hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
乱流場における蒸発液滴の熱・物質移動現象の解明

本研究では,乱流場における蒸発液滴の空気抵抗力,蒸発過程,熱および物質移動現象を把握することを目的として行っている.本年度は昨年度に製作した超音波液滴浮揚装置において,浮揚する液滴周りに乱流場ならびに高温場を形成するために装置の改良を行った.改良点を以下に示す.1.ホーン形状:ホーン形状を数種類用意した.ホーン先端を平面にした場合でもホーン先端を浅皿型にしたものと同程度の安定性,最大粒径を達成することができた.2.反射板(リフレクタ):反射板側から流れを吸入するために,ハニカム状の反射板を製作した.この反射板では液滴を浮揚させることができなかった.そのため,超音波振動子側から流れを吸入し,反射板に穴を設けることにより音圧場に液滴を注入できるように変更した.3.管型:超音波浮揚装置内で形成される音圧場をガラス管で覆うようにした.また,振動子側から流れを吸入し,反射板側から排出するようにした.これより,音圧場に流れ場を生成することが可能になった.さらに,流入形路上にヒータを設置することにより,温度を制御することが可能になった.このように改良した超音波浮揚装置において,反射板の位置を変更することにより,液滴の浮揚状態の安定性,振動する場合の形状変化状態の観察を行った.画像取込ボードとCCDカメラを組み合わせて液滴の形状変化履歴を撮影できるように,システムの構築を行った.また,表面張力の異なる数種の液滴(水,エタノール,メタノール,イソオクタン,ヘプタン等)の浮揚状態を観察した.さらに,超音波振動子に与える印加電圧の値を変化させ,浮揚液滴の形状変化に与える影響を調べた.印加電圧を高めるに従い,液滴の扁平率は大きくなることが分かった.このように液滴を安定して浮揚できる状態を探しだし,蒸発液滴を浮揚させ,その蒸発履歴を観察した.蒸発履歴は直径の二乗が比例的に減少するD2乗則に一致することを確認した.本研究では,乱流場における蒸発液滴の空気抵抗力,蒸発過程,熱および物質移動現象を把握することを目的として行っており,Levitatorと呼ばれる音響効果を利用した油滴浮遊装置を用いる.Levitatorでは,超音波による音響場により液滴を浮遊させることができるため,ラグラジアン的に蒸発液滴の空気力学的特性,熱・物質移動現象を把握することができる.しかし,Levitatorは一般に市販されていないため,以下のようにLevitatorの専用設計を行った.・超音波振動子には周波数,形状からランジュバン型振動子を用いる.・周波数により,音響場の強さ,節(ノード)間隔(浮遊している液滴距離)も異なる.そのため,60kHzの超音波振動子を用いることで,節間隔は約2.8mmとすることができる.・浮遊させている液滴の偏平率(形状)には,音響場の強さが関わる.そこで,超音波振動子に加える電圧出力を可変とすることで,音響場の振幅を変化させ,音響場を制御することができる.・反射板(リフレクタ)にピエゾ素子を組み込むことにより,音響場を形成する振動子の電圧分布を把握することにより,音響場が液滴を浮遊している力の大きさを知ることができる.・反射板(リフレクタ)位置を高精度に移動できるようにマイクロメータを持つトラバース装置を装置に設置する.さらに,このトラバース装置は取り付け位置を移動できるため,節(ノード)数を変化させることができる.初期状態では5個の節(ノード)を形成できるように設計した.・超音波振動子の加熱を防ぐため,空気冷却口を取り付けた.・Levitatorを他の装置に取り付けることも検討しており,装置を簡易,軽量に設計した.以上のような専用設計を行い,Levitatorを開発することができた.本研究では,乱流場における蒸発液滴の空気抵抗力,蒸発過程,熱および物質移動現象を把握することを目的として行っている.本年度は昨年度に製作した超音波液滴浮揚装置において,浮揚する液滴周りに乱流場ならびに高温場を形成するために装置の改良を行った.改良点を以下に示す.1.ホーン形状:ホーン形状を数種類用意した.ホーン先端を平面にした場合でもホーン先端を浅皿型にしたものと同程度の安定性,最大粒径を達成することができた.2.反射板(リフレクタ):反射板側から流れを吸入するために,ハニカム状の反射板を製作した.この反射板では液滴を浮揚させることができなかった.そのため,超音波振動子側から流れを吸入し,反射板に穴を設けることにより音圧場に液滴を注入できるように変更した.3.管型:超音波浮揚装置内で形成される音圧場をガラス管で覆うようにした.また,振動子側から流れを吸入し,反射板側から排出するようにした.これより,音圧場に流れ場を生成することが可能になった.さらに,流入形路上にヒータを設置することにより,温度を制御することが可能になった.このように改良した超音波浮揚装置において,反射板の位置を変更することにより,液滴の浮揚状態の安定性,振動する場合の形状変化状態の観察を行った.画像取込ボードとCCDカメラを組み合わせて液滴の形状変化履歴を撮影できるように,システムの構築を行った.また,表面張力の異なる数種の液滴(水,エタノール,メタノール,イソオクタン,ヘプタン等)の浮揚状態を観察した.さらに,超音波振動子に与える印加電圧の値を変化させ,浮揚液滴の形状変化に与える影響を調べた.

印加電圧を高めるに従い,液滴の扁平率は大きくなることが分かった.このように液滴を安定して浮揚できる状態を探しだし,蒸発液滴を浮揚させ,その蒸発履歴を観察した.蒸発履歴は直径の二乗が比例的に減少するD2乗則に一致することを確認した.
エチレンの「三重反応」を誘導する新規物質EH-1の作用機構解明と実用化研究

本年度において、EH-1の作用機構をより詳細に解析するため、計画した研究を実施した。具体的には、蛍光標識したEH-1であるEH-DF[5-ジメチルアミノナフタレン-1-スルホン酸(1-アリル-3,5-ジメチル-1H-ピラゾール-4-イルメチル)メチルアミド]を用いて、エチレン受容体を含むエチレンシグナル伝達機構遺伝子突然変異植物に対する作用を焦点に、以下の三つのアプローチにより解析を行った。まず、エチレン受容体の一つであるETR2の遺伝子突然変異植物について解析を行った。ETR2は、小胞体に存在するたんぱく質であり、エチレンを特異的に認識する受容体である。また、ETR2遺伝子が破壊された植物は、エチレンに対して、「三重反応」の形態を誘導されない特徴がある。本研究では、暗発芽したETR2遺伝子突然変異植物にEH-DFを与え、薬剤処理により誘導される遺伝子突然変異体の形態を調べた。EH-DFは、濃度依存的にETR2遺伝子突然変異植物に「三重反応」の形態を誘導した。次に、エチレン受容体の下流に機能する因子であるEIN2とエチレン関連遺伝子の発現を制御する因子であるEIN3の遺伝子突然変異植物を用いて同様の解析を行った。EH-DFは三種類のエチレンシグナル伝達機構遺伝子突然変異体に対して、「三重反応」の形態を誘導した。以上の研究から得られた成果は、植物の「三重反応」分子機構解明に重要な知見である。本研究課題の目標は、植物の「三重反応」形態を誘導する化合物EH-1の作用機構解明と実用化研究である。EH-1は、エチレン活性を示す化合物の大規模スクリーニングを通じて見出された化合物であるが、エチレン活性の一つである植物の「三重反応」形態を誘導するため、EH-1の作用機構を解明し、EH-1をエチレン活性物質として利用する実用化研究を計画した。これまでに、「三重反応」形態誘導活性を指標に、EH-1誘導体の構造活性相関解析研究の結果、強い「三重反応」形態誘導活性を示す化合物を見出した。2018年度において、エチレンシグナル伝達機構遺伝子突然変異体を利用した作用機構解析研究を進めた結果、EH-1の「三重反応」誘導作用は、エチレンの情報伝達機構を介さないことが判明され、これは当初予期していないことである。これまでに、EH-1の構造活性相関解析研究を進めた結果、強い活性を示す化合物開発した。しかし、EH-1がエチレンと異なる作用機構により三重反応を誘導することが明らかとなったため、EH-1を含むこの系統の化合物の実用化研究について、方向を転換する必要がある。他方、エチレン活性化合物の大規模スクリーニングの際、1,2,3,4;テトラヒドロー2メチル-N-フェニル-4-キノリンアミン類化合物が、植物「三重反応」形態を誘導することが明らかにされた。今後の研究推進方策として、1,2,3,4;テトラヒドロー2メチル-N-フェニル-4-キノリンアミン類化合物の化学合成研究を行い、エチレン活性を示す化合物を探索する。本年度は「三重反応」誘導活性を示す化合物の構造活性相関解析研究を中心に以下2点の研究を行った。1、EH-1のナフチル基構造変化と生物活性本研究の第一の課題はライブラリースクリーニングで発見した植物「三重反応」誘導活性を示すEH-1の生物活性を向上させることである。そのため、本研究では、EH-1の化学構造に修飾可能なナフチル基に着目し、その代わりに様々な置換基を挿入できるフェニル基を有するEH-1誘導体の合成研究を行った。アルキル基、フッ素や塩素など様々な置換基を挿入したフェニル基を有するEH-1誘導体25種類を合成した。合成した化合物の「三重反応」誘導活性を評価の結果、アルキル基やフッ素原子を導入したフェニル誘導体はナフチル基を有するEH-1より低い生物活性を示した。一方、塩素原子をフェニル基に挿入した合成化合物はアルキル基やフッ素原子を挿入したフェニル化合物より強い生物活性を示した。特に3,4-ジクロロフェニル誘導体がEH-1と同程度の「三重反応」誘導活性を示した。フェニル基はナフチル基より水溶性が高いことから、植物細胞への移行性が高い。本研究で見出した3,4-ジクロロフェニル誘導体は、生物活性の面においてEH-1と同程度であるが、植物細胞への移行性については、EH-1より優れている。2、ピラゾールN-1位の化学修飾と生物活性EH-1はN-1-メチルピラゾール部分構造を有しており、N-1-メチル基の化学修飾ができるため、本研究ではメチル基の代わりにアリル基やイソブチル基など4種類の誘導体を合成した。合成した化合物の「三重反応」誘導活性を評価の結果、N-(1-アリル-3,5-ジメチル-1H-ピラゾール-4-イルメチル)-N-メチル-3,4-ジクロロベンゼンスルフォアミドが強い「三重反応」誘導活性を示し、EH-1の約5倍程度強い活性を示した。本研究の第一の課題はライブラリースクリーニングで発見した「三重反応」誘導活性化合物EH-1の生物活性を向上させることである。この課題を解決するため、今年度では、ナフチル基とピラゾールの構造修飾を焦点に計29種類のアナローグを合成した。ナフチル基の構造修飾を行うため、アルキル基、フッ素原子や塩素原子を導入したフェニル誘導体25種類のアナローグを合成した。合成した化合物の植物細胞への移行性が向上したが、これら化合物の生物活性を検定したところ、明瞭な活性向上効果が認められなかった。

ナフチル基の構造修飾は予想以上に手間がかかり、研究の進展を遅らせた。一方、ピラゾール部分構造の化学修飾研究では、合成した化合物の「三重反応」誘導活性の向上に貢献した。EH-1より5倍程度活性の強い化合物N-(1-アリル-3,5-ジメチル-1H-ピラゾール-4-イルメチル)-N-メチル-3,4-ジクロロベンゼンスルフォアミドを発見した。このことから、EH-1をリード化合物とするこの系統の「三重反応」誘導活性化合物の活性を向上させるためには、ピラゾール環の構造修飾が重要であることが明らかにされた。以上の結果から、本研究の第一関門であり、重要な課題である化合物の活性向上させるための重要な糸口を見つけた。現在、ピラゾール環の構造修飾を中心に、化合物の合成研究を進めている。今後、実用レベルで利用可能な活性化合物を開発し、化合物の作用機構解明研究を加速させる。本年度において、以下の3点の研究を行った。まず、「三重反応」誘導活性を示すピラゾール系化合物EH-1の蛍光プローブを開発し、それを利用した蛍光解析研究。そして、定量的RT-PCR法によるRNA-Seq解析結果の再現性の確認。さらに、活性の強いEH-1誘導体N-(1-アリル-3,5-ジメチル-1H-ピラゾールー4-イルメチル)-N-メチル-3,4-ジクロロベンゼンスルフォアミド(EH-28)を用いる三重反応誘導活性化合物の綿に対する落葉誘導活性の検証である。EH-1の蛍光プローブを開発するため、本研究では、ダンシル基を蛍光発色団とする化合物を合成した。N-(1-アリル-3,5-ジメチル-1H-ピラゾール-4-イルメチル)-N-メチルアミンとダンシルクロリド反応することにより蛍光プローブEH-DFを調製した。調製したEH-DFの蛍光スペクトルを測定したところ、最大励起波長が350 nmであり、最大蛍光波長は535 nmである。EH-DFのシロイヌナズナに対する三重反応誘導活性を評価したところ、30μM濃度では、明瞭な胚軸伸長抑制活性、根の伸長抑制活性とフックの弯曲誘導活性を示した。蛍光顕微鏡を用いた解析では、EH-DF由来の蛍光シグナルが細胞壁に集積する結果が得られた。また、RT-PCR法によるRNA-Seq解析結果の再現性の確認において、次世代シークェンサーを用いたRNA-Seq解析結果と一致する結果が得られたので、次世代シークェンサーの解析で得られた結果の信憑性が確認された。さらに、EH-28を用いた綿に対する落葉誘導活性の認証研究では、エチレンに比べ、明瞭な綿落葉誘導活性が認められなかった。この結果と次世代シークェンサーの結果を照らし合わせると、EH-1の植物三重反応誘導活性の作用機構はエチレンと異なる可能性が示唆された。昨年度に掲げた目標であるEH-1蛍光プローブの合成とそれを利用した植物組織におけるEH-1の作用部位の解析を推進した。これは、EH-1の植物
悪性脳腫瘍のＤＮＡ合成能の分子イメージング－新規ＰＥＴ薬剤の世界初の臨床試験－

PET診断薬として初めて生体で腫瘍細胞のDNAに取り込まれることが確認された薬剤である4'-[methyl-11C]thiotymidine(11C-4DST)の悪性脳腫瘍患者への臨床実用化を目指した研究を行った。86回の4DST-PET計測を既存の脳腫瘍診断PET薬剤11Cメチオニンと全例対比して行った。その結果全種のグリオーマにおいて4DSTの取り込みがメチオニン以上に腫瘍の増殖能を良く反映することが明らかになった。血液脳関門の保たれた部にある悪性腫瘍細胞への取り込みも確認された。急性炎症と腫瘍の鑑別能が既存薬剤の中で最も優れている事もわかった。更なる臨床研究を継続予定である。分担研究者豊原らによって新規に開発された4'-[methyl-11C]thiotymidine(11Cチオチミジン)(以降11C-4DSTと表記)は、PET診断薬として世界で初めて生体で腫瘍細胞のDNAに取り込まれることが確認された薬剤である。本研究において、悪性脳腫瘍患者におけるより大規模な本格的な臨床試験を開始した。これまで述べ23名の脳腫瘍患者の計測を行った。原則として動脈採血下の動態解析から腫瘍DNA分画への診断薬の取り込み速度の定量計測を行っている。これまで臨床使用による有害事象は発生していない。4DSTの腫瘍への取り込み速度は臨床的悪性度(増殖速度)との相関が高いことが明らかになった。また化学療法、放射線療法に対しての治療効果が鋭敏にかつ早期に判定できることも明らかになった。動物用PETを用いた基礎研究として急性期炎症と腫瘍の鑑別に関する論文が出版された。これによりこれまでのPETによる代謝診断薬に較べると4DSTが血流や血管床の変化には影響を受けづらく増殖しつつある腫瘍細胞に特異的に取り込まれることを示唆する所見が臨床的にも基礎実験に置いても集積されつつある。これらの結果を踏まえ、年度後半からは悪性腫瘍のみではなく良性腫瘍や炎症などの非腫瘍性疾患の可能性が高い場合にも研究的計測へのご協力を依頼し、ご理解が得られた方での計測を開始している。また、本手法が新たな診断法として有力であることが明らかになってきたことを内外の学会やセミナーでにアピールしてきた。その成果で、我が国での研究参画する施設が一施設増加した(香川大学医学部附属病院)。多施設共同研究の形で定期的研究会議を開催しつつ情報交換しながら研究を継続している。本研究において、脳腫瘍患者における臨床計測を継続した。これまで述べ60名の脳腫瘍患者の計測を行った。また、神経膠腫の悪性度の判定には既存の分子イメージング薬よりも精度が高いことが明らかになった。また、また化学療法、放射線療法に対しての治療効果が鋭敏にかつ早期に判定できることを示す計測例が得られている。一方で、種類を異にする腫瘍間(神経膠腫、転移性腫瘍、良性腫瘍)では、定性的な取り込み率のみでの一律な比較は難しい結果も得つつある。動物用PETを用いた基礎研究として慢性期炎症と腫瘍の鑑別に関する論文が出版された。これまでのPETによる代謝診断薬に較べると4DSTが血流や血管床の変化には影響を受けづらく増殖しつつと考えられる。臨床計測例でも炎症と腫瘍の鑑別において既存診断薬以上の精度がある事を示す計測例が蓄積されている。これらの結果を踏まえ、次年度では、多くの種類の腫瘍の動態計測を継続することが必要であると考えている。治療効果判定に関するデーター集積を計画的に行う事も必要である都考えている。本研究において、種々の脳腫瘍や非腫瘍性疾患患者における臨床計測を行った。建久機関において述べ約90名の脳腫瘍患者の計測を行った。

原則として動脈採血下の動態解析から腫瘍DNA分画への診断薬の取り込み速度の定量計測を行ないつつ、後期では定常状態の定性的計測に移行していった。期間中一例も臨床使用による有害事象は発生しなかった。全例で現在の脳腫瘍PETにおける最も優れた診断薬と認識されている11Cメチオニンと併用しての計測を行い、二つの診断薬の特性を比較した。その結果、全グリオーマにおいて4DSTの取り込みが腫瘍の増殖能を11Cメチオニン以上に良く反映することが判明した。主たる原因はこれまで細胞増殖能のみでなく血管床の影響が取り込みに関連する事が判明している11Cメチオニンは良性の乏突起細胞腫にも強く取り込まれるが、4DSTの取り込みは強くないことによっていた。また炎症と腫瘍の鑑別には11Cメチオニン以上に4DSTが有用であることも判明した。一方で、豊原の動物実験で4DSTは急性炎症にはほとんど取り込まれないが慢性炎症になると取り込みが増加することも判明しており、本診断薬が決して万能では無いことも明らかになった。本診断薬の有用性と注意点を明かにし研究期間を終了した。26年度が最終年度であるため、記入しない。脳神経外科学26年度が最終年度であるため、記入しない。順調に本研究費を用いた臨床計測を継続し臨床データーを蓄積している。研究参加施設が増え他施設での成果を交換しながらの全国規模の共同研究に発展しつつある。基礎実験の成果も発表され本手法の有用性を指示する基礎的データも蓄積された。ただし、現状では4DSTを用いての臨床計測は依然と研究段階での使用であるため臨床計測の継続のためにはPET計測費用の研究費からの支出とボランティアー患者に対する計測を行うために謝金の支払い等のための研究費取得の継続が本臨床研究の継続のために必須であるため、積極的な成果の発信を、論文、著書、国際学会にて行い認知を受けることが必須であるため、成果の発信を今以上に継続して行う必要があると考えている。。臨床計測を本研究費の使用のもとに継続する。病理学的所見との対比を確実に行うため手術前の患者には原則として本研究への参加を呼びかけることとする。臨床計測対象を全脳腫瘍に広げて研究参加者を募る予定である。基礎研究では急性期炎症実験結果が出版されたことを踏まえ慢性期炎症に対しての実験を行うことを計画している。他種類の脳腫瘍患者において研究協力を呼びかけ良性脳腫瘍を含んだ計測を計画的に行い、本計測法が適用できる対象疾患に関しての情報を早期に得ることを目的とそる。基礎研究で急性期と慢性期の炎症実験結果が出版されたことを踏まえ、多発性硬化症と神経膠腫との鑑別が問題となる患者の計測を積極的に行う。また当教室における悪性神経膠腫の治療耐性の克服に向けての基礎研究が開始されたことを受けて新規治療の効果および耐性の判定を4DSTを用いて行えるような実験計画を開始する。東京都健康長寿医療センター研究所のマイクロPET実験に当教室の大学院生が参加出来るよう訓練を行う。
ヒト血小板のインテグリンを介する凝集シグナルの解析

血小板インテグリンの欠損はBernard-Soulier症候群や血小板無力症の原因であることが明らかであり、アゴニスト刺激によるinside-outシグナルがGPIIb/IIIaを活性化し、リガンドが結合するとoutside-inシグナルが生じ凝集が起こることが知られている。このリガンドを介したoutside-inシグナルにはFAKのチロシンリン酸化が関与することが知られているが、詳細は明らかでない。アゴニスト刺激によるinside-outシグナルはイノシトール三リン酸(IP3)とジアシルグリセロール(DG)の産生による細胞内カルシウム上昇とプロテインキナーゼCの活性化を引き起こし、情報変換ホスホリパーゼC (PLC)が重要な役割を演ずる。本研究課題ではこれらの両シグナル系の関連因子を明らかにすることを試みた。血小板をトロンビン刺激すると、凝集に伴い細胞骨格の再構築を生じ、TritonX-100不溶性画分に多くのシグナル分子(Src, PKC, PLC, Gi, Gqなど)が移行する。経時的にPLCも細胞骨格に移行するが、PLCアイソフォームにより移行の機構が異なっていた。血小板には数種のPLCアイソフォームが存在し、主なものとしてはβ2, β3, γ1, γ2があり、他に少量のβ1, δ1, β4が検出された。PLCβ3にはa (155kDa)とb (140kDa)が膜とサイトゾル画分にそれぞれ存在しており、トロンビン刺激により再構築された細胞骨格に移行する。この移行はRGDSやインテグリンβ3の抗体あるいはチロシンキナーゼ阻害剤のゲニステインによって阻害される。また、PLCβ3 (a, b)は細胞骨格に移行後、カルバインにより限定分解をうけ100kDaになり、G蛋白質βγサブユニットにより活性が増強され、凝集に関係した後期のDG産生に関与していることを示唆した。ヒト血小板のインテグリンファミリーGPIIb/IIIa複合体は構造変化を引き起こすことによりリガンドと結合して凝集を引き起こすが、このシグナル系は種々のアゴニスト刺激により生ずるシグナルに依存し、両経路のシグナル連係により血小板凝集が完成することが示唆されているが、GPIIb/IIIaを介するシグナル連携について十分明らかでない。インテグリンの活性化によるシグナルは多くのシグナル因子の再構築された細胞骨格への移行により伝達される。そこでアゴニスト刺激による細胞骨格へのシグナル因子の移行をGPIIb/IIIa複合体に対する特異抗体やリガンド結合部位に対するアンタゴニスト(RGDS)を用いて検討した。ヒト血小板をトロンビン刺激し、経時的にTX100不溶性の細胞骨格へのシグナル因子の移行を種々の抗体によるウエスタンブロッドにより検討したところ、トロンビン刺激によりPKC-α,PKC-βや低分子量G蛋白質Rho,Rac,Cdc42などが速やかに細胞骨格に移行することが確認された。また、ヒト血小板には4種のPI-PLCアイソザイム(PLC-β2,-β3a,-β3b,-γ1,-γ2)が存在することが各種抗体を用いて同定しており、これらPLCアイソザイムのトロンビン刺激による細胞骨格への移行を詳しく検討したところ、PLCアイソザイムは異なる機構で細胞骨格へ移行することを明らかにした。トロンビン刺激により、PLC-β3a(155kDa)とPLC-β3b(140kDa)は速やかに(15-30秒)細胞骨格に移行する。

この移行はインテグリンGPIIIaに対する抗体やフィブリノーゲンアンタゴニストのRGDSペプチド前処理により完全に阻害され、インテグリン依存性の移行が見られた。一方、PLC-β2とPLC-γ2は緩やかな移行(2分まで)を示し、インテグリン非依存性であった。また、PLC-β3a(155kDa)とPLC-β3b(140kDa)はトロンビン刺激により活性化されるカルパインにより限定分解され100kDaになるが、この修飾は両者の細胞骨格の移行後引き起こされることが示めされた。以上の結果より、ヒト血小板ではPLC-β3がインテグリンシグナリングに関係した凝集になんらかの役割を果たしていることが示唆された。ヒト血小板のインテグリンファミリーGPIIb/IIIa複合体はアゴニスト刺激によるinside-outシグナルにより構造変化を伴う活性化が生じ、リガンドと結合すると凝集を引き起こす。このリガンドを介したoutside-inシグナルにはFAKのチロシンリン酸化が関与することが知られているが、詳細は明らかでない。本年度はこれらの両シグナル系の関連因子を明らかにすることを試みた。血小板をトロンビン刺激すると、凝集に伴い細胞骨格の再構築を生じ、TritonX-100不溶性画分に多くのシグナル分子(Src,PCK,PLC,Gi,Gqなど)が移行することを、各種抗体を用いたウエスタンブロッティングにより示した。細胞骨格への移行はインテグリン依存的であり、フィブリノーゲンのアンタゴニストであるRGDSにより阻害される。経時的にPLCが細胞骨格に移行するが、PLCアイソフォームにより移行の機構が異なっていた。血小板には数種のPLCアイソフォームが存在し、主なものとしてはβ2,β3,γ1,γ2があり、他に少量のβ1,δ1,β4が検出された。PLCβ3にはa(155kDa)とb(140kDa)が膜とサイトゾル画分にそれぞれ存在しており、トロンビン刺激により再構築された細胞骨格に移行する。この移行はRGDSやインテグリンβ3の抗体あるいはチロシンキナーゼ阻害剤のゲニステインによって阻害される。また、PLCβ3(a,b)は細胞骨格に移行後、カルパインにより限定分解をうけ100kDaになり、G蛋白質βγサブユニットにより活性が増強され、凝集に関係した後期のDG産生に関与していることが示唆された。一方、PLCβ2とγ2は細胞骨格に移行するが、インテグリン非依存的でありゲニステインによる阻害が少ないことから、むしろ、アゴニスト刺激におけシグナル系に関与していることが示唆された。以上の結果から血小板凝集には、異なるPLCアイソフォームの活性化によるアゴニスト刺激とインテグリンシグナルの連係が重要であることが示唆された。
アトピー性皮膚炎の病態における樹状細胞の役割に関する研究

一般にアトピー性皮膚炎(AD)では、Th1/Th2バランスがTh2優位の状態に傾いていると報告されているが、そのメカニズムはいまだ不明である。われわれはT細胞への抗原提示を担っている樹状細胞系の細胞が、Th1/Th2バランス決定の鍵を握るものと考え、この細胞がT細胞機能に及ぼす影響を検討することにより、ADにおけるTh1/Th2のアンバランスの発症メカニズムを明らかにすることを計画した。まず研究対象となるAD患者の免疫状態を把握するため、患者末梢血単核球を用い、ADの増悪因子と考えられている黄色ブドウ球菌由来スーパー抗原(SEB)で刺激を加え、細胞増殖能、サイトカイン産生能を検討した。その結果、重症AD患者では、健常人に比べてT細胞が刺激に対してアポトーシスに陥り易い状態になっていることが判明し、サイトカインの産生については、予想に反してTh1活性だけでなくTh2活性も著明に低下していることが明らかとなった。そしてこのアポトーシスの誘導には、樹状細胞が関与している可能性を見いだした。しかし実際のAD病巣部の浸潤T細胞を調べたところ、アポトーシスはほとんど見られなかったことから、患者血清中にアポトーシスを制御する物質が存在するのではないかと考えた。そこで、患者血清がT細胞の増殖反応におよぼす影響を検討した結果、重症AD患者血清がSEBによるT細胞の活性化を著明に抑制しうることが判明し、この抑制物質がSEBに特異的に結合するIgG抗体であることを見いだした。実際の患者の生体内では、この中和抗体がSEBによるT細胞アポトーシスの抑制ならびにSEBによって引き起こされる炎症反応の制御に寄与しているものと考えられた。一般にアトピー性皮膚炎では、Th1/Th2バランスがTh2優位の状態に傾いていることが報告されているが、そのメカニズムはいまだ不明である。われわれはT細胞への抗原提示を担っている樹状細胞系の細胞が、Th1/Th2バランス決定の鍵を握るものと考え、アトピー性皮膚炎と健常人とにおけるこの細胞の性質の違いを明らかにすることを計画した。本研究を始めるに当たり、まず研究対象となるアトピー性皮膚炎患者の免疫状態を把握するため、55人の患者から、81サンプルの末梢血単核球を分離し、黄色ブドウ球菌由来のスーパー抗原の一つであるSEBあるいはPHAで刺激を加え、T細胞の増殖能、サイトカイン産生を検討した。その結果、重症アトピー性皮膚炎では、健常人に比べて増殖反応が有意に抑制され、またサイトカインの産生については、Th1活性だけでなくTh2活性も著明に低下していることが判明した。その機序として、重症患者におけるT細胞が健常人と比較してアポトーシスに陥り易い状態になっていることを見出し、これがSEBあるいはPHAに対する反応性の低下の原因となっていること、さらにFas-Fas-Lのシグナルがこの現象に関与している可能性を示した。次に、この重症アトピー性皮膚炎におけるT細胞のアポトーシスの誘導に、樹状細胞が関与しているか否かを検討するため、寛解期または増悪期の患者末梢血からnegative selectionにより単離した樹状細胞とT細胞を用いて、両者を混合培養することによりアポトーシスの発現を検討した。その結果、寛解期の樹状細胞よりも増悪期の樹状細胞の方がT細胞のアポトーシスをより強く誘導する傾向が見られ、現在この実験系を用いて樹状細胞によるT細胞アポトーシスの誘導機序を研究中である。これまでに、我々は重症アトピー性皮膚炎(AD)患者の末梢血単核球を黄色ブドウ球菌由来スーパー抗原(SEB)で刺激した場合、T細胞がアポトーシスに陥り易いことを明らかにした。しかし実際のAD病巣部の浸潤T細胞を調べたところアポトーシスはほとんど見られなかった。このことから、患者血清中にアポトーシスを制御する物質が存在するのではないかと考え、T細胞の増殖反応に患者血清がおよぼす影響を検討した。

その結果、重症AD患者血清がSEBによるT細胞の増殖反応を著明に抑制することが判明し、一方、尋常性乾癬、健常人血清には抑制活性ほとんど見られなかった。今年度は、このT細胞増殖抑制活性を担う物質の同定・解析を試みた。その結果、AD患者血中のIgG分画にT細胞増殖抑制活性が存在していることが判明し、さらに、SEBを抗原としたウエスタンブロッティング法によりこの患者血清中のIgG抗体がSEBに結合することが明らかとなった。次に、この抗SEB-IgG抗体のin vivoでの役割を調べるために、ADのモデルマウスであるNC/Ngaマウスを用いて血清の移入実験を試みた。その結果、AD患者血清で処理したマウスでは、健常人血清で処理したマウスと比べて、SEBにより誘導される皮膚炎の抑制が見られた。以上の結果から、実際のAD患者の生体内では、この中和抗体がSEBによるT細胞アポトーシスの抑制ならびにSEBによって引き起こされる炎症反応の制御に寄与しているものと考えられた。
機能性薄膜のX線吸収微細構造解析

1.数マイクロメータの厚さ、あるいはそれ以下の厚さの薄膜は、情報記憶用磁気材料・アモルファス合金、各種センサー、光学部品の表面コート、メッキ膜などの重要な機能を担っている。この様な薄膜物質の機能を理解し、さらなる性能向上をはかるためにはその構造解析が重要であるが、そのためのよい構造解析手法はあまり存在しない。本研究では、注目元素の周囲のミクロ構造解析法として有力である広域X線吸収微細構造(EXAFS)解析法を薄膜材料の構造解析に適用した。2.厚い基盤上の薄膜のX線吸収スペクトルを測定することは通常の透過法では不可能である。そこで、本研究では転換電子収量法を用いた。これはX線を吸収した原子が放出するオージェ電子の飛程が短いことを利用して表面敏感XAFSとするものである。3.測定はPhoton FactoryおよびSPring-8にて行った。これまで専ら第一遷移金属元素についてのデータを収集してきたが、今年度はSPring-8にてさらに重元素を対象として本測定法の限界を探った。重元素においてはオージェ電子のエネルギーが非常に高くなるため、分析深さが深くなり表面感度が低下する。転換電子収量法はX線の吸収が問題にならない程の薄い表面しか観測しないのでバルク試料の"そのまま"の測定に有効な手法である。しかし、高エネルギー領域においても本法が有効であるかどうかについての検討を行う必要があるのでそのための実験を行った。現在データの解析中である。また、これまでに測定したSrTiO_3薄膜の精密解析を試みている。この薄膜のスペクトルは、これまでのバルク材の解析に用いていたカーブフィッティング計算用パラメータでは再現できない形状をしており、その原因の検討を行っているところである。本研究の目的は、注目元素の周囲のミクロ構造解析法として有力である広域X線吸収微細構造(EXAFS)を薄膜材料にも応用可能とするための開発を行うものである。そこで、本研究ではX線の吸収によって放出されるAuger電子の検出を行う転換電子収量法の装置を開発した。試料は大気圧Heガス中に置き、転換電子電流を測定することでX線吸収スペクトルを得る。試料の大きさは約1cm角である。3.測定は高エネルギー物理学研究所放射光実験施設、BL-7CおよびBL-12Cにて行った。スパッター法により形成した単結晶表面の数十nmのSrTiO_3のSr-K端、Ti-K端のスペクトルを得ることができた。4.各種の厚さに析出した試料を用いて、Sr-KおよびTi-K端の観測深さを見積ることができた。また試料板とSR放射光の偏光関係を利用し、極く薄いSrTiO_3のSr-K端スペクトルは膜面内方向とこれに垂直な方向で構造に差異が存在する可能性を見い出した。

本研究の目的は、注目元素の周囲のミクロ構造解析法として有力である広域X線吸収微細構造(EXAFS)を薄膜材料にも応用可能とするための開発を行うものである。2.厚い基盤上の薄膜のX線吸収スペクトルを測定することは通常の透過法では不可能である。そこで、本研究ではX線の吸収によって放出されるAuger電子の検出を行う転換電子収量法の装置を開発した。試料は大気圧Heガス中に置き、転換電子電流を測定することでX線吸収スペクトルを得る。試料の大きさは約1cm角である。3.測定は高エネルギー物理学研究所放射光実験施設、BL-7CおよびBL-12Cにて行った。Si基盤やガラス基盤上に形成したAu薄膜がその膜厚に依存した構造変化を行うかどうかを調べたところ、Siに拡散させても金属金の構造を保ち、MgOを用いて分散させたAu薄膜の場合に金属金とは異なる構造をとることが分かった。また磁性記録材料としてよく用いられるフェライト薄膜をガラス基盤上に形成させたもののFeのEXAFS解析も行うことができた。1.数マイクロメータの厚さ、あるいはそれ以下の厚さの薄膜は、情報記憶用磁気材料・アモルファス合金、各種センサー、光学部品の表面コート、メッキ膜などの重要な機能を担っている。この様な薄膜物質の機能を理解し、さらなる性能向上をはかるためにはその構造解析が重要であるが、そのためのよい構造解析手法はあまり存在しない。本研究では、注目元素の周囲のミクロ構造解析法として有力である広域X線吸収微細構造(EXAFS)解析法を薄膜材料の構造解析に適用した。そこで、本研究では転換電子収量法を用いた。これはX線を吸収した原子が放出するオージェ電子の飛程が短いことを利用して表面敏感XAFSとするものである。3.測定はPhoton FactoryおよびSPring-8にて行った。これまで専ら第一遷移金属元素についてのデータを収集してきたが、今年度はSPring-8にてさらに重元素を対象として本測定法の限界を探った。重元素においてはオージェ電子のエネルギーが非常に高くなるため、分析深さが深くなり表面感度が低下する。転換電子収量法はX線の吸収が問題にならない程の薄い表面しか観測しないのでバルク試料の"そのまま"の測定に有効な手法である。しかし、高エネルギー領域においても本法が有効であるかどうかについての検討を行う必要があるのでそのための実験を行った。現在データの解析中である。また、これまでに測定したSrTiO_3薄膜の精密解析を試みている。この薄膜のスペクトルは、これまでのバルク材の解析に用いていたカーブフィッティング計算用パラメータでは再現できない形状をしており、その原因の検討を行っているところである。
骨髄幹細胞移植によるペリサイトの再生が実験的脊髄損傷の機能回復をもたらす

我々は、これまでに間葉系幹細胞(MSC)をドナー細胞として、動物疾患モデルに対する移植実験を行い、良好な結果を得てきた。脊髄損傷では、損傷部周囲に浮腫を生ずる血液脊髄関門の破綻が機能障害(運動麻痺)などの原因となることが考えられる。本研究においては、脊髄損傷作成後において、骨髄幹細胞移植群では血液脊髄関門の安定化が生じることによって、運動機能の回復に貢献するという仮説を検証し、治療メカニズムを検討することを目的とした。脊髄損傷においては、外傷によって生ずる組織内の出血、虚血、浮腫などが引き起こす微小循環の機能不全によって複雑な病態生理を呈し、神経組織が壊死することが機能障害(運動麻痺)などの原因となる。特に、損傷部周囲生じる浮腫は、今までは、血液脊髄関門を構成する血管内皮細胞とアストロサイトの損傷・破綻によると考えられてきたが、最近、血液脊髄関門を構成するもう一つの細胞である周皮細胞(ペリサイト)の役割に注目が集まっている。本研究では、実験的脊髄損傷におけるペリサイトの動向を観察し、さらに、骨髄幹細胞移植により、ペリサイトの損傷を抑制することで、神経組織内の微小循環調節系における重要な機能単位である血液脊髄関門の再生をターゲットにした新たな治療法を開発することを目的として、ラット実験的脊髄損傷に対する骨髄幹細胞の静脈内投与による神経機能回復のメカニズムに血液脊髄関門の安定化が強く関与することを検証することを主目的とするものである。本研究費によって、脊髄損傷作成機器を用いて、SDラットに対して、脊髄圧挫モデルを作成し、胸髄(Th10)レベルに直接損傷を加える動物実験モデルの作成を行った。予備実験より、与えるインパクトによって脊髄損傷の重症度、損傷機能が変化することが判明していたので、本年度は、損傷程度と運動神経機能の相関に関わる行動学的データを収集してきた。行動学的評価には、Basso Beattie. Bresnahan (BBB)スコアを用いた。さらに、観察期間終了後に、ラットを灌流固定し、凍結組織切片を作成し、免疫組織学的解析を行い、血管内皮、ペリサイト、アストロサイトを染色し、適切な染色条件の設定を試みた。さらに、電子顕微鏡の解析も行った。以上のように、補助金は補助条件に従って、有効に使用されている。さらに、観察期間終了後に、ラットを灌流固定し、凍結組織切片を作成し、免疫組織学的解析を行い、血管系の再構築を検証した。さらに、corticospinal tract、raphespinal tractのsproutingの検証、および、光学顕微鏡・電子顕微鏡による再有髄化した軸索の解析、Diffusion Tensor Imagingによる修復された神経線維の解析も行った。脳神経外科、再生医学本研究費によって、脊髄損傷作成機器を用いて、SDラットに対して、脊髄圧挫モデルを作成し、胸髄(Th10)レベルに直接損傷を加える動物実験モデルの作成を行った。本年度は、コントロールデータの収集を行った。具体的には、行動学的評価として損傷程度と運動神経機能の相関に関わる行動学的データをBasso Beattie. Bresnahan (BBB)スコアを用いて定期的に収集した。さらに、観察期間終了後に、4%パラホルムアルデヒドで、ラットを灌流固定し、凍結組織切片を作成したのちに、免疫組織学染色を行った。特に、血管内皮細胞、ペリサイト、アストロサイトの染色を行い、共焦点顕微鏡で観察を行い、適切な染色条件および血管内皮細胞とペリサイトのcoverageを評価する方法を数種類のコンピューターソフトウェアを用いて探索した。本年度の結果より、本実験系の行動学的評価、免疫組織学的評価の実現可能性が高いことが判明したため、継続して、上記コントロールデータの収集を行う。

さらに、ラットより、骨髄幹細胞を採集・培養し、作成したラット脊髄圧挫モデルに対して、経静脈的に骨髄幹細胞移植を行い、神経機能の回復を評価する。運動機能の評価に加え、血液脊髄関門形成のメカニズムに関して、組織学的(軸索追跡法)、免疫組織学的、電子顕微鏡を駆使して、検討を行う予定である。
眼震運動により摂動を補償する速度分布計測システムの研究

眼震運動などの眼球運動が、高次視覚系における運動知覚において積極的な役割を果たし得る可能性は従来から示唆されている。本研究では計算論的視覚情報処理に基づく時空間微分法によるオプティカルフロー計測法において、速度の摂動成分を抽出するための手段として眼震運動に相当する運動を付加できる撮像光学系を利用することを提案し、これにより従来以上に正確で測定範囲の広い速度計測システムが実現できることを示す。輝度勾配の不変性に基づく時空間微分法では、画像上の像運動の速さが12画素/フレーム程度までは対象パターンの速度がほぼ正確に測定できる。ところが、像速度がこれよりより大きい場合には、計算で得られる速度値は実際の速度よりも小さい不正確な値になる傾向が見られる。このように、時空間微分法には像速度が大きいと推定される速度が不正確になるという計算原理上の問題があり、従来から解決が望まれていた。本研究では眼震運動装置を用いて対象運動の大きな速度成分を制御された眼震運動により打ち消し、残った摂動成分だけを時空間微分法を用いて正確に推定し、得られた摂動速度値に既知の眼震運動量を加算することで対象運動速度が正確に推定できることを示した。この方式は今後速度分布計測システムを発展させる際に有用と考えられる。実験では眼震運動に類似した像流れを付加できる撮影装置を新たに開発し、様々な運動対象物の速度分布測定を行った。この装置は、光学系を構成するプリズム対が高速に1回転する問に360度すべての向きの像流れを実現でき、また、プリズム対の間隔を変化させることで像流れの速さも調整できるので、視野全体にわたって任意速度の像流れを短時間に周期的に加えることができるという特徴を有する。本研究は人間などの生物の眼球運動のうち眼震性の運動が速度計測の適用範囲を広げるために積極的に利用できることを実験的に示すことを目的とする。本年度は眼震性の運動を実現できる撮像装置の製作と、時空間微分法に基づくオプティカルフロー計算アルゴリズムの実装を目標に研究を行った。まず眼震性の眼球運動に相当する運動をCCDカメラの撮像系で実現するための機構を設計製作した。この機構は対象像をCCDカメラの撮像面上で円振動させるためのプリズム対と対物レンズから構成される光学系とステップモータを用いた回転機構の組み合わせで実現される。これにより像面上に撮像レンズが結ぶ像に眼震性の眼球運動を模すような微小な円振動を生じさせることができた。使用したプログレシブスキャンCCDカメラでは最大で秒間に30フレーム以上を取得でき、像が1周期に振動する間に数十枚程度の画像を取得することが可能であった。対象物として静止背景および静止物体を用いた実験では画像上で眼震運動による規則的な像流れが観測できた。これより試作装置によって向きが高速に切り替わる速度バイアス成分を重畳させられ、生物の眼震運動を模すことができることが示せた。さらに、今回のシステムに合わせて時空間微分法により速度を計算するプログラムを作成し、得られた画像から速度ベクトルが計算できることを確かめた。今後は画素毎に最も変位量が小さいものを動的に選択する処理と組み合わせて画像中の速度分布を再構成し、本研究で提案する概念の有効性を検証していく。本年度の結果を踏まえ、次年度は移動対象物および速度分布を有する対象物の速度測定の実験をおこなう予定である。
新たな天然活性物質の発掘に基づいた新規メタロ-β-ラクタマーゼ阻害剤の創製

2018年度はこれまでに連携研究者によって調製・供給された糸状菌ならびに放線菌培養物のおよそ4,000検体の微生物培養液サンプルを用いてスクリーニングを行った。すなわち、メタロ-β-ラクタマーゼ阻害物質のスクリーニングを簡便に行う方法として、カルバペネム系のメロペネムと共存しているときに阻止円径の大きくなる物質のアッセイ系を独自に構築し、微生物培養液からのスクリーニングを開始した。さらにin houseの天然物化合物ライブラリーからのスクリーニングも実施した。スクリーニングは以下の一次から三次までを行った。一次スクリーニングとしてメロペネム含有培地上で阻止円が確認された検体、二次スクリーニングとしてメロペネム含有、非含有培地で選択性が確認できた検体、そして三次スクリーニングとしてメタロ-β-ラクタマーゼ阻害活性が確認できた検体。その結果、強いメロペネム耐性克服活性を示し再現性のあった3検体の培養液を選抜した。この3検体について再培養後、活性物質生産が再現されることを確認した結果、海洋土壌由来放線菌のKMA-0491、KMA-0492ならびKMA-0493株のそれぞれ培養液にメロペネム耐性克服活性が再現された。放線菌KMA-0491、KMA-0492ならびKMA-0493株は同種の可能性があり、かつ予備的な精製実験において活性画分の挙動が一致したことから、活性物質は同一物質である可能性が高いことが示唆された。そのため放線菌KMA-0491、KMA-0492ならびKMA-0493株の培養物を混合し、その培養物の活性物質を精製・単離した結果、cinnamic acidと同定した。2018年度はスクリーニングを行い、メロペネム耐性克服活性を示した培養液からの活性物質を精製していく計画を実施した。さらに、in houseの天然物化合物ライブラリーからのスクリーニングも実施した。これまでにおよそ4,000検体の微生物培養液サンプルを用いて、スクリーニングを行い、メロペネム耐性克服活性を示した3検体の培養液を選抜できた。海洋土壌由来放線菌のKMA-0491、KMA-0492ならびKMA-0493株の培養検体を精製対象候補検体として選抜した。KMA-0491、KMA-0492ならびKMA-0493株の培養物から単離した活性物質はcinnamic acidと同定した。本化合物はすでに放線菌の生産物として報告されていた。また植物界にも広く存在する芳香族不飽和カルボン酸に分類される有機化合物である。本化合物の生物活性は肥満抑制作用やPKG阻害活性など多岐にわたり報告されているが、メロペネム耐性を示す臨床分離大腸菌株においてメロペネム併用時にその耐性を克服する活性を示すことが明らかとなった。また、メロペネムを不活性化する酵素であるメタロ-β-ラクタマーゼに対する阻害活性試験を実施するために、IMP型メタロ-β-ラクタマーゼのクローニングを行い、今年度はタンパク質発現ベクターの構築も実施した。今後もメタロ-β-ラクタマーゼ阻害物質のスクリーニングを簡便に行う方法として、カルバペネム系のメロペネムと共存しているときに阻止円径の大きくなる物質のアッセイ系を独自に構築し、微生物培養液からのスクリーニングを用いる。連携研究者が分離したIMP型メタロ-β-ラクタマーゼが発現している臨床分離大腸菌株を検定菌として用いる本スクリーニングは有用であると考えられる。さらに、連携研究者によって調製・供給される糸状菌ならびに放線菌の微生物培養液サンプルを用いて、メロペネム耐性克服活性を有する微生物培養液の選抜を2019年度も引き続いて行う。さらに、選抜された微生物培養液についてメロペネム耐性克服活性物質を単離・構造解析後に、in vitroでメロペネムを不活性化する酵素であIMP型メタロ-β-ラクタマーゼ阻害活性試験を実施し、その阻害活性能を検証する。2019年度に取得された活性物質については、その活性物質の誘導体合成を計画する。一方、活性物質選抜後には、各種検定菌によるメロペネム耐性克服活性、IMP型メタロ-β-ラクタマーゼ阻害活性の詳細な検討およびメロペネム併用時におけるメロペネム耐性菌の抗菌スペクトルを測定する。これらの試験によって優れた活性を示した活性物質については、連携研究者らによるメロペネムを併用したマウス感染モデル系での治療効果を検討する。

この3検体について再培養後、活性物質生産が再現されることを確認した結果、海洋土壌由来放線菌のKMA-0491、KMA-0492ならびKMA-0493株のそれぞれ培養液にメロペネム耐性克服活性が再現された。放線菌KMA-0491、KMA-0492ならびKMA-0493株は同種の可能性があり、かつ予備的な精製実験において活性画分の挙動が一致したことから、活性物質は同一物質である可能性が高いことが示唆された。そのため放線菌KMA-0491、KMA-0492ならびKMA-0493株の培養物を混合し、その培養物の活性物質を精製・単離した結果、cinnamic acidと同定した。2018年度はスクリーニングを行い、メロペネム耐性克服活性を示した培養液からの活性物質を精製していく計画を実施した。さらに、in houseの天然物化合物ライブラリーからのスクリーニングも実施した。これまでにおよそ4,000検体の微生物培養液サンプルを用いて、スクリーニングを行い、メロペネム耐性克服活性を示した3検体の培養液を選抜できた。海洋土壌由来放線菌のKMA-0491、KMA-0492ならびKMA-0493株の培養検体を精製対象候補検体として選抜した。KMA-0491、KMA-0492ならびKMA-0493株の培養物から単離した活性物質はcinnamic acidと同定した。本化合物はすでに放線菌の生産物として報告されていた。また植物界にも広く存在する芳香族不飽和カルボン酸に分類される有機化合物である。本化合物の生物活性は肥満抑制作用やPKG阻害活性など多岐にわたり報告されているが、メロペネム耐性を示す臨床分離大腸菌株においてメロペネム併用時にその耐性を克服する活性を示すことが明らかとなった。また、メロペネムを不活性化する酵素であるメタロ-β-ラクタマーゼに対する阻害活性試験を実施するために、IMP型メタロ-β-ラクタマーゼのクローニングを行い、今年度はタンパク質発現ベクターの構築も実施した。今後もメタロ-β-ラクタマーゼ阻害物質のスクリーニングを簡便に行う方法として、カルバペネム系のメロペネムと共存しているときに阻止円径の大きくなる物質のアッセイ系を独自に構築し、微生物培養液からのスクリーニングを用いる。連携研究者が分離したIMP型メタロ-β-ラクタマーゼが発現している臨床分離大腸菌株を検定菌として用いる本スクリーニングは有用であると考えられる。さらに、連携研究者によって調製・供給される糸状菌ならびに放線菌の微生物培養液サンプルを用いて、メロペネム耐性克服活性を有する微生物培養液の選抜を2019年度も引き続いて行う。さらに、選抜された微生物培養液についてメロペネム耐性克服活性物質を単離・構造解析後に、in vitroでメロペネムを不活性化する酵素であIMP型メタロ-β-ラクタマーゼ阻害活性試験を実施し、その阻害活性能を検証する。2019年度に取得された活性物質については、その活性物質の誘導体合成を計画する。一方、活性物質選抜後には、各種検定菌によるメロペネム耐性克服活性、IMP型メタロ-β-ラクタマーゼ阻害活性の詳細な検討およびメロペネム併用時におけるメロペネム耐性菌の抗菌スペクトルを測定する。これらの試験によって優れた活性を示した活性物質については、連携研究者らによるメロペネムを併用したマウス感染モデル系での治療効果を検討する。