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東南アジア法制の総合的研究

「東南アジア法制の総合的検討」も本年度が最終年度であり、これまでの成果をまとめる作業を行なった。本研究の主たるねらいは、これまでほとんど研究されてこなかった東南アジア地域の法制度に関する基礎資料の収集・整理にあった。タイ・インドネシア・シンガポール・ブルネイ・香港などの諸国については、基本法令の収集を行なえた。また、マレーシアについては「法律雑誌」を収集することができた。これらの文献については、遂次整理のうえカード化の作業を進めてきている。これらについては、整理ができ次第、文献目録を作成し発表する予定である。さらに、国別に資料を収集・整理するだけでなくテーマ別にも資料の収集・整理を試み、「アジアの刑事司法」に関する基礎資料づくりを邦語の各種文献から行い、これについても文献目録を作成した。また、法制度の研究のうえで必要な各国の政治・社会・文化事情についての情報を獲得するために、アジア諸地域について欧文で書かれた論文について、(1)Journal of Asian Study誌等から文献をカード化し、文献目録を作成した。そして、インドネシアのゴシタ教授の協力で、同国の法制度に関連するいくつかの文献の収集・整理を行ない、これについても文献目録を作成した。いうまでもなく、これらのものが網羅的であるとはいえないが、「研究」のいとぐちとなればと考える。その他、アジアの少年非行及び少年法制についての比較研究を行ない、五九年度に、極東アジア犯罪防止研修所での合同セミナー、六○年度に、第四回アジア太平洋地域少年非行会議を開催し、少年非行・少年司法に関する貴重な情報の交換を東南アジアからの参加者と行なうことができた。昭和60年度は、昨年度に引き続き刑事法に関する研究を行うとともに、全般的な基本法令・文献の収集にあたった。1.本年もアジアの少年非行及び少年法制についての比較研究を行った。ことに、1985年11月10日から17日まで東京(都ホテル・慶應義塾大学)と神戸(神戸ポートピアホテル)において第四回アジア太平洋地域少年非行会議を開催し、東南アジアをはじめ世界各国から約90名の参加を得て、少年非行の現状と対策についてはばひろい視野で研究を行なうことができた。2.昨年注文した法令集のうち、タイおよびシンガポールの総合法令集が入手できた。これらについては、各分野ごとに専門分野の会員により紹介していきたいと考えている。4.アジアの犯罪に関する基礎資料づくりを昨年に引き続き各種文献から行った。これについても「法学研究」誌に発表する予定である。5.その他、アジアの法制度を比較研究するうえで重要と思われる文献を昨年に引き続き広く収集することができた。なお、現在インドネシア・香港・大韓民国などの基本法令・判例の収集について、入手を検討している。6.1985年12月宮澤浩一と安冨潔が大韓民国を訪問し、同国の法務部および治安本部において検察官および警察官と両国の犯罪動向について意見交換をするとともに、同国の犯罪動向に関する資料を収集してきた。
EGFRシグナル阻害による細胞分化誘導を用いた食道癌に対する新しい治療法の開発

食道癌細胞株(TE1, TE5, TE11, TE11R, TE8, HCE4)、形質転換した食道上皮細胞株(T-Epi, T-Mes)に対するEGFR阻害剤の殺細胞及び抗腫瘍効果をin vitro, in vivoで検討した。上皮系細胞株であるTE1, TE5, TE11, TE11R, T-Epi細胞は、EGFR阻害剤投与により細胞分化が誘導され、有効な殺細胞効果、抗腫瘍効果が見られたが、間葉系細胞株であるTE8, HCE4, T-Mes細胞にはそうした効果は見られず、有効性が示されなかった。EGFR阻害剤は上皮系食道癌細胞には有効な治療となりうることが示唆された。食道扁平上皮癌に対するEGFRシグナル伝達阻害が、「治療抵抗性癌細胞」を「治療感受性細胞」へ分化誘導することにより、抗がん剤に対する治療感受性を増強するか、in vitroの実験系で検討した。EGFR阻害剤として、チロシンキナーゼ阻害剤であるエルロチニブを使用した。EGFR阻害に基づき、その下流シグナルであるAkt,ERK, MAPK, Statシグナルが抑制されることを確認した。ヒト食道扁平上皮癌細胞株TE1, TE11にエルロチニブを72時間添加培養した後に細胞蛋白を抽出し、扁平上皮の分化マーカーであるInvolucrinの発現をWestern blottingで評価した。TE1, TE11両細胞株ともに、エルロチニブ投与後、濃度依存的、時間依存的なInvolucrinの発現上昇を認め、EGFRシグナル阻害による食道扁平上皮癌細胞の細胞分化誘導作用が示された。また、細胞増殖についても濃度依存的、時間依存的な増殖抑制効果を確認できた。5FU耐性食道癌細胞株TE11Rを用いた同様の検討でも、EGFR阻害による細胞分化誘導作用が確認できた。次に、このTE11R細胞を用いて、EGFR阻害剤を72時間投与した後に5FUを投与した群と、EGFR阻害剤を添加せずに5FUを投与した群で、細胞生死率をWST1 assayで比較したところ、EGFR阻害剤を投与後(分化誘導後)に5FU投与を行った群の方が、EGFR阻害剤なしの群に比較し、有意に(p<0.01)細胞死率が高いことが示された。食道扁平上皮癌に対するEGFRシグナル伝達阻害が「治療抵抗性癌細胞」を「治療感受性細胞」へと分化誘導することにより抗がん剤に対する感受性を増強するか、チロシンキナーゼ阻害剤:エルロチニブ、及びEGFR抗体:セツキシマブを用いて検討した。EGFR阻害により、その下流シグナル(Akt, ERK, MAPK, Statシグナル)が有効に抑制されることを確認した。ヒト食道扁平上皮癌細胞TE-1, TE-11細胞にエルロチニブ、セツキシマブを72時間培養後、細胞分化マーカーであるInvolucrin発現をmRNA,蛋白レベルで検討した。両細胞株ともに、濃度依存的、時間依存的にInvolucrinの発現が亢進し、EGFRシグナル阻害による食道扁平上皮癌の細胞分化誘導作用が示された。細胞分化誘導に伴い、細胞増殖は濃度依存的、時間依存的に増殖抑制された。細胞分化誘導機序を解明するため、分化増殖の重要な制御因子であるNotchシグナルに注目し、EGFR阻害剤にNotchシグナル阻害剤を添加し細胞分化誘導作用を検討した。Notchシグナル阻害剤(gammma-secretase inhibitor:GSI)とEGFR阻害剤を同時投与すると、GSI濃度依存的にEGFR阻害剤の分化誘導作用が抑制された。また、EGFR阻害によりNotchレポーター活性が上昇することを示した。このことより、EGFR阻害による分化誘導作用はNotchシグナル伝達シグナル系を介した機序によるものであることが推察された。さらに、5-FU耐性食道癌細胞TE-11R細胞の薬剤耐性(5-FU耐性)はEGFR阻害剤の添加により軽減されることをWST1アッセイで示した。本研究では食道癌細胞にEGFRシグナル伝達阻害剤を投与し抗腫瘍効果を検討した。まずin vitroの実験として食道癌細胞株TE11R細胞にチロシンキナーゼ阻害薬エルロチニブあるいは抗体薬セツキシマブを投与し、TE11R細胞中のEGFR阻害効果を確認した。TE11R細胞のEGFR阻害により分化マーカーであるInvolucrin及びCK13の発現が上昇し、これに伴い細胞増殖が抑制された。次にin vivo実験としてTE11R細胞でxenograftモデルを作成後、セツキシマブを投与すると有効な腫瘍増殖抑制効果、分化誘導効果が確認できた。一方、別の食道扁平上皮癌細胞であるTE8細胞に同様のin vitro, in vivo実験を行ったが、この細胞株ではEGFR阻害による分化誘導作用、増殖抑制作用、抗腫瘍効果は認められなかった。TE11R細胞は上皮系癌細胞、TE8細胞は間葉系癌細胞で、この形質の差異がEGFR阻害の効果に影響を及ぼす可能性を考え、次に別の食道癌細胞株TE1(上皮系癌細胞)及びHCE4(間葉系癌細胞)にEGFR阻害を行うと、TE1では分化誘導作用、増殖抑制作用が見られたがHCE4ではその作用が見られなかった。さらに別の食道細胞株T-Epi(上皮系細胞)とT-Mes(間葉系細胞)にEGFR阻害を行った場合も、T-Epiでは分化誘導作用、増殖抑制作用が見られたが、T-Mesではそれらの作用が見られなかった。

このように、食道癌細胞におけるEGFR阻害効果は、上皮系癌細胞では有効に働くが、間葉系癌細胞には有効性が乏しい可能性が示唆された。また、EGFR阻害剤投与で分化誘導を行ったTE11R細胞、T-Epi細胞は、無治療の同細胞と比較し有意に抗がん剤5FUの感受性が増強する一方、TE8細胞、T-Mes細胞に同様の治療を行ってもその感受性に影響を及ぼさなかった。以上より食道癌に対するEGFR阻害は上皮系癌細胞には有効性があるが間葉系癌細胞には効果が乏しいことが示された。食道癌細胞株(TE1, TE5, TE11, TE11R, TE8, HCE4)、形質転換した食道上皮細胞株(T-Epi, T-Mes)に対するEGFR阻害剤の殺細胞及び抗腫瘍効果をin vitro, in vivoで検討した。上皮系細胞株であるTE1, TE5, TE11, TE11R, T-Epi細胞は、EGFR阻害剤投与により細胞分化が誘導され、有効な殺細胞効果、抗腫瘍効果が見られたが、間葉系細胞株であるTE8, HCE4, T-Mes細胞にはそうした効果は見られず、有効性が示されなかった。EGFR阻害剤は上皮系食道癌細胞には有効な治療となりうることが示唆された。食道癌細胞におけるEGFR阻害作用に伴う分化誘導作用、増殖抑制効果を、異なる機序のEGFR阻害剤で示しており、EGFR阻害が細胞分化を誘導することに関する普遍性を示すことができている。また、Notchシグナル阻害剤を用いた実験によりEGFR阻害が細胞分化を誘導する機序についても明らかにすることができている。この観点から本研究は概ね順調に遂行できていると考えられる。消化器内科In vitroの実験系で、EGFR阻害による細胞分化誘導が5-FUによる細胞傷害を増強する機序についてさらに検討する。具体的には、細胞内アポトーシスの程度や細胞内活性酸素量、核内Nrf2発現量を検討する予定である。また、In vitro実験で明らかにした事象がin vivoの実験系で再現できるか検討する。5-FU耐性食道癌細胞TE-11Rによるxenograft腫瘍に対しEGFR阻害剤、Notchシグナル阻害剤を投与し、その5-FU感受性に及ぼす抗腫瘍効果を検討する。食道癌細胞におけるEGFR阻害剤の細胞分化誘導作用ならびに細胞増殖抑制効果を、複数の細胞株で確認することができた。5FUに対する抗癌剤耐性株を用いた実験系でもその分化誘導作用に伴ない、5FUの感受性が増強される効果が示せており、食道癌細胞に対する細胞分化誘導を標的とする治療戦略の基盤となるproof of conceptをおおむね遂行できていると考えられる。必要な試薬が充足したため今回のin vitroの実験に使用した5FU耐性食道癌細胞株TE11R細胞を用いてxenograftモデルを作成し、EGFR阻害にともなう分化誘導作用をin vivoの実験系で検討する。具体的には腫瘍の増殖増殖抑制効果を判定し、また分化誘導マーカーの発現、細胞増殖マーカの発現を病理組織学的に評価する。EGFR阻害に伴う分化誘導抑制による細胞形態の変化を3D培養を用いた実験系で評価する。また、放射線感受性に関する基礎的検討についても今後検討を加える予定である。次年度の研究経費として使用する予定である
代謝プロセスに着目した生態系における一般炭素・窒素安定同位体動態機構モデルの構築

細胞内TCAサイクルのエネルギー代謝での炭素、窒素の安定同位体比の動態を調べるため各素過程での同位体効果と基質供給量の間の関係をモデル化し、これらをつないだ定性的な代謝動態モデルを構築した。餌の量が多いほど、代謝速度が速いほどC・Nとも同位体効果が大きくなり、成長速度が大きい場合には同位体効果が小さくなること、また餌のC/N比が自らに比して高い場合にはCの、低い場合はNの同位体比が高くなる傾向も再現できた。必須アミノ酸では炭素鎖の代謝頻度が低く抑えられれば、可欠アミノ酸に比べてCの同位体比が低くなることも示唆された。生態系間で共通するC・N同位体濃縮比をもたらすメカニズムの解明の一助となる。1.細胞レベルの代謝マップにおいて、C・Nの同位体効果の起こる部位の特定とその素過程ごとのプロセスモデルのプロトタイプの開発をおこなった。ミトコンドリアを中心とする代謝経路のなかでC・N同位体効果が起こる脱炭酸・脱アミノ反応が起こる部位のエネルギー代謝中間産物を炭素骨格とする可欠アミノ酸の合成経路から分類した4つの群系について、これらの同位体効果のおこる代謝素過程ごとに、同位体効果の定量的関係、アミノ酸、グルコース、脂肪酸を基質とする代謝産物量の関係を元に、同位体動態モデルを開発し、これらを連結したモデルの試作を行った。2.文献情報から、西武北太平洋域(海洋貧栄養)、琵琶湖、バイカル湖(陸水湖沼)、モンゴル草原の各生態系について、C・N同位体情報のデータベース化をおこなった。またこれらの生態系について、捕食-被食関係、依存する一次生産者、その成長制限環境要因の情報を収集し、データベース化を進めている。3.飼育系の魚類のサンプルを同位体分析は、諸事情により操作実験を行うことができなかったが、該当業種の部位ごとのC・N同位体分析は予備的に行った。1.ミトコンドリアを中心とする代謝経路において特定されたC・Nの同位体効果の起こる部位での素過程のプロセスモデル開発をすすめ、炭素源、窒素源の供給量と消費量を変化させた際のそれぞれの元素の同位体効果の変化について、数値実験による検討が行える基盤ができた。従来の同位体比をベースにした計算方法に加え、十分な数の分子数をベースにしたモデルを作ることで、これらの素過程を連結したモデルでの定量的な追跡が容易になった。今後、このモデルでの擬似的な個体内代謝系での同位体の動態モデルを開発し、フラックスとしての同位体費の変化についての検討をすすめる。2.これまで調べた限られた食物連鎖の範囲では、生態系や生物種によらΔδ15N/Δδ13Cに大きな差が見られない=似通っていることから、自然界の食物連鎖中の摂餌プロセスの同位体分別(Δδ15N/Δδ13C)は、自然界の食物連鎖中の摂餌プロセスの同位体分別(Δδ15N/Δδ13C)は、地域によらず統一的な規則性が低次から高次まで一定であることが強く示唆されているが、一方で従来の研究からは、同一海域の季節変化では、ブルーミングの時期にこの傾きが大きく揺らぐことが示されていた。このような、季節的におこるC・N同位体効果の変動を代謝の素過程から考察すべく、関連研究でのブルーミング期の藻類サンプル、動物プランクトンサンプル入手、分析と、同位体分析と上記素過程モデルから検討を試みた。今年度は明瞭な季節的なブルーミング期のサンプリングがかなわず、今年度の結果からは上記の目的は果たせなかったが、次年度再度試みる。代謝モデルの開発に必要となる同位体比の実測値は、各生物種の部位ごとのストックの値に限られている。これらは一般に代謝動態のフローの時間変動に比較してゆっくり変化すると仮定して、変動の小さい定常状態とみなせる場合の同位体比の妥当性の検証に用いているが、今後はさらに短い時間スケールでの変動についても参照できる微生物のデータなども収集し、検証に用いることを検討する。当初予定していた飼育系での操作実験の計画については、時間的制約や、餌の均質性などの条件設定に困難があり計画通りには進捗していないが、外洋での海洋生態系の調査は順調に進捗している。ミトコンドリアを中心とするアミノ酸、糖、脂質の代謝プロセスにおいて、炭素、窒素の同位体効果が起こると考えられる重要な素過程を含む、定量的な動的数値モデル(Individual Based-model)を開発し、動物の採餌、成長、排泄などの生命活動によって引き起こされる両元素の同位体濃縮がおこる部位、タイミング、規模を連続して考察できることが可能になった。ただし、モデル内の各化学反応や、物質の移動の時間スケールについてはまだ不確実性が高いため、既往の分析結果を再現できる段階には達していない。探索的なパラメータの検討も含め、引き続き同モデルの高度化をすすめる。生理的素過程部分についての論文作成中である。一方、従来の研究から示唆されてきた、季節変化に伴う両元素の同位体比のゆらぎが見られる理由については、今年度に予定していた、海洋生態系でのブルーミング期の植物プランクトン、動物プランクトンの分析は実現しなかったため、本研究による直接の知見は得られなかった。

動物の食物連鎖上の栄養段階は、種と、体サイズの両方に大きく依存するが、湖沼、海洋など水域生態系では後者への依存度が高いこと、また死亡率も体サイズに大きく依存し低下することに着目し、同位体比から推定されている栄養段階が、個体の成長と死亡により変動する種個体群のどのような特性を代表しうるのか、再検討することを開始した。本研究計画時には入っていなかった視点であるが、ある種が持つ生態系機能が従来の理解と異なるものを示す可能性をもつため重要であると考え取り組むこととした。当初予定してた生物飼育実験と、海洋の動物のサンプリング・分析による、モデルの精緻なパラメータ取得と検証は、時間的制約から縮小したが、困難が生じ計画を変更したが、一方で、モデリングについては手法、視点とも新しいものが加わり、発展が見られるため。昨年度までに開発を進めてきたミトコンドリアでの物質代謝における炭素、窒素の同位体効果が起こると考えられる重要な素過程を含む、定量的な動的数値モデル(Individual Based-model)の、パラメーターの設定について、動物の採餌、成長、排泄などの生命活動、および動物の移動によって引き起こされる両元素の同位体濃縮がおこる部位、タイミング、規模をについて、文献および研究協力者からの情報を収集し、同モデルの高度化をすすめ、論文の投稿準備を進めている。水域生態系では、栄養段階が体サイズに大きく依存すること、また死亡率も体サイズに大きく依存し低下することから、既往の多くの生態学研究が提示してきた種ごとに同位体比から推定されている栄養段階が、個体の成長と死亡により変動する種個体群のどのような特性を代表しうるのかには、まだ明確な評価がなされていない。この点について、既往の文献からサンプルのサイズ・種両方の属性についてのをおこなった。分析された同一サンプルセットの内、種内で十分な体サイズ、及び年齢の分散があるケースは少なかったが、季節、地域などを網羅し多くサンプリングされている普通種のデータをまとめて企画した上で分析を行っている。体サイズと死亡率の関係については、既存の関係式を当てはめることで、バイオマスベースでの代表的な種ごとの栄養段階を計算するモデルを開発した。本件についても論文準備中である。細胞内TCAサイクルのエネルギー代謝での炭素、窒素の安定同位体比の動態を調べるため各素過程での同位体効果と基質供給量の間の関係をモデル化し、これらをつないだ定性的な代謝動態モデルを構築した。餌の量が多いほど、代謝速度が速いほどC・Nとも同位体効果が大きくなり、成長速度が大きい場合には同位体効果が小さくなること、また餌のC/N比が自らに比して高い場合にはCの、低い場合はNの同位体比が高くなる傾向も再現できた。必須アミノ酸では炭素鎖の代謝頻度が低く抑えられれば、可欠アミノ酸に比べてCの同位体比が低くなることも示唆された。生態系間で共通するC・N同位体濃縮比をもたらすメカニズムの解明の一助となる。生態系内の同位体濃縮についての反応速度論に基づいた生理的要因、外的環境要因を含む一般的なメカニズムの演繹的数理モデルを用いての検討を進めており、細胞内代謝マップ内で主なC・Nの同位体効果の起こる部位の特定と、各素過程での通常の同位体分別係数についての知見を、哺乳類を含む複数の生物分類群について調べ、これを元に同位体動態から定量的に検討する数値モデルの試作を行った。複数の素過程を連結し包含した代謝モデルを用いて、細胞内代謝経路による代謝産物が受ける同位体効果を検討を開始しているが、まだ数値モデル上で実測値を定量的に再現できるには至っておらず、各素仮定モデル、連結条件共に基礎反応式とパラメーターの確認と検討を行っている。
刺胞動物の生活史の多様性に関する研究

本研究では、刺胞動物の生活史を、(1)クラゲ世代とポリプ世代の老化と寿命、(2)単体性および群体性イシサンゴの群体やポリプの年齢について、そして(3)イシサンゴ幼生における共生成立機構について解明することを目的とした。サンゴやサカサクラゲの体細胞組織がテロメラーゼ活性をもつことを示すとともに、サンゴやクラゲで特定染色体のテロメア長を測定する方法を開発した。テロメア長によりサンゴの年齢を推定できる可能性が示唆された。サンゴ幼生は、様々な遺伝子型の褐虫藻を選択せずに獲得することが明らかとなった。本研究では、花虫網のイシサンゴ類と鉢虫網のサカサクラゲを研究対象とし、再生、生殖開始年齢、老化、共生、そしてポリプ世代とクラゲ世代の差異などの生活史特性を分子生物学的手法を用いて解明することを目的とした。今年度は、サンゴやサカサクラゲの寿命を、細胞の老化や分裂寿命に関するテロメラーゼやテロメア長の観点から研究した。アザミサンゴとサカサクラゲの両者において、テロメアは脊椎動物と同様TTAGGGの繰り返し配列よりなること、そして体細胞組織がテロメラーゼ活性を有することを示す成果を得た。サカサクラゲにおいて、無性生殖を行い寿命の長いポリプ世代と有性生殖を行意寿命の短いクラゲ世代間で、テロメラーゼ活性に顕著な差がないことを見いだした。この結果は、両世代の寿命の差が体細胞組織のテロメラーゼ活性の差によっては説明できないことを示唆する(Ojimi et al.2009)。またサンゴやサカサクラゲにおいてテロメアの隣接配列を決定することで、ヒトで開発された特定染色体のテロメア長を測定するSTELA法をサンゴやサカサクラゲに適用することに成功した。(Ojimi et al.投稿準備中)。単体サンゴのトゲクサビライシにおいて、個体のサイズとテロメア長が負の相関関係を示すことから、テロメア長がサンゴの年齢を示す可能性が示唆された。また、クラゲ世代は、ポリプ世代よりもテロメア長が長い傾向を示すことから、ポリプが横分体形成によりクラゲ体を形成する際にテロメア長の回復が起こる可能性が示唆された。今後、サンゴ群体内でのポリプ間でテロメア長に差があるかなどについて調べるとともに、褐虫藻との共生関係が宿主の形態形成や寿命などの生活史特性にどのような影響を及ぼすかを調べることが今後の課題である。本研究では、花虫綱のイシサンゴ類と鉢虫綱のサカサクラゲを材料とし、刺胞動物の顕著な再生能力や際限の無い無性生殖を可能にするメカニズム、有性生殖と老化や寿命との関係など、刺胞動物の生活史特性を分子生物学的手法を用いて解明することを目的とした。(1)サンゴやサカサクラゲなどゲノム情報のない非モデル生物において、テロメアの隣接配列を決定することで、特定染色体のテロメア長を測定する方法(簡便型STELA法)を開発した。(2)単体性サンゴであるトゲクサビライシにおいて、サンゴ重量とテロメア長の間に負の相関関係があること、精子のテロメアは体細胞のテロメアより長いことを見出し、単体性サンゴのテロメア長がサンゴの年齢とともに短縮すること、テロメア長によりサンゴの年齢を推定できる可能性があることを示した。(3)群体性サンゴであるアザミサンゴにおいても、テロメア長を測定することに成功し、群体内のポリプが同一年齢なのか、ポリプ形成の時期によりポリプ問で年齢が異なるのかなどを調べる道が開けた。(4)サカサクラゲにおいて、無性生殖を行い寿命の長いポリプ世代と有性生殖を行い寿命の短いクラゲ世代で、テロメア長を比較した結果、クラゲの傘部は、ポリプよりもテロメア長が長い傾向を示すことから、ポリプが横分体形成によりクラゲ体を形成する際にテロメア長の回復が起こる可能性が示唆された。ただし、組織内の生殖幹細胞や体細胞性幹細胞の頻度や分布により、テロメア長の差が生じる可能性もあり、これら幹細胞の分布密度を解析することが必要である。(1)サンゴやサカサクラゲなどゲノム情報のない非モデル生物において、テロメアの隣接配列を決定し、テロメア2本鎖部をPCR増幅することにより、特定染色体のテロメア長を測定する方法を開発した。ヒトで開発されたSTELA法を、非モデル生物へ応用した初めての例である。PCR産物(STELA産物)の長さを決定する際には、テロメアプローブを用いたサザンハイブリダイゼーションを行うことが必要であった。

非特異増幅を起こさないようなプライマーの設計、テロメアを無傷のままDNAを抽出する方法、in situ hybridizationによる今回テロメア長を測定した特定染色体の同定など、課題点も明らかになった。(2)単体性サンゴであるトゲクサビライシに加えて、群体性サンゴであるアザミサンゴにおいても、テロメア長を測定することに成功した。アザミサンゴでは、単体サンゴのトゲクサビライシと異なり、プラヌラ幼生と精子間でテロメア長に差が見られず、初期発生過程でテロメラーゼ活性が発現している可能性が示唆された。組織内の生殖幹細胞や体細胞性幹細胞の分布密度により、組織のテロメア長の差が生じる可能性もあり、今後、これら幹細胞の分布密度を解析することが必要であり、現在そのための分子マーカーを開発中である。(3)サンゴの生存に重要な生活史初期におけるサンゴー褐虫藻共生成立について、野外実験により明らかにした。その結果、サンゴ幼生は浮遊期間中に褐虫藻を獲得可能であること、また、成体サンゴとは異なり、幼生や初期ポリプは様々な遺伝子型の褐虫藻を選択せずに獲得することが明らかとなった。このことは、サンゴが生活史初期において海洋環境中で利用できる褐虫藻と先ず共生を成立させ、当面必要なエネルギーを得て生存率を高めている可能性を示唆する。
Drop-seqによる不均一性を伴う患者由来消化器癌微小環境の単一細胞解析

消化器癌は腫瘍微小環境内・間にheterogeneityといわれる高度な不均一性をもっており、癌の浸潤や転移に深く関わる細胞集団を癌細胞・間質細胞として含んでいる。これらの解明およびその制御により究極の個別化医療を確立することができると考えるが、このためには機能別に細胞集団を分取することが必要であると考えた。本研究では、手術切除標本を用いたDrop-seq技術によるシングルセル解析を行うことで、遺伝子網羅的発現解析により従来の分類とは一線を画したこれまでにない機能的な細胞集団の分類を構築し、特に癌の悪性度に関わる細胞集団を同定、分取することを目的とする。
膵β細胞における食事誘導性O-結合型糖修飾調節異常と、膵β細胞機能不全との関係

細胞内蛋白へのO-GlcNAc修飾における転移酵素O-GlcNAc transferase(OGT)の役割を明らかにするために、タモキシフェン(TM)誘導性の膵島特異的OGT遺伝子ノックアウトマウスを作成した。これらのマウスは一過性に低血糖や高インスリン血症、脂肪量の増加を呈していたが、その後高血糖やインスリン分泌能の低下へと変化しており、膵β細胞におけるアポトーシスが認められた。また、TM誘導性の全身OGTノックアウトマウスはTM投与4週後までに8割のマウスが致死性表現系を示した。これらのことから、O-GlcNAc修飾は膵β細胞機能や生存に対して重要な役割を持つものと考えられた。Cre-loxedPシステムを用いて膵島に特異的に作用するタモキシフェン誘導性Pdx1-CreマウスとOGT遺伝子floxedマウスとを交配させ、出生した児にタモキシフェンを投与することで、膵島特異的OGT遺伝子ノックアウトマウスを作成した。これまでの検討にて、膵島特異的OGT遺伝子ノックアウトマウスは、タモキシフェン誘導後4-5週より一過性に体重及び空腹時血中インスリン値の上昇を認めた。しかしながらその後空腹時血中インスリン値は減少していき、タモキシフェン誘導後10週では血中インスリン値は対象マウスと比較して有意に低下していた。それと同時に空腹時血糖値の上昇及び体重減少を認め、糖尿病と同様の表現系を呈した。また、膵臓を摘出し組織学的な検討を行い、タモキシフェン誘導後4-5週並びに10週の膵島におけるOGTやO-GlcNAc修飾蛋白の蛋白発現は低下していた。また、タモキシフェン誘導後10週において、膵組織に対する膵島面積は減少しており、膵島内インスリン蛋白の発現も低下していた。さらに、透過型電子顕微鏡ではβ細胞において、インスリン顆粒の減少及び形態の乱れが認められた。アポトーシスの評価のために行ったTUNEL染色では膵島特異的OGT遺伝子ノックアウトマウスで陽性細胞の増加を認めた。そこでアポトーシスが惹起される直前であるタモキシフェン誘導後7週での膵島単離及びqPCRを行ったところIns1,2, MafAの発現が有意に低下していた。ND3-5, Mtco1, Cycなどミトコンドリア関連の遺伝子は有意に増加しており、Ho1, Nqo1, Catalase, MnSODなどの酸化ストレス、抗酸化関連遺伝子も有意に増加していた。平成27年度の研究実施計画のうち、「1)膵島特異的OGT遺伝子ノックアウトマウスにおける、膵β細胞機能やインスリン分泌能の変化の検討」については、摘出した膵臓から組織標本を作製し、タモキシフェン誘導後10週のマウスにおいて膵島面積の減少やインスリン蛋白発現の減少を確認した。また、細胞内でのアポトーシスの存在を明らかにした。「2)膵島特異的OGT遺伝子ノックアウトモデルマウスから単離した膵島細胞において、グルコース応答性のインスリン分泌能の経時的な変化の検討」については、タモキシフェン投与後10週のマウスにおいて全膵臓に対する膵島量が減少しているために、グルコース投与に必要な単離膵島細胞の数が少なく、多くの匹数を用いて検討を行っているところである。また、タモキシフェン誘導後5週におけるグルコース応答性のインスリン分泌能の評価を、実験条件を検討しながら行っているところである。タモキシフェン誘導性膵島特異的OGT遺伝子ノックアウトマウスを作成した。これまでの検討にて、膵島特異的OGT遺伝子ノックアウトマウスは、タモキシフェン誘導後4-5週(早期相)より一過性に体重及び血中インスリン値の上昇を認めたが、その後血中インスリン値は減少していき、タモキシフェン誘導後10週(後期相)では血中インスリン値は対象マウスと比較して有意に低下していた。また、組織学的検討にて早期相並びに後期相の膵島におけるOGTやO-GlcNAc修飾蛋白の蛋白発現は低下していた。また、早期相では膵島内インスリン量の増加やIns2、Pdx1発現が増加していたが、後期相では膵組織に対する膵島面積は減少しており、膵島内インスリン蛋白発現の低下やIns1,2, MafAの発現が低下していた。また、透過型電子顕微鏡ではβ細胞においてインスリン顆粒の減少及び形態の乱れが認められた。さらにアポトーシスの評価のために行ったTUNEL染色では陽性細胞の増加を認めた。そして後期相ではND3-5, Mtco1, Cycなどミトコンドリア関連の遺伝子が増加しており、Ho1, Nqo1, Catalase, MnSODなどの酸化ストレス、抗酸化関連遺伝子も有意に増加していた。また、小胞体ストレスの増加が観察された。一方、全身で作用するタモキシフェン誘導性OGT遺伝子ノックアウトマウスを作成した。このマウスは肝臓や骨格筋、膵臓や脂肪組織でのO-GlcNAc修飾蛋白の蛋白発現が減少していた。また、血糖低下を伴う致死性表現系を示した。また、膵β細胞由来細胞株MIN6に対してOGTのsi-RNAを投与したところ、OGT遺伝子発現の減少を認めた。平成27年度の研究実施計画のうち、「1)膵島特異的OGT遺伝子ノックアウトマウスにおける検討」については、タモキシフェン誘導後4-5週(早期相)では膵島内インスリン量の増加やIns2、Pdx1発現が増加を確認し、タモキシフェン誘導後10週(後期相)では膵島面積の減少やインスリン蛋白発現の減少を確認した。

また、細胞内でのアポトーシスの存在を明らかにし、酸化ストレスや小胞体ストレスが関与していることが考えられた。「2)膵島特異的OGT遺伝子ノックアウトモデルマウスから単離した膵島細胞における検討」については、タモキシフェン投与後10週のマウスにおいて実験に必要な単離膵島細胞の数が少なく、多くの匹数を用いて検討を行っていく。また、タモキシフェン誘導後5週におけるグルコース応答性のインスリン分泌能の評価を行ったが、結果の再現性が低いことなどから実験条件を検討している。平成28年度以降の研究実施計画のうち、「1)2型糖尿病モデル動物を用いた検討」では、2型糖尿病モデルであるOLETFラットの52週令で、膵島面積の減少やインスリン遺伝子発現の減少の他に、O-GlcNAc修飾蛋白の発現が低下していたことより、O-GlcNAc修飾の調節異常がインスリン分泌不全や糖尿病発症に関係していることが考えられた。「2)単離した膵島細胞におけるO-GlcNAc調節酵素(OGT、OGA)の役割」については、単離膵島細胞へのsi-RNA導入効率が不安定のため、膵β細胞由来細胞株MIN6に対してOGTのsi-RNA導入を行ったところ、OGT遺伝子発現の低下を認めた。「4)タモキシフェン誘導性に全身でのOGT遺伝子をノックアウトさせたマウスの作成」に成功しており、このマウスは血糖低下を伴う致死性表現系を示した。O-GlcNAc修飾は全身での細胞恒常性維持において重要な役割を果たしていることが示唆された。タモキシフェン誘導性膵島特異的OGT遺伝子ノックアウトマウスを作成した。これまでの検討にて、膵島特異的OGT遺伝子ノックアウトマウスは、タモキシフェン誘導後4-5週(早期相)より一過性に体重及び血中インスリン値の上昇および低血糖を認めたが、その後血中インスリン値は減少していき、タモキシフェン誘導後10週(後期相)では血中インスリン値は対象マウスと比較して有意に低下していた。それと同時に空腹時血糖値の上昇及び体重減少を認め、糖尿病と同様の表現系を呈した。また、組織学的検討にて早期相並びに後期相の膵島におけるOGTやO-GlcNAc修飾蛋白の蛋白発現は低下していた。また、早期相では膵島内インスリン量の増加やIns2、Pdx1発現が増加していたが、後期相では膵組織に対する膵島面積は減少しており、膵島内インスリン蛋白発現の低下やIns1,2, MafAの発現が低下していた。また、透過型電子顕微鏡ではβ細胞においてインスリン顆粒の減少及び形態の乱れが認められた。さらにアポトーシスの評価のために行ったTUNEL染色では陽性細胞の増加を認めた。そして後期相ではND3-5, Mtco1, Cycなどミトコンドリア関連の遺伝子が増加しており、Ho1, Nqo1, Catalase, MnSODなどの酸化ストレス、抗酸化関連遺伝子も有意に増加していた。また、小胞体ストレスの増加が観察された。一方、全身で作用するタモキシフェン誘導性OGT遺伝子ノックアウトマウスを作成した。このマウスは肝臓や骨格筋、膵臓や脂肪組織でのO-GlcNAc修飾蛋白の蛋白発現が減少していた。また、血糖低下を伴う致死性表現系を示した。さらに、膵β細胞
地域エネルギーシステムにおけるユーザーの便益と受容性に着目した自立分散電源の評価

本研究は、都市機能が高度に集積する既存地域冷暖房地区を対象に、災害時機能継続の観点から自立分散電源導入ケースを類型化し、メリット/デメリットの整理を行ったうえで、非常時のエネルギー供給途絶による損失の回避効果を定量化すること、またその効果を得るために必要な追加的費用に対するユーザーの受容性を明らかにすることを目的としている。2年度目である平成30年度は、全国の地域冷暖房地区の需要家建物を抽出し、災害時の建物機能継続のための対策の実施状況や、電力の供給途絶時の業務支障率、自立分散電源導入によりエネルギー供給途絶による損失の回避効果に対するニーズと、追加的費用に対するユーザーの受容性を調査するべく、建物側(ユーザー側)の施設管理実務者にヒアリングを行い、アンケート調査用紙を詳細設計し、調査を実施した。調査結果の回収数が不足しているため、追加調査を次年度実施予定で、あわせて調査結果の集計分析を実施する予定である。建物側(ユーザー側)の施設管理実務者にヒアリングを行い、アンケート調査用紙の設計・製作に時間を要した。また、アンケート調査を郵送により配布したが、予定より回収率が低く、現時点では有効な回答数が集まっていない状況である。よって、アンケート調査の回答数を増やすために追加的な調査の実施、電話などによる依頼等を行っている状況である。前述のとおり、全国の地域冷暖房地区の需要家建物を対象とした災害時の建物機能継続のための対策の実施状況や、自立分散電源導入によりエネルギー供給途絶による損失の回避効果に対するニーズと、追加的費用に対するユーザーの受容性に関するアンケート調査の回答数を増やすべく調査を継続するとともに、アンケート調査回答結果を集計分析し、建物用途別の停電による業務支障率、業務支障を回避するための自立分散電源導入という追加的費用に対する受容度を明らかにする予定である。本研究は、都市機能が高度に集積する既存地域冷暖房地区を対象に、災害時機能継続の観点から自立分散型電源導入ケースを類型化し、メリット/デメリットの整理を行ったうえで、非常時のエネルギー供給途絶による損失の回避効果を定量化すること、またその効果を得るために必要な追加的費用に対するユーザーの受容性を明らかにすることを目的としている。初年度である平成29年度は、まず既存地域冷暖房地区において自立分散型電源導入ケースを類型化しメリット/デメリットを定性的に整理した。この内容は、空気調和衛生工学会の「次世代型地域エネルギーシステム検討小委員会」と連携して実施し、平成29年9月に高知工科大学で開催された同学会大会にて報告した。次に、札幌、仙台、東京、横浜、新潟、名古屋、大阪、福岡の産業連関表の粗付加価値額および各都市の用途別床面積ストック情報、各都市の地震発生確率を整理し、工月らの先行研究手法をもとに各都市における大規模地震による停電発生に伴う業務停止率、経済的損失額の算出を行った。その結果、今後30年間の損失額の期待値は、経済活動の集積が大きい東京が突出して大きく、また年間の粗付加価値額に対する割合としては名古屋が大きくなることが明らかになった。更に、横浜市みなとみらい21地区を対象に、みなとみらい21地区の産業連関表および地域間表をもとに、産業連関分析により停電による業務停止の地域内、地域外への経済的波及の影響を明らかにした。自立分散電源を導入している地域冷暖房地区へのヒアリングを計画していたが、先方の業務の都合などあり一部延期している状況である。自立分散電源を導入している地域冷暖房地区へのヒアリングを着実に実施するとともに、需要家建物に対するアンケート調査を実施する。アンケート調査に際しては、建物用途別に停電による業務支障率を明らかにするための設問、業務支障を回避するための自立分散電源導入という追加的費用に対する受容度を明らかにするための設問を工夫して実施する。予定していたヒアリング調査が都合により延期となったため、旅費等の支出が予定より少なかった。次年度に改めてヒアリング調査を実施する予定である。

予定したアンケート調査回答数が得られていない状況であることが原因である。次年度に引き続きアンケート調査を実施する予定である(調査補助学生謝金および調査にかかる郵送費など通信費)。
がん微小環境における炎症性サイトカインに着目した肺がん分子標的薬治療抵抗性の克服

これまでに申請者らが樹立した様々な分子標的薬耐性肺がん細胞株(耐性株)を用いて、薬剤耐性化機序および克服方法を引き続き詳細に検討した。遺伝子の変化(二次変異やコピー数の異常)を中心とした既知の薬剤耐性化機序以外にも、これまでに報告のない新たな耐性化機序を同定し、これらを克服するための新たな治療薬の効果を検討した。HER2遺伝子に異常を有する肺がん細胞株に対し、HER2分子標的薬であるアファチニブを用いて樹立した耐性株についての検討では、MET遺伝子増幅等の既知の耐性化機序の他に、HER2遺伝子の増幅および過剰発現の消失、上皮間葉移行(EMT)特性、およびがん幹細胞(CSC)様の特性を有する耐性株が出現した。これらのEMTやCSC特性を獲得した耐性株は、薬剤耐性化前と同様に一部抗がん剤への感受性を示していた。また、EGFR遺伝子変異を有する肺がん細胞株よりEGFR分子標的薬(ゲフィチニブ、オシメルチニブ等)を用いて樹立した耐性株についても、様々な薬剤耐性化機序を同定した。オシメルチニブについては、耐性株で炎症性サイトカインを含むがん微小環境との密接な関係を有する分子であるAXLが過剰発現していることを突き止めた。これらの耐性株については、AXLを含む複数のキナーゼを阻害する薬剤をオシメルチニブと併用することで、薬剤耐性を克服できる可能性を証明した。一方で、近年様々ながん種で効果が期待されている新規薬剤の一部(HSP90阻害剤等)が、薬剤耐性化機序に関わらずEGFR変異肺がんに強い効果を示すことを明らかにした。これらの結果から、治療が困難と考えられてきた分子標的薬耐性化後の肺がんについて、新たな治療法の可能性を示す多くの知見を得たが、他方で、がん微小環境を中心とした薬剤耐性化に関する機序には未だ不明な点も多く、今後の更なる検討が必要と考えられた。非小細胞肺がんに対して、発がんに関わるドライバー遺伝子異常を標的とした様々な分子標的治療薬が開発され既に臨床応用されているが、その効果は未だ不十分である。これらの治療抵抗性の原因としては、がん細胞の遺伝子に生じる二次的な変化を中心とした遺伝子が原因となる機序の他に、上皮間葉移行(EMT)に代表されるような、主にがん微小環境が要因と考えられる遺伝子に変化を来さない機序の存在が徐々に明らかになっている。本研究では、遺伝子に変化を来さない治療抵抗性機序の一つであるがん微小環境における炎症性サイトカインとその下流分子の関与に着目し、肺がん分子標的治療抵抗性の克服に向けた新規治療法を開発すること目的としている。初年度では申請者らが既に樹立した分子標的薬耐性肺がん細胞株を用いて、薬剤耐性化機序を検討した。これまでに報告のあるような特定遺伝子のコピー数増幅といった遺伝子変化が原因と考えられる耐性化機序が認められた一方で、既知の耐性化機序では説明不可能な耐性化機序を示す細胞株を複数同定した。これらの細胞株の一部では、薬剤耐性化後にEMT様変化とともに炎症性サイトカイン関連遺伝子の発現亢進を認めており、特定の分子標的薬投与が発現亢進のトリガーとなっていることを突き止めた。また、がんの微小環境を構成するがん関連線維芽細胞がこれらサイトカインと密接な関係を持つことも同定した。本年度中に予定していた薬剤耐性細胞株のピックアップと耐性化機序の解析を行い、既に耐性化に関わるいくつかの候補分子を特定した。当初予想通り、炎症性サイトカインがこれらの薬剤耐性化に深く関わっていることが判明しており、今後薬剤耐性克服に向けた詳細な検討を続ける予定である。また、これまでに得られた知見の一部は既に学術集会等で発表を行っており、研究は順調に進んでいると考えられる。

これらの結果から、治療が困難と考えられてきた分子標的薬耐性化後の肺がんについて、新たな治療法の可能性を示す多くの知見を得たが、他方で、がん微小環境を中心とした薬剤耐性化に関する機序には未だ不明な点も多く、今後の更なる検討が必要と考えられた。これまでに得られた知見をもとに、薬剤耐性に関わる炎症性サイトカインと下流分子の活性化について詳細に検討を行い、分子標的薬治療抵抗性のメカニズムを解明する。特に、これまでの検討で判明した経路を活性化させる具体的な因子の同定を、がん微小環境に着目しつつ行う。また、実際の臨床検体でも細胞株レベルで判明したのと同様の変化が起きているかを確認する。さらに、これらの薬剤耐性化に関わる分子および下流経路を効果的に阻害する薬剤を同定し、分子標的薬と併用することで、治療抵抗性を克服できる可能性を追求する。
絶滅危惧種シマフクロウ集団の変遷史の解明および保全遺伝学的研究

北海道のシマフクロウ集団では遺伝的多様性の低下や地域集団の分化が生じていることが、これまでの研究で示唆されてきた。現在の北海道シマフクロウの集団構造形成の歴史的な経緯の解明のために、個体数減少以前の古い剥製サンプルを含めて、マイクロサテライトおよびミトコンドリアDNA配列の分析を行った。その結果、集団の有効集団サイズが1980年前後に非常に小さくなったこと、それ以前には地域間の交流が存在していたが、その後生息地の断片化によって地域集団の孤立が生じたことが示された。さらに、過去30年間の400個体以上を対象とした解析により地域ごとの遺伝的多様性の変化や近親交配の程度をより詳細に推定した結果、近親交配が特に多い地域や一部の個体の移動が明らかになった。これらの結果をまとめた論文はZoological lettersに掲載決定となった。今年度はロシア産のサンプルも加えて分析を行い、系統関係や遺伝的多様性の比較を行った。遺伝的多様性の減少は感染症等への抵抗力の低下をもたらす恐れがある。そこで、当初の計画に加えて、免疫反応に関わる主要組織結合遺伝子複合体(MHC)の多様性についても研究を行った。定量PCR法を応用した分析の結果、シマフクロウのMHCの遺伝子座数は、一般的な鳥類や他のフクロウ類に比べて多いことが明らかになった。また染色体マッピングの結果、MHC遺伝子は単一の微小染色体上に位置することが明らかになった。これは、MHC遺伝子群は1つの染色体上の小さな領域内で重複していることを意味する。シマフクロウではMHCクラスIIの遺伝子座数は多いが、対立遺伝子の種類は少ないことが示され、シマフクロウの保全のためには免疫力の低下についても注意が必要であることが示唆された。翌年度、交付申請を辞退するため、記入しない。今年度の研究では、現在の北海道シマフクロウの集団構造形成の歴史的な経緯の解明のために、個体数減少以前の古い剥製サンプルを含めて、マイクロサテライトおよびミトコンドリアDNA配列の分析を行った。サンプルとしては北海道大学に保管されていた培養細胞、環境省の許可を得て標識調査の際に採取された血液、各地の博物館等から提供を受ける羽毛等を用いた。ミトコンドリアDNAについては全塩基配列の解読が完了し、遺伝子群が重複していること、およびシマフクロウのミトコンドリアゲノム(約21kbp)が脊椎動物で報告されている中で最大級であることが明らかになった。ミトコンドリアDNA配列をもちいた解析によって遺伝的多様性の変化や地域集団間の遺伝子流動の評価を行った結果、個体数が特に減少したとされる1980年代以前には地域間の交流が存在していたが、その後生息地の断片化に伴って地域集団の孤立が生じたことが示された。また、過去30年間の400個体以上を対象にマイクロサテライト解析により地域ごとの遺伝的多様性の変化や近親交配の程度をより詳細に推定した結果、近親交配が特に多い地域や一部の個体の移動が明らかになった。これらの結果は環境省のシマフクロウ保護増殖計画でもペアリングや放鳥のための情報として利用されている。これらの成果は2013年度日本動物学会および日本鳥学会において発表した。さらに国際英文誌に投稿し現在査読中である。当初主な目標としていた、北海道のシマフクロウ集団の歴史的変遷の解明について、ある程度達成することができたため。

シマフクロウの配偶システムや分散の様式等の生態的特徴の解明、およびミトコンドリアDNAに大きな反復配列を含む遺伝子群の重複をの分子進化のメカニズムや系統との関係の検証を引き続き行う。遺伝的多様性が低下したシマフクロウでは病原体への抵抗力の低下が懸念される。そこで当初の計画に加えて、免疫系に関わるMHC遺伝子の多様性や分子進化、寄生虫等についての研究を優先して行う。
π共役ポリマーの超高速伝導光スイッチ

π共役ポリマーは主鎖上のπ電子が長距離にわたり非局在化することで高い電気伝導性を有する物質であるが、外部刺激によりポリマー主鎖の電子状態を自在に制御することが可能になれば、さらに魅力的な物質となる。低分子化合物と決定的に異なるπ共役ポリマーの特徴としては、ポリマー主鎖の部分的な電子状態変化が比較的長距離に伝搬し、バルクとしての電気伝導性、磁性、色などの変化をもたらすことである。本研究では光照射により磁性や伝導性が制御可能なπ共役ポリマーの創製を目指して、ポリマー主鎖に不対電子を配したπ共役ラジカルポリマーと、主鎖の光誘起スピン分極を引き起こす光信号入力ユニットとしてラジカル解離型高速発消色フォトクロミック分子を合成開発した。ヘキサアリールビスイミダゾール(HABI)は純国産のラジカル解離型フォトクロミック化合物であり、無色のHABIは溶液、結晶の何れの状態においても紫外光照射により、二つのイミダゾール環を結ぶC-N結合が均等解裂し、発色体である赤紫色のトリフェニルイミダゾリルラジカル(TPIR)を生成するフォトクロミズムを示す。TPIRからHABIへの戻り(ラジカル再結合)反応は熱反応であり、典型的なT型フォトクロミック分子といえる。一方、分子内に二つのイミダゾリルラジカル部位を有するBDPI-2Yは、ラジカル二量化反応を起こすことなく、スピン間の多様な相互作用により特異な電子構造を有する。これまでに、π電子が非局在化した一重項開殻ビラジカル状態の物性化学に関しては十分な研究がなされておらず、新たなパラダイムに差し掛かっているが、そのパラダイムシフトを実現するためには一重項開殻ビラジカル化合物に関する知見を集約し、新たな物性発現に向けた研究を推進する必要がある。このような経緯から、本研究では一重項開殻ビラジカル状態を有するモノマーユニットから構成されるπ共役ラジカルポリマーの創製を試みた。われわれは有機フォトクロミック化合物のヘキサアリールビスイミダゾール(HABI)の研究を進めていく過程で、分子内に二つのイミダゾリル部位を有するBDPI-2Yが特異な電子構造を有することを見いだした。BDPI-2Yは、基底状態付近にエネルギー準位が近接した開殻一重項ビラジカル状態と閉殻一重項キノイド状態が存在し、三重項ビラジカル状態がそれよりも高いエネルギー準位に存在している。一方、これまでに報告されているラジカルポリマーの大多数は高分子側鎖にラジカル部位を導入したものであり、共役主鎖に不対電子を配しかラジカルポリマーの合成例は数少ない。平成19年度には、開殻電子構造の特徴であるビラジカル性を有するBDPI-2Yに着目し、BDPI-2Yをモノマーユニットとするπ共役ビラジカルポリマー(poly-BDPI-2Y)の合成と、その機能開拓に向けた研究を推進した。BDPI-2Yでは600 nm付近に吸収帯が見られるが、poly-BDPI-2Yは700 nm付近に幅広い吸収極大を有し、その吸収端は1200 nmにまで及ぶ濃青色粉末として得られ、強いESRシグナルを示すラジカルポリマーであることが確認された。poly-BDPI-2Yは有機溶媒に可溶であり、ベンゼン溶液からスピンコートすることにより、ガラス基板上に良質なポリマー薄膜を形成することができた。次年度以降は、これらの粉末および薄膜の磁気特性、半導体特性、非線形光学特性などについて検討を行う。これまでに、π電子が非局在化した一重項開殻ビラジカル状態の物性

化学に関しては十分な研究がなされておらず、新たなパラダイムに差し掛かっているが、そのパラダイムシフトを実現するためには一重項開殻ビラジカル化合物に関する知見を集約し、新たな物性発現に向けた研究を推進する必要がある。このような経緯から、本研究では一重項開殻ビラジカル状態を有するモノマーユニットから構成されるπ共役ラジカルポリマーの創製を試みた。
フグ毒のＭＲＩ三次元イメージング動態解析とフグ毒化関連分子の解明

フグの毒化機構解明のため、高磁場MRI三次元イメージング法によるテトロドトキシン(TTX)検出法を開発し、フグ肝臓におけるTTXの分布を調べた。無毒の養殖トラフグに筋肉投与されたTTXは6時間後に肝臓で検出され、肝門脈に高濃度に存在した。60時間後、TTXは放射状に広がっていることが観察された。TTXを投与されたトラフグの肝臓では、TTX非投与に比べ、代謝関連酵素、シグナル伝達系、免疫タンパク質をコードする推定転写産物が多く、高レベルで発現していた。トラフグ肝組織切片に蓄積したTTXの一部は高分子成分と結合し、in vitroでTTXを添加してもTTXは高分子成分と結合することが確認された。フグの毒化機構を、フグ毒テトロドトキシン(TTX)の体内動態と毒化に関与する機能性分子から解明するため、以下の項目を実施した。1)高磁場MRIU三次元イメージング法によるTTXの体内動態解析:平成24年度は、高磁場MRI三次元イメージング法によるTTX可視化検出法の開発に取り組んだ。無毒の養殖トラフグにTTX溶液を筋肉内に強制投与して、投与6時間後に水槽から取り上げたものと、TTX溶液の代わりに生理食塩水を投与した対照区を用意して、TTXが高濃度に蓄積する肝臓を中心に、高磁場MRI三次元イメージングを行い、TTXの最適測定条件を決定した。また、画像解析法を検討した結果、通常の合成スムージング法よりも特徴検出処理法がトラフグ肝臓におけるTTXを高感度に検出できることを明らかにした。2)フグ毒化関連分子の特定と機能解析:玄界灘で漁獲した天然トラフグを、肝臓の毒性を指標に"無毒"および"有毒"個体に分け、肝臓の遺伝子発現レベルをマイクロアレイで調べた。有毒肝臓では、248遺伝子の発現レベルが無毒肝臓に比べて有意に増大し、430遺伝子の発現レベルは有意に減少していた。パスウェイ解析の結果、有毒肝臓では脂質やエネルギー代謝に関わる遺伝子群が有意に発現増大していることがわかった。TTX結合タンパク質解析を行うため、TTXをリガンドとするTTXアフィニティー磁性ビーズの作製のためのカップリング条件を検討した。フグの毒化機構を、フグ毒テトロドトキシン(TTX)の体内動態と毒化に関与する機能性分子の観点から解明するため、以下の項目を実施した。1)MRI三次元イメージング法によるTTXの体内動態解析:TTX動態を解析するため、高磁場MRI三次元イメージング法を開発し、トラフグに投与されたTTXの各組織への移動を三次元イメージングでとらえ、TTXが蓄積する組織を明らかにする。平成2425年度において、無毒の養殖トラフグにTTX溶液を筋肉内に強制投与して、投与6時間後に水槽から取り上げたもの、同じく無毒の養殖トラフグにTTX溶液を筋肉内投与して4日間水槽で飼育したもの、TTX溶液の代わりに生理食塩水を筋肉内投与した対照区を用意して、それぞれ高磁場MRI三次元イメージングを行った。2)フグ毒化関連分子の特定と機能解析:TTXの体内動態解析で顕著な変化がみられた組織を中心に、フグの毒化に関与する遺伝子とタンパク質を調べた。平成25年度は、養殖トラフグにTTXを投与し、TTX蓄積に伴い肝臓で発現する遺伝子をマイクロアレイ法で解析している。フグの毒化に関与するタンパク質については、ヒガンフグ卵巣とトラフグ肝臓からそれぞれフグ毒結合タンパク質を見出し、ヒガンフグ卵巣からフグ毒結合タンパク質を精製した。フグの毒化機構を、フグ毒テトロドトキシン(TTX)の体内動態と、毒化に関与する機能性分子の観点から解明するため、以下の項目を実施した。1)MRIイメージング法によるTTXの体内動態解析:無毒の養殖トラフグに生理食塩水に溶解したTTXを0および1日目にそれぞれ2回ずつ筋肉投与した(総投与TTX量1.6mg)。最終投与後、60時間水槽で飼育後に水槽から取り出し、氷冷後、高磁場MRI測定に供した。対照魚には生理食塩水だけを投与したものを用い、TTXの特異的なプロトンスペクトラムにより選択的励起強調画像法で連続測定し、画像処理にて三次元表示した。その結果、TTX投与したトラフグでは、TTXは肝門脈から放射状に点在して分布することが初めて明らかになった。2)フグ毒化関連分子の特定と機能解析:トラフグ肝臓に見いだされたTTX結合性物質を明らかにするため、組織培養法でTTXを蓄積させ、そのホモジネートをゲルろ過カラムに供すると高分子画分にTTXが検出された。