hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
平均曲率一定曲面の変形と安定性の研究への関数解析的アプローチ

1.3次元ユークリッド空間内の,「体積一定」という条件のもとでの,「表面積+重力エネルギー」の変分問題の解(の表面)は,平均曲率が高さの一次関数であるような曲面となる.はめ込まれた曲面であって,平均曲率が高さの一次関数であるようなものについて,その幾何学的性質と安定性に関する多くの結果を得た.2.重力を無視できないような薄膜に関する変分問題を提唱し,部分的に自由境界をもつ特別な場合について,すべての解を求め,さらにそれらの安定性・不安定性を完全に決定した.3.3次元ユークリッド空間内の非等方的平均曲率一定曲面の幾何学的性質と安定性について,下記の結果を得た.ただしここで,「非等方的平均曲率定曲面(以下ではCAMC曲面と呼ぶことにする)」とは,体積一定なる条件のもとでの非等方的表面エネルギーの臨界点を与える曲面であり,平均曲率一定曲面の一般化になっている.(1)非等方的表面エネルギーの第2変分公式を導き,CAMC曲面に対する安定性の概念を定式化した.(2)CAMC曲面のガウス写像が(ある種の)エネルギー最小性を持つことを示した.(3)完備で安定なCAMC曲面に関する一意性定理を得た.(4)回転対称なCAMC曲面について,表現公式を求め,幾何学的性質及び安定性を解析した.(5)CAMC曲面のガウス写像の除外値について研究し,ガウス曲率のL^1評価,一意性定理,安定であるための十分条件等に関する結果を得た.1.3次元ユークリッド空間内の,「体積一定」という条件のもとでの,「表面積+重力エネルギー」の変分問題の解(の表面)は,平均曲率が高さの一次関数であるような曲面となる.はめ込まれた曲面であって,平均曲率が高さの一次関数であるようなものについて,その幾何学的性質と安定性に関する多くの結果を得た.2.重力を無視できないような薄膜に関する変分問題を提唱し,部分的に自由境界をもつ特別な場合について,すべての解を求め,さらにそれらの安定性・不安定性を完全に決定した.3.3次元ユークリッド空間内の非等方的平均曲率一定曲面の幾何学的性質と安定性について,下記の結果を得た.ただしここで,「非等方的平均曲率定曲面(以下ではCAMC曲面と呼ぶことにする)」とは,体積一定なる条件のもとでの非等方的表面エネルギーの臨界点を与える曲面であり,平均曲率一定曲面の一般化になっている.(1)非等方的表面エネルギーの第2変分公式を導き,CAMC曲面に対する安定性の概念を定式化した.(2)CAMC曲面のガウス写像が(ある種の)エネルギー最小性を持つことを示した.(3)完備で安定なCAMC曲面に関する一意性定理を得た.(4)回転対称なCAMC曲面について,表現公式を求め,幾何学的性質及び安定性を解析した.(5)CAMC曲面のガウス写像の除外値について研究し,ガウス曲率のL^1評価,一意性定理,安定であるための十分条件等に関する結果を得た.Bennett Palmer博士(University of Durham, UK)との共同研究により,3次元ユークリッド空間内の,平均曲率が高さの一次関数であるような,はめ込まれた曲面(PMC曲面と呼ぶことにする)の幾何学的性質と安定性についての多くの結果を得た.詳しくは,下記のとおりである.(1)PMC曲面に対するFlux公式及びバランス公式を構成し,それらを用いることにより,PMC曲面の幾何学的な性質に関する結果を得た.そのうちの主なものを次に記す.(i)コンパクトで境界のない安定なPMC曲面は,標準球面のみである.(ii)コンパクトで境界のないPMC曲面であって,体積非零のものは,平均曲率一定である,したがって,特に,コンパクトで境界のない埋め込まれたPMC曲面は,標準球面のみである。(iii)コンパクトで境界のないPMC曲面であって,その平均曲率が曲面上定符号であるものは,平均曲率一定曲面のみである.(iv)水平面内の半径rの円周で張られるコンパクトなPMC曲面の平均曲率Hが,曲面上定符号ならば,境界上ではHの絶対値は1/γを超えない.(v)平面曲線で張られる埋め込まれたPMC曲面が,境界と同じ対称性を持つための,十分条件を得た.(2)エネルギーの第2変分に附随する固有価問題の固有値及び固有関数を用いることにより,PMC曲面が,PMCという性質と境界を保つ変形を持つための条件を求めた.(3)平面曲線で張られる,埋め込まれたPMC曲面の安定性に関する結果を得た.(4)強安定なPMCグラフの高さに関する上からの評価を初期データによって表した.与えられた曲線上に境界の一部を持つ,重力を無視できないような薄膜に関する変分問題を提唱し,考察した.その解は,与えられた曲線Γ上に境界の一部を持つ曲面Fの,面積を保つ変分に対する「自由境界Cの長さL+Fの重力エネルギーG_γ+Fの濡れエネルギーW_β」(総エネルギーと呼ぶ)の臨界点として定式化され,そのEuler-Lagrange方程式は,Fの平均曲率,Fの自由境界Cの曲率,及びCとΓの成す角の満たすべき条件として表現される.特に,Γが鉛直平面上にあり,かつFが平面領域である場合については,以下に述べるような詳しい結果を得た.

この場合,我々の変分問題は,Γ上に両端点(自由境界)を持つ埋め込まれた曲線Cに対する変分問題の形で述べることができる.Cがこの変分問題の臨界点であるための必要十分条件は,Cの曲率が高さの線形関数であり,かつ,Cがその両端点においてΓと成す角が互いに補角を成すことである.Cが臨界点であるとき,CとΓによって囲まれるコンパクト領域Fが安定であるとは,面積を保ち境界条件を満たす任意の変分に対して総エネルギーの第2変分が非負であることと定義する.曲率が高さの線形関数であるという条件は,振り子の方程式に帰着されることがわかり,その解は,Jacobiの楕円関数を用いて具体的に記述できる.特に,Cが鉛直平面内に与えられた互いに平行な二鉛直線のそれぞれに一つずつ端点を持つ場合については,すべての臨界点を求め,さらに,対応する解それぞれの安定性・不安定性を完全に決定した.なお,安定性の判定には,解の満たす微分方程式より得られる解の対称性を本質的に用いた.Bennett Palmer氏(Idaho State University, USA.海外共同研究者)との共同研究により,3次元ユークリッド空間内の非等方的平均曲率一定曲面の幾何学的性質と安定性について,以下の結果を得た.ただしここで,「非等方的平均曲率一定曲面」とは,体積一定なる条件のもとでの非等方的表面エネルギーの臨界点を与える曲面である.また,「非等方的表面エネルギー」とは,曲面の単位法ベクトルを変数とする関数の曲面上での積分であり,結晶の表面エネルギーの数学的抽象化である.したがって,非等方的平均曲率一定曲面は,平均曲率一定曲面の一般化になっている.1.非等方的表面エネルギーの第2変分公式を導き,非等方的平均曲率一定曲面に対する安定性の概念を定式化した.2.非等方的平均曲率一定曲面のガウス写像が(ある種の)エネルギー最小性を持つことを示した.3.完備で安定な非等方的平均曲率一定曲面に関する一意性定理を得た.4.非等方的平均曲率一定回転面の表現公式を求め,その幾何学的性質を解析した.5.非等方的平均曲率一定曲面のガウス写像の除外値について研究し,ガウス曲率のL^1評価,一意性定理,安定であるための十分条件等に関する結果を得た.また,ガウス写像が調和写像であるという性質が使える場合の曲面の存在定理や変形の研究,平均曲率一定曲面の自然な一般化である「調和逆平均曲率曲面」の基本的性質の研究,複素2次元空間内のLagrangian曲面の決定及び分類に関する研究を行った.
栄養状態で変化する生体膜脂肪酸の生理学的意義

本研究では、脂肪酸の過剰および欠乏によって変化する生体膜脂肪酸の生物学的意義について検討を行った。まず、栄養過剰のモデルとして脂肪細胞における脂肪滴膜リン脂質の脂肪酸に着目した。本研究より、脂肪滴膜リン脂質の飽和脂肪酸が大型脂肪滴の形成や安定化をもたらす物理的性質を有することが示唆された。また、栄養欠乏のモデルとして必須脂肪酸欠乏における脂肪酸代謝の変化を調べた。脂肪酸伸長酵素のElovl5は必須脂肪酸欠乏時にリン酸化を介して基質特異性が変化し、必須脂肪酸欠乏時のミード酸(C20:3n-9)産生を誘導していることを明らかにした。脂肪酸は生体内における重要なエネルギー源であり、生体膜の主要な構成成分である。生体膜を構成しているリン脂質には様々な脂肪酸が結合しており、この脂肪酸の多様性は膜の流動性だけでなく、膜タンパク質の局在や細胞機能に影響を及ぼすことが指摘されている。栄養状態によって生体膜の脂肪酸鎖は変化することが知られているが、その変化が細胞機能にもたらす影響はよく分かっていない。そこで本研究では、脂肪酸の過剰及び欠乏によって変化する生体膜脂肪酸が持つ生理学的意義を明らかにする。脂肪細胞は脂肪酸が中性脂肪となって脂肪滴に蓄積され、脂肪滴自身の肥大化がみられる。そこで、栄養過剰のモデルとして脂肪蓄積に伴う脂肪滴サイズの変化に着目し、肥大化脂肪滴に特徴的な脂質組成を明らかにすることで、その脂質組成が脂肪蓄積においてどのような意義を持つか検討を行う。また、必須脂肪酸欠乏時にはミード酸(C20:3n-9)という脂肪酸がオレイン酸から産生されるが、我々はオレイン酸からミード酸の産生遺伝子とその経路を明らかにしている(Biochim. Biophys. Acta., 2014)。そこで、栄養欠乏のモデルとして、必須脂肪酸欠乏時のミード酸がどのような制御機構で産生されるかを明らかにする。また、必須脂肪酸のミード酸は生体膜のホスファチジルイノシトールというリン脂質で顕著に増加することことから、ミード酸のリン脂質における必要性とともに、必須脂肪酸欠乏時のミード酸の生理作用について検討を行う。1脂肪滴膜の脂肪酸鎖と脂肪滴肥大化との関連性本研究では、脂肪蓄積に伴う脂肪滴サイズの変化に着目し、肥大化脂肪滴に特徴的な脂質組成を明らかにし、その組成が脂肪蓄積においてどのような意義を持つか検討を行った。まず、大型脂肪滴に特徴的な脂質組成が、大型脂肪滴の形成に有利な物理的性質をもたらすかについて調べた。脂肪酸を添加すると脂肪滴を形成するNIH3T3細胞に、脂肪滴同士の融合を促進するFSP27を過剰発現させ、大型脂肪滴を形成するFSP27安定発現細胞を作製した。それぞれの細胞の脂肪滴から脂質を抽出し、その脂質抽出物を用いて試験管内でエマルションを再構成させる方法を試みた。すると、FSP27安定発現細胞の脂質抽出物からは大型のエマルションが再構成され、脂肪滴を構成する脂質そのものの生物物理的性質が、大型脂肪滴形成に寄与していることが示唆された。そこで、リン脂質の脂肪酸の不飽和度の違いがエマルション形成に与える影響を調べた。不飽和度の異なるリン脂質とトリグリセリドを混合して脂肪滴様エマルションを形成させると、飽和脂肪酸が結合したリン脂質を用いた際に大型の脂肪滴が観察された。したがって、リン脂質の飽和脂肪酸は大型脂肪滴の形成あるいは安定化に必要であることが示唆された。2必須脂肪酸欠乏時に産生されるミード酸の産生制御機構と生理作用我々は必須脂肪酸欠乏時にオレイン酸から産生されるミード酸の産生遺伝子を報告している。その中で、ミード酸の産生遺伝子である脂肪酸鎖長伸長酵素Elovl5は、多価不飽和脂肪酸存在下でオレイン酸に対する活性が消失し、その結果ミード酸の顕著な減少がみられた。そして、多価不飽和脂肪酸存在下ではElovl5のタンパク質にリン酸化が生じていた。したがって、必須脂肪酸欠乏時にはリン酸化Elovl5が減少することで、オレイン酸に対して活性を生じ、ミード酸が産生されることが示唆された。脂肪酸は生体内における重要なエネルギー源であるとともに、生体膜の主要な構成成分であり、生体内の恒常性維持に必要な物質である。まず、栄養過剰のモデルとして脂肪細胞の脂肪滴膜の脂肪酸に着目した。脂肪滴は細胞内の脂肪蓄積を調節するオルガネラであり、脂肪滴表面はリン脂質の一重膜で覆われているが、この一重膜リン脂質の脂肪酸鎖の多様性および意義は不明であった。今年度の研究成果で、脂肪滴を構成する脂質そのものの生物物理的性質が、大型脂肪滴形成に寄与していること、さらにリン脂質の飽和脂肪酸が大型脂肪滴の形成や安定化をもたらす生物物理的性質を持つことを明らかにしている(Biochem. Biophys. Res. Commun, 2016)。さらに、脂肪滴膜へのタンパク質局在において、膜リン脂質の脂肪酸組成が影響する可能性を検討した。その結果、脂肪滴の脂肪蓄積に関わるPerilipin1の脂肪滴膜への局在に不飽和脂肪酸が関与していることが示唆された。また、栄養欠乏のモデルとして必須脂肪酸欠乏時の代謝変化に関する研究を行った。我々は以前、必須脂肪酸欠乏時に産生されるミード酸(C20:3n-9)の産生遺伝子とその経路を明らかにしていることから(Biochim. Biophys. Acta., 2014)、必須脂肪酸欠乏時にミード酸が産生されるように脂肪酸代謝が変化する制御機構について検討を行った。

その結果、脂肪酸伸長酵素のElovl5において必須脂肪酸欠乏時に特異的に基質特異性が変化することが分かった。さらに、その基質特異性の変化はタンパク質のリン酸化を介しているを明らかにした。本研究では、脂肪酸の過剰および欠乏によって変化する生体膜脂肪酸の生物学的意義について検討を行った。まず、栄養過剰のモデルとして脂肪細胞における脂肪滴膜リン脂質の脂肪酸に着目した。本研究より、脂肪滴膜リン脂質の飽和脂肪酸が大型脂肪滴の形成や安定化をもたらす物理的性質を有することが示唆された。また、栄養欠乏のモデルとして必須脂肪酸欠乏における脂肪酸代謝の変化を調べた。脂肪酸伸長酵素のElovl5は必須脂肪酸欠乏時にリン酸化を介して基質特異性が変化し、必須脂肪酸欠乏時のミード酸(C20:3n-9)産生を誘導していることを明らかにした。1脂肪滴膜の脂肪酸鎖と脂肪滴肥大化との関連性in vitroの実験で得られた脂肪滴膜のリン脂質における脂肪酸と脂肪滴サイズとの関係が生体でもみられるか検討する。肥満マウス及び通常マウスの白色脂肪組織からプライマリーを作製し、それぞれの細胞の脂肪滴サイズと脂肪滴膜リン脂質の脂肪酸組成の比較を行い、in vitroの現象が生体内でも同様にみられるか確認する。また、脂肪滴膜のリン脂質の脂肪酸組成が膜タンパク質の局在にも影響を及ぼすか検討を行う。in vitroの実験で得られた結果を元に、不飽和度の異なる脂肪酸が結合したリン脂質を用いて脂肪滴様エマルションを作製し、脂肪蓄積に関わる膜タンパク質Perilipi1の局在が脂肪酸の不飽和度の影響を受けるか調べる。これらの研究によって、脂肪滴一重膜における脂肪酸鎖が持つ生物学的意義を明らかにする。2必須脂肪酸欠乏時に産生されるミード酸の産生制御機構と生理作用必須脂肪酸欠乏時におけるミード酸の産生に、Elovl5のリン酸化が関わっていることを明らかにすることで、必須脂肪酸欠乏時の脂肪酸代謝の新たな制御機構を提示する。また、ミード酸の産生遺伝子のノックアウトマウスや阻害剤を用いて、必須脂肪酸欠乏時にミード酸の産生を抑制した際の生体への影響を調べることで、必須脂肪酸欠乏時にミード酸が産生される生理的意義を明らかにする。脂質栄養学
血管平滑筋細胞の形質変換における血液凝固系・線溶系蛋白質の発現

急性冠状動脈症候群の発生ならびに動脈硬化病変の発生・進展おいて血栓形成が重要な役割を担っていることが知られている。この血栓形成は凝固系と線溶系とのバランスの破綻によって起きるが、血管の重要な構成成分である血管平滑筋細胞(SMC)に注目し、その関与を、特に、動脈硬化巣でみられる収縮型から合成型への形質変換と、凝固・線溶系因子の発現の差異について検討した。剖検例およびDCAにより得られるヒト大動脈・冠状動脈の各種段階の動脈硬化巣において免疫組織学的に検討し、また、培養ヒト血管平滑筋細胞における合成型から収縮型への分化誘導モデルを作成し、各種凝固・線溶系蛋白の発現の差異を検討した。1)ヒト剖検例およびDCAからの大動脈・冠状動脈サンプルにおける検討:死後3-6時間以内の剖検例およびDCAサンプルにおいて、各段階の動脈硬化巣病変を採取し、4%パラフォルムアルデヒド固定し、免疫組織学的検討に供した。免疫組織学的に細胞成分に富む動脈硬化巣におけるSMCはほとんどがSMemb陽性、SM2陰性で、収縮型から合成型へと形質変換しているものと思われたが、進行した動脈硬化病変ほど、細胞外基質に富み細胞成分はごく僅かであり、SMCの形質変換は、動脈硬化初期病変においての大きく関与するものと思われた。凝固系の開始因子である組織因子(TF)およびその阻害因子である外因系経路阻害因子(TFPI)は、細胞・細胞外基質ともに発現が認められ、動脈硬化病変の進展に伴い、発現強度が増加する傾向にあった。さらに、線溶系因子であるウロキナーゼ型プラスミノーゲンアクチベータ(uPA)およびその阻害因子であるプラスミノーゲンアクチベーター1(PAI-1)も発現していたが、一定の差異を見いだせなかった。凝固系・線溶系とも、しかも促進因子・抑制因子とも同程度に発現しており、その量的差異が問題となるが組織学的検索範囲では確立し得なかった。2)培養SMCの分化による凝固系・線溶系因子の発現の検討:昨年までに確立した培養系により得られた収縮型分化誘導SMCと従来の増殖(合成)型SMCにおいて、蛍光免疫染色および細胞抽出液を用いたウエスタンブロットでは形質変換の指標であるアクチン・カルポニン・カルデスモンの発現は有意な差異を認めなかったが、ミオシン重鎖のSMembでは未知のsubfractionの発現の差異を認め、継代SMCにおいても分化の差があることが推察された。培養上清・細胞抽出液を用いてTF・TFPI・uPA・PAI-1の発現をウエスタンブロット法にて検討したところ、分化誘導SMCに比して再増殖させたSMCにおいて、培養上清中での有意なTFPI・PAI-1の増加を認め、また、細胞中のTFの増加、uPAの減少を認めた。以上より、元来血管には血栓抑制系があるので動脈硬化巣進展に伴い、血栓形成の促進系が早期より蓄積性に増加し、血栓形成・動脈硬化進展が左右される可能性が示唆された動脈硬化病変の発生・進展および急性冠状動脈症候群の発生の首座をなす血栓形成における血管平滑筋細胞(SMC)の関与を、特に、収縮型から合成型への形質変換と、凝固・線溶系因子の発現の差異について、剖検例およびDCAにより得られるヒト大動脈・冠状動脈の各種段階の動脈硬化巣において免疫組織学的に検討した。また、培養ヒト血管平滑筋細胞における合成型から収縮型への分化誘導モデルを作成し、各種凝固・線溶系蛋白の発現の差異を検討した。1)ヒト剖検例からの大動脈・冠状動脈サンプルの収集と形質変換の証明死後3-6時間以内の剖検例およびDCAサンプルにおいて、各段階の動脈硬化巣(びまん性内膜肥厚、粥腫、複雑病変)より免疫組織学的検討用に4%パラフォルムアルデヒド固定サンプルを収集したが、剖検例4例、DCA2例に留まった。免疫組織学的に細胞成分に富む動脈硬化巣におけるSMCはほとんどがSMemb陽性、SM2陰性で、収縮型から合成型へと形質変換しているものと思われた。また、凝固系の開始因子である組織因子(TF)およびその阻害因子である外因系経路阻害因子(TFPI)、さらに、線溶系因子であるウロキナーゼ型プラスミノーゲンアクチベータ(uPA)およびその阻害因子のプラスミノーゲンアクチベータ-1(PAI-1)も発現していたが、症例が少なく一定の差異を見いだせなかった。また、凍結サンプルはごく少数しか、収集できなかった。2)培養SMCの分化誘導およびその確認と凝固系因子の発現の検討培養SMC(大動脈および冠状動脈中膜由来)を一定の細胞数(lx10^5/dish)で播種し接着・初期増殖を確認後低血清または無血清培養液(分化誘導培地)に置換し5日間培養、増殖培地および分化誘導培地に再び置換し、増殖(合成型)SMCと分化(収縮型)SMCを得た。形質変換を確認するために、形質変換の指標であるアクチン・カルポニン・カルデスモン・ミオシン重鎖の発現の差異を蛍光免疫染色および細胞抽出液を用いたウエスタンブロットによって検討したが、初代培養ではないためか、完全な収縮型への誘導は確認できなかった。しかし、培養上清・細胞抽出液を用いてTF・TFPI・uPA・PAI-1の発現をウエスタンブロット法にて検討したところ、再増殖させたSMCにおいて、培養上清中での有意なTFPI・PAI-1の増加を認めた。

細胞抽出液中のuPAにおいては変化を認めず、TFにおいて測定感度以下であったため、現在、ELlZA法およびRTーRCR法にて検討をすすめている。急性冠状動脈症候群の発生ならびに動脈硬化病変の発生・進展おいて血栓形成が重要な役割を担っていることが知られている。この血栓形成は凝固系と線溶系とのバランスの破綻によって起きるが、血管の重要な構成成分である血管平滑筋細胞(SMC)に注目し、その関与を、特に、動脈硬化巣でみられる収縮型から合成型への形質変換と、凝固・線溶系因子の発現の差異について検討した。剖検例およびDCAにより得られるヒト大動脈・冠状動脈の各種段階の動脈硬化巣において免疫組織学的に検討し、また、培養ヒト血管平滑筋細胞における合成型から収縮型への分化誘導モデルを作成し、各種凝固・線溶系蛋白の発現の差異を検討した。1)ヒト剖検例およびDCAからの大動脈・冠状動脈サンプルにおける検討:死後3-6時間以内の剖検例およびDCAサンプルにおいて、各段階の動脈硬化巣病変を採取し、4%パラフォルムアルデヒド固定し、免疫組織学的検討に供した。免疫組織学的に細胞成分に富む動脈硬化巣におけるSMCはほとんどがSMemb陽性、SM2陰性で、収縮型から合成型へと形質変換しているものと思われたが、進行した動脈硬化病変ほど、細胞外基質に富み細胞成分はごく僅かであり、SMCの形質変換は、動脈硬化初期病変においての大きく関与するものと思われた。凝固系の開始因子である組織因子(TF)およびその阻害因子である外因系経路阻害因子(TFPI)は、細胞・細胞外基質ともに発現が認められ、動脈硬化病変の進展に伴い、発現強度が増加する傾向にあった。さらに、線溶系因子であるウロキナーゼ型プラスミノーゲンアクチベータ(uPA)およびその阻害因子であるプラスミノーゲンアクチベーター1(PAI-1)も発現していたが、一定の差異を見いだせなかった。凝固系・線溶系とも、しかも促進因子・抑制因子とも同程度に発現しており、その量的差異が問題となるが組織学的検索範囲では確立し得なかった。2)培養SMCの分化による凝固系・線溶系因子の発現の検討:昨年までに確立した培養系により得られた収縮型分化誘導SMCと従来の増殖(合成)型SMCにおいて、蛍光免疫染色および細胞抽出液を用いたウエスタンブロットでは形質変換の指標であるアクチン・カルポニン・カルデスモンの発現は有意な差異を認めなかったが、ミオシン重鎖のSMembでは未知のsubfractionの発現の差異を認め、継代SMCにおいても分化の差があることが推察された。培養上清・細胞抽出液を用いてTF・TFPI・uPA・PAI-1の発現をウエスタンブロット法にて検討したところ、分化誘導SMCに比して再増殖させたSMCにおいて、培養上清中での有意なTFPI・PAI-1の増加を認め、また、細胞中のTFの増加、uPAの減少を認めた。以上より、元来血管には血栓抑制系があるので動脈硬化巣進展に伴い、血栓形成の促進系が早期より蓄積性に増加し、血栓形成・動脈硬化進展が左右される可能性が示唆された
乳癌幹細胞鍵分子の機能解析

乳がん幹細胞を制御する重要な分子メカニズムのひとつとして、HRG/ErbBシグナルを同定した。ErbBシグナルはPI3K/NF-κBを介して乳がん幹細胞の維持に関わっていることを見出し、増殖因子と炎症応答パスウェイのクロストークが重要であることを示した。さらにPI3K下流ではIGF2シグナルが活性化することが乳がん幹細胞の維持に必要であることを明らかにした。また、HRGおよびIGF2によって発現誘導される遺伝子signatureは乳がん悪性度や転移/再発等の予後と強く相関したことから、これらの増殖因子シグナルにより乳がん幹細胞が維持されることで乳がん悪性化につながることが示唆された。乳癌幹細胞はEGFなどを加えた無血清培地による浮遊培養を行なうと、sphereという直径100μm程度の球状浮遊細胞塊を形成するが、これまでの解析から、ErbB受容体型チロシンキナーゼシグナルがsphere形成を促進することを見出している。そこで昨年度は、ErbB受容体下流のシグナル伝達機構について詳細に調べることにより、新たなsphere形成能制御因子を同定することを目指した。まずErbB3のリガンドであるHRG刺激により発現変化する遺伝子群を、時系列にマイクロアレイ解析を行なうことで同定した。その結果約600個の遺伝子群が発現変化することがわかった。これらの遺伝子群をErbB signatureと定義し、乳がん患者の表現型との相関を検討したところ、ErbB signatureは乳がんのグレードや再発、転移などのイベントと有意に相関することがわかった。また、このsignatureにはいくつかの分泌タンパクが含まれていたため、これらのsphere形成に対する影響を乳癌の手術摘出検体から得られた細胞を使って検討した。その結果、IGF1R受容体型チロシンキナーゼのリガンドであるIGF2がsphere形成を促進することを見いだした。また多くのヒト乳癌細胞株でもIGF2がsphereの形成を促進する働きがあることがわかった。これらの発見から、ErbBやIGFを標的としたがん幹細胞標的療法の可能性が示唆されるが、今後IGF2下流の標的遺伝子を明らかにすることで、さらなる癌幹細胞標的療法の確立につながることが期待される。これまでの解析から、いくつかの乳がん細胞株において、インスリン様成長因子IGF2の刺激によりsphereが形成されることを見出している。Sphereはがん幹細胞様の細胞から形成されると考えられているため、IGF2は乳がん幹細胞の増殖制御機構に深く関わっている可能性がある。この現象をさらに検証するために、乳がん患者由来の臨床検体細胞を用いた実験を行なった。その結果、解析を行なった4名の患者細胞すべてにおいて、IGF2はsphereの形成を促すことが確認された。このことはIGFシグナルが乳がん細胞のsphere形成に普遍的に関わることを示す結果である。またIGF2で処理したMCF7細胞と無処理群のマイクロアレイ解析を行い、IGF2の刺激によって発現変化する遺伝子singatureを同定した。このsignatureと患者予後との相関を解析すると、がんの再発や転移と関わっている事がわかった。さらにIGF2刺激によりID3の発現が強く上昇することを見出し、ID3をノックダウンするとsphereの形成が阻害されることから、IGF2シグナルはID3を介してsphere形成を誘導していることが示唆された。以前の我々の研究ではErbBシグナルが乳がん幹細胞の維持/増殖において重要であることを明らかにしているが、今回のIGF2シグナルの発見はがん幹細胞制御における増殖因子シグナルの重要性を再確認させるものである。これらの知見をもとにいくつかの共同研究を進めた結果、EGFRのリガンドであるepiregulinもglioblastomaのsphere形成能を促進することが分かった。これらの結果は増殖因子シグナルをターゲットとしたがん幹細胞標的療法を確立する必要性を示すものであると考えられる。乳癌幹細胞はEGFなどを加えた無血清培地による浮遊培養を行なうと、sphereという直径100μm程度の球状浮遊細胞塊を形成するが、これまでの解析から、このsphere形成に転写因子NF-κBの活性が必要であることを見出している。本研究では、転写因子NF-κBがどの様に乳癌幹細胞の維持に関わっているかを明らかにすることで、乳癌幹細胞維持機構を包括的に理解することを目指している。そこでまず今年度は、sphere形成過程においてNF-κBが活性化するメカニズムを解析した。まず、乳癌の手術摘出検体から得られた細胞を使ってsphereを形成するための条件を詳細に調べた結果、ErbB3受容体型チロシンキナーゼのリガンドであるHRGが癌幹細胞集団のsphere形成を促進することを見いだした。また多くのヒト乳癌細胞株でもHRGがsphereの形成を促進する働きがあることがわかった。

さらに、HRG下流のシグナル伝達経路について調べたところ、HRG刺激によりErbB3受容体とErbB2受容体がヘテロダイマーを形成し、その下流でリン酸化酵素であるPI3K/Aktを介してNF-κBが活性化することがわかった。PI3KとNF-κBを抑制するとsphere形成が阻害されることから、HRGはPI3K/NF-κB経路を介してsphere形成を促進していると考えられた。また、MCF7細胞はNF-κBの抑制型mutantであるIκBαSRを強制発現させると、免疫不全マウスにおける腫瘍形成能が低下することから、NF-κBが乳癌幹細胞による腫瘍発生を制御していることが示唆された。これらの知見はErbB/PI3K/NF-κB経路による癌幹細胞制御機構を明らかにしたものであり、今後PI3KやNF-κB下流の標的遺伝子を明らかにすることで、癌幹細胞標的療法の確立につながることが期待される。今年度の研究からは、乳癌幹細胞の特徴のひとつであるsphere形成において、ErbBシグナルとIGFシグナルが重要な働きをしていることがわかった。具体的には、ErbB下流で発現変化する遺伝子群が乳がんグレードや再発、転移などを規定している可能性が示唆され、さらにErbB下流ではIGFシグナルがsphere形成能を制御していることを明らかにした。これらの結果は、増殖因子のオートクライン/パラクラインシグナルが乳癌幹細胞の維持に重要であることを示しているため、非常に興味深い知見である。また、これまでに乳癌臨床検体から乳癌上皮細胞を効率よく得て、in vitroにおいてsphere培養を行なう実験系を立ち上げていたが、昨年度はさらに検体組織をマウスへ移植したxenograftを作成する系の立ち上げを行なった。この系を用いて様々な遺伝子の解析を行なうことで、多くの乳癌幹細胞関連遺伝子を同定することができると考えている。また、がん幹細胞維持に重要なIGF2下流の標的分子を明らかにすることで、今後のさらなる研究展開も期待される。具体的にはIGF受容体ががん幹細胞に多く発現しているか?、IGF受容体の発現を抑制すると造腫瘍能が抑えられるか?、IGF下流の標的分子は何か?などの問題点が今後の課題であるが、現在までの研究の進捗としてはおおむね順調に進んでいると考えている。今年度の研究からは、乳癌幹細胞維持においてNF-κBが活性化する新たなメカニズムを明らかにすることができた。具体的には、乳癌幹細胞維持におけるNF-κB活性の制御因子として、ErbB受容体型チロシンキナーゼやリン酸化酵素PI3K/Aktを同定することができた。これらの結果は、増殖因子のシグナルと炎症シグナルのクロストークが乳癌幹細胞の維持に重要であることを示しているため、非常に興味深い知見である。また、乳癌臨床検体から乳癌上皮細胞を効率よく得ることや、そこから癌幹細胞集団を単離し、in vitroにおいてsphere培養を行なう実験系も立ち上げた。
波浪特性に基づいた大気一海洋間の二酸化炭素交換速度の評価法に関する研究

海洋観測塔でのフィールド観測を実施し,大気一海洋間CO2交換速度に及ぼす波浪特性の効果について検討を行った.海水中の溶存CO2分圧の測定にはLEDによる光学的原理に基づく液一液平衡式海洋CO2センサーを用いた.観測で得られたCO2フラックスおよび大気一海洋間CO3分圧差4ρCO2からCO2交換速度を算定した.CO2交換速度は風速67m/s付近から急激に増大し,波齢が大きいほど相対的に大きくなる挙動を示すことを確認した.また,従来の経験式と比較すると,本観測で得られた交換速度はかなり大きな値を示した.さらに,Woor(2005)and Soloviev et al.(2007)の知見に基づいて,砕波による乱流機構を取り込んだCO2交換速度のハイブリッドモデルに関する研究を進め,波齢によって風速依存性が変化する交換速度モデルの検討を行った.CO2交換速度に対する波浪場の影響について種々の知見が得られ,特に純粋な風波波浪場に対しては交換速度を定量化するための基本フレームを構築することができた。本研究では,京都大学防災研究所白浜海象観測所所有の田辺中島高潮観測塔においてフィールド観測を行う.本年度は,計測システムの整備ならびに大気側計測システムの観測塔への設置を行った.超音波風速温度計とオープンパス型赤外線ガス分析計(NDIR)を設置して,風速変動,温度変動,水蒸気濃度変動,大気側CO_2濃度変動の観測を開始した.測定データは,無線LANシステムによって地上の観測所に伝送され,20Hzの高周波数で記録されている.これらのデータを用いることによって,渦相関法および慣性散逸法による海洋上の運動量フラックス,CO_2フラックスを算定することができる.LEDによる光学的原理を用いた液-液平衡式CO_2濃度測定器について技術協力を受けている海洋研究開発機構と打ち合わせを行った.同研究機構の液-液平衡式溶存CO_2濃度測定器はブイに登載するタイプのものであるが,これを観測塔へ固定できるものへ改良し,次年度に観測塔に設置することになっている.また,海面画像データを取得するための計測システムの整備を行った.このシステムは高解像度のWEBカメラにより撮影した海面画像データを無線LANを介して観測所へ伝送するものであり,次年度に設置・運用する.さらに,大気-海洋間CO_2交換速度のモデル化に関する理論研究を実施した.その結果,乱流効果と砕波効果を分離して定式化するハイブリッドモデルが交換速度の摩擦速度依存性を表現する上で有効であることを確認した.次年度は,フィールド観測からCO_2交換速度の評価法を構築する基盤となる精度の高いデータセットを取得し,理論的検討と併せて交換速度を評価する上で有効な波浪特性量を明らかにする予定である.本年度,海洋中の溶存CO_2濃度を評価するために液-液平衡式海洋CO_2センサーの設置を行った.このセンサーは海洋研究開発機構の研究グループが開発したもので,海水中のCO_2とセンサー内部溶液中のCO_2を透過膜を介して液-液平衡状態にし,内部溶液のpHを分光学的な方法で測定することで間接的に海水中のCO_2分圧を算定するものである.これに大気側観測機器を加えることにより,沖合海洋観測塔における観測体制を整えることができ,波浪データを付随したCO_2交換速度あ観測値を取得することが可能となった.これらの計測システムを用いて大気側と海洋側の同時観測を実施した.大気中のCO_2フラックスの測定においては,渦相関法と慣性散逸法による同時併用を実施し,両者の測定値が統計的に一致する時間帯のデータを抽出することによって,測定誤差の小さなフラックスのデータセットを作成することができた.また,超音波波高計による水位変動測定の結果から,有議波高,ピーク波周期等を算定し,波齢等の波浪特性量を評価した.観測で得られたCO_2フラックスおよび大気-海洋間CO_2分圧差△pCO_2からCO_2交換速度を算定した.CO_2交換速度は平均風速67m/s付近から急激に増大し,波齢が大きいほど交換速度が相対的に大きくなる挙動を示すことがわかった.また,既存の経験式と比較すると,本観測で得られた交換速度の値はかなり大きな値を示すことを確認した.さらに,砕波による乱流機構を取り込んだCO_2交換速度のハイブリッドモデルに関する研究を進め,波齢によって風速依存性が変化する交換速度モデルの検討を行った.

このモデルは,CO_2交換速度の波浪依存性を説明できる有用なものと考えられる.最終年度は,海洋観測塔において得られた観測データに基づいて大気海洋界面における運動量および二酸化炭素フラックスを渦相関法と慣性散逸法の2つの手法によって算定し,各フラックスについて両手法の適合性に影響を及ぼす力学的要因を検討した.理想的な海面交換過程の場合,両手法の値は良く一致すると考えられるため,その適合性を乱す因子を調べることで,フラックスの主要な変動要因を明らかにすることができる.本研究では,そのような因子として,風速と二酸化炭素濃度の非定常性および波浪状態に着目した.その結果,両手法の適合性は,主風向に対する海面風応力の偏向度に顕著に依存することを明らかにした.さらに,主風向とうねりの伝播角との関係を調べた結果,風向に対してうねりが斜めに伝播する場合に風応力が偏向することを確認した.このことは,両手法の適合性,すなわち大気-海洋間の交換過程の変動機構にうねりの力学的作用が大きな影響を及ぼすことを示唆している.本研究を通じて,二酸化炭素交換速度に対する波浪場の影響について種々の有用な知見を得ており,特に純粋な風波波浪場に対しては波浪特性を考慮した二酸化炭素交換速度のハイブリッドモデルの基本フレームを構築することができたと考えられる.より実用的な交換速度モデルを確立するには,本研究において定式化した交換速度のハイブリッドモデルをうねりの作用場に拡張する必要がある.本研究の観測結果と従来の結果との定量的な差異について分析を行う必要があるが,CO_2交換速度を評価するための観測手法を整備することができており,おおむね当初の計画通りに研究は進展していると判断できる.24年度が最終年度であるため、記入しない。CO_2フラックスの評価法には未だ検討の余地があると思われるので,評価の際に使用されている仮定や経験定数を再考することによってフラックスの高精度化を試みたいと考えている.また,CO_2交換速度の評価モデルと観測値との適合性について検討を行い,波浪依存性を表現可能な新しい交換速度の評価法の構築を試みる予定である.24年度が最終年度であるため、記入しない。
exosomal microRNAをもとにした周産期予後マーカーの新規開発

目的:エクソソーム中に検出可能なmiRNAを出生直後の臍帯血から得,新生児予後に役立てる基礎実験とすること.方法:予定帝王切開を対象に,臍帯動脈血,臍帯静脈血を採血し血清からエクソソームを分離.さらにエクソソームからRNAを抽出した.RNAよりmiRNAをビオチン標識し,アレイ上にハイブリダイズ.アレイスキャナによりシグナルを検出.シグナルを解析用ソフトウェアを用い解析した.結果:臍帯動脈血,臍帯静脈血ともにエクソソーム由来のmiRNAを検出した.とくにC19MC由来のmiRNAの発現が認められたことから,母体・胎盤・胎児間miRNA loopの可能性が示唆された.本研究課題初年度である平成25年度は,研究計画にしたがい,分娩時に臍帯血を採取し,エクソソーム抽出試薬を用いてエクソソームを回収.totalRNAを得,電気泳動により,抽出産物中に低分子RNAが含まれていることを確認した.本研究課題2年目にあたる平成26年度は、分娩時臍帯血から血清分離後、エクソソーム抽出試薬を用いてエクソソームを回収。total RNAを得て、miRNAアレイを用いたマイクロRNAの解析を行った。本研究課題2年目にあたる平成27年度は、平成26年度に引き続き、研究協力者である石川源講師の指導のもと、分娩時臍帯血から血清分離後、エクソソーム抽出試薬を用いてエクソソームを回収。total RNAを得て、miRNAアレイを用いたマイクロRNAの解析を継続したが、前年度に引き続き、RNAの収量が少ないため、血清からのエクソソーム抽出に問題があると考え、収量増加のための基礎実験を繰り返した。繰り返す抽出操作を経て得られたサンプルは、抗CD63抗体によるImmunoblottingによって、エクソソームが抽出されていることを確認した。本研究課題の最終年度として以下の成果を得た。すなわち、抽出キットを用い、得られたエクソソームよりtotalRNAが抽出された。miRNA標識試薬により標識した後、アレイスキャナにより検出したmiRNAシグナルは、Tukey's biweight algorithmにより発現強度が示され、臍帯動脈、臍帯静脈ともに、miRNAを検出した。Gene Avg Signal (log2)により示された発現強度として、とくに強く発現している特定のmiRNAが確認された。また、One-Way Between-Subject ANOVAにより、臍帯動脈血由来と臍帯静脈血由来との比較において、特異的に強く発現しているmiRNAについて検討を行った。良好にエクソソームが回収されたサンプルからは、臍帯動脈血、臍帯静脈血ともに、C19MC (第19番染色体microRNAクラスター)由来のmicroRNA 49種類のいずれの発現も認められた。これにより、母体・胎盤・胎児間のmiRNA loopの可能性が示唆された。目的:エクソソーム中に検出可能なmiRNAを出生直後の臍帯血から得,新生児予後に役立てる基礎実験とすること.方法:予定帝王切開を対象に,臍帯動脈血,臍帯静脈血を採血し血清からエクソソームを分離.さらにエクソソームからRNAを抽出した.RNAよりmiRNAをビオチン標識し,アレイ上にハイブリダイズ.アレイスキャナによりシグナルを検出.シグナルを解析用ソフトウェアを用い解析した.結果:臍帯動脈血,臍帯静脈血ともにエクソソーム由来のmiRNAを検出した.とくにC19MC由来のmiRNAの発現が認められたことから,母体・胎盤・胎児間miRNA loopの可能性が示唆された.当初の計画では初年度後半からマイクロRNAプロファイリングを進める予定だったが、2年目(平成26年度)からのスタートとなった。アレイ解析を進めて来たが、シークエンサ解析の進捗が遅れている。医歯薬学予定していたアレイ解析が進捗しており、今後早期にシークエンサ解析も行われる予定である。本課題の計画研究期間としている3年間で目的を達成できるものと考えている。初年度後半に行う予定であった,miRNAのプロファイリングを行わなかった.理由:検体件数が不十分なため,試薬を効率的に用いるため,検体が一定量に達してからプロファイリングを行うこととしたため.本年度(平成26年度)に執行した研究に基づいて試薬等消耗品類を購入したが、研究進捗状況との兼ね合いから、試薬を購入した際に使用期限に基づいて適切に使用するため次年度使用額が生じている。研究課題2年目である平成26年度は,当初,研究課題初年度後半に行う予定であったプロファイリングを開始する.当初の研究計画通りに,胎盤特異的マイクロRNAが臍帯血中からも検出されるかどうか検討することになる.シークエンサ解析とアレイ解析の両手法により検討し,ディファレンシャル解析を行う.また,異常妊娠病態である,検体採取の対象を胎児発育不全,妊娠高血圧症候群に広げ,プロファイリングを行っていく.主にハイスループットシークエンサを用いたプロファイリングのための試薬等消耗品と、特異的マイクロRNAの発現解析の試薬等消耗品。さらに最終年度成果報告のための論文作成費等に用いる予定です。初年度後半に行う予定であった,miRNAのプロファイリングを行わなかったため.既に目的とする,臍帯血中のマイクロRNA抽出に成功しているが,試薬・機器使用に効率的にプロファイリングを行うには検体件数が不十分なため,検体が一定量に達してからプロファイリングを行うこととしたため.研究課題

2年目である平成26年度は,当初,研究課題初年度後半に行う予定であったプロファイリングを開始する.当初の研究計画通りに,胎盤特異的マイクロRNAが臍帯血中からも検出されるかどうか検討することになる.シークエンサ解析とアレイ解析の両手法により検討し,ディファレンシャル解析を行う.また,異常妊娠病態である,検体採取の対象を胎児発育不全,妊娠高血圧症候群に広げ,プロファイリングを行っていく.
Discorhabdin類の合成研究

銅触媒に代えても進行することを見いだしたパラジウム触媒を用いたダブルアミノ化反応を基軸としたDiscorhabdin Cの形式全合成は、これまでの方法に比べて圧倒的な短行程で実現可能でありDiscorhabdin類の合成に必要なピロロイミノキノン骨格を簡便に合成する方法を提供できた。これは多くの海洋性アルカロイドの網羅的合成にも展開できるポテンシャルを秘めている。しかし、合成終盤に低収率な変換が連続し、またスピロ環構築に際しては北らの方法を踏襲するなど独自性に乏しい点が問題であった。そこで、Discorhabdin類の網羅的合成を視野に入れた、スピロ環構築法について検討した。信頼性が高く天然物合成に広く用いられるHeck反応に着目した結果、高度に多官能基化された複雑な基質にも関わらず、反応は円滑に進行し、目的のスピロ環を高収率で与えた。ここからスピロジエノンへの変換も達成できた。これはDiscorhabdin Pの短行程合成への展開が期待できる。一方、スピロジエノンへの臭素原子の導入は困難を極めた。そこで、臭素原子を予め導入しておくことが可能なパラアルキル化について再考した。そして独自性をさらに追求すべく、これまでに自身が確立したオルトアルケニルイソシアニドのラジカル環化反応を基軸とするDiscorhabdin Cの合成ルートの抜本的な見直しを行った。その問題点として1重要中間体である三環性骨格の構築に多段階を要していたこと2臭素原子の導入に保護基の脱着を伴い工程数の増加の原因であったこと3スピロ環構築が低収率であったことが挙げられた。1はインドール骨格の反応性を巧みに用い増炭することで2は臭素原子を予め有するユニットを合成に導入することで解決できた。具体的には臭素原子の脱落を伴うことなく、鈴木宮浦カップリング反応を行うことができた12の融合により、これまで重要中間体の合成に25工程要していたところを17工程に削減することに成功した。一方3に関して詳細な検討を行い、2つの窒素原子の保護基をより強固なものに変更することにより、スピロ環構築における収率を大幅に向上させることに成功した。これらを総合することで、私は実用的観点からも効率的なDiscorhabdin Cの合成方法論を提供できた。Discorhabdin類の中で全合成を達成したものはDiscorhabdin Cのみであるが、他のDiscorhabdin類の合成に際し、必要な知見は十分に集めることができた。例えば臭素原子の数が異なるDiecorhabidn E, P Dには容易に展開可能であるし、不斉炭素原子を有するDiacarhabdin Aなどに関しても、既に進行することが明らかとなったHeck反応に不斉配位子を添加することで、容易に展開することが可能であると考えている。今後、芳香環のピロロイミノキノンへの温和な酸化を検討する。先述のスピロ環構築における収率向上のため強固な保護基を導入したが、これに伴い、続くピロロイミノキノンへの酸化が進行しなくなるという問題が生じた。これは、メチルエーテルの切断を行いフェノールとすることで、超原子価ヨウ素などを用いて温和かつ中性条件で酸化することが可能であろうと考えられる。これが困難だったとしても、適切な保護基の選択、順序構成の最適化を行うことで、問題を解決することが可能であると考えている。銅を用いた芳香族ダブルアミノ化反応は困難をきわめたため、配位子により錯体の安定化が期待できるパラジウムを用いたBuckwald-Hartwing反応によるアミノ化反応を検討した。すなわち2つの側鎖を有するジブロモベンゼンに対し、触媒量のテトラキストリフェニルポスフィンパラジウムを塩基存在下加熱したところ、予想通りダブルアミノ化反応が円滑に進行し、所望の三環性骨格を定量的に与えることに成功した。これによりピロロイミノキノン骨格合成に必要なユニットを一挙に簡便に合成することができることをしめした。ここからベンジル基の除去ならびに2段階の酸化を経ることでピロロイミノキノン骨格へと導いた。これに対しジブロモチラミンの付加脱離ならびにメトキシカルボニル基の除去を行い、北らの報告する重要中間体を合成した。すなわちDiscorhabdinCの形式全合成を達成した。これにより、福山インドール合成を基軸とした第1世代合成の工程数を大幅に削減する合成ルートの確立に成功した。しかしながら、本合成ルートでは合成の最終段階でスピロジエノン環を合成する際、北らの方法を踏襲しているため新規性に乏しく、また低収率かつ再現性に乏しいことから実用的観点からも満足いくものではなかった。そこで、効率的なスピロジエノン環の構築を目指し更なる検討を行うこととした。具体的には天然物合成において信頼性が高く汎用されるHeck反応に着目し、これを実現した。またこれまでに培った化合物の挙動に関する知見をいかし、合成ルートの抜本的な見直しを行った。市販の7-メトキシインドールから得られるフェノールを亜硝酸イソアミルでジニトロ化し、その生成物を酸性条件下水素添加反応の条件に付すことで2つのニトロ基を還元し、そのままラクタム形成を行うことで2つのニトロ基を差別化した。ここから、3段階の変換を経て環化前駆体へと導いた。これに対しパラジウム触媒を作用させたところ、所望のHeck反応が円滑に進行し、目的のスピロ骨格を高収率で合成することに成功した。

銅触媒に代えても進行することを見いだしたパラジウム触媒を用いたダブルアミノ化反応を基軸としたDiscorhabdin Cの形式全合成は、これまでの方法に比べて圧倒的な短行程で実現可能でありDiscorhabdin類の合成に必要なピロロイミノキノン骨格を簡便に合成する方法を提供できた。これは多くの海洋性アルカロイドの網羅的合成にも展開できるポテンシャルを秘めている。しかし、合成終盤に低収率な変換が連続し、またスピロ環構築に際しては北らの方法を踏襲するなど独自性に乏しい点が問題であった。そこで、Discorhabdin類の網羅的合成を視野に入れた、スピロ環構築法について検討した。信頼性が高く天然物合成に広く用いられるHeck反応に着目した結果、高度に多官能基化された複雑な基質にも関わらず、反応は円滑に進行し、目的のスピロ環を高収率で与えた。ここからスピロジエノンへの変換も達成できた。これはDiscorhabdin Pの短行程合成への展開が期待できる。一方、スピロジエノンへの臭素原子の導入は困難を極めた。そこで、臭素原子を予め導入しておくことが可能なパラアルキル化について再考した。そして独自性をさらに追求すべく、これまでに自身が確立したオルトアルケニルイソシアニドのラジカル環化反応を基軸とするDiscorhabdin Cの合成ルートの抜本的な見直しを行った。その問題点として1重要中間体である三環性骨格の構築に多段階を要していたこと2臭素原子の導入に保護基の脱着を伴い工程数の増加の原因であったこと3スピロ環構築が低収率であったことが挙げられた。1はインドール骨格の反応性を巧みに用い増炭することで2は臭素原子を予め有するユニットを合成に導入することで解決できた。具体的には臭素原子の脱落を伴うことなく、鈴木宮浦カップリング反応を行うことができた12の融合により、これまで重要中間体の合成に25工程要していたところを17工程に削減することに成功した。一方3に関して詳細な検討を行い、2つの窒素原子の保護基をより強固なものに変更することにより、スピロ環構築における収率を大幅に向上させることに成功した。これらを総合することで、私は実用的観点からも効率的なDiscorhabdin Cの合成方法論を提供できた。当初の計画であった銅によるダブルアミノ化は困難であったが、それをパラジウムに代用することで、触媒化を実現し、必要骨格を簡便に合成できるようになった。Discorhabdin類の中で全合成を達成したものはDiscorhabdin Cのみであるが、他のDiscorhabdin類の合成に際し、必要な知見は十分に集めることができた。例えば臭素原子の数が異なるDiecorhabidn E, P Dには容易に展開可能であるし、不斉炭素原子を有するDiacarhabdin Aなどに関しても、既に進行することが明らかとなったHeck反応に不斉配位子を添加することで、容易に展開することが可能であると考えている。今後、改良された合成ルートに従ってDiscorhabdin Cの効率的な全合成を達成する予定である。その際、スピロジエノンに対してのジブロモ化が立体障害の観点から困難となることが予想される。そこで、スピロジエノンの反応性を上げるべく、還元を行い、ジアリルアルコールとすることや、骨格自体の安定性を向上させるべく、保護基の検討を行う計画である。
マウス顎下腺の体内時計発振機構の解明と体内時計に制御される唾液腺機能分子の解析

ヒトの安静時唾液には、分泌量に昼夜差を示すことが知られている。しかしながら、その調節機構は明らかでない。本研究はマウス顎下腺を用いて、唾液腺機能に概日リズムを生じる機構を解明することを目的としている。マウスにおいて、生体内(in vivo)での顎下腺に発現する時計遺伝子(Per2、Bmal1)、時計制御遺伝子(Dbp)、唾液腺機能分子のうち、水チャネルであるAquaporin5 (Aqp5)に時刻依存的な発現変動を示すことを明らかにした。これに対して、糖質分解酵素Amylase (Amy)は発現に変動を示さなかった。Aqp5の発現はマウスの活動期である夜間に最大値を示した。このことから、唾液分泌量の日内変動にAqp5の発現変動が関与していると考えられた。また、マウスから顎下腺を摘出して培養し、生物発光を指標としたPER2の発現変動を連続的に測定した結果、明瞭な概日リズムを示した。このことは、顎下腺に固有の概日リズムが存在する事を示している。顎下腺に転写・翻訳フィードバックループによる分子時計機構が存在するかを明らかにするため、遺伝子改変発光レポーターマウス(Per2::lucknock-in mouse)から顎下腺を摘出、培養を行い、生物発光を指標にして経時的に培養顎下腺を回収しRNAを抽出後、定量PCRを行った。その結果、時計遺伝子(Per2、Bmal1)、時計制御遣伝子(Dbp)の発現に概日変動を示した。Per2とBmal1の発現パターンが、互いに逆位相となっていたことから、顎下腺に分子時計機構が存在する事が明らかとなった。現在、唾液腺の時計機構に発現が制御される機能分子の解析を行っている。本研究課題は、唾液腺機能に概日リズムを生じる機構を解明することを目的としている。平成25年度の研究により、マウス顎下腺に固有の概日リズムが存在する事を明らかにした。また、胎生期顎下腺の発生過程において、PER2タンパク質発現に概日リズムが生じる過程を解析した。研究は、おおむね計画通りに進んでいると考えられる。マイクロアレイ解析を行い、唾液腺において『時間依存的に発現が変動する』、『発現に変動を示さない』遺伝子を網羅的に解析し、定量PCRを行う。唾液腺遺伝子の発現変動を解析し、唾液腺機能に概日リズムを生じる機構を解明する計画である。