hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
バイオリアクターとしての干潟機能の解明

セルロース繊維が露出したヨシなどの残渣のセルロースを分解し、その結果生じるオリゴ塘をヤマトシジミが取り込みことで、栄養源として利用している可能性が考えられた。体外セルラーゼの分解能について:ヤマトシジミが体外に分泌したセルラーゼが実際にヨシの葉を分解することができるかどうかを検討する目的で、ヤマトシジミの飼育水にヨシの葉を浸演し、生じた還元糖とグルコース量を測定した。バクテリア由来の酵素活性を抑制するためアジ化ナトリウムを飼育水に添加した。その結果、飼育開始後半月にわたって経時的に還元糖の分解が認められた。還元糖のうち約1/3はグルコースであった。この結果から、ヤマトシジミから体外に分泌されたセルラーゼは、実際にヨシの葉のセルロースを分解し、自ら利用できる還元糖やグルコースを産生することが明らかとなった。一方、ヤマトシジミの飼育水にグルコースを与えると、経時的に飼育水中のグルコースが減少したことから、ヤマトシジミはセルロースの分解の結果生じたグルコースを利用している可能性が示唆された。本研究は、これまで科学的に扱われることのなかった干潟の炭素循環に果たす役割を、そこに生息するベントスの体外分泌性のセルラーゼに注目して明らかにしたものである。汽水域の干潟などに生息するヤマトシジミは濾過食者であることから、すべての栄養源を水に懸濁した状態で摂取している。これまでこのような濾過食者が能動的に体外に酵素を分泌して、体外の有機物を分解していることは全く報告されていなかったが、本研究はヤマトシジミのセルラーゼのアミノ末端に存在するCBMと呼ばれるセルロース結合ドメインに注目し、CBM-GFP融合タンパク質を用いた視覚的検出により、ヤマトシジミのセルラーゼのCBMが実際にヨシなどの植物残渣に結合能を有することを示すことに世界で初めて成功し、これまで機能が不明であった水生生物由来のCBMが流水環境においてある種のアンカーとして機能していることを証明した。また、本研究はCBMを介してセルロースに結合したヤマトシジミのセルラーゼが実際にセルロースを分解して低分子糖を生成すること、このようにして生じたグルコースがヤマトシジミに吸収されていること、土壌中の非晶質アルミニウムの分泌された酵素結合に果たすことなどを示唆する結果を得ることにも成功した。以上のことから、これまで仮説にとどまっていた底泥バイオリアクター説が、単なる仮説ではなく、定説として成立する可能性を示したことも価値あることと考える。「環境酵素」という概念を提示したことは、この分野に飛躍的な進歩をもたらした。これらの知見は、これまで生物の観点から論じられることの多かった干潟の保全には、その地域特有の土壌の特性にも注意を払う必要があることを示唆しており、特に我が国のように地域による土壌特性が多様な国土を持つ国の、沿岸保全に新たな視点をもたらすものとして評価できる。26年度が最終年度であるため、記入しない。CBM-GFP融合タンパク質を用いた視覚的検出により、ヤマトシジミのセルラーゼのCBMが実際にヨシなどの植物残渣に結合能を有することを示すことに世界で初めて成功し、これまで機能が不明であった水生生物由来のCBMが流水環境においてある種のアンカーとして機能していることを証明した。
わが国の男性における産後のうつの有病割合と、その予防要因の解明に関する縦断研究

本研究の主たる目的は、妊産婦とそのパートナーにおいて、妊娠期から産後にかけてメンタルヘルスが不調になる者の割合を把握することとした。本研究では、愛知県西尾市に妊娠届を提出した妊婦とそのパートナー262組から同意を得て、妊娠20週、産後数日、2週、1か月、2か月、3か月の計6回の調査を実施した。妊産婦のパートナーにおけるEPDS+(8点以上)の者の割合は、妊娠20週から産後3か月にかけて、9.1%、8.1%、3.4%、5.8%、8.5%、7.1%であった。本研究の結果から、妊産婦のパートナーであるわが国の男性も、妊娠期や産後には、メンタルヘルスの問題を抱えるリスクが高いことが示された。当初の計画では妊産婦のパートナーのみを対象にした疫学調査を実施する方向で準備を進めてきたが、より質の高い結果を得るためには、夫婦を対象にした調査が望ましいことが明らかになった。そこで、今年度、妊産婦のメンタルヘルスについて縦断的な調査を実施する研究グループと共同研究を実施する方向で計画を立て直し、愛知県西尾市をフィールドとする縦断研究を実施することになった。産前・産後のパートナーを対象とした研究としては、わが国で極めて稀なpopulation-basedの縦断調査が始まっている。この研究デザインは、実施計画における「産前・産後の男性における“うつ"と判定される者の有病割合を算出する」という目的において、もっとも適した方法の一つである。今年度は研究計画の修正をするとともに、愛知県西尾市から、本研究への全面的な協力をとりつけた。研究計画について、2012年秋に所属先の研究倫理委員会の承認を得て、同12月よりデータ収集を開始している。3月末の時点で204組の夫婦から同意が得られている。産前・産後のパートナーを対象とした研究では、回収率が30%を下回っていることを考えると、順調に対象者のリクルートが進んでいると言える。また、当初の計画では、出産直後をベースラインとし、産後に2度のフォローアップをする、という予定であった。しかし、修正後の計画では、妊娠中期をベースラインとし、産後5回にわたり、フォローアップすることとしており、より緻密かつ豊富なデータが得られる計画に進化した。本研究では、妊産婦とそのパートナーの産前産後のメンタルヘルスについて状況を把握するために、妊娠20週から産後3か月までの追跡調査を実施した。妊娠20週のベースライン調査への回答が得られた262組のカップルを対象に自記式質問票によって、データを収集した。産後3か月時にも、197組の対象者から回答が得られ、当該時期に父親を対象に実施した調査としては、極めて高い回収率となった。EPDS(エジンバラ産後うつ病質問票)などにより、対象者のメンタルヘルスの推移を観察したところ、ハイリスク者の割合は男女ともに妊娠期がもっとも高く(男性:9.1%、女性11.5%)、産後しばらくは頻度が低下するものの、産後23か月にかけて、再度、ハイリスク者の割合が上昇することが示された。男女ともに初産婦の方が経産婦に比べて、EPDSのハイリスク者の割合が高く、初産婦の夫婦へのケアをより重点的におこなう必要性が示された。他の研究班において、本研究と同じ研究デザインで妊産婦を追跡した結果と比較してみると、EPDSのハイリスク者の割合の推移は異なり、それぞれの調査対象地域の特性から、分娩時の入院後や、里帰りを終えるなど、周囲から受けるサポートが減った直後が、男女ともにメンタルヘルスの状態が悪くなりやすいことが示唆された。それぞれの時期のQOLを測定してみると、妊産婦においては、産後数日から1か月にかけて、「ぐっすり眠れない」といった項目が強くQOLを低下させていることが示された。夫婦のいずれもがEPDSでハイリスクと判定された家庭は、妊娠期には全体の18.7%、産後でも10%を越えていた。夫婦のメンタルヘルスは、相互に関連しあうことが明らかになるとともに、両親のメンタルヘルスが悪い場合、育児などへの影響が懸念される。母親のメンタルヘルスのみならず、父親のメンタルヘルスにも着目することが公衆衛生上、極めて重要であることを示す結果が得られた。本研究班は、パートナーが出産した直後の男性を対象とした縦断研究の実施を通じ、産後の男性の精神的な健康状態に関する実態を把握することを目指している。平成23年度は(1)縦断研究の計画立案・実施準備、(2)立ち会い出産をした男性を対象とした質的調査の実施、(3)男性の産後うつに関するシステマティックレビューの実施、の3つをおこなった。それぞれの活動の主な成果は以下の通りである。

(1)縦断研究の研究計画書の原案の作成、使用する心理尺度の選定をはじめとする質問票の作成、調査協力施設への事前の打ち合わせなど、研究の実施体制の整備を進めた。(2)立ち会い出産をした男性10名を対象に聞き取り調査を実施した。その結果、立ち会い出産をした男性は、妊娠・出産のことがよく分からないがゆえに、恐怖感にも似た強い不安に駆られていること、妻を支えたいという一心で出産に臨んでいることが示された。また、妊娠・出産に関わっていく中で、男性の役割や居場所のなさに苦しむことも示された。出血など出産のあまりの生々しさに、産後1年ごろまでトラウマとなってしまう可能性があることも明らかになった。男性に対して、医療従事者や産後の女性が声をかけること、男性自身の存在意義が大きかったことをきちんと伝えることの重要性が示唆された。(3)Pubmedを用いて、2000年以降に掲載された男性の産後うつに関する論文についてシステマティックレビューをおこなった。259件の論文が検索され、その内容を精査した結果、59件の論文がレビューの分析対象となった。レビューを通じ、男性の産後うつは2005年以降に注目されるようになった新しい課題であること、妊娠期から産後1年にかけて約10%の男性が精神的な問題に苦しんでいること、わが国では男性の産後うつの実態が十分に把握されていないこと、産後の男性を対象に質問票調査を実施する際の難しさなどが明らかにされた。本研究は妊産婦のパートナーが対象という、前例が極めて少ない研究課題であったため、平成23年度から聞き取り調査や文献調査、専門家・関係者との意見交換を綿密におこなった。それにより、妊産婦のパートナーの精神的な健康状態には、妊産婦の心身の健康状態が与える影響が大きく、研究結果に看過できないバイアスが生じることが明らかになった。そこで、研究の対象者に妊産婦も含めて、妊娠中の女性とそのパートナーを対象とした調査へと計画を修正をする必要があると判断した。そのため、当初の計画を大幅に見直したため、本研究の事業期間の延長を申請し、認められた。当初の予定では、平成23年度中より縦断研究を開始する予定であった。しかし、研究計画の立案に際して、我が国における先行研究の知見がほとんどなかったため、諸外国の先行研究のレビューおよび、対象者となる産後の男性への聞き取り調査といった、基礎的なデータ収集を実施する必要が生じた。それらの活動を実施したため、申請当初の予定に比べ、遅れが生じている。平成24年度のできるだけ早い時期から縦断研究を開始するとともに、申請書の「研究が当初の予定通りに進まない時の対応」に記載した通り、2度目のフォローアップ調査の実施を断念して、産後3カ月時までのフォローアップを実施するように、計画を修正する。この修正により縦断研究の調査期間は短縮されてしまう。しかし、先行研究のレビューや質的調査の成果と併せて、本研究班の成果として公表することは、「男性の産後うつ」について多角的に評価することができ、今後のさらなる研究の実施に向けた重要な基礎となりえる、本研究班としての成果が大きく損なわれるわけではない。できるだけ質の高いデータを収集するために、実施中の縦断研究のスーパーバイズと成果の報告に尽力する。追跡調査時の対象者の脱落率を低減させるために、西尾市のみならず、近隣の分娩施設に、本研究の対象者に対して調査への協力依頼の声掛けをしていただくなど、できるだけの配慮をしているところである。
真空紫外フェムト秒レーザーイオン化質量分析の研究

本年度は、紫外近赤外域に亘る超短パルス光を発生させ、これを光源とする質量分析計を開発した。すなわち自己位相変調を用いてレーザー光のスペクトル帯域を拡大し、分散補正により光パルスを圧縮した。そのパルス幅を第二高調波発生周波数分解光ゲート法により測定した。その結果、近赤外域(650-1400 nm)で3.2 fs, 120 μJの光パルスを発生できることがわかった。また、その光パルスをアルゴンガスに集光して第三高調波発生により紫外光(200-400 nm)に変換し、1.9 fs, 20 nJの光パルスを得た。一方、高繰り返しフェムト秒Ybレーザー(1030 nm)の第二(515 nm)、第四高調波(258 nm)を効率よく発生させる方式について検討した。その結果、それぞれ41%、20%の高い変換効率が得られた。さらに、B5サイズ程度の小型質量分析計を設計、製作し、これを上記のレーザー及び時間相関単一イオン計数装置と組み合わせた質量分析計を開発した。一方、超短パルスレーザーを光源とする質量分析については、以下の研究を行った。(1)3.2 fsの超短光パルスをイオン化光源とすることにより、残留性有機汚染物質(POP)の一つであるペンタクロロベンゼンの分析感度が7倍増大することを明らかにした。(2)ブロモメチルナフタレン(BMN)を用いて神経ガス代謝物を測定した結果、約0.2 ng/mLの検出限界が得られ、これまでの最良の方法に匹敵することが分かった。(3)この誘導体化試薬を用いて環境汚染物質であるパーフルオロ有機酸(PFOA)を測定した。(4)時間相関イオン計数法に基づく小型質量分析計を用いて、アレルギー物質などを高感度にオンライン計測できることを示した。平成30年度が最終年度であるため、記入しない。応募者はレーザーイオン化質量分析法を開発し、数1000種類の成分を一斉に、かつサブフェムトグラムまで分析できることを報告している。しかし、爆発物、神経ガス、農薬等の化合物の幾つかは、このような光イオン化法を用いても分子イオンが観測されず、高感度分析が困難である。本研究課題では、過酸化アセトン等の爆発物、サリン等の神経ガスの合成副産物・代謝物、農薬等の分子イオンを検出し、かつ高感度に計測できる真空紫外深紫外フェムト秒レーザーイオン化質量分析法の開発を目的とする。当該年度は、研究期間全体に亘り、複数の研究項目を同時かつ円滑に遂行するためのチタンサファイアチャープパルス増幅器を導入した。また、当該研究課題の核となる光源、真空紫外ー深紫外ラマンレーザーを開発するため、チタンサファイアチャープパルス増幅器の基本波(800 nm)と光パラメトリック増幅器の出射光(1200 nm)、そして、第3高調波(267 nm)の3色のフェムト秒レーザー光を水素ガス中に集光し、複数のラマンサイドバンドを発生させる研究を行った。とくに、基本波と第3高調波の高出力化を目的とした装置改良を重ね、高出力の紫外フェムト秒多色レーザー光を得る研究を行った。更に、次年度以降の真空紫外光の発生を念頭に置いた第4高調波(200 nm)発生光学系の構築、並びにその動作確認、パルス幅計測光学系の構築・計測を進めた。飛行時間型質量分析において真空紫外多色レーザー光を利用する際、一度空間的に波長分離して用いる必要がある。その波長分離器(真空装置)の設計・開発を進めた。また、得られた紫外超短パルスレーザー光を爆発物、神経ガス代謝物の高効率イオン化へ応用する研究を同時に進め、得られた結果を光源開発研究へフィードバックし、高効率イオン化に必要な光源開発に関する指針を得た。質量分析法は、爆発物、神経ガス、農薬等の有力な分析手法の一つである。応募者は、レーザーイオン化質量分析法を開発し、数1000種類の成分を一斉、かつサブフェムトグラムまで分析できることを報告している。そこで、本研究では、過酸化アセトン等の爆発物、サリン等の神経ガスの合成副産物・代謝物、農薬等の分子イオンの高感度検出を可能とする、深紫外真空紫外フェムト秒レーザーイオン化質量分析法について研究する。本年度は、水素の四波ラマン混合に基づく深紫外真空紫外領域におけるフェムト秒レーザーを開発した。すなわち、基本光(800 nm)と水素の振動ラマンシフト周波数に相当するだけ周波数が異なる1200 nmの光を、水素を充填したラマンセル中に集光させる。そこに基本光の第三/第四高調波(267 /200 nm)を入射させ、光位相変調により紫外真空紫外超短パルス光を発生させた。真空紫外光を利用するには、これを発生させるためのラマンセルと質量分析計を真空ラインにより結合する必要がある。そこで、このための新たな真空装置を設計し、製作した。本装置には波長を選択できる機能を付与し、波長を選択しながら真空紫外超短パルスレーザーイオン化が行えるようにした。また、自己相関及び周波数分解光ゲート法に基づき光パルス幅を測定する装置を開発し、その性能を評価した。さらに、本年度は紫外超短パルス光を用いて、爆発物や神経ガス関連物質を測定した。

たとえば、深紫外超短パルス光を用いる神経ガス関連物質の測定では、ペンタフルオロベンゼンで標識し、200nmの超短パルスレーザーでイオン化することにより、分子イオンを増強できることを明らかにした。その他、PM2.5やディーゼル排ガス中のニトロ多環芳香族化合物の分析やトランス油中の多塩素化ビフェニル(PCB)の分析等を行った。基本光(800 nm)と水素の振動ラマンシフト周波数に相当するだけ周波数が異なる1200 nmの光パルスを、水素を充填したラマンセル中に集光し、水素の分子振動を誘起した。そこに、基本光の第三/第四高調波(267/200 nm)を入射させ、その光を位相変調させることにより、真空紫外深紫外超短パルス光を発生させた。発生効率は10%程度と考えられ、今後、質量分析に十分応用できると考えられる。本装置を実際に質量分析に応用するには、特定波長のレーザー光を空間的に分離して用いることが望ましい。そこで、真空チャンバーを新たに設計、製作し、内部にプリズム(ビームウェッジ)を設置して空間的に波長分離が行えるようにした。また、自己相関法の他、第二高調波発生、和周波混合に基づく周波数分解光ゲート法に基づくパルス幅測定法を開発し、それらの性能を評価した。本研究では、Isopropylmethylphosphonic acid(IMPA)、Pinacolymethylphophonic acid(PMPA)等の神経ガス関連物質を分析した。測定に際しては、pentafluorobenzoyl化(PFB化)とtert-butyldimethylsilyl化(TBDMS化)の2つの誘導体化について検討した。チタンサファイアレーザーの第三/第四高調波(267/200 nm)を用いてイオン化した結果、IMPA-PFB、PMPA-PFBでは共鳴多光子イオン化が優勢となる200 nmを使用した方が、非共鳴多光子イオン化が優勢となる267 nmを使用した場合と比較して、フラグメントイオン化が抑制され、またイオンの生成効率が高くなる結果を得た。本研究では、その他にも大気中のPM2.5に含まれるニトロ多環芳香族化合物、トランス油中の多塩素化ビフェニル(PCB)等の分析についても検討した。質量分析法は、爆発物、神経ガス、農薬等の有力な手法の一つである。応募者はレーザーイオン化質量分析法を開発し、数1000種類の成分を一斉に、かつサブフェムトグラムまで分析できることを報告している。そこで、本研究では過酸化アセトン等の爆発物、サリン等の神経ガスの合成副産物・代謝物、農薬等の分子イオンの高感度検出を可能とする真空紫外深紫外フェムト秒レーザーイオン化質量分析法について研究する。本年度は、真空紫外光を効率よく発生するため、水素を中空導波路に封入する方式を検討した。これにより変換効率を増大させ、質量分析計に導入して分析に用いた。また超短パルス光発生に必要な位相情報を取得するため、第二高調波発生、自己回折、過渡回折、和周波発生に基づくSHG FROG、SD FROG、TG FROG、XFROGなどに基づく光パルス評価法を開発した。一方、開発した質量分析計の有用性を実証するため、幾つかの試料を分析した。神経ガス代謝物の分析に関しては、多光子イオン化が容易なナフタレンを基本骨格とするブロモメチルナフタレン(BMN)で標識する方法を見出し、これを用いて妨害の寄与を顕著に抑制でき、かつ高感度に分析できた。さらに、紫外域における多光子イオン化と近赤外域におけるフィールドイオン化について比較検討した。その結果、近赤外域においてイオンが吸収バンドをもたない場合は分子イオンが生成し易いことがわかった。
気道ウイルス感染に対するマスト細胞の生体防御的役割の解明

白血球の一分画であるマスト細胞は、アレルギー疾患の病態に深く関与している。生体内でのマスト細胞の新たな役割として、細菌感染防御への関与が示されているが、ウイルス感染における役割は不明な点が多かった。ウイルス類似成分(poly I:C)をマウスに点鼻投与すると、肺に炎症が生ずるが、マスト細胞欠損マウスでは炎症が減弱しており、肺での炎症起因物質の濃度も低下していたが、マスト細胞を移入すると炎症は回復した。このことから、マスト細胞は気道ウイルス防御に寄与している可能性が示唆され、この知見は、喘息などのアレルギー疾患がウイルス感染で悪化する機序の解明にもつながるものと考える。【目的】2008年度は、ウイルスニ重鎖RNAのアナログであるpoly I:Cを,野生型マウス(+/+)とマスト細胞欠損マウス(W/w^v)に気道内投与し,気道炎症の差異を検討することで、マスト細胞のウイルス防御への関与を明らかにすることを目的とした。また、細菌菌体成分として、グラム陽性球菌リポペプチドのアナログであるTLR2リガンド、Pam_3CSK_4を気道内に投与して、気道炎症を比較した。【方法】+/+とWIW^vに、poly I:Cまたは、Pam3CSK4を3日間点鼻後、4日目に解析した。また、W/w^vへの+/+骨髄由来培養マスト細胞の移入実験も行った。評価項目は、気管支肺胞洗浄液中の細胞成分、気道過敏性とした。気管支肺胞洗浄は、留置針より生理食塩水を注入・回収し、白血球分画を検討した。気道過敏性は、拘束型呼吸機能解析装置を用いて、アセチルコリン(Ach)吸入後の気道抵抗を測定した。【結果】+/+へのpoly I:C点鼻で、BALFリンパ球・好中球数が有意に増加し、炎症細胞浸潤を認めた。W/w^vでは、BALF細胞数が有意に少なかったが、マスト細胞移入により回復した。気道過敏性については、いずれの群間でも有意差は認められなかった。+/+へのPam_3CSK_4点鼻でも、W/W^vではBALF細胞数が有意に低値であった。【結論】ウィルスニ重鎖RNAによる気道炎症は、マスト細胞欠損マウスでは減弱し、マスト細胞移入で回復した。ウイルス性気道炎症形成へのマスト細胞の寄与が示された。また、グラム陽性球菌に対する気道炎症惹起にもマスト細胞が関与している可能性が示唆された。【目的】2008年度は、ウイルス二重鎖RNAのアナログであるpoly I:Cを、野生型マウス(+/+)とマスト細胞欠損マウス(W/W^V)に気道内投与し比較した。+/+では、気管支肺胞洗浄液(BALF)中リンパ球・好中球数が有意に増加したが、W/W^Vでは、細胞数が有意に少なく、マスト細胞移入で回復することから、ウイルス性気道炎症形成へのマスト細胞の寄与が示された。2009年度は、その機序の一端を明らかにする目的で、BALF中のサイトカイン・ケモカイン濃度を網羅的に検討した。【方法】+/+とW/W^Vにpoly I:Cを3日間点鼻後、4日目にBALFを採取し、23種の液性因子をLuminexシステムを用いて、網羅的に解析した。【結論】ウイルス二重鎖RNA成分に対し、マスト細胞は複数のケモカイン、サイトカイン産生に関与し、気道におけるウイルス感染防御的な炎症形成に寄与している可能性が示唆された。リンパ球および好中球指向性の複数のケモカインや、好中球生存延長に関与するサイトカインが、ウイルス二重鎖RNA投与後のリンパ球、好中球性炎症形成に関与している可能性が考えられた。本研究は、マスト細胞の生体内での新たな役割として、ウイルス感染に対する生体防御機構への関与を明らかにすることである。前年度までに、マスト細胞欠損マウスにウイルス二重鎖RNA(dsRNA)のアナログであるpoly I : Cを投与する系を用いて、マスト細胞は複数のケモカイン、サイトカイン産生に関与し、気道におけるウイルス感染防御に寄与している可能性を明らかにしてきた。今年度は以下の計画を立案した。1)ウイルス防御に関与するマスト細胞TLRを同定するTLR3欠損マウス由来のマスト細胞をマスト細胞欠損マウスに移入することで、マスト細胞TLRのウイルス防御への関与を証明することを目指したが、TLR3欠損マウスの安定的入手が困難であり、結果を得るに至らなかった。本研究申請後に、ウイルスdsRNAの受容体については、TLR3の他にMDA-5,RIG-1といった新規細胞内受容体も同定されてきており、dsRNAがどの受容体を用いるかは細胞種によって異なる事も報告されている。

TLR3以外の受容体も含め、今後もマスト細胞のウイルス認識に関与する受容体に関する検討を継続したい。2)ウイルス感染による気管支喘息増悪へのマスト細胞の関与を検討するOVA(ovalbmin)による感作、チャレンジによる喘息モデルマウスにdsRNAを投与するとアレルギー性気道炎症は増悪し、気道過敏性は亢進することを既に見いだしており、気管支喘息のウイルス感染による増悪モデルとして検討してきている。また、マスト細胞欠損マウスと野生型マウスに対し、OVA感作、チャレンジを行うと、マスト細胞欠損マウスでは炎症細胞浸潤は軽度低下するものの、Achに対する気道過敏性は残存することを予備的検討で確認している。マスト細胞欠損マウスと野生型マウスに喘息モデルを作製した後に、poly I : Cを追加投与し、増悪におけるマスト細胞の役割を明らかにすることを目指したが、炎症細胞浸潤における有意差を見出だすに至らず、さらに投与量の条件検討が必要であることが明らかになった。今後も至適条件を見出し、マスト細胞の果たす役割を明らかにしていきたい。
再生不良性貧血の病因としての heat shock protein 70 の解析

免疫抑制療法を受けた多数の再生不良性貧血症例について,末梢血リンパ球におけるheat shock protein(hsp72)の発現をフローサイトメトリーで検討した.その結果,シクロスポリン療法に反応して改善した再生不良性貧血患者のリンパ球では,熱ショック後のhsp72の発現が亢進していることが明らかになった.この現象は,再生不良性貧血以外の血液疾患患者ではみられなかった.hsp72の発現はTリンパ球においてとくに顕著であった.したがって,治療前に末梢血リンパ球のhsp72の誘導性を調べることは,シクロスポリンのような免疫抑制剤に対する反応性を予測する上で有用と考えられた.一方,全国の症例について調査を行ったところ,再生不良性貧血全体の約40%の症例で,末梢血単核細胞中のhsp72陽性細胞の割合が高値(>30%)を示した.しかし,抗胸腺細胞グロブリン+シクロスポリン療法の効果との関係をみたところ,シクロスポリン療法でみられたような明らかな相関は認められなかった.一部の再生不良性貧血患者では,リンパ球だけでなく,赤血球の表面にもhsp72が検出された.そこで,赤血球表面のhsp72について詳細に検討したところ,hsp72は,再生不良性貧血患者だけでなく,約30%の健常人で2090%の赤血球表面に発現していた.血液型との関係を調べたところ,hsp72はA型とAB型の赤血球にのみ検出された.hsp72の発現は熱ストレスとは無関係であった.hsp72陽性の健常人の骨髄をin vitroで培養し,赤血球前駆細胞を分化させたところ,得られた赤芽球の表面にはhsp72は検出されなかった.このためhsp72は,A型およびAB型の赤芽球が脱核したのちに赤血球表面に発現すると思われた.赤血球表面にはhsp72だけでなく,hsp90の発現も認められた.A型物質との関係を調べるため,O型赤血球をNアセチルガラクトサミン(GalNAc)トランスフェラーゼとUDP-GalNAcで処理することによりA血球に変換したところ,抗hsp72抗体との反応はみられなかった.したがって,赤血球表面のhsp72の発現は,遺伝的に決定されたものであり,A型物質の発現と密接な関係にあることが示唆された.免疫抑制療法を受けた多数の再生不良性貧血症例について,末梢血リンパ球におけるheat shock protein(hsp72)の発現をフローサイトメトリーで検討した.その結果,シクロスポリン療法に反応して改善した再生不良性貧血患者のリンパ球では,熱ショック後のhsp72の発現が亢進していることが明らかになった.この現象は,再生不良性貧血以外の血液疾患患者ではみられなかった.hsp72の発現はTリンパ球においてとくに顕著であった.したがって,治療前に末梢血リンパ球のhsp72の誘導性を調べることは,シクロスポリンのような免疫抑制剤に対する反応性を予測する上で有用と考えられた.一方,全国の症例について調査を行ったところ,再生不良性貧血全体の約40%の症例で,末梢血単核細胞中のhsp72陽性細胞の割合が高値(>30%)を示した.しかし,抗胸腺細胞グロブリン+シクロスポリン療法の効果との関係をみたところ,シクロスポリン療法でみられたような明らかな相関は認められなかった.一部の再生不良性貧血患者では,リンパ球だけでなく,赤血球の表面にもhsp72が検出された.そこで,赤血球表面のhsp72について詳細に検討したところ,hsp72は,再生不良性貧血患者だけでなく,約30%の健常人で2090%の赤血球表面に発現していた.血液型との関係を調べたところ,hsp72はA型とAB型の赤血球にのみ検出された.hsp72の発現は熱ストレスとは無関係であった.hsp72陽性の健常人の骨髄をin vitroで培養し,赤血球前駆細胞を分化させたところ,得られた赤芽球の表面にはhsp72は検出されなかった.このためhsp72は,A型およびAB型の赤芽球が脱核したのちに赤血球表面に発現すると思われた.赤血球表面にはhsp72だけでなく,hsp90の発現も認められた.A型物質との関係を調べるため,O型赤血球をNアセチルガラクトサミン(GalNAc)トランスフェラーゼとUDP-GalNAcで処理することによりA血球に変換したところ,抗hsp72抗体との反応はみられなかった.したがって,赤血球表面のhsp72の発現は,遺伝的に決定されたものであり,A型物質の発現と密接な関係にあることが示唆された.免疫抑制療法を受けた多数の再生不良性貧血症例について末梢血リンパ球におけるheat shock protein(hsp72)の発現をフローサイトメトリーで検討した.その結果,シクロスポリン療法に反応して改善した再生不良性貧血患者のリンパ球では,熱ショック後のhsp72の発現が亢進していることが明らかになった.この現象は,再生不良性貧血以外の血液疾患患者ではみられなかった. hsp72の発現はTリンパ球においてとくに顕著であった.したがって,治療前に末梢血リンパ球のhsp72の誘導性を調べることは,シクロスポリンのような免疫抑制剤に対する反応性を予測する上で有用と考えられた.このようなhsp72の易誘導性は,hsp遺伝子の多型性によって支配されている可能性があるため,各患者のhsp70-2遺伝子の多型性を決定した.

その結果,hsp70-2対立遺伝子のうち,9.0kbを持つ例(9.0kb/9.0kbおよび9.0kb/8.5kb)は,このアリルを持たない例(8.5kb/8.5kb)に比べてhsp72の熱誘導性が高いことが示された.また,前者は後者にくらべてシクロスポリンに対する反応性が高いことが明らかになった.一方,熱誘導が亢進している一部の患者では,hsp72がリンパ球の細胞内だけでなくBリンパ球の細胞表面にも検出された.免疫機序による一部の再生不良性貧血症例では,リンパ球の活性化の指標としてhsp72がT細胞内に検出されることに加えて,B細胞の表面にもhsp72が検出されることから,hsp72は何らかの抗原提示にも関わっていることが示唆された.昨年度に引き続き,免疫抑制療法を受ける前の重傷再生不良性貧血患者の末梢血単核細胞について,熱処理後のheat shock protein(hsp)72の発現率を検討した.PE標識抗CD3モノクローナル抗体を用いた2カラー解析を行ったところ,熱処理後にhsp72が細胞内に誘導されるのは大部分がT細胞であった.再生不良性貧血全体の約40%の症例で,末梢血単核細胞中のhsp72陽性細胞の割合が高値(>30%)を示した.抗胸腺細胞グロブリン+シクロスポリン療法の効果との関係をみたところ,シクロスポリン療法でみられたような明らかな相関は認められなかった.一部の再生不良性貧血患者では,リンパ球の細胞内だけでなく,赤血球の表面にもhsp72が検出された.そこで,赤血球表面のhsp72について詳細に検討したところ,hsp72は,再生不良性貧血患者だけでなく,約30%の健常人で2090%の赤血球表面に発現していた.血液型との関係を調べたところ,hsp72はA型とAB型の赤血球にのみ検出された.赤血球表面のhsp72の発現は熱ストレスとは無関係であった.hsp72陽性の健常人の骨髄をin viroで培養し,赤血球前駆細胞を分化させたところ,得られた赤芽球の表面にはhsp72は検出されなかった.したがってhsp72は,A型およびAB型の赤芽球が脱核したのちに赤血球表面に発現すると思われた.赤血球表面にはhsp72だけでなく,hsp90の発現も認められた.A型物質との関係を調べるため,O型赤血球をNアセチルガラクトサミン(GalNAc)トランスフェラーゼとUDP-GalNAcで処理することによりA血球に変換したところ,抗hsp72抗体との反応はみられなかった.したがって,赤血球表面のhsp72はA型物質の発現と密接な関係にあるが,発現の有無は遺伝的に決定されていることが示唆された.
多様な環境中を長距離にわたって自律的にナビゲーションする移動ロボットの構成法

本研究では、市街地の環境を通行人に混じって走破する自律移動ロボットを目指し、移動ロボットが目的地まで信頼性高く到達するための枠組みとして、1.移動ロボットの構成法と基本機能の制御方式2.ロボットが自ら得た環境情報を統合して地図を作る方式3.センサ情報にリフレクシブに反応して安全を確保しつつ、全体としては計画された経路を走行する、反射行動と計画行動の融合方法について、アルゴリズムや方式の研究を行いつつ実証システムの開発を行った。本研究の大きな成果としては、移動ロボットの環境認識のための測域センサの開発とそれを用いたナビゲーションのロバスト化があげられる。本研究プロジェクトのメンバーが参加して新たに開発された測域センサどそれを用いた自己位置認識及び障害物の検出は本研究の大きな成果であり、実世界における移動ロボットの自律ナビゲーション技術に大きな進歩をもたらすものと考えている。開発した機能分散コントローラは、別途開発試作した教育研究用の移動ロボットプラットフォーム(名称:ビーゴ)の上で走行制御サブシステムとして評価を行った。さらに、研究期間終了後のH19の11月には本研究の成果の実証の場として、国内の数多くの移動ロボット研究者にも声をかけて参加を誘って、自律移動ロボットに実環境内を1kmにわたって自律走行させる「つくばチャレンジ」をつくば市の遊歩道で開催した。幸いにして、研究分担者坪内のティーム及び研究代表者油田が指導する大学院生大島章君の2台のロボットは、課題である1kmの自律走行を達成することができ、本研究の成果を実証することができた。本研究では、市街地の屋外環境を通行人に混じって走破する自律移動ロボットを目指して、移動ロボットが目的地まで信頼性高く到達するための枠組みとして、1.地図の与え方と自己位置の推定方式、ならびに、これに基づく動作計画法2.地図(環境モデル)を応用して時々刻々の環境の状況を確実に把握し、環境を認識する方法3.ロボットに持たせる環境モデル(地図)とロボットが行動中に自らのセンサで得た環境情報の融合方法4.センサ情報にリフレクシブに反応して安全を確保しつつ、全体としては計画された経路を走行する、反射行動と計画行動の融合方法5.その行動プログラムの記述法と構成法の研究・開発を目的としている。本年度は問題の定式化を行い、実証システムの設計のための、1.実証の対象とする環境の設定と基本的走行方法の検討2.実証システムの機構と機能分散コントローラの設計3.ロボットに持たせる地図について、環境およびランドマークの表現法の索定4.DGPSとランドマークを用いた自己位置推定方式の検討と基礎実験5.レーザーレンジセンサによる通行人と障害物の検出と回避方式の検討6.熱画像を用いた夜間の人間検出法の検討を行った。とくに、2.の実証システムの機能分数コントローラについては、IEEE1394バスをバックボーンとする分散型コントローラのアーキテクテャの設計を行った。また、例として走行制御サブシステムの回路の詳細設計を行い、具体的に回路を操作して評価を行った。この新しいアーキテクテャは広範囲の知能ロボット用コントローラとして、それ自体大きな可能性を有すると考えられる。本研究では目的地まで信頼性高く到達する、自律移動ロボットの枠組みとしての、1.地図の与え方と自己位置の推定方式、並びに、これに基づく動作計画法2.地図(環境モデル)を応用して時々刻々の環境の状況を確実に把握し、環境を認識する方法3.ロボットに持たせる環境モデル(地図)とロボットが行動中に自らのセンサで得た環境情報の融合方法4.センサ情報にリフレクティブに反応して安全を確保しつつ全体としては計画された経路を走行する、反射行動と計画行動の融合方法5.その行動プログラムの記述方法と構成法を開発している。本年度はとくに自律ロボットが、スキャニングレンジセンサを用いて環境の形状と自己位置の認識を行い安全に走行させる方法について研究を進めた。利用したスキャニングレンジセンサは、本研究者らのグループによって開発されつつあるもので、自律移動ロボットが多様な実環境内を信頼性高く走行するにはきわめて有効である。

また、この種のセンサを用いてロボットが自律的に環境地図を作成する方法、および、作成された地図を用いて経路計画を行いつつ目的地まで走行させる方式についても検討し、移動ロボットプラットフォーム上に実証システムの構築を行った。さらに、自律ロボットの分散コントローラのためのIEEE1394通信方式並びに、組み込み型コントローラとPCを用いたロボット制御システムの実装を行い、汎用の移動ロボットプラットフォームの高機能化を進めた。本研究では、市街地の環境を通行人に混じって走破する自律移動ロボットを目指しており、移動ロボットが目的地まで信頼性高く到達するための枠組みとして、1.移動ロボットの構成法と基本機能の制御方式2.ロボットが自ら得た環境情報を統合して地図を作る方式3.センサ情報にリフレクシブに反応して安全を確保しつつ、全体としては計画された経路を走行する、反射行動と計画行動の融合方法などの研究・開発を目的としている。本年度は、実証システムを設計・開発しつつ1.移動ロボットの機構と機能分散コントローラの設計と開発2.ロボットが環境を認識するために開発されたセンサの利用方式とランドマーク地図及び地形情報に基づく自己位置認識方式の検討と実験3.レンジセンサによる環境の認識と走行経路計画の実装4.車道の横断を含む歩道走行方式の検討と実験5.走行路に階段・段差を含む場合のナビゲーション方式の検討と実装を行った。本年度の大きな成果としては、移動ロボットの環境認識のための測域センサの開発とそれを用いたナビゲーションのロバスト化があげられる。本研究プロジェクトのメンバーが参加して新たに開発された測域センサとそれを用いた自己位置認識及び障害物の検出は本年度の大きな成果であり、実世界における移動ロボットの自律ナビゲーション技術に大きな進歩をもたらすものと考えている。また、開発している機能分散コントローラは、別途開発試作した教育研究用の移動ロボットプラットフォーム(名称:ビーゴ)の上で走行制御サブシステムとして評価を進めている。この走行制御サブシステムは車輪型移動ロボットの標準的な走行制御システムとして利用できるものであり、ソースコードの公開を予定している。本研究では、市街地の環境を通行人に混じって走破する自律移動ロボットを目指し、移動ロボットが目的地まで信頼性高く到達するための枠組みとしての、1.移動ロボットの構成法と基本機能の制御方式2.ロボットが自ら得た環境情報を統合して地図を作る方式3.センサ情報にリフレクシブに反応して安全を確保しつつ、全体としては計画された経路を走行する、反射行動と計画行動の融合方法の研究・開発を行った。本年度は、最終年度として実証システムを用いた実験を行い、1.移動ロボットの機構と機能分散コントローラの設計法2.ロボットが環境を認識するために開発されたセンサの利用方式とランドマーク地図及び地形情報に基づく自己位置認識方式3.レンジセンサによる環境の認識と走行経路計画
掻痒機序の解明と治療薬の開発

1.肥満細胞の脱顆粒によりケミカルメディエーターの遊離を惹起するDextranの投与により誘導されるマウスの掻動作回数を指標とした痒みモデルを、各種条件の検討により作製した。さらに本モデルを用いて、現在臨床応用されている抗アレルギー薬の痒み抑制効果を評価し、本モデルが抗痒み物質のin vivoアッセイ法として利用できることを示した。2.同様の手順により、Dextranよりも強力にケミカルメディエーターの遊離を惹起するCompound48/80を用いた抗痒み物質のアッセイ法を確立した。また、その他の起痒物質によるモデルを検討する過程で、マウスではヒスタミンやセロトニンの起痒作用は比較的弱いこと、近年炎症部位でのシグナル伝達物質として注目されている一酸化窒素(NO)が痒みの増強にも関与することを確認した。3.アトピー性皮膚炎などの病態での強く持続的な痒みモデルの確立を目的として、我々が先に開発したI型アレルギーのモデルマウスとノーマルマウスとの掻動作の違いを上記アッセイ法により検討した結果、本病態マウスでは血圧低下などのアナフィラキシ-様のショック症状が強く観察され、掻動作数の計数が困難となることが明らかとなり、病態モデルについてはさらに検討中である。しかし、本結果はアレルギー病態ではヒスタミンによる血圧低下がより重篤になる(感受性が増加する)という我々の先の報告を支持すると共にアレルギー病態での痒み機序解明に役立つと考える。4.上記アッセイ法を用いて、本研究室ですでに抗I型アレルギー作用を確認しているホウセンカ(Impatiens balsamina L.)の白色花弁の35%エタノールエキスの痒み抑制活性を明らかにした。また、その活性成分が数種のフラボノール及び1,4-ナフトキノン誘導体であることも明らかにし、天然物質から新規痒み抑制成分の検索を行った。
無溶媒酸触媒反応:巨大アニオンをもつケイ素ルイス酸による理想的グリーン触媒反応

多くの有機合成反応は有害性の高い塩素系溶媒や芳香族炭化水素溶媒を必要とする。これらの溶媒中で行われることが多いアルドール反応や共役付加反応をはじめとするルイス酸触媒反応に着目し、その無溶媒化を確立した。ルイス酸触媒反応は医農薬等の合成に工業的に多用されており、反応の無溶媒化による環境負荷低減効果は非常に大きい。また、無溶媒化は酸触媒反応にとって革新的な反応条件であり、新規な現象が発見される可能性が高い。しかし、液体有機化合物を基質とする無溶媒酸触媒反応はほとんど例がなかった。本研究では、巨大アニオン(弱配位性対アニオン)を有するケイ素ルイス酸塩を触媒として用いると、交差アルドール反応などの代表的なルイス酸触媒反応が無溶媒条件で円滑に進行することを見出した。さらに、反応の無溶媒化により触媒の効率が著しく向上することを明らかにした(solvent-free効果)。例えば、従来のルイス酸触媒では進行しないケトンとシリルエノールエーテルのアルドール反応は、無溶媒条件下で巨大アニオンを有するケイ素ルイス酸を触媒として用いると、ほぼ定量的な収率で進行することが分かった。無溶媒ルイス酸触媒反応を実現する上で、この結果はブレークスルーをなすものと考えている。本研究では、この革新的な触媒系をα,β-不飽和エステルやα,β-不飽和ニトリルに対する共役付加反応など合成的に重要なルイス酸触媒反応に拡張することで、理想的なグリーンプロセスである無溶媒酸触媒反応を確立した。アシル位に強力な電子吸引基であるペンタフルオロフェニル基をもつアミド基の分子内配位をともなう4配位シリルカチオン塩の合成に成功した。対アニオンとして、テトラキス(ペンタフルオロフェニル)ボレートのような巨大アニオンを有するケイ素塩である。X線結晶解析により、中心ケイ素原子がsp^2性を反映した平面配置をとるとともに、異常に長いSi-O結合をもつことを明らかにした。これらの構造的特長から、ケイ素上の正電荷は、弱いSi-O配位結合により効果的に安定化されていると考えられる。このペンタフルオロフェニル基をもつ4配位シリルカチオンは、従来のルイス酸触媒にくらべて、飛躍的に高い触媒活性を示すことが分かった。例えば、シリルエノールエーテルとケトンの交差アルドール反応において、従来のルイス酸触媒によっては、反応はほとんど進行しないが、今回開発したシリルカチオン塩を触媒として用いて反応を行ったところ、定量的に対応するアルドールを与えた。また、これらの反応は無溶媒条件において特に効率的に進行することが分かった。すなわち、溶媒を使用せずに、1mol%のシリルカチオン塩を触媒として、交差アルドール反応を行なったところ、反応は円滑に進み、ほぼ純粋なアルドールを得ることができた。他のルイス酸触媒、例えば、Me_3Sil、Me_3SiOTf、B(C_6F_5)_3、BiCl_3等を用いた場合、無溶媒条件下では、同様な交差アルドール反応は効率的に進行せず、基質の分解反応などが起こり、アルドール体の収率は低下した。この結果から、無溶媒条件における高いルイス酸触媒活性は、シリルカチオン塩のユニークな特徴であることが分かった。シリルカチオン塩が、無溶媒条件で高い触媒活性を示す理由として、対アニオンとして巨大アニオンをもつことが考えられる。電荷の分散した巨大アニオンは反応性がほとんどないため、無溶媒条件でも基質の分解反応を引き起こさず、ケイ素化学種は高いルイス酸触媒活性は維持できるものと考えられる。アシル位に強力な電子吸引基であるペンタフルオロフェニル基をもつアミド基が分子内配位した、4配位シリルカチオンの高収率合成に成功した。このシリルカチオンは対アニオンとして弱配位性アニオン(巨大アニオン)であるテトラキス(ペンタフルオロフェニル)ボレートをもつ。弱配位性アニオンは、配位性が極度に低いため、無溶媒条件下でも、対カチオン種とゆるやかなイオン対を形成すると考えられる。

このため、無溶媒条件下でもカルボニル化合物等の有機化合物を効果的に活性化する可能性がある。この仮定に基づき、種々のシリルエノールエーテルとカルボニル化合物のアルドール反応を無溶媒条件下で検討したところ、従来困難であったケトンとの交差アルドール反応が円滑に進行し、高収率で対応するアルドール付加体を与えることが分かった。同様に、無溶媒条件下で、触媒として同じシリルカチオンを用い、種々のシリルケテンアセタールとケトンを含むカルボニル化合物の交差アルドール反応を行ったところ、良好な収率でβ-ヒドロキシエステルを与えた。無溶媒条件下で進行する新規なシリルカチオン触媒反応として、シリルエノールエーテルとα、β-不飽和カルボニル化合物のマイケル反応を検討した。反応は室温条件で円滑に進行し、良好な収率でマイケル付加体を与えることが分かった。さらに、同様な反応条件下、α、β-不飽和ニトリルとシリルエノールエーテルの共役付加反応を検討したところ、無溶媒条件下で反応が進行することを認めた。これまで、α、β-不飽和ニトリルとシリルエノールエーテルが反応した例はなく新規な反応である。また、同様な無溶媒条件下、2-シロキシフランとケトンを含むカルボニル化合物との付加反応が進行した。これまで、ケトンと2-シロキシフランが反応した例はなく新反応である。以上、弱配位性アニオン(巨大アニオン)であるテトラキス(ペンタフルオロフェニル)ボレートをもつシリルカチオン触媒が、新規反応を含む無溶媒触媒反応に高い活性を示すことを明らかにした。アシル位に強力な電子吸引基であるペンタフルオロフェニル基をもつアミド基が分子内配位した、4配位シリルカチオンを触媒とする、種々の触媒的有機反応を検討した。無溶媒条件下で進行する新規なシリルカチオン触媒反応として、α,β-不飽和ニトリルとシリルエノールエーテルまたはケテンシリルアセタールとのマイケル反応を開発した。カルボニル化合物とα,β-不飽和ニトリルのマイケル反応は、有機合成的に有用なδ-ケトニトリルの直接的合成法として重要な反応であるが、従来の反応条件では反応選択性が乏しいため、これまで利用されてこなかった。われわれは、触媒としてシリルカチオン触媒を用い、カルボニル化合物の等価体としてケイ素エノラートを用いることにより、この反応における高い選択性を実現した。このマイケル反応は、5mol%のシリルカチオン触媒の存在下、無溶媒条件で円滑に進行し、対応する付加体を良好な収率で与えた。シリルカチオン触媒を用いる、カルボニル化合物とケイ素エノラートの交差アルドール反応において、高い官能基選択性を認めた。すなわち、基質としてケトン基とホルミル基の二種類のカルボニル基を有するアセチルベンズアルデヒド等を用いたところ、交差アルドール反応はホルミル基とのみ反応し、良好な収率でケトンカルボニル基を有するアルドール化合物を与えた。さらにカルボニル基と水酸基が共存する基質においても水酸基を保護する必要なく、ケイ素エノラートとカルボニル基の交差アルドール反応が円滑に進行することが分かった。通常の金属ルイス酸触媒の場合、水酸基とルイス酸が反応してしまうため水酸基を保護する必要がある。これらの結果は、シリルカチオン触媒が従来のルイス酸触媒に比べて温和かつ効果的な触媒活性を有し、高い選択性を示すことを明らかにしている。
アクネ菌を用いたサルコイドーシスぶどう膜炎モデルの樹立と解析

サルコイドーシスは眼、肺、皮膚などに肉芽腫を形成する、原因不明の炎症性疾患である。近年、皮膚常在菌であるアクネ菌がサルコイドーシスの肉芽腫の内部に存在する事が分かり、アクネ菌に対する免疫反応がサルコイドーシスの原因と考えられている。本研究は、マウスの尾静脈からアクネ菌生菌を注射する事でアクネ菌感染マウスを作成し、続いてアクネ菌に対する細胞性免疫反応を誘導する事でアクネ菌を中心とした肉芽腫を形成する眼サルコイドーシス実験モデルの作成を試みた。その結果、多くの実験マウスの肺と肝臓に肉芽腫が形成され、その中にアクネ菌に対する抗体で染まる部位が確認されたが、眼内には肉芽腫性炎症は観察されなかった。今年度は、1.アクネ菌感染マウスの作成、2.強化免疫によるアクネ菌感染マウスへの肉芽腫性ぶどう膜炎の誘導の二つの実験を並行して行った。1.アクネ菌感染マウスの作成:眼組織を含む全身諸臓器にアクネ菌の感染状態を成立させる事を目的に、以下の実験を行った。実験動物には6から8週齢のC57BL/6マウスまたはBalb/cマウスを用いた。アクネ菌に同定されている2種類の血清型のうち、7割を占めかつ細胞内に侵入出来る事が分かっているserotype Iのアクネ菌を実験に用いた。尾静脈からの静脈注射から1週間経過したマウスを屠殺した後に眼球、脾臓、肺、肝臓を摘出し、これらを直ちに10%ホルマリン緩衝液にて固定し、アクネ菌特異的抗体(抗リポテイコ酸抗体)を用いた免疫組織化学染色を行い、全身諸臓器におけるアクネ菌の局在を確認した。これらのうち、脾臓、肺、肝臓にはリポテイコ酸が陽性となり、アクネ菌の感染が確認された。しかし、眼内においてアクネ菌の感染が確認された例はごく少数であり、安定して眼内に感染を成立させる実験系は確立されなかった。2.強化免疫によるアクネ菌感染マウスへの肉芽腫性ぶどう膜炎の誘導:アクネ菌感染マウスにアクネ菌特異的な細胞性免疫応答を惹起させ、多臓器の肉芽腫性病変を伴う肉芽腫性ぶどう膜炎を誘導する事を目的に、以下の実験を行った。アクネ菌死菌をのリン酸緩衝生理食塩水(PBS)に希釈し、結核死菌を含む完全フロインドアジュバントと1:1に混合し、超音波破砕装置を用いてエマルジョンを作成した。これをアクネ菌感染マウスまたはコントロールマウスの背部に、1匹につき200μlを皮下注射した。これを2週間間隔で、計3回施行した。その結果、アクネ菌感染マウスの脾臓、肺、肝臓において肉芽腫病変が形成されたが、眼内炎症は惹起されなかった。サルコイドーシスは非乾酪壊死性肉芽腫が、眼や肺などの全身の様々な臓器に生じる疾患である。サルコイドーシス患者の肉芽腫内からは皮膚常在菌であるアクネ菌が高率に検出され、サルコイドーシスの原因として強く示唆されている。本研究は、アクネ菌感染マウスをの作製、それを用いた眼サルコイドーシスの実験モデルの作製、その病態を解析する事を目的として施行した。アクネ菌感染マウスの作成には、6から8週齢のBalb/cマウス、C57Bl6マウスを用いた。感染成立を目的としてサルコイドーシス患者組織から分離されるアクネ菌の7割を占め、細胞内に侵入できるアクネ菌生菌serotype Iをマウスの尾静脈から静脈注射した。また、免疫グロブリン標識したアクネ菌、細胞壁欠失型アクネ菌も同様に用いた。注射後さまざまな時期に屠殺した後に眼球、脾臓、肺、肝臓などを摘出し、アクネ菌特異的抗体(抗リポテイコ酸抗体)を用いた免疫組織化学染色を行った。その結果、脾臓、肺、肝臓にはリポテイコ酸が陽性となり、アクネ菌の存在が確認されたが、眼内においてアクネ菌の感染が確認された例はごく少数であった。これらのアクネ菌感染マウスにアクネ菌特異的な細胞性免疫応答を惹起するために、アクネ菌死菌希釈液と結核死菌を含む完全フロインドアジュバントを1:1に混合し、超音波破砕装置を用いて乳濁液を作成し、アクネ菌感染マウスの背部に皮下注射した。その結果、アクネ菌感染マウスの脾臓、肺、肝臓において肉芽腫病変の形成が確認された。

一方、明らかな網脈絡膜炎症は惹起されなかった。眼内にアクネ菌を中心とする肉芽腫病変が形成されない原因として、アクネ菌が免疫応答によって拒絶、排除されている可能性を考え、現在アクネ菌に対する経口免疫寛容を誘導し、それを用いたアクネ菌感染実験を行っている。眼科学本研究は、生体内に持続感染状態のアクネ菌に対する免疫応答を惹起する事で、肉芽腫形成性の炎症像を眼内に生じる事を目的としている。これまで、肺などの眼外臓器においては上記の機序による肉芽腫性炎症を惹起できる事が報告されており、我々の用いた実験系でも再現可能であった。しかし、眼内においてはアクネ菌の持続感染を生じる事が未だ困難な状態であり、そのためアクネ菌を用いた強化免疫によっても眼内炎症を惹起するに至っていない。アクネ菌の眼内感染を成立させるために、以下の実験を行う。1.複数の動物種を用いる感染実験:現在主に実験に用いているのは無色素マウスであるBalb/cマウスである。これは、有色素マウスではアクネ菌に対する抗体の染色を免疫組織学的に確認する事が困難なためである。しかし、アクネ菌に対する組織親和性は動物種によって異なる可能性があるため、有色のC57BL/6マウス、ラットの各系統などを用いて感染実験を行う。2.免疫寛容を誘導した動物に対する感染実験:アクネ菌は弱毒性の常在細菌であり、軽度の免疫反応によって拒絶、排除されるために感染が成立しない可能性がある。これに対して、アクネ菌に対する免疫寛容を誘導し、その後に感染成立を試みる。免疫寛容の誘導法として、腸管免疫の誘導、前房関連免疫変移の誘導などを行う。本研究は、生体内に持続感染状態のアクネ菌に対する免疫応答を惹起する事で、肉芽腫形成性の炎症像を眼内に生じる事を目的としている。しかし、眼内においてはアクネ菌の持続感染を生じる事が未だ困難な状態であり、そのためアクネ菌を用いた強化免疫によっても眼内炎症を惹起するに至らなかった。そのため、予定していた養子移入実験および眼内炎症像の解析まで研究が進まず、一部を次年度使用とした。アクネ菌の眼内感染を成立させるために、アクネ菌に親和性を持つ可能性のある他の動物種(有色のC57BL/6マウス、ラットの各系統など)を用いて感染実験を行う。また、アクネ菌に対する免疫寛容を誘導し、その後に感染成立を試みる。これらの追加実験のために、次年度使用額を用いる予定である。