hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
WT1を標的とした急性骨髄性白血病のキメラ抗原受容体発現T細胞療法の基盤構築

CD25陽性急性骨髄性白血病(AML)の白血病幹細胞(LSC)におけるCD25の発現についての検討を継続して施行してきている。これまでに、CD25陽性AML症例のAML細胞から、LSCが含まれるCD34陽性CD38陰性あるいはCD34陽性分画からCD25陽性AML細胞とCD25陰性AML細胞を分離し、免疫不全マウス(NSG)へ移植し、生着細胞がヒトAML細胞であることを確認した。さらに、生着した細胞をCD25陽性AML細胞とCD25陰性AML細胞に分離し、二次移植を行ったが、CD25陽性AML細胞とCD25陰性AML細胞の双方が生着した。これらのNSG移植実験系からは、CD25の発現はLSC分画において変動することが明らかなっている。同様のことがin vitroの細胞培養系で再現できるかを検討した。CD34陽性CD25陽性AML細胞とCD34陽性CD25陰性AML細胞を分離し、IL-3、G-CSF、GM-CSF、EPO、TPO、SCFのサイトカインの存在下で48時間培養すると、CD34陽性CD25陽性AML細胞の培養では、CD34陽性CD25陽性AML細胞とCD34陽性CD25陰性AML細胞が検出される症例とCD34陽性CD25陽性AML細胞だけが検出される症例があった。CD34陽性CD25陰性AML細胞の培養では、CD34陽性CD25陽性AML細胞とCD34陽性CD25陰性AML細胞が検出された。LSC分画におけるCD25の発現は変動がin vitroでも確認された。CD25はCD25陽性AMLのLSCに特異的に発現されているのではなく、CD25陽性AMLの治療分子標的とはない難いことが示された。また、CD25陰性AMLのCD34陽性AML細胞をNSGに移植しても、CD34陽性分画において、CD25が陽性化することはなかった。WT1を標的としたAMLのキメラ抗原受容体発現T細胞療法の基盤構築については、研究が進行していない。しかしながら、AMLおよびCMLの分子標的となりうる可能性の報告があったCD25分子について、AMLの分子標的とはならないことを示すことができたことは、AMLに対するキメラ抗原受容体発現T細胞療法を構築していく上においても有用な情報を与えたと思われる。すなわち、分子標的として有望なものとして報告されている分子についても、詳細な検証が必要であることを示しており、今後のAMLに対する治療戦略を考案する上で、考慮されるべき事項である。作製されたHLAクラスI/WT1分子由来ペプチド複合体を認識するモノクローナル抗体による、蛍光標識を用いてのフローサイトメーターでは、複合体の検出は感度以下であった。作製されたモノクローナル抗体によるHLAクラスI/WT1分子由来ペプチド複合体の検出感度を上げる工夫が必要である。ヒトAML細胞のWT1遺伝子の発現をリアルタイムRT-PCRにて検討し、WT1遺伝子の発現の高い症例のAML細胞での作製されたモノクローナル抗体による認識を確認するとともに、WT1遺伝子の発現の低い症例のAML細胞との比較解析も行うべきである。WT1遺伝子を導入した細胞株での検討も試みる必要がある。急性骨髄性白血病(acute myeloid leukemia; AML)の発症、病態形成、再発にはごく少数の白血病幹細胞(leukemic stem cell; LSC)が関与している。また、これまでのAMLに対する標準化学療法では、長期生存は40%前後に留まっており、造血幹細胞移植が治療成績の改善に貢献しているが、適切な造血幹細胞ソースがない症例や発症年齢の中央値が60歳以上であることから、AMLの治療成績の向上には、LSCに対する分子標的療法の開発が必要である。インターロイキン2受容体のα鎖であるCD25はAMLの1020%の症例でAML細胞に発現されており、CD25陽性AMLはCD25陰性AMLに比べ、予後不良であることが多くの論文で報告されている。また、CD25は正常造血幹細胞には発現されておらず、AMLのLSCに発現されていると報告されていることから、CD25を標的とした治療は画期的なAMLに対する治療戦略となる可能性がある。そこで、CD25発現のLSC特異性を再検証した(投稿論文準備中)。方法は、CD25陽性AMLの幹細胞(CD34陽性CD38陰性あるいはCD34陽性)分画から、CD25陽性AML細胞とCD25陰性AML細胞を分離し、免疫不全マウス(NSG)へ移植し、生着細胞がヒトAML細胞であることを確認した。また、一部においては二次移植を施行した。CD25陽性AML9例中3例では、CD25陽性AML細胞とCD25陰性AML細胞がともに生着した。生着した細胞をCD25陽性AML細胞とCD25陰性AML細胞に分離し、二次移植を行ったが、CD25陽性AML細胞とCD25陰性AML細胞の双方が生着した。CD25陽性AMLのLSCはCD25陽性分画とCD25陰性分画に存在し、CD25の発現はCD25陽性AMLのLSCに特異的ではないことが明らかとなった。WT1を標的としたAMLのキメラ抗原受容体発現T細胞療法の基盤構築については、研究が十分には進行していない状況である。HLAクラスI/WT1分子

由来ペプチド複合体を認識するモノクローナル抗体は作製されたが、この抗体によるHLAクラスI/WT1分子由来ペプチド複合体を発現する細胞に対する殺細胞効果は認められるものの、蛍光標識を用いてのフローサイトメーターでは、複合体の検出は感度以下であった。HLAクラスI/WT1分子由来ペプチド複合体の発現量の問題であると認識している。しかしながら、AMLに対する分子標的療法における分子標的の1つの候補であるCD25の検証をできた。これらの研究結果はAMLに対するキメラ抗原受容体発現T細胞療法の開発に有用な情報を与えるものである。AML細胞の免疫不全マウス(NSG)の新生児への移植実験系も確立でき、今後のAMLに対するキメラ抗原受容体発現T細胞療法の基盤構築に役立つものと思われる。CD25陽性急性骨髄性白血病(AML)の白血病幹細胞(LSC)におけるCD25の発現についての検討を継続して施行してきている。これまでに、CD25陽性AML症例のAML細胞から、LSCが含まれるCD34陽性CD38陰性あるいはCD34陽性分画からCD25陽性AML細胞とCD25陰性AML細胞を分離し、免疫不全マウス(NSG)へ移植し、生着細胞がヒトAML細胞であることを確認した。さらに、生着した細胞をCD25陽性AML細胞とCD25陰性AML細胞に分離し、二次移植を行ったが、CD25陽性AML細胞とCD25陰性AML細胞の双方が生着した。これらのNSG移植実験系からは、CD25の発現はLSC分画において変動することが明らかなっている。同様のことがin vitroの細胞培養系で再現できるかを検討した。CD34陽性CD25陽性AML細胞とCD34陽性CD25陰性AML細胞を分離し、IL-3、G-CSF、GM-CSF、EPO、TPO、SCFのサイトカインの存在下で48時間培養すると、CD34陽性CD25陽性AML細胞の培養では、CD34陽性CD25陽性AML細胞とCD34陽性CD25陰性AML細胞が検出される症例とCD34陽性CD25陽性AML細胞だけが検出される症例があった。CD34陽性CD25陰性AML細胞の培養では、CD34陽性CD25陽性AML細胞とCD34陽性CD25陰性AML細胞が検出された。LSC分画におけるCD25の発現は変動がin vitroでも確認された。CD25はCD25陽性AMLのLSCに特異的に発現されているのではなく、CD25陽性AMLの治療分子標的とはない難いことが示された。また、CD25陰性AMLのCD34陽性AML細胞をNSGに移植しても、CD34陽性分画において、CD25が陽性化することはなかった。WT1を標的としたAMLのキメラ抗原受容体発現T細胞療法の基盤構築については、研究が進行していない。しかしながら、AMLおよびCMLの分子標的となりうる可能性の報告があったCD25分子について、AMLの分子標的とはならないことを示すことができたことは、AMLに対するキメラ抗原受容体発現T細胞療法を構築していく上においても有用な情報を与えたと思われる。
ツメガエル8細胞期胚における背腹軸パターンとアクチビンレセプターの相関

申請者は8細胞期のツメガエル動物半球分離割球のアクチビン応答能背腹の差があることを報告しており、このプレパターンが体軸の決定に関与していると考えている。応答能勾配の形成機構にアクチビンレセプターの量の差が関与している可能性が考えられたため、申請者は背腹の割球内での複数のレセプター分子の母性mRNA量の経時的な変化を調べた。その結果、RNAase protection法でmRNA量に著しい差は検知できなかった。よって勾配はレセプター量の差が直接的に関与しているのではないことが示唆された。しかし、胚に含まれている母性mRNAは極めて少量であるため、より検出感度の高い方法(RT-PCR法など)によって再検討をおこなう予定である。現在申請者は、細胞分化の勾配の原因となるのが背側割球に局在するといわれる背方化因子の存在であると考えている。背方化の勾配への影響と、最終的な体軸決定の機構を調べるために、分離割球に塩化リチウム(胚の背方化の作用をもつ)を処理する実験を行ってみた。すると、リチウム処理を受けた割球はいずれも著しく背方化され、特に腹側の割球は背側割球と同様の性質を獲得して背側中胚葉を分化するように転換された。この結果は、8細胞期胚の動物半球にはあらかじめ背腹軸に沿った中胚葉分化能の勾配が存在するが、これは絶対的な決定ではなく外部からの作用(植物半球による誘導)によって変わりうるものであることを示唆している。このことは16細胞期に動物半球と植物半球を分離して180度回転させても胚が発生し、背腹軸は植物半球の軸に依存することと一致する。植物半球の作用は、中胚葉誘導のみならず動物半球の細胞を積極的に背方化することと考えられる。
ナトリウムポンプ遺伝子の筋分化に伴う発現制御機構

ナトリウムポンプα2サブユニット遺伝子の筋分化に伴う転写制御機構を知る為に、本遺伝子の転写制御領域をL6筋芽細胞への形質転換法にて同定した。転写開始点の上流-175から-108の間に810倍の転写促進領域を見出した。本領域中には2ヶ所のEボックスとSp1コンセンサス配列及びGGGAGG配列が見出されたので、各部位に特異的な変異を導入し、制御へのかかわりを検討した。その結果、上流のEボックスは負の制御エレメントとして作用し、Sp1コンセンサス配列とGGGAGG配列は正の制御エレメントとして作用することが明らかになった。各エレメントを通して作用する転写因子を同定するために、L6細胞核抽出液を調製し制御領域DNA断片(-175-104)をプローブにゲルシフト法,D Nase Iフレットプリント法,メチル干渉法にて結合因子を解析した。その結果、2つのEボックスに結合する因子の存在、及びSp1コンセンサス配列とGGGAGG配列にまたがった広い領域にSp1が結合すること、を見出した。Sp1の結合様式をさらに解析するため、Sp1コンセンサス配列,GGGAGG配列の各々に変異を導入してゲルシフト阻害実験を行うと、結合そのものに変化はなく、親和性が低下することが明らかとなった。さらに、T4DNAポリメラーゼフットプリント法にてSp1の結合領域を解析したところ、3ヶ所の結合部位が見出され、上記の解析で見出した広い領域への結合が3つの結合状態の混合物であることが強く示唆された。このことからSp1結合がKinetic Synergismによって転写促進に作用する可能性が示された。さらに、Sp1の結合がDNAに湾曲を引き起こすことも、湾曲検出ベクターを用いたゲルシフト法によって発見した。このように、ナトリウムポンプα2サブユニット遺伝子の転写制御エレメント及び因子の同定とそのDNA結合様式の詳細な解明を行い、本遺伝子の制御機構の分子レベルの理解に大きな基礎づけができた。ナトリウムポンプα2サブユニット遺伝子の筋分化に伴う転写制御機構を知る目的で、本遺伝子の連続欠失変異遺伝子を作成し、10T1/2細胞に筋分化マスター遺伝子であるNyoDとともに形質転換を行い、転写制御領域の同定を行った。同時にL6筋芽細胞にも連続欠失変異遺伝子を形質転換し、転写制御領域を解析した。両細胞とも、-175から-108の間に810倍転写を促進する領域が存在することがわかった。本領域には2つのE-box配列と1つのSp1結合コンセンサス配列とGGGAGG配列が存在したので、各部位特異的な変異を導入し、制御エレメントを詳細に解析した。その結果、L6細胞では上流のE-boxが負の制御エレメントとして作用し、Sp1コンセンサス配列とGGGAGG配列とを含む領域が正の転写制御エレメントとして作用することが明らかになった。各エレメントを通じて作用する転写因子を同定するためにL6細胞株抽出液を調製し、制御領域DNA断片(-175-104)をプローブにゲルシフト法、DNaseIフットプリント法、メチル化干渉法にて結合因子を解析したところ、2つのE-boxに結合する因子の存在、及びSp1コンセンサス配列とGGGAGG配列両者にわたる広い結合領域にSp1が結合することを見出した。これらの因子の結合様式と蛋白質間相互作用の様式と転写制御とのかかわりについて今後分子レベルでの解析を進める予定である。ナトリウムポンプalpha2サブユニット遺伝子の筋分化に伴う転写制御機構を知る為に、本遺伝子の転写制御領域をL6筋芽細胞への形質転換法にて同定した。

転写開始点の上流-175から-108の間に810倍の転写促進領域を見出した。本領域中には2ケ所のEボックスとSplコンセンサス配列及びGGGAGG配列が見出されたので、各部位に特異的な変異を導入し、制御へのかかわりを検討した。その結果、上流のBボックスは負制御エレメントとして作用し、Snlコンセンサス配列とGGGAGG配列は正の制御エレメントとして作用することが明らかになった。各エレメントを通して作用する転写因子を同定するために、L6細胞核抽出液を調製し制御領域DNA断片(-175-104)をプロープにゲルシフト法、D Nase Iフットプリント法、メチル干渉法にて結合因子を解析した。その結果、2つのEボックスに結合する因子の存在、及びSplコンセンサス配列とGGGAG配列にまたがった広い領域にSpl結合すること、を見出した。Splの結合様式をさらに解析するため、Splコンセンサス配列、GGGAGG配列の各々に変異を導入してゲルシフト阻害実験を行うと、結合そのものに変化はなく、親和性が低下することが明らかとなった。さらに、T4DNAポリメラーゼフットプリント法にてSplの結合領域を解析したところ、3ケ所の結合部位が見出され、上記の解析で見出した広い領域への結合が3つの結合状態の混合物であることが強く示唆された。このことからSpl結合がKinetic Synergismによって転写促進に作用する可能性が示された。さらに、Splの結合がDNAに湾曲を引き起こすことも、湾曲検出ベクターを用いたゲルシフト法によって発現した。このように、ナトリウムポンプalpha2サブユニット遺伝子の転写制御エレメント及び因子の同定とそのDNA結合様式の詳細な解明を行い、本遺伝子の制御機構の分子レベルの理解に大きな基礎づけができた。
有機高分子薄膜の分子配向制御とその光・電子機能

我々付加重合系における蒸着重合においてその分子配向制御と重合性に関する知見を得るため、典型的な櫛形高分子を形成し、また主鎖はフレキシブルであるがアルキル側鎖が結晶化する事が知られているビニル系長鎖アルキル化合物であるオクタデシルアクリレート及びオクタデシルメタクリレートの蒸着膜を作製し、その分子配向と光重合性について検討すると共に、光を照射しながら蒸着を行う蒸着光重合について整理した。1.オクタデシルアクリレート分子は本研究で用いたZnSe及びNaCl結晶上基板温度-1015°Cのいずれにおいてもhexagonal packingに結晶化していることがIRスペクトルより明かとなった。この結晶系においては分子は分子軸周りに自由な回転運動が許されるため、UV光照射において重合が進行しその重合率は照射時の基板温度の上昇にともない増加した。一方、オクタデシルメタクリレートは両結晶上共-3°C以下ではtriclinic packingとなり回転が抑制されるため重合は進行しない。高い基板温度ではhexagonal packingをとり、オクタデシルアクリレートと同様な挙動を示した。2.蒸着光重合において得られる薄膜中の高分子の分率は、オクタデシルアクリレート、タクリレート共に基板温度の上昇に伴い増加し、その高分子収率は単分子膜作製後の光重合に比べ35倍高い。これは蒸着中基板表面での分子のマイグレーションが重合性に大きく寄与しているためと考えられた。3.偏光FT-ATR-IRスペクトル測定より、膜中の分子の特性吸収についてその遷移モーメントと基板法線とのなす角を求め、それらよりアルキル側鎖の配向を評価した。アルキル側鎖は基板に対し垂直配向であり、基板温度上昇に伴いその基板法線となす角は徐々に大きくなる。高分子においては主鎖から数個のメチレン鎖はアモルファス状態であることから、高分子化によりアルキル側鎖の配向が乱された結果と考えられた。
CPUとFPGAによる高性能ヘテロジニアス並列分散計算フレームワークの開発

高性能コンピュータの消費電力が性能向上を阻む主要因となり、スーパーコンピュータやデータセンターにはGPUやFPGAといったアクセラレータデバイスが広く導入されている。しかし現在のところ、プログラミング環境の制約からFPGAはデータセンターなどの環境でその潜在的な性能を充分に発揮できているとはいえない。本研究では、これを解決するための並列分散プログラミング環境と動作検証環境の実現を目指す。
ペアリング群上の暗号要素技術に対する対称-非対称群自動変換手法の研究

対称ペアリング群上の方式を非対称ペアリング群上の方式に変換する際に、それら方式の安全性証明をも含めて変換する方法を提案していたが、さらに"署名サイズが最も小さくなるようにする"、"メッセージは特定の群にのみ設定されるようにする"などといった禁止事項や制約条件が存在する場合についても変換可能な方式を提案した。さらに、変換対象が巨大化した場合、その探索を効率的に行い現実的な実行時間で変換方法を出力する効率化の手法についての検討を行い、効率化する手法を提案し、その提案を反映した手法を具現化させたツールを公開した。併せて、マニュアル、いくつかのサンプル例なども公開した。なお、本結果は、電子情報通信学会の本論文誌(IEICE-EA)に掲載された。また、変換先の非対称ペアリング群上で、擬似コードを用いたパフォーマンス評価を行える手法についても昨年度から検討していた内容をツールとして具現化し、さらに、より幅広い利用ユーザに対応できることを目的とし、対応する記述言語を複数にし、記述したコードの正しさも同時に確認できる機能も備えたツールを具現化し、公開した。併せてマニュアル、いくつかのサンプルなども公開した。なお、本結果を暗号と情報セキュリティシンポジウムにて発表し、イノベーション論文賞を受賞した。目標として掲げている課題のうち、1.に相当する「対称群上で動くペアリング演算を用いた暗号部品を非対称群上で動くペアリング演算を用いた暗号部品へと自動変換する手段に関する調査・研究」について、および、2.に相当する「対称ペアリング群上の困難性仮定にもとづいて安全性が保証されている暗号要素技術を、非対称ペアリング群上での困難性仮定に基づいて安全性が保証された暗号要素技術に変換する方法。」について、目標としている新たな手法を創出するために、対称群上のペアリング演算と非対称群上のペアリング演算の挙動の違いを抽出し、汎用的な変換方法に関する既存研究の現状調査を行った。また、課題の一つのアプローチとして、対称群上で動作することを想定したペアリング演算を用いた暗号アルゴリズムやプロトコルを対象として、その挙動を記述したものを入力とし、非対称群上で動作するペアリング演算を用いた暗号アルゴリズムへの変換方法を検討。検討内容に関連する結果として、国際会議CRYPTO2016にて発表した。会議発表では、クラウド上などで用いられるような暗号アルゴリズムを複数含んだ暗号アプリケーション・システムなどについて、取り扱う対象となるアプリケーションやシステムの規模が大規模化した場合でも、パフォーマンスを損なわずに効率的に変換方式を抽出する手法に関する新しい探索手法の提案を行った。実際に、その探索アルゴリズムを駆動した際に、従来方式に比べ、数百倍のパフォーマンスの向上が図れることを示した。具体例として、これまでに提案された対称群上で動作することを想定した暗号アルゴリズムに対して、非対称群上で動作するアルゴリズムに変換した際のパフォーマンスが実用に耐え得るほどの処理時間で実施可能であることを示した。本課題となる技術分野の最新動向を把握するために国際会議などへの参加を複数予定していたが、基礎知識の習得および課題に対する問題抽出などを重点的に進めた。課題に対しては、新しいアプローチによる提案手法の検討を進めることができた。最新の技術動向調査については、若干手薄であったが、2年目以降で補うことで予定通りに遂行可能である。今後、最新の技術動向を踏まえた上で、更なる提案手法の向上を目指す。対称ペアリング群上での方式から非対称ペアリング群上への方式へと変換する際に、安全性の観点・実装上の効率(通信量や計算量を抑える)の観点・他の暗号方式との接続の観点などから、様々な制約条件が必要となるケースが往々にして発生する。例えば、安全性を確保するために、ある群要素は、もう一つの別の群要素とは異なる群に配置する必要があり、同じ群に存在させると、方式自体の安全性を壊してしまう、もしくは方式として想定している機能に矛盾を期してしまう、などの理由から制約条件が発生する。別の一例としては、計算量を抑えるためにある群要素は、可能な限り演算コストの小さい方の群に配置したい、などの理由からも制約条件が発生する。これらの制約条件や要求条件を加味した上で、その条件に適した方式を抽出し、オリジナルの方式からの変換を可能とする手法について検討を行った。さらに、変換先の非対称ペアリング群上で、擬似コードを用いたパフォーマンス評価を行える手法についても検討を行った。非対称ペアリングでは、用いるパラメータや曲線によって、高速処理が可能な演算、多くの時間を要する演算などが異なる。そこで、曲線ごとの実装データベースを準備し、方式の入力ファイルをもとに、対象方式のパフォーマンス評価を行える手法を提案した。この手法を用いることにより、対象方式の曲線ごとの処理速度の比較、異なるパラメータによる処理速度の比較、同一曲線状での比較対象となる複数の方式の処理速度の比較、高速化手法の効果の検証、などを行うことが可能となる。また、非対称群上の方式を対象とした擬似コードを用いたパフォーマンス評価手法については、具体的な方式を例として、実際に実装した場合のパフォーマンス値と擬似パフォーマンス評価手法を用いて算出したパフォーマンス値を比較し、その乖離が誤差程度の範囲に収まることも確認した。当初予定していた検討項目は、予定通り実施することができた。さらに、非対称群上の方式を対象とした擬似コードを用いたパフォーマンス評価手法についても検討を行うことができた。

対称ペアリング群上の方式を非対称ペアリング群上の方式に変換する際に、それら方式の安全性証明をも含めて変換する方法を提案していたが、さらに"署名サイズが最も小さくなるようにする"、"メッセージは特定の群にのみ設定されるようにする"などといった禁止事項や制約条件が存在する場合についても変換可能な方式を提案した。さらに、変換対象が巨大化した場合、その探索を効率的に行い現実的な実行時間で変換方法を出力する効率化の手法についての検討を行い、効率化する手法を提案し、その提案を反映した手法を具現化させたツールを公開した。併せて、マニュアル、いくつかのサンプル例なども公開した。なお、本結果は、電子情報通信学会の本論文誌(IEICE-EA)に掲載された。また、変換先の非対称ペアリング群上で、擬似コードを用いたパフォーマンス評価を行える手法についても昨年度から検討していた内容をツールとして具現化し、さらに、より幅広い利用ユーザに対応できることを目的とし、対応する記述言語を複数にし、記述したコードの正しさも同時に確認できる機能も備えたツールを具現化し、公開した。併せてマニュアル、いくつかのサンプルなども公開した。なお、本結果を暗号と情報セキュリティシンポジウムにて発表し、イノベーション論文賞を受賞した。1年目で手薄となっていた関連技術の最新技術動調査を行い、課題を解決するために必要となる技術を見極め、有用なアプローチを策定する。また、新たな関連技術動向として、非対称群の困難性を仮定している問題に対して、既存結果として知られている解法を上回る効率で問題を解く手法が提案された。本研究では、"安全性を維持したまま"動作する暗号アルゴリズム等の変換を課題としているため、これらの安全性の根拠としている困難性仮定に関する技術動向も把握し、適切なパラメータ設定等にも配慮し、課題解決を図る。実際社会で用いられている情報システムは、様々な暗号技術が複数用いられ、複雑化・巨大化しているのが現状である。そのような複雑で巨大な暗号システムに対しても、実用に耐えうる処理速度で変換が行えることは、実利用に向けて重要な課題となる。さらにそれらの安全性証明などを併せて考慮する場合、その解析はより複雑で困難なものとなる。そこで、対象方式やシステムが、複雑化・巨大化する場合に対しても、対象方式の安全性を損ねることなく、安全性証明を併せて考慮したうえで、実用的な処理時間で変換が可能となる手法について検討を進める。関連する最新の技術動向調査のための旅費を想定していたが、現状把握および課題の抽出に重点を置いたため、予定額を下回った。予定していた旅費の支出などが次年度に延長となったため。昨年度手薄となってしまった最新の技術動向調査を目的とした旅費として使用する予定である。
フラストレートした磁性体における量子スピン液体の研究

量子スピン液体状態の有力な候補と考えられていたが謎も多いフラストレートした磁性体Tb2Ti2O7を詳細に研究した。このためにはTb2+xTi2-xO7+yの純良単結晶、すなわち微小な組成(x, y)をコントロールした結晶を育成することが非常に重要と考え、試行錯誤の後、結晶育成に成功した。そして純良単結晶を用いた比熱・磁化測定、中性子散乱実験等を行い、この系は磁気的スピンのみならずフラストレートした電気的多極子自由度を持つ系であること、また微小な組成変化により多極子秩序状態と量子スピン液体状態の間を量子相転移することを発見した。本研究の目的は、量子スピン液体状態だろうと言われているフラストレートした磁性体Tb2Ti2O7の基底状態を実験的に究明することである。我々の最近の研究結果に基づく予想も含めた仮説では、この系はTb{2+x}Ti{2-x}O{7+y}と書くべきものであり微小なx (and y)に依存して基底状態が変化する。x > x_c = -0.002では、0.5 K付近で4極子秩序(and Jahn-Teller格子変形)が起こると同時に微小磁気モーメントの反強磁性体になる。一方x < x_cでは、この系はスピンと4極子(格子変形)の両者が量子力学的に揺らいだ液体的基底状態になるだろうと考えている。このようなスピン-4極子(格子)系の揺らいだ基底状態と量子相転移の研究例はほとんどなく、非常に重要な物性物理学の舞台になっている。本研究目標を達成するには、Tb{2+x}Ti{2-x}O{7+y}の純良単結晶を育成することが最重要課題であるが、2013年は、赤外線イメージ炉を用いたFZ法の育成条件を様々に試し、数mm程度の大きさの長距離秩序を持つ純良単結晶を育成することに成功した。現在、この単結晶を用いて比熱、磁化、中性子回折実験を用いた物性の総合評価を行っている。この単結晶が真に純良かどうか?の判断は、これらの実験結果と解析を待つ必要がある。当初の研究計画では、2013年3月に納入された新しい3Heクライオスタットを用い、試料を評価するために低温比熱&磁化の測定を可能にする予定とした。こちらの計画は、3Heクライオスタットを使用する上で低温技術上の若干の問題があることが分かったので進行が遅い状況となってしまった。研究当初に以下の仮説を立てた。この系はTb{2+x}Ti{2-x}O{7+y}と書くべきものであり微小なx (and y)に依存して基底状態が変化する。x > x_c = -0.002では、0.5 K付近で電気的4極子秩序が起こると同時に微小磁気モーメントの反強磁性体になる。一方x < x_cでは、この系はスピンと4極子の両者が量子力学的に揺らいだ液体的基底状態になる。この仮説を検証するには、Tb{2+x}Ti{2-x}O{7+y}の純良単結晶を育成することが最重要課題であり、2013年度に、数mm程度の大きさの長距離秩序を持つ領域(x > x_c)の純良単結晶を育成することに成功した。2014年度にはこの単結晶を用いて、比熱、磁化、中性子回折実験を用いた実験を行った。これらの実験結果が、電気的4極子秩序状態を示すものかどうか?を調べるために、classical MC simulation、MF-RPA近似計算を用いた解析を行うと共に、理論家の助けを借りてquantum MC simmulationを用いた解析も行った。2015年3月の時点で、長距離秩序を持つTb{2+x}Ti{2-x}O{7+y}は電気的4極子秩序状態であり、理論的には4極子状態とU(1)量子スピン液体状態の境界付近に位置しているものと考えられることが分かった。この結果は、3月の物理学会で発表を行い、現在論文を執筆中である。2014年度は、より大型の純良単結晶を育成して中性子非弾性散乱を行う計画であったが、こちらは結晶育成法における困難に遭遇して苦戦中である(see現在までの達成度)。一方x < x_cでは、この系はスピンと電気的4極子の両者が量子力学的に揺らいだ液体的基底状態になる。この仮説を検証するには、Tb{

2+x}Ti{2-x}O{7+y}の純良単結晶を育成することが最重要課題であり、2013年度に、数mm程度の大きさの長距離秩序を持つ(x > x_c)純良単結晶を育成することに成功した。2014年度にはこの単結晶を用い、比熱、磁化、中性子回折を用いた実験と解析を行い、これらの結果を2015年度にいくつかの論文にまとめて発表した。ここで得た結論は、Tb{2+x}Ti{2-x}O{7+y}は電気的4極子秩序状態とU(1)量子スピン液体状態の境界付近に位置しているということである。2015年度は、ついに大型の量子スピン液体になる状態純良単結晶を育成成功した。2015年11月には、ILL-IN5で中性子非弾性散乱を行ない、現在この実験結果を解析中である。理論上の候補であるU(1)量子スピン液体状態が実現しているかどうか?非常に興味深い。中性子非弾性散乱実が可能な大型純良単結晶の育成に予想外の時間がかかり、研究課題の進捗状況は約1年ほど遅れていた。その後、2015年度に大型純良単結晶が育成できたので、現在は順調に進んでいる状況です。本研究の目的は、量子スピン液体状態(QSL)だろうと言われているフラストレートした磁性体Tb2Ti2O7の基底状態を実験的に究明することである。研究当初に以下の仮説を立てた。この系はTb{2+x}Ti{2-x}O{7+y}と書くべきものであり微小なx (and y)に依存して基底状態が変化する。x > x_c = -0.002では、0.5 K付近で電気的4極子秩序(QO)が起こると同時に微小磁気モーメントの反強磁性体になる。一方x < x_cでは、この系はスピンと電気的4極子の両者が量子力学的に揺らぐQSL状態になる。この仮説を検証するには、Tb{2+x}Ti{2-x}O{7+y}の純良単結晶を育成することが最重要課題であり、2015年11月にはついにxを制御した( x > x_c and x < x_c )QOおよびQSL基底状態をもつ大型単結晶の育成に成功した。2015-2016年度は、これらの単結晶を用いILL-IN5, ILL-Thales, JPARC-AMATERASで中性子非弾性散乱実験を行ない、QOおよびQSL状態の特徴と考えられる磁気スペクトルの観測に成功した。現在この興味深い実験結果を解析中であるが、中性子TOF実験データ解析は(ビッグデータの処理であるため)CPUを用いた数値計算にメモリと時間が予想以上に必要で、数値計算に困難を極めている状況である。これを解決するためFORTRANsource codesの書き直し、multi-core-CPUの購入&整備を進めたので、今後数ヶ月程度で解析結果が出るものと予想している。QO論文H. Takatsu et al. PRL 116, 217201 (2016)に続くQSL論文を2017年夏までに投稿したい。量子スピン液体状態の有力な候補と考えられていたが謎も多いフラストレートした磁性体Tb2Ti2O7を詳細に研究した。このためにはTb2+xTi2-xO7+yの純良単結晶、すなわち微小な組成(x, y)をコントロールした結晶を育成することが非常に重要と考え、試行錯誤の後、結晶育成に成功した。
日光東照宮建造物の保存のための建築材料劣化に関する調査研究

日光東照宮の国宝および重要文化財の全建物の劣化状態について調査を行い、その調査結果を基に劣化箇所の詳細を調べ、あわせて、同時代の建物数例との比較を行い、劣化の原因と程度を考察した。1.劣化の原因は自然環境の影響、材料の耐久性に対する特質、人的影響によるものに分けられ、自然環境、人的影響、材料の耐久性に対する特質の順で大きな要因となっている。2.主要使用木材の材種については、当初、林材の専門家への鑑定依頼を考えたが、大多数の部分については、結構書、修理報告書等に記録があり、材種の数も限られ、専門家を煩わせず判定できた。3.劣化の建物別比較、部位別比較、自然環境別比較、仕上げによる比較を行い、劣化状況については写真による調査記録の作成を行った。(1)建物別の違いは、自然環境、構法、材料の違いによっているがそれぞれの建物の劣化の程度を把握する資料となる。(2)部位別に見ると、内よりは外、上よりは下の部位の傷みが激しい。ただし、軒先・妻の破風などは、上部においても比較的劣化が進行している。屋根に雨漏りなどがあった場合は小屋裏でのくされが生じている。また、扉の軸、輪蔵の軸のように動く部分は損傷が見られる。(3)構法別では、土台の有無により柱の損傷に差が見られる。(4)材料別では、桧の方が欅より耐久性が見られるが、比較的陽当りがよく乾燥している場所では大きな差はない。(5)仕上げの有無による違いは、一般的に塗装があった方が良い状態が保たれている。ただし、塗装の質の悪いものや手入れの悪いものは無塗装以上に劣化を進化させている。4.保存・耐久性向上のための考察を行った。
新規の乳癌予後予測因子の研究-乳癌組織中の線溶系プロテアーゼとそのインヒビター

乳癌根治手術時に得られた265例の乳癌組織をホモジネートし、超遠沈にてその上清を採取し、細胞質分画を得、以下の測定に用いた。組織型プラスミノーゲンアクチベータ-(t-PA)、ウロキナーゼ型のプラスミノーゲンアクチベータ-(u-PA)、プラスミノーゲンアクチベータ-インヒビター(PAI-1)はELISAのキットを用いてその抗原量を測定した。多変量解析は、Cox Hazard Modelを用い、無再発生存曲線はKaplan-Meier法によって、生在曲線の有意差検定はGeneralized Wilcoxontest,Log rank testを用いた。乳癌の再発の有無により多変量解析を用い各因子を比べると,組織学的リンパ節転移度が最も強い悪性度の指標であることが判明した。(p<0.001)ついでu-PA(p<0.005),t-PA(p<0.01),PAI-1(p<0.01)が並び,すべて有意差を示した.エストロゲンレセプターレベルは有意の差を示さなかった.u-PA,PAIは高値のものが、t-PAは低値のものが有意に予後不良で、それらは予後予測因子となり得ることが判明した。同様に無再発生存曲線の解析では、t-PAの低値のものu-PA,PAIの高値のものは有意に予後不良であった。t-PA高値例の3年無再発生存率は87%で、低値例は69%であった。u-PA低値例の3年無再発生存率は85%で、高値例では74%であった。PAIでは低値例の3年無再発生存率は91%で、高値例では80%と3因子すべて有意差が認められた。結論としては、線溶系を調節する酵素であるt-PA,u-PAおよびそのインヒビターであるPAIは乳癌組織中に存在し、t-PAの低値の症例u-PA,PAIの高値の症例では、有意に予後不良であった。t-PA,u-PA,PAIは乳癌の生物学的悪性度の新しい指標と成り得るを考えられた。またこれらの線溶系のパラメータを測定することにより、再発の可能性の高い患者を選別し有効に補助療法を施行することが可能となり,患者にとっても,医療費の面からも非常に有用であることが判明した.乳癌組織中の組織型プラスミノーゲンアクチベータ-,ウロキナーゼ型プラスミノーゲンアクチベータ-およびプラスミノーゲンアクチベータ-インヒビターをそれぞれに対する抗体を用いて免疫組織化学法にてその局在を検討する。u-PAおよびu-PAのレセプターに対する抗体を用いて免疫組織化学法にて、乳癌組織中の両者の局在を検討したところ、両者の量の多い乳癌は、そうでないものと比べて予後不良であった。

u-PAおよびu-PAのレセプターに対する抗体を用いて免疫組織化学法にて、乳癌組織中の両者の局在を検討したところ、両者の量の多い乳癌は、そうでないものと比べて予後不良であった。
微生物に由来する環境保全型有害昆虫制御剤の開発

ユスリカ殺虫性BTについて、Bacillus thuringiensis var.israelensisの株からユスリカに活性を示す株を選抜して、そのユスリカ殺虫性とボウフラ殺虫性の比較を試験して、作用性の相違を明らかにした。ボウフラ殺虫性BTについて、Bacillus thuringiensis var.israelensisの殺虫蛋白質cryIVA及びcryIVBの消化液によるプロセシングの機能を明らかにし、この成果に基づいて組換え殺虫蛋白質を構築し、その遺伝子をらん藻に導入して殺虫蛋白質を高発現した形質転換体の作出を試みた。その他、BT剤の作用性の評価を行い、胞子が殺虫蛋白の殺虫効果を上げることを明らかにした。また、組換えBT剤の開発についても、Bacillus thuringiensis aizawai株の135kDa蛋白を酵母に発現することに成功した。以上の通り、ユスリカ殺虫性BT、ボウフラ殺虫性BT、鱗翅目殺虫性BTについて、それらの作用性を明らかにし、害虫防除の新しい手法を打ち出す基礎を作ることが出来た。Bacillus thuringiensis(BT)の各種菌株のうちで最も殺虫効力の優れた、双翅目衛生害虫に有効な殺虫蛋白遺伝子と鱗翅目農業害虫に有効な殺虫蛋白遺伝子を取り上げ、それらを解析、改変して、バクテリアや植物に発現し、殺虫蛋白の活性や作用を解析することにより、従来のものより高活性で安定性に優れた殺虫蛋白を創造し、それらを環境保全型の新規有害昆虫制御剤として開発する。(1).BTisraelensis株からユスリカに殺虫活性を示す亜種を選抜し、その殺虫蛋白質の殺虫活性及びアミノ酸配列を検討した。(2).BTisraelensis株のcryVAとcryIVBについて、転写開始点、プロモーター領域などの解析を行い、また、変異分析により構造遺伝子の保存領域の役割を明らかにした。(3).BTaizawai株のcryIAb及びその変異株の活性フラグメント部分を発現したトランスジェニック・タバコ植物を作出し、ハスモンヨトウ幼虫に対する耐性評価試験を行ない、食害耐性を示すことが判明した。(1).組換え体殺虫蛋白のレセプターとの作用を検討した。これまでの成果をふまえて、遺伝子・蛋白質の配列情報、作用性などの解析を行ない、改変箇所を選定して、高活性、高安定性の改良を目指す。本研究は微生物殺虫剤Bacillus thuringiensis(BT)の各種菌株のうちで、最も殺虫効力の優れた双翅目衛生害虫に有効な殺虫蛋白質遺伝子と鱗翅目農業害虫に有効な殺虫蛋白遺伝子を取り上げ、それらの構造、機能、殺虫性などを解明して、従来より高活性で安定性に優れた殺虫蛋白を創製し、それらを環境保全型の有害昆虫制御剤として開発する計画である。(1)BT israelensis株からユスリカ殺虫活性を示す遺伝子をクローニングして、その塩基配列を決定し、殺虫蛋白質の構造と機能の関係の解明を試みた。(2)BT israelensisのCry IVAの活性化機構の解明を試み、in vitroでボウフラ消化管抽出液によって42kDaと45kDaの断片を生じ、両者の共存で殺虫活性を示すことを明かにした。(3)BT Cry ICの修飾遺伝子の単独と、それとP4501A1との同時発現のための植物用発現プラスミドを構築し、アグロバクテリウムを介してリ-フディスク法でタバコを形質転換した。形質転換タバコの形質を解析している。(4)BT菌株のUV耐性株の殺虫活性を評価して生芽萌の役割を明かにした。(5)組換え体殺虫蛋白質の大量培養による生産性と殺虫活性の評価を検討した。ユスリカ殺虫性BTについて、Bacillus thuringiensis var. israelensisの株からユスリカに活性を示す株を選抜して、そのユスリカ殺虫性とボウフラ殺虫性の比較を試験して、作用性の相違を明らかにした。ボウフラ殺虫性BTについて、Bacillus thuringiensis var. israelensisの殺虫蛋白質cryIVA及びcryIVBの消化液によるプロセシングの帰能を明らかにし、この成果に基づいて組換え殺虫蛋白質を構築し、その遺伝子をらん藻に導入して殺虫蛋白質を高発現した形質転換体の作出を試みた。

その他、BT剤の作用性の評価を行い、胞子が殺虫蛋白の殺虫効果を上げることを明らかにした。また、組換えBT剤の開発についても、Bacillus thuringiensis aizawai株の135kDa蛋白を酵母に発現することに成功した。以上の通り、ユスリカ殺虫性BT、ボウフラ殺虫性BT、鱗翅目殺虫性BTについて、それらの作用性を明らかにし、害虫防除の新しい手法を打ち出す基礎を作ることが出来た。
樹状細胞と癌細胞との融合細胞を用いたオーダーメイド癌免疫療法

腫瘍特異的免疫の効率的な導入を確立し,ヒト悪性腫瘍に対するワクチン療法の確立を目的として本研究課題に取り組んだ.マウス骨髄細胞より単核球を抽出してGM-CSF、IL-4を用いて骨髄由来樹状細胞を誘導することに成功した.また,マウス癌細胞株と骨髄由来樹状細胞との融合細胞をポリエチレングリコール法にて作成した.以上の過程でマウス1個体あたり1X10^5の融合細胞を作成可能であった.樹状細胞と癌細胞との融合細胞はマウスにて腫瘍特異的細胞障害T細胞を誘導可能であった.しかし,in vivoでの実験系では樹状細胞を作成した個体にワクチン投与するにはいたらず,有効な成果は得られなかった.そこで,ヒト固形癌での樹状細胞の役割について検討を加えた.ヒト原発性乳癌症例について原発巣およびセンチネルリンパ節での樹状細胞の分布について組織免疫学的に検討した.対象はセンチネルリンパ節転移陽性例15例,陰性例14例.原発巣の腫瘍内浸潤樹状細胞は転移陽性例(1視野平均9.8個)が陰性例(2.5個)に比べ有意に高値であった.また,転移陽性例で原発巣と転移巣の腫瘍内浸潤樹状細胞を比較検討すると転移巣内の腫瘍内浸潤樹状細胞が高値であった.センチネルリンパ節での樹状細胞数には両群間に有意差は認めなかった.また,腫瘍エストロゲンレセプター発現と腫瘍内浸潤樹状細胞との関係では陰性例が陽性例より高値を示した.以上の結果より,樹状細胞の個数ではなく,その遊走および分布がヒト固形癌における生体内での免疫能誘導に深く関わっているものと推察された.C3H/Heマウスを使用し,前・後肢の長管骨骨髄より平均1x10^7個の単核球を分離することができた.この単核球をGM-CSF、IL-4にて刺激し,7日間培養することによって樹状細胞を誘導することに成功した.しかし,導入された樹状細胞は平均3x10^3から1x10^4個と充分な数の樹状細胞を誘導することができていない.さらに,マウス癌細胞FM-3Aと誘導した樹状細胞とをポリエチレングリコール処理を行って融合する基礎実験を行った.ポリエチレングリコール処理中に樹状細胞の細胞障害が生じるため腫瘍細胞と樹状細胞との融合細胞を充分な個数を導入するには至っていない.したがって,融合細胞の確認をフローサイトメトリーにて行っているが,細胞数が少ないために樹状細胞と腫瘍細胞の両者の表面抗原を併せ持っているかどうか検討が困難であった.現在,肺癌および乳癌患者の末梢血より単核球を分離し,GM-CSF、IL-4にて刺激し,7日間培養することによって樹状細胞を誘導している.また,その個体の腫瘍片あるいは癌性胸水中より腫瘍細胞を単離して培養を行い,これを患者末梢血単球由来の樹状細胞とをポリエチレングリコール処理にて融合細胞を作成する実験を行っている.患者末梢血50mlより1x10^6個の樹状細胞を誘導が可能であり,これと単離培養した腫瘍細胞を1:5の比率でポリエチレングリコール処理することで,1x10^4から1x10^5個の融合細胞を作成可能であった.この融合細胞から細胞障害性T細胞(CTL)を誘導する実験を行っているが,融合細胞の寿命が現在のところ35日と短命なため,CTL誘導には至っていない.腫瘍特異的免疫の効率的な導入を確立し,ヒト悪性腫瘍に対するワクチン療法の確立を目的として本研究課題に取り組んだ.マウス骨髄細胞より単核球を抽出してGM-CSF、IL-4を用いて骨髄由来樹状細胞を誘導することに成功した.また,マウス癌細胞株と骨髄由来樹状細胞との融合細胞をポリエチレングリコール法にて作成した.以上の過程でマウス1個体あたり1X10^5の融合細胞を作成可能であった.樹状細胞と癌細胞との融合細胞はマウスにて腫瘍特異的細胞障害T細胞を誘導可能であった.しかし,in vivoでの実験系では樹状細胞を作成した個体にワクチン投与するにはいたらず,有効な成果は得られなかった.そこで,ヒト固形癌での樹状細胞の役割について検討を加えた.ヒト原発性乳癌症例について原発巣およびセンチネルリンパ節での樹状細胞の分布について組織免疫学的に検討した.対象はセンチネルリンパ節転移陽性例15例,陰性例14例.原発巣の腫瘍内浸潤樹状細胞は転移陽性例(1視野平均9.8個)が陰性例(2.5個)に比べ有意に高値であった.また,転移陽性例で原発巣と転移巣の腫瘍内浸潤樹状細胞を比較検討すると転移巣内の腫瘍内浸潤樹状細胞が高値であった.センチネルリンパ節での樹状細胞数には両群間に有意差は認めなかった.また,腫瘍エストロゲンレセプター発現と腫瘍内浸潤樹状細胞との関係では陰性例が陽性例より高値を示した.以上の結果より,樹状細胞の個数ではなく,その遊走および分布がヒト固形癌における生体内での免疫能誘導に深く関わっているものと推察された.
集中リハビリテーションにおける神経回路レベルでの作用機序の解明と臨床応用への展開

脳損傷後には中枢神経系の構造的・機能的再編が生じ、これらは障害された機能の再獲得における生物学的基礎であると考えられる。本研究は、集中的なリハビリテーションが神経回路の再編、特に皮質-脳幹系においてどのような作用を及ぼすかを捉えることを目的としている。前年度までの検討により、リハ終了後に皮質赤核路を遮断すると改善した運動機能が低下すること、皮質赤核路を遮断してリハを行うと皮質網様体路において豊富な軸索分枝を生じること等が示されている。本年度は、予め皮質赤核路および皮質網様体路に対しウイルスベクターを感染させておくことで、両経路を選択的に機能遮断できる系を用い、運動機能との関連性を検証した。結果として、皮質赤核路を遮断してリハを行い、その後皮質網様体路の選択的な抑制を行うと、改善した運動機能が低下することが示された。これは皮質赤核路遮断によりみられる皮質網様体路の賦活が運動機能回復と関連を有することを証明するものである。更に、リハ終了後に皮質赤核路を遮断すると改善した運動機能が低下するが、そのまま遮断を維持すると運動機能が徐々に改善する。この時点で皮質網様体路を遮断すると、運動機能が再度低下することが示された。これらの結果は、皮質赤核路が遮断されると皮質網様体路へのダイナミックなスイッチングが生じ、この現象がリハによる運動機能の回復と密に関わることを示唆するものであり、脳血管障害後のリハにおける神経回路レベルでの作用機序の一端を詳らかにするものであると考える。本年度においては更にウイルスベクター感染に関する電気生理学的および組織学的証明を加え、海外誌に投稿を行った。本年度は皮質赤核路と皮質網様体路の関係性を調べるため、ウイルスベクターを用いた両経路の選択的遮断を行い、リハビリテーションによる運動機能改善効果との関連性を検証した。その結果、皮質赤核路から皮質網様体路へのスイッチングという、非常に興味深い現象を捉えることに成功した。加えて、このウイルスベクターによる選択的遮断に関しては、電気生理学的手法および組織学的手法において有効性の証明を行っており、データの信頼性を確認している。上記の通り、主な研究テーマについては一連の解析を終了することが出来た。ただし、発展的なテーマである、赤核および網様体における促通性亢進関連因子の探索やオプトジェネティクス法を用いた実験に関しては準備段階に留まっている。全体としては、本年度は前年度までの結果をまとめ、海外誌への投稿までを終えることが出来ており、概ね良好に進んだものと考える。これまでの検討により、内包出血後の集中的リハビリテーションにおける皮質-脳幹回路の動態および運動機能回復との因果性については概ね検討を終えている。今後は1神経回路の再編を引き起こす因子に関する分子生物学的探索や、2皮質-脳幹回路の刺激によるリハビリテーション効果の増幅について検討を行う所存である。具体的な方策として、1に関しては集中リハ終了後に赤核および網様体を切除し、マイクロアレイ法にて発現の変動する遺伝子を解析する。変動が著明な遺伝子に関してはreal-time PCR法にて別途再検証を行う。加えて、皮質-赤核路を遮断して集中リハを行った個体に関しても同様の検討を行い、遺伝子発現の変化を探索する。2に関しては集中リハと並行して運動野-脳幹路の賦活を行い、集中リハの効果が増強されるかを確認する。集中リハ実施前および実施中に運動野-脳幹路を刺激し、機能改善効果が増進されるかを確認する。刺激にはウイルスベクターによりチャネルロドプシンの導入し、光刺激による賦活を想定している。

その結果、皮質赤核路から皮質網様体路へのスイッチングという、非常に興味深い現象を捉えることに成功した。加えて、このウイルスベクターによる選択的遮断に関しては、電気生理学的手法および組織学的手法において有効性の証明を行っており、データの信頼性を確認している。上記の通り、主な研究テーマについては一連の解析を終了することが出来た。ただし、発展的なテーマである、赤核および網様体における促通性亢進関連因子の探索やオプトジェネティクス法を用いた実験に関しては準備段階に留まっている。全体としては、本年度は前年度までの結果をまとめ、海外誌への投稿までを終えることが出来ており、概ね良好に進んだものと考える。これまでの検討により、内包出血後の集中的リハビリテーションにおける皮質-脳幹回路の動態および運動機能回復との因果性については概ね検討を終えている。今後は1神経回路の再編を引き起こす因子に関する分子生物学的探索や、2皮質-脳幹回路の刺激によるリハビリテーション効果の増幅について検討を行う所存である。具体的な方策として、1に関しては集中リハ終了後に赤核および網様体を切除し、マイクロアレイ法にて発現の変動する遺伝子を解析する。変動が著明な遺伝子に関してはreal-time PCR法にて別途再検証を行う。加えて、皮質-赤核路を遮断して集中リハを行った個体に関しても同様の検討を行い、遺伝子発現の変化を探索する。2に関しては集中リハと並行して運動野-脳幹路の賦活を行い、集中リハの効果が増強されるかを確認する。集中リハ実施前および実施中に運動野-脳幹路を刺激し、機能改善効果が増進されるかを確認する。刺激にはウイルスベクターによりチャネルロドプシンの導入し、光刺激による賦活を想定している。平成30年度はウイルスベクター二重感染法による皮質赤核路および皮質網様体路の選択的遮断に関する実験を実施する予定であった。しかし、当初の計画よりもスムーズに実験が進捗したため、見込んでいた追加の実験を行う必要がなくなったため、次年度使用額が生じた。また、先行して行う予定であった、集中リハによる運動野-脳幹路の再編成を惹起する因子の探索についての検討が遅れていることも次年度使用額が生じた理由である。使用計画として、平成31年度において上記の集中リハによる運動野-脳幹路の再編成を惹起する因子の探索を行う予定であり、そちらに使用したいと考えている。また、平成32年度に実施予定の運動野-脳幹路の選択的賦活法による集中リハの機能改善効果の増幅の検討について、一部を前倒しして実施する計画であり、そちらに充填する所存である。