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ヒト3次元心筋組織モデルの作製

現在、創薬研究や再生医療研究において培養細胞を用いたin vitroでの解析が行われているが、ヒトの生体内3次元環境とは大きくかけ離れており組織レベルでの解析は困難である。本研究では生体外において再生組織内へ血管網を付与する技術を利用し、生体同様に灌流可能な3次元組織モデルを構築した。これは血管系から薬剤を投与することが可能であり、種々の解析項目をシンプルかつ同時に測定できる新しい3次元心筋組織モデルである。本研究で示した組織モデルは生体外で時間かつ空間的に詳細な解析を行うことが可能であり、従来のモデルでは解析し得ない治療メカニズム解明のためのツールになるものと考える。現在の再生医療研究や創薬研究において培養細胞を用いたin vitroでの解析が行われているが、ヒトの生体内3次元環境とは大きくかけ離れており組織・臓器レベルでの解析は困難である。申請者はこれまでに細胞シート工学を基盤とし生体外で再生組織内へ血管網を付与するための技術開発に成功し、生体同様に潅流可能な3次元組織の再構築を可能としてきた。本研究課題では生体外血管網付与技術を用いたヒト3次元心筋組織モデルの作製を目的としている。今年度はまず作製組織の薬物反応を代謝の観点から解析するためにルシフェレーストランスジェニックラットの心筋細胞を用い実験を行った。血管床はラット大腿動静脈を含む筋組織を成形し1週間生体内へ留置することにより毛細血管の動静脈短絡を誘導させin vitroにおいて灌流液が動脈から組織、さらに静脈へ戻るような組織を作製した。3層のラット血管内皮-心筋共培養細胞シートを血管床上へ積層化し組織灌流を行うことで3日後には心筋組織内の毛細血管と血管床の毛細血管との間に血管を介した繋がりができることを確認した。また細胞シートの段階的積層を行うことで、より厚みのある心筋組織を再構築した。この組織に対し動脈を介したイソプロテレノールの投与を行ったところ心筋細胞拍動数の上昇および血圧の低下、さらには再生心筋組織のATP活性の上昇を確認することができた。本研究において作製した血管付立体組織はより生体に近い創薬モデルとなり得ることが示唆された。申請者はこれまでに細胞シート工学を基盤とし生体外で再生組織内へ血管網を付与するための技術開発を行い、動静脈付きの血管床と細胞シートを用いバイオリアクターで組織灌流を行うことで生体同様に潅流可能な血管付きの3次元組織の再構築を可能としてきた。本研究課題では生体外における血管網付与技術を用いたヒト3次元心筋組織モデルの作製を目的としている。昨年度は作製組織の薬物反応を代謝(ATP)の観点から解析するためにルシフェレーストランスジェニックラットの心筋細胞を用い、血管床はラット大腿動静脈を含む筋組織を成形し一週間生体内へ留置することにより毛細血管の動静脈短絡を誘導させin vitroにおいて灌流液が動脈から組織、さらに静脈へ戻るような血管付き心筋組織を作製した。また心筋細胞シートの段階的積層を行うことで、6層のより厚みのある心筋組織を再構築した。本年度はこの作製心筋組織に対し動脈を介したイソプロテレノール、エピネフリンなどのカテコラミンの投与を行うことで心筋組織の拍動数とATP活性の上昇、また血圧の変動も確認した。さらに心毒性を有する抗がん剤であるドキソルビシンの持続投与による心筋組織のATP活性低下を確認し組織モデルとしての有用性を示すことができた。本研究において作製した血管付き3次元心筋組織はより生体に近い薬効や心毒性の評価モデルとなり得ると考えられる。ヒト3次元心筋組織モデルを作製するには、まずこれまでに研究開発した血管付きの3次元心筋組織を作製し組織モデルとしての有用性を評価することが第一であるため、今年度ではラット心筋細胞を用いて血管付き心筋組織を構築し強心作用や心毒性効果を示す薬剤を用いて、それらを血管系から投与することによる薬効試験を行った。その結果それぞれの薬に対し生体と同様の薬剤効果を示すことが確認でき薬剤評価のための組織モデルとしての有用性を示した。また血管床上へ積層化するヒト心筋細胞シートに関しては、iPS由来心筋細胞と血管のソースとしての血管内皮細胞との共培養条件の最適化は行えたものの、代謝解析のための発光イメージングに用いる心筋細胞へのルシフェラーゼ遺伝子の導入については最適条件を見出しておらず検討段階にとどまっているため。

作製組織の薬物反応を代謝(ATP)の観点から解析するためにルシフェレーストランスジェニックラットの心筋細胞を用い、血管床はラット大腿動静脈を含む筋組織を成形し一週間生体内へ留置することにより毛細血管の動静脈短絡を誘導させin vitroにおいて灌流液が動脈から組織、さらに静脈へ戻るような血管付き心筋組織を作製した。3層のラット血管内皮-心筋共培養細胞シートを血管床上へ積層化し組織灌流を行うことで3日後には心筋組織内の毛細血管と血管床の毛細血管との間に血管を介した繋がりができることを確認した。また心筋細胞シートの段階的積層を行うことで、6層のより厚みのある心筋組織を再構築した。この作製心筋組織に対し動脈を介したイソプロテレノール、エピネフリンなどのカテコラミンの投与を行うことで心筋組織の拍動数とATP活性の上昇、また血圧の変動を確認した。また心毒性を有するドキソルビシンの持続投与による心筋組織のATP活性低下を確認し組織モデルとしての有用性を示すことができた。最終年度ではヒトiPS由来心筋細胞へルシフェレース遺伝子を導入することで評価モデルとしてのヒト血管付き3次元心筋組織の構築に成功した。現在、創薬研究や再生医療研究において培養細胞を用いたin vitroでの解析が行われているが、ヒトの生体内3次元環境とは大きくかけ離れており組織レベルでの解析は困難である。本研究では生体外において再生組織内へ血管網を付与する技術を利用し、生体同様に灌流可能な3次元組織モデルを構築した。これは血管系から薬剤を投与することが可能であり、種々の解析項目をシンプルかつ同時に測定できる新しい3次元心筋組織モデルである。本研究で示した組織モデルは生体外で時間かつ空間的に詳細な解析を行うことが可能であり、従来のモデルでは解析し得ない治療メカニズム解明のためのツールになるものと考える。in vitroにおけるヒト心筋組織モデルの作製には、まず心筋細胞と血管となり得る細胞をソースとし細胞シートを作製し血管床を用いて血管網を付与した心筋組織を作製する必要があるが、今年度では組織の作製法ならびに解析手法について確立できた。一方で血管床上へ積層化するヒト心筋細胞シートに関してはヒトiPS心筋細胞とヒト血管内皮細胞との共培養条件の最適化検討にとどまっているため。次年度は発光イメージング解析のために最適化されたヒト内皮-心筋共培養細胞シートを用いて血管付き心筋組織モデルの構築を進める。作製した心筋組織モデルへの薬効試験や心筋障害モデルの作製、さらにはその組織に対する再生治療効果を検証するためにはバイオイメージング解析や電気生理学的解析が重要となるため前年度までに得た知見を元に必要な解析手法を選択し必要に応じて改良を行い進める。組織工学次年度からはヒト血管内皮-心筋細胞シートを用い血管付き心筋組織の作製を進める。また心筋障害モデルを作製しその組織を用いた薬理試験と再生治療効果の解析を行う。作製心筋組織モデルへの薬理試験や再生治療効果の検討にはバイオイメージング解析や電気生理学的解析が重要となるため、前年度で得た知見を元に必要な解析手法を選択し必要に応じて改良を行い進める。
日本における原子物理学の成立に関する歴史的研究、1920-1945

本研究は、戦前・戦中の日本で、量子力学が移入され、原子物理学の研究伝統が形成されて行く過程と、それがなされた制度的、社会的、そして文化的な背景を明らかにした。とくにこの過程で重要な役割を果たした仁科芳雄についての伝記的調査を行った。本年度は、次の資料館において調査を行った。京都大学基礎物理学研究所湯川記念資料室、名古屋大学理学部物理教室坂田記念資料室、国立国会図書館、東京大学総合図書館及び駒場図書館、カリフォルニア大学バークレー校Bankroft Archives、アメリカ哲学協会、ケンブリッジ大学大学図書館およびチャーチル・カレッジ・アーカイブズ・センター。これらの資料館において、日本の物理学者、とくに仁科芳雄の書簡や文書、および書籍を中心に、戦前日本の原子物理学に関する資料を収集または調査した。これらの資料のうち、例えば仁科芳雄の書簡は『仁科芳雄往復書簡集』等に所収されていないものである。7月末のブダペストにおける国際学会に別予算で参加し、本研究成果の一部を発表した。国内資料館としては、理化学研究所、仁科記念館、筑波大学朝永記念室も調査する予定であったが、イギリスに在外研究の機会を得たので、イギリスでの調査を先に行い、これらの資料館での調査は次年度に行うことにした。また、日本の戦前から戦中の原子物理学に関す原資料の書籍や論文および、日本の原子物理学に関する二次文献の書籍や論文を収集した。以上の資料調査と並行して、これまでの研究成果から、成果物の執筆計画を策定し、出版物とするための企画書の草稿を作成し、かつ出版物の一部の草稿を執筆した。本年度は、次の資料館において調査を行った:国立国会図書館、東京大学総合図書館及び駒場図書館、アメリカ議会図書館(オッペンハイマー文書およびI.I.ラビ文書)、カリフォルニア大学バークレー校、ノースカロライナ州立大学。6月のベルリンのマックスプランク科学史研究所における量子力学の歴史についての国際研究集会、HQ3に参加し、本研究成果の一部を発表した。その発表内容に基づいてこの研究集会のプロシーディングズに論文を投稿した。7月駒場でのSociety for Social Studies of Scienceで、関連した研究発表を行った。11月にバルセロナで開かれたヨーロッパ科学史学会で、本研究の一部分を発表した。また、日本の戦前から戦中の原子物理学に関す原資料の書籍や論文および、日本の原子物理学に関する二次文献の書籍や論文の収集を継続した。以上の資料調査と並行して、出版物とするための企画書(出版社と交渉するためのプロポーザル)を改稿し、かつ出版物の執筆をすすめた。本年度は、最終年度であるので、執筆作業を中心に行いつつ、落ち穂拾い的に、資料収集を行い、かつ研究成果の発表も行った。史料調査としては、岡山県立記録資料館において、仁科芳雄の兄の残した書簡等の資料が存在することが判明したので、それを調査した。同時に生地である里庄町浜中の実地調査を行った。この実地調査は、仁科芳雄の幼少時の環境を明らかにすることの一環をなすもので、周辺が江戸時代から現在まで続く干拓事業によって拓かれた土地であることを実地で確認することを目的としたものである。学会発表としては、オハイオ州立大学において、東アジア科学史の国際学会がひられたので、その機会を利用し、本研究の成果を発表することにし、本研究のうち、とくに物理学の「研究」が戦前の日本で行われた背景についての研究発表を行った。出版物に関しては、前年度のマックスプランク科学史研究所における量子力学の歴史についての国際研究集会、HQ3において、本研究の一部を研究発表したが、その内容を論文化してプロシーディングに投稿したものがアクセプトされ、出版が決定した。これは本研究のうち、仁科芳雄の電気工学者としての出身と、彼の研究の関係を論じたもので、電気工学と物理学(フェリックス・クラインと仁科芳雄によるいわゆるクライン=仁科の式の導出等)のテクニカルな内容を含むので、そのような内容の論文を出版することが可能な、この国際学会のプロシーディングズに発表したものである。著書出版計画に関しては、原稿を初期の草稿の段階に達した。ただし、今後も、とくに出版計画が現実化するのに対応して、加筆推敲は継続して行う必要がある。他方、企画書は完成し、出版計画を進めている。
脳神経系の分化と転写抑制因子,RP58の発現制御機構の解明

脳を構成する多数の神経細胞は、その特殊性から、神経前駆細胞から分化する過程で神経伝達物質とその合成酵素および受容体遺伝子の発現を巧みに調節するユニークな制御機構を備えていると予想される。このような脳・神経系の分化に伴う遺伝子発現のスイッチON/OFFを制御する機構に係わる遺伝子の解析は、生物学的にも極めて重要な意味を持つだけでなく、脳神経疾患のメカニズムを理解する上でも大きな意味を持つと考えられる。申請者は、多くの転写因子に共通するPOZドメインをN末端に持つZnフィンガー蛋白、RP58を発見し、その遺伝子をクローニングして以下の点を明らかにした。(1)RP58蛋白が、標的DNA塩基配列をプロモーターに持つ脳神経細胞特異的な転写抑制因子であり、遺伝子不活化領域として知られる核内ヘテロクロマチンに局在していることを金粒子を用いた免疫電子顕微鏡解析で明らかにした。(2)脳神経前駆細胞から神経細胞への分化に伴って、RP58蛋白のN末端を欠損するペプチド、RP58βが減少し、逆に、RP58とC末端を欠損するペプチド、RP58αやN末端を欠損する小脳神経細胞特異的なRP58γが出現することが判明した。特に、RP58γは小脳のプルキンエ細胞を欠損したPCDマウスでは認められないことから、小脳のプルキンエ細胞特異的なペプチドであった。以上の結果は、RP58蛋白の機能が、脳・神経系の分化に伴って出現する種々のペプチドによって制御されていることを意味している。(3)英国、Cambridge大学のグループとの共同研究で、DNA methyltransferase,Dnmt1がRP58蛋白と相互作用することを発見した。Dnmt1は、histone deacetylaseと結合することが知られているので、DNAのメチル化、クロマチンの変化がどのようにして転写抑制を引き起こすのかを明らかにする上で大きな成果と考えられる。今後の研究の発展が期待される。特に、RP58γは、小脳のプルキンエ細胞を欠損したPCDマウスでは認められないことから、小脳のプルキンエ細胞特異的なペプチドであることが証明された。以上の結果は、RP58蛋白の転写抑制機能が、脳・神経系の分化に伴って出現する種々のペプチドによって制御されていることを意味している。

このような脳・神経系の分化に伴う遺伝子発現のスイッチON/OFFを制御する機構に係わる遺伝子の解析は、生物学的にも極めて重要な意味を持つだけでなく、脳神経疾患のメカニズムを理解する上でも大きな意味を持つと考えられる。申請者は、多くの転写因子に共通するPOZドメインをN末端に持つZnフィンガー蛋白、RP58を発見し、その遺伝子をクローニングして以下の点を明らかにした。(1)RP58蛋白が、標的DNA塩基配列をプロモーターに持つ脳神経細胞特異的な転写抑制因子であり、遺伝子不活化領域として知られる核内ヘテロクロマチンに局在していることを金粒子を用いた免疫電子顕微鏡解析で明らかにした。(2)脳神経前駆細胞から神経細胞への分化に伴って、RP58蛋白のN末端を欠損するペプチド、RP58βが減少し、逆に、RP58とC末端を欠損するペプチド、RP58αやN末端を欠損する小脳神経細胞特異的なRP58γが出現することが判明した。特に、RP58γは小脳のプルキンエ細胞を欠損したPCDマウスでは認められないことから、小脳のプルキンエ細胞特異的なペプチドであった。以上の結果は、RP58蛋白の機能が、脳・神経系の分化に伴って出現する種々のペプチドによって制御されていることを意味している。(3)英国、Cambridge大学のグループとの共同研究で、DNA methyltransferase,Dnmt1がRP58蛋白と相互作用することを発見した。Dnmt1は、histone deacetylaseと結合することが知られているので、DNAのメチル化、クロマチンの変化がどのようにして転写抑制を引き起こすのかを明らかにする上で大きな成果と考えられる。今後の研究の発展が期待される。
植民地インドのマイスール藩王国における文芸と王権

本研究は、植民地インドの有力藩王国のひとつであったマイスール藩王国における現地語カンナダ語による文芸・学芸に着目し、それらの文献に見られる王の権威と権力をめぐる言説を分析する。3年目にあたる本年度は、昨年度同様、マイスール藩王国において19世紀から20世紀前半に著された/出版された伝統的詩文学形式の文芸・学芸作品、並びに、同藩王国の歴史書や古典サンスクリット文献の翻訳をはじめとする散文文献に関して、ロンドンの大英図書館で情報を収集するとともに、一部作品・文献の閲覧と収集を行った。並行して、これまでに収集した作品・文献の分析をすすめ、以下のような点を解明した。第一に、19世紀前半に著された藩王の生涯や藩王が主催する祭事・行事を題材とする伝統的詩文学形式の作品は、(藩)王を讃えることを目的とする点で、18世紀までの作品と共通する一方で、著者である詩人の(藩)王に対する従属的立場の強調、単純な理想化とは異なるある種の「写実主義」など、新しい特徴が見られる。これについては、学会発表を行った。第二に、19世紀後半以降に著された藩王の生涯を題材とする文学作品や藩王国の歴史書では、(藩)王権を「ダルマ」といった伝統的な理念・価値規範の護持者として正統化して藩王と臣民との階層序列的な上下の別を強調するよりも、藩王(家)と臣民が喜びや悲しみを共有し分かち合う、いわば「感情の共同体」として藩王国の政治社会が描出されていた。これについては、研究会において口頭発表を行った。第三に、19世紀末から、藩王の間接的な支援を受けてサンスクリット古典文献の近代的カンナダ語散文全訳が刊行されたこと、そのもとになった散文訳の少なくとも一部は18世紀に既に行われていた可能性が高いことが明らかになった。これまでの調査により、マイスール藩王国内でカンナダ語による伝統的詩文学形式の文芸・学芸作品や散文の歴史書が当初想定していたよりも数多く書かれていたことが判明した。これは調査研究の成果であるが、その一方でそれらの作品・文献の読解と分析に、想定以上の時間と労力を費やすことになっている。そのため、研究成果について学会報告や口頭発表を行ったものの、研究ノートや論文のかたちで成果を公開するには至らなかった。引き続き、マイスール藩王国内で著された/刊行されたカンナダ語の「伝統的」詩文学作品や散文文献の読解と分析を進め、その成果を研究ノートや論文のかたちで公開する。また、これまでに明らかになった同藩王国のカンナダ語による文芸・学芸の特徴とその年代的変遷を総括する。文芸・学芸の変遷を社会状況の変化と連動させながらその歴史的意義を探ることを通じて、本研究課題の最終目標である藩王国における近代のあり方を考察する。本研究は、植民地インドの有力藩王国のひとつであったマイスール藩王国を対象として、現地語カンナダ語による文芸・学芸の展開をたどるとともに、それらの文献に見られる王の権威と権力をめぐる言説の分析を行うことを通じて、インド社会の植民地的近代における文化的変容のあり方を再考することを目的とする。初年度にあたる本年度は、19世紀を中心としたマイスール藩王国におけるカンナダ語文芸・学芸の展開を概観するために、先行研究や文書館・図書館目録なども用いつつ、当該時期に著された具体的な文芸・学芸作品に関する情報を収集、整理した。また、インド現地におもむき、関連する文学作品や著作物について、調査、閲覧、収集を行い、収集した史料の分析にも着手した。これらの調査、分析から以下のような点が解明した。第一に、藩王(政府)の直接・間接の支援下で展開したカンナダ語による文芸・学芸活動において、大学をはじめとする西欧的教育制度が導入された19世紀第3四半世紀は大きな転換期であった。世紀前半に多く見られた藩王の個人的な庇護を受けた宮廷詩人による文学作品の創作が衰え、教員などの教育関係者による教科書の執筆が活発化した。ただし、この変化がもつ歴史的含意を明らかにするには、世紀前半の文学作品と世紀後半の教科書を内容・形式や著者などの点から具体的に比較分析する必要がある。第二に、19世紀前半の宮廷詩人による文学作品には、作者の主観に依拠した叙述・表現など、18世紀以前の宮廷文学と歴史的に連続する要素が見られる一方で、作中における王の過剰なまでの神格化や、作者=詩人の出自的背景の多様化など、18世紀以前の宮廷文学とは異なる特徴も認められる。植民地化前後の連続と不連続を多元的に把握することが求められよう。当該時期のマイスール藩王国内で書かれたカンナダ語文芸・学芸作品の具体的な情報を収集、整理する作業に、多くの時間と労力を費やすこととなった。また、作業の過程で、カンナダ語文芸・学芸の展開を、ペルシア語やウルドゥー(デカニー)語、サンスクリット語といったインドの他の言語による文芸・学芸と関連付けて把握する必要性・可能性が認識された。こうしたこともあって、今年度は、成果の一部を口頭発表するにとどまった。本研究が対象とするマイスール藩王国のカンナダ語文芸・学芸は、特に欧米での先行研究が乏しく、基本的な情報の収集、整理から行う必要がある。本年度の調査、分析をふまえて、当初計画通り、次年度以降、論文・研究ノートのかたちで研究成果を発表していく予定である。

本研究は、植民地インドの有力藩王国のひとつであったマイスール藩王国における現地語カンナダ語による文芸・学芸に着目し、それらの文献に見られる王の権威と権力をめぐる言説を分析する。2年目にあたる本年度は、昨年度に続き、マイスール藩王国において19世紀から20世紀前半に伝統的詩文学形式で著された文芸・学芸作品に関する情報を収集、整理するとともに、イギリスにおいて大英博物館を中心に、関連する文学作品や諸文献について、調査、閲覧、収集を行った。昨年度に収集した文学作品とあわせて、藩王の事績・生涯を題材としたものについて分析をすすめ、以下のような点を解明した。第一に、19世紀末、教育関係者による教科書的な歴史叙述と並行して、藩王の生涯や藩王家の歴史を題材とする伝統的詩文学形式の作品が、藩王と直接的な接点をもたない地方在住の詩人・知識人によって多く著された。また、近代的演劇の成立・普及を背景に、藩王家の歴史に取材した戯曲も書かれるようになった。両者には相互に照応する内容も見られ、詳細な比較分析が必要である。第二に、19世紀末以降に成立した史詩作品の内容面での特徴として、作品に登場する藩王やその家族の内面・心情の描写、(藩)王妃の役割への注目などが認められる。これらの特徴は、19世紀前半の史詩作品に見られない。また、書き手と読み手を一体化させる書法も特徴的であるが、書き手の主観に依拠した叙述・表現を特徴とする史詩の伝統からは大きく逸脱しているとも言える。植民地的近代にける文化的変容のあり方を再考するという本研究の目的にも直接かかわる点であり、その意義についてさらなる考察が求められる。マイスール藩王国内で書かれたカンナダ語による伝統的詩文学形式の文芸・学芸作品については先行研究が比較的少なく、具体的な情報を収集、整理するにも、当初想定していた以上に時間と労力が必要であった。また、そうした情報収集の結果、先行研究で利用・言及されたことがないのではと思われる作品が複数発見され、それらの作品の読解と分析にも、想定以上の時間と労力を費やすことになった。こうした事情により、今年度も、成果の一部を口頭発表するにとどまった。本年度までの収集・整理した情報と、史料となる作品の読解と分析をふまえて、来年度以降は、当初計画に沿うべく、研究ノート・論文、さらには学会報告のかたちで研究成果を発表していく予定である。3年目にあたる本年度は、昨年度同様、マイスール藩王国において19世紀から20世紀前半に著された/出版された伝統的詩文学形式の文芸・学芸作品、並びに、同藩王国の歴史書や古典サンスクリット文献の翻訳をはじめとする散文文献に関して、ロンドンの大英図書館で情報を収集するとともに、一部作品・文献の閲覧と収集を行った。並行して、これまでに収集した作品・文献の分析をすすめ、以下のような点を解明した。第一に、19世紀前半に著された藩王の生涯や藩王が主催する祭事・行事を題材とする伝統的詩文学形式の作品は、(藩)王を讃えることを目的とする点で、18世紀までの作品と共通する一方で、著者である詩人の(藩)王に対する従属的立場の強調、単純な理想化とは異なるある種の「写実主義」など、新しい特徴が見られる。これについては、学会発表を行った。
溶媒抽出における界面反応の評価

キレート抽出系およびイオン会合抽出系における界面反応の寄与を、主に高速撹拌法により平衡論的および速度論的に検討し、以下の成果を得た。1.キレート抽出系における界面現象(1)βーヒドロキシオキシムは、解離型と非解離型が共に界面吸着性を示し、撹拌状態のおける吸着機構がラングミュア式を用い解明された。SME529およびLIX65Nによるニッケル(II)の抽出速度が、ニッケル濃度、水素イオン濃度および試薬の界面吸着量にそれぞれ一次で比例することより、抽出の律速過程は、界面におけるニッケル(II)イオンと試薬の解離型との1:1錯体の生成反応であることが明らかにされ、界面における反応速度定数が決定された。抽出速度への置換基効果と有機相溶媒効果についても界面機構より説明された。(2)βージケトン類は、解離型のみが界面吸着性を示した。吸着量のpH依存性は、解離平衡と分配比のpH依存より説明された、種々のβージケトンについて、解離型の吸着定数と非解離型の分配定数との間に一次の比例関係が見い出され、吸着性と分子構造との関係が明らかにされた。2イオン会合抽出系における界面現象(1)1,10ーフェナントロリン類のトリス鉄(II)錯体の界面吸着性に及ぼす置換基効果、溶媒効果および陰イオン効果が明らかにされた。試薬の分配定数が大きい程、イオン対の界面吸着性は低下した。また、陰イオンの水和エネルギーが大きく抽出されにくいもの程、イオン対の吸着性は増大した。(2)1,10ーフェナントロリン類による鉄(II)のイオン会合抽出速度が検討され、鉄(II)イオン濃度および試薬濃度依存性から、1:1錯体の生成が律速であることが示された。試薬の分配定数が大きい程、界面反応によるイオン対生成の割合が大きく、また、イオン対の界面吸着性が大きい程、見かけ上バルク相への抽出速度が抑制された。本年度は、キレート抽出系における界面の役割について研究し、以下の成果を得た。1.高速撹拌液液分配系におけるβ-ジケトンの界面吸着7種のβ-ジケトンについて、高速撹拌により分散状態となったn-ヘプタン/水系における界面吸着性を吸光光度法により研究した。水相の酸濃度が高い場合は界面吸着は見られないが、pHの増大に伴い、解離型の界面吸着が観測された。トリフルオロメチル基を有するβ-ジケトンは、酸解離定数が小さいためpH7付近から界面吸着が起る。界面吸着平衡はラングミュア式により表され、各β-ジケトンについて解離型の吸着定数が決定され、分配定数との比例的相関性が明らかにされた。この結果は、キレート試薬の界面吸着性の一般的予測に有用と考えられる。今後、β-ジケトン系協同効果抽出における界面反応の研究に発展させる計画である。2.2 ́-ヒビロキシ-5 ́-ノニルアセトフェノンオキシムによるニッケル【II】の抽出速度における界面反応上記オキシムのn-ヘプタン/水界面への吸着と、ニッケル【II】の抽出速度との関係を高速撹拌法により研究した。電気的に中性なオキシムにおいても顕著な界面吸着が見い出され、有機相濃度との間にラングミュア式が確認された。

ニッケル【II】の抽出初速度は、ニッケルイオン濃度および水素イオン濃度の逆数に比例し、また、オキシムの有機相濃度には比例せず、むしろ、界面濃度に直線的に比例した。測定初速度は、水相内反応から予想される値に比べ約【10^3】倍大きい。これらの結果から、抽出の律速段階は界面における1:1錯体の生成反応であると結論した。この研究により、撹拌状態における抽出速度の連続測定法と界面濃度測定法が確立され、界面反応研究の新しい方法論が提示された。本年度は,イオン会合抽出における界面の役割について研究し,以下の成果を得た.1.溶媒抽出系における1,10ーフェナントロリン(phen)錯体の界面吸着クロロホルムおよび四塩化炭素/0.1MNacl系において〔Fe(phen)_3〕^<2+>が顕著な界面吸着性を示すことを,界面張力測定により見い出した.有機溶媒依存性より,水相から界面への錯体の吸着性は,phenの分配定数に比例することが示された. Zn(II)あるいはCu(II)を含む系においても特徴的界面吸着現象が見られた.試薬濃度依存性より,〔Zn(phen)_3〕^<2+>および〔Cu(phen)_2〕^<2+>あるいは〔Cu(phen)_3〕^<2+>の吸着が示唆された.2.静止系および攪拌系における鉄(II)ー4,7ージフェニルー1,10ーフェナントロリン(DPP)錯体の界面吸着〔Fe(DPP)_3〕^<2+>の界面吸着に及ぼす対陰イオンの影響を静止系および高速攪拌系において調べた.その結果,いずれの系でも有機相から界面への吸着性は,ClO^-_4<CCl_3COO^-+ュSY.simeq.+ャB^-_r〈Cl^-の順に増大し,クロロホルム相に抽出されにくい陰イオン系,すなわち,水和エネルギーの大きい陰イオン系ほど大きいことが示された.3.DPPによる鉄(II)のイオン会合抽出速度における界面の役割標記抽出速度のDPP濃度,鉄(II)イオン濃度および陰イオン依存性を検討した.その結果,(1)抽出速度は生成する錯体の界面吸着により,陰イオンに依存して見かけ上遅くなること,(2)律速段階は1:1錯体の生成過程であるが,この反応が水相で起るとすると速度定数が10^8M^<-1>S^<-1>となり水溶液中での値3×10^5M^<-1>S^<-1>に比べ異常に大きく,したがって界面反応が支配的であることが示された.この研究により,イオン会合抽出速度を評価するには,イオン化学種の界面吸着性の知見が不可欠であることが示された.本年度は、イオン会合抽出速度における界面の寄与をまとめ、さらに、協同抽出速度における界面現象についても若干の知見を得た。1.1,10-フェナントロリン類による鉄(II)のイオン会合抽出速度における界面の役割1.1,10-フェナントロリン(phen)、およびその4,7-ジメチル置換体(DMP)、4,7-ジフェニル置換体(DPP)のクロロホルム溶液による鉄(II)のイオン対の界面吸着性は、〔Fe(phen)_3〕^<2+>>〔Fe(DMP)_3〕^<2+>>〔Fe(DPP)_3〕^<2+>であり、有機相に溶けにくいもの程大きいことがわかった。一方、抽出の律速過程はいずれも1:1錯体の生成反応であるが、phenでは水相反応、DPPでは界面反応が支配的であり、DMPでは約70%が界面反応を経由することがわかった。攪拌中の抽出速度が見かけ上低下するのは、生成したイオン対が吸着するためであることが明らかとなった。2.イオン対の逆抽出速度における界面吸着の寄与〔Fe(DPP)_3〕X_2(Xは陰イオン)のクロロホルム溶液と水酸化ナトリウム水溶液を攪拌し、鉄(II)を水酸化鉄(III)として逆抽出する際の速度は増大した。
反応ダイナミクスの量子制御に関する共同研究

偏光依存の核波束制御:これまでの局所最適フィードバック制御理論を拡張し、偏光依存の多次元系反応ダイナミクスの量子制御理論を構築した。反応系として、シアン化水素(HCN)の異性化反応をとりあげた。x偏光とy偏光の2つの制御パルスにより得られた結果を1つのパルスによる制御と比較検討した。その結果、前者は後者と比較してより短い時間で反応が終了する。更に、HCNの異性化反応経路が2つあり、最適化制御パルスにより、反応経路の対称性を破ることが示された。分子配向の量子制御:分子を配向させることは、気相分子反応の光波による制御にとって極めて重要である。光波の電場に着目すると、基本波とその倍音の電場を合成によって電場の振幅が正負の値が非対称性をもたらす。本研究では、極性分子として構造が既知のHCNをとりあげ、量子力学的手法により最適な制御電場を設計することを目的とした。2色光波電場の変数として、中心周波数ω(2ω)と2つの電場成分の相対位相差φそれと電場の振幅である。ここでは分子配向のレーザー制御が可能であることを明らかにした。時間依存Schrodinger方程式を解いて得られた最適電場は2ωがCH伸縮振動の0-1遷移に共鳴するピコ秒パルスであった。核と電子波束の運動方程式の厳密解:分子の超短時間領域で起るクーロン爆発機構を解明するために、核・電子波束の厳密解を得る新しい方法論を初めて開発した。それはdual transformationを利用するもので、クーロン場のようなエネルギー発散の特異点を持つ系に適用できる。現在、最も簡単な水素分子イオン、更に、2電子系2原子分子に適用し方法論の評価を行なっている。新しい反応化学の研究領域である化学反応ダイナミクスの量子制御理論を構築することが本共同研究の目的である。今年度は、この目的遂行のために、第一に、多原子分子系の反応制御理論の構築をめざした。多原子分子として、遷移双極子モーメント・ポテンシャルが知られているHCNをとりあげた。この始めの研究項目に関して、日本国側から研究代表者藤村勇一が相手国研究室に6月に訪問し1週間滞在して、これまで独立に行なっていた反応制御理論の構築について相手国の研究分担者Bandrauk教授と討論を行なった。特に、レーザの偏光を制御パラメータにとることによって、反応をうまく制御できることがわかった。その研究結果は論文として、現在、THEOCHEMに印刷中である。次に、第二の研究項目に関して、電子・核波束運動の相関効果の解明を単純な水素分子イオンを例にとりダイナミクスの計算を行なった。日本国側分担者の河野裕彦を相手国研究室に10月の1週間派遣した。強い超短パルスの照射によって、電子波束運動と核の波束運動が相関を持っていることが明らかにされ、断熱・非断熱相互作用の概念を用いて、その現象が説明されることを、相手国の研究分担者Bandrauk教授と討論を行ない明らかにした。11月の2週間、相手国の研究者の一人であるChelkowski氏は日本を初訪問して、強いチャープパルスレーザー場中での分子ダイナミクスの理論的研究を行なった。xー、yー偏光の2つの制御パルスにより得られた結果を1つのパルスによる制御と比較検討した。

更に、HCNの異性化反応経路が2つあり、最適化制御パルスにより、反応経路の対称性を破ることが示された。分子配向の量子制御:分子を配向させることは、気相分子反応の光波による制御にとって極めて重要である。光波の電場に着目すると、基本波とその倍音の電場を合成によって電場の振幅が正負の値が非対称性をもたらす。本研究では、極性分子として構造が既知のHCNをとりあげ、量子力学的手法により最適な制御電場を設計することを目的とした。2色光波電場の変数として中心周波数ω(2ω)と2つの電場成分の相対位相差φそれと電場の振幅である。時間依存Schrodinger方程式を解いて得られた最適電場は2ωがCH伸縮振動の0ー1遷移に共鳴するピコ秒パルスであった。核と電子波束の運動方程式の厳密解:分子の超短時間領域で起るクーロン爆発機構を解明するために、核・電子波束の厳密解を得る新しい方法論を開発した。それはdual transformationを利用するもので、クーロン場のような特異点を持つ系に適用できる。現在、最も簡単な水素分子イオン、更に、2電子系2原子分子に適用し方法論の評価を行なっている。
探針による表面電子・原子過程の解明と制御

走査トンネル顕微鏡によって探針と試料表面の間隔で興味深い現象が引き起こされるが、特に個々の原子や電子の素過程は最も注目されるものである。これを記述する理論的な方法論を構築し、これらの詳細を明らかにすることが本研究の目的である。そのため探針と表面間の距離がごく近いコンタクト領域や、探針・表面間の電界や電流が強い場合に有効なリカ-ジョン・伝達行列法を開発した。この方法は局所密度汎関数法を本質的に非平衡・開放系へと拡張するもので、無限系の散乱波解を数値的に自己無撞着に解くことを基礎とする。これによりSTMの定量的な解析、探針によって誘導される表面の局所的な化学反応、表面上、あるいは表面-探針間の原子の移動など、探針による原子制御の基礎的な問題に対する理論的なアプローチが可能となった。リカ-ジョン・伝達行列法を用いて、二つ物質表面が接近し電子的な相互作用が引き起こされて"接触"が起こる様子を、種々の系について原子論的な立場から解明した。2つの金属表面が接近するとき電子的な相互作用は、あり距離から急激に始まる。このときトンネル電流は指数関数的に増大からの明瞭な飽和の傾向を示す。仕事関数の小さな金属表面/金属探針系での原子の引き抜きは、次のメカニズムによる。探針に強い負バイアスをかけると、探針の頂点原子の外側に電子分布が張り出してきて、試料表面の電子分布と橋をかけた様な状態になる。すると表面原子はこの橋がけされた電子の雲によって、探針側に引っ張り出されるような力を受け引き抜かれる。このとき探針から受ける力は特定の原子に集中しており、確実に狙った原子を引き抜ける。一方、探針・表面間の距離が大きい場合には、正電位表面の近くの吸着原子は正にイオン化した状況になり、電界蒸発的な機構で表面原子が引き抜かれる。探針による原子過程を記述し予言するために必要な第一原理的な電子状態計算法の開発と整備を行った。これはリカ-ジョン・伝達行列法とよばれ、強い電界や電流下で非平衡定常系の電子状態を局所密度汎関数法のレベルで計算することを可能とする。表面の数オングス-トロム程度の近傍で、探針が誘導する局所的な原子過程と化学過程の理論的な研究に有効である。今年度はアルカリ原子とアルミニューム原子の電極・探針系2電極モデルを対象に選んで、計算手法の立ちあげ、プログラム開発、準備的な計算を行った。得られた主な結果は次のようなものである。両電極間の距離を接近させるとある距離から探針先端原子の近傍でトンネル障壁に穴があき、そこを通して電子が弾道的に電極間を流れるようになる。探針-表面間の距離の減少とともにこの穴は大きく広がり、両者の間で電子の波動関数の混成が生じ始める。この距離はアルカリ系では10A程度であるがアルミニューム系ではもっと小さい。この距離を境として、空隙幅の減少に対する電流密度の指数関数的な増加が逓減し飽和の傾向を示す。これはマイクロコンタクト形成の微視的な描像を明らかにしたものである。探針と表面間に強いバイアス電圧を加えると両者の間で原子が移動するが、その機構は両者の距離により異なる特徴を示す。すなわち距離が小さいときは近接効果が非常に大きく、印加された電圧による電子密度分布の変化し局在した力を表面原子におよぼす。例えば探針を負電位にすると、頂点附近から電子雲が押し出され表面原子に橋懸けされ、その表面原子を引き抜く力を生じる。

一方、両電極間の距離が大きいときには、正電位表面側の突出原子は正にイオン化し、静電的な効果による電界蒸発がおこる。興味深い事実は負電位側ではイオン化ではなく、原子の強い分極が生じることである。昨年度に引続き、強電界・強電流の条件下にある表面界面の電子状態を非経験的に計算する方法である第一原理リカ-ジョン・伝達行列法の開発と応用計算を行った。本年度はアルカリ原子以外の系として、シリコンとアルミニュームを選び表面のマイクロコンタクトの問題を検討し、探針直下での原子尺度のバリア・電流分布・電子分布などの様相を研究した。またアリカリ原子系としては、表面間に介在したNa原子が、距離に応じてどのような力を受けるかについて解析し、探針による原子マニピュレーションの機構を探った。計算法やプログラムの開発については、種々の原子についてコーエン型擬ポテンシアルを使用できるようなプログラム開発を行い、またベクトルパラレル計算機による大規模計算を可能とするようなプログラムの並列処理化を考案した。現実系へ応用した計算では、以下のことが明らかになった。二つのSi(111)表面を接近させるときあるボンド長よりやや長い臨界距離で、表面間の力が最大になる。このときの力分布、その距離依存性からへき開機構についての重要な手がかりが得られる。アルミニューム探針とSi表面系の場合、距離の接近とともにトンネル障壁に局所的な穴があき、そこから弾道的に電子が流れる様子が確認された。面方向に平均したバリアー高は空隙間隔とともに減少するが、簡単な矩形バリアモデルと対応させる実効的な仕事関数は、観測値に近いものとなる。Na電極間のNa原子の働く力は、正電極付近ではイオン化蒸発に近い機構で大きな反発力となるが、負電極近くでは負イオン化は起こらず表面からの反発力はごく弱い。この性質の違いについて検討した。走査トンネル顕微鏡によって探針と試料表面の間隙で興味深い現象が引き起こされるが、特に個々の原子や電子の素過程は最も注目されるものである。これを記述する理論的な方法論を構築し、これらの詳細を明らかにすることが本研究の目的である。そのため探針と表面間の距離がごく近いコンタクト領域や、探針・表面間の電界や電流が強い場合に有効なリカ-ジョン・伝達行列法を開発した。この方法は局所密度汎関数法を本質的に非平衡・開放系へと拡張するもので、無限系の散乱波解を数値的に自己無撞着に解くことを基礎とする。これによりSTMの定量的な解析、探針によって誘導される表面の局所的な化学反応、表面上、あるいは表面一探針間の原子の移動など、探針による原子制御の基礎的な問題に対する理論的なアプローチが可能となった。リカ-ジョン・伝達行列法を用いて、二つ物質表面が接近し電子的な相互作用が引き起こされて“接触"が起こる様子を、様々の系について原子論的な立場から解明した。2つの金属表面が接近するとき電子的な相互作用は、あり距離から急激に始まる。このときトンネル電流は指数関数的に増大からの明瞭な飽和の傾向を示す。仕事関数の小さな金属表面/金属探針系での原子の引き抜きは、次のメカニズムによる。探針に強い負バイアスをかけると、探針の頂点原子の外側に電子分布が張り出してきて、試料表面の電子分布と橋をかけた様な状態になる。すると表面原子はこの橋がけされた電子の雲によって、探針側に引っ張り出されるような力を受け引き抜かれる。このとき探針から受ける力は特定の原子に集中しており、確実に狙った原子を引き抜ける。
細胞分化を制御する複素環化合物の創製

本研究では、細胞分化に関与する核内受容体の一つであるレチノイドX受容体RXRアゴニスト活性を有する複素環化合物の開発を主に展開した。新規RXRアゴニストを開発するにあたり、その構造的バリエーションの少なさ、脂溶性の高さ、α・β・γと3つあるサブタイプに対する特異的なリガンドが報告されていないことに着目し、これらを解決課題とした。一般的なRXRアゴニストは、テトラメチルテトラヒドロナフチル環からなる疎水性部位と芳香族カルボン酸等の極性部位、それとこれら二つの部位を連結するリンカー部分から構成される。そこで、リンカー部分に脂溶性低下の期待できるスルホンアミド基の導入、テトラメチルテトラヒドロナフチル環をイソプロピル基と極性のあるアルコキシ基を有する芳香環への変換、さらに芳香族カルボン酸のカルボキシル基をアクリル酸への変換という3つのアプローチから分子デザインした。合成化合物のRXRリガンド活性については、COS-1細胞を用いたreporter gene assayを用いて評価した。その結果、アルコキシル基の導入を図った化合物について、低脂溶性でありながら既存の高活性アゴニストに匹敵するRXRアゴニスト活性およびRXRα選択性が認められた。なお、サブタイプ選択的RXRアゴニストの報告例がないことから、本化合物は世界初のRXRサブタイプ選択的アゴニストと言える。またアクリル酸を導入した化合物にRXRアゴニスト作用のみならず、HDAC阻害作用を有する化合物も見出した。以上の化合物については、特許出願(特願2007-48059)しており、現在文献化中である。RXRアゴニストは、タモキシフェン耐性乳がんやタキソール耐性がん、II型糖尿病の治療の他、がん化学予防、発毛作用についても研究されている。したがって、本研究で開発されたRXRアゴニストは、これらへの応用が可能と考えている。分化とは、細胞がその目的に応じて特定の形・機能を持つようになることである。その本質は、DNAの特異的遺伝子に基づいて合成されるタンパク質により行われるが、その根本にはDNAに結合しRNAへの転写を制御する核内受容体などによる制御がある。その制御の異常は、がんなどの疾病の原因となりうる。本研究では、分化制御および抗がん剤開発に対する興味から、その代表例であるレチノイドに着目し、その標的分子であるレチノイン酸受容体RARおよびレチノイドX受容体RXRを標的としたアゴニスト、およびアンタゴニスト開発を目指し、構造展開容易な種々の複素環化合物をデザイン、合成し、ヒト急性前骨髄球性白血病株HL-60細胞に対する分化誘導評価を行った。その結果、RARの代表的リガンドであるAm80のアミド結合部位を化学的に安定な2,4(1H,3H)-quinazolinedione骨格で置換した化合物を合成したところ、レチノイドアンタゴニスト活性を有する化合物を見出した。RXRリガンドについては、その既知リガンドの高脂溶性が体内蓄積等の問題を生じうると考え、スルホンアミドタイプの化合物をデザイン、合成し、活性評価を行った。その結果、メシルスルホンアミド基を有するニコンチン酸化合物にアゴニスト活性を見出した。現在、これらの各受容体サブタイプ特性を検討するために、レポータージーンアッセイを進めている。さらに、coumarin環のような蛍光性の複素環骨格からなる化合物を合成することにより、RI標識レチノイン酸に変わるレチノイド受容体結合試験化合物を目的としだ蛍光性レチノイン酸受容体リガンドの創製も試みた。その結果、いくつかの化合物にレチノイドアゴニストおよびアンタゴニスト活性を見出した。なお、これらの化合物について蛍光スペクトル解析等による蛍光特を検討したが、残念ながら顕著な蛍光強度は得られなかった。現在、本問題を解決すべく新たな化合物合成を行っている。
神経障害性疼痛におけるセラミドの関与

神経障害性疼痛にはグリア細胞由来の炎症性サイトカインによる中枢感作が重要性である。本研究では、脂質メディエーターであるセラミドに着目し、神経障害性疼痛における役割について検討した。結果より、セラミドによる脊髄ミクログリアの活性化および炎症性サイトカインの発現増加が神経障害性疼痛の形成に寄与する可能性が示唆され、セラミドを神経障害性疼痛治療の新規治療ターゲットとして提示する。<研究目的>神経障害性疼痛治療の新規ターゲットとしてのセラミドの関与を検討する。<研究計画・方法>1.神経障害性疼痛モデルにおけるセラミドの発現分布2.神経障害性疼痛モデルにおける疼痛閾値に及ぼす影響セラミドを正常マウスおよび神経障害性疼痛モデルマウスの脊髄くも膜下腔内(intrathecal: i. t.)に投与し、von Frey filanlent法および熱刺激試験法により疼痛閾値の変化について行動薬理学的解析を行う。<結果・考察>1. PSLモデル作製後1日目よりアロディニアおよび痛覚過敏反応が観察され、1週間以上持続することが確認された。そのPSLモデルより採取した脊髄の免疫染色の結果、モデル作製後4日目において脊髄後角でのセラミド発現が観察されたが、sham opeおよび二次抗体のみを処置した脊髄では発現が認められなかった。2.セラミド(0.3-3nmol)のi. t投与により、正常マウスにおいて投与1日後から用量依存的にアロディニアが発現し、投与後3日まで持続した。しかし、熱刺激による痛覚過敏反応は観察されなかった。一方、セラミドの坐骨神経周囲投与では、von Frey filament法および熱刺激試験法どちらにおいても疼痛閾値に影響を与えなかった。さらに、脊髄をターゲットにし、神経損傷後7日目のPSLモデルにセラミドi. t.投与を行った結果、vehicle投与群と比較して疼痛閾値は変化しなかった。これらの結果より、神経障害性疼痛を増悪させる因子として働く可能性は低いが、脊髄において疼痛を誘発する因子として機能していることが明らかとなった。したがって、本研究結果により、セラミドが疼痛と密接に関連する脂質分子であり、神経障害性疼痛の治療ターゲットとなりうる可能性が導かれた。<研究目的>神経障害性.一痛治療の新規ターゲットとしてのセラミドの関与を検討する。<研究方法および計画>1.神経障害性疼痛モデルにおけるセラミドの:坐骨神経部分結紮(PSL)モデルを用い、疼痛反応に及ぼすセラミド合成酵素阻害薬(Fumonisin B1:FB1)の脊髄くも膜下腔内投与(i.t.)の影響についてvon Frey testにより疼痛評価した。FB1投与後脊髄を用い、Iba-1抗体による免疫染色を行った。PT-PCR法によりPSL後のセラミド生成酵素(NSMase)発現を測定した。2.セラミドによる脊髄ミクログリアおよび炎症性サイトカイン発現への影響:正常マウスにセラミドi.t.投与し、免疫染色およびRT-PCR法により解析した。<結果・考察>1. PSLにより惹起される触アロディニアは、疼痛形成過程であるPSL後3時間および3日目におけるFB1 (1-10nmol)投与により用量依存的かつ有意に減弱が認められた。一方、疼痛形成後であるPSL後7日目単回投与では疼痛反応は減弱しなかった。PSL後3時間および3日目FB1投与後脊髄後角において、PSLによる脊髄ミクログリアの活性化が顕著に抑制された。PSL後脊髄においてPSL後3時間よりNSMaseが発現増加し、7日まで持続した。2.セラミド(3nmol,i,t.)投与後3時間および24時間の脊髄ミクログリアの活性化が溶媒投与群に比して顕著に観察された。また、セラミド投与後3時間の脊髄で炎症性サイトカイン(IL-1β, TNFα)の発現増加が認められた。これらの結果より、セラミドによる脊髄ミクログリア活性化および炎症性サイトカイン発現増加が神経障害性疼痛の形成に関与することが示唆され、神経障害性疼痛の疼痛機構解明におけるセラミドの重要性と新規治療ターゲットとしての可能性を導いた。
膀胱癌化学療法におけるElectroporationに関する実験的研究

YTS-1(ヒト移行上皮癌樹立細胞株)を用い、種種の条件のelectroporationを行い、ルシファーイエロ-を細胞内に導入し、下記のごとくの至適条件が明らかとなった。すなわち、100μs、の直流方形電気パルスを8回(1Hz)、1000-1750V/cmの範囲で、75-80%の導入効率を得た。この条件下に、ブレオマイシン、アドリアマイシン、シスプラチンを細胞内に導入し、2時間後の各抗癌剤の細胞内濃度をelectroporation非施行群と比較した。この処置により各薬剤は1.52.5倍の細胞内濃度が確認された(p<0.01)。殺細胞効果は、トリチウムサイミジンの取り込みにより判定したが、アドリアマイシン、シスプラチンのelectroporation施行群の殺細胞効果が非施行群の101102倍の濃度に相当したのに対し、ブレオマイシンでは103倍の濃度に匹敵する効果が観察された。以上の実験より、本治療法においてはブレオマイシンを併用する場合において最大に効果の増強が得られると判断した。ブレオマイシンを静注後、正常ラットの膀胱組織に、前記の条件の高電圧パルス処置を行い、薬剤導入を試みた.処置群の膀胱組織には非処置群の2.7倍の濃度が認められた。BBNによってラットに膀胱癌を導入し、治療効果を組織学的に判定した。ブレオマイシン投与後electroporation処置群は6066%に何らかの組織学的効果が見られたのに対し、無治療群、ブレオマイシン単独群、electroporation単独群では、組織の変化は見られなかった。以上よりブレオマイシン併用electroporationは移行上皮癌に対し高い効果を示すことが分かった。(1)ヒト移行上皮癌樹立細胞株(YTS-1)を用い、400v/cm1400v/cmの高電圧を100v/cmきざみに作用させ、ルシファーイエロ-を細胞内に誘導した。パルス巾は100μs、パルス回数は8回に固定して行った。1000v/cmまたは1300v/cmの条件において約90%の細胞内にルシファーイエロ-が誘導され、電圧による死細胞は10%以下であることがわかった。以後これを至適条件として実験を進めた。(2)培養液中に100μg/mlと10μg/mlのブレオマイシン(BLM)を投与し、1250v/cmm100μsの方形の高電圧を8回作用させた群(electroporation群)とコントロール群の細胞内BLM濃度を測定した。投与後1時間でのelectroporation群の細胞内BLM濃度はコントロール群に比較し、109倍(BLM 100μg/ml作用時)または2.5倍(BLM10μg/ml作用時)高値を示した。(3)雄性Wistarラットを用い膀胱を経腹的に露出し、ブレオマイシン10ng/kgを尾静脈より注入した。5分後に1000v/cm 100μsの方形電圧を8回膀胱に作用させた群(electroporation群)とコントロール群の膀胱および血清、肝、腎、肺の各BLM濃度を測定した。静注1時間後の膀胱組織内BLM濃度はelectroporation群がコントロール群の2.5倍の高値を示した。(4)雄性Wistarラットに0.05%BBNを24時間投与し膀胱癌を作製した。これに対し、経腹的に膀胱を露出し、BLM10ny/kgを尾静脈より投与、5分後に1000v/cm、100μsの方形電圧を8回膀胱に作用させた(BLM+electroporation群)。

また開腹だけの無処置群、electroporationだけの群、BLM静注だけの群で腫瘍に対する効果を組織学的に比較した。BLM+electroporation群で腫瘍の1/2以上の壊死が見られた例が9例中4例あったのに対し、他群には1例も広範な腫瘍壊死所見が認められなかった。YTS-1(ヒト移行上皮癌樹立細胞株)を用い、種種の条件のelectroporationを行い、ルシファーイエロ-を細胞内に導入し、下記のごとくの至適条件が明らかとなった。すなわち、100μs、の直流方形電気パルスを8回(1Hz)、1000-1750V/cmの範囲で、75-80%の導入効率を得た。この条件下に、ブレオマイシン、アドリアマイシン、シスプラチンを細胞内に導入し、2時間後の各抗癌剤の細胞内濃度をelectroporation非施行群と比較した。この処置により各薬剤は1.52.5倍の細胞内濃度が確認された(p<0.01)。殺細胞効果は、トリチウムサイミジンの取り込みにより判定したが、アドリアマイシン、シスプラチンのelectroporation施行群の殺細胞効果が非施行群の10^110^2倍の濃度に相当したのに対し、ブレオマイシンでは10^3倍の濃度に匹敵する効果が観察された。以上の実験より、本治療法においてはブレオマイシンを併用する場合において最大に効果の増強が得られると判断した。ブレオマイシンを静注後、正常ラットの膀胱組織に、前記の条件の高電圧パルス処置を行い、薬剤導入を試みた.処置群の膀胱組織には非処置群の2.7倍の濃度が認められた。BBNによってラットに膀胱癌を誘導し、治療効果を組織学的に判定した。ブレオマイシン投与後electroporation処置群は6066%に何らかの組織学的効果が見られたのに対し、無治療群、ブレオマイシン単独群、electroporation単独群では、組織の変化は見られなかった。以上よりブレオマイシン併用electroporationは移行上皮癌に対し高い効果を示すことが分かった。