hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
内因性鎮痛系における下行性抑制系の役割 -基礎と臨床からのアプローチ-

本研究の動物実験では、内因性鎮痛系の中でも特にノルアドレナリン作動性下行性抑制系が慢性痛時にどのように変化するのかを調べた。神経障害性疼痛モデル(SNL)を作成後5週間経過すると、内因性鎮痛が減弱し、その原因にはノルアドレナリン作動性下行性抑制系の減弱が関与していた。アミトリプチリンを5日間投与すると、内因性鎮痛の減弱を抑制できた。臨床研究では健常人を対象にプレガバリン(150mg内服)が内因性鎮痛を増強するのか、プラセボ投与群と比較した。プレガバリンはプラセボと比較して内因性鎮痛を増強しなかった。しかし内因性鎮痛が弱い人ほど、プレガバリンによって内因性鎮痛が強まることが明らかになった。本研究の目的は動物実験で内因性鎮痛系における下行性抑制系の役割を解明すること、並びにプレガバリンがヒトの内因性鎮痛系を強化するのかを明らかにすることである。目的1と2に分かれており、並行して研究を進めているのでそれぞれの進捗状況を報告する。目的1(内因性鎮痛系の可塑性における下行性抑制系の役割を動物モデルで検討する)では次のような結果を得た。ラットのAscending nociceptivecontrol(ANC)法を用いて内因性鎮痛系の定量化を行った。ANC法ではラットの前肢にカプサイシン(250 μg)を投与すると内因性鎮痛系が活性化するため、後肢に鎮痛作用が認められるようになるが、この現象をNoxious stimulation induced analgesia (NSIA)と呼ぶ。後肢の鎮痛作用はPaw-pressure testを用いて、機械的侵害刺激への逃避閾値を計測することによって定量化した。正常動物ではNSIAが観察されるが、神経障害性疼痛モデルであるSpinal nerve ligation(SNL)を作成して、神経損傷からの時間経過とNSIAの関連を観察すると、4週間ではNSIAが弱くなり、5週間ではNSIAがほとんど観察されなくなる。現在は腰部脊髄後角からのマイクロダイアリシスによって、モノアミン(ノルアドレナリン・セロトニン)の変動を観察中である目的2(プレガバリンの内因性鎮痛系への作用を健康なボランティアで検討する)は臨床研究である。群馬大学臨床試験審査委員会の承認を得て(群馬大学臨床試験審査委員会: No. 1009)研究を行っている。申請書に記した方法によってヒトの内因性鎮痛(CPMテストによって判定)に対するプレガバリン(150 mg)の効果をプラセボ群と比較した。これまでにデータ解析に必要な最低限の症例数の実験は終了しており、今後はデータを詳細に解析する予定である。ラットのNoxious stimulation induced analgesia (NSIA)法を用いて内因性鎮痛系の定量化を行った。ラットの前肢にカプサイシン(250 μg)を投与すると、後肢に鎮痛作用が認められるようになるが、この現象がNSIAである。正常動物ではNSIAが観察されるが、神経障害性疼痛モデルであるSpinal nerve ligation(SNL)を用いて、神経損傷からの時間経過とNSIAを観察すると、4週間ではNSIAが弱くなり、5週間ではNSIAがほとんど観察されなくなる。腰部脊髄後角からのマイクロダイアリシスによってモノアミンの変動を観察すると、カプサイシン投与後にはノルアドレナリンだけが増加するが、セロトニンやドーパミンは増加しなかった。SNL作成から5週間経過したラットに三環系抗うつ薬であるアミトリプチリン、またはプレガバリン(それぞれ10 mg/kg/day)を5日間腹腔内投与すると、どちらの薬剤も神経結紮による痛覚過敏を抑制したが、NSIAはアミトリプチリンによってのみ回復したが、プレガバリンにはそのような作用はなかった。この結果は論文化しAnesthsiaand Analgesia誌に受理された。目的2(プレガバリンの内因性鎮痛系への作用を健康なボランティアで検討する)は臨床研究である。群馬大学臨床試験審査委員会の承認を得て(群馬大学臨床試験審査委員会: No. 1009)研究行った。申請書に記した方法によってヒトの内因性鎮痛(CPMテストによって判定)に対するプレガバリン(150mg)の効果をプラセボ群と比較した。全ての実験は終了している。プレガバリンは内因性鎮痛そのものは増強しないが、元々内因性鎮痛が低い被験者では増強させることが明らかになった。現在は論文を作成中である。目的1(内因性鎮痛系の可塑性における下行性抑制系の役割を動物モデルで検討する)では動物を用いた実験を行っている。研究結果はほぼ仮説の通りであったため、当初予定していた目的はほぼ果たして論文を作成した。ボランティアの参加者が予想以上に順調に集まったため、当初の計画よりも進捗は早い。ラットのNoxious stimulation induced analgesia(NSIA)法を用いて内因性鎮痛系の定量化を行った。

NSIA法ではラットの前肢にカプサイシン(250 μg)を投与すると、内因性鎮痛系が活性化するため後肢に鎮痛作用が認められるようになるが、この現象をNSIAと呼ぶ。正常動物ではNSIAが観察されるが、神経障害性疼痛モデルであるSpinal nerve ligation(SNL)を用いて、神経損傷からの時間経過とNSIAを観察すると、4週間ではNSIAが弱くなり、5週間ではNSIAがほとんど観察されなくなる。腰部脊髄後角からのマイクロダイアリシスによってモノアミンの変動を観察すると、カプサイシン投与後にはノルアドレナリンだけが増加するが、セロトニンやドーパミンは増加しなかった。最終年度はデュロキセチンをSNL5週後から10mg/kg/dayで3日間皮下注し、減弱したNSIAを改善するか検討した。デュロキセチンの投与によって減弱したNSIAが回復し、その効果は脊髄でのノルアドレナリンの蓄積効果である可能性が示唆された。目的2(プレガバリンの内因性鎮痛系への作用を健康なボランティアで検討する)は臨床研究である。群馬大学臨床試験審査委員会の承認を得て(群馬大学臨床試験審査委員会: No. 1009)研究行った。申請書に記した方法によってヒトの内因性鎮痛(CPMテストによって判定)に対するプレガバリン(150mg)の効果をプラセボ群と比較した。プレガバリンは被験者全体の内因性鎮痛の平均値を増加させることはなかったが、内因性鎮痛が弱い患者ほど強めることが明らかになった。本研究の動物実験では、内因性鎮痛系の中でも特にノルアドレナリン作動性下行性抑制系が慢性痛時にどのように変化するのかを調べた。神経障害性疼痛モデル(SNL)を作成後5週間経過すると、内因性鎮痛が減弱し、その原因にはノルアドレナリン作動性下行性抑制系の減弱が関与していた。アミトリプチリンを5日間投与すると、内因性鎮痛の減弱を抑制できた。臨床研究では健常人を対象にプレガバリン(150mg内服)が内因性鎮痛を増強するのか、プラセボ投与群と比較した。プレガバリンはプラセボと比較して内因性鎮痛を増強しなかった。しかし内因性鎮痛が弱い人ほど、プレガバリンによって内因性鎮痛が強まることが明らかになった。目的1(内因性鎮痛系の可塑性における下行性抑制系の役割を動物モデルで検討する)では動物を用いた実験を行っているが、行動薬理学的検討は大部分終了しており、現在はマイクロダイアリシスによる脊髄モノアミンの変動と、内因性鎮痛系の関連を観察中である。マイクロダイアリシスの研究は研究期間の後半に行う予定であったので、進捗は当初の計画よりかなり早い。こちらはプレガバリン投与群とプラセボ投与群で内因性鎮痛の変化を比較する研究である。ボランティアの参加者が予想以上に順調に集まったため、当初の予定していた最少症例数(各群21)以上のデータはすでに得ているため、こちらも当初の計画よりも進捗は早い。目的1の研究は当初の計画は達成し、論文はAnesthsia and Analgesia誌に受理された。
新規な励起エネルギー移動機構の提案とその解明

本研究では、酸化状態の異なるダイマーの励起状態を明らかとすることを目的とする。今年度は、安定な3つの酸化状態をとるビス(テトラアザポルフィリナト)ルテチウム錯体(Lu(TAP)_2)について、時間分解ESR(TRESR)による研究を行った。ここで、中性ラジカルとして合成される[Lu(TAP)_2]^0、その酸化種[Lu(TAP)_2]^+、及び還元種[Lu(TAP)_2]の励起状態について調べた。その結果、(1)2つのTAPラジカルから構成される酸化種[Lu(TAP)_2]^+の最低励起状態は、TAPビラジカルの三重項状態に相当し、励起は100%2つのユニットに非局在化していること、(2)2つのTAP配位子から構成される還元種[Lu(TAP)_2]の最低励起三重項状態では、励起子と電荷共鳴電子配置が混合し、その電荷共鳴電子配置の寄与は38%であること、(3)TAP配位子とTAPラジカルから構成される[Lu(TAP)_2]^0では、励起二重項→基底二重項間の速いスピン許容遷移により、TRESR信号が観測できないことなどを明らかとした。(1)と(2)は、酸化状態の異なる励起三重項状態をTRESRで観測した初めての例であり、重要である。また(1)は、強い反強磁性的相互作用を有する三重項ホモビラジカルの初めてのESR観測例であり、これより反強磁性的相互作用の新規解析法を提案することができた。このように、酸化状態の異なるそれぞれの励起状態の特徴を明らかにできた。本研究では、ダイマーの励起エネルギー移動を実験、理論両面から明らかとすることを目的とする。特に、一電子酸化型ダイマーの励起エネルギー移動は、一電子移動が励起エネルギー移動と同期するため、既知のForster、Dexter機構とは原理的に異なる新規なエネルギー移動機構になると期待できる。今年度は、自己集合型亜鉛フタロシアニンダイマーを、時間分解ESR(TRESR)により研究した。20KのTRESRスペクトルは、モノマーとダイマーでほとんど変化しなかった。これより、20Kにおける励起三重項エネルギーは、ESRのタイムスケールでどちらか片方のユニットに局在していること、電荷移動相互作用の寄与は十分小さいことが明らかとなった。一方、ダイマーのTRESRスペクトルは、顕著な温度変化を示し、この温度依存性は、ダイマーを構成するフタロシアニンユニット間における励起三重項エネルギー移動に帰属された。これは、ポルフィリン類縁体において初めて観測された三重項励起子状態である。励起エネルギー移動を考慮したシミュレーションプログラムを作成し、励起エネルギー移動速度を見積もることに成功した。これをアレーニウスプロットし、活性化エネルギーを2.7×10^2cm^<-1>と見積もることができた。通常、同一ユニットで構成されるオリゴマー内のユニット間エネルギー移動を評価することは困難だが、TRESRが有効な手段となることを例証できた。
心拍、呼吸、体温計測機能を有する超小型スマートRFID能動タグ回路の開発

人の健康管理や医薬品開発用実験用動物の生体情報モニタリングへの応用をめざして、人あるいは動物の個体識別符号(IDコード)を識別し、その心拍、呼吸、体温の情報をオンデマンドでかつリアルタイムに計測し、それらをデータ読み取り装置へ無線で送信できる超小型のRFIDタグ(無線個体識別ICタグ)を研究開発し、そのICチップと実装基板のプロトタイプを試作して、所望の諸機能を実験で確認した。本研究は、ヒトの実時間健康管理のため、あるいは医薬品開発用遺伝子改変マウスのなどの実験用動物の生理データの実時間計測のため、生体の心拍、呼吸、体温等の生理信号を計測し実時間で無線によりテレメトリーできる超小型スマートRFIDタグの実現を目的とする。具体的には、本研究期間内に、そのRFIDタグが具備すべき機能である個体識別コードの照合、センサー信号処理、多重化通信のための符号化といった諸機能を実現する回路を搭載したミクストシグナル・システムLSIを開発する。さらに、同チップを電源回路、RFトランシーバー回路と共に小型プリント基板上に実装したプロトタイプを試作し、実験で評価する。1.0.35μmCMOSプロセスを用いて心拍パルス抽出ICを開発し、そのICチップと計装アンプ付き心電センサーを用いて、実際のヒトならびにマウスからの心電信号から心拍パルス抽出実験を行った。その実験によって、心電センサーの計装アンプには6080dBの利得が必要なこと、また開発した心拍パルス抽出ICによって心拍パルスをパルス位置パルス幅アナログ変調信号として出力できることを確認できた。このICは電源電圧2.73Vで動作でき、平均消費電力は約600μWである。2.複数のICタグと1個のリーダーとの間の伝送信号の輻輳の解決策として、リーダーからのIDコード信号を受信して、そのIDコードを有するタグのみがスリープモードから覚醒する方式を採用した。この回路システムに関し、RF信号受信用低雑音アンプと周波数電圧変換用PLL回路、クロック再生回路、それにIDコード照合回路の回路設計を行い、SPICEシミュレーションでそれらの動作を確かめた。3.ダイオードPTAT温度センサー回路とその出力用のPWM変調回路について回路設計と回路解析を行い、その動作をSPICEシミュレーションで確認し、+2.6mV/°C程度の温度感度が得られることを明らかにした。4.電磁誘導によるワイヤレス給電用のダイオードチャージポンプ型低リプルAC-DC変換回路とその実験評価用実装基板の試作を行い、約50MHzまで正常に低リプルAC-DC変換できることを実験で確認した。また、完全IC化用としてダイオードの代わりにクロスカップル構成のn MOSFET対とp MOSFET対とを用いた新しいAC-DC変換回路を設計し、SPICEシミュレーションおよび実験により、85%以上の高い電力変換効率が得られることを明らかにした。1.ECGセンサーアンプからの入力信号を処理して、それにIDコードをヘッダーとして付けた位置パルスアナログ信号パケットを出力できる心拍パルス検出CMOS ICチップを0.25μm CMOSプロセスを用いて開発した。同ICチップを、0.5Hz高域通過フィルタ付き80dBECGセンサーアンプ、200Hz低域通過RCフィルタ、303MHz送信モジュール、それにボタン電池を2枚の基板に両面実装した35mm×70mm実装プロトタイプ基板を試作した。この基板について実験による評価を行い、人に貼り付けたAgCl-ECG電極からのECG信号から、期待どおりの心拍パルス信号パケットが得られることを確認した。また、送信回路モジュールのアンテナ出力には、ASK信号の形でIDコード付き心拍パルス信号パケットが出力されることを実験的に確認した。この試作基板は、3V電池駆動で、IDコード長は64ビット、1信号パケット長は約13秒、そのうちIDコードは800μsである。送信モジュールのASK波の搬送周波数は微弱無線領域の303MHzであり、電波暗室での実験によって、22mm×24mmのマイクロプリントアンテナを装着して見通し通信距離4m程度が達成できることを実証した。2.受動タグ用の無線給電電源として、1mm角の正方スパイラル結合コイルを実装したコッククロフト・ウォルトン型低リプルAC-DC変換回路実装基板を試作した。この試作基板のサイズは、結合コイルを含めて4.5mm×12mmである。低リプルAC-DC変換回路部分についての実験の結果、ほぼ期待どおり低リプルAC-DC変換特性を確認できた。心拍、呼吸、体温計測機能を有するRFID能動タグ回路について、前年度試作したベルト実装型スマートRFIDタグについて、タグとリーダー間を微弱無線の303MHzで交信させ、性能評価実験を行った。これにより、IDコード照合用の2値パルス幅シフトキーイング(BPWSK)変調と、生体信号用のパルス位置/パルス幅変調とが、共に有効であることを確認できた。また、TSMCの0.25μmCMOSプロセスで試作した5mm角試作チップの正常動作を確認できた。加えて、今年度新たに、タグ装着者の個人差に対応できる生体情報計測RFIDタグの実現をめざして、ECGアンプの自動利得調整回路、心拍パルス検出回路の判定レベルの自動追従調整回路を設計した。また、3つ生体情報の同時リアルタイム送信を可能にする符号化回路を設計し、そのICチップの試作と実装基板試作を行った。

RFID能動タグの電源部に関しては、スイッチトキャパシタ技術を用いることにより集積化可能な電源回路を設計し、変換効率、素子のばらつきの影響等の主要な設計条件を理論解析により明らかにした。無線による電力供給型RFIDタグに関し、実装基板上のスパイラル平面結合コイルのインダクタンス値を計算するための基礎資料として、方形断面導体の高周波インピーダンスの計算手法を開発し、基板より放射される不要電波を除去するための溝形吸収素子の特性を算出した。また、タグとリーダー間の通信に利用可能な非同期DS/CDMA通信用の負相関スペクトル拡散符号を設計し、これが線形フィードバックシフトレジスタで生成可能であること、および従来符号よりも低いビット誤り率を達成することを明らかにした。前年度の残された課題となった、1.回路全体の消費電流の削減、2.複数の生体情報の同時実時間返信機能の実現、3.心電R波信号を検出する回路への判定レベル自動調節機能の付与、4.心電信号増幅用アンプへの自動利得調整機能の付与、5.受動ICタグのための小型小電力CMOS電源回路の実現、6.試作した1mm角平面スパイラルコイルの特性解析、に関して以下の研究成果を得た。1.に関し、呼吸センサとしてベルト型静電容量センサ(最大容量342pF)を試作し、課題であった消費電力を2.54mW@3Vと前年度試作回路の歪ゲージセンサに比べて約1/10に低減できた。2.に関し、心電R波信号、呼吸信号、体温信号を同時サンプリングし、それを一体として2値信号のパルス長に変換して、3つの生体信号を同時実時間で無線により読み取り器へ返信できるディジタルIC回路(回路面積=0.74mm^2,消費電力=0.1mW)を開発し、動作を実験で確認した。これにより、生体情報計測においてより高い実時間性が得られるようになった。3.に関し、R波検出回路のR波検出しきいレベルを自動調整する新しい回路を設計し、個別ICによるブレッドボード回路を試作して所望の動作を実験で確認した。これにより、センサ装着者の個人差や体動による心電R波信号の波高変動に対し、自動適応したR波計測が可能になった。4.に関し、オンチップ可能な消葺電力0.13mWのスチッチトキャパシタ帯域通過フィルタ(通過帯域:0.5Hz200Hz)と自動利得調整機能付き増幅器(消費電力は0.809mW)を設計し、SPICEによる過渡回路解析と個別ICによるブレッドボード回路での実験により所望の動作を実現できる見通しを得た。5.および6.に関し、MOSプロセスによるIC化をめざした10mWの受動ICタグ用小型小電力AC-DC変換電源回路の設計と解析を行った。特に、1mm角平面スパイラル受電コイルとAC-DC変換回路を組み合わせて回路解析し、10mW@3V程度の電源の実現には、同受電コイルを232ガウス以上の交流磁束密度で励磁する必要があることを明らかにできた。
鍾乳石の茶色い縞々に着目した古気候変動復元の技術構築に関する基礎的研究

鍾乳石の茶白の縞模様を通して過去の気候変遷を復元できるようにすることを最終目標とした研究を行い,(1)鍾乳石の茶色縞は磁鉄鉱,輝石などの鉱物を含むヒューミンとフルポ酸から構成される腐植物質から成り,洞内河川の懸濁物に由来すること,(2)鍾乳石が洞内河川に水没する増水時に茶色縞が鍾乳石に織り込まれること,(3)滴下水の方解石飽和度と滴下量に応じて鍾乳石本体(方解石)の成長は季節変動をしていることなど基礎情報として有用な多くのことがらが明らかにした鍾乳石の茶白の縞模様を通して過去の気候変遷を復元できるようにすることを最終目標とした研究を行い,(1)鍾乳石の茶色縞は磁鉄鉱,輝石などの鉱物を含むヒューミンとフルポ酸から構成される腐植物質から成り,洞内河川の懸濁物に由来すること,(2)鍾乳石が洞内河川に水没する増水時に茶色縞が鍾乳石に織り込まれること,(3)滴下水の方解石飽和度と滴下量に応じて鍾乳石本体(方解石)の成長は季節変動をしていることなど基礎情報として有用な多くのことがらが明らかにした成長中の鍾乳石表面のその場色彩測定を毎月1年間行った結果,夏場に茶色の度合いが高くなることが判明した.この現象は,夏場の多雨期に鍾乳洞内の河川水位が上昇し,鍾乳石が洞内河川に一時的に水没することに関係すると見られ,河川水中の懸濁物の色合いが鍾乳石の茶色のそれと一致することや鍾乳石の塩酸溶解残渣中に不溶性腐植物質ともには砕屑性と見られる磁鉄鉱やシリカが含まれていることから,鍾乳石の縞模様の茶色いスジは洞内河川の作用によって形成されている可能性があるという新たな認識を得た.一方,鍾乳石の白い方解石部分を形成させている滴下水について,鍾乳石への滴下前と滴下後の水のCa^<2+>濃度と滴下レートを用いて間接的に鍾乳石の成長速度を割り出す方法を考案し,上述の成長中の鍾乳石へ応用したところ(毎月1年間の観測),Spotl et al. (2005)に予想されているように,鍾乳石は洞外大気による洞内空気のベンチレーションが激しい冬場の低pCO_2時によく成長し,夏場の高pCO_2時には成長が鈍るという現象を捉えることに成功した.上記2つの結果を総合し,「鍾乳石の茶色と白の縞模様は,鍾乳石本体を構成する方解石の成長の季節変化に対して,その成長が遅くなる夏場に洞内河川から茶色物質が付加されることで与えられる」という縞々の形成過程に関する新たなモデルを得るに至った.初年度の観測研究によって「鍾乳石の茶色と白の縞模様は,鍾乳石本体を構成する方解石の成長の季節変化に対して,その成長が遅くなる夏場に洞内河川から茶色物質が付加されることで与えられる」という縞々の形成過程に関する新たなモデルを提案した.2年目は,このモデルの拠り所となったデータを引き続き継続して入手する毎月の観測を実施した.開発した滴下水のCa濃度と滴下レートを用いて間接的に鍾乳石の成長速度を割り出す方法を用い,鍾乳石本体を構成する方解石の成長の季節変化について再現的なデータを入手することができ,一方,夏場の洞内河川水位上昇期に鍾乳石(表面の)茶色の度合いが強くなるという現象も再現することを認めるとともに,新たに始めた洞内河川水位観測によって,鍾乳石が一時的に洞内河川に水没するためであることを確認した.また,成長中の鍾乳石の近傍で室内分析用に採取していた鍾乳石について内部断面の微小領域元素分析を行い,縞模様の茶色い部位と鉄や珪素などの濃集部分が一致するというデータの入手に成功し,鍾乳石の縞模様の茶色いスジは洞内河川の作用によって形成されているという仮説を裏付ける有力な証拠とすることができた.昨年度までの研究で得られた「鍾乳石の茶色と白の縞模様は,鍾乳石本体を構成する方解石の成長の季節変化に対して,その成長が遅くなる夏場に洞内河川から茶色物質が付加されることで与えられる」という縞々の形成過程に関する新たなモデルの検証のために,成長中の鍾乳石表面のその場色彩測定,洞内河川水の懸濁物量(濃度)の計測,自記水位計による洞内河川の連続水位測定と比較検討のための自記雨量計による降水量観測を行った.その結果,鍾乳石の水没とともに鍾乳石表面の色が茶色になり,水没解消後に次第に白く戻って行く様子が観察された.さらに,日降水量100mm程度以上になるとき,鍾乳石が洞内河川に水没すること,そのような洪水時には河川懸濁物量は平水時の10倍以上に達することが判った.この結果は,鍾乳石の茶色縞は,洞内河川への鍾乳石の水没の記録であり,特に濃い茶色スジは洪水に対応している可能性を強く示すものである一方,初年度より継続して行っている滴下水を用いた間接的な鍾乳石の成長率(単位時間当たりの析出量)の観測から次のような新たな認識を得た.石筍の成長率は,夏場に遅く,冬場に速いという大方が予想する季節変動を示したが,冬場の1月頃に一時的に成長が少しだけ遅くなるのが見られた.

それは,その頃滴下水の水量が非常に少なくなるためであり,基本的に石筍の成長率に現れる変動は滴下水の炭酸カルシウムに対する過飽和度の季節変化によって生み出されることが判らた.そして,当初の我々も含め多くの人々が信じていたような「鍾乳石は洞外大気による洞内空気のベンチレーションが激しい低pCO_2時によく成長し,高pCO_2時には成長が鈍る」という関係は認められなかった
組織機能論的なカルパイン作用機序の解析とその普遍性抽出

カルパイン(CAPN)は、限定分解により基質機能を調節するプロテアーゼである。CAPN1/2は古くから研究されながら、その普遍性のため機能解明が難航している。申請者らは組織特異的分子種を発見し、発現組織機能と関連づけて生理機能を解析してきた。その結果CAPN3、8/9の機能不全は筋ジストロフィー、胃疾患の原因となることを明らかにした。しかし各分子の作用機序は不明な点が多い。そこで組織特異的CAPNに注目し、組織機能制御の分子機構を解析した。特にKO/KIマウスとプロテオミクスを基軸とした解析で、ヒト疾患や遺伝子改変マウス表現型を参照し、CAPN不全疾患発症機序へも迫った。カルパイン(CAPN)は、限定分解により基質機能を調節する「モジュレーター・プロテアーゼ」である。ヒトは15のカルパイン遺伝子を有し、その中ではμ-及びm-カルパイン(活性サブユニットがCAPN1及びCAPN2と呼ばれる)が古くから研究されている。しかし、その発現の普遍性のためノックアウト(KO)マウスが胚性致死となり、機能解明が難航している。申請者らは骨格筋特異的CAPN3、腸管特異的CAPN8及びCAPN9などの組織特異的カルパインを発見し、発現組織の機能と関連づけてこれらの生理機能を解析してきた。その結果、CAPN3はそのプロテアーゼ活性の不全で筋ジストロフィーを引き起こし、CAPN8またはCAPN9の遺伝子欠損はストレス性胃出血の原因となること、を明らかにした。しかしながら、各カルパインのin vivoでの作用機序及び活性制御機構には未だに不明な点ばかりである。そこで、本研究では、その機能が発現組織の特異的な機能と密接な関係が予想される、組織特異的カルパインの利点を生かし、特定の組織機能がこれらのカルパインにより調節を受ける分子機構を重点的に解析している。特に、遺伝子改変マウスとプロテオミクスを基軸とした遺伝学・生化学的解析によりカルパイン分子の活性制御機構と標的分子群の解明を目指している。その過程で、疾患やマウスの病態(表現型)を参照し、カルパイン不全疾患の発症機序へアプローチし、治療や診断の方向性を示しうるように解析を進めている。第1年目の今年度は、当研究計画の重要な基盤となるヒトm-カルパインの大腸菌での発現・精製系を確立した。一方、CAPN3については、ノックインマウスとKOマウスの表現型比較より、筋小胞体における非プロテアーゼ機能を明らかとした。今後は、これらの知見を踏まえ、さらに発展させてカルパインの生理機能の同定を目指したい。カルパイン(CAPN)は、限定分解により基質機能を調節するプロテアーゼであり、ヒトには15遺伝子が存在する。一方申請者らは骨格筋特異的に発現するCAPN3、胃腸特異的CAPN8/9などの組織特異的分子種を発見し、発現組織機能と関連づけて生理機能を解析してきた。その結果CAPN3機能不全は筋ジストロフィーの、CAPN8/9遺伝子欠損はストレス性胃出血の原因となることを明らかにした。しかし各分子の生体での作用機序は不明な点が多い。そこで本研究では組織特異的CAPNsに注目し、これらによる特定組織機能の制御分子機構を解析している。特に遺伝子改変マウスとプロテオミクスを基軸とした解析によりCAPNの活性制御機構と標的分子群の解明を目指している。その過程で、ヒト疾患や遺伝子改変マウス表現型を参照し、CAPN不全疾患発症機序へも迫ろうと考えている。今年度は、計画に従って、CAPN3, 6, 8, 9, 11, 12について、遺伝子改変マウスを用いて各関連臓器における機能を解析した。このうち、CAPN8についてはトランスジェニックマウスにおいて新たな表現型を見出した。一方、カルパインの基質特異性を含め、基盤解析技術の開発も行った結果、機械学習などの手法を取り入れることで、今までの生化学的解析だけでは解析できなかったCAPN1-2間の特異性の違いなどを明らかにすることが可能となった。

特にKO/KIマウスとプロテオミクスを基軸とした解析で、ヒト疾患や遺伝子改変マウス表現型を参照し、CAPN不全疾患発症機序へも迫った。1.骨格筋とCAPN3:CAPN3のKI及びKOマウスからの初代培養細胞、in vitro翻訳系と様々な発現コンストラクトを用いて、CAPN3の活性制御機構を解析した結果、他のプロテアーゼには見られない分子内相補という特殊な性質が明らかとなり、CAPN3の新たな機能が示唆された。2. CAPN8/9と胃腸機能:CAPN8/9不全はストレス性胃出血を増悪するが、この分子機序の解析を行った。大量発現系を確立し、CAPN8と9が酵素とシャペロンという異なる役割を果たすことを明らかとした。3.新規組織特異的CAPN:CAPN6(胎児筋)、CAPN11(精巣)、CAPN12(毛包)について、KOマウスの表現型を中心に、各々骨格筋分化・成長過程、受精過程、毛包の細胞周期との関連を解析した。特にCAPN6では成獣骨格筋再生との関連について興味深い知見が得られたため、重点的に解析し、筋分化を抑制的に制御することを明らかとした。4.カルパインの基質特異性:生物情報学的手法を応用しその解明を目指した。ウェットな実験と機械学習を組合わせることで、高精度の切断部位予測器を構築した。そして、これまでの結果を総合して、カルパインの生理機能はその広い基質特異性と強く関係することが示唆された。26年度が最終年度であるため、記入しない。分子生化学26年度が最終年度であるため、記入しない。本年度は上記の通り、CAPN3の非プロテアーゼ機能という極めて特異的な現象を見出すことができ、論文を発表すると共に、KOマウスとノックインの両方を用いた本格的な解析を開始することができた。予定していた実験はもとより、新たに得られた知見を元に大幅に研究を展開することができた。このように自由に研究を展開することができたのも、繰越や計画の発展的変更を認めて頂いている科学研究費補助金の制度に寄るものと、心から感謝している次第である。今年度も計画に従って、CAPN3, 6, 8, 9, 11, 12について、遺伝子改変マウスを用いて各関連臓器における機能を解析した。計画は順調に進んでおり、さらにいくつかの新たな知見が得られている。そのため、繰り越し申請と共に、来年度以降の計画を若干追加変更した。上記の通り、研究計画は当初の計画以上に発展して進んでいるため、今後も新しいことにチャレンジしていく精神を強くもち、より良い研究に発展させていきたい。特に、プロテオミクス関係で、強力な解析装置(MASCOT蛋白質同定システム)を導入することができたので、今後さらに差分プロテオーム解析をスピードアップして、新規知見の発見に力を尽くしたい。上記の通り、研究計画は当初の計画以上に発展して進んでいるため、今後も新しいことにチャレンジしていき、より実りある研究に発展させたい。特に、プロテオミクス関係の解析が進み、多くの興味深いデータが蓄積しつつあるので、これを効率的に解析するシステムを確立し、新しい知見の発見に尽力する所存である。
侵害的温度刺激による侵害受容器興奮機序の解明

冷痛覚や熱痛覚を担う痛み受容器における、低温や高温の温度受容の仕組みについて調べた。培養細胞と麻酔下動物において、一次知覚神経細胞(痛み受容器を含む)の温度感受性を調べ、知覚神経細胞の温度感受性と、温度受容体の有力候補とされるTRPイオンチャネルの発現との間に必ずしも強い相関が見られず、これらのTR以外の温度受容機構の存在が示唆された。また、改良した冷痛覚行動試験法を用いて、れまで曖昧であった健常動物の冷痛覚行動と炎症病態時の冷痛覚過敏が明瞭に観察可能となった。感覚神経細胞が、生体に痛覚を生じさせるレベルの侵害的温度刺激を受容するしくみを明らかにする目的で、以下の実験を実施した。1、ラットおよびマウス脊髄神経節の培養感覚神経細胞(DRGニューロン)と、HEK293培養細胞発現系において、温度感受性TRPイオンチャネルの温度応答への関与を比較検討した。細胞内カルシウムイメージング法により各細胞応答を観察したところ、侵害的冷受容体とされるTRPA1の活性化剤(マスタードオイル)への応答と冷応答の間の相関は、TRPA1発現HEK細胞では強くみられたものの、培養DRGニューロンにおいては明瞭ではなかった。また、侵害的熱受容体のTRPV2に関しては、両細胞系ともにTRPV2活性化剤(Probenecid)への応答と熱応答との相関は低かった。このように、DRGニューロンにおいてはこれらTRP分子だけでは侵害的な温度の受容には十分ではないことが示唆された。これらのTRPは潜在的には温度感受性に関与する可能性があるものの、感覚神経での温度受容には別のタンパク質、あるいは補助的な因子が必要である可能性が考えられた。2、冷痛覚を評価する行動実験系として、低温の金属板に一定時間動物をのせた際に、動物が後肢を鋭くひき上げる行動を指標とするコールドプレートテストがよく用いられるが、一般的な測定方法では健常個体での痛み行動の頻度が低く、冷痛覚を適切に評価できていない可能性があった。そこで、温度・測定時間・実験装置の構造等の至的条件を検討した。その結果、プレート温度をマイナス3度、測定時間3分に設定した場合に、適度な痛み行動が観察された。また本法で、持続性炎症を惹起したラットでの冷痛覚の継時変化を観察し、炎症の持続期に冷痛覚の増悪が見られることを示した。この時期の感覚神経細胞レベルでどのような変化が生じているかを調べることで、病態にみられるような冷痛覚悪化のメカニズムを調べることが可能であると考えられる。痛み受容に関与する侵害受容器において、極端な高温や低温刺激の受容に働くタンパク質や受容メカニズムを明らかにする目的で、本年度以下の実験を実施した。1,侵害的低温刺激に関しては、アジュバンド単関節炎モデルラットで、炎症持続期に冷痛覚過敏が見られることを昨年度示した。今回は、この持続性炎症期のラット脊髄神経節細胞において、冷感受性が指摘されているTRPM8とTRPA1イオンチャネルの発現量の変化をRT-PCR法により調べた。両者共に明瞭な変化は観察されず、この冷痛覚過敏は他の機構や他の分子を介している可能性が考えられた。2,生体の侵害的高温受容に関しては、高温感受性(約50°C)が指摘されているTRPV2の関与を検討した。既知のTRP阻害剤の中で、TRPV2の熱応答に特異性の高いものを検索するために、異所的にTRPV2を発現させたHEK293細胞において約50°Cの高温刺激による活性化電流を阻害する物質を調べたところ、ガドリニウムイオンの抑制効果が最も高かった。そこで、ガドリニウムイオンが、ラット脊髄神経節の初代培養神経細胞の高温応答を阻害するかどうかを検討したところ、やや弱いものの抑制効果が確認され、ガドリニウム感受性の機構の関与が示唆された。しかしながら、本実験で高温感受性が確認できた培養神経節細胞について、TRPV2タンパク質の発現を免疫細胞化学的に調べたところ、その多くが抗TRPV2抗体陰性であり、高温応答とTRPV2タンパク質発現との対応が見られなかった。このように、少なくとも培養神経節細胞の高温応答においては、TRPV2以外に別のタンパク質が関わっている可能性が示唆された。本計画は、痛み受容にはたらく侵害受容器においての、極端な高温や低温の受容メカニズムを明らかにする目的で実施しており、本年度は特に高温受容に関する以下の実験を行なった。Transient receptor potentialイオンチャネルの一種であるTRPV2は、50°Cを超える侵害的熱受容体として有力視されていることから、その高温受容への関与を免疫組織学的手法により検討した。深麻酔下のマウスの後肢を高温の水に短時間浸漬した後、急速に神経組織を化学固定し、その後高温で活性化された脊髄後根神経節知覚ニューロン(DRGニューロン)で見られるExtracellular signal-regulated kinasesの一過性のリン酸化(pERKレベルの増加)を、抗pERK

特異的抗体を用いて免疫組織学的に検出した。野生型マウスにおいては、皮膚温レベルの32°Cの熱刺激後、約4.7%のDRGニューロンがpERK陽性を示したが、60°Cの熱刺激後には24.4%ものDRGニューロンでpERKが観察され、これらが熱感受性ニューロンであると考えられた。その大部分は小型ニューロンであり、主に中型大型ニューロンに属する抗TRPV2抗体陽性細胞においては、熱刺激によるpERK出現頻度は低かった。さらにもう1つの熱受容体であるTRPV1の遺伝子欠損マウスにおいて同様に調べたところ、60°Cの熱刺激後のpERKはDRGニューロンの7.1%でしか観察されず、しかもそのほとんどが抗TRPV2抗体に陰性であった。このことから、野生型マウスの高温感受性pERK陽性細胞は、その多くがTRPV1発現ニューロンであると考えられ、それ以外の細胞はTRPV・V2の発現レベルの低い細胞であることが明らかとなった。以上の結果から、TRPV1・V2に依存しない高温受容機構の存在が示唆された。
インプラントの細胞骨格制御能に注目したオッセオインテグレーションへのアプローチ

本研究では、インプラントの表面形状による細胞骨格の制御機構と細胞機能に及ぼす影響について解析した。今回、Smooth(S)、Micro(M)、Nano(N)の3種類の表面形状で検討を行った。細胞形態は、Sでは細胞の伸展が認められたが、M、Nでは細長い突起を有する形態を示した。細胞骨格の制御因子であるRhoAは粗さに応じて経時的に活性化された。RhoA阻害剤では全ての表面で細く長い細胞突起を誘導した。細胞機能(接着、遊走、骨芽細胞への分化)ではSで明らかな変化を誘導するものの、M、Nでは限定的であった。以上より表面形状による細胞機能の制御に細胞骨格制御機構の関連が示唆された。今年度は、研究の前提となるチタンディスクの作製法の確立とその表面の特徴を解析した。今回使用したチタンは、タイプIVのもので、表面を研磨、硝酸処理を行ったものをスムース(S)とし、研磨後、サンドブラスト処理を行い、塩酸で処理したものをマイクロサーフェイス(M)、同じくサンドブラスト後、過酸化水素+硫酸で処理したものをナノサーフェイス(N)とした。この表面をSEMで解析したところ、表面性状が明らかに異なっていることが確認できた。また、粗さをレーザー顕微鏡で測定、粗さはM>N>Sという順になり、それぞれの粗さで統計学的な有意差を認めた。また、表面の化学的性質として、親水性を計測したところ、N>M>Sであり、これもまた各群間で有意差が検出された。これにより、各表面性状の特徴を把握できたといえる。使用する細胞について、研究開始当初は、セルライン、あるいは動物より採取した細胞の2種類を検討していたが、動物実験の倫理審査に時間を要したことから、まずは、セルラインを購入し、細胞の各種の挙動を検索した。今回、使用したマウス由来の間葉系幹細胞株と前骨芽細胞株は、今回の実験条件では、接着能、増殖能には問題がなかったものの、骨芽細胞への分化能は期待したものは得られなかった。しかし、現段階では、本細胞株での実験を継続していく予定である。上記細胞を各種チタン上に播種し、細胞形態の観察を行った。播種後、24時間で免疫蛍光染色下で観察すると、どの細胞も伸展しており、良好な接着が観察された。そのために、接着初期の段階では、表面性状の影響が顕著に出る可能性を考え、播種後、2時間、6時間で観察したところ細胞形態に違いが認められ、特にSと粗い表面性状を持つM、Nでは異なった細胞形態が観察できた。前年度、評価を行った3種類の表面性状を持つチタンディスクについて、使用するサンドブラストを変えたために、再度評価を行ったが、前年度に得られた結果(表面粗さ、SEM像、親水性)と相違はなく、新たな機器を使用した作製法も妥当だっといえる。作製した3種類の表面性状を持つチタンディスク上に細胞を播種した。複数の条件下で接着細胞数と細胞の遊走能について検討し、それぞれの機能発現化におけるRhoAの活性化を計測した。これにより、各種の表面性状が細胞機能に及ぼす効果とそれに伴ったRhoA活性化について検討が可能であった。スムース(S)な表面上では表面の粗いマイクロ(M)、ナノ(N)サーフェイスに比べて、RhoAの活性化は低く、表面性状がRhoAの活性化や細胞の形態に影響していることが示唆された。また接着は早期では表面の粗いM, Nで、細胞の遊走では表面が滑沢なSでその機能は高くなることが示された。RhoAのインヒビターを用いてRhoAの活性化を抑制した場合、各種チタン上で細胞は細く長い突起をより形成し、過去の報告と同様の挙動を示したことからRhoAインヒビターの効果が表れていることが示された。接着後のRhoAのインヒビターの効果について実際の活性化度を測定したところ、Sではその効果が顕著だったことに対して、Nではその効果は緩やかで3群間に有意差が認められた。接着、遊走の検討においてRhoAのインヒビターを投与したところ、Sではそれぞれの機能が促進されたものの、M, Nではその促進能は有意に低かった。これらよりインヒビターの効果はチタンの表面性状によって異なっていることがわかり、その制御機構について、今後検討していく必要性がうかがえた。前年度は使用細胞の反応が悪くかったが、現在は賠償に使用する血清を新たに選択し、細胞の反応が改善された。これにより、当初の予定に沿った実験経過であると判断される。本研究では、インプラントの表面性状(Surface Topography)のオッセオインテグレーション促進効果に関するメカニズムについて、インプラントを模倣したチタンディスク上での細胞形態の変化に注目して行った研究である。特に細胞骨格を制御する因子である低分子量Gタンパク質のRhoファミリーのRhoAの関与を中心に研究を進めた。チタンディスクでは3種類の表面形状(スムースサーフェイス(S)、マイクロサーフェイス(M)、ナノサーフェイス(N))の作製からそのチタンの物性に関する解析を行い、それぞれの表面の特徴を明らかにすることができた。細胞形態では、S上では細胞は広く伸展したのに対し、M、Nでは突起を有する細胞が観察された。その際のRhoAの活性は表面の粗さに依存する結果となった。また、RhoA阻害剤の使用により細胞はどの表面においても突起を有する形態へ変化した。細胞の接着はM、Nでよく接着し、RhoA阻害剤で部分的な抑制効果が認められた。

細胞遊走能や骨芽細胞への分化能についても表面性状依存性の結果が得られ、その一方でRhoA阻害剤の効果はSでは顕著にみられたのに対し。M、Nでは限定的であった。これらより表面性状の違いによって認められる細胞へ及ぼす作用は、細胞形態やRhoAの活性化の相違がその一因である可能性が示唆される一方で、Nでは他の表面性状とは異なる制御機構が存在していることも示唆された。今後は更なる詳細なメカニズムの検討とともに他の因子(表面のぬれ性)などがどのように関わっているかが検討事項であることが示唆された。本研究では、インプラントの表面形状による細胞骨格の制御機構と細胞機能に及ぼす影響について解析した。今回、Smooth(S)、Micro(M)、Nano(N)の3種類の表面形状で検討を行った。細胞形態は、Sでは細胞の伸展が認められたが、M、Nでは細長い突起を有する形態を示した。細胞骨格の制御因子であるRhoAは粗さに応じて経時的に活性化された。RhoA阻害剤では全ての表面で細く長い細胞突起を誘導した。細胞機能(接着、遊走、骨芽細胞への分化)ではSで明らかな変化を誘導するものの、M、Nでは限定的であった。以上より表面形状による細胞機能の制御に細胞骨格制御機構の関連が示唆された。研究開始当初の予定では、材料学的な点において、チタンディスクの作製法の確立、その特徴の解析が目的であった。今回、複数回のディスク作製において、SEMでの観察では、各回でそれぞれ同様の表面性状を獲得できたため、本手法は確立できたといえる。さらに当初、予定にはなかった表面の化学的性質の解析も行い、この点において有意差が検出できたことは、研究を行う上で非常に有益であったと考えている。細胞に関しては、動物実験の倫理審査に時間を要し、また、購入したセルラインが期待したほどの挙動を示さずに、細胞の培養条件の設定に時間を要したが、現状では、実験の遂行が可能な状態にはなっている。これらの細胞を使用し、処理したディスク上での細胞培養を開始できたこと、また、細胞の形態観察を免疫蛍光染色で行えたことは、手法が確立できたことでもあり、今後の研究の遂行にとってポジティブな期間であったと思われる。今後が細胞の分化に関して、検討を行う予定であり、チタンの表面性状とRhoAのかかわりについて今年度同様、RhoAのインヒビターを用いて検討を行う。またRhoAの制御機構が表面性状の違いからくる骨分化能にどのような影響があるか、そのメカニズムについて検討を加えていく予定である。歯科補綴学これまでの研究機関で各種チタンディスクの作製は確立できたといえるために、今後は各チタンの表面性状に対する細胞反応に主眼点をおく予定である。特に細胞骨格を制御するといわれているGタンパクであるRhoAの発現機構やRhoAの各種細胞機能におよぼす効果を検討することを目的に実験を行う。本研究の遂行に際し、RhoAの発現の解析キットの購入、リアルタイムPCR等に必要なたんぱくなどの購入が必要となる。細胞に関しては、本研究費で購入した細胞株の使用を予定しているが、場合によっては動物から採取した細胞の使用も検討する。また、最終年度の実験に向けて、現在確立している表面の改造法に加え、新たな処理を検討する。
発癌を特徴づける炎症性背景と、単球のマクロファージ分化におけるシグナル経路の解明

稀少がんを対象に、腫瘍部および前癌病変をマイクロダイセクションしてDNA, RNAを抽出し、遺伝子変化の解析を進めた.形態変化と遺伝子変化との相関に対して不明の点が多いいくつかのがん抑制遺伝子に着目した.FLCNの胚細胞異常を有する場合、腎臓を主体にセカンドヒットやヘテロ接合性消失が認められた。しかしセカンドヒットが認められない症例においても蛋白質レベルでFLCNの顕著な減弱が認められた.メチル化は確認できなかった.ドミナントネガティブ効果により蛋白発現が抑制されている可能性が最も考えられた.数例の腎癌において初代培養株を作成した.1例はSV40T抗原により不死化した.卵巣癌・卵管癌・子宮内膜癌をモデルに、病変部におけるマクロファージの特徴を検討したところ、内膜症を背景とした癌部では免疫染色においてCD163 (+) CXCL4 (-)マクロファージが主体であり、さらにIFN-γ高発現EAOC症例においてsuppressor of cytokine signaling 1 (SOCS1)が減弱している知見を得ている.SOCS1発現の主体は浸潤マクロファージであり、内膜症では発現が認められるのに卵巣癌部では発現が明らかに低下していた.これらの知見は定量RT-PCRやWestern blotでも有意な差が確認された。さらにmiRNA検索でmiR30dとmiR155に関連が示唆されるデータを得た。どのような細胞内シグナル経路が関与しているかを確認するために目的細胞を単離してDNAを抽出し、JAK-STAT経路を中心に解析中である。また、子宮内膜ポリープを背景として閉経期に発症する高悪性度の微小漿液性腺癌(SEIC)について、病変部からlaser capture microdissection (LCM)を施行して腫瘍細胞のみを単離しDNAを抽出後、クロマチンリモデリング遺伝子として近年注目され始めている(Nat Genet 2012; 44: 1310-1315)FBXW7遺伝子のシーケンスを施行した。検討した6例中1例においてp.R505Cのミスセンス変異が同定された。これらのSEICではいずれも免疫染色においてFBXW7蛋白レベルの発現低下とその下流にあるcyclin Eの発現亢進が認められ、検索範囲内に変異が認められないSEICであってもFBXW7遺伝子による細胞周期調節に異常をきたしている可能性が強く示唆された。多重がん症例を対象に、腫瘍部および前癌病変などをマイクロダイセクションし、DNAやRNAを抽出し、遺伝子変化の解析を進めてきた。17番染色体にはp53, FLCN, BRCA1など複数のがん抑制遺伝子が存在することから、多発性腫瘍を発症する患者のがんにおける17番染色体の状態に着目した。遺伝的にFLCN変異を有する患者は全身臓器にがんや嚢胞を多発する。散発性嫌色素性腎がんでは17番染色体ロスが高率に起こることが既に知られているが、凍結検体を用いたFLCN変異保因者の嫌色素性腎がん(n=9)では17番染色体にコピー数にゲインやロスは認められず、1-22番染色体全体を通して殆ど安定したコピー数を呈した。また組織において17番染色体セントロメア領域を認識するFISHを用いて散発性腎がんと比較したが、FLCN変異保因者の腎がんはほぼ全例でダイソミーであるのに対して、散発性腎がんでは殆どがモノソミーであった。これらの結果から、がんを多発しやすいFLCN変異保因者の病変で染色体の大規模ロスは考えにくくなった。更にコピー数を詳細に解析すると、FLCN変異保因者の多発がん部において多数のヘテロ接合性消失(LOH)が見つかったが、いずれもコピー数に変化がない( copy neutral) LOHであった。染色体コピー数が変化しない一方で、免疫染色やウエスタンブロットを用いて検討すると、これらの腫瘍部では有意にmTORシグナル経路が亢進していた。またメチル化解析を行ったが、がん部における有意なメチル化は認められなかった。遺伝的背景が不明な婦人科臓器多重がん例をマイクロダイセクションによってWntシグナル制御に関与するCTNNB1遺伝子について検討したところ、遺伝子変異の有無によって多重がんの補助診断ができる症例が出たため、症例数を増加している。当初発癌周囲の炎症細胞を対象に研究する計画であったが、腫瘍部におけるNGS(次世代シーケンス)やCNV (コピー数解析)から得られるデータを早急に解析して世界に発信する必要がでてきた。現在、遺伝性が疑われる多臓器癌症例が当方に集積されるシステムが稼働しており、それらの原発・転移診断は診療にも大きな影響がるため、実地に即した研究にシフトしている。研究手法や技術は、いくつもの癌研究解析に応用できるため、引き続き婦人科癌や泌尿器腫瘍を対象に発癌過程に影響する炎症性微小環境についても症例解析を重ねている。希少がん症例を対象に、腫瘍部および前癌病変などをマイクロダイセクションし、DNAやRNAを抽出し、遺伝子変化の解析を進めてきた。FLCN, FH, PTENなど複数のがん抑制遺伝子に着目した。FLCNの胚細胞異常を有する患者において、様々な全身臓器の腫瘍(肺、唾液腺、甲状腺)に2hitやヘテロ接合性消失(LOH)が認められた.しかし2hitが認められない症例においても蛋白質レベルでFLCNの顕著な減弱が腫瘍の多くに認められた。メチル化は確認できなかったことから、FLCNの1hitだけでドミナントネガティブ効果により蛋白発現が抑制されている可能性が最も考えられた.FLCN

胚細胞変異を有する腫瘍細胞から初期培養を行い、数例において初代培養細胞株の作成に成功した.1例においてはSV40T抗原により不死化を行った.遺伝的背景が不明な骨盤臓器がん例をマイクロダイセクションによってp53変異箇所を検討したところ、晩期再発と思われた症例が原発巣と腹腔内病変とで相互排他的変異を呈していることが判明し、多重がんと最終的に判断した.一方、異時性に漿液性癌と境界悪性腫瘍を左右卵巣に発症した症例では変異箇所と変異パターンが同一で、組織学的悪性度に違いがあるものの一方から他方への転移が強く疑われた.子宮内膜漿液性癌の背景はしばしばポリープで、ポリープを構成する内膜間質細胞の半数以上にER, PgRの減弱みられ、閉経後の独特な炎症性微小環境から萎縮性内膜腺にp53変異が生じることが推測された。各腫瘍に頻度が高い癌関連遺伝子の詳細な検討によって、多重がんや再発転移の補助診断ができる症例が出てきたため、引き続き症例数を増やして検討していく予定である.稀少がんを対象に、腫瘍部および前癌病変をマイクロダイセクションしてDNA, RNAを抽出し、遺伝子変化の解析を進めた.形態変化と遺伝子変化との相関に対して不明の点が多いいくつかのがん抑制遺伝子に着目した.FLCNの胚細胞異常を有する場合、腎臓を主体にセカンドヒットやヘテロ接合性消失が認められた。しかしセカンドヒットが認められない症例においても蛋白質レベルでFLCNの顕著な減弱が認められた.メチル化は確認できなかった.ドミナントネガティブ効果により蛋白発現が抑制されている可能性が最も考えられた.数例の腎癌において初代培養株を作成した.1例はSV40T抗原により不死化した.症例集積において術前化学療法を施行する例が増えたため、末梢血を用いた検索に影響が出ており、採取方法を組織検体からのlaser capture microdissection (LCM)にシフトしている。LCMでは微小検体からも目的DNAやmRNAが比較的高精度に抽出できるため、予定を一部変更してLCMによる癌部や境界病変の単球や腫瘍細胞を単離して、IFN-γ高発現状況下でSOCS1の発現を負に調節する機構を遺伝子レベル検討している。また卵巣癌・子宮内膜を巻き込む癌症例においては病理学的に進行癌か重複癌か鑑別が困難な例も少なくないため、beta-cateninの免疫染色態度に違いが認められるものを主たる対象にPTEN変異とCTNNB1変異のパターンを解析に加え、補助的病理診断への有用性も複数症例で検討している。多臓器癌が異時性に起こる可能性が高い疾患背景を有する症例を日常診療から拾い上げていく工夫につながる研究を発展させる。同一患者の過去のFFPE(パラフィンブロックとして保存している)検体を利用した異時性多発癌の背景疾患を客観的に推定できる疫学論文を発表するとともに、形態診断と補助診断の組み合わせから、精度の高い病理学的診断や診療方針に介入できるよう、知見を重ねていきたい。その中で発癌する例、しない例の分岐点に炎症細胞がどう介入しているのか、シグナル経路の解明を行っていく予定である。発癌の背景にある炎症細胞や間質細胞についても基質関連酵素を中心に発現変化を検討する。人体病理SOCS