hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
ヘリコバクター・ピロリ関連疾患発症における宿主側因子としての胃粘液の解析

同様な結果はELISA法によっても得られ、現在その解釈を試みている。本年度は年度始めに計画した5つの検討課題の内、特にムチン糖鎖について集中的に検討を行った。1.Hpと結合するヒト胃粘膜ムチン糖鎖を同定するために、先ず、糖鎖の切り出し方法の検討を行った。ムチンの糖鎖の切り出しは、通常、還元剤存在化でのアルカリ分解により行うが、その方法では、得られた糖鎖をプレートに固定することが出来ず、したがってHpとの結合も見ることができない。そこで、糖鎖の分解が比較的少ない、ブレートに結合可能な糖鎖の切り出し法として、アミノメタンおよび気相でのヒドラジン分解法を選び、切り出し条件の検討を行った。その結果、分解がかなり押さえられた条件での糖鎖の切り出し法を確立した。2.次に、得られた糖鎖をプレートに固着させ、さらに糖鎖の分離・精製も可能な方法として、糖鎖を脂質と結合させてネオ糖脂質を合成し、それを薄層クロマトグラフィーで分離・精製する方法の条件を確立した。薄層上のムチン糖鎖解析実験のモデルとして、我々が開発したムチン糖鎖に対する単クローン抗体を用い、抗体と反応する特定の糖鎖を同定できることを確認した。すなわち、糖鎖の構造を同定する方法として、ネオ糖脂質を抽出後、MALDI-TOF-MSで分析することを試み、9糖程度までの糖鎖の分子量の同定に成功した。得られた値は、既に構造を決定した、特定の単クローン抗体が認識する糖鎖の分子量と完全に一致し、検討した一連の方法の妥当性を確認した。3.今年度に確立した方法を用いれば、Hpと結合するヒト胃粘膜ムチン糖鎖を同定することが可能になると考えられ、本研究の目的遂行に大きく前進する結果と考える。本年度は当初計画(b)の項目において、胃粘膜表層由来ムチンと深部由来ムチンの分離に必須の道具となる抗表層ムチンモノクローナル抗体の作成とその性質の解析について集中的に検討を行った。1.Hpは胃粘膜表層細胞に接着して存在するとともに、胃表層粘液ゲル層中にも存在する。しかし、深部粘液ゲル層には存在せず、その理由を探ることがHp感染に対する粘液の役割を知る上で大きな情報をもたらすと考えられた。そこで、ヒト胃表層由来ムチンと特異的に反応するモノクローナル抗体を、我々が作成した抗ラットムチンモノクローナル抗体のライブラリーから検索した。その結果、RGM23と名付けたモノクローナル抗体がヒト胃表層由来ムチンと反応することを見いだした。2.次に、RGM23の性質について、ラットおよびヒトの胃粘膜組織とそこから抽出・精製して得られた胃ムチンを材料として、組織化学的ならびに生化学的に解析した。その結果、RGM23はムチンのタンパク部分を認識すること、表層由来ムチンと特異的に反応する、すなわち深部由来ムチンとは反応しないこと、ラット消化管の免疫組織染色において、胃粘膜のみを染色すること、などの結果が得られた。これらの結果は、RGM23がMUC5ACムチンを認識することを示した。さらにこの抗体は、既に開発されている抗MUC5AC抗体である45M1と異なり、ムチンサブユニットをも認識することが明らかとなった。3.RGM23をムチン検出の道具として用いれば、ヒト胃粘膜ムチンを表層由来ムチンと深部由来ムチンに分けることが可能と考えられ、なぜ表層粘液ゲル層のみHpが存在するのか、その理由の解明に一歩近づいたと言える。本年度は,ヒト胃ムチンを用いた解析を行う予定であったが,検体の入手が計画通りに行かなかったため,予定を変更して,ムチン糖鎖についての解析を,ラット胃ムチンをモデルとして行った。
小胞体Ca2+ポンプの触媒部位から輸送部位への構造変化の伝達機構

Caポンプは細胞質ドメインの触媒部位でATPを加水分解し、膜ドメインの輸送部位にてCaを輸送する。本研究では、これらのドメインをつなぐM2ヘリックスの構造的役割について部位特異的変異を用いて調べた。結果は、M2の細胞質部分M2m、膜部分M2c、M2c-細胞質ドメイン間のループの各々が、特異的反応段階にて機能を持ち、細胞質ドメイン-膜ドメイン間の構造変化の伝達を可能にすることを示した。またM2m-M2c連結部分のGly105は、リン酸化中間体から内腔へのCa放出段階にて、細胞質ドメインの大きな動きに伴うM2の歪みを吸収することによって正常なCa-gatingを起こさせることを示した。小胞体CaポンプはATP加水分解に共役してCa2+を輸送し、その反応はリン酸化中間体(EP)の形成と分解を経由する。その反応機構は触媒部位を持つ細胞質ドメインA、P、NとCa2+輸送部位をもつ膜ドメインの間で構造変化の相互伝達であり、EP異性化ではCa2+が内腔へ放出される。ヘリックスM2は膜貫通部分(M2m)と細胞質部分(M2cyt)に概ね区別され、M2cytの先端はjunctionループを介してAドメインに繋がっている。M2はCa輸送反応中大きく構造変化するがその意義は不明であった。そこでこれらの領域に、5個のGlyを挿入(5Gi;伸長とヘリックスの局所的破壊)してその影響を調べた。これより、特にCa2+輸送活性はM2mおよびjunctionへの5Giによりほぼ完全に阻害され、脱共役した。これより、反応段階に応じてM2の各領域およびjunctionの2次構造や長さが変化することが、細胞質領域と膜ドメイン間の構造変化を介した相互応答によるエネルギー共役に必須であり、EPの異性化、加水分解、Ca2+-gatingに重要であることを示した(Daiho et al.JBC 2015)。次にCa-ATPase活性を保持した状態でCaポンプをnanodiscに組み込みこむ系を確立した。そこで、nanodisc中の脂質をPOPCから電荷の少ないPOPGや電荷の変わらないPOPEに変えたところ、EP異性化の速度が大きく低下した。さらに、イオン強度を変化させることにより、POPGでの活性の低下は脂質ヘッドグループの電荷変化によること、またPOPEでの活性低下は脂質とCaポンプ間の非静電的相互作用によることが明らかとなった。従って、EP異性化では塩基性ヘッドグループの正電荷が促進的に働くこと、またPEはCaポンプに作用して活性に影響を与えることを明らかにした。Caポンプの輸送反応はリン酸化中間体(EP)の形成、異性化、加水分解を経る。EP異性化では、Caを輸送部位に閉塞したEPの細胞質領域のAドメインが大きく回転してリン酸化Pドメインに結合する。筆者は、この構造変化がAドメインに繋がるヘリックスM1、M2を通じて膜ドメインに伝達され、Caは内腔に放出されると考えている。M2はCa輸送に伴って大きく構造変化すると結晶構造から推測されるがその意義は不明であった。M2の各部分を破壊/伸長する変異体の解析により、M2は機能の異なる細胞質領域(M2c)と膜貫通領域(M2m)に概ね区別され、Ca輸送の特異的反応段階で働くことを示した(JBC 2014)。今回M2c-M2m連結領域の役割を変異導入で調べた。この領域のG105のAla置換はCa輸送/ATP加水分解を脱共役させ、EP異性化を阻害した。従ってG105はM2cとM2mの蝶番として働き、Ca輸送で各々のダイナミックな構造変化を可能にすると考えられる。また、M2cとM2mの方向性をもつ構造変化がEP異性化とCa-gatingに重要であることが示唆された(投稿準備中)。以前、M2上のY122を含む5残基がE2Pにて疎水クラスタ(Y122-HC)を形成し、これがE2P加水分解、およびCa遊離したE2Pの構造を安定化することを報告した。今回、EP転換の中間的EPであるCaE2PからのCa遊離過程を調べた。Y122-HC変異体では、低濃度Ca存在下でCa遊離がEP異性化に遅れるが、Ca無しでは遅れないことから、非閉塞のCa結合E2Pが検出された。これよりY122-HCがCa親和性低下に働くこと、Y122-HCの集合がEP異性化とCa放出の共役に段階的に対応することが示唆された(JBC 2015)。これによっても、M2が細胞質ドメインとCa遊離の共役に重要な役割を果たすことが示唆された。本研究の目的は、Caポンプにおいて、リン酸化/脱リン酸化を経由してATP加水分解が起こる細胞質ドメインとCa輸送部位をもつ膜ドメインの間でいかに構造変化が伝達されて共役が起こるかを解明することである。筆者は、まずM2とAドメインを繋ぐjunctionループおよびM2に着目し、細胞質領域(M2c)と膜貫通領域(M2m)、およびそれらの連結領域が如何にはたらいて構造変化が伝達されるかを部位特異的変異導入により調べた。これをもとに、平成2627年度の計画に従って、その構造変化に障害を与える変異をM2上に見出し、速度論的解析に対応して構造的解析を行った。

これらは1特異的プロテアーゼ切断への耐性による構造変化観察、2特異的位置に蛍光色素導入して構造変化を蛍光観察、3適当な2か所にCys導入して酸化的架橋による2点間位置変化の測定(遂行中)である。1、2について得られた主な成果は、M2cとM2mが各々の機能を果たすためにその接続部位のG105が重要な役割を持つという新発見であり、投稿準備中である。また、2について、低ノイズ蛍光観察に適するように蛍光ラベルしたCaポンプをnanodiscに入れてゲル濾過精製する系を利用している。3については1、2に基づいて遂行中である。次に平成2728年度に計画した4「新しい構造因子を探索する」では、AドメインとM3をつなぐループA/M3-link、およびM3に部位特異的変異導入し、解析を始めている。その予備的実験の結果は、A/M3-linkが適切な長さであること、またM3が正常なヘリックス構造であることがCa輸送の共役、従って膜ドメインのCa-gateを正しく開閉させることに重要であることを示している。以上から、進捗状況はおおむね順調であるといえる。CaポンプはATP加水分解に共役してCaを輸送する。Ca輸送サイクルはリン酸化中間体(EP)の形成、異性化、加水分解を経由する。この異性化(E1PCa2→E2PCa2→E2P)では、触媒部位をもつ細胞質領域(A, P, Nの3ドメインが構成する)のAが大きく回転してP(リン酸化ドメイン)と結合する。そしてこの構造変化は膜ドメインのCa輸送部位に伝わり、E2PCa2の輸送部位に閉塞されたCaが内腔に放出される。膜ドメインからAに繋がる長いヘリックスM2は、概ね膜内領域M2mと細胞質領域M2cに区別される。本研究では、これらの連結部分にあるGly105の構造的役割を部位特異的変異で調べた。GlyをAlaに置換して柔軟性を下げると、ATP分解に共役したCa輸送が消失した。このときE1PCa2とE2PCa2へのCa閉塞が障害された。また、G105AはEP異性化を強く抑え、逆にE2→E1を促進した。しかし、E2P加水分解速度には影響しなかった。次に、GlyがM2上で正常な機能を果たす位置を調べるため、G105A/(他の残基→Gly)のダブル置換体を多数作成した。これらのうちG105A/A112Gのみにて、Ca輸送/ATP分解の共役、E1PCa2とE2PCa2へのCa閉塞、EP異性化とE2→E1の速度を野生型と同じレベルまで回復した。M2上で、A112はG105から2巻上にあり、G105とほぼ同じM4方向に向いている。従って、細胞質領域と膜ドメイン間の構造変化の伝達では、M2が特異的反応段階で特定方向へ屈曲・伸長し、また別の段階でその歪みが解消することが必要であると考えられる。G105は連結部分に柔軟性を与え、EP異性化/Ca放出では、Aの大きな動きに伴うM2への歪みがG105屈曲・伸長で吸収されることが正常なCa-gatingとCa輸送/ATP分解の共役に重要であると考えられる。Caポンプは細胞質ドメインの触媒部位でATPを加水分解し、膜ドメインの輸送部位にてCaを輸送する。本研究では、これらのドメインをつなぐM2ヘリックスの構造的役割について部位特異的変異を用いて調べた。結果は、M2の細胞質部分M2m、膜部分M2c、M2c-細胞質ドメイン間のループの各々が、特異的反応段階にて機能を持ち、細胞質ドメイン-膜ドメイン間の構造変化の伝達を可能にすることを示した。
公開株式会社における内部統制システムの法的考察

本研究の成果物として刊行した「内部統制の法的研究」(日本評論社2005年)では、2002年企業改革法(SOX法)に至るまでの米国における内部統制概念の歴史的展開において、コーポレート・ガバナンスと証券市場規制における「公正な情報開示」の要請とを接続する機能を果たす概念という視点から、公開株式会社の内部統制システムを法的に考察し、現在、我が国が直面している内部統制システム構築の課題に向けた示唆を提示した。申請時の課題として掲げた第一の目的は、SOX法の新しい内部統制概念である「開示統制・手続」につき、従来の概念との異同を明らかにすることであった。この点、従来の概念を踏襲するSOX法404条の「財務報告に係る内部統制」を支える新たな「開示統制・手続」は、SOX法302条のSEC規則に基づき、財務情報のみならず非財務も含む企業情報の収集・分析・判断・開示を迅速に行う手続として、GAAP基準に依拠しない内部統制であることを本書の第三篇において示した。第二の目的である監査委員会と内部監査部門との関係の検討については、外部監査人・内部監査人の独立性確保、および内部監査人から監査委員会に対する情報提供ルートの確立が、監査委員会のレビューの有効性を確保するうえで不可欠な要素であり、内部監査部門の機能の充実は、内部監査人協会(IIA)の内部監査の実施基準の変化からも読み取れることを本書の第二編・第三章において指摘した。第三の目的は、内部監査人と外部監査人との連携関係、および内部統制を巡る取締役会と監査委員会の役割分担等の関係を明らかにすることであったが、監査人が内部統制の欠陥を発見した場合の報告義務を定めた34年法10A条を超えて、SOX法・NYSE規則等は、経営者、内部監査人、従業員、弁護士が内部統制の不備等を発見した場合、監査委員会に対して報告する義務を課し、その多様な情報により監査委員会は内部統制のプロセス監査を行い、それに基づき取締役会が最終的な監督権限を行うメカニズムを第三篇において示した。1研究計画で示した第一の課題である「1934年連邦証券取引法13条(b)(2)に関するSECの審決の検討から、SECによる法執行の変遷とその意義についての分析」を行った結果、1977年の同条制定当初は、不正な財務報告が契機となって、企業内の内部会計統制の未整備を追及していく方向性があったが、その後、80年代後半には、帳簿上の虚偽記載と内部統制の不備をわけて検討する例もみられるようになり、さらに90年代前半以降には、内部統制の有効性に関する経営者評価の要求や、監査委員会の同意なしに内部監査人を解任できないとすること、監査委員会に少なくとも1名の財務専門家を要求すること、経営者による内部統制の有効性評価を監査人がレビューすることなど、実は2002年米国企業改革法を先取りした内容を付随的救済に盛り込む法執行や、会計プロフェッションが主導して公表したCOSO報告書の内部統制概念の「統制環境」の整備を先取りした法運用の集積があったとみることができる。2第二の課題である、2002年企業改革法に登場した「開示統制・手続」と従来の「内部統制概念」の関係について検討した結果、これまでSECは、34年法13条

(b)(2)を根拠に「財務報告のための内部会計統制」を義務付け、それを支えるガバナンスを法執行の運用により求めてきたが、企業改革法は、さらに404条により経営者に「財務報告に係る内部統制」の有効性を評価させ、その開示の客観性を担保する監査人による証明を要求し、それを背後から支えるため、より広範でかつ迅速な情報収集・分析・開示を可能とする302条の「開示統制・手続」を法制化したといえる。即ちGAAPに従った財務諸表を作成すれば足りると考えられがちな「内部統制概念」とは切り離し、適時開示に供される重要情報のうち、非財務情報も網羅するべく「開示統制・手続」の構築義務が課せられたといえる。第一に、平成16年度の研究計画に基づき、内部統制整備の法的メカニズムを解明する一環として、SEC法執制度の展開について検討した。即ち、米国におけるSEC登録会社が、連邦証券取引所法一三条(b)(2)の内部統制規定に違反した場合、SECが行う法執行の集積により企業の内部統制構築実務が進展したことから、今回は、まず証券市場不正に対するSECの法執行制度を俯瞰し、これにより証券市場規制における内部統制規定違反の法効果の側面から、内部統制構築を促進する法的メカニズムを明かにした。具体的には、2002年米国企業改革法におけるSECの法執行権限の変化、および迅速かつ多様な法執行制度の目的と手段の組み合わせについて、公正な証券市場機能の確保に向けた変更について考察した。この研究成果は、証券経済研究48号において「証券市場不正に対するSECの法執行権限の展開」として公刊した。第二に、これまでの内部統制研究の総括として、2002年企業改革法に至るまでの内部統制概念の歴史的展開を、コーポレート・ガバナンスと証券市場規制における「公正な情報開示」とを接続する機能を果たす概念という視点から考察した。この研究成果は、日本評論社より「内部統制の法的研究」として単著として出版した。本書は、第一編では、法と会計・監査の領域において、それぞれ相互に拮抗しながら内部統制概念が明確化される過程を、1970年代から90年代までの監査基準書等の展開とSEC法執行事例の分析を中心に検証し、第二編では、1990年代半ば以降、外部監査人、監査委員会、内部監査人の機能の充実により、内部統制システムが法的に充実・強化される過程を検討し、第三編は、2002年企業改革法に基づき規定された内部統制規定の新たな展開を中心に検討し、最後に第四編では、全体のまとめとして米国企業の内部統制の法的展開と深化は、今後整備が求められる日本企業の内部統制にどのような示唆を与えるのかを展望した。平成17年5月に日本評論社から出版した「内部統制の法的研究」では、2002年企業改革法に結実するまでの米国における内部統制の歴史的展開を、コーポレート・ガバナンスと証券市場規制の「公正な情報開示」の要請とを接続する概念という視点から考察し、最後に、わが国の内部統制構築に向けた法的指針作りに関する提言を行った。全体の構成としては、第一に、米国の内部統制概念は、法と会計・監査の領域において、相互に影響しあいながら明確化されたが、その過程を1970年代から90年代までの監査基準書等の展開を踏まえつつ、海外不正支払防止法による初の内部統制規定を根拠とするSECの法執行事例の分析を通して考察した。第二に1990年代後半以降、外部監査人、監査委員会、内部監査人の機能が、連邦証券取引所法および自主規制機関規則の改正によって強化され、これにより内部統制システムが法的に明確化される過程を示した。第三に、2002年米国企業改革法404条「財務報告に係る内部統制」および302条「開示統制・手続」の導入による、新たな内部統制システムの規制を証券市場規制の視点から考察した。
無毒な多光子励起用バイオマーカーの創製：セラノティクスへの展開

本研究構想が目指しているのは、半導体量子ドットに発現するフォトサーマル効果の医療応用である。具体的には、生体に対して毒性のない半導体としてシリコン、ゲルマニウム等を選択し、これらの量子ドットに対して光を照射することで発生する熱量のサイズ依存性を明らかにする。さらに適切な表面処理技術を施すことで水溶性・油溶性が制御されたコロイダル量子ドットの熱フォノニクス現象を明らかにする。
視機能訓練装置の開発と斜視・弱視訓練への応用

立体映像技術を用いた視機能訓練法・装置を開発し,小児の弱視,斜視患者の視機能訓練効果検討した。本訓練法は立体(3D)ディスプレイを用いることで患者に両眼分離映像を提示し,両眼視下で患眼のみに映像を提示することで患眼における抑制を除去し,小児の弱視,斜視患者の視機能を回復に導くことを目的とする。本研究では訓練に同意の得られた小児の弱視患者2例,間欠性外斜視患者13例に実施された。弱視患者2名において訓練効果を認められ,訓練後に視力1.0以上の良好な視力を獲得した。間欠性外斜視患者13名のうち10名において訓練効果を認め,眼位の保持が改善した。本視機能訓練法は効果的な小児の弱視・斜視訓練法としての有用性が示唆された。本研究は効果的な視機能訓練法・装置を開発し,視能訓練の問題点の解消及び小児の斜視,弱視患者の時間的・精神的負担を軽減することを目的としている。平成22年度は視機能訓練法・装置の開発とともに訓練効果を評価する視機能検査装置を開発した。視機能検査には両眼視機能検査,眼位・眼球運動検査,また視能訓練には弱視訓練,斜視訓練(抑制除去,融像訓練,立体視訓練)を実装した。各視能訓練法は既存の訓練法を参考にして,刺激の質(静止画,動画など)刺激映像の質(サイズ,色,形など),効果的な検査時間などを調整し,最も効果的な訓練法について検証できるシステムとした。これらの検査・訓練を行う装置は立体映像提示ディスプレイ,映像提示部,記録解析部,及び両眼分離(左右眼に別々の映像提示)装置で構成することができる。開発した視機能検査の両眼視機能検査(同時視,融像,立体視),眼位・眼球運動検査について,健常青年(平均年齢22歳)及び小児(412歳)を対象に検討した。その結果、本装置で得られた検査値と既存装置の検査値の相関性を求め、本装置の有効性を検証した。その結果、全ての検査項目において既存検査装置による検査値と高い相関を認め、本検査装置の有効性が示された。また本装置は多機能化,操作性の向上及び検査結果の自動記録・出力により検査時間を従来比で50%以下を達成した。平成23年度は22年度に開発した視機能訓練装置の安全性・安定性の検証行い,小児斜視弱視患者を対象とした臨床応用を行う計画である。本研究は効果的な視機能訓練法・装置を開発し,視能訓練の問題点の解消及び小児の斜視,弱視患者の時間的・精神的負担を軽減することを目的に実施した。平成22年度は視機能訓練法・装置の開発とともに訓練効果を評価する視機能検査装置を開発し,既存の検査装置の検査結果と高い相関を認め,本検査装置の有効性が示された。平成23年度は平成22年度に開発した視機能訓練装置に実装している弱視訓練法,斜視訓練(抑制除去,融像訓練,立体視訓練)法の効果を小児の弱視患者・斜視患者を対象に検討した。本検討は北里大学医療衛生学部倫理委員会,北里大学病院倫理委員会の承認を得た後,十分なインフォームドコンセントを行い同意の得られた弱視患者及び間欠性外斜視患者に対して実施された。結果として,本訓練弱視患者の弱視眼視力向上,間欠性外斜視患者における抑制除去及び融像訓練効果が認められた。訓練効果の得られた代表例として弱視患者1例、間欠性外斜視患者1例を示す。症例1:4歳男児。健眼視力1.2,弱視眼視力0.1,両眼視機能も不良であった。本訓練施行後,視力は両眼1.2に改善し,良好な両眼視機能を獲得した。症例2:7歳女児。視力は両眼1.2,眼位は遠見18Δ,近見25Δ外斜位斜視。抑制があり,融像が不安定であった。本訓練施行後,完全に抑制が除去され融像が安定し融像幅も増加した。従来の視能訓練法は訓練法に対する集中力及び興味の欠如から期待される訓練効果が得られない例を度々経験する。本訓練装置は立体映像ディスプレイにキャラクターを用いた検査・訓練映像を提示する構成であり,患児の注意引きやすく,訓練に対する集中を持続できる。今後,臨床応用を継続して行うことで,新たな弱視及び斜視訓練法としての応用が期待される。
高インテグリティを実現するin vitro卵子産生系の開発

1)in vitroで産生された卵子の脆弱性の原因解明:2018年度は、single cell RNA-seqの実験系を確立した。前段研究として、in vitro由来卵子から作出された2細胞期胚(n=5)とin vivo由来卵子から作出された2細胞期胚(n=10)のそれぞれのトランスクリプトームを比較した。その結果、513遺伝子に有意な発現変動が認められ、胚性ゲノムの活性化に関与する遺伝子などが含まれた。また、階層的クラスタリング解析では、in vitro区とin vivo区の胚が明確に異なるクラスターを形成することがわかった。2)in vitroで産生された卵子の発生支持能の非破壊的予見:2018年度は、マウス2細胞期胚をMeta-Spectral-imaging法に供試し、観察後に回収することが可能なデバイスを作製した。このデバイスを用いて2細胞期胚を観察し、観察を行わなかった2細胞期胚と同等に、胚盤胞およびマウス個体へ発生するレーザー強度の条件も決定した。なお、このレーザー強度の条件で、in vivoかin vitroかの由来によらず胚の発生能を損なわないこと、さらに5枚のZ-スタック観察を行っても胚の発生能を損なわないことを確認した。3)in vitro卵子産生系を用いた卵子(卵胞)形成機構の理解:2018年度は、卵胞形成時、生体内においてエストロジェンシグナルを制御しうる候補因子を同定した。FBS添加培地でマウス胎仔卵巣をに培養すると、エストロジェンシグナルが活性化され卵胞形成が異常になるが、マウス胎仔で発現している候補因子の精製物をFBS添加培地に加えると、二次卵胞が形成されることを突止めた。さらに、エストロジェンで活性化されるマーカー遺伝子の発現も大幅に下方修正されることがわかった。single cell RNA-seqの前段解析において、各胚の全トランスクリプトームの相関を比較するとin vivoおよびin vitro由来卵子から作出された2細胞期胚は、両者間で顕著な差異として示された。また、高いインテグリティーを有するin vivo由来卵子間においてもトランスクリプトームの差は認められたが、この差はインテグリティーに影響しないと考えられるため、これらを考慮してフィルタリング設定を行った。その結果、胚性ゲノムの活性化に影響する遺伝子などが実際に抽出され、インテグリティーに影響する遺伝子群の絞り込みが可能であると判断された。また、実際の研究では、2細胞期胚の片割球を発生能解析に片割球をsingle cell RNA-seq解析に供試するが、in vivoおよびin vitro由来2細胞期胚のいずれにおいても、同一胚に由来する各割球の発生能はほぼ等しいことが確認できた。前段研究で、概ね、方法論を確立できたと考えている。卵子の発生支持能の非破壊的予見については、研究費の前倒し申請により研究器材を購入し、申請者の所属機関でもMeta-Spectral-imaging解析が可能となった。これにより正しい予見につながることが期待できる。卵胞形成時のエストロジェンシグナル制御に寄与する内因性の候補因子については、当該因子をコードする遺伝子のヘテロ欠損マウスの繁殖を行っており、ホモ型欠損マウスの作製に向けて個体数を順当に増やしている。生体内における候補因子の機能解析は、準備が整いつつある。1)in vitroで産生された卵子の脆弱性の原因解明:生体由来の卵および二次卵胞の成長・成熟培養で産生された卵それぞれをIVFし2細胞期胚を作出する。前年度までに、in vitroおよび生体由来の2細胞期胚では、それぞれ、発生(卵割)スピードが異なることが示唆された。そこでタイムラプスシステムを導入し、卵割時間を特定した上で、RNA-seq解析へ供試する。それぞれ25個の2細胞期胚を供試し、片割球をシングルセルRNA-seq解析に片割球を発生能解析に供試する。各割球の発生能とそれぞれの遺伝子発現プロファイルを比較し、mRNAの差を比較することでin vitroで産生された卵子の脆弱性の原因と推定される遺伝子や異常な経路、発生能を持つ胚の特徴について抽出する。さらに、生体由来のGV期卵子および二次卵胞の成長で産生されたGV期卵子のRNA-seq解析を実施し母性因子の差についても抽出する。2)in vitroで産生された卵子の発生支持能の非破壊的予見:生体由来のM II期卵子および二次卵胞の成長・成熟培養で産生されたM II期卵子それぞれをIVFし2細胞期胚を作出する。Meta-Spectral-imaging法にM II期卵子および2細胞期胚を供試し、得られた自家蛍光パターンと受精能および発生能を機械学習し、発生支持能を非破壊的に予見するための情報を集積していく。3)in vitro卵子産生系を用いた卵子(卵胞)形成機構の理解:卵胞形成時のエストロジェンシグナル制御に寄与する内因性の候補因子を欠損したマウスを作製し、卵子形成および卵胞形成を継時的に解析していく。

その結果、513遺伝子に有意な発現変動が認められ、胚性ゲノムの活性化に関与する遺伝子などが含まれた。また、階層的クラスタリング解析では、in vitro区とin vivo区の胚が明確に異なるクラスターを形成することがわかった。2)in vitroで産生された卵子の発生支持能の非破壊的予見:2018年度は、マウス2細胞期胚をMeta-Spectral-imaging法に供試し、観察後に回収することが可能なデバイスを作製した。このデバイスを用いて2細胞期胚を観察し、観察を行わなかった2細胞期胚と同等に、胚盤胞およびマウス個体へ発生するレーザー強度の条件も決定した。なお、このレーザー強度の条件で、in vivoかin vitroかの由来によらず胚の発生能を損なわないこと、さらに5枚のZ-スタック観察を行っても胚の発生能を損なわないことを確認した。3)in vitro卵子産生系を用いた卵子(卵胞)形成機構の理解:2018年度は、卵胞形成時、生体内においてエストロジェンシグナルを制御しうる候補因子を同定した。FBS添加培地でマウス胎仔卵巣をに培養すると、エストロジェンシグナルが活性化され卵胞形成が異常になるが、マウス胎仔で発現している候補因子の精製物をFBS添加培地に加えると、二次卵胞が形成されることを突止めた。さらに、エストロジェンで活性化されるマーカー遺伝子の発現も大幅に下方修正されることがわかった。single cell RNA-seqの前段解析において、各胚の全トランスクリプトームの相関を比較するとin vivoおよびin vitro由来卵子から作出された2細胞期胚は、両者間で顕著な差異として示された。また、高いインテグリティーを有するin vivo由来卵子間においてもトランスクリプトームの差は認められたが、この差はインテグリティーに影響しないと考えられるため、これらを考慮してフィルタリング設定を行った。その結果、胚性ゲノムの活性化に影響する遺伝子などが実際に抽出され、インテグリティーに影響する遺伝子群の絞り込みが可能であると判断された。また、実際の研究では、2細胞期胚の片割球を発生能解析に片割球をsingle cell RNA-seq解析に供試するが、in vivoおよびin vitro由来2細胞期胚のいずれにおいても、同一胚に由来する各割球の発生能はほぼ等しいことが確認できた。前段研究で、概ね、方法論を確立できたと考えている。卵子の発生支持能の非破壊的予見については、研究費の前倒し申請により研究器材を購入し、申請者の所属機関でもMeta-Spectral-imaging解析が可能となった。これにより正しい予見につながることが期待できる。卵胞形成時のエストロジェンシグナル制御に寄与する内因性の候補因子については、当該因子をコードする遺伝子のヘテロ欠損マウスの繁殖を行っており、ホモ型欠損マウスの作製に向けて個体数を順当に増やしている。生体内における候補因子の機能解析は、準備が整いつつある。1)in vitroで産生された卵子の脆弱性の原因解明:生体由来の卵および二次卵胞の成長・成熟培養で産生された卵それぞれをIVFし2細胞期胚を作出する。前年度までに、in vitroおよび生体由来の2細胞期胚では、それぞれ、発生(卵割)スピードが異なることが示唆された。
転写開始反応と転写調節因子CRPの作用機構

大腸菌の転写因子であるCRPはその結合部位の転写開始点からの相対位置によって、転写活性化の分子機構が異なることが示唆されてきた。私は転写開始複合体の形成に着目して、その構造機能とCRPの作用機構について解析を行い、以下の結果を得た。1.CRP結合部位の位置の異なる典型的なCRP依存プロモーターであるmalT,galの系において、転写開始複合体からCRPをヘパリを用いて選択的に解離させることに成功した。また、CRP-RNAポリメラーゼ相互作用の強度と結合部位の距離との相関関係が示唆された。2.いずれのプロモーターにおいてもCRP除去により、転写開始複合体の構造に大きな変化は見られず、CRPの転写開始複合体の構造、及び安定性への寄与を否定した。さらにこの結果生じた転写複合体が転写活性を十分保持していることから、CRPの作用はプロモーターにおけるその結合部位の位置にかかわらず転写開始複合体の形成までであることが結論された。3.以上の解析中にCRPの転写開始複合体形成以降への寄与が示唆されていたmalTプロモーターにおいてCRP非存在下でRNAポリメラーゼは転写活性をもたないnonproductiveな転写複合体を形成することを見いだした。現在、性質の異なる転写複合体について分子生物学的解析を進めており、RNAポリメラーゼの機能とプロモーター活性について新しい知見が得られることが期待される。またCRPによる活性化型転写複合体の形成機構について解析を進めている。
ミクロ/マクロスケールダイナミックス解析システムの開発およびゲル科学への展開

本研究課題の重要なひとつである、高分子ゲルの物性・機能と密接な関係のある網目鎖の中のプローブ分子などの極めて遅い拡散過程および網目サイズ・サイズ分布の本格的な研究にはどうしても必務である2000G/cm以上の磁場勾配を発生させることが可能な超磁場勾配NMRプローブを本研究において完成させ、それにより10^<-10>-10^<-11>cm^2/sの拡散係数の測定が可能となり、極めて遅い拡散過程の研究を大きくブレイク・スルーすることに成功した。さらに、この方法を高分子科学の重要な高分子液晶、高分子融液・濃厚溶液の拡散およびダイナミックスの研究に優れた方法として応用に成功した。また、このような超高磁場勾配システムをNMRイメージングに組み込むことにより高分解能三次元拡散画像化解析を開発し、ゲル系に応用しゲル科学に大きな方法論となることを明らかにした。さらに、高分子内のナノスケールサイズの分子キャビティーの中にサイズの小さなプローブ分子を導入しその制限拡散を解析するシステムを開発してキャビティーの高精度なキャラクタリゼーションし、物性・機能の解析評価の大きな展開を行った。これらの距離情報に関してスピン拡散を利用する方向からもミクロ/マクロスケール距離解析システムの開発を行った。今年度は1)高分子ネットワーク中のアミノ酸および溶媒の拡散過程を通してキャビティーの分子間相互作用およびサイズの解析、2)規則構造を有する高分子ネットワークの作成とそのネットワーク中と通してキャビティーの分子間相互作用およびサイズの解析、3)高分子ゲルの高分解能三次元拡散画像化解析、4)高分子液晶の拡散過程の解析を行い、および5)スピン拡散を利用した高分子鎖間の相互作用と距離情報の解析を行い、得られた研究成果を論文として発表した。高分子ゲルの物性・機能と密接な関係のある網目鎖の揺らぎ運動過程の本格的な研究にはどうしても2000G/cm以上の磁場勾配を発生させることが可能な超磁場勾配NMRプローブの開発が必要である。それにより10^<-10>-10^<-11>cm^2/sの拡散係数の測定が可能となり、極めて遅い拡散過程の研究を大きくブレイク・スルーすることができる。これによりゲル系および高分子の融液・濃厚溶液のダイナミックスの研究に有力な方法として応用できる。また、このような超高磁場勾配システムをNMRイメージングに組み込むことにより高分解能三次元拡散画像化解析が可能となり、ダイナミックス解析法の可能性を大きく発展させることができ、これはゲル科学に大きな方法論を提供することになる。本研究では、このような2000G/cm以上の超磁場勾配発生のできるNMRプローブを電磁気学的設計をもとに試作し、世界でトップの超磁場勾配発生装置を試作することを目的のひとつとし、その試作を行い、この超磁場勾配NMRプローブを用いて、高分子ゲルの網目鎖の揺らぎ運動過程を解明することに応用して、可能性の高い研究成果を得つつある。その一部を論文として発表を行い高い評価を受けている。次年度では、装置の改善を行いゲル科学の研究において大きな発展を期待している。

本研究では、このような2000G/cm以上の超磁場勾配発生のできるNMRプローブを電磁気学的設計をもとに試作し、世界でトップの超磁場勾配発生装置を試作することを目的のひとつとし、その試作を行い、この超磁場勾配NMRプローブを用いて、高分子ゲルの網目鎖の揺らぎ運動過程を解明することに応用して、可能性の高い研究成果を得つつある。このような超高磁場勾配システムを利用して、高分子内のナノスケールのサイズの分子キャビティーの中にサイズの小さなプローブ分子を導入しその制限拡散を解析するシステムを開発してキャビティーの高精度なキャラクタリゼーションし、物性・機能の解析評価の大きな展開することを目的としている。今年度は1)高分子ネットワーク中のアミノ酸および溶媒の拡散過程を通してキャビティーの分子間相互作用およびサイズの解析、2)規則構造を有する高分子ネットワークの作成とそのネットワーク中と通してキャビティーの分子間相互作用およびサイズの解析、および3)水素ガスなどを高分子キャビティーの中に充填させてキャビティーの分子間相互作用およびサイズの解析を行い、得られた研究成果を論文として発表した。本研究課題の重要なひとつである、高分子ゲルの物性・機能と密接な関係のある網目鎖の中のプローブ分子などの極めて遅い拡散過程および網目サイズ・サイズ分布の本格的な研究にはどうしても必務である2000G/cm以上の磁場勾配を発生させることが可能な超磁場勾配NMRプローブを本研究において完成させ、それにより10^<-10>-10^<-11>cm^2/sの拡散係数の測定が可能となり、極めて遅い拡散過程の研究を大きくブレイク・スルーすることに成功した。さらに、この方法を高分子科学の重要な高分子液晶、高分子融液・濃厚溶液の拡散およびダイナミックスの研究に優れた方法として応用に成功した。また、このような超高磁場勾配システムをNMRイメージングに組み込むことにより高分解能三次元拡散画像化解析を開発し、ゲル系に応用しゲル科学に大きな方法論となることを明らかにした。さらに、高分子内のナノスケールサイズの分子キャビティーの中にサイズの小さなプローブ分子を導入しその制限拡散を解析するシステムを開発してキャビティーの高精度なキャラクタリゼーションし、物性・機能の解析評価の大きな展開を行った。これらの距離情報に関してスピン拡散を利用する方向からもミクロ/マクロスケール距離解析システムの開発を行った。今年度は1)高分子ネットワーク中のアミノ酸および溶媒の拡散過程を通してキャビティーの分子間相互作用およびサイズの解析、2)規則構造を有する高分子ネットワークの作成とそのネットワーク中と通してキャビティーの分子間相互作用およびサイズの解析、3)高分子ゲルの高分解能三次元拡散画像化解析、4)高分子液晶の拡散過程の解析を行い、および5)スピン拡散を利用した高分子鎖間の相互作用と距離情報の解析を行い、得られた研究成果を論文として発表した。
細胞周期におけるセンサー型転写因子の制御機構

細胞分裂期の染色体分配など複雑な物理的ストレスをがん細胞が回避する機構を解明する端緒として,様々なストレスに反応する転写因子であるp53およびその下流の実働分子であるp21/WAF1が細胞分裂期にAuroraによりリン酸化され,それらの機能が細胞分裂期特異的に不活性化されていることを見出した。Auroraは分裂期に活性化されるセリン/スレオニンキナーゼで,染色体不安定性に関与している。1,p53とAuroraファミリーとの結合について,強発現系において両者の結合を確認した。2,p53およびか21/WAF1がAuroraの非常に良いリン酸化基質になることを確認した。さらに変異型p53を基質としてSer215およびThr284が実際リン酸化されることを確認した。3,全長p53cDNAを用いて,p53を有しないH1299細胞に強制発現させ,p21/WAF1の発現をイムノブロットにより観察した。リン酸化を模倣した変異を導入したp53ではp21/WAF1の発現誘導を認めなかった。4,ヒトp53のリン酸化特異的抗体の作製が難航しているため,p53の5カ所ある予想リン酸化部位の正当性を検討し,Auroraの基質特異性について以下のように論文にまとめた。(2)Aurora-Aと-Bの基質特異性はリン酸化部位のP+1にあった。(3)作成したマウスモノクローナルT288リン酸化Aurora-A抗体はin vitroでAurora-Aのキナーゼ活性を阻害した。がん細胞における染色体動態に伴う物理的ストレス回避の分子機構の解明により,がんの新たな理解を目指し,さらにその分子構造を破壊することでがん細胞特異的な標的治療への応用が可能になる。染色体不安定性と紡錘体機能は密接に関連しているため、我々が同定したAuroraファミリーの新規基質、微小管プラス端集積因子(+TIPs)に属するEBファミリーのホモログのひとつであるEB3のAurora-AおよびBによるリン酸化の意義を検討した。EB3は同じEBファミリーのEB1と異なり不安定なタンパク質で、M-G_1期移行時にRINGフィンガー型のユビキチンリガーゼ(E3)であるSIAH-1によりユビキチン化され、26Sプロテアソームで分解されることを明らかにした。さらに、SIAH-1によるEB3の分解はM期でのAuroraによるEB3のリン酸化で阻害されることを明らかにした。細胞周期でのEB3タンパクレベルの変動は、Auroraによるリン酸化とSIAH-1による分解で制御されているという機構を明らかにした。Auroraは分裂期に活性化されるセリン/スレオニンキナーゼで,特にAurora-BはヒストンH3キナーゼであり染色体不安定性に関与している。2,p53およびp21/WAF1がAuroraの非常に良いリン酸化基質になることを確認した。4,ヒトp53のリン酸化特異的抗体の作製が難航したため,p53の5カ所ある予想リン酸化部位の正当性を検討した。がんの新たな理解を目指した本研究により,がん細胞における染色体動態に伴う物理的ストレス回避の分子機構が明らかとなり、さらにその分子構造を破壊することでがん細胞特異的な標的治療への応用が可能になることが明確になった。
高濃度流の流動機構と分類基準に関する研究

研究の成果を列記すると下記のようである。(1)掃流状集合流動機構の解明:二次元高濃度流の流れの運動方程式の各項を比較し、慣性項と衝突応力項の比を表す無次元量が導かれた。この無次元パラメータは相対水深と濃度の関数として表され、高濃度流の流況を規定する。従来掃流状集合流動と称されていた領域の流れについて、慣性力と衝突応力が支配的な二層に分け、それぞれの層について流速及び濃度の式を導き、両者の界面での接合条件を適用して、濃度分布式、抵抗則、流砂量式などを導き、種々の粒径及び勾配で行った実験により検証した。その結果、従来あいまいであった掃流状集合流動のメカニズムが明確にされた。(2)抵抗則:現象を規定するパラメータが相対水深と濃度であることに着目し、流速係数に対する濃度の影響を調べた。従来提案されている土石流や泥流の式においては、流速係数は濃度に無関係とされているが、広い範囲の泥流・土石流のデータを検討した結果、同一相対水深においては、濃度の増加とともに流速係数が減少し、抵抗が増大していることが見出された。その結果、抵抗は相対水深と濃度によって規定されることが明らかになり、泥流から土石流に至る広い範囲の高濃度流に適用可能な流速係数の実用式が提案された。(3)流砂量:従来の土石流の式は、流砂量は勾配のみによって規定され水深には無関係とするものが多い。しかし、次元解析によると、流砂量は無次元掃流力と相対水深によって規定されると思われる。そこで、水路勾配が1°から30°の範囲のデータを収集・整理し、流砂量に関して新たな経験式を提案した。この式は、パラメータとして無次元掃流力と相対水深の項を含み、泥流から土石流まで適用範囲が広い。また、雲仙・水無し川におけるシミュレーションから、従来の式では表せなかった実河川における緩勾配高濃度の土石流にも適用できることが明らかにされた。
ブドウ球菌が表皮自然免疫応答に及ぼす影響に着目したアトピー性皮膚炎の病態解明

表皮ケラチノサイトはToll様受容体を発現しており、β-defensin (hBD)などの抗菌ペプチドを産生し、自然免疫応答を発動することで外界からの防御の第一線を担っている。我々はこれまでに、アトピー性皮膚炎(AD)の増悪因子である黄色ブドウ球菌、皮膚バリア機能維持に役立っている表皮ブドウ球菌が、ケラチノサイトの自然免疫応答に及ぼす影響について研究し、これらのブドウ球菌刺激が異なるサブタイプのhBDを誘導することを明らかにしてきた。本研究では、ブドウ球菌に対する皮膚の自然免疫応答がADの病態形成においていかなる役割を担うのかを明らかにすることを目指した。まず、皮膚バリア機能に重要な役割を担っているフィラグリン(FLG)発現をsiRNAにより阻害し、さらに高カルシウム培地で分化させたケラチノサイトをブドウ球菌で刺激したが、黄色ブドウ球菌および表皮ブドウ球菌によるhBDの産生誘導に対するFLG異常の影響は認められなかった。一方、AD類似環境としてTh2関連サイトカイン・ケモカイン(IL-4, IL-13, IL-10)を正常ヒトケラチノサイト培養系に添加した環境下でブドウ球菌による刺激を行ったところ、Th2環境下では表皮ブドウ球菌によるhBD-2の産生が抑制される傾向がみられた。さらに我々は、悪性腫瘍の治療に広く用いられている分子標的治療薬の一つである上皮成長因子受容体阻害薬(EGFR-1)がしばしば特徴的な薬疹を引き起こすことに着目し、この薬剤が皮膚の自然免疫応答に及ぼす影響を検討した。その結果、EGFR-1が、表皮ブドウ球菌刺激によるhBD産生を特異的に抑制することを見出した。以上の研究結果から、表皮常在細菌叢に対するケラチノサイトの自然免疫応答のアンバランスが、ADや分子標的治療薬による皮膚障害などの様々な皮膚疾患の病態形成に関わっている可能性が示唆された。
ひねり姿勢作業による負担評価のための計測法の検討

腰痛の作業要因として重要でありながら従来は現場での測定が困難だった体のひねりを簡便に測定できる計測法について以下の研究結果を得た。1.まず体のひねりを検出するセンサーとして、回転子を利用したジャイロ(レートジャイロ)および圧電素子を利用した角速度センサーを比較検討したが、人のひねり動作による角速度に十分追従できるという要件から圧電素子を利用した角速度センサーを使用することとした。2.角速度センサーのドリフト除去法については、ハイパスフィルタとソフトウエアフィルタを利用する方法を検討したが、前者は簡便だがフィルタ特性の影響で動作によっては感度が適性に校正できない、後者はCPUの負担が大きく携帯化するときにCPUパワーが不足するという問題点がそれぞれあった。そこで現在は、ハードとソフトを併用した方法については改めて検討を行っている段階である。3.体が屈曲した状態での体のひねりの検出については、角速度センサーの検出回転軸が体の回転軸に対してθだけ傾くと、出力がほぼcosθに低下することが判明した。そこでこの影響を補正するために、磁気抵抗素子を利用した傾斜計と角速度センサーを一体化した検出ユニットを試作した。4.この検出ユニットを用いた装置を試作し、被験者にモデル作業をさせて、ひねりの程度が適切に測定できるか検討した。その結果、体の前軽を伴わない作業(座作業)も前軽のある作業(床からの荷物持ち上げ作業)のいずれも適切にひねりの程度に応じた測定結果がえられることが確認できた。また、体全体の回転の影響は、腰と上体の2カ所に固定した検出ユニットの差を求めることでうまく除去できることも確認できた。
ニコチン刺激後の破骨細胞のシグナル伝達の解明

破骨細胞前駆細胞はニコチンで刺激により,分化の過程で成熟破骨細胞が骨無機質を溶解する際に必要な酸産生酵素(CA II)の発現を増加させた。また、各種サイトカインおよびPGE2の産生を増加した。PGE2産生に不可欠なCOX阻害剤およびニコチンの存在下では酸産生酵素の発現は有意に抑制された。このことからニコチン存在下での無機質溶解性の向上にはPGE2のオートクリン作用が関与していることが示唆された。喫煙は、歯周病における環境面からみた最大のリスクファクターであり、歯周病の発祥や進行および治療効果の低下に大きく関与することが指摘されている。タバコの成分の中で最も含有量の多いニコチンに着目し、ニコチンが骨芽細胞と破骨細胞前駆細胞との細胞間相互作用後の成熟破骨細胞の機能発現に及ぼす影響を調べたところ、成熟破骨細胞が骨無機質を溶解する際に必要な酸産生酵素(CAII)の発現がニコチン存在下では大きく増加する結果を得た。しかしこの現象がニコチンの直接作用によって起こるのかニコチン刺激によって破骨細胞前駆細胞が産生する炎症サイトカインなどによる間接的作用が関与しているかは不明である。これを解明するために以下の実験を行った。α7ニコチン受容体の遺伝子発現は検出されたが、ニコチン刺激による顕著な差は認められなかった。ニコチン刺激により遺伝子発現およびタンパク発現においてもCAIIの発現は増加したが、ニコチン受容体阻害剤であるD-tubocrarine同時添加によりCAIIの発現はcontrol levelにまで低下した。この結果から、本実験により得られた発現の変化はニコチンの作用によるものであることが確認された。刺激後24時間の培地を用いて上清中における破骨細胞の分化に重要な働きを示すサイトカインである、IL-1α、IL-1β,TNF-α,IFN-γ等を調べた。無刺激群に比ベニコチン刺激群で発現が増加した主なサイトカインはIL6、減少したサイトカインはTNF-αであった。CA2の発現増加にはこれらのサイトカインのautocrine作用の影響が関与している可能性が示唆された。喫煙は歯周病における環境面からみた最大のリスクファクターであり、歯周病の発症や進行および治療効果の低下に大きく関与することが指摘されている。申請者はタバコの中で最も含有量の高いニコチンが破骨細胞におよぼす影響を調べた。破骨細胞としてRAW264.7細胞以下(RAW細胞)を用いた。まず、RAW細胞を各種濃度のニコチン(0,1^<-5>M,10^<-4>Mまたは10^<-3>M)で刺激後により、α7ニコチン受容体の遺伝子発現は有意に増加した。破骨細胞様細胞の形成が認められる培養5日目以降,CA II発現は上記濃度のニコチン刺激によって有意に増加した。一方,カテプシンKおよびMMP-9発現は10^<-4>Mおよび10^<-3>Mニコチン刺激によって有意に低下した。また、ニコチンがRAW細胞の各種炎症性サイトカイン発現およびPGE_2産生に与える影響を検討した。RAW細胞を上記の濃度のニコチンで刺激後,IL-1β,IL-8およびTNF-αの遺伝子発現を調べた。その結果,これらのサイトカイン発現は,10^<-3>Mニコチン刺激によって有意に増加した。また,ニコチン刺激で増加したこれらのサイトカイン発現は,ニコチン受容体アンタゴニストの同時添加によって,コントロールレベルまで低下した。RAW細胞を種々の濃度のニコチンで刺激後,PGE_2産生に不可欠なCOX-1およびCOX-2の遺伝子発現に及ぼす影響を調べた。その結果,COX-1発現にはニコチン刺激の影響は認められなかったが,COX-2発現は培養5日目までの早い時期にニコチン刺激によって有意に増加した。ニコチン刺激によって増加したCA II発現は,COX-2阻害剤の同時添加によって,コントロールレベルに対して約35%低下した。これらの結果から,ニコチン刺激によって増加したCA II発現にはPGE2によるオートクリン機構が35%程度関与している可能性が示唆された。
噴霧気流中におかれた細線周りの着氷挙動と着氷限界熱流束に関する研究

本研究は,着氷現象に対する一考察として,着氷物体の加熱により結氷を防ぐ方法について,伝熱工学的な観点からの基礎研究を遂行した.以下に本報告の目的である,着氷挙動および着氷防除の実験で得られた結果を示す.1,着氷挙動着氷の成長速度は気流の温度と速度の変化に影響を受けることが分かった.また着氷形状は噴射液滴の過冷却状態と液滴径の変化に大きく依存することが分かった.着氷物体の形状(細線の径)を変化させた場合,着氷挙動は主に初期段階の成長過程に影響を及ぼす.しかし十分時間が経過すると細線径の差異による着氷厚さへの影響はなくなることが分かった.2,着氷防除着氷物体の熱量を徐々に減少させて噴射液滴が細線に結氷する瞬間の細線表面温度の微弱な変化を高速サンプリングを行い,着氷が生じない最小限度の熱流束(着氷限界熱流束)の最適値を求めた.なお従来の着氷限界熱流束に対する測定は,全て目視による測定であったが,本研究において正確な熱流束の把握が可能となった.さらに着氷限界熱流束は気流の温度および速度に大きく依存するが,本実験の範囲内にいて細線径の変化には大きく影響を受けないことが分かった.なお,今後着氷防除に対するさらに詳細な知見を得るためには,実際の自然条件に近づけた,より多くのパラメータを含めた実験,さらに着氷現象をよりミクロな観点(例えば,単一液滴を対象)からの実験,検討が必要と思われる.特に過冷却状態からの潜熱放出現象に対するモデルを確立し,数値シミュレーションを含めた体系的な研究が必要と考えている.本研究は,着氷現象に対する一考察として,着氷物体の加熱により結氷を防ぐ方法について,伝熱工学的な観点からの基礎研究を遂行した.以下に本報告の目的である,着氷挙動および着氷防除の実験で得られた結果を示す.1,着氷挙動着氷の成長速度は気流の温度と速度の変化に影響を受けることが分かった.また着氷形状は噴射液滴の過冷却状態と液滴径の変化に大きく依存することが分かった.着氷物体の形状(細線の径)を変化させた場合,着氷挙動は主に初期段階の成長過程に影響を及ぼす.しかし十分時間が経過すると細線径の差異による着氷厚さへの影響はなくなることが分かった.2,着氷防除着氷物体の熱量を徐々に減少させて噴射液滴が細線に結氷する瞬間の細線表面温度の微弱な変化を高速サンプリングを行い,着氷が生じない最小限度の熱流束(着氷限界熱流束)の最適値を求めた.なお従来の着氷限界熱流束に対する測定は,全て目視による測定であったが,本研究において正確な熱流束の把握が可能となった.さらに着氷限界熱流束は気流の温度および速度に大きく依存するが,本実験の範囲内にいて細線径の変化には大きく影響を受けないことが分かった.なお,今後着氷防除に対するさらに詳細な知見を得るためには,実際の自然条件に近づけた,より多くのパラメータを含めた実験,さらに着氷現象をよりミクロな観点(例えば,単一液滴を対象)からの実験,検討が必要と思われる.特に過冷却状態からの潜熱放出現象に対するモデルを確立し,数値シミュレーションを含めた体系的な研究が必要と考えている.