hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
材料の強度特性・破壊予測を目指した放射光Ｘ線によるミクロ組織イメージング法の構築

Co-Cr合金では引張変形に伴うX線回折パターンの変化から、降伏強度に近づくと、弾性領域にもかかわらず転位の再配列が進むと同時に転位密度が減少した。この転位密度の減少は、負の積層欠陥エネルギーにより部分転位が安定であるため、荷重に伴い完全転位が拡張し、積層欠陥と成ったためと推定している。また、高温下で伸線加工パーライト鋼のラインプロファイルの変化を追跡した実験では、転位セルにおけるセルウォール内の転位が優先的に回復することが明らかになった。以上の知見は今回開発した測定法、解析法により初めて導かれたものである。この研究を遂行するに辺り、放射光X線回折ラインプロファイル解析のための標準プロファイル導出法の開発も行っており、同分野の実験を行う研究者への解析指針を提案している。多様な合金で本研究の有効性を示すことで、さらなる多様な材料分野への新展開を促す波及効果が期待される。量子ビーム組織解析学H25年度はH24年度で課題となった逆空間分解能の向上とそれに基づく材料解析を目標とした。そこで、高輝度線源を利用した角度分散型回折計の開発を行った。実験装置はSPring-8 BL22XUのアンジュレーター高輝度X線源を利用した回折計とした。2台のPILATUS-2次元検出器を同時に走査し、3分程度の測定時間でフェライトの110から310の回折をカバーする光学系とした。ラインプロファイル解析では回折計由来のピーク拡がりをデコンボリューションする必要がある。一般にはLaB6粉末を標準試料として測定するが、粒径が大きいため、高平行マイクロビーム線源では回折リングを測定することが不可能である。このため、通常の方法では回折計由来のピーク拡がりをデコンボリューションできない。この問題を解決するため、CeO2粉末とLaB6粉末を併用した回折計由来のピーク拡がりの解析法を構築した。この方法は実験室系回折装置にてCeO2粉末の構造由来の拡がりをあらかじめ定義しておき、その結果をもとに放射光の回折計由来の拡がりを定義する方法である。この方法により、実試料に対する測定プロファイルに対し、構造由来プロファイルをデコンボリューションすることに成功した。開発した測定・解析系を用い伸線加工パーライト鋼の解析を行った。エネルギー分散型X線回折法によるラインプロファイル解析では、逆空間分解能が高くはなかったため、転位の配置パラメーターの精度や転位密度のエラーバーは大きかった。一方、回折計の高分解能化を実現することで、これらミクロ組織パラメーターを精度良く求めることに成功した。また、高温その場測定X線回折測定をトライし、高温下での時分割変化の可能性と課題を確認した。H24年度は「白色X線を利用したエネルギー分散型X線回折」によるラインプロファイル解析法の構築を行った。実験はSPring-8の白色X線ビームラインであるBL28B2で実施した。当初懸念された検出器の分解能の影響は分解能のシミュレーションを予め行うことで、最適測定条件を導き、ラインプロファイル解析に必要な逆空間分解能を得ることに成功した。
カベオリン-3とジストロフィンの二重欠損筋ジストロフィーマウス作成と病態の研究

骨格筋の変性・壊死および再生を主病変とする筋ジストロフィーの研究では、Duchenne型筋ジストロフィーのジストロフィン遺伝子をはじめとして、その病因遺伝子が約30個明らかにされている。カベオリン-3遺伝子異常による肢帯型筋ジストロフィーの症例が1998年に報告され、カベオリン-3と筋ジストロフィー病態との関連が注目されている。本研究では、研究代表者らがジーンターゲティング法で作成したカベオリン-3欠損(Cav-3 KO)マウスと、ジストロフィン欠損のmdxマウスとの交配により、カベオリン-3とジストロフィンとの二重欠損マウスを作成し、両タンパク質の筋ジストロフィー病態への複合的関与を明らかにすることを目的とする。mdxマウスとCav-3 KOマウスを34世代交配することにより二重欠損マウスを作成した。組織学的解析では、二重欠損マウスでの相加的効果ははっきりしなかった。両マウスの遺伝子発現レベルでの比較を実施した。Cav-3 KOマウスにおいては、野生型マウスでの2倍以上に発現が上昇していた遺伝子は約200種類、1/2以下に発現が減少していた遺伝子は約60種類あった。カベオリン-3遺伝子は激減していたが、カベオリン-1,2は野生型マウスとの差がなく、またNOS遺伝子の発現もn,e,iの3種類共に野生型マウスとの発現に差がみられなかった。オステオポンチン(OPN)遺伝子発現がノックアウトしたカベオリン-3遺伝子と同程度に減少していたので、二重欠損、mdx、Cav-3 KOおよび野生型マウスでのmRNA発現量を測定して比較した。内部コントロールのG3PDHmRNA量で補正したOPNmRNA量は、mdxマウスでは野生型マウスの3055倍増加、二重欠損マウスでは野生型の514倍増加していた。二重欠損マウスでOPNmRNA量がmdxマウスの半分以下であったこと、Cav-3 KOマウスでは野生型マウスより減少していたことから、OPN遺伝子発現にカベオリン-3遺伝子が関与していることが示唆された。骨格筋の変性・壊死および再生を主病変とする筋ジストロフィーの研究では、Duchenne型筋ジストロフィー(DMD)のジストロフィン遺伝子をはじめとして、その病因遺伝子が約20個明らかにされている。カベオリン-3遺伝子異常による肢帯型筋ジストロフィー(LGMD1C)の症例が1998年に報告され、カベオリン-3と筋ジストロフィー病態との関連が注目されている。本研究では、研究代表者らがジーンターゲティング法で作成したカベオリン-3欠損マウスと、ジストロフィン欠損のmdxマウスとの交配により、カベオリン-3とジストロフィンとの二重欠損マウスを作成し、両タンパク質の筋ジストロフィー病態への複合的関与を明らかにすることを目的とする。本年度は、mdxマウス♀とカベオリン-3ホモ変異マウス♂との交配で得たF1同士をさらに交配したF2で二重欠損マウスが得られた。しかし、F2では二重欠損および比較する同腹のmdxマウスともに♀,♂それぞれの1/8という低頻度でしか得られない。カベオリン-

3ヘテロ変異のmdxマウスF2同士を交配したF3では1/4の頻度で得られるので、今後はF3での解析を予定している。カベオリン-3およびジストロフィンの遺伝子変異は、PCR法により同定した。本年度に得られたF2でのイムノブロットおよび免疫組織化学による予備的な解析において、二重欠損マウスの骨格筋には、ジストロフィンおよびカベオリン-3は共に発現していなかった。またHE染色では、壊死・再生像、中心核筋線維がみられた。F3での詳細な解析を予定している。骨格筋の変性・壊死および再生を主病変とする筋ジストロフィーの研究では、Duchenne型筋ジストロフィー(DMD)のジストロフィン遺伝子をはじめとして、その病因遺伝子が約20個明らかにされている。カベオリン-3遺伝子異常による肢帯型筋ジストロフィー(LGMD1C)の症例が1998年に報告され、カベオリン-3と筋ジストロフィー病態との関連が注目されている。本研究では、研究代表者らがジーンターゲティング法で作成したカベオリン-3欠損マウスと、ジストロフィン欠損のmdxマウスとの交配により、カベオリン-3とジストロフィンとの二重欠損マウスを作成し、両タンパク質の筋ジストロフィー病態への複合的関与を明らかにすることを目的とする。本年度は、カベオリン-3ヘテロ変異のmdxマウスF2同士を交配したF3での解析を行った。イムノブロット解析において、二重欠損マウスの骨格筋には、ジストロフィンおよびカベオリン-3は発現していなかった。ユートロフィン、ジスフェルリンは、野生型に比べて発現が増加していた。免疫組織化学でのジストロフィン抗体では、mdxマウスと同様にリバータントファイバーを除いては筋細胞膜は染まらなかったが、ユートロフィン抗体では筋細胞膜が濃く染まった。カベオリン-3抗体ではカベオリン-3ホモ変異マウスと同様に筋細胞膜は染まらなかった。週齢を追った二重欠損マウスヒラメ筋でのH&E染色像では、2.5週齢でわずかに浸潤細胞が観察された。壊死・再生像が3.5週齢で観察され、5週齢では多くの小さい中心核筋線維がみられたが、同腹のmdxマウスヒラメ筋での病理像と比較して特別な差はみられなかった。さらに、2ケ月齢、4ケ月齢、1年齢のヒラメ筋の病理像でも差がみられず、組織学的には二重欠損マウスでの相加的効果は、はっきりしなかった。今後は両マウスの遺伝子発現レベルでの比較を予定している。骨格筋の変性・壊死および再生を主病変とする筋ジストロフィーの研究では、Duchenne型筋ジストロフィーのジストロフィン遺伝子をはじめとして、その病因遺伝子が約30個明らかにされている。カベオリン-3遺伝子異常による肢帯型筋ジストロフィーの症例が1998年に報告され、カベオリン-3と筋ジストロフィー病態との関連が注目されている。本研究では、研究代表者らがジーンターゲティング法で作成したカベオリン-3欠損(Cav-3 KO)マウスと、ジストロフィン欠損のmdxマウスとの交配により、カベオリン-3とジストロフィンとの二重欠損マウスを作成し、両タンパク質の筋ジストロフィー病態への複合的関与を明らかにすることを目的とする。昨年度にカベオリン-3ヘテロ変異のmdxマウスF2同士を交配したF3での組織学的解析を行ったが、組織学的には二重欠損マウスでの相加的効果は、はっきりしなかった。
環境負荷を低減するチタン合金の超音波振動ドライ切削に関する研究

チタン合金は、軽量かっ高強度で腐食しない。その優れた性質から、近年、航空用部品や医療部品などで用いられ、その需要を伸ばしている。しかしながら、チタン合金は、典型的な難削材である。例えば、旋削加工の場合、チタン合金は、その熱伝導性の低さから、工具刃先から熱が逃げずに激しい工具磨耗にいたる。そのため、大量の切削液を供給しながら切削加工するのが常識となっている。しかし、近年の環境問題の観点からすれば、使用する切削液の量は削減したい。そこで本研究では、工具刃先を超音波振動させながら切削を行う「超音波振動切削」により、切削液の使用量を減らせるのではないかと考えた。すなわち、切削液の機能として、(1)潤滑、(2)冷却、(3)切り屑排出の3つがあるが、超音波振動の付加により、まず切削抵抗の低減(潤滑性の向上)と切り屑排出性の向上が期待できる。さらに、連続切削である旋削を、超音波振動による断続切削にすることにより、工具温度の冷却が促進され、工具磨耗の低減、さらには、工具寿命の延長も期待できると予想した。以下に、チタン合金の超音波振動切削の研究を通して得られた結論をまとめる。1)実験に先立ち、切削加工のコンピュータシミュレーションを行った。切削シミュレーションの結果、超音波を付与しない従来の慣用切削に比較して、超音波振動切削では工具刃先の温度を100°C程度低くすることが予想できた。2)超音波振動切削では、慣用切削の1/3程度に切削抵抗を低減できた。3)超音波振動切削は、慣用切削に比べて切りくずの排出性がよい。常に連続した流れ型の切りくずが排出され、切りくずの巻き込みトラブルなど観察されなかった。4)切削液供給方法について、ウエット加工、セミドライ加工、ドライ加工の3つの方式について比較をしたところ、チタン合金の超音波振動切削にはセミドライ加工が最も適していることがわかった。5)超音波振動切削において、切削速度の影響を調べたところ、切削速度は30m/minが最適であることがわかった。これは、超音波振動する刃物の最大速度に対して約30%の速度である。6)超音波振動切削は慣用切削に比べて、切削面の表面粗さが小さくなる(向上する)。切削速度20m/min、切込み0.1mm、送り0.1mm/rev、ノーズ半径0.4mmの切削条件において、超音波振動切削の表面粗さRyは3.1μm、慣用切削の表面粗さRyは4.0μmであった。チタン合金のドライ切削技術を開発することが本研究の目的である。切削液の機能として、(1)潤滑、(2)冷却、(3)切り屑排出の3つがある。

切削液をなくしてドライ化するためには、これら機能を代替する技術が必要になる。本研究では、超音波振動切削によりチタン合金のドライ切削化を試みる。超音波振動の付加により、切削抵抗の低減、切り屑排出性の向上が期待できるからである。また、連続切削である旋削を、超音波振動を負荷し断続切削にすることにより、工具温度の冷却が図られ、工具磨耗の低減、さらには、工具寿命の延長も期待できる。超音波振動切削では、切削条件や超音波振動条件、工具形状やコーティングなど、多くの因子の影響を検討する必要がある。切削試験を試行錯誤的に繰り返して、研究するのは非効率的で、高価なチタン合金を大量の切り屑に変えてしまうことは避けるべきである。そこで、本研究では、有限要素法による切削シミュレーションを活用し、さらに、これに品質工学のパラメータ設計手法(タグチメソッド)を組合せ、効率よく因子の効果を調べ、最適切削条件を見出した。シミュレーションでは、超音波振動の付加により、切削温度を約100°C低減できる効果があることがわかった。シミュレーションで決定した最適条件で、実際にチタン合金の超音波振動ドライ切削を行ったところ、以下の結果が得られた。1)超音波振動なしの慣用切削に比べて、超音波振動切削は、切削抵抗は1/2から1/3に低減する。2)切削温度も低減するため、切りくずの溶着を防ぎ、工具磨耗も小さくできることがわかった。3)切りくず排出性も良くなるので、切りくず巻き込みなどのトラブルも見られなくなる。チタン合金は、軽量かつ高強度で腐食しない。その優れた性質から、近年、航空用部品や医療部品などで用いられ、その需要を伸ばしている。しかしながら、チタン合金は、典型的な難削材である。例えば、旋削加工の場合、チタン合金は、その熱伝導性の低さから、工具刃先から熱が逃げずに激しい工具磨耗にいたる。そのため、大量の切削液を供給しながら切削加工するのが常識となっている。しかし、近年の環境問題の観点からすれば、使用する切削液の量は削減したい。そこで本研究では、工具刃先を超音波振動させながら切削を行う「超音波振動切削」により、切削液の使用量を減らせるのではないかと考えた。すなわち、切削液の機能として、(1)潤滑、(2)冷却、(3)切り屑排出の3つがあるが、超音波振動の付加により、まず切削抵抗の低減(潤滑性の向上)と切り屑排出性の向上が期待できる。さらに、連続切削である旋削を、超音波振動による断続切削にすることにより、工具温度の冷却が促進され、工具磨耗の低減、さらには、工具寿命の延長も期待できると予想した。以下に、チタン合金の超音波振動切削の研究を通して得られた結論をまとめる。1)実験に先立ち、切削加工のコンピュータシミュレーションを行った。切削シミュレーションの結果、超音波を付与しない従来の慣用切削に比較して、超音波振動切削では工具刃先の温度を100°C程度低くすることが予想できた。2)超音波振動切削では、慣用切削の1/3程度に切削抵抗を低減できた。3)超音波振動切削は、慣用切削に比べて切りくずの排出性がよい。常に連続した流れ型の切りくずが排出され、切りくずの巻き込みトラブルなど観察されなかった。4)切削液供給方法について、ウエット加工、セミドライ加工、ドライ加工の3つの方式について比較をしたところ、チタン合金の超音波振動切削にはセミドライ加工が最も適していることがわかった。5)超音波振動切削において、切削速度の影響を調べたところ、切削速度は30m/minが最適であることがわかった。これは、超音波振動する刃物の最大速度に対して約30%の速度である。
殺虫性タンパク質δ-内毒素リセプターの抽出と解析

Bacillus thuringiensis(Bt)の生産する結晶様タンパク質はδ-内毒素として知られてい、無公害殺虫剤、BT剤として利用されている。このBT剤の殺虫特異性を決定する因子は中腸上皮細胞刷子縁膜(BBM)に存在するリセプターと考えられる。そこで本研究はカイコのBBMよりBt var.aizawaiの生産するCryIA(a)に対するレセプターを抽出しその特性を明かにすることを目的とした。大腸菌中にクローニングされたB.thuringiensis var.aizawaiのδ-内毒素を精製使用した。次いで、リセプターはカイコ中腸上皮細胞刷子縁膜小胞(BBMV)を作成し2%コール酸で可溶化し、活性化CryIA(a)を固定化したTresyl-Toyopearlのアフイニティーカラムに吸着溶出し、更に、DEAE-Toyopearlカラムにて精製した。次いで、^<125>I-CryIA(a)との結合力を明らかにすると共にBBMVによる阻害活性を確認した。この結合活性タンパク質をSDSゲル電気泳動にかけ^<125>I-CryIA(a)との結合力をオートラジオグラフイ-にて確認したところ180kDaと170kDaタンパク質が認められた。170kDaタンパク質は抽出精製過程を通してプロテアーゼ阻害剤混合物を使用すると出現しなくなる事より180kDaタンパク質がリセプターであると確認した。又、180kDaタンパク質はハロイシンアミノペプチターゼやアルカリフォスファターゼとは異なる事を示した。更に、コール酸可溶化BBMVのSuperdex 200ゲル〓過より180kDaタンパク質は3量体を成していることも示唆した。180kDaタンパク質のN末端は何らかのブロクを受けているので、リシルペプチターゼ処理を行いオリゴペプチドを分画し、6オリゴペプチドのN末端アミノ酸配列を決定した。これらのアミノ酸配列の検索で既知のペプチドを検出できなかつた。また、このリセプタータンパク質は糖鎖を有する事も明かとなつた。大腸箘中にクローニングされたB.thuringiensis var.aizawaiのδ-内毒素をレノグラフィン密度勾配遠心法により精製したCryIA(a)のLD_<50>は20ng/頭まで精製したサンプルとして使用した。そこでカイコ中腸上皮細胞より刷子縁膜小胞(BBMV)を作成しこの小胞にCryIA(a)のリセプターの存在すること明らかにした。次いで、このリセプターは糖蛋白質であることをプロテアーゼ処理、レクチン処理で阻害されることより明かにした次ぎに、このBBMVを2%コール酸で可溶化し、CryIA(a)を固定化したTresyl-Toyopearlのアフイニテイニカラムに吸着させ、4M尿素で溶出させた。蛋白質は大部分非吸着に溶出し、δ-内毒素との結合力を有する蛋白質は吸着部に存在した。結合活性は放射性ヨウ素の標識によりドツトプロツト法により測定した。その結合活性を有する画分をSDS-PAGEおよびprotein-blot法で分析したところ、毒素と反応する180kDaと170kDaの2本のバンドを検出した。さらに、MonoQカラムにて精製し、約200倍にまで精製した。

尚、180kDaの蛋白質は経時的に170kDaに変化することから180kDa蛋白質がリセプター蛋白質であると判断した。さらに、BBMVの可溶化物をHi-Load6/60Superdex200ゲルロ過カラムにて精製して求めた分子量は約600kDaであった。この精製受容体はコンカナバリンAと反応し、LCA、RCA120、WGA、などのレクチンとは反応しなかった。このことから可溶化されたδ-内毒素リセプターは糖蛋白質複合体であることを明らかにした。また、180kDa蛋白質の3量体である可能性を示唆した。Bacillus thuringiensis(Bt)の生産する結晶様タンパク質はdelta-内毒素として知られている。このdelta-内毒素は無公害殺虫剤、BT剤として利用されている。このBT剤の殺虫特異性を決定する因子として中腸上皮細胞刷子縁膜(BBM)に存在するリセプターであると考えられている。そこでカイコのBBMよりBt var.aiza waiの生産するCryIA(a)に対するレセプターを抽出しその特性を明かにすることを目的としている。大腸菌にクローン化されたCryIA(a)遺伝子産物を抽出精製し使用した。リセプターはカイコより中腸上皮細胞刷子縁膜小胞を作成しデオキシコール酸にて溶解し抽出を進めた。まず、上記精製CryIA(a)をトリプシン消化し活性化した画分をTresyl-Toyopearlに吸着させ、アフニテイーカラムを行つた後、活性画分をDEAE-Toyopearlカラムを通し、比活性235倍にまで精製を行つた。この180kDaタンパク質は特異的に活性なdelta-内毒素に結合するものである。SDS-PAGE後、N末端のアミノ酸配列解析をおこなつたがN末端はブロツクされてい解析することができなかつた。そこで180kDaタンパク質を電気泳動後、リシルエンドペプチダーゼ処理を行い切断、断片化の後、ペプタイドを逆相カラムにかけ分離した。その中より分離が良いピークを選んでペプチドのN末端アミノ酸配列を気相ペプチドシークエンサにかけ分析した。その結果、6ペプチドのN末端配列を解析することができた。この配列をホモロジー検索にかけたがホモロジーの高いタンパク質を見い出すことが出来なかつた。次いで、この可溶化タンパク質とdelta-内毒素の反応はレクチンにより阻害されることを明らかにした。特に、コンカナバリンAに加えWGAとも反応する事を示した。カイコ中腸刷子縁膜に存在するCryIA(a)のリセプターは分子量180kDaの糖タンパク質で有ることを示しそのペプタイドのアミノ酸配列のの一部を明らかにした。Bacillus thuringiensis(Bt)の生産する結晶様タンパク質はδ-内毒素として知られている。このδ-内毒素は無公害殺虫剤、BT剤として利用されている。そこでカイコのBBMよりBt var.aizawaiの生産するCryIA(a)に対するレセプターを抽出しその特性を明らかにすることを目的とした。KnightらやSangdalaらはCryIA(C)に対するリセプターをタバコスズメガより抽出し、その分子量120kDaのアミノペプチターゼと65kDaのアルカリフォスファターゼであることを示した(1994)。
歯根膜トランスクリプトーム解析によるオーダーメード歯周組織再生療法の新展開

G-cap法にて作製したヒト歯根膜完全長cDNAライブラリを用いて、無作為に抽出した約20,000クローンの塩基配列解析を行った。そのデータを基にヒト歯根膜組織遺伝子完全長cDNAデータベース(FuL-PerioGen)を完成させた。このうち、発現頻度39以上の遺伝子87個の内9個の新規遺伝子を見いだした。同上cDNAデータベースにおいても見いだされた歯根膜特異的遺伝子Periodontal Ligament Associated Protein-1(PhAP-1)の機能解析を推進した結果、PLAP-1タンパクはBMP-2刺激により誘導されるOsterixやアルカリフォスファターゼ活性の発現を抑制すること、同タンパクはBMP-2と分子結合することにより、BMP2-BMPレセプター間の結合を阻害し、BMP-2依存的な歯根膜細胞の分化を負に制御することを明らかにした。また、両分子間の結合にはPLAP-1/asporin分子のleucinerich repeatmotifが重要な役割を果たしていることも明らかにした。次世代の歯周組織再生誘導薬として期待されている塩基性線維芽細胞増殖因子(FGF-2)に焦点を当て、FGF-2刺激により発現制御されている細胞外基質を解析した。その結果、ヒアルロン酸合成酵素(HAS)、osteopontin(OP)等の遺伝子がFGF-2刺激により発現上昇することが確認された。次にこれら細胞外基質が歯周組織再生過程にどのように関与し得るのかを検討したところ、ヒアルロン酸、OPが歯周組織再生の初期過程において、歯根膜細胞の遊走を促進している可能性を示唆する結果が得られた。歯根膜組織からのRNA精製事前に研究について十分な説明を行いインフォームドコンセントが得られた患者の便宜抜去歯の歯根膜組織からRNAを精製した。得られたRNAを電気泳動し、イメージ解析することにより、RNA分解が殆どないことを確認した。全てのRNA5'末端に存在するCap構造を利用して、精製RNAの5'末端に逆転写用プライマーを添加し逆転写反応を行った。これらcDNA産物をクローニングベクターpGCAP10に挿入することにより、ヒト歯根膜完全長cDNAライブラリを作製した。ライブラリサイズは2.2X10^6で、平均インサートサイズは約1.5kbであった。ヒト歯根膜完全長cDNAライブラリのシークエンス解析作製したライブラリから無作為に96個のクローンを選び出しテストシークエンス解析を行った結果、インサート率95%、完全長率68%であることが明らかとなった。データベース解析の結果、96クローン中、9種の新規遺伝子が見出された。さらに、以前我々が発見した歯根膜特異的遺伝子PLAP-1やCollagen type Iをコードするクローンが認められ、in vivo歯根膜組織での遺伝子発現が正確に再現された良質なライブラリであることが示された。歯根膜特異的遺伝子PLAP-1の発現制御機構の解析上記ライブラリシークエンス解析において見出された遺伝子群の中から歯根膜特異的遺伝子PLAP-1を選び出し、歯根膜細胞におけるその発現制御機構を詳細に解析した。PLAP-1の発現は、細胞増殖を誘導するサイトカインであるFGF-2およびPDGF-BBにより抑制を受けること、一方、硬組織形成分化を誘導するBMP-2およびBMP-4により増強されることが明らかとなり、歯根膜細胞の増殖や分化に密接に関連してPLAP-1の発現が制御されていることが示された。1.ヒト歯根膜組織完全長cDNAデータベースの構築前年度にG-Cap法にて作製したヒト歯根膜完全長cDNAライブラリを用いて大腸菌に形質転換を行い、それらクローンを無作為に約20,000個選択し、全自動大規模型DNAシークエンサーにて5'末端側からのone-way sequencing塩基配列解析を行った。さらに、得られた塩基配列情報を、スーパーコンピューターを利用して大規模BLAST遺伝子情報解析を行い、ヒト歯根膜組織中で、約20,000種の規模で、如何なる遺伝子が如何なる頻度で発現しているのかを示すヒト歯根膜組織遺伝子発現プロファイル(PDL gene expression profile)を完成させた。尚、得られた歯根膜組織完全長cDNAデータベースをFuL-PerioGenデータベースと命名した。2.新規歯根膜特異的遺伝子の抽出検索ヒト歯根膜組織完全長cDNAデータベースを基に遺伝子発現プロファイルをコンピューター上で解析したところ、Collagen Type I, Collagen Type III, Osteonectin, Periostin, PLAP-1などの歯根膜組織を特徴づける遺伝子群が恒常的に高発現していることが確認された。さらにこれまでに報告のされていない新規遺伝子に関しては発現頻度39以上の遺伝子87の内9個見いだされた。

次年度は、各新規歯根膜特異的遺伝子の発現調節について、特異的プライマーを用いた培養歯根膜細胞でのRT-PCR法により解析すると共に、これまで歯根膜における機能については全く報告のない遺伝子について、その発現制御のメカニズムおよび歯根膜での機能を解析する予定である。1.新規歯根膜特異的遺伝子および機能未知遺伝子の機能の解析我々が確立したヒト歯根膜組織cDNAデータベースにおいて見いだされた歯根膜特異的遺伝子PLAP-1(Periodontal Ligament Associated Protein-1)/asporinの機能解析を推進した。その結果、PLAP-1/asporinはBMP-2刺激により発現上昇すること、リコンビナントPLAP-1/asporinタンパクはBMP-2刺激により誘導されるOsterix発現やアルカリフォスファターゼ活性の発現を抑制すること、同タンパクはBMP-2と分子結合することにより、BMP2-BMPレセプター間の結合を阻害し、BMP-2依存的な歯根膜細胆の分化を負に制御することを明らかにした。また、両分子間の結合にはPLAP-1/asporin分子のleucinerich repeat(LRR)motifのLRR5が重要な役割を果たしていることも明らかにした。2.歯周組織再生関連遺伝子データベースの構築現在、歯周組織再生誘導薬としての有効性と安全性が臨床試験により検証されているFGF-2に焦点を当て、FGF-2で歯根膜細胞を刺激した際に誘導される遺伝子発現変化を検討した。その結果、ヒアルロン酸合成酵素(HAS)、osteopontin等の遺伝子がFGF-2刺激により発現上昇することが複数のドナーから単離・培養された歯根膜細飽において確認された。次にFGF-2により誘導されるこれら細胞外基質が歯周組織再生過程にどのように関与し得るのかを検討したところ、これらの分子が歯周組織再生の初期過程において、歯根膜細胞の遊走を促進している可能性を示唆する結果を得た。以上の結果により、PLAP-1/asporin、ヒアルロン酸、osteopontin分子は、歯周組織再生過程に密接に関連する分子群であると判断された。
片麻痺に対するハイブリッド・パワーアシスト治療的電気刺激

パワーアシスト型電気刺激装置は、同一の電極で筋電信号記録と電気刺激を兼用し、電気刺激そのものと筋肉の筋電信号を混同しないように特殊な回路を利用してある。装置全体はできるだけポータブルに作製できるように設計してある。筋電信号をピックアップする感度と電気刺激強度は自由に可変設定できるようなポータブル筋電比例式電気刺激装置の開発・作製を行ない、安全性、機能を確認の上で脳卒中患者の機能改善に関する検討をおこなった。対象:事前にインフォームドコンセントがえられた脳卒中発症後1年経過した慢性期脳卒中患者14名。片麻痺上肢の手関節伸展、手指伸展運動が僅かに可能であるが、flexor synergyなどにより伸展制限されているもの。また、肩関節屈曲が可能であるが、制限されており麻痺側上肢の巧緻運動障害をきたしているものを対象とした。方法:脳卒中片麻痺側の各筋肉のモーターポイントに表面電極を固定した。手関節伸展・手指伸展動作:1)手関節伸筋群,2)総指伸筋,3)固有示指伸筋,最終的に僅かな筋収縮に対し比較的弱い電気刺激が行なわれ、強い電気刺激にはさらに強い電気刺激が行なわれるようにパワーアシスト的機構を被験者毎に設定した。結果:8例にハイブリッド型電気刺激療法を行い、拮抗筋に痙縮が認められ、共同運動パターンが障害となる場合には、神経ブロックを併用した。6例は対照群として通常の作業療法を同頻度で施行した。手関節手指関節伸展の自動的可動域、各筋肉での最大収縮時のroot mean square、巧緻運動テスト(9ペグテスト、10カップ移動テスト)で評価した。各評価において対照群に比べ、ハイブリッド型電気刺激療法群にF検定によって有意な改善が認められた。今後は電気刺激装置をより簡便に設定できるように改良し、患者自身が自宅でホームプログラムに使用できるようにして、毎日パワーアシスト訓練を行えるように計画している。1.パワーアシスト型電気刺激装置の作製・version-up電気刺激装置のチャンネル1は、同一の電極で筋電信号記録と電気刺激を兼用するチャンネルである。電気刺激そのものと筋肉の筋電信号を混同しないように特殊な回路を利用する。筋電信号をピックアップする感度と電気刺激強度は自由に可変設定できるようなポータブル筋電比例式電気刺激装置の開発・作製を行ない、安全性、機能を確認の上で脳卒中患者の機能改善に関する検討をおこなう。2.対象:事前にインフォームドコンセントがえられた脳卒中発症後1年経過した慢性期脳卒中患者8名。3.方法:脳卒中片麻痺側の各筋肉のモーターポイントに表面電極を固定した。A.手関節伸展・手指伸展動作:1)手関節伸筋群,2)総指伸筋,3)固有示指伸筋,B.肩関節屈曲動作:1)三角筋前部線維,2)棘下筋最終的に僅かな筋収縮に対し比較的弱い電気刺激が行なわれ、強い電気刺激にはさらに強い電気刺激が行なわれるようにパワーアシスト的機構を被験者毎に設定した。拮抗筋に痙縮が認められ、共同運動パターンが障害となる場合には、神経ブロックを併用した。手関節手指関節伸展、肩関節屈曲での自動的可動域、各筋肉での最大収縮時のroot mean square、巧緻運動テスト(9ペグテスト)に改善が認められた。

パワーアシスト型電気刺激装置は、同一の電極で筋電信号記録と電気刺激を兼用し、電気刺激そのものと筋肉の筋電信号を混同しないように特殊な回路を利用してある。装置全体はできるだけポータブルに作製できるように設計してある。筋電信号をピックアップする感度と電気刺激強度は自由に可変設定できるようなポータブル筋電比例式電気刺激装置の開発・作製を行ない、安全性、機能を確認の上で脳卒中患者の機能改善に関する検討をおこなった。対象:事前にインフォームドコンセントがえられた脳卒中発症後1年経過した慢性期脳卒中患者14名。片麻痺上肢の手関節伸展、手指伸展運動が僅かに可能であるが、flexor synergyなどにより伸展制限されているもの。また、肩関節屈曲が可能であるが、制限されており麻痺側上肢の巧緻運動障害をきたしているものを対象とした。方法:脳卒中片麻痺側の各筋肉のモーターポイントに表面電極を固定した。手関節伸展・手指伸展動作:1)手関節伸筋群,2)総指伸筋,3)固有示指伸筋,最終的に僅かな筋収縮に対し比較的弱い電気刺激が行なわれ、強い電気刺激にはさらに強い電気刺激が行なわれるようにパワーアシスト的機構を被験者毎に設定した。結果:8例にハイブリッド型電気刺激療法を行い、拮抗筋に痙縮が認められ、共同運動パターンが障害となる場合には、神経ブロックを併用した。6例は対照群として通常の作業療法を同頻度で施行した。手関節手指関節伸展の自動的可動域、各筋肉での最大収縮時のroot mean square、巧緻運動テスト(9ペグテスト、10カップ移動テスト)で評価した。各評価において対照群に比べ、ハイブリッド型電気刺激療法群にF検定によって有意な改善が認められた。今後は電気刺激装置をより簡便に設定できるように改良し、患者自身が自宅でホームプログラムに使用できるようにして、毎日パワーアシスト訓練を行えるように計画している。
ナノ構造合金における水素の吸蔵・放出機構に関する研究

マグネシウム基のMg-Ni, Mg-Ni-La系合金では,合金組織をナノ構造化することにより,水素の吸蔵放出速度が著しく向上するとともに,水素吸蔵量やプラトー特性も改善されることが明らかになっている。これらナノ合金中で水素がどのような状態で存在しており,またどのようなプロセスを経て表面から吸蔵・放出されるのか,その機構を解明する目的で研究を行った。実験は主として水素の熱放出スペクトル(TDS)の測定,並びに高分解能透過電顕観察(HRTEM)により行った。TDS装置は本科研費により作製したものである。HRTEMは名大黒田研究室の協力を得て実施した。試料は溶融急冷法でアモルファス化後,結晶化してナノ構造化したものである。まず,TDS測定によりadの4種類の水素放出ピークを確認した。ピーク温度の昇温速度依存性や繰り返し吸蔵放出特性などを調べ,各ピークの強度や活性化エネルギーを求めた。その結果,ピークa(190°C)はMg_2NiH_4の分解,b(210°C)はMgH_2の分解,c(240°C)はナノ結晶粒界固溶水素の放出,d(340°C)はLaH_3の分解によるものであると同定し,ピーク強度から各水素化物中の水素の存在割合を求めたところ,理論的に予測される比率にほぼ一致していた。次に,HRTEM観察を水素吸蔵前,水素吸蔵後,水素放出後の各試料について行った。Mg-Ni系では,吸蔵前は510nmサイズのMg及びMg_2Ni結晶粒の存在を格子像や電子回折パターンから確認した。水素吸蔵後はMgH_2やMg_2NiH_4水素化物,並びに約2nm幅の結晶粒界ネットワークが認められた。水素の存在は,EELSスペクトルの水素プラズモンピークとプラズモン像を観察することによって確認した。水素放出後は水素吸蔵前の構造に回復することも確認した。これらの吸蔵-放出サイクルによる結晶粒成長などの構造変化は殆ど見られなかった。Mg-Ni-La系ではLaH3の球形粒子の形成も確認した。以上のTDSとHRTEMの結果から,これらの合金では,ナノ結晶粒内に水素化物として存在している水素原子は,その放出過程でナノ粒界(アモルファスに近い構造をもつ)を拡散経由して表面に到達し,そこで水素分子として再結合し試料外に放出される,という機構が妥当であることが明らかになった。(1)水素顕微鏡による水素のMg基合金への吸着・吸蔵状態の観察Mg-10%Ni,及びMg-30%Ni合金表面に吸着・吸蔵したH原子の2次元分布状態を水素顕微鏡で観察した,H原子は粒状に析出したMg2Ni相にのみ吸着し,Mg相やMg/Mg_2Ni共晶組織には吸着しないことを明らかにした。Mg-10%Ni,及びMg-10%Ni-5%La

合金を液体急冷法でアモルファス化し,それを結晶化して作製したナノ構造合金について,そのPCT特性を測定して,通常の鋳造合金の特性と比較した。ナノ構造合金は鋳造合金に比べ活性化が容易で,また,水平でヒステレシスの少ないプラトー特性をもち,吸蔵・放出速度も極めて速い。特にLaを含む3元系合金は優れた水素吸蔵・放出特性を示し,実用化できる見通しを得た。本科研費でTDS装置を作製し,ナノ構造Mg-Ni-La合金の測定を行った。TDSスペクトルは一般に4本の放出ピーク(a-d)からなり,合金中の水素の存在状態を反映していることが分かった。ピークa,bはMg_2NiH_4,MgH_2の分解,ピークcはナノ結晶粒界に偏析した水素の放出,ピークdはLaH_2の分解によると結論し,合金中の水素の放出機構について考察した。'平成17年度の研究で,MgベースのMg-Ni, Mg-Ni-La系合金では合金組織をナノ構造化することにより,水素の吸蔵放出速度が著しく向上するとともに,水素吸蔵量やプラトー特性も改善されることが明らかになった。そこで本年度は,これらナノ合金中で水素がどのような状態で存在しており,またどのようなプロセスを経て表面から放出されるのか,その機構を解明する目的で研究を行った。実験は主として水素の熱放出スペクトル(TDS)の測定,並びに高分解能透返電顕観察(HRTEM)により行った。TDS装置は17年度科研費により作製したものである。HRTEMは名大黒田研究室の協力を得て実施した。試料は溶融急冷法でアモルファス化後,結晶化してナノ構造化したものである。結晶相の同定はX線回折で行った。まず,TDS測定によりadの4種類の水素放出ピークを確認した。ピーク温度の昇温速度依存性や繰り返し吸蔵放出特性などを調べ,各ピークの強度や活性化エネルギーを求めた。その結果,ピークa(190°C)はMg_2NiH_4の分解,b(210°C)はMgH_2の分解,c(240°C)はナノ結晶粒界固溶水素の放出,d(340°C)はLaH_3の分解によるものであると同定し,ピーク強度から各水素化物中の水素の存在割合な求めた。次に,Mg-Ni系について,HRTEM観察を水素吸蔵前,水素吸蔵後,水素放出後の各試料について行った。吸蔵前,は510nmサイズのMg及びMg_2Ni結晶粒の存在を格子像や電子回折パターンから確認した。水素吸蔵後はMgH_2やMg_2NiH_4水素化物,並びに約2nm幅の結晶粒界ネットワークが認められた。水素の存在は水素プラズモン像を捉えることによって確認した。水素放出後は水素吸蔵前の構造に回復することを確認した。これらの吸蔵-放出サイクルによる結晶粒成長などの構造変化は殆ど見られなかった。以上のTDSとHRTEMの結果から,これらの合金では,ナノ結晶粒内に水素化物として存在している水素原子は,その放出過程でナノ粒界(アモルファスに近い構造をもつ)を拡散経由して表面に到達し,そこで水素分子として再結合し試料外に放出される,という機構が妥当であると考えられる。
細胞鋳型による人工細胞外マトリクスの3次元配列制御に関する研究

角膜実質の超微細構造の発生メカニズムに関して、個体発生時の体積膨張に起因する組織への張力とそれに応答する細胞の骨格構造が鋳型になり形成するという作業仮説を証明するために、発生環境を模倣した流動式培養システムとナノファイバーECMモデル構築を行った。モデルECMに対して培地が流れる水圧により力学刺激を導入することで、細胞が外力に応答しながら周囲の人工ECMを束ね再配列を行う様子が観察され、細胞の関与した構造形成の逐次変化を観察可能なシステムが出来上がった。細胞表面のインテグリンレセプターと相互作用可能な表面を有するナノファイバーを電界紡糸あるいは自己組織化技術を用いて調整し、モデル人工ECMの合成を行う。蛍光ラベルしたモデルECMを用いて、角膜実質細胞の平板およびゲル培養を行う。この平板および3次元ゲル培養に対して、角膜用に改良を加えるバイオリアクターを用いてストレスを与えるとともに、角膜発生初期に見られる生体分子の変化を再現する環境を整えることで、細胞を鋳型とした構造形成が起こるか、また、ナノファイバーをベースとした無定形3次元ゲルマトリクスからの配向構造の出現が観察されるかを共焦点レーザー顕微鏡などを用いて詳細に検討することで、角膜実質組織構造構築に及ぼす応力の果たす役割を明確にするとともに、角膜実質再生に対する基礎的知見を集積する。本年度は、人工ECMモデルとしてのナノ繊維の合成を行った。また、PDMS細胞培養基材上で家兎から採取した角膜実質細胞を培養し、2次元1軸引っ張り付加を与えられる培養モデルを構築した。この培養システムを用いて、引っ張り刺激を受ける細胞の応答を検討した結果、これまでに他の研究で示されているように2次元の引っ張りに対して角膜実質細胞も一定の方向を向いた配列構造をとり、力に応答することが判明した。次年度に向けた予備実験として角膜実質細胞とに高分子電解質からなるナノファイバーの短繊維を一定条件のもと混合し培養を行うと細胞-ナノファイバーの集合体形成を認め、数日間の培養では細胞生存、高次構造体の維持が確認された。次年度において、類似の系を用いて力学刺激を加えながら長期培養を行う。細胞表面のインテグリンレセプターと相互作用可能な表面を有するナノファイバーを電界紡糸あるいは自己組織化技術を用いて調整し、モデル人工ECMの合成を行なった。特に今年度は、電界紡糸法を用いて各種ナノファイバーの作製を行い、3次元培養モデルへの展開を図った。初期的に作製したモデルは、電界紡糸から作製した不織布ナノファイバーを短繊維化処理を行い、平均直径2μm、繊維長200μm程度のマルチ分散した短繊維を作製して、これをECMのモデルとして細胞と立体的に相互作用させた。この際、繊維と細胞の状態の可視化を実現するために、あらかじめ繊維を蛍光ラベルし細胞との3D相互作用を共焦点レーザー顕微鏡で観察した。その結果、平板培養や、ゲル培養とは大きく異なる、細胞がナノ-ミクロンファイバーを立体的に握りこむ様子(細胞と人工繊維状ECMの3D相互作用)が可視化された。この技術を展開して外場からの力を加えることで細胞の3D応答が可視化できる可能性を示せた。次に、細胞の鋳型化が起こるのかを検証するために、電界紡糸ナノファイバー不織布を用いた3Dバイオリアクターシステム構築を行った。市販の還流培養装置の流路を培養液が3Dファイバー構造体の中を一方向に通過するようにし、3D足場に一定のテンションがかかるように工夫した培養器で、培養基材部にファイバー不織布をセットして角膜実質細胞を播種し、3週間の培養を行った。この結果、生着細胞は周囲のナノファイバーを引き寄せるような様子を示すSEM像が観察された。今回用いた円筒形のリアクターでは、通過する培地でナノファイバー不織布はある種風船が膨らむような力のかかり方をする。細胞のモデルファイバー引き込みは、角膜の層構造形成メカニズムを説明する証拠に成り得る。しかし、細胞が鋳型となってファイバーの配向が層によって90度回転してゆく構造の形成メカニズムは証明できておらず更なる検討を要する。
フラクタル集合上の解析学と離散ラプラス作用素の反復力学系

本研究においては、ネットワークのシステム解析を具体的な系であるフラクタル集合上のと離散ラプラス作用素の反復力学系について行った。以下これについて述べる。(1)離散ラプラス作用素の反復力学系ラプラス作用素は数理物理にとって基本的な作用素であり、これを用いずには物理現象を記述することは出来ない。従ってこの離散化を考えることは当然の成り行きといえる。ここでは平面格子を考えその上で0と1をとる関数を考える。ひとつのセルに対してこれと隣接する幾つかのセルを近傍と定めて離散ラブラス作用素を定義してその反復力学系を考えた。この力学系はカオス力学系を記述すると同時に決定論的な力学系でもあり、現実の組織化あるいは進化を記述するのに都合がよいものと思われる。その結果、系の組織化・生物系の進化をよく記述することがわかった。実際、平成16年度においてはデザインの分類、その構成法に関するソフトウエアの開発を行った。これによりほぼ市販可能な状態にあるソフトウエアデサイナー・ケンタウルス2005を作成し実験を行った。平成16年には進化を記述するかどうかを確かめるべく古生物の族数の時代変化をシミュレーションを行った。突然変異等は近傍の取替えにより実行し、湧き出しにより、その繁殖力を設定すると、セシル紀、オルドビス紀、べルモ紀の大量絶滅も自動的に表現されることが確かめられた。(2)フラクタル集合上の解析学フラクタル集合上にはハウスドルフ測度のような測度が定義され積分は従来通り考えることが出来る。平成16年には微分法を定めその微分・積分学を構成した。この研究の結果現在問題になっているベキ則を揺らぎにもつ力学系の解析を行うことが可能になった。平成17年度にはこれを極をもつフラクタルという概念を設定して研究を行い、言語、宇宙の進化、場の量子論の取り扱いの可能性を研究した。本年度の研究は離散ラプラス作用素の反復力学系の基本的性質とその応用についてなされた。以下これらを別々に報告する:(1)離散ラプラス作用素の反復力学系の基本的性質離散ラプラス作用素は通常のラプラス作用素として導入されるのが通例であるが、一般の離散ラプラス作用素の導入は代表者の創意である。またこの反復力学系を今後の有望な研究対象として取り上げるべきであると提案している。格子上の離散ラプラス作用素は考えている点とその近傍における値の差として定義される。近傍の個数が偶数個あるいは奇数個によりその振る舞いは相当に異なる。また、格子は周期条件を付与して考える。格子の大きさおよび偶奇性によりその振る舞いは変化する。これらについて幾つかの予想をコンピュータ・シミュレーションにより述べた.(2)離散ラプラス作用素の反復力学系の応用湧き出し点をあたえて離散ラプラス作用素で時間発展させると様々な図形がえられる。これをもとにして幾つかのシミュレーションをおこなった。(I)古生物の進化と大量絶滅、(II)水の結晶(III)デザインサンプラーの作成。これらの結果はソフトウエアもこめてインターネットのホーム・ページにて公開される予定である。本研究においては、フラクタル集合上の解析学の構築とその生物進化への応用を取り扱った。進化は単純な細胞からより複雑な組織を持った生物へと進行したと考えられる。またメンデルの法則に見られるように進化の過程は一定の演算の繰り返しとして表わされる。したがって、この過程はフラクタル構造を形成することが期待される。従ってフラクタル集合上の解析学の構成は重要となる。本研究においてはフラクタル集合上にウェーブレット解析を構築しこの基定を用いて進化に見られるフラクタル性を実現した。これについて次ぎの事柄が示された:

(1)フラクタル集合の生成規則を解析することによりその周期性がどのような基底でどのように現れるかを明かにした。(2)フラクタル構造から離散力学系が得られるがこの生成関数を考えると様々な分野の様々なゆらぎが実現できることが示された。これによりフラクタル集合上の解析はゆらぎ解析の基礎を与えるものと期待される。つぎに進化についての結果を述べる。進化については多くの人々が研究を行っているが、決定的となるものは得られていない。ここでは離散ラプラス作用素の反復力学系が有望な候補者の一つであることを示した:(3)水の結晶、デザインの生成等組織化をよく再現することが分かった。(4)カンブリア紀からペルモ紀にいたる古生物の進化、ここでは進化は科数の時代変化を意味する、をよく記述する。特筆すべき点はカンブリア紀の科数の爆発的な増大、オルドビス紀、セシル紀、ペルモ紀の大絶滅もよく記述することが分かった。
発生過程における嗅上皮細胞でのNotch Signalの発現に関する研究

嗅上皮の基底細胞層には幹細胞が含まれ生涯にわたる神経細胞再生を担っている。一方、哺乳類内耳感覚細胞は現在のところ障害された細胞は再生不能とされている。近年、内耳感覚細胞の発生にNotch Signalの関与が注目され、Notch1、Math1、Jagged2、Hes5などの各遺伝子の発現が明らかにされた。Jagged2の発現を阻害した動物モデルでは感覚細胞が過剰に発生し、内耳感覚細胞再生への手がかりとして注目されている。我々は、嗅神経細胞の発生においてこれら4つの遺伝子の発現をIn situ hybridization等の手法を用い観察した。実験には胎生11日目から生後14日目までのBALB/c系マウスを用いた。その結果、Notch1の発現は胎生11日目から生後14日目まで球状基底細胞層に散在性に、Math1とJagged2の発現は胎生18日目から生後14日目まで嗅神経細胞層に観察された。Hes5は胎生11日目から生後3日目までは球状基底細胞層に散在性に、生後5日目以後嗅神経細胞層に発現が見られた。これらの結果からNotch1は生涯続く再生のための幹細胞のストックに、Math1は前駆細胞の嗅神経細胞への分化に、Jagged2はMath1の発現にあわせて周囲の細胞の分化抑制に、Hes5は発生初期にはNotch1と同じ働き、後期にはMath1の過剰発現を抑制し神経細胞の数を調整する働きがあるのではないかと考察した。支持細胞にはこれまで遺伝子の発現の報告は無く、発生のメカニズム解明は今後の課題である。我々は硫酸亜鉛による嗅粘膜障害動物モデルによる研究も進め、嗅上皮再生過程においてもMath1とJagged2の発現を確認した。今後これらの遺伝子と嗅神経細胞、支持細胞の発生の関係を明らかにしそのしくみを解き明し、嗅覚障害の治療・内耳再生へのヒントをつかみたいと考えている。胎生11日目から生後14日目までの正常BALB/Cマウスより頭部標本を採取。10%ホルマリンにて固定後EDTAにて脱灰し、パラフィン包埋を行った。5μmに薄切した標本をシランコーテイングスライドにマウントし、Notch1、Jagged2、Hes、Math遺伝子に対するRNAプローブを用いてin situ hybridizationを行った。Notch1の発現は胎生11日目には見られなかったが生後3日で嗅上皮全体に強く見られ、生後14日では嗅上皮全体に散在性に見られた。Jagged2の発現は胎生11日には嗅上皮全体に弱く見られ、生後3日で嗅上皮全体にやや強く、生後14日には基底膜に近い側に強く見られた。Hesの発現は胎生11日で嗅上皮全体に弱く見られ、生後3日と14日は嗅上皮全体に強く見られた。Mathの発現は胎生11日では見られず、生後3日では上皮に近い側で強く見られ、生後14日では嗅上皮全体に強く見られた。嗅上皮・神経の存在部位はolfactory marker proteinで免疫染色施行し確認した。呼吸上皮には今回観察したいずれの遺伝子も観察されなかった。Notch Signalは嗅神経細胞の発生過程において重要な役割を果たしていることが示唆された。今後は胎生期における嗅神経細胞の分布とNotch Signalの発現の変化を観察する必要があると考えている。また、硫酸亜鉛溶液などを用い嗅覚障害のモデルマウスを作製し、その再生過程を観察中である。
シリカ化合物粉塵による呼吸器障害と肺胞マクロファージ由来一酸化窒素の関係

多くの疫学調査や実験研究はアスベスト粉塵吸入によって肺癌、悪性中皮腫や肺線維症になることを示している。然し、その発生機序は殆ど不明である。肺に吸入されたアスベストが肺胞マクロファージ(Mφ)と反応して細胞・組織障害性の強い一酸化窒素(NO)を産生し、上記疾患を起こす可能性がある。そこでクリソタイル(CH),アモサイト(AM),クロシドライト(CR)の3種のアスベストと培養したラット肺胞Mφが放出するNOを測定した。CHと培養したMφのみがNO産生を著明に増加させた。NO産生酵素(NOS)の誘導剤である細菌性内毒素(LPS)とCH,AH又はCRの共存下の培養では、CHの共存によってLPSのMφ放出NO増加作用は強く抑制された。一方、LPSでNOS誘導したMφをLPS不含-CH含有新鮮培養液で培養しても、誘導されたNOSによるNO産生増加は抑制されなかった。これら所見はLPSとCHは互に異る機序でNOSを誘導してNO産生することを強く示唆する。更に、生理食塩水、またはアスベストを含む同液をラット気管内に注入したとき、CHを注入したラット肺のみがNOS活性の著明な増加を示した。その肺は強い浮腫と褐色斑形成を伴う炎症を示し、肺重量も他の処理ラット群のものに比べ約2培に増加した。以上の実験結果から、アスベスト暴露をうけた肺、とくにCH暴露された肺では肺胞MφがNOSを誘導して多量のNOを産生すること、およびこのNOが呼吸器病変の発生に関与することを強く示唆する結果をえた。今後、CHがLPSと異る機構でNOSを誘導してNO産生増加を導く過程とNOによる発癌の過程を分子生物学的研究で明らかにしたい。