hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
エントリー・ポイントを用いた不得意科目を克服する教師支援システムの開発研究

特別支援教育・発達心理学的見地よりエントリー・ポイントとの関連性の調査・授業実践研究を次の点から実施した。LDなどの学習障害児にM Iチェックリストで知能の凸凹から弱点と得意の強みが2E的にヴィジュアルに優れた児童が多く見られ、年少児のLD児でも視覚的強みがみられた。健常児も朝活動での描画が社会科や理科に影響がある点がエントリー・ポイントの逆作用の可能性が明確となった。欧州の調査、北米での最新研究の2Eへの支援ではカナダの通級指導教室の実践例を参考に日本でも実施可能な学習法について検討を加え、個の9つのMI知能の凸凹支援を視野に入れた公立中学校、私立保育園でも通級指導教室での指導を開始した。Unit 1グループは、MI(多重知能)チェックリストを作成し、小学校レベルで児童による自己のチェックと、教師の側からみた行動特性をふまえたMIチェックリストを作成した。その学級での成績と知能の相関関係を試行した。Unit 2グループは、中学校の総合学習や教科学習で、生徒のMI(多重知能)を中心とする認知的個性を把握して活かす実践を進めた。MIや同時・継次処理の特性を総合学習の小集団形成や教科授業の方法に有効に活かせることが分かった。また、発達障害生徒のMIを学習のエントリーポイントとして活用する方法を探るため、アメリカの発達障害生徒の大学進学指導を重点とする特別学校および発達障害学生の学習支援を行う大学への訪問・資料収集とともに、障害児向けの教育の歴史のあるヨーロッパへも間口を広げ、シュタイナー学校など歴史のある英国あるいはヨーロッパに調査先の範囲を広げることになり、次年度の研究調査にむけての資料収集に基づいて、日本への示唆を検討した。以上の成果は【査読付論文】4本,【投稿論文】10本,【学会発表】5件,【著書】2冊(池内慈朗著『ハーバード・プロジェクト・ゼロの芸術認知理論とその実践ー内なる知性とクリエティビティを育むハワード・ガードナーの教育戦略』東信堂、を含む)として、メンバー全員がそれぞれ本年度の研究実績の発表を行った。ハワード・ガードナー(ハーバード大学教育学大学院教授)が提唱するMI(多重知能)理論から援用した個々の思考パターン、興味の持ち方の違いを考慮したエントリー・ポイント(学習の入り口)の調査を特別支援教育・発達心理学的見地より、エントリー・ポイントとの関連性の調査・授業実践研究を実施した。(1) MIチェック法の再構築、中学校で、生徒のMIを含む認知的個性の把握およびそれを活かした総合学習・教科授業の開発。(2)海外でのエントリー・ポイントに似通った実践を行う小中学校・美術館等の調査と適応化の実施を行った。ドイツ・デュッセルドルフでの基礎学校、ギムナジウム、特別学校、シュタイナー学校5校の授業観察や聞き取り調査、オランダ・アムステルダム等の学校・美術館等での造形活動・美術鑑賞教育の事例の調査。ではトロッペン・ミュージアムにおけるハーバード・プロジェクト・ゼロの実践、とくにMaking Thinking Visible(思考の可視化)やVisual Thinking Strategy(視覚的思考の方略)を指導している元学芸員からの聞き取り調査を行った。また、ロンドン・テートギャラリーにみられる、歴史や社会状況などの対象を成立させる「文脈(Context)」重視の問いなどエントリー・ポイントの多様なアプローチを網羅した個々の思考プロセス、認知的特性を活かす学習方法である点を海外での調査から発見できた。(3)2E教育の観点から高校と大学が連携した発達障害生徒のMI等、得意を活かす支援の調査・授業実践研究。さいたま市近郊の障害者施設の発達障害者・小学校の健常児の子どもたちの描画の制作過程の分析を通して創造性の研究を行った。特別支援教育・発達心理学的見地より、エントリー・ポイントとの関連性の調査・授業実践研究を次の点から実施した。LDスペクトラムなどの学習障害児にM Iチェックリストで知能の凸凹から弱点と得意の強みが2E的にヴィジュアルに優れた児童が多く見られ、視覚的ツールを活かす、エントリー・ポイントの有効性について調査した。健常児も朝活動と描画活動は社会科や理科に影響のある点が明確となった。欧州の調査、北米での最新研究の2E生徒への支援ではカナダの通級指導教室の実践例を参考に日本でも実施可能な学習方法について検討を加え、個の知能の凸凹支援を視野に入れた公立中学校、私立保育園でも通級指導教室での指導を開始した。発達障害と才能を併せもつ2E生徒への支援について、昨年度調査したドイツ、オランダでのMaking Thinking Visible(思考の可視化)、VisualThinking Strategy(視覚的思考の方略)の分析とともに、カナダの公立学校の通級指導教室の実践例を参考に、日本の公立学校でも実施可能な指導・学習方法について検討を加えた。そして2E生徒の特別なニーズも考慮して、得意を引き出し才能を伸ばす指導・支援を視野に入れた某市公立学校、保育園の通級指導教室での指導の準備を開始した。

欧州の調査、北米での最新研究の2Eへの支援ではカナダの通級指導教室の実践例を参考に日本でも実施可能な学習法について検討を加え、個の9つのMI知能の凸凹支援を視野に入れた公立中学校、私立保育園でも通級指導教室での指導を開始した。H26年度の研究は、エントリー・ポイント(学習の入り口)の調査に関する課題であり、以下3つのアプローチから実施することができた。(1)特別支援教育・発達心理学的見地より、エントリー・ポイントの調査・授業実践研究を中学校で、生徒のMIを含む認知的個性の把握およびそれを活かした総合学習・教科授業の開発ができた。(2)ドイツ、オランダでのMLV、VTSなどエントリー・ポイントに似通った実践を小中学校・美術館等の調査の実施を行った。ロンドン・テートギャラリーにみられる、「モノ(Object)」、「主題(Subject)」、「文脈(Context)」からの鑑賞教育理念は、それがなぜ博物館にあるのか、なぜ美術品になったのかという歴史や社会状況などの対象を成立させる「文脈(Context)」重視の問いなどエントリー・ポイントのfoundationalな問いと重り合い、一昨年調査した英国・大英博物館でのハンズ・オン・アプローチもまた含まれ、エントリー・ポイントは一般的に知られていないだけで既に多様なアプローチを網羅した有用性・普遍性のある学習方法であることを裏付ける発見ができたことも成果である。(3) 2E教育の観点から発達障害生徒のMI等、得意を活かす支援の調査・授業実践研究。さいたま市近郊の障がい者施設の発達障がい者・小学校の健常児の子どもたちの描画の制作過程の分析を通して創造性の研究ができた。以上、メンバーの多様な研究視点より、各自のテーマにそって代表者と協議しつつ調査、研究を行っており成果をあげることができている。これらの事から、おおむね順調に進展していると判断した。美術教育2E教育1.平成26年度に着手したエントリー・ポイントとの関連性の調査・授業実践研究の結果を分析して、さらに展開を図る。特に発達障害と才能を併せもつ2E生徒への支援に焦点を合わせ、教師の意識調査や2E生徒のニーズの基礎調査等、学習意欲を高める実証的研究をより綿密に進める。また、幼稚園、保育園などで2E教育の観点研究から、幼児の早い時点より強弱がみられ、MIからみた知能の凸凹や特に空間認識と読字能力(言語的知能)との関係について、また、さいたま市近郊の障害者施設(工房「集」)、さいたま市内の小学校の特別支援学級の描画(ドローイング)の調査と分析を行い、障害児、健常児の子どもたちの描画の制作過程とそれらを比較して創造性に対する考察を更に深める。2.ドイツ、オランダ等の学校・美術館等での造形活動・美術鑑賞教育の事例の調査からプロジェクト・ゼロの実践、Making Thinking Visible(思考の可視化)やVisual Thinking Strategy(視覚的思考の方略)の収集資料の調査分析をまとめ、できれば追加調査も行えるか検討している。上記の調査をふまえ海外の小中学校・美術館等の調査と適応化の実施の研究を行う。ロンドン・テートギャラリーの「文脈(Context)」重視の鑑賞教育理念、エントリー・ポイントに似通った実践を調査して行く。
自然量子井戸物質の非線形光学特性に関する研究

自然量子井戸構造を有する層状ペロブスカイト型物質,特に(C_6H_<13>NH_3)_2PbI_4およびその関連物質についてその光学特性に関する研究をおこなった。1.磁気光吸収:(C_6H_<13>NH_3)_2PbI_4の励起子は極めて強く局在しており,その振る舞いはカチオニックなフレンケル励起子として良く説明できること,また,井戸層厚が2倍の(C_6H_<13>NH_3)_2(CH_3NH_3)Pb_2I_7の励起子はやや局在性が弱まっているものの依然としてフレンケル励起子的な性格を有していることもわかった。2.非線形分光:(C_6H_<13>NH_3)_2PbI_4についてナノ秒パルスレーザを用いたパンプ・プローブ分光をおこなったところ,励起子共鳴付近のパンプによって数十%にも及ぶ吸収飽和が観測された。これはX^<(3)>に換算すると10^<-4>esuオーダーの極めて大きな変化である。一方,強励起のフォトルミネッセンス測定では,励起光強度に対して非線形な応答を示す発光が観測されたが,二光子吸収測定ではそれに対応する準位は確認できず,その起源は不明である。3.縮退四光波混合:(C_6H_<13>NH_3)_2PbI_4についてナノ秒パルスレーザを用いて縮退四光波混合の測定をおこなった。励起子吸収に一光子共鳴するエネルギーでX^<(3)>は共鳴的に増大し,そのピーク値は室温で6×10^<-4>esu,77Kで2.4×10^<-3>esuにも達した。これは我々が以前,光第3高調波発生によって測定したX^<(3)>(-3ω;ω,ω,ω)=10^<-9>esuと比較してけた違いに大きく,誘電率閉じこめ効果による非線形性の増強を反映している可能性がある。この巨大なX^<(3)>の起源を明らかにするために,今後,時間分解のパンプ・プローブ分光などをおこなっていく予定である。(C_6H_<13>NH_3)_2PbI_4を中心に各種の分光測定を行い、以下のような知見を得た。[PbI_6]オクタヘドラ1層の井戸層を持つ(C_6H_<13>NH_3)_2PbI_4と2層の井戸層の(C_6H_<13>NH_3)_2(CH_3NH_3)Pb_2I_7についてそれぞれ40Tまでの強磁場下での磁気光吸収測定をおこなった。その結果、(C_6H_<13>NH_3)_2PbI_4の励起子は極めて強く局在しており、その振る舞いはカチオニック・フランケル励起子として良く説明されることが明きらかとなった。また、(C_6H_<13>NH_3)_2(CH_3NH_3)Pb_2I_7の励起子は(C_6H_<13>NH_3)_2PbI_4と比較するとやや局在性が弱まっているものの依然としてフレンケル励起子的な性格を持つことも明らかにした。(C_<10>H_<21>

NH_3)_2PbI_4の多結晶薄膜を用いて室温で第3高調波発生によりx^<(3)>の評価をおこなった。最低励起子に3光子共鳴する領域でx^<(3)>=0.7×10^<-9>esuという大きな値が得られた。また、単結晶での測定でも同程度のx^<(3)>が得られた。ナノ秒パルスレーザを用いたパンプ・プローブ分光をおこなったところ、励起子共鳴付近のパンプによって数十%にもおよぶ吸収飽和が観測された。これはχ^<(3)>に換算すると10^<-4>esuオーダーの極めて大きな変化である。一方、強励起のフォトルミネッセンス測定では励起光強度に対して非線形な応答を示す発光が観測されたが、2光子吸収測定ではそれに対応する準位は観測できず、その起源は不明である。これ以外にも、フォトルミネッセンス励起スペクトル測定やキャリアのドーピング、層状構造を持たない3次元類似物質の研究なども並行して進めている。[PbI_4]層が一層からなる(C_6H_<13>NH_3)_2PbI_4の光学特性,特にその三次非線形性を中心に研究を進めた。また,三次元類似物質である(CH_3NH_3)PbI_3も含めた一連の物質についての光学測定もおこない,[PbI_6]八面体のネットワークの様子(次元性)と光学特性の関連についても調べた。1.(C_6H_<13>NH_3)_2PbI_4についてナノ秒パルスレーザを用いて縮退四光波混合の測定をおこなった。励起子吸収に一光子共鳴するエネルギーでχ^<(3)>(-ω;ω,-ω,ω)は共鳴的に増大し,そのピーク値は室温で6×10^<-4>esu,77Kで2.4×10^<-3>esuにも達した。この値はTHGで得られたχ^<(3)>(-3ω;ω,ω,ω)(〕SY.simeq.〔)10^<-9>esuと比較すると桁違いに大きく,誘電率閉じこめ効果による非線形性の増強を反映している可能性がある。2.(C_6H_<13>NH_3)_2PbI_4と(C_<10>H_<21>NH^3)_2PbI_4についてフォトルミネッセンス励起スペクトルの測定を初めておこなった。励起子吸収の高エネルギー側に見られる吸収の肩の部分ではっきりとした発光効率の増大が観測されたことから,これがバンド端の吸収に対応しているものと思われる。3.[PbI_6]八面体ネットワークの形態の異なる各物質の光学スペクトルをそれぞれ測定し,その励起子エネルギーの変化を説明するために簡単なモデル計算をおこなった。その結果,ワニア励起子的な描像では一連の物質の励起子エネルギーの差をうまく説明することができず,フレンケル励起子を基本にしたモデルではかなりよく実験結果を再現できることがわかった。以上の研究を通じて,これらの自然量子井戸物質では励起子は極めて局在性の強いフレンケル励起子的な振る舞いを示すこと,また,その励起子エネルギーに共鳴する領域で異常に大きな非線形光学応答を示すことが明らかとなった。今後は,この巨大なχ^<(3)>の起源を明らかにするために,時間分解のパンプ・プローブ分光などをおこなっていく予定である。
裁判官の経歴移動

裁判官が過去にだした判決、そして過去の経歴が、当該裁判官のその後の昇進にどのような関連をもつのかを検討した。昇進は地裁所長および高裁総括判事への昇進と規定し、労働事件に関与した裁判官の経歴データを対象に、質的比較分析をおこなうブール代数アプローチによって分析した。その結果、次のような知見をえた。第1に、地裁総括判事と高裁判事の双方を経験することが、地裁所長か高裁総括判事に昇進するための必要条件になっていた。任官57期で一部に事例はあるが、これら双方の経歴をもつことが必要条件であった。これは、裁判官の序列が階段型階層になっており、官僚制組織に典型的なパターンであることをしめしていた。第2に、最高裁や法務省への出向経歴は、昇進を確実にする、あるいはその昇進を早める条件となっていた。昇進格差の生じる経歴段階において、これらの出向経験は、その後の昇進に有利に作用していた。他方で、支部勤務の経験はそうした昇進を促進する条件になっていなかった。第3に、行政や公的企業体に有利な判決だけに関与することは、昇進を早める条件であった。昇進格差があらわれはじめる段階では、行政や公的企業体に有利な判決だけをだしていたことが、早期昇進を促進するような結果となっていた。最高裁や法務省への出向経験がその後の昇進の促進条件であること、行政や公的企業体に有利な判決だけをだすことが早期昇進を促進条件になっていたことは、裁判官が最高裁の中央集権的な人事評価のもとにおかれ、最高裁あるいは行政の立場を擁護する思考様式と態度をもたらしているという指摘を否定できないことを示していた。本研究では、裁判官経歴データの分析から、以下のような仮説を検証することを研究課題とした。(1)卒業大学によって昇進に差がある。(2)出向経験は昇進に有利になる。(3)支部勤務の経験は昇進に不利になる。(4)行政・企業側に不利な判決に関与すると昇進が不利になる。(5)裁判官の昇進は官僚制的トーナメント型移動である。平成10年度には、法曹関係者や法社会学者の数名にたいして別個に聴き取り調査をおこなった。その結果は、上記諸仮説に支持的な意見もあったが、必ずしも明確に断定できないとの所見もあり、仮説にたいする統計的分析による検証の必要がいっそう増大した。平成10年度のもう1つの課題は、コンピュータによって統計的分析をおこなうための裁判官経歴データファイルを作成に入力することであった。その原データである『全裁判官経歴総覧』の改訂版が平成10年に出版されデータ内容が一新されたため、データファイル作成に遅れが生じた。そのため、裁判官経歴データの統計的分析に着手できなかった。他方で、統計的分析手法にかんする検討も進めた。質的比較分析法としてのQCAは適用できることを確認した。しかし、統計的分析手法をもちいる場合、ロジスティック回帰分析とイベントヒストリー分析のいずれが適するのかという問題が新たな検討課題となった。イベントヒストリー分析は経歴データを前提としているが、ロジスティック回帰分析にはそうした前提はなく、この相違がたがいに矛盾した分析結果をもたらすことがある。この統計的分析手法の選択の問題は、平成11年度に継続して検討する。平成11年度は、昨年度に引き続き法曹関係者や法社会学者にたいして聴き取り調査をおこないながら、労働事件にかかわった裁判官の経歴パターンのデータ分析を進めた。データ分析は、経歴データにブール代数分析をもちいた質的比較分析をおこなった。データには、まだ昇進しきっていない若年層も含まれるので、裁判官任用期を第57期、第810期、第1113期にわけ、昭和63年時点で満53歳以上を対象とした。昇進は地方裁判所所長または高等裁判所総括判事の経歴とした。また、労働事件の判決は、労働側有利、当局(行政・企業)側有利、混合型判決に3分類した。

第57期では、昭和63年時点でほとんどが昇進しきっており、そのほとんどが「出向または支部勤務」そして「地裁総括・高裁判事」の後に昇進するパターンであった。第810期では、昇進格差が現れており、最高裁事務局や法務省への出向が、支部勤務よりも昇進を確実にする条件であった。第1113期は、昇進するものがまだ少なく、当局側有利判決にかかわることと、支部勤務と出向の双方をおこなうことが昇進を早める傾向があった。データ分析から、(1)出向経験は昇進を確実にして早める、(2)当局側に有利な判決に関与すると昇進が促進される、などの傾向があらわれた。データ分析を進める中で、定年以前で退職する者が多いことがわかった。これは、途中退職者の経歴を検討し、途中退職しなかった者と比較する必要があることを示している。また、出向や支部勤務の勤務年数などの量的側面も検討すべき課題として残された。これらは平成12年度の課題とする。裁判官が過去にだした判決、そして過去の経歴が、当該裁判官のその後の昇進にどのような関連をもつのかを検討した。昇進は地裁所長および高裁総括判事への昇進と規定し、労働事件に関与した裁判官の経歴データを対象に、質的比較分析をおこなうブール代数アプローチによって分析した。その結果、次のような知見をえた。第1に、地裁総括判事と高裁判事の双方を経験することが、地裁所長か高裁総括判事に昇進するための必要条件になっていた。任官57期で一部に事例はあるが、これら双方の経歴をもつことが必要条件であった。これは、裁判官の序列が階段型階層になっており、官僚制組織に典型的なパターンであることをしめしていた。第2に、最高裁や法務省への出向経歴は、昇進を確実にする、あるいはその昇進を早める条件となっていた。昇進格差の生じる経歴段階において、これらの出向経験は、その後の昇進に有利に作用していた。他方で、支部勤務の経験はそうした昇進を促進する条件になっていなかった。第3に、行政や公的企業体に有利な判決だけに関与することは、昇進を早める条件であった。昇進格差があらわれはじめる段階では、行政や公的企業体に有利な判決だけをだしていたことが、早期昇進を促進するような結果となっていた。最高裁や法務省への出向経験がその後の昇進の促進条件であること、行政や公的企業体に有利な判決だけをだすことが早期昇進を促進条件になっていたことは、裁判官が最高裁の中央集権的な人事評価のもとにおかれ、最高裁あるいは行政の立場を擁護する思考様式と態度をもたらしているという指摘を否定できないことを示していた。
リソソームはいかにしてストレスを感知し、恒常性維持機構を活性化させるのか?

細胞は古くなった分子・小器官を常に分解することで恒常性を維持している。その分解の主要な場の1つがリソソームであり、リソソームには様々な「細胞内老廃物」が送られて分解されている。リソソームは非常に重要なオルガネラであり、リソソームの機能異常が様々な疾患に結び付いているとされているが、リソソーム自体の品質を保つメカニズムは十分に解明されていない。本研究では1私たちが発見し報告したLRRK2(パーキンソン病関連タンパク質)のリソソームストレス応答に着目した解析、2CRISPR-Cas9システムを利用した最先端のゲノムワイドスクリーニング法を用いた解析の両面からリソソームのストレス応答解明を目指す。
着床・妊娠成立におけるアディポサイトカインの意義

脂肪細胞由来の生理活性物質アディポサイトカインの異常は、子宮内膜での炎症反応の制御異常を介して着床を障害する可能性が考えられた。アディポサイトカインの1つであるアディポネクチン受容体の子宮内膜における発現は月経周期の着床期に有意に増加し、着床期子宮内膜のアディポネクチン受容体およびリン酸化AMPキナーゼ(AMPK)の発現は不妊症患者では正常女性に比べ低下している傾向が認められ、アディポネクチンやメトフォルミンによるAMPKリン酸化が着床に促進的に関与している可能性が示唆された。子宮内膜への受精卵の適切な着床は、妊娠の成立・維持に必須である。着床障害は、体外受精、顕微授精などの高度生殖補助医療を用いても妊娠に至らない難治性不妊症の主因であり、着床障害の解明は喫緊の課題であると考えられる。肥満・やせのどちらの体重異常も、生殖機能を低下させ、不妊となることが知られている。肥満・やせといった代謝障害は、脂肪細胞由来の生理活性物質であるアディポサイトカインの産生・分泌異常を惹起し、子宮内膜での炎症反応の制御異常などを介して着床を障害することが示唆されている。本研究では、着床・妊娠成立におけるアディポサイトカインの役割を明らかにし、着床障害の機序解明と治療につなげたい。着床におけるアディポサイトカインの役割を調べるために、子宮内膜におけるアディポサイトカインの機能についての検討を行った。良性婦人科疾患のために手術を受ける患者より書面によるインフォームドコンセントを得た上で、子宮内膜組織を採取し、採取した各種月経周期の子宮内膜組織に対して、アディポネクチンのリガンドと受容体の抗体を用いて、それらの発現を免疫組織化学染色法で検討した。アディポネクチン受容体の発現は月経周期の分泌期中期すなわち着床の時期に有意に増加しており、アディポネクチンが着床を促進する方向に作用している可能性が示唆された。今後は他のアディポサイトカインのリガンドおよび受容体の発現についても検討していく予定である。不妊症の有無による子宮内膜のアディポサイトカインおよびアディポサイトカイン受容体の発現の差異について検討するために、同様にして採取した子宮内膜組織に対して、アディポネクチンのリガンドと受容体の抗体を用いて、それらの発現を免疫組織化学染色法で検討し、不妊症の有無で比較した。不妊症例の検体が少なく現在は有意な発現の差異は得られていないが、今後検体数を増加させて検討していく予定である。子宮内膜への受精卵の着床は妊娠成立の第一歩であり、高度生殖補助医療を用いても妊娠に至らない難治性不妊症の原因となる着床障害は解明すべき喫緊の課題である。着床は炎症反応を中心に様々な物質により時間的空間的に緻密に制御されており、肥満・やせの体重異常は生殖機能を低下させ不妊となる。肥満・やせの代謝障害は、脂肪細胞由来の生理活性物質アディポサイトカインの産生・分泌異常を惹起し、子宮内膜での炎症反応の制御異常などを介して着床を障害することが示唆されている。メトフォルミンは、アディポサイトカインの1つであるアディポネクチンと同様にAMPキナーゼ(AMPK)を介して作用する糖尿病治療薬で、インスリン抵抗性改善作用の他に抗炎症作用や癌抑制効果、ステロイド合成調節作用を持つ。本研究では、着床・妊娠成立におけるアディポサイトカインの役割とメトフォルミンの作用を明らかにし、着床障害の機序解明と治療につなげたい。子宮内膜におけるメトフォルミンの着床障害改善作用について調べるために、子宮内膜組織・細胞を用いて、メトフォルミンがAMPKの発現・リン酸化を介して着床にどのように影響するかを検討した。良性婦人科疾患の手術患者より書面によるインフォームドコンセントを得た上で、子宮内膜組織より子宮内膜上皮細胞・間質細胞を分離培養し、得られた細胞にメトフォルミンを添加し、AMPKの発現・リン酸化をWestern blot法を用いて確認した。また、不妊症の有無によるAMPKの発現の差異を調べるために、子宮内膜組織におけるAMPK・リン酸化AMPKの発現を免疫組織化学染色法で検討し、不妊症の有無で比較した。着床期子宮内膜のリン酸化AMPKの発現は不妊症患者では不妊症ではない女性に比べ低下している傾向が認められ、AMPKのリン酸化が着床に促進的に関与している可能性が示唆された。24年度が最終年度であるため、記入しない。
組織再生におけるマトリセルラープロテインの機能と形態制御に対する役割の解明

再生軟骨医療の臨床導入にあたり、移植後再生軟骨の形態維持が極めて重要な課題である。移植後の再生軟骨は、外周にI型コラーゲンを基調とした線維組織を形成し組織再生が進行するが、これら線維組織にはマトリセルラープロテインと呼ばれるタンパク質が存在し、中でもペリオスチン(PN)が豊富に存在することが確認されている。本研究では、再生軟骨を取りまく線維組織におけるPNの機能解明ならびに再生医療での活用を目的とし、遺伝子欠損(Pn-/-)マウスを用いた解析とPN含有再生軟骨の検討を行った。結果、PNはコラーゲンの高次構造形成を促し、再生軟骨組織の形状維持と軟骨細胞の分化促進に貢献することが明らかとなった。皮下移植した再生軟骨の形態維持機構を明らかにするため、周囲を取りまく界面線維組織と同部位に局在するマトリセルラープロテインに着眼し、その機能解明を行った。最初に、マウス再生軟骨皮下移植モデルを用いて、再生軟骨の成熟と周囲に形成される外周線維組織の形成機構を確認した所、移植後初期1週目で再生軟骨周囲にI型コラーゲン陽性の線維組織が形成され、同部位にはマトリセルラープロテインの中でも特にペリオスチンが強く発現していることが確認された。そのため、マトリセルラープロテインの中でも、ペリオスチンに着目して解析を進めた。線維組織の機能獲得には、構成するコラーゲン線維が重要なため、昨年度はコラーゲン成熟におけるマトリセルラープロテインの関与解明を目的とした。In vitroにおいて、可溶化コラーゲンにぺリオスチンを添加してゲル化を評価した所、添加に伴い物理的強度が増強し、内部構造を電子顕微鏡(SEM,TEM)で確認すると、ペリオスチン添加により、コラーゲン分子の会合が進み、コラーゲン分子の高次構造化が促進されていた。そこで、ペリオスチン遺伝子欠損マウスを用い、ペリオスチン欠損がin vivoでの線維形成に与える影響を確認した。野生型マウスと比較して、遺伝子欠損マウスの線維組織は、物理的強度が低下し、特に剥離強度の著しい低下を示した。組織所見では、構成する線維組織の直径低下、構成線維の密度低下、線維組織間の会合度の低下が確認された。最後に、軟骨細胞への支持機能の変化について調べるため、ペリオスチン添加したコラーゲンゲルを用いて軟骨細胞を三次元培養した所、軟骨分化関連遺伝子の上昇と軟骨基質タンパク質の蓄積が上昇し、軟骨分化を促進することが確認された。さらに、軟骨細胞のインテグリンを介した細胞内シグナルタンパク質のリン酸化が誘導されていた。本研究は、再生組織周囲に形成される線維組織の機能を明らかにすることで、移植後再生軟骨の形態制御機構解明し、長期に渡る形態と機能の維持を可能とした新規の移植型再生軟骨組織を開発することを目的とした。特に、線維組織におけるマトリセルラープロテインに焦点を当て、その機能および形態制御との関わりについて解明を行った。予備実験において、線維組織主要構造タンパク質のI型コラーゲンと共局在するマトリセルラープロテイン、ペリオスチン(PN)が確認された。そこで、このPNの機能を明らかにするため、PNノックアウトマウスを用いて再生軟骨皮下移植実験を行った。結果、ホストに野生型(Pn+/+)および遺伝子欠損(Pn-/-)マウスを用いて、マウス耳介軟骨細胞から作製した再生軟骨を同系移植すると、ホストにPn+/+マウスを用いた移植では再生軟骨の外周線維にI型コラーゲンと共局在するPNが発現し形状は維持されるのに対し、ホストにPn-/-マウスを用いた移植では外周線維にPNを欠き外周線維組織の強度は低下し、再生軟骨は外部に広がる不整形を呈した。そこで、線維組織形成におけるPNの機能を解析するため、外周線維組織の組織学・物理学的評価を行った。Pn+/+マウス線維組織では、会合度が高い線維が密に集合しているのに対し、Pn-/-マウスでは会合度が低い線維が疎に観察された。剥離応力においても、Pn-/-マウスで有意に物理的強度の低下が示された。in vitroにおいて、PNを可溶化コラーゲンに添加しゲル化検討した所、PN添加に伴いコラーゲンゲルの力学強度は増加し、電子顕微鏡所見でコラーゲン分子の会合促進と線維の高次構造化が観察された。マトリセルラープロテインのPNは外周線維組織においてコラーゲンと結合することでコラーゲンの高次構造形成を促し、力学特性獲得を担い、再生軟骨の形態維持に貢献することが示された。昨年度予定していた、再生軟骨移植系におけるマトリセルラープロテインの局在確認。コラーゲン形成における機能解明をin vitro、in vivoの系で確認する。また、軟骨細胞への支持機能の評価、という3課題を昨年度中に実行できており、おおむね順調に進展していると考える。25年度が最終年度であるため、記入しない。

今年度以降は、着目するマトリセルラープロテイン遺伝子欠損マウスを用いて再生軟骨移植モデルを作製し、その表現型の解析を行う。昨年度の知見から、外周線維組織の形成への関与が推測されるペリオスチンの遺伝子欠損マウスを使用する。遺伝子欠損マウスをホストに用い、再生軟骨外周に形成される線維組織でのペリオスチンの機能を解析する。ドナーには野生型マウスから単離した耳介軟骨細胞からマウス再生軟骨を作製し、遺伝子欠損マウスの背部皮下に移植する。移植後2週、8週で再生軟骨および外周線維組織を採取し、形態学的、組織・生化学的、生体力学評価を行う。遺伝子欠損マウスを用いた再生軟骨移植モデルでマトリセルラープロテインの機能を明らかにした後、軟骨再生医療への応用の可能性を探るべく、大型動物を用いた実証実験を予定している。ビーグル犬を用いて、マウスの同系移植の方法に準じ、耳介軟骨組織から軟骨細胞を採取し、イヌ再生軟骨組織を作製する。昨年度の研究結果から、マトリセルラープロテインの中のペリオスチンが、コラーゲンの高次構造化を誘導し、外周線維組織の形成および成熟を促すことが確認されたているため、このペリオスチンの機能を利用して、再生軟骨移植時に外周にペリオスチンを塗布し、外周線維組織の構造化を促し、形態制御への効果を検討する。作製したイヌ再生軟骨は背部皮下へ自家移植し、移植後1、2、6、12か月で経時的に体表形状を追跡する。また、移植後の再生軟骨は2、12か月で摘出し、3次元形状、軟骨基質産生、力学強度、細胞生存性などを評価し、対照群と比較検討する。経時的な体表形状の追跡にはレーザー3次元形状測定装置VIVID910で評価する。25年度が最終年度であるため、記入しない。
新型電子分析器による半導体表面からの光励起脱離イオンの放出角度分布の研究

本研究の目的は、我々が開発した新型電子分析器を用いて半導体表面に吸着した分子からの脱離イオンの放出角度分布を測定し、吸着・脱離のメカニズムを解明することにある。この分析器は、これまでの分析器と異なり、エネルギ-と質量の揃ったイオンの放出角度分布が得られるので、このような研究が大きく進展することが期待される。本年度は、DMAH(ジメチルアルミニウムハイドライド)をSi(111)表面に吸着させた系での脱離イオンの測定を行った。この系は、Si上のAl配線時におけるエピタクシャル成長の初期過程になっており、半導体産業において重要である。実験では、10^<-10>Torrの超高真空中において清浄化したSi(111)面の7x7表面上に、室温でDMAHガスを飽和吸着させた。そこへ、400eVの電子線を照射して出て来るイオンの運動エネルギ-分布、質量分布、放出角度分布を2次元表示型の球面鏡分析器で測定した。運動エネルギ-分布は、2.6eVにピ-クを持つなだらかな分布を示した。飛行時間法(TOF)によってそれぞれの運動エネルギ-でのイオンの種類を測定した結果、出てきているイオンは、ほとんどがH^+であり、20分の1程度のCH_3^+が混じっていることが判った。また、それぞれのイオンの運動エネルギ-は大きく異なり、ピ-ク値は、H^+が2.6evなのに対してCH_3^+は約1eVとなっている。これらのイオンの収量は、基板温度に大きく依存している。また、それらの放出角度分布も、室温では表面に垂直な方向から50度位開いた方向が強く、200度以上では表面に垂直な方が強くなっている。これらの結果から、DMAHの初期吸着状態に関する新たなモデルが導かれた。このモデルは、DMAHは室温ではAl原子を下にして吸着しており、高温では解離して吸着しているというものである。
DNA相同組換えタンパク質Rad52の非相同末端結合での働き

Rad52にはN末端側とC末端側の両方にDNA結合部位がある。C末端側では457-504アミノ酸残基にあり、特に475-504残基が重要であることを特定した。この領域を欠失したrad52Δ475-504は、Rad51の相同対合活性(D-loop形成)の促進効果がなかった。この475-504残基領域は、Rad52結合した一本鎖DNAをRad51に受け渡すために必要であることを発見した。rad52Δ475-504は、直鎖状DNA末端の結合の促進は見られず、直鎖状DNA多量体形成率も低下した。さらにrad52Δ457-504では、二本鎖DNA結合活性は野生型と同程度であったが、DNA末端の結合の促進とDNA多量体形成は共に見られなかった。このことは457-504アミノ酸領域にDNA末端結合に関与する重要な機能があることを示唆している。これまでにN末端側のDNA結合領域変異rad52K117A/R148AでもDNA末端の結合とDNA多量体形成が見られなかった。以上のことから、N末端側とC末端側の両方のDNA結合領域がDNA末端の結合とDNA多量体形成に関与していることが示された。一方、酵母での非相同末端結合を解析する系を構築のためにura3欠失株を作成して用いる計画であったが、ura3を欠失すると生育が極めて悪くなり、計画変更を余儀無くされた。別の方法として、LEU2を持つブラスミドを大腸菌由来のDNA配列内で切断して、leu2欠損株に導入して、ロイシン非要求性形質転換体(LEU+)の形成率を調べた。rad52欠失株でのLEU+の形成率は野生型株の1/4に低下し、RAD52が非相同末端結合に関与していることが示された。また、回収したプラスミドは95%以上が正確に結合され、rad52欠失株と野生型株で差はなかった。出芽酵母のRad52は、相同組換えだけでなく非相同末端結合への関与も示唆された。試験管内で直鎖状DNAはDNAリガーゼによりDNA分子内で末端が結合し環状となるが、Rad52の存在下では直鎖状DNAが分子間で連結した多量体となりDNA連結も促進された。平成28年度は以下の2点に焦点を当てた。1、Rad52によるDNA連結促進と直鎖状DNA多量体形成が同じ分子機構に由来するのか。2、Rad52のどの領域が機能しているのか。まず、Rad52によるDNA連結促進と直鎖状DNA多量体形成について至適条件を決定した。Rad52の至適濃度は狭い領域にあり過剰量では阻害された。PEGによりDNAリガーゼ活性は促進されたが、Rad52活性の促進効果は認められなかった。Rad52(全長34-504アミノ酸)の重要領域を特定するために以下の8種類の変異体を用いた解析を行った。C末側欠失変異:Δ238-504、Δ328-504、Δ457-504。N末側欠失変異:Δ34-237、Δ34-357、Δ34-456。N末側DNA結合欠損変異:K117A/R148A。Rad51との結合欠損変異:F349A/Δ409-412。その結果、Rad51との結合領域とN末側DNA結合部位は影響しなかったが、N末端側またはC末端側だけでは不十分であり両方が必要であった。C末側の457-504アミノ酸領域にDNA結合部位があることを突き止め、分子生物学会年会で報告した。そしてこの領域を欠失すると活性が顕著に低下し、重要な役割をしていることが示された。これらの解析を通していくつかの反応条件を検討し、使用したRad52変異にもDNA連結促進と直鎖状DNA多量体形成を分離するような変異はなく常に連動していることから、DNA連結促進と直鎖状DNA多量体形成は関連していると考えている。出芽酵母のRad52による非相同末端結合への関与について、平成28年度の計画では、1「Rad52のDNA連結促進と直鎖状DNA多量体形成が同じ分子機構に由来するのか」、2「Rad52のC末側のどの領域が機能しているのか」の2点に着目して試験管内での反応を中心に解析を行うことであった。まず、試験管内でDNA連結促進と直鎖状DNA多量体形成の至適条件を決定できた。また、解析した8種類のRad52変異体のうち、これまで精製を終えていた6種類に加えて、C末側の欠失変異を2種類(Δ328-504、Δ457-504)構築し大腸菌で発現し精製して解析を行った。C末側の457-504領域にDNA結合領域があることを見つけ、さらに絞り込んで475-504領域の合成ペプチドがDNAに結合することが示された。この457-504のDNA結合領域は、Rad52の機能に重要な役割をしていた。即ち、DNA連結促進と直鎖状DNA多量体形成だけでなく、相同組換えの相同対合(D-loop形成)にも関与し、さらにその領域を欠失したRad52Δ457-504を発現した出芽酵母ではDNA修復能力が低下することが示された。

これまでRad52のN末側のDNA結合部位の重要性は示されてきたが、C末側のDNA結合部位の必要性は見逃されてきた。従って、C末側のDNA結合領域の決定と機能の一部の解明は今後のRad52の非相同末端結合と相同組換えの機能解明に新たな展開をもたらすものと考えている。一方、これまで使用したRad52変異にはDNA連結促進と直鎖状DNA多量体形成を分離するような変異はなく、分離できる反応条件もなかったことから両活性は関連していると考えている。以上のように研究は予定どおりに進行し、C末側のDNA結合領域特定という新たな発見もあった。出芽酵母(S. cerevisiae)のRad52は、DNAリガーゼによる直鎖状DNA末端の結合を促進し、直鎖状DNAが連結した多量体を形成する。この活性が非相同末端結合に関与していると考えて解析を進めている。平成29年度は以下の2点に焦点を当てた。(1)Rad51とRad52による直鎖状DNA多量体の形成の活性に関連性はあるのか。(2)出芽酵母内での非相同末端結合に、Rad52のリガーゼ活性促進と直鎖状DNA多量体形成が直接的に機能しているのか。Rad51は、Rad52と同様にDNAリガーゼによる直鎖状DNA末端の連結を促進し、直鎖状DNAの多量体を形成する。Rad52による反応は、MgのみでDNA末端連結の促進、直鎖状DNA多量体を示すが、Rad51ではPEG、Mg、Ca、ADPが必要である。Rad51とRad52は複合体を形成するため活性のさらなる促進を期待し、様々な反応条件を検討した。しかしDNA末端連結の促進効果において、両蛋白質の存在下で活性はむしろ低下し、互いに活性を打ち消し合っているようであり、異なる反応機構によると考えられる。Rad51-Rad52複合体としてDNA末端連結を促進する条件がまだ見つかっていない可能性も残っているが、細胞内での相同組換えではRad52単独で働く経路があり、DNA末端連結でも単独で機能しているのかもしれない。Rad52の非相同末端結合への関与には、酵母細胞内での解析が必要である。そのためにURA3、LEU2遺伝子をもつプラスミドDNAのURA3内の一箇所で切断した直鎖状DNAを酵母に導入して、環状になる効率を野生型株とrad52欠失または変異株で観察する系の構築を行った。まずプラスミドとゲノムのURA3間で相同組換えが生じないように、ゲノム上のURA3領域を全て除去した(HIS3に置換)株を作成した。出芽酵母のRad52による非相同末端結合への関与について、平成29年度は以下の2点について解析を進めた。(1)Rad51は、DNAリガーゼによる直鎖状DNA末端の連結を促進し、直鎖状DNAの多量体を形成する。この点においてはRad52と同様であるが、Rad52はMgのみでDNA末端連結の促進、直鎖状DNA多量体を示すのに対し、Rad51では、PEG、Mg、Ca、ADPが必要である。Rad51とRad52は複合体を形成するため、Rad51の反応を中心に条件を変えながら両蛋白質によるDNA末端連結の促進効果を解析したが、両蛋白質の存在により、Rad51またはRad52単独の活性より低下し、両蛋白質が互いに活性を打ち消し合っているようであった。そこで、試験管内でのRad52とRad51の共存下でのDNA末端連結の解析はここで停止し、Rad52単独で非相同末端結合に働いている可能性を細胞内で解析する実験へと移行した。
変動壁面せん断応力の電気化学的計測と成層流体中のマルチスケール渦構造の解明

本研究は,成層流体中を回転する円筒周りに現れるマルチスケール渦構造の時間的・空間的変化と円筒表面上に生じる擬周期的壁面せん断応力との対応を調査するものである.電気化学的手法を,管内流,回転二重円菅内の流れ,および単独円柱周りの流れに適用し,測定手法の妥当性と時間的・空間的変化に対する応答性を検討した.その結果,変動壁面せん断応力に関してはノイズの問題が未解決のままであり,したがって本手法を確立することが出来なかった.マルチスケール渦構造に関しては,円筒表面から発生した渦輪列が特異な層構造を形成する過程について,速度場ー密度場の同時観察に基づいて特徴的なスケールを抽出した.本研究は,成層流体中を回転する円筒まわりに現れるマルチスケール渦構造の時間的・空間的変化と円筒表面上に生じる擬周期的壁面せん断応力との対応を調査することを目的としている.平成24年度は,壁面せん断応力の擬周期的変動とマルチスケール渦輪列構造との対応関係を把握することを目的として進めた.(1)昨年度の結果を踏まえ,電気化学的手法を一様流中の円柱まわりの流れへ適用し,はく離を伴う状況下の本手法の妥当性,ならびに適用限界を検討した.その結果,時間平均壁面せん断応力については,円柱の周方向に依存して変化する分布傾向を捉えることが出来た.また,変動壁面せん断応力についても,渦放出周波数に対応するせん断応力の周期的変動を捉えることが出来た.しかしながら,測定値の再現性の向上ならびにサンプリング周波数の変化に依存して増減するノイズの除去といった解決すべき課題が残されている.(2)新規に購入したPIV専用カメラ(デジタルビデオカメラ)を,現有の光学装置と組み合わせることで,流れパターンおよび速度ベクトルの変化と密度場の変化とを同時に把握することが可能となった.具体的には,シュリーレン法により得られた画像から,渦輪列の形成過程,融合・合体を繰り返す変化過程の密度勾配の変化を輝度変化量として抽出した.その結果,輝度変化量の空間分布を比較することで,流体の鉛直方向の輸送があまりなされていないこと,および速度場変化と密度場変化とが対応する範囲と対応しない範囲が存在する(したがって代表スケールが異なる可能性がある)ことが明らかとなった.本研究は,成層流体中で回転する円筒まわりに現れるマルチスケール渦構造の時間的・空間的変化と円筒表面上に生じる擬周期的壁面せん断応力との対応を調査することを目的としている.本年度は,昨年度の課題を踏まえ,(1)測定精度向上による非定常はく離を伴う流れ場での多点同時非定常壁面せん断応力の計測,(2)マルチスケール渦構造理解のための同時観察(壁面せん断応力と速度・密度場との同時計測)を目標として取り組んだ.壁面せん断応力の測定に関して,時間平均壁面せん断応力については,単独円柱周りの流れ,あるいは回転二重円筒内の流れ等において,リニアスイープボルタンメトリー法を用いることで,測定値の妥当性をほぼ確認することが出来た.しかしながら,変動壁面せん断応力については,クロノアンペロメトリー法を用いて測定を行ったが,再現性を有する信頼のおけるデータを取得することが出来なかった.特に,測定値に含まれる比較的高周波のノイズについて,その原因は不明のままである.したがって,目標としていた多点同時非定常計測を達成することが出来なかった.一方,壁面せん断応力と速度・密度場との同時計測については,流れの可視化手法と計測手法の組合せを検討し,可視化のための最適条件の抽出等を行ったが,上記理由により同時計測には至らなかった.そのため,本年度は研究成果の公表を差し控えた.なお,今後も継続して課題解決に取組んでいく所存である.本研究は,成層流体中を回転する円筒周りに現れるマルチスケール渦構造の時間的・空間的変化と円筒表面上に生じる擬周期的壁面せん断応力との対応を調査するものである.電気化学的手法を,管内流,回転二重円菅内の流れ,および単独円柱周りの流れに適用し,測定手法の妥当性と時間的・空間的変化に対する応答性を検討した.その結果,変動壁面せん断応力に関してはノイズの問題が未解決のままであり,したがって本手法を確立することが出来なかった.マルチスケール渦構造に関しては,円筒表面から発生した渦輪列が特異な層構造を形成する過程について,速度場ー密度場の同時観察に基づいて特徴的なスケールを抽出した.本研究は,成層流体中を回転する円筒まわりに現れるマルチスケール渦構造の時間的・空間的変化と円筒表面上に生じる擬周期的壁面せん断応力との対応を調査することを目的としている.平成23年度は,電気化学手法による回転円筒まわりの時間平均壁面せん断応力の多点同時計測法を確立することを目的として進めた.電気化学的計測法は,微小電極まわりの物質移動係数と壁面せん断応力とのアナロジーを利用する間接的な計測手法である.本研究では水酸化ナトリウムを支持電解質とし,フェリシアン・フェロシアン化カリウム水溶液の酸化・還元反応を拡散律速条件下で行い,限界電流を測定することで壁面せん断応力変動の計測を行うものである.(1)新規に購入したマルチポテンショスタットモジュールを,現有のポテンショスタットと組み合わせることで,複数電極からの信号を同時にサンプリングできるよう計測システムの確立を試みた.

(2)計測システムの妥当性を確認するために,検定用流路(層流状態の円管流)の壁面にそれぞれ陽極(Ni泊),陰極(Pt線直径0.5mm)を埋設し,限界電流と流量および圧力損失との関係(時間平均値)を検討した.その結果およそ測定精度2%の範囲内で一致することが明らかとなった.新規に購入した振動式粘度計・電子比重計は,供試電解溶液の物性値を計測するために使用した.(3)続いて,円柱まわりの流れへ本手法を適用し,はく離を伴う状況下での計測手法の妥当性ならびに適用限界を検討している段階である.(4)なお本年度の交付金が,当初予定の70%となる可能性があったため,上記購入物品は研究の遂行が可能な必要最低限の機能に絞って機種選定を行った.また次年度へ向けて計測システムの検討を進めていく中で,平成24年度購入予定のデジタルビデオカメラのスペックが不足することが明らかとなったため,本年度予算を次年度に繰り越すこととした.はく離を伴う状況下での壁面せん断応力の擬周期的変動に関して,時間平均壁面せん断応力については,測定値の妥当性を確認することが出来た.しかしながら,変動壁面せん断応力については,再現性を有する精度良いデータの取得に至っていない.壁面せん断応力の擬周期的変動は,マルチスケール渦構造の発展過程を理解する上で重要であるため,継続して計測手法の確立に取り組む必要がある.残された解決すべき課題は容易ではなく,したがって,流れの条件と電極の設置位置・設置間隔,サプリング速度・サンプリング時間等との関係,および適用範囲を詳細に検討しながら,測定データの精練化に努めなければならない.新規に購入した機器と既存の機器とを組み合わせ,本研究の主要な課題である壁面せん断応力の電気化学的計測に見通しが立った.具体的には,定常状態の層流においてせん断応力の検定を行い,続いてはく離を伴う円柱まわりの流れおいて適用の可能性を検討した.また次年度以降に本手法と組み合わせる密度場変化の可視化手法についても,取得画像の精練化を進めた.したがって,おおむね順調に進展していると考えている.次年度の課題は,主として以下の2点を継続して行う.(1)測定精度向上による非定常はく離を伴う流れ場での多点同時非定常せん断応力計測,(2)マルチスケール渦構造理解のための同時観察(せん断応力と速度・密度場との同時計測).これらの結果に基づき,流れ場の支配的な時間及び空間スケールを抽出し,現象のスケーリングを行うことで,普遍的渦構造(マルチスケール渦構造)の一端を捉えることを試みる.次年度の課題は,主として以下の2点である.(1)測定精度向上による非定常はく離を伴う流れ場での多点同時非定常せん断応力計測,(2)マルチスケール渦構造理解のための同時観察(せん断応力・密度場変化・速度場変化)の試み.これらを検討する中で,当初予購入を予定していたビデオカメラではスペックが不足することが明らかとなった.そのため上位機種へ変更する.H25年度は,当初物品費を計上していなかったが,研究の遂行には電気化学溶液,電極作成が必要不可欠となったため,他費目から流用する予定である.また,旅費については国際会議での発表を想定して計上していたが,研究の進捗状況にやや遅れが出ているため国際会議への参加は延期し,一部を他費目へ流用する予定である.今年度の繰越金のうち,およそ1,100,000円と平成24年度の物品費1,300,000とを併せ,デジタルビデオカメラの購入に充てる.その他の費用については当初の計画通りに使用する予定である.
孤発性筋萎縮性側索硬化症におけるRNA編集新規基質の探索とバイオマーカーの開発

孤発性筋萎縮性側索硬化症(ALS)では、グルタミン酸受容体サブユニットのRNA編集異常が発症に関与し、編集酵素ADAR2の活性低下によると推定されている。未知のADAR2の基質が重要な役割をしているものと考えられ、本研究ではADAR2の基質となる新規RNA分子の同定を試みた。ヒト小脳からADAR2結合RNAを抽出し、マイクロアレイにより解析した。分析を行った候補遺伝子配列からは編集部位と思われる塩基置換は認められなかった。本研究でADAR2の基質候補となるデータベースを構築しており、今後のRNA編集機構ならびにALS発症メカニズムの研究の加速を保証した点は重要である。孤発性筋萎縮性側索硬化症(ALS)の原因として運動ニューロンでグルタミン酸受容体(GluR-Bサブユニット)の編集異常が考えられており、このRNA編集はADAR(adenosine deaminase acting on RNA)という酵素で触媒される。ALSにおけるGluR-BのRNA編集異常は、ADAR2の活性低下によると推定されるが、運動ニューロンの細胞死を引き起こすメカニズムは不明のままである。一つの可能性としてGluR-B編集異常により起こる神経細胞内へのカルシウム流入の増加が細胞死に関係している可能性があったが、研究代表者によるGluR-B遺伝子改変マウスの検討により、脊髄運動ニューロン特異的にGluR-B編集が低下・欠失しカルシウム流入が増加したモデルマウスにおいても運動機能異常は起こらず、細胞死も認められなかった。この結果からADAR2はグルタミン酸受容体編集以外の未知の基質を介して運動ニューロン死を引き起こしているものと考えられる。このADAR2の新規基質を同定するために免疫沈降法を用い、脳組織よりADAR2蛋白質が特異的に結合するRNAを回収することが本研究の第一の目標である。そのため、まずマウス・ラット脳を用い抽出、免疫沈降法についての条件を検討した。文献的に知られている、核分画抽出法3種および免疫沈降法2種を比較検討し、最適な方法を確立した。次年度においては本法を用い、ヒト脳よりADAR2結合RNAを抽出しマイクロアレイにより同定する。さらに得られた候補遺伝子のヒト組織内での分布を組織学的に検索し、培養細胞における神経細胞死への関与をsiRNAを用いて検証する。孤発性筋萎縮性側索硬化症(ALS)の原因については、GluR-BのRNA編集異常が関与していると考えられており、編集酵素ADAR2の活性低下によると推定されている。しかしながら、ADAR2活性低下あるいはGluR-B編集異常が運動ニューロンの細胞死を引き起こすメカニズムは不明のままである。本研究代表者は、ADAR2の既知の基質であるグルタミン酸受容体サブユニット(GluR-B)を遺伝子変化させたマウスの解析を行っていた。その結果、ADAR2はグルタミン酸受容体編集以外の作用を通じて脊髄運動ニューロンに致死的な作用を及ぼすものと考え、未知のADAR2の基質が重要な役割をしているものと考えた。そこで本研究ではADAR2に結合する新規RNA分子の同定を通じ、生体材料を用いたALSバイオマーカーの確立を目的とした。昨年度中に抗ADAR2抗体を用いた免疫沈降法による、脳からのRNAの抽出法については確立した。本年度はヒト小脳からADAR2結合RNAを抽出し、DNAマイクロアレイ(東洋紡)により結合していたRNA分子を解析した。精度を高めるために別試料を用い、2回の解析を行った。これによりADAR2に特異的に結合するRNAの候補(2回ともコントロールとの発現比が2倍以上)が56個得られた。これらから知られているRNAの分布(核内)から18個にしぼり、mRNAからRT-PCR、シークエンスを行い、ゲノムデータベースとの照合を行った。これらの配列からは編集部位と思われる塩基置換は認められなかった。本研究ではADAR2の基質候補となるデータベースを構築しており、今後のRNA編集機構ならびにALS発症メカニズムの研究の加速を保証した点はきわめて重要である。