hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
生体内活性酸素種生成量の間接的推定法の開発と臨床応用

平成25年度においては、基礎的検討のひとつとして水素ガス吸入によるROS評価と臨床試験として種々の生活習慣が水素消費量・ROS生成量に与える影響を検討する計画を立てた。予備的検討として市販の密閉型マスクによる試験を実施したところ、必ずしも一致しなかった。マスク呼吸による鼻呼吸とマウス呼吸による口呼吸の影響によるものと考えられ、さらに詳細な検討が必要となり今後の課題となった、他方、水素消費量の予備試験では水素水飲水法と水素ガス吸入法を検討したところ、ヒトでは38%程度の水素消費量を認めた結果の妥当性を検証するため、心・肺などで活性酸素の上昇が報告されているモノクロタリン誘発性肺高血圧症ラットを用いて水素消費量の検討を行った。正常ラットの水素消費率は28%であったのに対してモノクロタリン肺高血圧症では32%とやや上昇したものの有意差は認められなかった。すでに報告されているし健康成人を対象とした方法(マウスピース法)では38%,自然呼吸の場合の簡易的な水素水飲水法で行った水素消費量の推定値は2025%程度と予測した値よりも大きく、マウスピース法の場合では平成25年度は麻酔人工呼吸器下でのラットを用いて、準閉鎖系での水素水飲水の際の水素消費量を評価した。また、水素分子の溶存以外にも分子吸着の存在を示唆している報告もあるため、血液中への水素溶存が血液水分以外にもあるか否かを検討した。当初予定の研究計画を進めるにあたって、水素水飲水法と水素ガス吸入法の水素ガス摂取のより詳細なメカニズムを明らかにする必要がでてきた。そこで、疾患モデルを用いた検討が必要になった。そのため、当初予定の研究計画の実施は遅れることになったが、本研究の成果として生体内における水素ガスカスケードの存在と肝臓における水素消費が明確になった。水素分子の生体内機能を明確にする上で一定の成果がは得られた。活性酸素種(ROS)は種々の酸化ストレス疾患に関与し、ROSの中でも特にヒドロキシルラジカル(OH・)は反応性がきわめて強く生体内寿命はきわめて短いため、ヒト全身におけるROSの直接計測は難しい。他方、水素分子(H2)が弱いながらも選択的にOH・を消去することが明らかになりつつある。本研究はROSまたはOH・をヒトで安全かつ定量的に評価する方法として、1低濃度H2ガス吸入または2H2含有水を飲み消失する水素量から間接的に推定する簡便法と3抗酸化剤投与前後の生体ガス中の超高感度質量分析から求める分析システムを開発し、種々の日常生活習慣や運動負荷時、循環器関連疾患におけるROS生成量計測の臨床試験を実施することを目的とする。いずれも生体内OH・の間接的評価法であるが、原理的にヒトに対して安全かつ簡便な世界初のヒト生体内OH・計測法となることが期待できる。また活性酸素種計測の臨床的ニーズが強くあり、新規臨床検査法として展開可能である。当該年度は、H2含有水を飲み消失する水素量から間接的に推定する簡便法をヒトで確認を行った。そして、活性酸素種消失を生体内の動態とリンクさせ検証するために、ラットにH2含有水飲水を行い検討した。さらに循環器疾患モデルであるモノクロタリン(MCT)誘発性肺高血圧ラットにも同様にH2含有水の飲水を行い、対照群と比較検討を行った。得られた呼気水素濃度曲線を、薬力学においての経口投与時における1次吸収1-コンパートメントモデルに倣い、H2含有水の生体内への吸収、排出などの動態の解析を試み、種差の異なる、ヒトとの比較を行った。本研究の目的は1低濃度

H2ガス吸入または2H2含有水を飲み消失する水素量から間接的に推定する簡便法と3抗酸化剤投与前後の生体ガス中の超高感度質量分析から求める分析システムを開発し、種々の日常生活習慣や運動負荷時、循環器関連疾患におけるROS生成量計測の臨床試験を実施することである。当該年度では、ヒトと同様にラットでのH2含有水飲水に伴い、生体内での水素消失を確認した。さらに呼気水素濃度曲線を、薬力学においての経口投与時における1次吸収1-コンパートメントモデルより、呼気排出ピーク値の時間tmax、呼気水素排気量Cmax、排出の傾きから吸収速度定数ka、除去速度定数keを求めた。ラットに比べ、ヒトの呼気排出ピーク値の時間tmaxは遅く、吸収速度定数kaも除去速度定数keも有意に低かった。これは飲水後、上部消化管吸収から呼気排気への解剖学的な距離と相まって循環時間が長いことが考えられた。ラットでの実験では心拍数および血圧も同時に計測した。モノクロタリン(MCT)誘発性肺高血圧ラットと正常群とでは共に差はなかったが、血圧が体内へのH2含有水の取り込みである、収速度定数kaと有意に相関した。さらに、水素摂取量と排出量の比より求めた水素消失率は、MCT群と対照群との間では有意な差は現時点では確認できなかった。循環器疾患モデルラットと対照群との群間での水素消失率の比較を、さらに突き詰める。また、抗酸化剤投与前後での水素消失率も同様に検討し、水素の抗酸化作用の立証を試みる。H2含有水飲水と生体内循環経路が異なる、低濃度H2ガス吸入を行い比較検討を行い、有用性を検証する。病態下におけるOH・生成量の臨床評価試験に先立ち、開発した計測技術を用い、成人50名を対象に低濃度水素ガス吸入、水素水飲水による水素消費量を計測する。生体内水素摂取量と血液・呼気凝縮液・尿中のOH・特異性の高い酸化ストレスマーカ(8-OHdG)/臨床検査成績/生活習慣(喫煙、飲酒、睡眠、運動、ストレス、食生活習慣など)との関連を探索する。水素ガス計測装置である半導体つきガスクロマトグラフのカラムエージング代1回約10万円×2回。血液・呼気凝縮液の酸化ストレスマーカであるBAP、oxy、d-ROM検出キット、尿中のOH・特異性の高い酸化ストレスマーカ8-OHdG検出キットなど約30万円被験者への謝礼、消耗品、国内海外での成果報告発表での使用を計画。
水素ダイアグラムの提唱-水素化物中での水素の存在状態は如何に遷移するか

水素化物中の水素は、原子性、共有結合性、陰・陽イオン性など、多彩な結合状態を示すことが知られているが、これらの存在状態間の遷移に関する系統的な研究報告は無い。そこで本研究では、金属間化合物CaPdをヘリウムグローブボックス中での高周波溶解により作製して、粉末X線・中性子回折測定、水素定量分析、水素力一組成等温線(PCT)測定などを用いて、水素の存在状態間の遷移の観点からその水素化特性を実験的に解析した。その結果、広い温度域で特異な水素化・脱水素化反応が進行することが判明した。すなわち、273-473Kの低温域においては、共有結合性の水素を有するCaPdH_<2.0>(三方晶)に対してさらに格子間水素が侵入してCaPdH_<2.4>(擬立方晶)が生成することで可逆的な水素化・脱水素化反応が進行する。より高温域の473-773Kにおいては、CaPdH_2と1/2CaPd_2+1/2CaH_2との間で相分解-再結合が生じることで可逆的な水素化・脱水素化反応が進行する。また最も高温域の873K付近においては、1/2CaPd_2+1/2CaH_2が金属間化合物CaPdに戻る(再生する)。このように、金属間化合物CaPdでは、温度域に応じた水素の存在状態間の遷移により、水素の格子間侵入および相分解-再結合という多段(multimode)での脱水素化・再水素化反応が連続的に進行する。水素の存在状態間の遷移に関するこの性質は、今後、水素ダイアグラムを用いて広い温度域で利用できる新たな水素貯蔵材料を設計するうえできわめて重要となる。
日本人のインスリン抵抗性に関与する遺伝子の同定

1、細胞レベルやノックアウトマウスを解析することにより、インスリン作用機序を解明した。肝臓特異的にPKCλを欠損するマウスは、肝臓における脂肪酸合成系遺伝子の発現低下及び中性脂肪蓄積の低下に加え、インスリン感受性の増強を示した。培養細胞系での検討ともあわせて、PKCλは肝臓における脂肪酸合成制御に必須の役割を果たすとともに、個体レベルでのインスリン感受性の制御にも関与することを明らかとした。また転写因子であるSTAT3を肝特異的に欠損したマウスは、通常食飼育下でインスリン抵抗性を示し、高脂肪食飼育により耐糖能障害を呈した。本マウスの肝では糖新生に関わるPEPCKやG6Pase、また、これらの遺伝子の制御因子である転写コアクチベータ-PGC1αの発現が増加していた。培養肝細胞を用いた実験でもSTAT3が、これらの遺伝子の発現に関与していることを示した。以上より、STAT3は肝における糖新生系酵素の生理的な調節因子であることを示した。その他に、PI 3キナーゼ、PDK-1、SREBP-1、p27^<kip1>などの分子について、新たな知見を示した。2、インスリン抵抗性に関与する遺伝子について、遺伝子多型を同定し患者対照研究により糖尿病感受性遺伝子を同定した。候補遺伝子のSNP解析において患者対照関連解析を行うとともに、magnetic resonance spectroscopy(MRS)により骨格筋細胞内脂肪含量(IMCL)や肝細胞内脂肪含量(HLC)などを測定し、これらを含む詳細な臨床情報との関連を検討した。UCP1遺伝子の5'UTRに存在するA>C多型が2型糖尿病発症と関連があり、このリスクアリルであるCアリル保持者はHLC、HOMA-IRが有意に高いことを示した。UCPl遺伝子に関してはプロモーターに存在するA/C多型とMet229Leu多型を同定した。両者は連鎖不平衡の関係にあった。2型糖尿病患者320名、正常対照者250名に関して多型頻度を解析したところ、前者に関して糖尿病群ではA/A:257名、A/C:61名、C/C:2名でCアリル頻度は10.2%あったが、正常対照群ではA/A:220名、A/C:29名、C/C:1名でCアリル頻度は6.2%であり出現頻度に有意差を認めた。(P=0.017、χ^2検定)A/A型プロモーターとC/C型プロモーターの機能をルシフェラーゼァッセイを用いて解析したところ、C/C型の機能はA/A型の40%に低下していた。以上からUCP1遺伝子のプロモーター内のC多型はUCP1の発現低下や2型糖尿病との相関を有することが示された。AMPKは、レプチンやビグアナイド薬の作用を仲介している分子として現在非常に注目されているセリン・スレオニンキナーゼである。このγサブユニットをコードするPRKAG遺伝子に関して、Pro46Alaを同定した。2型糖尿病患者428名、正常対照者412名に関して多型頻度を解析したところ、糖尿病群ではPro/Pro:192名、Pro/Ala:198名、Ala/Ala:38名でAlaアリル頻度は32%であった。一方、正常対照群ではPro/Pro:178名、Pro/Ala:180名、Ala/Ala:54名でAlaアリル頻度は35%であり、両群間に有意差を認めなかった。他にintron4+31C/G多型も同定されたが、同様に糖尿病群と正常群で出現頻度に有意差は確認できなかった。2型糖尿病者200名とその対照コントロール200名のDNAサンプルは神戸大学、東京女子医科大学それぞれにおいて収集できた。

今後は、これらの検体も用いて遺伝子解析を行うPI3-キナーゼが個体レベルでインスリン作用にどのようにかかわっているかを明らかにするために、アデノウイルスベクターを用いてマウスの肝臓特異的にPI3-キナーゼの優位抑制型蛋白を発現した所、そのマウスにおいてインスリン抵抗性、耐糖能の異常、血中FFAならびに中性脂肪の低下がみられた。従って、PI3-キナーゼは個体レベルでもインスリン作用の発現に重要な働きをしていると考えられた。候補遺伝子アプローチとしては、IRS-2遺伝子について検討した。IRS-2はインスリン受容体の基質であり、インスリン情報伝達に重要な働きをしていることが、そのノックアウトマウスが糖尿病を示すことから明らかにされている。そこでヒトIRS2遺伝子の上流2399塩基をクローニングして、その多型を調べた。その結果、-765C/Tならびに-2062T/Cという2つのSNPをみいだしたが、いずれも2型糖尿病者と対照コントロールでその頻度に差はなかった。しかしながら、-765C/TはインスリンによるIRS-2遺伝子の転写抑制に関与していることが示唆された。また、同じく候補遺伝子アプローチとしてAMPK遺伝子について検討した。AMPKはAMPによって活性化される蛋白キナーゼであり、インスリン抵抗性の発現に深く関係していることが明らかにされつつある。AMPKは、α、β、γの3つのサブユニットからなる。αは触媒サブユニット、β、γは調節サブユニットである。我々はγ3サブユニットのSNPのひとつの頻度が糖尿病者と対照コントロールとで異なることを見い出した。今後この意義についての詳細な検討が必要である。研究代表者の春日らは、インスリン抵抗性を示すマウスを遺伝子操作によって作製した。すなわち、転写因子であるSTAT3を肝特異的に欠損したマウスを作製すると、肝における糖新生系酵素の発現が上昇し、肥満とインスリン抵抗性を呈することを見い出した。すなわち、生理的にSTAT3を活性化するリガンドが存在し、これらが耐糖能の正常化に関与していると考えられた。一方、インスリンによってPIS-キナーゼの下流で活性化されるPKCλを肝特異的に欠損したマウスでは、肝における脂肪含量が低下しインスリン感受性が良化していることを見い出した。この時、肝におけるSREBP-1cの発現量は低下しているので、インスリンによるSREBP-1cを介しての脂肪合成にPKCλが関与している可能性が示された。春日らは、候補遺伝子アプローチとして、PGC1α,CPT1A, SREBP1、FATP4をとりあげ、それらのSNPを同定するとともに、2型糖尿病者450名、正常対照者360名を用いて、同定したSNPについてcase-control相関解析を行った。しかしながら、いずれのSNPも2群間でアレル頻度に有意差はなかった。2型糖尿病者に限って臨床データと遺伝子多型との関係を検討した所、CPT1AのひとつのSNPと肝細胞内の脂肪含量との間に有意な相関を認めた。研究分担者の岩本らは、日本人256組の罹患同胞対を用いて連鎖解析を行い、染色体上の12ヵ所で2型糖尿病の発症に有意な部位を認めた。
インドネシア高層気象データベースの構築による赤道域準2年周期気候変動の解明

本研究の目的は,これまで"気候学上の空白領域"となっていたインドネシア「海洋大陸」域の長期にわたる高層気象観測資料(生データ)を,各気象官署へ出張するなどして収集し,これに基いて,「準2年周期振動(QBO)」の生成・維持機構を解明することであった.政変に伴って渡航が一時制限されたりしたが,最終的にはほぼ交付申請書記載の事項を達成できた.初(10)年度には,インドネシア全土11地点における最近8年間(199198年)のレーウィンゾンデ観測資料のデジタル化と信頼度チェックを開始し,米国海洋大気庁(NOAA)や日本気象庁の客観解析データ等と比較し有効性を検討した.Hadley循環の年周期南北変位とこれに伴う偏東風ジェット気流半年周期振動,さらにエルニーニョ南方振動と相関のあるQBO西風フェイズの対流圏内への垂れ下がりなどの結果を得た.次(11)年度には,データ収集作業を継続して行い,1999年分まで極力収集した.収集したデータの有効性(連続性・信頼度)について,他の東南アジア諸国の各気象庁(局)と連絡を取り,比較検討のため既存の高層気象観測データベースをも部分的に入手して検討に加えた.収集したデータから,QBOの空間構造,ENSOと関連していると思われる大きな偏差,インド洋側からの大規模擾乱の影響,などが明かになりつつある.データベースは最終的に日本(神戸大学)・インドネシア(BPPT)双方のサイト上に置き,代表的な図面などはホームページ等を用いて広範囲に公開している.本研究の目的は,これまで"気候学上の空白領域"となっていたインドネシア「海洋大陸」域の長期にわたる高層気象観測資料(生データ)を,各気象官署へ出張するなどして収集し,これに基いて,「準2年周期振動(QBO)」の生成・維持機構を解明することであった.政変に伴って渡航が一時制限されたりしたが,最終的にはほぼ交付申請書記載の事項を達成できた.初(10)年度には,インドネシア全土11地点における最近8年間(199198年)のレーウィンゾンデ観測資料のデジタル化と信頼度チェックを開始し,米国海洋大気庁(NOAA)や日本気象庁の客観解析データ等と比較し有効性を検討した.Hadley循環の年周期南北変位とこれに伴う偏東風ジェット気流半年周期振動,さらにエルニーニョ南方振動と相関のあるQBO西風フェイズの対流圏内への垂れ下がりなどの結果を得た.次(11)年度には,データ収集作業を継続して行い,1999年分まで極力収集した.収集したデータの有効性(連続性・信頼度)について,他の東南アジア諸国の各気象庁(局)と連絡を取り,比較検討のため既存の高層気象観測データベースをも部分的に入手して検討に加えた.収集したデータから,QBOの空間構造,ENSOと関連していると思われる大きな偏差,インド洋側からの大規模擾乱の影響,などが明かになりつつある.データベースは最終的に日本(神戸大学)・インドネシア(BPPT)双方のサイト上に置き,代表的な図面などはホームページ等を用いて広範囲に公開している.本研究の目的は,これまで“気候学上の空白領域"となっていたインドネシア「海洋大陸」域の長期にわたる高層気象観測資料(生データ)を,各気象官署へ出張するなどして収集し,信頼度その他の入念な検討を踏まえてデータベース化するとともに,これに基いて,気候変動の基本モードとして重要視されながら特に励起源となる波動(下部成層圏)・対流(対流圏内)の実態に謎の多い「準2年周期振動(QBO)」の生成・維持機構を,飛躍的に解明することである。計画調書の時点では3年計画であったものが2年計画として採択されたため,交付申請書の時点で,計画調書では2年次に実施予定の内容も初年次である本年度中に一部前倒しで行う形に修正した。また政変に伴って渡航が一時制限されたりしたが,最終的にはほぼ交付申請書記載の事項を達成できた。まずジャカルタの技術応用評価庁(BPPT)およびBMG本庁に出張して,本研究全体の具体的計画を確定させ,「高層気象観測」の生データの複写・収集作業を開始した。本報告書執筆時点において,インドネシア全土11地点における最近8年間(199198年)のレーウィンゾンデ観測資料のデジタル化と信頼度チェックを完了し,日本(神戸大学)およびインドネシア(BPPT)双方の計算機上にデータベースとして置き,研究分担者間で公開して,米国海洋大気庁(NOAA)や日本気象庁の客観解析データ等と比較し有効性を検討した。さらに,下部成層圏と対流圏内それぞれのQBOの解析を開始するとともに,新たにHadley循環の年周期南北変位とこれに伴う偏東風ジェット気流半年周期振動さらにエルニーニョ南方振動と相関のあるQBO西風フェイズの対流圏内への垂れ下がりなどの極めて興味深い結果を得た。本研究の目的は,これまで"気候学上の空白領域"となっていたインドネシア「海洋大陸」域の長期にわたる高層気象観測資料(生データ)を,各気象官署へ出張するなどして収集し,信頼度その他の入念な検討を踏まえてデータベース化するとともに,これに基いて,気候変動の基本モードとして重要視されながら特に励起源となる波動(下部成層圏)・対流(対流圏内)の実態に謎の多い「準2年周期振動(QBO)」の生成・維持機構を,飛躍的に解明することであった.最終年度である本年度は,(i)高層気象観測データの収集作業を前年度から継続して行い,1999年分まで極力収集した.

また本庁に送られていないデータ収集,生データ参照による検討を行うため,パダンなどの地方気象官署を訪問した.(ii)収集したデータの有効性(連続性・信頼度)について,タイなど他の東南アジア諸国の各気象庁(局)と連絡を取り,比較検討のため既存の高層気象観測データベースをも部分的に入手して検討に加えた.(iii)収集したデータからQBO成分を含む経年変動の解析を本格化したとともに,波動や対流など小規模現象の解析も試みた.これらから,QBOの空間構造,ENSOと関連していると思われる大きな偏差,インド洋側からの大規模擾乱の影響,などが明かになりつつある.以上の成果は,国内学会で発表したほか,国際会議でも多数回発表した.前年度に得られた成果のいくつかを国際学術誌に論文として刊行あるいは投稿し,現在なおその他の成果を順次投稿準備中である.また成果をまとめたデータベースを最終的に日本(神戸大学)・インドネシア(BPPT)双方のサイト上に置き,代表的な図面などはホームページ等を用いて広範囲に公開している.
心臓のNitric Oxicle Synthase含有神経節細胞

心臓は迷走神経、交感神経からの外来性の支配を受けているが、心房に内在する神経節も心臓の調節に重要な働きを担っている。心臓神経節細胞の伝達物質としては様々な物が報告されているが、近年発見されたMessenger moleculeである、酸化窒素もまた心臓内の情報伝達の担い手であることを、以前報告した。前年度の研究で、酸化窒素合成酵素(nitric oxide synthase,NOS)は外来性の入力である迷走神経の一部と心臓神経節細胞の一部に含まれることがわかった。神経節では、NOSを持つ細胞と持たない細胞があり、前者が後者に軸索をのばしている像も認められた。また、NOSを含む神経線維左心房にある神経節細胞に直接シナプスを作って接触していることも観察した。酸素窒素(NO)を伝達物質として持つ神経線維の性質を知るため、他の部位での分布も調べた。そして、頚動脈洞、頚動脈小体、鼻粘膜における分布も調べ、これらの器官でもNOがその調節に重要な役割を果していることを観察した。本年度は、こうした結果を踏まえ、NOSを持つ線維と刺激伝導系の特殊心筋との関係を調べた。モルモットの心房中隔と心室中隔をNOSに対する抗体を用いた免疫組織化学により調べてみると心房中隔内の神経節にNOSを持つ神経細胞があり、そこからのびる陽性線維が房室結節に分布していた。陽性終末が結節の特殊心筋と直接接している像も電子顕微鏡で観察した。すなわち、NOは心臓の調節に直接関係していることが確認できた。心臓神経節細胞の伝達物質としては様々なものが報告されているが、近年発見されたMessenger moleculeである、酸化窒素(nitric oxide,NO)もまた心臓内の情報伝達の担い手であることを、以前報告した。本年度の研究では、まず、酸化窒素合成酵素(nitric oxide synthase,NOS)を含む神経細飽に対する入力と出力とを知ることを目指した。そして、NOSに対する抗体を用いた免疫組織化学によって、NOSは外来性の入力である迷走神経の一部と心臓神経節細胞の一部に含まれることがわかった。神経節では、NOSを持つ細胞と持たない細胞があり、前者が後者に軸索を伸ばしている像もみとめられた。また、NOSを含む神経線維が左心房にある神経節細胞に直接シナプスを作って接触していることも観察した。NOを伝達物質として持つ神経線維の性質を知るため、他の部位での分布も調べた。そして、頚動脈洞、頚動脈小体鼻粘膜における分布も調べ、これらの器官でもNOがその調節に重要な役割を果たしていることを観察した。今後はNOSを持つ神経と心筋、とくに刺激伝導系の特殊心筋とがどのような関係にあるかを電子顕微鏡レベルで調べる計画である。酸化窒素(NO)を伝達物質として持つ神経線維の性質を知るため、他の部位での分布も調べた。

そして、頚動脈洞、頚動脈小体、鼻粘膜における分布も調べ、これらの器官でもNOがその調節に重要な役割を果していることを観察した。本年度は、こうした結果を踏まえ、NOSを持つ線維と刺激伝導系の特殊心筋との関係を調べた。モルモットの心房中隔と心室中隔をNOSに対する抗体を用いた免疫組織化学により調べてみると心房中隔内の神経節にNOSを持つ神経細胞があり、そこからのびる陽性線維が房室結節に分布していた。陽性終末が結節の特殊心筋と直接接している像も電子顕微鏡で観察した。すなわち、NOは心臓の調節に直接関係していることが確認できた。
個別化医療の実現を目指したVKORC1の立体構造解析

ヒト由来VKORC1およびラット由来VKORC1について、バキュロウイルス発現系におけるコドンの最適化を行い、発現系を構築した。続いて発現ウイルスを作成し、力価測定を行った結果、タンパク質を発現させるのに十分な感染力を持ったウイルスの発現に成功した。同時にin silicoの手法を用いてヒト由来,ラット由来,ウシ由来VKORC1に対してホモロジーモデリングを行うことでそれぞれの立体構造を予測し、ヒト由来VKORC1,ラット由来VKORC1に関してはワルファリンとのドッキング計算を行い、それぞれのVKORC1に対してワルファリンの結合部位および結合様式を予測することが出来た。X線を用いた結晶構造解析を行うためには、大量の純品タンパク質が必要となる。目的タンパク質であるヒト由来VKORC1をバキュロウイルス発現系を用いて発現させ、精製し結晶化を行ったが、一度の培養での発現量が少ないために、数百条件の結晶化スクリーニングを行うとなると、莫大な量の培養が必要となる。そこで、一度の培養で大量に得られるVKORC1の発現系の再構築を行うために、コドンの最適化を行った。GenScript社にコドンの最適化を依頼し、プラスミドと発言ベクターを2種類の制限酵素で切断後、Ligationを行うことで発現ベクター内にVKORC1遺伝子を組み込んだ。現在、Sf9細胞にTransfectionを行い、発現用のウイルスを作成している。創薬などの観点から、ヒト由来VKORC1の構造を明らかにするのが理想的だが、哺乳類由来の構造が未知であるVKORC1の構造解析を迅速に行うために、マウス由来VKORC1、ウシ由来VKORC1に関しても並行して研究を進めており、こちらの2種類の酵素に関してもコドンの最適化を行い、発現系の構築に成功した。本研究の目的は、VKORC1の変異にも有効な新規ワルファリン様薬を目指しており、それを行うためには立体構造が不可欠である。X線を用いた構造解析が順調に進まなかった時のために、X線構造解析と並行して、現在構造が明らかになっている微生物由来VKORC1を用いたヒト由来VKORC1の立体構造予測を計算科学を用いて行っている。ワルファリンは、抗凝血剤あるいは抗凝固剤として古くから日本のみならず世界中で広く使用されてきた薬剤の一種であるが、至適投与量に個人差がある上に治療域が狭いため、専門医を超えて広く使用される状況にはない。ワルファリンのターゲットとなるVKORC1の遺伝子多型はワルファリン使用量の最重要決定因子であるが、VKORC1の立体構造が明らかになっていないため、分子メカニズムやワルファリンによる阻害機構は明らかにされていない。本研究では、ヒト由来VKORC1(以下hVKORC1と言う)とワルファリン複合体の立体構造を高分解能で明らかにし、分子メカニズムやワルファリンによる阻害機構を解明することで、様々な変異に対して有効なワルファリン類似薬開発の手がかりを得ることを目指している。本研究ではX線結晶構造解析の手法を用いて、hVKORC1の立体構造を明らかにすることを目指しているが、タンパク質の結晶化には大量の精製タンパク質が必要なため、一度の培養で効率よく大量にhVKORC1が得られるように、コドンの最適化を行うことで発現系の再構築を行った。GeneScript社にコドンの最適化およびDNA合成を依頼し、バキュロウイルス発現ベクター中に組込み、Sf9細胞にTransfectionすることでhVKORC1発現能を持ったバキュロウイルスを作成した。作成したウイルスをSf9細胞に感染させることで、hVKORC1タンパク質の発現を確認することができたことから、hVKORC1を大量に得ることに成功した。その後、TALONカラムを用いたアフィニティークロマトグラフィー、HiTrapQカラムを用いた陰イオン交換クロマトグラフィー、Superdex 200pgを用いたゲル濾過クロマトグラフィーの3種類のクロマトグラフィーを行うことで、SDS-PAGE上、純品のhVKORC1を得ることに成功した。本研究では、ヒト由来VKORC1(以下hVKORC1という。)とワルファリン複合体の立体構造を高分解能で明らかにし、分子メカニズムやワルファリンによる阻害機構を解明することで、様々な変異に対して有効なワルファリン類似薬開発の手がかりを得ることを目指している。本研究ではX線結晶構造解析の手法を用いてhVKORC1の立体構造を明らかにすることを目指しているが、タンパク質の結晶化には大量の精製タンパク質が必要なため、一度の培養で効率よく大量にhVKORC1が得られるようにコドンの最適化を行うことで発現系の構築を行った。昨年度は、hVKORC1の精製を行い、本年度は様々な結晶化スクリーニングを用いて結晶化を行ったが、結晶を得ることが出来なかった。そこで、創薬などの観点からヒト

由来酵素の構造を明らかにするのが理想だが、哺乳類由来の構造が未知であるVKORC1の構造解析を迅速に行うために、マウス由来VKORC1、ウシ由来VKORC1に関しても並行して研究を進めており、こちらの2種類の酵素に関してもコドンの最適化を行い、発現系の構築および大量発現を行った。また、実験だけではなくin silicoを用いてhVKORC1の立体構造予測を行い、哺乳由来VKORC1の立体構造を明らかにすることを目指した。ヒト由来VKORC1およびラット由来VKORC1について、バキュロウイルス発現系におけるコドンの最適化を行い、発現系を構築した。続いて発現ウイルスを作成し、力価測定を行った結果、タンパク質を発現させるのに十分な感染力を持ったウイルスの発現に成功した。同時にin silicoの手法を用いてヒト由来,ラット由来,ウシ由来VKORC1に対してホモロジーモデリングを行うことでそれぞれの立体構造を予測し、ヒト由来VKORC1,ラット由来VKORC1に関してはワルファリンとのドッキング計算を行い、それぞれのVKORC1に対してワルファリンの結合部位および結合様式を予測することが出来た。X線結晶構造解析法を用いたタンパク質の構造解析は、大量の精製タンパク質が必要となる。既に発現系を構築していたが、研究を迅速に遂行するために、一度の培養で大量にタンパク質を得られるよう、コドンの最適化を行うことで発現系の再構築を行った。個別化医療コドンの最適化を行い、発現系の再構築を行うことで、一度の培養でより大量のhVKORC1を得ることが出来るようになり、結晶化条件の探索を効率よく行うことが出来るようになった。今後は、多くの結晶化条件を用いたスクリーニングを行い、hVKORC1の立体構造を明らかにしたい。1年間、文部科学省に技術参与として出向していたため、申請書通り研究を進めることができなかった。既にタンパク質を発現させる発現系を構築していたが、研究を効率よく行えるように、一度の培養量でより多くのタンパク質が発現できるよう、コドンの最適化を行い、発現系を再構築したことによる。昨年度にコドンを最適化し、発現系の再構築を行い、発現量の大幅な増加が予想されるので、本年度、申請通りに研究が進み、昨年度の遅れを取り戻すことができると考えている。効率よく研究が進むように、一度の培養量でより多くのhVKORC1を発現させる発現系の構築に成功したので、来年度は多くの結晶化条件をスクリーニングし、迅速に構造解析まで進みたいと考えている。昨年度は、文部科学省に技術参与として出向していたため、研究を計画書通り進めることができなかったため。昨年度出来なかった分、本年度は本研究に集中して進めていくつもりである。
新生児・乳児における感覚-運動ダイナミクスに見る発達の個人差

本研究は,運動感覚計測技術の開発・解析手法の提案・発達個人差の理解を通した発達理論の検証を目標に,1新生児・乳児の詳細な関節運動計測,2個人差を反映する身体モデル作成,3乳児運動における運動出力/感覚入力の推定,4脳モデルを利用した運動感覚統合シミュレーションを進めている。平成30年度は以下の二点を実施した。1新生児・乳児の詳細な関節運動計測:新生児と乳児を対象に独自に開発した、新生児および乳児向けモーションキャプチャシステムを用いて運動計測し、逆運動学を用いた関節運動計測を行った。2個人差を反映する身体モデル作成:1で計測した運動データを適応可能な身体モデルを作成した。本モデルは成人筋骨格モデルをベースに、新生児および乳児向けに変形、修正したもので、各身体パーツおよび筋のパラメータを個人適応することが可能である。3乳児運動における運動出力/感覚入力の推定:1で計測した運動データを2で作成した新生児・乳児筋骨格モデルに適応し、逆動力学計算および順動力学シミュレーションを反復計算することで、筋長、筋張力、筋活動度、固有感覚入力の順に推定可能とした。4段階ある計画のうち、いったん3段階目まで進めており、4段階目の脳モデルを利用した運動感覚統合シミュレーションに進むことが可能な段階に進んでいる。来年度以降は13段階目の計算過程で発生する計算誤差の抑制を目的とした修正を進めると同時に、実運動データに基づく運動感覚シミュレーションに利用可能な脳モデルの構築を進める。赤外線カメラの購入費を計上していたが共同研究者から借用することができたため、不要となった。来年度に簡易型赤外線カメラを購入・利用することで簡易計測システムの開発を進める。
骨膜の再生機構に関与するシグナル遺伝子の解析

in situ hydridizationのため,4%paraformaldehyde溶液中に浸漬後,マイクロウェーブ処理を加えて固定した.in situ hydridization結果:4週齢・40週齢ラットとも正常骨膜では,血管周囲に存在する紡錘形細胞にBMP receptor mRNAが発現していた.前骨芽細胞や骨芽細胞にオステオポンチンmRNAが発現していた.骨芽細胞と骨細胞にオステオカルシンmRNAのシグナルを認めた.40週齢ラット剥離後は骨膜構造が極めて不明瞭になり,小血管周囲に存在する紡錘形細胞にBMP receptor mRNAが発現していた.オステオポンチンmRNAは紡錘形細胞や前骨芽細胞に発現していたが,経時的に骨膜の再生が進むと前骨芽細胞や骨芽細胞に発現の増強がみられた.石灰化を開始した部位の骨芽細胞と骨細胞にオステオカルシンmRNAのシグナルを初めて認めた.ラットからRNA用組織として正常骨膜と剥離復位骨膜をサンプリングし,液体窒素で急速凍結後-80°Cで保存した.剥離復位骨膜の遺伝子発現は,正常骨膜に比較して特にオステオポンチンmRNAの増強が著明であった.オステオカルシンmRNAは,剥離後骨膜では不明瞭であった.in situ hydridizationのため,4%paraformaldehyde溶液中に浸漬後,マイクロウェーブ処理を加えて固定した.in situ hydridization結果:4週齢・40週齢ラットとも正常骨膜では,血管周囲に存在する紡錘形細胞にBMP receptor mRNAが発現していた.前骨芽細胞や骨芽細胞にオステオポンチンmRNAが発現していた.骨芽細胞と骨細胞にオステオカルシンmRNAのシグナルを認めた.40週齢ラット剥離後は骨膜構造が極めて不明瞭になり,小血管周囲に存在する紡錘形細胞にBMP receptor mRNAが発現していた.オステオポンチンmRNAは紡錘形細胞や前骨芽細胞に発現していたが,経時的に骨膜の再生が進むと前骨芽細胞や骨芽細胞に発現の増強がみられた.石灰化を開始した部位の骨芽細胞と骨細胞にオステオカルシンmRNAのシグナルを初めて認めた.ラットからRNA用組織として正常骨膜と剥離復位骨膜をサンプリングし,液体窒素で急速凍結後-80°Cで保存した.剥離復位骨膜の遺伝子発現は,正常骨膜に比較して特にオステオポンチンmRNAの増強が著明であった.オステオカルシンmRNAは,剥離後骨膜では不明瞭であった.4週齢と10ヵ月齢ウィスター系雄性ラット(各々幼若期と成熟後期に相当)の頭部を実験部位とした.頭蓋骨の正常骨膜組織標本と骨膜剥離復位後の経時的変化に関する組織標本を作製した.全身麻酔下でラット頭部骨膜を剥離後復位して,頭皮骨膜を縫合した.切除組織は,4%paraformaldehyde溶液を用いて,4°C,16時間浸漬固定した.10%蟻酸で脱灰後パラフィン包埋して,ヘマトキシリン-エオジン染色標本を作製した.光学顕微鏡観察結果より,正常骨膜は4週齢では細胞成分が主体で胞体の大きな骨芽細胞層がみられたが,10ヵ月齢では骨膜は薄くなり脂肪細胞が増加していた.また,骨芽細胞層は薄く,骨芽細胞は扁平になっていた.<剥離、復位後1日>骨膜および疎性結合組織は浮腫性に肥厚し,骨膜の構造は不明瞭であった。すなわち,脂肪細胞は散在し,線維間には赤血球および好中球など炎症性細胞の浸潤を多数認め,周囲にはヘモジデリンの沈着を認めた。骨形成層は完全に消失しており,骨上には薄層状に凝血塊がみられ,骨表層の形態は凹凸を呈していた.<剥離、復位後3日>骨膜の線維の配列は不規則であり,脂肪細胞,血管が混在していた。線維間の赤血球は減少し,多数の未分化間葉細胞の出現を認めた.血管周囲のコラーゲン,フィブリン様組織内に胞体の明るく大きな未分化間葉細胞と骨芽細胞様形態を示す細胞像を観察した.骨上には凝血塊が残存し,ヘモジデリンも多数認めた。骨の表層は波状を呈したままであるが、骨表層の骨小腔には骨細胞が消失している部位を確認した.RNA抽出用の組織は,正常骨膜,復位骨膜,および骨に分別して液体窒素で急速凍結後-80°Cのフリーザー内で保存した.4週齢と10ヵ月齢ウィスター系雄性ラット頭部組織をRNA抽出用と組織標本用に分けた.RNA用組織として正常骨膜と剥離復位骨膜をサンプリングし,液体窒素で急速凍結後-80°Cで保存した.各組織からのRNAは,RNase-free DNaseで処理した.アンカープライマーを添加後,サーマルサイクラーで加温して逆転写反応を行った.cDNA溶液を含むPCRミックスを増幅させ,D.D法で発現パターンの異なる遺伝子の検索を試みた.現在BMP-2遺伝子を中心に解析中である.In situ hybridizationとH-Eのため,4% paraformaldehyde溶液を用いて,浸漬固定した.最初にH-E標本を作製して評価した.4週齢(幼若期)ラット頭頂骨骨膜(以後骨膜)は細胞成分が大部分を占めており,線維構造は幼若であった.すなわち,骨に接する内層は細胞成分が豊富で,明るい細胞質を有する骨芽細胞と胞体の大きい前骨芽細胞で構成されていた.

疎性結合組織に接する外層は幼若な線維成分と血管から成り,血管周囲には紡錘形から円形の未分化間葉細胞を認めた.PCNA陽性細胞は,血管周囲の円形から紡錘形の細胞の核に陽性像を認め,線維間の紡錘形細胞にも散在性に陽性を認めた.骨形成細胞層には陽性像を認めなかった.一方,40週齢(成体後期)骨膜の約半分は脂肪細胞であり,骨膜は菲薄化傾向を示した.骨形成層も菲薄化を認めた.すなわち,細胞成分は乏しく,骨芽細胞は線維芽細胞様に扁平な形態を呈していた.線維層の外側は多数の脂肪細胞が一列に配列し,脂肪層を形成していた.線維層は脂肪層に圧迫されるように菲薄化し,線維芽細胞数は減少し,扁平化を呈していた.血管は脂肪細胞間に少量混在を認めた.PCNA陽性細胞は極僅かに,血管周囲と脂肪細胞間の円形から紡錘形の細胞の核に陽性像を認めた.線維層と骨形成細胞層には陽性像を認めなかった.4週齢(幼若期)と40週齢(成体後期)ウィスター系雄性ラットからRNA用組織として正常骨膜と剥離復位骨膜をサンプリングし、液体窒素で急速凍結後-80°Cで保存した。BMP-2遺伝子ノーザンプロット分析結果:4週齢正常骨膜に強い発現が認められたが、10ヵ月齢では発現が減弱した。剥離復位骨膜では、4週齢と40週齢共に発現が増大した。in situ hydridizationとH-E染色のため、4%paraformaldehyde溶液中に浸漬後マイクロウェーブ処理を加えて固定した。BMP-2遺伝子in situ hydridization結果:4週齢正常骨膜では、骨芽細胞から前骨芽細胞、血管周囲の紡錘形細胞に遺伝子発現が観察された。40週齢正常骨膜では血管周囲の紡錘形細胞にわずかな発現が見られた。H-E染色から40週齢(成体後期)骨膜は菲薄化傾向を示し、骨膜の約半分歯脂肪細胞であった。すなわち、加齢に伴い骨形成性の細胞成分に乏しく、血管周囲の未分化間葉細胞が遊離したBMPのシグナルを受けて、BMP-2遺伝子を発現するものと考えられた。剥離後は細胞突起の切断により骨芽細胞層は壊死した。母骨や壊死骨芽細胞層由来のBMPfamilyが骨膜の修復再生に関与する可能性が示唆された。なお、BMP抗体を使用した免疫染色を試みたが陽性細胞の判定はできなかった。原因は抗体の特異性が弱いことや、組織細胞の抗原性が処理過程で低くなったことが考えられる。
倍数体化と非対称分裂による環境ストレス耐性機能の解明

昨年度、申請者は、2倍体細胞が1倍体細胞に比べて高い紫外線耐性能を持つことや、DNA相同組換え機構が2倍体の紫外線耐性に必須の機能を果たしていることを明らかにした。そこで今年度は、CLUV環境における相同組換え修復機能の役割に注目して解析を行った。まず初めに、組換えの基質となる1本鎖DNAと紫外線による直接的な損傷であるピリミジンダイマーの蓄積量について、1倍体と2倍体NER欠損細胞を用いて解析した。各損傷の検出にはRPA-YFPフォーカス形成とピリミジンダイマー抗体によるゲノムDNAドットブロットアッセイを用いた。その結果、ピリミジンダイマーは1倍体と2倍体のいずれにおいてもCLUVに依存して同程度の蓄積が見られた一方で、RPA-YFPフォーカス形成は2倍体において有意に低下していることがわかった。また、このような1倍体と2倍体のフォーカス形成の違いは、定常期の細胞では見られず、対数増殖期のような細胞が増殖する環境に依存して起こっていた。以上の結果より、CLUV耐性の細胞増殖能は、ピリミジンダイマーではなく1本鎖DNAの蓄積量と相関性が見られることが示された。次に、二倍体rad14欠損細胞を用いてCLUV環境におけるヘテロアリル間の組換え頻度の測定を行ったところ、CLUVに依存して顕著な増加が見られた。以上の結果より、CLUV環境では、ピリミジンダイマーの蓄積が細胞増殖阻害の直接的な原因ではなく、むしろ、ピリミジンダイマーによる複製阻害が一本鎖DNAの蓄積を引き起こし、この処理能力の有無が細胞増殖の能力(CLUV耐性能)に大きく影響していると考えられる。さらに、2倍体細胞では通常あまり起こらない相同染色体間の組換えが複製阻害の解消に重要な役割を果たしていることが示された。本研究課題の主要なテーマである「倍数性の増加がCLUVストレスに対する耐性獲得(適応)に果たす役割の解明」に関しては、一本鎖DNAの蓄積の有無が耐性能と相関性があることや、相同染色体間の組換えが2倍体において顕著に増加することを明らかにするなど、大きな進展が見られた。一方、「損傷染色体を持つ細胞の非対称分離の分子メカニズムの解明」に関しては、タイムラプス解析ではある程度非対称分離の傾向を見ることができたが定性的であることや、実験の性質上、メカニズムの解析には向いていないため、現在定量化が可能な実験系の確立に向けて研究を行なっている。以上の進捗状況を踏まえて、現時点では概ね順調に進展していると判断した。「倍数性の増加がCLUVストレスに対する耐性獲得(適応)に果たす役割の解明」:一本鎖DNAに結合するRPA-YFPのフォーカス形成の観察から、CLUV環境では、一倍体の約7割の細胞がフォーカスを形成しているにも関わらず、チェックポイントの活性化が起こらないことを見出している。急性の損傷の場合、7割以下でもチェックポイントの活性化が起こるため、慢性的なDNA損傷と急性DNA損傷の条件の違いによってチェックポイント活性化の閾値が変化する可能性が示された。そこで、チェックポイントタンパク質の検出株やYFP融合タンパク質による蛍光顕微鏡観察によってチェックポイントタンパク質の挙動を詳細に解析する。「損傷染色体を持つ細胞の非対称分離の分子メカニズムの解明」:酵母細胞をアルファファクター等により同調することで、RPA-YFPフォーカスを持つ細胞の1細胞周期後の母、娘細胞への分配を定量化する。長期に渡るDNA損傷ストレスへの暴露は、生物の様々な機能に影響を及ぼしヒトにおいては発がんや老化と密接に関連している。申請者は、自然環境で問題となる慢性的かつ低レベルの紫外線ストレス(chronic low-dose UV; CLUV)下で酵母細胞を培養可能な装置を作製し解析を行った結果、紫外線損傷の修復ができないNER経路の欠損株がCLUV環境では増殖阻害を引き起こさない一方で、複製ストレスの解消に関与するDNA損傷トレランス経路の欠損株が増殖阻害を引き起こすことを明らかにした。この結果は、本実験系が致死的でないDNA損傷ストレスに対する細胞のトレランス機構について解析する優れた実験系であることを示している。今回、申請者は、NER欠損株を用いて、CLUV環境下で継代培養による長時間(6日間)に渡る突然変異頻度の測定を行ったところ、培養開始後数日は突然変異頻度の顕著な上昇が観察されたが、培養3日目以降に急激に頻度が低下するという興味深い結果が得られた。そして継代培養時の細胞のDNA含量をFACS解析により調べたところ、3日目以降に二倍体化した細胞の割合が顕著に増大すること(倍数性の変化)を見いだした。さらに、一倍体から四倍体までの酵母を用いてCLUV感受性を調べた結果、二倍体細胞が最も耐性能力が高いことが示された。次に、二倍体耐性株におけるCLUV耐性能に関して、様々な損傷応答関連の変異株を用いて解析した結果、DNA相同組換えが二倍体細胞におけるCLUV耐性の獲得に必須の機能を果たしていることを明らかにした。また、CLUVによって誘発する一本鎖DNA結合タンパク質RPAのフォーカス形成に関して、細胞分裂の際に非対称分離することが明らかになり、このメカニズムの解析のため、タイムラプス解析による生細胞観察が可能な条件検討を行い実験系の構築に成功した。本研究課題では大きく2つのテーマに取り組んでおり、1)「倍数性の増加がCLUV

ストレスに対する耐性獲得(適応)に果たす役割の解明」に関しては、慢性紫外線環境において2倍体細胞が最も環境に適応的であることや、この適応においてDNA相同組換え経路が必須の役割を果たしていることを明らかにした点は大きな進展と言える。また、2)損傷染色体を持つ細胞の非対称分離の分子メカニズムの解明に関しては、CLUVによって生じるRPA-YFPフォーカスを持った細胞のタイムラプス解析の条件検討を行い、来年度以降の変異体解析に使える実験系の構築に成功した。以上の進捗状況を踏まえんて、現時点では概ね順調に進展していると判断した。昨年度、申請者は、2倍体細胞が1倍体細胞に比べて高い紫外線耐性能を持つことや、DNA相同組換え機構が2倍体の紫外線耐性に必須の機能を果たしていることを明らかにした。そこで今年度は、CLUV環境における相同組換え修復機能の役割に注目して解析を行った。まず初めに、組換えの基質となる1本鎖DNAと紫外線による直接的な損傷であるピリミジンダイマーの蓄積量について、1倍体と2倍体NER欠損細胞を用いて解析した。各損傷の検出にはRPA-YFPフォーカス形成とピリミジンダイマー抗体によるゲノムDNAドットブロットアッセイを用いた。その結果、ピリミジンダイマーは1倍体と2倍体のいずれにおいてもCLUVに依存して同程度の蓄積が見られた一方で、RPA-YFPフォーカス形成は2倍体において有意に低下していることがわかった。また、このような1倍体と2倍体のフォーカス形成の違いは、定常期の細胞では見られず、対数増殖期のような細胞が増殖する環境に依存して起こっていた。以上の結果より、CLUV耐性の細胞増殖能は、ピリミジンダイマーではなく1本鎖DNAの蓄積量と相関性が見られることが示された。次に、二倍体rad14欠損細胞を用いてCLUV環境におけるヘテロアリル間の組換え頻度の測定を行ったところ、CLUVに依存して顕著な増加が見られた。以上の結果より、CLUV環境では、ピリミジンダイマーの蓄積が細胞増殖阻害の直接的な原因ではなく、むしろ、ピリミジンダイマーによる複製阻害が一本鎖DNAの蓄積を引き起こし、この処理能力の有無が細胞増殖の能力(CLUV耐性能)に大きく影響していると考えられる。さらに、2倍体細胞では通常あまり起こらない相同染色体間の組換えが複製阻害の解消に重要な役割を果たしていることが示された。本研究課題の主要なテーマである「倍数性の増加がCLUVストレスに対する耐性獲得(適応)に果たす役割の解明」に関しては、一本鎖DNAの蓄積の有無が耐性能と相関性があることや、相同染色体間の組換えが2倍体において顕著に増加することを明らかにするなど、大きな進展が見られた。一方、「損傷染色体を持つ細胞の非対称分離の分子メカニズムの解明」に関しては、タイムラプス解析ではある程度非対称分離の傾向を見ることができたが定性的であることや、実験の性質上、メカニズムの解析には向いていないため、現在定量化が可能な実験系の確立に向けて研究を行なっている。以上の進捗状況を踏まえて、現時点では概ね順調に進展していると判断した。DNA損傷抗体を用いたゲノム上に蓄積するピリミジン二量体や一本鎖DNA量の定量化を行い、CLUV環境下における損傷量とDDT経路や組換え経路の働きに関する関係性を調べ、倍数性の違いがこの関係性に及ぼす影響を調べる。
留学生のための専門用語辞典-医学系-作成に関する研究

平成7年度では,まず,留学生のための医学系の専門用語について,いわゆる医学専門述語である医学語と,医学専門述語ではないが留学生が医学学習をするとき必要な医学関連語という二つの語彙概念を定めた。次に,医学語では学部教育における包括的・基本的な文献(11種)の索引項目,医学関連語では医学論文を書くための文献3種の索引項目などをコンピューター入力した。平成8年度では、前年度の作業に続き、医学語では学部使用の教科書7種の索引、医学関連語では患者・医療者間の語・表現(文献3種より)を入力した。この入力資料から取捨選択、必要項目の追加、重複項目の整理を行い、医学語で7,517項目、医学関連語で4,155の項目のリストを作り、これを第1次選定語とした。この過程において,臨床医学と日本語教育上の基礎的な語彙の対応を調べ,「医学教育における日本語教育のことば」(平成8年度日本語教育学会秋期大会)として口頭発表した。第1次選定語のリストをもとに7,884の項目を選出しアンケートリストを作り、留学生の理解の意識を調べるアンケート調査を実施した。平成9年度では、前年度実施のアンケートの集計・分析を行った。この分析の結果に基づき、「医学語と医学関連語についての留学生の理解」(平成9年度日本語教育学会秋期大会)を口頭発表した。次に「東京医科歯科大学教養部研究紀要28号」において、医学・医学関連語の第1次選定と上述アンケート分析の記述を行った(1998年3月刊行)。また、アンケート分析の結果も考慮し、専門用語辞典作成のための第1次選定語の再検討と修正,英訳の検討を行い、医学語と医学関連語のそれぞれについてのリストを作成した。このリストは今後の研究の継続・発展および医学系留学生のための専門用語辞典作成の基本資料となるものである。平成7年度(研究第1年度)の研究活動の目標は、医学系留学生のための基本語選定の対象となる医学・医学関連用語の収集とそのコンピューター入力、及び、作業に必要な資料の収集及び入力体制作りであった。資料の収集、コンピュータ及び関連機器購入は順調に行われた。医学・医学関連用語の収集作業においては、まず、いかに膨大な数の医学専門用語から基本語選定の対象となる語集団を選定するかが問題となった。本研究によって作成される辞書は、学部留学生と大学院留学生による使用を念頭に置いているが、基本語として要求される普遍性、基本度を満たすものは、学部教育において使用される語彙である。しかし、そこで使用される教科書の語彙量は、なお、膨大であるため、基礎・臨床の各分野で、包括的でかつ代表的で基本的な文献の索引項目を利用することを考えた。基礎分野で利用したものが、医学書院の「系統看護学講座・専門基礎」の計9巻、臨床分野が、医学書院の「今日の治療指針」である。この索引項目から専門家による取捨選択、及び、必要項目の追加を行う一方、この索引項目が各分野の教科書の索引項目とどのように対応するかをコンピュータソフトを利用して調査した。また、医学専門語ではないが、医学を学ぶ上で知らなければならない医学関連用語の収集は、種々の資料の検討後、医学論文を書く上で必要とされる関連用語がもっとも適当なものであるという結論を得、文献資料を収集し、その入力作業を行った。以上のように、本年度の研究作業は目標を達成し、来年度の医学系留学生に対する意識調査で使用される語彙リスト作成のための基礎資料がコンピュータ入力された。平成8年度(研究第2年度)の研究活動目標は、医学系留学生のための基本語選定の対象となる語彙の整理・リストアップとそのリストに基づきアンケートを実施し、医学系留学生の意識調査を行うことであった。

前年度に収集された膨大な数の医学及び医学関連用語から基本語選定のための語彙リストを作成した。この作成作業において、医学分野では、前年度の作業に加えて複数の基本的と思われる学部で使用される教科書の索引をコンピューター入力し、リスト作成の対象とした。医学関連分野では、患者、医師、看護婦の間で用いられる用語に着目し、3種の文献から用語・表現を取捨選択して、コンピューター入力し、リスト作成の対象とした。両分野の対象語彙を合わせ、不明点の究明、重複するものなどの整理を行いできあがったリストは、医学分野で約7500項目、関連分野で約5800項目である。さらに、両分野から、それぞれ、約3700、約4200の項目を選出し、アンケートリストを作成した。このリストに基づき現在アンケート作業を実施中である。研究発表では、平成8年度日本語教育学会秋季大会において、「医学教育における日本語教育のことば」として、臨床医学上の基礎的な語彙3146が、日本語能力試験1・2級の語彙7800とどのように対応しているかについて研究した成果を発表した。以上のように、本年度の研究作業は目的を達成し、実施したアンケート作業の整理・分析の結果を、来年度の基本語彙選定の再検討と修正、さらには、本研究の最終段階にある辞典作成に生かすことができる基礎資料を作成することができたと考える。平成9年度では、前年度(平成8年度)に実施した医学語・医学関連語についてのアンケートの集計・分析作業を行った。この作業により医学系留学生のための専門用語辞典作成の基本となる重要な情報を得ることができた。この研究成果については、平成9年度日本語教育学会秋期大会において、「医学語と医学関連語についての留学生の理解」として口頭発表を行った。これは、アンケート結果の分析に基づいて、特に医学語で使用されるカタカナを含む語についての、3グループの留学生の習得の難易意識について調査・研究を行ったものである。また、『東京医科歯科大学教養部研究紀要28号』において、上述アンケートの調査・研究と研究初年度(平成7年度)以来行ってきた専門用語辞典作成の対象となる医学・医学関連用語の第1次選定作業についての記述を行った(1998年3月刊行予定)。さらに、アンケート分析による獲得情報も考慮し、専門用語辞典作成のための語彙選定(前年度行われた第1次選定)の再検討と修正を行い、医学語と医学関連語のそれぞれについてのリストを作成した。このリストは今後の研究の継続・発展および医学系留学生の専門用語辞典作成の基本資料となるものである。以上が平成9年度の研究実績である。