hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
回転水中紡糸法の模擬実験による急速冷却の研究

本研究は、アモルファス金属細線の製造法の一つである回転水中紡糸法における伝熱特性を模擬実験により明らかにすることを目的として行ったものである。実験は、溶融金属ジェットを模擬して円弧状に保持したB熱伝対素線(直径0.5mm)を通電加熱した後、回転ドラムの内側に形成された水層内に、一定の回転速度で浸漬冷却する方法である。細線の入射角度23°、細線の回転速度39m/s、水層表面の流速59m/s(ドラム回転速度202364rpm)、初期加熱温度1000,1200°C、水温10,40°Cの実験条件で行い、以下のことが明らかになった。1.写真観察によると、細線の水中突入直後の後流域には空気の巻き込みおよび発生蒸気によるシートが形成されており、実際の製造プロセスに近い様相を示していた。2.水平細線の垂直落下浸漬冷却の実験における熱流束は入水直後に急激に上昇するのに対して、本実験ではかなり緩やかである。これは、線の軸方向の熱伝導と後流部に形成される蒸気シートが原因であると考えられる。3.入水後しばらくは熱伝達に及ぼすドラム回転速度の影響はほとんど認められない。しかし、ドラム底面に近づくにつれて、回転速度が大きいほど熱流束が大きくなる。4.細線の回転速度V_f=69m/sの場合の熱流束は単調に増加するのに対して、V_f=3m/sでは増加して極大点に達した後、減少する。今後、塩類水溶液による伝熱促進効果について検討するとともに、現象の解明を進める予定である。
温熱耐性の分子機構

我々が見出した40-kDaのHsp40はバクテリア熱ショック蛋白質DnaJの相同体である。これまでに,Hsp40熱ショック時にHsp70とともに核,核小体に移行して局在を同じくすること,またHsp70と会合していることなどを報告してきた。今年度はまず,精製したリコンビナントHsp40およびHsc70を用いて生化学的研究を行った。Hsc70は弱いながらATPase活性をもっているが,Hsp40は2-3倍程度その活性を促進した。この促進活性は42-45°Cでは4-5倍に増加した。このことはHsp40/Hsc70が厳しいストレス条件下でも効率よく分子シャペロンとして機能することを示唆している。また,モデル蛋白質としてロ-ダニ-スを用いた実験では,Hsp40とHsc70が協調的に働いて,変性したロ-ダニ-スの凝集を抑制し,ある程度活性を回復させることも示された。ただしHsp40単独ではこのような活性は見られなかった。次に,細胞内でのHsp40/Hsp70のシャペロン機能を調べるために,ルシフェラーゼを発現している細胞にHsp40 and/or Hsp70遺伝子を導入し,熱ショックによるルシフェラーゼの失活および失活後の活性回復に対するHsp40とHsp70の効果を検討した。ルシフェラーゼの失活に対しては,Hsp40単独では全く防護効果がみられないが,Hsp70またはHsp70+Hsp40ではほぼ同程度の防護効果がみられた。またルシフェラーゼの失活後の活性回復に対しては,Hsp40単独ではやはり効果がなく,Hsp70単独でもわずかながら効果がみられるが,Hsp70+Hsp40ではさらに強い回復効果が認められた。これは細胞内でのHsp70/Hsp40のシャペロン活性を示した初めての報告である。またHsp40単独では防護効果も回復効果もみられないことは上述の生化学的結果ともよく対応する。以上の結果から,Hsp70とHsp40は変性蛋白質の凝集を防いで元どうりに折りたたむように機能しており,これが温熱耐性の分子機構の1つであることが示唆された。
RNAによるテロメアヘテロクロマチン制御機構に関する研究

真核生物の線状染色体末端に存在する構造体であるテロメアは、特殊なヘテロクロマチン構造をとっており、ゲノムの安定性に寄与している。分裂酵母のセントロメアや接合型遺伝子座位のHP1ヘテロクロマチン領域においては、RNAiがヘテロクロマチンの確立に関与している。しかし、テロメアにおいてどのようにしてHP1ヘテロクロマチンが確立されるのか、分裂酵母においてだけでなく、他の生物においても全く明らかにされていなかった。そこで本研究では、分裂酵母のテロメアにおいて如何にしてヘテロクロマチンが確立されるのかを調べた。まず、染色体末端に存在するテロメアリピートDNAに直接結合するTaz1タンパク質は、テロメアリピートDNAを染色体内部に挿入した領域におけるヘテロクロマチンの確立、および、テロメアリピートのみ保持し、サブテロメア領域を持たない人工ミニ染色体のテロメアにおけるヘテロクロマチンの確立に必須であった。従って、Taz1はテロメアリピートDNAを拠点とするヘテロクロマチンの確立において、重要な機能を果たしていると考えられた。一方、テロメアリピートを欠失したテロメアにおいてもヘテロクロマチンが確立されることがわかった。その確立に必須なサブテロメア領域には、DNA helicaseをコードすると思われるORFが存在し、その中にはセントロメアや接合型遺伝子座位に共通に存在するDNA配列の一部が含まれていた。そのORFの転写はRNAi依存的であり、さらに、その領域におけるヘテロクロマチンの確立にRNAiが関与していることが明らかになった。以上のことなどから、分裂酵母のテロメアにおいては、Taz1とRNAi機構が独立にヘテロクロマチンの確立を行っていると考えられた。このようなredundantなシステムは、接合型遺伝子座位においても見られ、ヘテロクロマチンの安定な維持に寄与していると思われる。真核生物の線状染色体末端に存在する構造体であるテロメアは、特殊なヘテロクロマチン構造を保っている。分裂酵母やヒトなどの真核生物におけるテロメアやセントロメアのような構成的なヘテロクロマチン領域では、まずヒストンH3のLys9残基がメチル化され、それを認識してヘテロクロマチンタンパク質(ヒトではHP1、分裂酵母ではSwi6など)がヒストンH3にリクルートされる。ヘテロクロマチンタンパク質は染色体の凝縮を直接制御する。本研究では、分裂酵母のテロメアにおいて如何にしてヘテロクロマチン状態が制御されているか調べた。まず、染色体末端に存在するテロメアリピートDNAに直接結合するTaz1タンパク質は、テロメア末端に集中して局在することがわかった。一方、Swi6はテロメア末端部分にはあまり局在せず、染色体内側のTAS領域の広い範囲に局在することがわかった。分裂酵母のセントロメアや接合型遺伝子座位においては、Swi6ヘテロクロマチンの確立にはRNAi機構が関与していることが知られている。しかし、テロメアにおいては、RNAi機構はSwi6ヘテロクロマチンの確立に必要ではないことがわかった。そして、分裂酵母のテロメアにおけるSwi6ヘテロクロマチンの確立には、テロメアリピートに局在するTaz1が必要であることがわかった。また、Taz1に結合するタンパク質であるRap1やRif1は関与していないことも明らかとなった。以上のことから、分裂酵母テロメアにおいては、RNAi機構ではなく、テロメア結合タンパク質Taz1が何らかの形でヒストン修飾酵素をリクルートすることにより、Swi6ヘテロクロマチンの形成に重要な役割を果たしていることが示された。一方、TAS領域にはテロメアヘテロクロマチンによって転写制御されている領域が存在することがわかった。この領域のDNAを鋳型としてRNAi機構が働き、テロメアの何らかの機能制御を行っている可能性について現在検討している。
生体高分子の界面吸着が誘起する氷の結晶成長促進・自励振動現象の異方的ダイナミクス

寒冷環境に住む変温生物の凍結を防ぐ機能を持つ凍結抑制タンパク質の機能が発現するメカニズムを解明するために、実験・理論的研究を行った。氷結晶の成長がこのタンパク質の界面吸着と関連することを初めて実証するとともに、2段階可逆吸着様式というタンパク質分子の氷界面への吸着特性を明らかにした。すなわち、界面に吸着したタンパク質分子は、界面へのより強い吸着状態を実現するために自らその形状(二次構造)を変化させる。この特性は、結晶成長速度の促進や自発的な振動現象を引き起こすことも示した。氷結晶の成長を抑制する機能を持つ凍結抑制タンパク質(糖鎖を持つものをAntifreezeglycoprotein(AFGP)、動したりする。これは、成長界面に吸着したタンパク質分子による結晶成長カイネティクスの改変と、結晶成長に伴い界面で排斥されたタンパク質分子の挙動(拡散や分配)とが、非線形的に相互作用することに起因する。さらに、同じ分子であっても、結晶の面方位ごとにその作用が異なる(異方性)。このような現象は、アミノ酸やタンパク質など、いわゆるマクロサイズの生体高分子が添加物として作用する場合に極めて特徴的に現れる新しい物理現象で、塩などの無機の小分子が添加物である場合には決して観察されない。本研究では、結晶が成長しつつある動的状態での界面吸着状態にあるタンパク質分子のコンフォメーションや結晶成長過程などのその場測定を行う。さらに、理論的考察や計算機シミュレーションとも共同し、凍結抑制タンパク質の不純物効果が氷結晶の異方的成長カイネティクスに与える効果を解明し、「マクロ分子の関与した新しい結晶成長機構モデルの構築」を目指す。さらに、氷の凍結を抑制するタンパク質を研究試料として用いることから、生体の耐凍結・耐寒冷戦略のメカニズム解明を物理的手法で目指すという生命科学的役割も果たす。1)氷の結晶成長を制御する機能を持つ不凍糖タンパク質(Antifreeze Glycoprotein, AFGP)が、氷/水界面に吸着した状態でどのような二次構造を持つかを、全反射プリズムを使ったフーリエ変換赤外分光法により調べた。AFGP分子は、水溶液中ではランダムコイルと呼ばれる構造を持つが、水溶液が凍結した状態ではα-ヘリックス構造を持つ分子の割合が増加した。すなわち、氷/水界面に吸着したAFGP分子がα-ヘリックス構造を持つと考えられる。この結果は、AFGP分子が界面に吸着するためには、二次構造の変化を伴うことを示す初めての結果である。2)AFGP分子が海面に吸着した場合の、氷結晶成長カイネティクスモデルの構築を行った。AFGPの界面への吸着には、不完全な吸着と完全な吸着の場合が存在し、前者は結晶成長を抑制しないが後者は成長を抑制する。すなわち、AFGPの界面吸着は、階層構造を持つことが示唆された。この様な階層構造が存在すると、結晶成長に伴う自励振動の発生を導く結晶成長カイネティクスモデルの構築が可能になる。3)氷/水界面に不凍タンパク質タイプI(Antifreeze protein, AFP Type I)が吸着している場合の結晶成長のプロセスの計算機シミュレーションを、分子動力学法により行った。AFP Type Iは、プリズム面からある傾きを持ったピラミッド面にもっとも強固な結合が出来、この場合は氷の結晶成長が抑制された。そのほかの方位の結合では、AFGP分子が氷/水海面の成長に伴って前方に押し出された。すなわち、成長抑制効果が観察されなかった。この結果は理論的考察で予測された吸着状態の階層構造を反映しているものと考えられる。このようなシミュレーションは、本研究が最初の成功例で、AFPが不凍効果を発現するためのメカニズムの解明に極めて有効である。1.分子量の異なるいくつかのタイプの混合物として供給される不凍糖タンパク質(AFGF)を分予量ごとに分画する技術を習得し、AFprotein社から購入した試料、及び本研究課題に関連して国際共同研究を実施中の米国カリフォルニア大学デービス校のYin Yeh教授の研究室から提供を受けて試料を分子量ごとに分画した。前者は、AFGP8-6の混合物であり、後者はAFGP6-4の混合物であり、各種のAFGPを単独で利用できるようになった。2.これらの分画したAFGP試料を用いて、氷結晶成長実験を行った結果、分子量の小さいAFGP8が単独で存在する場合は結晶成長抑制機能がほとんど観察されないが、分子量が大きいAFGP5,6などでは強い抑制機能が発現することが明らかになった。3.さらに、分画前のAFGP8-6の混合物試料をそのまま使った氷結晶成長実験では、AFGP8単独の場合より強い凍結抑制効果が観察された。この試料は、AFGP8が80%以上を占めているので、わずかに含まれるAFGP6の分子量の大きなタンパク質との共同現象として凍結抑制機能が発現したことを強く示唆する結果を得た。4.AFGP分子が氷/水界面に吸着した状態での二次構造変化の測定もATR-FTIR法により継続した。

分子量の大きいAFGPほど、ランダムコイルからα-ヘリックス構造への変化を示すシグナル強度が上昇することが明らかになった。5.これらの実験結果は、AFGP分子が単一の分子量のもので構成されるよりも、分子量の異なるもの混合物のほうが機能を強く発現させるという協同現象が存在することを明確した。1.氷表面や氷/水界面における成長ステップの観察システムを立ち上げ、氷表面においては1分子ステップの観察が可能になりつつある。これが実現したことで、蛍光ラベルした凍結抑制タンパク質の氷/水界面における挙動を可視化する道筋が開かれた。(佐崎)2.連携研究員である金子(大阪大学)とともに、AFGP水溶液から得られたX線小角散乱データの解析を行った。その結果、水溶液中では過冷却状態になってもAFGP二次構造に大きな変化は存在しないことが確認された。すなわち、,前年までにATR-FTIR法により得られた氷/水界面吸着状態のAFGP二次構造変化の結果を強く補完する。また、中性子散乱による測定実験の可能性についても検討を行い、次年度以降にマシンタイムの獲得を目指す。3.本研究課題で横山(学習院大、連携研究員)により提案された、凍結抑制タンパク質の氷/水界面吸着に対する二段階可逆吸着モデル(2-step reversible adsorption mode)の定式化を行った。この定式化により、成長速度の振動現象がこの吸着モデルを証明する指針のひとつであることが明確にされた。振動現象はすでに実験的に観察されており、このモデルとの整合性が明らかにされた。4.灘(産総研、連携研究者)が独自に開発した新しい水分子モデルを使用して、AFP type I分子の吸着を分子動力学法でシミュレーションを実施した。特に、吸着の異方性に注目して解析を行い、プリズム面から角度を持った高次数の微斜面に強い吸着が起こることを示した。5.分画したAFGPを使った氷の結晶成長実験により、凍結抑制機能の発現は協同現象の一種であることを明らかにした。(古川、博士研究員)1.氷表面において、1分子高さのステップの運動をその場観察できるようになるとともに、表面融解に伴う疑似液体層の挙動も可視化された。この結果、氷のベーサル面は融点近傍までステップ成長することが確認された。(佐崎)2.氷/水界面の成長速度の精密測定とステップ運動の可視化を目指し、位相差顕微鏡とマイケルソン型干渉顕微鏡を同光軸で使用できる新しい顕微光学系を開発した。この装置により、ガラス表面の1/100以光反射率しかない氷/水の界面でも、十分なコントラストで干渉縞が観察できることが確認された。このシステムを使い、不凍糖タンパク質の水溶液中での成長界面の詳細観察を行った。その結果、成長速度が振動することが改めて確認された。(古川・博士研究員)3.氷核生成を促進する効果を持つ氷核タンパク質の水溶液中で氷結晶成長実験を行い、このタンパク質も結晶成長抑制の効果を併せ持つことが明らかになった。
原子炉を使ったニュートリノ振動パラメータの精密測定

有効体積を拡大するにあたって、最も顕著なバックグラウンドは検出器外側と低エネルギー領域にある偶発イベントであるが、これらのイベントは検出閾値を高くすることで除かれる。また、ミューオン起源の高速中性子は検出器外側に集中する。エネルギーの高い領域では、高速中性子のバックグラウンドが支配的になるため、ミューオンの軌跡と中性子生成のプロセスを含めた詳細なシミュレーションが必要となる。検出器に到達する高速中性子数を見積もる際に、最も不定性が大きいのはミューオンによる中性子の生成プロセスである。この不定性を抑えるために、検出器外側にある外部検出器を通過したミューオンを用いて、中性子生成量に対する校正を行なう。外部検出器との同時計測を用いて観測された中性子生成量とミューオンフラックスから予想される生成量との違いは1.5倍程度であった。また、ミューオンが外部検出器を通過しない場合でも、約半数はミューオンがおこす電磁シャワーによって外部検出器で観測できることが分かった。この結果、原子炉ニュートリノの観測エネルギー領域において高速中性子のバックグラウンドは全体積で0.002events/day程度となり、原子炉ニュートリノイベント数0.8events/dayに対して十分に小さくなることが確かめられた。2002年3月9日から2004年10月31日までのデータ(749.1日)を用いて解析を行い、3.0MeV以上のエネルギー領域において有効体積をこれまでの半径5.5m球から半径6.0m球に拡大したところ、統計量は1.3倍となり振動パラメータに対する感度が向上した。その結果、>99%の信頼度で振動パラメータを質量2乗差Δm^2=7.9x10^<-5>eV^2付近のみに絞り込むことができた。KamLANDでは、平均距離、約180kmの原子炉より飛来する反ニュートリノの振動の研究を行っている。検出器は、1,000トンの液体シンチレータ、バッファーオイル、水チェレンコフカウンターなどから構成されており、バックグラウンドを低減するための工夫がなされている。放射線源やミューオンによる原子核破砕のイベントを用いて、0.514MeVでのエネルギーの校正を行っている。エネルギーの絶対値に対するエラーの他に、液体シンチレータのクエンチ(消光)やチェレンコフ光の寄与なども考慮すると、2.6MeVにおける全エラーは2.0%以内に抑えられることが分かった。エネルギー分解能は、これまでの1325本の17インチのPMT(光電子増倍管)に554本の20インチのPMTが2003年2月27日に新たに加わったことにより、エネルギー1MeVのイベントにおいて7.3%から6.2%に向上した。2002年3月9日から2004年1月11日までのデータ(515.1日)を用いて解析を行う。バックグラウンドイベントは、偶発イベント、^8He/^9Li、高速中性子、^<13>C(α,n)^<16>Oなどを合わせると17.8±7.3となった。ニュートリノ振動がない場合の期待される原子炉ニュートリノイベントは、先発信号のエネルギー閾値2.6MeVにおいて365.2±23.7(syst)であるに対し、観測されたのは258イベントであった。このことから、ニュートリノの平均生存確率は0.658となり、99.998%の信頼度でニュートリノの消失が確認された。ニュートリノ振動がない仮説に対する検定は、スペクトルの情報のみを用いても行うことができる。イベント数のスケールをフリーにしたニュートリノスペクトルの歪みに対するχ2乗検定によって、振動のないスペクトルは99.78%の信頼度で排除された。
光合成酸素発生系の形成機構

光合成酸素発生系は、核および葉緑体DNAにコードされた光化学系IIポリペプチドが、光照射下でチラコイド膜上に分子集合することによって形成される。本研究では、ユーグレナおよびオオムギを用いて、緑化過程におけるポリプペチドの合成とチラコイド膜での蓄積の様子を生化学的、分子生物学的、形態学的手法により詳細に検討した。ユーグレナの緑化過程の初期においては、光化学系IIのアンテナクロロフィル結合タンパク質CP43/47が、その結合クロロフィルを遊離しやすいなど、複合体としてはかなり不安定で、その安定化には膜表在性の30kDaタンパク質の結合が必要であることが分かった。このことは、CP43/47と30kDaタンパク質が構造的に密接な相互作用をしていることを示唆するとともに、以前に報告した緑化過程におけるチラコイド膜での30kDaタンパク質の特異的な蓄積の遅れが酸素発生系の形成過程に及ぼす影響を具体的に示している。30kDaタンパク質は核支配のタンパク質であり、その蓄積の遅れの原因の一つは、ユーグレナ特有の葉緑体タンパク質輸送過程にあると考えられた。そこで30kDaタンパク質遺伝子のクローニングを行い、タンパク質前駆体の構造を決め、さらにそのタンパク質前駆体の輸送経路についての解析をすすめた。その結果、このタンパク質の前駆体は、高等植物の対応するタンパク質前駆体に比べて長いプレ配列をもち、その構造にも高等植物のものとは異なる特徴がみられた。また、前駆体は10分程度のhalf-timeでゆっくりとチラコイド内腔まで輸送されることが分かった。葉緑体の三重の包膜のcontact siteを電顕的に調べたところ、この部位がタンパク質輸送を律速していることが示唆された。光合成の光化学系IIは,反応中心結合サブユニット,アンテナクロロフィル結合サブユニット及び水分解サブユニットから構成される超分子複合体である。それぞれのサブユニットは複数のタンパク質成分から構成され,それらは核又はプラスチドDNAによってコ-ドされている。光化学系IIの形成には,これらのDNAの情報発現が必要であるが,そこでは光が極めて重要な役割りを果している。本年度は,ユ-グレナとオオムギを用いて,光化学系IIのうちで酸素発生反応に直接関与すると考えられるタンパク質成分について,それらのチラコイド膜への集合と酸素発生活性の発現,およびそれらの過程に対する光作用の機構を明らかにする目的で研究を行った。その結果,次の様な研究成果を得た。1.ユ-グレナの緑化過程では,光化学系IIの反応中心コアを形成するタンパク質が,酸素発生に関与する膜表在性タンパク質より早い時期にチラコイドに蓄積を始めるが,これと関連して,アンテナクロロフィルタンパク質が膜表在性タンパク質の蓄積とほゞ平行して,光によって安定化されることを見出した。2.膜表在性タンパク質の前駆体をmーRNAの翻訳産物の免疫沈殿より検出したところ,それらは従来高等植物で知られていたものよりかなり高分子量のタンパク質であることが分った。また免疫電顕によりこの表在性タンパク質の前駆体と思われるタンパク質がゴルジ体に存在することが明らかとなった。3.オオムギでは緑化過程の極めて初期に,すでに葉緑体チラコイド膜に酸素発生に必要なMn原子,表在性タンパク質が存在していた.しかし光化学系IIの反応中心コアタンパク質が存在しないため,表在性タンパク質のチラコイド膜への結合は弱く,それに引き続く光照射によってコアタンパク質が膜に蓄積して初めて結合の安定化がもたらされた。ユ-グレナの光化学系II/酵素発生系の構成タンパク質の一つである膜表在性30KDaタンパク質の輸送過程を調べた。

その結果,このタンパク質は,45KDaの分子量をもつ前駆体として細胞質で合成された後,小胞体,又は小胞体様の性質を示す膜を経由して葉緑体へ輸送され,成熟型になることがほゞ確実となった。このタンパク質前駆体の構造を更に詳しく解折するために,cーDNAクロ-ニングを行った。現在,この遺伝子の構造を引き続き解折中である。オオムギの実生を用いて緑化過程での酵素発生系の形成機構の研究では,エチオプラストが葉緑体に発達する際に,チラコイド膜に蓄積する酵素発生系のタンパク質の存在状態を主に検討した。オオムギでは,エチオプラストに,膜表在性の3種類のタンパク質とチトクロムb_<559>が存在し,光照射に伴って短時間のうちに光化学系IIの反応中心結合タンパク質やアンテナクロロフィル結合タンパク質が蓄積し,光化学系II複合体が完成することが分った。暗条件下でのエチオプラストにおいて膜表在性タンパク質とチトクロムb_<559>が複合体の前駆体の様なものを形成しているのかという問題を架橋実験などで検討している。酵素発生反応には,光化学系IIの反応中心,マンガン原子,表在性タンパク質などが関与しているが,それらがお互いにどのような位置関係をチラコイド膜上でとり,どのような過程で反応が進行するかについては未だ充分な理解がなされていない。本年度はこの問題に取り組むために,ホウレンソウの光化学系II種品の酵素発生系膜成分の除去と光阻害との関連を調べ,その結果,光化学系IIからマンガン原子と膜表在性タンパク質が除去された条件下で弱光を照射すると,反応中心結合タンパク質と,それより更に著しい程度でアンテナクロロフィル結合タンパク質が分解されることを初めて見出した。酸素発生系の形成機構に関連して、ユーグレナの酸素発生系タンパク質である膜表存性30kDaタンパク質の精製を行った。このタンパク質の精製には、チラコイド膜を脱イオン水で処理するという極めて簡単な方法が有効であることがわかった。また、この結果から、このタンパク質がチラコイド膜に弱く結合していることが示唆され、高等植物葉緑体の対応するタンパク質である33kDaタンパク質の存在状態とは異なることが示された。ユーグレナ30kDaタンパク質の輸送経路を明らかにするために、このタンパク質のcDNAクローニングを行ない、タンパク質前駆体の構造を決定した。また、in vitro合成したタンパク質前駆体を用いて、単離葉緑体へのタンパク質輸送の実験も行った。ただし、輸送条件の設定の不完全さから、再現性のよい輸送系を確立するには至っていない。さらに、電子顕微鏡により、葉緑体包膜上にあるタンパク質輸送部位(contact site)の観察を行った。その結果、ユーグレナでは包膜の三重構造が輸送過程を律速している可能性が示された。免疫電顕により、タンパク質の成熟型および前駆体の細胞内の存在部位を決定する試みを行ったが、技術的な問題を未だ克服できていない。また、オオムギの光化学系IIの形成過程をタンパク質の蓄積のレベルで検討し、エチオプラストが葉緑体にまで発達する過程での33kDaタンパク質とcytochrome b559の果たす役割について、基礎的な知見を得た。
魚類の生殖巣に見い出されたカルシトニンmRNAの生理的意味の解明

本研究は、ラットの子宮の腺細胞で骨硬化ホルモンであるカルシトニンが発現しているという米国の研究者の報告に刺激され、試みにキンギョの精巣・卵巣をホモジェナイズしてRT-PCR法でカルシトニンcDNAが増幅されるか否かを行った所、まさしくそれが増幅され、さらにキンギョの精巣でカルシトニン免疫陽性神経線維が見っかつた所から始まった。従って、魚の生殖巣の神経がカルシトニンを発現させていると考えられた。そこで遺伝的に性が解明されるティラピア用いて生殖巣へ軸索を伸ばしている神経節に免疫染色を行ない、神経軸索が、例えば生殖巣の筋肉にアクセスしているのか、あるいはステロイド産生細胞へアクセスしているのか、神経節を切除したらどうなるか等を見るべく計画した。しかしながら、ティラピアの神経節に免疫陽性反応はなく、しかも神経節は分節していることがあり、全摘出は困難であることもわかった。従って、当初の計画は頓挫してしまった。しかしながら、生殖巣内のカルシトニンの発現にこだわり、新たなる試みとして、サケの未受精卵をホモジェナイズしてRT-PCR法によるカルシトニンcDNAの増幅を試みると、明らかに鰓後腺がつくるタイプと同じカルシトニンcDNAが増幅された。従って、残りの時間を全力を挙げて卵の中でカルシトニンmRNAがどこにあるのか、発生に伴ってどうなるのかを調べた。その結果、卵の動物極側に多く存在すること、卵膜にも卵黄にも存在し、発生中も検出できることがわかった。ペプチドホルモンのmRNAが未受精卵にすでに含まれているという発見は脊椎動物では初めてであり、日本動物学会第70回大会にて報告した(Zool. Sci.,17,suppl.6p)。結局、タイトルと研究内容が異なる結果となり、今回は教訓となったが、卵内のカルシトニンmRNAの発見は脊椎動物全体に関わる重要なことかもしれず、今後も研究を続けて行きたいと考えている。これまでの予備的研究において、キンギョでは生殖巣内の神経がカルシトニンを産生していることを免疫染色とRT-PCRで見いだしている。しかしながら、キンギョではその神経細胞の位置が不明であるのに対して、ティラピアでは、それは生殖巣外の特定の位置に存在する。従って、成熟に伴って神経細胞内でどのようにカルシトニン産生が変化するか、あるいは生殖巣を除去した時に、神経細胞がどうなるのか、が興味ある。しかしながら、in situ hybridizationや競合的RT-PCRでも、ティラピアのカルシトニンの塩基配列を知る必要がある。そこでカルシトニンの内分泌器官である鰓後腺を摘出し、それよりRT-PCRによってcDNA断片の増幅を試みたところ、上手く行き、次の段階へ進む手がかりができた。その配列を以下に記すが、これは過去に我々がすでに調べているベラのカルシトニンの塩基配列と96%の相同性をもち、さらにアミノ酸に置換すると100%同じであった。本研究は、重要なポイントで引っかかり、上手く進行していない。後1年という残された時間でどこまで解明できるか、全力を尽くすべく、現在、実験を考えている。上手く行かない肝腎な点は、テイラピアの生殖巣へ入って行く神経節をサケ・カルシトニンの抗体で染色しても、予想に反して神経節の細胞は染色されなかったと言う点である。用いた抗体は、サケばかりでなくカルシトニンならば他の種のカルシトニンでも染める力はあることがわかっている。

したがって、染色されなかった理由は、テイラピアの神経節がカルシトニンを作っていなかったことになる。あるいは、作っていても、その時は作っていなかった可能性もある。用いた個体は、雌雄とも成熟しておらず、成熟したときだけ、つくっていることも考えられるからである。さらに作っていても微量であったので免疫組織化学では検出できなかった可能性もある。テイラピアにおいてin situ hybridizationによってカルシトニンのmRNAを検出するのが近道と考えるが、他の魚種、例えば、すでに成熟した精巣からカルシトニンの抗体に反応する神経線維を検出しているキンギョでもう一度、確かめる手もあるかもしれない。但し、キンギョでは生殖巣へ入って行く、神経節がどこにあるのかがわかっていない。それは染色された神経線維を追えばわかるかもしれないが。また、今回、テイラピアの神経節は、それほどコンパクトにまとまった組織ではなく、比較的ルーズで、同じ種類の神経細胞の小塊が神経節のそばにあったりすることもわかった。従って、手術をするときでもかなりの注意を払って神経節の全部を摘出する必要があると感じた。今後は、残された時間を有効に使って魚の生殖巣に存在するカルシトニンを産生する神経の生理的意味の解明を目指す。本研究は、ラットの子宮の腺細胞で骨硬化ホルモンであるカルシトニンが発現しているという米国の研究者の報告に刺激され、試みにキンギョの精巣・卵巣をホモジェナイズしてRT-PCR法でカルシトニンcDNAが増幅されるか否かを行ったところ、まさしくそれが増幅され、さらにキンギョの精巣でカルシトニン免疫陽性神経線維が見つかった所から始まった。したがって、ティラピアを用いて生殖巣へ軸索を伸ばしている神経節に免疫染色を行ない、神経軸索が、例えば生殖巣の筋肉にアクセスしているのか、あるいはステロイド産生細胞へアクセスしているのか、神経節を切除したらどうなるのか等を見たかった。しかしながら、ティラピアの神経節に免疫陽性反応はなく、しかも神経節は分節していることがあり、全摘出は困難であることもわかった。従って、当初の計画は頓挫してしまった。しかしながら、生殖巣内のカルシトニンの発現にこだわり、さらに全くの試みに、サケの未受精卵を数個ホモジェナイズしてRT-PCR法による増幅を試みると、明らかに鰓後腺がつくるタイプと同じタイプのカルシトニンcDNAが増幅された。したがって、残りの時間を全力を挙げて卵の中でカルシトニンmRNAがどこにあるのか、発生に伴ってどうなるのかを調べた。その結果、卵の動物極側に多く存在すること、卵膜にも卵黄にも存在し、発生中も検出できることがわかった。ペプチドホルモンのmRNAが未受精卵にすでに含まれているという発見は脊椎動物では初めてであり、日本動物学会第70回大会にて報告した。詳細は、研究成果報告書に載せてある。タイトルと研究内容が異なる結果となり、今回は痛い教訓となったが、この発見は脊椎動物全体に関わる重要なことかもしれず、今後も研究を続けて行きたいと考えている。
発作性夜間血色素尿症(PNH)における変異クローンの選択的拡大機序

PNHは、造血幹細胞のPIG-A遺伝子体細胞変異により、GPIアンカー型膜蛋白(GPI-AP)を欠損する異常血球がクローン性拡大をきたし溶血などの臨床症状を呈する血液難病である。このクローン拡大機序に関しては増殖優位または生存優位説で説明が試みられてきたが、その詳細は不明である。後者は、PNHに特徴的な自己免疫機序による造血障害下では、異常クローンがその膜特性を利用して細胞障害リンパ球の攻撃を回避することで生存優位を獲得するという説であり、本研究はこれを実証する目的で計画された。我々は、まずGPI-AP欠損細胞株およびPIG-A cDNAを導入しGPI-AP発現を回復させた回復株のペア細胞株を標的細胞とした細胞障害活性測定法を確立し、欠損株がナチュラルキラー細胞(NK)のPerforin-Granzyme(Pf/Gz)による細胞障害に対して感受性が低下していることを明らかにした。次に、感受性低下のメカニズム解析を試み、精製したPfやIL-2で充分に活性化されたNKに対しては両株細胞間で細胞傷害感受性に差がなかったことから、Pf放出自体には問題が無く、標的細胞との接触によるNK活性化の過程に差があることが判明した。細胞接触によるNK活性化はIFN-γやTNF-αなどのサイトカイン産生能を指標にすると両株細胞間に差がないことから、欠損株におけるPf/Gz放出に特異的な細胞内情報伝達系の低下が示唆された。この結果から、欠損するGPI-APの中にPf/Gz放出に関与する分子が想定されたが、既存のGPI-APに対する単クローン抗体による抑制試験により責任分子の同定を試みるも特定できなかった。この分子の同定は今後の課題である。以上の研究成果より、PNH血球はNK細胞による細胞傷害から回避することで生存優位を獲得することが強く示唆された。(774文字)PNHは、造血幹細胞のPIG-A遺伝子体細胞変異により、GPIアンカー型膜蛋白(GPI-AP)を欠損する異常血球がクローン性拡大をきたし溶血などの臨床症状を呈する血液難病である。(774文字)PNHは造血幹細胞のPIG-A遺伝子変異に起因するクローン性疾患であり、異常クローンはGPIアンカー型膜蛋白(GPI-AP)欠損を特徴とする。臨床症状発現には異常クローン拡大が必須であり、しばしば正常細胞を凌駕するが、その拡大機序は不明である。一説としてPNH発生には自己免疫機序による造血障害が関与することから、異常クローンがその膜特性を利用して、自己免疫性細胞傷害から回避して選択的に拡大すると想定されている(生存優位説)。これを実証する目的で今年度は、1)GPI-AP発現の有無による細胞傷害感受性の違い、2)細胞傷害誘導エフェクター細胞の同定、3)細胞傷害様式、4)標的分子の同定、について検討した。標的細胞として、GPI-AP欠損株(K562,JY-5,Raji)および、PIG-A導入によりGPI-AP発現を回復させた回復株のペア株細胞を準備した。まず健常人末梢血単核球(PBMNC)をエフェクター細胞とし、51Cr放出法で細胞傷害活性を測定したところ、欠損株が回復株に比べ傷害されにくかった。そこで、この活性差がPBMNC中のどの細胞に起因するかを各種精製リンパ球を用い検討したところ、NK細胞が主役と判明した。この特性は13人のNK細胞で再現された。またNK細胞による細胞傷害様式は、阻害剤(EGTAおよびConcanamycin A)で完全に阻止されることから、Fas/Fasリガンド系ではなくPerforin-Granzyme系であった。以上よりGPI-AP膜発現の有無でNK細胞感受性が規定されることが明らかとなり、PNH細胞がNK細胞による細胞傷害から回避しうることが示された。

なお、このような感受性差にどのようなGPI-AP分子が関与するか未だ同定できておらず,次年度以降の課題である。PNHは、造血幹細胞のPIG-A遺伝子体細胞変異により、GPIアンカー型膜蛋白(GPI-AP)を欠損した異常血球がクローン性拡大をきたし溶血などの臨床症状を呈する血液難病である。このクローン拡大機序に関しては増殖優位または生存優位説で説明が試みられてきたが、その詳細は不明である。後者は、PNHに特徴的な自弓免疫機序による造血障害下では、異常クローンがその膜特性を利用して細胞障害リンパ球の攻撃を回避することで生存優位を獲得するという説であり、本研究はこれを実証する目的で計画された。13年度は、GPI-AP欠損細胞株およびPIG-A cDNA,を導入しGPI-AP発現を回復させた回復株のペア紬胞株を標的細胞とした細胞障害活性測定法を確立し、欠損株がナチュラルキラー細胞(NK)のPerforin-Granzyme(Pf/Gz)による細胞障害に対して感受性が低下していることを明らかにした。これをもとに14年度は、感受性低下のメカニズムの解析および標的分子の同定を試みた。まず精製したPfやIL-2で充分に活性化されたNKに対しては、両株細胞間で細胞傷害感受性に差がなかったことやから、Pfに対する感受性に差があるのではなく、細胞接着によるNK活性化の程度に差があることが明らかとなった。そこで細胞接着によるNK活性化をIFN-γやTNF-αなどのサイトカイン産生能でみてみると、両株細胞間では差が無く、欠損株によるPf/Gz放出に必要な十分な刺激が入らないことが原因であることが示唆された。つまり欠損するGPI-APの中にPf/Gz放出に関与する分子が想定されたが、既存のGPI-APに対する単クローン抗体による抑制試験では同定できず、との責任分子の同定が今後の課題である。以上の研究成果より、PNH細胞はNKによる細胞傷害から回避することで生存優位を獲得することが示唆された。(789文字)
歯の保存状況と生命予後に関する地域住民を対象とした25年コホート研究

沖縄県宮古島市および多良間村在住の40歳以上の地域住民5,742名(男性2,256名,女性3,486名)を対象に,歯の保存状況と生命予後との関連について1987年から2015年までの28年間の追跡調査を行った.機能歯数と生命予後との関連についてCox比例ハザード解析を用いて分析したところ,男女いずれも機能歯数が多い群(10歯以上群)が少ない群(10歯未満群)に比べて有意に生存期間が長いという結果であった(p=0.002).40歳以上の成人および高齢者において歯数は男女いずれも生命予後に関連する因子であることが示された.本研究の計画は、宮古島住民に対する下記事業を3年間で行うことである。研究1.現在歯数と生命予後長期(25年)コホート研究研究2.65歳以上の高齢者の機能歯数等の口腔内状況と25年後の身体状況の比較研究(前後研究)および85歳以上の高齢者の口腔内状況、全身状況についての長寿研究研究1にかかわる平成26年度計画は、死亡小票の目的外利用申請を行うことであり、その手順は、厚生労働省大臣官房統計情報部の予備審査と、その後総務省への目的外利用申請書の提出である。現在、予備審査を受けているところである。また計画時には、死亡小票の閲覧申請を予定していたが、3年間の死亡小票と25年間の死亡票の目的外利用申請の予備審査を受けている。研究2の65歳以上高齢者の歯科健診および全身の健康状態等に関わる質問紙調査の予備調査を行う予定であったが、これまで2014年10月8日・9日および2015年4月11日・12日に現地宮古島市を訪問し、保健所、宮古島市役所および宮古島地区歯科医師会等との協議を行った。高齢者調査の方法に関する協議であり、予備調査を行うことと同様の目的を果たしている。分担研究者との打ち合わせについては、東京で2回の会議(2014年8月9日、2015年3月27日)を開催し、それ以外にも定期的にWeb会議を行って、事業計画の進行状況および対処について協議した。本研究の計画は、宮古島住民に対する下記事業を3年間で行うことである。研究1.現在歯数と生命予後長期(25年)コホート研究研究2.65歳以上の高齢者の機能歯数等の口腔内状況と25年後の身体状況の比較研究(前後研究)および85歳以上の高齢者の口腔内状況、全身状況についての長寿研究研究1にかかわる平成26年度計画は、死亡小票の目的外利用申請を行うことであり、その手順は、厚生労働省大臣官房統計情報部の予備審査と、その後、総務省への目的外利用申請書の提出である。現在、予備審査を受けているところであるが、概ね2016年6月には、許可が得られる予定との回答を得ている。また計画時には、死亡小票の閲覧申請を予定していたが、3年間の死亡小票と25年間の死亡票(CDR転写)および死亡個票の目的外利用申請を行っている。研究2の65歳以上高齢者の歯科健診および全身の健康状態等に関わる質問紙調査については、2015年12月20日に宮古島市住民を対象とした講演を行うと共に、翌21日には宮古島市下地地区の住民(高齢者)の歯科検診を実施した。今年度の予定の歯科医院受診患者を対象とした高齢者調査および保健所を訪問しての転記作業については現在、宮古地区歯科医師会および保健所と協議している。分担研究者との打ち合わせについては東京での会議(2016年1月18日)を開催し、それ以外にも定期的にWeb会議を行って、事業計画の進行状況および対処について協議した。死亡情報の目的外利用の許可が遅れているのが理由である。しかし、目的外利用申請については、2016年6月に許可が得られるとの回答をすでに得ており、死亡票(CD-R転写分)を得られ次第、5年間のコホート分析に着手する。また、死亡小票の宮古福祉保健所内での転記作業については、保健所長および沖縄県と日程調整中(7月予定)である。死亡小票および死亡票とベースラインデータとの連結手順については、ベースラインデータの対象者の居住地の再入力等、死亡票に合わせた準備を完了している。また、高齢者の調査については、市および地区歯科医師会の協力を得て10月には完了する予定であるので、ほぼ計画通りの進行状況である。本研究の申請計画は、宮古島住民に対する下記事業を平成26年から28年の3年間で行うことであるが、前後比較研究を継続することおよび生存状況の確定をより精緻にするための調査を継続するため平成29年の1年間の延長を行った研究1.現在歯数と生命予後長期(25年)コホート研究研究2.65歳以上の高齢者の機能歯数等の口腔内状況と25年後の身体状況の比較研究(前後研究)および85歳以上の高齢者の口腔内状況、全身状況についての長寿研究研究1については、目的外利用申請を行った結果、厚生労働省より平成28年7月28日付で人口動態調査に係る調査票情報の提供を得た。内容は、人口動態調査死亡票(昭和62年1月平成27年12月)および死亡個票(平成15年1月平成25年12月)である。また, 8月1日から8月3日に宮古保健所において死亡小票(平成26年1月平成27年12月)の転記作業を行った。

現在、昭和62年に得た住民歯科健診情報等(5,777名)との連結作業とデータクリーニングを行っている。調査期間内の死亡者数は3,242名であった。研究2の65歳以上高齢者の歯科健診および全身の健康状態等に関わる質問紙調査については、平成28年7月1日から11月30日までの期間、宮古島市内9歯科医療機関において調査を行った。平成27年に行った住民歯科健診と合わせて、298名(男性124名、女性174名)である。現在データ分析を行うと共に、昭和62年調査データとの連結作業を行い、前後比較の対象者の選定を行っているところである。また、平成28年度に宮古島市役所、保健所、歯科医師会等関係者との協議と住民対象の説明会等は随時行った。死亡情報の目的外利用の許可が遅れていたが、平成28年度中に厚生労働省の許可を得、データを得ることができた。高齢者歯科健診についても平成28年度予定通り実施することができた。調査期間内の対象者の生存状況の確定については、対象者のベースライン時からの転居情報等も考慮して、より精緻に行うことを平成29年度に行う計画である。本研究の目的は,2005年に報告した沖縄県宮古島市在住の40歳以上5,700名規模の地域住民を対象に行った15年コホート調査結果(1987年2002年)を基に,その追跡期間を2015年まで延長し歯の保存状況と生命予後との関連について明らかにすることである.併せて,現存者の口腔内状況および健康状態を調査し,ベースライン時からの変化と生存との関係を検討することである.方法は,調査期間の生存状況の確認を厚生労働大臣への人口動態調査に関る調査票情報の提供申出後承認され得られた死亡票,死亡個票,および許可された死亡小票の閲覧と転記作業によって得られた情報から分析した.最終年度の本年度は,生存状況について聞き取り調査等によりその精度を高めた.現存者の口腔内状況については,昨年度までに得られたベースライン対象者を含む65歳以上の住民歯科健診結果を基に,ベースライン時との比較を行った.15年コホート結果では,機能歯数と生命予後との関連は,男性に顕著であったのに対して女性においてはその関連は明確ではなかった.それに対して今回の調査でKaplan-Meier法およびCox比例ハザード解析を用いて分析した結果,男性における関連は,15年コホート結果に比べてより強く認められた.加えて女性においても機能歯数の減少が寿命を有意に短縮することが明らかになった.死亡原因について検討した結果,女性において機能歯数が少ない群は多い群に比べて有意に肺炎による死亡が有意に高い割合を示した.以上の結果から,歯の保存状況が生命予後に及ぼす影響は,その期間が男女で異なるもののいずれにおいてもその関連は有意であり,歯の喪失は寿命を短縮するリスクファクターの一つである.したがって,地域住民の歯の保存状況を把握し政策的に歯の喪失予防を図ることは寿命延伸に寄与する.沖縄県宮古島市および多良間村在住の40歳以上の地域住民5,742名(男性2,256名,女性3,486名)を対象に,歯の保存状況と生命予後との関連について1987年から2015年までの28年間の追跡調査を行った.機能歯数と生命予後との関連についてCox比例ハザード解析を用いて分析したところ,男女いずれも機能歯数が多い群(10歯以上群)が少ない群(10歯未満群)に比べて有意に生存期間が長いという結果であった(p=0.002).40歳以上の成人および高齢者において歯数は男女いずれも生命予後に関連する因子であることが示された.概ね順調に進展している。理由目的外利用申請については、予備審査を受けているところであり、その後の総務省の申請及び許可取得も平成27年度中には完了し、保健所での転記作業も終了すると予想され、当初の計画通りの進行状況である。
古代東アジアと西アジアへの家畜馬の拡散に関する研究

本研究は、日本国内におけるプロジェクトとトルコにおけるプロジェクトの2つの部分からなる。日本国内のプロジェクトでは、日本の古代-中世の遺跡から出土したウマのサイズと形態に関するデータを収集し、日本への家畜馬の導入経緯や日本固有の品種の成立過程について明らかにすることを目的とした。関東地方と長野県の古代近世の遺跡および関西地方(奈良、大阪)の古代中世の遺跡出土のウマの歯および四肢骨の計測データを収集した。日本の家畜馬の体格の時代的な変遷を考察するための資料が蓄積されるとともに、ウマの生産地である長野県佐久地方出土のウマの形態やサイズと、古代、鎌倉時代、江戸時代にそれぞれ政治や経済の中心でウマが供給され仕様された地域との比較が可能になりつつある。また、多数のウマが出土している長野県、神奈川県、茨城県の4遺跡から出土したウマ遺体の歯にみられる異常な摩耗や、後頭部、脊椎骨、中手骨、中足骨にみられる骨増殖などの病変の有無を観察し記録し、ウマの用途について考察した。トルコの遺跡出土動物骨の資料収集プロジェクトに関しては、総研大に保管されているトルコ南東部の新石器時代遺跡から出土した動物骨の分析を行うとともに、トルコの中央部、南東部の遺跡出土動物骨の資料を収集する目的で海外調査をおこなった。特にトルコ中央部のテペジク遺跡では、野生のウマが出土しており、ユーラシア大陸に生息した野生馬の重要な資料を得ることができた。本研究は日本の古代中世の遺跡から出土したウマのサイズと形態に関するデータを収集し、日本への家畜馬の導入経緯や日本固有の品種の成立過程について明らかにすることを目的とする。分担者のギュンデムは、11月に来日し、生活の準備、1ヶ月間の日本語研修、物品の購入等の研究の準備の後、実際に研究を開始できたのは1月末であったため、今年度の研究活動は限定的なものであった。今年度は、長野県の遺跡出土のウマ骨の資料を収集し、同定と計測を行った。また、もうひとつの研究プロジェクトである、西アジアの遺跡出土動物骨の資料収集に関しては、総研大に保管されているトルコ南東部の新石器時代遺跡から出土した動物骨の分析を行った。また、イスタンブール大学に所蔵されているチャヨヌ遺跡出土の動物骨の計測、とくにウマ科(オネガー)の骨の計測、分析を行った。23年度は、長野県・と関東地方の古代近世遺跡出土のウマ骨の資料を収集し、計測を行った。ウマは権力層と結びついた家畜で、戦争における重要性などからも考古学的な関心は高いが、日本の古代、中世の遺跡から出土するウマの骨格形態とサイズに関する網羅的な研究はこれまで行われていなかった。もうひとつの研究プロジェクトである、西アジアの遺跡出土動物骨の資料収集に関しては、総研大に保管されているトルコ南東部の新石器時代遺跡から出土した約3000点の動物骨の分析を行った。7月8月上旬、トルコ南東部バットマン県のハサンケイフ遺跡の、筑波大学による発掘調査に受け入れ研究者と共に参加し、約5000点の出土動物遺存体資料を分析、記載した。出土動物遺存体の分析をおこなった。また、8月中旬、トルコ中央部ニーデ県のテペジク遺跡の発掘調査に参加した。この調査はイスタンブール大学により行われており、新石器時代から銅石器時代までの長期間継続して居住された遺跡であることから、中央アナトリアにおける家畜飼育に関して、他の遺跡からは得られない通時的なデータを得られることが期待される。また、当時この地域に生息していた野生馬の利用や絶滅の時期に関して解明するため、出土資料の研究を進めている。当初の計画では、23年度は、岩手・宮城・福島の考古遺跡から出土したウマ骨格の計測データを収集する予定だったが、東日本大震災のため、所蔵機関に資料閲覧の対応をしていただくことが困難になり、延期した。しかし、長野県屋代遺跡・西近津遺跡群・茨城県村松白根遺跡・神奈川県由比ガ浜南遺跡から出土した古墳時代江戸時代初期の出土馬の骨格の計測を進め、データを蓄積することができた。

また、トルコのテペジク遺跡から出土した、銅石器時代の野生馬の資料を収集し、中央アナトリア高原に生息していた野生馬がいつごろ絶滅したか、オネガーなど他のウマ科野生動物の狩猟と共に、生業の中でどのような位置を占めていたかなどの問題を解明する研究を継続する今後は、神奈川県由比ガ浜南遺跡の大量の資料の計測を進め、大阪・奈良の遺跡から出土した古代のウマ骨格資料の収集を進める。
背皮弁観察窓を用いたラット移植腫瘍の新生血管の増殖動態の観察

目的:ラットの背皮に直径1cmの観察窓を作成し、移植可能な腫瘍塊を観察窓内に置き、光学顕微鏡下で腫瘍組織、腫瘍内血管の発達を観察、計測した。方法:1)実験動物:7週令のfischer rat(清水実験動物)に自家製の背部観察窓を装着した。2)移植腫瘍:MammaryadenocarcinomaをAmerican type culture collection(株)より購入し、ラットに移植継代維持している。その塊(0.1mm^3)を観察窓の中に置き、23日毎に観察を行い、移植腫瘍の着床状態を観察した。3)背部観察窓:直径1cmで、厚さ1mmの石英ガラス、間隙200μmのアルミニウム製の観察窓を作成した。4)腫瘍、腫瘍内血管の成長の計測:移植腫瘍が窓内に着床後、毎日写真撮影を行い、腫瘍径と腫瘍血管を観察者がtraceし、その面積をNIH imageを用いて算出した。結果及び考察:腫瘍移植後9日目で腫瘍面積は0.15mm^2程度、血管面積は0.04mm^2であった。それが、10、11日目の腫瘍面積は0.54、1.7mm^2、腫瘍血管面積は0.12、0.47mm^2と経日的に対数増大を示すが、腫瘍容積と腫瘍血管の増大量は直線関係を示した。腫瘍増大には血管の増大が必要なことが、本法によって直接確認された。
微細構造を制御した高性能な非鉛系圧電セラミックスの作製

予定計画により、アルカリ濃度、表面活性剤の量、合成温度と時間などの水熱合成条件を再検討した結果、破片の少ない、厚み12μmの板状NaNbO3が合成できた。改善した点は、原料調合時にアルカリの水和熱によって暖められた溶液が室温になってからNb2O5を混ぜ込むことと、合成後の冷却速度を制御することである。前者により、Nb2O5の分解から合成反応が順方向に進むようになり、後者によりNaNbO3の成長が最適化された。NaNbO3テンプレートをより高く配向させるには、テープ成型ブレードの高さを50μm(第一)と30μm(第二)に狭くした。その結果、乾燥後の厚みが2.7μmになる薄いシートを成型できた。そのシートを一定厚みまで円筒状に巻いた後、φ12mmに切り抜くことにより、うまく重ね合わせに成功した。260MPaの一軸加圧や脱脂・焼結を経て、緻密なセラミックス試料を作製できた。その配向度を前年度の17%から約倍の36.5%まで向上した。本研究で得られた最高値の49%に再現できなかった。高温拡散観察と高温粒子成長観察を行った。はっきりとしたテンプレート粒子の成長は観察されなかったが、周囲にあるマトリックス粒子よりサイズが大きいので、焼結中に成長したことは焼結体のSEM観察で確認できた。ただし、配向度がまだ低い原因の究明は今後の課題になる。結果的に、本研究の目的であるキーポイント(a), (b)と(c)を併せ持つ圧電セラミックスである、97%以上高緻密、80%以上高配向度、かつ平均粒径が10μm以下の高性能な非鉛系圧電セラミックスを低コストで作製するプロセスにまだ課題が残っているが、焼結プロセスの最適化により、その可能性が十分にあると言えるだろう。予定計画により、初年度の結果を再検討し、アルカリ濃度、表面活性剤の量、合成温度と時間などの水熱合成条件を変えて板状NaNbO3の厚みを1μm以下に制御する試みをしたが、破片や未成長粒子の割合が増えたので、配向セラミックス作製に適していないと判断した。よって、厚みを2μm以下になるようにNaNbO3テンプレートを作製して、次のステップに進めた。上記のNaNbO3テンプレートと平均粒径0.8μm以下の(K,Na)NbO3マトリックス材を重量比3:17で調合したスラリーからシート成形でセラミックスグリーンを作製した。脱脂後、1100°C1170°Cで3時間保温の条件で焼結した。1140°Cで焼結した試料は高い密度を有した。しかし、円形試料の切り抜き作業のため、成形したシートの厚みが約60μmとなり、テンプレートを横にするせん断力が十分に発揮できなかった原因で、焼結した試料の配向度が20%以下であり、配向セラミックスとは言えない。シート成形時のせん断力を利用するには、厚み30μm以下にする必要があるとわかった。薄いシートを成型できるスラリーの調合と、切り抜くプロセスの改善が課題となった。高温拡散観察と高温粒子成長観察を行ったが、自作の簡易型高温顕微鏡が溶融温度まで加熱するために大きな電流を流した原因で、加熱装置が故障してしまい、うまく観察できなかった。この原因で、最適な焼結条件を決定できなかった。結果的に、最も重要なことである高い配向度を持つセラミックスの作製についてはH28年度の結果より新しい進展はなかった。本研究の目的と予定計画により、H29年度には最終組成で70%の配向度を持つ圧電セラミックスを作製でき、評価を行うべきだったが、70%の配向度には達していない。その原因は、スラリーの調合に改善すべき点が幾つかあると考えられる。1NaNbO3テンプレートの分散;2低粘性スラリーの調合;3焼結プロセスの調整などが挙げれる。