hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
複製複合体の形成とその制御機構の解析

しかし、複製開始点により高頻度で結合している可能性も示された。ORC2、CDC6は今の所明確な結果が得られていない。最も重要であると考えているORC1蛋白に関しては、tag付きORC1を安定発現している細胞を樹立し解析を始めた。CHIPに関してはさらなる検討が必要である。一方、我々は複製開始蛋白と相互作用している候補蛋白として、RB/E2Fによる転写制御に関与しているクロマチンリモデリング複合体の構成蛋白であるアクチン関連蛋白を同定した。機能解析のために有用なその変異蛋白を作成し、発現する細胞株の樹立に成功した。今後この系を用いてアクチン関連蛋白の核での機能の解析が進むと期待している。静止期細胞にE2Fを発現させることによりDNA複製を惹起する系を確立し、E2FはまずMCMのクロマチン結合を引き起こすことを明らかにした。つぎにCDC45のクロマチン結合が起こるが、これにはCdk2活性が必要であることがわかった。ORC1が核高次構築の基礎としての核マトリックスに結合していることを明らかにした。ORC1抗体で複合体を単離し、それらをmass spectrometryで解析した。その結果等から、ORC1を足場としてG1期特異的に核マトリックス上で機能的ORC1-5複合体が形成されていることが示された。一方、ORCが核マトリックスに結合し、かつ集積してfociを形成しているのとは対照的に、MCM複合体はより広範囲のクロマチンに結合していることがわかった。MCMが複製終了クロマチンから遊離し、S期以降は再度クロマチン結合されないという機構でDNA再複製は抑制されている。我々等により、CDC6がS期に細胞質に排出されることが示されていたが、その排出は部分的であった。今回、ORC1がS期に分解されることを見出した。一方、S期後期以降はCdc2キナーゼが再複製抑制を担っていること、そしてその機構として、MCMやCDC6の高リン酸化が考えられることを我々は報告してきた。最近Cdt1もMCM loaderとして機能していることが明らかとなってきた。そこでCdc2がCdt1の機能制御を行っている可能性を検討を行した。その結果、Cdc2/cyclinAはCdt1にそのサイクリン結合モチーフを介して結合し、リン酸化を介してCdt1-gemininの結合を調節していることが示唆された。複製開始蛋白と相互作用している蛋白としてアクチンを同定した。アクチンは、RB/E2Fによる転写制御に関与しているBAFクロマチンリモデリング複合体の構成蛋白であり、また核マトリックス構成成分である可能性も指摘されている。それが核内で機能しているのかどうかという問題は興味深い。アクチンの様に量も多く多機能の蛋白の場合、主に阻害薬剤を用いた実験が行われている。最近ラトルンクリンが特異的阻害剤として多用されている。しかし、薬剤による表現型のすべてがアクチンへの特異的効果によるものかどうかは不明である。
日本における内閣制度の形成史に照らした現行内閣制度の再検討

イギリス、ドイツと比較した場合、日本の首相は、組織上の優位性が明確であるにもかかわらず、運営上の地位が脆弱であることが明らかとなった。また、行政各部との関係では、従来、指揮監督権(憲法72条)の主体が内閣にあり、閣議決定がなければ「指示」しかできないことが議論の中心であったが、この点はイギリスやドイツの場合と大きな違いはないことが明らかとなった。むしろ、首相には各省の組織編制権がないこと、各省の上級公務員の任命権が内閣レベルに存在しないことこそが日本の特徴であり、いわゆる行政割拠主義の弊害を産み出している原因ではないかと思われる。憲法が明記する首相の組織上の優位性を、内閣の運営にも反映させて、内閣での政策形成における首相の指導的地位を正面から認めるべきである。また、いわゆる各省割拠主義も、憲法上の根拠があるものではなく、組織編制権や上級公務員の人事権のあり方についても再考するべきであると考えられる。内閣制度の前史である、太政官内閣の形成とその内容について、1867年の職制創定以来、明治14年政変直前の職制第七変までの動きを、太政官沿革誌を中心に、従来の政治史学、憲法史学の論考を手掛かりとしながら、纏める作業を行ってきた。また、その中で、江藤新平に着目し、「江藤新平文書」のマイクロフィルムを購入して、江藤の構想を探求しようと試みている。しかし、史料の読み込みに時間がかかり、論文として纏めて公表する段階には至っていない。これに対して、研究実施計画の一翼をなす、比較法研究及び現行の日本内閣制度の考察は、いくらかの進展を見ている。現在の日本を取り巻く政治状況は、政権交代以後、そして昨年夏の参議院議員通常選挙以降、大きく変化しており、また、その統治システムの構造も動態的で注目を要することとなっている。本研究代表者も、各種の報道や時事論評的に著される論考を摂取している。また、上記のような背景から、恩師に強く薦められたこともあって、従来、本研究代表者が行ってきた、内閣制度の比較法史的研究を纏めて一書にまとめる機会を得た。そこで、イギリス、ドイツの内閣制度について、当初の研究論文発表後の変化や、またそれらに関わる学界の成果を取り入れて、加筆を行っている。また、日本の内閣制度について、この十数年来の変動を踏まえた現在の姿について、新たに分析を行い書き下ろす作業を行っているところである。その中で、明治期から現行憲法に至るまでの、内閣制度の歴史についても検討を深めるところになるであろう。今年度は、イギリスの在外研究を機に、この10年のイギリスにおける内閣制度の変容について研究を行った。その結果、ブレア政権下で、首相の権力が--その内容の当否は別にして首相が自らの政策を実現できるという点において--一層強化されていること、その具体的な現れとして首相府(No.10)及び内閣府(Cabinet Office)の組織が大きくなり、またこれらの組織による各省の具体的政策に対する関与も高まっていること、さらに、内閣レベル、各省レベルともに、政策に関して特別顧問(Special Adviser)の果たす役割が重要になっていることが明らかとなった(なお、その過程で、イギリスにおいても、日本と同様、伝統的に各省大臣が法律による授権の名宛人であり政策を起案し実施するのも原則的に各省であることが判明した。このような伝統にもかかわらず、イギリスでは首相の権力が非常に強まっているのである)。もっとも、議会との関係においては、従来はあまりみられなかった平議員の「反乱」が増加してきており、現在のキャメロン連立政権下でも、EU政策や社会保障・財政政策などをめぐり政府指導部に対する異論が公然と与党内部から出されるという現象もみられる(とはいえ、最終的には首相の意向が実現している点には留意が必要である)。他方で、小泉改革後の日本の内閣制度の変容をみると、内閣官房及び内閣府で政府の重要政策が起案される傾向が窺われる。震災後に設立された復興庁も内閣に直接所属する部局であり、組織の点からみれば、伝統的な各省割拠主義に対して首相の地位が高まってきていると評価できる。もっとも、首相が自らの政策を実現できている程度という点ではなおその権力は弱い--あまりにも政策実現の速度が遅い--といえる。また、鳩山政権下でみられたように、各省レベルで大臣が適切に政策の立案と実施を行えているかにも疑問が残る。これらの点より、日本の内閣制度は大きな制度上は首相及びその周辺の強化がなされているといえるが、その運用面において問題があるという知見が得られている。

研究代表者は、2012年8月末まで、在外研究の機会を得てイギリスに滞在し、文献の検討を行うとともに、当地でイギリスにおける内閣制度の理論と実情に直接触れて考察することができた。その結果、個別責任(Individual responsibility)のもと、特定の政策について第一次的に責任を負うのは大臣であること、しかしだからといって各省割拠になるわけではなく、首相は大臣の任免権と閣議の運営権を梃子にその政策を大臣に行わせることが可能であること、各省の政策や内部運営に関する事項について、首相府や内閣府の関与がみられるが、それは首相と大臣の信頼関係を基礎として大臣が首相府や内閣府にその権限を委ねているとの法的構成をとることが可能であること、等が明らかとなった。これらの点は、既出の論文に加除修正する中で反映して、公刊予定の書籍の一章に盛り込むことができた。他方、イギリスにおいても日本の現実政治とそこでの内閣制度の運用の在り方に関心を持ち注視してきたが、帰国後、日本国憲法下の内閣制度について、英独と比較してこれらとの異同を浮かび上がらせるよう努めながら、I首相の組織上の地位と権限、II首相の運営上の権限、III首相の行政各部に対する権限、という視点から、1従来の理解・運用と、2橋本行革における改革の考え方、3その後の10年余りの変化(変わっていない点も含めて)について纏める作業を行った。これについても、公刊予定の書籍で描き下ろしの形で纏めた。3年間の研究期間の2年目に当たるが、当初の予定にはなかったイギリスにおける長期の在外研究(2011年8月から1年間)が入ったため、前期は講義負担が倍増した。また、在外研究中は、イギリスの現在の制度との比較に関する研究は進展しているが、日本の文献を参照できないため、日本における内閣制度形成史の研究は遅れている。24年度が最終年度であるため、記入しない。イギリスにおける長期の在外研究という、当初の計画にはなかった出来事を活用するため、8月までの在外研究中には、イギリスやドイツにおける内閣制度の歴史と日本における受容と変容という基本的な計画は維持しながら、より実践的でアクチュアルな、イギリスにおける現代の内閣制度の発展と日本における内閣制度の現在の比較を行いたい。9月の帰国後、講義負担が倍増するため、充分な進展は得られないかもしれないが、日本の内閣制度の形成史の考察のための史料を読み進めたい。
美濃派伝書の分類整理に関する基礎研究

今年度は、以下の調査、研究、整理作業を行った。1 2000年2001年に作成した「俳諧伝書データベース」に登録済みの美濃派伝書について、調査の上、新たに得られた情報を追加した。(1)光丘文庫(山形県酒田市)所蔵資料など、前年度までに調査できなかった美濃派伝書について、本文(の異同)、書写者、伝来、系統等について調査した。(2)(1)の調査をもとに分類整理し、必要な情報を「俳諧伝書データベース」に追加した。2「俳諧伝書データベース」に未登録の美濃派伝書を新たに調査し、追加登録した。(1)光丘文庫(山形県酒田市)所蔵の美濃派伝書を調査し、「俳諧伝書データベース」に未登録の美濃派伝書を追加登録した。(2)愛媛県立図書館(伊予俳諧文庫、伊予史談会文庫)所蔵の美濃派伝書を調査し、追加登録した。(3)『和歌・連歌・発句秘伝書』(仮題)等の伝書を購入し、調査の上、必要な情報をデータベースに追加した。3「俳諧伝書データベース」をもとに、これまでの調査、研究によって分類整理された情報を持つ「美濃派伝書データベース」を作成した。1 2000年2001年に作成した「俳譜伝書データベース」に登録済みの伝書について、情報を追加した。(1)明らかに美濃派伝書と判断できるものについて、それを同定した。(2)同名異書、異名同書、書写関係にあると判断できた美濃派伝書について、その情報をデータベースに追加した。(3)序文、跋文、奥書、書写者、伝来等の情報が得られた美濃派伝書について、その情報をデータベースに追加した。2「俳諧伝書データベース」に未登録の美濃派伝書を新たに調査し、データベースに追加登録した(明らかな書誌情報に限定し、伝書の詳しい位置づけなどは今後行う)。(1)石川県立図書館月明文庫(蔵月明氏旧蔵本)の調査を行った。その中から美濃派伝書を同定し、データベースに追加登録した。(2)秋田県由利郡佐々木啓喜氏所蔵資料で、以前の調査から漏れていた新たな美濃派伝書について調査し、データベースに追加登録した。(3)『俳諧口伝書抜』(仮題)などの美濃派伝書を購入し、データベースに追加登録した。1 2000年2001年に作成した「俳諧伝書データベース」に登録済みの伝書について、新たに得られた情報を追加した。(1)15年度に同定できなかった美濃派伝書を、調査・研究の上、同定した。(前年度からの継続)(2)「企画展・由利美濃派と俳人達」(於・本荘市郷土資料館平成16年5月28日8月18日)での資料展示によって、序文、跋文、奥書、書写者、伝来等の情報が新たに得られた美濃派伝書について、その情報をデータベースに追加した(佐々木啓喜氏、滝沢滋氏等所蔵資料多数含む)。(3)本文の異同、伝来等により、美濃派伝書の分類整理をした。(来年度へ継続)2「俳諧伝書データベース」に未登録の美濃派伝書を新たに調査し、データベースに追加登録した(明らかな書誌情報に限定し、伝書の詳しい位置づけなどは今後行う)。(1)「企画展・由利美濃派と俳人達」(於・本荘市郷土資料館平成16年5月28日8月18日)での展示資料について、未登録の資料を、新たにデータベースに登録した。(2)『蕉門八条目』(付・『蕉門名家文集』)(仮題)などの美濃派伝書を購入し、データベースに追加登録した。また『俳諧蘭のかほり』などの、美濃派伝書の理解に必要な美濃派俳書も購入した。
主体的鑑賞と評価還元を可能にする「パーソナルミュージアムコンシェルジュ」の開発

本研究では、直感的な操作による多様な情報の閲覧が可能な展示支援システムの開発を行う。展示支援システムの開発プロセスが博物館の学芸員とって、また体験型展示システムが博物館の来館者にとって、有効であるかを明らかにすることである。実証結果によるとシステムの面では、来館者の正確な室内位置情報を取得するシステムの安定化が求められることがわかった。それは個人向けのコンテンツを提供するための先決課題でもある。そして、コンテンツの面では、音声解説のほかに写真や映像、3DCGコンテンツに至るコンテンツの構成は来館者に好まれ、興味を持続させるための手がかりとなることが確認できた。特に、展示物のデジタルアーカイブ化による3DCGコンテンツの活用は、新しい展示体験ができることがわかった。本研究は、次世代型博物館に向けたインタラクティブな自動誘導機能が付加された展示解説コンテンツと、その展示を効率的に評価できる展示評価支援システムの開発を目標としている。本年度は、国内外の先進事例における調査・研究とそれらについての問題点や課題の抽出を行い、基本設計を行った。また、詳細設計においては、これまでの九州国立博物館との共同研究で得られた諸データや博物館側の要請する用件定義を行い、より実用的な設計を行った。(1)国内外における先進事例の調査・研究携帯型展示解説や閲覧補助システムを導入している国内外の施設へ足を運び、担当者インタビューや稼動システムについて取材を行い、調査内容を詳細に分析した。(2)九州国立博物館との共同研究における諸データの分析を行い、以下のようなプロトタイプの設計と提案を行った。(1)来館者行動分析によるGUI基板の展示評価システムの提案(2)ユーザの状況や興味を反映した個別閲覧ルートの自動構成手法の開発(3)ユーザに行動鑑賞を促すガイドコンテンツの配信(来館者の状況に応じたコンテンツの切り替えをユーザ自身で行えるサポート)(4)能動的鑑賞を促す博物館ガイドインタフェース(キーワードチェックを基本とする能動的学習・鑑賞方法の提案)(5)能動的な博物館学習を促す子供向けコンテンツの設計(学校単位・家族単位で連れてこられがちな子供が、自ら進んで足を運びたくなるようなコンテンツ)(6)創造的な学習を支援するコンテンツの設計(歴史像を想像するという学問として歴史の面白さを体験してもらうためのコンテンツ)本研究は、次世代型博物館に向けたインタラクティブな自動誘導機能が付加された展示解説コンテンツと、その展示を効率的に評価できる展示評価支援システムの開発を目標としている。本年度は、九州国立博物館において次のプロトタイプの開発と実証実験を行った。(1)子供用コンテンツ作成展示物を観察することで情報を取り出し、与えられたテーマについて自分の考えをまとめ、それを絵や文章で表現するという、子供向けのお絵かきコンテンツとゲーム的な要素を取り入れたインタラクティブコンテンツを制作した。さらに、画像共有システムを組み込み、学習者を新しい発見や解釈に導き、「見る」「考える」「表現する」「発信する」というプロセスを通じて、暗記科目ではなく創造的な学問としての歴史学習を体験してもらうことができた。(2)閲覧コンテンツの開発九州国立博物館の大型の有形文化財である「多宝千仏石幢」のデジタルアーカイブ化から、3Dモデルデータを活用したガイドコンテンツの制作までを検証した。デジタルアーカイブの利活用として携帯端末用の展示解説コンテンツの制作を行い、従来までの一方的な情報ではなく、直感的な操作による多様な情報提供を可能とした。(3)来館者行動履歴等の情報収集システムの構築時間や位置等の客観的なデータを効率的に収集し、評価、提示を一貫して行うシステムの構築を行なった。来館者には館内を移動する際に携帯端末を持ち運んでもらい、来館者の行動履歴等のデータを自動で収集した。データの収集は来館者に意識させることなく行い、来館者の観覧終了後にサーバーに保存し、保存されたデータから分析・評価を行った。評価結果は、視覚的に整理した情報として提示することで、学芸員が直感的にデータの傾向を認識できるようにした。本システムは、学芸員が展示方法を決める一つの指標として利用してもらうことを目標にした。その結果、来館者の満足度の向上につながった。本年度は、九州国立博物館においてWEBサービス・閲覧行動評価システムの開発を行った。本研究では子どもが特に興味を示しやすい「体験学習」に着目した。自宅でも体験可能な事前学習コンテンツを提案することで、博物館への興味や関心を喚起させることを目的している。また、WEBコンテンツを利用した事前学習・博物館での調べ学習・まとめを行う事後学習という三つのプロセスに一貫性を持たせた授業を行うことで、学習効果が得られるかを検証した。「体験学習」と「デジタルコンテンツ」の二つの事項に着目し、本研究を進めてきた。

博物館に来館する機会の少ない子供たちが自宅や学校で、デジタルコンテンツを利用した体験学習を行う。そうすることで、博物館へ興味を持つきっかけとなるのではないかという仮説の元、事前学習コンテンツの提案と学習プログラムの開発を行った。事前学習コンテンツでは、展示品に関する基礎知識を習得できること、WEB上で、行った気分になれると同時に、実際に行きたいという欲求も引き出せることとして、バーチャル体験型の事前学習コンテンツを制作した。実証実験とそこで得られたアンケート結果から、デジタルコンテンツは子供が抵抗を抱かずに、博物館に触れるきっかけとなることが明らかとなったといえる。また、WEB上での来館体験を行うことで、さらに興味を喚起させることが可能となり、子供たちは自主的に学ぼうという姿勢を示していた。事前学習で見たり、調べたりしたという体験が来館した際の行動にもつながったと考えられる。本研究で提案した事前学習コンテンツおよび授業カリキュラムは、今後学校や自宅など様々な場所や場面での活用が見込めるものとなった。本研究は、次世代型博物館に向けたインタラクティブ展示解説コンテンツと、その展示を効率的に評価できる展示評価支援システムの開発を目標としたものである。研究最終年度である本年度は、九州国立博物館において開発した携帯型展示解説システムを用いて実証実験を行った。特に本年度は、子どもの博物館離れという問題の解決策として、子どもの博物館鑑賞を充実するためのひとつのアプローチを提案することを目的とした。そのために、子どもに博物館鑑賞を楽しんでもらうことに重点を置き、コンテンツの設計を行った。また、子どもの個人入館者のほとんどは保護者と一緒であるということを踏まえ、親子で鑑賞できるコンテンツを設計し、実証実験を通じてその有用性を検証した。実験は、博物館を回り様々な展示品に触れるという行為を促す内容のガイドコンテンツを取り入れたタブレット端末を用いて、小学生以下の家族連れ、55組を対象に行った。端末上で展示品にまつわるクイズやゲームなどの課題を与え、子どもは鑑賞を通じてそれらをクリアしていくものである。親は子どもと一緒に鑑賞しながら、課題のヒントや、タブレット端末上に示された展示品についての解説をしていくものである。実証実験の際、自動ログ集計システムの集計結果から、ガイドシステムを使った鑑賞平均時間は41分で、傾向として男子よりも女子の鑑賞時間が長く、解説をしっかりと聞くことが確認できた。また、得られたとアンケート結果から、子どもを中心にして、親子で博物館を楽しむ際のひとつのモデルとして提示することができたと考えられる。結果、本研究で提案したインタラクティブ展示解説コンテンツと展示評価システムは、歴史系博物館で活用が見込めるものとなった。
早産における病原微生物の意義(周産期感染症予防の試み)

妊婦膣分泌物および妊婦子宮頚管粘液を臨床検体として妊婦20週70例、妊婦30週70例、妊婦34週80例の合計220例の検討を行った。このうち、正期前陣痛、正期前前期破水などの羊水感染をきたした症例は合計12症例であり、残りの208症例は羊水感染をきたすことなく正常分娩に至った症例であった。1.細菌学的検討妊婦膣分泌物および妊婦膣子宮頚管粘液ともに、いずれの妊婦各時期においても羊水感染症例では、正常例に比較して、検出菌株数が有意に増加していた。また、妊娠子宮頚管粘液から検出された細菌は、必ず妊婦膣分泌物からも検出されており、上行性感染を支持する結果となっていた。2.感染局所におけるS.agalactiae抗原の存在膣分泌物中の30症例に、子宮頚管粘液中の16症例にS.agalactiae抗原の存在が認められた。正期前陣痛、正期前前期破水などの羊水感染をきたした12症例では2症例にS.agalactiae抗原の存在が認められた。3.感染局所におけるエンドトキシン値正期前陣痛、正期前前期破水などの羊水感染をきたした12症例中の10症例で子宮頚管粘液中のエンドトキシン値が高くなる傾向が認められたが、膣分泌中のエンドトキシン値には、明らかな傾向は認められていない。症例数が少ないため、カットオフ値を定めるには至らなかった。今後も症例数を増加させて検討していく必要がある。
口腔領域における侵害受容機構の研究

口腔領域の各種侵害刺激に対する反応を末梢と中枢で形態、機能両面から多角的に追及した。歯髄に対する窩洞形成等の侵害刺激により産生されたBKはライソゾームのエンケファリン産生酵素を活性化して侵害刺激に対応することが示された(猪木)。この際に歯髄循環系に対しては知覚神経線維からのPGの遊離が歯髄血管拡張に関与することが明らかになった(伊藤)。また窩洞形成後の露出象牙質では象牙細管の透過性、および神経末端の細管口に対する位置により神経応答が決まることが示された(堀内)。これに対して骨組織に接触してインプラントを植立しても神経線維の分布がみられなく、感覚受容機構とは無関係であった(永井)。糖尿病ラット歯肉、血管ではPGIの産生が低下し炎症増悪因子の遊離がみられ、歯周病増悪をおこすことが示された(辻本)。またヒト唾液にはヒスタミン遊離活性を示す蛋白が存在し、口腔内炎症への関与が調べられている(古田)。研究手法の確立としては、歯根膜細胞のコラーゲン中での培養の成功(小椋)、硬組織の侵害刺激応答におけるプロテアーゼの役割を調べるためのカテプシンの精製とその抗体の作成(加藤)、歯牙にHRPを注入して三又神経節内におけるHRP標識細胞の配列の決定(重永)など今後の研究に有用な手段が得られた。口腔領域の機械的、温度的侵害刺激、および味刺激により唾液分泌誘発がみられ、各々に独立した副交感神経系の関与が示された(森本)。痛みに関する研究ではカプサイシンによるSP含有知覚神経の変性で針麻酔の効果が消失した(船越)。歯髄の温度刺激に反応する細胞は大脳皮質体性感覚野のうち3b野のIII-V層に局在し(角野)、三又神経核ニューロンは同一歯髄を受容野とする他のニューロンにより調節を受けていることが明らかとなった(佐藤)。本総合研究の遂行により多くの新しい知見が得られ、今後の研究の大きな基礎ができたものと思われる。
微分ゲーム理論を応用した非線形制御系の解析的検証手法の開発とその応用

入力やパラメタの変動,外乱などに対する非線形制御系の性能を保証するための解析的手法を開発し,その有効性を車両運動制御系への適用によって検証した.微分ゲーム理論に基づき,システムを最も不安定な状態に陥れる最悪入力に対する制御器の挙動によってシステムの性能を保証する方法を開発した.この方法が車両の4輪トルクコントローラの性能保証に適用された.その結果.どのような入力が加えられても横すべり角の最大値をある値以下に保証できる入力の範囲を理論的に決定することができた.本研究の目的は,非線形性を含む実際的な制御系の制御性能を保証するための新しい解析的検証手法を開発し,実際的なシステムへの応用から開発手法の実用性・信頼性を評価することである.本研究では微分ゲーム理論を応用して外乱入力と制御対象のパラメタ変動の影響を同時に考慮できる,より信頼性の高い新たな解析的検証手法の開発を目指している.その基本的なアイディアはコントローラと外乱・パラメタ変動を利益の相反する2人のプレイヤと見なし,微分ゲーム理論を応用してシステムを最悪状態に陥れる外乱とパラメタを求め,これに対する制御系の性能を調べることにより検証を行うというものである.平成27年度は最悪外乱・最悪パラメタ問題の微分ゲーム理論としての定式化および簡単な例題を用いた検討を中心に研究を行った.まず,コントローラの入力をu(t),パラメタ変動および外乱入力をv(t)とし,終端時間で計算されるJ(u,v)のような評価関数を設定する.u(t)はJを最小に,v(t)はJを最大化するものとすれば,お互いの利益が相反する微分ゲーム問題を構成できる.この問題では,初期時刻における状態量と終端時間における随伴システムの状態量が拘束条件となるので,最適制御の2点境界値問題を解くことが必要となる.一般にこのような最適制御問題は変分法を用いて解かれるが,ここではより実用的な「直接法」と呼ばれる数値計算法の適用を検討した.この方法は入力u(t)とv(t)を離散化し,時間関数であるu(t)とv(t)を各離散時間における静的なパラメタとみなして拘束条件付きの非線形計画法を適用して解を求めるものである.簡単な車両モデルと後輪操舵制御を用いた例題で検討した結果,制御系の検証問題を微分ゲームとして定式化し,直接法によって解くことができることを確認した.「研究実績の概要」で述べたように,平成27年度は制御系検証問題の微分ゲーム理論を用いた定式化とその数値解法について研究し,簡単なシステムへの適用から,当初の予定であった問題の定式化と数値解法の確認という目標を達成した.ここまでの研究で明らかになった問題点として,評価関数J(u,v)の選び方,および数値計算の精度と計算コストの問題があげられる.前者は車両の運動状態を最もよく表現する評価関数として,車両横すべり角の終端値,車両ヨーレイトの終端値などが考えられ,例題計算では横すべり角終端値を評価関数として用いた.この評価関数をu(t)は最小化,v(t)は最大化しようとするが,これ以外の評価関数についても検討する必要がある.後者は,終端の評価関数が離散時間入力に対する微分方程式の解として計算されるため,最適化計算の効率が微分方程の計算精度によって影響を受けるという問題である.当然,微分方程式を精度良く計算するためには計算のコストがかかり,計算精度と計算コストのトレードオフを考慮して,アルゴリズムを改良する必要がある.本研究の目的は,非線形性を含む制御対象に対する制御系の性能保証を目的とした新しい解析的手法を開発し,実際的なシステムへの応用から開発手法の実用性・信頼性を検討することである.新たな制御系解析方法の基本的アイディアは,制御器および外乱・パラメタ変動を,それぞれシステムを最適に制御しようとするプレイヤおよびシステムを最悪状態に陥れようとするプレイヤのように,利益の相反する2人のプレイヤと見てゲームの理論を応用し,最悪状態において制御器がどの程度制御系の性能を維持できるかを評価するというものである.平成28年度は昨年度に引き続き,制御器の最適化と外乱・パラメタの最悪化問題を微分ゲームとして定式化し,簡単な例題で検討した.制御器によって生成される制御入力をu(t),時間に依存しない変動パラメタをb,時間的に変動する外乱をd(t)とし,終端時間で計算される評価関数J(u, b, d)を設定する.昨年度は時間に依存しない変動パラメタを考慮していなかったが,今年度は新たに考慮した.この時,u(t)はJを最小に,bとd(t)はJを最大にするように決定されるものとすれば,u(t)とb,d(t)の間でお互いの利益が相反する微分ゲーム問題を構成できる.この問題は一種の最適制御問題であるが,時間関数であるu(t)とd(t)および時間に依存しないパラメタbの最適化が必要となるので,通常の変分法に基づいた最適化は難しい.そこで数値解法として,時間関数を離散化し,各離散時間における値を静的なパラメタとして扱う「直接法」と呼ばれる方法を用いてこの問題を解いた.

簡単な例題でこの方法の計算時間,計算精度,結果の信頼性などについて検討したところ,低次元の簡単なシステムについては,検討した手法によって妥当な解が得られた.しかし,より高次の制御対象については計算時間,計算精度などの面で問題があることもわかった.当初の予定では平成28年度は前年度に開発した検証手法を実際的な車両運動制御系に適用し,その実用性・信頼性を検討する予定であった.しかし,「研究実績の概要」で述べたように,平成28年度は平成27年度に引き続き,制御系の解析的検証問題を微分ゲームとしての定式化する方法とその数値解法について種々検討した結果,低次のシステムに対しては開発手法が有効であることが示されたが,より実際的な高次非線形システムに対しては計算精度,計算時間などの面で問題があることがわかった.また,評価関数の選び方によって最悪外乱・最悪パラメタが変化し,制御系全体としての評価が難しいという問題も明らかになった.すなわち,ゲーム理論に基づく検証方法はピンポイントの最悪状態に対する制御系の性能を示しており,全体的な制御系の限界性能を明らかにし,制御系の優劣を客観的に比較・評価するためにはさらなる工夫が必要であると考えられる.そこで,研究代表者が以前から提案している「可制御領域に基づく制御系の解析的評価法」の考え方を導入できないかを検討した.可制御領域は,「許容された範囲内の入力を用いて状態空間の安定な平衡点に到達可能な初期値の集合」と定義され,状態空間におけるこの可制御領域の大きさによって全体的な制御系の限界性能を解析的・客観的に評価できる.微分ゲーム理論に基づく最悪状態評価と可制御領域による全体的な限界性能評価を融合することにより,両者の利点を生かせるのではと考え,融合方法について検討したため進捗状況がやや遅れる結果となった.非線形制御系の検証問題を,利益の相反する2人のプレイヤの微分ゲーム問題として定式化し,最悪状態において制御器がどの程度まで性能を維持できるかによって検証する手法を考案した.まず制御系検証問題を微分ゲーム問題として定式化することについて検討した.制御器によって生成される制御入力をu(t),パラメタ変動を|b(t)|<B,外乱を|d(t)|<Dとし,有限の終端時間で計算される評価関数J{u(t),b(t),d(t)}を設定し,u(t)はJを最小(最適)に,b(t)とd(t)はJを最大(最悪)にするように決定されるものとする.最悪状態においても制御器が制御対象を安定な平衡点に到達させることができるなら,|b(t)|<B,|d(t)|<Dの条件を満足するいかなるパラメタ変動や外乱に対しても,制御系は性能を保証できることになる.この問題は一種の非線形最適制御問題であるため,平成2829年度はこの問題の数値的な最適化手法について検討した.簡単な例題でこのような手法と得られる解(均衡解)の妥当性について評価した.その結果,制御対象が低次系であれば妥当な解が得られるが,高次系となるにしたがって計算時間,計算精度などの面で問題があることが明らかとなった.上記のような問題を解決するため,問題の設定,最適化手法,最適化アルゴリズムなどについて種々の検討を行なった.その結果,問題設定によっては工学的に意味のある均衡解が得られない(存在しない)ことが経験された.そこで,確実に解が存在するような問題として定式化するため,安定平衡点に到達可能な状態空間内の領域を最大化する最適制御問題に変更した.この問題を前年度までに検討していた数値的方法で解くことにより,妥当な解が常に得られることを確認した.この改良手法を車両運動制御系に応用し,シャシ制御系の性能を統一的に評価できることを明らかにした.入力やパラメタの変動,外乱などに対する非線形制御系の性能を保証するための解析的手法を開発し,その有効性を車両運動制御系への適用によって検証した.微分
活断層による微地形の形成が居住と土地利用に与えた影響の地理学的解明

近年、高解像度地形データおよび判読技術の充実を背景に、微小規模の断層変位地形が、長波長のものを含め、全国で相次いで発見されており、低地における居住域や土地利用と微地形との関わりを「活断層との関係」から捉えなおす機運が高まっている(従来は主に外的営力や気候変動、土砂供給との関係で議論されてきた)。こうした背景のもと、本研究では「活断層による微地形の形成が居住と土地利用にいかに寄与したか」という問いを立て、飯山市街地と熱田台地北方を主な調査対象として研究を実施している。平成30年度は、熱田台地北方に関し、取得済のボーリングコアNAG-14(計22 m長)について層相および層序の確認作業を行った後(コアの中上部は旧河道を埋積する堆積物、同じく下部は旧河道堆積物と推定される)、旧河道埋積堆積物に注目して放射性炭素年代測定を実施し、その堆積速度曲線を描くことで、旧河道地形の成立時期を推定した。飯山市街地に関しては、平成31年度に予定している表層地質本調査に向け、ハンドオーガーを用いた表層地質予察調査を実施し、年代測定を行ったほか、実施済のトレンチ掘削調査で得られた試料の年代測定も実施し、表層地質の状況把握をすすめた。そのほか、長野県大町市街地など、本研究の目的に合致する他の地域の事例についても調査を実施した。全体を通じ、大縮尺航空写真および高解像度DEMを用いた地形判読や地形計測、遺跡調査報告書の収集・分析などを行って、調査計画および成果の充実をはかった。「研究実績の概要」に記したように、研究の目的および研究実施計画に沿う形で進捗している。平成31年度以降は、熱田台地北方に関し、前年度までに得られたデータを整理して、活断層による微地形と土地利用との位置的および時代的な関係について検討を行い、取りまとめて成果の公表をすすめる。飯山市街地に関しては、表層地質本調査と年代測定を実施し、必要に応じて表層地質補完調査を行う。その後、得られたデータを整理して、活断層による微地形と遺跡との位置的・時代的な関連性について検討し、取りまとめを行って成果の公表をすすめる。本研究の目的に合致する他の地域の事例についても調査を実施する。期間中、大縮尺航空写真および高解像度DEMを用いた地形判読や地形計測、遺跡調査報告書の収集・分析などを行って、調査計画および成果の充実をはかる。
RNAサイレンシング制御因子の同定と機能解析

RNAサイレンシングとは、小分子RNAによって誘導される塩基配列特異的な遺伝子発現制御機構の総称であり、生物種間で高度に保存され、細胞内プロセスにおいて非常に重要な役割を担っている。これまでに、その基本機構は明らかにされてきた。一方で、申請者はRNAサイレンシングの新規関連因子群を多数同定している。本研究では、これら新規関連因子群の詳細な機能解析を行い、RNAサイレンシングを制御する機構の解明を目指す。これにより、RNAサイレンシングの人為的な制御とその応用利用の可能性を探る。RNAサイレンシングとは、小分子RNAによって誘導される塩基配列特異的な遺伝子発現抑制機構の総称であり、生物種間で高度に保存され、細胞内プロセスにおいて非常に重要な役割を担っている。ショウジョウバエにおいては、RNAサイレンシング機構の基本経路は明らかにされている。これまでに、研究代表者はショウジョウバエRNAサイレンシング活性中心体RISCに相互作用する新規因子群を多数同定した。その中の一つとして、miRNAによる遺伝子発現抑制機構の活性中心因子Ago1およびGW182の相互作用タンパク質として、Tdrd3を同定した。Tdrd3の分子機能理解のため、抗Tdrd3マウスモノクローナル抗体の作製を進めている。これまでに、ショウジョウバエS2培養細胞のcDNAを用いて、Tdrd3 cDNAのクローニングに成功した。また、大腸菌を用いてTdrd3のN末端200アミノ酸とGSTの融合タンパク質を精製したのち、マウスに免疫を行なった。これまでに、免疫したマウスから得た血清は、ショウジョウバエS2培養細胞抽出液を用いたウエスタンブロッティングにて内在性Trdr3に特異的に反応した。本抗体の取得により、Tdrd3複合体の精製、既知の因子と相互作用、細胞内局在性などの解析を進めることができる。一方で、CRISPR/Cas9システムを用いて、Trdr3ノックアウト(Tdrd3 KO)ショウジョウバエの作製を進めている。これにより、Tdrd3 KOショウジョウバエの表現型の解析やmiRNA標的レポーター遺伝子をもつハエと掛け合わせることによるTdrd3の機能を解析が可能になる。Tdrd3は、miRNAを介したRNAサイレンシング制御因子と期待される。そこで、本研究では、これらTdrd3の詳細な分子機能解析を行い、その制御機構の解明を目指す。Tdrd3の分子機能解析のため、抗Tdrd3モノクローナル抗体の作製を進めている。これまでに免疫したマウスの血清が内在性Tdrd3に反応していることから、本マウスを用いてモノクローナル抗体の取得可能であると考えられる。今後の研究が大幅に進展すると期待される。一方で、CRISPR/Cas9システムを用いて、Trdr3ノックアウトショウジョウバエの作製を進めており、順調に進捗している。抗Tdrd3抗体を用い、免疫沈降法によるTdrd3を含むRISCの構成因子(タンパク質およびmiRNA)の同定、CLIP法を用いた標的mRNAの同定を行う。これら解析により、Tdrd3が普遍的なmiRISC制御因子であるか、もしくは特異的なmiRISC制御因子であるかを明確にする。一方でTdrd3 KOショウジョウバエの作製を進め、このショウジョウバエを用いて、miRNA標的レポーター遺伝子発現を指標としたTdrd3の機能解析を進める。これらの発現に影響があった場合、その原因が、miRNAのRISCへの取り込みの欠損か、標的RNAの認識・結合の欠損か、発現抑制能の欠損か明らかにする。また、レスキュー解析などを行い、機能ドメインやRISCとの結合ドメインの同定、タンパク修飾の関与の解析を進める。

これにより、Tdrd3 KOショウジョウバエの表現型の解析やmiRNA標的レポーター遺伝子をもつハエと掛け合わせることによるTdrd3の機能を解析が可能になる。Tdrd3は、miRNAを介したRNAサイレンシング制御因子と期待される。そこで、本研究では、これらTdrd3の詳細な分子機能解析を行い、その制御機構の解明を目指す。Tdrd3の分子機能解析のため、抗Tdrd3モノクローナル抗体の作製を進めている。これまでに免疫したマウスの血清が内在性Tdrd3に反応していることから、本マウスを用いてモノクローナル抗体の取得可能であると考えられる。今後の研究が大幅に進展すると期待される。一方で、CRISPR/Cas9システムを用いて、Trdr3ノックアウトショウジョウバエの作製を進めており、順調に進捗している。抗Tdrd3抗体を用い、免疫沈降法によるTdrd3を含むRISCの構成因子(タンパク質およびmiRNA)の同定、CLIP法を用いた標的mRNAの同定を行う。これら解析により、Tdrd3が普遍的なmiRISC制御因子であるか、もしくは特異的なmiRISC制御因子であるかを明確にする。一方でTdrd3 KOショウジョウバエの作製を進め、このショウジョウバエを用いて、miRNA標的レポーター遺伝子発現を指標としたTdrd3の機能解析を進める。これらの発現に影響があった場合、その原因が、miRNAのRISCへの取り込みの欠損か、標的RNAの認識・結合の欠損か、発現抑制能の欠損か明らかにする。また、レスキュー解析などを行い、機能ドメインやRISCとの結合ドメインの同定、タンパク修飾の関与の解析を進める。
神経細胞の移動を制御する因子ｓｒＧＡＰの立体構造決定と機能解析

RhoファミリーGタンパク質のGTPase活性化タンパク質(GAP)であるsrGAPは、神経細胞の移動方向に生じる細胞突起の形成を促進し、抑制的に細胞の移動を制御する。srGAPはGAPドメインに加え、F-BARドメインとSH3ドメインを有する。srGAPは他のF-BARタンパク質と異なり、陥入膜ではなく、突起膜に対応する膜曲率を誘導する。昨年度、srGAP3のF-BARドメインの結晶化に成功していたが、複結晶であり、単結晶にならなかった。本年度はsrGAP2、srGAP3、srGAP4のF-BARドメインのみの断片、F-BARからGAP、SH3ドメインまでの断片を結晶化を試みたが、新規の結晶は得られなかった。srGAP3のF-BARドメインの結晶化を続けたところ、これまでと異なる条件で単結晶を得ることができたが、結晶の大きさは不十分であった。大型の結晶を得るための検討を進めている。一方、srGAPと類似のF-BARドメインを持つタンパク質GAS7についても研究を進めており、良好な結晶の作成に成功した。GAS7とsrGAPは、どちらも突起構造を誘導する点で共通である。実施計画における立体構造決定までは至っていないが、結晶化までは達成したことになり、GAS7については立体構造決定が目前である。構造決定に成功すれば、細胞突起を誘導するメカニズムの直接的な解明が可能になると期待している。24年度が最終年度であるため、記入しない。F-BARドメインは細胞膜の変形を担うドメインである。本年度はsrGAP2、srGAP3、srGAP4のF-BARドメインをGST融合タンパク質として大腸菌内で発現させた。グルタチオンアフィニティーカラム、ゲルろ過カラムを用いて精製し、上記拡散法を用いて結晶化を試みいたところ、srGAP3のF-BAR断片の結晶化に成功した。結晶化条件の最適化を行い、薄い板状の結晶を作成し、シンクロトロンでX線を照射したところ分解能約4オングストロームまでの予備的な回折データを得ることができた。実施計画における立体構造決定までは至っていないが、結晶化までは達成したことになる。結晶化は立体構造決定に必須であり、srGAPのF-BARドメインの立体構造情報は研究目的の大半を達成するため、この結晶化成功は大変重要である。また、srGAP2、srGAP3のF-BARとGAPドメインを含む領域の断片タンパク質については、大腸菌内で発現させ、精製することには成功しているが、結晶は得られていない。srGAPのF-BARドメインの立体構造決定までが本年度当初の計画であが、結晶化は立体構造決定に必須であり、立体構造情報は研究目的の大半を達成するため、本年度の結晶化成功はおおむね順調な進展と言える。引き続きsrGAP3 F-BARドメイン断片の結晶化条件の最適化を行い、完全な回折データを収集する。また、セレノメチオニンを標識したsrGAP3 F-BARドメイン断片を調製、結晶化し、異常分散法を行って位相決定を試みる。また、F-BARドメインとGAPドメインやSH3ドメインを含む領域についても断片タンパク質の調整と結晶化を続けていく。決定した立体構造をもとに機能に必須なアミノ酸残基を特定し、それらの残基に対して変異を導入した変異体を作成し、細胞内や試験管内での挙動を野生型と比較する。
チップスケール原子時計による次世代情報システム

今後、原子時計の小型化&安価化により、チップスケール原子時計(Chip Scale Atomic Clock)がさまざまな電子機器に内蔵されることが予想される。既存の電子機器間の通信プロトコルや分散アルゴリズムの内蔵時計の計時精度は相違・誤差を想定しているが、計時精度はほぼ正確かつ一致することになる。本年度は原子時計による時刻合わせアルゴリズムを設計した。本来、相対的な計時精度は一致しても、絶対的な時刻の一致には明示的なアルゴリズムが必要となるからである。具体的にはNetwork Time Protocolと同様に通信によるものと、GPSによる時刻情報を利用したものである。また、これらはTDoA方式、つまり電波の到着時間差による測位手法に応用できることになる。研究期間中では測位システム自体への導入は間に合わなかったが、原子時計による高精度なTDoA方式を想定した位置検出サービスの実験を行い、それを論文にまとめた。また、原子時計を想定した同期及び相互排除アルゴリズムを開発し、それらを論文としてまとめた。同期、相互排除、認証、暗号化などの分散システムにおいて必須となる分散アルゴリズムや通信プロトコルについて、事象順序づけや識別子の生成において時刻情報を使っているかを調べた。具体的には既存のアルゴリズムやプロトコルの時刻情報の取得有無や必要精度については、それらの仕様書や論文などを調べるとともに、分散システムの処理の多くはオープンソース化されていることから、そのソースプログラムについて時刻取得システムコールの呼び出し有無などを調べることちにした。この結果、既存の代表的なプロトコルや分散アルゴリズムを、(1)絶対時間の計時を必要とするもの、(2)(相対的な)時間経過の測定を必要とするもの、(3)時間情報を必要としないものに分類し、次に時間情報の桁数や演算の正確により、(a)事実上のコンピュータに内蔵された原子時計による時間情報を正確と扱えるものと(b)それ以外に分類した。(1)は暗号関連及びユニーク識別子の生成以外は少ないが、それらも乱数生成処理を利用しており、絶対時間の計時を必ずしも必要としているわけではないことがわかった。逆に言うと時計の計時誤差を前提にしているといえ、チップスケールの原子時計が普及すると分散アルゴリズムが一変することを意味する。原子時計の小型化&安価化により、チップスケール原子時計(Chip Scale Atomic Clock)がさまざまな電子機器に内蔵されることになり、電子機器同士がほぼ正確な時刻を共有するというまったく新しい時間・時刻情報の使い方が出現することが予測されている。これは単に時間精度が向上するだけでなく、情報通信の原理や作り方を変えてることになる。この研究課題では、現在の情報システムの基盤となっている分散システムへの影響を中心にその影響を調査することを目的としている。本年度は同期、相互排除、認証、暗号化などの分散システムにおいて必須となる分散アルゴリズムや通信プロトコルについて、事象順序づけや識別子の生成において時刻情報を使っているかを調べるとともに、原子時計を想定した分散アルゴリズムの設計を行った。具体的には高精度時計を前提にしたトランザクション処理におけるログベースのデーター貫性制御とリカバリー処理である。そしてベクタークロックなどの分散コンピュータ間の因果関係維持プロトコルを実時間性を使うことで簡略化することを試みた。
無機-有機ハイブリッド型不斉光触媒の創成

光触媒に担持する助触媒には、白金などの金属微粒子がよく用いられており、水素発生の還元サイトとしての役割を担っている。一方、近年シンコニジンなどのアルカロィドを白金やパラジウムなどの貴金属に修飾した不均一系の不斉水素化触媒が開発され、プロキラルなα-ケトエステル類の不斉水素化に優れたエナンチオ選択性を示すことが報告された。従って、還元サイトとして働く白金助触媒上をシンコニジンなどのキラル分子で修飾した光触媒は、水素ガスを使用することなく、光照射下でプロキラルなα-ケトエステル類をエナンチオ選択的に水素化する不斉光触媒となりうる。今年度の研究は、上記のアイデアのもと、白金を担持した酸化チタン(Pt-TiO_2)と未担持のTiO_2にシンコニジンあるいはシンコニンのアルカロイド類を修飾した光触媒を調製し、プロキラルなα-ケトエステル類の不斉水素化を検討した。シンコニジンを修飾したPt-TiO_2ならびに未担持TiO_2を用いたときのピルビン酸エチルの分解とそれに伴う乳酸エチルの生成の経時変化を調べたところ、いずれの光触媒でもピルビン酸エチルの分解は1次反応速度則に従い、白金を担持していないほうが若干速く分解した。一方、水素発生量で比較すると、白金を担持したほうが約4倍の発生量があり、改めて白金が水素発生の助触媒であることを示している。これらの結果から、本研究でのピルビン酸エチルの還元反応は、熱的な水素付加が主たるプロセスではなく、電子移動とプロトン付加を伴う光電気化学的な還元プロセスが重要であることが示唆された。一方、生成物の乳酸エチルに対するエナンチオ選択性を調べたところ、シンコニジンまたはシンコニンで修飾したPt-TiO_2および未担持TiO_2のいずれも、明確なエナンチオ選択性は観測できなかった。本研究の当初の計画では、バナジン酸ビスマス(BiVO_4)光触媒の表面に不斉反応場を与えるシクロデキストリンを固定化した無機-有機ハイブリッド型不斉光触媒を開発することを目的とした。しかしながら、固定化する前のシクロデキストリンを用いたフェノール類の不斉開環反応について予備的な検討を行ったところ、シクロデキストリン固定型BiVO_4を合成したとして、不斉光触媒としての機能を有することはあまり期待できないと判断した。そこで、銀担持(Ag-BiVO_4)光触媒の表面にアミノ酸・ヒドロキシル酸などの不斉反応場を与える有機物を固定化した無機-有機ハイブリッド型不斉光触媒を開発し、O_-^2が関与する不斉光触媒反応を検討する研究計画に変更した。この研究では、Ag-BiVO_4の表面水酸基とアミノ酸・ヒドロキシル酸(L-フェニルアラニン、S-フェニルこはく酸、S-マンデル酸)のカルボキシル基をエステル縮合し、Ag-BiVO_4表面にアミノ酸・ヒドロキシル酸を固定化する新規合成法を開発した。この方法で固定化したアミノ酸・ヒドロキシル酸の密度は、約12mol/gであった。つまり、修飾密度は、1nm^<-2>単位面積あたりに610分子存在することになる。このように、本研究で開発した固定化法により、上記に示すアミノ酸・ヒドロキシル酸をAg-BiVO_4表面へ高密度に固定化することが可能となった。これらの光触媒を用いて、アドレナリンの光環化反応におけるエナンチオ選択性を調べた。光照射時間とともに300nmと480nm付近に二つのブロードな吸収バンドが現れることから、アドレナリンがO_-^2と反応して着色体であるアドレノクロムを与えることが確認できた。しかしながら、円二色性スペクトルの測定からは、アドレナリンの光環化におけるエナンチオ選択的な反応は確認できなかった。

一方、生成物の乳酸エチルに対するエナンチオ選択性を調べたところ、シンコニジンまたはシンコニンで修飾したPt-TiO_2および未担持TiO_2のいずれも、明確なエナンチオ選択性は観測できなかった。
ハイスループットtRNA修飾分析技術の開発

tRNA修飾が診断や予後予測マーカーとして検査医学へ応用されることが期待される。しかし、従来のtRNA修飾解析方法では、高感度かつハイスループットに解析することが困難であった。そこで本研究では、PCR法の原理を利用して簡単かつ迅速にハイスループットで解析できる技術開発を行った。本技術を用いると100マイクロリットルの末梢血からtRNA修飾が定量解析できた。本技術の開発により、tRNA修飾解析を検査医学へ応用することが期待できるようになった。1.qPCR-tRNA修飾分析法によるミトコンドリアtRNA修飾解析の実証・・・Mto1欠損マウス及び野生型マウスの骨格筋、心筋、脳から全RNAをフェノール・クロロフォルム抽出法にて精製した。同様にCdk5rap1欠損マウスの肝臓および胃から全RNAを精製した。ノックアウトマウスならびに野生型マウスから精製した全RNAを、100:0, 75:25, 50:50, 25:75, 0:100で混合し、ミトコンドリアtRNA修飾についてqPCR-tRNA修飾分析法にて解析した。その結果、理論値と実測値が完全に一致し、本分析法の有効性が示された。2.qPCR-tRNA修飾分析法によるミトコンドリア病患者末梢血のtRNA修飾解析・・・ミトコンドリア病患者の末梢血からトータルRNAを精製した。その後ミトコンドリアtRNAの37位のアデノシンのチオメチル化修飾について、qPCR-tRNA修飾分析法にて解析した。その結果、ミトコンドリアDNAの変異率とチオメチル化修飾が逆相関することが明らかになった。本研究結果より、ミトコンドリア病発症にミトコンドリアtRNA修飾の低下が関与していることが示唆された。qPCR-tRNA修飾分析法が臨床検査分野で応用可能か実証するために、ボランティア健常人末梢血標本を用いて2型糖尿病と関連のあるtRNA修飾であるtRNALys(UUU)修飾について検討した。100名のボランティア健常人から採取した末梢血から血球成分を分離後、赤血球を低浸透圧溶血させ、残存した血球から全RNAを精製した。qPCR-tRNA修飾分析法により、tRNALys(UUU)の37番アデニンのチオメチル化修飾について解析を行い、同法のヒト末梢血標本を用いた時の感度、正確性を検討した。その結果、100&#181;lの末梢血からtRNALys(UUU)のチオメチル化修飾を同定できることが明らかになった。これは、従来の方法の約1000倍の感度であった。2.qPCR-tRNA修飾分析法による2型糖尿病患者、胃がんおよび乳がん患者末梢血標本のtRNA修飾解析の実証早期胃がんおよび早期乳がん患者のがん部および非がん部標本を用いてtRNA修飾解析を行った。その結果、胃がん、乳がんともがん部におけるミトコンドリアtRNAのチオメチル化修飾が低下していることが明らかになった。一方、転移を認めた進行胃がんおよび乳がんでは、がんのステージの進行に伴って同修飾が増加することが明らかになった。さらにsiRNAでCdk5rap1の発現を抑制し、ミトコンドリアtRNAのチオメチル化修飾を抑制すると、がん細胞の浸潤が抑制された。以上の結果から、本研究で開発したqPCR-tRNA修飾分析法が、患者末梢血のtRNA修飾解析に有用であることが示された。また本技術を用いることにより、tRNA修飾を標的とした新しい疾患マーカーの発見につながることが示された。計画していた研究をすべて遂行することができた。また、ミトコンドリアtRNA修飾を簡便・迅速・ハイスループットに測定する技術開発を行い、本技術を用いてミトコンドリア病患者のtRNA修飾について解析することに成功した。その結果、ミトコンドリアtRNAの37位のアデノシンのチオメチル化修飾とミトコンドリア病の病態が完全に逆相関することを突き止めた。本研究成果をCell Metabolismに発表し、多くのマスメディアが本成果を取り上げた。生理学当初の計画どおり、様々な疾患(がん、糖尿病など)の患者末梢血標本を用いてtRNA修飾を調査し、各種疾患とtRNA修飾の関連性について解析する。