hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
アデノシンの神経伝達促通作用の分子機構の解明

脳に存在する物質であるアデノシン及びその誘導体は、中枢神経系の神経伝達に対しneur omodulat orとして作用し、上丘においては主として興奮作用をもつことが明らかにされている。本研究課題においては、この神経伝達促進作用の機構を解明することにある。平成7年度は(1)その機構解明の1つとして、in vivo系においてアデノシンによるグルタミン酸放出が直接的に興奮作用に結びつくかについて検討した。すなわちin vivoラットにおいて、アデノシンデアミナーゼ阻害剤であるEHNAを腹腔内投与すると、マイクロダイアリシス法で定量した上丘でのグルタミン酸の放出が170%に増大した。一方、視神経刺激で上丘浅灰白質層に誘発されるシナプス電位の振幅は、上丘グルタミン酸放出の増大とともにもとの130%に増大し、in vivoにおいてもアデノシンの局所的な増加が興奮性伝達物質であるグルタミン酸の放出を増大させ、上丘浅灰白質層での神経伝達を促通していることが明かとなった。(2)アデノシンがシナプス後性に興奮性作用をもつかどうかについて検討するため、上丘浅灰白質層からニューロンを単離し、その培養細胞に対するアデノシン及びその誘導体を作用させ、チャンネルレベルのアデノシンの効果をパッチクランプ法にて調べた結果、シナプス後性にはK^+電流を増大し、その受容体はP2プリン受容体であることが明かとなり、上丘においてはシナプス後性のアデノシンの作用としては海馬と同様の抑制機構が存在する可能性が示された。平成8年度は上記平成7年度の実績に基づき、上丘におけるアデノシンの興奮性効果がアデノシンのどの受容体を介して惹起されているかを明らかにするために、ラットを用いてEHNAによる興奮性効果がA1、A2アンタゴニストで抑制されるかどうかを検討した。EHNAによって上昇するアデノシンによる興奮性効果は、A1受容体アンタゴニストであるDPGPXの前投与によって抑制されないが、A2アデノシン受容体アンタゴニストであるKF17837によって抑制された。さらにRT-PCR法によってA2アデノシン受容体mRNAが上丘に存在することが確認された。これらの事実は、上丘における神経伝達が内因性のアデノシンによって促通されること、その促通効果はアデノシンのA2受容体を介して惹起されることが明らかとなった。脳に存在する物質であるアデノシン及びその誘導体は、中枢神経系の神経伝達に対しneuromodulatorとして作用し、上丘においては主として興奮作用をもつことが明らかにされている。本研究課題においては、この神経伝達促進作用の分子機構を解明することにある。本年度は(1)その機構解明の1つとして、in vivo系においてアデノシンの局所的な増加が直接的に興奮作用に結びつくかについて検討した。すなわちin vivoラットにおいて、アデノシンデアミナーゼ阻害剤であるEHNA(25mg/kg)を腹腔内投与し、上丘でのアデノシン量を測定すると、その量は2.6倍に増大した(25.5mg/g蛋白→68.3mg/g蛋白)。逆にアデノシンの代謝産物であるイノシン量は、1/4に激減した。

この時、上丘表面での脳脊髄液のアデノシン濃度は1.5倍に増大した。一方、視神経刺激で上丘浅灰白質層に誘発されるシナプス電位の振幅は、上丘アデノシン濃度の増大とともにもとの130%に増大し、in vivoにおいてもアデノシンの局所的な増加が上丘浅灰白質層での神経伝達を促通していることが明かとなった。(2)アデノシンがシナプス後性に興奮性作用をもつかどうかについて検討するため、上丘浅灰白質層からニューロンを単離し、その培養細胞に対するアデノシン及びその誘導体を作用させ、チャンネルレベルのアデノシンの効果をパッチクランプ法にて調べた結果、シナプス後性にはK^+電流を増大し、その受容体はP2プリン受容体であることが明かとなり、上丘においてはシナプス後性のアデノシンの作用としては海馬と同様の抑制機構が存在する可能性が示された。現在アデノシンのシナプス前性への興奮性効果の機構を検討するためスライススパッチによる解析を進め、平成8年度にはその機構の解明に大きな進展が見られる予定である。脳に内在する物質であるアデノシン及びその誘導体は、中枢神経系の神経伝達に対し抑制性と興奮性のneur omodulatorとして作用しているが、上丘においては主として興奮性効果をもっている。本研究課題は、上丘におけるアデノシンの神経伝達促通作用の機序についてその分子機構を解明することである。平成7年度の研究で、ラットにアデノシンの分解酵素であるアデノシンデアミナーゼ阻害薬(EHNA)を投与して、上丘の内因性アデノシンの上昇によって神経伝達が促通されることが確認されたが、その成果に基づいて平成8年度はこの促通作用がアデノシンのどの受容体を介してなされるかその分子機構を検討した。すなわち、ラットin vivoで上丘浅灰白質層より視神経の刺激で誘発されるシナプス電位(C1,C2波)を記録した。EHNAを10mg/kgi.p.投与すると上丘表面(第4脳室)に貯留する脳髄液中のアデノシンの濃度は3倍にも増加し、この時シナプス電位の振幅は150%に増大した。EHNA投与前にアデノシンA1受容体アンタゴニストであるDPCPX,A2アンタゴニストであるKF17837を投与しておくと、KF17837の前処理によってシナプス電位の振幅の増大は抑制されるが、DPCPXはEHNAの興奮作用に変化を及ぼさなかった。これらの事実は上丘におけるアデノシンの興奮性効果が、アデノシンのA2受容体を介してなされていることを示している。さらにRT-PCR法を用いて上丘にはA2アデノシン受容体mRNAの存在することを確認した。これらの結果によって上丘におけるアデノシンによる神経伝達促通作用はアデノシンのA2受容体を介してなされることが明らかとなった。
高速プロジェクタ・カメラを用いたモバイルユーザインタフェースの研究

プロジェクタを搭載するモバイル端末のためのユーザインタフェースの開発を行った.プロジェクタつきモバイル端末の動きに関わらずに投影対象平面座標系て固定された映像を提示するためのシステム開発を行うとともに,そのようなシステムを利用する際にモバイル端末の動きを入力操作に活用するユーザインタフェースの開発を行った.具体的には,高フレームレートで映像を座標変換する機能を持つプロジェクタの開発,モバイル端末と投影平面との間の幾何学的拘束を利用したモバイル端末の位置姿勢推定手法の開発,モバイル端末の姿勢やダイナミックな動きを活用する操作インタフェースの開発を行った.プロジェクタを搭載するモバイル端末のためのユーザインタフェースの開発を行った.プロジェクタつきモバイル端末の動きに関わらずに投影対象平面座標系て固定された映像を提示するためのシステム開発を行うとともに,そのようなシステムを利用する際にモバイル端末の動きを入力操作に活用するユーザインタフェースの開発を行った.具体的には,高フレームレートで映像を座標変換する機能を持つプロジェクタの開発,モバイル端末と投影平面との間の幾何学的拘束を利用したモバイル端末の位置姿勢推定手法の開発,モバイル端末の姿勢やダイナミックな動きを活用する操作インタフェースの開発を行った.本年度は,高速プロジェクタ・カメラシステムのハードウェア部の開発を進めるのと並行して,プロジェクタ・カメラ位置姿勢推定アルゴリズムや映像提示方法,および実現可能なユーザインタフェースの基礎的な検討を行った.プロジェクタ・カメラ位置姿勢推定アルゴリズムの開発に関しては,自身によって平面に投影された既知パターンの観測によって,プロジェクタ・カメラ位置姿勢のうち決定可能な3自由度を求め,低自由度の状態推定問題に帰着する方法の検討を行った.また,直接決定可能な3自由度の精度に関する実験的評価を行った.高速投影による動きぼけ低減に関しては,倍速駆動法とフレーム分割法による動きぼけの定量評価を行い,動きぼけが視認性を妨げないために必要となるフレーム分割数を明らかにした.高速DMDプロジェクタ用ファームウェア開発については,DMD制御ボード上に格納された映像データを,外部から動的に指定されたパラメータに基づいて高速平行移動させる投影パターン制御回路を実装した.また,任意の透視投影変換を実現するための実装方式について検討し,演算量を削減するための近似計算アルゴリズムを開発した.ダイナミックな入力インタフェースに関しては,モバイルプロジェクタの向きを利用した投影コンテンツ操作手法の評価を行うとともに,プロジェクタの向きと投影面の向きの両方を利用した投影コンテンツ制御や,高速ビジョンを用いた対象運動予測に基づく情報提示手法の開発を行った.本年度は,これまで開発を行ってきたシステムの評価と改良を進めるとともに,ユーザビリティ評価およびデモンストレーションシステムの実装を行った.高速プロジェクタシステムのDMD制御ファームウェアに関しては,前年度までに開発した近似透視投影変換の実装におけるパイプライン構成を見直してさらなる高速化を図り,毎秒1300フレームの座標変換および映像投影を実現した.これにより,スクリーン平面とプロジェクタ間の任意の相対位置姿勢に対応して映像を高速に幾何学的補正を加えることが可能となり,また任意の仮想的相対位置姿勢をシミュレートした映像投影を行うことが可能となった.プロジェクタ搭載型携帯端末の動きを利用したユーザインタフェースの評価およびデモンストレーションに関しては,前年度に検討した映像コンテンツ検索・再生操作インタフェースのユーザビリティ評価を行った.具体的には,上下左右方向の2自由度のカーソル移動に加えて,プロジェクタを回転させる自由度を操作に用いることにより,操作性を向上させられる可能性があることを示した.また,端末のダイナミックな動きをさらに活用するユーザインタフェースを開発した.投影される映像内のコンテンツのうち,スクリーン座標系に固定されるコンテンツと端末とともに動くコンテンツの相互間にダイナミクスを導入することで,より直観的で快適な操作の実現をねらうものである.具体的にはコンテンツを跳ね飛ばす動作を活用するユーザインタフェースを開発し,オブジェクト操作やスクロール操作等に応用するデモンストレーションを実装した.本年度は,高速プロジェクタ・カメラシステムのハードウェア部の開発を進めるのと並行して,プロジェクタ・カメラ位置姿勢推定アルゴリズムの具体的実装と評価を行うとともに,プロジェクタ・カメラシステムの動きを利用するユーザインタフェースの具体的なアプリケーションを想定した検討を行った.高速プロジェクタ・カメラシステムのハードウェア開発に関しては,前年度検討を行った動きぼけ低減のために必要なフレーム分割数と必要なフレームレートを考慮しながら,前年度に開発した透視投影変換の近似計算手法の具体的な実装方法を検討した.その結果,変換に必要な除算のうちの大部分を削除できるとともに,他の算術演算もすべて固定小数点精度での現実的な実装が可能であることがわかり,これを実際にDMD制御ボード上のFPGAに対して実装した.プロジェクタ・カメラ位置姿勢推定アルゴリズムに関しては,代表的なSLAM (Simultaneous Localization And Mapping)アルゴリズムの複数に対して,前年度検討した推定自由度削減を適用し,それらの推定精度向上と計算時間削減量の定量的評価を行った.プロジェクタ・カメラシステムの動きを利用するユーザインタフェースに関しては,プロジェクタ・カメラを搭載した携帯端末によって映像を表示する状況を想定して,映像コンテンツの検索・再生操作をプロジェクタ・カメラシステムの姿勢及び向きを利用して行うインタフェースの検討を行った.本年度の研究実施計画の各項について成果が得られており,目標達成に向かっておおむね順調に進行していると考える.25年度が最終年度であるため、記入しない。本年度の研究実施計画の各項について成果が得られており,目標達成に向かっておおむね順調に進行していると考える.DMD制御ファームウェアの開発を進めて任意の透視投影変換が可能な高速プロジェクタ・カメラシステムを実装するとともに,基礎検討を進めてきたプロジェクタ・カメラシステムの位置姿勢推定手法,映像投影手法の具体的実装を行う.

これらと並行して,携帯端末の動きを利用したユーザインタフェースについてもより具体的なアプリケーションを想定した検討と評価を進める.25年度が最終年度であるため、記入しない。DMD制御ファームウェアの開発を進めて任意の透視投影変換が可能な高速プロジェクタ・カメラシステムを実装するとともに,基礎検討を進めてきたプロジェクタ・カメラシステムの位置姿勢推定手法,映像投影手法の具体的実装を行う.これらと並行して,携帯端末の動きを利用したユーザインタフェースについてもより具体的なアプリケーションを想定した検討と評価を進める.
仮想壁で姿勢を安定化：仮想インピーダンスと振動刺激による歩行時立位姿勢の保持支援

本研究では,あらゆる空間でLight touch contact (LTC)の効果を被験者に与える方法論としてVLTC法を考案した.LTCはわずかな力(1N以下)でカーテンなどに触れることで立位・歩行時の重心動揺が低下する現象である.提案法は,人間の周りに仮想的な慣性,粘性,剛性を有する仮想壁を作ることで,被験者が仮想壁に接触した際の反力推定を可能とし,推定反力を振動として被験者にフィードバックしてLTCの効果を被験者に与える.提案法を用いて被験者の立位や歩行状態を評価した結果,通常の立位や歩行状態に比べてLTC,仮想LTC状態が被験者の重心動揺を有意に低下させることを明らかにした.LTCはわずかな力(1N以下)でカーテンなどに触れることで立位・歩行時の重心動揺が低下する現象である.まずあらゆる空間でLTCの効果を与えるため,人間の周りにインピーダンスパラメータ(仮想慣性,仮想粘性,仮想剛性)を有する仮想的な壁を作り,被験者が仮想壁に触れた際の仮想反力の推定を可能とした.具体的には,3次元モーションキャプチャやKinectを用いて体幹および指先の3次元位置を計測し,微分フィルタを用いて速度,加速度を算出する.そしてインピーダンスパラメータを用いた運動方程式により,手先に発生する反力を壁への侵入量,速度,加速度からリアルタイムで推定可能とした.さらに,推定反力を小型の振動デバイスを用いてフィードバックするため,推定反力を振動刺激振幅に対応させた比例制御を実施し,反力に応じた刺激の提示を可能とした.また健常者数名の立位評価実験を実施し,タンデム立位,紙に触れた状態の立位(LTC立位),提案法(仮想LTC立位)の比較を行った.フォースプレートを用いて計測した足圧中心(Center of pressure: COP)から,タンデム立位に比べてLTC立位,仮想LTC立位が被験者の重心動揺を有意に低下させることを明らかにした[MHS2013など口頭発表].また,評価指標から立位機能の定量的な評価を実施するためには,特徴量から運動機能状態を推定する方法論や,立位状態を表現するモデルが必要である.本年度は2つの従属な入力ベクトルから同時事後確率を推定可能なニューラルネットを考案し,動作識別へ応用した[SICE論文誌掲載].また,指運動や歩行などのリズム運動を再現するモデルを考案し,パーキンソン病の評価へ応用した[SICE論文誌掲載].前年度までに確立させた仮想ライトタッチコンタクト法に基づき,倒立真摯を用いた人間の立位制御モデルを構築するとともに,モデルパラメータに基づいて立位機能を評価するためのインデックス定義を目指して研究を行った.具体的には,倒立振子モデルにライトタッチコンタクト(LTC)による反力入力,ならびにヒトの位置覚特性を考慮したモデルを構築し,動力学シミュレーションによってLTCの再現を可能とした[電子情報通信学会口頭発表].また,仮想LTC法に含まれるインピーダンスパラメータを変化させた際に被験者の立位状態と重心動揺に与える影響を調査し,それらの関係性をモデル化するとともに,加速度パラメータのみでLTCの効果を与えられることを明らかにした.また,加速度センサを用いた新しい仮想LTCシステムを提案し,有効性を検証した[電子情報通信学会口頭発表].さらに,仮想LTCを用いた立位機能評価システムの提案を行った[SI2014口頭発表].また,評価指標などから立位機能を定量化するためには,特徴量から運動機能状態を正確に推定する方法が必要である.本年度は,特徴ベクトルから未学習クラスを推定可能な新しいニューラルネットを提案し,有効性を示した[ロボット学会誌論文掲載].本研究の目的は,指先へ仮想壁に触れた際の反力を被験者に知覚させてLight touch contactの効果を仮想絵的に与えるVirtual light touch (VLT)法を考案することである.Light touch contact (LTC)はわずかな力で壁やカーテンなどに触れることで立位姿勢動揺が低下する現象である.我々はこの効果をあらゆる空間で被験者に与えるため,仮想的なインピーダンスパラメータ(仮想慣性,仮想粘性,仮想剛性)を有する壁を被験者の周りに生成し,その壁への接触反力を小型の振動子を用いて指先にフィードバックする方法論を構築してきた.これにより,被験者の立位能力を向上させる方法論の確立を目指している.本年度は,これまでに構築してきたVLT法の有効性を検討する様々な検証と応用を実施した.具体的には,これまで検証してきた仮想壁のインピーダンスパラメータの変化から,加速度センサと小型の振動子を利用した,小型・軽量かつウェアラブルな仮想壁提示デバイスを開発し,加速度センサのみで立位および歩行時に重心動揺を低下させられることを示した[AROB2016口頭発表,SI2015口頭発表など].また,VLT法に基づいて転倒リスクを評価するための立位機能評価法のプロトタイプを開発し,健常若年者と高齢者の立位機能を定量化できるインデックスの可能性を示した[BIOCAS2015口頭発表など].本研究により,仮想LTCの実現,ウェアラブルデバイスの開発,立位機能評価インデックスの提案を実現した.今後はこれらの成果をもとに,高齢者の転倒予防実現に向けた実用的なデバイス開発へ発展させていく予定である.

本研究では,あらゆる空間でLight touch contact (LTC)の効果を被験者に与える方法論としてVLTC法を考案した.LTCはわずかな力(1N以下)でカーテンなどに触れることで立位・歩行時の重心動揺が低下する現象である.提案法は,人間の周りに仮想的な慣性,粘性,剛性を有する仮想壁を作ることで,被験者が仮想壁に接触した際の反力推定を可能とし,推定反力を振動として被験者にフィードバックしてLTCの効果を被験者に与える.提案法を用いて被験者の立位や歩行状態を評価した結果,通常の立位や歩行状態に比べてLTC,仮想LTC状態が被験者の重心動揺を有意に低下させることを明らかにした.仮想的な壁を被験者の周りに設置するための基礎理論ならびに機会インピーダンスモデルに基づく仮想反力の推定歩法を既に確立しており,推定反力を小型振動子制御に用いることでLTCの効果を与えられる事実を既に明らかにしている.また,LTCの現象解明に向け,新たなヒト立位モデルの構築や立位機能評価の新しい方法論確立に取り組んで成果を挙げており,これらは高齢者の転倒予防実現に向けて大いに寄与するものである.生体医工学・リハビリテーション科学・福祉工学基礎理論は既に確立済みであるため,前年度までに構築した仮想LTCモデルおよび立位支援システムについて被験者を増加させて論文誌へ投稿する.また,ヒト立位モデルならびに立位機能評価システムについても被験者増加と理論の検証,成果発表を推し進める.さらに,小型ウェアラブルデバイスによる歩行支援デバイスの開発を目指す.仮想的な壁を被験者の周りに設置するための3次元モーションキャプチャを用いた指先位置のリアルタイム計測,速度,加速度パラメータの算出方法,ならびに機械インピーダンスモデルに基づく仮想反力の推定方法を既に確立している.また,推定した反力に基づいて小型の振動刺激を制御することで,実際に紙に触れる際に生じるLTCの効果を提案法を用いて擬似的に与えることに成功した.インピーダンスパラメータは任意に設定可能なため,各パラメータが立位状態に与える影響を詳細に議論することが可能である.また本年度に仮想LTCが人間の姿勢動揺を有意に低下させることを示したことにより,センサなどの小型化・ウェアラブル化によってあらゆる空間でLTCの効果を与えられる可能性が示唆された.この結果は,立位モデルの構築や立位機能の定量化に大いに寄与するものである.学会発表時に想定していた金額より少ない費用で対応することができたため.確立した仮想インピーダンスと振動刺激による仮想LTC法を用いて,倒立振子を用いた人間の立位制御モデルを構築するとともに,モデルパラメータに基づいて立位機能を評価するためのインデックスの定義を目指す.具体的には,倒立振子モデルにLTCによる反力入力,ならびに視覚刺激などの外部入力を考慮した新たなモデルへ発展させることを試みるとともに,シミュレーションによってLTCの再現することを目指す.また,仮想LTC法に含まれるインピーダンスパラメータを変化させた際に被験者の立位状態と重心動揺に与える影響を調査してそれらの関係性をモデル化し,効果的なパラメータについて検討する.さらに加速度パラメータに着目し,小型の加速度センサを用いてLTCの効果を与える新たな方法論について検討を行うとともに,歩行時に仮想LTCを行うことで被験者の姿勢に与える影響を調査する.繰り越し分は,今年度分の物品使用費と併せて消耗品の購入に使用する.
脂質異常に着目した悪性リンパ腫の層別化と新規治療戦略開発のための基礎的研究

質量顕微鏡法を用いて古典的ホジキンリンパ腫(Hodgkin-Reed Sternberg(HRS)細胞)に分布する網羅的な脂質解析を試みた。14検体の検討により7つのm/zで有意差が認められた。このうち、m/z 885.5はホジキンHRS細胞にて反応性リンパ球に対し減少し、残り6つのm/zは相対的に増加していた。MS/MS解析により、HRS細胞で減少するm/z885.5は成熟型ホスファチジルイノシトール(PI)(18:0/20:4)であり、増加を示すm/zはPI(18:0/18:1)やPI(18:0/18:2)などの多価不飽和脂肪酸を含まないde novo PIであることを見出した。昨今のゲノミクスの劇的な発展により、悪性リンパ腫をはじめとした悪性腫瘍に生じる遺伝子異常が一塩基のレベルで解読さている。一方で、従来の脂質の解析はその性質上DNAに直接コードされている分子ではないため、核酸やタンパク質と比較すると分子生物学的手法の適用に限りがあった。本研究は悪性リンパ腫における脂質代謝・分布の異常が病態に大きく関与しているという仮説に基づき、近年開発された最新の手法を用いて脂質の異常を網羅的かつ包括的に捉え、病態の新たな層別化と新規治療戦略開発の知見を得ることを主な目的としている。具体的には、近年開発された質量顕微鏡を用いて研究を進めていく。質量顕微鏡法は凍結切片にレーザーを当ててその箇所に分布している脂質を検出し、それにより得られた脂質ごとの二次元分布図と顕微鏡画像を重ね合わせることによって分布とシグナルの多寡を可視化することができる。本研究では、古典的ホジキンリンパ腫内に散在性に存在するホジキンリンパ腫細胞に特異的に分布する脂質を同定し、同定された脂質の多寡や有無に基づいて臨床病理学的な検討を行うことにより、その脂質の量的・分布的異常の意義を捉えることを目的とする。本年度は16例の古典的ホジキンリンパ腫組織を用いて質量分析顕微鏡による網羅的脂質探索を行った。そのうち9例では良好な脂質シグナルが確認され、複数のリンパ腫細胞に共通する脂質を見出すことに成功した。今後はMS/MS法を用いて詳細な脂質の構造の特定を行うとともに、詳細な臨床病理学的な相関を検討していく。本研究では東京医科歯科大学付属病院にて採取され、ホジキンリンパ腫と診断された症例の残余冷凍検体から切片を作成し使用している。ホジキンリンパ腫の中でも、古典的ホジキンリンパ腫のみを扱っている。質量分析法(MS)に使用した全症例数は16症例であるが、現在のところそれらのうち9症例についての解析が進められている。質量分析器については浜松医科大学メディカルフォトニクス研究センターの質量顕微鏡iMScope(島津製作所)を使用し、測定は陰イオンを検出するネガティブイオンモードにより行った。解析方法についてはROI(Region of interest)解析によって行い、ホジキン細胞存在領域と反応性リンパ球領域(ホジキン細胞非存在領域)の2領域において比較を行った。その2領域において量的に有意な差が見られる脂質を検索し、さらにそれらのうち複数症例間に共通であるものを検索する。この方法により検出された脂質をホジキン細胞において特異的に発現している脂質として考える。現在解析を進めている9症例(うち再発性ホジキンリンパ腫5例)について、9症例全てに共通した量的に有意差のある脂質、すなわちホジキン細胞において特異的に発現していると考えられる脂質は現在のところ見つかっていないが、再発性ホジキンリンパ腫のホジキン細胞に特異的に発現していると考えられる脂質は複数見つかっている。また、陽イオンを検出するポジティブイオンモードにより、ネガティブイオンモードと同様の手法で解析を行った。ポジティブイオンモードによる解析の結果については、ホジキン細胞存在領域と反応性リンパ球領域において量的に有意差のある脂質のうち複数症例間に共通するものは現在のところ見つかっていない。元来がん細胞は解糖系を用いたエネルギーに依存しているとされてきたが,近年様々な悪性腫瘍において脂肪酸代謝が亢進していることが報告され,この脂肪酸代謝異常ががんの発症・悪性転化にも大きく関与していることが示唆されている.脂肪酸代謝の異常は,細胞内の脂質エネルギー代謝異常のみならず,その代謝経路の本体,すなわち脂質の量的・質的異常が病態を形成する一因となっている可能性がある.今回の研究では、近年開発された質量顕微鏡法を用いて古典的ホジキンリンパ腫に分布する網羅的な脂質解析を試みた, 14例の古典的ホジキンリンパ腫の冷凍リンパ節検体を用いて切片上でのHodgkin Reed sternberg(HRS)細胞と非腫瘍性リンパ球での脂質分布の比較したところ, m/z 700-1000の範囲にて両者の細胞域に計106個のピークが検出された.これら106ピークのうち強度の高い25ピークについてROI解析を行った結果, 7つのピークで有意差が認められた.

この7つのピークのうち, m/z 885.5のみHRS細胞にて相対的な減少傾向を示し,残り6つのピークはいずれも相対的に増加傾向を示した, MS/MS解析により、HRS細胞で減少するm/z 885.5は成熟型ホスファチジルイノシトール(PI)(18:0/20:4)であり、他の増加傾向を示すm/zはPI(18:0/18:1)やPI(18:0/18:2)などの多価不飽和脂肪酸を含まないde novo PIであることを見出した。本研究の結果から, HRS細胞ではPIの脂肪酸リモデリングに異常を来しており,さらにその結果としてPIの関与する細胞内シグナル伝達経路の1つであるPI3K/Akt経路に異常を来し, HRS細胞の増殖能や細胞死の抑制などの獲得に寄与している可能性が示唆された.質量顕微鏡法を用いて古典的ホジキンリンパ腫(Hodgkin-Reed Sternberg(HRS)細胞)に分布する網羅的な脂質解析を試みた。14検体の検討により7つのm/zで有意差が認められた。このうち、m/z 885.5はホジキンHRS細胞にて反応性リンパ球に対し減少し、残り6つのm/zは相対的に増加していた。MS/MS解析により、HRS細胞で減少するm/z885.5は成熟型ホスファチジルイノシトール(PI)(18:0/20:4)であり、増加を示すm/zはPI(18:0/18:1)やPI(18:0/18:2)などの多価不飽和脂肪酸を含まないde novo PIであることを見出した。イオン選択の観点からは、ポジティブイオンモードよりもネガティブイオンモードのほうが感度か高いことが判明したため、ネガティブイオンモードによる解析を進めているものについてはさらに症例数を増やし、ホジキン細胞に特異的に発現していると考えられる脂質を同定していく。新しく同定された脂質と現在までにすでに同定されている再発性ホジキンリンパ腫で特異的に発現していると考えられる脂質について、具体的な構造式の推定を行う。そのためにはまずMETLINやHMDBなどのデータベースから候補となる脂質をあらかじめいくつか決めておき、その後MS/MSによって構造式を推定する。MS/MSの際もMSの時と同様にiMScopeによって行う予定である。血液病理学
トポロジカル電子状態に基づく新世代デバイス技術の創出

スピントロニクスから量子コンピューティングまで次世代電子デバイスへの利用が期待される「トポロジカルな電子状態をもつ物質」について、新物質の開拓、そこから生まれる新奇な量子現象や機能の探索に取り組んだ。1トポロジカル絶縁体:Bi4I4が、結晶の特定の面にしかトポロジカル表面電子状態をもたない「弱い」トポロジカル絶縁体であることを確立することに成功した。温度履歴により通常絶縁体とトポロジカル絶縁体のスイッチング機能も有することも見出した。この成果はNature誌に掲載された。加えて、遷移金属ダイカルコゲン化合物において、トポロジカル電子状態が出現する一般則を第一原理計算から見出し、実験検証することにも成功した。この成果はNature Materials誌に掲載された。2トポロジカル半金属:非磁性物質にもかかわらず、超巨大な磁気抵抗効果を示すトポロジカル半金属物質を複数発見し、単結晶の純良性と超巨大磁気抵抗の関連性などを明らかにした。その成果として、WTe2においては14Tにおいて10万倍もの変化を引き起こすことに成功した。また、InBiにおいては、強いスピン軌道相互作用によって出現するバルクにおけるDirac電子状態の出現が起源であることも突きとめた。平成30年度が最終年度であるため、記入しない。本研究では、スピントロニクスや量子計算など次世代エレクロトニクス用材料として期待されるトポロジカル電子物質について、新物質開発および新奇なトポロジカル量子現象や機能の探索に取り組んだ。(成果1)巨大磁気抵抗を示す非磁性半金属物質の開拓:非磁性物質にもかかわらず巨大磁気抵抗効果を示す物質を、トポロジカル半金属を中心に探索したところ、InBiなど数種類を発見した。磁気抵抗は磁場の二乗に比例し、結晶の純良さの指標となる残留抵抗比(RRR)が大きいほど大きな変化を示すことも明らかにした。(成果2)トポロジカル超伝導体候補物質の開拓:トポロジカル超伝導体では、未発見の準粒子(マヨラナフェルミオン)の発生が理論予言されており、これを利用することで新原理の量子計算ができると言われている。超伝導になる半金属の中でトポロジカルな表面状態をもつ物質を探すというアプローチから、実験的実証に適した物質の探索を行った。トポロジカル超伝導の可能性を更に高めるトリプレットクーパー対の形成が期待される「空間反転対称性の破れ」にも着目することで、PbTaSe2を有力候補物質として発見した。(成果3)トポロジカル絶縁体表面スピンの磁場応答の解明:スピン偏極したトポロジカル表面電子の状態を磁場で制御する場合、それらが示す磁気的相互作用の理解が欠かせない。今回、走査トンネル顕微鏡・分光法を活用し、磁場中のランダウ量子化現象を詳細に測定・解析することにより、トポロジカル表面電子のゼーマン効果とg因子(角運動量と磁気モーメントの比例係数)を定量化することに初めて成功した。同じ結晶構造で組成の異なるBi2Se3とSb2Te2Se2における観測から、g因子に顕著な物質依存性があることを発見した。これは、組成でトポロジカル表面電子状態の磁気応答を物質設計できる可能性を示すものとしても有用である。本研究では、トポロジカルな電子状態をもつ新しい物質、現象、機能の創出を目指している。成果を得るには発見的な要素が強く、挑戦的な課題であると予想されたが、トポロジカルな電子状態をもつ絶縁体から、半金属、超伝導までの幅広く異なる方向性において3つの大きな成果を得ることができたことは、計画以上の進展であると考えている。1トポロジカル絶縁体:低温においてバルク由来のキャリアが消失してトポロジカル表面状態が支配的となる「高絶縁性トポロジカル絶縁体」を確立することに成功した。電子とホールの表面キャリア状態をもつ試料を作り分ける結晶育成技術、結晶の表面と裏面のキャリアの種類と量を独立で自在に制御できるデバイス技術などの開発にも成功した。2トポロジカル半金属:非磁性物質にもかかわらず、超巨大な磁気抵抗効果を示すトポロジカル半金属物質をいくつも発見し、それらがもつ電子構造との関連を議論することに成功した。エネルギ・ギャップがゼロのトポロジカルに保護された表面状態が運動量空間の対称性の高い場所でライン状に存在している物質の発見や、14Tにおいて10万倍の超巨大磁気抵抗を示す物質の発見などが特筆される。3トポロジカル超伝導体:まだ未発見のトポロジカル超伝導体について、候補物質の探索指針を確立した。トポロジカルな表面電子状態を持ちうる半金属の中で超伝導を示す物質を対象とすることで、定比化学組成でへき開性ももつ有力候補物質を選定できることを提唱した。この指針に従って、β-PdBi2 (Tc 5.4 K)、α-PdBi2 (Tc 1.7 K)、α-PdBi (Tc 3.6 K)、PdTe2 (Tc 1.7 K)、PbTaSe2 (Tc 3.8 K)などの新しい候補物質をいくつも発見し、それら物質の常伝導状態および超伝導状態の詳細について実験検証を進めた。

トポロジカル絶縁体、トポロジカル半金属、トポロジカル超伝導体のそれぞれについて、当初計画を上回るような物質、現象、機能についての想定外の発見が相次ぎ、インパクトファクターの高い論文誌への掲載も多数行うことができたことから。スピントロニクスから量子コンピューティングまで次世代電子デバイスへの利用が期待される「トポロジカルな電子状態をもつ物質」について、新物質の開拓、そこから生まれる新奇な量子現象や機能の探索に取り組んだ。1トポロジカル絶縁体:Bi4I4が、結晶の特定の面にしかトポロジカル表面電子状態をもたない「弱い」トポロジカル絶縁体であることを確立することに成功した。温度履歴により通常絶縁体とトポロジカル絶縁体のスイッチング機能も有することも見出した。この成果はNature誌に掲載された。加えて、遷移金属ダイカルコゲン化合物において、トポロジカル電子状態が出現する一般則を第一原理計算から見出し、実験検証することにも成功した。この成果はNature Materials誌に掲載された。2トポロジカル半金属:非磁性物質にもかかわらず、超巨大な磁気抵抗効果を示すトポロジカル半金属物質を複数発見し、単結晶の純良性と超巨大磁気抵抗の関連性などを明らかにした。その成果として、WTe2においては14Tにおいて10万倍もの変化を引き起こすことに成功した。また、InBiにおいては、強いスピン軌道相互作用によって出現するバルクにおけるDirac電子状態の出現が起源であることも突きとめた。1非磁性であるにも関わらず異常に大きな磁気抵抗効果を示す物質、2トポロジカルに保護された表面電子状態をもつ半金属で超伝導を示す物質、3空間反転対称性の破れた結晶構造をもち超伝導を示す物質などを、理論計算科学的な物質探索と、合成・単結晶化に続く精密物性評価による実験的実証という流れで見出すことに成功した。これら成果の出始めている物質については、電子状態の解明に向けた実験に取り組む、特に14テスラと0.3ケルビン、3万気圧という複合極限条件での物性測定が行える環境が整ったので、磁場下輸送特性の量子化現象(Shubnikov-de Haas振動)を角度依存性も含めて詳細に測定・解析することにより、フェルミ面などの電子構造を明らかにすることを進める。一方で、更に新しいトポロジカル電子物質の開発も平行して進める。特に、特定の結晶面にしかトポロジカルな表面電子状態の現れない「弱いトポロジカル絶縁体」や、バルクで質量ゼロの電子状態をもつ「3次元ディラック半金属」、更にそのスピン縮退が解けた「ワイル半金属」、そしてそれらと超伝導が共存する「トポロジカル超伝導体」の開発などを目指す。継続して絶縁体、半金属、超伝導体を対象としてトポロジカル電子物質の計算科学的探索と選定、合成と単結晶化、物性評価と機能実証を行う。これまでに見出した種々の物質群については、電子構造の解明とデバイス応用に向けた研究に取り組む。昨年度から利用可能になった14テスラの高磁場、0.2ケルビンの極低温、3万気圧の超高圧という複合極限環境を利用して、輸送特性の量子化現象(Shubnikov-de Haas振動)を角度依存性も含めて精密に測定・解析することから、フェルミ面や有効質量などの電子状態の詳細を明らかにすることを進める。並行して、研究協力者との連携により角度分解光電子分光および走査型トンネル顕微鏡・分光法による電子構造の直接観察も引き続き行う。
放射線大量一括照射に伴う乏突起神経膠細胞のapoptosisに関する研究

ラットの全脳に5Gy、10Gy、20Gyの一回大量照射をそれぞれ20体づつ行い、各線量を照射して1、4、8、24時間後にラットを5匹づつsacrificeして灌流固定した。DNA damageをTUNEL法を用いてin situに検出し結果、照射1時間後より、照射群ではコントロール群に比して有為なTUNEL標識率の上昇を認めることを確認した。TUNEL標識率は10Gy群では照射8時間後、20Gy群では照射4時間後に最大となったが、両群とも照射24時間後にはコントロールレベルに低下した。TUNEL positive cellは主に大脳、及び小脳の白質に分布し、形態学的にgliaと思われた。神経細胞、及び血管内皮細胞で標識されたものはなかった。Apoptosisrateは白質のうち特にCA1領域のcorpus callosum及びfimbriaで高く、corpus callosumのgenu及び小脳白質では低い傾向があった。GFAPとの二重免疫染色の結果、GFAPで標識されるTUNEL positive cellはなく、同法で標識されたgliaはoligodendrocyteである可能性が強く示唆された。しかしながら、CD57やAnti CNP等のoligodendrogliaの選択的指標となるマーカーについては、一部で標識率が上昇した部分も認めたが、あきらかなTUNEL positive cellとの相関は確認されなかった。次に、p53を検出する抗体(Novocastra CM5,polyclonal, NCL-p53-CM5p)を用いて、TUNEL positive cellの標識率が最大であった照射4時間後の20Gy群で、どのくらいの割合いでp53の発現が認められるかを二重免疫染色を行って確認した。しかしながら、この実験では、一次抗体と二次抗体の至適濃度の決定が困難であり、p53の発現状況の検討に著しい手間と時間を必要とした。結果として、apoptosis rateの高かったCA1領域のcorpus callosum及びfimbriaの白質で、p53の発現自体も認められていることが確認されたものの、これらとTUNEL positive cellと相関については、有意な相関が得られなかった。このため、p53 knock-out mouseを用いての放射線の大量一括照射後のoligodendrogliaにおけるapoptosisに関する検討は未だ結果が出ていない。TUNEL posidvecellは主に大脳、及び小脳の白質に分布し、形態学的にgliaと思われた。しかしながら、CD57やAnti CNP等のoilgodendrogliaの選択的指標となるマーカーについては、一部で標識率が上昇した部分も認めたが、あきらかなTUNEL positive cellとの相関は確認されなかった。次に、p53を検出する抗体(Novocastra CM5, polyclonal, NCL-p53-CM5p)を用いて、TUNEL positive cellの標識率が最大であった照射4時間後の20Gy群で、どのくらいの割合いでp53の発現が認められるかを二重免疫染色を行って確認した。しかしながら、この実験では、一次抗体と二次抗体の至適濃度の決定が困難であり、部でp53の発現が認められていることが確認されたものの、こちらについてもTUNEL posidve cellと有為な相関は得られなかった。

しかしながら、CD57やAnti CNP等のoligodendrogliaの選択的指標となるマーカーについては、一部で標識率が上昇した部分も認めたが、あきらかなTUNEL positive cellとの相関は確認されなかった。次に、p53を検出する抗体(Novocastra CM5,polyclonal, NCL-p53-CM5p)を用いて、TUNEL positive cellの標識率が最大であった照射4時間後の20Gy群で、どのくらいの割合いでp53の発現が認められるかを二重免疫染色を行って確認した。しかしながら、この実験では、一次抗体と二次抗体の至適濃度の決定が困難であり、p53の発現状況の検討に著しい手間と時間を必要とした。結果として、apoptosis rateの高かったCA1領域のcorpus callosum及びfimbriaの白質で、p53の発現自体も認められていることが確認されたものの、これらとTUNEL positive cellと相関については、有意な相関が得られなかった。このため、p53 knock-out mouseを用いての放射線の大量一括照射後のoligodendrogliaにおけるapoptosisに関する検討は未だ結果が出ていない。
EMDR(眼球運動による脱感作と再処理法)による恐怖感低減効果の検討

ゴキブリに対して強い恐怖感を持ち、そのきっかけとなる記憶が明確で、さらに治療を希望する女子大学生21人を無作為に統制群、逆制止群、EMDRの3群に振り分けた。実験の第1日目には3群にそれぞれの介入を約30分行い、その前後に様々な指標を測定した。介入は、統制群はマンガを読むなどして休憩してもらい、逆制止群は筋肉を弛緩させて、恐怖イメージを浮かべさせた。EMDR群は恐怖イメージに焦点を当てながら眼球運動を行った。さらに、1週間後の第2日目にフォローアップとして第1日目と同様の指標の測定を行った。測定した指標は、主観的な指標として、(1)その記憶の映像の鮮明さ、(2)映像に対する否定的な感情の強さ(SUD)、(3)望ましい認知を信じられる程度(voC)、(4)ゴキブリに関連した様々な課題をどのくらいできそうかというセルフエフィカシ-、(5)ゴキブリ入りのゴキブリ捕獲器を捨てる課題直前の状態不安(STAI-S)の上昇、生理的な指標としては、(6)ゴキブリ入りのゴキブリ捕獲器を捨てる際の心拍数の上昇、行動的な指標としては(7)ゴキブリ入りの捕獲器を捨てる際の様子であった。結果の分析はまだ継続中だが、これまでの分散分析では、(3)のvoCにおいて、EMDR群の1週間後の上昇が統制群より傾向として大きかった。1週間後に測定した(5)状態不安(STAI-S)の課題直前の上昇が、EMDR群において他の2群より傾向として小さかった。今後、セルフエフィカシ-、心拍数、行動評定のデータを分析する予定である。これまでのところ、ゴキブリ恐怖の低減に関してEMDR群が統制群や逆制止群より優れた効果を持つようである。1週間後のフォローアップの後からは、3群ともにEMDRによる治癒的介入を十分な改善が見られるまで最高3セッション継続し、大幅な改善をどの指標においても示した。今後、長期的な効果の維持を確認するために、半年後にフォローアップを行う予定である。
低温適応酵素の遺伝学的研究

本研究では、21世紀型バイオテクノロジー創出の一環として、低温域(0-15°C)で積極的に高機能を発揮できる微生物もしくは個々の酵素の開発を目指した。目標へのアプローチとして、(1)自然界からの低温適応酵素生産菌の検索、(2)中温菌酵素からの実験進化による低温適応化の2つのアプローチが考えられる。1.第1年目は(1)のアプローチを実施し、モデル酵素としてプロテアーゼとラクトース分解酵素を選び、南極大陸やバイカル湖、日本の各地からの湖水、川水、土壌等多数のサンプルを集め、低温適応酵素生産菌候補株(細菌)を検索した。検索法を効率化し、両酵素ともに数十株の候補から10°Cで高活性を示すものが数株得られたが、高活性が低温域に特異的なものは見いだせなかった。2.第2年目はアプローチ(2)に入り、代表的Bacillus属プロテアーゼの一つサチライシンをモデルに選び、新しいアイデアにより実験進化系を構築した。この系は活性低下の1次変異と活性上昇の2次変異からなり、大腸菌の宿主ベクター系で限定域ランダム変異と選択を行うところに特徴がある。約30株の進化株が得られ、そのうちの一つは、10°C(低温)を含む広温度域で野生型サシライシンの1.5倍のk_<cat>/Km値に進化していた。3.第3年目は、前年度に得られた低温適応サチライシンよりさらに活性の向上した、あるいは異なったタイプの低温適応を示すサチライシンの創成を目指すべく、実験進化系の改良を行った。その結果、10°Cにおいて野生型に比べ約70%の活性向上を示すもの、野生型に対し低温で特異的に活性上昇を示す新しいタイプのものなどが続々と得られるようになり、本研究の目標をかなり達成した。前者の活性向上はKm値,k_<cat>値の両方の変化の寄与、後者の相対活性向上はとくにKm値変化の寄与によることが明らかになった。初年度研究実施計画にしたがい、まず自然界に分布する微生物、とくに細菌から低温域(15°C以下)で出来るだけ活性を発揮する酵素をスクリーニングした。モデル酵素として遺伝学的取扱いに便利なプロテアーゼ(11項1参照)と乳糖分験酵素を選び、南極大陸の湖水や土壌サンプル(11項2)、日本各地の川水や土壌サンプルから低温菌ないし中温菌を分離し、低温適応酵素生産菌の候補株を検索した。プロテアーゼについては、スクリーニング方法を検討し、所要日数を大幅に短縮、総計83株のプロテアーゼ分泌生産菌を取得、この中から10°Cでの活性が中温菌の生産するサチライシンBPN'の活性に比べ優秀なもの数株を見いだした。これらを含む40株のプロテアーゼの温度特性について解析した結果、低温域で高活性を示すものは種々のプロテアーゼ種の中に存在したが、低温域に活性のピークをもつ珍しいものは未だ見いだせなかった。乳糖分解酵素についてもほぼ同様にして効率よい検索法を検討し、総計58株中0-15°Cでの活性が腸菌K12株よりかなり高い株2株を得た。温度特性曲線が低温域でピークをもつもの、もしくは低温域から中温域にかけてフラットのものがタンパク質工学的にきわめて興味ぶかい対象となるので、そのような特異な性質のものを自然界から発見するのが今後の課題である。一方、第2のアプローチとして計画している方法は、すでに構造の明らかな既知の中温適応酵素を出発材料に選び、この酵素遺伝子をベクターにクローニングした後、遺伝子工学的手法(11項3,4)と新しい進化工学的手法(11項図書参照)を駆使して低温に適応させてゆく方法であるが、次年度から本格的にスタートすべくその準備実験を行った。モデル酵素をサチライシンBPN'と定め、大腸菌と枯草菌の宿主ベクター系でそれぞれ分泌生産系を構築した。現在、構造遺伝子内限定ランダム変異法と効率的な目的株スクリーニング手法を開発中である。

3.第3年目は、前年度に得られた低温適応サチライシンよりさらに活性の向上した、あるいは異なったタイプの低温適応を示すサチライシンの創成を目指すべく、実験進化系の改良を行った。その結果、10°Cにおいて野生型に比べ約70%の活性向上を示すもの、野生型に対し低温で特異的に活性上昇を示す新しいタイプのものなどが続々と得られるようになり、本研究の目標をかなり達成した。前者の活性向上はKm値,k_<cat>値の両方の変化の寄与、後者の相対活性向上はとくにKm値変化の寄与によることが明らかになった。前年(平成5年)度には、主として自然界より低温適応酵素スクリーニングを行ったので、今年度は第2のアプローチとして、すでに構造の明らかな既知の中温適応酵素を出発材料に選び、この酵素遺伝子をベクターにクローニングした後、遺伝子工学的手法と新しい進化工学的手法を駆使して低温(5-15°C)に適応させてゆく方法に着手した。モデル酵素としてB.amyloliquefaciensの生産するサチライシン(subtilisin)BPN'を選んだ。進化工学的プロセスは2つのステップからなり、ひとつは第1次変異で、プロテアーゼ活性をあえて低下させ、二つ目の第2次変異で活性をintragenic suppressionにより復活させる。実験はサチライシン遺伝子に限定してランダム変異が誘起されるようデザインし、かつ1次、2次の目的変異株が効率的に得られるようにした。特に工夫した点は、1次、2次変異株を選択するために大腸菌の宿主・分泌ベクター系を用い、プロテアーゼ活性検定を一定温度のプレート上で行なったことで、これによりわずかな活性低下株(1次)でも検出分離できた。また、進化サチライシンの生産、単離のためには、遺伝子を枯草菌の宿主・分泌ベクター系にサブクローニングし、大量に分泌発現させた。全体として31株の進化株を得、今回はそのうちの1株、12-12株を代表に選んで遺伝学的、酵素学的に詳細な検討を加えた。その結果、第1次変異によりサチライシン分子のN末端から197番目のAspがAsnに置換(D197N)することによりプロテアーゼ活性が親株の80%に低下し、第2次変異(G131D)により親株の1.5倍(kcat/Km値)に上昇していることが明らかになり、この上昇は10°Cの低温域を含む広い温度範囲に及んでいた。タンパク質工学的解析により、これらの遺伝子変異がタンパク質の構造と機能に与える影響についても考察した。次年度はさらなる人工進化に挑戦する。前年(平成5年)度には、すでにランダム突然変異の導入により、活性低下1次変異から活性復帰2次変異を得るという原理を基盤としたスクリーニング系を駆使して、活性向上型サチライシンの分離に成功している。今年度は、さらに本システムを改良し、低温域でさらに活性向上した、あるいは異なったタイプの低温適応を示すサチライシンの創成を試みた。まず従来どうり、活性復帰2次変異においてサチライシン活性の指標となるクリアゾーンの形成を10°Cで行うことで、低温に適応した変異酵素の分離を実行した。スクリーニングの結果、得られた変異体は10°Cにおいて野生型の30%以下の活性向上にとどまっていた。そこで、変異の可能性を広げるために、活性低下1次変異体の母集団を増大させ、既知の高活性変異体の示す活性を指標に効率的な高活性サチライシン・アッセイシステムを構築した。その結果、野生型と比べ低温に特異的に活性上昇を示す新しいタイプの変異体が分離された(M-15)。
病原性大腸菌のタイプIIIエフェクターの機能解析

申請者らは培養細胞にEPECを感染させると微小管ネットワークの破壊とアクチン繊維束の形成が顕著に誘導されることを見いだし、これらの細胞骨格の再編成はタイプIII分泌装置に依存した現象であることを明らかにした。さらに、エフェクター欠損株を用いた感染実験の結果より、EspGとEspG2がアクチン繊維束の形成、ならびに微小管の破壊を誘導するエフェクターであることを明らかにした。EspG/EspG2は微小管構成因子であるチュブリンに直接結合することをGSTプルダウン法にて確認し、精製EspG/EspG2を用いたin vitro微小管再構成系の実験より、EspG/EspG2は微小管破壊を誘導することを明らかにした。微小管に局在する宿主側因子のGEF-H1は通常不活化型であるが、微小管から解離すると活性化型に変換され、RhoAを活性化する。GEF-H1のドミナントネガティブ型を発現させた細胞にEPECを感染させるとアクチン繊維束の形成は完全に抑制され、GEF-HImRNAに対するsiRNAを用いた実験によっても同様な結果が得られた。以上の結果、EspG/EspG2は1)微小管ネットワークを破壊することでGEF-H1を活性化し、2)そのGEF活性によりRhoA-ROCKシグナル伝達系が活性化され、3)アクチン繊維束の形成を誘導することを明らかにした。GEF-H1は上記シグナル伝達系の活性化の他に、腸管上皮の細胞間透過性(paracellular permeability, PP)を制御していることが報告されている。そこでMDCK培養細胞にEspGならびにEspG2を発現させPPを測定したところ、低分子物質のPPが亢進していることが明らかとなった。また、EspG/EspG2が誘導するPP亢進においては、タイトジャンクション(TJ)の破壊は認められなかった。病原細菌によるTJ破壊が下痢発症の一機序であると推察されているが、本研究ではTJ破壊のルートとは別に、PP制御を撹乱するエフェクターが存在することが初めて示され、「PPの脱制御による下痢惹起」という新たなモデルを提唱することができた。申請者らは培養細胞にEPECを感染させると微小管ネットワークの破壊とアクチン繊維束の形成が顕著に誘導させることを見出した。Rho-kinase(ROCK)の阻害剤、RhoAのドミナントネガティブ型を発現させた細胞を用いた感染実験から、EPEC感染に伴うアクチン繊維束の形成は、RhoA-Rockシグナル伝達系の活性化によって誘導されることを明らかにした。また、これらの細胞骨格の再編成はタイプIII分泌装置に依存した現象であった。そこでタイプIII分泌装置によって宿主に移行するエフェクターの欠損株を作製し、それらを用いて感染実験を行った結果、EspGとそのホモログであるOrf3がアクチン繊維束の形成ならびに微小管の破壊を誘導するエフェクターであることを明らかにした。近年、GEF活性を持つGEF-H1と呼ばれる因子が同定された。この因子は微小管に局在している時は不活性であるが、微小管から解離すると活性化型GEF-H1に変換され、RhoAを特異的に活性化させる。