して、高次連立方程式を反復計算するGauss-Seidel法を基盤とする拘束条件を解く接触計算法を導入することにより適切な接触力を算出できる動力学シミュレータを開発し、そのシミュレータを用いて出力特性ならびに幾何学的拘束条件を考慮した物体の把持状態を安定に遷移させるため動作制御法の有効性を確認した。また、物体とロボットとの拘束状態を明らかにするために、光学式の触覚センサを用いた基礎実験により触覚情報を処理するシステムを構築し、視覚情報を補完できることを確認した。最後に、ロボットの全身を使った把持状態の遷移を実現するために、実機HRP-2による物体の持ち上げ動作の実験を行って提案手法の有効性を確認した。以上の提案手法をまとめ、その研究成果を国内学会にて発表した。また、国際会議に講演論文を提出し、採択された。本年度は、ヒューマノイドロボツトの全身運動により対象物を動的に移動させて把持状態を遷移させるための運動計画法ならびに制御手法を明らかにし、賃機によりその動作を実現した。具体的には、物体の把持状態を変える動作として、環境に接しながら重量物を把持する状態からロボットのみの接触による物体把持状態へ変えて動的に物体を操る動作を取り上げ、その動作生成法を検討した。まず、ロボットの関節の出力が均一でないことに着目して、低出力部の特異姿勢ならびに高出力部の操作性の高い姿勢を考慮した静的安定な初期・最終把持状態を導出する手法を開発した。次に、静的には関節駆動脈の出力飽和が生ずる初期-最終間の不安定な領域を動的に移動させるために、高出力部による物体加速動作ならびに素早く物体の下に潜り込む動作を組み合わせた物体持ち上げ法を提案し、閑却駆動源のトルク-角速足にMする出力限界、zMPを規範とした安定性等を拘束条件として、駆動脈の発熱量が最小となる持ち上浮動作を内点法に基づいた最適化法によって生成するアルゴリズムを開発した。また、ロボットや物体、環境とのそれぞれの間の接触点において、Effective Massの概念から導かれる運動方程式を反復法によって解くことにより接触力を高速に計算するアルゴリズムを開発した。さらに、そのアルゴリズムを川田工業株式会社製のヒューマノイドロボットHRP2のモデルを持つ動力堡シミュレータに導入した。このシミュレータを用いてロボットの自重の60%以上の重量物を頭上の尚さへ安定に持ち上げることができることを示した。
シロイヌナズナCDKA遺伝子の植物の発生過程における機能解析

真核生物の細胞周期を制御するサイクリン依存性キナーゼCDKAはシロイヌナズナには1遺伝子しか存在せず、本研究ではそのT-DNA挿入変異体であるcdka-lの機能解析を行った。雄性配偶体形成過程において花粉母細胞から小胞子がつくられ、栄養細胞と雄原細胞が生じる花粉第一分裂と雄原細胞が2個の精細胞に分裂する花粉第二分裂が起こる。しかし、cdka-1では花粉第二分裂が起こらずに1個の精細胞的な精様細胞になることを明らかにした。また、CDKAの161番目のスレオニンのリン酸化の生理機能を解析するため、リン酸化できないアラニンに置換したT161A変異体とリン酸化を模倣するグルタミン酸に置換したTl61E変異体を作製し、雄性配偶体形成過程における表現型に対する相補性を評価した。その結果、T161Aではcdka-lを相補できなかったのに対し、T161E変異体はcdka-lを相補することが示され、CDKAのT161のリン酸化が雄性配偶体の形成過程で重要な役割を担っていることが示唆された。一方、CDKAの優性の抑制変異体である146番目のアスパラギン酸をアスパラギンに置換したDl46N変異体をcdka-lに導入したところ、少なくても雄性配偶体形成過程ではdominant-negativeな表現型を示さず、むしろcdka-1を相補する結果が得られた。したがって、雄性配偶体形成過程ではCDKAの活性化は花粉第二分裂の細胞分裂には必要でない可能性が示唆された。現在、温度感受性変異型CDKAの形質転換植物体の解析を行っているが、本研究により発芽後のCDKAの機能を解析する上で、重要な実験材料を提供することが可能となった。CDKAはシロイヌナズナには1遺伝子しか存在せず、そのT-DNA挿入変異体であるcdka-1は雄性配偶体における花粉第二分裂を遂行できず、本来雄原細胞が2個の精細胞に分裂する過程に異常を来して1個の精細胞的な精様細胞になる。この原因遺伝子がCDKAであることを証明するため、CDKA遺伝子のゲノム領域およびCDKAプロモーターにcDNAを連結したCDKA遺伝子をcdka-1に導入し、花粉第二分裂に異常が見られる表現型に対する相補性を評価して、原因遺伝子であることを明確に示した。また、CDKAの161番目のスレオニンはリン酸化による活性制御を受けることが知られている。そこで、161番目のリン酸化の生理機能を解析するため、リン酸化できないアラニンに置換したT161A変異体と、リン酸化を模倣するグルタミン酸に置換したT161E変異体を作製し、雄性配偶体形成過程における表現型に対する相補性を評価した。その結果、T161A変異体では相補できないのに対して、T161E変異体では相補することが明らかになった。現在、発芽後の細胞分裂におけるCDKAの機能解析を行うために、温度感受性変異型CDKAを作製して、cdka-1に導入している。酵母や動物の知見から、温度感受性を示すと予想されるアミノ酸を置換した変異型CDKAにGFPを融合させてCDKAプロモーターの制御下に発現するバイナリーベクターを作製した。GFPを融合したCDKA遺伝子をcdka-1に導入して、花粉第二分裂の異常を相補することからGFP融合CDKAが機能することを確認した。得られた形質転換植物体は制限温度下においてCDKA欠損型の表現型を示すことが期待され、今後この植物体を解析することによって発芽後のCDKAの機能を調べる計画である。真核生物の細胞周期を制御するサイクリン依存性

キナーゼCDKAはシロイヌナズナには1遺伝子しか存在せず、本研究ではそのT-DNA挿入変異体であるcdka-1の機能解析を行った。解析の結果、cdka-1では雄性配偶体における花粉第二分裂を遂行できず、本来雄原細胞が2個の精細胞に分裂する過程に異常を来して1個の精細胞的な精様細胞になることを明らかにした。また、CDKAの161番目のスレオニンのリン酸化の生理機能を解析するため、リン酸化を模倣するグルタミン酸に置換したT161E変異体を作製し、雄性配偶体形成過程における表現型に対する相補性を評価した。その結果、T161E変異体はcdka-1を相補することが示され、CDKAのT161のリン酸化が雄性配偶体の形成過程で重要な役割を担っていることが示唆された。一方、CDKAの優性の抑制変異体である146番目のアスパラギン酸をアスパラギンに置換したD146Nをcdka-1に導入したところ、少なくても雄性配偶体形成過程ではdominant-negativeな表現型を示さず、むしろcdka-1を相補する結果が得られた。したがって、雄性配偶体形成過程ではCDKAの活性化は花粉第二分裂の細胞分裂には必要ではない可能性が示唆された。現在、温度感受性変異型CDKAの形質転換植物体の解析を行っており、今後この植物体を詳細に解析することによって発芽後のCDKAの機能が明らかになることが期待される。
差動位相シフト量子鍵配送システムの高性能化に関する研究

量子力学の原理に基づき絶対に安全な暗号通信を実現する量子暗号、特に簡便さを特長とする差動位相シフト(DPS)量子鍵配送(QKD)に関連する技術について研究した。システム性能(伝送距離、データ速度)を向上させる改良版の考案・性能評価、現実の状況に即した状況下でのシステム性能評価、などを行った。また、実用性の高いQKD方式として、通常の光通信システムの装置構成を用いて量子暗号通信を実現する新しいQKD方式を提案・性能評価を行った。代表者研究者考案による差動位相シフト(DPS)量子鍵配送(QKD)に関すれ研究を中心的に進めている。H25年度は以下の項目に関し研究を行った。(1)DPS-QKDに対する連続クリック攻撃:前年度、実用レーザ光源を用いるDPS-QKDに対する連続クリック攻撃について検討し、純粋コヒーレント光を用いる場合より盗聴に強い見通しを得た。この検討をさらに進め、論文化した。(2)量子/古典信号多重システム:QKDでは量子チャネルと古典チャネルが使用される。両者を1本のファイバで波長多重伝送できれば効率的であるが、自然ラマン散乱がその障害となることが知られている。この課題に関して検討し、量子信号光と古典信号光の波長間隔を狭くすると、ラマン散乱の影響を低減できることを明らかにした。(3)DPS-QKDに対するブラインド攻撃:超伝導単一光子検出器を用いるDPS-QKDシステムに対する盗聴法として、高パワー光を検出器に入射するブランド攻撃が提案されている。これに関して検討し、ハンディ型光パワーメーターによる簡便なモニター法により盗聴検知可能であることを示した。(4)APD単一光子検出器:APD単一光子検出器はQKDのシステム性能を決めるキーデバイスであるが、その高速動作化を妨げる要因としてアフターパルスが知られている。これまでその対策がいくつか提案・開発されているが、いずれも動作速度が固定という欠点があった。この課題に関し、ローパスフィルタを挿入するだけという簡便な構成により、動作速度フレキシブルにアフターパルスを抑制する手法を提案し、原理確認実験を行った。代表者研究者考案による差動位相シフト量子鍵配送(DPS-QKD)方式に関連する研究を中心に進めている。H24年度は主に、DPS-QKDに対する盗聴で用いられるUnambiguous State Discrimination(USD:誤りのない状態識別)に関する検討、QKD/古典信号多重伝送システムに関する検討、強度変調/直接検波によるQKD方式の提案と性能評価、を行った。(1)DPS-QKDに対しては、USDを用いた連続クリック攻撃が最も強敵であることが知られている。そこでは従来、被測定状態であるコヒーレント光の絶対位相は既知とされていたが、実際のシステムでは位相揺らぎのある光源が用いられるため、この前提は成り立たない。そこで、位相が揺らいでいる信号光に対するUSDについて検討し、従来の想定より識別能力が低いことを明らかにした。(2)従来のQKDでは単一光子または微弱コヒーレント光が送受信され、その受信系が実装上の制限要因となっている。そこで、通常の光通信で用いられている強度変調/直接検波と同一の送受信装置を用いてQKD機能を実現する方式を提案し、シミュレーションにより数10km程度のQKD伝送が可能であることを示した。(3)QKDでは、量子チャンネルとともに鍵生成処理のための古典チャンネルが使用される。通常、両者は異なる経路で伝送されるが、これを同一伝送路上で多重できればシステムの利便性が向上する。そこで、両チャンネルを同一波長で時間多重伝送または偏波多重伝送するシステムについて検討した。その結果、時刻同期信号を送ることは可能であるが、各種情報を双方向伝送するにはレーリー散乱が障害となることを示した。(4)その他、強度変調DPS-QKDについて、特定の条件下でのシステム性能を評価した。また、APD光子検出器を実装し、広ゲート電圧印加時の出力特性を観測した。量子力学の原理に基づき究極的に安全な安全性を保証する量子暗号(正確には量子鍵配送-QKD-)の研究が進められている。本研究課題は、本代表者研究者考案による差動位相シフト量子鍵配送(DPS-QKD)と呼ばれるQKD方式の性能向上及びその周辺技術に関する。この研究課題に関し、主に以下の項目を実施した。なお、最後の2項目がH26年度に主に行った内容である。1.現実的光源を用いたDPS-QKDの性能評価:従来の研究では理想的光源を想定した盗聴法が検討されていたのに対し、位相揺らぎのある現実的光源を用いたDPS-QKDの盗聴耐性を検討した。その結果、従来想定よりも長距離化が可能であることを明らかにした。2.強度変調DPS-QKD:信号光パルス列をフレーム化し、各フレームの平均光子数をランダムに割り当てる改良方式の提案/性能評価を行い、従来方式より長距離化が可能という結果を得た。3.量子/古典多重伝送システム: QKDシステムでは、量子状態を伝送する量子チャンネルと制御情報を伝送する古典チャンネルが用いられる。

この2つを時間または偏波または波長多重伝送するシステムについて検討し、量子チャンネル劣化が軽微にとどまる古典チャンネル伝送容量を明確化した。4.測定装置無依存DPS-QKD:近年のQKD研究では、光受信器の不備を利用した盗聴法に対処するため、光受信器の特性に依らないQKD方式(測定装置無依存QKD)が話題となっている。DPSの考え方によりこれを実現する方式を提案した。5.通常光パワーによるQKD:従来のQKDでは極微小パワーの信号光が用いられており、そのための高度な光受信装置が必要となる。これに対し、通常の光通信の装置構成でQKD機能を実現する方式を提案し、その性能評価を行った。性能自体を従来QDKには劣るものの低コストなシステム実装が可能である。光通信H25年度実績(4)は計画項目(i)に関わる。当初計画とは異なる手法ではあるが、より簡便な構成を新たに提案し、その基本動作確認を行った。一部目標達成と言える。計画項目(ii)については、検討は進めたものの、まとまった結果を得るには至っていない。計画項目(iii)については、当初は実験を行う予定であったが、未だ未着手という状態である。これは、同様の目的をより簡便な構成で実現する巨視的IM/DD-QKD方式の理論検討を優先したためで、当初計画を変更して実施し、現在進捗中という状況である。上記に加え、H25年度実績(1)(2)(3)の研究を行った。(1)(3)はDPS-QKD方式のシステム性能向上に関する研究、(2)はDPS-QKDのシステム化に関する研究であり、(1)(3)は所望の成果達成、(2)は一部達成、という状況である。以上のように、当初の目論見通りには進んでいない項目、当初計画を変更して行い進捗中の項目、新たに行い結果を得た項目または進捗中である項目、が混在しているが、DPS-QKDシステムの高性能化という本研究プロジェクトの主旨からすると、総じて、7-8割方の進捗状況と言える。当初計画では、H24年度は、(i)連続クリック攻撃対策としての低速位相変調DPS-QKD、(ii)盗聴検知能力を高める強度変調DPS-QKD、(iii)広ゲート幅電圧印加APD単一光子検出器、について研究する予定であった。前記実績(1)は計画項目(i)に関わる。計画では故意に位相変調するシステムを検討する予定であったが、位相揺らぎのあるコヒーレント光を用いることは位相変調と等価であることに気付き、その場合のシステム性能評価へと研究内容を変更した。その結果、従来の想定よりもUSDによる連続クリック攻撃の効果が小さくなる見通しを得た。ことさら位相変調することなく同等の効果が得られることになり、実効的に項目(i)を行ったと言える。計画項目(ii)については、特定の盗聴法に対する性能評価は行ったものの、まとまった結果を得るには至らなかった。計画項目(iii)については、APD光子検出器を実装し、それに広ゲート電圧を印加して光子検出信号を観測するところまでを行った。これは当初の予定通りである。
パルス放射線分解法による極低温化学反応の研究

1.極低温におけるイオンー分子反応エタノ-ルにベルゼンを添加した系に20ー120Kでパルス電子線を照射し、溶媒からベンゼンアニオンへのプロトン移行反応を光学吸収測定によって研究した。さらに4Kと77Kでγ線照射後のESR吸収測定も行なった。反応に著しい温度効果を見出し、低温にすると反応が抑制されることがわかった。またC_2D_5ODを用いるとC_2H_5OHの時に比べ移行反応は77Kで1/100以下に遅くなる。この著しい同位体効果は反応に5ー8Kcal/molの反応障壁を考え、トンネル効果によって透過するとしたモデルによって説明出来た。イオン分子反応はこれまで気相で主に研究されており、活性化エネルギ-は零であり、温度効果や同位体効果は見られず、トンネル効果の関与も考えられない。極低温固相では気相とは異なり、本研究で初めて低温イオン分子反応におけるトンネル効果を指摘した。2.水素原子・分子トンネル反応に対する回転量子状態の影響極低温においてパラH_2とオルトH_2の回転量子状態はそれぞれJ=0と1である。4K固体pーH_2とnーH_2(oーH_275%)を用いてH+H_2(J=0,1)→H_2+Hトンネル反応に対する回転量子状態の影響を調べた。その結果H_2(J=0)の方がH_2(J=1)よりもトンネル反応の速度が3ー4倍速いことを見出した。これはトンネル反応に対する回転量子状態の影響を世界で初めて観測したものであり、直ちにアメリカおよび日本において理論家による理論計算が開始された。3.1ショット・ホトンカウンティング法によるパルス放射線分解の研究この新しい測定方法を完成させた。極低温H_2Oのパルス放射線分解を行い、極低温では77Kとは励起状態が異なってくると云う新しい現象を見出した。従来77K以下の極低温では化学反応は全く起らないと考えられていたが、粒子の波動性に基づく量子力学的トンネル効果により極低温でも反応が起ることがわかって来た。ここでは新しい極低温トンネル反応について研究した。また研究手段として高感度ホトンカウンティング法を製作した。極低温パルス放射線分解法と極低温ESR法を併用して研究した結果を実施計画の順に以下に説明する。1.ホトンカウンティング法の確立光量子の数を測定するホトンカウンティング法を立ち上げ、種々の困難を克服し、最終的にはこの方法を確立することに成功した。2.極低温におけるイオン分子反応低温エタノ-ル中におけるベンゼンアニオンへのプロトン移行反応において著しい同位体効果を発見した。これはトンネル反応の関与を示唆するものであり、イオン分子反応としては初めての例である。3.H(D)原子のトンネル反応および量子拡散4.2K H+H_2→H_2+Hトンネル反応に対し回転量子状態の影響を初めて明らかにした。また固体水素中でのH(D)原子のトンネル反応や量子拡散において重要な支配因子となる水素原子の捕捉サイトについても知見を得ることが出来た。4.極低温・凍結生細胞に対する放射線照射効果ハムスタ-細胞は生きた状態で極低温に凍結することが出来る。これに着目し生細胞の放射線照射効果を電子スピン共鳴吸収によるラジカル測定と生物学的測定とを併用して研究した。この結果、従来云われていたOHラジカルによる放射線生物影響説には疑問があり、H原子のトンネル反応やイオン反応が重要であろうと結論した。1.極低温におけるイオンー分子反応エタノ-

ルにベンゼンを添加した系に20ー120Kでパルス電子線を照射し、溶媒からベンゼンアニオンへのプロトン移行反応を光学吸収測定によって研究した。さらに4Kと77Kでγ線照射後のESR吸収測定も行なった。反応に著しい温度効果を見出し、低温にすると反応が抑制されることがわかった。またC_2D_5ODを用いるとC_2H_5OHの時に比べ移行反応は77Kで1/100以下に遅くなる。この著しい同位体効果は反応に5ー8Kcal/molの反応障壁を考え、トンネル効果によって透過するとしたモデルによって説明出来た。イオン分子反応はこれまで気相で主に研究されており、活性化エネルギ-は零であり、温度効果や同位体効果は見られず、トンネル効果の関与も考えられない。極低温固相では気相とは異なり、本研究で初めて低温イオン分子反応におけるトンネル効果を指摘した。2.水素原子・分子トンネル反応に対する回転量子状態の影響極低温においてパラH_2とオルトH_2の回転量子状態はそれぞれJ=Oと1である。4K固体pーH_2とnーH_2(oーH_275%)を用いてH+H_2(J=0,1)→H_2+Hトンネル反応に対する回転量子状態の影響を調べた。その結果H_2(J=0)の方がH_2(J=1)よりもトンネル反応の速度が3ー4倍速いことを見出した。これはトンネル反応に対する回転量子状態の影響を世界で初めて観測したものであり、直ちにアメリカおよび日本において理論家による理論計算が開始された。3.1ショット・ホトンカウンティング法によるパルス放射線分解の研究この新しい測定方法を完成させた。極低温H_2Oのパルス放射線分解を行い、極低温では77Kとは励起状態が異なってくると云う新しい現象を見出した。
低温誘導性NTR-Cの機能解明に基づく耐凍性植物の作出

本年度は下記に示す(1)(4)の項目について研究を実施した。両組換えタンパク質を0-500mM NaCl含有緩衝液内で反応させ,ゲルろ過クロマトグラフィーによる複合体検出ならびに分子量測定を行った。その結果,両タンパク質が形成する複合体ピークは塩濃度により異なる保持時間で検出された。また,100mM NaCl存在下で過酸化物分解活性が最大となったことから,本抗酸化系が環境条件により複合体形成様式を変化させ,その活性を調節する機能を持つことが示唆された。CvNTRC,CvPrx遺伝子を単独または共発現する酵母を作製し,耐凍性,耐熱性,酸化ストレス耐性試験を行った。その結果,CvNTRCのみを発現,および両遺伝子を共発現する酵母において,全ストレスに対する耐性が増大した。さらに,酸化ストレス誘導剤であるメナジオン存在下で,両遺伝子の発現による超酸化物アニオンの蓄積抑制が観算された。本成果は,植物NTRCが関与する系の耐凍性,耐熱性への効果とin vivoにおける機能を初めて明らかにしたものである。(3)植物用2遺伝子同時発現ベクターの改変pRI101-ANベクターを用い,CaMV35SプロモーターからNOSターミネーターまでの領域をPCRで増幅し,制限酵素を用いてT-DNA領域に導入することで,2つの異なる遺伝子を個別に同時発現できるベクターに改変した。CvNTRC,CvPrxの単独または両方を前項(3)のベクターに組み込み,植物発現コンストラクトを作製した。本コンストラクトをアグロバクテリウムに導入し,コロニーダイレクトPCRにより導入を確認した。今後,本形質転換アグロバクテリウムを用いてシロイヌナズナの形質転換を行い,本抗酸化系の耐凍性獲得への関与と機能を調べていく。本研究では,低温処理により耐凍性を獲得する単細胞緑藻クロレラ(Chlorella vulgaris C-27)を研究材料とし,クロレラ低温誘導性遺伝子産物である葉緑体局在NADPH依存型チオレドキシン還元酵素(CvNTRC)の耐凍性獲得への機能解明ならびに,CvNTRC遺伝子とその他耐凍性関連遺伝子の高等植物同時発現による耐凍性植物の作出を目的とした。平成20年度の研究として,(1)CvNTRCの低温条件下での発現挙動解明,(2)CvNTRCと協同して過酸化物分解に機能する2-Cys型ペルオキシレドキシン(2-Cys Prx)の同定を行った。(1)CvNTRCの低温条件下での発現挙動Northern blot analysisの結果,CvNTRC遺伝子の転写量は低温処理24時間にかけて顕著に増加した。大腸菌組換えCvNTRC蛋白質を抗原として作製した抗CvNTRC抗体を用いてWestern blot analysisを行った結果,CvNTRC蛋白質量は低温処理直後に減少し,その後低温処理24時間まで増加した。また,他のNTRアイソザイムを含むクロレラの総NTR活性は,低温処理中に蛋白質量と同様の変化を見せた。以上の結果から,CvNTRCは,耐凍性獲得時に機能するためにその転写量を増加させ、低温により分解、変性した蛋白質量ならびに活性を一定に保っていることを見出した。(2)CvNTRCと協同して過酸化物分解に機能する2-Cys Prxの同定大腸菌組換えCvNTRCを固定化したカラムを用いたin vitro pull-down assayにより,クロレラ粗酵素液中からCvNTRCと複合体を形成する21.2kDaの蛋白質を精製した。そのN末端配列は,東京農業大学新村研究室で単離されたクロレラ2-Cys Prx遺伝子(CvPrx)の推定アミノ酸配列の一部と完全に一致した。当該研究室よりCvPrx発現大腸菌の分与を受け,大腸菌組換えCvNTRCとCvPrx蛋白質を調製し,in vitroでの再構成系実験を用いて過酸化物分解活性を測定した。その活性は両蛋白質存在下で顕著であり,CvNTRC/CvPrx抗酸化系が同定された。以上本年度の成果により,植物のNTRC/Prx抗酸化系が耐凍性に機能する可能性を初めて見出した。(3)植物用2遺伝子同時発現ベクターの改変pRI101-

ANベクターを用い,CaMV35SプロモーターからNOSターミネーターまでの領域をPCRで増幅し,制限酵素を用いてT-DNA領域に導入することで,2つの異なる遺伝子を個別に同時発現できるベクターに改変した。CvNTRC,CvPrxの単独または両方を前項(3)のベクターに組み込み,植物発現コンストラクトを作製した。本コンストラクトをアグロバクテリウムに導入し,コロニーダイレクトPCRにより導入を確認した。今後,本形質転換アグロバクテリウムを用いてシロイヌナズナの形質転換を行い,本抗酸化系の耐凍性獲得への関与と機能を調べていく。
超臨界流体における同位体効果の発現とその同位体分離プロセスへの応用

超臨界流体中での大きな同位体効果が観測されたクリプタンド(2B,2,1)を固定相とし,超臨界二酸化炭素にメタノールを添加して塩化チウムを溶解させた流体を移動相とする系について,ブレークスルー方式によるクロマトグラフィー実験を行うことにより減圧して得られる溶出液中のLiの同位体比を誘導結合プラズマ質量分析計で測定した.溶出曲線におけるLi濃度とLi同位体比より,平衡分離係数と理論段相当高さを解析により算出し,圧力によって変化する溶媒和効果との相関を試みた.得られた平衡分離係数は,一例としては,10MPaの場合に1.025±0.009であり,理論段相当高さは約10mmであった.平衡分離係数については,超臨界二酸化炭素を用いずメタノール溶媒だけを用いた実験結果は1.040であったので,溶媒和効果の影響があり,圧力を変えることで平衡分離,係数を制御できることがわかった.圧力を高めた場合には,樹脂に対する吸着量が大きくなる傾向があり,理論段相当高さを小さくできることがわかった.溶出曲線におけるLi濃度とLi同位体比より,平衡分離係数理論段相当高さおよび吸着容量を解析により算出し,二酸化炭素モル分率によって変化する溶媒和効果との相関を試みた.この結果,二酸化炭素モル分率が小さくなると溶媒和の効果が大きくなり平衡分離係数を大きくできるが,吸着容量は小さくなることから,工学的な同位体分離においては,二酸化炭素モル分率すなわち溶媒和の大きさに最適値が存在することがわかった、さらに,超臨界二酸化炭素中の溶媒和の効果を理論的に解析するために,クラウンエーテルやポリエチレングリコールのように超臨界二酸化炭素に親和性を有する分子をモデル分子として,Gaussian 98による量子化学計算を実施し,実験結果を定性的に説明する結果を得た.超臨界流体中での大きな同位体効果が観測されたクリプタンド(2B,2,1)を固定相とし,超臨界二酸化炭素にメタノールを添加して塩化チウムを溶解させた流体を移動相とする系について,ブレークスルー方式によるクロマトグラフィー実験を行うことにより減圧して得られる溶出液中のLiの同位体比を誘導結合プラズマ質量分析計で測定した.溶出曲線におけるLi濃度とLi同位体比より,平衡分離係数と理論段相当高さを解析により算出し,圧力によって変化する溶媒和効果との相関を試みた.得られた平衡分離係数は,一例としては,10MPaの場合に1.025±0.009であり,理論段相当高さは約10mmであった.平衡分離係数については,超臨界二酸化炭素を用いずメタノール溶媒だけを用いた実験結果は1.040であったので,溶媒和効果の影響があり,圧力を変えることで平衡分離,係数を制御できることがわかった.圧力を高めた場合には,樹脂に対する吸着量が大きくなる傾向があり,理論段相当高さを小さくできることがわかった.溶出曲線におけるLi濃度とLi同位体比より,平衡分離係数理論段相当高さおよび吸着容量を解析により算出し,二酸化炭素モル分率によって変化する溶媒和効果との相関を試みた.この結果,二酸化炭素モル分率が小さくなると溶媒和の効果が大きくなり平衡分離係数を大きくできるが,吸着容量は小さくなることから,工学的な同位体分離においては,二酸化炭素モル分率すなわち溶媒和の大きさに最適値が存在することがわかった、さらに,超臨界二酸化炭素中の溶媒和の効果を理論的に解析するために,クラウンエーテルやポリエチレングリコールのように超臨界二酸化炭素に親和性を有する分子をモデル分子として,Gaussian 98による量子化学計算を実施し,実験結果を定性的に説明する結果を得た.超臨界流体中では,圧力を制御することによって溶媒としての強度を変化することができる.本研究では,超臨界流体を溶媒とする系で同位体効果を発現するとともに,超臨界流体の圧力を制御することで,溶媒和による同位体効果を最大化する手法を開発することを研究目的とした.超臨界流体として超臨界二酸化炭素を,同位体としてリチウム同位体を用いて,同位体分離に関する実験研究を行った.超臨界二酸化炭素と液相または固相との相平衡における同位体効果を発現するためには超臨界二酸化炭素にリチウムまたはリチウム化合物を溶解し,液相(水相または有機相)または固相(環状化合物を固定化した樹脂等)との相平衡を実現する必要がある.これらの組み合わせを海外共同研究者である米国アイダホ大学ウァイ教授と共同して検討した.米国では水溶液中のリチウムとクラウンエーテルを溶解した超臨界二酸化炭素間の相平衡におけるリチウムの平衡分配係数の測定を行ない,NMR測定によってリチウムの分配が水の分配によって大きく影響されることを確認した.研究代表者らは,日本において,塩化リチウムのメタノール溶液を超臨界二酸化炭素に溶解した超臨界流体を移動相とし,クリプタンド(2B,2,1)を固定化した樹脂を固定相とし置換クロマトグラフィーを構成することを提案した.リチウム濃度が0.5mol/lである塩化リチウムのメタノール溶液と超臨界二酸化炭素の相互溶解度を測定し,メタノールと二酸化炭素のモル比が1:1であれば,7MPa以上で均一な移動相を実現できることを確認した.また,提案した系でブレークスルー法による置換クロマトグラフィー実験を行い,同位体効果が発現できることを発見するに至った.この系でのリチウム6と7の平衡分離係数は10MPaで1.012±0.008であった.1.超臨界二酸化炭素置換クロマトグラフィーによるLi同位体分離における圧力効果の検討

昨年度の研究で超臨界流体中での大きな同位体効果が観測されたクリプタンド(2B,2,1)を固定相とし,超臨界二酸化炭素にメタノールを添加して塩化チウムを溶解させた流体を移動相とする系について,ブレークスルー方式によるクロマトグラフィー実験を行うことにより減圧して得られる溶出液中のLiの同位体比を誘導結合プラズマ質量分析計で測定した.溶出曲線におけるLi濃度とLi同位体比より,平衡分離係数と理論段相当高さを解析により算出し,圧力によって変化する溶媒和効果との相関を試みた.得られた平衡分離係数は,一例としては,10MPaの場合に1.025±0・009であり,理論段相当高さは約10mmであった.平衡分離係数については,超臨界二酸化炭素を用いずメタノール溶媒だけを用いた実験結果は1.040であったので,溶媒和効果の影響があり,圧力を変えることで平衡分離係数を制御できることがわかった.また,圧力を高めた場合には,樹脂に対する吸着量が大きくなる傾向があり,理論段相当高さを小さくできることがわかった.海外共同研究者である米国アイダホ大学C.M.Wai教授が3ヶ月間名古屋大学に滞在して共同して研究を行った.2.超臨界炭素置換クロマトグラフィーによるLi同位体分離条件の最適化上記項目をうまく説明する粒内拡散係数およびカラム内流動の効果を表す分散係数を推算するため,拡散移流方程式に基づく物質移動解析モデルを作成した.これを計算コード化することにより,Li同位体分離条件の最適化を試み,最適化手法の構築を行った.(1)昨年度までの研究で超臨界流体中での大きな同位体効果が観測されたクリプタンド(2B,2,1)を固定相とし,超臨界二酸化炭素にメタノールを添加して塩化チウムを溶解させた流体を移動相とする系について,ブレークスルー方式によるクロマトグラフィー実験を行うことにより減圧して得られる溶出液中のLiの同位体比を誘導結合プラズマ質量分析計で測定した.溶出曲線におけるLi濃度とLi同位体比より,平衡分離係数,理論段相当高さおよび吸着容量を解析により算出し,二酸化炭素モル分率によって変化する溶媒和効果との相関を試みた.この結果,二酸化炭素モル分率が小さくなると溶媒和の効果が大きくなり平衡分離係数を大きくできるが,吸着容量は小さくなることから,工学的な同位体分離においては,二酸化炭素モル分率すなわち溶媒和の大きさに最適値が存在することがわかった.(2)超臨界二酸化炭素中の溶媒和の効果を理論的に解析するために,クラウンエーテルやポリエチレングリコールのように超臨界二酸化炭素に親和性を有する分子をモデル分子として,Gaussian98による量子化学計算を実施し,実験結果を定性的に説明する結果を得た.(3)同位体分離に関する権威ある国際学会であり,米国Oak Ridge国立研究所にて開催された分離現象に関する国際ワークショップ(SPLG2003)において,本研究の成果を取り纏めて発表した.