hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
緑内障動物モデルによる新規薬物治療の開発と現在の緑内障診療の合理性の検討

ロメリジンによる網膜神経節細胞に対する神経保護効果を、ラット実験緑内障モデルを用いて証明した。メタロチオネイン(内因性アンチオキシダント)によるNMDA誘導網膜神経細胞死の抑制をマウス眼で証明した。コバルトを用いた網膜視細胞層に選択性の高い新しい網膜神経細胞障害のモデルを確立した。これらの研究成果は新たな緑内障実験モデルとして有用性が期待できる。臨床研究では、緑内障診断の基礎となる視神経乳頭の解析をより精確に進めるため、岐阜大学で開発中の新型立体眼底カメラによる視神経乳頭解析の新手法に関して検討し、正常眼圧緑内障の視神経評価に有用であることを証明した。また、視野検査によらない新しい緑内障機能評価法として多局所ERGを評価し、二次核反応の耳側と鼻側の正常眼における非対称性が緑内障眼で変化していることを示すとともに、その程度が視野異常と関連することを証明した。眼圧の大幅な下降と乳頭出血の関係を調べる目的で、正常眼圧緑内障並びに原発開放隅角緑内障の乳頭出血出現頻度を濾過手術前後で比較し、十分な眼圧下降により乳頭出血頻度が有意に減少することを示した。多数例を対象とした眼圧24時間日内変動測定のデータを解析し、正常眼圧緑内障症例の眼圧変動パターンの基礎データを確立した。ハイデルベルグレチナトモグラフにより測定される視神経乳頭パラメータを正常眼と緑内障眼で検証し、日本人正常眼における視神経乳頭パラメータを確定した。この検討により、性別、年齢、乳頭サイズが乳頭パラメータに関連していることを示すとともに、乳頭の上半部と下半部の非対称性の可能性を示唆した。これらの研究により、緑内障管の基礎となる、眼圧、視神経所見の基準値を確立することができ、さらに、新たな診断機器、および治療法の確立に路を開くことができた。緑内障臨床データ解析:(1)緑内障の有病率を多治見市民眼科検診のデータを用いて科学的に検証し、日本人成人における緑内障有病率が5.0%であること、うち、原発閉塞隅角緑内障が0.6%であることを実証した。(2)ハイデルベルグレチナトモグラフにより測定される視神経乳頭パラメータを正常眼と緑内障眼で検証し、日本人正常眼における視神経乳頭パラメータを確定した。性別、年齢、乳頭サイズが乳頭パラメータに関連していることを示すとともに、乳頭の上半部と下半部の非対称性の可能性を示唆した。(3)ラタノプロストの眼圧下降効果と房水流出率について正常眼圧緑内障を対象として統計学的に検討した。眼圧下降量と房水流出率の間に有意の関係は認められず、ラタノプロスト点眼による眼圧下降量を房水流出量測定により点眼前に予測することは困難であると推定した。基礎実験として、初年度の成果を発展させて他の薬物の神経保護効果を確認するとともに、緑内障動物モデルの確立に向けた実験を行った。また、臨床データ解析においては正常眼圧緑内障と原発開放隅角緑内障の眼圧変動と乳頭出血に関して統計的解析を行った。具体的成果を以下に記す。神経保護治療動物実験:(1)カルシウム拮抗薬ロメリジンによる網膜神経節細胞に対する神経保護効果を、ラット実験緑内障モデルを用いて証明。(2)メタロチオネイン(内因性アンチオキシダント)によるNMDA誘導網膜神経細胞死の抑制をマウス眼で証明。(3)コバルトを用いた網膜視細胞層に選択性の高い新しい網膜神経細胞障害のモデルを確立。

これら3研究はいずれも今後各種薬物等の実験系として用いうる緑内障実験モデルと考えられる。緑内障臨床データ解析:(1)眼圧の大幅な下降と乳頭出血の関係を調べる目的で、正常眼圧緑内障並びに原発開放隅角緑内障の乳頭出血出現頻度を濾過手術前後で比較した。十分な眼圧下降により乳頭出血頻度が有意に減少することを示した。乳頭出血が日本人に多い正常眼圧緑内障に頻発すること、まだ出血の成因が不明であることから、今後、日本人の緑内障及び乳頭出血の成因を考える上で重要な成果である。(2)過去に報告のない多数例を対象とした眼圧24時間日内変動測定のデータを解析した。その結果、正常眼圧緑内障の疑われた症例のうち約5%が日内変動測定により眼圧上昇が証明され、原発開放隅角緑内障に診断名が変更となることが明らかにされた。また、正常眼圧緑内障症例の眼圧変動パターンの基礎データを確立した。基礎実験として、新規開発中のカルパイン阻害剤の網膜神経保護作用の検討をおこなった。NMDA局所投与で作成した網膜神経節細胞障害に対する同薬物の神経保護作用を証明することができた。このことは新しい薬物治療につながる可能性がある。また、各種緑内障薬のヒト培養結膜上皮に対する障害実験を行い、数種類の薬物で細胞増殖抑制作用の強いことを見出した。これは薬物の副作用回避のための重要な知見である。臨床研究として、原発閉塞隅角緑内障、原発閉塞隅角症の予後解析を進めた。本症の予後を明らかにするとともに、周辺虹彩前癒着の範囲と視神経障害の程度が予後に大きく関与していることを示すことができた。このことは本症における視機能障害回避のためには早期診断の重要なことを改めて示すことでもあり、今後の失明予防の基礎となるデータと考える。こうしたデータを含めて、アジアの緑内障研究者と共同で原発閉塞隅角緑内障に関するモノグラフを刊行した。また、緑内障診断の基礎となる視神経乳頭の解析をより精確に進めるため、岐阜大学で開発中の新型立体眼底カメラによる視神経乳頭解析の新手法に関して検討し、正常眼圧緑内障の視神経評価に有用であることを証明した。加えて、従来から緑内障の機能異常評価に使用されている視野検査によらない新しい緑内障機能評価法として多局所ERGを行った。二次核反応の耳側と鼻側の正常眼における非対称性が緑内障眼で変化していることを示すとともに、その程度が視野異常と関連することを証明し、緑内障の新しい他覚的緑内障診断へ路を開いた。これは原発開放隅角緑内障(広義)による失明回避に役立つものである。
転写因子GATA-5心筋過剰発現による心不全発症モデルマウスの作成

心不全は、心収縮障害がその病態形成において第一義的であることは疑う余地がない。しかしこの心収縮不全を是正する目的で開発された強心薬が必ずしも心疾患の生命予後を改善しないことが明らかになってきた。このため、既成概念にとらわれない従来とは異なった新しい視点でこの病態を解明すると同時に、心不全治療薬をスクリーニングするための動物モデルを開発する必要がある。これまでの研究によると、生体において何らかのストレスが心臓に加わると、交感神経系、レニン・アンジオテンシン系、エンドセリン系などの神経・体液・内分泌因子が作動することが明らかとなってきている。これらの因子は心筋細胞膜に存在するそれぞれの受容体に結合し、種々の細胞質内情報伝達を経て刺激は最終的に心筋細胞核に到達する。そして核内において何らかの転写調節因子が活性化されることにより、心筋細胞は成人型から胎児型へと遺伝子発現パターンを変化させる。これらの変化は種々の因子によって引き起こされる心筋細胞肥大に共通の変化であり、また心筋機能不全と密接に結び付いていることから、この核内情報伝達機構の詳細な解明は心不全の分子細胞レベルでの解明と根本的な治療法の開発に非常に有用である。我々は心筋遺伝子直接注射法を用い成人ラットにおいてin vivo圧負荷に反応するプロモーターエレメントを解析する方法を初めて確立した。そして詳細な検討の結果、肥大における遺伝子発現調節にGATA転写因子群特にGATA-5が中心的な役割を果たしていること、転写コアクチベーターであるp300がGATA-5と結合し、相協力して心筋遺伝子の転写に関与していることを見出した。さらに最近我々は、p300を心筋に過剰発現させるとp300/GATA経路の標的であるエンドセリン-1の心筋における発現が亢進し、心肥大及び心不全が誘発されることを見出した。心筋細胞肥大は蛋白合成の量的な増加だけでなく、心筋における遺伝子発現の著明な変化を伴う。これらの変化は心筋機能不全と密接に結び付いており、その発現変化機構の解明は心不全発症の分子細胞レベルでの解明に非常に有用である。我々は、β-ミオシン重鎖、心房性利尿ペプチドやエンドセリンー1遺伝子のプロモータ解析により、肥大における遺伝子発現調節にGATA転写因子群が中心的な役割を果たしていることを見出した。さらに転写コアクチベーターであるp300がGATA因子と結合し、相協力してこれらの遺伝子の心筋における転写活性亢進に関与していることを見出した。又、圧負荷後の成人ラット不全心筋においてp300蛋白とGATA因子の複合体が著明に誘導されることを見出した。P300の心不全発症における役割をさらに検討するため、我々はp300を心筋に過剰発現するトランスジェニックマウスを作成した。即ち、6キロ塩基マウスα-ミオシン重鎖遺伝子プロモータの下流にヒトp300cDNAを組み込んだプラスミドを作成し、定法によりトランスジェニックマウスを作成したところ、心肥大と心筋における著明なエンドセリン-1発現亢進が引き起こされた。組織学的にも心筋細胞肥大が認められたが、間質の線維化増加は認められなかった。以上よりp300/GATA経路が心肥大の核内情報伝達に重要であることが示された。今後、このマウスの解析をさらに押し進めると同時に、このマウスの心肥大を抑制する薬物をスクリーニングしていくことは、心不全の根本的な解決に重要である。

このため、既成概念にとらわれない従来とは異なった新しい視点でこの病態を解明すると同時に、心不全治療薬をスクリーニングするための動物モデルを開発する必要がある。これまでの研究によると、生体において何らかのストレスが心臓に加わると、交感神経系、レニン・アンジオテンシン系、エンドセリン系などの神経・体液・内分泌因子が作動することが明らかとなってきている。これらの因子は心筋細胞膜に存在するそれぞれの受容体に結合し、種々の細胞質内情報伝達を経て刺激は最終的に心筋細胞核に到達する。そして核内において何らかの転写調節因子が活性化されることにより、心筋細胞は成人型から胎児型へと遺伝子発現パターンを変化させる。これらの変化は種々の因子によって引き起こされる心筋細胞肥大に共通の変化であり、また心筋機能不全と密接に結び付いていることから、この核内情報伝達機構の詳細な解明は心不全の分子細胞レベルでの解明と根本的な治療法の開発に非常に有用である。我々は心筋遺伝子直接注射法を用い成人ラットにおいてin vivo圧負荷に反応するプロモーターエレメントを解析する方法を初めて確立した。そして詳細な検討の結果、肥大における遺伝子発現調節にGATA転写因子群特にGATA-5が中心的な役割を果たしていること、転写コアクチベーターであるp300がGATA-5と結合し、相協力して心筋遺伝子の転写に関与していることを見出した。さらに最近我々は、p300を心筋に過剰発現させるとp300/GATA経路の標的であるエンドセリン-1の心筋における発現が亢進し、心肥大及び心不全が誘発されることを見出した。
新規ナノキャリアによる伝達システムと生体イメージングを利用した評価系の構築

ウイルスベクターによる遺伝子治療は、臨床応用の難しさから見直されると同時に、ウイルスベクターに代わるDDS用生体材料に注目が集まってきている。デリバリーする物も化合物、核酸,タンパク質などと多様になっており、包含機能に富んだDDS用生体材料の必要性が高まっている。特に、がん組織でのEPR効果を利用して、DDSによる抗がん剤治療は、投与量の削減、副作用の回避という点から、臨床応用での期待が大きい。本研究では、分担者木村が、これまで開発・研究してきた包含性の高い空中型ペプチドナノキャリア(ペプトソーム)に機能を付加し、改変することで、標的特異性を付加した新規DDS用生体材料を構築することを目的としている。本研究は、ペプトソームの生体内での可視化による評価系の構築を行い、生体内動態を調べることで、腫瘍へのデリバリー効率を評価するとともに、より効率よくデリバリーできるようにペプトソームを改良することを目指した。18年度までの研究で、EPR効果を利用して、腫瘍特異的にデリバリーできるペプトソームのサイズや、構築方法の最適化を行い、坦がんマウスを用いた実験で、極めて好ましいDDS機能を有することを確認した。19年度は、1)内包性を評価するために、近赤外蛍光色素を内包させ、実験動物を用いて、生体内動態評価を行った。生体外(in vitro)で内包性が高いことは既に検証しているが、生体内での内包状態を検証した結果、DDS材料と同じ成分を内包する材料に付加することで、安定に内包できることが分かった。また、2)ペプトソーム表面への修飾を行うことで、標的特異性を持ったペプトソームの構築を試みた。具体的には、HER2結合領域を表面に付加したペプトソームの構築を行い、HER2が過剰発現しているがん細胞への集積を調べるための実験を開始した。本研究では、包含性の高い空中型ペプチドナノキャリアに標的特異性を付加することで、能動的にデリバリーできる新規DDS用生体材料を構築し、診断薬・治療薬に応用することを目的としている。昨年度は、ナノキャリア自体に近赤外蛍光標識を付けて、担がんマウスに投与し、生体内での動態を光イメージングより評価し、より良い系の構築を行うための情報収集を行った。まず、いくつかの試作品をつくり、これまでに構築してきた培養細胞系等で機能評価および動物による生体適合性評価を行った結果、1)ナノキャリアが腫瘍にEPR効果により集積するためのサイズが30nm程度でもみられるが、100nm程度にした方が、より腫瘍以外への分布を抑えることができることが分かった。2)100nm程度のサイズのナノキャリアを安定に作成する条件を決定することができ、また、外側に材料を付加するためのイメージング材料の構築と付加するためのリンカーの調整・条件検討も行った。3)イメージングのための近赤外蛍光標識をつけた融合タンパク質を内包したものを動物に投与して、生体内動態をイメージングシステムを用いて観察したところ、ナノキャリアは、生体内でも安定に融合タンパク質を内包したままデリバリーされていることを示唆する画像が得られたと共に、腫瘍への集積を確認することができた。これらの結果から、このナノキャリアは、新規DDSとして十分機能しうることが確認できた。

本研究では、分担者木村が、これまで開発・研究してきた包含性の高い空中型ペプチドナノキャリア(ペプトソーム)に機能を付加し、改変することで、標的特異性を付加した新規DDS用生体材料を構築することを目的としている。昨年度の研究は、ペプトソームの生体内での可視化による評価系の構築を行い、生体内動態を調べることで、腫瘍へのデリバリー効率を評価するとともに、より効率よくデリバリーできるようにペプトソームを改良することを目指した。一昨年度までの研究で、EPR効果を利用して、腫瘍特異的にデリバリーできるペプトソームのサイズや、構築方法の最適化を行い、坦がんマウスを用いた実験で、極めて好ましいDDS機能を有することを確認した。昨年度は、1)内包性を評価するために、近赤外蛍光色素を内包させ、実験動物を用いて、生体内動態評価を行った。生体外(in vitro)で内包性が高いことは既に検証しているが、生体内での内包状態を検証した結果、DDS材料と同じ成分を内包する材料に付加することで、安定に内包できることが分かった。また、2)ペプトソーム表面への修飾を行うことで、標的特異性を持ったペプトソームの構築を試みた。具体的には、HER2結合領域を表面に付加したペプトソームの構築を行い、HER2が過剰発現しているがん細胞への集積を調べるための実験を開始した。
数学科テクノロジー利用法開発における東アジア周辺地域共同研究のための企画調査

東アジア周辺各国は、それぞれの理由からテクノロジー利用による教育課程開発を急務としている。本研究は、数学科でテクノロジー利用法開発を進める東アジア周辺各国が、課題に対する諸研究の先端情報を交換し、教育改革に還元する国際共同研究を組織化するための企画調査を行うことを目的とした。国際共同研究は、Asian Technology Conference in Mathematicsを足場に研究代表者等が企画した。筑波で行われたATCM98では、421名の参加者をえて、アジア各国からも参加者を得て、参加者らと今後の研究を企画した。そこでの調査で得られる各国の教育課程におけるテクノロジー利用の実状は、教育課程改革に本質的に有益な情報となった。年度後半には、北京師範大学、広州師範大学にて、今後の研究企画を行った。1999年度12月における広州でのATCM99並びに、2000年夏に東京で行うICME9へ向けての共同研究の企画打ち合わせを行った。
鶏伝染性ファブリキウス嚢病ウイルス病原性関連因子の分子病態発現機構に関する研究

伝染性ファブリキウス嚢病ウイルス(IBDV)は,鶏B細胞に感染し,罹患鶏に免疫抑制を惹起する。本病制御のため,これまで多くの研究がなされているが,ウイルス感染による免疫抑制機構や病態発現の分子機構等,基礎獣医学的研究はほとんど進展していない。本研究では,致死性が極めて高い超強毒型IBDVおよび致死性の低い従来型IBDV病原株を用い, IBDVの分子病態発現機構解明を目的に,1) in vitroモデルとしての鶏B細胞由来LSCC-DT40(DT40)細胞の有用性検討,2) IBDV非構造タンパク質の単独発現による細胞障害性および細胞内局在に関する検討,3)マイクロアレイを用いた超強毒型および従来型病原株感染細胞における遺伝子発現動態の比較・解析および,4)IBDV感染感受性細胞から抵抗性細胞を確立し,その遺伝子発現動態をマイクロアレイにより解析した。IBDV病原株は線維芽細胞などでは,連続継代による馴化無しには増殖しない。一方, DT40細胞では病原株が容易に増殖し,実験モデルとして有用であることが明らかとなった。強毒型および従来型病原株をDT40細胞に接種し,感染後の遺伝子発現動態をマイクロアレイ解析により検討した。170遺伝子にIBDV感染後に著明な発現変動が認められ,用いた株の病原性により動態の異なる遺伝子の存在が明らかになった。さらに, DT40細胞からIBDV感染抵抗性細胞を確立し,感受性細胞と発現動態の異なる遺伝子を明らかにした。次に,致死的および非致死的病原株のウイルスタンパク質を細胞内で単独発現させ,宿主細胞に与える影響を解析したところ,病原性とは無関係と考えられてきたVP4がIBDVの細胞障害性に関与する可能性が示された。また, IBDV感染細胞で発現後細胞膜に移行し細胞傷害との関連が知られるVP5は,膜移行にパルミトイル化の関与することが示唆された。伝染性ファブリキウス嚢病ウイルス(IBDV)において,病原性との関連が推察されているカプシドタンパク質VP2および非構造タンパク質VP5について,各ウイルスタンパク質を病原性の異なる株から真核細胞発現ベクターにクローン化し,宿主細胞での一過性発現を行った。VP2については,核濃縮を指標にアポトーシスの誘導を検討したが,各VP2由来株の病原性による差は認められなかった。一方VP5では,致死的病原株由来VP5と非致死的病原株由来VP5を宿主細胞でGFPと共発現したところ,非致死的病原株由来VP5発現細胞ではGFPの蛍光がGFP単独発現対照と同様であったのに対し,致死的病原株由来VP5発現細胞ではGFPの蛍光が有意に低かった。VP5発現によるGFP蛍光強度の減少は,ゴルジ装置の機能を可逆的に阻害する薬剤のBFA添加で抑制された。BFAの添加は,VP5の細胞質膜への蓄積阻害効果のあることが報告されている。このことから,致死的病原性株のVP5に認められたGFP蛍光強度に対する影響がVP5の細胞膜への蓄積阻害により抑制される可能性が示された。この現象におけるVP5の機能ドメインを明らかにするためVP5欠損変異体を作成したところ,C末端欠損VP5では蛍光の減少が認められず,VP5C末端に細胞障害に関与する機能ドメインのある可能性が推察された。現在,VP5の中央に存在する疎水性アミノ酸領域の欠損変異体を作出し,細胞膜への局在とGFPの蛍光を指標とした細胞障害性との関連について検討を進めている。伝染性ファブリキウス嚢病ウイルス(IBDV)において,病原性との関連が推察されている非構造タンパク質VP5について,致死的病原株由来VP5と非致死的病原株由来VP5を鶏線維芽細胞においてGFPと共発現した。

非致死的病原株由来VP5発現細胞でのGFP蛍光強度はGFP単独発現対照と同様であったが,致死的病原株由来VP5発現細胞ではGFPの蛍光強度が有意に低いことを見出した。VP5は感染細胞膜に蓄積し,細胞膜の破壊に関与することが推察されている。そこで,VP5の膜移行を阻害したところ,蛍光強度の相違は観察されなかった。また,蛍光強度が減弱した細胞では細胞内GFP量が減少していることを見出し,VP5の細胞膜への蓄積による障害でGFPが細胞外に漏出した可能性が推察された。以上のことから,病原性の異なる株に由来する各VP5は,膜障害性の異なる可能性が示唆された。次に,VP5の膜局在を決定するアミノ酸領域を検索した。VP5中央には疎水性アミノ酸の連続する領域があり,膜移行への関与が推察されていたが,VP5の膜移行にこの疎水領域は関与せず,C末端側アミノ酸の関与が明らかになった。また,IBDV感染初期においてVP5が感染細胞のオートファゴゾームへの局在を明らかにした。致死的病原株と非致死的病原株感染細胞のマイクロアレイ解析では,感染12時間後の測定でIFNαの発現量上昇の傾向が認められたが,株間で明確な差は認められなかった。
免疫機構に着目したDown症患者の歯周疾患の基礎的解析および治療法の開発

小児歯科診療では、日々様々な疾患や障害に遭遇する。その中でも、Down症候群は高頻度に遭遇する症候群であり、疫学的にも遺伝疾患及び染色体異常の中では最も発生頻度が高い。原因としては、体細胞の21番染色体が通常より1本多く存在し、3本になることで発症する。歯科的な臨床像としては、齲蝕の罹患率は低いが、歯周疾患への罹患率は高いことが知られている。しかし、Down症候群において歯周疾患に罹患しやすいことに対する分子メカニズムは、未だ不明である。そこで申請者らは21番染色体に乗る遺伝子の強発現が、歯周疾患に関与している可能性の解析を行ってきた。つまり、Down症候群での歯周疾患の発症には、21番染色体遺伝子にコードされたサイトカインによるサイトカインネットワークが関与しているのではないかと考え解析を行ってきている。Eotaxin-1(CCL11)は、好酸球およびレセプターCCR3を発現するTh2細胞の遊走を誘導する。好酸球自身は局所を酸性にし、またTh2細胞は炎症性サイトカインの産生の誘導、B細胞の遊走を誘導し、ともに局所の炎症の憎悪を誘導することが予想される。すなわち複数のステップを介して炎症に介入すると考えられる。そこで我々はヒト歯肉細胞におけるEotaxin-1の産生を検討し、歯肉細胞でEotaxin-1が恒常的に発現していることを確認した。Eotaxin-1による炎症制御機構が存在すると予想した。そこで、歯周疾患に罹患しやすいDown症候群由来の歯肉細胞と健全歯肉由来の細胞を比較することにより、Eotaxin-1に着目したDown症候群由来の歯肉細胞での免疫機構の検討を行っている。ダウン症歯肉細胞を供与いただき、hTERTを遺伝子導入して不死化細胞株の作成を行っている。しかし安定的hTERT発現細胞の作成にかなり時間がかかっている。H29年度は、研究に使用するサンプル(Down症候群歯肉由来線維芽細胞不死化細胞株)の樹立を試みた。H30年度は作成した細胞株について、Down症候群由来であることを証明するために、遺伝子検査を行った。遺伝子検査を行ったサンプルは4倍体であり、細胞株の作成は失敗であった。ヒト細胞株において、細胞周期調節因子や紡錘体タンパク質に変異が起こると染色体分離が正しく起こらなくなり、4倍体が生じることが知られている。また、細胞の老化の過程において、細胞分裂期のG2期に分裂が回避された結果として,老化細胞は4倍体のG1期細胞となることも明らかにされている。今回のDown症候群の細胞株もこれらの理由で4倍体となった可能性が高いと考えられた。したがって、再度サンプル作成を行った。今回はsingle cell cloningを行い、6つの細胞株を樹立した。また、Down症候群由来の細胞であることを確認するために、21番染色体上にあるDyrk1A(dual-specificity tyrosine-(Y)-phosphorylation-regulated kinase 1A)のDNA量をreal time PCRを用いて測定した。Dyrk1Aは、脳の発達と機能に不可欠のセリン/スレオニンキナーゼであり、この酵素の過剰活性化はダウン症候群の病因の1つであると考えられている。また、昨年度死滅した健常歯肉細胞についても再度再細胞株の樹立行い、こちらは安定的hTERT発現細胞の不死化細胞株作成を完了している。今後は再度作成したサンプルの染色体検査を行い、細胞株を早期に樹立する。樹立した細胞株と昨年度作成に成功した健常歯肉細胞株を用いて以下の研究を行う予定としている。健常人の歯肉細胞でEotaxin-1は強発現していることがわかっている。Down症候群由来の歯肉細胞株でも同様の検討を行い、Eotaxin-1の発現を検討する。これを健常歯肉由来の歯肉細胞と比較し、21番染色体上にあるサイトカインとEotaxin-1との関係を検討する。また、歯髄細胞ではFGF-2投与によってEotaxin-1の発現が抑制されたが、歯肉細胞ではFGF-2による抑制効果が弱かった。このことから歯肉細胞にはEotaxin-1を強発現するメカニズムが存在するのではないかと予想された。そこでFGF-2を投与した歯髄細胞と歯肉細胞での遺伝子発現の比較を行い、関与する遺伝子の同定を予定している。候補遺伝子の阻害剤やsiRNA、中和抗体の使用によって解析を行う予定である。歯科において歯の保存が最も重要であるが、歯の喪失原因はう蝕と歯周疾患である。歯を喪失することで食物の摂取機能不全、審美不全、発音等の障害を生じ、患者自身のQuality of Life (QOL)の大きな低下を生じる。一方でダウン症患児はう蝕の発生は少ないが、歯周疾患の早期発症を生じる。そこで申請者らは21番染色体に乗る遺伝子の強発現により、直接的に歯周疾患や寿命に関与していると考え解析を行ってきた。しかし近年の研究でダウン症の神経細胞数が減少する仕組みは21番染色体に乗る2つの遺伝子の強発現によることが説明され、白血病発症の仕組みは複数の遺伝子によることが説明された。以上のことからダウン症での歯周疾患の発症も21番染色体遺伝子が、一部または複数部位に介入する複雑なサイトカインネットワークが関与しているのではないかと考え解析を行ってきている。Eotaxin-1はCCL11とも呼ばれ、好酸球およびレセプターCCR3を発現するTh2細胞の遊走を誘導する。

好酸球自身は局所を酸性にし、またTh2細胞は炎症性サイトカインの産生の誘導、B細胞の遊走を誘導し、ともに局所の炎症の憎悪を誘導することが予想される。すなわち複数のステップを介して炎症に介入すると考えられる。そこで我々はヒト歯髄細胞、歯根膜細胞、歯肉細胞におけるEotaxin-1の産生を比較した。歯髄細胞および歯肉細胞でEotaxin-1は恒常的に発現していたが、歯根膜細胞では発現していなかった。興味深いことにFibroblast growthfactor-2 (FGF-2)の投与により歯髄細胞のEotaxin-1の発現は抑制されたが、歯肉細胞におけるEotaxin-1の発現に変化が認められなかった。このことからダウン症の歯肉では健常人よりもEotaxin-1による炎症制御機構が存在すると予想し、解析を行っている。ダウン症患者は精神発達遅滞を示し、安定的なダウン症患者由来の歯肉細胞の採取が困難なことが予想された。そこでダウン症歯肉細胞の供与を日大松戸歯学部障碍者歯科学講座の田中陽子先生から供与を受け、hTERT導入による不死化細胞株の作成を行っている。しかし安定的hTERT発現細胞の作成に時間がかかり、解析が遅れてしまっている。また健常歯肉細胞においても不死化細胞株を所有していたが、細胞株が死滅するトラブルがあり、こちらも再細胞株の樹立を試みている。こちらも安定的hTERT発現細胞の不死化細胞株作成を行っている。しかしこの細胞株作成の間に、歯髄細胞株におけるEotaxin-1の発現解析も同時に行っており、FGF-2投与により発現抑制が認められた。こちらはEotaxin-1発現抑制における細胞内シグナル分子の候補を同定して解析を進めている。こちらの解析結果を進めることで、歯髄細胞でのEotaxin-1発現を抑制し、歯髄保存のための薬剤開発のためマウスによる解析を行う予定である。歯は歯髄を失うと歯自体の乾燥を招き、歯根破折などにより歯を喪失する大きな原因となる。こちらの解析結果から歯の保存のため、QOLの向上に大きな意義があると考えられる。さらに矯正力や外力を付加した圧迫側の歯根膜を想定して、低酸素状態での歯根膜細胞の解析も行った。こちらでも多数の知見を得ている。小児歯科診療では、日々様々な疾患や障害に遭遇する。その中でも、Down症候群は高頻度に遭遇する症候群であり、疫学的にも遺伝疾患及び染色体異常の中では最も発生頻度が高い。原因としては、体細胞の21番染色体が通常より1本多く存在し、3本になることで発症する。歯科的な臨床像としては、齲蝕の罹患率は低いが、歯周疾患への罹患率は高いことが知られている。しかし、Down症候群において歯周疾患に罹患しやすいことに対する分子メカニズムは、未だ不明である。そこで申請者らは21番染色体に乗る遺伝子の強発現が、歯周疾患に関与している可能性の解析を行ってきた。つまり、Down症候群での歯周疾患の発症には、21番染色体遺伝子にコードされたサイトカインによるサイトカインネットワークが関与しているのではないかと考え解析を行ってきている。
ラット3Y1細胞の温度感受性細胞周期変異株の変異遺伝子の分離とその機能の解析

ラット二倍体正常線維芽細胞株3Y1から分離されたG1期温度感受性変異株の一つであるtsD123の欠損機能を補う遺伝子を単離すことを試みた。許容温度から制限温度に移すと、tsD123は可逆的に増殖停止するのに対し、この細胞をSV40でトランスホ-ムして得たSVーtsD123は急激に死ぬため、SVーtsD123に相補遺伝子を導入して温度耐性への復帰株の単離が容易にできると予想した。SVーtsD123細胞に、増殖状態にあるヒト線維芽細胞に発現している遺伝子のcDNAライブラリ-(阪大、岡山教授より分与)を導入して制限温度で増殖できる細胞株を7株分離した。この7株の細胞からそれぞれDNAを調整して再びSVーtsD123に導入して、もとの導入cDNAライブラリ-のマ-カ-であるG418耐性を持ちかつ温度耐性に復帰した細胞株(二次復帰細胞株)を3株分離した。これらの二次復帰細胞株とCOS細胞(ラ-ジT抗原を産生するSV40の許容細胞)とを細胞融合して(cDNAライブラリ-のベクタ-部分はSV40の複製開始領域を含む)培養し、その細胞破壊液を大腸菌に導入して二次復帰細胞のDNAに組み込まれているプラスミドを回収することを試みたところ、1.7kbの挿入遺伝子を有するプラスミドの回収に成功した。サザンブロットでこの1.7kbの遺伝子は上記の3つの二次復帰株のDNAに組み込まれているが、SVーtsD123のDNAには組み込まれていないことを確認した。この1.7kbの遺伝子が挿入されたプラスミドをSVーtsD123に導入して制限温度で増殖する細胞に戻ることを確認した。したがってこの1.7kbの挿入遺伝子はSVーtsD123の温度感受性の機能を相補する遺伝子であると考えられる。今後3Y1細胞におけるこの遺伝子に対応する遺伝子の単離およびその産物の抗体の作成を行い、この遺伝子の機能と細胞周期移行の調節との関係を明かにしてゆきたい。
海洋微小生物の生理活性物質に関する研究

ヒラ虫に共生する渦鞭毛藻Symbiodiniumsp.を大量培養し、血管収縮作用を指標として分離精製を進めた結果、2種の活性成分Zooxanthellatoxin-A(ZT-A)およびZT-Bを単離した。これらの化合物はパリトキシンのように水溶性が高く、また分子量も2900あまりと類似していた。収量は、477gの培養藻体あたり124mgと比較的良好であった。ZT-Aは酸ならびにアルカリに対して不安定で、また分子が大きいため複雑なNMRスペクトルを与えることから、まず化学的性質のアウトラインを得るために種々の化学反応を行い、ビスエポキシド、硫酸エステル、共役ジエンなどの特徴的な構造単位を含む概ね80%に相当する部分構造を得ることが出来た。また、窒素原子の存在が元素分析ならびにNMRから示唆され、アルカリ分解にてアミノ基が遊離し、Cl'以降のカルボン酸ユニットが取れてくることからアミド結合の存在が明らかになった。一方、穏和な条件にてアルカリ分解すると極性の高い物質に変換し、その際分子量が18増加することから、分子内エステル結合が示唆され、NMRスペクトルから62員環ラクトン構造が推定された。過ヨウ素酸ナトリウムにて注意深く分解すると、末端がカルボン酸であるアルコール体が得られ、FABMSのデータから得られたZT-Aの分子式より、残りの部分構造が連続したオキシメチンであることが明らかになった。^<13>CNMRの化学シフトならびに化合物の安定性から6員環ヘミアセタール構造とし、ZT-Aの構造が62員環ラクトンを含む特異な構造であることが明らかになった。また、アプリシアトキシンが発ガンプロモーター活性を発現する際に必須な構造因子を明らかにするために、モデル化合物を設計し、その合成を完了した。生物活性については現在検討中である。共生藻ゾーザンテラを40日あたり約250Lの培養を行い、毎回200グラム前後の抽出材料が安定して得られるようになった。現在の方法にて、100グラムの藻体からはおおよそ30ミリグラムの活性成分が単離され、それらを用いて分解反応を行った。本化合物では、低温下での過ヨウ素酸による分解反応が有効で、8種の主要な分解生成物が得られた。これらの構造解析を行った結果、ZT-Aのスルフォン酸エステル、エステル、ジエポキシド、共役ジエンを含む部分構造を明らかにするとともに一部相対立体配置を決定することが出来た。現在、これらの情報をもとに600MHZのNMRを用いて、全体の構造解析を進めており、いくつかの推定構造式を得るに至った。以上の結果ならびに薬理活性の解析からも、この活性成分が、他の海産天然物にない新しいタイプの化合物であることが示唆された。今後さらに詳細な構造解析を行い、構造と機能についても検討する予定である。アプリシアトキシンの基本骨格であるスピロアクセタール構造の構築方法については、立体化学を決定する要因を解析することにより、低収量ながら目的を達成することが出来た。また、C-5ユニットについても導入を完成し、現在、マクロラクトン化と、保護基の除去ならびに疎水性側鎖の導入について検討している。今後、各ユニットのより効率的な構築と、スピロアセタールの収率の向上を図り、各構造ユニットと生理活性との相関について検討する。昨年度に引き続き共生藻ゾーザンテラの大量培養を行い、材料を抽出精製して、ZTを確保した。得られた化合物ZT-Aを使って、600MHzNMRによる構造解析を行ったところ、溶媒ならびに温度を変化することによって、今まで不明であった概20%の部分構造に関する情報が得られてきた。

昨年度明らかにした分解反応生成物の構造を繋ぐことによって、世界で最も大きな62員環ラクトンを含む特異な構造を推定し、この推定構造式に基づいてさらに分解反応を行ったところ、推定構造を支持する結果が得られた。また、推定されたアミド結合については、加水分解によってアミノ基が遊離すること、ならびに元素分析によって窒素原子が確認されたことによて証明された。以上の結果から、ZT-Aが既存の海産天然物とは異なる極めてユニークな化合物であることが明らかになった。また、薬理活性試験を調べてもらった結果、やはり既存の化合物には見られない特異な作用を示すことが判明した。昨年度確立したアプリシアトキシンスピロアセタール部分構造の構築方法によってモデル化合物を合成し、さらにマクロラクトンへと誘導した。この化合物の保護基を除去することによって、当初予定したモデル化合物の合成を完了した。共生藻の研究と対比して行った浮遊性渦鞭毛藻ゴニオラックスの研究から、発光基質のD環部の絶対配置を決定する方法を見出した。またメチオニンを投与した際に増加、蓄積する新規物質ゴニオールを単離、構造決定を行い、一部生合成に関する知見を得た。
制作・展示・受容-新たな芸術システムの構築に向けて

これまでの芸術研究では、「制作・展示・受容」という各位相は、それぞれ別個に論じられてきた。本研究では、まず、制作・展示・受容を、相互に作用しあう未分化の営みとして捉え直し、総合的な視点から、今日における芸術が抱える諸問題を明らかにした。個としての芸術家による創造と、その帰結としての美的に自律した芸術作品や、教養あるエリートによる作品受容という、西欧モダニズムにおいて定着した関係性の枠内で芸術の問題を考えるのには、もはや限界がある。現代芸術-とくにポストモダン以降-においては価値の多元化・水平化が進み、美術館や展覧会といった美的制度は行き詰まり、美術教育や芸術のアカデミズムはステロタイプ化している。こうした状況に対する突破口は、芸術と社会・文化・歴史・教養との関係を、改めて批判的に問い直すことによって、はじめて開かれるといえよう。本研究では、各分担者が以下の3つの視点から、芸術・社会・文化・歴史・教養の媒介項として機能する「展示」の可能性について考察し、そこから、今日ありうべき新たな芸術システムを具体的に提言した。1.美学的・芸術学の視点から社会主義と資本主義、大衆とエリート、物質と記憶、保存と破壊、場所性と時間性の媒介項としての、展示の可能性についての考察(三木)2.歴史学・ミュゼオロジーの視点から美術館、美術教育、文化財保護における展示の功罪についての考察(石田・中川・並木)3.制作者の視点から建築、デザイン、メディア・アートにおける制作・展示・受容の連関についての考察(岸・中野・市川)以上の研究の成果を総括し、2007年5月に研究報告書を刊行した。なお、本研究の成果をふまえ、さらに広い分野の研究者や芸術家による論考を編纂するかたちで、書籍『芸術展示の現象学』(仮題)の出版を今夏に予定している。制作・展示・受容という芸術の3つの領域の相互関係に注目し、新たな芸術システムの構築をめざすという本研究課題の基礎作業を着実に行った。この研究テーマの中核には、「近代美学」「純粋芸術」「美術館」といった概念・制度を生み出した西欧モダニズムのもつ、美的な、自律的な、視覚優位の産物としての作品概念がある。研究分担者全員は、それぞれの専門分野に立って、これとの対話と対決を行い、制作と受容を媒介する広義の「展示」の諸相と意義を解明しようとした。研究分担者は、その際、前モダニズムとポストモダニズム(メディア時代)の時代性および、日本と東洋の地域性にも十分考慮した。1.建築家は、今日、建物が、どのような場所に建てられ、どの様な住み手に受容されるかを十分考慮して作品を設計する。また、写真家も、単一のタブローではなくむしろシリーズをインスタレーションの展示形式で自らの撮った作品を展示する。その具体例を岸と市川は示した。2.事例研究として、スイス・バーゼル大学の美術試験吸湿とバーゼル美術館との関係をG.ベームらのヒアリングを含め実施調査し、アカデミックな美術史の授業の教材として美術館の展示作品が重要な役割を果たしたことを明らかにした(三木)。3.ジェームズ・タレルの「光の館」をはじめとする越後妻有トリエンナーレのアートおよび金沢21世紀美術館の調査を行い、制作者と受容者の媒介としての展示の問題点をディスカッションした(三木、並木、中川)。4.「展示の力」のあり方と問題点をモダニズムからポストモダニズムまで歴史的に、理論的に考察した(太田)。Staniszewski : The Power of Display(1998)をはじめとする先行研究の批判的考察を下に、特に写真とインスタレーションの展示デザインに注目して、「スペクタクル」とでもいうべきあり方の問題点を明らかにした。

5.その他、アルスエレクトロニカのメディアアートの「芸術システム」や「限界芸術(工芸)」のシステム、MoMA(ニューヨーク近代美術館)についても資料収集に努めた。以上から、西欧モダニズムでの芸術作品概念とは、かなり違った多様な展示の姿を示す平成16年度においては、本研究課題の基礎作業を行ったが、平成17年度は、この基礎作業の上に、研究代表者および分担者は、芸術の展示の諸問題をさらに歴史的、地理的、ジャンル的に広い視点から解明した。その際、一方で文献中心に理論研究を行い小規模の研究会を開き、他方で、多くの協力者の協力を得て展示に関する調査・資料の収集を行った。その結果、以下のような課題の遂行への見通しが付いた。1.西欧における「展示の歴史」を聖像破壊・イコノクラスムと偶像崇拝に言及する旧約聖書にまでさかのぼり、展示を「見えないものから見えるものへ」という人間の複合的経験の中に位置づけ、さらに展示とその理論の歴史を現在までいくつかのエッポックに分け解明した。2.メディアアートの制作過程を市川、また協力者、高橋匡太、岸本康の協力で解明。3.先端科学技術の展示、日本科学未来館「サイエンス+フィクション」展での展示と受容を、また文化庁メディア芸術祭でのアートとテクノロジーの融合を調査した。その他、地方にアートミュージアムを作る試み、そこでの展示の問題を、グッゲンハイム・ミュージアム・ビルバオと直島文化村を中心に調査研究を行った。季刊雑誌『オクトーバー』掲載の図版のデータベース化を終えた。これにより現代アートのオピニオン・リーダーのひとつの雑誌での「展示」の意義と特色を問うことが出来た。過去2年間の成果は来春、書物『芸術展示の現象学』(仮題)として、出版を予定している。今年度は、おもに4つの方向で、代表者および分担者がそれぞれに下記のとおりのとおり研究を行った。1.展示は、芸術と社会を媒介し、また人間と歴史的文化を媒介する力を持つ。今日では、ミュゼオロジーの一環として、特徴ある展示の事例に基づきながら、ディスプレイやインスタレーションの方法論がさまざまに検討されつつある。同時に、展示されるべき文化財の保存が、専門的な技術を要することがらとして注目されつつある。だが、そもそもなぜ、展示という営みが必要なのか、また、展示という営みをとおして人間が共有すべき文化とはいったい何なのかは、実は自明ではない。本研究では、このことを、展示という営みが抱えるこの根本問題としてあぶり出すとともに、この根本問題について、大衆と文化的エリート、物質と記憶、保存と破壊、場所性と時間性といった観点から、美学的・芸術学的に考察を加えた。(三木)。2.美術館、展覧会に関わる、内外のアクチュアルな事例に注目し、2006年に開館した青森県立美術館や、スペイン・ビルバオのグッゲンハイム美術館、ロンドンのテイト・モダン、および歴史的な大改装を遂げた台湾の故宮博物館で調査にあたった。(石田・中川・並木)。3.制作者-とくに建築、デザイン、メディア・アートを中心とした一視点から、今日の展示と受容の可能性と問題点を明らかにした。(建築家として岸、グラフィック・デザイナーとして中野、写真映像家として市川)。4.研究代表者および各研究分担者は、それぞれの研究の成果を執筆し、これを研究代表者が総括して、研究報告書を5月に刊行する。
超分子集合系による新しいドラッグデリバリーシステムの開発

研究分担者(イスラエル,ヘブライ大学,Y.Barenholz教授)が1998年10月約1ケ月間,研究代表者(日本,京都大学,砂本順三教授)を訪問し,双方の研究グループで既にえられている成果の確認と本研究課題の推進の方策について討議し確認した.その結果に基づいて、1.砂本研究室で合成された疎水化多糖への蛍光プローブの導入を行った.具体的には、コレステロール置換プルラン(以下CHPと略記)蛍光プローブとしてFITC残基を化学修飾した.2.ポリエチレングリコール(PEG)は分子量に対応した曇天を持ち薬物運搬体に温度感受性を付与することが出来る.また、生体内に投与したとき、網内系を回避して、血流中での滞在時間を長く出来ると期待される.そこで同上コレステロール置換プルラン(CHP)に更にPEG鎖を修飾し、更なる機能化を図った.PEG修飾CHPは期待通り複合化した薬物の温度感受型の放出の可能性を示した.3.上記3,4で合成・精製した化合物を用いて既に我々が確立した方法に依って、リポソーム表層を被覆した.いずれの多糖類でも効率的な被覆に成功した.被覆したリポソームは、ゲルコロマトグラフィーにより分離、精製した.4.多糖被覆リポソームを小動物へ投与し、蛍光プローブをモニターすることによりとその体内動態を検討した.5.上記合成品の全てについて水分数系のクライオ透過電顕(cryo-TEM)観察を行い、水中での構造を確認した.研究分担者(イスラエル,ヘブライ大学,Y.Barenholz教授)が1998年10月約1ケ月間,研究代表者(日本,京都大学,砂本順三教授)を訪問し,双方の研究グループで既にえられている成果の確認と本研究課題の推進の方策について討議し確認した.その結果に基づいて、1.砂本研究室で合成された疎水化多糖への蛍光プローブの導入を行った.具体的には、コレステロール置換プルラン(以下CHPと略記)蛍光プローブとしてFITC残基を化学修飾した.2.ポリエチレングリコール(PEG)は分子量に対応した曇天を持ち薬物運搬体に温度感受性を付与することが出来る.また、生体内に投与したとき、網内系を回避して、血流中での滞在時間を長く出来ると期待される.そこで同上コレステロール置換プルラン(CHP)に更にPEG鎖を修飾し、更なる機能化を図った.PEG修飾CHPは期待通り複合化した薬物の温度感受型の放出の可能性を示した.3.上記3,4で合成・精製した化合物を用いて既に我々が確立した方法に依って、リポソーム表層を被覆した.いずれの多糖類でも効率的な被覆に成功した.被覆したリポソームは、ゲルコロマトグラフィーにより分離、精製した.4.多糖被覆リポソームを小動物へ投与し、蛍光プローブをモニターすることによりとその体内動態を検討した.5.上記合成品の全てについて水分数系のクライオ透過電顕(cryo-TEM)観察を行い、水中での構造を確認した.
マイクロ細胞パターニング技術を利用した植物細胞集積型酸素供給パネルの創製

近年の二酸化炭素排出量の増大により,地球温暖化や海水の酸性化など環境問題が深刻となっている.本研究では水,養分などの供給インフラ網を必要とせず,植物系生物の光合成機能を活用した二酸化炭素固定・酸素供給デバイスの開発を目的として基盤技術の開発を行った.具体的には光合成機能に優れた緑藻類細胞に着目し,二酸化炭素固定・酸素供給デバイスの根幹となる藻類細胞の三次元的集積化技術を確立した.藻類細胞を三次元集積することによって酸素生成速度が通常の懸濁培養と比較して24倍程度上昇する結果が得られた.また,循環培養系を構築することで光合成による二酸化炭素の固定と酸素生成を6時間にわたり連続的に持続することが可能となった.近年の二酸化炭素排出量の増大により,地球温暖化や海水の酸性化など環境問題が深刻となっている.本研究では水,養分などの供給インフラ網を必要とせず,植物系生物の光合成機能を活用した二酸化炭素固定・酸素供給デバイスの開発を目的として基盤技術の開発を行った.具体的には光合成機能に優れた緑藻類細胞に着目し,二酸化炭素固定・酸素供給デバイスの根幹となる藻類細胞の三次元的集積化技術を確立した.藻類細胞を三次元集積することによって酸素生成速度が通常の懸濁培養と比較して24倍程度上昇する結果が得られた.また,循環培養系を構築することで光合成による二酸化炭素の固定と酸素生成を6時間にわたり連続的に持続することが可能となった.本年度は光合成機能を有する植物系細胞からなるマイクロスフェロイドの創製を目的として,以下の2項目の研究を行った.・シロイヌナズナT87細胞を光合成機能を有する細胞の第一候補として選定した.T87細胞の誘電泳動特性の評価を行い,細胞の集積化条件を検討し,直径80150μm程度のスフェロイドのアレイ化技術を確立した.さらに細胞スフェロイドを光照射下で培養したところ,光合成による酸素生成と推測される気泡が認められた。一方で,シロイヌナズナT87細胞は,ガラス基板上での生育性に乏しく培養2,3日程度で気泡の発生は低下する傾向にあった.・植物系細胞の第2候補として,光合成および増殖能に優れた藻類細胞(クロレラ)を選定し,シロイヌナズナT87細胞で得た知見を元に藻類細胞の同様の集積化を行い,ガラス基材で構築されたチャンバ内に封入した.また,光照射下で培養を行ったところ,培養1日でシロイヌナズナT87細胞と比較して510倍の体積の気泡の発生が認められ,その後の2日間の培養で気泡が培養チャンバ内から消失した.これは藻類細胞の高い光合成能によって光照射下で光合成が急速に進んだ後に,チャンバ内の二酸化炭素量が不足したことで藻類細胞が陰呼吸を行い,酸素が消費されたことと考えられる.本年度は光合成機能を有し,かつ,それにより酸素生成が可能となる植物系細胞集積化型のパネルを開発することを目的として,以下の2項目の研究を行った.・初年度のシロイヌナズナT87細胞の光合成機能は酸素生成能は十分ではなかったために,新たに植物系細胞として微細緑藻類(chlorella)を選定した.Chlorellaの酸素生成能を検討したところ,T87細胞の10倍以上の値を示した.また,さらに光合成能を高めるためにアルギン酸ゲルビーズに包埋して三次元培養を行った.その結果,細胞を分散して培養するよりもゲルビーズに集積して培養する方が23倍程度の高い酸素生成能を示すことが明らかになった.・確立されたゲルビーズ培養法を用いてchlorella包埋マイクロビーズを作製し,ガラス管内に封入して循環培養系を構築した.ゲルビーズを用いた循環培養は細胞懸濁液を用いた循環培養に比べて酸素生成量が高いことが確認された.懸濁培養では測定中にChlorellaが沈降してしまうため,光の照射効率が低く光合成が十分に行われなかったと推測される.一方で,Chlorella包含ゲルビーズによる三次元培養では,細胞が沈殿せずに三次元的な配置が維持されるために均一に光が照射され,より多くの酸素が生成されたと考えられる.この結果よりゲルビーズを用いた循環培養における光合成能の優位性が確認された.また,Chlorella包含ゲルビーズを用いた循環培養を行うことで,藻類細胞の光合成は6h維持することができた、
脳に特異的に存在する14kDa(PNP14)タンパク質の生理機能の解明

脳に特異的に存在するPNP14は、牛、およびラットで見いだされたが、両生類、魚類、爬虫類、鳥類の脳にもその存在が認められた。ラット大脳、および小脳では全可溶性タンパク質中の0.1%に相当し、1μg/mgタンパク質であった。哺乳類以外の脳においてもその含量はラットとほぼ同程度であった。PNP14は種を越えて保存されていることから、中枢神経系で重要な機能を演じているものと考えられる。その機能に関しては、情報伝達系に重要な役割を演じているphosphatidylinositol 3-kinase、およびpp60^<c-src>と複合体を形成することから、PNP14は情報伝達に関与していることが強く示唆される。本タンパク質はグリア細胞には検出されず、神経細胞に特異的であり、その局在が軸索終末の前シナプスであることから、そこで機能発現しているものと考えられる。PNP14は細胞体にはほとんど検出されないことから、生合成後、速い軸索輸送により神経終末に運ばれるものと考えられる。また、PNP14はin vitro,in vivoでリン酸化され、カルモデュリンキナーゼIIによりセリン残基が、また、EGF受容体やpp60^<v-src>によりチロシン残基がリン酸化されることから、その機能はこれらのプロテインキナーゼによるリン酸化反応を介して制御されている可能性が示唆される。(1)ラット脳におけるPNP 14 mRNAの検出をin situハイブリダイゼーション法を用いて行った。Biotin-21-dUTPを用いるcDNA標識法では十分なシグナルが得られなかったので,〔^<35>S〕dCTP/ランダムブライマー法に変更して行った。その結果,大脳においてPNP 14 mRNAの発現は梨状皮質,海馬(CA14,歯状回)で高かった。これらの部位はPNP 14タンパク質の存在部位と一致していた。一方,小脳では顆粒層のみにmRNAの発現が認められ,分子層,プルキンエ層,髄質では検出されなかった。タンパク質は分子層に最も多量に,次いで顆粒層にみられることから,PNP 14の合成場所は顆粒層で,その後分子層へと運ばれるものと推定された。(2)ELISAに関しては,抗PNP 14血清からIgGを精製し,ペプシン消化,還元後にFab'を得た。これにマレイミド基を導入したペルオキシダーゼ(HRP)を作用させ,Fab'ヒンジ部の-SH基を介して結合させることによりHRP標識Fab'を調製した。調製した酸素標識抗体をサンドイッチ法ELISAに適用した。最高検出感度は0.5ng/wellで,分子量,および脳に多量に存在するという点で類似するカルモデュリン,S-100とは全く交差反応を示さず本法は満足すべきものであった。現在,本法によりPNP 14タンパク質の組織内含量について詳細に検討中である。(3)EGF受容体を用いてPNP 14をリン酸化後,そのチロシンリン酸化部位を同定した。チロシンを含む部分配列に相当するペプチドをFast Fmocケミストリーに従って化学合成した。それぞれのペプチドを基質に用い,in vitroキナーゼ反応を行って解析した結果,Tyr39がEGF受容体のリン酸化部位であることを明らかにした。【.encircled1.】牛大脳から精製したPNP 14の全一次構造をタンパク化学的手法を用いて決定した。牛大脳から精製したPNP 14をトリプシン、キモトリプシン、V8プロテアーゼ、あるいはBrCN処理し、ODS逆相カラムを用いたHPLCで各ペプチドを単離した。得られたペプチドを気相プロテインシークエンサーによりアミノ酸配列を決定した。それぞれのペプチドのアミノ酸配列をオーバラップさせることにより、PNP 14の全一次構造を決定した。牛PNP 14は134アミノ酸から構成され、C-末端に酸性アミノ酸に富む領域を有し、PNP 14が酸性タンパク質であることをその構造上から証明した。【.encircled2.】

PNP 14がin vitro,in vivoでリン酸化されることを見いだした。さらに、in vitroキナーゼ反応により、カルモデュリンキナーゼIIによってリン酸化されることを明らかにし、そのリン酸化部位がSer118であることを報告した。また、EGF受容体やpp60^<v-src>によりチロシン残基でもリン酸化され、EGF受容体のリン酸化部位がTyr39であることを明らかにした。【.encircled4.】ラット脳中のPNP 14、およびそのmRNAの局在性について免疫組織化学、およびin situハイブリダイゼーション法を用いて解析した。PNP 14は大脳では、海馬、線条体に、小脳では分子層、顆粒層に認められた。一方、mRNAは大脳では海馬、梨状皮質に、小脳では顆粒層にその発現を認めた。