hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
新しい分泌型マラリア防御抗原タンパクの機能と遺伝子構造の解析

1.Plasmodium bergheiXAT感染に対して強い防御効果を示すモノクローナル抗体B1D6抗体とH6G11抗体(いずれもIgG1)を、原虫感染赤血球を接種して感染耐過後、感染赤血球を再接種したBALB/cマウスの脾細胞を用いて作成した。これらのうち、B1D6抗体が認識する標的抗原の推定分子量をwestern blot法によって検討すると、この抗体は還元条件下で電気泳動によって分離されたタンパクのうち推定分子量150kDと160kDの成分に反応した。B1D6抗体を結合させたHiTrapNHS-activatedカラムおよびホルミルセルロファインカラムにより標的抗原をアフィニティー精製し、50mgの粗抗原から約300ugの精製抗原を得た。Western-blot法により、この精製抗原標品中に上記の150kDと160kDタンパクが含まれることを確認した。精製標品を電気泳動したSDS-PAGEゲルによりを用いて150kDと160kDタンパクを分離後、それぞれの内部アミノ酸配列の解析が進行中である。2.P.berghei XATの感染防御抗原であるB1D6抗原が感染のどの時期に出現するかを明らかにするためにB1D6抗体を用いたtwo-sited assay systemを構築した。H6G11抗体の標的抗原がB1D6抗体の標的抗原と同一であることが明らかとなったので、より感度の高いアッセイ系を確立するために各々の抗体を精製・標識し、1抗体法と2抗体法を比較検討した。その結果、2抗体法により血中のマラリア抗原を検出し得た。3.P.berghei XATの感染防御抗原は、蛍光抗体法および免疫電子顕微鏡法の結果からMSP-1などの膜結合型抗原とは異なるタイプの可溶性抗原と考えられた。今後、さらにその遺伝的性状について解析を進めるとともに、この抗原が如何にして原虫排除・殺滅に関わるのかを探る予定である。
活性酸素を発生させる除草剤による光合成系の損傷と抵抗性機構

本研究は活性酸素の一種である一重項酸素の発生を通して植物を枯死させると考えられる除草剤を用いて、一重項酸素の生成とそれによる光合成系の損傷、および、抵抗性植物における一重項酸素抵抗性の機構を明らかにしようとするものである。本研究により得られた結果は以下のように要約される。1.多くの作物および雑草種について、われわれが一重項酸素発生剤であることを明らかにしてきたジフェニルエーテル系の除草剤に対する抵抗性を比較した。その結果、比較的強い抵抗性を示す種がいくつか見い出された。さらに、それらの種について抵抗性機構を検討した結果、イネやダイコンは一重項酸素酸化に対する抗酸化作用が強いことで抵抗性であることを示す結果が得られた。2.包膜を有する完全葉緑体を単離し、その電子伝達活性に対する上記除草剤の影響を調べることにより、光合成系は損傷を受けることが明らかとなったが、その程度は一重項酸素消去剤の共存下で軽減された。このことから剤の作用への一重項酸素の関与がより明らかとなった。3.抵抗性の強いイネと弱い植物における抗酸化酵素や物質の検討からは、過酸化の開始反応(引き金)は一重項酸素でも、膜の過酸化反応にはそれから派生する種々の活性酸素種が関わっていることを示唆する結果が得られた。4.以前に選抜した上記除草剤に対する抵抗性ダイズ細胞は、既知の一重項酸素発生剤には抵抗性を示さなかった。この細胞は除草剤の標的酵素レベルで抵抗性を持っており、酵素が阻害されにくい結果、一重項酸素発生を引き起こす代謝中間体の蓄積が少なくなっていることが明らかとなった。本研究は活性酸素の一種である一重項酸素の発生を通して植物を枯死させると考えられる除草剤を用いて、一重項酸素の生成とそれによる光合成系の損傷、および、抵抗性植物における一重項酸素抵抗性の機序を明らかにしようとするものである。本年度得られた結果は以下のように要約される。3.以前に選抜した上記除草剤に対する抵抗性ダイズ細胞は、既知の一重項酸素発生剤には抵抗性を示さなかった。今後はこれらの植物材料を用いて一重項酸素障害の発生と抵抗性の機構について、さらに検討を進める。

さらに、それらの種について抵抗性機構を検討した結果、イネやダイコンは一重項酸素酸化に対する抗酸化作用が強いことで抵抗性であることを示す結果が得られた。2.包膜を有する完全葉緑体を単離し、その電子伝達活性に対する上記除草剤の影響を調べることにより、光合成系は損傷を受けることが明らかとなったが、その程度は一重項酸素消去剤の共存下で軽減された。このことから剤の作用への一重項酸素の関与がより明らかとなった。3.抵抗性の強いイネと弱い植物における抗酸化酸素や物質の検討からは、過酸化の開始反応(引き金)は一重項酸素でも、膜の過酸化反応にはそれから派生する種々の活性酸素種が関わっていることを示唆する結果が得られた。4.以前に選抜した上記除草剤に対する抵抗性ダイズ細胞は、既知の一重項酸素発生剤には抵抗性を示さなかった。この細胞は除草剤の標的酵素レベルで抵抗性を持っており、酵素が阻害されにくい結果、一重項酸素発生を引き起こす代謝中間体の蓄積が少なくなっていることが明らかとなった。
細胞内カルシウム動態制御による渦巻き型旋回興奮の成立・分裂の抑制

近年、心室細動・頻拍など致死性不整脈の発生メカニズムである渦巻き型旋回興奮(スパイラル・リエントリー)の発生に、心筋細胞内Ca^<2+>動態の変化が重要な役割を果たすことが、主にシミュレーション研究の結果から示唆されている。本研究の目的は、2種類の蛍光プローブ(RH-237とRhod-2)を用いて、心筋細胞の活動電位と細胞内Ca^<2+>動態を同時にマッピングすることができるシステムを新たに開発し、細胞内Ca^<2+>動態が心臓におけるスパイラル・リエントリーの成立・維持に果たす役割について検討することである。膜電位と細胞内Ca^<2+>同時マッピング装置としては、それぞれの蛍光プローブのシグナルをdicrotic mirrorで分離し、2台の高速度CMOSビデオカメラでそれぞれの画像を撮影する装置と、励起光源の発光ダイオード(LED)と回転式光学フィルターを高速で切り替えて、膜電位と細胞内Ca^<2+>蛍光画像を1台の高速度ビデオカメラで撮影する装置を試作した。ウサギ摘出灌流心臓を用いた実験では、両システムともに心室筋における活動電位と細胞内Ca^<2+>を同時にマッピングすることが可能であった。しかし、前者では2台のカメラで撮影された電位とCa^<2+>画像を重ね合わせる技術について、後者では主に時間分解能(20フレーム/秒)に点において、さらに改善する余地が残されている。心室細動・頻拍(VF/VT)の基盤となる渦巻き型興奮旋回(スパイラル・リエントリー)の発生には、心筋構築の不均一性・不連続性とともに、心筋興奮の動的不安定性が重要な役割を果たしている。心筋細胞内のカルシウム濃度変化は細胞興奮の不安定性を増し、興奮波分裂を促すことが示唆されている。本研究の目的は、心筋細胞内のカルシウム動態がスパイラル・リエントリーの成立・維持に果たす役割を動物実験で明らかにし、細胞内カルシウム動態制御による心臓突然死の新たな治療・予防技術を開発することである。今年度の研究では、実験動物の摘出灌流心臓標本における心筋細胞の活動電位と細胞内カルシウムとを同時にマッピングすることができる光学計測システムを構築した。膜電位の計測には、我々が以前に開発した高輝度発光ダイオード(LED)と高速度デジタルビデオカメラを用いる高分解能マッピング装置を使用し、カルシウム蛍光シグナルを観察するビデオカメラと蛍光分離用dicrotic mirrorおよび狭帯域吸収フィルターを新たに増設した。ウサギ摘出灌流心臓を用いた実験では、膜電位感受性色素RH237による活動電位シグナルと、カルシウム感受性色素Rhod2-AMによる細胞内カルシウムシグナルを心室筋から同時に計測することでき、電気的ペーシングおよびスパイラル・リエントリーにおけるそれらの伝播様式について高い分解能で(時間分解能1ms、空間会解能0.1mm)解析することが可能であった。今後、この計測システムを用いて、高頻度ペーシングで誘発される交代現象や、スパイラル興奮波の形成・分裂における心筋活動電位と細胞内カルシウム動態との関係について解析を進める予定である。心筋細胞におけるCa^<2+>動態はtriggered activityの発生のみならず興奮波の分裂現象にも深く関与しており、心室細動/頻拍など致死性不整脈の発生・維持に重要な役割を果たすことが示唆されている。昨年度の本研究では、2種類の蛍光プローブを用いて心筋活動電位と細胞内Ca^<2+>動態を同時に計測するシステムを開発した。しかし、この装置ではダイクロイックミラーを用いて光路を分割して2台の高速度カメラによって蛍光画像を撮影する手法を用いたため、同一画角で画像を記録することが困難であり、心筋活動電位とCa^<2+>動態の関連性を詳細に解析することはできなかった。今年度の研究では、1台の高速度CMOSカメラで心筋活動電位とCa^<2+>動態の同時・同期計測が可能なシステムの開発を行った。本システムでは、膜電位と細胞内Ca^<2+>

計測プローブとしてRH-237とRhod-2を用い、それぞれの励起光源LEDを交互に点灯するとともに、それぞれの蛍光計測用光学フィルタを回転させて交互に切り替える機構を備え、同一光路で活動電位とCa^<2+>画像を撮影することができるように設計した。ウサギ摘出灌流心臓を用いた実験では、左心室の活動電位と細胞内Ca^<2+>動態を20フレーム/s,画面解像度256×256 pixel,空間分解能1.56mmで撮影でき、心室における興奮波の伝播とCa^<2+>動態を高い分解能で同時にマッピングすることが可能であった。今後、本計測システムを用いてスパイラル・リエントリーのダイナミクスを詳細に解析することにより、致死性不整脈の発生機序の解明や制御技術に関する新たな知見が得られるものと期待される。
喉頭神経機構とその破綻への対応

延髄腹側呼吸ニューロン群および傍顔面神経核呼吸ニューロン群は非呼吸性喉頭運動についてもその制御に影響を与えていることが示唆された。また、咳、嚥下についてはその中心的な神経ネットワークが傍顔面神経核呼吸ニューロン群のレベルよりもより尾側に存在していることが明らかになった。ステロイドホルモンは声帯・気管・食道の線維芽細胞に対して、受容体を介して作用し、細胞外基質発現に影響を与えることが示された。線維芽細胞は部位によりステロイドホルモンに対して様々な反応性を有することが示された。また、マウス迷走神経運動核における性ホルモン受容体陽性細胞の分布と性差、その免疫組織学的特性が明らかとなった。呼吸、発声、嚥下、咳などの喉頭運動は特有の神経機構により制御されている。この多機能性を有する喉頭運動を最終的に駆動するのは疑核に存在する喉頭運動ニューロンである。そして、その前駆ニューロンである、いわゆるpremotor neuron (PMN)は多機能性を有するとされ、喉頭運動の様々な機能を支配している。実際に一部のPMNは嚥下、咳などでその特徴的な活動を呈することが証明されている。そこで喉頭premotor neuron (LPMN)の活動性の解析を目指し研究を行った。LPMNの解析対象領域には後疑核、橋背外側領域が挙げられる。当初の予定では平成25年度に後疑核に存在するLPMNの活動記録を予定していたが、その効率的な活動記録の実現を優先させ、延髄の全般的な喉頭多機能性の解析を行った。喉頭運動は安静時呼吸に同期した運動を呈する。従って喉頭運動ニューロンの多くは呼吸性活動を示し、LPMNも呼吸性活動を呈する。従って呼吸ニューロンプールがその解析対象領域とも言える。そこでまず、延髄腹側呼吸ニューロンの発声、嚥下、咳時の活動性の変化を解析した。除脳非動化モルモットを使用し、非動化発声、嚥下、咳時の活動を呼吸時と比較すると、呼吸ニューロンの活動パターン毎にその特徴的な活動パターンの変化を示し、喉頭の多機能性の実現に貢献していることが解明された。また、喉頭神経機構に対するステロイドホルモン、特に性ホルモンの関与について検討した。免疫組織学的手法を用いて延髄におけるアンドロゲンレセプター(AR)、エストロゲンレセプターα(ERα)の発現を調べた。ARは疑核吻側・迷走神経背側核に、ERαは疑核・迷走神経背側核・孤束核に発現していた。これらの結果は性ホルモンが喉頭の神経支配に影響を与える可能性を示している。以上の結果は喉頭神経機構の解明に重要な研究実績と成り得るものである。呼吸、発声、嚥下、咳などの多機能性を有する喉頭運動を最終的に駆動するのは疑核に存在する喉頭運動ニューロンである。喉頭運動ニューロンのpremotor neuron (PMN)も多機能性を有するとされ、喉頭運動の様々な機能を支配している。当初の予定では平成26年度に後疑核に存在するLPMNの活動記録を予定していたが、その効率的な活動記録の実現を優先させ、延髄の全般的な喉頭多機能性の解析を行った。まず、延髄腹側呼吸ニューロンの発声、嚥下、咳時の活動性の変化を解析した。除脳非動化モルモットにて、非動化発声、嚥下、咳時の活動を呼吸時と比較すると、呼吸ニューロンの活動毎にその特徴的な活動パターンの変化を示し、喉頭の多機能性に貢献していることが解明された。また嚥下、咳反射生成機構の中核を限定するために、傍顔面神経領域の呼吸関連ニューロン解析も行った。また、喉頭神経機構に対する性ホルモンの関与についても研究をすすめた。雄マウスの疑核・迷走神経背側核は性ホルモン受容体を発現しており、性ホルモンが喉頭の神経支配に影響を与える可能性を示している。本年度は性ホルモン受容体陽性細胞の支配臓器の検討に加えて、免疫組織学的特性について検討した。陽性細胞はcholine acetyltransferaseやcalcitonin gene-related peptideを発現していた。以上は喉頭神経機構の解明に重要な研究実績と成り得るものである。喉頭運動ニューロンを制御しているpremotor neuronは脳幹の様々な領域に存在していることが予想されている。この多機能性を有する喉頭premotor neuronの機能解析を目指して研究を行った。Premotor neuronの多くは呼吸性活動を示すことが予想されるため、前年度は延髄の呼吸関連ニューロンの多機能性について検討した。この結果をもとに、本年度は延髄腹側呼吸ニューロン群の最も吻側に位置し、咳、嚥下制御への関与が疑われる呼吸ニューロン群についてニューロンの活動解析および呼吸、咳、嚥下生成への影響を解析した。

また、橋呼吸中枢に存在することが予想されているpremotor neuronについては脳幹切断実験による咳、嚥下生成への影響を検討した。その結果、喉頭の呼吸性活動については橋呼吸中枢は重要な役割を担っているが、咳、嚥下生成においてはその関与は比較的少なく、傍顔面神経核呼吸ニューロン群より尾側レベルの延髄で咳、嚥下のリズム生成が行われている可能性が示唆された。また、喉頭神経機構におけるステロイドホルモンの関与に関する研究も継続した。ラット脳幹のアンドロゲンレセプター、エストロゲンレセプター、グルココルチコイドレセプター抗体での免疫組織化学により、迷走神経背側運動核、疑核における各ステロイドホルモンの分布様式が解明された。さらに気管、食道へ分布する迷走神経背側運動核のニューロンの局在が明らかになり、気管および食道を同時に支配しているニューロンが迷走神経背側運動核に存在することが示された。延髄腹側呼吸ニューロン群および傍顔面神経核呼吸ニューロン群は非呼吸性喉頭運動についてもその制御に影響を与えていることが示唆された。また、咳、嚥下についてはその中心的な神経ネットワークが傍顔面神経核呼吸ニューロン群のレベルよりもより尾側に存在していることが明らかになった。ステロイドホルモンは声帯・気管・食道の線維芽細胞に対して、受容体を介して作用し、細胞外基質発現に影響を与えることが示された。線維芽細胞は部位によりステロイドホルモンに対して様々な反応性を有することが示された。また、マウス迷走神経運動核における性ホルモン受容体陽性細胞の分布と性差、その免疫組織学的特性が明らかとなった。平成26年度の予定では後疑核の喉頭運動ニューロンのpremotor neuron (LPMN)の発声、嚥下、咳時の活動記録を予定していたが、その効率的な同定や活動記録を目的として、延髄呼吸ニューロンの喉頭多機能性に関する活動性の解析を行った。その結果、延髄腹側呼吸ニューロン群は呼吸時と活動パターンを変化させ、発声、嚥下、咳運動生成に貢献することが解明された。さらにその活動パターンは呼吸時の活動タイプにより特徴的な変化を呈する傾向がみられることが分かった。また、解析されたニューロンの一部はLPMNである可能性があり、LPMN解析という当初の研究予定に合わせて考慮しても、当初に予想された研究内容の範疇である。さらに、多機能性を有する喉頭運動調節機構についての解析を追加したことにより、LPMN解析を補完する情報が得られた。また、喉頭神経機構へのステロイドホルモン関与の検討に関しては、逆行性トレーサー(コレラトキシンB)注入実験の結果から、気管や食道を支配する疑核(NA)や迷走神経背側核(DMV)の神経細胞の一部がアンドロゲンレセプター(AR)、エストロゲンレセプターα(ERα)を発現していることが判明した。マウス喉頭へのトレーサーの確実な注入が手技的に困難であるため、喉頭を支配する神経細胞について性ホルモン関与の証拠は得られなかったが、DMVにおける受容体の分布からは性ホルモンが喉頭腺分泌機能や血流制御に関与している可能性も考えられる。次年度の追加研究は必要となるが、その基盤となる結果は得られたと考える。また、NA・DMVにおけるAR・ERα陽性細胞の大部分がcholine acetyltransferaseやcalcitonin gene-related peptideを発現することも判明した。
哺乳類中枢シナプス伝達・短期可塑性メカニズムの解明

シナプス伝達・可塑性がシナプス前性のメカニズムによってどのように媒介されているかを明らかにすることを主要な研究目的として研究を進めている。本年度は、おもに苔状線維シナプス前終末を用いて、膜容量測定法と全反射蛍光顕微鏡を用いた研究をおこなった。(1)膜容量測定法を用い、Ca-伝達物質放出連関を測定した。シナプス小胞はいくつかの小胞プールの間を遷移するが、そのプールを分離した。また、細胞外からCaバッファを導入することにより、伝達物質放出、プール間の遷移速度、エンドサイトーシスのCa依存性について実測することが可能になった(論文準備中)。(2)全反射蛍光顕微鏡を用い、形質膜伝達物質放出部位付近のCaおよびシナプス小胞を50-100 nmの空間分解能で実測することが可能になった。この方法を用いて、Ca動態、シナプス小胞動態を測定した。また、シナプス小胞の動態がcAMPといったセカンドメッセンジャーによってどのような修飾を受けるかを調べ、詳細な解析をおこなった。これ以外に、小脳、下丘のシナプス特性に関して以下の成果を得た。(3)小脳プルキンエ細胞出力シナプスに関して、シナプス形成に細胞間マトリックスに関連するBral2が重要な役割を果たすことを電気生理学、遺伝学を用いて明らかにした(Edamatsu et al., 2018, J. Neurochem)。(4)下丘への入力シナプスに関して、その伝達特性を明らかにした(Kitagawa and Sakaba, in press)。海馬苔状線維シナプスにおいて、膜容量測定法、全反射蛍光顕微鏡によるCa,シナプス小胞動態測定が日常的にできるようになっており、当初の予定よりも研究が進んでいると考えられるため。来年度に関しては、研究を進めるとともに、公刊可能なデータから速やかに論文投稿を進めることが重要である。
ナノヘテロ構造制御によるナノ結晶/アモルファス複合合金の高強度・高延性化

ナノ結晶合金やアモルファス合金は結晶粒の超微細化等により極端に高強度化・硬質化しており、塑性変形中の加工硬化メカニズムは存在しない。このため、引張変形中にせん断帯が局所的に形成され、脆性的に破壊する。本研究ではこれまでに、ナノ結晶/アモルファス複合組織を有するNi-W系のナノヘテロ材料を開発し、応力誘起のナノ結晶粒成長による局所的硬化を生じさせ、加工硬化の発現と大きな塑性変形を発現させることができた。また、Zr-Cu-Ni-Al系金属ガラス合金においても、微量なAu, Pd等を添加すると、ナノ準結晶相の析出が容易となり、応力誘起のナノ準結晶相の析出による加工硬化の発現が認められ、圧縮変形時に大きな塑性変形を発現できることを明らかにした。このような結果を得て、上記材料の実用化に向けた研究にも着手している。このような応力誘起によるナノ結晶粒成長やナノ準結晶相の析出には、アモルファス母相中に原子拡散を促進するための過剰なフリーボリュームの存在が必要である。しかしながら、これらナノヘテロ材料は、常温で放置しておいても体積収縮を伴うフリーボリュームの放出が生じ、徐々に応力誘起変態が生じ難くなる欠点を有する。このように、応力誘起の相変態を容易に起こさせる材料は、同時に、常温付近の低い温度領域でも時効硬化が徐々に生じて、応力誘起による加工硬化は徐々に認められなくなり、高い延性能は消失する傾向ある。今後は、これらの問題を解決するため、熱的に安定な結晶相と時効硬化性のあるナノ結晶/アモルファス複合組織を有するナノヘテロ材料をマイクロメータサイズに積層化する等の方法により、これら材料の実用化に必要な温度領域での体積収縮を伴う組織変化を抑制する必要がある。本研究ではこれまでに、ナノ結晶/アモルファス複合組織を有するNi-W系合金において、応力誘起のナノ結晶粒成長による局所的硬化を生じさせ、加工硬化の発現と大きな塑性変形を発現でき、これら材料の塑性変形機構の解明にまで研究を進めることができた。このため、Ni-W系合金においては複数の企業を含めて実用化研究の準備が進んでおり、マイクロ機械部品、マイクロ金型等の開発を検討している。一方、ナノ結晶/アモルファス複合合金に見られる応力誘起によるナノ結晶粒成長の発現には、アモルファス母相中に原子拡散を促進するための過剰のフリーボリュームが必要である。しかしながら、これらナノヘテロ材料は、常温で放置しておいてもフリーボリュームの放出が生じ、徐々に応力誘起ナノ結晶粒成長が生じ難くなる欠点を有する。このような応力誘起のナノ結晶粒成長を容易に起こさせる材料は、同時に、常温を含めた低い温度領域でも時効硬化が徐々に生じて、塑性変形時の応力誘起による加工硬化は認められなくなり、高い延性は認められなくなる傾向が明らかとなった。このような現象は、試料作製直後の大きな塑性変形能と、これら材料の耐熱性・耐久性とが相互にトレードオフの関係にあり、実用化への大きな障害となる。これらの問題を解決するため、熱的に安定な結晶相と時効硬化性のあるナノヘテロ材料をマイクロメータサイズに積層化する等により、常温での体積収縮を伴う組織変化を抑制するなどの複合組織化を検討した。実際に、Ni-W合金相と純Ni相を1ミクロン間隔で交互に積層することにより、構造緩和の抑制と体積収集を抑制できることが確認できた。Zr-Cu-Ni-Al系金属ガラス合金においても、微量なAu, Pd等を添加すると、ナノ準結晶相の析出が容易となり、応力誘起のナノ準結晶相の析出による加工硬化の発現が認められ、安定相との積層化による組織の最適化を検討する。ナノ結晶/アモルファス複合合金の引張塑性変形量は、アモルファス母中原子拡散を伴ったナノ結晶粒成長に起因する加工硬化挙動に依存し、残留する過剰なフリーボリューム量に依存する。このようなフリーボリュームは、常温でも徐々に放出することから加工硬化性能が減少し、塑性変形伸びが時間とともに減少する。このため、以下の項目のついて検討を行う。1)電析Ni-W合金を用いて、W含有量を制御することにより、ナノ結晶単相材、アモファス単相材および、ナノ結晶/アモルファス複合材料を作製し、これら合金の熱収縮挙動を熱機械試験機(TMA)を用いて検討する。これら合金の収縮量と引張強度と塑性変形伸びとの相関性を明らかにする。さらに、安定なfcc結晶構造を有する純Niもしくはナノヘテロ構造を有するNi-W合金をマイクロメータサイズに積層電析材を作製する。Ni相は細密充填構造で熱収縮はほとんど認められず、Ni-W相は過剰なフリーボリュームの放出により収縮する。これらを積層化することにより、Ni-W相の収縮が抑制できることが予想される(山崎)2)上記の積層合金を用いて最適積層厚さを検討する。TMAによる収縮挙動を測定するとともに、常温から300°C付近までの温度で熱処理を行い、収縮量と引張試験による強度と塑性変形量との関係を検討する。また、放射光による積層材の引張試験中の各相のピークシフト量を測定し、各相の応力分配、残留応力を検討し、最適積層厚さを検討する。(山崎、足立、網谷)3)窒素雰囲気中でのMAやガスアトマイズ法等により、Fe-TiN, Ni-TiN, Zr-TiN系等のナノヘテロ構造を有する合金粉末の作製を検討し、安定な金属結晶構相とナノヘテロ構造造との複合組織を有するバルク材の作製について検討する。

上述の合金を用いたマイクロ金属金型の作製等についても検討する(網谷、三浦、加藤、山崎)。電解析出法を用いてW含有量が1518 at. %で、ナノ結晶/アモルファスの二相からなるナノヘテロ組織を有するNi-W合金を作製した。これら合金は、引張強度2.5 GPa程度を保持しつつ、1数%の塑性伸びを得る高強度・高延性特性が観察された。しかしながら、Ni-W合金の合金膜厚が20μm以上に増加すると、高い破断強度は維持するが、塑性変形量が減少し、次第に脆性的な挙動を示すようになった。電解析出法により100μm厚の脆化状態にあるNi-W合金を作製し、これに強ひずみ加工を施して、アモルファス相中のフリーボリュームを増加させ、高延性化することを試みた。ビッカース硬度測定から、強ひずみ加工量の増加とともに軟化が認められるようになり、延性の回復が生じていると判断された.電解析出中の浴抵抗や基板抵抗も、電析材の延性に大きく関係することが明らかとなり、今後、これらのパラメータを検討する。また、積層電析法により、ナノ結晶/アモルファスの二相からなる硬質のNi-W合金と、比較的軟質のNi相を交互にそれぞれ0.3μm, 1μmおよび2μmの厚さで繰り返し積層バルク化した合金を作製し、ナノ・マイクロマルチスケールのヘテロ構造を有する合金を作製した。その結果、1μm積層材では、引張破断伸びが大きく増大した。バルク状のZr基金属ガラス合金に強歪加工を加え、アモルファス中の自由体積のヘテロ化、もしくはAu等の添加によるナノ結晶を変形誘起析出させることにより、本合金系でも塑性変形部におけるナノ結晶粒の析出と硬化現象が観察され、圧縮変形時において、局所的なせん断帯の形成が大幅に抑制された。これらのバルク状アモルファス合金に軟質の金属相をナノ・マイクロスケールで交互に積層状に配置された合金組織を形成させるために、メカニカルアロイング法が有効であることから、その実験準備も進めた。電解析出法により、安定的にナノ結晶相とアモルファス相からなるナノへテロ構造のNi-W合金を作製できるようになった。これら合金試料を用いて、今後、合金中に含まれるアモルファス相中のフリーボリューム量と、応力誘起のナノ結晶粒成長との相関性の検討が可能となった。試料材料の安定的な作製が可能となったことから、これら合金試料に、各種の熱処理や強加工処理を加えて、フリーボリュームを制御し、加工硬化現象との関係を明らかにすることが出来る。積層電析技術を確立して、サブミクロンレベルでの、異なる電析層を積層して、引張試験を実施することが出来た。本技術を用いて、数十ナノスケールのヘテロ構造とサブミクロンスケールのマルチスケールのヘテロ構造を有する合金の作製技術を確立することが出来た。これら試料作製技術を利用して、高強度・高延性を発現できる理想的な材料組織の形成を目指す。事実、各層の厚さが、1μm程度で、大きな塑性変形性を示す結果が認められており、これら試料を用いて、SPring-8を利用した引張塑性変形中の構造変化をダイナミックに測定し、各層間の塑性変形挙動や、残留応力の発生状況を解析して、高強度を維持しつつ高延性を発現するメカニズムの解明を目指すことが出来る。金属ガラスと呼ばれる高強度のバルク状のアモルファス合金においても、準結晶相の析出を誘発する元素の添加や、強加工処理により、ナノスケールのヘテロ構想の形成が可能で、圧縮変形では大きな塑性変形が可能となっている。
心筋症の分子機構解明に向けた変異トロポニン分子内の局所ダイナミクス計測

Caの結合・解離により心筋収縮を調節するトロポニン(Tn)の変異が家族性心筋症を引き起こすことは広く知られている.しかし,変異によってTnの分子特性にどのような異常が起こるのかこれまで不明であった.そこで本研究では,野生型及びK247R変異型Tnの中性子準弾性散乱実験を行い,変異によるピコ秒領域の分子内運動変化を調べた.その結果,Ca結合によって野生型と変異型は逆のダイナミクス変化を示し,+Ca状態では変異型構成原子の運動振幅が野生型より大きくなることが分かった.変異による機能異常が生じるのは+Ca状態であることから,変異体分子内運動の振幅増大が心筋症発症と関連していることが明らかとなった.今年度は、目的タンパク質複合体を大量調製するための環境構築を行った。また、次年度以降に必要となるタンパク質重水素化を行うための基盤整備に着手した。本補助事業の最終年度前半に、重水素化サブユニットを含むタンパク質複合体の中性子準弾性散乱実験を計画している。今年度は、中性子散乱実験で得られる散乱データの解析を行うための基盤を整備した。関連タンパク質の中性子散乱データを用いて、解析プログラムの作成及び処理を行った。さらに、溶液試料由来のデータを扱うときに重要な因子の影響について検討した。本研究課題は,心筋症原因となる変異が心筋トロポニン分子のピコ秒領域ダイナミクスに与える影響を,中性子散乱を用いてサブユニットレベルで明らかにしようとするものである.そのために,研究対象である心筋トロポニン(3つのサブユニットTnC, TnI, TnT2から構成される)の2つのサブユニットを重水素化し,残り1つのサブユニット(計測対象となるサブユニット)を重水素化しないままトロポニン複合体を形成させる.このようにして,野生型及び変異型(TnTのK247R変異)トロポニン複合体の溶液試料を調製し,中性子準弾性散乱(QENS)によってダイナミクスが変異によってどのように変化するかを明らかにする.今年度は,サブユニットの重水素化システムを進展させた.中性子散乱実験では,一般的な生化学実験とは異なり大量の試料(50100mg)が要求される.従って,高効率・高収率のタンパク質重水素化システムが必須である.緑藻から抽出されるペプトンを用いて最小培地下で大腸菌を培養し,タンパク質が大量に発現されることを確認した.今後は,緑藻を重水中で培養することでペプトンを重水素下し,重水素下サブユニットを作成し,中性子散乱実験に供する予定である.特定のサブユニットが重水素化されたトロポニン複合体の調製に向けて,サブユニット重水素化に必要な試料調製環境を整えることができた.このペースで研究が進めば,補助事業期間内に中性子散乱実験データの取得及び解析を終えることが可能であるため,「おおむね順調に進展している」と判断した.本研究課題は,心筋トロポニン分子(Tn)内に生じる家族性肥大型心筋症の成因の1つである変異によって,Tn分子のピコ秒領域の構造揺らぎがどのような変化を示すかを明らかにし,疾患発症の分子機構解明に新たな知見を与えようとするものである.Tn分子は3つのサブユニット(TnC, TnI, TnT)からなり,TnCのCaイオン結合・解離によって心筋収縮を調節している.TnCへのCa結合シグナルはTnI及びTnT,さらに他のタンパク質(トロポミオシン・F-アクチン)へと伝達されることで正常な収縮調節機能が実現される.しかし,Tn分子内に生じる様々な点変異が,この収縮調節機能に異常をもたらし,家族性心筋症を引き起こすことが知られている.この分子機構を解明するためには,変異によるTn分子の構造や揺らぎの異常を捉えることが必須であるが,本研究では特に,中性子準弾性散乱を用いて構造変化の駆動力となるピコ秒領域の構造揺らぎ(ダイナミクス)に焦点を当てている.そして,TnTサブユニットに生じるK247R変異に着目し,この変異によってTn分子のピコ秒ダイナミクスがどのような異常を示すかを明らかにする.中性子散乱実験施設のトラブルに伴う長期停止により,当初の研究計画に遅れが出ている.しかし,今年度はビームタイムを確保することができ実験を行うことができた.ヒト心筋由来Tn分子の各サブユニット(TnTは野生型とK247R変異型の2種類)を大腸菌発現系を用いて発現・精製し,野生型及び変異型TnTを含むTn分子を再構成した.Caイオン有無の両条件の重水中溶液試料を調整し,中性子準弾性散乱実験を行った.得られた散乱スペクトルの詳細な解析は現在進行中である.今年度行った中性子散乱実験では,目的とする全ての実験を実施することはできなかったため,区分は「やや遅れている.」と判断した.そのため,補助事業期間の延長申請を行った.本研究は,心筋トロポニン(Tn)分子に生じる家族性肥大型心筋症の原因変異によって,分子内部の局所運動を反映するピコ秒領域のダイナミクスがどのような変化を示すかを明らかにし,疾患発症の分子機構に対する理解を進展させようとするものである.Tnは3つのサブユニット(TnC, TnI, TnT)からなり,TnCのCaイオン結合・解離によって心筋収縮を調節している.本研究では,TnTのK247R変異によるTnコアドメイン(Tn-CD)ダイナミクス異常を明らかにすることを目的とした.今年度は,昨年度得られた中性子準弾性散乱(QENS)スペクトルの解析及び論文発表を行った.

解析では,分子全体の重心拡散と分子内部の局所運動の動力学パラメータを導出した.重心拡散について,導出した拡散係数は全サンプル間で有意差は見られなかったが,この拡散係数には分子の重心拡散だけではなくコイル領域などのセグメント運動が寄与していることが分かった.局所運動については,野生型TnにCaが結合すると,滞留時間減少及び運動振幅の減少することが分かった.これは,TnC-TnIの結合や,分子動力学計算で予測されているTnT2の揺らぎ増大を反映していると考えられる.一方,-Ca状態の野生型と変異型を比較すると,野生型では滞留時間が減少していた.これは,変異箇所周辺の水素結合ネットワークが乱されることによる変化と解釈される.-Ca状態におけるこのような変化により,Ca結合に対する応答性が変化することが考えられる.実際,変異型+Caでは,野生型+Caと比べて運動振幅が有意に増加していた.この振幅増大は,X線溶液散乱によるモデリング研究により報告されている変異型+Caの野生型+Caとは異なるTnT2構造が不安定である可能性を示唆する.このような変異による原子運動の振幅増大が,心筋症発症に伴う機能異常と関連していると考えられる.Caの結合・解離により心筋収縮を調節するトロポニン(Tn)の変異が家族性心筋症を引き起こすことは広く知られている.しかし,変異によってTnの分子特性にどのような異常が起こるのかこれまで不明であった.そこで本研究では,野生型及びK247R変異型Tnの中性子準弾性散乱実験を行い,変異によるピコ秒領域の分子内運動変化を調べた.その結果,Ca結合によって野生型と変異型は逆のダイナミクス変化を示し,+Ca状態では変異型構成原子の運動振幅が野生型より大きくなることが分かった.変異による機能異常が生じるのは+Ca状態であることから,変異体分子内運動の振幅増大が心筋症発症と関連していることが明らかとなった.本年度内に、目的とするタンパク質複合体の大量調製環境が整った。これを基に、次年度は重水素化タンパク質の調製環境を整える。このペースで研究が進めば、補助事業期間内に本実験データの取得及び解析までを終えることが可能であるため、「順調に進展している」と判断した。最終年度は,野生型及び変異型トロポニンについて,トロポニン分子内の特定サブユニットのみを重水素化した複合体の溶液試料を調製し,中性子散乱実験を行うことを目標にする.本実験により,心筋症につながる分子内の変異によってサブユニットレベルでどのようなダイナミクス異常が起こるのかを明らかにする.再構成した野生型及びK247R変異型ヒト心筋Tn分子の中性子準弾性散乱実験データの詳細な解析を行い,変異が分子ダイナミクスに及ぼす影響を明らかにする.解析では,分子ダイナミクスのピコ秒,オングストローム領域の時空間情報を得ることができる.これらの情報に関するパラメータをスペクトルから抽出し,野生型と変異型ダイナミクス間の定量的な比較を行う.さらに,Tn分子のサブユニットを重水素化した試料を用いて,分子内の特定のサブユニットのみに由来するダイナミクスの変異による影響を調べる予定である.生物物理学,中性子散乱, X線散乱トロポニンは3つのサブユニットから構成されるタンパク質であるため、各サブユニット毎に培養・精製を行う必要がある。次年度は、2つのサブユニットの重水素化試料の調製環境を整えることを目標にする。そして、次々年度前半に中性子散乱実験データの取得及び解析を行う予定である。
がん由来DNAによるがん免疫の誘導機構の解明

申請者は抗がん剤であるトポテカンががん細胞の細胞死を介して免疫賦活化DNAの放出を誘導し、樹状細胞の活性化を促進することを明らかにした。担がんマウスにおいてトポテカンの投与は樹状細胞とCD8陽性T細胞を介したがん免疫の誘導を促進した。これらの応答はDNA受容体であるcGASとその下流分子であるSTINGに依存しており、STING欠損マウスにおいてはトポテカンによる腫瘍の縮小は見られなかった。またトポテカンによりがん細胞から放出される免疫賦活化DNAはエクソソームに内包されており、このDNA内包エクソソームが樹状細胞に取り込まれることでSTING依存的ながん免疫応答が誘導されることが判明した。本研究では既知抗がん剤の新たな機能と新規がん標的分子の同定を目指す。これまで申請者は抗がん剤ライブラリーを用いたスクリーニングにより、抗がん剤Aががん細胞死だけではなく、がん細胞からの免疫賦活化DNAの放出を促進し、がん免疫を活性化することを明らかとした。抗がん剤AはDNA複製に関わる遺伝子Xを阻害することでがん細胞の増殖抑制と細胞死を誘導することが知られている。しかし遺伝子Xを阻害する他の薬剤では細胞死は誘導することができるが、免疫賦活化DNAの放出は確認できなかった。そのため抗がん剤Aは遺伝子X以外の未知の標的遺伝子に作用することでDNAを介したがん免疫の増強を行っていると考えられる。そこで申請者は抗がん剤Aの未知のターゲット遺伝子を同定することで免疫賦活化DNA産生のメカニズムを解明し、がんに対する免疫療法の開発にも貢献できると考えた。そこで申請者は抗がん剤A固定化FGビーズを用いることでその結合タンパク質を同定した。FGビーズはフェライト粒子の表面をスチレン等の高分子で被覆したナノサイズのビーズであり、化学反応を介してその表面に様々な薬剤を結合させることができる。先行論文では細胞抽出液とサリドマイドを固定化したFGビーズを混合し、FGビーズと共沈したタンパク質を質量分析により解析することで、サリドマイド結合タンパク質であるセレブロンを同定し、サリドマイドによる催奇形性のメカニズムが明らかとなっている。この結合タンパク質をコードする遺伝子をCas-CRISPR法を用いて欠損させ、候補遺伝子欠損細胞を作成した。現在はこの遺伝子がどのように免疫賦活化DNAの産生に関与するのかを解析中である。抗がん剤Aによる免疫賦活化DNAの産生には抗がん剤Aの未知の結合タンパク質が関与すると考えられる。そこで申請者は抗がん剤A固定化FGビーズを用いることでその結合タンパク質を同定できると考えた。そのため、まず抗がん剤A固定化FGビーズを用いることで抗がん剤Aの未知の標的タンパク質を同定し、次にその標的タンパク質を介した免疫賦活化DNAの産生とがん免疫に対する寄与を標的遺伝子欠損細胞株を用いて検証する予定である。既に上記の標的遺伝子の同定は完了しており、この遺伝子の欠損細胞も作成済みであるため、おおむね予定どおりに研究は進展している。これまで申請者は抗がん剤ライブラリーを用いたスクリーニングにより、トポイソメラーゼ阻害剤であるトポテカンががん細胞死だけではなく、がん細胞からの免疫賦活化DNAの放出を促進し、樹状細胞におけるがん免疫の活性化を誘導することを明らかとした。しかし、この免疫賦活化DNAの産生機構は不明であったため、本研究ではトポテカンによる免疫賦活化DNAを介したがん免疫の活性化機構の解明を行うことを目的とした。本研究の結果より、担がんマウスにおいてトポテカンの投与は樹状細胞とCD8陽性T細胞の活性化によるがん免疫の誘導を促進した。これらのがん免疫の活性化は細胞内DNA受容体であるcGASとその下流シグナル分子であるSTINGに依存しており、STING欠損マウスにおいてはトポテカンの投与による腫瘍の縮小は見られなかった。このトポテカンによるDNA内包エクソソームの放出はアポトーシスやネクロプトーシスなどに代表される既知の細胞死経路とは異なる未知の細胞死経路を介して誘導されていることが示唆されたが、残念ながらその未知の細胞死経路の解明までは本研究では達成できなかった。よって未知の細胞死経路とDNA内包エクソソームの放出の詳細については今後の研究から明らかにしていく予定である。これらの結果は抗がん剤処理したがん細胞由来DNAがSTING依存的ながん免疫を活性化させるアジュバントとしての機能を持つことを示唆する。

これらの応答はDNA受容体であるcGASとその下流分子であるSTINGに依存しており、STING欠損マウスにおいてはトポテカンによる腫瘍の縮小は見られなかった。またトポテカンによりがん細胞から放出される免疫賦活化DNAはエクソソームに内包されており、このDNA内包エクソソームが樹状細胞に取り込まれることでSTING依存的ながん免疫応答が誘導されることが判明した。樹立した抗がん剤A標的遺伝子欠損細胞に抗がん剤A処理を行い、回収した培養上清をマウス骨髄由来樹状細胞に添加し、サイトカインの発現をELISA法及びqPCRにより定量することで免疫賦活化DNAを介した自然免疫応答の活性化に対する抗がん剤A結合タンパク質の寄与を検証する。また自然免疫シグナルにおいて重要な役割を担うNF-kB, IRF3, p38 MAPK, ERK等のリン酸化をウェスタンブロット法により検出することで免疫賦活化DNAによる細胞内シグナルの変化も併せて検証する。次に抗がん剤A標的遺伝子の欠損細胞をC57BL/6マウスに同系移植し、抗がん剤Aを投与後、がんに浸潤するT細胞や樹状細胞をFACSにより解析する。その結果から抗がん剤Aの標的遺伝子による免疫賦活化DNAの産生誘導が細胞障害性T細胞の活性化や樹状細胞の成熟などのがん免疫の活性化に寄与するかをin vivoで評価する。28年度が最終年度であるため、記入しない。自然免疫28年度が最終年度であるため、記入しない。
ミセル動電クロマトグラフィーによる多環式芳香族炭化水素の分離・定量法の開発研究

キャピラリー電気泳動(CE)の一手法であるミセル動電クロマトグラフィー(Micellar Electrokinetic Chromatography,MEKC)は、電気的に中性な化合物をも電気泳動によって分離可能とし、電気泳動の対象試料範囲を飛躍的に拡大した分離分析法である。本研究では、従来MEKCでは分離困難とされてきた脂溶性物質の分析を行い、MEKCの応用範囲拡大を試みた。これまでの研究で、MEKC系に有機溶媒を添加することにより数種の脂溶性化合物が分離できることが明らかとなっており、ここでは有機溶媒添加系を中心にMEKCによる多環式芳香族炭化水素(PAH)の分離について最適条件を探った。1.予備検討の結果、硫酸ドデシルナトリウム(SDS)ミセル水溶液にジメチルスルホキシド(DMSO)またはアセトンを添加することにより、十数種のPAHが良好に分離できることが明かとなった。2.DMSO-SDS系およびアセトン-SDS系について、有機溶媒濃度・SDS濃度・pHなどが分離に及ぼす影響について検討した。アセトン系はDMSO系に比べ検出感度が高く、またより低い有機溶媒含量で良好な分離が達成されることが分かった。3.50mMSDS-50%(v/v)アセトン溶液を用いた場合、これまで分離が極めて困難であったo-terphenylとtriphenyleneについて良好な分離が達成された。4.SDS以外の界面活性剤として高分子量界面活性剤であるアクリル酸ブチル-メタクリル酸ブチル-メタクリル酸共重合体(BBMA)の使用について基礎的検討を行った。BBMAは一分子でミセルを形成するため有機溶媒含量を自由に調節できることが期待される。5.PAHの分析に対して非水系溶液を用いることが効果的であると考えられるので、CEにおける非水系溶液の利用について基礎的検討を行った。その結果、非水系ゾーンを水系緩衝液のゾーンで挟み込む部分注入法を用いることにより、脂溶性試料の分析が可能であることが明かとなった。
アポトーシス誘導遺伝子による悪性グリオーマ細胞に対するワクチン療法の開発

当初の研究計画にしたがってmyc遺伝子をグリオーマ細胞で高発現させる系にdifferential display PCR法を適用し、アポトーシスの過程で発現が変動する複数の遺伝子をクローニングした。このうちcalmodulinに着目し、悪性グリオーマ細胞のアポトーシスならびに免疫原性の賦活化にはcalciumを介したシグナル伝達系が関与しているとの仮説を立て、それを検証し、さらにその結果を糸口としてグリオーマに特異的な腫瘍抗原を同定することあるいはワクチン療法を開発することを最終目標とした。本研究期間中に最終目標までは到底至らなかったが、アポトーシスに関する以下のことが明らかになった。(1)これまでの報告の追試になるがcalcineurinの発現は脳あるいは神経系の細胞で高いこと(2)calcineurinの発現を高進させるとプロテアソームの活性が低下すること(3)種々の細胞でプロテアソームの活性を低下させるとアポトーシスが誘導されること(4)その結果としてcalcineurinの発現あるいは活性の高い細胞ではアポトーシスをおこしやすいことである。(2)(4)の結果はグリオーマ細胞等神経系の細胞に限らず種々の細胞に普遍的な現象と考えられるが、例えば海馬CAI細胞ではcalcineurinの発現が高いことがわかっているがこの海馬CAI細胞の一過性虚血による選択的な遅発性細胞死などはこれで説明できるかもしれない。グリオーマ細胞に特異的な腫瘍抗原の賦活化などはこのプロテアソームの機能に関与した現象である可能性が高く、今後解明していく予定である。当初の研究計画にしたがって、ヒトおよびラットグリオーマ細胞にs-mycおよびc-myc遺伝子を導入して発現させ、アポトーシスを誘導するモデルをもちいて、アポトーシスの誘導に先だって発現が変動してくる遺伝子の単離同定を試みた。以下に詳細を記す。前記のモデルにおいてアポトーシス誘導前後の状態の細胞からmRNAを調製し、differential display-PCR法を用いてそれらを増幅し、発現に変化のあるものを約100個選別し、それらを単離クローン化した。次にこれらクローン化したものをブローブとして用い、もとのRNAに対してNorthern hybridizationをおこなって、differential display上での発現変化と一致するか否かを確認した。その結果、かなりのものがNorthern hybridization上では発現変化が再現できず、再現できたものはわずか6クローンであった。これらのPCR産物(cDNA)についてすべて塩基配列決定をおこなったところ、これまでに報告されている遺伝子が3クローン、未知のものが3クローンであった。既知の遺伝子3クローンの内訳は、mitochondrial cytochrome c oxidase,calmodulin,phosphatidyl inositol triphosphate transfer proteinであった。これらが、直接、アポトーシスあるいは免疫原性の変化に関与しているのか否かについては今後検討していく予定であり、また、未知の3クローンについてもopen reading frame全長を含むcDNAを単離して、その塩基配列を決定した後、アポトーシスあるいは免疫原性との関連について検討する予定でいる。当初の研究計画にしたがって、ヒトおよびラットグリオーマ細胞にs-mycおよびc-myc遺伝子を導入して発現させ、アポトーシスを誘導する系においてそのシグナル伝達にcalmodulinあるいはcalcineurinが関与するか否かを確認し、さらに、その分子機序を明らかにすることを本年度の計画目標とした。以下に得られた結果の詳細を記す。calcineurinの阻害剤であるcyclosporin A(CsA)を用いるとこの系におけるアポトーシスが抑制された。また、この際、近年アポトーシス遂行の中心的役割を果たしていると考えられているcysteine proteaseの一つであるCPP32の活性化も抑制された。さらに、CsAはこの系のみならず、他の複数の神経系細胞の異なる複数のアポトーシスの系においても同様にアポトーシス、CPP32の活性化を抑制したが、リンパ球系その他の細胞では無効であった。このことよりCsAのアポトーシス抑制効果が神経系細胞に特異的であることが示唆された。

次に、calcineurinの脱リン酸化活性は通常状態のグリオーマ細胞中で、あるレベル存在し、アポトーシスの経過中では殆ど変化しなかった。calcineurinのcDNAをグリオーマ細胞に遺伝子導入したトランスフェクタントでcalcineurinを強制発現させると、CPP32の活性が高くなり、また、CPP32の発現(mRNA)そのものも亢進してくることが明らかとなり、CPP32の転写がcalcineurinにより直接的あるいは間接的に制御されていることが示された。今後さらにこれらの制御機序を明らかにする予定である。当初の研究計画にしたがってmyc遺伝子をグリオーマ細胞で高発現させる系にdifferential display PCR法を適用し、アポトーシスの過程で発現が変動する複数の遺伝子をクローニングした。このうちcalmodulinに着目し、悪性グリオーマ細胞のアポトーシスならびに免疫原性の賦活化にはcalciumを介したシグナル伝達系が関与しているとの仮説を立て、それを検証し、さらにその結果を糸口としてグリオーマに特異的な腫瘍抗原を同定することあるいはワクチン療法を開発することを最終目標とした。本研究期間中に最終目標までは到底至らなかったが、アポトーシスに関する以下のことが明らかになった。(1)これまでの報告の追試になるがcalcineurinの発現は脳あるいは神経系の細胞で高いこと(2)calcineurinの発現を高進させるとプロテアソームの活性が低下すること(3)種々の細胞でプロテアソームの活性を低下させるとアポトーシスが誘導されること(4)その結果としてcalcineurinの発現あるいは活性の高い細胞ではアポトーシスをおこしやすいことである。(2)(4)の結果はグリオーマ細胞等神経系の細胞に限らず種々の細胞に普遍的な現象と考えられるが、例えば海馬CAl細胞ではcalcineurinの発現が高いことがわかっているがこの海馬CAl細胞の一過性虚血による選択的な遅発性細胞死などはこれで説明できるかもしれない。グリオーマ細胞に特異的な腫瘍抗原の賦活化などはこのプロテアソームの機能に関与した現象である可能性が高く、今後解明していく予定である。
DDS基盤技術を駆使した新規粘膜ワクチン戦略の構築

膜融合リポソーム(FL)は、本来気道粘膜に吸着・感染するセンダイウイルス(HVJ)の細胞膜付着・融合能のみをリポソームに付与したものであり、機能面で細胞膜結合・融合能を有した安全なバイオ・ナノキヤリアである。このFLの細胞質内物質導入ベクターとしての有用性・安全性をin vitro、in vivoにおいて今年度まで継続的評価を行ってきた。その結果、FLは殆ど全ての細胞に対して、細胞傷害性を示す事なく、リポソーム内に封入可能であれば、分子(抗原蛋白質・遺伝子)・粒子(機能性ナノ粒子)といった形状やその物理化学的性質に依存する事なく、如何なる物質をも効率よく細胞質内へ、一挙かつ直接導入出来る事を見い出した。即ちFLは、1)細胞内への物質導入に非効率なエンドサイトーシス経路を介する陽電荷リポソーム等の、従来までの細胞内物質導入キャリアよりも細胞内への物質(遺伝子・蛋白質等)導入効率や安全性の点ではるかに優れている。2)粘膜付着性を有する、3)HVJは元々ヒトに対して病原性を示さないうえ、事前に紫外線照射等によりHVJ自身のゲノムRNA遺伝子を完全に断片化しておく為、ウイルスベクターとは異なり安全性が高度に保証されている、4)内封された蛋白質や遺伝子に高い生体内安定性(プロテアーゼ回避能)を付与できるといった、粘膜ワクチン用の抗原デリバリー型アジュバントとして好都合な特性を有する事を明らかとした。以上の基盤的研究成果をもとに、粘膜ワクチン用のアジュバントとしてFLの有用性を経鼻投与により評価したところ、内封したOVA等のモデル抗原を効率よく鼻腔組織の上皮細胞やMac-1陽性細胞、NALTのM細胞に送達出来る事、その結果基礎的重要情報として、in vivo鼻腔粘膜面において強い抗原特異的IgAを誘導し、かつ全身系で十分な抗原特異的IgGをも誘導し得る事等を、当初計画通り見いだした。