hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
文字・映像・音声データベースを利用した語学教育研究システム

4年度に引きつづき、文字・映像・音声・データの収集及び大量のデータから必要な語句を検索するプログラムの制作を行った。新聞紙、週刊誌については、英米でCD-ROMを利用した全文データベースの発売が相次ぎ、それらを購入した。また4年度より使用を継続している光学式読み取装置ではもっぱら小説の文字字データ収集を行った。最終的に収集された文字データは優に1億語を越えた。これは偏りはあるものの、全文データベースとしては有意な結果を出せるものである。そこで本年度後半からはその膨大なデータを検索するソフトの制作を開始した。ワープロソフトの検索機能、データベースソフトの検索機能、さらに入力方法などを検討した結果、市販のVZエディタを使って検索ソフトを制作する方向が決まった。音声・映像データに関しては、文字情報を記録したレーザーディスクの発売が遅れていること、文字(台詞)の正確さの確認に時間がかかり、データは少量に留まっている。(映画20本分ほど)データの収集、検索ソフトの開発状況は以上のようであるが、この2年間で、パーソナル・コンピュータを使ったデータベース・システムの構築が可能であることが立証されたと考える。今後はデータの充実、検索利用システムの実用化を目指し、さらに教育利用の可能性を探っていきたい。文字・音声・映像を統合したデータベース構築の初年度である本年度は、まずコンピュータを中心としたシステムの構築から始めた。夏休み前になってようやく文字データ入力に関するハードウェアとソフトウェアが揃い、7月後半から光学式読み取り装置を利用したデータ入力が開始された。もっとも文字入力の手順の決定にはかなりの時間を要した。スキャニングの方法、最適パラメータの発見、読み取り精度の比較、スペリングチェック・ソフトウェアの比較など数多くの微調整点があったためである。本補助費を謝金とする実際の入力作業は学生アルバイトの帰学を待って、9月から始まった。現在までに『タイム』誌、『ニューズウィーク』誌各10冊ずつ、小説5冊など、約7MBほどのデータ量になっている。文字データについては、取り敢えず両誌1年分、小説50冊を目標としており、来年度中に達成することを目標にしている。音声・映像データに関しては、主に「英語字幕(クローズド・キャプション)入りレーザーディスク」を利用し、会話英語のデータ収集を試みた。レーザーディスクの購入、セリスの文字データ化に本補助金を使用している。現在までにレーザーディスク15枚分ほどの入力を終っているが、コンピュータの能力、レーザーディスクの収集枚数などの制約のために、明らかな結果の出るデータベースには至っていない。来年度はこの両面に力を入れ、会話英語の音声、映像を含めたデータベースを作り上げたいと考えている。なお、少量ながら本データベースの研究への応用も始まっており、詳細については本補助金を別途受け、本研究の分担者でもある電気通信大学講師坪井栄治郎氏の研究実績報告書を参照されたい。上記課題の下に行う本年度の作業は、「データ入力」と「データ検索プログラム作成」の2つで、交付された補助金は全額謝金に使用することになっていた。しかしながら、過去1年間のコンピュータ技術の進歩拡大により、多少の変更が必要となった。データ入力のうち文字データについては、当初光学式読み取り装置を使って作業をする予定で、謝金はその作業に対して支払われるはずであったが、英米で新聞や雑誌の記事を全文データにする速度は予想をはるかに上回り、大量のデータがCD-ROMの形で販売されたため新聞雑誌については光学式読み取り装置による入力を止め、文字データ入力作業謝金に充てる予定だった金額でそうしたCD-ROMを購入した。科学研究費補助金以外で購入したものも含めて、現在TIME誌4年分(1989年から1992年まで)、Newsweek誌1年分(1992年)、The Times誌4年分(1989年から1992年まで)など、およそ1GBを越えるデータが集まっている。データ入力のうち、会話データの文字化はアメリカ合衆国で売られている英語字幕信号入りレーザーディスクと、日本で発売され始めた英語字幕信号入りレーザーディスクの両方を使って収集した。どちらもレーザーディスクの購入に時間がかかり、現在レーザーディスク3枚(5時間分)の会話データしか集められていない。このデータ入力について、本補助金を謝金として利用した。データ検索プログラム

作成作業は現在IBM PC互換機上での簡単な検索ができるようになっている。このプログラムの作成に本補助金を謝金として支出した。現材ある検索プログラムでは、まだキーワードの数が限られているので、正規表現を用いてさらに複雑な検索を行えるようにすることを目指して、現在もプログラム作成作業中である。また、そうした複雑な検索をコンピュータに詳しくない英語の先生でも容易に行えるようにするために適切なインターフェイスも考案中である。また、マッキントッシュ上でも大量のデータから検索できるようにするためにさまざまな工夫をしているが、今までのところ成功していない。大量のデータをできるだけ加工せずに、生のデータのまま検索できることが全文データベースの大きな魅力であるため、何とか小さく分けずに(構造化せずに)直接検索できないものかと思案しているところである。
中枢神経髄鞘形成不全症の遺伝子治療に関する基礎研究

先天性の中枢神経の髄鞘形成不全症は精神運動発達遅滞や脳性麻痺の主な要因であるが、乳児期早期より精神運動発達遅滞、眼振をきたすPelizaeus-Merzbacher病(以下、PMD)は最近の画像診断により早期診断が可能となった疾患であり、X染色体連鎖を示す遺伝性疾患である。PMDは乏突起膠細胞の髄鞘形成の不全が原因であると考えられており、proteolipid protein(以下、PLP)遺伝子が深く関係していることが報告されている。PLP遺伝子は中枢神経のみに発現しているために、これまで細胞レベルでの病態研究が困難であり、治療法も確立していない。そこでこれらの遺伝子の異常と中枢神経の髄鞘形成不全との関係を明らかにし、治療法の開発を行っていくために、髄鞘形成不全症のモデル細胞として、異常を示したDNAを導入した中枢神経由来の乏突起膠細胞の培養系を作成し、その病態を解析することにより、遺伝子治療に向けた基礎研究を行うことを目的とした。本年はまず臨床的にPMDと診断された症例の末梢血から抽出したDNAから、PLP遺伝子をPCR法により増幅し、ベクターに組み込み塩基配列自動解析装置によりPLP遺伝子の解析を行い、1家系において異常を認めた。この異常は1塩基対の置換であり、これまでに報告のないものであった。今後はこの遺伝子を導入した中枢神経由来の乏突起膠細胞の培養系を作成し、その病態解析を行い、遺伝子治療に向けた基礎研究を行う予定である。
蛍光エネルギー移動測定による分子モーターミオシンのエネルギー変換機構の研究

本プロジェクトはモータータンパク質であるミオシンが、ATPを加水分解してその化学エネルギーをアクチンと相互作用してどのように力学エネルギーに変換するかを明らかにする為、蛍光エネルギー移動測定によってミオシン上の特異的な2つの部位間の距離を測定し、それがミオシンの生理機能に対応してどのように距離を変化させるかを調べることによって、構造的な情報を得ることである。ミオシンS1の50KDaのlower domainにあり、又アクチン結合部位近くであるLys-533に蛍光エネルギー移動のエネルギー受容体となるFluorescein系の色素、6-[fluorescein-5(and6)-carboxamido]-hexanoic acid succinimidl ester(FHS)をつけ、一方その蛍光エネルギー供与体となるIAEDANSをSH1(Cysteine-707)に結合させたミオシンS1を調製した。蛍光エネルギー移動測定により、この距離を測定すると52-53Åであった。この距離はATPを加えても、又アクチンを加えても大きな変化は見られなかった。更にミオシンのATPaseサイクルの中間状態を保つことが報告されているATPアナログである、AMPPNP,Mg・ADP-aluminiumfluorideを加えたが大きな距離変化は見られなかった。これは、ミオシンの構造変化は尾部領域では数十オングストロームの大きな構造変化があるが、頭部先端領域では大きな変化がみられないという結晶構造解析の結果とよく一致している。今後はアクチンとミオシンとの相互作用を、それらの多くの部位間の距離測定から多面的に調べて、ミオシンモーターのアクチン上での動きを明らかにしていきたい。
光相関イメージング法を用いた2次元エリプソメトリの開発

本研究の目的は,近年物理学分野で新たに提唱された光相関イメージング法と高精度エリプソメトリーと組み合わせることで,2次元エリプソメトリーを開発することである.エリプソメーターは,測定原理に高速偏光変調された測定光を用いるためCCDなどの2次元センサを利用することができず膜厚の分布を一度に計測することはできなかった.そこで,光相関イメージング法という手法を用いた点型光検出器を用いたイメージング法に着目した.これは,点計測手法による像再現法であるため既存の2次元イメージングに取って代わる手法として有効である.本課題では,測定原理を新たに構築し原理検証を行った.平成27年度は,光相関イメージング法と偏光計測法に分けて研究に取り組んだ.光相関イメージング法では,蛍光強度分布を取得するための光相関イメージング装置の基本システムを構築し,さらに,光相関イメージング法の微弱光特性を取得した.光相関イメージング法の光学系は,ランダムな強度分布を照明するためのDMDプロジェクター,被撮影物体および点型光検出器であるピンフォトダイオードで構成した.また,蛍光観察を行うために,蛍光フィルタを光学系に導入した蛍光顕微鏡光学系を導入した.ここで用いたプロジェクターは一般的な投影速度である30Hzのプロジェクタを利用した.また,顕微鏡の倍率は,5倍から50倍まで対応可能な光学系としている.プロジェクタから照明された光により発せられた蛍光は,ピンフォトダイオードによる光強度検出を経たのちに,AD変換機によりデジタルデータとして取得した.最終的な蛍光像を得るために必要な相関演算はPC内で計算を行った一方,偏光計測法としては,量子光学効果を利用した計測を行ってきた.近年,光スピンホール効果という原子一層の検出が可能な原理が提唱されている.本研究では,まずは,光スピンホール効果の基礎実験を行うことで,その計測への有効性を確認した.光学系は,一般的なエリプソメーターの光学系に弱測定光学系を導入するという簡易な光学系である.サンプルとしてガラス基板を用いたところ光スピンホール効果による100nm程度の光線のシフトを確認することができた.この計測方法は点計測であることから,光相関イメージング法を組合わせることを考えている.計画当初は,一般的な偏光計測をベースとして光相関法を用いることで二次元展開を図る予定であった.しかし,一般的な偏光計測法よりも光スピンホール効果を利用した偏光計測の研究の緊急性が高まったため,急遽計画を変更した.当初は,光スピンホール効果を検出できるかという点に不安があったが,取り組んだところ正確に検出することができた.今後,世界的に類の見ない偏光計測法を確立することができることから,予想以上の成果とも言える.一方で,二次元イメージングするための光相関光学系の作製も行った.また,微弱光特性を明らかにすることで,一般的な撮影法に対して良好な耐ノイズ性能を確認することができた.付加的ではあるが,一分子イメージング等への応用展開も図ることができる.以上のことから,当初の予定とはことなるものの,当初の予定よりも波及効果が大きな研究へと発展しているという自己評価である.平成28年度は,光相関イメージング法を基礎とした蛍光顕微鏡と研究の遂行過程で新たに派生した光スピンホール効果エリプソメータの基礎的検証に取り組んだ.光相関イメージング法は,超微弱光の測定を可能にすべく光子数計測を行うことのできる顕微鏡とした.当初は,エリプソメトリを導入する予定であったが,本課題を遂行していく上で超微弱光に対応することが急務であり,また,本来のエリプソメトリは新たな計測原理を考案したため,まずは,蛍光顕微鏡を開発した.具体的には,フォトンカウンティング装置を用いて蛍光が発する確率を時間で置き換えることにより,わずか数フォトンでイメージングができる手法を構築した.本手法は,従来の報告例に比べて格段に感度が向上した手法である.本年度は,測定原理の確認として蛍光マイクロビーズをサンプルとして用いて,ビーズが移動する様子を捉えることに成功した.一方,エリプソメータにも量子光学的な要素を導入した.具体的には,光スピンホール効果を測定原理として用いた.光スピンホール効果は,サンプルの表面で反射した光が,測定したいサンプルの屈折率に依存して数nmから数100nmシフトする現象である.このシフト量を測定することで屈折率やエリプソパラメータを測定することができるが,ここでは,測定原理の構築と実験的検証に成功した.具体的には,測定サンプルに対して直線偏光を照明し,サンプル表面で反射した後に70nmほどシフトした情報を得た.また,そのシフト量から,構築した原理から屈折率を求めて10%以内で良い一致を示すことができた.このように,量子光学を具体的に利用可能な測定法に落とし込む研究は,世界的に稀であり,また,精度も向上することから今後の展開に期待が持てる成果である.本研究の目的は,近年物理学分野で新たに提唱された光相関イメージング法と高精度エリプソメトリーと組み合わせることで,2次元エリプソメトリーを開発することである.エリプソメーターは,測定原理に高速偏光変調された測定光を用いるためCCDなどの2次元センサを利用することができず膜厚の分布を一度に計測することはできなかった.そこで,光相関イメージング法という手法を用いた点型光検出器を用いたイメージング法に着目した.これは,点計測手法による像再現法であるため既存の2次元イメージングに取って代わる手法として有効である.本課題では,測定原理を新たに構築し原理検証を行った.

平成28年度は,主に二つの点に焦点を絞って研究を進めていく.一つ目は,当初の計画のとおり,二次元偏光計測システムの構築と測定装置としての最適化である.光スピンホール効果を利用した偏光計測法を新たに確立したので,別途構築しておいた光相関イメージング法を偏光計測光学系に導入する.ここでは,偏光計測法の光源と検出器を偏光するだけなので容易に実現できると考えられる.導入後は,基本的な動作特性や精度検定を行ったのちに高速化への最適化を図る.高速化では,照明する光パータンをアダマール行列に準じたパターンを照明することで照明回数を減らすことを考えている.しかしながら,アダマール行列に基づいたパターンは,空間解像度が限定されるため,市場で必要とされる空間分解能を考慮しながら最適化を図る予定である.二つ目は,本システムの新たな分野への展開である.ここでは,蛍光顕微鏡への応用と精密距離計測への応用を模索する予定である.蛍光顕微鏡では,一分子イメージングなどの微弱光イメージングが必要とされている.そこで,光相関イメージング法を蛍光観察に適用することでその優位性を利用することができる.また,本システムでは,光スピンホール効果を利用していることから,その効果が発生した時に生じる光のシフト量は100nm以下である.また,そのシフト量は,定量的に明確であることから距離計測に応用できると考えている.精密計測当初の計画のうち,偏光計測法に関する内容を偏光した.当初は,点型検出器を新たに購入し用いる予定であったが,基本原理確認のため二次元検出器を用いた.この二次元検出器は現有装置を利用したため費用に差が生じた.平成28年度では,基本原理が確立したことによる装置の最適化を図る.ここでは,高速化のために,可視光に対応した位置依存型点型検出器(PSD)を新たに導入する予定である.
リポキシトーシスの実行を制御するユビキチンリガーゼの同定とその機能解析

酸化リン脂質還元酵素GPx4を細胞やマウスで欠損するとカスパーゼ非依存性で脂質酸化依存的な新規細胞死経路を辿って致死となることを見出しており、新規細胞死実行遺伝子群として6遺伝子見出している。見出した6遺伝子のうちユビキチン関連因子が2遺伝子あったため、ユビキチンリガーゼ複合体の構成因子の解析を行うことにした。脂質酸化依存的新規細胞死経路で機能するユビキチン化による細胞死の実行メカニズムを明らかにすることを目的に、GPx4欠損による脂質酸化依存的新規細胞死経路で機能する新規のユビキチンリガーゼ複合体及び基質の同定と機能解析を行う。
3D映像による近見反応測定の確立と視空間認知障害へのリハビリテーションへの応用

1)外斜視・内斜視患者に対して3D映像を視覚刺激として近見反応を誘発して、輻湊眼球運動と瞳孔縮瞳の2つの因子を記録した。その後これらの患者に対して斜視手術を施行し眼位矯正を行った後、同様に近見反応を記録した。斜視前後での動的な近見反応の改善および斜視手術効果を比較検討した。2)脳損傷疾患である動静脈奇形若年患者に対して同様に3D映像を用いて近見反応が誘発されるか検討した。斜視手術後にも近見反応を記録し比較検討した。本研究は2つの目標を持つ。第1として「3D立体映像(以下3D)刺激による近見反応を誘発させた際の瞳孔の位置から解析された視線の位置(輻輳眼球運動)を測定し、また輻湊反射の記録装置の確立」である。次に、本装置を用いて対象を2つに絞って1健常者、2間欠性外斜視の測定および治療として斜視手術(外直筋後転術)を行い、手術前後での近見反応の変化を解析し斜視手術の効果、間欠性外斜視の両眼視機能を検討することである。【開発すべき近見反応測定装置の設定開発について】3D映像対応のPC画面(50cm前方に設置)に液晶シャッター式3Dモニターにて2種類の動的3D映像連続刺激とステップ刺激を提示可能とした。3D刺激の提示方法としては、連続運動3D刺激映像(連続刺激);振り子運動するテニスボール映像は、“大きさ"と“両眼視差"刺激を用いる。視差は最も近方時で4.45°、最も遠方時で視差2.27°。step 3D刺激映像(step刺激):視差0°、視差0.56°、視差2.27°の3段階を10秒毎に近づく直径0.33°(3mm)の円と直径1. 11°(10mm)の輪からなる標的の映像刺激の作成を行った。一方、これら視覚刺激と同期させて測定可能とした立体視度計測システムET-3D10(ニューオプト社製)を用いて輻湊眼球運動の記録を行った(以下、記載)。【健常者被験者と間欠性外斜視に対する近見反応測定および斜視手術(外直筋後転術)手術前後での近見反応の変化の解析】対象は、1)健康若年者を正常被験者、2)間歇性外斜視・外斜視患者を対象とした。被験者が立体映像として認識して、近見反応が誘発されるか否か、また刺激としては適切であるかどうかを解析検討し、さらに装置の精度などを確認した。また斜視手術前・後に検査することで、神経学的な所見を眼球運動といった実際の他覚的な指標を用いて治療効果を確認できた。1)基礎実験として健常者5名を対象とし3D映像刺激を呈示した際の動的な近見反応を解析した。輻湊(視線の位置)は、若年者・高齢者ともに画像の呈示距離に応じた正常運動を示す。一方、瞳孔縮瞳は、若年者は縮瞳せず、高齢者は近見視に伴う縮瞳が解析により起こることが分かった。この結果は、若年者は焦点調節機能により高齢者は縮瞳による被写界深度を深くすることで画面に焦点を合わせるていると考えられた。2)間歇性外斜視あるいは外斜視患者9名に対して、手術前後に近見反応測定装置を用いて輻湊と瞳孔縮瞳の記録を行った。本装置は、ステップ刺激を与えることができ、かつramp状の刺激が可能で日常的な近見反応に近い状態を捉えることが出来た。3)脳損傷患者(右頭頂葉出血)輻湊不全型外斜視若年者(22歳男性)。第一眼位は右外斜視。動的視野検査で左下1/4半盲を認めた。輻湊不全と調節反応の減弱を認めた。交代プリズムカバーテストにて遠見眼位45Δ外斜視3Δ右上斜視、近見眼位60Δ外斜視3Δ右上斜視であった。右外直筋後転術8mmを施行。術前の主訴である複視は消失した。斜視の術後2年後、平成25年6月、交代プリズムカバーテストによる眼位検査では、遠見眼位4Δ外斜位、近見10Δ外斜位であり、近見立体視は、TNO stereo testで240secまで可能となった。輻湊が可能となり眼位は正位を保つようになった。しかし3D映像記録装置での解析では、輻湊には改善がみられたが正常な輻湊ではないことを検証した。頭頂後頭葉領域は近見反応にとり重要な領域であり、外斜視発症の重要な原因領域と考えられる。4)これらの結果は、国際斜視学会in Kyoto 2015にて報告した。活発な質疑応答が行われた。論文発表にて近見反応の重要性を啓発した。原著論文「右頭頂後頭葉出血により輻湊不全型外斜視を発症した1例(神経眼眼)」、「脳梁欠損症に似た高度水頭症症例の両眼視機能(眼科臨床紀要)」を報告した。また視覚機能からみたICT環境ー映像の生体への影響と上手に付き合う方法ー(小児科)、視覚機能と学習効果&#8211;視覚機能向上により運動パフォーマンスは向上するのか?(臨床スポーツ医学)、

片頭痛の眼科臨床と視機能異常(日本の眼科)など近見反応の大脳高次機能と関係を総説などで報告した。新規計画として、新しい瞳孔とLEDとの関係を診るために、「VDT作業に使用する遮光レンズのコントラスト視力装置CAT2000を用いた視機能評価-遮光レンズ眼鏡の自覚的、他覚的選択方法の見直し(あたらしい眼科)」を報告した。近見反応を用いたさらなる測定方法の確立を目指して、全身自律神経症状との関係をみるために「血圧・心拍変動解析」ソフトを購入した。1)外斜視・内斜視患者に対して3D映像を視覚刺激として近見反応を誘発して、輻湊眼球運動と瞳孔縮瞳の2つの因子を記録した。その後これらの患者に対して斜視手術を施行し眼位矯正を行った後、同様に近見反応を記録した。斜視前後での動的な近見反応の改善および斜視手術効果を比較検討した。2)脳損傷疾患である動静脈奇形若年患者に対して同様に3D映像を用いて近見反応が誘発されるか検討した。斜視手術後にも近見反応を記録し比較検討した。1)正常者に対して、3D映像により実際に映像呈示部分の視線制御すなわち輻湊眼球運動を記録することができた。また映像提示部分に輻湊に伴って瞳孔縮瞳反応を確認できた。老年者では、瞳孔が小さいもののさらなる縮瞳が起きていること、一方、若年者は縮瞳はせずに焦点調節により縮瞳することが分かった。以上、本装置により3D映像視聴時には近見反応が起きかつ緻密な視線制御が起きていることが検証できた。2)間歇性外斜視の輻湊と縮瞳間歇性外斜視の斜位近視群は近見反応の調節・縮瞳が過剰となっていたが、手術により可逆的であったこと、非斜位近視群は術前に過剰な調節反応はみられなかった。これらは、強い融像性輻湊と縮瞳が持続する適応的変化であり、また独自の神経経路により調節を補償することが判った。間歇性外斜視による近見反応は、疲労の原因であると啓発中として極めて困難と思われます。一方で、NHK放送番組:ためしてガッテン「ヤバイ!疲れ目頭痛肩こりまとめて劇的改善DX」(2014.6.4放送にてさらに啓発することができた。神経眼科現在までのデータを解析して、新しい知見を検討を行っていき、これを学術論文にする。また本装置・実験系は、近見視した状態すなわち近見反応した状体で瞳孔計測が可能であることから、デジタル画面による画面からの光刺激による輻湊と瞳孔縮瞳の役割や影響など現在のデジタルライフでの"視機能への影響"を研究する方策である。視覚刺激としてルーチン化したソフトの開発ができた。またその装置を用いて間歇性外斜視患者に対する輻湊眼球運動を記録ができた。そこから眼球運動の解析が可能であったことが再確認できた。また斜視手術後にも同様に記録しその解析から、手術により極めて眼球運動が改善することが認識できた。学術論文作成特に英文作成が遅れているため。また人件費が使われていないため。1)3D立体映像を視覚刺激として"動的な近見反応"の記録を正常被験者(年齢別)に記録する。対象となる正常被験者のデータを積極的に集める。若年者と高齢者の2群に分けて加齢に伴う近見反応の変化・年齢的な相違を比較する。その結果をもとに、高齢者の近見反応と若年者との近見反応の相違を明らかにすることで、高齢者の奥行き感に関する病態生理を明らかにする。加齢に伴う輻輳眼球運動の変化、瞳孔縮瞳率の正常値を構築する。2)3D立体映像の視聴の際には疲労が出現するが、遮光レンズ(眼鏡)の装用により近見反応の差異を評価する。3)近見反応測定装置の精度や使い勝手などを高めたい。1)学術論文の作成、特に英語論文翻訳代として使用する計画である。英文抄録および本文の日本語から英文に翻訳する場合、高額な費用がかかると思われる。2)報告会・学会に参加、旅費として使用する予定である。3)研究分担者との最終的な研究報告会を開催する(会場費と旅費に使用する予定)。
梨状葉皮質における抑制性ニューロンの軸索分布パターン

モルモットの梨状葉皮質第III層の多極性細胞と錘体細胞を免疫組織化学的染色とbiocytin細胞内染色法で解析した。多極性細胞はγ-aminobutyric acid,calbindin,およびparvalbuminnに対する免疫組織化学反応陽性であるために抑制性神経細胞であると考えられた。細胞内染色法によって、単一多極性細胞の細胞体の直径は約19x17γmであり、一部の樹状突起は嗅球からの入力線維が入る梨状葉皮質第Ia層に達していた。軸索は、細胞体から112μm走る間に4本の主な枝を分岐し、軸索の全長約90mmに達した。単一多極性神経細胞の軸索および測枝が持つ神経終末(ボタン)の総数は約7000個であり、その殆どは通過ボタンであった。この神経終末(ボタン)のうち、梨状葉皮質第III層に分布する神経終末(ボタン)数はボタン総数の65%を占める約5000個であった。なお、梨状葉皮質第I、II層には軸索は分布せず、神経終末もなかった。また、扁桃体の諸核には19%、約1300個、島皮質には10%、約700個、dorsal endopiriform nucleusには5%、約350個、ventral pallidumには1%、約80個が分布した。したがって、多極性細胞は、梨状葉皮質の第III層において、第II、III層の錘体細胞の基底樹状突起に抑制性出力をフィードバックすると考えられた。錘体細胞はglutamateに対する免疫組織化学反応が陽性であり、尖端樹状突起にN-methyl-D-aspartate受容体を持つ。単一錘体細胞の軸索は全長約140mmであり、約14000個の神経終末(ボタン)を有した。軸索側枝は梨状葉皮質内で約7000個の神経終末を形成し、錘体細胞と多極性細胞に興奮性出力をフィードバックすると考えられた。また、側枝は扁桃体、嗅内野、および島皮質などにも到達した。これらの神経回路は、梨状葉皮質におけるてんかん波の生起、およびその扁桃体、海馬、島皮質への伝搬を単一細胞レベルで説明するものである。モルモットの梨状葉皮質の第2a層の半月様細胞、第2b層の錐体細胞、第3層浅部の錐体細胞、第3層深部の多極性細胞の形態をゴルジ染色法で確認し、化学伝達物質の種類を免疫組織化学法で検索した。さらに、嗅球に刺激電極を設置し、約20個の第3層の神経細胞内に軸索トレーサーを注入・染色し、次の結果を得た。1)第3層深部の多極性細胞:この細胞は、glutamateの免疫組織化学反応は陰性であり、GABAの免疫陽性、GABA陽性細胞を亜区分するCalbindineとParvalbuminに対する免疫陽性であるために、抑制性神経細胞である。この樹状突起は嗅球の軸索投射を受ける第1a層に達しており、軸索は嗅皮質第3層およびendopiriform nucleus多数のシナプスボタンを形成することを証明した。

2)第3層浅部の錐体神経細胞:単一細胞の軸索は細胞体近傍において多数の軸索側枝に分岐し、広範な領域の嗅皮質第1-3層に多数のシナプスボタンを形成する他に、ブローカの対角帯、扁桃体皮質、外側内嗅野、および前交連を通り対側の嗅皮質に達した。この細胞はglutamate免疫陰性であるために、さらに化学伝達物質の種類を検討中である。結果の一部をFourth IBRO World Congress of Neuroscienceで報告したが、さらに実験結果を解析中である。モルモットの梨状葉皮質の第2a層の半月様細胞、第2b層の錐体細胞、第3層浅部の錐体細胞、第3層深部の多極性細胞に形態をゴルジ染色法で確認し、化学伝達物質の種類を免疫組織化学法で検索した。さらに、嗅球に刺激電極を設置し、約20個の第3層の神経細胞内に軸索トレーサーを注入・染色し、次の結果を得た。第3層深部の多極性細胞は、樹状突起の形態から有棘性細胞と無棘性細胞に分類される。両者ともにglutamateの免疫組織化学反応は陰性であり、GABA免疫陽性、GABA陽性細胞を亜区分するCalbindineとParvalbuminに対する免疫陽性であるために、抑制性神経細胞であると考えられる。有棘性細胞の樹状突起の先端は、嗅球の軸索投射を受ける第1a層に達した。軸索は梨状葉皮質第3層深部で軸索側枝を分岐した。側枝は第3-1層の梨状葉皮質、endopiriform nucleus、嗅結節、側坐核、ventral pallidum、fundus striati、ventrolateral orbital cortex、前嗅核、対角帯水平脚、対角帯垂直脚、扁桃体の諸核などの広範な範囲に分布し、多数のシナプスボタンを形成した。なお、無棘性の多極性神経細胞について光学顕微鏡による三次元的解析中であり、両者を併せて出版予定である。また、第3層浅部の錐体神経細胞の三次元的解析を行った。この細胞の軸索側枝は、第1-3層の梨状葉皮質、対角帯水平脚、扁桃体皮質、外側内嗅野に分布した。本年度は、既にbiocytinを細胞内に注入・染色した標本を用いて、モルモットの梨状葉皮質第III層の多極性細胞と錐体細胞の軸索側枝の定量的解析を集中的に遂行した。単一多極性細胞の細胞体の直径は約19×17μmであり、一部の樹状突起は嗅球からの入力線維が入る梨状葉皮質第Ia層に達していた。軸索は、細胞体から112μm走る間に4本の主な枝を分岐し、軸索の全長約90mmに達した。単一多極性神経細胞の軸索および側枝が持つ神経終末(ボタン)の総数は約7000個であり、その殆どは通過ボタンであった。この神経終末(ボタン)のうち、梨状葉皮質第III層に分布する神経終末(ボタン)数はボタン総数の65%を占める約5000個であった。なお、梨状葉皮質第I、II層には軸索は分布せず、神経終末もなかった。また、扁桃体の諸核には19%、約1300個、島皮質には10%、約700個、dorsal endopiriform nucleusには5%、約350個、ventral pallidumには1%、約80個が分布した。前年度の研究により、多極性細胞はGABA,calbindin,parvalbuminに対する免疫組織化学的染色陽性であることが分かっている。したがって、多極性神経細胞は、梨状葉皮質の第III層において、第II、III層の錐体細胞の基底樹状突起に抑制性出力をフィードバックすると考えられた。また、錐体細胞はglutamateに対する免疫組織
インスリン抵抗性の制御におけるフラクタルカインと受容体の役割

病態形成におけるフラクタルカインの役割は、疾患ごとに炎症を惹起または抑制のいずれにも調節し、大きく異なる。本研究課題では、肥満による炎症の誘導と維持におけるフラクタルカインとその受容体CX3CR1の役割について検討を行った。受容体CX3CR1を欠損したマウスは、対照群に比し、高脂肪食摂取によるインスリン抵抗性・高血糖・脂肪肝の増悪を認めた。フラクタルカイン-CX3CR1系は、肥満によるインスリン抵抗性の形成に重要であることが示唆される。現在、炎症細胞との関連性に着目し、フラクタルカイン-CX3CR1の慢性炎症、インスリン抵抗性に与える影響とそのメカニズムについて解析を進めている。ケモカインは骨髄から代謝臓器(脂肪組織、肝臓等)へ単球・マクロファージ等の炎症細胞を浸潤・集積させる重要な役割を果たし、肥満による炎症の誘導と維持に関係している。肥満に伴い、発現が変化するケモカインとその受容体に着目し、糖脂質代謝調節への関与を検証している。ケモカインfractalkineとその受容体CX3CR1は、炎症細胞で発現し、慢性炎症疾患の発症に深く関与することが知られている。しかし、これらの脂肪組織における局在、肥満による炎症やインスリン抵抗性との関連については不明である。高脂肪食投与で肥満を誘導したマウスの脂肪組織におけるfractalkineとCX3CR1の発現は、マクロファージやTリンパ球で認められた。さらに、脂肪組織中のfractalkineは、肥満に伴い、発現が持続的に低下することを見いだした。そこで、肥満の進展に伴うCX3CR1シグナルの減弱が、慢性炎症および全身のインスリン抵抗性に与えるインパクトを検証するため、肥満のCX3CR1欠損マウスの代謝表現型解析を行った。CX3CR1欠損マウスは、対照マウスに比し、脂肪組織に浸潤する炎症細胞の増加、インスリン抵抗性の亢進および糖脂質代謝異常を認めた。以上の結果から、肥満によるCX3CR1シグナルの減少は炎症の誘導やインスリン抵抗性の形成に重要であることが示唆された。高脂肪食負荷により肥満を誘導したCX3CR1欠損マウスは、インスリン抵抗性の亢進および糖脂質代謝異常を引き起こす。このマウスの脂肪組織における炎症病態の解析および、脂肪組織に浸潤する炎症細胞の定量化を行い、肥満状態におけるfractalkine-CX3CR1の役割について検討を行った。肥満のCX3CR1欠損マウスの脂肪組織では対照群に比し、TNF-αの発現上昇、NF-κBシグナルの増強を認め、炎症がより強く惹起されていることが示唆された。炎症病態の形成に深く関与する、脂肪組織へ浸潤するマクロファージ量について、遺伝子発現およびフローサイトメトリーで定量的に解析したところ、有意な増加を認めた。また、肝臓では、脂肪蓄積の増加が認められた。CX3CR1欠損マウスは、脂肪組織へのマクロファージ集積による炎症を基点に、インスリン抵抗性・高血糖・脂質異常症・脂肪肝を合併することが考えられる。Fractalkine-CX3CR1系は肥満による炎症とインスリン抵抗性の形成に重要であることを明らかにした。代謝学脂肪組織のwhole mountによる蛍光免疫組織染色法の確立により、脂肪組織中のケモカインとその受容体の局在を解析することが可能となった。CX3CR1欠損モデルマウスの作製および解析が滞りなく進んでいる。糖・脂質代謝調節におけるfractalkine-CX3CR1系シグナルの生理学的意義を明らかにするために、1.肥満状態の炎症細胞の動態制御に対する役割を解析し、2.シグナル増強による炎症やインスリン感受性に与える影響について検証する。次年度使用額は少額であり、研究に必要な物品の購入額に達しなかったため。研究を遂行するために必要な物品の購入に使用する。
化学教育における「電子のふるまいを表現した化学変化のモデル」の理論的・実践的研究

本研究課題は「現代科学的視点と学習者の認識形成」の課題を考慮した「電子のふるまいを表現した化学変化のモデル」を理論的・実践的に明らかにするものである。目的を達成するためには、現代科学とは何か、化学とは何か、化学変化とは何か、モデルとは何かといった「現代科学的視点」と、「学習者の認識形成」という「双方の課題」を考慮した「妥当なモデル」を明らかにする必要がある。「双方の課題」を結びつける基礎的枠組として「科学理論における適用限界」に着目した。これは実施計画における具体的課題(1「適用限界」の分析による「“電子のふるまい"を表現した化学変化のモデル」、2適用限界を克服するための「一連の補足的なモデルと実験の系列」)に対応する。日本の科学教育において「科学理論における適用限界」「モデル」が論争的性格を帯びながら議論されたのは「教育の現代化(探究の過程)」の受容過程の時期である。日本における「教育の現代化運動」は、アメリカにおける探究学習論の影響を受けている。1960年代後半から70年代初頭の日本の理科教科書では「ボルトとナット」を使用した化学変化のモデルが使用されており、これはアメリカにおける『IPS物理』との同一性を確認できる。ボルトとナットでは、H2Oのような結合を示すことができても、H2のような結合を表すことはできない。従来の研究では、ボルトナットモデルのこのような問題性や、この時期のモデル論の一般的特徴を科学哲学的に批判(観念論的傾向や反科学論的性質)してきた。しかしこのような問題性があるにも関わらず、アメリカ・日本においてなぜそうしたモデルが構成され使用されたのか、教科書作成者側の「論理」を先行研究は明らかにしていない。そこで本研究では『IPS物理』における適用限界型の単元構成を抽出し、その根拠拠となる科学教育論としてJ.シュワブの探究学習論に注目し検討を加えた。アメリカにおける探究学習論の系譜と、日本における現代化(アメリカにおける探究学習論)の受容過程の考察を通じて、上に述べた「双方の課題」「妥当なモデル」を構成していくための基礎的枠組(科学的概念・法則の学習過程における、法則の習得、モデルの構成・適用、適用限界)が明らかになりつつある。当初の実施計画に従い、研究を進める。
三重鎖DNA結合蛋白質の三重鎖DNA認識機構の解明と三重鎖DNA安定化への利用

三重鎖DNAは、ホモプリン・ホモピリミジン二重鎖(pur・pyr)の主溝に沿ってホモピリミジン単鎖あるいはホモプリン単鎖がHoogstecn型の水素結合をすることにより形成する。これまで三重鎮DNA構造に結合する蛋白質は全く知られていなかった。しかし、ヒト癌遺伝子c-mycのプロモーター近傍のpur-pyr配列が形成する三重鎖DNA構造に結合し、c-mycの発現を制御する三重鎖DNA結合蛋白質MAZを、我々は単離した。この蛋白質はCys2His2型の5個のZn finger motifを有する。これまで、N末端に位置する3個のZn finger motifが三重鎖DNAと結合するのに必要な最小領域であることを確立した。また、この三重鎖DNAに結合するのに必要な最小領域の蛋白質(DBD)を大腸菌内で大量発現する系を樹立し、単品に精製することに成功した。さらに、精製したMAZのDBDはホモピリミジン単鎖DNAや三重鎖DNAと強く結合するが、ホモプリン単鎖DNAや二重鎖DNAとは結合しないあるいは弱く結合することを明らかにしてきた。ところで、ホモピリミジン単鎖DNAがpur・pyrに結合するピリミジン型三重鎖DNAは、酸性pHでは安定であるが、中性pHでは不安定である。一方、ホモプリン単鎖DNAがpur・purに結合するプリン型三重鎖DNAの形成反応は、K^+イオン存在下で阻害される。そこで本年度の研究では、中性pHやK^+イオン存在下のような三重鎖DNAが形成しにくい条件下に三重鎖αDNA結合蛋白質MAZを加えた場合に、MAZが三重鎖DNA構造を安定化するかどうかを解析した。その結果、中性pHやK^+イオン存在下で三重鎖DNAを形成する際にMAZを共存させると、三重鎖DNA構造がかなり安定化されることが明らかとなった。これは、MAZを利用することにより、生理的条件で不安定な三重鎖DNAを安定化できる可能性を示すものである。また、三重鎖DNA形成を利用したアンチジーン法を生理的条件で適用する際に、MAZを利用できる可能性を示すものである。現在これと共に、X線結晶解析により、MAZのDBDと三重鎖DNAとの複合体の高次構造を明らかにし、MAZのDBDの三重鎖DNA認識機構を原子レベルで解明しようとしているところである。
声とモノから探る戦時期の音楽教育実践史研究

戦時期の音楽教育実践史の特質として次の点を明らかにした簡易楽器の指導は、1930年代に東京市内尋常小学校の教師たちによって着手された。それらは玩具的楽器による音楽的自己表現という児童中心主義の思想とともに、次第に戦時行事の活性化という意図を含んで拡大していった大阪府堺市の佐藤吉五郎によって推進された和音感教育は、音楽の基礎的能力の育成とともに、敵の飛行機や潜水艦の音の聴き分けるといった国防教育としての新しい位置づけが生まれたこれら音楽教育実践の普及には雑誌の発行やSPレコード、映画などメディアの活用が不可欠な条件となっていた戦時期の音楽教育実践史の特質として次の点を明らかにした簡易楽器の指導は、1930年代に東京市内尋常小学校の教師たちによって着手された。それらは玩具的楽器による音楽的自己表現という児童中心主義の思想とともに、次第に戦時行事の活性化という意図を含んで拡大していった大阪府堺市の佐藤吉五郎によって推進された和音感教育は、音楽の基礎的能力の育成とともに、敵の飛行機や潜水艦の音の聴き分けるといった国防教育としての新しい位置づけが生まれたこれら音楽教育実践の普及には雑誌の発行やSPレコード、映画などメディアの活用が不可欠な条件となっていた平成21年度には、以下3点の作業を行った。1.昭和前期から戦後にかけての音楽科教育実践のうち、器楽指導の初期実態について先駆的実践者、山本栄、上田友亀を中心に資料収集し、分析を行った。その結果昭和初期の器楽教育は、唱歌教育の閉塞状況の打開策として位置づけ、1)児童の音楽を生活化、2)全員斉奏による器楽教育の実現、を教育理念として行われていた。上田の用いた木琴、ガラガラ、横笛、ミハルス、スズネットなどの楽器は生活の延長という点で「玩具的」なものも肯定され、たて笛、横笛、竹笛など西洋音楽、日本音楽の様式といったものも等閑視されて扱われた。このことが実際の音楽授業での「音楽的にはどうなのか」といった批判にさらされる原因にもなっていた。しかし、「簡易」楽器による器楽合奏は戦後の器楽教育振興の基盤となったことは明らかであり、山本は実践者として、上田は白桜社の設立による楽器供給によって牽引していく実践力を戦前に形成していた。2.当時の楽器の実態を探るため、楽器の収集と分析を行った。昭和前期に前述のように多様な形態のものを使用していた笛は戦後の楽器業界の開発競争の中で、「スペリオパイプ」が登場し安定期を迎えた。ソプラノ、アルトのスペリオパイプは現物を確認、音は現在のリコーダーとそれほど変わらず、高音部の鳴りにくさが若干あった。更に昭和前期に作られたミハルスも現物を確認。これは二つの円型の木片を打ち合わせるもので、打点のエネルギーを中に入れ込む構造をもった。打った後に二つの木片が開くカスタネットは、外側に打点のエネルギーを出すもので、類似のリズム打楽器でありながら楽器構造は対照的で、ミハルスはより日本的性質を有していた。3.その他戦前から戦後の楽器製造の状況を把握するために『楽器商法』『ミュージックトレード』等の雑誌記事の収集と分析を行っている。平成22年度には、以下3点の作業を行った。1.昭和前期から戦後にかけての器楽指導の初期実態について、先駆的実践者のうち山本栄を中心に資料収集し、分析を行った。山本の簡易楽器教育は、唱歌教育の閉塞状況の打開策として位置づけ、1)児童の音楽を生活化、2)全員斉奏による器楽教育の実現、を教育理念として行われていた。特にハーモニカを使った実践は授業の大衆化か和声的音楽の実現かで議論となっていた。2.1930年代の大正自由教育思想の流とファシズム思想が台頭し戦時体制下して行くなかで、ハーモニカも含めた簡易楽器は当時の社会的・文化的な文脈の中にどのように組み込まれながら誕生し、展開していったのかを明らかにするために文献研究とその整理を行った。1920年代からの出版、レコード、映画、ラジオ放送などテクノロジーによるメディアの発達が1930年代には文化の大衆化、産業化を起こしたといわれる。そうした中で映画館の伴奏音楽からレコード音楽となった和洋合奏、都心部のチンドン屋の音楽、青年団や高等小学校で組織された喇叭鼓隊、大衆歌謡からクラッシックまで網羅したハーモニカやシロホン合奏など、西洋音楽と日本音楽、大衆音楽と正統派音楽のそれぞれが混合して文化を創り、また戦意高揚のためのデモストレーションにも楽器合奏が借り出されていった時代であった。こうした背景の中で生まれた簡易楽器合奏も混合的な音楽を生み出していった。3.1930年代の堺市を中心にした和音感教育は、国民皆唱、和声音楽の発展を目指して創案され実践化されたものであった。しかし、これもマスメディアの主体的活用の中で次第に国防教育としても注目され、遂に軍部に採用されるまでになる。音楽の高度化かと国民統合のための軍事化という二局面をもつ音感教育がどのように形成されていったのかを一教師の生涯を通して検討している。H23年度はモノと声にかかわる音楽教育実践の具体化として簡易器楽指導と音感教育に焦点を当て、その実際を明らかにするとともに、1930年代の政治、社会状況の中で学校音楽がどのような特質と機能を有していたのかについて検討を行った。・器楽指導については、1930代に東京市内の尋常小学校訓導、上田友亀、山本栄らを中心に展開された簡易楽器指導の成立とその実際を辿った。

玩具的楽器を使用し、粗雑な音であっても子どもの興味関心、経験に繋がることを第一と考えた上田友亀に対し、山本栄は音程正確でハーモニーを作るハーモニカを利用し、和声的合奏を重視した。山本の実践は大衆音楽楽器として流布していたハーモニカの学校音楽への導入を意味するものでもあった。また彼らの情報交換・研究の媒体として雑誌『学校音楽』の活用があったことは特筆すべき事柄であった。それは音楽文化と教育との間で新たなものが創り出される時、メディアを媒介として、一般の教師たちがその創出の主体となっていったこの証左であった。・歌唱指導については、昭和前期に大阪府堺市において実践された和音感教育を取り上げた。堺市視学佐藤吉五郎が主導した音感教育は、基礎的な音楽能力の獲得を目指し、幼・小学校の継続的指導を組織的に実施した。またその実践は軍部の接近により、次第に国防教育の先進的取り組みとしての色彩を帯び、レコード、記録映画などのメディアを活用して全国へと喧伝されていった。音楽基礎力の育成と国防教育というのは今日では相反する理念に見える。しかし、戦時体制へと向かう時代にあって、教師たちにはそれらは矛盾なく両立する使命となり、軍国主義というイデオロギーが教師自らの内的動機としても選択されていく、そうした危うさが日々の実践の中に存在することが看取された。
新規二次胆汁酸生成腸内細菌の探索と大腸ガン発症プロモーター生成機構の解明

糞便サンプルから,一次胆汁酸であるコール酸(CA)とケノデオキシコール酸(CDCA)をそれぞれ大腸ガンのプロモーター活性を持つ二次胆汁酸,デオキシコール酸(DCA)とリトコール酸(LCA),に変換する7α-脱水酸化活性を持つ未知の腸内細菌の分離を目的として研究を行った.嫌気チャンバー内で糞便サンプルから合計619株の腸内細菌を分離し,これらのCAあるいはCDCAからの二次胆汁酸生成活性をTLC,HPLC,GC-MS分析により検出した.その結果,8株の二次胆汁酸生成菌を取得した.16SrRNA遺伝子の塩基配列の決定により,DCAやLCA生成菌株としてClostridum scindensとC.leptumを得たが,これらは既知の変換菌であった。他の6株はCDCAからLCAとは異なる代謝産物として7-オキソリトコール酸(3α-hydroxy-7-oxo-5β-cholanoic acid,7-keto-LCA)を生成していた.これら6株は7-keto-LCA生成菌としては既知のEscherichia coli(3株)やBacteroides fragilis(2株)に加えて,今まで報告のなかったBeacteroides intestinalsを含むことが判明した.本株をB.intestinalis AM-1と命名した.AM-1株はCAからは7-keto-DCAを生成した.基準株JCM13265^Tでも同様の活性が確認された.変換反応を既知の変換株E.coliHB101およびB.fragilis JCM11019^Tと比較したところ,AM-1株は変換反応培養時の生育量は他株に比べて低いが,変換率は90%以上であり,菌体当たりの変換活性が格段に高いことが分かった.本反応を触媒する酵素7α-hydroxysteroid dehydrogenase活性はこれら3株間に大差を認めなかった.糞便サンプルから,一次胆汁酸であるコール酸(CA)とケノデオキシコール酸(CDCA)をそれぞれ大腸ガンのプロモーター活性を持つ二次胆汁酸,デオキシコール酸(DCA)とリトコール酸(LCA),に変換する7α-脱水酸化活性を持つ未知の腸内細菌の分離を目的として研究を行った.嫌気チャンバー内で糞便サンプルから合計619株の腸内細菌を分離し,これらのCAあるいはCDCAからの二次胆汁酸生成活性をTLC,HPLC,GC-MS分析により検出した.その結果,8株の二次胆汁酸生成菌を取得した.16SrRNA遺伝子の塩基配列の決定により,DCAやLCA生成菌株としてClostridum scindensとC.leptumを得たが,これらは既知の変換菌であった。他の6株はCDCAからLCAとは異なる代謝産物として7-オキソリトコール酸(3α-hydroxy-7-oxo-5β-cholanoic acid,7-keto-LCA)を生成していた.これら6株は7-keto-LCA生成菌としては既知のEscherichia coli(3株)やBacteroides fragilis(2株)に加えて,今まで報告のなかったBeacteroides intestinalsを含むことが判明した.本株をB.intestinalis AM-1と命名した.AM-1株はCAからは7-keto-DCAを生成した.基準株JCM13265^Tでも同様の活性が確認された.変換反応を既知の変換株E.coliHB101およびB.fragilis JCM11019^Tと比較したところ,AM-1株は変換反応培養時の生育量は他株に比べて低いが,変換率は90%以上であり,菌体当たりの変換活性が格段に高いことが分かった.本反応を触媒する酵素7α-hydroxysteroid dehydrogenase活性はこれら3株間に大差を認めなかった.1.糞便サンプルから未知の7α-脱水酸化活性を持つ細菌の分離(横田/和田)嫌気チャンバーを用いて絶対嫌気条件で糞便サンプルを希釈後,嫌気性菌用平板培地にてコロニー分離を行い,3名の糞便サンプルから合計619株の候補株を収集保存した.7α-脱水酸化活性を持つ菌株のスクリーニングはコール酸(CA)/ケノデオキシコール酸(CDCA)を含む液体培地で,嫌気チャンバー内で分離菌株を培養し,反応生成物(デオキシコール酸(DCA),リトコール酸(LCA),その他)の有無を薄層クロマトグラフィー(TLC)により検出した.活性を認めた株は137株であった.再現性の確認により候補株を11株に絞った.反応生成物をHPLC,GC-MS分析により同定中である.2.7α-脱水酸化活性を持つ細菌の同定(湯本/横田)3.腸内細菌の生育/生理におよぼす二次胆汁酸の影響(横田)腸内乳酸菌に対する二次胆汁酸の生育阻害機構をエネルギー代謝解析および細胞膜に対する損傷の両面から検討し,生育阻害濃度におけるプロトン濃度勾配の解消によるエネルギー代謝阻害,および膜損傷によるカリウムイオンや紫外線吸収物質の漏出によることを明らかにした.4.7α-脱水酸化反応機構の解析と反応制御への応用(横田)本項目は未着手である.1.糞便サンプルから未知の7α-脱水酸化活性を持つ細菌の分離(横田/和田)昨年度コール酸(CA)/ケノデオキシコール酸(CDCA)の7α-脱水酸化活性を持つ候補菌株として、薄層クロマトグラフィー(TLC)検出による判定基準で11株を選択した。

これらの株について反応再現性の確認、反応生成物(デオキシコール酸(DCA),リトコール酸(LCA),その他)のHPLC,GC-MS分析による同定を試みたが、当初目的のLCAを生成する未知菌株の取得には至らなかった。しかしこの検討の過程で、いくつかの株がCDCAからLCAとは異なる代謝産物を生成していることが認められた。HPLC,GC-MS分析による検討の結果、本代謝産物は7-オキソリトコール酸(3α-hydrOxy-7-OXO-5β-cholanoic acid)であることが判明した。2.7-オキソリトコール酸生成活性を持つ細菌の同定(湯本/横田)1.で得られた7-オキソリトコール酸生成株の16SrRNA遺伝子のほぼ全長の塩基配列を決定することにより,菌種を簡易同定した.その結果、今まで報告のなかった変換菌として,Bacteroides intestinalsを取得できた.本変換菌はCAからは7-ケトDCAを生成した.本株は理化学研究所の〓野らによりごく最近新種として記載されたものである。基準株JCM13265を取り寄せて比較したところ、JCM株でも同様の変換反応が確認された。3.腸内細菌の生育/生理におよぼす二次胆汁酸の影響(横田)昨年度の本項目における研究成果を論文としてまとめ、Journal of Bacteriology誌に投稿し、掲載された。平成16,17年度の研究により,糞便サンプルから未知の7α-脱水酸化活性を持つ細菌の分離を試み,当初目標としていた7α-脱水酸化活性を持つ新規細菌は分離できなかったが,ケノデオキシコール酸(CDCA)から7-オキソリトコール酸(3α-hydroxy-7-oxo-5β-cholanoic acid)(7KLCA)を生成する今まで報告のなかった変換菌Bacteroides intestinals AM-1を取得できた.平成18年度は本菌の変換反応と酵素活性について検討した.1.変換反応の検討基質としてCDCAを用いた場合は7KLCAが,コール酸(CA)を用いた場合は,7-ケトデオキシコール酸(7KDCA)が生成する.すでに変換活性が知られている大腸菌HB101とB.fragilis JCM11019Tを比較対象として変換反応を見たところ,AM-1株は変換反応培養時の最大生育量は他の2株に比べて低いが(25-50%),変換率は90%以上であり,菌体当たりの変換活性が既知の株に比べて格段に高いことが分かった.2.酵素活性の測定本反応を触媒する酵素は7α-hydroxysteroid dehydrogenase(7α-HSDH)であることが知られているので,AM-1株の本酵素活性を測定する条件を確立し,種々の条件で測定した.その結果,本株の酵素活性は大腸菌HB101やB.fragilis JCM11019Tと同程度であった.従って,AM-1株の変換活性の高さは酵素活性から直接説明はできなかった.おそらく,7α-HSDHの補酵素として働くNAD/NADHの嫌気条件下での細胞内リサイクルが,AM-1ではより円滑に行われるためではないかと考えられた.