hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
産卵回遊時のシロザケ脳内における神経ホルモン遺伝子の発現変動とその調節機構

サケの産卵回遊の時間軸により規定される「ホルモンの遺伝子発現プログラム」を明らかにするため,母川回帰にともなう脳内のsGnRH遺伝子および下垂体中の下垂体ホルモン遺伝子の発現変動を解析した.さらに,下垂体細胞の初代培養系を用いて,sGnRHおよび性ステロイドホルモンの効果を調べた.今年度はこれらの結果を原著論文2報、総説1報として公表した.なお,本研究の成果の一部を発表した国際比較内分泌会議では,最優秀ポスター賞を受賞した.内容を以下に示す.1)1997-1999年にわたり,石狩川を遡上するシロザケの脳内各領域に含まれるsGnRH-I,-II mRNA量を測定したところ,遡上にともない脳内全域でsGnRHの遺伝子発現が高まることが分かった(Journal of Neurobiology誌に掲載).2)2001-2003年にかけて,6-7月および9月にベーリング海のシロザケから採取した下垂体,血液を解析した.その結果母川へと回帰する成熟個体では,下垂体中の生殖腺刺激ホルモン(GTH)サブユニット遺伝子の発現量,血中の性ステロイドホルモン量ともに,未成熟個体の10-100倍にまで高まることが分かった(国際比較内分泌学会で最優秀ポスター賞(Jimmie Dodd Memorial Prize)を受賞).3)サクラマスの下垂体細胞を用いて,sGnRHおよび性ステロイドホルモンが下垂体ホルモンの遺伝子発現に及ぼす効果を調べたところ,性成熟の後期には,性ステロイドホルモンがプロラクチン,ソマトラクチン,および転写調節因子Pit-1の遺伝子発現を変化させることが分かった(General and Comparative Endocrinology誌に掲載).さらに同じ細胞を用いて,転写調節因子FF1およびERaの遺伝子発現を調べ,GTH遺伝子の発現調節機構についても知見を得た(投稿準備中).サケの産卵回遊の時間軸により規定される「ホルモンの遺伝子発現プログラム」を明らかにするため,母川回帰にともなう脳-下垂体-生殖腺系の動態を調べている.今年度は,産卵回遊経路にそって採取した脳,下垂体,血液試料を用いて,神経ホルモン(sGnRH)遺伝子および下垂体ホルモン遺伝子の発現変動を解析した.同時に,下垂体ホルモン遺伝子の発現調節機構について知見を得るため,下垂体細胞の初代培養系を用いて,sGnRHおよび性ステロイドホルモンの効果を調べた.今年度は以下のような結果が得られている.1)母川回帰にともなうsGnRH前駆体遺伝子(sGnRH-I,-II)の脳内部域特異的な発現変動:1997-1999年にわたり,石狩川を遡上するシロザケから採取された脳の凍結切片を作成し,そこに含まれるsGnRH-I,-II mRNA量を測定した.その結果,ほぼ全ての脳部域で,遡上にともないsGnRH mRNA量が高まることが分かった(印刷中).2)産卵回遊の開始にともなう下垂体・生殖腺系の動態:2001-2003年にかけて,6-7月および9月にベーリング海のシロザケから採取した下垂体,血液を解析した.その結果母川へと回帰する成熟個体では,下垂体中の生殖腺刺激ホルモン(GTH)サブユニット遺伝子の発現量,血中の性ステロイドホルモン量ともに,未成熟個体の10-100倍にまで高まることが分かった(投稿準備中).3)下垂体ホルモンの遺伝子発現に対する,sGnRHと性ステロイドホルモンの効果:サクラマスの下垂体細胞を成熟初期から産卵期まで4回にわたり採取し,sGnRHおよび性ステロイドホルモンが下垂体ホルモンの遺伝子発現に及ぼす効果を調べた.その結果,成熟後期,産卵期にのみ,性ステロイドホルモンがプロラクチン,ソマトラクチン,および転写調節因子Pit-1の遺伝子発現を変化させることが分かった(印刷中).サケの産卵回遊の時間軸により規定される「ホルモンの遺伝子発現プログラム」を明らかにするため,母川回帰にともなう脳内のsGnRH遺伝子および下垂体中の下垂体ホルモン遺伝子の発現変動を解析した.さらに,下垂体細胞の初代培養系を用いて,sGnRHおよび性ステロイドホルモンの効果を調べた.今年度はこれらの結果を原著論文2報、総説1報として公表した.なお,本研究の成果の一部を発表した国際比較内分泌会議では,最優秀ポスター賞を受賞した.内容を以下に示す.1)1997-1999年にわたり,石狩川を遡上するシロザケの脳内各領域に含まれるsGnRH-I,-II mRNA量を測定したところ,遡上にともない脳内全域でsGnRHの遺伝子発現が高まることが分かった(Journal of Neurobiology誌に掲載).2)2001-2003年にかけて,6-7月および9月にベーリング海のシロザケから採取した下垂体,血液を解析した.その結果母川へと回帰する成熟個体では,下垂体中の生殖腺刺激ホルモン(GTH)サブユニット遺伝子の発現量,血中の性ステロイドホルモン量ともに,未成熟個体の10-100倍にまで高まることが分かった(国際比較内分泌学会で最優秀ポスター賞(Jimmie Dodd Memorial Prize)を受賞).3)サクラマスの下垂体細胞を用いて,sGnRHおよび性ステロイドホルモンが下垂体ホルモンの遺伝子発現に及ぼす効果を調べたところ,性成熟の後期には,性ステロイドホルモンがプロラクチン,ソマトラクチン,および転写調節因子Pit-1の遺伝子発現を変化させることが分かった(General and Comparative Endocrinology誌に掲載).さらに同じ細胞を用いて,転写調節因子FF1およびERaの遺伝子発現を調べ,GTH遺伝子の発現調節機構についても知見を得た(投稿準備中).
蛋白質による膵β細胞量調節機構の解明

膵β細胞特異的C/EBPβトランスジェニックマウス(TG)に対するカルノシンの効果を検討した。4週齢から24週齢までの体重の推移は、カルノシン投与群と非投与群で優位な差はなかった。随時血糖値も、野生型マウスのカルノシン投与群と非投与群で有意な差はなかった。一方で、14週齢および16週齢においてTG群の随時血糖値は、カルノシン投与群は非投与群に比べ、有意に低下していた。随時インスリン値は、野生型、TGともに、カルノシンによる効果は明らかではなかった。しかし、TG群では血糖値が低い傾向があるため、血糖に対するインスリン分泌はカルノシン投与群で改善していると考えられた。16週齢のマウスに前日からカルノシン投与を中断して、OGTTを施行した。野生型では血糖値、インスリン値ともにカルノシンによる効果は明らかではなかった。しかし、TG群ではカルノシン投与群において、カルノシン非投与群と比較して、OGTTの60分、90分、120分で有意に血糖値が低下していた。インスリン反応はカルノシン投与群でカルノシン非投与群に対して、改善している傾向はあったが有意差はなかった。OGTTの際の初期インスリン分泌反応を15分後、30分後の血糖の変化に対するインスリン分泌の変化で評価した。TG群ではカルノシン投与によりインスリンの初期分泌能が改善している傾向があった。これが、OGTTにおける血糖値の60分以降の低下をもたらしていると考えられた。16週齢における膵β細胞量を評価したところ、野生型ではカルノシンの効果は認めなかった。TGマウスでは野生型と比較して、膵β細胞量は著明に低下していたが、カルノシン投与により有意に増加していた。カルノシンはインスリン分泌には影響を及ぼさないことが報告されており、この膵β細胞量の増加がTG群における血糖値の改善をもたらしていると考えられた。2型糖尿病発症において糖尿病発症初期からの膵β細胞量の減少が注目されている。一方、L-carnosineは脳や筋肉に多く含まれており、糖尿病腎症の発症を抑制すること、またレプチン受容体欠損マウスに投与することで、膵β細胞量を増加させることが報告されている。しかし、L-carnosineがどのような機序で膵β細胞量を増加させるのかは明らかとなっていない。そこで、膵β細胞量の減少した前糖尿病モデルマウスとして作成した膵β細胞特異的C/EBPβトランスジェニックマウスにL-carnosineを投与し、膵β細胞に対するL-carnosineの効果を解析した。12週齢および14週齢においてTG群の随時血糖値は、carnosine投与群は非投与群に比べ、有意に低下していた。インスリン値は、TG群は野生型に比べて低値の傾向であったが、carnosineによる効果は明らかではなかった。経口ブドウ糖負荷試験(OGTT)では、トランスジェニックマウスのcarnosine投与群は、非投与群と比較して、空腹時の血糖値に有意差はなかったが、グルコース負荷後45分値から血糖値が有意に低下していた。インスリン分泌は、TG群は野生型に比べて低値の傾向であった。野生型、TG群ともにcarnosine投与によってインスリン分泌能が改善する傾向ではあったが、有意な差は認めなかった。次に、膵β細胞量を評価した。トランスジェニックマウスのcarnosine投与群は非投与群に比較して、膵β細胞量が有意に増加していた。さらに、膵β細胞量増加の機序を検討するため、MIN6細胞にC/EBPβを強発現させたところ、L-carnosineによりこの発現が抑制された。以上の結果より、L-carnosineはC/EBPβの発現を抑制することで膵β細胞量を増加させていることが示唆された。膵β細胞量の調節機構膵β細胞量減少型の耐糖能異常モデルマウスであると考えている膵β細胞特異的C/EBPβトランスジェニックマウスに対して、カルノシンを飲水投与し、耐糖能や膵β細胞量に対する影響を検討した。随時血糖、インスリン、OGTT、膵β細胞量などの表現型の解析は、予定通り進行しており、カルノシンが膵β細胞量に対して、保護的に作用するという結果を得ることができた。現在、カルノシンの膵β細胞量に対する効果が直接的なものであるのか、間接的なものであるのかをマウスの膵島を単離して、評価を行っている。この評価を25年度中に終わらせる予定であったが、はっきりとした結果が未だ得られていない。カルノシンを経口摂取した場合に、各臓器でアミノ酸のプロファイルがどのように変化するのかを調べることが重要であると考えている。そこで、膵島、視床下部、肝臓、血漿、筋肉のそれぞれの組織において、メタボローム解析を予定している。また、カルノシンを投与したマウスの膵島のサンプルを蛋白レベル、転写レベルで解析し、カルノシン投与による細胞内シグナルの変化を評価していく予定であるカルノシンを投与したマウスの各組織(視床下部、肝臓、膵島、血漿、筋肉)サンプルを用いたメタボローム解析を予定していたが、未実施であったため、次年度使用額が生じた。もともと予定していた研究に加えて、前年度に予定していたメタボローム解析を実施する予定である。
高磁場MRIによる高精細位相画像を用いた脳幹神経核の鉄濃度定量法の検討

MRI画像からの鉄濃度推定のための位相画像解析ソフトウェアは完成した。また、パーキンソン病患者や健常人での撮像し、神経メラニン画像による神経メラニンの半定量測定に成功した。結果として、患者群と健常人との識別が可能となった。さらに、7 Tesla MRIでの神経メラニン画像の取得にも成功し、今後の研究の発展に繋げることができるようになった。本研究の目的は、高磁場MRIによる位相画像を用いて、脳幹神経核の鉄濃度定量法を確立し、従来のMRIでは診断が困難であったパーキンソン病などの変性疾患・精神疾患の画像診断に応用し、その病態解明や診断バイオマーカーとしての意義を確立することである。本学に設置されている高磁場3 Tesla MRIを用い、パーキンソン病患者と健常人ボランティアの神経メラニン画像および鉄濃度測定用の位相画像を撮像した。独自の画像解析ソフトウェア上で新たに解析用プログラム・アルゴリズムを開発し、まず神経メラニン画像において中脳黒質の神経メラニン濃度の半定量解析手法を確立した。本手法を用いて、パーキンソン病患者と健常人ボランティア間で神経メラニン量が有意に異なることが示された。次に、鉄濃度の定量測定に向けて、位相画像を用いた解析プログラム・アルゴリズムを作成中であり、同様の手法にてパーキンソン病患者と健常人ボランティア間での鉄濃度を半定量測定する予定である。患者データにおいては臨床的な重症度や発症からの罹病期間、MIBGシンチグラフィなどの情報を加味して、さらに検討を行う予定である。また、本学に新たに導入される超高磁場7 Tesla MRIでのデータ収集も予定している。これらの手法により、パーキンソン病患者における中脳黒質での神経メラニンおよび鉄濃度を客観的に評価することが可能となり、病態解明や早期診断におけるバイオマーカーとしての意義を確立したいと考えている。本研究の目的は、高磁場MRIによる位相画像を用いて、脳幹神経核の鉄濃度定量法を確立し、従来のMR王では診断が困難であったパーキンソン病などの変性疾患・精神疾患の画像診断に応用し、その病態解明や診断バイオマーカーとしての意義を確立することである。次に、鉄濃度の定量測定に向けて、位相画像を用いた解析プログラム・アルゴリズムを作成し、同様の手法にてパーキンソン病患者と健常人ボランティア間での鉄濃度を半定量測定した。両群で位相値に有意差は認められず、解析プログラムの改良が必要と思われた。また、本学に新たに導入された超高磁場7 Tesla MRIを用いた撮像も行った。健常人ボランティアでの神経メラニン画像の取得に成功し、位相画像も安定して得られるようになった。
ハイブリッドメソ細孔材料を利用する有機ハイドライドマイクロ燃料電池の研究開発

平成17-18年度には以下の研究成果が得られた。1)メソ細孔材料を利用する耐熱・保湿性リン酸プロトン伝導ゲルの研究開発硫酸、硝酸、塩酸を吸着したFSM-10,FSM-16およびFSM-37メソ細孔材をカルシウムリン酸ゲル膜に複合した場合のプロトン伝導度1050倍に増大してNafion^【○!R】膜に比べて高いプロトン伝導度が得られた。リン酸や硫酸の吸着量やメソ細孔径が及ぼすプロトン伝導度の増大に関する固体NMRデーター解析を行った結果、メソ細孔内でのプロトン伝導は、吸着ブレンステッド酸濃度よりは、メソ細孔壁のシリケートスルフォン酸基を経由するプロトンホッピング機構に基づくことを推定した。2)多孔質酸化物材料を利用するMoカーバイド担持白金触媒の作成と有機ハイドライドの水素供給性能評価メソ細孔シリカ材料(FSM-16)およびアルマイトモノリス基板にモリブデン酸アンモニウム塩から含浸担持し500°C焼成後、メソ細孔内壁やアルマイト表面にMoO_3をコートした多孔質複合酸化物材料を作成した。これに0.5-2.5%白金担持触媒を調製した。250-350°Cでメチルシクロヘキサンの脱水素化反応を調べた結果、水素生成速度は、白金のみの担持触媒に比べてMo2C複合白金担持触媒の方がPt当たりの活性が約3-10倍増大することがわかった。作成された硫酸・硝酸を吸着したメソ細孔材料と複合したリン酸カルシウムゲル膜を利用した燃料電池を組み立ててイソプロパノールを用いて60°C,80-150mW/cm^2出力性能を再確認するとともにハイブリッドメソ細孔材料を利用する有機ハイドライドマイクロ燃料電池に関する研究成果のとりまとめを行った。平成17年度は以下の研究を行った。1)メソ細孔材料を利用する耐熱・保湿性リン酸プロトン伝導ゲルの研究開発まず有機基成分を(-CH_2-)_nSO_3H(n=2,3,4)及びフェニレン基にSO_3H基を持つ有機・無機ハイブリッドメソ多孔質材とFSM-16などのメソ細孔材にリン酸、硫酸などを吸着添加したカルシウムリン酸ゲル膜のプロトン伝導度を交流インピーダンス法により室温-80°Cで測定を行った。その結果、リン酸プロトン伝導体ゲルに対するリン酸や硫酸を吸蔵したメソ細孔シリカ材料(FSM-16,MCM-41)やSO_3H基含有ハイブリッド無機・有機メソ細孔材料(HMM-1)を添加することにより、プロトン伝導度は1050倍に増大してNafion^<【○!R】>膜に比べて高いプロトン伝導度が得られた。リン酸や硫酸の吸着量、保湿度についての最適化を行い、メソ細孔内でのプロトン伝導機構について解析した。メソ細孔径には依存せず、細孔壁表面積に比例してリン酸吸着メソ細孔材料の添加によりプロトン伝導度は顕著に増大した。作成されたリン酸カルシウムゲル膜を利用した燃料電池を組み立てて60°C,80-150mW/cm^2出力性能が得られた。2)メソ細孔材料を利用する金属カーバイドナノチューブの作成とナノ構造制御白金触媒の研究

メソ細孔シリカ材料(FSM-16,MCM-41)にMoO_3やWO_3を500°CでCVD担持して、メソ細孔内壁をMoO_3やWO_3をコートした複合酸化物メソ細孔材料を作成し、これに500-650°Cでメタンあるいはブタンと水素との混合ガスを反応させてメソ細孔内でMoあるいはWカーバイド細線、粒子及びチューブ構造のカーバイド(Mo_2C, W_2C)を作成した。これに0.5%白金担持して作成したPt/Mo_2C触媒は、Pt/Al_2O_3に比べてPt当たりのシクロヘキサン脱水素活性は約25倍程増大した。平成18年度は17年度成果に基づき以下の研究を行った。1)メソ細孔材料を利用する耐熱・保湿性リン酸プロトン伝導ゲルの研究開発硫酸、硝酸、塩酸を吸着したFSM-10,FSM-16およびFSM-37メソ細孔材をカルシウムリン酸ゲル膜に複合した場合のプロトン伝導度1050倍に増大してNafion【○!R】膜に比べて高いプロトン伝導度が得られた。リン酸や硫酸の吸着量やメソ細孔径が及ぼすプロトン伝導度の増大に関する固体NMRデーター解析を行った結果、メソ細孔内でのプロトン伝導は、吸着ブレンステッド酸濃度よりは、メソ細孔壁のシリケートスルフォン酸基を経由するプロトンホッピング機構に基づくことを推定した。2)多孔質酸化物材料を利用するMoカーバイド担持白金触媒の作成と有機ハイドライドの水素供給性能評価メソ細孔シリカ材料(FSM-16)およびアルマイトモノリス基板にモリブデン酸アンモニウム塩から含浸担持し500°C焼成後、メソ細孔内壁やアルマイト表面にMoO_3をコートした多孔質複合酸化物材料を作成した。これに0.5-2.5%白金担持触媒を調製した。250-350°Cでメチルシクロヘキサンの脱水素化反応を調べた結果、水素生成速度は、白金のみの担持触媒に比べてMo2C複合白金担持触媒の方がPt当たりの活性が約3-10倍増大することがわかった。作成された硫酸・硝酸を吸着したメソ細孔材料と複合したリン酸カルシウムゲル膜を利用した燃料電池を組み立ててイソプロパノールを用いて60°C,80-150mW/cm^2出力性能を再確認するとともにハイブリッドメソ細孔材料を利用する有機ハイドライドマイクロ燃料電池に関する研究成果のとりまとめを行った。
ＤＮＡ複製開始制御における新規機構の解析

HBO1は細胞周期の促進因子であるがDNAダメージ下においての制御機構は良く解っていなかった。我々は細胞周期を抑制するためにDNAダメージ後、HBO1が分解されることを証明した。HBO1 Ser50/53はUV照射後ATM/ATRによりリン酸化され、CRL4/DDB2によりユビキチン化される。Ser50/53をアラニンに変異させたHBO1変異体はUV照射後、ヒストンH3 Lys14のアセチル化を維持し、細胞周期制御を失わせた。これらの結果はHBO1がDNAダメージチェックポイントの標的であり、ユビキチン依存的HBO1分解はUVに対する生存率に寄与することを示していた。我々はDNA損傷修復の際に、dNTPs供給経路の律速酵素リボヌクレオチドレダクターゼ(RNR)が損傷部位に集積することを見出している(Genes Dev. 2010 24:333-338)。この損傷部位への局在にはヒストンアセチルトランスフェラーゼ(HAT),Tip60に依存することを報告した。この発見に基づきDNA複製の際にもRNRが複製起点に局在し、dNTPsの局所的な供給を行う可能性について検討した。Tip60と同じMYSTfamilyに属するHATであるHBO1は複製開始前複合体(pre-RC)のORCおよびCDTIと結合し、複製起点近傍のピストンをアセチル化してDNA複製のヘリカーゼと考えられるMCM複合体のローディングを促すことが報告されている(Genes Dev. 2008 22:2633-2638, Molecular Cell 2010 37:57-66)。このHBOIとRNRが複合体を形成しRNRが複製起点にリクルートされるか否かについて調べたところ、HBOlとRNRの間に結合は認められなかった。しかしながらHBO1はDNA損傷後にリン酸化されるHATであることを見出し、このリン酸化がチェックポイントにより制御されていることを検討した。ヒトHBO1には5カ所S/TQ配列が存在するがこのうちATM/ATR依存的にリン酸化される部位を特定した。この部位得意的リン酸化抗体を作成し検討したところ、HBO1はDNAダメージ後にこのS/TQ部位がリン酸化され複製起点から遊離することが明らかとなった。このためまだMCMヘリカーゼがローディングしていない複製起点におけるライセンシングを抑制し、損傷修復までDNA合成の開始を抑制する新規機構の存在を明らかにした。真核生物の細胞が増殖する時に遺伝情報がコードされている染色体DNAは細胞分裂毎に厳密に一回だけ複製されなければならない。DNA複製の過不足はただちに遺伝情報の変異を誘発し、癌などの疾病の発症原因となる。細胞はDNA複製の厳密さを担保するために複製起点をライセンシング化している。我々はDNA損傷がG1期に発生した時にDNA修復が完了するまでライセンシングを抑制する機構が存在するのではないかと考えて、チェックポイントにより制御されうるライセンシング因子を探索した。この結果、ATM/ATRはチェックポイント機構に重要なキナーゼであるが、このキナーゼの基質となるコンセンサス配列pSQ/TQがUVダメージ後にリン酸化されるライセンシングco-factor, HBO1ヒストンアセチルトランスフェラーゼを同定した。HBO1はCDT1依存的に複製起点にリクルートされ、周辺領域をアセチル化することによりMCM複合体のローディングを促すと報告されている。我々はHBO1のリン酸化の意義を明らかにするために解析を行った結果、ATM/ATR依存的なHBO1のリン酸化はHBO1の複製起点からの解離に必須であることを見出した。また、このリン酸化を阻害するとUV照射後においてMCM複合体のクロマチンへのローディングを抑制できず、DNAダメージ後のG1からS期への細胞周期停止に欠陥をきたすことがわかった。この原因を明らかにするためHBO1とCDT1の結合部位をFluoChase assayを用いて検討するとHBO1はCDT1のダメージ依存的分解に必須であるPIP boxを含む領域に結合している事を明らかにした。このためリン酸化の阻害によりHBO1が複製起点に維持され続けるとCDT1の分解を抑制するのであろうと予測される。哺乳動物細胞のDNA複製は数多くの分子が時空間的に秩序だってはたらくことで正確に全DNA領域を複製する。これまでに基本的なメカニズムは解明されてきているが、DNA損傷に応答した細胞内の反応は未知の部分が存在する。我々はDNA損傷時にこれを感知し、応答反応を惹起するチェックポイントキナーゼであるATM/ATRの基質であることが示唆されているヒストンアセチルトランスフェラーゼ(HAT)、HBO1のリン酸化修飾とDNA損傷反応に関わる機構について解析を進めてきた。HBO1は複製起点に結合するORC複合体と相互作用するHATとして同定された。その後HBO1はCDT1依存的に複製起点にリクルートされ、ヒストンのアセチル化をすることでMCM複合体のローディングを促す、pre-RC促進因子であることが明らかにされた。HBO1はプロテオミクス解析により放射線照射後にATM/ATRによりリン酸化される基質であることが示唆されたが、その修飾の意義は明らかではない。我々はこの点を解明することを目的として解析を行った。その結果、HBO1のSer50, Ser53はどちらもその後にGlnと続くSQ配列であり、様々なDNA損傷ストレスによりリン酸化が亢進することを示した。

このリン酸化はATMおよびATRをノックダウンすると抑制されること、またそれぞれのキナーゼの特異的阻害薬によってもリン酸化が抑制されることからATM/ATR依存的なリン酸化であることを示した。DNA損傷によりATM/ATRによりリン酸化されるためこの修飾は細胞周期進行に対して抑制的に機能すると予想し既知のpre-RC形成に関する影響を検討した。その結果HBO1のリン酸化はCDT1との結合を解除し、CDT1のPIP boxを露出させることにより分解へと導くことを明らかにした。HBO1はDNA複製開始時においてpre-replicative complex (pre-RC)を促進するヒストンアセチルトランスフェラーゼ(HAT)である。Pre-RC形成過程においてCDT1依存的に複製起点周辺のヒストンをアセチル化することによりクロマチン構造の可塑性を増し、MCMヘリケース複合体のローディングを促進していることが報告されている。このHBO1は放射線照射後にATM/ATRによりリン酸化を受けることが示唆されている。我々は紫外線(UV)によるDNA損傷後にもHBO1がATM/ATR依存的にリン酸化を受けることを明らかにした。リン酸化されたHBO1はCUL4/DDB2ユビキチンライゲースによりユビキチン化されproteasomeにより分解される。この分解はUVにより損傷を受けた細胞がG1期に止まりDNA修復を完了するために必要であり、リン酸化されないHBO1変異体を発現させた細胞ではヒストンH3リジン14のアセチル化が減少せず、DNA損傷後のS期への進行が検出され、それと共にアポトーシスする細胞が顕著に増加した。この結果よりATM/ATR依存的HBO1リン酸化はCUL4/DDB2によるHBO1分解を促すことによりDNA複製開始を抑制し、細胞周期停止を行うための新規機構であると考えられる。HBO1は細胞周期の促進因子であるがDNAダメージ下においての制御機構は良く解っていなかった。我々は細胞周期を抑制するためにDNAダメージ後、HBO1が分解されることを証明した。HBO1 Ser50/53はUV照射後ATM/ATRによりリン酸化され、CRL4/DDB2によりユビキチン化される。Ser50/53をアラニンに変異させたHBO1変異体はUV照射後、ヒストンH3 Lys14のアセチル化を維持し、細胞周期制御を失わせた。これらの結果はHBO1がDNAダメージチェックポイントの標的であり、ユビキチン依存的HBO1分解はUVに対する生存率に寄与することを示していた。研究開始時に予測していたATM/ATRによるHBO1を介したDNA複製抑制機構の解明はほぼ達成できた。この研究の過程においてHBO1のリン酸化がユビキチン依存的分解にも重要な修飾であることが示唆され、これについても明らかにすることでより包括的な生理機構を示すことが出来ると考えているため。27年度が最終年度であるため、記入しない。細胞周期2015年度においてDNA損傷に応答したHBO1の分解機構を明らかにしたいと考えている。DNA複製に関して促進するHBO1の分解が細胞の増殖抑制に如何に関与しているのかをHBO1欠損細胞をゲノム編集技術を用いることで作製し、非リン酸化
マダニ生物活性分子組換え体ウイルスを用いた抗マダニワクチンとバイオ殺ダニ剤の開発

マダニはヒト以外の動物では第1位に、またヒトでは蚊に次いで第2位に重要な疾病媒介節足動物であり、マダニとマダニ媒介性疾病によって世界の畜産が蒙っている経済的被害額は毎年70億米ドルの巨額にのぼる(FAO,1995)。加えて、地球温暖化や国際交易増大によるマダニ分布域の変容・拡大と、マダニ媒介性の新興・再興感染症の出現は、先進国と途上国に共通する新たな大問題となっている。DDTが発明された1950年代以降、マダニとその媒介疾病の防圧はもっぱら各種の化学物質を殺ダニ剤として用いることによって行われてきた。しかし、近年、化学的殺ダニ剤に対する抵抗性マダニの出現、残留殺ダニ剤による環境・食物連鎖の汚染、強化された安全性試験による新規化合物開発経費の高騰などの問題が深刻化している。このため、現行のマダニ対策は抜本的な見直しを迫られており、化学的殺ダニ剤に代わりうる安全性・有効性・経済性に優れた新たなマダニ防除技術の開発が、今や世界的に焦眉の急務となっている。このような社会的ならびに学術的背景に鑑み、本研究は、第1には、マダニの生存に重要な役割と機能を発揮する物質(マダニ生物活性分子tick bioactive-molecules : TBMと総称)の探索と特性解明を行い、ワクチン候補物質としての可能性を検証し、有効性が示されたTBMの遣伝子は、ヘルペスウイルスに導入し抗マダニウイルスベクター組換えワクチンとして、免疫学的マダニ防除の目的に活用することである。第2には、TBMの特性解明の過程で組換え蛋白作成目的に利用したAcNPVなどのバキュロウイルス組換え体について、殺ダニ活性を検証し、バイオ殺ダニ剤としての可能性を追求することである。そして、最終的にはこれらの成果に立脚し、抗マダニワクチンとバイオ殺ダニ剤の併用によって、化学的殺ダニ剤に極力依拠しないマダニ防除を実現することを、究極の目的とするものである。平成18年度においては、マダニ臓器別のcDNAライブラリー4種を活用した統合クラスターリングを実施し、この結果に立脚したマグロアレイを構築した。さらにこのマイクロアレイを活用し、吸血とイヌバベシア(Babesia gibsoni)感染によって、唾液腺と中腸においてそれぞれ発現が著しく上方あるいは下方調節されるマダニ生物活性分子(TBM)遣伝子群の網羅的解析を実施した。

しかし、近年、化学的殺ダニ剤に対する抵抗性マダニの出現、残留殺ダニ剤による環境・食物連鎖の汚染、強化された安全性試験による新規化合物開発経費の高騰などの問題が深刻化している。このため、現行のマダニ対策は抜本的な見直しを迫られており、化学的殺ダニ剤に代わりうる安全性・有効性・経済性に優れた新たなマダニ防除技術の開発が、今や世界的に焦眉の急務となっている。このような社会的ならびに学術的背景に鑑み、本研究は、第1には、マダニの生存に重要な役割と機能を発揮する物質(マダニ生物活性分子tick bioactive-molecules : TBMと総称)の探索と特性解明を行い、ワクチン候補物質としての可能性を検証し、有効性が示されたTBMの遺伝子は、ヘルペスウイルスに導入し抗マダニウイルスベクター組換えワクチンとして、免疫学的マダニ防除の目的に活用することである。第2には、TBMの特性解明の過程で組換え蛋白作成目的に利用したAcNPVなどのバキュロウイルス組換え体について、殺ダニ活性を検証し、バイオ殺ダニ剤としての可能性を追求することである。そして、最終的にはこれらの成果に立脚し、抗マダニワクチンとバイオ殺ダニ剤の併用によって、化学的殺ダニ剤に極力依拠しないマダニ防除を実現することを、究極の目的とするものである。平成15年度においては、マダニの唾液腺cDNAライブラリーを作製し、マダニ吸血による家兎抗マダニ血清を用いたイムノスクリーニングによって新たな生物活性分子として、VCPを発見した。また、既存のマダニ胚cDNAライブラリーのイムノスクリーニングによって、カテプシン、セリンプロテアーゼ、コンドロイチン硫酸トランスフェラーゼなどの精製とクローニングに成功した。現在これらの局在、発現動態、特性などの解明を図っている最中である。マダニはヒト以外の動物では第1位に、またヒトでは蚊に次いで第2位に重要な疾病媒介節足動物であり、マダニとマダニ媒介性疾病によって世界の畜産が蒙っている経済的被害額は毎年70億米ドルの巨額にのぼる(FAO,1995)。加えて、地球温暖化や国際交易増大によるマダニ分布域の変容・拡大と、マダニ媒介性の新興・再興感染症の出現は、先進国と途上国に共通する新たな大問題となっている。DDTが発明された1950年代以降、マダニとその媒介疾病の防圧はもっぱら各種の化学物質を殺ダニ剤として用いることによって行われてきた。このような社会的ならびに学術的背景に鑑み、本研究は、第1には、マダニの生存に重要な役割と機能を発揮する物質(マダニ生物活性分子tick bioactive-molecules:TBMと総称)の探索と特性解明を行い、ワクチン候補物質としての可能性を検証し、有効性が示されたTBMの遺伝子は、ヘルペスウイルスに導入し抗マダニウイルスベクター組換えワクチンとして、免疫学的マダニ防除の目的に活用することである。
有限群のモジュラー表現の研究

有限群Gを一つ与える。BをGのp-ブロックとし、DをBの不足群とする。さらにHをDの正規化群、fを(G,H,D)に関するGreen対応とおく。次の2つの条件を仮定する;(1)DはTI-setである。(2)hd(f(Mi))は既約である(1≦i≦r)。ただし、M_1、...。MrはBの既約なkG-加群の代表系。kは標数pの代数的閉体。この定理の証明はやや巧妙で、Robinsonによる既約加群の誘導加群がいくつ主直既約加群を直和因子も持つかという結果が最終的に鍵となって証明される。上の定理で(ii)の条件はもしAlperin予想が正しければ必ず成り立つ。従ってこの予想の成否に関する一つの必要条件を与えたことになる。仮定(1)、(2)は例えばD=Z/(p)のときにはOKであり、やや強いが現実に起っている。現在この仮定をなるべく弱めることを研究中である。以上が研究代表者自身による研究実績の概要である。
細胞増殖因子の作用機構とトランスホーメーションの研究

細胞の代謝、増殖や分化の生理的過程は、ポリペプチド性増殖因子によってもたらされるシグナルで調節されている。一方、癌細胞の自己増殖をもたらす因子、TGFも見出されている。本研究班は、多様な増殖因子に関して生化学的性状、生物学的作用の分子機構を追究することによって、細胞のトランスホーメーションと癌細胞の異常増殖の関連を解明しようとしている。本年度において、清水はEGFのエンドサイト-シス過程で見出された新しいオルガネラ、マイトソームを部分精製し、その生化学的性状を解析して特徴的な蛋白成分から構成されていることを示した。梅田は癌患者尿中にTGF-β様の活性を認めただけでなく、新しい増殖阻害因子の存在も見出した。平井はTGF-γ2の生合成過程を解析し、癌細胞では細胞内プロセッシングの受け方が異なることを明らかにした。西川はローダミン肉腫由来のDSFの性状解析を進め、EGFとレセプターの相互作用の解析に必要な数種の抗EGFモノクローナル抗体を作製した。春日はIGF-Iレセプターのリン酸化と細胞骨格蛋白の関与を明らかにした。矢追は、トリ胚細胞表面から遊離される糖ペプチドがインスリンやIGF-Iに結合し、細胞増殖を抑制することを見出した。伊藤はEGF作用に関して、細胞膜のラッフリングが【Li^+】イオンによる蛋白脱リン酸化で制御されていることを見出した。瀬川は、ポリオーマウイルスT抗原のリン酸化とオンコジンH-rasの発現を検討した。桑野はEGFのエンドサイトーシス変異株とTGF-βによる増殖調節の関連を解析した。河野はEGFやFGFで誘導される42Kのリン酸化蛋白を見出し、そのシグナル伝達との関連を追究した。このように2年次の目標はそれぞれ達成でき、3年次での総合的な発展が期待できる。
哺乳類の受精における卵と精子の相互作用に関する研究

本研究班はそれぞれのメンバーが随時互いの研究室を訪れて共同研究を行ってきた。この3年間に得られた結果は以下の通りである。(1)本研究の中心課題であった精子の超活性化について、ハムスター、モルモット、ウシ、サルを用いて色々な面から検討が加えられてきた。高速度ビデオ装置等による鞭毛波形の観察から、超活性化をおこすと中片部が大きく曲がるようになって非対称的な運送を示し、さらに先体反応をおこすと一層曲がりやすく振幅も大きくなるが対称的な運動になることが分かった。また精子先体に緑色蛍光を発するGFPタンパク質を発現する形質転換マウスを利用してこの間の経過を追った。(2)超活性化はハムスターやウシではプロカインによって、またモルモットではリソレシチンによって誘起されることが分かった。(3)精子の運動状態には停止状態、弱い活性化状態、強い活性化状態、超活性化状態があり、それぞれに特異的なタンパク質がリン酸化されることが明らかになった。(4)超活性化の初期にはカルシウムの働きで非対称性の波が起こる。またcAMPによって中片部の対称的な振幅の大木運動がひきおこされる。カルシウムの貯蔵場所は鞭毛基部の特殊な構造であることが示されたが、遊離したカルシウムはミトコンドリアの活性を高めて超活性化を支えていると思われる。(5)卵透明帯を通過しつつある精子の鞭毛は対称な振幅の大きな屈曲を作っていることが観察され、このような運動によって精子が透明帯を通過するための充分な推力が与えられることが明らかになった。(6)運動活性化過程におけるグルコースの役割が解析され、また精子鞭毛運動のモーターであるダイニンの軽鎖2本がTctex遺伝子に相当することが示された。(7)この他、精子や精子形成細胞の卵細胞質内注入によるマウスの作成、死体から得られたマウス精子の受精能についての研究などが行われた。本年度は3年計画の初年度に当たるので、まず全員の顔合わせとこれからの研究の方向を討議することを第一の目的とした。まず8月末に研究代表者の毛利がハワイ大学においてアメリカ側の代表者である柳町と全体的な打合わせを行った。その結果研究協力者として新たにA.I.Yudinを加えること、12月始めに岡崎において全員による会議を開くことが決定された。岡崎の会議には、アメリカ側1名を除き全員が集まり、これまでの各人の研究結果と、今後の共同研究のあり方について討議した。また引続き東京において、Yudinによる、ハムスター精子の透明帯通過を顕微鏡下で観察する方法のデモンストレーションが行われ、各人の今後の研究の参考とした。これとは別に、奥野と石島はコ-ネル大学においてSuarezと共同研究を行い、それぞれプロカインで誘起したウシ精子の超活性化の波形の観察と、ハムスター精子の超活性化の鞭毛運動の解析を行った。これらについてはSuarezが来日した時に結果の検討が行われた。また奥野はハワイ大学においての柳町との共同研究から、モルモット精子の超活性化をリソレシチンで同調性よく引き起こさせることに成功した。おくれて来日したStewart-Savageは、奥野と共に超活性化したハムスター精子の運動がグルコースにより一時的に阻害されることに着目し、その運動波形の観察を行った。

この他にも各人の研究室で、超活性化に伴う特定タンパク質のリン酸化、精子先体に存在するPH-2.0の透明帯との結合および通過における役割、先体反応と超活性化との関係の解析、鞭毛ダイニン軽鎖とマウスのt-complexとの関係などが追究されており、超活性化についての理解が進みつつある。諸般の準備もととのったので、平成10年度には、透明帯通過時における超活性化精子の力の測定を行って、その意義を明らかにする予定である。今年度は以下のような成果が得られた。1)ハムスターとサルの精子を用いて、超活性化と先体反応の鞭毛運動に対する影響を調べた。受精能獲得用溶液で培養3時間でほとんどのハムスター精子は鞭毛屈曲の非対称性のため頭を大きく振る円運動を示し、更に1時間後先体反応がおこると、中片部の異常な屈曲も加わり前進しなくなることが分かった。サルでも同様であった。2)ハムスター精子がグルコースにより一時的にその運動が阻害される現象につき解析がなされた。エネルギー代謝系に何らかの作用をしていると考えられる。また運動活性化の際にタンパク質のリン酸化だけでなく、脱リン酸化される低分子ダンパク質の関与が示唆された。3)ウシ精子と軸卵管上皮苧の結合が先体の細胞膜にあるレクチン様の分子を介しておこることを明らかにした。この分子はフコースを認識する。精子が受精能獲得すると、フコースへの結合能が失われ、精子は上皮から離れる。4)精子の先体部分に緑色蛍光タンパク質を発現させて、先体反応を非侵襲的に観察できる系が確立された。今後の解析に用いる予定である。5)t-ハロタイプ・マウスは非メンデル型遺伝をしてもハロタイプが集団に残るが、この現象に関与するTctex遺伝子の2つが、精子鞭毛運動のモーターであるダイニンの2本の軽鎖に相当することが明らかにされた。6)カナダのモントリオールで第8回国際精子シンポジウムが行われた機会を捉えて、ほとんどの班員が集まり、現況報告と今後の方針についての検討を行った。(1)精子の超活性化に関しては、ハムスターでの高速度ビデオ装置による記録から、受精能を獲得して超活性化すると中片部が大きく曲がるようになり、さらに先体反応をおこすと一層曲がりやすく大きな振幅を示すようになることが分った。また屈曲の仕方も非対称的な運動から対称的な運動へと変化した。しかし蛍光タンパクGFPを先体に発現させたマウスで観察したところでは、先体反応の前後でこのような変化はみられていない。超活性化はハムスターおよびウシでプロカインによって誘起された。(2)精子の運動の活性化については、停止状態、弱い活性化状態、強い活性化状態、超活性化状態に応じてそれぞれに特異的なタンパク質のリン酸化がおこることが明らかになった。超活性化では80kDaのタンパク質がリン酸化され、このタンパク質は鞭毛主部に局在する。(3)超活性化の初期ではカルシウムの働きによって非対称の波形が観察される。またcAMPによって中片部の対称な大きな振幅の運動がひきおこされる。カルシウムの精子内の貯蔵場所は鞭毛の基部にある特殊な構造であることがハムスターやウシの精子で明らかになった。(4)遊離したカルシウムはミトコンドリアに働きATP生産を高めて超活性化を支えると考えられる。(5)卵の透明帯を通過しつつある精子の運動の観察から、鞭毛は対称な振幅の大きな屈曲を作りながら通過していることが分かった。このような運動により精子が透明帯を通過するのに必要な推力が与えられることが明らかになった。
顔面骨骨切り後の骨成長に関する基礎的研究

『頭蓋顔面骨に自律的成長制御能があるか否か』を調べる為,微小血管吻合方を用いて,幼若ラットの頭部を同系ラットの鼠蹊部に移植したモデルを考案作製した.本モデルの特徴は,従来の『骨移植モデル』に見られたような(1)移植骨周囲の瘢痕,(2)血行動態の著しい変化,がない点にある.本モデルを用い,鼻骨,上顎骨,口蓋骨および下顎頭の成長制御について検討を加えた.評価方法としては, (1)実体顕微鏡による測定,(2)規格X線撮影を利用した測定,(3)非脱灰研磨標本CMR法,(4)同骨ラベリング法, (5)脱灰標本オートラヂオグラフィー法,などの各方法を用いた.結果は以下の通りである.1.移植後5週以上にわたって,鼻骨,上顎骨,口蓋骨にsutunaldeposit outward remodeldnoが認められた.これよりこれらの顔面骨は少なくともある程度の自律的成長制御能を持っていることが示唆された.特に,従来外力によって生じると考えられてきたsuturaldepositが外力が全く働いていないと考えられる移植頭の顔面骨に見られたことは極めて興味ある所見と言える.2.移植後2週目まで下顎頭軟骨の増殖が認められた.ただしその後はこの増殖層も側方から骨によって置換された.一方,内軟骨性骨化を思わせる所見はこの移植頭ではほとんど見られず,この内軟骨性骨化には外力が必要なことが示唆された.ついでこれは当初の計画にはなかったものであるが,本モデルが長時間完全脳虚血モデルとして有用であることが判明した為,脳虚血の実験を併せ行った.その結果は以下の通りである.1.同じ阻血時間では, 10日令ラットの方が3週令ラットよりも脳障害が少なかった.これより日令の若い程脳は虚血に強いことが示唆された.2.虚血中頭部を冷却することより脳損傷が軽くなることが示された.『頭蓋顔面骨に自律的成長制御能があるか否か』を調べる為,微小血管吻合方を用いて,幼若ラットの頭部を同系ラットの鼠蹊部に移植したモデルを考案作製した.本モデルの特徴は,従来の『骨移植モデル』に見られたような(1)移植骨周囲の瘢痕,(2)血行動態の著しい変化,がない点にある.本モデルを用い,鼻骨,上顎骨,口蓋骨および下顎頭の成長制御について検討を加えた.評価方法としては, (1)実体顕微鏡による測定,(2)規格X線撮影を利用した測定,(3)非脱灰研磨標本CMR法,(4)同骨ラベリング法, (5)脱灰標本オートラヂオグラフィー法,などの各方法を用いた.結果は以下の通りである.1.移植後5週以上にわたって,鼻骨,上顎骨,口蓋骨にsutunaldeposit outward remodeldnoが認められた.これよりこれらの顔面骨は少なくともある程度の自律的成長制御能を持っていることが示唆された.特に,従来外力によって生じると考えられてきたsuturaldepositが外力が全く働いていないと考えられる移植頭の顔面骨に見られたことは極めて興味ある所見と言える.2.移植後2週目まで下顎頭軟骨の増殖が認められた.ただしその後はこの増殖層も側方から骨によって置換された.一方,内軟骨性骨化を思わせる所見はこの移植頭ではほとんど見られず,この内軟骨性骨化には外力が必要なことが示唆された.ついでこれは当初の計画にはなかったものであるが,本モデルが長時間完全脳虚血モデルとして有用であることが判明した為,脳虚血の実験を併せ行った.その結果は以下の通りである.1.同じ阻血時間では, 10日令ラットの方が3週令ラットよりも脳障害が少なかった.これより日令の若い程脳は虚血に強いことが示唆された.2.虚血中頭部を冷却することより脳損傷が軽くなることが示された.1近交系ラットを用いた頭蓋顔面骨成長の研究前年度の実験結果を基に新しくプロトコールを作製、今回は顔面骨の成長について研究を行った。その結果、(1)顔面骨には、それ自体成長制御能が備っていること(2)骨縫合は、従来考えられていたことと異なり、周囲からの外力が必ずしも働かない状況でも成長することが明らかとなった。尚今後の予定として同一モデルを用い(1)下顎骨および顎関節の成長に関する研究(2)骨縫合を中心として成長機序の解明に向けての基礎的研究を行ってゆく予定である。2同上モデルを用いた脳阻血に関する研究本年度の実験により(1)日齢12日と21日のラットでは、12日齢のラットのほうが虚血に対する耐性を持っていることが示唆された。(2)日齢12日のラットでは2時間の虚血により脳の完全な変性を生じることが示された。の結果を得た。尚今後更にデータを整理して報告してゆく予定である。
表面機能性を有する新規温度応答性ナノミセルの分子設計と薬物キャリアへの応用

分子量制御した温度応答性高分子鎖と疎水性高分子鎖からなるブロックコポリマーを合成し、種々の官能基を温度応答性高分子鎖末端に導入することで、表面機能型温度応答性高分子ミセルを作製した。ミセル表面に蛍光基を導入することにより、ミセルの相転移温度以上で細胞内への移行が著しく増大することを明らかにした。また、スルホンアミド誘導体を導入することで、生体内の低pH環境に応答して相転移を引き起こす薬物キャリアを構築した。可逆的付加-開裂型連鎖移動ラジカル重合をより、水酸基を持つ連鎖移動剤存在下、N-isopropylacrylamideとN,N-dimethylacrylamideの共重合をおこない、a位に水酸基基、w位にジチオエステル基を有する温度応答性高分子を合成した。このポリマーのα末端のヒドロキシル基からD,L-lactideを開環重合した(数平均分子量=11300)。得られたブロックコポリマーの温度応答性高分子鎖末端のジチオベンゾエート基をアミノ分解でチオール基に置換した後、Oregon Green maleimideと反応した。このブロックコポリマーを用いて、表面に蛍光基を持つ温度応答性高分子ミセルを作製した。ミセルを含む培養液(最終濃度200μg/ml)でウシ血管内皮細胞を37°Cおよび42°Cでインキュベートし、共焦点レーザー顕微鏡(CLMS)およびフローサイトメトリーを用いて温度変化によるミセルの細胞内移行の違いを評価した。CLMS観察では、ミセルの相転移温度(LCST)より低温の37°Cでは蛍光標識ミセル由来の蛍光がほとんど観察されなかった。一方、LCST以上の42°Cでは核の周辺部を中心に細胞全体的に粒子状の蛍光が観察された。フローサイトメトリー測定による細胞内取り込み量を検討した結果、37°Cでは顕著な細胞内取り込みは観察されなかったが、42°Cでは時間経過と共にミセルの取り込み量が増加し、約6時間で飽和することが明らかとなった。以上の結果より、温度変化によるミセルの細胞内移行の違いを利用することで、薬物や遺伝子の細胞内導入を温度変化で制御できる可能性が示唆された。Poly(benzylmethacrylate)(PBzMA)とPoly(N-isopropylaclylamide-co-N, N-dimetylacrylamide)(P(IPAAm-co-DMAAm))が連結したブロックコポリマーをRAFT重合により合成した(数平均分子量9000, monomerunits : IPAAm/DMAAm/BzMA=21/12/13)。得られたブロックコポリマーの温度応答性高分子鎖末端のジチオベンゾエート基をアミノ分解でチオール基に置換した後、pHにより親水性/疎水性が変化するacryloyl sulfadimethoxine (SDM, pKa=6.2)基をマイケル付加反応により導入した。SDM末端を有するブロックコポリマーを用いて作製した高分子ミセルは約20nmの単分散な粒径分布を示した。各pHにおけるミセルの表面電位の違いを検討したところ、低pH側になるにしたがい、表面電位が消失していくことが明らかとなった。この結果は、ミセル表面のSDM基がプロトン化することにより、アニオン性から非荷電になったためであると考えられる。次にpH変化(pH8.5-5.0)にともなうミセルの温度応答性挙動の違いに検討した。pH応答性部位であるSDM基を表面に有するミセルでは、低pH側になるにしたがい、ミセルのLCSTが約39°Cから約23°Cの範囲で低温側に大きくシフトすることが明らかとなった。これは低pHになることで表面に存在するSDM基がプロトン化することにより荷電が消失し、疎水性になることでミセル外殻を構成するIPAAm誘導体の脱水和を著しく促進したためであると考えられる。以上の結果より、ミセル表面にpH応答性基を導入することで、pHにより温度応答性挙動を制御するマルチシグナル応答型の高分子ミセルを構築することが可能となった。
染色体バンド境界に着目した神経可塑性の遺伝学的分子基盤の解明

我々のグループが開発した新規エピゲノム解析法をもとに、各種神経系由来のヒト細胞系列を対象に、体系的なDNA複製タイミングの解析を行い、染色体バンド境界部位を塩基配列レベルでゲノム網羅的に特定し、各細胞ごとに染色体バンド境界地図を作成した。その染色体バンド境界地図の比較解析により、ヒト染色体の構造的クロマチン境界と考えられる染色体バンド境界領域には、神経シナプス関連遺伝子群や脳神経疾患遺伝子群が集中して局在することを再検証することができた。また、染色体構造とゲノム配列の統合を目指した研究から、極端に長いシナプス関連遺伝子群や脳神経疾患遺伝子群が局在するバンド境界の位置は、塩基配列レベルでエピジェネティクに変移することが判明し、記憶の可塑性の分子基盤と関連していることが示唆された。結論として、ヒト染色体のバンド境界領域の特殊な構造環境は、神経シナプス機能と密接に関連した神経可塑性の分子基盤や脳神経疾患の発症メカニズムと密接に関連した特殊な生物学的機能を併せもつ重要な染色体機能領域であることを実証することができた。また、染色体バンド境界の持つ特殊事情の解明により、ヒト染色体バンド境界に関する分子レベルでの医学的な解析は、脳神経疾患の病因の分子機構を知る手がかりを与えるだけでなく、あらたな脳神経疾患と関連した病因遺伝子を能率的に探索する方法としても発展する可能性があることが示唆された。これまでの一連の研究成果については、分担著書として発表することができた。これまでの研究から、染色体バンド境界領域の特殊な構造環境は、神経シナプス機能と関連した神経可塑性の遺伝学的な分子基盤と密接に関連する重要な染色体機能領域であることが実証され、記憶ダイナミズムの分子基盤とも関連していることが示唆されたことが主な理由である。また、染色体バンド境界の持つ特殊事情の解明により、ヒト染色体バンド境界に関する分子レベルでの医学的な解析は、脳神経疾患の病因の分子機構を知る手がかりを与えるだけでなく、あらたな脳神経疾患と関連した病因遺伝子を能率的に探索する方法としても発展する可能性があることを検証することができたことも理由としてあげられる。さらに、これまでの一連の研究成果を分担著書として発表することができた。これまでの研究成果をもとに、さらに高精度のヒト染色体バンド境界地図を再構築して、ゲノム網羅的に特定したバンド境界領域に共通する塩基配列を抽出し、境界を特徴づけるシグナル群が存在するかを明らかにする。また、あらたに脳神経疾患と関連した病因遺伝子を能率的に探索する方法の開発に関する研究についても進めていく予定である。(1)DNA複製タイミングとGC含量分布を指標にしたヒト染色体のバンド境界領域のゲノム網羅的な特定ならびに“染色体バンド境界地図"の作成した。具体的には、ヒト由来の神経由来細胞を含む各種細胞系列群について、DNAマイクロアレイを用い、ゲノム全域を対象にした複製タイミングの解析を行った。また、GC含量の区分境界(Isochore border)と複製タイミングの転換を基準にして、各種細胞系ごとに染色体バンド境界を網羅的に塩基配列レベルで特定する。その結果をもとに、各細胞ごとに“染色体バンド境界地図"の作成した。(2)極端に長いシナプス関連遺伝子群や脳神経疾患遺伝子群に着目した細胞系列間での“染色体バンド境界地図"の比較解析を行った。その結果、異なる細胞系列間で、バンド境界のエピジェネティクな位置の変移を起こすことが判明した。ヒト染色体のバンド境界領域は、脳神経機能の分子基盤、神経シナプス機能やその可塑性のメカニズムなどの遺伝学的な分子基盤と密接に関連していることが判明した。バンド境界領域を軸としたヒト染色体バンド構造は、脳神経機能の分子基盤、神経シナプス機能やその可塑性のメカニズムなどの遺伝学的な分子基盤と密接に関連していることが判明し、その重要性が明らかになったため。これまでの研究から、神経シナプス機能や脳神経疾患と関連した遺伝子群は、ゲノム上にランダムに局在しているのではなく、ある特定のゲノム領域に局在していると推測された。そこで、我々のグループが開発したエピゲノム解析法を駆使して、神経系由来を含む各種ヒト細胞系を対象に、DNA複製タイミングの解析を行い、染色体バンド境界領域を塩基配列レベルでゲノム網羅的に特定した。また、解析した各種細胞系ごとに“染色体バンド境界地図"を作成し、細胞系列間での比較解析を行った。具体的な方法としては、DNAマイクロアレイを用い、ゲノム全域を対象にした複製タイミングの解析を行った。またGC含量の区分境界(Isochore border)と複製タイミングの転換を基準にして、各種細胞系ごとに染色体バンド境界を網羅的に塩基配列レべルで特定した。その解析結果をもとに、染色体バンド境界地図を作成し、細胞系列間での比較解析を行った。その結果、極端に長いシナプス関連遺伝子群や脳神経疾患遺伝子群は染色体バンド境界に集中して局在していることを判明した。また、脳神経疾患遺伝子群においてしばしば検出されるトリプレットリピート伸長を起こすゲノム不安定性部位は、染色体バンド境界と密接に対応していることがわかった。これまでの研究結果から、ヒト染色体バンド境界に関する分子レべルでの医学的な解析は、脳神経疾患の病因の分子機構を知る手がかりを与えるだけでなく、あらたな脳神経疾患と関連した病因遺伝子を能率的に探索する方法としても有効であることがわかった。これまでの研究結果から、ヒト染色体の“バンド境界領域"は、神経シナプス機能と密接に関連した記憶ダイナミクスの分子基盤や脳神経疾患の発症メカニズムと密接に関連した特殊な生物学的機能を併せもっていることを実証できたため。