hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
血球貪食症候を自然発症する新規動物モデルの開発と発症機構の解析

アスパラギンエンドペプチダーゼ(AEP)遺伝子欠損マウスを解析し,体温上昇,貧血,肝脾腫,骨髄や脾臓における血球貪食細胞の出現など,ヒト血球貪食症候群(HPS)の病態をよく再現したモデルマウスとして位置づけた。血球貪食細胞はマクロファージであり赤血球貪食能は上昇し,一部でリソソーム病であるゴーシェ病に特徴的なゴーシェ細胞様の特徴も示した。リソソーム酵素であるAEPの欠損により貪食作用の亢進と血球分解産物の異常な蓄積を生じ, HPS様病態形成に深く関わっていることが示唆された。マウスのLegumain(アスパラギンエンドペプチダーゼ;AEP)遺伝子をノックアウトすると,加齢に伴って骨髄および脾臓に赤血球を貪食した細胞が多数出現した。本マウスをヒトの難治性血液疾患である血球貪食症候群(HPS)を自然発症する新しい動物モデルと位置づけ,その病態を解析した。加齢個体の骨髄で顕著に出現した赤血球貪食像は,脾臓肥大の見られない3ヶ月齢で既に顕著に出現しており,サイトスピンによる検索によって,貪食されているのは赤血球のみではなく,ヒトHPS同様に,有核細胞の貪食像も観察された。膜抗原の検索により,貪食細胞はマクロファージ系の細胞であることが確認され,ヒトのHPS様病態を自然発症することが示唆された。貧血を示すヘマトクリット値の低下は6ヶ月齢で有意に見られたが,特殊染色により網状赤血球を観察すると,3ヶ月齢で既に有意に上昇しており造血の亢進が示唆されるとともに,体温の上昇についても3ヶ月齢で既に1°C以上の上昇が見られた。一方,白血球や血小板の減少は観察した全ての期間にわたりヒトの症例のように減少しておらず,白血球数はむしろ上昇傾向にあり,ヒトHPSで見られる高サイトカイン血症についても,TNFαの血中値の上昇が一部の個体でのみ観察され,IFNγ,IL-1β,IL-4,M-CSFは正常であったことから,結論するには至っていないものの,本モデルはヒトHPSの全症例を再現するモデルではなく,一部の病態を示す病態モデルであることが示唆された。一方,AEPにはカスパーゼI(ICE)様活性が報告されている。ICEの関与が示されているFasリガンドにより誘導されるIL-1βの成熟型へのプロセッシングが,ICEのKOマウスで残存していることからAEPの関与が疑われたが,FasLを発現する細胞の移植によってもIL-1βの産生上昇は見られず,AEPの関与は観察されなかった。リソソーム酵素であるAEPを欠損したマウスの遺伝背景をC57BL/6にすると,B6;129背景で観察された体温上昇は観察されなかったが,骨髄における血球貪食像は6ケ月令でも顕著に観察され,加えてゴーシェ細胞様に細胞質が波状に染色される組織球が多数観察された。この細胞はB6;129背景でも観察できるが,電子顕微鏡像では細胞質に細長い結晶状の封入体を含むマクロファージが観察され,いわゆるゴーシェ様細胞の形態とは異なっていた。尚,C57BL/6背景では水腎が多発しており,既に報告した腎尿細管での超微形態的なリソソーム蓄積症様病態が遺伝背景を変えることにより形態的にも顕在化したものと推察される。一方,脾臓や骨髄で顕著に出現するCD68、F4/80陽性細胞の血球貪食像が組織球側の異常によるのか,赤血球の異常によるのかを明らかとするため,腹腔マクロファージによる蛍光ビーズの取込を測定したところ,僅かながらも有意な取込増が観察された。さらに,オプソニン化した若齢マウス由来の赤血球とチオグリコレート誘発腹腔マクロファージを用いて赤血球貪食を測定したところ,AEP欠損マウス由来の赤血球を用いた場合とAEP欠損マウス由来のマクロファージを用いた場合双方で,正常マウス由来の細胞を用いた赤血球貪食との差は見られなかった。老齢個体に由来する細胞を用いた貪食試験を待つ必要があるが,脾臓肥大や脾臓、骨髄の血球貪食病態の出現時期が36ケ月令以降であることを合わせると,血球貪食症候様病態は,加齢に伴ってAEP欠損に対する代償性機能が低下することによって引き起こされることが示唆される。さらにAEP欠損マウスの骨髄に多数存在する組織球がリソソーム蓄積症と関連するのかを検討する余地があると思われた。

アスパラギンエンドペプチダーゼ(AEP)欠損マウスにおいて加齢により進行する造血系細胞の異常を特徴付けるために,B6;129交雑系における主に6ヶ月齢以降のAEP欠損マウスに見られる病理変化を解析し,病態モデルとしての性格付けを行った。加齢したAEP欠損マウスは体温上昇,貧血,肝脾腫,骨髄や脾臓における血球貪食病態が観察された。これらの所見はヒトの血球貪食症候群(HPS)に特徴的な病態に一致した。血球貪食細胞の一部は,リソソーム病に分類されるゴーシェ病に特徴的なゴーシェ細胞様の形態を有し,自家蛍光やPAS陽性など,その特徴を示した。さらに,血球貪食細胞はF4/80およびCD68に陽性のマクロファージであり,赤血球貪食が顕著なことから,腹腔マクロファージの赤血球に対する貪食能を解析した結果,AEP欠損マウスの腹腔マクロファージでは貪食能が若干ではあるが有意に上昇していた。ヒトHPSは骨髄や脾臓などにおいて血球貪食マクロファージが異常増加する難治性疾患であり,サイトカインの過剰産生によるマクロファージの活性化が一因と考えられている。さらにAEP欠損マウスの赤血球膜蛋白質に異常が観察されたことから,赤血球の成熟や老化の異常により貪食作用が亢進しHPS様病態の悪化につながっている可能性も示唆された。AEP欠損マウスにおけるHPS様病態発現の分子機序は未だ不明であるが,リソソーム酵素であるAEPの欠損がタンパク質などの異常な蓄積を生じ,HPS様の病態形成に深く関わっていることが示唆された。AEP欠損マウスは末梢血中のサイトカイン上昇は見られないものの,ヒトHPSの病態をよく再現したモデルマウスとして位置づけることができた。
AMP経口摂取によるAMPK活性の増強と肥満およびインスリン抵抗性改善効果の検討

肥満および糖尿病を発症させた動物モデルでは、摂食中枢や骨格筋でのAMPK(AMP activated kinase)活性が変化しており、エネルギー代謝異常に関与していることが示唆されている.本研究では、AMPの経口摂取がAMPK活性の増強やエネルギー代謝異常の改善に有効であるか、AMPの栄養生理物質としての可能性について検討した.その結果、糖のみを摂取した時に対してAMPを同時に摂取した場合、インスリン感受性の亢進と血糖上昇の緩和が認められた.肥満および糖尿病を発症させた動物モデルでは、摂食中枢や骨格筋でのAMPK(AMP activated kinase)活性が変化しており、エネルギー代謝異常に関与していることが示唆されている.本研究では、AMPの経口摂取がAMPK活性の増強やエネルギー代謝異常の改善に有効であるか、AMPの栄養生理物質としての可能性について検討した.その結果、糖のみを摂取した時に対してAMPを同時に摂取した場合、インスリン感受性の亢進と血糖上昇の緩和が認められた.AMPK(AMP activated kinase)はAMPを基質とするキナーゼで,生体内エネルギー代謝に深く関わる。レプチン作用がAMPK活性を介することや,肥満および糖尿病発症モデルでは,摂食中枢や骨格筋でのAMPK活性が変化しており,エネルギー代謝の異常に拍車をかけていることが示唆されている。本研究では,AMPの経口摂取がAMPK活性の増強やエネルギー代謝異常の改善に有効であるか,またAMPの栄養生理物質としての可能性について,血液成分およびAMPK活性の解析を行った。5%Glucose液および5,10,15%のAMPを添加したGlucose/AMP混液をゾンデでマウスに投与し(0.5m 1/匹),5,10,15,30分から150分後まで30分毎にエーテル麻酔下で心採血および肝臓,膵臓,小腸,骨格筋,腹腔脂肪を採取し,分析に用いた。血糖に対するAMP濃度の検討の結果AMP10%液投与群において投与後15分から有意に血糖上昇抑制され15%液との差が見られなかったことから他の解析は10%液投与群についてのみ行った。血中インスリン濃度は投与後5分では差はなかった。AMP群ではその後コントロール群のような急激な上昇はみられず,緩やかな低下を示した。血中中性脂肪は両群に違いが認められなかったが,遊離脂肪酸は両群とも投与から15分後にかけて低下したが,その幅はAMP群で太きく,その後の上昇も抑えたれた。.以上のことから鯉経口摂取は血糖上昇および脂肪酸合成を緩やかにし,また糖の流入による脂肪分解抑制を増進し,糖尿病などの血糖,脂質コントロールが重要な疾患に有益な生理物質となりうることを示唆が示唆された。そのはたらきはインスリン作用以外,つまり骨格筋での糖吸収の増進や肝臓での解糠系,グリコーゲン合成の促進など,急速なGlucose利用に影響しているためと推測されるが,肝,筋組織におけるAMPK活性について明確な違いは認められなかった。2カ年目はGLUT,GSK活性を中心に更に詳細な検討を行うと伴に,肥満,糖尿発症モデルでの効果も検討していく。AMPK(AMP activated kinase)はAMPを基質とするキナーゼで、生体内エネルギー代謝に深く関わる。レプチン作用がAMPK活性を介することや、肥満および糖尿病発症モデルでは、摂食中枢や骨格筋でのAMPK活性が変化しており、エネルギー代謝の異常に拍車をかけていることが示唆されている。本研究では、AMPの経口摂取がAMPK活性の増強やエネルギー代謝異常の改善に有効であるか、またAMPの栄養生理物質としての可能性について、血液成分およびAMPK活性の解析を行った。5%Glucose液および5、10、15%のAMPを添加したGlucose/AMP混液をゾンデでマウスに投与し(0.5ml/匹)、5、10、15、30分から150分後まで30分毎にエーテル麻酔下で心採血および肝臓、膵臓、小腸、骨格筋、腹腔脂肪を採取し、分析に用いた。AMP群ではその後コントロール群のような急激な上昇はみられず、緩やかな低下を示した。血中中性脂肪は両群に違いが認められなかったが、遊離脂肪酸は両群とも投与から15分後にかけて低下したが、その幅はAMP群で大きく、その後の上昇も抑えたれた。以上のことからAMP経口摂取は血糖上昇および脂肪酸合成を緩やかにし、また糖の流入による脂肪分解抑制を増進し、糖尿病などの血糖、脂質コントロールが重要な疾患に有益な生理物質となりうることを示唆が示唆された。そのはたらきはインスリン作用以外、つまり骨格筋での糖吸収の増進や肝臓での解糖系、グリコーゲン合成の促進など、急速なGlucose利用に影響しているためと推測されるが、肝、筋組織におけるAMPK活性について明確な違いは認められなかった。
知識メディアによる再編集・再流通可能な知識流通に対応したライセンス並びに課金機構

本研究ではIntelligentPadが実現している再編集・再流通機能に、ライセンス及びロイヤルティ管理の機能を導入し、各基本部品や合成部品のどの機能をどれだけ用いたかに応じて、課金・請求・決済を行う機構を実現し、再編集・再流通可能な電子的知財の流通基盤システムの実用化を目指した研究開発を行った。本研究開発では、申請者が既に開発したIntelligentPadを流通メディアとして用いたので、(1)マルチメディア文書のみならず、各種アプリケーションツールも含むあらゆる電子的知財を、(2)可視的コンポーネントをスクリーン上で組み合わせて定義することができ、(3)得られた合成オブジェクトをウェブ・ページに埋め込んでインターネットを介して出版流通させ、(4)クライアント側のローカル環境で自在に再利用でき、(5)流通知財をユーザが自由に再編集・再流通できる。しかも、部品パッドの開発提供者(プロバイダ)、システム・インテグレータ、流通仲介者(ブローカ)、利用者(ユーザ)の4者を各々複数含む流通モデルを構築し、ブローカを介さないユーザ同士の直接流通においても、各ユーザから各パッドの使用量に応じた対価がブローカを経由してプロバイダやインテグレータに支払われる流通モデルを構築した。この流通モデルと整合性の取れたライセンス機構・課金機構を、各パッドに組み込まれるリクエスト・モデュールとカーネルに組み込まれるアカウント・モデュールの2つのモデュールで実現した。これらの組み合わせによって、各種の課金やセキュリティ保護、ライセンス保護、ロイヤリティ管理がいかに実現できるかを明らかにした。これらのモデュール開発に必要なAPIライブラリを開発し、リクエスト・モデュールとアカウント・モデュールの開発を行った。これを用いて各種課金方式やライセンス保護・ロイヤリティ管理機構の試作開発を行った。これらを基盤にロイヤリティ・サーバの実現のための技術検討を行った。(1)再編集・再流通可能な超流通基盤方式の研究開発(田中譲)部品パッドの開発提供者(プロバイダ)、システム・インテグレータ、流通仲介者(ブローカ)、利用者(ユーザ)の4者を各々複数含む流通モデルを構築し、ブローカを介さないユーザ同士の直接流通においても、各ユーザから各パッドの使用量に応じた対価がブローカを経由してプロバイダやインテグレータに支払われる流通モデルを構築した。(2)ライセンス機構・課金機構のためのAPIの抽出(田中譲)(1)の流通モデルと整合性の取れたライセンス機構・課金機構を、各パッドに組み込まれるリクエスト・モデュールとカーネルに組み込まれるアカウント・モデュールの2つのモデュールで実現すべく、これらの組み合わせによって、各種の課金やセキュリティ保護、ライセンス保護、ロイヤリティ管理がいかに実現できるかを明らかにし、これらのモデュール開発に必要なAPIライブラリを開発した。(3)課金モデュール、利用要求モデュールの試作開発(赤石美奈)(1)(2)に基き、リクエスト・モデュールとアカウント・モデュールの開発を行った。(4)ロイヤリティ管理機構の研究開発(赤石美奈)ロイヤリティ情報の集中管理検索システムの研究開発を行った。本研究では、IntelligentPadが実現している再編集・再流通機能に、ライセンス及びロイヤルティ管理の機能を導入し、各基本部品や合成部品のどの機能をどれだけ用いたかに応じて、課金・請求・決済を行う機構を実現し、再編集・再流通可能な電子的知財の流通基盤システムの実用化を目指した研究開発を行った。本年度は、以下の項目を計画に基づいて研究開発した。(1)再編集・再流通可能な超流通基盤方式の研究開発(田中譲)初年度に開発されたリクエスト・モデュールとアカウント・モデュールを用いて各種課金方式やライセンス保護・ロイヤリティ管理機構の試作開発を行った。(2)ライセンス機構・課金機構のためのAPIの抽出(田中譲)

初年度のライセンス機構・課金機構のセキュリティに関する成果をAPIに反映し、リクエスト・モデュールとアカウント・モデュールのモデュール間通信のセキュリティを保証した。同時にクロスプラットフォーム流通可能性へと拡張するために、Macintosh用APIライブラリを開発した。(3)ライセンス機構・課金機構のセキュリティを保証するための暗号化技術の確立(田中譲)初年度の基礎研究を進め、セキュリティ・ホールの有無を検討するとともに、ロイヤリティ・サーバのセキュリティを保証するための技術を検討した。(4)課金モデュール、利用要求モデュールの試作開発(赤石美奈)(2)に基き、リクエスト・モデュールとアカウント・モデュールを改良した。同時にクロスプラットフォーム流通可能性へと拡張するために、Macintosh用リクエスト・モデュールとアカウント・モデュールの開発を行った。(5)ロイヤリティ管理機構の研究開発(赤石美奈)ロイヤリティ情報の分散管理検索システムの基礎的研究開発を行った。
ホスホ硫酸エステルの反応(金属イオンとアデニンの役割)

1.【Mg^(2+)】生物有機化学的特性を明らかにするために、アデノシンホスホ硫酸エステル(APS,PAPS)のモデル化合物,フェニルホスホ硫酸エステル(PPS)のアルコリシスCMeOH,EtOH,iPrOH,sec-BuOH)に及ぼす種々の金属イオンの触媒効果(加速と結合開裂部位の選択・1・2式)について研究した。2.(【i】)【Mg^(2+)】の効果:(a)メタノリシスにおいて、【Mg^(2+)】は【Mn^(2+)】や【Ca^(2+)】と同様に選択的P-O結合開裂を触媒した。(b)その他のアルコリシスにおいてはP-OとO-Sの混合開裂を触媒し、O-S結合開裂の割合はアルコール分子の嵩高さと共に増大した。(c)DMFの添加はO-S結合の開裂と【Mg^(2+)】の加速効果を抑制した。(【ii】)【Zn^(2+)】の効果(a)メタノリシスにおいて、【Be^(2+)】,【Se^(3+)】,【Fe^(3+)】と同様に【Zn^(2+)】は選択的なO-S結合の開裂を触媒した。その上、(b)その他のアルコリシスにおいても、またDMFを共存させても、O-S結合の開裂のみを促進した。3.以上の結果より次の事が明らかになった。(1)【Mg^(2+)】の強い溶媒和はPPS-【Mg^(2+)】錯体の形成を抑制する。(2)脱溶媒和は錯形成を容易にし、【Mg^(2+)】の触媒効果を顕著にする。(3)一部脱溶媒和した【Mg^(2+)】はP(v)中間体(【1!】)の安定化に働きP-O結合の開裂を触媒する。(4)更に脱溶媒和が促進されれば、【Mg^(2+)】は【1!】の安定化に働くよりも遷移状態(【1!】)の安定化に働く方がエネルギー的に有利となりO-S結合の開裂を促進する。(5)【Mg^(2+)】の脱溶媒和はそのハ面体配位構造から四面体配位構造への変化を反映していると考えられる。【Mg^(2+)】の特性は周囲のミクロ溶媒環境に応じて容易に配位構造を変化することにあると決論できる。APSやPAPSの反応についても検討中である。
C型肝炎ウイルス蛋白質の発現調節能と遺伝子不安定化能に関する研究

本研究ではHCV蛋白質の細胞内機能と肝発がんとの関係を明らかにすることを目的として、HCVコアおよびNS5A蛋白質の転写調節能や遺伝子不安定性に及ぼす影響を調べ、以下に示すような結果を得た。HCV蛋白質の転写調節能に関しては、HCV高感受性株であるヒト肝PH5CH8細胞を用いて、昨年度のコア蛋白質に引き続いて、NS5A蛋白質の発現により影響を受ける遺伝子群の解析を行い、Collagen type IV alpha-1,Zyxin related protein-1,Prothymosin alpha,RAF oncogene,Cytokeratin 18およびE2F-1 pRB-binding proteinの6種類の発現が高進していることを明らかにした。さらに、昨年度見い出したコア蛋白質による2′-5′オリゴアデニル酸合成酵素(OAS)遺伝子プロモーターの活性化についてさらに詳しく解析した。その結果、コア蛋白質による2′-5′OAS遺伝子プロモーターの活性化はinterferon処理によりさらに増強されることが分かった。また、この活性化はE1、E2、NS5A蛋白質を発現させた場合には認められず、活性化の程度は導入したコア蛋白質発現ベクターの量に比例していた。アミノ酸配列が異なる各種遺伝子型(1a,1b,2a,2bおよび3a)由来のコア蛋白質もこの遺伝子プロモーターを活性化した。2′-5′OAS遺伝子プロモーターの活性化は転写レベルで起こっていることがノーザンブロットにより確かめられた。さらに、内在性の2′-5′OAS遺伝子の活性化も同時に起こっていることが明らかとなった。2′-5′OAS遺伝子プロモーターの欠失変異体やinterferon stimulated response element(ISRE)の配列を有するレポータープラスミドを用いて解析したところ、コア蛋白質による2′-5′OAS遺伝子プロモーターの活性化はISREを介していることが示唆された。遺伝子不安定性に関しては、上記の肝細胞とレトロウイルスベクターによる発現系を用いて、ミスマッチ修復系に属するマイクロサテライト不安定化能に関する細胞レベルでのアッセイ系の開発を行い、実用的なシステムを得ることができた。この新たに開発したアッセイシステムを用いてHCV蛋白質がマイクロサテライト不安定性にどのような影響を与えるかを検討した結果、コア蛋白質の発現により、マイクロサテライト不安定性が増強される傾向にあることが分った。NS5A蛋白質の発現ではこのような現象は認められなかった。現在、この現象をさらに追究するとともに、他のDNA修復系のアッセイ系についても構築中である。
歯周病原細菌は腸管透過性亢進に関与するか？

歯周疾患と様々な全身疾患との関連において、腸内細菌叢バランスの変動が影響することが報告されている。歯周病原細菌の一つであるPorphyromonas gingivalisを経口投与したマウスモデルにて、腸管において遺伝子レベルでタイトジャンクションタンパク発現が有意に低下し、血清中エンドトキシンレベルの上昇を確認した我々の先行研究をうけ、本研究では腸上皮細胞への刺激実験、無菌環境下にて経口投与するマウスモデルを用いた感染実験を行い、P. gingivalisの腸管透過性に対する直接的な影響を検討した。ヒト結腸癌由来細胞(Caco-2)をP. gingivalis LPS、菌体、上清にて各々刺激し、タイトジャンクション遺伝子・タンパク発現、腸管透過性について解析した。P. ginigivalis LPS刺激では明確な変化が認められなかった。菌体、上清を用いた高濃度での刺激においては、遺伝子・タンパクレベルで接着分子の発現低下、透過性亢進が認められた。無菌環境で行ったマウスへのP. gingivalis単独経口投与では歯槽骨吸収を認めなかった。歯肉・腸管・肝臓の炎症性サイトカイン遺伝子発現に変動は認められず、腸管タイトジャンクションタンパク遺伝子発現については口腔内常在菌投与のコントロール群と同程度であった。血清中エンドトキシンレベル、IL-6レベルへの影響は認められなかった。以上より、P. gingivalis自体が腸管へ直接的に影響を及ぼすのではなく、腸内細菌叢バランスの変動を惹起することで腸管透過性が亢進され、全身に影響が及ぶことが示唆された。歯周炎と関連するといわれているいくつかの疾患では,腸内細菌叢のバランスの乱れ(dysbiosis)とそれに伴う腸管透過性の亢進による内毒素血症(endotoxemia)が深く関わっていることが報告されている.近年申請者の研究グループでは,歯周病原細菌を経口投与したマウスモデルにおいて,腸内細菌叢のバランスの変動とともに,血清中エンドトキシンレベルの上昇と,様々な組織や臓器における炎症の惹起を確認した.本研究では,このメカニズムのKEYとなるであろう腸管透過性の亢進における, Porphyromonas gingivalisの直接的な影響について明らかにすることを目的とした.腸上皮細胞に対し, E. coli LPS, P. gingivalis LPS, P. gingivalis W83株生菌にて各々刺激し,腸管透過性,炎症性応答,腸管粘膜防御作用へ及ぼす影響を検討する.またP. gingivalis経口投与マウスモデルにて,腸管における細胞接着分子の発現,腸管透過性,血清中のエンドトキシンレベルの変動について解析し,腸管透過性の亢進へ及ぼす影響を検討する.本研究で,腸上皮細胞に対するP. gingivalisの特異的な作用が明らかになるだけではなく,今後,唾液とともに嚥下しているであろう他の歯周病原細菌や,それらにより変動した腸内細菌における腸管・生体への作用を比較検討する際にも応用できる.そして歯周炎と全身疾患との因果関係を検証していくうえで,常在細菌叢のバランス破綻が生体機能に及ぼす影響を解明する足がかりとなると考える.ヒト結腸癌由来細胞(Caco-2)をTranswellに播種し十分に分化させた腸上皮細胞に対し, Transwellの内側であるApical側(腸管側),外側であるBasal側(粘膜固有層側)へ各々E. coli LPS, P. gingivalis LPSにて刺激し,細胞間接着分子であるZo-1, Occludin遺伝子発現,腸管透過性の機能的評価を行った.今年度は細胞培養条件,経時的条件,濃度条件, Transepithelial resistance (TER)測定方法における検討にとどまった.E. coli LPS 100ng/mlで刺激した際のZo-1, Occludin遺伝子発現はApical側への刺激により有意な低下が認められたが, Apical, Basalいずれへの刺激においてもTERはほとんど差がなかった. P. g. LPS 100ng/mlで刺激した際のZo-1, Occludin遺伝子発現はApical側への刺激により遺伝子発現は低下傾向が認められるものの有意差はなく, Apical, Basalいずれへの刺激においてもTERはほとんど差がなかった. P. gingivalis LPS単独では上皮細胞における物理的バリア機能に及ぼす影響はそれほど大きくないことが示唆される.歯周疾患と様々な全身疾患との関連において,腸内細菌叢バランスの変動が影響することが報告されている.歯周病原細菌の一つであるPorphyromonas gingivalis (P. gingivalis)を経口投与したマウスモデルでは,腸管において遺伝子レベルでタイトジャンクションタンパク発現が有意に低下し,血清中エンドトキシンレベルが上昇した.またこのモデルでは,腸内細菌叢のバランスの変動とともに様々な組織や臓器における炎症の惹起を確認した.このメカニズムには,腸管透過性亢進の関与が考えられる.前述の変動について,経口投与したP. gingivalisが直接的にどのような影響を検討することを目的とした本研究では,腸上皮細胞に対するP. gingivalisの直接的・特異的な作用の解析に加え,今後,唾液とともに嚥下しているであろう他の歯周病原細菌や,それらにより変動した腸内細菌における腸管・生体への作用について比較検討し,詳細なメカニズムの解明へ応用することを期待する.ヒト結腸癌

由来細胞(Caco-2)培養条件,経時的条件,濃度条件, Transepithelial resistance (TER)測定方法の検討を行った昨年度に引き続き,本年度ではE. coli LPS, P. gingivalis LPSにて各々刺激し,腸管透過性,炎症性応答,腸管粘膜防御作用へ及ぼす影響を解析した.加えてマウスモデルにて, Gnotobiote実験による検証として無菌環境下におけるP. gingivalis単独投与での感染実験系の確立と解析を行った.また, 6週齢雄無菌マウスC57BL/6にP. gingivalis W83株を経口投与したP. gingivalis群,コントロールとしてLactobacillus salivarius ATCC11741を投与したL. salivarius群,基材のみ投与したSham群に分け,週2回投与を5週間,計10回投与を行い,歯槽骨吸収解析,歯肉・腸管の遺伝子発現解析を行った.無菌環境でP. gingivalis単独の口腔投与は歯槽骨吸収を誘導しなかった.歯肉・腸管の炎症性サイトカイン遺伝子発現に変動は認められなかったが,腸管タイトジャンクションタンパク遺伝子については有意な発現上昇が認められた.歯周疾患と様々な全身疾患との関連において、腸内細菌叢バランスの変動が影響することが報告されている。歯周病原細菌の一つであるPorphyromonas gingivalisを経口投与したマウスモデルにて、腸管において遺伝子レベルでタイトジャンクションタンパク発現が有意に低下し、血清中エンドトキシンレベルの上昇を確認した我々の先行研究をうけ、本研究では腸上皮細胞への刺激実験、無菌環境下にて経口投与するマウスモデルを用いた感染実験を行い、P. gingivalisの腸管透過性に対する直接的な影響を検討した。ヒト結腸癌由来細胞(Caco-2)をP. gingivalis LPS、菌体、上清にて各々刺激し、タイトジャンクション遺伝子・タンパク発現、腸管透過性について解析した。P. ginigivalis LPS刺激では明確な変化が認められなかった。菌体、上清を用いた高濃度での刺激においては、遺伝子・タンパクレベルで接着分子の発現低下、透過性亢進が認められた。無菌環境で行ったマウスへのP. gingivalis単独経口投与では歯槽骨吸収を認めなかった。歯肉・腸管・肝臓の炎症性サイトカイン遺伝子発現に変動は認められず、腸管タイトジャンクションタンパク遺伝子発現については口腔内常在菌投与のコントロール群と同程度であった。血清中エンドトキシンレベル、IL-6レベルへの影響は認められなかった。以上より、P. gingivalis自体が腸管へ直接的に影響を及ぼすのではなく、腸内細菌叢バランスの変動を惹起することで腸管透過性が亢進され、全身に影響が及ぶことが示唆された。今後Caco-2に対するP. gingivalis生菌や他の歯周病原細菌LPSでの刺激,腸管透過性についてはFITC蛍光標識Dextran透過性測定の追加を検討中である.またP. gingivalis経口投与マウスモデルにて,腸管における細胞接着分子の発現,腸管透過性の変動,腸管粘膜防御作用へ及ぼす影響等について解析し,より多角的な視点から検討を行うことを予定している.
ペロブスカイト薄膜における特異的準安定ナノ構造と電子輸送特性に関する研究

1. PCMO結晶性-抵抗-パルス抵抗スイッチングの関係の体系的研究マンガナイト系ペロブスカイトPCMO((Pr_<0.7>Ca_<0.3>)MnO_3)薄膜における、電界パルス誘起抵抗変化(electricpulse-induced resistive change: EPIR)(APL.76, 2749(2000))は、磁場印加の必要無しに電圧パルスの印加により室温で数桁におよぶ抵抗変化が現れるという電子デバイス応用上画期的なものであった。単結晶あるいはエピタキシャル成長PCMOは、AgまたはPt電極の4端子法測定で金属的な導電性しか示さない(Phys. Rev. B 62, R16337(2000))が、何故に初期的に高抵抗を示し、電圧パルスの印加により高抵抗-低抵抗のスイッチングを起こすのかは、謎であった。我々は、様々の基板(Si、(111)配向Pt電極、SrTiO_3)にパルスレーザー法、スパッタリング法で化学両論、非化学両論組成PCMOを成膜温度、酸素アニーリング条件などを体系的に変化させて作製し、PCMO薄膜の結晶性と初期抵抗、抵抗スイッチング現象との関係を詳細に調べた。その結果、Pt電極を使用する限り、高結晶性のPCMO薄膜では、高抵抗は実現できず抵抗スイッチングも起きない。高抵抗アモルファスPCMOにフィラメントパスとナノスイッチが形成され、スイッチング動作がおきていることを明らかにした(APL 89, 243504(2006)他)。2.フィラメントパスーナノドメインスイッチ構造の原理試作と動作メカニスムの解明拡散防止導電性膜としてCMOSプロセスで使用されるTiN表面を低温酸化させ、モット転移の臨界ドナー濃度の低いTiO_2アナターゼナノ層を形成、前者をフィラメントパス、後者をナノスイッチとして抵抗スイッチングデバイスを作製、高分解能透過型電顕(HR-TEM)、エネルギ分散X線スペクトロスコピー(EDS)、電子線エネルギ損失分光(EELS)によりスイッチング特性とナノ構造(電子軌道構造)を解析して、電子注入に伴う酸素イオン拡散、欠陥形成(VO_2+2e')によるナノ領域モット転移のメカニスムを解明した(APL 89, 223509(2006)他)。(Pr1-xCax)MnO3(x=0.4,0.5)薄膜の超巨大磁気抵抗効果(CMR)は成長基板からの応力に著しい影響を受けることが報告されている。しかしながらこの領域では、斜方晶空間群Pbnmのa,b比は1に近く、そのため擬似立方晶a_p=0.385nmを基にした各種単結晶基板上でのエピ成長とそれに伴う結晶歪が議論できるが、相境界組成x=0.3では、a,b比が1に近似できなくなり、擬似立方晶を単斜晶として取り扱わねばならなくなる。それ故相境界組成では従来報告されている応力歪の発生と電子輸送特性とが大きく異なることが予想される。そこでSrTiO3(001)単結晶基板(以下STO)およびSi基板(111)配向Pt

電極上にRFスパッタにより相境界組成(Pr1-xCax)MnO3(x=0.3)(以下PCMO)薄膜を成膜して、そのナノ構造を詳細に調べた。その結晶方位関係は従来報告のない<110><001>PCMO//<100><010>//STO、<001><110>PCMO//<100><010>STOであり、強誘電体ドメインと同様のナノ構造を形成することが解明された(Appl.Phys.Lett投稿中)。またCMR素子を実用的に作製する上で重要なSi基板(111)配向Pt電極においては、Pt(111)上の3つの基本結晶方位[-110][-1-12],[0-11][2-1-1],[10-1][-12-1]に規定されたPCMO(102),(100),(112)の3種類のエピ成長が確認され、成膜温度で配向比率が変化する。今後これらエピ成長膜の電子輸送特性を調べる予定である。また、TiN上のTiO2膜でナノ秒オーダーの極性パルスにより40,000%の抵抗スイッチングを確認し、HR-TEMにより確認されたアナターゼ構造からモット転移による機構が推定されることを発表した(JJAP Exp.Lett)。前年度は、金属導電性TiNの表面を低温オゾン酸化させることで、数ナノメートルのTiO_2酸化膜を形成して、これが超高速のバイポーラパルス抵抗変化を示すことを明らかにした(JJAP Exp.Lett.45、L310(2006))。本年度はこのナノメーターオーダーの酸化膜の精密な構造解析と動作原理検証とを、高分解能TEMとEELSを用いて行った。TiNのTiN_6八面体は歪みを伴わずにOhで表記される高い対称性を有している。これに対しTiO_2ルチルのTiO_6八面体は、わずかに斜方晶へと歪んでおり(D2h)、アナターゼTiO_6八面体は、斜方晶よりもさらに歪んだ構造となっている(D2d)。すなわちこれらの対称性は、Oh、D2h、D2dの順に対称性が低下している。TiNのTi_<3d>軌道はその部分対称性を反映してt_<2g>とe_gに分かれる。それゆえ2pスピン-軌道相互作用は2p_<3/2>(L_3)と2p_<1/2>(L_2)とに分裂する。同様にルチルとアナターゼではその対称性の低下を反映したクリスタル-フィールド相互作用により3d軌道の更なる分裂を誘起する。ルチルもアナターゼも同様にL_3とL_2のスプリットが現れるが、アナターゼのTiサイトがより歪んでいることを反映して、L_3の二番目のピークがhigh-energy shoulderとなる。2.5nmの厚さの酸化膜のEELS/ELNESプロファイルはアナターゼであることを示し、アナターゼのMott転移臨界ドナー濃度がルチルよりも遥かに低いことから、観測された高速の抵抗値変化はアナターゼナノ層への電子の注入・抽出とそれに伴うO^<2->のマイグレーションにより動作しており、stufEed barrierとも称される粒界に酸素を溜め込む機能を有するTiNがO^<2->のreservoirの役割を果たしていることで機能していることを明らかにした(Appl.Phys.Lett.89, 223509(2006))。
法学教育における比較法史の役割を考える-中世の法を素材にして-

1)ドイツのマールブルク大学図書館を拠点にして、Hubnerが作成した目録に従い西洋中世裁判文書を収集し、解読を進めるとともに、ゲルマン法関係史料、文献を集めた。2)日本法制史研究者の助力を得ながら、日本中世の和与文書とそれに関係する文献を収集した。また日本三代実録に記録されている裁判関係記録を読み進めた。明法家を養成する仕組み、明法家の法律実務の手法を伝える史料や文献を収集し、読み進めた。3)先輩研究者からの聞き取りについては、三人の方にお話をうかがった。また故人となられた方お一人について、参加者の異なる二つの座談会をした。「本年度の研究実施計画」に従い、以下のことをした。(1)ドイツ中世法について:*短期間ドイツに滞在し、Hubnerが作成した裁判文書目録に従い、13の文献から117点の文書を収集できた。*それとは別に日本で入手可能な文献に収録されている22点のラテン語の文書を仮訳することができた。(2)ゲルマン法について:Die Begriffe Germanisches Recht und Deutsches Recht bei den Rechtshitorikerndes 19. und 20. Jahrhunderts,1968をドイツ滞在中に見つけた。またゲルマン法をめぐる議論に関連した論文を作成し、『同志社法学』で公表することができた。またこの論文は、ドイツ中世法に係わる1990年以前の論争の整理にもなっていて、その意味で(1)に間接的に関連する成果であるといえる。(3)研究テーマに関連し、三浦澄雄先生(関西学院大学名誉教授)、山中永之佑先生(大阪大学名誉教授)にインタビューができた。テープ起こしをしたものを現在編集中である。(4)日本中世法について:鎌倉時代の裁判(=和与)に絞って文献を収集し、ヨーロッパとの比較を念頭において検討した。「本年度の研究実施計画」に従い、以下のことができた1裁判文書について(1)ドイツのマールブルクに短期間滞在し、Hubnerの目録に従い、4点の文献から12点の文書を収集した(2)裁判文書が記録された裁判の具体的なあり方を知るために、西欧中世における裁判制度の発展のプロセスを明らかにできる文献の収集に努めた(3)(2)に関連して論文を作成した2ゲルマン法について3日本中世法について(1)鎌倉時代の和与に関する史料集1点を入手した4聞き取りについて(1)法制史教育に関連する英知を記録にとどめるために、先輩法制史研究者に対するインタビューを次のように実施した*山中永之佑大阪大学名誉教授に対する2回目のインタビュー。次年度春学期中に公表できるところまで作業が進んでいる*故・塙浩神戸大学名誉教授の法史学を語る座談会を、関係者4人に集まっていただき実施した。テープお越しが済み、現在編集中である*上山安敏京都大学名誉教授に、法制史学会近畿部会の協力を得てインタビューをすることができた。テープお越しが終了した本年度の研究実施計画に従い、以下のことをした。裁判文書について2)科研費で購入したスキャナーを用い、収集済み文書の保存作業を進めた。3)裁判文書の仮訳の作業を進めた。日本中世法について1)武家家法、鎌倉時代の和与文書について専門研究者と間題点の検討を進めた。先輩法制史研究者に対する聞き取りについて1)「聞き書き・わが国における法史学の歩み(四)-山中永之佑先生にお聞きする」原稿を完成し、本年1月31日原稿締切りの『同志社法学』に投稿した。2)「聞き書き・わが国における法史学の歩み(五)-塙浩先生の法史学を語る」原稿を本年3月31日原稿締切りの『同志社法学』に投稿する。3)「聞き書き・わが国における法史学の歩み(六)-塙陽子先生にお聞きする」原稿は、「あとがき」を除いて完成した。来年度早々、『同志社法学』に投稿する。4)奥村郁三先生(東洋法制史)に2回のインタビューをし、原稿に起こした。来年度中には、『同志社法学』に投稿し、公にできる予定である。
認知症予防のためのライフコース要因と社会・物理的環境の解明

2017年9月から10月にかけて、新潟県十日町市の都市部及び農村部より層別無作為抽出法によって抽出しJAGES質問紙調査の協力が得られた65歳から84歳の非要介護高齢者527名を対象に、1週間に渡りGPS及び活動量計の装着を依頼した。ここでは、3日以上のGPSデータ及び4日以上の活動量計データが得られ、且つ調査期間中に非日常的な行動(例旅行)を行わなかった388名のデータの解析を行った。初日と最終日のデータを除くGPSデータから算出した日常行動範囲を基に、参加者を十分位に分けた。平均行動範囲(Mean+SD)は、下位群(第1十分位数:56名)が0±0 km2、中位群(第29十分位数:310名)が12.3±21.6km2、上位群(第10十分位数:32名)が384.2±233.1km2であった。まず、行動範囲下位群と上位群のの身体活動を、1日あたりの歩行時間、座位行動時間、そして身体活動ガイドライン基準の充足割合という観点から比較したところ、平均歩行時間は、下位群は45.1±24.5分、上位群は67.8±38.5分であり、上位群の方が平均歩行時間が統計的にも有意に高く、GPS装着の妥当性を確認できた。さらに、日本語版MMSEのガイドラインに従って認知障害(26点以下)の割合を比較したところ、下位群が35.3%、上位群は16.1%であり、下位群の方が統計的にも有意に多かった。また、ソーシャル・キャピタルが高い群と低い群における日常行動範囲の比較を行ったが、一般的信頼、互酬性の規範、地域愛着、どの側面においても、ソーシャル・キャピタルが高い群と低い群の日常行動範囲には、有意な差は見られなかった。今後はGPSで検出される具体的なホットスポットと高齢者のソーシャルキャピタル、および健康アウトカムとの関連を解析する予定である。十日町、および涌谷町での調査は順調に実施することができたが、データ解析のためのクリーニング、とくにGPSデータの整理に時間がかかっている。また、ジオコードの入手および十日町における現場の方々の実体験に基づく解釈をすべくインタビューを実施していたため、論文執筆がやや遅れている。今後はさらにデータクリーニングを進め、具体的なホットスポットと高齢者のソーシャルキャピタル、および健康アウトカムとの関連を解析し、論文化および学会等で発表していく予定である。追跡調査の可能性も視野に入れて現場との交渉も進める。本研究は、高齢化のすすむ新潟県十日町および宮城県涌谷町において、高齢者1万8千人の各個人の行動を質問紙で調査し、さらに代表サンプルをGPSで追跡しそのデータを地図上に重ね合わせることで、各個人のつながりをネットワーク分析によって解析し、認知症を予防しうるライフコースでみた物理的・社会的環境を明らかにすることを目的に行った。具体的には、特定健診または高齢者健診を活用し、対面式の認知症のスクリーニングテスト(MMSEおよびQMCI)をトレーニングされた面接者によって特定健診および高齢者健診時に実施した。また、ウエラブルセンサリングデバイスを用いて1週間の活動量、睡眠時間等を測定し、客観的なデータを得た。さらに、GPSを用いて位置情報を連続的に測定・記録することで、参加者が地域のどのような場所にどのような時間帯でどの程度過ごしているのかを把握した。そしてアンケート調査においても外出頻度を把握し、GPSデータとの比較を行なった。その結果、ある事例では自宅から駅まで幅広い範囲で活動しているパターンがある一方で、別の事例では自宅と思われる一定の場所に止まっているパターンがあることがはっきりと示された。これらを重ね合わせると、幹線道路沿いに居住している場合は行動範囲が広く、山間部に居住している場合には行動範囲が狭いことが示唆された。このように、物理的環境、そして予測される社会的環境が高齢者の行動パターンを規定していることが予想され、それによって認知機能に影響を与えていることが示唆された。今後はさらにデータを解析し、認知機能との関連を量的に示して行くことで認知症の予防可能な環境を明らかにして行く予定である。

まず、行動範囲下位群と上位群のの身体活動を、1日あたりの歩行時間、座位行動時間、そして身体活動ガイドライン基準の充足割合という観点から比較したところ、平均歩行時間は、下位群は45.1±24.5分、上位群は67.8±38.5分であり、上位群の方が平均歩行時間が統計的にも有意に高く、GPS装着の妥当性を確認できた。さらに、日本語版MMSEのガイドラインに従って認知障害(26点以下)の割合を比較したところ、下位群が35.3%、上位群は16.1%であり、下位群の方が統計的にも有意に多かった。また、ソーシャル・キャピタルが高い群と低い群における日常行動範囲の比較を行ったが、一般的信頼、互酬性の規範、地域愛着、どの側面においても、ソーシャル・キャピタルが高い群と低い群の日常行動範囲には、有意な差は見られなかった。今後はGPSで検出される具体的なホットスポットと高齢者のソーシャルキャピタル、および健康アウトカムとの関連を解析する予定である。十日町、および涌谷町での調査は順調に実施することができたが、データ解析のためのクリーニング、とくにGPSデータの整理に時間がかかっている。また、ジオコードの入手および十日町における現場の方々の実体験に基づく解釈をすべくインタビューを実施していたため、論文執筆がやや遅れている。今後はデータクリーニングを進め、解析し、論文化および学会等で発表していく。今後はさらにデータクリーニングを進め、具体的なホットスポットと高齢者のソーシャルキャピタル、および健康アウトカムとの関連を解析し、論文化および学会等で発表していく予定である。追跡調査の可能性も視野に入れて現場との交渉も進める。十日町、および涌谷町での調査で収集したデータ解析のためのクリーニング、とくにGPSデータの整理に時間がかかり、当初予定していた解析に関わる費用等が発生しなかったため。平成30年度には継続調査と共に解析を進めて、得られたデータを個人レベルでリンゲージし、ビックデータ化することと、どのような物理的・社会的環境が認知機能に影響しているのかを明らかにする。また、学会等に参加し、情報収集及び成果を発表する予定。
光化学系２複合体の構築過程の解明

光の力を使って水を分解して酸素を発生する光化学系IIの構築過程の解明に取り組んだ。光照射によって光化学系IIの構築が開始されるモヤシのような独自のシアノバクテリアを用い、構築の過程のみに関与することが見出された複数のタンパク質の中でもとくに3種類が安定的な系IIの構築にとくに重要であることが判明した。また、そのような構築の過程のみに関与するタンパク質が欠失しても機能が代替され、構築の仕組みが極めて柔軟であることも明らかとなった。光化学系II(系II)の構築過程に関わることが予想された5種の機能未知タンパク質(Slr0172、Sll1398、Slr1128、Sll1099、Slr0399)に関する形質転換に取り組んだ。シアノバクテリアの系II合成の誘導が可能な変異株(系II合成誘導株)と野生株を用い、上記5種のタンパク質それぞれの欠失変異体とC末端へのHis-tag融合体の作出を進めた。系II合成誘導株を親株として、His-tag導入株は全て作出され、Sll1099以外は欠失変異体が作出された。また、Sll1099については、野生株でも完全変異化に至っていないため、必須の因子である可能性がある。さらに別の5種のタンパク質について変異体の作出に着手した。作出された変異体を用い、細胞増殖、系IIの含量評価等を進めた。Sll0172以外の欠失変異体は、野生株と同様に増殖した。また、液体窒素温度での蛍光スペクトル測定によると、通常培養条件下では成熟型系IIの顕著な低下は認められなかった。そのため、これらタンパク質が系IIの構築に関わっているとしても、他のタンパク質が機能を代替することが予想された。系II合成誘導株を親株としたHis-tag融合変異体の暗所培養細胞からタンパク質の精製を行った。2種のHis-tag融合株において、精製標品に複数のタンパク質が含まれていた。それらタンパク質の同定により系II構築に関わる因子を得ることが期待される。高等植物系IIの構成因子PsbPと相同なCyanoPは、シアノバクテリアでは結合量が少ないため、系II構築に関わっている可能性が考えられる。そこでとくにCyanoPのN末端へのHis-tagの遺伝子工学的導入を進めた。CyanoPは翻訳後にN-末端の一部が切断されて脂質が付加されると予想されるため、His-tag導入部位および方法を慎重に決定した。シアノバクテリアの系II合成の誘導が可能な変異株(系II合成誘導株)を親株として欠失変異体およびHis-tag融合変異体が作出された。Sll1099の欠失については完全変異化が完了していないが、系II構築あるいは細胞生存に必須の因子であることが示唆されるという重要な結果と考えている。系II構築に必須の因子であっても、従属栄養的環境下で完全変異化を達することができる可能性があるので、現在取り組んでいる。得られた欠失変異株を用い、細胞増殖や系IIの含量評価等を進めた。また、His-tag融合体を用いてタンパク質の精製を行い、精製標品中に複数のタンパク質を電気泳動的に確認した。CyanoPについて、発現に影響の少ないC末端へのHis-tag融合では効果的ではなかったため、N末端への導入を進めた。CyanoPは、翻訳後にN末端の一部が切断されて成熟型になるが、成熟型タンパク質のN末端に脂肪酸が付加されると予想している。成熟型タンパク質のN末端アミノ酸を破壊しないようにHis-tag融合部位を決定し、形質転換のためのコンストラクトを作製し、形質転換体の作出を進めた。このように、形質転換体の作出が順調に進み、系II構築のタンパク質レベルでの解析にも着手したので、「おおむね順調に進展している」とした。シアノバクテリアSynechocystissp. PCC 6803の光化学系II(系II)複合体構築の最初期に、11種の機能未知タンパク質(Slr0172、Sll1398、Slr1128、Sll1099、Slr0399。Sll1390、Slr0013、slr0483、Sll1106、slr0670、slr1739)が係わることが研究代表者により予想されている。前年度までに作出に取り組んだ5種の欠失変異体の中で、Sll1099の完全変異体化に引き続き取り組んだ。しかし依然、親株として野生株を用いた場合でも完全変異体は作出できなかったため、系IIの構築あるいは細胞の生存に必須の因子であると見られる。残りの6種のタンパク質についても、欠失変異体とC末端へのHis-tag融合体の作出を進めた。すでに作出できたHis-tag融合変異体から、未成熟系II複合体の精製を進めた。また、光合成色素結合タンパク質の精製を進める過程で、界面活性剤dedecyl-α-D-maltoside(α-DDM)を用いて膜タンパク質を可溶化すると、これまで用いてきたdodecyl-β-D-maltosideより、より健全な複合体の精製が可能であることが分かってきた。そのため、すでに作出したHis-tag融合変異株を用い、α-DDMによる可溶化を行い、構築初期にある系II複合体の精製条件の検討を進めた。

さらに、タンパク質の網羅的解析には等電点電気泳動を用いた二次元電気泳動が多用されるが、一般に用いられる等電点電気泳動では系II複合体のような膜タンパク質が分離されない。そこで、構築過程にある系II複合体を構成するタンパク質の網羅的解析のために、DNAのような巨大分子の分離にも使われるアガロースを用いた等電点電気泳動の改良に取り組み、膜タンパク質を分離するための目安となる条件を絞り込むことができた。得られたHis-tag融合変異体を用いてタンパク質の精製を行い、精製標品中に複数のタンパク質を電気泳動的に確認できているが、いずれの変異体においてもMnの解析を行っておらず、Mnクラスター形成時期の特定には至っていない。また、他種シアノバクテリアの相同遺伝子との入れ替え実験を計画していたが、Synechocystis sp. PCC 6803本来のタンパク質機能解析を優先して進めた。これらのため、「やや遅れている」とした。しかし、Mn定量は研究室で行うことができる状態にあるので、複数の構築段階の標品を得て、早急にMnの解析を進めることができる。また、好熱性シアノバクテリアのゲノムDNAも確保済みなので、相同遺伝子の入れ替え実験も早急に進めることができる。シアノバクテリアSynechocystis 6803の光化学系II(系II)複合体構築時に、11種の機能未知タンパク質(Slr0172、Sll1398、Slr1128、Sll1099、Slr0399、Sll1390、Slr0013、slr0483、Sll1106、Slr0670、Slr1739)が係わることが研究代表者により予想されている。これら11種について、欠失変異体とHis-tag融合体の作出を進めてきた。暗所では成熟型系IIを蓄積することができない株(MYS株)のSlr0399にHis-tagを導入した変異体を暗所培養し、Slr0399と複数のタンパク質を含む複合体が得られたため、他タンパク質との強い総合作用が明らかとなった。しかし、このSlr0399やSll1398などの欠失変異体の増殖は野生株と遜色なく、他タンパク質が機能を代替する可能性が示唆された。一方、Slr0172のように、His-tag導入体が系IIの成分と同時には精製されず、系IIの構築時にごく少量含まれるか、複合体との結合が弱いことが示唆されるタンパク質も見出された。Slr1739の欠失変異体では通常の系II電子伝達活性が認められたものの、増殖が顕著に遅く、温度が高い条件では増殖が困難であることが見出された。したがって、正常な系IIが構築はされるものの、安定的な系IIの構築に不可欠であることが示唆された。このように、本研究で構想したMYS株を用いた実験系は、系IIの構築時のタンパク質組成を解析する上で有用な系である。そして、Sll1099は生存に必須のタンパク質であると考えられ、Slr0399やSlr1739は、安定的な系IIの構築にとくに重要であることが判明した。一方、シアノバクテリアでは未知の他のタンパク質が機能を代替することができ、系IIの構築の仕組みが極めて柔軟であることも明らかとなった。光の力を使って水を分解して酸素を発生する光化学系IIの構築過程の解明に取り組んだ。光照射によって光化学系IIの構築が開始されるモヤシのような独自のシアノバクテリアを用い、構築の過程のみに関与することが見出された複数のタンパク質の中でもとくに3種類が安定的な系IIの構築にとくに重要であることが判明した。