hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
二連球型新高分子ツインデンドリマ-の合成

新規ツインデンドリマ-型(二連球型)高分子の合成を下記の経路にしたがって進めた。1.デンドリマ-を結ぶリビングポリペプチドの合成:開始末端側に、保護されたアミノ基を導入するために、開始剤としてN-(2-アミノエチル)カルバミン酸ベンジルを用い、◯-メチルセリンN-カルボキシ無水物(◯-MeSerNCA)およびサルコシンNCAをリビング重合させ、ω-アミノ基を有するポリペプチドスペーサーを得た。2.リビングポリマーの成長末端側のBデンドリマ-合成:ポリペプチドスペーサーの成長末端側のアミノ基を核に、アクリル酸メチルのマイケル付加と、引続きエチレンジアミンによるアミド形成反応とを繰返すことにより、ポリ(アミドアミン)デンドリマ-部分を合成した。surface-メチルエステル基にヘキシルアミンを反応させ疎水性デンドリマ-とした。3.両親媒体の二連球型構造への誘導:スペーサーリビングポリマーの開始末端側のベンジルオキシカルボニル基で保護したアミノ基を、トリフルオロ酢酸/チオアニソールを用い選択的に脱保護し、さらにこのアミノ基を開始核として、上述と同様にマイケル付加とアミド形成反応とを繰返し、ポリ(アミドアミン)デンドリマ-(Aデンドリマ-)部分の構築を検討した。このツインデンドリマ-は親水性のAデンドリマ-と疎水性表面をもつBデンドリマ-とから成り、両親媒性の新しいダンベル型分子であり、生医学材料などへの応用が期待できる。ツインデンドリマ-型(二連球型)高分子のプロトタイプとして、疎水性球状頭部と親水性線状尾部とからなる新規ブロック型高分子の合成を行い、その自己組織化形態を明らかにした。この球状/線状ブロック型高分子は、従来の高分子の形態と比較すると新しい範疇に属する。リビング重合法とデンドリマ-段階合成法とを組み合わせた精密構築法により合成した。まず、2-メチル-2-オキサゾリンのリビング重合([M]_O/[I]_O=25)を行ない、成長末端を過剰のエチレンジアミンで停止し、イオン交換することによりω-エチレンジアミン置換ポリ(2-メチル-2-オキサゾリン)1を調製した(DP=26,M_W/M_n=1.1_2)。次に1のω-アミノ基を開始核として、アクリル酸メチルとのマイケル付加とエチレンジアミンによるアミド形成反応とを繰返し、ポリ(アミド-アミン)デンドリマ-部分を合成し、新規重合体ポリ(2-メチル-2-オキサゾリン)-block-ポリ(アミド-アミン)デンドリマ-2を得た。ポリ(アミド-アミン)デンドリマ-部分は第3.5から第5.5世代までのメチルエステル末端型とアミン末端型を合成した。メチルエステル末端型の重合体2は親水性のポリ(2-メチル-2-オキサゾリン)鎖と疎水性のポリ(アミド-アミン)デンドリマ-とからなる両親媒性分子である。滴重法によって2の水溶液の張力測定を行ったところ、臨界ミセル濃度(CMC)が認められ、2が集合体を形成する能力を持っていることがわかった。5.5世代のデンドリマ-を有する2が3.5世代の2よりも低いCMCを示した。さらに、2の重水中での集合体の形態を小角中性子散乱法により解明した。5.5世代のデンドリマ-を持つ2についてCMC以上の3.0wt%における中性子散乱実験を行った。その結果、直径54nmの球状組織体を形成していることが判明した。このことは、構造が精密に規制された両親媒性球状高分子誘導体が規制的な組織体を形成する可能性を示している。
蛋白質キナーゼROCK―アイソフォーム特異的活性型酵素検出法ならびに阻害剤の開発

蛋白質キナーゼROCKには2つのアイソフォームが存在し、癌悪性化におけるそれらの特異的機能の解明が必須であった。本研究は、ROCK2特異的内在性阻害因子(CRMP2L)由来のペプチドを大腸癌細胞に単独で発現することにより癌細胞の遊走・浸潤能を抑制できること、GSK3によるCRMP2Lのリン酸化によってCRMP2LによるROCK依存的大腸癌細胞の移動/浸潤能の阻害が調節されることを見いだした。癌悪性化への寄与が示唆されているタンパク質キナーゼROCKには2つのアイソフォームが存在し、病態に関連したROCKアイソフォームの遺伝子やタンパク質レベルでの発現変化の報告が多くなされている。しかし、ROCKの活性は多様な分子機構で制御されていることが解明されつつあり、ROCKアイソフォームの活性状態を測定する方法の開発が必要である。本研究は、細胞内ROCKアイソフォーム活性検出法と阻害剤の開発を目的とする。癌組織でのROCKアイソフォーム特異的機能に関する基礎的知見獲得を通じ、癌悪性度の診断、ROCKアイソフォーム特異的阻害剤の治療応用、標的細胞への阻害剤デリバリーを念頭にした創薬への基盤形成を目指す。平成25年度はROCKアイソフォーム活性検出ペプチドの作成と、阻害剤としての評価を行った。我々が先に報告した内在性ROCK2阻害剤Collapsin response mediator protein-2 long form (CRMP2L)由来のROCK2結合フラグメントをさらに短小化し、当該フラグメントを大腸癌細胞に単独で発現することにより癌細胞の遊走能、浸潤能を抑制できることを見出し、この結果を含む論文(査読付き)を発表した。tag付きROCKアイソフォーム結合フラグメントを作成し、これを用いて、恒常的活性型ROCKを発現させた細胞において活性型ROCKを検出できることを確認した。タンパク質キナーゼROCKは2つのアイソフォームが存在し、癌の悪性化に関連したROCKアイソフォームの遺伝子やタンパク質レベルでの発現変化の報告が多くなされている。しかし、ROCKアイソフォームそれぞれに2因子以上の内在性阻害因子が存在するため、ROCKの発現量は必ずしも活性を反映しない。また、ROCKは癌細胞だけでなく、癌組織を構成する種々の細胞で多様な機能をもつことが示唆されてきており、ROCKアイソフォームの活性状態を1細胞レベルで測定する方法の開発が待たれてきた。本研究は、細胞内ROCKアイソフォーム活性検出法と阻害剤の開発を目的とし、癌細胞を含めた癌組織構成細胞を標的としている。平成26年度は、癌組織を構成する細胞種の一つである線維芽細胞に着目し、特異的ROCK阻害効果の解析を進めるための評価系の構築を行った。ROCKは線維芽細胞の細胞外マトリクス形成能に関与することが示唆されていたことから、細胞外マトリクス量の測定法を構築した。また線維芽細胞は、それが分泌する増殖因子やサイトカインなどの液性因子や、形成する細胞外マトリクスなどを介して、癌細胞の増殖生存や移動能に影響することから、各種癌細胞との共培養下で癌細胞の増殖生存に与える線維芽細胞の影響を評価する系を構築した。また、前年度までに同定したROCK結合フラグメントを大量に大腸菌で発現する条件および精製する系を確立した。一方、これらフラグメントを線維芽細胞や各種癌細胞に導入し、特異的ROCK阻害効果の解析を進めている。タンパク質キナーゼROCKは2つのアイソフォームが存在し、癌の悪性化に伴うROCKアイソフォームの発現変化の報告が多くなされている。しかし、ROCKアイソフォーム各々に多くの内在性阻害因子が存在するため、ROCKの発現量は必ずしも活性を反映しない。また、ROCKは癌組織を構成する種々の細胞で機能をもつことが示唆されており、ROCKアイソフォームの活性状態を1細胞レベルで測定する方法の開発が待たれてきた。本研究は、細胞内ROCKアイソフォーム活性検出法と阻害剤の開発を目的とした。先に我々が見出した内在性ROCK2阻害因子Collapsin response mediator protein-2 long form (CRMP2L)由来のROCK2結合フラグメントをさらに短小化し、当該フラグメントを大腸癌細胞に単独で発現することにより癌細胞の遊走能、浸潤能を抑制できることを見出した。tag付きROCKアイソフォーム結合フラグメントを作成し、恒常的活性型ROCKを発現させた細胞において、活性型ROCKを検出できることを確認した。ROCK結合フラグメントを大量に大腸菌で発現する条件および精製する系を確立した。線維芽細胞は、液性因子の分泌や細胞外マトリクス形成などを介して、癌細胞の増殖生存や移動能に影響する。癌細胞と共培養することで癌細胞の増殖生存に与える線維芽細胞の影響を評価する系、細胞外マトリクス量の測定法を構築した。これを用い、ROCKの上流因子を調節することで、癌細胞の増殖を阻害できることを示す結果を得た。これらフラグメントを線維芽細胞や各種癌細胞に導入し、特異的ROCK阻害効果の解析を進めた。本成果の一部を関連学会においてポスター(国内)および口頭(国際)発表し、論文(査読付き)と総説(査読付き)を発表した。

癌組織を構成する細胞種のうち線維芽細胞に焦点をあて、線維芽細胞の細胞外マトリクス形成能の測定法の確立、癌細胞との共培養において癌細胞の増殖生存に与える線維芽細胞の影響評価系の構築を行った。これまでに同定したROCK結合フラグメントをtag付きで構築し、大量に大腸菌で発現、精製する系を確立した。ROCK結合フラグメントを線維芽細胞や各種癌細胞に導入し、特異的ROCK阻害効果の解析を進めている。本成果の一部を総説(査読付き)および関連学会(招待講演)において発表した。以上のことより、実施計画と目標は概ね順調に達成できたと考える。細胞生物学引き続き、癌組織を構成する細胞種における活性型ROCKアイソフォームの細胞内局在の解析とROCKアイソフォーム特異的阻害効果の解析を進める。各種細胞を培養し、作成したプローブを用いて、活性型ROCKの細胞内局在を解析する。ヒトの癌病理切片(市販)を用いて、活性型ROCKアイソフォームの検出を行う。同定したフラグメントを癌細胞、線維芽細胞など癌組織構成細胞に導入し、癌細胞の増殖生存、移動能を解析し、各種細胞におけるROCKアイソフォームの活性の重要性を明らかにする。ROCK2結合フラグメントとして、CRMP2L由来のフラグメントを短小化し、これを浸潤性大腸癌細胞に単独で発現させることにより、癌細胞の遊走、浸潤を全長のCRMP2Lと同程度まで阻害できることを示した。本成果の一部を論文(査読付き)および関連学会において発表した。当該フラグメントを含むROCK結合フラグメントをtag付きで作成した。これらを用いて、恒常的活性型ROCKを発現させた細胞において、活性型ROCKを検出できることを確認した。本年度の使用額はほぼ計画どおりである。次年度使用額は前年度比較的安価な試薬を用いる分子生物学実験が多かったためである。癌組織を構成する細胞種における活性型ROCKアイソフォームの細胞内局在の解析と特異的ROCK阻害効果を解析する。ROCKの活性は、癌細胞自体の浸潤や増殖への影響のみならず、線維芽細胞による細胞外マトリクス形成、マクロファージによる線維芽細胞活性化因子の分泌、血管形成能に関わる可能性が示されている。上記のような活性化あるいは分化状態になるよう各種細胞を培養し、活性型ROCKの細胞内局在を解析する。また、これまでに同定したフラグメントを細胞に導入し、細胞表現系を解析し、ROCKアイソフォームの活性の重要性を明らかにする。癌組織を構成する各種ヒト培養細胞の培養、遺伝子導入、細胞染色、ヒトの癌病理切片(市販)、切片染色試薬など、細胞生物学、分子生物学、生化学実験に必要な費用、および成果の発表(論文、学会(国内および国外))にかかる費用を使用する予定である。比較的安価な試薬を用いる分子生物学実験が多かったため。
ベトナム教育改革の質的向上を支える授業研究ー日越地域間共同ー

ベトナムでは、教え込みから子ども中心主義への教育改革に取り組んでいる。本研究は、貧困問題や差別、学力問題や言語問題などの課題を抱える少数民族地域の小学校をフィールドとし、共通の問題を抱えた沖縄で培われた理論や実践に基づき、ベトナムの教育改革の質的向上に参加した。その成果については、日本語版『日本・ベトナム共同授業研究の歩みー教え込みから子ども中心主義へ』(明石書店、2015)とベトナム語版"Tu giao duc nhoi nhet sang giao duc tich cuc"(フォレスト社、2106)として刊行し、ベトナム側にも広く還元した。23年度は、代表者が途中で病気入院したため、研究計画を縮小・変更せざるを得なかった。そうした中で、22年度までの共同研究の歩みを冊子『日越共同授業研究の歩み2007-2011』(2012年)にまとめ、ベトナム側に贈呈し、これまでの到達点とさらなる課題を共有し合った。そこから新たなベトナム側の要望や課題も明らかになった。第1の成果は、これまで共同授業研究を行っていたタイグェン省ボーニャイ郡クックドゥオン小学校よりさらに山岳地域にあるトゥーヌン小学校を参観し、少数民族出身で少数民族の踊りや遊びを指導する指導員を配置するなどの配慮がなされているにもかかわらず、フモン族児童が1年生からすでに授業の中で疎外されている実態を目の当たりにしたことである。クックドゥオン小学校では見られなかった光景である。北部少数民族児童の中でもフモン族児童の教育が非常に大きな課題であることを認識させられた。今後この小学校のフモン族をエンパワーし、民族間の相互理解を深める共同授業研究が切実に必要なこと、そして児童中心主義を理解する教員の養成が喫緊の課題であることが明らかになった。第2の成果は、ベトナムでは2015年学習指導要領改訂に向けて、児童中心主義の理論と実践の学習が切実な課題となっていることが明らかになった。文献も収集し、現在翻訳にとりかかっている。タイグェン師範大学学長より児童中心主義について学生に教える集中講義を強く要請され、24年度実施する予定である。本研究は、これまでに共同研究の成果と課題を日越二カ国語で明らかにする報告書を作成した。その内容は以下の通りである。ベトナムでは、lay hoc sinh lam trung tam (学習者中心主義)をキーワードとして教育改革が進められている。一方日本では、「子ども中心主義」による教育改革を経て、今日、「子ども中心主義」は「格差」の固定化やさらなる拡大を招くという論調が興っている(小玉重夫『学力幻想』(ちくま新書、2013年)など)。こうした論調は、「教育格差・学力格差をこえる」ために、学習事項の確かな達成の可視化(「確かな学力」の保障)を唱え、その基礎をもとに自らの〈声〉を社会的メッセージへと転化する市民的力量の育成を唱えている。マイノリティや「弱者」に位置づけられた側の〈声〉が社会的メッセージとして公共圏で位置づけられることを通して、「少数者」「多数者」あるいは「弱者」「強者」という関係性自体を組み換えることが可能となるという議論である。こうした議論に対し、本研究はつぎのような論点を提起した。○マイノリティの子どもたちが、自らの尊厳が尊重されていると実感できる関係性を育み、その〈声〉を安心して表現でき、その〈声〉を聴き合い、相互理解を深めてこそ、自己や他者を尊重する姿勢や学ぶ意欲は生まれる。こうした関係性を、教室や学校でつくりだすことこそが、教育格差、学力格差をこえる根幹である。○そのために、マイノリティに位置づけられた側の〈声〉を社会的なメッセージへと転化する方法論の開発が必要である。○その〈声〉を聴き、対話する場や道筋を、教員養成カリキュラムにおいて正式に位置づけることが求められる。今年度は、2回に及ぶタイグェン師範大学における集中講義およびワークショップを核に据え、共同研究を進めた。主題は、「子どもたちの自尊感情を育てるための授業づくり子ども中心主義とは何か」である。(第1回)9月18日20日(タイグェン師範大学およびトゥーヌオン小学校にて)以下の内容で実施した。1岩木桃子によるアイスブレイキング、2子ども中心主義を掲げて実践を積み重ねてきた善元幸夫による集中講義「「日本における子ども中心主義の歴史と実践自らの小学校教師体験をもとに」、3那須泉・村上呂里による新宿区立大久保小学校日本語国際学級のドキュメントの視聴およびそれを学習材としたワークショップ(KJ法による)、4沖縄とアイヌ民族の創作民話を学習材とし、自らの教育体験を振り返るワークショップ、5「子ども理解を出発点とする授業づくり」をテーマに、少数民族地域にあるトゥーヌオン小学校における観察実習(少数民族学生を含む学生6名)、6地理学者・西岡尚也による国際理解教育の講義。(第2回)12月14日(トゥーヌオン小学校にて)19月に観察実習をした学生による研究授業を行い、その後授業研究会を持った。2民族楽器演奏者コウサカワタルによるモン族の楽器を学習材としたワークショップ「楽器の来た道、音楽の行く道」を実施した。学習者中心主義に立つ学びを実際に体験してもらう→その体験をもとにベトナム人学生自身が子ども理解を踏まえた研究授業を行い、授業研究会を持つという一連の流れを実施した。

これらの提起に対し、タイグェン師範大学クヮン学長は、少数民族地域の困難を学ぶために教員養成カリキュラムにおいて教育実習が重要であることを認識し、教員養成カリキュラムに位置づけると語った。また日本側研究者も、少数民族出身学生の作文を通して、その教育体験と深い思いに触れることができた。ベトナム山岳少数民族地域の小学校をフィールドとし、lay hoc sinh trung tam(学習者中心主義)の検証を課題とする共同授業研究を行ってきた。今年度の最大の成果としては、これまでの歩みを『教育格差をこえる日本・ベトナム共同授業研究「教え込み」から「子ども中心主義」の学びへ』(明石書店、2015年3月、全270頁)としてまとめ公刊したことがあげられる。本書第6章「ベトナム側はこの試みをどう受けとめたか」には、共同研究に参加したタイグェン師範大学Pham Hong Quang学長「共同授業研究の意義」、Tu Quang Tan「タイグェン師範大学と琉球大学教育学部の協力がめざす道程」の2つの論考について、ベトナム語原文と日本語訳の双方を収録している。Pham Homg Quan学長は、少数民族地域の最善の教育政策とは、「当該地域がアプリオリに有している可能性を真摯に尊重すること」であると、少数民族地域におけるlay hoc sinh trung tam(学習者中心主義)の拠り所とすべき指針を的確に指し示している。2015年教育改革の年に、本研究の成果をベトナム語で示し得たことは大きな成果であったと考えられる。今年度は最終年度のため、研究成果のベトナム側への還元に力を注いだ。平成27年8月20・21日の両日に行われたタイグエン師範大学主催国際シンポジウム「教員養成カリキュラムの発展に向けてその可能性と挑戦」において3本の研究発表を行った。1つは「教育改革に向けたベトナムと日本の共同研究の歩み」、2つは「子ども中心主義に立つ数学科授業の世界的動向」、3つは「子ども中心主義に立つ地理学習」である。またタイグエン省Nguyen Viet Xuan小学校にて、算数と地理の研究授業を行い、ベトナム教育改革の中心課題である「教え込みから学習者中心主義への転換」を、実践を伴い提起した。シンポジウムと研究授業については、地元紙で紹介されるとともに、インターネット上で公開され、ベトナム側で大きな反響を呼んだ。また、前年度に出版した『教育格差をこえる日本・ベトナム共同授業研究ー教え込みから子ども中心主義へ』(明石書店、2016)のベトナム語翻訳版『Tu giao duc nhoinhet sang giao duc cuc』(2017)を作成し、ベトナム教育関係者がベトナム語で参照できるように成果をまとめた。ベトナムの教育困難地域が直面する教育改革の課題に対し、同じく貧困問題や学力問題で苦悩する沖縄の体験を踏まえて理論的実践的に応え、その成果をシンポジウムやベトナム語版書で還元したことにより実質的にベトナム教育改革の質的向上に参加できたと考える。ベトナムでは、教え込みから子ども中心主義への教育改革に取り組んでいる。本研究は、貧困問題や差別、学力問題や言語問題などの課題を抱える少数民族地域の小学校をフィールドとし、共通の問題を抱えた沖縄で培われた理論や実践に基づき、ベトナムの教育改革の質的向上に参加した。
動的政策評価における政策効果の異質性の検定と政策割り当てルールの統計的決定

本年度の研究では、パネルデータを用いた動的政策の割り当てルールの統計的決定方法を開発した。機械学習の識別の方法を基にして、実験・非実験データから観察される個人の性質に応じた動的政策の最適な割り当てルールを統計的に決定する方法を構築した。この方法を応用することで、個人の異なる性質に応じて、複数段階にわたる政策の最適な実行フローや複数期間にわたる政策の最適な停止・開始時期をテータに基づいて決定することができる。動的政策の割り当てルールの統計的決定では、(i)各時点における政策割り当てルールの決定に過去の政策割り当てやその結果の情報をどのように活かすという点、(ii)複数期間にわたる政策実行の予算をいかに効率よく各期の政策に配分するかとう点が重要となる。本研究では、前者に関しては、Kitagawa and Tetenov (2018)の提案したEmpirical Welfare Maximization (EWM)法を応用して、各期の政策割り当てルールの関数のクラスが過去の政策の割り当てや結果に依存する形とした。後者に関しては、予算制約を最適化問題の制約条件として組み込むことで、予算制約の下で社会的厚生を最大化する政策割り当てルールを推定する方法を提案した。問題設定や最適な政策割り当てルールの推定方法の考案の後、提案方法の理論的な性質の導出に取り組んだ。主要な結果として、推定された政策割り当てルールの真に最適な割り当てルールへの一致性を示した。また、推定されたルールのregretの上界を政策割り当て関数のクラスの複雑度や期間の数等との関係性から導出した。更に、予算政策の下での推定問題では、推定したルールを実行した場合に予算制約が漸近的に満たされることも示した。平成30年度が最終年度であるため、記入しない。
神経変性疾患原因蛋白の相互作用、翻訳後修飾、細胞内局在の検討と治療的応用

本研究の目的は、種々の神経変性疾患原因蛋白同士の相互作用、翻訳後修飾、細胞内局在を検討することである。翻訳後修飾はユビキチン化とリン酸化を対象とする。常染色体優性遺伝小脳失調症14型の原因遺伝子protein kinase Cγが常染色体劣性遺伝小脳失調症の原因遺伝子アプラタキシンのリン酸化を亢進し、核内輸送を妨げ、結果としてDNA修復蛋白でもあるアプラタキシンの核内欠乏を来たすことで、DNA損傷が蓄積し神経細胞の障害が生じることを証明した(Hum Mol Genet 2009 ; 18 : 3533)。また、X連鎖性優性遺伝の筋萎縮性側索硬化症(ALS)の原因蛋白として新たにubiquilin2を同定し、病理学的に、神経にこの蛋白およびそのほかのALS原因蛋白であるTDP43, FUS, Optineurinなどと共に家族性あるいは孤発性ALS患者の運動ニューロンにみられるユビキチン陽性封入体に凝集することを示した(Nature 2011 ; 477 : 211)。本年度はユビキチンE3リガーゼであるParkin関連パーキンソン病患者線維芽細胞において、酸化ストレス下で細胞死が誘導されること、それがDNA損傷蓄積を伴うことを見出し、報告した(Biochem Biophys Res Commun 2010 ; 391 : 800)。また、ユビキチン化が低下している患者細胞で、脱ユビキチン化阻害剤iodoacetamideを負荷し、ユビキチン化を促進することで、細胞がどのような影響を受けるかを検討した。この負荷により、細胞死は促進した。このことは、ユビキチン化蛋白が蓄積することは、ユビキチンが減じ元の障害蛋白が蓄積するよりも細胞障害が強くなったことを意味すると思われた。また、常染色体優性遺伝小脳失調症14型の原因遺伝子protein kinase Cγが常染色体劣性遺伝小脳失調症の原因遺伝子アプラタキシンのリン酸化を亢進し、核内輸送を妨げ、結果としてDNA修復蛋白でもあるアプラタキシンの核内欠乏を来たすことで、DNA損傷が蓄積し神経細胞の障害が生じることを証明した(Hum Mol Genet 2009 ; 18 : 3533)。すなわち、2種類の神経変性疾患原因蛋白、アプラタキシンとprotein kinase Cγの相互作用を明らかにした。昨年度はユビキチンE3リガーゼであるParkin関連パーキンソン病患者線維芽細胞において、酸化ストレス下で細胞死が誘導されること、それがDNA損傷蓄積を伴うことを見出し報告した(Biochem Biophys Res Commun 2010;391:800)。今年度はリン酸化酵素であり、家族性パーキンソン病の原因であるPINK1に注目した。この蛋白はミトコンドリア異常に伴う細胞障害に関して、パーキンの上流に位置するが、PINK1の量的変化がパーキンの量的変化と平行することをパーキンの患者細胞において発見した。現在、蛋白相互作用によるかパーキンの発現調整によるかを検討している。また、昨年度、常染色体優性遺伝小脳失調症14型の原因遺伝子protein kinase Cγが常染色体劣性遺伝小脳失調症の原因遺伝子アプラタキシンのリン酸化を亢進し、核内輸送を妨げ、結果としてDNA修復蛋白でもあるアプラタキシンの核内欠乏を来たすことで、DNA損傷が蓄積し神経細胞の障害が生じることを証明した(Hum Mol Genet 2009;18:3533)。今年度は、アプラタキシンの複数のリン酸化部位をアラニン(不活性化)やグルタミン(擬似リン酸化)に置換したタンパクの局在を観察した。アプラタキシンの核内移行はリン酸化部位の不活化により促進され、擬似リン酸化により阻害されることを確認した。また、リン酸化アプラタキシンに対する特異的抗体を作製・解析した。線維芽細胞のウエスタンブロットにおいて、軽度高分子側にシフトしたバンドが観察された。

今後、種々の細胞におけるリン酸化蛋白の局在などを検討している。本研究の目的は、種々の神経変性疾患原因蛋白同士の相互作用、翻訳後修飾、細胞内局在を検討することである。翻訳後修飾はユビキチン化とリン酸化を対象とする。今年度は家族性筋萎縮性側索硬化症(ALS)の原因遺伝子のUBQLN2の同定に携わった(Nature 2011;477:211)。この遺伝子がコードする蛋白ubiquilin2はユビキチン様ドメインとユビキチン関連ドメインを有し、変異蛋白は、ユビキチンープロテアゾーム系の障害を生じる。このubiquilin2は家族性ALSのみならず、遺伝子異常のない孤発性ALSの脊髄運動ニューロンにも凝集を生じるが、その凝集には別のALS原因蛋白であるFUS,OPTN,TDP43,SOD1などとも共在する。すなわち、これら原因蛋白との相互作用が推定される。実際にfamily蛋白であるubiquilin1はTDP43蛋白の毒性を緩和することが指摘されており、今後はこういった、機能的な関連を証明する予定である。一昨年度、常染色体優性遺伝小脳失調症14型の原因遺伝子protein kinase C γが常染色体劣性遺伝小脳失調症の原因遺伝子アプラタキシンのリン酸化を亢進し、核内輸送を妨げ、結果としてDNA修復蛋白でもあるアプラタキシンの核内欠乏を来たすことで、DNA損傷が蓄積し神経細胞の障害が生じることを証明した(Hum Mol Genet 2009;18:3533)。昨年度は、リン酸化アプラタキシンに対する特異的抗体を作製・解析した。線維芽細胞のウエスタンブロットにおいて、軽度高分子側にシフトしたバンドが観察された。今年度は、神経様SH-SY5Y細胞におけるリン酸化蛋白の局在検討した。この結果、リン酸化蛋白は核内にも存在することが判明した。今後、核内でリン酸化を受ける機序の解明をする予定である。
Semaphorin 4Dが口腔癌骨浸潤に果たす役割とその発現制御機構

作製した細胞株(shControlを遺伝子導入したHSC-2とshSema4D#4を遺伝子導入したHSC-2)をヌードマウス大腿骨傍骨膜に移植し,骨浸潤モデルにおけるSema4D発現抑制の影響を検討した.移植後,経時的に腫瘍サイズを計測し,4週後に大腿骨とともに腫瘍組織を摘出した.shControl群とshSema4D群を比較したところ腫瘍体積,腫瘍重量ともにshSema4D群で有意に抑制されていた.Sema4D発現抑制により腫瘍増殖が抑制されたと考えられた.摘出した腫瘍組織を免疫組織化学的に解析を行った.腫瘍組織のPlexinB1,IGF-I,IGF-IRの発現はshControl群とshSema4D群ともに変化なかったが,Ki-67陽性の癌細胞数,CD31陽性の血管数はshSema4D群で減少しており,Sema4D発現抑制により腫瘍増殖および血管新生が抑制されている事が明らかとなった.癌細胞の産生するSema4Dが腫瘍増殖および血管新生を促進している可能性があると考えられた.腫瘍組織の酒石酸抵抗性酸性ホスファターゼ染色(TRAP染色)を行なったところ,shSema4D群で腫瘍組織中の破骨細胞数は有意に減少しており,Sema4D発現抑制により破骨細胞形成が抑制されたと考えられた.癌細胞の産生するSema4Dが破骨細胞の形成を促進している可能性があると考えられた.各種口腔扁平上皮癌細胞株にRNA干渉によりPlexinB1発現抑制細胞株を作製し,ヌードマウス大腿骨傍骨膜に移植を行い,骨浸潤モデルでのその影響を検討する予定である.移植後,経時的に腫瘍サイズを計測し,4週後に大腿骨を摘出し,組織学的に解析する予定である.マウスの大腿骨から骨髄細胞を採取し,破骨細胞の形成能の検討を行った。C57BL/6Jマウスの大腿骨から骨髄細胞を回収し、macrophage colony-stimulating factor(M-CSF)を添加した.翌日,浮遊している細胞のみを回収し,M-CSFを添加して3日間培養を行った.その後,浮遊細胞は洗い流し,接着細胞のみを再度回収して,Bone marrowmacrophages(BMMs)としてプレートに播種し、Sema4Dを添加して6日間培養した.培養後,酒石酸抵抗性酸性ホスファターゼ染色(TRAP染色)を行った.破骨細胞数の評価として,3核以上をもつTRAP陽性の細胞を破骨細胞として計測した.Sema4D添加群においてTRAP陽性である破骨細胞数は有意に増加した.作製した細胞株(shControlを遺伝子導入したHSC-2とshSema4D#4を遺伝子導入したHSC-2)をヌードマウス大腿骨傍骨膜に移植し,骨浸潤モデルにおけるSema4D発現抑制の影響を検討した.移植後,経時的に腫瘍サイズを計測し,4週後に大腿骨とともに腫瘍組織を摘出した.shControl群とshSema4D群を比較したところ腫瘍体積,腫瘍重量ともにshSema4D群で有意に抑制されていた.Sema4D発現抑制により腫瘍増殖が抑制されたと考えられた.摘出した腫瘍組織を免疫組織化学的に解析を行った.腫瘍組織のPlexinB1,IGF-I,IGF-IRの発現はshControl群とshSema4D群ともに変化なかったが,Ki-67陽性の癌細胞数,CD31陽性の血管数はshSema4D群で減少しており,Sema4D発現抑制により腫瘍増殖および血管新生が抑制されている事が明らかとなった.癌細胞の産生するSema4Dが腫瘍増殖および血管新生を促進している可能性があると考えられた.腫瘍組織の酒石酸抵抗性酸性ホスファターゼ染色(TRAP染色)を行なったところ,shSema4D群で腫瘍組織中の破骨細胞数は有意に減少しており,Sema4D発現抑制により破骨細胞形成が抑制されたと考えられた.癌細胞の産生するSema4Dが破骨細胞の形成を促進している可能性があると考えられた.各種口腔扁平上皮癌細胞株にRNA干渉によりSema4D発現抑制細胞株を作製し,ヌードマウス大腿骨傍骨膜に移植を行い,骨浸潤モデルでのその影響を検討する予定である.現在、HSC-2のSema4D発現抑制細胞株は作製済である.移植後,経時的に腫瘍サイズを計測し,4週後に大腿骨を摘出し,組織学的に解析する予定である.各種口腔扁平上皮癌細胞株にRNA干渉によりPlexinB1発現抑制細胞株を作製し,ヌードマウス大腿骨傍骨膜に移植を行い,骨浸潤モデルでのその影響を検討する予定である.移植後,経時的に腫瘍サイズを計測し,4週後に大腿骨を摘出し,組織学的に解析する予定である.
微小組織多領域シークエンスによる免疫療法治療抵抗性分子機構の解明

肺癌の治療戦略は免疫療法を加えた治療標的層別化による個別化医療の時代を迎えているが、PD-1抗体治療は抵抗性を示す患者も多く、新規治療効果予測バイオマーカーの早急な開発が望まれる。一方、同一腫瘍からの多領域シークエンスと統計科学的なアプローチによって、がんの進化構造とがんの再発・治療抵抗性との間には密接な関連性があることが示されている。そこで本研究では、免疫療法治療抵抗性を示す分子機構の解明のため、PD-1抗体治療を行った肺癌組織から直径100μm領域のがん組織を複数採取、多領域シークエンスとサブクローン進化構造のクラスタリングの結果から、治療抵抗性を示す遺伝子の同定及び機能解析を施行する。
空間的因子からみた侵入犯罪と街頭犯罪の関連性の分析と数理的設計手法への展開

本研究では,京都市伏見区中心部を対象地域として,侵入犯罪と街頭犯罪の発生場所の空間的特徴の関連性を明らかにし,さらに,防犯環境設計のアルゴリズミック・デザイン手法に関する基礎的検討を行った.分析の結果,対象地域でそれぞれの犯罪発生を左右する大きな要因は海抜であり,それが低い場所では空き巣の発生密度が低いことがわかった.また推定歩行者数が少ないと空き巣の発生密度が低いことがわかった.ひったくりを対象として建物用途の割り当ての最適化手法の開発を行った結果,犯罪発生地区で見られた事業所等の非住宅系の建物の場所に個人家屋を中心とする住宅系建物が配置される結果となった.本研究では,京都市伏見区中心部を対象地域として,侵入犯罪と街頭犯罪の発生場所の空間的特徴の関連性を明らかにし,さらに,防犯環境設計のアルゴリズミック・デザイン手法に関する基礎的検討を行った.分析の結果,対象地域でそれぞれの犯罪発生を左右する大きな要因は海抜であり,それが低い場所では空き巣の発生密度が低いことがわかった.また推定歩行者数が少ないと空き巣の発生密度が低いことがわかった.ひったくりを対象として建物用途の割り当ての最適化手法の開発を行った結果,犯罪発生地区で見られた事業所等の非住宅系の建物の場所に個人家屋を中心とする住宅系建物が配置される結果となった.本年度は,対象地域の選定,犯罪発生マップの整理,カーネル密度推定画像からのイベント発生点の逆推定手法に関して研究を行った.対象地域の選定のポイントとしては,都市構造が大きく異ならないことや,統計的な有意性の確保,犯罪発生分布の多様性などいろいろな要因を考慮して,京都市伏見区中心部を対象地域とした.それに併せて対象地域で必要なGISデータの整備と,ひったくりに関する基礎的な解析を行った.申請者は京都府警察本部ホームページにある京都府内全ての犯罪マップのデータを過去2年以上蓄積しており,そのデータを用いて以降の分析に必要な基礎データを構築した.地図画像から四半期毎の犯罪マップを用いて,犯罪発生地点と犯罪発生密度のデータだけを,画像処理ソフトや画像解析プログラムにより抽出した.そして,抽出された犯罪発生密度の地図を重ね合わせ,罪種別に過去の犯罪発生密度の総和をもとめて可視化を行った.整理した画像データを用いて,犯罪発生場所が示されている街頭犯罪データからカーネル密度関数のイベント点とパラメータ推定を行う手法を研究した.推定手法は,侵入犯罪の犯罪密度と発生点の数が与えられたときに,データの発生密度と最も良く整合する犯罪発生密度をもたらす,複数の犯罪発生点の位置を求める問題として定式化できた.この問題を,非線形計画法とメタヒューリスティクスの二つを用いて解き,点数が25点程度までであれば,実際のイベント点の発生位置にかなり近い推定を行うことができることを確認した.本年度は,当初の研究計画には入れていなかったが,別の関連研究で対象地域の高精度な空間データを入手することができたため,研究を補強するために,それを用いて対象地域内の自然監視性に関して塀や遮蔽物などの存在を暗黙的に考慮したモデルを新たに構築した.このデータは実際の空間の3次元形状を忠実に計測したものであり,3次元の離散空間モデルとして高速に処理することで,細い路地などの空間的特徴などを考慮できる.また,対象地域に特徴的な地形データが犯罪発生に密接に関連していることが判明したため,それをモデル化し,さらに侵入犯罪を考慮して,新たに国勢調査のデータを導入するなど,分析用のデータの拡充を行った.分析手法の改良として,これまでのひったくり発生点の周囲を固定的に潜在的犯罪発生点に含める手法を改め,各クラスの判別精度が高くなるような半教師型の学習手法を提案し,その有効性を確認した.さらに,ひったくり点と空き巣の発生分布をクロスさせ,それぞれの犯罪発生に関する6種類の組み合わせのクラスラベルを定義し,構築したデータに関してRepTreeを用いた判別分析を行った.分析の結果,対象地域でそれぞれの犯罪発生を左右する大きな要因は海抜であり,それが低い場所では空き巣の発生密度が低いことがわかった.また推定歩行者数も大きな因子であり,全体的にその値が低いと空き巣の発生密度が低いことがわかった.事業所系の建物が若干存在する付近では,ひったくりの発生傾向が高いことがわかった.また,空き巣とひったくりが多いのは海抜が低く長屋建が比較的多く,壁面監視度の合計値が高いところでは,ひったくりが発生していない,といったことが明らかになった.平成24年度は,ひったくりを対象として,それが発生する場所に多くみられる空間構成パタンが出来るだけみられないように,建物用途を再配置する方法を開発した.対象地域はこれまでと同様に,京都市伏見区の北部とし,ひったくり犯罪の発生場所を考慮して,対象地域内の約60kmの長さの道路上を分析対象とした.空間属性として,視点から半径r(=40)m以内にある建物の壁面に,可視グラフに基づく正確な可視量の抽出アルゴリズムを適用して壁面からの監視性の度合いを定量化し,建物用途別の監視性の指標とした.さらに,街路上の歩行者を,既往研究と同様に,駅を起点とするランダムウォークにより推定して説明変数とした.次に,建物用途の割り当ての最適化手法の開発を行った.

ここでは,建築面積の違いがある範囲内に収まり,かついずれかの建物用途が異なる建物同士を交換する操作としてそれを実装した.最適化の前にオリジナルデータにおいて,各サンプリング点と犯罪発生点について空間属性の計算を行って学習用データを作成し,そのデータを使ってCAEPの学習を行った.次に最適化を行って建物用途の交換を行い,その交換されたデータで,空間属性を計算し直し,検証用データを作成した.そのデータを先に学習済みのCAEPに入力し,各点について各クラスの集約スコアを計算して分類を行った.各サンプリング点と犯罪発生点でのCAEPの集約スコアの和ができるだけ安全側になるような目的関数を定義し,反復局所探索法を用いて用途配置の最適化を行った.最適化の結果,犯罪発生地区で見られた事業所等の非住宅系の建物の場所に個人家屋を中心とする住宅系建物が配置され,監視性に関するクラスP側の顕在パタンを低下させるとともに,クラスN側の顕在パタンを上昇させたことなどが明らかになった.また,これまで行ってきた研究を纏めて査読論文に投稿・発表することなども行った.カーネル密度推定のイベント点位置の予測において,イベント点が増加すると位置の推定誤差が大きくなり,現状では侵入犯罪の発生エリアを絞り込めていないため.24年度が最終年度であるため、記入しない。上記の問題点については,EMアルゴリズムやABCアルゴリズムなどの別の最適化手法を用いて,点位置推定手法の改良を行う.最終年度は,当初の予定通り自然監視性を目的関数とする空間生成アルゴリズムの基礎的検討を行う.24年度が最終年度であるため、記入しない。
光プローブ法による高分子鎖のコイル-グロービュル転移の研究

(1)高分子鎖のコイル-グロビュール転移の理論的研究(イ)高分子鎖の内部凝集の仕方を作用する力のタイプで転移の基本型に分類した。(A)Van der Waals力(B)飽和性化学結合(C)溶媒との親和性による力(D)静電相互作用(E)トポロジー的相互作用(ロ)高分子添加によるコイル-グロビュール転移の可能性を理論的に示し、その計算機実験により、添加高分子の最密パッキング前でコイル-グロビュール転移が起こることを見い出した。(ハ)飽和性化学結合をもつアクリル基を側鎖に導入した粘着性高分子を例にとり、計算機シュミレーションより、グロビュール内の密度分布や温度転移の特性を具体的に示した。これ等の高分子溶液では、濃度が高くなると、分子内のみならず分子間の水素結合による会合体が形成され、粘性率,浸透圧などの物理量に強い濃度依存性が現われる。(2)色素ラベル高分子の合成スチレン系高分子鎖にアントリル基,ピレニル基,ローダミン基,フルオレッセン基などを導入した。(3)POE添加系におけるスチレン系高分子鎖のコイル-グロービュール転移(イ)POEを添加高分子として、スチレン系高分子に導入された色素のケイ光偏光解消の体積分率依存性を測定した。ここでは、約55%POEにおいて転移が観測された。これは上記の理論を支持する。(ロ)(イ)と同一の条件で、スチレン系高分子に導入された色素の自己消光速度を測定した。約50%POEで転移が起こり、(3)(イ)とよく一致した。以上より、(1)(イ)は月刊フィジクス,(1)(ロ)(ハ)はJ,Chem,Phys.,(3)(イ)はEur.Polym.J.に印刷され、(3)(ロ)はEur.Polym.J.に印刷中である。
DNA解析と日齢査定によるウナギの接岸回遊機構の解明

以下の項目について、ウナギ接岸回遊機構の解明に取り組み、次のような成果を得た。1.日齢査定と回遊履歴の推定:(1)東アジアに接岸するシラスウナギの日齢はおよそ143-206日齢で、低緯度ほど、若齢・高成長率のものが加入することが明らかになった。(2)またEPMAにより、耳石中のSr濃度を調べたところ、レプトケファルスからシラスウナギへ変態が始まるのは約130日齢(80160日齢)で、約30日間(2040日間)かけて判定を終了することがわかった。2.mtDNAによる解析:(1)16SrRNA遺伝子領域の500bpの塩基配列を比較することで世界に分布するウナギ属魚類全18種・亜種の分類を行うことができるようになった。また、これを用いて、形態では識別できなかったウナギの卵やレプトケファルスの査定が可能となった。(2)茨城県、神奈川県、鹿児島県(種子島)に接岸したシラスウナギ合計47体の調節領域601bpの塩基配列を基に集団解析を行ったところ、これらのウナギはすべて同一の繁殖集団に属することが明らかとなった。また、これまでに報告されている台湾、韓国、中国のウナギの塩基配列も合わせて解析してみても遺伝的変異は少なく、東アジア一帯に生息するウナギは、単一の繁殖集団から成ることが示された。このことから、本種の資源管理を行う場合、その分布域の東アジア全域の国々が協調し、国際的な規模でこれにあたる必要があると考えられた。本研究の目的はDNA解析と耳石日齢査定に基づいてウナギの接岸回遊機構を明らかにし,これらをシラスウナギ資源の適性管理と持続的利用のために資することである。計画初年度に当たる本年は,次の項目について研究した。以下に経過と成果を記す。1,耳石日周輪による接岸回遊機構の解析:種子島においてニホンウナギのシラスを遡上期の前・中・後期に採集した。これらについてSEMを用いて日齢査定を行ったところ,ウナギの接岸時の日齢はほぼ6ヶ月であることがわかった。また孵化後約3ヶ月前後に変態期に対応すると考えられる日周輪幅の広い帯域の出現することがわかった。このことは現在耳石中のSr/Ca比の解析により確認を急いでいる。これにより,今後変態前の成長率と変態時期,接岸日齢および接岸時期の間の相関を検討することが可能になるものと考えられた。一方,ニホンウナギの対照として熱帯ウナギA.maromorataの耳石微細構造の解析も行っている。2,mtDNAによる解析:先ず,外洋で採取されたレプトケファルスの分子生物学的同定法を確立するために,mtDNA上の16SrRNA遺伝子などの塩基配列をウナギ類各種について決定した。現在そのデータを比較することにより,ニホンウナギのレプトケファルスのみを検出するDNAマーカーを探索中であるが,ほぼそれが得られる見通しがついている。次に,レプトケファルスと東アジア一帯に接岸するシラスウナギの集団間の対応関係を検討するためまず,レプトケファルスのmtDNA抽出,増幅のための条件設定を行った。D-loop領域の塩基配列決定およびデータの集団間比較は現在進行中である。これらにより,外洋のレプトケファルスと各接岸集団との対応関係が明らかになり,ウナギの接岸回遊機構の一端が解明されるものと期待される。本研究の最終年にあたる本年度は以下の2つの項目について次のような成果をとりまとめた。1.耳石による日齢査定と回遊履歴推定:走査電子顕微鏡で調べた東アジアでに接岸するスラスウナギの日齢は143から206日齢で、約半年間の接岸回遊期間を持つことがわかった。低緯度ほど,若齢・高成長率の個体が体色素が未発達の状態で加入することが明らかになった。

またEPMAにより,耳石中のSr濃度を調べたところ,レプトケファルスからシラスウナギへ変態が始まるのは約130日齢(80160齢)で,変態は約30日間継続するものと考えられた。2.mtDNAによる解析:16SrRNA遺伝子領域の500bpの塩基配列を比較することで世界に分布するウナギ属魚類全18種・亜種の分類を行うことができるようになった。また,これを用いて,形態では識別できなかったウナギの卵やレプトケファルスの査定が可能になった。茨城県,神奈川県,鹿児島県(種子島)に接岸したシラスウナギ合計47個体の調節領域601bpの塩基配列を基に集団解析を行ったところ,これらのウナギはすべて同一の繁殖集団に属することが明らかとなった。また,これまでに報告されている台湾,韓国,中国のウナギの塩基配列も合わせて解析してみても遺伝的変異はな少なく,東アジア一帯に生息するウナギは,単一の繁殖集団から成ることが示された。このことから,本種の資源管理を行う場合,その分布域の東アジア全域の国々が協調し,国際的な規模でこれにあたる必要があると考えられた。
肝虚血再灌流障害に対する薬理学的ポスコンのメカニズムとミトコンドリア機能の関与

ラット肝虚血再灌流モデルを用い、虚血プレ・ポストコンディショニングならびに虚血前および再灌流早期のPDEIII阻害薬、Rhoキナーゼ阻害薬投与が肝虚血再灌流障害に与える影響について検討したところ、保護効果のあることがわかった。また、これらのメカニズムにPI3-Aktの活性が関与することがわかった。肝切除術で用いられるプリングル法や生体肝移植など臨床的に肝臓の虚血再灌流に直面する機会は多く、その制御は重要な問題となっている。肝臓においては、短時間先行虚血(虚血プレコンディショニング)やPDEIII阻害薬、Rhoキナーゼ阻害薬の虚血前投与の肝虚血再灌流障害に対する保護作用は報告されているが、そのメカニズムに関する報告は少ない。また、虚血・薬理学的ポストコンディショニングについての報告はない。ラット肝虚血再灌流モデルを用い、虚血プレ・ポストコンディショニングならびに虚血前および再灌流早期のPDEIII阻害薬、Rhoキナーゼ阻害薬投与が肝虚血再灌流障害に与える影響について検討した。雄性SDラットにペントバルビタール腹腔内投与にて基礎麻酔後、右総頚静脈に静脈ルート、右内頸動脈にA-lineを確保、開腹し60分の部分肝虚血(70%)を行う。これをラット肝虚血再灌流モデルとし、シャム群、コントロール群:肝虚血再灌流のみ、虚血プレコンディショニング群:虚血前30秒虚血1分再灌流5回、PDEIII阻害薬プレコンディショニング群:再灌流直前にミルリノンまたはオルプリノン投与、Rhoキナーゼ阻害薬プレコンディショニング群:虚血前にファスジル投与、虚血ポストコンディショニング群:再灌流直後30秒虚血1分再灌流5回、PDEIII阻害薬ポストコンディショニング群:再灌流直前にミルリノンまたはオルプリノン投与、Rhoキナーゼ阻害薬ポストコンディショニング群:再灌流直前にファスジル投与を行った。再灌流5時間後に採血し、肝細胞障害の指標としてAST、ALT、LDH、α-GSTを測定した。また、組織標本を作製し組織学的障害の有無とTUNELアッセイによりアポトーシスの検討を行ったところ、PDEIII阻害薬、Rhoキナーゼ阻害薬が肝虚血再灌流障害に対し保護効果のあることがわかってきた。肝臓においては、短時間先行虚血(虚血プレコンディショニング)やPDE工II阻害薬、Rhoキナーゼ阻害薬の虚血前投与の肝虚血再灌流障害に対する保護作用は報告されているが、そのメカニズムに関する報告は少ない。ラット肝虚血再灌流モデルを用い、虚血プレ・ポストコンディショニングならびに虚血前および再灌流早期のPDEIII阻害薬、Rhdキナーゼ阻害薬投与が肝虚血再灌流障害に与える影響について検討したところ、保護効果のあることがわかった。虚血プレ・ポストコンディショニングにおける分子機序を解明するため、RISK経路に関する検討を行った。PI3-Akt活性化阻害薬wortmannin、LY294002とERK活性化阻害薬PD-98059を用いて、虚血プレ・ポストコンディショニングならびに虚血前・再灌流早期のPDEIII阻害薬、Rhoキナーゼ阻害薬投与の肝虚血再灌流障害保護効果が拮抗されるかを検討したところ、これらのメカニズムにPI3-Aktの活性が関与することがわかった。さらに、肝虚血再灌流モデルを用いて、シャム群、コントロール群、虚血プレコンディショニング群、虚血ポストコンディショニング群、PDEIII阻害薬群、Rhoキナーゼ阻害薬群で再灌流15分後に肝前葉を摘出しホモジナイズする。ホモジナイズしたサンプルを用いてPI3-Akt、ERK、Rhoキナーゼの活性化をウエスタンブロット法により確認を行っているところである。
入眠のタイミングを司る物質の同定と新規入眠薬の開発

時計遺伝子の発見により、体内時計の研究は格段の進歩を遂げてきた。しかしながら未だに睡眠・覚醒リズムの入眠のタイミングを決める仕組みがわからない。すなわち、体内時計の出力が睡眠誘発物質の量をコントロールしているのか、あるいは睡眠物質を増やし、活性化する酵素活性を制御しているのは不明である。したがって本研究は、体内時計が入眠を誘発する仕組みを解明するのが、その第一の目的である。第二の目的は新しいタイプの入眠薬を開発する事である。本研究では体内時計た関わる時計遺伝子の働きから、第1、2の研究目的を達成する試みも企てる。すなわち、体内時計が停止しているCry1/Cry2マウス、位相後退作用が顕著に出現するClockのミュータントマウスをそれぞれ用いる。これらの動物は、ヒトでいう非24時間睡眠や睡眠相後退症候群(DSPS)に相当し、睡眠障害モデルマウスとして利用できるからである。動物に制限給餌を行なうと覚醒レベルが、給餌時間にシフトすることがわかった。そこで、この覚醒を起こすメカニズムが解明できれば、入眠のタイミングを変えうることが可能となる。オレキシンのノックアウト動物を使用したところ、面白いことに給餌性のリズム形成が非常に強く障害された。したがって、オレキシンは覚醒にかかわる入眠薬になりうる可能性が指摘できた。一方、時計遺伝子ミュータント動物を用いた実験を行なった。Cry1/Cry2のダブルノックアウト動物では、給餌による覚醒時間にシフトが起こったが、安定性が悪いことがわかった。すなわち体内時計遺伝子の働きの1つに、覚醒リズムのシフトの安定性への寄与が考えられた。今回の研究により、睡眠のタイミングには給餌によるリズム移動が重要であり、その分子のひとつにオレキシンを挙げることができた。先に述べたように体内時計が入眠を誘発する仕組みがわかれば、その分子を制御する化合物の開発を行なう。また、本研究では体内時計に関わる時計遺伝子の働きから、第1、2の研究目的を達成する試みも企てる。後者のマウスは、ヒトでいう非24時間睡眠や睡眠相後退症候群(DSPS)に相当し、睡眠障害モデルマウスとして利用できるからである。まずadenosine deaminaseの線状体発現リズムを調べたが、全く変動がみられず、睡眠誘発に関わっている可能性は少なかった。つぎに、覚醒持続にかかわり間接的に睡眠調節に関与するオレキシンの作用について調べた。オレキシン神経脱落マウスは、求餌にともなう活動量増大が低下しており、給餌制限による睡眠覚醒リズム形成も減弱していることがわかった。また、ClockミュータントマウスのDSPS発症は発達期の光環境具体的いえば、恒常的に光にさらされると、非常に発症しやすいことがわかった。現在これを改善する薬物を検索中である。