hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
疾患モデルマウスを用いた狭窄性腱鞘炎の病態解析

狭窄性腱鞘炎は一般に更年期や周産期の女性、糖尿病患者に発症する事が多い疾患であるが、その発症機序は未だ不明である。我々は老化モデルマウスと糖尿病モデルマウスを用いて、狭窄性腱鞘炎の病態解明を試みた。遺伝子発現解析の結果、老化モデルマウスにおいては滑膜内腱における腱関連マーカーの発現が加齢とともに減少しており、逆に軟骨関連マーカーの発現が高くなっていた。一方、糖尿病モデルマウスにおいては、明らかな変化を検出することはできなかった。本研究により得られた結果は、加齢に伴い潜在的に進行する腱組織から軟骨組織への遺伝子発現レベルでのシフトが腱鞘炎発症の原因の一つとなっている事を示唆するものであった。平成25年度は24年度に引き続き,老化モデルマウス(SAMP6マウス)および糖尿病モデルマウス(db/dbマウス)における腱とその周辺組織の組織学的解析と腱組織における遺伝子発現解析を行った.8, 16, 24週齢のSAMP6マウス各10匹の後肢第24趾より長趾屈筋腱を採取,リアルタイムRCRにより各種マーカーとLubricinの発現を定量し,コントロールマウスと比較した.その結果,SAMP6マウス,コントロールマウスともに腱細胞のマーカーであるTenomodulinと腱の主要基質であるCOL1A2の発現が24週齢で有意に低下し,逆に軟骨細胞のマーカーであるSOX9,Aggrecanの発現が有意に増加していた.特に,Tenomodulin, SOX9,Aggrecanについては,コントロールマウスと比べSAMP6マウスにおいてその傾向が強かった.また,腱の滑走抵抗を減少させる働きのあるLubricinについては,SAMP6マウスにおいて24週齢で有意に発現が低下し,コントロールマウスでは逆に増加していた.以上の結果は,Lubricinノックアウトマウスを用いた先行実験の結果や,弾発指患者の腱鞘と屈筋腱に軟骨化生を認めたとする過去の報告と一致していた.また,db/dbマウスについては,現在同様の方法で遺伝子発現解析を行っている.SAMP6マウスを用いた遺伝子発現解析の結果,発現の変化が大きかったTenomodulinとAggrecanについては,引き続き免疫組織学的に解析を行った.その結果,蛋白レベルでは両者の発現に加齢に伴う明らかな変化は確認されなかった.しかし,いずれのマウスの腱組織内においてもTenomodulinとAggrecanの両方の抗体で同時に染まる細胞とTenomodulinの抗体のみで染まる細胞の少なくとも2種類が存在することが確認された.また,Alcian Blue染色を行ったところ,軟骨細胞様の比較的大きな細胞は主に屈筋腱の背側と周辺に局在し,中心部分には比較的小さな腱細胞と思われる細胞が局在していることが確認された.狭窄性腱鞘炎は一般に更年期や周産期の女性、糖尿病患者に発症する事が多い疾患であるが、その発症機序は未だ不明である。平成24年度は,糖尿病および老化モデルマウスにおける腱とその周辺組織の組織学的解析と腱組織における各種マーカーの定量を行った.15週齢の糖尿病モデルマウス(db/dbマウス),および8週齢の老化モデルマウス(SAMP6マウス)の後肢の横断面の標本を作成.HE染色にて腱およびその周辺組織を観察し,それぞれのコントロールマウスと比較した.しかし,どちらのモデルマウスにおいても,明らかな組織学的な変化は確認できなかったため,糖尿病モデルマウスマウスについては20週齢,老化モデルマウスについては12,16週齢を追加し同様の観察を行ったところ,これらについても明らかな組織学的な変化は認められなかった.当初は本実験に引き続き免疫染色を行う予定であったが,いずれのモデルマウスにおいても明らかな組織学的変化が認められなかったため,平成25年度以降に行う予定であった遺伝子発現解析を先行させ,同解析により変化が認められた遺伝子について再度組織学的に解析を行うという方針に変更した.15,20週齢のdb/dbマウス各10匹.8,12,16週齢のSAMP6マウス各10匹の後肢第24趾より長趾屈筋腱を採取,リアルタイムRCRにより各種マーカーとルブリシンの発現を定量し,コントロールマウスと比較した.その結果,16週齢のSAMP6において腱細胞のマーカーであるTenomodulinが有意に増加している事が確認された.また,Tenomodulinは血管新生の抑制因子である事から,血管新生を促進する増殖因子であるVEGFや血管内皮細胞のマーカーであるCD31についても定量を行ったところ,逆に有意に低下している事が判明した.ルブリシンについては現在解析中であるが,予備実験においては,腱組織自体からの発現は既に確認されている.平成26年度は前年度に引き続き老化モデルマウス(SAMP6マウス)における滑膜内腱の組織学的解析を行うとともに,糖尿病モデルマウス(db/dbマウス)における滑膜内腱の組織学的解析および遺伝子発現解析を行った.

老化モデルマウスについては,これまでの遺伝子発現解析の結果,発現の変化が大きかったTenomodulinとAggrecanについて,さらに検体数を増やし免疫組織学的に解析を行った.その結果Tenomodulinは週齢数の高いSAMP6において蛋白レベルでの発現が減少しており,特にエンドテノンにおいてその変化が著明であった.またAggrecanは両マウスとも加齢に伴いエンドテノンにおける発現量が減少し,逆に腱の背側部分ではわずかに増加傾向を認めた.さらに二重染色による腱内部の細胞局在の解析も試みたが,十分な至適条件が得られず,評価可能な結果を得ることができなかった.またLubricinの発現低下が確認されたSAMP6の腱組織内におけるアポトーシスの発生についての解析では,コントロールとの比較において明らかな差を認めなかった.老化モデルマウスを用いてこれまでに得られた研究結果は,Lubricinノックアウトマウスを用いた先行研究の結果や,腱鞘炎患者の腱鞘と屈筋腱に軟骨化生を認めたとする過去の報告と一致しており,加齢に伴い潜在的に進行する腱組織から軟骨組織への遺伝子発現レベルでのシフトが腱鞘炎発症の原因の一つとなっている事を示唆するものであった.本研究により得られた結果は現在英論文としてまとめ,国際学術雑誌に投稿するための準備を行っている.一方,糖尿病モデルマウスについても,15, 20週齢のdb/dbマウスを用いて,老化モデルマウスと同様のプロトコールで解析を行った.しかし,組織学的解析,遺伝子発現解析いずれにおいても腱鞘炎発症に結びつくような明らかな変化を検出することはできなかった.整形外科遺伝子発現解析については,マウスの長趾屈筋腱からのRNA抽出とリアルタイムPCRの条件の最適化にかなりの時間を要してしまったが,最終的には信頼性の高いデータが得られるようになった.組織学的解析では,現時点で加齢に伴う明らかな変化は観察されていない.しかし,観察を行った標本数が少ないことから,今後さらに検体数や切片の枚数を増やし,より詳細に検討する必要がある.また,これまでの実験から屈筋腱組織内に少なくとも蛋白の発現パターンが異なる2種類の細胞が存在する可能性が示されており,この結果についても二重染色などを用いて,さらに詳細に調べる必要がある.またLubricinについても組織学的に発現量と局在を調べるための予備実験を行ってきたが,未だLubricinに対する最適な抗体が見つかっておらず,今後実験方法についての検討が必要である.db/dbマウスについては,マウスの死亡などによりSAMP6マウスと比較して全体的に実験が遅れてしまったが,遺伝子発現解析から組織学的解析までの実験系はSAMP6マウスの実験で既に確立されているため,引き続き同様の方法で実験を継続する予定である.当初は組織学的解析の結果を基に変化を認めた組織の特異的マーカーに対する免疫染色を行い,組織の性状をさらに詳細に調べる予定であったが,いずれのモデルマウスにおいてもルブリシンノックアウトマウスで観察されたような変化が認められなかったため,変化が最も予想される屈筋腱の遺伝子発現解析を優先的に行い,そこで変化を認めた遺伝子に対して改めて組織内での発現の状態や発現部位について解析を行うという方針に変更した.そのため免疫組織化学的手法による組織の解析については,予定より遅れた形となってしまった.
乳腺浸潤性微小乳頭癌の特徴的な浸潤転移機構の解明

乳腺の浸潤性微小乳頭癌は間質の裂隙中に偽乳頭状あるいは微小乳頭状構造を示す癌細胞の胞巣がみられる腫瘍である。通常型の浸潤性乳管癌に比してリンパ管侵襲の頻度,リンパ節転移の頻度が高いことが知られている。今回はあらかじめDNAマイクロアレイデータで得られた情報をもとに免疫染色的検討を行った。C21orf118(BC-1514)は浸潤性微小乳頭癌での発現が高く、CD1D,PJA2は、微小乳頭癌のほうが通常型の浸潤癌より発現が低かった。CD1Dは静脈侵襲(p=0.002),リンパ節転移(p=0.047)と負の相関を示した。CD1Dはリンパ節転移に対して抑制的に働いている可能性があるものと考えられた。川崎医科大学で2009年6月から2010年12月までに手術が施行された浸潤性乳癌症例のうち、微小浸潤癌を除いた連続症例231例(11例の浸潤性微小乳頭癌を含む)および、その後の64例の浸潤性微小乳頭癌の計294例を用いて行った。代表的なパラフィンブロックを抽出し、組織マイクロアレイを作成した。免疫染色は、Santa Cruz社の2種類の抗BC-1514ポリクローナル抗体(C-15及びW-12)を用いて施行した。免疫染色結果は面積と染色強度の積をスコアとして検討した。C-15では、浸潤性微小乳頭癌での発現(218.77±64.87、中央値200)が通常型浸潤癌(139.41±67.45、中央値180)より有意に高かった(p<0.0001)。また、W-12でも浸潤性微小乳頭癌での発現(242.84±58.32、中央値200)が通常型浸潤癌(211.43±75.59、中央値200)より有意に高かった(p<0.0001)。C-15発現は、pT因子、術後ステージ、組織学的異型度、脈管侵襲、ホルモン受容体、HER2、Ki-67、予後とは有意差がなかったが、W-12ではpT(p=0.0153)、組織学的異型度(p=0.0005)、HER2(p=0.0234)、Ki-67(p=0.0185)と各々、正の相関があり有意差がみられた。2009年から2010年までに手術が施行された浸潤性乳癌症例のうち,微小浸潤癌を除いた231例(11例の浸潤性微小乳頭癌を含む)および,その後に手術が施行された浸潤性微小乳頭癌64例の合計294例を用いた。組織マイクロアレイを構築して免疫染色を施行した。BC-1514C15抗体では,浸潤性微小乳頭癌での発現(218.77±64.87,中央値200)が,他の浸潤癌(139.41±67.45,中央値180)より有意に高かった(p<0.001)。また,BC-1514W12抗体でも浸潤性微小乳頭癌が,他の浸潤癌より有意に高かった(P<0.001)。CD1Dは,浸潤性微小乳頭癌での発現が,他の浸潤癌より有意に低かった(p<0.001)。PJA2は,浸潤性微小乳頭癌での発現が,他の浸潤癌より有意に低かった(p=0.002)。これらは,マイクロアレイデータに合致する結果であったが,一方で,CaMK2N2,RPJ5,SAM13,TCF4,TXNIPは微小浸潤癌と他の組織型で差がないか,あるいはマイクロアレイデータと矛盾する結果であった。BC-1514は,無再発生存率において有意な相関を示し(C15 P=0.034,W12 P=0.024),全生存率においても有意であった(C15 P=0.007,W12 P=0.001)(Cox単変量解析)。CD1DとTXNIPは各生存率との有意な相関はみられなかった。BC-1514W12は,pT(p=0.0153),組織学的異型度(p=0.0005),HER2(p=0.0234),Ki-67(p=0.0185)と各々,正の相関があり有意差がみられた。

CD1Dはリンパ節転移に対して抑制的に働いている可能性があるものと考えられた。BC-1514については2種類の抗体を用いて、294例の臨床症例でのケースコントロール研究を施行することができ、各種の臨床病理学的因子との比較もできた。予定していた他のマーカー(CaMK2N1, RPL5, PJA2, CD1D, TXNIP, SAMD13, TCF4)での免疫染色についても一次スクリーニングは終了している。乳腺病理他のマーカー(CaMK2N1, RPL5, PJA2, CD1D, TXNIP, SAMD13, TCF4)での免疫染色は、今の所、各種の臨床病理学的因子との関連が見いだせていないが、予後情報を含めた検討を続ける。また、ケースコントロールではなく、連続症例でのコホートでの検討も予定している。市販抗体を用いた免疫染色はいずれも比較的容易に染色条件最適化が可能であった。また,ポリクローナル抗体の作製も全て完了することができ,これらについての免疫染色の条件設定もすることができた。臨床症例(連続する浸潤性乳癌症例230例)での組織マイクロアレイを作製し,免疫染色を施行した。免疫染色用の抗体などにかかる費用が予定より安価に施行可能であったため。染色が完了した症例群についての詳細なデータ分析をまず施行する。ただし,今回のコホート研究の症例群には浸潤性微小乳頭癌が5例しか含まれていないため,統計学的検索については不十分な可能性がある。そのため,必要に応じて,浸潤性微小乳頭症例を追加し,症例対照研究の形で研究をすすめるつもりである。薄切標本作製、免疫染色抗体・試薬の購入および論文の添削費用などを予定している。共同研究者の山口博士担当分の症例の染色にかかる費用は予定より低い金額で可能であったため。薄切標本作製や免疫染色抗体・試薬の購入にあてる予定。
視覚情報の時間知覚への影響を利用した脳内時間情報処理の解明と映像メディアへの応用

本年度の研究から、映像内容の文脈的な変化によってその前後の時間知覚が変化することが明らかになった。実験では,日常環境の映像を呈示する間に,別の刺激を瞬間呈示(フラッシュ)した。その結果,映像中の文脈的な場面転換の境界の前後に呈示したフラッシュは,文脈的な分節場面に同期して知覚されることが明らかになった。音声言語の先行研究では,短い音刺激をスピーチに挿入すると,音刺激がスピーチの言語的分節に同期して知覚されることが報告され,その特性から,音声が分節的に知覚されていると考えられている。フラッシュの分節同期効果は,こうした音声言語の聴覚特性と同じ性質の視覚特性であり,映像が音声と同様に分節的に知覚されていると示唆された。一方,文脈の分節的な知覚は,逆再生映像などの不自然な映像変化や,未学習の映像変化に対しては見られなかった。このことから,映像の分節的な知覚は,内容の学習や経験による理解を反映していると考えられる。本研究成果は、国際学術雑誌に原著論文として掲載された。さらに,映像中の各場面の認知について研究を行った。その結果,新規の映像の文脈的な分節の境界場面では,場面の知覚精度に有意な変化はないが記憶精度が特異的に向上することがわかった。一方,既知の映像の分節境界場面では知覚精度が特異的に向上し,記憶精度に影響は見られなかった。このことから,映像内容の学習過程には,分節境界場面の記憶が関係し,映像構造の分節的な記憶を用いて,既知の映像の文脈を予測的に分節化して知覚しているという,映像の時間的変化とその学習過程の認知モデルを提案した。視覚情報が時間の知覚に与える影響の解明を目指し、これまで我々は、物体の運動する映像中におこる視覚的な変化が他の視覚的なイベントの時間知覚に影響を及ぼすかを調べてきた。その結果、視覚的な変化(色の変化)が予測できないタイミングで起こった場合、他の視覚イベント(フラッシュ)の時間知覚を歪めることを示した。すなわち、予測不可能なタイミングで起こった視覚的な変化の前後で起こる別の視覚的なイベントは、視覚的な変化のタイミングに引き付けられて知覚される。同様の時間知覚の圧縮現象は、視覚と聴覚のmodality間において報告されている(Fendrich&Corballis,2001)。さらに、サッケード眼球運動の報告では、サッケードの直前に提示された視覚刺激の時間知覚には影響を及ぼすが、聴覚刺激(クリック音)の時間知覚には影響を与えない、すなわち、時間あ圧縮が視覚とサッケードに特異的に起こることが報告されている(Morrone et al.,2005)。このことから、我々の示した時間知覚の引き込み効果がcrossmodalで起こるかを確認することは、先行研究との関連を考察する上で重要な課題であった。そこで、新たに視覚刺激(フラッシュ)の代わりに聴覚刺激(短い音)を用いることで、聴覚刺激の時間知覚が視覚的な色の変化に引き付けられるかどうか検証した。実験の結果から、予測不可能なタイミングで起こる映像の視覚的変化に、音刺激が引き付けられて知覚されることが示された。従って、聴覚刺激でも、視覚刺激同様、映像の変化に対する時間的引き込みが起こると考えられる。本年度の研究結果によって、時間知覚の引き込み効果は、サッケード研究における時間の圧縮現象と異なり、視覚情報が時間情報処理に与える影響を反映している可能性が示された。これまで我々は、視覚情報が時間の知覚に与える影響の解明を目指し、単純な図形を用いた映像を用いて、映像中におこる視覚的な変化が他の視覚的なイベントの時間知覚に影響を及ぼすかを調べてきた。その結果、視覚的な変化が予測できないタイミングで起こった場合、その前後に呈示されるフラッシュの時間知覚が視覚的変化に引きつけられることがわかった。そこで、この"時間的引き込み効果"を、時間情報処理に関する先行研究と比較検討し、発見した現象が生じる要因および機序の明確化を目指した。本年度の研究から、時間的引き込み効果は、映像中の文脈的な変化によっても起こることが明らかになった。実験では、より日常生活に近い動画を用いて、映像中の文脈的な変化の前後にフラッシュを呈示した。その結果、映像中の意味的な変化においても時間的引き込み効果が生じることが明らかになった。また、逆再生映像などの不自然な(あるいは未経験な)映像変化に対しては、この効果が見られないことがわかった。本研究結果は、国際学術雑誌への論文掲載が決定している。加えて、本年度は、映像中の視覚的変化の時点で、その場面情報の記憶が促進されることを発見した。これは、突発的なイベントを知覚すると、その場面は、スナップショットのように、自動的に、より正確に記憶されることを示唆する。こうした本年度の研究成果は、2つの論文として投稿され、一本はすでに掲載が決まっている。さらに、新たな現象の発見によって優秀発表賞を受賞している。

音声言語の先行研究では,短い音刺激をスピーチに挿入すると,音刺激がスピーチの言語的分節に同期して知覚されることが報告され,その特性から,音声が分節的に知覚されていると考えられている。フラッシュの分節同期効果は,こうした音声言語の聴覚特性と同じ性質の視覚特性であり,映像が音声と同様に分節的に知覚されていると示唆された。一方,文脈の分節的な知覚は,逆再生映像などの不自然な映像変化や,未学習の映像変化に対しては見られなかった。このことから,映像の分節的な知覚は,内容の学習や経験による理解を反映していると考えられる。本研究成果は、国際学術雑誌に原著論文として掲載された。さらに,映像中の各場面の認知について研究を行った。その結果,新規の映像の文脈的な分節の境界場面では,場面の知覚精度に有意な変化はないが記憶精度が特異的に向上することがわかった。一方,既知の映像の分節境界場面では知覚精度が特異的に向上し,記憶精度に影響は見られなかった。このことから,映像内容の学習過程には,分節境界場面の記憶が関係し,映像構造の分節的な記憶を用いて,既知の映像の文脈を予測的に分節化して知覚しているという,映像の時間的変化とその学習過程の認知モデルを提案した。
メタボリック症候群・生活習慣病のバイオマーカーとしてのオゾン酸化コレステロール

コレステロール脂肪酸エステルのオゾン酸化物として、新規にエステル型セコステロール-A類とそれらのアルドール化により生成するセコステロール-B誘導体を同定した。さらに、LC-/MS法を用いる高感度分析法を用いて、健康なヒト血液から調製したLDLコレステロール中に微量のエステル型セコステロール類を検出した。この分析法をさらに改良し、生体試料中に存在するすべてのアルデヒド化合物を網羅的に分析する方法を開発した。現在、この方法を用いて、セコステロール類を含むアルデヒド化合物が酸化ストレスに関連する生活習慣病(動脈硬化症、神経変性症、がんなど)の発症において演じている役割について検討を行っている。コレステロール脂肪酸エステル(CE)のパルミチン酸コレステロール(C16:0-CE)などの飽和脂肪酸CEをオゾン酸化すると、ステロイド骨格の5,6位の2重結合が開裂したエステル型secosterol類が生成することを見出した。一方、リノール酸コレステロール(C18:2-CE)及びオレイン酸コレステロール(C18:1-CE)からは、既に報告されている9-oxononanoyl cholesterolに加えて、新規に9-oxononanoate secosterol-Aとそのアルドール化により生成する9-oxononanoate secosterol-Bの生成されることを見出した。次に、これらCE酸化物をLC-ESI-MS/MSを用いて分析する方法を確立し、健康なヒト血液(n=6)から調製したLDL分析に応用した。エステル型secosterol-A及びBは、全試料から、1020pmol/DLmg protein(遊離型secosterol類の1/21/5の濃度)検出された。また、これらエステル型secosterol類は、エステル型でないsecosterol類と同様に、強い細胞毒性の活性を有することを見出した(Free Radic. Biol. Med. 60,73-79,2013)。一方、コレステロールのオゾン酸化で生成するsecosterol-Aを、子牛血清を含む細胞培養液に添加すると、速やかに、アルドール化されてsecosterol-Bに変化することを見出した。このアルドール化を促進させる血清成分について検討したところ、血清中に存在している遊離アミノ酸、特に、システインに強いアルドール化促進能を見出し、システインによるsecosterol-Aのsecosterol-Bへのアルドール化促進の分機構を新たに提唱した。コレステロールのオゾン酸化物であるsecosterol-Aとそのアルドール化により生成するsecosterol-Bは、ヒトの動脈硬化プラ-クや認知症の脳組織において、その存在量が増加することが報告されている。これらのsecosterol類は、強い細胞毒性を示すことから、動脈硬化や神経変性症などの発症において重要な役割を演じているものと考えられている。また、secosterol類は、タンパク質と共有結合して付加体を生成し、タンパク質の凝集、異常な折り畳み、線維化などを誘導し、タンパク質を変性させることが報告されている。そこで、本年度は、secosterol類により変性する細胞タンパク質の同定を試みた。ヒト白血病細胞HL-60から作製した細胞抽出物に、secosterol-Aおよび-B、あるいはその他の過酸化脂質由来のアルデヒド(4-hydroxynonenal, malondialdehyde, acrolein)を添加し反応させた。不溶化したタンパク質は、SDS-PAGEで分離し、さらにプロテオミクスの方法を用いてMALDI-TOF-MSで分析した。その結果、secosterol類を反応させた時に特異的に不溶化するタンパク質の一つとして、ankyrin repeat domain-containing protein 6 (diversin)を同定した。このタンパク質diversinは、Wntシグナル経路を抑制的に調節していることで知られている。従って、secosterol類によるdiversinの変性は、発がんの促進や脳における新生ニューロンの産性阻害などの影響を及ぼす可能性がある。コレステロールのオゾン酸化物であるsecosterol-Aとそのアルドール化により生成するsecosterol-Bは、強い細胞毒性を示し、慢性炎症などの強い酸化ストレス下でその存在量が著しく増加することが知られている。同様に、酸化ストレス下で高濃度に生成する活性酸素・窒素種は不飽和脂肪酸やアミノ酸を酸化し、多種多様なアルデヒド類を生成する。これらのアルデヒド類は、生体成分であるタンパク質・核酸と反応して付加体を生成し、タンパク質の機能不全を誘発し、また核酸付加体は修復されないと突然変異の原因となることから、酸化ストレスに関連する生活習慣病(動脈硬化症、神経変性症、がんなど)の発症において重要な役割を演じているものと考えられる。そこで、secosterol類のHPLC-MSによる分析法をさらに改良し、生体内に存在するすべてのアルデヒド・カルボニル化合物を網羅的に分析する方法を開発した。続いて、ヒト血漿中に存在するアルデヒド類の種類・濃度と大腸がん発症との関連について検討するため、開発した方法を用いて、正常及び肥満体重の健常者及び大腸がん患者の血漿(合計約40試料)についてアルデヒド類の網羅的分析を行った。現在結果を解析中である。

一方、多層カーボンナノチューブは、環境発がん物質であるアスベストと同様に、肺に吸入されると、肺内で慢性炎症を引き起こし、肺がん、中皮腫などの悪性腫瘍を引き起こす可能性が危惧されている。そこで、多層カーボンナノチューブを肺内投与したラット肺試料について、カルボニル化合物を網羅的に分析解析した。カルボニル化合物の投与により、未知のアルデヒドを含めて、多くのアルデヒドが肺内において生成・存在することが明らかになった。26年度が最終年度であるため、記入しない。総合領域26年度が最終年度であるため、記入しない。コレステロールのオゾン酸化で生成するsecosterol-Aを、子牛血清を含む細胞培養液に添加すると、速やかに、アルドール化されてsecosterol-Bに変化することを見出した。このアルドール化を促進させる血清成分について検討したところ、血清中に存在している遊離アミノ酸、特に、システインに強いアルドール化促進能を見出し、システインによるアルドール化促進の分機構を新たに提唱した。現在投稿準備中である。secosterol類により変性する細胞タンパク質として、ankyrin repeat domain-containing protein 6 (diversin)と同定した。このタンパク質diversinは、Wntシグナル経路を抑制的に調節していることで知られており、secosterol類によるdiversinの変性は、発がんの促進や脳における新生ニューロンの産性阻害などの影響を及ぼす可能性がある。遊離型及び脂肪酸エステル型のsecosterol-Aとそのアルドール化により生成するsecosterol-Bを認識する抗体の作成、それを用いる分析法の開発、生体試料における存在量と疾患との関連などについて検討していく。今年度は、最終年度であり、secosterol類の生体試料(血清など)中の存在量と疾患との関連について検討していく。疾患としては、現在、我が国において約1000万人存在すると推定されている非アルコール性脂肪肝疾患に注目し、単純性脂肪肝および非アルコール性肝炎(NASH)患者からの生体試料(血清など)について分析を進めて行く。また、必要に応じて、NASHの動物モデル由来の生体試料についても分析を行う。平成24年度については、学会参加を限定したこと等により、全体として余剰が生じた。次年度使用額は、上記研究のため、試薬等を購入する予定である。培養細胞を用いた解析を優先させた結果、未使用額が生じた。
狭義加齢黄斑変性症とポリープ状脈絡膜血管症におけるブルッフ膜構成分子遺伝子多型

日本人の加齢黄斑変性(AMD)の感受性遺伝子に関する研究を行い、ARMS2/HTRA1、CFH、CFI、RDBP、SKIV2L、CD36などの遺伝子多型と狭義AMDあるいはポリープ状脈絡膜血管症(PCV)との間の関連性を証明した。また、エラスチン遺伝子多型においては狭義AMDとPCV間で関連性が異なることを発見した。さらに、光線力学療法(PDT)の治療効果とAMDの表現型や遺伝子多型との関連を調べ、PDTの効果とAMDの病型やARMS2/HTRA1、CFHの遺伝子多型間に有意な関連性があることを証明した。1.狭義加齢黄斑変性症(AMD)116例、ポリープ状脈絡膜血管症(PCV)136例、および正常対照者183名についてDMの抽出を行ない、遺伝子多型の解析を行った。2.まず、ブルッフ膜の主要構成分子であるエラスチン遺伝子の各領域の一塩基多型におけるアレル頻度を同定し、統計解析にかけた所、rs2301995のホモリスクアレル保有が対照群に対してPCVの感受性を7.56倍上昇させることが明らかになった。また、ハプロタイプ解析において対照群とPCV群間に有意な相違が見られた(オッズ比2.06倍)が、対照群とAMD群間には有意差が見られなかった。PCVに特異的は遺伝子多型が同定されたのはこれが世界初である。3.次に血管新生や炎症に抑制的な働きをするCD36の遺伝子多型を調べ、rs3173798とrs3211883におけるマイナーアレル頻度がちもAMDと対照群で有意に違うことを発見した。4.さらに欧米人でAMDとの関連が示唆されるものの、日本人ではその閲連が明らかでなかった補体H因子において、特に162V多型が日本人に特に多いとされているPCVと強い関連を持っていることを見出した。5.このような遺伝子多型が表現型の発現に関与し、その疾患特有の感受性(リスク)を規定していることが明らかになれば、それは診断においてHLAタイピングのように裏付けデータとしての活用ができるほかに、各種の治療に対する反応性を事前に予測できる可能性を持っている。1.狭義加齢黄斑変性症(AMD)116例、ポリープ状脈絡膜血管症(PCV)140例、および正常対照者189名についてDNAの抽出を行ない、遺伝子多型の解析を行った。2.最近、欧米において組織適合性複合体クラスIII領域に存在するcomplement factor B(CFB)およびcompliment component 2(C2)の遺伝子多型がAMD(欧米人では殆どを狭義AMDが占める)の疾患感受性に関与しているとの報告がなされた。しかし、その後行われたアジア人に多い(日本人に特に多い)病型であるPCVを対象とする追試ではこの関連性を認めなかった。ただ、この際に選択された個々の一塩基多型(SNP)はアジア人におけるマイナーアレル頻度が非常に低いことから、関連性の検出力に限界があった可能性を考慮し、我々は同領域におけるハプロタイプ解析を行った。その結果、ある7つのSNPのハプロタイプがPCVの疾患感受性と有意に相関することが明らかとなった。しかしながら、ハプロタイプ中の単一SNPとPCVの疾患感受性に有意なものが見つからなかったため、同領域を超えた遺伝子座に検索範囲を広げて解析を行った。その結果、C2やCFBよりも下流の遺伝子座に存在するRDBPのイントロン(rs3880457)およびSKIV2Lの3'-UTR領域(rs2075702)の遺伝子多型が有意にPCVの疾患感受性に対して保護的に関与していることを見出した。3.また血管新生に抑制的な働きをするPEDFの遺伝子多型の中で最近アジア人のAMDとの関連が報告されたMet72Thr多型を我々のPCVサンプルを用いて関連性を調べた。しかし、有意な関連性はみられなかった。4.さらに日本人AMDとの関連性が報告されたSOD遺伝子におけるV16A多型に関してPCVとの関連性を調べたが、有意な結果は得られなかった。1.狭義加齢黄斑変性症(AMD)139例、ポリープ状脈絡膜血管症(PCV)210例、および正常対照者189名についてDNAの抽出を行ない、遺伝子多型の解析を行った。2.欧米のAMDに強く関連しているとされる補体H因子complement factor H (CFH)のY402H多型について、この一塩基多型(SNP)はアジア人におけるマイナーアレル頻度が非常に低いことから関連性の検出力に限界があったが、我々はアジア人AMDのマス解析を行い、その結果、Y402H多型がアジア人AMDの疾患感受性にも有意に相関することを明らかにした。3.また、CFHY402H多型およびrsl410996多型がPCVに対する光線力学療法(PDT)の解剖学的改善効果に有意に影響を及ぼすことを明らかにした。

特にrs1410996多型はPDT後の視力予後とも相関していた。4.さらにCFHと並んでAMDの感受性遺伝子として注目されるARMS2遺伝子のrs10490924(A69S)多型が狭義AMDおよびPCVに対するPDT後の視力予後に有意に関連することを見出した。5.上記以外に欧米のAMDとの関連性が報告されたCFI遺伝子におけるrs10033900多型が日本人AMDとの関連もあることを証明した。6.日本人PCVの自然経過における視力予後、およびそれに関連する眼底所見を統計学的に解析した。この研究は、今後PCVに対するいかなる治療効果とも比較できる元になるデータをまとめるという重要なものと考える。
上気道粘液の産生機序とその物性と組成に関する研究

本研究の目的の一つである上気道の産生機序については,1.鼻アレルギ-の水様性鼻濡,慢制副鼻腔炎上顎洞貯留液の産生に上皮のイオン輸送に伴う水の移動が重要な役割を果たしていることが明らかになった。2.モノクロナ-ル抗体を用いて漿液腺細胞のみを特異的に認識することが可能となり,種々の気道疾患における漿液腺細胞と粘液腺細胞の役割を明らかにする可能性を得た。3.慢性副鼻腔炎患者鼻腔粘膜の分泌細胞の定量的組識化学により,固定鼻腔腺細胞の増成が本症における鼻濡過多の一因となっていることが示唆された。本研究のもう一つの目的である上気道液の物性と組成に関する研究では種々の角度より検討がなされたが,4.慢性副鼻腔鼻汁の粘稠度の決定因子として鼻汁中の糖蛋白,特にフコ-スが最も重要であることに明らかにした。5.鼻汁中の各細胞成分を定量的に測定する方法を初めて確立し,今後は各鼻疾患における炎症細胞の役割を検討する予定である。6.鼻汁中に含まれる蛋白分解酵素であるプロテア-ゼとその拮抗物質の検討によりプロテア-ゼの一つであるカテプシンBとB様チオ-ルプロテア-ゼが炎症の遷延化に重要であることを明らかにした。7.鼻汁中の好中球由来のプロテア-ゼ(エラスタ-ゼ)の測定法を開発し粘液の粘性部分と漿液性部分の好中球エラスタ-ゼ濃度を測定し前者が高値であることを示した。8.また慢性化膿性中耳炎の緑膿菌プロテア-ゼ活性の測定し緑膿菌感染による本症の慢性化の糸口を示した。9.急性および滲出性中耳炎中耳腔貯留液中のエンドキシン,プロテア-ゼ活性を測定し,エンドトキシンが好中球遊走を促進し,遊走した好中球のプロテア-ゼが炎症を遷延化することを示した。10.またこのような物質を含んだ中耳腔貯留液が織毛運動に影響を示すことを明らかにした。本研究の初年にあたる本年は方法の確立を中心として行なわれたが、以下にのべる研究成果も得られた。方法の確立としては滲出性中耳炎(ネコ)、副鼻腔炎(ウサギ)、鼻アレルギ-(ラット)の動物モデルが完成したこと、およびアッシングチャンバ-による膜のイオン輸送の測定が可能となったことである。イオン輸送に関してはウサギ気管や鼻腔粘膜の電気生理学的特性を明らかにし、さらに慢性副鼻腔炎上顎洞粘膜のイオン輸送能と上顎洞貯留液の粘弾性との間に逆相関がみとめられ、上顎洞貯留液の粘弾性の決定に洞粘膜のイオン輸送能が重要な役割を果たしていることが明らかになった。慢性副鼻腔炎、鼻アレルギ-、正常人の鼻粘膜分泌細胞の組織化学的検討で、副鼻腔炎、鼻アレルギ-ともに腺細胞の増殖が著明なことが示され、これらの疾患における分泌増多の一原因として鼻腔の腺細胞の増殖が示唆された。また慢性副鼻腔炎鼻汁中の糖蛋白に対するモノクロナ-ル抗体の作成を試み、漿液腺細胞のみを特異的に認識する抗体を得ることができた。

今後は本抗体を用いて種々の病的状態における分泌物に占める粘液腺と漿液腺の役割を解明する計画である。また分泌液中の糖蛋白の定量的測定も高速液体クロマトグラフィ-の導入で可能となった。病的分泌物における糖蛋白の分布、また糖蛋白と分泌物の粘弾性との関係につき検討する予定である。慢性疾患に於ける炎症産物の果たす役割を知る目的で緑膿菌より産生される蛋白分解酵素(エラスタ-ゼ)について検討した。緑膿菌エラスタ-ゼに対するポリクロナ-ル抗体を作製し、本抗体を用いた酵素抗体法でエラスタ-ゼレベルを測定した。慢性化膿性中耳炎分泌物中の値は他の中耳疾患のそれに比し高値を示し慢性中耳炎に於ける緑膿菌エラスタ-ゼの重要性が示唆された。本研究の最終年にあたる本年は昨年度の方法の確立をもとに以下に述べる研究成果が得られ実り多い年度であった。上皮のイオン輸送に伴う水の移動は気道液の産生に重要な役割を果たしており,本年は鼻アレルギ-患者の誘発前と誘発後の上皮のイオン輸送について検討した。結果,誘発後には粘膜下側から粘膜側に水の移動が増加し,鼻アレルギ-では誘発後に繊毛間液の増加が存在するとともに,水様性鼻漏の原因の一つに上皮を介する水の移動の増加が考えられた。粘液糖蛋白は気道液の重要な構成成分であり,気道液の重要な性質である粘稠度に影響を与えるといわれている。そこで慢性副鼻腔炎鼻汁中の主な糖蛋白であるフコ-スやシアル酸濃度と鼻汁の粘稠度(弾性率,粘性率)との関係を検討した。この結果鼻汁の弾性率,粘性率は局所産生糖蛋白のフコ-ス濃度と高い相関を示すことが明らかとなった。今後は高い粘稠度を産生する病的気道粘膜のフコ-スの産生機構につきさらなる検討を加えたいと考えている。気道液の組成の中で細胞成分は病態と密接に関係があり診断,治療上重要な位置を占めている。気道液の細胞成分の検討は定量的なものが少なく特に鼻汁においてはなされていなかった。本年は正常,慢性副鼻腔炎,鼻アレルギ-の定量的鼻汁細胞診を小児,成人患者で施行し比較検討した。今後は定量的細胞診と病態との関係,他の組織の気道液との関係,物性との関係を検討する予定である。気道液中の炎症細胞から放出されるプロテア-ゼ(P)は生体防御として働く一方,生体障害性に働く可能性を有しておりこれを中和するインヒビタ-(PI)との生体内でのバランスが重要である。そこで慢性副鼻腔炎鼻汁と鼻副鼻腔粘膜中のPとPIを測定した。結果,慢性副鼻腔炎の鼻汁や組織中にはPIにより中和されないチオ-ルプロテア-ゼが多く存在しており,これが本疾患の遷延化の一原因であることが明らかとなった。
自治体主導型学習支援事業の効果検証

教育委員会主催の放課後の無料塾など自治体が公費投入し、行政による私教育支援が行われている。しかし、自治体がおこなう私教育支援に対する位置づけは依然不明瞭であり、これらの存在や機能、意義を含めて成立する公教育と私教育に関する理論的説明もなされていない。そこで、地方自治体が実施する学習塾を活用した学習支援事業を実証的に分析し、低所得者世帯等の児童生徒への学習支援のあり方を検討した。平成28年度は、1学習塾を活用した学習支援事業の影響に関する実証的研究において掲げた「教育委員会及び福祉部局主導の学習支援事業の実態」について、調査対象機関のホームページや教育関係資料(雑誌など)を用いて情報収集を実施した。その結果、学習塾を活用した学習支援については、全国的に拡大傾向にあること、高校生を対象にした学習支援も見受けられ、ICTによる学習支援事業なども行われていた。また、自治体主導で行われている学習支援の位置づけの方向性、学習塾を活用した学習支援に関する研究の可能性について、日本教育学会第75回大会(北海道大学)ラウンドテーブルにおいて「地方自治体における学習支援ー学習塾の活用に着目して」として報告した。2学習塾を活用した学習支援事業の効果検証において掲げた「学習塾を活用した学習支援事業による学校及び行政への影響とその波及効果」については、埼玉県において実施されている「生活保護受給者チャレンジ事業」を取り上げ、事例分析や埼玉県や関係自治体に対する聞き取り調査を行なった。この事業は、生活困窮者自立支援法施行前より実施されている事業であり、新たな生活困窮者自立支援制度に関する厚生労働省資料にもモデルケースとして掲載されている事例である。事例分析及び聞き取り調査を通して、学習支援事業が制度化される過程の一端が明らかになり、その成果の一部を日本教育行政学会第51回大会(大阪大学)において「子どもの貧困対策における「教育の支援」の現状と課題ー47都道府県調査よりー」として共同報告を行ったところである。上記の判断理由は、平成28年度に予定していた学習塾を活用した学習支援事業を受けた児童生徒、当該自治体における学校及び行政関係者への定性調査の実施が、当該自治体の教育長退任など人事異動の関係で再度ラポール形成する必要があり、調査が行えなかったためである。平成29年度は、1学習塾を活用した学習支援事業の影響に関する実証的研究で揚げた「1教育委員会及び福祉部局による学習塾を活用した学習支援事業の事例分析」を行い、調査対象機関のホームページや教育関係資料(内外教育など)を用いて情報収集を実施した。あわせて、いくつかの自治体に対して、資料提供を求めた。あわせて、当該自治体における学校及び行政関係者への定性調査も行ったが、3学習塾を活用した学習支援事業を受けた児童生徒への定性調査については実施できなかった。その結果、自治体主導型学習支援事業の目的には、子供たちへ教育機会の提供以外にも地方創生の一環で実施されていることや定住政策の一環で実施されていることが明らかになった。研究報告としては、まず、日本学習社会学会第14回大会(国士舘大学)にて教育委員会が主導して実施されている自治体主導型学習支援事業の事例を通して、その効果と課題を明らかにしようと試みた。次に、日本教育事務学会第5回大会(日本大学文理学部)では、自治体主導型学習支援事業の中でも福祉部局が実施する学習支援事業の現状と課題を沖縄県の事例を通して、「チーム学校」における福祉行政との連携に必要な示唆を検討した。そして、北海道教育学会第62回研究発表大会(室蘭工業大学)にて、自治体が主導して独自に行う学習支援事業を「自治体主導型学習支援事業」と呼び表し、その実態と課題を探るため、全国的な動向を踏まえつつ、北海道岩見沢市「土曜学習塾」と同歌志内市「チャレンジキャンパス」の事例を取り上げ、その制度的・実践的特徴の比較検討を行った。平成28年度に予定していた学習塾を活用した学習支援事業を受けた児童生徒、当該自治体における学校及び行政関係者への定性調査を平成29年度の前半に実施する。かつ、教育委員会及び福祉部局による学習塾を活用した学習支援事業の事例分析を通して、低所得者世帯等の児童生徒に学力向上・保障に関する学習支援事業の効果的事業モデルの提示を予定している。なお、研究成果については平成29年度中に公刊を予定しており、加えて日本教育行政学会にて報告予定である。教育学次年度使用額が生じた理由は、平成28年度に予定していた学習塾を活用した学習支援事業を受けた児童生徒、当該自治体における学校及び行政関係者への定性調査が実施できなかったためである。次年度使用額については、平成28年度に予定していた学習塾を活用した学習支援事業を受けた児童生徒、当該自治体における学校及び行政関係者への定性調査を平成29年度の前半に実施するため、その経費として使用する予定である。
膜蛋白・分泌蛋白のCAST/SAGE解析による消化管癌の新規診断・治療開発

CAST/SAGE解析により食道癌・胃癌の特異的膜蛋白・分泌蛋白を同定し、診断の向上と治療抵抗性の克服に資することを目的した。1) SAGE法による食道癌特異的遺伝子解析とその機能解析:昨年度にSAGE法で同定したADAMTS16は、増殖能・浸潤能を促進し、深達度との相関を明らかにした。また、その標的としてEGFおよびTGFαの可能性を検討した。SAGE法で発現低下遺伝子として、S100A9, EMP1, EEF1A1, TSPAN9などを同定した。2) CAST法による胃癌特異的膜蛋白コード遺伝子の同定:胃癌で発現の亢進する14遺伝子(PCDHB9, ADAM17, TMEM50B, ENPP4, SLC38A2, DSC2など)を見いだした。DSC2は、CDX2で発現が制御され、腸型粘液形質を示す胃癌で発現しており、食道扁平上皮癌の殆どでも陽性を示した。さらに、スキルス胃癌を材料にCAST解析を進めている。3)胃癌におけるmicroRNA(miRNA)発現とその標的遺伝子解析:胃癌で発現が亢進しあるいは低下している35miRNAを同定した。組織型、進行度、予後と関連するmiRNAを見いだした。ホルマリン固定パラフィン包埋組織における発現についても確認した。miR-148aなどいくつかのmiRNAについては、TargetScanなどによる標的遺伝子の同定と機能解析を行なった。得られた成果は、新しい診断・治療開発につながるものと期待される。上部消化管癌の新たな診断・治療標的を同定し、癌の不均一性によってもたらされる治療抵抗性の機序の解明とその克服に資することを目的し、本年度は以下のとおり実施した。1) SAGE法による食道癌の網羅的遺伝子発現解析と特異的遺伝子の同定2) CAST法による胃癌特異的膜蛋白・分泌蛋白コード遺伝子の同定膜蛋白あるいは分泌蛋白を効率良く同定する方法CAST(Escherichia coli ampicillinsecretion trap)法を用いて網羅的解析を行なった。MKN-28およびMKN-1と正常胃粘膜から調整したcDNAライブラリーをpCASTベクターに組み込み、アンピシリン耐性クローンをそれぞれ1200クローン以上解析した。胃癌のみに発現していた67遺伝子について、定量的RT-PCRより、正常全身諸臓器および癌組織における発現を解析した結果、DMKN, PCDHB 9, BST2, DSC2などが胃癌特異的発現遺伝子の候補として抽出された。これらについて、免疫染色による発現と局在、細胞生物学的な機能解析を行なっている。
水素／重水素交換反応及び質量分析法による糖タンパク質の高次構造解析技術の開発

本研究では,糖タンパク質の高次構造解析技術を開発する一環として,糖タンパク質のモデルとして抗TNF-α抗体関連医薬品を用いて,ヒト可溶性TNF-αとの相互作用解析を水素重水素交換/質量分析(HDX/MS)行った.4種類の抗TNF-α抗体関連医薬品について解析した結果,いずれの抗体との相互作用においても,重水素交換率が減少する内部領域があることを明らかにし,抗TNF-α抗体関連医薬品は,共通のTNF-α高次構造変化を利用して薬理作用を発現している可能性を見出した.また,それぞれの抗TNF-α抗体関連医薬品のエピトープとなりうる領域を特定した.抗TNF-α抗体をビーズに固定化することで,HDX反応後にTNF-αのみを選択的に回収することが可能となり,MS解析におけるTNF-α由来ペプチドの同定本数を増加させることができた.HDX/MSにより4種類の抗TNF-α抗体とTNF-αの相互作用解析を行った結果,いずれの抗体との相互作用においても,共通して重水素交換率が減少する領域が検出された.最も変化のみられた領域は,TNF-α三量体の内側に位置し,β-ストランドを形成している領域であった.また,その他の変化がみられた領域についても,大部分は分子内部のβ-ストランドに位置していた.4種類の抗TNF-α抗体のエピトープが共通している,あるいはエピトープが分子内部に存在するとは考えにくいことから,変化のみられた領域の多くは,抗体結合部位ではなく相互作用に伴い高次構造が変化した領域であることが示唆された.抗TNF-α抗体の薬理作用には,TNF-αのアロステリックなコンフォメーション変化が関係している可能性が示唆された.本研究では,糖タンパク質の高次構造解析技術を開発する一環として,糖タンパク質のモデルとして抗TNF-α抗体関連医薬品を用いて,ヒト可溶性TNF-αとの相互作用解析を水素重水素交換/質量分析(HDX/MS)行った.4種類の抗TNF-α抗体関連医薬品について解析した結果,いずれの抗体との相互作用においても,重水素交換率が減少する内部領域があることを明らかにし,抗TNF-α抗体関連医薬品は,共通のTNF-α高次構造変化を利用して薬理作用を発現している可能性を見出した.また,それぞれの抗TNF-α抗体関連医薬品のエピトープとなりうる領域を特定した.抗TNFα抗体医薬品は,ヒトの炎症性サイトカインTNFαを標的とする分子標的薬であり,関節リウマチ,炎症性腸疾患,及び乾癬などの自己免疫が介在する炎症性疾患の治療に用いられている.抗TNFα抗体の作用機序については,TNFαの機能抑制やTNFα産生細胞への細胞傷害作用などが明らかにされているが,TNFαの捕捉とその機能阻害の構造的な機序については不明な点が多い.既存の抗TNFα抗体医薬品のエピトープ,及び結合により誘起される構造変化を明らかにすることは,新規抗TNFα抗体や抗TNFα抗体後続品の開発において,有用な情報をもたらすものと考えられる.近年の液体クロマトグラフィーと質量分析技術の進歩により,重水溶媒中でタンパク質を重水素標識し,ペプシン消化後,ペプチドごとに取り込まれた重水素数を質量分析法で測定する,水素/重水素交換質量分析法(HDX/MS)が,高次構造変化の観測法として実用的になりつつある.HDX/MSは,液相中でのタンパク質の高次構造変化を観察することが可能であり,NMRやX線結晶構造解析等の従来法では難しかった高分子量タンパク質の相互作用解析に応用されている.そこで本研究では,抗TNFα抗体によるTNFα抑制作用の高次構造的メカニズムの解明を目的として,HDX/MSにより,ヒト可溶性TNFαと抗TNFα抗体関連医薬品(インフリキシマブ・アダリムマブ・ゴリムマブ・エタネルセプト)との相互作用解析を行った.4種類の抗TNFα抗体の結合に伴う,TNFαの重水素交換数の変化をHDX/MSにより解析した結果,いずれが結合した場合でも,特定のペプチドで類似した重水素化率変化が起こることが明らかとなり,抗TNFα抗体が共通のTNFα高次構造変化を利用して薬理作用を発現している可能性が示唆された.また,それぞれの抗TNFα抗体のエピトープ候補となる領域を特定した.本研究では,バイオ医薬品の作用機序の構造的背景を解明することを目的として,水素/重水素交換質量分析(HDX/MS)により,ヒトtumor necrosis factor-α(TNF-α)と市販抗TNF-α抗体医薬品との相互作用解析を行っている.昨年度は,HDX/MSにより,ビーズに固定した抗TNF-α抗体を用いて,TNF-αとの相互作用解析を行い,抗TNF-α抗体のエピトープとなりうるTNF-αのペプチド領域を推定した.さらに,相互作用時にTNF-α分子内にコンフォメーション変化が生じている可能性も明らかにした.一方,そのコンフォメーション変化は,ビーズとの非特異的な相互作用を観察していることも否定できない.

そこで本年度は,抗TNF-α抗体を固定化することなく相互作用解析を行うために,文献情報等を参考にHDX/MS条件を再度最適化した後,モデル抗TNF-α抗体のエピトープ解析を行った.最適化したHDX/MS条件で,コントロールのTNF-αを分析した結果,47本のペプチドが同定された(配列カバー率:98.1%).次に,抗TNF-α抗体とTNF-αをインキュベートした後,HDX/MS解析を行ったところ,コントロールと比較して,いくつかのペプチドで重水素交換率の低下が認められた.特に,5565,100120,及び135145付近のペプチドは,重水素交換反応初期から顕著な重水素交換率の低下を示したことから,相互作用が強いものと考えられる.これらのペプチドの中で,分子表層の配列を含んでいた100120,及び135145付近のペプチドをエピトープ候補として特定した.一方,5565付近のペプチドは,分子内部のβ-ストランドに位置しており,分子内にコンフォメーション変化が生じている可能性が再確認された.分析化学本研究では,HDX/MSを用いた糖タンパク質性医薬品の高次構造解析,及び相互作用解析手法の確立を目的としている.平成24年度は,モデル糖タンパク質として抗体医薬品を用いて,HDX/MSの分析条件を最適化すると共に,一部の抗体医薬品のエピトープ構造を特定した.またH25年度は,抗体医薬品とリガンド分子の相互作用に伴う,リガンド分子内でのコンフォメーション変化を明らかにした.HDX/MSにより高次構造解析及び相互作用解析が可能となっていることから,おおむね順調に進展していると判断した.本研究では,HDX/MSを用いた糖タンパク質の高次構造解析技術を確立すること,及び糖タンパク質医薬品とそのリガンド分子の相互作用を解析することを目的としている.本年度の研究により,糖タンパク質である抗体医薬品のHDX/MSの分析条件を最適化できたこと,また,抗TNFα抗体の薬理作用発現に関係する可能性のあるTNFαの高次構造変化,及びエピトープ構造を特定することができたことから,おおむね順調に進展していると判断した.現在のHDX/MSでは,ペプチドレベルでの重水素交換率を解析しており,X線結晶構造解析法や核磁気共鳴法と比較して解像度が十分ではない.そこで本年度は,アミノ酸残基レベルでのHDX/MS解析を可能にすることを目的として,重水素交換したペプチドの断片化法として注目されている電子移動解離(ETD)法を利用したタンデム質量分析法(MS/MS)の最適化についても検討を開始している.今後は,HDX/MSとETDを組み合わせた手法の構築と最適化を行うと共に,本年度までに特定した抗TNF-α抗体のエピトープ及びコンフォメーション変化に関係する領域について,HDX/MS/ETDによりアミノ酸残基レベルでの解析を行う.さらに,抗体及びホルモン等の糖タンパク質性医薬品について,糖鎖分解酵素等を用いて糖鎖構造の異なるモデル糖タンパク質を作製して,HDX/MS/ETDにより高次構造解析を行い,糖鎖構造の差異に伴う高次構造の変化が生物活性等に与える影響についても検討する予定である.平成24年度実施したHDX/MSは,抗TNFα抗体とTNFαを重水溶媒中で反応させた後,ペプシン消化を行い,重水素交換された消化物を液体クロマトグラフィー/質量分析(LC/MS)により分析するものである.従って,観測される重水素交換数はペプチド単位のため,高次構造解析の解像度としては十分ではない.LC/MSによるペプチド配列解析は,一般に,衝突誘起解離(CID)法を用いたタンデム質量分析(MS/MS)により行われる.しかし,CIDで重水素交換されたペプチドの断片化を行うと,重水素のscramblingが起こり,交換部位を正確に特定できないことが報告されている.近年,重水素のscramblingを起こしにくいMS/MSの1つとして,電子移動解離(ETD)法が注目されている.