hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
α-シヌクレインの発現を抑制する薬剤スクリーニング研究

薬剤スクリーニングで選出された、α-シヌクレイン(α-Syn)の発現を抑制する2種類の化合物(A・B)を基に、15種類の類似構造化合物、60種類の類似作用化合物を選出し、スクリーニングを行った。その結果、特に、一定の芳香環を持つ化合物が、α-Synの発現に影響を及ぼすと考えられ、より効果と安全性の高い薬剤選出への方向性が示された。一方で、α-Syn脳内接種モデルマウスに化合物A・Bを投与し、異常α-Synの伝播抑制効果の検証も行った。α-Syn脳内接種モデルマウスに関しては、既存のマウスよりも数倍α-Syn伝播速度の速いモデルマウスの作製に成功した。薬剤スクリーニングで選出された、α-シヌクレイン(α-Syn)の発現を抑制する2種類の化合物(化合物A・B)を基に、15種類の類似構造化合物と60種類の類似作用化合物を選出し、それぞれ同様にルシフェラーゼ活性と細胞毒性をスクリーニングした。その結果、類似構造化合物に関しては、いずれも化合物A・Bと同様の傾向を示した。類似作用化合物に関しては、化合物A・Bと同様の傾向を示すものもあったが、むしろ低用量でα-Synの発現量を倍増させるものがあり、作用機序の二面性を伺わせる結果であった。一方で、化合物投与に使用するモデル動物に関しても改良を行った。以前までは、野生型マウス、もしくはヒトα-Synとその発現調節領域を含む細胞人工染色体トランスジェニックマウス(α-Syn-BAC Tgマウス)にα-Syn凝集体を脳内接種していたが、α-Syn凝集体の脳内伝播の程度が少なく、薬効効果の検証が難しい可能性があった。これに対し、ある特定の遺伝子変異を導入したマウスにα-Syn凝集体を脳内接種すると、α-Syn凝集体脳内伝播の程度が強く、薬効検証が十分期待できる結果となった。化合物A・Bの類似構造物および類似作用化合物のスクリーニングを行った。ルシフェラーゼアッセイを用いたスクリーニングでは、類似化合物は、概ね化合物A・Bと同程度のルシフェラーゼ活性抑制効果を認めたが、化合物A・B以上に効果が期待できるものはなかった。類似作用化合物は、低用量ではむしろα-Synの発現を促進させるものを数種類確認した。これらの化合物は受容体を介して作用している可能性があった。しかしながら、化合物A・B処置後のSH-SY5Y細胞、HeLA細胞でのRT-PCRを再検したところ、α-SynのmRNA量に変化が確認できず、再現性がとれなかった。このため、細胞培養や薬剤処置の条件を再検討することとなり、研究の進行が遅れている。類似作用化合物に関しては、化合物A・Bと同様の傾向を示すものもあったが、低用量ではα-Synの発現量を増加させるものもあり、至適濃度が重要と考えられた。また、スクリーニングに使用した細胞は神経線維芽細胞株であったが、これは化合物投与によりわずかに分化し、α-Syn量が変化して実験の再現性に影響を及ぼす可能性が考えられた。このため、神経線維芽細胞株を神経細胞に分化させてα-Syn量を一定にし、化合物の薬効を再検証した。一方で、α-Syn脳内接種モデルマウスに化合物A・Bを投与し、異常α-Synの伝播が抑制されるかどうかの検証も行った。α-Syn脳内接種モデルマウスに関しては、複数の遺伝子改変マウスにα-Syn脳内接種を行い、野生型マウスよりも数倍α-Syn伝播速度の速いモデルマウスの作製に成功した。化合物A・Bは脂溶性薬剤のためジメチルスルホキシドを溶媒に使用する必要があったが、α-Synの発現抑制効果のある濃度まで化合物A・Bを投与するためにジメチルスルホキシド濃度を上げると、マウス生体への毒性が強くなり、目標量の投与は難しかった。今後は、より低用量での投与が可能な薬剤をスクリーニングする予定である。まず、化合物A・Bのα-Syn転写抑制効果を、RT-PCRで再現できるように、条件検討を継続する。化合物A・Bによるα-Synの転写抑制効果が再現できた場合、計画していた、抑制機序の解明およびモデル動物への投与による薬効検証を行う。

パーキンソン病薬剤スクリーニングにて選出した候補化合物(化合物A・B)の、タンパクレベルおよびmRANレベルでのα-Syn抑制効果の再現性が得られず、条件検討を継続していたため、予定していた実験に着手する事ができず、試薬等の購入を見合わせていた。ボトルネックとなった実験の再現性がとれれば、予定していた試薬や物品の購入を行う。
電荷移動型交互性の主鎖を有するπ共役系高分子の合成とナノスケールでの組織制御

チオフェン環のような電子余剰環とピリミジン環のような電子欠如環からなる電荷移動型交互性の主鎖構造を有する高分子は興味深い電子・光機能を有しており、その電荷移に基づくstack構造などの興味ある高分子組織体を形成することが期待される。本研究では、有機金属的手法を用いてチオフェンとピリジンやチオフェンと溶解性向上のための置換基を導入したキノキサリン誘導体との交互共重合を行い、種々の電解移動型π共役高分子を合成した。得られた高分子の紫外・可視吸収スペクトルにおいて最大吸収波長は対応するホモポリマーのそれよりも長波長側に観測された。また、溶液状態よりもフィルム状態の方が大きな長波長シフトが見られたが、キノキサリン上の置換基として嵩高いフェニル基が2つ含むものよりも、アルキル基のような比較的嵩高くない置換基を有する方が紫外・可視吸収スペクトルにおける最大吸収波長の長波長シフトが顕著であった。これらは電解移動型高分子がstackingによる三次元的な組織体を形成していることを示唆している。サイクリックボルタモグラムでは、p型ド-ピングとp型脱ド-ピング間に大きな電位差が観測された。これはドナーのp型ト-ピング時に高分子フィルムにおいてナノスケールでの組織変化を伴うエレクトロクロミズム機構が関与しているためと考えられる。さらに、得られた電荷移動型ポリマーはstack構造に基づく比較的大きな三次非線形感受率(約5×10^<-11>esu)を示した。
運動効果獲得の個体差を理解するための骨格筋エピジェネティクス研究

若齢期における高脂肪食摂取の影響がその後どの程度残存するのか検討した。1ヵ月齢の雄マウスに3ヵ月齢までの期間、高脂肪食(総エネルギーの約60%が脂質由来)またはコントロール食を摂取させた。3ヵ月齢からは通常食に戻し、13ヵ月齢までの期間毎月ハングテストによる筋力評価およびグルコース液腹腔内投与による耐糖能評価を実施した。高脂肪食摂取により筋力は有意に低下し、その後5ヵ月間低下したまま保たれた。空腹時血糖は高脂肪食摂取により約1.5倍まで増加したが、1カ月から7ヵ月後までは逆に低値となった。グルコース液投与から2時間後の血糖値は高脂肪食摂取により有意に増加した。1カ月後にはこの値はコントロールレベルに戻ったが、8ヵ月から10ヵ月後までの期間は耐糖能がコントロール群よりも改善された。高脂肪食摂取直後と10カ月後に前脛骨筋をサンプリングし、2型糖尿病に関連する遺伝子発現を知らべた。その結果、PDK4やUCP3遺伝子発現が高脂肪食摂取により増加し、10ヵ月後も高発現を維持したままであることが分かった。GLUT4遺伝子発現は、高脂肪食摂取により低下したが、10ヵ月後にはコントロールレベルまで戻った。PDK4やUCP3遺伝子座にはアセチル化ヒストンやH3K4me1修飾が多く認められることも分かった。以上の結果から、高脂肪食摂取により発現誘導される遺伝子発現が残存することで、加齢に伴う耐糖能低下を抑制したと示唆される。2018年度に計画していた実験は概ね実施できた。まだ最終的なデータは得られていないが、当該年度はH2B-GFPマウスを用いた再生筋の機能評価実験も計画されており、十分な予備実験ができた。筋再生中におけるサテライト細胞の過増殖が、損傷後に再生した筋線維が肥大しにくい原因であると仮説を立てている。それを検証するために薬剤投与実験を行っている。薬剤の効果も仮説どおり得られており、現在本実験を実施しているため、研究全体としては総じて順調に進んでいると評価できる。再生筋機能に関する研究は以下のように進める。1薬剤投与によりサテライト細胞の過増殖を抑制した場合の影響を調べる。また、筋再生中に顕著に増加するヒストン修飾(2018年度に特定済み)とサテライト細胞増殖または再生筋線維サイズとの関係、筋系細胞の融合因子であるmyogenin遺伝子座のエピゲノム変化を調べる。2上記の実験において筋再生中に出現するサテライト細胞をGFP強度によって分画し、培養条件下において自己複製能・筋分化能を測定する。3増殖頻度に依存してサテライト細胞で増加するヒストン修飾を阻害薬を用いて抑制し、再生筋線維の肥大機能との関係を調べる。以上の一連の実験から「筋損傷歴」がどのような原因で将来の筋肥大機能を低下させるのか明らかにできる。2019年度は運動歴を有するマウスを用いた実験も行う。本研究では運動による骨格筋のエピゲノム変化について2016年度から2017年度まで検討を行った。他の実験モデルと比較するためマウスを使った実験が必要であることと、トレッドミルを用いた運動ではミトコンドリア代謝能が大きく亢進するほどの運動量を与えることができなかったためである。そのため2019年度はランニングホイールを使った自発走運動によるエピゲノム変化を追究する。本テーマは、運動効果の獲得や病気のなりにくさにおける個体差を解明することを目的として、過去の様々な生活習慣が将来の刺激応答性を変化させるのか検討を行っている。平成28年度は、筋損傷後に再生した骨格筋線維の機能変化について検討を行った。骨格筋線維の形成は、胎児期の筋発生時と成熟筋ではソースになる細胞が異なることが知られている。胎児期から筋線維に融合し残存している筋核の有無によって筋機能がのように変化するのか追究するために一連の実験を実施した。初めに、成熟した動物の骨格筋において胎児筋核が残存しているか検証するため、ドキシサイクリン誘導性に骨格筋特異的にEYFPを発現するマウスを交配した(長崎大学)。この遺伝子組換えマウスの妊娠中にドキシサイクリンを投与し、出生後は通常の水で飼育した。その結果、13週齢においても骨格筋からEYFPが検出されてことから、胎児期に筋分化した筋核が成熟筋でも残存していることが明らかになった。しかし、カルジオトキシン注入により損傷・再生した筋ではEYFPの発現が消失しており、筋再生が生後に分化したサテライト細胞によって起こったことが分かる。次に、成熟ラットを用いてヒラメ筋に筋損傷を誘発した後8週間再生を促し、協働筋腱切除による過負荷を与えた。正常筋では約30%の筋線維肥大が起こったが、再生筋は肥大しなかった。筋タンパク質合成に重要な関与をすると考えられるIgf1rの遺伝子発現も、同様の傾向を示した。Igf1rの遺伝子座では転写開始点付近においてアセチル化ヒストンの分布が認められるが、再生筋では顕著に低下していた。このような肥大応答性およびヒストンアセチル化の低下は、新生児ヒラメ筋由来の細胞を移植することで改善された。以上の結果から、胎児期に出現する筋系細胞ではヒストンアセチル化レベルが高く、転写応答しやすいことが分かった。損傷後に再生した骨格筋線維の肥大応答性低下について詳細を明らかにし、論文発表まで至ることができた。さらに次のステップとして、筋再生中の筋機能低下を予防する介入実験もすでに実施済みであり、現在サンプルの解析を行っている。

介入方法として用いているのは加速度刺激であり、本テーマの主幹である「個体差を発生させる履歴」の1つとして検討する予定であった。当初の計画であれば2年目に実施予定の実験であったが、再生筋の機能評価実験が順調に進んだため、前倒しに実施している。詳細なデータは現在分析中であるものの、加速度刺激による変化も認められていることから、本テーマの進捗は当初計画よりも進展していると判断できる。前年度までの研究から、走運動歴が将来の廃用性筋萎縮を予防することが分かっている。平成29年度は、どのような運動条件が走運動によって誘発されるエピジェネティクスのトリガーになるのか検証した。成熟ラットを用いて、先行研究と同等の運動を行う(Run1)群、1日あたりの運動時間を半分にした(Run2)群、1日あたりの運動時間を2倍にし運動期間を半分にした(Run3)群に分け実験を実施した。その結果、慢性運動によって引き起こされるヒストンの置き換わりはRun1群のみで起こっており、運動量・期間ともに重要な要因であることが明らかになった。損傷歴を持つ骨格筋がどのように機能低下するのか、ドキシサイクリン誘導によりヒストン2BとGFPの融合タンパク質を発現する(H2B-GFP)マウスを用いて検討を行っている。筋損傷後の再生過程において筋幹細胞が過剰に増殖することが筋機能低下の原因であると考え、細胞の増殖頻度をGFP強度によって評価できるH2B-GFPマウスモデルを使用している。平成29年度は、マウスの交配ならびにプレ実験と本実験の一部を実施した。H2B-GFPマウスに6週間ドキシサイクリンを投与し、カルジオトキシン注入による筋損傷を前脛骨筋に誘発した。損傷前、損傷4週間後に筋サンプリングし、組織化学的解析を行った。正常側ではサテライト細胞のGFP強度は保たれていたが、再生筋ではサテライト細胞、筋核ともにGFP強度が同レベルまで低下した。また、筋核GFP強度と筋線維サイズには負の相関が認められた。新規導入したH2B-GFPマウスが非常に生まれにくく、年度当初は計画が遅れたが、現在は十分な匹数が確保できている。ドキシサイクリンによるGFP誘導、筋損傷によるGFP強度変化は予想どおりの結果となり、安定的な実験モデルができたと考えている。前年度の研究成果も現在論文の修正中であり、追加実験なども概ね終了している。以上の状況から、研究全体の計画は概ね順調に進んでいると評価できる。若齢期における高脂肪食摂取の影響がその後どの程度残存するのか検討した。1ヵ月齢の雄マウスに3ヵ月齢までの期間、高脂肪食(総エネルギーの約60%が脂質由来)またはコントロール食を摂取させた。3ヵ月齢からは通常食に戻し、13ヵ月齢までの期間毎月ハングテストによる筋力評価およびグルコース液腹腔内投与による耐糖能評価を実施した。高脂肪食摂取により筋力は有意に低下し、その後5ヵ月間低下したまま保たれた。空腹時血糖は高脂肪食摂取により約1.5倍まで増加したが、1カ月から7ヵ月後までは逆に低値となった。グルコース液投与から2時間後の血糖値は高脂肪食摂取により有意に増加した。
ヒト胆管癌細胞におけるFasを介したアポトーシスの誘導とその増強に関する検討

[結果]1)HuCCT1およびHuH28細胞において,それぞれ21.7および30.9%のFasの発現を認めた。2)CH-11は0.01-1.0μg/mlの濃度で用量依存性に、HuCCT1およびHuH28細胞の細胞数を3日間でそれぞれ最高16.4および71.7%減少させた。3)CH-11またはIFN-γを加えた細胞においては、陽性controlど同じ位置のpeakを認め、DNAの断片化が証明された。4)CH-11を加えた細胞から抽出したDNAのelectrophoresisはsmear状となった。5)CH-11またはIFN-γで処理したHuCCT1およびHuH28細胞で、核の濃縮、断片化、apoptpsis小体などapoptosisに特徴的な所見が認められた。6)HuCCT1細胞においては、4B4はCH-11による細胞数の減少に変化を与えなかった。HuH28細胞においては、4B4はCH-11による細胞数の減少を41.7%抑制した。7)IFN-γの24時間の前処置により、HuCCT1細胞ではFasの発現は17.6%増加したが、HuH28細胞ではFasの発現に変化はなかった。8)IFN-γの24時間の前処置により、CH-11によるHuCCT1とHuH28の細胞数の減少はそれぞれ41.2%および8.2%増加した。9)IL-2のみでは3日間でHuCCT1の細胞数に変化はなく、IL-2の24時間の前処置によってもCH-11による細胞数の減少に変化はなかった。IL-2のみではHuH28の細胞数は3日間で11.2%減少したが、IL-2の24時間の前処置によってもCH-11による細胞数の減少に変化はなかった。10)IFN-γは0.1-100U/mlの濃度において用量依存性に、HuCCT1およびHuH28の細胞数を3日間でそれぞれ最高45.1%およよび87.8%まで減少させた。11)HuH28細胞において、CH-11の8時間処理によりcaspase-3を検出した。[結論]ヒト胆管癌細胞においてFasが発現していること、抗FasmAbまたはIFN-γによりapoptosisが誘導されること、4B4によりCH-11のapoptosis誘導作用が抑制されること、IFN-γによりFasの発現とapoptosis誘導作用が増強されること、さらに抗FasmAbによりcaspase-3が活性化されることが明らかとなった。[方法]1)ヒト胆管癌細胞HuCCT1およびHuH28にapoptosisを誘導する作用を持たないanti-Fas monoclonal antibody(mAb),4B4を加え,さらにこのmAbに対するfluoresceinで標識された第2抗体を加えてFasの発現をflow cytometry(FCM)により分析した.

2)ヒト胆管癌細胞に0.01,0.4,4.0μg/mlのapoptosisを誘導する作用を持つanti-Fas mAb,CH-11を加えて培養し,3日後に生細胞数を測定した.3)1.0μg/mlのCH-11を加えたヒト胆管癌細胞と,陽性controlとしてDNase Iを加えた細胞を,TUNEL法を用いてfluoresceinにより標識しFCMにより分析した.4)ヒト胆管癌細胞に1.0μg/mlのCH-11を加えて3日間培養し,細胞からDNAを抽出してagarose gel electrophoresisにより分析した.5)ヒト胆管癌細胞に10μg/mlの4B4を加え24時間培養した後,1.0μg/mlのCH-11を加えて3日後に生細胞数を測定した.[結果]1)HuCCT1およびHuH28細胞において,それぞれ21.7および30.9%のFasの発現を認めた.2)HuCCT1およびHuH28細胞において,CH-11は0.01-1.0μg/mlの濃度で用量依存性に,細胞数を3日間でそれぞれ最高16.4および71.7%減少させた.3)CH-11を加えた細胞においては,陽性control細胞と同じ位置のpeakを認め,DNAの断片化が証明された.4)CH-11を加えた細胞から抽出したDNAのelectrophoresisではsmear状となった。5)HuCCT1細胞においては、4B4はCH-11による細胞数の減少に変化を与えなかった。HuH28細胞においては、4B4はCH-11による細胞数の減少を41.7%抑制した。[結論]ヒト胆管癌細胞においてFasが発現していること,anti-Fas mAbによりapoptosisが誘導されること,4B4によりCH-11のapoptosis誘導作用が抑制されることが明らかとなった.[方法]1)ヒト胆管癌細胞HuCCT1およびHuH28を200U/mlのIFN-γで24時間前処置した後、apoptosisを誘導する作用を持たない抗Fas monoclonal antibody(mAb)4B4を10μg/ml加え、さらにこのmAbに対するfluoresceinで標識された第2抗体を加えてflow cytometry(FCM)により分析した。2)HuCCT1およびHuH28細胞を200U/mlのIFN-γで24時間前処置した後、これらの細胞にそれぞれ1.0,0.1μg/mlのapoptosisを誘導する作用を持つ抗Fas mAb、CH-11を加えて3日後にtrypan blueを加えて生細胞数を測定した。3)胆管癌細胞を200U/mlのIL-2で24時間処理した後、HuCCT1とHuH28細胞にそれぞれ1.0、0.01μg/mlのCH-11を加えて3日後に2と同様に生細胞数を測定した。4)1.0μg/mlのCH-11または100U/mlのIFN-γを加えた胆管癌細胞と、陽性controlとしてDNase Iを加えた細胞を、TUNEL法を用いてfluoresceinにより標識しFCMにより分析した。5)胆管癌細胞に0.1-100U/mlのIFN-γを加えて3日後に生細胞数を測定した。6)1.0μg/mlのCH-11または200U/mlのIFN-γを加えた胆管癌細胞において、caspase-1,3,6,8をcaspase fluorometric protease assayにより測定した。[結果]1)IFN-γの前処置により、HuCCT1細胞ではFasの発現は17.6%増加したが、HuH28細胞ではFasの発現に変化はなかった。
遺伝子解析によるソリトン波の形成・維持メカニズムの解明

次世代シーケンサによりソリトン株であるKI-5株、KI-10株及びそれらの親株であるXP55株それぞれの全ゲノム配列を決定し一塩基多形(SNP)解析を行った。その結果、KI-5において75箇所、KI-10においも75箇所の塩基置換が見出された。さらに、遺伝子発現の大規模解析の結果、ソリトン現象後において16倍以上発現量が増加している遺伝子はKI-5において105遺伝子、KI-10において19遺伝子存在すること等が判明した。変異の見つかった遺伝子のうちソリトン表現型に対する責任遺伝子同定を行った。その結果、一つのものについてソリトン形質に影響があることが判明した。衝突しても形や運動量を崩さず安定に存在し続ける波(ソリトン波)は、非線形を扱う物理学や数学等の基礎研究にとって、また光通信等の工学的な応用研究にとって重要な物理現象である。これまで生物の振る舞いにソリトン波の性質が存在することは報告されていなかったが、申請者は細胞性粘菌のある突然変異体が、衝突しても形や運動量を崩さずにすり抜ける波状の細胞集団(細胞ソリトン波)を形成することを発見し、生物の細胞レベルの現象にソリトン波現象が存在することを世界で初めて報告した(Kuwayama and Ishida, Scientific Reports, 2013)。本研究では、細胞ソリトン波形成の原因遺伝子を同定しその生物的機能を解析することにより、細胞ソリトン波の物理的性質を検討することを目的とした。初年度は当初の計画通り、1遺伝学的解析、2ソリトン波関連遺伝子変異株の作製、3遺伝子発現ライブラリーの作製、4変異株への遺伝子発現ライブラリーベクターの導入を行った。その結果約2000株のスクリーニングを行ったが、目的とする復帰形質転換株を得ることはできなかった。これは予想された困難であったため、計画書にあるように最先端のDNA配列解読機器を利用しソリトン波変異株のゲノムにあるすべてのゲノム配列の解読を行った。幸い新学術領域研究「ゲノム支援」によって、全ゲノム配列の決定をしていただけることになり、ソリトン変異株2株(KI-5とKI-10)の全ゲノム配列とその親株のゲノム配列、またソリトン波形成前後における発現遺伝子配列の決定と比較を行った。その結果、KI-5とKI-10遺伝子コーディング領域内にそれぞれ99と98の変異箇所が判明した。そのうちKI-5の5つの変異遺伝子について遺伝子破壊株を作製を試み、1つの遺伝子について破壊株を得ることができた。しかしながら、この遺伝子破壊株はソリトン形質を示すものではなかったため、現在順次遺伝子破壊株の作製を行っている。次世代シーケンサによりソリトン株であるKI-5株、KI-10株及びそれらの親株であるXP55株それぞれの全ゲノム配列を決定し、それぞれ約2.4 x 107、2.6 x 107、2.1 x 107リードの配列、total bpsとしてはそれぞれ、6.0 x 109、6.6 x 109、6.1 x 107の塩基数の配列を元にbowtie2およびbwaによる相互マッピングを行い、一塩基多形(SNP)解析を行った。その結果、親株XP55とタンパク質コード領域において塩基配列の異なる箇所が、KI-5において75箇所、KI-10においも75箇所見出された。これらのうち、74箇所がKI-5とKI-10に共通の変異であることが分かった。さらに、KI-5株、KI-10株それぞれのソリトン現象前後での遺伝子発現の大規模解析の結果、ソリトン現象後において16倍以上発現量が増加している遺伝子はKI-5において105遺伝子、KI-10において19遺伝子存在することが判明した。逆に、ソリトン現象後において16倍以上発現量が減少している遺伝子はKI-5において384遺伝子、KI-10において57遺伝子存在することが判明した。これらのうちで、KI-5株とKI-10株に共通する遺伝子は、16倍以上増加するもので6遺伝子、16倍以上減少するもので24遺伝子であった。変異の見つかった遺伝子のうちソリトン表現型に対する責任遺伝子同定のため、対応する正常12を発現ベクターに組み込み、ソリトン株に発現した。その遺伝子の分子機能はこれまで報告がなされておらず、現在分子生物学的手法により遺伝子機能の解析を行っている。研究計画にあるように、初年度中にソリトン変異株の変異遺伝子の同定と原因遺伝子候補の絞り込みを行うところまで進展することができたので、おおむね順調に進展していると判断した。生物物理学同定したソリトン変異株の変異遺伝子の中から、ソリトン原因遺伝子の同定を行う。方法として、それぞれの変異遺伝子の遺伝子破壊株を作製し、それらのうちソリトン波形成の表現形を示すものを探索する。

遺伝子破壊株にソリトン波形成の表現形を示すものが見つからなかった場合、遺伝子の塩基置換がソリトン波形成に重要である可能性が考えられるので、それらの遺伝子破壊株に塩基置換した遺伝子を導入・発現させる。それらの形質転換体のうちでソリトン波を形成するものがあるかを引き続き探索する。
ウイルス性肺炎の発症メカニズム

肺炎はインフルエンザウイルス感染症における主要な死因の一つである。しかしインフルエンザウイルス肺炎の成立機序については不明な部分が多い。我々は通常アレルギー反応を引き起こす肥満細胞が、インフルエンザウイルス肺炎においても重要な役割を演じることを明らかとした。肥満細胞はインフルエンザウイルスの生体への侵入を検知し、呼吸器官で分化、増殖する。肥満細胞は肺胞マクロファージの活性化を引き起こす。また、肥満細胞ではインフルエンザウイルスの感染性を上げるタンパク質が発現しており、肥満細胞が呼吸器で増加することでウイルス増殖が高進し、マクロファージの活性化と相まって肺炎症を増悪していることが考えられる。平成25年度にはインフルエンザウイルス感染が肥満細胞を活性化するメカニズムについて研究を行う予定であった。具体的にはインフルエンザウイルス感染マウスにおける肥満細胞でのRNAseq解析と、IL-33欠損マウスを用いたインフルエンザウイルス感染実験を行うことが予定されており、これらの実験は予定通り遂行された。1.インフルエンザウイルス感染マウスにおける肥満細胞のRNAseq解析、我々は肥満細胞を欠損させたマウスではインフルエンザウイルスによる肺炎が減弱することを見出し、インフルエンザウイルス肺炎における肥満細胞の役割を明らかにする目的で、感染マウスより肥満細胞をソートしRNAseqによるトランスクリプトーム解析を行った。その結果、感染後3日目において肥満細胞でのIFN関連遺伝子の発現上昇が認められ、肥満細胞がウイルス感染により活性化されていることが明らかとなった。また、感染マウスの肥満細胞において好中球の遊走に関与するケモカインの発現の顕著な増加が認められた。これらの結果より肥満細胞はウイルス感染により活性化され好中球を遊走させるケモカインを放出することで、好中球による肺炎を増強する可能性が考えられる2.IL-33欠損マウスを用いたインフルエンザウイルス感染実験、IL-33はウイルスに感染した上皮細胞やマクロファージから放出され、肥満細胞上にはIL-33受容体が発現するため、初期感染細胞と肥満細胞を結ぶ因子である可能性がある。この可能性について検証するため、IL-33欠損マウスにインフルエンザウイルスを感染させ、肺の炎症について解析を行った。その結果、IL-33欠損マウスでは、肺の炎症が増悪することが明らかとなった。IL-33欠損マウスではウイルス感染前から肺における好酸球と好中球のバランスに異常が認められ、このことがウイルス感染時の肺炎の増悪につながっていると考えられるインフルエンザウイルスで起こる呼吸器官での炎症制御と組織障害の分子基盤を理解するために、我々はマスト細胞に着目し、マスト細胞が存在しないマウスではウイルス感染による肺での炎症症状が軽減することを見いだした。ウイルス肺炎の成立機序について明らかとするため、肺炎症に関わる自然免疫担当細胞(肺胞マクロファージ・好中球・マスト細胞)を対象として、トランスクリプトーム解析を行ったところ、マスト細胞を欠失させたマウスでは、肺胞マクロファージや好中球でおこるインターフェロン関連遺伝子やRNAウイルスのセンシングに関わるRIG-I経路関連遺伝子・ケモカインの発現が軒並み抑制傾向にあった。ウイルス感染マウスにおけるマスト細胞の動態を調べるために組織学的解析とFACS解析を行ったところ、インフルエンザウイルス感染マウスの気道ならびに肺において感染後に速やかにマスト細胞の動員が生じることが明らかとなった。また、マスト細胞のトランスクリプトーム解析では、RIG-IおよびMDA5に関連する分子の発現上昇が認められ、マスト細胞がウイルス感染に鋭敏に応答していることが明らかとなった。次にマスト細胞において、ウイルス感染に関わる遺伝子の経時的発現を探索したところ、H1N1ウイルスのヘマグルチニンを特異的に認識するセリン型のプロテアーゼTMPRSS2の発現が感染後3日でマスト細胞特異的に上昇していた。この結果よりマスト細胞が感染初期における、気道、肺での感染性ウイルスプロデューサーとして重要な役割を演じることが示唆された。一連の本研究からマスト細胞が感染初期におけるウイルス増殖とウイルスの検出の両面に重要であることが明らかとなり、マスト細胞の機能を制御することにより、インフルエンザウイルスによるウイルス性肺炎を軽減できる可能性が示された。感染免疫、ウイルス学平成25年度に予定していた実験はおおむね予定通り遂行された。インフルエンザウイルス感染マウスにおける、肥満細胞のトランスクリプトーム解析からは、肥満細胞がインフルエンザウイルス感染によって活性化され、好中球の動員するケモカインの放出を介してウイルス性肺炎を正に制御している可能性が明らかとなった。したがって、この実験に関しては、期待されていた通りの結果を得ることができており、研究は順調に進展していると評価できる。また、IL-33欠損マウスにインフルエンザウイルスを感染させ、ウイルス性肺炎を解析する実験においては、予想に反して、IL-33欠損マウスにおいて、野生型マウスに比較してウイルス性肺炎の増強が認められ、IL-33が、肥満細胞の活性化因子であるか否かを特定することはできなかった。しかしながら、この実験からIL-33が肺の好酸球ー好中球バランスの維持に重要な役割を演じていることや、このバランスの乱れが、ウイルス性肺炎の増悪につながることが明らかとなった。

この実験よりウイルス性肺炎の制御にはIL-33経路も肥満細胞とは違った形で役割を担うことが示唆されており、ウイルス性肺炎の発症メカニズムの解明という本実験課題において、非常に意義のある実験であったと評価できる。どのような因子が肥満細胞の活性化にかかわっているのかについては、初期感染細胞である上皮細胞やマクロファージのトランスクリプトーム解析が進行中であり、その結果によって補完することが期待できるため、今回の実験においてIL-33がウイルス性肺炎における肥満細胞活性化因子であることを同定できなかったことは、実験計画全体の進展においては大きな支障にはならないと考えられる。平成25年度に行った実験より、インフルエンザウイルス感染により肥満細胞が活性化され、その肥満細胞から放出されるケモカインによって好中球が動員されることでウイルス性肺炎が増強される、というスキームが示唆された。次年度においてはこの結果を踏まえ、このスキームの検証を行うことを主な目標としたい。具体的には今回同定されたキーとなるケモカインまたはケモカインレセプターの欠損マウスを用いた実験や、これらのケモカインに対する抗体を投与する実験をおこない、インフルエンザウイルス感染によって放出される、肥満細胞由来のケモカインによって動員された好中球が肺炎を引き起こすことを明確にしていく。また、インフルエンザウイルス感染がどのようにして肥満細胞の活性化を引き起こすのかを明らかとするために、インフルエンザウイルス感染マウスより、初期感染細胞である肺胞上皮細胞ならびにマクロファージをフローサイトメーターによりソートし、RNAseqによるトランスクリプトーム解析を行う。これによって、肥満細胞活性化因子の候補の絞り込みをおこなう。さらに、可能であれば、それらの候補因子を特異的抗体などを用いてブロックした状態で、インフルエンザウイルス感染実験を行い、ウイルス性肺炎を解析することによって検証することにより、因子を確定し、肥満細胞の活性化機構に迫りたいと考えている。研究遂行における課題としては、検証する対象となる因子のノックアウトマウスが存在しなかったり、抗体によるブロックが困難であったりすることが考えられる。その対処法の一つとして、CRISPRによるノックアウトマウスの作成を並行して進めていくことで、データを補完していく、もしくは検証をさらに強固なものとしていくことを予定している。
ビスマスナノプレートの磁気的および電気的特性に関する研究

ビスマスの磁気的・電気的特性のサイズ効果を調べるために、ポリオール法を用いた粒子形状およびサイズの揃ったビスマスナノ粒子の合成の条件を調査した。微量のビスマスナノ粒子の異方性磁化率を測定するために、動的な粒子の配向挙動を光学的に観察する装置の開発を行った。板状および球状ナノ粒子の異方性磁化率を精度よく測定することに成功した。異方性磁化率は粒子形状ではなくc軸の長さに対して単調に増加することが分かった。PMMA中に磁気配向させ固化したナノプレート複合体は光学定数の差異に起因する偏光透過率差と複屈折を示すことを明らかにした。1.磁気配向現象を用いた磁気的性質の解析ビスマス結晶の異方性誘電率から現れる偏光透過率の差異を利用して、板状および球状ナノ粒子の配向状態を観察する磁場中偏光評価装置の改良を行った。電源ならびに測定系全体の安定性を向上させることで、数時間オーダーの信号安定性を確保することができた。直径約400nmおよび球直径約200nmの球状ナノ粒子を適度な緩和時間が得られる粘度のシリコンオイル中に分散させ、磁場中配向の時間変化を観察した。その結果、数数百secの広いダイナミックレンジで緩和時間τを観察できることが分かった。緩和時間は磁場強度とともに短くなり、緩和時間の時間依存性から、400nmの粒子で3.6x10-5、200nmの粒子で3.2x10-5の異方性磁化率値を得ることができた。このうち、400nmの粒子の結果は過去の磁場中でのXRD実験によって得られた結果と合致した。板状ナノ粒子の実験では、形状効果が異方性誘電率よりも大きくなることから、逆の偏光特性が現れることが分かった。球状粒子と同オーダーの緩和時間とそれよりも12桁大きい緩和時間の二つの配向挙動が新たに観察された。2.ビスマスナノプレートの配向挙動と光学特性800-900nmサイズ(厚さ約50nm)のナノプレートを磁場中においてMMA中に分散させ、これを重合することによってナノプレートが配向したPMMAを作製した。X線回折を用いてナノプレートの配向状態を調べた結果、同質量の球状粒子よりも低磁場から配向が進展し、より大きな磁気異方性を有する可能性が示唆された。球状粒子が固定されたPMMAでRCWA解析を行った結果、バルクビスマスの異方性光学定数の文献では大きな偏光依存性を説明できなかった。1.ポリオール法による板状ビスマスナノ粒子の合成エチレングリコール中に溶解された塩化ビスマスを加熱還元することで金属ビスマスナノ粒子を合成し、水酸化ナトリウム、ポリビニルピロリドンおよび助剤としての塩化鉄の影響を調べた。助剤を添加しない合成では板状粒子の生成は数%以下であり、サブミクロン以下の球状粒子が生成した。ポリビニルピロリドンの添加により粒子径は減少し、200-400nmの平均粒径の範囲で変化することが分かった。反応式量の2倍以下の水酸化ナトリウムの添加では粒径分布が大きくなり安定した粒子の形成ができないことが分かった。微量の助剤の添加により60%以上の数量比で約800nm厚さ50nmの板状粒子が生成された。板状粒子のサイズにはポリビニルピロリドンの添加量の影響は顕著ではなかった。水酸化ナトリウムの減少とともに板状粒子のサイズが大きくなる傾向が見られ、500-2000nmの範囲で変化した。助剤の増加によりロッド状粒子の生成比率が増加することが確認された。このように粒子形状とサイズへの添加材の影響について明らかにすることができた。生成した粒子はX線回折により三方晶の単結晶であることを確認した。2.磁気配向現象を用いた磁気的性質の解析ビスマス結晶の異方性誘電率から現れる偏光透過率の差異を利用して、磁場中での粒子の配向変化を観察することを試みた。本年度はこのナノ粒子の配向状態を観察できる磁場中偏光評価装置を設計試作した。本装置では直流信号での観測システムを採用したため、対流や磁場中でのシステムの不安定のために正確な配向状態の磁場依存性が得られなかった。そこで、強磁場下でのX線回折スペクトルのその場観察から磁気的性質を調べた。板状粒子においても磁場とともに(110)ピークの増加が観測された。強度変化の磁場依存性から球状粒子と同じオーダーの異方性磁化率を持つことが分かった。1.磁気配向現象を用いたビスマスナノ粒子の磁気的性質の解析昨年度

試作した粘性液体中に分散されたナノ粒子の過渡的な磁気配向を偏光透過率で観測する装置の計測において、初期回転角と磁場値を多数選ぶことにより、異方性磁化率の測定精度を改善した。直径370nmおよび直径200nmの球状ビスマスナノ粒子の異方性磁化率はそれぞれ3.9×10-5および2.9×10-5となった。磁場中X線回折の磁場依存性から解析された直径400nmの粒子の異方性磁化率は3.6×10-5に近い値を得た。一方、80%以上の収率で作製可能となった直径約700nm厚さ50nm板状粒子の異方性磁化率は2.3×10-5となった。粒子の異方性磁化率はバルク値5.3×10-5よりも小さく、結晶のc軸方向のサイズに対して単調に減少することを初めて明らかにした。さらに、長い緩和時間の透過率変動が観測され、粒子同士の配列に起因することが画像のフーリエ解析から示唆された。2.ビスマス粒子の誘電的性質の解析直径約400nmの球状粒子および直径800nm厚さ50nmの板状粒子をMMA中に分散し、8Tの磁場下で配向・固化させたビスマス粒子PMMA透明複合体を作製した。複合体のX線回折から粒子はほぼ完全に配向していることを確認した。c軸に垂直な入射方向からの偏光透過率の厳密結合波(RCWA)解析を行った結果は、誘電率の異方性がバルクの値から推定される10倍以上の差があることを示唆した。さらに、球状および板状粒子複合体では屈折率差に起因する透過光に位相差が発生することが明らかになった。400nm球状粒子1個の位相差は同等厚のバルク膜で計算される位相差に比べて50分の1であった。ビスマス金属は微細化により半導体に転移してゆくことが明らかになっているが、異方性磁化率の減少や屈折率差の減少はサイズ効果によるものと推察された。材料工学磁場中におけるナノ粒子の配向挙動を光学的に観察する測定装置を構築した。数時間にわたり信号の安定性を示すことから、ナノ粒子のように磁気トルクが小さいために数百秒の長い緩和時間がかかる場合においても再現性よく解析できる事を示した。さらに、配向時の光学的異方性と形状効果による光学異方性が逆転するビスマス球状粒子と板状粒子の場合、合成時において両者が混在していても、本手法であれば分離して測定できることも示した。これらのことは、本研究の目的が達成できる一つの手法として新たに提示するばかりでなく、当該分野の発展にも役立つと考えられる。粒子径により異方性磁化率値が変化する傾向が実験からみられたことや板状粒子では2種類の配向緩和挙動があることが見出されたことは大変興味深く、粒子形状やサイズの影響を理解する上で重要な結果を得たといえる。今後理論シミュレーションを加えた現象の理解と解析を進めために着実に研究が進んでいるといえる。ナノ粒子作製では多くの合成実験を実施し、いままで不明であった、粒子形状や粒子サイズへの水酸化ナトリウム、ポリビニルピロリドン、助剤の塩化鉄の影響を初めて明らかにした。ポリビニルピロリドンはビスマス原子の凝集を抑制するが形状への影響が小さく、塩化鉄が平板性形状の形成に影響することが明らかになったことは、学術的にも興味深い結果である。磁気的性質の解析にでは配向状態を光学的に評価する装置を設計試作した。配向状態の正確な評価には改造が必要であるが、本年度はX線回折による静的な配向挙動の観察を行った。今回調べた形状の板状粒子では、ほぼ同質量の球状粒子に近い異方性磁化率を有することが分かった。
蛍光細胞分析分離装置と次世代シークエンンサを用いた水中生菌の網羅的解析技術の確立

本研究では,分離培養に依存しない解析手法として,蛍光細胞分析分離装置および次世代シークエンサーを用いて,水中の細菌叢の網羅的解析手法を確立することを目的とした。国内の浄水場から収集した処理工程水試料を用いて,確立した次世代シークエンサーを用いた手法を培養に基づく従来の遺伝子解析手法と比較した結果,手法の違いによって細菌叢に差が現れた。培養に基づく手法では,Alphaproteobacteria綱が主要だった。一方,次世代シークエンサーを用いた手法では,Alphaproteobacteria綱およびGammaproteobacteria綱が主要であり,多様な綱に属する細菌が検出された。本研究では、はじめに蛍光細胞分析分離装置を用いた水中に存在する生菌の分離手法について検討した。既往研究および染色キット記載のプロトコルを参考にして、環境微生物試料を対象に生菌・死菌染色を実施したが、蛍光顕微鏡による目視の観察では生菌・死菌サンプルの蛍光の差に大きな違いが見られなかった。蛍光細胞分析分離装置では、両者に蛍光の差は見られたものの、明確に分離されなかったため、染色条件の適正化が不可欠であると考えられた。また、実際に分離された試料を顕微鏡観察し、細胞数を計数した結果、装置上でのカウント数と必ずしも一致が見られなかったことから、装置上での分離条件についてもさらに検討を行う必要がある。次世代シークエンサを用いた水中に存在する細菌の網羅的解析技術についても検討を行った。国内複数の水道水源、浄水場工程水を対象とした。ポリカーボネイト製のメンブレンフィルターを用いて細菌の濃縮を行った後、核酸を抽出した。16S rRNAを対象としたTailed PCRを実施した後、次世代シークエンス解析(アンプリコンシークエンス)に供した。その結果、試料の種類に係わらず、簡便に膨大な細菌叢の情報を得ることができた。微生物の多様性の指標であるChao1を用いて評価した場合、1試料あたり10万リード以上得ることで、その試料中に含まれるほとんどの細菌群を捉えることができることが分かった。97%の相同性でグルーピングした場合、1試料あたり約5,000 OTUsが得られた。また、浄水場工程水で見た場合、処理が進むにつれて多様性が低下したことから、水道原水中に除去されやすい細菌とされにくい細菌が存在しており、されにくい細菌がろ過池から流出していると考えられた。水道水源や飲料水、医療用水等における細菌叢(種類)やその存在量を正確に把握することは、我が国における水衛生問題の健全性を鑑みた上で極めて重要な課題である。水中の細菌叢の解析は、従来、培養に依存した手法によって実施されてきたが、培養困難な微生物が多いこと、また検査に長期間を要することから、特に水道分野においては、網羅的な解析が行われていないのが現状である。そこで本研究では、培養に依存しない解析手法として、蛍光細胞分析分離装置(FACS)および次世代シークエンサーに着目し、水中の細菌叢の網羅的解析技術を確立することを目的としている。本年度は、主に次世代シークエンサーを用いた細菌叢の解析技術について検討を行った。国内の水道水源等から採取した水試料を対象とした。データ解析には、16S rRNA菌叢解析のパイプラインとなっているQIIMEを用いた。さらに、クローニング解析も実施し、その結果について比較を行った。次世代シークエンサーを用いた場合、1試料あたりの解析遺伝子(リード)数は10万以上となり、クローニング法と比べ非常に多く解析することができた。この結果、クローニング法では検出できないマイナーな細菌種まで検出することができた。このように、次世代シークエンサーを用いることで、網羅性が著しく向上することがわかった。また、複数の試料水における細菌叢・存在量を調査した結果、同じ属であっても種や株によって、水中での挙動が異なることを定量的に示すことができた。水道水源や飲料水、医療用水等における細菌叢(種類)やその存在量を正確に把握することは、我が国における水衛生の健全性を鑑みた上で極めて重要な課題である。水中の細菌叢の解析は、従来、分離培養および培養後の微生物の遺伝子解析に依存した手法によって実施されてきたが、分離培養困難な微生物が多いこと、また検査に長期間を要することから、特に水道分野においては、網羅的な解析が行われていないのが現状である。そこで本研究では、分離培養に依存しない解析手法として、蛍光細胞分析分離装置(FACS)および次世代シークエンサーに着目し、水中の細菌叢の網羅的解析技術を確立することを目的としている。本年度は、昨年度に引き続き、主に次世代シークエンサーを用いた細菌叢の解析技術について検討を行った。国内の水源貯水池、浄水場等から採取した水試料を試験対象とした。ポリカーボネイト製のメンブレンフィルターを用いて細菌の濃縮を行った後、CTAB法等によりゲノムDNAを抽出した。16S rRNAを増幅対象としたTailed PCRを実施した後、次世代シークエンス解析(アンプリコンシークエンス)に供した。

複数の試料水における細菌叢・存在量を上記手法で網羅的に調査した結果、採水地点、時期によって微生物群集構造が大きく異なることを定量的に示すことができた。また、同じ属であっても種や株によって、水中での挙動が異なることが明らかとなった。浄水処理工程で除去されづらい細菌種の存在を明らかとした。蛍光細胞分析分離装置を用いた水中に存在する生菌の分離手法については、検討を進めているものの、必ずしも当初の研究実施計画通りには研究は進展していない。既往文献に記載された実験条件を参考に検討を進めたが、生菌・死菌染色を実施した際に、生菌・死菌サンプルの蛍光の差に大きな違いが見られなかった。このため、染色剤の種類や染色条件を変更して検討を行ったが、生菌・死菌を明確に分離する実験条件を確立するには至っていない。次世代シークエンサーを用いた水中に存在する細菌の網羅的解析技術については、ある程度計画通りに進展している。ポリカーボネイト製のメンブレンフィルターを用いて大量の試料水を濃縮し、核酸を抽出した後に、Tailed PCR、次世代シークエンス解析(アンプリコンシークエンス)に供する手法は、水試料中の細菌叢の網羅的解析に効果的であることが証明された。また昨年度以上に多様な水試料を入手し、本手法を適用した結果、適用性の高さを証明することができた。一方、分離培養法およびノーマルシークエンサを用いた従来法と試験結果を比較する予定であり、今年度も試みてはいるが、十分に比較可能なデータを入手するには至っていないことから、次年度に行う予定である。水道原水や処理工程水試料に含まれる細菌叢の解析は,従来,分離培養および培養後の微生物の遺伝子解析に依存した手法によって実施されてきたが,分離培養が困難な微生物が多いこと,また検査に時間を要することから,あまり実施されていないのが現状である。そこで本研究では,分離培養に依存しない解析手法として,蛍光細胞分析分離装置(FACS)および次世代シークエンサーを用いて,水中の細菌叢の網羅的解析手法を確立することを目的とした。本年度は,培養に基づく従来の遺伝子解析手法と比較しながら,これまでに最適化した次世代シークエンサーを用いた手法を評価した。評価には,国内の浄水場から収集した処理工程水試料を用いた。分離培養に基づく手法では,試料を濃縮した後,R2A培地を用いて従属栄養細菌を培養した。コロニーをピックアップし,16S rRNA遺伝子を増幅対象としたPCRに供した後,PCR産物をシークエンス解析し,塩基配列を得た。得られた塩基配列について,FASTAによる相同性検索を行った。次世代シークエンサーを用いた手法では,試料の濃縮を行った後,CTAB法によりゲノムDNAを抽出した。16S rRNA遺伝子を増幅対象としたTailed PCRを実施した後,次世代シークエンス解析に供した。データ解析には,QIIMEを用いた。解析手法の違いによって細菌叢に大きな差が現れた。綱レベルで見た場合,分離培養に基づく手法では,Alphaproteobacteria綱が主要で,一部の試料ではBetaproteobacteria綱等も見られた。
テトラスパニンCD81を標的とする低分子型新規次世代リウマチ治療薬の開発

4回膜貫通型タンパク質テトラスパニンであるCD81を標的とする低分子型新規次世代リウマチ治療薬開発のため低分子化合物のスクリーニングを行った。最初にCD81分子を細胞表面に発現するSW982細胞を用いて結合試験によるスクリーニングを行った。抗CD81モノクローナル抗体と化合物を添加したところ、この抗体の結合を大きく上昇あるいは減少させる化合物が8種存在した。そこで次にこれらの化合物についてSW982細胞における炎症性サイトカインやリウマチ因子のシノビオリンの発現を減少させることを指標に2次スクリーニングを行った。その結果3種の化合物を選択した。テトラスパニンCD81を標的とする低分子型新規次世代リウマチ治療薬を開発するためのスクリーニング系の開発検討を行った。まずCD81分子を細胞表面に発現するSW982細胞を用いて結合試験に関するスクリーニング系の検討を行った。既に樹立したCD81結合モノクローナル抗体(IgGおよびIgM)を固定化したSW982細胞に反応させて、さらに別のCD81結合モノクローナル抗体を作用させたところ、これらの抗体の認識するエピトープの違いによって最初に添加した抗体の結合が減少したり増大したりすることが確認された。そこでこの系を低分子化合物のスクリーニングに応用するために、実際に上記モノクローナル抗体と低分子化合物を添加してモノクローナル抗体の結合率を調べたところ、化合物の種類によってモノクローナル抗体の結合が上昇あるいは減少した。上昇する場合、最大、化合物無添加コントロールの200%を超える検体があり、また減少する場合は50%以下に減少する検体が存在した。減少する検体については、検体が細胞自体に大きなダメージを与えていないことを確認した。結合に大きな影響を及ぼす検体についてはその効果の容量依存性を検討したが、ほとんどの検体は容量依存性を示し、最大効果を示す容量は検体によってやや異なっていた。そこでこの系を用いて1000個以上の検体のスクリーニングを実施した。その結果、結合率が200%を超える検体および50%を下回る検体合わせて8個の化合物を選別した。CD81発現細胞を用いて約1300個の化合物ライブラリーからスクリーニングを行った。結合試験の結果、抗CD81抗体の細胞表面のCD81への結合を2倍以上上昇させる、あるいは1/2以下に減少させる化合物を選別した。これらについてさらに機能試験として、関節リウマチ関連の細胞における炎症性サイトカインの発現を減少させる、あるいはリウマチ因子シノビオリンの発現を低下させるような化合物を選別するため、細胞に化合物を添加した後に定量PCR法にて遺伝子発現を解析して、最終的に3種の化合物を選別した。これらの化合物が関節リウマチ由来の滑膜細胞の増殖を抑制するかどうか調べたところ、いずれも抑制する傾向を示した。そこで現在、これらの化合物について細胞毒性評価を行って、さらに関節リウマチモデル動物に投与して治療試験を行うべく準備を進めている。研究計画では昨年度までに結合試験と機能試験の2種のスクリーニングを終えて今年度モデル動物治療試験に入ることになっているが、スクリーニングの結果、目的の条件を満たす化合物の選択に成功し、さらにこれらが滑膜細胞の異常増殖をも抑制する可能性を示すことができた。そこで今年度の治療実験に向けて準備を進めているところである。昨年度、細胞表面のCD81分子への結合に変化を生じることと炎症性サイトカインの発現あるいはリウマチ因子シノビオリンの発現を減少させることを指標に、CD81発現細胞を用いて化合物のスクリーニングを行ったが、その結果得られた3種の化合物についてさらにその性質を調べた。その結果、これらの化合物はいずれも細胞におけるシノビオリンの発現を抑制したが、濃度によっては炎症性サイトカインの発現を増大させる方向に働くものがあった。またこれらの化合物は、濃度依存的にCD81発現細胞の増殖を抑制したが、他の細胞に大きな毒性は示さなかった。現在、動物モデルを用いてこれらの化合物の治療効果の検討を進めている。さらに、これらの化合物の体内動態や安定性についても検討を行う予定である。初年度、CD81を標的とする低分子型新規次世代リウマチ治療薬の候補の一次スクリーニング系を確立し、実際にライブラリーのスクリーニングを実施して化合物の一次選抜を行う予定であったが、この目標は達成されたと判断される。有望な化合物について、様々な細胞や組織に対する毒性試験や影響評価等を実施して、容量設定や投与スケジュールを十分検討した上で、in vivoにおける治療試験を行う。また、これらの化合物の作用機序について解明を行う。生化学・分子生物学予定に従って、一次選抜した化合物について二次選抜、すなわち機能的に関節リウマチ治療効果が期待出来る化合物を選別するスクリーニングを実施する。さらに二次選抜された化合物についてモデル動物治療実験を行う。スクリーニング試験用抗体について、当初予定よりも支払金額が減少したため。特許の関係で論文投稿を次年度に見送りしたため投稿に予定した費用を繰り越した。