hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
ATP加水分解スイッチ仮説に立脚したABCトランスポータ駆動メカニズムの解明

この成果は、日本生物物理学会年会および日本生理学会年会で発表した。本研究の初年度(平成22年度)において、3篇の論文発表を行なった。そして、その研究成果に基づいて新学術領域「水和とATP」公募研究への応募を行なって採択され、さらに本研究課題の進展速度を速めることができた。本年度は、CFTRのATP加水分解サイクルとゲーティングサイクルとのカップリングについて、従来の1;1固定ではなく確率的に変化するという、ATP駆動蛋白のメカニズムを理解する上で極めて重要な発見を行なった。24年度が最終年度であるため、記入しない。平成24年度は本研究課題の最終年度であるので、今までの実験結果に基づいたゲーティングモデルによるモンテカルロ・シミュレーションを行なって、本研究のまとめとなる理論的な論文の執筆を計画している。また、本年度から導入予定の高速AFMによるゲーティング中のCFTR分子のコンフォメーション変化の測定に挑戦する。成功すればCFTRチャネルにおけるATP加水分解サイクル、ゲーティングサイクルおよび分子コンフォメーション変化サイクル間の関係を明確にすることができる。これは本課題に中心命題であるABCトランスポータの機能発現におけるATP加水分解の役割が、エネルギー供給なのか、それともATP結合エネルギーからADP-Pi間静電反発エネルギーへのスイッチ機能なのかを明らかにするためにも非常に重要な情報である。
モンゴル国の土地法制に関する法社会学的研究~環境保全と紛争防止の観点から~

本研究では、モンゴル国における土地法制をめぐる諸問題を法社会学的な観点から研究することにより、モンゴル国の土地をめぐる紛争と環境破壊の防止に貢献することを目指した。日本国内で研究会・シンポジウムを開催するとともに、都市・牧地・定着過程にある牧地・農地・鉱山の5つの研究班による現地調査を実施し、その調査結果をモンゴル国で開催した研究成果報告会で報告した。この調査結果は高く評価され、モンゴル鉱物資源法改正のための参考資料としてモンゴル国会にも提出された。平成17年度の研究実績は、以下の4点に要約できる。第一に、国内研究会を開催し(6月、8月、12月)、研究計画・方法論について議論すると共に、関係する研究者を招待して報告会および討論を行った。第二に、国際シンポジウム「モンゴル遊牧社会と土地所有体制移行国における土地私有化の比較研究」を開催し(9月)、モンゴル国の法学者・法律実務家・アメリカのモンゴル研究者・日本のモンゴル研究者による報告・討論を行った。これにより、モンゴル土地法研究の現状を明らかにすると共に、今後の研究課題について明らかにすることができた。本シンポジウムの報告書は、次年度に刊行される予定である。第三に、モンゴル国での予備調査を実施した(8月、11月、12月、3月)。この予備調査は、次年度以降の大規模な現地調査の準備として行われたもので、関係機関へのインタビュー・牧地調査・農地調査・都市部調査を行った。この成果や反省点を生かして、来年度の本調査のための調査票を作成する予定である。第四に、他国によるモンゴル法整備支援状況の調査を行い、ドイツによる民法起草支援と土地法・土地私有化法の関係について研究した(9月)。ドイツの法学者・法整備支援機関とは、今後も共同研究や情報交換などの協力関係を発展させる計画である。本年度の成果を最大限に活用して、次年度以降の牧地・農地・都市部での本調査を行い、その分析を進める計画である。また、平成18年9月に名古屋大学がモンゴル国立大学に開設する日本法教育研究センターを現地調査・共同研究の拠点として活用する予定であり、海外研究拠点を利用しての本格的な法社会学的研究としての成果が期待される。平成18年度の研究実績は、以下の4点に要約できる。第一に、国内研究会を開催し(7月、1月)、研究計画・方法論・中間調査結果について議論した。第二に、モンゴル国での予備調査を実施した(5月)。この予備調査は、大規模な本調査の準備として行われたもので、関係機関へのインタビュー・農地調査・都市部調査・鉱山調査を行った。この成果や反省点を生かして、本調査のための調査票を作成した。第三に、モンゴル国での本調査を実施した(89月)。この本調査では、関係機関へのインタビュー・牧地調査・農地調査・定着過程にある牧地調査・都市部調査・鉱山調査を行った。第四に、他国によるモンゴル法整備支援状況の調査を行い、他のプロジェクトとの共催により国際シンポジウム「法整備支援をめぐる日本・ドイツの対話」を開催した(10月28日、名古屋大学)。このシンポジウムの報告書は、次年度に刊行予定である。本年度の成果を最大限に活用して、平成19年度も牧地・農地・定着過程にある牧地・都市部・鉱山での本調査を行い、その分析を進める計画である。また、平成18年9月に名古屋大学がモンゴル国立大学に開設した日本法教育研究センターを現地調査・共同研究の拠点として活用しており、海外研究拠点を利用しての本格的な法社会学的研究としての成果が期待される。平成19年度の研究実績は、以下の4点に要約できる。第一に、平成18年度の調査結果を総括し、それを踏まえて平成19年度の調査方針を確定すると共に、モンゴルでの本調査の準備を進めた。第二に、モンゴル国での本調査を実施し(8月)、関係機関へのインタビュー・農地調査・都市部調査・鉱山調査を行い、現地で関係者との協議を行った。第三に、アメリカの研究者の協力を得て国際共同調査を牧地で行った(89月)。この報告書は完成しており、web上で公開予定である。また、将来の英文による研究書刊行についても協議を開始した。第四に、最終年度の成果とりまとめの方針についてモンゴル側の協力機関と打ち合わせを行い、最終年度の成果報告会の方針について協議した。今年度の調査により、モンゴルにおいて土地私有化が牧地・農地・都市・鉱山に与えている影響をほぼ明らかにすることができた。また、モンゴルにおける最新の土地法制の変動とその問題点について、明らかにすることができた。本年度の成果を最大限に活用して、平成20年度も牧地・農地・定着過程にある牧地・都市部・鉱山で追加調査を行い、調査結果を分析した上で、結果報告会をモンゴルで平成20年9月に開催予定である。

この調査報告会は、モンゴルの牧畜業・土地問題に関わる官庁・研究機関・司法機関の関係者を交えて行う予定であり、モンゴルの土地法制の改正に学問的な立場から貢献することが期待される。また、最終年度である2008年には調査結果についての報告書を刊行予定である。本研究は、モンゴル国における土地法制、とりわけ土地私有化をめぐる諸問題を法社会学的な観点から研究し、モンゴル国における土地をめぐる紛争と環境破壊の防止に貢献することを目指した。モンゴル国では1990年の民主化以後、政治的民主化と市場経済化をめざす改革が開始され、2002年には土地私有化法が採択された。モンゴル国は遊牧を基幹産業とする世界でも数少ない国であり、そこに土地の私的所有権制度を導入するということは、遊牧文明を転換するということを意味するが、土地私有化の是非やその方法に関して十分に議論をすることなく、アジア開発銀行等の国際金融機関の強力な後押しを受けて当時の与党が当該法案を強行採決したために、土地私有化反対運動が発生した。そこで本研究では、モンゴル国の土地法制の問題点、都市と地方における紛争の実態、土地利用の慣行調査・法意識調査をモンゴル国の研究者と共同研究し、それを踏まえてモンゴル国の法学者が土地法制の改革案を提言することに協力をすることをめざした。今年度の研究成果は、以下の通りである。1)土地法・土地私有化法の影響について調査するために、研究期間内に牧地・定着過程にある牧地・農地・都市部・鉱山の5つの地域に分けてモンゴル人研究者と共同で実態調査を行ってきたが、そのとりまとめの最終調査を実施した(平成20年5月8月)。2)実態調査の結果について分析するための研究会を日本国内で開催し、調査結果の成果とりまとめに向けての準備を行った(平成20年5月8月)。3)調査結果の報告会をモンゴル土地管理局・モンゴル国立大学・モンゴル国立法律センターと共同でモンゴル国立法律センターにて開催した(平成20年9月)。4)実態調査の結果と分析について報告書を刊行するための作業を行った(平成21年13月)。
光誘電効果のメカニズム解明と新しい光機能性誘電体素子材料の創出

優れた光誘電効果を示す物質(光応答性誘電体)の新規開発と、光誘電効果のメカニズム解明が本研究課題の最終的な目標である。それに向けて本年度は、1還元焼成によって酸素欠損を意図的に導入したLaAlO3の多結晶及び単結晶の合成と光誘電効果の検証を実施した。さらに、第一原理計算によって、還元焼成LaAlO3中に生じる欠陥の同定に取り組んだ。また、2Ba(Al1-xZnx)2O4における光誘電効果のZn置換率依存性を調べるとともに、分光エリプソメトリの援用によって10^12-10^14Hzの高周波数帯域での光照射下誘電測定を実施した。1では、還元焼成LaAlO3多結晶において誘電率変化120%にも及ぶ巨大な光誘電効果の創出に成功した。また第一原理計算によって、本研究で採用した合成条件下ではLa欠陥と酸素欠陥の対が最も安定に生じる欠陥であり、そのうち酸素欠陥が光誘電効果に主要な役割を果たすことを示唆する結果を得た。一方、還元焼成LaAlO3単結晶では光誘電効果を観測されなかった。これに関しては、多結晶と合成する条件が違うため生成する欠陥種が異なる可能性が考えられる。次年度以降、単結晶合成の条件と光誘電効果の相関を詳細に調べる必要がある。2では、Zn置換率5%のBa(Al1-xZnx)2O4(x = 0.05)多結晶試料において、誘電率変化30%の比較的大きな光誘電効果を得ることに成功した。また、分光エリプソメトリによる光誘電効果測定では、LCRメータによる通常誘電測定で少なくとも10^6Hzまで観測される光誘電効果が、10^12Hz以上の周波数領域では観測されないことを明らかにした。この結果は、光誘電効果の起源としてGHz領域に緩和周波数を有する光誘起電気双極子の可能性を提起している。研究提案当初に光誘電効果の発現機構に関する知見を欠陥科学の観点より得ることを計画していた。それに対して本年度、還元焼成下でLaAlO3中に安定的に生成する欠陥種がLa欠陥と酸素欠陥の対であることを第一原理計算によって明らかにし、そのうち酸素欠陥に起因する光学遷移エネルギーが光誘電効果の照射光エネルギー依存性を整合するという結果を得た。これによって、光誘電効果において酸素欠陥が重要な役割を果たすことを明らかにした。この成果は、以後の新規光誘電体探索および物性最適化における重要な道標となるものであり、本研究課題の初期の段階にこの成果が得られたことは当初の計画以上に大きな進展である。今後は前年度の成果に基づいて、LaAlO3単結晶における光誘電効果の検証に特に集中して研究を進める。単結晶は前年度に引き続きフローティングゾーン法によって育成する。得られた単結晶を大気中で段階的にアニーリングすることで酸素欠損量をコントロールしつつ、光照射下の誘電測定を実施して光誘電効果を検証する。それと並行して、放射光X線吸収等によって第一原理計算によって明らかにした酸素欠陥の実験的な検証に取り組む。これに関しては、実験の難易度がより現実的な、光照射下のオペランド測定を必要としない永続的光誘電効果を示すBa2AlO4系材料より着手し、状況に応じてLaAlO3系におけるオペランド測定を検討する。得られた成果は随時国内外の学術会議等において発表し、そこでの議論を実験計画にフィードバックすることで研究を効率的に実施する、優れた光誘電効果を示す物質(光応答性誘電体)の新規開発と、光誘電効果のメカニズム解明が本研究課題の最終的な目標である。

それに対して本年度、還元焼成下でLaAlO3中に安定的に生成する欠陥種がLa欠陥と酸素欠陥の対であることを第一原理計算によって明らかにし、そのうち酸素欠陥に起因する光学遷移エネルギーが光誘電効果の照射光エネルギー依存性を整合するという結果を得た。これによって、光誘電効果において酸素欠陥が重要な役割を果たすことを明らかにした。この成果は、以後の新規光誘電体探索および物性最適化における重要な道標となるものであり、本研究課題の初期の段階にこの成果が得られたことは当初の計画以上に大きな進展である。今後は前年度の成果に基づいて、LaAlO3単結晶における光誘電効果の検証に特に集中して研究を進める。単結晶は前年度に引き続きフローティングゾーン法によって育成する。得られた単結晶を大気中で段階的にアニーリングすることで酸素欠損量をコントロールしつつ、光照射下の誘電測定を実施して光誘電効果を検証する。それと並行して、放射光X線吸収等によって第一原理計算によって明らかにした酸素欠陥の実験的な検証に取り組む。これに関しては、実験の難易度がより現実的な、光照射下のオペランド測定を必要としない永続的光誘電効果を示すBa2AlO4系材料より着手し、状況に応じてLaAlO3系におけるオペランド測定を検討する。得られた成果は随時国内外の学術会議等において発表し、そこでの議論を実験計画にフィードバックすることで研究を効率的に実施する、第一原理計算によって光誘電効果に主要な役割を担う欠陥種に対する重要な知見が得られ、それによって研究が当初計画以上に進展して研究計画に微変更が生じた為。
ゲノム変異から探る ～ カロリー制限の放射線発がん予防機構の解明

子ども期の放射線被ばく影響では、生涯の発がんリスクの上昇が最も心配される。我々は実験マウスを用いて、子ども期の放射線被ばくによる肝癌リスクを、成体期からのカロリー制限により低減できることを証明した。本研究では肝癌リスク低減メカニズムの解明をめざす。本研究では、1放射線誘発マウス肝癌に生じる遺伝子変異全貌の解明、2カロリー制限の肝癌遺伝子変異への寄与を明確にすることを目指す。そのため、全エクソーム解析によりカロリー制限下で発生した肝癌と標準食下で発生した肝癌の遺伝子変異の相違を明らかにする。本研究の成果を通し、カロリー制限に代わるがん予防法の基礎データの提供に繋げる。
哺乳類の全能性分子基盤における糖鎖修飾の役割

全能性は単独の細胞が自律的に発生を開始して個体を形成する能力であり、哺乳類では着床前初期胚にのみその能力が備わっているが、その分子基盤は不明である。一方、生物の体内には多様な糖鎖が存在し、組織や細胞が持つ固有の機能の発揮に深く関わっていることが示唆されているが、その生理的役割・機能は未解明の部分が多い。本研究では、全能性の分子基盤における糖鎖修飾の機能・生物学的意義を明らかにすることを目指し、全能性の消失と関連する4細胞期胚特異的糖鎖修飾およびその制御因子の同定に成功し、同定した4細胞期胚特異的糖鎖修飾がマウス着床前初期胚発生において重要な役割を果たすことを明らかにした。ES細胞やiPS細胞が持つ多能性は個体を構成する全ての細胞種に分化できるが、自律的な個体形成はできない。一方、全能性は自律的な個体形成ができる細胞の能力であり、哺乳類では受精卵から桑実胚に至る前の着床前初期胚にのみその能力が備わっている。しかし、全能性の分子基盤は多能性に比べ解明が進んでいない。研究代表者らはマウス着床前初期胚における糖鎖修飾プロファイルを調べ、4細胞期胚が特異的な糖鎖修飾状態であることを見出した。マウスでは4細胞期胚までが全能性を有し、その後失われることから、4細胞期胚特異的な糖鎖修飾状態が全能性の分子基盤に深く関与する可能性が高い。そこで本研究では、全能性の消失と関連する4細胞期胚特異的糖鎖修飾が全能性の分子基盤において果たす役割を明らかにすることを目的としている。当該年度は、以下の研究を進めた。4細胞期胚特異的なタンパク質糖鎖修飾の責任分子の同定について、以下の解析を行った。まず、卵母細胞(GV期、MII期)、初期胚(1、2、4、8細胞期胚、桑実胚、胚盤胞期胚)のDNAマイクロアレイ解析およびRNA-seq解析を行い、トランスクリプトームの情報解析から4細胞期胚特異的な糖鎖の合成に関わる候補酵素を絞り込んだ。次に、受精卵への候補酵素のsiRNAをインジェクションすることにより、特異的糖鎖修飾が消失する候補酵素の探索を行った。また、胚性遺伝子の機能欠損は主に卵母細胞や受精卵へのsiRNAのインジェクションによるノックダウンが用いられているが、実験操作および機能欠損の効果を踏まえると汎用性が高いとは言えない状況である。そこで、CRISPR/Cas9システムをマウス受精卵にエレクトロポレーションにより導入することで、100%のマウス胚で標的遺伝子をノックアウトする方法を確立した。当該年度の研究目的は、4細胞期胚特異的なタンパク質糖鎖修飾の責任分子の同定、4細胞期胚特異的な糖鎖修飾を持つタンパク質の同定、および4細胞期胚特異的な糖鎖修飾の発生における役割の解析である。上記研究目的達成のための研究計画において、4細胞期胚特異的な糖鎖の合成に関わる酵素の探索、胚性遺伝子のノックアウト法の確立、4細胞期胚特異的な糖鎖修飾を持つタンパク質の同定などの研究計画はほぼ順調に進展しているが、4細胞期胚特異的な糖鎖修飾の発生における役割の解析については計画より遅れており、当初研究目的の達成度はやや遅れている状況である。一方、全能性は自律的な個体形成ができる細胞の能力であり、哺乳類では受精卵から桑実胚に至る前の着床前初期胚に存在する細胞のみにその能力が備わっている。1. 4細胞期特異的な糖鎖修飾を認識するレクチンを用いて、マウス着床前初期胚における糖鎖修飾の局在を調べたところ、透明体と胚体の両方に存在していることを明らかにした。さらに、胚体では2細胞期までは細胞膜に局在しているが、4細胞期以降は細胞質内に移動することを明らかにした。2.昨年度に行ったマウス着床前初期胚のトランスクリプトームの情報解析により絞り込んだ糖鎖の合成に関わる候補酵素について、マウス受精卵におけるCRISPR/Cas9システムを用いたノックアウトにより糖鎖修飾の責任分子の探索を行い、遺伝子の欠損により4細胞期特異的な糖鎖修飾が減少する糖鎖合成酵素を同定した。3. 4細胞期特異的な糖鎖修飾の責任分子であることが示唆された糖鎖合成酵素を欠損させると着床前初期胚発生の異常および遅延が観察され、4細胞期特異的な糖鎖修飾が胚発生に重要な役割を果たしていることが示唆された。

一方、生物の体内には多様な糖鎖が存在し、組織や細胞が持つ固有の機能の発揮に深く関わっていることが示唆されているが、その生理的役割・機能は未解明の部分が多い。本研究では、全能性の分子基盤における糖鎖修飾の機能・生物学的意義を明らかにすることを目指し、全能性の消失と関連する4細胞期胚特異的糖鎖修飾およびその制御因子の同定に成功し、同定した4細胞期胚特異的糖鎖修飾がマウス着床前初期胚発生において重要な役割を果たすことを明らかにした。本研究課題の今後の推進方策として、H29年度の研究実施計画は4細胞期胚特異的な糖鎖修飾の発生における役割の解析、4細胞期特異的な糖鎖修飾構造の同定、4細胞期胚特異的な糖鎖修飾のタンパク質機能発現における役割の解析とし、以下のように研究を遂行する。まず、H28年度で遅れている4細胞期胚特異的な糖鎖修飾の発生における役割を明らかにする。次に4細胞期特異的な糖鎖修飾構造の同定を計画通りに遂行する。4細胞期胚特異的な糖鎖修飾のタンパク質機能発現における役割の解析については、本年度に確立したCRISPR/Cas9システムによる初期胚におけるノックアウト法(ノックアウト効率100%)を用いることで、H28年度の遅れを補い研究を推進する。生命科学
植物における純粋な二酸化炭素シグナル伝達機構の探索

平成26年度では、25年度に選抜した9系統の変異体のうち、まだ原因遺伝子が不明であり、且つ特に興味深い形質をもつ3系統について、遺伝学的マッピングおよび次世代シーケンスの手法を用いて原因遺伝子の同定を行った。このうち1系統ついては、実験が進んだ結果、既知の気孔開閉応答関連遺伝子が原因遺伝子である可能性が高まった。一方残りの2系統のうち1系統では、既知ではあるもののこれまで気孔開閉応答との関連は報告されていなかった遺伝子においてナンセンス変異が起こっていることが判明した。さらにもう1系統でも同じく気孔応答との関連が報告されていなかった遺伝子または未知のタンパク質をコードする遺伝子にミスセンス変異が起こっていることが分かった。このことから本研究の主目的の大部分が達成できたと考える。また本研究の一環としてシロイヌナズナエコタイプの気孔応答性解析も行っている。平成26年度では、巨大気孔をもつ4倍体エコタイプMe-0が通常の4倍体(Col4倍体)よりも高いガス交換能を示す理由を調べるため、孔辺細胞内のイオンバランスや遺伝子発現レベルを比較した。その結果Me-0ではCol4倍体に比べリンゴ酸含量が高くなっており、また防御応答関連遺伝子群の発現低下および細胞壁弛緩関連遺伝子群の発現上昇が見られた。このことからMe-0では巨大気孔を開くために生理的且つ遺伝子的な変化が起こっている可能性が示唆された。この研究成果は現在論文にまとめている最中である。さらに別のエコタイプを用いた研究で、二酸化炭素応答性の低いエコタイプ複数系統間で環境シグナルの種類による気孔応答性の違いを比較をするという試みを行った。その結果、調査した3系統のエコタイプで共通して、環境シグナルの種類によってシグナルネットワークのクロストークに偏りが見られるという興味深い知見を得た。この研究成果は学術誌に掲載済みである。26年度が最終年度であるため、記入しない。本研究では、環境刺激に対する気孔応答機構の解明に向け、アブシジン酸(ABA)シグナル経路とクロストークしている二酸化炭素(CO_2)シグナル経路から、純粋なCO_2シグナル経路に関わる新規の遺伝子を発見することを目的としている。平成24年度では、目的とする遺伝子に変異をもつ植物体を選抜するため、サーモグラフィを用いたハイスループットスクリーニングを行った。まずスクリーニングの準備として、環境試験機の動作調整を行った。この試験機は本研究のため新たに開発したものであるが、従来の試験機に比べ精密な環境条件のコントロールを可能にする。動作確認の結果、従来の試験機よりも湿度低下の速度が遅かったため、新たに除湿器を設置することで対策とした。その後本格的にスクリーニングを開始した。このときスクリーニングに用いた植物体は、変異原処理をする前に、目的の変異体を単離する上で邪魔になるABAシグナル応答の影響を排除してあったが、この植物体は野生株に比べて枯れやすく、CO_2応答性も低いため、目的とする変異株候補がとれる割合が低かった。そのため、別のアプローチとして、野生株に変異原処理を施して得たM2植物を用いてスクリーニングを行い、その結果一次選抜において68系統の変異株候補を得ることに成功した。一次選抜で単離した変異株については、二次選抜においてABA定量およびABA応答性解析を行うことで、ABAシグナル経路とは独立した経路に関わる変異株を絞り込む。また気孔のCO_2シグナル応答研究の一環として、シロイヌナズナエコタイプ集団について、同様の手法によりCO_2応答に違いのあるエコタイプを探索したところ、解析の中でMe-0というエコタイプのCO_2応答性が通常と異なっており、その原因が気孔サイズの拡大にあることを発見した。そこでこのエコタイプの気孔応答性を詳細に解析し、その結果を国際会議にて発表した。平成25年度では、平成24年度に引き続き変異体の選抜および表現型解析を行った。初期の計画ではアブシジン酸(ABA)応答能または合成能を喪失した変異体に変異原処理を施したM2植物の中から二酸化炭素(CO2)応答性に異常をもつ変異体を探し出す計画であったが、これらの植物は枯れやすい上に気孔応答性も野生株に比べて低いため、目的とする変異体候補の選抜が厳しい状況であった。そこで別のアプローチとして、野生株に変異原処理を施したM2植物の中からCO2応答性に異常がある変異体を選抜し、さらに二次選抜としてABA定量およびABA応答性確認を行うことで目的とする遺伝子に変異をもつ植物体を絞り込んだ。この手法に切り替えたことで予定より変異体の選抜に時間がかかったものの、平成24年度に68系統、平成25年度(繰越期間含む)に87系統の変異体を一次選抜により単離することに成功した。さらに平成25年度ではこの155系統から二次選抜を行い、9系統にまで変異体候補を絞り込んだ。またこれらの変異体に関しては気孔形態・気孔応答性を中心に表現型解析を行い、特に興味深い形質を示した変異体から順次、遺伝学的マッピング・次世代シーケンスによる原因遺伝子の同定作業を行った。この結果、1系統については平成25年度終了時までに原因遺伝子候補の絞り込みに成功した。また本研究の一環として、シロイヌナズナエコタイプの気孔応答性解析も行っている。平成25年度では、巨大気孔をもつエコタイプMe-0の気孔巨大化の原因が倍数性の上昇にあること、Me-0では気孔開口能および気孔コンダクタンス(gs)が通常の4倍体よりも高いことを突き止めた。

さらに、気孔の密度・深度・開口部面積から算出される推定上のgsにおいても同様の結果が見られたことから、Me-0では確かに通常の4倍体よりも高いガス交換能をもつことが計算上でも証明された。平成26年度では、25年度に選抜した9系統の変異体のうち、まだ原因遺伝子が不明であり、且つ特に興味深い形質をもつ3系統について、遺伝学的マッピングおよび次世代シーケンスの手法を用いて原因遺伝子の同定を行った。このうち1系統ついては、実験が進んだ結果、既知の気孔開閉応答関連遺伝子が原因遺伝子である可能性が高まった。一方残りの2系統のうち1系統では、既知ではあるもののこれまで気孔開閉応答との関連は報告されていなかった遺伝子においてナンセンス変異が起こっていることが判明した。さらにもう1系統でも同じく気孔応答との関連が報告されていなかった遺伝子または未知のタンパク質をコードする遺伝子にミスセンス変異が起こっていることが分かった。このことから本研究の主目的の大部分が達成できたと考える。また本研究の一環としてシロイヌナズナエコタイプの気孔応答性解析も行っている。平成26年度では、巨大気孔をもつ4倍体エコタイプMe-0が通常の4倍体(Col4倍体)よりも高いガス交換能を示す理由を調べるため、孔辺細胞内のイオンバランスや遺伝子発現レベルを比較した。その結果Me-0ではCol4倍体に比べリンゴ酸含量が高くなっており、また防御応答関連遺伝子群の発現低下および細胞壁弛緩関連遺伝子群の発現上昇が見られた。このことからMe-0では巨大気孔を開くために生理的且つ遺伝子的な変化が起こっている可能性が示唆された。この研究成果は現在論文にまとめている最中である。さらに別のエコタイプを用いた研究で、二酸化炭素応答性の低いエコタイプ複数系統間で環境シグナルの種類による気孔応答性の違いを比較をするという試みを行った。その結果、調査した3系統のエコタイプで共通して、環境シグナルの種類によってシグナルネットワークのクロストークに偏りが見られるという興味深い知見を得た。この研究成果は学術誌に掲載済みである。26年度が最終年度であるため、記入しない。平成24年度途中から変異体スクリーニング手法の変更を行ったため、当初の実験計画よりもスクリーニングに要する時間が増加したが、この手法の変更により、目的とする変異体候補を予定よりも多く単離することに成功した。さらにこれらの変異体について表現型解析を行い、特に興味深い形質を示したものから原因遺伝子の同定作業を行った結果、1系統については既に原因遺伝子候補の絞り込みが完了した。残念ながら挙がってきた原因遺伝子候補は既知であったが、そのほかの系統についても遺伝学的マッピングを行う準備は整っており、平成26年度中に多数の変異体の原因遺伝子が同定されることが期待できる。変異体候補の表現型解析の結果、これまで報告例のないような気孔応答性を示した系統も見つかっている。このことからも、新規のCO2シグナル伝達経路関連遺伝子を発見する可能性は高いと思われる。
大脳白質障害が及ぼす脳機能障害の病態解明と治療法開発のための基盤研究

大脳白質障害の病態解明と治療法の開発を目的として、エンドセリン局所注入によるラット大脳白質モデルの手技を検証し最適化した。多角的に病態を評価し、ラクナ梗塞に近似した形態変化を示すことが判明した。本動物実験モデルの応用モデルとして、ストレス負荷による表現型を解析した。本モデルラットは、拘束ストレスを加えることにより、うつ様症状の一端を呈することが判明した。臨床現場にて仮説とされた大脳白質病変とストレス脆弱性の関連性が示唆された。さらに本モデルラットを用いて、新たな治療法として脳血管内皮細胞移植による白質障害の治療効果を検証した。MRIにより同一個体にて細胞移植による梗塞巣の縮小効果を確認した。選択的白質梗塞(ラット白質脳梗塞)ラットモデル作成においては、定位的に、大脳白質(内包)へエンドセリンを注入し(血管収縮により)たところ、再現性良く、白質梗塞を作成することができた。(1)大脳白質障害における局所的な病態解明を目指した。神経症状評価として経時的な運動機能をみたが明らかな運動麻痺は認めなかった。組織・形態学的評価として、H&E染色,免疫組織染色法を用いた。障害部位においては、軸索、髄鞘、オリゴデンドロサイト、アストロサイト、血管の障害、浮腫の所見を認めた。さらに。質量顕微鏡(Imaging mass spectrometry:IMS)により分子レベル(リン脂質、タンパク質)で障害部位を観察するとある特定のリン脂質が炎症期に特異的に増加指定ことが判明した。(2)大脳白質(軸索)障害部位と関連(投射)部位の神経細胞体(灰白質)の病態評価を目指した。まず初めに、内包で障害された軸索の神経細胞体がどの部位に存在するのかを、逆行性の軸索トレーサーにて標識し、同定した。前頭葉吻側の皮質および大脳基底核の神経細胞体が標識された。内包白質障害と関連する神経細胞体の存在部位が明らかになった。同側の前頭葉皮質と大脳基底核との関連が示唆された。平成26年度までに大脳白質病変モデルラットの作成時における技術的な面においては、穿刺針の角度を変えることにより、内包へのエンドセリン注入(脳室に漏れることによる合併症を回避)法の最適化を実現した。選択的大脳白質障害を作成することができた。運動機能においては、外見上は明らかな麻痺症状を呈することはなかったが、Ladder testによる詳細な運動機能評価において病変部位の対側である右脚において、術前日から手術1日後にかけて有意に運動機能の低下を認めた。H27年度においては、分担研究者によりMRIを用いて、細胞移植治療による効果を脳梗塞巣変化を指標として同一個体において評価した。細胞移植治療に関しては、以前、筆者らが脳障害時における神経保護作用を報告している脳微小血管内皮細胞(MVECs)を用いた。同種成熟ラット脳皮質より調製したMVECsを、内包障害発症後7日目に移植した。対照としてウシ血清アルブミンの移植(注入)を用いた。移植直前と移植後14日目にMRIを撮影し,病変体積を計測し経時的体積変化を解析した。MVECs移植群は対照群と比較し,MRI T2高信号病変の体積の有意な縮小を認めた。MR画像評価と並行して、オリゴデンドロサイト前駆細胞(OPCs)およびオリゴデンドロサイト系譜細胞(OLCs)の細胞動態に注目して組織学的評価を行った。MVECs移植群では対照群と比較し,OPCsの細胞数およびOLCsの細胞数について有意な増加を認めた。MVECs移植によりに,OPCsよびOLCsが増加することにより髄鞘形成が促進され、白質障害(梗塞)が改善するメカニズムが示唆された(J Neurochem. 2015 135: 539-550)。大脳白質障害における細胞移植治療効果に関して、オリゴデンドロサイトによる髄鞘の改善の可能性は示されたが、軸索再生に関しては尚検討すべき課題として残る。大脳白質障害モデルにおける脳機能障害の評価をおこなった。特にストレス下における行動(運動・感覚)を制御するシステム(皮質脊髄路に関しての評価)と情動反応や覚醒状態を調節するシステム(大脳辺縁系、脳幹網様体賦活系など)に関して評価を行った。具体的には白質障害モデルラットに拘束ストレスを加えた時に生じる運動機能と情動反応を評価した。結果としては、内包障害だけでは一見何ら運動機能や情動反応の異常な神経所見を示さない。一方、毎日2時間拘束ストレスをかけることにより、情動反応に異常が見られた。最も著明な所見としては、無働時間の延長と食欲低下による体重増加の鈍化など、一見するとうつ病様の症状を呈することが示された。次に、大脳白質(内包)で障害される軸索のもととなる神経細胞体の同定を行った。内包障害部位に逆行性のラベル(Fluoro Gold)を注入し、その分布を傾向顕微鏡で観察した。内包を通過する軸索のもととなる神経細胞体は、前頭葉大脳皮質だけでなく大脳基底核など広く存在することが示唆された。白質(内包)を通過するのは皮質脊髄路が有名であるがこれのみではなく、大脳基底核の連絡路としても重要である。うつ病様症状の原因として大脳基底核を含めた神経連絡ネットワークの障害がその一因である可能性が示唆された。

多角的に病態を評価し、ラクナ梗塞に近似した形態変化を示すことが判明した。本動物実験モデルの応用モデルとして、ストレス負荷による表現型を解析した。本モデルラットは、拘束ストレスを加えることにより、うつ様症状の一端を呈することが判明した。臨床現場にて仮説とされた大脳白質病変とストレス脆弱性の関連性が示唆された。さらに本モデルラットを用いて、新たな治療法として脳血管内皮細胞移植による白質障害の治療効果を検証した。MRIにより同一個体にて細胞移植による梗塞巣の縮小効果を確認した。血管内皮細胞移植(MVECs)による治療効果に関しては、移植細胞からの分泌因子(エクソソーム)が、オリゴデンドロサイト前駆細胞(OPCs)やオリゴデンドロサイト系譜細胞(OLCs)の生存・増殖調節に重要な役割を演じている可能性が示唆された。臨床治療への応用を目指して、移植された細胞から分泌されるエクソソームに含まれる神経栄養因子の同定を目指す。脳神経外科申請課題は、ある程度予備実験を行った上での研究立案と計画である。そのため、おおむね順調に研究が遂行できている。実験はおおむね終了し、現在研究成果の論文投稿準備中である。英文校正や出版費用のため次年度に使用額の申請をお願いした。また追加実験の可能性があり次年度に予算を確保した。論文草稿の準備とその後英文校正費に使用する予定である。出版費もカラー+オープンアクセスにすると約50万円の予算を要する見込みである大脳白質障害における脳機能障害の評価として、行動(運動・感覚)を制御するシステム(皮質脊髄路に関して)については一定の評価ができた。今後は、情動反応や覚醒状態を調節するシステム(大脳辺縁系、脳幹網様体賦活系などの高次脳機能)に関して評価を行う。具体的には白質障害に拘束ストレスを加えたうつ病モデルによる評価系を用いる予定である。最終目標は、大脳白質障害に対する治療法の開発である。現在は細胞移植による治療法の開発を計画しているが、その他、細胞を用いない、具体的には血液中の微小粒子:エクソソーム投与による治療法の開発も検討している。これまでは、予備実験の段階であり物品費は予想されたほど消費しなかったが、これから本実験となり物品費としての消費が増加することが予想される。実験動物と試薬の購入資金並びに論文校正の際の謝金として使用する予定である。
がん化におけるcaspase-8機能異常の解析

我々の目的は、アポトーシスにきわめて重要な分子であるcaspase-8の機能異常が、細胞のがん化に関与することを明らかにすることにある。我々は最近このcaspase-8のsplice variant(caspase-8L)を見いだし、その発現がある種のリンパ系腫瘍細胞で大きく偏っていることを報告した。Caspase-8Lは、caspase-8の酵素活性部位のみを欠失するため、アポトーシスを抑制することが予想された。本年度の成果の第一は、caspase-8Lの機能を細胞生物学的に明らかにしたことである。すなわちcaspase-8Lがcaspase-8によるアポトーシスをdominant negativeに抑制すること、その機序がFADDとcaspase-8との結合を競合的に阻害することを明らかにした。Caspase-8Lが過剰に発現することにより、アポトーシスが抑制されがん化が生じる可能性が考えられる。第二の成果は、caspase-8の全エクソンについて各種がん組織で変異を同定する解析システムが動き始めたことである。第三の成果はcaspase-8を選択的に欠損したヒト由来T細胞株を樹立したことである。この細胞でがん組織から得られた変異caspase-8を発現させることにより、正常のcaspase-8の影響を受けずに変異caspase-8の機能解析が可能になった。
ミドリゾウリムシにおける共生藻獲得に伴う遺伝子発現・代謝動態とその意義の解明

真核細胞による光合成能獲得は、藻類補食、藻類の一時的保持(盗葉緑体;任意共生)、絶対共生(葉緑体)の順に進行したと考えられている。この進化過程の理解は、光合成真核生物の誕生と多様化を理解する上で非常に重要であるが、ほとんど理解が進んでいない。この問題を解く有力な手段として、光合成を基盤とした任意共生系を対象として、細胞内共生の成立に必要な、宿主及び共生体に求められる要件を理解することが挙げられる。そこで本研究では、ミドリゾウリムシとクロレラの任意細胞内共生系を用いて、両者の代謝産物を介した相互作用を明らかにするとともに、宿主ミドリゾウリムシと共生クロレラそれぞれに求められる共生を成立させるために必要な要件を明らかにすることを目的とする。研究開始の本年度は、光合成において重要な窒素代謝に注目した解析を行った。宿主ミドリゾウリムシの共生クロレラへの窒素源供給と共生クロレラの窒素源利用形態を解明するため、ミドリゾウリムシ、単離した共生クロレラ、独立生活クロレラを様々な濃度の無機窒素源及びアミノ酸存在下で培養した。共生クロレラは独立生活クロレラに比べて、無機窒素源を同化する能力が顕著に低い一方で、外界からアミノ酸を取り込み効率よく増殖に利用できることが明らかとなった。さらに、共生藻がどのように窒素源のやり取りをしているのか推測するための予備データを得るために、各培養条件に於けるRNA-seq解析を行うとともに、共生クロレラのゲノムをPacBioによって解読した。翌年度、交付申請を辞退するため、記入しない。
近世イランにおける都市、農村、遊牧民に関する経済史的研究

本研究は、前近代イランにおける都市と農村、さらには遊牧民の社会経済史的な実態とそれらの相互関係を明らかにするための新たな史料として、これまであまり利用されることのなかったオスマン史料に着目し、その分析を通じて前近代イランの社会経済史研究にあらたな知見と問題群を提起することを目指したものである。本研究が用いたオスマン史料のうち最も重要なものは、18世紀初頭のサファヴィー朝崩壊に乗じてオスマン朝がイラン西部をおよそ5年にわたって占領・統治した際に作成した行政文書群である。報告書にあるように、成果として特に以下の4点を挙げることができる。1.オスマン史料利用に先立ち、前近代イラン社会研究に関わる諸問題を整理して、とくに農村・遊牧民をも射程に入れた社会史研究の遅れを指摘した。2.オスマン朝が占領地域を対象として作成した検地帳の作成経緯や史料的価値を明らかにした。今後、この台帳を利用するにあたっての指針となることを期待したからである。3.サファヴィー朝後期の有力名望家に関する財産目録をオスマン史料のなかに発見し、その分析を通じて、エリートによる土地所有の実態、さらには都市と農村との関わりの一端を明らかにすることができた。4.納税台帳を用いてある特定地域における果樹栽培の分布状況を明らかにし、サファヴィー朝期においても都市の市場を対象とした果樹栽培が行われるなど、都市の消費者の存在が農業生産に対して一定のインセンティヴを与えていたことを実証した。本研究は、オスマン朝が18世紀初頭のサファヴィー朝崩壊に際してイラン西部をおよそ5年にわたって征服した際に作成した膨大な納税台帳(以下、「検地帳」と呼ぶ)を分析することで、前近代イランにおける都市と農村、さらには遊牧民の社会経済史的な実態とそれらの相互関係を明らかにすることを目指している。平成16年度は史料の収集を中心に調査を進めた。まず、基本史料となるオスマン検地帳については、平成16年8月にトルコ共和国総理府古文書局(イスタンブル)で行った調査で、該当時期のイランに関わる検地帳15冊をほぼすべて複写(ただしCD-ROM)することができた。なお、以前は複写に関して台帳の3分の1までという厳しい制限があったため、当初、本研究では当面アゼルバイジャン地方の台帳に限定して収集するつもりであった。しかし、最近、当該史料に関しては複写の制約が緩やかになり、また、当該時期のすべての検地帳を比較考量することが個々の検地帳の史料批判のために不可欠であることから、すべての台帳を収集することとした。現在は、データベース・ソフトをもちいて、これらの史料から得られる情報を台帳ごとに順次、入力している。現時点でアゼルバイジャン関係の台帳3冊分をほぼ入力することができた。このほか、フランスの国立国会図書館においては、研究対象となる18世紀を中心とする時期にイランを訪れたヨーロッパ人旅行者の旅行記などの史料を閲覧した。こうした史料には、書き手の偏見などが含まれているとはいえ、都市や農村などに関する、現地語史料からは得られない情報が含まれているからである。このほか、西アジアの社会経済史にかかわる諸研究や基本的な文献を収集した。本研究は、サファヴィー朝崩壊直後にイラン西部を占領したオスマン朝が作成した一連の検地帳を分析することで、当時のイラン社会における都市、農村、遊牧民のあり方を探ろうとするものである。昨年度、トルコにおいて当該検地帳の複写を完了したので、本年度は、これらオスマン検地帳の情報をコンピュータを使ってデータベース化するとともに、これらの史料を補完する、あるいはその理解に利用しうる史料として、イラン側の文書史料の調査と収集を行った。夏と冬、合計1ヶ月半の間イランに滞在し、もっぱらゴレスターン宮殿と国立公文書機構で調査を行った。とくにゴレスターン宮殿では、19世紀後半、カージャール朝下のイラン各地で行われた人口統計資料を閲覧し、その一部(コルデスターン州に関する部分)を複写することが出来た。オスマン検地帳が作成された18世紀初頭とは150年ほどの隔たりがあり、また様式も異なるために両者の比較は容易ではないが、これら「国勢調査」

資料は、検地帳の解釈に役立つとともに通時的な変化をとらえるための手がかりを与えてくれると思われる。国立公文書機構においては、イラン西部諸地域、とくにコルデスターン州の社会経済史に関する文書の有無を調査した。その結果、19世紀以前についてはごくわずかな文書が数点残されているだけであったが、19世紀末、とりわけ20世紀以降については、都市はもちろんのこと、農村や遊牧民、さらにワクフに関する、すくなくとも数百点以上に及ぶ、さまざまな文書が残されていることが確認できた。これらの史料もまた、本研究の対象時期とは時代が大きく離れているが、検地帳が作成された時期の社会経済的状況を探るための貴重な材料となることが予想される。これら史料収集のほか、検地帳データのコンピュータへの入力と収集した史料の解読を進めた。
コンピューターのパターン認識による介形虫類の形態形成の解析と分類の基礎的研究

介形虫類の殻に現われる各種の一般装飾に加えて、眼の円形小突起、多数の感覚子孔や分泌孔、蝶番、筋痕は機能上重要な意義を持ち、介形虫分類の基本単位となり得る。本研究はこれらの微細構造の観察に基づき、各々の形態要素が持つ生物学的意味を明らかにする。また、それらの各形態をコンピューターのパターン認識から、その機能を考慮した形質評価を行って、介形虫類の新しい分類体系を確立することである。更に、この新しい分類体系に基づき、介形虫の種分化の機構をも解明しようとするものである。研究は次の様な経過でなされた。1.形態解析のためのコンピューター(ルーゼックス【II】)をニレコKKの協力のもとに新しく開発することから始めた。2.形態解析のための基礎的作業を静岡大学・増田俊明助手の協力のもとに変成岩中の石英粒を用いて行った。3.次に主として、Cytheromorpha,Cythere属を材料として、殻表面上の網目装飾の粗・細の程度と殻に垂直に貫通する多数の感覚子孔の数とその分布パターンを個体発生レベルで統計的に調べた。(1)Cytheromorpha属に現われる網目装飾の幅広い変異は種内でも生じており、生育時の水温と密接な関係を持つことが明らかになった。(2)Cythere属における感覚子孔の数とその分布パターンは種レベルで非常に安定した形質であることが判明した。即ち、同一種内での孔の総数の"変動量"は"5"以内であり、その分布パターンは種ごとにはっきりとした特徴を有する。4.以上の分類要素を用いて、世界中の化石および現生の同属種を再分類して、それらの系統関係を考察した。その結果、Cythere属は5つの系統に分けられ、中新世から現在にかけての種分化の過程が追跡された。以上の結果は個々に研究論文として公表され、また、今後発表すべく準備されている。
イネ茎頂分裂組織におけるパターン形成機構の分子遺伝学的モデル基盤構築

本研究では、ユニークな地上部器官分化パターン異常である「双極葉」を生じるイネabl突然変異体を複数解析し、SAMにおいて異所的な葉原基の分化抑制に関わる新規マスター調節遺伝子の機能と相互関係および植物ホルモンとの関係性を明らかにする。これは、SAMにおけるパターン形成機構の分子遺伝学的モデル構築の基盤となる。
せん妄の薬物療法を開拓する：髄液分析および介入研究

計画変更後の研究『せん妄患者と非せん妄患者での血漿中オレキシン濃度の差に関する研究』の臨床情報収集と検体採取が前年度に終了し(症例数70名)、本年度はその解析と論文投稿を行った。現時点での主な解析結果は以下の3点。1、せん妄患者と非せん妄患者とで、血漿中オレキシン濃度に差はなかった。また、血漿中オレキシン濃度はせん妄の重症度やせん妄の病型とも関連がなかった。さらに、せん妄患者について、せん妄が改善する前後のオレキシン濃度にも差がなかった。全体として、血漿中オレキシン濃度とせん妄には関連がないことを明らかにした。オレキシンは主に脳から分泌されるため、オレキシンとせん妄との関係をより正確に把握するには、やはり血液ではなく脳脊髄液を用いた研究が必要である。これらの結果は論文として投稿し掲載済み。2、血漿中オレキシン濃度は腎機能と負の相関を示した。血漿中オレキシンは腎臓を通して尿中へ排泄されている可能性があり、腎機能の低下とともに体内のオレキシン濃度が高くなる可能性がある。世界で血漿中オレキシン濃度を測定する研究が増えてきているが、今後は研究の計画や解釈に腎機能を考慮する必要がある。この結果は論文として投稿し、査読者からの修正依頼に回答中。近日中に受理される見込み。3、入院時に簡単に収集できる情報を元に入院後のせん妄の発症を予測する方法を検討し、結果として、従前のADL(日常生活動作)が悪いことと、入院時の疾患が重篤であることの2項目が強い予測因子であることを見出した。この結果は国内学会で発表済みで、現在論文投稿への準備中。研究計画を変更し、倫理委員会の承認を得た。今後患者登録予定である。UMIN試験ID:UMIN000024565。当初の計画では入院中のせん妄患者30名、非せん妄患者30名について、入院中に2回ずつ髄液採取を行う予定であった。しかしこれは侵襲が大きく、対象がせん妄患者ということもあり倫理的にも実施が困難と判断した。このため計画を変更した。変更後の研究計画の概要は下記の通り。せん妄と髄液中オレキシン濃度との関連の研究において、髄液に代わって血漿で研究が可能かを評価するために、せん妄患者の髄液中オレキシン濃度と血漿中オレキシン濃度とが相関するかを検証する。対象患者は入院後せん妄が5日以上続いている患者10名(髄液採取の必要性が比較的高い者のみを対象とすることにした)と、日常診療の一貫で髄液採集をするせん妄ではない患者10名(特発性正常圧水頭症の患者など)。髄液と血液を採取し、オレキシン濃度の相関を調べる。髄液採取の回数は各被験者1回。この研究で髄液中オレキシン濃度と血液中オレキシン濃度に相関があることがわかれば、今後は血液を用いて研究を進める予定である。計画変更、倫理申請およびその承認に時間を要した。研究計画を変更し、『せん妄患者と非せん妄患者での血漿中オレキシン濃度の差に関する研究』とした。最も大きな変更点は、当初の研究計画では髄液と血液とを採取することとしていたところを、血液のみとした点である。この理由は主に以下の2つである。1.せん妄患者に腰椎穿刺を行うのは危険を伴うため、対象者の利益を少しでも大きくするために選択基準・除外基準を厳しく設定したが、これにより該当患者がなかなか現れなかった。また研究同意を得にくい。2.髄液中と血漿中のオレキシン濃度に強い相関があるとの報告がなされ、それを受け血漿中オレキシンのみで研究を行った報告が出てきた。計画変更後の研究計画の概要は以下の通り:老年内科に入院した全患者について、第2-4病日と第10-12病日に1回ずつ採血を行い、オレキシン濃度を測定する。対象は65歳以上の全患者。ただしスボレキサント(オレキシン受容体拮抗薬)を服用している患者と第10病日までに退院することが確定している患者は除外する。目標症例数は70名。うち2割程度はせん妄患者であると想定される。1回目の検体について、せん妄患者とせん妄ではない患者との間でオレキシン濃度の差を検定する。また、せん妄患者について、1回目の検体と2回目の検体でオレキシン濃度に差があるか検定する(2回目の採血時にはほとんどの患者でせん妄が治まっていると想定され、せん妄の最中と改善後とでの血漿中オレキシン濃度の差を調べる)。合計70名分の検体採取と臨床情報収集は終了し、血液検体を検査会社へ提出した。検体採取が終了し、検体を検査会社に手渡した。

1、せん妄患者と非せん妄患者とで、血漿中オレキシン濃度に差はなかった。また、血漿中オレキシン濃度はせん妄の重症度やせん妄の病型とも関連がなかった。さらに、せん妄患者について、せん妄が改善する前後のオレキシン濃度にも差がなかった。全体として、血漿中オレキシン濃度とせん妄には関連がないことを明らかにした。オレキシンは主に脳から分泌されるため、オレキシンとせん妄との関係をより正確に把握するには、やはり血液ではなく脳脊髄液を用いた研究が必要である。これらの結果は論文として投稿し掲載済み。2、血漿中オレキシン濃度は腎機能と負の相関を示した。血漿中オレキシンは腎臓を通して尿中へ排泄されている可能性があり、腎機能の低下とともに体内のオレキシン濃度が高くなる可能性がある。世界で血漿中オレキシン濃度を測定する研究が増えてきているが、今後は研究の計画や解釈に腎機能を考慮する必要がある。この結果は論文として投稿し、査読者からの修正依頼に回答中。近日中に受理される見込み。3、入院時に簡単に収集できる情報を元に入院後のせん妄の発症を予測する方法を検討し、結果として、従前のADL(日常生活動作)が悪いことと、入院時の疾患が重篤であることの2項目が強い予測因子であることを見出した。この結果は国内学会で発表済みで、現在論文投稿への準備中。1.髄液中オレキシン濃度と血液中オレキシン濃度に相関があるか評価するための研究とした。相関があることがわかれば、今後は血液を用いて研究を進める予定である。2.対象患者数を減らした。当初の計画では合計60名、変更後の計画は合計20名。3.髄液採取の回数を2回から1回へ減らした。4.せん妄患者については髄液採取の必要性が比較的高い者のみを対象とすることにした(せん妄が5日以上続いている者)。血液検体のオレキシン濃度の分析結果を待って、収集した臨床情報をあわせて解析し、論文で発表する。今年度から患者登録、検体採取・検査が始まるため。検体を検査会社へ提出したが、支払いはまだ終わっていない。これに200万円ほどかかる見込み。その他、論文出版費用や旅費などを見込んでいる。腰椎穿刺、髄液検査(オレキシン、インスリンなど)、血液検査(オレキシン、インスリン、その他一般生化学など)に使用する。
大腸癌組織浸潤・肝転移に伴う特異的PKCの発現及び局在の分子生物学的検討

大腸癌転移性肝腫瘍は、大腸癌死因の約1/3をしめる重篤な病態である。一方細胞内情報伝達系のsecond messengerの1つであるPKCは、発癌プロモーションとの関係が推察されている。現在10種類のPKC isoformの存在が報告されているが、その役割は明らかでない。我々はヌードマウス肝転移モデルを用いて肝転移に伴う特定のisoform発現の変化を報告した。今回PKC isoformの大腸癌増殖に伴う発現の変化を検討する為、切除組織を用いたmRNA発現及びその蛋白局在を検討した。【研究成果】1.当院外科で手術された大腸・直腸癌17例(Dukes'B6例、C11例)、転移性大腸腫瘍1例(原発巣肺癌)、肝細胞癌1例、肝血管腫1例の手術例より原発癌組織、対照隣接正常組織を採取し大腸癌Tissue bankの設立を行った。2.大腸癌組織におけるPKC isoform mRNA発現の検討:原発性大腸癌23例、肝転移巣4例について検討した。Total RNAはAGPC法により抽出、mRNAの検討はヒトPKC isoformに特異的な9種のRNA probe(PKC-α,βI/II,δ,ε,ζ,η)を用いたRNase protection assayを行った。PKC-α,βII,δ,ε,η(L)、ζmRNAは検討した全ての検体で発現していたが、発現は大部分の原発巣で減少していた。2.蛋白局在の検討:新鮮組織より連続切片を作製、PKC-β及びδに対する免疫染色を行った。抗ヒトPKC-β、PKC-δポリクロナール抗体を用いたABC法で検討した。両isoform共に発現は正常粘膜において微弱であった。しかしPKC-δは、細胞膜下染色性の増強を認め、translocationの可能性を示唆した。一方癌組織においてPKC-βは殆ど検出されなかった。PKC-δは瀰慢性の染色性を示し、正常粘膜で認められた細胞膜下集積は明らかでなかった。【結論】我々は大腸癌組織において、PKC-sioformの発現の変化をmRNAレベル及び蛋白レベル明らかにすると共に、癌部におけるisoform発現パターンの変化は、悪性細胞の持つ増殖性・未分化特性を示唆した。我々は、大腸癌切除組織及びヌードマウス肝転移モデルを用いたPKC isoform mRNA発現の検討で、大腸癌の浸潤・転移において特異的なisoformの発現の変化が関与している可能性を示唆した。そこで1995年度(平成7年度)は、臨床手術材料の収集と同切除組織を用いてPKC isoform蛋白発現を免疫組織学的に局在を下記の様に検討した。1)大腸癌Tissue bankの設立:当院外科で手術された、大腸癌・直腸癌・大腸腺腫・肝癌・肝血管腫手術例21症例より原発癌組織、対照隣接正常組織を採取した。大腸癌検体は疾患の進行度(Dukes'分類)に基ずいて分類、切除後直ちに液体窒素で凍結その後-80Cで保存した。21検体の内訳は、大腸・直腸癌17例(Dukes'B 6例、C11例)、転移性大腸腫瘍1例(原発巣肺癌)、肝細胞癌1例、肝血管腫1例である。