hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
サイトカインのシグナル制御を基盤とした外尿道括約筋再生療法の開発

前立腺全摘後や加齢に伴う腹圧性尿失禁では、外尿道括約筋の脆弱化が原因のひとつである。本研究はヒト外尿道括約筋の再生による新規の尿失禁治療法開発を目的として、ヒト外尿道括約筋衛星細胞を分離培養し、各種サイトカインの作用とシグナル伝達経路について検討した。TNF-αは濃度依存的にヒト外尿道括約筋衛星細胞の増殖を抑制し、一部の細胞にアポトーシスを誘導した。また、抗TNF-α治療薬はこれらの作用を抑制しうることが示された。Myostatinは骨格筋特異的増殖抑制因子であるが、ヒト外尿道括約筋はMyostatinをmRNA及び蛋白レベルで発現している。Myostatinは濃度依存的にヒト外尿道括約筋衛星細胞の増殖を抑制し、Myostatinの阻害因子であるフォリスタチンは、これらの作用を阻害することが示された。抗TNF-α治療薬やMyostatinの阻害剤によって外尿道括約筋の再生が可能となり、腹圧性尿失禁の新たな治療法となる可能性が示唆された。ヒト外尿道括約筋衛星細胞における炎症性サイトカインによるアポトーシス誘導機序の解明1)インフォームド・コンセントの得られた前立腺全摘および膀胱全摘症例より前立腺尖部に付着する外尿道括約筋を微量採取し、抗NCAM抗体を用いたMACS法にてヒト外尿道括約筋衛星細胞を分離培養した。外尿道括約筋衛星細胞にSV40T抗原を遺伝子導入して長寿化し、以下は長寿化外尿道括約筋細胞を用いて実験を行った。2)炎症性サイトカインTNF-αを長寿化外尿道括約筋衛星細胞に添加したところ、TNF-αは濃度依存性に増殖を抑制し、またアポトーシスも誘導することをFlow Cytometry及びannexin-V FITC染色にて確認した。長寿化外尿道括約筋衛星細胞をTNF-αで刺激後に10%SDSを含むバッファー内で溶解し,ilnmunoblot法にてprocaspase-3,-8及びPARPの分解を検出し、アポトーシス誘導を確認した。3)TNF-α受容体の阻害薬であるetanercept及びinfliximabを長寿化外尿道括約筋衛星細胞に加えた後、TNF-αで刺激したところ、増殖抑制とアポトーシス誘導は濃度依存性に阻害された。以上より、TNF-αはヒト外尿道括約筋衛星細胞の増殖抑制とアポトーシス誘導を惹起し、その阻害薬であるinfliximabはこれらの作用を阻害することより、抗TNF-α治療薬は高齢者尿失禁の治療薬あるいは予防薬として有効である可能性が示唆された.Myostatinは骨格筋特異的に発現するTGF-βファミリー分子であり、骨格筋の増殖を強力に抑制する因子である。本年度はヒト外尿道括約筋におけるMyostatinの発現と増殖におよぼす作用機序について検討した。【方法】前立腺全摘時に微量採取したヒト外尿道括約筋を採取し、Neural cell adhesionmoleculeをマーカーとしてヒト外尿道括約筋衛星細胞を分離培養し、SV40T抗原を遺伝子導入して長寿化した。この細胞を用いてMyostatin、follistatin添加時における細胞増殖試験、またWestern blot法によりMyostatinの発現を検討した。さらに、イソペンタンにて急速冷凍した外尿道括約筋組織を用いて、免疫染色を行い局在を確認した。【結果】1, Myostatinによる細胞増殖抑制作用,2.阻害因子であるFolhstatinがこの増殖抑制を中和すること,3. RT-PCRによるMyostatinの遺伝子発現,4.蛋白レベルでのMyostatinの発現を確認した。長寿化した衛星細胞においてはWestern blot法にてMyostatinの発現を認めた。また、括約筋組織において免疫染色で横紋筋の細胞質に発現を認めた。【考察】ヒト外尿道括約筋にはMyostatinが蛋白レベルで発現しており、Myostatinを標的とした腹圧性尿失禁の新規治療の開発が期待される。ヒト外尿道括約筋衛星細胞におけるTGF-βの増殖抑制作用【目的】TGF-βは骨格筋に対して増殖抑制作用を示すが、近年加齢に伴う骨格筋再生能力の低下にTGF-βが関与していることが報告されている。これまで我々は、加齢とともに外尿道括約筋細胞が減少する原因としてTNF-αの関与について検討してきたが、今回はTGF-βのヒト外尿道括約筋衛星細胞に及ぼす影響について検討した.【方法】

膀胱全摘除術時に採取したヒト外尿道括約筋を細切し,コラゲナーゼ処理後に初代培養した。抗NCAM抗体を用いたMACS法にて筋衛星細胞を分離培養し,SV40T抗原を導入し長寿化した細胞作成した。この細胞にTGF-βを濃度依存的に添加して細胞増殖テスト及びFlow cytometryによる細胞周期解析を行った。Western blot法にてTGF-βのシグナル伝達経路であるSmadのリン酸化を検討し、さらに細胞周期関連タンパクの解析を行った。【考察】ヒト外尿道括約筋衛星細胞はTGF-βによってSmad3がリン酸化され、CDK inhibitorの発現が亢進することによって増殖が抑制されるものと考えられた。一方、TNF-αと異なりTGF-βでは、ヒト外尿道括約筋衛星細胞にアポトーシスの誘導はみられなかった。
形状記憶合金を用いた手述用インプラント材料の表面処理とその評価

著者らは生体インプラント材料としてNi一Ti形状記憶合金の利用を考えているが、そのままでは孔食が発生するので、表面にTiをプラズマ溶射して防食を試みた。しかし、溶射層が多孔質であるため、むしろ孔食を増長させる結果となり、生体親和性の有機高分子を用いて封孔することを試みた。樹脂としては一液硬化性のシリコーン樹脂、二液型のエポキシ樹脂、一夜性型、速乾性で、比較的粘性の低い、シアノアクリル系樹脂の三種類の接着剤を採り上げ、それらの封孔持性およびその孔食防止性能の評価を検討した。シリコーン樹脂、二液型のエポキシ樹脂はいずれも粘度が大きく、そのままではTi溶射多孔層内部に浸透出来ず、溶媒による希釈が必要であった。シリコーン樹脂では四塩化炭素が最適な溶媒であるが、エポキシ樹脂ではアセトンが最適であった。また、希釈した樹脂に試料を浸しで浸透させる時に超音波を併用すると効率が向上した。これは細孔中の空気が脱離し易いためである。シアノアクリル系樹脂は粘度が低く、溶媒は必要ないと考えられたが、浸透しても速乾性なために底部まで到達しない内に固化した。このため硬化速度を制御する目的で溶媒を使用した。封孔性能については電気化学分極法により評価したが、性能はエポキシ樹脂>シアノアクリル系樹脂>シリコーン樹脂の順であった。三者ともそれぞれ底部まで浸透する最適条件が得られたが、上の異差は樹脂の吸水性の差によることが分かった。Ni-Ti合金の表面を直接高分子膜でコーティングする方法として、テフロン系樹脂のプラズマプレーテイングを試みたが、非常に薄く、破れ易く密着性が悪く、実用上に問題を残した。形状記憶合金表面に金属Tiをプラズマ溶射する際、試料表面が2000°C以上に加熱されるため、形状記憶性を失う危険がある。そこで、Af点上下での繰返し曲げ試験、示差熱分析により確かめたが、形状記憶性に変化がないことがわかった。また、溶射時にTiが酸化され、接合性を失う危険性が考えられたが、金属状に溶射されており、直かつ、Ti膜とNi-Ti合金との接合性も良好であった。そこで、各厚さのTi膜を溶射し、Hankの生理食塩水中で電気化学分極実験を行ない、Ni-Ti合金に対する防食性能の評価を行なった。Ni-Ti合金そのものは不働態領域ではNiイオンの溶解が観測された。皮膜形成溶解電気量とICP分析の結果から、Niイオンは不働態皮膜の形成に伴う溶解であることを明らかにした。しかし、Tiをコーテイングした試料は殆んど溶解せず、防食効果があることがわかった。本Ni-Ti合金は、OV付近で孔食を発生することを観測した。この溶解ではNi^<2+>とTi^<2+>が合金比で溶解することをICP分析から明らかにしたが、Tiコーテイングの防食効果が殆んどないことも明らかとなった。むしろ、Tiコーテイング膜の厚いほど孔食電位は僅かに卑な方向にシフトする傾向が見られた。これは、Ti溶射層が多孔質なため、塩化物イオンが存在するとすでに孔食または隙間が存在する状況と同様となり、Tiコーテイング膜の厚いほど深い食孔となっており、より激しい孔食を起こすためと考えられた。このことから、Tiコーテイングだけでは生体内でのNi-Ti合金の防食は殆んど不可能であることがわかり、生体親和性からTiコーテイング層の多孔性を残しながら、封孔処理技術を開発することが肝要であることがわかった。本研究の一部は第42回腐食防食討議会(1995.9、札幌)にて発表した。

前年度の研究結果から、プラズマ溶射法によるTi金属の被覆は返って下地Ni-Ti合金の孔食を増大させることが明らかとなり、封孔以外には有効な手段は無いものと考えられた。しかし、生体内環境では材料としては耐熱性はそれほど必要としないが、生体親和性を持つことを必須の条件とする。そこで今日生体材料として使用されている高分子材料に注目した。弾力性に富み、生体埋め込み材料として使用されているシリコーンを用いた。シリコーンは一般には高分子のため比較的粘度が高く、市販の接着剤タイプではTi溶射層の表面のみに重合し、被覆膜しか形成しなかった。この材料の弁極実験では孔食は発生せず結果としては良好であったが、経時変化による劣化と表面多孔性の消失が問題となった。そこで、樹脂を希釈することにし、溶剤の選択を行つた結果、四塩化炭素が最も適していることがわかり、希釈度を変えてTi層への浸透重合を試みた。希釈濃度の最適値は0.50.7g/mlCCl_4であったが、しかもこの希釈液への試料の浸漬を4回以上繰り返すと孔食ほ発生しない優れた封孔材料が得られることがわかった。しかし、Ti封孔層の断面のEPMA分析から、シリコーンはTi層内の表面から1/3程度しか侵入しておらず、長期寿命を考慮すると、十分とは言えず、Ti層の底まで達するような高分子材料の選択と、注入法の開発が今後の発展を左右するものと考えられた。著者らは生体インプラント材料としてNi-Ti形状記憶合金の利用を考えているが、そのままでは孔食が発生するので、表面にTiをプラズマ溶射して防食を試みた。しかし、溶射層が多孔質であるため、むしろ孔食を増長させる結果となり、生体親和性の有機高分子を用いて封孔することを試みた。前年度はシリコーン樹脂および二液型のエポキシ樹脂による封孔を検討したが、平成9年度は一液性型であり、速乾性である、比較的粘性の低い、シアノアクリル系接着剤を採り上げ、その封孔特性およびその孔食防止性能の評価を検討した。Ti溶射試料に市販の接着剤である-液性シアノアクリル系樹脂を注入し、重合させた。本樹脂は粘度が低いので最初は希釈せず使用したが、しかし速乾性であり、Ti層底部に浸透せぬ内に固化したので、重合反応速度を抑制するためにアセトンまたは四塩化炭素により希釈して封孔を試みた。その結果、Ti溶射試料の封孔を試みると、速乾性のため樹脂はすぐに固まって表面層のみしか封孔できず、また、固化した面に亀裂を生じ、孔食は抑制されなかった。そこで、重合反応の反応速度の低下のためにシアノアクリル樹脂のアセトンによる希釈を試みた。樹脂がTi層底部に達し、尚且つ底部まで充分封孔できるかどうかは接着剤の希釈と重合速度の競争反応である。この結果、アセトンによる希釈度は7倍が最適であることが、電気化学分極実験から評価された。この時、試料断面のEPMA分析でも底部まで充分量侵入していることが確認された。また、シリコーン、エポキシ樹脂との比較ではエポキシ樹脂に次いで良好な封孔性を示した。
ヒト巨核球多倍体化過程における細胞周期制御蛋白の解析

血小板を産生する血液細胞である巨核球の多倍体化のメカニズムについて、特に細胞周期関連蛋白、転写因子に注目して検討した。ヒト巨核芽球性白血病細胞株であるMeg-J細胞にインドロカルバゾール系化合物の一つであるK52aを添加し液体培養すると、成熟巨核球系への分化傾向が、認められ、さらに正常巨核球と同様に多倍体化した。そこで、この多倍体化過程における種々の細胞周期関連蛋白の変化について検討した。その結果、多倍体化の際にはcyclinB1およびcdc2の一過性の上昇と、それに続く急速な低下が認められ、この変化が巨核球の多倍体化に重要な役割を果たしているものと考えられた。このMeg-J細胞の多倍体化過程における各種転写因子(NF-E2 P45,GATA-1,GATA2,Ta1-1/SCL,Evi-1,Maf-K)の発現について検討したところ、NF-E2 P45のみ発現の増強が認められた。また、Gel shift assayにおいても明らかにNF-E2のDNA結合能の増強が認められた。以上の結果より、Meg-J細胞の多倍体化過程にNF-E2 P45が関与している可能性が示唆された。そこで、NF-E2 p45のアンチセンス、センスオリゴヌクレオチドをTPOおよびK-252aとともにMeg-J細胞に添加して培養し、その影響について検討した。その結果、Meg-J細胞の多倍体化はNF-E2 P45アンチセンスオリゴヌクレオチドにて完全に抑制された。これらの結果より、NF-E2 P45は巨核球系細胞の多倍体化を制御している転写因子であることが示唆された。血小板を産生する血液細胞である巨核球の多倍体化のメカニズムについて、特に細胞周期関連蛋白に注目して検討を行っている。ヒト巨核芽球性白血病細胞株であるMeg-J細胞にインドロカルバゾール系化合物の一つであるK252aを添加し液体培養すると、細胞は大型化し、偽足形成を認めるようになるなど、成熟巨核球系へ分化傾向を示す。さらに興味深いことには、正常巨核球と同様に多倍体化を示す。そこで、この多倍体化過程における種々の細胞周期関連蛋白の変化について、各種抗体を用いたウエスタンブロット法により、経時的に検討した。その結果、多倍体化の際にはcyclin B1およびcdc2の一過性の上昇と、それに続く急速な低下が認められ、この変化が巨核球の多倍体化に重要な役割を果たしているものと考えられた。また、我々は巨核球の多倍体化過程におけるpolo-like kinase 1(PLK1)の関与の有無について注目し、検討を開始している。ヒトPLK1は細胞周期のM期に特異的なprotein kinaseであり、centrosomeの成熟とspindle formationに必要であるといわれている。また、M期のanaphase、telophaseにおいてmidbody、cleavage planeに分布することから、細胞質分裂においても何らかの役割を果たしている可能性も考えられている。そこで我々は巨核球の多倍体化過程にPLKlが関与している可能性があると考え、巨核芽球性白血病細胞株および正常ヒト巨核球を用いて検討中である。我々は、最近、クローニングされたセリンスレオニンキナーゼであるAIM-1が、anaphase B、telophaseにおいて発現が抑制されることが、巨核球の多倍体化という現象につながるのではないかと推測して、以下のような実験を行っている。すなわち、CD34陽性細胞にSCFとIL-3と添加し、液体培養し、同時に、あるいは時期をずらして種々の濃度のAIM-1のアンチセンスオリゴを添加し、その影響について検討した。しかし、現在までのところ、巨核球系細胞の多倍体化は認めらない。

今後、実験系の種々の改善を試みて、さらに検討していく予定である。多倍体化機序におけるNF-E2の関与をさらに検討するために、NF-E2 p45をMeg-J細胞へウイルスベクターを用い導入した。細胞の形態、ploidyには変化がみられなかったが、CD41の発現が増強した。多倍体化が認められない原因として、ヒストンアセチル化のためNF-E2の転写が稼働しなかった可能性を考え、ヒストン脱アセチル化酵素(HDAC)阻害剤trichstatin Aの添加を行ったが、多倍体化は認められなかった。巨核球の多倍体化において、Rasの関与が報告されており、Meg-JおよびMeg-J transfectに導入したところ、多倍体化傾向は認められた。しかしながら、K562とTPOで誘導されるような多倍体化には至らず、Ras以外の機構も関与していると考えられる。現在、さらに巨核球の多倍体化の機構の検討のため、CD34陽性細胞にNF-E2を導入し、検討を進めている。
森林における一斉開花・結実の時間空間ダイナミックスの理論的研究

森林の多くの樹種は、空間的に広い範囲にわたって同期し、一斉開花・結実を行なう.我々はこの手法を拡張して、森林生態系での一斉開花・結実の更新動態を統一的に扱う理論的手法を開発した.さらに進化力学の解析により種子捕食者飽食仮説と送粉者仮説の重要性を時間空間動態から見きわめた.樹木の物質収支を考え、同化産物蓄積量がある「閾値」をこえると超過分を花の生産にむけ、花数と受粉効率に応じて結実を行うとする.結実コストが開花コストより大きいと、結実量は年ごとにカオス的に変動する.樹木の開花・結実量同期性の時間的・空間的解析:森林が同一種から構成される状況で、結実による資源消耗の強さと花粉制約の強度に依存して、森林すべての個体が同期して結実する場合、・森林がいくつかの部分集団に分かれてそれぞれで同期する場合など、さまざまな状態があらわれる.その対象として、(1)日本の冷温帯林におけるブナ林での種子生産の同期、および(2)熱帯多雨林での種を越えた同期繁殖、の2つのシステムに焦点を当てて解析を行なった.基本的に風媒花をもつブナ林と主に動物媒花をもつ熱帯多雨林での一斉開花・結実様式の相違を理論的な解明を試みた.さらに、熱帯林で観察される種を超えた同期や開花時期が少しずれた咲分け現象を、送粉者の共有度、個体群内での個体の分布様式を詳細に調べることによって明らかにしようとした.花粉のやり取りが森林全体で行われる大域結合モデルはJTBに掲載された.次に、このような樹木が多く集まり、2次元に配置され、花粉の交換を通じて相互作用する結合写像格子モデルを解析しEcologyに掲載予定となった.森林の多くの樹種は、空間的に広い範囲にわたって同期し、一斉開花・結実を行なう.我々はこの手法を拡張して、森林生態系での一斉開花・結実の更新動態を統一的に扱う理論的手法を開発した.さらに進化力学の解析により種子捕食者飽食仮説と送粉者仮説の重要性を時間空間動態から見きわめた.樹木の物質収支を考え、同化産物蓄積量がある「閾値」をこえると超過分を花の生産にむけ、花数と受粉効率に応じて結実を行うとする.結実コストが開花コストより大きいと、結実量は年ごとにカオス的に変動する.樹木の開花・結実量同期性の時間的・空間的解析:森林が同一種から構成される状況で、結実による資源消耗の強さと花粉制約の強度に依存して、森林すべての個体が同期して結実する場合、・森林がいくつかの部分集団に分かれてそれぞれで同期する場合など、さまざまな状態があらわれる.その対象として、(1)日本の冷温帯林におけるブナ林での種子生産の同期、および(2)熱帯多雨林での種を越えた同期繁殖、の2つのシステムに焦点を当てて解析を行なった.基本的に風媒花をもつブナ林と主に動物媒花をもつ熱帯多雨林での一斉開花・結実様式の相違を理論的な解明を試みた.さらに、熱帯林で観察される種を超えた同期や開花時期が少しずれた咲分け現象を、送粉者の共有度、個体群内での個体の分布様式を詳細に調べることによって明らかにしようとした.花粉のやり取りが森林全体で行われる大域結合モデルはJTBに掲載された.次に、このような樹木が多く集まり、2次元に配置され、花粉の交換を通じて相互作用する結合写像格子モデルを解析しEcologyに掲載予定となった.森林の多くの樹種は、空間的に広い範囲にわたって同期し、一斉開花・結実を行なう。我々はこの手法を拡張して、森林生態系での一斉開花・結実の更新動態を統一的に扱う理論的手法を開発した。さらに進化力学の解析により種子捕食者飽食仮説と送粉者仮説の重要性を時間空間動態から見きわめた。樹木の物質収支を考え、同化産物蓄積量がある「閾値」をこえると超過分を花の生産にむけ、花数と受粉効率に応じて結実を行うとする。結実コストが開花コストより大きいと、結実量は年ごとにカオス的に変動する。樹木の開花・結実量同期性の時間的・空間的解析:森林が同一種から構成される状況で、結実による資源消耗の強さと花粉制約の強度に依存して、森林すべての個体が同期して結実する場合、森林がいくつかの部分集団に分かれてそれぞれで同期する場合など、さまざまな状態があらわれる。その対象として、(1)日本の冷温帯林におけるブナ林での種子生産の同期、および(2)熱帯多雨林での種を越えた同期繁殖、の2つのシステムに焦点を当てて解析を行なった。基本的に風媒花をもつブナ林と主に動物媒花をもつ熱帯多雨林での一斉開花・結実様式の相違を理論的な解明を試みた。さらに、熱帯林で観察される種を超えた同期や開花時期が少しずれた咲分け現象を、送粉者の共有度、個体群内での個体の分布様式を詳細に調べることによって明らかにしようとした。花粉のやり取りが森林全体で行われる大域結合モデルはJTBに掲載された。次に、このような樹木が多く集まり、2次元に配置され、花粉の交換を通じて相互作用する結合写像格子モデルを解析しEcologyに投稿した。森林の多くの樹種は、空間的に広い範囲にわたって同期し、一斉開花・結実を行なう.我々はこの手法を拡張して、森林生態系での一斉開花・結実の更新動態を統一的に扱う理論的手法を開発した.

さらに進化力学の解析により種子捕食者飽食仮説と送粉者仮説の重要性を時間空間動態から見きわめた.樹木の物質収支を考え、同化産物蓄積量がある「閾値」をこえると超過分を花の生産にむけ、花数と受粉効率に応じて結実を行うとする.結実コストが開花コストより大きいと、結実量は年ごとにカオス的に変動する.樹木の開花・結実量同期性の時間的・空間的解析:森林が同一種から構成される状況で、結実による資源消耗の強さと花粉制約の強度に依存して、森林すべての個体が同期して結実する場合、森林がいくつかの部分集団に分かれてそれぞれで同期する場合など、さまざまな状態があらわれる.その対象として、(1)日本の冷温帯林におけるブナ林での種子生産の同期、および(2)熱帯多雨林での種を越えた同期繁殖、の2つのシステムに焦点を当てて解析を行なった.基本的に風媒花をもつブナ林と主に動物媒花をもつ熱帯多雨林での一斉開花・結実様式の相違を理論的な解明を試みた.さらに、熱帯林で観察される種を超えた同期や開花時期が少しずれた咲分け現象を、送粉者の共有度、個体群内での個体の分布様式を詳細に調べることによって明らかにしようとした.花粉のやり取りが森林全体で行われる大域結合モデルはJTBに掲載された.次に、このような樹木が多く集まり、2次元に配置され、花粉の交換を通じて相互作用する結合写像格子モデルを解析しEcologyに掲載予定となった.
感染グリア病態学:ウイルスから解き明かすグリア細胞の新機能

本研究は、ボルナ病ウイルス(BDV)の病原性を利用してグリア細胞、特にアストロサイトの未知なる機能の解明を行うものである。BDVは、感染によりアストロサイトの機能障害を誘導することが示唆されており、グリア細胞機能異常による神経疾患の発症モデルとして広く用いられている。BDV感染によるグリア細胞の機能異常とその分子機序を総合的に解析することで、新たな視点でグリア細胞機能の本質に迫ることができると考えた。そこで、BDVによるアストログリア細胞の機能障害について詳細な解析を行った。前年度までに、BDVの病原遺伝子であるP遺伝子を発現させたC6グリオーマ細胞において68個の宿主遺伝子が有意な発現変化を示すことを明らかにした。そこで本年度、同定された遺伝子の中で、発現量の上昇が大きく、神経疾患との関連性が示唆されているIGFBP3に注目して解析を進めた。リアルタイムPCRを用いた解析の結果、BDVのP遺伝子をアストログリアで発現するトランスジェニックマウス(P-Tg)脳由来グリア細胞においてもIGFBP3 mRNAの発現が顕著に増加していることが確認された。野生型マウスより分離した神経初代培養に適量のIGFBP3を添加し、抗カルビンジン抗体で染色される神経細胞の生存数について経時的な観察を行った。その結果、IGFBP3を添加した神経細胞では培養10日目において生存数が顕著に減少していることが明らかとなった。また、P-Tg小脳ではインスリン様成長因子受容体のリン酸化が顕著に低下しており、P-Tg小脳におけるインスリン関連シグナルの異常が示された。このことから、IGFBP3には神経細胞脱落を誘導する活性があることが明らかとなり、アストログリア由来のIGFBP3の発現意義について明らかになった。BDVは、感染個体に遅発性の神経疾患を誘導する。このウイルスは、感染によりアストロサイトの機能障害を誘導することが示唆されており、グリア細胞機能異常による神経疾患の発症モデルとして広く用いられている。また、グリア細胞の新機能のみならず脳神経疾患の発症に関連するグリア細胞の役割についても明らかになると考えられる。本年度は、BDVの神経病態モデルとしてグリア細胞にBDVの病原性遺伝子(P遺伝子)を発現するトランスジェニックマウス(P-Tg)を用いた解析を行った。まず、P遺伝子発現によるグリア細胞内での宿主遺伝子発現の変化について解析を行った。P遺伝子を発現させたC6グリオーマ細胞とGFPを発現させたコントロール細胞を作製し、これら細胞間の遺伝子発現の違いをcDNAマイクロアレイを用いて検討した。C6グリオーマ細胞においてP遺伝子の発現により68個の宿主遺伝子が有意な発現変化を示した。これらの遺伝子には、細胞外で機能する蛋白質をコードするものが多く含まれていた。一方、機能面ではその多くが組織の発生・再生に関与する遺伝子群に分類された。同定された遺伝子の中で、発現量の上昇が大きく、神経疾患との関連性が示唆されているIGFBP3に注目して解析を進めた。リアルタイムPCRを用いた解析の結果、BDV P-Tg脳由来グリア細胞においてもIGFBP3 mRNAの発現が顕著に増加していることが確認された。現在、IGFBP3の発現とグリア細胞の機能異常についての相関性を追求している。
顆粒球分化における転写因子の役割

正常白血球や骨髄性白血病細胞の増殖分化に転写の調節機構が密接に関連している。顆粒球の特異的タンパク質であるミエロペルオキシダーゼ(MPO)の遺伝子は、顆粒球の分化の特定の時期に発現する。この遺伝子の発現にイントロン7と9のシス-エレメントが関与すると考えている。本研究の目的は、これらのシス-エレメントに結合するDNA結合タンパク質を分子生物学的に明らかにすることである。上記2つのシス-エレメントFEREとJKT41を合成し、これらをプローブとして用いて、ゲルシフトアッセイをおこない、DNA結合タンパク質を解析した。HL-60細胞のこれらのタンパク質は分化誘導剤のレチノイン酸やTPA処理により少し減少した。だが、MPO発現のないK562細胞でも、検出された。つぎに、これらのDNA結合タンパク質cDNAクローニングに着手した。HL-60cDNAやK562cDNA発現ライブラリを上記プローブを用いて、サウスウエスタン法により検索した。2つのクローンを得て、KJ1とKJ2と命名した。cDNAはそれぞれ約250と900塩基対であった。cDNAの塩基配列のホモロジ検索をしたところ、KJ1は新規クローンであり、KJ2はDNA複製因子Cの一部であた。KJ1は部分アミノ酸配列の特徴から、DNAにもRNAにも結合する転写因子だろうと推察した。今後、完全鎖長cDNAをクローニングし、構造を解析、タンパク質機能を解析しなければならない。
接峰面上での水系網のシミュレ-ションによる原水系と河谷の復元

国土数値情報中の標高デ-タ(1km×1km)を利用して、接峰面メッシュマップを作成し(原地形の復元)、この接峰面メッシュマップ上で水系網のランダムウォ-ク型シミュレ-ションを行ない、確率的な水系網を形成し(原地形に発達しやすい水系・河谷の復元)、流域や水系・河谷の変遷(環境変化)について考察した。また、国土数値情報を使って接峰面や水系網を作成することはデ-タ量や計算量が多いことからコンピュ-タ処理が必要となる。そのため、目的に沿った機器の整備(32ビットパソコン・MOディスクの使用)やデ-タ処理手法・必要なプログラムの開発などを行なった。開発したプログラムの概要は以下のようである。(1)大容量の国土数値情報中からパソコンの計算量・グラフィック処理能力に見合った部分範囲を抽出する。(2)国土数値情報の統合メッシュ数を変えた数種の接峰面や関連する各種地形計測図(接谷面、起伏量、地性線)を作成し、グラフィック表示する(数値地図の作成とデ-タの保存)。(3)モデル流域での水系網の形成から、水流の次数化、流域区分、水流や流域の地形計測までをコンピュ-タ上で自動的に行なう。(4)指定された統合メッシュ数の接峰面から傾斜方向や勾配を求め、これをデ-タとして偏向性を持たせたランダムウォ-ク型の水系網シミュレ-ションを行なう。これらによって形成された中・四国地方の水系網(統合メッシュ数5、約1.4kmメッシュ)は現在の多くの主要な河川の水系網とほぼ一致している。しかし、岡山3川(吉井川・旭川・高梁川)や四万十川は現水系とかなりかけ離れている。これらの河川の特徴は、流域に広い盆地を抱えることで、水系網の発達に傾斜の緩やかな内陸盆地の存在が影響していると考えられる。
Satb1の複合体形成に関与する新規長鎖非翻訳RNAの同定およびその機能解明

平成30年度は、Satb1を介した制御性T細胞(Treg)特異的なエピゲノム形成およびTregの分化・増殖機構の分子基盤の確立を目指し、特にSatb1と複合体を形成する転写因子Ikzf1のTregにおける役割を中心に解析を行った。具体的には、まずIkzf1蛋白の種々のドメイン欠損変異体を作製し、それらを用いてSatb1との免疫沈降実験を行うことで両因子の複合体形成に重要なIkzf1のドメインを生化学的な手法により同定した。さらに、生理的な役割を検討するため、Treg特異的にIkzf1のDNA結合能を欠失した遺伝子改変マウスを作製し、その解析を行った。その結果、TregでIkzf1の機能が欠失することでマウスが自己免疫性の炎症疾患により早期に死亡し、Tregの分化・増殖および免疫抑制機能に異常が生じることを見出した。また近年、標的遺伝子の発現を人為的に抑制する新たな方法として従来のsiRNAやshRNA、アンチセンスオリゴと比較して安価で特異性も高いことからCRISPR/dCas9システムを利用したCRISPR interference (CRISPRi)が注目を集めている。そこで、Treg細胞における長鎖非翻訳RNA (LncRNA)を標的とした網羅的なスクリーニング系の確立を目的としてCRISPRiシステムを導入したノックインマウスを作製し、そのマウスの評価を行った。まず、CRISPRiマウスからCD4陽性T細胞を単離し、レトロウイルスの系を用いて標的遺伝子に対するgRNAsを導入後、数日培養して標的遺伝子の発現をRT-qPCRにより確認した。その結果、CRISPRiにより翻訳RNA (Cd4およびFoxp3)だけでなくLncRNA (Neat1およびMalat1)の発現も特異的かつ顕著に(95%以上)抑制され、非常に有用なスクリーニング系を樹立することに成功した。本年度は、当初予定していたSatb1の複合体形成に関与する新規LncRNAの同定まで進むことはできなかったが、その代わりにSatb1の胸腺における結合因子である転写因子Ikzf1のTreg特異的機能欠損マウスを作製することに成功し、その解析からTregでIkzf1の機能が欠失するとマウスが自己免疫性の炎症疾患を発症し、早期に死亡すること、さらにIkzf1がTregの増殖や維持、転写因子Foxp3を介した免疫抑制機能において重要な役割を担っていることが示唆された。またLncRNAに関しても、今回、CRISPRiのシステムを導入したノックインマウスを作製することで、翻訳RNAだけでなく非翻訳RNAに対しても従来の遺伝子発現抑制法(RNAi、アンチセンスオリゴなど)と比較して非常に特異的かつ強力な発現抑制を可能とする新規の実験系を確立することに成功した。これらの進捗状況から、本研究は、おおむね順調に進展していると考える。今後の研究推進方策として、Tregの分化および免疫抑制機能に関与する新規LncRNAの同定を目的に、今回確立したCRISPRiマウスを用いて、Treg特異的なエピゲノム形成(スーパーエンハンサーの形成、DNAの脱メチル化)やTreg分化(Foxp3発現誘導)、免疫抑制機能(suppression assay)に影響を及ぼすTreg特異的なLncRNAの網羅的スクリーニングを推し進める。具体的にはRNA-Seqの結果から予想されるT細胞もしくはTreg細胞で高発現している全LncRNAに対するgRNAsのライブラリーを作製し、先ずはFoxp3の発現を指標にスクリーニングを試みる。また、Satb1を介したTreg分化制御の詳細な分子機構を明らかにするために、Ikzf1によるTreg分化制御および免疫抑制機能制御についてより詳細なメカニズムの検討を行う。特にIkzf1の機能欠損によりSatb1を介したTreg特異的なエピゲノム形成にどのような影響が及ぶのか、同様にIkzf1の機能欠損によりFoxp3を介した遺伝子発現制御にどのような影響が及ぶのかRNA-Seq法およびChIP-Seq法を用いて網羅的な解析を進める。

その結果、CRISPRiにより翻訳RNA (Cd4およびFoxp3)だけでなくLncRNA (Neat1およびMalat1)の発現も特異的かつ顕著に(95%以上)抑制され、非常に有用なスクリーニング系を樹立することに成功した。本年度は、当初予定していたSatb1の複合体形成に関与する新規LncRNAの同定まで進むことはできなかったが、その代わりにSatb1の胸腺における結合因子である転写因子Ikzf1のTreg特異的機能欠損マウスを作製することに成功し、その解析からTregでIkzf1の機能が欠失するとマウスが自己免疫性の炎症疾患を発症し、早期に死亡すること、さらにIkzf1がTregの増殖や維持、転写因子Foxp3を介した免疫抑制機能において重要な役割を担っていることが示唆された。またLncRNAに関しても、今回、CRISPRiのシステムを導入したノックインマウスを作製することで、翻訳RNAだけでなく非翻訳RNAに対しても従来の遺伝子発現抑制法(RNAi、アンチセンスオリゴなど)と比較して非常に特異的かつ強力な発現抑制を可能とする新規の実験系を確立することに成功した。これらの進捗状況から、本研究は、おおむね順調に進展していると考える。今後の研究推進方策として、Tregの分化および免疫抑制機能に関与する新規LncRNAの同定を目的に、今回確立したCRISPRiマウスを用いて、Treg特異的なエピゲノム形成(スーパーエンハンサーの形成、DNAの脱メチル化)やTreg分化(Foxp3発現誘導)、免疫抑制機能(suppression assay)に影響を及ぼすTreg特異的なLncRNAの網羅的スクリーニングを推し進める。具体的にはRNA-Seqの結果から予想されるT細胞もしくはTreg細胞で高発現している全LncRNAに対するgRNAsのライブラリーを作製し、先ずはFoxp3の発現を指標にスクリーニングを試みる。また、Satb1を介したTreg分化制御の詳細な分子機構を明らかにするために、Ikzf1によるTreg分化制御および免疫抑制機能制御についてより詳細なメカニズムの検討を行う。特にIkzf1の機能欠損によりSatb1を介したTreg特異的なエピゲノム形成にどのような影響が及ぶのか、同様にIkzf1の機能欠損によりFoxp3を介した遺伝子発現制御にどのような影響が及ぶのかRNA-Seq法およびChIP-Seq法を用いて網羅的な解析を進める。
Zic転写因子のもつ２種の結合モチーフの転写調節における役割

転写因子による特定のDNA塩基配列(結合モチーフ)への特異的な結合は、細胞がゲノム情報を読み解く最初のステップであり、多くの生物学的プロセスの基盤である。近年、多くの転写因子が従来決定された結合モチーフに加えて、それとは配列が大きく異なる他の結合モチーフにも高い親和性で結合することが明らかになってきた。しかし、生体内におけるこれらの使い分け、その生物学的意義についてはよくわかっていない。本研究は、ホヤ発生過程におけるZic転写因子の結合モチーフの使い分けについて解析することで、多くの転写因子が複数の結合モチーフをもつことの生物学的意義を明らかにする研究である。
拡張エクソーム解析による疾患モデルラットの原因変異の網羅的探索

本課題は、ナショナルバイオリソースプロジェクト「ラット」が保有する様々な疾患モデルラットを対象にした網羅的エクソーム解析から、それらの疾患原因変異を同定することを目的とし、原因遺伝子に基づく発症機序の解明を目指す。その際の解析手法として、エクソン領域以外に脊椎動物のゲノムで高度に保存した部位もターゲットとしたすでに開発済みの「拡張エクソーム解析」を適用し、遺伝子発現制御領域での変異も検出可能とする。本年度は、前年度得られた疾患モデルラットのシーケンシングデータの解析を進めたが、現在のところ、疾患原因候補の検出には至っていない。また、新規系統のターゲットキャプチャのためのライブラリを作成し、シーケンシングのための準備を進めた。このライブラリは、次年度にシーケンシングをし、データ解析を行う予定である。さらに、これまでに得られた拡張エクソームデータから変異情報を集積し、そのデータをもとに、実験動物ラットの系統解析を試みた。ラットにおける系統解析は、これまでは限られた数のマイクロサテライトにより行われていたが、今回、多数のゲノムワイドな変異情報が得られたことから、より精密な系統解析が可能になった。特に、ラットのゲノム中には、ゲノムワイドな変異をもとに作成した系統樹のトポロジーと一致しないdiscordantな変異を呈するサイトが多数存在することを明らかにした。これは祖先系統で存在した多型(ancestral polymorphism)が、ランダムに固定したためと考えられる。本年度は当初予定していた、ターゲットキャプチャの対象とするラットを選定し、シーケンシングのためのライブラリを作成した。さらに、これまでに得られた変異情報を集積した。さらに、それらの情報を用いた系統解析を実施したところ、ゲノム全体から得られた系統樹の系統関係と一致しないdiscordantな変異サイトがゲノム中に多数存在することがわかった。それらのゲノム上での分布を調べたところ、ある特定の領域に集積していることを見出した。それらの領域の多くは免疫系の遺伝子座であることが多く、もともと祖先系統に存在した多くのハプロタイプが、現在の系統確立の過程でランダムに固定したものと新たに解釈できることを示した。この解析で得られた情報は、より精度の高い系統解析に有用なものである。次年度は、当初計画に基づき、前年度に引き続き拡張エクソーム解析を種々の疾患モデルラット系統に適用する。また、拡張エクソーム解析結果の蓄積に伴い、得られた多型情報をデータベース化する。これにより、コモンバリアントとレアバリアントの区別がつくようになり、レアバリアントの効率的な絞り込みが可能になる。また、得られたデータを順次公共データベースに登録し、研究者コミュニティーの研究推進に役立てる。疾患原因の候補変異が得られたものについては、その発症メカニズムをモデル化する。その傍証として遺伝子発現情報の取得が可能であれば、それを活用する。さらに、得られた結果の論文化を進める。本課題は、ナショナルバイオリソースプロジェクト「ラット」が保有する様々な疾患モデルラットを対象にした網羅的エクソーム解析から、それらの疾患原因変異を同定することを目的とし、原因遺伝子に基づく発症貴女の解明を目指す。本年度は、まず、拡張エクソーム用のターゲットキャプチャキットのデザインの評価を行った、具体的には、既にパイロットスタディでリード数を多めに読んだランの結果があるので、そこから計算機上でランダムに配列を抽出し、リード数が少ないデータセットをシミュレートすることで、安定して変異を同定するのに必要な最低限のリード数を求めた。その結果、パイロットスタディはターゲットキャプチャ1反応分の試薬あたり4サンプルの処理を行っていたが、20サンプルを処理しても変異をコールするのに十分な深度、すなわちターゲット領域の平均深度20、が得られることがわかった。このシミュレーションの結果は、今後の解析をより効率的に進めることが可能であることを示している。そこで、てんかんや水頭症、高脂血症など疾患と関連した表現型を示すモデルラット7種に対して、拡張エクソーム解析を適用した。上述のシミュレーション結果に従い、ターゲットキャプチャ試薬あたりの処理するサンプル数を増やしたが、予想通り十分な量のリードデータが得られた。得られたデータについてマッピングおよび変異コールを行った。現在、表現型の原因候補変異の絞り込みを行っている。本年度は当初予定していた、ターゲットキャプチャキットのデザインの評価と、そのデザインに基づく拡張エクソームの実施を予定していたが、予定どおりそれらを遂行した。すなわち、まず、ターゲットキャプチャキットのデザインの評価であるが、パイロットスタディでは過剰にデータ解読をしており、そこからランダムに選んだサブセットを作ることで、どの程度までシーケンシングをスケールダウンできるか検討をし、今後の解析の効率化の指標を得ることに成功した。また、難解読領域の除外も検討したが、その必要がないことが明らかとなり、今後も同じデザインで進めることが判明した。さらに予定通り疾患に関連した表現型を有するラットについて、新たに拡張エクソームを実施し、それらの変異データを取得した。

また、新規系統のターゲットキャプチャのためのライブラリを作成し、シーケンシングのための準備を進めた。このライブラリは、次年度にシーケンシングをし、データ解析を行う予定である。さらに、これまでに得られた拡張エクソームデータから変異情報を集積し、そのデータをもとに、実験動物ラットの系統解析を試みた。ラットにおける系統解析は、これまでは限られた数のマイクロサテライトにより行われていたが、今回、多数のゲノムワイドな変異情報が得られたことから、より精密な系統解析が可能になった。特に、ラットのゲノム中には、ゲノムワイドな変異をもとに作成した系統樹のトポロジーと一致しないdiscordantな変異を呈するサイトが多数存在することを明らかにした。これは祖先系統で存在した多型(ancestral polymorphism)が、ランダムに固定したためと考えられる。本年度は当初予定していた、ターゲットキャプチャの対象とするラットを選定し、シーケンシングのためのライブラリを作成した。さらに、これまでに得られた変異情報を集積した。さらに、それらの情報を用いた系統解析を実施したところ、ゲノム全体から得られた系統樹の系統関係と一致しないdiscordantな変異サイトがゲノム中に多数存在することがわかった。それらのゲノム上での分布を調べたところ、ある特定の領域に集積していることを見出した。それらの領域の多くは免疫系の遺伝子座であることが多く、もともと祖先系統に存在した多くのハプロタイプが、現在の系統確立の過程でランダムに固定したものと新たに解釈できることを示した。この解析で得られた情報は、より精度の高い系統解析に有用なものである。平成30年度は、当初計画に基づき、前年度に引き続き拡張エクソーム解析を種々の疾患モデルラット系統に適用する。また、拡張エクソーム解析結果の蓄積に伴い、得られた多型情報をデータベース化する。これにより、コモンバリアントとレアバリアントの区別がつくようになり、レアバリアントの効率的な絞り込みが可能になる。また、得られたデータを順次公共データベースに登録し、研究者コミュニティーの研究推進に役立てる。疾患原因の候補変異が得られたものについては、その発症メカニズムをモデル化する。その傍証として遺伝子発現情報の取得が可能であれば、それを活用する。次年度は、当初計画に基づき、前年度に引き続き拡張エクソーム解析を種々の疾患モデルラット系統に適用する。
古代ギリシア・ローマの叙事詩における歴史意識と詩的創造

叙事詩はもとより詩的虚構であって歴史叙述ではないが、その素材が神話伝説であれ歴史事件であれ、詩人の独自の歴史意識が働いて素材を詩へと昇華させる。ヘシオドスは天地開闢から神々の誕生を系譜の形で描き、神々の時代から現代の人間の時代への移行をエポック概念で説明することにより、歴史意識をもった最初の詩人とされる。しかし、それに先だつホメロスも、トロイア戦争というひとまとまりの出来事を語りつつ、数々の詩的技巧で因果の糸を溯らせ、宇宙の始まりの頃の出来事をも語りこむ。あるいは、ムーサ(詩神)を呼び出すことにより何百年も昔の出来事を眼前のことの如くに語り、過去と現代を結びつける。そこには明確な歴史意識が見られることが明らかになった。この二詩人の影響を強く受けるウェルギリウスは、読者が既に知っている過去の出来事を、主人公のアエネアスは冥界の霊から未来の予言として聞かされる、という不思議な語り方をする。ウェルギリウスは過去の語る詩の中で未来を予言することにより、読者が生きる現代も語り、ひいては、叙事詩の主人公と読者のつながりを通して、過去・現代・未来にわたるすべての人間の存在を語る意志を示ししていることが考察された。ウェルギリウスは神々の定めた運命によるローマの建国とその永遠の世界支配という思想を打ち出したが、敗者の描き方を見る限り、ローマの平和にも陰の部分があることを意識していたと考えられる。事実、百年後のルカヌスは内乱の平定からローマ帝国の成立に至る歴史を世界崩壊の過程ととらえて『パルサリア』を創造したのである。ギリシア・ローマの叙事詩を一貫して流れる伝統、その中で詩人の独自の歴史意識がそれぞれ個性的な詩を生み出してきたことが本研究によって明らかにされた。
中高齢者の膝関節痛低減に対する運動効果発現の機序に関する研究

中高齢者の変形性膝関節症(膝OA)に対して、疼痛および運動機能低下を予防するための介入として実施する運動プログラムを検討してきた。本研究では、その運動プログラムを改変しながらヘルスケアサービスとして実施し、効果が得られる対象の範囲(運動介入の適用)や、運動介入の実施によって疼痛緩和が生じる機序を明らかにした。我々はすでに中高齢者の変形性膝関節症(膝OA)に対して,疼痛および運動機能低下を予防するための介入として実施する運動プログラムを開発してきた。本研究は,その運動プログラムを改変しながらヘルスケアサービスとして実施し,効果が得られる対象の範囲(運動介入の適用)や,運動介入の実施によって疼痛緩和が生じる機序を明らかにすることを目的とする。H19年度には55歳から75歳までの中高齢女性を対象に運動介入前後における膝関節周囲の各種画像の撮像,理学療法検査,運動機能検査などを実施し,運動介入の効果やその原因について検討した。医師の診察により行われた隙学的評価による膝OA分類では,40%がgrade2で最も多く,次いでgradelとgrade3がそれぞれ24%と22%であった。また,grade4が10%,grade5が4という内訳であった。このgradeを要因として疼痛,自己記載式膝OA機能評価表(WOMAC),各種運動機能などの初期状態が異なるかを統計学的に解析した。しかし,現時点ではgradeによる主効果が認められたのは関節可動域のみであった。同様に,gradeの違いにより運動介入効果に差を生じるか検討した。ビジュアルアナログスケールおよびWOMACをアウトカムとした検討では,gradeによる主効果がなかった。MRI像の読影結果において,約50%の参加者に半月板損傷が認められた。しかし,その中で疼痛などの症状が改善しないものはいなかった。これらの結果から,膝OAに対する運動療法介入の開始時点において,膝OAのX線学的評価によるgradeやMRI像の読影による半月板損傷の有無などで介入効果の適用を判断することは難しく,運動療法効果の適用範囲は幅広いことが示唆された。昨年度に引き続き,日常生活が自立している55歳から75歳までの女性で,整形外科医に膝OAと診断され運動療法が問題ないと判断された症例を対象に,運動療法による介入を実施する無作為化比較対象試験(RCT)を行なった。3ヶ月間の運動プログラム介入前後に得られた主観的疼痛(VAS)および主観的な疼痛と運動機能のスコア(WOMAC),理学検査結果,関節可動域(膝関節屈曲と伸展の自動と他動),筋力(膝関節屈曲と伸展,下肢伸展),それ以外の各種運動機能,形態計測(大腿脛骨角:FTA,内顆間距離)などを計測した。さらに,介入前のMRI画像の読影から半月板の状態に関する所見をまとめた結果,およびRCT参加者の一部に対して実施しか電流知覚閾値の結果を示す。VASとWOMACは群要因(介入群,対照群)と時期要因(介入前後)に交互作用があり,介入群は昨年度と同様に有意に改善していた。交互作用が有意であり介入群において明らかな改善が認められた項目は,関節可動域の一部,筋力,筋柔軟性を示す長座体前屈と膝窩角,などであった。平衡機能を含めた複合的な運動機能を示すファンクショナルリーチ,timed up and go(TUG),片脚立ち時間,歩行速度などには交互作用がなかった。また,形態計測の結果(FTA,内顆間距離)についても交互作用がなかった。今回の参加者の半数以上で,MRI所見によって半月板損傷が疑われた。また,理学所見でMcMurraytestの結果を要因とした検討によって,陽性となった対象者においても有意にWOMACが改善していることが示された。電流知覚閾値は無髄C神経を検査する5Hz,および太い有髄A神経を検査する2000Hzは変化しなかったが,細い有髄A神経を検査する250Hzにおいて閾値が有意に低下した。
経静脈栄養輸液に含まれる微量元素の最適必要量の検討

完全静脈栄養の進歩は患者の栄養管理に著しい進歩をもたらした。そして、長時間、完全静脈栄養に依存する患者が増加するにつれて、輸液中に微量元素を添加する必要性が認められてきた。そのような状況において、本研究の目的は完全静脈栄養に用いられる輸液中の微量元素の理想的な組成を確立することである。最も基本的な研究は次のように実施した。ラットを必須微量元素欠乏の飼料で週間飼育した後、次の3群に分けた。A群:微量元素欠乏の輸液で飼育した。B群:微量元素、即ち、鉄、亜鉛、銅、マンガン沃素を添加した輸液で飼育した。C群:B群に添加した微量元素類を欠乏させた食事を与えて飼育した。D群:対照として正常の飼料(微量元素添加)飼料で飼育した。微量元素欠乏の輸液で飼育したラットでは小球性低色素性貧血が発生し、血漿及び組織中の鉄濃度が低下した。輸液中に微量元素を添加することにより貧血が改善し、骨中の鉄濃度が上昇した。微量元素欠乏ラットでは血漿や組織中の亜鉛や銅濃度も低下したが、微量元素を添加した輸液で飼育したラットでは亜鉛ゃ銅濃度の低下は認められなかった。血漿中の亜鉛や銅濃度は肝臓、腎臓及び骨中の亜鉛や銅濃度と良い相関を示し、血漿中の亜鉛、銅を測定することは、亜鉛、銅の栄養状態を評価する良い指標となることが判明した。しかし、血漿中のマンガン濃度は組織中のマンガンと相関が認められなかった。また、微量元素欠乏のラットでは血漿中トリヨ-ドチロニンとチロキシン濃度が低下したが、微量元素を添加した輸液を与えたラットでは血漿中チロキシン濃度が上昇する傾向が認められた。この研究は微量元素欠乏の輸液を施行したラットは微量元素欠乏になることを示している。我々は微量元素投与量を変えて同様な研究を繰り返し行なって、輸液に添加すべき理想的な微量元素組成を決定した。また、別の研究で錫も必須微量元素であることを解明した。近年完全静脈栄養施行時に種々な微量元素欠乏症の発生が報告されており、微量元素を補給した輸液製剤の必要性が医療の現場から指摘されている。しかし、これら微量元素はその必要量と中毒量の幅が明確にされていないのが現状である。そこで、我々は最適な輸液中の微量元素組成を決めるために研究を開始した。本年度は微量元素欠乏食にて飼育したラットに5元素を同時に添加した輸液を施行し、組織中ミネラル類の含有量を測定した。すなわち、体重160180gのラットをAーDの4群に分けた。A群には21日間微量元素添加飼料を自由に摂取させた。残りの3群には14日間微量元素飼料を摂取させた後、B群には引き続き微量元素欠乏飼料にて、C群は微量元素無添加輸液にて、D群は鉄、亜鉛、銅、マンガン、ヨウ素を添加した輸液を施行して7日間飼育した。この期間C、D群には飼料を与えなかった。D群における微量元素の量は体重当りにするとヒトに通常用いられている量の10倍であり、これはラットの通常の1日当たりの経口摂取量の10分の1に相当する。これらのラットは21日間の飼育後、ネンブタール麻酔下にて採血し、各種組織を摘出した後、硝酸・過塩素酸により湿式灰化し原子吸光法にて銅、亜鉛、Mg、Ca量を測定した。