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嫌気微生物エコシステムによる高濃度ビタミンB_<12>生産法の確立

ビタミンB_<12>の工業生産はプロピオン酸菌を糖質基質で培養し、菌体内に蓄積したB_<12>を抽出精製している。しかし、生成酢酸およびプロピオン酸の増殖阻害により高濃度菌体の取得が困難である。また、偏性嫌気酢酸生成菌はメタノール/CO_2から酢酸を生成する。本菌のB_<12>含量は高いが、生成酢酸により同様の増殖阻害を受ける。そこで、本研究ではこれら生成有機酸を資化しうる嫌気性微生物とのエコシステムによる高濃度B_<12>生産法の開発を図った。得られた研究成果を既述したい。(2)光合成細菌(Rhodobacter sphaeroides)は硝酸呼吸下、プロピオン酸、酢酸を同時資化しN_2を生成した。混合培養によりB_<12>生産量を約4倍増加できた。しかし、光合成細菌による有機酸消費が不十分であり、プロピオン酸菌の菌体濃度は10g/lが限界であった。(1)本菌の酢酸阻害定数は270mMであり、B_<12>含量は5mg/gと高かった。(2)脱窒菌との共生培養は至適ORPの相違故に、また硫酸還元菌との共生培養は低酢酸資化故に、双方とも不可能であった。(3)メタン生成菌との共生培養を検討した。両菌の比増殖速度は著しく異なるので上述のような混合培養は不可能であった。そこで、Methanothrixの固定床バイオリアクター(担体:セラミック・ポリプロピレン混合体)をAcetobacteriumの連続培養系に連結し液循環する事により酢酸除去を図った。その結果、酢酸濃度をほぼゼロに維持する事が可能となった。またCO_2の代わりに蟻酸を用いることにより約20mgB_<12>/l・dが達成できた。ビタミンB_<12>の工業生産はプロピオン酸菌を糖質基質で培養し,菌体内に蓄積したB_<12>を抽出生成している。しかし,生成酢酸およびプロピオン酸の増殖阻害により高濃度菌体の取得が困難である。また,偏性嫌気性酢酸菌(Acetobacterium sp.)はメタノール/CO_2から酢酸を生成する。そこで,本研究ではこれら生成有機酸を資化し得る嫌気微生物とのエコシステムによる高濃度B_<12>生産法の開発を図る。本年度(初年度)の研究成果を以下に概述する。(1)まず,脱窒菌の単独培養結果として,本菌は硝酸呼吸下グルコース存在下でも酢酸およびプロピオン酸を選択的に資化しN_2Oを生成することを見い出した。したがって,プロピオン酸菌との相利共生培養が可能となり,B_<12>生産量をプロピオン酸菌単独培養に比べて2倍増加できた。しかし,硝酸塩添加による塩阻害が問題となる。(2)光合成細菌(脱窒)の場合,プロピオン酸および酢酸を同時資化しN_2を生成した。この場合も共生培養は可能であり,B_<12>生産を3.9倍増加できた。しかし,有機酸消費は完全ではなく,菌体濃度10g/lが限界であった。2.Acetobacterium sp.との共生培養(脱窒素,硫酸還元菌およびメタン生成菌)系の構築(2)脱窒菌との共生培養は至適ORPの相違ゆえに,また硫酸還元菌との共生は低酢酸資化ゆえに不可能であった。(3)メタン生成菌(混合系)との共生培養は可能であったので,次年度以降はMethanothrixを用いて実施したい。

ビタミンB12の工業生産はプロピオン酸を糖質基質で培養し、菌体内に蓄積したB12を抽出精製している。しかし、生成酢酸およびプロピオン酸の増殖阻害により高濃度菌体培養系の確立が困難である。また、偏性嫌気性酢酸生成菌(Acetobacterium sp.)はメタノール/炭酸ガスから酢酸を生成する。本菌のB12含量は高いが、生成酢酸により同様の増殖阻害を受ける。そこで、本研究ではこれら生成有機酸を資化し得る嫌気性微生物とのエコシステムによる高濃度B12生産法の開発を図る。本年度(2年度)の研究成果を以下に概述する。1.プロピオン酸菌(Propionibacterium freudenreichii)と脱窒菌(Paracoccus denitrifican s)との共生培養KNO_3の添加によりプロピオン酸菌(グルコース基質,酢酸・プロピオン酸生成)と脱窒菌(硝酸呼吸,酢酸・プロピオン酸消費)との共生培養が達成できた。この場合,両菌の接種比率は重要であり、プロピオン酸菌/脱窒菌=2の時,単独に比べて菌体量は2倍,B12量は3倍となった。1)Acetobacterium sp.の増殖特性をメタノール/CO2培地を用い、ケモスタット培養にて解析した。その結果、メタノール濃度を変えても酢酸生成速度は6mmol/liter・hが限界であり、炭酸ガスの供給が律速であること、および酢酸の生産物阻害が大きいことが判明した。2)そこで、炭酸ガスに代わり得る基質について検討した。その結果、メタノール/ギ酸系が有効であることを見い出した。3)酢酸による阻害を取り除く方法として、Acetobacterium sp.培養液をMethanothrix(メタン生成菌)を付着させた固定床リアクターに液循環した。さらに、酢酸生成によりpHが6.8以下に低下すればメタノール培地の供給が停止し、酢酸消費に伴い、pHが6.8以上に上昇すれば培地が連続供給されるpH auxostatを組み入れた。その結果、酢酸濃度をほぼゼロに維持できる連続培養系が達成できた。さらに、メタン菌の生成する炭酸ガスを利用でき、CO_2無添加培地を使用できた。ビタミンB_<12>の工業生産はプロピオン酸菌を糖質基質で培養し、菌体内に蓄積したB_<12>を抽出精製している。一方、偏性嫌気性酢酸生成菌(Acetobacterium sp.)はメタノール/炭酸ガスから酢酸を生成する。本菌のB_<12>含量は、プロピオン酸菌の10倍ほど高いが生成酢酸により同様の増殖阻害を受ける。そこで、本研究ではこれら生成有機酸を資化しうる嫌気性微生物とのエコシステムを構築することにより高濃度B_<12>生産法の開発を図った。本年度(最終年度)の研究成果を以下に概述する。1.Acetobacteriumの培養法の改善Acetobacterium sp.は炭酸ガスを資化できるがその供給速度が律速となる。そこで、炭酸ガス以外のC_1供給源について検討した結果、メタノール/蟻酸が有効であることを見い出した。蟻酸は供給が容易であり、且つ、蟻酸を用いた場合若干のB_<12>含量が増加する利点を有していた。また、蟻酸は蟻酸脱水素酵素系により炭酸ガスへ変換される。
扁桃体における経路選択的な神経活性化を担う細胞・分子基盤の解析

マウスにおいては異性や天敵に由来する匂い・フェロモン物質が性行動や忌避行動をひき起こすことが知られている。しかし、特定の感覚シグナルが適切な行動をひき起こす神経基盤については不明だった。本研究は、生得的にマウスの性行動に影響をおよぼすフェロモンESP1の責任神経回路を末梢から脳の中枢まで特定した。その過程で、内側扁桃体においてESP1は雌雄で異なる神経回路を活性化させること、視床下部においてESP1と天敵のシグナルは同じ脳領域内の異なるニューロンによって処理されることが分かった。すなわち、生得的な行動を制御する感覚シグナルに専用の神経回路が存在することを明らかにした。本研究ではマウスにおいて異性や天敵の化学シグナルが受容され、情動や行動の変化が引き起こされる仕組みを、扁桃体・視床下部の神経回路のレベルで明らかにすることを目指している。特に、フェロモンのシグナルが視床下部領域へと伝達されるハブとして機能する内側扁桃体にあって特異的な視床下部領域へと軸索を伸ばす「投射経路選択的なニューロン」の機能解析に主眼を置いている。平成28年度には、研究代表者が最近開発した「投射経路選択的なニューロン」の網羅標識法(Nature 524, 88, 2015)を用いて内側扁桃体から視床下部の腹内側核と呼ばれる領域に軸索を送るニューロンを解析した。対照として、内側扁桃体から視床下部の内側視索前野に軸索を送るニューロンも調べた。その結果、これら二種類にニューロンは概ね重なり合わない亜集団であり、それぞれ特異的な投射先に優先的に軸索を伸ばすことが判明した。さらに、これら二種類のニューロン群は、性フェロモンESP1による活性化パターンに性による差異(性的二型性)があることを見出した。これらの結果は、ほ乳類の脳内において雌雄で共通の神経回路の「使われ方」に雌雄差があるという新規の性的二形性の様式を見出したもので、脳の機能的な性分化のメカニズムを研究する上で優れたモデルを提供するものである。また“情動の座"たる扁桃体が、それぞれ特異的な下流標的に情報を「振り分ける」ための特別な構造を有することが明らかになった点も重要である。これらの成果は、視床下部領域の機能解析と合わせて現在国際主要誌に論文を投稿中である。内側扁桃体の経路選択的ニューロンの網羅的可視化に成功し、その機能解析の一端として性フェロモンESP1による活性化パターンの雌雄差を見出したことは重要な進捗である。速やかに論文化も進めていることから概ね順調な展開と言える。本研究では、雄マウスの涙液に分泌されるタンパク質性の雄フェロモンESP1によって雌マウスの性受け入れ行動ロードシスが促進されるという性フェロモンの活性に関し、その神経作用機構を解明した。まず、順行性ウイルストレーシングによってESP1受容体の下流に位置する神経核を網羅的に可視化し、それらについて薬理遺伝学な介入実験を行うことでESP1が効果を発揮するために、内側扁桃体後腹部(MeApv)の機能が必要であることを明らかにした。次に、投射経路選択的な軸索マッピング法によって、MeApvにおいて視床下部の異なる領域(腹内側核VMHあるいは内側視索前野MPA)に選択的に投射する亜集団を見出し、これらがESP1によって受ける活性化のパターンに顕著な雌雄差があることを発見した。すなわちMeApvからVMHに投射するニューロンは雌のみで、MeApvからMPAに投射するニューロンは雄のみで、ESP1により活性化された。このように同一の感覚入力が雌雄で異なるルートに「振り分けられる」構造を見出したのは哺乳類では初めてのケースである。次に、雌マウスのVMHの背側領域(VMHd)にはESP1によって活性化されるニューロンがあり、この活性がESP1による性受け入れ行動の促進に必要かつ十分であることを薬理遺伝学、遺伝学的なTRAP法を組み合わせて示した。最後に、VMHdから中脳の中心灰白質への投射経路がESP1の情報伝達を担うことを経路選択的な神経活動の遮断実験により示した。以上の成果は、フェロモンの入力が行動出力へと変換される仕組みを神経回路のレベルで初めて解き明かしたものである。本成果は2017年7月にNeuron誌に発表された。国内外のニュース記事に取り上げられたほか社会行動を司る神経回路についての総説にも大きく取り上げられるなど好意的な評価をもって迎えられている。内側扁桃体の経路選択的ニューロンを特異的に標識する遺伝子マーカーの同定が遅れていることから、研究代表者が2015年に開発・発表したcTRIO法を用いてシナプス前ニューロンの網羅的解析を行う。

具体的には,副嗅球の僧帽細胞からの入力頻度の違い,局所的な抑制性入力の違い,視床下部からのフィードバック入力の違い,海馬体や視床からやってくるトップダウン入力の違い等を分析することで,匂い・フェロモン分子の表現に違いが生じるメカニズムを神経回路の観点から解析する.この際、神経回路の雌雄差に特に着目する。またESP1以外のフェロモンが内側扁桃体を活性化する際に、これらの経路選択的ニューロンがどのようなに活性化されるのかについても研究を進める予定である。神経科学トランスクリプトーム解析の遅れによりRNAseq外注のための予算を該当年度中に使用することができなかった。次年度にこれを使用する予定である。次年度使用額に関してはRNAseqおよびその後の組織化学的研究の消耗品代として使用する。もともと申請してあった助成金は予定どおりcTRIO法をもちいたシナプス前ニューロンの網羅的解析や他のフェロモン因子の活性化パターンの解析に使用する。
水面単分子膜を用いたガングリオシドの受容体機能の定量的解析

スフィンゴ糖脂質の生体膜での集合構造や認識機能を評価するためには、脂質分子の存在状態や糖鎖密度が明確な生体膜モデルが必要であると判断した。そこで、気ー液界面単分子膜を生体膜モデルとして用い、単分子膜界面におけるスフィンゴ糖脂質の認識機能を定量化するシステムを開発した。この様な本測定システムの特徴を利用して、スフィンゴ糖脂質含有膜の構造と糖鎖認識性に関する検討を行った。1)ラクトシルセラミド(LacCer)は飽和脂肪酸を有するジパルミトイルホスファチジルコリン(DPPC)膜中では均一に分布するのに対して、不飽和脂肪酸を有するジオレイルホスファチジルコリン(DOPC)膜中では相分離構造を示したことを昨年報告した。本年度はLacCer以外のスフィンゴ糖脂質(GMl,GM3,GM4,GD1a)を用いて同様の測定を行ったところDOPC膜中では相分離していることが示された。DOPCとLacCerは結晶性が異なることから相分離構造を形成するものと考えられる。細胞表層でのスフィンゴ糖脂質のバッチ構造の形成機構を知る上で、モデル膜での糖脂質の相分離形成に関する研究は非常に有用であると思われる。2)インフルエンザウイルスの感染阻害剤として2,7-dideoxy-7-fluoro-2,3-didehydrosialic acidを合成し、シアリダーゼの阻害活性があることを見いだした。さらに、ガングリオシドGM3とインフルエンザウイルスのヘマグルチニンとの相互作用の阻害剤として評価したところ、高い活性が観察された。3)インフルエンザウイルスに含まれるヘマグルチニン(HA)とGM3ラクトンとの相互作用について観察した。本年度はインフルエンザウイルスとGM3ラクトンとの相互作用についで水面単分子膜を用いて観察した。GlcCer中に再構成したGM3Lactoncに対してもSM中に組み込まれたGM3Lactoneに対しても同等なウイルスの結合が見られた。
第五高等学校における勤労動員の実態について

総力戦下、教育機関は国家の生産体制に組み込まれ、勤労動員により学生・生徒は学校生活全般に影響を受け、勉学の機会を奪われた。本研究では第五高等学校での実態を明らかにすることを目的とした。このため、勤労奉仕・勤労動員経験のある昭和14・19・22・23年の五高卒業生13名に対して聞取り調査を行った。聞き取りに際しては、五高進学の決定過程、入学後の学校生活、勤労奉仕・勤労動員の経験、学徒出陣等の戦時体験などについて項目を立てた。また、資料により勤労動員の情報を収集した。以上により、次のような事実を確認した。五高の勤労奉仕・勤労動員は昭和13・14年の陸軍飛行場の整地に始まり、以後は周辺農村で農作業が行われた。昭和19年になると三菱重工業熊本航空機製作所、三菱重工業長崎造船所、八幡製鉄所、佐世保海軍工廠等へ学科、学年単位で組織的に動員された。昭和19年入学生は、勤労動員の動向をにらみ、入学後1年間で高等学校の課程を講義する詰め込み教育が行われた。勤労動員に際しては、その都度壮行会が行われ、動員先の宿舎では習学寮の自治方式をとることを目指した。昭和20年8月、三菱重工業長崎造船所に動員されていた生徒たちは原爆投下直後の長崎市街に救援に入り、多くが被爆した。その体験について口を閉ざしたままの卒業生も多くいる。また、昭和20年4月には五高の体育館に三菱重工業熊本航空機製作所が工場疎開し、爆撃機「飛龍」の組み立てが行われた。聞取り調査の過程で、五高工場で使用されていた飛行機の部品と思われる金属物を収集し、五高記念館にて公開した。勤労動員・壮行会の写真や生徒が長崎への原爆投下一週間前に三菱長崎造船所小ヶ倉寮から実家に出した手紙も確認することができた。
触媒学会参照触媒酸化ジルコニウムを利用する超強酸触媒の標準化

本企画調査の成果として、推奨される硫酸化ジルコニアの標準的調製法と使用方法を示すことができた。出発原料として参照触媒のJRC-ZRO-2と-5の使用が推奨される。ジルコニアゲルは、硫酸イオンを導入する前に充分乾燥した方が良く、乾燥温度は結晶化が進行しない300°C以下が望ましい。簡便な硫酸化法として平衡吸着法と硫安混練法を調査したが、何れでも再現性良く硫酸化される。平衡吸着法では、結晶化していないゲルでは高表面積で硫酸イオン濃度の高い硫酸化ジルコニアが得られるが、結晶化が進んでいるゲルでは、導入量が少なく表面積の減少も大きい。硫酸混練法では導入される硫酸イオン量の再現性は高い。しかし、超強酸点の形成に直接関わらない、不要な硫酸イオンも残留する傾向がある。特に高い酸強度の酸点形成には不利である。焼成温度は650°C以下が望ましい。炉内の温度の不均一などを考慮すると、600°C程度とした方が確実である。硫酸化ジルコニアは、高温で焼成されているため、保存に関しては特に注意は必要ない。活性化等の反応前の処理も、特に必要ない場合がある。保管中に吸着する被毒物質は、ほとんどの場合空気中の水分であるので、これを脱離させるだけで充分である。流通系の場合は、前処理無しに、反応温度に達したら反応を開始して良い。還流などの操作をする反応では、容器をヒートガンなどで加熱し水分が飛散した後に使用することが推奨される。通常良く行われる500°Cでの前処理は、酸量の減少などが見られる場合があるので、必要がなければ避けた方が良い。硫酸化ジルコニアが確実に調製されたかを確認する方法としては、熱分析が最も簡便で推奨される。硫酸イオンの分解に伴う重量減少の温度と減少量(硫酸イオン量、SO_3として脱離)に再現性があれば、概ね良好に調製出来ていると言える。

還流などの操作をする反応では、容器をヒートガンなどで加熱し水分が飛散した後に使用することが推奨される。通常良く行われる500°Cでの前処理は、酸量の減少などが見られる場合があるので、必要がなければ避けた方が良い。硫酸化ジルコニアが確実に調製されたかを確認する方法としては、熱分析が最も簡便で推奨される。硫酸イオンの分解に伴う重量減少の温度と減少量(硫酸イオン量、SO_3として脱離)に再現性があれば、概ね良好に調製出来ていると言える。
置換型ポリ乳酸ステレオコンプレックス形成の法則性の解明および高性能化材料開発

L-2-ヒドロキシブタン酸(L-2HB)(置換型乳酸の一種)およびL-乳酸(L-LA)、D-2-ヒドロキシブタン酸(D-2HB)およびD-2-ヒドロキシ-3-メチルブタン酸(D-2H3MB)(置換型乳酸の一種)をベースとするL体およびD体非対称ランダムコポリマー(50/50)のステレオコンプレックス(SC)形成を検討した。その結果、非ブレンドpoly(L-2HB-co-LLA)は再沈試料においてのみ結晶化したが、非ブレンドpoly(D-2HB-co-D-2H3MB)では全ての試料で結晶化が認められ、ポリ乳酸(PLA),ポリ(2-ヒドロキシブタン酸) [P(2HB)],あるいはポリ(2-ヒドロキシ-3-メチルブタン酸)[P(2H3MB)]のL体あるいはD体と類似したWAXDパターンを示した。これに対して、ブレンド試料は、溶融結晶化試料において、今まで報告されてきたPLA, P(2HB),あるいはP(2H3MB)のSC結晶と同様のWAXDパターンを示し、キャスト試料および再沈試料においては、SC結晶の回折以外に、P(D-2HB-co-D-2H3MB)結晶の回折が認められた。この結果は、P(L-2HB-co-LLA)とP(D-2HB-co-D-2H3MB)のブレンドによりSC結晶が形成されることを示唆している。また、ブレンド試料のSC結晶の融点(Tm)は181.0-183.7°Cであり、非ブレンドP(L-2HB-co-LLA)およびP(D-2HB-co-D-2H3MB)のTm(それぞれ、90.5°Cおよび96.2-126.0°C)よりも高く、ブレンド試料のSC結晶の形成を裏付けている。ここでは、P(L-2HB-co-LLA)とP(D-2HB-co-D-2H3MB)の非対称ブレンドにおけるSC形成と非ブレンドのランダム共重合体P(D-2HB-co-D-2H3MB)が50/50の組成であっても結晶化することを初めて報告したが、本研究成果と今まで報告されている結果は、L-およびD-体のホモポリマーブレンド、非ブレンドランダム共重合体、L-およびD-体のランダム共重合体ブレンドにおいて、光学活性2-ヒドロキシアルカン酸は他の光学活性2-ヒドロキシアルカン酸と高い共結晶化能を有することを示唆している。置換型ポリ乳酸であるポリ(2-ヒドロキシブタン酸)[P(2HB)]およびポリ(2-ヒドロキシ-3-メチルブタン酸)[P(2H3MB)]のL体とD体の1:1ブレンド試料のヘテロステレオコンプレックス結晶化およびホモ結晶化、熱的特性と熱分解に関する詳細な検討を行った。このヘテロステレオコンプレックスの平衡融点は234.5°Cであり、各非ブレンド試料の平衡融点よりも高いことが明らかとなった。溶融結晶化においてブレンドはregime IIおよびregime IIIで結晶化することが分った。また、1:1ブレンドの熱分解活性化エネルギーは、非ブレンド試料の間にあった。このことは、溶融状態において、異なる分子間の相互作用と同一の分子間の相互作用に差異がないことを示している。さらに、ポリ乳酸(PLA)、P(2HB)、およびP(2H3MB)のD体、L体、D体の間で3成分ステレオコンプレックスが形成されることを初めて見出した。今まで最多で4成分ステレオコンプレックス形成に関する報告をしたが、P(2HB)およびP(2H3MB)のそれぞれのL体とD体のブレンドであり、分子構造的には2種類の分子構造を有するステレオコンプレックスであった。これに対して、今回発見したステレオコンプレックスは、異なる3種類の分子構造を有する分子間の初めてのステレオコンプレックスである。また、PLA、P(2HB)、およびP(2H3MB)のD体どうしのブレンドにおいては共晶が形成されないことより、L体のP(2HB)がD体のPLAおよびP(2H3MB)をつける分子接着剤としての役割を有していることを示している。H28年度の研究成果で着目すべきものは、ポリ乳酸(PLA)、P(2HB)、およびP(2H3MB)のD体、L体、D体の間で3成分ステレオコンプレックスが形成であり、これは、異なる3種類の分子構造を有する分子間のステレオコンプレックス形成の初めての例である。L体のP(2HB)がD体(PLA)およびP(2H3MB)をつける分子接着剤としての役割を有していることは非常に興味深い点である。この実験結果を利用することにより、今まで不可能であった多種多様な光学活性高分子の組合わせによる共晶化が可能となり、幅広い物理特性および生分解性を有する高分子材料の作製が可能になることが期待される。本研究成果は、Nature publishing Groupが発行するScientific Reports (2017, 7, Article number: 45170)に掲載された。量平均分子量が3,000-20,000 g/molのポリ(L-乳酸)(PLLA),ポリ(L-2-ヒドロキシブタン酸)[P(L-2HB)],およびポリ(2-ヒドロキシ-3-メチルブタン酸)のL体およびD体[P(L-2H3MB)およびP(D-2H3MB)]を縮合法により合成した。合成したポリマーは再沈により精製し、ブレンド試料はキャスト法およびキャスト試料を再溶解し再沈することにより得た。

2つの異なる化学構造を有するP(L-2H3MB)/P(D-2H3MB)/P(L-2HB)あるいはPLLAブレンドにおける3成分ステレオコンプレックス(TSC)形成およびP(D-2H3MB)/PLLAブレンドにおけるヘテロステレオコンプレックス(HTSC)形成の可否を主に広角X線回折法により評価した。P(L-2H3MB)/P(D-2H3MB)/P(L-2HB)ブレンドのキャスト試料においてTSC形成が確認されたが、P(L-2H3MB)/P(D-2H3MB)/PLLAブレンドにおいてはキャストおよび再沈の両試料においてTSCの形成は認められなかった。以前に報告されている結果およびこの結果を総合すると、TSC形成されるのは、各成分の側鎖の炭素数の差が1以下であることを示唆している。また、P(D-2H3MB)/PLLAブレンドにおいては結晶化法によらずHTSCが形成されなかった。以前に報告されている結果およびこの結果を総合すると、HTSCが形成される条件は側鎖の炭素数の差が1であることを示唆している。また、乳酸とアラニンのランダム共重合体におけるステレオコンプレックス形成も検討した。これは、エステル結合の以外の結合(アミド結合)を有するランダム共重合体においてステレオコンプレックス形成を検討した最初の例である。さらに、ポリ乳酸の分岐型ステレオブロック共重合体におけるステレオコンプレックス形成も検討した。H29年度において、ポリ乳酸および置換型ポリ乳酸において3成分ステレオコンプレックス(TSC)あるいはヘテロステレオコンプレックス(HTSC)形成が形成される条件を検討したが、TSC形成されるのは、各成分の側鎖の炭素数の差が1以下、HTSCが形成されるのは、各成分の側鎖の炭素数の差が1であることが分かった。このステレオコンプレックス形成の規則は今までに報告されておらず、未知のブレンド系におけるTSCあるいはHTSC形成の可否の予測を可能にする重要な規則である。本研究成果は、本研究課題の目的の一つを達成するものであり、アメリカ化学会が発行するCrystal Growth and Design (2018,18, 521-530)に掲載されている。L-2-ヒドロキシブタン酸(L-2HB)(置換型乳酸の一種)およびL-乳酸(L-LA)、D-2-ヒドロキシブタン酸(D-2HB)およびD-2-ヒドロキシ-3-メチルブタン酸(D-2H3MB)(置換型乳酸の一種)をベースとするL体およびD体非対称ランダムコポリマー(50/50)のステレオコンプレックス(SC)形成を検討した。その結果、非ブレンドpoly(L-2HB-co-LLA)は再沈試料においてのみ結晶化したが、非ブレンドpoly(D-2HB-co-D-2H3MB)では全ての試料で結晶化が認められ、ポリ乳酸(PLA),ポリ(2-ヒドロキシブタン酸) [P(2HB)],あるいはポリ(2-ヒドロキシ-3-メチルブタン酸)[P(2H3MB)]のL体あるいはD体と類似したWAXDパターンを示した。これに対して、ブレンド試料は、溶融結晶化試料において、今まで報告されてきたPLA, P(2HB),あるいはP(2H3MB)のSC結晶と同様のWAXDパターンを示し、キャスト試料および再沈試料においては、SC結晶の回折以外に、P(D-2HB-co-D-2H3MB)結晶の回折が認められた。この結果は、P(L-2HB-co-LLA)とP(D-2HB-co-D-2H3MB)のブレンドによりSC結晶が形成されることを示唆している。
フランスのコメルス・アソシエ（協同商業）に関する実証研究

研究初年度は、フランスのコメルス・アソシエの全国組織であるFCAへのインタビュー調査を実施するとともに、ヨーロッパにおける協同組合論や社会的連帯経済論に関する資料収集に努めることを第1目的とした。フランスでの現地調査は、研究分担者である鳥羽とともに2018年9月に実施した。また、必要文献や資料も適宜収集し分析を進めている。研究は、コメルス・アソシエの事業展開に影響を及ぼす小売企業の国際事業展開やボランタリー・チェーン等を中心に研究を進めた。その成果は、以降の項で記した佐々木の論文1本、著書1冊、学会発表1回、鳥羽の著書1冊、学科発表3回を中心に提示することができた。元来、大規模小売業としてのハイパーマーケットへの対抗策の一環として登場したコメルス・アソシエであるが、今日では、国際的小売競争やインターネット販売の拡大(研究協力者・森脇の研究業績有)とそれに伴うオムニ・チャネルの進展といった小売環境変化を背景に、競争力の強化を企図して、一部アソシエ企業において大手ハイパーマーケット企業との提携がみられる。そのような現象については、「近年におけるフランス小売企業の経営戦略-カルフールのCarrefour 2022を中心に-」として学会研究発表を行った。また、コメルス・アソシエのチェーン形態特質を明らかにするために、日本のボランタリー・チェーンのメカニズムや現状、課題を考察し、著書の1章として著した。さらに、鳥羽とは共同調査を行う一方で、小売企業の国際的事業展開について個別に研究を進めた。小売企業が現地適応化や進出地域での社会的責任を推進するには、現地企業や現地小売商業との協同事業が重要となるが、この点について、論文や学会発表で研究成果を発表した。研究1年目は、研究分担者の病気療養に伴い、フランスでの現地調査の参加人員の減少があったが、おおむね順調に進捗した。それは、第1に研究実績の概要でも記したが、研究初年度に計画していたフランスでの現地調査が実行でき、コメルス・アソシエの実態把握や研究上の課題解決の貢献につなげることができたからである。第2に、著書も含めて研究論文では、コメルス・アソシエを取り巻くフランス小売企業の最新動向や小売商業の協同事業の理解をいっそう豊富にするための小売企業の国際的事業展開に関する研究成果を論文や学会で発表することができたからである。そして、第3に2018年度末には、東南アジアにおける協同組合流通(コープマート)の実地調査も行うことができたからである。これについては、協同組合および協同商業のアジア的な発現形態として、今後研究を深めていきたい。今後は、まず2018年度に実施できなかった日本の「ボランタリーチェーン協会」へのヒアリング調査を実行し、日仏の協同商業組織の実態把握に取り組む。その成果は適宜学会や論文にて発表する。そして、ルクレールをはじめとするコメルス・アソシエ企業への現地調査を中心に研究を進めたい。現地調査は研究メンバー全員で行う方向で調整していく。また、2018年度以前より収集した学際的な領域の先行研究内容を整理すると同時に、協同組合論や社会的連帯経済研究者とのワークショップを開催し、コメルス・アソシエ研究との接合を図っていく。最終年度である3年目(平成32年度)は、再びコメルス・アソシエの全国組織であるFCAへの実地調査を行うとともに、フランスおよび英国の協同組合に対する調査を実施したい。現地調査は研究メンバー全員で行う方向で調整する。本研究の最終年度では、小売業態論研究の先行研究をいっそう精査し、コメルス・アソシエの業態的特質について明らかにしていく。

それは、第1に研究実績の概要でも記したが、研究初年度に計画していたフランスでの現地調査が実行でき、コメルス・アソシエの実態把握や研究上の課題解決の貢献につなげることができたからである。第2に、著書も含めて研究論文では、コメルス・アソシエを取り巻くフランス小売企業の最新動向や小売商業の協同事業の理解をいっそう豊富にするための小売企業の国際的事業展開に関する研究成果を論文や学会で発表することができたからである。そして、第3に2018年度末には、東南アジアにおける協同組合流通(コープマート)の実地調査も行うことができたからである。これについては、協同組合および協同商業のアジア的な発現形態として、今後研究を深めていきたい。今後は、まず2018年度に実施できなかった日本の「ボランタリーチェーン協会」へのヒアリング調査を実行し、日仏の協同商業組織の実態把握に取り組む。その成果は適宜学会や論文にて発表する。そして、ルクレールをはじめとするコメルス・アソシエ企業への現地調査を中心に研究を進めたい。現地調査は研究メンバー全員で行う方向で調整していく。また、2018年度以前より収集した学際的な領域の先行研究内容を整理すると同時に、協同組合論や社会的連帯経済研究者とのワークショップを開催し、コメルス・アソシエ研究との接合を図っていく。最終年度である3年目(平成32年度)は、再びコメルス・アソシエの全国組織であるFCAへの実地調査を行うとともに、フランスおよび英国の協同組合に対する調査を実施したい。現地調査は研究メンバー全員で行う方向で調整する。本研究の最終年度では、小売業態論研究の先行研究をいっそう精査し、コメルス・アソシエの業態的特質について明らかにしていく。研究分担者の一人が入院後、2018年度においても通院療養が必要となった。そのため、2018年9月に計画していたフランスにおける現地調査に参加することが困難となった。それゆえ、その研究分担者からも研究費の次年度使用を許容されたいと申し出があった。2019年度においては、次年度使用額と当該年度以降分の請求助成金をあわせて、研究代表者と研究分担者によるフランスにおける現地調査を計画しているが、それに加えて、アジアでの協同商業調査を企図する。さらに、協同組合関連の専門書の収集をいっそう図っていく。
脊索動物尾芽伸長のロジック

脊索動物の尾が伸びる仕組みを細胞レベルから個体レベルへ階層を超えて明らかにしたい。さらに、カタユウレイボヤの尾部は卵殻を除去して後も腹側に湾曲する事が知られている。しかしながら、尾部が腹側に湾曲する分子・物理的・力学的なメカニズムはいまだに解明されていない。そこで尾部伸長過程が比較的短時間で観察可能であり尾部を構成する脊索・表皮・神経管などの組織が少数の細胞から構成されるホヤをモデル生物として用いた一連の実験を行うこととした。まず、FGFやwntパスウェイ関連遺伝子の阻害、細胞レベルでのホヤ尾芽伸長過程の4Dイメージングを行った。次に、尾部が腹側に湾曲する分子・物理的・力学的なメカニズムを知るため、レーザーカッターによる特定組織の切除実験を行った。ホヤにおいても、wntパスウェイの活性化やFGF阻害は短尾を引き起こすこと、また、wntパスウェイの活性化による短尾はFGFによりレスキュー可能であることから両方のパスウェイが尾芽伸長に関わっていることが示唆された。興味深いことに短尾の表現型は脊索の収斂伸長(CE)が異常であるものと脊索のCEは正常だが表皮の配列が異常であるものに分けられた。尾部側表皮細胞は最終的に8列の筒のように尾部をとりまく形となり、その過程で脊索細胞と同様にCEを行うこと、そして側方表皮細胞は後期尾芽胚期には50個が1列に並ぶことが観察された。腹側表皮細胞をアブレーションした時に尾の移動がみられたことから、腹側表皮の収縮力が尾の腹側への湾曲の力を発生させていることが示唆された。また、Y27632処理した胚ではこのような差がみられなかったことから、ホヤ幼生尾部の腹側への湾曲はミオシンの収縮力が関わっている可能性が示唆された。26年度が最終年度であるため、記入しない。これまでの本領域での研究から、以下の結果を得た。1)尾芽の伸長にはWntパスウェイとFGFパスウェイのクロストークが関わっているといった報告がゼブラフィッシュ胚においてなされていることから、ホヤにおいてもこのことが当てはまるかどうかを阻害剤を用いた実験により確かめた。その結果、wntパスウェイの活性化は短尾を引き起こすが、FGFによりレスキュー可能であることから両方のパスウェイが尾芽伸長に関わっていることがわかった。2)ホヤの尾芽を構成する組織の一つである尾部神経管が尾部伸長に伴ってどのような細胞のダイナミクスを示すかを明らかにするために、ホヤ神経管形成過程の4Dイメージングを行った。ホヤの神経管は神経管閉鎖過程が比較的短時間であり少数の細胞から構成されるため、神経管閉鎖過程を観察するために適したモデルである。神経管閉鎖過程における全神経細胞の核をラベルし3次元で時系列画像撮影(4D)を行った。得られた画像の核を計算機上で追跡し、細胞系譜を明らかにすることができた。本計測により、ホヤ神経管形成における細胞分裂方向を含むさまざまな細胞の振るまいを明らかにすることができた(未発表)。3)ラマン散乱スペクトルを発生期におけるカタユウレイボヤに適用しその応用可能性について検討した。カタユウレイボヤから得られたラマン散乱スペクトル解析により、胚内において局所的なパターンを作るラマンスペクトルをいくつか得ることができた。この内、分化した筋肉と内胚葉に特異的なラマンスペクトルである1002と1526を同定することができた。本研究成果からモルフォゲンの1つであるレチノイン酸のような可視化が難しい物質の非ラベルイメージングの可能性を示すことができた(Nakamura et al., 2013, PlosOne)。

また、Y27632処理した胚ではこのような差がみられなかったことから、ホヤ幼生尾部の腹側への湾曲はミオシンの収縮力が関わっている可能性が示唆された。26年度が最終年度であるため、記入しない。平成25年度は1尾芽伸長における細胞の物理量の定量および2細胞マニュピレーション・ノックダウンによる物理量変化の検出を研究実施計画に掲げた。1に関しては神経管形成時の細胞系譜および細胞分裂方向の計測に成功している。2に関しては尾芽先端部破壊実験や阻害剤によるノックダウンを通じ、尾部伸長および湾曲における種々の変異胚の単離に成功した。さらにこれらの成果に加え、ラマン顕微鏡を活用することによりモルフォゲン等の可視化が難しい生体内小分子の可視化の可能性を示すことができた。以上、当初の計画に加えて付加的な研究成果も得られていることから研究は概ね順調に進展していると判断した。細胞破壊および移植実験:尾芽伸長には異なる組織間の相互作用が必要であることがわかっているが、ホヤ胚においては64細胞期の内胚葉をレーザーで取り去った胚においても表皮・筋肉・脊索・神経だけで正常の尾部と同様な細胞配置で伸長がみられることがわかっている(Munro et al., 2002)。また、ホヤの初期発生では隣り合う細胞1個分の誘導が重要であり、オーガナイザーからのモルフォゲン勾配による形態形成が行われるといった証拠はない。ホヤ尾部先端に高発現Wnt細胞を欠失あるいは異所的に移植し、ホヤ尾芽伸長におけるモルフォゲン勾配の有無を検証する。細胞破壊はマニュピレーションまたはレーザーアブレーションによって行う。カタユウレイボヤの未受精卵を切り分けた後に受精させると野生型個体よりも小さい、Dwarf幼生を作成することができる。Dwarf幼生は正常に変態し幼若体になることができた。興味深いことに、野生型尾芽胚は常に腹側に湾曲するのに対して、Dwarf幼生の尾部は背側に湾曲していた。来年度はこの尾部湾曲がどのような物理学的な力によって制御されているかについての実験も行う。上記カタユウレイボヤで得られた分子・物理メカニズムが他の脊索動物においても当てはまるかどうかを実験的に検証する。得られた遺伝子と物理量との関係全体を、時系列の観点・空間的な配置との関係から再解析することで、尾芽伸長過程における保存されたメカニズムを見出す。そして最終的に脊索動物に保存された尾芽伸長のモデルを構築する。
音楽のナショナリズム:中欧各国におけるその現象形態

本研究は、19世紀終わりから20世紀前半の音楽におけるナショナリズムの問題を、幾つかの具体的事例に則して、比較検討することを目指していた。これによって今日、ますます重い問題を投げかけつつある「ナショナリズム」的視座が、音楽史にとってどのような意義を持っていたかを明らかにできると考えた。今回まとめた報告書は、およそ次のような構成となっている。まず「序」では、研究成果について概観を試みた。本課題と関連して書かれた論文、記事、解説、口頭発表などについて、それらが本課題の中でどのような意義を持つかについて述べている。「本論」は三つの章に分かれる。第一章は「音楽の民族主義:その視覚」と題され、本研究課題の基本的視座を明らかにしたものである。第二章「民族の音楽/音楽の民族」は、昨年度に書かれた論文に基づくものだが、ハンガリー、チェコ、ルーマニアの各国の音楽、音楽研究を主題とするものである。そして第三章「クレズマーをめぐる試論」は、本課題の研究過程で浮かび上がってきた最も興味深い問題である東欧ユダヤの大衆音楽、クレズマーについてシャガールの絵との関連で論じたものである。この報告書は、本課題が本来含み込むはずの広範な研究のうち、その骨格だけを素描し得たにすぎない。今後、さらに幾つかの論点を補足し、できるだけ早期に単行本として公刊したいと考えている。本研究が対象とするのは、バルトーク、エネスク、ヤナーチェク、シマノフスキなど、今世紀初頭に活躍した中欧各国の作曲家たちによる作品と、その音楽活動である。本課題では、それをA:各作曲家の「民謡」との具体的関わりについての検討、B:彼らの民謡編曲作品についての検討、の二点について、研究を進めている。具体的には、まず、基礎的な文献資料、録音資料、楽譜などについて情報を集め、実際の入手につとめた。本年度は、その研究の過程で、これらの作曲家たちの共通のバックボーンとなった民俗的器楽の伝統、具体的にはロマ(ジプシー)やユダヤのクレズマー達の音楽の重要性について認識を新たにし、文献資料、音響資料を収集した。これらについては、現在その内容を検討中で、来年度以降も引き続き資料の収集、検討を行いたいと考えている。また、平成11年12月には、ハンガリー、ルーマニアを訪れ、現地の研究者に研究についてレビューを受け、また資料提供について協力を依頼した。具体的な訪問先は、ブダペストのリスト音楽院図書館、およびブカレストの農村博物館およびブカレスト音楽院、さらにヤーシ民族学博物館などである。ここでは特に、ハンガリー出身のバルトークと、ルーマニア出身のエネスクについて、資料状況の把握につとめた。現在、これらについて中規模の論文を執筆中で、これは『民族』と題された論集に掲載される予定である。本研究は、20世紀前半の音楽的ナショナリズムを研究対象としているが、本年度はその第二年にあたる。研究の過程で、とりわけ重要な論点として浮かび上がってきたのは、国民国家形成の時期に重要視された各国単位の民俗音楽、国民音楽の背後に、民族や国家を超えて拡がるトランス・エスニックな器楽がどのように作用したか、というものである。これは具体的には、昨年度の研究に着手したロマ(ジプシー)やユダヤのクレズマーの音楽を指すのだが、本年度も引き続きこれらの器楽と、各国の民俗音楽あるいは芸術家たちとの関係について研究を進めた。まず年度前半は、昨年行った現地での調査をもとに、比較的大きな論文をまとめた。本報告書中11.研究発表の〔図書〕の項目に挙げた論文がそれで、ここではまずハンガリーの作曲家、民俗音楽研究者であったZ.コダーイの著作と、モラヴィア出身の小説家M.クンデラの記述の比較、さらにはトランス・エスニックな音楽の実例としてのモルドヴァのブラス・バンドの音楽の検討などを行った。また12月には、中・東欧のユダヤ人たちの民俗的器楽奏者であったクレズマーに関する調査のためにニューヨークのユダヤ研究センター(YIVO)を訪れ、その成果をもう一つの論文(11.研究発表中の最初の論文)にまとめた。これはベラルーシのユダヤ人社会の出身である画家、M.シャガールの絵に登場するヴァイオリン弾きとクレズマーとの関係について論じたものである。

次年度もこれらの研究を続け、最終的には著作をまとめたいと考えている。本研究は、20世紀前半の音楽におけるナショナリズムの問題を、いくつかの具体的事例に則して、比較検討することを目指していた。研究を通じて明らかになったのは、次の諸点である。1.ハンガリー、チェコ、スロヴァキアなどにおいて、民俗音楽に関心が寄せられ、熱心な研究の対象となってきた背景に、ナショナリズムの問題があること。2.しかし、そのような背景の故に、研究の客観的外観の背後に、しばしば国家主義的バイアスが見て取れる場合があること。3.また、民俗音楽ないし民族音楽研究の枠組み自体が国家、民族の境界に左右されてきた結果、それらの境界を超えた現象について、これまで研究上の盲点となってきた問題が多いということ。4.上記のような観点からすると、ロマ(ジプシー)による器楽、ユダヤの大衆音楽家クレズマーによる器楽、など儀礼の際の舞踊音楽について、調査を進めることで、これまでの音楽的ナショナリズムの研究に新しい視座を提供することができること。5.このような問題は、さらに東欧から新大陸へとわたった移民とともにアメリカの大衆音楽の基盤ともなり、またロシアからの亡命者を通して満州、日本等にも及ぶ世界規模の広がりをもった現象であったと考えられること。別に提出する研究成果報告書(全頁)では、上記1、2、3についてその骨子を論じ、4、5については試行的論考をまとめた。
レニン・アンジオテンシン系を標的とした妊娠高血圧腎症に対する新規薬剤の開発

妊娠高血圧腎症(preeclampsia; PE)に対する病態に即した根本的治療は存在しない。PEの病態形成においてレニン-アンジオテンシン系(RAS)の亢進は本質的な機序であり、RAS阻害はPEに著効する理想的治療となりうる。しかしながら、RAS阻害薬は胎児腎障害を代表とする胎児毒性により妊娠中の使用ができない。そこで、既存のアンジオテンシンII1型受容体拮抗剤(ARB)を出発点とし、その構造変換により、胎児への毒性懸念のない新規ARB製剤を創製し、PEに対する治療剤としての開発を目指す。
吸入麻酔薬の心保護作用に対するオートファジー・ミトコンドリアダイナミックスの影響

マウスを人工呼吸下に開胸、血行動態を測定しながら、心臓冠動脈を30分間閉塞した後、2時間再潅流し、再び冠動脈を閉塞、Evans Blueを注入し心臓を取り出した。心臓をスライスし、TTCにて再染色を行い心筋梗塞サイズを測定した。コントロール群、吸入麻酔薬(イソフルラン1.0 MAC)群、オートファジー誘導剤(ラパマイシン)群、オートファジー抑制剤(3-メチルアデニン: 3-MA)群において心筋梗塞サイズを測定比較した結果、吸入麻酔薬群においてはコントロール群と比較して心筋梗塞サイズが減少した。このことは以前から報告のある、吸入麻酔薬のプレコンディショニング作用を示すものとして相違はなかった。また、オートファジー誘導群においては吸入麻酔薬群と同等の心筋梗塞サイズの減少を認めた。オートファジー抑制群では心筋梗塞サイズの減少は認めず、コントロール群同様、心筋保護効果がないことが明らかとなった。次に、吸入麻酔薬イソフルランにオートファジー抑制剤(3-メチルアデニン: 3-MA)を加えた群、およびオートファジー誘導剤(ラパマイシン)にオートファジー抑制剤(3-メチルアデニン: 3-MA)を加えた群について虚血再灌流後の心筋梗塞サイズを測定した。その結果、両群ともに心筋梗塞サイズの減少は認められず、オートファジー抑制剤(3-メチルアデニン: 3-MA)によって、吸入麻酔薬やオートファジー誘導剤の心筋保護効果が棄却されることが明らかになった。申請書に記載した研究目的に対し、平成30年度の進捗度合いは同じであり、おおむね順調と思われる。また、現在イムノブロットによる研究を進行中であり、さらには、研究協力者である海外の研究者ともやり取りを行い、研究の進め方についてディスカッションを進めている。これらによって本研究期間内に、吸入麻酔薬の心筋保護作用経路におけるオートファジー・ミトコンドリアダイナミックスの果たす役割が解明されることが期待される。研究実績の概要に記載した各群について、各群のマウスの摘出心を組織固定し、オートファジーの誘導を単位面積当たりのオートファゴソームを電子顕微鏡にて観察、アッセイキットにて検出し比較検討する。また、関連タンパクについてイムノブロッティング法にて比較する(LC3-I/LC3-II、Beclin1など)。また、摘出心をランゲンドルフ酵素法を用い得られた遊離心室筋細に対し、1時間低酸素状況に暴露することで心室筋細胞に虚血状態をつくりだす。その後通常の培養状態に戻すことで再潅流状態とする。ミトコンドリア染色色素(MitoTracker)、光褪色後蛍光回復法(FRAP assay)を用いて各群のミトコンドリアダイナミクス(ミトコンドリアの分裂と融合)を明らかにする。また、ミトコンドリア膜電位を蛍光検出し、プレコンディショニング作用が与える影響について考察を加える。さらに、オートファジー及びミトコンドリアの分裂・融合タンパクについてイムノブロット・real-time PCRを用いて調べる。また、各群の心臓をホモジナイズし、密度勾配遠心法にてミトコンドリア分画を得た後、ミトコンドリア膨化アッセイにより吸光度の変化によってCa2+依存性ミトコンドリア膨化がAPC刺激による心筋保護効果にどのように影響するかを調べる。さらにこの影響を可視化するため、calsein-AM試薬を用いて細胞を蛍光ラベルし、mPTP開閉を観察する。

また、摘出心をランゲンドルフ酵素法を用い得られた遊離心室筋細に対し、1時間低酸素状況に暴露することで心室筋細胞に虚血状態をつくりだす。その後通常の培養状態に戻すことで再潅流状態とする。ミトコンドリア染色色素(MitoTracker)、光褪色後蛍光回復法(FRAP assay)を用いて各群のミトコンドリアダイナミクス(ミトコンドリアの分裂と融合)を明らかにする。また、ミトコンドリア膜電位を蛍光検出し、プレコンディショニング作用が与える影響について考察を加える。さらに、オートファジー及びミトコンドリアの分裂・融合タンパクについてイムノブロット・real-time PCRを用いて調べる。また、各群の心臓をホモジナイズし、密度勾配遠心法にてミトコンドリア分画を得た後、ミトコンドリア膨化アッセイにより吸光度の変化によってCa2+依存性ミトコンドリア膨化がAPC刺激による心筋保護効果にどのように影響するかを調べる。さらにこの影響を可視化するため、calsein-AM試薬を用いて細胞を蛍光ラベルし、mPTP開閉を観察する。(理由)平成30年度3月納品となり、支払いが完了していないため、次年度使用額が生じた。(使用計画)平成31年度に支払予定である。
前立腺特異的PTEN/p53ダブルノックアウトマウスモデルに関する研究

我々は以前にPTEN flox/PSA-Creトランスジェニックマウス前立腺癌モデルを確立し、今回、本マウスモデルを用いて、よりaggressiveな転移モデルの確立をめざし、PSAコンディショナルPTEN/p53(Trp53)ダブルノックアウトマウス(PTEN/p53 DKO)を作製した。DKO Homo-deletionマウスでは早期より肺・肝・リンパ節などに遠隔転移をきたし、全生存期間の中央値は55週とかなり短くなった。これにより、ヒト前立腺癌の第3相試験と同様のPFSとOSをエンドポイントとしたPre-clinicalな治療実験が可能となり、極めて有用なモデルと思われた。PTENconditional gene targeting (PTEN flox/PSA-Cre)と同じ手法を用い、PTEN+/+/Trp53f/fマウスとPSA-Cre+マウスを交配することにより、PSA-Cre+/Trp53f/fマウスを作製し、我々が確立した♂PSA-Cre+/PTENhomo deletionマウスと交配させ、PSA-Cre+/PTENf/+/Trp53f/+ (PTEN、Trp53ともにヘテロ欠失型)を確立した。その後、ヘテロ型を交配させて、第一目的であるhomo deletionすなわちPSA-Cre+/PTENf/f/Trp53f/fマウスを確立した。組織学的な経時的変化(PINや癌の発生、転移の有無など)をCharacterizeしたところ、易転移性の極めて悪性度の高い前立腺癌モデルであることがわかった。また、各表現型におけるラージスケールによる生存期間の確認と転移臓器の確認(死因)したところ、ダブルノックアウトマウスモデルでは、通常のPSA-Cre+/PTEN homo deletionマウスと比べ12週間以上短い生存期間であり、ヒトにおける第3相試験のようにOSをエンドポイントにおいた治療研究が可能と思われた。また、PTENーKOおよびPTEN/p53 DKO腫瘍の培養細胞を樹立し、サブクローニングを行っている。昨年度より、PSA-Cre+/Trp53f/fマウスを作製し、♂PSA-Cre+/PTENhomo deletionマウスと交配させ、PSA-Cre+/PTENf/+/Trp53f/+ (PTEN、Trp53ともにヘテロ欠失型)を確立し、交配により計画通りPSA-Cre+/PTENf/f/Trp53f/fマウスを作製した。同時に各シグナル分子の発現をチェックすることで、PTEN/p53 DKOマウスモデルを確立したことを確認した。また、このPTEN/p53 DKOマウスモデルの有用性については、当初の計画通り、種々の分子標的薬や抗アンドロゲン剤による抗腫瘍効果を近接効果だけでなく生存期間についても比較検討した。また、種々の培養細胞を樹立し、サブクローンを確立し得た。メタボロノーム解析については、ヒューマン・メタボローム・テクノロジーズ株式会社と組織・培養細胞の解析について契約を済ませ、腫瘍組織と培養細胞のサンプリングを終え、解析依頼した。PSA-Cre+/Trp53f/fマウスを作製し、♂PSA-Cre+/PTENhomo deletionマウスと交配させ、PSA-Cre+/PTENf/+/Trp53f/+ (PTEN、Trp53ともにヘテロ欠失型)を確立し、交配により計画通りPSA-Cre+/PTENf/f/Trp53f/fマウスを作製した。同時に各シグナル分子の発現をチェックすることで、PTEN/p53 DKOマウスモデルを確立したことを確認し得た。また、このPTEN/p53 DKO

マウスモデルの有用性についても検することができた。これらは当初、かなり時間を要すると思われたが、大量の動物実験を行うことで達成し得た。メタボロノーム解析についても、ヒューマン・メタボローム・テクノロジーズ株式会社と組織・培養細胞の解析について契約を済ませ、サンプリングを行っている。1)PTENーKOと今回確立したPTEN/p53 DKOマウスモデルを用いた、Intervention治療実験を行い、腫瘍縮小など近接効果だけでなく、生存曲線によるOSをプライマリーエンドポイントにした研究を拡大していく。2)樹立した培養細胞のサブクローンを用いて、各サブクローンのCharacterについて分子レベルで検討する。3)組織および培養細胞のメタボロノーム解析から得られた結果を解析し、重要な因子・分子について検索する。前立腺癌1)本PTEN/p53 DKOマウスモデルを用いた、治療実験(Intervention研究)を行い、腫瘍縮小など近接効果だけでなく、生存曲線を描き、生存期間をプライマリーエンドポイントにした治療実験を行う。2)培養細胞を確立し、DKOマウスの前立腺癌細胞のCharacterについて分子レベルで検討する。3)現在計画中のメタボロノーム解析を実行し、結果について検討する。昨年度から11万2201円を今年度に持ち越した。予定通りの実験を遂行できたが、年度末の発注分や動物試料などの支払いが反映されていないために、見かけ上、少額を持ち越した形となった。昨年度から37万6030円を今年度に持ち越した。ほぼ予定通りの実験を遂行できたが、年度末の発注分や組織のブロック作製費などの支払いが反映されていないために、見かけ上、少額を持ち越した形となった。今年度は本PTEN/p53 DKOマウスを用いて、ヒトの第3相開発治験に酷似したPre-clinical治療実験を行う予定である。種々のコンパウンド単剤および併用による生存期間をエンドポイントにする治療研究を行い、各種パラメータの統計学的検討を行う。また、本年度はChemopreventionの治療研究も行いたい。以上の研究計画から、多くの組織検体についての数多くの関連分子の発現解析が必要となり、免疫組織染色だけでなく、タンパク発現量の定量のために大量の抗体に費用が必要となることから、すべてを使用すると思われる。今年度は本DKOマウスを用いて、ヒトの第3相開発治験に酷似した治療研究を行う予定である。すなわち生存期間をエンドポイントにする治療研究を行い、各種パラメータの統計学的検討を行う。そのため、多くの組織検体について、多くの関連分子の発現解析が必要となり、免疫組織染色だけでなく、タンパク発現量の定量のために大量の抗体に費用が必要となる。加えて、メタボロノーム解析に100万円以上が必要となるため、すべてを使用すると思われる。