hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
近赤外発光による脳深部のin vivo光イメージングシステムの構築

ラット脳深部からのルシフェラーゼ発光をAkaLumineを基質としてIVISによる非侵襲的にイメージングすることを目指したが、in vivoはもとより摘出した脳の上部からの検出もできなかった。代ってGFPを特定の神経細胞で発現するトランスジェニックラットを用いて、脳内に挿入した光ファイバー束(200μm直径、3000本)を介してGFP発現細胞のイメージングに成功した。。本研究計画は、赤色ルシフェラーゼ発光(ルシフェラーゼの発光基質としてアカルミネを用いる赤色発光)をin vivo imagin system(IVIS)によって検出することで、神経活動を反映する脳深部のライブイメージングを目指すものである。我々はそのモデルケースとして、時計遺伝子Per2プロモーター制御下でルシフェラーゼを発現するトランスジェニックラット脳室にアカルミネを注入し、生物時計の中枢である間脳視床下部に位置する視交叉上核(suprachiasmatic nucleus: SCN)からサーカディアンリズムの検出に取り組んでいる。切片培養によりSCNは他領域とくらべ特に高いルシフェラーゼ発光を示すことが知られている。しかしSCNは脳底部に位置しており、脳室内にアカルミネを注入した後に成体ラットを頭頂からイメージングを試みても検出は不能であった。そこで頭皮の剥離、さらには頭蓋骨へのウィンドウを試みたが有意なシグナルは検出できなかった。脳室にアカルミネを注入後に摘出した脳を用いても頭頂部からのシグナル検出は出来なかった。続いて脳の比較的小さい若齢ラットを用いた検出を進めている。現在まで有意なシグナルは得られていない。本研究の究極的な目的は、脳深部のイメージングであり光ファイバーを用いたシグナルの可能性について並行して検討を進めている。これは非侵襲によるシグナル検出が難しい場合、プローブを脳内に挿入して神経細胞活性を反映するイメージを得る方法の開発である。予備実験として、現在までに直径200μm 3000束の光ファイバー束(bundle optical fiber)によりGFP発現トランスジェニックラットより脳深部の神経細胞の蛍光イメージを得ている。in vivoにおいて脳内の特定の神経細胞が発するルシフェラーゼ発光のイメージングを目指したが、摘出した脳、さらに分割した脳からからでも上部からルシフェラーゼ発光をIVISを用いて検出することができなかった。やむなくIVISによる検出を断念した。代わってGFPを発現するトランスジェニックラットの脳内に、光ファバー束(200μm直径、3000本)を挿入して頭蓋骨に固定することにより、脳内の細胞レベルのイメージング法の開発を試みる。今年度、無麻酔・自由運動下で、GFPを発現する神経細胞のイメージを蛍光顕微鏡により取得することができた。神経細胞の画像は、動物の運動によってぶれることはなく、長時間にわたる細胞レベルのイメージングの可能性が開けた。さらに接眼レンズの至適条件について検討を進めた。またin vivoからのイメージングへの応用を念頭に、ペプチドホルモンの脳組織への結合、麻酔による脳深部の応答等に関する探索研究を行った。。蛍光検出が難しい理由として、発光基質アカルミネによりルシフェラーゼより発せられる赤色光の脳組織に対する透過性が、期待したよりも低いことにある。現在、動物への処置方法、用いる動物の選択に関して工夫を試みている。神経解剖学神経内分泌学1より長波長の発光基質を用いたイメージングを試みる。2Per2::dLUCトランスジェニックラットからの蛍光検出ではなく、タンパク質標品LUC+アカルミネ混合液をを脳実質の比較的浅層に注入して有意なシグナルを得ることを試みる。3シグナルを検出するためのプローブを挿入する方法についても検討を進める。
DNA修復と遺伝情報発現制御のクロストークの解明

本研究では、DNA修復因子と転写因子のクロストークを解明し、DNA修復機構に異常を持つ遺伝病を分子レベルで理解することを目的とした。その結果、ヌクレオチド除去修復に関わるXPGタンパク質が基本転写因子TFIIHに加えていくつかの転写因子と相互作用することを明らかにした。また変異体を用いた解析から、XPGの転写反応における機能とXPGの変異によって引き起こされる遺伝病との間に関係があることを見いだした。DNA修復因子の転写反応における機能解析では、これまでに(i)XPGをノックダウンした細胞では上皮増殖因子(EGF)で刺激した後にc-fos遺伝子の誘導発現が抑制されること、(ii)また正常細胞においてはこの刺激依存的にXPGがc-fos遺伝子座にリクルートされることを明らかにしている。そこで本研究においては、GFPタグを付加した野生型XPGやXP-G群患者にみられる変異型XPGを恒常的に発現する293細胞を樹立し、これらの組換えXPGがEGF刺激後にc-fos遺伝子座にリクルートされるかどうか検討を行った。その結果、野生型XPGやXP-G患者にみられる変異型XPGはEGF刺激に依存してc-fos遺伝子座にリクルートされたが、CSを併発する重症型の患者(XP-G/CS)にみられる変異型XPGはリクルートされなかった。どちらの変異体もヌクオチド除去修復活性を失っているので、今回の現象はCSの発症と関係していることが示唆される。また、CS様病態を示す患者細胞の解析においては、まず幅広い実験を可能にするため患者の初代培養細胞をヒトテロメラーゼ逆転写酵素とSV40ラージT抗原で不死化した細胞を樹立した。次にこの細胞を用いて不定期DNA合成やDNA損傷後のRNA合成の回復といった、細胞のヌクレオチド除去修復活性を検討したところ、患者細胞は正常細胞と同等の修復活性を示した。そのためこの細胞はヌクレオチド除去修復機構そのものには異常がないことが示唆された。また患者細胞のゲノムDNAを調製しCGHアレイ解析により、6番染色体に3.7Mbの欠損と10番染色体に17.5Mbの増幅が見られることを明らかにした。1)NA修復因子の転写反応における機能解析については、前年度までの解析によって(i)XPGをノックダウンした細胞では上皮増殖因子(EGF)で刺激した後のc-fos遺伝子の発現誘導が抑制されること、(ii)正常細胞においてはこの刺激依存的にXPGがc-fos遺伝子座にリクルートされること、(iii)野生型XPGと患者細胞にみられる変異型XPGではこのリクルートに差が見られること、を明らかにしている。そこで本年度はXPGがより広範な転写反応に関与する可能性を検討するために、c-fos遺伝子座以外のXPGの局在の検討と、XPGと物理的に相互作用する因子の探索を試みた。具体的には前者では、これまでの報告からRNAポリメラーゼIIによって転写が活発に行われているEEFlAl遺伝子座におけるXPGの局在を検討した。その結果、c-fos遺伝子座で観察したときと同様に、XPGはEEFlAl遺伝子座においてもリクルートされていることが分かった。後者では、GFP及びV5タグを付加したXPGタンパク質を発現する293細胞を用い、この細胞抽出液をGFPまたはV5抗体で免疫沈降を行った。この実験ではより弱い若しくは一時的な相互作用を検出するためにクロスリンカーを用いた。その結果、XPGがこれまでに相互作用の報告のあるTFIIHに加えて、いくつかの転写因子と相互作用することを明らかにした。以上のことから、XPGがこれまで考えていたよりも広範囲な転写反応に関与することが示唆された。CS様病態を示す患者細胞の解析では、前年度に得られたCGHアレイ解析により明らかとなった欠損や増幅領域に存在する遺伝子を検索し、病態と関係する可能性があるものをリストアップした。
初期寺院における瓦生産体制の研究

今年度は、昨年に引き続き、日本の初期寺院の瓦生産に多大な影響を与えた韓半島、百済の瓦生産との比較(軍守里廃寺・亭巌里窯跡出土軒丸瓦)および瓦工の渡来(広陵町三吉周辺出土軒丸瓦)のあり方に関わる検討を行った。軍守里廃寺出土軒丸瓦の検討では、軍守里廃寺の創建瓦が亭巌里窯跡をはじめとした2箇所以上の生産地から瓦の供給を受けていることが明らかになった。また、亭巌里窯跡出土軒丸瓦の分析からは、(1)同窯が軍守里廃寺の専用窯でないこと、(2)複数の消費地に瓦を供給する官窯の可能性が高いこと、(3)同窯には少なくとも2つ以上の瓦工集団が関与したこと、(4)同一瓦工集団が消費地の要求に応じて、有段式、無段式丸瓦を作り分けていること、などを明らかにした。特に、亭巌里窯跡では、日本の初期瓦生産において体系的な技術を異にするとされる飛鳥寺「星組」、「花組」の相異点でもある有段式(星組)、無段式(花組)丸瓦のどちらをも同一瓦工集団が生産していたことになり、日本の初期瓦生産で指導的な役割を担うことになった「星組」、「花組」瓦工集団の技術的保守性を伺ううえで重要な情報を得ることができたといえる。また、奈良県広陵町三吉周辺出土軒丸瓦の分析では、同軒丸瓦が百済・烏合寺跡出土軒丸瓦を粗型とする百済直系の瓦であること、これらの瓦が百済からやってきた瓦工によって生産されたものであることを明らかにした。また、これらの瓦やその影響を受けたとみられる瓦が周辺に分布しないことから、瓦工は単に瓦の生産を目的として渡来したものであり、瓦生産技術を指導・教授するという目的はなかった可能性を推測した。この分析によって、「星組」、「花組」瓦工集団のあり方とは全くことなる瓦工の渡来のあり方を示すことができたといえる。本年度ははじめに素弁蓮華文軒丸瓦出土遺跡の全国的なデータ集成を行った。およそ6世紀末から7世紀前半の時期に属する軒丸瓦が出土する遺跡は約105遺跡を数える。そのほとんどは畿内に分布し、そのうち約半数が大和に集中することが判明した。初期寺院の展開の実態を反映する遺跡の分布状況とみることができる。つぎに、韓半島、とくに『日本書紀』等の文献史料においても密接な関係があるとみることができる百済の軒丸瓦と飛鳥寺の軒丸瓦の瓦当文様、製作技法の比較を報告書等の文献によって行った。その結果、飛鳥寺のいわゆる「星組」の瓦当文様が公州大通寺創建瓦の系譜にあること、「星組」の製作技法に特徴的な丸瓦先端「片ほぞ形」加工、瓦当裏面回転なで技法の技術が百済でも広く展開していることがわかった。とくに、舒川郡金徳里瓦窯跡、青陽郡冠硯里窯跡出土品は瓦当文様と製作技術の両面ともに「星組」と類似しており、日本における初期瓦生産に参画した瓦工集団を特定するうえで注目できた。「花組」の瓦当文様は従来から扶余官北里遺跡出土品等に類似することが指摘されているが、製作技法は「花組」と異なることを確認した。「花組」の丸瓦先端凸面をカットする技法は百済ではほとんどみられないが、益山弥勒寺跡出土品にその可能性がある資料を確認した。「花組」瓦工集団の出自を探るうえで注目できる。今年度は日本の初期寺院における瓦生産の特徴を過去の研究成果から見出し、日本の瓦生産の源流ともいえる百済の瓦生産との比較を行なった。その結果、日本の初期瓦生産の特徴として指摘できる遠隔地生産体制、瓦陶兼業体制、複数生産体制という諸特徴を百済の瓦生産においても確認することができた。飛鳥寺の瓦生産が百済の瓦工の指導のもとで始められたことは、『日本書紀』や『元興寺伽藍縁起并流記資財帳』に記載があり、また、飛鳥寺と百済の瓦の文様意匠、瓦生産体制が同一系統にあることから疑うことはできない。飛鳥寺の瓦生産に百済の瓦工が関与したことは確実といえる。したがって、日本の初期瓦生産体制の諸特徴が百済の瓦生産に確認できるという点も、日本においてこうした諸体制が考案されたとみるよりも、百済からシステム(体制)を移入したとみたほうが良いと思われる。百済と日本の初期瓦生産に共通する特徴が多くみられるという事実は、百済の瓦生産の指導が瓦の文様意匠や製作技術、窯の構築方法といった実際的な技術にとどまらず、生産体制のレベルにまで及んだ可能性を示すものと考えられる。日本における初期瓦生産体制は、日本側の諸事情により幾分の変容はなされたとしても、基本的には、瓦生産先進国である百済のそれに倣ったのであろう。また、亭巌里窯跡出土軒

丸瓦の分析からは、(1)同窯が軍守里廃寺の専用窯でないこと、(2)複数の消費地に瓦を供給する官窯の可能性が高いこと、(3)同窯には少なくとも2つ以上の瓦工集団が関与したこと、(4)同一瓦工集団が消費地の要求に応じて、有段式、無段式丸瓦を作り分けていること、などを明らかにした。特に、亭巌里窯跡では、日本の初期瓦生産において体系的な技術を異にするとされる飛鳥寺「星組」、「花組」の相異点でもある有段式(星組)、無段式(花組)丸瓦のどちらをも同一瓦工集団が生産していたことになり、日本の初期瓦生産で指導的な役割を担うことになった「星組」、「花組」瓦工集団の技術的保守性を伺ううえで重要な情報を得ることができたといえる。また、奈良県広陵町三吉周辺出土軒丸瓦の分析では、同軒丸瓦が百済・烏合寺跡出土軒丸瓦を粗型とする百済直系の瓦であること、これらの瓦が百済からやってきた瓦工によって生産されたものであることを明らかにした。また、これらの瓦やその影響を受けたとみられる瓦が周辺に分布しないことから、瓦工は単に瓦の生産を目的として渡来したものであり、瓦生産技術を指導・教授するという目的はなかった可能性を推測した。この分析によって、「星組」、「花組」瓦工集団のあり方とは全くことなる瓦工の渡来のあり方を示すことができたといえる。
術中の臓器変形を反映したデータフュージョンによる術中支援システム

1.実空間における臓器変形のCGによる再現本研究では、術前にMRIもしくCTのデータからあらかじめ対象臓器の三次元画像を構築し、術中にリアルタイムに得られるデータから臓器の状態を再現して術者に提示するデータフュージョンシステムの構築を行った。臓器変形には三つのCCDカメラによって非接触に肝表面形状を三次元的に取得する三次元形状計測装置と本装置では計測ができない部位の位置計測のために三次元位置センサを用いた。これらの計測装置から得られるデータを基に、肝表面形状と肝内部の脈管構造を三次元再構築し、術者の視野に融合させて提示することを試みた。2.仮想空間と実空間の融合本研究では、術中に術者に負担となることなく、その視野に三次元画像と実像を融合するためのデバイスとしてFloating Windowを開発した。Floating Windowは術者の視点と実際の術野の間に置かれ、容易に移動可能なスクリーン上に対象臓器の三次元再構築像を表示し、術者がそのスクリーンを通して実際の術野と重ね合わせてみることが可能な装置である。スクリーンや術者の頭部の位置も計測して画像表示に反映させることで、術中の様々な状況に対応して使用可能な装置とした。また仮想空間も実空間と同様に三次元的に観察することができるように、ステレオ表示も可能とした。3.臨床への適用本装置の臨床での問題点抽出のために、使用する計測機器の術場での影響を計測した。その結果、磁気式の三次元位置センサは術場の金属(ベッド、手術器具等)や電気メス等の影響を非常に受けやすく、光学式や超音波式などの計測装置を用いる必要があることが分かった。またブタを用いた臓器変形処理の検証、および本システムを開腹手術だけでなく内視鏡手術にも応用するための実験も行った。今後はより精度の高いシステムの構築を行い、臨床で適用可能なシステムとしていきたいと考えている。1.実空間における臓器変形のCGによる再現本研究では、術前にMRIもしくはCTのデータから、予め臓器の3次元画像を構築しておき、術中にリアルタイムに得られる限られたデータから臓器の状態を再現することとした。変形の指針には、3つのCCDカメラから非接触に肝臓の表面形状の3次元的なデータを取得する三次元形状計測装置および、本装置で取得不可能な背面の情報を取得するために、3次元位置センサを用いることとした。これらのデバイスからリアルタイムに得られる情報を用い、肝臓のCGを内部の脈管構造ともども3次元再構築し、術者の視野に融合させようと試みた。2.仮想空間と実空間の融合本研究では、術中に術者の負担となることなく、その視野に3次元画像と実像を融合するためのデバイスとしてFloating Windowを開発した。Floating Windowは、術者の視点と実際の術野の間におかれ、容易に移動可能なスクリーン上にCGにより表現された3次元再構築像を表示し、術者がそのスクリーンを通して、実際の術野と重ね合わせて見ることを可能とするデバイスである。これにより、CGによって提供される仮想空間と実際の実空間をhead mount display等の装置なしに融合させることを可能とした。またCGを3次元的に見ることができるように、ステレオ表示も可能とした。3.臨床への適用本システムは、臨床の場で用いることを目標としている。そこで、これらのシステムを実際の臨床の場へ持ち込むことにより、臨床の場ならではの問題も克服しようと努めている。また、臓器変形に関しては、実際にブタを開腹し、そのときの肝臓の変形をCG上で表現する試みを行っている。これらの実験を通して、臨床の場における問題点の克服、誤差の定量的な解析を行い、精度を高め、実際の臨床の場で用いることができるよう、システムの向上に努めている。
磁気及び電気泳動を利用した医療・環境用磁性粒子マイクロ化学分離システムの開発

これまでに開発した磁性の弱い物質への磁気的種付け技術を基礎にして、先端医療分野や微量高感度環境分析に応用できるように、多様な物質の磁気牽引力による分離や誘導の開発を行ってきた。本研究では、さらにこの基礎技術を発展させ、磁場と電場を組み合わせた新規なシステムとしてのマイクロ化学精密分離システムの開発を行った。申請者は、磁性微粒子表面に多様な反応性や表面の帯電状態を制御する方法を開発してきたので、その磁性粒子に対して電気的分離ならびに磁気的分離が行えるよう、計算および実験的検討を行い、システムの概念設計を行った。とくに常磁性物質である細胞等に強磁性微粒子を接着させて、電気泳動速度の測定のみならず、磁気泳動速度の測定を行い、メディカルバイオ分野ならびに環境分野で使用可能なシステムの構築をめざした。また、磁場を精密制御することにより流れのある場から磁性粒子を効率よく集積させたり、分離する実験とシステムの開発も行ってきた。なかでも、粒子表面の帯電状態により分離した粒子をさらに磁気泳動により再度分離し、より精密な分離を行えるシステムの概念設計と簡単なモデルシステムが構築できた。将来的に実現が切望されている磁気ドラッグデリバリーや磁気ターゲティングに活用できる均一性粒子の集積、誘導、分離を可能にするための基礎実験を行い、誘導および分離に関しては計算結果と実験結果の間に良好な相関があることを見出した。これら精密分離が可能になったことで、体内の狭い患部にも局所的に集中させることのできる新規薬剤の開発や精製あるいは、米国の研究者と共同研究を行っているテロ活動に悪用されるような超微量毒物の迅速分析技術の構築にも資することが可能と考えている。平成16年度では、マイクロ化学分離システムの概念設計を行った。とくにマイクロチップ型電気泳動、磁気泳動分離システムのプロトタイプ作製に向けて自作の磁性粒子ならびに購入した磁性粒子の電気泳動速度、磁気泳動速度の測定から研究を着手した。具体的には種々の磁化、粒子径を有する試料を対象に測定を行い、分離システム用セルの最適化のためめ基礎データの蓄積を行った。これら取得したデータはセルの大きさ、印加する電場や磁揚の大きさ、分離能等を設計する際に極めて重要な基礎データとなる。また、対象とする磁性粒子の大きさがサブミクロンサイズになることも十分考慮して、測定対象範囲を広げるために電気泳動速度、磁気泳動速度測定プローブとしてレーザーを使用できるような設計行った。電気泳動速度については、既存のゼーター電位測定装置があるので従来法で測定された値と比較を行った。また磁気泳動速度については海外共同研究者のUrs Hafeli博士より磁気泳動速度のデータを頂き、磁性粒子の粒子径と泳動速度の関係ならびに速度分布について比較を行い、磁性粒子を医療用として利用する際、必要なデータが取得可能かどうかを検討した。磁性粒子をベクター等のドラッグデリバリー物質に付着させたときにも本手法が使用可能なように1ミクロン程度の比較的大きな細胞に磁性粒子を付着させて電気泳動速度ならびに磁気泳動速度の実験も併せて行い、今後の本システムの汎用性の拡張のための基礎データとした。これまでに開発した性の弱い物質への磁気的種付け技術を基礎にして、先端医療分野や微量高感度環境分析に応用できるように、多様な物質の磁気牽引力による分離や誘導の開発を行ってきた。

また、磁場を精密制御することにより流れのある場から磁性粒子を効率よく集積させたり、分離する実験とシステムの開発も行ってきた。なかでも、粒子表面の帯電状態により分離した粒子をさらに磁気泳動により再度分離し、より精密な分離を行えるシステムの概念設計と簡単なモデルシステムが構築できた。将来的に実現が切望されている磁気ドラッグデリバリーや磁気ターゲティングに活用できる均一性粒子の集積、誘導、分離を可能にするための基礎実験を行い、誘導および分離に関しては計算結果と実験結果の間に良好な相関があることを見出した。これら精密分離が可能になったことで、体内の狭い患部にも局所的に集中させることのできる新規薬剤の開発や精製あるいは、米国の研究者と共同研究を行っているテロ活動に悪用されるような超微量毒物の迅速分析技術の構築にも資することが可能と考えている。
新規な神経活動依存的遺伝子を用いた昆虫の性フェロモン神経回路の可視化と機能解析

外界からの情報を正確に感知し、適切に応答することは、動物の生存・子孫維持に極めて重要である。本研究者は比較的シンプルな構造からなる昆虫の嗅覚系に着目し、性フェロモン受容が行動を制御する仕組みの解明に取り組んできた。本研究ではカイコガの脳より神経活動依存的に発現量が増加する新規な遺伝子としてHr38を同定し、これがカイコガ・ショウジョウバエの脳において神経活動のマーカーとして利用できることを見出し、異性の匂いに応答する細胞の包括的同定に成功した。さらに遺伝子組換え昆虫を用いて神経活動の起こった神経細胞特異的にGFPなどのレポーター遺伝子を発現する昆虫の作成を試みた。外界からの感覚情報は如何にして脳内で処理され、適切な運動指令や行動として出力されるのか?この疑問に答えるために本研究では、入力(感覚情報)と出力(性行動)が明確な昆虫の性フェロモンに着目し、申請者が新規に同定した神経活動依存的に発現する遺伝子Hr38を利用することで、性フェロモン情報を伝達する神経細胞を可視化することを目的とした。まずカイコガを用い、性フェロモン(ボンビコール及びボンビカール)によって刺激した際に脳のどの領域で神経活動が起きているのかということを調べた。その結果、触角葉(嗅覚中枢)・食道下神経節(運動中枢)・キノコ体および前大脳(高次中枢)において、性フェロモン刺激依存的に神経活動が起こることを見出した。昆虫の脳で性フェロモンに反応する神経細胞の分布を包括的に明らかにしたのは本研究が世界で初めてであると考えられる。次にキイロショウジョウバエの脳においても性フェロモン刺激に応答する神経細胞の分布を調べた。ショウジョウバエにおいて性行動を誘発する揮発性の性フェロモンは未同定のため、断頭した未交尾メスを用いて刺激を行った。その結果、ショウジョウバエの脳においても、触角葉・キノコ体・食道下神経節・前大脳において、メス刺激依存的な神経活動が検出された。ここで見られた神経活動が性フェロモンに依存することを、性フェロモン感知に必要な触角及び前足前端の外科的な除去や、嗅覚変異体orco mutantや性フェロモン受容体ノックアウト系統(Or47b mutant)を用いて確認した。これらの研究成果をCurrent Biologyに出版した。これらの結果を受けて、Hr38の発現を検出することの出来る遺伝子組換えカイコガ及びショウジョウバエの作製を行った。これらの系統はある程度順調に作出出来ており、今後解析を行うことで、神経活動の起こった細胞の形態を可視化できると考えられる。性フェロモンによる行動制御のメカニズムを、嗅覚系のシンプルな昆虫を用いることで解明することを試みている。これまでに神経活動依存的な発現を示す新規な初期応答遺伝子としてHr38を同定し、Hr38のプロモーター活性を利用した神経回路の可視化と操作法の確立に取り組んできた。平成24年度は、遺伝子組み換えカイコガ作出のための機器類のセットアップを行い、Hr38のプロモーター領域の同定を試みた。Hr38の転写開始点から上流2.6kbもしくは5kbのゲノム断片にGAL4を繋いだコンストラクトを導入したカイコガを作成したが、神経活動依存的なGAL4の発現は認められなかった。そこでさらに広いゲノム領域が神経活動依存的な転写制御に関わる可能性を考え、第1イントロンを含む18kbのゲノム領域をGAL4の前に配置したコンストラクトを導入したカイコガを作成したが、残念ながら神経活動依存的なGAL4の発現は認められなかった。遠位のゲノム領域からの制御がHr38の神経活動依存的な転写制御に重要であると考えられた。同様の実験をショウジョウバエを用いて行ったが、Hr38周辺の30kbに渡るゲノム領域において、適切なプロモーターを単離することはできなかった。そこで次にHr38が転写活性化因子であることを利用し、Hr38の結合配列(NBRE)を利用した神経活動の検出法の構築を行った。その結果、ショウジョウバエ・カイコガ双方において、神経活動依存的なHr38の発現を検出することに成功した。現在、この方法を利用した神経回路の可視化条件の最適化を行っている。また別のアプローチとして、Hr38の遺伝子座にGAL4を導入するジーン・ターゲティングを行った。これまでにショウジョウバエではターゲッティングコンストラクトを導入した系統を作出している。また、カイコガではTALENを用いたターゲッティングに着手した。通常、初期応答遺伝子の発現制御は、直近のゲノム領域によって制御されることが多いにも関わらず、神経活動依存的なHr38の発現制御が遠位のエンハンサーにより制御されているという予想外の制御が認められ、神経活動の可視化に必要なトランスジェニック系統の作出に手間取ってしまった。

しかし、NBREを利用した手法により神経活動を検出することが出来たため、今後はこの手法を利用することで目的の達成は十分に可能であると考えられる。また、失敗のリスクは高いが、成功した場合にはHr38の発現を完全にモニターすることが出来ると考えられるジーン・ターゲッティングを並行して走らせることにより、NBREを利用した方法以上に、より良い系統を作出することが出来る可能性がある。これまでにショウジョウバエでは、NBREの繰り返し回数を5x,10x,15x,25x,35x,40xとした6パターンを試し、10xが最も感度良くHr38の発現をモニター出来ることを確認している。また、カイコガにおいては5x,15x,25x,35xの4パターンを試し、25xもしくは35xが最も感度が良いことを確認している。これを踏まえ、最適なNBRE繰り返し回数プロモーター下流に、転写活性の強さの異なるGAL4(GAL4Δ,GAL4,GAL4-VP16,GAL4-p65)を配置した系統を作出し、どの条件が最も精度良く神経活動依存的な神経回路の可視化に有用であるかを検討する。またこれまでに、GAL4のレポーターカイコガとして、5xUAS-mCD8GFP, 5xUAS-GFP.NLS, 20xUAS-IVS-myrGFP-p10等の系統を作出済みであり、GFPの発現が最も強い系統を選別する。その上で、カイコガ・ショウジョウバエにおいて、性フェロモンに反応した神経細胞の可視化・投射パターンの詳細な解析を行い、性フェロモン情報処理を行う神経回路を明らかにしたい。次年度の研究費は主に消耗品類(遺伝子工学試薬類及びプラスチック器具類)や昆虫の飼育用消耗品類(カイコガ及びショウジョウバエの餌や器具類)に使用する。また、学会発表及び論文発表に必要な費用も次年度研究費より支出する。
代謝工学的手法による木質系バイオマス由来六炭糖・五炭糖同時発酵性酵母の育種

木質バイオマスに含まれる五炭糖キシロースをサッカロミセス酵母に効率的に発酵させるために、細胞外の糖の取り込みとセンシング機構に注目した。ピキア酵母の推定糖輸送体遺伝子の網羅的解析から、六炭糖・五炭糖輸送能を有する遺伝子の同定に成功した。スクリーニングにより得られた有用野性株を宿主として、ピキア酵母五炭糖輸送体やサッカロミセス酵母糖センサー遺伝子の構成的な発現のキシロース発酵に与える影響を解析した。また、遺伝子組み換え酵母による木質バイオマスからのエタノール実証生産試験を行った。本研究課題では、酵母の細胞外糖センサーRGT2・SNF3に注目しそれをSaccharomyces cerevisiaeによるキシロース発酵向上に利用することを最終目標としている。一方、酵母のキシロースの細胞内への取り込み、特に固有の五炭糖発酵能を有するPichia stipitis酵母における分子基盤はほとんど明らかとなっていない。そこで本年度は予定を一部変更し、まずP. stipitisの糖輸送体(これにはRGT2・SNF3ホモログも含まれている)の全容を明らかにするため、ゲノム上に存在する計37個の糖輸送体ホモログの糖輸送能の解析を行うこととした。まず、これらの遺伝子をサッカロミセス酵母の構成的発現プロモーターPGKにつなぐ形で自律複製型プラスミドにサブクローニングした。これを、主要六炭糖輸送体遺伝子(HXT1-7・GAL2)が欠損したS. cerevisiae KY73変異株に形質転換した。こうして作製した遺伝子組み換えKY73酵母を、KY73株の唯一の生育可能な炭素源であるマルトースで前培養し、グルコース・マルトース・フルクトース・ガラクトースをそれぞれ炭素源とする最少培地で生育できるかどうかを指標に六炭糖輸送体遺伝子のスクリーニングを行った。一方五炭糖輸送体の同定は、遺伝子組み換えKY73酵母に取り込ませたキシロース・L-アラビノースを再度細胞外へと排出させその濃度をHPLCで測定することで行った。その結果、主要六炭糖輸送体としてSUT1・SUT2・SUT3・HGT2・XUT1・XUT3・RGT2が、主要キシロース輸送体としてSUT1・SUT2・SUT3・HGT2が、主要L-アラビノース輸送体としてHGT2・XUT1が、それぞれ新たに同定された。興味深い点としては、(1)六炭糖・五炭糖輸送システムは相当程度リンクしている可能性がある(2)HGT2は解析したほぼ全ての六炭糖・五炭糖を効率的に輸送できる(3)S. cerevisiaeのRGT2には全く糖輸送能が無いが、P. stipitisのRGT2は少なくともマルトースは輸送できた。これはP. stipitisの糖センシングがS. cerevisiaeとは一部異なる可能性を示唆する。これら成果は今後のバイオエタノール生産のための酵母育種に重要な貢献ができると期待されるため、本年度内に特許出願を行った。本年度は、前年度同定したピキア酵母由来の六炭糖・五炭糖輸送体遺伝子のバイオエタノール生産における応用の可能性についての検討を行った。具体的には、まず主要六炭糖・五炭糖輸送体であるSUT1・SUT2・SUT3・HGT2について、サッカロミセス酵母変異株KY73XYL株(親株であるKY73は六炭糖・五炭糖輸送体が全て欠損しており、それにキシロース代謝遺伝子群を染色体組み込みで導入したもの、つまりキシロースの潜在的代謝能はあるが輸送能はない)で個別に発現させ、キシロース発酵を行った。その結果、有意な発酵が認められたのはSUT1とHGT2のみであり、HGT2ではキシリトール蓄積が大幅に抑制されるという興味深いものだった。これは、糖の細胞内輸送と細胞内代謝が一部リンクすることを示す。両遺伝子を共発現させた場合は、それほど加算的効果は見られなかった。次に、同定した輸送体を実用酵母IR-2株へ導入することを試みた。本株はアミノ酸選択マーカーが使えないことから、抗生物質ジェネティシンを選択マーカーに、URA3遺伝子への染色体組み込みによってSUT1、HGT2及びSUT1とHGT2の両方を導入することに成功した。来年度以降にキシロース発酵能に及ぼす影響を解析する予定である。前年度国内出願した特許について、将来的な重要性を鑑み海外出願も行ったことも付記する。最終年度である本年度は、前年度までに同定したピキア酵母由来のキシロース輸送体遺伝子のサッカロミセス酵母キシロース発酵に及ぼす影響、及びサッカロミセス酵母の細胞外糖センサー遺伝子RGT2・SNF3の構成的発現によるキシロース発行に及ぼす影響について包括的な研究を行った。まず、優秀な宿主酵母菌の選抜を目的にこれまで使用していたIR-2株に替わる野生株の取得を行った。これは、IR-2株に関する特許が産総研に優先権があるため今後その使用に支障が出る可能性があるためである。

IR-2株はキシルロース高代謝能を指標に得られた凝集性酵母であるが、今回熊本県で球磨焼酎製造に用いられている1200株を取得した。本株は他の株より高いアルコール発酵能を有している。1200株にキシロース代謝遺伝子群を染色体組み込みで導入した1200X株では、同様の形質転換を施したIR-2株と遜色ないキシロース発酵が確認された。これにより、今後は1200X株を主要な発酵酵母宿主として使用できる目途がついた。次に、この1200X株に前年までに構築したピキア酵母由来のキシロース輸送体遺伝子SUT1・HGT2・SUT1/HGT2のジェネティシンをマーカーとしURA3遺伝子座に染色体組み込みする系を用いて形質転換を行った。まず好気的条件でのキシロースを炭素源とする生育を見たところ、特にSUT1を組み込んだ株でコントロールより有意に速い生育を確認した。例えば、50g/Lキシロース条件では生育定常期に入る時間がコントロールに比べて24時間以上速かった。しかし、嫌気的条件下でのキシロース発酵ではこれら遺伝子を入れたことによる有意な影響は見られなかった。次に、サッカロミセス酵母の糖センサー遺伝子であるRGT2・SNF3の影響を調べた。これら遺伝子を導入する際にも、上記ジェネティシンをマーカーとする形質転換システムを用いた。興味深いことに、それぞれの遺伝子を構成的に発現させた株ではキシロースを炭素源とする好気的条件下での生育がコントロール株に比べて有意に速くなった。また、嫌気的キシロース発酵でもキシロース消費速度が速まる結果となった。これより、キシロースの取り込みそのものを行う輸送体の改良よりも、サッカロミセス酵母の持つ六炭糖輸送体の発現制御を行うシグナル伝達系の増強が結果としてキシロース発酵を増進させるという興味深い結果が得られ、当初の目標を達成することができた。
多孔性配位高分子の細孔次元性に注目した細孔内静電場と分子吸着能の相関解明

多孔性配位高分子はその構造と機能の多様性が注目され、機能性錯体高分子として急速に発展してきた。細孔空間と捕捉されたゲスト分子の相互作用が機能発現・制御に重要であることは広く知られているが、一方で多孔性配位高分子の細孔空間の本質的な性質に関する理解は未だなされていない。本研究では、三次元細孔のみならず、異方的な二次元や一次元細孔の静電場にも注目していく。特に細孔の次元性に注目すると、吸着状態のような静的な状態だけでなく、細孔内拡散や細孔空間の広がり方といった動的な状態に関しても静電場は重要だと考えられ、細孔の次元性、細孔内静電場、吸着特性の関係を明らかにし細孔空間の本質的な理解を目指す。
変異PKCによる神経変性疾患の病因解明 -ターゲティングを指標にした解析-

1)変異γPKCの解析報告されている変性疾患を起こしうる変異γPKCに関しては、変異γpKC発現ベクターを作製し、培養細胞にそれらを発現させ、生化学的解析、ターゲティングの解析を行った。その結果、以下の点が明らかになった。(1)変異γPKCは、培養細胞に発現させると凝集体を形成し、トリトン不溶画分に回収される。(2)変異γPKCは、脂質との結合性が変化しているが、酵素活性は保たれている。(3)Gq共益型受容体を刺激するとγPKC-GFPは一過性に細胞質から細胞膜にトランスロケーションし、再び細胞質に戻るという動態を示す。変異γPKC-GFPを受容体刺激でトランスロケーションさせると細胞膜から細胞質に戻る際に有意に凝集体を形成することが確認された。(4)変異γPKCは、細胞死を誘導する。2)変異γPKC-GFP発現トランスジェニックマウスの作製部位特異的・時期特異的変異γPKC-GFP発現トランスジェニックマウスの作製に着手した。3)変性疾患を起こしうる新たなγPKCの変異の同定広島大学大学院脳神経内科の協力を得て、原因が特定されていない小脳変性疾患の患者さんの血液から採取したゲノムDNAを解析し、新たな変性疾患を起こしうるγPKCの変異を同定試みた結果、遺伝性脊髄小脳疾患の一家系から、新たなγPKCの変異を同定した。我々が同定した変異γPKCに対しても生化学的、細胞生物学的な検討とトランスジェニックマウスの作製に着手した。
層状無機有機複合材料の分子設計と触媒化学的研究

ホスホン酸にジルコウニウムは組成式Zn(O_3PーR)_2で示され、層状構造を有している。ジルコニウムの層の上下に種々の性質をもった官能基ーRを保持させることにより、-Rの大きさに応じて層間距離を制御することが可能である。本研究では、官能基として酸性基に-OH,-CH_2COOH,-CH_2SO_3H疎水基には-C_6H_<13>,-C_<12>H_<25>,-C_<10>H_<20>-を層間に持つホスホン酸ジルコニウム誘導体を合成し、その構造解析及び触媒機能の検討を行った。合成したZr(O_3PC_<10>H_<20>PO_3)のXRD,MASNMRの結果から、-C_<10>H_<20>ーが層同志を架橋しピラ-となっていることが解った。層間に異なる性質をもつ官能基を2種導入した複合体では、層間距離はかさ高い官能基に依存しており、その複合比によらず常に一定の値であった。またMASNMRの結果から、それぞれの官能基が同一層間内に存在していることが示唆された。これらのことから、複合体ではかさ高い方の官能基が層間を保持し、その間にもう一方の官能基が存在するという構造をしていると考えられる。これらのホスホン酸ジルコニウムの触媒機能を評価する為、酢酸のエステル化反応を行った。-OH及び-CH_2COOHの単独体はほとんど触媒活性を示さなかったが、複合化により触媒活性は著しく向上し、酸性基と疎水基とが1:1の割合で導入された複合体が最も高い活性を示した。このことから、複合化により層空間が広がり、層間が反応場として有効に機能するようになったと考えられる。Zr(O_3PCH_2SO_3H)_2は非常に高活性を示したが、その親水性の為反応溶液中に溶解してしまい不均一系触媒として利用することができなかった。しかし、ーCH_2SO_3Hと疎水基とを複合化することによりこれを改善でき、高活性固体酸触媒とすることができた。特に,-C_<10>H_<20>のピラ-は層同志を架橋しているため、この効果が大きく-C_<12>H_<25>よりも少ない導入量で不溶性を与えることができた。また、触媒活性もピラ-との複合体の方が高かった。ホスホン酸ジルコニウムは組成式Zr(O_3PーR)_2で示され、層状構造を有している。ジルコニウム層の上下に種々の性質をもった官能基ーRを保持させることにより、ーRの大きさに応じて層間距離を制御することが可能である。本年度は、官能基としてーC_6H_<13>,ーC_<12>H_<25>,ー

CH_2SO_3H,ーCH_2COOHなどを層間に持つホスホン酸ジルコニウム誘導体を合成し、その構造解析と触媒機能の検討を行った。層間に異なる性質を持つ官能基を2種導入した複合体では、直鎖アルキル基で層間距離を拡大して疎水環境を向上させると共に、スルホメチル基のような酸性基を導入することによって酸性質を保持させることが可能である。官能基としてドデシル基及びスルホメチル基を層間に有した複合体では、層間がかさ高いドデシル基によって保持され、広い層空間の中にスルホメチル基が存在していることが、XRD及び固体MASNMRの測定結果より明らかになった。官能基の持っている性質は層間内にあっても機能し、層間で全てのイオン交換点が機能することが分かった。この複合体の触媒機能を検討するため、モデル反応として酢酸のエステル化反応を行ったところ、複合化によって反応活性は著しく向上し2種の官能基が1:1の割合で導入された複合体が最も高活性を示した。また、層間を炭化水素で架橋し酸性基を導入したピラ-複合体では、架橋することによってさらに反応場が規則正しく区画されるために形状選択性が発現すると考えられる。そこで、かさ高さの異なるカルボン酸を混合した系でエステル化を行ったところ、かさ高いカルボン酸の反応は抑制され、かさ高くない方のカルボン酸が選択的にエステル化されることが明らかになった。これらの結果はホスホン酸ジルコニウム誘導体を機能材料として利用する上での可能性を示唆するものである。ホスホン酸でジルコニウムは層状化合物であり、組成式Zr(O_3PーR)_2で表すことができる。この-Rの部分に様々な官能基を導入することが可能であり、その官能基の種類により層間距離を制制するとともに、酸性質や疎水性等の性質を付与することが可能である。これまで、-C_6H_5,-C_<12>H_<25>,-CH_2COOH,-CH_2SO_3H等の官能基が、ジルコニウムの層にぶらさがった形をとるペンダント型と呼ばれるものについて研究を行ってきた。本年度は原料にデシルジホスン酸を用いることにより、層と層とをアルキル基で架橋したピラ-型と呼ぶものの合成を試み、その性質について検討した。Zr(O_3PC_<10>H_<20>PO_3)の層間距離はXRDより求めた値と計算値とがほぼ一致しており、また^<13>ClCPーMASNMRの結果より、メチレン鎖のみが層間に存在していることが示唆された。これらのことから、デシル基は層同志を架橋したピラ-となっていることが解った。このピラ-型のもつ構造を触媒として利用する為に、酸性基を同時に導入した複合体を合成した。複合体の層間距離は、酸性基の導入量にかかわらず常に一定でデシルピラ-単独体と同じであった。また、MASNMRの結果から、複合体では双方の官能基が層間内に存在していることが解った。これらのことから、ピラ-型もペンダント型と同様に複合化が可能でありその構造は、デシル基のピラ-により層間が保持され、生じた広い層空間に酸性基が存在しているものと考えられる。この複合体の触媒機能を検討するため酢酸のエステル化反応を行ったところ、複合化によって触媒活性が著しく向上することが解った。Zr(O_3PCH_2SO_3H)_2は反応溶液中で溶解してしまうが、これに不溶性を与えるのにもピラ-との複合化は有用で、ピラ-をわずかに導入した複合体でも溶解しなかった。このことは、ピラ-体は層同志がアルキル基により架橋されている為、層構造がより安定に保持されていることを示唆している。
精密超音波計測による酸化亜鉛単結晶/薄膜の評価

精密超音波計測による酸化亜鉛のバルク単結晶および薄膜の評価法についての基礎を構築した。高精度に音響関連物理定数を決定したバルク単結晶を標準試料として用いて、薄膜の評価を行う手法を開発した。異方性を考慮した抵抗率の評価を行うために、一方の抵抗率のみが関与する超音波の伝搬モードと二つの抵抗率が関与する伝搬モードの位相速度および伝搬減衰を計測することでそれらを決定する手法を開発した。酸化亜鉛(ZnO)を用いた高効率・高輝度発光(紫外)半導体デバイスを実現するうえで、基板上に良好な成長膜を形成する必要があり、それを得るためには膜と同じ材料の高均質なバルク基板を用いた膜成長(ホモエピタキシー)が理想的である。しかし、このバルク単結晶は開発途上の段階であり、導電性(抵抗率)の分布が生じる問題があるため、膜の品質に大きな影響を与えることが予想される。将来的により均質なバルク単結晶基板および成長膜を作製するうえでは、基板面全体を評価する技術も重要となる。そこで本研究は、精密な超音波計測技術を拡張して、抵抗率評価法を開発し、ZnO単結晶および薄膜評価のための基盤作りを行なうことを目的とする。本年度は、水熱合成法により育成されたZnOバルク単結晶に対し、超音波計測により均質性評価を行うとともに精密な音響関連物理定数を決定し、弾性波伝搬特性の理論計算や評価のための基礎作りを行った。また、弾性特性と抵抗率依存性について抵抗率異方性の度合いを変化させて数値シミュレーションを行い、漏洩弾性表面波速度・減衰の周波数依存性を明らかにした。さらに、ZnO多結晶薄膜/SiO_2ガラス基板構造に対する漏洩弾性表面波速度・減衰の計測法について、複素v(z)曲線測定・解析法の検討、膜表面粗さに関する検討を行ない、多結晶構造の影響を弾性波の音速や減衰の超音波周波数に関する変化として抽出できることを明らかにした。将来的に、より均質なバルク単結晶基板および成長膜を作製するうえでは、基板面全体を評価する技術も重要となる。本年度は、異なる育成炉で育成されたZ面バルク単結晶に対し、超音波計測により均質性評価を行うとともに精密な音響関連物理定数を決定し、定数や音響特性の違いを比較し、評価のための基礎作りを行った。また、異なる定数を用いた弾性特性と抵抗率依存性について抵抗率異方性の数値シミュレーションを行った。また、残留歪みについての基本モデルを構築するために、等方性材料であるSio_2ガラス膜を異なる熱膨張係数を持つPyrexガラスや同じ熱膨張係数をもつ合成石英ガラスに成膜し、音響特性の変化を計測した。ガラス膜の成膜条件にややばらつきが見られ充分な評価ができてはいないが、残留歪みの評価の基本モデルの検討としての可能性は見出せた。本年度は、抵抗率の異方性について誘電率に導電性(抵抗率)を導入した計算モデルと実験的検討を行った。ZnOの属する結晶系の抵抗率はρ11とρ33の2つが定義できる。そのため、ρ33しか関与しないZ伝搬縦波音速の周波数依存性の測定と、ρ11とρ33の両方が関与するZ-cut漏洩弾性表面波速度の周波数依存性を測定し、各速度の分散性からそれぞれの抵抗率を独立に求める手法を開発した。誘電緩和の生じる周波数帯では減衰のピークが観測されるため、速度情報だけでなく減衰情報も重要な評価パラメータとして利用できることを明らかにした。また、精密な音響特性の広範囲温度特性測定を行うための計測法の検討を行った。

水熱合成法により育成されたZnOバルク単結晶に対し、音響特性の温度依存性の測定を行い、高抵抗単結晶、低抵抗単結晶に対する基礎的音響特性を得た。また、超音波計測による均質性評価から、+Z面と-Z面では-Z面で低抵抗となりやすいことを実験的に確認した。また、ドーパントを行ったZnO膜に対する漏洩弾性表面波伝搬特性分布を計測し、ドーパント依存性についての基礎データを得た。震災の影響もあり、評価装置や成膜装置の移設、修理、立ち上げ作業に大幅な時閲を割かれて、研究自体はやや遅れ気味である。24年度が最終年度であるため、記入しない。今後は、抵抗率依存性についての実験的検討を進めるとともに、ZnOのドーパント依存性や光学特性と音響特性の関係の検量線の作成を進めて、本研究の目的である超音波計測によるZnO単結晶および薄膜の評価法の基礎を確立していく。
パーキンソン病のL-DOPA投与による副作用発現とグリアのドパミン取込みとの連関

昨年度,ラット胎児中脳あるいは線条体からの初代培養アストロサイトにおいてドパミンD1,D3,D4,D5レセプターおよびドパミントランスポーター(DAT)が発現しており,L-DOPA投与によりパーキンソン病(PD)モデル傷害側のアストロサイトでのドパミンの取り込みおよびDATの発現増加が認められることを明らかにした.本年度は,初代培養アストロサイトにおけるドパミンの取り込み,L-DOPAからのドパミン産生能,PDモデル脳のミクログリアにおけるドパミン取り込みについて検討した.1.ドパミン神経障害時の培養アストロサイトでのドパミンの取込み動態の変化線条体からのニューロン・アストロサイト混合初代培養系に6-OHDAあるいはLPSで前処置を行い,さらにドパミンを添加しドパミン神経障害を惹起させると,アストロサイトへのドパミンの取り込みがみられ,DATの発現が増加することを蛍光二重染色により明らかにした.さらに,このときアストロサイト細胞内においてドパミンが増加することを高速液体クロマトグラフィーにより検出した.2.培養アストロサイトにおけるL-DOPAからのドパミン産生機構線条体からの初代培養アストロサイトにおいて,DOPA脱炭酸酵素およびL型中性アミノ酸トランスポーターが発現していることをWestern blot法により確認した.このことから,L-DOPAはアストロサイトに取り込まれ,ドパミンに変換されている可能性が考えられる.3.パーキンソン病モデル脳のミクログリアにおけるドパミン取り込み6-OHDA注入による片側PDモデルラットにL-DOPAを1週間連日投与し,最終投与3時間後の脳凍結切片を用いてドパミンとOX-42(ミクログリアマーカー)の蛍光二重染色を行った.PDモデル傷害側線条体でミクログリアの著しい増殖がみられたが,ミクログリアへのドパミンの取り込みは認められなかった.1.初代培養グリア細胞におけるドパミンレセプター、トランスポーターmRNAの発現ラット胎児中脳あるいは線条体からの初代培養ニューロンおよびアストロサイトにおけるドパミンレセプター(D1D5-R),ドパミントランスポーター(DAT)およびvesicle monoamine transporte-2 (VMAT-2)のmRNA発現をRT-PCRで検討した.中脳あるいは線条体ニューロンでは,D1D5-R,DAT,VMAT-2のすべてのmRNA発現が認められた.中脳アストロサイトでは,D1,D4,D5-R,DAT,線条体アストロサイトでは,D1D5-R,DAT,VMAT-2のすべてのmRNA発現が認められた.2.初代培養グリア細胞におけるドパミンレセプター、トランスポーター蛋白の発現さらに,ドパミンレセプター,DATおよびVMAT-2の蛋白発現をWestern blot法により検討した.中脳ニューロンでは,D1D5-R, DAT, VMAT-2のすべての発現が認められ,線条体ニューロンでも,D4-R, DATを除く蛋白発現が認められた.中脳および線条体のアストロサイトでは,D4, D5-R, DATの発現がニューロンでの発現に比して弱いものの認められた.3.アストロサイトにおけるドパミンレセプターを介した二次情報伝達系初代培養アストロサイトをあらかじめ各種ドパミンアンタゴニストで前処置しておき,さらにドパミンを添加し,リン酸化CREBの変化をみた.ClozapineおよびL-745,870処置により,ドパミンにより誘導されるリン酸化CREBの増加は抑制された.以上より,アストロサイトではD4-Rを介した二次情報伝達系が存在する可能性が示された.4.パーキンソン病モデル脳のグリア細胞におけるドパミン取り込みとL-DOPA短期投与の影響6-OHDA注入による片側パーキンソン病モデルラットにlevodopa/carbidopa (50/5mg/kg)を1週間連日投与し,最終投与3時間後の脳凍結切片を用いて抗ドパミン抗体,抗ドパミントランスポーター抗体および抗GFAP抗体による蛍光二重染色を行った.L-DOPA投与によりパーキンソン病モデル傷害側のアストロサイトでのドパミンの取り込みおよびトランスポーターの発現増加が認められた.傷害時に過剰のドパミンがアストロサイトに取り込まれることを明らかにできた.昨年度,ラット胎児中脳あるいは線条体からの初代培養アストロサイトにおいてドパミンD1,D3,D4,D5レセプターおよびドパミントランスポーター(DAT)が発現しており,L-DOPA投与によりパーキンソン病(PD)モデル傷害側のアストロサイトでのドパミンの取り込みおよびDATの発現増加が認められることを明らかにした.本年度は,初代培養アストロサイトにおけるドパミンの取り込み,L-DOPAからのドパミン産生能,PDモデル脳のミクログリアにおけるドパミン取り込みについて検討した.1.ドパミン神経障害時の培養アストロサイトでのドパミンの取込み動態の変化線条体からのニューロン・アストロサイト混合初代培養系に6-OHDAあるいはLPSで前処置を行い,さらにドパミンを添加しドパミン神経障害を惹起させると,アストロサイトへのドパミンの取り込みがみられ,DATの発現が増加することを蛍光二重染色により明らかにした.さらに,このときアストロサイト細胞内においてドパミンが増加することを高速液体クロマトグラフィーにより検出した.2.培養アストロサイトにおけるL-DOPAからのドパミン産生機構線条体からの初代培養アストロサイトにおいて,DOPA脱炭酸酵素およびL型中性アミノ酸トランスポーターが発現していることをWestern blot法により確認した.このことから,L-DOPAはアストロサイトに取り込まれ,ドパミンに変換されている可能性が考えられる.

3.パーキンソン病モデル脳のミクログリアにおけるドパミン取り込み6-OHDA注入による片側PDモデルラットにL-DOPAを1週間連日投与し,最終投与3時間後の脳凍結切片を用いてドパミンとOX-42(ミクログリアマーカー)の蛍光二重染色を行った.PDモデル傷害側線条体でミクログリアの著しい増殖がみられたが,ミクログリアへのドパミンの取り込みは認められなかった.