hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
世界におけるエキノコックス、テニア条虫の種分化、分子共進化に関する総括研究

本研究の目的はエキノコックス、テニア条虫の種分化、分子共進化に関する総括研究である。エキノコックス条虫の遺伝子解析成果:多包条虫の地理的遺伝子型、4種類がすべて分布している国はロシアであった。単包条虫G1について、ペルー、中国、イラン、ヨルダンのサンプルのミトコンドリア遺伝子解析から、中近東が起源であると結論した。テニア条虫の遺伝子解析成果:人体寄生テニア条虫3種類のミトコンドリア遺伝子、核遺伝子を比較解析し、無鉤条虫、アジア条虫2種間での種間交雑、有鉤条虫のアジア型とアフリカ・アメリカ型との間での種内交雑を確認し、条虫の生殖戦略の一部を証明した。嚢虫症、エキノコックス症を惹起するテニア科条虫の病原性の進化、地理拡散に関する総括的研究:1、これまで解析していなかったpold遺伝子解析を追加し、無鉤条虫とアジア条虫の種間交雑を強く示唆する成績を追加できた。雌雄同体の条虫において異種間での交雑が証明され、有性生殖の事実が初めて証明されたことになる。2、人体嚢虫症を惹起する有鉤条虫にはアジア型とアフリカ・アメリカ型が存在し、両型の存在がマダガスカルから報告されていた。本研究ではマダガスカルから送付された嚢虫のミトコンドリアと核遺伝子を解析した結果、両遺伝子型間の交雑を明示する成績が確認され、現在論文投稿中である。さらに、エチオピアのハイエナから採取されたテニア科条虫の遺伝子解析を追加した結果、これまで知られていない数種類のテニア条虫が発見されている。3、エキノコックス症(単包虫症)を惹起する種は種内変異を有する1種類、Echinococcus granulosus sensu latoとみなされていたが、遺伝子解析から5種類に因ることを既に報告した。本年度の活動では特にEchinococcus canadensisの分類学的位置づけ、ヒトへの感染性、分布地域、宿主動物種の確定など、4、地理変異として4遺伝子型を報告してきたEchinococcus multilocularis(多包虫症を惹起する種類)4遺伝子型をロシア、2遺伝子型をモンゴルから確認し、キツネ以外にオオカミが終宿主として重要である新事実を明らかにした。5、上記の遺伝子解析が大きく進展したことにより、種の確定に基づく抗体解析が重要になってきた。遺伝子組み換え抗原を用いた血清疫学への新しい取り組みが可能になった。6.流行地での疫学調査(インドネシア、タイ、中国)、肝多包虫症の動物モデル作成も大きく進展した。1ロシア各地の動物、患者から入手したエキノコックス属条虫からタホウジョウチュウ(4種類すべての遺伝子型)、タンホウジョウチュウ(G1, G6, G8, G10)が確認された。2モンゴルの野生動物からタホウジョウチュウ(Mongolian genotype),タンホウジョウチュウ(G6/7, G10)が確認された。3中近東(ヨルダン、イラン)から入手したタンホウジョウチュウ(G1)の遺伝子解析結果とこれまでの成績とを比較し、タンホウジョウチュウ(G1)の起源について考察した。4エチオピアのヒツジ、ウシ、ラクダから得られたエキノコックス(幼虫)についての遺伝子解析から、タンホウジョウチュウ(G1,G6)が確認された。5ハイエナから採取されたテニア属条虫の遺伝子解析、形態観察から、ヒトへの感染が予測される未記載種が発見された。一方、血清診断ならびに遺伝子診断の研究では、6これまで旭川医科大学で開発してきた遺伝子組み換えAgB8/1(単包虫症)ならびに遺伝子組み換えEm18(多包虫症)を用いる検査がそれぞれ、イラン、中国、ロシア、モンゴル、イタリアにおける単包虫症患者、中国、ロシア、モンゴル、フランスにおける多包虫症患者検出に役立つ成果が得られた。7脳嚢虫症に関する血清診断法と遺伝子診断法の開発と評価が順調に進展した。中国、タイ、インドネシアでヒトへの感染源となる有鉤条虫保虫者、有鉤嚢虫患者をリアルタイムで検出できる検査技法が確立され、流行現場で評価された結果、予期していた以上に深刻な流行拡大が懸念される事態に直面している。7さらに、中国、タイで入手したムコウジョウチュウとアジアジョウチュウのミトコンドリア並びに核遺伝子を詳細に解析した結果、両種間の雑交個体が複数確認された。8肝多包虫症患者から病巣が完全に切除された場合に観察される抗体応答の著減機構解析モデルを確立した。テニア科条虫によって引き起こされるヒトならびに家畜における嚢虫症、エキノコックス症、ヒトで成虫になるテニア症に関する病原性の進化と地理拡散に関する総括的研究はほぼ当初の目的を達成できた。5月現在国際専門誌に公表されている論文は12編、現在投稿中の論文が4編である。本事業により、2つの地理的

遺伝子型(アジア型、アフリカ型)が混在していることが証明されていたマダガスカルで採取された有鉤嚢虫のミトコンドリア(1N)と核遺伝子(2N)を比較解析した結果、2つの異なる遺伝子型の成虫間での他家受精が起こっていたことを示す遺伝子交雑個体が確認された(業績6)。これは雌雄同体である条虫が他家受精することを証明した成果である。エキノコックス症を惹き起こすエキノコックス属条虫を、9種類に再分類し直し、テニア属を3属に再分類した前年度までの成果に基づき、アフリカ、エチオピアで採取されたテニア属、エキノコックス属条虫の遺伝子解析から、これまで報告されていない複数の新種の存在を強く示唆する成果(業績12)、テニア属条虫のアフリカ起源に疑問を投げかける成果(業績10)が得られている。さらに、モンゴルにおけるエキノコックス条虫の遺伝子解析、患者(業績9)解析成果から、現在5種類から構成されている、いわゆる単包虫症を惹き起こす単包条虫を病原性、疫学成績、抗体応答性など、すべてが1種類によって引き起こされていたという時代のWHOのガイドラインの見直しが必要であるという提言をTrends in Parasitologyに再投稿中である。すなわち、遺伝子確認により5種類のいずれによる症例かを確認が評価の大前提であると。テニア科条虫の遺伝子解析から、種の概念、種の分類、生殖戦略を見直す世界に発信できる成果が得られた。26年度が最終年度であるため、記入しない。寄生虫学、感染症学、熱帯病学26年度が最終年度であるため、記入しない。1、テニア科条虫各種の遺伝子解析が大きく展開し、テニア科条虫、テニア属条虫、エキノコックス属条虫の再分類が可能になり、これまでの定説を覆す新事実が多数得られ、今後の研究課題が明確になりつつあること。具体的には(1)条虫における有性生殖戦略が明らかになったこと、(2)非常に病原性の強いテニア科条虫の遺伝子ならびに形態学的再分類が可能になり、テニア科条虫全体像が見え始めたこと、(3)ヒトへの病原性を異にするエキノコックス条虫種、有鉤条虫種内変異を確認したうえで、血清疫学を含む疫学調査が必要であることを初めて公表できたこと、(4)人体寄生テニア条虫は現在3種類が知られているが、アフリカ(エチオピア)から追加種の報告が予見できる成果が得られていること。2、総説原稿、原著論文共に、国際専門誌編集長から総説寄稿を要請される機会が増えていること。4、25年度業績としてすでに公表済みの国際専門誌に掲載された論文が21編(本報告書掲載)、現在採択され印刷中の論文4編、再投稿中総説1編、再投稿準備中論文3編、投稿中総説1編であること(本報告書に未掲載)。5、これらの研究成果により、本研究参加研究者への国際会議招聘(2013年度の国際会議での講演はすべて招待講演)が増えていること。概要に述べた如く、予想以上の成果、100点以上、200点くらいの成果が上がっている。現在、印刷中の業績の多さからも客観評価に十分耐えうる達成度と自己評価している。1ヒトへの最も病害性が高いタホウジョウチュウの北半球での地理分布と遺伝子多型について、これまで全く手が付けられなかった、ロシアとモンゴル、特にロシアでの研究が大きく展開し、地球規模で今後の流行を推測することも可能になると予測される。北半球で流行している多包虫症の病原体であるタホウジョウチュウでこれまで旭川医科大学が中心に確認している4種類の地理的
デザインされた誘発Dicによる微小核/クロモトリプシス形成過程の解析

電離放射線によるDNA二本鎖切断(DSB)が誘発するランダムな不安定型染色体異常である二動原体染色体(Dicentric Chromosome: Dic)の生物学的重要性は明らかではない。近年、不安定な異常染色体は間期に微小核(Micronucleus: MN)を形成し、さらにクロモトリプシス(染色体破砕)を起こして複雑に融合した安定な異常染色体となり、発癌に寄与することが示唆されている。Dicの同期的誘導を可能にするため、11番染色体CCND1遺伝子の5'側領域、14番染色体のIgH鎖Eμ領域の各々に特異的なgRNA配列をデザインし、効率よく切断が起きることを確認した。また、それぞれのゲノム領域に相同組換を用いてloxPを導入するための鋳型となるtargetting vectorを作成した。これらを用いて、CRISPR/Cas9による特異的な切断を起こし、相同組換によりそれぞれloxPをノックインしたHEK293細胞を作成した。loxPは、Dicおよび転座が生成されるようにKnock-Inベクターを2種作成し細胞株もそれぞれ作成した。Dicおよび転座の誘導は、GFPを共発現するCreレコンビナーゼを一過性に導入・GFP陽性細胞のセルソーター分離やTetOffによるCre誘導で行った。PCRにより転座の誘導は確認できたが、確率は0.1%以下と大変低く、またDicはさらに低頻度であった。転座誘導細胞については、細胞を純化しPCRやDNA配列解析によりloxPを介した染色体転座が起こっていることを確認できた。同期的に誘導された細胞を大量に回収し様々な解析に用いるため、Dic誘導細胞のみを単離できるマーカーをloxPとともに予め導入する実験系を計画した。当初予定していた、Cre/loxPのみで染色体異常を誘発する方法ではDicが生じる効率が低く、大量にDicをもつ細胞を得ることが難しい。そのため誘導された細胞のみを単離する方法に変更するために、相同組換の鋳型ベクターを再構築している。Dicが誘導された細胞を効率よく回収するために、現在、Dicが誘導された場合にのみプロモータートラップによりGFPが発現するよう、loxPとともにPGKプロモーターあるいはGFPを、11番および14番染色体にKnock-Inしておき、誘導後のGFP+細胞をソーティングすることによりDic生成細胞を単離し解析するべく、ベクターを構築中である。また染色体異常の標的領域や染色体の組み合わせについても検討を行っている。実験の効率を上げるために研究計画を変更したため、次年度使用額が生じた。変更した研究計画に基づき、次年度の助成金を使用する。
不全心のエネルギー効率改善法の開発:EmaxとPVAの応用

イヌ摘出交叉灌流心臓標本を用い、興奮収縮連関エネルギー(主にCa^<2+>ハンドリングに要する)を、心収縮性と関連させ解析した。我々は期外収縮後の一過性収縮性増強はある条件に合致するときのみ指数関数形減衰を呈し、その他は全て一過性交互脈形減衰であることを見い出した。一過性交互脈形減衰の経過について、期外収縮後x拍目の収縮性をyとすると、と表わされ、r^2=0.999±0.0002(mean±SD)という高い相関を得た。この式の第一項は心筋内Ca^<2+>再循環率(recirculation fraction:RF)に第二項は筋小胞体のCa^<2+>ハンドリングに関係するというモデルを考えた。RF=exp(-1/τe]として求め、Ca^<2+>並びにエピネフリンを冠動脈内投与して同程度のEmax(収縮性の指標)の上昇を得た時の2剤の収縮性の酸素コストに差は無いが、Ca^<2+>はRFを増加させエピネフリンでは不変であった。また機械的収縮のための総機械的エネルギーはPVAとして表わされ、興奮収縮連関及び基礎代謝に利用される酸素はPVA非依存性Vo_2と呼ばれる。定常一心拍当たりの酸素消費量を計測し興奮収縮連関による酸素消費量とRFとを組み合わせ、心筋細胞内外でハンドリングされる総Ca^<2+>量を推定し得た。さらに筋小胞体Ca^<2+>放出チャンネルを半開状態に固定する低濃度リアノジンを用いた病的心モデルではRFは減少した。このことは細胞膜を介した回路は筋小胞体を介した回路に比べ2倍のエネルギーを要することを考えると興奮収縮連関での酸素の浪費を説明できる。丸ごと心臓において、細胞内のCa^<2+>動態を評価する方法は他になく、不全心の病態生理の理解を深め、薬物の作用評価など臨床的にも応用できる手法と考えられた。これまで主として、イヌ摘出交叉灌流心臓標本を用いて、種々の収縮不全心を作製して、その前負荷、後負荷、収縮性を様々な方法で変えて、収縮性の指標のEmax(収縮期末圧容積関係の勾配)、心臓の発生する総機械エネルギーのPVA(圧容積面積)、さらには、心臓の一泊毎に消費する酸素消費量VO_2を測定算出した。VO_2-PVA関係は直線性を示し、勾配はPVAの酸素コストで逆数は収縮効率であるが、両者共、多くの収縮不全心で変わらなかった。また、Y-切片はPVAに依存しない酸素消費量を示すが、これは機械的に無負荷の状態でクロスブリッジのサイクリングに関与しない酸素消費と思われるが、全心臓標本では、完全な無負荷状態は得られないため、次に、ラット心臓の心筋スライス標本を作製し、完全な無負荷状態で電気刺激により自由収縮を行なわせた際の酸素消費速度を測定できる計測系を新たに確立した。この系で測定した酸素消費が、基礎代謝と興奮収縮連関でカルシウムを取扱うのに要するエネルギー消費からのみ構成されるかあるいは残渣的なクロスブリッジのサイクリングが起こっておりその為の酸素消費も含まれているのかを検討した。具体的にはクロスブリッジのサイクリングを選択的に抑制する2,3-butandione monooxime(BDM)を作用させても、心筋スライスの自由収縮による酸素消費速度は不変であったので、残渣的なクロスブリッジのサイクリングは起こっていないことが明らかになった。

また、外液カルシウム濃度を上昇させるとそれと比例して、心筋スライスの自由収縮による酸素消費は増加したので、自由収縮により増加した酸素消費は大部分興奮収縮連関でのカルシウムの取扱いに消費されるものと考えられる。今後、このカルシウムの取扱いに消費されるエネルギーは、イヌの実験等で予測されるような筋小胞体のカルシウムポンプによるものが大部分を占めるかどうかを検討する予定である。これまで主として、イヌ摘出交叉潅流心臓標本を用いて、種々の収縮不全心を作製して、その前負荷、後負荷、収縮性を様々な方法で変えて、収縮性の指標のEmax(収縮期末圧容積関係の勾配)、心臓の発生する総機械エネルギーのPVA(圧容積面積)、さらには、心臓の一拍毎に消費する酸素消費量(Vo_2)を測定算出した。Vo_2-PVA関係は直線性を示し、勾配はPVAの酸素コストで逆数は収縮効率であるが、両者共、多くの収縮不全心で変わらなかった。また、Y軸切片はPVAに依存しない酸素消費量を示すが、これは機械的に無負荷の状態でクロスブリッジサイクリングに関与しない酸素消費と思われるが、全心臓標本では、完全な無負荷状態は得られない。そこで新たに確立したラット心臓の心筋スライス標本で完全な無負荷状態で電気刺激により自由収ekを行なわせた際の酸素消費速度を測定できる計測系を用いて,酸素消費が基礎代謝と興奮収縮連関の消費からのみか,あるいは残存的クロスブリッジサイクリングの酸素消費も含まれているのかを検討した。クロスブリッジサイクリングを選択的に抑制する2,3-butandione monooxime (BDM)を作用させても,心筋スライスの自由収縮による酸素消費速度は不変であったので、残存的クロスビリッジサイクリングは起こっていないことが明らかになった。さらに,興奮収縮連関中のカルシウムハンドリングのどの程度が,効率の高い筋小胞体経由か,その半分の効率しかない形質膜経由かを定量するために,期外収縮後増強収縮の減衰時定数を求めて,細胞内カルシウム再循環率(RF)を計算した.その結果,正常心のRF=0.6に比べて,例えばリアノジン処理不全心ではRF=0.5にまで低下し,興奮収縮連関でのエネルギー浪費が起こり,結果的に心臓エネルギー効率が低下することなどが明らかとなった.イヌ摘出交叉潅流心臓標本を用い、興奮収縮連関エネルギー(主にCa^<2+>ハンドリングに要する)を、心収縮性と関連させ解析した。我々は期外収縮後の一過性収縮性増強はある条件に合致するときのみ指数関数型減衰を呈し、その他は全て一過性交互脈型減衰であることを見い出した。一過性交互脈型減衰の経過について、期外収縮後x拍目の収縮性をyとすると、と表わされ、r^2=0.999±0.002(mean±SD)という高い相関を得た。この式の第一項は心筋内Ca^<2+>再循環率(recirclation fraction : RF)に第二項は筋小胞体のCa^<2+>ハンドリングに関係するというモデルを考えた。RF=exp(-1/τe)として求め、Ca^<2+>並びにエピネフリンを冠動脈内投与して同程度のEmax(収縮性の指標)の上昇を得た時に二剤の収縮性の酸素コストに差は無いが、Ca^<2+>はRFを増加させエピネフリンでは不変であった。また機械的収縮のための総機械的エネルギーはPVAとして表わされ、興奮収縮連関及び基礎代謝に利用される酸素はPVA非依存性VO_2と呼ばれる。定常一心拍当たりの酸素消費量を計測し興奮収縮連関による酸素消費量とRFとを組み合わせ、心筋細胞内外でハンドリングされる総Ca^<2+>量を推定し得た。
蛋白質工学の手法を用いた芳香環開裂酵素の改良

本年度は、酵素の再活性化のための実験装置作成および再活性化実験と、酵素活性を高める目的で変異体酵素を作成した。(1)脱酸素装置の作成本酵素の活性には活性中心に二価の鉄イオンが必要である。酸素を含む大気下での実験では、この鉄イオンが容易に酸化されるために酵素活性は失われる。このため、活性能を高めることを狙ったいくつかの変異体の酵素活性を評価する場合、各酵素の鉄イオンが完全に二価の状態(活性化状態)になっている必要がある。そこで失活の原因となる酸素を酵素サンプルから取り除く装置を作成した。(2)不活性酵素の再活性化実験上記の脱酸素装置を用いて、大気下で精製したPheB酵素に対して再活性化実験を行ったところ、酵素活性が上昇した。現在、不活性化した酵素が全て再活性化できるような条件を検討しているところである。今後得られる再活性化条件を天然型および変異型PheB酵素に用いることにより、正確な酵素活性の比較を行うことが可能となる。(3)酵素活性を高めることを目的とした変異体酵素の作成PheB酵素とBphC酵素(PheB酵素と基質特性が異なる)の立体構造を比較したところ、BphC酵素の活性中心には、セリンプロテアーゼの水素リレーと類似した構造を形成していた。この水素リレーの形成は、BphC酵素の活性を高める働きをしていると考えている。一方、PheB酵素には、このような水素リレーを形成する構造を形成していない。そこで、コンピューターグラフィクス上のPheB酵素とBphC酵素の立体構造を照らし合わし、PheB酵素に水素リレーを形成できるような変異体を作成した。現在、(2)の再活性化条件を検討しだい、これら変異体酵素の酵素学的データを測定し、また同時にX線結晶構造解析を行う予定である。本研究は、高温菌由来のExtradiol型芳香環開裂二原子酸素添加酵素であるPheB酵素の高精度の立体構造をX線結晶構造解析の手法により明らかにし、すでに得られている酵素活性データ、基質特異性の異なるBphC酵素の立体構造と組み合わせて総合的に解析することで、基質特異性の起源と反応機構を立体構造に基づいて明らかにすることである。(1)本年度は、良質な結晶を得るために、ゲルを用いたPheB酵素の結晶化を試みた。現在、いくつかの結晶を得ており、X線回折による測定により分解能の向上を確認したい。今後、更に結晶化条件を最適化し、良質な結晶が得られる条件も探索していく。(2)基質特異性の起源を明らかにするために、コンピューターグラフィックスを用いたPheB酵素とBphC酵素の立体構造比較、及び他の基質特異性を有する酵素の酵素活性データとアミノ酸配列等を総合的に検討した。その結果、PheB酵素が有する高catechol分解能力に関わるアミノ酸を推定し、その変異体酵素を作成した。これらアミノ酸の一つは299番のフェニルアラニンで、catecholとの反応性が高いPheB酵素などが属するグループでは完全に保存しているものである。PheB酵素の立体構造上、この299番のフェニルアラニンは、基質ポケットとcatecholとの相補性に深く関わっているアミノ酸と考えられる。一方、catecholとの反応性が低いBphC酵素では、このフェニルアラニンは保存していない。現在、このフェニルアラニンをアラニンに置換した変異体PheB酵素を精製し、結晶化を行っている。また、この変異体酵素の酵素活性データも測定し解析中である。
自己組織化を階層的に利用したナノユニット集積型複合光触媒材料の創成

本研究課題では、前駆体から分子設計を行い、自己組織化などの手法を活用して無機ナノユニットを形態制御合成し、それらを階層的に組織化して複合化した高性能光触媒の開発を目指している。2年度目である2018年度においては、まず前年度に引き続き、液相プロセスを活用して、無機ナノユニットの形態制御合成について検討を行い、さらにそれらを可視光応答光触媒として期待される酸窒化物に転換する手法の開発を実施した。さらに、電気泳動堆積法を用いて、無機ナノユニットを導電性基材表面に集積する手法についても検討した。まず、無機ナノユニットの形態制御合成については、前年度のチタン系に加え、新たにニオブやタンタルの水溶性金属錯体等を用いて、それぞれのナノ酸化物の合成を行った。ニオブについては、水溶性ニオブ錯体と水酸化ストロンチウムを前駆体とした水熱合成によって層状ペロブスカイト化合物であるSr2Nb2O7が合成でき、得られた試料がナノロッドの形態を有していることを明らかにした。また同様に水溶性タンタル錯体を用いることで、Sr2Ta2O7を水熱法で合成できることを明らかにした。次に、これらの層状ペロブスカイト化合物を無機ナノユニットとして、尿素を窒素源に用いて酸窒化物に転換することを試みた。前年度に合成したLa2Ti2O7を用いた場合、水熱合成時に副生するLa(OH)3が共存した状態においてLaTiO2Nへの転換ができることが分かり、詳しく解析したところ、La(OH)3と尿素の反応によって中間体としてLa2O2CN2が生成しており、これが酸窒化物生成の鍵となっていることも明らかにした。Zn-Ga LDHナノ結晶を用いて、同様に尿素でGaN:ZnOへの転換を行ったところ、結晶子のサイズがナノレベルで維持されたGaN:ZnOができることも明らかにした。さらに、ポリカチオンを用いた電気泳動堆積法で無機ナノ粒子を配列を制御して基板上に集積化できることにも成功した。無機ナノユニットの前駆体となる水溶性金属錯体の合成を前年度までに完了し、それを活用して、水熱合成法を用いて、La2Ti2O7、Sr2Nb2O7、Sr2Ta2O7をナノロッドとして合成することができた。さらに比較対象とするために同物質を錯体重合法で合成することも研究分担者の協力のもとできている。さらにこれを用い、酸窒化物に転換するアプローチに関しても、La2Ti2O7からLaTiO2N、Sr2Nb2O7からSrNbO2Nへ尿素を窒素源に用いて実施し、成功している。この過程で、それぞれ、反応系に水熱合成時に複製するLa(OH)3やSrCO3が共存することが窒化反応に必須であり、その役割についても解明が進みつつある。また、Zn-Ga LDHナノ粒子を前駆体に用い、尿素を固体窒素源に用いてGaN:ZnOをナノ結晶として合成することにも成功している。電気泳動堆積法による導電性基材への無機ナノユニットの集積化においては、まずSiO2粒子をモデル物質に用い、種々の電着方法を検討した結果、ポリカチオンを用いることでカソード電着による製膜が可能であり、また、粒子分散媒のpHが粒子集積膜における粒子配列に影響を及ぼしていることも明らかにすることができた。さらに、Z-スキーム型複合光触媒を構成する酸化物であるSrTiO3やBiVO4なども合成し、また助触媒坦持も実施し、次年度における複合光触媒構築のための準備も予定通り進めることができた。以上を総合的に勘案し、本研究は当初の計画に対し、おおむね順調に進展していると判断している。本研究課題の最終年度となる2019年度は、まず無機ナノユニットを前駆体とする酸窒化物光触媒の新規合成法の開発に取り組む。これまでに合成法を確立したLaTiO2N、SrNbO2N、GaN:ZnOに加え、SrTaO2NやBaTaO2N、CaTaO2Nなどの合成にも着手する。さらに得られた物質の光触媒活性評価も順次実施していく。また、酸化物系においては、前年度までに合成してきたSrTiO3やBiVO4の粒子を混合して溶媒に分散させ、電気泳動堆積法を用いて導電性基材上に製膜して複合光触媒とすることを試みる。助触媒を坦持するほか、電子メディエータとなるITOナノ粒子などを組み込むことで性能の向上を図る。その他、ナノユニットの多様な組み合わせを検討したり、基板上での集積薄膜化に加え、コアーシェル粒子、ヤヌス型接合粒子など、機能発現に最適な複合形態を模索したりし、さらなる光触媒の高活性化を試みる。これらにおいては、研究分担者や研究協力者とも緊密に連携し、検討を進める。

まず、無機ナノユニットの形態制御合成については、前年度のチタン系に加え、新たにニオブやタンタルの水溶性金属錯体等を用いて、それぞれのナノ酸化物の合成を行った。ニオブについては、水溶性ニオブ錯体と水酸化ストロンチウムを前駆体とした水熱合成によって層状ペロブスカイト化合物であるSr2Nb2O7が合成でき、得られた試料がナノロッドの形態を有していることを明らかにした。また同様に水溶性タンタル錯体を用いることで、Sr2Ta2O7を水熱法で合成できることを明らかにした。次に、これらの層状ペロブスカイト化合物を無機ナノユニットとして、尿素を窒素源に用いて酸窒化物に転換することを試みた。前年度に合成したLa2Ti2O7を用いた場合、水熱合成時に副生するLa(OH)3が共存した状態においてLaTiO2Nへの転換ができることが分かり、詳しく解析したところ、La(OH)3と尿素の反応によって中間体としてLa2O2CN2が生成しており、これが酸窒化物生成の鍵となっていることも明らかにした。Zn-Ga LDHナノ結晶を用いて、同様に尿素でGaN:ZnOへの転換を行ったところ、結晶子のサイズがナノレベルで維持されたGaN:ZnOができることも明らかにした。さらに、ポリカチオンを用いた電気泳動堆積法で無機ナノ粒子を配列を制御して基板上に集積化できることにも成功した。無機ナノユニットの前駆体となる水溶性金属錯体の合成を前年度までに完了し、それを活用して、水熱合成法を用いて、La2Ti2O7、Sr2Nb2O7、Sr2Ta2O7をナノロッドとして合成することができた。さらに比較対象とするために同物質を錯体重合法で合成することも研究分担者の協力のもとできている。さらにこれを用い、酸窒化物に転換するアプローチに関しても、La2Ti2O7からLaTiO2N、Sr2Nb2O7からSrNbO2Nへ尿素を窒素源に用いて実施し、成功している。この過程で、それぞれ、反応系に水熱合成時に複製するLa(OH)3やSrCO3が共存することが窒化反応に必須であり、その役割についても解明が進みつつある。また、Zn-Ga LDHナノ粒子を前駆体に用い、尿素を固体窒素源に用いてGaN:ZnOをナノ結晶として合成することにも成功している。電気泳動堆積法による導電性基材への無機ナノユニットの集積化においては、まずSiO2粒子をモデル物質に用い、種々の電着方法を検討した結果、ポリカチオンを用いることでカソード電着による製膜が可能であり、また、粒子分散媒のpHが粒子集積膜における粒子配列に影響を及ぼしていることも明らかにすることができた。さらに、Z-スキーム型複合光触媒を構成する酸化物であるSrTiO3やBiVO4なども合成し、また助触媒坦持も実施し、次年度における複合光触媒構築のための準備も予定通り進めることができた。以上を総合的に勘案し、本研究は当初の計画に対し、おおむね順調に進展していると判断している。本研究課題では、前駆体から分子設計を行い、自己組織化などの手法を活用して無機ナノユニットを形態制御合成し、それらを階層的に組織化して複合化した高性能光触媒の開発を目指している。初年度である2017年度においては、無機ナノユニットの前駆体となる水溶性金属錯体の合成と、それらを利用した無機ナノユニットの形態制御合成を行った。まず、水溶性金属錯体については、研究分担者の冨田との連携のもと、チタン、ニオブ、タンタルの水溶性錯体の合成を行った。このうちチタンについては、これを前駆体として用い、水熱合成法によって光触媒としても利用可能なLa2Ti2O7をナノロッドとして合成することに成功した。
高熱伝導率及び低熱膨張係数を有する新型ヒートシンク材の開発

パワー半導体などで発生する熱を放散させるために、導電性の高いCu合金と熱膨張係数が小さいFe-Co-Cr系ステンレスインバー合金とのハイブリッド組織を形成する新型のヒートシンク材の開発を目指した。その結果、(1)粉末組織には、外側がCuリッチ、中心部がFe-Co-Cr系合金の卵型粉末やCuリッチ相とFe-Co-Crリッチ相との分散組織が得られた。(2)熱伝導率は焼結前の試料より焼結後の試料が高くなる事、さらにスパークプラズマ焼結法によって最も高い特性が得られた。(3) W添加の影響について調査した結果、熱膨張係数10.86pp m/K、熱伝導率46.7 W/m・Kが得られた。パワー半導体などで発生する熱を放散させるための放熱板(ヒートシンク材)は、基板との熱膨張係数差が小さくかつ熱伝導率の高い材料が求められる。そこで導電性の高いCu合金と熱膨張係数の小さいステンレスインバー合金(Fe-Co-Cr系)とのハイブリッド組織を形成し、両特性を満足させるための新しいヒートシンク材の製造法の開発に挑戦する。CuはFe,Co,Crいずれの系とも液相で2相分離を生ずるのでCu-Fe-Co-Cr系合金粉末は外側がCuリッチ、中心部がFe-Co-Cr合金の卵型粉末の形成が期待される。実際にCux(Fe0.37Co0.54Cr0.09)100-x(x=30,40,60,70)の合金粉末を作製した。その結果、次のことがわかった。1.x=30の試料では予想通り外側がCuリッチ、中心部がFe-Co-Cr合金の卵型粉末が得られた。またその他のx=30,40,70の合金粉末はCuリッチ相とFe-Co-Crリッチ相との分散組織が得られた。2.これらのハイブリッド合金粉末を焼結し、一部の試料については熱膨張係数と熱伝導率の測定を開始した。その結果、熱膨張係数はCuの比率が高いほど大きくなることが確認された。3.熱伝導率は、焼結前の試料より焼結後の試料のほうが高くなることが確認された。今後すべての試料について熱膨張係数と熱伝導率を測定し焼結や熱処理条件の影響も含め測定するとともに既存のCu-WやCu-Mo系ヒートシンク材との特性比較を行う予定である。当初の計画通り、ほぼ順調に研究が進展している。卵型粉末のみならずCuリッチ相とFe-Co-Crリッチ相との分散組織が広い組成で得られたことは予想外であるが、これらの特徴的な組織の特性評価も興味がある。また焼結の有無によって特性が変化することを確認できた。パワー半導体をはじめコンピュータの容量と動作速度の増加に伴い、Si、SiC、GaNなどの半導体から発生する熱を放散させる放熱板(ヒートシンク)が必要とされ、基板との熱膨張差が小さくかつ熱伝導率の高い材料が求められる。本研究は、このヒートシンク材に適した低熱膨張でかつ熱伝導率の高い材料を開発する事を目的とするが、導電性の高いCu合金は、熱膨張係数が高い(117ppm/K)のでそれを低下させるためにステンレスインバー合金(Fe-Co-Cr系)とのハイブリッド組織形成に挑戦する。本年度は、Fe-Co-Cr系合金をベースに熱膨張係数が低くまた熱伝導率が高いタングステン(W)を添加しその効果について調査した。その結果、次の事が判明した。2.これらの粉末を次の3条件で焼結を行った。(a)980°C、40MPaのホットプレス、(b)980°C、50MPaのホットプレス、(C)スパークプラズマ(SPS)焼結した。3.SPS焼結法によって最も良い特性が得られ、熱伝導率46.7W/m・K、熱膨張率10.36(×10E-6/K)を示した。5.W添加による効果は(Fe、Co、Cr)相のCu固溶度の減少ならびに、液相の2相分離促進によると推察される。卵型粉末組織だけでなく分散組織についても熱膨張係数と熱伝導率を測定する予定である。また焼結の有無が特性に影響を与えることがわかったので、焼結条件およびその後の熱処理条件によって両特性がどのように変化するかを測定する。これらのデータに基づき最適な焼結および熱処理条件を確立する。組織制御
南日本沿岸における熱帯産ベントスの北進：在来種への影響評価のための基礎研究

国内では、奄美群島、大隅諸島、小笠原諸島、南鳥島、九州沿岸、瀬戸内海、東北地方沿岸において、調査を行った。また、国外では、インドネシア(アンボン島)、オーストラリア北部で調査を実施した。そこで得られた新たな標本と研究室所蔵の過去の標本を合わせて、分類学的検討を行った。環形動物については、汽水産カワゴカイ同胞種群の北半球全体での分子系統に関する論文(南日本における特異な分布状況の記載を含む)など3編の論文を出版した。また、奄美群島の潮間帯における海産環形動物のこれまでの分布記録をまとめた総説1編を出版した。様々な動物と共生するカイアシ類については、6新種の記載を行った学術論文4編を出版し、3新種に関する報告2編を投稿した。また、先島諸島の海底洞窟から得られたカイアシ類2新種に関する論文を準備中である。これら以外にも、多くの本邦未報告種(未記載種を含む)を発見することができた。例えば、コヤナギウミウシとイボヤギミノウミウシをそれぞれ宿主とするウミウシヤドリ科カイアシ類は2種とも未記載種であり、本邦からわずか5種しか報告のない本科の重要な知見となりうる。刺胞動物については、奄美群島沿岸域から未記載のイソギンチャク1種、奄美群島以北での分布未記録のイシサンゴ目1種およびスナギンチャク目1種を新たに採集した。昨年度までに得られた標本群と合わせ、詳細な分類学的検討を進めている。本研究で得られた成果の一部を活用し、イソギンチャク目の分類体系に関する総説論文1編を出版した。また、本調査に伴って発見された底生性魚類1新種の記載論文1編と沖縄諸島以北分布新記録の十脚類1種の報告論文1編を出版した。これまでに国内では、八重山諸島(西表島)、沖縄諸島(沖縄島、久米島、沖縄トラフの深海域)、奄美群島各地(奄美大島、徳之島、沖永良部島、与論島)、トカラ列島(中之島)、大隅諸島(屋久島、種子島、口永良部島)、九州沿岸、瀬戸内海、東北地方沿岸、小笠原諸島父島列島、南鳥島において、野外調査を実施し、標本の収集を行った。また、国外では、マレーシア(トレンガヌ州)、インドネシア(アンボン島)、オーストラリア北部で調査を実施した。これらの調査で得られた新たな標本と研究室所蔵の過去の標本に基づいて、分類学的検討を進めている。一部の分類群については形態観察に加えてDNA解析も行っている。その結果、これまでに多くの新知見が得られている。これまでの成果は、2017年度中に、合計17編の学術論文、15件の国内・国際学会で公表し、2018年度中に、合計11編の学術論文、17件の国内・国際学会で公表している。昨年度に引き続き、本年度も各地において生物相調査を実施する。またこれまでの調査で発見された未記載種等について、順次、記載論文を完成させ、投稿する。環形動物については、奄美大島以南の南西諸島の小汽水域から発見されたゴカイ科の2未記載種の記載論文、九州・有明海における多毛類24種の10年間の分布変化についてまとめた論文、およびオトヒメゴカイ科とオフェリアゴカイ科の記載論文(共に南九州で新たに発見した知見を含む)を完成させる予定である。また、海岸の潮間帯に最も普通に見られるゴカイ科イソゴカイ属の九州と南西諸島における日本未記録種の分布状況を詳細に調べる予定である。カイアシ類については、これまで得られた標本類の種同定を行うことを最優先事項として取り扱う。また、これまで得られた種の中には琉球列島の最南部である八重山諸島と最北部付近である三島村海域でのみ発見されている種のように、分布域に空白がみられる可能性が高いものが存在している。これは、黒潮の流路による影響が大きいと考えられるが、今後はこれらに特に注目し、その分布パターンの把握を目指すことを念頭に置き野外調査を実施する。刺胞動物については、これまでに得られた標本の分子系統解析を含む種同定作業を進め、奄美大島およびトカラ列島浅海域における有藻性イシサンゴ類の種多様性を明らかにしたい。また、加計呂麻島沿岸の砂泥底、奄美群島南部(特に、徳之島ー沖永良部島)における海中洞窟などの暗環境、サンゴ礁における夜行性生物に着目することで、イソギンチャク目・スナギンチャク目の未記載種や日本未記録種のさらなる発見に努めたい。国内では、八重山諸島(西表島)、沖縄諸島(沖縄島)、奄美群島各地(奄美大島、徳之島、与論島)、トカラ列島(中之島)、および九州沿岸(鹿児島本土、有明海、八代海)において、調査を行った。また、国外では、マレーシア(トレンガヌ州)で調査を実施した。環形動物については、奄美大島以南の南西諸島の汽水域からゴカイ科の未記載種2種を発見し、それらを新属新種として記載する予定である(近日中に論文投稿予定)。それ以外にも少なくとも5種のゴカイ科の日本未記録種を発見した。それらの種(または近縁種)の参照標本をマレーシアの汽水域から得ることができ、形態観察とDNA解析を進めている。様々な動物と共生するカイアシ類については、6新種の記載を行った学術論文4編を執筆した(2編は受理済み)。

この他に、八重山諸島産のコモチハナガササンゴから、少なくとも3種の日本未記録種(または未記載種)を採集した。また、沖縄島周辺海域の4種のウミウシ類から未記載種と思われるRhynchomolgidae科およびPhiloblennidae科のカイアシ類4種を採集した。刺胞動物については、トカラ列島からスナギンチャク目未記載種1種、未記録種1種が採集された。また、10 m以浅に生息する有藻性サンゴ類51種が採集された(先行研究では15種のみ)。奄美大島周辺からは日本未記録と思われる2種および少なくとも北部琉球列島未記録の2種のイシサンゴ目が採集された。また、沖縄島と奄美大島の両沿岸海域からは、未記載種と思われるイソギンチャク目3種、スナギンチャク目2種も採集されている。上記のものを含む刺胞動物、特にイソギンチャク目は、分類群の同定に際して多くの解析が必要であるため、なお詳細な検討を進めている。国内では、八重山諸島(西表島)、沖縄諸島(沖縄島)、奄美群島各地(奄美大島、徳之島、与論島)、トカラ列島(中之島ほか)、および九州沿岸(鹿児島本土、有明海、八代海)において、調査を行った。また、国外では、マレーシア(トレンガヌ州)で調査を実施した。そこで得られた新たな標本と研究室所蔵の過去の標本に基づいて、分類学的検討を進めている。一部の分類群については形態観察に加えてDNA解析も行っている。これまでに得られた成果については、2017年度中に、合計17編の学術論文、15件の国内・国際学会で公表した。国内では、奄美群島、大隅諸島、小笠原諸島、南鳥島、九州沿岸、瀬戸内海、東北地方沿岸において、調査を行った。また、国外では、インドネシア(アンボン島)、オーストラリア北部で調査を実施した。そこで得られた新たな標本と研究室所蔵の過去の標本を合わせて、分類学的検討を行った。環形動物については、汽水産カワゴカイ同胞種群の北半球全体での分子系統に関する論文(南日本における特異な分布状況の記載を含む)など3編の論文を出版した。また、奄美群島の潮間帯における海産環形動物のこれまでの分布記録をまとめた総説1編を出版した。様々な動物と共生するカイアシ類については、6新種の記載を行った学術論文4編を出版し、3新種に関する報告2編を投稿した。また、先島諸島の海底洞窟から得られたカイアシ類2新種に関する論文を準備中である。これら以外にも、多くの本邦未報告種(未記載種を含む)を発見することができた。例えば、コヤナギウミウシとイボヤギミノウミウシをそれぞれ宿主とするウミウシヤドリ科カイアシ類は2種とも未記載種であり、本邦からわずか5種しか報告のない本科の重要な知見となりうる。刺胞動物については、奄美群島沿岸域から未記載のイソギンチャク1種、奄美群島以北での分布未記録のイシサンゴ目1種およびスナギンチャク目1種を新たに採集した。昨年度までに得られた標本群と合わせ、詳細な分類学的検討を進めている。本研究で得られた成果の一部を活用し、イソギンチャク目の分類体系に関する総説論文1編を出版した。また、本調査に伴って発見された底生性魚類1新種の記載論文1編と沖縄諸島以北分布新記録の十脚類1種の報告論文1編を出版した。
Rumination症候群の逆流生理の解明：シンチグラフィーを用いた動的病態評価

Rumination syndrome (RS)は食後に繰り返す胃内容物の食道内逆流と嚥下と定義される。胃食道逆流症の主な治療は胃酸分泌抑制薬であるが、これはRSには無効であり、治療抵抗性胃食道逆流症に数多く存在する。Acid pocketが胃食道酸逆流の主な寄与因子と考えられている胃食道逆流症と、胃内食残の逆流・嚥下を繰り返すRSは、病態そのものが異なり、詳細な動的病態理解は必須と考える。そこで、胃食道シンチグラフィー、食道胃内圧検査、食道pHインピーダンスモニタリングを用いて、動的側面からRSと胃食道逆流症の病態の違いを解明する。
オートフレーミング－主観的被写体検出と客観的美的尺度に基づく最適構図の自動決定

本研究では,撮影者の意図を汲みながらも最適な構図をもつ写真が自動で撮れるオートフレーミング手法の開発を行った.写真の構図に関する様々なルールを体得し,実際の撮影時に常に最適な構図を得ることは,素人には困難である.我々は,カメラのファインダー画像列を動画解析して撮影者の撮りたい被写体を特定する主観的評価に加え,その位置が構図として美しいかどうかを客観的な美的尺度に基づいて評価することによって,この問題をオンラインで解決する最適化アプローチを確立した.評価実験では、提案手法により生成した画像がユーザが手動で選択したベスト構図に近いことを確認することができた.本研究では,撮影者の意図を汲みながらも最適な構図をもつ写真が自動で撮れるオートフレーミング手法を開発することを目的としている.初年度に該当する平成26年度の前半ではまず画像構図の美的評価,画像をより構図のよいものへの変更,既存カメラ商品にあるオートフレーミング機能,および視線を利用した個人の注意の推定とその画像・映像処理への応用に関する既存研究を広く調査した.続いて,屋外での撮影実験を繰り返し実施し,ユーザがカメラを構えてからシャッターを切るまでの予備動作を調査・解析した.構図を探索しながら動かしている間の各フレーム画像におけるORB画像特徴点を抽出し,トラッキングによってフレーム間の位置合わせを行う方法,そしてフレーム画像を統合してマスター画像を作成する方法を実装した.撮影者がどうしても捉えたい部分はカメラ移動で得られる動画の多くのフレーム内に収まっているものと仮定し,この情報を利用して,マスター画像内の各領域がユーザの主観的被写体である確率を表すHeatMapを生成する方法も実装した.実装した方法では,各フレームについて,検出した特徴点での画素値を1,それ以外での画素値を0とする特徴画像を作成し,それをガウスカーネルと畳み込むことで,当該フレームのHeatMapを作成してマスター画像と統合する.被験者実験により,HeatMapにより予測された撮影者の関心領域は被験者の実際の関心領域とほぼ一致することを確認できた.本研究では,撮影者の意図を汲みながらも最適な構図をもつ写真が自動で撮れるオートフレーミング手法を開発することを目的とする。その実現に向けて、1.ユーザが構図を決めようとカメラを構えながら迷う期間中の画像列から撮影者の意図する構図を推定する主観的評価方法、2. 3分割法という美的尺度に基づき、構図として美しいかどうかを判断する客観的な評価方法、3.主観的と客観的の両方の評価尺度に基づき最適な画像を生成する、この3つの技術の設計・実装・評価を行った。開発した手法では、以下の3つのステップで結果の画像を生成する。ステップ1ユーザがシャッターを切るまで構図を決めかねている間の情報を動画として記録、一定間隔で画像をサンプリングし,特徴点マッチングとスティッチング処理によりて1枚の大きな合成画像を作成し、ユーザが見ている撮影世界を再現する.ステップ2各サンプリング画像においてORB特徴を時空間的に解析することによってユーザが撮ろうとしている被写体の構造情報を示すStructure Mapおよびユーザの意図する被写体領域をを示すFixation Mapを作成し,顔認識の処理を施したものも統合して,Master Mapを得る.ステップ3 Master Mapを基に,スティッチング後の合成画像から,最適サイズで最適位置においてトリミングが行われるよう探索を行い、ベストショットを得る.平成26年度はステップ1とステップ2のを実したのに対して、平成27年度はステップ3のアルゴリズムの設計と実装を行い、プロトタイプを完成させた後、評価実験を実施した。評価実験では20代の大学生9名に計34シーンを撮影したもらい、撮影者にスティッチング後の画像から手動で切り取ってもらった画像を正解として,提案手法で作成した画像との一致率を検証し、非常に良い結果が得られた。研究成果は国内の査読付きシンポジウムに採択された。本研究では,撮影者の意図を汲みながらも最適な構図をもつ写真が自動で撮れるオートフレーミング手法の開発を行った.写真の構図に関する様々なルールを体得し,実際の撮影時に常に最適な構図を得ることは,素人には困難である.我々は,カメラのファインダー画像列を動画解析して撮影者の撮りたい被写体を特定する主観的評価に加え,その位置が構図として美しいかどうかを客観的な美的尺度に基づいて評価することによって,この問題をオンラインで解決する最適化アプローチを確立した.評価実験では、提案手法により生成した画像がユーザが手動で選択したベスト構図に近いことを確認することができた.本研究の目的は,撮影者の意図を汲みながらも最適な構図をもつ写真が自動で撮れるオートフレーミング手法を開発することである.カメラのファインダー画像列を動画解析して撮影者の撮りたい被写体を特定する主観的評価に加え,その位置が構図として美しいかどうかを客観的な美的尺度に基づいて評価することによって,この問題をオンザフライで解決する最適化アプローチを確立する.平成26年度は当初予定していた動画解析して撮影者の撮りたい被写体を特定する主観的評価方法を確立することができた.画像処理平成27年度は26年度に開発した主観的評価方法と客観的な美的尺度の統合を実現し,最適構図画像の自動生成技術を実装する.さらに実機への移植も行い,多くの実験データを収集する.最後に成果をまとめた論文を国際会議または学術誌に投稿する.次年度に成果発表のための国際会議への参加が予定されているためである.初年度の研究成果をまとめた論文が国内会議に採択され,会議参加のための旅費に利用する予定である.
抗血管新生治療中における癌微小環境変化の解析

血管新生促進因子VEGFに対する中和抗体ベバシズマブが大腸癌に使用されているが、同治療中における癌の悪性化や治療抵抗性、治療中断後における腫瘍の急速増大が報告されている。本研究では、主にヒト大腸癌固形腫瘍TK4を用いたヌードマウス同所移植モデルを用いて、抗VEGF抗体治療中における癌微小環境の変化が大腸癌の進展に与える影響を解析した。長期の抗VEGF抗体治療によって腫瘍内低酸素が惹起され、hypoxia inducible factor-1 (HIF-1)の標的遺伝子であるstanniocalcin2 (STC2)の発現が上昇し、癌細胞の増殖能や遊走能が亢進することが示された。ヌードマウスの皮下で継代維持されているヒト大腸癌固形腫瘍であるTK4の同所移植モデルへ、抗VEGF中和抗体を投与したところ、腫瘍血管密度が低下し移植腫瘍が縮小したが、完全には増殖阻害されなかった。そこで同治療中の移植腫瘍(ヒト組織)における遺伝子発現変動をマイクロアレイ(human chip)にて解析した。抗VEGF抗体治療により移植腫瘍で発現が亢進した97遺伝子のうち、最も発現変化が大きかったstanniocalcin 2 (STC2)に注目した。STC2はHIF-1の標的遺伝子であり低酸素環境で発現が亢進すること、また上皮間葉移行(epithelial mesenchymal transition : EMT)を誘導することが報告されている。これらの背景に基づき、平成24年度は以下に示す研究を行った。1.TK4同所移植腫瘍におけるSTC2発現を免疫組織化学染色にて調べたところ、抗VEGF抗体治療群で有意にSTC2タンパクの発現亢進を認めた。3.腫瘍組織における癌幹細胞数の変化を、CD133およびCD44の免疫組織化学染色を用いて解析したが、抗VEGF抗体治療に伴う変化は確認されなかった。一方、ALDH1染色の検討では、抗VEGF抗体治療群で有意にALDH1陽性細胞の増加を認めた。4.抗VEGF抗体治療に伴う、腫瘍周囲の間質(マウス組織)における遺伝子発現変化をマイクロアレイ(mouse chip)にて解析し、癌微小環境が癌細胞に与える影響を検討したが、有意なデータは得られていない。近年、大腸癌に対する治療において抗血管内皮増殖因子(VEGF)抗体bevacizumabが用いられているが、同治療に対する耐性を生じ得ることが次第に明らかとなってきている。さらに、不完全な血管新生阻害により癌微小環境の変化を生じ、癌の悪性化が惹起される可能性も指摘されている。本研究は、bevacizumab治療中における癌微小環境変化の、大腸癌進展への影響を解析することを目的とする。ヒト大腸癌固形腫瘍TK4のヌードマウス同所(盲腸)移植モデルへ抗VEGF中和抗体を投与したところ、腫瘍が縮小し腫瘍血管密度が低下した。一方、抗VEGF治療群で一時は減少した核分裂像は、長期治療で回復し、治療によって一時誘導されたアポトーシスは長期治療で減少した。同腫瘍のマイクロアレイ解析では、低酸素で誘導される遺伝子群が抗VEGF治療群で有意に発現上昇しており、HIF-1の標的遺伝子であるSTC2の上昇が最大であった。大腸癌細胞株を用いた実験では、低酸素培養によりSTC2発現が上昇し、siRNAを用いたSTC2-knockdownにより、低酸素下での細胞増殖および遊走が抑制された。大腸癌臨床検体の解析では、bevacizumab治療群でSTC2が高発現であった。TK4をマウスの皮下に移植し、bevacizumab治療群、対照群に分け、治療開始後28,56,81日目に腫瘍を採取し同大にカットし、異なるヌードマウスの盲腸壁に累代移植した。56日後に盲腸移植腫瘍の重量を評価したところ、bevacizumab治療後の累代移植マウス盲腸移植腫瘍は、対象群に比べ有意に腫瘍が増大していた。以上の結果から、大腸癌に対する長期の抗VEGF抗体治療によって腫瘍内低酸素が引き起こされ、癌細胞の増殖や遊走に関与するSTC2発現の上昇を介して、腫瘍の更なる悪性化が惹起される可能性が示唆された。血管新生促進因子VEGFに対する中和抗体bevacizumab (Avastin)が大腸癌に使用されているが、耐性機構や同治療中における癌の悪性形質獲得が示唆されている。本研究では、抗VEGF抗体治療中における癌微小環境の変化が大腸癌の進展に与える影響を解析した。ヒト大腸癌固形腫瘍TK4をヌードマウスの盲腸壁に同所移植し、抗VEGF中和抗体治療を行ったところ、腫瘍の核分裂像は治療中期(14日)に減少したが、治療後期(35日)では差を認めなかった。

一方、アポトーシスは治療中期では差がなく、治療後期に減少した。治療後期に腫瘍を採取しマイクロアレイ解析したところ、低酸素で誘導される遺伝子群が有意に発現上昇しており、最も発現が上昇した遺伝子として、HIF-1の標的遺伝子であるstanniocalcin2 (STC2)が抽出された。大腸癌細胞株の検討では、低酸素培養によってSTC2発現が上昇し、STC2-knockdownによって低酸素下における細胞増殖および遊走が抑制された。TK4をマウスの皮下に移植し、治療開始後28,56,81日目に腫瘍を採取し同大に整え、異なるマウスの盲腸壁に累代移植し、二次移植の56日後に腫瘍量を評価した。抗VEGF抗体治療を受けた皮下腫瘍は、累代移植後のマウス盲腸壁における発育が有意に亢進していた。肝切除術前に化学療法が施行された、大腸癌肝転移14例(ベバシズマブ投与:4、非投与:10)におけるSTC2発現を評価したところ、ベバシズマブ投与群で有意にnecrotic areaが大きく、同周囲でSTC2発現が亢進していた。以上より、長期の抗VEGF抗体治療によって腫瘍内低酸素が惹起され、STC2の発現が上昇し、癌細胞の増殖能や遊走能が亢進することが、大腸癌の悪性化や治療抵抗性、治療中断後における腫瘍の急速増大などの一因である可能性が示唆された。26年度が最終年度であるため、記入しない。消化器外科学26年度が最終年度であるため、記入しない。当初の研究計画に従い遂行できており、negative dataもpositive dataも得られている。交付申請書に記載した研究計画を全て行い、良好な結果を得た。ヒト大腸癌固形腫瘍マウスモデルのみならず、大腸癌細胞株を用いたin vitro実験を行い、STC2の機能解析などを行っていく予定である。ヒト大腸癌固形腫瘍TK4のヌードマウス同所(盲腸)移植モデルを用いた抗VEGF中和抗体投与実験における、腫瘍間質の遺伝子発現解析等を行う予定である。実験関係の消耗品の購入に充てる。