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国民政府の形成と日中関係

本年度の研究では、満州事変期から日中戦争初期に至る日中関係を多角的に分析した。その際の力点は軍事面よりも外交面に置かれ、第2次幣原外交の展開と中国国民政府の対応、国際連盟との関係、さらには王正廷の動向などを研究した。とりわけ、中国側の中心人物の1人が王正廷外交部長である。王正廷については、イェール大学に回顧録が残されているため、その全文を翻刻した。すなわち、拙編『王正廷回顧録Looking Back and Looking Forward』(中央大学出版部、2008年)がそれである。伝記的な研究としては、日中間で評価の別れる広田弘毅について研究を行った。その成果は、拙著『広田弘毅-「悲劇の宰相」の実像』(中央公論新社、2008年)として公刊された。研究分担者の高文勝も、博士論文をさらに発展させて現地調査を重ねており、新史料の保存公開状況を論文に活かした。その成果の一端は、「戦間期の日中関係再検討:19181931-王正廷の対日構想を中心に」と題して、日本国際政治学会で発表された。そこでは、王正廷を中心とする中国のいわゆる「革命外交」を単なる反日的な急進ナショナリズムとみなすのではなく、より実体に即した日中関係史像が描かれている。中国および日本の外交文書はもとより、新聞や雑誌といった二次文献についても系統的に分析を加えたことは大きな特徴である。中国国民党と日本によって形成された当該期の中国対日外交と、それに基づいた日中関係をめぐるディスコース分析を行いながら、満州事変前後の実証的な研究のうえに均衡のとれた日中関係史像を再構築した。今年度の研究では、主に満州事変前、すなわち、国民政府成立期の日中関係を多角的に分析した。その際に、外交面からの分析に力点をおき、とりわけ中国国民政府の対日構想、ならびに対日政策の決定過程を解明し、幣原外交や田中外交との関係を含めて交渉過程を時系列的に跡づけた。なかでも、中国国民党と中国共産党、および日本によって形成された当該期の中国対日外交と、それに基づいた日中関係をめぐるディスコース分析を克服しながら、より精密で実証的な研究のうえに均衡のとれた日中関係史像を再構築した。その過程で、当時外交部長だった王正廷の回顧録の全文を入手し、ほぼ翻刻を終えており、来年度には刊行を計画している。研究分担者の高文勝は、博士論文を基礎としながら、北京や台北で現地調査を重ねており、新史料の保存公開状況を把握している。中国および日本の外交文書はもとより、新聞や雑誌といった二次文献についても系統的に分析を加えた。統一に向かう中国と国民政府内部の対立する権力の拮抗に着眼し、最高権力者の蒋介石、対日政策の立案にかかわった外交部長陳友仁・黄郛・王正廷らを中心に、東北政権の張学良をも対象とした。このような分析視角から、中国のいわゆる「革命外交」を単なる反日的な急進ナショナリズムの文脈に置くのではなく、より実体に即した日中関係史像を描いた。
模型流路による微細多孔質材料の物質移動機構の解明とコンクリート劣化予測への応用

本研究ではコンクリート構造物を対象とした、各種非破壊試験における測定値の物理的な意味の理解と、高精度な劣化予測手法の提案を最終目的として検討を行った。まず、コンクリート中の物質は空隙を経路として移動するが、空隙構造を代表する指標の抽出手法の開発を行った。本手法は、空隙構造の分析手法である水銀圧入法(MIP)の試料を、微小面積を残してエポキシコーティングし、MIPによる分析を行うものであり、これにより、連続空隙の最小径である閾細孔径が抽出される。非破壊試験として、トレント法による表層透気試験および横浜国立大学で開発された表面吸水試験装置を用いてある程度乾燥したコンクリートを対象に検討を行った。開発された手法により抽出された閾細孔径は表層透気係数および表面吸水試験から得られた指標と高い相関(いずれも決定係数0.8以上)を示したことから、上記の非破壊試験では閾細孔径に支配された物質移動を測定しているものと考えられる。また閾細孔径と透水係数、ガスの拡散挙動、液状水の浸潤挙動との間にも高い相関を確認している。ナノオーダーでの塩化物イオンの挙動の把握を目的として、まず深さ16-100nmのナノ流路の作製を行った。作製は東京大学生産技術研究所火原研究室の指導のもと行った。また、ナノ流路中の塩化物イオンの挙動を観察する手法を、TWENTE大学MESA+研究所のEijkel教授指導のもと検討した。その結果、塩化物イオンの存在により蛍光強度の減少する蛍光試薬(MQAE)を用いて、ナノ流路中の塩化物イオンを光学的に観察する手法を確立した。数mM程度のリン酸緩衝液および塩化カリウムの溶液中では、流路が10nm程度になると壁面の静電気的作用により、塩化物イオンのナノ流路への侵入が抑制されることを確認した。また理論的な検討も行い、実験値と定量的に対応することを確認した。翌年度、交付申請を辞退するため、記入しない。
リンパ造血器細胞の分化、増殖における染色体転座切断点領域遺伝子の役割

粘膜関連リンパ組織(MALT)リンパ腫に関与するt(11;18)転座の本態は細胞死を抑制するAPI2遺伝子と18番染色体上の新規遺伝子MALT1が融合遺伝子を作ることであることを明らかにしたが、MALT1遺伝子の役割を蛋白レベルで解析するために、MALT1遺伝子を大腸菌に発現させ、リコンビナント蛋白を精製し、4種類のモノクローナル抗体を作成した。現在、組織レベルでの検討をおこないつつある。また、蛋白レベルの検討により、API2,MALT1ともに不安定な蛋白であることがわかったが、API2-MALT1キメラ蛋白を形成すると安定な蛋白となることを明らかにした。また、我々は、び慢性大細胞型B細胞性リンパ腫(DLBL)に関連するBCL6転座を解析したが、複数の疾患単位からなるDLBLのなかに、特徴的な病型を見出すことはできなかった。しかし、CD5+DLBLが予後の悪い疾患単位を形成することを見い出したため、cDNA array法にて検討しつつある。また、本疾患単位には染色体8番短腕の異常が報告されており、BAC cloneを用いて追求しつつある。一方、T細胞性リンパ腫の染色体異常についてはほとんど明らかになっていないが、染色体6番q21に高頻度に以上があることが報告されていた。我々は、本領域からその責任遺伝子TCBA1を見出し報告した。TCBA1は膜4回貫通蛋白であり、種を超えて保存されていることがわかっているが、その腫瘍化における機能については、今後の検討を要する。リンパ造血器腫瘍の発症に関る染色体転座切断点領域遺伝子は、腫瘍化に重要な役割を果たすだけでなく、正常造血器細胞の分化や増殖に直接関る遺伝子であると考えられ、重要視されている。本研究の目的は、リンパ造血器細胞の分化、増殖に関る遺伝子を特定し、診断、治療の指針となる分子マーカーを確立することである。B細胞リンパ腫はリンパ節二次濾胞(Germinal center,以下GC)を中心として、分化段階がPre-GC段階、GC段階、post-GC段階に分けられる。Pre-GC分化段階に属するMALTリンパ腫に特徴的な染色体異常t(11;18)(q21;q21)転座を解析し、その本体は11q21領域のアポトーシス抑制に関与するAPI2遺伝子と18q21領域に位置する機能不明なMALT1遺伝子が融合蛋白を作ることであることを見出し、報告した。これらの遺伝子がB細胞分化にどのような役割を担うのか今後明らかにする必要がある。また、悪性リンパ腫の約半数をしめるびまん性リンパ腫は主として、post-GC段階由来と考えられているが、細胞表面マーカー並びに転座関連遺伝子の免疫染色を検索することで、臨床的に意義のある少なくとも3つの独立した疾患単位が存在することが示唆され、これらを明確に規定することができる他の分化マーカーを見出す必要性があると考えられた。乳児白血病に関与するMLL遺伝子の標的遺伝子を発現遺伝子差異検出方法である、RDA法やcDNA microarray法で見出しつつあるが、本方法を悪性リンパ腫の分化段階を規定する遺伝子を見出す方法としても適用しつつある。リンパ造血器細胞の文化増殖における転座切断点領域遺伝子卯の役割を検討した。MLL遺伝子は多様な転座相手遺伝子を有するが、t(9;11)転座は骨髄球性白血病に強く相関して認められ、t(4;11)転座はリンパ性白血病に強い相関が認められるため、MLL遺伝子は細胞分化に関して、重要な役割を担っていることが推測される。そこで、白血病細胞におけるMLL遺伝子転座を代表する変異MLLであるMLL-Zf(-)を安定発現する導入細胞と、ベクターのみの導入細胞で、発現に差のある遺伝子をRDA(representational difference analysis)法で解析した。MLL-Zf(-)導入細胞でG-CSF存在下で発現が増強する遺伝子として、あるsubtypeのPI-3 kinase遺伝子を単離した。

別の変異型MLLであるMLL-LTG9の導入細胞でも同じ遺伝子の発現増強が認められ、標的遺伝子であることが輝かとなった。粘膜関連リンパ組織(MALT)リンパ腫に関与するt(11;18)転座の本態は細胞死を抑制するAPI2遺伝子と18番染色体上の新規遺伝子MALT1が融合遺伝子を作ることであることを明らかにしたが、MALT1遺伝子の役割を蛋白レベルで解析するために、MALT1遺伝子を大腸菌に発現させ、リコンビナント蛋白を精製し、4種類のモノクローナル抗体を作成した。現在、組織レベルでの検討をおこないつつある。我々は、び慢性大細胞型B細胞性リンパ腫(DLBL)に関連するBCL6転座を解析したが、複数の疾患単位からなるDLBLのなかに、特徴的な病型を見出すことはできなかった。しかし、CD5+DLBLが四語の悪い疾患単位を形成することを見出し、多数症例による解析にて、より明確となった。この分化段階を代表するマーカーを見出すため、cDNA array法にて検討しつつある。粘膜関連リンパ組織MALTリンパ腫に関与するt(11;18)転座の本態は細胞死を抑制するAPI2遺伝子と18番染色体上の新規遺伝子MALT1が融合遺伝子を作ることであることを明らかにしたが、MALT1遺伝子の役割を蛋白レベルで解析するために、MALT1遺伝子を大腸菌に発現させ、リコンビナント蛋白を精製し、4種類のモノクローナル抗体を作成した。また、蛋白レベルの検討により、API2,MALT1ともに不安定な蛋白であることがわかったが、API2-MALT1キメラ蛋白を形成すると安定な蛋白となることを明らかにした。また、我々は、び慢性大細胞型B細胞性リンパ腫(DLBL)に関連するBCL6転座を解析したが、複数の疾患単位からなるDLBLのなかに、特徴的な病型を見出すことはできなかった。しかし、CD5+DLBLが予後の悪い疾患単位を形成することを見い出したため、cDNA array法にて検討しつつある。また、本疾患単位には染色体8番短腕の異常が報告されており、BAC cloneを用いて追求しつつある。一方、T細胞性リンパ腫の染色体異常についてはほとんど明らかになっていないが、染色体6番q21に高頻度に以上があることが報告されていた。我々は、本領域からその責任遺伝子TCBA1を見出し報告した。TCBA1は膜4回貫通蛋白であり、種を超えて保存されていることがわかっているが、その腫瘍化における機能については、今後の検討を要する。
卵巣機能の実時間評価のためのドップラー光干渉断層画像化システムの開発

マウス卵巣内の卵胞の発達段階を非侵襲解析するためのドップラー光干渉断層画像化法(OCT)の応用について検討した.卵巣内の卵母細胞におけるOCT信号の時間変化は周辺組織とは異なることを新たに発見した.これらの信号は,フレーム間の画像強度を用いるドップラーOCT技術によって強調することができ,卵巣内の卵母細胞の3次元分布を評価することができた.OCTは,卵巣内の卵胞や卵母細胞の発達の解析に有効であった.本研究では,卵巣機能の新しい早期診断法として,卵巣に存在する初期発達段階の卵胞の形態変化を観察するため,5ミクロンの空間分解能を有する高分解能・光干渉断層計(OCT)システムを開発する.さらに安価なGPU(Graphics Processing Unit)を用いた超高速画像処理を開発し,形態の断面構造だけでなく,生命を司る機能情報のリアルタイム表示を実現することによって,卵巣機能を「生きたままで」診断できる画期的な解析技術を開発する.本年度は,前述した目的を達成するために,これまでの使用してきた波長840nmより長い波長帯(1310m)のOCTシステムを構築した.この波長帯で感度を有する近赤外高速ラインカメラ(1024画素,91.9kライン/秒)を導入し,高速に干渉信号を取得した.さらに構造情報と機能情報のリアルタイム表示実現のため,GPUによるフーリエドメインOCT用高速画像処理の開発を行った.OCT画像の強度情報を利用しドップラー角に関係なく流体位置のマッピングを行うcorrelation mapping OCT(cmOCT)やintensity based Dopplervariance OCT(IBDVOCT),speckle variance OCT(svOCT)の3つのアルゴリズムをGPUで開発し,各々実行した結果,いずれの方法でもデータ取得時間より短い時間で処理が終えることを確認し,リアルタイム表示が可能であることがわかった.さらに横方向分解能の改善を検討を行った.まず測定プローブに焦点距離の短いレンズを用いて,テストターゲットを用いて分解能を評価した結果と5.5umなった.本研究では,生殖分野における卵巣機能の新しい早期診断法として,卵巣に存在する初期発達段階の卵胞の形態変化を観察するため,高分解能・光干渉断層計(OCT)システムを開発する.さらに安価なGPU(Graphics Processing Unit)を用いた超高速画像処理を開発し,形態の断面構造だけでなく,生命を司る卵母細胞の動きから得られる機能情報のリアルタイム表示を実現することによって,卵巣機能を「生きたままで」診断できる画期的な解析技術を開発する.本年度は,卵母細胞の小さい動きを可視化するため,OCT画像のモード(強度,振幅,対数)を変えてcorrelation mapping OCT (cmOCT),speckle variance OCT (svOCT), Squared differential image(SDI)のアルゴリズムの評価を行った.強度モードでSDIを計算したほうが最もコントラストが高いことがわかった.またこれらの処理をGPUに実装し,さらにフレーム間のジッターの影響を軽減する方法もGPU処理に実装してもデータ取得時間より短い時間で処理が終えることを確認し,リアルタイム表示が可能であることがわかった.これにより卵巣内の卵母細胞の3次元分布を可視化することに成功した.また前年度開発した1310nm波長帯OCTシステムにおいて,より高い深さ方向分解能を得るため,これまでより広帯域な超広帯域光源を導入した.分解能を評価した結果と15umであった.本研究では,卵巣機能の新しい早期診断法として,卵巣に存在する初期発達段階の卵胞の形態変化を観察するため,5ミクロンの空間分解能を有する高分解能・光干渉断層計(OCT)システムを開発する.さらに安価なGPU(Graphics Processing Unit)を用いた超高速画像処理を開発し,形態の断面構造だけでなく,生命を司る機能情報のリアルタイム表示を実現することによって,卵巣機能を「生きたままで」診断できる画期的な解析技術を開発する.本年度は,OCT画像の強度を用いるドップラーOCTとしてSV(speckle variance),CM(correlation mapping ),SDI(squared differential images)の3つアルゴリズムについて,OCT画像形式を強度・振幅・logスケールに変えたときに,コントラストの変化について検討を行った.マウス卵巣において評価を行ったところ,3次元データで卵母細胞を確認することができた.さらにフレーム間のジッターの影響を軽減する方法を検討した.これらの方法をGPU処理に実装したところ,いずれの方法でもデータ取得時間より短い時間で処理が終えることを確認し,リアルタイム表示が可能であることがわかった.さらに画像処理による卵胞腔検出の検討も行った.画像処理としてOCT画像の2値画像化,膨張収縮によるマウス卵巣のマスク画像生成の検討を行い,この2枚の画像を用いて卵胞腔検出を検討した.これにより卵胞の発達段階評価として卵胞腔を持つ卵胞の識別を可能にした.マウス卵巣内の卵胞の発達段階を非侵襲解析するためのドップラー光干渉断層画像化法(OCT)の応用について検討した.卵巣内の卵母細胞におけるOCT信号の時間変化は周辺組織とは異なることを新たに発見した.これらの信号は,フレーム間の画像強度を用いるドップラーOCT技術によって強調することができ,卵巣内の卵母細胞の3次元分布を評価することができた.OCTは,卵巣内の卵胞や卵母細胞の発達の解析に有効であった.卵巣内の卵子のわずかな動きをコントラストよく可視化するアルゴリズムがGPU上で正しく動作するプログラムを開発でき,卵巣内の卵母細胞の3次元分布を可視化することができたことから,おおむね順調であるといえる.

生体医光学構築したOCTシステムにおいて,これまでより広帯域光源を導入したが深さ方向分解能は,理論値より劣る値であった.そこで今後は計測系の改良と開発中の計算による数値的な補償のGPUプログラムにより,分解能向上を図る.卵巣内の卵子の動きを画像化ため,血流のマッピングに有効なアルゴリズムを適応した.それらがGPU上で正しく動作するプログラムを開発できたため,概ね順調にできているといえる.横方向の分解能は測定プローブに焦点距離の短いレンズを用いることで概ね達成できている.システムの改良に必要な光学部品などの物品を購入するには,少額であったため前年度構築したOCTシステムにおいて,より高い深さ方向分解能を得るため,これまでより広帯域な超広帯域光源を導入し,システムの改良を行う.OCTシステムで超広帯域光源を利用することから,参照光路とプローブ光路の違いによる分散の影響が大きい.そこで分散を補償するため,プローブ光路と同等の光学素子を参照光路に入れるて調整する.当初の計画通り十分な補償が出来ない場合は,計算による数値的な補償を検討し,GPUプログラムに実装する.機能情報可視化のためのアルゴリズムの再評価し,GPUプログラムに改良を加える.さらにシステム構築後,マウス卵巣を用いて,評価を行う.得られた結果をまとめ学会発表を行う翌年度分と合わせて,物品を購入し,システムの改良を行う予定である.システム改良に必要な光学部品などの物品を購入するには,少額であったため翌年度分と合わせて,物品を購入し,システムの改良を行う予定である.
高純度視細胞前駆細胞の網膜への移植および移植ホストのコンディショニング

我々は、網膜視細胞および視細胞前駆細胞をGFP蛍光蛋白で標識させたトランスジェニックマウスを用いて3つのテーマについて研究を行ってきた。#1網膜変性モデルに対し、高純度の視細胞前駆細胞を網膜への移植した場合の解剖学的・機能的な回復を評価。#2ES細胞・虹彩色素細胞から視細胞前駆細胞への分化・転換誘導方法の確立。#3移植ホスト側の移植受け入れ環境の検討。#1,3視細胞前駆細胞をGFP標識したマウスの新生仔網膜を採取し、網膜変性モデルに対して移植実験を行った。単独の移植では移植細胞は視細胞層に生着したがホスト双極細胞との接合はほとんど見られなかった。瘢痕形成を抑制するChondoritinse ABCを移植と同時に投与することによって、移植視細胞は神経突起をホストに向かって伸ばすようになった。組織学的検討では、シナプス特異的蛋白の発現を認め、3次元的解析においても、移植細胞がシナプスを形成していることが示唆された。また、全細胞がGFP標識されたマウスの新生仔網膜を用いると、標識細胞は視細胞層以外にも侵入する傾向があった。機能的回復を網膜電図を用いて調べた。12匹の片眼のみ処置を行い、対眼をコントロールとした。1匹の処置眼で正常眼と同等のA派が観測され、その対眼では反応がなかった。他の11眼では波形を認めず、明らかな機能的回復を示すことはできなかった。#2マウス虹彩細胞を培養し、遺伝子導入によって視細胞様の細胞の作製を試みた。我々の過去の報告に基づき、遺伝子導入方法をさらに改良しより効果的な、作製法を検討した。また、マイクロアレイ法を用い遺伝子発現プロファイルを検討した。虹彩特異的遺伝子、視細胞特異的遺伝子を選別した。分化誘導の指標として、種々の条件を検討中である。(1)我々は、視細胞前駆細胞をGFP蛍光蛋白で標識されたトランスジェニックマウスを作製した。フローソーティングにより、そのマウスの網膜から効率的にGFP蛍光で標識された視細胞前駆細胞および視細胞を選択し得た。発生の各段階において、GFP陽性細胞を回収し、発生の各段階における遺伝子発現パターンを解析した。遺伝子発現の増減が特徴であったものには、従来の方法では検出しえなかった新規遺伝子も含まれていた。また新生児期における網膜を採取し、網膜変性モデルを用いて移植実験を行った。(2)網膜ではMuller細胞が移植細胞のシナプス結合を阻害するが、Muller細胞に発現するGFAPおよびvimentinの欠損マウスにおいて、移植細胞導入効率が向上するという報告に基づき、分裂Muller細胞を特異的に傷害する代謝拮抗剤や、siRNAによる遺伝子発現抑制を行い、遺伝子欠損のない動物モデルに於いて、移植細胞導入効率を向上させる条件を検討した。siRNAは標的遺伝子の発現を抑制することをreal time PCRで確認した。しかし、移植効率の向上にはつながらなかった。また、Muller細胞による瘢痕形成を抑制する薬剤の投与によって、移植視細胞の生着率向上を認めた。(3)本研究の過程において、mRNAレベルで遺伝子発現を解析するin situ hybridization法における、改良技術を開発した。従来法であれば時間のかかるプローブ作製を二段階のPCRで短時間に作製出来るようになりこれを報告した。我々は、網膜視細胞および視細胞前駆細胞をGFP蛍光蛋白で標識させたトランスジェニックマウスを用いて、昨年度に引き続き実験を行った。

その新生仔期における網膜を採取し、網膜変性モデルに対して移植実験を行った。単独の移植では細胞の生着は不十分であったが、瘢痕形成を抑制するChondroitinase ABCを移植と同時に投与することによって、移植視細胞の生着率向上を認めた。組織学的検討では、シナプス特異的蛋白の発現を認め、3次元的解析においても、移植細胞がシナプスを形成していることが示唆された。また、網膜全体がGFP蛍光蛋白で標識されたトランスジェニックマウスを用いて同様の実験を行った。視細胞は、視細胞があるべき位置にとどまり、視細胞でない細胞は、それらの細胞はあるべき位置へ侵入していくことが観察され、それぞれの細胞が到達すべき位置を認識していることが示唆された。網膜電図を用いた生理的な機能回復を調べた。12匹の片眼のみに処置を行い、対眼をコントロールとした。1匹の処置眼で正常と同等のA波が観測され、その対眼では反応がなかった。残念ながら今回の実験では、明らかな機能回復を示すことはできなかった。一方、マウス虹彩細胞を培養し、遺伝子導入によって視細胞様の細胞の作製を試みた。我々の過去の報告に基づき、遺伝子導入方法をさらに改良しより効果的な、作製法を検討した。また、マイクロアレイ法を用い、発現プロファイルを網羅的に検討中である。
薬剤誘導性アポトーシス関連遺伝子用いた養子細胞免疫遺伝子治療の基礎的研究

数多くの予備実験により、HSV-TKに変わる新規自殺遺伝子としてヒト由来Fas death domainを選択した。また、薬剤によるFas遺伝子発現調節に関しては、FKBPの変異分子であるFKbinding protein12(FKBP12)を利用した。FKBP12は免疫抑制剤のFK506には結合せず、新たに合成された低化合物AP20187の存在下でのみ二両体を形成する分子である。AP20187も同様に生体に存在するFKBPに結合することはなく、免疫抑制効果は示さない。これら分子と細胞膜固定のための低親和性神経成長因子受容体分子(LNGFR)とのキメラ蛋白質LFDを作成し(低親和性神経成長因子受容体分子:L、FKBP12:F、ヒトFasのdeath domain:D)、LFD発現レトロウイルスベクターを産生する細胞株PG13/GCsapLFD(MPSV)を樹立した。また、コントロールとしてLFDよりdeath domainを欠失したキメラ蛋白質(LFDD)も同時に作製し、そのウイルス産生細胞も樹立した(PG13/GCsapLFDD(MPSV))。これらウイルス産生細胞を用いて、ヒト末梢血リンパ球を含む種々の細胞に遺伝子を導入し、AP20187によるアポトーシス効果を検討した。遺伝子導入細胞はLFD、あるいはLFDD遺伝子導入後、LNGFR抗体を用いて分離された。その結果、LFDD発現HeLa、HT1080(human fibrosarcoma)では高濃度のAP20187(1mM)においても増殖を続けたが、LFDを発現したこれら細胞はわずか1nMのAP20187の存在下で死滅した。同様に、LFDを発現したヒト末梢血T細胞の半数以上は10nMのAP20187の存在下で12時間以内に死滅したが、LFDDを発現したヒト末梢血T細胞は過剰量のAP20187(10mM)の存在下においても増殖を続けた。
MRSPN/MRGP解析の自動化に向けたスケーラブルアルゴリズムの開発

本研究課題ではMRSPN (Markov Regenerative Stochastic Petri Net)ならびにMRGP (Markov Regenerative Process)に対する解析アルゴリズムの開発を行った.特に,大規模MRSPNに対する解析手法,および,システムの性能評価で必須となるシステムの過渡状態を評価するための過渡解析手法の開発を行った.さらに,それらを実装したツールの作成を行った.平成26年度はMRSPNの解析手法の検討を行った.特に,BDDを用いたMRSPNの状態探索アルゴリズムとMRGPの分割アルゴリズムの検討を行った.MRSPNを解析するためには,全プレースのトークン配置(マーキングと呼ばれる)を網羅的に抽出し,抽出したマーキングを状態空間とした離散状態・連続時間の確率過程(マーキングプロセスと呼ばれる)を考えることが必要である.一般的には深さ優先探索や幅優先探索が行われるが,プレース数やトークン数の増加により比較的小規模なMRSPNでも状態爆発を引き起こす.そこで,BDDを用いた状態網羅のアルゴリズムを構築した.一つのプレースに対して一つのトークンしか存在しない場合については既知の成果があったが,これを複数トークンへ拡張した.いくつかの実験を通じて,中規模サイズのペトリネットについては,従来の深さ優先あるいは幅優先探索が高速であるが,ある一定のサイズを超えると,メモリの関係からBDDによる状態探索が有効に機能することがわかった.また,Javaに基づいたペトリネットの解析ツールの作成も行った.また,ペトリネットの分割アルゴリズムについては,t-インバリアント, p-インバリアントの性質に着目した分割アルゴリズムの考察を行った.このアルゴリズムでは,ペトリネットの静的な解析によって,インバリアントな部分ネットワークを抽出し,それらの部分ネットワークの直積として,ペトリネットの状態空間を定義することを考えた.部分ネットワークを独立と見なすため,見かけ上の状態数は増加するが,BDDにおける直積表現が容易である点と,クロネッカー和・積による表現が容易である点から,扱いやすいものと考察される.平成27年度はMRGPの過渡解析手法に関する研究を行った.まず,MRGPの過渡解析に対して位相型近似による手法を開発した.位相型近似とは一般分布を位相型分布と呼ばれる分布で近似する手法である.位相型分布が連続時間マルコフ連鎖で定義できることから,一般的なMRGPを連続時間マルコフ連鎖の解析に還元することができる.ここでは,状態数の低減を行うためクロネッカー和・積による位相型近似の表現を行った.また,これらをMRSPNから状態間の依存関係を分析して,自動的に分割するためのアルゴリズムを構築し,有効性の検証をおこなった.探索では,一般分布による推移に基づいた状態分類を効率的に行うことによって,過渡解のみならずMRGPの定常解析にも利用できる表現を得ることができた.また,位相型近似では近似によって得られた連続時間マルコフ連鎖の状態数が大きくなるため,通常の解析では現実的な時間で結果を得ることが困難な場合がある.そのため,クリロフ部分空間法に基づいた解析手法の検討も行った.クリロフ部分空間法によるマルコフ連鎖の解析はこれまでに知られていたが,連続時間マルコフ連鎖の定常解・準定常解を利用することにより,より高速な解析手法の構築を行った.過渡解析に利用可能なMRSPNの分割アルゴリズムが完了している.また過渡解析手法としてはクリロフ部分空間法による手法の検討が終了した.全体の進捗としては問題ない.平成28年度は「モデル検査への拡張」と「ツール作成」を行った.【モデル検査への拡張】モデル検査では,状態推移モデル上で指定された時間に依存した性質が成立するかどうかを検査する.確定的なモデル検査は二分決定木(BDD)や充足可能性問題(SAT)を用いた条件を満たす状態を探索することが主な解析手法となるが,状態が確率的に推移するモデル上での検査は本質的に状態依存モデルの過渡解析に対応する.そのため,ここまでで確立した解析手法を確率的モデル検査に応用した.さらに,確率的モデル検査では特定の状態しか注目しないため,確定的なモデルチェッキング手法との組み合わせた過渡解析アルゴリズムの開発を行った.【ツールの作成】ツールの作成では「MRSPN/MRGPを定義するXMLスキームの開発」,「解析ツールの実装」を行う.他のツールからの利便性を考慮してMRSPN/MRGPの定義を行うためのXMLスキーマ開発する.XMLスキーマはXML文書中のタグなどの意味づけを行うものであり,このような定義はモデルの自動変換などに役立つ.本研究では,既存のペトリネットに対するXMLに対してMRSPNを記述できるような拡張を行う.また,MRGPを定義するためのXMLの開発も行った.さらに,MRSPN解析ツールJSPetriNetの実装を行った.MRSPN構造解析ツールはMRSPNを入力として,連続時間マルコフ連鎖の生成行列を出力する.また,連続時間マルコフ連鎖を数値的に評価するツールをR上に作成した.本研究課題ではMRSPN (Markov Regenerative Stochastic Petri Net)ならびにMRGP (Markov Regenerative Process)に対する解析アルゴリズムの開発を行った.特に,大規模MRSPNに対する解析手法,および,システムの性能評価で必須となるシステムの過渡状態を評価するための過渡解析手法の開発を行った.さらに,それらを実装したツールの作成を行った.BDDによるアルゴリズムは作成および検証が完了している.また,分割アルゴリズムについてはインバリアントに基づく分割の検討が終了した.分割アルゴリズムの有効性検証が一部完了していないのと,依存関係が自明でない場合(ガード条件を伴う)場合の扱いを考慮する必要がある.

これらは平成27年度に行うクロネッカー表現による近似精度と併せて検証することができるため,全体の進捗としては問題ない.平成28年度は「モデル検査への拡張」と「ツール作成」を行う.【モデル検査への拡張】モデル検査では,状態推移モデル上で指定された時間に依存した性質が成立するかどうかを検査する.確定的なモデル検査はBDDやSATを用いた条件を満たす状態を探索することが主な解析手法となるが,状態が確率的に推移するモデル上での検査は本質的に状態依存モデルの過渡解析に対応する.そのため,ここまでで確立した解析手法を確率的モデル検査に応用することを考える.確率的モデル検査では特定の状態しか注目しないため,確定的なモデルチェッキング手法との組み合わせることにより高速な過渡解析を実現する.【ツールの作成】ツールの作成では「MRSPN/MRGPを定義するXMLスキームの開発」,「解析ツールの実装」を行う.他のツールからの利便性を考慮してMRSPN/MRGPの定義を行うためのXMLスキーマ開発する.XMLスキーマはXML文書中のタグなどの意味づけを行うものであり,このような定義はモデルの自動変換などに役立つ.本研究では,既存のペトリネットに対するXMLに対してMRSPNを記述できるような拡張を行う.また,MRGPを定義するためのXMLの開発も行う.さらに,二つのツール(MRSPN構造解析ツール,MRGP過渡解析ツール)の実装を行う.MRSPN構造解析ツールはMRSPNを入力として,分割されたMRGPのXMLを出力とする.一方,MRGP過渡解析ツールでは開発された数値計算アルゴリズムを実装したツールであり,性能評価指標の過渡特性や確率的モデル検査の結果を出力とする.信頼性工学平成27年度はMRGPの過渡解析手法の開発を予定している.特に,MRGPの過渡解析における(i)クロネッカー表現による位相型近似の適用,(ii)過渡解析アルゴリズムの開発に関する作業を行う.【クロネッカー表現による位相型近似の適用】MRGPの過渡解析に対して位相型近似による手法を開発する.位相型近似とは一般分布を位相型分布と呼ばれる分布で近似する手法である.位相型分布が連続時間マルコフ連鎖で定義できることから,一般的なMRGPを連続時間マルコフ連鎖の解析に還元することができる.しかしながら,一般分布に対して位相近似を適用した場合,近似されたマルコフ連鎖の状態数も多くなる.そのため,「MRGPの分割アルゴリズム」で行ったのと同様にクロネッカー表現を適用することで,状態数の増加を低減させることを考える.また,クロネッカー表現によって,計算すべきマルコフ連鎖の無限小生成行列を分割することで,過渡解析の高速化も視野に入れる.【過渡解析アルゴリズムの開発】
地殻深部起源のマフィック岩類に見られる融解・同化プロセスと花こう岩質マグマの生成

阿武隈山地の竹貫変成岩において,閃緑岩質貫入岩体の接触部にある角閃岩中に,はんれい岩からトロニエム岩質の岩脈がネットワーク状に分布している.これらの岩石の産状,組織,鉱物組成,主成分および微量成分組成の特徴は,ソレアイト質玄武岩組成の角閃岩が部分溶融し,メタアルミナスなカルクアルカリ岩質のマグマを形成したことを示す.部分溶融は,800°C以上,3kb,そして水に富んだ条件で起こった.このマグマの形成プロセスを明らかにするために,希土類元素組成の定量的なモデル計算を行った.マグマの発生と分化のプロセスについて,それぞれ部分溶融と結晶分化作用を考え,部分溶融については異なる3つのメカニズム,すなわち平衡溶融,分別溶融,そして非平衡溶融を,結晶分化作用については分別結晶作用を検討し,次のような結果を得た.起源角閃岩が非平衡の部分溶融し(溶融度約25%),まずトロニエム岩質の液を,次いでト-ナル岩質の液を生成・分離した.溶融残滓として,枯渇角閃岩が残った.生成したト-ナル岩質の液(ト-ナル岩I)は1030%の分別結晶作用により,集積物としてはんれい岩,石英閃緑岩をつくり,ト-ナル岩IIに分化した.分化はト-ナル岩IIでとまり,トロニエム岩までにはいたらない.このように,ト-ナル岩やトロニエム岩の生成においては平衡溶融や分別結晶作用よりも,直接的な非平衡溶融が重要な役割を果たした.なお,この報告ではまとめきれなかったが,マグマの移動・濃集過程の力学的なメタニズムの解明に現在取り組んでいる.さらに,紀伊半島の熊野酸性岩中のマフィックな捕獲岩類についての研究も進行中であり,下部地殻への玄武岩質マグマの付加作用による地殻下部物質の溶融・同化を示すモデルケースとしてその実態を明らかにしていきたい.阿武隈山地の竹貫変成岩において,閃緑岩質貫入岩体の接触部にある角閃岩中に,はんれい岩からトロニエム岩質の岩脈がネットワーク状に分布している.これらの岩石の産状,組織,鉱物組成,主成分および微量成分組成の特徴は,ソレアイト質玄武岩組成の角閃岩が部分溶融し,メタアルミナスなカルクアルカリ岩質のマグマを形成したことを示す.部分溶融は,800°C以上,3kb,そして水に富んだ条件で起こった.このマグマの形成プロセスを明らかにするために,希土類元素組成の定量的なモデル計算を行った.マグマの発生と分化のプロセスについて,それぞれ部分溶融と結晶分化作用を考え,部分溶融については異なる3つのメカニズム,すなわち平衡溶融,分別溶融,そして非平衡溶融を,結晶分化作用については分別結晶作用を検討し,次のような結果を得た.起源角閃岩が非平衡の部分溶融し(溶融度約25%),まずトロニエム岩質の液を,次いでト-ナル岩質の液を生成・分離した.溶融残滓として,枯渇角閃岩が残った.生成したト-ナル岩質の液(ト-ナル岩I)は1030%の分別結晶作用により,集積物としてはんれい岩,石英閃緑岩をつくり,ト-ナル岩IIに分化した.分化はト-ナル岩IIでとまり,トロニエム岩までにはいたらない.このように,ト-ナル岩やトロニエム岩の生成においては平衡溶融や分別結晶作用よりも,直接的な非平衡溶融が重要な役割を果たした.なお,この報告ではまとめきれなかったが,マグマの移動・濃集過程の力学的なメタニズムの解明に現在取り組んでいる.さらに,紀伊半島の熊野酸性岩中のマフィックな捕獲岩類についての研究も進行中であり,下部地殻への玄武岩質マグマの付加作用による地殻下部物質の溶融・同化を示すモデルケースとしてその実態を明らかにしていきたい.花こう岩質マグマの発生・移動・濃集プロセスを明らかにするために,本年度はとくにマグマの実際の分布パターンを詳細に解析した.さらに,新しくSrおよびNd同位体法を導入し,生成した花こう岩質マグマと起源岩である角閃岩,そして熱源としての石川閃緑岩との関係を調べた.・阿武隈山地においては,融解している角閃岩の露頭3カ所で岩石ブロックの切り出し工事を行い,8ブロック(40×30×70cm前後)を採取した.それぞれ異なる地質条件(温度,圧力など)を反映して部分融解の程度が異なり,融解によって生じたはんれい岩-花こう岩質岩脈の分布パターンも異なる.現在,これらのブロックを薄く切断し,種々の岩脈の幾何学的構造を調べている.このような実際のメルトの分布パターンの解析は,今後の化学的方法によるマグマの進化の研究や,さらにメルトの移動・濃集の理論的研究に対して重要な制約を与えるだろう.・これらの新しく採取された岩石について,茨城大学分析センターにおいてプラズマ発光分析法により希土類元素,蛍光X線分析法によって主成分元素の組成を測定した.今回の測定によってとくに起源岩の化学的性質がはっきりし,融解の初期条件が定まってきた.・これらの角閃岩やはんれい岩

-花こう岩質岩脈などについて,岡山大学地球内部研究センターにおいて,SrとNdの同位体組成を測定した.Rb-Sr同位体組成の特徴は,角閃岩の融解に際して,これを融解した熱源である石川閃緑岩から単に熱だけではなく,流体を通じた物質の介在があったことを示している。石川閃緑岩のRb-Sr年代は約9千万年が得られた.さらに結果を解析中である.今年度はとくに、部分融解した角閃岩と、生成したはんれい岩、石英閃緑岩、ト-ナル岩、トロニエム岩についての、これまでに得られた岩石学的データ、すなわち鉱物組成、主成分組成、微量成分組成(とくに希土類元素:REE)をもとに、マグマの発生と分化について定量的な種々のモデル計算を行い、可能な具体的プロセスの検討を行った。検討した融解と分化のプロセスは、融解については、1.平衡融解、2.分別融解、3.非平衡融解で、分化は、1.平衡結晶作用、2.分別結晶作用である。これらの検討の結果、非平衡融解と分別結晶作用が角閃岩の融解とマグマの生成・分化を支配していることが明らかになった。すなわち。角閃岩の2段階非平衡融解(融解率25%)により、母岩の角閃岩を溶け残りとして、トロニエム岩質、およびト-ナル岩質メルトを生成した。さらにト-ナル岩質メルトは、分別結晶作用を行い、はんれい岩、石英閃緑岩を集積物として分別し(1020%)、SiO_2=70%程度のト-ナル岩に分化した。トロニエム岩は分別結晶作用によっては生ぜず、非平衡融解によって生成された。これらの2つの非平衡融解と生成したト-ナル岩質メルトの分別結晶作用のプロセスは、とくにREEと主成分組成の挙動を明瞭に説明する。研究成果は1996年地球惑星科学関連学会で発表するとともに、最終年度に論文としてまとめ報告する予定である。今年度は,今までに得られたデータを総合して,研究成果報告書に示すような論文としてまとめている.以下にその要旨を記す.阿武隅山地の竹貫変成岩において,閃縁岩質貫入岩体の接触部にある角閃岩中に,はんれい岩からトロニエム岩質の岩脈がネットワーク状に分布している.これらの岩石の産状,組織,鉱物組成,主成分および微量成分組成の特徴は,ソレアイト質玄武岩組成の角閃岩が部分溶融し,メタアルミナスなカルクアルカリ岩質のマグマを形成したことを示す.部分溶融は,800°C以下,3kb,そして水に富んだ条件で起こった.このマグマの形成プロセスを明らかにするために,希土類元素組成の定量的なモデル計算を行った.マグマの発生と分化のプロセスについて,それぞれ部分溶融と結晶分化用を考え,部分溶融については異なる3つのメカニズム,すなわち平衡溶融,分別溶融,そして非平衡溶融を,結晶分化作用については分別結晶作用を検討し,次のような結果を得た.起源角閃岩が非平衡の部分溶融し(溶融度約25%),まずトロニエム岩質の液を,次いでト-ナル岩質の液を生成・分離した.溶融残滓として,枯渇角閃岩が残った.生成したト-ナル岩質の液(ト-ナル岩I)は1030%の分別結晶作用により,集積物としてはんれい岩,石英閃縁岩をつくり,ト-ナル岩IIに分化した.分化はト-ナル岩IIでとまり,トロニエム岩までにはいたらない.このように,ト-ナル岩やトロニエム岩の生成においては平衡溶融や分別結晶作用よりも,直接的な非平衡溶融が重要な役割を果たした.メタアルミナスなト-ナル岩やトロニエム岩は,必ずしもマントルまたは下部地殻においてエクロジャイトに変成した玄武岩の溶融によっても生成するのではなく,より浅い地殻中部(約10km)においても,水に富んだ条件での玄武岩質岩石の部分溶融によって生成することができる。
ガンマレトロウイルス属の感染機構の包括的研究

ブタ内在性レトロウイルス(PERV)の受容体同定に関して、申請書の通りパンニング法による検索を行ったが、有力な候補を得ることができなかった。これについて、同法による受容体同定効率(特にエンベロープ蛋白質(Env)の培養用ディッシュへの固着)の改善のため、PERVのEnvに対するモノクローナル抗体を作製した。今後、この抗体を用いたパンニング法による受容体同定が期待される。一方、PERVと非常に近縁であり、内在化機構、種間伝播メカニズム、及び病原性解析について非常に有用なモデルと考えられるコアラ内在性レトロウイルス(KoRV)について、4つのサブタイプ(AD)を新規に分離:同定し、それらについての宿主細胞域の評価を行った。このうち、KoRVサブタイプBにおいて、末端反復配列(LTR)のU3領域に縦列反復配列が存在することを明らかにし、この反復配列により、LTRの転写活性および、ウイルスの自己増殖能が増加することを示した。加えて、LTRの縦列反復配列は、有胎盤類細胞よりも有袋類細胞で高い転写活性を有しており、さらに、骨髄系細胞への細胞指向性にも関与していることを明らかにした。また、転写活性化に必要となる宿主因子(Mzf-1)の同定も行った。上記に加えて、内在性ネコ白血病ウイルス(FeLV)由来の可溶性Envがネコ血清中にあることを証明した。さらに、この可溶性Envが外来性ウイルスであるFeLVサブタイプBの感染を阻害する一方で、Tリンパ球指向性FeLVの感染を促進することを明らかにした。さらに、内在性FeLV由来蛋白質がネコ属動物の血清中に共通して存在することを明らかにした。内在性レトロウイルスの持つ病原性解析(KoRV)と内在性レトロウイルスと外来性レトロウイルスの相互作用の解析(FeLV)から得られた知見は、PERV制御を目指す本研究において非常に重要なものであると言える。ブタ内在性レトロウイルスサブタイプB(PERV-B)およびサブタイプC(PERV-C)の受容体同定を目的として、バキュロウイルスによるタンパク質発現系を用いて、PERV-BおよびPERV-Cのエンベロープ糖タンパク質の発現・精製を行った。これらの精製タンパク質に対して、高い結合親和性を示す細胞をフローサイトメトリーを用いた結合試験により明らかにし、293細胞とMV-1-Lu細胞を同定した。さらにこれらの細胞からcDNAライブラリーの作製を行った。上記は年次計画に基づいて遂行されており、本成果によりPERVの受容体の分離・同定が十分に期待される。一方で、国内の動物園コアラにおけるコアラ内在性レトロウイルス(KoRV)の汚染状況をPCRで評価するとともに、得られたKoRVのエンベロープ糖タンパク質の遺伝子をもとにLacZシュードウイルスを作製し、KoRVの宿主細胞域をLacZアッセイにより評価した。KoRVはマウス・ハムスターを除く多くの細胞株に感染が可能であり、細胞侵入の際に必要な受容体としてネコ白血病ウイルスサブタイプBやギボン猿白血病ウイルスと同様にPit1分子を利用することを明らかにした。また、既知のKoRVとは異なる受容体利用能を示す新しいサブタイプの分離・同定に成功し、この新規サブタイプの全長配列を明らかにし、感染性クローンを作製した。KoRVはPERVと非常に近縁であり、かつ、近年に未知の前宿主から種の壁を超えて感染し内在化の過程の途中にあるという特徴を持っため、KoRVの研究は、異種移植の際に問題となるPERVの制御を目的とする本課題において、内在化および種間伝播の機構解明や病原性の評価を行う上で非常に有用である。ブタ内在性レトロウイルス(PERV)の受容体同定に関して、申請書の計画通りパンニング法による候補分子の検索を行ったが、現在までのところ有力な候補が得られていない。これについては、cDNAライブラリーから発現される分子と精製したPERVのエンベロープ蛋白質の結合親和性が十分でないためであると考えられる。また、実験系において、エンベロープ蛋白質の培養用ディッシュへの固着が不十分であるのも一因と考えられる。現在、PERVエンベロープ蛋白質に対してより高い結合親和性を示す細胞の再検索とPERVエンベロープ蛋白質をより強固にプレートに固着させるために必要な抗体の作製を行っている。一方、PERVと非常に近縁であり、内在化機構、種間伝播メカニズム、及び病原性解析について非常に有用なモデルと考えられるコアラ内在性レトロウイルス(KoRV)について、4つのサブタイプ(AD)を新規に分離・同定し、それらについての宿主細胞域の評価を行った。このうち、新規に分離したKoRVサブタイプBが、転写活性・自己複製能ともに非常に高いことを明らかにした。また、この高い転写活性は、LTR内のU3領域に生じる縦列反復配列によるものであることを明らかにした。内在性レトロウイルスの再活性化と病原性の発揮という点で、PERVとKoRVにおいて共通点が多いが、KoRVの方がこれらの現象がより顕著であり、観察対象としてより有用であると考えられる。このことから、KoRVの性状解析により、PERVとの共通点と相違点を分析することは、PERVの感染機構及び病原性発揮のメカニズムの解明、異種移植の安全性を確保する上で非常に重要なものであると考えられる。

今後、この抗体を用いたパンニング法による受容体同定が期待される。一方、PERVと非常に近縁であり、内在化機構、種間伝播メカニズム、及び病原性解析について非常に有用なモデルと考えられるコアラ内在性レトロウイルス(KoRV)について、4つのサブタイプ(AD)を新規に分離:同定し、それらについての宿主細胞域の評価を行った。このうち、KoRVサブタイプBにおいて、末端反復配列(LTR)のU3領域に縦列反復配列が存在することを明らかにし、この反復配列により、LTRの転写活性および、ウイルスの自己増殖能が増加することを示した。加えて、LTRの縦列反復配列は、有胎盤類細胞よりも有袋類細胞で高い転写活性を有しており、さらに、骨髄系細胞への細胞指向性にも関与していることを明らかにした。また、転写活性化に必要となる宿主因子(Mzf-1)の同定も行った。上記に加えて、内在性ネコ白血病ウイルス(FeLV)由来の可溶性Envがネコ血清中にあることを証明した。さらに、この可溶性Envが外来性ウイルスであるFeLVサブタイプBの感染を阻害する一方で、Tリンパ球指向性FeLVの感染を促進することを明らかにした。さらに、内在性FeLV由来蛋白質がネコ属動物の血清中に共通して存在することを明らかにした。内在性レトロウイルスの持つ病原性解析(KoRV)と内在性レトロウイルスと外来性レトロウイルスの相互作用の解析(FeLV)から得られた知見は、PERV制御を目指す本研究において非常に重要なものであると言える。
脂質性2次メッセージ代謝酵素に関する分子生物学的・組織化学的研究

イノシトールリン脂質(PI)代謝産物は細胞内情報伝達の2次メッセンジャーとして重要な機能を担ううえに,膜の細胞内輸送機構にも重要であることが知られつつある.その代謝産物のジアシルグリセロール(DG)がプロテインキナーゼCへの2次メッセンジャー機能を担うこと,およびPAも新たな2次メッセンジャーである可能性が指摘されていることに注目して,本研究ではDG--ホスファチジン酸(PA)変換に働く酵素のDGキナーゼとPAホスファターゼに対象を絞り,これらの酵素の分子構造を遺伝子工学的に解明し,それらの発現局在と活性特性を明らかにして,DGとPAの情報伝達機能における機能の理解を深めることを目指した.先ず,ラット脳cDNAライブラリーをスクリーニングすることにより,四種の異なるDGキナーゼ分子種を同定して,I-IV型と名付けた.I-II型はいずれもC側にATP結合部位を持ち,N側に2コのEF-handとZinc Finger様構造を持ち,互いの相同性は58%であった.細胞内ではI型が可溶性画分に,II型は膜画分,II型が両画分に存在した.脳内の発現局在を遺伝子組織化学で調べると,I型は白質に限られ,抗体による検索の結果,オリゴデンドロサイト特異的であることが判明した.髄鞘形成不全マウスでは脳内発現が認められないので,髄鞘形成維持への関与が示唆される.II型は線状体,側坐核,嗅結節と下垂体中葉に発現を限局しており,ドーパミン作動性神経伝達への関与が示唆される.但し,ドーパミン2型受容体遺伝子ノックアウトマウスの線状体での発現には変化が認められなかった.II型については小脳プルキニエ細胞に最も強く,そして顆粒細胞にも明確に発現が認められたので,小脳運動調節機能に重要であることが示唆される.ところが,IV型は分子構造上で前者三分子種と大きく相違し,EF handを持たずにC端にankyrin-like repeatを持ち,既報のショウジョウバエで網膜変性原因遺伝子の一つのrdgAと相同性が認められた.しかしラット網膜では視細胞ではなく双極細胞に発現が局在しており,相同分子の種による機能相違が示唆される.さらに,分子構造内に核移行モチーフを含んでおり,培養細胞に強制発現させると核に明確に局在するので,この分子は核内での転写調節への関与が示唆される.一方,研究分担者のJ.A.Glomsetはこれら四種とは異なり,基質としてアラキドン酸含有DG指向性のありしたがってPI代謝特異と見なされるDGキナーゼの分子構造をラットで解明したので,分担者の後藤薫がワシントン大学に渡米滞在してその脳と網膜内局材を共同で研究し,その所見について現在論文作製中である.J.A.Glomsetは来仙して,当研究室に短期滞在して,研究情報交換と院生の研究指導をを行った.分担者のW.J.van Blitterswijkは我々が発見した四種とは異なる第五型のヒトDGキナーゼ分子を同定し,その脳内発現を当方で分担者の後藤薫と坂上洋行が解析し,その所見を共同でまとめて別紙のごとく発表した.van Blitterswijkも来仙して当研究室に短期滞在して,研究情報交換を行った.分担者の加納英雄は以上の六種のものとは異なるヒトDGキナーゼ分子を同定し,それはpleckstrinhomology領域とEPH型チロシンキナーゼ構造を持つことを明らかにし,新たな機能を担うことを示唆した.さらにPAホスファターゼII型の遺伝子クローニングに成功し,この分子は35kDaで膜結合型酵素であり,hic53と名付けたHO誘導型遺伝子と相同性を持つことを明らかにした.以上の結果,この研究グループによりDGキナーゼとPAホスファターゼ酵素分子の分子多様性の全貌を明らかにすることが出来,当初の研究目標はほぼ達成出来たと考える.今後は,発見した分子を種々の実験条件下におけるin vitro細胞系での発現調節を行って,これらの機能解析を遂行する覚悟である.イノシトールリン脂質(PI)代謝産物は細胞内情報伝達の2次メッセンジャーとして重要な機能を担ううえに,膜の細胞内輸送機構にも重要であることが知られつつある.その代謝産物のジアシルグリセロール(DG)がプロテインキナーゼCへの2次メッセンジャー機能を担うこと,およびPAも新たな2次メッセンジャーである可能性が指摘されていることに注目して,本研究ではDG--ホスファチジン酸(PA)変換に働く酵素のDGキナーゼとPAホスファターゼに対象を絞り,これらの酵素の分子構造を遺伝子工学的に解明し,それらの発現局在と活性特性を明らかにして,DGとPAの情報伝達機能における機能の理解を深めることを目指した.先ず,ラット脳cDNAライブラリーをスクリーニングすることにより,四種の異なるDGキナーゼ分子種を同定して,I-IV型と名付けた.I-II型はいずれもC側にATP結合部位を持ち,N側に2コのEF-handとZinc Finger様構造を持ち,互いの相同性は58%であった.