hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
マイクロRNAシステムによる包括的骨代謝制御機構の解明

microRNA(miRNA)は骨代謝調節に関わることがわかっているが、その詳細は明らかではない。我々はDEAD-box型RNAヘリカーゼのp68がmiRNAプロセシング過程における重要な因子であることを明らかにしてきた。そこで、本研究ではmiRNAのプロセシングに関与するp68の骨組織特異的遺伝子欠損マウスの作成し、骨組織におけるmiRNAの機能解明を試みた。また、骨芽細胞分化調節機能を有する新たなマイクロRNAを同定し機能解析を行った。骨は運動・支持器官としての強度と血中カルシウム濃度の恒常性を保つため、一生涯にわたり形成と破壊を繰り返している。骨の形成は骨芽細胞、破壊(骨吸収)は破骨細胞が担っており、形成と破壊の巧妙なバランスによって骨組織の恒常性が維持されている。近年の高齢化社会の進展に伴い、高齢者の生活の質の向上と維持の面からも骨疾患に代表される運動機器疾患の制御と克服が社会的にも求められている。骨粗鬆症や関節リウマチ、変形性関節症等、正常な骨代謝の破綻を起因とする疾患は患者数が非常に多いにも関わらず、そのメカニズムの解明や創薬研究についてはあまり進んでいないのが現状である。このため、骨代謝の分子メカニズムを解明し、その成果を臨床応用することが社会的な急務となっている。本申請者は世界で初めてRNAヘリカーゼp68の全身性KOマウスの作製に成功し、その解析からp68特定のmiRNA群のプロセッシングに重要な因子であることを証明した。これらの知見を踏まえ、マウスを用いた個体レベルでののmiRNAによる骨代謝調節機能の解明を行うことにした。p68の生体内での機能を解明するため、p68 floxマウスを作製することとした。floxマウス作製にあたり、まずin vitroにおいてp68が骨芽細胞分化に影響を与えるかについて解析を行った。マウス線維芽細胞由来MC3T3-E1細胞を用い、siRNAでp68をノックダウンすると骨芽細胞分化マーカーであるアルカリフォスファターゼの活性が低下した。floxマウスの作成を行ったところ、4ラインの相同組み換えESクローンを取得した。これらESクローンよりキメラマウスの作製を行ったところ、全てのラインでキメラマウスを取得し、その後の交配によりES細胞を由来とするF1マウスの作出に成功した。骨は運動・支持器官としての強度と血中カルシウム濃度の恒常性を保つため、生涯にわたり形成と破壊を繰り返している。骨の形成は骨芽細胞、骨吸収は破骨細胞が担っており、形成と破壊の巧妙なバランスによって骨組織の恒常性が維持されている。骨粗鬆症や関節リウマチ、変形性関節症等、正常な骨代謝の破綻を起因とする疾患は患者数が非常に多いにも関わらず、そのメカニズムの解明や創薬研究についてはあまり進んでないのが現状である。本申請者は世界で初めてRNAヘリカーゼp68の全身性欠損マウスの作製に成功し、その解析からp68特定のマイクロRNA(miRNA)群のプロセッシングに重要な因子であることを証明した。一方、最近の研究の進展により、miRNAが骨代謝調節にも関係していることが明らかとなりつつある。これらのことからp68欠損マウスを用いて骨組織におけるmiRNAの機能解明を行うことにした。これまでの研究成果により、全身性p68欠損マウスは胚性致死であることが明らかとなっている。このため、p68floxマウスを新たに樹立し、骨組織特異的p68欠損マウスの作出を試みた。骨組織に存在する細胞の一種である骨細胞特異的Cre発現マウスであるDMP-1 Creマウスとfloxマウスを交配し、骨細胞特異的p68欠損マウスの作出に成功した。また、骨代謝は神経系によっても制御されることから、神経特異的Cre発現マウスであるSynapsin I Creマウスとの交配を行い神経特異的p68の作出も試みた。また我々は、骨芽細胞分化に伴い発現が上昇するmiRNAを新たに同定した。そこで、骨芽細胞分化に対する新規miRNAの影響を検討したところ、骨芽細胞分化を制御していることを見出した。骨代謝学in vitroの解析と共に、本研究課題の大きな柱であるfloxマウスの作成に成功した。作成したfloxマウスと各種骨細胞特異的Creマウスを交配し、骨組織の変化を検討する。また、培養細胞系においても骨芽細胞だけでなく、破骨細胞に対する影響も検討する。実験消耗品・試薬の効率的な使用により、予算の使用額が削減されたため。目的とするfloxマウスの作成に成功したため、動物実験に関連する費用の充実を図る。
森林生態系における細根生産量と養分吸収能が窒素動態に及ぼす影響

ミズナラと林床植生であるクマザサの細根生産および養分吸収の季節変化パターンの違いを同一環境下で別々に栽培することにより測定した。ミズナラとクマザサでは異なる細根生産および窒素吸収の季節変化パターンを示した。この違いは葉のフェノロジーの違いによると考えられた。このことから森林生態系の窒素動態の時間変化を評価するうえでは、樹木だけでなく林床植生も考慮する必要性が示された。森林植生の窒素吸収は、森林生態系における土壌-植生系の窒素動態および渓流水質を決定する上で重要な要因である。土壌-植生系において植生と土壌の境界にあり、養分吸収を担っているのが、細根とよばれる直径数mmの植物根である。細根の寿命は比較的短く入れ替わりが速いことから、細根動態や窒素吸収の時間変化は窒素動態に影響を及ぼすと考えられる。しかし細根の動態や窒素吸収能に関する知見は非常に限られている。さらに日本の森林では林床植生が比較的大量に繁茂しているが、林床植生が窒素動態に果たす役割に着目した研究例は少ない。そこで本研究では、樹木だけでなく代表的な林床植生であるササにも着目し、細根生産量と窒素吸収能を同時に測定することにより、森林植生の窒素吸収量の季節変化を明らかにすることを目的とした。本研究は森林の物質循環において重要な役割を果たすと考えられる植物の細根(直径<2mm)の動態と機能を評価することを目的とした。多様な植生が生育する森林生態系の根圏は複雑系であり、細根の機能を理解するためにはグループごとの細根動態パターンや機能を評価する必要がある。本研究では、樹木だけでなく冷温帯林において密生する林床植生の細根の動態や機能に注目した。1年目にはミズナラ(樹木)とクマザサ(林床植生)を用いた栽培実験を行い、両者の細根動態パターンや窒素吸収能を比較した。細根動態観測のために、それぞれ別の根箱で栽培し細根生産の時間変化を観測した。細根生産の観測は、毎週または2週間ごとに根箱の側面をスキャナーで撮影し、画像上で個々の根の長さを測定することによった。このように非破壊的に観測することにより、生産と枯死・消失が同時に起こっている細根の動態パターンを正しく評価することができ、さらに細根が入れ替わる速度や一年間につくられた細根量を評価することができる。また、窒素吸収能評価のために、根と葉の硝酸還元酵素活性を測定し、根の呼吸活性を評価するために根呼吸速度を測定した。その結果、ミズナラの細根生産は6月から8月下旬まで高く、9月以降は低下した。ミズナラの根呼吸量は細根生産の季節変化と同調し、地温上昇に伴い指数関数的に上昇した。このことから地温が細根生産や呼吸活性に影響を及ぼす要因であることが示唆された。一方、クマザサの細根生産速度は67月までと、910月に高かった。ササの新葉は9月10月に大量に展開し、その時期の光合成量も多いことから、光合成産物の生産量など地上部の要因の影響も受けていると考えられた。ミズナラとクマザサでは、細根生産の季節パターンが異なることが明らかになった。樹木と林床植生の細根生産および養分吸収の季節変化パターンの違いを明らかにするために、冷温帯林の優占樹種であるミズナラと代表的な林床植生であるクマザサを別々に栽培し、根箱法による細根生産の観測と硝酸還元酵素活性の測定を行った。細根生産の観測では、スキャナーを用いて根箱側面を2週間間隔で観測し、画像上で根長を測定した。測定間隔ごとの根の伸長量を根生産速度とした。また根フェノロジーと地上部フェノロジーの関係を明らかにするために、全当年葉の葉面積やクマザサの光合成速度を測定した。硝酸還元酵素活性の測定は、根生産の測定とは別に栽培したミズナラとクマザサを用いて8月,10月,2月,5月の4回行った。根生産速度はミズナラでは7月にピークがあったのに対して、クマザサでは7月と10月の二山型ピークとなり、異なる季節変化パターンを示した。ミズナラでは地温と根生産速度の間に非常に強い相関があったが、クマザサにおいては地温だけでは説明できなかった。一方、クマザサの葉フェノロジーはミズナラとは異なり、当年葉は夏後半に展開した。またクマザサの光合成速度は葉面積変化に同調して9月に最大になった。このことからクマザサでは夏後半の光合成で獲得した炭素を用いて10月に細根生産速度が高まったと考えられた。硝酸還元酵素活性もミズナラとクマザサでは異なる季節変化パターンを示し、この違いも葉や根の生産パターンの違いと関係しているものと考えられた。以上のことから、さまざまな種が混在する森林生態系においては、根の生産や機能の季節性は樹木と林床植生では異なり、根の機能を評価する際には樹木だけでなく林床植生をも考慮する必要があることが示唆された。

植物細根は植物と土壌の境界にあり、その生産・枯死プロセスは陸域生態系の炭素循環において重要な経路となり、細根生産量は生態系の純一次生産に寄与するほか、窒素などの養分循環に影響を及ぼすことと考えられている。一方、地球規模での環境変化が進行しつつあり、環境変動下での細根動態を評価することも必要である。本研究では、積雪寒冷地域において、積雪量の変化が林床植生の細根動態パターンに及ぼす影響を明らかにするために、北海道北部においてクマイザサを根箱で栽培し、スキャナーを用いて細根生産パターンを測定した。北海道北部における細根バイオマスの主要な構成要素であり、細根への直接的なダメージのほか地上部へのダメージも細根生産に影響を及ぼすと考えられるササを供した。針広混交林においてササを含む50cm四方の土壌を採取し、土壌の側面にアクリル板を取り付けて根箱とし、実験苗畑に移植した。スキャナーを用いて根箱側面の細根を含む画像を撮影した。冬季間に積雪除去処理、および土壌凍結処理を行い、処理区は積雪除去区、土壌凍結区、および対照区とした。土壌凍結区では、外気に開放したパイプを地中に埋設することにより土壌凍結を引き起こした。しかしながら、実験をした年の冬季初期の積雪量が極端に少なかったことから、全処理区でササ地上部は枯死した。一方、根系は全処理区で生存が確認されたが、処理の影響は明らかでなかった。ササは地上部が枯れた場合でも地下茎や細根への炭素や養分の蓄積があるために、生存できるものと考えられた。植物細根は植物と土壌のインターフェースであり、その生産・枯死プロセスは陸域生態系の炭素循環において重要な経路となり、細根生産量は生態系の純一次生産に寄与するほか、窒素などの養分循環に影響を及ぼすことと考えられでいる。またわが国の冷温帯林は林床植生が密生していることも特徴であり、森林生態系の機能を評価するためには、樹木だけではなく林床植生も含めて評価することが必要である。本研究では、林床植生が密生する冷温帯林における冬季を含めた樹木および林床植生の根の動態や機能を評価した。北海道北部の林床にクマイザサが密生する森林において、冬季の積雪下にある細根を表層土壌10cmから採取した。2月の積雪は約1.5mあった。その結果、冬季でも樹木およびササの細根が観察された。2月の細根バイオマスは樹木は155-227,ササが21-77gm-2を示した。これは当該地域において報告されている生育期の細根バイオマスと比べて著しく低いものではない。したがって冬季においても植物の細根は積雪下で維持されていることが明らかになった。また先行研究ではササが細根バイオマスの主要な構成要素であることが報告されているが、本研究の結果は樹木の細根バイオマスの方がササよりも大きく、樹木・ササの根圏での優占度の空間的ばらつきが大きいことが示唆された。また今回は表層10cmの細根バイオマスで樹木根の方が大きかったことから、樹木細根がより土壌表層に集中して分布する可能性が示された。
歯周組織炎症におけるアポトーシスの検索(炎症組織におけるプログラムされた細胞死)

歯周炎の進行過程において歯周組織は破壊され、歯周組織を構成する細胞および炎症組織に浸潤する炎症細胞は死滅する。これらの死は壊死(ネクローシス)と考えられてきたが、歯周組織を構成する細胞は炎症細胞の浸潤によるシグナルで、また炎症細胞はそれ自体のプログラムで自己消去する細胞死(アポトーシス)によると考えられる。そこで、歯周組織を構成する細胞および炎症浸潤細胞のどの細胞にアポトーシスが誘導されているか、また、DNA電気泳動により炎症歯肉組織において、アポトーシスに伴うクロマチンDNAのヌクレオソーム単位の断片化がどの程度進んでいるかを検索した。歯周炎罹患歯肉においてnick end labeling法、アポトーシス関連抗Le^Y抗体による組織学的検索を行ったところ、単核白血球、上皮細胞、線維芽細胞、多形核白血球にアポトーシスが誘導されていることが示唆された。また、DNAプローブであるHoechst33258による検索を行ったところ、アポトーシスの特徴である核クロマチンの凝縮と断片化が認められた。また、試料からDNAを抽出した後、アガロースゲル電気泳動を行いDNA断片化の検索を試みたが、明らかな約180塩基対のDNAラダーパターンは確認できなかった。次に試料より調製した細胞のアガロース浮遊液にティアドロップアッセイを行いDNA断片化の検索を行った結果、アポトーシスが誘導されている細胞に見られる“comet"様の像が少数であるが観察された。以上のことより炎症歯肉においてアポトーシスが様々な細胞において誘導されていることが明らかであるが、アポトーシスに伴うクロマチンDNAのヌクレオソーム単位の断片化がどの程度進んでいるかについては不明である。
グラフベース機械学習ソフトウェア工学の研究

2018年度の目標:ソフトウェア開発における開発組織とその成果物を表現する高い表現能力を持つ新たな言語としてプロパティグラフを基礎とするグラフ言語SEGL(Software Engineering Graph Language)の提案とそれを用いた開発組織の分析方法の提案にある.具体的成果:オープンソースソフトウェア(OSS)開発を対象としてSEGLの具体的言語としてSCGM(Software Community Graph Model)を定義し,それを用いた開発組織と成果物のモデル化とその上で機械学習の一つである表現学習による特徴量分析方法を提案した.提案方法を実行するソフトウェアを開発し,主要な機械学習OSSを含む10種のOSS開発の過去10年間分の開発データに適用し,提案方法の有効性,妥当性を評価した.成果の意義と重要性:従来困難であった大規模ソフトウェア開発組織の時間的変化を表現可能とし,グラフ理論に基づく局所的特徴分析方法と機械学習(表現学習)による広域的特徴分析方法を提案し,開発構造の変化に関して1)非中核,準中核,中核の3層進化モデル,2)3つの成長パターン,3)開発者間の相互作用の変化を明らかにした.さらに,開発者の行動のグラフ表現から抽出した特徴量のクラスタリングから開発者が3つのクラスに分類できることを発見した.提案方法は表現学習をソフトウェア開発構造分析に適用する新しい方法を提案し,実際の開発組織特性を明らかにした点で新規な成果である,また,ソフトウェア開発の組織構造をプロパティグラフに基づく表現を可能とした点で,ソフトウェア工学における新らたな成果と言える.さらに,,実際に10種のOSS開発組織の過去10年間の開発活動をSCGMで表現し,従来知られていなかったOSS開発活動の準中核的開発者の存在の発見など,新たな特性を明らかにした点で新たな意義ある成果を得ている.以上の成果から2018年度に計画していた目標を達成できていると言える.2019年度は,2018年度の成果を発展させ,次の課題に取り組む.1.SCGMの一般化:SEGLの具体的言語として定義したSCGLを一般化し,SEGLの表現すべき内容とその言語仕様の研究を行う.2.SCGM上での機械学習の方法の深化:近年のグラフニューラルネットワーク(GNN)やGraph2vecなどのグラフの離散構造化の方法を適用した,SEGMの新たな分析方法の研究と実際のデータに適用しその有効性,妥当性の評価を行う.あわせて,分析過程と結果の視覚化方法の研究を行う.3.機械学習に学習過程を制御するプロセスの提案:機械学習において,適切なデータで効率的に学習するためのプロセスをソフトウェア工学のプロセス技術を基礎として研究し,実際のデータに適用し,その有効性,妥当性を評価する.2018年度の目標:ソフトウェア開発における開発組織とその成果物を表現する高い表現能力を持つ新たな言語としてプロパティグラフを基礎とするグラフ言語SEGL(Software Engineering Graph Language)の提案とそれを用いた開発組織の分析方法の提案にある.具体的成果:オープンソースソフトウェア(OSS)開発を対象としてSEGLの具体的言語としてSCGM(Software Community Graph Model)を定義し,それを用いた開発組織と成果物のモデル化とその上で機械学習の一つである表現学習による特徴量分析方法を提案した.提案方法を実行するソフトウェアを開発し,主要な機械学習OSSを含む10種のOSS開発の過去10年間分の開発データに適用し,提案方法の有効性,妥当性を評価した.成果の意義と重要性:従来困難であった大規模ソフトウェア開発組織の時間的変化を表現可能とし,グラフ理論に基づく局所的特徴分析方法と機械学習(表現学習)による広域的特徴分析方法を提案し,開発構造の変化に関して1)非中核,準中核,中核の3層進化モデル,2)3つの成長パターン,3)開発者間の相互作用の変化を明らかにした.さらに,開発者の行動のグラフ表現から抽出した特徴量のクラスタリングから開発者が3つのクラスに分類できることを発見した.提案方法は表現学習をソフトウェア開発構造分析に適用する新しい方法を提案し,実際の開発組織特性を明らかにした点で新規な成果である,また,ソフトウェア開発の組織構造をプロパティグラフに基づく表現を可能とした点で,ソフトウェア工学における新らたな成果と言える.さらに,,実際に10種のOSS開発組織の過去10年間の開発活動をSCGMで表現し,従来知られていなかったOSS開発活動の準中核的開発者の存在の発見など,新たな特性を明らかにした点で新たな意義ある成果を得ている.以上の成果から2018年度に計画していた目標を達成できていると言える.2019年度は,2018年度の成果を発展させ,次の課題に取り組む.1.SCGMの一般化:SEGLの具体的言語として定義したSCGLを一般化し,SEGLの表現すべき内容とその言語仕様の研究を行う.2.SCGM上での機械学習の方法の深化:近年のグラフニューラルネットワーク(GNN)やGraph2vecなどのグラフの離散構造化の方法を適用した,SEGMの新たな分析方法の研究と実際のデータに適用しその有効性,妥当性の評価を行う.あわせて,分析過程と結果の視覚化方法の研究を行う.3.機械学習に学習過程を制御するプロセスの提案:機械学習において,適切なデータで効率的に学習するためのプロセスをソフトウェア工学のプロセス技術を基礎として研究し,実際のデータに適用し,その有効性,妥当性を評価する.2018年度末に入手予定であった書籍の発行が2019年度にずれ込んだため.
フローサイトメトリー法を利用した活性化血小板検出法の臨床応用

心筋梗塞、脳梗塞で代表される致死的動脈血栓症の治療、特に脳梗塞の再発予防などに抗血小板薬が有効であったとする大規模臨床研究が報告されている。一方で、フローサイトメトリーと血小板活性化特異的なモノクローナル抗体を利用した血小板活性化測定法は、簡便で、再現性、定量性、感度、特異度などにおいて優れている。今回、申請者は、この方法を用いて、(1)モノクローナル抗体(MoAb)として、血小板活性化によって出現するフィブリノゲン受容体を認識するPAC1、血小板の放出反応に伴って血小板表面に出現するα顆粒膜糖蛋白CD62を標識するMoAb、の2種類のMoAbを用い、疾患別、病態別に2種類のMoAb陽性パターンの特徴を検討した。(2)対象患者:急性脳梗塞、慢性脳梗塞、睡眠時無呼吸症候群など血小板活性化の測定は、これまでの基礎的研究の成果をふまえて、次のように行なった。21ゲージの翼状針をもちいて2シリンジ法により採血し、3.14%クエン酸ナトリウム1/10容を加えて抗凝固した。15分以内に蛍光色素FITC-PAC-1、PE-CD62P、PerCP-MoAb-CD61の混合液と15分間反応させ、さらに1%パラホルムアルデヒドで固定し、試料とした。フロサイトメトリーメーターは、BD社FACScan(現有機器)を用いて3カラーで測定した。結果;急性および慢性脳梗塞患者群は、血小板活性化マーカーが正常人と比較し有意に高値となり(PAC-1、MoAb-CD62陽性率、P<0.01)、さらにCD62Pについては、急性期が慢性期より有意に高値となった(P<0.05)。また、睡眠時無呼吸症候群においては、PAC-1、CD62Pともに正常人と比較し有意に高値となったが、特にPAC-1が高値であるのが特徴であった。
ブラシカオレラセアの根こぶ病抵抗性の遺伝子解析と抵抗性選抜DNAマーカーの開発

本研究では,キャベツ(B. oleracea)に同定されている5つの根こぶ病抵抗性QTLから,抵抗性遺伝子をクローンニングするとともに,最も効果の大きいQTL, pbBo (Anju1)近傍に分子マーカーを位置づけ,マーカー利用選抜技術を確立することが目的である。PbBo (Anju) 1領域とシンテニーのあるシロイヌナズナの第5染色体に着目しての開発したESTマーカーについて, SCAR化を行った。また,同領域がより近縁種であるB. rapaの第2染色体とも相同性を示すことを利用して,分子マーカーを設計した。その結果,設計した42ESTマーカーのうち, 22マーカーをPbBoAnju1領域, 13cM内にマップできた。抵抗性親×罹病性親由来のF2分離集団において,今回作成したPbBoAnju1近傍マーカーを用いたDNA検査の結果と病原菌の接種検定の結果が一致し, DNAマーカー選抜が確実に機能することを確認することができた。PbBo (Anju) 1が存在すると推定される領域とシンテニーを示すシロイヌナズナやB. rapaゲノムの対応領域が明らかになった。この結果と,次世代シーケンサーを用いた抵抗性親と罹病性親の全ゲノムシーケンス解析から決定したPbBo (Anju) 1が座乗するゲノム領域のシークエンス結果を合わせて,現在, PbBo (Anju) 1座の候補遺伝子の同定を行っている。現時点で, NBS-LRRモチーフなど病害抵抗性遺伝子の特徴を持つも複数の遺伝をターゲット領域内に見いだしており,これらを根こぶ病抵抗性遺伝子(PbBoAnju1)の候補遺伝子として挙げている。(抄録なし)本研究で単離を目指しているBrassica oleraceaの根こぶ病抵抗性遺伝子pbBo(Anju1)近傍に,さらに分子マーマーを位置づけるため,ゲノム情報が決定されているB.rapaとArabidopsisの情報を用いB.oleracea根こぶ病抵抗性遺伝子領域に54個のArabidopsis遺伝子と相同性を持つ遺伝子を同定した。これらのArabidopsis遺伝子の情報を用い,B.oleraceaでPCR増殖できる分子マーカープライマーを16個デザインした。これらのうち,pbBo(Anju)1領域に4つのESTマーカーをマップすることに成功した。次に,さらに詳細なマップを作成するため,F2分離集団1,467個体を用いスクリーニングを行いpbBo(Anju)1領域領域において染色体組換えを持つ46個体を選抜した。その結果,pbBo(Anju)1領域に新規ESTマーカーとBRMS228マーカーを座上させることに成功した。さらに,マップで得られたpbBo(Anjul)近傍マーカーを用い,Brassica oleracea var. alboglabraのBACライブラリーをスクリーニングしてPbBoAnju1領域を含むBACクローン#38を単離した。得られたクローンのDNAシークエンスを一部決定して,現在,全体シークエンスを決定すべく実験中である。また,BACクローン#38に対応した領域を単離するため,pbBo(Anju)1の同定に用いた根こぶ病抵抗性親'安寿'からコズミドライブラリーを作成した。我々の以前の研究で、根こぶ病に対して罹病性のブロッコリー'GC'と抵抗性のキャベツ'安寿'の交雑から得たF3後代を用いて,根こぶ病抵抗性に関与する量的形質遺伝子座(QTL)の解析を行った結果、大きい効果を持つAnju-1のほか比較的小さい効果をもつAnju-2,-3,-4,GC-1の合計5つの抵抗性QTLを明らかにした。しかし,5つのQTLが根こぶ病抵抗性に及ぼす効果については明らかになっていないほか,5つのQTLにリンクしているDNAマーカーを用いて,各抵抗性遺伝子の有無を検査できるか明らかになっていない。そこで,課題のひとつとして,これらの点を明らかにすることを目的に実験を行った。5つのQTLにおいて抵抗性の遺伝子を含むかどうかを判定するにDNAマーカーを各QTLにおいて23個選んだ。このDNAマーカーを用い,罹病性'GC'×抵抗性'安寿'由来のF3後代において,各個体がどのような抵抗性QTLを持つか検査を行い,抵抗性QTLを単独で持つ個体や,複数組み合わせて持つ個体を選抜した。選抜個体は,接種試験を行い,その個体の抵抗性程度を判定した。その結果,Anju-2,-3,-4を単独で含む系統は極めて罹病度が高かったが,Anju-1に加え-2,-3,-4を含む個体は比較的強い抵抗性を示した。また,Anju-1に-2,-3,-4を累積する毎に,抵抗性が強くなることが明らかになった。本実験で,高度病害抵抗性を植物に付与するには抵抗性遺伝子の集積が必要なことが明らかになったほか,本研究で用いた根こぶ病抵抗性遺伝子連鎖マーカーを用いると,正確に根こぶ抵抗性遺伝子を選抜することができることが分かった。一方,根こぶ病抵抗性遺伝子の遺伝子単離に向け、3つのQTLについて、QTL領域に染色体組換を起こした個体を選抜するとともに、ファインマップの作成を行なった。

PbBo (Anju) 1領域とシンテニーのあるシロイヌナズナの第5染色体に着目しての開発したESTマーカーについて, SCAR化を行った。また,同領域がより近縁種であるB. rapaの第2染色体とも相同性を示すことを利用して,分子マーカーを設計した。その結果,設計した42ESTマーカーのうち, 22マーカーをPbBoAnju1領域, 13cM内にマップできた。抵抗性親×罹病性親由来のF2分離集団において,今回作成したPbBoAnju1近傍マーカーを用いたDNA検査の結果と病原菌の接種検定の結果が一致し, DNAマーカー選抜が確実に機能することを確認することができた。PbBo (Anju) 1が存在すると推定される領域とシンテニーを示すシロイヌナズナやB. rapaゲノムの対応領域が明らかになった。この結果と,次世代シーケンサーを用いた抵抗性親と罹病性親の全ゲノムシーケンス解析から決定したPbBo (Anju) 1が座乗するゲノム領域のシークエンス結果を合わせて,現在, PbBo (Anju) 1座の候補遺伝子の同定を行っている。現時点で, NBS-LRRモチーフなど病害抵抗性遺伝子の特徴を持つも複数の遺伝をターゲット領域内に見いだしており,これらを根こぶ病抵抗性遺伝子(PbBoAnju1)の候補遺伝子として挙げている。23年度に実施する事項として,根こぶ病病害抵抗性遺伝子の位置を絞り込むため,現在まで作成した連鎖地図に,さらにSSRマーカー(単純反復配列マーカー)を追加することを挙げていたが,pbBo(Anju)1領域に新規ESTマーカーとBRMS228 SSRマーカーを座上させることに成功した。さらに,23年度内にBACライブラリーの作成およびコスミドライブラリーを作成でき,現在,根こぶ病QTLPbBoAnju1領域を含むと思われる#38クローンについてDNAシークエンスを決定中である。所期に設定したマップの精密化とBACライブラリーの作成およびコスミドライブラリーが予定どおりできたので,本研究が順調に進展していると判断した。1年目に実施予定であった「'キャベツ'の根こぶ病QTL領域のさらなるファインマッピングと抵抗性選抜マーカーの作成」については,抵抗性遺伝子そのものから設計したDNAマーカーではないが,抵抗性遺伝子の近傍マーカーを使い,植物体が抵抗性遺伝子を含むかどうか判定できた。そのマーカーを用い,複数の抵抗性遺伝子を集積した個体(系統)は,根こぶ病に対して極めて強い抵抗性を示すことを実証した。この結果より,本研究で用いた根こぶ病抵抗性遺伝子マーカーは,キャベツ等の根こぶ抵抗性育種を推進する上で,極めて有効と思われた。接種試験による候補遺伝子座乗領域の絞り込むため,根こぶ病抵抗性QTL領域に組み換えをもつ個体の選抜と後代個体に接種試験を行う。BACクローン#38に対応し,pbBo(Anju)1を含みと思われるコスミドクローンを単離し,コスミド末端のシークエンス,プライマーの作成を行い,根こぶ病抵抗性QTL近傍領域のコスミドコンティグを作成する。コンティグ作成と平行して,コスミドDNAをショットガンクローニングでサブクローン化し,コンティグ領域内をシークエンスし,根こぶ抵抗性の候補遺伝子を同定する。
戦後の日本におけるゲーテ受容

戦後の日本におけるゲーテ受容について語るとき、最も重要なのは、『ファウスト』である。ゲーテの『ファウスト』の中核には悪魔との契約譚がある。したがって日本の作家が『ファウスト』文学を受容するときには、「悪魔との契約」という主題を日本の風土に馴染ませなければならない。ところがこれは決して容易なことではない。というのも日本人の多くは、「悪魔との契約」はもとより、悪魔の存在そのものを信じてはいないからだ。遠藤周作は小説『真昼の悪魔』(1980年)のなかで、日本人にとっての悪魔の間題に真正面から挑んだが、その試みは成功したとはいえない。これに対して三島由紀夫は「悪魔」ではなく「通り魔」のような「魔」を間題にし、より日本の現実に即した考察を行なった。しかもその「魔」の考察を三島はゲーテの『ファウスト』と結びつけ、三島の「わがファウスト」を書いた。それが彼の『禁色』と『卒塔婆小町』である。この2作品の中核をなすのは、美と醜の対立であり、メフィストには「醜」の役が与えられている。石川達三は『四十八歳の抵抗』において、ゲーテの『ファウスト』を下敷きにしながら、現代日本のサラリーマンの悲哀に満ちた生活をパロディ風に描き出した。ファウストのように人生をやり直そうと試みた主人公の試みは挫折せざるをえない。ファウストのように生きることは、現代の日本においては不可能だということを石川達三は示した。手塚治虫は生涯に3度、ゲーテの『ファウスト』を漫画化している。彼の諸作品の中心にあるテーマは、科学技術による地球環境の汚染であるが、このテーマは遺作の『ネオファウスト』に明瞭に表れる。ゲーテの『ファウスト』に出てくる人造人間ホムンクルスを手塚はクローン人間に置き換え、大量生産されたクローン人間による軍隊によって地球が壊滅する。『ネオファウスト』によって手塚は、漫画がどれほど強い時代批判力を持っているかを示すことに成功した。平成13年には、主として三島由紀夫と辻邦生におけるゲーテ受容を研究した。三島由紀夫は『禁色』や「卒塔婆小町」(『近代能楽集』所載)を書いていた頃、ゲーテと特に取り組んでいた。三島が人文書院版『ゲーテ全集』第4巻に「プロゼルピーナ」を訳したのは昭和30年代前半のことであり、この頃にもゲーテに対する強い関心が続いていたものと思われる。この訳は三島自身から申し出られたものだということを、人文書院のかつての編集者(樋口至宏氏)に会って知った。また三島と陽明学との関係を研究している林田明大氏からも彼の三島観を聞いた。『禁色』や「卒塔婆小町」は三島由紀夫の「わがファウスト」と呼べるものであり、『禁色』に出てくる南悠一と檜俊輔はそれぞれファウストとメフィストに、また「卒塔婆小町」に出てくる若き詩人と100歳の小野小町もファウストとメフィストに当たる。そのようなものとして三島は両作品を構想したというテーゼを裏づけるべく、調査・研究をおこなった。作家とは暗い鬱勃たる情念のなかに閉じ込められ、悲劇的な生涯を送るものであるという俗説がある。この俗説からすれば、辻邦生は「悲劇的な作家」とは正反対の生の明るい面を体現していた。辻邦生がその点で、同じく人生の「明」の面を好んだゲーテに惹かれたのは偶然ではない。

辻邦生のゲーテ論である「ゲーテにおけるよろこびと日々」には、人生とは楽しむべきものであると考えたゲーテの生き方が生き生きと活写され、これまでのゲーテ学者が見落としていたようなゲーテの本質が浮かび上がっている。しかし、ゲーテは決して明るいだけの人ではなかった。同じく辻邦生氏も、一見すると明るい面の裏には、多くの苦悩が隠されていたことを、未亡人の辻佐保子から詳しく聞くことができた。平成14年度には、主として石川達三と三島由紀夫と手塚治虫におけるゲーテ受容を研究した。石川達三の『四十八歳の抵抗』はゲーテの『ファウスト』を下敷きにして書かれているが、しかしその主人公はゲーテのファウストとは似て非なる人物である。ゲーテのファウストが快楽などに満足せず、精神的に高いものを目指してひたすら努力したのに対し、『四十八歳の抵抗』の主人公は、ファウストが禁じた快楽の甘い蜜を吸おうとしている。このような主人公のアヴァンチュールを通して石川達三は、1950年代の日本のサラリーマンのわびしい生活と夢、そして当時の風俗を描き出している。石川達三が描いた風俗がどこまで正しいのか確かめるために、慶応大学の前田富士男氏らの協力を得て、1950年代の日本の風俗を写した絵画や写真に当たった。三島由紀夫の最初の「わがファウスト」と言うべき「卒塔婆小町」を『ファウスト』との関係を踏まえて演出した例がないかどうか、最近の蜷川幸男の演出にいたるまで上演史を調べたが、そのような演出は残念ながら見当たらなかったものの、三島の第二の「わがファウスト」と言うべき『禁色』については、共立女子大学の大石直記氏に色々と教えていただくことができた。手塚治虫は『ネオファウスト』のなかで第1部のみならず、第2部--特に人造人間ホムンクルスのモティーフ--も取り上げ、これをクローン人間の問題として描いた。この点に関する興味深い文献を見つけた。シェイクスピアの『マクベス』とゲーテのホムンクルスを結びつけた論文である。魔女たちはマクベスに、「母親の腹から生まれた者は、マクベス、お前を殺せない」と語るが、クローン人間はまさしく「母親の腹から生まれなかった者」である。この論文を援用しながら、手塚治虫の『ネオファウスト』とゲーテの『ファウスト』第2部の関係を扱った。
小胞体カルシウムポンプの触媒部位からCa^<2+>輸送部位への共役エネルギーの伝達機構

筋小胞体Ca^<2+>-ATPase(SERCA1a)はATP加水分解に共役してCa^<2+>を細胞質から小胞体内腔に汲み上げ、Ca^<2+>による細胞機能制御に必須の役割を果たす。Ca^<2+>輸送部位は膜貫通ドメインにあり、細胞質に突き出た領域の3つのドメイン(A、P、N)に触媒部位がある。リン酸化部位がP(リン酸化ドメイン)に、ATPのアデノシン部分の結合ポケットはN(ヌクレオチド結合ドメイン)に存在する。Ca^<2+>輸送は、細胞質の3つのドメインの相互作用の変化が輸送部位に伝達されることによると予想されている。我々は、リン酸化中間体の構造転換(E1P→E2P)に伴いAドメインが90°以上も大きく回転しドメインPへ結合することを示唆した。1.Tyr^<122>などの7残基がドメインA-Pの界面に形成する疎水性クラスターがEPの構造転換と小胞体内腔へのCa^<2+>放出に必須であろうこと、さらに構造転換後のE2Pの構造形成に重要な役割を担うことを明らかにした。2.本酵素(E2)にBe/F、Al/F、またはMg/Fが結合したの複合体が本酵素のリン酸化中間体とその加水分解過程の安定なアナログであり、各々、基底状態、遷移状態、酵素・生成物複合体のアナログであることを示した。さらに、リン酸化中間体の加水分解過程における触媒部位の変化によりCa^<2+>輸送路が閉じて小胞体内腔からCa^<2+>を漏出させない構造が獲得されることを示した。3.ダリエー病の原因となるSERCA2b変異体3種I274V,L321F,M719Iの変位酵素について発現量と速度論的解析を行った。I274VとM719Iが野生型にかなり近い性質をもつことから、haploinsufficiencyを避けるためには厳格な機能要求があること、また内腔のCa^<2+>感受性低下が見られたL321Fではこの性質と神経精神的病態との関連性が指摘された。1.筋小胞体Ca^<2+>ポンプATPaseはリン酸化部位を含む細胞質ドメイン(A、P、N)とCa^<2+>輸送部位を含む膜貫通ドメインより成る。このAとPの接触部位の疎水性結合性相互作用が、本酵素のATP分解反応におけるリン酸化中間体(EP)とその加水分解過程に重要な役割を果たしていることを示した。2.Ca^<2+>ポンプ(E2)にBe^<2+>とF^-、Al^<3+>とF^-、およびMg^<2+>とF^-が結合したBe/F/E2、Al/F/E2、Mg/F/E2の複合体は、EPとその加水分解過程の安定なアナログであり、それぞれ、基底状態アナログ(Be/F/E2)、遷移状態アナログ(Al/F/E2)、酵素・生成物複合体アナログ(Mg/F/E2)であることを示した。さらに、リン酸化中間体の加水分解過程における触媒部位の変化によりCa^<2+>輸送路が閉じて小胞体内腔からCa^

<2+>を漏出させない構造が獲得されることを示した。3.優性遺伝性角化異常症ダリエー病は、小胞体Ca^<2+>ポンプ2b型の遺伝子異常によりおこる。ダリエー病家系の遺伝子解析より報告された51種のミスセンス変異について発現と機能を解析した。そのうち48種では、各々の変異がポンプの発現と機能に強い阻害をもたらすことを示した。残り3種は、僅かなCa^<2+>親和性(L321F、M719I)あるいは僅かなCa^<2+>輸送速度の低下(I274V、M719I)、また小胞体内腔に蓄積したCa^<2+>によるfeedback阻害の不具合(L321F)をもたらした。特にL321Fでは小胞体内腔のCa^<2+>濃度が異常に高く設定されることを意味する。この家系の患者は皮膚症状に加えて神経症状・行動異常を呈している。小胞体内の異常な高濃度Ca^<2+>が小胞体の機能に影響し、脳・神経細胞において障害をもたらすことが示唆された。筋小胞体Ca^<2+>-ATPase(SERCA1a)はATP加水分解に共役してCa^<2+>を細胞質から小胞体内腔に汲み上げ、Ca^<2+>による細胞機能制御に必須の役割を果たす。Ca^<2+>輸送部位は膜貫通ドメインにあり、細胞質に突き出た領域の3つのドメイン(A、P、N)に触媒部位がある。リン酸化部位がP(リン酸化ドメイン)に、ATPのアデノシン部分の結合ポケットはN(ヌクレオチド結合ドメイン)に存在する。Ca^<2+>輸送は、細胞質の3つのドンインの相互作用の変化が輸送部位に伝達されることによると予想されている。我々は、リン酸化中間体(EP)の構造転換に伴いAドメインが90°以上も大きく回転しドメインPへ結合すること、この変化はEPの構造転換と小胞体内腔へのCa^<2+>放出に必須であろうこと、さらにドメインAの根元にあるTyr^<122>が構造転換後のEPの構造形成に重要な役割を担うことを明らかにした。Tyr^<122>は構造転換後のEPに相当する結晶構造ではドメインAとPの六つの疎水性残基の中心に位置し、両ドメインの接合面で疎水性クラスターを形成する。Tyr^<122>疎水性クラスター形成とそれによるドメインA-P間相互作用の役割を明らかにするため、クラスターを形成する7残基それぞれをAlaおよびSerで置換した変異体を作成し、速度論的に解析した。リン酸化中間体の構造転換と小胞体内腔へのCa^<2+>放出がどのような構造因子の貢献によりどのように逐次的に進行するかの詳細が明らかになった。Tyr^<122>疎水性クラスター、Ile^<235>、およびT^<181>GEの3つの近接した構造因子は、それぞれ独自の構造的および触媒的機能を果たすことにより全体として協調しこの逐次的プロセスを可能にしている。本研究により、Ca^<2+>輸送における最も重要なプロセスについての理解が顕著に進み、これによりエネルギー共役機構の解明に大きく貢献した。
心不全における心筋収縮制御因子としての一酸化窒素(NO)の役割

1)不全心筋細胞におけるNO産生不全心におけるNO発現の変化について検討した。雑種成犬に右室頻拍ペーシングを行ない心不全モデルを作成した。心不全犬では、左室拡張末期圧の上昇、左室径の増大、左室駆出率の低下をみとめた。シトルリン法により測定した心筋の誘導型NO合成酵素(iNOS)および構成型NO合成酵素(cNOS)活性は、不全心筋でともに有意に亢進した。2)心筋収縮不全の修飾因子としての心筋細胞NOの役割不全心筋細胞で過剰に産生・放出されたNOは、心筋細胞の基礎収縮には影響しないが、βアドレナリン受容体刺激に対する陽性変力反応を直接減弱させると考えられた。したがって、心筋細胞で産生されたNOが、心筋収縮能の制御因子として心不全の形成に関与している可能性が示唆された。本研究では不全心における一酸化窒素(NO)発現の変化と単離心筋細胞の収縮機能を解析し、心筋収縮不全の修飾因子としての心筋細胞NOの役割について検討した。雑種成犬に右室頻拍ペーシングを行い心不全モデルを作成した。心不全犬では、左室拡張末期圧の上昇、左室経の増大、左室駆出率の低下をみとめた。不全心筋細胞の収縮能は、正常心筋細胞に比し有意に低下した。正常心筋細胞の収縮は、イソプロテレノール(ISO;1nM)処置により用量依存的に増強したが、不全心筋細胞のISOによる陽性変力作用は有意に小さかった。NOS阻害薬であるN^G-nitro-L一arginine methylester;(L-NAME,0.1nM)自体は、心筋細胞収縮能を変化させなかったが、L-NAME前処置は、不全心筋細胞のISOに対する反応を有意に増強した(ISO 107.1±7.3% vs L-NAME+ISO 140.6±10.7%;p<0.05)。一方、正常心筋細胞のISOに対する収縮増強反応は、L-NAMEによってさらなる増強は認められなかった(ISO 135.5±9.9% vs L-NAME+ISO 137.1±11.4%;p=NS)。このようなNOS阻害薬の効果はNOS基質であるL-arginine(5mM)の同時投与により拮抗された。以上より、不全心筋細胞で過剰に産生・放出されたNOは、心筋細胞の基礎収縮には影響しないが、βアドレナリン受容体刺激に対する陽性変力反応を直接減弱させると考えられた、したがって、心筋細胞で産生されたNOが、心筋収縮能の制御因子として心不全の形成に関与している可能性が示唆された。2)心筋収縮不全の修飾因子としての心筋細胞NOの役割不全心筋細胞で過剰に産土・放出されたNOは、心筋細胞の基礎収縮には影響しないが、βアドレナリン受容体刺激に対する陽性変力反応を直接減弱させると考えられた。
大学コミュニティにおける乳児保育の場から生成される重層的カリキュラムの開発

乳幼児02歳が過ごす学内保育所(お茶の水女子大学附属「いずみナーサリー(以下、ナーサリー)」)の教育的質の向上と、大学全体のコミュニティとしての教育環境「大学の中で赤ちゃんが笑う」構想を実現するために、下の3つの視点から研究を総合的にすすめた。(1)週1日から週5日の通所日数自由選択や一時保育、また、1日の保育時間もフレキシブルに決められる多元的保育体制において、保育の質を保証するための保育方法、カリキュラム(学び/育ちの履歴)開発(2)環境的教材、芸術的表現教材の開発(3)大学の特性を生かし多世代・他分野との協働を生かしたコミュニティ的実践。平成24年3月に最終報告書「大学の中で赤ちゃんが笑うII」を発行した。学内保育施設「いずみナーサリー」は、大学独自の運営方針で営まれる比較的新しい施設である。現在、次の3つの特質:すなわち1)大学の研究機関であること、2)利用目数選択制保育(女性研究者支援にもとづく方針)、3)02歳児のための家庭的保育環境としての質の向上、を生かした、よいよい子ども環境の創造を目指している。そのために今年1年目の本研究は、3つのグループに分かれてそれぞれの成果を見出してきた。「保育カリキュラム開発」グループは、保育所保育指針改訂をふまえつつ、附属幼稚園の教育カリキュラムと整合性のある保育課程を第1案として策定した。ほぼ毎日登園する子どもと週1回3回登園の子どもとが共同性をもって過ごせるような見通しある保育課程が、保育士同士の話し合いと大学との研究会をもとに作成された。「乳児保育教材開発」グループでは、「ガラス絵」という保育教材を用いた実践と研究発表を行い、日本保育学会等で高い評価を得ることができた。「大学コミュニティ内保育実践構想」グループでは、大学内プレイルームの環境整備を行い、ナーサリーの子どもたちが散歩に立ち寄ることができるような試みをおこなった。また、幼稚園と保育所の連携的保育の生活実践を記録し考察を行った。お茶の水女子大学附属「いずみナーサリー(以下、ナーサリー)」)の教育的質の向上と、大学全体のコミュニティとしての教育環境「大学の中で赤ちゃんが笑う」構想を実現するために、下の3つの視点から研究を部門別にすすめた。(1)週1日から週5日の通所日数自由選択制、および一時保育の受け入れも含めて、多層的な保育形態を追求する。つまり、保護者である女性研究者や学生の研究・教育の時間に合わせて、1日の保育時間をフレキシブルに決定できるカリキュラム体制をとる中で、個々の子ども・保護者の多様なニーズに応え、理念として一元的に保育の質を保証する保育方法、カリキュラム(学び/育ちの履歴)を構想した。おおよそ月1回の保育士と大学院教員共同の保育研究会を開催し、保育士からの課題研究報告を中心に、カリキュラム内容や環境構成の工夫などについて検討した。具体的には午睡と昼食のタイミング、担当制等について試行錯誤がなされ、重層的カリキュラム化の方向性を探った。(2)環境的教材、芸術的表現教材の開発。工房の家具製作者と保育士が共同して、大型遊具の開発設計を行った。全体的に平面性が中心の保育環境に垂直性のある空間を作ることで、運動的遊び、移動空間、子供同士の関係形成にどのような変化が生まれたか検討された。(3)大学の特性を生かし多世代・他分野との協働を生かしたコミュニティ構想を測り、食育プログラムとの交流、学生の自主サークル音楽活動、附属幼稚園はじめ異種学校生徒との交流がなされた。乳幼児02歳が過ごす学内保育所(お茶の水女子大学附属「いずみナーサリー(以下、ナーサリー)」)の教育的質の向上と、大学コミュニティとしての教育環境「大学の中で赤ちゃんが笑う」構想を実現するために、下の3つの視点から研究を総合的にすすめた。(1)保護者である女性研究者や学生の研究・教育の時間に合わせて、週1日から週5日の通所日数自由選択や一時保育の受け入れを行い、また、1日の保育時間もフレキシブルに決定できる体制をとる中で、個々の子ども・保護者の多様なニーズに応えつつ、理念として一元的に保育の質を保証するための保育方法、カリキュラム(学び/育ちの履歴)開発。表現、及び子ども同士の学び合う姿をとおした探求力の育成カリキュラムが02歳において生活の中で展開される成果を示すことができた。(3)大学の特性を生かした多世代・他分野にわたるコミュニティ、学生のインターンシップ、附属幼稚園はじめ附属学校生徒のナーサリー訪問、保育士の出張授業、その他の学内職員や生協店員との交流などを行った。

最終年度にあたる23年度は、ナーサリーにおける過去3年間のカリキュラムの変化と、定例のナーサリー研究会において検討・開発された教材の成果を発表した。また、大学内の他機関および大学外の施設や専門家との交流、連携の成果も総括した。平成24年3月に最終報告書「大学の中で赤ちゃんが笑うII」を発行し、約400部が研究者、保育者養成関連校、保育所等に配布され好評を得た。そこでは、ナーサリー保育者によるドキュメンテーションを生かした総括および、研究分担者、協力者全員によるカリキュラム、教材開発の成果発表、大学コミュニティ的視野からのナーサリー保育の位置づけについて到達点を示すことができた。
分子擬態を利用したRNA新薬の創製

触媒機能を持つRNA分子の発見以降、RNAはDNAからタンパク質への遺伝情報発現の媒体として機能するだけでなく、より積極的な機能を持つ分子として注目されるようになった。我々はタンパク質とRNAが互いの構造をまねる「分子擬態」という概念を提示した。このことは新たな生理活性を持つRNA分子を創造でき、それを医薬品としても応用できる可能性を示している。ランダムなRNAプールから、ある標的タンパク質と高いアフィニティーを有するRNA分子(RNAアプタマー)を濃縮する試験管内人工進化法(SELEX)を用いることにより、標的タンパク質の機能を促進・阻害するRNA分子を分離できる。近年、翻訳調節の異常が癌化につながり、また癌細胞において翻訳開始因子(eIF)の発現異常が見られるという知見が得られており、今後このような翻訳異常による疾病に対する医療対策は重要性を増してくると考える。本研究において、我々は種々のeIFに対してシステマティックにSELEXを行い、特異的に結合するRNAアプタマーを取得しカタログ化の基礎研究を行った。このうち、in vitroで翻訳阻害活性を有するアプタマーは、培養細胞レベル、個体レベルで癌抑制の作用が確認できれば新規の癌治療薬となる可能性がある。RNAアプタマーは標的物質と特異的に結合するという抗体の特徴を持っているので、「RNA抗体」として使用できる可能性がある。eIF4A1に対するアプタマーの中には解離定数3nMという、一般的な抗原と抗体の結合力に勝る強力な結合能を持つものもある。これらeIF4A1に対するアプタマーはATPase活性を阻害し試験管内反応で翻訳昂進を抑制できることも明らかになった。さらに、NMR解析法によりアプタマーRNA構造の一部が明らかになり、興味あるRNA構造モチーフも明らかになりつつある。今後、in vitro translationに対する影響を詳しく調べると伴に、培養細胞に投与もしくは発現させてその影響を調べる予定である。同時に、30種類以上ある翻訳開始に関わる因子のできるだけ多くに対してアプタマーの作成を継続する。これら相互作用を持つRNA分子については生化学的解析を行った後、培養細胞レベル、個体レベルで生理作用があるかどうかを検討し、医薬品への応用に可能性を探りたい。ランダムな配列を持つRNAプールから目的とする活性を有するRNA分子(アプタマー)を試験管内で濃縮・取得するSELEX法により、標的分子のアゴニスト、アンタゴニスト、リガンド等を作成しRNA性医薬品の開発へ応用する目的で、平成11年度はTc細胞の活性化において主要な役割を持つインターロイキン2(IL-2)分子および抗IL-2抗体を標的にしたSELEXを行った。試験管内レベルでIL-2および抗IL-2抗体に結合するRNA分子を複数作成することができたが、最終的に細胞レベルでの陽性クローンは得なれなかった。原因として、今回用いた条件が生体内と異なるため、細胞レベル/生体レベルでの評価に耐えなかった可能性が考えられる。また、中和抗体のepitopeのmappingを行う必要もあり、IL-2の受容体への結合様式をきちんと検討し、それに見合うような中和抗体の作製が必須となってくると思われる。これらの成績より(本質的にRNAとの親和性が薄いと思われる)サイトカインを標的とした戦略の見直しが必要と判断した。平成11年1月から新たに次の2つの戦略を研究に組み込み、推進した。1)翻訳開始因子(eIF)に結合する。

RNA分子(アプタマー)の作成と、2)培養細胞にランダム配列の遺伝子を導入して生理的、形態的変化を引き起こすRNAアプタマーの検索を行う。eIFは真核生物において少なくとも30種類が知られており、以下の点でRNAアプタマーの作用を評価するモデルとして適している。すなわち、いくつかのeIFはRNA結合能があるためRNAアプタマーを得やすいこと、複数のeIFが高次構造をとることによって機能するためにアプタマーにより高次構造が崩されて機能が阻害されることが期待できることである。さらに幾つかのeIFは過剰発現により細胞の癌化を起こすため、作成したRNAアプタマーの癌抑制効果を試験し、医薬品化の可能性を検討できる。現在、1)についてはeIF-4G、eIF-4Aとうを標的にRNAアプタマーの作成を実施している。ランダムな配列を持つRNAプールから目的とする活性を有するRNA分子(アプタマー)を試験管内で濃縮・取得するSELEX法により、標的分子のアゴニスト、アンタゴニスト、リガンド等を作成しRNA性医薬品の開発へ応用する目的で、平成12年度は動物細胞の翻訳開始因子eIF4G,eIF4A1を標的にしたSELEXを行った。その結果、eIF4A1とeIF4Gに対するRNAアプタマーが取得できた。前者のクローン中には解離定数3nMという、一般的な抗原と抗体の結合力に匹敵する強力な結合能を持つものもある。これらeIF4A1に対するアプタマーはATPase活性を阻害することから、何らかの生理作用を持つことが期待できる。開始因子eIF4E,eIF4A及びeIF4Gからなる複合体は40SリボソームとmRNAの結合に必須で、eIF4AはATPase活性を有するRNA helicaseでmRNAの2次構造をほどくことにより翻訳を促進する働きがある。eIF4GはeIF4E,eIF4Aをまとめるアダプターの役割を持つ。このうち、eIF4EとeIF4Gは培養細胞で過剰発現させると癌化が促進されることが報告されていることから、これらタンパク質の機能を阻害することができれば細胞の癌化を抑制できる可能性がある。今後、in vitro translationに対する影響を詳しく調べると伴に、培養細胞に投与もしくは発現させてその影響を調べる予定である。同時に、30種類以上ある翻訳開始に関わる因子のできるだけ多くに対してアプタマーの作成を行う予定である。これら相互作用を持つRNA分子については生化学的解析を行った後、培養細胞レベル、個体レベルで生理作用があるかどうかを検討し、医薬品への応用に可能性を探りたい。ランダムな配列を持つRNAプールから目的とする活性を有するRNA分子(アプタマー)を試験管内で濃縮・取得するSELEX法により、標的分子のアゴニスト、アンタゴニスト、リガンド等を作成しRNA性医薬品の開発へ応用する目的で、平成13年度は動物細胞の翻訳開始因子eIF4G, eIF4A1を標的にしたSELEXにより作成したRNAアプタマーの分析を推進した。