hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
全身性エリテマトーデスにおけるSOCS1の役割の解明と治療への応用

上記、本質的なSLEの病態改善に対する理解も深まったので、今年はSOCS1のSLE病態への関与を解明する。1)マウスの実験では、制御性T細胞(Treg)を含むヘルパーT細胞各サブセットでのSOCS1の発現状態、さらにはそれぞれのサブセットに誘導される過程でのSOCS1の発現動態を調べる。SOCS1トランスジェニックマウスを用いて、SOCS1の高発現状態がSLEにどのような影響を与えるかも調べる。SOCS1を安定的に高発現する因子の探索も行う。2)ヒト検体を用いた研究では、上記マウスの実験結果を参考にしながら、SLE患者末梢血リンパ球でのSOCS1の発現量をreal time PCR法にて解析する。結果によっては、免疫担当細胞をTregなど各Tリンパ球サブセットに分別しての発現解析も施行する。SLE病態の継時的な変化や治療状態(免疫学的検査結果(DNA抗体価、補体値)、臓器病変の種類、内服薬の種類・投与量など)とSOCS1の発現の比較を施行する。加えて、病変局所である、SLE患者の皮膚、腎臓の生検組織を用いて、浸潤しているリンパ球(そのリンパ球サブセットも同定する)のSOCS1の発現を免疫染色にて解析する。所属異動特にヒト検体を用いた実験のための抗体(フローサイトメトリー、免疫染色など)、real time PCRの試薬などの購入に用いて、遅延分の実験を精力的に進める。
米国との連携によるICTを活用した看護倫理教育プログラムの開発と教育効果の検証

指している。平成30年度も前年度に引き続き、米国における看護倫理教育の実態に関し、米国のCNS資格を持つ日本人看護師および米国での看護実践の経験を持つ日本人看護師からの聴き取りを行った。国内の実態については、看護現場(病院・在宅・地域)における看護倫理の実態および教育ニーズを把握するための質問紙調査の内容検討を行い、対象施設に研究協力の同意を得ることができた。また、国公立の看護系大学がインターネット上で公開しているシラバス(講義・授業計画)における、教育内容に関する分析を行った。ここまでの段階で得られた看護職を対象とした看護倫理教育の現状と課題に基づき、ブレンディッドラーニング(集合授業5回、eラーニング10回程度)の教育教材の作製を進めた。eラーニング教材は、「倫理的能力を高めること」を目指し、倫理課題を含む事例を通して学習する内容とした。教材では、最初に教育目標を提示し、次に事例紹介(文章と動画・イラスト)、倫理的課題を整理するための1知識;倫理的に知ること(倫理原則・倫理的行動の4つの要素)等に関する質問形式のページ、2知覚;倫理的に見ること(事例情報の整理)、3認知;倫理的に振り返ること(事例の分析)、4行動;倫理的な行動を定める(この事例に対し看護職として実践するケア内容・方法)の4つの要素で構成した。急遽、教育業務上必要となった10週間の研修会に参加することになり、その間の研究活動を中断せざるを得なかった。そのため、看護職を対象とした質問紙調査は令和元年度に持ち越し、調査に先立ってeラーニング教材の作製に着手した。令和元年度中には遅れを取り戻せる予定である。令和元年度前半には、看護現場(病院・在宅・地域)における看護倫理の実態および教育ニーズを把握するための質問紙調査を実施し、分析を進める。その上で、平成30年度に作製した教材の改良を行い完成させる。加えて、客観テストおよび学習評価指標をマトリクス形式で作成する。令和元年度後半から令和2年度前半には、開発した教育プログラムの実施と教育効果に関する検証・プログラムの改良を行う。令和2年度後半には、開発した看護倫理教育プログラムのユーザビリティ等を評価し,Webサイト構築のための条件や課題を明らかにしていく。平成29年度は、米国における看護倫理教育の実態に関し、米国のCNS資格を持つ日本人看護師からの聴き取りを行った。国内の実態については、先行文献や関連書籍の分析を行い、看護職を対象とした看護倫理教育の現状と課題の抽出を行った。これらの情報に基づき、看護倫理教育のための授業および評価方法について検討した。その結果、授業はブレンディッドラーニング(集合授業5回、eラーニング10回程度)で行い、集合授業にはグループワークを取り入れることとした。評価については、1中間学力評価(選択回答式評価)、2パフォーマンス評価(振り返りレポート)、3最終学力評価(選択回答式評価)、4総合評価(達成度評価)を受講生に取り組んでもらい、そのデータに基づき教育効果の検証を行うこととした。また総合評価については、倫理的能力の5つの構成要素「知識;倫理的に知ること,知覚;倫理的見ること,認知;倫理的に振り返ること,行動:倫理的に行なうこと,特性:倫理的であること」を用い、評価基準をマトリクス形式(ルーブリック)で作成することとした。さらに、教育内容・評価基準の焦点化を目指し、看護現場(病院・在宅・地域)における看護倫理の実態および教育ニーズを把握するため、質問紙調査の内容検討、調査対象施設の選定基準、リクルート方法について検討を行った。計画当初予測していなかった新たな業務に専念するため、エフォート35%を20%に変更したことによる。平成30年度中には教育教材の作成および評価に必要となるデータ収集を終え、遅れを取り戻せる予定である。また、米国に居住する看護倫理にかかわる豊富な経験・事例を持つ看護職との連携を図り、米国での知見を教育プログラムに反映する計画であったが、当事者が平成29年に帰国し国内での業務が多忙となってしまった。そのため、米国研究者との連携は次年度以降にずらすこととした。指している。

そのため、看護職を対象とした質問紙調査は令和元年度に持ち越し、調査に先立ってeラーニング教材の作製に着手した。令和元年度中には遅れを取り戻せる予定である。平成30年度以降には、看護現場(病院・在宅・地域)における看護倫理の実態および教育ニーズを把握するための質問紙調査を実施し、分析を進める。その上で、教育教材(講義資料・配付資料・eラーニング教材・客観テスト)を作成する。併せて学習評価指標をマトリクス形式(ルーブリック)で作成する予定である。その後、開発した教育プログラムの実施と教育効果に関する検証を行い、プログラムの改良点を明らかにする。また、開発した看護倫理教育プログラムのユーザビリティ等を評価し,Webサイト構築のための条件や課題を明らかにしていく。令和元年度前半には、看護現場(病院・在宅・地域)における看護倫理の実態および教育ニーズを把握するための質問紙調査を実施し、分析を進める。その上で、平成30年度に作製した教材の改良を行い完成させる。加えて、客観テストおよび学習評価指標をマトリクス形式で作成する。令和元年度後半から令和2年度前半には、開発した教育プログラムの実施と教育効果に関する検証・プログラムの改良を行う。令和2年度後半には、開発した看護倫理教育プログラムのユーザビリティ等を評価し,Webサイト構築のための条件や課題を明らかにしていく。平成29年度は学内業務が増え、本務に力を入れることにしたため、教育教材を作成するまでに至らなかった。それに伴い、教材作成に必要となるパソコンやレーザープリンター等の設備備品の購入を平成30年度に延期した。次年度中には、設備備品や必要なソフト等を購入し、教育教材作成に取り掛かる予定である。また外国旅費を計上し、米国に居住する看護倫理にかかわる豊富な経験・事例を持つ看護職の研究者に来日してもらう計画であったが、当事者が平成29年に帰国し国内での勤務に就くこととなった。別の米国研究者に研究協力の交渉をしているため、外国旅費はプールし平成30年度以降に使用することとした。急遽、教育業務上必要となった10週間の研修会に参加することになり、その間の研究活動を中断せざるを得なかったことが主な理由となる。そのほか、外国旅費を計上し、米国に居住する看護倫理にかかわる豊富な経験・事例を持つ看護職研究者に来日してもらう計画であった。しかし、当事者が多忙であり来日が難しく、インターネット電話による会議を実施したことに伴い、外国旅費は令和元年度に持ち越した。また、eラーニング教材作製の遅れから、学習履歴等のログ機能の設定を専門業者に依頼する予算に関しても令和元年度に持ち越した。令和元年度には、eラーニング教材を完成させられることから、これら持ち越した助成金を使用していく。
糖尿病性血管障害は口腔から予見できるか？ 歯肉微小血流による非侵襲的評価法の確立

生活習慣病の多くは、まず末梢血管障害が生じます。この血管障害と口腔内循環との関連を調べるため、糖尿病動物モデルの歯肉血管機能を測定しました。糖尿病により歯肉血管機能は低下し、この低下は歯周病により悪化しました。歯周病による歯槽骨吸収量は、糖尿病により増大しました。また、腎糸球体は、糖尿病により血管網の減少や管腔の変性が、さらに歯周病により、血管壁の破綻が観察されました。加えて、糖尿病、歯周病による歯肉血管障害への酸化ストレスの関与が証明されました。これらは、糖尿病による末梢血管障害が口腔内にも生じており、歯肉血流量を指標に簡便に生活習慣病のリスクのスクリーニングができることを示しています。近年,患者数が増加している糖尿病は合併症として血管障害を起こすことが知られている。この合併症は末梢の微小血管の肥厚や硬化を生じ,動脈硬化や脳・心筋梗塞を引き起こす。合併症が生じる網膜,腎臓と同様に,歯肉も微小血管で構成されている。このため,糖尿病により影響を受ける歯周病も合併症として知られおり,糖尿病は歯周病のリスク因子であるにもかかわらず,糖尿病による微小血管の機能障害機構のメカニズムの解明されていない。本研究は糖尿病性血管障害に焦点を絞り,口腔の血管反応を測定系として「歯肉微小血管と糖尿病性血管障害との関連性メカニズムの解明」を目的とし,臨床応用の基盤となる科学的エビデンスに基づく非侵襲的血管評価法の確立を目指し計画された。本年度は,糖尿病性血管障害に関し,レーザードップラー血流計により歯肉血流量を測定し,次の結果を得た。1)糖尿病による歯肉微小循環に対する影響:血流測定用プローブでラット歯肉を1分間圧迫,解放後の血流変化を測定し,歯肉反応性充血による血管弾性を評価した。その結果,コントロールラットに対し糖尿病モデルラット(Goto-Kakizaki: GK)の歯肉微小血管機能は病態の進行に伴い,血管内皮,平滑筋機能の経日的な低下が認められた。2)歯周病菌感染による歯肉微小循環に対する影響:GKとコントロールラットに歯周病菌であるPorphyromonas gingivalis (Pg)を感染させ,1)と同様レーザードップラー法を用いてPg感染による歯肉微小循環への影響を解析した。その結果,Pg感染により,コントロールラット,GKともに歯肉微小血管機能が低下したが,この機能低下はGKでより顕著に認められた。これら1),2)の結果より,糖尿病性血管障害は歯肉微小血管機能に影響与えることが示され,歯肉微小血管機能の変化が,糖尿病による末梢血管障害の一指標となる可能性が示唆された。生活習慣病のひとつである糖尿病は合併症として血管障害を起こす。この合併症は末梢の微小血管の肥厚や硬化により,動脈硬化や脳・心筋梗塞の原因となる。このため,糖尿病により影響を受ける歯周病も合併症として知られ,糖尿病は歯周病のリスク因子でもある。しかし,歯肉を含めた微小血管機能に対する糖尿病の影響は解明されていない。本研究は糖尿病性末梢血管障害に焦点を絞り,口腔の血管反応を測定系として「歯肉微小血管と糖尿病性血管障害との関連性メカニズムの解明」を目的とし,臨床応用の基盤となる科学的エビデンスに基づく非侵襲的血管機能評価法の確立を目指す。本年度は昨年度と同様,糖尿病性血管障害に関し,レーザードップラー血流計により歯肉血流量を測定し,下記の結果を得た。その結果,コントロールラットに対し糖尿病モデルラット(GK)の歯肉微小血管機能は病態の進行に伴い,血管内皮,平滑筋機能の経日的な低下が認めらた。その結果,Pg感染により,コントロールラット,GKともに歯肉微小血管機能が低下し,GKでより顕著に認められ、さらに腎糸球体の微小血管網の破綻が形態学的に観察された。これらの結果より,糖尿病性血管障害は歯肉微小血管機能に影響与えることが示され,歯肉微小血管機能の変化が,糖尿病による末梢血管障害の一指標となる可能性が示唆された。

本年度は,糖尿病性血管障害に関し,レーザードップラー血流計により歯肉血流量を測定し,下記の結果を得た。1)糖尿病による歯肉微小循環に対する影響血流測定用プローブでラット歯肉を1分間圧迫,解放後の血流変化を測定し,歯肉反応性充血による血管弾性を評価した。その結果,コントロールラットに対し糖尿病モデルラット(GK)の歯肉微小血管機能は病態の進行に伴い,血管内皮,平滑筋機能の経日的な低下が認められた。2)歯周病菌感染による歯肉微小循環に対する影響GKとコントロールラットに歯周病菌であるPorphyromonas gingivalis (Pg)を感染させ,1)と同様レーザードップラー法を用いてPg感染による歯肉微小循環への影響を解析した。その結果,Pg感染により,コントロールラット,GKともに歯肉微小血管機能が低下したが,この機能低下はGKでより顕著に認められた。これら1),2)の結果より,糖尿病性血管障害は歯肉微小血管機能に影響与えることが示され,歯肉微小血管機能の変化が,糖尿病による末梢血管障害の一指標となることが改めて示唆された。当初の計画通り下記の結果が得られたため,本研究は“おおむね順調に進行している"と思われる。1)糖尿病による歯肉微小循環に対する影響を検討した結果,糖尿病により歯肉微小血管機能は病態の進行に伴い,血管内皮,平滑筋機能ともに低下が認められた。2)歯周病菌感染による歯肉微小循環に対する影響を検討した結果,歯肉血管機能は歯周病と糖尿病による影響が認められた。また、高血圧ラットでも上と同様な結果が得られた。以上より,歯肉微小血管機能の変化が,糖尿病、高血圧症を含めた生活習慣病による末梢血管障害の一指標となる可能性が強く示唆された。近年,患者数が増加している糖尿病は合併症として血管障害を起こすことが知られている。この合併症は末梢の微小血管の肥厚や硬化を生じ,動脈硬化や脳・心筋梗塞を引き起こす。合併症が生じる網膜,腎臓と同様に,歯肉も微小血管で構成されている。このため,糖尿病により影響を受ける歯周病も合併症として知られおり,糖尿病は歯周病のリスク因子であるにもかかわらず,糖尿病による微小血管の機能障害機構のメカニズムの解明されていない。本研究は糖尿病性血管障害に焦点を絞り,口腔の血管反応を測定系として「歯肉微小血管と糖尿病性血管障害との関連性メカニズムの解明」を目的とし,臨床応用の基盤となる科学的エビデンスに基づく非侵襲的血管評価法の確立を目指し計画された。その結果,正常ラットに対し糖尿病モデルラット(GK)の歯肉微小血管機能は病態の進行に伴い,血管内皮,平滑筋機能の経日的な低下が認められた。2)歯周病菌感染による歯肉微小循環に対する影響GKと正常ラットに歯周病菌であるPorphyromonas gingivalis (Pg)を感染させ,1)と同様レーザードップラー法を用いてPg感染による歯肉微小循環への影響を解析した。その結果,Pg感染により,正常ラット,GKともに歯肉微小血管機能が低下したが,この機能低下はGKでより顕著に認められた。これら1),
非平衡系における新しい操作的変分原理の構築とその応用

ある時間間隔で時間平均された物理量は、平均時間を十分大きくとるとほぼ確定的な値をとる。その確定値からずれる事象はまれにしか生じない。その頻度が平均時間に関して指数関数的に減衰していくレートがまれな程度を特徴づける。本研究によって、そのレートをゆらぎの測定をせずに実験によって求める一般的な公式を提案した。この公式が直接的に役立つ例は簡単な場合に限られているので、次の発展のために数理構造の理解を深めた。ある時間間隔で平均されたカレントは、その時間間隔がカレントの相関時間に比べて十分に長い場合、ほぼ確定的にある値をとる。そこからのずれ(ゆらぎ)が生じることはめったにない。そのようなまれな事象が従う確率分布は、大偏差原理に従い、大偏差関数によって特徴づけられる。数学的に美しく定式化されているが、まれにしか生じないゆらぎの性質なので、その物理的意味は確立していなかった。ところで、近年の非平衡統計力学の発展によると、大偏差関数の対称性が明らかになるほど、自然法則との関わりも示唆されてきた。そこで本研究課題では、この大偏差関数を実験により操作的に決定することを目標とした。この際、鍵となるのは、熱力学とゆらぎの関係である。平衡条件下のゆらぎについては、まれなゆらぎが従う大偏差関数が実験で決めることができる熱力学関数と一致することが知られている。これと同様な関係を「時間平均されたカレントの大偏差関数」についても見出そうとする。研究の結果、マルコフ確率過程として記述される広いクラスの模型に対して、新しいタイプの変分原理が存在することを示した。この変分原理は、実験を行う操作者が制御可能な形でかけている。つまり、大偏差関数そのものをゆらぎの測定することなく実験で決めることができる。さらに、そこで見出された数理的構造を生かして、これまで計算できなかった量についても計算できるようになってきた。この成果については、国際会議の招待講演で2度発表している。また、ミクロなレベルで大偏差関数を考え、それに対して粗視化を実行することは(私たちの変分原理を使えば)流体極限を計算するよりはずっと簡単であることが分かりつつある。この計算を具体的に実行することで、これまでに議論できなかった流体極限についての知見を得ることができる。現在、この研究成果をまとめている。カレントの時間平均のキュミュラント母関数についての、操作的変分原理の基本的骨格を構築した。特に、マルコフジャンププロセスにおいて汎用的に成立する公式を見出した。この公式では、ポテンシャルを余分に加えた系のアクティビティーともとのアクティビティーの差を最大化するようにポテンシャルを調整することで、カレントの時間平均に重みをかけたバイアスアンサンブルを作ることができ、その結果として母関数を求めることができる。ここで重要なことは、この変分原理では、変分パラメータが、加えるポテンシャルとして表現されており、原理的には実験で実現可能な形になっている。また、この綺麗な結果は、目標に掲げた、大偏差関数についてのドンスカー=バラダン理論との関係を考える上でもきわめて重要な役割を果たした。実際、ドンスカー=バラダンと理論との関係は直接的になり、例えば、ドンスカー=バラダン理論にもとづいて我々の変分原理が導出できるようにもなった。さらには、離散時間マルコフ鎖においても、同様な公式を導出することができた。ランジュバン系も含めて、形式的な面については、ほぼ完全な理解を得たといってよいだろう。さらに、この公式の意義について考察し、より大きな問題の中に位置づけられつつある。以上の成果の一部は、Phys. Rev. Eに18ページの論文として出版された。国際会議で期待以上の有意義な議論などがあり、また、幸運も重なった。これまでの研究で得た知見やそこで得た今後の展開を踏まえ、さらに進展する。特に、問題としてとりあげるのは、大自由度系への適用である。我々の公式は、原理的には、自由度に関係なく成立する。しかし、自由度に関して指数関数的に「操作するパラメータ」が増えてしまい、実用てきではない。ところで、いくつかの状況証拠から、広いクラスの系について、一体ポテンシャルの制御だけで変分関数を最適化できる可能性がある。この可能性を追求し、数理的な証明と数値実験での提示を行う。23年度からの少額の繰り越し分も含め、交付申請書に記したとおりに行う。昨年度の場合も、海外研究者との議論がきわめて有効であったので、引き続き交流を大事にしたい。
有用資源魚筋タンパク質のアミノ酸配列解析

本研究ではシロサケ、ホッケ、スケトウダラ、サバの普通筋、血合筋、心筋よりcDNAファージ・ライブラリーを構築し、ミオシン重鎖およびアクチンのcDNAクローニング、PCR、サーマル・サイクル法による塩基配列解析、オンライン・データベースによる各種解析を行い、以下の成果を得た。1.シロサケ背筋に、2種類のミオシン重鎖cDNAクローンの存在が明らかになった。それらの塩基配列解析し、1種は10-12年度に、他の1種は11-13年度に、いずれも1937残基から成る全アミノ酸配列を決定した。両者は配列相同性が71%と低く、別遺伝子由来と判断された。2.シロサケ血合筋および心筋よりミオシン重鎖のそれぞれ246残基の部分アミノ酸配列を決定した。それらの配列およびデータベース検索の結果から、普通筋のクローンのうちの一つは、血合筋のクローンと同一であることが分かった(12-13年度)。3.ホッケ背筋より(1)普通筋タイプおよび(2)血合筋タイプのcDNAクローンを得たので、塩基配列を解析し、(1)については1931残基の全アミノ酸配列を決定し(平成12-13年度)、(2)については832残基の部分配列を決定した(同)。4.サバ背筋より普通筋タイプおよび血合筋タイプのcDNAクローン得たので、13年度にそれぞれについて245アミノ酸の部分配列を決定した。5.シロサケ背筋よりα-アクチンのcDNAクローンを得たので、その塩基配列を解析し、375残基の全アミノ酸配列を決定した(11年度)。6.スケトウダラおよびホッケの背筋より得たα-アクチンのcDNAクローンの塩基配列を解析し、375残基の全アミノ酸配列を決定した(同)。7.以上のミオシン重鎖およびアクチンの配列について、種々の観点より比較検討を行った。また、成果の一部について、2編を学術誌に投稿した。スケトウダラ、シロサケ、ホッケ等多獲性魚は将来とも貴重なタンパク質資源であり、加工品として高度利用するには、主要筋肉タンパク質の性質と構造を知る必要がある。本年度はシロサケのミオシン重鎖の一次構造を解析するために、筋肉タンパク質のcDNAライブラリーの作成、ミオシン重鎖cDNAクローニング、一部の配列解析を行った。1.シロサケ(Oncorhynchus keta)は函館近郊の茂辺地川に1998年11月に回帰した体長60cm体重2.2kgの雄を用いた。即殺したシロサケからただちに背筋5gを採取し、グアニジンチオシアン酸-フェノール法で全RNAを抽出した。全RNAからOligotex-dT30を使用して約2μgのmRNAを得た。このmRNAとcDNA Synthesis Kit(Takara)を用いてcDNAを合成し、これをλZAPII DNAにライゲートした。ライゲート反応液をGIGAPACK-III GOLD-4(Stratagene)によりin vitroパッケージし、λZAPII-シロサケcDNAライブラリーを作成した。このときのtiteを測定した結果、約8,000個の組換え体が得られていることが分かった。2.既にクローニングしてあるスケトウダラ・ミオシンのLMM領域のcDNAをDIG標識し、これをプローブとして、約2万個の組換えλZAPIIをスクリーニングした。その結果、1.3kbp,0.7kbp,0.3kbp,0.2kbpの挿入cDNAをもつクローンが得られた。.これらcDNAをpBluescriptIIにサブクローニングし、5'および3'末端領域の塩基配列を本年度申請設備のPerkin-Elmer社製のDNAシーケンサ(ABI-310型)で分析し、それらがミオシン重鎖のcDNAであることを確認した。現在、0.7kbpクローンの697全塩基配列の解明を終え、186アミノ酸残基の配列を演繹した。

6.スケトウダラおよびホッケの背筋より得たα-アクチンのcDNAクローンの塩基配列を解析し、375残基の全アミノ酸配列を決定した(同)。7.以上のミオシン重鎖およびアクチンの配列について、種々の観点より比較検討を行った。また、成果の一部について、2編を学術誌に投稿した。シロサケ・ミオシン重鎖の一次構造は、背筋mRNAから定法により合成したcDNAを一部はPCRの鋳型とし、一部は【lambda bar】ZAPIIに組み込みファージライブラリーを作成して解析した。塩基配列はABI310型シーケンサで分析した。シロサケには脊椎動物で報告されている骨格筋タイプと心筋タイプに類似するアイソフォームの存在が分かった。1.骨格筋タイプのミオシン重鎖cDNAは、尾部領域の既知塩基配列と保存的アミノ酸配列に基づき合成したプライマーを用いてPCRで増幅した。それらの塩基配列を重ね合わせ、合計5687bpの塩基配列を明らかにした。この配列から演繹したRLR領域(N末端から約80番目)からC末端までの1851残基のアミノ酸配列は骨格筋タイプに分類できた。2.心筋タイプのミオシン重鎖をコードスルcDNAについても同様に分析した結果、2262bpの塩基配列を明らかにし、RLRから調節軽鎖結合部位までの754残基のアミノ酸配列が演繹された。この配列は心筋タイプに分類された。3.普通筋タイプと心筋タイプのミオシン重鎖間での配列相同性は全体で73%程度であるが、ATP結合部位や調節軽鎖結合部位の相同性は75-95%と高く、loop1,2および必須軽鎖結合部位では46-56%と低かった。4.アクチンについては6個のクローンのうち翻訳領域の全長を含む1個の塩基配列を分析し、375残基からなるシロサケ・α-アクチンの全アミノ酸配列を決定した。その配列は脊椎動物筋アクチンとは45残基、また無脊椎動物筋アクチンとは1544残基が異なっており、相同性は各種脊椎動物筋アクチンとは8791%、無脊椎動物筋アクチンとは8085%であった。今年度はシロサケおよびホッケの各々2種のミオシン重鎖、スケトウダラおよびホッケのアクチンについてアミノ酸配列を解析した。なお、タンパク質の一次構造は、組織のmRNAからcDNAライブラリーを構築し、PCR、RACE法でcDNAを増幅し、TOPOベクターでクローニングした。1.昨年度に引続き、シロサケ骨格筋タイプのミオシン重鎖cDNAの塩基配列を分析し、未解明のN末端から79番目のアミノ酸配列を含む1,937の全配列を演繹した。この配列は既報のコイ(10°Cタイプ)、スケトウダラ、シログチのものと84-87%の相同性を示した。2.シロサケ普通筋中の心筋タイプと称したミオシン重鎖の方は、昨年度の2262bp(754アミノ酸相当)の配列決定に引続き、合計4,119bpの塩基配列を決定し、N末端からS-2までの1,373残基のアミノ酸配列を演繹した。この配列の一部について、心筋および血合筋から得たミオシン重鎖の配列と比較した結果、心筋のものとはかなりの違いが見られたが、血合筋のものとは完全に一致した。3.ホッケ普通筋から得たミオシン重鎖のcDNAにも普通筋タイプと血合筋タイプのアイソフォームを認め、HMM内部のそれぞれ1217bpおよび1226
糖鎖関連新規プローブの開発による生体機能の解明と制御

本研究代表者は前年度までに、陽電子放射断層画像撮影法(PET)による生体内分子イメージングのためのsp-sp^3炭素間のStille型高速クロスカップリング反応の開発に成功した。これによりアセチレン末端部への高速メチル化が実現し、[^<11>C]ヨウ化メチルから種々の該当化合物の^<11>C-含有PETトレーサー化が可能になった。そこで、本年度は実際に本反応を活用したPETトレーサー合成を試みた。具体的には、がん診断薬開発への発展を意図したステロイド骨格を有する基質への適用を試みた。その結果、目的とする^<11>C標識化合物の高速合成を達成し、本反応が実際のPETトレーサー合成にも応用可能であることを示すことが出来た。一方、細胞の分化や癌化、細胞間のシグナル伝達などの様々な生命現象に深く関与している糖鎖のプローブ化を行うため、表面プラズモン共鳴法(SPR)による糖鎖プローブ分子の簡便な解析法の開発にも取り組んだ。まず、糖鎖プローブとSPRセンサーチップを繋ぐスペーサー部分の合成を行った。スペーサー部分には、糖鎖プローブをSPRセンサーチップの金膜上に特異的に固定化するため、Au-S結合が可能なチオクト酸構造を導入した。また、糖鎖は集合化することによって糖結合型タンパク質とより強く相互作用するので、糖鎖部分の集合化が可能な三分岐型構造を導入した。続いて、糖鎖部分とスペーサー部分との縮合を行った。糖鎖部分にはモデルとして、グルコースを末端に持つマルトースを選択した。スペーサー部分への糖鎖の導入は還元アミノ化反応によって行い、効率よく糖鎖集合体を合成することに成功した。本研究により得られた糖鎖集合体は、センサーチップへ固定化することによりレクチンや糖転移酵素などの糖結合型タンパク質との相互作用解析が可能となり、これまで不明であった糖鎖の生命機能発現機構の解明などに向けた研究への応用が期待される。本研究指導者である鈴木らのグループによりこれまでに、脳実質内に新たな中枢型プロスタサイクリン(PGI_2)受容体(IP_2)が発見されるとともに、IP_2に強くかつ特異的に結合する15R-TICが創製されている。また、陽電子断層画像撮影法(PET法)による脳内のIP_2の画像化を目指して、sp^2/sp^3炭素間のStille型高速クロスカップリング反応が新たに開発され、その応用により15R-TICのトリル基部分に短寿命ポジトロン放射核^<11>Cを導入した15R-[^<11>C]TICメチルエステルの短時間合成が達成された。実際に本PETトレーサーを用いて、サル、さらにはヒト脳内のIP_2分布の画像化に成功している。本研究では、中枢型受容体(IP_2)のPET画像化の成功を受けて、その対照受容体であり、従来からよく知られている末梢組織に発現するPGI_2受容体(IP_1)のPET画像化を目指した。今回、脳内および末梢組織でのIP_1の分子イメージングを達成するためにIP_1特異的PGI_2人工類縁体であるイロプロストの^<11>C標識体の合成を目指した。その合成には、アセチレン末端への^<11>CH_3基の効率的な導入法が必要であるが、これまではそのような、sp/sp^3炭素間のクロスカップリング反応は困難であるとされていた。そこでまず、ヨウ化メチルと1-ヘキシニルスズ化合物とのモデル反応において条件検討を行った結果、適切なパラジウム触媒を使用することで目的とするメチル化体が収率良く得られることが分かった。また、PETトレーサー前駆体となるアルキニルスズ化合物に対して、非放射条件下、上記反応条件の適用を試みた結果、目的とするイロプロストメチルエステルを収率良く合成することに成功した。今後、実際のPETトレーサー合成およびそれを活用したサル、さらにはヒトIP_1の分子イメージングが行われる予定である。本研究指導者である鈴木らのグループではこれまでに、陽電子放射断層画像撮影法(PET法)による生体内分子イメージングを目指して、sp^2/sp^3炭素間のStille型高速クロスカップリング反応の開発に成功している。本研究代表者は上記研究の発展的課題としてsp/sp^3炭素間のStille型高速クロスカップリング反応の開発に着手し、昨年度までにその最適条件を見出すことに成功した。本反応の開発によりアセチレン末端部への高速メチル化反応が可能となり、[^<11>C]ヨウ化メチルの活用により種々の該当化合物の^<11>C-含有PETトレーサー化を可能なものにした。本反応を基盤に、従来からよく知られている末梢組織に発現するプロスタサイクリン(PGI_2)受容体(IP_1)の脳内および末梢組織でのPET画像化を目指し、IP_1特異的PGI_2人工類縁体であり、アセチレン末端メチル基構造を有するイロプロストの^<11>C標識体の合成を目指した。実際にPETトレーサー前駆体となるアルキニルスズ化合物を合成し、これに対して、非放射条件下、上記反応条件の適用を試みた結果、目的とするイロプロストメチルエステルを収率良く合成することに成功している。現在、実際のPETトレーサー合成およびそれを活用したラットやサル、さらにはヒトIP_1の分子イメージングを目指した研究が進行中である。

そのほかにも本研究では、各種酸素宮能基化されたアルキニルスズ化合物を合成し、上記反応の適用範囲の検証を行った。その結果、水酸基、エーテル、エステルなどの酸素官能基を分子内に有する基質でも上記反応条件を用いることにより高収率で目的のメチル化生成物を与える事がわかった。実際、抗ウイルス作用や抗癌作用を示すことが知られている核酸やステロイド骨格を分子内に有する化合物の合成に本反応を適用してみたところ、いずれの場合にも収率良く高速メチル化反応が進行した。本研究代表者は前年度までに、陽電子放射断層画像撮影法(PET)による生体内分子イメージングのためのsp-sp^3炭素間のStille型高速クロスカップリング反応の開発に成功した。これによりアセチレン末端部への高速メチル化が実現し、[^<11>C]ヨウ化メチルから種々の該当化合物の^<11>C-含有PETトレーサー化が可能になった。そこで、本年度は実際に本反応を活用したPETトレーサー合成を試みた。具体的には、がん診断薬開発への発展を意図したステロイド骨格を有する基質への適用を試みた。その結果、目的とする^<11>C標識化合物の高速合成を達成し、本反応が実際のPETトレーサー合成にも応用可能であることを示すことが出来た。一方、細胞の分化や癌化、細胞間のシグナル伝達などの様々な生命現象に深く関与している糖鎖のプローブ化を行うため、表面プラズモン共鳴法(SPR)による糖鎖プローブ分子の簡便な解析法の開発にも取り組んだ。まず、糖鎖プローブとSPRセンサーチップを繋ぐスペーサー部分の合成を行った。スペーサー部分には、糖鎖プローブをSPRセンサーチップの金膜上に特異的に固定化するため、Au-S結合が可能なチオクト酸構造を導入した。また、糖鎖は集合化することによって糖結合型タンパク質とより強く相互作用するので、糖鎖部分の集合化が可能な三分岐型構造を導入した。続いて、糖鎖部分とスペーサー部分との縮合を行った。糖鎖部分にはモデルとして、グルコースを末端に持つマルトースを選択した。スペーサー部分への糖鎖の導入は還元アミノ化反応によって行い、効率よく糖鎖集合体を合成することに成功した。本研究により得られた糖鎖集合体は、センサーチップへ固定化することによりレクチンや糖転移酵素などの糖結合型タンパク質との相互作用解析が可能となり、これまで不明であった糖鎖の生命機能発現機構の解明などに向けた研究への応用が期待される。
プロテアソームの分子集合と多様性の解析

プロテアソームは不要になった細胞内の蛋白質を選択的に分解するための巨大で複雑な細胞内装置である。プロテアソームの分子集合を支援するための複数の分子シャペロンを発見して、本複合体が形成される仕組みを解明した。またプロテアソームには分子多様性があり、以前に見出した免疫プロテアソームに加えて新たに胸腺プロテアソームを発見した。胸腺プロテアソームはT細胞のレパートリー形成に必須な酵素であり、本酵素の発見により長い間不明であった胸腺における"正の選択"の分子機構解明の糸口を掴んだ。プロテアソーム(真核生物のATP依存性プロテアーゼ複合体)はユビキチン(蛋白質分解の指標分子)で修飾された蛋白質を選択的に分解する大掛かりな細胞内装置であり,多様な生体反応を迅速に、順序よく、一過的にかつ一方向に決定する合理的な手段として生命科学の様々な領域で中心的な役割を果たしている。本研究の課題は、プロテアソームにおける最大の謎である分子集合の機構と多様性の解明である。20Sプロテアソームは7種類のαサブユニットから形成されるαリングと7種類のβサブユニットから形成されるβリングがαββαの順に重なった分子量750kDaの巨大な複合体であり、活性型26Sプロテアソームの触媒活性を担っている。本年の最大の成果は、20Sプロテアソームの分子集合を促進する新奇なシャペロン分子PAC(Proteasome Assembling Chaperone)1,PAC2を発見したことである。即ちPAC1,PAC2はヘテロダイマーとして働き、20S形成の最初のステップであるαリングの形成を促進することを明らかにした。そしてPAC1及びβリングの形成と引き続く20Sプロテアソームの完成(成熟)を仲介することが知られていたUmp1(プロテオアセンブリン)の欠損マウスの作製に成功し、これらが個体発生に必須な役割を果たしていることを証明した。またプロテアソームの多様性の解析としては、5つのアイソフォームが存在するユビキチン受容体「Rpn10」の遺伝学的解析、新規サブユニット「Rpn13」と「胸腺特異的プロテアソーム」の発見に成功した。さらにユビキチンに関する研究では、品質管理リガーゼとしてのCHIP(シャペロン依存型ユビキチンリガーゼ),Parkin(常染色体劣性若年性パーキンソン病の責任遺伝子産物),SCF^<Fbs>ファミリー(ERADに関与する糖蛋白質識別リガーゼ)について分子機能や活性制御を詳細に検討した。さらにオートファジー(自食作用)の遺伝学的研究から、オートファジーがユビキチン化蛋白質の選択的分解に関与すること、オートファジーの欠損は神経変性疾患を発症させるという新知見を得た。プロテアソームはユビキチンをパートナーとする真核生物のATP依存性プロテアーゼ複合体である。本酵素は触媒機能を司る20Sプロテアソームの両端に調節ユニットであるRegulatory Particle(RP)が会合した分子量2.5MDaの巨大な多成分複合体である。このようにプロテアソームは生命科学史上最も巨大で複雑な酵素複合体であり、蛋白質分解のための特殊な細胞内装置である。本研究では、プロテアソーム複合体の分子集合機構と分子多様性の解明を目指している。最初の分子集合機構の研究課題であるが、昨年発見した哺乳動物の会合支援シャペロンPAC1/PAC2ヘテロダイマーにに加えて本年はPAC3ホモダイマーを発見した。その結果、複数の分子シャペロンの協調的な作用により哺乳動物の20Sプロテアソームが正確に形成されることが判明した。さらに出芽酵母においてPAC1/PAC2/PAC3を代替するシャペロンとしてDpm1/Dpm2ヘテロダイマーを見出した。Dpm1/Dpm2とPAC3は一次構造上の相同性は乏しいがX線結晶構造解析で立体構造を解明すると、きわめて類似していることが判明した。次に分子多様性の課題であるが、我々は以前にImmunoproteasomeを発見したが、本年度さらに胸腺の上皮細胞に特異的に発現しているThymoproteasomeを発見し、作製したノックアウトマウスの解析から、胸腺におけるキラーT細胞の正の選択に関係していることを見出した。他方並行して進めているユビキチン研究においては、品質管理リガーゼの分子的機能や生理的役割を明らかにした。またオートファジー(自食作用)研究においてもニューロン特異的オートファジー欠損マウスが神経変性疾患を発症することを突き止めた。これらの成果は、生命の謎に鋭く迫ると共に、健康科学の発展に大きく寄与すると思われる。プロテアソームはユビキチン(分解のための目印を形成する翻訳後修飾分子)をパートナーとする蛋白質分解のための大掛かりな細胞内装置である。本酵素は生命科学史上他に類を見ない巨大で複雑な多成分複合体(分子量2.5MDa,総サブユニット数約100個)である。

本研究ではプロテアソームの分子集合機構と分子多様性の解明を基軸に蛋白質分解の生命科学における役割の解明を目指す。第1の課題である「プロテアソームの分子集合機構の解明」については,最近,我々が発見した哺乳動物の会合支援シャペロンであるPAC1/PAC2異型二量体に加えて,本年新たにPAC3/PAC4とプロテアソームとの共結晶による4次構造を決定し,これらのシャペロンの作動機構の解明にも成功した。これらの結果に基づいて我々はプロテアソームの分子集合に関する“逐次的多段階会合モデル"を提唱した。第2の課題である「プロテアソームの分子多様性の解析」については,約10年前に我々は構成型プロテアソーム以外に“免疫プロテアソーム"を発見し,この酵素が細胞性免疫の始動に関与していることを明らかにしたが,本年,第3のプロテアソームとして“胸腺プロテアソーム"を発見した。そして作出した遺伝子欠損マウスの解析から,胸腺プロテアソームがCD8^+リンパ球の分化に必須な役割を果たしていることを突き止めた。その結果,長い間免疫学における謎であった胸腺における“正に選択"の分子機構解明の糸口を掴んだ。その他,オートファジー(Self-Eating:自食作用)の破綻によって生じるユビキチン陽性の封入体形成機構を初めて明らかにした。これらの成果は,細胞内蛋白質の動態(輪廻転生)や病態解明の基盤となると共に,健康科学の発展にも大きく寄与する波及効果が期待される。プロテアソームは不要になった細胞内の蛋白質を選択的に分解するための大規模な細胞内装置である。本酵素は触媒機能を司る20S CP(Core Particle)の両端に調節ユニットである19S RP(Regulatory Particle)が会合した分子量2.5MDaの巨大で複雑な多成分複合体である。CPはα-Ringとβ-Ring(各々7種のα/βサブユニットから構成)がαββαの順で会合した円筒型粒子であり、RPは6個のATPase(Rpt1-6)と約15個のnon-ATPase(Rpn1-15)サブユニットがLid(蓋部)とBase(基底部)を構成している。本年度までにこの超複合体の分子集合を支援するPAC1-PAC4を含む約10種の分子シャペロンを発見して、本複合体が形成される仕組みの解明に成功した。一方、プロテアソームには分子多様性があり、以前に見出した免疫プロテアソームに加えて新たに胸腺プロテアソームを発見した。胸腺プロテアソームはT細胞のレパートリー形成に必須な酵素であり、本酵素の発見により長い間不明であった胸腺における"正の選択"のメカニズムが明らかとなった。この成果は、新しい感染免疫研究の発展に貢献することが期待できる。本年は同時にユビキチンの代謝研究、とくに常染色体劣性若年性パーキンソン症候群の原因遺伝子産物Pink1とParkinが傷害ミトコンドリアの品質管理に関与することを突き止めた。また細胞内でユビキチンの量がコントロールされる仕組みも解明した。さらにオートファジー(自食作用)の機能解析研究を通して、オートファジーが細胞ストレスで生じた異常蛋白質を選択的に処理する細胞内浄化機構の解明に成功した。これらのプロテアソームを基軸とした蛋白質分解系の先駆的な研究は、がんや神経変性疾患の発症機構解明に鋭く迫る研究であり、高齢化社会における医学研究への大きな波及効果が期待できる。
数学的な思考力を高める教材開発と認知心理学的な教科指導法について

数学的な思考力を高めるために、3つの段階を経て指導する教材を「数列」の分野で開発した。それは「1各分野における知識の根幹を、内容が持つ自然な流れの中で理解し記憶する2思考力を高めるのに有効な典型的問題を解き、思考の筋道を体験する(一度体験した思考の筋道をたどる問題は、二度目からは単なる知識の問題となるが、身につけておくべき思考力を体験することは学習者にとって有意義なことである)3解いたことのない問題を試行錯誤しながら解く」というものである。この教材構成により、生徒は「問題の意味を自分の知識に照らして吟味し、『解くべきこと』を設定し直す過程を経て、真に思考力を鍛える」ことができた。認知心理学によると高校生の年頃からエピソード記憶(特定の時間場所で自分が体験した出来事の記憶)が意味記憶(辞書的な意味の丸暗記)よりも次第に優位になってくる。そこで教材を身近なものに感じさせることができれば、エピソード記憶として内容を容易に覚えさせることができる。このための教科指導法を以下の三点に留意してまとめた。それは「1解法を思い出すよりも、何が起きているか具体的に状況を調べる動きが問題の理解に役立ち、かえって解法につながりやすいこと。2数理現象を調べるのに、図や表やポイントのまとめなどの視覚的な表現が有効であること。3生徒の動きを引き出すには、サジェストペディア(少しでも合っている部分を積極的に認め、間違えた部分は咎めない)の教授法が有効であること。」という方法である。この教科指導法を参考に、教師が自らの経験を加味して教えることで、比較的容易に生徒の中に知識・知見が形成されよう。さらにこの知識・知見の評価付けを生徒自らに行なわせることで、良質なチャンク(知識・知見のまとまり)が形成され、思考力の向上につながると期待できる。」という方法である。
蛍光トレーサーを用いた配列ナノ繊維群形成機構の解明とその応用

本研究の最終目的は、溶媒型電界紡糸(S-ELSP)法を用いて高配列ナノ繊維群の広幅マットを作製し、そのマットを用いて機能性材料を開発することであり、このための試みを数年行っている。この試みの中で作製されたマットは、高度に配列した繊維群とランダムに配列した繊維から構成されていることが分かった。この構造は、マット形成には二種類の性質の異なる機構が関与していることを暗示し、ランダム配列繊維を排除して配列度を向上させるためには、その機構の解明が不可欠であると判断した。そこで、本研究では、第1にナノ繊維の配列生成機構を解明する、第2にそれを用いて導電性マットを作製しその特性を評価することである。この目的に基づいて本年度研究を行い以下の様な結論を得た。1.溶媒型電界紡糸法で繊維形成過程をミクロに観察することを試みたが、テーラコーンからの繊維が吐出するまでは観測されたが、それ以上検討することが不可能と判断した。そこで、溶融型電界紡糸装置を開発し、繊維形成過程と配列群形成機構を観察した。この場合、生成される繊維の径が大きいため形成機構が分かり、溶媒型電界紡糸法における繊維群形成機構も推測できた。結果は、高分子に導入された電荷がコレクターから引力を受け、自己伸張して一本の微細繊維が形成されることが分かった。この伸張領域の長さは、10mm程度であることを明らかにし、この領域の制御がナノ繊維形成に対して重要であることを明らかにした。2.既存の溶媒型電界紡糸装置を用いて、導電率が高く、異方性導電率を持つ薄膜マットを開発した。具体的には、作製した装置を用いて導電率が高く、異方性導電率を持つ可撓性マットの開発をする。その方法は、(1)セルロースアセテート(CA)をアセトンとDMSOに溶解させ紡糸する。それと同時に、塩化第3鉄を含む水溶液も電界スプレーし、CAナノ繊維表面に塩化第3鉄が付着したマットを作製する。これをピロールガスに曝すことにより、ポリピロールを生成し、導電性を付与する。(2)ポリピロールの生成量と試料の透明度を分光光度計(要求装置)で調べる。(3)異方性導電率を4端子プロープ法(要求装置)で調べ、マット厚さとの関係を明らかにする。また塩化第3鉄のスプレー量がマット厚さと異方性導電率に及ぼす効果を明らかにする。(4)以上の結果をまとめ、高導電性マットの作製可能性を明らかにすることである。結果は、配列したナノ繊維マットは異方性のある導電性マットが開発できることが分かった。

本研究の最終目的は、溶媒型電界紡糸(S-ELSP)法を用いて高配列ナノ繊維群の広幅マットを作製し、そのマットを用いて機能性材料を開発することであり、このための試みを数年行っている。この試みの中で作製されたマットは、高度に配列した繊維群とランダムに配列した繊維から構成されていることが分かった。この構造は、マット形成には二種類の性質の異なる機構が関与していることを暗示し、ランダム配列繊維を排除して配列度を向上させるためには、その機構の解明が不可欠であると判断した。そこで、本研究では、第1にナノ繊維の配列生成機構を解明する、第2にそれを用いて導電性マットを作製しその特性を評価することである。この目的に基づいて本年度研究を行い以下の様な結論を得た。1.溶媒型電界紡糸法で繊維形成過程をミクロに観察することを試みたが、テーラコーンからの繊維が吐出するまでは観測されたが、それ以上検討することが不可能と判断した。そこで、溶融型電界紡糸装置を開発し、繊維形成過程と配列群形成機構を観察した。この場合、繊維径が大きく形成機構が分かり、溶媒型電界紡糸法における繊維群形成機構が推測できた。結果は、高分子に導入された電荷がコレクターから引力を受け、自己伸張して微細繊維が形成されることが分かった。この伸張領域の長さは、10mm程度であることを明らかにし、この領域の制御がナノ繊維形成に対して重要であることを明らかにした。2.既存の溶媒型電界紡糸装置を用いて、導電率が高く、異方性導電率を持つ薄膜マットを開発した。具体的には、作製した装置を用いて導電率が高く、異方性導電率を持つ可撓性マットの開発をする。その方法は、(1)セルロースアセテート(CA)をアセトンとDMSOに溶解させ紡糸する。それと同時に、塩化第3鉄を含む水溶液も電界スプレーし、CAナノ繊維表面に塩化第3鉄が付着したマットを作製する。これをピロールガスに曝すことにより、ポリピロールを生成し、導電性を付与する。(2)ポリピロールの生成量と試料の透明度を分光光度計(要求装置)で調べる。(3)異方性導電率を4端子プローブ法(要求装置)で調べ、マット厚さとの関係を明らかにする。また塩化第3鉄のスプレー量がマット厚さと異方性導電率に及ぼす効果を明らかにする。(4)以上の結果をまとめ、高導電性マットの作製可能性を明らかにすることである。結果は、配列したナノ繊維マットは異方性のある導電性マットが開発できることが分かった。本研究の最終目的は、第1にナノ繊維の配列生成機構を解明すること、第2にそれを用いて導電性マットを作製しその特性を評価することである。本年度行った研究内容を以下に記述する。昨年度の研究に於いて、溶媒型電界紡糸法で繊維形成過程をミクロに観察することを試みたが、テーラコーンから繊維が吐出するまでは観測されたが、それ以上観察することが不可能であった。そこで、新たにレーザ加熱部を有する溶融型電界紡糸装置を開発し、繊維形成過程と配列群形成機構を観察した。その結果以下の事が分かった。溶融した高分子から、一つのテーラコーンが形成され、このコーンから一本の繊維が繊維捕集体方向に直線的に形成されることが明らかになった。溶媒型電界紡糸法においては、テーラコーンから一本の繊維が形成され、これがwhipping運動しながら繊維堆積物が得られると報告されている。溶融型の場合,whipping運動が観察されなかったので、whipping運動は溶媒の蒸発に伴う現象であると結論出来る。1本の繊維がwhipping motionを伴わないで形成されるため、配列繊維マットを得るには単にコレクターの回転数を増加させることで達成される。
有毒ツツガムシ幼虫唾液腺細胞からのリケッチア脱出形式に関する電子顕微鏡的観察

つつが虫病は、有毒ツツガムシ幼虫がヒトに吸着した後に、幼虫体内のOrientia tsutsugamushiが人の体内に侵入して発症する感染症である。有毒ツツガムシ幼虫は、愛知県内の患者発生地域内で捕獲した野鼠に寄生していたLeptotrombidium pallidumに由来したもので、得られた幼虫の一匹をヌードマウスに吸着させると3週後に感染死した。12時間以上吸着させたマウスは全て感染死し、3時間以下の吸着時間では感染は成立しなかった。これらから6時間以上の寄生を受けた場合は感染の可能性が極めて高い。Orientia utsugamushiを保有するツツガムシ幼虫は、ほとんどの組織にリケッチアを認めるが、特に唾液腺細胞内には他の組織に比べ多数のリケッチアが存在することが電顕的に明らかになった。未吸着幼虫では腺腔へのリケッチアの脱出は全く認められなかったが、吸着24時間後の唾液腺の腺腔内には細胞から脱出したリケッチアが所々で観察された。唾液腺の遊離面には多数の微絨毛が存在し、その間隙には放出直後と考えられる宿主細胞膜で被われたリケッチアが認められた。分裂過程にあると思われるリケッチアも腺腔内で観察された。腺細胞からのリケッチアの放出は、細胞膜を細胞内から腺腔側に押し上げるようにしてリケッチアが腺腔側に移動し、やがて細胞膜をその外側に被った状態、いわゆるBuddingで放出される過程が電顕的に観察された。また腺腔内には、これらのリケッチアとは別に直径100-280nmの球形の小顆粒が多数観察される。これらの顆粒の細胞壁構造は、電子密度の高い外層と低い内層から成りOrientia tsutsugamushi由来と考えられた。腺腔に放出された顆粒の最外層は、唾液腺細胞の細胞膜で被われている。腺細胞遊離面に存在する微繊毛先端の細胞質内にも、腺腔内に見られる小顆粒と同様の顆粒が数多く認められた。これらの顆粒は腺腔へ放出され、その後導管へと移動し、宿主内に注入される可能性がある。また媒介者であるツツガムシは幼虫期のみ寄生することから幼虫の行動と幼虫体内のリケッチアの動態を観察することは極めて重要である。実験に使用した有毒ツツガムシ幼虫は、愛知県内の患者発生地域内で捕獲した野鼠に寄生していたLeptotrombidium pallidumに由来したもので、これを室内飼育し有毒コロニーをその中から分離した。得られた有毒ツツガムシ幼虫の一匹をヌードマウスに吸着させるとマウスは3週間後に感染死した。幼虫を12時間以上吸着させたマウスは全て感染死した。6時間吸着させたマウスは5匹中4匹が感染し、1匹は発症しなかった。3時間以下の吸着時間では感染は成立しなかった。これらから有毒ツツガムシ幼虫に6時間以上の寄生を受けた場合は感染の可能性が極めて高い。

Orientia tsutsugamushiを保有するツツガムシ幼虫を電顕的に観察するとそのほとんどの組織にリケッチアを認めるが、特に唾液腺細胞内には他の組織に比べ多数のリケッチアを認める。未吸着幼虫では腺腔へのリケッチアの脱出は全く認められなかったが、吸着24時間後の唾液腺の腺腔内には細胞から脱出したリケッチアが、所々で観察された。腺細胞の遊離面側には分泌顆粒と共に放出直前と考えられるリケッチアも認められた。唾液腺の遊離面には多数の微絨毛が存在し、その間隙には放出直後と考えられる宿主細胞膜で被われたリケッチアが認められた。分裂過程にあると思われるリケッチアも稀に腺腔内で観察された。腺細胞からのリッチケアの放出は、細胞膜を細胞内から腺腔側に押し上げるようにしてリケッチアが腺腔側に移動し、やがて細胞膜をその外側に被った状態、いわゆる`Budding'で放出される過程が電顕的に観察された。Orientia tsutsugamushiを保有するツツガムシ幼虫の唾液腺細胞内には多数のリケッチアが存在し、これらは幼虫が哺乳動物に寄生し組織液を吸入する際に、その最外層に唾液腺細胞の細胞膜を被って腺腔に放出される。腺腔内には、これらのリケッチアとは別に直径100280nmの球形の小顆粒が多数観察される。これらの顆粒の多くは内部が無構造である。腺腔に放出された顆粒の最外層は、唾液腺細胞の細胞膜で被われている。腺細胞の遊離面に存在する微絨毛先端の細胞質内にも、腺腔内に見られる小顆粒と同様の顆粒が数多く認められる。これらの顆粒は、腺腔から導管へと移動し、やがて宿主内に注入される可能性がある。唾液腺細胞内にもこれらの顆粒が多数分布する。顆粒の外被膜はOrientia tsutsugamushiと同様に電子密度の高い細胞壁外層と密度の低い細胞壁内層から構成されることからリケッチアに由来するものと考えられる。特に細胞内部が融解し崩壊しつつあるリケッチアの周辺部に集積して観察される。これらから崩壊したリケッチアの外被膜の断片がin vitroで観察されているようにループを形成して多数の小顆粒を生産していると考えられる。また一部は、培養細胞内で認められているように完全と思われるリケッチアの細胞壁の一部が部分的に突出し、これが離脱して顆粒を形成しているようである。一部には内部に構造物の存在が認められる顆粒も存在する。唾液腺細胞内ではリケッチアの分裂像も観察され、これらの増殖に関与し小顆粒は形成されていると考えられる。