hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
移植腎Klothoの腎移植後ミネラル代謝における役割と腎・生命予後への影響

全体的構想は、腎移植でもたらされたKlothoが、腎移植患者でどのように機能し、ミネラル代謝や腎・生命予後に影響を与えているかの解明である。腎移植患者と生体腎ドナーから血中の可溶性Klothoを定期的に測定した。可溶性Klotho値は、術前値から軽度低下した後3ヶ月から6ヶ月の時点で回復する傾向が認められた。一方、生体ドナーでは術後低下し、術前値まで回復したのは少数例であった。慢性腎不全である腎移植患者のKlotho値は低値で、移植腎によって可溶性Klothoは回復する可能性が示唆されたが、症例ごとにかなり相違が認められた。今後Klotho産生臓器である副甲状腺との関連性に注目している。<予備的研究>腎移植ドナーから摘出された5腎の腎静脈から採取した可溶性Klotho値は、3315±1402 pg/mlで、生体腎移植ドナー5名の術前採血から測定した可溶性Klotho値416±94 pg/mlより有意に高値を示し、約8倍に相当した。ドナーの術前腎機能(血清Cr値)との相関は認められなかった。摘出された腎静脈のKlothoの測定値は、血中濃度より遥かに高値を示し、腎から可溶性Klothoが流出していること、移植腎からレシピエントにKlothoが持ち込まれる可能性が高いことが確認できた。<横断的研究>研究内容を説明の上、同意の得られた外来腎移植患者から血液を採取した。患者背景(年齢、性別、原疾患、透析歴、移植後期間、免疫抑制剤内容)、検査項目(一般生化学検査(Cr, Ca, P, ALP, T-Chol, TG, CRPなど)、血球検査、副甲状腺ホルモン、可溶性Klotho)をもとに相関関係などを分析した。(結果)腎移植患者12名(年齢45歳、透析歴15ヶ月、移植後期間平均3ヶ月)。1)腎移植患者におけるKlotho値: 478.2±234.0pg/ml。2)腎移植患者におけるKlotho値と種々の背景因子との関係:年齢、性別、原疾患、透析歴、移植後期間、服薬免疫抑制剤による相関は認められなかった。3)腎移植患者におけるKlotho値と骨ミネラル関連パラメータとの関係では、Klotho値と血清Caと有意な相関関係が認められた(p=0.024, r=0.670)。P, ALP, iPTH値との相関は認められなかった。4)腎移植患者におけるKlotho値と腎機能:Klotho値とCr値との相関は認められなかった。5)腎移植患者におけるKlotho値と内服免疫抑制剤:有意差は認められなかった。(考察)腎移植患者のKlotho値にはばらつきが多く、背景因子やミネラル関連マーカーとの相関も少ないようである。血清Ca値との相関関係の意味は今の段階では不明である。腎移植でもたらされた移植腎Klothoの、移植患者におけるミネラル代謝や移植腎機能の影響を解明することと、生体腎ドナーにおいては術後のミネラル代謝や腎機能とKlothoの関連を解明することを研究の目的とする。対象・方法:今年度においては、同意の得られた腎移植患者15名、生体腎ドナー15名から、腎移植後の期間を定めて採取した血清中の可溶性Klothoなどを測定し前向き縦断的研究を始めた。結果:腎移植患者の可溶性Klotho値の推移を、移植前値を基準に期間を追って測定すると、腎移植後3週間までは低下した(14/15例)。移植前値を上回った症例は、術後3ヶ月の時点で15例中10例、6ヶ月の時点では15例中12例であった。また腎提供ドナーにおいては、提供前値から術後低下したまま持続し、6ヶ月の時点で前値に回復したのは15例中2例のみであった。考察:慢性腎不全状態にある腎移植患者の移植前のKlotho値は低値で、術後1ヶ月は低値のまま経過するが、3ヶ月過ぎに上昇し6ヶ月の時点では前値を上回る傾向が認められ、移植腎Klothoの血中への移行の可能性を推察できる。一方、生体腎ドナーの血清中の可溶性Klotho値は術後低下する。その後上昇傾向を示すが個体間のばらつきがかなり大きい。腎移植患者のKlotho値の凡その推移が判明したが、患者との生命予後との関係について今後検討が必要である。今後の計画:腎移植患者から採取した移植腎生検について、Klothoの発現程度を半定量化して評価する。最終的に評価すべきアウトカムは腎予後・生命予後であるが、今研究の期間は短いため、血清Klotho値および腎組織Klotho発現に影響を与える背景因子や術後腎機能、ミネラル代謝マーカーを解析する計画である。腎移植でもたらされた移植腎Klothoの移植患者のミネラル代謝や移植腎機能への影響と、生体腎ドナーにおいては術後のミネラル代謝や腎機能への影響を解明することを目的とする。対象と方法:今年度において同意の得られた腎移植患者5名、生体腎ドナー5名を、前年度に加えて対象に加え、移植後の期間を定めて血液を採取した。血清中の可溶性Klothoなどを測定し縦断的研究を継続した。また、前年度対象とした腎移植患者のうち5例について、移植時、3ヶ月、12ヶ月後に採取した腎生検標本に対して、Klotho染色とFGFRの染色を行い、それらの発現度を評価した。

結果:腎移植患者の可溶性Klotho値の推移は、前年度と同様の結果となった。すなわち、腎移植後1週間の時点では前値より有意に低下した。術後6ヶ月の時点では前値を上回った症例が20例中15例にみられた。腎提供ドナーにおいては、術前値から低下したまま持続し、6ヶ月の時点で前値に回復したのは2例のみであった。腎生検標本上のKlothoの発現は、術後3ヶ月の時点で移植時より減少傾向を示し、1年後にはやや増加する傾向が認められているが、複雑な構造物をいかに半定量化するか検討中である。考察:慢性腎不全状態にある腎移植患者の移植前のKlotho値は低値で、術後1ヶ月は低値のまま経過するが、3ヶ月過ぎに上昇し6ヶ月の時点では前値を上回る傾向が認められ、移植腎Klothoの血中への移行の可能性を推察できる。今年度施行した腎生検標本によるKlotho発現度の評価については、症例数が少なく半定量化が未だ困難なことから結論は見出せていない。今後組織の免疫染色の半定量化方法を検討しKlothoの発現度を評価していく予定である。また、この研究の最終的に評価すべきアウトカムは腎予後、生命予後と考えているので、継続した研究を考えている。全体的構想は、腎移植でもたらされたKlothoが、腎移植患者でどのように機能し、ミネラル代謝や腎・生命予後に影響を与えているかの解明である。腎移植患者と生体腎ドナーから血中の可溶性Klothoを定期的に測定した。可溶性Klotho値は、術前値から軽度低下した後3ヶ月から6ヶ月の時点で回復する傾向が認められた。一方、生体ドナーでは術後低下し、術前値まで回復したのは少数例であった。慢性腎不全である腎移植患者のKlotho値は低値で、移植腎によって可溶性Klothoは回復する可能性が示唆されたが、症例ごとにかなり相違が認められた。今後Klotho産生臓器である副甲状腺との関連性に注目している。研究への参加に同意を得ることができた腎移植患者・ドナー数が減少した。血清Klothoの測定は施設内で行われているが、測定精度をより改善するためにある程度期間を要した。腎生検組織の免疫化学的染色方法の条件設定が難しく、確立するまでに期間を要した。腎移植上記に記した今後の検討課題を明らかにしていくために、確立すべき測定方法、組織の染色方法に関してほぼ達成していると考えている。腎生検組織の染色の半定量的評価を確立するとともに、検体サンプル数を増加させ、より信頼度の高い解析結果を導き出す必要がある。サンプル数を増やした上で、解析を効率的に行っていく予定である。腎予後や生命予後についての解析については、腎移植の成績が良好で、研究期間において、腎機能低下症例、死亡症例が極めて少ないため、腎機能やミネラル代謝マーカーの変化とKlothoとの関連性を解析し結果を導く予定である。この臨床研究における倫理委員会の承認を待って患者サンプルの採取を開始したので、サンプル採取がやや遅れる結果となった。パイロット研究となる予備研究におけるサンプル採取の機会が少なく、やや律速段階となった。また、この研究の最も中心となるKlotho値の測定にばらつきがあり、測定精度を良くするために期間を要した。軌道にのってからは順調にサンプル採集、測定も安定しており、今後も順調なペースで進展していくものと考えている。購入予定であった病理標本の染色用試薬の一部について、在庫があったことで次年度での購入に予定変更した。
方言の推量表現に関する文法記述的研究

日本語方言の推量表現形式のうち、古典語ラムに由来する形式「ロー」を持つ地域の一つとして、山口県長門地方と島根県石見地方の方言に焦点を絞り、当該地域の現在の推量表現形式の意味や用法を老年層面接調査で得たデータによって文法的特徴を記述した。この地域では現在「ジャロー」類と「ロー」がほぼ同じ意味・用法で併用されているが、長門方言の一部に「ロー」が名詞に直接付くことが可能な地域があり、その場合の「ロー」は確認要求表現に限定されることが明らかになった。また過去の方言資料等と比較すると、長門方言・石見方言では推量表現に「ジャロー」類が主に使われ、「ロー」の使用地域が狭くなっていることが確認された。平成27年度の研究実績は次のとおりである。まず、長門(山口県北部)や石見(島根県西部)の方言資料や、過去に記録された方言資料等や既に刊行されている方言地図を用いて、推量表現形式や確認要求表現の用例を抽出し、これまでの当該形式の意味・用法や使用傾向を確認した。この作業によって、ことばの変化を考えていくための出発点となるデータを得た。また、長門・石見地域での臨地面接調査の前段階として、本研究で使用する調査票を作成し、関係諸地域において準備調査を行うとともに、本調査のためのインフォーマントの確保に向けて依頼等を行った。山口県徳佐、須佐、萩、島根県津和野、益田で実施した準備調査によって、本調査で注目すべき事象や調査地域の選定のための情報を得た。3つ目の実績として、国立国語研究所のプロジェクト(FPJD)「方言の形成過程解明のための全国方言調査」における推量表現に関する調査結果の分析を進め、言語地理学フォーラムでの発表(6月7日、於国立国語研究所)、および論文「推量表現形式の分布とその変化ー地域共通形式への収斂と脱推量形式化ー」の執筆を行った。なおこの論文は次年度刊行予定の論文集『空間と時間の中の方言』に編まれる予定である。研究計画調書に記載した平成27年度の研究実施計画に概ね沿っており、(1)談話資料および方言地図の分析、(2)調査票の作成、(3)調査の準備、(4)国立国語研究所のプロジェクト(FPJD)調査結果の分析、のいずれも進んでいることから、順調に進展していると判断した。長門・石見地域の推量表現について、津和野町・益田市・須佐(萩市)において、生え抜きの老年層・中年層インフォーマント数名に面接調査を実施した(8月)。また島嶼部での状況を把握するために、見島(萩市)でも同様の調査を行った(8月)。このような質的調査によって得られたデータをもとに、推量表現、確認要求表現およびその周辺的意味を担う形式群に関する形式と意味との整理を進めた。特に老年層において、推量表現形式(「ロー」および「ジャロー(ヤロー)」)と動詞の活用(特にラ行五段化)との関係、否定推量表現形式との関係、意志表現との関係が見えてきた。これによって当該地域の推量表現・確認要求表現などに関わる部分体系がある程度把握できたが、部分的に不足している情報があり、次年度も継続してデータ収集と分析を進める必要がある。また益田市では若年層の日常的な使用状況を把握するために、自由会話形式の談話資料の収録を行った(8月)。この談話資料を定量的な分析に使用できるように作業を進めつつある。面接調査による共時的データの収集と並行して、既刊の方言資料や方言地図を用いての用例抽出作業を行った。当該地域については江戸期以前の方言資料が多くはないため、現在のところ、時期・地点・ジャンルにばらつきのある用例を点描するような状況である。引き続き、分析に耐える資料を探し、記述内容を精査する必要がある。国立国語研究所のプロジェクト(FPJD)での分析結果については、前年度に発表した内容を論文化し、論文集『空間と時間の中の方言』(共著、朝倉書店)として刊行するための作業を行った(印刷中)。老年層の臨地面接調査に関しては、協力的なインフォーマントにめぐりあうことができたため、調査がうまく進んだ。一方で、中・若年層はなかなかインフォーマントとの日程的な調整がつかず、調査の実施が難しい。代替的な方法として若年層については自然談話の収録を行うなど、工夫した。前年度に実施した長門・石見地域の推量表現についての調査(生え抜きの老年層対象、津和野町・益田市・須佐の3地点)の結果を、論文「石見方言・長門方言における推量表現形式「ロー」の使用状況」(2018年3月、『神女大国文』29、神戸女子大学国文学会)にまとめた。まとめる過程で必要となった詳細情報は、2017年8月に補充調査を実施して得た。この論文では、推量表現、確認要求表現およびその周辺的意味を担う形式群に関して、形式と意味との整理を行い、老年層において、推量表現形式(「ロー」および「ジャロー(ヤロー)」)と動詞の活用(ラ行五段化)との関係、否定推量表現形式との関係、意志表現との関係を詳しく記述することができた。全国調査では推量表現形式としての「ロー」が衰退過程にあるが、この地域の老年層は「ロー」と「ジャロー」を併用していること、ヤロー類は受容していないこと、推量には意志表現に関わる動詞ラ行五段化形は使用しないことを確認した。

一方で、確認要求表現については須佐の老年層がラム由来推量形式の「ロー」を名詞に直接後接させて使用するという「ロー」の文法的性格の変質が確認され、また益田や須佐では確認要求表現には動詞ラ行五段化形(意志表現と同形)を使う状況なども捉えることができた。ただし確認要求表現に関わる部分体系については、詳らかにできなかった部分が残った。確認要求表現については推量形式だけでなく否定疑問形式や終助詞なども視野に入れながら今後確認していきたい。国立国語研究所のプロジェクト(FPJD)での推量表現形式に関する分析結果は、「推量表現形式の分布とその変化ー地域共通形式への収斂と脱推量形式化ー」(2017年、『空間と時間の中の方言ーことばの変化は方言地図にどう現れるかー』大西拓一郎編、朝倉書店)にまとめた。日本語方言の推量表現形式のうち、古典語ラムに由来する形式「ロー」を持つ地域の一つとして、山口県長門地方と島根県石見地方の方言に焦点を絞り、当該地域の現在の推量表現形式の意味や用法を老年層面接調査で得たデータによって文法的特徴を記述した。この地域では現在「ジャロー」類と「ロー」がほぼ同じ意味・用法で併用されているが、長門方言の一部に「ロー」が名詞に直接付くことが可能な地域があり、その場合の「ロー」は確認要求表現に限定されることが明らかになった。また過去の方言資料等と比較すると、長門方言・石見方言では推量表現に「ジャロー」類が主に使われ、「ロー」の使用地域が狭くなっていることが確認された。平成28年度は研究実施計画に従い、次のことを実施する予定である。(1)平成27年度の準備調査の結果をふまえて、本調査としての臨地面接調査による文法データの収集と整理を行う。長門・石見地域で、生え抜きのインフォーマント(老年層・中年層・若年層)各数名に面接調査を実施し、推量表現・確認要求表現およびその周辺的意味を担う形式群に関する詳しい文法の情報を収集する。(2)本調査で得たデータから、推量表現・確認要求表現およびその周辺的意味を担う形式群に関する分析を進め、文法記述を行う。(3)国立国語研究所のプロジェクト(FPJD)「方言の形成過程解明のための全国方言調査」で得た全国方言データのうち、推量表現に関するデータの分析結果を活用し、本研究の方言間対照に役立てる。また、平成29年度には平成28年度の本調査を補充する補足調査等を実施した上で、研究成果をまとめていく。本研究課題については、まず昨年度までに面接調査で得た共時的データとそこから導き出した知見を整理し、不足する情報を追加調査等によって補い、当該方言の推量表現体系を記述することを第一の課題として進める。またこの作業と同時進行で、他地域の推量表現体系との対照もすすめる。一定の結果がまとまれば、学会または研究会等で報告できるよう準備する。分析には、昨年得た若年層の談話データも利用するが、必要が生じれば本年度は追加調査に加えて老年層の談話データの収録も試みる。さらに並行する作業として、方言資料などから得た用例を通時的データと位置づけ、推量表現体系の変化を長いスパンで考察できるように資料収集と用例の分析を進める。日本語学、方言学、社会言語学
Collagenase産生口腔内殺菌の遺伝学的研究

コラゲナ-ゼ(以下Case)産生菌からCaseをコ-ドする遺伝子をクロ-ニングする目的で実験を行なった。まずCase産生菌を容易に検出する方法としてコラ-ゲン平板培養法を検討した。Caseの基質であるコラ-ゲンは熱などによって変性し易い蛋白質で、変性するとCase以外のプロテア-ゼによっても水解されるようになる。基質の分解を指標として平板培地上でCase活性を特異的に検出するには、未変性の無菌コラ-ゲンを培地に加える必要がある。コラ-ゲンを変性させないように滅菌・添加する方法を検討した結果、滅菌法としては、凍結乾燥した未変性コラ-ゲンう電子レンジで5分間処理する方法が有効で、この滅菌コラ-ゲンを36°Cに冷ました低融点がロ-ス添加ハ-トンフュ-ジョン培地に加えて平板に固めると、コラ-ゲンはほとんど変性しなかった。この平板を用いてBacteroides8菌種・42株、Capnocytophage2菌種・2株、Actinomyces4菌種・6株、Corynebacterium matruchotii1株およびRothia dentocarisa2株、計8菌種・53株のCase活性を調べたところ、24株のB.gingivalisにだけCase活性がみられた。これらのCase陽性株についてプラスミドの有無を調べたが、保有株はなかった。このことからこれらの菌株のCase遺伝子は染色体上にあると推定し、染色体DNAからCase遺伝子をクロ-ニングすることにした。B.gingivalis NG2028株の染色体DNAをSau3AIで部分消化し、4-9kbの大木さの断片を抽出してプラスミドpUC13のBamHI切断サイトに結合され、それをE.coliJM103株にtransfectこせた。これまで、組み換え体2507株について、Case活性だけでなく、ゼラチン液化能、スキムミルク分解能、トリプシン様酵素活性、Glycylprolyl protease活性等のプロテア-ゼ活性、カナマイシン耐性および黒い色色素産生能を調べたが、これらの活性を表現しているクロ-ンは得られなかった。健康人の口腔からCollagenase(以下Caseと略す)産生菌をCollagen平板上でスクリーニングしたところ、Case活性を有する株は、すべてBacteroides gingivalis(以下B.gingivalisと略す)であった。活性程度はさまざまで、全くCase活性を保有しない株もあった。そこで、Case活性を有するB.gingivalisの新鮮分離株および教室保存株100株についてプラスミドの存在を調べた。Todd-Hewittbroth,Heart in fusionbroth, Tnypticase soybrothおよびSchaedler brothにヘミンとメナジオン添加した培地に、それぞれを接種し、3日間嫌気培養してプラスミドの存在を各種の方法で調べたところ、いずれの株においてもプラスミドの存在はみられなかった。次にB.gingivalisでCase活性の強い1株よりDNAを抽出し、Case活性遺伝子をクローニングすることにした。ベクターとして大腸菌由来のプラスミドpBR322を使用した。pBR322は制限酵素のBamH Iでリニアーにした後アルカリフォスファターゼ処理した。B.gingivalisのDNAは制限酵素のSau3A Iでバーシャルに切断した後アガロールゲル電気泳動を行い49Kbpおよび923Kbpの範囲の長さのDNAを分取した。

それぞれを先のpBR322に組み込み、大腸菌に入れた。テトラサイクリン添加培地に発育せずアンピシリンの入った培地に発育してきたコロニーをひろいCase活性の有無についてゼラチン培地で分解能を調べた。活性を有する疑いの有る株については、さらにCollagen平板上でCase活性を有するかどうかを調べているが、現在のところ確実に保有している株は得られていない。Case活性を増強する因子を添加する必要が有るものと思われ、それについても現在検討中である。またこの酵素が大腸菌では分泌しない恐れがあると思われるので活性測定方法や、使用するべクターを工夫する必要があると考えている。コラゲナ-ゼは歯周組織のほか多くの口腔内細胞によって産生される酵素で、歯周疾患の成立や進行に重要な役割を果たしているものと考えられています。われわれは、これらのコラゲナ-ゼの相互関係を解明するためにまず最初にコラゲナ-ゼ産生菌からコラゲナ-ゼをコ-ドする遺伝子をクロ-ニングする実験を行なった。以前の結果から、口腔内常在菌種のうちコラゲナ-ゼを産生する菌種はBacteroides gingivalisのみであったので、この菌種についてプラスミドの有無を調べたが、プラスミドDNAはみられず、これらの菌株のコラゲナ-ゼ遺伝子は染色体上にあると推定された。そこで染色体DNAからコラゲナ-ゼ遺伝子をクロ-ニングすることにした。歯周疾患患者由来の新鮮分離株のうち、コラゲナ-ゼ活性が非常に強い株B.gingivalis NG2028株を供試した。ヘミンとメナジオンを添加したトリプチケ-ス・ソイブロスで3日間嫌気培養し、集めた菌体から染色体DNAを抽出・精製した。次にそのDNAをSau3AIで部分消化し、シヨ糖密度勾配遠心法によって49kbの大きさの断片を抽出し、プラスミドpUC13のBamHI切断サイトに結合させ、それをEscherichia coli JM 103株にtransfectさせた。これまでに2,507株の組み換え体について、昨年度われわれが開発したコラ-ゲン・アガロ-ス平板を用いてコラゲナ-ゼ活性を調べたほか、ゼラチン液化能、スキムミルク分解能、トリプシン様酵素活性、Glycylprolyl protease活性などのプロテア-ゼ活性、カナマイシン耐性および黒色色素産生能を調べた。残念ながら現在までのところ、これらの活性を表現しているクロ-ンは得られなかった。
制限酵素を用いたヒトゲノム上へのDNA二重鎖切断導入とその修復課程の解析

本研究の目標はヒト細胞内におけるDNA二重鎖切断の修復の過程を明らかにする上で、今必要なものは、ゲノム上に部位特異的に同調的にDNA二重鎖切断(DSB)を導入しその修復過程の経時変化をモニターすることができる系を確立することである。ヒト培養細胞HeLaS3細胞およびヒト正常リンパ球細胞を用いて、制限酵素BamHIにより生細胞中でDSBを導入させ、その修復過程について解析を行った。今年度は、おもに制限酵素により導入されたDSB部位のヒトゲノム上での位置の特定を行うことを目標として解析を行った。DSB末端に相補的な末端を持つ、ビオチンラベルしたオリゴDNAによりキャッピングを行い、ストレプトアビジンビーズにより回収してDSB末端の塩基配列を決定した。その結果、ヒトゲノム上で約200カ所の高頻度でDSBが入る部位を特定することができた。その中でも特に頻度が高かった部位について、クロマチン免疫沈降法を行った。DSB末端プールからDSB依存的に特定領域を検出することができたが、修復タンパク質に対する抗体を用いた、免疫沈降産物からのクロマチン免疫沈降法特定領域の検出にはいたらなかった。さらに検出条件の検討を行うことにより、改善可能だと考えている。逆に特定部位にこだわらず、全ゲノム上のDSB末端の濃縮方法を確立したことからゲノムワイドなDSBの分布とゲノム上の構造あるいは様々な染色体上の蛋白質の分布との比較が可能になった。ゲノム安定化における脆弱部位の特定や、今後、この手法を用いてゲノム安定化に寄与するタンパク質とその修飾状態等の要因究明に多いに貢献できると考えている。BamHIによってDSBが導入されるゲノム上の特定部位を約200サンプルから同定し、染色体の位置情報などを明らかにした。H19年度は、現在も集めているDSB末端配列のコレクションの中から、サザン解析(DNA構造解析)とクロマチン免疫沈降法(ChIP法)に適した部位を選び出す作業を行った。まずはサザン解析によりDSBの検出を行ったが、サザン解析により検出できるサンプルは見つからなかった。サザン法で検出するためには、全細胞の10%で同一部位にDSBが導入されている必要があり、そのような高頻度でDSBが導入される部位が今回のサンプルには含まれていなかったことがわかった。そこで、PCR法によるDSB検出と組換えたい検出を試みている。また、ChIP通常ヒストン抗体をポジティブコントロールとして、プライマーの設定などヒト細胞からのChIPの条件検討を行っている。ヒト培養細胞HeLaS3細胞を用いて、制限酵素BamHIによりDSBを導入させ、薗修復過程についてサイトロジーをもちいて解析を行った。その結果、DNA二重鎖切断のマーカーであるヒストンH2Aのリン酸化と相同組換えを行うRad51の局在を経時的に観察することが出来た。一方、NHEJに必須であるDNAリガーゼIVについて、Ligase-IVとその制御サブユニットであるXrcc4タンパク質に対する抗体を作成してその局在について解析を行ったがRad51等の相同組換え因子とは異なりFociとしては観察することが出来なかった。酵母においてそれらのホモログであるDn14あるいはLif1タンパク質に対して同様の解析を行ったがヒト細胞と同様にFociとしては観察することが出来なかった。しかし、酵母においてはChIPでこれらの因子のDSB末端への集積を検出することが出来たことから、ヒト細胞についても同様の方法を導入し、これらの修復タンパク質のDSB末端への集積と解離についてその経時変化について解析を行っていく予定である。
グルタミン酸受容体を標的としたPETプローブの薬理学的応用研究

本研究の目的は、薬物刺激によるグルタミン酸神経の賦活及び抑制状態におけるグルタミン酸受容体の密度(発現量)変化を陽電子断層撮像法(PET)を用いることにより生きたままの状態で観察することである。平成28年度では、グルタミン酸の一過性過剰放出を促すピロカルピンを投与することにより、てんかん発作を起こす病態モデルを用いてPETイメージング研究を行い、代謝型グルタミン酸受容体1(mGluR1)の受容体密度がグルタミン酸神経毒性に由来する神経炎症に付随して減少していくことを見出した。平成29年度では、グルタミン酸の慢性的な放出を促す非炎症型の動物モデルを用いてmGluR1を標的としたPETイメージング研究を行い、慢性的なグルタミン酸高濃度状態においては、mGluR1の発現量が上昇し、グルタミン酸濃度の低下に付随して正常レベルに戻ることを見出した。最終年度では、mGluR1活性化に伴い、副産物である内在性カンナビノイドが過剰に産生され、生理的な逆行性のグルタミン酸神経の抑制が生じ、グルシナプス間隙のグルタミン酸濃度が正常レベルまでに徐々に回復したと示唆されたことから、平成29年度で用いた非炎症型の動物モデルを用いて内在性カンナビノイドの分解酵素であるMAGLを標的としたPETイメージング研究を行った。その結果、N-Acetylcysteine(NAC)溶液を入れたアルゼットポンプ(AZP)を腹腔内に移植したラットにおいて、MAGLに選択的なPETプローブである[11C]SARの放射能集積は、AZP移植後1日目から徐々に上昇し始め、7日目で最大に達し、その後低下した。本研究を通じて、グルタミン酸の過剰な放出がmGluR1の発現量を増加させ、その結果、内在性カンナビノイドの産生が促進され、逆行性のグルタミン酸放出抑制が起こることをPETイメージングによって明らかにした。本研究の目的は、薬物刺激によるグルタミン酸神経の賦活及び抑制状態におけるグルタミン酸受容体の密度変化をPETを用いて生きたままの状態で観測することである。平成28年度では、薬物刺激としてピロカルピンを用いた癲癇モデル動物を用いて研究を行った。ピロカルピンは、グルタミン酸神経を強刺激し、興奮性神経伝達物質であるグルタミン酸を過剰にシナプス間隙に放出させ、癲癇様発作を誘発する薬物である。本年度では、グルタミン酸受容体の中でも、挙動があまり知られていない代謝型グルタミン酸受容体1(mGluR1)を標的としたPETイメージング研究を行った。mGluR1に選択的なPETプローブとして[11C]ITDMを用い、ピロカルピン-癲癇モデル(PISE)ラットにおいて発作後1日(急性期)、1週間(亜急性期)及び3週間(慢性期)で、それぞれPET撮像を行ったところ、視床及び海馬において、[11C]ITDMの放射能集積は亜急性期から慢性期にかけて徐々に低下した。この結果は、これまでに報告されていた、mGluR5の挙動と異なるものであった。本研究結果を通じて、グルタミン酸の過剰な神経興奮は、グルタミン酸受容体においてサブタイプ間で異なる影響を与えることが示唆された。このことは、今後の癲癇やその他の神経疾患に対する治療薬開発研究に寄与することが期待される。現在のところ、予定通りに進捗している。平成29年度では、グルタミン酸の慢性的な放出を促す非炎症型の動物モデルを用いてmGluR1を標的としたPETイメージング研究を行った。SDラットに、グルタミン酸の放出を促進することが知られるN-Acetylcysteine(NAC)をアルゼットポンプ(AZP)を腹腔内に留置し、15 mg/dayの流速で継続的に投与した。AZP移植後1, 3, 7, 10, 14日後にPET撮像を行ったところ、投与後1日から3日にかけて、mGluR1の発現量が豊富な領域である帯状回、線条体、視床、海馬、小脳で受容体密度の上昇が見られ、その後、7日から10日後にかけて、正常レベルまで減少することが明らかとなった。これらの結果から、移植後初期では、シナプス間隙のグルタミン酸の恒常性維持のためにmGluR1の発現量が増加し、その後、mGluR1活性化に伴い、副産物である内在性アナンダミドが過剰に産生され、生理的な逆行性のグルタミン酸神経の抑制が生じ、グルシナプス間隙のグルタミン酸濃度が正常レベルまでに徐々に回復したと示唆される。想定された結果が得られたことで、順調に研究が進展している。

平成28年度では、グルタミン酸の一過性過剰放出を促すピロカルピンを投与することにより、てんかん発作を起こす病態モデルを用いてPETイメージング研究を行い、代謝型グルタミン酸受容体1(mGluR1)の受容体密度がグルタミン酸神経毒性に由来する神経炎症に付随して減少していくことを見出した。平成29年度では、グルタミン酸の慢性的な放出を促す非炎症型の動物モデルを用いてmGluR1を標的としたPETイメージング研究を行い、慢性的なグルタミン酸高濃度状態においては、mGluR1の発現量が上昇し、グルタミン酸濃度の低下に付随して正常レベルに戻ることを見出した。最終年度では、mGluR1活性化に伴い、副産物である内在性カンナビノイドが過剰に産生され、生理的な逆行性のグルタミン酸神経の抑制が生じ、グルシナプス間隙のグルタミン酸濃度が正常レベルまでに徐々に回復したと示唆されたことから、平成29年度で用いた非炎症型の動物モデルを用いて内在性カンナビノイドの分解酵素であるMAGLを標的としたPETイメージング研究を行った。その結果、N-Acetylcysteine(NAC)溶液を入れたアルゼットポンプ(AZP)を腹腔内に移植したラットにおいて、MAGLに選択的なPETプローブである[11C]SARの放射能集積は、AZP移植後1日目から徐々に上昇し始め、7日目で最大に達し、その後低下した。本研究を通じて、グルタミン酸の過剰な放出がmGluR1の発現量を増加させ、その結果、内在性カンナビノイドの産生が促進され、逆行性のグルタミン酸放出抑制が起こることをPETイメージングによって明らかにした。今年度はグルタミン酸神経の過剰興奮状態下におけるmGluR1の変化を観測したが、今後は、薬剤投与によるグルタミン酸神経の抑制状態下における同受容体の変化をPETを用いて観測する予定である。今後は、逆行性のグルタミン酸神経の抑制を確かめるために、カンナビノイドシステムを標的としたPETイメージングによってシナプス間隙のグルタミン酸高濃度状態における関連分子の変化を明らかにしていく予定である。また、シナプス間隙のグルタミン酸濃度変化についてもマイクロダイアリシスによって定量する予定である。実験の進捗が順調だったため、使用動物数が必要最低限で済んだため。年度末に学会参加費に計上予定が、円相場の影響で残額を越えてしまったため。予備実験のための動物購入にあてる。
海域間エコトーンにおける藻場生態系の変曲点探査と温暖化による変動機構解明

近年我が国沿岸域で進行する水温上昇を背景とする藻場生態系の変化(磯焼けの拡大)の機構解明のため、瀬戸内海と黒潮流域に介在し、比較的小さな海域に明瞭かつコンパクトな水温勾配がみられる宇和海で研究を実施した。この水温勾配に沿って、藻場の海藻植生はクロメやホンダワラ類等による温帯性のものから、磯焼け域の一部に群落を形成する熱帯性ホンダワラ類によるものへと劇的に変貌した。また、同海域では1990年代初頭と比較し上記の温帯性海藻の南限が大幅に北上するとともに、熱帯性海藻の分布が拡大していた。現地実験から、この藻場生態系の変化には水温上昇にともなう植食動物の採食活動の変化が作用していることが示唆された。日本の暖流域沿岸では、近年「磯焼け」に特徴づけられる藻場の変化が進行しており、沿岸域の生態系と漁業生産等に及ぼす影響が懸念されている。この背景には、継続して上昇しつつある水温との関連が考えられるが、藻場の変化との因果関係は不明である。本研究では、比較的小さい地理空間に明瞭な水温勾配(冬季で最大8°C程度)のみられる瀬戸内海と太平洋域の間に介在する豊後水道部において、水温等環境のゆらぎと藻場生態系の応答機構について集約的な調査を行い、藻場の変化と水温上昇の因果関係を明らかにする。これを通じて、近年の藻場の変化の機構解明と、気候変動による将来的な変化予測を可能とする知見を集積する。平成25年度は、宇和海(豊後水道東部の愛媛県側)の南北方向に7か所の調査地点を設定し、藻場のライントランセクト調査と水温自記記録計の設置等を実施した。調査地点は北から三崎(St.1)、伊方(St.2)、明浜(西予市;St.3)、北灘(宇和島市;St.4)、内海(愛南町;St.5)、西海(同;St.6)、東海(同;St.7)であり、南北距離は65km、それぞれの点間は1020km程度離れている。藻場の主要構成種は、宇和海北部のSt.1、St.2では温帯性のコンブ目海藻クロメと温帯性ホンダワラ類ノコギリモク等であり、瀬戸内海と同様であった。しかし、St.3の藻場ではクロメが欠落、さらにSt.4では温帯性ホンダワラ類が欠落し、マクサ等の小型海藻が優占した。St.5以南では漸深帯上部で熱帯性ホンダワラ類のフタエモクが、それ以深ではサンゴ類をともなう磯焼け的景観が出現した。このように宇和海では北部と南部で藻場が劇的に変化し、北部の藻場でもサンゴ類やガンガゼ等の入植が一部にみられた。本結果を1990年代初頭の環境省の藻場調査結果と比較すると、特に温帯性のクロメ、ホンダワラ類の南限が大幅に北上していた。近年の我が国沿岸域における水温上昇と、磯焼けの進行など藻場生態系の変化との関連を把握するために、瀬戸内海豊後水道部の水温勾配に沿って複数の調査点を設定し、藻場の状況とその背景にある環境要因との関係を解析するとともに、藻場を構成する主要海藻類の移植実験を実施し、水温環境と海藻の生産力の関係を解析した。昨年に引き続き、豊後水道東部の宇和海で、島嶼部を中心に南北に6つの調査点を設け、ライントランセクト法により藻場の現状を把握した。調査点はそれぞれ、1990年代初頭の環境省による藻場調査の際に、大規模な温帯性のホンダワラ類やクロメ等の温帯性コンブ目藻類の藻場が観察されている場所を選定した。これらの調査点のうち、宇和海北部の大島・地大島等では温帯性ホンダワラ類とクロメの藻場を確認した。一方、宇和海南部の日振島、横島、戸島では、これらの温帯性海藻による藻場は確認されず、ソフトコーラルや亜熱帯ホンダワラ類の藻場に変貌していた。したがって、宇和海域では1990年代に比較し、温帯性藻場の南限が大幅に北上していることが確実となった。長期の水温観測データを解析した結果、宇和海では1990年代初頭と比較し水温が0.51°C以上上昇し、特に冬季の水温上昇が著しいことが明らかになった。上記の藻場の変化が、水温上昇による生産力の低下によるものかどうか確認するために、瀬戸内海から宇和海南部にかけて6つの定点における藻場海藻の育成実験を行った。温帯性(瀬戸内海産)のホンダワラ類2種とクロメを対象とした。各定点間では特に冬季に水温環境の大きな違いが確認されたにも関わらず、海藻の成長には有意な差は認められなかった。したがって、宇和海における藻場の変化は水温上昇による海藻への生理的な影響よりも、植食動物等との生物間相互作用の変化が主要因となっている可能性が示唆された。近年の我が国沿岸で拡大する藻場の衰退・消失(磯焼け)と水温上昇との因果関係を明らかにし、温暖化による藻場生態系への影響評価・予測に資するため研究を実施した。本研究では、藻場が残存する瀬戸内海と、藻場が大きく変貌しつつある黒潮沿岸域をつなぐ海域(豊後水道)にみられる水温勾配に着目し、野外調査・実験を通じて、藻場の水温変動への応答とその機構解明を試みた。平成25年度および26年度には、豊後水道東部(宇和海)で計13の調査点を設け、潜水調査を実施した。

その結果、1)宇和海北部海域-温帯性ホンダワラ類や温帯性コンブ目藻類のクロメの藻場、中部海域-マクサ等小型海藻類中心の藻場、南部海域ー基本的に磯焼けであるが浅所に熱帯性ホンダワラ類ヒイラギモクの藻場、とわずかな地理的距離(30km)の間で藻場の様相が大きく変貌すること、2)同海域では、1990年代初頭と比較し、温帯性ホンダワラ類やクロメの南限が大幅に後退する一方で、ヒイラギモクの分布が拡大したこと、3)過去30年の間に宇和海全域にわたり12°Cの水温上昇があり特に冬季に著しかったこと、等を明らかにした。これらの藻場の海藻の潜在的生産力と水温の関係を明らかにするために、平成26年度および27年度に、瀬戸内海から宇和海にかけての計6地点で野外実験を行った。南北の6地点間の水温差は夏季はほぼ無く、冬季は最大で5°Cであった。藻体をカゴに収容し、植食性の動物の採食圧から防護した場合、温帯性ホンダワラ類やクロメの生産力は春季秋季は6地点間で差がなく、一方冬季は水温が最も高く、本来これらの藻場が分布しない宇和海南部で最も高かった。一方、藻体を採食圧から防護しない場合は、宇和海南部では魚類による食害により消失した。この結果から、藻場の変化は水温上昇を背景とした動物による採食圧の増加(トップダウンの効果)により引き起こされていることが明らかとなった。近年我が国沿岸域で進行する水温上昇を背景とする藻場生態系の変化(磯焼けの拡大)の機構解明のため、瀬戸内海と黒潮流域に介在し、比較的小さな海域に明瞭かつコンパクトな水温勾配がみられる宇和海で研究を実施した。この水温勾配に沿って、藻場の海藻植生はクロメやホンダワラ類等による温帯性のものから、磯焼け域の一部に群落を形成する熱帯性ホンダワラ類によるものへと劇的に変貌した。また、同海域では1990年代初頭と比較し上記の温帯性海藻の南限が大幅に北上するとともに、熱帯性海藻の分布が拡大していた。現地実験から、この藻場生態系の変化には水温上昇にともなう植食動物の採食活動の変化が作用していることが示唆された。実施計画にあげた調査対象海域における藻場の現状と1990年代以降の変化、および水温環境との関連をほぼ把握し、貴重な知見を得ることができた。また、計画にあげた海藻の生産力と生育環境との関連を把握する現地移植実験も順調に進捗中である。藻類生理生態学水温の上昇に伴って分布が縮小しつつある種(温帯性のホンダワラ類、コンブ目藻類、アカウニ等の藻場に生息する動物類)の衰退機構を明らかにするとともに、分布を拡大しつつある種(サンゴ類、亜熱帯性海藻類やガンガゼなどの暖海性動物)の分散・入植機構の解明が、今後の温暖化の進行と沿岸域の生態系の変化のメカニズムを理解するうえで重要と考える。申請時の計画通りに進捗している。物品(消耗品)購入の際、派数が合わなかったため。平成25年度の調査結果をもとに、藻場が劇的に変化した調査点間(St.2St.5)にさらに調査点(第2次調査点)を設定し、環境省の1990年代初頭の調査からの変化の実態を精査するとともに、藻場の変化の変曲点の実態について明らかにする。平成25年度の調査点も含めて環境要因のモニタリングを継続し、水温の変動パターンと藻場の様相との関係について解析を進める。また、藻場を構成する主要種について、温帯性種、熱帯性種のそれぞれで地点間の移植実験を行い、温度環境がこれらの海藻の生産力に及ぼす影響を明らかにする。引き続き、物品(現地調査に係る消耗品)費として有効に活用させていただく予定である。藻場の現地調査のための用船に係る費用が想定額を下回り、調査経費が総額として低く抑えられたため。引き続き現地でのデータ取得を継続・強化するため、用船費などの調査経費に充当する。
総力戦体制下の農業生産・農業経営-とくに農事実行組合の機能に着目して-

1)大正期におもに集落を基盤にして設立された農家小組合は、地域農業再編のための地域的・農民的自発性に基づく意味ある試行錯誤であったが、組織的にはそれを継承したものの戦時体制下の農事実行組合は、総力戦体制を支える基本ユニットにすぎず地域的・農民的自発性をそぎ取った別物である。この両者を明示的に区別し、農家小組合のもっていた可能性を評価する必要がある。これが第一のポイントである。2)戦時体制期に集落と集落を基盤にした農民組織が注目されたのは、それがもつ共同体的な結合力が、一方では農民支配を容易にし、他方では労働力と生産資材欠乏のもとで必要とされる相互調整を可能にすると考えられたからであった。しかし、戦時体制末期には生産諸要素の欠乏深化のため集落内での解決が不能となり、集落をはるかに超えた市町村および市町村間レベル・府県および府県間レベルの大掛かりで重層的な相互調整が不可避となった。戦時体制は集落及び集落に依拠した農業組織の力を最大限引き出すとともに、その限界も露呈させた。これが第二のポイントである。3)わが国で構造政策が容易にすすまない原因の一つは、「家・土地」の結びつきがあまりに強固なことである。しかし戦時体制はかかる固着を大幅に揺り動かす初めての経験となった。しかしこのような経験は戦争の暗い思い出として葬られ、戦後の民主化は「家・土地」結合の強化・普遍化(自作農体制)として帰結することとなった。農地改革=戦後自作農体制送出は大きな歴史の進歩でありえたが、それは排他的・私的所有の弱化=自作農的土地所有の公共的性格の強化に裏打ちされるべきであったが、かかる観点からみる時、上述したような戦時体制下の動きは貴重な経験として見直されるべきであった。これが第三のポイントである。本年度は、主に基本資料の収集と既存研究の整理に費やした。本研究で使用する基本資料は、(1)『帝国農会報』、(2)『各府県農会報』(3)各種団体の実施した当該期調査資料、(4)在地資料の4つであるが、(1)『帝国農会報』については関連部分の複写を終了した。(2)『各府県農会報』については、その量が膨大であり、現時点では滋賀県分をほぼ終了したに留まっている。(3)については主に京大農学研究科図書館及び同生物資源経済学専攻司書室所蔵資料の整理と複写をすすめるとともに、幾多の古書資料の購入を行った。(4)は今のところ宮城・群馬・香川・島根・京都・滋賀・兵庫など、できるだけ広く網をかけている。本年中に絞り込むことにしたい。なお、(5)アメリカ占領軍関係資料の閲覧については、今年は検討できなかった。次年度の課題としたい。わが国の戦時体制農業論と総力戦体制論を中心とする研究史整理をすすめてきたが、これまでに基本文献はほぼ渉猟し終え、主要論点についてもある程度確認し得た。現在は、代表的な業績についてやや詳しい抜書きを行っており、主要学説相互の事実認識と説明論理の違いを細部にわたり比較検討することを試みている。なお、以上の取り組みを踏まえて、戦時日本農業に関する三つの研究会に参加(うち一つは主催)し、研究報告と討議を行った。本年は、当初予定にいれていなかったハンガリー調査を急遽組み入れることとなった。

本研究はもともと、わが国第二次世界大戦下の農業における統制経済システムの特徴を「「集落機能に即した農事実行組合による統合」であるところに見出し、その性格を明らかにしようとするものであったが、これを「総力戦体制下の統合システムにおける日本(東アジア)型形態」として位置づけることを想定していた。ところが、西欧諸国の戦時体制においてもその統合システムは多様であり、とくにハンガリーにおいては、自らのすすむ方向を「西ヨーロッパ(資本主義)型でもなくロシア(社会主義)型」でもない、「第三の道」と位置づける運動が農村部において展開されていたことを知った。本研究では比較自体を課題にはできないが、これまで私が主張してきた西欧型と東北アジア型のシンプルな堆肥ではなく、いわばその中間的位置にあるハンガリー型コースとの類似性を意識しつつ、考え直してみたいと思っている。また、収集した資料は内容別に、(1)政策過程...「食糧増産政策」「農業統制政策」「土地政策」「その他」、(2)実態...「技術と普及・指導」「生産」「離農統制」「職工農家」ほか、(3)部落と農事実行組合...「部落機能」「共同作業」「勤労奉仕等労力調整策」「社会施設」ほか、(4)論争・理論...「適正規模論」に分類し、要点の抜書きをすすめている。現時点でほぼ3割程度終了した。なお、以上の取り組みを踏まえて、戦時日本農業に関する研究会を主催し、研究報告と討議を行った。本年度は、『帝国農会報』『農業研修』『戦時農業資料集成』の三つの資料から作成した課題別抜書き資料を中心に分析を加えた。得られた知見は以下のようなものである。1)前時代の小組合には共同の合理性がみられるが、戦時体制期の実行組合は労力不足と統制上の必要に支えられたもので、前向きの合理性は欠いていた。共同による一定の生産力増強はあったものの程度は限られ、しばしば中心的な生産力担当者(篤農家)に自己犠牲を強い、参加農家に全般的な労働強化と労働力疲弊をもたらした。このジレンマを解決するためには機械力の助けが必要であったが、軍事産業への極端なシフトのなかで、農業と農村を「裸の労働力」の摩滅・疲弊に追いやった。2)自発性の余地を残していた前時代とは異なり、統制の基礎単位としての性格を強め、国民的団結の基本単位、諸問題の調整母体として位置付けられた。他方集落は時給経済の基礎単位とされ、労働力不足もまずは集落内で調達努力をすることが基本とされた。しかし、事態は集落の解決能力をはるかに超えており、戦時末期には、町村のレベルすら超えるような頻繁な調整が必要となった。この点で集落の機能は、すでに限定的であった。3)このような過程は、近世以来の土地と農民とのリジッドな対応(緊縛)関係を揺さぶった。生産諸要素の深刻な不足の下で進行せざるをえなかった大胆な再結合の試みは、これまでの化石化した慣習を大幅に相対化する「強いられた条件下での合理化」の試みでもあった。戦争という大きな不幸の下での暗中模索ではあったが、この後の時代に振り返るべき遺産として自覚されるべきであった。
落屑症候群の緑内障発生機序に関する研究

落屑症候群は高齢者の水晶体前面あるいは虹彩の瞳孔縁にフケ様の落屑物質が沈着し、高頻度に緑内障を合併する疾患である。落屑物質の起源についてはまだ不明な点が多い。免疫組織化学の手法を用いて、落屑物質におけるHNK-1 carbohydrate epitopeを染め出すと同時にクプロメロニックブルーを用いた組織化学でプロテオグリカンを染色した。この新しい手法で落屑物質の構成成分である、HNK-1 carbohydrate epitopeとプロテオグリカンの関係を明らかにすることができた(Kubota et al.:Current Eye Research 1998)。落屑症候群は高齢者の水晶体前面あるいは虹彩の瞳孔緑にフケ様の落屑物質が付着し、高頻度に緑内障を合併する疾患である。緑内障眼には乳頭周囲に網脈絡腺萎縮が高頻度に観察される。この乳頭周囲網脈絡膜萎縮の発生原因を調べる目的で組織学的検討および造影検査での検討を行い、脈絡循環の障害が原因であることを見い出した(Kubota T.et al.: Graefe's Arch Clin Exp Ophthalmol 1996,中村ら:あたらしい眼科1996)。落屑物質が認められる眼では前房内蛋白濃度の上昇や、血液房水関門の破綻が報告されている。本研究の一環として老人性円板状黄斑変性症眼のフレア-値をレーザーフレア-セルメーター(興和社)を用いて測定し正常眼に比較して有為に高く、網膜下新生血管の面積と相関があることがわかった(Kubota T.et al.:Graefe's Arch Clin Exp Ophthalmol 1996)。落屑物質の起源を調べる目的で正常人の虹彩が加齢変化を観察し、上皮細胞基底膜の加齢変化と落屑症候群が密接な関係があることを見いだした(Khalil et al.,Arch Ophthalmol 1996)。免疫組織化学を使用しHNK-1 epitopeが落屑物質の形成に関与していることを電子顕微鏡で確認した(Kubota T.et al.: Curr Eye Res 1997)。免疫組織化学の手法を用いて、落屑症候群を持つ眼と正常眼の前眼部におけるHNK-1 carbohydrate epitopeを染め出した。正常前眼部におけるHNK-1cafbohydrate epitopeの分布および、HNK-1 epitopeが落屑物質の形成に関与していことを電子顕微鏡で世界で初めて明らかにした。また眼内に存在する落屑物質にはHNK-1cafbohydrate epitopeは陽性に染まるが、眼外に存在する落屑物質にはHNK-1 carbohydrateepitopeは染まらず、眼内と眼外で落屑物質の組成に違いがある可能性が明らかにした(Kubota et al.:Current Eye Research 1997)。いままでに報告されている落屑症候群患者の眼所見は主に欧米人のものであるが、日本人の落屑症候群患者の眼所見を観察した結果をまとめた。欧米人に比較して虹彩の変化が検出しにくい以外は相違点はなかった。緑内障の有無で眼所見に違いはなかった(Kubota et al.:Amals of Ophthalmology and Glaucoma 1997)。
甲状腺がんの発症分子機構の解明と分子標的治療の臨床応用

チェルノブイリの原発事故より20年が経過し、事故後5年で急増した小児甲状腺がんは、すでに発症年齢のピークが思春期から若年成人に移っている。しかし、依然として甲状腺がんの発症増加がみられる。比較的予後良好な経過をとる甲状腺がんの特徴ゆえに、2005年のIAEAの調査では、甲状腺がんで死亡した患者数は、現在までに9名と少ない。しかし遠隔転移を特徴とする小児甲状腺がんでは、将来的に再発する可能性が高く、通常の外科手術が適用にならない再発後の治療法が問題となる。そこで我々は、該当研究期間内に、遺伝子発現プロフィールを用いて、悪性度、転移の有無を調べる方法を開発するための基礎研究をすすめるとともに、悪性度の高い未分化甲状腺がんに対して放射線とc-ABL阻害薬を併用することでがん細胞の老化様の細胞増殖停止を誘発することを明らかにした。さらにin vitroで有意な甲状腺がん細胞死誘導作用をもつNF-kB阻害薬であるDHMEQが、in vivoでも有効なことを報告し、さらに現在、甲状腺がん発症のモデルマウスであるBRAF発現トランスジェニックマウスおよびRet/PTC発現トランスジェニックマウスを用いてDHMEQの効果を判定する研究を実施中である。DHMEQの甲状腺がんに対する治療に関する特許はすでに取得しておりさらに実用化できるように基礎研究を進めてゆく。また、甲状腺がんの治療標的となる可能性を有するがん幹細胞の研究も同時に進めており、甲状腺がん細胞株でいわゆる幹細胞のマーカーとみなされているSP分画の細胞を確認できている。今後、これらの幹細胞の性状についてさらに検討を加える予定である。ヒストン脱アセチル化阻害剤を用いて、ヒト甲状腺がん細胞株における細胞増殖実験、アポトーシス実験、細胞周囲解析MAPKs、c-Ab1、p27、p21、p53などのウエスタンおよびリン酸化抗体を用いたブロッティング実験を行い、これらの細胞内情報伝達系の解明を推進する。核マトリックス(ヒストン等)の脱アセチル化による染色体の局在の変化に伴う遺伝子発現調節の解析とルシフェラーゼアッセイ、ゲルシフト、フットプリンティング、アセチル化リジン抗体によるブロッティング法を用いて検討した。甲状腺癌の癌遺伝子であるret/PTCは遺伝子再配列に対するアンチセンスやリポザイムでは効果塩基配列が限られている為、正常のret遺伝子発現抑制による副作用の危険性がある。RNAiベクターの改変を再配列部や変異部を特異的に認識し、強力に発現を抑制するように開発する。また1分子で数百倍のRNA分子を繰り返し切断することが可能で、強力なU6プロモーター系を用いるret/PTC1に対するRNAiの効果を証明し、その細胞毒性検討や効果判定を行う。BRAF遺伝子の突然変異が甲状腺癌で高頻度(約30%)にみられることを見いだした。BRAF遺伝子変異と甲状腺癌の組織型および病期との間の関連性について臨床データを基に検討し、BRAF遺伝子変異解析をおこなうことで診断及び予後予測に応用できるか評価した。その結果BRAF変異は、臨床病期と相関が見られ、JCEM、88、4393,2003に報告した。さらに、BRAF遺伝子変異の結果、細胞内MAPK経路が活性化された甲状腺腫瘍に対して分子標的治療として、BRAF変異がある腫瘍では、NF-kBの活性化がみられることより、甲状腺未分化癌に対するNF-kB阻害剤の効果をin vitroとin vivoで調べたところ有意な増殖抑制がみられ分子標的治療薬としての臨床使用が期待された。さらに解析の結果、この遺伝子異常を伴う甲状腺癌細胞でMAPK経路が持続的に活性化されていることを確かめた。またこの変異により細胞の形質転換がおこることを明らかにした。但し、チェルノブイリ組織バンクへ申請して譲渡を受けた小児甲状腺がんの遺伝子会席の結果、BRAF変異は小児では低頻度であることがわかり報告した。