hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
慢性肝炎モデルマウスの作製ー複製因子の同定

実験計画では、転写活性が存在しないことを想定していたが、50 bpのPol I promoterでも転写活性があることがわかった。蔗糖密度勾配法でウイルスの密度を測定した所、所定の密度であった。感染性をHuH7.5.1細胞を用いて、測定してみると、ほとんどの細胞で抗Core抗体で陽性を示した結果が得られた。阻害剤を用いて、HCV genome RNAが複製をするかどうかを検討した結果、RNA copy数が3分の1に減少した。このことは、複製がおこっていることを示している。つまり、マウス複製因子でHCVゲノムRNAの複製は可能であり、ヒト複製因子が必須ではないことが判明した。HCVゲノムトランスジェニック(HCV Tg)マウスは最もコピー数が多いマウスをA系統、次がB系統と名付けた。A, B系統のマウスの肝細胞内HCV RNAコピー数は10,000/ug RNA代であり、血液中は1,000,000 copy/ml serum代である。血液中のウイルスをRNase処理した後、蔗糖密度勾配法でウイルスを分離したところ、ウイルスの密度に相当する分画にRNA copyのピークが観察された。また、この分画をヒトHuh7.5.1細胞に感染させると、細胞内にCore蛋白質が免疫染色にて同定された。Pol I promoterにより転写されるHCV RNAが複製されているかどうかを検討するために、複製阻害剤のBMS790052を投与すると、肝細胞内HCV RNAのコピー数は約3分の1になり、血液中のウイルスは約3分の1まで減少した。このことから、Pol I promoterにより作製されたHCV RNAは自ら産生したNS蛋白質によりマウス肝細胞内でもゲノムRNAの複製が起こっていることが判明した。このことは、マウス肝細胞のもつ蛋白質でHCVウイルスの複製は起こることが示され、ヒト特有の因子は必要ないことが示された。つまり、HCVがマウス肝細胞に感染しないのは、感染に関わる蛋白質がヒト特有であり、相当するマウス蛋白質とのアミノ酸配列が異なるために、ウイルス侵入に対する機能的な差が生じていると結論できた。C型肝炎ウイルス(HCV)は感染すると慢性肝炎となり、肝硬変、肝癌を高頻度におこす厄介な病原体である。しかし、モデル小動物がないため、HCVの感染過程、複製過程、粒子形成過程について多々わかっていないこtがある。今回、HCVの複製について研究する。そのために、Pol I promotor-HCV genome cDNA-Pol I terminatorをマウス受精卵に微小注射して、トランスジェニックマウスを作成し、15種得た。マウス尻尾から抽出したDNAを用いたサザンブロット解析した。X線フィルムに出たシグナルによりコピー数の多い方から、A系統、B系統、ーと名前を付けた。すべての系統を維持することは不可能なので、コピー数の多い系統を実験に使用した。マウス肝細胞の抽出液をウエスタンブロットすると、HCV Core蛋白質が検出された。また、肝細胞からRNAを抽出し、HCV RNAを測定してみると1,000,000 copy/liverぐらい検出できた。血液の採取は眼の内側の静脈叢から行った。血液中のHCV RNAをqRT-PCR法で測定すると、A系統が最大で、次にB系統というように、大体ゲノムコピー数に比例関係があった。血液を蔗糖密度勾配遠心にて分画するとHCVの密度の分画にRNAが検出された。今後、血液中のウイルスが感染性をもつかどうかを検定する予定である。また、E1/E2蛋白質が感染に関与していることは抗E2抗体や抗CD81抗体を用いて、証明する予定である。さらに、ウイルス粒子を形成している証明は電子顕微鏡で行う。コンディショナルHCV genomeトランスジェニックマウスの作成に成功した。数十コピー/パプロイドから数コピー/ハプロイドまで多様なトランスジェニックマウスが得られた。マウス血液中にウイルス様の物質が存在しており、その特徴を明らかにすれば慢性肝炎の解明に役立つと思われる。今後、血液中のウイルス様物質が感染性をもつかどうかを検定する予定である。マウス肝細胞で作られたgenome RNAが」複製をするか否かを決定するために、RNase protection法を用いる。具体的には、HCV genome cDNAの鋳型からP32ラベルしたsense RNAをT7 polymeraseを用いて作成する。これと肝細胞からのRNAをhybridizeさせた後、RNaseによる消化を行い、保護されたラベルRNAを電気泳動にて検出する。複製が観察された場合、マウス肝臓でも複製は可能ということが判明する。
骨系統疾患由来の変異型受容体の解析に基づく骨代謝機序の解明

進行性骨化線維異形成症(Fibrodysplasia Ossifications Progressiva;FOP)は全身の骨格筋で内軟骨性骨化によって異所性骨が形成される難治疾患である。この疾患はBMPのI型受容体である変異ALK2(R206H)の過剰なBMPシグナルの活性化により異所性骨化が誘導されると考えられている。そこで、我々は誘導性にヒトALK2(R206H)を発現するTgマウスを樹立し、このマウスの骨格筋組織から単核細胞を分離しin vitroで解析を行った。本研究により、我々はin vitroで骨格筋組織由来細胞を使用した新しい実験系を樹立する事に成功した新しい実験系を確立した。進行性骨化線維異形成症(Fibrodysplasia Ossifications Progressiva;FOP)は全身の骨格筋で異所性骨が形成される難治疾患である。典型的FOPでは筋損傷が急激な異所性骨形成を誘導するため、バイオプシーや手術などの侵襲的医療行為が禁忌であり、異所性骨形成における組織学的な研究が困難である。これはBMPのI型受容体である変異ALK2(R206H)の活性異常が原因とされている。そこで、新たにCre-loxPシステムで誘導性にヒトALK2(R206H)を発現するTgマウスを樹立した。このマウスの後肢骨格筋組織から単核細胞を分離し、以下の実験に使用した。調節した細胞にCre DNA組換え酵素を発現するアデノウイルスを感染させる事で、mRNAおよびタンパクレベルでウイルスの用量依存的にヒトALK2(R206H)の発現を誘導させた。そして、ALK2の下流の転写因子Smad1/5を解析したところ、Smad1/5のリン酸化が誘導された。さらに、BMPの初期応答因子であるId1,Id2遺伝子の発現上昇も認められた。本研究によりin vitroでヒトALK2(R206H)による細胞内シグナルを解析できる新しい実験系を樹立することに成功した。また、近年様々な変異ALK2を持つ非典型的FOP患者が報告されている。我々は筋芽細胞C2C12細胞に典型的ヒトALK2 (R206H)または非典型的ヒトALK2 (G325A)をII型受容体と共発現させる事でFOPの発症メカニズムを解析した。典型的ヒトALK2(R206H)はBMPR-IIで活性されるのに対し、非典型的ヒトALK2 (G325A)は別のII型受容体であるActR-IIBにより活性化された。これよりII型受容体による変異ALK2の活性が、FOPにおける症状の多様性に関与する事が示唆された。また、我々は筋芽細胞C2C12細胞に典型的ヒトALK2 (R206H)または非典型ヒトALK2 (G325A)をII型受容体と共発現させる事でFOPの発症メカニズムを解析した。典型的ヒトALK2 (R206H)はBMPR-IIで活性されるのに対し、非典型ヒトALK2 (G325A)は別のII型受容体であるActR-IIBにより活性化された。これよりII型受容体による変異ALK2の活性が、FOPにおける症状の多様性に関与すると考えられた。この知見は今後のFOPの発症機序の解析や治療方法の開発に大きく貢献するものと期待される。骨疾患我々は典型的FOP発生機序解析のためのCre-loxPシステムで誘導性にヒトALK2(R206H)を発現するTgマウスを樹立し、in vitroでのFOPの実験系を確立した。これによりFOPを細胞、分子レベルで解析することが可能となった。この実験系によりヒトALK2(R206H)を発現する骨格筋組織由来細胞でBMPシグナルが亢進する事が確認できた。これはFOP患者での異所性骨形成には骨格筋組織に由来する単核細胞が強く関与することを明らかにするものである。

また、典型的FOPと非典型的FOP症例から同定された2種類のALK2変異体の解析より、それぞれのALK2が異なるBMPのII型受容体によって活性化される事も見出した。この結果から、変異型ALK2のみならずBMPのII型受容体がFOP発症や症状の多様性に重要な役割を担うものと考えられ、この知見は今後のFOPの発症機序の解析や治療方法の開発に大きく貢献するものと期待される。前年度の結果より、FOP患者では骨格筋組織由来の単核細胞が異所性骨誘導に関与することが示唆された。今年度では、これらのヒトALK2(R206H)の発現細胞を解析するために、FACSによって標的細胞を単離し、in vitroにおける骨、軟骨及び脂肪細胞分化能の評価を行う事で異所性骨を誘導する細胞の同定を行う。そして、この同定した細胞を免疫不全マウスに移植し、異所性骨の形成の有無を確認する。また、BMPR-IIによる典型的ALK2変異体の活性化がFOPの発症に寄与する事から、BMPR-IIによるALK2のリン酸化を阻害する化合物はFOPの予防、及び治療薬になると考えられる。よってALK2リン酸化阻害剤のスクリーニングを行い、FOP治療薬なりうる化合物の同定を行う。平成25年度にアメリカ骨代謝学会(バルチモア)で発表予定であったが、発表を行わなかったため。ヒトALK2(R206H)の発現細胞の詳細な解析のための試薬購入費として使用する。
生物輸送管ネットワークの適応過程に着想したネットワーク最適化

本研究では原始的な生物である真正粘菌変形体(以下、粘菌と呼ぶ)から着想を得た粘菌アルゴリズムを応用して、電力ネットワークのように需要量と供給量が変動する条件での最適ネットワーク設計を目的とする。前年度の研究では、粘菌アルゴリズムにより得られた小規模ネットワークのパラメータ依存性について、ネットワークのトポロジーと評価関数(電力損失、コスト、脆弱性)を中心に議論した。そして、このパラメータ依存性について、単純なネットワークを対象にして線形安定性解析と吸引域計算により数理的解析を行った。今年度は、需要量一定の条件において粘菌アルゴリズムを適用したネットワーク設計やネットワークトポロジーに依存した電力損失の計算を行い、粘菌アルゴリズムを用いた需要量変動条件下でのネットワーク設計の利点を示した。今年度は新たに中・大規模ネットワークの設計にも着手した。一般的な配電ネットワークを想定したモデルを対象にして粘菌アルゴリズムを応用したネットワーク設計を行った。これまでの研究ではランダムメッシュなネットワークを初期状態として変電所と需要家を繋ぐネットワーク形態を計算していた。しかし、対象モデルでは座標データが与えられていないため、変電所と各需要家を結ぶネットワーク形態を計算することができない。そこで、配電網に設置された開閉器のON/OFF状態を粘菌アルゴリズムにより決定することで、電力損失最小となるネットワーク設計を目指した。配電網を設計する際には三つの制約条件(樹状制約、電圧降下制約、線路容量制約)を満たす必要がある。粘菌アルゴリズムの成長パラメータμを大きな値(μ>1)に設定して計算することで樹状制約を満たす設計は可能となった。今後、電圧降下制約、線路容量制約を克服することが出来れば、粘菌アルゴリズムが実際の配電網設計に応用可能であることを示せる。需要量一定条件の導入やネットワークトポロジーに依存した電力損失の計算により粘菌アルゴリズムを用いた需要量変動条件下でのネットワーク設計の利点を示すことができた。しかし、中・大規模ネットワークにおける電力網設計は着手するに留まり、制約条件の克服することができず解析が十分に進められなかったため。今後は配電網における制約条件を考慮した上で粘菌アルゴリズムを応用した配電ネットワーク設計を行う。課題として電圧降下制約、線路容量制約の克服が残っている。電圧降下制約については需要家における電圧を予め固定して計算することで解決を試みる。線路容量制約については成長関数を変更することで解決を試みる。粘菌アルゴリズムの特性上、上記の対応策で十分には解決できない場合も想定される。その場合は粘菌アルゴリズムを用いたネットワーク設計を複数回行った後、得られたネットワークの中から制約条件を満たすもののみを抽出することでアルゴリズムの評価を行う。本研究の目的は生物の輸送管ネットワークに着想したアルゴリズムを応用して最適電力網設計を行うことである.今年度は電力消費量が変動する小規模な系でのシミュレーションと分析を行った.計画では中・大規模ネットワークでの数値計算も行う予定であったが,より単純な系での数理的な解析を重点的に行った.発電所1つと需要家2つにより構成された系で電力消費量が位相差を伴って正弦振動した場合の電力網設計を行った.数値計算により得られたネットワーク形態について,ネットワークの成長に関わるパラメータμと需要家間の位相差φという2つのパラメータに対する依存性を調べた.成長パラメータμが小さい場合はネットワークがメッシュ状になり,大きい場合は樹状になるという傾向が得られた.ネットワーク形態の位相差φ依存性についても新たに発見できた.特にμが大きい場合,φ=0(同位相)に近いとネットワークはV字型(発電所から各需要家までの電線が独立している)に形成され,φ=π(逆位相)に近いとY字型(発電所から各需要家までの電線が共通部分を持つ)に形成される傾向があるということがわかった.電力損失,材料費,脆弱性の評価関数を定義して得られたネットワークに適用した.その結果,評価関数のバランスが良いネットワークはμ=1.5辺りで得られることなどがわかった.ネットワーク形態のパラメータ依存性を数理的に理解するために,ネットワークサイズを小さくした系で定常解の安定性解析と吸引域計算を行った.その結果,成長パラメータμ≦1のときに単安定となり,μ>1のときに多重安定となることや位相差φ依存性が吸引域の差異によるものであることなどがわかった.以上の結果によりアルゴリズムをネットワーク設計に適用する際のパラメータ設定の基準が明らかになった.今年度で達成できなかった中・大規模ネットワークについては今後研究を進める.本研究では原始的な生物である真正粘菌変形体(以下、粘菌と呼ぶ)から着想を得た粘菌アルゴリズムを応用して、電力ネットワークのように需要量と供給量が変動する条件での最適ネットワーク設計を目的とする。

そこで、配電網に設置された開閉器のON/OFF状態を粘菌アルゴリズムにより決定することで、電力損失最小となるネットワーク設計を目指した。配電網を設計する際には三つの制約条件(樹状制約、電圧降下制約、線路容量制約)を満たす必要がある。粘菌アルゴリズムの成長パラメータμを大きな値(μ>1)に設定して計算することで樹状制約を満たす設計は可能となった。今後、電圧降下制約、線路容量制約を克服することが出来れば、粘菌アルゴリズムが実際の配電網設計に応用可能であることを示せる。計画通り小規模な系における電力消費量の変動を考慮したネットワーク設計を行い,得られたネットワークのパラメータ依存性およびその特徴を分析することができたため,中・大規模ネットワークにおける電力網設計は未達成であるが,単純なネットワークにおける平衡解の線形安定性解析と吸引域計算による数理的解析を重点的に進めることができたため.需要量一定条件の導入やネットワークトポロジーに依存した電力損失の計算により粘菌アルゴリズムを用いた需要量変動条件下でのネットワーク設計の利点を示すことができた。しかし、中・大規模ネットワークにおける電力網設計は着手するに留まり、制約条件の克服することができず解析が十分に進められなかったため。未達成となっている中・大規模ネットワークにおけるシミュレーションを行う.得られたネットワークについて,電力損失,材料費,脆弱性を表す評価関数を用いて評価を行う.複数の需要家を設置するため位相差というパラメータでは分析が困難になる.そこで,位相差のばらつき度合いを測るオーダーパラメータを導入する.発展的な課題として,週・年周期で需要量が変動する系や需要家毎に変動量の最大値が異なる系でのシミュレーションを行い,日変動させた場合や変動量の最大値が一様な場合での計算結果との比較を行う.現実系により近いシミュレーションを行うために各需要家の消費電力の時系列データを用いてアルゴリズムの有用性を検証する.今後は配電網における制約条件を考慮した上で粘菌アルゴリズムを応用した配電ネットワーク設計を行う。課題として電圧降下制約、線路容量制約の克服が残っている。電圧降下制約については需要家における電圧を予め固定して計算することで解決を試みる。線路容量制約については成長関数を変更することで解決を試みる。粘菌アルゴリズムの特性上、上記の対応策で十分には解決できない場合も想定される。その場合は粘菌アルゴリズムを用いたネットワーク設計を複数回行った後、得られたネットワークの中から制約条件を満たすもののみを抽出することでアルゴリズムの評価を行う。
スリングエクササイズによる大腰筋の変化が疾走能力に与える影響

本研究は,スリングエクササイズトレーニング(ST)が大腰筋の筋形態,股関節屈曲トルクおよび最大疾走速度に与える影響を明らかにすることを目的とした.陸上競技短距離および跳躍選手45名を,通常のトレーニングに加え,STを10週間実施する群(TR)と,通常のトレーニングのみを実施する群(CON)に分けた.その結果,TRでは大腰筋横断面積,股関節屈曲筋力および最大疾走速度は有意に増加した.一方,CONでは,股関節屈曲トルクは有意に減少し,その他の項目に有意な変化はなかった.本研究の結果は,通常のトレーニングにSTを加えることで,股関節屈曲筋群の機能改善を促し,疾走能力を改善することが明らかとなった.我が国の100m走の日本記録は、17年前に10秒00が記録されてから長い間更新されていない。そのようなことから、日本人選手と9秒台の記録を持つ選手との差について、さまざまな視点から検討が行われており、近年、両選手の大きな差の一つとして、大腰筋が注目されている。大腰筋は、体幹部と下肢をつなぐ唯一の筋であり、横断的研究において、短距離疾走能力の高い選手ほど、大腰筋が大きいことが示されている。競技スポーツ現場では、大腰筋の力発揮能力の増大を目的としてスリングエクササイズが実施されている。一方で、そのトレーニングが大腰筋の筋形態および筋機能が増大させるという報告は見当たらず、疾走能力に与える影響についても検討されていない。それらのことを明らかにすることができれば、我が国の陸上競技短距離走の競技力向上の底上げに寄与し、有用なトレーニング処方を提案できる可能性がある。そこで本研究は、スリングエクササイズによる大腰筋の筋形態および股関節屈曲筋力の変化が疾走能力に与える影響を明らかにすることを目的とした。被検者は,大学男子短距離選手21名とした.本研究では、スリングエクササイズを週3回の頻度で12週間連続して実施した。被検者には、足部を専用のベルトにかけ、宙吊りの状態から股関節と膝関節を屈曲し、踵にタッチする動作を10回3セット行わせた。スリングエクササイズ中の負荷は、自重負荷を用いて実施した。測定項目は,大腰筋筋断面積,等尺性および等速性股関節屈曲トルクおよび疾走パフォーマンスであった.スリングエクササイズによるトレーニングの結果,大腰筋筋断面積および等尺性および等速性股関節屈曲トルクおよびスプリントパフォーマンスに改善がみられた.以上のことから,スリングエクササイズによるトレーニングは股関節屈曲筋群を改善させ,疾走能力を向上させうることが明らかとなった.当初予定した研究計画が,おおむね達成できているため.我が国の100m走の日本記録は,18年前に10秒00が記録されてから長い間更新されていない.日本人選手と9秒台の記録を持つ選手との差について,さまざまな視点から検討が行われており,近年,両選手の大きな差の一つとして,大腰筋が注目されている.競技スポーツ現場では,大腰筋の力発揮能力の増大を目的としてスリングエクササイズが実施されている.しかしながら,そのトレーニングが実際に大腰筋および短距離疾走能力に与える影響については検討がなされていない.それらのことを明らかにすることができれば,我が国の陸上競技短距離走の競技力向上の底上げに寄与する有用なトレーニング手段を提供できると考えられる.そこで本研究は,スリングエクササイズが大腰筋の筋形態および筋機能に及ぼす影響を明らかにし,そのうえで短距離疾走能力に与える影響を検討することとした.被検者は,大学男子陸上競技短距離,跳躍および混成選手41名であった.被検者は,通常のトレーニングに加え,スリングエクササイズを実施する群(Tr群)と通常のトレーニングのみを実施する群(Con群)に分けた.Tr群では,週3回の頻度で12週間連続でスリングエクササイズを実施した.スリングエクササイズは,足部を専用のベルトにかけ,宙吊りの状態から股関節および膝関節の屈曲によって動作を遂行するものであった.測定項目は,大腰筋の筋横断面積,等尺性および等速性股関節屈曲筋力,最大疾走速度とし,トレーニング期間前および後において測定を実施した.本研究の結果,Tr群では,大腰筋の筋横断面積,等尺性および等速性股関節屈曲筋力,最大疾走速度において有意な増大が認められた.一方,Con群ではすべての項目において有意な変化は認められなかった.以上のことから,スリングエクササイズは大腰筋の筋形態および筋機能を改善させ,疾走能力を向上させうることが明らかとなった.本研究は,スリングエクササイズトレーニング(ST)が大腰筋の筋形態,股関節屈曲トルクおよび最大疾走速度に与える影響を明らかにすることを目的とした.陸上競技短距離および跳躍選手45名を,通常のトレーニングに加え,STを10週間実施する群(TR)と,通常のトレーニングのみを実施する群(CON)に分けた.その結果,TRでは大腰筋横断面積,股関節屈曲筋力および最大疾走速度は有意に増加した.一方,CONでは,股関節屈曲トルクは有意に減少し,その他の項目に有意な変化はなかった.本研究の結果は,通常のトレーニングにSTを加えることで,股関節屈曲筋群の機能改善を促し,疾走能力を改善することが明らかとなった.平成27年度において,トレーニング群の結果を取得することができたため,平成28年度はコントロール群の結果について取得することとする.また,トレーニング群においても分析中の項目があるため,平成28年度中にすべての分析項目について解析を行う.28年度が最終年度であるため、記入しない。スポーツバイオメカニクス,運動生理学28年度が最終年度であるため、記入しない。
宇宙高精度ガンマ線撮像観測に向けた半導体撮像検出器の開発研究

本研究では、ラインガンマ線の高精度な撮像、集光観測を目的に、高い位置分解能とエネルギー分解能を持った半導体撮像検出器として、テルル化カドミウム半導体(CdTe)両面ストリップ検出器の開発、研究を行なった。世界に先駆けて、数100μmの位置分解能、1-2keVのエネルギー分解能、3.2cm角という大面積を併せ持つCdTe半導体両面ストリップ検出器を実現し、確立した。また、小型コーデッドマスクカメラ、Si/CdTe半導体コンプトンカメラへの適用を行い、ガンマ線イメージングを実証した。本研究では、ラインガンマ線の高精度な撮像、集光観測に向けて、高い位置分解能とエネルギー分解能を持った半導体検出器の開発、研究を行っている。本年度は、まず、ストリップ間隔60μm、ストリップ数128のCdTe両面ストリップ検出器の試作に取り組んだ。CdTe半導体は、もろく柔らかいため、シリコンストリップ検出器で適用できるワイヤーボンディング技術が使えず、ストリップ電極と読み出しLSIの接続に工夫が必要である。すでに開発済みのストリップ間隔400μmの検出器では、貫通導線と配線を持ったセラミック基板と我々がCdTeピクセル検出器向けに開発した金バンプ接合技術を組み合わせ、さらにセラミック基板にワイヤーボンディングすることで、この接続を実現。ていた。しかし、60μm間隔では、セラミック基板上に形成することが可能な配線の幅、間隔に限界のため、新たな素材での基板開発を行い、その基板による金バンプ接合技術を確立した。新たな試作検出器の製作を現在、行っており、平成22年度に、測定実験を行う。また、ストリップ間隔400μmのCdTe半導体両面ストリップ検出器の測定実験を行う中で、CdTe半導体両面ストリップ検出器ならでは、検出器応答を発見した。そして、CdTe半導体内でのキャリアの移動と両面ストリップ電極への誘導電荷の振る舞いを模擬できるシミュレーションコードを開発し、その検出器応答を再現できるようになった。今後、このコードを利用し、様々なストリップ間隔の検出器での応答を調べ、電極パラメータの最適化、データ処理方法の開発を行っていく。10keVから数MeVでの高感度のガンマ線宇宙観測を目指し、高精度のガンマ線撮像型検出器の開発研究を進めている。本研究では、テルル化カドミウム(CdTe)半導体検出器、および、アナログLSIを読み出しに用いた多チャンネル検出器を発展させ、50-200μmという位置分解能を持つCdTe両面ストリップ検出器の実現を目的としている。本年度は、3.2cm角と大きな撮像面積を持ち、250μmのストリップピッチを持つCdTe両面ストリップ検出器の設計を完了し、製作方法を確立した。さらに、これらの製作したCdTe両面ストリップ検出器を用いて、詳細な動作試験を行うことができた。動作試験では、FWHM1-2keVの優れたエネルギー分解能と、均質な性能を得られることを確認した。測定データを詳細に解析し、複数ストリップにまたがるイベントと一つのストリップにのみエネルギーを検出したイベントの割合を使うことで、ストリップピッチの250μmより優れた200μm以下という位置分解能を得ることができることが分かった。さらに、1週間、連続で動作させる長期測定を実施し、性能の変化を測定した。結果として、変化の割合は、1週間で1%以下と小さく、さらにバイアス高電圧印可のオペレーションを工夫することで1ヶ月や1年間という長時間、性能の変化を小さく抑えたまま測定できることを実証した。これは、実際に宇宙観測を行う場合、非常に重要であり、両面ストリップ型のCdTe半導体検出器では、初めて、実証することができた。10keVから数MeVでの高感度のガンマ線宇宙観測を目指し、高精度のガンマ線撮像型検出器の開発研究を進めてきた。本年度は、昨年度までに確立した撮像面積3.2cm角、ストリップピッチ250μmのCdTe両面ストリップ検出器を複数製作し、それらの詳細な評価試験を行った。撮像領域内での詳細な応答を調べるために、SPring8の硬X線ビームラインを用いて、スキャン実験を行った。硬X線ビームを6μm角にスリットで絞り、10μm間隔で、各検出位置でのデータを取得し、波高値の均一性、2つのストリップにまたがるイベントの割合、陰極ストリップと陽極ストリップの相関、といった検出器の応答の実測値を得た。また、これを基に、検出器シミュレータの構築と調整を行い、実際の応答を再現できるようになった。これは、高感度観測を行う上で欠かすことができない。コーデッドマスクカメラやコンプトンカメラとしての実証試験を行った。

コーデッドマスクカメラでは、CdTe両面ストリップ検出器の高い位置分解能を生かすことで、400μmピッチの微細なマスクとの組み合わせが可能になり、10cm程度のコンパクトなカメラが実現した。ガンマ線源を用いて測定を行い、30cm先で、50μmの位置決定精度が達成できることを実証した。コンプトンカメラでは、同じ構成のシリコン両面ストリップ検出器と積層して、Si/CdTe半導体コンプトンカメラとして動作させ、測定試験を行った。180°にわたる広視野と優れたエネルギー分解能、角度分解能を実証することができた。
シグマトロピー転位-環拡大反応:遷移状態の定量的解析法の研究と天然物合成への応用

シグマトロピー転位は,(E)-二重結合を立体選択的に合成する方法として広く知られ,有機合成に活用されてきた。しかし,シグマトロピー転位によって(Z)-二重結合を生成しようとする試みは,今までほとんど行われることはなかった。我々は,硫黄原子を含むアリルチオノカーボネートがたやすく転位反応を起こすことを用いて,反応系に生成する8員環アリルチオノカーボネートの[3,3]シグマトロピー転位がチェア型及びボート型の二つの遷移状態を明確に区別して生成物の10員環化合物中に(Z)あるいは(E)-二重結合のどちらか一方のみを高収率で生成する方法を見いだした。我々は,本反応の遷移状態を分子力学(MM)及び分子軌道法(MO)計算を組み合わせ,そこに有機化学的に妥当とする仮定を加えることにより簡便に遷移状態の近似の構造とエネルギーを求める方法を考案し,計算結果によって得られた遷移状態と実験事実によって導かれた遷移状態が本質的に同一のものであることを確かめた。一方で我々はこの反応を有機合成の場で応用することを計り,イソプロピル基を持つ3置換シス-オレフィン構造を持つ(-)-Yellow Scale Pheromone(きまるかいがらむしの性フェロモン)の立体選択的合成を試みた。最終的に出来上がった合成ルートは効率よく進行し,合成化学的にも中環状化合物を合成中間体とするなどユニークなものとなっている。本転位反応を三重結合を持つ反応基質に適用すると中環状アレン化合物を容易に与えることが明らかとなった。この場合,生成物のリングサイズに係わらず反応はスムーズに進行するという特徴を持ち8員環から11員環に及ぶ新しいタイプの中環状アレン化合物を容易に合成することができた。我々は,Eーオレフィンを持つジオールモノチオノカーボネートE-1を塩基で処理すると,中間体の8員環チオノカーボネートE-2の[3,3]シグマトロピー転位により,一挙にZーオレフィンを持つ10員環チオールカーボネート3を排他的に与えることを見いだした。また,これは2がチェア型遷移状態Tcをとることを独自に開発した分子力学及び分子軌道本計算の組み合わせ法によって実証してきた。さらに当該年度内に以下の事柄を明かとした。1.従来反応中間体としてきた8員環中間体の存在を実験的に証明し,エネルギー解析で,このものの安定性についても検討した。2.生成物の10員環生成物のX線構造解析によってそのコンフォメーションを明かとした。3.本反応を用いてYellow Scale Pheromone4の立体選択的合成を行い4の高能率合成を達成した。これにより有機合成への応用性を実証した。これまで検討してきた基礎的成果を基に,その有機合成への応用を目的として(-)-Yellow Scale Pheromone(きまるかいがらむしの性フェロモン)の立体選択的合成を検討した。このものの合成は、今日まで数グループで研究されてきたが,立体選択性がなかったり,合成工程が非常に長いなど多くの問題をもっている。我々は,立体選択的に合成したジエンヨウ素化合物をt-ブチルリチウムで処理し,リチウム塩とした後,キラルアルデヒドを添加,続いてTHFで希釈するだけで図に示された四つの反応[i)ハロゲン-リチウム交換反応,ii)付加反応,iii)8員環形成反応,iv)シグマトロビー転位を経由する環拡大反応]が一つのフラスコ内で進行し,Z-二重結合を持つ10員環中間体を一挙に与えるというものである。このようにして得られた中間体は,環元的脱SCO反応,続くアセチル化によって目的化合物を高能率で与えるというものであり,ユニークな合成法である。
非ヘム遷移金属酵素活性中心における分子状酸素の活性化機構の解明

キノリン系配位子を用いた銅(II)錯体と過酸化水素との反応一連のキノリン系配位子を用いて調製した銅(II)錯体と塩基存在下、過酸化水素との反応について各種分光法や理論計算により検討を加え、その反応メカニズムを明らかにした。その結果、本反応は初めに銅(II)中心に溶媒分子が配位子した5配位単核銅(II)ヒドロペルオキソ種が生成した。反応はさらに進行し、溶媒分子が脱離し、分光学的性質の異なる平面4配位単核銅(II)ヒドロペルオキソ種生成することを明らかにした。以上の結果は新規な特性を持つ銅-酸素活性種について知見を与えるものである。銅(I)錯体の分子状酸素への反応性に及ぼすピリジン環の6位のメチル基効果ピリジン環の6位にメチル基を導入したピリジルメチルアミン系三座配位子を用いて調製した銅(I)錯体の構造・化学的特性・分子状酸素との反応性について系統的に検討を加え、一連のピリジン系三座配位子の銅(I)錯体と比較し、考察を加えた。その結果、用いる配位子のピリジン環の6位にメチル基を導入することや、ピリジン環とアミン窒素原子との間のアルキルリンカー長の長さを変えることにより銅(I)錯体の分子状酸素との反応性を精密に制御することを明らかにした。四酸化オスミウムを用いたメタンガスの直接酸化水溶液中・温和な条件下でメタンの直接酸化を行う遷移金属触媒の開発を目指し、四酸化オスミウムを用いてメタンの直接酸化反応について検討を加えた。その結果、8.7atmメタン存在下、NMRチューブ中、50°Cで一日加熱することにより、CH_3OH、CH_2(OH)_2、HCHO、CO_2の生成を確認した。この結果、これまで難しいとされているメタンの直接酸化を水溶液中、温和な環境で達成したものであり、新規酸化触媒の開発に繋がるものとして期待される。二核銅-酸素錯体とフェノールとの反応ピリジルエチルアミン系三座配位子を用いて調製した(μ-η^2:η^2-peroxo)二核銅(II)錯体、および同様の二座配位子を用いて調製したbis(μ-oxo)二核銅(III)錯体と各種フェノール誘導体との反応を速度論的に検討した。いずれの二核銅酸素錯体も各種パラ置換フェノール誘導体と反応し、対応するフェノールの二量体を良好な収率で与えることがわかった。また、この反応速度は基質の酸化還元電位に大きく依存していることから本反応はいずれの場合にもプロトン移動とカップルした電子移動機構で進行していることがわかった。また、bis(μ-oxo)錯体の反応性はペルオキソ錯体に比べかなり高いことも判明した。銅(I)錯体内に存在するd-π相互作用に及ぼすパラ置換基効果配位子側鎖の芳香族環のパラ位に各種置換基を有するピリジルエチルアミン系三座配位子を用いて調製した銅(I)錯体内に存在するd-π相互作用の構造や物性および反応性に及ぼす配位子の置換基の電子的効果について検討した。いずれの場合においても銅(I)イオンと配位子側鎖のベンゼン環との間にη^2型のd-π相互作用の存在が確認された。各種分光学的手法からd-π相互作用の相対強度を決定したところ、H体の場合が最もd-π相互作用が強く、電子供与基や吸引基を導入することによりd-π相互作用が弱くなることを明らかにした。銅(I)錯体の分子状酸素との反応に及ぼす配位子効果ピリジルメチルおよびエチルアミン系三座配位子を用いて調製した銅(I)錯体の構造や物性及び分子状酸素との反応性について比較検討を行った。その結果、配位子側鎖をエチレンからメチレンに変えることにより、中心金属のルイス酸性が向上し、銅(I)錯体の分子状酸素に対する反応性を増大させるとともに高原子価bis(μ-oxo)錯体が生成することを見いだした。二核銅-ジスルフィド錯体とリチウムフェノラートとの反応分子内にジスルフィド結合を導入したピリジルアルキルアミン系二核化配位子を用いて調製したジスルフィド二核銅(I)錯体およびビス-μ-チオラト二核銅(II)錯体とフェノールのリチウム塩との反応について詳細に検討を加えた。その結果、いずれの場合も反応が効率良く進行し、配位子の硫黄原子とフェノールのα位に炭素-硫黄結合が生起した生成物が定量的に得られた。この得られたチオエーテル基を有するフェノールの構造はガラクトースオキシダーゼ活性中心に存在する有機補欠分子の構造と同じであることが判明した。したがって、この炭素-硫黄結合の生起反応はガラクトースオキシダーゼ活性中心の有機補欠分子の生合成過程のモデル反応として大変興味深いものと考えられる。銅(I)錯体によるC-Cカップリング反応機構に関する速度論的考察一連のピリジルアルキルアミン系配位子を用いて調製した銅(I)錯体と各種ベンジルハライド誘導体との反応について詳細に検討を加え、ベンジルハライドのカップリング反応に及ぼす配位子の効果とその反応メカニズムを明らかにした。その結果、銅中心へのドナー性の高い配位子のみに反応の進行が見られた。さらに本反応は銅(III)有機金属種が反応中間体として存在し、対応するカップリング生成物が得られるとともに銅(II)ハロゲン化物が得られるというメカニズムで進行していることを明らかにした。以上の結果はこれまで不明であった

Atom Transfer Polymerizationの反応メカニズムについて重要な知見を与えるものとして期待される。キノリン系配位子を用いた銅(II)錯体と過酸化水素との反応一連のキノリン系配位子を用いて調製した銅(II)錯体と塩基存在下、過酸化水素との反応について各種分光法や理論計算により検討を加え、その反応メカニズムを明らかにした。その結果、本反応は初めに銅(II)中心に溶媒分子が配位子した5配位単核銅(II)ヒドロペルオキソ種が生成した。反応はさらに進行し、溶媒分子が脱離し、分光学的性質の異なる平面4配位単核銅(II)ヒドロペルオキソ種生成することを明らかにした。以上の結果は新規な特性を持つ銅-酸素活性種について知見を与えるものである。銅(I)錯体の分子状酸素への反応性に及ぼすピリジン環の6位のメチル基効果ピリジン環の6位にメチル基を導入したピリジルメチルアミン系三座配位子を用いて調製した銅(I)錯体の構造・化学的特性・分子状酸素との反応性について系統的に検討を加え、一連のピリジン系三座配位子の銅(I)錯体と比較し、考察を加えた。その結果、用いる配位子のピリジン環の6位にメチル基を導入することや、ピリジン環とアミン窒素原子との間のアルキルリンカー長の長さを変えることにより銅(I)錯体の分子状酸素との反応性を精密に制御することを明らかにした。四酸化オスミウムを用いたメタンガスの直接酸化水溶液中・温和な条件下でメタンの直接酸化を行う遷移金属触媒の開発を目指し、四酸化オスミウムを用いてメタンの直接酸化反応について検討を加えた。その結果、8.7atmメタン存在下、NMRチューブ中、50°Cで一日加熱することにより、CH_3OH、CH_2(OH)_2、HCHO、CO_2の生成を確認した。この結果、これまで難しいとされているメタンの直接酸化を水溶液中、温和な環境で達成したものであり、新規酸化触媒の開発に繋がるものとして期待される。
非晶質試料の構造解析のための固体ＮＭＲによる炭素間距離決定法の開発

1.概要固体NMRは、試料の単結晶化、または微結晶粉末化を必要としない解析法であり、特に結晶化が難しいオリゴペプチドなどの解析のための手法が期待されている。固体NMRでは、炭素原子間の偏極移動を利用した炭素原子間距離を用いて構造解析を行うことが多い。しかし、偏極移動を用いた手法は、NMRスペクトル上で全く同じ化学シフトを示す炭素間では距離を得ることが出来ない、という問題点があった。本研究では化学シフトが同じでも炭素間距離を得られる可能性のある、炭素間の双極子相互作用による粉末線形の線形解析を用いた解析法の開発を行った。より具体的には「炭素間の双極子相互作用による粉末線形」を測定するための手法の検証を行った。2.実験500MHz固体汎用NMRシステム、500MHz固体高分解能NMRシステムを用いて、直接観測側は13C高分解スペクトル、関節観測側は13C-13C間の双極子相互作用による粉末線形スペクトルとなる2次元スペクトル(高分解能-粉末線形の2次元スペクトル)測定を行った。4.得られた成果上述のように2つの手法について、炭素間距離の解析に対する有用性について検証出来た。2017年度は「まず、多スピン系試料で精度が低下する原因について考察した。その結果、その原因を回避するためには炭素1つだけを炭素13標識すれば良い事が分かり、実際にL-Valineを用いた解析で高精度な炭素間距離を求めることが出来た。」ところまで進捗した。2018年度は、2017年度とは炭素間距離を求めるための別の方法[Double quantum Homonuclear Rotary Resonance (HORROR)法およびBroadband Back-to-Back (BBB)法]について検討を行い、それぞれの手法の長所、短所について検証した。また、解析する試料の分子を大きくするためにペプチド受託合成を行い、3残基のペプチドを作成した。今後はこの3残基の試料を用いてさらに解析手法の検証を進める。試料作成と手法の検討まで概ね終了したため、「おおむね順調に進展している」と判断できる。2018年度に作成した3残基のペプチドの微結晶粉末試料を用いて炭素間距離の解析を行い、結晶構造との比較から本研究で開発した手法がどの程度の精度で、どのぐらいの距離まで解析できるかを検証する。0.5 nm以上の距離を10%程度の誤差で測定することが出来れば、固体NMRを用いた解析としては、かなり長距離、かつ精度の高い方法が開発できたと言える。また、そこまでの高い精度でなくとも、どの程度の精度で距離が得られるかが分かれば、その精度でも十分に構造解析が出来る試料に関しては適用可能となる。また、時間が許せば試料を凍結乾燥により非晶質に変えたうえで解析が可能であるかを検証したい。非晶質の解析が可能となればかなり研究が進むことになる。ただし、まずは微結晶粉末試料で解析法の検証を優先して行う。本研究では、固体NMRによる非晶質物質の構造解析を可能とするために、固体NMRで得られる炭素13原子間の距離情報の精度の向上を目指す。平成28年度4月から9月までは、炭素13原子間の距離の解析に必要となる解析式の導出、求める変数を減らすために出来るだけ実測から得られる情報を用いて解析を行う解析方法の考案、粉末試料での計算に用いる粉末積分を出来るだけ計算の最後に行う、とい計算方法の改善を行った。また、解析式の導出の過程において、3スピンフリップーフロップという現象が3つ以上の炭素原子を炭素13原子で標識した試料では、炭素13原子間の距離情報の精度を下げているという問題点が見つかった。平成28年度9月から11月では、セリン、ロイシン、グリシン、アラニン、バリンの5つのアミノ酸に対して本研究で考案した解析法を用いた解析を行った。この解析では、解析式による計算結果と実測が全てのアミノ酸で良い一致を示すことが分かった。また、距離の精度に関しては、2つの炭素原子を炭素13原子で標識したセリン、ロイシン、グリシンでは高い精度で距離が得られるが、3つ以上の炭素原子を炭素13原子で標識したアラニン、バリンでは精度が下がることが確認され、精度の原因が上記の3スピンフリップフロップであることが示された。また、この問題点の克服のための1つの炭素原子を炭素13原子で標識し、その炭素原子と他の炭素原子との距離を求める、という方法の考案を行った。平成28年11月に、以上の内容を第55回NMR討論会での口頭発表で発表した。平成28年度の研究により、本研究で考案された新規解析法により、2つの炭素原子を炭素13原子で標識した試料(2スピン系試料)では高精度で炭素原子間距離を得られた。また、解析式の導出の過程から発見された3スピンフリップフロップという現象により、3つ以上の炭素原子を炭素13原子で標識した試料(多スピン系試料)では、精度が下がることが実測と計算の比較により示された。現在は、この問題点の克服のためには、1つの炭素原子を炭素13原子で標識した試料(1スピン系試料)、他の天然存在比の炭素13原子との距離を解析するという方法を考えている。考案した解析方法により、2スピン系試料では炭素原子間距離の精度を上げることに成功したので、初年度の目標は達成したと考えている。

しかし、2スピン系試料は複数の炭素原子間距離を求めるのに適した試料ではない。今後は1スピン系試料を用いることで、標識炭素原子と他の天然存在比の炭素原子との複数の炭素原子間距離を求めるための解析を行う。難溶性の非晶質試料は、X線結晶構造解析や液相での核磁気共鳴(NMR)での解析が困難であるため、粉末の測定が可能な固体NMRによる構造解析法が研究されている。これまではおおまかな距離情報を数多く集めることでタンパク質やアミロイドβなどの構造解析が行われてきたが、測定の分解能の低い試料やオリゴペプチドなどの小さい分子では距離情報の数が少なく従来の方法での解析は難しい。今後固体NMRによる構造解析の適用範囲を拡げるためには、炭素間距離の精度向上が必須である。固体NMRによる従来の炭素間距離の解析方法は2つの炭素からなる1つの炭素間距離を求める場合には有効であり、高精度な炭素間距離を求めることが出来た。しかし、3つ以上の炭素を標識した試料(多スピン系試料)で複数の炭素間距離を同時に求める場合は精度が著しく低下する。本研究課題では、距離の精度向上のために固体交換NMRの炭素間距離から信号強度を求めるための解析式を導出した。この解析式により計算される信号強度と実測値とを比較することで炭素間距離を解析し、直接結合している2つの炭素に対し、表1のように文献値に対して±0.01nm以下の高精度な距離の解析に成功した。次に多スピン系試料で精度が低下する原因について考察した。その結果、その原因を回避するためには炭素1つだけを炭素13標識すれば良い事が分かった。実際にL-Valineのカルボキシ基のみを炭素13標識した試料を用いて、カルボキシ基とその他の炭素との距離を解析したところ、0.15から0.39 nmまでの範囲で±12 %以下の誤差で炭素間距離を求めることができた。この誤差と得られた最大の距離はこれまでに報告された中で最も良い例と同程度の誤差である。ただし、本研究の手法の方が弱いラジオ波で測定できるために試料への加熱が少なく、生体分子へ適しているという利点がある。そのため、本研究課題の最初の2年では、多スピン系試料から得られる炭素間距離の精度向上を目的として研究を進めた。まず、多スピン系試料で精度が低下する原因について考察した。その結果、その原因を回避するためには炭素1つだけを炭素13標識すれば良い事が分かり、実際にL-Valineを用いた解析で高精度な炭素間距離を求めることが出来た。次年度の目的を達成できたので、「おおむね順調に進展している」と判断できる。1.概要固体NMRは、試料の単結晶化、または微結晶粉末化を必要としない解析法であり、特に結晶化が難しいオリゴペプチドなどの解析のための手法が期待されている。固体NMRでは、炭素原子間の偏極移動を利用した炭素原子間距離を用いて構造解析を行うことが多い。しかし、偏極移動を用いた手法は、NMRスペクトル上で全く同じ化学シフトを示す炭素間では距離を得ることが出来ない、という問題点があった。
トンネル電流プローブを用いた真円度・円筒度のナノメータ計測

走査プローブ顕微鏡法(Scanning Probe Microscopy;SPM)を回転体の測定に適用した新しいコンセプトの真円度測定法の開発研究を行った。研究室に現有しているタリロンド真円度測定機を改良しただけではその分解能に限界があることが検証されたので、空気軸受けを用いた測定システムを新たに設計、製作した。また、トンネル電流を検出する走査トンネル顕微鏡(Scanning Tuneling Microscopy;STM)モードではチップのクラッシュが多発し、その不安定性が露呈したため、原子間力顕微鏡法(Atomic Force Microscopy;AFM)に変更してナノメータオーダーの真円度測定を目指した。剛性や吸振動性を考慮して、位置決め精度としてサブミクロンの精度を有する万能測長機上に各ユニットを組み上げた。基本構成要素は、(1)回転テーブル(空気軸受け,プーリー,ステッピングモーター)、(2)原子間力を計測するためのチップとトライポット、(3)レーザーフォトダイオードと四分割フォトディテクター、(4)ピエゾ素子駆動による測定物センタリング装置である。AFMを含めてすべての測定ユニットはパーソナルコンピュータによって、駆動、制御されている。測定は市販のAFMを管理している実験室雰囲気とした。SKH51のピンゲージ(0.1φ)をめのうのホルダーに装着しピエゾ素子を逐次駆動させてセンタリングを行った。数rpmまでの回転数でテーブルを操作したところ、回転に起因するリード線からの微弱な電磁ノイズが発生が認められたが、これは回転数を下げることとコードレス化を考えることで解消するものと思われる。また、ディテクターの検出感度に多少の問題が残されているものの現在のところ50nmにせまる検出感度が得られている。本装置はプロトタイプの域を出ないが、操作性を向上させれば真円度、円筒度をナノメータオーダで測定する可能性を十分に示唆することができたものと考えられる。マイクロマシンの駆動技術に関しては、静電モーターなどで問題となっている回転精度がキ-ポイントとなっている。しかし、ミリメートル以下の軸に対する真円度、円筒度などの計測は全くなされていないのが現状である。本研究では、研究室に現有している真円度測定器タリロンド100にマイクロ計測を付加することを目的とし、走査プローブ顕微鏡のプローブヘッドを応用して真円度計測を試みた。ピエゾ素子を3次元にアッセンブルしたトライポットを用いて、棒ゲージ(2mm、1mm)の円筒度を計測したところ、当初企画したトンネル電流測定は困難であり、原子間力をコンタクトモードで計測する方が実用的であり、かつ再現性も高いことが明らかになった。これはトンネル電流の大気中測定では測定物表面に吸着する気体の影響によって表面電子状態が不安定になることのほか、コンタミネーションの介在による放射電流値の揺らぎの影響が大きいためと思われる。また、原子間力の測定による真円度、円筒度検出は当初の研究目的を何ら損なうものではなく、研究遂行上全く問題はない。以上のような研究の進展により、現在では原子間力顕微鏡法によってミリメートルサイズ以下の細線の真円度計測実験を続行している。本研究においてネックであった、測定物のセンタリングはピエゾ素子を用いた微小位置決め機構の採用によって飛躍的に改善され、テーブル回転時の振動は空気バネの採用により解決できた。
創薬に向けた、CALR変異とfibrocyteに着目する骨髄増殖性腫瘍研究

I. MPLとの会合、およびSTAT活性化に必須な変異CALRの領域同定と、それを標的とする治療法開発:A.血球特異的CALRノックアウトマウスを用いて野生型CALRの造血における機能を解析した。現在論文作成中である。B.変異CALRとMPL結合に必須な領域、および変異CALRによるSTATの恒常的活性化に必須な領域をそれぞれ同定した。結合能とSTAT活性化能、及び細胞内の局在に相関があるのかどうかについて解析を進めている。II.骨髄線維症発症、骨髄線維化進展に要する分子イベントの同定:骨髄線維症において変異がみられるエピジェネティクス調整分子であるEZH2、TET2とCALRの二重変異マウスの作成に成功し、表現型解析を進めている。III. Fibrocyteが骨髄線維化に及ぼす影響の同定と、線維化を改善するMEK阻害剤の機序解明:A. Fibrocyteをフローサイトメトリー、免疫染色で検出する系を確立した。CD11bのプロモーター下にdiphtheria toxinreceptor(DTR)を発現するCD11b-DTRマウスにDTを投与し単球を除去する実験系を確立し、JAK2変異マウスにおける単球除去の影響を解析した(論文作成中)。B.骨髄線維症を発症するJAK2変異マウス、線維化を生じずETを発症するCALR変異マウスのfibrocyte数について比較実験を開始した。C. MEK阻害剤が単球からfibrocyteへの分化に及ぼす影響をin vitro,in vivo両面で解析中である。I. MPLとの会合、およびSTAT活性化に必須な変異CALRの領域同定と、それを標的とする治療法開発:ノックアウトマウスの樹立と繁殖は予定通り進み、解析が完了した。in vitroの実験に関してもcDNAコンストラクト、各種変異体作成も順調に進んでおり、さらに変異体の細胞内局在を調べる実験系やin vivo発症能を調べる実験系も確立した。II.骨髄線維症発症、骨髄線維化進展に要する分子イベントの同定:骨髄線維症において変異がみられるエピジェネティクス調整分子であるEZH2、TET2とCALRの二重変異マウスの作成に成功した。現在解析を進めている。III. Fibrocyteが骨髄線維化に及ぼす影響の同定と、線維化を改善するMEK阻害剤の機序解明:単球から分化する紡錘形細胞であるFibrocyteをフローサイトメトリー、免疫染色で検出する系を確立した。CD11bのプロモーター下にdiphtheria toxin receptor(DTR)を発現するCD11b-DTRマウスとJAK2変異マウスの2重変異マウスを作成し、JAK2変異マウスにおける単球除去の影響を解析中である。MEK阻害剤の影響を調べる実験も並行して実施できている。I. MPLとの会合、およびSTAT活性化に必須な変異CALRの領域同定と、標的とする治療法開発:1)野生型CALRの造血における機能同定・・・2018年度の研究を継続する。造血幹細胞の自己複製能、および抗がん剤投与、出血などの危機的造血を検討し、CALRの造血に果たす生理的役割を明らかにする。2)変異CALRとMPLの結合、STAT恒常的活性化に必須な領域の阻害・・・2018年度の研究により同定した、変異CALRがMPLに結合するために必須な領域のペプチドの作成を試みる。II.骨髄線維症発症・進展に要する分子イベントの同定:2018年度に作成した変異CALR/TET2欠損マウス、変異CALR/EZH2欠損マウスの解析を継続する。骨髄線維化、競合連続移植による二重変異造血幹細胞の自己複製能の評価、造血幹細胞の遺伝子発現の網羅的解析を行う。III. Fibrocyteが骨髄線維化に及ぼす影響の同定と、線維化を改善するMEK阻害剤の機序解明:2018年度までに確立した解析系を用いて、今年度は下記の研究へと進む。1)ドライバー変異の違いによるfibrocyteの数、質、分化能の同定:骨髄線維症モデルマウス、線維症を発症しないマウスの末梢血fibrocyte数・単球からfibrocyteへの分化能を測定する。2) JAK2変異マウスの単球を試験管内でMEK阻害剤処理し、数の変化、fibrocyteへの分化能が阻害されるかを検討する。更にJAK2変異マウスにMEK阻害薬を投与し、in vivoでの影響も解析する。成体マウスの解析を終え、現在骨髄移植実験によって造血幹細胞の機能解析へ進んでいる。現在、結合能とSTAT活性化能に相関があるのかどうかについて解析を進めている。II.骨髄線維症発症、骨髄線維化進展に要する分子イベントの同定:骨髄線維症において変異がみられるエピジェネティクス調整分子であるEZH2、TET2とCALRの二重変異マウスを作成した。多重変異マウスのため交配に時間を要したが、現在マウスのコロニーを拡大し、表現型解析を開始している。III. Fibrocyteが骨髄線維化に及ぼす影響の同定と、線維化を改善するMEK阻害剤の機序解明:A.単球から分化する紡錘形細胞であるFibrocyteをフローサイトメトリー、免疫染色で検出する系を確立した。Cldoronate liposome静注による単球除去の実験系を確立した。