hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
単分散超微細ナノ結晶シリコンの作製と配列制御

1.粒径10nm程度のナノ結晶シリコンは、低温で単電子トンネル現象や可視光発光などの興味深い量子効果現象を示す。これらの現象を室温で観測するために、粒径5nm以下の超微細ナノ結晶シリコンの形成と配列制御を目指して研究を行った。パルスプラズマプロセスで形成したナノ結晶の酸素中熱処理において表面酸化機構のストレス効果を調べた。粒径10nmレベルのナノ結晶では、酸化時間の経過に従い酸化速度が低減し、やがて飽和することを見いだし、4nmのナノ結晶を作製できた。2.単一または2-3個のシリコンナノ結晶の電気特性を調べるため、電極間隔15nmの超微細ギャップとトップゲートを有する平面型トランジスタおよびポリシリコンラップゲートを有する縦型トランジスタを電子ビーム露光法と微細エッチングで形成した。安定した単電子トンネル特性を観測することが出来た。また、種々の温度による詳細な検討とシミュレーションとの比較から、単一ドットだけでなく周囲に隣接するドットとの結合相関に関する情報が得られた。3.表面酸化膜を有するシリコンナノ結晶のフォトルミネッセンスを測定し、結晶粒径減少に伴うブルーシフトとストレスによるレッドシフトを観察した。電子顕微鏡観察と合わせてナノ結晶シリコンの酸化機構を解明した。粒径5nm以下の強く閉じこめた系では、フォノン支援を介さない高効率の発光再結合を観測した。4.粒径10nmのナノ結晶シリコンを3-4層シリコン基板上に堆積してからリンを含む雰囲気でアニールする事により、表面酸化膜を1100°Cで融解し、ナノ結晶シリコンを再配列させた。薄い金薄膜を蒸着して電子放出特性を測定したところ、約10%という高効率の電子放出を観測した。ナノ結晶シリコンを高密度に集積し、酸化膜厚を低減化して表面を平坦化した結果、効果的に電界を加えることが出来たものと考えられる。1.パルスプラズマプロセスで形成したナノ結晶の酸素中熱処理による表面酸化とエッチングの機構を調べた。透過型電子顕微鏡観測により酸化前後のナノ結晶粒径とその分布を調べた。粒径10nmレベルのナノ結晶では、表面ストレスにより酸化速度が低減することを見いだした。酸化速度の自己停止機構により超単分散ナノ結晶を実現する道を開いた。2.酸化プロセス中のエッチング条件を調べたところ、バルクではエッチングが起こらない7.6Torrでも粒径が減少して分布は均一化していることが分かった。酸素圧力と温度を制御して酸化膜の形成とエッチングの条件を調節することにより、ナノ結晶シリコンの粒径を高精度に制御できる可能性を見いだした。3.単一または2-3個のシリコンナノ結晶の電気特性を調べるため、電極間隔15nm超微細ギャップとトップゲートを有する平面型トランジスタおよびポリシリコンラップゲートを有する縦型トランジスタを電子ビーム露光法と微細エッチングで形成した。1.パルスプラズマプロセスで形成したナノ結晶の酸素中熱処理において表面酸化機構のストレス効果を調べた。透過型電子顕微鏡観測により酸化処理前後のナノ結晶粒径とその分布を調べた。粒径10nmレベルのナノ結晶では、酸化時間の経過に従い酸化速度が低減し、やがて飽和することを見いだした。4nmのナノ結晶を作製できた。量子ドット表面酸化膜によるストレスのもとで酸化機構をモデル化し実験結果をうまく説明できた。2.表面酸化膜を有するシリコンナノ結晶のフォトルミネッセンスを測定し、結晶粒径減少に伴うブルーシフトとストレスによるレッドシフトを観察した。

3.粒径10nmのナノ結晶シリコンを3-4層シリコン基板上に堆積してからリンを含む雰囲気でアニールする事により、表面酸化膜を1100°Cで融解し、ナノ結晶シリコンを再配列させた。薄い金薄膜を蒸着して電子放出特性を測定したところ、4.5%という高効率の電子放出を観測した。ナノ結晶シリコンを高密度に集積し、酸化膜厚を低減化して表面を平坦化した結果、効果的に電界を加えることが出来たものと考えられる。1.粒径10nm程度のナノ結晶シリコンは、低温で単電子トンネル現象や可視光発光などの興味深い量子効果現象を示す。これらの現象を室温で観測するために、粒径5nm以下の超微細ナノ結晶シリコンの形成と配列制御を目指して研究を行った。パルスプラズマプロセスで形成したナノ結晶の酸素中熱処理において表面酸化機構のストレス効果を調べた。粒径10nmレベルのナノ結晶では、酸化時間の経過に従い酸化速度が低減し、やがて飽和することを見いだし、4nmのナノ結晶を作製できた。2.単一または2-3個のシリコンナノ結晶の電気特性を調べるため、電極間隔15nmの超微細ギャップとトップゲートを有する平面型トランジスタおよびポリシリコンラップゲートを有する縦型トランジスタを電子ビーム露光法と微細エッチングで形成した。安定した単電子トンネル特性を観測することが出来た。また、種々の温度による詳細な検討とシミュレーションとの比較から、単一ドットだけでなく周囲に隣接するドットとの結合相関に関する情報が得られた。3.表面酸化膜を有するシリコンナノ結晶のフォトルミネッセンスを測定し、結晶粒径減少に伴うブルーシフトとストレスによるレッドシフトを観察した。電子顕微鏡観察と合わせてナノ結晶シリコンの酸化機構を解明した。粒径5mm以下の強く閉じこめた系では、フォノン支援を介さない高効率の発光再結合を観測した。4.粒径10nmのナノ結晶シリコンを3-4層シリコン基板上に堆積してからリンを含む雰囲気でアニールする事により、表面酸化膜を1100°Cで融解し、ナノ結晶シリコンを再配列させた。薄い金薄膜を蒸着して電子放出特性を測定したところ、約10%という高効率の電子放出を観測した。
沿岸及び外洋性植物プランクトン鉄摂取増殖並びに生体内鉄利用機構

ある特殊な場合を除き、植物プランクトンが摂取出来る鉄の形態は溶存無機鉄イオン種と言われており、海洋植物プランクトンによる鉄摂取速度は、海水中に存在する溶存無機態鉄(Fe(III)')濃度に依存すると考えられる。また昨年度の研究において、植物プランクトンは生体内に鉄をプールする能力を有することが明らかとなった。本年度の研究では、種類の異なる珪藻について過剰にプールした鉄による増殖能力を、生体内に蓄えられた鉄量の違いによる到達最大セル数を測定することにより求めた。また以前求めたセル当たりの臨界鉄量(植物プランクトンが増殖するのに最低限必要な鉄量)とそれぞれ種類の異なる珪藻の大きさを顕微鏡で測定し、それぞれの種のセル表面積及び体積当たりの鉄摂取速度を算出した。一般的に、植物プランクトンによる微量金属摂取速度は、そのセル表面に存在する金属取込みサイトの数によって決まると考えられる。また同じ沿岸性珪藻であれば、セル表面積当りの取込みサイト数は同じと考えると、セル表面積当たりの鉄摂取速度はどの種でも同じであると推察される。しかしながら、実験結果から算出されたセル表面積当たりの鉄摂取速度は、種によって異なっていることがわかった。このことは、種によってセル表面積当りの鉄取込みサイト数が異なるか、または鉄と鉄取込みサイトとの錯体形成能力が異なることを意味している。また最近の我々の植物プランクトン培養実験では、栄養塩及び鉄が十分量存在するにも関わらず生長が制限され、マンガン欠乏であることが示された。植物プランクトンが高い比生長速度を維持するためには、栄養塩に加え鉄とマンガンが重要であることが明らかになった。一般的に植物プランクトンの利用できる鉄は溶存無機イオン種のものであり、植物プランクトンによる鉄取り込み速度は、海水中に存在する溶存無機態鉄Fe(III)'濃度に依存すると考えらる。また植物プランクトンの生体内に過剰にプールされた鉄による増殖能力については、今だよく解明されていない。そこで、本年度の研究では、沿岸性珪藻4種を使用し、沿岸性珪藻存在培地に直接溶存無機態鉄を添加することで、一時的に植物プランクトン利用可能な鉄の高濃度環境(固体水酸化鉄の溶解平衡でのFe(III)'濃度以上)を作り、各増殖段階までに生体内に取り込まれた鉄量と生長との関係、固体水酸化鉄存在下における鉄摂取増殖機構、また増殖初期における生体内に取り込まれた鉄量の重要性について調べた。各増殖段階において、陸生菌類起源鉄錯体有機配位子(Desferrioxamine B:DFB)を添加することにより、培地中から植物プラントンへの鉄の供給をすべて絶ち、DFB添加時までに生体内に蓄えられた鉄量で、どれだけ生長できるかを比較検討した。すべての沿岸性珪藻の比生長速度は、生体内鉄量にそれ程関係なく、DFB添加後数日間最大比生長速度を維持して増殖することがわかった。しかし、生体内に蓄えられた鉄量の違いにより、到達最大セル数に違いがあることが解明され、植物プランクトンが増殖するのに必要な単位セル当たりの鉄量(セル当たりの臨界鉄量)の存在が明らかになった。また固体水酸化鉄存在下における植物プランクトン増殖並びに鉄摂取速度は、直接溶存無機態鉄を添加したものに比べ低く、固体水酸化鉄からの低い鉄の溶解速度が、植物プランクトンによる鉄摂取速度を支配したためと考えられた。
天然における異種微生物間の生存戦略の解明

申請者らは樹皮片から糸状菌(カビ)とそれに拮抗する細菌(バチルス)を見出した。バチルス分離株の示す生育阻止円の周囲付近にカビの菌糸や胞子が集中することを観察したが、バチルス属菌株でこのような報告はほとんどない。そのため、本研究では、申請者らが見出したカビ分離株とバチルス分離株を用い、バチルス分離株が生産する1抗カビ活性および2カビ菌糸塊や胞子形成促進活性の主体の解明、そして3抗カビ活性のカビ菌糸・胞子形成への関与を明らかにし、異種微生物間における生存戦略について、その分子メカニズムの一端を解明する。
可とう膜袋による簡易防火水槽の研究

既存の60m^<>水槽の内部に可とう膜袋を設置して平成9年7月12日40m^3注水し、その後の経過を観察した。注水開始後216日経過した時点で水位低下は1cmである。これは当初水量の0.5%(約200l)に相当する。この減水は蒸発によるものと推定される。したがって、可とう膜袋による防水性能は実物大のスケールで確認された。途中経過は平成9年11月の第2回都市直下地震災害総合シンポジウムで発表した。1年間の観察の後に最終結果を報告する予定である。使用水槽は地下埋設型で、観測者の出入口は2ケ所の標準型マンホールのみである。観測は1つのマンホール直下に囲いを作って行った。この水槽は借用品で、返還時には復旧の必要があるので、工事を必要最低限度とした。このため、可とう膜袋は上面解放型として水槽壁面に取り付けたレールによって吊るしてある。漏水は膜袋外部の水槽底のピットに水中ポンプを設置して排水量を調べた。漏水は、可とう膜袋内の貯水からではなく、膜袋外の水槽壁を通じて外部の土中からしみ出してくるものであった。観測期間中震度1の地震を経験したが、もちろん水槽に異常はなかった。しかし、これをもって耐震性を議論することはできない。阪神・淡路大震災のときに、激震地に設置されていた同種水槽が被害を受けなかったことから、耐震性の傍証としたい。
下界証明アプローチによる分岐プログラム充足アルゴリズムの研究

分岐プログラムの充足可能性問題とは,与えられた分岐プログラムが値1を出力するような変数入力(0/1割当)が存在するかどうかを判定する問題である.与えられる分岐プログラムに制限がない場合,総当たり探索よりも高速なアルゴリズムは知られていない.本研究では与えられる分岐プログラムの性質を(1)幅限定分岐プログラム,または(2)長さ限定分岐プログラムに制限し,総当たり探索よりも高速なアルゴリズムの開発を目標としている.これらの制限に対して総当たり探索よりも高速なアルゴリズムの開発によって,現在未解決問題である計算量クラスNEXPとNC1の分離が導かれる.以下に本年度の成果を述べる.(1)幅2の分岐プログラムを対象として検証した.既存研究の調査によって幅2の分岐プログラムはある論理回路クラスに含まれ,その論理回路を入力とする充足可能性問題に対して総当たりよりも高速なアルゴリズムの存在が判明した.幅2の分岐プログラムを上記の論理回路に変換することは入力サイズの多項式時間で可能であり,幅2の分岐プログラムに対する充足可能性問題が総当たりよりも高速に計算できることが導かれる.(2)長さ限定分岐プログラムの特別な場合としてk回読み分岐プログラムがある.代表者らによって,k回読み分岐プログラムを入力とする充足可能性問題を総当たり探索よりも高速なアルゴリズムが既に知られている.2018年度はkが2の場合に対して計算時間の改良に成功した.既存の結果では計算時間の解析において確率的証明を用いていたが,より厳密な解析を与えることによって計算時間の改善に成功した.この解析方針が一般のkへ拡張可能か検討中である.幅限定分岐プログラムに関して調査・研究を進めているが,充足可能性問題に対する新しいアルゴリズムの開発には至っていない.例えば,幅2の分岐プログラムが入力の場合,高速なアルゴリズムの存在は判明したが,これはある論理回路クラスに対するアルゴリズムである.k回読み分岐プログラムに対して計算時間の改良に成功しているがkが特定の値の場合に留まっており,一般のkに拡張できるかの検討が早急の課題である.(1)幅2の分岐プログラムに対して既存の結果よりも高速なアルゴリズム開発を目指す.(2)k回読み分岐プログラムを入力とする充足可能性問題に対して,kが2の場合で達成された高速化が一般のkへ拡張可能か検討する.さらに,一般の長さ制限分岐プログラムへの拡張も目指す.分岐プログラムの充足可能性問題とは,与えられた分岐プログラムが値1を出力するような変数入力(0/1割当)が存在するかどうかを判定する問題である.与えられる分岐プログラムに制限がない場合,総当たり探索よりも高速なアルゴリズムは知られていない.本研究では与えられる分岐プログラムの性質を(1)幅限定分岐プログラム,または(2)長さ限定分岐プログラムに制限し,総当たり探索よりも高速なアルゴリズムの開発を目標としている.これらの制限に対して総当たり探索よりも高速なアルゴリズムの開発によって,現在未解決問題である計算量クラスNEXPとNC1の分離が導かれる.以下に本年度の成果を述べる.(1)幅2の分岐プログラムを対象として検証した.既存研究の調査によって幅2の分岐プログラムはある論理回路クラスに含まれ,その論理回路を入力とする充足可能性問題に対して総当たりよりも高速なアルゴリズムの存在が判明した.幅2の分岐プログラムを上記の論理回路に変換することは入力サイズの多項式時間で可能であり,幅2の分岐プログラムに対する充足可能性問題が総当たりよりも高速に計算できることが導かれる.(2)長さ限定分岐プログラムの特別な場合としてk回読み分岐プログラムがある.代表者らによって,k回読み分岐プログラムを入力とする充足可能性問題を総当たり探索よりも高速なアルゴリズムが既に知られている.2018年度はkが2の場合に対して計算時間の改良に成功した.既存の結果では計算時間の解析において確率的証明を用いていたが,より厳密な解析を与えることによって計算時間の改善に成功した.この解析方針が一般のkへ拡張可能か検討中である.幅限定分岐プログラムに関して調査・研究を進めているが,充足可能性問題に対する新しいアルゴリズムの開発には至っていない.例えば,幅2の分岐プログラムが入力の場合,高速なアルゴリズムの存在は判明したが,これはある論理回路クラスに対するアルゴリズムである.k回読み分岐プログラムに対して計算時間の改良に成功しているがkが特定の値の場合に留まっており,一般のkに拡張できるかの検討が早急の課題である.(1)幅2の分岐プログラムに対して既存の結果よりも高速なアルゴリズム開発を目指す.(2)k回読み分岐プログラムを入力とする充足可能性問題に対して,kが2の場合で達成された高速化が一般のkへ拡張可能か検討する.さらに,一般の長さ制限分岐プログラムへの拡張も目指す.理由:国際会議等参加の予定が変更され海外旅費の執行に変更が生じたこと等による.使用計画:最新の研究成果調査のため,国内学会及び国際会議への参加を積極的に行う.
認知科学に基づく施設介護従事者における口腔機能維持・管理能力向上プログラムの開発

今年度は,実態調査の結果の分析をすすめ,関係研究者および介護従事者らによるミーティングを開催し,適切に伝わる「口腔機能維持・管理能力向上プログラム」の検討を行った.本研究では,介護保険施設に勤務する介護職員の歯科保健行動及び口腔ケアに関する知識と技術の実態を把握した.調査の結果,介護職員は,自分自身の口腔清掃や歯科保健行動を適切に行っているにもかかわらず,口腔QOLが低く,口腔ケアに自信がないことが明らかとなった.あわせて歯科との関係が薄いと感じており,歯科への理解が不十分であった.介護職員の歯科知識については,歯石,歯垢(プラーク),食物残渣,歯周病,舌苔,歯間ブラシ,誤嚥性肺炎,総義歯,部分床義歯,義歯安定剤など介護業務で用いる口腔機能維持・管理に関する用語は広く認知が進んでいた.一方で,口唇や口蓋といった解剖学的用語は人によりその認知が分散し,口腔機能維持・管理に関する用語の中でもインプラント,ブリッジ,唾液腺,残根は全体的に認知があいまいであった.また,クラスプに関しては,ほとんど認知が進んでいないことが分かった.これらの結果から,介護職員の口腔ケア方法や歯科知識は一律ではなく,職員ごとにその度合い,傾向が異なることが示された.介護職員の口腔ケア技術や歯科知識は,制度化された教育の中で体系的に得たのものではなく,一般的な生活習慣の延長と介護福祉施設における介護業務の中で経験的に習得した結果と考えられる.そのため,介護職員の多くは口腔ケアの重要性は理解しながらも,自信がなく口腔ケア業務に消極的になっている可能性が示唆された.今後は,現在の介護教育の中で歯科教育の充実を図るとともに,歯科専門職が介護保険施設に出向き,直接対話の中で口腔ケアの知識を深める機会を設ける必要があると考えられた.本年度は, 1.歯科医療従事者の専門的介入,2.介護従事者などによる一般的介入,3.歯科関係者と介護従事者との密接な連携による知識や技術などの共有化,の3項目について現状を把握するため,沖縄県・徳島県・岐阜県にある介護保険施設に訪問し,実際に業務に従事する職員に聞き取り調査を行った。聞き取りでは,歯科医療従事者と介護従事者の摂食・嚥下機能の目標設定の違いや歯科医療従事者が常駐すると介護従事者が口腔ケアを歯科医療食に任せきりにしてしまうなどの指摘があった。介護保険施設の職員の中では,口腔機能維持・管理が重要と認識されているものの,歯科と福祉の連携において,口腔機能維持・管理に関する共通認識や職種の役割理解が求められることが示された。介護保険施設の中で調査協力を得られた139施設において,介護職員,管理栄養士あるいは栄養士,看護師,調理員を対象に実施した「食事形態決定に必要な観察項目」の調査結果を活用して,専門職による観察視点の相違に関する分析を行った。その結果,食事支援に関して介護従事者と看護職は,介護従事者と管理栄養士との組み合わせと比較して観察視点に共通性がみられることが分かった。介護業務において,同じ空間や時間を共有することが知識や技術の共有認識につながることが示唆された。上記の結果を考慮に入れ質問票の内容を検討し,来年度早々に郵送調査を実施できるよう,研究協力機関への協力依頼などの準備を進めた。初年度に実施予定の郵送調査,訪問調査の準備に時間を要し実査に至らなかった。本調査の目的は,口腔機能維持・管理に関する自己評価と客観的評価を併せて行うことで,口腔機能維持・管理に関する認知の歪みを明らかにすることである。本年度は介護保険施設の介護従事者を対象とした郵送調査及び訪問調査を実施した。郵送調査は,徳島県内の介護保険福祉施設(特別養護老人ホーム)8施設及び岐阜県内2施設に勤務する介護従事者〔各30名,合計300名〕を対象として,1口腔機能維持・管理に関する知識,2歯科に対する認知及び感情,3歯科保健行動,4口腔健康自己評価に関するアンケート調査を行った。訪問調査は,上記10施設のうち調査協力の同意を得られた8施設において,介護従事者を対象に1口腔機能・維持管理の捉え方,歯科専門職との関係構築プロセスに関するインタビュー調査と2介護従事者自身の口腔ケアと歯垢染め出し液による磨き残しの確認,3要介護高齢者に対する口腔機能維持・管理業務(口腔ケア,摂食嚥下リハビリテーション,食事介助)の様子を観察した。現在,収集したデータの分析を終え、雑誌への投稿準備を進めている。実態調査を踏まえ,関係研究者および介護従事者らによるミーティングを実施した。現在,調査結果に関して、分析を進め,原著論文として投稿の準備を進めるとともに,徳島大学歯学部で開発した『口腔保健支援ICTシステム』への導入を検討している。今年度は,実態調査の結果の分析をすすめ,関係研究者および介護従事者らによるミーティングを開催し,適切に伝わる「口腔機能維持・管理能力向上プログラム」の検討を行った.本研究では,介護保険施設に勤務する介護職員の歯科保健行動及び口腔ケアに関する知識と技術の実態を把握した.調査の結果,介護職員は,自分自身の口腔清掃や歯科保健行動を適切に行っているにもかかわらず,口腔QOLが低く,口腔ケアに自信がないことが明らかとなった.あわせて歯科との関係が薄いと感じており,歯科への理解が不十分であった.介護職員の歯科知識については,歯石,歯垢(プラーク),食物残渣,歯周病,舌苔,歯間ブラシ,誤嚥性肺炎,総義歯,部分床義歯,義歯安定剤など介護業務で用いる口腔機能維持・管理に関する用語は広く認知が進んでいた.

一方で,口唇や口蓋といった解剖学的用語は人によりその認知が分散し,口腔機能維持・管理に関する用語の中でもインプラント,ブリッジ,唾液腺,残根は全体的に認知があいまいであった.また,クラスプに関しては,ほとんど認知が進んでいないことが分かった.これらの結果から,介護職員の口腔ケア方法や歯科知識は一律ではなく,職員ごとにその度合い,傾向が異なることが示された.介護職員の口腔ケア技術や歯科知識は,制度化された教育の中で体系的に得たのものではなく,一般的な生活習慣の延長と介護福祉施設における介護業務の中で経験的に習得した結果と考えられる.そのため,介護職員の多くは口腔ケアの重要性は理解しながらも,自信がなく口腔ケア業務に消極的になっている可能性が示唆された.今後は,現在の介護教育の中で歯科教育の充実を図るとともに,歯科専門職が介護保険施設に出向き,直接対話の中で口腔ケアの知識を深める機会を設ける必要があると考えられた.介護保険施設の介護従事者を対象とした郵送調査及び訪問調査を実施する。口腔機能維持・管理に関する自己評価と客観的評価を併せて行うことで,口腔機能維持・管理に関する認知の歪みを明らかにする.具体的には,介護保険施設の介護従事者を対象として,(1)口腔機能に関する知識,(2)歯科に関する認知バイアス及び感情バイアスに関する郵送調査を行う。加えて,研究協力施設の介護従事者を対象とした個々の口腔機能の評価,歯科への関心およびその者がケアする要介護高齢者の口腔機能について訪問調査を実施し,介護従事者の口腔機能に関連する認知と行動を検証する。今年度は,実態調査の結果に基づき,関係研究者および介護従事者らによるミーティングを引き続き開催して,適切に伝わる「口腔機能維持・管理能力向上プログラム」を開発する。また,プログラムの有用性を検証するため,調査協力を得た4施設を対象とした介入研究を行い,患(利用)者の口腔機能の維持・改善状況をアウトカム評価として介入群に定式化したプログラムを実施し,プログラムの有用性を検証する。具体的には,介入群・対照群それぞれに,介護従事者を対象とした調査(口腔内診査,細菌数,ブラッシング実技後,歯垢付着度,使用歯ブラシの状態,利用者に対する口腔ケア実技,「介護職のための口腔評価指標」を用いた利用者の口腔機能評価),利用者を対象とした調査(口腔内診査,細菌数,口腔機能評価,認知症自立度,要介護度,食形態,摂食状況)を実施する。介入効果として,介護従事者のメタ認知の歪みの有無,利用者の口腔評価指標の介入前後の数値変化について,統計分析を行う。初年度に実施予定の郵送調査,訪問調査の準備に時間を要し実査に至らなかったため,次年度使用額が生じた。当初、郵送調査の対象施設を全国の介護保険施設(1,000施設)と設定していたが、回収率などを検討した結果、大学所在地の徳島県の介護保険施設(75施設)に変更した。そのため、調査票印刷費、通信費が大幅に縮小した。また、今年度,海外学会に発表するよう演題登録を行っていたが,自然災害(火山噴火)の発生により渡航を断念しテレビ会議による学会参加となった。そのための旅費が未使用のまま残された。繰り越した研究費は、当初の予定通り、通信費や印刷費,調査協力施設までの交通費など,介入研究の実施に係る費用,成果発表のための論文掲載料に充てる。
極域光合成生物の適応戦略とその多様性の解明-新規光応答プロセスの探索-

本研究は、南極の陸上環境に大きな群落を形成する気生緑藻ナンキョクカワノリの新規光応答システムに関して、その生理学的特性と生態学的な有用性を明らかにすることを目的としている。ナンキョクカワノリの生育環境を明らかにするため、生育地に無人微気象観測装置(AWS)を設置した。観測項目は、群落周辺の地表面付近の温度、湿度、光量子密度、紫外線強度、4波長分光測定、群落内部の温度である。現地での作業は、第60次日本南極地域観測隊に同行し、2018年12月から1月にかけて東南極地域のラングホブデにて設置作業を行った。設置は無事完了したが、衛星データ通信にトラブルが生じたためデータ取得の方法を変更する必要があった。生理学実験手法を用いた解析では、基礎生物学研究所の大型スペクトログラフを利用し長波長光利用タンパク質(成分710)の発現誘導に関わる波長の解析を行った。クロロフィル蛍光分光測定とウエスタンブロッティングによる抗体反応により発現量の変動を調べたところ、700 nmより長波長で発現の増加が確認された。一方で、400 nmより短波長の光でも一時的な成分710の増加が示唆された。また、先進ゲノム支援による援助を受けて、ナンキョクカワノリの全ゲノム情報取得を目指した解析を開始した。培養株はバクテリアのコンタミが見られたため、抗生物質や多種類の培地条件を組み合わせてコンタミの除去を行った。ロングリードシーケンスを行うためDNA抽出法を検討し、現在シーケンスを進めている。2018年度に予定していた生育微気象観測装置の設置は無事行うことができ、全ての観測項目でデータが蓄積されていることを確認した。ただし、衛星データ通信機器にトラブルがありリアルタイムのデータ取得を行うことができないため、今後のデータ解析に遅れが生じる見込みである。生理学実験においては、成分710の生理学的機能が明らかとなり、発現条件も明らかになりつつある。今後、ゲノム情報と通年の生育微気象データが取得されることで、成分710の生育環境下での発現機構について解析が可能になる。南極の生育地に設置した自動微気象観測装置のデータ回収とメンテナンスを2020年1月に行う。南極での作業は第61次日本南極地域観測隊に依頼する。微気象観測データを解析し、生育環境における温度湿度条件と光質および光量の年変動と日変動を明らかにする。南極の露岩域に広く分布するPrasiola crispaの近赤外線領域に顕著な吸収を持つクロロフィルが結合したタンパク質(成分710)の生理学的特性を明らかにするため、基礎生物学研究所の大型スペクトログラフを用いて光合成酸素発生活性の波長依存性を測定した。その結果、藻体の透過スペクトルとアクションスペクトルの形状はよく一致しており、成分710に吸収された近赤外線が高い励起エネルギーを必要とする光化学系IIを効率良く励起することが明らかとなった。密度勾配遠心法とイオン交換クロマトグラフィーによりP. crispaから成分710を精製し、ペプチド分解後にN末端アミノ酸シーケンスを行うことでアミノ酸配列の一部を特定した。次にP. crispaの培養株を用いて成分710の発現条件を明らかにし、その条件を用いてRNA-seq法による発現変動量解析を行った。cDNAライブラリーの作成は秋田県立大学のバイオテクノロジーセンターに委託した。HiSeqによる次世代シーケンシングで得られたリードからde novoアセンブリを行い、最終的に134,053個のコンティグを得た。発現変動量解析により成分710のタンパク質の発現量と相関が見られたコンティグの中から、アミノ酸シーケンス解析で特定したアミノ酸配列を持つものを検索することで成分710の全アミノ酸配列を推定した。Blast検索の結果、一部の緑藻で相同性の高いタンパク質が登録されていたが、光捕集アンテナタンパク質(LHC)の一種であることまでしか分からなかった。推定されたアミノ酸配列から3次元構造の予測を行ったところ、一般的なLHCタンパク質と同様に3回膜貫通へリックス構造を持つことが明らかになったが、クロロフィルが配位しているアミノ酸残基には違いが見られた。近赤外光吸収成分(成分710)の機能解析は生理学的解析と分子生物学的解析の二方向から行っている。生理学的解析は計画した3つの解析のうち、光合成活性の波長依存性の解析とアミノ酸シーケンス解析の2つを終了した。これらの結果から、成分710の生理生態学的役割について設定した2つの仮説のうち、近赤外線を光合成に利用している可能性が実証された。分子機構の解析はRNA-seqによるタンパク質の発現解析を実施したが、コンタミしていたバクテリアとのキメラ配列が生成するという問題が生じた。しかし、RNA-seqとアミノ酸シーケンスの分析の結果から、第一の目的としていた成分710のアミノ酸配列の特定は達成することができた。

設置は無事完了したが、衛星データ通信にトラブルが生じたためデータ取得の方法を変更する必要があった。生理学実験手法を用いた解析では、基礎生物学研究所の大型スペクトログラフを利用し長波長光利用タンパク質(成分710)の発現誘導に関わる波長の解析を行った。クロロフィル蛍光分光測定とウエスタンブロッティングによる抗体反応により発現量の変動を調べたところ、700 nmより長波長で発現の増加が確認された。一方で、400 nmより短波長の光でも一時的な成分710の増加が示唆された。また、先進ゲノム支援による援助を受けて、ナンキョクカワノリの全ゲノム情報取得を目指した解析を開始した。培養株はバクテリアのコンタミが見られたため、抗生物質や多種類の培地条件を組み合わせてコンタミの除去を行った。ロングリードシーケンスを行うためDNA抽出法を検討し、現在シーケンスを進めている。2018年度に予定していた生育微気象観測装置の設置は無事行うことができ、全ての観測項目でデータが蓄積されていることを確認した。ただし、衛星データ通信機器にトラブルがありリアルタイムのデータ取得を行うことができないため、今後のデータ解析に遅れが生じる見込みである。生理学実験においては、成分710の生理学的機能が明らかとなり、発現条件も明らかになりつつある。今後、ゲノム情報と通年の生育微気象データが取得されることで、成分710の生育環境下での発現機構について解析が可能になる。研究計画の課題3「成分710の極域環境下における生理学的役割の解明」のため、南極の生育環境に微気象観測機器を設置する。測器の組み立ては業者に依頼し、9月までに国立極地研究所の施設を利用して試運転を行う。測器の設置場所は東南極地域のラングホブデにあるP. crispaの群落周辺を予定している。国立極地研究所と日本南極地域観測隊の協力のもと観測器設置とデータの取得を行う。生理学的解析においては、近赤外光吸収成分(成分710)が光捕集アンテナタンパク質の一種であることが明確になったことから、ステート遷移や光エネルギーの熱散逸といった光障害防御機構を担っている可能性を検証していく。分子機構の解析においては、RNA-seq解析の際に起きたキメラ配列の問題解決を試みる。既に報告されているP. crispaのトランスクリプトーム解析データと照合し、成分710の発現に連動して発現量が変化したタンパク質の同定を目指す。また、本種の分子生物学的解析を促進させるため、文部科学省科学研究費助成事業「先進ゲノム支援」に応募しP. crispaのドラフトゲノムの取得と光合成関連遺伝子の特定を目指す。南極の生育地に設置した自動微気象観測装置のデータ回収とメンテナンスを2020年1月に行う。南極での作業は第61次日本南極地域観測隊に依頼する。微気象観測データを解析し、生育環境における温度湿度条件と光質および光量の年変動と日変動を明らかにする。アミノ酸シーケンス解析を外部委託する予定であったが、基礎生物学研究所の共同研究支援を受けて解析することができたため正の差額が生じた。生じた差額は平成30年度に予定している野外調査のための物品費や諸経費に充てる。
次世代シーケンサーによる舌痛症関連唾液ｍｉｃｒｏＲＮＡの探索

本研究では舌痛症患者の唾液中に特異的に存在するmicroRNA (miRNA)の同定を試みた。次世代シーケンサーによるsmall RNA解析では舌痛症患者特有の唾液miRNAは同定できなかったが、マイクロアレイを用いた網羅的発現解析では舌痛症患者由来唾液に共通して存在量が増加するmiRNAを6種類同定した。これらmiRNAは舌痛症の診断に応用できるかもしれない。舌痛症は、器質的な変化が認められないにもかかわらず、舌に慢性的な痛み、しびれ、灼熱感などが生じる病気であるが、その原因については十分に解明されていない。一方、microRNA (miRNA)は癌など様々な疾患の発症に関与していること、また血清などの体液中に安定した状態で存在することが報告されている。そこで、本研究では舌痛症の発症に唾液中のmiRNAが関与していると考え、舌痛症患者の唾液中において特異的に存在量が変動するmiRNAを探索した。抗真菌薬、ビタミン剤、抗うつ薬、漢方薬など薬物療法に抵抗性を示し、かつサクソンテストにより唾液分泌量の低下を認めない舌痛症患者(6名)と同年代同性の健常者(4名)の唾液0.2 mlよりmiRNeasy Mini Kit (Qiagen)を用いてmiRNAを抽出し、マイクロアレイ(Affymetrix)による網羅的発現解析を行った。網羅的発現解析の結果、健常者と比較して舌痛症患者の唾液では、6種類のmiRNAの存在量が著明に上昇していた。前年度の次世代シーケンサーによる網羅的発現解析では舌痛症患者と健常者間に明らかに存在量が変動する唾液miRNAが同定できなかったことから、miRNAの検出感度はマイクロアレイが優っていると考えられた。以上の結果より、舌痛症患者の唾液中のmiRNAは有用なバイオマーカーかつ治療標的となる可能性が示唆された。そこで、本研究では舌痛症の発症に唾液中のmiRNAが関与しているか否かについて検討を試みた。まず、舌痛症患者および健常者の唾液よりmiRNAを抽出し、次世代シーケンサーを用いて唾液中の全てのmiRNAを定性定量解析した。すなわち、抗真菌薬、ビタミン剤、抗うつ薬、漢方薬など薬物療法に抵抗性を示し、かつサクソンテストにより唾液分泌量の低下を認めない舌痛症患者(2名)と同年代同性の健常者(2名)の唾液0.2 mlよりmiRNeasy Mini Kit (Qiagen)を用いてmiRNAを抽出した。つづいて、抽出したmiRNAよりcDNA libraryを作成し、デスクトップ型次世代シーケンサーMiSeq (illumina)にてsmall RNA解析を行った。その結果、ヒト唾液中にはmiR-1246が最も多く、その他約150種類程度のmiRNAが含まれていることが明らかとなった。しかしながら、舌痛症患者と健常者由来の唾液で明らかに異なるmiRNAは検出されなかった。舌痛症患者由来の唾液検体数がまだ十分収集できていない。舌痛症患者の唾液検体数を増やして次世代シーケンサーおよびマイクロアレイにてmiRNAの網羅的発現解析を行う。その結果を定量的RT-PCR (qRT-PCR)法にて検証する。新たに舌痛症患者(30名)と健常者(30名)の唾液よりmiRNAを抽出する。次世代シーケンサーおよびマイクロアレイ解析にて各群の唾液miRNAの正確なプロファイリングを決定する。つづいて、その結果をqRT-PCRにて検証する。最終的に、qRT-PCRにて舌痛症患者に共通かつ特異的に増減する唾液miRNAを舌痛症関連miRNAとして同定する。さらに、これらmiRNAの標的遺伝子と口腔粘膜上皮細胞における機能を探索する。
Ｇｑ蛋白質共役型受容体の細胞内選別輸送機構に関する研究

細胞外N末端及び細胞内C末端を変異させたGq蛋白質共役型ヒト・ヒスタミンH1受容体をCHO細胞に強制発現させ、アゴニスト刺激に伴うH1受容体の細胞内輸送機構を解析した。その結果、細胞外N末端をヘマグルチニンで標識したH1受容体は、ヒスタミン刺激に伴いクラスリン依存性機構によって細胞内に輸送されたが、細胞内C末端のセリン487残基を切除したH1受容体は、ヒスタミン刺激をしても細胞内に輸送されなかった。以上の結果から、H1受容体のC末端は、H1受容体の細胞内輸送に極めて重要な役割を果たしていることが示唆される。Gq蛋白質共役型ヒスタミンH1受容体(H1R)は、中枢から末梢に至るまで広範囲に分布し、覚醒レベル調節や即時型アレルギーなどの各種生理・病態に深く関与している。しかしながら、受容体刺激に伴うH1Rの細胞内Trafficking機構に関する研究は、ほとんど進んでいない。一般に、G蛋白質共役型受容体(GPCR)の細胞内Traffickingにおいて、アレスチンは、GPCRの細胞内C末端に結合することによって、クラスリン被覆小胞の形成に関与するとされる。ここで、H1Rの細胞内C末端は、他のGPCRに比べて極端に短く(17アミノ酸残基)、また、可視化を目的にH1Rの細胞内C末端をGFPで標識したH1Rは、野生型H1Rと異なり、脂質ラフト/カベオラを介した機構によって細胞内に輸送される(Self et al., Br. J. Pharmacol., 146, 612, 2005; Hishinuma et al., J. Neurochem., 113, 990, 2010)。従って、H1受容体のC末端に対するアレスチンの結合親和性が、H1Rの細胞内輸送におけるクラスリン/カベオラ選別輸送に関与する可能性が高いと考えられるが、受容体可視化の目的で細胞内C末端を修飾することは、H1Rの真の細胞内Trafficking機構の解明には不適当と考えられる。そこで、当該年度は、まず、H1Rの細胞外N末端にHAタグをつけた変異H1R(HA-H1R)を作成し、その細胞内Trafficking機構を解析した。その結果、HA-H1Rは、野生型H1Rと同様に、脂質ラフト/カベオラ経路ではなく、クラスリン被覆小胞を介して細胞内に輸送されることが明らかとなった。現在、H1Rの細胞内輸送におけるクラスリン/カベオラ選別機構の詳細を解明する目的で、HA-H1Rの細胞内C末端側の変異受容体を作製中である。アゴニスト刺激に伴うG蛋白質共役型受容体(GPCR)の細胞内輸送には、G蛋白質共役型受容体キナーゼ/アレスチン/クラスリンを介した小胞輸送経路が関与することが知られている。一般に、GPCRの細胞内輸送において、アレスチンは、GPCRの細胞内第3ループ/C末端に結合することによって、クラスリン被覆小胞の形成に関与するとされる。ここで、ヒスタミンH1受容体(H1R)の細胞内C末端は、他のGPCRに比べて極端に短く、また、可視化を目的にH1Rの細胞内C末端をGFPで標識したH1Rは、野生型H1Rと異なり、脂質ラフト/カベオラを介した機構によって細胞内に輸送されることが知られている(Self et al., Br. J. Pharmacol., 146, 612, 2005; Hishinuma et al., J. Neurochem., 113, 990, 2010)。当該研究では、昨年度までに、H1Rの細胞外N末端をHAタグで標識した変異H1R(HA-H1R)を作成し、その細胞内輸送機構を解析した。その結果、HA-H1Rは、野生型H1Rと同様に、クラスリン被覆小胞を介して細胞内に輸送されることが明らかとなった。そこで、今年度は、H1Rの細胞内輸送におけるC末端の役割を明らかにする目的で、HA-H1Rの細胞内C末端変異受容体3種(HA-T478A、HA-S487A、HA-S487trancation)を作製して解析した。その結果、HA-T478A及びHA-S487Aは、野生型H1Rと同様に、アゴニスト刺激に伴いクラスリン被覆小胞を介して細胞内に輸送されること、一方、C末端1残基を切断したH1R(HA-S487trancation)では、細胞内輸送が阻害されることを見出した。従って、H1Rの細胞内C末端は、細胞内輸送に極めて重要な役割を果たしていると考えられる。受容体は生体機能の中心を担う。

当該研究では、G蛋白質共役型受容体の生理的・病理的・薬理的変動機構の解明を目的として、神経系でも免疫系でも重要な役割を果たしているGq蛋白質共役型ヒスタミンH1受容体に焦点を当て、H1受容体の細胞内選別輸送機構を明らかにする。特に、(1) H1受容体のInternalizationにおけるクラスリン/カベオラ選別機構(2) H1受容体のDown-regulationにおけるプロテアソーム/リソソーム選別機構(プロテインキナーゼC/ユビキチン/プロテアソーム経路を介した即時型Down-regulation及びCaMキナーゼII/リソソーム経路を介した遅発型Down-regulation)の解析により、個々の受容体に備えられた細胞内選別輸送機構の詳細を分子レベルで明らかにする。Down-regulationに関与するH1受容体のリン酸化部位として、第2細胞内ループ(Thr140・Thr142)、第3細胞内ループ(Ser396・Ser398)及びC末端(Thr478)の5ヶ所のセリン・スレオニン残基が報告されている。当該年度は、様々なリン酸化酵素によってリン酸化されると推定されている第3細胞内ループSer398に着目し、Ser398をアラニンに置換した変異H1受容体(S398A)発現CHO細胞を用いて解析した。その結果、S398Aは、ヒスタミン30分間刺激に伴いInternalizationは生じるが、即時型Down-regulationは受けないことが明らかとなった。従って、ヒスタミン刺激に伴うSer398のリン酸化が、PKC/ユビキチン/プロテアソーム選別輸送の引き金となり、H1受容体の即時型Down-regulationが誘導される可能性が示唆される。アゴニスト刺激に伴い、細胞表面受容体が細胞内に移行する現象は、受容体の細胞内輸送と呼ばれ、細胞の刺激感受性制御機構の一つと考えられている。Gq蛋白質共役型ヒスタミンH1受容体は、中枢から末梢に至るまで広範囲に分布し、覚醒レベル調節や即時型アレルギーなどの各種生理・病態・薬物治療に密接に関与していることから、H1受容体の細胞内輸送機構の解明は重要な課題である。受容体の細胞内輸送機構には、クラスリン依存性機構とクラスリン非依存性機構がある。我々は既に、アゴニスト刺激に伴うH1受容体の細胞内輸送には、クラスリン依存性機構が関与することを明らかにしているが、当該研究では、C末端の変異H1受容体を用いて解析した結果、クラスリン被覆小胞の形成には、H1受容体のC末端が決定的役割を果たしていることを明らかにした。そこで、当該年度は、クラスリン被覆小胞を介して細胞内に輸送されたH1受容体の局在を、免疫組織染色(共焦点顕微鏡)によって調べた。その結果、H1受容体は、刺激初期に細胞表面から細胞質に拡散した後、トランス・ゴルジネットワークを介して次第にゴルジ装置に局在化することが明らかとなった。本研究は、H1受容体の細胞内輸送機構に新たな知見を提供するものである。一方、我々は、細胞内に輸送されたH1受容体は、プロテアソームで速やかに分解されること(即時型Down-regulation)を報告しているが、N末端をヘマグルチニンで標識したH1受容体は、クラスリン依存性機構によって細胞内に輸送されるものの、即時型Down-regulationを受けないことが明らかとなった。従って、H1受容体のN末端は、Down-regulation機構に関与する可能性が考えられるが、今後、さらなる解析が必要である。受容体薬理学当該研究は、(1) H1受容体のInternalizationにおけるクラスリン/カベオラ選別機構(2) H1受容体のDown-
食物繊維としてのレジスタントスターチ4:栄養・生理機能の評価と作用機構

レジスタントスターチ・タイプ4(RS4)とは加工デンプンのことであり、各種の加工食品に利用されている。本研究では、RS4の消化性、発酵性、血糖およびインスリン応答、糖尿病発症抑制効果、消化管免疫に対する影響ついて検討した。その結果、置換基の付加により、1) RS4の消化性は低下し、発酵性血糖値およびインスリン分泌応答は改善され、その効果は置換基の種類および置換度によって影響された、2) RS4は2型糖尿病モデルマウスにおいて発症を抑制した、3) RS4はIgAの分泌を促進したことなどを明らかになった。本研究からRS4は糖代謝、消化管免疫機能に影響を与えるとともに、低エネルギー食品の開発に有用な素材であることも明確になった。(1)レジスタントスターチ・タイプ4(RS-4)の栄養・生理機能について検討し、食物繊維としての位置付けおよび役割を明らかにする。(2)RS-4の物理的および化学的特性と栄養・生理機能の関係について明らかにする。上記の2項日を達成することにより、新規機能性食品の開発を目指す。1.ヒドロキシプロピルデンプン(HPS)のインスリン抵抗性改善効果2型糖尿病モデルマウス(KKAyマウス)を用い、HPSのインスリン抵抗性改善効果について検討した。HPS(5%,10%)摂取により耐糖能およびインスリン抵抗性改善効果は改善された。HPSの添加量の差は認められなかった(J Food sci.,73(3)H1-H8,2009)。高脂肪飼料下でもHPSに同様の効果が認められた(Nutr Res投稿中)。次に、飼料摂取量またはエネルギー摂取量を対照群と同じにしたところ、HPS摂取のインスリン抵抗性改善効果は認められなくなった。したがって、HPSのインスリン抵抗性改善効果は飼料摂取量・摂取エネルギー量の低下が主たる要因であることが示唆された。HPS摂取による飼料摂取量低下の原因を明らかにするため、飼料摂取量をコントロールしている消化管ホルモンの一つであるグレリンの飼料摂取後の血清濃度の変動を経時的に調べたところ、HPS摂取により胃内容物湿重量は増加し、グレリン濃度は低下していた(投稿準備中)。HPSのインスリン抵抗性改善効果は、ヒドロキシプロピル化度が大きくなるにつれて強くなった。2.ヒドロキシプロピルデンプン(HPS)中の難消化性炭水化物の定量法化学修飾デンプンの消化性実験において、化学修飾の種類と程度により消化性の程度は異なった。しかしながら、難消化性炭水化物の測定は測定法が確立されていないので、実際にはなされていない。そこで、HPS中の難消化性炭水化物の測定法を新たに組み立て、実際に分析を行い、検討し、測定法を提案した(J Food Sci投稿中)。また、この検討の中で、化学修飾デンプン中の難消化性炭水化物の測定においては、個々の化学修飾に応じた分析法が必要であることも明らかになった。3.化学修飾デンプンの脂質代謝に及ぼす影響タピオカデンプン、ハイアミロースコーンデンプンにリン酸架橋、ヒドロキシプロピル化およびその両方の処理を施した化学修飾デンプン6種類を用い、血漿脂質濃度に及ぼす影響を検討した。用いた6種類の化学修飾デンプンはどれも血漿脂質濃度に影響を及ぼさなかった。1)エネルギー代謝:レジスタントスターチ4(加工デンプン)の食品への利用にあたっては、エネルギー評価は欠かせない。架橋デンプンを摂取させたヒトにおける実験で、呼気中に水素ガスが出てこないことにより、架橋デンプンは大腸で発酵されないことを明らかにし、架橋デンプンは発酵により生じるエネルギー量はゼロであり、架橋デンプンのエネルギー量評価は小腸での消化性だけで評価できることを明らかにした。ヒドロキシプロピル化リン酸架橋デンプンについては、排泄物中のヒドロキシプロピル化リン酸架橋デンプンの定量法を確立することにより、エネルギー評価を行った。ヒドロキシプロピル化リン酸架橋デンプンの不消化部分は、全く小腸内で消化および吸収されなかった。エネルギー評価への道筋が明らかにできた。2)糖代謝:糖尿病治療食への応用に際しては、耐糖能評価は欠かせない。架橋デンプン、ヒドロキシプロピル化デンプンが、実験動物だけではなく、ヒトにおいても耐糖性効果を示すことを明らかにした。また、ヒドロキシプロピル化デンプンの耐糖性効果の作用機序を明らかにするために、消化管の運動、インスリン分泌と関連の深い消化管ホルモンについて血中濃度および各消化管部位におけるmRNA発現量を測定した。ヒドロキシプロピル化デンプンの耐糖性効果は、特にCCKと関わりの深いことを明らかにした。加工デンプンの消化性は耐糖性試験によるIAUCの測定により評価できることを明らかにした。高脂肪飼料摂取時にもヒドロキシプロピル化リン酸架橋デンプンは糖尿病発症遅延効果を示すことがKKAyマウスを用いた実験で示された。

糖尿病治療応用のための基礎的知見の蓄積ができ、応用への可能性が明らかになった。3)消化管機能:消化管免疫、特にIgAの分泌に関して、水溶性のものについては粘度、非水溶性のものについては添加量とに関連性の深いことが示唆された。1)エネルギー代謝:エネルギー代謝においては、消化率および盲腸発酵物である短鎖脂肪酸について詳細に検討することが必要である。消化率の検討にあたっては、in vitroの結果とin vivoの結果が必ずしも一致しないことが多々あった。実験条件等を詳細に検討した結果、消化率測定までの食餌歴が大きく影響を及ぼすことを明らかにし、レジスタントスターチ4の消化率をin vivoで測定し、より正確な消化率の測定ができるようにした。短鎖脂肪酸を介してのエネルギー値については、新たに装置を考案し、それを用いて測定し、より正確なエネルギー値が求めることが可能になった。2)糖代謝:これまで糖尿病モデルマウスマウスKKAyにおいて、レジスタントスターチ4が糖尿病予防効果のあることを見いだし、報告してきたが、ヒトにおいての検討はしてこなかった。今回、ヒトにも同様の効果がみられるかを耐糖能改善効果の面から検討を行い、効果のあることを確認した。糖代謝に関しては胃内容物の滞留時間およびインクレチンの関与を明らかにした。胃内容物滞留時間は回腸および結腸ブレーキによる消化管ホルモン分泌を介して行われている可能性を示唆する結果を得た。また、小腸および大腸の粘膜形態に及ぼす影響についても検討し、レジスタントスターチ4が小腸および大腸の粘膜の正常化に関与していることを明らかにした。ヒドロキシプロピル化高アミロースデンプン、置換度を変えたヒドロキシプロピル化タピオカデンプンおよびアセチル化タピオカデンプン、アセチル化リン酸架橋タピオカデンプンについて、特に発酵性および消化管免疫の面から栄養・生理機能について検討した。1)高アミローススターチはヒドロキシプロピル化することにより、呼気排泄水素量、盲腸内容物中の短鎖脂肪酸量は減少し、発酵性が低下した。コハク酸の量も有意に低下し、盲腸内細菌のプロフィールも相同性は20%に低下し、ヒドロキシプロピル化は腸内細菌叢に影響を与えた。回-直腸吻合ラットを用い、デンプンの見かけの消化率は有意に低下し、消化性も低下することが認められた。盲腸内容物中IgA含量も増加した。2)通常タピオカデンプンのヒドロキシプロピル化は置換度の増加に伴い消化性は低下し、小腸および盲腸内容物中のIgA量は増加した。呼気排泄水素量は置換度に伴い増加するが、最も置換度の高いものではむしろ低下した。3)アセチル化デンプンおよびアセチル化リン酸架橋タピオカデンプンは、糊化前には消化抵抗性を示したが、糊化により消化抵抗性は失われ、耐糖性改善効果も認められなかった。盲腸内容物中の短鎖脂肪酸量は、アセチル化およびアセチル化リン酸架橋により増加した。
第6染色体短腕に存在する潰瘍性大腸炎感受性遺伝子の同定

99年同胞罹患対を用いた疾患連鎖解析にて,潰瘍性大腸炎を含む炎症性腸疾患感受性遺伝子が染色体6番短腕に存在することが明らかとされた(Am J Hum Gene, 1999).この染色体6番短腕(座位名:IBD3)の感受性領域は,約16Mbの広範なゲノム領域であり,直ぐに感受性遺伝子を同定できるほど狭い領域ではなっかった.そこで本申請者らはマイクロサテライトマーカーを(平均0.6Mb間隔)用いて連鎖不平衡マッピングを行い,さらにHLA,SNPをマーカーとして追加し,本疾患の感受性遺伝子座位を約0.3Mbまで絞り込むことに成功した.そこで、特定された0.3Mbのハプロタイプについてシークエンス及び相関解析を行い,潰瘍性大腸炎の感受性遺伝子を同定することを目的とした.その結果、Butyrophilin-like 2 gene、HLA-DRB1 gene,HLA-B geneが、感受性遺伝子候補として残り、解析した結果、最も強い相関を示した遺伝子はHLA-B遺伝子であった。またHLA-Bの中でも、HLA-B*52が正の相関を示していた。一方、HLA-DRB1遺伝子については、疾患感受性遺伝子ではなかったものの、潰瘍性大腸炎の病型に影響を与える疾患修飾遺伝子であったことが明らかとなった。またHLA-Bの各種対立遺伝子は全く潰瘍性大腸炎の表現型との関連は認められなかった。このことより、疾患感受性遺伝子はHLA-B、疾患修飾遺伝子はHLA-DRB1と考えるのが妥当という結果になった。'99年同胞罹患対を用いた疾患連鎖解析にて,潰瘍性大腸炎を含む炎症性腸疾患感受性遺伝子が染色体6番短腕に存在することが明らかとされた(Am J Hum Gene,1999).この染色体6番短腕(座位名:IBD3)の感受性領域は,約16Mbの広範なゲノム領域であり,直ぐに感受性遺伝子を同定できるほど狭い領域ではなっかった.そこで本申請者らはマイクロサテライトマーカーを(平均0.6Mb間隔)用いて連鎖不平衡マッピングを行い,さらにHLA, SNPをマーカーとして追加し,本疾患の感受性遺伝子座位を約0.3Mbまで絞り込むことに成功した.そこで、特定された0.3Mbのハプロタイプについて全シークエンス及び相関解析を行い,潰瘍性大腸炎の感受性遺伝子を同定することを目的とした.平成17年度は,HLA-DRB1*1502-MICA*009-HLA-B*52-C2-4-4・allele239のハプロタイプをホモ接合にもつ日本人潰瘍性大腸炎患者2名をPool DNAとしてsample No.1,さらに前記ハプロタイプを持たないHLA-B51-C2-4-4・allele235をホモ接合にもつ健常対照者2名をPool DNAとしてsample No.2として,この2検体について全シークエンシングを行っていた.なお基準となるreference sequenceは,HLA-DR15-Cw7-B7-A3(Genome Research 2004)とした.このDNA sample No.1,2を用いて,HLA-B-C2-4-4領域約0.3MbをDyeTerminator法にてすべて直接シークェンスしている.HLA-B-C2-4-4領域約0.3Mbの配列を,約600bずつのフラグメント単位に分割し,MJ Research社DNA Engine PTC-2000を用いてPCRにて増幅している.PCRプライマーの設計には,独自開発のソフトウエアを使用した.得られたPCR産物は,Millipore Multiscreen-PCRキットを用いて精製されたのち,5'側および3'側の2方向よりシークエンスプライマーを設定し,ABI BigDye Terminatorを用いてサイクルシークエンス反応を行っている.その後,SIGMA Sephadex G50およびMillipore Multi Screen-HV, Clear platesを用いて再度精製している.