hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
ハイブリッドゲノムを用いた難培養細菌ファイトプラズマの培養系の確立

すでに報告されている環状YAC(酵母人工染色体)ベクターを改良することで、高いクローニング効率を持つ全ゲノムクローニングのためのベクターを作成した。またファイトプラズマゲノムを感染植物から効率的に抽出する系を確立した。加えて、ゲノムのクローニングを確認するためのマルチプレックスPCRの系を確立した。確立したマルチプレックスPCRの手法を応用し、ファイトプラズマ感染植物中の系統判別が可能であることが判明したため、このストラテジーも確立した。本年度は、まず難培養細菌ファイトプラズマの全ゲノムをクローニングする系を確立するため、これに先立ち、クローニング用ベクターの調査および検討を行った。酵母において大きなゲノム断片をクローニングするためのYAC(酵母人工染色体)ベクターはいくつか開発されているため(Science 317:632-8, 2007)、これらを改変し、クローニング用ベクターとして検討した。ベクターは、酵母および大腸菌において複製するように設計されており、かつ、酵母においては環状のゲノムとして保持されるように設計されている。このベクターを用いたクローニングは、ベクター配列とターゲットとなるゲノム断片とが60 bpほど重複するような「のりしろ」配列を設計すると、酵母の細胞内で相同組換えによるアッセンブルが自然に起こるというTAR (Transformation-Associated Recombination)cloningを応用している(Science 317:632-8, 2007)。本研究ではこの手法に倣ってストラテジーを確立した。「のりしろ」配列は、プライマー合成によって作製した。加えて、難培養細菌ファイトプラズマの全ゲノムを感染植物から抽出する系の確立を行った。感染植物におけるファイトプラズマ菌体の量は非常に少ないため、植物の核およびオルガネラゲノムの混入を防ぐ必要がある。遠心分離法およびパルスフィールドゲル電気泳動法を用いることで、純度の高いゲノムを抽出することができた。精製したゲノムをテンプレートとして用い、これとベクターとを混合し、酵母の形質転換を行った。小さなゲノム断片のクローニングに成功したため、大きなゲノム断片のクローニングを試みた。昨年度、難培養細菌のゲノムを酵母においてクローニングするストラテジーの確立を目指し、ベクターについての詳細な調査を行い、クローニング・ストラテジーを確立した。これを踏まえて本年度では、難培養性細菌ゲノムのクローニングを行った。クローニング対象とするゲノムは、難培養性細菌ファイトプラズマのほかに、スピロプラズマを用いた。難培養性細菌であるファイトプラズマのゲノムは、感染宿主から単離する必要があるが、クローニングに必要な量を集めることが極めて困難であったため、代替の手法として、ゲノムの全領域をLA-PCRによって増幅し、その増幅断片をクローニングするストラテジーを用いた。これにより、ファイトプラズマゲノムの全領域をクローニングすることに成功し、その確認を行った。加えて、培養可能なスピロプラズマも同様にクローニングを試み、全ゲノムクローニングを行った。加えて、大規模なゲノム断片のクローニングに成功したかどうかを確認する必要がある。これにはマルチプレックスPCRが最適であろうと考えられるため、この系の確立を試みた。ファイトプラズマゲノムの複数の領域に対してプライマーを設計し、これを混ぜ合わせ、1つのPCR反応で9断片(9ゲノム領域)を増幅することができる系を確立した。これにより、クローニングに成功したかどうかを1チューブ、1PCRリアクションで確認することができる。加えて、確立したマルチプレックスPCRの手法を応用することで、ファイトプラズマ感染植物中のファイトプラズマ系統の簡易判別を行うことができることが判明したため、このストラテジーの確立も行い論文発表を行った。この系をクローニングしたゲノムに対して行い、ゲノムのクローンを確認した。クローニング・ストラテジーの確立昨年度、難培養細菌ファイトプラズマゲノムを酵母においてクローニングするストラテジーの確立を目指し、ベクターの追加調査を行ってきた。本年度はさらに詳細な調査および検討を行った。新たに検討したベクターは、これまでのベクターと同様に酵母においては環状のゲノムとして保持されるように設計されているが、形質転換時における偽陽性クローンが得られにくいように設計されている。このベクターを使うことでクローニング効率が大幅に改善されることを確認した。この手法を用いることで、難培養細菌ファイトプラズマのゲノムを酵母においてクローニングするストラテジーを確立した。大規模ゲノムクローニングを確認する系の確立加えて、大規模なゲノム断片のクローニングに成功したかどうかを確認する必要がある。プライマーは、全ゲノム内に1コピーのみ存在する遺伝子に対して設計する必要があり、プライマー同士のアニーリングおよびプライマー内のセルフアニーリングを防ぐ必要があるため、詳細な解析が必要であった。これにより、数百kbpの断片のクローニングに成功したかどうかを1チューブ、1PCRリアクションで確認することができる。この系により、ゲノムクローニングの実験が速やかに進展するものと考えられる。

加えて、確立したマルチプレックスPCRの手法を応用することで、ファイトプラズマ感染植物中のファイトプラズマ系統の簡易判別を行うことができることが判明したため、このストラテジーの確立も行い諸学会において発表した。難培養細菌ファイトプラズマの全ゲノムをクローニングする系を確立するため、必要な手法・ベクター・試料等を準備することができ、また一部のゲノム断片のクローニングも成功した。研究は順調に進展している。25年度が最終年度であるため、記入しない。難培養細菌ファイトプラズマの全ゲノムをクローニングする系を確立し、加えてマルチプレックスPCRの系も確立した。また、マルチプレックスPCRを用いた簡易系統判別の系も確立した。今後も引き続き研究を推進し、全ゲノムクローニング・ストラテジーの確立および、それを確認する系の確立を行い、ハイブリッドゲノムの作製に向けて推進する方策である。加えて、全ゲノムをいくつかのパーツに分けてクローニングし、それを再アッセンブルする手法の確立も目指す。今後も引き続き研究を推進し、全ゲノムクローニングおよびハイブリッドゲノムの作製に向けて推進する方策である。マルチプレックスPCRを用いた簡易系統判別の系については迅速に論文発表する予定である。
延伸成形ポリ-L-乳酸膜を用いた能動的骨誘導再生法に関する基礎的研究

ポリ-L-乳酸(PLLA)は吸収性の高分子精緻材料である。これまで、われわれは骨折および顎変形症の手術においてPLLAプレートおよびスクリューを使用し、良好な結果を得ている。さらに、PLLAを延伸形成することによって作製した膜を骨誘導再生法に応用することを考察し、すでにPLLA膜がGBR法に用いる隔壁としての条件(生体親和性・封鎖性・スペース確保)を満たしていることを確認した。今回の研究においては、スペースを確保して骨組織の再生を持つだけではなく、ここにリコンビナントヒト骨形成タンパク(rhBMP)を応用し、積極的に骨の誘導をはかる試みを行った。<方法>実験にはビ-グル犬を用い、両側下顎第三および第四前臼歯を抜歯した後、抜歯窩が上皮にて被覆されるまで約3ヶ月間放置した。この部位の辺縁切除を加え、ここに厚さ100μmのPLLA膜を適合させた。さらに骨欠損部充填材としてrhBMPを用いた場合の骨組織の再生状態を確認した。術後時間経過とともに新生される骨の状態は、軟X線写真・pQCT・三次元CT・硬組織研磨標本により評価した。<結果>rhBMP非充填群、充填群ともに経時的に骨組織の形成が認められたが、rhBMP充填群では非充填群と比較して著明な骨形成が観察された。また、rhBMP充填群における骨形成量は濃度依存的であった。以上により延伸成形PLLA膜は顎骨欠損に対するGBR法に有用であり、rhBMPを応用することにより、より優れた結果が得られることが判明した。今後これらの結果を口腔外科領域における機能的顎骨再建に応用し、臨床での実用化の可能性を追求したい。
高い線型性を持つ光検出器の開発

まず、線形性を0.1%の精度で測る装置を開発した。これは、光量の大きい青色の発光ダイオード(GaNタイプ)を8個用いて、2個ずつ光らせた時の光検出器の出力と、8個全部光らせたときの出力の比を測る。この比を光量の関数として測定することにより、線形性を求めた。次に、線形性に優れていると考えれる次の新しい光検出器の線形性を測定した。*アバランシ型フォトダイオードこれは1500Vから2400Vのバイアス電圧をフォトダイオードにかけた物である。p側に入った光子は電子とホールの対を作り、電子が加速されてまた更に電子とホールの対をまた作っていく。こうして電子雪崩が起き、信号が増幅される。増幅率200の時の非線形性は、140、000個の光電子に対応する光量以下では0.1%以下であった。*ハイブリッド型光検出器(Siダイオードを用いた物)これは、光電子増倍管のようにフォトカソードを持っているが、中にはPINダイオードが入っている。カソードとPINダイオードの間に約10kVの電圧をかけることにより、カソードから出た光電子は加速され、ダイオードに当たったところで約2500倍の電子をたたき出す。この信号をPINダイオードを用いて検出する。この特徴は電子軌道が単純であることとPINダイオードの性質のため、優れた線形性を保つ事ができる事である。測定した結果、140、000個の光電子に対応する光量以下では、線形性は0.1%であった。*ハイブリッド型光検出器(アバランシ型Siダイオードを用いた物)これは上のハイブリッド型と同じであるが、PINダイオードの代わりにアバランシ型フォトダイオードを用いている。増幅率5000の場合の非線形性は14、000個の光電子に対して、-6%と、極端に悪かった。これは、アバランシ型ダイオード自身の線形性に問題があったためで、原理的にはより良いものができるはずである。*メタルパッケージ型光電子増倍管これは薄い金属板に多数のスリットを開けたものを重ねることにより、作った小型の光電子増倍管である。但し、現在あるものは線形性は満足するものではなかった。まず、高い線形性を持つ新しい光検出器の候補を浜松ホトニクス社と検討した結果、電子打ち込み型のフォトダイオード、電子打ち込み型のアバランシフォトダイオードは、そしてメタルパッケージが有力となった。電子打ち込み型の(アンバラシ)フォトダイオードは、光電子増倍管と同じようにフォトカソードを持ち、そこから出てきた光電子を高い電圧で加速し、フォトダイオード、もしくはアバランシフォトダイオードに打ち込むことにより、高い増幅率を得るものである。また、メタルパッケージと呼ばれるものは、エッチングによって金属に多数の特殊な形のスリットを開けたものを作り、これをダイノードとして、短い間隔で重ね合わせたものである。これはダイノード間の距離が短いために高い電場を作ることが可能であり、従って線形性も良くなると考えられる。

現在、こうした新たな型の光検出器が製作されている。線形性を0.1%の精度で測る装置の開発も行った。これは、統計量を増やすために、光量の大きい発光ダイオードを8個用い、2個ずつ光らせた時の光検出器の出力と、8個全部光らせたときの出力の比を、光量の関数として測定することにより、線形性を求める。現在まで、光源の開発、光量調整の機能は作り上げ、回路の検討を行っている。今後は、線形性の測定装置を完成させ、線形性に優れたファインメッシュ型の光電子増倍管などを用いて装置の評価を行った後、できあがってくる新たな光検出器の線形性の測定を行う。その上で、必要な改良を加えていく。まず、線形性を0.1%の精度で測る装置を開発した。これは、光量の大きい青色の発光ダイオード(GaNタイプ)を8個用いて、2個ずつ光らせた時の光検出器の出力と、8個全部光らせたときの出力の比を測る。この比を光量の関数として測定することにより、線形性を求めた。次に、線形性に優れていると考えれる次の新しい光検出器の線形性を測定した。*アバランシ型フォトダイオードこれは1500Vから2400Vのバイアス電圧をフォトダイオードにかけた物である。p側に入った光子は電子とホールの対を作り、電子が加速されてまた更に電子とホールの対をまた作っていく。こうして電子雪崩が起き、信号が増幅される。増幅率200の時の非線形性は、140、000個の光電子に対応する光量以下では0.1%以下であった。*ハイブリッド型光検出器(Siダイオードを用いた物)これは、光電子増倍管のようにフォトカソードを持っているが、中にはPINダイオードが入っている。カソードとPINダイオードの間に約10kVの電圧をかけることにより、カソードから出た光電子は加速され、ダイオードに当たったところで約2500倍の電子をたたき出す。この信号をPINダイオードを用いて検出する。この特徴は電子軌道が単純であることとPINダイオードの性質のため、優れた線形性を保つ事ができる事である。測定した結果、140、000個の光電子に対応する光量以下では、線形性は0.1%であった。ハイブリッド型光検出器(アバランシ型Siダイオードを用いた物)これは上のハイブリッド型と同じであるが、PINダイオードの代わりにアバランシ型フォトダイオードを用いている。増幅率5000の場合の非線形性は14、000個の光電子に対して、-6%と、極端に悪かった。これは、アバランシ型ダイオードの有効口径が小さいため、うまく光電子が集められないためである。
表面エネルギーを考慮した微小構造体の力学理論の構築と形態制御への応用

本研究では,固体表面のぬれ性に着目し,液面に浮かべたフィルムの中央部を引き上げることで円筒状の立体構造を形成する方法を提案した.様々な寸法のプラスチックフィルム,ゴムシートで実験を行った結果,適切な寸法を選択することで,円筒状構造が形成可能であることを示した.また,液体とフィルムの物性値,寸法を用いて,形成される円筒状構造の解析解ならびに形成に必要なフィルム厚さの条件を導出することができた.さらに,グラフェンシートからも円筒状構造が形成可能なことを,シミュレーションにより示した.本研究では、微小構造体においては重力に対して液体のぬれが及ぼす表面張力の影響が大きくなることに着目して,ぬれ性による変形を利用した立体構造形成への応用を提案している.本年は,液面に浮かせた四角形の樹脂フィルムの中心部を糸で引き上げて円筒を形成することを目的に,樹脂フィルムの材質,面積,厚さを変えて変形の様子を観察した.結果,液面から離れた後の樹脂フィルムの形状は,面のまま,二つ折り,涙滴型の3つに分類された.これらの分類について考察するため,簡易的なモデルを立ててフィルムの曲げによる弾性エネルギーと界面のエネルギーの大小関係を求めた.これにより,引き上げ後にフィルムの変形を維持できる寸法の範囲を算出し,実験結果と比較したところ,概ねモデル通りの分類となることを確認できた.次に,フィルムの曲率を変数として弾性エネルギーを求め,その極小値により引き上げ後に形状を維持したときの曲率半径を導出した.これより,曲率半径はフィルムの弾性率,厚さと固液界面エネルギーによって決まることが明らかとなった.そこで,同じ材質,寸法のフィルムをプラズマ照射処理することによって固液界面エネルギーを大きくし,ぬれ性を向上させることによる曲率半径の変化を測定した.結果,プラズマ照射処理前に形状を維持できなかった厚さのフィルムでも涙滴型を形成できるようになった.しかし,形成された形状の曲率半径については,処理前後で大きな違いを見ることができなかった.固液界面エネルギーの変化が曲率半径に違いを出すほど大きくはなかったことが原因と考えられるが,固液界面エネルギーを精度よく測定することで確認する必要がある.当初の計画では,一年目に液架橋形状の導出とそれに基づく円筒形状のFEM計算を行う予定であったが,実験に必要な機器を揃えることができたため二年目に予定していた実験から先に取り組んだ.およその実験方法を確立できたことに加え,簡単な理論モデルに基づく評価にまで至っており,順調に進んでいると言える.前年度は、液体へのぬれ性に伴う構造体の変形現象の観察を目的として、液面からのフィルム引き上げによる円筒形成実験を実施し、フィルムの寸法によって引き上げ後の形状が異なることを明らかにした。そこで今年度は、得られた実験結果を考察するため、固体表面へのぬれ性に伴う液体の運動と、構造体との変形を表す解析解の導出に取り組んだ。これまでの成果として、二平板間の毛管現象に伴う平板の静的な変形量については解析解が得られていたため、まずはこのモデルにおいて液体の運動を考慮した形式を導出した。毛管現象による液柱の上昇を運動方程式で表し、液柱の上昇に伴うラプラス圧の変化から平板の変形量を更新しながら、数値計算を行った。この解析解の有効性を検証するため、毛管上昇速度、液体の種類、平板の寸法をパラメータとして実験を行った。結果、ある範囲内の毛管上昇速度においては、実験結果と解析解とおおよそ一致することを確認した。さらに、導出した液柱の運動方程式において、液柱の上昇速度が一定と見なせる場合には静的なつり合いを表す式へと変形することができる。流速がゼロの場合には、これまでに得られていた平板の静的な変形量を表す解析解と一致することから、流速に伴う粘性抵抗を含む形式へと拡張できたことになる。二枚の平板間の毛管現象については液体の運動を考慮に入れた解析解を導出することができたため、今後はフィルムの引き上げ現象へと応用していくことを検討する。また、今回導出した解析解は、流速がある大きさ以上だと実験結果と一致しないことから、この原因についても明らかにする必要がある。一年目に実験結果の取得、二年目に解析的な考察を達成しており、当初計画していた通りの成果を得ることができている。最終年度は、フィルムを液面から引き上げることで形成される立体構造について、ポテンシャルエネルギーが最小となる条件から解析解を導出した。これにより、立体構造を形成するために必要なフィルム厚さ、フィルム長さの条件を決めることができた。実験結果と比較するため、様々な厚さ、長さのポリエチレンフィルム、シリコンゴムフィルムを水面から引き上げ、形成の可否を整理したところ、解析解から導かれた形成条件とよく一致することが示された。次に、提案している立体構造形成法を分子スケールへと展開していくため、分子動力学シミュレーションによって、単層グラフェンシートを液面から引き上げる計算を行った。グラフェンシートと水分子の間のポテンシャルを決めるパラメータによって接触角を変化させ、引き上げた後に形成される円筒構造の違いについて考察した。結果、接触角が90°よりも大きいときには液体からはく離してしまうが、接触角が小さいときには円筒構造が形成されることを確認した。しかし、形成された円筒構造は解析解よりも遥かに小さい寸法であったことから、単層グラフェンシートからの立体構造形成には分子スケール特有の現象を考慮に入れ、理論の修正が必要であることが明らかとなった。

研究期間全体を通じて、表面エネルギーの効果をポテンシャルエネルギーに加えることで、固体表面のぬれ性に伴う構造体の変形現象を捉えることに成功した。これにより、構造体を連続体と見なせるマイクロスケールの範囲において、ぬれ性を利用した独創的な立体構造形成法を提案することができた。今後は、分子スケールにまで理論を拡張し、連続体の枠組みを超えた力学理論の構築へと繋げていきたい。本研究では,固体表面のぬれ性に着目し,液面に浮かべたフィルムの中央部を引き上げることで円筒状の立体構造を形成する方法を提案した.様々な寸法のプラスチックフィルム,ゴムシートで実験を行った結果,適切な寸法を選択することで,円筒状構造が形成可能であることを示した.また,液体とフィルムの物性値,寸法を用いて,形成される円筒状構造の解析解ならびに形成に必要なフィルム厚さの条件を導出することができた.さらに,グラフェンシートからも円筒状構造が形成可能なことを,シミュレーションにより示した.当初一年目に予定していた液架橋形状の導出と円筒形状のFEM計算に取り組み,初年度に得た実験結果との比較により適宜修正しながら理論モデルの構築を目指す.最終年度は、分子動力学計算による分子スケールへの応用に取り組む予定である。これまでの成果で、ミリメートルスケールにおいては表面エネルギーが及ぼす構造体の変形現象を表すことができており、さらにスケールを小さくした際の適用性について検証していく。材料強度学,破壊力学,接着接合,複合材料年度中に大学の異動が決まったため,新しい研究環境のセットアップに向けて繰越した.予定した以上に旅費が必要となったため20万円立替えを行い、その残額が次年度使用額となった。以前所属していた大学では材料物性値取得のための引張試験機を共有していたが,こちらには無いため購入を検討している.当初計画の通り、消耗品と旅費に使用予定。
麻酔薬のタキキニンレセプターに対する作用の解析

塩酸トラマドール〔以下トラマドール〕は非麻薬性鎮痛剤で、その薬理機序としてはオピオイド受容体に作用することと同時にノルアドレナリンやセロトニンのシナプトゾームへの取り込み抑制が考えられている鎮痛薬であるが、しかしその詳細な薬理機序の検討は未だになされていない。また、鎮痛作用を目的として広く使用されているイミプラミンなどの抗欝薬もやはりノルアドレナリンやセロトニンのシナプトゾームへの取り込み抑制作用をもちノルアドレナリントランスポーターやカテコールアミンの分泌を抑制することがその疼痛抑制機序として考えられているが、トラマドールに関するノルアドレナリントランスポーターやカテコールアミンの分泌に関する報告はない。また最近、G蛋白結合受容体であるサブスタンス-P受容体をはじめとしたタキキニン受容体が落痛発生に関与しているという報告がなされ、トラマドールがサブスタンス-P受容体に対してもどのように作用するか興味がもたれるところであるが、トラマドールのサブスタンス-P受容体に対する作用は詳しく解析されていない。今回の研究においてはトラマドールの鎮痛効果及びその副作用の機序解明を詳しく探る目的で培養ウシ副腎髄質細胞およびアフリカツメガエル卵母細胞系を用いて、(1)トラマドールがカルバコールによるカテコールアミン分泌に対する抑制作用が有ることを明らかにした。(Shiraishi et al.,In press)(2)さらにトラマドールがノルアドレナリントランスポーターに対して抑制作用を持つことも明らかにした(Sagata et al.,In press)。またトラマドールの阻害形式は拮抗阻害を示し、^3Hデシプラミンの結合実験を行った結果、その作用部位はデシプラミンやケタミンの阻害部位と同じであることが明らかになった。(Sagata etal.,Inpress)(4)さらにアフリカツメガエル卵母細胞系を用いて、トラマドールがムスカリン受容体(M1)を抑制することが明らかとなった(Shiraishi et al.,2001)。今後は麻酔薬のターゲットであるタキキニン受容体(サブスタンス-P受容体、サブスタンス-K受容体)にいかに作用するかを検討する予定である(Minami et al.,2002)。これらの結果より、トラマドールの鎮痛作用機序としてノルアドレナリントランスポーターに対して抑制作用とムスカリン受容体(M1)への抑制作用が何らかの影響を与えていることが明らかとなった。疼痛機序にサブスタンス-P(NK1)レセプターなどのタキキニンレセプターが関与していることは以前から知られていたが、麻酔薬がどのようにタキキニンレセプターに関与しているのか興味が持たれているのもかかわらず、いまだにその作用機序は解明されていない。今回の研究においては麻酔薬のタキキニンレセプター受容体に与える影響を詳しく解析するために、アフリカツメガエル卵母細胞発現系を用いて、(1)吸入麻酔薬(ハロセン、イソフルラン、エンフルラン、セボフルラン)がサブスタンス-P(NK1)受容体にいかに作用するかを検討した結果、麻酔薬はサブスタンス-P(NK1)

レセプター受容体機能を吸入麻酔薬(ハロセン、イソフルラン、エンフルラン、ジエチルエーテル)が抑制するという結果を得た(2000年度日本麻酔学会総会において発表)。(2)さらに、現在まで、麻酔薬は燐酸化酵素を介してGq蛋白結合受容体を抑制していることが明らかとなっているので、麻酔薬のタキキニンレセプター受容体に対する抑制効果が燐酸化酵素と関係があるかどうか解析した結果、Protein Kinase C阻害薬によってこれらの麻酔薬の抑制効果が消失したことにより、Protein Kinase Cが麻酔薬の抑制効果に関与していることが明らかとなった。今後は、さらにサブスタンス-P、ニューロキニンA受容体のProtein Kinase C,Protein Kinase A,Protein Kinase Gの燐酸化部位であるセリン、スレオニンやMAP Kinaseの燐酸化部位などを他のアミノ酸に変えて、吸入麻酔薬(ハロセン、イソフルラン、エンフルラン、セボフルラン)がこのMUTANT受容体にいかに作用するかを検討する予定である。疼痛機序にサプスタンスーP(NK1)レセプターなどのタキキニンレセプターが関与していることは以前から知られていたが、最近になってこれらの遺伝子欠損マウスを用いた実験によってタキキニンレセプターと疼痛との関係がより明らかになってきた。タキキニンレセプターを介した疼痛メカニズムに対して麻酔薬がどのように関与しているのか興味が持たれているが、いまだにその作用機序は解明されていない。一方、最近麻酔作用にメタボトロピックグルタミン酸受容体や5HT受容体、ムスカリン受容体などのGq蛋白結合受容体が関係していることが明らかになり(Minami et al.、1997,1997,1998),同じGq蛋白結合受容体であるタキキニンレセプターも麻酔薬が何らかの影響を与えているのではないかと予想されるが、詳しい検討は今だになされていない。一方、アフリカツメガエル卵母細胞発現系は中枢神経系のGq蛋白結合受容体に対する薬剤の作用を検討する実験系として広く使用されている。昨年度の研究においては麻酔薬のタキキニンレセプターに与える影響を詳しく解析するために、アフリカツメガエル卵母細胞発現系を用いて、(1)吸入麻酔薬(ハロセン、イソフルラン、エンフルラン)がサブスタンスーP(NK1)受容体を抑制する事を明らかにした。(Minami K, et al., Anesth Analg In press)(2)現在まで麻酔薬は燐酸化酵素を介してGq蛋白結合受容体を抑制していることが明らかとなっているので、麻酔薬のタキキニンレセプター受容体に対する抑制効果が細胞内燐酸化酵素Protein Kinase Cと関係があるかどうか解析した結果PKC阻害薬であるGF109203Xにより吸入麻酔薬のSubPに対する抑制作用は消失した。これらの結果から吸入麻酔薬はタキキニンレセプターに対して細胞内リン酸化酵素(PKC)を介して抑制していることが明らかとなった。
1920年代から40年代におけるフィラデルフィア年会ミッション・ボードと日米関係

米国プロテスタント日本伝道に関する事例研究として、キリスト友会フィラデルフィア年会ミッション・ボードの戦間期における日本伝道の方針と活動を検証した。太平洋戦争下における日系人強制収容への抗議活動についてボードの書簡資料を紹介する論文と、同ボードと協力関係にあった米国フレンズ奉仕団の日本との関係-関東大震災時の救援活動、排日移民法と日本人留学生基金、太平洋戦争下での日系人支援活動-を概観し、従来ミッション・ボードが担ってきた活動の一部が国際NGOである米国フレンズ奉仕団の手に移行しつつあったことを指摘する論文を作成した。研究期間は平成19年度から21年度までの3年間であり、最初の2年間はフィラデルフィアで資料調査・資料収集の予定。平成19年度は2回(9月と3月)に分けて、主としハバフォード大学クエーカー・コレクションでフィラデルフィア年会ミッション・ボードの資料調査を実施した。具体的な調査内容は以下の通りである。(1)経歴不明のボード幹部の身元調査をした。(2)新たに作成された年会委員会資料インデックスに基づき、排日移民法と日系アメリカ人収容に関する資料を収集した。(3)二人の宣教師(ギルバート・ボールズとエスター・ローズ)文書インデックスの提供を受け、ボールス自伝と関連箇所の資料を入手した。(4)アメリカ・フレンズ奉仕団のパンフレット集から、関連箇所の資料を得た。さらにアメリカ・フレンズ奉仕団本部とペンシルベニア歴史協会などを訪ね、日本関連資料の問い合わせをした。奉仕団の日本に関わる活動記録はむしろ西海岸支部が所蔵している可能性があることが指摘された。また歴史協会は日系アメリカ人関係資料としてはPapers of the U. S. Commission on Wartime Relocation and Internment of Civilians Part 1(マイクロフィルム)を所蔵しているものの、アメリカ・フレンズ奉仕団については衣服委員会(clothing committee)以外に特に日本に関連した資料はないことが判明した。以上、本年度の研究成果として、アメリカ・フレンド奉仕団の日本関係資料についてはまだ全体像が見えてこないものの、ミッション・ボード資料はクエーカー・コレクションで大体が網羅されるこことを確認し、排日移民法と日系アメリカ人収容に関する資料を入手した。本研究では最初の2年間は資料の調査と収集を予定しており、2年目にあたる平成20年度は9月と2月に2週間ずつ主としてババフォード大学クエーカー・コレクションで、太平洋戦争中の・ミッション・ボードの活動を追う資料を収集した。成果は以下の通りである。(1)ミッション・ボード委員長が大統領をはじめとする政府高官に宛てた書簡、同委員長が下部組織に宛てた指示、さらにボードがアメリカ・フレンド奉仕団に派遣した宣教師の報告書をコピーで入手した。アメリカの教会の太平洋戦争開戦への反応や日系人収容へのかかわりを裏付ける資料はこれまで紹介されたことはなく、これらの資料はいずれも重要な意味をもつ。今後、順次紹介していくつもりであるが、手始めとして解題を付して政府高官と交わした書簡を紹介する論文を書いた。(2)アメリカ・フレンド奉仕団について、断片的にではあるが年報やパンフレットに目を通した。また西海岸で日系入の援助活動に従事した奉仕団メンバーと強制収容所から東海岸に転住した日系人たちのインタビュー資料(1991年)を得た。(3)(1)と(2)の資料を精読した結果、アメリカ・フレンド奉仕団が政府政策に異議を唱える一方で、強制収容が実施に移されると、政府の要請に応じる形で日系人援助活動を展開した可能性が見えてきた。これは人道支援活動における政府とNGOの補完関係を示唆するものであり、NGOの役割と意義を論じるうえで重要な視点を提供することになると考えている。杢研究は第一次世界大戦以降、日米関係が悪化する時代、ミッション・ボードという民間セクターが日米関係にどのように対処したのかを、キリスト友会(クエーカー派)フィラデルフィア年会ミッショ.ン・ボードを事例として検証することを目的とレている。平成21年度はインディーアナ州のアーラム大学フレンズ・コレクションで主要宣教師の資料を調査し、フィラデルフィア郊外にあるババフォード大学クエ「カー・コレクションにおいて機関紙を閲覧した。研究成果として、次の2点をまとめた。1.ミッション・ボード内における伝道方針をめぐる議論について英語論文を書き、米国のクエーカー史の学術誌に投稿し、現往、『掲載にむけて修正作業中である。この論文では、初期段階ではボード内に伝道観の対立が存在したものの、次第に国際親善と国際協力を重視する方針を採るように変化したことを検証した。2.ミッション・ボード資料に含まれていた米国フレンズ奉仕団(AFSC)の記録を整理し、ミッション・ボードとAFSCの協調関係を明らかにする論文を勤務校の紀要に発表した。2つの組織の幹部は重複しており、日米関係が悪化する戦間期,これらの組織は情報を共有し、日米交流事業を展開した。AFSCの果たす役割は次第に大きくなっていき、太平洋戦争下の日系人強制収容問題ではむしろAFSCが主導的立場になっていることを解明している。
脳のディジタル通信:感覚刺激による変調と脳波からの復調

定常的視覚誘発電位に基づく脳コンピュータインタフェイスには,コマンドを増加させると視覚刺激に利用可能な周波数が不足するという問題がある.また,周波数によって誘発電位の発生強度が異なるため,コマンド間で識別率が異なり,入力されやすいコマンドや入力されにくいコマンドが存在してしまうという問題がある.これらを解決するために,異なる周波数の2種類の視覚刺激でバイナリ符号を定義し,その符号をコマンドに割り当てる方法を提案した.これは,ディジタル通信における周波数偏移変調に基づいて,脳コンピュータインタフェイスの視覚刺激を変調する方法であるといえる.本研究では,10コマンドのオンライン実験を行って従来の方法と提案する方法とを比較した.実験結果から,提案する方法は,コマンド間の識別率の差異が小さい,信頼性の高いBCIを実現できることが示された.本研究課題では,ブレイン・マシン・インタフェース(BMI)における「周波数枯渇問題」を,通信工学的に解決しようという挑戦的な目的を設定している.とくに,定常的視覚誘発電位(SSVEP)と呼ばれる,視覚的な外部刺激によって誘発する特徴的な脳波に関して,脳を「通信路」とみなしてディジタル通信の理論を適用しようという課題を設定した.本年度は,SSVEPの周波数特性の測定と外部出力型BMIへの実装,周波数変調(FSK)方式によるコマンドの設定とBMIの特性,また,位相変調(PSK)方式によるコマンドの設定とBMIの特性に関して研究を実施したので,以下に詳細を記す.まず,SSVEPの周波数特性については,LCDで点滅周期の異なる視覚刺激を作成し,これを被験者に提示した.その上で,正準相関分析法(CCA)を用いて多チャンネルで測定されるSSVEPの強度を測定した.これによって,SSVEPの平均強度スペクトルを作成した.つぎに,平成23年度に引き続き,FSK方式によるBMIについて研究を行った.23年度の段階では被験者の数が十分ではなかったため,被験者を合計10名に増やし,FSK-BMIに関してコマンド識別率とITRを測定した.また,バイナリ符号0/1の組み合わせで最適となる視覚刺激の点滅周波数を測定する方法と,実際の測定を実施した.その結果,従来の変調を加えない方式より高い情報伝達レートを達成した.さらに,PSK方式に関しても,実現可能性を明らかにするための予備実験を行った.ここでは,180度位相が異なる視覚刺激を呈示し,離散フーリエ変換によりSSVEPの位相を検出することで,シンボル符号の復調が可能であることを示した.定常的視覚誘発電位に基づく脳コンピュータインタフェイスには,コマンドを増加させると視覚刺激に利用可能な周波数が不足するという問題がある.また,周波数によって誘発電位の発生強度が異なるため,コマンド間で識別率が異なり,入力されやすいコマンドや入力されにくいコマンドが存在してしまうという問題がある.これらを解決するために,異なる周波数の2種類の視覚刺激でバイナリ符号を定義し,その符号をコマンドに割り当てる方法を提案した.これは,ディジタル通信における周波数偏移変調に基づいて,脳コンピュータインタフェイスの視覚刺激を変調する方法であるといえる.本研究では,10コマンドのオンライン実験を行って従来の方法と提案する方法とを比較した.実験結果から,提案する方法は,コマンド間の識別率の差異が小さい,信頼性の高いBCIを実現できることが示された.本研究では,定常的視覚誘発電位(SSVEP)に基づくブレイン・コンピュータ・インタフェース(BCI)において,変調した視覚刺激を用いる方法を提案した.特に,SSVEPに基づくBCIをディジタル通信の枠組みで捉えることを提案し,BCIのコマンドを符号化する方法を考案・構築した.その上で,視覚刺激を変調する方法を示した.この方法を用いることで,コマンドの数が点滅周波数によって制限される従来の問題に解決を与えた.さらに,すべてのコマンドに対応する視覚刺激を2種類の周波数飲みを用いて点滅させるため,コマンドによる識別率の偏りと言った従来の問題を解決することが出来た.以上のアルゴリズム的枠組みのもとで,10コマンドのBCIを構築し,オンライン・オフラインで脳波の測定をおこなった.この実験においては,まず使用周波数を決定するための脳波測定を行った.また,フォトダイオードにより,コンピュータのディスプレイにおける視覚刺激の点滅強度を確認した.この周波数を用いて,つぎに,識別率を測定した.さらに,オンラインBCI実験を行い,情報伝達レート(ITR)を測定し,従来のSSVEPに基づくBCIの方法と提案した方法とを比較した.実験結果から,提案した方法によって,コマンド間の識別率の差異が小さくなることを実証した.さらに,オンラインBCI実験においては,信頼性の高いBCIシステムを実現することを示した.研究計画書において記述した実験等においては,順調に実施している.本研究における実験では,一部の被験者においてSSVEPをうまく検出できず,その結果ITRについては提案する方法の優位性を示すことができなかった.これは,BCI illiteracy(BCI不適合者)の存在が知られており,そのような被験者から脳波を測定しても,ほとんど意味のある脳波を取得できないことも原因の一つである.したがって,提案手法の信頼性を増すためには,被験者を増やす必要がある.また,BCI illiteracyとは別に,SSVEPの検出方法を改善する必要がある.本研究では,周波数偏移変調(FSK)に基づき,視覚刺激の符号化をおこなった.

今後は,位相偏移変調(PSK)に基づく方法でも実験を行うことが課題であり,そのために多チャンネル脳波信号からSSVEPの位相を検出する信号処理手法を研究する必要がある.また,昨年度の研究においてはコマンドの符号化に単純な符号語群を使用したが,符号理論に基づいた符号化方法を検討することも課題である.H23年度に購入予定であった信号処理のためのパイパフォーマンス計算サーバを購入する.これは,購入予定であったマシンがH24年度早々にアップグレードされるとの情報を入手したため,買い控えていたことによる.また,成果発表のための国内外の出張をする.またそのための会議参加費を支出する.大学院生をリサーチアシスタントとして雇用する.
ニューロコンピューティングに基づく発生系遺伝子ネットワークの理論的研究

発生遺伝学という系統だった遺伝子検索法の適用により、ショウジョウバエの初期発生研究が分子生物学による解析の対象として大きく前進した。本研究はこれに応える形で進行したものであり、突然変異誘発法によって得られる(遺伝子型-形質)の組み合わせ、mRNAあるいは蛋白質の可視化技術の胚への適用にる遺伝子転写量の経時的変化から、位置情報の決定に機能している遺伝子ネットワークシステム内の相互作用を推定・モデル化によって理解・解析することを目標とした。[1]胚の前後軸に沿っての周期的体節構造を指定するペアルール遺伝子の発現領域をモデル化する作業は、分子生物学によるプロモータ断片からの解析に相補的な、領域全体としての入出力関係をニューラルネットによって予測することを目標とした。観測データが非常に疎であることから予測は汎化性をどのように保証するかに焦点が集まる。本研究では入力因子の濃度が低い領域ではその因子に対して親和性の高い結合部位が、逆に高濃度領域では低親和性結合部位が遺伝子発現調節に関わっているという入出力写像レベルでの経験則を満たすファジ-ニューロ型のネットワークを構成するプロシ-デュアを開発・実装し、これの応用としてのプロモータレベルからの調節領域モデル作製計画が、米国Mount Sina医科大のReinitz博士との共同研究として、團生命科学国際基金のフェロ-シップに採択された。[2]胚の背腹軸に沿っての勾配的位置情報を指定する情報伝達系の経路をモデル化する作業は、エピスタシスという遺伝学の概念を定量的に再定義し、これを用いて相互作用の因果関係を再構成することに成功した。生化学による相互作用の解明に併せて、そこに現れる作用の連鎖を機能的に理解することが現時点での課題である。
"MUC4"の遺伝子多型が薬剤性肺障害をおこす分子細胞生物学的機序の解明

日本人は薬剤性肺障害、特発性間質性肺炎の急性増悪などの頻度が多い。これらの疾患の病理像はびまん性肺胞障害であり、共通の遺伝的要因が想定される。まず、日本人のびまん性肺胞障害をきたした患者を集積しエキソーム解析を行い、コーカシアン、中国人と比較することにびまん性肺障害の原因遺伝子として、MUC4を同定した。研究期間内に、患者と健常人のMUC4の遺伝子多型を解析、クローニングし発現ベクターを作成した。さらに、患者と健常人の気道上皮細胞の機能の違いを解析するため、肺癌等のために切除した肺から気道上皮の初代培養細胞を樹立、さらに不死化し、細胞株を作成した。ヒトの切除肺からの気道上細胞初代培養を試みた。当初、切除肺から気管を分離し、上皮細胞を剥離し、プロテアーゼ処理し、細かく切り刻み細胞懸濁液を作成し、コラーゲンでコートした容器で培養したが、作成効率が悪かった。そのため、切除肺の気管支をブラシで擦過し細胞を回収したところ、高率に気道上皮細胞の初代培養細胞を得ることができるようになった。同時に、MUC4のVNTR部分のクローニングとシークエンスを行った。southern blottingにより、VNTRの大きさを同定した。制限酵素処理した場合、MUC4のVNTR部分にの長さは個人差が大きかったが、薬剤性障害を持つ患者は約20000のバンドを共通して持っていた。また、VNTR分部のクローニングを試みた。当初はBiotion probeを用いて、VNTR分部を回収することを目指した。しかし、十分な量を回収することができず、long PCR用のtaqを使用し、1800020000塩基のPCR産物を生成、さらに相同組み換えを利用した、クローニングキットを使用し、VNTR分部のクローニングに成功した。さらに、クローニングしたプラスミドを、Fragmentaion Kitを使用し、10002000塩基程度に裁断し、TAベクターに回収。回収したベクターを大腸菌に導入しコロニーを形成させた。4896コロニーを回収、それぞれをシークエンスし、複数を組み合わせることにより、VNTR部分の全長のシークエンスを確認した。1MCU4発現ベクターの作成ヒトのリンパ球からDNAを抽出し、制限酵素で切断し、MUC4のVNTR領域についてSouthern blottingを行ったところ、肺障害をきたした患者のリンパ球では21000塩基付近のバンドを共通して認めた。そのため、この21000塩基の中に肺障害の原因配列があると考え、DNAから相同組み換えを使用し、プラスミドに回収した。また、正常(特に肺障害の既往のない)成人についてもリンパ球を抽出し、southern blottingを行った。同様に21000塩基付近にバンドを認めたため、正常コントロールとして、同じくプラスミドに回収した。この2つのベクターの塩基配列を比較すると、繰り返し配列以外に3塩基の挿入を認め、MUV4の機能になんらかの影響を与えているものと予測した。これらのプラスミドからそれぞれの発現ベクターを作成した。2手術検体からのヒトの初代気道上皮細胞の作成と不死化MUC4の肺での発現は,これまでの報告から、主に気道上皮細胞と予測される。そのため、手術検体(切除肺)からの初代気道上皮細胞の作成を試みた。ヒトの切除肺の気管支をブラシで擦過、培養液で洗浄することにより、気道上皮細胞を回収した。これらの細胞をトリプシン等で処理し、初代気道上皮細胞を作成した。ただし、これらの細胞は短期間で細胞老化に至ってしまい、安定して細胞の機能解析を行うことは困難であった。そのため、hTERTをレトロベクターを用いて、初代気道上皮細胞に導入した。その結果、初代気道上皮細胞を安定して長期間培養することが可能となった。MUC4のVNTR領域は約20000塩基と大きく、発現ベクター作成に時間を要した。また、初代気道上皮細胞はすぐに細胞老化することが判明し、そのままでは実験に使用できなかった。そのため、新たにこれらの細胞をhTERT導入し不死化する必要が生じた。日本人の肺は遺伝的に脆弱であると考えられる。(1)薬剤性肺障害が他国(西洋や他のアジア人)より高頻度で見られ、致死的な経過をとる、(2)特発性肺線維症で他国より高頻度で急性増悪が起こり、高い致死率を示すこと、(3)皮膚筋炎のびまん性肺胞障害(diffuse alveolar damage :DAD)型の急性間質性肺炎は海外では非常に少ないこと、(4)特発性肺線維症合併肺手術後の特発性肺線維症急性増悪が海外ではみられないなどの事実が知られている。これらの疾患の病理像は、すべてびまん性肺胞障害で共通し、致死的な臨床経過も共通する。本研究グループでは日本人の肺にびまん性肺障害を起こしやすくする特有の遺伝的要因の存在が予想した。薬剤性障害及び特発性肺線維症急性増悪の患者検体を収集し、診断確実例の劇症例、死亡例98例でヒト全遺伝子コード領域シークエンス解析(エキソーム解析)を行い、コーカシアン、中国人、日本人のエクソームfastqデータをデータベースより取得し比較した。統計的に有意に肺障害患者で多く認めた変異のみ選択した。これらの遺伝子変異のうち、疫学データに合致し、肺で発現しており、間質性肺疾患と関連のある機能を有する遺伝子はMUC4のみであった。

MUC4の遺伝子多型がびまん性肺胞上皮障害を起こす原因を明らかなにするため、以下の研究を行った。ヒトの切除肺からの気道上皮初代培養細胞の作製した。また、MUC4の遺伝子多型ごとにMUC4遺伝子をクローニングしMUC4の発現ベクターの作製した。今後、これらの細胞と発現ベクターを使用し解析を進める方針である。日本人は薬剤性肺障害、特発性間質性肺炎の急性増悪などの頻度が多い。これらの疾患の病理像はびまん性肺胞障害であり、共通の遺伝的要因が想定される。まず、日本人のびまん性肺胞障害をきたした患者を集積しエキソーム解析を行い、コーカシアン、中国人と比較することにびまん性肺障害の原因遺伝子として、MUC4を同定した。研究期間内に、患者と健常人のMUC4の遺伝子多型を解析、クローニングし発現ベクターを作成した。さらに、患者と健常人の気道上皮細胞の機能の違いを解析するため、肺癌等のために切除した肺から気道上皮の初代培養細胞を樹立、さらに不死化し、細胞株を作成した。気道上皮細胞の初代培養細胞は、1週間程度の培養で、senesenceに陥ってしまい、このままの状態では、細胞障害実験等に使用できないことが判明した。また、ヒト切除肺を使用し、MUC4の発現細胞を同定する予定であったが、倫理委員会への申請に手間取り、実際にヒトの肺検体での検討が行えていない。MCU4の発現ベクターをヒトの上皮細胞に導入し、機能解析を行う。ErbB2やErbB3を共発現させ、機能解析を行う。また、作成した、不死化したヒトの気道上皮細胞を用いて機能解析を行う。ヒトの気道上皮細胞を好中球エラスターゼで処理した場合、MUC4の発現が亢進することが知られており、不死化した気道上皮細胞を好中球エラスターゼで処理し、MCU4のVNTR領域の遺伝子多型により、細胞機能が変化しているか検討する。呼吸器内科学MUC4のVNTR部分のシークエンス、及びクローニングが完了したため、次にMUC4の発現ベクターを作成を開始する。また、気道上皮細胞の初代培養細胞にhTERTをレンチベクター等により導入し、安定し培養できる細胞株を作成する。新たに病理医に協力を仰ぎ、MUC4の発現細胞の検討を行う。患者の肺からの初代培養細胞の作成と不死化、また、MUC4のクVNTR部分のクローニングと発現ベクターの作成に予想以上に時間がかかり、シグナル伝達系の検討のための実験にまで進むことが出来なかったため。MUC4のVNTR部分のクローニングに難渋し、発現ベクターの作成に至らなかった。また、患者のMUC4のVNTR部分のシークエンスを行うことができたが、対象となる健常人のシークエンスとの比較が不完全で、MUC4の遺伝子多型が完全に同定できておらず、薬剤耐性試験やMUC4遺伝子多型による機能の変化については、実験をすすめることが出来なかった。患者の肺検体から、初代培養細胞の作成と不死化を進め、さまざまなVNTRの遺伝子多型を持つ気道上皮細胞を作成する。これまでに、気道上皮細胞を好中球エラスターゼで処理することによりMUC4の発現が亢進することが報告されている。そのため、好中球エラスターゼで気道上皮細胞を処理しVNTRの遺伝子多型で細胞の反応が異なるか検討する予定である。また、MUC4の発現ベクターが完成しており培養細胞に導入してMUC4のシグナル経路の解析を行う予定でる。
自閉症スペクトラム感受性全遺伝子のハイスループット解析法の確立と臨床応用

自閉症スペクトラム感受性遺伝子の遺伝子変異(疾患特異的な変異)/多型(疾患非特異的な変異)の有無を迅速かつ安価、正確に検出する解析系を確立した。PCR-高精度融解曲線解(PCR-HRM)分析法を改善し、自閉症感受性遺伝子AUTSX1、AUTSX2、AUTS1、AUTS9の至適解析条件を決定し、320以上の検体での検索を行い、日本人患者特有の新規の遺伝子変異を多数同定した(コード領域の1塩基置換を13個、そのうちアミノ酸の変化を伴う変異は6個)。本研究の目的は自閉症スペクトラム感受性遺伝子について、網羅的に遣伝子変異を検出するハイスループットな解析系を確立し、病態に関与する遺伝子変異を明らかにするとともに、遺伝子変異が細胞機能発現に及ぼす影響を細胞生物学的に解析し、病態の一端を解明することである。自閉症スペクトラムは自閉症やアスペルガー症候群、ADHD(注意欠陥多動性障害)などの疾患に共通に認められる思考や想像力、コミュニケーションの領域における障害をいう。潜在的患者数は少なくなく(児童人口の5%程度ないしはそれ以上)社会的に関心が高いこと、発達期における治療・療育によって患者のQOLが大きく左右されることなどから、早期における診断と本質的な病因解明が急務である。当該年度はこれまでの論文を見直し、より自閉症に感受性のある遺伝子、AUTSX1(NLGN3)、AUTSX2(NLGN4X)、AUTS1(RELN)、AUTS9(MET)を選択、PCR-高精度融解曲線分析法(PCR-HRM分析法)とPCR-HRM分析法に連続して解析可能なシークエンス解析法を組み合わせた解析システムの確立を試みた。AUTSX1、AUTSX2、AUTS9については、すべてのエクソンを含む領域についてPCR-HRM分析法による解析条件の至適化を終了し、自閉症スペクトラム患者での遣伝子変異/多型スキャンニングを行った。遣伝子変異/多型が有ると判定された検体についてはシークエンス解析まで行い塩基配列を決定した。シークエンス解析の結果はデータベースと照合し、多型として登録されていない変異に関しては健常者gDNAでのスクリーニングを行い、疾患特異的な変異なのか、非特異的な変異(多型)なのかを追加解析している。なお、AUTS1(RELN)に関しては、現在、条件の至適化を検討している途中である。自閉症スペクトラムとは自閉症やアスペルガー症候群、ADHD(注意欠陥多動性障害)などの疾患に共通に認められる思考や想像力、コミュニケーションの領域における障害をいう。家系内での発症が多く認められることから病因に遺伝的背景が強く示唆されており、これまで自閉症スペクトラムに感受性のある複数の染色体領域および遺伝子が報告されてきた。しかしながら、これらの遺伝子は個別的、散発的に解析されているものがほとんどで、臨床症状と感受性遺伝子変異相互の関連については不明な点が多く、遺伝子情報として不十分といわざるをえない。本研究では、多くの検体で感受性遺伝子を網羅的に解析することを目的として、PCR-高精度融解曲線解析法(PCR-HRM分析法)の改善に取り組み、自閉症スペクトラム感受性遺伝子の遺伝子変異(疾患特異的な変異)/多型(疾患非特異的な変異)の有無を迅速かつ安価、正確に検出する解析系の確立を試みている。自閉症感受性遺伝子AUTSX1(NLGN3)、AUTSX2(NLGN4X)、AUTS1(RELN)、AUTS9(MET)のエクソンを含む領域(合計97エクソン)についてPCR-HRM分析法による解析条件の至適化を終了し、自閉症スペクトラム患者(62検体)での遺伝子変異/多型スキャンニングを行った。これまでに、SNPデータベースに登録されていないコード領域の1塩基置換を13個検出した。そのうちの6個はアミノ酸の変化を伴う変異で、日本人健常者gDNA(190検体以上)でのスクリーニングでは見いだされないことから、疾患特異的な変異である可能性が高いことが強く示唆された。現在、アミノ酸変化を伴わない7個のSynonimous変異について解析を進めているところである。PCR-HRM分析法は未知、既知に関わらず、遺伝子変異を効率的に、再現性良く検出することから、多検体を迅速に解析する方法として有用な手段と考えられた。本研究課題では自閉症スペクトラム感受性遺伝子の遺伝子変異(疾患特異的な変異)/多型(疾患非特異的な変異)の有無を迅速かつ安価、正確に検出する解析系の確立を試た。自閉症スペクトラムとは自閉症やアスペルガー症候群、ADHD(注意欠陥多動性障害)などの疾患に共通に認められる思考や想像力、コミュニケーションの領域における障害をさし、病因に遺伝的背景が強く示唆されている。これまで複数の染色体領域および遺伝子が自閉症スペクトラムに感受性があると報告されてきたが、個別的、散発的に解析されているものがほとんどで、臨床症状と感受性遺伝子変異相互の関連については不明な点が多く、遺伝子情報として不十分といわざるをえなかった。

1.研究成果:PCR-高精度融解曲線解(PCR-HRM)分析法を改善し、自閉症感受性遺伝子AUTSX1(NLGN3)、AUTSX2(NLGN4X)、AUTS1(RELN)、AUTS9(MET)の至適解析条件を確立した。自閉症スペクトラム患者62検体および健常者200検体、EBVトランスフォームB細胞60検体で検索したところ、日本人患者特有の新規の遺伝子変異を多数同定することができた(コード領域の1塩基置換を13個、そのうちアミノ酸の変化を伴う変異は6個;研究成果については現在投稿中)。2.今後の展開:2012年の時点で、より網羅的な迅速な遺伝子解析法として、次世代シークエンサーが比較的手軽に用いられてくるようになってきた。しかしながら、次世代シークエンサーから得られる膨大な量のデータは、最終的には従来のサンガー法による確認が必須であり律速段階になっている。本研究で示されたように、PCR-高精度融解曲線解は遺伝子変異の有無を迅速かつ安価、正確に検出することが可能である。次世代シークエンサーとサンガー法による解析の間に介在させることによって、より迅速な遺伝子変異解析に貢献する。