hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
食後血管組織で活性化される炎症関連転写因子の活性化と遺伝子応答を明らかにする。

食後の血管組織で活性化される遺伝子発現を検討する目的で、培養血管平滑筋細胞を用いてインスリンによる遺伝子発現調節機構として転写因子C/EBP-betaおよびdeltaの遺伝子発現を検討した。インスリンは生理的濃度である10nmol/LにおいてC/EBP-βおよびδのmRNAの発現を増加させ、C/EBPの標的遺伝子であるMCP-1遺伝子の発現をmRNAおよび蛋白のレベルで増加させた。このインスリン効果はPl3キナーゼ阻害剤であるLY294002で完全に抑制されたことから、Pl3キナーゼ依存的的効果と考えられた。一方、インスリン抵抗性動物モデルの検討では、血管壁においてPl3キナーゼの下流分子であるAKTの燐酸化が高インスリン血症を呈する高果糖食ラットにおいて亢進しており、高インスリン血症の程度と血管壁における転写因子C/EBP-βおよびδのmRNA発現が有意な正の相関関係を示した。さらに、血管壁でのC/EBP-βのmRNA発現の程度とMCP-1mRNA発現には極めて良好な正の相関(r=0.90,p<0.001)が認められた。また、クロマチン免疫に沈降法(ChlP assay)にて検討したC/EBP-βのMCP-1遺伝子5'上流域への結合はインスリン抵抗性動物の血管壁において亢進していた。以上のことから、食後の高インスリン血症は血管平滑筋細胞においてPl3キナーゼを活性化を介して転写因子C/EBPの発現を増加させ、MCP-1をはじめとする炎症関連遺伝子の発現を増加させていることが明らかになった。高インスリン血症を呈するインスリン抵抗性動物の血管壁でのインスリンシグナルとインスリンによって誘導される転写因子C/EBP-βの発現およびDNAへの結合活性およびMCP-1発現を食事の前後において検討した。その結果1)インスリン抵抗性動物の血管壁においてP13キナーゼの下流分子であるAKTの燐酸化はむしろ対照に比較して食事の前後で共に亢進していた。2)さらにインスリン抵抗性動物の血管壁において食後のMCP-imRNA発現が九進しており、血清インスリン値とMCP-lmRNA発現が有意な相関を示した。4)Chip assayにて検討したC/EBP-βのMCP-1遺伝子5'上流域への結合はインスリン抵抗性動物の血管壁において亢進していた。以上、血管壁での炎症関連遺伝子の発現に転写因子C/EBPが重要な役割を果たし、食後の高インスリン血症がその活性と相関した。インスリンは転写因子C/EBP-βの発現を介してMCP-1をはじめとする炎症関連遺伝子発現を亢進させていることが明らかになった。食後の血管組織で活性化される遺伝子発現を検討する目的で,培養血管平滑筋細胞を用いてインスリンによる遺伝子発現調節機構として転写因子C/EBP-betaおよびdeltaの遺伝子発現を検討した。インスリンは生理的濃度である10nmol/LにおいてC/EBP-βおよびdeltaのmRNAの発現を増加させ,C/EBPの標的遺伝子であるMCP-1遺伝子の発現をmRNAおよび蛋白のレベルで増加させた。このインスリンによる遺伝子発現調節はP13K阻害剤であるLY294002で完全に抑制された。またchromatin immunoprecipitationassayによりMCP-1遺伝子のプロモーター領域へのC/EBPの結合がインスリンにより増加することが確認できた。さらに,高果糖食ラットでの検討から,高果糖食によって誘導される高インスリン血症の程度と血管壁における転写因子C/EBP-betaおよびdeltaのmRNA発現が有意な正の相関関係を示したこと,一方,血管壁でのC/EBP-βのmRNA発現の程度とMCP-1mRNA発現には極めて良好な正の相関(r=0.90,p<0.001)が認められた。

以上のことから,食後の高インスリン血症は血管平滑筋細胞においてPl3キナーゼを活性化を介して転写因子C/EBPの発現を増加させ,MCP-1をはじめとする炎症関連遺伝子の発現を増加させていることが明らかになった。
ボナンザ型食物資源を利用する昆虫類の生活史適応の解明

本研究はキノコ食昆虫の(1)生活史パターンの地理的変異と(2)存続期間の違う寄主(硬質菌と軟質菌)を利用する種間での生活史比較から、空間的に散在し発生予測が困難なボナンザ型食物資源を利用する昆虫類の生活史適応様式の多様性とその進化経路を解明する。最終年となる本年度は(1)(2)の結果の総括とDacne属の生活史様式の進化について分子系統学的に検討した。(1)シイタケを寄主とするDacne japonicaとD.pictaの岩手と茨城県個体群の生活史を解明した結果、両個体群ともに前種は春繁殖後、翌春まで長期成虫休眠を行う年1化性、後種は成虫と幼虫が越冬休眠を行う年多化性であることが明らかとなり、本属の生活史パターンは気候条件等の影響をほとんど受けないことが予想された。(2)発生後、長期間存続する硬質菌食のD.zonaria, D.maculata, D.fungorumと、短期で消失する軟質菌食のD.japonica, D.picta, D.osawaiの岩手個体群の生活史を解明した結果、硬質菌食の種は成虫期に長期休眠を持つ年1化性であり、軟質菌食の種は1化性から多化性まで種ごとに異なる生活史を持つことが示された。しかし、いずれの種も休眠時期は、変動時期の年次変化が少なく予測が可能な環境変動(夏期、冬期などの季節変動)の時期と一致しているのに対して、移動分散は発生予測が困難な環境変動(餌発生や消失時期など)時に行われることから、食菌性甲虫の「休眠」と「移動分散」が環境変動の予測可能性により使い分けられていることが予想された。また上記6種の系統樹からは、硬質菌食の種と軟質菌食の種はそれぞれ単系統であるがLaetiporus属を利用するD.fungorumと季節により同属菌も利用するD.pictaが系統的に近いこと、生活史と系統間には関係がないことが示され、本属は硬質菌から軟質菌へ食性分化しそれぞれの生活史はそれぞれの餌資源の予測可能性に従って決定されたことが予想された。空間上に散在し、発生予測が困難な食物資源であるボナンザ型食物資源を利用する昆虫類の生活史適応の解明を目標に、菌類の子実体(キノコ)上で繁殖する食菌性甲虫の生活史適応様式について調査を行った。本年度は食菌性昆虫の生活史適応様式の地理的変異について検討するため、茨城県での生活史が既知であるニホンホソオオキノコムシDance japonicaの岩手個体群の生活史について調査した。本種は、夏期にほとんどキノコが発生しない茨城県下では主に春と秋に発生を行うシイタケLentinula edodesを寄主とし、春繁殖後、夏期から翌年春までの長期成虫休眠を行う年1化性の生活史を行う。この生活史制御が夏期の環境条件に対する適応なのか、それとも食物資源であるキノコの発生に対する適応なのか検証するため、夏期が短く低温である岩手県下での本種の生活史を調査し、茨城県個体群との比較を行った。野外調査の結果、岩手県下でもシイタケは茨城と同様に春と秋の2回発生したが、ヒラタケ類などは夏季に多かった。そして、岩手県下でも本種は主に春繁殖を行うが、一部個体が高温長日条件によって生殖休眠覚醒し夏期にも繁殖する部分2化性の生活史を行うことが明らかとなった。また、室内実験の結果、本種の卵から成虫までの発育零点と有効積算温度は、茨城、岩手個体群それぞれで9.9°C・589.8日度、10.2°C・554.3日度とほぼ同様であったが、卵期の発育零点はそれぞれ9.2°C,4.1°Cと岩手個体群で著しく低かった。茨城県と岩手県の積算温量から推察される本種の発生可能回数はそれぞれ3回と2回であることから、いずれの地域においても本種は成虫の生殖休眠により春繁殖するための年間スケジュール調整や発育適応を行っていることが明らかとなった。そして、岩手の個体群では一部の個体が夏期のキノコの発生に繁殖調整をしていることなどから、食菌性昆虫が食物資源の発生時期に合わせるよう生活史制御していること、各地域でのキノコ発生にあわせた地理的変異が存在することが検証された。ボナンザ型食物資源を利用する昆虫類の生活史適応の解明を目標に、菌類の子実体(キノコ)上で繁殖する食菌性甲虫の生活史適応様式について調査を行った。ボナンザ型資源とは、空間上に散在し発生予測が困難な餌資源を指す。本年度は生息パッチの存続期間と昆虫類の生活史適応様式との関係を検討するために、一年のうちごく限られた時期にしか発生しないが、各個体は比較的長持ちするシイタケと、年間の発生期間は長いが、各個体は短期間で劣化・消失するヒラタケ類を利用する食菌性甲虫の生活史適応様式の比較を行った。シイタケを利用する種の生活史特性については、昨年までの調査において、ニホンホソオオキノコムシDacne japonicaとセモンホソオオキノコムシD. pictaの茨城・岩手個体群ならびにD. osawaiの岩手個体群の化性、休眠特性、成虫の移動分散能力などについて解明した。本年度は、ヒラタケ食のシベリアチビオオキノコムシTriplax sibiricaとホソチビオオキノコムシTriplax japonicaの生活史特性を調査し、シイタケ食種との間で生活史特性を比較した。

その結果、ヒラタケ類を利用する両種の幼虫はシイタケ食種と比べて非常に早く発育するが休眠を持たないこと、成虫は越冬休眠を持つが長日下での飢餓耐性能力は低いことが明らかとなり、野外では年間を通して発生・消失を繰り返す餌資源間を移動しつつ繁殖する年多化性の生活史を持つことが示唆された。これらのことから、オオキノコムシ類は、発生予測が困難な餌資源の発生・消失に対しては移動分散、予測可能性の高い季節変動に対しては休眠によって対処していることが明らかとなり、オオキノコムシ類の生活史の概要が環境変動の予測可能性により「休眠」と「移動分散」が使い分けられるとされる生活史鋳型仮説(Southwood,1977)により説明可能であることが示唆された。本研究はキノコ食昆虫の(1)生活史パターンの地理的変異と(2)存続期間の違う寄主(硬質菌と軟質菌)を利用する種間での生活史比較から、空間的に散在し発生予測が困難なボナンザ型食物資源を利用する昆虫類の生活史適応様式の多様性とその進化経路を解明する。最終年となる本年度は(1)(2)の結果の総括とDacne属の生活史様式の進化について分子系統学的に検討した。(1)シイタケを寄主とするDacne japonicaとD.pictaの岩手と茨城県個体群の生活史を解明した結果、両個体群ともに前種は春繁殖後、翌春まで長期成虫休眠を行う年1化性、後種は成虫と幼虫が越冬休眠を行う年多化性であることが明らかとなり、本属の生活史パターンは気候条件等の影響をほとんど受けないことが予想された。(2)発生後、長期間存続する硬質菌食のD.zonaria, D.maculata, D.fungorumと、短期で消失する軟質菌食のD.japonica, D.picta, D.osawaiの岩手個体群の生活史を解明した結果、硬質菌食の種は成虫期に長期休眠を持つ年1化性であり、軟質菌食の種は1化性から多化性まで種ごとに異なる生活史を持つことが示された。しかし、いずれの種も休眠時期は、変動時期の年次変化が少なく予測が可能な環境変動(夏期、冬期などの季節変動)の時期と一致しているのに対して、移動分散は発生予測が困難な環境変動(餌発生や消失時期など)時に行われることから、食菌性甲虫の「休眠」と「移動分散」が環境変動の予測可能性により使い分けられていることが予想された。また上記6種の系統樹からは、硬質菌食の種と軟質菌食の種はそれぞれ単系統であるがLaetiporus属を利用するD.fungorumと季節により同属菌も利用するD.pictaが系統的に近いこと、生活史と系統間には関係がないことが示され、本属は硬質菌から軟質菌へ食性分化しそれぞれの生活史はそれぞれの餌資源の予測可能性に従って決定されたことが予想された。
周手術期看護の基礎的知識獲得を支援するコンピュータ学習教材(CAI)の開発

15年度の文献検討より、周手術期実習において手術・麻酔侵襲により急性状況にある患者の身体的変化の理解、および術後急性期にある患者の観察項目の理解について特に基礎看護教育課程の学生は困難を抱えていることが明確になった。これより今年度本研究では、手術侵襲・麻酔侵襲による生体反応、および周手術期のアセスメント・看護の要点の学習を目的とした学習教材の構成(コースウェアフローチャート)および各フレームを作成した。教材の具体的教授内容は、(1)手術侵襲のタイプ、(2)手術侵襲からの回復過程を示したMooreの4分類、(3)侵襲に対する神経・内分泌系反応、(4)侵襲に対する代謝系反応、(5)侵襲に対するサイトカインの働き、(6)術後急性期のアセスメントポイント、(7)術後急性期の看護のポイント、の計7項目であり、モデルによる手術後の患者状況設定映像を含む画像を数多く取り入れることで、理解を促すよう配慮した。教材は各項目の質問と解説、および誤答ごとのコメント表示を挿入した解説分岐が含まれ、全40フレーム余りで構成されている。教材は今後の汎用性を考慮し、html形式で作成した。Html形式は教材利用者が学習項目を随時選択して実施することが可能であり、また前後のフレームに自在に行き来できることが利点であるが、一方で学習履歴の分析が困難であり、この点については今後の課題となっている。CAI教材を看護基礎教育に導入している岐阜大学医学部看護学科視察より、学生が実習前に手術に関連したCAI教材を導入し自己学習することで、手術室入室オリエンテーションにおいても人的・時間的資源の削減につながるという効果の実践報告を得た。このことから、今後本研究で作成した教材の学習効果を検証するとともに、e-learningを視野に入れた多機関での教材共同開発・教材共有を行うことで、基礎教育過程の教育効果に寄与するものと考える。15年度は、看護基礎教育過程において周手術期看護を実践する上で必要と考えられる知識について文献検討により抽出する作業を主として行った。周手術期実習において学生が困難に感じることを調査した先行研究では、手術・麻酔侵襲により急性状況にある患者の身体状況の変化について行けない感を抱く、あるいは急性期の患者を眼前に観察の要領を得ない、などの点が指摘されていた。特に基礎教育課程の学生は、病態や侵襲と患者の身体所見とを関連させることが困難であることが挙げられており、このことから手術侵襲、術式、麻酔と患者の身体状態との関連、患者の主訴、全身のアセスメント内容及び検査データから患者の情報と病態との関連を考えさせることの重要性が示唆された。これに対し、手術室見学演習を取り入れ、患者の侵襲を理解し共感を高めたとする調査、術直後の患者を実習室でシミュレーションし、学生がその場でケアを検討する試みの効果を検討した調査報告が示されており、教育現場での教授方法の工夫が伺えた。術後の患者問題を理解していることが、実習の場において学生の能力発揮、実習意欲の向上に繋がることも指摘されており、侵襲に対する生体反応への理解を強化する教材の必要性が示唆された。一方わが国で現在利用可能な周手術期看護に関するCAIは、竹内らによる術後呼吸器系合併症に関するもの、手術室入室手順を扱ったもののみであった。以上より、本研究では特に手術・麻酔侵襲に対する生体反応を患者の反応と関連させて理解することに焦点をあてた看護CAIを作成することとした。
アジア経済発展とグローバル化に伴う新たな畜産・食品リスクと効果的制御法の開発

アジアでは急速な経済発展とそれに伴う畜産物需要の増加により、畜産物の生産・流通構造はダイナミックに変化している。各国において家畜衛生・食品衛生政策の拡充が進められてきたが、屠場や小売レベルの衛生管理は限定的で、価格や費用を重視した機会主義的な取引が行われていることが明らかとなった。食品衛生に対する国民の関心は、農薬や化学肥料、食品添加物等に対する懸念が大きく、一方で微生物についてはリスクを小さく見積もる傾向があることが示された。本研究の目的は,東南アジアにおける近年の国内外畜産物流通構造の変化と,それに伴う食品リスクへの影響について整理することにある。経済発展に伴う畜産物需要の高まりが見られる東南アジアにおいて,家畜や畜産物の国境を越えた移動にもダイナミックな変化が見られる。バンコクOIE事務所に本部をおくSEACFMD(東南アジア・中国口蹄疫キャンペーン)やベトナムの屠畜業者(牛流通業者)および家畜衛生局へのヒアリング,既往文献やSEACFMD関連プロジェクトの成果報告書によれば,本研究で対象としている牛の流通についてみると,90年代中頃には比較的発展段階の高いタイやマレーシアへ向けた移動が主流であったが,近年は西方(ミャンマー以西)からベトナムや中国など沿岸地域へ向けた移動が活発化している。フエ市のある屠畜業者は,2006年に仕入れ先をラオスへ,2008年にはタイへと広域化を進めていた。背景には,牛肉への需要の高まり,内外価格差と家畜のサイズの違いがある。1頭の屠畜に係る手間は大きく変わらず,また販売時に畜種の違いを示す手段も確立されていないことから,屠畜業者にとって枝肉重量の大きい外来種の方が利益は大きくなる。食品リスクの指標として取り上げた病原性大腸菌の検出については,6月にフエ及びハノイの屠畜場で計10頭,9月に53頭の検体(糞および枝肉表面拭取)を採取し,O157の分離を試みたが見つけられなかった。一方で,stxl遺伝子は約50%の糞と10%以上の枝肉表面から,stx2遺伝子も数検体から分離された。本研究の目的は,東アジア・東南アジアにおける近年の国内外畜産物流通構造の変化と,それに伴う畜産・食品リスクへの影響について整理することである。経済発展に伴う畜産物需要の高まりがみられる東アジア・東南アジアにおいて,家畜や畜産物の国境を越えた移動にもダイナミックな変化が見られる。平成23年度は,ベトナムとカンボジアおよびラオス国境における家畜の移動や検疫について,現地調査に基づく情報収集を行なった。また,フエ市内のと畜場で牛152頭(3業者)の糞便及び枝肉から病原性大腸菌の分離を試みた。Stx1遺伝子とStx2遺伝子は,いずれも約30%の牛の糞から検出され,その出現率はベトナム原産の黄牛と西方(タイなど)から輸入されるブラーマン種の間に差はみられないものの,比較的大型の家畜を扱う業者で汚染率が高かった。一方,枝肉の汚染率はStx1が6.6%,Stx2が5.3%であった。同地域では,2-3月にかけて,フエ市民(300名)を対象に,食肉衛生とリスク認知,食習慣等に関するアンケート調査を対面で実施した。また,2010年に日本国内および韓国で問題化した口蹄疫について,アジアでの対策をフォローする研究の一環として,台湾における口蹄疫対策について97年の大規模発生以降の畜産政策と家畜衛生政策について整理するとともに,養豚農家100名を対象にアンケート調査を実施し,現在の口蹄疫対策(強制的ワクチン接種と,サーベイランスの実施,ワクチンへの補助,ワクチン接種証明書の発行によるワクチン接種の担保等)の効率性について複数の政策オプションについて対策費のシミュレーションを行った。その結果,ワクチン接種時期を早めるための啓蒙キャンペーンの有効性を示唆する結果を得た。東南アジアにおける食肉需要の増加に伴い、畜産物の生産・流通構造はダイナミックに変化している。ベトナムでは特に近年の経済発展に伴う牛肉需要の増加に対応するため、タイやラオスからの陸路による輸入が急増し、これに伴う家畜疾病や食品衛生の問題が懸念されている。今年度はベトナムの牛肉流通について引き続き調査を行うとともに、タイの国内での牛肉生産および流通構造の変化について把握するため、現地ヒアリングとアンケート調査を実施した。この結果、タイ中部においてもベトナムや中国、マレーシアから多くの流通業者が牛を買い付けにくること、取引価格は、タイ国内に比べ周辺諸国が高いことから機会主義的な取引が行われていることが明らかとなった。また、ベトナムでは、昨年実施したアンケートに加え、食中毒の経験やその際の個人対応、医療システムについて調査項目を加え、食学生の子供を持つ母親約200名に対して調査を行った。タイでは、ベトナムと同様の調査票を用いて、牛肉生産者、流通業者、屠畜業者および消費者を対象にアンケートを実施した。これまでの調査結果をもとに現場の獣医師や研究者と実施した意見交換会からは、ASEAN諸国で共通の畜産物品質保証制度の必要性が指摘された。ベトナム国内での牛肉卸売業者へのヒアリングから、2007年以降タイやラオスからの牛の生体での買い入れが増加していることが示されたた。

タイやラオスから家畜を移動させる際の国境での手続きや国境を越えての移動に必要な書類等、輸出国での手続きについて確認するため、ベトナム国内の卸売業者を追跡した。その際にタイの家畜市場での家畜の購入から移動に係る手続き、国境検疫の手順についてヒアリング調査および視察を行った。ベトナム人が食肉衛生についてどのように把握しているかを確認するため、400人を対象に対面でのアンケート調査を実施した。調査票は、ベトナムの研究者と意見交換をしながら英語で用意し、これをベトナム語に翻訳した。第1回の調査では、英語版の調査票を利用して調査を行った調査員がいたため、調査員間での質問にばらつきが生じたため、再調査を必要とした。再調査の際は、すべてベトナム語ですることとし、調査員を教育して調査を実施した。アンケートの対象は、獣医師、屠畜業者、小売業者、食肉卸売業者、子供を持つ母親、農学部の大学生、農学部以外の大学生とした。調査結果から、微生物由来の食肉に由来するハザードによるリスクは、加熱することで回避することができると認識されていること、残留農薬や食品添加物など化学物質に由来するリスクを高く認識していることが示された。屠畜場や小売の現場での食肉衛生検査に関する調査は、現地の研究者が長期不在であったためH24年度に実施することができなかった。この点については、予算を繰り越し、H25年度に実施する。また、韓国における近年の牛肉産業の展開と生産者の衛生意識に関する調査も実施した。ベトナム国内での腸管出血性大腸菌O157の分離に成功していない。他の研究グループでは分離されているため,技術的問題と,サンプリングを行う地域や時期が異なる点が理由として考えられる。25年度が最終年度であるため、記入しない。2012年度は、ベトナム国内での研究協力者がH24年度は長期間不在であり、その間の代理人も辞職してしまったため、ベトナム国内での食肉衛生検査を行うことができなかった。また、市民のリスク認知に関する調査では、ベトナム語に翻訳した調査票を利用せず、英語版を利用した者がいたことから、回答状況にばらつきが大きく、再調査を必要とした。これらについては2013年度に実施することができた。屠畜場での糞便・枝肉からのO157(あるいは他のEHEC)分離については,引き続き行う。屠場での糞便から枝肉への汚染は限定的であると考えられ,小売店にサンプリングを広げても,汚染率は低いと考えられる。したがって,別の屠場を含め,屠場でのサンプリングと菌の分離を引き続き行い,小売レベルへの拡張は,屠場での菌の分離後に着手する。H23年度に実施したアンケート調査は,食肉流通業者と獣医師や研究者など専門家の調査を拡充する。平成25年度が最終年度のため記載しない
リチウムイオンの挿入・脱離に伴う酸化物電極の結晶構造変化および電子構造変化

スピネル型酸化物であるLiMn_2O_4の充電過程における結晶構造の変化をX線回折パターンに対するリ-トベルト法により詳細に検討した結果、リチウムの脱離に伴い分解反応がわずかであるが生じることを明らかにした。また、この分解反応が主にMnイオンの状態変化と関係していることを示した。すなわち、Mnイオンの溶出が生じていることを明らかにした。また、電子スピン共鳴法を用いて調べた結果、Mn^<2+>イオンの生成が確認され、Mnイオンの関与した分解反応が生じていることが分かった。この結果はリ-トベルト解析により得られた結果と一致していた。次に、このような分解反応を抑制するために、結晶構造を安定化させることが必要であると考え、超格子構造の導入によるスピネル結晶の安定化を試みた。本研究では、Li_<4/3>Mn_<5/3>O_4の組成を有するスピネルMn酸化物の合成を行った。その結果、500°C付近の温度で酸素雰囲気下で焼成することにより、LiイオンとMnイオンが規則的に配列した超格子構造を有するスピネル型Mn酸化物の合成に成功した。この化合物へのリチウムの挿入・脱離反応についてX線回折法により調べた結果、結晶構造が無限小に抑制されていることが分かった。また、上述の分解反応も生じていないことがX線回折法および電子スピン共鳴法により分かった。さらに、電気化学的に重要な因子である電極電位のリチウム挿入・脱離に伴う変化を調べた結果、リチウム組成に依存せず、ほぼ一定の値を示すことが分かった。すなわち、超格子構造を持たないスピネル型酸化物に比較して、超格子構造を有するスピネル型酸化物が、リチウムの挿入・脱離に対してより高い安定性を示すことを明らかにした。このような結果は、これまでにまったく報告例がなく、本研究において始めて明らかになった事実であり、リチウムの挿入・脱離反応に対する新規の合成指針を示すことができた。遷移金属酸化物中へのリチウムの挿入あるいはそれからの脱離反応は、エネルギー貯蔵の観点から重要であり多くの研究がなされてきている。本研究においては、特に結晶構造と電子構造を関連させてリチウムの挿入・脱離反応を明らかにすることを目的としている。本年度はスピネル型の結晶構造を有し電子構造と結晶構造の相関が強いと考えられるLiMn_2O_4を用いてリチウムの脱離に伴う結晶構造変化をX線回折法により、また電子構造を電子スピン共鳴法を用いて調べた。リチウムの脱離に伴う構造変化についてリ-トベルト解析を用いて格子定数の精密決定を行ったところ、これまでには観測さていなかった格子定数の変化をとらえることができた。この結果、新規の構造変化を提案した。一方、電子構造について電子スピン共鳴法を用いて研究を行った結果リチウムの脱離に伴うMnイオンのスピン変化を測定することができた。この点については、現在理論的なモデルから考察を行っている。さらに、非常に興味深い発見として、電子構造的に独立したMn^<2+>に帰属されるピークを観測し、この結果を基に新規に提唱した結晶構造変化が妥当性の高いものであることがわかった。また、これらの結果からスピネルLiMn_2O_4のリチウムの脱離に伴う固相反応について、これまでに報告さていない新しい現象を発見した。ここで得た結果はエネルギー材料としてのスピネルLiMn_2O_4にとり重要な知見である。

他の遷移金属酸化物についてもX線回折と電子スピン共鳴の測定を並行して行うことにより、これまでに見いだされていない物性変化をとらえることができるものと期待している。スピネル型酸化物のリチウム挿入・脱離反応の解析をX線回折法および電子スピン共鳴法を用いて調べてきた結果、Mn系のスピネル系材料では、リチウムの挿入あるいは脱離により結晶構造が不安定化することを報告してきた。このような結晶の不安定化を取り除くために、新規のスピネル型酸化物材料の開発を行った。スピネル型酸化物の一つの特徴としてカチオンのオーダリングがある。このオーダリングは結晶をより安定化する方向に作用するため、前述の結晶の不安定化を抑制できる可能性がある。そこで、Li_<4/3>M_<5/3>O_4の組成を有するMnやTiの酸化物を合成した。これらの材料では16dと呼ばれるカチオンサイトにLiとMが存在し、これらが規則正しく配列していることをX線回折により確認した。この材料のリチウムの挿入・脱離反応についてX線回折法および電子スピン共鳴法を用いた調べた。また、電気化学的な挙動として一定の速度でリチウムを固体内に挿入した時の電位の変化について測定した。結晶構造的に見ると、このようなカチオン配列を有する材料は、リチウムの挿入・脱離による構造変化が非常に小さく、また、電子スピン共鳴により通常のMn系のスピネル酸化物において見られた分解に関するピークは観測されなかった。また、電気化学的には非常に平坦な電位変化を示し、リチウムの挿入・脱離に伴う自由エネルギー変化が非常に小さいことがわかった。このような挙動はMn系だけでなくTi系においても観測された。このように、通常のスピネル酸化物では考えられないいくつかの特筆すべき性質がカチオンの規則的な配列を構造内に導入することにより引き出されることがわかった。
強い層間結合と垂直磁気異方性をあわせ持つ磁性人工格子薄膜の研究

磁性金属と非磁性金属からなる人工格子に広く見られる2つの磁気的な性質、すなわち隣り合う強磁性層に生じる層間交換結合と、形状磁気異方性よりも大きな磁気異方性に関する研究を行った。本研究ではこれら二つの性質が顕著に表れる系として、Co/Rh人工格子を選んだ。MBE法を用いて、Co/Rh(001)および(111)人工格子をエピタキシャル成長させたものを試料とした。Rh層厚に依存した磁気層間結合とCo層厚に依存した磁気異方性を調べるため、RhおよびCo層厚を楔状に変化させた人工格子膜を作製し、SQUID磁力計を用いて磁化曲線を測定した。どちらの成長方向でも強い層間結合を観測した。またCo/Rh(111)の試料においては、Co層厚が12Å以下の時に垂直磁化膜となることを見いだした。この磁気異方性の主たる原因が、Co/Rh界面での対称性の低下によるものなのかあるいは、Co/Rhに存在する大きな格子不整合(約7%)による格子歪みであるのか明らかにするため、以下に述べるような定量的な議論をおこなった。RHEEDパターンのストリーク間隔は、成長面の格子定数に比例するため、この変化を捉えることにより膜面内の格子定数の変化を調べた。Co/Rh界面における合金化は無視できるほど小さいことから、RHEEDパターンから得られた格子歪みとその緩和過程および、既知のCoの磁気弾性定数を用いて、垂直磁気異方性のCo層厚依存性が再現できることを示した。その結果、すくなくともCo/Rhに関しては界面における磁気異方性は小さく、格子歪みにより磁気弾性結合を通じて生じる異方性が支配的であることが分かった。本年度は強い磁気層間結合を持つCo/Rh系多層膜作製を行い、その磁気異方性を中心に調べた。この系では格子定数の差が7%程度あり、エピタキシャル成長させた磁性膜では磁性層内の歪みが寄与した磁気異方性の出現が期待できる。まず作製中の格子定数の変化をとらえるために反射高速電子線回折(RHEED)の整備を行った。電子線源やスクリーン等はすでに装置に配備されているが基板ヒーターを商用交流周波数で加熱していたため、電子線が加熱電源の電流が作る磁場により回折像が影響を受けて明確な像を得られなかった。このため電源を直流化する基板加熱制御系改良を実施し、交流磁場の影響を小さくした。この結果、Co層の基板垂直方向の格子定数の変化をより精度良く求めることができた。次ぎに(111)面に成長させた多層膜についてRh層厚を変化させ磁気異方性の情報を詳細に得た。まずCo層厚を7Å付近に設定しRh層厚をくさび状に変化させた試料を作り、磁化曲線から層間結合を調べた。その結果、7Åと18Åに反強磁性結合の極大を観測し、加えて磁化容易軸が基板に垂直方向となる正の垂直磁気異方性を確認した。そこで強磁性結合を示すRh膜厚を選び、Co層厚を変化させたくさび状膜を作製した。磁気異方性の大きさを求めて界面部分と体積部分の寄与に分離した。この結果、Co層厚が薄い場合、体積寄与と界面寄与には単純に分離することが不可能だった。RHEED観測から求めた結晶歪みによる誘導磁気異方性を取り入れたところ、磁気異方性の振る舞いをバルクの物理定数を用いて調節パラメーター無しに説明することができた。結果を順次公表中である。

MBE法を用いて、Co/Rh(001)および(111)人工格子をエピタキシャル成長させたものを試料とした。Rh層厚に依存した磁気層間結合とCo層厚に依存した磁気異方性を調べるため、RhおよびCo層厚を楔状に変化させた人工格子膜を作製し、SQUID磁力計を用いて磁化曲線を測定した。どちらの成長方向でも強い層間結合を観測した。またCo/Rh(111)の試料においては、Co層厚が12Å以下の時に垂直磁化膜となることを見いだした。この磁気異方性の主たる原因が、Co/Rh界面での対称性の低下によるものなのかあるいは、Co/Rhに存在する大きな格子不整合(約7%)による格子歪みであるのか明らかにするため、以下に述べるような定量的な議論をおこなった。RHEEDパターンのストリーク間隔は、成長面の格子定数に比例するため、この変化を捉えることにより膜面内の格子定数の変化を調べた。Co/Rh界面における合金化は無視できるほど小さいことから、RHEEDパターンから得られた格子歪みとその緩和過程および、既知のCoの磁気弾性定数を用いて、垂直磁気異方性のCo層厚依存性が再現できることを示した。その結果、すくなくともCo/Rhに関しては界面における磁気異方性は小さく、格子歪みにより磁気弾性結合を通じて生じる異方性が支配的であることが分かった。
画像の構造認識のための記述言語の設計とそのハードウェアシステム化

可変スリット法という新しい図形の特徴抽出方式を提案し、そのハードウェアシステムの作成、ファームウェアの作成、特徴抽出ソフトウェアパッケージの作成、図形構造の記述からソフトウェアを起動し、さらにファームウェア、ハードウェアの起動が出来るシステムの作成を行い、システムを完成した。このシステムを用いて、種々の単純な図形の認識を行った。その1つは図形の境界線をたどることによって図形認識を行うものであり、他は2次元標準図形のマッチングによって認識を行うものである。ハードウェアシステムは特殊な構造であるため、その回路動作の正常動作のチェック、調整に少し時間がかかったが、60年の夏からあとは安定に動作している。このハードウェアシステムはSM7という画像処理用コンピュータシステムにつながれており、このSM7に図形の特徴抽出のサブルーチンパッケージが作られている。このSM7はさらにLISPマシンSymbolics 3600に接続されていて、図形の構造記述とその認識プロセスは、このLISPマシンで行われる。この図形認識のプロセスは、図形特徴の抽出のためのSM7上のサブルーチンを駆動し、その結果の情報をSM7から得て図形の認識を行うという形になっている。認識を行った図形は、3角形、4角形、スパナ、ボルト、ナットなどの比較的単純な図形のほかに、回路図面、機械の設計図面、手書きの線図などであり、折線の精度を決めれば、その精度で簡単に線図形の認識が行えることを確認した。このシステムのハードウェアの設計・製作は株式会社東芝、アジアエレクトロニクスと共同で行い、信頼性の高い装置を比較的短期間で作ることが出来た。現在他の企業でこの原理による装置の製作が検討されている。
血管奇形に対する冷凍療法についての第I/II相臨床試験

前向き臨床試験として、血管腫血管奇形に対する凍結療法の安全性確認試験を行った。プロトコールの予定通り9例の症例登録を行った。登録された症例はいずれも静脈奇形で、骨盤病変が1例、残り8例は下肢病変であった。全例大きな合併症無く、問題なく凍結治療を完遂できた。治療後には一時的に局所の腫脹や疼痛がみられたが、保存的に改善している。治療効果は良好で、全例で著明な疼痛の改善効果を認めた。治療前のVASは平均で6.3であったが、治療1ヶ月後には2.5まで低下した。また、治療3ヵ月後には0.4まで低下した。さらに、全例で縮小効果も認められた。小病変で全体を凍結できた6症例では、病変がほぼ消失した。疼痛や腫脹等の症状を有する血管奇形に対して凍結治療を施行し、その安全性を評価する臨床試験を行っている。現在2症例の静脈奇形に対して凍結療法を実施している。1例目の症例では疼痛が消失し、著明な症状の改善が得られている。MRI上も病変は縮小し、治療効果は良好である。2例目は治療施行後間もないため、1週間後の経過観察を行った段階であるが、2例目においても疼痛の改善が得られている。今後残存している疼痛がさらに改善していくことが期待できる。2例ともに重篤な有害事象は認めていない。現在3例目の治療予定が計画されており、症例の集積は徐々に進行している。血管奇形に対する治療法としては、従来より外科的切除や経皮的硬化療法が行われてきた。外科的切除では、深部への浸潤症例では、切除による侵襲が大きくなり、術後の機能障害や整容に問題を生じることがある。経皮的硬化療法では、硬化剤の病変内への注入により、疼痛の改善や縮小効果が得られるが、十分な治療効果を得られにくい症例も少なくない。このような治療背景より、安全でより治療効果の高い新しい治療方法が臨床的に必要とされている。凍結療法は治療時の疼痛も少なく、血管奇形により生じる疼痛の改善ならびに腫脹の改善の両者に関して非常に良好な治療効果を得られる可能性があり、有望な治療法として期待されている。今後も症例の集積を継続し、その安全性についての評価を継続していく。現在7症例の静脈奇形に対して凍結療法を実施している。重篤な合併症が起きていないかどうか3例施行する毎に1ヶ月の登録休止期間を設定して運用しているが、大きな合併症なく順調に7例の治療が完遂している。全例有症状の症例を登録しているが、疼痛に関しては全例で著明な疼痛改善を得られている。病変の縮小に関しても良好な結果が出ており、辺縁にわずかな残存病変を認める症例もあるが、良好な縮小効果も期待できている。外科的切除は、深部への浸潤症例では、切除による侵襲が大きくなり、術後の機能障害や整容に問題を生じることがある。凍結療法は治療時の疼痛も少なく、血管奇形により生じる疼痛の改善ならびに腫脹の改善の両者に関して非常に良好な治療効果を得られることが期待され、有望な治療法として注目されている。試験終了の9例まで、あと2例の追加登録をすでに予定しており、27年度中に登録は完了する見込みである。3例登録する毎に、1ヶ月の登録休止期間を設定し、安全面にも配慮しながら試験を進めた。重篤な有害事象は認められず、1例の入院症例を除いて、8例は外来で治療が行われた。治療後に局所の腫脹や疼痛がみられた。2例にCTCAE ver4.0でgrade2の疼痛を生じたが、保存的に改善している。他には、凍結治療中に一過性の神経症状(足の可動制限)を生じた症例を認めたが、凍結を中止すると症状の改善がみられた。治療前のVAS scoreは平均で6.3であったが、治療1ヶ月後には2.5まで低下した。大きな病変で、一部のみを治療した症例では縮小効果は限定的であったが、小病変で全体を凍結できた症例では、病変がほぼ消失した症例も6例認められた。このように、従来の治療法では考えられない優れた治療効果を得ることが出来た。予定されている9例の症例登録は修了し、経過観察も修了している。安全性も確認され、有効な治療効果も確認された。

研究結果は学会発表を行い、続いて論文作成に取り掛かっている。前向き臨床試験として、血管腫血管奇形に対する凍結療法の安全性確認試験を行った。プロトコールの予定通り9例の症例登録を行った。3例登録する毎に、1ヶ月の登録休止期間を設定し、安全面にも配慮しながら試験を進めた。登録された症例はいずれも静脈奇形で、骨盤病変が1例、残り8例は下肢病変であった。全例大きな合併症無く、問題なく凍結治療を完遂できた。重篤な有害事象は認められず、1例の入院症例を除いて、8例は外来で治療が行われた。治療後に局所の腫脹や疼痛がみられた。2例にCTCAE ver4.0でgrade2の疼痛を生じたが、保存的に改善している。他には、凍結治療中に一過性の神経症状(足の可動制限)を生じた症例を認めたが、凍結を中止すると症状の改善がみられた。治療効果は良好で、全例で著明な疼痛の改善効果を認めた。治療前のVAS scoreは平均で6.3であったが、治療1ヶ月後には2.5まで低下した。また、治療3ヵ月後には0.4まで低下した。さらに、全例で縮小効果も認められた。大きな病変で、一部のみを治療した症例では縮小効果は限定的であったが、小病変で全体を凍結できた症例では、病変がほぼ消失した症例も6例認められた。このように、従来の治療法では考えられない優れた治療効果を得ることが出来た。治療後には一時的に局所の腫脹や疼痛がみられたが、保存的に改善している。治療前のVASは平均で6.3であったが、治療1ヶ月後には2.5まで低下した。小病変で全体を凍結できた6症例では、病変がほぼ消失した。登録予定症例数は9例であり、現在8例登録され、あと1例を残すのみとなっている。研究結果をまとめ、論文作成し投稿する。9例目予定症例がキャンセルとなったため、最後の1例の登録をすすめる研究費用の額より、治療に用いる凍結針を購入する本数が大きく制限されることがわかった。当初予定していた症例数を完遂することが難しい状況であり、倫理委員会に申請する書式の内容検討時間を要した。このため、症例登録の開始が半年以上遅れ、症例登録数は計画よりもやや遅れて進行している。研究は順調に進行しており、最終年度は研究内容の発表段階に来ている。最終年度には研究内容の発表及び論文作成費用が発生する。予定していた治療が延期になり凍結針の購入も次年度にくりこしている研究内容の発表に使用する旅費ならびに論文作成にかかる費用を使用する予定である。臨床試験の計画内容に一部修正を行い、I相試験部分のみを完遂するように変更する針の購入を予定している。
ヒト血管平滑筋における酸素感受性イオンチャネルに関する研究

ヒト臍帯動脈から酵素処理により血管平滑筋細胞を作成し低酸素,高酸素での差電流から酸素感受性イオンチャネルを推定する手法を用いた.着目したイオン電流はCa電流とK電流である.1.臍帯動脈から分離した単一平滑筋細胞を用いてパッチクランプ法(全細胞型)を応用し,血管の収縮に重要な役割を果たすCa電流とK電流の酸素感受性を調べた.2.まずCa電流であるが,電流が小さく評価困難なためCaチャネルを通過するイオンとして30mMBa^<2+>を用いた.外液に100%N_2をバブリング還流液から100%O_2をバブリングした還流液に変えてもBa電流は変化しなかった.3.続いてK電流の酸素感受性を調べた.外液を100%N_2バブリング還流液から100%O_2バブリング還流液にかえたところ,外向き電流が減少した.この差電流はATP感受性Kチャネル阻害剤であるグリベンクラマイドほぼ完全に抑制され,臍帯動脈に存在する酸素感受性イオンチャネルにATP感受性Kチャネルが含まれている可能性が示唆された.以上のようにヒト臍帯動脈血管平滑筋を用い,その酸素感受性につき検討した結果,ATP感受性Kチャネルが重要な役割を演じている可能性が示唆された.今後さらに研究を継続し,血管の収縮に貢献するNa-Ca交換輸送に酸素感受性が存在するか否かについても検討を加えていきたい.ヒト臍帯動脈から酵素処理により血管平滑筋細胞を作成し低酸素,高酸素での差電流から酸素感受性イオンチャネルを推定する手法を用いた.着目したイオン電流はCa電流とK電流である.1.臍帯動脈から分離した単一平滑筋細胞を用いてパッチクランプ法(全細胞型)を応用し,血管の収縮に重要な役割を果たすCa電流とK電流の酸素感受性を調べた.2.まずCa電流であるが,電流が小さく評価困難なためCaチャネルを通過するイオンとして30mMBa^<2+>を用いた.外液に100%N_2をバブリング還流液から100%O_2をバブリングした還流液に変えてもBa電流は変化しなかった.3.続いてK電流の酸素感受性を調べた.外液を100%N_2バブリング還流液から100%O_2バブリング還流液にかえたところ,外向き電流が減少した.この差電流はATP感受性Kチャネル阻害剤であるグリベンクラマイドほぼ完全に抑制され,臍帯動脈に存在する酸素感受性イオンチャネルにATP感受性Kチャネルが含まれている可能性が示唆された.以上のようにヒト臍帯動脈血管平滑筋を用い,その酸素感受性につき検討した結果,ATP感受性Kチャネルが重要な役割を演じている可能性が示唆された.今後さらに研究を継続し,血管の収縮に貢献するNa-Ca交換輸送に酸素感受性が存在するか否かについても検討を加えていきたい.研究テーマであるヒト臍帯動脈を用いての血管平滑筋における酸素感受性イオンチャネルに関して平成14年度の研究成果は以下のように要約できる。1)学内倫理委員会からヒト臍帯動脈を研究に供してもよいという許可を得て、これまで5家族から新生児娩出後の臍帯動脈を実験に供した。2)臍帯から臍帯動脈を剥離し、酵素処理により単一血管平滑筋細胞を分離した。3)パッチクランプ法(全細胞型実験)を用いて臍帯動脈血管平滑筋細胞に存在するイオンチャネル電流を測定した。臍帯動脈血管平滑筋細胞にはCa電流、ATP感受性K電流等のイオンチャネルが存在することを確認できた。4)さらに、Ca電流、ATP感受性K電流は酸素により変化(増加あるいは減少)することが確認された。当初の計画では臍帯動脈の成熟度(妊娠週数)によるイオンチャネル電流の変化等についても研究を進める予定でいたが、症例が集まらず本年度の研究では行なうことが出来なかった。また、各種チャネル阻害薬等を用いて酸素によりイオンチャネル電流が変化するメカニズムに関しても推論を進める予定であったが、本年度は十分な検討を加えることが出来なかった。これら本年度に遂行できなかった研究を次年度に繰り越し研究を継続する予定である。加えて、平成15年度の研究ではsingle-channel手法を用いてより詳細な検討を加えていく予定である。ヒト臍帯動脈から酵素処理により血管平滑筋細胞を作成し低酸素,高酸素での差電流から酸素感受性イオンチャネルを推定する手法を用いた.着目したイオン電流はCa電流とK電流である.1)帝王切開で出生した新生児につながる臍帯から約3cmほど切除し,実体顕微鏡下で臍帯動脈を剥離した.臍帯動脈に付着するゼリーをきれいに取り除き酵素処理により単一平滑筋細胞を分離した.2)分離した単一平滑筋細胞を用いてパッチクランプ法(全細胞型)を応用し,血管の収縮に重要な役割を果たすCa電流とK電流の酸素感受性を調べた.3)まずCa電流であるが,電流が小さく評価困難なためCaチャネルを通過するイオンとして30mMBa^<2+>を用いた.外液に100%N_2をバブリング還流液から100%O_2をバブリングした還流液に変えてもBa電流は変化しなかった.4)続いてK電流の酸素感受性を調べた.外液を100%N_2バブリング還流液から100%O_2バブリング還流液にかえたところ,外向き電流が減少した.

この差電流はATP感受性Kチャネル阻害剤であるグリベンクラマイドほぼ完全に抑制され,臍帯動脈に存在する酸素感受性イオンチャネルにATP感受性Kチャネルが含まれている可能性が示唆された.以上のようにヒト臍帯動脈血管平滑筋を用い,その酸素感受性につき検討した結果ATP感受性Kチャネルが重要な役割を演じている可能性が示唆された.
微小管ダイナミクスと細胞極性・遊走の制御機構

本研究ではRhoファミリーやそのエフェクター分子(Rho-kinaseやMBSなど)による微小管やアクチン線維の再編成、細胞の極性形成機構や遊走機構を明らかにすることを目的とした。細胞の極性化の過程において小胞輸送が重要な役割を果たすことが知られている。これまでに、Rhoのエフェクター分子であるRho-kinaseがミオシンフォスファターゼや微小管結合蛋白質(Tau,MAP2など)を介してアクチン細胞骨格や微小管の再構築を制御していることを示してきたが、小胞輸送におけるRho-kinaseの役割は明らかではなかった。EGF受容体はリガンドと結合後エンドサイトーシスにより細胞内に移行し分解されるが、ドミナントアクティブ型RhoによりEGF受容体の取り込みが抑制されることが既に報告されている。今回、ドミナントアクティブ型Rhoと共にドミナントネガティブ型Rho-kinaseを発現させたところ、ドミナントアクティブ型RhoによるEGF受容体の取り込み抑制が部分的に回復した。このことより、Rhoの下流でRho-kinaseがエンドサイトーシスの制御に関わっていることが示された。そこで、小胞輸送に関わるRho-kinaseの新規基質分子の探索を行い、endophilinを同定した。endophilinは脂質二重膜を屈曲させることによりクラスリン被覆小胞の形成に関わる分子で、細胞表面からのエンドサイトーシスにおいて役割を果たす。Rho-kinaseはendophilin A1の14番目のThrをリン酸化することを見出した。endophilin A1の14番目のThrをリン酸化を模したAspに置換した変異型endophilin A1を細胞に発現させたところ、EGF受容体の取り込みが抑制された。さらに、受容体のエンドサイトーシスの際にendophilinはCblとCIN85と複合体を形成して機能するとされているが、リン酸化endophilinはCIN85に対する結合能が低下していることを見出した。以上のことより、Rho-kinaseはendophilinをリン酸化することで、おそらくCbl/CIN85/endophilin複合体形成を阻害し、EGF受容体のエンドサイトーシスを抑制すると考えられる。本研究では、Rhoファミリーやそのエフェクター分子による微小管の再編成の制御機構を明らかにすることを目的としている。申請者はこれまでに、Rhoのエフェクター分子であるRho-kinaseとミオシン脱リン酸化酵素のミオシン結合サブユニット(MBS)が協調してミオシンなどの基質蛋白質のリン酸化レベルを調節することを見出している。今回、微小管結合蛋白質であるTauとMAP2がMBSに結合すること、Rho-kinaseおよびミオシン脱リン酸化酵素の基質となること、を見出した。Rho-kinaseが、TauのThr245,Thr377,Ser409、およびMAP2のSer1796をリン酸化することを示し、各部位についてリン酸化状態を特異的に認識する抗リン酸化抗体を作製した。Tauはin vitroでチューブリンの重合を促進するが、Rho-kinaseによりリン酸化を受けるとTauのチューブリン重合促進活性が低下した。また、COS7細胞においてTauとRho, Rho-kinaseを共発現させると、TauはRho, Rho-kinase依存的にリン酸化を受けた。さらに、Rho-kinaseによるリン酸化部位をAspに置換した変異型Tauを作製し、in vitroにおいてチューブリン重合促進活性を調べたところ、野生型やリン酸化部位をAlaに置換した変異型に比べてその活性が有意に低下した。また、TauをPC12細胞に導入すると、Cytochalasin(アクチン重合阻害剤)依存的に神経突起の伸長を引き起こすことが知られている。そこで、Asp変異型TauをPC12細胞に導入したところ、突起の伸長が野生型Tauを導入した場合に比べて有意に抑制された。以上の結果より、Rho-kinaseとミオシン脱リン酸化酵素が協調してTauやMAP2のリン酸化レベルを調節し、微小管の再編成を制御している可能性が示された。細胞の極性形成や形態変化は細胞膜を裏打ちする細胞骨格や接着のダイナミックな再構築によって担われている。細胞の分化や形態変化、遊走、極性形成に伴い微小管やアクチン繊維がダイナミックに再構築されることが知られているが、その制御メカニズムについては理解されていない部分も多い。本研究ではRhoファミリーやそのエフェクター分子(Rho-kinaseやMBSなど)による微小管やアクチン線維の再編成の制御機構を明らかにすることを試みる。また、微小管、アクチン繊維の再編成と細胞の極性形成機構や遊走機構の関係を明らかにすることも目的とする。申請者はこれまでに、Rhoとそのエフェクター分子であるRho-kinase, myosin phosphataseがミオシンIIのリン酸化レベルを調節することで細胞骨格の調節に重要な役割を果たすことを示してきた。Rho-kinaseの阻害剤は、細胞の収縮や遊走を抑制することで血管攣縮や動脈硬化の改善に効果が有ることが報告されているが、in vitroでのRho-kinase阻害剤の細胞遊走に及ぼす影響については統一した見解が得られていなかった。そこで、Rho-kinase阻害剤の細胞遊走に及ぼす影響を種々の細胞種で解析したところ、Rho-kinase阻害剤はマクロファージ、平滑筋細胞、血管内皮細胞の遊走を阻害するが、線維芽細胞や上皮細胞の遊走は阻害しないことが分かった。さらに、ミオシンII阻害剤を用いても同様の傾向が認められたことから、Rho-kinaseとミオシンIIの細胞遊走に果たす役割が細胞種によって異なることが示唆された。

今後、その分子機序を明らかにすることを試みる。また、アフィニティクロマトグラフィー法によりRho-kinase相互作用分子としてミオシンIIを同定した。ミオシンIIはRho-kinaseのC末端領域と結合し、Rho-kinaseの細胞内局在にも関与していることを示唆するデータを得た。本研究ではRhoファミリーやそのエフェクター分子(Rho-kinaseやMBSなど)による微小管やアクチン線維の再編成、細胞の極性形成機構や遊走機構を明らかにすることを目的とした。細胞の極性化の過程において小胞輸送が重要な役割を果たすことが知られている。これまでに、Rhoのエフェクター分子であるRho-kinaseがミオシンフォスファターゼや微小管結合蛋白質(Tau,MAP2など)を介してアクチン細胞骨格や微小管の再構築を制御していることを示してきたが、小胞輸送におけるRho-kinaseの役割は明らかではなかった。EGF受容体はリガンドと結合後エンドサイトーシスにより細胞内に移行し分解されるが、ドミナントアクティブ型RhoによりEGF受容体の取り込みが抑制されることが既に報告されている。今回、ドミナントアクティブ型Rhoと共にドミナントネガティブ型Rho-kinaseを発現させたところ、ドミナントアクティブ型RhoによるEGF受容体の取り込み抑制が部分的に回復した。このことより、Rhoの下流でRho-kinaseがエンドサイトーシスの制御に関わっていることが示された。そこで、小胞輸送に関わるRho-kinaseの新規基質分子の探索を行い、endophilinを同定した。endophilinは脂質二重膜を屈曲させることによりクラスリン被覆小胞の形成に関わる分子で、細胞表面からのエンドサイトーシスにおいて役割を果たす。Rho-kinaseはendophilin A1の14番目のThrをリン酸化することを見出した。endophilin A1の14番目のThrをリン酸化を模したAspに置換した変異型endophilin A1を細胞に発現させたところ、EGF受容体の取り込みが抑制された。さらに、受容体のエンドサイトーシスの際にendophilinはCblとCIN85と複合体を形成して機能するとされているが、リン酸化endophilinはCIN85に対する結合能が低下していることを見出した。以上のことより、Rho-kinaseはendophilinをリン酸化することで、おそらくCbl/CIN85/endophilin複合体形成を阻害し、EGF受容体のエンドサイトーシスを抑制すると考えられる。