hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
量子ビームによる微細加工用高分子のイオン化ダイナミクスの解明

微細加工用材料であるレジスト内でのイオン化後の微視的電荷ダイナミクスを、極端紫外光(EUV)自由電子レーザー(FEL)や電子線など量子ビームを励起源とする分光法を用い研究を行った。高分子フィルム中の酸発生の量子収率は、EUVFELのエネルギー付与線量率(dose rate)が下がることによって、増加することが示唆された。またパルスラジオリシスにより、ポリ(スチレン-アクリレート)共重合体やポリ(4-ヒドロキシスチレン)の電荷ダイナミクスについて明らかにした。微細加工用材料であるレジスト薄膜のイオン化とその後の酸生成に伴う素反応について明らかにすることは、将来の半導体加工寸法の縮小化にとって重要である。そこで、レジスト内でのイオン化後の微視的電荷ダイナミクスの詳細を極端紫外光(EUV)や電子線を用いた量子ビームを励起源とする分光法によって明らかにして、EUVリソグラフィ用の高い解像度、加工精度および感度を満たすレジスト材料実現に向けての放射線化学的な知見を得ることが目的である。本年度の研究により以下の成果を得た。1.EUV自由電子レーザー(EUVFEL)を用いた薄膜用イオン化装置の構築数十ナノメートルオーダーの極薄膜の分光実験を実現するため、理化学研究所(播磨研究所)内に設置されているEUVFEL(20eV)を照射源とした新規分光測定系の構築を行った。2.EUV、電子線による励起を用いた薄膜中での酸形成レジストモデル高分子薄膜にEUVFELもしくは電子線露光装置を用いて照射を行い、各レジストモデル薄膜より生成する酸収量について、酸の指示薬をレジスト内に混合させることによって分光的に定量を行った。またパルスラジオリシス法を組み合わせることによって、ポリ(スチレン-アクリレート)共重合体での酸の収量と分子ダイナミクスの相関を明らかにした。3.パルスラジオリシスを用いた高分子のイオン化後の時間分解測定レジストのモデル化合物であるポリスチレン、ポリメルメタクリレート等の高分子にナフタレン、ベンゾフェノン等を添加した薄膜からの、ナノ秒時間分解の蛍光もしくは、燐光測定を上記装置を用いて行った。それぞれの量子収率を求めることにより、EUVFELの光子エネルギーおよび照射フラックスを変化させることによるイオン化ダイナミクスの変化(スパーの重なりや配置)に基づく(一重項/三重項)生成比に対する依存性を明らかにした。半導体加工寸法の縮小のために、リソグラフィにおける露光源の短波長かが行われている。極端紫外光(EUV)への露光波長の短波長化によって、照射線源の有するエネルギーがイオン化閾値を超えるため、レジスト高分子へのエネルギー付与に伴うイオン化反応の理解が重要である。そのため、本研究課題では、極端紫外自由電子レーザー(EUVFEL)および電子線を用いて、高分子での線量率変化による正負イオン反応場への影響やレジスト中の放射線誘起反応機構について研究を行った。また、FELの高いコヒーレンス性を利用したリソグラフィプロセスに向けた基礎研究を行った。前年度開発した発光分光パルスラジオリシス法を用いて、ポリスチレンにナフタレンおよびベンゾフェノンを添加した薄膜をサンプルとして、添加剤の励起状態からの発光の検出を行った。その結果、波長60nmのEUVFELの線量率増加による再結合過程を経た一重項/三重項生成比の減少が明らかとなり、スパーの重なりや配置の変化に基づくジェミネート再結合(イオン化初期のイオン対間の再結合)とクロス再結合(別々のイオン対間の再結合)の割合の変化が明らかとなった。またEUVFELを露光源として電子線レジストに照射を行い、その殆どが80nm以内の膜厚内でエネルギーが吸収され、線量率を約10倍増加した条件下において、約1/2倍程度感度が減少し、線量率増加によるレジスト感度の低下が明らかになった。さらに、FELの持つ高いコヒーレンス性を利用したEUVFELの干渉露光によるパターニングを目指すために、電子線リソグラフィとニッケルめっきを組み合わせた回折格子の作製を試み、240nmピッチの格子の作製に成功した。
企業的農業経営における雇用管理問題に関する研究

1.農業部門における雇用管理は、零細な資本、労働の繁閑などのため、労働力調達問題に直面する。雇用者は労働の繁閑と地域労働市場を睨みながら、調達可能な労働力を見極め、労働力確保に務めている。高原野菜地域では地域魅力を情報発信し、大都市から収穫期のアルバイト雇用を確保している。選果場では、対象は高齢者や主婦に絞られ、町人材センターや役員の責任で確保している。2.雇用依存経営は複合経営に多く、雇用形態は労働多投型部門では内職ないしパート比率が高く、資本集約部門で恒常的雇用、果樹で臨時的雇用が多い。雇用者は女性が大部分を占め、各年齢層に平均的に分布する。雇用条件は、定期休暇は設定しているが、有給休暇のある経営は少なく、保険を整備しているのは少ない。賃金も、恒常的雇用者にしても時給制が大半であった。作業環境面では健康上の障害が指摘され、雇用依存経営の発展には条件・環境整備が避けられない。3.施設野菜・花卉部門では、家族労力限界まで規模拡大した段階で雇用導入するケースが一般的で、雇用依存経営も家族経営的色彩を残している。雇用作業は、農業の自然的・産業的特性を考慮し、その類型化と標準化を進め、また労働能力管理面では、評価基準の工夫や窮屈な時間管理の回避により、雇用者の自発性と定着を図っている。経営主は生産管理、作業工程管理を担い、妻が人間関係管理的労働の中軸になるケースが多い。4.大規模雇用経営を行うには、作業の機械化や作業内容を単純化し、雇用労力でも能率や品質の低下が生じない作業法及びこれを補う装置の開発が必要である。そのために栽培種類の整理、生態を把握し、それに合致した的確な作業行程を組み立て、各施設に責任者を置くなど、パートも能力のある人には仕事を任せ、時間給を上げ、慰安旅行や海外研修を行うなど、やりがいのある環境を作りだすことが重要である。5.雇用中心経営では、経営の成長過程に対応する雇用者自身の雇用管理能力の向上が必要になっている。1.雇用依存型経営が数多く形成されている愛知県内の雇用実態を把握するべく、農業改良普及所や農協等の関連機関に聞き取りを行うなどした。その結果、複合経営に雇用依存型経営の多いこと、雇用形態は労働多投型部門では内職的ないしパートタイマー的雇用比率が高く、資本集約的部門では恒常的雇用者に依存するケースが目につき、果樹部門では臨時的雇用の多いことが判明した。雇用者は女性が大部分を占め、30代、40代、50代、60代いずれにも平均的に分布していた。雇用条件については、定期休暇のある経営は少なくないが、有給休暇のある経営は少なく、恒常的雇用者にしても保険を整備しているのは少なく、賃金も、恒常的雇用者にしても時給制が大半であった。作業環境上の問題は暑い・寒い、トイレ・休憩所の不足、かぶれ・筋肉痛など健康上の障害が相当数指摘される状況にある。雇用依存型経営として展開するには、雇用条件、雇用環境などの整備・充実が避けられない課題になっていることが判明してきた。

2.施設野菜・施設花卉部門における雇用中心経営の聞き取り調査によれば、家族労力で限界まで規模拡大したところで雇用導入に転換するケースが一般的で、雇用依存の企業的経営と言っても家族経営的色彩を残していること、しかし雇用依存作業について農業の自然的・産業的特性を考慮しながらその類型化と標準化を進め、また労働能力管理面では、評価基準の工夫や窮屈な時間管理の回避により、雇用者の自発性と定着を図っていること、経営主は生産管理、作業工程管理を担い、妻は人間関係管理的労働の中軸になるケースの多いこと、雇用者の提案制度を導入し、トイレの設置改装、豆腐デイなど幾つかの改善策を実施していること、雇用管理に雇用労力確保の厳しさが反映していることなどが判ってきた。二つの典型事例をみる。部会員全体の被雇用者数3300名弱、支払い賃金総額約20億円の及ぶ、大規模でユニークな雇用中心型の施設園芸経営集団を作り出した豊橋温室園芸農協「大葉部会」の場合、収穫・調整作業に10アール当り7000時間を超す、大量の労働力を必要とするだけに、ハウス内収穫作業と、パック詰め調整作業に適した労働力を確保如何が、経営の存立・発展条件となる。同部会は、前者の作業をパート形態で、後者の作業を内職形態で雇用し、新聞への折り込み広告、立て看板、口コミなどによって募集・確保するとともに、賃金の協定、パートの送迎、就業規則の明確化、就業時間の柔軟化、快適な作業環境の創出等により、部会員相互の雇用競合を回避しつつ雇用労働力の定着を図ることに成功している。(有)S植物園は優れた工程管理と技術管理をベースに、雇用管理も際だって優れた経営体である。施設型専業経営が大量・広範囲に展開する渥美半島地区では、雇用調達は容易でないが、同経営は、10代から70代に亙る雇用者に対し、(1)雇用者の年齢、能力、個性、希望等に応じて、ライン部門や肥培管理部門などの持ち場を決める、(2)8時間労働を基本としつつ、雇用者の条件に応じ柔軟な労働時間を適応する、さらには(3)給与に能力給を採用しつつ、他所へいって働くより少なくないことを能力査定の基準にすることによって、雇用者の納得いく水準を確保し、かつ会社の収益が上がればそれをボーナス時に分配することによって、大勢の雇用者がそれぞれの自発性を最大限発揮して働けるようにしている。その際、自らの合理主義的特性とパートナーとしての妻の「人の良さ、角を立てない」特性とをうまく結び付け、雇用管理に当たっていることも、人間関係管理として重要な役割を発揮している。その結果、雇用者の定着度は極めて高い。1.農業部門における雇用管理問題は、労働力調達の場面から多くの問題に直面する。雇用依存型経営は、企業的経営ではあるが資本規模は零細で、また自然相手の産業故、労働の繁閑は避けがたく、労働力の周年雇用は容易でない。そのため、労働の繁閑と地域労働市場を睨みながら、調達可能な労働力を見極め、労働力確保に務めている。男子労働力は底辺下請並み以上の雇用条件で確保され、主婦労働力は、量販店と同程度の条件でされている。2.高原野菜で有名な南佐久郡川上村では、内発型地域作りが情報発信され、それが地域魅力となって、レタス収穫期における大都市からのアルバイト雇用が可能になっている。夏場のピーク時には、村全体で2000人の雇用労働力が調達され、農家一戸当たりでは、多い農家が10人前後、通常は4-5人のアルバイト労働力を導入。日当は1万円(9000円+1200円)が相場である。アルバイタ-が行う作業は主に収穫・運搬・定植作業である。レタス切りと箱詰めは、ほとんどを経営主と妻、後継者が行うことが一般的であるが、大規模農家の場合、ベテランの雇用者にレタスの切り取り作業を分担させるケースも少なくない。
メンデル遺伝病の補完遺伝子検査システムの構築と遺伝医療における社会実装

COLD-PCR法の至適化を行い、いくつかの遺伝子変異で変異アレルの濃縮、モザイク変異の検出は可能であったが変異のパターンや周辺DNA配列により結果は大きくばらついた。これは変異を含むDNA配列に依存して、変異アレルを分離するための至適な変性/アニーリング温度が異なる事に起因すると考えられた。従って、本法においては各変異に対する個別の至適化が必須となり、単一プロトコールによる低頻度モザイク検出は困難であると結論された。解決のための代案として次世代シークエンサー(NGS)を用いた網羅的解析法を考案した。NGSを用いた遺伝子診断は、一般には高価となるがLong PCR baseとし、イルミナ社のNexteraを用いてライブラリー作成を行う事で、安価に解析可能である。1520KbのAmpliconで解析遺伝子領域をタイリングすることで塩基置換のみならず、大欠失等の構造変異も同時検出可能である。またAmpliconに多型が存在しない場合には、さらに大きなレベルの欠失が存在する事が予想され、これを昨年度までに開発したMugCap法にて確認できることを示した。さらに、TSC1/2に関しては、白血球RNAで全長mRNAのRT-PCRが可能であり、これも同様にNGSの系でライブラリーを作成する事ができる。Indexを変えることで複数検体に関して、特定遺伝子のイントロンを含めた全DNA配列と全mRNAを一度に解析する事ができ、その成果として、TSC1の深部イントロン変異によるスプライス異常の家族例を報告した(Shoji et al. 2019)。また、NGSの特性を生かしdepthを増やすことで癌の生検材料においてSMAD4の1%のモザイク変異を検出し得た。Long PCR baseのNGS解析は、特定遺伝子の遺伝子診断において網羅的な解析を安価に提供でき、本研究課題の目的は達成された。責任遺伝子領域の大欠失が判明している結節性硬化症(TSC1, TSC2遺伝子)および神経線維腫症1型(NF1遺伝子)患者由来のDNAを用いてMugCap法を開発した。本法に関しては大きく2点を改良することにより、実用的なレベルに完成することが出来た。1点目は伸長反応酵素の変更である。当初は5'側プローブからの伸長反応にTaq polymeraseを使用していたが、この酵素は5'to 3'exonuclease活性を持つために、伸長して3'側プローブに達した際に停止せず、3'側プローブを5'端より分解しながらさらに伸長反応を継続する。Taq polymeraseが3'側プローブを全て分解した場合、共通プライマー配列は遊離するためPCR反応で増幅されなくなる。この反応とTaq ligaseによる結合反応とが競合するために、実験毎、プローブ毎に有効なPCRテンプレートの産生量にばらつきが生じる。この結果、安定した定量性(コピー数測定)が得られない。そこで伸長反応酵素を5 to 3'exonuclease活性を持たないKlen Taq polymeraseに変更する事で問題を解決し、安定した結果が得られるようになった。2点目は解析手法の変更である。当初はアガロースゲル電気泳動のイメージをフリーソフト(Image J)で解析し、ピークの面積比からコピー数の変動を算定していたが、この方法ではバックグラウンドピークの水準を一律に規定する事が難しく、実験毎、プローブ毎の誤差が大きくなる。そこで共通PCRプライマーの片方を蛍光標識し、キャピラリーシーケンサーによるフラグメント解析を行った。これによりばらつきのない安定した結果が得られるようになった。MugCap法に関しては実験系が確立され、臨床応用段階に入った。当初の計画よりも精度、汎用性の高いシステムとなり順調な経過と言える。一方、今年度はCOLD-CHIPS (co-amplification at lower denaturation temperature PCR with CHIPS)法の開発も行ったが、まだ条件決定が必要である。様々なタイプの1塩基置換および欠失/挿入変異の検体よりパネルを作り、患者DNAを対照DNAで希釈した系列をつくり、仮想的なモザイク変異状態のサンプルを作成した。COLD-PCRにより、これらのモザイク変異の濃縮が可能であるかどうかを検討したが、現在のところは効率的な濃縮は得られておらず、条件の至適化が必要である。MugCap法に関しては、Klen Taq polymeraseへの変更と、蛍光キャピラリーシーケンサーによるフラグメント解析の導入により、TSC1/2やNF1以外の他の複数の遺伝子においても、コピー数決定が容易に行えることが示された。実際の症例においても、この技術は、Long-PCR法と組み合わせる事で、ミトコンドリア三頭酵素欠損症の責任遺伝子HADHAの未知の大欠失変異のbreak pointを決定することが可能であった(Bo et al. Journal of Human Genetics 62,809-814,2017)。予めMugCap法によるスクリーニングで欠失が存在すると目されるゲノム領域周辺を、2コピー領域と1コピー領域(欠失領域)に仕分けておき、欠失を跨ぐ最近傍の2コピー領域にLong-PCR Primerを設定することで、break pointを含むPCR増幅産物を得ることが出来た。この産物を、ダイレクトシークエンスすることで、break pointのDNA配列を決定し、Alu-Alu recombinationによる欠失であることを、クローニングすることなく突き止めた。これはAnchored Long-PCR法の応用例の一つとして注目に値する成果である。また、COLD-PCRで1st PCR産物中の低頻度変異を濃縮するためには、2nd PCRプライマーとして、よりTm値が低いものを使用する必要があることが判明した。

これは、ヘテロデュプレックス形成時にプライマーがアニーリングしないように、温度差(分別マージン)を設けるという事であり、これがCOLD-PCRのキーテクノロジーとなる。各1st PCR産物に対し、2nd PCRとしてCOLD-PCRを行い、CHIPS法でスクリーニングすることで、Full mutationからMosaic mutationへのスクリーングが検体を無駄にすることなく連続して可能となる。COLD-PCR法の至適化を行い、いくつかの遺伝子変異で変異アレルの濃縮、モザイク変異の検出は可能であったが変異のパターンや周辺DNA配列により結果は大きくばらついた。これは変異を含むDNA配列に依存して、変異アレルを分離するための至適な変性/アニーリング温度が異なる事に起因すると考えられた。従って、本法においては各変異に対する個別の至適化が必須となり、単一プロトコールによる低頻度モザイク検出は困難であると結論された。解決のための代案として次世代シークエンサー(NGS)を用いた網羅的解析法を考案した。NGSを用いた遺伝子診断は、一般には高価となるがLong PCR baseとし、イルミナ社のNexteraを用いてライブラリー作成を行う事で、安価に解析可能である。1520KbのAmpliconで解析遺伝子領域をタイリングすることで塩基置換のみならず、大欠失等の構造変異も同時検出可能である。またAmpliconに多型が存在しない場合には、さらに大きなレベルの欠失が存在する事が予想され、これを昨年度までに開発したMugCap法にて確認できることを示した。さらに、TSC1/2に関しては、白血球RNAで全長mRNAのRT-PCRが可能であり、これも同様にNGSの系でライブラリーを作成する事ができる。Indexを変えることで複数検体に関して、特定遺伝子のイントロンを含めた全DNA配列と全mRNAを一度に解析する事ができ、その成果として、TSC1の深部イントロン変異によるスプライス異常の家族例を報告した(Shoji et al. 2019)。また、NGSの特性を生かしdepthを増やすことで癌の生検材料においてSMAD4の1%のモザイク変異を検出し得た。Long PCR baseのNGS解析は、特定遺伝子の遺伝子診断において網羅的な解析を安価に提供でき、本研究課題の目的は達成された。MugCap法に関しては、今年度の改良によりプローブの多重化が容易である事が示された。また、異なる共通PCRプライマー配列を持つプローブを混合して、同時にハイブリダイゼーションした場合、各プライマー毎に異なるプローブセットを増幅できることも確認された。プライマー毎に異なる蛍光色素で標識すれば、フラグメント解析上はPCR産物を混合して1サンプルとして流すことが出来るため、解析効率は飛躍的に向上する。
早期英語教育指導者の養成と研修に関する総合的研究

指導者に求められる英語力に焦点を絞ったアンケート調査を実施し、千葉県、熊本県、愛知県の公立小学校の教員総計418名の意識を探った。回答の分析から、指導に求められる英語力のレベルの査定には、指導の目的、自身の英語力の査定、望まれる指導形態等が関与していることが判明した。また『英語ノート指導資料』中の指導者言の分析を行い、『英語ノート』を使用して英語活動を実施する際に想定されている英語の特徴を抽出した。平成16年度より3年間実施してきた『早期英語教育の指導者養成及び概修の実態と将来像に関する総合的研究』を2007年3月に終了し、それに引き続き本研究プロジェクトを開始した。研究活動の初年度にあたる平成19年度は、(1)前プロジェクトからの継続課題の確認と今後3ヵ年の研究計画立案、(2)現行の早期英語教育指導者養成・研修に関わる諸問題の抽出、(3)前プロジェクトの研究成果発表を実施した。(1)に関しては、前プロジェクトの研究活動の中で実施した二つのアンケート調査より得られたデータをより仔細に分析する中から、新規研究プロジェクトの方向性を探り、翌年度以降のアンケート調査実施の準備を進めた。(2)に関しては、前年度に引き続き、学会・研究会への参加等による資料収集活動を行い、早期英語指導者養成・研修の現状と諸問題を考察した。(3)に関しては、2007年9月に、大学英語教育学会シンポジウム(広島)で研究発表を行い、同年11月には全国語学教育学会(東京)で英語による口頭発表を行った。また、2007年10月には、東京国際フォーラムにおいて、「英語教育国際シンポジウムーこれからの子ども英語指導を考える」を開催、翌2008年2月には、ブリティッシュ・カウンシルと共催で、「小学校英語の現状と課題」と題する一日のセミナーを東京(神田外語学院)と大阪(大阪国際会議場)で開催し、満場の参加者と共に、様々な角度から子ども英語指導に関する諸問題を考えた。平成20年3月末には、平成19年度の研究活動実績に基づき、報告書をまとめた。(628字)研究プロジェクトの2年目にあたる平成20年度の主な研究活動は以下の3点である。(1)昨年度の活動過程で準備を進めてきた公立小学校教員を対象とするアンケート調査、(2)第一次プロジェクトで得たデータの発展分析及び研究成果の発表、(3)指導者研修・セミナーの実施。(1)に関しては、前年度までの研究活動の成果を基に、指導者に求められる英語運用能力に焦点を絞ったアンケート調査を実施し、千葉県、熊本県、愛知県の公立小学校の教員総計418名から回答を得た。回答の集計・分析を行い、中間結果をまとめた。(2)に関しては、第一次プロジェクトの調査結果を質的に分析し、考察を深め、国際応用言語学会(AILA)(平成20年8月;於ドイツ・エッセン市)及び全国語学教育学会(JALT)(同年11月)において、英語による研究発表を行った。また、平成19年度の口頭研究発表を基にまとめた論文が日本児童英語教育学会(JASTEC)紀要に掲載された。(3)に関しては、これまでの研究活動の成果を実際の指導者研修の場で実践に結び付けることを目指し、熊本県、千葉県、東京都において、主として小学校英語活動に関わる指導者を対象とするセミナー及びワークショップを開催した。平成21年2月には、神田外語大学とブリティッシュ・カウンシルの共催で、文部科学省・東京都教育委員会・千代田区教育委員会他の後援を得て、「実りある小学校英語に向けて」と題する一日のセミナーを東京(神田外語学院)で開催し、間近に迫った小学校5,6年生の英語活動必修化に向けて、現場の教師や関係者が強く関心を寄せるテーマに取り組んだ。平成21年3月末には、平成20年度の研究活動実績に基づき、報告書を編纂し、関係諸機関・個人に配布した。研究プロジェクトの最終年度にあたる平成21年度は、特に早期英語教育指導者に求められる英語力の特定を焦点に当て、以下の4点を中心に研究活動を進めた。1.前年度までの活動過程で実施した公立小学校教員総計418名を対象とするアンケート調査回答の質的・量的両面からの詳細分析、2.『英語ノート指導資料』掲載の指導者言の分析、3.上記2項の分析結果についで、学会・学会誌における成果発表、4.指導者研修・セミナーの実施。上記3に関しては、小学校英語教育学会(JES)第9回全国大会(平成21年7月於東京学芸大学)及び全国語学教育学会(JALT)35回国際大会(同年11月於グランシップ静岡)において、日本語及び英語による研究発表を行った。また、上記学会発表のうち、『英語ノート指導資料』指導者言の分析についての口頭発表を基にまとめた「小学校英語活動指導に必要な英語力とは?」と題する研究論文が小学校英語教育学会紀要に掲載された。4に関しては、これまでの研究活動の成果を実際の指導者研修の場で実践に結び付けることを目指し、熊本県、千葉県、東京都において、主として小学校英語活動に関わる指導者を対象とするセミナー及びワークショップを開催した。

平成22年2月には、熊本大学とブリティッシュ・カウンシルの共催で、文部科学省・熊本県教育委員会・熊本市教育委員会その他多数の団体の後援を得て、「ともに築こう!豊かな小学校英語」と題する一日のセミナーを熊本大学黒髪キャンパスで開催し、間近に迫った小学校5,6年生の英語活動必修化に向けて、現場の教師や関係者が強く関心を寄せるテーマに取り組んだ。平成22年3月末には、平成21年度の研究活動実績に基づき、報告書を編纂し、関係諸機関・個人に配布した。(736字)
羊を用いた変形性顎関節症発症過程の研究

10頭の羊を用い実験を行なった。8頭の羊に外科的方法で初期条件を与え、変形性顎関節症実験モデルの作成を試みた。他2頭はコントロールとして用いた。その方法とは顎関節軟骨の表層のみをメスを用い切り取る方法であった。全て左側を術側とし右側はそのまま保存した。初期手術から3か月後羊は屠殺され左右顎関節は一塊として取り出され、x線的、病理組織的検索を行なった。X線検査はlateral、P-Aの2方向で行ない、病理組織的検索は関数窩、関節円板関節頭をそれぞれ9分轄して各々左右を比較し、関節窩に於ては関節軟骨の厚みを測定し、関節円板に於てはその厚みを計測した。また関節頭に於てはIshimaru、Gossの方法を用いOAstageのindexを付与し、それぞれ左右を比較した。その結果、x線学的には手術側関節頭にはflattening、erosion、sub-cortical cyst等の変化が認められた。マクロ的には顎関節軟骨の表層をメスを用い切り取った羊の手術に於ける下顎頭周囲にはosteophyteを伴ったeburnationが認められ、関節円板には菲薄化、穿孔が認められ関節窩表層には軟骨の増殖が認められた。反対側の顎関節には形態的変化は認められなかった。またミクロ的にも手術側関節窩の関節軟骨は非手術側に比べ有意に減少しており、関節頭におけるOA stageも有意に上昇していた。したがって今回の実験で出現した顎関節の形態的変化は典型的な変形性顎関節症と認められた。従って今回作成に成功した変形顎関節症モデルは今後顎関節に於けるOAの研究に大いに寄与するものと考えられた。
新規制御性T細胞の自己免疫疾患への関わりの解明と同細胞の骨髄移植への適用

主に、ヒト多発性硬化症の動物モデルと言われるマウス実験的自己免疫性脳脊髄炎(EAE)を用いて、CD8^+CD122^+制御性T細胞の効果を検討した。抗CD122抗体をin vivo投与してCD8^+CD122^+制御性T細胞を除去しておいたマウスにEAEを誘導した場合、対照マウスに比べて、その症状が強いまま継続することがわかった。その症状が回復しないマウスに、CD8^+CD122^+制御性T細胞を移入するとEAE症状が劇的に快復することから、CD8^+CD122^+制御性T細胞がEAE症状の快復期に必須の役割を果たしていることが証明された。また、EAEの症状はT細胞の出すIFN-γとIL-10のバランスに非常によく相関していることもわかった。C57BL/6マウスをドナーに、BALB/cマウスをホストにした骨髄移植を行い、骨髄細胞の移入と同時にドナー系統マウス由来のCD8^+122^+細胞を移入してその効果を検討した。骨髄細胞の単独移入ではマウスは次第に衰弱して体重減少を起こしたが、CD8^+CD122^+細胞を同時に移入したマウスは比較的健康で体重減少も軽微であった。このような骨髄移植後の現象がどのような機構で起こっているのかを解明するために血球の状態を調べたところ、全身状態の悪くなったマウスではホスト側の血球細胞が特にT細胞で多く残っていることがわかり、骨髄移植がうまく行われておらず、ホスト側の免疫細胞がドナー側細胞に対して免疫応答を起こしていることが示唆された。一方、制御性T細胞を移入して状態の良いマウスではT細胞も含めた血球が全てドナー型の細胞に置き換わって骨髄移植が成功しており、同種間骨髄移植に対するCD8^+CD122^+制御性T細胞の有用性が示された。「研究の目的」CD8^+CD122^+制御性T細胞がヒトの自己免疫疾患や骨髄移植後のGVHに関わっていること、ならびに治療や予防に有用であることを証明するために、その基礎となるモデルマウスを用いた動物実験を行い、免疫異常を基盤とする疾患におけるCD8^+CD122^+制御性T細胞の意義、役割についての理解を深める。「平成17年度の研究実績」疾患モデル動物として、ヒトの多発性硬化症のモデルであるマウス実験的自己免疫性脳脊髄炎(EAE)に対すCD8^+CD122^+制御性T細胞の効果を検討した。抗CD122抗体をC57BL/6マウスにin vivo投与し、CD8^+CD122^+制御性T細胞を除去しておく。このようなマウスに、MOGペプチドで免疫してEAEを誘発した。抗体処置をしなかったマウスは、EAE症状がピークに達した後に速やかに症状の回復が見られたが、抗CD122抗体投与によってCD8^+CD122^+細胞を除去しておいたマウスではピークに達した症状がそのまま長期間持続するという現象が見られた。また、そのような抗CD122抗体を投与しておいてEAEを誘発したマウスに、他のマウスから得られたCD8^+CD122^+細胞を移入してやるとEAE症状は快方に向かったが、細胞移入しなかったマウスはそのまま重篤なEAE症状が継続した。以上の結果は、CD8^+CD122^+制御性T細胞が免疫応答を抑制し沈静化する働きがあり、自己免疫疾患の治療に有用であることを示唆する。マウスを用いた予備的な実験の段階では、異系統間(例えばC57BL/6からBALB/cへ)の骨髄移植後に起こってくるGVH様の現象を、CD8^+CD122^+制御性T細胞が抑えることができるという結果が得られている。1.自己免疫疾患への関わりの解明マウスEAE(実験的自己免疫性脳脊髄炎)について、CD8^+CD122^+制御性T細胞がどう関わるかの解析を行なった。EAEは、C57BL/6マウスにMOG(ミエリン稀突起細胞糖タンパク)を強力なアジュバントとともに免疫することで誘導した。他に処置をしない場合には、免疫後10日目頃から症状(四肢と尾の麻痺)が現れ始め、16日目前後をピークとして症状は徐々に軽快していく。免疫前に抗CD122抗体をin vivo投与し、CD8^+CD122^+制御性T細胞を除去しておいたマウスにEAEを誘導すると、症状の現れる時期やピークの症状の激しさは変わらないものの、ピーク後の症状の消退が見られずに、激しい症状のまま数十日が経過した。そこで、抗体処置をして激しい症状が続くマウスに、他の同系マウスからとったCD8^+CD122^+制御性T細胞を移入すると、速やかに症状が軽快していく現象が見られた。CD8^+CD122^+制御性T細胞は、EAE(ヒト多発性硬化笙のモデルと言われる)の快復に重要な役割をしている可能性が示唆された。2.骨髄移植への適用C57BL/6マウスの骨髄細胞をBALB/cマウスに移植する、完全異系統問の骨髄移植を行ない、そこにCD8^+CD122^+制御性T細胞がどう関わるかを調べた。単純に骨髄移植を行なっただけでは、T細胞のドナー型への置き換わりは非常に悪く、また慢性GVH様の反応が現れてマウスの体重減少が著しかった。

しかし、骨髄細胞と同時に5×10^5個のドナー系統マウス由来のCD8^+CD122^+制御性T細胞を同時に移入した場合、きれいにT細胞を含めた全ての血球がドナー型に置き換わり、GVH様の反応は見られず、マウスの体重減少も観察されなかった。これは、CD8^+CD122^+制御性T細胞の骨髄移植への応用を強く示唆する実験結果であった。主に、ヒト多発性硬化症の動物モデルと言われるマウス実験的自己免疫性脳脊髄炎(EAE)を用いて、CD8^+CD122^+制御性T細胞の効果を検討した。抗CD122抗体をin vivo投与してCD8^+CD122^+制御性T細胞を除去しておいたマウスにEAEを誘導した場合、対照マウスに比べて、その症状が強いまま継続することがわかった。その症状が回復しないマウスに、CD8^+CD122^+制御性T細胞を移入するとEAE症状が劇的に快復することから、CD8^+CD122^+制御性T細胞がEAE症状の快復期に必須の役割を果たしていることが証明された。また、EAEの症状はT細胞の出すIFN-γとIL-10のバランスに非常によく相関していることもわかった。C57BL/6マウスをドナーに、BALB/cマウスをホストにした骨髄移植を行い、骨髄細胞の移入と同時にドナー系統マウス由来のCD8^+122^+細胞を移入してその効果を検討した。骨髄細胞の単独移入ではマウスは次第に衰弱して体重減少を起こしたが、CD8^+CD122^+細胞を同時に移入したマウスは比較的健康で体重減少も軽微であった。このような骨髄移植後の現象がどのような機構で起こっているのかを解明するために血球の状態を調べたところ、全身状態の悪くなったマウスではホスト側の血球細胞が特にT細胞で多く残っていることがわかり、骨髄移植がうまく行われておらず、ホスト側の免疫細胞がドナー側細胞に対して免疫応答を起こしていることが示唆された。一方、制御性T細胞を移入して状態の良いマウスではT細胞も含めた血球が全てドナー型の細胞に置き換わって骨髄移植が成功しており、同種間骨髄移植に対するCD8^+CD122^+制御性T細胞の有用性が示された。
MHCクラスI抗原提示経路に移行する炭疽菌外毒素を用いた新タイプのHCVワクチン

C型肝炎ウイルス(HCV)のワクチン開発のため、MHCクラスI分子に高い移行能を持つ炭疽菌外毒素を用いてHCVに対する細胞傷害性Tリンパ球(CTL)の誘導能を検討した。前年度、炭疽菌外毒素のprotective antigen(PA)と、HCVの既知エピトープを結合したlethal factor(LF)でマクロファージ(Mφ)細胞株を処理し、BALB/Cマウスに免疫することでCTL活性を誘導した。今回、さらに効果的な抗原刺激の方法を検討した。Mφ細胞株を放射線照射(50Grey)し、アポトーシス状態で免疫することで高いCTL活性が得られた(非照射群の約3倍)。蛋白を高率に吸着するラテックス粒子にPA、LFを処理後免疫しても高いCTL活性が誘導できた(E/Tが150の場合、30%のkiller活性)。PA、LFと共に樹状細胞増多因子であるGM-CSF、あるいは樹状細胞成熟を促す抗CD40で処理したラテックス粒子で免疫することでCTL活性は更に高まった(それぞれLatex-PALF単独投与群の約2倍の活性)。しかし、PA、LFの反復刺激でCTL活性の増加は見られず、免疫記憶の誘導は認められなかった。PA、LFの免疫で得られたCTLはHCVのエピトープ配列を含んだ組み換えワクチニアウイルスを感染させた標的細胞にkiller活性を示した。また低濃度のエピトープ(10nM)をパルスした標的細胞にkiller活性を示したことよりPA、LF系はHCVワクチンとして有望と思われた。GM-CSF、抗CD40のCTL誘導に対する促進効果、あるいはアポトーシス細胞を介しての樹状細胞のcross presentationの存在などより、PA、LFによるCTL誘導には樹状細胞が重要であることが示唆された。現在、長期培養で高純度の樹状細胞を得(94.6%)、免疫刺激をおこなっている。細胞障害性T細胞(CTL)の誘導を主な作用機序とするC型肝炎ウイルス(HCV)ワクチンの検討を行った。炭疽菌外毒素成分の一つのlethal factor(LF)とHCVのCTL epitopeに相当するペプチドの融合タンパク7種類を、共同研究者であるNIHのDr.Lepplaが作成し、供与を受けた。このうちH-2dのエピトープをもつ3種類を、もう一つの炭疽菌外毒素成分protective antigen(PA)と共にBALB/cマウスに投与したところ、2種類の融合タンパク(HCVのcore epitopes、35-44、および133-142残基)によりCTLの誘導がみられた。もう一つのNS5,2422-2437残基のものではCTLは検出されなかった。投与法をいろいろ検討した結果、筋肉内、あるいは皮下が良く、これを骨髄出来の樹状細胞にex vivoで処理して投与することにより、DNAワクチンや組み換えvaccinia virus免疫と同程度の活性を得ることができた。これは最近研究されているex vivoの遺伝子治療と比較しても、安全かつ有効な方法として期待される。この系が予想通り融合タンパクが細胞質内に入り、MHC class I processing pathwayにのってCTLに提示されることを、融合タンパク処理細胞をbrefeldin Aあるいはchloroquineで処理することにより確認した。現在はさらに高いCTL誘導を目指して、ex vivo細胞感作法の改良を行っている。前年度、炭疽菌外毒素のprotective antigen(PA)と、HCVの既知エピトープを結合したlethal factor(LF)でマクロファージ(Mφ)

細胞株を処理し、BALB/Cマウスに免疫することでCTL活性を誘導した。今回、さらに効果的な抗原刺激の方法を検討し外。Mφ細胞株を放射線照射(50Grey)し、アポトーシス状態で免疫することで高いCTL活性が得られた(非照射群の約3倍)。蛋白を高率に吸着するラテックス粒子にPA、LFを処理後免疫しても高いCTL活性が誘導できた(E/Tが150の場合、30%のkiller活性)。PA、LFと共に樹状細胞増多因子であるGM-CSF、あるいは樹状細胞成熟を促す抗CD40で処理したラテックス粒子で免疫することでCTL活性は更に高まった(それぞれLatex-PALF単独投与群の約2倍の活性)。しかし、PA、LFの反復刺激でCTL活性の増加は見られず、免疫記憶の誘導は認められなかった。PA、LFの免疫で得られたCTLはHCVのエピトープ配列を含んだ組み換えワクチニアウイルスを感染させた標的細胞にkiller活性を示した。また低濃度のエピトープ(10nM)をパルスした標的細胞にkiller活性を示したことよりPA、LF系はHCVワクチンとして有望と思われた。GM-CSF、抗CD40のCTL誘導に対する促進効果、あるいはアポトーシス細胞を介しての樹状細胞のcross presentationの存在などより、PA、LFによるCTL誘導には樹状細胞が重要であることが示唆された。
学校現場におけるネットワーク型OJTに関する実証的研究

本研究では,以下の3つの調査を柱として研究を進める。1OJT関連の文献資料を集め,OJTの理論に関する調査・研究を行う。2学校現場で先進的なOJTの取組を行っている自治体や学校での,OJTに関する実態調査を行う。3さらに,2の調査を行った自治体や学校での,その効果に関する調査を行う。以上の調査結果を元に,「誰が」「どのような状況で」「どういった支援を」行った時にOJTが有効に機能するかを解明することで,学校現場でこれまで行われてこなかった新しい手法による効果的なOJTの方法について検討する。また,学校現場以外にも適用できる汎用的な人材教育のモデルを提示できる可能性もある。
近代日本における人口変動のミクロ実証分析

戦後日本が高度成長を達成することができた要因の一つは、戦前から生じた長期的な出生率の低下による年少人口の減少と、生産年齢人口の増加にあるとされている。本課題では、このような戦前日本における人口変動に係る、家計による意思決定のメカニズムを研究した。そのためにまず、1920-30年代における都市家計についてのデータ・ベースを、複数の統計資料から構築した。そして、人々の健康状態や栄養摂取量の変化、出生率や死亡率に影響を与えた要因の特定、公衆衛生政策等が人口の変動に与えた影響などを分析した。東京市における個人データの構築については、史料の収集、整理、読解、入力を行い、統計解析に利用可能なフォーマットにまで落とし込むことができた。また、研究計画で予定していた補足史料の収集についても、対象地域・時代に近い、新たな個票データを発掘することができた。統計解析では、モデル選択に予想以上の時間がかかったが、予備的な分析からは研究計画に記した仮説と整合的な結果を得ることができた。さらに、東京市における死亡率の空間分布を把握するために町丁目単位の格子データを作成し、GWRの枠組みからSMRの予測を行った。戦前の大都市についてSMRの予測と視覚化を行った研究は初めてであり、これにより当時の疾病の地理的分布を正確に把握できるようになった。以上の結果をまとめた論文は、所属機関のdiscussion paperとして刊行済みである。本年度は、前年度までに構築したデータベースを利用して、戦前日本の都市家計における家計内資源配分に関する論文をまとめた。都市家計の労働配分や消費の構造、およびそれに関連する人口変動については、19-20世紀初頭を対象とする英国の経済史研究を中心に関心がもたれてきた。これら研究をふまえて、本研究では新たに構築した都市家計データを利用し、1920-30年代における東京市の労働者階級家計における労働供給、および消費構造の一部を明らかにした。また、消費構造そのものに加えて、栄養摂取と健康状態との関連についても定量的な分析を行った。以上の結果を論文にまとめ、所属機関のdiscussion paperとして刊行した。また、本研究で得られた結果の妥当性を議論するためLondon School of Economicsに短期滞在し、Eric Schneider教授、Janet Hunter教授、およびNeil Cummins教授を中心に複数の研究者からコメントを受ける機会を設けた。また同様に、University of SussexのIan Gazeley教授、University of OxfordのJane Humphries教授からも、論文の内容について個別にコメントを受ける機会を設けた。研究計画に記した個人データの構築については、史料の読解から統計解析に利用可能なフォーマットにまで落とし込む段階まで進めることができた。また、補足史料の収集についても、幸い対象地域・時代に近い、新たな個票データを発掘することができた。このように、データベースの構築については、当初の予定以上に進展したと考えられる。一方で、統計解析ではモデル選択に時間がかかり、具体的な定式化まで進むことができなかった。以上から、平成26年度はおおむね順調に進展したと言える。27年度が最終年度であるため、記入しない。日本経済史予備的な分析結果からは、男女の交渉力が近代日本における出生率低下に影響を与えていた可能性が示唆された。そこで今後は多少方針を修正し、これら複数の要因に配慮した分析を行う。具体的には、これまで進めてきたマイクロデータによる分析に加えて、国勢調査報告と人口動態統計の報告書から格子パネルデータを構築し、出生率の変動を分析する。その際、構造変化を明示的に分析できるよう、戦前と戦後を含むある程度長期に亘るパネルを作成する予定である。
腫瘍免疫の抗原認識機構の解析と人為的制御

本研究は腫瘍抵抗性の賦与に関与する腫瘍抗原の固定及びその認識過程の細胞性及び分子機構の解明更にはそれら知見に基づいた腫瘍免疫の人為的制御法の確立を目的としている。この観点から本年度は(1)可溶化腫瘍拒絶抗原の分子免疫学的性状解析、(2)腫瘍特異的T細胞の腫瘍抗原認識機構の解析、(3)マクロファージの活性化、細胞障害機構の解析を目指し次の成果を得た。(1):前年度、RSV誘発CSAM腫瘍より分子量約60KDの腫瘍拒絶抗原(TRA)が分離された。今回、このTRAのps60^<src>との異同を解析したその結果、TRAよりpp60^<src>を除去してもTRA活性が残存すること、又別に調製したpp60^<src>自身によってTRA活性を賦与出来ないことがわかった。以上TRAは分子量においてそのoncogene産物(pp60^<src>)と類似するが、pp60^<src>とは異なることが明らかとなった。(2):腫瘍特異的ヘルパー型T細胞はL3T4^+及びLYC-2^+両T細胞集団を含むが、両集団とも腫瘍抗原を直接腫瘍細胞上で認識しえず、腫瘍細胞表面よりsheddingした腫瘍抗原をAPC上で認識すること、更にその認識にはAPC上のHMC抗原の関与が必須でL3T4^+又はLYC-2^+T細胞はそれぞれ、TRA+MHCクラスII抗原、TRA+MHCクラスI抗原を認識することが明らかとなった。又本年度腫瘍特異的ヘルパー型T細胞株が樹立され、今後このT細胞株を用いた腫瘍抗原認識機構のより詳細な解析が可能となった。(3):マクロファージが抗腫瘍効果を発現する為には、インターフェロンγ(IFN-γ)によるpriming、次いでリポポリサッカライド(LPS)によるttiggeringといった段階的活性化が必要である。本研究によりIFN-γによるシグナルの少なくとも一部にはCa^<++>が関与している事及び抗腫瘍Mφ活性化に関与するIFN-γシグナルは、Ca^<++>やPLCのみでは説明できない別のシグナルをも包含する事が示唆された。
動物のGPSを支える光駆動型地磁気受容体分子の構造と機能

申請書に記載の研究計画に基づき下記の研究を行った。【1】光・磁気受容体クリプトクロムの立体構造の決定:酵母を用いて高純度のクリプトクロムを大量に得ることに成功したことを受けてこれまでに、多数の条件をスクリーニングしたものの結晶は得られていない。そこで、構造が安定しないと推定されるカルボキシ末端郎行きを削った多数の変異体を用いて、さらに検討したものの結晶は得られなかった。そこで、引き続き条件を検討続けると共に、結晶化に替わる構造推定手段としてMD計算を用いて立体構造を推定した。推定した構造を元に、光反応に伴う発色団近傍の電子移動を推定し、変異体を作成・解析した。【2】光・磁気受容体クリプトクロムの光反応機構の解析:光を受容した直後の光反応を検討するために、ミリ秒分光法を用いた解析を行った。ここでは、中間体を含めた詳細な光反応過程を推定するため、特異値分解法を利用した解析を行った。その結果、興味深いことに光照射直後において、これまで観察された中性ラジカルの前駆体であるアニオンラジカル体がサブミリ秒スケールで安定に生じていることが判明した。アニオンラジカル体が他のクリプトクロムよりも安定に存在していたことから、アニオンラジカル体の形成前後において高効率の磁気応答反応が起こっている可能性が考えられた。【3】光・磁気受容体クリプトクロムの光依存的な磁気応答反応の検出:クリプトクロムの磁気応答反応の検出には、クリプトクロムを分子レベルで一定方向に並べることが重要である。そこで、これまでに得たモノクローナル抗体の一本鎖抗体を大腸菌において大量に発現し、変性・再生を経て高純度に得ることに成功した。特に、クリプトクロムのカルボキシ末端を認識するC13抗体は、温度変化に応じて結合力が変化することが判明したため、この性質を利用して、タンパク質精製・可逆的固定化を行う基本技術を確立した。クリプトクロムの結晶化について条件検討を続けるのと並行して、その過程で確立した高純度試料の精製方法を利用することによって、これまで不可能であった高速分光が可能となった。現在は、発現量の少ない変異体の大量精製も可能となりつつあり、結晶構造は確定できていないものの、光反応過程を知るために必須の高濃度試料が得られた点が、今後の研究展開の大きな突破口となっており、その点が大きな進展である。また、クリプトクロムアフィニティー精製方法の詳細な検討過程において、温度感受性の一本鎖抗体を用い、温度変化によって高純度タンパク質精製が可能となった。この方法は他のクリプトクロムにも応用可能であると同時に、タンパク質の固定化技術にもつながる可能性があり、以上を総合して、概ね順調に進展していると判断した。研究1の結晶化に関してはひきつづき条件検討をつづける。具体的には、これまで用いてきた酵母以外の宿主にも広げて純度の高いタンパク質の精製を試みる。また、立体構造解明のリスクも考え、MDシミュレーションで得られた予測立体構造の正しさについて、変異体の光反応解析と酵素部分分解解析、ならびに、反応する抗体のエピトープ解析などを合わせて、総合的に評価・検討する。研究3の磁気応答反応の検出には、分子固定化技術と光反応の検出技術の両方の確立が必要であり、これまでにない新規の技術開発が必要と考えられた。高速分光法を導入することによって、分子固定を行わずとも、磁気効果を検出できる可能性が考えられた。そこで、光反応の検出にやや重点を置きたい。つまり、固定化方法はひきつづき検討しつつも、並行して蛍光等を用いてクリプトクロムの構造変化のリアルタイム検出ができないかを検討する予定である。【1】光・磁気受容体クリプトクロムの立体構造の決定:立体構造推定をより効率的に進めるため、これまでに構築した精製方法を改良した。具体的には、発現する酵母株の検討、タグの変更、培養条件の変更、スケールアップを行い、mgレベルのクリプトクロムを得る方法を確立した。さらに、精製段階を増やし、高純度かつ大量のCRY4を得た。これを用い、光条件を含めて、数百の条件を検討したが、結晶は得られなかった。そこで、タンパク質内でゆらぎをもつと推定されるC末端領域を削った多数の変異体を用いてさらに検討を進めると共に、結晶化に替わる構造推定手段としてMD計算を進めている。【2】光・磁気受容体クリプトクロムの光反応機構の解析:光反応機構の詳細を検討するために、発色団近傍のアミノ酸を置換した多数の変異体を作製した。酵母を用いて精製方法を検討し、得られたタンパク質を用いて光反応サイクルを検討した。その結果、Asn391の変異により、ラジカル生成効率が大きく影響を受けることなどが判明し、この結果を元にラジカル形成機構を推定した。また、ゼブラフィッシュなどに存在する多数のクリプトクロム分子の発現系を構築し、それらの高純度精製法を確立した。【3】光・磁気受容体クリプトクロムの光依存的な磁気応答反応の検出:クリプトクロムの磁気応答反応の検出に向けてまず、精製したタンパク質を用いた光反応のリアルタイム検出方法を検討した。ELISA法や蛍光検出による光反応の解析、および可視分光解析によるラジカル中間体の詳細な解析を行い、ラジカル形成に及ぼす種々の反応条件を検討した。

また、光・磁気依存的な構造変化を認識できるC1モノクローナル抗体に関して、ハイブリドーマより抗体分子のcDNAを単離し、一本鎖抗体を大腸菌で発現、さらに精製して活性のある状態で再生することに成功した。研究1において、クリプトクロムの結晶化を行う予定で研究を進めた。当初に確立した精製方法では、結晶が見られず、そのため、培養株、発現方法、精製タグ、精製スケールなどを全面的に見直し、結晶化の専門家と日々協議しながら実験を進めた。残念ながら現在までに、結晶は得られていないものの、高純度に大量精製する方法を構築することができ、他のさまざまな物理化学的解析に耐え得る質および量の試料を得ることに成功した。こうして得られた試料を用いて現在、高速分光解析等の共同研究を進めており、興味深い成果が得られつつある。また、精製方法の詳細な検討により、CRY4以外のCRY分子の精製にも成功し、広くCRYファミリー分子の発現・精製系が完成しつつある。このようにして得られた試料を用いて光反応サイクルの比較解析が可能となった。また、変異体の発現に際して、MDシミュレーションによる構造予測を行い、発色団近傍の構造も予測することができた。予測構造を元にした変異体により興味深い成果も得られている。上記のように、結晶化は未だ成功していないものの、そのための試料作りや試行錯誤で得られた成果によって、当初予期しなかった多くの成果も得られ、別の共同研究も発展しつつある。以上を総合して、概ね順調に進展していると判断した。申請書に記載の研究計画に基づき下記の研究を行った。【1】光・磁気受容体クリプトクロムの立体構造の決定:酵母を用いて高純度のクリプトクロムを大量に得ることに成功したことを受けてこれまでに、多数の条件をスクリーニングしたものの結晶は得られていない。そこで、構造が安定しないと推定されるカルボキシ末端郎行きを削った多数の変異体を用いて、さらに検討したものの結晶は得られなかった。そこで、引き続き条件を検討続けると共に、結晶化に替わる構造推定手段としてMD計算を用いて立体構造を推定した。推定した構造を元に、光反応に伴う発色団近傍の電子移動を推定し、変異体を作成・解析した。【2】光・磁気受容体クリプトクロムの光反応機構の解析:光を受容した直後の光反応を検討するために、ミリ秒分光法を用いた解析を行った。ここでは、中間体を含めた詳細な光反応過程を推定するため、特異値分解法を利用した解析を行った。その結果、興味深いことに光照射直後において、これまで観察された中性ラジカルの前駆体であるアニオンラジカル体がサブミリ秒スケールで安定に生じていることが判明した。アニオンラジカル体が他のクリプトクロムよりも安定に存在していたことから、アニオンラジカル体の形成前後において高効率の磁気応答反応が起こっている可能性が考えられた。【3】光・磁気受容体クリプトクロムの光依存的な磁気応答反応の検出:クリプトクロムの磁気応答反応の検出には、クリプトクロムを分子レベルで一定方向に並べることが重要である。そこで、これまでに得たモノクローナル抗体の一本鎖抗体を大腸菌において大量に発現し、変性・再生を経て高純度に得ることに成功した。特に、クリプトクロムのカルボキシ末端を認識するC13抗体は、温度変化に応じて結合力が変化することが判明したため、この性質を利用して、タンパク質精製・可逆的固定化を行う基本技術を確立した。