hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
新規抗体模倣ペプチド(ミニ抗体)の創製と高感度高選択的臨床分析システムへの応用

得られた形質転換体をIPTGとスクロースの存在で培養して、対応する抗原に強く結合するscFvをペリプラズム抽出物として得ることに成功した。11-DCに対するscFvの親和力と特異性をRIAにより詳細に検討し、モノクローナル抗体の性質を十分に保持していることを確認した。BUFに対するscFvの結合特性については現在検討中である。抗体は多岐にわたる標的抗原に対して高い特異性と親和力を示すため、臨床化学分析における機能性器材として利用価値が高い。しかし、天然の抗体には分子量が大きいこと(約15万)に起因する種々の制約があるうえ、十分な特異性・親和力を示さない場合も少なくない。そこで、抗体工学の技術により天然型抗体の構造と機能を改変して、超高感度・高選択的な臨床化学分析システムの確立に有用な低分子量の抗体模倣ペプチド(ミニ抗体)の創製を企てた。その一環として、副腎皮質ステロイドである11-デオキシコルチゾール(11-DC)及び光学活性なβ遮断薬である(IR)-ブフラロール(BUF)をモデル抗原に取り上げ、抗体H鎖及びL鎖の可変部(V_H、V_L)をリンカーペプチドで連結した一本鎖Fvフラグメント(scFv;分子量約2.5万)の調製を検討した。本年度、抗BUF抗体scFvの結合特性をELISAで調べたところ、由来するMabの約1/2(Ka=6×10^8M^<-1>)の親和力を保有することが判明した。また、IR配置をもつBUF及びその代謝物に群特異性を示す反面、IS配置の化合物との反応性は低く[(IS)-BUFとの交差反応性1.0%]、Mabとほぼ同様のエナンチオ選択性が認められた。現在、これらscFvの相補性決定部のアミノ酸配列を基盤とした、更に低分子量の分子認識モデュールの創製を検討している。
政策評価指標としての消費者余剰の研究

市場経済における価格変化と所得変化に対する消費者余剰とそれによる社会厚生関数の公理化可能性の分析について研究を行った。消費者余剰による社会厚生関数がいくつかの公理(パレート性公理、対称性公理、独立性公理、連続性公理)によって特定化可能であることを証明した。これは、公理の条件をこれ以上に強めるとアロー型不可能性定理が成立することを意味している。よって、消費者余剰による社会的評価が整合的で政策分析に適用可能であると結論できる。本年度では(1)市場経済におけるアロー型一般不可能性定理の分析(2)代替的公共財に対する消費者余剰とそれによる社会厚生関数の可能性定理の分析についての研究を実行した。(1)においては、市場経済における代替的な政策に対する社会的評価(順序付け)の問題をアロー型の社会厚生関数として定式化し、アローの最初の公理系:(パレート性)、(匿名性)、(独立性)から出発して、これらに修正、改良を加えることにより、市場経済の特性に対応した公理系を導出した。そして、最初の結果として、修正された公理をすべて満たすアロー型の社会厚生関数が存在しないことを確認した。(2)においては、(1)で与えられた公理系を固定したままで、社会厚生関数の適応範囲(定義域)を限定する条件を新たに加えることで、可能性定理を導出した。その最大範囲は補償変分(willingness-to-pay)については準線形効用のクラスであり、等価変分(willingness-to-accept)では分離可能効用のクラスであることを証明した。以上の結果なかで、代替的公共財に関する部分は単著論文として、国際学術誌:Social Choice and Welfare(平成22年4月号)に発表した。さらに残りの市場財に関する部分は、ひとつの単著論文としてまとめて、国際学会(Econometric society:東京、東京大学平成21年8月)と日本経済学会(東京、専修大学、平成21年10月)において単独で口頭発表した。当初の計画調書のとうり、今年度は、市場経済における価格変化と所得変化に対する消費者余剰とそれによる社会厚生関数の可能性定理の分析について研究を行った。さらに具体的な消費データと厚生指標との関連性を明らかにする研究をおこなった。その成果は単著論文(論題:Axiomatic characterizations of the aggregate consumer surplus measures as social welfare indices)にまとめた。なおこの論文は国際学会:Asian Meeting of Econometric Society,2011で口頭報告するとともに、当該学会の予稿集AMES2011(電子媒体:USBメモリー)において公表した。これは韓国での学会であったが、欧米の研究者が集まる国際学会:European Meeting of Econometric Societyでも同じ論題で口頭報告をおこなった。具体的には、消費者余剰に基づく政策評価指標をアロー型社会厚生関数として定式化し、それがいくつかの公理(パレート性公理、対称性公理および独立性公理)によって特定化可能であることを証明した。特に、国際間の不平等、南北格差問題における、具体的な消費データと厚生指標との関連性が明らかにされたが、医療、福祉問題への応用は、現段階の分析では不十分であることが判明した。その理由は、医療、福祉問題では、伝統的に等価尺度による厚生指標が用いられ、消費者余剰に基づく評価指標は殆ど採用されていないからである。これに対して、国際間の不平等問題には消費者余剰の公理系がそのまま適用可能であることがわかった。
高架構造物音の発生機構の解明及びその対策に関する研究

本研究では,高架構造物音,すなわち高速道路周辺において構造的要素の振動によって生じる可聴周波数域の騒音に対し,その発生機構を解明し,有効な対策を見いだすことを目標として以下の項目について検討を行った.1.鋼桁の音響放射特性のモデル解析:これまで述べたように,高架構造物音と桁の構造に関係がみられることから,まず鋼I桁のウェブ部分からの音響放射特性を,単純化したモデル解析によって考察し,高架構造物音の性質や特徴との関連において考察する.2.鋼桁の振動特性の境界要素解析:鋼I桁のウェブ部分の振動特性について,境界要素法を用いて桁をモデル化し,詳細な解析を行う.その結果から,高架構造物音と桁の構造との関連性についてさらに検討を加える.まず,1.の結果から,鋼I桁をモデル化した無限長弾性帯板の音響放射特性は,高架構造物音と共通した特徴を有しており,高架構造物音の発生原因が鋼I桁である可能性が非常に高いことが示唆された.また,2.の結果から,鋼I桁のウエブの振動については500Hz付近では面外振動が卓越することが分かった.さらに,ウエブが面内加振に近い状態であっても面外振動モードが卓越して生じることが明らかとなり,鋼I桁のウエブが高架構造物音に特に大きくかかわっていることが示唆された.以上の成果から,鋼I桁が高架構造物音の主因であることはほぼ明らかである.実際の桁の加振状態の解明など,さらに研究を要する部分は多い.しかし,本研究の成果から,対策の基本的な考え方を示すれことが出来る.本年度の研究では、高架構造物音に関する既存の実測データ等をもとにして、構造物及び音響放射の解析モデルを構築し、基礎的検討を行なった。(1)既存の実測データにもとづく考察から、高架構造物音の主な発生源は、プレートガ-ダ橋の桁部であることを推定した。この知見をもとに単純化したモデルによって、鋼桁の音響放射特性を解析したところ、実際の高架構造物音と同様の特性を得た。このことから、高架構造物音の主因は、鋼桁であることがわかった。(2)現在は、より詳細な検討のため、鋼桁の振動特性を、境界要案法を用いて解析するためのモデリングについて検討中である。この解析によって、高架構造物音の発生機構がより明確に把握できることが期待される。本研究では,高架構造物音,すなわち高速道路周辺において構造的要素の振動によって生じる可聴周波数域の騒音に対し,その発生機構を解明し,有効な対策を見いだすことを目標として以下の項目について検討を行った.1.鋼桁の音響放射特性のモデル解析:これまで述べたように,高架構造物音と桁の構造に関係がみられることから,まず鋼I桁のウェブ部分からの音響放射特性を,単純化したモデル解析によって考察し,高架構造物音の性質や特徴との関連において考察する.2.鋼桁の振動特性の境界要素解析:鋼I桁のウェブ部分の振動特性について,境界要素法を用いて桁をモデル化し,詳細な解析を行う.その結果から,高架構造物音と桁の構造との関連性についてさらに検討を加える.まず,1.の結果から,鋼I桁をモデル化した無限長弾性帯板の音響放射特性は,高架構造物音と共通した特徴を有しており,高架構造物音の発生原因が鋼I桁である可能性が非常に高いことが示唆された.また,2.の結果から,鋼I桁のウエブの振動については500Hz付近では面外振動が卓越することが分かった.さらに,ウエブが面内加振に近い状態であっても面外振動モードが卓越して生じることが明らかとなり,鋼I桁のウエブが高架構造物音に特に大きくかかわっていることが示唆された.以上の成果から,鋼I桁が高架構造物音の主因であることはほぼ明らかである.実際の桁の加振状態の解明など,さらに研究を要する部分は多い.しかし,本研究の成果から,対策の基本的な考え方を示すれことが出来る.昨年度の研究で得られたモデル解析の結果を踏まえ,高架構造物音の発生機構を解明する手がかりを得るため,動的基本解を用いた境界要素法によって鋼I桁の調和振動解析を行った.解析した鋼I桁は普通鋼の材料諸元を持ち,フランジ幅,ウエブ高は実橋に近い値とした.スパン長については,上下フランジの接合線を固定端とした実橋に近いスパン長の単一板の固有振動解析から,500Hz付近のウエブの面外振動を問題とする場合,スパン長は重要なファクターでないことが分かった.これを踏まえて,短スパンの鋼I桁に対する固有振動解析から,500Hz付近の振動数では桁全体のねじり振動や上フランジの局部的な振動モードが現れるが,ウエブの面外振動モードが卓越することが分かった.一方,スパン中央の上フランジを鉛直および回転加振した強制振動解析でも,ウエブの面外振動が卓越するという結果が得られた.とくに,鉛直加振では,面内加振に近い状態にもかかわらず,面外振動モードが卓越して生じるのは興味ある結果である.解析結果より,音響放射面積の大きいウエブの面外振動が高架構造物音に大きな関わりを持つという考えを強くした.しかし,鋼桁上を走行する自動車によって,なぜ高い周波数の加振力が発生するのかという問題が残る.これについては,タイヤと路面の相互作用が関係すると考えるのが当然の成りゆきであるが,今後の調査研究の課題としたい.
ローカスおよびゲノムワイド関連解析による統合失調症の分子基盤の解明

(1)ローカスワイド関連解析:グルタミン酸受容体遺伝子群のなかでカイニン酸受容体7型、KA1型、KA2型各遺伝子(GRIK3, GRIK4,GRIK5)につき連鎖不平衡を考慮し選択したSNPを用いて関連解析を行った。GRIK3, GRIK4, GRIK5については関連を認めなかった。グルタミン酸トランスポーター遺伝子EAAT3, EAAT1, EAAT4(SLC1A1, SLC1A3、SLC1A6,)について同様の関連解析を行い、SLC1A6についてハプロタイプで関連を認めた。(2)ゲノムワイド関連解析: 3次サンプルを用いた解析で1,014個のマーカー中352個(34.7%)につき有意差を認めた。これらの領域について、各スクリーニング間で有意差の見られるアレルの再現性の確認等を行い59マーカーを選択した。これらのマーカーを中心に200 kbの領域におけるMAF>0.1,r^2>0.8のTag SNPを合計1,564個選びタイピングを行った。その結果167個のSNPに有意差が認められた。うち98個が遺伝子内に位置していた。複数の検定で有意差がみられる31個のSNPについて、スクリーニングサンプルとは独立の約2,400ペアのサンプルによる確認のための関連解析を実施中である。(3)個体を用いた機能解析:先に関連を報告し作出したGRIA4ノックアウトマウスについてC57BL/6系マウスへの戻し交配を続け6世代まで終了し現在行動解析を実施中である。統合失調症のエンドフェノタイプとして指摘されているPrepulse inhibitionの障害が、本変異マウスでも見られている。1.ローカスワイド関連解析(1)グルタミン酸トランスポーターEAAT3, EAAT1, EAAT4遺伝子(SLC1A1, SLC1A3、SLC1A6)について連鎖不平衡を考慮し選択したSNPを用いた関連解析を行った。その結果SLC1A6についてハプロタイプで関連を認めた。(2)罹患同胞対解析による5q33.1領域の5.7Mbに存在する43個の遺伝子につき同様な解析を行い、日本人集団で、遺伝子型・アレル頻度で1遺伝子、ハプロタイプ頻度において1遺伝子、それぞれ疾患との有意な関連を認めていた。しかし、タイ人集団で再検を試みたところ、有意差は認められなかった。日本人特異的な疾患感受性遺伝子の可能性が考えられた.(3)PCP投与ラットの大脳の5部位から、マイクロアレイを用いて発現に変化を来す遺伝子を見出し(発現亢進71個、発現低下31個)、さらに定量的RT-PCR法により2.5倍以上の変化を来す12個の遺伝子を選択した。これらのうち5遺伝子について関連解析が終了し、1個の遺伝子に有意差が認められた。2.ゲノムワイド関連解析約3万個のマイクロサテライトマーカーを用いたゲノムワイド関連解析を行っている。プーリングサンプルによる13次スクリーニングまで終了した。1次スクリーニングで情報が得られた28,082個マーカー中2,966個につき有意差が認められた。これらのマーカーについて2次サンプルを用いたスクリーニングを行い、2,894個のマーカー中1,0191個で有意差が見られた。次に3次サンプルを用いた解析で1,014個のマーカー中352個(34.7%)につき有意差を認めた。
生体用金属材料における水素の吸収と存在状態による機能の劣化と誘起

本研究では、生体用金属材料が吸収した水素の量や存在状態によって、材料強度、形状記憶効果・超弾性特性などの機械的特性や生体模擬環境下における耐食性などの機能が劣化あるいは誘起することを明らかにした。さらに、水素の吸収量と存在状態を制御することで、生体内における金属材料の機能の劣化を抑えつつ機能が誘起されるバランスについて材料強度学、生体材料学及び電気化学からの観点を相互に関連させて複合的に調べ評価した。得られた知見は、生体用金属材料の安全性・信頼性のさらなる向上のための材料開発の新たな指針となることが期待される。本年度は、生体用金属材料について、水素吸収量だけでなく固溶水素や水素化物などの存在状態の違いに注目して機能劣化と機能誘起の特徴を調べ、以下の知見を得た。水素吸収後の純Tiを大気中で熱処理することで、水素化物分解による試料外への水素放出を抑制し、微細な水素化物が析出した母相を取り囲むように粗大な水素化物が析出した領域と母相と粗大な水素化物が混合した領域に大別される微視的に不均一で巨視的に均一な組織形態とすることに成功した。この組織の場合、引張試験において水素脆化するのに十分な水素量であるにもかかわらず、数十%程度の伸びと強度が上昇することが明らかになった。破面解析から巨視的及び微視的に塑性変形していることも確認された。これらのことから、水素吸収後の組織制御によって機械的性質の向上が誘起されることが示唆された。Ni-Ti超弾性合金にほとんど水素脆化しない程度の微量の水素を添加すると、生理食塩水中において局部腐食が抑制されるという機能が誘起される。本年度では、母相あるいは応力誘起マルテンサイト相の弾性域に対応する応力を負荷した場合においても、その機能は保持されることを明らかにした。また、定電位を印加しながら応力誘起マルテンサイト変態させた場合は、局部腐食発生電位が貴な方向へシフトすることが確認された。これらのことから実際の使用においても水素添加による局部腐食の抑制が期待される。Ni-Ti超弾性合金で明らかにしてきた相変態と水素との相互作用による脆化は、準安定オーステナイト系ステンレス鋼の水素脆化においても支配的であることを水素の存在状態を変化させて破断させた試料の破面観察などから明らかにした。以上、水素吸収による機能の誘起に関して得られた結果は実用的に大きな意義を持ち、機能の劣化の機構に関して得られた知見は学術的にも重要である。本年度は、生体用金属材料について、主に水素吸収量に注目し機能劣化と機能誘起の特徴を調べ、以下の知見を得た。口腔内環境を模擬した酸性フッ化物ナトリウム水溶液中において、純Zrは純Ti及びTi合金と同様に腐食するが、その挙動は純Tiと異なることを定量的に示した。また、純Zrの腐食に伴う水素吸収量は、純Tiのそれと比べて少なく、純Zrの水素脆化感受性を考慮すると機能劣化しにくいことが示唆された。これらの結果から、今後、口腔内で使うことのできる金属材料の一つとして、Zrが重要な役割を果たすことが予想される。所定の水素量をチャージしたNi-Ti超弾性合金を室温時効すると、合金表面の水素濃度が低下することなどにより、超弾性などの機能の劣化は回復する。一方、熱誘起マルテンサイト変態⇔逆変態させた後に室温時効すると劣化の回復は抑制されることが明らかになった。これは、熱誘起マルテンサイト変態と水素との動的相互作用が劣化に寄与していることを示している。また、相変態の回数が増加するにしたがってこの現象が顕著になったことから、相変態と水素との相互作用に伴う転位などの欠陥の蓄積も劣化に影響することが示唆される。この機能劣化を抑制するために合金に水素チャージする前に応力誘起あるいは熱誘起変態によるトレーニング処理を行うことが有効であることを見出した。これは、トレーニング処理で形成される欠陥に水素がトラップされることで、後の相変態との相互作用に関与する水素が減少することによると考えられる。以上、得られた知見は、水素吸収による機能劣化に関して学術的に重要というだけでなく、生体用金属材料の寿命評価や超寿命化への指針の一つとなり得るため、実用的にも大きな意義を持つと言える。本年度は、主に生体用金属材料の水素の存在状態を変化させた場合における機能劣化と誘起について調べ以下の知見を得た。水素吸収後の組織制御による機械的性質の向上の誘起について、水素化物の析出形態を制御した純Tiの変形組織観察から、粗大な水素化物はき裂の優先的な発生伝播サイトになるが、粒界に微細な集合体として析出する水素化物の場合は、母相の変形を拘束する析出強化の役割を果たし、き裂の優先的な発生サイトにならないことが明らかになった。このことは、水素の存在状態により必ずしも水素脆化しないことを示唆している。

微量の過酸化水素をう蝕予防に用いられるリン酸酸性フッ化物水溶液中に添加することで、本溶液中における純Tiの水素吸収を抑制することに成功した。純Tiでは、フッ化物濃度が高い場合、過酸化水素添加により腐食が著しく促進される場合があることも明らかにした。水素チャージしたNi-Ti超弾性合金を熱誘起マルテンサイト変させた後に応力を負荷しマルテンサイトバリアントの再配列を行った場合、低温で昇温放出される水素量が増加することを見出した。この現象は水素と熱誘起あるいは応力誘起マルテンサイト変態との相互作用の影響ではほとんど見られないことから、水素とバリアントの再配列との相互作用は、水素脆化により大きな影響を及ぼすことを示唆している。加えて室温時効により水素濃度分布を変化させると、再配列の途中過程で破断するまでに脆化が促進することも明らかになった。準安定オーステナイト系ステンレス鋼において、電解水素チャージ法を改良することにより材料中の水素の存在状態を変化させ、水素とひずみ誘起マルテンサイト変態との相互作用と粒界破壊が関連することを示した。以上、本研究で得られた知見は、安全性・信頼性のさらなる向上のための材料開発の新たな指針の一つとして役立つことが期待される。工学本年度で得られた結果の一部は、学会などで研究成果としてすでに発表しており、当初計画通り進展しているため。本年度で得られた結果の一部は、当初予想していた以上の現象を含むものであり、論文や学会などで研究成果としてすでに発表しているため。本年度までに得られた知見をさらに発展させ、当初の計画通り同様の体制で研究を推進する予定である。順調に研究が進行し、当初予定していた追加実験等で必要となる物品等を購入する費用を軽減することができたため。次年度の研究費は当初に計画した通り、実験消耗品費(試験用材料、試料加工用関連物品、試薬など)、旅費(研究打合せ旅費、成果発表旅費など)、人件費・謝金(実験補助費、英文校閲費など)、その他(印刷費、論文掲載費など)として使用する予定である。本年度の結果の一部は、当初予想していた以上であり、追加実験等で必要となる費用を軽減することができたので、次年度の研究費へ繰り越した。次年度の研究費は、当初に計画した通り、実験消耗品費(試験用材料、試料加工関連物品、試薬など)、旅費(研究打合せ旅費、成果発表旅費など)、人件費・謝金(実験補助費、英文校閲費など)、その他(印刷費、論文掲載費など)として使用する予定である。
ソーラーとバッテリーを効率良く利用するための水槽型モーター推力試験装置の試作

【研究目的】身近な自然エネルギーである太陽光から電気を生み出すソーラー発電は,省エネとエコロジーを両立する優れた技術として注目されている.それを応用したソーラーボート大会に,本校は毎年チャレンジしているが,結果はあまり芳しくはない.勝敗を分ける要素は主に(1)船体形状,(2)スクリュー形状,(3)モーター出力などがある.しかし,最大の要素は,バッテリーに蓄えられた電力を適切に使い切るような出力調整である.そこで,本研究では(2)(3)に鑑み,モーター推力試験装置を設計・試作する.すなわち,ボートを実際に浮かべなくても,推力試験によってモーター出力制御の最適値(参考値)を求めることができる.【研究方法と成果】1.アルミ製可動式台の設計・製作モーターとスクリューによる推力によって,前後に可動するアルミ製可動式台を設計・製作した.可動部にはスライドレールを使用し,回転数測定用の歯車やスクリューを軸に固定する部品を製作した.2.モーター制御と計測データを表示する制御盤の設計・製作制御回路,電源,回転数計,電圧/電流計器を配置した制御盤を製作した.指示計器は視認性の良いデジタル表示と,変動がわかりやすいアナログ表示を組み合わせた.歯車と近接センサで回転数を測定表示した.3.モーター制御実験装置の総合試験の実施水槽は折りたたみ可能なプールを使用し,特注のスクリューで最大出力試験を行った.参考値ではあるが,現スクリューで昨年の予選タイム以上はバッテリーが持つことが判明した.今後は,ソーラーを用いて実走行に近い条件で試験を行い,複数のスクリューについて最適値を求め,実レースに活用していく予定である.【研究目的】身近な自然エネルギーである太陽光から電気を生み出すソーラー発電は,省エネとエコロジーを両立する優れた技術として注目されている.それを応用したソーラーボート大会に,本校は毎年チャレンジしているが,結果はあまり芳しくはない.勝敗を分ける要素は主に(1)船体形状,(2)スクリュー形状,(3)モーター出力などがある.しかし,最大の要素は,バッテリーに蓄えられた電力を適切に使い切るような出力調整である.そこで,本研究では(2)(3)に鑑み,モーター推力試験装置を設計・試作する.すなわち,ボートを実際に浮かべなくても,推力試験によってモーター出力制御の最適値(参考値)を求めることができる.【研究方法と成果】1.アルミ製可動式台の設計・製作モーターとスクリューによる推力によって,前後に可動するアルミ製可動式台を設計・製作した.可動部にはスライドレールを使用し,回転数測定用の歯車やスクリューを軸に固定する部品を製作した.2.モーター制御と計測データを表示する制御盤の設計・製作制御回路,電源,回転数計,電圧/電流計器を配置した制御盤を製作した.指示計器は視認性の良いデジタル表示と,変動がわかりやすいアナログ表示を組み合わせた.歯車と近接センサで回転数を測定表示した.3.モーター制御実験装置の総合試験の実施水槽は折りたたみ可能なプールを使用し,特注のスクリューで最大出力試験を行った.参考値ではあるが,現スクリューで昨年の予選タイム以上はバッテリーが持つことが判明した.今後は,ソーラーを用いて実走行に近い条件で試験を行い,複数のスクリューについて最適値を求め,実レースに活用していく予定である.
免疫学的パラメーターに基づいたB型劇症肝炎の治療

B型慢性肝炎は、C型と異なりしばしば急性増悪を来す。この増悪のONのswitchの一つとして、ウイルスのCTL epitopeに生じるアミノ酸の変化が想定される。これまでに、ペプチドを用いたワクチンは、すでにいくつかのウイルスについて開発され、すでに臨床に用いられたケースもある。これらのペプチドはin vitroでのCTL assayや、HLAとの結合実験などの結果をもとにデザインされたが、患者の生体内で、あるペプチドを標的にするCTLの攻撃が実際の臨床像を規定しているかの検証はなされていない。そこで申請者は、30例のB型慢性患者において、急性増悪の前後で生じるHBVのpreC/C領域のアミノ酸変異とHLA class Iの相関について検討した。B型慢性肝炎の経過観察中急性増悪を起こした30例(男性26例、女性4例、平均45.9±11.4歳)を対象とした。保存血清よりDNAを抽出後、PCRで増幅して、direct sequenceを行った。またTerasaki-NIH Standard法によりHLA class Iのtypingを行った。急性増悪前後でみられた、あるアミノ酸変化が生じる患者について、HLA class I typeを持つ患者と、そのHLAを持たない患者に分けて各々割合を算出し比較した。その結果、急性増悪前から増悪期にかけてのアミノ酸変化では、A26とaa49、Cw3とaa174に有意差が認められた。また増悪期から鎮静化の時期では、A2とaa27、A2とaa174、A11とaa97、A11とaa130、A26とaa59、A26とaa77、B61とaa27、B61とaa121、Cw1とaa26に有意な相関が認められた。上記の結果のうち、A2とaa27だけがこれまでの報告にあるclass Iモチーフのみで、そのほかのアミノ酸変化とHLAの相関については報告されていない。また、有意差のない変化は、それぞれのHLAを持つ患者で多数の領域にみられ、臨床例では、in vitroの実験と異なり、エピトープはかなり分散している可能性がある。したがって、ペプチドワクチンをデザインする場合、それぞれのHLAの患者ごとに、いくつかのペプチドを混合して用いることを考慮する必要があると考えられた。
微生物代謝産物を用いた毛包構成細胞の生物活性制御の試み

我々の体に存在する様々な種類の毛は、組織構造がよく似ているだけでなく基本的に同じメカニズムで形灰・維持され、再生すると考えられている。毛髪を作り出す毛包は成長期退行期休止期成長期を独自の周期で繰り返す。成長期においては毛包中の毛母細胞が激しく分裂する結果、毛髪の形成・伸長が起こる。この毛母細胞に隣接して存在する毛乳頭細胞は種々の因子を産生し、毛母細胞の増殖や分化に影響を及ぼすと考えられている。従って毛髪が正常に形成されるためには、これら毛乳頭細胞、毛母細胞等の毛包構成細胞の活性制御が重要となる。本研究は長い食履歴から安全性が確認されている食用微生物の中でも、特に真菌類は培養条件に依存して様々な代謝産物を産生・蓄積することに着目し、得られる代謝産物が毛包構成細胞の活性に影響を及ぼし得るかを観察するために動物実験を行い、その結果を組織化学的手法によって解析することを目的とした。本年度は強制除毛したマウス背部に試験試料を継続塗布し、休止期から活性期への移行、及び活性期退行期休止期に至る過程に及ぼす影響を観察した。まず活性期への移行に関しては、活性期への誘導をやや遅延させる微生物代謝産物標品が幾っか認められたとはいえ、動物個体間差の域を越えることはなく、全体としては活性期を強く誘導する効果を有するものは認められなかった。一方、活性期退行期休止期に至る過程に及ぼす影響に関しては、退行期の過程が極めて急速に進行するために、試験試料の塗布開始期と終了期、及びその評価系を精査した。その結果、R. oryzae及びM. purpureusより得られた代謝産物中に休止期への移行を遅延する因子が含まれていることが示唆された。活性期維持を指標とした研究は、活性期誘導におけるそれよりも遥かに少なく、本研究で確立された実験系は今後、規範の一つとなり得ると評価される。(抄録なし)我々の体に存在する様々な種類の毛は、組織構造がよく似ているだけでなく基本的に同じメカニズムで形成・維持され、再生すると考えられている。本研究は長い食履歴から安全性が確認されている食用微生物の中でも、特に真菌類は培養条件に依存して様々な代謝産物を産生・蓄積することに着目し、得られる代謝産物が毛包構成細胞の活性に影響を及ぼし得るかを観察するために細胞培養、器官培養実験及び実験動物を行い、その結果を組織化学的・分子生物学的手法によって解析することを目的とした。本年度の研究計画としては、まず9菌種の食用真菌類を種々の固形培地を用いて培養した後、メタノール、次いでクロロホルムを加えて脂溶性代謝産物を抽出すること、次いでこれをマウス鼻部触毛毛包(vibrissa)より分離・調製した毛乳頭細胞の細胞培養時に添加して、毛乳頭細胞の増殖性に及ぼす影響を観察することの2点が設定され、平成23年12月1日より研究を開始した。微生物代謝産物については概ね調製は完了し、現在は毛乳頭細胞の培養を行っている段階にある。微生物の発育状況や色調は使用する培地によって大きく異なり、同じ菌種でもその培養環境によって多様な代謝産物を産生していることが窺われた。特に注目すべき菌種と培地が特定されれば、培養期間や培養温度等のより詳細な検討が必要となろう。我々の体に存在する様々な種類の毛は、組織構造がよく似ているだけでなく基本的に同じメカニズムで形成・維持され、再生すると考えられている。本年度は剃毛したマウス背部より表皮を強制的に剥奪した皮膚の組織培養を行うことによって試験試料が有する生物活性の評価を試みた。しかしながら、細胞の増殖性を評価する際に生化学的手法のみに頼ると、得られる結果が毛包を構成するどの細胞に由来するのか特定出来ず、組織切片の作成とそれに続く免疫組織学的評価の導入を余儀なくされた。この方法では操作が煩雑な上に同じ処理群から得られる標品においても切片毎での換算値の変動が大きく、評価系の更なる検討が求められた。

我々の体に存在する様々な種類の毛は、組織構造がよく似ているだけでなく基本的に同じメカニズムで形灰・維持され、再生すると考えられている。毛髪を作り出す毛包は成長期退行期休止期成長期を独自の周期で繰り返す。成長期においては毛包中の毛母細胞が激しく分裂する結果、毛髪の形成・伸長が起こる。この毛母細胞に隣接して存在する毛乳頭細胞は種々の因子を産生し、毛母細胞の増殖や分化に影響を及ぼすと考えられている。従って毛髪が正常に形成されるためには、これら毛乳頭細胞、毛母細胞等の毛包構成細胞の活性制御が重要となる。本研究は長い食履歴から安全性が確認されている食用微生物の中でも、特に真菌類は培養条件に依存して様々な代謝産物を産生・蓄積することに着目し、得られる代謝産物が毛包構成細胞の活性に影響を及ぼし得るかを観察するために動物実験を行い、その結果を組織化学的手法によって解析することを目的とした。本年度は強制除毛したマウス背部に試験試料を継続塗布し、休止期から活性期への移行、及び活性期退行期休止期に至る過程に及ぼす影響を観察した。まず活性期への移行に関しては、活性期への誘導をやや遅延させる微生物代謝産物標品が幾っか認められたとはいえ、動物個体間差の域を越えることはなく、全体としては活性期を強く誘導する効果を有するものは認められなかった。一方、活性期退行期休止期に至る過程に及ぼす影響に関しては、退行期の過程が極めて急速に進行するために、試験試料の塗布開始期と終了期、及びその評価系を精査した。その結果、R. oryzae及びM. purpureusより得られた代謝産物中に休止期への移行を遅延する因子が含まれていることが示唆された。活性期維持を指標とした研究は、活性期誘導におけるそれよりも遥かに少なく、本研究で確立された実験系は今後、規範の一つとなり得ると評価される。来日後の研究期間が4ヶ月であったことや本研究で対象としている真菌類は発育の遅い菌種が多いことを考慮すると、供試試料の調製を経て毛乳頭細胞の培養実験に取組んでいる点でその達成度は(2)と評価して良いものと考える。本課題は応用微生物学と皮膚科学を融合する研究であり、研究分担者にとって後者は初めて取組む分野であるが、頻繁に議論を重ねる中から後述するような新たな実験系の構築にも強い意欲を示しており、今後の発展が期待される。スクリーニング系の確立に予想以上の困難を伴ったため、「順調に進展している」とは評価し難い。しかし、現在適用している塗布試験は多検体の中からスクリーニングする上では使用動物数が多くなる点からは不利な評価系とはいえ、信頼性の上では最も確実であり、しかも試験試料の塗布開始時期等について詳細な検討を終えているので、これらの状況を総合し、現時点での本研究の達成度を「やや遅れている」とした。毛包においては毛乳頭細胞と毛母細胞が特有の配置を保持しながら細胞間で情報交換を行っていることから、各細胞単独のみならず器官培養法や組織培養法の導入が望まれる。当研究室ではマウス鼻部触毛毛包(vibrissa)全体の器官培養を行っているが、周期の近い毛包を損傷なく、多数採取するには想像以上の労力と時間を要し、本課題にある程の多検体を対象としてスクリーニングを行う場合には、より簡便、かつ信頼性の高い方法を適用する必要がある。そこで現在、マウス背部を剃毛後、ワックスを用いて表皮を剥がした後(depilation)、組織培養する方法を模索している。
多機能因子Id2による分化と形質発現の制御機構に関する研究

(1)Id2欠損マウスにみられる小腸腫瘍は回腸中部に1個数個認められ、病理組織学的には様々なグレードのものが見られる。腫瘍部においてはβ-cateninの過剰発現も核移行も認められない。Smad4やCdx2などの発現をId2欠損マウスの腫瘍部で免疫組織学的に検討すると、Smad4は正常組織と変わらないが、Cdx2はId2欠損マウスの腫瘍部で発現が欠落している。Id2欠損マウスの腸管腫瘍は新生仔期にすでに認められるという特徴を持っており、この点を手がかりに現在も解析中である。(2)Id2タンパク質の細胞内局在について検討し、Id2のHLH領域とC末端領域に、それぞれ核移行シグナルとCRM1依存性の核排出シグナルが存在することが判明した。Id2タンパク質は核と細胞質を常に行き来しており、定常状態では細胞質に主に存在することが明らかになった。(3)Id2欠損マウスと転写因子であるC/EBPβの欠損マウスは共に妊娠乳腺上皮細胞の増殖障害を示す。Id2のプロモーター解析などにより、Id2がC/EBPβの直接の標的遺伝子であることを明らかにした。C/EBPβ欠損マウスの妊娠乳腺においては対照マウスにみられるId2の発現誘導が認められないことも確認した。(4)Id2欠損マウスでは脾臓CD8陽性T細胞においてCDKインヒビターのタンパク質レベルでの発現亢進があり増殖障害をきたすことを明らかにした。(5)Id2欠損マウスにみられる多動は線条体におけるドーパミンの放出亢進による。黒質緻密部のドーパミン作動性神経細胞においてはId2の発現はみられず、また、黒質網様部のGABA作動性神経細胞の数や分布に異常はみられず、現在も解析を継続している。(6)Id2欠損マウスがヘテロでもホモでも、ヒトの場合に類似した腎盂尿管移行部狭窄による先天性水腎症を発症することを見いだした。MyoDを始めとしたbasic helix-loop-helix(bHLH)型転写因子が様々な系列の細胞分化や機能発現に重要な役割を担っているが、こうしたbHLH型転写因子の機能を蛋白質レベルで抑制的に制御するのが分化抑制因子Id(inhibitor of DNA binding/differentiation)である。哺乳動物でこれまでに同定されている4種類(Id1Id4)のうちId2は、ナチュラル・キラー(NK)細胞を始めとした免疫担当細胞の分化制御と機能制御、妊娠に伴う乳腺上皮細胞の増殖と分化などに関わっていることが判明している。本研究はId2の機能解析をとおして生体における細胞の分化の調節と形質発現の制御機構を分子レベルで解明していくことを目的としている。本年度に得られた成果は以下のとおりである。1)Id2欠損マウスでは腸管のリンパ球、特に胸腺由来の腸上皮間リンパ球が著明に減少しており、腸粘膜バリアーの損傷により容易に致死的な感染症を来すことが明らかになった。この原因の少なくとも一部は、リンパ球における接着分子の発現低下による。2)B細胞の免疫グロブリンのクラススイッチに重要な役割を果たすAIDの遺伝子発現にはPax5が関与しており、Id2はこのPax5の機能発現を抑制的に制御していることが判明した。

3)Id2欠損マウスにみられる乳汁分泌不全は乳腺上皮細胞でのサイクリンD1の異所性過剰発現によっても回復せず、Id2はサイクリンD1の機能的な下流因子ではないと考えられた。一方、サイクリンD1の異所性過剰発現によって生ずる乳腺上皮細胞の過形成はId2遺伝子の欠損により消失し、Id2はサイクリンD1のエフェクター分子である可能性が示唆された。4)Id2欠損マウスはヒトのものに類似した先天性水腎症を発症することが明らかになった。(1)Id2欠損マウスにみられる小腸腫瘍は回腸中部に1個数個認められ、病理組織学的には様々なグレードのものが見られる。腫瘍部においてはβ-cateninの過剰発現も核移行も認められない。Smad4やCdx2などの発現をId2欠損マウスの腫瘍部で免疫組織学的に検討すると、Smad4は正常組織と変わらないが、Cdx2はId2欠損マウスの腫瘍部で発現が欠落している。Id2欠損マウスの腸管腫瘍は新生仔期にすでに認められるという特徴を持っており、この点を手がかりに現在も解析中である。(2)Id2タンパク質の細胞内局在について検討し、Id2のHLH領域とC末端領域に、それぞれ核移行シグナルとCRM1依存性の核排出シグナルが存在することが判明した。Id2タンパク質は核と細胞質を常に行き来しており、定常状態では細胞質に主に存在することが明らかになった。(3)Id2欠損マウスと転写因子であるC/EBPβの欠損マウスは共に妊娠乳腺上皮細胞の増殖障害を示す。Id2のプロモーター解析などにより、Id2がC/EBPβの直接の標的遺伝子であることを明らかにした。C/EBPβ欠損マウスの妊娠乳腺においては対照マウスにみられるId2の発現誘導が認められないことも確認した。(4)Id2欠損マウスでは脾臓CD8陽性T細胞においてCDKインヒビターのタンパク質レベルでの発現亢進があり増殖障害をきたすことを明らかにした。(5)Id2欠損マウスにみられる多動は線条体におけるドーパミンの放出亢進による。黒質緻密部のドーパミン作動性神経細胞においてはId2の発現はみられず、また、黒質網様部のGABA作動性神経細胞の数や分布に異常はみられず、現在も解析を継続している。(6)Id2欠損マウスがヘテロでもホモでも、ヒトの場合に類似した腎盂尿管移行部狭窄による先天性水腎症を発症することを見いだした。
急性膵炎における膵微小血管病変の病態解明と血行改善を目的とした新しい治療法の開発

本研究ではWister系雄性ラットを(a)正常コントロール群、(b)軽症膵炎群;セルレイン膵炎モデル、(c)重症膵炎群;5%タウロコール酸膵炎モデル、(d)軽症膵炎+nafamostat mesilate(FUT)静注群、(e)軽症膵炎+heparin静注群、(f)重症膵1炎+FUT静注群、(g)重症膵炎+FUT動注群、(h)重症膵炎+heparin静注群に分類し、走査型電子顕微鏡を用いて膵微小血管の変化を観察した。また、上記モデルにおける膵組織および膵微小血管の組織学的検討を行った。1)軽症膵炎群では膵微小血管の障害(微小破綻、血管の狭小・途絶)が末梢の毛細血管領域に留まっていたが、重症膵炎群では血管障害が中枢側の血管へと波及しており、小葉構造が破壊されていた。2)軽症膵炎群ではFUTの静脈内投与により膵組織学的変化・微小血管障害の改善を認めたが、重症膵炎群では明らかな改善傾向を認めなかった。3)heparinの静脈内投与では軽症・重症膵炎群ともに膵組織学的変化・微小血管障害の改善傾向を認めた。4)重症膵炎群ではFUTの動脈内投与によって膵組織学的変化・膵微小血管障害の改善傾向を認めた。この効果はheparinの静脈内投与よりも明らかであった。以上、本研究では走査型電子顕微鏡を用いてラット急性膵炎モデルにおける膵微小血管障害を明らかにし、さらにこの血管障害に重症度による差を認めた。これまでに膵微小血管病変に着目して、膵炎の重症度による変化を観察した報告はなく、膵微小血管障害が末梢の毛細血管から中枢側に拡がることが明らかになった。また、本研究では、FUTおよびheparin投与によって膵微小血管障害が改善することを示したが、これは新しい知見であり、膵微小血管障害の発生に血液凝固が関与している可能性が示唆された。さらに、FUTは投与経路の違いによって効果に差があり、FUTの効果発現には膵組織内濃度が重要であると考えられた。本研究の結果は急性膵炎における膵壊死発生機序の解明に繋がるものであり、抗凝固薬を用いた新しい治療法の開発が期待される。(背景と目的)急性膵炎では発症早期に膵虚血を生じることがあるが、重症例ではその後、不可逆的な膵壊死に陥ることが多い。急性膵炎ではこのように膵血管病変が病態に関与している可能性があるが、膵血管病変を中心とした膵炎の重症化機序は明らかではない。平成18年度は各種ラット急性膵炎モデルを作成し、膵血管病変を走査型電子顕微鏡で観察した。また、蛋白分解酵素阻害剤を静脈内投与し、膵血管病変の変化を観察した。(方法)Wister系雄性ラットを以下の5群に無作為に分類した。(a)正常コントロール群、(b)軽症膵炎群;セルレイン膵炎モデル、(c)重症膵炎群;5%タウロコール酸膵炎モデル、(d)軽症膵炎+nafamostat mesilate(FUT)静注群、(e)重症膵炎+FUT静注群。以上のラットについて膵炎作成後6時間目に膵血管鋳型を作成し、走査型電子顕微鏡を用いて膵微小血管の変化を観察した。また別のラットを用いて膵組織および膵微小血管の組織学的検討を行った。(結果)1、軽症膵炎群では組織学的に膵間質の浮腫と腺房細胞の空胞化が著明であった。また、炎症性細胞浸潤も認めた。重症膵炎群では膵腺房細胞壊死が著明であり、出血も認めた。2、ラット急性膵炎モデルでは膵炎の重症度に応じた膵微小血管の変化(微小破綻、血管の狭小・途絶)を認め、小葉構造が障害されていた。この変化は軽症膵炎では毛細血管に留まっていたが、重症膵炎では中枢側の血管へと波及していた。3、軽症膵炎ではFUTの静脈内持続投与により膵組織学的変化・微小血管障害の改善傾向を認めたが、重症膵炎では明らかな改善を認めなかった。(結語)ラット急性膵炎モデルでは重症度に応じた膵微小血管の障害を認めた。この膵微小血管障害は軽症膵炎群ではFUT投与によって改善傾向を示した。

3)heparinの静脈内投与では軽症・重症膵炎群ともに膵組織学的変化・微小血管障害の改善傾向を認めた。4)重症膵炎群ではFUTの動脈内投与によって膵組織学的変化・膵微小血管障害の改善傾向を認めた。この効果はheparinの静脈内投与よりも明らかであった。以上、本研究では走査型電子顕微鏡を用いてラット急性膵炎モデルにおける膵微小血管障害を明らかにし、さらにこの血管障害に重症度による差を認めた。これまでに膵微小血管病変に着目して、膵炎の重症度による変化を観察した報告はなく、膵微小血管障害が末梢の毛細血管から中枢側に拡がることが明らかになった。また、本研究では、FUTおよびheparin投与によって膵微小血管障害が改善することを示したが、これは新しい知見であり、膵微小血管障害の発生に血液凝固が関与している可能性が示唆された。さらに、FUTは投与経路の違いによって効果に差があり、FUTの効果発現には膵組織内濃度が重要であると考えられた。本研究の結果は急性膵炎における膵壊死発生機序の解明に繋がるものであり、抗凝固薬を用いた新しい治療法の開発が期待される。
アラキドン酸代謝物による分子シャペロン機能調節メカニズムを探る

前年度までに、プロスタグランジン(PG)E2生合成経路の最終段階を触媒する酵素である細胞質型PGE合成酵素(cPGES)を同定し、シクロオキシゲナーゼ(COX)-1と機能連関して即時的PGE2産生に関与することを明らかにしてきた。一方、cPGESはコシャペロンタンパク質であるp23と同一分子である側面も有しており、本年度の研究では、cPGESの生体内機能を解明するためにcPGES-/-マウスの樹立を行った。cPGESの酵素活性に必須の9番目のチロシンをコードするエキソン2をネオマイシン耐性遺伝子で置換できるターゲティングベクターを構築し、本ベクターをマウス胚性幹細胞に導入して得られた相同組換えクローンを用いて、常法に従いノックアウトマウスを作製した。その結果、cPGES+/-マウスは正常に発育し生殖能力にも異常は見られなかった。しかし、cPGES+/-同士を交配した結果、cPGES+/+とcPGES+/-はほぼ1:2の比率でメンデル律に従って生まれたが、cPGES-/-はcPGES+/+に対して0.15と顕著に少なく、得られたcPGES-/-新生児も生後まもなく死亡した。従って、cPGES-/-マウスは胎生致死あるいは生直後に死に至ることが明らかになった。この表現型はこれまで知られている他のアラキドン酸代謝酵素のノックアウトマウスより重篤であり、cPGESがマウスの正常な発生や生存に必須であることがわかった。cPGES/p23の活性調節メカニズムの解明を目指し以下の解析を行った。cPGES/p23は一次構造上多数のリン酸化されうる部位が存在する。ラット線維芽細胞ライゼートをホスファターゼで処理すると、無処理群と比べてPGES活性が顕著に抑制されることを見いだした。細胞を32P正リン酸でラベルした結果、cPGES/p23のリン酸化体が検出され、カルシウムイオノフォア刺激に伴ってリン酸化が促進した。ホスホアミノ酸分析により刺激の有無に関わらずリン酸化セリンのみが検出された。次に各種タンパク質キナーゼの阻害剤によるアラキドン酸添加あるいはカルシウムイオノフォア刺激した際のPGE2産生量への影響を検討した結果、カゼインキナーゼII (CKII)阻害剤DRBにより抑制が観察された。リコンビナントcPGES/p23をCKIIはin vitroでリン酸化し、cPGES/p23はリン酸化に伴い酵素活性が上昇した。そこでCKIIのdominant negative体を強制発現した細胞株を樹立した結果、酵素活性およびPGE2産生の有意な抑制が見られた。次に、CKIIによる想定リン酸化部位の変異体(S113A,S118A,S151G)を強制発現した細胞株を作製し、刺激依存的なPGE2産生の変化を検討した結果、S113AとS118A変異体発現株は外因性アラキドン酸添加によるPGE2産生ならびにカルシウムイオノフォア刺激PGE2産生が親株細胞レベルまで減弱した。一方S151G発現細胞は天然型PGES発現細胞と同レベルのPGE2産生を示した。従って、cPGES/p23の活性上昇に必要なリン酸化部位は113番目と118番目のセリン残基であることが示唆された。さらにcPGES/p23のリン酸化がhsp90との結合を促進することを見いだした。以上の結果から、cPGES/p23のSer113とSer118に対するCKIIのリン酸化がhsp90/cPGES複合体形成の促進、cPGES/p23の酵素活性の上昇を誘発し、PGE2産生が亢進することが想定された。
植物の多細胞システム構築の基盤となる細胞分裂の制御機構

まずタバコ培養細胞をアフィディコリンとプロピザマイドによりG2/M期に同調化して、経時的にサイクリンD抗体により免疫沈降した画分を用いてタバコRbタンパク質を基質にキナーゼ活性を検出した。その結果、Rdタンパク質に対するキナーゼ活性がG1期中期以降に上昇することがわかった。一方、サイクリンA抗体により免疫沈降した画分ではヒストンH1に対するキナーゼ活性は検出されたが、タバコRbタンパク質に対するキナーゼ活性は検出されなかった。この結果は植物由来のRbタンパク質をリン酸化するRbキナーゼの実体を初めて証明したことになり、今後植物のG1/S期の制御機構を理解する上で貴重な知見である。次に、タバコサイクリンDにGFP(green florescent protein)を融合させて、細胞内局在性を観察した。その結果、野生型のサイクリンDと融合したGFPは主に核に局在するが、リン酸化部位の変異体では核に局在しないことが分かった。この結果によりタバコサイクリンDの核局在性にサイクリンDのリン酸化が関与していることが分かった。また、この変異体をバキュロウイルス発現系により解析した結果、Cdc2aと結合するにもかかわらず、ヒストンH1キナーゼ活性がかなり低下したことより、サイクリンDのリン酸化はキナーゼ活性にも関与していることが分かった。なお、GFP融合サイクリンDがin vivoで機能していることを証明するため、GFP抗体を用いた免疫沈降により、4種のサイクリンDがCdc2aと複合体を形成してヒストンH1キナーゼ活性を示すことを証明した。また、レーザースキャニングサイトメトリーによりDNAの相対量を解析したところ、これらの形質転換体の中で、G1期の細胞の割合が減少してS期の細胞が増加するものが認められ、サイクリンDの高発現によりG1期が短縮する可能性が示唆された。
日本産マルハナバチ類の周年飼育法の確立とその花粉媒介への利用に関する研究

(1)オオマルハナバチ(Bombus hypocrita)、エゾオオマルハナバチ(B. hypocrita sapporoensis)及びクロマルハナバチ(B. ignitus)を実験室内の閉鎖的な条件下で累代飼育することに成功した。この3種は、飼育も比較的容易で日本の温室内において使用する上では働き蜂の生産数も十分と思われ、実用化可能な種と考えられた。(2)Roseler (1985)によって、交尾したセイヨウオオマルハナバチ(B. terrestris)の女王蜂に受精卵を産ませる方法として開発されたCO_2処理を日本産のマルハナバチにも試験した。その結果、論文に記述されているままの方法では、未受精卵を産む個体の割合が多かったが、オオマルハナバチに関しては交尾してからその処理までの日数を2から4日間とることで、受精卵を産ませることができることが明らかとなった。(3)種間交雑実験の結果、セイヨウオオマルハナバチの雄蜂は交尾に関して非常に活発であり、日本産の新女王蜂に高頻度で交尾した。組み合わせによっては雑種ができる可能性もあり、遺伝子汚染が生じる危険性も示唆された。別の実験で巣の乗っ取りが起こる可能性も示され、生態系への重大な影響を考えると在来種の実用化は急務といえる。(4)実験室内で育てられた日本産マルハナバチのコロニーをトマトハウスに導入して、その花粉媒介能を調べた。その結果、訪花率、着花率ともに商品化されているセイヨウオオマルハナバチに匹敵する優れたものであった。新規に導入したマルハナバチ専用増殖装置をフル稼働し、研究は順調に進展した。コロニー創設の出発点となる日本産マルハナバチの女王蜂の確保も、長野県、山梨県、北海道に好適な採集地を見つけ、十分量できた。さらに、採集過程で行った調査において、オオマルハナバチ、クロマルハナバチ、コマルハナバチの3種はブルーベリ-において振動採粉をし、その送粉者として極めて重要な役割を果たしていることが明らかとなった。飼育法に関しては、実験室内に持ち帰った女王蜂に餌だけでなく羽化直後の欧州産の働き蜂をヘルパーとして加えたが、蛹の入った繭を与えるとさらに良い結果となることも判明した。当該年度は、7種のマルハナバチを約300群飼育したが、コマルハナバチ、オオマルハナバチ、クロマルハナバチ、トラマルハナバチに関してはトマト温室に導入して花粉媒介能の検定も実施した。対照区とした、欧州産の導入種セイヨウオオマルハナバチ(商品化されている種)と訪花率、着果率を比較した結果、勝るとも劣らない好成績が得られた。増殖用のコロニーからは、多数の新女王蜂と雄蜂が得られ、実験室内で交尾させることにも成功した。交尾させた新女王蜂に二酸化炭素処理をして休眠回避を試み、現在、非休眠で第3世代目までのコロニーを作り出している。休暇回避の成功により、室内で周年的継代飼育法の確立に大きな一歩が踏み出せた。以上の結果を踏まえると日本在来種のマルハナバチを果菜類のポリネーターとして実用化することは、十分可能であることが示唆された。今後、さらに詳細な検討を続ける予定である。日本産マルハナバチ類の中で作物の受粉用に実用化できる候補種として、オオマルハナバチ(Bombus hypocrita)とクロマルハナバチ(B.ignitus)の2種が絞り込まれた。この2種は、欧州で商品化された導入種セイヨウオオマルハナバチと分類学的に近縁である。初年度の研究補助金で導入したマルハナバチ専用増殖装置内で、春に野外で採集した越冬後のオオマルハナバチ(採集地:長野県、山梨県、岐阜県、北海道)とクロマルハナバチ(採集地:長野県)を人工飼育した。