hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
選択的スプライシングに起因する疾患遺伝子のプロテオーム解析

(1)スプライス・バリアント情報の収集:選択的スプライシングが疾患に関連すると考えられる遺伝子の抽出を行った。ASDBから選択的スプライシングによって複数のタンパク質が発現している遺伝子を、OMIMから癌・アルツハイマーなどの疾患に関連する遺伝子をそれぞれ抽出し、これら両方に含まれる候補遺伝子の絞込みを行った。(2)IVV法のハイスループット・スクリーニングシステムの構築:96個のベイトタンパク質に対するIVVスクリーニングを並列に行える自動化ロボットの最適化を行うとともに、大量に算出されるデータの解析処理速度を向上させた。(3)スプライシング関連遺伝子の大規模タンパク質間相互作用解析:96ウェルプレートでの並列セレクションを実施し、68種類のタンパク質をベイトとしたスクリーニングの結果、約1000相互作用を検出することに成功した。相互作用データの信頼性を評価するために、プルダウンアッセイによる検証を行った結果、約7割の信頼性確度をもつことがわかった。(4)タンパク質C末端蛍光ラベル化法による相互作用データの検証:上記の大規模実験データに対するスプライス・バリアント解析の結果、タンパク質相互作用部位がスプライス・バリアントによって変化している遺伝子が24個抽出された。この中の複数の遺伝子について、in vitroで検証実験を行ったところ、実際にスプライシングパターンの変化が相互作用に影響を及ぼしていることが確認された。(5)相互作用データベース構築と疾患の分子機序の解析:IVV法によって決定された相互作用領域情報に加えて、タンパク質複合体の結晶構造、選択的スプライシングおよびSNPに由来する可変領域、遺伝子が発現する組織に関する情報などを統合した新しいデータベースを開発した。これにより、選択的スプライシングによる翻訳産物の変化が遺伝子ネットワークの変化にどのように関わっているか解析することが可能となった。1.スプライスバリアント情報の収集選択的スプライシングが疾患に関連すると考えられる遺伝子の抽出を行った。ASDB(database of alternatively spliced genes)から選択的スプライシングによって複数のタンパク質が発現している遺伝子を抽出した。一方、OMIM(Online Mendelian Inheritance in Man)から癌、アルツハイマーなどの疾患に関連する遺伝子を抽出した。これら両方に含まれる候補遺伝子1088個の中から、さらに以下のような条件で候補遺伝子の絞込みを行った。タンパク質間相互作用に変化をおこす選択的スプライスバリアントを抽出するため、モチーフ領域がバリアントエクソンに重なる遺伝子を対象とした。また、Entrez Geneでタンパク質の機能がある程度わかっており、タンパク質間相互作用が何らかの形で検証されている遺伝子を対象とした。さらに、完全長cDNAのクローンが商業的・学術的を問わず入手可能であり、IVV法のベイトとして利用できるものを対象とした。今後、このようにして絞り込んだ候補遺伝子をベイトとして、スクリーニングを行う準備が整った。2.IVV法のハイスループット・スクリーニングシステムの構築IVV法での96ベイト並列スクリーニングを実現するために、アフィニティー精製についての自動化検討を行った。アフィニティー精製において遠心分離を行う「遠心分離法」とカラムを用いてビーズとバッファーを分離する「カラム法」の2つの方法について検討した。その結果、カラムを用いた精製では再現性の良い精製結果は得られなかったが、遠心分離法では、これまで用いていた1.7mlチューブで行っていた結果と同様の結果(100倍の濃縮率)を96穴プレートで再現良く確認することが出来た。またウエル間の濃縮率のバラツキなども手動によるバラツキと変わらないことがわかった。この結果を受けて、遠心分離法によるIVV法での96ベイト並列スクリーニングを、QIAGEN Biorobot8000を用いて進める方針を固め、現在までに、洗浄におけるバッファーの量、ピペッティング、遠心分離の回転数など種々の条件を検討し、再現性と最適化に成功している。1.IVV法のハイスループット・スクリーニングシステムの構築

IVV法を用いた並列セレクションによりタンパク質相互作用解析を効率的に行うためのシステムを確立し、これまでマニュアルで6ヶ月かかっていた工程を、96個のタンパク質を並列に準備できるロボットにより、2ヶ月で完了できるようになった。並列セレクションで大量に算出されるデータの解析処理速度も1000seq/dayから16000seq/dayへ向上させた。プレ実験で、6ベイトについての並列セレクションによるタンパク質間相互作用解析の結果、約120相互作用が得られた。また、以前にTAP法を用いて酵母で解析された複合体とホモロジーを持つヒトの複合体もいくつか検出された。IVV法は、1:多の解析が可能なため、他の類似の相互作用解析法と比較して一度に解析できる相互作用数が多いこと、かつ、複合体を解析できることが示された。また、ロボットでのベイトタンパク質作製は、約7割の高い発現効率を示し、IVV法が完全にin vitroで行う方法であるため、細胞毒性などがなく、ベイト蛋白質の発現に有利であることが示された。2.スプライスバリアント情報の収集および解析IVVのプレ実験(6ベイト;5千シーケンス)データの中から、スプライス・バリアントをもった遺伝子の抽出を試みた。IVVデータのクラスタリング、スプライス・バリアントのデータベースの選択、IVVデータとスプライス・バリアントのマッチング、抽出基準の調整などの解析を行い、タンパク質間相互作用部位がスプライス・バリアントによって変化している遺伝子を20前後抽出することができた。この過程で、複数のスプライス・バリアントデータベースの統合、IVVデータとスプライス・バリアントのマッチング工程の半自動化、抽出された候補遺伝子の画像化、などを行い、現在、さらにより大量のデータへの対応を行っている。18年度は、大規模実験データ(3-4万シーケンス)を用いてスプライス・バリアント解析を行っていく。1.IVV法による大規模タンパク質間相互作用解析前年度までに構築したIVV法のハイスループット・スクリーニングシステムを用いて、本年度は、実際に、大規模タンパク質間相互作用解析を行った。96ウェルプレートでの並列セレクションを実施し、68種類のタンパク質をベイトとしたスクリーニングの結果、約1000相互作用を検出することに成功した。この相互作用データの信頼性を評価するために、プルダウンアッセイによる検証実験をロボットを用いて96ウェルプレート単位で大規模に行うことができるシステムの構築を行い、プルダウンアッセイを手動操作と同程度の感度で検出できる条件を決定した。これにより手動操作で1.5ヵ月かかる検証実験を3週間に短縮することが可能となった。
パイ電子間の相互作用を利用したポリエーテル型比色試薬の実用化

新しい発光モード変化を持つ分析試薬としてポリオキシエチレン鎖の両端に様々な蛍光性官能基を導入した化合物を分子設計・合成し、アルカリ土類金属イオンヘの分析試薬としての性能を評価した。(1)ピレン環を発光団として導入し、金属イオンへの選択性を増すため、剛直なベンゼン環を工ーテル鎖の一部に導入したポリエーテル型配位子を分子設計・合成した。この配位子はアルカリ土類金属イオンと錯形成すると、ピレンの蛍光はダイマーからモノマー発光へと変化した。蛍光試薬としての可能性が確かめられた。又、NMRの測定により、詳しい構造変化が解った。(2)ポリオキシエチレン鎖の途中にアニリンのアミド結合を導入するとアミド結合の回転による消光により、Freeでは発光しないが、アルカリ土類金属イオンを取り込むと発光する。いわゆるTICT型の発光モード変化を起こすことが解った。(3)ポリエーテル鎖の両端に2つの異なる芳香環を導入した化合物を合成した。この場合にはFree種ではエネルギー移動蛍光発光がみられたが、アルカリ土類金属イオンとの錯形成によりエキサイプレックス発光へ変化することが解った。平成9年度はポリオキシエチレン鎖に2つのピレンメチルアミンを導入した化合物について検討を行った。まず、ポリオキシエチレン鎖の長さの異なる(n=3,4,5)三種の化合物を合成し、これとアルカリ土類金属イオンとの錯形成ならびに、それに伴う蛍光スペクトルの変化を検討した。この化合物は金属イオンと錯形成していないときには、ビレンのダイマーに相当する発光(490nm)が観測され、2つのピレン環がスタッキングしていると考えられる。これにアルカリ土類金属イオン(Ca^<2+>)を加えるとダイマーの発光は減少し、代わりにモノマーの発光(410nm)が発現した。これは金属イオンとの錯形成により、2つのピレン環が引き離され、π軌道間の相互作用がなくなったためと考えられた。このことを証明するために、蛍光寿命を測定した。蛍光寿命には3成分存在し、1つはダイマーに相当する約40nsの成分、2つ目はダイマーからモノマーへ変換する数nsの成分、さらにモノマーに相当する約120nsの成分であった。モノマーとダイマーの間の比較的遅い変換(4ns程度)を仮定すると、2成分にしかならないことから、基底状態では2つのピレン環が相互作用していないモノマーと、sタッキングしているがモノマー状態の2つのコンホメーションが有り、相互の変換はかなり遅い(数μs以上)ことがわかった。これはNMRの測定からも示唆されている。平成10年度は、錯形成により蛍光強度が増加する試薬として、ポリオキシエチレン鎖にアミド結合を介してナフタリン環を導入した化合物を合成した。まず、市販のポリエーテル鎖の両端にアミノ基を有する化合物を出発原料とし、これに通常の縮合方法を用いて両端に2つの1-ナフトエ酸を導入した。この化合物について、種々の条件での蛍光スペクトルを測定した。まず、金属イオンが存在しない(Free)状態では、ほとんど蛍光を発しないことがわかった。2-ナフトエ酸を導入した化合物では、通常のナフタレンの蛍光を発することから、「1位のアミド基の自由回転が阻害されている」か、「アミド基がナフタレン環と同一平面をとれないため」、と考えた。また、このことは参照化合物である1位にアルキルアミド基を持つナフタレンでも同.様に蛍光を発しないことからも支持される。金属イオンとして種々検討した結果、アルカリ土類金属イオンであるカルシウムイオンを添加すると、その料に伴って400nm付近に蛍光発光が見られるようになった。この蛍光強度は金属イオンが1:1のときに最大となり、1:1錯体を形成していることがわかった。このスペクトルの形はモノマーとは異なっていた。NMR測定からは、2つのナフタレン環が錯形成により近づいて相互作用をしていることがわかった。このことから蛍光スペクトルはエキシマー的な発光であると考えられた。平成11年度は、ポリオキシエチレン錯にベンゼン鎖(アニリン)を介して、アントラセンをアミド結合により2個導入した化合物を新規に分子設計し、それに従って種々の誘導体を合成した。この試薬は試薬のみの場合、アセトニトリルのような極性の高い溶媒中ではほとんど発光しない。

しかしアルカリ土類金属イオンと錯形成すると、アントラセンの発光がみられるようになった。この試薬は、金属イオン濃度と蛍光強度の関係から、1:1錯体を形成することがわかり、種々の金属イオンに対する錯形成定数を求めることができた。この錯形成による蛍光強度の増加の機構を解明するために、アントラセンカルボン酸のアリニドを合成し、その蛍光挙動に対する溶媒の極性、粘度の効果について検討した。溶媒の極性が高いと発光は見られないが、極性が低いと発光が見られることから電子移動消光であることがわかる。又、粘性の高い溶媒では、やはり発光が回復することから結合の回転が関与していることが示された。つまりTITC型の蛍光消光によるものと考えられる。
日本の医療ビッグデータに基づく効用値・QOL推定アルゴリズムの作成と検証

平成30年度は、以下の項目について研究を実施した。1.効用値を得るためのアルゴリズムに必要な変数選択について:平成29年度に、研究者がアクセス可能なコホートデータの中の特定健診に係る項目、自覚症状・併存症・問診項目のそれぞれならびにすべて投入した場合の予測能の比較を行ったものの、いずれの予測性能も悪く、更なる改善が必要と推察された。平成30年度はその反省を踏まえ、特定健診以外で比較的容易に入手できる健診などで収集される項目のうち、効用値を含むQOLの予測に重要と思われる変数について、、臨床疫学者3名、ビッグデータの専門家1名、総合内科専門医2名により討議を行った。結果、レセプトに基づき推定される疾患名、医療資源の消費の程度、社会経済的地位に関する情報などが候補として挙げられ、これらの情報をも加えたモデル構築を目指すこととなった。2.QOL推定値算出のためのモデル開発のためのデータ整備:上記の検討結果を踏まえ、データの入手可能性について再度検討を行ったところ、アクセス可能なコホートデータの一部についてレセプトデータの活用が可能であることが判明した。データマネジメントを行い、個人情報を一切含まない形でQOLに関するデータとレセプトデータを連結した上で、レセプトデータにおけるレセプト電算コード(医薬品・診療行為を含む)ならびに傷病名コードとの紐づけを行い活用可能な状態へと整備を完了した。その他国民標準値調査の社会経済的地位に関する情報や、さらには自己記入式併存疾患の情報をも用いた予測を測るべく、国民標準値調査で使用したデータベースの利用について申請、受理され次年度以降の分析を可能なものとした。昨年度の報告書で目標として掲げた「1.モデルの改善、ならびに別コホートデータ使用」「2.実際のQOLスコアとモデルに基づくQOL推定値との乖離に関する検討」について、それぞれ進捗状況を以下に記載する。1.モデルの改善、ならびに別コホートデータ使用:十分なモデル性能を得られなかった結果に基づき、特定検診以外の項目(レセプト項目など)でモデル改善が見込めうる変数について、専門家と協議を行い候補となる変数を臨床的に選択した。研究代表者がアクセス可能なコホートデータにレセプトデータを利用可能な形に変換することに成功した。2.実際のQOLスコアとモデルに基づくQOL推定値との乖離に関する検討:複数のモデルを構築し比較検討を実施した。また、モデルを他のデータにおいても利活用することが可能か検討する(external validation)ため、国民標準値データの取得を行うことに成功した。直接効用値を測定するためのデータについて候補となる住民集団について一般住民パネルを所有する企業とも協議を行った。実際の調査は本年度に実施の予定である。進捗で問題になっている点として、依然として使用に耐えうるモデルとするためには性能の改善が必要である点である。そのためには投入する変数の範囲を広げ、より精度の高いモデルの構築を目指してゆきたい。1.モデルの更なる改善:説明変数としてレセプトデータに含まれる変数を組み合わせて投入することでモデル改善が見込めるかを検証を引き続き行う。また、レセプトデータの範囲を超えてその他の因子を投入することで改善するかどうかについても検討する。また、推定QOL値の推定精度を落としうる対象者の背景因子について探索的に検討する。2.日本のレセプトデータベース(National Database, NDB)での検討・アルゴリズムの最終化:上記でレセプトのみである程度の精度を担保されたモデルが構築されれば、申請者も開設当初より携わっている日本全国のレセプトデータを用いた調査が可能なオンサイト・リサーチセンター(京大病院内設置)もしくは研究代表者が利用を認められている特別抽出データにてNDBを利用し、モデルの検証を行う。具体的には、レセプトを活用して、特定の病名の患者(例:糖尿病)ごとにQOL推定値を求め、重症度(糖尿病ならインスリン使用の有無等)との基準関連妥当性を検討する。最終的には、QOL推定アルゴリズムを固定し、公表する。3.研究が当初計画どおりに進まない時の対応:全体集団においてアルゴリズム推定精度の向上が望めない場合には、推定の対象となるQOL尺度を変更し、高い推定精度が得られうるものを探索的に検討する。また、対象者の疾患などでのサブグループごとの推定精度を算出し、比較的高い推定精度を得られる疾患を同定することで、少なくとも特定の疾患領域での利用可能性を確保することを計画している。・平成29年度は、derivationへの使用が可能な既存の大規模コホート研究のデータを確認し、実際にマッピングに活用が可能かを検討した。また、複数の項目からQOL推定値を得るためのマッピングの手法に関する文献レビューを行い、最適なマッピング手法を検討した。その上で、選択した手法を用いて、特定健診データ項目から効用値を推定するモデルを試行的に作成した。推定能に問題があり、今後他のQOLの項目の推定するモデルを構築すると同時に、ベイジアンアプローチや変数選択などでモデル性能の改善を目指す。2.マッピングの手法に関する文献レビュー:モデル作成に先立ち、効用値を含むQOL推定値を得るためのマッピング手法に関する文献レビューを行った結果、本年度は、通常のマッピングの方法に従いbasic modelとして最尤法・Tobitモデルを実施し、ベイズ情報量基準、残差推定値プロット等によりモデルを評価することとした。3.コホート研究のデータを利用した、QOL推定値算出のためのモデルの開発と検証:本年は特定健診の項目から効用値・各QOLの指標の推定を行うためのモデルを複数作成した。

具体的には自覚症状、併存症、問診項目のそれぞれならびにすべて投入した場合の予測能の比較を行った。結果、自覚症状のみを入れたモデルが最もBICが小さい値となったものの、プロットでは予測性能が悪く、更なる改善が必要と推察された。当初目標として掲げた「1.アルゴリズムを得るための大規模コホート研究の選定」「2.マッピングの手法に関する文献レビュー」「3.コホート研究のデータを利用した、QOL推定値算出のためのモデルの開発と検証」について、それぞれ進捗状況を以下に記載する。1.コホート研究の選定について:特定検診、ならびにQOLのデータを含むコホートにアクセスが可能となったこと、ならびに3000名を超えるデータが活用可能であることが判明し、マッピングに必要なサンプル数としては十分確保することができたと考える。2.マッピングの手法に関する文献レビューについて:これまでの先行研究に基づき、構築すべきbasic modelを選定することができた。またモデル性能の比較に用いる手法についても複数用意し、国際的な評価に耐えうる検討が可能となったものと思われる。3.実際のモデル構築について:本年度は効用値、精神に関するコンポーネントサマリースコア(Mental Component Summery; MCS)、身体に関するコンポーネントサマリースコア(Physical Component Summery; PCS)、役割に関するコンポーネントサマリースコア(Role Component Summery; RCS)、以上の4つの指標をアウトカムとし、説明変数として特定検診の自覚症状、併存症、ならびに問診項目を用いたモデルを、最尤法ならびにTobitモデルにて構築することに成功した。進捗で問題になっている点として、通常の一般的なモデル構築の方法では予想以上に性能が悪く、使用に耐えうるモデルとするためには大幅な性能の改善が必要であると思われる。また変数選択についても、一括で変数を投入する方法ではなく、どの変数を投入するかについても複数の方法に基づき継続して検討を行う必要があると考えられた。平成30年度は、以下の項目について研究を実施した。1.効用値を得るためのアルゴリズムに必要な変数選択について:平成29年度に、研究者がアクセス可能なコホートデータの中の特定健診に係る項目、自覚症状・併存症・問診項目のそれぞれならびにすべて投入した場合の予測能の比較を行ったものの、いずれの予測性能も悪く、更なる改善が必要と推察された。平成30年度はその反省を踏まえ、特定健診以外で比較的容易に入手できる健診などで収集される項目のうち、効用値を含むQOLの予測に重要と思われる変数について、、臨床疫学者3名、ビッグデータの専門家1名、総合内科専門医2名により討議を行った。結果、レセプトに基づき推定される疾患名、医療資源の消費の程度、社会経済的地位に関する情報などが候補として挙げられ、これらの情報をも加えたモデル構築を目指すこととなった。
ウイロイドの病原性発現機構―ウイロイド特異的スモールＲＮＡとマイクロＲＮＡの解析

本研究ではまず、未だ詳細がわかっていないウイロイドの病原性を制御する分子機構をさらに絞り込むために、ジャガイモやせいもウイロイド(PSTVd)の基準株(PSTVd-I:強毒系統)とダリア株(PSTVd-D:弱毒系統)を親株とした複数のキメラ変異体を作成した。PSTVd-IとPSTVd-Dを比較した結果、その塩基配列相同性は96%であり、右側分子(V及びTR領域)中に3箇所(118,126,201番塩基)、左側分子(TL,P領域)中に5箇所(42,43,64,310,312番塩基)の違いが見られた。そこで、PSTVd-I、-D間で1塩基或は数塩基組換えた24種の変異体の感染性クローンを構築し、トマトへ接種した。分析の結果、PSTVdの右側分子は病原性(病徴の強さ)にさほど影響を与えない結果が得られ、PSTVdの病原性は左側分子によって決定されることが推測された。また、PSTVd-Iの左側分子中の42番、64番塩基のみをPSTVd-D型に変異誘導した2種変異体(I-C42U,I-64U)は、トマトに対する病原性がPSTVd-Iよりも明らかに低下しており、強毒及び致死型PSTVdの病原性を両塩基でコントロールできる可能性が見出された。特にI-C42Uは、42塩基がUになるが、その予測分子構造には変化が見られないことから、トマト細胞中にウイロイドの塩基配列を特異的に認識するメカニズムが存在する一つの根拠であると言える。さらに、PSTVd-Dに致死型PSTVdの2塩基を導入したD-C46-47CAは、感染後に共変異を伴い計5塩基の塩基置換が生じるにも関わらず、トマトに対して弱毒性を維持いたことを考慮する限り、PSTVd-Dの弱毒性は塩基置換箇所だけではなく周辺塩基や周辺分子構造が補助的に作用することによって強固に保持されているのではないかと推測された。翌年度、交付申請を辞退するため、記入しない。
発達障害学生の修学支援に関するコーディネーターの役割

近年、障害者に関する法の整備に伴い、大学で障害のある学生を支援するコーディネーターが急増しているが、個々のコーディネーターの資質の点で課題がある。特に発達障害の場合、個別性が高く、本人の自己認識が乏しい場合もあり、支援を行う上で、建設的な対話や合意形成を行うスキルが重要となる。しかし、日本では、コーディネーターに求められる資質や役割は明確化されていない。そこで、本研究は、発達障害のある大学生に対する修学支援をより推進させるために、コーディネーターが実践すべき指針を示すことを目的としている。日本では障害学生支援の歴史は浅く、先行研究が無いに等しいため、今年度の前半は、先進的取り組みがなされている米国のコーディネーターに関する資料を収集し文献研究を行った。その後、米国の大学を実際に訪問し、障害のある学生への支援プロセスと支援内容に関する情報を収集し、発達障害者を支援する有効な手法として、コーチングの技法を学んだ。また、研究協力者であり、国立大学で障害のある学生を支援している複数のコーディネーターと検討会を3度実施した。そこで、アメリカ心理学会が提示している対人援助におけるコンピテンシー評価フォーム(知識、能力、価値観、態度を評価するフォーム)を日本語に訳し、コーディネーターのコンピテンシーを調査するために必要な項目について審議を行った。年度末より、その評価フォームを用いてコーディネーターへインタビューを実施した。当初予定をしていた質問紙ではなく、本評価フォームを用い、半構造化面接を行うことで、対象者の資質を、より掘り下げることができた。コーディネーターの役割が明確になれば、我が国の標榜するインクルーシブ社会の実現に貢献できる研究となると考えている。専門性の異なる支援実務者が集まる検討会で、コンピテンシーについての議論を交わし、調査を行うことができた。コーディネーターの現状を把握するためには、当初予定していた量的な質問紙ではなく、半構造化のインタビュー形式を用いることで、より根源となる支援の質について調査することが可能となった。また、次年度に考えていた海外での情報収集を今年度終えることができた。・コーディネーターに関する半構造化面接で集まったデータを分析する。・障害のある学生がどのように合理的配慮へ至ったのかについてインタビューを行う。・中間報告を学会で行う。・両視点の分析結果より、修学支援をより推進するためのコーディネーターが実践すべき指針を提示する。購入予定であった統計用のソフトなど、既に前年度に異なる予算にて購入していたため、不要となった。開催地を代表者の和歌山ではなく、工夫することで共同研修者が旅費を抑えることができた。人件費は、4月へとずれ込んだため、次年度の予算になった。
β-アミロイドによるニューロン新生阻害機構の解明とその防御

「β-アミロイドが胎児性蛋白を誘導するだけではなく、神経幹/前駆細胞の増殖や新生ニューロンの生存を阻害するため、ニューロン新生が抑制される」という作業仮説を証明するのが本研究の目的である。そこで、網羅的遺伝子解析から得られた、Ass1-42によって誘導され、神経幹/前駆細胞や幼若ニューロンで発現する遺伝子(7種類)から、新生ニューロンの生存を阻害する遺伝子の同定を試みた。その結果、ただ一種類(Cas/HEF1-associated signal transducer, Chat)が幼若ニューロンの生存を阻害することがわかった。そこで、Chat (Sh2d3c)に的を絞り、Chatがニューロンの生存を阻害する機序を解析し、以下の点が明らかとなった。(1)Chatの過剰発現がニューロンの生存を阻害するためには、ChatのC-末端が必要であった。(2)ChatのC-末端にはCAS family protein結合部位が存在する。しかし、CAS family protein(神経系に発現するp130CasとNEDD9)とChatを共発現させても、ニューロンの生存は阻害されなかった。また、CASと結合しないmutant constructを過剰発現させてもニューロンの生存は阻害された。これらのことから、幼若ニューロンの生存阻害には、ChatのC-末端でCas結合部位以外の部位に何らかの分子(未知)の結合が必要であることが示唆された。そこで、「β-アミロイドが胎児性蛋白を誘導するだけではなく、神経幹/前駆細胞の増殖や新生ニューロンの生存を阻害するため、ニューロン新生が抑制される」という作業仮説を証明するのが本研究の目的である。そこで、アルツハイマー病脳では、immature neuronal markerが発現しているにもかかわらず、なぜ、ニューロン新生がおこらないのか?我々は「β-アミロイドがimmature neuronal markerを誘導するだけではなく、神経幹/前駆細胞の増殖や新生ニューロンの生存を阻害しており、それが、結果としてニューロン新生を抑制している」という作業仮説を提唱し、それを証明しようとしている。具体的には、β-アミロイドによって誘導され、神経幹/前駆細胞の増殖や新生ニューロンの生存を阻害する遺伝子を同定する。検索する候補として、β-アミロイドによって誘導され、神経幹/前駆細胞で発現する遺伝子を選んだ。今年度は、そのうちのChatに着目した。ChatはCAS(Crk-associated substrate)familyのC-末端に結合するが、その機能は不明である。CAS familyは細胞の分裂、移動、分化や死に関与するが、そのうち、NEDD9とp130Casが神経系にも存在する。そこで、まず、野生型およびADモデルマウス(Tg2576)大脳皮質における、Chat、NEDD9p、p130Casの発現局在を調べた。その結果、Tg2576では、ChatやCAS familyが分化途中のニューロンやmicrogliaにも発現するようになることがわかった。そこで、Chat遺伝子を神経細胞へ導入し、細胞の運命を蛍光免疫組織化学によって調べた。その結果、full-length Chatを導入した細胞では細胞死が誘導されたが、p130Cas結合部位を欠損したChatを導入した細胞では細胞死はおこらなかった。また、Chat-p130Casを共発現した細胞でも細胞死は誘導されなかった。このことは、Chatは結合標的との相互作用によって、異なる機能をはたすことが示唆された。「β-アミロイド(Aβ)が胎児性蛋白を誘導するだけではなく、神経幹/前駆細胞の増殖や新生ニューロンの生存を阻害するため、ニューロン新生が抑制される」という作業仮説を証明するのが本研究の目的である。そこで、網羅的遺伝子解析から得られた、Aβによって誘導され、神経幹/前駆細胞や幼弱ニューロンで発現する遺伝子(7種類)から、細胞の増殖や新生ニューロンの生存を阻害する遺伝子の同定を試みてきた。対象となった7遺伝子それぞれをEYFPとともに培養神経幹/前駆細胞や培養ニューロンに遺伝子導入し、細胞の増殖とニューロンの生存への影響を調べた。その結果、ただ一種類(Sh2d3c,Cas/HEF1-associated adoptor protein,Chat)がニューロンの生存を阻害すること、しかし、他のすべては、細胞増殖やニューロンの生存を阻害しないことがわかった。そのため、以降、Chat(Sh2d3c)に的を絞り、実験計画を実施した。ChatのC-末端は、CAS family proteinに結合する。

Chatの過剰発現がニューロンの生存を阻害するためには、ChatのC-末端が必要であったため、ニューロン生存阻害作用はChat-Cas結合を介していると考えた。CAS family proteinのうち、p130CasとNEDD9が神経系でも発現している。p130Casは成熟に多く分布するのに対し、NEDD9は胎児脳に主として分布する。そこで、Chatの結合相手によってニューロン生存阻害作用が変化するかどうかを調べた。しかし、Chat-p130Cas、Chat-NEDD9のどちらを共発現させてもニューロンの生存は阻害されなかった。以上のことから、ニューロンの生存阻害には、ChatのC-末端にCas family protein以外の分子(未知)の結合が必要であることが示唆された。「β-アミロイド(Aß)が胎児性蛋白を誘導するだけではなく、神経幹/前駆細胞の増殖や新生ニューロンの生存を阻害するため、ニューロン新生が抑制される」という作業仮説を証明するのが本研究の目的である。そこで、網羅的遺伝子解析から得られた、Aßによって誘導され、神経幹/前駆細胞や幼弱ニューロンで発現する遺伝子(7種類)から、細胞の増殖や新生ニューロンの生存を阻害する遺伝子の同定を試みた。その結果、ただ一種類(Sh2d3c,Cas/HEF1-associated adoptor protein, Chat)がニューロンの生存を阻害することがわかり、以降、Chat (Sh2d3c)に的を絞り、実験計画を実施した。Chatの過剰発現がニューロンの生存を阻害するためには、ChatのC-末端が必要である。ChatのC-末端はCAS family proteinに結合するが、CAS family proteinとの共発現は、ニューロンの生存を阻害しなかった。また、CASと結合しないmutant constructを過剰発現させてもニューロンの生存は阻害された。これらのことから、ニューロンの生存阻害には、ChatのC-末端でCas結合部位以外の部位に何らかの分子(未知)の結合が必要であることが示唆された。そこで、ChatのC-末端(Chat-C)に結合する蛋白を同定するために、GST-Chat-C fusion proteinを調整し、大脳ニューロン抽出液を使い、pull-down assayし、結合した蛋白をnanoLC-MS/MSで解析した。しかし、結合蛋白を同定できなかった。このことは、Chat-Cのhomopolymer形成がニューロン生存阻害に関与していることを示唆した。研究計画の実施自体はおおむね順調である。しかし、候補遺伝子7種類のうち、目的に合致するものは一種類のみであった。また、同定した遺伝子の作用機序がかなり複雑であるため、目的の達成までにはクリアしなければならない課題がある。
磁気検出法を用いた高速・高感度な定量的免疫検査法の開発

免疫検査法は、抗体の抗原に対する特異的な結合を利用したアッセイ法であり、臨床検査においては最もメジャーな物質検出法の一つである。本研究においては、磁気を発生する微粒子と磁気検出装置の組み合わせによって、簡便かつ高感度なホモジニアスアッセイ法を開発した。また、本手法の臨床検査への応用と実用化に向けて、種々の標的蛋白質や真菌の検出実験を行い、その有効性を実証できた。報告者は、磁気を持つナノ微粒子-抗体複合体をマーカーに使用し、特定の抗原に結合した複合体の磁気を超電導デバイスで測定することにより、生体成分の微量検出を可能にする新しい免疫検査手法の開発に取り組んでいる。またこれまでに、サンドイッチ法を用いたヒト由来蛋白質(IgE,IL-8)の定量的検出法の開発に成功し、1時間以内に数pgのターゲットを再現良く検出することを実証してきた。本研究では、これらの要素技術を応用し、さらに短時間で高感度に効率良く定量検出を行うことのできるシステムの開発を目指している。今年度(平成20年度)は、作業時間の短縮と再現性の向上を目指し、抗体結合ポリスチレンビーズの導入による磁気検出を試みた。サンドイッチ法は、一次抗体を物理的にプレート(固相)に固定化する手法であり、これが迅速性と再現性を妨げる要因の一つである。そのため、一次抗体をポリスチレンビーズにペプチド結合で固定すれば、試験者はそれを混和するだけの作業で済み、また、ビーズはある程度の流動性があるために抗原(ターゲット)との結合時間の短縮も期待できる。このような考えの下、今年度は既に固相法で実績のあるヒトIgE,IL-8をターゲットとし、ポリスチレンビーズによる磁気検出を行い、抗原抗体反応の速度論的解析と反応条件の最適化に関して検討した。その結果、固相法と比べて検出感度を下げることなく、最短20分程度での検出が可能であることが示された。現在、本手法(仮にホモジニアス法とする)を用いた他の生体物質の検出について検討している最中である。平成21年度は、これまで開発してきた磁気ナノマーカー、SQUID磁気検出装置によるホモジニアスアッセイの試みとその最適条件の検討を行った。具体的には、モデル蛋白質(IgE,IL-8,TSH)の血中濃度測定と、カンジダ菌の定量についての条件検討を行ったが、カンジダ菌の定量については、昨年度末期と同等(約300個)の検出感度しか得られなかった。IgE,IL-8については、固相法と同等のアトモルレベル(10^<-18>モル)の検出感度が得られたが、TSH(副甲状腺刺激ホルモン)については、その100分の1程度であった。この原因としては、1)抗体の相性、2)マーカーの分散性、等々の原因が考えられる。現在その理由を物理化学的分子挙動の面から探っているところであるが、現在のところ、マーカーを分散させるために行っている超音波処理により、磁気ビーズ表面の高分子ポリマーが剥がれているということが示唆されており、さらに詳細な実験を行っているところである。これは二次抗体やストレプトアビジンといった、いわゆるレポーターとしての蛋白質がマーカー表面から脱離することにより、抗原との結合が弱くなっていると考えられる。この現象が回避されれば、実用的なシステム開発の条件面をほぼクリアできると考えられるので、本課題の解決が急務であり本年度の大きなテーマとなっている。また、この2年間の間に開発した定量的測定手法については、ほぼ完成されており、30分以内でのモデル蛋白質の再現良い検出がIgEで示された。この成果は、Clin Chem Lab Medに論文として投稿し、採択の返事を得ている(2010年9月号に掲載予定)。抗原に結合した抗体の検出法としては、古くは放射性物質を利用したRIA法から、現在における酵素免疫法、化学発光物質を用いた方法、ラテックス凝集法と、より安全で高感度を目指した手法へと変化を続けており、現在も新しい分析手法の研究開発が世界中で行われている。本研究では、磁気を発生する微粒子(磁気マーカー)と磁気検出装置の組み合わせによる高感度なホモジニアスアッセイの開発に関する研究である。最終年度である22年度は、これまで開発してきた要素技術の組み合わせによる、モデル標的物質のホモジニアス検出実験と、その結果浮かび上がった問題点の解消による、最終的な実験系の確立を行い、本手法が有効であることの証明を行った。具体的には、1)分散性・結合性のよいマーカーの新規開発(日立マクセルと共同)、2)TSH(甲状腺刺激ホルモン)・pTH(副甲状腺ホルモン)の測定限界の向上、3)抗原抗体反応における各種物理定数の測定、である。このうち、1)マーカーについては免疫検査に適した微粒子の作製と安定した磁界を持つ(ロット間差のない)製造法が開発できた。また、2)については現行の測定限界(0.003μIU/ml)と同程度の感度を示すことができた(論文作成中)。
HPLC法を用いた血清D-Lactate検出による腸管虚血の早期診断法の確立

本研究の目的はいまだ検出の難しい腸管の虚血を、早期に検出し虚血に陥った腸管のviabilityが保たれている間に、虚血の解除などの治療に結びつけようとする事である。当初一番はじめに行うよていであった、HPLC法によるD-lactateの検出は未だ不能で、システムの確立がしっかりできていない状況である。そのため今実験が可能である、実験動物の絞扼モデルの作成を急ぐこととした。ラットの回腸末端20cmの絞扼モデルにおいて90分間の絞扼(温虚血)においては絞扼解除後3日以内に全例死亡した。この死亡したラットの詳細な組織学的検討で腸管の不可逆的な壊死(Parkらの腸管壊死Grade V)を認めた。腸管虚血実験をすすめていく上で、臨床上必要なことは、まだ腸管がviableな状態での虚血の検出である。よって不可逆的な状態におちいる前の状態を見つけ出す必要がある。よって絞扼解除後数日の間に不可逆的な状態に陥る90分の虚血より短時間の虚血を行い、その後のラットの生存、腸管の再生を検討した。45分の回腸絞扼虚血では全例ラットは7日間生存し、7日経過後に犠死させ絞扼虚血部分の腸管組織を検討した結果、粘膜の絨毛の丈は低いものの、絨毛はすべて再生し、非虚血部の腸管となんら遜色を認めなかった。よってこの回腸末端20cmの絞扼虚血モデルにおいては、90分で不可逆的な変化をきたし、45分では完全に回復可能、その間の45分から90分が虚血腸管の回復境界域である可能性が高い事がわかった。今後この時間帯領域で、腸管虚血のパラメーター検出をし、D-lactateの検出ができるようになった時点でデーターを集積していく予定である。本研究の目的はいまだ検出の難しい腸管の虚血を、早期に検出し虚血に陥った腸管のviabilityがあるうちに、虚血の解除などの治療に結びつけようとすることである。その手段として腸管虚血の早期から血中に上昇するといわれているD-lactateをHPLC法を用いて高感度に検出する方法がある。このD-lactateはHPLC法ではなく吸光度計を使用した検出法が以前より報告されているが、この吸光度計を用いた検出法とHPLC法の感度の違いを比較するため、まずラットを用いて虚血腸管を作成し、その血液を採取した。その検体を吸光度計を用いた既存のD-lactate検出法をもちいて測定した。しかし、これらの方法では十分なD-lactateの検出ができなかった。その原因を検索したところ吸光度計の吸光度検出範囲以下(感度以下)の範囲でしか血液中のD-lactateが変化していないことがわかった。現在までに吸光度計を用いたD-lactateの検出の論文は数編報告されてはいるが、いずれもその検出にはpH、温度など非常にデリケートな要素が関与し、再現性に問題がある事が明白となった。一方ラットの回腸末端20cmを絞扼するモデルを作成し、90分間絞扼する実験を行い、その結果、この90分絞扼モデルにおいては、絞扼を受けた腸管が絞扼解除後にviabilityを失いラットが死亡することが明らかとなった。さらには死亡したラットの腸管を検討することによって、死亡したラットには腸管粘膜の再生が不能な粘膜基底細胞の壊死を伴う障害が併発されていたことが明らかとなった。絞扼腸管が上記の状態では90分で不可逆性変化をきたすことが、確認されたため、次年度は既存の方法ではなく、HPLC法によるD-lactate測定法を確立し、この90分の絞扼状態より短時間の絞扼状態で、腸管の絞扼が検出可能か否かを検討していく予定である。

よってこの回腸末端20cmの絞扼虚血モデルにおいては、90分で不可逆的な変化をきたし、45分では完全に回復可能、その間の45分から90分が虚血腸管の回復境界域である可能性が高い事がわかった。今後この時間帯領域で、腸管虚血のパラメーター検出をし、D-lactateの検出ができるようになった時点でデーターを集積していく予定である。
珪酸塩（ポスト）ペロブスカイトにおける固溶鉄原子の挙動に関する第一原理的研究

内部無撞着LSDA+U法および格子動力学法を組み合わせ、Fe3+及びAl3+を含有するMgSiO3ブリッジマナイトにおける不純物の安定配置および高温高圧熱力学特性を調べた。様々な不純物配置のエネルギーを計算した結果、Al3+はSiサイトを好み、高スピン状態のFe3+を隣接したMgサイトに引き寄せ、その結果Fe3+-Al3+の置換イオン対を形成することを見いだした。さらに準調和近似を用いて熱力学特性を計算した結果、マントル濃度程度のFe3+AlO3成分の固溶はブリッジマナイトの体積をわずかに増加させるが、熱力学特性に対してはほとんど影響を与えないことを見いだした。引き続き、鉄含有ブリッジマナイトと、これに次いで下部マントル中に多量に存在する(Mg,Fe)Oフェロペリクレースの熱弾性特性を計算した。地震学的観測モデル(PREM)を再現するようにブリッジマナイトとフェロペリクレースの量比を最適化した結果、パイロライトと同程度の割合で混合した場合に最もよくPREMを再現できることを見いだした(Nat Geosci誌に印刷中)。ブリッジマナイトに続き、その高圧相であるポスト・ペロブスカイトについても、同様に内部無撞着LSDA+U法および格子動力学法を組み合わせ、高温高圧熱力学特性を計算した。得られた自由エネルギーをブリッジマナイトの結果と比較することで、鉄含有ブリッジマナイトのポスト・ペロブスカイト相平衡を理論的に決定した。その結果、Fe2+が固溶した場合は狭い2相共存領域が出現し観測されるような地震波不連続を生じることが可能であるのに対し、Fe3+が固溶した場合は2相共存領域が広がり不連続変化を生じにくくなることが分かった。また、2価鉄イオンが金属鉄と3価鉄イオンに分離する圧力誘起電荷不均化反応の可能性についても計算し、Alが存在する場合この反応が自発的に生じる可能性を示唆した。26年度が最終年度であるため、記入しない。内部無撞着LSDA+U法および格子動力学法を組み合わせ、Fe^<3+>及びAl^<3+>を含有するMgSiO_3ペロブスカイト(MgPv)の安定不純物配置および高温高圧熱力学特性を調査した。様々な不純物配置のエネルギーを計算した結果、Al^<3+>はSiサイトを好み、高スピン状態のFe^<3+>を隣接したMgサイトに引きつけ、その結果Fe^<3+>-Al^<3+>の置換イオン対を形成することが分かった。さらに準調和近似を用いて熱力学特性を計算した結果、625mol%のFe^<3+>AlO_3成分の固溶はMgPvの体積をわずかに増加させるが、熱力学特性に対してはほとんど影響を与えないことが分かった。得られた熱力学特性と、これまでの研究で得たフェロペリクレースに関する計算結果(Fukui, Tsuchiya, Baron, J. Geophys. Res., 2012)を組み合わせることで、下部マントル構成物質候補と考えられる鉱物集合体モデル(パイロライト、ペロブスカイタイト、オリビン)の密度・断熱体積弾性率・バルク音速を計算し、地震学的観測結果(PREM)と比較した。その結果、3つのモデルのうちパイロライトが最もよくPREMを再現することが分かった。よりSiに富む組成もよりSiに枯渇した組成も、いずれも再現性を改善することはなかった。さらにこの際特に高圧下で、MgPv中の鉄が二価の状態でMgと単独で置換する場合より、三価の状態でAl^<3+>と置換イオン対を作る場合の方が、よりPREMを再現できることが分かった。これらの結果は、高スピンのFe^<3+>を含むMgPvからなるパイロライト的な組成が下部マントルの合理的な組成モデルであることを示している。MgPvの他、引き続きその高圧相であるMgsiO_3ポスト・ペロブスカイト(MgPPv)についても同様の計算を行った。その結果、MgPvと同様Mg席に置換したFe^<3+>では高スピン状態が安定化するが、Si席に置換したFe^<3+>では低スピン状態が安定化することが分かった。Fe^<3+>と同量のAl^<3+>が共存する場合は、Al^<3+>がSi席に置換するため、結果的にFe^<3+>は下部マントル全域の圧力範囲で高スピン状態にあることが分かった。

ブリッジマナイトに続き、その高圧相であるポスト・ペロブスカイトについても、同様に内部無撞着LSDA+U法および格子動力学法を組み合わせ、高温高圧熱力学特性を計算した。得られた自由エネルギーをブリッジマナイトの結果と比較することで、鉄含有ブリッジマナイトのポスト・ペロブスカイト相平衡を理論的に決定した。その結果、Fe2+が固溶した場合は狭い2相共存領域が出現し観測されるような地震波不連続を生じることが可能であるのに対し、Fe3+が固溶した場合は2相共存領域が広がり不連続変化を生じにくくなることが分かった。また、2価鉄イオンが金属鉄と3価鉄イオンに分離する圧力誘起電荷不均化反応の可能性についても計算し、Alが存在する場合この反応が自発的に生じる可能性を示唆した。26年度が最終年度であるため、記入しない。おおむね交付申請書に記載した研究計画の通りに研究を実施することができた。その結果、MgPv中での鉄の存在形態として、当初は想定していなかったFe^<3+>とAl^<3+>を含む場合が最もPREMをよく再現するという、新たな知見を得た。前年度に珪酸塩ペロブスカイト(MgPv)に対して行ったのと同様の方法を用いて、珪酸塩ポストペロブスカイト(MgPPv)の熱力学特性、さらにそれぞれのFe置換形式に対応するL端X線発光分光スペクトルを計算するとともに、得られた置換自由エネルギーを用いてFe及びAlを含むMgPv、MgPPvにおけるFeの電荷不均化反応について解析を行う。電荷不均化反応とは、二価の鉄イオンが三価の鉄イオンと中性の金属鉄とにわかれる現象で、鉄を含むMgPvにおいて高圧下で生じることが実験的に示唆されている。その後、2年間の研究から得られた成果を総括し、地球下部マントルの鉱物学モデルと鉄の存在形態についてまとめる。
HIV-1増殖抑制に関与するHIV-1特異的CD4陽性ヘルパーT細胞に関する研究

我々は無治療慢性日本人HIV-1感染者を対象にして, HIV-1増殖抑制に寄与するHIV-1特異的CD4T細胞を同定するため,オーバーラップペプチドを用いてCD4T細胞反応を解析した。その結果, Gag3, Gag4, Pol18カクテルに対するCD4T細胞反応が低い血中ウイルス量と相関していたが,続く特異的CD4T細胞の樹立はできなかった.一方で, CD4T細胞反応が非常に強かったGag6カクテル中のGag17-45ペプチドを用いたところ, HIV-1特異的CD4T細胞クローンの樹立に成功した.本研究の成果はHIV-1感染制御ワクチンの開発に重要な知見を与えるものと考えられる.本研究は、HIV-1増殖抑制に寄与するHIV-1特異的CD4T細胞を探索し、さらに詳細な機能解析をおこなうことで、HIV-1増殖抑制に結びつく免疫機序を明らかにすることを目的としている。我々はこれまでに、394人の無治療慢性日本人HIV-1感染者のPBMCよりCD4陽性T細胞を分離し、続いてHIV-1 Gag、PolおよびNef領域をカバーする17 mer HIV-1オーバーラップペプチドを含むペプチドカクテルを処理し、特異的CD4T細胞反応の網羅的解析を行った。その結果、Gag領域:2種、Pol領域:2種、Nef領域:1種のカクテルに対するCD4T細胞反応を示した感染者は、示さなかった感染者に比べて低いウイルス量を示していた。一方で、Gag領域:4種、Pol領域:4種、Nef領域:1種のカクテルに対するCD4T細胞反応の強さが、有意に低いウイルス量と相関していることが認められた。そのうち、前者の解析と一致したものは、Gag3、Gag4、Pol18であり、特にGag4カクテルに反応する検体が多かった。続いて、カクテル中のいずれの17merオーバーラップペプチドが反応しているかを明らかにするため、Gag4カクテルに反応した検体に対して、個々のペプチドカクテルを処理し、ELISPOT法による特異的CD4T細胞反応の網羅的解析を行った。その結果、Gag17-27、Gag17-28およびGag17-30のオーバーラップドペプチドが、標的エピトープを含むペプチドの候補として同定された。本研究のこれまでの成果により、HIV-1特異的CD4T細胞を誘導するための最適な抗原の探索のための重要な結果が得られ、HIV-1特異的CTLおよび抗HIV-1中和抗体産生B細胞のHIV-1感染制御・防御に対する相乗効果が得られるワクチンの開発にとって非常に意義があると考えられる。我々はこれまでに、無治療慢性日本人HIV-1感染者を解析し、低いウイルス量と関連することが示されたGag4ペプチドカクテルに含まれるGag17-27、Gag17-28およびGag17-30のオーバーラップドペプチドが、標的エピトープを含むペプチド候補であることを同定し、続く研究によってHIV-1特異的CD4T細胞を同定するための候補ペプチドが得ることができた。一方でGag4オーバーラップドペプチドカクテルを感染者のCD4陽性T細胞に処理し、カクテルに反応するCD4T細胞を誘導し、抗原提示細胞(同一感染者のPBMCより樹立したEBV-transformedB細胞株)およびカクテルに含まれる個々のオーバーラップペプチドを用い、細胞内サイトカイン(IFN-γ)染色法によって反応を検出することを試みたが、非常にCD4陽性T細胞の反応性が低いことが明らかになった。これは、慢性期患者ではHIV-1特異的CD4T細胞はわずかな数しか存在していないと考えられる。今後の実験では、オーバーラップドペプチドに特異的なCD4T細胞を誘導する必要があるため、現在HIV-1特異的CD4T細胞の樹立の際にMACS法によるCD4陽性T細胞を分離してから数日間培養する方法を検討している。本研究は、HIV-1増殖抑制に寄与するHIV-1特異的CD4陽性T細胞を探索、同定、樹立し、詳細な機能解析をおこなうことで、HIV-1増殖抑制に結びつく免疫機序を明らかにすることを目的としている。我々は394人の無治療慢性日本人HIV-1感染者のPBMCよりCD4陽性T細胞を分離し、17merオーバーラップペプチドを含むペプチドカクテルを処理し特異的CD4陽性T細胞の網羅的解析を行った結果、低いウイルス量とその反応が関連したGag4カクテル中のGag17-27、Gag17-28、Gag17-30のオーバーラップペプチドが標的エピトープを含むペプチド候補として同定された。これらのペプチドに特異的なCD4陽性T細胞の樹立を試みたが、非常に反応性の乏しいものしか得ることができなかった。続いてHIV-1特異的CD4陽性T細胞の樹立を目指し、ペプチドカクテルに対する反応が非常に強い検体を用いて特異的CD4陽性T細胞の樹立を試みた。その結果、Gag6に対するT細胞反応が非常に強かった検体を用いることで特異的CD4陽性T細胞を樹立することに成功し、さらにGag6カクテル中のGag17-45ペプチドに特異的であることを同定した。本研究の成果によりHIV-1特異的CD4陽性

T細胞を誘導するための最適な抗原の探索のための重要な知見が得られ、それはHIV-1感染制御および防御に対するワクチンの開発にとって非常に意義があると考えられる。我々は無治療慢性日本人HIV-1感染者を対象にして, HIV-1増殖抑制に寄与するHIV-1特異的CD4T細胞を同定するため,オーバーラップペプチドを用いてCD4T細胞反応を解析した。その結果, Gag3, Gag4, Pol18カクテルに対するCD4T細胞反応が低い血中ウイルス量と相関していたが,続く特異的CD4T細胞の樹立はできなかった.一方で, CD4T細胞反応が非常に強かったGag6カクテル中のGag17-45ペプチドを用いたところ, HIV-1特異的CD4T細胞クローンの樹立に成功した.本研究の成果はHIV-1感染制御ワクチンの開発に重要な知見を与えるものと考えられる.これまでの研究により、低いウイルス量と関連することが示されたGag4ペプチドカクテルに含まれるGag17-27、Gag17-28およびGag17-30のオーバーラップドペプチドが、標的エピトープを含むペプチド候補として同定された。そこでまず、HIV-1特異的CD4T細胞の樹立の際にMACS法によるCD4陽性T細胞を分離してから数日間、IL-7等のようなT細胞の生存を促すインターロイキンを処理したうえで培養し、CD4T細胞の増殖・活性化を促す。もしくは、セルソーティングにより確実にCD4陽性T細胞を分離し、特異的CD4T細胞の誘導を試みる予定である。続いて、誘導したオーバーラップドペプチド特異的CD4T細胞が特定のHLA class II分子に拘束されているかを調べる。まず、感染者のPBMCよりペプチド特異的CD4T細胞を誘導し、感染者の持つHLA class II分子を発現させた抗原提示細胞(721.221細胞)を用い、HLA class II拘束分子を判定する。続いて、17merオーバーラップペプチド特異的CD4T細胞およびオーバーラップペプチドを基に新たに合成した短いペプチドを結合させた抗原提示細胞を用い、最適な長さのエピトープペプチドの決定を試みる。また、最適長エピトープが決定した上で、それらエピトープ特異的CD4T細胞を誘導し、クローンの樹立を試みる。さらに、それらクローンを用いてサイトカイン産生能の解析、およびHIV-1感染細胞に対するサイトカイン産生の解析を試みる。また一方で、エピトープ特異的CD4T細胞クローンの機能によって、HIV-1特異的CTLが活性化するか、またHIV-1増殖抑制能が亢進しているかどうかを明らかにする予定である。感染免疫学これまでの研究結果により、今後様々な長さのペプチドを購入する必要があるため、次年度に繰り越した。これらのペプチドを購入することにより、次年度の研究の大幅な進展が期待される。オーバーラップペプチドにより推定される様々な長さのペプチドを合成し、HIV-1特異的CD4陽性T細胞が認識することのできる最適長エピトープペプチドを同定する。