hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
進化分子工学に基づく生体高分子の設計

1.多値配列空間上の理想適応度地形の理論を作り、多くの実験データがこの理論と矛盾しない事を示し、その最適適応歩行法を示した。一蛋白が多段反応に関与する場合も、段数に相当する歩幅で歩行すれば、富士山型と見なしうる。2.遺伝子型・表現型対応付けにおけるウイルス的戦略が、翻訳系の起源を駆動しうること、また、in vitroウイルスの設計指針と有効性を示した。3.カタラーゼの野性型近傍では、熱安定性の地形は単峰性で高度は高いが、触媒活性の地形はそうではない事、ペルオキシダーゼ活性の地形と重畳していることを示した。C末端にランダム配列を付加し、配列空間の次元を上げると、さらに高く登れる。4.常温菌と好熱菌のキメラであるイソプロピルリンゴ酸脱水素酵素を出発材料として、高度好熱菌内で培養し、耐熱化蛋白へ進化させた。耐熱化部位を解析し、好熱菌蛋白をさらに耐熱化した。立体構造データから耐熱化機構を解明し、進化的アプローチの優秀性を実証した。5.モジュールを分類し、機能の異なる蛋白間に共有されるものを特定する見通しを立てた。この例として、DNAリン酸基結合モジュールを見いだした。また、分子動力学計算でバルナーゼのモジュールが水中で力学的に安定性であることを示し、モジュールの部品としての安定性を示した。6.ヘモグロビンサブユニット界面付近に存在し、4量体形成に寄与していると考えられるモジュールM4をα鎖、β鎖、ミオグロビン間で置換したキメラ分子を作り、モジュールが構造及び機能の単位であることを示した。7.モジュールをかき混ぜる「マルチリコンビナントPCR」法を開発した。8.大腸菌変異体の競争連続培養実験において、相互作用による競争的共存を見出した。9.細胞分化モデルのシミュレーションを通して、内部状態をもち、相互作用しつつ増殖する集団が、自発的分化、集団レベルの安定性、再帰的な増殖の形成をすることを示した。進化分子工学の手法を、遺伝子型と表現型の対応付け戦略と、カンダム置換の階層により、分類した。すなわち、前者でウイルス型、細胞型、RNA型に分けた。「ウイルス型」では、ファージ進化リアクターの改良と、in vitroウイルスと呼ぶべき人工増殖系の開発を行った。これらを用いて凸凹を伴う富士山型地形の測定するための実験理論を作った(伏見)。コンピュータシミュレーションにより、地形が環境や他の固体数で動的に変化する際の多様性の進化、地形のカオス的変動による自発的分化現象を見いだした(金子)。「細胞型」では、イソプロピル酸デヒドロゲナーゼをその酵素遺伝子を好熱菌の中で発現させるという方法で耐熱化した。双子型酵素イソクエン酸デヒドロゲナーゼからの基質特異性の進化の道筋を研究した(大島)。好熱菌タカラーゼにランダム点突然変異やランダム伸長変異を導入し、立体構造と、酵素機能を評価軸とする地形を測定した(ト部)。「RNA型」では、枯草菌にポリtRNA構造が見られるが、これが、翻訳装置の多くの遺伝子と配列が相関していることがわかった(大西)。「モジュールの組み合わせ型」では、モジュールの結合様式をパターン化し、機能発現のために必須な安定構造の設計指針を得るために、立体構造既知の蛋白質を構成するモジュールの構造と機能を分類した(郷)。モジュールを置換したキメラグロビンを種々作成し、ヘム結合様式、4次構造形成能を調べた結果、構造と機能はモジュール単位で分担している可能性が強く示唆された。(森島)。

バルナーゼのモジュールの一部は単独でも活性を示すこと、自己集中すること、順列を変えた変異体の構造はモルテングロビュールに近いこと明らかにした(柳川)。班会議を3回開いた。また、3月3日には、東京・化学会館で第2回進化分子工学シンポジウムを主催した。班員全員と、ゲストスピーカー3名による11講演があり、108名の出席があり、活発な質疑討論が行われた。1.多値配列空間上の富士山型の適応度地形における突然変異体スペクトルの理論を作り、多くの実験テ-タがこの理論と矛盾しない事を示した。ウイルスメンバーを持つハイパーサイクル理論を構築し、遺伝子型・表現型対応付けにおけるウイルス的戦略が、翻訳系の起源を駆動しうることを示した。2.細胞分化の抽象モデルを作り、そのシミュレーションを通して、内部状態をもち、相互作用しつつ増殖する集団の一般的性質として、自発的分化、集団レベルの安定性、再帰的な増殖の形成が起こる事を示した。3.カタラーゼIの配列空間上の野生型近傍の地形を調べたところ、熱安定性の地形は単峰性で高度は高いが、触媒活性の地形は凸凹で、高度は高くない事がわかった。また、無細胞翻訳系によるDNAポリメラ-ザ遺伝子の発現とせれによるPCRでその遺伝子の増幅を繰り返すという試験管内進化実験系を構築できた。4.予め耐熱性を下げておいて高度好熱菌由来のイソプロピルリンゴ酸脱水素酵素2種類を出発材料として、高度好熱菌内で高温下に培養し、耐熱化タンパク質の選択に成功した。これを元に、好熱菌野生型タンパク質をさらに耐熱化した。5.枯草菌オペロンのポリtRNA構造がアミノアシルtRNA合成酵素とtrpオペロンのコード域に進化した事が示された。さらに、蛋白質モジュールがtRNAモジュールに依存して起源したことが示された。6.バルナーゼのモジュールが水中において力学的に安定であることを、分子動力学計算で示した。また、レプレッサー蛋白のヘリックス・ターン・ヘリックスモジュールの中に、DNAリン酸基に結合するものを見いだした。7.ヘモグロビンサブユニット界面付近に存在し、4量体形成に寄与していると考えられるモジュールM4をα鎖、β鎖、ミオグロビン間で置換したキメラを作り、モジュールが構造及び機能の単位であることを示した。1.前年度までに開発した多値配列空間上の富士山型の適応度地形の理論がプロリルエンドヌクレアーゼの進化実験に適用され、これも富士山型地形に極めて近い事を示した。この地形上の最適適応歩行法を示した。一蛋白が多段反応に関与する場合も、段数に相当する歩幅で歩行すれば、富士山型と見なしうる。2.in vitroウイルスの設計指針と有効性を示した。3.カタラーゼのC末端にランダム配列を付加し、配列空間の次元を上げると、さらに適応度の地形を高く登れることを示した。4.前年度までに得られた進化分子工学によって耐熱化されたイソプロピルリンゴ酸脱水素酵素の立体構造を決定し、耐熱化が第1議的には局所構造の微妙な変化に基づくこと、大域的変化が寄与する場合もあることがわかり、構造論的アプローチよりも進化的アプローチが優れていることが実証された。
口蓋扁桃胚中心の細胞動態に関する研究

BrdUに対するモノクローナル抗体が作製されるようになってから、分裂期にある細胞をアイソトープを用いず、簡単な方法で検出できるようになった。まずウサギにBrdUを静脈注射し、時間をおいて口蓋扁桃を摘出する。固定、脱水、包埋の後、連続切片を作製し抗BrdU抗体にて免疫組織学的に染色した。静脈注射から摘出までの時間を変えることによりリンパ球の動態を観察できる。家兎のin vivoの実験により口蓋扁桃においては胚中心の主に底極部でリンパ球がさかんに分裂しているが、H^3-thymidineを用いたKoburgの報告とは異なり、分裂したリンパ球は暗殻には移動せず、注射の24時間後には扁桃からBrdUに変色された細胞はほとんど認められなくなっていた。また抗IgG抗体、抗IgM抗体で2重染色したところ抗BrdU抗体で染色されたリンパ球は抗IgG抗体、抗IgM抗体では染色されず、分裂期にあるリンパ球は形質細胞に成熟するまえに扁桃から出て行ってしまうと考えられた。重層扁平上皮においてはBrdUでラベルされた細胞が基底部から時間の経過とともに表面に移動して行く所見が得られた。つぎに手術により摘出したヒトの口蓋扁桃を薄切しBrdU含人工血液中でO_2とCO_2の混合ガスのもとに15分間培養することにより人の組織の検討もおこなった。この培養実験から、人の扁桃胚中心においても家兎と同様、BrdUでラベルされた細胞は胚中心底極部と上皮の基底部に認められた。習慣性扁桃炎と同様の所見が病巣感染においても認められ、明らかな相違はみられなかった。
衝突数値シミュレーションによる太陽系小天体の構造進化モデルの構築

彗星や小惑星といった太陽系小天体は、原始惑星系円盤中でミクロン以下のサイズの塵(ダスト)が合体成長して形成された微惑星の名残であると考えられている。本研究ではダスト同士の衝突過程の数値シミュレーションを行うことで、微惑星および小天体の構造進化モデルを構築することを試みた。結果としてダスト同士の衝突合体によって超低密度の微惑星が形成され、それが現在見られる小天体の低密度構造の一因であることが明らかとなった。本研究課題においては、衝突成長過程を通じた微惑星や小天体(小惑星や彗星)の構造進化モデルを確立することを目指す。とくに、サイズ・密度の異なるアグリゲイト同士の衝突シミュレーションを行うことによって、微惑星や小天体における局所的圧縮過程およびクレーター形成過程を明らかにすることを目的とする。本年度ではまず様々なサイズ・密度のアグリゲイトを生成し、予備的な衝突シミュレーションを行うことを計画した。得られた成果は以下の通りである。まず、アグリゲイトを繰り返し付着させて大きくしたいわゆるBallistic Cluster-Cluster Aggregation (BCCA)構造と、一粒子を逐次付着させていくことで大きくしたいわゆるBallistic Particle-Cluster Aggregation (BPCA)構造をもつアグリゲイトを作成した。BCCA構造は原始惑星系円盤内で形成される低密度ダストを模擬したものであり、BPCA構造はコンパクトなダストを模擬したものである。これらを衝突速度や衝突パラメータを変えながら互いに衝突させるシミュレーションを行うことで、様々なサイズ・密度をもつアグリゲイトを作成することに成功した。この衝突シミュレーションは同じサイズ・密度同士のアグリゲイト衝突を行ったものであったが、シミュレーション結果を検討した結果、(1)ダストアグリゲイトは衝突によっては圧縮されにくくそのフラクタル次元は2.5程度に留まること、(2)衝突速度が大きくなるにつれては破壊が生じるが、成長限界速度は氷アグリゲイトの場合50m/s程度と大きく、原始惑星系円盤内で十分合体成長が可能であること、が示された。これは低密度な微惑星や小天体の形成を示唆するものである。次年度では、サイズ・密度の異なるアグリゲイト同士の本格的な衝突シミュレーションを行う予定である。とくに、サイズ・密度の異なるアグリゲイト同士の衝突シミュレーションを行うことによって、微惑星や小天体における圧縮過程やクレーター形成過程を明らかにすることを目的とする。去年度では様々なサイズ・密度をもつアグリゲイトを作成し、同サイズ・同密度のアグリゲイト同士の衝突をシミュレートすることによってフラクタル次元の小さい低密度状態でダストが成長することが示唆された。本年度では、異なるサイズのアグリゲイト同士の衝突のシミュレーションを行った。結果として、(1)サイズ比が大きくなればなるほど、圧密される領域は局所的になるがその圧密度合いは大きいものではなく衝突での圧密は難しいこと、(2)そのような過程で形成されるクレーターから放出されるイジェクタは少量であること、(2)サイズ比によって成長限界速度自体はほとんど変わらない(氷アグリゲイトで50m/s)が、成長限界速度より小さい衝突速度ではサイズ比が増すほどより成長しやすくなること、が明らかとなった。また、様々な密度(配位数)のアグリゲイトの衝突シミュレーションを行った結果、配位数が大きい密なアグリゲイトは跳ね返ってしまう可能性があるが、配位数が6より小さいアグリゲイトなら付着できることが明らかとなった。これは従来の室内実験の結果に対して重要な示唆を与えるものである。総じて、本研究によってダストの衝突成長過程を通じて形成される微惑星および小天体は極端に低密度としか成り得ないことが結論された。現在観測される比較的高密度の状態になるためにはガス圧による圧縮や熱的変性など衝突以外の過程が必要であることが示唆される。
アデノ随伴ウイルスを用いた循環器疾患の遺伝子治療法の開発

我々はアデノ随伴ウイルス(AAV)ベクターによる心・血管への遺伝子導入法の確率、さらに内皮型NO合成酵素(ecNOS)遺伝子導入による肺高血圧・心肥大の遺伝子治療法の開発を目指して研究を進めてきた。平成10-11年度の文部省科学研究費補助により、以下のような研究成果が得られた。(1)AAVベクターによる心・血管への遺伝子導入LacZ遺伝子を組み込んだβ-galactosidase発現ベクター(AAV-LacZ)を作製した。このAAV-LacZを用い、血管・心筋組織への遺伝子導入が高率に可能であること、さらに導入したLacZ遺伝子は3ヵ月以上の長期にわたり発現が持続することを観察した。(2)ecNOS発現ベクターの作製(3)心筋肥大に対するecNOS遺伝子導入の効果ラット培養心筋細胞にAAV-ecNOSを遺伝子導入した。遺伝子導入した心筋細胞では細胞内cGMPの上昇が認められ、またphenylephrine刺激による心筋細胞の肥大反応が有意に抑制された。さらに、ecNOS遺伝子導入に心肥大抑制作用は、NOS阻害剤であるL-NMMA存在下で完全に消失した。以上の研究成果より、AAVベクターを用いたecNOSの心・血管への遺伝子導入が、肺高血圧・心肥大の新しい治療法として有用である可能性が明らかとなった。我々は循環器疾患の遺伝子治療を目的に、アデノ随伴ウイルス(AAV)ベクターによる心、肺への遺伝子導入法の確立を目指して研究を進めてきている.文部省科学研究費補助により、平成10年度は以下のような研究成果が得られた.(1) AAVべクターによる心、血管への遺伝子導入LacZ遺伝子を組み込んだβ-galactosidase発現ベクター(AAV-LacZ)を作製した.このAAV-LacZを用い、血管、心筋組織への遺伝子導入が可能であること、さらに導入されたLacZ遺伝子は1ヶ月以上の長期にわたり発現が持続することを観察した.(2) ecNOS発現ベクターの作製内皮型・酸化窒素(NO)合成酵素(ecNOS)遺伝子を組み込んだAAVベクター(AAV-ecNOS)を作製し、ヒト293細胞へ導入した.ecNOSの発現をWestern bloth法およびecNOS活性を^3H-L-arginineを用い解析した.293細胞へecNOS遺伝子を導入することにより、293細胞のMAPキナーゼ活性およびc-fosの発現は有意に抑制され、これに伴い293細胞のDNA合成能も有意に抑制された.(2)心筋肥大に対するecNOS遺伝子導入の効果ラット培養心筋細胞にAAV-ecNOSを遺伝子導入した.遺伝子導入した心筋細胞では細胞内cGMPの上昇が認められ、またphenylephrine刺激による心筋細胞の肥大反応が有意に抑制された.さらに、このecNOS遺伝子導入による心肥大抑制作用は、NO合成酵素の阻害剤であるL-NMMA存在下では消失した.このことから、ecNOSを心筋細胞に遺伝子導入することにより、心肥大の治療が可能であることが明らかにされた.我々はアデノ随伴ウイルス(AAV)ベクターによる心・血管への遺伝子導入法の確立、さらに内皮型NO合成酵素(ecNOS)遺伝子導入による肺高血圧・心肥大の遺伝子治療法の開発を目指して研究を進めてきた.平成10-11年度の文部省科学研究費補助により、以下のような研究成果が得られた.(1)AAVベクターによる心・血管への遺伝子導入LacZ遺伝子を組み込んだβ-galactosidase発現ベクター(AAV-LacZ)を作製した.このAAV-LacZを用い、血管・心筋組織への遺伝子導入が高率に可能であること、さらに導入されたLacZ遺伝子は3ヶ月以上の長期にわたり発現が持続することを観察した.(2)ecNOS発現ベクターの作製(3)心筋肥大に対するecNOS遺伝子導入の効果ラット培養心筋細胞にAAV-ecNOSを遺伝子導入した.遺伝子導入した心筋細胞では細胞内cGMPの上昇が認められ、またphenylephrine刺激による心筋細胞の肥大反応が有意に抑制された.

さらに、このecNOS遺伝子導入による心肥大抑制作用は、NOS阻害剤であるL-NMMA存在下で完全に消失した.以上の研究成果より、AAVベクターを用いたecNOSの心・血管への遺伝子導入が、肺高血圧・心肥大の新しい治療法として有用である可能性が明らかとなった.
インスレーターを介した糖尿病発症機構の解明

C57BL6/N(WI)マウスに2.5%DSSを服用させると経時的な体重減少が認められる。この時、腸内短鎖脂肪酸濃渡の変化を測定した所、酢酸、フマル酸やプロピオン酸の濃度変化は無かったが、酪酸濃度のみがDSS服用時に半減した。腸内細菌産生産物の一種である短鎖脂肪酸(酪酸)を、至摘濃度にて培養細胞(NCI-H716)上清内に添加した。特に酪酸はヒストン脱アセチル化複合体阻害作用を有しており、種々の遺伝子発現活性化に関与している。酪酸添加における培養細胞からmRNAを単離し、cDNAに変換した後にDNAマイクロアレイを用いて遺伝子発現変化を解析した。検討項目としていたGLP-1遺伝子は、発現量が約25%程度に減少していた。一方で、細胞接着因子であるMFGE8は5倍程度の顕著な発現上昇を認めており、この遺伝子について機能解析を進めて行く事とした。クロマチン免疫沈降法を用いて、MFGE8プロモーター領或のヒストンH3K9アセチル化を評価した所、酪酸添加時、経時的に同領域のアセチル化が増加している結果が得られた。次にWTマウス及びMFGE8ノックアウト(KO)マウスに対して、各々DSSの投与を行いつつ、加えて酪酸の経直腸内投与をを行った。まずWTマウス及びKOマウス各々の腸内細菌叢を16S rRNAメタゲノム解析にて調べたが、菌叢の大きな差異はみられなかった。コントロールマウス(生理的食塩水投与)に比べて、酪酸の投与を受けたWTマウスは、有意な体重減少の抑制がみられたものの、酪酸投与KOマウスでは有意差は認められなかった。ELISA法を用いて、腸組織における炎症パラメーターの測定も行ったが、やはり酪酸投与を受けたWTマウスでは、炎症性サイトカインの発現抑制がみられたが、KOマウスでは有意な差はみられなかった。C57BL6/N(WT)マウスに2.5%DSSを服用させると経時的な体重減少が認められる。この時、腸内短鎖脂肪酸濃度の変化を測定した所、酢酸、フマル酸やプロピオン酸の濃度変化は無かったが、酪酸濃度のみがDSS服用時に半減した。クロマチン免疫沈降法を用いて、MFGE8プロモーター領域のヒストンH3K9アセチル化を評価した所、酪酸添加時、経時的に同領域のアセチル化が増加している結果が得られた。次にWTマウス及びMFGE8ノックアウト(KO)マウスに対して、各々DSSの投与を行いつつ、加えて酪酸の経直腸内投与を行った。

コントロールマウス(生理的食塩水投与)に比べて、酪酸の投与を受けたWTマウスは、有意な体重減少の抑制がみられたものの、酪酸投与KOマウスでは有意差は認められなかった。ELISA法を用いて、腸組織における炎症パラメーターの測定も行ったが、やはり酪酸投与を受けたWTマウスでは、炎症性サイトカインの発現抑制がみられたが、KOマウスでは有意な差はみられなかった。当初、正常腸上皮を用いた報告より、酪酸投与により培養細胞のGLP-1発現は上昇すると考えられていたが、予想に反して発現量は著明に低下していた。この事は、使用した培養細胞が「癌由来」である事が起因している可能性も考えられた。マイクロアレイの結果より、細胞接着因子の一つであるMFGE8の発現が約5倍と著明に上昇していた事より、この遺伝子の機能解析に移行した。当初MFGE8はアポトーシスに関与する因子と考えられていたが、その他にも細胞ホメオスターシス維持機能や、抗炎症作用を有するといった報告がここ最近散見されている。当教室には、MFGE8に関する各種抗体や、京都大学長田博士より御供与頂いたMFGE8KOマウスをストックしていた事より、これらの抗体やマウスを用いて解析を進め得た。この為、当初の予定計画以上に進展しており、平成23年度終了時点までの結果をまとめて、現在論文投稿段階まで進んでいる。平成23年度までの所で、培養細胞及び実験マウスを用いたin vitro系での解析は終了している。臨床の場において、実際に炎症性腸疾患の患者に対して酪酸注腸療法も行われつつあるが、その効果に関しては酪酸不応性のケースも散見される事より議論が分かれている。平成23年度の解析結果より、酪酸添加によるMFGE8を介した抗炎症作用が強く示唆された。MFGE8プロモーター上流域にはCpGアイランドが存在しており、同領域のDNAメチル化によるMFGE8発現低下の可能性も考えられる。この場合、腸炎に対する酪酸を介したMFGE8の抗炎症作用が効率的に誘導されない可能性も十分に考慮される。今後(平成24年度)は、実際の炎症性腸疾患患者の大腸生検サンプルより、プロモーター部を含めたMFGE8遺伝子領域のDNA及びヒストンの修飾状況を検討し、個々の臨床所見との相関や、酪酸投与への反応性(治療効果)が予測可能かどうかを検討する事を推進方策とする。上記の推進方策に基づき、当施設倫理委員会の承認を取得後に実際の炎症性腸疾患患者の炎症部及び非炎症部を含めた大腸生検サンプルを内視鏡下に回収する。この大腸生検サンプルを用いて、定量的PCR法にてMFGE8遺伝子の発現量を、またクロマチン免疫沈降法を用いてMFGE8プロモーター領域のDNA及びヒストン修飾解析を進める。併せて、臨床パラメーター情報と照らし合わせた多因子解析を行う予定であり、当該の研究費をこれらの解析に充てる。
21番染色体上の2つの常染色体劣性非症候群性聾遺伝子のポジショナルクローニング

聾は新生児約1000人に1人の割合で罹患が見られる感覚器障害で、先天性聾の50%以上が遺伝性であると推定されている。遺伝性聾の約70%が他の臨床症状を示さない非症候群性である。この遺伝性非症候群性聾の約75%が常染色体劣性、20%が常染色体優性の遺伝形質を、23%がX染色体劣性形質を示し残りのケースは母系から受け継がれたミトコンドリア・ゲノム上に変異が存在すると考えられている。このうち最も多い常染色体劣性非症候群性聾(ARNSHL)は新生児約2500人に1人で見られ、30100の異なる遺伝子が関与していると推定されている。現在までに30ヶ所のARNSHL座位が報告されており、28ヶ所についてはマップされている。最近、8ヶ所すなわちDFNB1DFNB4、DFNB9、DFNB12、DENB21、DFNB29に関してその原因遺伝子がそれぞれGJB2/connexin26、MYO7A、MYO15、PDS、OTOF、CDH23、TECTA、CLDN14と同定されたが、その他の多くについては未だ同定されていない。しかし、極最近我々はDFNB8/10の原因遺伝子を発見した。その経過は以下の通りである。我々のグループはこの数年来、ヒトゲノム計画の一環として21番染色体長腕の全塩基配列の決定および遺伝子の系統的探索を目指し、ヒトゲノムBACライブラリーを中心に据えた基盤整備を進めてきた。その結果、今年5月に日独共同プロジェクトとして21番染色体の長腕約34Mbの塩基配列を決定し報告した。ARNSHL座位のうちDFNB8およびDFNB10はそれぞれ独立の家系の連鎖解析からマップされたものであるが、どちらも21q22.3上にマップされており同一の原因遺伝子ではないかと考えられてきた。我々は、DFNB10のポジショナルクローニングを目指し、患者家系(パレスチナ人由来)を用いた連鎖不平衡解析を行った。我々の決定した塩基配列から新たに作成した多型マーカーを用いた詳細な連鎖不平衡解析の結果からDFNB10はマーカー1016E7.CA60-1151C12.GT45の間約1Mbに存在することが明らかとなった。そこで我々はこの領域に存在する全ての遺伝子を明らかにするためにエキソントラッピング法とコンピュータ予測を駆使し、結果として13個の遺伝子を同定した。これら全ての遺伝子について疾患家系に対して変異解析を行ったところ今までに同定されたARNSHL原因遺伝子とは機能の面で異なる新規膜結合型プロテアーゼ(TMPRSS3)遺伝子にβ-サテライト・リピートの挿入という極めて特異な変異が見つかった。β-サテライト・リピートは68bpを単位とする繰り返し配列であり、主に末端動原体型染色体の短腕に数百kbにおよぶ反復配列として存在するが、この挿入による遺伝子欠損はこれが最初の例である。さらにDFNB8の疾患家系(パキスタン人由来)についてもこの遺伝子を調べたところプロテアーゼ活性を消失すると推定される変異が見つかった。この様にして我々はDFNB8/10の原因遺伝子(TMPRSS3)を同定することに成功した。聾は新生児約1000人に1人の割合で罹患が見られる感覚器障害で、先天性聾の50%以上が遺伝子性であると推定されている。遺伝性聾の約70%が他の臨床症状を示さない非症候性群である。我々はヒト・ゲノムプロジェクトの一貫としてヒト21番染色体の塩基配列を決定している。従って21番染色体上にマップされているDFNB10およびDFNB8の原因遺伝子を同定することによって聴覚障害の機構解明ひいていは臨床診断・治療に寄与したいと考え研究を行った。DFNB10座位はD21S212-D21S361間の領域に存在することが示唆されており、この領域はまさに我々がシーケンシングを行っている領域に含まれている。我々はBACクローンを用いてコンティグを作製し、現在までにD21S212-D21S361間の塩基配列をほぼ完全に決定した。得られた配列情報を基に多数の多型マーカーを用いてこの領域を約1Mbに絞り込んだ。そこでこの領域に存在する遺伝子をコンピュータおよび実験的な解析を行い13個の遺伝子を同定した。このうちABCG1、TFF3、TFF2、TFF1、PDE9A、NDUFV3の6個の既知遺伝子に対して患者家系(モロッコ人由来)に特異的な遺伝子変異の検出を試みた。結果として、これらの遺伝子には特異的な変異は検出されなかった。従って候補遺伝子は残り7個に絞られ、現在これらについても遺伝子変異の検出を試みている。

遺伝性聾の約70%が他の臨床症状を示さない非症候群性である。この遺伝性非症候群性聾の約75%が常染色体劣性、20%が常染色体優性の遺伝形質を、23%がX染色体劣性形質を示し残りのケースは母系から受け継がれたミトコンドリア・ゲノム上に変異が存在すると考えられている。このうち最も多い常染色体劣性非症候群性聾(ARNSHL)は新生児約2500人に1人で見られ、30100の異なる遺伝子が関与していると推定されている。現在までに30ヶ所のARNSHL座位が報告されており、28ヶ所についてはマップされている。最近、8ヶ所すなわちDFNB1DFNB4、DFNB9、DFNB12、DENB21、DFNB29に関してその原因遺伝子がそれぞれGJB2/connexin26、MYO7A、MYO15、PDS、OTOF、CDH23、TECTA、CLDN14と同定されたが、その他の多くについては未だ同定されていない。しかし、極最近我々はDFNB8/10の原因遺伝子を発見した。その経過は以下の通りである。我々のグループはこの数年来、ヒトゲノム計画の一環として21番染色体長腕の全塩基配列の決定および遺伝子の系統的探索を目指し、ヒトゲノムBACライブラリーを中心に据えた基盤整備を進めてきた。その結果、今年5月に日独共同プロジェクトとして21番染色体の長腕約34Mbの塩基配列を決定し報告した。ARNSHL座位のうちDFNB8およびDFNB10はそれぞれ独立の家系の連鎖解析からマップされたものであるが、どちらも21q22.3上にマップされており同一の原因遺伝子ではないかと考えられてきた。我々は、DFNB10のポジショナルクローニングを目指し、患者家系(パレスチナ人由来)を用いた連鎖不平衡解析を行った。我々の決定した塩基配列から新たに作成した多型マーカーを用いた詳細な連鎖不平衡解析の結果からDFNB10はマーカー1016E7.CA60-1151C12.GT45の間約1Mbに存在することが明らかとなった。そこで我々はこの領域に存在する全ての遺伝子を明らかにするためにエキソントラッピング法とコンピュータ予測を駆使し、結果として13個の遺伝子を同定した。これら全ての遺伝子について疾患家系に対して変異解析を行ったところ今までに同定されたARNSHL原因遺伝子とは機能の面で異なる新規膜結合型プロテアーゼ(TMPRSS3)遺伝子にβ-サテライト・リピートの挿入という極めて特異な変異が見つかった。β-サテライト・リピートは68bpを単位とする繰り返し配列であり、主に末端動原体型染色体の短腕に数百kbにおよぶ反復配列として存在するが、この挿入による遺伝子欠損はこれが最初の例である。さらにDFNB8の疾患家系(パキスタン人由来)についてもこの遺伝子を調べたところプロテアーゼ活性を消失すると推定される変異が見つかった。この様にして我々はDFNB8/10の原因遺伝子(TMPRSS3)を同定することに成功した。
情報技術と経済成長:利用サイドと提供サイドの実証分析

本研究では、情報技術(IT : Information Technology)革新が経済成長に及ぼす影響について、ITの利用サイドと提供サイドの両面から産業や企業レベルの実証分析を行った。その結果、利用サイドでは、日本企業の経営改革への取り組み姿勢がIT導入効果に強く影響しており、大胆な企業改革を実施した企業では日本も諸外国と同様の効果を得る可能性が高まること、他方、提供サイドでは、中長期的に機器などのハードウェア中心から雇用誘発力の高い上位レイヤーの情報サービス活動が盛んになっていることなどが明らかとなった。本研究の目的は、情報技術(IT:Informatioll Teclmology)革新が経済成長に及ぼす影響について、利用サイドと提供サイドの両面から産業や企業レベルの実証分析を深め、日本の経済・産業・企業の特徴と成長戦略実現に向けた課題を明らかにするものである。初年度となる平成20年度においては、次の三点に取り組んだ。第一に、研究に必要な、ハード、ソフト、データ、資料等の体制整備を図ると同時に本研究に関連する国内外の研究者、研究機関、公的機関、企業への精力的な聞き取り調査を実施した。第二に、IT利用サイドの産業・企業に関する国際比較分析として、国際アンケート(日本、米国、ドイツ、韓国)調査結果の個票データをもとに四力国別に多重検定処理を行った。第三に、IT供給サイドの産業・企業分析として、放送や通信などを中心に、技術革新と制度変化の変遷を跡付けた上で、平成20年8月に刊行された平成17年産業連関表(速報)を用いて産業規模の変化をデータに基づき分析した。これらの調査・研究活動の結果、IT利用サイドでは、日本企業の経営改革への消極姿勢がIT導入効果を削いでいる可能性が示唆されること、また、IT提供サイドでは、中長期的な潮流としてIT機器などのハード中心からからソフト化、サービス化、コンテンツ化が進展していること、さらに、今回の景気後退がこうしたダイナミックな変化を加速させているとみられること、などが明らかとなった。本研究の目的は、情報技術(IT:Information Technology)革新が経済成長に及ぼす影響について、利用サイドと提供サイドの両面から産業や企業レベルの実証分析を深め、日本の経済産業・企業の特徴と成長戦略実現に向けた課題を明らかにするものである。2年目となる平成21年度においては、次の三点に取り組んだ。第一に、平成21年3Aに刊行された平成17年産業連関表(確報)を用いて、IT提供サイドの産業における生産誘発力や雇用誘発力を計測した。さらに、固定資本マトリクスを用いて、情報サービス産業の設備投資による生産誘発力の計測も行った。第二に、IT利用サイドの企業に関する日、米、独、韓の国際比較分析として、国際アンケート調査の個票データをもとに、それぞれ四力国別に、企業改革の有無がIT導入効果の有無に統計的に有意な影響を与えているかどうかの検定作業を行った。これらと並行して、第三に、関連する国内外の研究者、研究機関、公的機関、企業への精力的な聞き取り調査を実施した。これらの調査・研究活動の結果、IT提供サイドでは、雇用誘発力の高い上位レイヤーの情報サービス活動が盛んになり、データ・センターへの集約化も進展していること、地球環境問題や情報の価値化がこうした動きを促進しているとみられること、また、IT利用サイドでは、日本企業では諸外国と比べて、企業改革の有無がIT導入効果の有無に影響する傾向が強いことなどが明らかとなった。本研究の目的は、情報技術(IT:Information Technology)革新が経済成長に及ぼす影響について、利用サイドと提供サイドの両面から産業や企業レベルの実証分析を深め、日本の経済・産業・企業の特徴と成長戦略実現に向けた課題を明らかにするものである。最終年度となる平成22年度においては、平成20年度および平成21年度に実施した研究の成果をもとに、関連する国内外の研究機関、公的機関、関連企業の研究者、実務家、政府関係者らとの討論意見の聞き取り調査を精力的に行うと同時に、研究成果の全体の取りまとめ作業を集中的に行った。特に、これまでの分析結果に基づく著作物および研究報告等による情報発信に関しては、本研究が平成22年度をもって閉鎖的に完結してしまうのではなく、今後さらに発展していく基盤となるよう、学術界のみならず実業界、政策当局、言論界など、幅広い領域で多面的に取り組んだ。一連の研究活動を通じて、IT利用サイドでは、日本企業の経営改革への取り組み姿勢がIT導入効果に強く影響しており、大胆な企業改革を実施した企業では日本も諸外国と同様の効果を得る可能性が高まること、また、IT提供サイドでは、中長期的に機器などのハードウェア中心から雇用誘発力の高い上位レイヤーの情報サービス活動が盛んになっていること、また、世界的な経済危機による景気後退がこうしたダイナミックな変化を加速させていることなどが明らかとなった。
5軸能動制御式ベアリングレスモータを搭載した超精密・高性能加工機の研究開発

本研究では,マイクロエンドミル加工に適用可能な超高速・超精密5自由度制御形磁気浮上モータの実現を目指している.しかし,モータの電磁外乱力が,磁気軸受の位置決め精度に悪影響を及ぼす.そこで,表面磁石形モータにおいて,1スロットに主・補助の2種類の巻線を施し,その巻数比を0.37とする巻線構造を提案した.提案巻線構造により,トルク脈動の主原因である回転数の6倍周波数成分を零にできることを理論式により示し,有限要素解析によりその有効性を示した.テスト機を用いたトルク測定試験の結果,平均値に対して6倍周波数成分が0.25%と十分小さい値であった.光学部品の金型加工などの超微細加工において,リソグラフィ・レーザ加工と比べ生産性・コストの点で優位なマイクロエンドミル加工が脚光を浴びている.しかし,既存のエアタービン駆動方式では,切削抵抗による回転数低下,刃の回転振れ等が原因で加工精度が低い.これに対し,本研究では,5軸能動制御式磁気浮上ベアリングレスモータを加工機に応用し,スピンドルのトルクと位置・姿勢を非接触で超精密に制御することで,課題解決を図り,さらに5軸制御電流から刃に作用する切削力をリアルタイム測定することで,切削力をフィードバックした精密な加工を実現することを目的としている.平成26年度は,加工と位置決め制御・精度に影響を及ぼさないモータ構造を検討した.具体的にはトルクリプルを低減する表面磁石貼付形永久磁石モータの巻線構造を提案,理論的に解析し,有限要素法により確認を行った.各相の1スロットあたりの巻線数を変更することで,起磁力の空間高調波の特定成分を零とし,トルクリプルを低減する構造を設計した.本研究では,マイクロエンドミル加工機に適用可能な5軸制御式精密・高速ベアリングレス磁気浮上モータの実現を目指している.磁気浮上回転主軸の位置決め精度に影響を及ぼす要因の一つに,モータの電磁外乱力が挙げられる.平成26年度には,この電磁外乱力の一つであるトルク脈動を低減する表面磁石形モータの設計を行った.具体的には,各相の1スロットあたりの巻線比を変更し,発生する電磁トルクの脈動を極小にする巻線比を理論的に導出し,有限要素電磁界解析により確認を行った.平成27年度には,まず,コギングトルクを低減するために磁石スキューの検討を行った.その結果,永久磁石に3段階スキューを施すことで,コギングトルク(3σ)を6mNmから0.2mNm低減可能であることを,有限要素電磁界解析により示した.次いで,提案する巻線構造を固定子に適用し,かつ,3段磁石スキューを回転子に施した高速モータを試作した.回転子直径は40mm,固定子高さは15mm,永久磁石表面から固定子鉄心表面までの距離は1.5mmに決定した.トルク測定は,PWM駆動による高調波の影響を排除するため,リニアアンプを3台用いて三相正弦波電流をモータに供給し,渦電流ブレーキとトルクメータを用いて,出力トルク信号のスペクトル解析を行った.その結果,トルク脈動(平均値に対する脈動振幅)は,0.24%であった.今後の予定は,本提案モータを磁気浮上モータに適用し,位置決め精度を評価する.本研究では,マイクロエンドミル加工に適用可能な超高速・超精密5自由度制御形磁気浮上モータの実現を目指している.しかし,モータの電磁外乱力が,磁気軸受の位置決め精度に悪影響を及ぼす.そこで,表面磁石形モータにおいて,1スロットに主・補助の2種類の巻線を施し,その巻数比を0.37とする巻線構造を提案した.提案巻線構造により,トルク脈動の主原因である回転数の6倍周波数成分を零にできることを理論式により示し,有限要素解析によりその有効性を示した.テスト機を用いたトルク測定試験の結果,平均値に対して6倍周波数成分が0.25%と十分小さい値であった.平成26年度は,5軸能動制御式磁気浮上ベアリングレスモータを加工機に応用し,超精密位置決めを実現するため,支持制御に影響を及ぼさないことを目指した低トルクリプルのモータを試作し,性能評価を目的としていたが,設計にとどまったため,やや遅れていると言える.精密機械システム速やかにモータの試作と性能評価を行い,低トルクリプルであることを実証する.また,磁気軸受を設計,試作し,超精密5自由度制御形ベアリングレスモータを製作し,位置決め実験,および加工実験を行う.5軸能動制御式磁気浮上ベアリングレスモータのテスト機を,平成26年度に試作できなかったため.5軸能動制御式磁気浮上ベアリングレスモータのテスト機の試作費用,およびトルクメータと検出器,負荷試験装置の購入費用とする.
非線形性の発現制御とダンピング制御による高機能同調液体タンパーの実現

まず最初に、円筒型同調液体ダンパーの制振性能予測のための研究を行い、制振性能を予測することの可能なシミュレーションコードの開発に成功した。また、最適減衰を得るために円筒容器内にネットを1枚、加振方向と直角に挿入した場合について基礎理論を構築し、このダンパーを構造物に搭載した場合のモデル実験を行い、減衰ネットの開口面積比、構造物との質量比、初期振幅、液深比などをパラメータとして変化させて実験を行い、シミュレーション結果と比較することによって、解析手法の妥当性を検証した。つぎに、さらなる制振性能向上を目指して、減衰ネットの挿入方法について二つの方向から検討を加えた。すなわち、複数枚のネットを水槽底面に直角に挿入することでネットが散逸するエネルギーを自由表面全体にわたって平均的に分散される方法と二枚の減衰ネットを矩形容器の各側壁に垂直に挿入し、最も流速変化の激しい場所に減衰ネットを挿入することによって散逸エネルギー増やす方法である。これらについても解析モデルの提案、制振効果の計算、モデル実験結果との比較を行った。さらに、矩形容器を対象として、容器内に流入・流出がある時のスロッシングを利用した循環流制御による可変減衰型同調液体ダンパーに関する研究を行った。まず、流入と流出がある時のスロッシングの応答特性を調べるために、モデル水槽を作成し、加振台の上に搭載し、加振振幅、振動数と液深をパラメータとして、加振実験を行った。その後、摂動法による非線形解析を実行し、自由表面近傍を流れる流水がスロッシング応答特性に与える影響について解析した。この結果を踏まえて、流体力を測定することの可能な加振台上で、流入・流出を伴う矩形同調液体ダンパーの性能試験を行った結果、循環流が存在する場合にはエネルギー散逸効果が現れる周波数帯域が広がることが明らかになった。自由表面を持つ液体の動揺を利用している制振装置は同調液体ダンパー(TLD)と呼ばれ、斜張橋の主塔や高層ビルなど実際の構造物にも組み込まれるようになってきた。しかしながら、対象となる構造物の固有周期が約35秒であることから、実際に建物に搭載する以前に実験室での加振実験によって制振性能を正確に予測することは困難である。そこで、適切なモデル化に基づいた計算機シミュレーションコードが必要となってくる。本研究の目的は、実際に建物に搭載する前に、各種TLDの制振性能を計算によって予測可能にする設計支援システムを開発することである。特に、従来取り組まれていなかった、大振幅入力に対する評価法の開発と容器内に流入流出する流れを伴う流水型TLDの設計法及び制振性能の評価法を確立することである。研究の最初の段階では、平成7年度の研究課題は、大振幅入力に対する評価法の開発と実験による検証であった。実験装置の設計および試作は順調に進み、実験に必要なジグ等の製作も完了し、実験に取り掛かれる状態に来ている。ただし、大振幅入力に対する理論解析が遅れている。そこで、引き続き解析法の研究を急ぐ予定である。本年度途中から重点的に行った研究は、各種TLDのうち、これまで研究が全く行われていなかった、減衰ネットを水平に挿入したタイプの制振装置の制振性能の予測に関する基礎理論の構築である。矩形容器内に減衰ネットが挿入された場合を対象に、ネットを通過する流線によって形成される仮想U字管モデルを構築し、矩形容器内に仮想的なマノメータ振動系を想定し、ネットの効果を考慮に入れて、発生する散逸エネルギーを計算することの出来るプログラムを開発した。次年度は、実験によって妥当性を確認する予定である。

自由表面を持つ液体の動揺を利用している制振装置は同調液体ダンパー(TLD)と呼ばれ、斜張橋の主塔や高層ビルなど実際の構造物にも組み込まれるようになってきた。しかしながら、対象となる構造物の固有周期が約35秒であることから、実際に建物に搭載する以前に実験室での加振実験によって制振性能を正確に予測することは困難である。そこで、適切なモデル化に基づいた計算機シミュレーションコードが必要となってくる。本研究の目的は、実際に建物に搭載する前に、各種TLDの制振性能を計算によって予測可能にする設計支援システムを開発することである。特に、従来取り組まれていなかった、減衰ネットを水平に挿入したタイプの制振装置の制振性能の予測、大振幅入力に対する各種TLDの制振性能の評価法の開発および容器内に流入流出する流れを伴う流水型TLDの設計法及び制振性能の評価を確立することである。昨年度から今年度にかけて重点的に行った研究は、各種TLDのうち、これまで研究が全く行われていなかった、減衰ネットを水平に挿入したタイプの制振装置の制振性能の予測に関する基礎理論の構築である。矩形容器内に減衰ネットが挿入された場合を対象に、ネットを通過する流線によって形成される仮想U字管モデルを構築し、矩形容器内に仮想的なマノメータ振動系を想定し、ネットの効果を考慮に入れて、発生する散逸エネルギーを計算することの出来るプログラムを開発した。また、実験装置を作成し、実験によって評価プログラムの妥当性を確認した。その結果、水平にネットを挿入した場合でも垂直に挿入した場合のように有効な減衰特性が得られることが明らかになった。自由表面を持つ液体の動揺を利用している制振装置は同調液体ダンパー(TLD)と呼ばれ、実際の構造物にも組み込まれるようになってきた。しかしながら、対象となる構造物の固有周期が約35秒であることから、実際の構造物に搭載する以前に実験室での加振実験によって制振性能を正確に予測することは困難である。本研究の目的は、各種TLDの制振性能を計算によって予測可能にする設計支援システムを開発することである。昨年度から今年度にかけて行われた研究は、容器内で発生するスロッシングを自由表面近傍に定常流れを作ることによって制振性能をコントロールすることの可能な流水型TLDの開発と制振性能の予測である。矩形容器を対象として、容器内に流入・流出がある時のスロッシングを利用した循環流制御による可変減衰型同調液体ダンパーに関する研究を行った。まず、流入と流出がある時のスロッシングの応答特性を調べるために、モデル水槽を作成し、加振台の上に搭載し、加振振幅、振動数と液深をパラメータとして、加振実験を行った。その後、摂動法による非線形解析を実行し、自由表面近傍を流れる流水がスロッシング応答特性に与える影響について解析した。その後、流体力を測定することの可能な加振台上で、流入・流出を伴う矩形同調液体ダンパーの性能試験を行った。その結果、流入・流出のある矩形容器におけるスロッシングの非線形応答に関する研究からは、循環流の流速が大きくなるにつれて、ハードスプリング型の非線形性が強くなることが解析と実験から明らかになった。
喘息重症化における真菌認識機構Dectin-1経路の役割の解明

近年の研究によりToll like receptor(TLR)のみならず、真菌認識機構であるDectin-1もCD4陽性T細胞分化を始めとした獲得免疫に関与していることが示された。我々はDectin-1特異的リガンドであるCurdlanを用いてDectin-1経路のCD4陽性T細胞分化に対する働きを検討した。その結果、Curdlanは抗原提示細胞上に発現するDectin-1経路を活性化することによりIL-10産生性T細胞分化を誘導することが明らかとなった。さらに、これらのIL-10産生性T細胞はc-Mafを高発現しているが、Th1、Th2、Th17、制御性T細胞分化に必須である転写因子T-bet, GATA3, RORγt, FoxP3は発現していないこと、またSTAT6欠損マウスを用いた実験によりDectin-1依存的に誘導されるIL-10産生性T細胞分化にはT細胞内のSTAT6が必須であることが明らかとなった。以上の結果よりDectin-1経路はSTAT6、c-Maf依存的にIL-10産生性T細胞分化を誘導することが示唆された。本研究者らは、喘息の重症化機構を解析し、IL-17産生性CD4陽性T細胞(Th17細胞)がTh2細胞依存的なアレルギ-性気道炎症を増悪させることを明らかにした(Wakashin et al. Am. J. Respir. Crit. Care Med. 2008)。一方近年、真菌由来β-glucanの認識機構であるDectin-1経路がTh17細胞の分化を誘導することが報告された。他方、Th17細胞依存性実験的脳脊髄炎の発症はDectin-1経路の活性化により抑制されることが報告されており、獲得免疫応答におけるDectin-1経路の役割の詳細は依然不明である。そこで本研究では、CD4陽性T細胞分化、さらに気管支喘息の病態におけるDectin-1経路の役割の解明を目的とした。平成20年の研究では、まずCD4陽性T細胞分化に対するDectin-1刺激の効果を検討した。その結果、Dectin-1刺激は抗原特異的Th1、Th2、Th17細胞の分化に影響しない用量で、IL10産生性T細胞の分化を著明に促進させることが明らかとなったこのDectin-1刺激により誘導されたIL10産生性T細胞はFoxP3陰性であり、制御性T細胞とは異なる細胞集団と考えられた。また、Dectin-1刺激によるIL-10産生性T細胞の分化誘導には抗原提示細胞の存在が必須であることから、抗原提示細胞に対するDectin-1刺激が、IL-10産生性T細胞の分化誘導に必須と考えられた。さらに、ICOSL抗体を用いた中和実験により、Dectin-1刺激によるIL-10産生性T細胞の分化にはICOS-ICOSL経路が重要な役割を果たしていることが明らかとなった。平成21年度の研究では抗原提示細胞を介したIL-10産生性T細胞の分化誘導機構の解明とともに、アレルギ-性気道炎症におけるIL-10産生性T細胞の役割の解明を目指す。本研究者らは、喘息の重症化機構を解析し、IL-17産生性CD4陽性T細胞(Th17細胞)がTh2細胞依存的なアレルギー性気道炎症を増悪させることを明らかにした(Wakashin et al.Am.J.Respir.Crit.Care Med.2008)。平成20年21年の研究では、CD4陽性T細胞分化に対するDectin-1刺激の効果を検討した。

その結果、Dectin-1刺激は抗原特異的Th1、Th2、Th17細胞の分化に影響しない用量で、IL-10産生性T細胞の分化を著明に促進させることが明らかとなった。また、Dectin-1刺激によるIL-10産生性T細胞の分化誘導には抗原提示細胞の存在が必須であることから、抗原提示細胞に対するDectin-1刺激が、IL-10産生性T細胞の分化誘導に必須と考えられた。さらに、その分子機構としては、TGFβシグナルとともにICOS-ICOSL経路が重要な役割を果たしていることを明らかにした。平成22年度の研究ではアレルギー性気道炎症におけるIL-10産生性T細胞の役割を解明するとともに、Dectin-1経路を用いた抗原特異的IL-10産生細胞の誘導によるアレルギー性気道炎症制御の可能性を検証する。本研究者らは、喘息の重症化機構を解析し、IL-17産生性CD4陽性T細胞(Th17細胞)がTh2細胞依存的なアレルギー性気道炎症を増悪させることを明らかにした(Wakashin et al.Am.J.Respir.Crit.Care Med.2008)。一方近年、真菌由来β-glucanの認識機構であるDectin-1経路がTh17細胞の分化を誘導することが報告された。他方、Th17細胞依存性実験的脳脊髄炎の発症はDectin-1経路の活性化により抑制されることが報告されており、獲得免疫応答におけるDectin-1経路の役割の詳細は依然不明である。そこで本研究では、CD4陽性T細胞分化、さらに気管支喘息の病態におけるDectin-1経路の役割の解明を目的とした。平成20年22年の研究では、CD4陽性T細胞分化に対するDectin-1刺激の効果を検討した。その結果、Dectin-1刺激は抗原特異的Th1、Th2、Th17細胞の分化に影響しない用量で、IL-10産生性T細胞の分化を著明に促進させることを明らかにした。また、Dectin-1刺激によるIL-10産生性T細胞の分化誘導には抗原提示細胞の存在が必須であることから、抗原提示細胞に対するDectin-1刺激が、IL-10産生性T細胞の分化誘導に必須であることが明らかとなった。平成22年度には、Dectin-1経路によるIL-10産生性T細胞の誘導にはT-betは必須ではないこと、その一方、T細胞内に発現するSTAT6の活性化が必要であり、さらにその下流の転写因子としてc-Mafが関与していることを明らかにした。現在、アレルギー性気道炎症におけるIL-10産生性T細胞の役割を解析するとともに、Dectin-1経路を用いた抗原特異的IL-10産生細胞の誘導によるアレルギー性気道炎症制御の可能性を検証している。
HLAアリル多型性とT細胞の抗ウイルス機能

HIVなどヒトに慢性疾患を引き起こすウイルス感染症では、病態の進行がHLAアリルのハプロタイプと相関するが、その要因は明らかになっていない。本研究では、HLAアリル多型性がT細胞の抗ウイルス機能に与える役割と、ウイルス因子が獲得免疫応答に及ぼす影響を解析した。その結果、(1)HIVに対するCTL免疫監視システムは、HIV-1病原性因子であるNefの機能に著しい影響を与えること、(2)抗原ペプチド・MHC複合体の安定性が、TCRによる抗原認識を通じて、HIV特異的CTLの抗ウイルス活性に大きく影響すること、の二点を明らかにした。本研究では、HLAアリル多型性がT細胞の抗ウイルス機能に与える役割を明らかとするとともに、このシステムにウイルス因子が及ぼす影響を解析する。本年度は、HLA-B35拘束性のHIV特異的CTLの抗ウイルス活性を解析するとともに、そうしたCTLによる免疫淘汰圧がHIVの複製に与える影響について解析した。その結果、以下の3点を明らかにした。1.極めて保存性の高いNefの機能性領域に、稀(データベース上で約5%)に認められる変異は、HLA-B35を持つHIV感染者で非常に多く(ほぼ90%)認められた。さらにHIV感染者から樹立したCTLの機能解析から、この変異はHLA-B35拘束性CTL応答によって選択されるCTL逃避変異であることが明らかとなった。2.この変異を含む領域は、PxxP領域と呼ばれ、Nefのさまざまな機能を担うと考えられている。まずNefによるCD4分子およびHLAクラスI分子の発現低下作用を解析した。その結果、このCTL変異は、CD4分子の発現低下には影響しないが、HLAクラスI発現低下機能を減弱化させた。さらにこのことにより、変異ウイルスに感染した細胞は、他のCTL(Gag、Pol、Envなどに特異的な)に対して、より殺されやすくなることが分かった。これらの結果は、Nef上に認められたCTL逃避変異は、生体内ではウイルス複製にネガティブに働くと考えられた。3.さらに、このNef変異を持つウイルスは、試験管内でウイルス複製機能が弱まっていることから、この変異はNefのウイルス複製増強作用を減弱化すると示唆された。以上のことから、HIVに対するCTL免疫監視システムは、Nefの病原性機能に著しい影響を与えることが明らかになった。本年度は、HLA-B35拘束性の2つのNefエピトープに対するHIV特異的CTLの抗ウイルス活性を解析するとともに、抗ウイルス活性の違いをもたらす要因について検討した。1.感染早期に主要な応答を示したVY8エピトープに特異的なCTLの抗ウイルス活性は非常に強く、慢性期に主要なRY11エピトープに特異的なCTLの抗ウイルス活性は弱かった。2.それぞれのエピトープに特異的なCTLからT細胞レセプター(TCR)をクローニングし、TCRを再構築して、TCRと抗原ペプチドの相互作用を解析したが、エピトープ間で大きな違いは見いだせなかった。3.一方、HLAクラスI分子からのエピトープペプチドの解離を調べたところ、エピトープ間で大きな違いが認められた。VY8エピトープの方がHLAクラスI分子からの解離が顕著に遅く、非常に安定な複合体を形成していることが分かった。このように、ペプチド配列が重複する良く似た2つの抗原ペプチドに対するCTL応答を解析することにより、ペプチド・MHC複合体の安定性が、TCRによる抗原認識を通じて、HIV特異的CTLの抗ウイルス活性に大きく影響することが明らかとなった。