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日本におけるスタニスラフスキーシステム受容の系譜

世界の俳優教育の現場において、大きな影響力を持つ俳優教育方法「スタニスラフスキー・システム」がいかにして日本に導入されたのか、その歴史の見直しをすることで、その問題点を明らかにした。特に大きな成果として、一部で最初のシステムの指導者であったとされた小山内薫が、史料調査によりシステムではなく別の方法を用いていたことを明らかにできた。また、システムに関する文献の翻訳を通じて、使われている専門用語に関する分析結果を論文として発表し、実際の俳優に向けたレクチャーを開催し成果の波及に努めた。平成26年度の研究活動として、小山内薫とスタニスラフスキーの関係を慶應義塾大学図書館の協力により一次資料などの調査を行い、その成果として論文「日本におけるスタニスラフスキー受容の系譜ー小山内薫はスタニスラフスキー・システムの受容者だったのか?」を発表した。論文ではこれまで定説となってきた小山内薫をスタニスラフスキー・システムの受容者とすることの誤りを指摘し、彼の演出方法がスタニスラフスキーではなく同時期のアメリカの演出家デヴィッド・ベラスコから学んだものであることを明らかにした。これにより小山内による近代の日本演劇の発展が、より詳細で正確なかたちで再認識することが可能になったことは、日本演劇研究に置いて大きな意義を持つと考えられる。また、論文では日本における俳優養成と演出の発展過程についても新たな知見を定義できたことも重要な意味を持っている。このほか、ロシアのモスクワにある国立文学芸術文書館での調査により、1927年に小山内薫がソヴィエト連邦を訪れた際にメイエルホリド劇場で行った演説記録を発見し、その翻訳と解題を研究成果として発表した。これまで晩年の小山内の演劇観は、本人の演説での発言を元にではなく、それを聞いていた第三者によるものであったが、この研究成果により小山内薫本人の言葉を知ることが可能になったのは小山内薫研究において重要な意味を持つと考えられる。これら日本におけるスタニスラフスキー・システムの受容に関する研究のほか、中国におけるスタニスラフスキー・システムの受容について、中国演劇研究者の協力を得て、中国語文献の翻訳を行った。翻訳の公開は行っていないが、その内容については今後研究会などで報告を予定している。平成27年度の活動として、前年度の成果報告として日本ロシア文学会において、小山内薫とスタニスラフスキー・システムの関係性について発表を行った。小山内薫がスタニスラフスキーと交友があったことで、システムの受容者とみなされることが定説となっていたが、発表により小山内をシステムの受容者として捉えることには資料などから不可能であることを明らかにした。このほか資料調査として演劇博物館に保管されている千田是也資料、土方与志資料を閲覧し、戦前・戦後において日本の演劇人がスタニスラフスキー・システムをどのように受容したのかについて調査を行った。千田、土方両名の資料には、彼らが率いていた劇団内のみで閲覧されていたスタニスラフスキーに関する翻訳資料が含まれており、これらの資料の分析を通じて、これまで公にはされず一般には知られていなかった日本におけるスタニスラフスキーシステムの摂取を知ることができた。申請時には様々な専門家を招いて研究会を開催する予定であったが、それぞれが教育者や演劇人として活動しているため、定期的な研究会を開催することが困難なため、専門家を招くのではなく、申請者自身が専門家のもとを訪れ、スタニスラフスキー・システムについて聞き取り調査を行うよう予定を変更した。これによりロシアの演劇大学で博士号を受領した丸知亜矢氏に、ロシアの演劇大学で実際に行われている教育について聞き取り調査を行い、今現在行われている教育においてスタニスラフスキーがどのように扱われているかについて知識を得ることができたのは大きな収穫である。また、初期のスタニスラフスキーシステムの重要文献として、これまで注目されてこなかったスタニスラフスキーの同僚であったヴォルケンシテインの著作の翻訳を行い、システムの初期の状態について新たな情報を得ることができたのも大きな成果である。本来は平成27年度で研究計画が終了する予定であったが、一身上の都合で計画通りには進めることが困難となった。このため海外での資料調査、学会発表、論文投稿などを中止せざるを得ず、計画を完了させるため1年間の延長申請を行った。最終年度では、第一に日本におけるスタニスラフスキー・システムの受容について、その教育方法の内容面での研究活動を中心に行った。具体的には日本において主流となったスタニスラフスキーや彼の弟子たちが残したシステムに関する教科書をロシア語文献や邦訳文献、英語文献などを合わせてそれぞれ分析し、スタニスラフスキー本人と弟子たちの用いるシステムには差異が存在していることをを明らかにした。そして、その差異を明確にしないまま現在でも日本では教育方法を受容しており、そうした問題点を指摘する学会発表および論文投稿を遂行した。また、現在行われているスタニスラフスキー・システムによる教育方法を探るため、システムによる教育を受けた人物に対するインタビュー調査を実施した。特に、ロシアの演劇大学やアメリカで演劇を学んだ人物などを対象に、システムがどのように現在の俳優教育に浸透しているのか、聞き取りによる情報収集を行った。この活動によっても、戦後日本の演劇界におけるシステムの受容と、実際にロシアの演劇大学で行われている俳優教育とのあいだにある距離を測ることが可能となった。このほか、ロシアのアーカイブを訪れ、スタニスラフスキーがシステムを開発し始めたロシア革命前の資料、彼自身によるシステムの解説や、彼と共にシステムを開発していった人物の残した資料を調査した。

そして、それを翻訳することで、その教育方法がいかに発展していったのか、演劇界でどのような扱いを受けていたのか研究を明らかにし、成果報告として学会発表と論文投稿を行った。また、俳優など学術関係者以外も参加可能な研究発表会を行い、資料の翻訳を通じて得られた成果などを積極的に公開することに努めた。世界の俳優教育の現場において、大きな影響力を持つ俳優教育方法「スタニスラフスキー・システム」がいかにして日本に導入されたのか、その歴史の見直しをすることで、その問題点を明らかにした。特に大きな成果として、一部で最初のシステムの指導者であったとされた小山内薫が、史料調査によりシステムではなく別の方法を用いていたことを明らかにできた。また、システムに関する文献の翻訳を通じて、使われている専門用語に関する分析結果を論文として発表し、実際の俳優に向けたレクチャーを開催し成果の波及に努めた。当初予定していた日本の近代演劇(西洋演劇・新劇)の道を切り開いた小山内薫とスタニスラフスキー・システムの関係性については、順調に研究を進めることができ、その成果を論文を発表したことで、初年度計画していた研究の目的は完全に達成された。このほか海外出張による一次資料の調査も達成することができ、翻訳を公開しおおむね計画通りに研究を進めることができた。今後は今年度の資料調査の成果を公開するため、戦前と戦後の日本におけるスタニスラフスキー・システムの受容について、発表および論文投稿を行うことを第一の目標とする。このほか日本におけるシステムの用語の翻訳の問題について、研究課題の遂行中に新たに発見したため、こちらも成果を論文として発表する計画である。このほか、専門家への聞き取り調査の範囲を広げ、ロシアの演劇大学で学び日本で活動をしている演劇人たちへの聞き取り調査を通じて、現在のスタニスラフスキー・システムの状況について情報収集を行っていく計画である。ロシア演劇今後は初年度の研究成果を踏まえ、第二次大戦以前のスタニスラフスキー・システムの受容について研究を継続し、その成果を論文として発表する計画を進めていく。初年度は個人的に行った研究は順調であったが、各言語のスタニスラフスキーに関する資料の翻訳を行えたものは中国語文献のみで、計画していた外国語文献の翻訳は条件面で折り合わず担当予定のものに断られたため一部遂行ができなかった。今年度はあらたに担当者を探すか、計画していた文献などを変更することで、前年度の計画を引き継いで研究に必要な文献の翻訳と公開を遂行していく。また今年度は最終年度にあたるため、研究を行うだけではなく一般公開形式の研究会を積極的に開催することで研究成果を論文や学会発表のような専門化を対象にしたもの以外でもアウトプットを行い、広く社会に還元していく予定である。今年度は一身上の都合により計画遂行が困難となり、翌年度への計画延長を申請した。特に長期出張や海外への資料調査を中止せざるを得なかったため旅費の支出が計画通りには進めることができなかった。また人件費についてもアルバイトの使用にあたって監督することが難しく、予定通りの雇用を遂行することができなかった。
歯周病原性細菌における新規ペプチド分解機構の解明

糖非発酵性周病原性細菌はそのエネルギーや炭素源のすべて外来のタンパク質より得る。タンパク質は最終的にエキソペプチダーゼによってジペプチドやトリペプチドとなり菌体内に取り込まれる。2001年までにこの担当酵素としてジペプチジルペプチダーゼ(DPP)4、DPP7、プロリルトリペプチジルペプチダーゼAが知られていたが、私たちは2011年に、全く新規の酸性アミノ酸特異的DPP(DPP11と命名)を発見した。本研究ではさらに基質特異性の異なるDPP5とアシルペプチジルオリゴペプチダーゼが発現していることを見いだし、歯周病原性細菌が細胞外タンパク質をほぼ完全に分解して利用できることを明らかにした。歯周病原性細菌Porphyromonas gingivalisは糖非発酵性で、アミノ酸を炭素原およびエネルギー原としている。従来、細胞外ペプチド分解の最終過程であるオリゴペプチドをジペプチドとする酵素(DPP)としてDPP4とDPP7が知られていたが,本研究開始前に全く基質特異性を異にするDPP11を私たちは見いだした。そのため平成25年度はさらなる酵素の存在する可能性に関して検討した。その結果,本菌の生育に寄与するに種類のS9ファミリーペプチダーゼが新たに2種類見いだすことができた。ひとつはP1位置に疎水性アミノ酸を有するペプチドよりジペプチドを遊離するDPPであり、種々の検討からこれまでカビなど一部の真核生物に存在するとされていたDPP5と結論された。もうひとつはDPP4-5-7-11遺伝子を同時破壊しても残存するMet-Leu-MCA分解を担うS9ファミリー遺伝子であったが,実際にはDPPではなく、オリゴペプチダーゼ活性を有していた。S9ファミリーではこれまで塩基性アミノ酸を基質とするためオリゴペプチダーゼBと命名された遺伝子はあるものの疎水性アミノ酸を基質とするペプチダーゼの存在は報告されていないので新規の酵素の可能性がある。従来DPP7のみで構成されていたS46ファミリーペプチダーゼの中に,基質特異性の異なるDPP11の存在を見いだした結果,S46ファミリー内の2DPPの分類が混乱をきたしていた。具体的には全体のアミノ酸配列による分類ではDPP7とDPP11が複雑に入り組み,あたかも分子進化の過程でDPP7とDPP11が独立に何度も出現したようにみえた。しかし,酵素活性と基質特異性に必須のC末側の1/3のドメインのみを比較することで両者がきれいに二分され,DPP7とDPP11が分子進化上一度のイベントで生じたことを示唆していた。歯周病原性細菌であるPorphyromonas gingivalis (Pg)は糖非発酵性で,アミノ酸を炭素源およびエネルギー源とする。菌体外でのアミノ酸代謝に係わる酵素として従来,ジンジパインとジペプチジルペプチダーゼ(DPP)IVとDPP7が知られる。最近,我々は新規のDPP11を発見したが,さらにゲノム解析からDPPIII, Ala-DPP, DPPVの存在が示唆された。本研究ではこれらによるPgの菌体外ペプチド代謝系を明らかにすることを目的として,全てのDPPを組換え体として発現し,それらの基質特異性とDPP遺伝子破壊菌株でのペプチダーゼ活性を比較検討した。【結果】組換えDPPIII,DPPIV,DPP7,DPP11は,それぞれArg,Pro,疎水性アミノ酸,酸性アミノ酸を認識しジペプチドを産生したが,Ala-DPPには活性は認めなかった。DPP7では新たにP2位置の疎水性アミノ酸選択性が明らかになり,その場合P1部位に疎水性アミノ酸がない場合でも切断が可能になることが判明した(1)。この性質はPgの分解レパートリーに寄与していた。DPP11遺伝子破壊株ではAsp/Glu|-X結合を切断する活性が消失し,主要代謝アミノ酸であるAsp,Gluを含むジペプチド産生におけるDPP11の重要性が明らかになった。DPPIV-7-11三重遺伝子破壊株は主だったDPP活性を消失したが, ML-, KA-, GF-, SY-MCA分解活性の一部が残った。その活性は,DPPVの活性に酷似し,実際PgのDPPV遺伝子破壊によってほぼ消失した。歯周病原性細菌Porphyromonas gingivalisではエンドペプチダーゼであるジンジパインの研究が先行しており、細胞外ペプチドの最終分解過程を司るエキソペプチダーゼに関する研究は少ない。それでも2001年までにはジペプチジルペプチダーゼ(DPP)4、DPP7、プロリルトリペプチダーゼA(PtpA)が明らかとなっていた。私たちは2011年に、酸性アミノ酸特異的な新規DPP、DPP11を発見し、この謎の一端を明らかにした。

その結果から、さらに歯周病原性細菌にはまだ未知のDPPやエキソペプチダーゼが発現しており、全ての種類の配列のペプチドを分解することによって、限定栄養条件での生存を可能にしていると考えるに至った。そこで、既存のペプチダーゼでは分解できないペプチド結合を念頭に置き、新規ペプチダーゼを同定することを目的とした。3DPP遺伝子破壊株を作成した所、疎水性アミノ酸特異的なジペプチド産生能が残った。DPP様構造を有する遺伝子を大腸菌発現したところ、PGN_0756がほぼこの残存活性を示した。本酵素は従来コウジ菌などにのみ分布するとされてきたDPP5のオルソログであった。さらにDPP5遺伝子も破壊したところ、Met-Leu遊離活性が誘導された。検討の結果、疎水性アミノ酸を好む新規ペプチダーゼであった。本分子はジペプチドとトリペプチドを遊離し、しかも、N末ブロックペプチドを効率よく分解した。従来いかなる種でも知られていない新規酵素であり、アシルオリゴペプチジルペプチダ-ゼと命名した。本酵素はDPPが利用できないN末修飾ペプチドから非修飾末端を生じさせるたるために重要だと考えられる。総合すると歯周病原性細菌は従来考えられていたよりも、特異性の異なる多数のエキソペプチダーゼが発現しており、細胞外ポリペプチドを余すところなく利用していることが明らかとなった。口腔生化学研究申請時点では、われわれが2011に報告したDPP11を含めても本菌には3つのDPPしか同定されていなかった。しかし,現在ではさらにひとつのDPP(DPP5)と新規の特異性を有すると思われるオリゴペプチダーゼを見いだすことができた。さらにDPP7においてはP2位置の基質特異性を明らかにすることで,新規に見いだしたDPP5との基質特異性の差から担当基質の違いも明らかにすることができた。これらの機能遺伝子の発見が,もし他の菌に見いだされたペプチダーゼを,単に歯周病原性細菌P. gingivalisにも見いだしたというものであれば,本研究の進展速度はやや遅いと判断されるかもしれない。しかし,本研究では他のすべての細菌や真核生物でまだ見いだされていなかった機能未知遺伝子を初めて明らかにしたものである。その意味で,本研究はおおむね順調に進展していると考えている。当初は我々が新規に発見したDPP11を中心に解析を進めていたが,その後DPP7の新規のP2部位基質特異性を発見し,P. gingivalisにおけるジペプチド産生機構の一端を明らかにすることができた。さらに現在では第4のDPPであるDPPVの存在を認め,DPPVとDPP7によるレパートリーの機能的補完関係も明らかにしつつある。予備実験の結果,我々はすでにP. gingivalisにおいて発現しているすべてのDPPを捉えたと考えている。まず第一に新たに見いだしたオリゴペプチダーゼの性質の決定をさらに進める予定である。われわれは従来知られているDPPのみでは分解が不可能なペプチド基質配列が存在するため,P. gingivalis菌のペプチド代謝がきわめて非効率的なものになってしまうと考え,その矛盾を解消するペプチダーゼ遺伝子を探索してきた。今回DPPではないこのオリゴペプチダーゼが見いだされたことで,この矛盾が一気に解消される可能性がある。
導電性高分子をマトリクスに用いるエネルギー貯蔵電極の開発

1ポリ(3-ヘキシルチオフェン)と人造黒鉛の複合体の負極活物質としての電気化学特性リチウムイオン電池の負極材料の候補である人造黒鉛とポリ(3-へキシルチオフェン)のクロロホルム溶液を混合し、銅集電体に塗布し乾燥することによって両者の樵合体を調製した。その負極活物質としての電気化学特性を調べたところ、人造黒鉛と高分子の両者のレドックス反応を有効に用いることができ、またポリ(3-ヘキシルチオフェン)が人造黒鉛の不可逆容量を低下させる効果を有していることを明かとした。2ポリアニリンとV_2O_5複合体の正極活物質としての電気化学特性ポリアニリンのN-メチルピロリドン溶液にV_2O_5結晶粒子を分散させ、それをニッケル集電体に塗布して乾燥させることによってポリアニリンとV_2O_5の複合体を調製した。複合体を正極に、リチウム板を負極に用いて充放電特性を調べた結果、複合体のポリアニリンがV_2O_5粒子のバインダー兼導電性マトリクスとして機能することにより、V_2O_5の充放電反応をスムーズに進行させ、V_2O_5の利用率はほぼ100%に達した。さらに、ポリアニリンの酸化還元反応による電気量も活物質の充放電容量に寄与するので、充放電容量密度は炭素材料の導電性マトリクスとテフロン製バインダーを用いて調製する通常のV_2O_5正極活物質のそれよりも大きなものとなった。3ポリピロールとLiMn_2O_4の複合体の調整と4V級リチウム二次電池の正極としての特性LiMn_2O_4粉末を分散させた酸性水溶液にピロールを滴下すると、LiMn_2O_4が酸化剤として働くことによってピロールの酸化重合が進行し、ポリピロールとLiMn_2O_4の複合体が調製される。粉末を集電体とともに加圧成形して、4V級リチウム二次電池用の正極活物質として調べたところ、ポリピロールはバインダー兼導電性マトリクスとして機能することがわかった。また、4V vs.Li//Li^+の電位領域では、ポリピロールはキャパシターとしての特性を示すが、複合体ではそれによる充放電容量も利用できることがわかった。1 LiMn_2O_4とポリピロールの複合体ナノチューブの充放電特性200nmのポアサイズを有するメンブランフィルターを鋳型に用いてLiMn_2O_4のナノチューブ集合体を合成し、それへピロールの酸性水溶液を塗布することにより,LiMn_2O_4とポリピロールの複合体のナノチューブを調製した。そしてリチウム二次電池の正極活物資として用いて充放電特性を調べた。その結果,ポリピロールが導電剤兼活物質として機能することによる優れた充放電挙動を示すことが解り,また同量のLiMn_2O_4で調製した通常の正極活物質よりも10倍以上の速度で充放電反応を行えることを見出した。

2ポリ(3-ベキシルチオフェン)と人造黒鉛の複合膜の負極活物質としての電気化学特性リチウムイオン電池の負極材料の候補である人造黒鉛とポリ(3-ヘキシルチオフェン)のクロロホルム溶液を混合し、電極基体に塗布し乾燥することによって両者の複合膜を調製した。そして負極活物質としての充放電特性を調べたところ,人造黒鉛と高分子の両者のレドックス反応を有効に用いることが出来,またポリ(3-ヘキシルチオフェン)が人造黒鉛の不可逆容量を低下させる効果を有していることがわかった。3ポリアニリンとV_2O_5複合体の充放電特性V_2O_5粒子とポリアニリン溶液を混合する,あるいはV_2O_5粒子を分散させた酸性水溶液中にアニリンを添加して化学的に酸化重合することによって、ポリアニリンとV_2O_5の複合体を調製した。そしてこの複合体がリチウム二次電池の正極活物質として優れた特性を有していることを見出した。1.ポリアニリンを導電性マトリクスに用いたV_2O_5正極活物質アニリンの化学酸化重合によって得たポリアニリンを還元し、N-メチルピロリドンに溶解することによってポリアニリン溶液を調製した。それへ、V_2O_5粒子を分散させた後に集電体にキャストし、乾燥させてポリアニリンとV_2O_5との複合膜(V_2O_5/PAn)を調製した。複合膜を正極に、リチウム板を負極に用いてリチウム二次電池としての充放電特性を調べた結果、V_2O_5/PAn複合膜のポリアニリンがV_2O_5粒子のバインダー兼導電性マトリクスとして働くことにより、V_2O_5の充放電反応をスムーズに進行させ、V_2O_5の利用率はほぼ100%に達した。さらに、ポリアニリンの酸化還元反応による電気量も充放電容量に寄与するので、炭素材料を導電性マトリクスに、フッ素系高分子をバインダーに用いて調製する通常のV_2O_5正極活物質よりも容量密度は大きなものであった。また、充放電にともなって複合膜を出入りするイオン種を調べたところ、ほぼLi^+だけであったので、このことは、この複合膜がリチウム二次電池の正極活物質として適したものであることを示している。2.ポリピロールとLiMn_2O_5の複合体の調製と、4V級リチウム二次電池の正極としての特性LiMn_2O_4粉末を分散させた酸性水溶液にピロールを滴下すると、LiMn_2O_4が酸化剤として働くことによってピロールの酸化重合が進行し、ポリピロールとLiMn_2O_4の複合体粉末(LiMn_2O_4/PPy)が調製される。粉末を集電体とともに加圧成形して、4V級リチウム二次電池用の正極活物質として調べたところ、ポリピロールはバインダー兼導電性マトリクスとして機能することがわかった。また、4Vvs.Li/Li^+の電位領域では、ポリピロールはキャパシターとしての特性を示すが、複合体ではそれによる充放電容量も利用できることがわかった。
フェムト秒レーザーによるナノ構造付与高機能低温表面改質合金の創製

γ系ステンレス鋼の低温硬化層(浸炭・窒化),純チタン,硬質薄膜の表面にフェムト秒レーザーを照射し,ナノ構造を各種サイズで平面状に均一加工する条件を明らかにした.耐食性に優れる低温硬化層は熱影響を受けやすいが,ナノ構造を加工しても耐食性がほとんど劣化しないことを確認した.また,照射面の腐食電流密度がフルーエンスに依存して変化することが判明し,ナノ構造形成による表面積の増加割合を評価する新手法として応用できることを示した.チタンの低強度照射面には偏光方向に平行な超微細な周期構造が観察され,通常のナノ構造形成面には化学合成が困難なセルロース系の有機膜が形成することを見出した.γ系ステンレス鋼SUS304に対し,耐食性の劣化を防ぐために約400°Cと比較的低温で窒化処理を行い,厚さ約10μmの硬化層(HV1000)を加工した.また,SUS304鋼と純Tiに対し,PVD法を用いてTiNやCrNの窒化物膜(HV15002000)を低温で2μm以上の厚さに成膜した.次に,表面硬化層および窒化物膜にナノ構造を加工する条件を検討した.即ち,フェムト秒レーザーをスポットで固定照射し,レーザー強度と照射パルス数を変化させた時の照射痕の形状をSPMで測定することにより,アブレーション閾値や加工速度を求めた.また,SEMにより,ナノ構造の間隔や形状を観察し,ナノ構造形成のためのレーザー条件を明らかにした.次に,レーザースキャン技術を応用し,硬化層表面に平面状に均一なナノ構造を加工する技術を開発し,比較のため,未処理材の表面に対しても同様な照射実験を行った.ナノ構造を加工された試料に対し,表面分析装置により照射面の元素含有量,結晶構造,結合状態の変化等を分析し,表面物性に与えるレーザー照射の影響を明らかにした.また,ナノ構造が加工された表面硬化層に対し,ボール・オン・ディスク型摩擦摩耗試験機により,大気中乾式下で摩擦係数の変化をモニタリングし,周期的ナノ構造のトライボロジー特性に与える効果を検証する実験を開始した.さらにステンレス鋼の低温硬化層や窒化物膜に対し,レーザー照射による耐食性の劣化の有無を調べるため,電気化学測定システムを用いた分極曲線測定を開始した.なお純Tiについては、低強度で照射すると、波長の1/10以下の間隔でレーザーの偏光方向に平行な超微細な周期構造が形成される現象を見出した。研究計画に基づいて,表面硬化層および窒化物膜にフェムト秒レーザーによりナノ構造を加工する条件の検討実験や照射面の解析・評価を行った.なお本予算で購入した電気化学測定システムを用いて分極曲線測定などの電気化学分析を行い,低温硬化層や窒化物膜の耐食性評価を開始した.特にTiのナノ構造に関して興味ある現象を見出し,学会に発表した.平成27年度に得られた結果を基に,新たにγ系ステンレス鋼SUS316に対し,同様に低温硬化層の作製および窒化物膜の成膜条件を明らかにする実験を開始した.低温硬化層については,窒化以外に低温浸炭処理を開始した.次にこれらの試料表面にフェムト秒レーザーを照射し,SEMやSPMを用いて,ナノ構造の加工条件や加工速度等を明らかにした.その際に,窒化・浸炭による加工速度への影響などにも注意し、ナノ構造の間隔のフルーエンス依存性を求めた.また,純Tiの低強度照射時に見出したレーザーの偏光方向に平行な超微細な周期構造の物性評価を継続して行い,未処理または低温窒化・浸炭されたステンレス鋼でも同様な現象が確認されないか検証実験を行った.ナノ構造形成面に対しては,昨年度と同様に,XPS等の表面分析装置を用いて,表面物性に与えるレーザー照射の影響を調べた.今年度はさらにToF-SIMSを用いてナノ構造形成面の有機物の構造についても評価し,興味ある結果が得られた.ステンレス鋼の低温窒化・浸炭層や窒化物・DLC膜に対しては,レーザー照射による耐食性の劣化の有無を確認する電気化学的実験を継続して行い,低フルーエンスの照射では熱影響がないことを明らかにした.ボール・オン・ディスク型摩擦摩耗試験については,ナノ構造を加工した硬化層や高靱性窒化物膜に対し,水・油滴下中の評価を開始した.なお,純Tiについては,平成27年度に低強度で照射すると,レーザー波長の1/10以下の間隔でレーザー偏光方向に平行な超微細な周期構造が形成される現象を見出した.得られた成果をレーザー精密加工に関する国際会議LPM2016に発表し,欧文学術論文誌へ投稿し採択された.研究計画に基づき,表面硬化層および窒化物膜にフェムト秒レーザーによりナノ構造を加工する条件の検討実験や照射面の解析・評価を行った.本予算で購入した電気化学測定システムを用いて分極曲線測定を行い,低温硬化層や窒化物膜の耐食性に与えるレーザーの影響を評価できることが判明した.特にTiのナノ構造に関して興味ある現象を見出し,国際会議に発表し欧文誌に採択された.γ系ステンレス鋼(SUS304,316)の低温硬化層(浸炭・窒化)およびステンレス鋼や純Tiに被覆した窒化物膜(CrN,TiN等)や固体潤滑膜(DLC)の表面にフェムト秒レーザーを照射し,ナノ構造を平面状に均一に加工する条件を明らかにした.ナノ構造の特性は,SUS316鋼の低温浸炭・窒化層を重点的に調べた.

化学測定システムを用いた分極曲線測定による耐食性評価については,低温硬化層は通常の窒化層に比べてはるかに耐食性に優れ,未処理のステンレス鋼とほぼ同等であること,低温窒化より低温浸炭の方が耐食性に優れることなどを明らかにした.また,熱影響を受けやすい低温硬化層に対し,フェムト秒レーザーによりナノ構造を加工しても耐食性がほとんど劣化しないことを確認した.さらに照射面の腐食電流密度が,レーザーフルーエンスに依存して変化することが判明し,ナノ構造形成による表面積の増加傾向を判断する新規手法として期待される.純Tiの低強度照射面で見出したレーザーの偏光方向に平行な超微細な周期構造については,XPSやToF-SIMSによる表面分析により,表面状態としては未処理面に近いこと,通常のナノ構造形成面には化学合成が困難なセルロース系の有機膜が形成されることを見出し,欧文論文誌に投稿し掲載された.また,この超微細なナノ構造は,未処理のステンレス鋼には加工されるが,表面硬化層やDLC等の硬質薄膜では形成されないことが判明した.得られた研究成果は,海外の国際会議で2件,国内の学術講演会等で7件の講演発表を行った.新たに見出した偏光方向に平行な超微細周期構造,セルロース系有機膜のレーザー合成,ナノ構造形成面の電気化学的手法による表面積増加の評価法については,今後も研究を継続し,国際会議や論文等に発表する.有機膜合成法に関する論文が,国際的な先端研究紹介WebサイトAIEに掲載された.γ系ステンレス鋼の低温硬化層(浸炭・窒化),純チタン,硬質薄膜の表面にフェムト秒レーザーを照射し,ナノ構造を各種サイズで平面状に均一加工する条件を明らかにした.耐食性に優れる低温硬化層は熱影響を受けやすいが,ナノ構造を加工しても耐食性がほとんど劣化しないことを確認した.また,照射面の腐食電流密度がフルーエンスに依存して変化することが判明し,ナノ構造形成による表面積の増加割合を評価する新手法として応用できることを示した.チタンの低強度照射面には偏光方向に平行な超微細な周期構造が観察され,通常のナノ構造形成面には化学合成が困難なセルロース系の有機膜が形成することを見出した.ナノ構造を加工した低温硬化層および窒化物等硬質薄膜,さらにDLC等の固体潤滑膜を被覆した複合改質層に対し,各種雰囲気(大気中乾式下,水・油滴下)におけるトライボロジー特性の評価や耐食性の評価を継続して行う.得られた結果をレーザー照射条件や照射面への潤滑膜の蒸着条件等にフィードバックすることにより,最適な加工条件を明らかにし,他の金属材料に対しても波及効果の高いナノ構造付与高機能低温表面改質技術の開発へと結びつける.ナノ構造を加工した低温硬化層(浸炭・窒化)および窒化物等硬質薄膜,さらにDLC等の固体潤滑膜を被覆した複合改質層に対し,各種雰囲気(大気中乾式下,水・油滴下)におけるトライボロジー特性の評価や耐食性の評価を継続して行う.得られた結果をレーザー照射条件や照射面への潤滑膜の蒸着条件等にフィードバックすることにより,最適な加工条件を明らかにし,他の金属材料に対しても波及効果の高いナノ構造付与高機能低温表面改質技術の開発へと結びつける.材料工学、表面改質、レーザー加工
疼痛治療用ヘルペスウイルスの作製

本研究の趣旨は、ヘルペスウイルス(HSV-1)を用いて、間質性膀胱炎や癌性疼痛など難治性疼痛の治療を行うことである。神経節に潜伏感染するという、HSV-1が本来有する特徴に着目し、潜伏感染時もモルヒネ様分子を持続的に発現させて難治性疼痛を緩和させるウイルスを作製することを研究目的としている。まず、モルヒネ様物質を発現するウイルスT3-Xを作製した。マウス足底にウイルスを注射してホルマリンテストを行ったところ、その行動実験では、モルヒネ様物質の発現群が対照群と比較して有意に疼痛を減弱させていた。さらに、その神経後根でRT-PCRにてモルヒネ様物質の発現の有無を確認した。治療のイメージとしては、疼痛部位にウイルスを注射すると、ウイルス自身が軸索を逆行性に後根神経節まで伝達していき、そこで潜伏感染してLATプロモータ下にβエンドルフィンが持続的に発現し、疼痛の緩和を図る、というものである。本研究は、神経節に潜伏感染するという、ヘルペスウイルス(HSV-1)が本来有する特徴に着目している点が独創的である。ヘルペスウイルスを用いた先行研究は存在するが、あくまでも遺伝子を発現させるベクターとしての使用に限定されており、潜伏感染させて持続的に遺伝子を発現させたものではない。また、発現遺伝子として、モルヒネ様分子であるβエンドルフィンに着目した点も有用性で利点があると考えられる。感染効率が高いウイルスによる導入といえども、現実には感染効率には限界があり、感染した細胞中でのみ効果を発揮しても充分な除痛効果は得られない。これまで、抑制性の神経伝達物質や抗炎症ペプチドの研究が進められたが、どれも充分な除痛効果は得られておらず、我々は感染細胞以外でも効果を発揮する分泌型分子に注目し、その中でも、オピオイド系分子に着目した。δ受容体のエンケファリン発現型HSV-1が除痛に有効であるとの実験結果が報告されているが、後根神経節での除痛にはミュー受容体の方が重要であるとの報告が最近見られるため、ミュー受容体のβエンドルフィン(β-EP)を今回の研究の対象とした。具体的には、上記の目的に合うHSV-1を作製し、マウスを使用した動物実験の疼痛モデルでの検証を行う予定である。神経節に潜伏感染するという、HSV-1が本来有する特徴に着目し、潜伏感染時もモルヒネ様分子を持続的に発現させて難治性疼痛を緩和させるウイルスを作製することが研究目的である。

本研究の趣旨は、ヘルペスウイルス(HSV-1)を用いて、間質性膀胱炎や癌性疼痛など難治性疼痛の治療を行うことである。神経節に潜伏感染するという、HSV-1が本来有する特徴に着目し、潜伏感染時もモルヒネ様分子を持続的に発現させて難治性疼痛を緩和させるウイルスを作製することを研究目的としている。治療のイメージとしては、疼痛部位にウイルスを注射すると、ウイルス自身が軸索を逆行性に後根神経節まで伝達していき、そこで潜伏感染してLATプロモータ下にモルヒネ様物質が持続的に発現し、疼痛の緩和を図る、というものである。平成24年度には、既存のT-BACシステムを改変して、潜伏感染LATプロモータ下にモルヒネ様物質を発現するウイルスT3-Xを作製した。平成25年度には、新たに作製されたT3-Xの動物実験における疼痛の評価を様々な方法で行った。最終年度である平成26年度には、これまでの実験結果から適切なモデルを選択し、行動実験を進めた。具体的には、マウス足底にウイルスを注射して、右足底皮下に30G針を用いて5%ホルマリン溶液を投与し、右後肢へのlicking timeの持続時間を測定するホルマリンテストを行った。その行動実験では、モルヒネ様物質の発現群が対照群と比較して有意に疼痛を減弱させていた。さらに、その神経後根でRT-PCRにてモルヒネ様物質の発現の有無を確認した。これは、神経後根でのモルヒネ様物質の発現が疼痛を減弱させることを証明し、さらに、モルヒネ様物質を発現する疼痛ウイルスの作製に成功したことを示している。医歯薬学平成24年度には、既存のT-BACシステムを改変して、潜伏感染LATプロモータ下にβエンドルフィンを発現するウイルスT-03-βEPを作製した。平成25年度には、新たに作製されたT-03-βEPの動物実験における疼痛の評価を行った。具体的には、マウス足底に注射して、その神経後根でHSV-1抗体にて感染の有無を、ELISAにてβ-EPの発現の有無を確認した。さらに、下記の如くマウスにおける疼痛の評価を行った。1)ホルマリンテスト(化学刺激による自発痛)右足底皮下に30G針を用いて5%ホルマリン溶液を投与し、右後肢へのlicking timeの持続時間を測定する。通常反応は2相性で、第1相はホルマリンによる直接刺激による反応、第2相は局所の炎症反応による侵害受容性興奮と脊髄後角に誘発される過敏化の相乗効果を反映し、モルヒネは第1相、第2相ともに抑制効果がある。2)坐骨神経部分損傷モデルによる解析(Spared nerve injury model)麻酔下にて坐骨神経の枝である総腓骨神経と脛骨神経を結紮する。機械的刺激による著明な痛覚過敏状態が、術後長期間認められる。マウスを網の上に置き、馴化させた後、様々な重さのvon Freyフィラメントを下方より足底にあて触圧刺激を加え、足を上げる逃避反応を示すフィラメントの重さを測定する。痛覚過敏状態では、通常では逃避反応を示さない細いフィラメントで逃避反応を示すようになる。3)CFA(Complete Freund adjuvant)による炎症性疼痛モデルによる解析マウス後肢足底にCFAを皮下注入し炎症痛モデルを作成する。これにより著明な痛覚過敏とアロデイニアが誘起される。4)術後痛モデルによる解析麻酔下にて右足底の皮膚・筋肉に切開を加え、足底筋層を持ち上げた後に筋を縫合し、皮膚を閉じる。術後、切開部近位の機械的刺激による疼痛が認められる。現在の結果の解析中であり、ここまで研究計画の記載通りに順調に進行している。
顎関節内癒着病変の発生機序に関する基礎的臨床的研究

顎関節内癒着病変の発生機序を解明する目的で顎関節症癒着病変(band-like adhesion[BA]、pseudowall-like adhesion[PW])の形態学的特性を生体外で拘縮現象を観察できる、コラーゲンゲル収縮モデルを用い,ヒト正常皮膚(NS)線維芽細胞、歯肉線維(GF)芽細胞、関節円板(D)由来、滑膜(S)由来および癒着病変由来細胞との比較を試みた.ゲル収縮の経時的観察では、NS、PW、BA、D=GF、Sの順にゲル収縮が強く起こり、顎関節由来ではPWとBAが強い収縮を示した.これは癒着病変由来細胞の活性の高さ(細胞の増殖能力、遊走活性、サイトカインの産生能、反応力、細胞外基質産生能)を反映していることが示唆された.透過型、走査型電子顕微鏡所見、アクチン蛍光染色所見からBAは、滑膜A細胞類似のマクロファージ様細胞、PWは線維芽細胞様細胞として観察された.BAはコラーゲン束の走行は整然としており、癒着病変の進展方向と一致しており、PWのコラーゲン束は癒着の方向と関連なく、ランダムに走行し、一部には、石灰化したコラーゲン細線維が観察された.上記の形態学的観察所見はPWがBAより癒着が高度であり、BAはその含有細胞から癒着の発生環境が滑膜と密接な関係があり、臨床所見との関連を示唆していた.癒着病変由来培養細胞の形態変化に及ぼす薬剤の影響の検討を調べる目的で、添加薬剤としてトラニラストを選択した.ゲル収縮のトラニラスト添加群では、特に顎関節癒着病変由来細胞で有意差を持った収縮抑制効果が認められ(P<0.05>、形態学的観察所見でも、トラニラスト添加群では、細胞突起、マイクロフィラメントの数、長さの減少が認められた.PWよりBAの方にトラニラスト反応効果が高く、トラニラストレセプターの発現の差、サイトカインへの反応の差を反映しており、顎関節滑液中のサイトカイン環境により、癒着細胞の発現、種類、癒着マトリックスの形成が影響されることが本研究により示唆された.顎関節内癒着病変の発生機序を解明する目的で顎関節症癒着病変(band-like adhesion[BA]、pseudowall-like adhesion[PW])の形態学的特性を生体外で拘縮現象を観察できる、コラーゲンゲル収縮モデルを用い,ヒト正常皮膚(NS)線維芽細胞、歯肉線維(GF)芽細胞、関節円板(D)由来、滑膜(S)由来および癒着病変由来細胞との比較を試みた.ゲル収縮の経時的観察では、NS、PW、BA、D=GF、Sの順にゲル収縮が強く起こり、顎関節由来ではPWとBAが強い収縮を示した.これは癒着病変由来細胞の活性の高さ(細胞の増殖能力、遊走活性、サイトカインの産生能、反応力、細胞外基質産生能)を反映していることが示唆された.透過型、走査型電子顕微鏡所見、アクチン蛍光染色所見からBAは、滑膜A細胞類似のマクロファージ様細胞、PWは線維芽細胞様細胞として観察された.BAはコラーゲン束の走行は整然としており、癒着病変の進展方向と一致しており、PWのコラーゲン束は癒着の方向と関連なく、ランダムに走行し、一部には、石灰化したコラーゲン細線維が観察された.上記の形態学的観察所見はPWがBAより癒着が高度であり、BAはその含有細胞から癒着の発生環境が滑膜と密接な関係があり、臨床所見との関連を示唆していた.癒着病変由来培養細胞の形態変化に及ぼす薬剤の影響の検討を調べる目的で、添加薬剤としてトラニラストを選択した.ゲル収縮のトラニラスト添加群では、特に顎関節癒着病変由来細胞で有意差を持った収縮抑制効果が認められ(P<0.05>、形態学的観察所見でも、トラニラスト添加群では、細胞突起、マイクロフィラメントの数、長さの減少が認められた.PWよりBAの方にトラニラスト反応効果が高く、トラニラストレセプターの発現の差、サイトカインへの反応の差を反映しており、顎関節滑液中のサイトカイン環境により、癒着細胞の発現、種類、癒着マトリックスの形成が影響されることが本研究により示唆された.顎関節内癒着病変の発生機序を解明する前段階として、まず顎関節鏡視下に採取した癒着病変組織(band-like adhesion、pseudo-wall adhesion)の培養条件の確立および培養細胞の形態学的観察を行った。17歳から48歳の男性2名女性19名の顎関節症患者から採取した癒着病変組織を10%FBS添加Dulbecco's modified Eagle's medium 1 mlを満たした35mm dishに静置し、5%CO_2、37°Cで器官培養を施行した。約72時間後に癒着病変組織周囲に細胞が出現し、これら細胞を継代培養した。細胞増殖速度をヒト培養皮膚線維芽細胞、ヒト培養口腔粘膜線維芽細胞をコントロールとして比較したところ、癒着病変部由来細胞は有意に遅いことを示した。継代培養した細胞をKarnovsky固定後、透過型、走査型電子顕微鏡にて形態観察を行った。透過型電顕観察により、癒着病変部由来細胞は線維芽細胞様細胞、滑膜A細胞様細胞で構成されていることが明らかとなった。癒着病変部が発生する関節腔内環境は、前方転位、内方転位した関節円板、炎症性滑膜組織が近接しており、これら組織由来の細胞で癒着病変部の発生が生じることが示唆された。

走査型電顕観察では近接する細胞に伸びる発達した細胞突起とマイクロフィラメントが観察された。さらに継代培養した癒着病変部由来細胞をtype I collagen gel内三次元培養を施行し経時的にgelの直径を測定した。コントロールとしてヒト培養皮膚線維芽細胞を用いた。コントロールと比較し癒着病変部由来細胞gel収縮は緩徐であるが、症例によって経時的収縮曲線の差があり、臨床症状を反映していることが示唆された。今後、本科研費により購入した、光顕用ミクロトームも用いて癒着病変試料の連続切片を作製し、各種細胞外マトリックス抗体、細胞接着蛋白抗体を用いた免疫組織化学染色を行い、臨床症状との比較、癒着発生のメカニズムについて検索を行う予定である。顎関節内癒着病変の発生機序を解明する目的で顎関節症癒着病変(band-like adhesion[BA]、pseudowall-like adhesion[PW])の形態学的特性を検討した.実験には生体外で拘縮現象を観察できる、コラーゲンゲル収縮モデルを用いた.ヒト正常皮膚(NS)線維芽細胞、歯肉線維(GF)芽細胞、関節円板(D)由来、滑膜(S)由来および癒着病変由来細胞との比較を試みた.ゲル収縮の経時的観察では、NS、PW、BA、D=GF、Sの順にゲル収縮が強く起こった.顎関節由来ではPWが一番強い収縮を示し、癒着病変由来細胞の活性の高さ(細胞の増殖能力、遊走活性、サイトカインの産生能、反応力、細胞外基質産生能)を反映していることが示唆された.透過型、走査型電子顕微鏡所見、アクチン蛍光染色から、癒着病変由来細胞の中でBAは、滑膜A細胞類似のマクロファージ様細胞、PWは線維芽細胞様細胞として観察された.BAは細胞密度は低く、PWは高く、両細胞ともに比較的太い細胞突起を有する細胞が認められた.BAはコラーゲン束の走行は整然としており、癒着病変の進展方向と一致していた.PWのコラーゲン束は癒着の方向と関連なく、ランダムに走行していた.PWの一部には、石灰化したコラーゲン細線維が観察された.BA、PW供にアクチンフィラメントは細胞膜直下、細胞突起内、細胞辺縁でよく発達していたが、PWはBAと比較して細胞1個あたりのアクチンフィラメントの数が多く認められた.上記の形態学的観察所見はPWがBAより癒着が高度である臨床所見との関連を示唆していた.癒着病変由来培養細胞の形態変化に及ぼす薬剤の影響の検討を調べる目的で、添加薬剤としてトラニラストを選択した.ゲル収縮のトラニラスト添加群では、特に顎関節癒着病変由来細胞で有意差を持った収縮抑制効果が認められた(P<0.05>.形態学的観察所見でも、トラニラスト添加群では、細胞突起、マイクロフィラメントの数、長さの減少が認められた.BAとPWの間でトラニラストの反応に差があり、PWよりBAの方に反応効果が高かった.この違いの理由は明らかではないが、トラニラストレセプターの発現の差、サイトカインへの反応の差を反映していることが示唆された.
生体分子修飾の異常を標的とした消化器癌の個別化治療

消化器癌の発生と進展において、様々な生体分子の修飾異常が関与する。中でも、遺伝子のエピジェネティックな異常は遺伝子サイレンシングに関与する。特にアポトーシス関連遺伝子の異常メチル化による不活化は、腫瘍細胞のアポトーシス抵抗性、抗癌剤の低感受性に重要な役割を果たす可能性がある。腫瘍細胞におけるアポトーシスは、DNA損傷や酸化ストレスなど様々なストレスにより誘導される。本研究では、これまで報告がほとんどない、低酸素誘導性アポトーシスに関連する遺伝子群の異常メチル化と発現抑制について検討し、,BH3 Onlyファミリー遺伝子の一つ、BNIP3が大腸癌、胃癌および膵癌において、異常メチル化により不活化されていることを明らかにした。BNIP3が発現していない腫瘍細胞においても、異常メチル化を解除することにより、低酸素誘導性のBNIP3発現が回復しアポトーシスを誘導出来た。われわれはこれまで、一部の大腸癌において、ゲノムワイドなメチル化の異常、CpGアイランドメチル化フェノタイプを示すことを明らかにした。本研究では、胃癌におけるCpGアイランドメチル化フェノタイプにと関連する臨床病理学的因子の検討を行い、Epstein-Barrウイルス関連胃癌においてゲノムワイドなメチル化の異常が起きていることを明かにした。さらに、細胞周期調節遺伝子、特に分裂期チェックポイントに関連する遺伝子のDNAメチル化解析し、CHHR遺伝子の異常メチル化が、微小管阻害剤感受性の予測に有用であることを明らかにした。また、CHFRをRNA干渉法でノックダウンすることにより、微小管阻害によりおこる、分裂期チェックポイントを解除し、腫瘍細胞の微小管阻害にたいする感受性を増強することが可能であった。CHFRの機能を阻害する薬剤は微小管阻害の抗腫瘍作用を増強すると考えられ、分裂期チェックポイント遺伝子の異常が、分子標的として有用である可能性が示唆された。近年、癌細胞における遺伝子異常を標的とした分子標的治療が注目を集めている。しかし、消化器癌において、遺伝子に点突然変異を有する腫瘍は実際には少なく、より有効な分子標的の探索が急務となっている。本研究では、DNAメチル化異常やヒストン脱アセチル化などのエピジェネティックな異常や、タンパクのユビキチン化を標的とした治療法開発に向けて、基礎的研究を行うことを目的とする。われわれは、低酸素誘導性アポトーシスに関与するBNIP3遺伝子が、大腸癌および胃癌において高頻度に異常メチル化により不活化されていることを見出した。大腸癌細胞はしばしば低酸素誘導性アポトーシスに抵抗性を示すが、BNIP3遺伝子が異常メチル化している腫瘍細胞をメチル化阻害剤、5-aza-dCで処理することにより、低酸素によるアポトーシス誘導能を回復出来た。また、RASシグナル制御因子である、RASSF遺伝子ファミリーのエピジェネティックな異常について検討したところ、RASSF2が大腸癌および胃癌において高頻度に異常メチル化により不活化されていることが明らかとなった。RASSF2が発現消失している腫瘍細胞に遺伝子導入したところ、細胞増殖の抑制とアポトーシスを誘導し、消化器癌におけるRasシグナルの活性化は、遺伝子変異だけでなく、Rasを負に制御している分子のエピジェネティックな異常が重要である可能性が示唆された。ユビキチンリガーゼである、CHFRが微小管阻害剤抵抗性に関与することを見出した。RNA干渉法によりCHFRをノックダウンすることにより、微小管阻害剤による抗腫瘍作用を増強できた。以上の結果から、エピジェネティックな異常やユビキチン化の異常などの生体分子の修飾異常は、これまで考えられていた以上に消化器癌の発生と進展に重要な役割を果たしており、治療の分子標的として重要と考えられた。がんの治療の分子標的として、これまで増殖因子受容体やチロシンキナーゼが注目を集めてきた。しかし、これら遺伝子の変異の頻度は低く、阻害薬の適応は限られている。

本研究では消化器癌において高頻度に異常を認める、DNAメチル化異常やヒストン脱アセチル化などのエピジェネティックな異常を標的とした治療法開発に向けて、基礎的研究を行うことを目的とする。本年度は、WNT、Rasおよびp53シグナルに関与する遺伝子群の分子標的としての可能性について検討した。SFRP遺伝子ファミリーおよびDKK遺伝子ファミリーをβ-cateninが活性化している大腸癌および胃癌細胞に導入したところ、TCF/β-catenin転写活性を抑制、細胞増殖の抑制とアポトーシス誘導を認めた。特にDKK1およびDKK2は、TCF/β-catenin転写活性抑制能が低いにも関わらず、強い細胞増殖抑制を示し、non-canonical経路を介したWNT抑制を行っていることが示唆された。また、Rasの負の制御遺伝子であるRASSF2を大腸癌および胃癌細胞株に導入することにより、ERKおよびAKTのリン酸化の抑制を認めた。PIK3CAの変異を認める細胞株では、飴KTのリン酸化を認めず、RASSF2はPIK3CAの上流で機能することが示唆された。また、胃癌におけるメチル化の標的遺伝子をスクリーニングし、Gasdermin遺伝子ファミリーの一つ、DFNA5がメチル化により不活化されていることを明らかにした。DFNA5はp53の標的遺伝子の一つであり、p53の変異がない腫瘍でも、p53の標的遺伝子がメチル化により機能しなくなる可能性を示した。これらの結果より、脱メチル化によりp53標的遺伝子の発現を回復することが可能と考えられた。
ヒト腫瘍におけるEph/Ephrinファミリーおよびその周辺蛋白の発現機能解析

Ephfamilyの中で、大腸癌症例において、腫瘍部での発現が低下していることが示されているEphA7の解析を行っている。各constructがHCT116でどのように局在するか観察した。その結果、全長、-KD、-SAMで細胞膜に局在した。これは一般的にいわれていることと矛盾しない。しかし、-Elbdや-extracellularで細胞内にびまん性に局在した。これはEphA7のN端側に膜移行signalがあるといわれていることに矛盾しない。細胞挙動については、細胞増殖やsoft agarにおいてEphA7とcontrol間で差が認められ、EphA7がある方が細胞増殖は抑制され、colony形成も抑制された。今後それぞれのdomainを削ったものにおける細胞挙動の差を観察し、expression arrayや免疫共沈法等でEphA7発現低下における癌進展のsignal経路を同定する。Ephfamilyの中で、大腸癌症例において、腫瘍部での発現が低下しているということが示されているEphA7についての解析を行っている。まずEphA7の細胞生物学的な解析にあたり、pQCXIN vector (retro virus vector)を用いた発現vectorを制作した。制作されたものはpQCXIN EphA7とpRevTRE EphA7のコンストラクトである。このときEphA7タンパク質の同定には市販抗体を用いることにした。4種類の抗体でウエスタンブロット法によるチェックを行い、そのうちのSanta Cruz社の1種類が使用可能であると判断された。しかし、同定の安定性の面より、抗体価が低いのではないかということが示唆されたので、今後のアッセイのためには、タグ(FLAG, EGFP)がフュージョンされたコンストラクションのほうが有効と考えられ、現在それらを製作中である。製作中のコンストラクションはpQCXIN-FLAG-EphA7(C端側にFLAGタグのついたEphA7の融合タンパク)と、pQCXIN-EphA7-EGFP(N端側にEGFPのついたEphA7の融合タンパク)である。さらに市販抗体2種類で、EphA7のウエスタンブロット法による安定した同定が可能かであるかどうかをチェック中である。現段階ではEphA7に関するデータとしては、colony assayにおける増殖抑制はHCT116とDLD-1(ともにcolon canserのcell line)において明らかな増殖抑制の差はみられないということがわかっている。Eph familyの中で、大腸癌症例において、腫瘍部での発現が低下していることが示されているEphA7の解析を行っている。