hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
microRNAによる新しいCOPD治療を目指した気道分泌型エクソソーム解析

本年度は、末梢および中枢の気道上皮細胞のタバコ煙曝露に対する反応性の違いについてin vitro, in vivoの両面から詳細に解析することができ、一連の成果を英文論文として報告するという目標を達成することができた。気道上皮細胞の培養上清からの超遠心法を用いたエクソソーム分離法を確立することはできていたが、SAECおよびNHBE細胞由来のエクソソームについては詳細な解析は今後の課題となっている。エクソソーム解析およびその評価について、専門家から指導いただける体制を構築しており比較的順調に行うことができている。タバコ煙曝露装置SG-300については、製造元である柴田科学との連携により、定期的なメンテナンスを実施することができ、実験が計画的に進捗することができた。以上の理由から本研究は概ね順調に進展していると考える。末梢気道を起点とすると考えられるタバコ煙曝露に伴う炎症が肺全体へ波及するメカニズムを検討する目的に、末梢気道および中枢気道由来のエクソソームを引き続き解析する。解析に十分なエクソソームを得るには多くの細胞が必要であることから、新たなロットの細胞を大量に培養することで、解析に十分なエクソソーム由来RNAの回収を試みる。それぞれの細胞での遺伝子発現プロファイルの違いを検討し、さらにmiRとターゲット遺伝子の統合解析を行い、抽出されたmiRの機能的な分析を試みる。COPD患者由来細胞でのプロファイルの違いについても解析する。すべての喫煙者の呼吸細気管支レベルで炎症が観察され、COPDにおいては末梢気道炎症を契機として、炎症が慢性化するとともに病変が中枢気道あるいは肺胞へ進展すると考えられている。そこで、末梢および中枢気道におけるタバコ煙曝露に対する反応性の違いを詳細に検討する目的で、ヒト小気道上皮細胞(SAEC)、ヒト気管支上皮細胞(NHBE)それぞれにタバコ煙抽出液(CSE)刺激を行った。24時間曝露後の各気道上皮細胞からRNAを抽出し、マイクロアレイ法を用いた細胞内遺伝子発現解析、さらに、pathway analysis用いた遺伝子機能解析を行った。CSE曝露により2倍以上の発現変動がみられた遺伝子を抽出した。その結果、どちらか一方でも発現亢進が確認されたのは155遺伝子であり、そのうち44遺伝子が共通で亢進、39遺伝子がNHBEのみで亢進、72遺伝子がSAECのみで亢進していた。一方、どちらかで発現減少が確認されたのは149遺伝子であり、23遺伝子が共通で減少、71遺伝子がNHBEのみで減少、55遺伝子がSAECのみで減少していた。Pathway analysisの結果、SAECにおいて多くのpathway変動があり、TNF signaling pathwayやNF-kappa B signaling pathwayといった炎症関連のpathwayがNHBEと比較して有意に亢進していることが分かった。一方、発現が減少する遺伝子については有意なpathwayが検出されなかった。さらに、SAECで亢進するpathwayおよびtermに含まれる遺伝子としてPTGS2 (COX-2)が抽出され、これが、CSE曝露により、NHBEと比較してより早期から有意に発現亢進することを確認した。これまでの実験結果より、気道上皮細胞と小気道上皮細胞のタバコ煙抽出液に対する反応性の違いが明確となった。さらに、予備検討として、それぞれの細胞上清から、本研究のメインターゲットである分泌型エクソソームの抽出法(超遠心法)を確立することができているため、今後反応性の違いをエクソソームレベルで詳細に解析していくことが可能となっている。In vivoでも、マウスの気管支洗浄液からエクソソームを抽出することに成功した。タバコ煙抽出液作成装置については、製造元である柴田科学との連携により、定期的なメンテナンスを実施することができ、実験が計画的に進捗することができた。以上の理由から本研究は概ね順調に進展していると考えた。近年、呼吸器系細胞間においてmiRのエクソソームを介した情報伝達機能が明らかとなりつつあることから、エクソソームはmiRの生理的な供給システムとしても重要であり、かつエクソソームに内包されるmiRは病態形成あるいは抑制といった目的を有する機能性miRである可能性が高いと考えられる。異なるレベルの気道上皮細胞から分泌されるエクソソームを詳細に解析することで、それら細胞間でのクロストークや小気道上皮を端緒とすると考えられるCOPD病態形成機構の解明を目指す。さらに、in vivoでは、COPDモデルマウスへの、エクソソームを介したmiR投与実験系を確立することを目指し、将来的なエクソソームによるCOPD治療実験につなげていきたい。

末梢気道を起点とすると考えられるタバコ煙曝露に伴う炎症が肺全体へ波及するメカニズムを検討する目的に、末梢気道および中枢気道由来のエクソソームを引き続き解析する。解析に十分なエクソソームを得るには多くの細胞が必要であることから、新たなロットの細胞を大量に培養することで、解析に十分なエクソソーム由来RNAの回収を試みる。それぞれの細胞での遺伝子発現プロファイルの違いを検討し、さらにmiRとターゲット遺伝子の統合解析を行い、抽出されたmiRの機能的な分析を試みる。COPD患者由来細胞でのプロファイルの違いについても解析する。当該年度においては、他の原資にて、実験消耗品および人件費等の支出をまかなうことができたため。次年度においては、実験助手雇用のための人件費および実験消耗品費、2018年4月に大阪で予定されている日本呼吸器学会学術講演会の旅費、参加費等への使用を予定している。前年度の未使用額分があり、今年度としては予定使用額に近い金額の支出となっている。その他の項目については、マイクロアレイ解析について、精度を担保する意味合いから実績のある業者への委託解析を行ったことによる支出額となっている。次年度については、実験助手雇用のための人件費および実験消耗品費、2019年4月に東京で開催される日本呼吸器学会学術講演会の参加費等への使用を予定している。
林野火災延焼予測に関する基礎的・応用的研究

本研究は、文部省科学研究費「林野火災大規模化の要因解明に関する基礎的・応用的研究」に引き続いて行なったものである。前回の研究結果に基づいて本研究は次の2点に焦点を絞って研究を進めた。(1)燃焼程度別に分類された正確な林野火災図の作成方法の確立と林野火災跡地の植生回復の経時変化の捕捉方法及び林野火災と地形との関連を追求するための地形情報との重ね合わせ手法の確立。(2)林野火災解析にとって最も重要な火災現場における風向・風速の定量的な把握手法と火災延焼予測法の確立。第1点については、火災前・火災直後・継続的な火災後の空中写真の入手は不可能に近いので、ランドサットデ-タの活用を試みた。そのため、ランドサットデ-タの分類手法について検討を加え、新しい分類手法を提案し火災跡地などで検証した。この手法はRESTEC(リモ-トセンシング技術センタ-)の「衛星デ-タ解析手法デ-タベ-ス登録論文」のNo.32として登録・評価された。更に植生指標(NDVI)の時期別重ね合わせにより林野火災跡地の経時変化を明らかにした。此等の研究成果は研究協力者のサマラコ-ン氏により集大成され、学位論文としてまとめられた。第2の点については、室内実験と野外実験により、樹木の片面燃焼により、その地点における風向・風速の定量的な推定が可能である事が確かめられ、風速推定式を提案した。また、燃焼速度の推定式である。Rothermel式を室内・野外実験で検討し、風速の割り増し係数式の検討結果によりわが国において適用出来る様な修正式を提案すると共に室内・野外実験により検証した。此等一連の研究は研究協力者である井上氏により集大成され、学位請求論文としてまとめられつつある。本研究は、林野火災燃焼予測に関し、主として片面燃焼に焦点をしぼって研究を行うことを目的としている。また短期間で研究の成果を挙げるため、数値計算・風洞実験・火入れを利用した野外実験・火災動態図の解析など理論から応用までの研究を相互に関連させながら併行的に進めているのが特色である。(1)数値計算。片面燃焼は樹木の周りの風速分布・圧力分布と炎の形状の外的条件による変化という三次元的な流れの問題であり、かなり複雑な現象で、そのモデル化も容易ではない。本年度はまず解析の第一歩として二次元モデル解析のプログラムを作成した。メッシュは円筒座標をとり、支配方程式は流速と圧力を従属変数とする方程式系を採用し、境界条件としては風洞実験に対応させるためにダクト流路内の流れを与えた。計算の結果は、双子渦、カルマン渦等の放出渦が発生した。計算結果は流速ベクトル表示(可視化)でも示されるようにしている。(2)風洞実験。幅42cm、高さ42cm、長さ2mの耐火型の風洞を用いて、片面燃焼の実験を継続中で、現在までに材の直径・風速・風上着火・風下着火など条件を変化させ、18回の実験を行った。風上着火の場合は、従来までの知見を実験レベルで確認したが、風下着火の場合には、従来の知見になかった延焼の動態が明らかになった。(3)火入れによる野外実験。実験は山口県秋吉台と福岡県平尾台の火入れを利用し、スギ丸太を各40本設置し、観測を行った。観測の結果典型的な片面燃焼の実態を把握すると共に、微地形が炎ひいては片面燃焼に及ぼす影響が半定量的に明らかになった。(4)火災動態図の解析。昭和56年から63年までの46件の火災動態図を収集・解析し、延焼モデルを作成した。

但し現地での局所風の資料がないので、理論・実験結果をまって更に検討予定である。現地実験と室内風洞実験により片面燃焼の実態と片面燃焼を利用した火災時における風速の推定が可能になりつつある。1)室内風洞実験により、風上側,風下側からの燃焼・延焼にかかわらず、片面燃焼はその時の風向に左右されて起こることが確認され、片面燃焼によりその時の風向を推定することが可能であることがわかった。2)室内実験により、片面燃焼を利用した風速推定式を作成した。すなわち、片面燃焼の最大高と最小高の差と、最大高と最小高との比の積をHとすれば、このHを樹木の直径Dで割った値は、風速,直径,空気の動粘性係数の関数で表わされることがわかった.3)山口県秋吉台の現地実験において、稜線付近で主風の影響のみによって片面燃焼が発生している実験杭に推定式を適用すると、風速の実測値とよく一致し、式の適合性が認められた.4)そこで、この推定式を適用して、実験地内の風速分布を求め、観測された燃焼速度分布と対照した結果、斜面燃え上がりの時は燃焼速度は風速に比例して増加し、燃え下がりの場合に風速に無関係に一定速度であることがわかった.5)福岡県平尾台での実験結果も同様の現象を示し、斜面での風向は主風向と関係なく傾斜方向に近似し、風速は斜面勾配に比例することがわかった。以上の成果は今年4月の林学会大会において発表すると共に、学会誌に発表予定である。6)林野火災の燃焼程度をランドサットデ-タから分類する手法について検討し、日本リモ-トセンシング学会誌に掲載すると共に、その手法を用いて火災跡地の植生回復の状況について学会誌に投稿中である。7)ギリシアの林野火災発生に関する自然的・社会的条件を解明すると共に、林野火災が水土流出に及ぼす影響について投稿中である。今年は最終年度であり、此迄の研究結果の整理・発表の準備を行なうと共に、室内・野外実験を継続して研究結果の追試に重点をおいて進めた。この報告は片面燃焼に関する研究と今後の問題点について報告する。(1)片面燃焼は「林野火災の化石」であり、最も重要な情報が秘められていると云う、我々の仮説に基づいて風洞を用いた室内実験と奈良の若草山・山口県秋吉台・福岡県平尾台における山焼きを利用して、片面燃焼の研究を行なった。その結果、林野火災現場の風向は主風向に影響されず、火災による対流風が卓越する事が確かめられ、片面燃焼調査により、火災時の風向が把握出来る事が確認出来た。(2)林野火災現場における風速は、燃焼方向と火災の進行方向との関係により異なり、先ずその各々の場合における風速の推定式を室内実験により作成した。(3)この風速実験式を山焼きを利用した実験杭の片面燃焼とビデオを利用した火災動態図・風速計による計測等を利用して、火災現地での検証を行い、適合性を確かめた。(4)燃焼速度の推定式であるRothermel式を室内・野外実験で検討し、風速の割り増し係数の推定式を修正する事によりわが国でも適合出来る事を明らかにした。(5)今後の問題点としては、最近わが国に大規模林野火災が発生せず、片面燃焼の野外実験がカルスト台地の草地の火入れを利用して設置した実験杭だけであるので、大規模林野火災の多発地である北米やギリシャなどの火災跡地で検証する必要がある。更に火災程度分類図作成のためのランドサット解析には日陰の補正を行なう必要があるが、従来の補正方法には問題があり、今回提案した手法に改良を加え完成させる事が望まれている。
フィリピン独自のキリスト教会の日本における宣教過程の実証的研究

本研究でな、1994年にマニラで設立されたフィリピン生まれのキリスト教会であるイグレシア・ニ・クリスト(Iglesia ni Cristo)の海外、とくに日本における宣教活動の展開及び教会の形成をテーマとした。イグレシアは現在、フィリピン以外に世界の57の国又は地域に162教会(congretations)、179の信者グループ(committee prayer groups)を持つ。イグレシアによる海外宣教は公式には1968年以降に開始されたが、その多くは海外におけるフィリピン人移民、出稼ぎ者を主たる対象としてきた。日本国内には1996年の時点で、9つの教会(千葉県、群馬県、浜松、茨木、名古屋、岡谷、大阪、東京、横浜)、16の信者グループ(福井、札幌、岩国、岩手、香川、釧路、宮崎、沼津、岡山、沖縄、兵庫県小野、佐世保、高浜、山口、福岡、横田)が存在する。1980年代初めまでは在日米軍基地周辺に信者グループが形成されていたが、日本に在住するフィリピン人が増加し、日本人との結婚が増えるにつれて、上記のように日本各地に信者グループが見られるようになり、さらにそうしたグループを基礎にして、教会(フィリピン本部より牧師が派遣される)が形成されるようになった。この研究においては、とくに茨木県内におけるイグレシア教会の形成に関する資料を集めた。これまでのところ、こうした教会に所属する信者の大部分はフィリピン人、フィリピン系の人々であるが、日本人配偶者や子弟のなかから新たに信者が生まれている。イグレシアはこれまでフィリピン人によるフィリピン人のための教会として知られてきたが、近年こうした海外宣教の進展により、フィリピン人の教会というこれまでの性格を脱する可能性も示唆される。本年度は、日本国内のイグレシア・ニ・クリスト(Iglesia Ni Cristo)の支部教会、信者グループのうち、とくに大阪市内、つくば市内の関係者等に面会し、インタビュー調査をおこなった。イグレシア・ニ・クリストの日本における教会形成および宣教は、当初は在日米軍基地で働くフィリピン人、フィリピン系アメリカ人の信者らによって、自主的に始められたものであった。したがって1970年代のなかばまでは、正規の牧師などは派遣されておらず、信者らが自宅などを用いて行う祈祷会形式の宗教活動がその中心であった。しかし、1980年代になると、上記の在日米軍関係者以外に、フィリピンから日本にやってくる出稼ぎ労働者、日本人と国際結婚をしたフィリピン人の信者などが急速に増加したため、在日米軍基地所在地以外の全国各地に支部教会、信者グループが形成されるようになった。近年設立された、つくば市におけるイグレシア・ニ・クリストの教会は、当初は小規模の祈祷会であったが、信者数の増加にともなって、東京の支部教会から正規の牧師が定期的に訪問するようになった。その後、信者らがフィリピンの教会中央に対して、正規の支部教会の新設を働きかけた結果、新たに教会堂を建設し、フィリピンから教会監督が訪問して、教会の新設をおこなった。これまでのところイグレシア・ニ・クリストは依然として、フィリピン人を主な信者としているものの、フィリピン人以外の信者も徐々に増えており、そのことが今後の教会の活動、儀礼、神学等にどのような影響を及ぼすかが注目される。本研究の目的は、フィリピンのキリスト教会イグレシア・ニ・クリスト(Iglesia Ni Cristo)の日本における近年の宣教過程を明らかにすることにある。同教会は1914年にマニラで、フィリピン人フェリックス・マナロにより創始され、三位一体を否定し、創始者を「神の最後の使い」とする独自の神学を保持、現在フィリピン総人口の5%(推定)が信者である。1968年にハワイに最初の支部教会を設立したのをかわきりに、フィリピン人の海外移住者、海外出稼ぎ労働者の増加にともない世界各地に教会を形成してきた。1996年には57カ国に162支部教会、179信者集会をおいている。

日本では1980年の時点で、7カ所(東京、横浜、三沢、岩国、佐世保、沖縄)に信者集会がおかれていたが、ほとんどが在日米軍基地に勤務するフィリピン人、フィリピン系アメリカ人を中心とするものだった。しかし、70年代末以後の在日フィリピン人の増加、日本人との国際結婚の増加により、国内各地に信者集会が形成され、そのなかから支部教会が新たに設立されるようになった。1996年現在で16信者集会、9支部教会(千葉、群馬、浜松、茨木、名古屋、大阪、岡谷、大阪、東京)が報告されている。支部教会は原則として教会堂を持ち、牧師が配置され、フィリピンの本部との緊密な連絡のもとに礼拝が行われている。信者のほとんどはフィリピン人とその日本人の家族が中心であり、在日アジア系のキリスト教会として機能している。宣教および牧会の対象が事実上はフィリピン人とその家族に限定されている点では、創立以来の「フィリピン人のキリスト教会」としての性格が濃厚だが、今後非フィリピン人の信者が増加すれば、典礼(礼拝でフィリピン語を用いるなど)や教会運営の面での変化が予測される。本研究の成果は、寺田勇文編『東南アジアのキリスト教』(仮題、めこん社、2000年春刊行予定)に収録される。
エストロゲンの制御性T細胞を介した妊娠維持機構と糖代謝調節は存在するのか

C57BL/6がバックグラウンドであるCD4+T細胞特異的ERα欠損マウス(雌)に高脂肪食負荷をかけた後にBALB/cのワイルドタイプマウス(雄)と交配させ、妊娠糖尿病モデルマウスを作製した。ノックアウトマウスの妊娠率、体重、胎仔重量への影響はなかったが、フロックスマウスと比較して耐糖能の増悪が見られた。ノックアウトマウスの内臓脂肪組織において、T-bet, RORγt, IFNγ,およびTNFαの発現増加を認めた。以上の結果より、妊娠糖尿病モデルマウスにおいて、エストロゲンはT細胞のERαを介して内臓脂肪のTh1,Th17浸潤を低下させることで慢性炎症を軽減し、耐糖能の維持に寄与すると考えられた。閉経後、糖尿病になる前の未病状態でカギとなる遺伝子を検出するために、閉経モデルマウス(卵巣摘出)、閉経肥満モデルマウス(卵巣摘出、高脂肪食負荷)、コントロールマウス(偽手術)を飼育し、耐糖能異常が出現する負荷開始後2か月までの内臓脂肪組織の変化をDNAチップを用いて解析した。さらにDNB(Dinamic Network Biomarkers)理論を用いて、閉経肥満モデルマウスの未病状態の変動マーカーを検出した。1週間後の内臓脂肪組織において、変動の大きかった遺伝子の一つとしてCD52が検出された。次にCD52ノックアウトマウスに卵巣摘出を行い、ワイルドタイプマウスと比較し、耐糖能や体重などの代謝表現型に差があるかを検討した。卵巣摘出のみではCD52ノックアウトマウスとワイルドタイプマウスの間に有意な差はなかった。動物モデルとしてCD4+T細胞のみにエストロゲン受容体(ER)αを欠損するマウスを作製し、安定した繁殖が得られた。このマウスをワイルドタイプマウスと交配させ、妊娠中の糖代謝異常について解析を行った。通常の食事の場合はノックアウトマウスの糖代謝異常は認められなかった。また、脂肪組織における炎症の評価を行ったが、脂肪組織において、制御性T細胞の減少は認めらず、炎症の増悪も認められなかった。妊娠前から高脂肪食負荷をかけた妊娠糖尿病モデルマウルを用いて、糖代謝異常を評価する予定である。同じノックアウトマウスを用いた流産の検討を行った。有意な差はないが、ノックアウトマウスでは子宮において制御性T細胞が減少している傾向が見られた。アロ交配、同系交配マウスの流産率に差はなかった。閉経肥満モデルマウスの耐糖能異常が制御性T細胞の輸注により改善するかについて検討した。閉経により脂肪組織でM1マクロファーが増加し、炎症所見の増悪が認められ、糖代謝との関連性が示された。さらに制御性T細胞の関連を明らかにするため、閉経肥満モデルマウスに制御性T細胞を輸注した。輸注した制御性T細胞の80%が内臓脂肪に動員されていることが確認できたものの、耐糖能に有意な変化は得られなかった。一方、制御性T細胞を増加させるビタミンD3の投与は糖代謝の改善傾向が見られた。現在、この機序に関して脂肪組織等の炎症など検討中である。CD4+T細胞特異的ERα欠損マウスの卵巣摘出を行い、閉経状態としたマウスで糖代謝、内臓脂肪組織の炎症を検討したが、有意な差は得られなかった。CD4陽性T細胞特異的ERα欠損マウスを交配し、妊娠することに成功し、現在、安定した繁殖が得られている。またこのマウスの通常食負荷時の妊娠における免疫寛容の解析のため、脾臓、全身表在リンパ節、子宮所属リンパ節および子宮からリンパ球を分離したのリンパ球の変動をフローサイトメトリーにて解析した。ただし、妊娠糖尿病についての解析は通常食負荷での糖代謝の検討に留まっているため、今後、高脂肪食負荷をかけ、糖尿病を誘導した妊娠マウスでの検討を追加する必要がある。閉経肥満モデルマウスにおける脾臓、内臓脂肪細胞等の免疫担当細胞の変動の解析が終了した。CD4陽性T細胞特異的ERα欠損マウスの閉経状態での解析も行った。今後は閉経後すぐ(未病状態)での制御性T細胞やそのほかの免疫担当細胞、炎症所見の検討を行う予定としている。

次にCD52ノックアウトマウスに卵巣摘出を行い、ワイルドタイプマウスと比較し、耐糖能や体重などの代謝表現型に差があるかを検討した。卵巣摘出のみではCD52ノックアウトマウスとワイルドタイプマウスの間に有意な差はなかった。D4+T細胞特異的ERα欠損マウスの妊娠における免疫寛容は通常食負荷では有意な差は得られなかったため、今後、高脂肪食負荷をかけ、肥満状態にしたマウスを用いて、妊娠糖尿病との関連性を評価する予定である。閉経肥満モデルマウスの解析は閉経4週間より糖代謝異常が出現することがわかり、これ以前での炎症、免疫細胞の変化の解析を行う予定である。学会参加のための旅費、人件費が予定より少なくなったために差額が生じた。次年度は学会参加(国際学会を含め)が増えることが予想され、その費用として使用したい。また、妊娠糖尿病の実験ではさらに高脂肪食負荷をかけて解析をすることになったため、マウスの購入費、フローサイトメトリーの試薬費用として使用したい。
キイロショウジョウバエ酵素遺伝子座における自然突然変異率の推定とDNA変異の解析

自然突然変異の蓄積は,今迄と同じように継続して行い,今年度分だけで26世代の蓄積を行なったことになる.電気泳動法による自然突然変異の検出の対象となった酵素遺伝子座は,アルコール脱水素酵素(Adh),グリセロー3-リン酸脱水素酵素,グルタミン酸オキザロ酢酸転移酵素,リンゴ酸脱水素酵素,ヘキソキナーゼ,ダイペプチターゼとアミラーゼの7つである.総計1,500の系統について2回,電気泳動法によって自然突然変異の調査を行なった.この結果,今迄,総計約450万アリールメ世代数の調査が行なわれたことになり,この中で37個のヌル突然変異, 2個のバンド型突然変異が検出された.これをもとに自然突然変異率を推定すると,ヌル突然変異については, 2.4×10^<-5>/遺伝子座/世代となり,バンド型突然変異については, 1.5×10^<-6>/遺伝子座/世代となる.現在これらの突然変異について,詳細な遺伝子構造の解析を計画中である.自然突然変異の蓄積は,今迄と同じように継続して行い,今年度分だけで26世代の蓄積を行なったことになる.電気泳動法による自然突然変異の検出の対象となった酵素遺伝子座は,アルコール脱水素酵素(Adh),グリセロー3-リン酸脱水素酵素,グルタミン酸オキザロ酢酸転移酵素,リンゴ酸脱水素酵素,ヘキソキナーゼ,ダイペプチターゼとアミラーゼの7つである.総計1,500の系統について2回,電気泳動法によって自然突然変異の調査を行なった.この結果,今迄,総計約450万アリールメ世代数の調査が行なわれたことになり,この中で37個のヌル突然変異, 2個のバンド型突然変異が検出された.これをもとに自然突然変異率を推定すると,ヌル突然変異については, 2.4×10^<-5>/遺伝子座/世代となり,バンド型突然変異については, 1.5×10^<-6>/遺伝子座/世代となる.現在これらの突然変異について,詳細な遺伝子構造の解析を計画中である.
機能的過負荷による骨格筋線維組成の変化に及ぼす神経の役割

本研究では協働筋切除による筋線維組成の変化が神経支配の有無によって影響を受けるかどうか調べるために、正常に神経支配されたラットと除神経されたラットについて腓腹筋とヒラメ筋を切除したときの足底筋の形態的変化について観察を行った。被験動物として成熟したWistar系雄性ラット(380700g、15匹)を用い、正常に神経支配されたラット群(8匹)と除神経ラット群(7匹)に分けた。さらにそれぞれの群について一方の脚に対し足底筋の協働筋である腓腹筋とヒラメ筋を切除することによって足底筋に対し過負荷をかけ(OL脚、DN+OL脚)、反対脚に対しては偽手術のみを施し、それぞれC脚、DN脚とした。除神経は脛骨神経を約0.5mm取り除くことによって行われた。3週間後、足底筋に対しmyosinATPase染色(preincubation pH10.3、4.6、4.3)を施し、筋線維をtype I、IIA、IIB、IICに分類した。OL脚の足底筋はC脚と比較して有意な筋重量の増加を示した。筋線維タイプ別横断面積の観察においても、OL脚はC脚と比較してtype I、IIA、およびIIB線維のいずれにおいても有意に大きかった。除神経下において協働筋切除を施したDN+OL脚はDN脚よりも有意に筋重量が大きく、筋線維横断面積についてもtype IIB線維については有意な違いは観察されなかったものの、type I、およびIIA線維についてはDN+OL脚はDN脚よりも有意に大きかった。このように足底筋の協働筋切除による筋肥大は除神経を施しても維持されていた。一方、筋線維組成について観察すると、OL脚はC脚と比較してtype IIB線維の割合の低下とtype IIC線維の割合の増加が観察された。しかしながら、除神経を施したラットでは協働筋切除によって足底筋の筋線維組成に変化がみられなかった。このことは協働筋切除による筋線維組成の変化は神経からの影響を少なからず受けている可能性を示唆する。
ハンドル型電動車椅子の乗り心地に基づく歩道路面の点検および診断システムの開発

近年,シニアカーに代表されるハンドル型電動車椅子が,高齢者や障がい者の移動負担を軽減するための歩行補助用具として注目されている.一方,社会基盤の老朽化に伴い,路面凹凸に起因するハンドル型電動車椅子の乗り心地は低下することが懸念される.しかし,既存の歩道路面評価は車椅子や歩行者を対象としたものが主であり,誰もが安心して利用できる歩行空間の形成には,ハンドル型電動車椅子の乗り心地を考慮した評価が必要である.そこで本研究は,ハンドル型電動車椅子の乗り心地に関係する路面特性を明らかにし,路面凹凸を測定し把握する「点検」と点検結果に対する「診断」を一体化した,歩道路面の評価システムの開発を目指す.近年,シニアカーに代表されるハンドル型電動車椅子が,高齢者や障がい者の移動負担を軽減するための歩行補助用具として注目されている.一方,社会基盤の老朽化に伴い,路面凹凸に起因するハンドル型電動車椅子の乗り心地は低下することが懸念される.しかし,既存の歩道路面評価は車椅子や歩行者を対象としたものが主であり,誰もが安心して利用できる歩行空間の形成には,ハンドル型電動車椅子の乗り心地を考慮した評価が必要である.そこで本研究は,ハンドル型電動車椅子の乗り心地に関係する路面特性を明らかにし,路面凹凸を測定し把握する「点検」と点検結果に対する「診断」を一体化した,歩道路面の評価システムの開発を目指す.
胆管癌癌源細胞誘導におけるYAP/TAZの役割と新規分子標的治療法の開発

肝胆道においては何らかの障害に対して、組織幹細胞を頂点とした階層性が確立しておらず,肝胆道癌における癌源細胞も組織幹細胞由来というよりは分化した癌細胞の脱分化で誘導されている可能性がある。われわれは以前、肝内胆管癌においてgankyrinと肝前駆細胞マーカーとの関連を明らかにし,癌源細胞様の特徴を持った細胞が分化した細胞の脱分化により誘導できることを明らかにしたが,癌源細胞が誘導されるメカニズムについてはいまだ不明な点が多い。YAPとそのパラログであるTAZという転写共役因子はさまざまな癌腫において発現亢進がみられ,その発癌・進展に関与していることが報告されている。また,それらはコランジオパチーに共通して発現が上昇していることが知られている。そこで,コランジオパチーに関連して発生すると考えられる肝内胆管癌につき,癌源細胞にYAP/TAZが大きな役割を果たしている可能性を考えた。昨年度までにYAPの発現が癌源細胞の誘導やEMTに強く関係していることを明らかにしたが、今年度はYAP inhibitorであるverteporfinの効果について、まずはin vitroで検討し、verteporfinが肝内胆管癌にも有効に働くとともに、YAPとcancer stem cell-like propertyやepithelial-mesencymal transitionとの関連性を裏付けた。さらにin vivoにおいてもverteporfinによる腫瘍増殖抑制を示し、YAPを標的とした治療法が肝内胆管癌に対して有効である可能性を証明した。さらにverteporfinのAkt/mTOR pathwayへの関与も調べ、verteporfinによる腫瘍増殖抑制効果に対するrapamycinの上乗せ効果も明らかにした。われわれは以前、肝内胆管癌においてgankyrinと肝前駆細胞マーカーとの関連を明らかにし,癌源細胞様の特徴を持った細胞が分化した細胞の脱分化により誘導できることを明らかにしたが、癌源細胞が誘導されるメカニズムについてはいまだ不明な点が多い。胆管癌は胆汁酸をはじめとした細胞傷害性物質によるコランジオパチーを契機としてBilINやIPNBといった前癌病変が発生すると考えられるが、BilINやIPNBからのEMTや癌源細胞誘導にYAPとそのパラログであるTAZという転写共役因子が大きな役割を果たしている可能性を考えた。そこで,臨床検体を用いて、YAP/TAZの発現を検討するとともに、Ki-67による増殖能、腫瘍内血管新生関連としてmicrovessel density、EMT関連としてE-cadherin、vimentinの発現を検討している。現在までに52例の肝内胆管癌症例についてYAP/TAZの発現を免疫組織学的に検討したところ、YAP発現を39例、TAZ発現を35例に認め、それらの外科切除後予後が有意に不良であることを明らかにした。また、YAP発現は細胞増殖能の亢進と血管新生の誘導をもたらすこと、EMT誘導と相関を示すことを見出した。さらに現在はOct4, SOX9, CD133, CD44, CD24, NCAM, OV6といった前駆細胞あるいは癌源細胞の特徴を有する細胞のマーカーとの関連も検討している。また、HuCCT1やHuh28といった肝内胆管癌細胞株を用いた検討も準備している。臨床検体を用いた解析では、概ね順調に進展しており、肝内胆管癌において腫瘍細胞の発生・進展にYAP/TAZが関与している可能性を示しつつある。また、前駆細胞あるいは癌源細胞との関係も見出しつつある。一方、細胞株によるYAP/TAZのノックインあるいはノックダウンについては、特に安定したstable transfectionあるいはshRNAによる遺伝子サイレンシングをえるために時間を要しているためやや遅れがでている。YAPとそのパラログであるTAZという転写共役因子はさまざまな癌腫において発現亢進がみられ、その発癌・進展に関与していることが報告されている。また、それらはコランジオパチーに共通して発現が上昇していることが知られている。そこで、コランジオパチーに関連して発生すると考えられる肝内胆管癌につき、癌源細胞にYAP/TAZが大きな役割を果たしている可能性を考えた。昨年度までに52例の肝内胆管癌症例についてYAP/TAZの発現を免疫組織学的に検討したところ、YAP発現を39例、TAZ発現を35例に認め、それらの外科切除後予後が有意に不良であることを明らかにした。今年度はE-cadherin, vimentin, CD34, MMP9, CD133, OV6といった前駆細胞あるいは癌源細胞の特徴を有する細胞のマーカーとYAP/TAZの発現との関連を検討し、特にYAPとの関連を見出した。すなわち、YAP発現は癌源細胞の誘導やEMTに強く関係していることが示唆される結果であった。

さらに、HuCCT1やTKKKといった肝内胆管癌細胞株を用いてYAPをノックダウンするとOV6やvimentinの発現低下が、in vitroでも証明された。臨床検体を用いた解析では、概ね順調に進展しており、肝内胆管癌において癌源細胞の誘導・EMT促進にYAP/TAZ、特にYAPが関与している可能性を示しつつある。一方、細胞株においてもYAPのノックダウンによる細胞動態の変化を示しつつある。さらに、TEADはYAPの機能発現に重要な転写因子であるが、それを抑制するVeteporfinを用いたin vitroの検討でもTEADが肝内胆管癌における癌源細胞の誘導やEMTに強く関係しているもとを示しつつある。しかし、一方で、癌源細胞として重要な因子であるsphere formationについてはやや遅れている。肝胆道においては何らかの障害に対して、組織幹細胞を頂点とした階層性が確立しておらず,肝胆道癌における癌源細胞も組織幹細胞由来というよりは分化した癌細胞の脱分化で誘導されている可能性がある。われわれは以前、肝内胆管癌においてgankyrinと肝前駆細胞マーカーとの関連を明らかにし,癌源細胞様の特徴を持った細胞が分化した細胞の脱分化により誘導できることを明らかにしたが,癌源細胞が誘導されるメカニズムについてはいまだ不明な点が多い。YAPとそのパラログであるTAZという転写共役因子はさまざまな癌腫において発現亢進がみられ,その発癌・進展に関与していることが報告されている。また,それらはコランジオパチーに共通して発現が上昇していることが知られている。そこで,コランジオパチーに関連して発生すると考えられる肝内胆管癌につき,癌源細胞にYAP/TAZが大きな役割を果たしている可能性を考えた。昨年度までにYAPの発現が癌源細胞の誘導やEMTに強く関係していることを明らかにしたが、今年度はYAP inhibitorであるverteporfinの効果について、まずはin vitroで検討し、verteporfinが肝内胆管癌にも有効に働くとともに、YAPとcancer stem cell-like propertyやepithelial-mesencymal transitionとの関連性を裏付けた。さらにin vivoにおいてもverteporfinによる腫瘍増殖抑制を示し、YAPを標的とした治療法が肝内胆管癌に対して有効である可能性を証明した。さらにverteporfinのAkt/mTOR pathwayへの関与も調べ、verteporfinによる腫瘍増殖抑制効果に対するrapamycinの上乗せ効果も明らかにした。今後も引き続き研究目的に沿って臨床検体および細胞株を用いて癌におけるYAP/TAZの発現とその役割の解析を進める。特に、癌源細胞にこだわり、癌源細胞との関係をより明らかにするため、細胞株を用いてYAP/TAZをノックイン、ノックダウンし癌源細胞動態の可逆性を中心に解析し、機能的な面(薬剤耐性、自己複製能、腫瘍形成能)からも検討する予定である。また、肝内胆管癌に加え、BilINやIPNBでの発現にも注目して検討を加えたい。
都市域における生産緑地の保全手法に関する日米比較研究

日米両国における農業を巡る経済環境や農地保全に係わる法的制度は大きく異なっているが、都市域における農地保全の必要性は共通の課題となっている。本研究では、まず制度的比較を行い、我が国では農地法、農振法、都市計画法など農地保全に関する法律はより整備されているが、実態としては十分目的を達成しえない状況があり、米国においては逆に、農地も市場原理に強く左右され、法的な保全政策が取りにくい状況を明らかにした。次いで、米国においてその役割が増大している非営利民間組織であるランドトラストについて調査を行い、1980年代以降の急激な増加傾向と、全国レベルでの組織の活動のみではなく、州や市、町など地域レベルでの活動の広がりを把握した。またそれらへのアンケート調査から、活動目的は優良農地の保全を第一に、田園的特性の保持も強く挙げられ、野性動物の生息環境の保全や緩衝域としての役割についても関心が高いことが示された。また、具体的な保全手法としては開発権の購入に強い期待を持っている事が明らかにされ、実際、地役権を購入したり贈与を受ける事が重要な農地保全の手段となっており、州や地方自治体との密接な強力関係がその成功につながっている場合が多い。これに対して我が国では、制度上の制約もあって民間団体による直接的な保全運動はあまり見られないが、一部の自治体や農業協同組合、市民団体などによる農地保全に関する動きなど注目される事例も生じている。一方、両国において良好な計画的開発の誘導と農地保全の両立が求められているが、米国における例として限定的開発の事例をマサチューセッツ州において調査するとともに、札幌市郊外での土地利用と景観評価に関する調査を行い、農地と周辺土地利用との関係を分析し景観評価モデルの作成を試みた。今後はこれらを基にさらに事例分析を行い日米の比較研究を進めたい。
皮膚腫瘍のビタミンA結合蛋白に関する実験的研究

(1)外科的に切除したケラドアカントーマを体外でディスパーゼ処理により真皮成分の混入なしに腫瘍細胞塊を得た.この腫瘍塊よりcytosol分核を採取し,この中の細胞内レチノイン酸結合蛋白(CRABP)の定量をゲル濾過法に基づいて行てった.即ちcytosolを^3H-レチノイン酸と暗所でincubateレセファデックスG75カラムクロマトグラフィーにかけ各フラクションを採取し,分子量約15,000のピークの放射活性量からGRABP濃度を算出した.その結果,腫瘍細胞中には約60pmol/mg蛋白の濃度で存在することが明らかとなった.これは従来報告されている正常人表皮におけるGRABPの濃度4.0pmol/mg蛋白よりははるかに高濃度である.(2)長期エトレチネートを服用している角化量常症状,皮膚腫瘍患者の血中エトレチネート濃度及び活性代謝物であるRo10-1670濃度の解析を高速液体クロマトグラフィーを用いて行なった.その結果,これら患者の血中薬物濃度は必ずしも効果発現に相関しないことを証明し,報告した.このことより尋常性乾癖・掌蹠角化症並びに皮膚腫瘍におけるビタミンAの効果は血中濃度よりも皮膚病多部における結合親和性に依存る可能性の高いことが示唆された.(3)ビタミンA類縁化合物E-5166の培養表皮ケラチノサイトの分化に及ぼす影響につき検索した.E-5166は他のレチノイドの様にシクロヘキセニル環をもたないがCRABPへの結合親和性が高いことが知られている.培養液に添加する牛胎児節制を脱脂処理し培養液中のビタミンAを完全に除去するとケラチノサイトの角化傾向は強くなり,生体表皮でみられるような角質層を形成した.これに10^<-7>MのE-5166を添加することにより角質層の形成が阻止され,高分子ケラチン蛋白の産生がおさえられる結果を得た.(1)外科的に切除したケラドアカントーマを体外でディスパーゼ処理により真皮成分の混入なしに腫瘍細胞塊を得た.この腫瘍塊よりcytosol分核を採取し,この中の細胞内レチノイン酸結合蛋白(CRABP)の定量をゲル濾過法に基づいて行てった.即ちcytosolを^3H-レチノイン酸と暗所でincubateレセファデックスG75カラムクロマトグラフィーにかけ各フラクションを採取し,分子量約15,000のピークの放射活性量からGRABP濃度を算出した.その結果,腫瘍細胞中には約60pmol/mg蛋白の濃度で存在することが明らかとなった.これは従来報告されている正常人表皮におけるGRABPの濃度4.0pmol/mg蛋白よりははるかに高濃度である.(2)長期エトレチネートを服用している角化量常症状,皮膚腫瘍患者の血中エトレチネート濃度及び活性代謝物であるRo10-1670濃度の解析を高速液体クロマトグラフィーを用いて行なった.その結果,これら患者の血中薬物濃度は必ずしも効果発現に相関しないことを証明し,報告した.このことより尋常性乾癖・掌蹠角化症並びに皮膚腫瘍におけるビタミンAの効果は血中濃度よりも皮膚病多部における結合親和性に依存る可能性の高いことが示唆された.(3)ビタミンA類縁化合物E-5166の培養表皮ケラチノサイトの分化に及ぼす影響につき検索した.E-5166は他のレチノイドの様にシクロヘキセニル環をもたないがCRABPへの結合親和性が高いことが知られている.培養液に添加する牛胎児節制を脱脂処理し培養液中のビタミンAを完全に除去するとケラチノサイトの角化傾向は強くなり,生体表皮でみられるような角質層を形成した.これに10^<-7>MのE-5166を添加することにより角質層の形成が阻止され,高分子ケラチン蛋白の産生がおさえられる結果を得た.
各種GTR材の親和性に関する評価検討(ヒト骨芽細胞及び線維芽細胞を用いた評価系の確立)

歯周組織再生誘導(GTR)法のバリアーに用いられている各種新素材(PTFE膜とMillipore┣D1【○!R】〔)膜)の骨への直接的な作用の一端を明らかにしたいために、ヒト骨芽細胞様細胞(MG63)を用いin vitroでこの細胞がGTR膜と接する領域において産生する接着性タンパクの動態を経時的に検討した。すなわち当該部におけるフィブロネクチン、I型およびIII型コラーゲンについて免疫抗体法により蛍光染色を行った。この蛍光組織化学染色標本を介し、これを蛍光画像解析装(ACAS)を用い検討した。その結果(1)コントロール実験条件下では、骨芽細胞MG63はフィブロネクチン、I型およびIII型コラーゲンモノクローナル抗体に反応する。(2)Gore-Tex┣D1【○!R】〔)膜(PTFE膜)およびMillipore膜とも、フィブロネクチンの平均蛍光量やその局在領域は、培養3日より6日で減少する蛍光がみられた。(3)Gore-Tex┣D1【○!R】〔)膜およびMillipore┣D1【○!R】〔)膜周囲のI型コラーゲンの平均蛍光量やその局在領域は、培養日数の経過とともに上昇する傾向をみた。(4)Gore Tex┣D1【○!R】〔)膜およびMillipore┣D1【○!R】〔)膜周囲のIII型コラーゲンの平均蛍光量やその局在領域は、I型コラーゲンと同様に培養日数の経過とともに上昇する傾向をみた。(5)フィブロネクチン、I型およびIII型コラーゲンの産生において、Gore-Tex┣D1【○!R】〔)膜とMillipore┣D1【○!R】〔)膜間で差は認められなかった。以上の結果から、骨芽細胞が組織再生誘導に用いる膜に接する領域でのフィブロネクチン、I型およびIII型コラーゲン等の接着タンパクが働き、膜周囲の細胞機能の調節に関与していることが示唆された。GTR素材の細胞親和性を検討するにあたり今年度は骨形成細胞である骨芽細胞の培養系および骨形成の評価系の確立を行った。これら素材の臨床応用と細胞外マトリックスに対するモノクロ-ナル抗体の種類及びその使用を考慮してヒト由来の細胞を実験に用いることを決定した。その結果、今年度は骨芽細胞の形質を維持した細胞株であるMGー63(骨肉腫由来の骨芽細胞様細胞株)を本研究に用いることにし、最良な状態にて培養する条件設定に努めた。そのために、MGー63のALP活性、DNA量、タンパク量およびハイドロキシプロリン量の経日的変化をそれぞれ把握した。近年、骨形成の指標として骨芽細胞により特異的に産生される非コラ-ゲン性基質タンパクであるオステオカルシンが考えられている。GTR素材との細胞親和性後の骨形成を検討するにあたり、オステオカルシンの測定系を考え、オステオカルシンのNおよびC末端に対する二抗体法を用いたインタクトオステオカルシンノ測定法の応用を試みた。その結果MGー63は、1,25(OH)_2D_3によインタクトオステオカルシンを産生することが明らかになり、この培養系及びインタクトオステオカルシンによる骨形成の評価系は、今後の検討に応用可能であることが明らかになった。ヒト骨肉腫

由来骨芽細胞用細胞MG-63の培養系を用いてGTR(Guided Tissue Regeneration)膜と骨芽細胞との細胞親和性を、細胞の産生するI、III型コラーゲンおよびフィブロネクチンを指標にその経時的変化をレーザーサイトメーター(Meridian ACAS 570)を用いた定量分析法により比較検討してみた。さらに骨に特異的なマーカーであるオステオカルシンの動態についても検討を加えた。GTR(Guided Tissue Regeneration膜は四フッ化エチレンを延伸して、強く柔軟な多孔質構造をもつゴアテックス膜(5x5mm)をもちい、実験に供した。1.I型コラーゲン産生:対照群では7日目より経時的に産生を増し、21日目で最大となった(555%培養7日目対照群を100%としたときの値)以降減少していった。一方、GTR膜群では、7日目より上昇し、28日培養時においてもGTR膜周囲の骨芽細胞でI型コラーゲンが活発に産生(856%)されていた。2.III型コラーゲン産生:対照群では714日で、産生を増すがその後、プラトーとなった。一方GTR膜群では7日目より活発に3型コラーゲンを産生し、21日目で最大(1970%)となった。その後、その産生は急速に減少していく傾向が認められた。3.フィブロネクチン産生:対照群では、721日で活発に産生(792%)され、その後減少、GTR膜群では、14日目(474%)まで、対照群と同様に増加するが、その後、減少してゆく傾向が認められた。4.オステオカルシン産生:両群共に7日目から経時的に産生を増加していく傾向が認められた。対照群に対してGTR膜群では、オステオカルシンの総産生量が減少している傾向が認められた。GTR膜群ではフィブロネクチンの産生が初期に行なわれ、コラーゲン線維形成のモジュレーターと考えられているIII型コラーゲンの産生が続いて増大しI型コラーゲンの産生がIII型コラーゲンの産生と入れ替わり増大していく。この様に対照群と比較してコラーゲン線維形成が成熟するのが認められた。歯周組織再生誘導(GTR)法のバリアーに用いられる各種新素材(PTFE膜とMillipore^<【.encircledR.】>膜)の骨への直接的な作用の一端を明らかにしたいために、ヒト骨芽細胞様細胞(MG63)を用いin vitroでこの細胞がGTR膜と接する領域において産生する接着性タンパクの動態を経時的に検討した。すななわち当該部におけるフィブロネクチン、I型およびIII型コラーゲンについて免疫抗体法により蛍光染色を行った。この蛍光組織化学染色標本を介し、これを蛍光画像解析装(ACAS)を用い検討した。その結果(1)コントロール実験条件下では、骨芽細胞MG63はフィブロネクチン、I型およびIII型コラーゲンモノクローナル抗体に反応する。(2)Gore-Tex^<【.encircledR.】>膜(PTFE膜)およびMillipore膜とも、フィブロネクチンの平均蛍光量やその局在領域は、培養3日より6日で減少する蛍光がみられた。(3)Gore-Tex^<【.encircledR.】>膜およびMillipore^<【.encircledR.】>膜周期のI型コラーゲンの平均蛍光量やその局在領域は、培養日数の経過とともに上昇する傾向をみた。(4)Gore-Tex^<【.encircledR.】>膜およびMillipore^<【.encircledR.】
歯周炎と動脈硬化性疾患の生物学的関連を解明するーインターフェースとなるエイジング

歯周炎マウスモデルを用いた解析においては、P.gingivalisの口腔内感染が全身的な炎症応答を誘導し、動脈組織における遺伝子発現の変化に加え、血清脂質の動脈硬化症リスクを高める方向への変動も誘導することが示された。動脈硬化性疾患と口腔感染の関連メカニズムとして、口腔感染が脂質代謝変動に寄与する新しい知見が得られた。またエイジングとの関連について検討を継続している。本研究の目的はエイジングを視点として、マウス歯周炎モデルにおける病態形成のメカニズムを明らかにするとともに、歯周炎と動脈硬化症との関連についてその関連機序について明らかにすることである。本年度はマウスにおける歯周炎モデルの作成とその評価を中心に行った。歯周病原細菌Porphyromonas gingivalis (P. gingivalis)W83株の口腔感染により作成したマウス歯周炎モデルについて、その疾患モデルとしての妥当性を歯槽骨の吸収により確認した。さらに全身的なマウス個体への影響について血清脂質、動脈硬化と関連するマーカーについても検討した。具体的にはP. gingivalisをC57 BL/6マウスに経口感染(3日毎に1x10^9CFU)し、30日後の歯槽骨破壊を計測した。P. gingivalis感染後の歯槽骨吸収についてマイクロCTを用いて検出することによりによりヒト歯周炎と同様な歯槽骨吸収がマウスモデルにおいても観察された。P. gingivalisの口腔内感染による血清中炎症マーカーであるIL-6、CRPの変化について検討したところ、経口感染後30日後においてIL-6、CRPともに有意な変動が認められた。血液中よりP. gingivalis DNAは検出されなかったことより、口腔内局所の感染により全身的に循環するIL-6、炎症マーカーが変動したものと考えられた。さらに動脈組織における遺伝子発現の変化をDNAマイクロアレイにより検討したところ、101の遺伝子群において有意な発現の変動が認められた。このなかには動脈硬化症と関連するとされる既知の遺伝子が含まれていた。この歯周炎マウスモデルにおいては、P. gingivalisの口腔内感染が(抹消血中炎症マーカーを指標とした際の)全身的な炎症応答を誘導し、動脈組織における遺伝子発現の変化も誘導することが示された。次年度以降はさらにこの作用機序について検討する。H20年度に作成したマウスにおける、歯周病原細菌Porphyromonas gingivalis (P.gingivalis)W83株の口腔感染モデルを用いて、感染による全身的なマウス個体への影響について大動脈中の遺伝子発現の変化、血清脂質の変化、動脈硬化病変の形成について検討した。P.gingivalisをC57 BL/6マウスに経口感染(3日毎に1x10^9CFU)し、4週間、32週間後、大動脈の動脈硬化関連遺伝子群発現の変動が観察された。また感染により血清HDLコレステロールの減少が認められた。しかしながらC57BL/6バックグラウンドのマウスにおいては実際に動脈硬化病変の発症は認められなかった。ApoE欠損マウスにおいては長期感染によりHDLコレステロールが減少、LDLコレステロールが上昇し、動脈硬化病変が促進された。実験期間を通して血液中よりP.gingivalis DNAは検出されなかったことより、口腔内局所の感染がIL-6などのサイトカインを関して間接的に動脈における炎症反応に影響していると考えられる。この歯周炎マウスモデルにおいては、P.gingivalisの口腔内感染が全身的な炎症応答を誘導し、動脈組織における遺伝子発現の変化に加え、血清脂質の動脈硬化症リスクを高める方向への変動も誘導することが示された。P.gingivalisの口腔感染によりC57BL/6バックグラウンドのマウスにおいては実際に動脈硬化病変の発症は認められなかったが、先天的に動脈硬化病変を発症するApoE欠損マウスにおいては長期感染により動脈硬化病変が促進された。P.gingivalisの口腔感染はマウスにおいて動脈硬化症の発症要因としてではなく、促進因子として作用することが示唆された。また血清脂質の変動としてHDLコレステロールが減少、LDLコレステロールが上昇した。口腔内局所の感染がSMやIL-6などのサイトカインを介して動脈における炎症反応に影響していると考えられたが、同時にABCA1、LXRsなどの脂質代謝関連遺伝子の変動も観察された。

この歯周炎マウスモデルにおいては、P.gingivalisの口腔内感染が全身的な炎症応答を誘導し、動脈組織における遺伝子発現の変化に加え、血清脂質の動脈硬化症リスクを高める方向への変動も誘導することが示された。動脈硬化性疾患と口腔感染の関連メカニズムとして、口腔感染が脂質代謝変動に寄与する新しい知見が得られた。エイジングとの関連については今後検討がさらに必要である。