hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
細胞取り込み能をもつ「コンピテント胚」の開発

本年度は胚融合の生物学的メカニズムを明らかにするため、種々の実験的操作による胚融合誘起を試みた。まず、前年度同様、酸とアルカリによる薬剤処理による融合を試みた。この実験の結果、平均するとおよそ10%程度の胚で融合が可能であることが確認された。続いて、物理的ダメージ誘起による胚融合の誘起を試みた。超微小ガラス針により胚融合モールドに固定した2個体の接触面を傷つけたところ、その後の発生過程で、すべての個体において速やかな胚の融合が認められた。これらの結果は、胚融合は上皮層の微小な傷を2個体で接触共有することにより生じることを示している。そこで最後に、プラズマ発生装置により、胚融合モールドに固定した2個体の上皮層にダメージを与え、融合が生じるかどうかを観察した。その結果、およそ10%の胚で融合が認められた。プラズマによる電気的ダメージとそれに続くエンドサイトーシスが胚融合に関与している可能性がある。このことは、胚融合のプロセスを機械制御できる可能性を示しており、融合胚作出の効率化につながるものと期待される。並行して、胚融合用モールドの改良も行った。光造形式3Dプリンタにより様々な形状の胚融合モールドを試作し、胚融合の成否を調べたところ、比較的効率的にコンピテント胚を静置できるモールド形状が明らかとなった。この改良モールドを使用すると、短時間で数10ペアの胚を融合実験用に準備することが可能となった。胚融合の生物学的メカニズムが明らかになりつつあり、胚融合条件も改良されている。これまで全く知られていなかった「魚類胚の融合現象」を人為的にコントロールできつつあるという点で、萌芽研究として順調に進展しているものと考えている。最終年度はこれまで明らかにしてきた「胚融合現象」に関する情報を論文としてまとめるとともに、胚融合条件を更に洗練させマニュアル化する。また、胚<->細胞(あるいは細胞塊)の融合を検討し、生殖系列キメラの作出を試みる。この実験のために研究室では、すでに生殖細胞に緑色蛍光タンパク質を有するトランスジェニックゼブラフィッシュ系統(vasa::GFP/AB strain)および生殖細胞のモニタリングを容易にするアルビノ系統および透明鱗系統(Casper)を購入し維持しており、これらの系統を駆使して実験を行う予定である。具体的には、トランスジェニック系統の胞胚期胚盤を乖離あるいは断片化し、アルビノあるいはcasper系統胚に融合する。可視化された生殖細胞の取り込まれ率を融合杯中で観察し、生殖系列キメラが作出されるか田舎を検討する。本年度はゼブラフィッシュを用いて、コンピテント胚を効率的に誘導するための胚処理条件を探った。自然産卵により得られた受精卵の卵膜をトリプシンにより除去した2から4細胞期の胚を用いた。胚表面に軽微なダメージを与えることが胚融合に重要な役割を果たしていると考えられるため、今回は、1)トリプシン処理+トリプシンインヒビター、2)NaOH処理+ビタミンE、の条件で胚融合の誘導を試みた。多数の処理胚をペアで隣接させ、融合胚の割合を指標にすることで、胚の融合能を定量的に評価した。1)の条件よりも2)の条件のほうが効率的に融合胚を生産できることが明らかとなった。また、2)の実験条件では、より短時間でNaOH処理を行い、処理後はHCl処理により中和することで生残率が高まることが明らかとなった。様々な発生段階の胚に対して2)の処理を行い、効率よくコンピテント胚を誘導するステージを探ったところ、胞胚期以前に処理をし、胞胚期に胚融合を誘導するのがもっとも効率的に融合胚を作出できることが明らかとなった。薬剤処理を施した胚を飼育したところ、その大部分は奇形化し発生途上で死亡した。また、融合胚を作出するための寒天モールドの形状を検討した。直径600マイクロメートルほどの穴を1.5%寒天に作り、そこに2個の薬剤処理胞胚期胚を静置することで、融合胚を誘導することができた。しかし、同一の誘導条件を用いても卵により誘導率に違いが認められたことから、親による影響あるいは、卵質による影響が考えられた。予定されていた融合条件を検討し、アルカリ処理により高頻度で融合胚を作出できる事が明らかとなり、融合させるための至適発生段階も検討できた。寒天モールドの改良により、定量的に融合の評価が可能となった。これらの結果から、実験計画は概ね順調に進んでいると考えている。

このことは、胚融合のプロセスを機械制御できる可能性を示しており、融合胚作出の効率化につながるものと期待される。並行して、胚融合用モールドの改良も行った。光造形式3Dプリンタにより様々な形状の胚融合モールドを試作し、胚融合の成否を調べたところ、比較的効率的にコンピテント胚を静置できるモールド形状が明らかとなった。この改良モールドを使用すると、短時間で数10ペアの胚を融合実験用に準備することが可能となった。胚融合の生物学的メカニズムが明らかになりつつあり、胚融合条件も改良されている。これまで全く知られていなかった「魚類胚の融合現象」を人為的にコントロールできつつあるという点で、萌芽研究として順調に進展しているものと考えている。今後はより安定的に融合胚を作出できる条件を探るとともに、作出した融合胚を用いて更に詳細な解析を行う予定である。最終年度はこれまで明らかにしてきた「胚融合現象」に関する情報を論文としてまとめるとともに、胚融合条件を更に洗練させマニュアル化する。また、胚<->細胞(あるいは細胞塊)の融合を検討し、生殖系列キメラの作出を試みる。この実験のために研究室では、すでに生殖細胞に緑色蛍光タンパク質を有するトランスジェニックゼブラフィッシュ系統(vasa::GFP/AB strain)および生殖細胞のモニタリングを容易にするアルビノ系統および透明鱗系統(Casper)を購入し維持しており、これらの系統を駆使して実験を行う予定である。具体的には、トランスジェニック系統の胞胚期胚盤を乖離あるいは断片化し、アルビノあるいはcasper系統胚に融合する。可視化された生殖細胞の取り込まれ率を融合杯中で観察し、生殖系列キメラが作出されるか田舎を検討する。初年度においては、ほぼ既存の研究資材を用いて実験を行うことができたため。来年度以降は、より詳細な解析を行うため、消耗品を購入する必要性が高まる予定である。当初、胚融合用モールド作成のための金型作製は専門業者に委託することを想定していた。しかしながら、近年の3Dプリンタの低価格化と高精細化、さらには設計用のCADソフトウェアの教育機関における無料化により、比較的安価にモールド形状を試作する環境を研究室内に構築することができた。このことから、当初予定よりも大幅に研究をコストダウンすることができた。しかしながら来年度は各種ゼブラフィッシュ系統の飼育システムを見直し、より効率的に研究を行うための環境整備に投資を行う。それに加えて、作出する予定の生殖系列キメラの各種分析に用いる物品費がかさむことが予想される。
変異ｐ５３に特異的な治療標的の発見

この研究は、ヒトがんに高頻度に見られる変異p53特異的に細胞死を引き起こす標的分子を発見することが目的である。ヒト悪性腫瘍で高頻度変異であるR175H変異p53を誘導発現するSF126細胞にレンチウイルスshRNAライブラリーにより網羅的に遺伝子発現をノックダウンし、R175H変異p53特異的細胞死遺伝子としての候補遺伝子を複数発見した。個々の候補遺伝子に対応するsiRNAを導入し、真に変異p53特異的に細胞死を引き起こす遺伝子としてID1遺伝子を同定した。将来、ID1遺伝子産物の阻害薬の開発に成功すれば、臓器横断的な新しいがん薬物療法の開拓に貢献しうる。この研究は、変異p53特異的に細胞死を引き起こす標的分子を発見することが目的である。想定される新規標的分子は、特定変異p53を発現するがん細胞特異的(正常細胞に発現なし)であると同時に、同じ特定変異p53を発現する他臓器のがんにも有効で(臓器横断的で、全癌の約5%が対象)、成功すれば新規の創薬シーズに繋がり、新しいがん薬物療法開拓に貢献できる。平成25年度は、平成24年度に実施した以下の研究(1)および(2)を再検証した。すなわち、(1)変異p53(ヒト悪性腫瘍で高頻度変異であるR175H, R248W, R273H)を誘導発現するSF126細胞(ヒト神経膠芽腫由来でp53欠失)・変異p53発現誘導株(テトラサイクリンONで発現誘導できる)に対してレンチウイルスshRNAライブラリーにより網羅的に遺伝子発現をノックダウンし、バーコードマイクロアレイでのスクリーニングを行い、R175H変異p53特異的細胞死遺伝子としての候補遺伝子を複数発見し、(2)さらに個々の候補遺伝子に対応するsiRNAを導入し、真に変異p53特異的に細胞死を引き起こす遺伝子を選択後、得られた変異p53特異的細胞死遺伝子うち、ID1遺伝子は変異p53を自然に発現する他の培養細胞でも細胞死を変異p53(R175H, R248W, R273H)特異的に引き起こすこと、を再検証した。R175H変異p53特異的な細胞死遺伝子のノックダウンがタンパク質発現抑制によって生じ、変異p53非発現時には起きないことを検証(proof of concept)した。再現性が得られたため、結果を英文論文として発表した。平成24年度は、変異p53(ヒト悪性腫瘍で高頻度変異であるR175H, R248W, R273H)を誘導発現するSF126細胞(ヒト神経膠芽腫由来でp53欠失)・変異p53発現誘導株(テトラサイクリンONで発現誘導できる)に対してレンチウイルスshRNAライブラリーにより網羅的に遺伝子発現をノックダウンし、バーコードマイクロアレイでのスクリーニングを行い、R175H変異p53特異的細胞死遺伝子としての候補遺伝子を複数発見した。個々の候補遺伝子に対応するsiRNAを導入し、真に変異p53特異的に細胞死を引き起こす遺伝子を選択した。得られた変異p53特異的細胞死遺伝子うち、ID1遺伝子は変異p53を自然に発現する他の培養細胞でも細胞死を変異p53(R175H, R248W, R273H)特異的に引き起こすことを検証した。現在、論文を作成して投稿中である。ヒト悪性腫瘍で最も変異頻度が高いR175H変異p53特異的に細胞死を引き起こす遺伝子を1つ発見した(ID1遺伝子)。最初の当初の研究計画よりも早く結果を得たが、複数の発見と検証には至らなかった。研究目標は概ね達成しているが、次年度にはさらに新たな合成致死遺伝子の発見に努めることが必要である。平成25年度は、原理の証明(proof of concept)のための実験を行う。具体的には、変異p53特異的な細胞死遺伝子(上記)について、既知の遺伝子の場合はその発現とsiRNAによる発現ノックダウンをウェスタンブロットで確認する。抗体がない遺伝子産物の場合は転写レベルで測定する。機能が未知の遺伝子の場合は、機能解明のための研究移行を検討する。具体的には、網羅的遺伝子発現解析、in silico pathway finding、ホモロジーサーチによる構造・機能予測、p53関連タンパク質の機能関与の解析などを行う予定である。

また、他の変異p53に対する効果の検索も実施し、変異p53特異的な分子治療法開発のための基礎的データを積み重ねる予定である。次年度使用額(B-A)50,605円は物品費(実験の消耗品)に使用予定である。
ヘリウム照射ナノ構造タングステンの熱パルス及び可視光応答性の評価

超高密度定常及びパルスプラズマ生成が可能なプラズマ装置MAGNUM-PSI(オランダ,DIFFER研究所)においてタングステンへのヘリウム照射プラズマ照射実験を実施した。試料にバイアスをかけ,その電位を-12-55Vまで変化させながらヘリウム照射を実施した。試料表面温度は1100 K程度で実施し,照射後の試料を電子顕微鏡を用いた観察を実施した。試料バイアスが高いときには(-12V),表面に突起状のナノ構造ができる程度であったが,-22 Vになると,材料周辺部が黒色化しナノ構造化が起こり始めた。-45V程度までは中心部では損耗,周辺部でナノ構造化が起こっている状況であった。試料バイアスを-50 Vまで負に深くバイアスした場合にも,プラズマ中心部では損耗が起こり,周辺部では不均一なナノ構造が形成された。この結果は,通常のナノ構造形成の様子とは異なり,特に中心部では予想と異なる結果となった。中心部で起こった損耗,再堆積し不均一なナノ構造を形成したのではないかと推測された。酸化鉄薄膜の光触媒向上のための実験を行った。ITO基盤上に鉄の薄膜を形成し,その薄膜への日本で所有する直線型装置NAGDIS-IIでヘリウム照射を実施したところ表面構造変化がナノスケールで起こった。さらに,ヘリウムプラズマ中でITO基板上に薄膜堆積を実施したところ,凹凸のある薄膜が形成された。ヘリウム照射を行った薄膜を用いて,電気化学特性評価を行った。その結果,ヘリウムプラズマ照射を行った試料上では,光電流の増加がみられた。ヘリウムプラズマの照射実験及び光触媒実験の準備を行い,実験を開始し初期結果を得始めた。MAGNUM-PSIでの照射実験を進める。試料温度を上昇させ,周辺部でも十分に1000Kを超える状況でヘリウムプラズマ照射を行うとともに,スパッタリングを起こす追加試料を導入し,共堆積実験を実施する。光触媒実験に関しては,異なる膜厚や,ヘリウム照射条件で作製した材料を用いて,光電流の計測を実施する。内定年度:2017超高密度定常及びパルスプラズマ生成が可能なプラズマ装置MAGNUM-PSI(オランダ,DIFFER研究所)においてタングステンへのヘリウム照射プラズマ照射実験を実施した。
内分泌臓器に対する凍結療法の凍結解凍サイクルと至適プロトコールの検討

副腎凍結療法の解凍時に致死的な高血圧、頻脈が発生した。これは血清カテコラミン値の上昇によるhypertensive crisisであると結論した。血圧上昇や頻脈の発生が非常に早く、動脈ラインでの血圧測定および迅速な薬剤注入が必要であると考えた。甲状腺凍結療法では凍結範囲が、他の実質臓器より小さいということが判明した。この理由として、周囲に走行している頸動静脈などが熱を供給してしまう、いわゆるheat sink効果による影響が強く疑われた。実験結果に大きなばらつきが生じたが、頸動静脈の個体差(動静脈の太さの違い)によってheat sink効果の大小があるためと推測された。24年度は昨年度に引き続き、豚を用いた甲状腺と副腎の実験を繰り返し行なった。豚の甲状腺と副腎に対して凍結療法を行い、凍結時、解凍時のバイタルの変化、末梢血のホルモン濃度(アルドステロン、コルチゾール、T3, T4)を測定した。副腎凍結療法後は、著しい高血圧が出現し、末梢血の副腎皮質ホルモン濃度も高値を示した。甲状腺凍結療法後は、血圧や体温などに変化なく、末梢血の甲状腺ホルモン濃度にも変化がなかった。これらに加えて今年度は、甲状腺の凍結療法時の温度分布を測定し、最適な凍結法を検討した。現在データを解析中であるが、いずれの実験結果も今後、実際に患者さんを治療する際に、合併症を防ぐための重要なデータとなると考えている。24年度の実験から得られたこれらのデータを、2012年7月13日に三重大学医学部附属病院で行われた第13回RFA談話会にて、演題名「ブタ甲状腺の凍結療法時におけるホルモンおよびバイタルの変化について」発表者:小黒草太、中塚誠之、井上政則、橋本統、栗林幸夫で発表した.活発な討論がなされ、フロアから建設的な意見を頂いた。25年度は最終年度であり、引き続きブタを使用した実験で、データを蓄積すると共に、実験結果を英文論文として報告する予定である。また、今年度は本研究の臨床応用を目指して、複数の甲状腺外来や耳鼻咽喉科の医師と連携を図っており、今後の臨床応用を検討している。平成23年度および24年度に得られた結果を基にして、豚を用いて甲状腺、副腎に対して凍結治療の温度計測の実験を行い、至適なプロトコール検討した。甲状腺ではEndocare社製の直線タイプ2.3mm針を使用して、凍結治療を行った。直径40mmのプレートに、プローブを中心とした40本の熱電対を固定して、5秒毎に温度検測を行った。凍結治療中の凍結される範囲をほぼリアルタイムで計測を行った。その結果、甲状腺では凍結される範囲が、肝臓や腎臓などの実質臓器と比較して小さいということが判明した。また、複数の豚で実験を繰り返したところ、実験結果に大きなばらつきが生じた。凍結範囲が小さい理由として、周囲に走行している頸動静脈などが熱を供給してしまう、いわゆるheat sink効果による影響が強く疑われた。また、豚の頸動静脈には個体差があり、動静脈の太さの違いによってheat sink効果の大小があり、このため実験結果に大きなばらつきがでることとなったと推測された。さらに、甲状腺周囲に存在する頚動静脈や皮膚に対する影響を調べるために、病理標本を採取したが、現在検討中である。副腎では引き続き、Endocare社製の直線タイプ2.3mm針を使用して、凍結治療を行った。こちらの凍結範囲も肝臓や腎臓などの実質臓器と比較して小さいということが判明した。やはり腹部大動脈、下大静脈などの太い脈管が熱を供給してしまういわゆるheat sink効果による影響が強く疑われた。病理標本を採取し、現在検討中である。震災の影響で研究所が一時使用不能となり、予定から遅れた。23年度は豚を用いた甲状腺と副腎の実験を繰り返し行なった。23年度は豚の甲状腺と副腎に対して凍結療法を行い、凍結時、解凍時のバイタルの変化、末梢血のホルモン濃度(アルドステロン、コルチゾール、T3, T4)を測定した。これらの実験結果より、副腎に対して凍結療法を行う際には、末梢血へ副腎ホルモンが流出することで、急激な高血圧が生じることが分かった。また、甲状腺に対して凍結療法を行う際には、末梢血へ甲状腺ホルモンが流出することがなく血圧や体温の変化などは生じないことが分かった。いずれの実験結果も今後、実際に患者さんを治療する際に、合併症を防ぐための重要なデータとなる。

実験から得られたこれらのデータを、2011年9月にドイツで行われたCIRSE2011という学会にて、演題名「Hemodynamic and hormonal changes during cryoablation of adrenal gland in swine: in vivo experimental study」発表者M. Inoue, S. Nakatsuka, H. Yashiro, S. Oguro, N. Ito, Y. Yamauchi, K. Hashimoto, K. Asakura, N. Tsukada, Y. Izumi, M. Kawamura, S. Kuribayashiで発表した。本年はブタを使用した実験を繰り返して行い、本年度施行する予定であった甲状腺のホルモン変化および凍結療法中の温度分布を測定することができた。また、実験結果の一部を研究会で発表し、フロアから建設的な意見を頂いた。23年度は東日本大震災のため、研究施設がしばらく使用できない期間があり、実験の遅れにつながった。25年度は最終年度であり、引き続きブタを使用した実験で、データを蓄積すると共に、実験結果を英文論文として報告する予定である。甲状腺に関しては、高血圧や熱発などの症状が出現しないことから、実際に治療を行うことが比較的容易であることが予想され、既に複数の甲状腺科や耳鼻科咽喉科の医師と連携を図っており、今後の臨床応用を検討している。これまでは正常な豚の副腎、甲状腺に対して、凍結療法を行なってきたが、今後は甲状腺機能亢進した状態の豚に対して実験を行いたいと考えている。副腎に関しては論文を作成中であり、24年度中に報告する予定である。副腎に関しては、著しい高血圧が出現することから実際の治療を行うには、それに対する予防を行う必要があり、すぐに実行することは困難を伴うことが予想される。甲状腺に関しては、高血圧や熱発などの症状が出現しないことから、実際に治療を行うことが比較的容易であることが予想された。今後、甲状腺専門の医師などと連携を図って、今後の研究方針を決定する予定である。24年度からの繰越金が少額生じた。なぜなら実験時に測定する予定であった血液サンプルの数が、実験計画段階より少ない数で終了したためである。よって24年度の繰越金と25年度以降に請求する研究費と合わせて今後の使用計画を立てることとした。25年度以降も豚に対する副腎、甲状腺の凍結療法を追加する予定である。また、24年度に得られた成果を英文論文にて発表する予定である。まず、23年度からの繰越金が少額生じた。よって23年度の繰越金と24年度以降に請求する研究費と合わせて今後の使用計画を立てることとした。24年度以降も豚に対する副腎、甲状腺の凍結療法を繰り返す予定である。また、24年度にも得られた成果を学会にて発表する予定である。
メタン生成菌・硫酸還元菌の嫌気的土壌中での微視的生態の解明

本研究は、メタン生成菌およびこれと競合する硫酸還元菌の微視的な生態を明らかにする新しい検出技術を確立し、実際の土壌中で、メタン生成菌がどのような場で、どのように生息しているか、またメタン生成菌と硫酸還元菌の相互作用などを微視的観点から解明して、微生物生態学の進歩に寄与するとともに、自然界でメタン生成菌の活動を制御する要因を提示することを目的として行った。本研究において次のような結果を得た。I)嫌気的条件下にある水田土壌の有機物分解過程におけるメタン生成菌の生態と物質代謝を比較するために、粒径別の水田土壌を用いた室内インキュベーション実験でpH・Ehの変化および硫化物イオン、低分子有機酸、メタン生成の消長および生成量のバラツキを調べ、メタン生成反応と硫酸還元反応の相互関係を明らかにした。II)昨年度に我々は土壌中の生きている全部のバクテリア細胞を映像化する目的で、sulfofluorescein diacetate (SFDA)を使用した染色法を開発した。本年度はさらに研究を進め、より鋭敏に微生物細胞の生死を判定できる蛍光色素6-carboxylfluorescein diacetate acetoxymethyl ester (CFDA-AM)を使用した微生物の染色法を開発した。III)葛西臨海公園から得た土壌中に生息するメタン生成菌、Methanosarcinaの映像を撮影することに成功し、この種類が実際の場で活発に生息していることが裏づけられた。IV)培養した数種のメタン生成菌の蛍光スペクトルを測定し、いずれも420nmと460nm付近にピークを持つことが確認され、これらのピークはメタン生成菌の大きな特徴の一つであることが示唆された。また、この特徴を利用して土壌中のメタン生成菌の同定の可能性が示された。本研究は、メタン生成菌およびこれと競合する硫酸還元菌の微視的な生態を明らかにする検索技術を確立し、実際の土壌中で、メタン生成菌がどのような場で、どのように生息しているか、またメタン生成菌と硫酸還元菌の相互作用などを微視的観点から解明して、微生物生態学の進歩に寄与するとともに、自然界でメタン生成菌の活動を制御する要因を提示することを目的として行った。上記のような観点から研究を行い、平成6年度は次のような結果を得た。I)嫌気的条件下にある水田土壌の有機物分解過程におけるメタン生成菌の生態と物質代謝を比較するために、水田土壌を用いた室内インキュベーション実験でpH・Ehの変化および硫化物イオン、低分子有機酸、メタン生成の消長を調べ、メタン生成反応と硫酸還元反応の相互関係を明らかにした。II)メタン生成菌やこれと競合的な関係にある硫酸還元菌が土壌生態系のどのような微小な場に生息するかを明らかにする目的で、これら2種のバクテリアの土壌中での実態を解明する技術の開発を行なった。その結果、後者については、まだ困難な点があったが、前者は蛍光技術導入して実際に土壌中で生育している菌の映像化に成功した。III)メタン生成菌あるいは硫酸還元菌が土壌環境の中で他種のバクテリアに対して占めている位置を明らかにする目的で、土壌中の生きている全部のバクテリア細胞を映像化する方法の開発を試みた。そして、新しい蛍光プローブSulfofluorescein diacetate(SFDA)で土壌微生物を染色するという技術を開発することにより目的を達成した。平成7年度は次のような結果を得た。

I)嫌気的条件下にある水田土壌の有機物分解過程におけるメタン生成菌の生態と物質代謝を比較するために、粒径別の水田土壌を用いた室内インキュベ-ジョン実験でpH・Ehの変化および硫化物イオン、低分子有機酸、メタン生成の消長および生成量のバラツキを調べ、メタン生成反応と硫酸還元反応の相互関係を明らかにした。II)昨年度に我々は土壌中の生きている全部のバクテリア細胞を映像化する目的で、sulfofluorescein diacetate(SFDA)を使用した染色法を開発した。本年度はさらに研究を進め、より鋭敏に微生物細胞の生死を判定できる蛍光色素6-carboxylfluorescein diacetate acetoxymethyl ester(CFDA-AM)を使用した微生物の染色法を開発した。III)葛西臨界公園から得た土壌中に生息するメタン生成菌、Methanosarcinaの映像を撮影することに成功し、この種類が実際の場で活発に生息していることが裏づけられた。VI)培養した数種のメタン生成菌の蛍光スペクトルを測定し、いずれも420nmと460nm付近にピークを持つことが確認され、これらのピークはメタン生成菌の大きな特徴の一つであることが示唆された。また、この特徴を利用して土壌中のメタン生成菌の同定の可能性が示された。
偏光双安定面発光半導体レーザを用いた超高速光信号処理の研究

偏光双安定面発光半導体レーザを用いた全光型3R中継の堤案と理論的検討、全光型バッファメモリの提案、およびスピン偏極電子注入素子に関する研究を行った。1.全光型3R中継波長0.98μm帯偏光双安定面発光半導体レーザを用いて、全光型フリップ・フロップ動作を1Gbit/sで実現した。弱いトリガ光により発振偏光をスイッチングでき、光入出力において約10dBの光学利得を得た。又、偏光双安定性を用いて、光3R(Regenerating, Reshaping and Retiming)動作が実現可能であること、100Gbit/s程度まで光利得をもつ光3Rが可能であり、160Gbit/s程度までReshapingとRetimingが可能なことを数値計算により明らかにした。面発光半導体レーザの共振器長を短くすること、バイアス電流を上昇することにより、より高速動作が可能なこともわかった。2.全光型バッファメモリの提案偏光双安定性をもつ面発光半導体レーザの二次元アレイを用いて、光パケット交換用の全光型バッファメモリが実現できることを考案した。記録情報を二次元アレイ内で一括転送し記録できる、シフトレジスタ機能をもつ。3.スピン偏極電子注入光素子スピン偏極電子が半導体内を伝導する間にどのように緩和するかを明らかにするため、円偏光フェムト秒パルスでスピン偏極電子を光励起し、自然放出光の偏光特性の時間変化から、電子のスピン偏極度とその緩和時間を評価した。光励起された直後の電子のスピン偏極度を明らかにするため、中間層をはさんで井戸幅の異なる二つの量子井戸をもつ素子を作製した。それぞれの量子井戸からの発光の偏光度の差から中間層でのスピン緩和を測定した結果、電界が弱い場合にはGaAs中を2μm輸送される間に電子のスピンはほとんど緩和しないこと、電界が強くなると緩和が速くなることがわかった。偏光双安定面発光半導体レーザを用いた全光型3R中継の提案と理論的検討、全光型バッファメモリの提案、およぴスピン偏極電子注入素子に関する研究を行い、以下の点について成果を得た。1.全光型3R中継面発光半導体レーザ(VCSEL)の偏光双安定性を用いて、光3R(Regenerating, Reshaping, and Retiming)が実現可能なことを数値解析より明らかにした。100Gbit/sまで3R機能をもつことが確認された。ビットレートが160Gbit/sと超高速になった場合には、光利得は得られないが、アイ開口が改善できることがわかった。又、面発光半導体レーザの共振器長を短くすること、バイアス電流を上昇することにより、より高速の動作が可能なことがわかった。2.全光型バッファメモリの提案偏光双安定性をもつ面発光半導体レーザのアレイを用いて、光パケット交換用の全光型バッファメモリが実現できることを考案し、その後、二次元アレイ面発光半導体レーザを用いて、記録情報を二次元アレイ内で一括転送し記録できる、シフトレジスタ機能をもたせることが可能なことを見い出した。3.スピン偏極電子注入光素子注入したスピン偏極電子が半導体内を伝導する間にどのように緩和するかを明らかにするため、円偏光フェムト秒パルスで光励起し、自然放出光の偏光特性の時間変化から、電子のスピン偏極度と緩和時間を評価している。初期的なデータでは、スピンはかなり長時間にわたって保存されていることがわかった。より詳細な検討を可能にするため、中間層をはさんで井戸幅の異なる二つの量子井戸をもつ素子を作製した。

現在、それぞれの量子井戸からの発光の偏光度の差から中間層でのスピン緩和を測定している。偏光双安定面発光半導体レーザを用いた全光型3R中継の提案と理論的検討、およびスピン偏極電子注入素子に関する研究を行い、以下の点について成果を得た。1.全光型3R中継波長0.98μm帯偏光双安定面発光半導体レーザを用いて、全光型フリップ・フロップ動作を1 Gbit/sで実現した。弱いトリガ光により面発光半導体レーザの発振偏光をスイッチングでき、光入出力において約10dBの光学利得を得た。又、面発光半導体レーザの偏光双安定性を用いて、光3R(Regenerating, Reshaping and Retiming)動作が実現可能であること、100 Gbit/s程度まで光利得をもつ光3Rが可能であり、160 Gbit/s程度までReshapingとRetimingが可能なことを数値計算により明らかにした。面発光半導体レーザの共振器長を短くすること、バイアス電流を上昇することにより、より高速動作が可能なこともわかった。2.スピン偏極電子注入光素子スピン偏極電子が半導体内を伝導する間にどのように緩和するかを明らかにするため、円偏光フェムト秒パルスでスピン偏極電子を光励起し、自然放出光の偏光特性の時間変化から、電子のスピン偏極度とその緩和時間を評価した。これまで明確でなかった光励起された直後の電子のスピン偏極度を明らかにし、輸送中のスピン緩和のより詳細な検討を可能にするため、中間層をはさんで井戸幅の異なる二つの量子井戸をもつ素子を作製した。それぞれの量子井戸からの発光の偏光度の差から中間層でのスピン緩和を測定した結果、電界が弱い場合にはGaAs中を2μm輸送される間に電子のスピンはほとんど緩和しないこと、電界が強くなると緩和が速くなることがわかった。
リボソーム異常によるがんの発症・進展機構の解明

リボソーム生合成の異常を引き金に、核小体からRPL11などのリボソーム蛋白質が核質に放出され、MDM2の機能を抑制、p53蛋白質を安定化し、細胞増殖を抑制する、核小体ストレス経路が明らかになり注目されている。一方で、リボソーム蛋白質遺伝子の異常によるリボソーム病の患者群ではがんのリスクが顕著に上昇すること、がん細胞においてリボソーム蛋白質遺伝子の変異および片アレル欠失が多く見つかることからは、核小体ストレスが、異常な細胞増殖、がん化を亢進する可能性を示唆しているが、その背景となる分子機構はわかっていない。申請者らは準備実験から、リボソーマルRNAの転写阻害剤により、がんの発症や進展に促進的に作動する転写共役因子YAP1/TAZの活性が上昇することを見出しており、これが、核小体ストレスのがん促進的な側面を説明する可能性を検討している。本年度は、リボソーマルRNAの転写阻害剤を用いた核小体ストレスの誘導によるYAP1/TAZ活性化を観察する最適条件の検討を行ったが、YAP1/TAZ活性の応答が不安定であり、安定的に応答の見られる条件が設定できておらず、追加の検討が必要となっている。また、並行して進めていたsiRNAライブラリーを用いたYAP1/TAZ制御因子のスクリーニングから、リボソーム蛋白質のノックダウンによりYAP1/TAZ活性が上昇する可能性が示唆されたため、この遺伝子のノックダウンによる核小体ストレスの誘導およびYAP1/TAZ活性への影響の検討を進めている。核小体ストレスの誘導によるYAP1/TAZ活性の変化を、安定して観察できる実験系を組むことができておらず、その分子機構に踏み込む研究を進められていない。この原因としては、核小体ストレス、およびその応答経路に、細胞増殖抑制的な側面と、促進的な側面があるためではないかと考えている。核小体ストレスの誘導によるYAP1/TAZ活性の変化を、安定して観察できる実験条件を探索し、分子機構の理解へ繋げる。また、核小体ストレス応答経路に関する理解を進める研究も並行して進め、細胞増殖に対する、促進的および抑制的な、二面的な応答の理解に繋げたいと考えている。所属研究室の余剰試薬等を譲り受けたことから、当初の予定より、必要な試薬等の購入にかかる費用が安価で済んだため、繰越金額が生じた。次年度使用額は主に質量分析の依頼測定及び消耗品購入に充てる予定である。
糖誘導体を利用した新規有機分子触媒の開発とその応用

本研究が目的とする、糖を母骨格とした新たな分子構造に立脚する新規有機分子触媒の設計を行い、その触媒の合成研究を行った。市販されているグルコサミンやグリカールを出発原料として、糖の2位や3位ににアミノ官能基を有する触媒前駆体の合成ルートの検討を種々行った。その結果、低収率のステップがいつくつか含まれるものの、目的の触媒前駆体の合成ルートの開発に成功した。現時点では、最終的な触媒の合成法の確立には至っていないものの、今後の触媒の合成ルートを計画するにあたり有用な知見を得ることが出来た。本研究課題では、実用的な有機分子触媒反応の実現を目標とした、新たな分子骨格を有する有機分子触媒の開発に取り組む。具体的には、糖類のアノマー位に直接芳香環が結合したアリール-C-グリコシド構造を基本骨格とした有機分子触媒を独自にデザインし、その触媒の合成及び、それらを利用した新規不斉反応の開発研究を行う。糖部分及び芳香環部位の官能基の導入やその変換が容易である、アリール-C-グリコシド構造の利点を最大限に活用し、触媒構造の緻密な最適化を行うことにより、従来の有機分子触媒では不可能だった、新規反応や低触媒量での反応の実現を目指す。初年度では、アリール-C-グリコシド型触媒の構築法の確立を目指した研究を行った。触媒を効率的に合成するため、市販の糖誘導体から、様々な官能基や構造を有したキラル糖ユニットライブラリーの構築を目指した。具体的には、容易に入手可能なグルコサミンやグリカールを出発原料として、糖の2位にアミノ官能基を有する触媒前駆体の合成を目指した。種々の変換反応を検討したものの、現時点では目的とする触媒の合成には至っていない。この原因の一つとして、各合成ステップにおける収率が低いことがあげられる。そのため、目的の触媒の合成経路を見直すことにより、より良い合成法の確立が必要と考えられる。また、今後は他の糖も出発原料とし、種々の変換反応を検討することにより、キラル糖ユニットライブラリーの構築を行う予定である。本年度、市販の糖を出発原料として、触媒前駆体の合成を行ってきたが、現在のところ目的の触媒の合成には至っていない。この原因の一つとして、各段階の合成ステップにおける収率の低さが挙げられる。各合成ステップの最適化と共に、反応のスケールアップ及び精製法の簡素化などを今後検討する必要があると考えられる。本研究課題では、実用的な有機分子触媒反応の実現を目標とした、新たな分子骨格を有する有機分子触媒反応の開発に取り組んでいる。具体的には、糖類のアノマー位に、官能基を持つ芳香環が直接結合したアリールCーグリコシド構造を母骨格とした、二間能性有機分子触媒の設計と、その触媒の合成及び、それらを利用した新規不斉反応の開発研究を行った。本触媒は、糖ユニット、芳香環ユニットそれぞれに対し、構造や官能基のチューニングが容易であるため、多様な触媒ライブラリーの構築が期待できる。それらを利用することにより、従来の有機分子触媒では実現不可能であった、不斉反応への適用を試みる。本年度は、昨年度に引き続き、触媒の合成ルートの探索を行った。市販されているグルコサミンやグリカールを出発原料として、糖の2位にアミノ官能基を有する触媒前駆体の合成ルートの検討を行った。昨年度うまくいかなかった合成ルートを見直し、新たな合成ルートに基づいた触媒合成の検討を行った結果、低収率ながらも目的の触媒前駆体の合成に成功した。また、2位にアミノ基でなく、リンやホウ素官能基の導入を試みたが、現時点では目的化合物の合成には至っていない。今後は、アリールーCーグリコシド構造の構築の検討を行い、目的とする触媒の合成を行う。また、各段階の収率が高くないので、反応条件及び合成ルートを再度検討することにより、それぞれの段階での収率の向上を目指す。引き続いて、糖を母骨格とした有機分子触媒の開発を行う。より効率的な合成計画の立案と糖の官能基変換手法の検討を行っていく予定である。特に、大スケールでの合成に耐えうる合成経路の確立を目指す。それと並行して、超原子価ヨウ素化合物によるラジカル反応を利用した、糖の新たな変換反応の開発も行っていく。28年度が最終年度であるため、記入しない。有機合成化学28年度が最終年度であるため、記入しない。
複雑な手指運動学習課題における運動技能の両手間転移に関する神経機構の解明

本研究は,複雑な手指運動学習課題における運動技能の両手間転移に関する神経機構の解明を目標としている。本年度は,主に昨年度構築した実験システムを用いて実験を行なった。被験者は,健常な男女40人であり,複雑な手指運動学習課題である健身球の回転運動課題を課した。両手間転移が評価できるように被験者を4群に分け,すなわち,右手から左手への転移を評価する群とその逆を評価する群に加え,それぞれに転移を生じない統制群を設けた。脳活動計測は,昨年来より共同研究を行っている生理学研究所の磁気共鳴画像装置(MRI)を用いた。MRIを撮像中に(1)ビデオ監視システムによる球の回転運動計測と(2)被験者の腕より導出した筋電図(EMG)計測を行ったが,解析の結果より被験者の行動は球の回転運動計測から評価することとした。その結果,行動学的には,学習に伴う,球の軌道分散が減少し,また回転角加速度の上昇が見られた。また脳活動計測データより,転移前では,運動学習に伴う,小脳、運動前野、補足運動野、体性感覚野、後上頭頂葉の活動減少が見られたが,転移後のデータにはそのような変化は確認されなかった。また,転移後の運動では,補足運動野と運動前野の活動が転移前に比較して上昇していることが確認された。以上の結果より,転移の成立は,転移前の補足運動野と運動前野で生じた運動学習がプライミング的な役割を持ち,それが転移後の当該領域の脳活動上昇を導き,さらには行動学上の促進効果の表出をもたらしたことが予想される。現在,行動学的データと脳活動計測データの相関分析などを継続中であり,それらの結果を踏まえた研究成果を今年度中に専門雑誌へ投稿予定である。本研究は、複雑な手指運動学習課題における運動技能の両手間転移に関する神経機構の解明を目標としている。本年度は、主に実験システムの構築と評価を行なった。本研究においては、複雑な手指運動学習課題である健身球の回転運動課題を遂行中の被験者の1、機能的磁気共鳴画像法(fMRI)による脳活動計測、2、ビデオ監視システムによる球の回転運動計測、3、被験者の腕より導出した筋電図(EMG)計測から得られる3つの計測量を用いて運動学習を多角的・包括的に評価することを試みる。しかしながら、MRIが発生する高磁場・強電磁場はそれらの計測装置に影響を与え、逆に計測装置の動作ノイズは、微弱なMRI信号に干渉し画像アーチファクトをもたらす。そこで本年度は、大学共同利用機関である生理学研究所の協力を得て、MRIと計測装置間のクロストークを最小限に抑えるための計測装置の選定と実験環境の整備を行い、本研究に最適化された実験システムを構築した。本実験システムの性能を確認するために評価実験を行なった。実験では、健身球の回転運動学習を上記の3つの計測量で定量化できるかどうかを検討した。被験者には、fMRI撮像中に球の回転運動と安静状態を繰り返す課題を遂行させた。その結果、球の回転角加速度は運動の繰り返しとともに減少し、EMGにも同様な減少が見られた。これらの結果は、運動が力を必要としないかつスムースなものになった、すなわち学習による運動の効率化が実現されたことを示唆していると考えられる。またfMRIデータは小脳や大脳皮質運動関連領域に学習関連性の賦活を認め、先行研究に合致する結果を得た。これによって、本実験システムにより運動学習を評価できることが確認された。次年度は、本実験システムを用いて当初計画した両手間転移を検証可能な実験パラダイム実行し、運動技能の両手間転移に関する神経機構の解明に努めたい。
生体適合素材でできた発熱ナノ粒子の発熱性能制御と単一粒子発熱量実測への挑戦

ガン細胞の非侵襲瞬間温熱治療への応用を目指し,生体材料のTiとSiOを使い,自己伝播発熱反応を発現する発熱ナノ粒子の製造に成功した.φ10nmのシリカ微粒子とφ100300nmのポリスチレンビーズからなる懸濁液をミスト化し,低温から高温への温度勾配を持つ電気炉に通すことで多孔質シリカナノ粒子を製造した.種々の条件を変化させ,粒子径,空孔径,空隙率の制御に成功した.次に,溶融塩プラズマ電解法等を用い,多孔形状を崩さずにシリカ粒子中の酸素濃度を27at%まで下げることができた.スパッタリングや溶融塩メッキ技術でTi/SiOナノ粒子群に電気刺激を与えた結果,自己伝播発熱反応を示すことを確認した.本研究の初年度となる平成28年度,スプレードライ法を用いて様々な空隙率,空孔径,粒径を持つ多孔質シリカナノ粒子の作製技術の確立を目指した.シリカゾルは直径10nmの市販品を採用した.ポリスチレンビーズは一定粒径のものが大量に必要なため,自作することとした.そのための情報収集と技術構築を行い,結果,直径80400nmの範囲で標準偏差10nm未満の均一なポリスチレンビーズの量産技術を確立することができた.スプレードライ法では,霧化時の振動数,窒素流量,5ゾーン電気炉の温度分布を変化させて多孔質シリカナノ粒子の形状と寸法など,目視評価を行った.その結果,今回の実験範囲ではこれらいずれのパラメーターの影響も小さかった.一方,シリカゾルとポリスチレンビーズの割合ならびに濃度を種々変化させ,混合してゾルを作り,多孔質ナノ粒子を作製した結果,様々な形状寸法,空孔数,空孔径の微粒子を作製することができた.ポリスチレンビーズの濃度が3wt%程度で,正配列多孔質微粒子を製造できることがわかった.その他の条件の依存性は小さかった.さらに,2種類の異なる粒径をもつポリスチレンビーズを混合させて粒子作製した結果,大小の空孔が規則正しく正配列した多孔質シリカ粒子を作ることができた.粒径の制御が課題であり,作製時の制御ができれば最良だが,できない場合はサイクロン方式などの分級技術を導入する必要がある.また,幾つかの方法でシリカ中に含まれる酸素量を低下させることに成功した.粒子形状を崩さずに還元する技術の構築が課題である.スプレードライ法で様々な空隙率と空孔径を持つ多孔質シリカ粒子の製造技術が確立し,綺麗に空孔が配列した多孔質シリカナノ粒子の製造条件を特定することができた.粒径の制御が課題であるが,これはサイクロン分級方式を霧化直後と粒子製造直後の2箇所に配置することで解決可能と考えており,今後の課題である.また,シリカ粒子の還元方法の検討を行った.溶融塩などで還元を今後試みる予定である.本研究の2年目となる平成29年度,スプレードライ法で作製した多孔質シリカナノ粒子に発熱機能を付与するための様々な実験を行った.その結果,癌細胞の非侵襲瞬間温熱治療への応用を目指し,生体材料のTiとSiから構成され,自己伝播発熱反応を発現する発熱ナノ粒子の製造に成功した.φ10nmのシリカ微粒子とφ100300nmのポリスチレンビーズと純水からなる懸濁液をミスト化し,低温から高温への温度勾配を持つ電気炉に通すことで多孔質シリカナノ粒子を製造した.種々の条件を変化させ,粒子径,空孔径,空隙率の制御に成功した.スプレードライ法では,霧化時の振動子の振動数,窒素流量,5ゾーン電気炉の温度分布などを変化させて多孔質シリカナノ粒子の形状と寸法などの変化を評価した.その結果,今回の実験範囲ではいずれのパラメータの影響も小さいことがわかった.シリカゾルとポリスチレンビーズの割合と濃度を変化させて多孔質粒子を作製した結果,粒径,形状,空孔数,空孔径などを変化させることができた.ポリスチレンビーズの濃度が3wt%程度で,正配列多孔質微粒子を製造できることがわかった.溶融塩プラズマ電解法等を用い,多孔形状を崩さずにシリカ粒子中の酸素濃度を27at%まで下げることができた.スパッタや溶融塩メッキ技術でTi堆積後に粒子に電気刺激を与えた結果,1mgの「粒子群」の状態では自己伝播発熱反応を示すことを確認した.今後の課題は,粒子一粒で発熱反応を誘起することを実験的に確認することである.電子顕微鏡内でマイクロプローブを電極に見立てて発熱反応を誘起させるような実験技術の開発が課題である.ガン細胞の非侵襲瞬間温熱治療への応用を目指し,生体材料のTiとSiOを使い,自己伝播発熱反応を発現する発熱ナノ粒子の製造に成功した.φ10nmのシリカ微粒子とφ100300nmのポリスチレンビーズからなる懸濁液をミスト化し,低温から高温への温度勾配を持つ電気炉に通すことで多孔質シリカナノ粒子を製造した.種々の条件を変化させ,粒子径,空孔径,空隙率の制御に成功した.次に,溶融塩プラズマ電解法等を用い,多孔形状を崩さずにシリカ粒子中の酸素濃度を27at%まで下げることができた.スパッタリングや溶融塩メッキ技術でTi/SiOナノ粒子群に電気刺激を与えた結果,自己伝播発熱反応を示すことを確認した.

多孔質シリカナノ粒子の製造技術の最適化を概ね行うことができたので,平成29年度は以下の実験を行う予定である.(1)粒子の多孔性を維持したまま多孔質シリカナノ粒子の還元を行う技術の模索・構築と確立これまでの予備実験で,多孔質シリカナノ粒子を適度な条件で真空アニールすると,表面がシリカゾルの集合体からシリカシェルに変化することがわかっている.これを利用して,還元時に崩れにくい多孔質シリカナノ粒子を作る.また,還元実験技術構築も目指す.(2)多孔質シリカナノ粒子の空隙部分に異種金属を充填するための技術開発通常のスパッタ技術や他の技術を用い,サブミクロンサイズの空孔内部に異種金属を析出させる技術を構築する.最初は粒子表面の被覆を確実に実施可能な技術構築を目指すが,それが確立した後,表面ではなく空孔内部のみに析出させる技術の構築を目指す.ナノテクノロジ,機能性材料,MEMS
腫瘍リンパ球共培養モデルにおける抗体療法併用NKT細胞治療の開発研究

コラーゲンゲルドロップ3次元包埋培養法を使用して、肺癌株化細胞とリンパ球を培養したところ腫瘍増殖抑制効果が確認された。腫瘍増殖抑制効果に関連する免疫細胞上に発現する表面抗原分子探索のため、肺癌リンパ節の免疫細胞を解析した。本年度は当施設呼吸器外科で手術を施行した25例の原発性肺癌患者の血液および肺・リンパ節・腫瘍検体、並びに9例の内視鏡による採取をしたリンパ節検体からマクロファージやリンパ球を採取し、マスサイトメトリーによる解析を行ない、それぞれの検体における、CD8+T細胞、CD4+T細胞、NK細胞、制御性T細胞、マクロファージなどの構成細胞を比較検討し、細胞表面や細胞内マーカーの発現解析を行った。約30種の抗体で標識し、viSNEやFLOWSOMといった解析アプリケーションを用いて多次元的な解析を行い、臨床プロファイルと比較して検討した。その結果、リンパ節の転移陽性もしくは転移陰性かによって、CD45ROやCD69などの細胞表面の活性・疲弊マーカーの他、tissue resident memory T細胞に特徴づけられる細胞表面マーカーであるCD103がCD8+T細胞中に増加していることを確認した。CD8+T細胞中にCD103陽性である細胞は、腫瘍浸潤リンパ球では42.9%、転移陽性リンパ節では9.2%、転移陰性リンパ節では4.7%、末梢血単核球では2.9%にそれぞれ認められ、腫瘍の存在下に発現が増加する可能性が示唆された。CD103は腫瘍の放出するTGF-βによるCD8+T細胞上に発現が増加することが報告されており、本研究において、腫瘍局所だけではなく所属リンパ節においてもリンパ細胞の変化が起きていることを支持する結果であった。また転移陰性リンパ節においても進行癌や腫瘍に近い所属リンパ節で高い傾向にあり、局所だけでなく全身性の反応でもあることも示された。コラーゲンゲルドロップ3次元包埋培養法やマスサイトメトリーを利用して自己腫瘍局所におけるNKT細胞の自然免疫系や獲得免疫系の抗腫瘍効果に対する増強作用を解析し、NKT細胞と抗PD-1/PD-L1抗体との併用療法の効果を確認するため、本研究を遂行した。昨年度は主に、患者腫瘍検体における各免疫細胞の構成ならびに機能解析、および肺癌株化細胞を使用したin vitroの解析を行った。1.当施設呼吸器外科で原発性肺癌の診断で手術された患者の血液および肺・リンパ節・腫瘍検体から、適切に酵素処理・遠心分離を行い、マクロファージやリンパ球を採取した。現在までに15例の原発性手術症例の解析を行ない、それぞれの検体における、NKT細胞やCD8+T細胞、CD4+T細胞、NK細胞、制御性T細胞、マクロファージなどの構成細胞を比較検討し、PD-1やPD-L1の発現解析を行った。8例はマスサイトメトリーを使用して金属標識をした検体の解析をし、約30種の表面マーカーや核内マーカーで染色し、多次元的な解析をした。また、IFNγやTNFα、IL-2などのサイトカインの産生も同時に測定をし、各細胞のサイトカイン産生能を比較検討した。マスサイトメトリーを使用した腫瘍局所の免疫細胞の解析では、予定された症例数に向けて順調に症例を蓄積されている。コラーゲンドロップ3次元包埋培養法においても免疫細胞との混合条件下で腫瘍の増殖抑制が確認されており、今後の臨床検体を使用した解析に向けての準備を進行している。さらに肺癌手術検体の解析数を増やしていく予定である。また、高度な炎症や多くの癌抗原に感作される前の初期の病変も解析に加え、臨床検体を利用した腫瘍免疫の解析手法に更なる検討を加える。

また、免疫細胞による腫瘍増殖抑制メカニズムについてサイトカインを添加した条件での培養や抗PD-1抗体療法と併用する実験系の検討を行う。さらに、患者腫瘍組織とPBMCを混合培養し、腫瘍特異的な免疫反応を検討したin vitroの実験を実施する。今年度中に購入を見込んでいた抗体の納入が次年度に延期となり繰越金が発生した。
タンパク質工学による大豆グリシニンの構造・機能特性相関に関する研究

大豆タンパク質の機能特性を改善してその用途を拡大するためには、その主要成分であるグリシニンの構造と機能特性との相関を分子レベルで解明する必要がある。本研究では、グリシニンの構造的特徴(種々のグリシニンと類似したタンパク質間での保存領域と可変領域、S-S結合の位置)やマクロなレベルでの構造・機能特性相関を踏まえた上でタンパク質工学の手法を用いてグリシニンの構造・機能特性相関を分子レベルで解析した。1.可変領域の持つ親水性という性質の改変及びCys12-Cys45とCys88-Cys298のS-S結合の欠失という改造の結果、以下のことが明らかとなった。(1)グリシニン分子のC末端部の疎水性が乳化性と密接に関係している。(2)Cys12-Cys45のS-S結合がグリシニンの加熱ゲル化過程初期におけるSH/S-S交換反応において重要な役割を果たしている。(3)遊離のSH基の数とトポロジーは加熱ゲル化と密接に関係している。(4)乳化性と加熱ゲル化性の発現に好ましい構造の不安定性の要素が互いに異なる。このように、グリシニンの構造・機能特性相関を分子レベルで解析することに成功した。2.本研究を遂行するために大腸菌で生産した天然型及び種々の改造型のプログリシニンの結晶化と予備的X線解析に成功した。これはグリシニンの分子レベルでの構造・機能特性相関の精緻な解析を可能とするものである。3.種々の改造グリシニンのうち本来のグリシニンよりも優れた機能特性を示すものがいくつかあった。それらがタバコ種子中でnativeなものと同様に発現・蓄積することを見い出した。このことは、構造・機能特性相関に基づいて分子設計した改造グリシニンを産生する大豆植物体を開発することが可能であることを意味している。世界の抱えている飽食と飢餓の問題を同時に解決するためには、成人病誘発の心配のない植物性タンパク質の栄養性、機能特性を改善することが要求される。この改質を理論的に達成するためには、構造と機能特性の相関を分子レベルで解明する必要がある。本研究では、大豆タンパク質の主要成分であるグリシニンの構造・機能特性相関をタンパク質工学の手法を用いて分子レベルで解析することを目的とした。1.S-S結合および遊離SH基と機能特性の相関:本研究に先立って行なった解析から、S-S結合と遊離SH基の数とトポロジーがグリシニンの機能特性と密接に関係していると考えられた。そこで、S-S結合(Cys12-Cys45,Cys88-Cys298)の形成に関与しているCys12とCys88を部位特異的変異によって変換し、S-S結合欠失の構造形成と機能特性発現に対する影響を調べた。まず、変異タンパク質Gly12,Ser88,Gly12Ser88に対する発現プラスミドを構築し、それらを大腸菌で大量に発現させた。発現タンパク質を解析した結果、いずれのものも非改変グリシニンと類似した構造を形成していると考えられた。つまり、2種のS-S結合とも構造形成に不必要である。一方、加熱ゲル化性と乳化性を解析した結果、Cys12-Cys45は加熱ゲル化過程におけるSH/S-S交換反応において重要な働きをしていること、また、遊離SH基の数とトポロジーは加熱ゲル化能やゲル物性と密接に関係しているが、乳化性とはしていないことが示唆された。2.等電点と機能特性の相関:グリシニンは等電点近辺で機能特性を発現しにくい。