hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
スマートフォンを用いた脳波・視線のオンライン解析による知的生産性の客観評価

本研究の目的は,スマートフォンのみで脳波と視線を簡単に同時計測し,建物内の環境および知的生産性をオンライン評価するシステムを初めて構築する事である。最終年度までに,スマートフォンのみで脳波と視線を同時に計測するシステムを構築し,興味・関心,集中,ストレス度をオンライン評価する新しいスマートシステムを構築した.脳波と視線情報を用いて執務環境における知的生産性の新しい定量評価を確立した.第一目標であった,脳波を用いた建物内における集中度実験を行い,集中度の変化を時系列に得ることができた.第二目標のアンケートを用いることなく,脳波の計測からその人の興味関心,集中,眠気,ストレスをオンラインで取得するための定義付けを行うことができた.第三目標に置いた,分解能よく視線を計測する装置の開発は,分担者によって注視点検出などを行うことができた.以上の理由から,概ね順調に進展している.しかしながら,現段階では実験回数が10回程度であり,より多くの実験を重ねることが必要かつ,人の納得度などのエビデンスを取得する必要があると考えている.平成28年度は実際の施設を用いた作業効率に基づく知的生産性評価のための実験に展開し,知的生産性を高める因子(望ましい環境)の特定を行う事を目的とする.この時,実際の施設を使う事が出来る.この施設は,室温や照明,自然光・風の入り具合,湿度,周囲の音の調整を自由に変更出来る事から,これらと脳波および視線情報から得られる興味・関心,集中,ストレスとの相関性を解析し,作業効率から得られる知的生産性を左右する室内因子を求める事を目的とする.これにより,集中度を上げる室温や湿度,照明の傾向,さらには時間による変化やストレス度との関係も探る予定である.生体信号解析平成27年度は脳波と視線情報を用いて興味・関心,集中,ストレス度をオンライン評価する新しいスマートシステムを構築し,執務環境における「知的生産性」の新しい指標を定量評価する方法を検討し,確立する事を目的とする.平成26年度が屋内の環境を対象にしていたのに対して,27年度は労務作業室内に限定し,環境によって変化する作業の効率を集中度とストレス度を以って評価する方法を提案する.作業執務者は,ヘアバンド型の脳波計測装置を付け,締め付け感や嫌悪感が無いことを確認した後,通常の業務に従事してもらう.この時に使用する脳波計測器,集中度およびストレス度解析装置は既に申請者が提案し,評価検証済みの装置を用いる.(特許出願済)手元作業の視線を無理なく追跡できるように,26年度に開発予定の分解能が高い視線追跡を手元の作業検出用に改良し,実際の執務環境や学習環境において,脳波から得られる集中度,ストレス度と視線の動きの相関によって得られる情報から興味・関心がある時,集中時,ストレス時の視線の動きの特徴を検出する予定である.さらに実験によって得られた結果の信頼性を検証するために,実際の環境で知的生産性について50名について実験を行う予定あである。また,人のサーかディアンリズムと執務内の知的生産性についての相関なども検討し,知的作業に最適な環境の定義確率を進めていく予定である.前年度に集中度とストレス度を屋内で測定するために,被験者を集めてアルバイトとして支出する予定であったが,当初は1人の被験者1回の測定を人数を多く取ることを予定していた.
SREBP-1の制御機構の解明と抑制薬の開発

糖尿病は、インスリン分泌低下の遺伝的素因に、高脂肪食・運動不足などの生活習慣により惹起された肥満によるインスリン抵抗性の負荷が加わり発症する。インスリン受容体基質(IRS)-2の欠損マウスを作製したところ、肝臓でのインスリン抵抗性に加え膵β細胞の増殖不全により糖尿病を発症した(Diabetes 49 : 1880-1889, 2000)。さらに、肝臓での遺伝子発現をDNAチップで包括的に調べたところ、脂肪酸の合成に関与するSREBP-1遺伝子が上昇し脂肪肝を呈していることを見出した(J. Biol. Chem., 276 : 38337-38340, 2001)。この原因として、IRS-2欠損マウスのレプチン抵抗性がSREBP-1遺伝子発現の上昇に関与することを明らかにした。過食・高脂肪食・運動不足のエネルギー過剰の肥満・インスリン抵抗性2型糖尿病には、高率に脂肪肝が合併する。脂肪肝が合併するヒト肥満・2型糖尿病の場合、レプチン抵抗性の関与も考えて病態を把握すべきものと考えられた。
放射線感受性におよぼすBag-1およびYama/CPP32発現の意義

1.T1-2口腔扁平上皮癌のBAG1発現北海道大学医学部口腔外科にて治療された扁平上皮癌22例を対象としBAG1発現を免疫組織学的方法により検索した結果BAG1の強度染色が22例中13例に認めた(59%)。BAG1蛋白は特に結合織へ浸潤する癌細胞の細胞質に認められた。Western blottingの定量の結果は免疫染色と対応していた。BAG1蛋白の高度発現はリンパ節転移陽性例で高頻度に認めた(89%)。リンパ節転移のない例での高度発現の頻度は38%であり両者に優位さを認めた(P<0.03)。また病理学的悪性度に関してGradelの5例中11例(45%)に高度発現をみたのに対しGradellでは11例中8例(73%)にみとめた(P<0.02)。2.細胞株を用いた照射実験1.T1-2口腔扁平上皮癌のBAG1発現北海道大学医学部口腔外科にて治療された扁平上皮癌22例を対象としBAG1発現を免疫組織学的方法により検索した結果BAG1の強度染色が22例中13例に認めた(59%)。2.細胞株を用いた照射実験Bag-1はBcl-2と結合する蛋白でアポトーシスを抑制する働きをもつ。同蛋白の発現の程度が腫瘍の進展様式および放射線治療への反応に影響をあたえると考えられる。放射線治療前の早期(T1-2)口腔扁平上皮癌22例においてBag-1の発現を調べ、臨床所見および予後との相関を検討した。免疫組織染色およびWestern blotによりBag-1を検索し、発現の強度とTNM分類、WHOによる組織分化度、組織診断時の浸潤様式(外向性、内向性)、後発リンパ節転移について比較検討を行った。Bag-1の強度発現は22例中13例(59%)に認められた。初診時リンパ節転移陽性6例および後発リンパ節転移3例計9例中8例(89%)にBag-1の強度発現が見られたのに対し、リンパ節転移陰性例では13例中5例のみ(38%)に同蛋白の強度発現がみられた(P<0.03)。またBag-1の強度発現はWHO組織分化度1の症例の45%に見られたのに対し分化度11では72%の症例にみとめ(P<0.02)Bag-1の強度発現がリンパ節転移および組織額的悪性度に関与していることが示唆された。また培養細胞をもちいた実験として放射線に抵抗性であるHSC3,HSC4および放射線に感受性が高いKB,SCC9の4培養細胞について、Bag-1の発現をWestern blotで検索した。Bag-1の強度発現がHSC3,HSC4で認められたのに対し、KB,SCC9では発現は弱く、放射線感受性にBag-1が関与している可能性が示唆された。1.細胞株を用いた照射実験2.扁平上皮癌における癌増殖遺伝子c-erb2発現と放射線治療効果107例の子宮頚癌のパラフィン切片を用い、免疫組織染色によるc-erb2蛋白の発現を検討した。c-erb2の発現は31%の症例に認めた。C-erb2陽性郡の5年生存率は33%であり陰性郡の56%に比べ有意に低い値を示した(p<0.02)。また陽性郡の無遠隔転移生存率は5年で36%と陰性郡の69%に比べ有意に低い値を示した(p<0.001)。一方照射野内再発cerb2は関与していなかった。これらの知見は個々の症例での治療計画の最適化に応用可能と思われる。
非平衡定常状態における熱統計力学の構築

非平衡定常状態における熱統計力学の構築に関して、以下の研究成果を得た。(1)液体中にあるマイクロメータサイズの粒子が周期ポテンシャルの影響をうけつつ一定の非平衡駆動力が与えられた場合に実現する非平衡定常状態をとりあげた。微分易動度と拡散係数の比が系の長距離の振舞を支配する有効温度として捉えれることを理論的に示し、具体的に、微分易動度と拡散係数を測定せずに、その比である有効温度を測定できることを示した。この成果は論文投稿中である。(cond-mat/0309618)。(2)外力で駆動された格子気体模型を例にして、上記の結果の多体系への拡張を考察した。微小ポテンシャル場の応答の性質から有効温度を定義すると、それは一般には複素数になる。そのさい、線形応答領域での多体系のEinstein関係式において、環境の温度をその複素有効温度の実部にいれかえたものが非平衡定常状態で成り立つことを数値実験と現象論的解釈により示した。また、複素有効温度の虚部は、密度揺らぎの伝搬速度、易動度、密度揺らぎと関係することも明らかにした。この成果は論文投稿直前にある。(3)ついで、線形応答理論の揺動散逸定理がどのような形で平衡からはなれたところにどのように継承されるのかを調べた。通常の応答関数の他に随伴応答関数という新しい応答関数を導入することにより、この2種類の応答関数と時間相関関数が複素有効温度で結ばれることを見出した。非平衡定常状態における統計力学の構築に関して、以下の研究成果を得た。(1)外力で駆動された格子気体模型に関して、拡張された熱力学関数があることを数値実験により明らかにした。さらに、この自由エネルギーがある特定の密度揺らぎと揺動散逸関係を満たすことも見出した。これらの結果は線形非平衡領域に限定されるものでなく、いままで各論的に議論するしかなかった非線形領域の非平衡系に統一的な体系があることを強く示唆するものである。これらの結果をまとめたものを論文として投稿中である。(2)揺らぎの加わった流体方程式を非平衡条件下で考察し、状態方程式にあらわれる異常性を議論した。非平衡条件下の圧力が非平衡度に関してる非解析的であることと圧力の示強性が破れるというふたつの異常性を同じ枠組で統一的に理解できることを示した。以上の理論的な考察をまとめたものを論文として投稿中である。(3)剛体球多体系の分子動力学法により熱伝導数値実験をおこなった。温度と化学ポテンシャルが連続、熱流が不連続につながる境界面ではたらくゼロでない浸透圧を測定すれば、局所平衡からの破れを検出することになり、その定量的な関係から拡張された熱力学関数の存在の是非を明らかにできる。現在、浸透圧の確認はできているが、定量的な関係を議論するところまではいたっていない。
コラーゲン誘導関節炎の発症機序の解析とその制御の研究-T細胞の抗原認識レベルに於けるマニピュレーション

コラーゲン誘導関節炎(CA)易発症性のBB/DRラットがそのクラスIIMHCのRTIDβ鎖のpolymorphic領域に有するRASS(ヒト慢性間節リウマチ(RA)患者に相関性が高いHLAハプロタイプに共通してみられる配列)の合成ペプチドを使って抗RASS単クローン抗体(KS-3)を作製した。このKS-3はII型コラーゲン(IIC)感作BB/DRラットのin vitroのIIC刺激による増殖反応を阻止し、フローサイトメトリーによってこのラットの膵臓細胞に結合性を有すると共に、この精製抗体100μgを1回IIC感作時に静注すると、BB/DRラットのCA発症を抑制する活性を有しており、このことから、本ラットにおけるCA発症においてRASSが抗原提示に使用されている可能性が強く示唆された。2)関節炎誘起性T細胞エピトープ(AE)についてDBA/1マウス由来T細胞クローンK-102は、IICのCNBγフラグメントCD11(アミノ酸278個)と反応する。CB11中にはT細胞エピトープが少なくとも5個存在するが、我々は20merの合成ペプチドとの反応性などから、CB11のN末端6081にK-102が認識するAEが少なくとも1つ存在することを明らかにした。さらにIIC60-81を構成するアミノ酸とI型コラーゲン(CA誘導性を欠く)のα1(I)鎖の対応する残基とが相似性が高くなるようにsite-directed substitutionを行ったアナログペプチドを4種類合成して調べたところ、そのうちの1つ、IIC60-81(S68、78、80)(IIC60-81の68P→V、78P→Aおよび80P→Aに置換)は、DBA/1マウス(H-2^q)の脾細胞を抗原提示細胞(APC)とし、K-102の増殖反応を指標としたcompetitive antigen presentation assayおよびwildペプチドのIIC60-81で免疫する際、このIIC60-81(S68、78、80)を加えて免疫すると、CAの発症が有意に抑制されることから、この合成ペプチドはAPCレベルでMHCアンタゴニストとして作用している可能性が強く示唆された。
ＭＲＩ所見による新たな食道癌治療効果判定法の確立

本研究では、食道癌に対する放射線・化学療法の治療効果を予測する画像パラメーターについて研究した。予備研究として食道造影での治療効果判定に関する研究をおこなった。この結果、治療前後での狭窄率の変化が治療効果と相関していることが判明した。主研究はMRI拡散強調画像を用い、治療効果判定について検討した。登録症例31例のうち、20例で治療効果判定が可能であった。根治的放射線化学療法を行った10例では、治療前および治療後のMRI所見と治療効果との関連は認められなかった。術前放射線化学療法を行った10例では、治療後のADC値と治療前後での変化率が、治療効果と有意に関連していた。【目的】食道癌の放射線・化学療法の治療効果を判定する際には、一般的にX線所見やCTなどの形態情報を判断材料として用いるが、MRIでは細胞レベルの変化を画像化し、よりミクロな形態変化を評価することが可能である。今回の研究の目的は、食道癌の治療において、MRI検査を用いた効果判定を用い、病勢や治療効果をを正確に評価し得る指標を構築することである。【研究実施計画】対象は術前補助療法を含め放射線・化学療法を予定された食道癌患者とした。治療前・治療中・治療後の時点で、MRIを行い通常のパラメーターに加え、見かけの拡散係数(ADC)を計測した。【結果】本研究期間に31名の患者が登録された。平均年齢72歳、男女比は24:8であった。臨床病期はII期が1例、III期が5例、IV期が25例であった。治療は手術前治療が10例、根治的治療が21例であった。1.術前治療:治療前のADCは、奏功群(1.04-1.20)と非奏功群(0.96-1.39)で有意差を認めなかった。治療後のADCは、奏功群(1.66-2.12)が非奏功群(1.07-1.80)より有意に高い傾向がみられた。2.根治的治療:治療前のADCは、CR群(0.81-0.96)が非CR群(1.13-1.54)より有意に低い傾向を認めた。治療後のADCは、CR群(0.96-1.64)と非CR群(0.97-1.24)で有意差を認めなかった。【考察】術前治療において、治療後のADCは、奏功群が非奏功群より高い傾向がみられた。これは治療により腫瘍内の壊死やアポトーシスにより拡散制限が軽減するためADCが上昇すると推察されており、従来の報告に合致する。現段階で、食道癌に対するMRIでの治療効果判定が可能であることが示唆された。さらに治療効果や予後予測因子となるパラメータを検索するため、症例数を増やし検討を重ねたい。食道癌は、周囲臓器への浸潤などにより手術が困難となった場合、放射線・化学療法などの集学的治療が施行される。これらの集学的治療による効果判定は、その多くが食道癌取扱い規約に定まるX線所見や内視鏡所見、すなわち腫瘍のマクロな形態変化に基づいて評価されているのが現状である。近年人体の躯幹部に対する応用が進むMRI検査は、細胞レベルの変化を画像化する診断法であり、腫瘍のよりミクロな形態変化を評価することが可能である。今回の研究の目的は、食道癌の治療に於いて、X線検査や内視鏡検査を用いた現行の効果判定とMRI検査を用いた効果判定を比較検討し、病勢をより正確に評価し得る指標を構築することである。登録症例42例のうち、24例がADC(みかけの拡散係数)を計測可能であった。根治的放射線化学療法を行った12例では、治療前および治療後のMRI所見と治療効果との関連は認められなかった。術前放射線化学療法を行った12例では、治療後のADC値と治療前後での変化率が、治療効果と有意に関連していた。食道癌は予後不良な疾患であり、手術不能な進行癌となった場合には放射線・化学療法などの集学的治療が施行される。放射線・化学療法の治療効果を判定する際には、一般的にX線所見やCTなどの形態情報を判断材料として用いるが、精度に劣ることから最近では重要視されない傾向にある。

近年MRIは生体の細胞レベルの変化を画像化し、よりミクロな形態変化を評価することが可能となってきており、悪性固形腫瘍の治療効果を予測できるという知見がある。今回の研究の目的は、食道癌の治療においてMRIを用いた効果判定を用い、治療効果をを正確に評価・予測し得る指標を構築することである。対象は未治療の食道癌で、術前補助療法を含めた放射線・化学療法を予定された患者とした。治療前・中・後の時点で、MRIを行い通常のパラメーターに加え、見かけの拡散係数(ADC)を計測した。治療効果判定は食道癌取扱い規約に基づき行うこととした。本研究期間に11名の患者が登録された。臨床病期はIII、IVa期がほとんどであった。治療は術前放射線化学療法が4例、根治照射が7例であった。治療後の結果は、手術例で全例grade1、根治照射例では奏功例が4例、非奏功例が3例であった。平均ADCは、奏功例が治療前1.03、治療後1.40、非奏功例が治療前1.25、治療後1.26であった。本研究の結果、治療前ADC値は非奏功例の方がやや低く、一般に治療前のADCが低い方が化学放射線治療効果が高いとする従来の報告に合致した。また治療に伴うADCの変化は、奏功例ではADCの上昇、非奏功例ではADCは不変であり、治療開始後早期からADCの増加率が高い場合は治療効果も高く,ADCが変化しない場合や減少する場合は治療効果が低いとする報告に合致した。以上、現時点ではあるが、食道癌のADC値を測定することで、治療効果を予測できる可能性が高いことが示唆された。食道癌の治療として、放射線治療を用いずに化学療法を行う方法が標準となっているため、術前照射の症例数が少ない。これまでに得られた症例に関しては、予想以上に良い結果が得られているが、対象症例が予想以上に少ないため、十分な解析を行えるほどの登録患者数に達していない。今後も、これまで通りの方法で研究を推進していく予定である。これまで通りに研究を進めていく。ただし上記に示す通り症例登録が十分とはいえない状況にある。大学病院では多数の診療科があるため、対象となる患者の登録や拾い上げが難しいことが大きな理由である。したがって今後は、他の診療科にも症例情報の提供などを協力してもらい、登録症例数を増やしていく予定である。データ解析用のPC購入等、成果発表のための学会出張の旅費等に使用予定である。これまでに得られたデータについて解析し、可能であれば学会等での発表、論文作成をする予定である。研究費は、データ解析に使用するPC、ソフトウェア、学会出張費、論文構成費、論文別刷り購入等に使用する予定である。
EBウイルス関連致死的血球貪食症候群の動物モデルの病態解析とその治療法の検討

1.サルEBV関連virus (Herpesvirus papio (HVP))感染によるウサギの血球貧食症候群を伴う致死的リンパ増殖異常症の本態が、反応性か腫瘍性かの検討HVP誘発リンパ球増殖異常症病変(LPD)をTCR-JβprobeによるSouthern blottingにより解析すると、polyclonalであり、基本的には反応性であることが判明した。さらに、immunomagnetic cell sortingにより採取したCD4+, CD8+, CD79a+の各リンパ球がすべてHVP-EBER1(+)Iであることからもpolyclonalであることが裏付けられた。2.サルEBV関連virus (Herpesvirus papio (HVP))誘発ウサギ血球貧食症候群を伴う致死的リンパ増殖異常症モデルの経時的変化の検討経時的に採取された血液像、血清学的検査と末梢血中のウイルス量の定量的測定をreal-time PCRで行った結果、ウイルス抗体価とウイルス量は逆相関する傾向を示して変動し、死亡前にはウイルスが急増してウイルス血症になり、リンパ節や脾臓のリンパ増殖異常症(LPD)が死亡前約1週間以内に急激に形成されることを明らかにした。In vivoのLPDおよびLPD由来のリンパ球細胞株では、ウイルス遺伝子発現型のそれぞれtype IIIとtype IIを示した。3.HVP誘発ウサギ血球貧食症候群を伴う致死的リンパ増殖異常症モデルの治療法の検討ウサギがHVPに感染したことを確認後、無治療群と抗ヘルペスウイルス薬(vidarabine)と化学療法(CHOP)の薬剤を用いた治療群を比較検討した結果、vidarabineは無効で、CHOP療法は、延命効果が見られたが、救命できなかった。この実験中に、予期せず、HVP感染性リンパ球増殖病変の中心部にHVP陰性のリンパ腫が発生することを見つけた。1.サルEBV関連virus(Herpesvirus papio(HVP))感染によるウサギの血球貧食症候群を伴う致死的リンパ増殖異常症の本態が、反応性か腫瘍性かの検討HVP誘発リンパ球増殖異常症病変(LPD)をTCR-JβprobeによるSouthern blottingにより解析すると、polyclonalであり、基本的には反応性であることが判明した。さらに、immunomagnetic cell sortingにより採取したCD4+,CD8+,CD79a+の各リンパ球がすべてHVP-EBER1(+)Iであることからもpolyclonalであることが裏付けられた。通常の初代培養ではLPDよりウサギ細胞株は樹立できなかったが、LPDのscid移植腫瘍よりIL-2依存性HVP感染細胞株を6株樹立した。これらはT-cen(CD8+)の表現系を示し、1株を除き正常ウサギ核型を持ち、in vitroでは潜伏感染II型である。Nude miceに3株が造腫瘍性を示した。これらの解析よりHVP-induced LPDには、IL-2やscid miceで選択されて腫瘍化するT-cenll cloneが一部含まれていると考えられる。また、HVP感染ウサギの経時的な血液やリンパ節、脾臓の病理学的変化を調べて、LPDが死亡前約1週間以内に急激に形成されることを明らかにした。これらの成果は、一部は著書(Research Advances in Virology 2002,2)や総説(Histol Histopathol.2002)に公表した。HVP感染細胞のHVP-EBER1をISHで検出する独自のシステムを確立して、感染細胞の局在を正確に検出できた。これらの成果をAm J Patholに投稿した。2.in vitroのHVP感染による家兎血液細胞の解析とimmortalization/transformation系の確立とその性状の検討

家兎の脾臓や末梢血白血球にHVPをin vitroで感染させて、感染細胞の種類の同定と増殖能、アポトーシスを調べ、さらに、immortalization/transformationさせた細胞株を樹立しようと試みて、その詳細なcharacterizalionを行うとしたが、ほとんど1-2か月以内に死滅してしまった。3.EBV関連ウイルス(HVP)誘発ウサギ血球貧食症侯群を伴う致死的リンパ増殖異常症モデルの経時的変化の検討家兎リンパ腫発生過程で経時的に採取された血液像、血清学的検査と末梢血中のウイルス感染細胞のPCRよる高感度の検出と血液中のウイルス量を定量PCRで測定を試みている。1.サルEBV関連virus(Herpesvirus papio(HVP))誘発ウサギ血球貪食症候群を伴う致死的リンパ増殖異常症モデルの経時的変化の検討家兎リンパ腫発生過程で経時的に採取された血液像、血清学的検査と末梢血中のウイルス感染細胞のPCRよる高感度の検出と血液中のウイルス量の定量的測定を行った結果、ウイルス抗体価とウイルス量は逆相関する傾向を示して変動し、死亡前にはウイルスが急増してウイルス血症になり、リンパ節や脾臓のリンパ増殖異常症(LPD)が死亡前約1週間以内に急激に形成されることを明らかにした。In vivoのLPDおよびLPD由来のリンパ球細胞株では、ウイルス遺伝子発現型のそれぞれtype IIIとtype IIを示した。これらの成果の一部をAm J Pathol,2003に公表した。2.HVP誘発ウサギ血球貪食症候群を伴う致死的リンパ増殖異常症モデルの治療法の検討ウサギがHVPに感染したことを確認後、無治療群と抗ヘルペスウイルス薬(vidarabine)と化学療法(CHOP)の薬剤を用いた治療群を比較検討した結果、vidarabineは無効で、CHOP療法は、延命効果が見られたが、救命することはできなかった。この実験中に、予期せず、HVP感染性リンパ球増殖病変の中心部にHVP陰性のリンパ腫が発生することを見つけて報告した(Histol.Histopathol.2003)。
慢性関節リュウマチ角膜におけるサイトカイン産生異常と創傷治癒遅延

1)慢性関節リウマチモデルマウス角膜におけるIL-1βの発現慢性関節リウマチ(以下RA)における関節破壊に深く関与するIL-1βがRAの角膜〓形成に関与するか否かを検討する目的で、RAモデルマウスであるMRL/lprを用い角膜におけるIL-1β発現を半定量RT-PCRと免疫組織科学を用い検討した。この結果、MRL/lprにおいて対照マウスと比べRNA,タンパクレベル双方で有意にIL-1βの発現が亢進していた。2) RAマウス角膜創傷治癒正常化の試みMRL/lprマウスにエキシマレーザー角膜表層切除を行い、角膜創傷治癒速度をビデオカメラと画像解析を用いて検討した。この結果、MRL/lprマウスでは対照に比べ創傷治癒速度が有意に遅延したが、IL-1レセプターアンタゴニスト投与により、創傷治癒速度が有意に促進された。このときMRL/lprでは持続してIL-1mRNA発現し、metalloprotainase 1(MMP-1)も同じく持続的に発現していた。3) RA患者の涙液中サイトカイン定量ヒトRA患者と健康成人の涙液を採取しIL-1β濃度をELISA法で検討した。RA患者涙液中には平均2370pg/mlのIL-1βが検出されたのに対し、正常者では平均82.7pg/mlに留まっていた。4)リウマチ角膜における形態学的異常の可能性MRL/lprにおけるIL-1βを中心としたサイトカイン異常が角膜組織に与える影響について、形態学的に検討した。角膜を光学顕微鏡および透過型電子顕微鏡により観察した。この結果、MRL/lprでは対照に比べ角膜上皮細胞層が角膜全層に占める割合は0.184であるのに対し、対照では0.278でMRL/lprで有意に上皮の菲薄化がみられ、また上皮基底膜細胞層の細胞密度が低下し円形から立方形を示し翼細胞層の形成が不明瞭となっていた。1)RAマウス角膜における炎症性サイトカインの発現慢性関節リウマチ(以下RA)のモデルマウスであるMRL/lprマウスと、対照としてC57BL/6マウスを用い半定量的RT-PCRによって角膜のIL-1β、IL-1α、TNFαの発現量を比較した。この結果、IL-1βの発現はMRL/lprマウスで有意に高かったが、IL-1α、TNFαmRNA発現量には、マウス間に差を認めなかった。2)RAマウス角膜創傷治癒正常化の試みRAモデルマウスであるMRL/lprマウスと、対照としてC57BL/6マウスを用いてエキシマレーザー角膜表層切除を行い、ビデオカメラと画像解析を用いて創傷治癒速度を計測した。この結果、MRL/lprマウスでは対照群と比較して創傷作成後6時間より有意に角膜創傷治癒遅延が認められた。また同様のモデルを用いてIL-1レセプターアンタゴニスト点眼剤を創作成後1時間毎に点眼した。この結果、創傷作成6時間から12時間後における創傷治癒速度が有意に促進した。1)慢性関節リウマチモデルマウス角膜におけるIL-1βの発現慢性関節リウマチ(以下RA)における関節破壊に深く関与するIL-1βがRAの角膜潰瘍形成に関与するか否かを検討する目的で、RAモデルマウスであるMRL/lprを用い角膜におけるIL-1β発現を半定量RT-PCRと免疫組織科学を用い検討した。

この結果、MRL/lprにおいて対照マウスと比べRNA,タンパクレベル双方で有意にIL-1βの発現が亢進していた。2) RAマウス角膜創傷治癒正常化の試みMRL/lprマウスにエキシマレーザー角膜表層切除を行い、角膜創傷治癒速度をビデオカメラと画像解析を用いて検討した。この結果、MRL/lprマウスでは対照に比べ創傷治癒速度が有意に遅延したが、IL-1レセプターアンタゴニスト投与により、創傷治癒速度が有意に促進された。このときMRL-lprでは持続してIL-1mRNAが発現し、met alloprot ainase 1(MMP-1)も同じく持続的に発現していた。3) RA患者の涙液中サイトカイン定量ヒトRA患者と健康成人の涙液を採取しIL-1β濃度をELISA法で検討した。RA患者涙液中には平均2370pg/mlのIL-1βが検出されたのに対し、正常者では平均82.7pg/mlに留まっていた。4)リウマチ角膜における形態学的異常の可能性MRL/lprにおけるIL-1βを中心としたサイトカイン異常が角膜組織に与える影響について、形態学的に検討した。角膜を光学顕微鏡および透過型電子顕微鏡により観察した。この結果、MRL/lprでは対照に比べ角膜上皮細胞層が角膜全層に占める割合は0.184であるのに対し、対照では0.278でMRL-lprで有意に上皮の菲薄化がみられ、また上皮基底膜細胞層の細胞密度が低下し円形から立方形を示し翼細胞層の形成が不明瞭となっていた。
強力な細胞毒性を示す新奇ペプチドチャネルにおける未知のイオン透過・制御機構

強力な細胞毒性を示す海綿由来のチャネル形成ペプチド・ポリセオナミドB(pTB)のイオンチャネル特性を、人工脂質平面膜を用いて解析した。その結果、イオン透過路には同時に2つのイオンが入らないこと、ゲート開閉速度が著しく速く、膜電位依存的であることがわかった。pTBでは、類似構造を持つグラミシジンA (gA)チャネルとは異なるメカニズムでイオンが透過し、gAで見られるペプチドの会合・解離によるゲート開閉ではなく、ペプチド内の構造変化が透過制御に関与していると推定される強力な細胞毒性を示す海綿由来のチャネル形成ペプチド・ポリセオナミドB(pTB)の作用機序解明に向け、人工脂質平面膜を用いてpTBチャネルのイオン透過特性の詳細な解析を行った。pTBはβへリックスという特異な分子構造を持つが、pTB以外唯一のβへリックス型チャネルには抗生物質として知られているグラミシジンがある。グラミシジンA(gA)チャネルのイオン透過機構に関する知見は多く蓄積しており、これと比較することでpTBチャネル特有のイオン透過特性を明らかにしようと試みた。まず、イオン透過機構を考察する際の基本的情報であるチャネル内イオン数を検討した。イオン透過速度のイオン濃度依存性、および様々なモル比で2種イオンを混合した各溶液条件でのイオン選択性の変化を単一チャネル電流から解析した結果、pTBチャネル内に同時に複数のイオンは入らないことがわかった。gAチャネルはpTBチャネルより長さが短いが、同時に2つのイオンが入り得るので、両チャネル内イオン透過の背景に存在するメカニズムは異なる可能性が考えられた。そこで、離散状態マルコフモデルを用いて実験データを解析したところ、イオンがpTBチャネル内を透過する際にも、チャネル内の2つのイオン結合部位を介していることが示唆された。なぜpTBではこれら2つの結合部位にイオンが同時に結合することが無いのか、今後さらなる検討が必要である。また、pTBチャネルの電位依存的なゲート開閉特性についても詳細に解析し、開状態の寿命に電位依存性があることを明らかにした。さらに、開閉遷移速度がgAと比較して著しく速いことがわかり、pTBチャネルのゲート開閉には、gAチャネルのようなペプチドの会合・解離ではなく、ペプチド内の構造変化が関与していると推定された。この様なゲート開閉機構の例は他に無く、今後具体的な分子機構を検討していきたい。pTBでは、類似構造を持つグラミシジンA (gA)チャネルとは異なるメカニズムでイオンが透過し、gAで見られるペプチドの会合・解離によるゲート開閉ではなく、ペプチド内の構造変化が透過制御に関与していると推定される強力な細胞毒性を示す海綿由来のチャネル形成ペプチド・ポリセオナミドB(pTB)の作用機序解明に向け、本年度は人工脂質平面膜を用いてpTBチャネルのイオン透過特性の詳細な解析を行った。グラミシジンA(gA)チャネルのイオン透過機構に関しては、これまでに知識が多く蓄積している。したがって、pTB、gA両チャネルのイオン透過機構を比較することで、pTBチャネル特有のイオン透過特性を明らかにしようと試みた。まず、pTBチャネル内に複数のイオンが同時に入り得るか検討した。イオン透過時のチャネル内イオン数は、透過機構の考察に必須の基本的情報であり、実験的に単一チャネルのイオン透過速度のイオン濃度依存性、および様々なモル比で2種イオンを混合した各溶液条件でのイオン選択性の変化を解析することで推定した。その結果、pTBチャネル内に同時に複数のイオンは入らないことがわかった。長さ3.5 nmのpTBチャネルよりも1 nmも短いgAチャネルには同時に2つのイオンが入り得るので、両チャネル内イオン透過の背景に存在するメカニズムは異なることが明らかになった。また、pTBチャネルの電位依存的なゲート開閉特性についても詳細に検討した。pTBの単一チャネル電流を解析し、開状態の寿命に電位依存性があることを明らかにした。さらに、開閉遷移速度がgAと比較して著しく速かったことから、pTBチャネルのゲート開閉には、gAチャネルのようなペプチドの会合・解離ではなく、ペプチド内の構造変化が関与していることが推定される。本年度は、ほぼ当初の計画通り研究を進めることができた。具体的には、ポリセオナミドBチャネルのイオン透過特性の詳細を明らかにすることができ、また、その電位依存的なチャネル開閉機構についても新たな知見を得ることができた。これまでに明らかにしたポリセオナミドB(pTB)チャネルのイオン透過特性を基に、その背景に存在する透過モデルを推定することで、研究結果を一般化したい。また、pTBチャネルの細胞膜上での挙動特性について人工脂質二重膜系(リポソーム、脂質平面膜)を用いて解析を進め、どのような機序で細胞毒性発現に至るのか明らかにしていきたい。pTBチャネルの脂質二重膜上での挙動解析のために様々な合成リン脂質、蛍光試薬などの消耗品を購入する。また、研究成果を学会で発表するための旅費、および、論文投稿料などを支出する予定である。
バイオアフィニティを利用する生理活性物質の新規微量定量法の確立

種々の化学物質を測定対象とするバイオセンサの開発が注目されているが、これらの多くは酸化酵素によって発生する過酸化水素の酸化電流値を電気化学的に検出する方式であり、測定物質が限定され、神経ペプチドなどの測定に適用した例はない。本研究は水晶振動子を高感度マイクロバランスとして利用し、抗原・抗体反応によって生ずる電極表面上での特異的質量変化を水晶振動子の基本周波数変化から求めるという新規の発想である。このため、(1)水晶振動子を高感度マイクロバランスとして利用するための理論解析と特性評価及び高感度化、(2)抗体などの生体物質をいかに効率よく、また活性を維持して固定化するかについて追及し、以下の成果を得た。(1) AT-cutの水晶結晶板上に金を蒸着し、ピエゾ圧電効果を利用した水晶振動子センサを作製した。この水晶振動子の電極の質量変化と基本振動数との間には比例関係が成立し、水晶振動子のマイクロバランス(微量天秤)としてナノグラムオーダーでの微量成分の検出・定量が可能であった。所定濃度のNaCl水溶液をサンプル液として電極表面に既知量の蒸発残留物を形成させ、その残留物質量と基本振動数の変化量を調べた。その結果、電極上の残留物質量(10100ng)と振動数変化との間に有意な直線関係が認められ、その傾きは1.0Hz/ngであった。(2)チラミンの電解重合により、電極表面にアミノ基を導入後、グルタルアルデヒドの架橋反応により抗体のアミノ基との間にシッフ塩基を形成せた。これにより電極表面に抗体を安定に固定化できた。(3)水晶振動子マイクロバランス免疫センサを用いて抗原-抗体反応の検出が可能であり、抗原濃度と免疫センサの応答には有意な相関が認められた。本研究の目的は、ある特定の行動時に作動する神経回路において、どの様な生理活性物質がどのように作用しているかを定量的、かつ経時的に分析するため、無麻酔・無拘束の動物の行動時に大脳の特定部位あるいは血中の神経伝達物質、神経ペプチドなどの動態を測定する方法を確立することにある。生体内には酵素、抗体などをはじめとする特異的分子認識機構を有する生体物質が多数存在するが、化学センサの識別部位にこれら生体物質の優れた分子認識機構を利用すれば、高選択性を有する高感度バイオセンサシステムを構築できる。本研究では(1)水晶振動子を高感度マイクロバランスとして利用するための理論解析と特性評価及び高感度化、(2)抗体などの生体物質をいかに効率よく、また活性を維持して固定化するかを追及する。水晶振動子を用いた起微小量測定技術の開発AT-cutの水晶結晶板上に金を蒸着し、ピエゾ圧電動果を利用した水晶振動子センサを作製した。この水晶振動子の電極の質量変化と基本振動数との間には比例関係が成立することから、水晶振動子をマイクロバランスとして利用すれば、ナノグラムオーダでの微量成分の検出が可能となる。本年度は以下の点について検討した。(1)溶液密度の影響、(2)温度と基本振動数の関係、(3)塩濃度と基本振動数の関係、(4)pHと基本振動数の関係抗体の固定化本研究では共有結合法による固定化を検討した。水晶振動子の金電極表面にチラミンを用いてアミノ基を導入し、このアミノ基にグルタルアルデヒドを反応後、アミノ基とアルデヒド基との間にシッフ塩基を形成させた。このチラミン・グルタルアルデヒド複合体に抗体を反応させると未反応のアルデヒド基と抗体のアミノ基との間にもシッフ塩基が形成され抗体は自然吸着よりはるかに効果的かつ安定に電極上に固定化できた。
関東平野における谷津奥部の生物多様性評価

今年度は谷津の湧水環境に依存して生息する動物の分布に影響する要因を解析した。千葉県北部の谷津の土地利用変遷を整理した。加えて、谷津環境の改善実験に着手した。湧水で涵養される谷津の水路に生息する生物の保全に寄与する知見を得るため、湧水依存生物の中でも特に減少が顕著なスナヤツメを対象に、宅地開発が進行した地域残存するスナヤツメ個体群のサイズ構造と生息環境の特徴と水路や河川における段差や横断構造物がスナヤツメ個体群に及ぼす影響を検討した。千葉ニュータウンの開発が進行している千葉県印西市でスナヤツメ個体群を発見し、その生息地を調査した。調査地は湧水が豊富であることや、底質が砂質であるという点では、スナヤツメの生息に適した環境の条件を備えていた。しかし、個体のサイズ分布とそこから推定された成長速度、繁殖期の成体の割合は、先行研究の結果よりも低かった。水路内の分布パターンは時期によって変化し、季節や成長段階に応じて水系内で移動していることが示唆された。調査した水路の下流端には段差があるため、成長したスナヤツメの一部はこの段差から下流側に落下している可能性があり、これにより再び上流側に戻ることができなくなるため、大型の個体が残存し難くなっていることが示唆された。谷津の湧水に依存して生息する動物のうち、スナヤツメよりも生息地点が多い種としてオニヤンマに注目し、分布に影響する要因を解析した。対象地は千葉県北部の谷津環境37地点調査とした。環境選好性の調査と同様に生物調査と環境調査を行った。オニヤンマが選好する環境要因を明らかにするためにパス解析を行った。その結果、オニヤンマの生息には、湧水の存在、水温(砂温)、有機物量、アメリカザリガニの存在が有意に影響していた。湧水の存在や量には台地上部における土地利用が影響している可能性が示唆されたが、関係は不明瞭であったため、来年度精査する予定である。谷津の土地利用の変遷について、当初は30年前と現在を比較することを予定していたが、すぐれた空中写真を入手できたため、1940年代以降の10年刻みでのデータを得ることが出来た。谷津に生息する動物の分布に影響する要因として、当初は土地改変、管理放棄、外来種の侵入とそれらの交互作用の影響に注目していたが、これらに加え谷津を流れる水路と河川の連続性の問題が明らかになった。農業用水路と河川は管理者が異なるため、その接続部分には大きな段差が生じるなど、生物にとっての連続性が損なわれることは一般的な問題であると考えられる。今後の研究ではこの連続性の評価について考慮する必要が有ることが示されたことは、予定以上の成果であった。なおこれらの成果は論文として英文誌に投稿中である。今年度はスナヤツメとオニヤンマに注目して分布調査と要因解析を行ったが、来年度は対象種を増やして一般性と個別性の検討を深める。また効果的な生物分布把握手法として環境DNAの活用を検討する。

谷津に生息する動物の分布に影響する要因として、当初は土地改変、管理放棄、外来種の侵入とそれらの交互作用の影響に注目していたが、これらに加え谷津を流れる水路と河川の連続性の問題が明らかになった。農業用水路と河川は管理者が異なるため、その接続部分には大きな段差が生じるなど、生物にとっての連続性が損なわれることは一般的な問題であると考えられる。今後の研究ではこの連続性の評価について考慮する必要が有ることが示されたことは、予定以上の成果であった。なおこれらの成果は論文として英文誌に投稿中である。今年度はスナヤツメとオニヤンマに注目して分布調査と要因解析を行ったが、来年度は対象種を増やして一般性と個別性の検討を深める。また効果的な生物分布把握手法として環境DNAの活用を検討する。当初は2018年秋に台風による出水を想定し、出水時の生物移動のモニタリング調査を行う予定としていた。しかし2018年は大きな出水がなく、予定していた調査は行わなかった。2019年は、前年の経験を活かし、複数回の調査により、さまざまな流量の時点での生物の移動を把握することで、出水がなくても目的のデータが得られるデザインに変更した。このため2018年度に執行を予定していた旅費と消耗品費の一部を繰り越し、2019年度に調査用のサーバーネットの購入や国内旅費にあてることにした。
ヒト腎臓トランスポーターのインビボ評価システムの開発

ヒト腎臓には有機アニオンを排出するOATPトランスポーターはSLCO4C1しかなく腎不全時にはその発現低下が糸球体濾過低下とともに尿毒症物質排泄低下の原因と考えられた。その仮説を検証するためにヒトSLCO4C1を腎臓特異的に発現するトランスジェニック(TG)ラットを作製し腎不全状態にした後にキャピラリー電気泳動質量分析計を用いて網羅的メタボローム解析を行ったところTGラットで多くの腎不全物質の血中濃度が有意に減少しておりそれらが抗炎症作用や血圧の正常化をもたらしていること、並びにスタチンにその発現増強作用があり尿毒症物質の排泄を促進しており、新たな腎不全治療法を提示した。腎機能障害時には尿毒症物質が蓄積して高血圧、腎機能障害の原因となり予後を増悪させると言われている。しかしその詳細な組成や生体内での機能、また蓄積様式と排泄機能については検討の余地があった。我々は有機アニオントランスポーター蛋白質SLCO4C1が腎不全物質の排泄に関与している事とヒトSLCO4C1の転写がスタチンによって発現増強され腎不全物質を排泄するトランスポーターである事を明らかにした。さらにCKD患者のCE-MSの検討から腎不全物質の蓄積様式にはクレアチニンの様にeGFRが30を下回らないと増加しないものがある一方でeGFRと一次式で相関しeGFR60近辺から直線的に増加するものもあり、その細胞毒性や性質から新たな腎不全マーカーとなり得る可能性を見いだした。腎不全と腎透析を受ける患者の数は年々増加の一途を辿っており毎年3万人以上が新たに透析導入されている。また現在人口の1割近くは慢性腎臓病であると言われている(隠れ腎臓病)。腎機能の悪化に伴い尿毒症物質の蓄積がおこり更に腎臓の障害をおこす悪性サイクル(図2)が問題となっており尿毒症物質の排泄システムの構築が急がれている。現在多くのの尿毒症物質が報告されているが、腎不全物質排泄の正確なメカニズムについてはこれまであまり知られていなかった。研究グループは2004年にヒト腎臓の物質排泄において重要な役割を担う輸送タンパク質遺伝子「OATP-R」を発見したが、腎不全時にはその発現量は低下しているため薬物や腎不全物質の排泄がなされなくなる。そこで我々はOATP-Rを腎臓のみに発現させた遺伝子改変ラットを作製し腎不全を起こさせ網羅的メタボローム解析を用いて検討した結果、OATP-R発現ラットは腎臓からの尿毒症物質の排泄が促されており、血圧の正常化や腎臓内の炎症改善効果、心肥大の抑制が確認され、生存率が向上する傾向が認められた。更にはOATP-Rを腎臓で増強させる薬剤を探索したところ高脂血症薬であるスタチンに同様の効果があることを見つけた。本研究により慢性腎不全患者へのスタチン等のOATP-R増強剤の投与により尿毒症物質を体外にくみ出すことで腎不全患者の腎障害の進行を抑制し透析導入時期を遅らせる新たな治療法が見つかった。生体内での異物、毒物、尿毒症物質の排泄には肝臓と腎臓が大きく関与している。なかでも水溶性あるいは水溶性に体内代謝を受けた物質は腎臓から尿中に排泄される。しかしながらヒト腎臓からの尿毒症物質の詳細な解析と腎排泄に関わる因子は詳細には解明されていなかった。また透析では除去できない尿毒症物質の体内への蓄積による腎障害の発生という悪性サイクルが臨床で問題となっており新たな尿毒症物質排泄システムの構築が急がれていた。我々はヒト腎臓からの薬物や尿毒症物質の排泄に重要な役割を担う遺伝子SLCO4C1を発見した。SLCO4C1は多くのアニオン、カチオン、更にはジゴキシンやウワバインの様な中性の物質も輸送する幅広い基質認識性を持ち、強制発現培養細胞を用いた実験からキノリン酸をはじめとする尿毒症物質の輸送をつかさどっていると考えられた。ヒト腎臓には有機アニオンを排出するOATPトランスポーターはSLCO4C1しかなく、SLCO4C1は尿毒症物質の排除する新たな血液浄化システムの開発や腎臓移行性を目標とした創薬のターゲットとして非常に有用であると考えられた。しかし腎不全時にはSLCO4C1の発現は低下しており、このSLCO4C1トランスポーターの発現低下が糸球体濾過低下とともにヒト腎不全時における尿毒症物質排泄低下の原因と考えられた。

その仮説を検証するために我々はヒトSLCO4C1を腎臓特異的に発現するトランスジェニック(TG)ラットを作製し、腎不全状態にした後にキャピラリー電気泳動質量分析計を用いて血漿、尿の網羅的メタボローム解析を行ったところTGラットで多くの腎不全物質の血中濃度が有意に減少していてそれらが抗炎症作用や血圧の正常化をもたらしていること、並びにスタチンにその発現増強作用があり腎不全時の投与が尿毒症物質の排泄を促進する事が明らかとなり、SLCO4C1の増強は新たな、腎不全治療のターゲットになると考えられた。
新開発の極低温蛍光顕微鏡で観測する光合成タンパク質の動的性質

極低温で動作可能な高空間分解能の顕微鏡を開発した。この装置を用いて、緑藻クラミドモナスの光合成調節機能であるステート遷移現象において、実際にアンテナタンパク質LHCIIがチラコイド膜内部を移動するのかを検証する研究を行った。光合成タンパク質光化学系I(PS I)において、単一分子蛍光分光を行い、これまで知られていなかった蛍光の明滅、ブリンキング現象が90 K程度の温度で観測されることを発見した。PS Iの構造揺らぎとの関連を考察した。また、光化学系IIの時間分解蛍光スペクトルの温度依存性を、構造に立脚したシミュレーションにより再現することに成功した。我々は、世界で初めて極低温用の生物光学顕微鏡において0.9という高い開口数を実現した。これにより、液体ヘリウム温度下で300nm程度の高い空間分解能で生体試料を観測する手法を手にした。開発した顕微鏡では色収差も高い精度で補正され、時-空間-スペクトル分解測定への応用に最適である。2012年度は、東北大で新たな研究チームの立ち上げの年として位置付けた。年度初頭に前所属である名古屋大学から装置の移設を終え、装置の再立ち上げ作業を行った。それとともに、東北大の大学院生に装置の原理、光学系の調整手順、クライオスタットによるサンプル冷却の手順など、基本的操作法を習得する期間とした。これまで、フェムト秒チタンサファイアレーザーの基本波である800nmのレーザー光を用いた、2光子励起顕微鏡としての使用法のみを用いてきたが、2012年度に新たにダイクロイックミラーを購入し、HeNeレーザーの633nmのCW光を新たに1光子励起の光源とすることも可能とした。同時に、検出器前にピンホールを設置することで、共焦点顕微鏡にすることで、より高い空間分解能を実現した。これまでのところ、ほぼ理論値通りの空間分解能を達成している。また、以前から課題であったサンプルステージの機械的な不安定性を改善するため、新たに設計を行い真空用ステージを購入して、サンプル位置の揺らぎを低減することに成功した。2012年度後半には、新たに分光用CCDカメラを購入しスペクトル測定が可能となるようにした。予定より早くCCDが納入されたため、CCDを自動制御するLabViewのプログラム作成に着手した。まだ完成には至っていないが、2013年度前半にはCCDを組み込んだプログラムによりシステム全体の制御が可能となると期待される。開発した極低温顕微鏡を用いて、植物型の光合成反応中心タンパク質、photosystem Iにおいて、1分子蛍光分光が可能であることが示せた。これまでphotosystem Iについては、液体He温度での1分子分光が主に報告されてきていたが、本研究により初めて、比較的温度の高い90 Kでのphotosystem I単分子の振る舞いが詳細に調べられた。その結果、蛍光強度が数秒程度の時間間隔で強くなったり弱くなったりする、ブリンキングと呼ばれる現象が観測された。現時点でその機構は明らかではないが、タンパク質のコンフォメーション揺らぎと関係していると考えており、非常に興味深い。緑藻クラミドモナスの生きた細胞を極低温顕微鏡で観測する研究も進展しており、細胞内部での光合成タンパク質分布の不均一性が明らかとなった。2013年度途中から、蛍光イメージの全ピクセルで蛍光スペクトルを取得できるように制御プログラムを改良したため、情報量が飛躍的に増加した。各ピクセルでのスペクトルをガウス関数の和でフィッティングして成分分割し、各成分の空間分布を画像化することも可能となった。これらの成果は、学会発表、国際会議発表、および論文として発表した。補助金により購入した青色半導体レーザーを開発した極低温顕微鏡に組み込み、さらに高い空間分解能の測定を行えるようにした。このことにより、ある程度の空間分解能の向上が見られたが、理論的に予測される空間分解能には到達しておらず、現時点ではさらなる光学系の最適化が必要である。実際の空間分解能が理論値よりも劣っている原因は突き止めたので、今後必要な光学素子を購入し最適化することで、この問題は解消されるものと考えられる。完成した極低温顕微鏡システムを用いて、以下の研究を推進した。1)黄化したトウモロコシの緑化過程の研究。研究代表者らが、過去に市販のクライオスタットを用いて行ってきた研究を、高い空間分解能を持つ装置により行うことで、より詳細な情報を得ることが出来た。黄化した植物細胞内で、クロロフィルの前駆体、プロトクロロフィリドが局在するプロラメラボディと呼ばれる粒子の蛍光偏光異方性を世界で初めて詳細に測定し、内部での色素の配向状態を明らかにした。2)クラミドモナスのステート遷移の研究。異なる波長の光を照射することで、低温での蛍光スペクトルが変化するステート遷移と呼ばれ現象では、アンテナタンパク質がステート遷移前後で移動していることと考えられている。

培養したクラミドモナスを用いて、ステート遷移の前後での極低温での顕微蛍光分光を行い、実際にアンテナタンパク質の移動が起こっていることを示唆する結果を得ることができた。26年度が最終年度であるため、記入しない。生物物理学26年度が最終年度であるため、記入しない。ステージの不安定性の低減や、励起光源を他波長にすること、またCCD検出器を自動制御するプログラムの開発も予定より早く着手できているなど、概ね計画は順調に進んでいる。サンプル温度が、当初期待した温度まで降下できていない点が次年度以降の課題となっている。開発した極低温顕微鏡により、1分子分光が実現可能であることを示せた。また、全ピクセルで蛍光スペクトルを取得できるように制御プログラムを改良し、スペクトルマッピングも可能となった。このことにより、単細胞緑藻における細胞内部の光合成タンパク質の不均一な分布も分解可能であることも示せた。当初は、共同研究者から緑藻細胞を送ってもらっていたが、当研究室においても緑藻クラミドモナスの培養を開始し、その育成も順調に進展している。建物の改修工事が遅れていることで、液体Heを使用する実験がまだ開始できていない点が、予定より若干遅れている部分である。CCD制御のためのLabViewプログラムの開発を急ぐ。また、これまでに極低温で世界最高の空間分解能を達成することが出来ており、こうした成果を論文にまとめる。サンプル温度を十分下げるために、新たなコールドヘッドの設計も視野に入れつつ、サンプルホルダとコールドヘッドを繋ぐ部分の改良を行う。photosystem I単分子のブリンキングの機構を解明するため、明状態、暗状態の持続時間の統計、その温度、励起光強度依存性の測定を行う。現時点では、クロロフィルの励起状態を経由した周囲のタンパク質のコンフォメーション変化がブリンキングの原因であると推察しているが、光強度依存性を見ることで、励起状態を経由しているかを調べることができる。温度依存性からは活性化エネルギーの見積もりが可能となり、どのようなコンフォメーション変化が関与しているかを推定できると期待している。すでに培養を開始しているクラミドモナスで、まずは既報のステート遷移を再現する実験系を組む。それが完成すれば、極低温顕微鏡下でステート遷移前後の光合成タンパク質の空間分布を調べる実験を行う。室温→ステート1に遷移→極低温で測定→室温→ステート2に遷移→極低温で測定、というサイクルが実現できれば、同一細胞でのステート遷移前後のタンパク質分布を調べることができる。このような実験を可能とするため、室温でブラウン運動を抑えることが可能となる媒質の検討などを行う。次年度使用額は、今年度の研究を効率的に推進したことに伴い発生した未使用額であり、平成25年度学とあわせ、平成25年度の研究遂行に使用する予定である。遠心機を購入検討していたが、優先度が低かったため、また2013年度分では足りなかったため、次年度に繰り越した。遠心機を購入する