hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
ストレス蛋白質誘導による心筋保護作用：多角的心保護戦略を目指して

エバンス-ブルーを注入した。心臓を摘出し横断スライスを作成,1%塩化トリフェニルテトラゾリウムで染色した。以上より心筋梗塞範囲,梗塞危険領域および全左室の重量,各重量比を計測し,コントロール群とGGA群で心筋梗塞/梗塞危険領域等を比較した。コントロール群における心筋梗塞/梗塞危険領域は44.3±9.8%(平均値±標準偏差,n=9)であった。虚血24時間前にGGAを経口投与することによりプレコンディショニング刺激を加えたGGA群においては,心筋梗塞サイズはコントロール群と比較して28.5±1.3%(n=7,P<0.05)と有意に減少した。GGAの遅延型プレコンディショニング作用による心筋保護効果が明らかとなった。続いて細胞膜マイクロドメイン(カベオラ)の構成タンパクであるカベオリン-3をノックアウトしたマウスを用いて同様の実験を行った。カベオリン-3ノックアウトマウスにおいては,GGAを24時間前に投与しても心筋梗塞サイズは41.7±1.9%(n=7)と減少せず,GGAによる心筋保護作用が棄却された。以上の結果からGGA投与による心筋保護作用には細胞膜マイクロドメインが関与することが明らかとなった。平成24年度の実験計画に沿って,マウス遊離心筋細胞を用いて,GGA投与によるカベオラ数およびカベオリン-3の活性化を形態学的方法,Western blottingにて評価した。その結果,GGAによる心筋保護作用にはカベオリン-3が関与しているという仮説が実証された。平成23年度および平成24年度の結果を受けて,次年度の実験計画を予定通り遂行できる。平成23年度の実験計画に沿って,ワイルドタイプマウスおよびカベオリン-3ノックアウトマウスを用いてストレス蛋白質を誘導するゲラニルゲラニルアセトン(GGA)投与による心筋保護作用を比較した。この結果を受けて次年度以降の実験計画を予定通り遂行できる。平成23年度および平成24年度の研究によりストレス蛋白質誘導による心筋保護作用におけるカベオラ・カベオリンの役割が明らかになった。次年度はストレス蛋白質誘導と遅延期プレコンディショニングによる心筋保護作用の関連を明らかにするためにラット培養心筋細胞を用いた低酸素モデルにて,GGAおよびオピオイド投与による心筋細胞死亡率への影響を測定する。次にストレス蛋白質誘導とポストコンディショニングによる心筋保護作用の影響を検討するため,同モデルを用いて低酸素後にオピオイドによるポストコンディショニング刺激が心筋細胞死亡率を低下することを明らかにする。続いてストレス蛋白質誘導したラット培養心筋細胞において,オピオイドによるポストコンディショニングの相互作用を評価する。以上よりストレス蛋白質誘導による心筋保護作用におけるカベオラ・カベオリンの役割を解明し,複数の心筋保護戦略により心保護効果を増強させることができることを明らかにする。平成23年度研究によりストレス蛋白質誘導による心筋保護作用におけるカベオラ・カベオリンの役割が明らかになった。今後はマウスin vitro遊離心筋細胞を用いて,ストレス蛋白誘導によるカベオラ数およびカベオリン-3の活性化を形態学的方法,Western blottingにて明らかにする。
レニン・アンギオテンシン系の糖尿病腎糸球体プロテインキナーゼC活性に対する影響

糖尿病性腎症の発症に対するプロテインキナーゼCの役割を明らかにすることを目的とし、糖尿病ラットを用いたin vivo,および糖濃度を上昇させた培養液を用いたメサンギウムあるいは腎間質線維芽細胞の培養実験を行った。1)糖尿病ラット腎糸球体におけるPKCストレプトゾトシン誘発糖尿病ラットにおいて、PKC活性の亢進および特異的アイソフォームのお増加を腎糸球体において確認した。2)アンギオテンシンIIのPKC活性化作用高糖濃度あるいはアンギオテンシンII刺激によって,メサンギウム細胞のPKC活性が亢進することを認めた。3)PKCのヒアルロン酸産生増加高糖濃度は腎間質線維芽細胞においてPKCを介してヒアルロン酸産生を増加させることを明らかにした。糖尿病性腎症の発症に対するレニン・アンギオテンシン系の関与を明らかにすることを目的とし,本年度は培養メサンギウム細胞を用いた検討を行った.高糖濃度培養条件下あるいはang II単独では,PKC,MAPK活性を増加させたが,高糖濃度培養後にang IIで刺激した場合、両キナーゼ活性に相加的な増加はみられなかった.糖尿病動物の腎組織において,ang IIのレセプターがdown-regulateされるとの報告があり,糖尿病性腎症の発症に対するレニン・アンギオテンシン系の関与を明らかにするには,更に詳細な検討が必要である.[目的]糖尿病性腎症の発症に対するレニン・アンギオテンシン系とプロテインキナーゼC(以下PKC)の関連を明らかにすることを目的とし,本年度は糖尿病ラットを用いたin vivoの検討を行った.[方法]Splaegu-Dawleyラットをストレプトゾトシン60mg/kgの腹腔内投与によって糖尿病とし,24週間飼育,腎を摘出し,sieving法によって糸球体を単離した.一部の糖尿病ラットでは,インスリンペレットの皮下植え込みにより,正常血糖とした.単離糸球体のPKC活性は,PKC特異的な基質を用いたin situ phosphorylation法により測定した.PKCアイソフォームは,単離糸球体を超遠心法によって細胞質分画と膜分画に分離,各アイソフォームに対する特異的モノクローナル抗体を用いたイッムノブロットを行い,特に膜分画の増加を検出した.[結果]糖尿病ラットでは,正常ラットに比べin situ PKC活性が有意に更新しており,この変化は糖尿病ラットをインスリン治療によってほぼ正常の血糖を維持することによって消失した.アイソフォームの検索では,糖尿病ラット腎糸球体の膜分画で,α,δ,εの各アイソフォームが増加しており,これらの変化もインスリン治療によって正常化した.[結論および来年度の課題]これまでに報告されている糖尿病ラット腎糸球体におけるPKC活性の増加に関しては,今回われわれも確認したが,膜分画で増加しているアイソフォームは異なっていた.今後これらPKCの変化に対するアンギオテンシンの影響について,細胞培養系を用いたin vitroの系で検討する予定である.糖尿病性腎症の発症に対するレニン・アンギオテンシン系とプロテインキナーゼCの関連を明らかにすることを目的とし、本年度は腎間質線維芽細胞(NRK)を用いたin vitroの検討を行った。(1)NRK細胞を高糖濃度(D-グルコース,25.6mM)で24時間培養し、上清中のヒアルロン酸濃度を測定、正常糖濃度(D-グルコース5.6mM)、L-グルコース(L-グルコース20.0mM+D-グルコース5.6mM)、およびマニトール(マニトール20.0mM+D-グルコース5.6mM)に比較し、ヒアルロン酸産生は明らかに亢進した。(2)NRK細胞を正常あるいは高糖濃度で24時間培養後、PKC刺激作用をもつフォルボールエステル(PMA)で更に24時間刺激し、その前後でPKC活性をin situ法によって測定した。PKC活性は、基礎値およびPMA刺激後とも、高糖濃度で上昇していた。(3)高糖濃度によるヒアルロン酸産生亢進には、PKC-TGF-βカスケードの活性化が関与していることを認めた。
近接場偏光分光法の開発とナノ磁気光学への応用

光ファイバをテーパー化し、遮光金属膜を塗布した後、先端に微小開口を作製することにより、NSOMプローブを準備した。開口を通して反射光をできる限り効率よく集光する必要があるため、テーパー構造の設計をFDTD法計算機シミュレーションによっておこない、23倍の感度向上を確認した。設計された構造を化学エッチングによって実現し、金コートの後、開口を試料への押し付け法によって作製した。13年度の予備実験の結果をふまえ、計測システムの改良をおこなう。偏光検出感度の向上が最重要課題であった。これまでのクロスニコル配置だけではなく、バランス検出、光弾性変調器による偏光変調検出などを試み、いずれにおいても改善を確認した。その他、ファイバの固定法や背景光除去などの細かな工夫をおこない、全体として前年度と比較して5倍程度の感度向上を達成することができた。また、半導体ナノ構造でのスピンダイナミクスの測定などを目的として、低温・磁場下にて動作するNSOMを設計し、その製作にとりかかった。観察対象としては、GGG薄膜、ハードディスク、MOディスクなどを試みた。光源としては、アルゴンレーザ、ヘリウムネオンレーザを用いた。波長にも依存するが、いずれの試料に対しても反射配置(カー回転計測)において、100200nmの空間分解能を確認した。また、今回開発した高い偏光検出感度を生かし、主に開口部にて生じる偏光解消効果を利用した非磁性材料のイメージングもおこなった。ここでは相変化記録材料(DVD)の記録マーク、ならびに30nmのナノピットを観察対象とした。いずれも30nm以下の小さな開口に対しても強いコントラストが確認され、分解能も30nmが確認された。超高密度光ディスクにおけるマーク読み出し法として有望であることを示した。偏光特性に優れた光ファイバプローブを使用し,高感度かつ安定な偏光検出型の近接場光学顕微鏡を開発することにより,鉄ガーネット薄膜の磁区イメージングや磁気光学記録,微小ピットの読み出しを反射配置(カー回転)にて成功した結果ならびに液晶配向観察に応用した結果を報告する.偏光状態の安定性を考慮し,光ファイバプローブの先鋭化にあたっては,化学エッチング法を用いた.反射配置においては,光の入出力の効率が最終的な偏光検出感度を制限するため,テーパー部の設計を計算機シミュレーションの援用によっで慎重におこなった.先鋭化したファイバに金属膜を蒸着し,先端を観察対象に対して押し当てることにより,良質な開口を作製した.なお,光ファイバ全体の長さは,偏光の安定性のため,80mmと極力短くし,端面反射を空間的に分離するため,斜め研磨をおこなった.観察用の光源としては,主にヘリウムネオンレーザ使用し,偏光回転の検出方法にはいくつかの方法を試行した.クロスニコル法,偏光変調法,バランス検出法などを試み,それぞれに一長一短を確認した.クロスニコル法においては,5桁の消光を達成したが,検出感度の点では,他の二者がより優れている.系全体の偏光の安定性を更に向上させ,バランス検出法を用いる方向で今後は装置の改善を進める.具体的な装置評価にあたっては,磁区の幅が350nmの鉄ガーネット薄膜と光磁気記録媒体の観察をおこなった.十分な信号検出感度を確保するためには,開口径として200nm程度の開口を必要とし,分解能としてもその程度の値にとどまった.また今回開発した測定システムの応用として,近接場領域における偏光解消効果を利用したイメージングもおこなった.レジスト膜にて作製された100nmのピット(窪み)を高感度かつ50nm程度の分解能にて観察することに成功した.また配向膜近傍の液晶分子のダイナミクス観察にも応用し,膜面の不均一性が液晶配向に与える影響について議論した.光ファイバをテーパー化し、遮光金属膜を塗布した後、先端に微小開口を作製することにより、NSOMプローブを準備した。
カーボンナノチューブ曝露により誘発された中皮細胞における遺伝子損傷作用の解析

本研究において、MeT-5A細胞を用いて脂質過酸化物及びアルデヒドの生成を調べた。その結果、TBA値の有意な増加が見出され、過酸化脂質修飾DNA付加体の生成が推定された。脂質過酸化の亢進から、スーパーオキサイド消去酵素であるSOD活性の変化を調べたところ、CNT暴露においてSOD活性が有意に減少した。従って、その減少により細胞内過酸化が進み、遺伝子や蛋白質の酸化が起こり増殖が抑制される可能性も考えられた。また、修復酵素XRCC-1はCNT曝露においてタンパク質で2時間後に、mRNAで12時間後において有意に発現が上昇した。この事から早い時点でDNA損傷修復系が活性化していることが予想された。本年度は、CNT暴露による細胞増殖抑制及び変異原性の機序を解明すべく、研究を進めた。これまでの先行研究で示唆されるG6PDHとCatalaseの活性及びグルタチオンレベルの変化について調べたところ、有意な変化は認められなかった。しかし、本検討では、暴露時間が従来の報告よりも短いため、より長い時間の暴露も行うと共に、24時間後のみの測定ではなく、経時的な変化を調べる事が望まれる。一方、細胞膜脂質の酸化を調べるために行ったTBA試験では、SWCNT暴露の結果において、有意な差が見られ、脂質過酸化の亢進が示唆された。TBA試験によってSWCNT暴露における膜脂質の過酸化が見られたことから、体内で発生する主要な活性酸素種のスーパーオキサイドを消去する、主要な酵素であるSODの活性がどのような影響を受けるかという点に注目した。暴露濃度と分散媒の組合せを変えて検討した結果、100μg/mlでの暴露において、SOD活性は有意に減少するという結果が再現性良く得られた。従って、SOD活性が低下することにより細胞内での過酸化が進み、膜の脂質過酸化と共に細胞増殖が抑制されている可能性が考えられた。DNA損傷評価についての検討において、CNTを細胞に暴露すると細胞内に取り込まれ、Histone(H3)に結合しDNA損傷を引き起こしていることが示唆された。また、修復酵素XRCC-1はSWCNT曝露においてタンパク質レベルで2時間後に、mRNAレベルで12時間後において有意な上昇が認められた。また、MWCNTにおいても、曝露1時間後に有意なmRNAの増大が示された。この事から早い時点で何らかのDNA損傷修復系が活性化していることが予想された。本年度は、カーボンナノチューブを擬似肺胞内液でコーティング後分散して細胞に添加し、あらためてコメットアッセイを行ない、DNA in tail (%)を求めた。データ解析の結果、SWCNT及びMWCNT曝露において有意なDNA損傷が認められ、再現性が得られた。更に、塩基除去修復酵素の発現変動についてもミトコンドリア画分も含めて再解析することで、CNT曝露による酸化的DNA損傷の可能性について検討した。その結果、従来指摘されたようなグリコシラーゼ等の変化は見られなかった。しかし、核内に蓄積した間接証拠として、細胞より抽出したCNTにヒストンH3が特異的に吸着している事が明らかとなった。この結果はCNTが核内に取り込まれ、更にはDNAと相互作用する可能性を示唆するものである。過酸化脂質修飾DNA等の付加体の解析を行う前段階として、MeT-5A細胞を用いて脂質過酸化物及びアルデヒドの生成について調べた。その結果、曝露後細胞より抽出した試料において、TBA値の有意な増加とSOD活性の低下が見出された。この結果から、過酸化脂質修飾DNA付加体の生成の可能性が推定される。今後の展開として、CNTによる直接的なDNA損傷の誘導に主眼を置き機序解明に向けLC/MS/MSによりDNAのアルデヒド付加体等の検出を行う。本年度は、カーボンナノチューブのヒト胸膜中皮細胞(MeT-5A)暴露により見出された変化が、それ自体によるものか、混入が指摘される鉄などの遷移金属によるものであるのかを明確にするため、遷移金属の暴露による、細胞内脂質過酸化、抗酸化酵素の失活およびDNA損傷修復酵素の発現変動について評価、解析を行った。遷移金属の混入を想定して、混入量が最大で5%となるように、鉄、コバルト、ニッケル塩を添加して、MeT-5A細胞に処理した結果、脂質過酸化が若干促進される傾向が観られたのみで、その他の細胞内の成分変化およびカーボンナノチューブ暴露で見られる現象は、いずれも認められなかった。更に、DNAの酸化部位を解析するために8-OHdGを検出し、その修飾箇所の解析をLC-MS/MSを用いて試みたが、その特定には至らなかった。一方、今年度はナノマテリアル暴露の指標となる酸化ストレスマーカーの探索を試み、大気汚染物質の暴露指標として注目される、ヒト血球中のペルオキシレドキシン2(Prx2)の酸化状態について解析するため、新規の分離検出法を考案した。

分析化学「研究の目的」の達成度としては、DNAアダクトーム解析が進んでいない状況にある。標準物質が入手できないことが原因として挙げられる。しかし、DNA損傷修復酵素の有意な発現変動をとらえたことから、間接的ながらも、CNTによる変異の促進が示唆された(達成度40%)。MeT-5A細胞細胞内で起こる変化として、新たにSOD活性の低下を認めた。TBA-RS値の有意な増加については、再現性が得られたため、DNAアルデヒド付加体について解析する必要があると思われる(達成度80%)。「研究の目的」の達成度としては、新型LC/MS/MSの導入が今年度(平成25年)となったため、主眼とするCNT曝露によるゲノムDNAの変異スペクトル解析及びDNAアダクトーム解析が行えず、試料調製法や分離条件のプロトコールを作成したに止まった。(達成度10%)。進捗が大幅に遅れる事が予想されたため、別な角度からCNTを曝露した中皮細胞内で起こる変化を解析した。MeT-5A細胞を用いて脂質過酸化物及びアルデヒドの生成について調べたところ、曝露後細胞より抽出した試料において、TBA-RS値の有意な増加が見出されたことから、DNAアルデヒド付加体の生成の可能性が推定された。曝露後細胞より抽出したCNTに曝露後細胞より抽出したCNTに結合しているタンパク質について解析した結果、多くのヒストンが結合し、特にH3がMWCNTに特異的に結合する事が分かった(達成度80%)。今後は、高速液体クロマトグラフータンデム質量分析器(LC/MS/MS)を用いたDNAアダクトーム解析法によりMeT-5Aに対するCNT曝露により起こる直接的なDNAの修飾を比較解析する。DNA損傷修復酵素系をプロテオームアレイ法で網羅的に解析することで、どのようなDNAの修飾が起きているかを類推し、標準物質の合成を試みる。更に、次世代型シーケンサーによる解析を行い、損傷部位の特定化を目指す。酸化のみならず、アルキル化などDNA上に何らかの損傷が起こった際、DNAからRNAへの転写に利用される転写鎖の方が、非転写鎖より優先的に修復されることが知られている。今年度は、高速液体クロマトグラフータンデム質量分析器(LC/MS/MS)を用いたDNAアダクトーム解析法によりMeT-5Aに対するCNT曝露により起こる直接的なDNAの修飾を比較解析する。更にその突然変異誘発能及びDNA修復メカニズムについて検討する。具体的には、アダクトーム解析のデータを詳細に調べ、その修飾パターンを明らかなものとする。DNA付加体の探索では、CNT曝露により生成する事が予想される過酸化脂質修飾DNA等の付加体の解析を、MeT-5A及びヒト気管支由来正常細胞を用いて行う。更に、様々なサイズのCNTに、肺サーファクタントなどを用いた分散を行い、CNTを細胞に曝露してDNA付加体の測定を行うと共に、そのパターンの違いを比較し、DNA除去修復の速度論的解析を行う。少額の端数で、適当な消耗品がなかったために生じた。細胞培養用血清およびプロテインアレイなど消耗品の購入。DNA付加物分析用HPLCカラム、DNA抽出用キット、DNA損傷修復酵素検出用合成プライマー及び一次抗体などの消耗品。
心筋症モデル動物における心筋障碑の分子レベルでの追究

特発性心筋症は未だ患者数こそ少ないがその予後の悪いこと,若年者にも発症することで問題視されつつある.一方その発症機序を解明する為に適当な実験動物が必要であるが,従来筋ジストロフィー症の実験動物として開発されたジストロフィーハムスターの心筋障碍が心筋症の心筋障碍と類似していることから注目されてきている.筋ジストロフィー症に関してはこの2, 3年ハーバード大のKunKelによって遺伝子工学的手法を駆使して飛躍的進歩がなされた.特に遺伝子上ジストロフィー発症連関mRNAを促え,そのcDNAをとり5′端より配列をきめつつある.今連関DNA欠損が原因となって産物の欠損が発症の機作になっているとすれば同様な機作が心筋にも心筋症で生じていることが考えられる.本年は先ずKunKelの結果をもとにジストロフィー連関遺伝子DNA中エクソン相当部の20merをペプチド合成しシステインをつけ,サイログロブリンをS-S結合したもので抗体を作製した.結果はウサギについて免疫したものはペプチドにもサイログロブリンにも反応したものでサイログロブリンで吸収した.ジストロフィー発症骨格筋も心筋症発症心筋も細胞膜に欠陥があると思われるので膜分画を行うことにした.心筋を蔗糖TKMでホモジエナイズしてマイクロゾーム分画をとり,次いで不連結蔗糖癌度勾配によりF_1, F_2, F_3の3つの分画を得た.小胞体に存在するカルセクエストリンをスティンズオール染色で染めるとF_1は小胞体を含まない表面膜, F_2はどちらも含むジャンクション膜, F_3は小胞体膜であることがわかった.そこでSDSPAGEの610%ゲルに流し,ウエスタンブロットして上記抗体で抗体染色することを試みたた.少なくとも分子量350Kダルトンに反応し,もっと高い分子量をもつ蛋白質と反応した.今後心筋症動物で検討していきたい.特発性心筋症は未だ患者数こそ少ないがその予後の悪いこと,若年者にも発症することで問題視されつつある.一方その発症機序を解明する為に適当な実験動物が必要であるが,従来筋ジストロフィー症の実験動物として開発されたジストロフィーハムスターの心筋障碍が心筋症の心筋障碍と類似していることから注目されてきている.筋ジストロフィー症に関してはこの2, 3年ハーバード大のKunKelによって遺伝子工学的手法を駆使して飛躍的進歩がなされた.特に遺伝子上ジストロフィー発症連関mRNAを促え,そのcDNAをとり5′端より配列をきめつつある.今連関DNA欠損が原因となって産物の欠損が発症の機作になっているとすれば同様な機作が心筋にも心筋症で生じていることが考えられる.本年は先ずKunKelの結果をもとにジストロフィー連関遺伝子DNA中エクソン相当部の20merをペプチド合成しシステインをつけ,サイログロブリンをS-S結合したもので抗体を作製した.結果はウサギについて免疫したものはペプチドにもサイログロブリンにも反応したものでサイログロブリンで吸収した.ジストロフィー発症骨格筋も心筋症発症心筋も細胞膜に欠陥があると思われるので膜分画を行うことにした.心筋を蔗糖TKMでホモジエナイズしてマイクロゾーム分画をとり,次いで不連結蔗糖癌度勾配によりF_1, F_2, F_3の3つの分画を得た.小胞体に存在するカルセクエストリンをスティンズオール染色で染めるとF_1は小胞体を含まない表面膜, F_2はどちらも含むジャンクション膜, F_3は小胞体膜であることがわかった.そこでSDSPAGEの610%ゲルに流し,ウエスタンブロットして上記抗体で抗体染色することを試みたた.少なくとも分子量350Kダルトンに反応し,もっと高い分子量をもつ蛋白質と反応した.今後心筋症動物で検討していきたい.
農業・環境分野での環境媒体中の各種イオンの生物利用可能量の次世代型評価方法の開発

本研究では、福島第一原子力発電所により環境中に放出された放射性セシウムおよびその吸収に大きな影響を与えるカリウムイオンの生物利用可能量を迅速に測定する方法を開発する。具体的には、実土壌等において、微細粒子を通過させずイオンを通過させるためのフィルターおよび放射性セシウムとカリウムを吸着させる材(銅置換体プルシアンブルー、マンガン酸化物)を組合せた装置を開発し、農用地土壌/リター/底質に適用、生物利生物利用可能量の推定方法を構築、農作物及びその周辺環境の安全性評価に寄与する。
延性金属の機械的接合及び分離の基礎的研究

1.塑性変形応力とひずみを独立に制御するため、十字配置の容量16tf,サーボバルブ付きアクチュエータをもつ4軸引張-圧縮材料試験機の仕様を設計し設置した。付属パソコンを用いて、運転・操作の容易化、作動制御、作動状態の目視把握及び精密計測を可能にした。2.本機上で制御された静水圧付加下の平面ひずみ冷間圧縮圧接実験を行うための特殊治工具及び静水圧媒体試験装置を設計、設置した。アルミニウム試験片に大ひずみを生じさせるための形状及び接合継手引張強度試験技術も工夫し、実験を行つた。静水圧は変形後期のみに付加されると接合強度を高めるが、変形前期のみ、又は全期に付加されるとかえって強度が落ちるという新事実が見出された。接合部分縦断面の顕微鏡検査により、接合面の予備処理のワイヤブラシングによって生成した硬化層は高圧下では延性が増してかなり伸びてから切断するため、清浄な母地金属面の露出面積割合が減る一方高圧が露出面部における接合強度を高めるという相反効果のあることが判明し、上記強度実験結果が説明できた。3.異種金属圧接のさい問題となる変形抵抗差にもとずく異常変形又は破断を実験的に研究するため、プラステイシンを主体とするモデル材料を考案した。パルスモータ駆動2軸加圧装置、アクリル樹脂製平面ひずみ側方ならびに前方押出し実験工具を設計、製作し、複合材料流動観測実験を行った。2層の変形抵抗差が大なるほど、硬層の厚さ割合が小なるほど、側方押出しでは硬層素材巾が狭いほど、前方押出しでは減面率が高く、硬層が内側にあるとき、硬層のくびれ、破断が起りやすいことが分ツた。側方押出しについてはスラブ法理論による解析を行つて実験結果と一致する結果を得た。4.以上により、接合の場合、軟層に囲まれて圧縮される硬層の破損という新しい破損問題が重要な役割を演ずることが明らかになった。
抗がん剤併用療法のための縮小回帰に基づく用量探索法の研究

高い抗腫瘍効果を得るために2つの抗がん剤を同時に投与する2剤併用療法の臨床開発が加速化している.一方で,併用療法の推奨用量を決定するための統計的用量探索法は確立されていない.本研究では,2剤併用量法のための用量探索法を開発し,既存の用量探索法との性能比較を行った.その結果,開発した方法は,毒性が高い用量を回避しながら,推奨用量を同定できる性質を有する方法であることが明らかになった.高い抗腫瘍効果を得るために2つの抗がん剤を同時に投与する2剤併用療法の臨床開発が加速化している.一方で,併用療法の推奨用量を決定するための統計的用量探索法は確立されていない.本研究では,2剤併用量法のための用量探索法を開発し,既存の用量探索法との性能比較を行った.その結果,開発した方法は,毒性が高い用量を回避しながら,推奨用量を同定できる性質を有する方法であることが明らかになった.提案法は,3パラメータロジスティックモデルに縮小係数(01の値をとる係数)を乗じたモデルであり,Copasの縮小推定法(Copas, 1983, Journal of the Royal Statistical Society, Series B, 45:311-354)を応用することで推定することができる.当該縮小ロジスティックモデルに基づく用量探索法は,試験初期に高用量を探索することで,過剰毒性用量を学習し,試験後期ではその用量を回避して用量探索を実施する.このため,最大耐量(maximum tolerated dose; MTD)の同定精度も向上し,既存法よりも優れた性能を有する.シミュレーション実験により既存の2方法と比較した結果,提案法はこれらの方法よりもMTD同定割合が12%高く,さらに過剰毒性選択割合を25%低くすることができた.今後は,他の方法も含めて提案法の性能を検証していく予定である.高い抗腫瘍効果を得るために2つの抗がん剤を同時に投与する2剤併用療法の臨床開発が加速化している.一方で,併用療法の推奨用量を決定するための統計的用量探索法は確立されていない.2剤併用療法の場合,許容できない毒性確率を有する用量(過毒性用量)に割付けられる症例が多くなる可能性があるが,既存法では当該問題に対応できていない.本研究では,2剤併用量法のための用量探索法を開発し,既存の用量探索法との性能比較を行った.具体的には,Copasが提案した縮小回帰モデルを基礎として,過毒性用量を回避できる縮小ロジスティックモデルを提案した.また,提案モデルのパラメータ推定法も開発した.次に,提案モデルのパラメータ推定が安定するまで用いるスタートルール,用量探索過程における増量・減量に対する制限について,提案法に適した方法を評価・選択した.これらの検討を踏まえて,過毒性用量を回避できる用量探索法(提案法)を開発した.シミュレーション実験により,提案法の動作特性を評価すると共に,既存法との性能比較を行った.シミュレーションの結果,提案法の推奨用量選択割合は既存法と同等であり,有用性が示唆された.他方で,過毒性用量選択割合については,提案法が最も低く,これに伴い毒性発現割合も最も低かった.なお,実際の臨床試験で提案法を用いる場合は,検討する用量組合せの毒性確率をいくつか想定し,それに適したコホートサイズ,スタートルール,増量・減量に関する制限を検討し,提案をカスタマイズしていくことが望ましいと言える.生物統計学提案法については,生物統計学の国際雑誌(Statistics in Medicine)に採択されており,さらに,当該領域の総説を執筆し,計量生物学(Japanese Journal of Biometrics)に採択されている.現在は,海外の共同研究者と共に,提案法を含めた用量探索法の性能比較に関する研究を実施し,その成果を国際雑誌に投稿中である.提案法に関する検討は一通り終わっているため,今後は,提案法の改良・拡張を試みる.具体的には,提案法を分子標的薬のための用量探索法に改良することを考えている.また,コンパニオン診断薬を伴う抗がん剤開発が増加しているため,バイオマーカー陽性例・陰性例のそれぞれでMTDを同定できる用量探索法への拡張を検討している.当該年度は,業務の都合上,国際学会への参加が困難であったため,当該旅費を次年度に繰り越すこととした.繰り越し分は,会議・学会旅費にあてる予定である.また,必要に応じて計算機を購入する予定である.
乳幼児期の海馬における新生顆粒細胞の移動機構とその破綻による海馬発達異常の解明

てんかんは、大脳の神経細胞がいっせいに活動してしまうことで様々な発作を起こす病気であり、その原因の一つは神経回路の形成異常である。本研究では、げっ歯類を利用した実験によって、乳幼児期の熱性けいれんが神経細胞の移動を撹乱することが、成体期の脳内における一部の神経回路の形成異常に繋がることが示唆された。また、この現象は、神経伝達物資であるγ(ガンマ)-アミノ酪酸(GABA)が、神経細胞の正常な移動を阻害するためであることが示された。本研究の目的は、大きく分けて以下の二つである。すなわち、(1)乳幼児期の海馬における新生顆粒細胞の移動機構を解明すること及び、(2)側頭葉てんかん患者の海馬で頻繁に観察される異所性顆粒細胞の出現機構を解明すること、である。研究代表者は、特に神経伝達物質であるGABAの関与に着目し、海馬培養切片及び個体動物を用いた実験をおこなった。まず、GFP強制発現ラット由来の歯状回門切片と野生型ラット由来の海馬切片を共培養することにより、放射状移動中の幼若顆粒細胞がGABA_A受容体を介した興奮性入力を受けていることを電気生理学的手法によって明らかにした。また、側頭葉てんかん患者が乳幼児期に高頻度で経験する熱性けいれんの実験モデルラットより歯状回門切片を摘出して共培養したところ、同切片由来の細胞が歯状回門中で逆走する様子が頻繁に観察され、この現象はGABA_A受容体阻害薬によって阻止された。さらに同モデルラットの海馬における異所性顆粒細胞の出現は、GABA_A受容体阻害薬の投与によって抑制された。以上の結果は、顆粒細胞の移動をGABAが調節することを初めて示すとともに、熱性けいれんを経験した海馬ではGABAの入力によって顆粒細胞が逆走し、将来的に異所性顆粒細胞となる可能性を示唆した。以上の結果は、GABA入力の制御による異所性顆粒細胞の出現の防止が、新たな側頭葉てんかんの治療法開発に繋がる可能性を含み、基礎医学的にも意義深い。これらの結果の一部は第37回北米神経科学会年会で研究発表し、2007年度日本神経科学学会「トラベルアワード」を受賞した。また、研究代表者は、成体海馬に存在する顆粒細胞の大部分が乳幼児期に新生した細胞であること及び、乳幼児期のてんかん発作が成体期の異所性顆粒細胞出現に繋がることを、マウスに新生細胞マーカーであるBrdUを投与することによって示し、2報の論文に纏めた。平成20年度は、熱性けいれんによって異所性顆粒細胞が生じるメカニズムを、in vitro及びin vivoの両実験系を利用して詳細に解析した。まず、歯状回門切片の移植片培養法を開発し、熱性けいれんラット由来の移植片から移動する細胞では、移動に必要な先導突起の成長円錐上におけるGABA_A受容体の発現量が上昇していることを発見した。さらに、このような先導突起に対してGABA_A受容体の作用薬を局所適用すると、先導突起から細胞体へとカルシウムオシレーションが生じ、細胞の移動が停止、または逆走することを発見した。次に、生後5日齢のラットに分裂細胞マーカーであるBrdUを投与し、生後11日齢において熱性けいれんを誘導したところ、熱性けいれんを誘導していない群と比較して、生後18日及び生後60日目における異所性顆粒細胞(BrdUおよび顆粒細胞マーカーProx1共陽性細胞)の密度が上昇することが明らかになった。さらに、熱性けいれんによる異所性顆粒細胞の出現は、けいれん誘導後にGABA_A受容体の阻害薬を処置することで抑制された。また、生後1118日目にGABA_A受容体の作用薬を慢性処置することにより、異所性顆粒細胞が出現した。以上の結果は、熱性けいれんによって将来的に異所性顆粒細胞が出現することを初めて示したと同時に、その原因が、先導突起成長円錐上のGABA_A受容体の活性化による新生顆粒細胞の逆走移動であることを解明した点で、細胞生物学的な見地からも意義深い。これらの結果の一部は第42回日本てんかん学会で発表し、優秀発表賞を受賞した。また、現在、本研究を論文として纏め、国際誌に投稿準備中である。
The Rise of Asian Multinational Enterprises: Drivers, Paths and Performance

この研究プロジェクトは、新興アジアの多国籍企業の世界的な台頭に対応して、先進国からの企業とドライバー、道路、業績の差異を明らかにすることを目的としています。ケーススタディと量的データと統計分析に基づいて、内在化理論、折衷的パラダイム、国際化プロセスモデルなどの伝統的な視点は、新興アジアからの多国籍企業についての強力な説明を提供しますが、所有権の利点、学習プロセス、国際化のためのグローバルおよび業界のコンテキストなど、少なくとも4つの分野での拡張が含まれます。この研究プロジェクトはまた、多国籍企業とその政府が国内市場と世界的な段階で競争力を強化するために実施すべき戦略と政策を勧告する。
マラリア流行ホットスポットのサーベイランス技術の開発

最近の対策の強化により世界的なマラリア死亡者数は減少傾向に転じた。そこで、アジア太平洋地域の流行国においては、マラリアエリミネーションを目指した施策が検討されている。本研究では、三日熱マラリア原虫の赤血球期タンパク質を網羅する307種類の組換えタンパク質からなるプロテインアレイを合成し、三日熱マラリア患者治療後の抗体価の推移を、タイ・ブラジル・パプアニューギニアの計96名の流行地住民で9ヶ月間追跡した。その結果、ホットスポットのサーベイランスに利用できる55種類の原虫抗原タンパク質を同定した。マラリアは、熱帯地域において猛威をふるっているが、最近の対策の強化により世界的なマラリア死亡者数は減少傾向に転じた(WHO)。そこで、アジア太平洋地域の流行国においては、マラリアエリミネーション(除去)を目指した施策が検討されている。これまでに申請者は、これらの地域で流行している熱帯熱及び三日熱マラリア原虫のゲノムワイドなプロテインアレイ、及びそれを用いた高速免疫スクリーニング技術を確立した。本研究では、熱帯熱マラリア及び三日熱マラリアが流行しているタイにおいて患者の追跡研究を実施し、マラリア流行ホットスポットの検出に必須なサーベイランス用抗原タンパク質をシステマティックに探索する。この抗原を同定することが出来れば、ディップスティック等、現場で使用可能なキットの開発が加速でき、流行国のマラリアエリミネーションプログラムに大きく貢献できる。平成27年度は、タイ北西部のマラリア診療所においてマラリア患者血清の経時的採取を開始したが、大部分が三日熱マラリア原虫患者であった。したがって、研究の焦点を先ず三日熱マラリアに当てることとし、300種類もの三日熱マラリア原虫タンパク質からなるハイスループット免疫スクリーニング用プロテインアレイの合成を終了した。タイ北西部のフィールドの実情に合わせて、三日熱マラリアに焦点を当て、患者血清の採取ならびに三日熱マラリア原虫のプロテインアレイの準備が完了したため、当初の計画通り研究は進捗していると考えられる。研究目的:マラリアは、熱帯地域において猛威をふるっているが、最近の対策の強化により世界的なマラリア死亡者数は減少傾向に転じた(WHO)。これまでに申請者は、これらの地域で流行している熱帯熱及び三日熱マラリア原虫のゲノムワイドなプロテインアレイ、及びそれを用いた高速免疫スクリーニングシステムを確立した。平成28年度の研究計画及び実績概要:1.タイ北西部のマラリア診療所において、三日熱マラリア患者合計32名の三日熱マラリア患者を治療後9ヶ月間フォローし、経時的な血清サンプルが入手できた。なお、この観察期間中に、対象者に再感染及び三日熱マラリアの再発は起こっていないことは確認済みである。2.平成27年度に作製した307種類の三日熱マラリア原虫タンパク質アレイと、治療後0,3,6,9ヶ月目の上記血清サンプルを高速免疫スクリーニングシステムを用いて抗体価の変動を測定した。当初の計画通り、三日熱マラリア患者血清の経時的サンプリング、ならびにそれを用いた307種類もの三日熱マラリア原虫組換えタンパク質に対する抗体価の測定は完了した。<研究目的>マラリアは、熱帯地域において猛威をふるっているが、最近の対策の強化により世界的なマラリア死亡者数は減少傾向に転じた(WHO)。<平成29年度の研究成果>平成29年度は、三日熱マラリア原虫の赤血球期タンパク質を網羅する307種類の組換えタンパク質からなるプロテインアレイを合成し、三日熱マラリア患者治療後の抗体価の推移を、タイ・ブラジル・パプアニューギニアの計96名の流行地住民で1年間追跡した。その結果、抗体価の半減期が地域差なく安定的に測定できる55種類のPv抗原タンパク質を世界に先駆けて同定した。この抗原セットは、三日熱マラリア流行ホットスポットの検出に有用なサーベイランス用抗原タンパク質と考えられる。

症例数を十分に確保するため、引き続き患者血清の採取を続けると共に、三日熱マラリアサーベイランス用抗原の免疫スクリーニングを開始する。平成29年度は、各三日熱マラリア原虫タンパク質に対する抗体価の変動をから抗体の半減期データを解析し、ホットスポットサーベイランスに適した抗原を同定する。29年度が最終年度であるため、記入しない。寄生虫学29年度が最終年度であるため、記入しない。
培養細胞の微小環境制御を目指した新しい微細加工技術の開発と応用

先年度までの成果である、集束レーザー光を用いた局所加熱によるアガロースゲルの微細加工技術、アガロースゲルへの官能基修飾ナノパーティクル埋め込みによるプロテイン修飾技術を、1)基礎生物的応用、2)工学的応用、の双方向へ展開する研究を行った。1)基礎生物学的応用では、アガロースゲル微細構造を生物体の形態形成プロセスに対する空間的境界条件として用いる新しい形態学実験手法の最初の一例として、種々の太さのアガロースマイクロトンネル構造内でのPC12細胞の神経突起伸展を約1週間にわたって追跡観察し、神経突起伸展に対する空間的拘束の影響を分析した。その結果、直線型のマイクロトンネル内での神経突起が伸長と縮退の振動を繰り返す様子が観察され、トンネルの直径が2μmから8μmの範囲内では、マイクロトンネルによる空間的拘束はその中で伸展するPC12の神経突起の運動速度を線形的に低下させる一方、伸縮振動の周期には有意の変化が見られない、という分析結果が得られた。2)工学的応用では、培養液・血液循環型の大型バイオ人工臓器作成の基礎技術として、血管内皮細胞を用いた直径数十μmから数mmの血管モデル作成の技術開発を行った。その結果、直径数十μmから数mmのフィブロネクチン修飾アガロースゲルトンネル内に血管内皮細胞を搬入して培養することで、微細加工したトンネル内壁を血管内皮細胞で覆った血管組織様の細胞集団構造が形成された。次に、それまでの細胞支持構造であったナノスフィア包埋アガロースゲルのかわりに、コラゲナーゼなどの酵素処理で培養細胞に非侵襲に分解除去できるゼラチンゲルを支持構造に用いる血管モデル作成法の開発を行った。その結果、微細構造の局所加熱加工時には、ゼラチンとアガロースの混合ゲルを用いることで、加熱による体積変化の極めて小さいアガロースゲルのネットワークで加熱店近傍のゼラチンの膨潤を力学的に抑止して、ゼラチンゲルを安定に局所加熱加工する方法を見出した。加工後のゼラチン-アガロース混合ゲルは、ゼラチン部をグルタルアルデヒト架橋した後にアガロースゲル部を加熱融解除去する、という工程を経ることによって、酵素による分解除去が可能な架橋ゼラチンゲルの微細構造に変換された。この工程で作成し洗浄したゼラチンゲルマイクロトンネル内で血管内皮細胞を培養すると、細胞は内壁を埋め尽くすまでに伸長・増殖し、血管モデルが作成できた。アガロースゲルを中心材料として、培養細胞の微小環境制御に目標を置いたソフトマテリアル微細加工技術の開発とその評価を行った。特に従来の細胞培養技術では技術的バリエーションに乏しかった3次元の細胞集団形状制御技術の新規開発に重点的に目標をおき、以下の新規技術の試験を行った。3)吸光発熱層を内部に挟み込んだアガロースゲルと波長1064nmの集束レーザー光を用いたPTEによるアガロースゲル内部の3次元微細エッチング加工4)以上1)3)を複合的に用いるアガロースゲル以外のハイドロゲル(コラーゲンゲル・メビオールゲル・カラギーナンゲル・カードランゲル等)の3次元微細構造作製法5)波長1064nmの集束レーザー光を用いた吸光発熱マイクロビーズのオプティカルトラップハンドリングによるアガロースゲル内部の3次元微細エッチング加工以上の研究開発の結果、5)についてはオプティカルトラッピング以外の強力な非接触微粒子ハンドリングが必要であることが判明したが、1)4)の技術を用いてアガロースゲルを含む種々のハイドロゲル内に任意の3次元形状の微細腔(Microcavity)を作製することが可能になり、そのMicrocavity内で任意の細胞を種々の細胞外基質(ECM)とともに培養することにより、任意の3次元形状と構成細胞種からなる細胞集団を得ることが可能であることを確認した。先年度の成果であるアガロースゲル微細加工技術と他のハイドロゲル類の微細加工材料としての特徴を考慮し、培養多細胞生物体の微小環境、特に形態を制御する技術に基づき形態と機能の相互作用について多細胞体を培養観察・解析する新規実験系の開発を行なった。1)ハイドロゲル微細構造への細胞接着性の制御技術の開発2)ハイドロゲル微細構造中の細胞の非侵襲的回収技術の開発3)ハイドロゲル微細構造の接着及び封鎖技術の開発4)癌細胞のモデル細胞としてのSTO細胞集団の形態依存的動態の観察解析系の開発5)血管内皮細胞を用いた形態制御モデル毛細血管断面の観察解析系の開発上記の各々の目標に対し具体的には以下の方法により実現を試みた。1)官能基修飾ナノパーティクル埋め込みによる任意の低反応性ハイドロゲルへの細胞接着分子の共有結合修飾アルギン酸-ポリリジンのポリイオンコンプレックスによる細胞接着性ハイドロゲル微細構造の作成2)物理的方法:アガロースゲルへの側鎖導入による融点降下化学的方法:陽イオン支持性カラギーナンゲルやアルギン酸ゲルのMicrostructureのキレート剤による分解酵素的方法:アガロースゲルのアガラーゼによる分解架橋ゼラチンゲル微細構造のコラゲナーゼによる分解3)紫外線硬化型ポリマーのマイクロピペットによる局所放出と紫外レーザー集束光照射による局所的硬化・接着4)アガロースゲルのマイクロキャビティー内でのSTO細胞培養観察5)PDMS微小流路内にさらに作成した細胞接着性ハイドロゲルの微小流路壁と微量定量ポンプを用いた培養液循環型血管内皮細胞培養観察以上のうちiv)の成果を第8回μTAS、第42回日本生物物理学会年会、第49回Biophysical Society年会で発表した。

先年度までの成果である、集束レーザー光を用いた局所加熱によるアガロースゲルの微細加工技術、アガロースゲルへの官能基修飾ナノパーティクル埋め込みによるプロテイン修飾技術を、1)基礎生物的応用、2)工学的応用、の双方向へ展開する研究を行った。1)基礎生物学的応用では、アガロースゲル微細構造を生物体の形態形成プロセスに対する空間的境界条件として用いる新しい形態学実験手法の最初の一例として、種々の太さのアガロースマイクロトンネル構造内でのPC12細胞の神経突起伸展を約1週間にわたって追跡観察し、神経突起伸展に対する空間的拘束の影響を分析した。その結果、直線型のマイクロトンネル内での神経突起が伸長と縮退の振動を繰り返す様子が観察され、トンネルの直径が2μmから8μmの範囲内では、マイクロトンネルによる空間的拘束はその中で伸展するPC12の神経突起の運動速度を線形的に低下させる一方、伸縮振動の周期には有意の変化が見られない、という分析結果が得られた。2)工学的応用では、培養液・血液循環型の大型バイオ人工臓器作成の基礎技術として、血管内皮細胞を用いた直径数十μmから数mmの血管モデル作成の技術開発を行った。その結果、直径数十μmから数mmのフィブロネクチン修飾アガロースゲルトンネル内に血管内皮細胞を搬入して培養することで、微細加工したトンネル内壁を血管内皮細胞で覆った血管組織様の細胞集団構造が形成された。次に、それまでの細胞支持構造であったナノスフィア包埋アガロースゲルのかわりに、コラゲナーゼなどの酵素処理で培養細胞に非侵襲に分解除去できるゼラチンゲルを支持構造に用いる血管モデル作成法の開発を行った。その結果、微細構造の局所加熱加工時には、ゼラチンとアガロースの混合ゲルを用いることで、加熱による体積変化の極めて小さいアガロースゲルのネットワークで加熱店近傍のゼラチンの膨潤を力学的に抑止して、ゼラチンゲルを安定に局所加熱加工する方法を見出した。加工後のゼラチン-アガロース混合ゲルは、ゼラチン部をグルタルアルデヒト架橋した後にアガロースゲル部を加熱融解除去する、という工程を経ることによって、酵素による分解除去が可能な架橋ゼラチンゲルの微細構造に変換された。この工程で作成し洗浄したゼラチンゲルマイクロトンネル内で血管内皮細胞を培養すると、細胞は内壁を埋め尽くすまでに伸長・増殖し、血管モデルが作成できた。
大腸菌の全ての転写因子の調節機能とネットワーク全体像の解明

ゲノム転写パターンの決定制御機構の理解を目指し、大腸菌RNAポリメラーゼの転写対象遺伝子選択能を制御する、転写因子全300種の制御機能の解明を目標とした先端研究を実施し、以下の研究成果を得た。1) Genomic SELEX法を開発し、転写因子300種のノム上の結合部位を解析し、制御支配下遺伝子群を同定した。2) NIP-chip法を開発し、菌体内での転写因子作動遺伝子領域を解析した。3)転写因子遺伝子欠損系統を利用し、転写因子支配下遺伝子群の転写制御を実証した。4)特異抗体を作製し、転写因子細胞内濃度を決定した。5)転写因子の制御ネットワーク全体像を提案した。6)ひとつの生物の全転写因子の制御機能を解明した,最初の成果となった。転写酵素RNAポリメラーゼは、転写因子との相互作用で、ゲノムから転写対象遺伝子を選択し、転写因子の交換でゲノムの遺伝子発現パターンが変化する。ゲノム転写包括制御機構の解明を目標に、大腸菌の300種類転写因子の全てについて、制御支配下遺伝子群の同定と制御機能の解析を実施した。転写因子の制御標的については、本研究で開発したGenomic SELEX法で、純化転写因子が認識結合するDNA配列を決定することで同定した。分子生物学勃興期からのモデル生物である大腸菌でも、凡そ100種転写因子に関しては、機能未知であった。既知転写因子についても、制御標的のひとつまたは数個の遺伝子の解析に終わっていた。しかし、研究初年度で、凡そ半数の転写因子に関して、SELEX解析を実施し、標的の全体像を明らかにすることが出来た。一方、転写因子の特異抗体を作製し定量的免疫染色法で、大腸菌各種培養条件での細胞内濃度の決定を実施した。本年度、約100種の転写因子濃度を決定した。また転写因子の活性に影響を与える物質と環境要件に関しては、形質マイクロアレイ法(Phenotype microarray)で探索した。存在する転写因子の活性が、これら要素・要因で制御されていることが明らかになった。この戦略での研究を継続することで、ゲノム転写制御の全体像の解明を目指す。研究終了時には、ひとつの生物の、すべての転写因子の制御機能を解明を、世界に先駆けて成功させたい。ゲノム転写包括制御機構の解明を目標に、大腸菌の300種類転写因子の全てについて、制御支配下遺伝子群の同定と制御機能の解析を実施し、以下の成果を得た。1.転写因子の制御標的遺伝子群を転写因子が認識結合するDNA配列を決定し同定するGenomcSELEX法を開発した。2.大腸菌転写因子300種のうち、機能未知転写因子ほぼ全部約100種および機能既知転写因子約100種に関してGenomic SELEXスクリーニングを実施し支配下遺伝子群を推定した。3.転写因子の支配下にある機能未知遺伝子群については、転写因子遺伝子欠損株を利用し、Northern blot解析、Primerextension解析で、生体内での制御を確認した。4.転写因子支配下と同定したが、機能未知の遺伝子群については、形質マイクロアレイ法(Phenotype microarray)で生理楼能を推定した。5.機能既知転写因子に関しては、既知標的を遥かに凌駕する新規標的を同定した。例えば、全ての生物を通して、もっとも解析されていた、大腸菌cAMP結合因子(CRP)についても.既知標的200を超える約500の標的を同定した。6.大腸菌転写因子群の制御標的の新規発見にともない、転写因子の多種多様な制御機能概念を提唱できた。7.転写因子支配下標的全体像の解明によって,膨大な転写因子ネットワークが明らかになって来た。8.転写因子の特異抗体を作製し定量的免疫染色法で、大腸菌各種培養条件での細胞内濃度の決定をした。9.転写因子の活性に影響する環境要因を、Phenotype microarrayで探索した。この戦略での研究を継続することで、研究終了時には、ゲノム転写制御の全体像を解明できる展望が開けた。ひとつの生物の、すべての転写因子の制御機能を解明を、世界に先駆けて成功させたい。研究代表者は、大腸菌RNAポリメラーゼの細胞内濃度を測定し、ゲノムの約4,400遺伝子の転写パターンは、2,000分子のRNAポリメラーゼのゲノム全遺伝子間での分配制御で決定されるとの理論を提唱してきた。RNAポリメラーゼの分配は、約300の転写因子との相互作用で決定される。

従って、300転写因子すべての支配下遺伝子セットを同定し、その上で、300転写因子の細胞内有効濃度を測定すれば、ゲノムの4,400遺伝子の発現パターンの理論的予測が可能となる。ゲノム発現パターン決定機構を理解し、その制御の全体像の解明を目指した本申請は、新時代の生命科学研究の先端研究である。以下は、本年度の研究成果の概要である。1)大腸菌転写因子300種全てを精製純化し、Genomic SELEX法(SEEX-clos及びSELEX-chip)を利用して、約200種類転写因子に関しては、転写因子結合部位を同定し、その情報から、制御支配下遺伝子群を同定した。2)大腸菌内の蛋白-DNAを、NIP-chip法で共有結合で連結し、転写因子結合部位を解析することによって、生体内で転写因子が実際に制御しているゲノム位置を同定した。3)Genomic SELEX及びNIP-chip実験から予測した転写因子支配下遺伝子群の転写制御を、野生株と転写因子遺伝子欠損系統を比較して実証し、また転写活性化・転写抑制の様式を決定した。4)転写因子の特異抗体を作製し、抗体を利用した定量的免疫ブロット解析で、各種培養条件、各種増殖相での細胞内転写因子濃度を決定した。5)Phenotype Microarrayで転写因子の活性に影響する要素・要因を探索し、転写因子の環境応答における役割wo探索した。全ての結果を総合して、転写因子によるゲノム転写包括制御モデルを構築し、全体像を提唱した。ひとつの生物のすべての転写因子の制御機能の解明を目指した研究の先陣を切ることが出来た。
時間可度二重光励起による有機金属化合物の新しい光反応の研究

1.EG&G製Xeフラッシュランプ(7FX-4、発光時間巾10μs、50J)2箇を、時間幅10μsから10msまで可変で間隔をあけた二重閃光発光装置を設計製作した。既存の高圧電源部を改良使用し、Flash Controllerを組立て、Flash HeadとしてはTrigger Module TM-11A、Spork Trigger Gap GP-20B(いずれもEG&G)を用いた。Charging VoltageとしてはMax 10KVとし、それ以下を可変とした。この光源系を二系統設け発光時間差を設定して手動で二連閃光発光を駆動させることを行う。Xeランプ2箇は垂直配置を主とし、試料の形態によっては装置を90°回転させ水平配置をとることも可能とした。試料セルはCaF_2窓のIR液体セルあるいは石英セル(l=10cm、φ=1cm)を用いる。2.上記装置製作と平行して、有機金属化合物ビス(ホスフィン)-およびビス(ホスファイト)(オクタカルボニル)ジマンガン、(カルベン)(ノナカルボニル)ジマンガンおよび1、^<10->フェナンスロリン錯体を合成し、これらを光照射量を四塩化炭素-ジマンガンデカカルボニル系での塩化マンガンペンタカルボニル生成量で規格化した条件で、10μs閃光と20ms閃光を用いて上記化合物の光化学的挙動を比較し、またCaF_2赤外セル中での光照射系と10cm石英セル中で光照射した後処理して取出した系についてIR的に比較し、本体完成後の実験条件を検討した。検討した化合物のうち、ビス(ホスフィン)錯体とビス(ホスファイト)錯体について全光量一定下で発光時間の違いによりその光化学に差異が出ることを検出した。ホスファイト錯体では長時間の方の条件で解離が認められた。カルベン錯体の光反応性にも時間差の影響が見られた。上記装置によりこの2種の化合物系について検討を進める。