hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
骨吸収抑制作用と骨形成促進作用を併せ持つ天然物を起点にした骨代謝の理解と創薬

骨吸収抑制作用と骨形成促進作用を併せ持つ天然化合物の作用を解明することを目的として、細胞および個体レベルにおける以下の研究を行った。ホノキオールはレチノイドX受容体及びソニックヘッジホッグ経路を介して骨芽細胞分化を促進する可能性が明らかになった。また、卵巣摘出およびRANKL誘導骨粗鬆症モデルマウスにおいて、ホノキオールの投与が骨量の減少を有意に抑制することを確認した。また、南米原産植物Pterogynine Nitensに含まれるNitensidine Aと、生薬シンイに含まれることが知られるEpimagnolin AがABCB1と相互作用することを見出した。社会活動と生産性を長期に渡って維持できる「健やかな社会」の創成に研究成果を還元することが申請者の研究の終着点である。この構想を実現するために、本申請課題では、「骨吸収を抑制すると同時に骨形成を促進する天然物」の作用を細胞および個体レベルで解明することを目指す。そして、全体構想の実現に向け、(1骨吸収と骨形成を制御する分子基盤の同定, 2骨吸収抑制・骨形成促進天然物の薬効・薬理の評価, 3骨代謝改善薬の開発準備)の解決を目指す。そのために、骨吸収抑制・骨形成促進天然物によって量や質が変動する細胞内タンパク質を二次元電気泳動の解析結果から同定すると共に、骨代謝評価モデルを用いて当該天然物の薬効・薬理を評価する。平成26年度は、harmineおよびhonokiolによって量や質が変動する細胞内タンパク質を二次元電気泳動で解析するために、評価系の構築を試みた。そして、薬剤処理を行っていない細胞群において従来同様の精度で解析を行えることを確認した。一方、骨代謝評価モデルを用いてharmineおよびhonokiolの薬効・薬理を評価するために、harmine 3gを入手し、honokiol 2gは、厚朴から精製した。そして、ICRマウスに単回経口投与した結果、harmineおよびhonokiolのいずれにおいても半数致死容量が> 400 mg/kgであることが明らかになった。平成27年度は、harmineとhonokiol処理に起因する細胞内タンパク質の量と質の変動を。2次元電気泳動で解析を継続するとともに、honokiolの骨粗鬆症のモデル動物における骨密度に対する効果と、骨や歯周組織形成促進への作用メカニズムを解析を行った。honokiol(20 mg/kg)の3か月間腹腔投与により卵巣摘出による骨粗鬆症モデルマウスにおいて、大腿骨の海綿骨塩量および海綿骨密度の減少が有意に抑制されることを確認した。分子と細胞レベルにおけるhonokiolにおいては、マウス骨芽細胞株であるMC3T3-E1細胞におけるhonokiolのALP活性促進作用が、RXRアンタゴニストであるUVI3003によって打ち消された。このことから、honokiolの骨芽細胞分化促進作用に核内受容体のRXRが関わっている可能性を見出した。また、歯根形成に深く関わるヘルトビッヒ上皮鞘由来細胞(HERS細胞)において、honokiolはShhおよびその標的遺伝子であるGli1の発現を誘導した。これらの歯周組織形成に関わる遺伝子発現誘導作用はShh阻害剤であるシクロパミンによって抑制されたことから、honokiolの作用にShhシグナルが関わっている可能性を見出した。二人の研究員の移動があり補充するまで時間が掛かった。平成28年1月にようやく研究員一人を確保した。本申請課題では、骨減少性疾患において有用であると考えられる、「骨吸収を抑制すると同時に骨形成を促進する天然物」の作用を、細胞および個体レベルで解明するために研究を進め、これまでの研究で、卵巣摘出骨粗鬆症モデルにおいて、honokiolの腹腔投与が骨稜の減少を結いに抑制することを明らかにしている。また、honokiolの骨芽細胞分化促進作用に核内受容体のRXRが関わっている可能性とShhシグナルが関わっている可能性を見出している。平成28年度は候補化合物であるharmineおよびhonokiolが共通して相互作用する生体分子として、ABCトランスポーターの一つのABCB1に着目して、骨代謝細胞の分化調節作用とABCB1の関連を明らかにするために、ABCB1と相互作用する化合物の探索を行った。その結果、南米原産植物Pterogynine Nitensに含まれるNitensidine Aと、生薬シンイに含まれることが知られるEpimagnolin AがABCB1と相互作用することを見出した。さらに、ドッキングシミュレーション解析によって、ABCB1とNitensidine AおよびEpimagnolin Aの相互作用部位について検討し、それぞれの結合に重要なアミノ酸残基候補を同定した。

これらの化合物と骨代謝との関わりを明らかにすることで、骨代謝におけるABCB1の関与とHonokiolおよびHarmineの作用機序への関与が明らかになることが期待される。骨吸収抑制作用と骨形成促進作用を併せ持つ天然化合物の作用を解明することを目的として、細胞および個体レベルにおける以下の研究を行った。ホノキオールはレチノイドX受容体及びソニックヘッジホッグ経路を介して骨芽細胞分化を促進する可能性が明らかになった。また、卵巣摘出およびRANKL誘導骨粗鬆症モデルマウスにおいて、ホノキオールの投与が骨量の減少を有意に抑制することを確認した。また、南米原産植物Pterogynine Nitensに含まれるNitensidine Aと、生薬シンイに含まれることが知られるEpimagnolin AがABCB1と相互作用することを見出した。当初予定していた人員を本研究課題に割くことができず、二次元電気泳動で解析するための試料を調製する手技を習得するまでに予定以上の時間を要した。また、同様の理由によって経口投与の手技を習得するまでに予定以上の時間を要した。遅れを取り戻すために、新しく採用された研究員を加えて、歯周組織に詳しい研究者との共同研究や受託可能な実験については、受託解析を積極的に利用する。28年度が最終年度であるため、記入しない。天然物化学遅れを取り戻すために、本研究課題にたいする人員を補強する。同時に、受託可能な実験においては、受託解析を積極的に利用する。平成27年度の消耗品の一部が、想定よりも安価で入手できたためである。平成26年度の消耗品の一部が、想定していた価格よりも安価に入手できたためである。平成28年度計画の予算と合わせて、消耗品を購入することとする。平成27年度計画の予算と合わせ、前半に実験用消耗品を購入することとする。
盲導犬使用者の経路探索を支援する建築・都市空間の知能化に関する研究

盲導犬は、経路上の障害物を回避することが出来るが、経路探索には視覚障害者自身の判断が必要であり、それを支援するために、電子ディバイスからの情報が必要である。この電子ディバイスに求められる機能は、カーナビゲーション・システムにおいて既に実用化されている。しかし、盲導犬使用者の利用に際しては、特別な仕様も求められる。それらは次のようにまとめられる。1)現在地を検知する機能:屋内での利用にも対応できるRFIDタグなどからの位置情報取得2)目的地を登録する機能:視覚障害者にも分かりやすい入力用インターフェイス3)現在地と目的地から最適な経路を選択する機能:小規模で無数に存在する歩行者用経路(経路ネットワークが既知でない場合)に対応した最適経路推定の技術4)選択した経路の情報を音声で伝える機能:視覚障害者の歩行に必須な情報の定式化(オーディトリーマップのマニュアル化)本研究では、特に3)4)についての考察を中心として行い、建築・都市空間のもつ階層的構造を表現すると同時に、それらのオリエンテーション情報を算出できる空間インデックスの開発が必要であることを論じた。そして、そのコード情報を発信するRFIDタグなどの参照エレメントを配備することで、建築・都市空間は知能化されることになる。自立移動ロボットによるシミュレーション実験本学備品である研究用ロボット(Khepera)とパーティションを移設することでさまざまな建築・都市空間のパタンを作ることのできる実験用走行路を用いてシミュレーション実験を行なった。走行路にはグリッド状に赤外線発光器が多数埋め込まれており、各発光器はCPUにつながれてロボットの位置検知と位置情報の応答ができるようになっている。本年度は、位置情報を取得して経路探索を行うプログラムをVisualBasicにより作成した。プログラムの機能は、下記の通りである。1)実験用走行路のCPUと外部コンピュータ(本年度購入備品)との通信を、RS232Cを介して行う機能。2)外部コンピュータのディスプレイ上に走行路の図を表示して目的地を登録する機能。3)ロボットの現在地を検知してディスプレイ上の走行路の図に表示する機能。4)取得したロボットの情報(位置と向き)から次のロボットの動きを制御する機能。5)目的地に到達したか否かを判断する機能。ここで、4)が本研究の根幹をなす「空間図式」の機能であり、本年度のプログラム上では関数プロシージャとして独立させている。本年度は地点通過カウンター変数を設けてロボットの向きを制御する最もベーシックなアルゴリズムを用いたが、これは、次年度開発する位置情報をコード化することで、目的地と現在地の間の経路探索(途中の経路が不明な場合の)を最適化するアルゴリズムのパフォーマンスを計る比較対象とする予定である。盲導犬使用者は、盲導犬によって移動時における近傍の危険を回避することができる。しかし、目的地の経路を検索することは、あくまで人間の役割である。新しい場所に行こうとするときは、予め本人が経路を調べておいて、その情報を記憶し歩行現場で再生することで、経路探索が可能となる。一方、近年はICタグなどの普及により、建築・都市空間における位置検知のための技術が格段に進歩してきたといえる。したがって、位置情報を発信する何らかのランドマークを環境側に備えることで、空間を知能化すれば、小型化されたコンピュータを携帯することで地図データベースを利用することで人間側に負担をかけずに、視覚障害者に経路探索情報を提供することができる。本研究では、以上のシステムを前提として、そこにおける位置情報の提供方法の考察をおこなった。具体的には位置コードの空間的な配置規則を提案し、それに基づいた経路探索のアルゴリズムの考察をおこなった。ここで留意された事項は、歩行者が使う経路においては、車道とは異なり、すべての経路が既知であるという前提は現実的ではないこと、したがってダイクストラ法などは適用しないこと、一方で迷路の探索における全く目的地の位置がわからない場合ではなく、ある程度、目的地の方角がわかる場合として用いられる、トレモー法に近い手法が有効であることなどである。以上についてKheperaロボットが走行する迷路盤を作成し、シミュレーション実験を行った。
予防抗菌薬の感染部位濃度測定による科学的有効性の検証

周術期感染予防抗菌薬として第1および第2世代セフェム系薬が推奨されているが、その有効性は血中濃度から推察しているに過ぎず、局所感染部位である直の組織内濃度によって判断されている訳ではない。本研究では、消化器外科領域の多数の手術症例を対象に、ターゲットとなる皮下・患部周辺組織ならびに血中の抗菌薬濃度を経時的に測定することによって、術後感染予防に適切な抗菌薬の投与方法を科学的に検証し、手術部位感染の減少に役立てることを目的としている。2018年度は、予防抗菌薬としてCMZを投与した腹腔鏡下・開腹結腸切除術、腹腔鏡下・開腹直腸切除術、人工肛門閉鎖術施行の33症例を集積した(手術時間3時間以内、体重<80kg)。患者背景は、男性20例、女性13例、平均年齢66.6歳、結腸癌15例、直腸癌14例、その他4例であった。方法は、皮膚切開3060分前にCMZ1gを静脈内投与し、経時的に血清および皮膚切開時及び創閉鎖時に皮下脂肪を採取した。分離分析法(HPLC法)により、皮膚切開時:血清濃度70120μg/ml、皮下脂肪濃度17μg/ml、創閉鎖時:血清濃度1530μg/ml、皮下脂肪濃度0.53μg/mlの結果が得られた。皮膚切開時のCMZ血清濃度は、E. coli 16μg/ml、B. fragilis 32μg/ml(各々MIC90の目安)を上回っていたが、皮下脂肪濃度は著明に低値であったことから、投与方法や投与間隔に課題があることが示唆された。症例の集積に時間を要した。当初の予定よりやや遅れているが、着実に結果は蓄積されており進捗に問題はない。症例の集積を進め、データの統計解析を実施する。各種濃度の結果を検証し、学会における公表を検討する。2018年度は33症例を集積した。今後は更なる集積が見込まれ、試薬類や消耗品の費用が発生すると考えられる。
CD40-CD40リガンド相互作用による免疫反応の制御機構

CD40シグナルによる体液性免疫反応の制御機構の解明を目的に、細胞質内部分に変異を持つCD40のみを発現するマウスを作製した。クラススイッチを含むT細胞領域(リンパ濾胞外)におけるB細胞分化はTRAF6結合部位などの膜近位領域からのシグナルだけでも誘導できるが、胚中心形成の誘導には、TRAF2/3/5結合部位を含む膜遠位領域からのシグナルが必要である事が明らかになった。EBウイルスの形質転換遺伝子産物LMPlは、TRAF分子に結合し、CD40と類似のシグナルを伝達している可能性が示唆されている。LMP1トランスジェニックマウスのB細胞を解析したところ、正常マウスに比してCD23、ICAM-1、Fasなどの活性化マーカーの発現が有意に亢進しており、試験管内で無刺激の状態でも有意な増殖と抗体産生を示した。更にLMP1をB細胞特異的にCD40欠損マウスに発現させたところ、クラススイッチなどのリンパ瀘胞外B細胞分化はレスキュウされたが、胚中心形成は誘導できなかった。興味あることにLMP1トランスジェニックマウスにおいては、胚中心形成が著しく抑制されていた。LMP1はクラススイッチ誘導などCD40シグナルと一部共通するシグナルを伝達するが、胚中心形成などのステップに対しては抑制的なシグナル伝達していると思われる。CD40リガンドを欠損したX連鎖型高IgM血症患者においてしばしば自己免疫の発症がみられ、CD40-CD4OL相互作用が自己反応性T細胞の制御に関与している可能性が考えられる。CD40欠損マウスのT細胞をCD40を発現するがT細胞のないヌードマウスに移入すると自己抗体の上昇に加え様々な臓器で自己免疫性の炎症が誘導された。更にこの自己反応性の上昇は、CD40-CD40L相互作用非存在下では抑制性T細胞が出現しないためであることが判った。CD40欠損マウス及び細胞質内領域に変異や欠失を持つ変異CD40を発現する一連のトランスジェニックマウスを用いて、体液性免疫や細胞性免疫の成立・調節におけるCD40シグナルの役割をin vivoで解析し、以下の成果を得た。1)CD40のリガンド(CD40L)の遺伝子に変異が原因の発症する高IgM血症の患者においては、免疫不全症にもかかわらず自己抗体の産生など自己免疫症状を呈することが知られていたが、そのメカニズムは不明であった。CD40-CD40L相互作用の自己免疫抑制への関与を明らかにするためにCD40欠損マウスのリンパ球を、T細胞を欠損したヌードマウスへ移入した。CD40欠損マウスのCD4T細胞を移入されたヌードマウスにおいて自己抗体の産生や、自己免疫性の胃炎や甲状腺炎が発症し、CD40-CD40L相互作用が自己反応性CD4T細胞の制御においても機能していることが明らかになった。2)ヒト野生型または変異CD40遺伝子を免疫グロブリンエンハンサー/プロモーターの支配下に発現するトランスジェニックマウスを作製すした。まず、ヒト野生型CD40を発現するマウスはT細胞依存性抗原に対する抗体産生が著しく阻害されていたが、胚中心形成や抗原特異的なB細胞の出現は正常に認められた。これらのマウスのCD40トランスジーンは内因性のCD40と異なり形質細胞上でも発現されており、CD40が形質細胞分化を抑制するシグナルを伝達している可能性が示唆された。更に、変異型CD40発現マウスの解析から、この抑制シグナルはCD40の細胞質内領域の膜遠位部より伝達されていることが明らかになった。

CD40シグナルによる体液性免疫反応の制御機構の解明を目的に、細胞質内部分に変異を持つCD40のみを発現するマウスを作製した。クラススイッチを含むT細胞領域(リンパ濾胞外)におけるB細胞分化はTRAF6結合部位などの膜近位領域からのシグナルだけでも誘導できるが、胚中心形成の誘導には、TRAF2/3/5結合部位を含む膜遠位領域からのシグナルが必要である事が明らかになった。EBウイルスの形質転換遺伝子産物LMP1は、TRAF分子に結合し、CD40と類似のシグナルを伝達している可能性が示唆されている。LMP1トランスジェニックマウスのB細胞を解析したところ、正常マウスに比してCD23、ICAM-1、Fasなどの活性化マーカーの発現が有意に冗進しており、試験管内で無刺激の状態でも有意な増殖と抗体産生を示した。更にLMP1をB細胞特異的にCD40欠損マウスに発現させたところ、クラススイッチなどのリンパ瀘胞外B細胞分化はレスキュウされたが、胚中心形成は誘導できなかった。興味あることにLMP1トランスジェニックマウスにおいては、胚中心形成が著しく抑制されていた。LMP1はクラススイッチ誘導などCD40シグナルと一部共通するシグナルを伝達するが、胚中心形成などのステップに対しては抑制的なシグナル伝達していると思われる。CD40リガンドを欠損したX連鎖型高IgM血症患者においてしばしば自己免疫の発症がみられ、CD40-CD40L相互作用が自己反応性T細胞の制御に関与している可能性が考えられる。CD40欠損マウスのT細胞をCD40を発現するがT細胞のないヌードマウスに移入すると自己抗体の上昇に加え様々な臓器で自己免疫性の炎症が誘導された。更にこの自己反応性の上昇は、CD40-CD40L相互作用非存在下では抑制性T細胞が出現しないためであることが判った。
7族元素を用いるC-H結合活性化を基盤とする有機合成反応の開発

単純な有機化合物から複雑な化合物を合成するには、数段階にわたる炭素-炭素結合(C-C結合)形成と官能基変換を組み合わせることになるため、効率の高い合成反応の開発が望まれている。有機ハロゲン化合物を用いる反応では、あらかじめ基質分子内にハロゲン原子(X)の導入が必要であり、反応後にそのハロゲンが不要な塩として副生する。これに対し、有機化合物中に多く存在する炭素-水素結合(C-H結合)から直接にC-C結合が形成できれば、C-H結合を一旦、C-X結合などに変換する必要がなく、反応ステップ数も減るとともに、当然ながら反応のあとにハロゲン塩が副生しない。C-H結合活性化反応の適用限界を拡げることは、有機合成において、重要なことである。本研究では、有機合成の触媒として使われることが少なかった7族元素の触媒作用を明らかにし、新しいコンセプトに基づいて反応開発を行なった。その結果、C-H結合活性化反応の適用範囲を拡げ、実用的で一般的な合成手法へと展開することができた。具体的には、これまではベンゼン環上のC-H結合活性化が大部分を占めていたが、本研究ではそれをアルケンのC-H結合活性化へと展開した。C-H結合へ挿入する分子も極性をもたないアルキンからアルデヒドのような分極したものまで、幅広い基質で適用できる反応条件を見いだすことができた。さらに現在は、より一般的な基質であるアルカンのC-H結合を直接変換する反応の開発を行なっている。従来、有機合成の原料として認識されていなかった炭化水素を用いた効率的な反応につながる可能性を秘めている。従来のC-H結合活性化を利用する反応では、分極していない不飽和分子を挿入させるものが大部分を占めていた。私はこれまで有機合成反応に利用されることが少なかった7属元素の錯体を用いて研究を行なった。7属元素であるマンガンやレニウムは、周期表では前周期と後周期の間に位置するため、従来C-H結合活性化反応に用いられてきた後周期金属錯体とは異なる反応性を示すことが期待された。反応を試みたところ、C-H結合の活性化に引き続き、不飽和カルボニル化合物やアルデヒドなどの分極した分子が挿入することを見いだしている。このようなレニウム触媒の特異的な反応性に興味をもち、反応メカニズムの詳細な検討を行なった。重水素化実験、速度論的同位体効果、鍵中間体からの反応などを検討することにより従来C-H結合活性化反応に用いられてきたロジウムやルテニウム錯体とは異なるルートで反応が進行していることがわかった。さらにレニウム触媒はベンゼン環のC-H結合だけでなく、オレフィンのC-H結合も活性化できることがわかった。レニウム触媒存在下、オレフィンを有するイミンとアクリル酸エステルを反応させると、シクロペンタジエン誘導体と少量のシクロペンタジエニル-レニウム錯体が生じた。レニウム触媒の量を基質と同じだけ加えることで、シクロペンタジエニル-レニウム錯体のみをほぼ定量的に合成することに成功した。本反応はシクロペンタジエニル錯体の合成法として非常に効率が高く、今後レニウム錯体だけでなく他の多種多様な金属錯体の合成へと応用できることが期待できる。
クルマエビ、タラバガニ及びヒラメ用環境負荷軽減型飼料の開発

環境を破壊することなく、増養殖を持続的に行う技術の開発は、21世紀の世界の水産業者、水産研究者にかせられた重要な課題である。飼料に適切な方法でアミノ酸を補足すれば、飼料タンパク質を節約することになり、外部への窒素の排泄量も削減される。そこで、本研究では、クルマエビ、タラバガニ及びヒラメを対象種として環境負荷軽減型飼料の開発を試みた。15年度は、主としてヒラメとクルマエビの必須アミノ酸要求量について、飼育実験および飼料や体組織の生化学的分析によって検討した。稚エビおよび幼生を用いて研究を行ったが、難溶性結晶アミノ酸を用いて試験飼料を作製すれば、ペレットタイプの固形飼料のみならず、エビ幼生用の人工微粒子飼料でも結晶アミノ酸の溶出量は少なく、飼料中の至適アミノ酸含量を検討することが可能であることがわかった。植物性タンパク源を飼料素材として使用すれば、リジンやアルギニンなどが制限アミノ酸となるので、まずヒラメおよびクルマエビ稚魚および稚エビを用いて飼育実験を行い、それらの必須アミノ酸の飼料中至適含量を決定した。現在は、飼育後の試験動物について一般分析、アミノ酸分析、生化学的パラメーターの測定などを行い、総合的にこれらの必須アミノ酸の至適含量を吟味している。クルマエビについては、幼生およびポストラーバーにおける遅溶性結晶アミノ酸を利用できるかどうかを調べた。その結果、従来の報告とは異なり、幼生およびポストラーバーともに結晶アミノ酸を成長や生残のために有効に利用できることを明らかにした。この研究成果は、2004年9月にシドニーで開催される国際会議Australasian Aquaculture 2004で発表する予定である。
アクチン結合蛋白質の歯胚形成における役割の解析

歯数や歯の形成異常の解析は、臨床における様々な症候群を含む全身疾患の有無及び、歯などの口腔組織だけでなく、全身の組織再生へと応用可能な有益な知見となりうる。これまで、増殖因子や細胞外マトリックス等の歯胚形成メカニズムにおける機能に関しての報告はあるが、細胞接着分子及び、細胞の骨格を決定する分子群の役割は未だ明らかではない。フィラミン-Aは、細胞接着分子インテグリン、膜内外受容体複合体、セカンドメッセンジャーと相互作用することによって、細胞骨格の再編成を調節するタンパク質である。フィラミン-Aは、X染色体長腕の第2領域の8番目のバンドに位置している遺伝子FLNAによってコード化された二量体を呈し、細胞内のF-アクチンおよびインテグリンβ1の細胞内ドメインと結合している。そのインテグリンのβ鎖を介してラミニンなどの細胞外マトリックス(ECM)からのシグナルがFAK(focal adhesion kinase)やtailin(細胞骨格タンパク質)、Srcを介して細胞内に伝達されるとともに、フィラミン-Aにも伝達され、細胞骨格の再編成や、細胞の増殖・分化に関わっている。このフィラミン-Aの変異は、頭蓋顔面の構造や骨格、脳、内臓、泌尿器感覚に影響を与え、神経細胞移動障害を引き起こすことが知られている。また、フィラミン-Aの遺伝子変異による疾患はOPD spectrum disordersと呼ばれ、中でもMNSは極めて稀な疾患であり、全身的な症状や診断、治療等に関しては文献に記載があるものの、歯科的所見については歯列不正としか記載がないため、新たな発見が期待される。そこで、細胞接着分インテグリンと細胞内のアクチン結合性アダプター分子であり、細胞骨格を担う分子フィラミンに着目し、歯の形成過程における役割について明らかにする。研究の進捗状況が遅れており、学会発表等を行えなかったため。フィラミン-Aの遺伝子異常を有する患児の口腔内所見をさらに詳細に解析し、歯原性上皮細胞株にプラスミド遺伝子を導入し、shRNA-フィラミン-A発現する細胞株を作製する。その後、細胞増殖や細胞移動についてのフィラミン-Aの役割を解析する。フィラミン-Aの遺伝子異常により、歯根の形成異常が認められることから、ヘルトリッヒの上皮鞘の細胞増殖低下、あるいは本上皮細胞の根尖方向への細胞移動の障害が生じていることが示唆される。そこで、当教室で保有する歯原性上皮細胞株SF2に、shRNA-フィラミン-Aを安定発現する細胞株を、プラスミド遺伝子導入により作製した。この細胞株にて細胞増殖、細胞の移動能について検討する。前者については、BrdUの取り込み能と細胞数計測法を用いて、後者については細胞スクラッチアッセイを用いて検討を行う。また、その細胞移動におけるインテグリンや細胞骨格分子アクチンの役割を明らかにするために、インテグリンβ1阻害抗体やRGDペプチドを用いたインテグリン機能阻害、F-アクチン-GFP過剰発現などの組み合わせにより検討を行う。また、フィラミン-A遺伝子異常における歯根形成異常を明らかにする目的で、胎生13.5日のマウスの歯胚を用いた器官培養系に、siRNA-フィラミン-Aをオリゴフェクタミンを用いて遺伝子導入を行い、歯根の形成過程を経時的に観察する。全身疾患の解析および歯数や歯の形成異常に関する解析は、歯などの口腔組織だけでなく全身の組織再生へと応用可能な有益な情報となる。特に、小児歯科は、小児が早期に受診する可能性がある診療科の1つで、疾患を早期発見できる可能性が高く、歯科的所見が全身疾患の診断の一助となり得る。東北大学小児歯科でフィラミン-Aに遺伝子変異を有するMelnick-Neddles症候群の患児に遭遇した。遺伝子解析の結果、フィラミン-Aの分子構造のうちフィラミンリピート11番目にアミノ酸の置換を伴う遺伝子変異を認め、歯の先天性欠損、エナメル質形成不全、さらには歯根の形成異常(単根歯)であることを見い出した。このフィラミン-Aの変異は、頭蓋顔面の構造や骨格、脳、内蔵、泌尿器感覚に影響を与え、神経細胞移動傷害を引き起こすことが知られている。これまで、増殖因子や細胞外マトリックス等の歯胚形成メカニズムにおける機能に関しての報告は多数ある。しかし、細胞接着分子および細胞の骨格を決定する分子群の役割は未だ明らかではない。そこで、細胞接着分子および細胞骨格を担う分子インテグリンと細胞内のアクチン結合アダプター分子であり、細胞骨格を担う分子フィラミンに着目し、歯の形成、特に歯根形成過程における役割について明らかにすることとした。これまでの研究で、フィラミン-Aは細胞移動に必須であることが報告されており、本患児の所見からも歯根の形成において細胞移動障害が関係していると考えている。研究計画では、Melnick-Needles症候群患児の口腔内の表現系の解析を行い、本患児の自然脱落した乳歯を使用しての詳細な解析を行う予定であったが、現在、口腔内の表現系の解析途中であり、さらに詳細な分析が必要であるため。

フィラミン-Aは、X染色体長腕の第2領域の8番目のバンドに位置している遺伝子FLNAによってコード化された二量体を呈し、細胞内のF-アクチンおよびインテグリンβ1の細胞内ドメインと結合している。そのインテグリンのβ鎖を介してラミニンなどの細胞外マトリックス(ECM)からのシグナルがFAK(focal adhesion kinase)やtailin(細胞骨格タンパク質)、Srcを介して細胞内に伝達されるとともに、フィラミン-Aにも伝達され、細胞骨格の再編成や、細胞の増殖・分化に関わっている。このフィラミン-Aの変異は、頭蓋顔面の構造や骨格、脳、内臓、泌尿器感覚に影響を与え、神経細胞移動障害を引き起こすことが知られている。また、フィラミン-Aの遺伝子変異による疾患はOPD spectrum disordersと呼ばれ、中でもMNSは極めて稀な疾患であり、全身的な症状や診断、治療等に関しては文献に記載があるものの、歯科的所見については歯列不正としか記載がないため、新たな発見が期待される。そこで、細胞接着分インテグリンと細胞内のアクチン結合性アダプター分子であり、細胞骨格を担う分子フィラミンに着目し、歯の形成過程における役割について明らかにする。研究の進捗状況が遅れており、学会発表等を行えなかったため。フィラミン-Aの遺伝子異常を有する患児の口腔内所見をさらに詳細に解析し、歯原性上皮細胞株にプラスミド遺伝子を導入し、shRNA-フィラミン-A発現する細胞株を作製する。その後、細胞増殖や細胞移動についてのフィラミン-Aの役割を解析する。Melnick-Needles症候群の患児における口腔内所見においてさらに詳細に解析し、歯原性上皮細胞株にプラスミド遺伝子を導入し、shRNA-フィラミン-A発現する細胞株を作製する。フィラミン-Aの遺伝子異常により、歯根の形成異常が認められることから、ヘルトリッヒの上皮鞘の細胞増殖低下、あるいは本上皮細胞の根尖方向への細胞移動の障害が生じていることが示唆される。そこで、当教室で保有する歯原性上皮細胞株SF2に、shRNA-フィラミン-Aを安定発現する細胞株を、プラスミド遺伝子導入により作製した。この細胞株にて細胞増殖、細胞の移動能について検討する。前者については、BrdUの取り込み能と細胞数計測法を用いて、後者については細胞スクラッチアッセイを用いて検討を行う。また、その細胞移動におけるインテグリンや細胞骨格分子アクチンの役割を明らかにするために、インテグリンβ1阻害抗体やRGDペプチドを用いたインテグリン機能阻害、F-アクチン-GFP過剰発現などの組み合わせにより検討を行う。また、フィラミン-A遺伝子異常における歯根形成異常を明らかにする目的で、胎生13.5日のマウスの歯胚を用いた器官培養系に、siRNA-フィラミン-Aをオリゴフェクタミンを用いて遺伝子導入を行い、歯根の形成過程を経時的に観察する。
特異なプロトン応答性酸化還元挙動を示す新規機能性錯体の創製

本研究では、2-(2-イミダゾリニル)フェノラト配位子(Himn-)または2-(1,4,5,6-テトラヒドロピリミジン-2-イル)フェノラト配位子(Hthp-)を有するルテニウム(III)錯体([Ru(Himn)(bpy)2]2+または[Ru(Hthp)(bpy)2]2+; bpy = 2,2'-ビピリジン)における塩基添加による特異な還元反応の反応機構を解明し、これを利用した新規機能性物質の創製を目指す。これまでの研究で、この特異な酸化還元挙動は配位子の2電子または4電子酸化によって錯体の金属中心が還元されることによると、明らかになった。本年度は反応機構の解明を試みた。また、このような分子に基づいた多電子移動反応の研究をより多電子の移動を媒介できると予想される金属酸化物ナノ粒子に拡張することは酸化還元活性を有する機能性物質を構築する上で意義深い。そこで、本年度は上記ルテニウム錯体の反応機構の解明に平行して金属酸化物ナノ粒子の多電子移動反応についても研究を行った。Ru(III)錯体の反応機構調査Stopped-flow分光光度計を用いて、ルテニウム(III)錯体[Ru(Hthp)(bpy)2]2+と過剰量の塩基の溶液を混合した後の吸収スペクトルの時間変化を測定した。その結果、混合後1ミリ秒後には既に中間体が生成しており、2段階以上の反応段階が存在することがわかった。しかし、複雑な反応過程が組み合わさっているためこれ以上の解析は難しいと考えられる。金属酸化物ナノ粒子の多電子移動還元されたアモルファスTiO2ナノ粒子とZnOナノ結晶を反応させることで、TiO2の伝導帯エネルギーレベルがZnOのものよりも高いことが示唆された。また、アモルファスTiO2ナノ粒子には2種類以上の異なるエネルギーレベルが存在することが示唆された。26年度が最終年度であるため、記入しない。本研究では、2-(2-イミダゾリニル)フェノラト配位子(Himn)または2-(1,4,5,6-テトラヒドロピリミジン-2-イル)フェノラト配位子(Hthp)を有するルテニウム(III)錯体([Ru^<III>(Himn Xbpy)2]^<2+>または[Ru^<III>(Hthp)(bpy)_2]^<2+> ; bpy=2,2'-ビピリジン)における塩基添加による特異な還元反応の反応機構を解明し、これを利用した新規機能性錯体の創製を目指す.本年度は反応の詳細について明らかにした。・Ru(III)錯体の塩本添加による酸化還元挙動の調査上記のRu^<III>錯体の重アセトニトリル錯体と塩基の反応を^iH NMR分光法によって追跡した。その結果、[Ru^<III>(Himn)(Xbpy)_2]^<2+>においてはイミダゾリニル基が2電子酸化されイミダゾラト型錯体が生成するためにRu^<III>中心が還元されることがわかった。一方、[Ru^<III>(Hthp)(bpy)_2]^<2+>ではテトラヒドロピリミジル基からピリミジル基へ4電子酸化されることでRu^<III>中心の還元が起こり、[Ru^<II>(Hthp)(bpy)_2]+[Ru^<II>(pym)(bpy)_2]^+(pym-=2-(2一ピリミジル)フェノラト)が3:1で生成することがわかった。・テトラヒドロピリミジル基の電気化学的4電子酸化反応サイクリックボルタンメトリー(CV)を用いて電気化学的手法による配位子の酸化反応を試みた。その結果、塩基存在下ではRu^<II/III>の1電子酸化を行うだけでRu^<III>錯体間の不均化反応を経てテトラヒドロピリミジル基の4電子酸化反応が進行することを明らかにした。さらに、大過剰の塩基存在下で微分パルスボルタンメトリーを測定することで、プロトン共役電子移動(PCET)反応の特徴である酸化還元電位のシフトが観測された。以上の結果から、テトラヒドロピリミジル基の4電子酸化はPCETによって誘起されていると考えられる。

また、このような分子に基づいた多電子移動反応の研究をより多電子の移動を媒介できると予想される金属酸化物ナノ粒子に拡張することは酸化還元活性を有する機能性物質を構築する上で意義深い。そこで、本年度は上記ルテニウム錯体の反応機構の解明に平行して金属酸化物ナノ粒子の多電子移動反応についても研究を行った。Ru(III)錯体の反応機構調査Stopped-flow分光光度計を用いて、ルテニウム(III)錯体[Ru(Hthp)(bpy)2]2+と過剰量の塩基の溶液を混合した後の吸収スペクトルの時間変化を測定した。その結果、混合後1ミリ秒後には既に中間体が生成しており、2段階以上の反応段階が存在することがわかった。しかし、複雑な反応過程が組み合わさっているためこれ以上の解析は難しいと考えられる。金属酸化物ナノ粒子の多電子移動還元されたアモルファスTiO2ナノ粒子とZnOナノ結晶を反応させることで、TiO2の伝導帯エネルギーレベルがZnOのものよりも高いことが示唆された。また、アモルファスTiO2ナノ粒子には2種類以上の異なるエネルギーレベルが存在することが示唆された。26年度が最終年度であるため、記入しない。当該年度の研究実施計画は、Hthp-配位子を含むルテニウム(III)錯体における塩基添加による特異な酸化還元挙動の詳細を解明することであったが、これまでにこの挙動はHthp-配位子の4電子酸化反応が進行するためであることが明らかとなった。また、この錯体系においては通常は強力な酸化剤や高い反応温度を必要とする4電子酸化反応を温和な条件で進行することがわかった。これらの結果は当該年度の研究実施計画を満たしていると考えられる。これまでの研究結果から、π-ドナー性のフェノラト型ドナーを配位子とすることで、ルテニウム錯体のRu^<III>およびRu^<IV>状態が安定化され、配位子の多電子酸化反応を促進することがわかった。一方で、これまでに用いた配位子ではフェノラト型配位子自体が反応してしまうため、触媒的に多電子酸化反応を行うことは難しい。そこで、今後はフェノラトドナーとして2-(イミダゾリル)フェノラト(Himl-)に着目する。この配位子はイミダゾール基のプロトン化状態を変化させることで金属錯体の触媒活性を制御できると考えられる。そして、[Ru(Him1)(tpy)Cl]^<nt>型錯体(tpy-2,2' : 6'2"-ターピリジン)を合成し、その酸化還元触媒能について調査する。
リヴィウスの『ローマ史』が近代の共和主義思想に与えた影響の検証

本研究は、リヴィウス、マキアヴェリ、ハリントンの三者を主要な研究対象とし、後二者がリヴィウスの『ローマ史』をどのように受容したのかを検証することで彼らの共和主義の特質を抽出し、近代共和主義思想の展開につき新たな展望を得ようとするものであり、本年度は、文献を収集するとともに、基本的なアイデアを固め、今後の研究を進める上での内外の批評を仰ぐことが中心となった。これまでの暫定的な見通しについては、『デモクラシーの政治学』(東大出版会、2002年)所収の「共和主義」の形で公表し、2003年2月の東京大学政治理論研究会、同3月の九州大学政治学研究会で有益なコメントを得た。また、同3月、千葉大学での国際会議「公共性の再興」では、ペーパー'What is republicanism not about?'を発表した。以上の活動を通じて得た知見は、第一に18世紀のヒュームやフェデラリストを初めから視野に入れた方が全体の議論の見通しがよくなること、第二に共和主義がすぐれて近代のものであること(すなわち、共和主義が君主政と専制をセットで攻撃するのは、古代ギリシアのポリスの政治学が確立した、専制とポリスの政治の区別--後者の中で初めて6政体分類が成立する--が近代では理解されなかったがゆえであるということ)、そして第三に、ジョン・ロックの議論が共和主義とは対照的なのは、そこに抵抗権や人民主権論が含まれていることのみならず、人民及び国王の裁量権が認められていることにこそあると考えられることであった。
意識障害患者の脳甦生リハビリの早期トランポリン運動と音楽演奏併用効果:科学的検証

脳血管障害や脳外傷後の重度の遷延性意識障害に対する脳甦生賦活またはリハビリ再生法としての音楽運動療法の意義を本年度購入の脳波・心拍リアルタイム装置(MemCalc/Meakin2,GMS社製)を用いて情緒バイタル指数を中心に医学的見地より検証した。音楽運動療法に際して実施するトランポリン上下動はたとえ寝たきりに近い患者でも、介助下坐位で実施可能な運動で、廃用萎縮予防で早期から行える。今回の研究で交感神経活動度は全く変動なく安全で、意外にも副交感神経活動面での賦活効果が認められた。その上、情動面でも`うっとり心地よい気分'にさせていることが会話可能な患者やボランティア正常体験者の事後調査で分かっている。また別施設で実施した例で、パルスオキシメータで血中酸素飽和度が安静臥位時に9389%の患者が演奏下でゆったりしたトランポリン上下動を加えると、9799%と上昇することも経験している。また安静時には閉眼している意識障害患者が上下動と共に大きく両眼を見開き周囲をキョロキョロする仕草も、光トポグラフイでみると、障害側の前頭部で酸素需給面での活動がみられることから、二足歩行時と同様に脊髄を介する脳へのインパルスが平衡バランス感覚を呼び戻していることを推測させる。また同時に演奏される音楽は、この様な集中力誘発状態下(覚醒)では聴覚刺激として受け入れ易い。これら快感刺激が大脳辺縁系などの感情中枢の活性にもつながり、内分泌系に好影響を及ぼすものと考えらえる。左右脳波の変動はMakin-MemCalc Systemで採取のうえ解析した.一方、心臓リズムの解析すなわち心拍変動の連続測定(自律神経活動度)をLRR-03/MemCalc Systemで併せて行い、得られた時系列数値を分析することで、これら重度の意識障害患者でも情緒・感情面の微妙な表現信号を発していることも含めて分析結果が得られた。音楽運動刺激が情緒バイタル指数を中心にした検討でも大脳辺縁系などの感情中枢の活性にもつながり、内分泌系に好影響を与えることが証明されたと考える。その上、情動面でも'うっとり心地よい気分'にさせていることが会話可能な患者やボランテイア正常体験者の事後調査で分かっている。

また同時に演奏される音楽は、この様な集中力誘発状態下(覚醒)では聴覚刺激として受け入れ易い。これら快感刺激が大脳辺縁系などの感情中枢の活性にもつながり、内分泌系に好影響を及ぼすものと考えらえる。左右脳波の変動はMakin-MemCalc Systemで採取のうえ解析した。一方、心臓リズムの解析すなわち心拍変動の連続測定(自律神経活動度)をLRR-03/MemCalc Systemで併せて行い、得られた時系列数値を分析することで、これら重度の意識障害患者でも情緒・感情面の微妙な表現信号を発していることも含めて分析結果が得られた。音楽運動刺激が情緒バイタル指数を中心にした検討でも大脳辺縁系などの感情中枢の活性にもつながり、内分泌系に好影響を与えることが証明されたと考える。脳血管障害や脳外傷後の重度の遷延性意識障害に対する脳甦生賦活またはリハビリ再生法としての音楽運動療法の意義を本年度購入の脳波・心拍リアルタイム装置(MemCalc/Meakin2,GMS社製)を用いて情緒バイタル指数を中心に医学的見地より検証した。音楽運動療法に際して実施するトランポリン上下動はたとえ寝たきりに近い患者でも、介助下坐位で実施可能な運動で、廃用萎縮予防で早期から行える。今回の研究で交感神経活動度は全く変動なく安全で、意外にも副交感神経活動面での賦活効果が認められた。その上、情動面でも'うっとり心地よい気分'にさせていることが会話可能な患者やボランティア正常体験者の事後調査で分かっている。また別施設で実施した例で、パルスオキシメータで血中酸素飽和度が安静臥位時に9389%の患者が演奏下でゆったりしたトランポリン上下動を加えると、9799%と上昇することも経験している。また安静時には閉眼している意識障害患者が上下動と共に大きく両眼を見開き周囲をキョロキョロする仕草も、光トポグラフイでみると、障害側の前頭部で酸素需給面での活動がみられることから、二足歩行時と同様に脊髄を介する脳へのインパルスが平衡バランス感覚を呼び戻していることを推測させる。左右脳波の変動はMakin-MemCale Systemで採取のうえ解析した。また、患者の無意識の応答信号としてのバランス指数を示す相関分布図からこうかん・副交感のバランスの良否の判定の有用性を示した。
スーパーアポトーシス抑制因子PTD-FNK蛋白を用いたバイオ人工膵の開発

バイオ人工膵皮下移植法の確立:血管新生法の確立:皮下移植法の成功には皮下組織内における血管新生法の確立が必須であるため,血管新生法の検討を実施した.1):すでに臨床応用について日本医科大学付属病院倫理委員会承認済であったゼラチンマイクロスフェアに塩基性繊維芽細胞増殖因子(b-FGF)を封入して徐放化したDDS製剤による血管再生療法を,難治性末梢動脈疾患であるバージャー病,重症糖尿病性壊疽に対して5例臨床応用を開始した.4週後の評価にて,術前にVAS80あった疼痛がVAS 0となり疼痛が除去出来し,16週後にはバージャー病の左第2指難治性潰瘍も綺麗に治癒した.2):そして新たな血管新生療法の臨床応用として,自己骨髄幹細胞を使用した血管新生療法も実施した.現行のいかなる内科的及び外科的治療法でも治癒しない(no optional patients)重症難治性虚血肢(バージャー病,ASO,糖尿病潰瘍・壊疽,PSS)33例,重症冠動脈性疾患(狭心症,虚血性心筋症)10例に対して自己骨髄細胞移植による血管再生療法を施行し,その有効性及び安全性を示した.^<99m>Tc-tetorofosmine(TF) perfusion scintigraphy等による種々の評価法により,4週以後良好な血流増加を証明し,疼痛の消失,緩和,QOLの著明な改善をもたらした.さらに重症難治性潰瘍・壊疽に対して医療用ウジ治療(MDT)を導入した.これらの複合的治療法は,limb salvageのための新しい戦略となりうると考えられた.バイオ人工膵皮下移植法の確立:血管新生法の確立:皮下移植法の成功には皮下組織内における血管新生法の確立が必須であるため,血管新生法の検討を実施した.1):すでに臨床応用について日本医科大学付属病院倫理委員会承認済であったゼラチンマイクロスフェアに塩基性繊維芽細胞増殖因子(b-FGF)を封入して徐放化したDDS製剤による血管再生療法を,難治性末梢動脈疾患であるバージャー病,重症糖尿病性壊疽に対して5例臨床応用を開始した.4週後の評価にて,術前にVAS80あった疼痛がVAS 0となり疼痛が除去出来し,16週後にはバージャー病の左第2指難治性潰瘍も綺麗に治癒した.2):そして新たな血管新生療法の臨床応用として,自己骨髄幹細胞を使用した血管新生療法も実施した.現行のいかなる内科的及び外科的治療法でも治癒しない(no optional patients)重症難治性虚血肢(バージャー病,ASO,糖尿病潰瘍・壊疽,PSS)33例,重症冠動脈性疾患(狭心症,虚血性心筋症)10例に対して自己骨髄細胞移植による血管再生療法を施行し,その有効性及び安全性を示した.^<99m>Tc-tetorofosmine(TF) perfusion scintigraphy等による種々の評価法により,4週以後良好な血流増加を証明し,疼痛の消失,緩和,QOLの著明な改善をもたらした.さらに重症難治性潰瘍・壊疽に対して医療用ウジ治療(MDT)を導入した.これらの複合的治療法は,limb salvageのための新しい戦略となりうると考えられた.バイオ人工膵機能維持に必要なangiogenesis, uasaculogenesisを惹起するため血管内皮前駆細胞(Endothelial pcgenita cells Epcs)を併用する為ラット下肢より骨髄を抽出し,これをリレフオプレッフを使用した比重遠心法にて骨髄幹細胞を分離した.まずPTD-FNKの至適濃度を確認する為共培養を施行し,PTD-FNK蛋白を骨髄幹細胞に慢性させた.結果PTD-FNK蛋白1nMが最stem cellの生存率viabilityを維持し,これをミトコンドリア及びCD34抗体して染色し,共に強く濃度されることを証明した.(1)バイオ人工膵皮下移植法の確立:すでに臨床応用について日本医科大学付属病院倫理委員会承認済であったゼラチンマイクロスフェアに塩基性繊維芽細胞増殖因子(b-FGF)を封入して徐放化したDDS製剤による血管再生療法を,難治性末梢動脈疾患であるバージャー病,重症糖尿病性壊疽に対して臨床応用を開始した.4週後の評価にて,バージャー病の左第2指潰瘍が治癒し,術前にVAS80(あった疼痛がVAS0となり疼痛が除去出来た(その他は現在評価検査中).さらに現在STZ糖尿病マウスにおいて皮下組織に血管誘導中である.(1)バイオ人工膵皮下移植法の確立:1:血管新生法の確立:皮下移植法の成功には皮下組織内における血管新生法の確立が必須であるため,まず,血管新生法の検討を実施した.1):すでに臨床応用について日本医科大学付属病院倫理委員会承認済であったゼラチンマイクロスフェアに塩基性繊維芽細胞増殖因子(b-FGF)を封入して徐放化したDDS製剤による血管再生療法を,難治性末梢動脈疾患であるバージャー病,重症糖尿病性壊疽に対して5例臨床応用を開始した.4週後の評価にて,術前にVAS80あった疼痛がVAS 0となり疼痛が除去出来し,16週後にはバージャー病の左第2指難治性潰瘍も綺麗に治癒した.さらに現在STZ糖尿病マウスにおいて皮下組織に血管誘導中である.2):そして新たな血管新生療法の臨床応用として,自己骨髄幹細胞を使用した血管新生療法も実施した.現行のいかなる内科的及び外科的治療法でも治癒しない(no optional patients)

重症難治性虚血肢(バージャー病,ASO,糖尿病潰瘍・壊疽,PSS)33例,重症冠動脈性疾患(狭心症,虚血性心筋症)10例に対して自己骨髄細胞移植による血管再生療法を施行し,その有効性及び安全性を示した.^<99m>Tc-tetorofosmine(TF) perfusion scintigraphy等による種々の評価法により,4週以後良好な血流増加を証明し,疼痛の消失,緩和,QOLの著明な改善をもたらした.さらに重症難治性潰瘍・壊疽に対して医療用ウジ治療(MDT)を導入した.これらの複合的治療法は,limb salvageのための新しい戦略となりうると考えられた.
音波を利用した難透水性地盤の汚染浄化に関する基礎的研究

動電的手法に音波の脱着効果を付加した新技術であるEASD(Electro-Acoustic Soil Decontamination)は,重金属・揮発性有機化合物で汚染された難透水性地盤に対する原位置汚染修復法として、その有効性が期待される数少ない技術といえる。本研究ではこの手法の確立に向けて、特に音波付与の効果に焦点を絞り、基礎的なデータの蓄積を目指した。本研究では密閉式の圧密試験容器に近い浸透実験装置(一種のコラム試験器)を試作した。この装置の特徴は、1)密閉式であるため、大きな水圧(動水勾配)をかけることができ、短時間で試料内に汚染物質を含んだ溶液や脱着のための水(純水)を浸透させることができる。2)デッドウェイトで鉛直圧密圧力をかけ、それに振動を加えるので、種々の拘束圧(応力履歴)の下で試験が可能。振動による圧力波を土圧計(或いは圧電センサー)により計測し、圧力波としての音波の伝播割合を確認できる。3)圧密リングに試料を入れるため、現場から採取した土も容易にセットでき、実験後の化学分析用の試料採取も簡単に行える。4)排出液の濃度変化(breakthrough curve)と浸透後のサンプルの濃度分布により、脱着の程度を調べることができる。これらを用いたコラム試験と一連のバッチ試験により、イライト粘土の重金属(亜鉛イオン)吸着、脱着特性とそれらに及ぼす音波付与の影響を調べた。その結果、以下の成果を得た。即ち、1)試作装置によりこれまでよりも短時間で、正確にコラム試験を実施できる。2)亜鉛のような重金属イオンは一旦粘土鉱物に吸着すると、溶液の希釈、水の透水程度では脱着は殆ど生じず、極めて強固な吸着形態である。しかしコラム試験、バッチ試験ともに音波を付与することにより、脱着が生じる。更に、この種の実験を行う上での各種要因の検討、試験試料の作成方法の影響についても明らかにした。しかし、本研究の条件で確認された上記脱着の程度は10%程度であり、その効率を上げるためにはより効率的な音波の付与、音波以外に脱着を促進させる環境(電気泳動条件、pH調整等)の検討を含め更なる研究の発展が必要である。
植物に作らせた可食性ＩｇＡ抗体による腸管粘膜表面での生体防御免疫の研究

近年、抗体医薬の普及が進んだが、生産コストに課題があり、IgGクラスの抗体に限られるのが現状である。粘膜表面での受動免疫を実現できる可食性IgA抗体医薬は未開発である。分泌型IgAは2量体IgAと分泌片で構成され、動物体内では異なる細胞由来のポリペプチドから構築されている。そこで、植物を用いて分泌型IgAをワンステップで作製することを試みた。具体的には、志賀毒素特異的な分泌型IgAをモデル植物および実用植物に作らせ、毒素中和活性を証明した。志賀毒素の消化管からの侵入機構の解明につなげるため、志賀毒素の大腸上皮細胞に対する傷害活性をin vivoにおいて高感度で検出する方法を確立した。母乳には免疫グロブリンA (IgA)が分泌され、乳児の腸管粘膜からの病原体や毒素の侵入を粘膜表面で防いでいる。経口投与できる分泌型IgAを抗体医薬あるいは高次機能性食品として利用できるように、4種類のポリペプチド鎖からなる分泌型IgAを植物にワンステップで発現させ、可食性植物抗体(edible plantibody)の作製を目指した。抗体遺伝子の発現には、社会的受容性を高めるため、ウイルス由来ではなく植物由来のプロモーターを利用した。ベロ毒素(Stx1)に特異的なH鎖(定常部はIgA)、L鎖、J鎖および分泌片のcDNAを、シロイヌナズナ由来のプロモーターおよびターミネーターの支配下、一つのバイナリーベクターに組み込んだ。アグロバクテリウム法でシロイヌナズナおよびリーフレタスに遺伝子導入し、組換え体を選抜した。シロイヌナズナでは、ゲノムDNAへの遺伝子導入の確認、ELISA,イムノブロット法、植物組織の免疫組織化学的染色による分泌型IgAタンパク質の発現と組み立てを確認した。レタスでは、ゲノムDNAへの遺伝子導入の確認、ELISAによるタンパク質の発現を確認した。組換え型シロイヌナズナの葉の抽出液を作製し、植物抗体の材料とした。Stx1を植物抗体で前処理すると、Vero細胞に対するStx1の細胞毒性が中和された。以上より、Stx1中和活性を有する分泌型IgA植物抗体を作製することができた。腸管粘膜表面での分泌型IgA植物抗体による生体防御活性を測定するため、侵入局所である大腸粘膜の傷害を評価するin vivo実験系の構築を目指した。マウスの肛門よりStx1のPBS溶液を注入し、TUNEL法によって上皮細胞のアポトーシスの検出を試みた。PBS投与群と比較して、アポトーシスを起こした大腸上皮細胞の数に増加が認められたが、組織傷害の程度は比較的軽微であった。母乳には免疫グロブリンA (IgA)が分泌され、乳児の腸管粘膜からの病原体や毒素の侵入を粘膜表面で阻止している。抗体医薬や高次機能性食品としての利用を展望し、経口投与できる分泌型IgAの有用性を研究するため、ベロ毒素(Stx1)に対する組換え型IgAを発現する植物を作製した。IgA抗体のH鎖、L鎖、J鎖および分泌片を一つのバイナリーベクターに組み込み、アグロバクテリウム法にてモデル植物シロイヌナズナおよび実用植物リーフレタスにて分泌型IgAの発現に成功した。シロイヌナズナに発現させた植物抗体は、Vero細胞のStx1による細胞傷害を試験管内で中和した。植物抗体による毒素中和活性を生体内で調べるため、マウス肛門よりStx1を投与し、大腸上皮細胞の傷害を検討した。昨年度までの検討によりTUNEL法によっては上皮細胞の傷害が十分に示されなかったが、今回活性型caspase-3の免疫組織染色によって、アポトーシス誘導の初期過程を観測できた。これにより、in vivoで毒素中和活性を評価する一つの手段が得られた。一方、経口投与したIgAが、大腸に届くのかどうかを評価するため、Stx1のBサブユニット(Stx1B)に特異的マウスモノクローナル抗体G2G7(2量体IgA)を経口投与して、糞中から活性のあるIgAの検出を試みた、その結果、確かに固相化Stx1Bに結合活性のあるIgAがELISAで検出された。G2G7は毒素中和活性がないため、中和活性のある分泌型植物抗体を用いて今後検討を進める予定である。植物での発現部位については、葉の超薄切片を用いた観察から、トランスジェニック植物において特異的に細胞質内にプロテインボディーを見出した。金コロイドを用いた免疫電子顕微鏡法によって、プロテインボディー内にIgAのH鎖および分泌片の存在を明らかにした。免疫学モデル植物のシロイヌナズナでStx1特異的な分泌型IgAの発現に成功した点で、研究計画を十分に達成した。さらに、リーフレタスにおいても、分泌型IgAの発現に成功し、分泌型IgAの抗原への結合を証明できた。