hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
食品摂取による自律神経バランスの計測とその食品機能評価の基盤研究

健常女性ボランティアへの計算負荷は、交感神経優位な自律神経バランス(ANB)変動を認めたが、緑茶の旨味成分であるテアニン前摂取は交感神経優位な変動は認めず、副交感神経系を高めることが観察された。さらに、ウェアラブル生体センサを用いたANB測定の簡易化によっても、同様な結果が得られた。以上、計算負荷による交感神経系の緊張をテアニンが減弱し、副交感神経系を高めていることを示唆する興味ある結果が得られた。また、ウシ副腎髄質細胞初代培養系を用いたカテコールアミン分泌及び生合成系において、フラボノイドIkarisosideAや松抽出物SJ-2がそれらの分泌・合成を抑制することを明らかにした。本研究は、健常女性ボランティアにおける豆乳や緑茶などの食品摂取後の自律神経バランス測定を行い、食品による特徴的なパターンを見出す。さらにこれらの食品の機能成分のカテコールアミン(CA)神経機能や抗ストレス効果に及ぼす影響を調べ、その効果を検討する。平成26年度において、緑茶の旨味成分の一つであるテアニン摂取後における自律神経バランスの変動について、プラセボ(乳糖)摂取群と比較検討した。テアニン摂取前後の自律神経バランスのパラメーターの比較において、起立負荷時の交感神経の指標の一つである興奮持続度mRR (sup-std)の値および相対的な交感神経の活動レベルの指標であるLF/TF比は低下傾向を示したが、交感神経被刺激度(瞬時反応)mRR(sup)-mRRminは、有意な増加を示した。他方、副交感神経系において、安静時における心拍数mRR(sup)(安静仰臥位でのR-R間隔平均値)は、テアニン摂取後に有意な上昇を示し、相対的な副交感神経活動レベルの指標であるHF/TF比でも、増加する傾向を示した。プラセボ摂取前後の比較では、自律神経パラメーターの統計学的な有意性は認められなかった。以上より、健常者へのテアニン摂取は、交感神経活性の減弱あるいは副交感神経活性の増加、あるいは両方の効果をもたらすかもしれない。今後、標本数の増加およびストレス負荷などを検討し、より正確なテアニンによる自律神経バランスの変化を捉えることにより、テアニンの中枢および自律神経系を含めた作用機構を解明する一助となると思われる。本研究は、健常女性ボランティアにおける豆乳や緑茶などの食品摂取後の自律神経バランス測定を行い、食品の特徴的なパターンを見出す。さらに食品に含有するアミノ酸やフラボノイド等による機能成分のカテコールアミン(CA)神経機能や抗ストレス(ST)効果に及ぼす影響を調べ、その効果を検討する。平成27年度の研究実績は、ST負荷は低強度の精神負荷とされるクレぺリンテストによる計算負荷を用い、自律神経バランスの変動について、テアニン摂取およびプラセボ摂取の効果を検討した。プラセボ摂取前後の比較では、交感神経領域と副交感領域(S/P)の比および交感神経興奮度は有意に増加し、交感神経の興奮が認められた。一方、同条件でのテアニン摂取前後の比較では、S/P比は有意に減弱し、副交感有意性は有意に増加したことから、テアニンによる副交感神経の興奮性が高まっていることが推測された。以上より、健常者へのテアニン摂取は、副交感神経活性の増加、あるいは抗ストレス効果をもたらす可能性を示唆した。これらの結果は、第62回日本栄養改善学会総会(福岡、2015年9月)において発表した。他方、共同研究者の柳原らは交感神経実験系である副腎髄質細胞において、フラボノイドのIkarisosideAがニコチン性アセチルコリン受容体機能を抑制して、CA分泌及び生合成を抑制する研究結果を第89回日本薬理学会年会(横浜、2016年3月)及び論文(Naunyn-Schmiedeberg's Arch Pharmacol 388: 1259-1269, 2015)において発表した。平成27年度は、健常者へのテアニン摂取は、副交感神経活性の増加、あるいは抗ストレス効果をもたらす可能性を示唆した。また、テアニン及びプラセボ摂取等の食品摂取30分前後の唾液を採取し、ストレス(ST)指標であるコルチゾール、アミラーゼおよびクロモグラニンAを測定し、自律神経バランスのパターンと比較検討する予定であった。それらのマーカーのうち、アミラーゼの測定を実施した。しかし、データのばらつきにより、一定の方向性が観察できなかった。したがって、アミラーゼ等のST指標の測定時間や標本数を検討し、平成28年度に再度測定を実施する。喜多らは平成27年度に低強度の精神負荷とされる内田クレぺリン(U-K)テストによる計算負荷条件を健常女性成人で検討し、交感神経優位な自律神経バランスの変動を認めた。さらに平成28年度まで、このU-Kテストによる自律神経バランスの変動に対する緑茶に豊富な遊離アミノ酸であるテアニンの摂取による影響を検討した。その結果、テアニン前摂取によりU-Kテストの交感神経興奮状況は観察されず、一方、副交感神経のパラメーターの興奮性が有意に高まっていた。以上の結果より、テアニン前摂取では、U-Kテストによる交感神経優位な自律神経バランス変動を認められず、さらに副交感神経活性の増加効果をもたらす抗ストレス効果の可能性を示唆した。これらの結果は、「第69回日本薬理学会西南部会(松山、2016年11月)」および「第90回日本薬理学会年会(長崎、2017年3月)シンポジウム14病態生理学および薬理学研究における自律神経バランスの新しい評価システム」において発表した。

他方、研究分担者の柳原らは、自律神経バランスにおける更年期障害用の自動測定・解析アプリケーションソフト、疲労度蓄積チェック及び職業性ストレスチェック用ソフトを開発した。現在、薬局店舗、大学や病院診療科の各研究機関で自律神経バランスの測定を実施している。これらの内容については「第90回日本薬理学会年会(長崎、2017年3月)シンポジウム14」において発表した。また、柳原らは交感神経実験系である副腎髄質細胞において、松節抽出物(pine nodules)の成分の1つSJ-2がストレス誘導によるニコチン性アセチルコリン受容体の機能を抑制して、CA分泌及び生合成を抑制する研究結果を第90回日本薬理学会年会(長崎、2017年3月)及び論文(J. Pharmacol. Sci.,133:268-275、2017)において発表した。平成27年度に低強度の精神負荷とされる内田クレぺリン(U-K)テストによる計算負荷条件を健常女性成人ボランティアで検討し、交感神経優位な自律神経バランスの変動を認めた。さらに平成27年度および平成28年度は、このU-Kテストによる自律神経バランスの変動に対する緑茶に豊富な遊離アミノ酸であるテアニン前摂取による影響を検討した。その結果、テアニン前摂取によりU-Kテストの交感神経興奮状況は観察されず、一方、副交感神経のパラメーターの興奮性が有意に高まっていた。以上の結果より、テアニン前摂取では、U-Kテストによる交感神経優位な自律神経バランスの変動を認められず、さらに副交感神経活性の増加効果をもたらす抗ストレス効果の可能性を示唆した。一方、ストレスマーカーの一つである唾液アミラーゼ活性については、平成27年度および平成28年度においてもU-Kテストによる計算ストレス負荷後のアミラーゼ活性を測定したが、個人差が大きく一定の方向性を認められなかった。本年度は、ストレスの種類、唾液アミラーゼ活性やその他のストレスマーカーの活性について検討する。健康成人を対象とする内田-クレペリンテスト計算負荷後の交感神経優位な自律神経バランスの変動に対して、テアニン前摂取では計算負荷による交感神経優位な変動は認められなかった。また、テアニン前摂取は副交感神経活性優位な自律神経バランスの変動をもたらす可能性を示唆した。これらの結果は、「第69回日本薬理学会西南部会」および「第90回日本薬理学会年会シンポジウム14病態生理学および薬理学研究における自律神経バランスの新しい評価システム」において発表した。さらに研究分担者である柳原は、ウシ副腎髄質細胞初代培養系を用いたカテコールアミン分泌及び生合成系において、フラボノイドIkarisosideAや松節抽出物SJ-2がそれらの分泌を抑制することを明らかにした。最終年度では、ウェアラブル生体センサ(Silmee,東芝製)を用いた自律神経バランス測定の簡易化を推進した。研究分担者である柳原らが開発した自律神経バランスにおける自動測定ソフトを用いて、計算負荷後の自律神経バランス変動に対するテアニン前摂取の検討を行なった。その結果、1新たに開発された自律神経バランスの自動測定システムは、従来観察されていた卓上心電計による自律神経バランスと同様な評価ができることを確認した。2計算負荷ストレスにより交感神経優位が観察されたが、その変動をテアニン前摂取により抑制した。
RhoファミリーG蛋白質Rnd1の神経回路形成における新規機能の探求

RhoファミリーG蛋白質は細胞骨格の重要な調節分子であり、様々な軸索ガイダンス分子の機能発現に深く関わっている。私は神経軸索ガイダンス因子semaphorin 4D受容体、Plexin-B1の細胞内領域がGAP様配列をコードしており、実際に低分子量G蛋白質R-Rasに対するGAPとして機能することを証明した(Oinuma et al.,Science 2004)。R-Rasは細胞接着因子受容体、インテグリンを活性化することが知られている分子である。私はさらに、Plexin-B1はR-RasGAP機能を発現することでR-Ras活性を低下させ、インテグリンを不活性化させ細胞の基質への接着を弱めることで反発性ガイダンス分子として働くことを証明した(Oinuma et al.,J.Cell Biol.2006)。R-Rasの細胞機能とその分子機構に関してはあまりわかっていない。R-Rasは細胞接着により活性化され、またこの活性化されたR-Rasが逆にインテグリンを活性化させ、さらなる細胞接着の促進を引き起こすという正のフィードバックシステムが細胞接着時に存在することを明らかにした(Oinuma et al.,J.Cell Biol.2006)。また、R-Rasを海馬初代培養神経細胞に過剰発現させることで、神経軸索形成が促進されることを明らかにした(Oinuma et al.,J.Biol.Chem.2007)。インテグリンによる細胞膜伸展や細胞の前進などに重要な役割を果たしていることが間違いない。軸索の反発作用に加え、神経細胞の移動の制御もR-RasGAP活性を介して行うことが予想され、現在さらなる検討を進めている。私はRhoファミリーG蛋白質の中で、脳・神経系に特異的に発現しているRnd1の神経機能を明らかにするため、Rnd1に結合する分子を、酵母のtwo-hybrid法を用いてスクリーニングし、ガイダンス因子受容体、Plexin-B1の細胞内領域に結合することを見いだした。Plexin-B1の細胞内領域で、Rnd1結合部位は、C1とC2とに挟まれた領域にある。私はPlexin-B1細胞内領域の配列を詳細に検討し、Plexin-B1の細胞内領域がGAP様配列をコードしており、実際に低分子量G蛋白質R-Rasに対するGAPとして機能することを証明した。R-Rasは細胞接着分子受容体、インテグリンを活性化することが知られている分子であることから、Plexin-B1がR-RasGAP機能を発現することで神経突起の基質への接着を弱めることで反発性ガイダンス分子として働くことが示唆された。Plexin-B1によるR-RasGAP機能の発現にはRnd1がC1とC2の間に給合することが必須であり、さらに、リガンド(Sema4D)によるPlexin-B1のクラスター化が起こることで、リガンド依存的な反応を示した。さらに、内在性のRnd1をノックダウンした神経細胞ではSema4Dによる成長円錐退縮応答が阻害された。以上のように、私はPlexin-B1-Rnd1複合によるR-RasGAP活性の発現がSema4D-Plexin-B1による反発作用に必要であることを明らかにした。R-Rasの細胞機能とその分子機構に関してはあまりわかっていないが、インテグリンによる細胞膜伸展や細胞の前進などに重要な役割を果たしていることが間違いない。Plexin-B1の細胞内領域で、Rnd1の結合部位は、C1とC2とに挟まれた領域にある。私はPlexin-B1の細胞内領域の配列を詳細に検討し、Plexin-B1の細胞内領域がGAP様配列をコードしており、実際に低分子量G蛋白質R-Rasに対するGAPとして機能することを証明した。Plexin-B1によるR-RasGAP機能の発現にはRnd1がC1とC2の間に結合することが必須であり、さらに、リガンド(Sema4D)によるPlexin-B1のクラスター化が起こることで、リガンド依存的な反応を示した。以上のように、私はPlexin-B1-Rnd1複合体によるR-RasGAP活性の発現がSema4D-Plexin-B1による反発作用に必要であることを明らかにした。

R-Rasの細胞機能とその分子機構に関してはあまりわかっていないが、インテグリンによる細胞膜伸展や細胞の前進などに重要な役割を果たしていることが間違いない。軸索の反発作用に加え、神経細胞の移動の制御もR-RasGAP活性を介して行うことが予想され、現在さらなる検討を進めている。RhoファミリーG蛋白質は細胞骨格の重要な調節分子であり、様々な軸索ガイダンス分子の機能発現に深く関わっている。私は神経軸索ガイダンス因子semaphorin 4D受容体、Plexin-B1の細胞内領域がGAP様配列をコードしており、実際に低分子量G蛋白質R-Rasに対するGAPとして機能することを証明した(Oinuma et al.,Science 2004)。R-Rasは細胞接着因子受容体、インテグリンを活性化することが知られている分子である。私はさらに、Plexin-B1はR-RasGAP機能を発現することでR-Ras活性を低下させ、インテグリンを不活性化させ細胞の基質への接着を弱めることで反発性ガイダンス分子として働くことを証明した(Oinuma et al.,J.Cell Biol.2006)。R-Rasの細胞機能とその分子機構に関してはあまりわかっていない。R-Rasは細胞接着により活性化され、またこの活性化されたR-Rasが逆にインテグリンを活性化させ、さらなる細胞接着の促進を引き起こすという正のフィードバックシステムが細胞接着時に存在することを明らかにした(Oinuma et al.,J.Cell Biol.2006)。また、R-Rasを海馬初代培養神経細胞に過剰発現させることで、神経軸索形成が促進されることを明らかにした(Oinuma et al.,J.Biol.Chem.2007)。インテグリンによる細胞膜伸展や細胞の前進などに重要な役割を果たしていることが間違いない。
沖縄反基地運動におけるトランスナショナリズムをめぐる同時代史的考察

本研究は、概ね予定通り進行している。2018年12月を以て異動となった関係で、この間2か月ほど研究や執筆から離れなければならなかったものの、その後、異動先(日本国外)での生活が落ち着き始め、2019年3月下旬には上記の英語論文を提出することができた。2019年度から翌20年度にかけては以下の予定で研究を進める。第一に、沖縄・韓国の反基地運動を通じた民衆連帯が起こる母体となる反基地運動体をネットワークの視点から分析する。そのために、70年代中葉から次第に活動を展開する「琉球弧の住民運動」の展開に関し、既に収集した一次資料の分析、またこの運動において中心的な役割を担った新崎盛暉の思想と実践を分析する。第二に、今年後半または来年初頭において、鹿児島と沖縄において更なる資料の収集にあたる。これらを来年度オーストラリアで開催されるアジア学会にて発表することを予定している。主に旅費と書籍代金を含む調査費に充てていたものの、2018年12月に生じた新しい本務校への異動(海外)及びその後、新天地に落ち着く期間のため、残額を使用し切れなかった。
興奮収縮連関における筋細胞内遊離Ca局在の経時的定量化

骨格筋の収縮-弛緩機構は細胞内遊離Ca濃度により制御されていることが明らかになりつつあるが、収縮-弛緩過程における細胞内遊離Caと収縮-弛緩の関係を時間的、空間的に明らかにすることを計画した。細胞内遊離Caの測定には、クラゲから抽出した発光タンパク、エクオリンを細胞内に注入して、発光を光電子増倍管により検出し、張力と同時記録した。収縮の誘起には、電気刺激による方法、カフェイン処理筋の液温を急速に低下させて生じる急冷拘縮の2つの方法を用いた。電気刺激による強縮発生時には細胞内遊離Caは6-8μM(40Hz)に達っし、トロポニン、パルブアルブミンのCa結合部位はほとんど飽和していると考えられた。一方、低濃度カフェイン処理により細胞内遊離Ca濃度は上昇するが張力発生閾濃度以下で、急速冷却により張力は最大に達っする。張力発生に必要なCaの閾濃度は約1.4μMであった。急冷拘縮が最大に達する時にはCaは約3.1μMであった。急速冷却時には3相にわたるCaの動態が観察され、張力との間に対応がみられないCa濃度変化があったので、細胞内Ca濃度は一様に変化するのではなく、局在を明らかにする必要があると考えられた。他方、カフェイン処理時の細胞内Ca濃度上昇はプロカインで抑制されたので、ごく低濃度の遊離Caが存在していても、カフェインによりCa誘発性Ca遊離が生じるか、カフェインが小胞体からのCa遊離をまず最初に誘起するのか2つの可能性が考えられた。【K^+】濃度の上昇、【No_3^-】によっても細胞内Caの上昇を観察し、このCa濃度上昇がプロカインで抑制されるといわれているのでCa誘発性Ca遊離の閾濃度を再考する必要があると思われる。細胞内Caの局在はエクオリン注入筋、または7-3-2負荷筋を用い、イメージインテンシィファイヤーにより検出が期待できるところにまで準備ができた。
中国主要都市大学におけるインターンシップの実態研究

研究の主たる目的は、中国(北京・上海・西安)等の大都市圏大学におけるインターンシップの実態研究である。つまり現状の中国主要都市で実施されているインターンシップ制度を詳細に実態解明することを主旨としている。研究方法は、最初にインタビューシートの設計と作成に取組んだ。インタビューの項目設定に際して、日本におけるインターンシップ制度全般について、インターンシップ学会や学術論文での先行研究等の文献調査を行なった。また日本の高等教育機関(大学)で現状実施されているインターンシップ制度やプログラム資料の収集、そして企業側からの視点においても情報収集を実施した。一定のインターンシップの調査研究が進んだのち、インタビューシートを精査しながら完成させた。中国の大学へのインタビュー調査に先立ち、先方の大学担当者へ各々大学の現状におけるインターンシップ制度の形態、プログラムの内容、実習での手当ての有無、受け入れ企業の業種、職種、企業数、受け入れ団体や政府の有無、単位認定、実習の評価方法、留学生の受け入れ実態などについて具体的にヒアリングを行いたい旨を伝えた。その上で実際に中国へ渡航して、現地大学訪問によるインタビュー調査を実施した。研究成果として、日本と中国のインターンシップ制度の相違点として、次の点が考えられることが知見として得られた。まず、日本が概ね1ヶ月が主流となっているのに対して、中国は6ヶ月1年間に及ぶ中長期型が主流となっていること。それから、実習手当てについては、日本の無償に対して、中国の有償という労働に対する考え方の違いが明らかになっていること。また、インターンシップ制度の目的と意味に関する点においては、日本のインターンシップが単なる実習体験を目的としているのに対して、中国のインターンシップは、就職を目的とする企業において、実習体験を行う点で異なっていることがわかった。
ヘリコバクター・ピロリ感染の多様な疾患とVacA毒素の多型比較調査

H.pyloriは空胞化毒素VacAを産生し、標的細胞の細胞質内に多数の空胞を形成して死に至らしめる。このVacA毒素の1次構造の中間(中間領域)に違いがあり,そのアミノ酸配列の違いからm1VacAとm2VacAの2つに大別される。m1VacAとm2VacAの両者は細胞特異性が異なり、それによる疾患特異性もうたがわれているが、m2VacAを産生する菌株は毒素産生が少ないことから(m1VacAに高い感受性を示す株化細胞を用いて細胞毒性を比較した知見に基づいているためにこうした判断が為されてきた)、m1VacAを用いた研究が多く為されてきた。本研究では、日本およびフィリピンのH.pylori感染者から臨床分離された菌株を集め、培養液からm1VacAとm2VacAをそれぞれ精製し、それぞれの性状を比較した。その結果これら2種のVacAはいずれも酸およびアルカリ条件下で活性化し、細胞への結合と空胞形成の亢進が認められた。さらに、活性化したm2VacAはm1VacA同様に2種のVacA受容体(RPTPαとRPTPβ)に強く結合し、毒性を示すことからm2VacAが本菌の消化器疾患に重要な病原因子となりうること、1998年に報告されたGoらの「m2VacAが十二指腸潰瘍と深く関連する」とする知見の毒素病態学的裏付けがなされた。尚、m2VacAの中間領域はさらに2つの構造的な違いもつグループに分けることができそうである。福井株と沖縄株でVacAのタイピングを行ったところ、福井株はほとんどが、s1/m1株でm2株は認められなかったが、沖縄株ではs1/m1株が78.6%、s1/m2株が16.7%、s2/m2株が4.7%であり、s2/m2株は空胞化毒素活性が認められなかった。従って沖縄で萎縮性胃炎の発生が低い理由は、強い空胞化毒素活性のある菌株に感染している頻度が低いためと考えられ、vacAのゲノムタイプがs1/m1株で毒素活性が強いH.pyloriの感染が萎縮性胃炎への危険因子であると考えられる。我々とDr.F.F.Naividadの部下であるDr.Guzmanと共には、沖縄株s1/m2より、VacAの精製を行い、その生物活性の有無と宿主受容体認識の差を調べた。その結果、s1/m2VacAはs1/m1VacAに比べてその空胞活性に著く弱いものの、両者にRPTPβとRPTPαを認識する受容体認識能の差は全くなかった。我々は空胞化活性のある完全なVacAに対する抗体価を測定することが、VacAに対する宿主の反応をみるのに重要と考えた。そこで米国毒素産生株であるU05676(60190)の培養上清より精製したs1/m1VacAを用いて、VacAに対する血清中の抗体価と臨床所見との関連を検討した.日本ではVacAに対する抗体は高頻度であると考えられた。胃潰瘍、十二指腸潰瘍、胃炎であり、疾患ごとの抗体陽性率に有意差はなかった。陽性群のみの検討では、体中部小弯の胃粘膜萎縮の程度が高度であるほうが抗VacA抗体価が高かった。また、ペプシノーゲンI/II比と抗VacA抗体価の間には負の相関を認め、年齢を考慮した偏相関では、その傾向はさらに増強した。抗VacA抗体価と胃粘膜萎縮の関連が示唆されたことは、H.pyloriの産生するVacAが胃粘膜萎縮を介して、胃癌の発生に何らかの関与をしている可能性を表している。

日本において萎縮性胃炎およぴ胃癌の頻度が高いのは、強力な病原因子を産生するヘリコパクターの感染とサイトトキシンに対する宿主の反応が関運していると考えられた。ヘリコバクター・ピロリは開発途上国に生活するヒトの約80%が20歳前にして感染し、その後も持続感染している。また最近の疫学的研究から全世界の約半数の人々が感染し、胃炎、消化性潰瘍、および胃癌との関連が指摘さている。我々は、本菌の病原因子、とくに本菌に知られる唯一の蛋白毒素毒素である空胞化毒素(VacA)の病原性を明らかにするとともに、種々の疾患との開連およびVacAに大別される2つの毒素型(m1VacAとm2VacA)との関連を追究した。我々は、先にRPTPβの遺伝子欠損マウスでは正常マウスで認められる胃炎や潰瘍が認められないことから、ヘリコバクター・ピロリが引き起こす胃炎・胃潰瘍に少なくともVacAが宿主の受容体RPTPβを介して関わることを明らかにした(Nature Genetics 33,375-381,2003)。本邦、特に沖縄の胃炎および消化性潰瘍の患者から分離されたヘリコバクター・ピロリが産生するm2VacAの分子量をWestern Blotで比較すると、十二指腸潰瘍患者から分離された菌株が産生するm2VacAは他の患者から分離された菌が産生するm2VacAよりも分子量がわずかながら大きかった。このことは後者のm2VacAには前者のm2VacAが持つ一部の構造が共通して欠失していることが分かった。同様な傾向はフィリピン、セントルークス病院で分離された数株にも認められたことからさらに研究菌株数を増やして検討する必要が生じている。一方、我々はかってm1VacAが酸やアルカリにさらされるとその毒性が増強することを報告した(J.Biol.Chem.274,36693-36699)。m2VacAにおいても酸やアルカリによる同様な活性化が認められた。しかもm2VacAの受容体認識、特に最近明らかにしたRPTPβ以外のVacA結合蛋白質であるRPTPαへの結合(J.Biol.Chem.278,19183-19189)において、RPTPαのもつ糖鎖認識に著しい違いのあることが判明した(投稿準備中)。こうした糖鎖修飾の違いがm1VacAとm2VacAの細胞特異性、しいては標的組織の違いに反映して疾患特異性を生み出すことにつながるのではないかと考えている。
T細胞非依存性抗原特異的唾液IgA産生における経鼻アジュバントの機能解明

マウス唾液腺および鼻咽腔関連リンパ組織の分泌型IgA抗体産生における、自然免疫下での粘膜アジュバントの役割とそのIgA抗体誘導・産生の分子細胞メカニズムの解明を目的とした。実験マウス群にはT細胞非依存性抗原(TNP-LPS)と粘膜アジュバントであるコレラトキシン(CT)を、対照マウス群にはTNP-LPSのみを経鼻投与し、唾液腺、鼻咽腔粘膜におけるハプテン特異的抗体産生誘導能と抗体産生誘導のための細胞一細胞間コミュニケーションを分子細胞学的手法を用い解析を試みた。実験群では対照群と比較して、唾液だけでなく鼻腔洗浄液中においてTNP特異的IgA抗体価の上昇と、また全身免疫応答である血清中のTNP特異的IgMおよびIgG3抗体価の上昇を認めた。さらに鼻咽腔粘膜、顎下唾液腺、NALTにおけるTNP特異的IgA抗体産生細胞数の上昇と脾臓においても抗体産生細胞数の有意な上昇をも認めた。顎下唾液腺単核球細胞中のB細胞サブセットを解析したところ、CD5^+sIgA^+B(BIB)細胞が有意に増加しており、またこのBIB細胞は、IL-5レセプターをも強発現していることが明らかにされた。さらに顎下唾液腺および鼻咽腔粘膜からのCD4T^+細胞を分取し5日間培養したところ、上清中にTh2型サイトカイン、特にIL-5の分泌誘導が有意に認められた。さらに抗IL-5抗体処理したマウスに対して同様の免疫を試行したところ、唾液および鼻腔洗浄液中のTNP-LPS特異的抗体価の上昇は認められなかった。以上より、粘膜アジュバントとしてのCTは、CD5^+slgA^+B細胞が強発現したIL-5レセプターとCD4^+T細胞からのIL-5とのクロストークにより、粘膜部におけるT細胞非依存性抗原特異的抗体が誘導されることが示され、CTは獲得免疫系だけでなく自然免疫系においてもアジュバント効果を有することを示唆するものである。マウス唾液腺における分泌型IgA抗体誘導のための自然免疫系における粘膜アジュバントの役割と粘膜免疫実効組織としての唾液腺の分子細胞メカニズムを解明するために、実験マウス群にはT細胞非依存性抗原(TNP-LPS)と粘膜アジュバントであるコレラトキシン(CT)を、対照マウス群にはTNP-LPSのみを経鼻投与し、唾液ハプテン特異的抗体産生誘導能と唾液腺における抗体産生誘導のための細胞-細胞間のコミュニケーションを分子細胞学的手法を用いて解析することを試みた。実験群では対照群と比較して、唾液、鼻腔洗浄液中においてTNP特異的IgA抗体価と、また全身免疫応答である血清中のTNP特異的IgMおよびIgG3抗体価の上昇を認めた。鼻咽腔粘膜、顎下唾液腺、NALTにおけるTNP特異的IgA抗体産生細胞数の上昇と脾臓においても抗体産生細胞数の有意な上昇を認めた。顎下唾液腺単核球細胞中のB細胞サブセットについて、対照群と比較してCD5^+sIgA^+B細胞が有意に増加しており、またこのB細胞は、IL-5レセプターを強発現していることをフローサイトメトリー法により明らかにした。

そして、顎下唾液腺からのB細胞を除いた単核球細胞の培養上清中のサイトカインプロファイルでは、Th2型サイトカイン、特にIL-5の分泌誘導を有意に認めた。また、顎下唾液腺からの単核球細胞のToll-like receptor 2および4のmRNAレベルを定量的PCR法により測定したところ、対照群と比して有意な発現上昇を認めた。以上より、粘膜アジュバントとしてのCTは、胸腺非依存性抗原に対して、Toll-like Receptorを介した自然免疫応答を賦活化しIL-5レセプターを強発現したCD5^+sIgA^+B細胞の誘導とそれによる抗体誘導の可能性が示され、自然免疫系から獲得免疫系への橋渡しを増強していることを示唆するものと考える。マウス唾液腺および鼻咽腔関連リンパ組織の分泌型IgA抗体産生における、自然免疫下での粘膜アジュバントの役割とそのIgA抗体誘導・産生の分子細胞メカニズムの解明を目的とした。実験マウス群にはT細胞非依存性抗原(TNP-LPS)と粘膜アジュバントであるコレラトキシン(CT)を、対照マウス群にはTNP-LPSのみを経鼻投与し、唾液腺、鼻咽腔粘膜におけるハプテン特異的抗体産生誘導能と抗体産生誘導のための細胞-細胞間コミュニケーションを分子細胞学的手法を用い解析を試みた。実験群では対照群と比較して、唾液だけでなく鼻腔洗浄液中においてTNP特異的IgA抗体価の上昇と、また全身免疫応答である血清中のTNP特異的IgMおよびIgG3抗体価の上昇を認めた。さらに鼻咽腔粘膜、顎下唾液腺、NALTにおけるTNP特異的IgA抗体産生細胞数の上昇と脾臓においても抗体産生細胞数の有意な上昇をも認めた。顎下唾液腺単核球細胞中のB細胞サブセットを解析したところ、CD5^+sIgA^+B(B1B)細胞が有意に増加しており、またこのB1B細胞は、IL-5レセプターをも強発現していることが明らかにされた。さらに顎下唾液腺および鼻咽腔粘膜からのCD4T^+細胞を分取し5日間培養したところ、上清中にTh2型サイトカイン、特にIL-5の分泌誘導が有意に認められた。さらに抗IL-5抗体処理したマウスに対して同様の免疫を試行したところ、唾液および鼻腔洗浄液中のTNP-LPS特異的抗体価の上昇は認められなかった。以上より、粘膜アジュバントとしてのCTは、CD5^+sIgA^+B細胞が強発現したIL-5レセプターとCD4^+T細胞からのIL-5とのクロストークにより、粘膜部におけるT細胞非依存性抗原特異的抗体が誘導されることが示され、CTは獲得免疫系だけでなく自然免疫系においてもアジュバント効果を有することを示唆するものである。
細胞老化によるネオ・セルフ生成の分子機構解明

老化・疲弊細胞で発現が著しく低下する腫瘍抑制因子meninを欠損した活性化CD8 T細胞を老化細胞モデルとして用い、老化に伴うミトコンドリア異常とネオ・セルフ生成に関する解析を行なった。抗原刺激後7日目においてmenin欠損活性化CD8 T細胞内のミトコンドリアでは、正常活性化CD8 T細胞ミトコンドリアに比べ,ROSの上昇、膜電位の低下が認められた。また、menin欠損活性化CD8 T細胞内では,ユビキチン化タンパク質の蓄積していたことから,タンパク質分解異常が起こっていると考えられた。さらに、透過型電子顕微鏡を用いた解析から、menin欠損活性化CD8 T細胞では形態的にも異常なミトコンドリアが多数存在し、マイトファジー不全が誘導されている可能性が示された。これらの結果は,meninは活性化CD8 T細胞のミトコンドリア機能の維持に必要な分子であることを示している。また、menin欠損CD8 T細胞で見られたこれらのミトコンドリア異常は、抗原刺激時にラパマイシン処理することにより抑制されたことから,mTORC1の活性化が関与していることが分かった。さらに、menin欠損CD8 T細胞において、抗原刺激時のmTORシグナル活性が正常CD8 T細胞に比べ高いことも明らかとなった。同様の結果は、in vitroで人為的に老化・疲弊様形質を誘導してmeninの発現が低下した野生型CD8 T細胞においても認められた。現在は、menin欠損CD8 T細胞におけるmTORシグナルとミトコンドリア異常、リソソーム活性化異常との関係を解析中である。また、T細胞特異的menin欠損マウスにおいて、リステリア感染後に自己タンパク質に反応する自己抗体の上昇が認められることも見出しており、今後はT細胞におけるmeninの発現低下と自己免疫応答の関連についても解析したいと考えている。平成30年度が最終年度であるため、記入しない。本年度は腫瘍抑制因子menin欠損をした活性化CD8 T細胞,menin欠損骨髄由来樹状細胞(BMDC)を老化細胞モデルとして老化に伴うネオ・セルフ生成に関する解析を行なった。その結果、抗原刺激後7日目においてmenin欠損活性化CD8 T細胞内のミトコンドリアでは、正常活性化CD8 T細胞ミトコンドリアに比べ,ROSの上昇、膜電位の低下が認められた。menin欠損活性化CD8 T細胞内では,ユビキチン化タンパク質の蓄積していたことから,タンパク質分解異常が起こっていると考えられた。さらに、menin欠損CD8 T細胞において、抗原刺激時のmTORシグナル活性が正常CD8 T細胞に比べ高いことも見いだしている。現在、menin欠損CD8 T細胞におけるmTORシグナルとミトコンドリア異常との関係を解析中である。一方、menin欠損BMDCを用いた解析では、menin欠損BMDCにおいてMHCクラスII、CD40、CD80の発現が野生型BMDCに比べ上昇していることが分かった。現在、TLR7またはTLR9リガンド刺激による炎症性因子の発現変化について解析を進めている。T細胞ミトコンドリア機能におけるmeninの役割解析は、当初の計画以上に進んでいる。一方,樹状細胞をはじめとした抗原提示細胞での解析の進捗はやや遅れている。

昨年度に達成できなかったMenin欠損骨髄由来樹状細胞(BMDC)における、効率的な細胞老化誘導方法をまず確立する。申請者らは、マイトファジーの亢進と障害を介してオートファゴソーム内に放出されるmtDNAを認識して活性化したTLR9シグナル伝達経路が、細胞老化に伴うネオ・セルフ生成に関与していると予想している。実際に、これらTLRを介したシグナルにより炎症性サイトカインやI型インターフェロン産生が誘導されるだけでなく、MHCクラスIIやCD80/CD86などの共刺激分子の発現も増強することが報告されている。そこで、今年度は作製した老化細胞モデルであるmenin欠損BMDCにおけるMHCクラスII、CD80/CD86分子の発現、I型インターフェロンの産生におけるmtDNAの役割について検討する。また、menin欠損老化T細胞と正常T細胞から調製したmtDNAに対するBMDCの応答について、IL-1β、IL-6、TNFαなどの炎症性サイトカイン産生、MHCクラスII、CD80/CD86分子の発現などを指標に解析を行なう。平成30年度が最終年度であるため、記入しない。
チロシナーゼ遺伝子の多型解析と多型診断法の開発

チロシナーゼ遺伝子は白皮症の責任遺伝子のひとつである。我々はチロシナーゼ陰性型患者とその家族についてチロシナーゼ遺伝子のエクソン1の5'上流に存在する繰り返し配列部位の多型(GArepeat)を利用しそこをPCRで増幅した産物の鎖長解析を行ったところ結果的にGArepeat Resionが5つに分類され、そのうち339ベースと370ベースについては正常なチロシナーゼ遺伝子しかみつからなかったが、349.357.359ベースについてそれぞれ4種類のチロシナーゼ遺伝子変異との連鎖が認められた。そこで平成10年度に本研究で日本人においてのチロシナーゼ遺伝子のエクソン1の5'上流に存在する繰り返し配列部位の多型(GArepeat)の鎖長解析を行ったところ、結果的にGArepeatは6種類の長さのものが存在し、日本人においても多型性が高いことを証明した。そこでチロシナーゼ遺伝子の4つの多形配列(Gaの繰り返し配列を含む領域、-222と-120の多形配列を含む領域、イントロン2の3'末端のTの繰り返し配列を含む領域)を正常人108人において調べ、各アリルの出現頻度、heterozygocityを調べた。その結果、各々の多形配列部位においてHeterozygoteが出現する頻度は、Ga repeat(0.71)>-222(0.49)>-120(0.20)>3'end of intron2(0.16)の順であり、従ってOCA1の多形診断を行うには、プロモーター部分の3つの多形配列の有用性が高いであろうことが予測された。今後健常人におけるチロシナーゼ遺伝子の検索に多型診断法を応用することで、白皮症の遺伝的な発症のrisk factorについて検索、判定することが可能になるため、この研究の有用性が推し量られる。健常人ボランティア108人から採血を施行後、genomicDNAを採取し、チロシナーゼ遺伝子の多形配列部位について、各アリルの出現頻度、heter ozygocityを調べた。まずチロシナーゼ遺伝子の多形性の高い部位であるエクソン1の5'上流に存在する繰り返し配列部位の多形(GArepeat)を利用しそこをPCRで増幅した産物の鎖長解析をABI373Aシークエンサーにて泳動後、Gene Scanというソフトを使用して解析した。結果としては、GAの繰り返し配列部分は鎖長解析にて320bp,339bp,349bp,357bp,359bp,381bpの6種類の長さのものが存在し、日本人においても多形性が高いことが示された。またイントロン2の3'末端のTの繰り返し配列を含む領域を、genomicDNAを鋳型に適当なプライマーを用いてそれぞれ増幅し、大きさ(鎖長)を決定した。結果として209bp,210bpの多形が存在した。また各々の多形配列部位においてHeterozygoteが出現する頻度は、GArepeat(0.71)>3'endofintron 2(0.16)の順であった。これによりOCA1の多形診断を行うには、プロモーター部分多形配列の有用性が高いであろうことが予測された。このプロモーター部位の多形が病因となる未知の変異と連鎖しているとすると、この多形の有無を調べることにより、病因となる真の変異が未知のまま、病因となる変異の存在がわかり、これが遺伝子診断に利用できると考えられる。
地球規模大気波動と大気大循環のモデリングの研究

成層圏プラネタリ-波の構造と変動に関する観測デ-タの解析、プラネタリ-波が物質循環に及ぼす効果のモデリングについてイギリス・レッディング大学を中心としたグル-プと研究結果の比較・検討を行った。すなわち、廣田と塩谷は、1979ー1988年10年間の人工衛星デ-タをもとに、南半球成層圏中間圏のプラネタリ-波の挙動を系統的に調べ、南半球では北半球と異なる地球をとりまく波数が2の成分は常に東向きに移動していること、移動速度に年による変動があることを明らかにした。1988年の南半球の春は、それまでと大変違って南極オゾンホ-ルが著しく弱く、その直接の原因は89月に南半球ではかつて見られない強さの成層圏突然昇温が起こったためと考えられていたが、この突然昇温の発生機構が、東向きに移動する波数2成分と停滞性のプラネタリ-波の干渉によって起こるものであることを詳細なプラネタリ-波の解析によって立証した。一方、瓜生らは、光化学過程と力学過程(大循環による輸送)を含むオゾンの2次元光化学・力学モデルを作り、季節ごとのオゾンの子午面分布を計算し、観測とかなりよく合う結果を得た。このモデルでは、プラネタリ-波による輸送過程を非等方渦拡散として表現した。松野は、1989月7月にジュネ-ブ近郊で行われたWMOとUNEPによる1989年現在の成層圏オゾンに関する科学的知見のまとめの検討会にレヴュ-・パネルの一員として参加し、各国の研究機関で行われたオゾンの2次元モデルの結果の比較・検討を行った。その際、前記の研究を含め日本での研究成果にたって討議に参加するとともに各国の最新の研究状況の情報を得た。また、南極オゾンホ-ルの成因と年々変動の原因や、最近の全地球的オゾン減少傾向について各国研究者と意見を交換した、さらに、オゾン減少を防ぐためのフロン等規制措置の科学的根拠に関する討論の際に日本の研究者(巻出と富永)による四塩化炭素とメチルクロロホルムの濃度観測結果を発表し、それまでにあった誤差を正した。林は、熱帯域における30ー60日周期振動に関して地球規模の赤道ケルビン波と対流活動の結び付きによるものであるとする研究成果にもとづき、各国の研究者と意見の交換を行った。
有権者の投票行動と政策への民意の反映についての政治経済学的実証研究

従来の政治経済学では、選挙における有権者の投票が政策にどのように反映されるのかについて、数理モデル(投票ゲーム)を用いた理論研究が進んできた。しかし、近年になって、その数理モデルの現実的有効性については疑義が提起されている。そこで、本研究では、有権者の投票行動と為政者によって実行される政策との関係について、行動学的投票理論に基づきながら、実証的に検討する。具体的には、西欧とアフリカの政治・経済データを用いて、統計学的な分析を行っていく。本研究による実証的アプローチにより、投票行動と政策を巡る政治経済的含意を明らかにすることで、関連する経済学、政治学、地域研究の各分野に知見を提供する。
精神科看護師の怒りの体験－怒りを鎮静化する方略選択の心理過程の解明

日常生活場面では怒りを表出する看護師も、対患者場面においては怒りを表出しない。また同じ対患者場面であっても、一般診療科(内科等)と精神科とでは怒りの表出の仕方に相違がみられるのではないかと考え、一般診療科看護師と精神科看護師における「怒りの経験」の違いについて分析する目的で本研究を実施した。また、精神科看護師の、対患者場面における怒りとその経過、及びサポートの現状を明らかにし、看護チームとしての今後の関わり方を考察することを目的に調査を実施した。その結果、精神科看護師が対患者場面において怒りを抑制する要因を抽出し、怒りを体験し反応を起こすまでの過程を示す因果モデルを作成した。病棟/外来に勤務する看護師を対象に、日常生活場面及び対患者場面各々における看護師の「怒りの体験」を調査した。具体的には、1)怒りを感じた相手について、2)怒りの強度、悪意の知覚、被害感(物理的被害、心理的被害)、3)怒りを緩和するために実際に行った行動、4)怒りを感じてから鎮静化するまでに表れた感情の変化について、を分析することを目的に調査を行った。調査実施に先立ち、Averillの質問紙(「日常生活における怒りの体験」日本語版)を参考に「対患者場面における怒りの体験」の質問紙を改変作成した。その質問紙の最終版を作成するために、日常生活場面と対患者場面の2場面において、看護師約200名を対象に調査を実施した。怒りを感じた時にいかなる行動(反応)に出るのかについて統計的な分析を行った。具体的には、「反応のタイプ」11項目がRAS(Rathus Assertive Schedule)やAX(Anger Expression Scale)とどのような関係があるのかを分析するため、RAS、AXの各因子との間でロジスティック回帰分析(ステップワイズ法)を行った。また、その結果から、看護師の怒りの表出を抑制/促進する要因について検討した。以上より、日常生活場面よりも対患者場面におけるRAS、AXの出現頻度が多いことがわかった。そして、日常生活場面においては比較的AXが少なくRASの効果が大きいようであるが、対患者場面においてはAXの方が効果があるのではないかと推測された。また、あわせて怒りの表出/抑制要因が抽出できたことで、今後の研究(対患者場面における怒り制御方略選択の尺度作成)への足がかりとすることができる。なお今回の研究成果については、平成27年10月にデンマーク・コペンハーゲンで開催される国際学会においてポスター発表を行うことが決定している(既に査読が受理されている)。目的:精神科看護師が対患者場面で感じる怒りについて、その怒りを処理するために実際に取った行動から、精神科看護師に特化した行動パターンや怒りのコントロールの仕方、またそれらがどのような関係にあるのか探ることと、一般科の看護師と比較して差異があるか否かを探ることを目的として質問紙調査(Averillの「怒りの体験」質問紙を使用、ただし例文を精神科用に改変した)を実施した。研究対象:愛知県内の精神科病院に勤務する看護師295名(490部配布)。結果及び結論:精神科看護師の「怒りの経験」を分析した。◆1:例えば怒りの強さを比較すると、一般科看護師(平均5.94点)、精神科看護師(平均5.44点)では有意差(t検定)がみられた。また、クラスター分析の結果、一般科看護師と精神科看護師は似たような樹状図を描くことができたが、今回の対象者である精神科看護師の方がより明確な樹状図が得られた。◆2:精神科看護師の怒りのコントロールの特徴として、「精神疾患の病状ゆえに仕方がないと思って諦める」「「疾患を理解すれば腹は立たない」のように疾患と絡めて怒りを昇華している様子が明確になった。これらは一般科の看護師ではみられなかったものである。◆3:項目間の相関関係の結果を参考に因子分析を行った結果、デモグラフィクス、悪意の知覚、被害、動機、反応を中心にした因子構造であることがわかった。したがって、患者からの「悪意を知覚」しないことと「被害」の種類によって「動機」別に取りうる「反応」が変化する可能性があることが推測された。当初の計画では、今回(平成27年度)行った調査(精神科に勤務する看護師を対象にした調査)が平成26年度に行う予定であった。しかし、平成26年度は、その前段階として、まず一般科(内科、外科等)に勤務する看護師を対象に調査を実施することになったため、当初の計画より遅れることになった。しかし、計画修正後の計画実施(平成27年度に精神科看護師を対象に調査を実施したこと)については、ほぼ計画どおりに進行している。目的:前年度に行った、精神科病棟に勤務する看護師が対患者場面において感じる怒り体験に関する調査について分析した(調査はAverillの質問紙を改変・作成したものを使用した)。得られたデータより、怒りを喚起するに至った「怒りの経験」、「怒りの原因」、怒りを喚起させた患者に対して感じた時に「したかった行動」、その怒りを処理するために「実際に取った行動」の関係、及びその関連要因について共分散構造分析を行い、因果モデル(パス図)に表すことを目的とした。研究対象:愛知県内の精神科病院に勤務する看護師295名。因果モデルの想定:「怒りの経験を経験しその怒りの原因によって、怒りの反応行動(願望)を喚起する→自己コントロールによって実際の怒りの反応行動は異なる」というプロセスを想定した。

関連要因として、デモグラフィックス(年齢、精神科経験年数など)、悪意の知覚、被害項目などを想定した。結果及び結論:精神科看護師の「怒りの体験」を分析するために、共分散構造分析を行った。その結果、「怒りの経験→怒りの原因→怒りの反応行動(願望)→怒りの反応行動(実行)」という基軸が得られた。その解釈は、看護師が「怒りを経験」しその怒りの強さなどが強いほど「怒りの原因(患者に悪意を感じたか否か)」に影響を与えた→患者に対して何らか(例:殴る、話し合う)の「行動を起こしたいと願望」する→「実際に何らかの行動を起こす」、である。以上の結果をパス図に表すことができた。怒りの反応行動(願望・実行)として、身体的攻撃、言語的攻撃などAverillの反応行動のうち8つが抽出できた。また、パス図の中で関連要因として、怒りのコントロール、被害項目の2つが抽出された。今回の研究成果については、平成29年10月にアイルランドで開催される国際学会においてポスター発表を行うことが決定している(既に査読審査を通過し受理されている)。研究分担者が平成27年度中に出産し、その後平成28年4月1日付で勤務異動し、子の養育及び異動に伴う業務負担が増えたため、本研究において担当予定だった【研究1】の分析(一部)が進まなかった。平成26年度に【研究1】の前研究として別の調査研究(一般科看護師の怒りの体験)を追加して実施したため、【研究1】の実施が平成27年度にずれ込んでしまった。平成27年度内に前研究の分析は終了している。また、平成27年度内に【研究1】の実施及び分析は既に終了し、平成28年度中に行った分析(上記概要に記載した共分散構造分析)も終了している。現在、前研究の結果と【研究1】の結果(平成28年度に行った共分散構造分析を含む)を合わせ、総合的に考察を加えた上で、現在投稿論文として作成中である。【研究2】の実施については、平成28年度中に調査用紙の作成はほぼ済んでいるので、平成29年度に調査を実施し、その分析及び考察を行う予定である。日常生活場面では怒りを表出する看護師も、対患者場面においては怒りを表出しない。しかし、同じ対患者場面においても内科等の一般診療科と精神科とでは、看護師の怒りの表出の仕方に相違がみられるのではないかと考え、まず一般診療科看護師と精神科看護師における「怒りの経験」の違いについて分析する目的で質問紙調査を実施し(研究1)、次いで精神科看護師による怒りの経験のうち、特に怒りの表出過程の詳細を分析する目的で面接調査を実施した(研究2)。【研究1】「怒りの体験」質問紙(改変)を用いた。分析は、一般科看護師及び精神科看護師が怒りを体験した時→反応を起こすまでの経過を示す因果モデルをそれぞれ作成することであった。因果モデルを想定し、「したかった行動→実際の行動」に至るまでにどのような要因が関連しているのかを中心に分析した。因果モデルの適合度検証は、パス図を描くことにより共分散構造分析によるパス解析を実施し、モデル適合度指標を使用した。その結果、一般的に言われている基準(GFIとAGFIが共に0.9以上)を下回ったものの、RMSEAは0.1以下であったため、結果の使用に耐えうると判断できた。しかし、因果モデルとして両者に大きな違いは認められなかった。
TRAF6シグナルが制御するSLPIの腸管組織における恒常性維持機能の解析

本研究は、腸炎の新たな分子機構の解明を目的とする。前年度の研究で、マウスに抗生物質(アンピシリンとバンコマイシン)を投与すると、盲腸内で腸管上皮のエネルギー源となるグルタミン酸や酪酸が減少し、上皮細胞の増殖が低下し盲腸内容物が増加して便潜血陽性となることを見出した。腸内細菌叢のメタゲノム解析により、酪酸をはじめとする短鎖脂肪酸を産生するclostridialesが減少していることが明らかになった。本年度は、更に上皮細胞のアポトーシスが亢進していることを見出した。この研究成果を原著論文としてまとめ英文学術誌に投稿し掲載に至った。一方、抗菌ペプチドSLPIの生理的機能を明らかにするため、SLPI欠損マウスにDSSを投与して腸炎を誘導し、その病態を解析した。腸炎誘導後の体重減少は、野生型マウスよりもSLPI欠損マウスで著しく、Disease Activity Indexスコアも欠損マウスで増加傾向が見られた。また、炎症性サイトカインの上昇も有意に亢進しており、病理学的解析では腸管組織への著しいリンパ球の浸潤が観察された。前年度の研究で見出したマウスに抗生物質(アンピシリンとバンコマイシン)を投与する事で誘導される盲腸内のグルタミン酸や酪酸の減少、細胞増殖の低下に加え、本年度は、上皮細胞のアポトーシスが亢進していることを明らかにした。上皮細胞の増殖能の低下とアポトーシスの亢進が腸管内のホメオスタシスの破綻に繋がる事が示唆された。抗生物質の投与により減少したclostridialesの関連が考えられる。一方、抗菌ペプチドSLPIの腸管組織における生理的機能を解明するために、連携研究者である大阪大学竹田潔博士より分与いただいたSLPI欠損マウスの遺伝的背景をC57BL/6系統に戻し、DSSを投与して腸炎を誘導した。腸炎誘導後のSLPI欠損マウスの体重は、野生型マウスよりも有意に低下し、Disease Activity Indexスコアと炎症性サイトカイン(IL-6, TNFα, IFNγ)の上昇は有意に亢進した。病理学的解析では腸管組織の粘膜下層への炎症細胞浸潤及び、形質細胞浸潤が観察された。rSLPIによるIBDの病態改善効果を検討するため、大腸菌発現ベクターにマウスSLPI遺伝子をクローニングした。これを大腸菌に形質導入しrSLPIの産生を試みたところ、大腸菌の増殖が抑制されrSLPIは得られなかった。SLPI欠損マウスにおけるDSS腸炎は、野生型マウスに比べ、炎症性サイトカインの有意な亢進を伴い増悪した。今後、腸管組織の恒常性に重要な制御性T細胞やTh17細胞、IgA産生B細胞の割合や局在を調べる。また、腸管内容物中の代謝産物等もGC-MSを用いて解析する。更に、メタゲノム解析により腸内細菌叢の変化を解析する。また、DSS腸炎モデルに加えトリニトロベンゼンスルホン酸(TNBS)による腸炎モデルも検討する。腸管組織におけるSLPIの誘導機構を個体レベルで明らかにするため、今後、腸管特異的TRAF6欠損マウスの個体数を増やし腸管におけるSLPIの発現レベルをリアルタイムPCR法、ウエスタンブロット法、免疫組織化学法によって解析する。また、DSSやTNBSによる腸炎を誘導したときの、SLPIの発現レベルも解析する。大腸菌発現ベクターによるマウスrSLPIの発現効率を改善するため、コンピテントセルの検討を行う。また、昆虫細胞発現ベクターにSLPI遺伝子を導入した系でもタンパク質発現を検討する。rSLPIが得られたら、SLPI欠損マウスや野生型マウスにDSSやTNBSを投与して誘導した腸炎に対して、rSLPIを胃管投与することで腸炎を改善できるか検証する。SLPIの欠損マウスにDSS腸炎を誘導した所、実験結果が安定せず、再現性を得るためにC57BL/6系統への戻し交配を進めている。本年度では戻し交配を4回進める事ができた。SLPIの発現機構を解析するために、腸管特異的TRAF6欠損マウス(Villin-Cre:TRAF6flox/floxマウス)の体外受精を3度施行し、産仔が得られた。現在交配を進めて個体数を増やしている。マウスの大腸癌細胞株を用いた予備実験によって、SLPIを誘導するためにはLPSなどの細菌の構成成分の刺激が必要である事が明らかになった。そこで、マウスに抗生物質を投与し、腸内細菌叢を変化させ、SLPIが変動するか検討したが、変化は認められなかった。しかし、偶然にも、抗生物質を投与する事によって、マウスの便潜血が陽性になり、盲腸内容物が増加する事を見出した。更に盲腸内の代謝産物をガスクロマトグラフ質量分析計で測定した所、グルタミン酸や酪酸といった腸管上皮のエネルギー源が減少していた。更に大腸上皮のki-67陽性細胞数が減少しており、細胞増殖が低下している事が判明した。抗生物質による腸内細菌叢の変化をメタゲノム解析した所、酪酸を始めとした短鎖脂肪酸を産生するClostridialesが減少しており、これらの菌が減少する事によって酪酸を始めとした腸管エネルギー物質の産生が低下している事が示唆された。SLPI