hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
インターネットを利用した総合型地域スポーツクラブの評価システムと情報サイトの構築

本研究では、スポーツ振興基本計画でも政策目標として掲げられている総合型地域スポーツクラブの各種クラブ情報を明らかにするため、平成7年度から文部科学省育成事業補助を受けた41市町村43クラブの調査を実施した。質問紙法と直接面接法を併用し、そのクラブの基本情報や施設情報を収集した。特に、クラブの属性、指導者、施設、クラブハウス、社会的効果等の項目へのクラブ担当者からの自己評価も実施した。また、ドイツ国クライスノイス郡でのスポーツクラブ調査(7クラブ)、北九州市、広島県熊野町、山形県鶴岡市、鹿児島県鹿屋市の総合型地域スポーツクラブ会員に対しては、ネットワーク形成機能とコミュニティ形成機能に関した質問紙調査を実施した。研究結果から、育成事業を実施している市町村では、自立運営に入っているものの、指導者の確保や学校や他の地域スポーツ団体と連携は、必ずしも十分に確立されていない評価が明らかになった。また、総合型地域スポーツクラブのクラブへの参加は、会員の地域での人的ネットワーク形成や部分的にはコミュニティモラール形成への肯定的な影響がみられ、それは、農村部よりも都市部において顕著な差がみられた。ドイツでのクラブ調査からは、伝統的なクラブの存続に当たっても、会員への多様なニーズと質の高いサービス内容の充実が重要な要因として上げられている。すべての研究結果については、形式を整えデジタルデータベース化され、今年度末までにインターネットサイトを立ち上げるため基本的なホームページの作成と検索メニュー作成についても完成した。今年度、本研究では、全国で展開されている総合型地域スポーツクラブの各種クラブ情報のうち平成7年度から9年度に育成事業を受け、すでに自主運営に入っている14市町村クラブの調査を実施した。質問紙と直接面接法を併用しそのクラブの基本情報や施設情報を収集した。各クラブの調査データは、すべて形式をそろえデジタルデータベース化された。調査の結果収集された地域のクラブデータは、岩手県金ヶ崎、山形県鶴岡市、愛知県半田市、広島県熊野町、福岡県北九州市、秋田県琴丘町、新潟県新井市、富山県福野町、滋賀県蒲生町、兵庫県姫路市、岡山県岡山市、山口県新南陽市の12クラブで、宮崎県田野町と岐阜県揖斐川町の2クラブは、すでに活動を休止し、会員実態も把握できない状態であったため、データベースからは削除した。日本の総合型地域スポーツクラブの手本になっているドイツの典型的なクラブとドイツクラブ研究の資料収集も実施した。これら、これまでの研究成果を3年後にインターネット上で公開するため、基本的なホームページの作成と検索キーワードの作成についても検討をおこなった。今年度、本研究では、ドイツ国クライスノイス郡でのスポーツクラブ調査(7クラブ)やカナダ国オンタリオ州ウォータール市での高齢者スポーツクラブ(3クラブ)及び、国内総合型地域スポーツクラブの各種クラブ情報のうち平成10年度から育成事業を受けている、すでに自主運営に入っている23市町村クラブの調査を実施した。また、すでに自主運営に入っている、北九州市大谷コミュニティスポーツクラブと広島県熊野町筆の里スポーツクラブには、コミュニティ形成機能に関した会員・非会員の質問紙調査を実施した。その結果、総合型地域スポーツクラブへの参加は、部分的にはコミュニティモラール形成への影響がみられ、それは、農村部よりも都市部において顕著な差がみられた。インタビュー調査を実施したクラブへは質問紙と直接面接法を併用しそのクラブの基本情報や施設情報を収集した。ドイツでのクラブ調査結果を含め各クラブの調査データ(47クラブ)は、すべて形式をそろえデジタルデータベース化された。これまでの研究成果を次年度にインターネット上と報告書で公開するため、基本的なホームページの作成と検索キーワードの作成についても完成し、テストも実施した。次年度は、今年度の成果を公表に向けて、さらに、調査データを積み上げ、学会での成果発表をしていく予定である。

本研究では、スポーツ振興基本計画でも政策目標として掲げられている総合型地域スポーツクラブの各種クラブ情報を明らかにするため、平成7年度から文部科学省育成事業補助を受けた41市町村43クラブの調査を実施した。質問紙法と直接面接法を併用し、そのクラブの基本情報や施設情報を収集した。特に、クラブの属性、指導者、施設、クラブハウス、社会的効果等の項目へのクラブ担当者からの自己評価も実施した。また、ドイツ国クライスノイス郡でのスポーツクラブ調査(7クラブ)、北九州市、広島県熊野町、山形県鶴岡市、鹿児島県鹿屋市の総合型地域スポーツクラブ会員に対しては、ネットワーク形成機能とコミュニティ形成機能に関した質問紙調査を実施した。研究結果から、育成事業を実施している市町村では、自立運営に入っているものの、指導者の確保や学校や他の地域スポーツ団体と連携は、必ずしも十分に確立されていない評価が明らかになった。また、総合型地域スポーツクラブのクラブへの参加は、会員の地域での人的ネットワーク形成や部分的にはコミュニティモラール形成への肯定的な影響がみられ、それは、農村部よりも都市部において顕著な差がみられた。ドイツでのクラブ調査からは、伝統的なクラブの存続に当たっても、会員への多様なニーズと質の高いサービス内容の充実が重要な要因として上げられている。すべての研究結果については、形式を整えデジタルデータベース化され、今年度末までにインターネットサイトを立ち上げるため基本的なホームページの作成と検索メニュー作成についても完成した。
環境要因の人体影響(基礎班)

本研究班は、研究小領域「環境要因の人体影響」の研究を総括するとともに、研究の進め方、記録、成果の発表、評価などについて検討することを目的として発足した。本年度は後期3年間の第2年度なので、各計画班においては研究が進展した。本基礎班では以下の活動を行った。1)人体影響研究小領域幹事会(本研究班メンバ-を中心に構成される)を開催して、研究の進め方、研究発表の方法、評価と将来計画などについて検討した。2)研究小領域の代表者会議(幹事会と公募研究代表者で構成される)を2回開催して、本研究の意義付けなどの討議を行ない、各研究の方向つけについて討論した。3)研究小領域の研究成果発表会を開催した(平成4年1月9,10日)。各研究班と各公募研究を合わせて計20題について活発な発表ー討論を行った。4)研究小領域の研究成果報告書を年度末に発行した。(「環境要因の人体影響(5)」)5)他の小領域との研究交流をはかり、平成4年度の研究にそれを生かすよう努力した。6)環境要因の人体影響の実験的研究を進めるに当たって、物理力や有害化学物質に曝露された実験系を隔離された位置から分光学的にモニタ-するための計測法を開発している。
放電加工システムの最適制御とその工業への応用に関する研究

【研究成果の概要】1.放電加工システムに対する最適制御を行う際の基礎となる放電加工システムの数学モデルを以下の手順で構成し、その定性的,定量的妥当性を検証した.(1)熱伝導現象を記述する従来の放物他モデルは熱伝達速度が無限大になるという欠点を有しているので,この欠点を物理的観点から修正した双曲型熱伝導モデルを提案した.(2)実際問題への応用を考慮して入力に外乱が作用する場合のモデルを構成した.(3)従来の放物型熱伝導モデルと提案した双曲型熱伝導モデルの解挙動の比較を行った.(4)提案した双曲型熱伝導モデルを用いる事により,より厳密な放電加工システムの解析が行える事を明かにした.(5)構成した数区モデルの数学的妥当性,即ちシステム方程式の一意回の存在条件をガレルキン法を用いて明かにした.(6)シミュレーション実験により,構成したモデルの定量的妥当性を検証した.2.実際に放電加工システムの最適制御を行う際に重要な役割を果たす材料内部の温度分布の推定機構の構成に関する問題を以下の手順で解決した.<推定機構の構成>(1)材料内部にセンサーを配置することは材料を損なう可能性があるので,材料表面に温度センサーを配置する境界観測機構を採用し,その数学モデルを構成した.(2)加工材料内の温度分布と加工深さの推定機構を構成した.(3)構成した推定機構は非線形となるなので,実現可能な推定機構を得るための近似手段を提案した.(4)近似推定機構を計算機で解くためのアルゴリズムを確立した.(5)提案したアルゴリズムを用いてシミュレーション実験を行い,加工中の材料内部の温度変化と加工深さのオンライン推定の有効性を検証した.【研究成果の概要】1.放電加工システムに対する最適制御を行う際の基礎となる放電加工システムの数学モデルを以下の手順で構成し、その定性的,定量的妥当性を検証した.(1)熱伝導現象を記述する従来の放物他モデルは熱伝達速度が無限大になるという欠点を有しているので,この欠点を物理的観点から修正した双曲型熱伝導モデルを提案した.(2)実際問題への応用を考慮して入力に外乱が作用する場合のモデルを構成した.(3)従来の放物型熱伝導モデルと提案した双曲型熱伝導モデルの解挙動の比較を行った.(4)提案した双曲型熱伝導モデルを用いる事により,より厳密な放電加工システムの解析が行える事を明かにした.(5)構成した数区モデルの数学的妥当性,即ちシステム方程式の一意回の存在条件をガレルキン法を用いて明かにした.(6)シミュレーション実験により,構成したモデルの定量的妥当性を検証した.2.実際に放電加工システムの最適制御を行う際に重要な役割を果たす材料内部の温度分布の推定機構の構成に関する問題を以下の手順で解決した.<推定機構の構成>(1)材料内部にセンサーを配置することは材料を損なう可能性があるので,材料表面に温度センサーを配置する境界観測機構を採用し,その数学モデルを構成した.(2)加工材料内の温度分布と加工深さの推定機構を構成した.(3)構成した推定機構は非線形となるなので,実現可能な推定機構を得るための近似手段を提案した.(4)近似推定機構を計算機で解くためのアルゴリズムを確立した.(5)提案したアルゴリズムを用いてシミュレーション実験を行い,加工中の材料内部の温度変化と加工深さのオンライン推定の有効性を検証した.【研究実績の概要】放電加工システムに対する最適制御を行う際の基礎となる放電加工システムの数学モデルを以下の手順で構成し,その定性的,定量的妥当性を検証した.(1)フーリエの法則およびエネルギ保存則より,加工材料内部の温度分布を支配する熱伝導方程式を導出した.(2)加工材料内に含まれる不純物の影響を考慮して,確率的要素を持った熱伝導方程式を導出した.(3)放電加工により材料が溶融,蒸発するため溶融表面が自由境界となるので,自由境界上で成立する条件をエネルギ保存則より導出した.(4)自由境界をシステム内部に埋め込むため変数変換を行い確率変分不等式によりモデル化を行った.(5)構成した数学モデルの数学的妥当性,即ちシステム方程式の一意解の存在条件をガレルキン法を用いて明らかにした.(6)シミュレーション実験により,構成したモデルの定量的妥当性を検証した.【研究によって得られた新たな知見】(1)放電加工システムは自由境界を持つため,変分不等式によりモデル化されることが明らかになった.さらに,その変分不等式は従来の変分不等式とは異なる新しい型になることがわかった.(2)得られた確率変分不等式は新しい型であるため,一意解の存在を証明する際には従来の方法を適用することが難しく,本研究で提案した方法が有効であることが明らかになった.(3)シミュレーション実験を行うため,変分不等式を差分化する際には材料の温度分布には拘束条件があるため射影作用素を考慮する必要があることがわかった.(4)本研究において構成したモデルを用いることにより,加工を行う前にどのように材料が溶融するかを知ることが可能となった.実際に放電加工システムの最適制御を行う際に重要な役割を果たす材料内部の温度分布の推定機構の構成と新しい見地に立った熱伝導モデルの構成に関する問題を以下の手順で解決した.〈推定機構の構成〉

(1)材料内部にセンサーを配置することは材料を損なう可能性があるので,材料表面に温度センサーを配置する境界観測機構を採用し,その数学モデルを構成した.(2)加工材料内の温度分布と加工深さの推定機構を構成した.(3)構成した推定機構は非線形となるなので,実現可能な推定機構を得るための近似手法を提案した.(4)近似推定機構を計算機で解くためのアルゴリズムを確立した.(5)提案したアルゴリズムを用いてシミュレーション実験を行い,加工中の材料内部の温度変化と加工深さのオンライン推定の有効性を検証した.〈厳密な熱伝導モデル〉(1)熱伝導現象を記述する従来の放物型モデルは熱伝達速度が無限大になるという欠点を有しているので,この欠点を物理的観点から修正した双曲型熱伝導モデルを提案した.(2)実際問題への応用を考慮して入力に外乱が作用する場合のモデルを構成した.(3)従来の放物型熱伝導モデルと提案した双曲型熱伝導モデルの解挙動の比較を行った.(4)提案した双曲型熱伝導モデルを用いる事により,より厳密な放電加工システムの解析が行える事を明らかにした.放電加工システムにおいては加工材料の溶融・蒸発に伴って,材料の占める空間領域が時間と共に変化し,さらに材料の変形には物理的高速条件が課せられる場合が多い.従って,放電加工システムは拘束条件を持つ自由境界問題として取り扱う必要がある.そこで,拘束条件を考慮した自由境界問題の観点から放電加工システムの数学モデルを以下の手順で構成し,その定性的,定量的妥当性を検証し,さらにその温度分布の推定法を考察した.(1)熱弾性特性を考慮して加工材料内部の温度分布を支配する熱伝導方程式を導出した.(2)加工材料内に含まれる不純物の影響を考慮して,確率的要素を持った熱伝導方程式を導出した。(3)放電加工により材料が変形し,さらに溶融・蒸発するため材料の変位に拘束条件を課し,溶融表面を自由境界として,自由境界の挙動を支配する条件を導出し,モデル化を行った.(4)構成した数学モデルの数学的妥当性,則ちシステム方程式の一意解の存在条件を明らかにした.(5)シミュレーション実験により,構成したモデルの定量的妥当性を検証した.(6)加工材量内部の温度分布を推定するシステムを構成した.【研究によって得られた新たな知見】(1)放電加工システムの数学モデルは変位に関する拘束条件を考慮する必要があり,かつ自由境界を持つため拘束条件をもつ自由境界問題として捉える必要があることが明らかになり,そのモデルは変分不等式によりモデル化されることが明らかになった.(2)拘束条件も変分不等式としてモデル化可能であることが示された.(3)本研究において構成した温度分布推定システムを用いることにより,加工を行う前にどのように材料が変形し,かつどのような応力を受けるかを知ることが可能となった.
キネマティックDGPSによる実船に作用する流体力と運動性能推定に関する研究

本研究ではリアルタイムキネマティックGPSという高精度の測位システムの性能に着目して,時々刻々の船の運動を計測し,それから加速度,続いて船に作用している力とモーメントを求め,最終的にはその船の操縦運動モデルを同定することを試みた。その概要は以下の通りである。先ず,練習船広島丸を用いて,最新のリアルタイムキネマティックGPSの精度確認を行い,瀬戸内海の試験海域で船の運動計測に十分な精度があることを確認した。続いて、計測した基準局、船上の3点の位置データから、船の重心の縦、横方向の移動量、船首方位、横傾斜角を求めるとともに、その速度、加速度成分を推定した。この推定計算にはディジタル方式の理想フィルタ技術を利用し、ローパスフィルタ、微分フィルタを船体の運動特性を考慮して適用した。この結果、GPS技術で船の操縦運動の推定が高精度で可能なことを確認した。これから、時々刻々と船に作用する力とモーメントを推定した。操縦運動モデルを同定するには、適切な数学モデルの選択、パラメータを決定する方法の確立が必要で、このために水槽試験を実施した。船に作用する流体力を直接に計測する拘束試験とエアープロペラで駆動し、自由に航走させる自由航走試験である。拘束試験に関してはCircular Motion Testの手法の開発を行い、精度良く流体力の計測が可能であることを確認した。また、自由航走試験の運動を計測より、船に作用する力とモーメントの同定を行う可能性も検討し、精度の重要性が分かった。広島丸の結果から、小さい湾に特有の潮流の影響が確認され、それを考慮してモデルの同定を行うには同船の拘束操縦試験が必要で、準備中である。要約すると、本研究では自由航走する船の運動からモデルを同定する可能性を確認し、実海面で実船で行う方法にするための課題が抽出できた。研究実績は以下のとおり。最近,人工衛星を用いた測位システム(GPS)の中に,搬送波の位相を用いた測定方式が開発され,キネマティックディファレンシャル方式として実用化され,水平方向で2cm,垂直方向で5cmという高精度の位置計測が海洋空間で行われる可能性を切り開いた。本研究はこの技術の高精度の測位性能を船の運動性能の推定,あるいは船に作用する流体力の推定に利用する可能性を検討するものである。本年度の研究は次の2つの目的に添って実施し,次の結果を得た。1.高精度のGPSシステムを購入して,実船の位置と運動の計測制度を確認する。この目的のためにキネマティックGPSシステムを購入して,位置の計測,その情報の処理による速度,加速度の同定試験を実施し,高精度での連続的計測,認識が可能であることを確認した。2.船体運動の計測による運動性能の同定を行い,船体運動予測を可能にする。この目的のために,自航模型試験を実施し,実際の出入港と同様な操船を行い,その運動を計測,処理することにより,船体に作用する流体力の同定を行い,運動モデルを同定した。この結果によると,個々の流体微係数の同定には難があるが,微係数の組み合わせで操縦運動の推定が可能なモデルの同定が可能であることを確認した。この方法は今後,実船で確認する必要がある。人工衛星を用いた測位システム(GPS)でも,搬送波の位相を用いたキネマティックDGPS(以下KGPS)方式は,水平方向で2cm,垂直方向で5cmという高精度の位置計測が海洋空間で行われる可能性を切り開いた。本研究は,この技術,特にこの測位をReal Timeで行うKGPS(以下RTK-GPS)の高精度測位性能を船の運動性能の推定,あるいは船に作用する流体力の推定に利用する可能性を検討するものである。

今年度は以下のように研究を推進した。・昨年度購入した「超精密船体運動計測システム」と既存のRTK-GPS装置を用い,広島商船高等専門学校の練習船「広島丸」で操縦性能試験を実施し,試験結果を船上のデータ収録システムと比較した。・船首およぴ両舷に設置したGPSから得られる時々刻々の位置データから前進方向と横方向の速度・加速度,回頭角速度・角加速度を求めた。さらに,潮流影響を考慮して力とモーメントのモデルによる近似を行っており,プロペラと舵による力を推定中である。・通常,幅広な角水槽で行われCircular Motion Test(以下CMT)を船型試験水槽で実施するためのシステムを開発し,以前にPMM試験を行った模型船を使用してCMTを実施し,精度良く微係数が求められることを確認した。・来年度,解析結果の検証を行うため,今年度開発したCMT装置を使用して「広島丸」の模型実験を行う予定である。
肺がんの進展に関与する肺循環血流の制御機構の解明

慢性閉塞性肺疾患は肺がんの危険因子であり、肺がん発生には炎症及びそれに起因する低酸素環境の関与が示唆される。ヘム分解系の律速酵素であるヘムオキシゲナーゼ-2(HO-2)は適正な換気・血流比の維持に関与する。よって、HO-2は換気血流比を制御する気道神経上皮小体において未知の機能を持つと考えられる。そこで、ヘム代謝系が関与する肺循環特異的低酸素応答の分子機構を解析し、以下のような結果を得た。1)気道神経上皮小体に由来するH146ヒト小細胞肺がん細胞におけるヘム制御性Caチャネル活性の分子基盤を解析した。その結果、同Caチャネル機能へのHO-2の直接的な関与は否定された。2)イーストtwo-hybrid法にてHO-2の機能発現に関わる分子を探索し、その候補分子としてプロテアソーム構成タンパクであるPSMA7を同定した。PSMA7がHO-2タンパクの分解を制御すると推定している。3)ヒト赤芽球系白血病細胞を低酸素に曝露すると、HO-2の発現は低下し、それに伴いヘモグロビン陽性細胞と細胞内ヘム量が増加した。この低酸素による赤血球分化誘導過程にTGF-betalが関与することを明らかにした。4)細胞増殖抑制作用を持つPGD2が、受容体依存的に種々ヒト細胞でHO-1の発現を誘導することを初めて明らかにした。しかし、A549ヒト肺がん細胞ではHO-1発現の誘導は見られなかった。なお、PGD2はいずれの細胞においてもHO-2の発現には有意な影響を与えなかった。5)DNAアレイ解析により、低酸素曝露マウスの心臓で発現が変化する分子を複数同定し、現在、各分子の生理機能を解析している。平成19年度に進展した計画5)に関しては、今後も研究を継続し、肺循環の分子制御法の開発を目指す。そこで、HO-2が関与する肺特異的低酸素応答の分子機構を解明し、肺循環血流の制御分子を同定した。さらに、気道神経上皮小体由来細胞の電気興奮能を解析した。1.HO-2の機能発現制御分子の探索:創薬の標的となるHO-2の機能発現に関わる分子を同定するため、イーストtwo-hybrid法によりHO-2と相互作用するヒトタンパク因子を同定した。当該分子はタンパク分解に関与する因子として知られており、HO-2タンパクの発現を負に制御すると考えられる。2.ヒトがん細胞におけるHO-2の発現と未知の機能解析:種々ヒト培養がん細胞を低酸素(1%O_2)環境で培養すると、HO-1とHO-2タンパクの発現が低下し、逆に細胞内ヘム量が増加した。次いで、有効なHO-2 siRNAを決定し、ヒト肝がん細胞などにおけるHO-2のノックダウンがHO-1 mRNAの発現を誘導することを見いだした。すなわち、HO-1の発現に関わるHO-2の未知の生理的役割が示唆された。3.ヒト小細胞肺がん細胞の電気興奮能の解析:気道神経上皮小体に由来するH146ヒト小細胞肺がん細胞にHO-2に対するsiRNAを導入法を開発した。同細胞は浮遊細胞であるため、siRNAの導入効率が悪く、難航した。今後、パッチクランプ法を用い、HO-2をノックダウンしたH146ヒト小細胞肺がん細胞の電位依存性カルシウムチャネルおよびナトリウムチャネルの機能を解析する。
アニマシオンの手法を取り入れたアートゲームの開発

鑑賞リテラシーを高める手立てを探るため,アニマシオンの手法を取り入れながらアートゲームの開発に取り組んだ。これまでのところ日本の学会誌等においては,アニマシオンとアートゲームをリンクさせた研究は見当たらない。そこで本研究では,読書におけるアニマシオンと図画工作科におけるアートゲームの類似点を挙げながら,それぞれの先行研究をもとにアクティブな鑑賞の在り方について考えることとした。まず,先行研究の中で得た知見をもとにアニマシオンの手法を生かしたアートゲームとして考えられるものを対応表にまとめた。そして「アートゲームパズルルつないでいっしょに見つけよう」という授業実践を行い,学習指導案や実際の展開等を示しながら詳細を述べた。授業は,アクティブ鑑賞コミュニケーションが成立しやすいよう大きなジグソーパズルを作成して行い,協働的な学びが生まれる状況を作ろうと2種類のお話タイムを取り入れた。アートゲームをとおして鑑賞リテラシーが高まったかどうかは,アートゲーム導入前と導入後の気づきが量的・質的にどう変容したかで検証した。その結果,一定時間内に書き出された気づきの量は,アートゲーム導入前は平均約9個だったのだが,アートゲーム導入後は約11個となった。次に,書き出された気づきを「児童・生徒の気づきを分析するためのルーブリック」を用いて質的に検証した結果,導入前に比べて鑑賞リテラシーが上がった児童もいたし,上がらなかった児童もいた。先行研究及び授業実践から見えてきた課題は,子どもが喜ぶアートゲームをするとすれば,能動的になるための時間を十分保障する必要があるということである。また,児童の気づきを単発で終わらせないように,造形要素に基づいてタッチや色から「なぜ」と根拠を問うなど,児童が複数の客観的事実を繋げやすくする配慮が必要であるということである。
腫瘍血管内皮細胞由来exosomal-miRNA の癌診断治療への応用

本研究では,がん細胞由来miRNAsがexosomeを介して血管内皮細胞に輸送されることで発現が変動し,さらに癌の浸潤転移を誘導する腫瘍血管内皮miRNAの同定を試みた.ヒト正常腎組織及び腎がん組織から血管内皮細胞を分離・培養し、miRNAの発現を解析し,公開されているデータベースを用いて腫瘍血管内皮細胞miRNAの標的遺伝子をピックアップした.これらのmiRNAの中にがん細胞の浸潤転移を促進するものが認められた.腫瘍血管はmiRNAを介してがん細胞に働きかけその悪性化に関与することが示唆された.4種のヒト腫瘍(腎がん、悪性黒色腫、口腔がん、脂肪肉腫)のヌードマウス皮下移植モデルから腫瘍血管内皮細胞と正常血管内皮細胞を分離培養した。腫瘍血管内皮細胞が正常な血管内皮細胞に比較して増殖が早く,遊走能が高いこと、染色体異常や薬剤抵抗性があるなど生物学的特性が異なることを明らかにした。さらに、ヒト正常腎組織及び腎癌組織から血管内皮細胞を分離・培養し、皮下移植モデル同様腎癌由来の血管内皮細胞が有意に染色体異常を認めることがわかった。また、がん細胞由来exosomeにmiR-1246が高発現すること、腫瘍血管内皮細胞の培養上清は、がん細胞の増殖・運動を亢進させることを見出した。近年、分泌されたexosomeが他の細胞へ輸送されることを示唆する結果が報告されているだけでなく、我々もがん細胞由来exosomeが血管内皮細胞へ輸送されることを確認した。これらの結果から、腫瘍血管内皮細胞由来miRNAがexosomeを介してがん細胞へ輸送されることで、がんの増殖・運動を亢進させる可能性が考えられる。マウス・ヒトの異なるがん種から分離した腫瘍血管内皮細胞内で、共通して発現の変動するmRNA及びmiRNAが存在することもわかった。ヒト正常腎組織及び腎がん組織から血管内皮細胞を分離・培養し、培養上清から超遠心法及び免疫沈降法を用いてexosomeを単離しmiRNAを抽出した。免疫沈降におけるexosomeの標識には、exosomeの膜抗原として知られるCD9, CD63の抗体を用いたマイクロアレイを用いてmiRNAの組成を解析するとともに腫瘍血管内皮細胞由来exosomeで高発現するmiRNAを検討中である。なお、肺癌患者血液検体から超遠心法を用いてexosomeを単離することは出来ており、腎癌患者血液検体での単離しmiRNAを抽出するため、倫理委員会に登録・申請中である。4種のヒト腫瘍(腎がん、悪性黒色腫、口腔がん、脂肪肉腫)のヌードマウス皮下移植モデルから腫瘍血管内皮細胞と正常血管内皮細胞を分離培養した。なお、肺癌患者血液検体から超遠心法を用いてexosomeを単離することは出来ていて、腎癌患者血液検体での単離しmiRNAを抽出し解析中である。腎癌患者においての血中exosomal-miRNAの発現の解析が進んでいない状況である。これまで腫瘍血管内皮培養上清は、がん細胞の増殖・運動を亢進させることを見出している.高転移性のがん細胞由来exosomeに特定のmiRが高発現していること,さらにそのmiRを正常血管内皮細胞にトランスフェクションするとこれまで見出してきた腫瘍血管内皮マーカーの発現の一部(Biglycanなど)が誘導されることがわかった.さらに腫瘍血管内皮由来miRNAの関与を証明するためにexosome分泌阻害剤であるGW4869で処理した腫瘍血管内皮細胞の培養上清を用いてがん細胞の形質の変化を検討したところ,腫瘍細胞の浸潤能の低下を認めた.このことからがん細胞由来miRNAsがexosomeを介して血管内皮細胞に輸送されることで、がんの増殖・運動を亢進させる可能性が考えられる。

このようにがん細胞からの影響を受けて発現が変動し、さらに癌の浸潤転移を誘導することが予想される分子の制御に関わる腫瘍血管内皮miRNAについて解析を進めた.ヒト正常腎組織及び腎がん組織から血管内皮細胞を分離・培養し、miRNAの発現を解析した.公表されているデータベース(Target scan, miRanda等)を用いて腫瘍血管内皮細胞miRNAの標的遺伝子をピックアップした.ピックアップした遺伝子群の変動にどのような生理的意義があるかを検討するため、パスウェイ解析ソフトウェア(Ingenuity Pathway Analysis)を用いた解析をおこなった.本研究では,がん細胞由来miRNAsがexosomeを介して血管内皮細胞に輸送されることで発現が変動し,さらに癌の浸潤転移を誘導する腫瘍血管内皮miRNAの同定を試みた.ヒト正常腎組織及び腎がん組織から血管内皮細胞を分離・培養し、miRNAの発現を解析し,公開されているデータベースを用いて腫瘍血管内皮細胞miRNAの標的遺伝子をピックアップした.これらのmiRNAの中にがん細胞の浸潤転移を促進するものが認められた.腫瘍血管はmiRNAを介してがん細胞に働きかけその悪性化に関与することが示唆された.腎癌患者においての血中exosomal-miRNAの発現量と臨床情報との比較を行う予定であったが、当院の倫理委員会の申請・登録が遅れており進んでいない状況である。1腎癌患者においての血中exosomal-miRNAの発現量と臨床情報との比較2マウス腎がん細胞株のマウス同種移植モデルにおける血中exosomal-miRNAの発現解析3ヒトメラノーマ細胞株のマウス異種移植モデルを用いた悪性度との相関比較泌尿器科学1腎癌患者においての血中exosomal-miRNAの発現量と臨床情報との比較2マウス腎がん細胞株のマウス同種移植モデルにおける血中exosomal-miRNAの発現解析3ヒトメラノーマ細胞株のマウス異種移植モデルを用いた悪性度との相関比較期待された研究成果を得ることが出来ておらず、次に予定していた実験に進めず次年度に研究費を持ち越しせざるを得ない状況にある。初年度予定していたマイクロアレイが実施できていないため、その後予定していた動物実験も進まず、マウスや抗体の購入が十分でなかったため。試薬、細胞株、細胞培養液、抗体の購入などに主に使用する予定である。マイクロアレイや動物実験に関わるマウスの購入などに主に使用する予定である。
低次元半導体における高密度励起子の協力現象の観測

本研究の目的は、高出力のパルスレーザーを、半導体低次元閉じ込め構造に照射し、高密度の生成された電子励起状態が示す特異な協力現象を検出することである。本年度に得られた結果として以下のものが挙げられる;(i)前年度に引き続き、微少空間分解能を持つ超高速・顕微分光システムの立ち上げ、および装置性能の向上を図った。特に極低温冷却器をシステムに付加することにより、低温下での分光測定が可能となった。これにより特に、II-VI族自己形成量子ドットにおける単一ドット発光線の観測に成功し、3次元量子閉じ込め系に特異に現れる遅い位相緩和を見いだした。今後は、より高密度励起下における単一ドット発光と特にその時間的ダイナミクスを観測することにより、3次元量子閉じ込めと多励起子間相互作用の関わりを探求する予定である。(ii)高密度励起子協力現象を担う相互作用としては、励起子間もしくは光注入キャリア間のクーロン相互作用のみならず、スピン間の交換相互作用を経由した、いわば強磁性転移的な協力効果も考えられる。そこで、円偏光の共鳴光照射に伴う高密度スピン偏極励起子注入後の過渡的ダイナミクスの研究に新たに着手した。今年度は特に、磁場下におかれた層状半導体の共鳴発光を測定し、ゼーマン分裂励起子間のスピン緩和過程の観測を行った。これから、高密度励起下における励起子スピン緩和の促進を見いだし、多励起子間交換相互作用の存在を確認した。本研究では、低次元量子閉じ込め構造をもつ直接遷移型半導体に、高出力パルスレーザーを照射し、高密度に生成される電子励起状態が新たに示すであろう特異な協力現象を、分光学的に検出することを目的としている。この高密度協力現象は、通常の分光装置では見逃されている、空間的なダイナミクとして現れ出ることが予想されている。したがって、協力現象の観測のためには、超高速時間分解能と微小空間分解能を合わせ持つ分光システムを新たに構築することが必須である。そこで本年度はまず、既存のピコ秒時間分解蛍光測定装置(ストリークカメラ)に、顕微分光系を付加することにより、時間分解能が2ピコ秒程度、空間分解能が1.5ミクロンメートル程度の時空間分解分光システムの開発を行った。開発した装置の性能評価のために、典型的なフォトニックバンド構造を示すポリスチレン微小球配列膜を用いて、フォトニックバンド構造中のフォトン伝搬現象を観測することに成功した。さらに、半導体レーザーダイオード試料における、光誘起キャリアの空間伝搬を観測することに成功した。これは、超短パルス光を用いてレーザーダイオード試料をスポット的に励起し、その直後の蛍光の時間発展を空間的に追跡したものである。キャリアの空間拡散過程は、励起密度に依存して変化したことが見いだされたが、これが高密度協力現象を反映したものかを現時点で判定することは難しい。以上の実験は室温中で行ったものであり、今後は試料を極低温に冷却することにより、よりマクロなコヒーレンス形成を促進する条件下での観測を行う予定である。
アルコキシド溶液担持粒子を用いた「擬気相法」による高純度セラミックス微粉末の製造

アルコキシド溶液(テトラエトキシオルソシリケート,TEOS)を多孔性炭素質物質に含浸させたのち加水分解反応を行わせマシリカを担持した炭素質多孔体を作成し、これを14001500°C窒素雰囲気中で還元窒化して窒素ケイ素を合成し、反応機構,反応速度,律速過程,生成物のモルフォロジー等について検討した。また、これらに先立ち、反応系からの酸素のパージ方法について厳格な実験技術上の検討を行い、炉心管等との反応もごくわずかに抑えるための手順を確立した。実験結果より、本研究が意図したセラミックス微粉末の合成法は十分実現可能であるとの感触を得た。すなわち、現在の窒化ケイ素プラントの通常の規模(100t/y)に相当する本方式の流動層の直径は約1m弱となることが反応速度データより算出され、妥当な設備規模となることを確認した。反応機構に関しては、Si【O_2】+C→SiO(g)+Co,Sio(g)+C→Si→CO,3Si+2【N_2】→【Si_3】【N_4】の他に、2Sio→Si+Si【O_2】の不均化反応も無視できないことがわかり、このため還元の第1段階と第2段階の進行度を分離する試みは成功しなかった。反応速度は上述のように各素反応に分離できなかったものの、サンプルの調整法によってかなり変わることから、第1段の固固反応が律速しているとの感触を得た。生成物は、核生成の度合によって大幅に異なり多様な結晶形態を取ることが明らかになった。しかし、おおむね六方晶のα窒化ケイ素が得られた。また、反応管下流部にシリカを担持させない炭素多孔体を置き、下流に流出したSiOガスの還元窒化を行ったが、この場合には針状晶が主であった。以上のように本方法の可能性についての初歩的確認を行ったので、より高度の粒子制御をめざして、初期のシリカ担持粒子の調製法,種晶の添加等による一次核の密度の制御などを行っている。結果は化学工学協会群馬大会,窯業基礎討論会,化学工学協会第52年会に発表した。
核磁気共鳴装置による運動中の筋代謝の非観血的及び連続測定

運動中に^<31>P-MRSから観察した無機燐酸(Pi)が2本のピークに分裂することが知られている。しかし、従来の報告では^<31>P-MRSの測定時間分解能が悪いので運動中に分裂した2本のPiピークの動態は不明であった。我々は^<31>P-MRS測定を5秒毎に行えるようにRFパルスを調整し、得られたスペクトラの画像処理を行った。その結果、運動中の^<31>P-MRSからPiピーク分裂状況と筋pHの動態を視覚情報として捉えることが出来た。そして、このPiピークの分裂に関与する生理学的機構を解明するために運動強度、酸素吸入濃度、クーリングダウンの有無などからそれぞれのPiピークの動態を検討することを目的とした。2.1-T、横置型NMR装置(直径67cm)内で膝屈曲運動を行った。運動中の^<31>P-MRSは5秒毎に測定した。得られたデータを一旦コンピューターにストアして、それぞれの燐化合物のピークの運動による変化の等高線処理及び、その疑似カラー表示を行った。また、PiとPCrの化学シフトから筋pHを求めた。疲労困憊まで下腿屈曲運動を行った時の^<31>P-MRSのPiとPCrピークを等高線処理し、カラー表示すると運動中のピーク分裂状況が明確に分かる。運動開始後にはPCrピークは減少するが、Piピークは運動強度の増加と共に増加し、さらに運動が続くと2つのピークに分裂した。ここで、これらのPiピークの変化とPCrの化学シフト差から筋pHを求めると、運動前の安静時から存在するピークのpHは比較的高いのでhigh-pHの変化を示すピークであり、運動開始後に出現したもう1つのPiピークのpH値はlow-pHのPiピークであった。さらに、このPiピークの分裂に影響すると思われる運動強度の違い、酸素吸入濃度の違い、クーリングダウンの有無による違いを検討すると、high-pHのPiピークは酸化能力の高い繊維の動員を示し、low-pHのPiピークは解糖能力の高い筋線維の動員を示すことが示唆された。^<31>P-NMRを用いて運動中の筋エネルギー代謝の変化を非観血的におよび連続的に測定して、高エネルギー燐酸および細胞内pHの動態を検討した。今年度は、運動強度別の動態の検討および選手と健常者の比較について行った。さらに、高時間分解能の検討も行った。まず、6名の健康な男子被験者を用いて2.1Tの超伝導磁石内で、4分間の大腿屈曲運動を行った。運動強度は“0"10、20、30kgm/分とし、その後5分間の回復を行った。実験中、被験者の大腿2頭筋部においたサーフェスコイルから、0.4秒のタイムインターバルで得た自由減衰信号を32回積算して、12.8秒間の^<31>P-NMR信号を得た。その結果、運動の開始時にはクレアチン燐酸(PCr)は指数関数的に減少し、運動終了後には逆に指数関数的に増加した。これらの速さを非線形最少自乗法で求めると運動開始時には27-32秒の時定数を、運動終了時には27-40秒の時定数を示した。これらの値には運動強度による依存性は見られなかった。

一方、無機燐酸(Pi)も運動開始時には指数的に増加して、一様な時定数を示したが、運動終了時には運動強度が高い程回復のスピードは遅った。次に、長距離走者5名、短距離走者5名、健常者6名を用いて10および30kgm/分の運動強度で4分の運動を行わせた。いずれの運動強度においても長距離走者のPCrレベルは他の被験者群の値よりも有意に少なかった(PC0.05)。また、運動後のPCrの回復のスピードも長距離走者の方が有意に速かった(PC0.05)。さらに、運動後のPiの回復スピードも長距離走者で有意に速かった。(PC0.05)、一方、30kgm/分の運動強度では健常者のPiは5分の回復期間では元のレベルには戻らなかった。これらの結果は、PCr合成機構が有酸素的代謝機能に依存しているために、長距離走者の筋組織において酸化能力が高いためであると推察された。運動中に^<31>P-MRSから観察した無機燐酸(Pi)が2本のピークに分裂することが知られている。しかし、従来の報告では^<31>P-MRSの測定時間分解能が悪いので運動中に分裂した2本のPiピークの動態は不明であった。我々は^<31>P-MRS測定を5秒毎に行えるようにRFパルスを調整し、得られたスペクトラの画像処理を行った。その結果、運動中の^<31>P-MRSからPiピーク分裂状況と筋pHの動態を視覚情報として捉えることが出来た。そして、このPiピークの分裂に関与する生理学的機構を解明するために運動強度、酸素吸入濃度、クーリングダウンの有無などからそれぞれのPiピークの動態を検討することを目的とした。2.1-T、横置型NMR装置(直径67cm)内で膝屈曲運動を行った。運動中の^<31>P-MRSは5秒毎に測定した。得られたデータを一旦コンピューターにストアして、それぞれの燐化合物のピークの運動による変化の等高線処理及び、その疑似カラー表示を行った。また、PiとPCrの化学シフトから筋pHを求めた。疲労困憊まで下腿屈曲運動を行った時の^<31>P-MRSのPiとPCrピークを等高線処理し、カラー表示すると運動中のPiピーク分裂状況が明確に分かる。運動開始後にはPCrピークは減少するが、Piピークは運動強度の増加と共に増加し、さらに運動が続くと2つのピークに分裂した。ここでこれらのPiピークの変化とPCrの化学シフト差から筋pHを求めると、運動前の安静時から存在するピークのpHは比較的高いのでhigh-pHの変化を示すピークであり、運動開始後に出現したもう1つのPiピークのpH値はlow-pHのPiピークであった。さらに、このPiピークの分裂に影響すると思われる運動強度の違い、酸素吸入濃度の違い、クーリングダウンの有無による違いを検討すると、high-pHのPiピークは酸化能力の高い筋繊維の動員を示し、low-pHのPiピークは解糖能力の高い筋線維の動員を示すことが示唆された。
抑制型PILRαの単球浸潤における役割及びその生体内での生理的意義の解明

現代病とも言えるメタボリックシンドロームに関連する疾患において、疾患局所に浸潤し組織固有の機能を持ったマクロファージに分化する能力を有する単球が注目されている。申請者はこれまでに抑制性の細胞表面分子であるPILRαが好中球の動態を負に制御していることを明らかにしてきた。マウスにおける単球はLy6cの発現によって、大きく二つのサブセットに分類される。申請者はPILRαが単球の両サブセットに発現しており、とりわけLy6cネガティブの単球に高発現していることを見出した。このことより、好中球と同様にPILRαが単球の組織への浸潤を制御している可能性が考えられので、単球の組織への浸潤におけるPILRαの役割について検討した。その結果、細胞ー細胞の接着に関与するインテグリンのシグナルを単球においてもPILRαが制御していることを明らかにした。さらに、PILRαがインテグリンのシグナルを制御することで、脂肪組織や肝臓への単球の浸潤を負に制御していることも明らかにした(Eur J Immunol, 2016)。この成果をもとにaged PILRα遺伝子欠損マウスの解析を進め、予想外にも加齢とともに強皮症様のフェノタイプも示し、強皮症においてもPILRα分子が関与している可能性を明らかにした(投稿準備中)。肥満をはじめとするメタボリックシンドロームに関連する疾患において、疾患局所に浸潤し組織固有の機能を持ったマクロファージに分化する単球の役割の重要性が指摘されている。これまでに抑制性の細胞表面分子であるPILRαが好中球の動態を負に制御している事を明らかにしてきた。マウスにおいて血中の単球はLy6cの発現による2つのサブセットに分類される。申請者はPILRαが単球の両サブセットにおいて発現されており、とりわけLy6c-の単球に高発現していることを見出した。これらのことより好中球と同様に、PILRαが単球の組織への浸潤を制御している可能性が考えられた。そこで本年度は単球の組織への浸潤にPILRαが関与しているか否か、及びその作用機序の解明を目的とした。その結果、細胞ー細胞接着に関与するインテグリンのシグナルをPILRαが制御していることを明らかにした。さらに、PILRαはインテグリンシグナルを制御することで、単球の組織への浸潤を負に制御していることも明らかにした。PILRαが単球の動態を負に制御していることが明らかになったので、次にメタボリックシンドロームに関連する疾患における単球とPILRαの関係について検討をした。現在、Pilraノックアウトマウスを用いて、生体内におけるPILRαの役割について、メタボリックシンドロームに関与する疾患を中心に解析を進めている。具体的には、脂肪組織の肥大、及び肝臓の繊維化に及ぼす単球の役割について解析している。PILRaによる単球の挙動の制御機構を明らかにしたものの、加齢との関係が重要な事がわかり、実験に使用する動物のagingが必要となった。そのため予定よりも生体内における役割の解析が遅れているため。申請者らはこれまでに抑制性の細胞表面分子であるPILRαが好中球の動態を負に制御していることを明らかにしてきた。このことより、好中球と同様にPILRαが単球の組織への浸潤を制御している可能性が考えられた。そこで、はじめに単球の組織への浸潤にPILRαが関与しているかについて検討した。さらに、PILRαがインテグリンのシグナルを制御することで、脂肪組織や肝臓への単球の浸潤を負に制御していることも明らかにした。現在PILRα遺伝子欠損マウスを用いて、PILRαが単球の動態を負に制御することによってメタボリックシンドロームに関与する疾患を中心に、その役割の分子機構の解析を進めている。さらには、予想外にも加齢とともに強皮症様のフェノタイプも示したため、強皮症への関与についても検討を開始した。PILRαが単球の浸潤を負に制御していることを明らかにしたが、さらにaged PILRα遺伝子遺伝子欠損マウスにおいてより強いフェノタイプを示すために、実験に必要なyoungとagedマウスを十分に確保するのに時間を予想以上に要しているため。我々はこれまで抑制性の細胞表面分子であるPILRαが好中球の動態を負に制御していることを明らかにしてきた。マウスにおける単球はLy6cの発現によって大きく二つのサブセットに分類される。我々はPILRαが単球の両サブセット発現しており、とりわけLy6cネガティブの単球に高発現していることを見出した。そこで、初めに単球のPILRαが組織への浸潤に関与していかについて検討した。

その結果、脂肪組織や肝臓への単球の浸潤が亢進していることが明らかとなった。さらに、単球においても細胞ー細胞の接着に関与するインテグリンのシグナルをPILRαが制御していることを明らかにした。また加齢とともにPILRα遺伝子欠損マウスにおいて、コントロールの野生型マウスよりも体重の増加が認められた。加齢とともにフェノタイプが亢進したため、脂肪組織や肝臓以外の組織への単細胞に浸潤、および浸潤している組織の異常について検討した。その結果、脂肪組織の肥大や肝臓の繊維に加えて、予想外にも加齢マウスにおいて強皮症様のフェノタイプを示した。現在PILRαのメタボリックシンドロームに於ける役割について検討中である。PILRαが単球の浸潤を負に制御していることを明らかにしてきたが、さらに加齢PILRα遺伝子欠損マウスにおいて新たなフェノタイプを皮膚で見出した。実験に必要な加齢マウスを十分に確保するのに時間を予想以上に要しているために、遅れを生じている。現代病とも言えるメタボリックシンドロームに関連する疾患において、疾患局所に浸潤し組織固有の機能を持ったマクロファージに分化する能力を有する単球が注目されている。申請者はこれまでに抑制性の細胞表面分子であるPILRαが好中球の動態を負に制御していることを明らかにしてきた。マウスにおける単球はLy6cの発現によって、大きく二つのサブセットに分類される。申請者はPILRαが単球の両サブセットに発現しており、とりわけLy6cネガティブの単球に高発現していることを見出した。このことより、好中球と同様にPILRαが単球の組織への浸潤を制御している可能性が考えられので、単球の組織への浸潤におけるPILRαの役割について検討した。その結果、細胞ー細胞の接着に関与するインテグリンのシグナルを単球においてもPILRαが制御していることを明らかにした。さらに、PILRαがインテグリンのシグナルを制御することで、脂肪組織や肝臓への単球の浸潤を負に制御していることも明らかにした(Eur J Immunol, 2016)。この成果をもとにaged PILRα遺伝子欠損マウスの解析を進め、予想外にも加齢とともに強皮症様のフェノタイプも示し、強皮症においてもPILRα分子が関与している可能性を明らかにした(投稿準備中)。ノックアウトマウスの解析を中心に、PILRaのメタボリックシンドロームにおける役割を、単球の役割を中心に計画通り進めていく予定である。ノックアウトマウスの解析を中心に、PILRαのメタボリックシンドロームにおける単球の役割を予定通りに進めていくだけではなく、CRISPRによってPILRα欠損細胞を作成し、in vitroにおいて詳細なる作用機構の分子メカニズムの解析も行う予定にしている。PILRα遺伝子欠損マウスの解析を中心に、PILRαのメタボリックシンドロームにおける単球の役割を予定通りに進めていくだけではなく、CRISPRによってPILRα欠損細胞株を作成し、in vitroにおいて詳細なるPILRαの作用機構を分子レベル、およびシグナル伝達機構に与える影響についての解析も行う予定にしている。in vitroの実験はほぼ計画通り進められたが、遺伝子欠損マウスの準備等で予定外の事態が発生したため、in vivoの実験がやや送れているため。
高基質特異性Ｌーアミノ酸オキシダーゼの特性解析と産業応用への基盤構築

本研究では,L-グルタミン酸酸化酵素とL-リシン酸化酵素という2つの高基質特異性アミノ酸酸化酵素の厳格な基質特異性の構造要因を明らかにできた。また低基質特異性酵素との構造比較から,高基質特異性をもたらす構造的要因も明らかにできた。更にL-グルタミン酸酸化酵素の特徴的な基質認識機構を活用し,L-アルギニン酸化酵素,L-ヒスチジン酸化酵素,L-チロシン酸化酵素の3種類の基質特異性変換酵素を創製でき,産業応用の基盤構築に成功した。L-リシンα-オキシダーゼ(LysOX)は,糸状菌Trichoderma virideから生産されるL-アミノ酸オキシダーゼ(LAO)の一種である。高い基質特異性を持ち,温度やpHに安定であることから食品工業分野においてバイオセンサーとして利用されている。しかしT. virideからの生産及び精製は困難であり,異種宿主による大量発現系の構築が望まれている。前年度の研究で放線菌発現系の構築には成功したが,培養日数が約20日間と長く,工業化には非効率であると考えられた。そのため宿主に大腸菌E. coli BL21(DE3),ベクターにpET39bを用いた組換え発現系の構築を試みた。また真核生物由来であるLysOXのコドン使用頻度は大腸菌のものと大きく異なっている。このためコドンの最適化を行い,生産条件の検討を試みた。これにより,発現は微弱ながら,LysOXの活性を確認できた。一方,L-グルタミン酸オキシダーゼ(GluOx)はStreptomyces sp. X119-6株から生産されるLAOの一種であり,厳格な基質特異性,pHおよび熱に対する安定性など優れた性質を有し,バイオセンサーに利用されている。これまでに活性中心のR305残基が厳格な基質認識において最も重要な役割を果たすことが判明しており,R305に変異を導入することで基質特異性が改変したL-ヒスチジンオキシダーゼ(R305L)とL-アルギニンオキシダーゼ(R305E)が得られている。そこで,新たにR305H変異酵素を作成し,精製および性質検討を行った。その結果,基質特異性に大きな変化が見られ,L-チロシンに対して高い活性を示す変異酵素が得られた。基質特異性が変化した要因を探るために,変異酵素の結晶構造解析を行う予定である。一方R305L変異酵素のX線結晶構造解析に成功し,基質特異性改変の要因や反応触媒機構についての新たな知見が得られた。糸状菌由来L-リシンα-オキシダーゼ(LysOX)は, L-リシンに対して高い基質特異性をもち,抗腫瘍性活性を有することからバイオセンサーや抗がん剤への応用が期待されている。T. virideの本酵素の生産量は微量で大量調整は難しいので異種発現系の構築を試みた。その結果放線菌S. lividansでの発現系構築に成功した。液体培養で菌体外に分泌させるため,精製が容易であり,コドンの最適化により発現量の増加も確認された。元菌による生産と比べて粗酵素液では約5倍,精製酵素では約2倍ほど高い生産量で,これにより本酵素の大量精製系確立の道筋を付けることが可能となった。低基質特異性の酵素が多いL-アミノ酸オキシダーゼ(LAO)の中で,本酵素は高い基質特異性を示す。本酵素のX線結晶構造解析を行い,基質認識機構の解析を行った。LysOXを精製,結晶化しSpring-8 BL41XUで回折データを収集した。解析は,蛇毒LAOを用いた分子置換法により行い1.9 Å分解能で構造を決定した。LysOXは他のLAOと同様に3つのドメインで構成され,結晶中で4量体を形成していた。LysOXの基質結合部位を蛇毒LAOの基質結合部位と比較すると,アミノ酸骨格の認識に関わる残基のコンフォメーションは保存されていたが,側鎖認識に関わる構造は大きく異なっていた。L-リシンとのドッキングシミュレーションの結果,L-リシンの側鎖アミノ基は,基質結合部位に存在するAsp212により認識されることとTrp371により基質結合部位の空間が狭められ,側鎖の大きいアミノ酸が入れなくなっていることが明らかになった。一方L-グルタミン酸オキシダーゼについても,R305L変異酵素のX線結晶構造解析に成功した。解析結果より,基質特異性が変化した理由及び野生型酵素の高い基質特異性の要因が推察できた。L-グルタミン酸オキシダーゼについて,新たな基質特異性変換酵素の作成に成功した。R305H変異LGOXは,L-Gluに全く反応せず,20種の天然アミノ酸のうち,L-Tyrに対して最も高い活性を示した。精製酵素のL-Tyrに対するKm値は3.0 mMであり,LGOXとほぼ同じ耐熱性,pH安定性を示した。R305