hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
キラルアシルイミニウムイオンの創成

光学活性含窒素有機化合物,中でもα位炭素がキラルなα位置換ピペリジンやピロリジンは医薬品に数多く用いられており,その高選択的合成法の開拓は極めて重要である。一方,本研究代表者らは,既にα-アミノ酸の電極酸化を利用したアシルイミニウムイオンの創成法とそのキラルバージョンを開拓している。しかし,キラルα-アミノ酸からキラルアシルイミニウムイオンへの変換(不斉記憶)において選択性の問題が残っていた。そこで,このイミニウムイオン創成の効率性に及ぼす各種影響因子の解明を行った。成果は以下のようにまとめられる。(1)不斉記憶に及ぼす構造効果:N-保護基がο-フェニルベンゾイル基,母核が立体的にバルキーであれば最高8391%ee,ピロリジン核のように母核がバルキーでなくN-保護基がバルキーなときには46%ee程度,母核がバルキーであってもN-保護基がバルキーで無いときには0%eeになることを見いだした。また,L-プロリン誘導体のカルボキシル基を還元して得られるβ-ヒドロキシアミンを電極酸化すると炭素間結合開裂反応が起こったが,その生成物のN, O-アセタールでも高い不斉記憶現象が観測された。さらに,ジフェニルメチル基をα位に有するN-アシルビロリジンの電極酸化でも中程度の不斉記憶が観られた。(2)不斉ルイス酸触媒と活性メチレン化合物との組み合わせによるイミニウムイオンへの触媒的不斉炭素間結合形成反応:光学活性ビスオキサゾリンと銅(II)からなる不斉触媒はマロン酸ジメチルと動的錯体動的錯体を形成させ,これとプロキラルなN-アシルピペリジニウムイオンを反応させるとピペリジン環α位でエナンチオ選択的に炭素間結合形成できることがわかった。キラル分子のキラル炭素に置換基を導入するとき、完全なS_N2機構で反応が進むとキラル生成物が得られるが、この形式の反応では出発物及び生成物の構造に制限がある。一方、アニオン、ラジカル、カチオンなどの活性中間体を経る機構で反応が進行すれば、より多彩な構造の生成物を得ることが出来るが、これら活性中間体を経る反応では、元のキラリティーが保存される例は無かった。近年、アニオン、ラジカルを経る反応で元のキラリティーが生成物に保存される現象が見いだされ、この現象が不斉記憶と呼ばれている。しかし、カチオン中間体を経る反応では、これまで不斉記憶現象の例は皆無であった。本研究は、光学活性α-アミノ酸から、酸化脱炭酸により光学活性を失うことなくアシルイミニウムイオン中間体を創成し,このキラル中間体を利用して光学活性含窒素化合物の新合成法を切り開くことを目的とする。本年度は、アミド結合の回転阻害による出発物のキラリティーの記憶の可能性を探り、o-Ph置換ベンゾイル基で窒素原子を保護したα-アミノ酸の脱炭酸反応において中程度(3055%ee)の不斉記憶が起こることを見いだした。さらに、セリンから誘導した環状アミノ酸にこの保護基を付け、電解酸化による脱炭酸反応を行うと、80%eeにまで不斉収率を高めることに成功した。また、キラルアシルイミニウムイオン中間体の安定性を計算し、計算値と実測のeeとの間に高い相関性があることを示すデータを得た。光学活性α位置換環状アミノ化合物は生理活性化合物が多く有機合成の重要な標的物質であるが、従来法ではその合成に多段階操作を要した。不斉な環状アシルイミニウムイオンを創成できれば、求核剤を不斉に導入でき一挙に光学活性α位置換環状アミノ化合物を合成できる。

しかし、アシルイミニウムイオンは平面構造をとる典型的なカルベニウムイオンであり、これまで不斉アシルイミニウムイオンを創成するのは困難であった。本研究で、キラルルイス酸を用いることにより不斉に求核剤をアキラルなアシルイミニウムイオンに導入できる方法を開拓した。即ち、窒素原子をベンゾイル基で保護したピペリジンをMeOH溶媒で電解酸化してα-メトキシ-N-ベンゾイルピペリジンとし、次いでそのβ、γ位に二重結合を導入、最後に、この不飽和化合物にキラルなビスオキサゾリンと2価の銅イオンを触媒量存在させてマロン酸ジメチルエステルを反応させると、ジメチルマロニル基がピペリジン環のα位に不斉に導入された。その不斉収率は46%eeであった。さらに窒素の保護基をp-シアノベンゾイル基にすれば53%eeにまで炭素求核剤導入反応の選択性を向上できた。一方、出発物の窒素の保護基をメトキシカルボニル基にすると、求核剤不斉導入の選択性は21%に低下した。また、マロン酸エステルのアルコール残基をメタノール以外のアルコールに変えると炭素結合形成反応が全く進行しなかった。さらに、生成した生成物の絶対構造を既知化合物に変換することによって確定した。以上の結果から、中間にキラル銅触媒が配位した不斉アシルイミニウムイオンが生成し、これに構造的に小さなマロン酸ジメチルが不斉に攻撃する機構を提案することができた。光学活性含窒素有機化合物,中でもα位炭素がキラルなα位置換ピペリジンやピロリジンは医薬品に数多く用いられており,その高選択的合成法の開拓は極めて重要である.一方,本研究代表者らは,既にα-アミノ酸の電極酸化を利用したアシルイミニウムイオンの創成法とそのキラルバージョンを開拓している。しかし,キラルα-アミノ酸からキラルアシルイミニウムイオンへの変換(不斉記憶)において選択性の問題が残っていた.そこで15年度は,このイミニウムイオン創成の効率性に及ぼす各種影響因子の解明を行った。成果は以下のようにまとめられる。(1)不斉記憶に及ぼす構造効果:N-保護基がo-フェニルベンゾイル基,母核が立体的にバルキーであれば最高8391%ee,ピロリジン核のように母核がバルキーでなくN-保護基がバルキーなときには46%ee程度,母核がバルキーであってもN-保護基がバルキーで無いときには0%eeになることを見いだした.また,L-プロリン誘導体のカルボキシル基を還元して得られるβ-ヒドロキシアミンを電極酸化すると炭素間結合開裂反応が起こったが,その生成物のN,O-アセタールでも高い不斉記憶現象が観測された.(2)不斉ルイス酸触媒と活性メチレン化合物との組み合わせによるイミニウムイオンへの触媒的不斉炭素間結合形成反応:光学活性ビスオキサゾリンと銅(II)からなる不斉触媒はマロン酸ジメチルと動的錯体動的錯体を形成させ,これとプロキチルなN-アシルピペリジニウムイオンを反応させるとピペリジン環α位でエナシチオ選択的に炭素間結合形成できることがわかった.
幻痛における視床シナプスのリモデリングとその臨界期

末梢神経を損傷すると、上位中枢において受容野が拡大するなどの機能的な可塑的変化が生じることが報告され、特異的な分子の発現も報告されている。しかしながら、神経回路、シナプスにおける変化については未だ十分明らかになっていない。申請者はこの問題に対し、三叉神経を切断した神経損傷モデルマウスを用いて、末梢神経損傷による可塑的変化を神経回路レベル、シナプスレベルで明らかにした。即ち、眼窩下神経切断によって、上位中枢である視床VPM核において神経回路の改編機構を電気生理学的に解析した。視床VPM核は体性感覚の中継核であり、その求心性線維である内側毛帯線維は、三叉神経核を起始核とし、齧歯類では主に髭の感覚情報を運んでいる。申請者は、VPM細胞への内側毛帯支配様式が、生後21日目までに内側毛帯線維が一本支配に完成されることを明らかにした。さらに、生後21日目以降で、マウス髭の感覚神経(眼窩下神経:三叉神経第二枝)を切断すると、わずか一週間であたかも発達過程を逆行したかのごとく、VPM細胞が複数の内側毛帯線維に支配されるようになる再多重化現象を発見した。また、新しくシナプスを形成したと思われる弱いシナプスは、そのシナプス電流の振幅が小さく、シナプス後膜側にグルタミン酸受容体であるAMPA受容体のGluR2(+)が出現してくる一方で、NMDA受容体は変化しない事を突き止めた。これらの成果は2008年、2009年の日本神経科学大会で報告した。齧歯類の髭の感覚は三叉神経第二枝である眼窩下神経を介し、三叉神経核主知覚核(体性感覚)三叉神経脊髄路核(痛覚)を経て内側毛帯線維束に合流し、内側毛帯シナプスとして視床VB核投射細胞(VB投射細胞)にシナプスを形成する。発達段階の内側毛帯シナプスにおいて、VB投射細胞は多くの軸索を受け、多数のシナプスが作られる(多重支配)。その後、必要なシナプスが残り、不要なシナプスは除去されるというシナプス除去過程を経て、生後21日令までにはVB投射細胞はほぼ一本の内側毛帯繊維で支配するようになることが、電気生理学的に報告されている(J.Physio1.573 : 121-132, 2006, Takeuchi et al., Neurosci. Res. 2008)。この除去過程は極めて強固であり、たとえば、髭を生後すぐから抜き続ける操作をしても影響をうけることはないとされてきた。我々は、視床VBのバレロイドのマップ形成の臨界期(生後5日)を過ぎた生後7日に眼窩下神経を切断し、生後21-25日齢でVB投射細胞から内側毛帯シナプス電流を記録したところ、幼弱期様の多重支配をみとめ、一本あたりのAMPA受容体を介するEPSCs(EPSC s _</fiber>)の減弱および減衰時間の延長を認めた。しかしながら、投射細胞に入力する総シナプス電流(maxEPSCs)は正常と差がなかった。また正常では認められないサイレントシナプスが認められた。次に、多重支配の臨界期を決めるべく、内側毛帯のシナプス除去が終了した生後21日齢で眼窩下神経を切断し、術後一週間後に測定を行った。その結果、興味深いことに、内側毛帯シナプスは再多重化を示し、EPSC s _</fiber>の減弱および減衰時間の延長を認めた。一方でmaxEPSCsも減弱し、サイレントシナプスは認められないなど、生後7日齢で処置した場合との差異も存在した。
脂質ラフトを場とするFc受容体シグナル発信機構の解析と自己免疫疾患における異常

抗原受容体架橋に続く細胞内シグナル発生がSrc family kinasと(SFK)によって媒介される事は知られているが、SFK動員の機構は不明である。近年、架橋抗原受容体α鎖が細胞膜微小ドメイン、脂質ラフトに移行する事が観察され、ラフトの受容体初期反応への関与が注目されている。我々は受容体シグナルが受容体架橋--脂質ラフトの空間的融合--SFKの近接と相互活性化の順に生じると考え、この仮説を支持する証拠として、ラフトに常在するSFK分子種のみがFc受容体シグナルを伝達する事、受容体架橋によるラフトの空間的融合がSFK活性の上流事象である事を示した。SFK活性化の新規機構を探索するためにLyn-SH3ドメインに会合し、Lyn活性化を惹起する2つの新規分子を同定した。1つはポリプロリン配列及び微小管会合に働くRINGドメインを持ち、微小管から遊離するとNF-AT活性化を生じる。抗原受容体反応における同分子の関与を解析中である。SLEに連関する抑制性受容体FcgammaRIIb多型の解析を行い、同多型のラフトへの分配が低下しておりB細胞受容体反応抑制が減弱している可能性を見いだした。Fc受容体は、自己、外来抗原を結合した免疫グロブリンを捕捉し貧食排除に働くと共に起炎性物質の産生を促し病像形成に関与する。Fc受容体の最初期反応は抗体結合α鎖細胞外部分の重合が情報伝達βγ鎖細胞内ITAM配列チロシンのリン酸化に転換されることである。この事象は最大のシグナル転換部位と考えられるがその機構は十分に解明されていない。この反応は免疫複合体腎炎や喘息発作をその炎症シグナルの始まりから制御する標的部位として臨床的に重要でありその解明が待たれる。本研究ではこの最初期メカニズムの解析を目的としている、本年度はFcγRsのシグナル伝達機構を解析し、以下の所見を得た。1.従来FcγR架橋の初期シグナルとしてSrc型チロシンキナーゼ(PTK),Lynの活性化があげられていた。本研究からFcγRα鎖の脂質ラフトヘの融合、そして空間的な脂質ラフトの集合がLyn活性化の上流事象であることが明らかとなった。2.シグナル開始にはFcγR細胞内部分のITAMが必須とされていたが、FcγR細胞外、膜貫通部分の架橋のみで空間的な脂質ラフトの融合安定化、蛋白質チロシンリン酸化、カルシウム動員が生ずることをみいだした、すなわち空間的な脂質ラフト融合自身が、おそらくLynの相互活性化を通じて最初期リン酸化シグナルを惹起する可能性を指摘した。キメラFcγR分子をもちいてITAMがその初期シグナルを増幅すること、抑制配列ITIMがそれを抑制することを示し、これらがシグナルの強度を調節するモデュールであることを示した。3.脂質ラフトのLynの基底活性は共存する抑制分子C-末端Srcキナーゼ(Csk)/Csk結合分子Cbpによって規定されると考えられる。Cbp分子の高発現がFcγRシグナルを抑制することを見出した。4.Cbp分子がラフト会合依存性にCblによってユビキチン化、プロテアソームによる分解を受けることを見出した。5.Lynの会合分子を酵母2-ハイブリrッド法で検索し、ユビキチン転移酵素E2、B細胞受容体Igα,β会合分子とLynとの分子会合を見出した。これらの事象の抗原受容体シグナル調節における意義を解析している。抗原受容体架橋に続く細胞内シグナル発生がSrcfamily kinase (SFK)によって媒介される事は知られているが、SFK動員の機構は不明である。我々は受容体シグナルが受容体架橋--脂質ラフトの空間的融合--SFKの近接と相互活性化の順に生じると考え、この仮説を支持する証拠として、ラフトに常在するSFK分子種のみがFe受容体シグナルを伝達する事、受容体架橋によるラフトの空間的融合がSFK活性の上流事象である事を示した。

1つはポリプロリン配列及び微小管会合に働くRINGドメインを持ち、微小管から遊離するとNF-AT活性化を生じる。抗原受容体反応における同分子の関与を解析中である。SLEに連関する抑制性受容体FcgammaRIIb多型の解析を行い、同多型のラフトへの分配が低下しておりB細胞受容体反応抑制が減弱している可能性を見いだした。
分娩期における酸化ストレス度と抗酸化力の推移

分娩期における酸化ストレス度と抗酸化力の推移を解明することと、その高低に関わる影響因子を明らかすることを目的とし、妊娠後期の女性を分娩終了時まで縦断的に追って、酸化ストレス度と抗酸化力の測定と生活習慣に関する質問紙調査を実施した。その結果、分娩期での酸化ストレス度は妊娠期よりも高くなり、抗酸化力は低くなるという結果が得られた。また、妊娠期と分娩期の酸化ストレス度には正の相関が認められた。酸化ストレス度を低く保つ要因としては、非妊時BMIが肥満にならないような体重管理が重要であることを示唆された。これまでの研究では、妊娠期における酸化ストレス度と抗酸化力の推移を明らかにした。しかし、分娩期における酸化ストレス度と抗酸化力の推移は未だ解明されていない。分娩は、陣痛による子宮筋の疲労や呼吸法などによる酸素消費量の増加により、酸化ストレスが増大しやすい状況であることが考えられる。本研究では、分娩期における酸化ストレス度と抗酸化力の推移を明らかにするとともに、胎盤組織からの酸化ストレス度も測定することにより、胎盤と母体血液中の酸化ストレス度との関連を解明することを第1の目的とした。また、酸化ストレス度と抗酸化力に対する影響因子を明らかすることを第2の目的とした。<平成25年度>妊娠30週前後の妊婦に対し、口頭と書面を用いて研究の説明と同意を得た。酸化ストレス度と抗酸化力の測定に必要な血液試料は、妊娠末期は妊婦健康診査受診時の採血時、分娩第1期と分娩第3期では分娩用末梢血管確保時に採取(2ml)を行い、得られた試料は測定に推奨される72時間以内に酸化ストレス度(d-ROMs)と抗酸化力(BAP)の測定を行った。酸化ストレス度はd-ROMsテストにより、活性酸素・フリーラジカルによる代謝物(ヒドロペルオキシド)を、抗酸化力はBAPテストにより、血液中の還元力を測定して分析測定を行った。どちらも数値化されたものである。胎盤組織は分娩終了後に拇指大に採取した。質問紙調査として、妊娠末期では生活状況に関する調査を行った。基礎情報はカルテからの情報収集を行った。なお、酸化ストレス度と抗酸化力の個別結果は得られた数値とともに生活習慣に関するコメントを加えた結果表として、結果開示を希望する研究対象者へ郵送で報告した。しかし、分娩期における酸化ストレス度と抗酸化力の推移は未だ明らかにされていない。本研究では分娩期における酸化ストレス度と抗酸化力の推移を明らかにすることを第1の目的とし、その影響因子を解明することを第2の目的とした。平成26年度では平成25年度から引き続き、口頭と書面にて研究協力の同意を得た妊産婦に対し、妊娠末期、分娩第1期、分娩第3期に少量の血液採取を行い酸化ストレス度(d-ROMs)と抗酸化力(BAP)の測定を行った。酸化ストレス度はd-ROMsテストにより、活性酸素・フリーラジカルによる代謝産物(ヒドロペルオキシド)を、抗酸化力はBAPテストにより、血液中の還元力を測定して分析測定を行った。どちらも数値化されているものである。目標としていた研究対象者数は150名であったが、同意を得られた妊婦の数は183名となり、データ収集を終えた。本研究では、分娩期における酸化ストレス度と抗酸化力の推移を解明することを第1の目的とし、その結果を受けて、酸化ストレス度と抗酸化力に対する妊娠期からの影響因子の示唆を得ることを第2の目的とした。本研究の意義は、いまだ解明されていない分娩期の酸化ストレス度と抗酸化力の数値の解明と安全・安楽な分娩管理の提供することを目指した妊娠期からの助産ケア介入のポイントの解明することである。平成25、26年度では、研究協力の同意を得た妊産婦に対し、妊娠後期、分娩進行中、分娩終了後(児娩出後)の計3回、試料の採取を行い、酸化ストレス度(dーROMs)と抗酸化力(BAP)の測定を行った。また、妊娠後期には生活状況に関する質問紙調査を行った。また、カルテから基礎情報の収集を行った。得られた同意の人数は183名であったが、妊娠合併症の発症や緊急帝王切開などにより、分析対象から除外する事例もあった。酸化ストレス度と抗酸化力の測定結果は、結果開示を希望する研究協力者へ郵送で報告し、生活習慣の改善に還元した。平成27年度では、得られたデータの分析を行い、結果をまとめて学術誌へ投稿し、原著論文として受理された。

酸化ストレス度を低く保つ要因としては、非妊時BMIが肥満にならないような体重管理が重要であることを示唆された。研究対象者を150名募る予定であったが、平成25年度までに分析可能な事例数が83名となったことで事例数の確保に遅れが出てしまった。原因としては、研究施設の特性もあり、正常妊婦が少ないこと、妊娠・分娩経過も異常になる事例が多いことが事例数確保の遅れにつながったことが考えられる。助産学・母性看護学平成27年度はデータの分析が終えられ次第、結果をまとめ、学術論文として投稿予定である。平成2526年度において、研究対象者を150名募る予定としていた。平成25年度までに得られた研究同意者数は160名、うち分析可能事例数は83名、分析不可能事例数は60名、平成26年度以降の分娩予定者数は17名であった。(分析不可能事例となった理由は、妊娠末期では妊娠合併症の発症、早産、採血時期の不適合など、分娩期では緊急帝王切開、狂乱分娩、精神疾患の悪化、急産などが挙げられた。)研究施設の特性もあり、正常妊婦が少ないこと、分娩経過も異常になる事例が多いことが事例数確保の遅れにつながっていることが考えられる。産前産後の休暇又は育児休業の取得に伴い、研究を一時中断したため。平成26年度では、引き続きデータの収集と分析を行う予定である。分析可能事例数の確保に関しては、少なくとも2者間の比較検討ができる事例数(約100事例)を目標とする。また、データの収集と分析が終えられ次第、結果をまとめ、学術集会での発表や学術論文として投稿することを予定している。研究発表へ向けて論文作成、投稿準備として使用する計画である。分析対象事例数が不十分であり、検査キットの消耗品の使用が少なくなったことと、それに伴い、発表を予定していた学会への旅費使用ができなくなったため。分析対象事例数の確保を行うため、検査キットの消耗品や研究対象者への検査結果の郵送代として執行すること、また、学会への参加や発表により旅費として使用する予定である。
ウソとユーモアの社会的機能に関する研究―感情調整機構からの解明―

本研究は、日常生活で使用されるウソやユーモアが社会的に機能するときに、聞き手の心的機構(認知・感情過程)に与える影響について明らかにすることを目的としている。過失により他者に不利益を与えてしまった状況(e.g.,遅刻)において、人は他者からの罰(e.g.,叱責)を避けるために弁解をすることがある。本年度は弁解としてのユーモアが聞き手の認知(おもしろさの程度)を媒介して感情調整(ネガティブ感情の抑制・ポジティブ感情の促進)を行っている可能性に着目し、ユーモアに関わる立場(ユーモアの話し手・聞き手)とユーモアの聞き手の状況(聞き手の不利益が大きい状況・不利益が小さい状況)を考慮した実験を行った。その結果、ユーモアに関わる立場に関係なく、弁解としてのユーモアは聞き手のおもしろさの認知を媒介することで過失に対するネガティブ感情を抑制し、聞き手からの罰を避けていることが明らかになった。また、ユーモアは聞き手のおもしろさの認知を媒介することでポジティブ感情を促進するが、罰の回避に与える影響は小さいことが明らかになった。そして、聞き手の不利益が大きい状況では不利益が小さい状況に比べて、ユーモアのおもしろさの程度が低く認知されることが明らかになった。ただし、ユーモアの聞き手の不利益が大きい状況においても、おもしろさが高く認知されれば、感情調整が行われ、聞き手からの罰を回避できることが明らかになった。これらの結果から、ユーモアに関わる立場に関係なく、弁解としてのユーモアは聞き手の認知を媒介し感情調整を行うことで社会的に機能することが示された。また、聞き手の状況(e.g.,不利益の大きさ)によっておもしろさの認知は影響を受けるが、この認知を聞き手に生じさせることができれば感情調整が行われ、ユーモアは社会的潤滑油として機能することが示された。本研究は、日常生活におけるウソやユーモアが聞き手の心的機構(認知・感情過程)にどのような影響を与えることで社会的に機能しているかについて明らかにすることを目的としている。過失により他者に不利益を与えてしまった状況(e.g.,遅刻)において、人は罰(e.g.,叱責)を避けるために弁解をすることがある。このような弁解の内容として日常的にウソやユーモアが使用されることがあり、これらは聞き手のさまざまな認知を媒介して感情調整を行うことで他者からの罰を避けている可能性が報告されている。本年度は弁解としてのウソが聞き手の認知(統制可能性・責任の程度)を媒介して感情調整(怒りの抑制)を行っている可能性に着目し、ウソに関わる立場(ウソの話し手・ウソの聞き手)とウソの露見(聞き手にウソが見破られない状況・聞き手にウソが見破られる状況)を考慮した実験を行った。その結果、ウソに関わる立場に関係なく、弁解としてのウソは聞き手の統制可能性と責任の程度の認知を媒介することで過失に対する怒りを抑制し、聞き手からの罰を避けていることが明らかになった。ただし、弁解としてのウソが聞き手の認知を媒介して感情を調整する機構は、ウソが露見しないことを前提としており、聞き手にウソが露見してしまった場合には統制可能性や責任の程度の認知は弁解の内容から影響を受けず、過失に対する怒りと話し手がウソをついたこと自体に対する怒りが促進され、聞き手から過失に対する罰とウソをついたことに対する罰を与えられることが明ちかになった。これらの結果から、ウソに関わる立場に関係なく、弁解としてのウソは聞き手の認知を媒介し感情調整を行うことで社会的に機能することが示された。しかし、一般的に嘘をつくことは非道徳的な行為と捉えられやすいため、弁解の内容がウソであることが聞き手に露見した時点で弁解が社会的に機能しなくなることが示唆された。
糖尿病角膜症に伴う基底膜の分子構築の変化の解析

糖尿病モデル動物GKラットを用いて、糖尿病角膜症に伴う基底膜の形態変化が糖尿病治療薬投与により回復するかについて検討した。その結果、基底膜の形態変化は薬剤投与により有意に回復することが明らかになった。さらに糖尿病による角膜の形態変化に伴って糖修飾が変化を示すタンパク質を調べるため、プロテオーム解析を行った。その結果、基底膜を裏打ちしている細胞骨格系タンパク質にO-GlcNAc修飾が増加することが明らかになった。LEA-DP/Sendaiラット(以下、Sendaiラット)はLong Evans Agouti (LEA)ラットコロニーから糖尿病を発症する個体を基に確立された非肥満型2型糖尿病モデル動物である。インスリン分泌低下を主因にするヒト2型糖尿病の優れたモデルと考えられている。今年度本研究では、糖尿病の発症に伴うSendaiラットの角膜における形態変化について免疫組織化学的に検討した。6、10、14週齢のいずれの週齢においても角膜上皮基底膜付近にトルイジンブルーに濃染する沈着物が観察された。またこの沈着物は週齢が進むにつれて量が増加した。電子顕微鏡で観察したところ、この沈着物は円形ないし楕円形をなし、上皮基底細胞内、上皮基底細胞と基底膜との間、あるいは基底膜近くの角膜固有質に認められた。これら沈着物の存在する部位の上皮基底細胞では多くの場合、空胞変性ならびに基底膜の剥離や多層化などの形態変化が観察された。分析電顕による解析より、この沈着物はリン酸カルシウム、リン酸マグネシウムの結晶であることが明らかになった。さらに細胞外マトリックスの構成成分(IV、VI、VIII型コラーゲン、ラミニン、フィブロネクチン、ヘパラン硫酸プロテオグリカン)に対する抗体を用いて免疫電顕にて局在を検討した。VI型コラーゲン、フィブロネクチン、ヘパラン硫酸プロテオグリカンは主に固有質に反応が認められた、またVIII型コラーゲンはデスメ膜に反応が認められた。しかしVI、VIII型コラーゲン、フィブロネクチン、ヘパラン硫酸プロテオグリカンの局在並びに発現に変化は認められなかった。これに対して、基底膜の形態変化に伴い、基底膜の構成成分であるラミニン、IV型コラーゲンの局在および発現が変化することが明らかになった。糖尿病の発症により基底膜に形態変化が起ることがよく知られている。今年度は、インスリン非依存性糖尿病モデル動物(GKラット)を用いて、糖尿病角膜症に伴い、基底膜の形態がどのように変化するか、その基底膜の分子構築変化を免疫組織化学的に検討し、さらに糖尿病治療薬投与によりこの形態変化が回復するかについて検討した。まず電子顕微鏡にて形態を観察したところ、糖尿病GKラット角膜では、角膜上皮基底細胞におけるヘミデスモゾームの減少並びに上皮基底細胞からの基底膜の剥離が観察された。またGKラットでは角膜内皮側の基底膜(デスメ膜)においてlong spacing collagenが正常な角膜に比べて、加齢に伴い顕著に増加することが観察された。次ぎに免疫組織染色により細胞外マトリックスの構成成分(I、III、IV、VI、VIII型コラーゲン、ラミニン、フィプロネクチン、ヘパラン硫酸プロテオグリカン)の発現を調べた。その結果、VIII型コラーゲンの発現の増加とラミニンの発現の減少が観察された。さらにコロイド金法ならびにHRP法を用いた免疫電顕により、VIII型コラーゲンが正常なラットの角膜ではデスメ膜全体にほぼ均一に分布するのに対し、GKラットでは特にlong spacing collagenに局在していることが明らかになった。以上の形態変化は糖尿病治療薬(nateglinide, glibenclamide)投与により有意に回復することが明らかになった。これらのことから基底膜の分子構築の変化が糖尿病角膜症の原因の一つになっていることが推測された。本研究では糖尿病性角膜症における基底膜の分子構築の変化を免疫組織化学に解明し、グライコプロテオミクスにより糖鎖修飾の変化する角膜のタンパク質を調べることにより、形態変化の成因を解明することを目的とする。糖尿病ではヘキソサミン代謝の亢進により、その代謝経路の最終産物であるUDP-GlcNAcが増加し、これを基質として、タンパク質への0-グリコシド結合型年アセチルグルコサミン(0-GlcNAc)の糖修飾が増加することが知られている。そこで本年度は、糖尿病による角膜の形態変化に伴って糖修飾が変化を示す蛋白質を調べるため、糖尿病モデル動物(GKラット)と正常(対照、Wistarラット)の角膜を用い、糖(0-GlcNAc)に対するモノクローナル抗体により免疫沈降して単離した蛋白質を2次元電気泳動後、タンパク質の量的変動をPDQuest(ver 8.0)を用いて解析し、その中のいくつかのspotについてMLDI-TOF質量分析を用いたプロテオーム解析を行った。その結果、総タンパク質の約12%のタンパク質に0-GlcNAc修飾が起こっていること、また糖尿病では、多数のタンパク質の0-GlcNAc修飾レベルが上昇することが認められた。

さらに、基底膜を裏打ちしているアクチンやビンキュリンなど細胞骨格系タンパク質に0-GlcNAc修飾の増加が観察された。以上のことから、基底膜の形態変化は基底膜を裏打ちしているタンパク質の糖修飾の異常が一因になっていることが推測された。
全身麻酔要素である鎮痛・筋弛緩・不動化における脊髄痛覚・運動ニューロンの役割解明

全身麻酔要素である不動化における脊髄サブスタンスP(SP)の役割について検討した。侵害刺激による脊髄後角C線維からのSP遊離は、モルヒネにより抑制される。一方、NMDAチャネル遮断薬であるMK-801が、高用量でもげっ歯類の正向反射を消失させないことは知られていた。私達は、MK-801の投与前に低用量のハロペリドールで処置しておくと、MK-801は正向反射消失を引き起こすが、不動化は生じないことを明らかにした。さらに、MK-801とハロペリドールの併用により正向反射を消失させたマウスにモルヒネを併用すると不動化を生じることを示した。本研究により不動化と脊髄でのSP遊離抑制の関係が示唆された。侵害刺激によるC線維からのサブスタンスPの遊離は、オピオイドやα2アドレナリン受容体作動薬により抑制されることがマイクロダイアリシス実験により明らかにされている。私達は、科学研究費による研究で、GABA神経刺激による意識消失時にオピオイドのモルヒネやα2アドレナリン受容体作動薬のデキスメデトミジンを併用すると不動化を起こすことを確認している。このことは、不動化が脊髄後角でのサブスタンスP神経の抑制を介して起きていることを予期させる。当該年度では、グルタミン酸受容体サブタイプであるNMDA受容体の選択的遮断薬であるMK-801を単独で高用量(50mg/kg)投与しても正向反射も侵害刺激による体動も抑制しないが、NMDA受容体の遮断はドパミン神経を刺激しマウスを覚醒させることが知られていることからハロペリドールによりドパミン受容体を遮断すると、MK-801は正向反射を消失させるが侵害刺激による体動の抑制(不動化)は生じないことを確認した。さらに、MK-801とハロペリドールの併用により正向反射を消失させたマウスにモルヒネあるいはデキスメデトミジンを投与すると用量依存性に不動化を生じた。しかし、不動化に必要としたモルヒネやデキスメデトミジンの用量は、鎮痛に必要としたこれら薬物の用量に比べ高用量が必要であった。この結果はGABA神経刺激時での結果と一致したが、さらに今回の結果からGABA神経刺激やNMDA受容体とドパミン受容体の遮断が下降性痛覚抑制系を抑制している可能性が示唆された。侵害刺激による脊髄後角でのC線維からのサブスタンスP遊離は、オピオイドやα2アドレナリン受容体作動薬により抑制されることがマイクロダイアリシス実験により明らかにされている。私達は、これまでに、γーアミノ酪酸(GABA)神経刺激による正向反射消失時にオピオイドのモルヒネやα2アドレナリン受容体作動薬のデキスメデトミジンを併用すると侵害刺激による体動の抑制(不動化)を起こすことを確認している。一方、選択的N-メチル-D-アスパラギン酸(NMDA)受容体拮抗薬であるMK-801は、極めて高用量でもげっ歯類の正向反射消失を起こさない。MK-801には、中枢性の興奮と抑制の混在した作用が認められる。このことは、MK-801のNMDA受容体拮抗作用とカテコーラミン神経刺激作用が関係しているものと考えられる。私達は、MK-801の投与前にドパミンD2受容体拮抗薬であるハロペリドールを極めて低用量で処置しておくと、MK-801は用量依存性に正向反射消失を引き起こすが、不動化は生じないことを明らかにした。しかし、当該年度で、ドパミンD1受容体拮抗薬であるSCH-23390、α1アドレナリン受容体拮抗薬のプラゾシンおよびβアドレナリン受容体拮抗薬のプロプラノロールの前投与はMK-801の正向反射消失作用にほとんど影響しないことを示した。さらに、MK-801とハロペリドールの併用により正向反射を消失させたマウスにモルヒネあるいはデキスメデトミジンを投与すると不動化を生じることを明らかにした。しかし、不動化に必要としたモルヒネとデキスメデトミジンの用量は、鎮痛に必要としたこれら薬物の用量に比べ高用量が必要であった。この結果はGABA神経刺激時での結果とほぼ一致したが、さらに今回の結果から、GABA神経刺激やNMDA受容体とドパミン受容体の遮断が下行性鎮痛系を抑制する可能性が示唆された。

全身麻酔作用は,健忘,意識消失,鎮痛,筋弛緩,侵害刺激による体動の抑制(不動化)などの要素が複合した状態である.今年度は,静脈麻酔薬のペントバルビタールにより引き起こされた意識消失,不動化,筋弛緩に及ぼすGABA,グリシンおよび神経性ニコチン受容体リガンドの影響を検討した.実験動物としてddY系成熟雄性マウスを用い,薬物は全て全身投与した.麻酔作用は,意識消失の指標として正向反射の有無,不動化の指標として侵害刺激による体動の有無および筋弛緩の指標として握力試験を用いて検討した.Gabaculineは用量依存性に正向反射を消失させその50%有効量は100 mg/kgであったが,不動化は400 mg/kgの高用量でも生じなかった.高用量のグリシントランスポーター阻害薬sarcocine(10 mg/kg)およびニコチン受容体拮抗薬mecamylamine(5 mg/kg)は,それ自体ではいずれの麻酔要素も引き起こさなかった。低用量のgabaculine(50 mg/kg)は,単独ではいずれの麻酔要素も生じなかったが,ペントバルビタールにより生じるこれら麻酔要素の全てを有意に増強した.Sarcocine(10 mg/kg)は,ペントバルビタールによる不動化のみを増強した.一方,mecamylamine (5 mg/kg)は何も影響を及ぼさなかった.選択的なGABA神経刺激は意識消失をもたらすが,不動化は生じない.ところが,低用量のgabaculineはペントバルビタールにより引き起こされる意識消失,不動化,筋弛緩の麻酔要素全てを増強し,sarcocineは不動化のみを増強した.以上より,各麻酔要素はそれぞれ異なる神経系を介して生じているのかも知れないが,ペントバルビタールにより引き起こされる種々の麻酔要素に対しGABAやグリシン神経は重要な役割を果たしていると考えられた.平成24年度以降は全身麻酔薬の鎮痛・筋弛緩・不動化作用とサブスタンスP、GABA、グリシンの関係を明確にするため、神経化学的手法を用いて、脊髄後角培養細胞からのサブスタンスPの遊離、受容体応答などについて検討する予定であったが、行動薬理学実験での結果が興味深くさらに検討を加えているため、神経化学実験に取り掛かるのが遅れている。全身麻酔薬が引き起こす鎮痛・筋弛緩・不動化などの麻酔要素には,脊髄の痛覚や運動ニューロンが重要な役割を果たしていると考えられるが,その作用機序については今のところよくわかっていない.本研究の目的は,これら麻酔要素の発現における脊髄の痛覚や運動と関連するニューロンの主要な神経伝達物質であるサブスタンスP,γーアミノ酪酸(GABA)およびグリシンの機能的な役割を明らかにし,その機序を応用した新しい全身麻酔法を開発することにあった.現在までの研究で,静脈麻酔薬のペントバルビタールにより引き起こされた意識消失,不動化,筋弛緩に及ぼすGABA,グリシンおよび神経性ニコチン受容体リガンドの影響を検討し,ペントバルビタールにより引き起こされる種々の麻酔要素に対しGABAやグリシン神経は重要な役割を果たしていることは分かった.しかし,これらのことが脳レベルで起きているのか、脊髄レベルで起きているのか,あるいはサブスタンスPの関わりはどうなのか,などまだ検討すべき点が残っている.今年度は予備実験的な意味合いもあり薬物も全身投与されたが,今後は脳内投与や脊髄腔内投与,中枢神経内の特定タンパクのノックダウンなどを行って検討していく.全身麻酔薬の鎮痛・筋弛緩・不動化作用とサブスタンスP、GABA、グリシンの関係を明確にするため、神経化学的手法を用いて、サブスタンスPの遊離、受容体応答について以下の諸点を明らかにする。まず、脊髄後角培養細胞からのサブスタンスP遊離を全身麻酔薬が抑制するか(培養実験)検討する。次に、侵害刺激により促進された脊髄後角での一次求心性C線維からのサブスタンスP遊離を全身麻酔薬が抑制するか、マイクロダイアリシス法を用いて実験する。
病理組織保存バンクの開発に関する基礎的研究

病理組織診断において組織・細胞試料を直接扱う立場から、遺伝子解析に適した組織保存法およびそのプロトコール作成の重要性を追究してきた。凍結乾燥後の組織は、室温保存が可能で、形態学的解析および遺伝子解析に有用であることを見出し、その条件を詳細に検討してきた結果、以下の点が本研究で明らかとなった。1)長期間の凍結乾燥保存後にも、高分子状態が保たれたDNA, RNA,タンパクの解析が可能である。DNAとタンパク解析については、5年間保存後も分子の分解はほとんど認められなかった。RNAは通常の凍結乾燥保存では分解が経時的に進行するが、RT-PCR解析は可能であった。トレハロースおよびEDTA処理後に凍結乾燥保存を行うとRNA分解が阻止できることを見出した。トレハロース浸漬による水分子の置換をすることによって、組織のガラス化移行が促進され、氷結晶による組織・細胞傷害を軽減できることが明らかとなった。形態学的保存性の向上も平行して認められた。2)凍結乾燥後の室温保存には、湿度と酸素の遮断が必要であるが、保存温度を室温以下に保つ必要性がないことが明らかとなった。3)タンパク解析が必要でない場合は、アルコールなどによる凍結置換法を用いることができ、これによって組織からの脱水効率が上がり、分子の保存性が向上した。4)塗沫細胞標本についても、組織と同様の保存方法を有効であった。我々が作成してきた遺伝子解析に適した病理組織の保存プロトールをもとに、以下の問題点に焦点をあわせて実験を行った。RNAの分解を抑制する条件を物理的傷害および酵素的分解の面について検討する。凍結乾燥から保存に至る基本的プロトコールは今まで我々が検討したものを基本的に使用した。すなわち、ラット肝組織小片を用いて凍結乾燥後に窒素ガスを充満した褐色バイアルにシリカゲルと共に密封し、室温保存した。DNAとタンパク各分子は保存状態良好な対照群として用い、RNAの保存状態の検定を行った。RNAの抽出とゲル電気泳動パターンの解析、さらに、Northernブロツト、RT-PCR法によってそれぞれの条件で解析した。従来からの結果と同様に400bp程度の長さのRT-PCRは可能であった。RNAは単鎖であることから構造的脆弱性が考えられたので、凍結時の氷結晶形成を防ぐために、冷却条件の再検討と凍結前の組織に高分子多糖類トレハロースを添加することによってガラス化状態を誘導し、物理的傷害を避ける条件を検討した。結果的には、5%トレハロースで処理した場合には、凍結時における氷結晶の影響や乾燥時における水分子の移動に伴う物理的損傷の影響が抑制され、RNAの保存が半年を越えて安定して得られることが明らかとなってきた。現在10ヶ月での結果を得て、さらに保存時間を延長中である。。RNaseの活性を押さえるためにEDTAに代表されるようなヌクレアーゼインヒビターを添加した場合については、凍結乾燥直後の短期間(1週間以内)においてわずかに保存状態の向上は見られたが、半年の時点での明らかな差はなかったことから、RNAの分解にはRNaseの関与が大きくないことが明らかとなった。

2)凍結乾燥後の室温保存には、湿度と酸素の遮断が必要であるが、保存温度を室温以下に保つ必要性がないことが明らかとなった。3)タンパク解析が必要でない場合は、アルコールなどによる凍結置換法を用いることができ、これによって組織からの脱水効率が上がり、分子の保存性が向上した。4)塗沫細胞標本についても、組織と同様の保存方法を有効であった。
文献資料の組織化を支援するコミュニティ形成のための情報通信網構成法の研究

博物館等に保存されている多くの「器物資料」とともに「文献資料」を対等に扱うことは、近代・現代の日本科学技術思想の体系化を検証するために極めて意義の大きなことと考える。この目標のために、全国の科学博物館、大学並びに関連研究機関に所属する研究者並びに研究情報を組織化することは喫緊の課題であり、これを効果的に支援する手段として情報通信の活用を図ることを本研究の目的としている。本研究班は、文部科学省の支援により学術情報ネットワーク(SINET並びにスーパーSINET)を運用する国立情報学研究所に所属する研究者で構成しており、情報通信技術を活用し、研究者間のグループ形成と活動の支援のための方策を検討するには格好の態勢を備えている。現在機関や組織においてセキュリティを維持するためにファイアウォールの導入が進んでおり、同時に世界的な接続性を持たないプライベート・アドレス(NAT)の採用が行われている。この現状は、リアルタイム性を重視する研究活動を、研究者間の閉域コミュニティの内部で運用するためには大きな障害となる。このような現状に採用でき、マルチメディア情報の取得を経済的に実現する汎用性の高いコミュニティ形成手法を提示し、E-Communityの形成を支援することを具体的目標としている。昨年度は、コミュニティ形成を支援する管理システムの開発を実施し、汎用ワークステーションを用いて実現した。最終年度である今年度は、開発した管理システムの上にpeer-to-peer通信までを可能とするE-Community支援システムを提案し、機能・性能・品質に関する評価を実施した。本提案システムは、Ipv4(現状)並びにIpv6(将来)の双方で運用することを可能としており、近年話題を集めている「オーバーレイ・ネットワーク」を形成する一方式とみなすことができる。即ち、インターネット事業者や学術情報ネットワークなど公衆的ネットワーク・サービスや加入者が限定されるネットワークによらずに汎用に使用できる。本提案と効果の分析を実施し、本開発研究を完了するものである。このために、全国の科学博物館、大学並びに関連研究機関を組織化することが課題であり、これを支援する情報通信の活用方策を確立することを目的としている。本研究班は、文部科学省の資金による学術情報ネットワーク(SINET並びにスーパーSINET)を運用する国立情報学研究所に所属する研究者で構成しており、情報通信技術を活用し、研究者間のグループ形成と活動の支援のための方策を検討するには格好の態勢を備えている。特に、リアルタイム性が高い研究活動を、マルチメディア情報を活用しつつ実施する閉域コミュニティのための通信網運用(VPN)を、目的や行動様式が異なる研究者が利用するSINETの内部で実現するためには、先端的な運用技術を導入することを必要としており、本研究班はこの実現に取組んでいる。今年度は、コミュニティ形成を支援する管理システムの開発を実施し、汎用ワークステーションを用いて実現した。同時に、コミュニティが情報蓄積や通信情報の一時蓄積に用いるサーバ(ネットワーク・ストレージ)を同じく汎用ミニ・サーバにより実現している。このような研究活動を支援する情報通信網を開発するプロジェクトが米国に存在しており、Internet2と称しているが、この年次会合に参加し、北米、欧州等の地域でコミュニティ形成の技術方策につき意見交換し、今後の研究指針の適正化にも努めた。次年度は、今年度の開発成果の実証評価を予定している。
非摂動領域におけるグル-オンの振る舞いと閉じ込め機構

強い相互作用をする素粒子はクオークとグルオンから構成されており、これらクオークとグルオンは単独で取り出すことは出来ないと考えられている。クオーク/グルオンの力学であるQCDは、摂動領域で実験をみごとに説明してきた。しかし、クオークとグルオンがその閉じ込めの性質を示す非摂動領域では、摂動論の計算は無力になり、現在もっとも強力な解析の手法は数値シミュレーシヨンに基づくものである。非摂動領域の振る舞いを正確に知るためには、短距離から長距離までを統一的に測定する必要がある。格子上のシミュレーシヨンにおいては、これは小さな格子間隔をもった非常に大きな格子の上で計算を行うことを意味する。本研究計画は、大規模数値計算によって、グル-オンの伝播関数を非摂動領域で精密に測定することを目的とした。これまでの数値シミュレーションの結果によれば、グル-オンの伝播関数の振る舞いは、質量ゼロのゲージ粒子の摂動的振る舞いとは大きく食い違っている。特に長距離の非摂動領域においては通常の粒子描像では理解できない様相を示している。虚時間の関数として表したとき、伝播関数は上に凸となる。このことはスペクトラル関数が正定値でないことを意味し、グル-オンが物理的粒子ではないことを示唆しているまた、現象理論にはこの振る舞いは、長距離でグル-オンの有効質量が増大すると解釈することもできる。これらはいずれも閉じ込めの描像としてこれまで議論されてきたが、始めてQCDから直接にその根拠を与えたことになる。1.プログラムの開発とテスト強い相互作用をする素粒子はクオークとグルオンから構成されており、これらクオークとグルオンは単独で取り出すことは出来ないと考えられている。この閉じ込めと呼ばれる現象は、分子/原子/原子核/核子という階層構造において、構成物質を分離して研究してきた自然界の認識の方法の変更を迫るものである。グル-オンの性質を調べるためには、近距離から遠距離までの振る舞いを調査しなければならない。この目的のため48×48×48×64というこれまでに計算されたもっとも巨大な格子上で計算のシミュレーションを並列ベクトル型という新しいタイプのスーパーコンピュータである航空宇宙技術研究所の開発した世界最高速の計算機「数値風洞」の上で開発した。2.結果グル-オンのプロパゲ-タの計算結果は以下のような特徴を示している:(1)質量ゼロの自由プロパゲ-タでは結果をフィットすることはできない、(2)虚時間が増大すると、プロパゲ-タはほとんどゼロになる、(3)実効質量は虚時間が大きくなると増大する。すなわち、グル-オンは通常のポールを持った粒子としての記述はできないが、それは距離が大きくなるに従って質量が増大していく粒子のように振る舞う。これは「閉じ込められた粒子」という描像とよく一致する。さらに統計精度を上げ遠距離でのグル-オンの振る舞いを確立するために、現在大規模シミュレーションを進めている。1.目的と研究手法グル-オンの性質をもっとも直接的に調べる方法は、その伝播関数を計算することであるが、そのためにはQCDの「色」の自由度を持った状態を取り出さねばならない。この「色」の自由度を引き出すだめには、「ゲージ固定」という操作を行う必要があるが、その際にQCDのゲージ固定は一意的でないという問題が起こる。現在、Grinov不定性を持つ系のシミュレーションのアルゴリズムとしてはZwanziger等による確率過程ゲージ固定法に基づくアルゴリズムが、もっとも意味が明らかである。この手法を格子QCD適用し、大規模モンテカルロ計算を行う。格子上のシミュレーションにおいては、これは小さな格子間隔をもった非常に大きな格子の上で計算を行うことを意味する。本研究計画は、大規模数値計算によって、グル-オンの伝播関数を非摂動領域で精密に測定するとを目的とした。2.これまでに得られた結果これまでの数値シミュレーションの結果によれば、グル-オンの伝播関数の振る舞いは、質量ゼロのゲージ粒子の摂動的振る舞いとは大きく食い違っている。

特に長距離の非摂動領域においては通常の粒子描像では理解できない様相を示している。虚時間の関数として表したとき、伝播関数は上に凸となる。このことはスペクトラル関数が正定値でないとを意味し、グル-オンが物理的粒子ではないことを示唆している。また、現像論的には、この振る舞いは、長距離でグル-オンの有効質量が増大すると解釈することもできる。これらはいずれも閉じ込めの描像としてこれまで議論されてきたが、始めてQCDから直接にその根拠を与えたことになる。
重度視力障害者の視機能評価-測定機器の開発と改良-

我々は重度視力障害者の視機能を評価する光覚測定機器Low Vision Evaluator(LoVE))の開発改良を行った。小児のフェイスカーブによくマッチングする専用ゴーグルを作成した。小児では3才以下では理解力が未熟なため評価不能なことが多かったが、およそ4才以上であれば視機能が評価可能であった。近年、トリパンブルー(TB)、インドシアニングリーン(ICG)色紫が黄斑部手術で用いられ有効であったと報告されている。一方で、それらのヒト網膜色素上皮細胞(RPE)、網膜ガングリオン細胞(RGC)に対する毒性も報告され議論されている。我々はTB(0.05%0.5%)のRPE、RGCに対する毒性を調べ、またそれらの低温下暴露(4°C、8°C)における毒性の程度も調べた。培養ARPE-19とRGCにTB(0.05%、0.5%)を37°Cと8°C下で1:分間暴露した。細胞生存率は暴露一日後にレサズリンを用いて測定し、コントロール(BSS暴露)と比較した。ARPE-19:37°C下TB0.5%では細胞生存率の低下したが(Pく0.01)、他の条件下では細胞生存率の低下は認めなかった。RGC:8°C下0.05%では細胞生存率の低下を認めなかったが、他の条件下では細胞生存率の低下を認めた(0.05%37°C;sPく0.05、0.5%37°Cand8°C;P<0.01)。さらに今回、我々はICGのRPEに対する毒性を調べ、またそれらの低温下暴露における毒性の程度も調べた。培養ARPE-19にICG(0.25mg/ml,0.5mg/ml,1mg/ml,2.5mg/ml1,and 5mg/ml)を37°Cと4°C下で30分間暴露した。ICG5mg/ml濃度に相当する低張性生理食塩水にARPE-19を暴露したところ、統計学的に有意な細胞生存率低下は認めなかった。37°C暴露:ICG0.25mg/mlの濃度以外は、どの条件下でもコントロールと比べて生存率が低下した(P<0,05)。低温下暴露においては、TB・ICG色素の同様な濃度・暴露時間条件でも、その網膜色素上皮・網膜ガングリオン細胞に対する毒性は低減される可能性がある。我々は重度視力障害者の視機能を評価する光覚測定機器Low Vision Evaluator (LoVE)の開発改良を継続した。近年、トリパンブルー(TB)色素が黄斑部手術で用いられ有効であったと報告されている。今回、我々はTBのRPE、RGCに対する毒性を調べ、またそれらの低温下暴露における毒性の程度も調べた。(1)培養ARPE-19にTB(0.05%、0.2%、0.5%)を37°Cと4°C下で5分または30分間暴露した。(2)培養ARPE-19とRGCにTB(0.05%、0.5%)を37°Cと8°C下で1分間暴露した。細胞生存率は暴露一日後にレザズリンを用いて測定し、コントロール(BSS暴露)と比較した。(1)5分間暴露:TB0.05%の濃度では37°C下、4°C下ともに細胞生存率の低下を認めなかったが、0.2%以上の濃度では両温度下で細胞生存率の低下を認めた(P<0.01)。0.5%の濃度では37°Cと4°C下での生存率の有意差を認め(P<0.01)、4°C下の生存率の方が良好であった。30分間暴露:TB0.05%の濃度4°C以外は、どの条件下でもコントロールと比べて生存率が低下した(P<0.01)。37°C下では0.05%、0.2%、0.5%間で生存率に差を認め、濃度依存性に生存率は低下した(P<0.01)。一方、4°C下では0.2%、0.5%間で生存率に差を認めなかった。4°C下での0.2%、0.5%TB暴露は、37°C下暴露に比べて、生存率が有意に高かった(P<0.01)。(2)ARPE-19:37°C下TB0.5%では細胞生存率は低下したが(P<0.01)、他の条件下では細胞生存率の低下は認めなかった。RGC:8°C下0.05%では細胞生存率の低下を認めなかったが、他の条件下では細胞生存率の低下を認めた(0.05%37°C;P<0.05、0.5%37°Cand 8°C;P<0.01)。低温下暴露においては、TB色素の同様な濃度・暴露時間条件でも、その毒性は低減される可能性がある。

小児のフェイスカーブによくマッチングする専用ゴーグルを作成した。小児では3才以下では理解力が未熟なため評価不能なことが多かったが、およそ4才以上であれば視機能が評価可能であった。近年、トリパンブルー(TB)、インドシアニングリーン(ICG)色紫が黄斑部手術で用いられ有効であったと報告されている。一方で、それらのヒト網膜色素上皮細胞(RPE)、網膜ガングリオン細胞(RGC)に対する毒性も報告され議論されている。我々はTB(0.05%0.5%)のRPE、RGCに対する毒性を調べ、またそれらの低温下暴露(4°C、8°C)における毒性の程度も調べた。培養ARPE-19とRGCにTB(0.05%、0.5%)を37°Cと8°C下で1:分間暴露した。細胞生存率は暴露一日後にレサズリンを用いて測定し、コントロール(BSS暴露)と比較した。ARPE-19:37°C下TB0.5%では細胞生存率の低下したが(Pく0.01)、他の条件下では細胞生存率の低下は認めなかった。RGC:8°C下0.05%では細胞生存率の低下を認めなかったが、他の条件下では細胞生存率の低下を認めた(0.05%37°C;sPく0.05、0.5%37°Cand8°C;P<0.01)。さらに今回、我々はICGのRPEに対する毒性を調べ、またそれらの低温下暴露における毒性の程度も調べた。培養ARPE-19にICG(0.25mg/ml,0.5mg/ml,1mg/ml,2.5mg/ml1,and 5mg/ml)を37°Cと4°C下で30分間暴露した。ICG5mg/ml濃度に相当する低張性生理食塩水にARPE-19を暴露したところ、統計学的に有意な細胞生存率低下は認めなかった。37°C暴露:ICG0.25mg/mlの濃度以外は、どの条件下でもコントロールと比べて生存率が低下した(P<0,05)。低温下暴露においては、TB・ICG色素の同様な濃度・暴露時間条件でも、その網膜色素上皮・網膜ガングリオン細胞に対する毒性は低減される可能性がある。