hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
がんの産生する蛋白の診断への応用に関する研究

我々はすでに3種類のソマトスタチン受容体遺伝子(SSTR1-SSTR3)の構造を決定し報告しているが、ヒトゲノムライブラリーをスクリーニングした結果さらに2つの新しいサブタイプ:SSTR4およびSSTR5のクローニングに成功した。SSTR4、SSTR5はそれぞれ388個、364個のアミノ酸からなりSSTR1-SSTR3と同様膜を7回貫通する構造を有していた。次にSSTR1-SSTR5遺伝子をCOS細胞に導入し、ソマトスタチンアナログであるSMS201-995との結合特性を検討した。各受容体サブタイプのSM201-995に対するIC_<50>値はそれぞれSSTR1:>0.1μM、SSTR2:0.4nM、SSTR3:35nM、SSTR4>0.1μM、SSTR5:7.0nMで、SSTR2、SSTR3、SSTR5がSMS201-995に親和性を有し、中でもSSTR2が最も高親和性を示す事が明らかとなった。さらに各種内分泌腫瘍におけるソマトスタチン受容体サブタイプの発現をreverse transcriptase-polynerase chain reaction(RT-PCR)法を用いて検討した。グルカゴノーマ2例およびそのリンパ節転移巣においては、SSTR1、SSTR2、SSTR3、SSTR4の発現を認めた。インスリノーマ4例においては、SSTR1、SSTR4は全例に発現を認めたが、SSTR2は3例にSSTR3は2例に発現を認めた。褐色細胞腫3例においてはSSTR1、SSTR2の発現を認めた。カルチノイドにおいてはSSTR1、SSTR4の発現を認めた。この様に各種内分泌腫瘍によりソマトスタチン受容体サブタイプの発現が異なる事が明らかとなった。従来より、標識したソマトスタチンアナログによる腫瘍のシンチグラフィーが開発されている。そのin vivoでの描出率は腫瘍により異なる事が報告されているが、これは各種腫瘍におけるソマトスタチン受容体サブタイプの発現の違いによると考えられた。また、SMS201-995に対しては、SSTR2の発現がソマトスタチンアナログを用いた画像診断にも重要であると考えられた。がんの産生する蛋白を診断へ応用する目的で本年度は以下の検討を行った。1.糠輸送担体(GLUT)の発現と脳腫瘍の関係について検康を加えたところ、神経膠腫では、GLUT3 mRNA、蛋白の発現が腫瘍の悪性度と対応して増大した。また内皮増殖をともなった腫瘍血管ではGLUT1は消失し、GLUT3蛋白のみが発現した。2.細胞の増耕を抑制するソマトスタチンレセプターのサブタイプを3種類(SSTR1、SSTR2、SSTR3)をクローニングした。ソマトスタチンサブタイプの腫瘍における発現をみると、胃癌(50%)、大腸癌(25%)、肝細胞癌(50%)においてSSTR1の発現を認めた。3.ヒト甲状腺癌に特異性の高いモノクロナール抗体TCM-9は流血中の変性Tgにより干渉をうけるので、これを除去するより特異性の高い測定系を確立した。本丸によりTCM-9結合活性を測定すると甲状腺癌に対する特異性が極めて高くなることを明らかにした。4.肝癌細胞からのIL-1α産生を明らかにするため免疫組織化学による検討を加えたところ20例中10例に陽性所見が得られ、特に増殖の旺盛な部分で転移部においてその傾向が著明であった。
消費税制の基礎研究:国際的観点から

経済活動のグローバル化に伴い、消費税制の国際的側面に対する関心が高まっていることに対応して、本研究においては、今後の日本の消費税のあり方を考えるために、既に高い税率を維持している諸外国の付加価値税制の特徴を日本の消費税と比較した。その結果、日本の現行システムには、今後の高税率化にうまく対応できない要素がある可能性があり、インボイスのあり方や情報技術面を含め、諸外国の制度から参考として学ぶべきことがなお多く残っていることを明らかにした。加えて、世界でも特色のある日本の消費税の仕組みを対外的に説明すべく発信した。具体的な研究成果は、日本の消費税と社会保障の関係に関する論文(邦文)、諸外国(EU・ニュージーランド・韓国)の特色ある制度の分析を行った論文(邦文)、及び日本の消費税制に関する英文資料等として取りまとめ、公表した。消費税制の基礎研究に関し、平成22年度及び23年49月の期間には、以下のような課題に取り組んだ。1.消費税の逆進性が指摘されることに関連して、「逆進性」概念を明確化するとともに、税制が所得分配に与える影響を歳出面の政策と合わせて総合的に評価するための枠組みや消費税課税のプロセスにおける情報の役割について考察した。その成果については、本報告書の「研究発表:雑誌論文」の項目に掲げた3本の論文に反映されている。3.国際比較に関しては、EU・中国・ニュージーランドの消費税制に関する基本的文献を調査した。特に、平成22年度は、ニュージーランドに重点を置き、文献調査をもとに、「ニュージーランド税制改革における消費課税」『税務弘報』2011年7月号104-111頁という概観的な論文を執筆した。また、8月20日から29日にかけて、ニュージーランドに出張し、ウェリントン・オークランドの大学・官庁を訪問した。この際の面談に基づき、Victoria University of WellingtonのProf.DavidWhiteと両国の消費税に関する比較研究を行っていくこととなった。3年計画の2年目である平成23年度においては、研究計画調書の記載事項に基づき、消費税制の金融取引と国際取引への適用に関する各国比較を行った。平成23年度における比較の対象は、主に、EUの仕組みとニュージーランドにおける仕組みである。また、平成22年度に検討行った不動産取引への適用に関しても、ニュージーランドにおける取り扱いを中心にさらに検討をさらに深めることができた。また、この過程で、ゼロ税率の適用に関する基礎的研究も行った(その成果は、平成24年度中に公表予定)。平成23年9月にパリで開催されたIFA(国際租税協会)の総会に出席し、他の国際課税における問題についての情報交換とともに、消費課税については、特に、事業再編における取り扱いを中心に情報入手に努めた。このほか、VATの金融・国際取引への適用について、EU等の状況問の比較を行うべく、日本の消費税制の研究を深めた。消費税の問題は、現在、「社会保障・税の一体改革」の文脈で、政治的な議論が中心になっているが、今後、税率が引き上げられた場合により顕在化すると考えられる問題点をあらかじめ検討しておく必要性を考慮するなら、国際比較を踏まえた基礎的検討の重要性は一層高まっている。今後、本プロジェクトの最終年度である平成24年度に向けて、EUの動向に関する調査を進展させるとともに、近年、ますます日本との経済的な関係が強まっている中国と韓国の付加価値税の動向と問題点についても検討していくこととしている。消費税制の国際比較に関し、2012年9月に韓国に出張し、現地の研究者・実務家と情報・意見交換を行った上で、韓国VATにおける電子インボイス制度に関する論文を取りまとめ、公表した。また、2013年2月にはオランダに出張し、現地研究機関(IBFD)の研究者と情報交換を行い、EU VATにおける電子インボイスの動向に関する論文を取りまとめた。また、我が国の消費税制の解説を英語でとりまとめた。この成果は、IBDFのVAT Worldwideというデータベースに2013年2月に掲載された。この資料は、我が国の消費税制についての英文での初めての体系的な解説であり、今後とも、毎年更新を行っていくことで、海外に情報発信を行っていく予定である。予定していた出張を行い、それをもとに、論文をまとめ公表するとともに、学会報告も行った。また、その過程で、海外の研究者との意見・情報交換も、これまでよりも深いものとすることが可能となった。日本の消費税の外への発信については、不動産取引に関して英文の論文を書籍の一つの章として公表するとともに、日本の消費税制全般にわたる英文のデータベースの作成に着手した。さらに、24年度中に公表予定の消費税に関する論文も、現在、既に3本について、準備を進めることができた。24年度が最終年度であるため、記入しない。

平成23年度の研究は、おおむね順調に推移したものの、予定していた消費税の納税義務者の問題、国際的事業再編における消費税の問題に関しては、まだ、本格的検討に着手できていない。これは、ヨーロッパの状況に比べ、日本の消費税の事案がまだあまりなく、制度的な問題点も浮き彫りになっているとは言い難いことにも一因がある。そこで、日本の消費税の仕組みをもう一度基礎から検討することを通じて、ヨーロッパのVAT(あるいはニュージーランドのGST)との比較を進め、消費税制の検討を進展させるように努めることとしたい。24年度が最終年度であるため、記入しない。
CIDPにおける軸索障害機序の解明:Tag-1を中心に

難治性末梢神経疾患のひとつであるChronic inflammatory demyelinating polyneuropathy(以下CIDP)は、軸索障害の合併が治療反応性や予後に影響する.軸索障害機序の解明は治療反応性や予後の予測だけではなく、CIDPや他の末梢神経疾患の病態解明に有用である.我々は一塩基多型(SNP)による遺伝子多型解析を治療反応性と関連して施行した.Juxtaparanodeに特異的に発現し、Schwann cellとaxonの相互作用を担うTAG-1について、nonsynonymous SNPのみならず、全SNPを対象にした連鎖不平衡解析で有意性が示され、本遺伝子が脱髄性疾患の治療反応性ならびに軸索障害機序の影響因子として重要であることが示された.難治性末梢神経疾患のひとつであるChronic inflammatory demyelinating polyneuropathy(以下CIDP)は、軸索障害の合併が治療反応性や予後に影響する.軸索障害機序の解明は治療反応性や予後の予測だけではなく、CIDPや他の末梢神経疾患の病態解明に有用である.我々は一塩基多型(SNP)による遺伝子多型解析を治療反応性と関連して施行した.Juxtaparanodeに特異的に発現し、Schwann cellとaxonの相互作用を担うTAG-1について、nonsynonymous SNPのみならず、全SNPを対象にした連鎖不平衡解析で有意性が示され、本遺伝子が脱髄性疾患の治療反応性ならびに軸索障害機序の影響因子として重要であることが示された.CIDPの治療反応性に関与する因子として軸策障害機序の合併が明らかになりつつある。今年度は、本邦におけるCIDP症例の長期予後について臨床検査所見を中心に解析し、軸索障害機転との関連性を検討した。運動機能についてはoverall disability sum scaleを用いることで運動機能改善度と電気生理検査上の変動を罹病期間ごとに算出した。その結果、運動機能改善度については罹病早期から改善傾向を示し、発症後3年未満については上下肢ともに60%以上の機能改善を示すことが判明した。一方で6年以上の長期罹病症例については多くに改善傾向は示すものの、改善率は鈍化傾向を示した。電気生理所見の改善は運動機能に遅れる形で認められ、6年未満まではMCV,CMAPとも改善を示すがその後の改善の程度は鈍化した。罹病期間別の解析では、発症から運動障害のピークを早期に認めた群の割合は長期罹病に従い減少するのに対し、慢性進行型の占める割合が増加した。そこで急性亜急性型(6ケ月以内)と慢性進行型を群別化して臨床電気生理的特徴を解析した結果、慢性進行型は筋萎縮の合併が高頻度であり、CMAPsについても急性亜急性型に比べ有意に低値を示すことが判明した。本研究の契機となった治療反応性と軸索障害機転の合併以外にも、長期予後の観点からも軸索障害機転が重要であることが示されたことになる。それ以外の成果として、第一次全国疫学調査による国内有病率・発症率の解析について本邦初の大規模調査に基づく疫学結果を国際ジャーナルに報告した。そのなかでCIDPの有病・発症率は、高齢にともない増加すること、国内分布については多発性硬化症でかつて推測された緯度(寒冷地)との関連性は特に認められないことを合わせて報告した。(J Neurol Neurosurg Psychiatry. 2008Jan 25;[Epub ahead of print])
多剤耐性病原細菌における薬剤耐性遺伝子の集積および再配列機構に関する研究

世界で最初に我が国で確認された16S rRNAメチレースの遺伝子(rmtA)の近傍に存在する2つのκγ-elementに挟まれた構造が、トランスポゾン様の挙動を示す事が昨年の研究で確認されたため、本年度は、2つのκγ-elementとそれらに挟まれたDNA断片上に、DNA断片の離脱、再挿入などを引き起こす遺伝子や機能が存在するか否かを検証した。その結果、いずれか片方のκγ-elementを除去すると、環状のDNAの離脱が発生しない事が確認され、κγ-elementが2つで1セットとして機能している事が示唆された。しかし、2つのκγ-elementに挟まれた領域の様々な欠失体を作成して検討したところ、2つのκγ-elementに挟まれた領域には、κγ-elementの部位を認識し、DNA断片の切り出しや挿入に必要な、トランスポセーズ、リコンビネース、インテグレースのような酵素を担う遺伝子は存在せず、それらは、染色体上あるいは、plasmidの他の領域に存在しているであろう、一般的な酵素を利用している事が強く示唆された。この事実は、薬剤耐性遺伝子を含む、特定の遺伝子が、2つのκγ-elementにより挟まれた場合、そのユニットは、κγ-elementを認識する特定のトランスポゼース等が存在しなくても、一般的なDNAの切り出しや挿入に関与する酵素の働きで、任意の場所に転位できる事を示唆しており、今後、多剤耐性菌の進化と蔓延に寄与する危険性が示唆された。一方、rmtC遺伝子の近傍に存在するISEcp1は、CCTAGATTCTACGTとACGTGGAATTTALGGなどの配列で挟まれたDNA断片とともに転移する機能を有する事が確認され、また、挿入箇所の両端には、TTCAAを典型とする5bpの配列が新しく生成する事が確認された。今回、Pseudomonas putida,Alcaligenes faecalis,Serratia marcescensで発見された4種類のclass 3インテグロンについて、それらに担われている遺伝子カセットが再配列される基本的な法則を解析した。その結果、[-GATAAACcacaaGTTAGAA-]および[-GTTAGAAaAGGAaaagtATGagcaaGTTG-]の特異的醇列が、各々の耐性遺伝子カセットの再配列の組み換え末端として重要な役割を果している事が示唆された。一方、我が国ではじめて確認された16S rRNAメチレースの遺伝子(rmtA)の近傍に存在するκγ-elementが、それを担うDNA断片の挿入や転位、再配列に関与しているか否かを解析したところ、κγ-elementで挟まれたDNA領域が環状のDNAとして離脱し、また離脱した両端のκγ-elementが連結されて残るなど、κγ-elementで挟まれたDNA領域がトランスポゾン様の挙動を示し、DNA断片の挿入、脱落、転移、再配列を引き起こす能力を持っている事が示唆された。以上の結果から、薬剤耐性に関与する遺伝子は、遺伝子カセットあるいは小DNA断片として、転移と再眠列を繰り返しつつ特定の領域に集積し、薬剤耐性遺伝子の複雑なクラスターが構築される事が示唆され、その詳しい機構についてさらに解析を進めている。
地球表層で形成される無機高分子の構造とその組織の解明

常温常圧に近く,また酸化雰囲気で水に豊富な地球表層では,一般的な鉱物のような3次元周期性を持たない無機物質が多く形成される,これらの物質は非常に微細であり,無機高分子とも呼べるような存在であるが,その構造や集合組織は,そのナノレベルのサイズや構造の非周期性ゆえに未だ明らかになっていない点が多い.本研究ではこのような範疇に入る物質としてイモゴライトやスメクタイト,さらに積層不整の著しい層状珪酸塩を取り上げ,その解析手法を確立するとともに,未知な構造の解明を目指した.天然のナノチューブと呼べるイモゴライトの構造は,主にその電子回折パターンを用いて解析を進めたが,回折強度全体を完全に説明できるモデルを未だ見つけることができず,今後も研究を継続していく.一方イモゴライトの合成条件に関する研究は産総研の鈴木により,いくつかの新しい知見を得ることができた.この結果はイモゴライトの効率的な合成条件の確立に大きく寄与するものである.またスメクタイトに代表されるような層状珪酸塩の2:1層については,特に八面体サイトの1/3が空になった二八面体型構造のバリエーションについての研究を進め,ある種の雲母を高温で脱水酸基化すると今まで無かったまったく新しい層状珪酸塩の構造が現れることを見出した.さらに積層不整の著しいカオリン鉱物,葉ろう石,滑石,緑泥石など様々な層状珪酸塩の積層欠陥の本質を,世界でトップレベルの高分解能電子顕微鏡法,さらにその結果と粉末X線回折のシミュレーションを組み合わせることにより,次々に明らかにした.また電子回折における菊池パターンを利用した積層構造の評価法,微細な結晶性物質の結晶方位や形態の解析法などの新しい手法,高分解能電子顕微鏡像の画像処理法等を確立し,論文・発表等で公表した.常温常圧に近く,また酸化雰囲気で水に豊富な地球表層では,一般的な鉱物のような3次元周期性を持たない無機物質が多く形成される,これらの物質は非常に微細であり,無機高分子とも呼べるような存在であるが,その構造や集合組織は,そのナノレベルのサイズや構造の非周期性ゆえに未だ明らかになっていない点が多い.本研究ではこのような範疇に入る物質としてイモゴライトやスメクタイト,さらに積層不整の著しい層状珪酸塩を取り上げ,その解析手法を確立するとともに,未知な構造の解明を目指した.天然のナノチューブと呼べるイモゴライトの構造は,主にその電子回折パターンを用いて解析を進めたが,回折強度全体を完全に説明できるモデルを未だ見つけることができず,今後も研究を継続していく.一方イモゴライトの合成条件に関する研究は産総研の鈴木により,いくつかの新しい知見を得ることができた.この結果はイモゴライトの効率的な合成条件の確立に大きく寄与するものである.またスメクタイトに代表されるような層状珪酸塩の2:1層については,特に八面体サイトの1/3が空になった二八面体型構造のバリエーションについての研究を進め,ある種の雲母を高温で脱水酸基化すると今まで無かったまったく新しい層状珪酸塩の構造が現れることを見出した.さらに積層不整の著しいカオリン鉱物,葉ろう石,滑石,緑泥石など様々な層状珪酸塩の積層欠陥の本質を,世界でトップレベルの高分解能電子顕微鏡法,さらにその結果と粉末X線回折のシミュレーションを組み合わせることにより,次々に明らかにした.また電子回折における菊池パターンを利用した積層構造の評価法,微細な結晶性物質の結晶方位や形態の解析法などの新しい手法,高分解能電子顕微鏡像の画像処理法等を確立し,論文・発表等で公表した.本年度はまず天然無機高分子(イモゴライト,スメクタイト)の原子配列を,電子回折で調べるための準備に取りかかった。既存の透過電子顕微鏡(TEM)に電子回折パターン取り込み用の高感度・高視野CCDカメラ(ガタン社製,ES500W)を装着し,さらにこれによって取り込んだ電子回折パターン中の多くの回折スポットから自動的にその積分強度を測定するプログラムを作成した。これにより今後様々な無機ナノチューブやナノシートの電子回折パターンの強度を定量的に解析し,その原子配列の情報を調べる予定でいる。イモゴライトのチューブ径及びその分布を原子間力顕微鏡(AFM)で調べる実験を開始した。特に今までの研究で天然のイモゴライトは合成のイモゴライトに比べ,そのチューブ径が細いと言われてきたが,このような違いがAFMで確実に見られることがわかった。しかしながらその径の値は高分解能TEM像などで求まる値と異なっており,その原因を今後調べる必要がある。またトンネル顕微鏡(STM)により,原子分解能で像を得ようとする試みを東京大学物理学専攻の長谷川研究室の支援により行ったが,最後まで良好なSTM像は得られなかった。また産総研のグループではイモゴライト形成過程の解明のため、イモゴライト前駆体形成時における溶液濃度の依存性について検討を行った。その結果Alの濃度が1.5mol/lとい非常に高い濃度から形成された前駆体からでも、分散過程において希薄な条件下ではイモゴライトが生成されることがわかった。イモゴライトは希薄な溶液からしか生成されないが、前駆体形成時にはイモゴライトの生成に影響を与えていないことが明らかとなった。今年度は主に層状の無機高分子と呼べるスメクタイトに関連する構造の解明に注力した。2八面体型2:1層を持ちAl成分の多いスメクタイト、例えばmontmorilloniteの多くは、その八面体サイトの陽イオン分布が、大きな結晶を形成するmuscovite等とは異なっているという報告がある。

muscoviteでは、配位する2つのOH基が対角線上にある八面体サイト(trans-site)が空になっているが、montmorilloniteでは、これとは別の、2つのOH基が隣接した八面体サイト(cis-site)の半分が空となっていることが示唆されている。このような八面体サイトの陽イオン分布の違いを、高分解能電子顕微鏡(HRTEM)法による原子配列の直接観察で明らかにすることを試みた。montmorilloniteはあまりに電子線に弱いため、今回はcis-siteが空になっているillite試料を観察した。ところがそのHRTEM像のコントラストは、通常のmuscoviteのものと全く変わらなかった。その原因について調べたところ、illiteは電顕試料室の真空中における電子照射で脱水素化が起こり、これにより八面体陽イオンのサイト間の移動が起きていることが明らかになった。この結果は、層状珪酸塩の構造をHRTEM法で解析する場合の問題として、論文として国際誌に投稿した。またイモゴライトの形成過程を解明するため、イモゴライト前駆体形成時におけるSiとAlの結合形態についてSi固体NMRによる検討を行った。その結果、Si源であるオルトケイ酸ナトリウムと、Al源である塩化アルミニウムを混合した段階で、SiとAlは重合しており、アロフェン・イモゴライトに共通なQ3(3Al)構造を有していることが明らかとなった。昨年度に続き,天然のナノシートと考えられるスメクタイトとそれに関連する物質の高分解能電子顕微鏡(HRTEM)法による解析を進めた。昨年度は2人面体型2:1層の構造をもち,Alが主要な八面体陽イオンであるilliteの陽イオン分布(cis-vacantとtrans-vacant)のHRTEM法による識別の可能性と,電子線照射→脱水酸基化による陽イオン分布の変化を報告したが,今年度は八面体陽イオンが主にFe^3+とMgで占められる2八面体型雲母のceladoniteについて,同様な解析を試みた。先行研究で,celadoniteは本来trans-vacantの陽イオン分布を持つが,加熱による脱水酸基化により,cis-vacant構造に変化することが報告されている。CeladoniteのHRTEM観察ではcis-vacantの構造に対応したコントラストが観察され,電子顕微鏡内で脱水酸基化→陽イオンの移動が起こることを指示する結果が得られた。一方このceladoniteは,大気中での加熱による脱水酸基化で,α軸の周期が3倍になる超構造を形成することが報告されている。この超構造の原因をHRTEM法で調べ,これは2:1層の上下の四面体シートが完全に対向した,今までに報告されていない新しい層状珪酸塩の構造であり,超構造は八面体イオンの長周期配列によって起きていることを明らかにした。この結果はすぐに国際誌(AmericanMineralogists)に投稿し,掲載された。またイモゴライトの合成において,加熱時間を長くすることにより,イモゴライトチューブの成長とその後の状態変化についての検討を行なった。その結果,イモゴライトチューブの成長が終わった後に,チューブ同士の重合がおきネットワーク構造を形成することが明らかとなった。
老化マーカーの開発と老化制御因子の網羅的スクリーニング

細胞の寿命の1つに、分裂を止めた状態でどれだけの期間生存できるかという「経時寿命」がある。経時老化は我々の臓器など分裂を停止した細胞の寿命制御機構を研究する良いモデルだが、細胞の寿命をその場で測定する方法がないために研究が遅れている。そこで本研究では即時に細胞の老化度を測定できるシステムを開発することを目指した。老化に伴って量が変動するタンパク質を分裂酵母の全5,000種類のタンパク質から探し出した。それらに蛍光タンパク質を融合することにより、目的タンパク質の量を可視化し、老化度と蛍光強度が相関するものを見出した。その結果、細胞の蛍光輝度を測定するだけで老化度が測定できるようになった。本研究では、分裂を止めて静止期に入った細胞の寿命モデルである経時寿命の制御メカニズムを解明すべく研究を行っている。経時寿命の測定法は一定期間細胞を飽和状態に置いた後、新しい栄養培地に蒔いた時にどの程度の割合の細胞が再び増殖してコロニーを形成するかを調べることによって行われるため、結果を知るまでに時間がかかり、操作も面倒である。これがこの分野の研究を難しくしている原因の一つであるため、本研究では、まず細胞の老化度合いを即時に知るためのマーカーの開発に取り組んだ。これまでに我々が構築した分裂酵母の全ORFライブラリーを活かし、約5,000種類の全遺伝子産物について、経時老化に伴う発現レベルの変化をプロテインアレイを用いて測定した。昨年度に行ったこのスクリーニングの結果、コロニー形成率が1割以下に低下する時点で発現レベルが顕著に変化するタンパク質として、増加・減少それぞれについて50種類以上のタンパク質を同定した。そこで、本年度はこれらの中からさらに経時老化マーカーに適した動態を示すタンパク質を選択するため、各候補タンパク質をコードする遺伝子の3'末端に蛍光タンパク質をコードする遺伝子を融合させて発現させ、経時老化に伴う細胞の蛍光強度の変化を観察した他、ウェスタンブロットによって細胞内タンパク質レベルの変化も調べた。その結果、定常期にタンパク質レベルが増加していくタンパク質として2種類、減少していくタンパク質として5種類のタンパク質を最終候補として選択した。一方で、定常期の培養時間に応じてmRNAの発現レベルが変化する遺伝子についてもDNAマイクロアレイを用いてスクリーニングした。その結果、細胞が飽和して増殖が停止した後、培養時間と共に発現レベルが増加・減少する遺伝子をそれぞれ多数見出した。分裂を止めた細胞の生存期間によって表される経時寿命はテロメア短縮などのメカニズムが提唱されている複製寿命に比べ、まだ不明な点が多く、老化時に細胞内で何が起こっているのかはまだほとんどわかっていない。経時老化の研究を難しくしている原因の一つは、細胞の老化を知るための有用なマーカーの欠如である。細胞が分裂しない経時老化ではテロメア長などは指標とはならない。経時老化マーカーが開発できれば、現在のようにいちいち培地に蒔いてコロニー数をカウントするという時間と労力のかかる作業がなくなり、老化研究を飛躍的に加速できると期待される。そこで本研究では、ポストゲノム研究に適したモデル生物である分裂酵母を用い、約5,000種類の全タンパク質について、経時老化に伴う発現レベルの変化を調べ上げ、老化の度合いを示すマーカータンパク質を開発することを目指した。初年度は経時老化において発現レベルが変化するタンパク質をスクリーニングするための条件検討をおこない、スクリーニング系を確立した。本研究者がすでに構築していた約5,000株からなる分裂酵母のタグ融合遺伝子発現株のセットを個々に飽和状態になるまで培養して分裂を停止させた後、そのまま培養を続け、経時老化させた。一定期間ごとに細胞を回収し、全細胞抽出液を調製した後、プロテインアレイ(リバースアレイ)を作製し、抗タグ抗体により各タンパク質の発現レベルを測定した。飽和直後の比較的若い細胞との間でデータを比較することにより、5,000種類のタンパク質全てについて経時老化に伴うレベルの変動を測定した。その結果、生存率が1割以下に落ちる時点で、発現レベルが顕著に変化するものとして、増加・減少それぞれについて50種類以上のタンパク質を同定した。我々は老化がどのようなことを意味しているのかを直感的には理解している。しかし、近年ようやく酵母や線虫、ショウジョウバエなどのモデル生物を用いた研究により、その制御因子が少しずつ見え始めたに過ぎず、その分子機構の大部分はまだ謎に包まれている。細胞の寿命には、一つの細胞が何回分裂するかで規定される「複製寿命」と、分裂を止めた状態でどれだけの期間生存できるかという「経時寿命」がある。複製寿命は幹細胞など生涯を通じて分裂を続ける細胞の寿命についての良いモデルである。一方で我々の皮膚や臓器など分化した細胞は通常もう分裂しない。経時寿命はこれら分裂しない細胞の寿命制御機構を研究する良いモデルであるが、その研究は複製寿命に比べて遅れている。

酵母のような微生物の場合、経時寿命は増殖を停止させた細胞集団を増殖可能な条件に戻した時に再び増殖できる細胞の割合(コロニー形成率)で測定されるため、時間と手間を要し、研究の大きな障壁となっている。これまでに研究代表者らは、モデル生物として有用な分裂酵母の約5,000種類に及ぶ全遺伝子の99%以上をクローニングし、それらに小分子のタグを融合した後、ゲノムに挿入して発現可能にした株約5,000種類を樹立することにより様々な大規模解析法を開発してきた。本研究では、このリソースを用いて経時老化に伴って発現レベルが変化するタンパク質をスクリーニングし、細胞の老化の度合いを示すマーカーとなるタンパク質を同定した。最終的に経時老化と発現レベルとの相関性が良いタンパク質を5種類に絞り込み、それらに蛍光タンパク質を融合させて可視化することにより、細胞の老化度を蛍光強度で測定可能にした。分子生物学タンパク質レベルの変動を元にしたスクリーニングによって老化マーカーを作製する戦略では、マーカーの最終候補を選択するにとどまり、老化マーカーとして確立するには至らなかった。しかし、新たにDNAマイクロアレイを用いてmRNAの発現レベルが変動する遺伝子をスクリーニングする戦略を取り入れたため、より理想的な振る舞いを有する老化マーカーを作製できる可能性が高くなった。初年度は条件検討をおこなった後、分裂酵母の全タンパク質を用いたプロテインアレイにより、経時老化にともなってタンパク質レベルの変化が見られるタンパク質を5,000種類のタンパク質の中からスクリーニングすることを目指していたが、現在までにこの一次スクリーニングは完了できていることから、本年度の目標には到達できている。2つの方法によって別々に得られた老化マーカーの候補について、発現レベルの増減と細胞の老化度が一番よく相関する組み合わせを選択し、実際に老化マーカーとして使用していく。DNAマイクロアレイによって同定した遺伝子については、プロモーター部分のみをクローニングし、GFP等蛍光タンパク質のORFを下流につないでレポーターとして用いる。マーカーの確立後は、遺伝子の過剰発現、あるいは遺伝子破壊と組み合わせ、経時寿命に影響を与える遺伝子をゲノムワイドにスクリーニングする。すでに分裂酵母の全タンパク質の中から経時老化にともなってレベルの変化が見られるタンパク質の候補が得られていることから、本年度は、分裂酵母において経時寿命が延長することがわかっている変異株等を用い、より老化のマーカーとしてふさわしいタンパク質を選出する。ここでは、経時老化にともなって増加するものと減少するものをそれぞれ最低1つは同定し、それぞれに別の蛍光タンパク質を融合させて同一の株中で発現させ、細胞の老化度を蛍光強度で測定可能にすることを目指す。経時老化のマーカーが確立できた場合は、当研究室が保有する全遺伝子の発現プラスミドのセットを老化マーカー発現株に導入し、経時老化に影響を与える遺伝子をスクリーニングすることにより、経時老化の制御に関わる遺伝子を見出す。
パルスラジオリシス・マイクロ波加熱法による亜励起電子を含む気相素反応過程の研究

本研究は、パルスラジオリシス・マイクロ波空洞法を適用することにより、主に電子の関与する素反応過程を対象として、その反応パラメータの決定と反応機構の解明、およびそれらの電子エネルギー依存性について調べることを目的にしている。本年度は(i)従来のパルスラジオリシス・マイクロ波空洞法を用い、SO_2の熱電子付着反応機構を解明すること、(ii)これまでこの手法で対象とした電子のエネルギーが主に熱エネルギーであるという制約を取り去る目的で、さらにマイクロ波加熱を利用して電子エネルギーを増大させる試み、について行った。まず、(i)については、純SO_2系・SO_2-M系(M:N_2,n-C_4H_<10>,CO_2)系を対象として、SO_2の熱電子付着速度の圧力及び温度依存生を調べ、その付着機構の詳細について検討したが、その結果、媒体気体の圧力領域によって、寿命の違う二種の振動励起負イオンを経る二段階三体過程の組合せとして全体の電子付着機構が理解できることが示された。(ii)については検出感度の点からXeを媒体気体に選び、その運動量移行断面積におけるラムザウアー極少を反映するマイクロ波電気伝導度信号の時間変化とマイクロ波加熱電力との関係を調べて平均電子エネルギーとの対応づけを行った。その結果約2ev程度まで平均電子エネルギーが可変であることがわかり、それによりCCl_4ならびにCHCl_3の電子付着速度定数の電子エネルギー依存性に関する知見を得た。いずれも所期の目的は達成することはできたが、さらに(i)においては温度依存性のデータ不足によりファンデアワールス分子の寄与について明確な結論が出せなかったこと、また(ii)では加熱マイクロ波電力と平均電子エネルギーとの正確な対応には約0.10.2ev程度の曖昧さが存在することが課題として残された。
偏微分方程式の無限精度数値シミュレーションに関する研究

3年間の研究期間で様々な研究成果がえられたが,主な成果を以下にあげる.1.並列計算環境の構築.高性能ワークステーションを購入してネットワーク接続し,これらにPVM(Parallel Virtual Machine)を実装することで,本研究で重要な設備である並列計算環境を徳島大学の今井研究室に構築した.2.無限精度数値シミュレーション法の開発.数値誤差は,打切り誤差と丸め誤差からなる.打切り誤差を任意に小さくするために,任意次数の近似を可能にするスペクトル法,とくに非線形問題に有用なスペクトル選点法がある.丸め誤差を任意に小さくするために,多倍長計算がある.本研究では,このスペクトル選点法と多倍長計算を組み合わせることで,数値誤差を任意に小さくする無限精度数値シミュレーションを実現した.1次元の境界値問題に本手法を適用したところ,誤差が10^<-2300>の数値計算ができた.これは,通常の数値計算精度である,倍精度計算の実に150倍以上という驚異的な計算精度である.また,数値誤差を任意に小さくできることが確認された.3.ライブラリ開発と公開.「無限精度数値シミュレーション」のためのライブラリ開発を行った.連立一次方程式を解くためのライブラリとして,ガウスの消去法を多倍長計算するものを開発した.また,これのPVMによる並列化したものも開発した.これらライブラリの公開は,今井のホームページにライブラリを収めた報告集を公開することで実現した.4.関連する成果.可視化における無限拡大法の開発,領域分割法による並列計算法の開発,逆問題・自由境界問題・流体問題への無限シミュレーションの応用とその基礎研究,精度保証の研究などにおいて多くの研究成果がえられた.3年間の研究期間で様々な研究成果がえられたが,主な成果を以下にあげる.1.並列計算環境の構築.高性能ワークステーションを購入してネットワーク接続し,これらにPVM(Parallel Virtual Machine)を実装することで,本研究で重要な設備である並列計算環境を徳島大学の今井研究室に構築した.2.無限精度数値シミュレーション法の開発.数値誤差は,打切り誤差と丸め誤差からなる.打切り誤差を任意に小さくするために,任意次数の近似を可能にするスペクトル法,とくに非線形問題に有用なスペクトル選点法がある.丸め誤差を任意に小さくするために,多倍長計算がある.本研究では,このスペクトル選点法と多倍長計算を組み合わせることで,数値誤差を任意に小さくする無限精度数値シミュレーションを実現した.1次元の境界値問題に本手法を適用したところ,誤差が10^<-2300>の数値計算ができた.これは,通常の数値計算精度である,倍精度計算の実に150倍以上という驚異的な計算精度である.また,数値誤差を任意に小さくできることが確認された.3.ライブラリ開発と公開.「無限精度数値シミュレーション」のためのライブラリ開発を行った.連立一次方程式を解くためのライブラリとして,ガウスの消去法を多倍長計算するものを開発した.また,これのPVMによる並列化したものも開発した.これらライブラリの公開は,今井のホームページにライブラリを収めた報告集を公開することで実現した.4.関連する成果.可視化における無限拡大法の開発,領域分割法による並列計算法の開発,逆問題・自由境界問題・流体問題への無限シミュレーションの応用とその基礎研究,精度保証の研究などにおいて多くの研究成果がえられた.本年度は研究期間の初年度にあたる。以下の項目について新たな成果が得られた。1. PVMの構築と性能評価。7台の高性能コンピュータをネットワーク接続し,並列計算環境PVMを徳島大学の数学教室に構築した。この環境で,2次元渦層の数値計算を行ったところ,台数分に近い倍率の高速計算ができた。2.無限精度数値計算法の基礎開発。徳島大学のグループは,スペクトル法と多倍長演算を組み合わせて,無限精度数値計算法の基礎を開発した。差分法などの既存の数値解法ではえられない,桁違いの超高精度性を確認することができた。また,多倍長演算による固有値・固有ベクトルの計算サブルーチンをFORTRAN言語で開発した。いままでの計算精度では固有値・固有ベクトルが求まらなかったような行列に対しても,本サブルーチンで正確に計算できることを確認した。3.精度保証に関する研究。中尾は,区分1次三角形有限要素近似の最良誤差評価定数を,精度保証付きで計算することに成功した。西田は,解空間の大域的な分岐構造を解明するために,いかなる解析的基礎理論及び計算機援用証明法が必要かを研究し,解の存在を保証する判定法を開発した。4.可視化ソフトの開発。金は,多倍長演算で吐き出される,長大な有効数字を持つ膨大な数値データの可視化を,有名な可視化ソフトAVSのモジュールを新たに開発することで可能にした。5.高速計算手法の開発と応用。池田は,領域分割法に基づく並列計算アルゴリズムを開発した。それをある反応拡散方程式系に適用して,美しいパターンを数値的に再現することに成功した。藤間は,メモリ分散型並列計算機において,プロセッサ間の冗長な通信を削減する方法を提案し,高速計算を可能にした。6.応用問題への適用のための基礎研究。田端は,流体中の物体の抗力係数を求めるために,数値計算における新しい誤差評価法を開発した。友枝は,自由境界問題において,厳密に保証する数学的証明も可能な数値計算法の開発を行なっている。磯は,多倍長計算による逆散乱問題の数値解析を行った。

形状の再構成は高精度で行うことができたが,数値誤差の影響の詳細な研究を現在進めている。本年度は研究期間の中間年度にあたる。以下の項目について新たな成果が得られた。1.無限精度数値シミュレーションの応用。徳島大学のグループは,無限精度数値シミュレーションの自由境界問題への応用に成功した。逆問題に対しては,振動現象がおきて計算できなかった問題にも応用できることがわかった。また,磯との共同研究によって,逆問題における本研究の数学的な位置づけを確立しつつある。2.高速計算手法の開発と応用。徳島大のグループは,PVMを用いて,無限精度数値シミュレーションの基本的な数値計算ライブラリーである,ガウスの消去法の並列計算プログラムの開発に成功した。3.計算機援用証明法に関する研究。中尾は,関数方程式の解に対する精度保障付き数値計算法として,変分不等式に対する解の検証法の改良や楕円型固有値問題の精度保証方式とその実現など多くの成果を得た。西田は,流体方程式の解の分岐現象の大域的な解析に対する計算機援用証明法の研究で大きな前進をみた。4.複雑の応用問題への適用のための基礎研究。田端は,流脈線の誤差解析をハウスドルフ距離を用いて行った。また,滑り境界条件を持つ問題の数値計算上の困難さを解決した。地球マントル対流の数値シミュレーション用有限要素コードを作成した。友枝は,吸収効果をともなった半線形・非線形拡散方程式に現われる自由境界問題の一つであるサポートの分離現象を再現する数値解析法を構成した。池田は,燃焼合成反応の数理モデルの数値シミュレーションの結果,ある程度以上の半径を持つ円柱領域においては振動進行波の波面が不安定化し,ヘリカル進行波が出現すること示した。藤間は,表面張力を考慮した2流体問題への領域分割法の適用妥当条件を得ることに成功した。本年度は研究期間の最終年度にあたる.新たにえられた主な成果を以下に示す.1.無限精度数値シミュレーションの新たな応用と精度限界の更新.一様流に対する無限精度数値シミュレーションの適用法を開発した.これはつい最近成功したもので,本格的なシミュレーションは今後の課題である.また,通常では実行不可能な,物理メモリ以上のメモリ容量を必要とする数値シミュレーションを,多倍長計算ライブラリのメモリ節約機能を用いて実行した.これによって,1次元の境界値問題を誤差が10^<-2300>で計算できた.研究開始初年度の2倍の計算精度を達成した.これは,有効数字の桁数でいうと,2300桁というとてつもない超高精度である.通常の数値計算精度である倍精度計算の,実に150倍以上という驚異的な計算精度である.2.ライブラリの公開.無限精度数値シミュレーションに必要なライブラリ(連立一次方程式を解くためのガウスの消去法の多倍長計算版とこのPVMによる並列化版)をネット上で公開した.これは,今井のホームページに,ライブラリを収めた科件費報告集を公開することで実現した.3.可視化における無限拡大法の開発.
CTL高誘導型Hsp90-癌抗原融合遺伝子ワクチンの基礎研究

本研究は、Hsp90遺伝子と既知の癌抗原遺伝子との融合遺伝子を用いたDNAワクチンの有用性についての基礎的検討を行ったものである。癌抗原としては、我々が同定した癌抗原サバイビンを用いて、Hsp90-癌抗原融合遺伝子によるDNAワクチンの有効性をマウスを用いて評価した。特に癌抗原の抗原提示細胞による取り込みと抗原提示を促進する目的で、シグナルシークエンス(SS)をN末端側に付加し、分泌型としたHsp90-マウスサバイビン融合遺伝子ワクチンの有効性を検討した。その際、癌抗原サバイビンをHsp90のN末端側(SS-Survivin-Hsp90)あるいはC末端側(SS-Hsp90-Survivin)に融合した場合の、免疫効果を比較検討した。腫瘍はマウスリンパ腫細胞A20および、腎細胞癌株RenCaを同型マウスに接種し、その免疫効果を検討した。非常に興味深いことに、いずれの腫瘍においてもHsp90のN末端側に抗原を配置したSS-Survivin-Hsp90の遺伝子ワクチンでは強い抗腫瘍効果を認めたが、C末端側に配置したSS-Hsp90-Survivinでは全く抗腫瘍効果を認めなかった。またシグナルシークエンスを付加していないSurvivin-Hsp90遺伝子ワクチンと比較すると、高い抗腫瘍効果を示した。またSS-Survivin-Hsp90融合遺伝子ワクチンで免疫されたマウスでは有意なサバイビン特異的CTLが誘導されていた。この抗腫瘍効果がサバイビンに対するCTL誘導によることを示すものと考えられた。以上の結果はHsp90のC末端側が樹状細胞をはじめとする抗原提示細胞による取り込みに際して非常に重要である可能性を示唆しているものと考えられる。(目的・意義)我々はHsp90-抗原複合体は、樹状細胞に非常に効率良くtargetingできることを示し、癌抗原特異的な細胞傷害性T細胞(CTL)を活性化することを明らかにしてきた。本研究では、Hsp90遺伝子と既知の癌抗原遺伝子との融合遺伝子を用いたDNAワクチンの有用性についての基礎的検討を計画した。(結果)ヒトHsp90遺伝子とヒトサバイビン遺伝子の融合遺伝子をFLAG tag付きベクター(pCAGGS)に挿入した。またコントロールとしてサバイビン単独DNAおよびHsp90単独DNAワクチンを作製し、マウスリンパ腫細胞A20を用いて比較検討した。まず投与方法の最適化を検討する目的で、サバイビン単独DNAワクチンを用いて、大腿四頭筋への筋注とfootpad内免疫の有効性を比較した。その結果、footpad内免疫法の有効性が高いことを示した。そこで、Hsp90-サバイビン融合遺伝子ワクチン、サバイビン単ワクチンの抗腫瘍効果を比較検討した。その結果、Hsp90-サバイビン融合遺伝子ワクチン、サバイビン単独ワクチンはHsp90単独ワクチンと比較すると腫瘍増殖および生存率において有意な抗腫瘍効果を認めた。さらにHsp90-サバイビン融合遺伝子ワクチンは、Hsp90-サバイビン単独ワクチンと比較して、腫瘍増殖抑制、生存率ともに有意な抗腫瘍効果を確認し得た。またHsp90-サバイビン融合遺伝子ワクチンで免疫されたマウスでは有意なサバイビン特異的CTLが誘導されていた。この抗腫瘍効果がワクチンとして用いたサバイビンに対するCTL誘導によることを示すものと考えられた。[目的]昨年度は、Hsp90-マウス癌抗原サバイビン遺伝子融合遺伝子ワクチンの有効性を検証した。本年度は、癌抗原の抗原提示細胞による取り込みと抗原提示を促進する目的で、シグナルシークエンス(SS)をN末端側に付加し、分泌型としたHsp90-サバイビン融合遺伝子ワクチンの有効性を検討した。

その際、癌抗原サバイビンをHsp90のN末端側(SS-Sur-Hsp90)あるいはC末端側(SS-Hsp90-Sur)に融合した場合の、免疫効果を比較検討した。[結果と考察]シグナルシークエンスを付加した、SS-Sur-Hsp90およびSS-Hsp90-Surはいずれも細胞外に分泌されることをWesternblottingにて確認した。これらの融合遺伝子を2回ワクチンしたのち、サバイビンを発現しているマウスリンパ腫細胞A20および、腎細胞癌株RenCaを接種した。非常に興味深いことに、いずれの腫瘍においてもHsp90のN末端側に抗原を配置したSS-Sur-Hsp90の遺伝子ワクチンでは強い抗腫瘍効果を認めたが、C末端側に配置したSS-Hsp90-Surでは全く抗腫瘍効果を認めなかった。またシグナルシークエンスを付加していないSur-Hsp90遺伝子ワクチンと比較すると、高い抗腫瘍効果を示した。またSS-Sur-Hsp90融合遺伝子ワクチンで免疫されたマウスでは有意なサバイビン特異的CTLが誘導されていた。この抗腫瘍効果がサバイビンに対するCTL誘導によることを示すものと考えられた。以上の結果はHsp90のC末端側が樹状細胞をはじめとする抗原提示細胞による取り込みに際して非常に重要である可能性を示唆しているものと考えられる。今後Hsp90のdeletion mutant遺伝子を作成して、C末端側の意義について明らかにする予定である。
BMCC1によるゲノム安定維持とその神経芽腫悪性化防止への関与

進行性の神経芽腫は、難治性を示す。本研究課題では、「神経芽腫の悪性化機構の理解」を目指し、神経芽腫の予後良好症例で高発現する癌抑制因子BMCC1に着目し、BMCC1を介したゲノム維持機構の分子基盤を解明する事を目的とし、以下の2項目について研究を推進している。『項目1. BMCC1によるATMリン酸化促進メカニズムの解明。』本項目では、E2F1-BMCC1-ATMの正のフィードバック制御について解明することを最終目的としている。平成30年度は、DNA損傷からアポトーシスに至る過程におけるBMCC1のmRNAと蛋白質の発現変動プロファイルを、神経芽腫細胞株を用いた継時的な解析より明らかにした。その際、BMCC1のmRNAはATM-E2F1の下流において転写レベルで発現誘導されることを示した。その一方で、BMCC1蛋白質は、DNA損傷応答により速やかに蓄積するものの、アポトーシスが進行するとカスパーゼ依存的に分解されることが分かった。以上の成果は、責任著者として学術論文にまとめ、現在投稿中である。さらに、BMCC1がATMのリン酸化を促進するメカニズムを解明する手がかりを得る目的で、抗がん剤のシスプラチンでDNA損傷を与えた神経芽腫細胞株のマイクロアレイ網羅的遺伝子発現解析を行ない、BMCC1の有無で発現変動する遺伝子群とそのシグナル経路を絞り込んだ。『項目2. BMCC1の発現低下を介したゲノム不安定性誘導と神経芽腫悪性化機構の解明。』平成30年度は、先行研究で行ったステージ3又は4かつMYCN非増幅で、ゲノム維持機構の破綻がドライバーと考えられる神経芽腫症例(難治性中間予後群)の全エクソンシークエンス結果の解析を進め、神経芽腫においてBMCC1の低発現が、11q欠損等と共にゲノム不安定性の一端となりうるかについて検討した。神経芽腫の悪性化機構の理解を目指し、その鍵となる分子のBMCC1に着目し、以下の2項目について研究を推進した。』神経芽腫細胞株を用いた解析からDNA損傷後のBMCC1の発現変動およびその制御機構を解明し、その成果について学術論文の発表を目指した(査読中)。さらに、神経芽腫細胞株を用いた網羅的遺伝子発現解析データーを元に、DNA損傷後のATMリン酸化促進に関わるBMCC1の機能メカニズムの一端についての手がかりを得た。以上、本研究項目は概ね順調に進展している。』先行研究で行ったゲノム解析データーをもとに、難治性中間予後群の分類を進めるとともにBMCC1の発現レベルとゲノム不安定生との関連性について解析を進めた。その成果の一部は、学術論文の投稿を準備中である。神経芽腫の悪性化機構の理解を目指し、その鍵となる分子のBMCC1に着目し、最終年度は以下の2項目について研究を推進し、その成果を報告していく。』最終年度は、マイクロアレイを用いた遺伝子発現解析より絞り込んだ遺伝子について解析を行い、DNA損傷後のATMリン酸化促進メカニズムにおけるBMCC1の寄与について明らかにする。本研究の成果を学術論文としてまとめる。』最終年度は、樹立したBMCC1ノックアウトマウスの遺伝子発現解析およびゲノム解析から、BMCC1の機能を個体レベルで明らかにしていく。さらに、難治性中間予後群のゲノムデーターの解析結果とあわせて、本研究の成果を学術論文としてまとめる。進行した腫瘍が難治性を示す「神経芽腫の悪性化機構の理解」を目指し、その予後不良症例で発現低下する癌抑制因子BMCC1が、ATMのリン酸化を促進しDNA損傷応答を活性化してゲノム安定性を担保する分子基盤の解明を目的として、以下の2項目について推進した。項目1. BMCC1によるATMリン酸化促進メカニズムの解明。本項目では、E2F1-BMCC1-ATMの正のフィードバック制御について解明することを最終目的としている。平成29年度は、その手始めとして、神経芽腫細胞株SK-N-AS細胞に対して抗癌剤(cisplatinおよびVP-16)を用いてDNA損傷による細胞死を誘導した際に、BMCC1はE2F1依存的に発現亢進されること、またアポトーシス後期の細胞ではタンパク分解制御を受けることを発見し、その分子制御メカニズムを明らかにした。さらに、BMCC1の分子機能を解明する手がかりを得る目的で、shRNAを用いてBMCC1を発現抑制したSK-N-AS細胞株を樹立し、マイクロアレイを用いて網羅的な遺伝子発現解析を行なった。項目2. BMCC1の発現低下を介したゲノム不安定性誘導と神経芽腫悪性化機構の解明。本項目では、先行研究で行った96症例の難治性中間予後群(ステージ3又は4かつMYCN非増幅で、ゲノム維持機構の破綻がドライバーと考えられる70症例)のゲノム解析データーを用いて、その低発現が有意に予後不良性を示したBMCC1の関与について解明することを最終目的としている。平成29年度は、ゲノムデーターの解析からBMCC1遺伝子領域の欠失を持つ症例を見出し、これは体細胞変異が多い表現型を示すことを明らかにした。

以上の研究成果の一部は、第76回日本癌学会学術総会で報告するとともに、学術論文として投稿準備中である。項目1.の『BMCC1によるATMリン酸化促進メカニズムの解明』については、上記のようにDNA損傷後の神経芽腫細胞株におけるBMCC1の発現制御機構の解明が進んでおり、学術論文の早期発表を目指している。さらに、DNA損傷後のBMCC1の役割について、マイクロアレイを用いた遺伝子発現解析より絞り込みつつある。項目2.の『BMCC1の発現低下を介したゲノム不安定性誘導と神経芽腫悪性化機構の解明』についても、上記のように、先行研究で行ったゲノム解析データーをもとに96症例の難治性中間予後群の分類をすすめており、学術論文の早期発表を目指している。さらに、これら情報とBMCC1の関係についても明らかにしつつある。以上、本研究は概ね順調に進展している。進行性の神経芽腫は、難治性を示す。本研究課題では、「神経芽腫の悪性化機構の理解」を目指し、神経芽腫の予後良好症例で高発現する癌抑制因子BMCC1に着目し、BMCC1を介したゲノム維持機構の分子基盤を解明する事を目的とし、以下の2項目について研究を推進している。『項目1. BMCC1によるATMリン酸化促進メカニズムの解明。』本項目では、E2F1-BMCC1-ATMの正のフィードバック制御について解明することを最終目的としている。平成30年度は、DNA損傷からアポトーシスに至る過程におけるBMCC1のmRNAと蛋白質の発現変動プロファイルを、神経芽腫細胞株を用いた継時的な解析より明らかにした。その際、BMCC1のmRNAはATM-E2F1の下流において転写レベルで発現誘導されることを示した。その一方で、BMCC1蛋白質は、DNA損傷応答により速やかに蓄積するものの、アポトーシスが進行するとカスパーゼ依存的に分解されることが分かった。以上の成果は、責任著者として学術論文にまとめ、現在投稿中である。さらに、BMCC1がATMのリン酸化を促進するメカニズムを解明する手がかりを得る目的で、抗がん剤のシスプラチンでDNA損傷を与えた神経芽腫細胞株のマイクロアレイ網羅的遺伝子発現解析を行ない、BMCC1の有無で発現変動する遺伝子群とそのシグナル経路を絞り込んだ。『項目2. BMCC1の発現低下を介したゲノム不安定性誘導と神経芽腫悪性化機構の解明。』平成30年度は、先行研究で行ったステージ3又は4かつMYCN非増幅で、ゲノム維持機構の破綻がドライバーと考えられる神経芽腫症例(難治性中間予後群)の全エクソンシークエンス結果の解析を進め、神経芽腫においてBMCC1の低発現が、11q欠損等と共にゲノム不安定性の一端となりうるかについて検討した。神経芽腫の悪性化機構の理解を目指し、その鍵となる分子のBMCC1に着目し、以下の2項目について研究を推進した。』神経芽腫細胞株を用いた解析からDNA損傷後のBMCC1の発現変動およびその制御機構を解明し、その成果について学術論文の発表を目指した(査読中)。