hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
乳幼児をもつ親のコミュニケーションからのネットワーク構築プロセスの社会学的研究

《概要》本研究員は、最終年度となる本年度を本研究課題の申請書において「総仕上げの年」と位置づけた。以下で述べるように、本年度の調査・研究活動は一定程度その目標を達し、次なる展開の具体的な足掛かりを築くものでもあった。《研究業績》本年度は、2本の論文(うち1本が査読付き論文)が掲載され、3回の研究報告を行った。本年度中に執筆した2本の論文はどちらも、本研究課題を推進すると同時に今後の展開にもつながるものだった。たとえば『家族研究年報』に掲載された論文は、子育て支援サークルを立ち去る間際に母親たちが発するひとり言をめぐるやりとり(やりとりが生じない場合もある)のメカニズムを解明すると同時に、そのメカニズムが公私区分という家族社会学の大きな研究課題に対してもっている含意も深く追究している。その意味でこの論文は、本研究課題を前進させるだけでなく、それを展開する可能性のひとつを提示してもいる。《調査》特筆すべきこととして、調査している子育て支援サークルの1ヶ所で同じ市の市立の子育て支援施設に勤めているスタッフ(保育士)と知己を得たことが挙げられる。このスタッフは、勤務する子育て支援施設内での活動と並行して、本研究員が調査している子育て支援サークルをはじめとする、市内の子育て支援関連組織との連携に取り組んでいるようだった。上の発見は、異なる組織に所属するスタッフどうしのコミュニケーションから、組織間のネットワークがどのように形成されるかという課題を示唆している。この課題は本研究課題と地続きでもあり、魅力的な今後の展開のひとつだと感じた。《会話分析の技術向上》本年度の新しい取り組みとして、本研究員自身が会話分析の研究会を催したことが挙げられる。本研究員は、この研究会を同じ奈良女子大学の須賀あゆみ准教授と共同で、平均日1回開催した。小規模な研究会であるがゆえに、自分のデータを提示するチャンスが多く、本年度の研究を進めろう身でも大いに有益だった。(抄録なし)《総括》本年度は本研究課題の初年度だが、既に研究成果を得ることができた。研究成果と同等とは言いがたいが調査においても貴重な情報・経験を得た1年であった。さらに、会話分析のトレーニングという面でも一定の成果を得ることができた。《研究成果》2011年5月に提出した交付申請書は、本年度の調査計画に、(1)会話分析にもとづく調査・(2)インタビュー調査の2項目をふくんでいた。本年度中に、(1)については「会話における親アイデンティティ-子どもについての知識をめぐる行為の連鎖」が『社会学評論』に掲載された。また、(2)については「なぜ通い続けるのか?-ある子育て支援サークルの2つの利用のしかた」が『京都社会学年報』に掲載された(なお、後者については日本社会学会でも報告を行った)。とくに『社会学評論』は日本の社会学を代表する学会誌であり、拙稿がこの雑誌に掲載されたことは一定以上の成果であったと評価できる。《調査》特筆すべきことを1点挙げるなら、2011年11月19日・20日に大阪市で開催された第10回全国子育てひろば実践セミナーに運営スタッフのひとりとして参加したことである。全国800以上の団体から延べ1,300人余りが出席したこのセミナーで、この10年での子育てひろばの広がりと関心の高まりを間近で再確認することができた。また、スタッフとして関与することによって、単なる参加者が通常獲得できる以上に豊かな情報と経験を得ることができた。《概要》本年度は、これまでの研究成果を様々な場・形式で報告し、国際的な研究活動に踏み出した年となった。前者については、以前はなかった研究報告の招待を受けるなどし、研究活動の展開に手応えを感じることができた。後者については、国際ワークショップで報告し、その内容がProceeding Paperではあるが公刊された。本研究員は申請書において、採用2年目を「研究を発展させ、海外に挑戦する年」と位置づけたが、本年度の活動はその目標を一定程度達成できたと思量する。《研究業績》本年度は学会・研究会報告を計4回行うなど、研究報告が多い年となった。たとえば9月の社会言語科学会では、数名の若手研究者とともに会話分析のワークショップを企画・実行した。また上でも述べたように、京都大学グローバルCOEの第5回次世代グローバルワークショップ(11月)で英語報告を行った。さらに研究報告ではないが、日本エスノメソドロジー・会話分析研究会で催された拙稿の書評セッションにも執筆者として出席し、評者からのコメントにリプライした。論文としては、先の国際ワークショップの報告にもとづいた英語論文(Proceeding Paper)が出版されたほか、現在1本の論文を国内の学会誌に投稿し、現在査読を受けている。《調査》特筆すべきこととして、調査先の子育て支援サークルのひとつで理事会に出席し、重要な意思決定の場に立ち会うことができたことがある。普段の調査からはうかがい知ることが難しい、子育て支援サークルの別の側面を垣間見て、スタッフの事務的なやりとりにもさらに関心を深めることができた。《会話分析の技術向上》本年度は、J. Streeck准教授(テキサス大学オースティン校)、L. Mondada教授(バーゼル大学)、M. Kidwell准教授(ニューハンプシャー大学)を招いた研究会などに参加できた。さらにG. H. Lerner教授(UCSB)、C. Kitzinger教授(イギリス・ヨーク大学)、S. Wilkinson教授(ラフバラ大学)を招いたワークショップにも参加し、充実したトレーニングを受けることができた。

《概要》本研究員は、最終年度となる本年度を本研究課題の申請書において「総仕上げの年」と位置づけた。以下で述べるように、本年度の調査・研究活動は一定程度その目標を達し、次なる展開の具体的な足掛かりを築くものでもあった。《研究業績》本年度は、2本の論文(うち1本が査読付き論文)が掲載され、3回の研究報告を行った。本年度中に執筆した2本の論文はどちらも、本研究課題を推進すると同時に今後の展開にもつながるものだった。たとえば『家族研究年報』に掲載された論文は、子育て支援サークルを立ち去る間際に母親たちが発するひとり言をめぐるやりとり(やりとりが生じない場合もある)のメカニズムを解明すると同時に、そのメカニズムが公私区分という家族社会学の大きな研究課題に対してもっている含意も深く追究している。その意味でこの論文は、本研究課題を前進させるだけでなく、それを展開する可能性のひとつを提示してもいる。《調査》特筆すべきこととして、調査している子育て支援サークルの1ヶ所で同じ市の市立の子育て支援施設に勤めているスタッフ(保育士)と知己を得たことが挙げられる。このスタッフは、勤務する子育て支援施設内での活動と並行して、本研究員が調査している子育て支援サークルをはじめとする、市内の子育て支援関連組織との連携に取り組んでいるようだった。上の発見は、異なる組織に所属するスタッフどうしのコミュニケーションから、組織間のネットワークがどのように形成されるかという課題を示唆している。この課題は本研究課題と地続きでもあり、魅力的な今後の展開のひとつだと感じた。《会話分析の技術向上》本年度の新しい取り組みとして、本研究員自身が会話分析の研究会を催したことが挙げられる。本研究員は、この研究会を同じ奈良女子大学の須賀あゆみ准教授と共同で、平均日1回開催した。小規模な研究会であるがゆえに、自分のデータを提示するチャンスが多く、本年度の研究を進めろう身でも大いに有益だった。本年度の交付申請書で掲げた主要な課題2項目について、初年度にして一定の成果を得ることができた。第1に、子育て支援サークルのコミュニケーションの会話分析的研究については、『社会学評論』に掲載された論文がその成果の一環を構成している。第2に、乳幼児をもつ親と子育て支援サークルのスタッフへのインタビュー調査にもとづく研究については、『京都社会学年報』に掲載された論文がその成果の一環を構成している。以上から、本年度は申請書の内容に照らして、予想以上の成果を挙げたものと評価できる。国際ワークショップでの英語報告をふくめ、年間4回の学会・研究会報告を行い、英語論文が(Proceedingsという形態ながらも)出版された。申請者は交付申請書で2年目を「研究を発展させ、海外に挑戦する年」と位置づけたが、本年度の業績はその目標を一定程度満足させるものだったと思量する。次年度以降、本研究課題をさらに推進させる手立てのひとつは、海外の研究者との意思疎通を図り、国内に留まらず国際的に研究成果報告を進めていくことである。
腫瘍由来増殖制御因子による癌増殖制御の解析

造腫瘍性を有するV79細胞の培養上清中には,低分子と比較的高分子の増殖制御因子があるが、この中の低分子の物質の一つは分子量2、000の熱に不安定、トリプシンで活性増強されるオリゴペプチド前駆体で、正常・悪性細胞両者に共通した増殖制御プロセスに働く制御因子であることが判明した(Cancer Res 48,3737,1988)。もう一つの低分子のものは、物理化学的にチミジンでることを証明し、チミジンは密度阻止の状態で濃度が立ち上がり部分的に増殖抑制に係わっていることをチミジンキナ-ゼ欠損株を用いた実験で証明した(BBA論文提出中)。一方、分子量約13万の制御因子は、TGFーβや腫瘍壊死因子(TNF)、ILー1αとも物理化学的にも生物学的にも全く異なり、しかもヒト線維芽細胞にはほとんど効果がないが、種々のひと癌細胞に対して抑制的に働くため腫瘍増殖抑制因子(Tumor Grovth Inhibiting Factor,TGIF)と命名した(J.Cell Science,論文提出中)。このTGIFの部分的精製の段階での性状は、熱、酸、トリプシンに安定なシングルチェインのポリペプチドであり、上皮系、間質系を問わず種非特異的で、ヒト癌細胞にも効果を有し、血清濃度に依存してBifunctionalに働き、その作用機序に関して、EGF、PDGFとの拮抗あるいは競合は認められなかった。これらの結果、この物質は腫瘍増殖に関連した全く新しいタイプのサイトカインであることを再確認した。現在,無血清による大量培養によりこの物質を大量に精製しアミノ酸分析による一次構析を行っている.癌細胞であるV79細胞の密度阻止の状態での培養上清中に、癌細胞の増殖制御に関連する2つの増殖制御因子が発見され、一つは分子量2kDのオリゴペプチド前駆体で、正常・悪性細胞に共通した増殖制御プロセスに働く制御因子である(Cancer Res.、48、3737、1988)。一方、分子量15kDの制御因子はC_8の逆相FPLC、C_4の逆相HPLCで部分単離された。その特徴は、1)熱、酸、トリプシンに安定でキモトリプシンで部分的に失活し、ジチオスレイト-ル(DTT)にて殆ど影響を受けないため、シングルチェインのポリペプチドである。2)上皮系、間質系を問わず腫瘍細胞に効果を有し、その作用は可逆的である。3)これに反し、ひと線維芽細胞には全く作用しない。4)腫瘍細胞に対し増殖抑制効果を有する既知のサイトカインであるTGF-β、腫瘍壊死因子(TNF)、インタ-ロイキン-1とも物理化学てきにも生物学的にも全く異なる。5)単層培養でも軟寒天培養でも増殖抑制を示す。これらの結果、この物質を腫瘍増殖、制御因子(Tumor Growth Regulating Factor,TGRF)と命名した。(論文提出中)。TGRF増殖制御効果は血清濃度に依存し、5%で最大抑制を示したが、血清濃度が0.5%と低い場合は逆に増殖刺激効果を示した。この抑制効果は上皮成長因子(EGF)や血小板由来増殖因子(PDGF)と競合によるものでもないことが分かり、TGF-βと同様なbifunctional regulatorの可能性を示唆している(論文提出中)。このように我々の単離したTGRFは、癌細胞の増殖制御に関連した全く新しいタイプのサイトカインであり、このような増殖制御因子が癌細胞自体から分泌されていることは、癌細胞の増殖能は正・負の両方向に昂進しており、癌は無限増殖能を獲得した後に増殖因子と増殖制御因子のバランスをある程度保ちながら発育していることが考えられる。現在、大量培養によりTGRFを大量に精製・純化し、アミノ酸分析による一次構造の解析を行っている。現在,無血清による大量培養によりこの物質を大量に精製しアミノ酸分析による一次構析を行っている.
異常原子価をもったケイ素化合物の構造と反応性に関する理論的研究

窒化ケイ素の化学蒸着(CVD)による合成の反応経路の一つとして、シランとアンモニアの反応(1)SiH_4+NH_3→SiH_3NH_2+H_2についてab initio分子軌道計算を行った。比較のため、メタンとアンモニアとの類似反応(2)についても計算を行った。反応(1)は反応(2)よりも速度論的にも熱力学的にも有利であった。シランと水およびメタンと水との反応についても同様の結果を得た。シランの方が求核置換の反応性が高いのは、シランの方が遷移状態の安定化が大きいためである。これはシランとメタンではLUMOが異なっていることによる。一方、シリコンのフッ素によるエッチング反応は、半導体の微細加工上、重要な技術である。ケイ素に結合したF数のエッチング反応への影響を調べるために反応(3)F_xH_<3ーx>SiSiH_3+HF→SiF_<x+1>H_<3ーx>+SiH_4(x=0ー3)についてab initio分子軌道計算を行った。x=2まではSi上のFの数が増すにつれて反応が熱力学的にも速度論的にも有利に進むことがわかった。つまりSiにFが多く結合するにつれてSiとFの置換が容易になり、FがSi上に凝縮して行き、最後に揮発性のSiF_4が生成脱離してシリコンがエッチングされると考えられる。このようなFのマイグレ-ションモデルは、SiF_3基を多く含む層がエッチング中に生成しているという実験事実とよく一致する。シリコンのエッチング反応に存在するド-ピング効果についてもモデル反応のab initio分子軌道計算を行った。SiーSi結合のFによる切断は、未ド-プシリコンよりもド-プした状態の方が容易となった。しかし、p型シリコンではFにより切断したSiーSi結合がさらにFにより架橋された安定な構造(SiーFーSi^+)を形成しフッ素化層が厚くなるとともにエッチング速度が遅められる。n型ではFがケイ素に配位した5配位構造が安定な反応中間体として形成されるためエッチング反応が速いにもかかわらずフッ素化層が薄くならない。こにように計算結果は実験結果とよく一致した。
中間子原子核で探る核媒質中での量子色力学

本研究では、原子核中における中間子の性質の変化を通じて、有限密度における強い相互作用の対称性に関する新しい知見を得る為に種々の中間子.原子核系に関して理論的な研究を行った。その結果、π中間子原子、K中間子原子核、η-、η(958)-、φ-中間子原子核に関して、有限密度での強い相互作用の効果、束縛系の構造、生成断面積に関する新しい情報を系統的に得る事が出来た。また2核子移行反応による、重い中間子と原子核の系の生成が有用である事を理論的に示した。本研究の目的は、強い相互作用の基礎理論(量子色力学)から原子核を含むハドロン多体系のダイナミクスを理解し、量子色力学の持つ多様な相構造を理解する事である。同様な目的を持つ研究は様々な観点から世界中で実施されているが、本研究では特に中間子原子及び中間子原子核に着目し、原子核中での中間子の性質を通じて、そこから、有限密度での強い相互作用の様相を理解する事を目指している。本研究の目的は、強い相互作用の基礎理論(量子色力学:QCD)から原子核を含むハドロン多体系のダイナミクスを理解し、量子色力学の持つ多様な相構造を理解する事である。この研究では特に中間子原子及び中間子原子核に着目し、原子核中での中間子の性質の変化を通して、核物質中での量子色力学のダイナミクスを理解する事を目指している。この目的の為に、当該年度はφ中間子-原子核系に関する研究を進めた。様々な中間子の核内での性質は、強い相互作用の持つ様々な対称性の破れの様相に関連している。φ中間子の場合は、OZI則、核(子)内s-quark成分、K中間子を通した媒質効果等によって原子核中での振る舞いが規定されると考えられていて大変興味深い。我々はK中間子の媒質効果として代表的な有効理論であるChiral Unitary模型を用い、φ中間子束縛系の構造と生成反応の理論的な評価を行った。従来考えられていた反応を超えて、重い中間子生成に適すると期待される(γ,d)反応も新たに理論的に検討した。この結果、φ中間子の性質や束縛状態の構造を、生成反応を通じて観測するためには、大きな吸収効果による難点があることが定量的に明らかになった。また、(γ,d)反応の生成断面積が小さくなる理由も明確になり、実際の観測を可能にする為に今後検討するべき点を理解する事ができた。本研究の究極の目的は、強い相互作用の基礎理論(量子色力学)から原平核を含むハドロン多体系のダイナミクスを理解し、量子色力学の持つ多様な相構造を理解する事である。当該年度ではπ中間子原子、K中間子原子核、φ中間子原平核に関する研究が進展した。π中間子原子に関しては、光学ポテンシャルのアインベグトル項かち得ちれるπ中間子の弱崩壊定数の情報に加えて、π原子生成断面積から波動関数くりこみ因子の情報が得られないか検討が進み、理化学研究所において計画されている実験で観測可能かどうかの定量的議論が開始できる状況になっている。K中間子原子核においては、in-flight K中間子を用いた実験結果の詳細な理論的解析が終了し、原子核中におけるK中間子の性質を定量的に決定づけるには、更に別のデータが必要である事が結論づけられた。軽い原子核にK中間子を束縛された系の研究も進みつつ有り、今後の進展が期待される。φ原子核の構造と包含生成反応に関する理論計算は終了した。今後はJPARCで提案されている実験により近い将来得られると期待されるデータから、物理的な知見を引き出す点に関して検討が必要である。特に、核内でφ中間子が吸収/崩壊した後に射出される粒子を同時計測するデータの有用性に関して更に検討を進める。本研究の究極の目的は、強い相互作用の基礎理論(量子色力学)から原子核を含むハドロン多体系のダイナミクスを理解し、量子色力学の持つ多様な相構造を理解する事である。当該年度では、K中間子原子核、φ中間子原子核に関する研究が進展し、研究報告を論文としてまとめる事ができた。K中間子原子核に関しては、包含(K,p)反応のスペクトラムの理解には関与する多くの物理的過程の理解が必要であり、相互作用の情報を引き出すには注意が必要である。この点を明確にし、論文として出版した。またφ中間子原子核に関しては、構造と包含生成反応に関する理論計算の結果、及び、核内でφ中間子が吸収/崩壊した後に射出される粒子を同時計測するデータの有用性に関して論文として報告した。

これは、JPARCで提案されている実験遂行において重要な情報である。今後は、η(958)中間子原子核の構造、生成に関する研究を深め、原子核中における軸性U(1)量子異常の効果に関して研究を進める予定である。特に、カイラル凝縮を通じた、t-channel型の質量生成機構が核内で変化し、吸収効果をほとんど伴わない質量減少を引き起こす可能性に関して、今年度に引き続き検討する。本研究の究極の目的は、強い相互作用の基礎理論(量子色力学)を基に原子核等のハドロン多体系のダイナミクスを理解し、量子色力学が記述する多様な現象や相構造を包括的に理解する事である。同様な目的・動機を持つ研究は様々な手法を用いて広く行われているが、中間子原子と中間子原子核の系に着目するのが本研究の特徴である。原子核中での中間子の性質を通じて、有限密度中での強い相互作用の様相を理解する事を目標としている。当該年度では、π中間子原子に関する研究を進展させ、成果を公表する事ができた。具体的には、π中間子原子におけるパイオン弱崩壊定数の核内での変化と、波動関数繰り込みの効果の観測可能性に関して、現実的な実験条件を視野に入れつつ詳細に研究した結果である。また、重い中間子系生成反応としての(γ,d)や(p,3He)等の2核子移行反応に関する理論的研究や、有限角度でのハドロン反応を用いたπ中間子原子生成に関する研究も公表した。π中間子原子生成スペクトルの特徴ある角度依存性や、2核子移行反応の持つ可能性が、理論的に初めて示された。更にη(958)中間子系の研究が進展し、カイラル凝縮を通じた質量生成機構に寄与する軸性量子異常の効果の特殊性から、強い引力にも関わらず極めて弱い吸収効果しか生じないといった相互作用の特徴が明らかになって来た。また、実験研究者との共同研究により、現存する加速器施設での研究の可能性に関しても検討が進み、近い将来に(p,d)反応による観測がなされる可能性もでてきた。
脳梗塞後の運動療法による神経保護と脳内生理活性物質の変化に関する研究

3週間のトレッドミル運動後にラット脳梗塞を作成し、脳梗塞発症前の定期的な運動による脳梗塞後の神経保護作用機序について調べた。運動群の脳梗塞体積は非運動群と比較し有意に縮小し、機能改善も認められた。反応性アストロサイトのマーカーであるGFAPや毛細血管のマーカーであるPECAM-1の発現、BDNFやMKの発現がペナンブラ領域で有意に増加していた。神経細胞死に関与するCaspase 3とフリーラジカル組織傷害のマーカーであるNitrotyrosineの変化を確認した結果,運動群の発現量が有意に減少しており,神経栄養因子の発現増加がアポトーシスや酸化障害を抑制している可能性が示唆された。今年度、本研究課題において、脳梗塞前のトレッドミル運動が脳梗塞巣の縮小効果や脳内生理活性物質に及ぼす影響を検討した。ラットを低強度運動群、高強度運動群、非運動群に分トレッドミル運動(30分/日、5回/週)を3週間行った。運動機能評価、神経学的評価、神経栄養因子の発現量を定量化した。その結果、脳梗塞前の3週間の定期的な運動を行うことで脳梗塞巣の縮小効果、運動機能向上、神経細胞の成長や生存、シナプス機能亢進などの役割を持つBDNFやMKの発現を促進することが示された。BDNFやMKは。特に、定期的な運動により脳梗塞後のMKの発現が増加されるかどうかについてはよく分かっておらず、今回の結果は定期的な運動により脳梗塞後のMKの発現を増加させることが示唆された。本年度、神経保護効果を有する神経栄養因子midkine(MK)やBrain derived neurotrophic factor (BDNF)の発現量、グリア増生、血管増生、アポトーシス、酸化ストレスに着目して、脳梗塞発症前の定期的な運動による脳梗塞後の神経保護の作用機序について検討した。その結果、ストレスのない定期的な運動により脳梗塞巣の縮小効果や運動-感覚機能の改善が認められ、その脳内メカニズムとして、MK、BDNFの発現増加、アストロサイトの活性化の促進、血管増生の促進、ペナンブラ領域のアポトーシス抑制、酸化ストレス抑制が脳梗塞後早期の神経保護作用に関与していることが示唆された。今年度の研究成果は関連学会で随時学会発表を行っており、多くの方々と議論を重ねて研究課題をさらに発展させている。今後も研究成果を関連学会で発表して伸展させていく予定である。今回の研究期間を通して、我々は神経栄養因子midkine(MK)やBrain derived neurotrophic factor (BDNF)の発現量、グリア増生、血管増生、アポトーシス、酸化ストレスに着目して、脳梗塞発症前の定期的な運動による脳梗塞後の神経保護作用機序について免疫組織学的および分子生物学的に調べた。3週間のトレッドミル運動後にラットに脳梗塞を作成し、運動群の脳梗塞体積は非運動群と比較し有意に縮小しており、機能改善も認められた。ペナンブラ(梗塞周囲巣)領域では、反応性アストロサイトのマーカーであるGFAPや毛細血管のマーカーであるPECAM-1の発現が有意に増加し、BDNFやMKの発現が有意に増加しており、MKが反応性アストロサイトから産生されていることを確認した。神経細胞死に関与するCaspase 3とフリーラジカル組織傷害のマーカーであるNitrotyrosine(NT)の変化を確認した結果,運動群のCaspase 3とNTの発現量が有意に減少しており,神経栄養因子の発現増加がCaspase 3やNTの活性化を抑制している可能性が示唆された。さらに運動頻度を変化させ神経保護効果に及ぼす影響を調べた。脳梗塞発症前に週1回、3回、5回で3週間定期的にトレッドミル運動を行い脳梗塞発症後の神経保護効果を免疫組織学的に検討した。その結果、非運動群と比較して週3回以上の運動習慣により脳梗塞巣の縮小効果、運動機能改善を認め、ペナンブラ領域のBDNF発現増加、Caspase 3発現減少が観察された。週1回の運動習慣では脳梗塞巣の縮小効果は見られなかった。低頻度の運動習慣では神経保護効果はなく、高頻度、少なくとも週3回以上の運動頻度で効果が期待できることが示唆された。脳梗塞モデルを作成して、おおむね順調に研究が進展している。随時、学会発表などで情報交換して研究をさらに進展させて行く予定である。今年度は、ストレスのない定期的な運動により脳梗塞巣の縮小効果や運動-感覚機能の改善が認められ、そのメカニズムとして、MK、BDNFの発現増加、アストロサイトの活性化促進、血管増生の促進、ペナンブラ領域のアポトーシス抑制、酸化ストレス抑制が関与していることを証明した。今後、運動による神経保護効果の持続性とそのメカニズムを免疫組織学的、行動学的、分子生物学的手法を用いてさらに検討していく予定である。リハビリテーション医学今年度、脳梗塞前のトレッドミル運動が脳梗塞巣の縮小効果や脳内生理活性物質に及ぼす影響を検討した。

今後、運動頻度による神経保護や脳内活性物質の変化を調べる。また、神経栄養因子ミッドカインの作用について遺伝子組み換えマウスを使用して詳細に検討する予定である。
メタボリックシンドロームの新規治療薬11β－ＨＳＤ１阻害剤の歯周病治療への応用

不活性型のコルチゾンを活性型のコルチゾールに変換する11β-HSD1はメタボリック症候群や慢性炎症性疾患に重要な役割を持つことが報告されている。しかし、慢性歯周炎における11β-HSD1の関与は報告されていない。今研究では、慢性歯周炎、11β-HSD1発現、および肥満の関係を検討した。11β-HSD1発現は歯周炎群で有意に高かった。コルチゾールを不活化する11β-HSD2発現は少し減少しており、11β-HSD1と11β-HSD2の比は歯周炎群でさらに高かった。11β-HSD1発現と肥満には相関が見られなかった。11β-HSD1増加は肥満とは関係なく慢性歯周炎発症に関与することが示唆された。メタボリックシンドロームにおいて脂肪組織における細胞内グルココルチコイド活性化酵素11βーHSD1の活性化が重要な役割を担うことが近年明らかになってきた。メタボリックシンドロームは脂肪組織の慢性炎症状態と考えられており、他の組織の慢性炎症状態における11βーHSD1の関与も報告されてきている。これらのことから、歯周組織の慢性炎症状態である歯周病においても11βーHSD1の活性化が原因の一つとなっている可能性が高いと考えられる。歯周病とメタボリックシンドロームとの関連については知られているが、歯周病における11βーHSD1の関与については今まで報告されていない。そこで我々は、歯周病における新たな治療ターゲットとして11βーHSD1の役割を解明し、11βーHSD1阻害剤による歯周病治療の可能性を探究することを目的として研究を開始した。その結果、歯周病患者の歯肉組織においては健常者の歯肉組織と比較して11βーHSD1遺伝子の発現が有意に亢進していた。また、歯周ポケットの深さと11βーHSD1遺伝子発現との間には有意な正の相関関係が認められた。これらの結果より、11βーHSD1遺伝子発現亢進が歯周病発症に関与する可能性が示唆された。今後は、歯周病における11βーHSD1の役割をさらに明らかにし、メタボリックシンドロームの新規治療薬として期待されている11βーHSD1阻害剤を歯周病治療に応用するために、歯周病モデル実験動物を用いて11βーHSD1阻害剤の歯周病に対する効果を検討する予定である。11βーHSD1(11β-hydroxysteroid dehydrogenase type 1)は不活性型のコルチゾンを活性型のコルチゾルに変換する酵素であり、研究分担者の益崎らはメタボリックシンドロームにおける11βーHSD1の関与を報告した(Science 294, 2166-2170, 2001)。また、動物実験において11βーHSD1阻害剤によるメタボリックシンドロームの諸症状の改善が報告され、11βーHSD1阻害剤はメタボリックシンドロームの新規治療薬として期待されており、臨床試験が進行中である。メタボリックシンドロームは脂肪組織の慢性炎症状態と考えられており、最近では他の組織の慢性炎症(関節リウマチ、非アルコール性脂肪肝炎、潰瘍性大腸炎など)においても11βーHSD1の関与が報告されている。これらのことから、慢性炎症状態である歯周病においても11βーHSD1が関与する可能性が高いと考えられる。歯周病とメタボリックシンドロームとの関連についてはすでに報告されているが、歯周病における11βーHSD1の関与については今まで報告されていない。その結果、歯周病患者の歯肉組織においては健常者の歯肉組織に比して11βーHSD1の発現が有意に亢進していることを見出した。また、コルチゾルを不活化してコルチゾンに変換する11βーHSD2の発現は逆にやや低下していた。これらのことから、歯周病の歯肉組織においてコルチゾルを増加させる方向に酵素が変動していることが示唆された。現在、ラットを用いて歯周病モデルを作製し、11βーHSD1/2の発現の変化を検討中である。11β-hydroxysteroid dehydrogenase type 1(11βーHSD1)は不活性型のグルココルチコイドを活性型に変換する酵素であり、細胞内でのグルココルチコイド活性化に関与する。脂肪組織における11βーHSD1の高発現による細胞内コルチゾルの増加が、メタボリックシンドローム発症に関与することが示唆されている。また、メタボリックシンドロームは脂肪組織の慢性炎症状態と考えられているが、他の組織の慢性炎症(関節リウマチ、潰瘍性大腸炎など)においても11βーHSD1の関与が報告されており、歯周組織の慢性炎症である歯周病においても11βーHSD1の発現が亢進し歯周病発症の原因の一つとなっている可能性が考えられる。歯周病とメタボリックシンドロームとの関連については以前より報告されていたが、歯周病における11βーHSD1の関与については今まで報告されていなかった。

そこで我々は、歯周病における新たな治療ターゲットとしての11βーHSD1の役割を解明するために研究を開始した(平成2224年度科学研究費基盤研究(C);平成2527年度科学研究費基盤研究(C))。その結果、歯周病患者の歯肉組織においては健常者に比べて11βーHSD1の発現が有意に亢進していることを見出した(Journal of Osaka Dental University 47, 7-10, 2013;SpringerPlus 5, 40, 2016)。今年度は、ラットの臼歯に絹糸を結紮することにより実験的歯周病モデルを作製して歯肉組織における11βーHSD1発現を検討したところ、ラットの歯周病モデルにおいても11βーHSD1発現が有意に亢進していた(平成27年日本歯科保存学会にて発表)。これらの結果から、歯周病発症における11βーHSD1の関与が示唆された。不活性型のコルチゾンを活性型のコルチゾールに変換する11β-HSD1はメタボリック症候群や慢性炎症性疾患に重要な役割を持つことが報告されている。しかし、慢性歯周炎における11β-HSD1の関与は報告されていない。今研究では、慢性歯周炎、11β-HSD1発現、および肥満の関係を検討した。11β-HSD1発現は歯周炎群で有意に高かった。コルチゾールを不活化する11β-HSD2発現は少し減少しており、11β-HSD1と11β-HSD2の比は歯周炎群でさらに高かった。11β-HSD1発現と肥満には相関が見られなかった。11β-HSD1増加は肥満とは関係なく慢性歯周炎発症に関与することが示唆された。実験動物を用いた歯周病モデルの作製に手間取ったため、研究の進行がやや遅れていたが、ラットを用いて歯周病モデルが作製できるようになり、今後は11βーHSD1阻害剤を用いた実験も可能な状態となっている。医歯薬学ラットを用いて歯周病モデルが作製できるようになったので、今後ラットの歯肉組織における11βーHSD1/2の発現の変化を詳細に検討し、さらに、11βーHSD1阻害剤の歯周病に対する影響を検討していきたい。なお、研究協力者として、中田貴也先生および藤田敦子先生(ともに大阪歯科大学歯周病学講座大学院生)にも研究に参加してもらう。歯周病患者の歯肉組織における11βーHSD1遺伝子の検討に関しては症例数が順調に増加しているが、動物を用いた歯周病モデル実験についてはまだ準備中の段階である。動物を用いた歯周病モデル実験の進行が予定よりも遅れ、その分の予算が残ったため、次年度に使用することとした。実験動物(マウスあるいはラット)を用いてLPSなどの刺激により歯周病モデルを作製し、その歯周組織における11βーHSD1遺伝子の発現についてRTーPCR法により検討する。さらに、11βーHSD1阻害剤を用いて歯周病モデル動物に対する歯周病の改善効果を検討し、11βーHSD1阻害剤による歯周病治療の可能性を探究する。なお、研究協力者として、中田貴也先生(大阪歯科大学歯周病学講座大学院生)にも研究に加わってもらう。ラットを用いた歯周病モデルを作製し、歯周組織における11β-HSD1/2の発現をリアルタイムPCR法により検討する。当該年度において、研究計画の遅れのため動物実験を行うことができず、そのための予算が残ったため、次年度に使用することとした。実験動物(マウスあるいはラット)を用いてLPSなどの刺激により歯周病モデルを作製し、その歯周組織における11βーHSD1の発現についてRTーPCR法や免疫組織染色により検討する。
神経疾患関連分子セプチンの神経細胞における分子機能解析

セプチンファミリー分子は真核細胞にて高度に保存されている分子群であり、いくつかのファミリー分子は神経組織に特異的な発現を示す。一方、神経細胞におけるセプチンファミリー分子の分子機能は、現在までにほとんど解明されていなかった。本研究の結果、同ファミリー分子のSept14およびSept4が大脳皮質形成時において興奮性神経細胞の移動過程に重要な役割を果たすことが明らかになった。セプチンファミリー分子は、真核細胞生物において高度に保存されている、GTP/GDP結合タンパクである。神経組織特異的発現を示すSept14に焦点を絞り、その大脳皮質発生における機能を検証した。特異的抗体を用いた免疫染色実験の結果、Sept14は発生期の大脳皮質の皮質板および中間帯上層に特異的な発現を示すことが明らかになった。次にRNA干渉法と子宮内遺伝子導入法を用いて、脳室帯神経幹細胞でSept14のノックダウンを行った。その結果、Sept14ノックダウン細胞の皮質板での局在化に異常が認められた。この現象はRNAi耐性型のSept14の強制発現によりレスキューされたことから、Sept14が興奮性皮質神経細胞の正しい局在化に機能的に関与することが示唆された。さらに皮質神経細胞の分化、移動過程のどの段階でSept14が関与しているかを検討した。Sept14ノックダウン細胞におけるBrdU取り込み率は対照群との有為差が認められなかった。よって、Sept14は皮質神経細胞の移動過程において機能することが示唆された。更に我々はSept14の作用機序(分子メカニズム)を検証する為に、yeast two-hybrid法によりSept14の相互作用分子の同定を試みた。その結果、セプチンファミリー分子の一つであるSept4が候補分子として見出された。COS7細胞を用いた過剰発現系およびマウス脳抽出液を用いた免疫沈降実験の結果、Sept14とSept4が生理条件下相互作用することが確認された。次にSept4の皮質神経細胞発生における機能を検討する為に、脳室帯神経幹細胞でのSept4のノックダウンを行った。その結果、Sept14のノックダウンと同様の表現型が認められた。これらの結果は、特定のセプチンファミリー分子が皮質神経細胞の移動過程に機能的に関与することを示唆すると考えられる。
新しい降圧ペプチド“アドレノメデュリン"の臨床診断学・治療学的応用

臨床診断学的応用:ヒト血中には、アミド化されたAM(成熟型AM)とアミド化されていないAM(AM-グリシン)が存在することが明らかになり、AM-グリシンが血中で成熟型AMに変換される可能性が考えられる。高血圧、うっ血性心不全、慢性腎不全の患者の血中では、成熟型AMとAM-グリシンがおよそ同じ割合で重症度に応じて増加していることが判明した。すなわち、血中AM濃度は、これらの疾患の病態と密接に関連しており、重症度を示すパラメーターとなりうることが明らかになった。一方、AMの異なった部位を認識する複数のモノクローナル抗体を作成し、これらを組み合わせることでAMのimmunoreactive radiometric assay (IRMA)を作成した。血漿の抽出が不要な本測定法を用いることにより、少量の血液で多くの検体を同時に測定することが可能となった。今回開発したIRMAは、成熟型AMを認識する系と、成熟型AMとAM-グリシンの双方を認識する系とがあり、成熟型AMとAM-グリシンの病態生理学的意義の解明が可能である。臨床治療学的応用:無麻酔無拘束の高血圧ラットにAMを長期間持続投与すると、血漿レニン活性の抑制と血中アルドステロン濃度の低下を伴った降圧作用が認められた。その際の血中AMは生理的濃度の範囲内であり、AM、AM受容体作動薬あるいはAM分解酵素阻害薬が、新たな降圧薬となる可能性が高いことが明らかになった。さらに、ラットを用いた実験で、合成AMは心筋の肥大を抑制する効果や心不全の重症度を改善する作用を有することが明らかになり、さまざまな循環器疾患に臨床応用が可能であることが判明した。(1)臨床診断学的応用測定系の確立:アドレノメデュリン(AM)の異なった部位を認識する複数のモノクローナル、ポリクロナール抗体の作成に成功した。これらを組み合わせることでAMの酵素免疫法(EIA)およびimmunoreactive radiometric assay(IRMA)は早期に作成できると思われる。血中AMの分子型:ラジオイムノアッセイ(RIA)の改良の過程で、ヒト血中にはアミド化されたAMとアミド化されてないAMが存在することが明らかになり、今後の測定系の開発を行なう上での重要な知見を得たのみならず、それらの臨床的意義のin vitroおよびin vivoでの検討が必要であることが判明した。血中Proadrenomedullin N-teminal 20 peptide(PAMP)の測定:降圧活性を有する全く新しいAM関連ペプチドであるPAMPがヒト血中に存在し、AMと同様に高血圧、心不全、腎不全の患者で血中濃度が上昇しているという新たな知見を本研究を遂行するなかで得ることが出来た。(2)臨床治療学的応用AM受容体作動薬・拮抗薬の開発:種々の修飾を加えたAMペプチドアナログを合成し、ヒト血管内皮細胞のcAMP上昇活性を観察したところ、AM受容体拮抗性のアナログが候補として発見された。さらに、少なくともヒト血管内皮細胞には、AMとホモロジーを有するカルシトニン遺伝子関連ペプチド(CGRP)とは親和性の低いAMの特異的受容体が存在することが明らかになった。AM分解酵素の精製:AM分解酵素活性の測定系の開発を行なっており、逆相高速液体クロマトグラフィーによる解析が有用であることが判明した。また、中性エンドペプチダーゼ(NEP)がPAMPを分解する活性をもつことを明らかにした。(1)臨床診断学的応用簡便な測定系の確立:アドレノメデュリン(AM)の異なった部位を認識する複数のモノクローナル抗体の作成に成功し、これらを組み合わせることでAMのimmunoreactive rediometricassay(IRMA)を作成した。

現在、本法を用いて健常人、循環器や腎臓疾患患者の血中AM濃度の測定を行っている。また、同モノクローナル抗体を用いて、高感度酵素免疫法(EIA)を作成している。血中AMの分子型:AM測定系改良の過程で、ヒト血中にはアミド化されたAMとアミド化されていないAMが存在することが明らかになり、高血圧患者の血中ではアミド化されていないAMが増加していることが判明した。現在、それらの生理学的および病態生理学的意義を検討中である。血中Proadrenomedullin N-teminal20peptide(PAMP)の測定系の開発:降圧活性を有する全く新しいAM関連ペプチドであるPAMPがヒト血中に存在していることが判明し、PAMPの簡便かつ高感度の測定系も作成中である。(2)臨床治療学的応用AM受容体作動薬・拮抗薬の開発:高血圧モデルラットにAMを長期間持続投与すると、血漿レニン活性の抑制を伴った降圧作用が認められた。その際の血中AMは生理的範囲の濃度であり、AM、AM受容体作動薬あるいはAM分解酵素阻害薬が、新たな降圧薬となる可能性が高いことが明らかになった。また、種々の修飾を加えたAMペプチドアナログを合成し、ヒト血管内皮細胞のcAMP上昇活性を観察したところ、AM受容体拮抗性のアナログが候補として発見された。(1)臨床診断学適応用:アドレノメデュリン(AM)の異なった部位を認識する複数のモノクローナル抗体の作成に成功し、これらを組み合わせることでAMのimmunoreactive radiometric assay(IRMA)を作成した。血漿の抽出が不要な本測定法を用いることにより、少量の血液で多くの検体を同時に測定することが可能となった。また、AM測定系改良の過程で、ヒト血中にはアミド化されたAM(成熟型AM)とアミド化されていないAM(AM-グリシン)が存在することが明らかになり、AM-グリシンが血中で成熟型AMに変換される可能性が考えられる。今回開発したIRMAは、成熟型AMを認識する系と、成熟型AMとAM-グリシンの双方を認識する系とがある。高血圧、うっ血性心不全、慢性腎不全の患者の血中では、成熟型AMとAM-グリシンがおよそ同じ割合で増加していることが判明した。現在、測定の対象となった患者の長期予後と血中AMやPAMP濃度の関係を検討するためのフォローアップを行っている。(2)臨床治療学的応用:腎血管性高血圧ラットにAMを長期間持続投与すると、血漿レニン活性の抑制と血中アルドステロン濃度の低下を伴った降圧作用が認められた。さらに、ラットを用いた実験で、合成AMは心筋の肥大を抑制する効果や心不全の重症度を改善する作用を有することが明らかになり、さまざまな循環器疾患に臨床応用が可能であることが示唆された。
大都市における社会-空間構造と社会的ネットワークに関する研究

本研究の目的は、居住地の特性、とくに都市度によって、社会的ネットワークがどのように異なるのかを体系的に明らかにすることである。本研究では、名古屋都市圏を対象として、因子生態学的な分析によって、地域類型を構成し、類型の異なる5つの地域を選んで、住民に対してパーソナルネットワークの調査を実施した。その結果、次の諸点が明らかになった。居住地の都市度が増大するにつれて、親族数は減少するが、それは東海3県出身者の地域親族数が減少するためである。居住地の都市度が増大するにつれて、隣人数は減少するが、この効果は東海3県出身男性で最も明瞭に現れる。居住地の都市度が増大するにつれて、友人数は減少する。この効果は東海3県出身者においてのみ当てはまる。これは、東海3県出身者において居住地の都市度が地域友人数を減少させるためである。また、中距離友人数に関しては、東海3県出身者においてのみ、都市度の増大とともに増加する。遠距離友人数は都市度にかかわりなく、東海3県以外の出身者に多く、高学歴者に多い。これらのことから、親族衰退仮説、隣人衰退仮説は、東海3県出身者にのみ当てはまること、友人興隆仮説は、当てはまらないこと、しかし、都市度とともに中距離友人数が増加するという仮説は、維持されていることが明らかとなった。ここから、素朴な下位文化仮説よりも、居住移動を考慮した修正下位文化仮説が妥当であることが確かめられた。居住地の都市度が住民の社会的ネットワークに及ぼす効果について検証するために、名古屋都市圏から5地点を抽出して、郵送による質問紙調査を実施した。調査地点を抽出するために、平成7年国勢調査(名古屋市学区別集計及び名古屋都市圏市区町村別集計)から人口学的・社会経済的属性を抜き出し、データファイルを作成、因子生態学的分析を施すとともに、社会地図を作製した。この結果にもとづき、研究目的に合致する調査地点として名古屋市昭和区、北区、日進市、多治見市、瑞浪市の5地点を選び、系統抽出法により住民サンプルを抽出、郵送による質問紙調査を実施した。各調査地点の位置づけは、昭和区が都市度の高いホワイトカラー地域、北区は都市度の高い旧ブルーカラー地域、日進市は名古屋市郊外のホワイトカラー地域であり、以下、多治見市、瑞浪市の順に都市度が低く、ブルーカラー率が高くなる。したがって、個人属性を調整しても、居住地によって回答者の社会的ネットワークに系統的な違いがあれば、その原因を居住地の都市度に帰属することができる。なお、調査地点の状況を具体的に把握するために、現地で自治体が独自に集計した統計資料や若干の文書資料を収集した。郵送調査は平成12年9月に実施し、配布数3000に対して有効1276票を回収した。現在、素データファイルをもとにデータ・クリーニング作業を開始したところであり、本格的な分析は来年度以降の課題である。平成12年度に実施した郵送調査のデータ・クリーニングと予備分析を行った。郵送調査のため、記入が不備な調査票が多く、データ・クリーニングに相当の時間を要した。予備分析の結果、居住地の都市度と社会的ネットワークの関連については、従来の研究とは、異なる結果が得られた。(1)親族ネットワーク規模は、居住地の都市度とともに減少する。この効果は、きょうだい数の効果を調整してもなお有意である。(2)隣人ネットワーク規模は、居住地の都市度とともに減少するが、この傾向はとくに男性の場合に顕著である。(3)地域友人数は、居住地の都市度とともに減少する。この効果はとくに、瑞浪市における同年会参加が地域友人数を増加させていることによって強められている。中距離友人数は、これまでの研究と同様に、都市度とともに増加するが、都市圏内友人数は地域友人数の大きさを反映して、都市度とともに減少する結果となった。こうした知見の理論的含意について検討中である。上記の他、サポート項目、意識項目との関連等の分析は、来年度以降の課題である。前年度に引き続き、平成12年度に実施した郵送調査のデータ分析を行った。

分析は、各種の親族サポート、隣人サポート、友人サポート、同僚サポートについて、サポート多重性指標を作成し、回答者の基本属性(年齢・性別・婚姻状態・家族周期段階・職業・学歴・企業規模・従業上の地位など)および居住地の都市度との関連を、分散分析、共分散分析、多重分類分析の手法を使って実施した。その結果、(1)親族サポートについては、親子のサポート関係については居住地の都市度による違いがないが、親子以外の親族によるサポート関係は、居住地の都市度が高まるにつれて低下する傾向があることが明らかとなった。(2)隣人サポートについては、居住地域による違いはなく、男性の場合には学歴、女性の場合には家族周期段階と居住年数によって規定されることが明らかとなった。したがって、都市度と隣人数との関連は、サポートの質に影響を与えていない可能性がある。(3)友人サポートについては、男性の場合、居住地域による違いはなく、年齢、婚姻状態、学歴に規定されていること、女性の場合には、年齢・学歴に加え、都市度の独立効果があることが判明した。すなわち、男性の場合、都市度とともに友人数は減少しているにもかかわらずサポートの質に変化はなく、女性の場合、都市度による友人数に違いがないにもかかわらず、サポート機能は向上していることが判明した。(4)同僚サポートに関しては従来の知見と大きく変わるものではなく、居住地よりも、若年の大企業ホワイトカラーにおいて同僚サポート多重性が大きいことが確認された。このほか、本研究に関連して、先行研究を概観し、研究上の理論的・経験的問題点を整理した論文を発表した。居住地の都市度が、社会的ネットワークに及ぼす効果を、住民の個人属性を調整して、分析的に解明することが、本研究の目的であった。最終年度は、2000年9月に名古屋都市圏で実施した調査データの再分析と並行して現地情報の収集を行い、データ解釈に活用した。また、分析結果のうち、中核的な部分に関して、報告書にとりまとめた。おもな知見は以下の通り。居住地の都市度が増大するにつれて、親族ネットワーク規模が減少するという親族衰退仮説に関して、従来、(1)都市度そのものが親族の衰退をひきおこすという下位文化仮説、(2)地元都市圏出身者においてのみ都市度の効果が見られるという修正下位文化仮説、(3)都市における少子化が親族関係を減少させるという少子化仮説が競合していたが、分析の結果、下位文化仮説と少子化仮説は不十分で、修正下位文化仮説が最も適合度が高いことが明らかとなった。また、近隣衰退仮説については、従来、女性に関する知見のみが報告されてきたが、本研究では、むしろ男性において顕著に見られることが明らかとなった。さらに、都市度の増大とともに友人ネットワーク規模が増大するという友人興隆仮説は反証された。その理由は、都市度の増大とともに地元出身者の地域友人関係が急速に減少するためであることが明らかとなった。また、地元都市圏出身者においてのみ都市度が中距離友人関係を増大させる効果をもつという修正下位文化仮説は実証された。遠距離友人関係については、都市度効果説と居住移動履歴説の2説があったが、居住移動履歴説が妥当であることが裏づけられた。
選択的分離手法を駆使した抗体医薬の体内動態解析法の開発と臨床分析への展開

近年,抗体医薬の使用が進むにつれ,臨床現場における有効治療域濃度の維持や投与計画の設定,適正使用などのための血中薬物濃度分析の必要性が高まっている。我々は,アフィニティー精製と高温逆相LC(HT-RPLC)-蛍光検出を組み合わせた抗体医薬の新規血漿薬物濃度分析法を開発した。我々の分析法は従来法と比べ,簡便かつ高感度,高精度な血中抗体医薬分析法であり,従来のELISA法やトリプシン消化-LC-MS/MS法に代替しうるポテンシャルを秘めており,製薬現場,臨床現場等での利用が期待できる。従来法の問題点を克服した簡便かつ迅速なトリプシン消化LC/MS/MSによる抗体医薬品の新規血漿中薬物濃度分析法を開発した。分析対象とした抗体医薬として、関節リウマチ治療薬であるtocilizumab、抗悪性腫瘍薬であるbevacizumabおよびcetuximabを用いた。本法ではトリプシン固定化モノリススピンカラム(MonoSpin Trypsin)を用いることで、トリプシン消化処理の簡便化と時間短縮を図った。また、MAYI-ODSカラムを分析カラムの前に配置することで、固相抽出操作のステップを省き、タンパク質や塩などの夾雑成分によるペプチド定量妨害の低減を図った。ヒト血漿中に含まれず、かつ各抗体医薬品に特異的なトリプシン消化ペプチドを探索した結果、それぞれ16(bevacizumab)、15(cetuximab)、8(tocilizumab)アミノ酸からなるトリプシン消化断片を見出すことができた。これらの標品ペプチドを化学合成し、MRM検出のための条件最適化を行った。トリプシン固定化モノリススピンカラムを用いることで、従来、長時間(14時間以上)を要していたトリプシン消化過程を2時間程度に短縮することができた。また、前処理カラムにMAYIカラムを利用することで、血漿添加試料におけるトリプシン消化物の脱塩・精製操作が不要となった。これらの結果を元に、各抗体医薬品を100 μg/mL添加した血漿試料をLC/MS/MS分析したところ、3医薬品ともに血漿中から良好に分離、定量することができた。各抗体医薬品についてバリデーション試験も実施した。また、tocilizumabについては、関節リウマチ患者中の血漿中薬物濃度分析に適用し、各種疾患マーカーと比較することで同薬物の治療効果判定を行った。本年度はイムノアフィニティー精製-高温逆相LC法による抗体医薬品の血漿薬物濃度分析法開発を実施した。この方法では,特異的抗体を修飾したアフィニティー担体により,IgGが多量に存在する血液試料の中から抗体医薬のみを選択的に捕集する。捕集した抗体医薬を,IgGに対して高い分離と感度が期待できる高温逆相LC-蛍光検出により分析することで,血漿中薬物濃度分析に十分な感度で分析可能となる。アフィニティー精製の迅速化と回収率の向上を期待して,直径約2.8 μmの磁性微粒子をアフィニティー精製用担体として使用した。抗体医薬品には抗癌剤であるBevacizumabと,関節リウマチ治療薬であるInfliximabを使用した。作製したアフィニティビーズにより,ヒト血漿中から抗体医薬のみを選択的に補集することができ,確立した高温逆相LC条件により,血漿成分の妨害を受けることなく抗体医薬品を15分以内に分析可能であった。また,分析バリデーションを実施したところ,1-20 μg/mlの範囲において優れた定量性,精度が得られた。本法はLC-MS/MSを用いずとも十分な感度で簡便に血中薬物濃度分析が可能となることから,臨床現場での利用も期待できる。現在,抗体医薬の血中薬物濃度分析には,主にELISA法が用いられている。ELISAは高感度かつハイスループットな分析を可能とするが,交叉反応の可能性や分析精度に問題がある場合も多い。そのため,ELISAの測定結果を補完する特異性かつ信頼性の高い分析法の開発が望まれている。そこで昨年度我々は,アフィニティー精製と高温逆相LC(HT-RPLC)-蛍光検出を組み合わせた抗体医薬の新規血漿薬物濃度分析法を開発した。本年度は、本分析法をBevacizumabおよびInfliximabが投与されたガン患者,関節リウマチ患者の実試料分析へと適用することができた。本分析法は臨床分析に十分な感度を有していたが,微量血液試料での分析や,低用量投与が予想される次世代型抗体医薬の分析に適用するには,更なる高感度検出化が要求される。そこで次に,上記分析法における検出感度の向上に関する検討を行った。具体的には,(1) o-phthalaldehyde(OPA)と2-mercaptoethanolによるポストカラム蛍光誘導体化,(2)ヒトIgGのFc部位と特異的に結合するZenon Human IgGlabelingkitによる蛍光標識法について検討した。その結果,(1)ではポストカラム誘導体化条件の最適化により,HT-RPLC分析において自然蛍光よりも2倍以上の高感度化を達成した。(2)では,SEC分析において抗体医薬との蛍光性複合体の生成が確認され,自然蛍光検出よりも10倍以上の高感度化を達成した。以上,本研究により簡便かつ高感度,高精度な血中抗体医薬分析法を確立することができた。