hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
OTOF遺伝子変異による難聴のデータベース構築とOAE消失メカニズムの解析

Auditoryneuropathy spectrum disorder(以下ANSD)は、OAE(耳音響反射)が正常でABR(聴性脳幹反応)が無反応もしくは異常反応となる新しいタイプの難聴である。本研究では、日本人難聴患者におけるOTOF遺伝子変異の頻度とその種類を明らかにことを目的に研究を行った。その結果OTOF遺伝子の解析を実施した結果、160例中3例にホモ接合体変異、4例よりヘテロ接合体変異、9例よりヘテロ接合体変異を見出した。今回検索を行った160例中7例(4.4%)がOTOF遺伝子変異による難聴であることが明らかとなった。本年度は日本人難聴患者におけるOTOF遺伝子変異の頻度やその種類を明らかにすることを目的とした研究を行った。当施設でおよび共同研究施設より高度重度の非症候群性難聴症例のうち、孤発例もしくは劣性遺伝形式をとる先天性難聴患者160名(難聴原因が特定されていない症例)対象として、OTOF遺伝子の変異解析を行った。OTOF遺伝子変異による難聴の場合、生後数年はOAEが検出されAuditoryneuropathy spectrum disorder(ANSD)の臨床像を呈するが、その後OAEが消失し、通常の感音難聴の臨床像をとると言われているため、解析をおこなった母集団はANSD患者だけではなく、通常の感音難聴患者を対象とした。末梢血より抽出されたDNAを用い、OTOF遺伝子のスプライシング部位を含む全エクソン領域を直接シークエンス法により解析した。病的変異の判断は、変異の種類、家系内での整合性、コントロール群における頻度などを検討して行った。今回変異検索を行った160人中3名にホモ接合体、4名がコンパウンドへテロ接合体、9名がヘテロ接合体であった。よって、今回変異検索を行った160人中7名(4.4%)がOTOF遺伝子変異による難聴と考えられる。7名のうち2名は通常の感音難聴の臨床像を呈しており、ANSD患者のみならず通常の感音難聴患者においてもOTOF遺伝子の検索を行うことが必要であることが明らかとなった。また、日本人感音難聴患者の中には今回同定された遺伝子変異の多くが本邦独自の変異であり、他の遺伝子同様に他の人種とは異なる日本人独自の変異スペクトラムがあることが示された。特にp.R1939Q変異はfounder effectにより日本人において高頻度で同定される変異であることが示され、難聴患者におけるスクリーニングを行うことにより、診断率の向上が見込めると考えられる。平成26年度は日本人難聴患者の中でOTOF遺伝子変異患者におけるOAEの経時的変化に関する検討、および昨年度にcommon mutationであることが明らかとなったR1939Q変異を中心とし、さらに大きな母集団を対象としたより効率的なOTOF遺伝子変異のスクリーニングについての検討を行った。OAEが経時的に消失していくメカニズムは未だ明らかとなっていないが、その原因として、長期にわたり求心性刺激がなされないことにより、廃用性に外有毛細胞の機能が失われる事によると仮定した。昨年度にOTOF遺伝子変異が同定された7例の中で、人工内耳装用者は3例(5耳)。この症例に対して術前、術後半年、術後1年、術後2年でのOAEを測定し、上記仮説の正否を検討した。術前のOAE反応があったものは4耳(1耳は不明)、術後半年で反応ありが0耳(1耳は不明)、術後1年で反応ありが0耳(1耳は不明、1耳は術後1年未満)となり、術後にOAEが保存される例は現在のところ0例であった。現時点までの検討では人工内耳挿入によるOAEの保持は得られていないが、今回の症例の中には人工内耳の電極が最近の内耳保護を目的とした繊細な電極でないものや、手術法が従来の高侵襲なものも含まれている。ゆえに、OAEの消失が手術侵襲によるものである可能性がある。現在主流となっている低侵襲な手術法、低侵襲な電極を用いて人工内耳が行われた症例に関して引き続きOAEの経時的変化をとらえていく。また、今年度は難聴患者800例に対してtaqmann法を用いたOTOF遺伝子変異のスクリーニングを行った。今回解析を行った症例のうち9例(1.13%)にp.R1939Q変異を同定していた。また、昨年度に同定されたp.Y474X変異も病的意義がはっきりしており、3例(0.375%)に変異を認めた。平成27年度は日本人難聴患者の中でOTOF遺伝子変異患者におけるOAEの経時的変化に関する検討として、OAEが経時的に消失していくメカニズムとして、長期にわたり求心性刺激がなされないことにより、廃用性に外有毛細胞の機能が失われる事によると仮定し、OTOF遺伝子変異が同定された症例の中で、人工内耳装用者は4例(8耳)に対して術前、術後半年、術後1年、術後2年でのOAEを測定し、上記仮説の正否を検討した。術前のOAE反応があったものは7耳(1耳は不明)、術後半年で反応ありが0耳(1耳は不明)、術後1年で反応ありが0耳(1耳は術後1年未満)、術後2年で反応ありが0耳(4耳は術後2年未満)となり、術後にOAEが保存される例は現在のところ0例であった。現時点までの検討では人工内耳挿入によるOAEの保持は得られていない。

現在主流になっている低侵襲な手術法、低侵襲な電極を用いて人工内耳が行われることで内耳機能は保存されていると考えられる。今回の結果からは電極挿入後のOAEの保持は得られず、上記仮説は否定的であることが明らかとなった。また、今年度は昨年度にtaqmann法を用いた800例に加え、更に200名のOTOF遺伝子変異のスクリーニングを行い、計1000例の難聴患者に対するOTOF遺伝子のスクリーニングを行った。その結果、12例(1.2%)にp.R1939Q変異、3例(0.3%)にY474X変異を認めた。うちヘテロ例であった9例(p.R1939Qヘテロ8例、p.Y474Xヘテロ1例)に対する直接シークエンス法による解析を行ったところ、6例にもう1つのOTOF遺伝子変異を認め、確定診断に至った。日本人難聴患者に高頻度で同定される変異をスクリーニングとして優先的に解析し、ヘテロ例に関する直接シークエンスを行うことで効率的にOTOF遺伝子変異による難聴を診断する事が出来たと考える。Auditoryneuropathy spectrum disorder(以下ANSD)は、OAE(耳音響反射)が正常でABR(聴性脳幹反応)が無反応もしくは異常反応となる新しいタイプの難聴である。本研究では、日本人難聴患者におけるOTOF遺伝子変異の頻度とその種類を明らかにことを目的に研究を行った。その結果OTOF遺伝子の解析を実施した結果、160例中3例にホモ接合体変異、4例よりヘテロ接合体変異、9例よりヘテロ接合体変異を見出した。今回検索を行った160例中7例(4.4%)がOTOF遺伝子変異による難聴であることが明らかとなった。当初の計画を大幅に上回る、難聴患者800例に対してtaqmann法を用いたOTOF遺伝子変異のスクリーニングを行い9例(1.13%)にp.R1939Q変異を同定していた。また、p.Y474X変異も3例(0.375%)に変異を認めた。今後の継続により更なる成果が期待できる。耳鼻咽喉科学平成27年度は、本年度に行ったOTOF遺伝子変異患者におけるOAEの経時的変化の確認をし、症例を増加させてさらなる検討を行う。また本年度に解析を行った800例のうちtaqmann法にてヘテロ接合体の症例に関しては、直接シークエンス法を用いて確定診断率の詳細な検討を行う。OAEが経時的に消失していくメカニズムに関して、本年度はOTOF遺伝子変異患者で人工内耳手術を行った症例に対するOAEの経時的変化を検討したが、全ての症例でOAEの消失を認めている。その理由として、以前の症例の中には従来の侵襲の高い手術法や電極で行われた例があることや、低侵襲手技および繊細な電極を用いた手術を行った例でも長期成績に関しては検討が行われていないことが挙げられる。今年度もOTOF遺伝子変異が同定された症例に関して術前、術後半年、術後1年、術後2年でのOAEを測定して長期成績および症例を増やした上での検討を行う。また、本年度800名を対象にしてtaqmann法を用いたOTOF遺伝子変異のスクリーニングではp.R1939Q変異患者が9例、p.Y474X変異患者が3例同定された。うちヘテロ症例は7例であり、それらの症例に関してはOTOF遺伝子のスプライシング部位を含む全エクソン領域を直接シークエンス法により解析する。また、聴力レベル別に変異の有無を検討することにより、より詳細にOTOF遺伝子変異による診断率を明らかにすることを目的とする。当初予定通り日本人難聴患者におけるOTOF変異の種類と頻度を概ね明らかにすることができた。
低酸素誘導性因子1システムによる酸素ホメオスターシス維持の分子機序の解明

酸素濃度感知性転写因子であるhypoxia-inducible factor 1(HIF-1 ;低酸素誘導性因子1)と低酸素センサーの活性を指標に酸素ホメオスターシスを分子生物学を援用しリアルタイムでモニターする実験系を構築し、大きく分類して以下の実験結果を得た。培養細胞、実験動物を用いてHIF-1活性化をアッセイする実験系を確立した。In vitro実験系で細胞酸素消費測定系を確立した。マウスを用いてHIF-1の活性化をリアルタイムで検出する実験系を確立した。培養細胞を用いた実験系とラットや遺伝子改変マウスを用いた実験系を用い酸素供給と需要のバランスで決定される酸素ホメオスターシスを分子生物学を援用しリアルタイムでモニターする実験系をin vitroまたin vivoで構築し、低酸素応答性の遺伝子発現またその結果としての細胞、組織の表現型と合わせて評価することが本申請の目的であった。この目的の達成のため、平成18年度は当初の研究計画に基づき、細胞をめぐる環境が低酸素応答に与える影響とその分子機序の探求(培養条件はpH、グルコース濃度、乳酸、ピルビン酸などのグルコース代謝物、血清の有無、浸透圧など項目について変化させ検討した)、細胞の由来する組織による低酸素応答の違いとその分子機序の探求(血管内皮細胞、血管平滑筋細胞、肝臓細胞、尿細管上皮細胞、神経細胞を検討の対象とした)、ミトコンドリアにおける酸素消費が低酸素応答に与える影響とその分子機序の探求、培養細胞において5xHRE-0DD-Luciferaseレポーターを用いたアッセイを行い細胞レベルで酸素負荷をリアルタイムでモニターするシステムの構築を遂行した。平成19年度は実験小動物を用いた実験系の構築を図る計画である。酸素濃度感知性転写因子であるhypoxia-inducible factor 1 (HIF-1;低酸素誘導性因子1)と低酸素センサーのを指標に明らかにあるために培養細胞を用いた実験系とラットや遺伝子改変マウスを用いた実験系を用い酸素供給とのバランスで決定される酸素ホメオスターシスを分子生物学を援用しリアルタイムでモニターする実験系をin vitro in vivoで構築し、低酸素応答性の遺伝子発現またその結果としての細胞、組織の表現型と合わせて評価することが本の目的であった。昨年度の研究成果を受けて今年度はクラーク電極を用いた酸素分圧測定を使い、培養細胞の酸素消費量を測定する実験系を確立した。各種のミトコンドリア電子伝達系の阻害薬を用いた検討により細胞の種類により酸素消費量のミトコンドリアへの依存率に差がある事が判明した。同時に、綱胞内ATP濃度、細胞培養上清中の乳酸・ピルビン酸の濃度の測定系を確立した。#2 5xHRE-ODD-Luciferaseレポーターを組み込んだ遺伝子改変マウスを用いて、内腸骨動脈の結紮モデルを構築しレポーターを用いたリアルタイムのHIF-1の活性化が、実際の遺伝子発現と良く相関する事を見いだした。#3内毒素LPSがHIF-1の活性化を引き起こす事、細胞のブドウ糖代謝経路を回答主体のものに変換させる活性を持つ事を見いだした。酸素濃度感知性転写因子であるhypoxia-inducible factor 1 (HIF-1;低酸素誘導性因子1)と低酸素センサーの活性を指標に明らかにあるために培養細胞を用いた実験系とラットや遺伝子改変マウスを用いた実験系を用い酸素供給と需要のバランスで決定される酸素ホメオスターシスを分子生物学を援用しリアルタイムでモニターする実験系をin vitroまたin vivoで構築し、低酸素応答性の遺伝子発現またその結果としての細胞、組織の表現型と合わせて評価することが本申請の目的であった。昨年度の研究成果を受けて今年度は以下の研究成果を得た。#1 in vitro細胞酸素消費測定系の確立クラーク電極を用いた酸素分圧測定を使い、培養細胞の酸素消費量、細胞内ATP濃度、細胞培養上清中の乳酸・ピルビン酸の濃度の実験系を確立した。静脈麻酔薬であるpropofol, thiopental, thyamilalがHIF-1活性を阻害することにより解糖系主体の代謝経路の抑制がおこり細胞内ATP濃度が減少することを見いだした。#2低体温が生体の低酸素誘導性の遺伝子発現に及ぼす影響を検討するため培養細胞とマウスを用いた実験系を構築して以下の様な結果を得た。摂氏32度程度の低温は4時間以内では培養細胞、脳における低酸素誘導性のHIF-1活性化やその下流遺伝子発現に大きな影響を及ぼさない。一方24時間にわたる低温への暴露によりHIF-1の活性化が阻害された。#3マウス個体を低酸素環境下で飼育し薬剤を処理を施し脳、肝臓、心臓、肺、筋肉など各種臓器のHIF-1活性化をアッセイする実験系を確立した。
環境被曝線量の変動要因弁別のための宇宙線線量モニタリング法の確立に関する研究

本研究を通して次の事実が明らかとなった。(1)3′′φNaI検出器の宇宙線線束密度を決めるには、地球起源の放射性核種からの光子に重なる3MeV以下の分布の形を決めることが重要であること。本研究では長岡らの実験的方法を採用した。その結果3MeV以上の計数を4.35倍すれば宇宙線線束密度が得られることがわかった。(2)宇宙線成分の線束密度を秋,冬で決定した(1992年10月;φμ=1.136,φe=0.450,φx=6.29,'93年2月φμ=1.157,φe=0.385,φx=6.24G/cm^2・min)。φμ,φxには大きな変化は認められないがφeが大きく変化することがわかった。しかし宇宙線線量には殆んど影響しないことがわかった。(3)φμ/φeの比は秋期に2.52,冬期に3.00と16%変化したが、この比の変化が宇宙線線量へは0.14%しか影響しなかった。(4)宇宙線線束の季節変動、特にφxの変動モデル、および低気圧通過時にφxが増加する現象の説明モデルを作成し、いずれもμ^±粒子の崩壊または、ノツクオンによって発生する電子の制動放射線によることがわかった。(5)光子による波高分布は、3′′φNaI検出器によりほづ17MeV以下に分布することがわかった。(3′′φNaI検出器の光子に対する応答行列を作成し、入射光子スペクトルを求めれば、光子スペクトルより宇宙線光子による被曝線量が求められることがわかった。これは将来の問題として残された。)簡単な試算によりφx=6G/cm^2・minの光子による線量は0.017μR/hr(旧単位)程度で宇宙線による被曝線量の0.5%程度にしかならないことがわかった。このことより宇宙線による被曝線量をモニタリングするには光子に対して感度の低い3′′φプラスチックシンチレーションカウンターでほぼ3MeV以上のμmとφeによる線束密度を測定すればよいことがわかった。逆にNaI検出器は光子に対して感度が高いので不適である。長期にわたるモニタリングを行なうには弁別レベルの安定性が重要である。(6)光子成分の変動は気象要因と関係していることがわかった。初年度は、当初の計画の一つである3"φ球型プラスチックシンチレ-ション検出器(以後(プラスチック検出器と略称)の製作を行なった。留意点は次の通りである;(i)既有の3"φNaIシンチレ-ション検出器(以後NaI検出器)と同じ幾何学的サイズに作成する,(ii)軸方向と軸に垂直方向から入射した単一エネルギ-放射線に対してほゞ同一の波高分布が得られること,(iii)長期間に及ぶ測定のため前置増幅器の温度特性などに配慮した。検出器の製作と並行して鄭は高エネルギ-研において高エネルギ-中性子と物質の相互作用について調査した。中島は既有の検出器を用いて、女川地区で環境放射線の弁別法の検討を行なった。測定にあたっては大学院生の協力をえ謝金を使用した。製作したプラスチック検出器とNaI検出器の感度の相違に着目して2次宇宙線成分;μ^±粒子,e^±および光子の線束密度の分離を試みた。測定では10cmPb遮蔽を併用した。結果はφ_μ=0.72,φ_e=0.26,およびφ_x=3.02個/cm^2・minであった。地上付近の宇宙線による被曝線量を推定するのにNaI検出器を使用し3MeV以上の計数率に変換係数を乗じている。しかし本結果によれば宇宙線による計数率のうち3/4は光子によるものである。慣用的に適用されてきた線量評価法は根拠のある方法とはいえない。NaI検出器による慣用法では宇宙線による線量率をほゞ3.4μR/h(旧単位)と予想しNaI検出器による3MeV以上の計数率との比により宇宙線線量への変換係数としていた。2次宇宙線による被曝の主成分はμ^±とe^±であるので光子に対して感度の高いNaI検出器のみによる宇宙線の被曝線量評価法は正しい方法ではないことがわかった。これらは本研究で得られた海面レベルの宇宙線による被曝線量評価に関する新しい知見である。その他に環境放射線の変動要因について気象要素との関連について基礎的考察を行なった。

(3)φμ/φeの比は秋期に2.52,冬期に3.00と16%変化したが、この比の変化が宇宙線線量へは0.14%しか影響しなかった。(4)宇宙線線束の季節変動、特にφxの変動モデル、および低気圧通過時にφxが増加する現象の説明モデルを作成し、いずれもμ^±粒子の崩壊または、ノツクオンによって発生する電子の制動放射線によることがわかった。(5)光子による波高分布は、3′′φNaI検出器によりほづ17MeV以下に分布することがわかった。(3′′φNaI検出器の光子に対する応答行列を作成し、入射光子スペクトルを求めれば、光子スペクトルより宇宙線光子による被曝線量が求められることがわかった。これは将来の問題として残された。)簡単な試算によりφx=6G/cm^2・minの光子による線量は0.017μR/hr(旧単位)程度で宇宙線による被曝線量の0.5%程度にしかならないことがわかった。このことより宇宙線による被曝線量をモニタリングするには光子に対して感度の低い3′′φプラスチックシンチレーションカウンターでほぼ3MeV以上のμmとφeによる線束密度を測定すればよいことがわかった。逆にNaI検出器は光子に対して感度が高いので不適である。長期にわたるモニタリングを行なうには弁別レベルの安定性が重要である。(6)光子成分の変動は気象要因と関係していることがわかった。平成3年度は環境光子成分と重なるほゞ3MeV以下のエネルギ-領域の宇宙線による波高分布を正確に評価するために必要なゲ-ト用プラスチックシンチレ-ション検出器を製作した。製作には既に経験を持つ中島が下、飯田、鄭の協力を得て行なった。環境光子成分との弁別を検討するため中島,鄭は宮城県女川原子力発電所サイトでも宇宙線の測定を行なった。ゲ-ト用検出器を球型NaI(Tl)又は球型プラスチック検出器の真上に配置し、環境光子と重なる宇宙線による分布を正確に評価することができた。両検出器を屋外に設置して両検出器が検出する海面レベルの宇宙線線束を連続的に観測した結果次の知見を得た。(1)プラスチック検出器による線束密度(α宇宙線線量)は夏期にほゞ10%低く冬期にほゞ6%高い、これは日本の緯度で予期される変化を示した。(2)NaI検出器による宇宙線線束は殆んど変化がみられない。(3)両検出器の宇宙線成分に対する感度の差より、宇宙線光子成分は夏期に高く冬期に低いという変動が示唆された。(4)低気圧の通過に伴なって宇宙線光子成分は4%程度短期間に増加した。(3)(4)の結果は本研究で得られた新しい知見である。連続測定では学生の協力を得たので謝金を使用した。下、飯田は環境放射線成分のうち地表面より散逸し大気中に分布し地上の観測点に寄与する^<222>Rnおよび^<222>Rn娘核種の変動について検討し、^<222>Rn娘核種は大気中に逆転層を形成したとき最大でも15%程度の線量の増加をもたらすことを明らかにした。宇宙線光子成分の変動(3)(4)について中島は変動の原因を説明するモデルを検討しザルツブルグ大学で開催されたNREーV(9月22ー28日)で発表し、大気中での宇宙線のシミュレ-ションを研究しているオブライエン氏(アリゾナ大学教授,アメリカ)の支持を得た。(3)(4)のモデルの詳細は最終年度の総合報告書で述べる予定である。平成4年度は、本研究の最終年にあたり、モニタリング法としての実用的測面に重点を置いて進めた。地球起源の放射性核種および宇宙線誘導核種からの光子成分の寄与を含まないほゞ3MeV以上のエネルギー領域の計数に変換係数を乗じて、宇宙線線量を求める方法が最も簡便な方法と考えられる。
身体技法と社会学的認識

研究課題「身体技法と社会学的認識」について、今年度は、昨年度に引き続き京都市にある武術教室、武術研究会S流の参与観察を行った。具体的には、週に二回の練習に継続的に参加することで、S流の構成員における身体技法の習得過程を記述・分析した。そのさい、指導のさいに用いられる比喩的な用語法、たとえば「身体の力を抜く」・「身体の線をつくる」などの「わざ言語」に焦点を当てた。分析には、方法論・認識論を扱った社会学的文献と、言語行為論・慣習論を扱った哲学的文献を用いた。今年度の科学研究費は、S流の指導者など情報提供者への謝金と、補助文献の購入費に充てられた。今年度の研究によって、従来の「わざ言語」についてのアプローチの問題点が明確にされ、それらを克服するような新たなアプローチが示された。従来の身体技法研究では、身体技法はM・ポラニーのいう暗黙知として捉えられてきた。そのため、「わざ言語」の重要性が指摘されつつも、それは暗黙的な技法が伝達されるための手段的媒介として位置づけられるにとどまっていた。このような目的論的な枠組みのもとでは、それぞれの学習者が上達のための試行錯誤のなかで「わざ言語」を実際にどのように解釈しているかは見えてこない。武術教室のフィールドワークによって、学習者の日常的な慣習的実践が「わざ言語」の理解に重要な役割を果たすことが明らかになった。「わざ言語」は一見したところ専門的な耳慣れない言葉であるが、それを構成する個々の言葉は日常的なものである。学習者は、それらの言葉を日常的に使用しているため、それぞれの言葉と慣習的に結びついた身体的実践を喚起することができる。したがって、「わざ言語」は言葉の比喩的な組み換えにとどまらず、このようにして喚起された身体性をも組み換えているのである。これは、学習者の慣習的身体の多様性と「わざ言語」の多様性に応じて多様かつ創発的な過程である。
液体金属-固体金属表面間相互作用の微視的機構

アルミニウム、アルミニウム合金、非晶質合金Al_<87>Ni_<10>Ce_3の、液体ガリウム付着時の脆化現象(LME)について研究した。用いた測定手段は、引張試験機、Acoustic Emission(AE)法、電子顕微鏡、走査トンネル顕微鏡(STM)、X線光電子分光法(XPS)、電子プローブマイクロアナライザー(EPMA)などである。ジュラルミン2017、99%アルミの引張り試験時にGa浸透によって引き起こされるAE信号を観測した。AE信号は応力無負荷時にも観測されたことから、Gaは応力なしでも浸透する。200600°Cで熱処理した試料では、結晶粒径が大きいほどAE振幅は大きく、脆化も顕著である。AE測定はLMEの破壊前駆現象を観測するのに有用であることが示された。また、アルミ多結晶では粒界破壊を起こすが、単結晶ではへき開破壊を起こす。Gaを蒸着したアルミ単結晶表面をSTMで観察した結果、Gaが高い濃度で固溶したAl合金が形成されていることがわかった。アルミ蒸着膜上にGaを付着させるとGaが数十分/cmで放射状に異常拡散していく。ガラス基板温度、アニール温度、付着するGa量などを変えて拡散速度を測定すると、網目状と曇り状拡散の2段階があるとがわかった。原子間力顕微鏡、走査電子顕微鏡、XPS、EPMAを用いて拡散後の試料観察を行い、拡散機構の解明を行った。金属に限らず非晶質Al_<87>Ni_<10>Ce_3でも、Ga付着により破壊応力が半分以下に低下し、serrationが著しく減少するなど変形機構も影響を受けることがわかった。液体金属脆化に、固体金属の結晶性がどのように効くかを調べるために、非晶質合金について液体金属を付着した場合の塑性および破壊の様子を調べた。試料には、結晶化したときに液体金属脆化を示す組み合わせを選ぶ必要がある。アルミニウム金属はガリウムをつけることで脆化することが知られているので、Alを主成分にした非晶質合金Al_<87>Ni_<10>Ce_3に液体Gaをつけて結晶化温度以下で引張り試験を行った。50°C以下で液体Gaをつけることにより、非晶質Al_<87>Ni_<10>Ce_3の破壊応力が半分以下に低下することがわかった。50°C以上では、非晶質Al_<87>Ni_<10>Ce_3の応力歪曲線はserrationを示し、同時に通常の結晶で見られるような降伏現象を示すが、液体Ga下では、serrationが著しく減少し、降伏直後に破壊が起きる。従って、試料が結晶でなくても液体金属脆化は起こり、さらに、液体Gaの存在が変形機構に対しても影響することが明らかになった。また、ジュラルミン2017、アルミニウム純度99%の2種類を試料にして、Gaを付着したときの引張り試験を行い、Acoustic Emissionを観測した。ジュラルミンについてはGaをつけない場合の破壊歪は約20%であるのに対し、Gaをつけた場合は付着量によって異なり、14%であった。Gaをつけた場合には、振幅が小さく、しかもほぼ同じ大きさのAEが数多く観測された。更に興味深い点は、応力を全くかけない状態でもGaをつけただけで小さなAEが検出されたことで、Gaが金属中に入り込んでゆく様子がわかった。今後の問題点は、Gaの付着量の多少が脆化にどう影響するか、アルミの酸化膜がGaの付着に与える影響等を明らかにすることである。酸化膜を除去するのに超音波ハンダコテが有効であることは確かめてある。来年度は、真空中の引張り試験を行う予定である。ジュラルミン2017、アルミニウム純度99%の2種類を試料にして、Gaを付着したときの引張り試験を行ない、Acoustic Emission(AE)を観測した。前年度の結果から、応力無負荷状態でのAE発生が残留応力によるものではないかと推察された。

しかし、あらかじめ歪みを約15%加えた試料と加えない試料について今年度実験を行なったところ、AE発生に大きな差はなく、残留応力は主たる原因ではないことが明らかになった。200,400,600°Cで熱処理した試料では、結晶粒径が大きくなる(熱処理温度が高い)程、Gaによる脆化が顕著で破壊歪みが小さくなることがわかった。AE振幅は粒径が大きいほど大きくなり、AEの発生原因と粒径との関係が示唆された。さらに、99%アルミニウムを用いてブリッジマン法で単結晶化を試み、結晶粒径約1cmの試料が作成できた。この疑似単結晶試料の結晶粒間、粒内にそれぞれGaを付着させ引張試験を行なうとGaは粒界の方がはるかに浸透しやすいが、粒内の場合でも脆化は起こり、破壊歪みはGaを付けない場合の1/2程度になる。電顕写真をとった結果によると粒間にGaを付けた場合は粒界破壊、粒内の場合はへき開破壊になることが明らかになった。今後はアルミ単結晶表面でのGaの吸収状態を走査トンネル顕微鏡や光電子分光法で調べ、これまでの結果と比較、検討する予定である。今年度は3種類の実験を行った。(1)これまでの実験の断続として、ジュラルミン・銅に一定の負荷応力ををかけた状態で液体ガリウムを付着させたときの破壊挙動を調べた。ジュラルミンを600°Cで熱処理した試料では、ガリウムによる脆性破壊に至る時間は負荷応力の値に大きく依存し、負荷応力が大きいほど破壊が加速されることがわかった。この傾向は400°C熱処理試料でも見られるが、600°Cの場合ほど顕著ではない。一方、熱処理をしない試料では破壊にまで至らなかった。この結果から、結晶粒が大きいほどまた負荷応力が大きいほどガリウムの浸透速度が大きいことがわかった。銅試料では、負荷応力なし、熱処理なしの場合は多数のAcoustic Emission観測されたが、引張試験においてガリウムによる脆化は起きなかった。600°C,800°Cで熱処理した銅では負荷応力なしでAEも観測されず、またガリウムによる脆化も見られなかった。銅-Gaの組み合わせはアルミ-Gaと異なり、脆化が起きないことがわかった。(2)アルミニウム薄膜のガリウム破壊模様の観察。純アルミニウムをガラス基板に真空蒸着させ、そこにガリウムを付着させるとガリウムが数十分のオーダーで放射状に浸透していくことが肉眼で見ることができた。そこで浸透の様子を顕微鏡下でビデオに録画した。このような破壊の様子が観察できるのはきわめて希であり、今後そのメカニズムについて研究する予定である。(3)トンネル顕微鏡による銅-ガリウム脆化機構の微視的観察。まず、アルミ-Gaの組み合わせでガリウム浸透の様子を原子スケールで観察することを試みたが、アルミ単結晶の清浄表面を観察することはできなかった。次に銅-Gaでは観察に成功し、段階状の銅原子のエッジからガリウムが侵食することがわかった。今年度は主として、昨年度に初めて見つかったアルミニウム薄膜上のガリウム異常拡散の実験を行った。純アルミニウムをガラス基板に真空蒸着させ、そこにガリウムを付着させるとガリウムが数十分のオーダーで放射状に拡散していくことが肉眼で見ることができた。そこでその様子を顕微鏡下でビデオに録画するとともに、ガラス基板温度、アニール温度、付着するGa量などを変えて、拡散速度を測定した。
反応を伴なう超臨界流体抽出用小型簡易装置の試作

反応を伴なう超臨界流体抽出用小型簡易装置を試作し、まず設計通りの性能が発揮されているかどうかを調べてから次の実験を行なった。1.チオ配糖体は糖があるために超臨界二酸化炭素で抽出されない。しかしチオグルコシダーゼにより加水分解され、生成物のイソチオシアネートは抽出される。原料としてワサビ、カラシ、タマネギを用い、酵素反応を伴なう超臨界二酸化炭素抽出により、原料に特有のイソチオシアネート(辛味成分)のみを抽出しうる条件を調べた。その結果、水の存在は必須であるが、圧力や温度は大きな影響はないことがわかった。さらに、抽出した辛味成分を一度分離することなく、直接サイクロデキストリンに包接させることを検討した。包接には水分含量が20%程度、圧力が4050気圧が最適であることがわかった。また、サイクロデキストリンとしてはβ型が最適であったが、α型でもかなり包接された。超臨界流体抽出と包接の組合せは分離能が高められるので、一般性のある方法と考えられる。包接された辛味成分は安定性がよく、粉末食品素材として種々の利用法が考えられる。2.ペプチドの合成反応に対して適用してみた。ペプチドの合成反応は可逆反応であり、生成物を連続的に系外に取出す方法が開発可能かどうかが工業化の鍵となっている。そこでペプチドとして需要が多い甘味剤であるアスパルテームを例として、酵素反応を伴なう超臨界流体抽出の可能性を検討した。反応物質はアミノ基またはカルボキシル基があるのであまり超臨界二酸化炭素で抽出されず、酵素反応の結果としてペプチド結合が形成されるので極性が低下し、生成物は抽出されやすくなった。酵素としてはサーモライシンが最適であった。以上のように、本試作により超臨界流体反応抽出なる概念が工業的に有用であることを明らかにした。
MRI装置を用いた死後画像診断におけるスペクトルデータの活用に関する基盤研究

MRI装置を用いた死後画像診断におけるスペクトルデータの活用に関する基盤研究を行なった。ラット死体の骨格筋および脳組織の死後早期の代謝物質の変化について、^1H NMRスペクトルデータをパターン認識した結果、死後経過時間の推定や死因の検索に有用な解析結果を得た。また、死体のMRI画像測定データを用いて、組織内の温度分布の時間変化を可視化することができた。本研究は、MRI装置を用いたin vivo MRS測定にNMRメタボロミクス技術を応用し、死後画像診断時におけるNMRスペクトルデータの活用を実現するための基盤研究である。平成20年度は、死後早期において死後経過時間との関連が深いとされる骨格筋の死後硬直の発現と緩解に着目した。過去に行った急死モデルの動物実験データ(後述)を用いて、我々が確立したNMRメタボロミクスによる解析を行った。主成分分析法による代謝物プロファイルのマッピングでは、死後15分以内では、死因によるクラスター化が確認されたが、死後45分では各死因による特徴抽出は困難となった。硬直の発現の有無、開始時期、強度の変化、緩解開始の時期との関連づけの可否についての検討では、硬直発現前、硬直発現期、緩解期に特徴的な代謝物プロファイルを得ることができた。骨格筋組織の^1H NMRズペクトルデータは、死後早期であれば死因との関連が深く、また硬直の発現前から緩解開始期にいたるまで、組織内の代謝学的な変化を特徴づけることが可能であった。今後、MRI装置を用いてin vivoで骨格筋のNMRデータを測定し、メタボロミクスによる解析を行えば、死後画像診断における有用な情報となり得ることが示された。また、MRI連続測定による温度マッピングに関しても、基礎的な実験を行ったところ、死後経過時間に伴うラット死体組織内の温度低下の推移を示す画像の作成が可能であった。<動物実験>Wistar系雄ラットを用いて窒素100%チャンバー内放置(酸素欠乏)、塩酸コカイン(200mg/kg)腹腔内投与、臭化パンクロニウム(1mg/kg)腹腔内投与による急死モデルを作製し、心停止確認直後から死後48時間まで20°Cにて一定時間放置し、大腿部骨格筋組織を採取し、液体窒素中で凍結後、0.6N過塩素酸にて低分子化合物抽出、^1H NMRスペクトルを測定した。平成21年度は、死後早期の摘出ラット骨格筋組織の1H NMRスペクトルデータと死因あるいは死後経過時間との関連づけについて、法医学の専門誌に論文報告することができた(Legal Med,11,S-282-S285(2009))。in vitro実験で良好なデータが得られたことから、本年度は、最終目標である実用可能なin vivo 1H MRSスペクトルデータ取得をめざし、基礎な研究に着手することができた。ラットを用いた急死実験を行い、in vivo測定に必要な動物実験手技の確立と測定条件の設定等を行った。生存時から死後数時間までのスムーズなデータ収集の実現には、さまざまな視点からの基礎的な検討が必要であった。薬物投与あるいは出血性ショック等による急死実験を動物実験用の高磁場MRI装置内で行うため、あらたに小動物実験に対応可能な高磁場環境対応の高性能非磁性薬液注入装置を開発し、産業財産権の出願(特願2009-143488)した。本開発により、生存状態から死戦期を経て心肺停止確認後死後数時間に至るまで、各種死因による急死モデルの同一個体による連続的な画像およびスペクトルデータの収集が可能となった。温度マッピングに関する基礎研究も継続し、ラット急死モデルの腹部画像データについて、最終測定時の画像データを基準とすることにより、死後経過時間に伴う死体組織内の温度低下の推移をスムーズに画像化することに成功した。本成果については、研究協力者の栗林がMRIの国際学会にて報告(ISMRM 2010, Stockholm, Sweden, May 2010)する予定である。我々は、MRIの死後画像診断への応用に関する基盤研究としてNMRスペクトルデータの活用に重点をおいた実験研究を進めており、これまでは主に代謝学的観点にたったアプローチを行ってきた。平成22年度は、あらたにスペクトル中の水分子のケミカルシフト値の変化に着目し、水分子由来のピークのケミカルシフト値のずれが組織内温度の変化と相関する特徴を生かした「MRI温度分布画像法」を用いた検討を行った。ラットをペントバルビタール過投与によって安楽死させ、15分ごとの測定を行い、死後330分後のデータを基準とした温度差分布画像を作成した。その結果、定量性については今後の課題であるものの、死体内部温の冷却挙動を十分に可視化することできた。早期死後経過時間の推定において、「死体の温度変化」に関する情報は重要であり、MRI技術によって、組織内温度分布の変化を可視化できた意義は大きい。

このほか、代謝学的研究をさらに推し進めるため、死因が死後MRIにおよぼす影響に関する基礎的研究として、「麻酔薬投与後の脳代謝変化」、「酸化ストレスが細胞におよぼす影響」「熱傷による体液成分の変化」などに関してラット、培養細胞等を用いた実験研究も行った。我々が独自に開発したNMRスペクトルデータの数値化法に関して、さらなる改良を行ってNMRデータ処理を行い、主成分分析、PLS-DA法などの多変量解析に関しても解析条件を最適化すれば、in vivo測定データへの応用も十分可能となる成績を得ることができた。
水素酸素ガスの吸入が筋疲労や筋痛に及ぼす回復効果の研究

我が国では、健康寿命の延伸や2020年の五輪開催などで、運動への関心が高まる中、運動によって生じる疲労をいかに残さないようにするのかは、運動継続やスポーツ障害の予防、我が国の医療費削減の上でも重要となる。近年、水素ガス吸入は医療の現場における緊急を要する疾患に対しての有効性が示されており、疲労回復や怪我の治癒促進には酸素ガス吸入が有効とされている。そこで本研究では、これまでに明らかにされていない水素と酸素の混合ガス(水素酸素ガス)の吸入が伸張性収縮でのレジスタンス運動のパフォーマンスや、運動後の筋疲労の回復に及ぼす影響について検証し、健康増進や運動効率向上、傷害予防の方法として提案する。
非正規労働者のキャリア開発制度導入による人的資源管理の有効性に関する研究

雇用の多様化が通常化しつつある現代において、急増する非正規労働者、とくに派遣労働者に対する管理や派遣労働者自身のキャリア開発が問題化している。期間の定めない雇用の正規労働か有期雇用の非正規労働の二分論の論議はこれまでも行われていたたが、非正規労働者の雇用問題だけだはなく働き方やキャリア開発についての研究は着手され始めた新しい研究分野である。本研究では、現在的課題である非正規労働者の雇用とキャリア、そして非正規労働者特に人材派遣労働者について彼らの労働観や働き方を分析し、雇用者である企業サイドの管理の有効性について人的資源管理視点から研究を行った。わが国の人材マネジメントは、第二次大戦後の年功序列・終身雇用制度に基づく一社雇用主義に支えられてきたが、第一次石油危機の前後からグローバル競争に対峙するために能力主義が主流となった。企業は能力主義の人的資源管理を制度設計どおりに運用することをしなくなり、次第に年功型に戻してしまったと苦い経験がある。その対応策として、能力主義に代わり、業績・成果主義型の人的資源管理が企業マネジメントに導入され、現在も多くの企業で実践している。しかしながら、期待した成果を上げた企業はまだ少ない状況にある。その間、非正規労働者のワーキング・スタイルは大きく変貌した。戦後は主婦の家計補助型のパートタイマーや学生アルバイトが主流であったが、高度経済成長期の労働力不足と豊かな社会になって働く労働者自身の労働観や働き方は多様化した。その典型として、人材派遣が非正規労働の新たな主役となった。正社員の補助的業務のパートタイマーに比べて、派遣労働者はホワイトカラーの正社員の仕事(高度業務)を担うようになり、特に女性のライフ・スタイルやワーキング・スタイルが変化したことは、労働市場に大きな影響を及ぼし、従来の内部労働市場を外部労働市場化へと転換促進したといえる。バブル経済崩壊後、アジア諸国の追い上げのなかで、日本はさらに厳しいグローバル競争に晒されることになり、日本を代表する大企業であっても常に革新をし続けなければ生き残れなくなった。このようなグローバルな環境下では、自分のキャリアは会社ではなく、自分自身で開発する時代となり、キャリアの自己形成が求められるようになったのである。正規労働者と非正規労働者の境界が不透明になりつつある現代にこそ、自己の市場価値を高めエンプロイアビリティを常に向上させていく努力を労働者にも要求されているので、非正規労働者自身の組織的有効活用と自身のキャリア開発の均衡を可能にする人的資源管理の施策を調査研究する必要がある。非正規労働者のキャリア形成は、正規労働者に比べてキャリアプランニングにおいて困難が伴う傾向にあるが、業種や地域性、企業規模等により、非正規労働者の働き方やワーキングスタイルが、どのような状況にあるかという視点から、北東北を代表する水産商工都市の八戸市を取り上げ、市が積極的に企業誘致している非正規労働者数が比較的多い情報・IT関連企業分野の正規労働者・非正規労働者の実例に基づいても考察を行った。地域の活性化は、産学官が同時的一体的活動が有効的であるが、八戸市が立ち上げた「はちのへLookout Vision」構想の実際の取り組みを調査した。「はちのへLookout Vision」構想は、平成19年施行の企業立地促進法に基づく「県南・下北地域産業活性化計画」として、地域が有する地区製・強みを最大限に活かした新たな産業の立地・創出を図るもので、環境負荷が比較的少なく、雇用創出効果や付加価値の高いIT関連企業の集積を図るものである。この構想には、環境面での環境・自然保護団体等の拠点としての機能をもつ環境配慮型オフィスの設定、文化財としての景観を守るビューポイントの設定や積極的な管理による景観の維持、人づくりにおいては企業と大学等の高等教育機関・地域との連携による人材育成と自然景観を守る次代につなぐ人づくり、そして持続可能な仕組みとしては、経済の活性化や雇用の創出・企業と環境・地域と働く人々との新しい関係の確立などの4つの視点に大別することができる。また、人間らしいはたらきがいのある適切な仕事を意味するディーセント・ワークの考え方の浸透に注力する必要がある。厚生労働省の諮問機関である労働政策審議会が昨年12月に提示した労働者派遣法改正案の原案には、製造者派遣の原則禁止や派遣先が違法行為をした際に派遣労働者を直接雇用することを義務づける直接雇用みなし制度の創設が明記されている。これまで派遣労働を有効な労働力として活用してきた企業にとってはコスト増につながる可能性が考えられる。また派遣労働者にとって規制対象となる派遣労働者数が40万人を超えると見通される。この数字は登録型派遣の約半数を占めることを意味しているので、派遣労働者にとっては今後の非正規労働という働き方や自らのキャリア開発について、ライフプランという長期的な視野に立って見直しを図る時期に来ていると考えられる。

さらにわが国の非正規労働の中のパート・アルバイトの約40%以上は小売業や外食産業に従事しており、特に大学生の約8割がアルバイトを経験し、その約60%が補助的労働に従事しているなど、非正規労働の働き方はすでに多様化している。このような現代において、職場に混在する正規・非正規労働者に対する効果的なマネジメントのあり方や派遣労働者自身のキャリア開発が課題化している。これまでの期間の定めない雇用の正規労働か有期雇用に定める非正規労働の二分論はだけではこれらの課題に対応できなくなっている。非正規労働者の雇用問題だけだはなく働き方やキャリア開発まで含めた研究の必要性を説いた。本研究では、現在的課題である非正規労働者の雇用とキャリア、そして非正規労働者の働き方や報酬金銭的報酬に限らない観等と経営管理の視点から人的資源管理の有効性について研究を行った。
新たに発見された線条体の投射ニューロン系

運動系の高次中枢の一つである線条体において神経回路の研究を進めるために、我々は線条体投射ニューロンを免疫学的に識別する手段を開発してきているが、特にNeurokinin B (Neuromedin K)の前駆体であるPreprotachykinin B (PPTB)のC末端に対する抗体を用いて、(1)新線条体には線条体黒質/淡蒼球内節系・線条体淡蒼球外節系以外に今までに報告されていなかった第3の線条体無名質投射系が存在し、(2)この系のみがPPTBを産生してNeurokinin Bを利用していることを明らかにしてきた。本年度はこの研究を以下のように進展させている。2.NK3 receptor (Neurokinin Bの受容体)を発現している無名質ニューロンについて、形態学的・電気生理学的に検討した。NK3発現無名質ニューロンのほとんどはGABA作動性ニューロンであり、大脳皮質へ投射していた。コリン作動性の無名質大脳皮質投射ニューロンと比べると、やや小型で、投射部位についてもコリン作動性ニューロンと違って、感覚系皮質よりは運動皮質により多く投射していた。大脳皮質へ投射するニューロンをホールセルクランプ法で調べたところ、その一部にNK3 agonistに反応するものがあり、膜抵抗が下がって膜電位が上昇する反応が認められた。したがって、NK3受容体はnon-selective cation channelを活性化しているのであろうと推測された。1.腹側線条体にも同様な第3の投射系が存在するかどうか検索した。腹側線条体の側座核にはPPTB陽性のニューロンが存在し、少なくともその一部は投射ニューロンであることを明らかにした。一方、腹側線条体の嗅結節にはこうしたニューロンが存在せず、嗅結節がこの点で背側線条体・側座核とは異なる組織であることが明らかになった。現在さらに側座核を中心とするPPTB陽性投射系の詳しい投射先を検討している。また、投射先の無名質ニューロンはPPTBの産物であるニューロキニンBに対する受容体を発現しているが、この無名質ニューロンがニューロキニンBに対してどの様な反応を示すか電気生理学的に検索している。
カベオリン３を介した神経型ＮＯ合成酵素制御による筋萎縮の病態治療研究

筋細胞膜カベオラ構成蛋白質caveolin-3はシグナル分子と結合しその活性を制御する。われわれは肢帯型筋ジストロフィーモデルとして筋萎縮を表現型とする変異caveolin-3 (CAV-3P104L)マウスを作出した。骨格筋ではcaveolin-3が欠損し、nNOS活性は亢進していた。nNOS活性亢進が、筋萎縮発症に促進的に働くか、抑制的に働くか検証するため、nNOS/caveolin-3二変異マウスを作出した。二重変異マウスでは、CAV-3欠損マウスと比較し、筋萎縮と筋力低下が増強した。caveolin-3欠損によるnNOS活性亢進は筋萎縮を抑制している。昨年度はカベオリン-3欠損マウス(CAV3P104LTg:CAV3P104L+/+)とnNOS欠損マウス(nNOS-/-)を交配し、野生型(CAV3P104L-/-/nNOS+/+)、カベオリン-3欠損(CAV3P104L+/+/nNOS+/+)、カベオリン-3/nNOS二重欠損(CAV3P104L+/+/nNOS-/-)、nNOS欠損(CAV3P104L-/-/nNOS-/-)の4種類の遺伝子型のマウスを作出した。本年度はこのマウスの生理機能(体重・握力・血清CK値)について経時的に解析を実施した。カベオリン-3/nNOS二重欠損マウスでは、カベオリン-3欠損マウスと比較して、体重と握力が減少し、血清CKが上昇する。一方、nNOS欠損マウスは筋萎縮は認められなかった。24週齢の骨格筋解析では、カベオリン-3/nNOSと比較してカベオリン-3/nNOS二重欠損マウスでは筋線維萎縮が増悪していたが、nNOS欠損マウスでは筋線維萎縮は認められなかった。この結果から、カベオリン-3欠損を起点とする骨格筋萎縮シグナルはnNOSを経由することが示された。カベオリン-3欠損マウスとnNOS欠損マウスを交配し、F2世代のマウスで、野生型(CAV3P104L-/-/nNOS+/+)、カベオリン-3欠損(CAV3P104L+/+/nNOS+/+)、カベオリン-3/nNOS二重欠損(CAV3P104L+/+/nNOS-/-)、nNOS欠損(CAV3P104L-/-/nNOS-/-)の4種類遺伝子型のマウスを得ることに成功した。これらのマウスを繁殖させ統計学的解析によって、カベオリン-3欠損常染色体優性肢帯型筋ジストロフィー(LGMD1C)においてnNOSが、カベオリン3欠損から発する筋萎縮シグナルに促進的に働くのか、抑制的に働くのかについて検討している。また、カベオリン-3欠損、nNOS欠損マウスのそれぞれの座骨神経を切除して、野生型コントロールマウスと比較した。CTによる下腿筋断面積、下腿筋重量、及び単一筋線維断面積は、いずれもコントロールと比較して有意に減少することが明らかとなった。この結果は、カベオリン3は筋萎縮シグナルを抑制するという以前の報告(Ohsawa Y, et al. JCI 116, 2006)とは一貫するが、nNOSが除神経後筋萎縮を抑制するという報告(Suzuki N, et al. JCI117, 2007)とは正反対の結果であった。すなわち、nNOSも、カベオリン3と同様に脱神経筋萎縮シグナルを抑制するという新しい知見が得られた。細胞膜の特殊陥入構造物であるカベオラを構成するカベオリンは、様々なシグナル分子と結合し活性を調整する足場蛋白質と考えられている。カベオリン-3は、その筋特異的アイソフォームで、欠損によって常染色体優生肢帯型筋ジストロフィー1C(LGMD1C)を発症する。われわれはLGMD1Cモデルマウス(CAV3P104L)を作出し、骨格筋が著明に萎縮し、筋細胞膜の神経型NO合成酵素(nNOS)活性が亢進することを発見した(Sunada, Hum Mol Genet 10, 173-178, 2001)。本研究は、このカベオリン-3欠損によるnNOS活性亢進(脱抑制)が、筋萎縮病態に促進的に作用するのか、抑制的に作用するのか、その是非を問うた。まず、カベオリン-

3欠損、及びnNOS欠損マウスを交配し、野生型、カベオリン-3欠損、カベオリン-3/nNOS二重欠損、nNOS欠損の4種類のマウスを作出した。二重欠損マウスでは、カベオリン-3欠損マウスより、骨格筋量が減少し、筋線維断面積・筋線維数減少が認められた。二重欠損マウス筋細胞膜及び骨格筋粗分画のnNOS活性は消失し、血管型NOS(eNOS)及び、誘導型NOS(iNOS)の代償性発現は認められなかった。すなわち、カベオリン-3欠損によるnNOS活性亢進は、筋萎縮の発症に抑制的に作用する。nNOSとその上位制御分子カベオリン-3による骨格筋萎縮抑制のより詳細な分子機構解明のため、現在、骨格筋遺伝子発現解析に取り組んでいる。神経内科学4種類のマウスを作出することに成功し本研究の目的であるカベオリン3欠損を起点とする骨格筋萎縮シグナルがnNOSを経由することを明らかとした。この結果は、nNOS欠損マウスで不動や除神経後の筋萎縮が抑制されるという以前の報告(Suzuki N, etal. JCI117, 2007)とは正反対で、カベオリン3と共同してnNOSが筋萎縮シグナルを抑制するという新たな可能性が考えられる。不動、除神経によって惹起される筋萎縮について、現在、カベオリン-3欠損マウスとカベオリン-3/nNOS二重欠損マウスについて解析し、併せてnNOS、eNOS、iNOS活性についても検討を加えている。まず、独自作出したカベオリン-3欠損マウス(CAV3P104LTg:CAV3P104L+/+)と米国ジャクソンラボから購入したnNOS欠損マウスnNOS欠損(CAV3P104L-/-/nNOS-/-)の4種類のマウスを作出することに成功した。現在、各遺伝子型のマウスを繁殖させ、体重・握力・血清CK値について経時的に統計学的解析を開始した。また、カベオリン-3欠損、nNOS欠損マウスの一側座骨神経を切除し、1週間後に小動物CT(Latheta)で骨格筋断面積(下腿中央)、2週間後に前脛骨筋とヒラメ筋の筋重量・単一筋線維断面積を測定した。カベオリン-3欠損マウスは野生型コントロールと比較して除神経後の骨格筋断面積、筋重量、単一筋線維断面積は有意に減少していた。すなわち、カベオリン3は脱神経筋萎縮シグナルを抑制し、われわれの以前の報告(Ohsawa Y, et al. JCI 116, 2006)と一貫していた。同様にnNOS欠損マウスもコントロールと比較して座骨神経除神経後の筋萎縮が促進していた。この結果は、nNOS欠損マウスで除神経後筋萎縮が抑制されるという以前の報告(Suzuki N, etカベオリン-3欠損とnNOS欠損マウスの交配によるF2世代4種類のマウスの24週齢での骨格筋群間、及びその脱神経筋萎縮負荷に対する遺伝子発現についてについてAffimetrix社のGeneChip法によって網羅的に解析する。得られた遺伝子発現変化によって、カベオリン-3/nNOSから発信する筋萎縮病態の促進ないし抑制シグナルを推定する。各遺伝子型のマウスについて大規模な繁殖をおこない、可能な限り一期的に骨格筋の生理学的・組織学的解析を進行させて、nNOSが、カベオリン3欠損筋ジストロフィーにおける筋萎縮シグナルに促進的に働くか、抑制的に働くかについて解析する。本年度明らかとなったカベオリン3及びnNOS欠損マウスにおける除神経後筋萎縮促進という新たな治験については、まずカベオリン3及びnNOSの干渉RNA(Origene社)を独自に開発したアテロコラーゲンデリバリーシステム(Kinouchi, et al. Gene Ther 15, 1126-1130, 2008)を用いてコントロールマウスの前脛骨筋へ導入して、同様に筋萎縮が促進されるかについて再現性を検討する。