hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
動脈硬化におけるプラーク破裂の分子機構に関する研究

^3H-エラスチンを基質としたエラスチン分解活性は線維性被膜と脂質コアに高い分解活性(1.5U/g重量以上)がみられた。以上、本研究によってプラーク局所における各種MMPsの発現・局在とMMPs由来の蛋白分解活性が明らかになった。粥腫性硬化巣(プラーク)破裂における平滑筋細胞/マクロファージとマトリックスメタロプロテアーゼ(MMP)の役割を検討した。本研究では新しく開発したFilm in situ Zymography(FIZ)法と免疫組織化学併用によってMMP活性化機構を解析し,次の成果を得た。1.プラークの肩領域では,主にマクロファージがMMP-1,MMP-2を産生し,MMP-3,MMP-9,TIMP-1,TIMP-2は平滑筋細胞,マクロファージからほぼ同程度に産生されている。3.脂質コアではMMP-1は主にマクロファージから産生され,MMP-2,MMP-3,MMP-9,TIMP-1,TIMP-2は平滑筋細胞,マクロファージからほぼ同程度に産生されている。4.FIZ法でプラークにおいて実際にゼラチン(MMP-1によって切断され,体温で変性したコラーゲン)が分解されていることが証明された。特にプラークの肩領域での分解活性が他の領域に比べて高く,マクロファージの産生するMMP-2によることが示された。以上,本研究によって各種MMP_Sがプラークを構成する細胞外マトリックスを分解し,プラークの脆弱化を引き起こすことが示された。特にプラーク破裂の好発部位である肩領域ではマクロファージの産生するMMP_Sが重要な役割を果すことが明らかとなった。今後,マクロファージおよび平滑筋細胞における各種MMP_Sの遺伝子発現調節機構を解析し,心筋梗塞,脳梗塞の原因となるプラーク破裂の予防に向けての研究を発展させたい。
ソコダラ科ヤリヒゲ亜属魚類の系統分類と形態進化：深海底生性魚類の浅海域への適応

ソコダラ科トウジン属ヤリヒゲ亜属魚類について、亜属レベルの分類体系と世界規模の種分類を、形態および遺伝的形質から再検討した。核DNAの系統解析の結果、伝統的に認められてきた本亜属は2つの明瞭なグループからなる側系統群であることが判明し、これらの2群は発光器、体側鱗、背鰭、色彩などの形態形質からも支持されるた。系統解析から再定義された狭義のヤリヒゲ亜属について、形態および遺伝的形質に基づき種分類を再検討し、既知の11有効種とインド-西太平洋域から5未記載種を認めた。本年度は,スミソニアン研究所(米国),国立台湾大学,国立海洋生物博物館(台湾),国立科学博物館,高知大学,および京都大学に保管されている博物館標本と組織サンプルの調査を行った.また,国内での標本採集(高知県と愛知県)に加え,現地研究者の協力を得て,台湾北東部および南西部,さらにベトナム南部で市場調査を行った.博物館標本の調査では,本亜属の種多様性が高い西部太平洋に重点を置き,この海域に生息する既知種のタイプ標本を重点的に観察した.一方,市場調査では,主に遺伝的分析に用いる組織サンプルを採取するとともに,生鮮時の色彩や発光現象を記録した.形態形質を検討したところ,伝統的に認められてきたヤリヒゲ亜属は,鱗の棘の形態や配列,発光器の構造,色彩,および頭部の被鱗域で大きく2つグループに分けられることが明らかになった.これらの2グループは,本研究で行ったミトコンドリアDNAの系統解析からも支持されたため,それぞれ独立した亜属に相当すると考えられる(このうち一方は新亜属となる).一方,種分類では,南シナ海およびオーストラリア東岸沖から未記載の可能性が高い2種を新たに確認した.本研究に関わる内容について,すでに4回の口頭発表を行っており(うち2つは国際シンポジウム,1つは招待講演),成果の公表に向けて投稿論文も複数執筆している.さらに,研究の課程で発見したトウジン属別亜属の1新種について記載論文を発表した.次年度に予定していた米国研究機関の訪問を前倒しして行ったため,今後のスケジュール調整が必要であるものの,標本の観察自体は着実に進んでいる.一方,本研究では,本属魚類の種多様性が高い東南アジア周辺を重点的に検討しなければならないが,国際シンポジウムへの積極的な参加を通し,現地研究者とのネットワークを構築することができた.また,海外の研究協力者を新たに得たことにより,遺伝的分析用の組織サンプルを当初の予想以上に充実させることができた.成果の公表も逐次行っており,研究はおおむね順調に進んでいる.本研究はソコダラ科のトウジン属に含まれるヤリヒゲ亜属を対象に,形態および遺伝情報を用いて(1)亜属レベルの分類を再検討すること,(2)種レベルの多様性を解明すること,(3)形態形質と生息水深との進化的な関連を明らかにすることを目的としている.2018年度はオーストラリア(シドニー,ダーウィン,ホバート),タイ(プーケット),台湾(台北)および中国(上海)の研究機関で所蔵標本を重点的に調査し,こらまで未観察のタイプ標本を精査するとともに,系統解析に必要な組織サンプルを入手した.その結果,計画の最終年度にあたる本年度までに,全名義種の形態的特徴が明らかになった.また,形態観察とDNAバーコーディングにより,オーストラリアと南シナ海から3未記載種が新たに確認され,全種について種同定に有用な識別形質が整理された.一方,前年度の形態的検討により,従来のヤリヒゲ亜属は2つのグループに分けられることが示唆されていたが,本年度実施したミトコンドリアDNAと核DNAの系統解析でも兼ね同様の結果が得られたことから,本グループは少なくとも2つの亜属に分かれると判断した(このうち一方は未記載の亜属となる).さらに,研究の過程で多数の標本を世界レベルで調査した結果,各種の分布域や生息水深について標本に基づく信頼度の高い分布情報を集めることができた.現在,これらの分布情報を形態観察と系統解析から得られたデータと合わせて解析している.本研究に関わる内容に関し,日本魚類学会でポスター発表を行うとともに,成果の公表に向けて投稿論文を複数執筆している.また,研究の過程で発見されたトウジン属の日本初記録1種について,論文を投稿して受理された.ソコダラ科トウジン属ヤリヒゲ亜属魚類について、亜属レベルの分類体系と世界規模の種分類を、形態および遺伝的形質から再検討した。オーストラリアなどの海外研究機関を訪問し,所蔵標本の調査を継続する.滞在先は標本の観察状況や現地研究者との調整によって変更する場合がある.また,遺伝的分析では,解析に用いるサンプルおよび遺伝子領域を充実させる.現在執筆中のものも含め,得られた成果を順次論文として発表する.29年度が最終年度であるため、記入しない。魚類系統分類学29年度が最終年度であるため、記入しない。
肝星細胞による加齢肝の肝再生能不全プロセスの解明と治療法の開発

高齢化社会において高齢者ドナー肝移植や高齢者の悪性腫瘍に対する肝切除術後肝不全の克服は重要な課題である。我々は加齢肝再生不全に対し、肝星細胞老化による機能不全に着目し検討を行った。加齢肝再生不全が加齢肝星細胞機能の低下に起因することなど新たな知見が得られ、肝星細胞制御によって、加齢肝機能低下を克服できる可能性がしめされた。今後は臨床応用に対する新規治療法開発に向けた研究を継続する予定である。肝星細胞による肝再生能不全プロセスの解明と治療法の開発1.加齢肝における背景肝内環境要因の解析:(1)マウス加齢肝再生の検討:Balb/cマウス4週令を若年群、40週令を加齢群とし、70%肝切除を施行し比較検討した。加齢群では術後肝障害(AST・ALT・LDH・T-Bil)が術後48時間以降、加齢群で有意に上昇し、術後24時間でHGF・CyclinA2、術後48時間でMet・CyclinD2が加齢群で有意に減少し、p16INK4a mRNAの有意な上昇は継続しており、肝切除術後加齢肝再生能の減弱が確認された。(2)ヒト加齢肝における解析:肝切除症例を若年群(<60歳:n=45)と高齢群(>70:n=54)に分類し、高齢群のp16が有意に高値で、肝切除術後再生率(術前/術後6ヶ月肝容積:VINCENT,Fuji Film)と有意に反比例した(R=0.6)。2.肝星細胞の肝再生への影響の検討(肝星細胞単離による解析)若年マウス及び加齢マウスから、濃度遠心分離でisolationした肝星細胞を用いて、肝再生関連因子(HGF, TGFβ)の発現を検討とするともに、若年・加齢肝星細胞の培養液(conditioned medium)を用いて、肝細胞を培養し、肝細胞増殖に与える影響を検討した。加齢肝星細胞では単離後24時間でHGF mRNAが低発現で加齢肝星細胞由来のConditioned mediumでは肝細胞増殖が低下しており(p<0.0001)、HGF濃度が低値であった。1.若年及び加齢肝星細胞機能解析若年・加齢C57BL/6雄性マウス肝から密度勾配分離法によりHSCを抽出。若年・加齢HSC活性化状態はHSC分離後24/48hr後までは加齢肝においてcytoglobin/αSMA mRNAが有意に高値であったが、分離後72hrで発現が逆転し、加齢HSCはすでに活性化状態にあるが、活性化反応は減弱していると思われた。また加齢HSCにおけるp16は有意に上昇、SMP30は有意に減弱し、HSCの老化も示唆された。さらに加齢HSCのHGF mRNAは分離後24hrで有意に低下し、medium内のHGF分泌も有意に低下しており、若年・加齢HSCによるconditioned mediumの若年肝細胞培養では、加齢群における肝細胞再生能(ki67 labeling index)が低い傾向を認め(p=0.15)、western blottingにおけるPCNA発現も加齢群が培養後48hrで低下していたことから、加齢HSCの機能低下による肝再生能への影響が示された。ただER stressマーカー(Xbp1/Atf4/Atf6/CHOP mRNA)発現には一定の傾向を認めず、加齢とER stressの関連を示すことができなかった。2.若年及び加齢肝星細胞における小胞体ストレス反応マウス加齢肝における加齢遺伝子発現とともに肝切除術後再生能の低下、肝障害の増強を確認するとともに、cyclin低下にみられる増殖能低下の影響がp16やSMP30などの加齢遺伝子の関与を解明した。また肝星細胞単離による星細胞機能解析において、HGF遺伝子発現・分泌低下認められ、加齢肝星細胞機能不全による加齢肝再生能の低下が示唆された。小胞体ストレスに関しては若年・加齢肝星細胞による違いを認めず、その反応性においても差を認めないことから、肝星細胞を介した加齢肝再生への関与は否定された。若年及び加齢肝星細胞機能解析(Mouse)若年・加齢C57BL/6雄性マウス肝から密度勾配分離法によりHSCを抽出したところ、加齢HSCにおいてvitamin A小滴が多数認められた。活性化状態はHSC分離後24/48hr後までは加齢肝においてcytoglobin/αSMA mRNAが有意に高値であったが、分離後72hrで発現が逆転しており、加齢HSCはすでに活性化状態にあるが、活性化反応は減弱していた。また加齢HSCにおける加齢マーカーp16は有意に上昇、SMP30は有意に減弱しており、HSCの老化も示唆された。

若年及び加齢肝星細胞機能解析(Human)70歳以上を加齢群(n=3)、50歳以下を若年群(n=2)とし、同様の手技でヒト肝星細胞を分離した。加齢マーカー(p16, SIRT1, SHC1)を解析したところ加齢群でSIRT1, SHC1が発現上昇している傾向を確認したが、TGF-βに関しては差を認めなかった。高齢化社会において高齢者ドナー肝移植や高齢者の悪性腫瘍に対する肝切除術後肝不全の克服は重要な課題である。我々は加齢肝再生不全に対し、肝星細胞老化による機能不全に着目し検討を行った。加齢肝再生不全が加齢肝星細胞機能の低下に起因することなど新たな知見が得られ、肝星細胞制御によって、加齢肝機能低下を克服できる可能性がしめされた。今後は臨床応用に対する新規治療法開発に向けた研究を継続する予定である。マウス加齢肝における加齢遺伝子発現とともに肝切除術後再生能の低下、肝障害の増強を確認するとともに、cyclin低下にみられる増殖能低下の影響がp16やSMP30などの加齢遺伝子の関与を解明した。さらにヒト加齢肝においても同様にp16の術後肝再生能低下に関与することが示された。また肝星細胞単離による星細胞機能解析において、HGF発現低下が認められ、加齢肝星細胞機能不全による加齢肝再生能の低下が示唆された。しかしながら、小胞体ストレスに関しては若年・加齢肝星細胞による違いを認めず、異なる経路により機能低下をきたいしている可能性がある。上記結果に加えて、今後は制御の可能性の探索とともに、若年肝の加齢肝細胞再生を確認した上で、加齢肝に対する若年肝星細胞投与による若返り効果の解析など、肝星細胞機能制御を推進していく予定である。さらにRho-kinase系を介したROSの制御やHDACシステムによる肝星細胞modulationの肝再生・傷害に与える影響について検討する予定としている。28年度が最終年度であるため、記入しない。医学薬学上記結果に加えて、今後は制御の可能性の探索とともに、加齢肝に対する若年肝星細胞投与による若返り効果の解析など、肝星細胞機能制御を中心に、さらに推進していく予定である。特にRho-kinase系を介したROSの制御やHDACシステムによる肝星細胞modulationの肝再生・傷害に与える影響についても検討する予定としている。計画書作成時に購入予定であった消耗品の価格変動のため28年度が最終年度であるため、記入しない。計画書作成時に購入予定であった消耗品の価格変動のため次年度への繰越額は消耗品に使用予定である28年度が最終年度であるため、記入しない。次年度への繰越額は消耗品に使用予定である28年度が最終年度であるため、記入しない。
新規水チャネルの脳における機能解析-脳浮腫発症機序の解明に向けて-

麻酔・集中治療領域において、脳障害にともなう脳浮腫はしばしば遭遇する重要な病態である。しかし、その発生機序は十分には解明されていなかった。いくつかの報告や申請者の研究により、水チャネルであるアクアポリン4(AQP4)が脳浮腫に深く関与している可能性が示唆されていた。一方、AQP4に次いで発現量が多いAQP9の機能は十分には解明されておらず、脳浮腫への関与も不明であった。本研究により、脳のアストロサイト(Ast)においては、p38 MAPKとNF-κBによりAQP9の発現が調節されていた。詳細な検討により、AQP9は損傷初期には発現が低下し、その後高発現へと転じることが分かった。以上より、脳浮腫発生時にはAQP4に加えてAQP9も大きな役割を果たすことを見出した。脳浮腫は頭部外傷、脳血管障害、脳腫瘍など様々な病態に随伴して発症し、現在の治療では調節ができず致命的となることも多い。その病態は、Astの膨化(水の移動による)とそれに伴う二次的神経細胞死と考えられている。しかし、その発生機序は十分には解明されていないのが現状である。近年の報告や申請者の研究により、水チャネルであるアクアポリン(AQP)が脳浮腫に深く関与している可能性が示唆されている。本研究では、脳に発現する新規水チャネル<アクアポリン9(AQP9)>の分布や機能を詳細に検討し、さらに脳障害時のAQP9の機能変化や脳浮腫発症への関与を検討する。これにより、脳浮腫発症機序の完全なる解明と新規脳浮腫治療法の開発へのヒントを得ることを目的とする。今年度の研究により、AQP9が全身臓器の中でも比較的抗発現していることを確認することができた。また、培養細胞による検討の結果、アストロサイトに特異的に発現していることが明らかとなった。現在、in vivoにおいて発現分布を組織染色により検討している。今後、その発現調節機構を解明していく。1. AQP9の発現調節機構の解明AQP9の発現調節機構を解明し、人為的発現調節を今後可能とすることを目的に検討を行う。代表的な細胞内情報伝達系や転写因子の阻害薬を使用し、AQP発現調節に中心的な役割を果たす細胞内情報伝達系あるいは転写因子を見いだす。AQP9の発現は、p38 MAPKにより調節されている可能性を見出した。2.培養アストロサイトにおけるAQP9発現抑制系の作成(研究分担浅井、祖父江)培養アストロサイトにAQP9 mRNAを阻害するRNAiを遺伝子導入し、AQP9の発現を低下させた培養細胞株の構築を試みた。RNAiを設計し、効率よくノックダウンできる塩基配列を検討中である。3.培養アストロサイトにおけるAQP9過剰発現系の作成(研究分担浅井、祖父江)AQP9の機能解析を後の実験で行うために、3.とは逆にAQP9を過剰発現したアストロサイト(Ast)の培養細胞株を構築するため、現在ベクターを作成中である。1.培養アストロサイトにおけるAQP9過剰発現系の作成AQP9の機能解析を後の実験で行うために、AQP9を過剰発現したアストロサイト(Ast)の培養細胞株の構築を試みた。AQP9遺伝子発現には、CAGプロモーターを用い、IRES配列をはさんでピューロマイシン耐性遺伝子を発現するpCAG-IPベクターを使用した。現在、遺伝子導入の効率が悪いため、導入の条件を検索しているところである。2.発現抑制系あるいは過剰発現系を用いたAQP9の機能解析AQP9発現抑制系細胞株あるいは過剰発現系細胞株を用いて機能解析を行った。AQP9発現抑制系細胞株では大きな細胞の形態、増殖能の変化は認められていないが、さらなる検討を要する。AQP9の機能が欠損しても、AQP4などの他のファミリーが機能を補完している可能性が示唆される。また、AQP9過剰発現系細胞株については、完全な確立ができていないため、検討はできなかった。3.培養アストロサイトに障害を与えた際のAQP9の発現・機能変化脳浮腫発症時にAQP9がどのように関与するかを明らかにすることを目的に行った。培養Ast低酸素・再酸素化モデルを用いて検討したところ、AQP9のmRNAと蛋白質量はともに低酸素により低下し、再酸素化により急速に増強した。虚血・再酸素化により、AQP9が増加することは明らかとなったが、その発現調節機能や機能的意義は不明であり、さらなる検討を要する。
ヒト嗅神経前駆細胞を用いた神経機能解析および中枢神経再生の検討

(1)動物嗅上皮から嗅神経前駆細胞(球形基底細胞:GBC)の単離と多能性神経幹細胞への脱分化の検討研究分担者らはこれまで、マウス嗅上皮組織から特異的抗体を用いた免疫染色法によってGBCマーカーのGBC-2を発現するGBCを同定し、さらに、嗅上皮の組織片培養を行うことにより、様々な細胞は混在するもののGBCの培養に成功した。そのうえで、GBCを単離し、神経幹細胞への脱分化の検討を行った。マウス嗅上皮を採取し、各種酵素処理によって単一細胞レベルまで分散させ培養する際、EGF、bFGF、LIFなど各種因子の添加について、また、血清条件など培養条件について、よりGBCの存在率が高くなり、さらに、より未分化な神経幹細胞の性質を有するようになる培養条件を検討した。また、嗅上皮を採取する前処理として、硫酸亜鉛処理することでGBCの回収率を上げることができた。しかし、現在のところ最適条件を見出すには至っていない。今後継続しこの細胞を用いて、脱分化の方法の確立を検討したい。(2)ヒト嗅上皮からのGBC単離と多能性神経幹細胞への脱分化の検討また、ヒト嗅上皮についても、免疫組織学的にGBCの存在場所の特定や、分離培養についても検討を行い、これまでにヒト嗅上皮については、免疫組織化学的に増殖細胞の特定を試みた結果、嗅上皮基底層に増殖細胞(Ki67陽性細胞)を確認することができ、ヒト嗅上皮においてGBCの存在場所を特定することができた。しかし、GBCの単離までには至らなかった。最近の知見より、体細胞の脱分化は今回行ってきた液性因子のみの操作では難しい例が多く、幹細胞やがん細胞に特異的に発現している遺伝子導入することで幹細胞様細胞を誘導することも報告されていることから、今後はこのような遺伝子操作技術も組み込んだ脱分化の検討を継続したい。鼻腔天蓋部の嗅上皮組織における嗅神経前駆細胞(球形基底細胞:GBC)を単離し、様々な神経細胞に分化する能力を持つ神経幹細胞に脱分化させ、移植による中枢神経再生の方法について検討することが本研究の目的である。そこで、本研究ではまず動物細胞を用いて検討を行った。その結果、マウス嗅上皮組織から特異的抗体を用いた免疫染色法によってGBCを同定することができた。さらに、Roisenらの方法(Roisen et al.,Brain Res.2001 890:11-22)にて嗅上皮の組織片培養を行うことにより、様々な細胞は混在するもののGBCの培養に成功した。しかし、neurosphereを形成させることによりGBCの単離、脱分化させることは成功しなかったため、現在、細胞分散法や血清条件など培養条件を変更することにより、GBCの単離・培養・脱分化について検討中である。また、ヒト嗅上皮についても、免疫組織学的にGBCの存在場所の特定や、分離培養についても検討を行った。長崎大学倫理規定委員会にて承認された方法を用いて、現在までに4例より嗅上皮の採取を行った。それら組織に対し、免疫組織化学的に増殖細胞の特定を試みた結果、嗅上皮基底層に増殖細胞(Ki67陽性細胞)を確認することができ、ヒト嗅上皮においてGBCの存在場所を特定することができた。マウスでの検討が終了次第、ヒト嗅上皮由来GBCの培養法についての検討を行う予定である。
過敏性腸症候群の未患者に対する携帯情報端末を用いた認知的介入は有効か？

本研究は,高頻度な消化器心身症である過敏性腸症候群(irritable bowel syndrome:以下IBS)を対象として,ストレス認知修正を意図した認知行動療法の技法適用の効果について検討し,non-patient IBSに対する発症予防的介入法の臨床的応用可能性を吟味することを目的とした。介入プログラムは12週間を1パッケージであり,認知的再体制化を意図した携帯情報端末上のワークシートへの取り組みを主とした。結果から,介入群では統制群に比して有意な症状の低下とQOLの向上が示唆され,本研究で用いられたプログラムは,治療的セルフコントロール技法として一定の有用性を持つことが推測された。本研究は,代表的な消化器心身症である過敏性腸症候群(Irritable Bowel Syndrome;以下IBS)の未患者(以下non-patient IBS)を対象として,心理的ストレス状況下における携帯情報端末を用いたリアルタイムでのストレス認知修正を意図した認知行動療法の技法適用が,どの程度症状低減効果を持つのか,ということについて検討することを目的としている。平成26年度は,(1)「成人を対象としたRome III診断基準を用いた対象者のスクリーニングと,ベースラインとしての症状,QOL評価や心理社会的背景をアセスメントする手続き」を行った。具体的には,抽出された対象者において心理的ストレス状況をあらかじめ設定し,各人が日常場面の中で携帯情報端末を用いて心理的・生理的状態の評価を行った。なお,計画は想定以上にスムーズに進んだため,本来平成27年度に実施予定であった,(2)「携帯情報端末上のワークシートを用いた心理的介入とその効果の検討」の一部を行った。介入はストレスモデル関連因子,特にストレス認知の修正を意図した認知的再体制化がメインであり,他に生活習慣改善のための心理教育も行われた。(1)の結果から,対象者においては心理的ストレス状況下におけるストレスモデル関連因子に特異性が認められ,これらの要因をコントロールすることでIBSの症状やQOLを改善することが出来る可能性が窺われた。また(2)については,平成26年度は介入期間におけるおおよそのデータ採取が終了し,引き続きフォローアップ期間のデータ採取を行うこととする。平成27年度は,平成26年度の後半に引き続き,「携帯情報端末上のワークシートを用いた心理的介入とその効果の検討」を行った。その裏付けとしては,平成26年度に行われた「成人を対象としたRomelll診断基準を用いた対象者のスクリーニングと,ベースラインとしての症状,QOL評価や,心理社会的背景をアセスメントする手続き」がある。具体的には,本検討の対象者においては,心理的ストレス状況下におけるストレスモデル関連因子に特異性が認められ,これらの要因をコントロールすることでIBS症状やQOLを改善することが出来る可能性が窺われたことがそれにあたる。平成27年度は本来最終年度の予定であったが,一部の対象者で介入期間中やフォローアップ期間に想定していた以上のドロップアウトがあり,追加での対象者リクルートとデータ採取の必要が生じた。そのため,フォローアップ期間と研究結果の公表までの時間的制約を考慮し,研究期間を延長し検討を続けることとなった。そのため,フォローアップ期間と研究結果の公表までの時間的制約を考慮し,研究期間を延長し検討を続けることとなったため。本研究は,代表的な消化器心身症である過敏性腸症候群(Irritable Bowel Syndrome;以下IBS)の未患者(以下non-patient IBS)を対象として,心理的ストレス状況下における携帯情報端末を用いたリアルタイムでのストレス認知修正を意図した認知行動療法の技法適用が,どの程度症状低減効果を有するのか,ということについて検討することを目的としている。平成28年度は,平成26年度の後半と平成27年度に引き続き,「携帯情報端末上のワークシートを用いた心理的介入とその効果の検討」を行なった。その裏付けとしては,平成26年度に行われた「成人を対象としたRomeIII診断基準を用いた対象者のスクリーニングと,ベースラインとしての症状,QOL評価や,心理社会的背景をアセスメントする手続き」がある。具体的には,本検討の対象者においては,心理的ストレス状況下におけるストレスモデル関連因子に特異性が認められ,これらの要因をコントロールすることでIBS症状やQOLを改善することが出来る可能性が窺がわれたことがそれにあたる。平成27年度は本来最終年度の予定であったが,一部の対象者でドロップアウトがあり,予定していたデータ数に満たなかったため,追加での対象者リクルートとデータ採取を行なった。そのため,平成28年度も引き続きデータ採取とフォローアップを行い,結果,本研究で用いられた心理的介入技法の有効性が一定程度示された。具体的には,介入期間全体においてIBS症状が有意に低減し,フォローアップ期間においても症状が改善した状態が維持されていた。

QOLに関しては介入中は不安定な経過をたどったが,フォローアップ期間には有意に改善していた。本研究は,高頻度な消化器心身症である過敏性腸症候群(irritable bowel syndrome:以下IBS)を対象として,ストレス認知修正を意図した認知行動療法の技法適用の効果について検討し,non-patient IBSに対する発症予防的介入法の臨床的応用可能性を吟味することを目的とした。介入プログラムは12週間を1パッケージであり,認知的再体制化を意図した携帯情報端末上のワークシートへの取り組みを主とした。結果から,介入群では統制群に比して有意な症状の低下とQOLの向上が示唆され,本研究で用いられたプログラムは,治療的セルフコントロール技法として一定の有用性を持つことが推測された。平成26年度は研究全体の大きな2つの柱である(1)non-patient IBSの心理的ストレス状況下における心理的・生理的状態の評価と,(2)non-patient IBSのストレス認知修正を意図した心理学的介入の効果,のうち,(1)のみを実施予定であったが,想定以上にスムーズに研究が進捗し,(2)の一部をも行うことが出来たため。研究期間は延長したものの,全対象者において直接的な介入期間自体は前年度内に終了しており,今後はフォローアップのデータ採取と結果の公表が研究活動の中核となる。フォローアップ期間が終了し次第,結果のとりまとめと解析,考察を迅速に行い,研究結果を関連学会を通じて国内外に発信することを予定している。ストレス疾患,心身症に対する認知行動療法の効果検討平成27年度は,大きな目的の一つである(2)non-patient IBSのストレス認知修正を意図した心理学的介入の効果について,携帯情報端末を利用し,申請者らが独自に作成した認知的再体制化ワークシートに取り組むことによって,消化器症状にどのような影響が及ぼされるのかを検討する。既に介入期間のデータ採取は概ね終了しているため,平成27年度はフォローアップ期間のデータ採取が中心となる。また,結果のとりまとめと解析,考察を早期に行い,研究結果を関連学会を通じて国内外に発信することを予定している。平成27年度は本来最終年度の予定であったが,一部の対象者で介入期間中やフォローアップ期間に想定していた以上のドロップアウトがあり,追加での対象者リクルートとデータ採取の必要が生じた。そのため,フォローアップ期間と研究結果の公表までの時間的制約を考慮し,研究期間を延長し検討を続けることとなったため。平成26年度は,想定していたよりも研究の進捗スピードが早かったため,前倒しにて調査を進めた。平成27年度は,このことに伴い,フォローアップデータ採取の残りを行うことになり,そのための残額が生じた。
シュミレーション解析を用いた糖尿病の病態解析と運動による糖代謝改善の機序の解明

血糖上昇に際しては、膵臓からのインスリン分泌(1)、インスリンによる骨格筋などの糖取り込みの促進(2)と肝糖放出の抑制(3)、血糖それ自身による糖取り込みの促進(4)と肝糖放出の抑制(5)など複数の機序が協調して作用を発揮する。本研究では、安定同位体標識糖負荷後の血糖とインスリン経時変化のシュミレーション解析から運動が糖代謝調節能を改善する効果の特徴を検討した。糖尿病患者、境界型糖尿病患者、運動習慣を持たない健常者および中高年マラソン愛好家に非放射性同位元素で標識した糖([6,6-^2H_2]glucose)を含むグルコース溶液を経静脈的に負荷し、3時間に渡って血糖、標識糖およびインスリン濃度の経時変化を測定し、これらをミニマルモデル・プログラムで解析した。糖尿病患者および境界型糖尿病患者においてはインスリン分泌あるいはインスリン感受性何れかが低下しておりインスリン依存性糖取り込みが低下していた。一方、インスリン非依存性糖取り込みの指標となるグルコース感受性(血糖それ自身による血糖の調節)は糖尿病患者および境界型糖尿病患者において低下しており、この機序の低下が糖尿病発症機序の要であることが示唆された。中高年マラソン愛好家はインスリン感受性およびグルコース感受性が高く、運動が耐糖能低下の主要な因子の一つであるグルコース感受性考も高める事を示唆した。しかし本研究の対象者の週間走行距離は75.6±8.7kmにも達しており、一般健常人あるいは疾病を有する中高年が遂行可能な運動においてもこのような効果が発揮されるかは今後の課題として残された。平成11年度は糖尿病患者の病態解析をするために、標識糖を用いた経静脈糖負荷試験を行い、ミニマルモデル・プログラムを用いたシュミレーション解析で1)膵臓のインスリン分泌能、2)末梢組織の糖利用を促進するインスリン感受性、3)末梢組織の糖利用を促進するグルコース感受性、および4)肝臓からの糖放出を定量的に検討した。合併症のない糖尿病患者20名は運動習慣をもたない健常者20名に比べ、インスリン分泌能の低下と末梢組織のインスリン抵抗性が顕著であり、末梢組織のグルコース感受性は比較的正常に保たれていた。肝臓からの糖放出は糖尿病患者では糖負荷直後(020分)の抑制が弱く、また負荷試験後半に健常者で見られた肝糖放出の昂進が認められない例が多く観察された。また、血中遊離脂肪酸濃度のも健常者に比べて小さかった。併せて中高年の長距離競走愛好家(49±2才、最大酸素摂取量52±2ml/kg/分、週間走行距離75±9km)の検査を開始し、運動週間が耐糖能に及ぼす影響についての検査を開始した。現在数名のランナーの検査が完了しているが、運動習慣のない同年令の健常者に比べて、インスリン感受性とグルコース感受性の上昇が顕著にみとめられている。更に、負荷試験後半に健常者で見られた肝糖放出の昂進が早期に大きくみとめられている。持久運動トレーニングが糖代を改善する機序を安定同意元素標識糖を用いた経静脈糖負荷試験の2-compartment minimalmodel解析により検討した。男性健常人に対する8名(15-25才)に乳酸閾値の強度の自転車エルゴメータ運動を60分間、週5日、6週間にわたって行なわせた。糖負荷試験はトレーニング前および最後のトレーニング終了16時間後及び1週間後に行った。6週間のトレーニングにより最大酸素摂取量は34%増大し、糖負荷試験により測定したインスリン感受性(トレーニング前:13.9±2.2、終了16時間後:18.3±2.4、終了1週間後:18.6±2.2x10^<-5> min^<-1>pM^<-1>)とグルコース感受性(トレーニング前:0.018±0.002、終了16時間後:0.024±0.001、終了

1週間後:0.023±0.002min^<-1>)は有意に増大した。この結果は、健常人においては、軽い運動であってもそれを持続することで糖代謝調節の主要な因子であるインスリン感受性とグルコース感受性を高めることが可能である事を示している。先の我々の研究(Diabetes 48:1054-1060,1999)において、糖尿病患者ではグルコース感受性とインスリン感受性の低下がインスリン分泌不全と重なって耐糖能低下の原因であることを示している。従って、今回、健常人において認められたトレーニングの効果、つまりグルコース感受性とインスリン感受性の改善が糖尿病患者やその予備群である耐糖能低下症の人々においても認められるか否かが次の研究課題となると考えられる。血糖上昇に際しては、膵臓からのインスリン分泌(1)、インスリンによる骨格筋などの糖取り込みの促進(2)と肝糖放出の抑制(3)、血糖それ自身による糖取り込みの促進(4)と肝糖放出の抑制(5)など複数の機序が協調して作用を発揮する。本研究では、安定同位体標識糖負荷後の血糖とインスリン経時変化のシュミレーション解析から運動が糖代謝調節能を改善する効果の特徴を検討した。糖尿病患者、境界型糖尿病患者、運動習慣を持たない健常者および中高年マラソン愛好家に非放射性同位元素で標識した糖(【6,6^<2>H_2】glucose)を含むグルコース溶液を経静脈的に負荷し、3時間に渡って血糖、標識糖およびインスリン濃度の経時変化を測定し、これらをミニマルモデル・プログラムで解析した。糖尿病患者および境界型糖尿病患者においてはインスリン分泌あるいはインスリン感受性何れかが低下しておりインスリン依存性糖取り込みが低下していた。一方、インスリン非依存性糖取り込みの指標となるグルコース感受性(血糖それ自身による血糖の調節)は糖尿病患者および境界型糖尿病患者において低下しており、この機序の低下が糖尿病発症機序の要であることが示唆された。中高年マラソン愛好家はインスリン感受性およびグルコース感受性が高く、運動が耐糖能低下の主要な因子の一つであるグルコース感受性をも高める事を示唆した。しかし本研究の対象者の週間走行距離は75.6±8.7kmにも達しており、一般健常人あるいは疾病を有する中高年が遂行可能な運動においてもこのような効果が発揮されるかは今後の課題として残された。
中枢神経系の発生と細胞分化過程における神経系特異的RNA結合蛋白質の役割の解析

神経系で発現している遺伝子の多くは,選択的スプライシングによる遺伝子産物の多様性の形成、RNAの安定性と翻訳調節、神経突起の先端へのRNA輸送といった転写後レベルでの発現調節により、複雑な神経系の発生過程と可塑性等において重要な役割を果していることが予想される。しかしながら、この神経系における転写後レベルでの発現調節機構に関与する遺伝子産物の機能や特異的RNA配列認識機構に関しては、殆ど知見がなかった。我々は、神経系における転写後レベルでの発現調節機構に関与する遺伝子産物の候補を以下のような方法により見出すことに成功した。1.ショウジョウバエ神経系特異的蛋白質musashi遺伝子産物ショウジョウバエ神経系に異常を有する変異体のスクリーニングにより、感覚器を含む神経系における細胞の分化・運命決定を制御している神経系特異的RNA結合性蛋白質をコードするmusashi遺伝子の同定を行った。musashi遺伝子は、外感覚器を構成する母細胞の非対称性分裂の制御し、母細胞から生ずる細胞の分化・決定に必要とされることが示された。2.ショウジョウバエmusashiに相同なmouse-musashi-1の単離と遺伝子産物の解析(クローニングおよびin vitroにおける機能解析)musashi遺伝子ファミリーの哺乳類神経系における役割を明らかにするために、low stringent hybridization法により、ョウジョウバエmusashiに相同なmouse-musashi-1 (m-msi-1)遺伝子のクローニングを行った。また、in vitroでNorthwestern法によりRNA結合能を明らかとした。(発現パターンの解析と予想される機能)m-Msi-1蛋白質の、成獣における発現パターンを検討したところ、神経系にほほ限局しており、小腸における幹細胞や卵巣を除く神経系以外の組織においては、発現がみられなかった。また、m-Msi-1蛋白質発現細胞の細胞型特異性を、組織切片および低密度の初代細胞の免疫組織化学的手法により検討したところ、中枢神経系では幹細胞(神経上皮細胞)のマーカーであるネスチンと同様に、中枢神経系の未分化幹細胞において特異的に発現しており、未分化幹細胞の非対称的分裂過程において、自己再生する幹細胞において強く発現していた。神経系に発現している遺伝子の多くは、選択的スプライシング等の転写後調節により遺伝子産物の多様性を形成し、遍在的に発現している遺伝子の中でも神経系における特有の構造と機能を獲得しているものが知られている。このような遺伝子産物の多様性の獲得だけでなく、neuriteへのRNAの輸送と局所における翻訳調節という形で、遺伝子発現の転写後調節は、複雑な神経系の発生過程と可塑性等において重要な役割を果たしていることが予想される。しかしながら、この神経系における遺伝子発現の転写後調節機構、特にそこに関与する遺伝子産物に関して殆ど知見がなかったが、最近、神経系において、遺伝子発現の転写後調節機構をおこなっている分子のcandidateである神経細胞特異的RNA結合性蛋白質をコードするmusashi遺伝子が、ショウジョウバエ神経系に異常を有する変異体のスクリーニングにより同定されている(Nakamura,Okano etal.Neuron,1994)。loss-of-function typeのmusashi変異体の表現型を解析結果より、ショウジョウバエmusashi遺伝子産物は、RNA結合性蛋白質として、post-transcriptional levelにおいて下流遺伝子群の発現を調節することにより、神経発生過程における細胞の運命決定特に感覚器母細胞の非対照的分裂を制御していると考えられる。更に我々は、より複雑で高次の神経系を有する哺乳類におけるmusashi遺伝子ファミリーの役割を明らかにするために、musashi遺伝子のマウス相同分子(mouse-musashi)の単離を行い、これも神経系特異的なRNA結合性蛋白質をコードすることを明らかにした。大腸菌体内で発現させたmouse-musashi遺伝子産物は、in vitroではNorthwesternブロット法により、polyGホモポリマーと結合するため、G-richな配列が下流標的配列であると考えられた。mRNAのin situハイブリダイゼーション、組織切片および低密度の初代培養細胞の免疫組織化学の結果、発育期の中枢神経系において、nestinと同様に中枢神経系の未分化幹細胞(CNSstem cell)において特異的に発現しており、分化した神経細胞においては殆ど発現していないことが明らかとなった。Mouse-Musashiは、このような発現パターンとショウジョウバエの相同分子(Musashi)との類似性から、神経系の幹細胞の非対称的分裂を起こすことにより、哺乳類神経発生過程における細胞の運命決定を制御していると考えられた。

2.ショウジョウバエmusashiに相同なmouse-musashi-1の単離と遺伝子産物の解析(クローニングおよびin vitroにおける機能解析)musashi遺伝子ファミリーの哺乳類神経系における役割を明らかにするために、low stringent hybridization法により、ョウジョウバエmusashiに相同なmouse-musashi-1 (m-msi-1)遺伝子のクローニングを行った。また、in vitroでNorthwestern法によりRNA結合能を明らかとした。(発現パターンの解析と予想される機能)m-Msi-1蛋白質の、成獣における発現パターンを検討したところ、神経系にほほ限局しており、小腸における幹細胞や卵巣を除く神経系以外の組織においては、発現がみられなかった。また、m-Msi-1蛋白質発現細胞の細胞型特異性を、組織切片および低密度の初代細胞の免疫組織化学的手法により検討したところ、中枢神経系では幹細胞(神経上皮細胞)のマーカーであるネスチンと同様に、中枢神経系の未分化幹細胞において特異的に発現しており、未分化幹細胞の非対称的分裂過程において、自己再生する幹細胞において強く発現していた。神経系で発現している遺伝子の多くは、選択的スプライシングによる遺伝子産物の多様性の形成、RNAの安定性と翻訳調節、神経突起の先端へのRNA輸送といった転写後レベルでの発現調節により、複雑な神経系の発生過程と可塑性等において重要な役割を果していることが予想される。しかしながら、この神経系における転写後レベルでの発現調節機構に関与する遺伝子産物の機能や特異的RNA配列認識機構に関しては、殆ど知見がなかった。我々は、神経系における転写後レベルでの発現調節機構に関与する遺伝子産物の候補を以下のような方法により見出すことに成功した。1.ショウジョウバエ神経系特異的蛋白質musashi遺伝子産物ショウジョウバエ神経系に異常を有する変異体のスクリーニングにより、感覚器を含む神経系における細胞の分化・運命決定を制御している神経系特異的RNA結合性蛋白質をコードするmusashi遺伝子の同定を行った。musashi遺伝子は、外感覚器を構成する母細胞の非対称性分裂を制御し、母細胞から生ずる細胞の分化・決定に必要とされることが示された。2.ショウジョウバエmusashiに相同なmouse-musashi-1の単離と遺伝子産物の解析(クローニングおよびin vitroにおける機能解析)
変異P型カルシウムチャネル由来のチャネル病の電気生理学的解析

P型Ca^<2+>チャネルをコードするα_<1A>サブユニットに変異が入り、ヒトでEpisodic Ataxia-2,家族性偏頭痛,SCA6等の中枢神経疾患が引き起こされる。また、テンカン及び小脳変性症のモデル動物であるtottering(tg)及びleaner(tg^<la>)マウスもP型Ca^<2+>チャネルをコードするα_<1A>サブユニットに変異があり運動失調症と痙彎発作/欠伸発作・脳波異常を示す。平成11年度の本申請研究でtg及びtg^<la>マウスのP型Ca^<2+>チャネルの機能が損なわれ、ヒトのSCA6でもP型Ca^<2+>チャネルが活性化されにくい事を明らかにした。本年度はtgとtg^<la>マウスの中間的な症状を示すrolling mousc Nagoya(tg^<rol>)の病因を解明する目的でα^<1A>サブユニット上の変異を見つけチャネル活性の変化を詳細に比較検討した。リピートIIIのセグメント4(S4)の3784番目のCがGに置換した結果、陽電荷を持つarginin(R)がglycine(G)に置換し電荷は中性化されていた。このS4はチャネルの電位センサーとして知られ、tg^<rol>はP型Ca^<2+>チャネルの電位依存性が変化していると予想された。急性単離プルキンエ細胞体のP型Ca^<2+>チャネル活性をパッチクランプ法で検討したところ、正常マウスの活性化曲線に比べtg^<rol>マウスの活性化曲線は傾きが緩やかで50%のチャネルが活性化される膜電位(V_<0.5>)は脱分極側に約10mV移動していた。更に、上記のR->Gの変異をα_<1A>サブユニットに導入し、BHK細胞にCa^<2+>チャネルのα_2とβサブユニットと共発現させ検討したところ、急性単離プルキンエ細胞体からのデータ同様に活性化曲線の傾きが緩やかになり、V_<0.5>は脱分極側に移動した。以上の結果より、P型Ca^<2+>チャネル活性の低下が小脳変性症の原因である可能性が強く示唆された。チャネルや受容体の研究分野への分子生物学の導入により、チャネルや受容体をコードする遺伝子の異常に起因する疾患(遺伝子異常症)が知られるようになった。電位依存性Ca^<2+>チャネルのうち、P型Ca^<2+>チャネルをコードするα_<1A>サブユニットに変異が入ることにより、ヒトでEpisodic Ataxia-2,Familiar Hemiplegic Migraine,SCA6等の中枢神経疾患が引き起こされることが報告された。また、テンカン及び小脳変性症のモデル動物であるtottering(tg)及びleaner(tg^<1a>)マウスもP型Ca^<2+>チャネルをコードするα_<1A>サブユニットに変異があり運動失調症と痙攣発作/欠伸発作・脳波異常を示すことが報告されている。しかし、これらの遺伝子異常症のP型Ca^<2+>チャネルの機能解析は行われていない。まず、tg及びtg^<1a>マウスのチャネル活性を検討した。

正常、tg及びtg^<1a>マウスから小脳Purkinje細胞を急性単離しP型Ca^<2+>チャネル電流を記録した。tg及びtg^<1a>マウスの電流密度は各々55%と37%に減少し、tg^<1a>マウスの活性化曲線が8.8mV、不活性化曲線が13.2mV脱分極側へ移動していた。次に、α_<1A>サブユニットに変異を導入した後、培養哺乳動物細胞(Baby hamster kidney細胞)に強制発現させたところ、Purkinje細胞で得た結果を再現できた。更に、SCA6(ポリグルタミン病)の病因を解明するために、α_<1A>サブユニットのC末に30個及び40個CAGを添加すると4個の物に比べ電流密度は変化しないが、不活性化曲線が13.2mV過分極側へ移動していた。このことから、SCA6の患者さんではCa^<2+>チャネル活性が低下していることが予想された。以上の様に、P型Ca^<2+>チャネル活性の減少が小脳変性症の原因になっていることが示唆された。P型Ca^<2+>チャネルをコードするα_<1A>サブユニットに変異が入り、ヒトでEpisodic Ataxia-2,家族性偏頭痛,SCA6等の中枢神経疾患が引き起こされる。また、テンカン及び小脳変性症のモデル動物であるtottering(tg)及びleaner(tg^<la>)マウスもP型Ca^<2+>チャネルをコードするα_<1A>サブユニットに変異があり運動失調症と痙攣発作/欠伸発作・脳波異常を示す。平成11年度の本申請研究でtg及びtg^<la>マウスのP型Ca^<2+>チャネルの機能が損なわれ、ヒトのSCA6でもP型Ca^<2+>チャネルが活性化されにくい事を明らかにした。本年度はtgとtg^<la>マウスの中間的な症状を示すrolling mouse Nagoya(tg^<rol>)の病因を解明する目的でα_<1A>サブユニット上の変異を見つけチャネル活性の変化を詳細に比較検討した。リピートIIIのセグメント4(S4)の3784番目のCがGに置換した結果、陽電荷を持つarginin(R)がglycine(G)に置換し電荷は中性化されていた。このS4はチャネルの電位センサーとして知られ、tg^<rol>はP型Ca^<2+>チャネルの電位依存性が変化していると予想された。急性単離プルキンエ細胞体のP型Ca^<2+>チャネル活性をパッチクランプ法で検討したところ、正常マウスの活性化曲線に比べtg^<rol>マウスの活性化曲線は傾きが緩やかで50%のチャネルが活性化される膜電位(V_<0.5>)は脱分極側に約10mV移動していた。更に、上記のR->Gの変異をα_<1A>サブユニットに導入し、BHK細胞にCa^<2+>チャネルのα_2とβサブユニットと共発現させ検討したところ、急性単離プルキンエ細胞体からのデータ同様に活性化曲線の傾きが緩やかになり、V_<0.5>は脱分極側に移動した。以上の結果より、P型Ca^<2+>チャネル活性の低下が小脳変性症の原因である可能性が強く示唆された。
薬物吸収動態の種差に基づいたｉｎ　ｖｉｔｒｏヒト薬物経口吸収性予測システムの構築

薬物の吸収過程に関与する多くの要因のうち、消化管上皮細胞に発現するトランスポーターによる輸送及び酵素による代謝は、極めて種差が大きくヒトでの予測が困難である。我々は、摘出腸管を用いたin vitro動物実験からヒトにおける経口薬物吸収性を予測するシステム構築の可能性を検証した。その結果、in vitro摘出腸管薬物膜透過試験によって、薬物膜透過性へのトランスポーターおよび代謝酵素の関与が評価できること、各種動物の組織を適用することにより膜透過の種差が評価できることを示した。効率的な経口剤開発を可能とするために、経口投与薬物の吸収動態の種差を明らかにし、in vitro動物実験からヒトにおける経口薬物吸収性を予想するシステムを確立することが本研究の目的である。摘出腸管を用いたin vitro実験法により、薬物の膜透過と同時に消化管内代謝を評価できること、in vitro代謝率は、in situおよびin vivo実験により求めた代謝率とは乖離があることをこれまでに明らかにした。本年度は、実験方法により結果が乖離する原因および薬物吸収動態の種差について検討した。ミダゾラムのラット腸管膜透過実験後のミダゾラムの分布を検討した結果、投与したミダゾラムの1割以上が腸管組織内に存在しており、薬物の組織内への滞留性が高いことが代謝酵素阻害の膜透過性への影響を弱め、in vitro実験において代謝率を低く評価してしまう要因であることが示された。また、ラットおよびカニクイザルの組織を本in vitro実験法に適用し、薬物の膜透過および消化管内代謝の種差について検討を行った。受動的に膜透過するアンチピリンおよびアテノロールは、ラットとサルでほぼ同程度の膜透過性を示した。ヒトCYP3Aの基質であるミダゾラムの膜透過過程での代謝率は、CYPの非選択的阻害剤アミノベンゾトリアゾールを用いて算出した結果、ラットでは10%であったのに対し、サルでは50%であった。P糖たんぱく質の基質としてジゴキシンを、阻害剤としてベラパミルを用いたトランスポーターについての検討では、ラットよりもサルの組織でP糖たんぱく質の薬物膜透過性への影響が大きいことが示された。本研究の結果を基に、さらに各種動物で検討を重ね、代謝や担体輸送などの程度の種差を評価すると共に、ヒトからの摘出腸管での検討を行うことで、薬物吸収の動物間種差の解析に基づいたヒト吸収性予測システムの構築に繋がると考える。まず、従来より膜透過性の評価に汎用されており、種によらず組織を利用できる摘出腸管を用いたin vitro実験法を用いて、薬物の膜透過と同時に消化管内代謝の評価を試みた。ヒトCYP3Aの基質であるミダゾラムやベラパミルのラット空腸膜透過性は、CYPの非選択的阻害剤アミノベンゾトリアゾール(ABT)の共存により増大した。この現象はCYP酵素の基質ではないとされるアンチピリンやアテノロールでは観察されず、また、代謝酵素の発言レベルが低いとされる結腸膜を用いた場合にも認められなかった。さらに、代謝阻害時にベラパミルの空腸膜透過性が結腸よりも高いとう部位差が観察されたが、これはP糖たんぱく質が多く発現する消化管下部において、ベラパミルの透過性が制限されるためと考えられる。これらの結果は、本評価法により、薬物の膜透過過程での代謝およびトランスポーターによる薬物輸送が評価できることを示していると考えられる。引き続き、本評価法の妥当性を検討するために、実際にラット消化管内に薬物を暴露するin situ実験および薬物を経口投与するin vivo実験により薬物代謝率を検討した。その結果、in vitro代謝率は、in situおよびin vivo実験により求めた代謝率とは乖離があったことから、今後、ABTによる代謝阻害効果や酵素活性の保持を念頭に実験条件を改善し、よりin vivoに近い状態を保った系の構築を行う必要があると思われる。初年度の研究実施計画通り、ラット摘出腸管を用いたin vitro実験により代謝酵素やトランスポーターが経口投与薬物の吸収に及ぼす影響を評価できる可能性を示すことができた。消化管粘膜に重層する筋層の剥離やリファレンス化合物としてアンチピリンおよびアテノロール併用の必要性など、実験条件の検討も行った。しかし定量的な観点からは、in situ実験やin vivo実験の結果と乖離が見られたことから、今後、実験条件のさらなる検討や生体組織側の要因など、その原因解明が必要であると思われる。また、当該年度には、トランスポーターおよび代謝酵素について網羅的でなく、臨床的にも薬物吸収に大きく関与しているとされているP糖たんぱく質およびCYPに絞って検討を行ったが、必要に応じて他の機能たんぱく質についても試験を行う予定である。経口投与薬物の吸収動態に関してin vivoとin vitroの実験結果が乖離する要因として、消化管組織の部位差や投与した薬物の消化管内移行等が考えられる。

そのため、ラットを用いての薬物消化管粘膜透過性の部位差や薬物経口投与後の消化管各部位における薬物濃度時間推移を評価し、その影響を検討する。また、これまでに用いている阻害剤の阻害効果の確認など、実験条件の再検討も行う。これまでにin vivo試験により数種薬物のカニクイザルのBAがヒトに比べて著しく低く、その原因としてトランスポーターによる排泄および消化管上皮細胞内での代謝が主な原因であることが報告されている。本研究で用いているUssing型拡散チャンバーは、筋層を剥離したサル消化管組織も適用可能である。そこで、ラットの試験同様に種々薬物のサル摘出腸管膜透過性をin vitroで測定し、サルにおいてBAが低くなる原因を明らかにする。同時に、本研究で構築したモデルを用いて、サル摘出腸管を用いたin vitro実験の結果からサルのin vivo吸収性を予測し、モデルの妥当性を検証し、種差を考慮したin vitro薬物経口吸収性の予測システムの構築を目指す。ラット、サルにおけるin vitro膜透過性試験の結果に、in vitro試験とin vivo試験の相違および消化管におけるトランスポーターおよび代謝酵素の活性種差等を考慮した薬物吸収予測モデルを構築し、その妥当性を検討する。当初、旅費および論文校正のための人件費・謝金を申請していたが、当該年度には実施できなかったため、「次年度使用額」が生じた。前年度の研究をふまえて、in vitro実験とin vivo実験の結果乖離の要因解析が必要であることが明らかとなったため、当初の申請に加えて、次年度は物品費の使用が増額すると考えている。