hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
好アルカリ性バチルス属細菌のアルカリ適応に関与するmrpオペロンに関する研究

昨年度までにNa^+イオンの排出や細胞内pHホメオスタシスに関与する遺伝子群mrpオペロンを好アルカリ性Bacillus firmus OF4株からクローニングすることに成功した。本遺伝子群の全塩基配列は、GenBankに登録した(アクセス番号:AF097740)。本年度は、OF4株の全mrpオペロンを含む遺伝子断片をベクターpMW118に連結し、主要なNa^+/H^+アンチポーターを欠損している大腸菌Knabc株に形質転換し生理的機能解析を試みた。形質転換株は、Knabc株が生育できない0.2M-NaCl濃度以上の培地で良好に生育した。また、形質転換株から調製した反転膜小胞を用いた実験より、本遺伝子にコードされているタンパク質が、Na^+/H^+アンチポーター活性を持つことを明らかにした。遺伝子の一部をプラスミド上で欠失させるとNa^+/H^+アンチポーター活性が消失し、Knabs株の欠損を相補できなくなった。このことから、本遺伝子群のNa^+/H^+アンチポーター活性には、少なくとも7つすべての遺伝子産物が関与していることが明らかになった。しかし、7つの遺伝子産物すべてで大きな複合体を形成してNa^+/H^+アンチポーターとして機能しているのか、一部はシャペロンや複合体の安定性に関与するだけなのかは現在のところ不明である。今後、本遺伝子産物の精製を試みることによりこのことが明らかになることが期待される。別のアプローチとして相同的組み換え技術を用いて染色体上のmrpオペロンの欠失を試みた。しかし、この遺伝子群の欠失変異株を取得することは全く出来なかった。同様の実験を枯草菌で行った場合、欠失変異株が容易に取得できた。このことは、枯草菌が、Na^+とK^+どちらかのカチオンを用いて生育を維持できるのに対し、好アルカリ性細菌Bacillus firmus OF4株は、生育にNa^+を必須とし、おそらく菌のNa^+サイクルの主要な役割を果たしているため、mrpオペロンの欠損が菌にとって致死的な変異になるためと考えられた。近年、好中性菌の代表的な枯草菌の細胞内pH調節に関与する遺伝子群mrpオペロンの生理的役割を著者とマウントサイナイメディカルセンターのKrulwich教授らのグループで明らかにした。今回、大腸菌を宿主として好アルカリ性細菌の中で最も生理的機能の解析が進んでいる好アルカリ性Bacillus firmus OF4株から、このmrpオペロンのクローニングを試み、全塩基配列を決定した。この塩基配列は、DNA塩基配列のデータバンクであるGenBankに登録した(アクセス番号:228795)。本遺伝子群は、オペロンを形成し7つの構造遺伝子から構成されていることが明らかになった。遺伝子解析ソフトを利用した解析から、これら7つの遺伝子にコードされているタンパク質は、いずれも疎水性が高く、膜に局在するタンパク質であることが示唆された。データベースを用いたホモロジー解析よりmrp遺伝子群と相同性のある遺伝子群が、ブドウ球菌、Rhiobiummeliloti,Bacillus sp.C-125株から報告されていることが明らかになった。この中で、Bacillus sp.C-125株とのタンパク質レベルでの相同性が最も高く、約75%の相同性があった。OF4株におけるmrpオペロンの生理的機能を解明するために、染色体DNA上のmrpオペロンをDNAの相同的組換え技術により構造遺伝子の一部を欠損させた変異株を現在作成中である。初期的な実験結果より、本領域がアルカリ性細菌のナトリウムサイクルに中心的な役割を果たしていることが示唆された。今後は、変異株の取得と変異株の生理的機能解析を中心に研究に取り組む予定でいる。

このことは、枯草菌が、Na^+とK^+どちらかのカチオンを用いて生育を維持できるのに対し、好アルカリ性細菌Bacillus firmus OF4株は、生育にNa^+を必須とし、おそらく菌のNa^+サイクルの主要な役割を果たしているため、mrpオペロンの欠損が菌にとって致死的な変異になるためと考えられた。
カルシウム流入制御機構を介した自己免疫疾患発症機序の理解と解析

本研究の目的は、カルシウムシグナルが自己免疫疾患の発症をどのように制御しているのかについて、ストア作動性カルシウム流入を欠損するマウス(Stim1とStim2の2重欠損マウス)を用いて解析することである。本年度は以下の解析を行った。1.カルシウム高感受性のNFAT変異体であるNFAT1-AVをレトロウイルスを用いて造血幹細胞に発現させ、Rag1欠損マウスに移入し、T細胞や制御性T細胞の分化に対する影響を調べた。その結果、NFAT1-AVを用いても、Stim1とStim2の2重欠損マウスにおける制御性T細胞の分化障害を回復することはできなかった。したがって、ストア作動性カルシウム流入の欠損による制御性T細胞の分化障害は、他のNFATに依存している可能性、あるいはカルシウム流入が制御性T細胞の生存に重要である可能性が考えられた。2.胸腺CD4陽性CD8陽性T細胞、胸腺CD4陽性T細胞や末梢のCD4陽性T細胞における様々なカルシウム透過性チャネルの発現をRT-PCRによって調べた結果、候補となる遺伝子を同定することができた。3.STIM2の生理的な機能を明らかにするために、T系列細胞分化におけるSTIM2の役割を解析した。その結果、STIM1欠損STIM2ヘテロマウスにおいて、invariant NKT細胞の分化が著しく阻害された。その一方で、制御性T細胞の分化は正常であった。この結果から、STIM1非存在下における、STIM2が担うカルシウム流入はiNKT細胞の分化に必須であり、各T系列細胞は異なる強度のカルシウムシグナルを利用していることが明らかとなった。
線虫C.elegansストレスタンパク質による安全性評価システムの開発

C.elegansHsp90遺伝子のプロモーター領域とGFP遺伝子の融合遺伝子を作製し、C.elegansに導入した。昨年度作製したGFP遺伝子導入C.elegans株は、種々ストレス下での反応を検出できたが、遺伝的に不安定であるという欠点があったので、新たにGFP遺伝子導入C.elegansを作製した。これらのGFP遺伝子導入C.elegansは継代を重ねても表現型が変化せず、ストレスに応答した蛍光の発色も良好であり、今後の分子レベルストレスの検出に有効であると考えられる。2,分子ストレス下におけるHsp群遺伝子mRNAの定量GeneAmp2000装置を用いたmRNAの定量の条件を種々検討し、凍結破砕法によるtotalRNAの抽出、One-StepRT-PCRの組み合わせが最適であるという結論を得た。また、PCR産物の定量については、サイバーグリーン法とTaqmanProbe法を比較したが、結果に有意差は認められず、サイバーグリーン法で十分であることが確認された。以上の手法で分析した結果、Hsp90mRNAは、32°C、2時間の処理で約67倍に、1μMCdで約2倍に増加した。また、Hsp7OmRNAでもほぼ同様の結果であった。Hsp90遺伝子の突然変異株であるdaf-21株を用いて、32°C、2時間の処理下でのHsp90mRNA量を測定したところ、野生株の場合よりもさらに多量(89倍)のHsp90mRNAが発現していた。このことは、Hsp90遺伝子発現制御でのネガティブフィードバック機構の存在を示唆しており興味深い。3,まとめ以上の研究によって、C.elegansHsp遺伝子群を利用した安全性評価システムの有用性が確認できた。しかし、毒物の作用を分類できるデータベースの構築には至らなかった。今後の課題は次の通りである。・分析するHsp遺伝子の種類の増加(特に低分子Hsp群)。・野生株のC.elegansでは、強固なクチクラ層のために化学的毒性検出感受性が十分ではないので、クチクラ層を構成分子に関する突然変異体を用いた検出感度の向上。線虫C.elegansから、効率よく純度のよいtotalRNAを抽出する条件を種々検討し、実用的で安定して抽出できる条件を確立した。また、totalRNAから、短時間で再現性良くcDNAを作製する条件についても各種の方法を試み、適切な手法を明らかにした。次に、hspmRNA(cDNA)を定量する手段として、RT-PCRとCCDイメージアナライザーによる方法、競合的PCR法及びPCRカイネティクス分析法によるデータを比較検討した。その結果、GeneAmp2000装置を用いたPCRカイネティクス分析法が、最も再現性良く詳細な分析データが得られ、他の方法より優れていると判断した。これらの手順によって、サイバーグリーン1蛍光色素を用いたPCR産物のリアルタイム定量実験を繰り返し行い、hsp90cDNA量を再現性良く推定できることがわかった。また、得られたPCRカイネティクスデータから検量線を作成することで、それぞれの実験データの信頼性を判定することができ、誤差の大きい失敗実験のデータを排除できることがわかった。一方、細胞質アクチンとグルタメートデヒドロゲナーゼcDNAを用いて対照実験を行った結果、少なくとも熱ショックストレスにおいては、これらのcDNA量に変動がなく、内部標準として適切であることがわかった。本年度の実験によって、基礎的な実験手法、条件を標準化できたので、今後は線虫に与えるストレスの種類と定量するhspの種類を増やしてデータを蓄積する予定である。1,遺伝子導入C.elegansによるストレスの検出線虫C.elegansのhsp90遺伝子のUTRを含む5'側上流部分とGFP遺伝子の融合遺伝子を作製し、線虫C.elegansに導入した。この遺伝子導入C.elegansを、熱、カドミウム、亜セレン酸、pヒドロキシ水銀安息香酸のストレス下に置いたところ、いずれもGFPの発現が誘導された。一方、アルコール類や過酸化ストレスでは、GFPの発現誘導は観察されず、導入したhsp遺伝子の発現調節とストレスの種類に関連があることが示唆された。また、この遺伝子導入C.elegansは、導入遺伝子に関してホモになると不稔になり、ヘテロでのみ継代が可能であった。2,hspmRNAの定量によるストレスの検出GeneAmp2000装置で、線虫C.elegansのhsp及び細胞質アクチンmRNA量を、種々のストレス下で測定した。熱ストレスによって総mRNA量は、約2倍に増加し、この増加分の大半はhspファミリーmRNAに由来すると推定された。hsp90mRNAは、熱ストレスで約7倍に、カドミウム処理で約2倍に増加していた。3,今後の方針本年度までの実験によって、線虫C.eleganshsp遺伝子に着目した安全性評価システムの有効性が、着実に明らかになってきた。今後は、今回作製した遺伝子導入C.elegansの遺伝子発現調節機構の解析、新規遺伝子導入C.elegansの作製、種々ストレス下でのhsp遺伝子群mRNA量の定量及び突然変異体を用いた分析の高感度化を進める予定である。

これらのGFP遺伝子導入C.elegansは継代を重ねても表現型が変化せず、ストレスに応答した蛍光の発色も良好であり、今後の分子レベルストレスの検出に有効であると考えられる。2,分子ストレス下におけるHsp群遺伝子mRNAの定量GeneAmp2000装置を用いたmRNAの定量の条件を種々検討し、凍結破砕法によるtotalRNAの抽出、One-StepRT-PCRの組み合わせが最適であるという結論を得た。また、PCR産物の定量については、サイバーグリーン法とTaqmanProbe法を比較したが、結果に有意差は認められず、サイバーグリーン法で十分であることが確認された。以上の手法で分析した結果、Hsp90mRNAは、32°C、2時間の処理で約67倍に、1μMCdで約2倍に増加した。また、Hsp7OmRNAでもほぼ同様の結果であった。Hsp90遺伝子の突然変異株であるdaf-21株を用いて、32°C、2時間の処理下でのHsp90mRNA量を測定したところ、野生株の場合よりもさらに多量(89倍)のHsp90mRNAが発現していた。このことは、Hsp90遺伝子発現制御でのネガティブフィードバック機構の存在を示唆しており興味深い。3,まとめ以上の研究によって、C.elegansHsp遺伝子群を利用した安全性評価システムの有用性が確認できた。しかし、毒物の作用を分類できるデータベースの構築には至らなかった。今後の課題は次の通りである。・分析するHsp遺伝子の種類の増加(特に低分子Hsp群)。・野生株のC.elegansでは、強固なクチクラ層のために化学的毒性検出感受性が十分ではないので、クチクラ層を構成分子に関する突然変異体を用いた検出感度の向上。
資源植物の初期形態形成の制御に関する研究

レタス(品種:カイザー)の種子を0.8%寒天上に播き、生じた幼植物から子葉を採取した。この子葉を細く切り、酵素処理をしてプロトプラストを分離した。蛍光顕微鏡にてプロトプラストを観察したところ、葉緑体は青(B)および紫(V)励起の条件下で赤い蛍光を発したが、紫外線(U)励起の条件下で消失した。葉緑体を含まないプロトプラストは、BおよびV励起の条件下で黄色の蛍光を発し、U励起で青い蛍光を示した。上記のレタスプロトプラストとイネ(品種:日本晴)カルスから酵素的に分離したプロトプラストを用いて細胞融合の実験をおこなった。細胞融合はポリエチレングリコール法および電気的方法でおこなった。何れの方法でも細胞融合はおこるが、反応の途中経過を視察するのには電気融合法の方が便利であった。レタスのプロトプラストは緑色であるので融合過程の観察は容易であった。電場におくと細胞相互の接着がおこり、パルス電圧をかけると、融合は比較的ゆっくりとすすんだ。一方、イネカルスから分離したプロトプラストは無色であり、微分干渉顕微鏡で観察した。細胞接着後パルス電圧をかけると、融合が急速におこり、大型のプロトプラストが出現した。レタスプロトプラストおよびイネプロトプラストを混合し、両者の融合をおこなった。両プロトプラストの識別は色から容易であった。融合がおこると、レタスプロトプラスト中の葉緑体が無色のイネプロトプラスト中に除々に拡散していく過程が観察された。
気道平滑筋のカルシウム依存性クロライドチャネルと気道過敏症

平成9年度にはモルモット気管平滑筋から単離した細胞において、細胞内Ca^<2+>動態の画像解析と膜電流測定を同時に行うことを試みた。indo-1あるいはfluo-3をwhole-cell clamp用パッチピペット内から細胞内へ単純拡散で導入し、共焦点レーザー蛍光顕微鏡(Nikon;RCM-8000)により画像を取得した。acetylcholine(ACh)やhistamine(His)を加えることにより細胞内Ca^<2+>濃度の振動にほぼ同期してCa^<2+>依存性Cl^-電流の振動が観察された。またcaffeineによっても細胞内Ca^<2+>濃度上昇と伴にCa^<2+>依存性Cl^-電流が発生したが、それらの振動は殆ど観察されなかった。一方、細胞内Ca^<2+>濃度上昇によりCa^<2+>依存性K^+電流はCl^-電流に比べより早く活性化された。大コンダクタンスCa^<2+>依存性K^+電流の活性化は、電位が一定の場合において細胞膜直下のCa^<2+>濃度上昇にのみ依存しており、時間依存性はないと推測される。一方、Cl^-電流の活性化には時間依存性が観察され、平均としての細胞内Ca^<2+>濃度上昇と比べても僅かに(百ミリ秒程度)遅れる場合が多いことが明らかとなった。Cl^-電流の不活性化にカルモジュリン依存性蛋白燐酸化酵素によるチャネルのリン酸化が関与していることが他の研究者によりごく最近報告されている。活性化機構も時間的な観点からCa^<2+>による直接作用だけでは説明が困難かもしれないが、少なくとも各種蛋白燐酸化酵素の関与の可能性は薬理学的実験結果から低いと思われる。平成8年度はモルモット気管から単離した平滑筋細胞を、サポニンの一種(β-エスシン)によりスキンド細胞とし、細胞内のイオン環境を変えられる状況下でオンセルパッチクランプにより大コンダクタンスClチャネルを記録することに成功した。この実験には購入した水圧式微動マニピュレーターが不可欠であった。このチャネルは細胞内外のCl濃度が140mMの時、約300pSと非常に大きなコンダクタンスを持ち、その活性が細胞内Ca濃度に依存していた。一定の浸透圧下でスキンド細胞でも観察されたことから浸透圧感受性Clチャネルとは異なるものと思われる。摘出パッチでチャネル活性を観察すると一定のCa^<2+>濃度においてもrun-downが生じ、数分以内に活性が消失したので、Ca^<2+>以外に活性化あるいは活性維持に必要な細胞内因子が存在すると考えられる。一方、細胞全体から巨視的電流として観察されるCa依存性Cl電流のノイズレベルは低いので、この大コンダクタンスClチャネルが主なClチャネルではない可能性が高い。小コンダクタンスClチャネルの記録も現在検討しつつある。また、細胞全体から巨視的電流として観察されるCa依存性Cl電流の活性化機序について検討し、各種蛋白リン酸化酵素(カルモジュリン依存性、c-AMP依存性、c-GMP依存性、チロシン)の活性化によるチャネル蛋白に燐酸化が直接的に必要ではないことを明らかにした。しかし、活性化されたCl電流の減少にはATPが必要なためCaポンプの活性維持が不可欠であるか、あるいはチャネル蛋白のリン酸化が必要であると思われる。単離したモルモット気管平滑筋細胞において脱分極あるいはcaffeineによって生じるCa^<2+>依存性Cl^-電流の活性化・不活性化の時間依存性とCa^<2+>依存性をCa^<2+>依存性K^+電流と比較検討した。

これらのうちK^+電流はCl^-電流よりも活性化が早く、電位が一定ならば活性化は細胞膜直下のCa^<2+>濃度上昇にのみ依存しており、時間依存性はないと推測された。一方、Cl^-電流の活性化には時間依存性が観察された。さらに細胞内Ca^<2+>動態の画像解析と膜電流測定を同時に行うことを試みた。indo-1あるいはfluo-3をwhole-cell clamp様パッチピペット内から細胞内へ単純拡散で導入し、共焦点レーザー蛍光顕微鏡(Nikon ;RCM-8000)により画像を取得した。Cl^-電流の活性化は平均としての細胞内Ca^<2+>濃度上昇と比べても僅かに(百ミリ秒程度)遅れる場合が多いことが明らかとなった。気管平滑筋Cl^-電流の不活性化にカルモジュリン依存性蛋白燐酸化酵素によるチャネルのリン酸化が関与していることを他の研究者がごく最近報告している。活性化機構も時間的な観点からCa^<2+>による直接作用だけでは説明が困難かもしれないが、少なくとも各種蛋白燐酸化酵素の関与の可能性は薬理学的実験結果から低いと思われる。さらにCa^<2+>依存性Cl^-電流を担う単一イオンチャネル電流の観測を試みたが、inside-outの状態では活性が見られない場合が多いので、細胞内情報伝達系を保持したまま細胞膜に小孔を開け、細胞内Ca^<2+>濃度を制御する系においてon-cell patch clampを試みた。この結果、大コンダクタンスのCa^<2+>依存性Cl^-チャネルの活性を認めた。巨視的電流から予測された単一チャネル電流とは性質が異なることから、このチャネル以外に、よりコンダクタンスの小さなCa^<2+>依存性Cl^-チャネルが存在するものと思われる。
機械部品に装着された記録素子を用いた分解組立支援システム

本研究は,部品やモジュール単位に記録された個体情報を分解・組立作業のFAや作業支援に利用することを目的として,(1)機械部品に装着できる記録素子の検討,(2)記録情報を利用した分解・組立支援システムの開発,(3)作業支援の効率の評価実験を行うものである.この中で本年度は,分解・組立支援システムの改良と,作業支援システムの評価実験を行った.分解・組立支援システムは,初年度に作成したプロトタイプではRFID(無線タグ)読み取りアンテナを手指に取り付けた場合に不安定になる場合があったので,アンテナをふさわしい形状に改良した.また,ソフトウェアにおいてはモバイル・エージェントを利用することで,作業者側の自律性と遠隔地からの作業指示性を共存させたシステムを構築した.これにより,作業者が移動して環境を変えても,遠隔地から新たな作業計画に見合った作業支援プログラムをダウンロードして実行できるうえ,作業者が存在する新たな環境でのセンサ構成に対応した作業モニタリングができるようになった.作業支援の効率についての評価実験では,機械の分解組立の作業として,小型旋盤の歯車交換作業を対象とし,RFIDタグを歯車などの部品に取り付け,その部品を確認しながら作業を行ったときの作業効率と安全性について評価した.作業効率の点では,RFIDの検出に伴う作業の遅延時間を計測し,安全性については,作業を急ぐことによる作業時間の短縮率を計測した.この結果に基づいて,作業効率を落とさず安全に作業していく作業手順の確認頻度の設計指針を示した.本研究は,部品やモジュール単位に記録された個体情報を分解・組立作業のFAや作業支援に利用することを目的として,(1)機械部品に装着できる記録素子の検討,(2)記録情報を利用した分解・組立支援システムの開発,(3)作業支援の効率の評価実験を行うものである.この中で記録素子の検討ならびに作業支援システム開発を本年度に行った.まず,RFID素子を機械部品に装着した際の読み取りの可能性を検討した.機械部品には,プラスチック製のものから金属製のものまで含むので,それらの材料の影響,また形状や大きさの影響を考慮する必要がある.今回は,代表的な素材である,ゴム,鋼,アルミニウムの3種類を選び,市販の金属対応型RFID素子と読取装置を用いて,読み取りができる距離に及ぼす影響を測定した.ここでは,電波に影響を及ぼさない環境においておよそ510mm程度で読み取りができるRFIDシステムを用いた.RFID素子をそれぞれ,ゴム板上,鋼板上,アルミ板上,および,鋼板に5mm厚のアクリル板を挟んで載せた場合の4タイプにおいて,それぞれの素材の影響を評価した.実験の結果に基づいて,RFID素子の設置方法の指針を得た.次に,RFID素子から読み取った情報を用いて作業支援に利用するシステムを開発した.作業支援への利用にはRFIDシステムの小型化,コンピュータとの統合が不可欠である.そこで,10mm角四方程度の超小型アンテナを用いた市販のRFIDシステムを採用し,これをコンピュータによって読み取り,書き込みができるようにするソフトウェアを作成した.本研究は,部品やモジュール単位に記録された個体情報を分解・組立作業のFAや作業支援に利用することを目的として,(1)機械部品に装着できる記録素子の検討,(2)記録情報を利用した分解・組立支援システムの開発,(3)作業支援の効率の評価実験を行うものである.この中で本年度は,分解・組立支援システムの改良と,作業支援システムの評価実験を行った.分解・組立支援システムは,初年度に作成したプロトタイプではRFID(無線タグ)読み取りアンテナを手指に取り付けた場合に不安定になる場合があったので,アンテナをふさわしい形状に改良した.また,ソフトウェアにおいてはモバイル・エージェントを利用することで,作業者側の自律性と遠隔地からの作業指示性を共存させたシステムを構築した.これにより,作業者が移動して環境を変えても,遠隔地から新たな作業計画に見合った作業支援プログラムをダウンロードして実行できるうえ,作業者が存在する新たな環境でのセンサ構成に対応した作業モニタリングができるようになった.作業支援の効率についての評価実験では,機械の分解組立の作業として,小型旋盤の歯車交換作業を対象とし,RFIDタグを歯車などの部品に取り付け,その部品を確認しながら作業を行ったときの作業効率と安全性について評価した.作業効率の点では,RFIDの検出に伴う作業の遅延時間を計測し,安全性については,作業を急ぐことによる作業時間の短縮率を計測した.この結果に基づいて,作業効率を落とさず安全に作業していく作業手順の確認頻度の設計指針を示した.
常時微動を用いた地盤増幅率推定法の開発

常時微動記録から地盤振動特性を抽出するための手法を提案した。ニュージーランド・クライストチャーチ市で測定されたおよそ100箇所における常時微動記録、19921993年に市中心部5地点および岩盤上の1地点で観測された微小地震の記録、および1994年6月に発生したアーサーズパス地震の直後に行われたアンケート震度調査の結果を利用した。まず初めに岩盤の基準点に対する市中心部の地震観測点での最大加速度振幅に関する増幅倍率(Af)を求め、常時微動の水平/上下スペクトル比のピークの値(Ap)と比較した。この結果、Apが大きい程Afが大きくなることが判明した。この関係を利用して市内各地で求められたApからAfを推定し、これと岩盤上における最大加速度から市内の各地点における最大加速度を推定する方法を提案し、1994年アーサーズパス地震における市内の震度分布の推定に適用した。推定された震度は、岩盤や砂丘上で比較的小さく、泥炭層上の地域で比較的大きくなるなどアンケート震度や地盤条件と符号する結果を得た。また、市中心部では高々数平方キロメートルの範囲で推定MM地震が2程度異なるなど、沖積平野上における地盤振動特性の地域性が本手法によって確認された。この手法が他の沖積平野における地盤振動特性推定へ適用できるか否かを調べるため、1994年北海道東方沖地震の際、強震動を観測した釧路市の強震観測点において常時微動測定を実施し、各観測点における増幅率と常時微動から推定した増幅率を現在比較検討しているところである。
載荷された異方性砂地盤の破壊機構と極限支持力に関する研究

異方性砂を可傾モールドで作り平面ひずみ試験を行った。試料は豊浦砂でe=0.69(Dr=78%)である。着色砂を互層に詰めテスト毎のすべり方向を観察した。最大主応力面と堆積方向のなす角をβとすると【Φ_(β=90゚)】<【Φ_(β=20゚)】であるがm=【φ_(90-)】/【φ_(0゚)】=0.906であった。一般にmを用いφβ=φ0/(【cos^2】β+【m^(-2)】【Sm^2】β)1/2(1)のように構内近似出来る。このときβ〓60゚でφβは最少となった。支時力計算ですべり面の水平よりの傾角をα,堆積方向を水平よりδとするとα=【45^P】-φβ/2-β+δ(2)であるのでm,α,δに対し(1),(2)よりβ,φβが決まる゚m=0.9として【Ng_A】/Ng【φ_0】;【N_(γA)】/【N_γ】【φ_0】を計算した。小田の異方性地盤の支持力実現値と比べると計算値は実測値の約1/2となるがδに対する傾向はよくなった。値の差異は容器側摩擦が効いたためと思われる。同じ計算を松岡等の関係式:tanφ∞45゚+φβ/2-β(3)を用い(2)とともに実施したが、この時の支持力はより低目のものとなった。砂,粘土,岩の三層からなる地盤の支持力は各層原,裁培中の大小,各層の強度比によって決る。砂が密で〓い粘土が絞り出される時の近似整姓〓の近似度か高い理由を示した。粘土層が厚く、そのすべり破壊が起る時の内〓計算法を〓え、二層問〓として山口が前に〓えた計算法の適用限界を論じた。また絞り出しを抽対称として計算し、その形状係数を数値として与えた。次に粘土,砂,岩の三層からなる地盤に対し上と同様な計算を行い、〓く弛い砂層の圧縮破壊の実用的耐壊式を導いた。この〓は山口が以前Kotter解法により求めた精密解とほぼ一致することが示された。また分割計算で支〓力を求めなければならない砂層原の条件についても吟味,検討を加えた。
Ret蛋白の変異によって生じる多様な臨床病態の解析

Retは受容体型のチロシンキナーゼをコードし、多発性内分泌腫瘍症(MEN)2A・2B型、Hirschsprung病の原因遺伝子である。リガンドはGDNFで、Retの活性化にはGDNFR-αを必要とする。神経芽細胞腫細胞株を用いて実験を行ったところ、GDNFの添加によるRetの2量体化、ShcとRetとの結合、Shcのリン酸化、ShcとGrb2の結合、GTP結合Rasの増加、MAPキナーゼのリン酸化が検出され、Ret→Shc→Grb2→SosからRas→MAPキナーゼへのシグナルが考えられた。ShcとRetの結合について解析で、MEN2a型変異ではRetはShcのPTBドメインとSH2ドメインの両者へ結合、2B型変異ではPTBのみに結合、GDNFによる活性化ではPTBとSH2の両者に結合した。結合様式の違いが、Shcを介したシグナルに影響を与え、MEN2A型と2B型の病態の違いが生じている可能性が考えられた。GDNFファミリーに属するneurturin(NTN)について、米国のGenentech社と共同研究を行い、NTNによるRetの活性化を明らかにした。活性化にはNTNR-αが必要で、NTN・NTNR-α・Retの複合体により活性化が起きる。また、Retの細胞外領域のカドヘリン様構造について、Caイオンの作用を検討したところ、Caイオンを除去した条件下ではGDNF、NTNによるRetの活性化が起こらないことが判明した。リガンドとRetの結合にはカドヘリン様構造領域が、Caイオン依存症に作用していると推定される。Hirschsprung病(HSCR)には、MEN2A型とHSCRの合併を示す家系が知られる。細胞外領域の変異により、HSCR型変異Retに細胞表面への蛋白の輸送障害が起こるが、MEN2A型とHSCRとの合併を示す家系の変異にも、Retの輸送障害が起こった。また、HSCRを合併しないとされるMEN2A型の家系の変異を解析した結果、輸送障害が起こる変異を見出した。したがって、これらの家系においてはHSCRの合併のリスクが潜在的に存在すると予想された。
リンパ管増生因子・増生因子レセプターから見た消化器癌リンパ節転移機構の解明

消化器癌において、リンパ行性転移は予後を規定する重要な因子であるが、その通路となるリンパ管についての詳細な知見はいまだ得られていない。そこで我々は、消化器癌の進展におけるリンパ管の役割をより詳細に分析するため、リンパ管特異的に発現するとされるFlt4(VEGF-C受容体)に着目し、消化器癌病巣における発現を検討することとした。胃癌、大腸癌の臨床検体について、抗ヒトFlt4抗体、および市販の抗VEGF-C抗体を用いて免疫組織染色を行った。癌病巣内ではリンパ管ばかりでなく血管にもFlt4の発現がみられた。臨床因子との比較では、胃癌ではFlt4の血管内皮での発現がリンパ節転移に相関していた。大腸癌では、むしろ癌組織内のリンパ管数がリンパ節転移に相関があり胃癌と異なる機序の関与が考えられた。VEGF-Cの発現は、両者の癌病巣でみられ、癌組織における血管、リンパ管新生にVEGF-C/Flt4systemが促進的に働いていると考えられた。一方、マウスモデルにてFlt4の検出及び阻害実験を行うため、坑マウスFlt4モノクロナール抗体を作成した。この抗体をヒト前立腺細胞株PC-3を移植したヌードマウスに投与することで、腫瘍の血管新生が阻害され、増殖抑制効果が見られた。このことは、VEGFのみならずVEGF-C(D)の阻害も、癌に対する抗血管新生療法のターゲットとなる可能性を示している。マウス血管内皮細胞株F-2が細胞外基質依存性に管腔形成などの分化を示す系を用いて、内皮細胞の分化におけるFlt4の役割を検討した。マトリゲル存在下では培養液に坑Flt4抗体を加えることによって管腔形成が阻害された。したがって、Flt4は内皮細胞分化に重要な役割があることが明らかになった。腎癌、大腸癌臨床検体18症例について、RT-PCRを用いてVEGF-CとFlt4の発現を検討した。リンパ管増生因子であるVEGF-Cの発現は、約半数の癌部と正常部にみられた。Flt4は胃では約30%、大腸では約15%の組織に発現していた。これまでのところリンパ節転移との相関は明らかでないが、今後RT-PCRの条件等の最適化を行い、さらに多くの症例について検討を進めて行く方針である。マウスモデルにてFltt4の検出及び阻害実験を行うため,抗マウスFlt4モノクローナル抗体を作成した。マウスFlt4免疫ラットの牌リンパ球より、細胞融合法によって抗マウスFlt4抗体産生ハイブリドーマを作成し、高力価抗体産生クローンを得た。この抗体がウェスタンブロッテリングにて195kDの正しい抗原を認識すること、Flt4とそのリガンドであるVEGF-Cとの結合をin vitroで競合的に阻害することを確認した。この抗体をもちいて、マウス胎仔の発生段階での発現パターンを調べた。リンパ管特異的と考えられていたFlt4は、胎仔では動脈、静脈、リンパ管全ての脈管系に一過性に発現していた。発現の時期はそれぞれの脈管によって異なっており、最終的にリンパ管のみに弱い発現を残していた。従って、Flt4はリンパ管のみならずすべての脈管系や形成において何らかの役割を担っていることが明らかになった。マウス血管内皮細胞株F-2がin vitroで細胞外基質依存性に管腔形成などの分化を示す系を用いて、内皮細胞の分化におけるFlt4の役割を検討した。マトリゲル存在下では培養液に抗マウスFlt4モノクローナル抗体を加えることによって管腔形成が阻害された。したがって、Flt4は内皮細胞分化にも重要な役割があることが明らかになった。
ポストヒューマニズム的な萌芽の解明―フランツ・カフカを中心に

2018年度は紀要論文「文化の病いと〈人間〉獣ーニーチェ、フロイト、カフカ」(『広島修大論集』第59巻第2号、S. 189-201)を発表した。ニーチェ、フロイト、カフカの三者は、世界大戦への予感を胸に、避けがたく自己破壊への欲望へと向かっていく西洋文化と人類をいかにしてみつめたのか。彼らはその洞察を、それぞれ哲学、精神分析、執筆という形でどのように描出したのか。また、当時の西洋は文化的な病いを抱えていたと考察しうるのか、あるいは病的な文化の中で、人類は獣性、すなわちニーチェの言葉を借りればタイトルへ挙げたような〈人間〉獣を自らの内に育んだのか。文化と人間にまつわる三者の言説を集めながら分析を行い、時代と人間に関する彼らの洞察の共通性を明らかにすることを目的とした論文である。本論文執筆により、交付申請書に挙げていた3つの研究目的のうち、3つめの目的である「カフカに座標を定め、ポストヒューマニズム的な視点の系譜を近代以降のドイツ文学・思想史へ遡上する」を遂行することができた。本論中では、ダーウィンの進化論と関係していると類推しうるニーチェ、フロイト、カフカの言説に関しても論じたため、当初の「研究の目的」に掲げていた、「ヒューマニズムに最初の衝撃を与えた人物としてダーウィンを措定し、進化論をドイツで広めたヘッケル、それを支持したニーチェ、フロイトなどの理論とカフカの洞察を交差させつつ、ポストヒューマニズム的な萌芽を文学・思想史に探る」という最終目的におおむね至ることができたといいうる。本課題の目的は以下の2点を明らかにすることである。1.ドイツ語圏作家フランツ・カフカのテクストには、人間と身体を新たに再概念化して、独自の視点から捉えなおそうとする姿勢が読み取りうるのではないか?2.その姿勢とは、現代におけるポストヒューマニズム(脱人間中心主義)的なスタンスと重ねられるのではないか?さらにはカフカに座標を定めて、ポストヒューマニズム的な視点の系譜を近代以降のドイツ文学・思想史の中へと遡上すれば、ヒューマニズムへの懐疑の発生からポストヒューマニズム的なディスクールに至るまでを俯瞰できるのではないか?2016年度は論文「〈退化〉の孕む美とグロテスクーフランツ・カフカと中島敦の人間観/動物像」を寄稿した。ここではヘッケルの進化論の分析にもとづいて、カフカと中島の作品における〈退化〉の概念について論じた。合理/進歩主義的な観点からすれば〈退化〉という概念は通常、〈進化〉に比して否定的表象と結びつくが、カフカや中島の作品では、自らの存在を〈退化〉させるという事象を描くことで、啓蒙的な指標から取りこぼされた弱者としての他者に読者の共感や同情を差し向けさせることに成功しているといえる。中島敦はカフカと同時代に生きた作家であり、カフカの短編小説を愛読し、『狼疾記』では彼の作品について言及している。中島とカフカの人間観、身体像の比較分析は当初、本課題の研究対象には挙げていなかったが、西洋とアジアにおける進化論の受容と、時代を同じくする作家の人間像に共通性があるのかを分析する試みだった。中島は、ノンヒューマン/動物をモティーフに多くの詩や短編を残した。これらのテクスト分析から、中島の作品には、過剰な人間中心主義への懐疑や、弱者としての他者に共感しようとする姿勢が存在しており、それはカフカの作品が内包するポストヒューマニズム的な視点の萌芽と重ねられることが明らかとなった。本務校が変わり、それに伴い研究環境と学内業務負担の状況が若干変化した。その影響から本課題を申請した当初の設定に比べて、わずかだが研究に遅れが生じたが、おおむね順調である。論文執筆に加えて、学会発表も行う計画であったが、この点は実行できなかった。2016年度に達成できなかった目標は、2017、2018年度へ持ち越し、申請時に設定した目標を達成したい。本研究では、ドイツ語圏作家フランツ・カフカに座標を定めて、ポストヒューマニズム的な視点の系譜を近代以降のドイツ文学および思想史の中へ遡上し、極端な人間中心主義に対する懐疑の発生からポストヒューマニズム的なディスクールの成立に至るまでを俯瞰することを目的としている。2017年度は日本オーストリア文学会秋季例会にて、「文化の病と〈人間〉獣ーニーチェ、フロイト、カフカ」というタイトルのもと、招待講演を行った。本発表ではニーチェ、フロイト、カフカの三者について、2度に亘る世界大戦を目前に活動を行ったという時代的共通性を踏まえて研究を行った。先行研究を確認すると、ニーチェからフロイト、ニーチェとフロイトからカフカへという思想的な影響関係が見出される。しかし、三者の中の二名を繋げる先行研究は見受けられるものの、この三者をひとつの線へと繋ぎ、当時の文化と人間に対する彼らの洞察がいかなる点で共通しているのかについて分析する試みはいまだ十分になされていないといえる。以上を踏まえて、次の2点に関して分析する試みを行った。1.ニーチェ、フロイト、カフカは人類大量殺戮を直前に、暴力性を募らせていく西洋文化と人間像をいかに洞察していたのか?

2.それらの言説を集めて分析を行うことで、三者の捉えた西洋文化の病理にまつわる洞察の共通項を見出しうるのではないか?本研究は次の結論を述べた。1.カフカの物語『変身』は、虫に退化するという皮肉を通じた、20世紀の精神の退行に対するカリカチュアである。2.『変身』の解釈から読み取られうる、カフカの執筆を貫く時代への抵抗の精神は、「偽善」という病いに陥った文化と、〈人間〉獣、「原始人」という表象で人間の獣性を批判したニーチェとフロイトの近代文化および人間批判の系譜へと据えることが可能である。以上、交付申請書の研究実施計画に則した研究内容で研究を行うことができた。2017年度は学内で担当する新規の講義科目が増えたことから、本研究を申請した前任校で勤務していた当時に想定していたエフォートを、本研究に注ぐことが難しくなった。その結果、2017年度は一度の招待講演を行うのみで、論文執筆に至ることができなかった。本来は毎年度に少なくとも1件の学会発表と、論文の掲載を目標として掲げていたために、努力の至らなかった結果と受け止めている。2018年度は紀要論文「文化の病いと〈人間〉獣ーニーチェ、フロイト、カフカ」(『広島修大論集』第59巻第2号、S. 189-201)を発表した。ニーチェ、フロイト、カフカの三者は、世界大戦への予感を胸に、避けがたく自己破壊への欲望へと向かっていく西洋文化と人類をいかにしてみつめたのか。彼らはその洞察を、それぞれ哲学、精神分析、執筆という形でどのように描出したのか。また、当時の西洋は文化的な病いを抱えていたと考察しうるのか、あるいは病的な文化の中で、人類は獣性、すなわちニーチェの言葉を借りればタイトルへ挙げたような〈人間〉獣を自らの内に育んだのか。文化と人間にまつわる三者の言説を集めながら分析を行い、時代と人間に関する彼らの洞察の共通性を明らかにすることを目的とした論文である。本論文執筆により、交付申請書に挙げていた3つの研究目的のうち、3つめの目的である「カフカに座標を定め、ポストヒューマニズム的な視点の系譜を近代以降のドイツ文学・思想史へ遡上する」を遂行することができた。本論中では、ダーウィンの進化論と関係していると類推しうるニーチェ、フロイト、カフカの言説に関しても論じたため、当初の「研究の目的」に掲げていた、「ヒューマニズムに最初の衝撃を与えた人物としてダーウィンを措定し、進化論をドイツで広めたヘッケル、それを支持したニーチェ、フロイトなどの理論とカフカの洞察を交差させつつ、ポストヒューマニズム的な萌芽を文学・思想史に探る」という最終目的におおむね至ることができたといいうる。ヒューマニズムに最初の衝撃を与えた人物としてダーウィンを措定し、進化論をドイツで広めたヘッケル、それを支持したニーチェ、フロイトなどの理論とカフカの洞察を交差させつつ、ポストヒューマニズム的な萌芽を文学・思想史に探ろうとする本研究のテーマに変更はない。2017年度は現時点での本研究の結果を社会に開示する目的で、市民向けの公開講座を2度行う予定である。また、本年度も論文を執筆し、学会発表を行う。2018年度には、海外/国内の研究者を迎えて、シンポジウムを実施することを計画している。当初の申請書には掲げていなかった目標だが、本務先変更に伴う若干の遅れを取り戻し、研究結果を広く公表するためにも、シンポジウムの実現に向けて他の研究者との連携を広げたい。2018年度内に研究内容を一冊の著書にまとめることは難しいと予測されるが、本研究課題の採択年度内にできるだけ多くの論文執筆を積み重ねることで、いずれは著書として公にしたい。
熱電素子により通電される1テスラ級高温超伝導マグネットの開発

外部電源を必要としない、いわゆるポータブル型超伝導マグネットの実現を目指して、本研究では、熱電素子によって高温超伝導コイルに通電し、1テスラを超える磁束密度の発生を実証した。このシステムでは、超伝導コイルの作動温度である極低温と室温との温度差を利用して、熱電素子で発生する起電力により通電を行なう。熱電素子以外の部分の電気抵抗はほぼ0なので、小さな熱起電力でも大きな電流をコイルに流すことができる。熱電素子を極低温で使い、しかも電力を取り出すのではなく無負荷状態で使う、珍しい使い方である。まず高温超伝導コイルに接続する熱電素子の設計・製作・性能実験と、コイルの設計・製作・冷却及びコイル単体の性能実験を行った。熱電素子は、2mm四方で厚さが1.5mmのビスマス・テルル系(Bi_2Ti_3)p型半導体とした。高温超伝導コイルは、ビスマス2223超電導線を用いて内径120mm、外径236mm、厚さ31mmとした。本実験では、2段GM冷凍機によって熱電素子とコイルを冷却した。熱電素子の一端を電気ヒーターによって加熱し、熱電素子高温端温度100K、低温端温度60K、コイル温度約10Kとしたとき、コイル中心で1.4テスラを発生した。そのときの電流値は155Aであった。これらの結果は、コイルの超伝導特性や熱電素子の諸特性を考慮した計算から予測されるものとほぼ一致した。一方で、熱電素子だけで励磁すると、155Aに達するまでに7時間もかかることが明らかになった。今後このシステムを実用化するためには、励磁・消磁には外部電源と熱電素子を併用して時間短縮を図り、定常時には電流リードを切り離して、熱電素子だけによる通電するシステムの開発が必要である。1テスラ級の高温超伝導コイルを熱電素子に接続したときに、コイルへの熱侵入量が小さく、しかも大きな電流を流すことのできる熱電素子の形状について、今までに開発した解析コードによって検討を行ない、その形状を決定した。素子の材質はBiTeで、2cm四方で厚みが1.5mmである。製作した熱電素子を高温超伝導に接続した短絡実験を行った。素子の高温側ヒーターで29Wの加熱を行なったとき、起電力1.5mV、通電電流値243Aが得られた。このときの熱電素子の両端の温度は87Kと48Kであった。これらの値は、解析から予測された値とほぼ一致した。熱電素子の研究と並行して、1テスラ級の高温超伝導コイルを設計・製作した。コイルの表面だけではなく芯も十分冷やすために、3個のダブルパンケーキを積層し、各ダブルパンケーキ間とコイルの表面に冷凍機からの冷却伝熱板を挟む構造とした。選定した高温超伝導線は、高強度Bi2223銀シース線材で、平均線材幅:4.2±0.2mm、平均線材厚み:0.22±0.02mm、臨界電流値:>110A(1μV/cm、77K、Self-field, End-to-end)、N値:>16(77K、10^<-9>10^<-6>V/cm)、許容引張強度:170MPa(室温)、210MPa(77K)、許容曲げ直径:50mm(室温)である。コイル完成後、GM冷凍機の冷却ステージとコイルを接続し、まず所定の温度にコントロールできるかを確認した。その後、既存の外部電源によって励磁実験を行った。

この実験により、50K以下において、パンケーキコイル間(2箇所)と口出し部(2箇所)の接続抵抗が、合計で0.36μΩ以下であることを確認するとともに、測定電圧範囲10^<-9>V/cm10^<-6>V/cmにおいてI-V特性や臨界電流値などの基礎特性を計測し、熱電素子と接続して通電実験が行えるコイルであることを確認した。外部電源を必要としない、いわゆるポータブル型超伝導マグネットの実現を目指して、本研究では、熱電素子によって高温超伝導コイルに通電し、1テスラを超える磁束密度の発生を実証した。このシステムでは、超伝導コイルの作動温度である極低温と室温との温度差を利用して、熱電素子で発生する起電力により通電を行なう。熱電素子以外の部分の電気抵抗は、ほぼ0なので、小さな熱起電力でも大きな電流をコイルに流すことができる。熱電素子を極低温で使い、しかも電力を取り出すのではなく無負荷状態で使う、珍しい使い方である。まず高温超伝導コイルに接続する熱電素子の設計・製作・性能実験と、コイルの設計・製作・冷却及びコイル単体の性能実験を行った。熱電素子は、20mm四方で厚さが1.5mmのビスマス・テルル系(Bi_2Ti_3)p型半導体とした。高温超伝導コイルは、ビスマス2223超電導線を用いて内径120mm、外径236mm、厚さ31mmとした。本実験では、2段GM冷凍機によって熱電素子とコイルを冷却した。熱電素子の一端を電気ヒーターによって加熱し、熱電素子高温端温度100K、低温端温度60K、コイル温度約10Kとしたとき、コイル中心で1.4テスラを発生した。そのときの電流値は155Aであった。これらの結果は、コイルの超伝導特性や熱電素子の諸特性を考慮した計算から予測されるものとほぼ一致した。一方で、熱電素子だけで励磁すると、155Aに達するまでに7時間もかかることが明らかになった。今後このシステムを実用化するためには、励磁・消磁には外部電源と熱電素子を併用して時間短縮を図り、定常時には電流リードを切り離して、熱電素子だけによる通電するシステムの開発が必要である。
Ｎｏｔｃｈ遺伝子を介した腸上皮化生進展過程における特有な胃癌幹細胞誘導機構の解明

Helicobacter pylori(H.pylori)感染によって胃粘膜上皮は固有胃腺から胃粘膜萎縮・腸上皮化生が進展し、分化型胃癌の発癌につながる。本研究のin vitroおよびin vivoの検討によって、幹細胞の分化・維持に関わる細胞膜受容体Notch1の発現は、H.pylori感染によって抑制され、Notch1細胞内シグナルを介して直接的に固有胃腺の分化を担うhomeobox遺伝子Sox2の発現を抑制し、胃粘膜萎縮を誘導していた。さらにNotch1細胞内シグナルの制御逸脱が胃癌幹細胞誘導による発癌機序に関わる可能性が示唆された。胃上皮細胞においてH.pylori感染により慢性胃炎・萎縮がおこり腸上皮化生が進展し、この過程で胃癌が生じると考えられている。この分化変更過程で、幹細胞維持に重要なHomeobox遺伝子Sox2からCdx2に発現変更が生じる。一方でNotch1遺伝子は幹細胞維持に必須の遺伝子で、その発現異常は癌幹細胞を誘導し発癌に関与する。そこで、Sox2からCdx2発現幹細胞への再プログラム化に絞り込んだ、Notch1に関連した癌幹細胞を誘導する遺伝子を、Microarray解析を用いて同定することを目的として研究を展開している。Notch1は、ヒト正常胃粘膜組織の固有胃腺において、主細胞と壁細胞で発現し、胃の分化成熟に関与し、その下流にある転写因子Hes1も一致して発現していた。胃培養細胞を用いた研究結果より、H.pylori刺激により、Notch1、Dll1、Sox2、ATPaseの発現が有意に抑制された。さらにNotch1siRNAを用いたRNA干渉法により、Sox2の発現は抑制された。しかしながら、Sox2はNotch1の発現調節には関与していないことが、Microarray法とSox2siRNAを用いたRNA干渉法より明らかとなった。このため、H.pylori感染によるNotch1発現抑制がSox2の発現抑制を介して発癌母地となる胃粘膜萎縮に関与していることが示唆された。また、このNotch1の発現抑制は、FACS解析よりアポトーシスの誘導を抑制することより、発癌機序に関与していることを明らかとなった。前年度までの研究期間の研究成果の一部として、幹細胞維持を調整しているNotch1遺伝子の発現は固有胃腺の分化成熟に関与し、in vitroの研究よりH.pylori刺激によりNotch1の発現が抑制を受けることを明らかにしている。一方、従来Notch1は細胞内ドメイン(NICD)が過剰発現することによって発癌に関与することが周知の事実であったが、逆に近年、扁平上皮癌においてNotchの機能不全が癌化、つまり、Notch遺伝子が癌抑制遺伝子的側面を持っていることが明らかとなっている。そこで当研究成果を踏まえて、H.pyloriによるNotch1発現抑制が胃癌を誘導するという作業仮説のもと研究を進めた。まずヒト胃癌培養細胞株においてNotchsiRNAを用いてNotch1発現を抑制したところ、細胞増殖の有意な亢進を認め、Notchの発現抑制が癌化につながることが示唆された。さらに、胃癌培養細胞株においてfull length Notchを維持するようにADAM阻害剤を用いて評価したところ、MTS assayで細胞増殖能は抑制され、Spheroid assayで造腫瘍能が抑制された。この過程においては、FACSおよび蛍光免疫染色でFull length Notchの発現が回復していることも判明した。このため、H.pylori感染による胃癌においては、Full length Notch1は癌抑制的に作用することを明らかにし、Full length Notchを維持回復するADAM阻害剤が胃癌に対する抗がん剤の創薬の基盤になることが示唆された。胃においてはH.pylori感染に対する免疫応答により腸上皮化生が進展する。この進展過程において、分化型胃癌が発生すると考えられている。幹細胞の観点ではHomeobox遺伝子であるSox2からCdx2の発現変更が生じ、分化の再プログラム化がおこると仮定できる。一方で幹細胞維持に重要なNotch1遺伝子の制御異常は癌幹細胞を誘導し発癌に関与することが乳癌等で報告されている。そこで、Sox2からCdx2発現幹細胞への再プログラム化に絞り込んだ、Notch1に関連した癌幹細胞を誘導する遺伝子を、Microarray解析を用いて同定することを目的として、当該年度の研究を開始した。最初にヒト正常胃粘膜組織に対する免疫組織化学を用いた検討より、従来の知見と同様に、固有胃腺でSox2、腸上皮化生でCdx2の発現を認めた。一方Notch1は、固有胃腺では主に主細胞と壁細胞で発現し、腺底部に向けて強く発現していた。また、腸上皮化生のPaneth細胞にも発現を認めた。

in vitroでの胃癌幹細胞誘導モデルとして、胃癌培養細胞株KATOIIIに対して、Knockout Single Vector System for inducible RNAi (Clontech)を遺伝子導入しNotch1遺伝子を抑制するNotch1siRNA誘導安定細胞株を樹立後、Agilent Expression Arrayを利用しMicroarray解析を行った。その結果、Notch1を抑制することにより、699遺伝子が抑制され、675遺伝子が発現誘導された。これらの同定された遺伝子群より、既に解析しているSox2遺伝子抑制により制御される遺伝子ファイルと照合し、ある遺伝子を抽出同定した。H.pylori感染による萎縮・腸上皮化生進展過程における胃癌の分子生物学的発癌機序として、H.pylori感染によりNotch1遺伝子の発現が抑制され、その下流のHes1発現が影響を受け、胃分化に重要なSox2遺伝子が抑制されることを明らかにできた。さらにNotch1の発現抑制がアポトーシス抑制を介して発癌に関与していることが類推できた。また、Notch1の発現抑制がどのように癌幹細胞誘導に関連した遺伝子に影響しているかという今後の研究の方向性を見出した。東日本大震災により、東北大学医学系研究科消化器病態学分野の生化学実験室、同医学部共同実験室は、測定機器を含め壊滅的な被害を受けており、23年8月以降、ある程度の実験が再開可能となった。この時間的遅れのため、当初の計画に照らし合わせて、in vitroでの胃癌幹細胞誘導モデルを用いたMicroarrayによる解析までは進捗できたが、同定された遺伝子の胃癌における発現異常についての検討まで推し進めることはできなかった。Notch1がSox2の発現制御をしていることが示唆されたため、昨年度実施したMicroarrayの結果を踏まえて、Notch1/Sox2細胞内シグナル伝達機構を同定し、そのシグナル異常がどのように癌幹細胞を出現させ、胃癌発癌機序に関与しているか明らかにする。さらにヒト胃癌組織を用いて、実際のヒト胃癌発癌機構にどのように関与しているか確認し、胃癌の診断や創薬の基盤となるように研究を進める。Microarrayの結果を踏まえたNotch1/Sox2細胞内シグナル伝達機構を解明する目的で、定量的PCR法、western blot法、luciferase assay法、RNA干渉法等の分子生物学的実験を行うための試薬を購入する。また、ヒト胃癌組織に対する免疫組織学を行うために、抗体を含めた試薬を購入し、研究費を使用予定である。上記の予定で、次年度使用額は、当初計画していたNotch1/Sox2細胞内シグナル伝達機構の解析の一部を次年度に延期することによって生じたものであり、一部延期したNotch1/Sox2細胞内シグナル伝達機構解明に必要な経費として平成25年度請求額と合わせて使用する予定である。次年度使用額は、東日本大震災による研究環境の悪化に伴い発生した未使用額であり、平成24年度請求額とあわせ、次年度計画している研究の遂行に使用する予定である。