hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
セルロースの分子運動の視覚化による分子鎖特性の解析

AllingerらのMM2分子力場に於いて、Jeffreyらのパラメータセットを用いてβ-(1,4)-D-glucan(セルロース)の孤立分子鎖について分子シミュレーションを行った。先ず、5量体分子鎖について、分子力学シュミレーションを行い、各グリコシド結合の回りの残基の空間配座の変化に伴うエネルギー表面図を描き、各グリコシド結合の回りの二つの二面角ΦとΨの可能な組み合わせを求め、可能なコンフォメーションが大きく分けて二つのグループに分けられることを示した。さらに、その一方は、二つのサブ構造を含み、その間のエネルギー障壁はわずか2kcal/molで、室温付近でも頻繁に構造が入れ替わることを示した。一方グリコシド結合の回りの分子鎖のエネルギー特性は、結合の位置には関係なく同じようなエネルギー挙動を取ることも示した。ついで、16量体の分子動量学シミュレーションを行った。シミュレーションは0.5fsの時間間隔で2nsの時間にわたって、のべ400万回Newtonの運動方程式を解き、16量体分子鎖中の各原子の空間座標の時系列変化を記録し、このデーターをもとに、CGにより分子運動のアニメーションを作製し、観察した。その結果、セルロース系分子鎖の分子運動は、分子鎖軸の回りの螺旋運動を基本としており、半剛直性を示すつつ、分子鎖全体としての協調運動をもしていることが示された。また、分子鎖中の各原子の空間座標の時系列変化から、各グリコシド結合について二面角Φ、Ψの組み合わせの出現頻度を算出し、孤立分子鎖の骨格のコンフォーメーションについて、セロバイオース型の骨格構造の出現頻度が、セルロースの結晶中での2回螺旋の分子対称を持った構造よりも高いことが示され、セルロースの分子物性が、半剛直性で、かつ、この螺旋を描く習性に基づいていることが推定された。また、セルロースの結晶中では、分子鎖のパッキングに伴い、歪みのエネルギーが蓄積されていくと考えることも示された。1.MM2-CARB(87)を用いてβ-1,4-D-グルカン(セルロース)のセロバイオース単位のφ-Ψマップを描いた結果、マップの中心付近に、高さ18.2Kcal/molのエネルギーの尾根を挟んで、15.8Kcal/molと17.9Kcal/molのエネルギーの谷の存在が確認され、β-1,4-D-グルカンの結晶中のコンフォーメションは15.8Kcal/molのエネルギーの谷に相当することが確認された。また、高さ26.0Kcal/molのエネルギーの尾根を挟んで、マップの周辺部に17.2Kcal/molのエネルギーの谷の存在することが確認された。2.MM2-CARB分子力場におけるβ-1,4-D-グルカンの16量体の、室温条件下での分子動力学シミュレーションの結果、出発構造の局部的な歪みを取り除くには、約300ピコ秒(60万ステップ)の予備的シミュレーションの必要なことがわかった。1.5ナノ秒にわたるシミュレーションの軌跡を解析した結果、シミュレーションの初期には激しく変化していた構造も、歪みが取り除かれた後には、比較的穏やかな変化を繰り返し、分子鎖構造は、ほぼ前述のφ-Ψマップの中心付近の二つのエネルギーの谷に相当する構造に収れんして行った。なお、これらの分子運動の軌跡を視覚化するために、分子構造表示のためのPDSと市販のビデオ画像編集ソフトを組み合わせて、分子運動のアニメーション化のためのシステムを組み、現時点で、700ピコ秒までのアニメーションを作成済みである。平成7年度には、引き続き、アニメーションの完成と、シミュレーション結果の時系列表示とその解析を行う予定である。

β-(1,4)-D-glucanの16量体の孤立分子鎖について、300°Kの恒温層中、AllingerのMM2分子力場において、Jeffreyらのパラメーターセットを用いて、0.5fsのタイムステップで2nsのタイムスケールにわたり、400万ステップの分子動力学シミュレーションを行った。シミュレーションの結果を、分子鎖中の各原子の空間座標値のセットの時系列変化による分子鎖構造の変化として記録し、このセットを用いて、CGにより分子運動のアニメーション表示を行った。このアニメーションから、セルロース系分子鎖の分子運動は、分子鎖軸の回りの螺旋運動を基本としているが、分子鎖全体としての協調運動をもしていることを示した。このことから、セルロースのような半剛直性の分子鎖では、自由鎖の弦の振動としての特性も兼ね備えていることが示唆された。また、分子鎖のコンフォメーション変化が、螺旋運動に誘発された分子鎖軸からの、連続したセグメントのずれの運動として起こっている様子も観察された。一方、分子鎖中の各原子の空間座標値のセットの時系列変化から、グリコシド結合の回りの二つの二面角の組み合わせのセットの時系列変化を算出し、各グリコシド結合を挟む残基間の空間配置の変化とその出現頻度を算出し、二種類の組み合わせに集中していることを示した。この時系列変化の様子から、孤立分子鎖の骨格における残基間の空間配置について、結晶中のセルロース分子鎖の二回螺旋の分子鎖対称を持った構造よりも、セロバイオースの結晶中での分子鎖骨格の構造の方が高い出現頻度で発生していることが分かった。これらのことから、セルロースの分子鎖が、拘束力から解放されたときには、基本的には、隣り合った残基間の相互作用で決まる、螺旋構造を取る習性のあることが示され、セルロース系分子鎖の分子物性が、この残基間の空間配置に基づく相互作用を基本として発現していることが示唆された。
準Banach関数空間の構造とマルチンゲール理論

Banach関数空間Xの弱空間w-Xに於いて,種々のマルチンゲール不等式が成立するようなXの特徴付けを与える研究を実施した.Banach関数空間とは,よく知られているLp-空間を一般化した関数空間であり,また,Banach関数空間Xの弱空間とは,Xに付随する準Banach空間であって,弱Lp-空間を一般化した関数空間である.本研究の結果,弱空間w-Xに於いてBurkholder型やDoob型のマルチンゲール不等式が成立するようなBanach関数空間Xの特徴付けを与え,マルチンゲール理論とBanach関数空間の構造の間には密接な関連があることを示すことができた.Lebesgue空間Lpからその弱空間w-Lpを定義するのと同様の方法で,非原子確率空間上のBanach関数空間Xに対し,その弱空間w-Xが定義される.w-Xは準Banach関数空間になる.本研究の目的は,マルチンゲールの諸性質を用いて,弱空間w-Xの構造とマルチンゲール理論の関係を解明することにある.これまでの研究代表者(菊池)の研究により,すべての条件付平均作用素がXからw-Xへの作用素として一様有界になる為の必要十分条件が得られているが,この研究成果を基に,離散時径数マルチンゲールf=(fn)に対して,その極大平均振動作用素θf,及び,2次変分作用素Sfが(フィルトレーションに依存することなく)w-Xからw-Xへの有界な作用素となる為の必要十分条件を得た.更に,θfのw-Xに於ける準ノルムが極大作用素MfのXに於けるノルム(の定数倍)で評価される為の必要十分条件などが得られた.得られた必要十分条件は,いずれも研究代表者(菊池)よって導入されたXの上基本関数の概念,及び,その上基本関数に対して定義されるある種の指標を用いて表現される.得られた結果は,Banach関数空間に於けるマルチンゲール不等式に関する結果などの,既知の結果に類似する部分とそうでない部分に分かれ,この分野に於ける新たな識見をもたらすものとなった.これらの結果は,3篇の論文として発表すべく,現在(平成26年5月現在)準備中である.本研究によって得られた結果を調和解析学など密接に関連する分野の研究者に対して,セミナーなどで紹介したところ,「各種作用素が有界になる空間の特徴付け」という発想はあまり聞かないということであった.調和解析学などでも同様の視点に立つ研究が可能ではないかと思われる.今後は,マルチンゲール理論にとどまらず,他の分野の研究に発展させられるよう,範囲を広げて研究を実施したい.Lebesgue空間Lpから弱空間(Lorentz空間)w-Lpが定義されるのと同様の方法で,非原子確率空間上のBanach関数空間Xの弱空間w-Xが定義される.w-Xは研究代表者の菊池によって導入され,既にこの空間の構造に関する結果も得られている.25年度に続き,マルチンゲール理論を用いて弱空間w-Xの構造を解析する研究を進めた.25年度の研究によって,マルチンゲールfの2次変分Sfのw-Xに於ける準ノルムと,fの概収束極限のw-Xに於ける準ノルムが,互いに他の定数倍で評価される為の必要十分条件(Burkholder型の不等式が成立する為の必要十分条件)が得られていた.この結果に関連する問題の研究を進めたところ,25年度に得られた結果に加え,更なる必要十分条件を得ることができた.新たに得られた必要十分条件は,Xの上基本関数φと定数A>1に対してφ(At)/φ(t)のt→0+とするときの上極限,及び,下極限を用いて表現されるものである.更に,マルチンゲールfの極大関数Mfのw-Xに於ける準ノルムが,fの概収束極限のw-Xに於ける準ノルムの定数倍で評価される為の必要十分条件(Doob型の不等式が成立する為の必要十分条件)についても,25年度に得られた結果に加え,新たな必要十分条件が得られた.これもXの上基本関数を用いて表現される.26年3月の時点で,既に執筆を開始していた論文の内容を再考し,26年度に新たに得られた必要十分条件を付け加えるなどの変更を加えて書き換えることとし,現在投稿準備中である.27年度は,Burkholder-Davis-Gundy型の不等式,及び,マルチンゲール変換に関する種々の不等式が弱空間w-Xに於いて成立する為の必要十分条件の導出を目標に,研究を進める予定である.Lebesgue空間Lpから弱空間w-Lpが定義されるのと同様の方法で,非原子確率空間Ω上のBanach関数空間Xから,その弱空間w-Xが定義される.w-Xは研究代表者の菊池によって導入され,ここ数年にわたりマルチンゲール理論を用いてその構造が解析されてきた.平成27年度に実施した研究の結果,一様可積分なマルチンゲールf=(fn)と,絶対値が一様に1以下であるような可予測過程v=(vn)に対し,マルチンゲール変換v*f=(v*fn)の概収束極限のw-Xに於ける準ノルムを,fの概収束極限のw-Xに於ける準ノルムの定数倍で評価する不等式が成立する為の必要十分条件を導出することができた.

Xの上基本関数をφで表すことにすれば,得られた必要十分条件の1つは,φ(At)/φ(t)のt→0+とするときの上極限,及び,下極限の値を用いて表現される.更に,この結果から派生する問題の研究結果として,一様可積分な2つのマルチンゲールf=(fn)とg=(gn)に対し,Ω上でfの概収束極限よりgの概収束極限の方が大きいときに,fの極大関数Mfのw-Xに於ける準ノルムを,gの極大関数Mgのw-Xに於ける準ノルムの定数倍で評価する不等式が成立する為の必要十分条件を導出することができた.これらの研究で得られた結果は,論文に纏め発表すべく現在準備中である.上記の研究結果に加え,平成27年度に実施した研究では,一様可積分なマルチンゲールf=(fn)の二次変分Sfのw-Xに於ける準ノルムを,fの概収束極限のXに於けるノルムで評価する不等式(Burkholder型の弱不等式)が成立する為の十分条件を得ることができた.この研究結果は更なる発展が期待できる為,引き続き研究を進めたうえで,次年度中に論文に纏める予定である.平成26年度の研究実施状況報告書に記載した通り,平成26年度までの進捗状況はおおむね順調に進展している.これに加え平成27年度は,マルチンゲール変換に関する種々の不等式がBanach関数空間Xの弱空間w-Xに於いて成立する為の条件,及び,Burkholder-Davis-Gundy型の不等式がw-Xに於いて成立する為の条件を導出することを目標としていた.研究の結果,目標通りマルチンゲール変換に関する不等式がw-Xに於いて成立する為の必要十分条件を導出することができた.また,Burkholder-Davis-Gundy型の不等式が成立する為の必要十分条件を導出することはまだできていないが,この問題と密接な関連を持つBurkholder型の弱不等式が成り立つ為の十分条件を得ることができた.後者の研究は更なる発展が期待できる.以上の事実から,研究はおおむね順調に進展していると判断される.マルチンゲール理論を用いて準Banach関数空間の構造を解析することが本研究課題の目的である。最終年度(平成28年度)は、Banach関数空間Xの弱空間w-Xに於いて、マルチンゲール変換に対するある準ノルム不等式が成立するようなXの構造を解明する研究を実施し、そのようなXの構造は、Xの上基本関数φ・下基本関数ψの性質、及び、φの2つの指標(上指標・下指標)を用いて表現できることが証明できた。本研究課題に於いて最初に実施した研究は、弱空間w-Xに於いて、マルチンゲールの極大平均振動に対するある準ノルム不等式が成立するようなBanach関数空間Xの構造を解明する研究であり、そのようなXの構造は、Xの上基本関数φの性質、及び、φの2つの指標を用いて表現できることが証明できた。次に実施した研究は、弱空間w-Xに於いて、マルチンゲールに対するDoob型の不等式、及び、Burkholder型の不等式が成立するようなBanach関数空間Xの構造を解明する研究であり、そのようなXの構造は、Xの上基本関数φの性質、及び、φの2つの指標を用いて表現できることが証明できた。Banach関数空間Xの弱空間w-Xは、研究代表者が導入した新たな空間であり、関数空間の研究に於いて自然かつ頻繁に現れる空間(弱Lp-空間など)を抽象化したものである。本研究課題の成果として、そのような新たな空間に於ける種々のマルチンゲール不等式の成立条件が明らかとなった。これらの研究成果がマルチンゲール理論の新たな展開に繋がることは、十分期待できるものと思う。この意味で本研究課題の成果は、その意義が大きいと考えられる。今後も、弱空間w-Xに於いて、まだ考察されていない種々のマルチンゲール不等式や収束定理が成立するBanach関数空間Xの構造を解明する研究など、この分野の研究を続けたい。
動原体のストレッチングによって促進されるM期チェックポイントの解除機構

動原体ストレッチング(動原体と紡錘体微小管とが結合しているとき動原体が伸長や収縮を繰り返す現象)は2極化が確立した後、紡錘体チェックポイントの解除を促進することが知られている。このとき染色体が両極に引かれる力、すなわち張力が姉妹動原体に加えられているが、この張力もチェックポイントの解除に関与すると考えられている。私はストレッチングに依存した紡錘体チェックポイント解除機構は張力に依存する解除機構とは別物であることを証明した。平成22年度は、動原体ストレッチング(動原体と紡錘体微小管とが結合しているとき動原体が伸長や収縮を繰り返す現象)がどのようにして発生するのかを検討した。2極の紡錘体形成を阻害して単極にしても動原体ストレッチングは発生するが、このとき動原体は張力を受けている可能性が残っている。それは染色体腕部を押す力と動原体を引く力によって動原体に引く力が加えられるというものである。そこで染色体腕部を押す力を除いた条件で動原体ストレッチングを調査した。押す力に関与するモーター分子のKid(クロモキネシン)をノックダウンしても動原体ストレッチングは発生していたことから、動原体が受ける張力はストレッチングの発生に必要ではないという可能性が示された。それならば動原体ストレッチングはどのようにして発生しているのかを明らかにするために、電子顕微鏡でストレッチングしている動原体を観察したところ、動原体の一部が波打つように変形していることが分かった。このことから、微小管の重合による伸長と脱重合による収縮が動原体を変形させ、それによって動原体ストレッチングは発生する可能性が示唆された。実際、薬剤添加により微小管と動原体との結合を安定化させることで、微小管の伸長や収縮がより強く動原体に伝わるようにしたところ、ストレッチングの頻度が増加した。また微小管の動態に関与するモーター分子であるMCAKをノックダウンするとストレッチングの頻度が減少した。これまで動原体間セントロメアや動原体が受ける張力と関連したチェックポイント機構というものが議論されてきた。一方動原体のストレッチングは紡錘体チェックポイント機構と関連があることが示されているが、動原体ストレッチングは張力を反映していない可能性が高いことから、「動原体ストレッチングが関与する紡錘体チェックポイント機構」は「張力が関与するチェックポイント機構」とは異なる新奇な機構であることが予想される。平成23年度は、動原体ストレッチング(動原体と紡錘体微小管とが結合しているとき動原体が伸長や収縮を繰り返す現象)の発生機構について検討した。これまでの研究により、微小管の重合による伸長と脱重合による収縮が動原体を変形させ、それによってストレッチングが発生することが示された。実際、細胞を低濃度のAurora Bキナーゼの阻害剤で処理することで動原体と微小管との結合を安定化(Aurora Bは結合をある一定の割合ではずしているので、その働きを阻害すると結合が安定化する)させ、それによって微小管の動態を動原体に伝わりやすくすると、ストレッチングの頻度が増加した。この実験は人為的に動原体と微小管との結合を安定化させた場合の結果であるが、このような結合の安定化は自然な条件でも生じるのかもしれない。すなわち姉妹動原体間に分布しているAurora Bはダイナミックに局在を変えること、そしてAurora Bが動原体から離れたとき結合が安定化すること、が考えられた。またそれによって動原体ストレッチングが生じると思われた。この仮説を検証した結果、実際にAurora Bはダイナミックに局在を変えていること、そしてAurora Bから遠く離れた動原体では、近い場合と比べてAurora Bの基質のリン酸化が減少し、そして動原体ストレッチングの発生頻度が増加していることが示された。これらの結果はAurora Bのダイナミックな局在変化が動原体ストレッチングの発生をもたらす可能性を示している。これまで微小管の引く力によって動原体間セントロメアや動原体が受ける張力と関連したチェックポイント機構というものが議論されてきた。一方動原体のストレッチングも紡錘体チェックポイント機構と関連があることが示されているが、本年度の研究により動原体ストレッチングは張力とは全く別の機構で発生することが示された。このことから「動原体ストレッチングが関与する紡錘体チェックポイント機構」は「張力が関与するチェックポイント機構」とは異なる新奇な機構であることが予想される。まず動原体ストレッチング(動原体と紡錘体微小管とが結合しているとき動原体が伸長や収縮を繰り返す現象)の発生を制御する機構について検討した。

これまでの研究で、姉妹動原体の間にあるAurora Bキナーゼという分子が動原体から離れて分布したとき、動原体と微小管との結合は安定化し、それによって微小管で生じた力はより動原体に伝わりやすくなり、そして動原体の伸長が生じる可能性が示唆された。本年度は動原体ストレッチングとAurora Bのダイナミクスとの関連についてさらに深く調べた。薬剤処理によってAurora Bが姉妹動原体の間に分布できなくなると動原体ストレッチングの頻度は減少していた。また生細胞を用いた実験により動原体がストレッチングするとき、Aurora Bの分布が変化していることを見出した。これらの結果は動原体ストレッチングの発生には姉妹動原体の間にAurora Bが分布し、なおかつそれが動原体から離れることが重要であることを示している。前年度の研究によりAurora Bはダイナミックに分布を変えていることがわかっているが、その意義は明らかでなかった。当該年度の研究によりこのAuroraBのダイナミックな分布変化は、動原体ストレッチングの発生を促進することを明らかにした。このストレッチングは後期への移行を促進することから、Aurora Bの分布変化は後期開始を促すはたらきをもつと考えられる。また動原体ストレッチングによる紡錘体チェックポイント解除機構を明らかにするために、薬剤を添加すると動原体ストレッチングが抑えられる系を開発した。この系は動原体の変形に関与すると予想される分子を加工することでできている。この系を開発できたことにより、微小管に影響を与えず(動原体と微小管との結合がなくなることによって生じる影響を除外できる)に動原体ストレッチングを制御できるようになった。研究の目的は1)動原体ストレッチングを発生させるしくみの検討と、2)動原体ストレッチングによるチェックポイント解除機構の検討であるが、1)についてはおおむね終了している、これが理由の第一である。また予定では1)の研究結果を応用して2)の研究を行うこととなっているが、研究の進展によりそれが可能になっている、これが理由の第二である。24年度が最終年度であるため、記入しない。研究の目的は1)動原体ストレッチングを発生させるしくみの検討と、2)動原体ストレッチングによるチェックポイント解除機構の検討であるが、1)についてはおおむね終了したことから、1)に関する論文を作成する。それと同時に2)を推進する。すなわち動原体ストレッチングを抑える(または増加させる)と、候補となる解除機構にどのような変化が見られるのかを調べる。その結果を検討することで、微小管が動原体を捉えた後にチェックポイントがどのように解除されるのかを明らかにする。
転写複合体による情報伝達、クロマチン制御、RNAプロセシングの統合的クロストーク

申請者らは、RNAポリメラーゼII(Pol II)に正確な転写を行わせる基本転写因子TFIIEとTFIIH、そして細胞核内の転写活性化シグナルを受け取ってPol IIに伝える役割の多サブユニット複合体メディエーターの機能の解析を行った。そして、メディエーターに関しては、転写における正と負の制御のスイッチの役割を2つのCDKサブユニットが果していること、またTFIIEがTFIIHと結合して制御している分子メカニズムを解明した。1.ヒトTFIIEの構造-機能解析ヒトTFIIEαのZnフィンガードメインの4個のシステインのC129A、C132A、C154A、C157Aの点変異に関して、構造をさらに詳しく解析した。その結果、ZnフィンガーのN末側とC末側で構造の安定性が異なるという結果が得られた。次にαのN末端に見出されたフォークヘッドドメインの機能解析を点変異を用いて行ったところ、転写開始から伸長への移行に重要であることが明らかになった。TFIIEβサブユニットのフォークヘッドドメインは二本鎖DNAとの結合に重要であり、同じような構造をしていても機能が異なることが明らかになった。また、βサブユニットC末にも転写開始から伸長への移行に関わる領域を見出しているが、構造的にαN末端フォークヘッドドメインとは全く異なった。2.分裂酵母TFIIEとRNAポリメラーゼII(PolII)の相互作用の解析分裂酵母TFIIEの2サブユニットとPolIIの12サブユニットの各々との結合を調べたところ、TFIIEαはRpb5、βはRpb2とRpb12に強く結合した。PolIIは転写開始の際にクランプ領域にあるRpb5とRpb2が構造を変化させる。転写の際にPolII活性中心近傍にTFIIEが結合するという事実と合わせ、この構造変化をTFIIE、特にそのαサブユニットが制御するモデルを提唱した。3.メディエーター複合体の解析核内シグナル伝達に関わるメディエーターのサブユニットにタグを付け発現させるヒトHeLa細胞株を我々で確立し、これからメディエーターを精製したところ、3つのサブタイプからなることが分った。siRNAを使ってキナーゼ活性をもつCDK8サブユニットの発現を抑制して転写における影響を見たところ、転写活性化が大きく抑制された。このことはCDK8が転写において活性化に関与していることを初めて示す結果である。1.ヒトTFIIEの構造-機能解析ヒトTFIIEαのN末端に見出されたフォークヘッドドメインの機能解析を点変異を用いて行ったところ、転写開始から伸長への移行に重要である領域、TFIIEβサブユニットとの結合領域が同定された。また、TFIIEαC末端のTFIIHのP62サブユニットとの特異的結合領域の構造と機能の解析を開始して、NMRによる構造決定を行っている所である。2.ヒトTFIIEとRNAポリメラーゼII(PolII)の相互作用の解析これまでに分裂酵母TFIIEの2サブユニットとPolIIの12サブユニットの各々との結合を調べたところ、TFIIEαサブユニットはRpb5、βサブユニットはRpb2とRpb12に強く結合した。そこで今回、ヒトにおいて同様に解析したところ、βサブユニットは分裂酵母と同様、Rpb2とRpb12に強く結合することが分った。ところが、TFIIEαはどのサブユニットにも非特異的に結合した。さらにTFIIEβのRpb12結合領域を変異体を用いて同定したところ、200番目のアミノ酸残基付近の芳香族アミノ酸と塩基性アミノ酸が結合に関わることが明らかとなった。これまでにC末端のbHL領域の塩基性アミノ酸がPolIIの結合に重要なことを見つけていたことと合わせると、Rpb2サブユニットがそのC末端領域に結合することが考えられる。siRNAを使つてキナーゼ活性をもつCDK8サブユニットの発現を抑制して転写における影響を見たところ、転写活性化が大きく抑制された。今年度我々は、核内シグナル伝達に関わるメディエーター複合体のサブユニットのなかでRNAポリメラーゼII(Pol II)のリン酸化を行うCDK8とCDK11の両サブユニットについて解析を進め、ともにメディエーター複合体を形成するが複合体中に両者が同時に含まれることはなく相互排他的であること、他のおよそ30個のサブユニットは各々のCDKが形成する複合体に共通に含まれることを明らかにし、報告した(Tsutsui et al., Genes Cells 13, 817-826, 2008)。一方、両CDKの細胞内での転写における役割をsiRNAにより発現をノックダウンした細胞内でのルシフェラーゼ遺伝子の発現で調べるルシフェラーゼアッセイにより調べたところ、Gal4-VP16依存的な転写活性化はCDK8をノックダウンすると低下し、CDK11をノックダウンすると逆に更新されることが明らかになった。

これらの結果は、CDK8が転写活性化に関与し、CDK11は転写抑制に関わっていることを示唆するものである。1.ヒトTFIIEの構造機能解析ヒトTFIIEβサブユニットの中央にあるフォークヘッドドメイン(アミノ酸66-146番目)の機能解析を進めたところ、この領域の球状構造を保持するのに重要な疎水性アミノ酸残基(Val77, Leu78, Ile102, Ile111)と3個の塩基性残基(Lys129, Lys140, Lys142)がこの領域の転写活性に重要であることが明らかになった。機能的な面からは後者の塩基性領域が重要と考えさらに解析を進めたところ、2本鎖DNA結合活性が最もこの領域の機能として重要性を持っていることを明らかにした(Tanaka, et.al., Genes Cells, 2009)。2.ヒトTFIIEとRNAポリメラーゼII(Pol II)の相互作用の解析TFIIEは、αサブユニットがPolIIのRpb5サブユニット、RサブユニットがRpb2とRpb12に強く結合する。今年度はTFIIEのサブユニットのどの領域に各々のPolIIサブユニットが結合するかを解析した。その結果、TFIIEαはN末のフォークヘッドドメインでRpb5と結合し、またTFIIEβはC末半分に位置するbHLH領域付近でRpb12、Rpb2と隣り合って結合するらしいことを示すことができた。3.メディエーター複合体の解析核内シグナル伝達に関わるメディエーターは、約30サブユニットからなる巨大複合体である。この複合体はヘッド、ミドル、テイル、CDK/Cycの4サブ領域から構成されることが明らかになった。その中でテイル領域に位置するヒトのMED15サブユニットは酵母のガラクトース代謝に関わる転写制御タンパクとして見出されていたGal11のオーソログであることが明らかにされているが、これがTFIIEと結合することを明らかにした。さらにはTFIIEαがMED15のN末にあるKIXドメインと結合することを示した。1.ヒトの基本転写因子TFIIEの構造-機能解析ヒトTFIIEβサブユニット中央に位置するフォークヘッドドメイン(アミノ酸66-146番目)の機能解析を進めたところ、この領域の球状構造を保持するのに重要な疎水性アミノ酸残基(Val77, Leu78, Ile102, Ile111)と3個の塩基性残(Lys129, Lys140, Lys142)がTHIIEの転写活性に重要であることが明らかになった。機能的な面からは後者の塩基性領域が重要と考えさらに解析を進めたところ、この領域の機能としては2本鎖DNA結合活性が重要であることを明らかにした(Tanaka et al., Genes Cells, 2009)。TFIIEはαサブユニットがPol IIのRpb5サブユニットと強く結合する。代表者らは、この結合がPol IIの転写開始の際の活性化に伴う構造変換の引金になっていると考えている。今年度は、分裂酵母TFIIEα遺伝子破壊株を作製した。
KeVX線レーザー研究におけるクラスターからの輻射過程の研究

今年度は、1.5TWのチタンサファイアレーザー(近赤外)を用いたXeクラスターの励起実験であり、XeのM殻遷移(1keV)とXeのL殻遷移(4keV)の観測を行った。M殻遷移の観測には平面型のX線結晶分光器を用い、L殻遷移観測には集光型のvon Hamos型分光器を用いた。L殻遷移はM殻のそれに比べ信号が桁違いに弱いためである。また、イリノイ大学におけるKrFレーザー(紫外)の結果と照らし合わせてみることで、Xeクラスターの多光子的内殻励起の効率の波長依存性が明らかになる。この結果判明したことは、Xeクラスターの励起源として近赤外光を用いた場合、特にL殻輻射を励起する場合を考えた場合、紫外光励起に比べ極めて効率が悪くエネルギー変換率にしておよそ3桁低くなることがわかった。ここで得られた知見は、Xeクラスターの多光子的内殻励起を利用したX線レーザーを考えた場合、励起波長を紫外光にすることが極めて重要であるということである。今後は、TW級の紫外レーザーシステムの準備とチタンサファイアレーザーシステムのさらなる超短パルス化によるパワーアップとそれらを用いた実験を予定している。
気分誘導によるレクリエーション効果の検討

○研究目的:レクリエーションによる気分改善効果をより高める方法を確立するための予備実験として、レクリエーション実施前に与えるポジティブ気分へ誘導する情動喚起刺激がレクリエーション実施後の感情や気分に与える影響について検討する。○研究方法:健常成人16名(平均年齢23.5±3.7歳,男性10名,女性6名)を対象として、気分誘導あり先行群および気分誘導なし先行群の無作為割付けによるクロスオーバー試験を実施した.気分誘導は,本研究者が撮影した季節感のある自然映像、スポーツ映像、動物の映像をそれぞれ組み合わせ10分程度に編集したものを用い、対象者に呈示した.レクリエーション活動の内容は,身体運動的プログラムを選定し、ストレッチ体操ならびに輪ゴム送りゲームとし、所要時間を20分に設定した.レクリエーション実施前後の気分変化について、日本版POMS短縮版を用いて評価を行い、統計処理は気分誘導の主効果について二元配置分散分析、レクリエーション実施前後の気分変化について対応のあるT検定を用いた.○研究成果:自然映像を中心としたビデオ映像呈示による気分誘導をレクリエーション実施前に導入することにより、対象者の緊張や不安がより軽減され、レクリエーション実施後に怒りや疲労などの減少と活気の有意な増加を認めるという直接的な効果が得られた.また、気分誘導なし群においてもレクレーション実施後に疲労混乱の有意な減少と活気の有意な増加を認めたことから、レクリエーションには一定の心身に与える影響があることが示された。今回の研究により、気分誘導による気分改善効果に着目したレクリエーション活動の有効性が示され、それが認知症高齢者にとって非常に有益となることが示唆されることから、今後は同様な効果が認知症高齢者においても得られるかどうか検証していく必要がある。
日本の食育と食文化を世界に発信できる栄養士養成のためのEAP

日本の食育と食文化を英語で発信できる栄養士を養成するEnglish for Academic Purposesプログラムを構築することを目的として、国際学会や専門科目の講義の参与観察をもとにニーズ分析を実施した。その結果、卒業後、病院、保育園、企業などで栄養士として活躍する学生のために、異文化間コミュニケーション能力の養成が肝要であり、日本人・外国人英語教員、専門教員の協業による、CLILプログラムが適したアプローチであることが明らかになった。本研究では、日本の食育と食文化を世界に向けて発信できる栄養士・管理栄養士を養成するため、栄養学におけるEAPを構築することを目標として、以下の3点を目標としている。1栄養学研究者の英語圏大学での学術研究のための英語ニーズ分析。2栄養学の国際学会における英語ニーズ分析、素材収集。31と2に基づく、栄養系学生、栄養士、栄養学研究者が自律的に学習するための英語教材とカリキュラム開発。初年度である本年度は以下の研究実績を上げることができた。1について、文献研究を行った。2について英国の管理栄養士による日本の栄養系学生向けのレクチャー(病院、高齢者施設、料理学校)で参与観察を行った。3について英国の学会(BAAL)とオックスフォードのCLILのワークショップ参加、TESOL CONVENTION 2015(トロント)参加(ESPワークショップ参加、CLILによる栄養学系英語の授業の実践報告の発表)により、先行事例の研究および、海外に研究協力者(英国、ドイツ、スペイン、UAE)を得ることができた。また、これまでの先行事例に基づいて開発した、栄養系学生が自律的に学習するための英語教材とカリキュラムを実践し、授業観察している。今年度は研究プロジェクトの初年次として非常に良好なスタートを切ることができた。本研究は、日本の食育と食文化を世界に向けて英語で発信できる栄養士・管理栄養士を養成するため、栄養学における学術目的の英語教育(English for Academic Purposes、以下、EAP)を構築することを目標として、以下の3点をこの研究の目的とする。(1)栄養学研究者の英語圏大学での学術研究(研究留学、海外研究者との共同研究)のための英語ニーズ分析(2)栄養学の国際学会における英語ニーズ分析、素材収集(3)(1)と(2)の調査結果に基づく、栄養系学生、栄養士、栄養学研究者が自律的に学習するためのEAPの教材とカリキュラムの開発(1)については、本年度は文献研究をした。(2)については、本栄養改善学会のポスターセッションにおいて、参与観察をした。(3)については、栄養士、管理栄養士を目指すイ学生を対象とした英語の授業「実用栄養英語」、セミナーにおいて、ESP/EAP教材を開発し、自律的学習を支援している。また、調理学、栄養学の研究者、英語ネィティブスピーカー教員とともに、協業し、EAPアクティビティーを開発し、実践した。これまでの成果を公開するために、TESOL Conventionでの発表、日本栄養改善学会でポスター発表をした。TESOL Pressへの論文投稿、JACET九州東アジア英語研究会での発表、学内でのCLILのワークショップの開催、合同研究大会での発表をした。学会発表と、論文投稿、ワークショップを実施し、おおむね研究計画どおりに実行できている。本研究では、日本の食育と食文化を世界に向けて英語で発信できる栄養士・管理栄養士を養成するため、栄養学における学術目的の英語教育(English for Academic Purposes)を構築することを目標として、英語ニーズ分析と素材収集をし、その調査結果に基づく、栄養系学生、栄養士、栄養学研究者が自律的に学習するためのEAPの教材とカリキュラム開発を目的とした。平成26年度は1文献研究、2イギリスの管理栄養士による栄養系学生向けのレクチャーで参与観察、3イギリスでの高等教育の教員向けCLILのワークショップへの参加(オックスフォード)、TESOL Convention 2015(トロント)での栄養学のCLILの実践報告の発表、英国の応用言語学学会への参加を通じ、日本の食育と食文化を英語で学ぶ試みについて、発信することができた。平成27年度は、栄養学の専門教員と協業し、これまでの栄養系学生向けのCLILの授業実践報告を、栄養学の専門教員向けの学会である日本栄養改善学会で発表した。また、専門教員(栄養学、調理学)、英語母語話者である外国人英語教員と、English as Lingua Franca (ELF) Speakerであるる研究代表者が協業し、栄養学系半期(15回)の「実用栄養英語」(ESP for dietetics)として、プログラムおよび教材を開発した。平成28年度は教員間の協業の成果発表として、JACET東アジア英語研究会での発表、および、TESOL Pressへの論文を発表した。今後の研究の展開に関する計画としては、1主催者都合で平成29年12月に1年延期になった国際学会、Worldwide Forum on Education and Culture (ローマ)での成果発表、2日本人学生と留学生がともに食育を学ぶための英語教育を構築したい。海外の研究協力者および、所属機関内の研究者に協力を得られたため、当初の計画以上に進展することができた。これまでの研究をまとめ、成果を公開していく。英語教育計画通り研究が進んでいる。

連携研究者には聞き取り調査項目や対象の選定について支援を得る予定である。当初、平成27年度計画のとおり、英語論文を投稿したが、査読者からフィードバックを受領したのが、平成27年2月であり、英文校正費について、繰り越し申請に間に合わなかったため、今回、申請を行う。学会のワークショップスケジュールが申請時には確定していなかったため。論文の英文校正費に使用する。ワークショップ参加や物品費購入に使用する。
仮説:レセプター結合領域の分子変異の畜積がヒトウィルスの出現と消失を支配する

RNAウイルスの遺伝子は一般のDNA遺伝子に比べて約100万倍の高速で進化する。この高い進化速度はヒトに病原性をもつ新しいウイルスの誕生と消失に密接にかかわっていると考えられる。本研究は分子進化系統樹上の存続と断絶を、レセプター結合領域の分子変異の面から追跡し、レセプターとの相互関係を分子レベルで解明することを目的とした。エンテロウイルス70(EV70)分離株約20株のゲノムRNAについてVP1(918塩基)の塩基配列を解読し、詳細な分子系統樹を作製した。各分離株の系統関係とこれに伴う塩基置換およびアミノ酸変異パターンを解析し、原型ウイルスが持っていたであろう塩基配列を推定した。分離株の塩基置換パターンを分子系統樹上に重ね合わせることにより、各分離株がどのような塩基置換を伴って分岐してきたかを明確に示すことができた。この解析で算出された塩基置換速度がエンテロウイルス遺伝子に普遍的な値であるのかどうかを確認するため、もうひとつの急性出血性結膜炎の病因ウイルスであるコクサッキーウイルスA24型変異株(CA24v)を用い解析を進めた。CA24v分離株44株の3Cプロテアーゼ領域(549塩基)の塩基配列を解読した。平行置換および復帰置換などの重複置換を補正した後の置換速度は、EV70で5.0x10^<-3>/座位/年、CA24vのそれは4.9x10^<-3>/座位/年と計算された。異なるウイルスの異なる領域間の比較であるにもかかわらず極めて類似の値を取ることが明らかになった。一方、EV70レセプター遺伝子のクローニングと同定に成功した。EV70感受性細胞表面に結合しウイルス感染阻止能を持つモノクローン抗体を作出し、真核細胞発現ベクターでHeLa細胞mRNAのライブラリーを作製後、パンニング法で発現クローンを選択した。本レセプター分子は細胞表面上にあって、免疫に関連した蛋白の発現制御に関与する蛋白と同じ塩基配列を持っていた。この高い進化速度はヒトに病原性をもつ新しいウイルスの誕生と消失と密接にかかわっていると考えられる。エンテロウイルス70(EV70)分離株RNA遺伝子の解析から、ある時期に分子進化系統樹上から消失する系統は流行株として存続する系統と比較して、消失以前に特にレセプタ-結合領域を形成していると思われるアミノ酸部位に変異が蓄積することを示唆する結果を得た。本研究ではウイルスの分子進化系統樹上の存続と断絶を分離株のレセプタ-結合領域の分子変異の面から追跡し、その変異パタ-ンから推定される人工的変異ウイルスを作製して細胞上のレセプタ-との相互関係を分子レベルで解明することにより、ウイルスの誕上と消失について理論的基盤を確立することを目的とした。約10年間に世界各国から集められたEV70分離株約20株のゲノムRNAについてVP1の塩基配列を解読し、詳細な分子系統樹を作成した。各分離株の系統関係とこれに伴う塩基置換及びアミノ酸変異パタ-ンの解析を行い、原型ウイルスが持っていたであろう塩基配列を推定した。分離株の塩基置換パタ-ンを分子系統樹上に重ね合わせることにより、各分離株がどのような塩基変異を伴って分岐してきたかを明確に示すことができた。10年間の短期間にもかかわらず、系統樹の異なる技上で同一塩基座位において同一方向への塩基置換及びアミノ酸変異が多くみられ、塩基の同義置換の90%はトランジション型であった。また最近まで存続した分離株では同義置換の割にはアミノ酸変異が極めて少ないことも明らかとなった。EV70は霊長類由来細胞以外の細胞でも増殖しうるので、馴化ウイルスの塩基配列もレセプタ-結合領域のアミノ酸配列を同定する上で有用な情報を提供するものと考えられ、今後の実験に組込む予定である。一方、EV70レセプター

遺伝子のクローニングと同定に成功した。EV70感受性細胞表面に結合しウイルス感染阻止能を持つモノクローン抗体を作出し、真核細胞発現ベクターでHeLa細胞mRNAのライブラリーを作製後、パンニング法で発現クローンを選択した。本レセプター分子は細胞表面上にあって、免疫に関連した蛋白の発現制御に関与する蛋白と同じ塩基配列を持っていた。本年度は約10年間に集められたエンテロウイルス70(EV70)分離株18株のVP1領域の塩基配列に基づいて作成された分子系統樹を用い、各分離株が獲得したであろう塩基置換を詳細に解析した。またEV70で算出された塩基置換速度を議論する上で、他のエンテロウイルスのそれと比較することが必要であるとの考えから、もう一つの急性出血性結膜炎の病因ウイルスである、コクサッキ-ウイルスA24型変異株(CA24v)の分離株を用い解析を進めた。EV70分子系統樹の各枝に各分離株が伴ってきたであろう塩基置換を重ね合わせてみた。比較した18株のVP1領域918座位のうち181座位に少なくとも1回の塩基置換が認められ、18株が10年間に蓄積した総数は計267置換であった。181座位はVP1領域全域にほぼ均等に分布していた。アミノ酸置換は306座位のうち28座位にみられた。復帰置換が最小になるようにして平行置換(異った枝上で、即ち異った分離株間で同一座位におこる変異)をみると、同義置換153座位のうち40座位に、非同義置換28座位のうち12座位にこの変異が認められた。この結果は、2つの分離株の比較で観察される塩基置換から計算される塩基置換速度は、実際の置換速度より遅いことを意味している。このことを確認する目的で約20年にわたって集められた(A24v分離株44株を用い、その3Cプロテア-ゼ領域549塩基の配列を解読した。EV70では変異の90%はトランジション型の変異であったが、復帰置換、平行置換も考慮し置換速度を求めた。補正後のEV70 VP1の置換速度は5.0×10^<ー3>/座位/年、CA24v 3Cのそれは4.9×10^<ー3>/座位/年と計算され、異なるウイルス及び遺伝子領域間の比較であるにも拘わらず、極めて類似の値となった。今後はアミノ酸変異に解析の中心を移し、EV70のレセプタ-結合領域の解析を進めていきたい。本年度はエンテロウイルス70(EV70)レセプター遺伝子のクローニングと同定において大いなる進展がみられた。これはEV70感受性細胞表面に強く結合し、ウイルス感染阻止能が際立ったモノクローン抗体(mAb)の作出に成功したことが大きな要因であると考えられる。本mAbはHeLa細胞を免疫することで得られたものであるが、EV70感染阻止能において変のエンテロウイルスと競合することはなくEV70に特異的であった。HeLa細胞から抽出精製したmRNAを鋳型にcDNAを合成し、真核細胞発現ベクターpCDM8のcDNAライブラリーを作製した。一部をサル腎臓由来COS-7細胞にトランスフェクトして4872時間増養後、レセプター発現細胞をパンニング法で回収した。パンニングには上記mAbを用いた。回収したCOS-7細胞からHirt法によってプラスミドを抽出し、大腸菌MC1061/P3を形質転換後、プラスミドを増幅・回収した。
ホルモン依存性腫瘍におけるGTP結合蛋白質共役受容体の機能と遺伝子変異

ホルモン感受性腫瘍細胞ではそのホルモンによって増殖が抑制される例が少なくない。ホルモンなどの生理物質はより自然な細胞死であるアポトーシスを惹起し,増殖抑制作用を発揮すると考えられている。生殖器腫瘍においても,GnRHアナログがin vivoおよびin vitroでアポトーシスを惹起し,抗腫瘍効果を発揮する。ところで生体内でアポトーシスが誘発される際,Fas・Fasリガンド系が関与していることが広く受け入れられている。Fasリガンドの発現には,tyrosine kinase/phosphataseが関わっており,GnRH受容体とFasとによるアポトーシスの受容応答機構に共通性があることが容易に推測できる。本研究では,GnRH受容体の抗腫瘍シグナルの解明を試みた結果,以下の知見を明らかにした。1)手術摘出の子宮内膜癌,上皮性卵巣癌,子宮筋腫および子宮筋肉腫の90%以上にGnRH受容体が存在する。一方,子宮頚癌ではGnRH受容体は認められない。2)GnRH受容体陽性細胞からの形質膜をGnRHとインキュベートすると,Gタンパク依存性にphosphotyrosine phosphataseが活性化され,分子量35Kの膜タンパクが特異的に脱リン酸化される。3)Gタンパクを同定すると,腫瘍GnRH受容体はGiとカップルしており,下垂体のそれとは異なる。4)GnRH受容体陽性の細胞にはFasリガンドの受容体であるFasも存在しているが,Fasリガンドは検出されない。5)腫瘍GnRH受容体をGnRHで48時間以上占有すると,Fasリガンドが発現する。つまり,腫瘍GnRH受容体が活性化されると,Gi-phosphotyrosine phosphataseを介してFasリガンドが出現する。このFasリガンドは腫瘍内に広く分布しているFasと結合し,増殖を抑制するものと思われる。細胞表面受容体とエフェクター分子(細胞内情報伝達物質産生系)との間でGTPと結合する三量体の制御蛋白質(Gタンパク)が伝達器として機能している。このGタンパクは単に情報の流れの仲介役としてだけではなく,流れてゆく情報の遮断・増幅・減衰といった調節も行っている。そこで、本研究では、内膜癌や卵巣腫瘍の増殖機構におけるGタンパクの役割を解明することを試みた。平成7年度に明らかになった事項は以下である。1)内膜癌・卵巣癌のGタンパクは蛋白質チロシンリン酸化とカップルしていること(Cancer 77:132,1996)。2)内膜癌・卵巣癌のGタンパクはGiファミリーに属すること(投稿中)。3)卵巣癌ではゴナドトロピン放出因子受容体が高頻度に発現しているが(Cancer 74:2555,1994),この受容体はGiファミリーを介して,蛋白質脱リン酸化(フォスファターゼ)を抗進すること(Cancer 77:132,1996)。4)その結果,すべてのリン酸化酵素(キナーゼ)と拮抗することになり,細胞増殖を抑制すること(Gynecol Oncol 58:110,1995)。5)このゴナドトロピン放出因子受容体→Gタンパクの異常が一部のホルモン依存性腫瘍で生じていること(投稿中)。以上の結果は,癌のホルモン療法や遺伝子治療を再考する上で意義深い。平成8年度は女性生殖器腫瘍のゴナドトロピン放出因子(GnRH)受容体カップルするGTP結合蛋白質を同定した。手術摘出した卵巣癌,子宮内膜癌,子宮筋肉種を研究材料として用いた。GnRH受容体のmRNAとGnRH結合部位が検出された試料から,形質膜を調製した。

GnRHは濃度依存性に百日咳菌毒素による41Kダルトン蛋白質のADPリボシル化を抑制した。41KダルトンのGiタンパクがimmunoblottingで検出された。GnRH受容体陽性の形質膜を予め百日咳菌毒素とインキュベートすると,GnRHによる膜現象(リン酸化チロシン脱リン酸化酵素の活性化,ホスファチジルイノシトールキナーゼの抑制)が阻害された。つまり,女性生殖器腫瘍のGnRH受容体はGiタンパクと共役していることが明らかとなった。このことは,Gq/G11ファミリーとカップルしている下垂体GnRH受容体とは異なる情報伝達機構を有していることを示唆するものである。ホルモン感受性腫瘍細胞ではそのホルモンによってアポトーシスが生じ,増殖が例が少なくない。生殖器腫瘍ではGnRH受容体が高頻度に存在しており,GnRHアナログがin vivoおよびin vitroでアポトーシスを惹起し,抗腫瘍効果を発揮する。ところで,生体内でアポトーシスが誘発される際,Fas・Fasリガンド系が関与していることが広く受け入れられている。平成8年度は,生殖器腫瘍のGnRH受容体活性化とFas・Fasリガンドについて検討した。手術的に摘出した卵巣癌または子宮内膜癌のGnRH受容体を予めスクリーニングした。FasならびにFasリガンドはそれらのmRNAの存在ならびに抗体に対するimmunoreactivityで定量した。GnRH受容体陽性の細胞にはFasリガンドの受容体であるFasが高頻度に存在しているが、Fasリガンドは検出されなかった。しかし,GnRHと48時間以上活性化すると,FasリガンドmRNAが発現し蛋白レベルでも検出された。しかも,GnRH受容体をGnRHアンタゴニストで予め占有すると,GnRHのFasリガンド発現効果が阻害された。つまり,腫瘍GnRH受容体が活性化されると,Fasリガントが出現する。このFasリガントは腫瘍内に広く分布しているFasと結合し,増殖を抑制するものと思われる。つまり,GnRHアナログの抗増殖効果はアポトーシスを惹起することによって発揮されることが推測された。
MMP-2欠損型マウスを用いた創傷治癒過程における肺胞上及遊走機序の解明

1 MMP-2欠損マウス、野生型マウスの肺胞上皮分離培養をCortiらの方法(Am.J.Respir.Cell Mol.Biol. 1996)に準じて行った。肺から分離した細胞にビオチン化した抗CD32,CD45抗体を作用させ、ストレプトアビジン付着のマグネット粒子を加え、マグネット管に作用させ、マクロファージを吸着し肺胞上皮を分離する方法である。マウス一匹から単離できる肺胞上皮数は少なく、4匹同時に単離することとした。上記方法は、肺胞上皮の分離には有用であったが、肺胞上皮は分離後一日で約50%は死にいたり、3日後には形質転換を起こすことがわかりII型肺胞上皮のままで、遊走実験を行うのは困難であることがわかった。2 MMP-2欠損マウス、野生型マウスの肺から、explant cultureの方法で線維芽細胞を分離し、遊走実験を行った。MMP-2欠損マウス、野生型マウスから分離した、線維芽細胞において、両者の増殖能や形態に違いはなかった。Lab Tek chamberを用いて傷実験を行ったが、両者の違いは顕著ではなかった。MMP-2がその作用に関わるラミニン-5をコート下の傷実験を行っている。1.MMP-2欠損マウス、野生型マウスの肺胞上皮分離培養をCortiらの方法(Am.J.Respir.Cell Mol.Biol,1996)に準じて行った。肺から分離した細胞にビオチン化した抗CD32,CD45抗体を作用させ、ストレプトアビジン付着のマグネット粒子を加え、マグネット管に作用させ、マクロファージを吸着し、肺胞上皮の純度を上げる方法である。一匹からの回収率は非常に悪く、4匹にて回収することにした。肺胞上皮は、分離後一日で50%は、死にいたり、三日目には形質転換を起こすことがわかり、II型肺胞上皮のままで、遊走実験を行うのは、困難であることがわかった。細胞死の原因を検索中である。2.肺胞上皮同定のため、組織化学的な方法として、ラメラ体を染色するタンニン酸染色を、免疫組織学的方法として、抗SP-C抗体を用いて同定を行っている。3.肺胞上皮の遊走実験は、上記理由から困難なため、lung fibroblastを用いて、MMP-2、EGFの関係を中心に実験を進行中である。