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奈良時代の中央と地方における建築技術の研究

本研究の成果は主に以下の3点である。中央と地方における造営体制を解明した。また発掘遺構を通して、上部構造と地方建築の特徴を明らかとした。さらに井戸枠を中心とした出土部材をもとに、建築部材の転用および木材のライフサイクルを検討した。これらの検討は奈良時代の造営体制や技術レベルを知るうえで、基礎的な研究と位置付けられる。年度の当初より計画していた奈良時代における造営僧である実忠に関する研究会(実忠研究会)を、小岩正樹氏(建築史)・清田美季氏(古代文献史)・児島大輔氏(美術史)とともに立ち上げた。この研究会によって、奈良時代の造営に深く関与した実忠について、学際的な検討をおこなうことができた。今後も継続して研究会を開催し、さらなる検討をおこないたい。地方の現地説明会(武蔵国分寺)や地方遺跡のシンポジウム(武蔵国の国司館遺跡の発掘速報展)、奈良文化財研究所における「古代官衙・集落研究会」などに、積極的に参加した。古代建築史に関する研究会である「古代建築を読む会」において、奈良時代における「楼」建築に関する考察と、東大寺創建大仏殿に関する検討について発表をおこなった。礎石・掘立柱を併用する建物の先行研究及び発掘事例を収集し、考察をおこなった。特に平城宮第一次大極殿院の東西楼について、その施工方法についての検討をおこなった。出土した建築部材について、山木遺跡および小谷地遺跡の出土部材の調査をおこなった。また当研究所の発掘調査によって出土した井戸枠(平城446次調査)についても実測調査を行った。当初の予定通り、六国史、三代格などの文献史料を中心に、造営状況、維持管理、取り巻く社会の実態を分析し、審査付学術雑誌(『日本建築学会計画系論文報告集』『建築史学』)や学会発表を通して、その成果を公開した。これらの結果、奈良時代の在地における造営技術者および造営技術者集団の存在を明らかとすることができた。年度の当初より計画していた奈良時代における造営僧である実忠に関する研究会(実忠研究会)を、小岩正樹氏(建築史)・清田美季氏(古代文献史)・児島大輔氏(美術史)ととも研究会を計3回、開催した。さらに申請者自身も発表を行った。地方遺跡のシンポジウム(古代城柵官衙遺跡検討会)に参加し、奈良文化財研究所における「古代官衙・集落研究会」を事務局として運営に携わった。そのなかで、多くの地方自治体関係者と情報を交換・共有し、特に四面席建物を中心に地方官衙に関する討議をおこなった。出土した建築部材については、当研究所の発掘調査(平城487次調査)において井戸枠の取上げをおこなった。来年度、実測調査を計画している。・当初の予定通り、六国史、三代格などの文献史料を中心に、造営状況、維持管理、取り巻く社会の実態を分析し、審査付学術雑誌(『日本建築学会計画系論文報告集』『建築史学』)や学会発表を通して、その成果を公開した。独自の研究手法として、現存建物に発掘史料・文献史料を加えた3方向からアプローチした。これらの発掘史料・文献史料に対して、新たに建築史学の視点を導入した。発掘史料:発掘報告書を中心に、発掘史料の建築学的見地からの読み取りと出土部材の調査によって、具体的な建物の形、構造、構法などの技術自体を考察した。文献史料:建物の造営状況、建物の使われ方、技術の伝播、さらには人や社会など建物を取り巻く状況、などを文献史料から読み取った。中央における発掘史料については、奈良文化財研究所における成果および遺構を中心に検討した。これらをもととした本研究の成果は主に以下の3点である。・中央と地方における造営体制を解明した。・発掘遺構を通して、上部構造と地方建築の特徴を明らかとした。・出土部材をもとに、建築部材の転用および木材のライフサイクルを検討した。これらの成果は奈良時代に於ける建築を取り巻く状況を示しており、技術の伝播や継承といった問題を解明するための基礎的な研究と位置付けられる。詳細は研究業績を参考にされたい。本年度は倉庫建築の屋根架構について検討した。通常、隅木は梁・桁に対して45度の方向とするが、倉庫建築については、この隅木の方向を変える振隅という技法が用いられたことが、修理工事を通して知られている。この振隅について検討したところ、振隅が奈良時代の校倉に限定して用いられる手法であること、二方向に出す組物との関係が深いことが明らかとなった。地方においても多く検出される総柱遺構を検討するうえで重要な成果であるまたこの倉庫建築の技術が寺院建築などとは異なる系譜の技術である可能性があり、この成果を日本建築学会関東支部研究会において発表した。

またかねてより、研究会を開催してきた実忠研究会の成果を受けて、東大寺創建大仏殿に関する復元研究をおこなった。奈良時代の最高級と目される建築技術について検討し、中国の規模大きい単層裳階付の建物との関係を検討した。裳階に関しては、発掘遺構と現存遺構の両面から検討し、二重の仏堂という観点から整理と変遷を推察し、その成果を『佛教芸術』にて発表した。すなわち二重基壇と裳階による構成から、法隆寺金堂のような二重の建物、その後、薬師寺金堂のような二重裳階付、さらには興福寺金堂のような単層裳階付へと変化していた。柱の形状や柱間をみると、裳階空間が従属的であったものが、次第に主屋と近似してくることを指摘した。東大寺大仏殿の検討と合わせて、「二重」という視覚的要素をもった第一級の建築の変遷や位置づけの一端を明らかとすることができた。当初、査読付論文1件を予定していたが、3件が審査を通過し、成果を公開することができた。ゆえに論文という形式での成果の公開状況は当初の計画以上に進展していると評価できる。25年度が最終年度であるため、記入しない。当初の目的であった地方(倉)と中央(大仏殿・裳階)の両方の技術について検討することができ、1本の審査付論文、1本の論文発表、1本の学会発表を行うことができたためである。計画通り、発掘遺構を中心に資料収集をおこない、同時に現存遺構および復原された建物の現地調査を通して、古代建築の技法の研究を進める。計画の変更部分としては、研究成果の公開が順調に進んでいるため、当初、刊行を予定していなかったが、研究業績の集成作業をおこない、出版の準備作業をおこなう。本年度までの成果をいかし、最終年度である2013年度は総括的な研究を行う。また古代建築の技術の解明を通じて、復原など社会的欲求に対する還元や東アジアとの関係を視野に入れた研究の基礎固めもおこないたい。
能動免疫による特異的T細胞養子免疫療法のための前駆細胞の検討

腫瘍を灌流するリンパ節中に存在するリンパ球は,生体内で腫瘍抗原の感作を受けていると考えられ,in vitroで活性化することにより特異的な抗腫瘍効果を発揮し養子免疫療法に使用可能となる。我々はShuらの方法により,腫瘍灌流リンパ節tumor-draining lymphnode(DLN)中のTリンパ球を用いた養子免疫療法の動物実験を,3-methylcholanthrene誘発同系マウス肉腫細胞株(MC-1)を用いて行い,その効果の検討ならびに臨床応用へ向けてのassay等の問題点を検討した。C57BL/6マウスの足蹠にMC-1を接種,腫張した膝窩リンパ節よりDLN cellを採取し,in vitroで抗CD3抗体及びrecombinant interleukin-2(rIL-2)で活性化と増殖をおこなった。活性化されたDLNはCD4^-CD8^+CD25^+CD44^+のT細胞で,in vitroでlymphokine activated killer細胞が無効であった同系腫瘍肺転移に対し特異的に抗腫瘍効果を発揮した。ところが,これらの細胞はin vitroのcytotoxicity assayにおいて細胞障害活性を全く示さず,in vivoとin vitroの結果に乖離がみられた。このことは,細胞障害活性の指標とされてきたin vitroの細胞障害性試験に加えて,effector細胞のin vivoでの抗腫瘍効果を反映するassayの必要性を要するものと考えられた。in vivoとin vitroの細胞障害性に関する乖離の一因としてcytokine産生に注目し,活性化DLN cellのinterferon-γ(IFN-γ)とtumor necrosis factor-α(TNF-α)産生についても検討した。活性化DLNcellはMC-1細胞による刺激で特異的にIFN-γを産生し,rIL-2により産生が強く増強された。一方,TNF-αの産生はみられなかった。活性化DLN cellの特異的IFN-γの産生がin vivoの抗腫瘍効果と相関することから,活性化DLNの抗腫瘍効果の発揮においてIFN-γが重要な役割を果たし,IFN-γ産生能の測定が従来のin vitroの細胞障害性試験にかわりうるassay法のひとつと考えられた。また,活性化DLN cellは腫瘍組織に対する適切なhoming能を持っており,cytokine等の遺伝子導入effector細胞の有望な候補になりうると考えられた。研究者は,平成3年9月に山梨医科大学第1外科より,東京大学第1外科へ移動したため,この移動を機会として新たな実験系を作成することとした.その第1の理由は,それまで使用して来たbalb C由来の腺癌であるcolon26があまりにもheterogeneityが強く,実験肝,肺転移作成時の転移個数のばらつきが余りにも大きいこと.第2の理由は,腫瘍免疫の実験では経験的にbalb CマウスよりもC57BL6マウスの方が適していることである.そこで,国内でC57BL6由来の腫瘍細胞を調査したところ,日本ゼリア中央研究所で作成されたC57BL6マウス由来のメチルコラントレイン誘発肉腫があった。

そこで同研究所へ依頼したところ快く以下の腫瘍を譲り受けることができた.MCー1,MCー3,MCー4.早速in vivoでの腫瘍移植を試みるに,いずれの腫瘍細胞も東大動物実験施設に飼育されているC57BL6に生着することが確認された.しかしながら,多数代の継代のため成長した腫瘍には壊死部分が特にMCー1及びMCー3に特に強く認められた。またin vitroでRPMI1640+FCSを用いた培養では,MCー4のproliferationがやや悪いことが分かった.現在これらの細胞を用いて実験肝転移,肺転移の腫瘍細胞経静脈投与条件の決定の為の実験,及び裏面発表論文に即したモデル作成を行うべく準備中である.具体的には,東大輸血部より供与された,抗CDー3,CKー4,CKー8抗体を,また武田薬品から供与を受けたILー2を用いin vitroでのIVS細胞及び抗CDー3,ILー2刺激細胞の培養条件の確定をしつつある。本年度は、C57BL6同系線維肉腫MC1の尾静脈注射により作成された肺転移に対する養子免疫療法を確立した。具体的にはMC1細胞を足蹠に接種し2週間後に所属リンパ節の膝窩リンパ節を摘出した。リンパ球を抗CD3抗体(2C11)を含む培養液で2日間培養後40VIL-2にて3日培養した。この細胞をDay3肺転移マウスに10^7個移入し、3日間IL-2を7500JRV投与(ip)した。腫瘍細胞投与後2週間でマウスを屠殺し、肺にインディアンインクを注入後フェケティー液で固定転移数を数えた。未治療群およびIL-2だけ投与の群は、肺転移数は、250以上であったが治療群は02個の転移に減少しており、有意な差を示し、治療モデルの確立に至った。培養リンパ球を、フローサイトメトリーで解析したところ、80%がCD8+で20%がCD4+であった。現在さらに細かく表面抗原の解析を施行中である。さらに、In vitro抗腫瘍活性をLAKと対比し、またin vivo活性もLAK及び遠隔リンパ系組織のリンパ球を用いて検討中である。尚治療モデルの確立が遅延した原因としては、他施設より譲り受けた抗CD3抗体に活性がなかったためと考えられる。なぜならば、新たに譲り受けたもので初めて治療に成功したからである。今後このモデルを用いてさまざまな免疫学的手法を用いて発展させることができるものと考えている。悪性腫瘍の所属リンパ節より得られたtumor-draining lymphocyte(TDL)は、in vitroでの適当な処理により特異的抗腫瘍活性を獲得し、養子免疫に利用可能となる。我々は、マウスTDLをin vitroで抗CD3抗体(2C11)とrecombinant interleukin-2(rIL-2)で培養し、微小肺転移および肝転移作成マウスに養子免疫療法を行い、LAK療法と比較検討した。
脂質由来リガンドによる細胞応答と食品成分による制御

Toll-like receptor (TLR)は、炎症性疾患などに関与している重要な分子である。本研究では、キャベツなどの野菜抽出物に強いTLR阻害活性を見出し、その活性成分としてイベリンと呼ばれる化合物を同定した。またその作用機構を解析した結果、TLRに直接結合することにより二量体化を阻害していることが明らかとなった。以上の結果から、TLR二量体化のステップが抗炎症活性食品成分の標的となりうることが示された。本研究では、内因的あるいは外因的に産生される脂質由来リガンドによる炎症誘導機構を分子レベルで解明し、さらにそれらを制御しうる食品成分の探索を目的としている。特に、自然炎症に関与する受容体であるTLRや、変性リポタンパク質受容体を活性化するリガンドの解析と、食品成分による制御機構の解明を通して、食による健康増進や疾病予防への貢献を目指すものである。平成25年度は、平成24年度において作成したTLR/NF-kBレポーター遺伝子発現HEK293細胞を用いて、タマネギ、ニンニクなどの抽出物にTLR阻害活性を見出した。さらに各種クロマトグラフィーや質量分析、NMRなどの機器分析により、それぞれの活性物質の単離・構造決定に成功した。平成24年度は、TLR受容体の活性化を評価するためのスクリーニング系の構築を行った。ヒト由来細胞であるHEK293細胞に、TLR2あるいはTLR4の発現ベクターを、TLRの下流に位置する転写因子NF-kBのレポーター遺伝子とともに導入し、安定発現株を取得した。NF-kBのレポーター遺伝子は、分泌型のルシフェラーゼを利用することにより、培養上清を用いたルシフェラーゼアッセイを可能とした。また、TLR4においては、そのアダプター分子であるMD2も同時に導入した。得られた細胞株に対し、TLR2およびTLR4に特異的なリガンドを処理し、ルシフェラーゼアッセイを行ったところ、リガンド処理濃度依存的にNF-kBの活性化が確認されたことから、取得した安定発現細胞株は、TLRの活性化を評価する上で有用であることが確認された。さらに、さまざまな野菜抽出物におけるTLR抑制活性を評価したところ、タマネギの酢酸エチル抽出物に抑制活性が認められた。また、ニンニクの油抽出物においても同様の活性が認められた。本研究では、内因的あるいは外因的に生成される炎症性リガンドによる炎症誘導機構を分子レベルで解明し、さらにそれらを制御しうる食品成分の探索を目的としている。特に、自然免疫受容体toll-like receptor (TLR)を活性化しうる脂質由来リガンドの化学生物学的解析と、食品成分の作用機構の解明を通して、食品成分による健康増進や疾病予防への貢献を目指している。平成25年度において炎症抑制活性の認められた野菜抽出物より、活性分子の単離精製を行い、NMRおよび質量分析装置などを利用してその化学構造を解析した結果、キャベツ抽出物よりイソチオシアネート化合物であるイベリンを見出した。同様に、タマネギ抽出物に含まれる炎症阻害物質としてケルセチンおよびその配糖体を見出した。イベリンに関して、in vivoにおける作用を検討するため、LPS投与マウスにおける炎症抑制活性を評価した。その結果、イベリンを摂取させることにより炎症性サイトカインの産生が抑制されることを確認した。また、イベリンによる炎症阻害メカニズムについて培養細胞レベルでの検討を行った。その結果、TLRシグナルの最上流であるTLR4の二量体化を阻害していることが明らかになった。さらに、イベリンのクリックケミストリープローブを用いて検討した結果、イベリンがTLR4に直接的に共有結合することにより、TLRの二量体化を阻害していることが示唆された。食品生化学当初の予定通り、TLR阻害活性を有する食品成分の探索と、TLRリガンド活性を有する酸化物の探索が順調に進展している。平成24年度の研究実施計画で予定していた通り、培養細胞を用いたTLR活性評価系を確立することができ、実際にいくつかの食品成分によるTLR阻害活性を見出すことができたことから、おおむね順調に進展していると考えられる。当初の計画通り、平成25年度に引き続いて、TLRリガンド活性を有する修飾タンパク質の探索とその化学構造の解明を行う。また、タマネギとニンニクに含まれるTLR阻害活性成分における作用機構の解明を目指す。平成25年度は、当初の研究実施計画通り、TLRに対するリガンド作用を有する修飾タンパク質や脂質などの探索を実施する。また、そのリガンド分子に対する検出系の確立を行う予定である。さらには、TLRシグナルを制御する食品成分の探索と作用機序解明を試みる予定である。実験に使用予定であった試薬が輸入手配のため、25年度中に納品が不可能であったため。

26年度において改めて見積もりおよび納期の確認を行った後、発注を行う。活性の認められたタマネギおよびニンニク中に含まれる活性物質の単離・構造決定のため、必要な有機溶媒類、HPLC様カラム類、また、共通機器使用料として使用する計画である。また、単離した食品成分の活性評価のため、細胞培養のための培地類やルシフェラーゼアッセイのためのキットを購入する予定である。
免疫寛容を導入したヒト化ファブリー病マウスに対する改変型酵素の治療効果

ファブリー病患者に対してヒトα-ガラクトシダーゼA(GLA)を用いた酵素補充療法が導入されたが、アレルギーなど克服すべき課題が残されている。我々はGLAと立体構造が似ているα-N-アセチルガラクトサミニダーゼ(NAGA)にアミノ酸2残基の遺伝子変異を導入してGLA活性を持つ改変型NAGAを作製した。しかし、この改変型NAGAをファブリー病モデルマウスに投与するとアナフィファキシーが起こり、治療効果を評価することが難しい。そこで、免疫寛容を導入したヒト化ファブリー病マウスを作製し、改変型NAGA投与による免疫反応と治療効果について検討した。ファブリー病は、α-ガラクトシダーゼA(GLA)欠損症であり、酵素補充療法が実施されている。ファブリー病患者では、補充した酵素に対して免疫寛容がないためにアレルギー反応を起こしやすい。我々は、この問題を克服するためにGLAと構造が類似したN-アセチルガラクトミニダーゼ(NAGA)を鋳型にし、2アミノ酸を置換してGLA活性を持つ改変型NAGAを作製した。本酵素は、ファブリー病患者のアレルギー反応の軽減が期待できる。しかし、本酵素をマウスに投与するとアレルギー反応を生じる。本酵素を用いた酵素補充療法を実現するために、ヒトNAGA遺伝子を肝臓特異的に発現させて免疫寛容を獲得したファブリー病マウス(寛容ファブリー病マウス)を作製し、本酵素による酵素補充療法の有効性を検討し、さらに寛容ファブリー病マウスから抑制性T細胞(Treg)を単離し、ファブリー病マウスに移入することにより、本酵素に対する免疫寛容を獲得できるかを検討する。本年度は、寛容ファブリー病マウスを作製する目的で、肝臓特異的に発現するマウスアルブミンプロモーターの下流にヒトNAGA遺伝子を連結したコンストラクト作製し、ファブリー病マウスの受精卵に注入し、トランスジェニックマウス13系統を樹立した。その寛容ファブリー病マウスが本酵素に対して免疫寛容を獲得できたかを検討するために、本酵素を週2回で投与したところ、ファブリー病マウスは6回目投与で本酵素に対するに対する抗体価が上昇したが、寛容ファブリー病マウスは抗体価の上昇は見られなかった。更に、ファブリー病マウスはアナフィラキシーによりほとんどが死亡したのに対し、寛容ファブリー病マウスではすべて生存した。これらの結果から免疫寛容ファブリーマウスは、本酵素に対して免疫寛容を獲得したと考えられる。今後、獲得した免疫寛容がTreg細胞によるものかついて検討する。改変型NAGAは、新しいコンセプトに基づくファブリー病治療薬になる可能性を秘めている。しかし、マウスを用いた動物投与実験を行うと、強い免疫原性を示すことが判明した。そこで、ヒトNAGAに対して免疫寛容を獲得させるため、肝臓特異的にヒトNAGA遺伝子を発現させたヒト化ファブリー病マウスを作製した。野生型マウスおよびファブリー病モデルマウス、ヒト化ファブリー病マウスを用いて、改変型NAGAの投与実験を行ったところ、野生型マウスおよびファブリー病モデルマウスは、投与4回目から改変型NAGAに対するIgG抗体レベルが顕著に増加し、5回投与後(14日後)に殆どの個体が死亡した。ヒト化ファブリー病マウスは、改変型NAGAを投与しても、抗原特異的なIgG抗体レベルは増加せず、投与した全てのマウスが生存した。これらの結果により、改変型NAGAは、マウスに対して強力な免疫原性を持ち、一方、ヒト化ファブリー病マウスではヒト改変型NAGAに対して免疫寛容を獲得したことが示唆された。次に、ヒト化ファブリー病マウスの改変型NAGAに対する免疫寛容が制御性T(Treg)細胞によるものかを検討するために、ヒト化ファブリー病マウスの脾臓由来のTreg細胞をファブリー病モデルマウスに養子移植した後、改変型NAGAを投与の投与実験を行った。その結果、ヒト化ファブリー病マウスのTreg細胞を移入したマウスは、移入しなかったマウスに比べて生存日数が僅かに伸びたが、最終的には全ての個体が死亡した。このことから、ヒト化ファブリー病マウスの改変型NAGAに対する免疫寛容は、Treg細胞の移入では、他のマウスに免疫寛容を獲得させることができないことが示唆された。改変型NAGAは、新しいコンセプトに基づくファブリー病治療薬として可能性を秘めている。しかし、ファブリー病モデルマウスを用いた静脈投与を行うと、強いアナフィラキシーを引き起し、治療効果を検討することが困難であった。そこで、肝細胞の強力な免疫寛容に注目し、肝細胞特異的にヒトNAGA遺伝子を発現させたファブリー病モデルトランスジェニックマウスを作製した。これらのマウスを用いて、改変型NAGAの免疫学的検討を行った。改変型NAGAで免疫した野生型マウスの脾細胞培養では、抗原刺激を加えるとリンパ球が増殖し、培養上清からTh2サイトカイン(IL-4, IL-13)が分泌され、Th2への分化が示唆された。

さらに、抗原特異的IgG1抗体が著しく高値であることが判明した。一方、改変型NAGAで免疫したファブリー病モデルトランスジェニックマウスの脾細胞培養では、抗原刺激を加えても、リンパ球は増殖せず、Th2サイトカインの分泌も検出されなかった。さらに、血液中の抗原特異的IgG1抗体も検出されないことから、ファブリー病モデルトランスジェニックマウスでは、肝細胞がヒトNAGAタンパク質を発現することで何らかの機序によりTh2分化およびIgG1クラススイッチを抑制していることが示唆された。本研究では、改変型NAGA投与による抗原特異的IgG1抗体が誘導されるとアナフィラキシーが起こることは明らかとなったが、そのメカニズムについては不明な点が多く残った。さらに、肝細胞により抗原タンパク質を発現させることによる免疫寛容について、全く分かっていない。今後は、まだ解明されないこれらの点について研究を進行させる。研究目的を達成するための研究の内の4つの内の(1)ヒト化ファブリー病マウスの作製、(2)改変型NAGA投与によるマウス免疫系の影響、(3)改変型NAGA投与による副作用の3つの項目についてほぼ終了することができた。24年度が最終年度であるため、記入しない。今後は、改変型NAGA投与によるマウスの死因は明確にする。そのためには、アナフィラキシーを含めたアレルギー反応が起きているかを詳細に検討する。さらに、改変型NAGA投与による治療効果をヒト化ファブリー病マウスを使い、生化学的および病理学的に検討する。
分散感覚ネットワークデバイスのネットワーク化による人間支援

本研究は、ロボット/メカトロニクス機器による物理的なサービス、また人間に意識させない形での知能的なサービスを提供することを目指す、分散感覚ネットワークデバイスによる知能化環境=Intelligent Spaceに関するものである。初年度は分散感覚デバイスの高機能化、複数のデバイスの配置最適化を中心に、人間中心環境への応用の前段階として個々の機能の高性能化を図ってきた。具体的な成果としては以下のとおりである。・最適カメラ配置より広範囲な場所を知能化環境の対象とする場合に、カメラとトラッキングシステムによる効率的な位置同定を行なうにはどのようにカメラセンサを配置すれば良いかが問題となる。そこで、対象物体の移動範囲や部屋の大きさ及び必要精度を入力情報として、最適な位置同定を行なえるカメラパラメータやカメラ配置位置及びカメラの姿勢が得られる最適カメラ配置シミュレータを製作し、これに基づいたカメラ配置により精度の高い位置同定ができることが明らかとなった。・人間追従ロボットの実現人間に近づいたり、後を追従するロボットは、病院やオフィスなどでの物資の運搬、人間とロボットの共存においては欠かすことのできない機能である。とくに、知能化環境では人間に物理的なサービスを提供するエージェントとして位置付けられており、これを実現するためには、人間とロボットできるだけ接近しなければならない。分散感覚デバイスの機能を利用し、広範囲で安定に人間に追従できる移動ロボットシステムを実現した。
自己確立の脳メカニズム解明

我々は複数の「自己」を持ち(例:研究者の私と家庭人としての私)それらの間の葛藤を経験する。さらにこれらの「個別的自己」を俯瞰的に眺める「総合的自己」も存在し、適応的に個別的自己間のバランスを調整する。思春期・青年期の“自己の確立"は、個別的自己の成熟を経て、その間の葛藤を調整する総合的自己の確立までの過程である。代表者は様々な自己に関する脳機能マッピング研究の成果に基づいて、行動出力とフィードバック入力の連合(「スキーマ」)が環境とのインタラクションの中で3階層に発達する、すなわち第1層の身体的自己(運動・感覚連合野)から第2層の対人関係的自己(dMPFC, TPJ他)を経て第3層の社会価値的自己(vMPFC, PCC)に至るモデルを提案していた。本研究では、自己確立の最終成熟段階である「総合的自己」の確立までの過程を複数のfMRI実験によってこのモデルに位置づけることを目指し、平成27年度は(1)第1層から第2層への発達過程の解明、(2)第2層から第3層への発達過程の解明、そして(3)個別的・総合的自己の神経基盤解明を行った。その結果、個別的自己の成熟を経て総合的自己が確立する過程は自己3層モデルと整合的であることが示された。さらに、その構成要素であるSMA, dMPFC, vMPFCといった前頭葉内側領域や、TPJ, PCCといった後部連合皮質について、自己確立過程で果たす役割がより具体的に理解できた。27年度が最終年度であるため、記入しない。申請者は様々な自己に関する脳機能マッピング研究の成果に基づいて、行動出力とフィードバック入力の連合(「スキーマ」)が環境とのインタラクションの中で3階層に発達し、各層で異なったレベルの自己を実現するモデルを提案している。これに立脚し、自分と他者の関係性を表象する第2層の「対人関係(対人行動-他者反応)スキーマ」(dMPFC, TPJ他)が土台となって、自己の社会的価値・役割を表象する第3層の「社会価値(社会行動-価値評価)スキーマ」(vMPFC, PCC)が発達する過程が“自己の確立"に相当する(すなわち個別的自己と総合的自己は、それぞれ対人関係スキーマと社会価値スキーマを基盤とする)というのが本研究で実証したい作業仮説である。これにより本領域の目指す「前頭前野を基盤として、高度なメタ認知を活用して自己像を表象し...」という人間像を認知神経科学的に具現化する。平成26年度は個別的自己と総合的自己の脳機能マッピングのために健常大学生被験者を対象に機能的MRI実験の準備(実験デザイン・倫理委員会信施・予備行動実験等)・デザイン検証を行い、3月には計測の着手にこぎつけた。事前面接で被験者ごとに個別的自己を定義し、MRI実験では被験者に個別的自己と総合的自己にポジショニング(その自己の立場になりきる)させながら自己価値評価課題を行わせた。少数被験者での予備的解析では、後者でのvMPFCの賦活上昇という作業仮説に整合的な結果を得ている。事前面接法や課題条件などの実験プロトコールを予定通りに確立し、機能的MRI実験に着手することができた。事前面接については、数度の予備実験を通じてプロトコールを改良し、実験者のスキルに依存しない半構造化面接をマニュアル化することに成功した。

また対照条件として、有名人や様々なレベルの個人的知己という選択肢の中から、これも数度の予備実験を通じて適切なレベルの個人的知己を選択し、これを各被験者に対して選択させるプロトコールも確立した。さらに自己確立の度合いを定量化する質問紙について、大規模な資料調査を行い、包括的な質問紙バッテリーを確立できた。27年度が最終年度であるため、記入しない。27年度には機能的MRI実験を前期中に完結し、個別的自己と総合的自己の脳機能マッピングを完了させる。さらに、自己確立の度合いを定量化する質問紙尺度得点と脳活動との関係を解析し、自己確立の脳メカニズムを解明する。研究成果の発表を関連する様々な学会で発表し、論文を執筆する。
ポリエステル系ペプチドミミックを指向したVCDによるバイオポリマー立体構造解析法

様々な分子量のL-ポリ乳酸についてのVCD測定を実施した。また、L-乳酸を出発原料として、二量体、四量体、六量体を合成した。合成されたオリゴマーのVCD測定及び理論計算を実施した。更に、対応するポリアミド体及びハイブリッド体の合成を実施した。合成した六量体のECD及びVCDの測定を実施した。エステルカルボニル、アミドI及びIIのIR、VCD吸収が観測され、これらのスペクトルから立体構造を解析した。また、カルボニル基に代わる候補官能基として、アジド基、ニトリル基、イソシアニド基、アルキンを考慮し、これらの官能基を含むモデル化合物を合成、それぞれの官能基の可能性についての検討を実施した。1)L-ポリ乳酸の詳細なVCD測定:L-ポリ乳酸は、生分解性プラスチックをはじめとした機能性素材と利用されているため、様々な分子量のサンプルが容易に入手可能である。IR吸収の面積を基本として規格化することで、VCDコットン効果を分子量によって強さを比較した。また、これまでCHCl3にのみによって確認されている分裂型VCDコットン効果について、様々な溶媒による効果を試みた。2ー1)L-乳酸オリゴマーの合成:L-乳酸を出発原料として、二量体の合成を行った。また、二量体をカップリングさせることにより四量体を合成、また、四量体と二量体から六量体を合成した。カルボニル基のα位のキラル中心のラセミ化をさけるため、できるだけ中性条件の保護、脱保護を実施した。同様にラセミ化をさけるような脱水縮合反応を実施した。また、NMR、キラルHPLCなどによるラセミ化の検証方法の確立を行った。2ー2)L-乳酸オリゴマーのVCD測定、理論計算:合成されたオリゴマーのVCD測定を実施した。特に、前述の結果を参考にして、カルボニル基のIR吸収をもとにした規格化のデータを用い、波数と強度を中心として、どのあたりから、固い構造、(らせんが主)を取りうるかを検討した。また、オリゴマーについてのVCDの理論計算を実施した。理論計算は、DFTによるab initio計算を基本とする。理論計算にはGaussianを使用、基底関数を工夫した。得られた理論スペクトルと実際のVCDスペクトルと比較した結果、よく一致することから、溶液中のオリゴマーの構造が確定することができた。目的オリゴマーの効率的合成に成功しており、また、オリゴマーを用いたVCDスペクトルは、期待したものであった。学会発表などの外部発表も実施、良好な応答が得られている。・L-乳酸オリゴマーの合成昨年に引き続き、L-乳酸を出発原料として、オリゴマーの合成を実施した。また、L-乳酸オリゴマーのVCD測定、理論計算を行った。種々のオリゴマーのVCDスペクトルを検討した結果、固い構造がとりうる範囲が大凡判明した。また、オリゴマーについてのVCDの理論計算を実施、実際のVCDスペクトルとの比較により、溶液中のオリゴマーの構造が明らかにすることができた。新たな試みとして、ポリアミド構造の知見に注目、ポリアミド体の合成を開始し、中間体の合成を達成した。・カルボニル基以外のIR官能基の検討我々が開発したVCD励起子キラリティー法は、原理的には、カルボニル基のみならず、他の官能基にも、適用可能と思われる。独立した位置に吸収をもち(アサインが容易)、振動モードが単純、かつ化学的に導入が可能な官能基として、アジド基を選び、適用性の検討を実施した。グルコース、ガラクトース、マンノースを出発原料として、3から6段階の工程をへて、4種のジアジド糖鎖誘導体の合成に成功した。また、これらの誘導体の水酸基は保護状態として、溶解度を高めるとともに、水素結合の影響を除去することとした。それぞれの化合物について、VCDスペクトルを測定した。2つの隣接するアジド基に由来するVCDシグナルは、明確な励起子型VCDシグナルを示すことが、判明した。また、これらの化合物の配座解析を実施、2つのアジド基の角度とVCDシグナルとの関連性について考察した。これにより、カルボニル基以外においても、VCD励起子キラリティー法が適用可能であること示された。概ね順調に進行している。ポスエステル体の溶液中での構造情報を得るのに成功している。新たな官能基として、アジド基に注目し、励起子型VCDシグナルの観測に成功している。また、これらの結果をもとに、学会発表などの外部発表も多数実施しており、その際の討論の結果も研究にフィードバックさしている。ポリエステル、ポリアミド、及びハイブリッド体の合成CD解析を行った。昨年に引き続き、L-乳酸を出発原料として、L-乳酸オリゴマーの合成を実施した。また、対応するポリアミド体及びポリエステル+ポリアミドのハイブリッド体の合成を実施した。ポリアミド体は同様な立体化学を有しているにもかかわらず、反対のらせん構造を有していることが知られている。合成した6つの六量体のECD及びVCDを測定した。また、ECDスペクトルからもアミド部分の二次構造を検証した。

ハイブリッド体の立体構造解析により、単独ではβ-ストランド構造を有しているポリL-アラニンに三つのL-乳酸を導入することにより、左巻きへリックス構造へと誘起させることが確認できた。更に、カルボニル基以外のIR官能基の検討を実施した。開発したVCD励起子キラリティー法は、原理的には、カルボニル基のみならず、他の官能基にも、適用可能と思われる。独立した位置に吸収をもち(アサインが容易)、振動モードが単純、かつ化学的に導入が可能な官能基として、アジド基、ニトリル基、イソニトリル基、アルキンなどが候補として考えた。コンフォメーションが既定されたビナフチルを母核として選択し、それぞれの官能基を有する4つのビナフナチル誘導体の合成を実施した。アルキンでは明確なピークは観測されなかったが、ニトリル、イソニトリルではフェルミ共鳴と思われる複雑なスペクトルを観測することができた。また、アジドに関してはカップルしたスペクトルを観測したもののそのコンフォメーションの予測が困難であることが判明した。様々な分子量のL-ポリ乳酸についてのVCD測定を実施した。また、L-乳酸を出発原料として、二量体、四量体、六量体を合成した。合成されたオリゴマーのVCD測定及び理論計算を実施した。更に、対応するポリアミド体及びハイブリッド体の合成を実施した。合成した六量体のECD及びVCDの測定を実施した。エステルカルボニル、アミドI及びIIのIR、VCD吸収が観測され、これらのスペクトルから立体構造を解析した。また、カルボニル基に代わる候補官能基として、アジド基、ニトリル基、イソシアニド基、アルキンを考慮し、これらの官能基を含むモデル化合物を合成、それぞれの官能基の可能性についての検討を実施した。引き続き、乳酸オリゴマーの合成及びVCD測定を実施するが、カルボニル基以外の発色団として、他の赤外官能基の検討を行う。我々が開発したVCD励起子キラリティー法は、原理的には、カルボニル基のみならず、他の官能基にも、適用可能と思われる。独立した位置に吸収をもち(アサインが容易)、振動モードが単純、かつ化学的に導入が可能な官能基として、アジド基、ニトリル基、イソニトリル基、アルキンなどが候補として考えられる。容易に誘導可能な、糖誘導体、ステロイド誘導体を用いることにより、これらの官能基が、励起子カップリングを起こすかどうか検討し、適用範囲拡大を試みる。・L-乳酸オリゴマーの合成、ポリアミド体の合成L-乳酸を出発原料として、オリゴマーの合成を引き続き実施するとともに、対応するポリアミド体の合成を実施する。ポリアミド体は同様な立体化学を有しているにもかかわらず、反対のらせん構造を有している。両者を比較することにより、らせん形性の本質的な力を見極める。両者における理論計算を実施する。また、ポリエステル体とポリアミド体のハイブリット体の合成も実施する。・カルボニル基以外のIR官能基の検討アジドに関しての実験、理論計算を繰り返すことにより、アジド官能基の実用性について検討する。また、他の官能基、ニトリル基、イソニトリル基、アルキンなどについても、励起子型のVCDシグナルを与えるかどうかの検討を行う。29年度が最終年度であるため、記入しない。キラル化学29年度が最終年度であるため、記入しない。
レーザ誘起蛍光を援用した誘電泳動による細菌の高速計測に関する研究

本研究の目的は、誘電泳動インピーダンス法(DEPIM)にレーザ誘起蛍光法(LIF)を援用した新たな細菌検出法(DEPIM-LIF)を確立するため、計測指標となる菌混合液中のインピーダンスと蛍光強度の相関を明らかにすることである。本年度(平成18年度)は前年度における準備的研究を基にして、(1)インピーダンスー蛍光強度の同時計測、(2)混合状態における検出特性の比較、(3)検量基準の作成を行った。(1)に関しては、モデル病原菌である大腸菌にCFDAやCTCなどの蛍光抗体を付与して染色し、各種菌濃度に対する蛍光強度を計測した。同時に電極間のインピーダンスも計測し、誘電泳動による大腸菌コロニー群の蛍光強度との相関を定量的に精査した。(2)に関しては、加温処理により代謝状態や活性(生死)の異なる大腸菌群を調整し、インピーダンスの変動傾向を調査した。結果として、生物学的検出法では同時計測が難しい複合的な生体活動変化を電気的定量値として間接的に捉えることが出来た。また、各種パラメータ(電圧振幅、駆動周波数、流量、バッファ溶液)の適切な調整によって、詳細な分離が可能であることが示唆された。蛍光分析に関しては、染色の有無による明確な計測分離に成功しており、マイクロセル中での混合菌溶液に対するDEPIMを十分に補完する結果が得られた。(3)に関しては、上記で得られた各種条件に対するインピーダンスの変動傾向をデータベース化するとともに、他の生物学的検出法で得られた特性と比較して相関係数を算出した。なお、本研究の関連成果は、学術投稿論文(静電気学会誌)及び国内学会講演会(静電気学会全国大会及び電気学会全国大会)にて発表されている。以上のことから、本研究では当補助金を有効に活用し、確実に到達目標を達成できたと思われる。本研究の目的は,誘電泳動インピーダンス法(DEPIM)にレーザ誘起蛍光法(LIF)を援用した新たな細菌検出法(DEPIM-LIF)を確立するため,計測指標となる菌混合液中のインピーダンスと蛍光強度の相関を明らかにすることである。主研究を円滑に遂行するために、本年度(平成17年度)は準備的な研究として、(1)対象菌種の生物的特性調査、(2)実験装置の構築、(3)インピーダンス計測を行った。(1)に関しては、モデル病原菌である大腸菌の形状や培養条件などの生物特性を調査し、誘電特性を明確にするための基礎データを揃えた。本研究において、菌の培養も実際に行い、実験が随時行える体制を整えることができた。また、大腸菌については結合抗体種の調査を行って、次年度から本格的に行う蛍光計測を円滑に進めるプロトコルを整えることができた。(2)に関しては、予備実験で作成したDEPIM装置に、インピーダンスの測定精度を上げるための高周波ロックインアンプ(本研究費にて新規購入)を組み込んだ。また、データロガーやパーソナルコンピュータを用いてデータの自動取得が行えるようにした。光学測定系としては、工業顕微鏡、蛍光装置、CCDカメラなどを揃え、適切な配置を施した。なお、誘電泳動セルは電極部および流路部を全面的に作り直し、菌の効率的な捕集動作が行えるように改善した。(3)に関しては、初期菌濃度を一定にした大腸菌溶液をポンプで循環させ、誘電泳動中のインピーダンスを計測した。さらに印加電圧、動作周波数および流量などの誘電泳動条件を変化させて、菌密度とインピーダンスの相関を解析した。なお、本研究の関連成果は、国内学会(応用物理学関係連合講演会)にて発表されている。
新規生物活性物質の探索を指向するジテルペン類の多角的合成研究

抗腫瘍活性等、興味ある生物活性を有するジテルペンahidicolane類および非常に類似した骨格を有するstemodane類の構造活性相関的興味から、これらの全合成研究を行なうにあたり、両ジテルペンを共通の中間体から選択的に作り分ける方法を確立することを目的とした.最近見いだしたシクロヘキセノンアセタール誘導体のルイス酸触媒によるスピロ閉環反応の光学活性体合成への応用は、途中の不斉導入の効率の低さから一時断念した。そこで、不斉導入が容易で、かつ両エナンチオマーの入手が確立されている手法、即ちSharplessの不斉エポキシ化を用い、両ジテルペンすべての光学異性体の合成が可能な合成経路の開発を計画した。即ち、合成初期の段階で不斉を導入し、tricyclo [6.3.1.0^<1.6>] dodec-5-en-6-oneの2種のエナンチオマーを合成し、その二重結合の還元方向を制御することにより、aphidicolane型,およびstemodane型B/C/D一環をつくり分ける手法である。シクロヘキシリデンアセテートのDIBAH還元により得られるアリルアルコールを不斉エポキシ化し、水酸基を保護した後、我々が開発したアリルチタニウムトリフェノキシドを用いるアリル化を伴うエポキシドの位置選択的開裂反応により将来スピロ炭素となる四級炭素を構築した。官能基変換の後、C環を立体選択的に構築し、その後、炭素鎖を変換し、B環をアルドール縮合により構築した。B環のエノン部の還元反応を検討したところ、接触還元によりstemodane型B/C/D環を選択的に構築できることが判明した。現在、aphidicolane型B/C/D環を選択的に構築する方法を検討中である。
希少動物由来の培養細胞バンクとiPS細胞樹立の試み

本研究は絶滅危惧動物からの初代培養細胞の作成と、遺伝子導入によるiPS細胞もしくは無限分裂のような付加価値を加えた細胞の作成を目的とした。。無限分裂細胞の誘導には主にレンチウィルスを用いた。レンチウィルスは核膜を通過できる性質を持つために、細胞分裂状態でしか遺伝子できないレトロウィルスよりも遺伝子導入効率において優れているとされている。我々は変異型CDK4、サイクリンD、TERTをサイトメガロウィルス由来のプロモータの制御下に発現するレンチウィルスを混合感染を行い、無限分裂誘導を行った。本研究では、絶滅危惧種を対象にまず培養細胞の樹立を試みた。本研究では絶滅危惧種に指定されている爬虫類特にウミガメ類に関して培養を行った。我々はアカウミガメおよびヒメウミガメの皮膚組織を採取し、初代培養を行った。その結果、アカウミガメおよびヒメウミガメの初代培養細胞の樹立に成功した。ヒメウミガメでは過去に我々が樹立したRPMI1640培地によって樹立が可能となったが、アカウミガメでは同培地での生育は比較的良くなかった。しかしアカウミガメの場合、アカウミガメはDMEM/F12の混合培地によって効率よく生育することが明らかになった。加えてヒメウミガメの培養細胞を用いて核型解析を行った。染色体標本を作成する上で、染色体数の誤差が検出されたが、合計で分裂体を50以上カウントした結果、2n=56にピークが認められ、本種が2n=56の核型を持つことを明らかにした。加えてヒメウミガメの場合、凍結組織からの初代培養を試みた。採取後1日の段階で、細胞凍結用不凍液に組織を浸漬した。その条件で細胞凍結用に用意された器具によって緩徐冷却をおこなった。その後液体窒素中で約6ヶ月保存を行った。6ヶ月後に通常の培養細胞と同様に解凍し、初代培養を行った所、初代培養細胞を得ることに成功した。このことはサンプリングフィールドと研究室が離れ、サンプリング後に長距離を長時間の輸送が必要になった場合、凍結状態で安定的な輸送が可能になることを意味する。今後はアカウミガメの核型解析を行なうと同時に、細胞への遺伝子導入を行うための基礎検討を開始する予定である。我々は絶滅危惧動物の一種であるアカウミガメを対象に昨年度に初代培養に成功した。アカウミガメはタイマイとは異なる培地条件を必要とすること、タイマイと同じ26°Cにて安定的に生育することを明らかにした。本年度はアカウミガメの細胞へ効率よく遺伝子導入するための基礎条件を検討した。導入にはレンチウィルスおよびレトロウィルスを使用した。EGFP(蛍光タンパク質)を使用した実験において26°Cで感染を行った場合は、数パーセントの細胞にしか遺伝子導入できないが、ウィルス感染時に一過性に37°Cで培養することにより80%を超える遺伝子導入が可能になることを見出した。この条件を元に、変異型CDK4 (Cyclin Dependent Kinase 4), Cyclin D, TERT(テロメラーゼ酵素サブユニット)を導入し無限分裂細胞の樹立を試みる予定である。我々の過去の研究によって変異型CDK4, Cyclin D, TERTの導入によって幅広い動物種の細胞を染色体パターンに変化を及ぼさず、元の細胞の性質を比較的保持したまま無限分裂に導くことができることが判明している。細胞周期の調節遺伝子群の構造は幅広い動物種において保存されており、爬虫類においても無限分裂細胞を誘導できる可能性がある。爬虫類において今まで無限分裂細胞の樹立の報告は全く例がなく、高い学術的価値をもつものと考えられる。また我々は組織を不凍液に浸漬することによって、6ヶ月以上冷凍保存した組織から初代培養細胞を得ることに成功した。本成果によって冷凍保存した組織であっても不凍液に保存すれば初代培養のための材料として利用出来ることが明らかになった。我々はアカウミガメ由来の初代培養細胞の樹立に成功した。加えてレンチウィルスを用いてヒト由来変異型サイクリン依存性キナーゼ4,サイクリンD,ヒトテロメラーゼ逆転写酵素遺伝子を入れることで細胞サイズが著明に小型化し、細胞分裂が加速されることを見出した。このことは爬虫類においても我々が適用した無限分裂化細胞技術が適用できる可能性を示している。現在、連続的な細胞培養を行い、無限分裂化に至っているかどうか検討中である。しかし、爬虫類由来の細胞の場合、細胞分裂が哺乳類と比較して遅い上、当初予想されるよりも長い期間(20世代以上)細胞の継代が可能となり、1年を越す連続培養実験を実施中である。染色体パターンを検出した結果、元の正常核型を維持したまま、無限分裂に至っていることが明らかになった。またウェスタンブロットによって導入した遺伝子の蛋白質レベルでの発現を検出した。また、得られた無限分裂細胞は核型解析の結果、元の正常核型を維持したまま、無限分裂に至っていることが明らかになった。iPS細胞化を行うために、山中4因子(Oct3/4, Klf4, Sox2, c-Myc)に加えてLin28およびNanogを加えた発現ベクターを導入した。遺伝子導入が行われたことは、下流に設置した蛍光蛋白質マーカーの発現によって検出されたが、iPS細胞のように小型化した細胞の出現はなく、元の線維芽細胞からの形態変化は認められなかった。このことは爬虫類では多能性幹細胞を維持する機構が進化上、保存されていない可能性を示唆する。爬虫類の培養細胞の分裂速度が予想されたよりもかなり遅く、連続継代実験に長い期間を必要としている。

通常、哺乳類の細胞では3-1週間の培養期間で細胞の継代が可能であるが、爬虫類細胞の場合、2-3週の培養期間が1回の継代で必要である。現在、論文投稿中であるが1年を超える細胞継代実験を要求されており、その要求を満たすために時間が必要となっている。本研究は絶滅危惧動物からの初代培養細胞の作成と、遺伝子導入によるiPS細胞もしくは無限分裂のような付加価値を加えた細胞の作成を目的とした。。無限分裂細胞の誘導には主にレンチウィルスを用いた。レンチウィルスは核膜を通過できる性質を持つために、細胞分裂状態でしか遺伝子できないレトロウィルスよりも遺伝子導入効率において優れているとされている。我々は変異型CDK4、サイクリンD、TERTをサイトメガロウィルス由来のプロモータの制御下に発現するレンチウィルスを混合感染を行い、無限分裂誘導を行った。前年度に引き続き、変異型サイクリン依存性キナーゼ4(CDK4)、サイクリンD、テロメラーゼ逆転写酵素サブユニット(TERT)を導入したアカウミガメの細胞の連続継代実験を実施している。現在まで継代数は30を超え、2年を超える長期にわたって細胞分裂が可能になることが明らかになった。既に野生型の細胞は細胞分裂を停止している。3つの遺伝子を導入することで実質的に無限分裂を誘導できると考えられた。また哺乳動物であるが、絶滅危惧種のひとつであり、スイギュウの一種、ローランドアノアの初代培養細胞から変異型サイクリン依存性キナーゼ4(CDK4)、サイクリンD、テロメラーゼ逆転写酵素サブユニット(TERT)を導入した無限分裂細胞を得た。本細胞は元のローランドアノアの染色体パターンを維持し、元の細胞の性質を保持していると考えられた。本細胞において連続パッセージを行い、変異型サイクリン依存性キナーゼ4(CDK4)、サイクリンDを入れたK4D細胞ではある一定の回数を継代できるがテロメラーゼ活性がないために継代途中で細胞分裂が停止すること、変異型サイクリン依存性キナーゼ4(CDK4)、サイクリンD、テロメラーゼ逆転写酵素サブユニット(TERT)を導入したK4DTでは無限分裂できることを明らかにした。またローランドアノア由来のK4DT細胞は元の染色体パターンを維持していることを明らかにした。またこれらのローランドアノア由来の研究成果を国際学術雑誌であるCytotechnologyへ掲載された。当初、予想した以上に遺伝子導入の効率が高く、無限分裂細胞を誘導するために遺伝子発現構築を改変する必要がなくなった。哺乳類細胞で行っていたようにそれぞれの単一遺伝子を発現する組み換えウィルスを混合して無限分裂細胞を樹立することが可能となった。高い遺伝子導入効率が可能になった理由は、一過性に37°Cに培養温度を上げ組み換えウィルスを感染させる工夫を行ったためである。組み換えウィルスの酵素が多くの哺乳類に最適化されているために、効率良い感染には37°Cの温度が必要であったと考えられた。これらの研究成果からおおむね順調に進展していると判断した。
核レセプタ-応答遺伝子の認識分子

過去数年に亘るレチノイドの構造と活性との研究に関連して発見したレチノイドレセプタ-は核内のレセプタ-であり、生命の中枢を制御するものである。本研究は、このレセプタ-の機能を調節しうる分子を合成しようとするものである。この目的のために、レチノイン酸レセプタ-遺伝子あるいはレチノイドによって制御される遺伝子の転写制御部位に強く結合する分子の合成を企画した。そのための方法として、我々はDNAの対掌体の合成を進めた。DNA対掌体が遺伝子と相互作用しうるか否かは不明であったが、本研究によってはじめて対掌体がDNAあるいはRNAと相互作用をもつことを明らかにした。この結果、対掌体がアンチセンス化合物として働きうることとなり、現在、配列特異性の検討を進めている。さらに、meso体と名づけたDNA,L体とD体とが交互に結合しているDNAに興味深い性質をみいだした。特定の配列をもつ場合にDNAと結合する。従って、これもアンチセンスDNAとして作用しうることが判った。以上の結果をもとに、遺伝子三重鎖の形成を目標としたDNA対掌体を合成しつつある。将来には、これらアンチセンス体が、DNAあるいはDNA関連物質である必要はないとの認識のもとに、もっと自由に化合物を分子設計すべきときになったと考えている。そのためにはDNAとタンパク(レセプタ-)との結合の解析が必要であり、目下、レチノイドレセプタ-とDNAの複合体解析のための基礎デ-タを集めている。
リンパ増殖性疾患におけるp73の機能解析

(目的)リンパ増殖性疾患におけるp73の発現を検索するため、p73アイソフォームの中で最も発現が高いp73αに対する抗体を作成し、免疫組織化学的検討とともに分子生物学的解析を行った。(方法)リンパ節や胸腺といった正常組織とともに、様々な種類の悪性リンパ腫や胸腺腫を対象として免疫組織化学を行った。また、p73αのcDNAをプローブとしたノザン解析により遺伝子発現も検討した。(結果と考察)1.正常のリンパ節や脾臓、胸腺皮質を用いた結果、各分化段階のT細胞、B細胞いずれにおいても、p73αの発現は免疫組織化学の検出感度以下であった。また検索した範囲では、各種悪性リンパ腫でのp73αの発現異常も見られなかった。一方、遺伝子再構成を余儀なくされるリンパ球の分化過程において、oncogenic translocationを抑制する機構が明らかにされつつある。DNA修復依存性の細胞死に深く関係しているp73が、RT-PCR法によりリンパ球に発現していることが報告されており、この機構にp73が関与しているかどうかは今後検討すべき課題と思われる。2.胸腺組織ではリンパ球に発現が見られなかったが、胸腺上皮細胞の細胞核に発現が認められた。ノザン解析でも胸腺組織でのp73α遺伝子の発現が観察された。リンパ増殖性疾患の中で、悪性リンパ腫にはp73αの発現異常は確認されたかったものの、様々な程度でリンパ球増殖を伴っている胸腺腫においてp73αの発現が低下していた。このことは、転写因子として機能するp73αの発現異常が胸腺腫発生に関与する可能性を示唆する。また、T細胞と胸腺上皮細胞との関係は、胸腺腫のみならず、自己免疫疾患などT細胞の機能異常が関与する疾病とも連関しており、p73に視点を置いた両者の関係が明らかにされれば、免疫異常の研究にも大きな展開がもたらされるかもしれない。