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精細管壁と精巣導管系壁の構造と機能の関連

精細管を取り巻いている筋様細胞はすべてのほ乳類に存在するが,その構造や配列は動物種によって異なる.実験用げっ歯類では,単層の偏平な細胞で,上皮細胞の様に結合装置をもつ.人や他の動物では,数層である.筋様細胞には沢山のアクチン細糸がある.ラットでは一個の筋様細胞に互いに直交するアクチン細糸の束があり,精細管にたいして輪状および縦走している.この束は精子形成と関係があり,実験的停留精巣をつくると,アクチン細糸束は断裂する.またこの束の形成過程をラットの生後発生においてしらべた.そのほかの細胞骨格性細糸(ミオシン,アクチニン,ビメンチン)が筋様細胞に局在している.筋様細胞は収縮性で精細管内精子と液体の輸送に関係しているのみでなく,いろいろな活性物質(アンドロゲンレセプター,プロスタグランヂン,TGF)の影響を受けるので,筋様細胞は単に解剖学的に精細管を取り巻く細胞でなく,その機能は精子形成,セルトリ細胞への関与,問質細胞,血流調節等に作用すると思われる.人では,筋-線維芽細胞(myofibroblast)として,細胞外の結合組織線維で結合し,筋細胞と結合組織細胞の両方の抗原を発現している.また,収縮機能はNO/cGMP系によって調節されている.精細管を取り巻いている筋様細胞はすべてのほ乳類に存在するが,その構造や配列は動物種によって異なる.実験用げっ歯類では,単層の偏平な細胞で,上皮細胞の様に結合装置をもつ.人や他の動物では,数層である.筋様細胞には沢山のアクチン細糸がある.ラットでは一個の筋様細胞に互いに直交するアクチン細糸の束があり,精細管にたいして輪状および縦走している.この束は精子形成と関係があり,実験的停留精巣をつくると,アクチン細糸束は断裂する.またこの束の形成過程をラットの生後発生においてしらべた.そのほかの細胞骨格性細糸(ミオシン,アクチニン,ビメンチン)が筋様細胞に局在している.筋様細胞は収縮性で精細管内精子と液体の輸送に関係しているのみでなく,いろいろな活性物質(アンドロゲンレセプター,プロスタグランヂン,TGF)の影響を受けるので,筋様細胞は単に解剖学的に精細管を取り巻く細胞でなく,その機能は精子形成,セルトリ細胞への関与,問質細胞,血流調節等に作用すると思われる.人では,筋-線維芽細胞(myofibroblast)として,細胞外の結合組織線維で結合し,筋細胞と結合組織細胞の両方の抗原を発現している.また,収縮機能はNO/cGMP系によって調節されている.単離精細管筋様細胞のアクチン細糸束について、共焦点顕微鏡により次のことが分かった.ラットで,生後15-20日では,アクチン細糸は管にたいして輪状に現れる.つぎに,30日以後管にたいして縦に走る細糸が現れる.50日以後,この両者が明瞭となり直交している.このことは管内で精子形成と液体成分の生産によりその内圧に対抗してアクチン細糸が発現し精子輸送にさいして縦走細糸が重要な役を行っていると思われる.アクチニンが筋様細胞細胞膜に局在していることが分かった.停留精巣では,アクチン細糸束は細く,さらに断裂していた.管内圧変化の測定を行い,その周期的変化をとらえ,ヴィデオに録画した.光学顕微鏡レベルでは,計画のように当初の結果が得られたと思う.さらに動物種による所見が残されている.電子顕微鏡レベルで,アクチン細糸の3次元配列について十分な結果がまだえられていない.しかし免疫電子顕微鏡法によってアクチニンの局在が解明されて来た..共焦点顕微鏡でラット筋様細胞のアクチンとアクチン結合タンパクであるαアクチニンの局在をしらべ,アクチン束上に点状なアクチニンの局在がわかった.アクチン束の方向と精細管の軸方向と密接な関係がある.筋様細胞内のアクチン束の走行はほぼ管の軸方向と一致するものと直交するものがある.この関係はラットで著明で,ハムスター,マウスの順で著名でなくなる.ヒトの場合は,数層の細胞があり,層によって,異なる性質がある.細胞化学的,免疫化学的に精細管から離れる程線維芽細胞の要素が多く,精細管に近いほどげっ歯類の筋様細胞とにている,との推測が可能である.この性質は管内輸送のみならず,間質細胞の内分泌機能,間質血管の機能を調節しているらしい.
核医学診断薬を目指す6位放射性ヨウ素標識アスコルビン酸の創製

外部から与えられた抗酸化剤のインビボ動態から局所組織の酸化状態あるいは抗酸化能を評価するための核医学診断薬としての可能性を追求する目的で,6位に放射性ヨウ素を導入したAsA分子として,6-iodophenyloxy-L-ascorbic acid (6-IPA)を設計した。前年度において、6-IPAはインビトロ還元活性は保持していること(72%),アスコルビン酸よりも脂溶性が高いこと(pH7.4でlogP値-0.42)を明らかにした他、6-^<125>IPAを効率よく得ることに成功した。また、dehydro6-^<125>IPAについてfibrosarcoma移植マウスにおけるインビボ体内動態を調べた結果、脳,腫瘍への分布は低かったが,腫瘍/筋肉比が最大で1.7倍でありある程度の選択性を示した。さらに脱ヨウ素代謝を受けやすいことが示唆された。本年度は6-^<125>IPAのfibrosarcoma移植マウスを用いたインビボ評価をまず行った。その結果、脳、腫瘍への分布は低かったが、腫瘍/筋肉比が最大で2.1倍の選択性を示した。これらの結果、2-IBA、3-IBA、6-IPAはアスコルビン酸とは全く異なる挙動を示す事が明らかとなった。この原因として、導入したヨードベンジル基、あるいはヨードフェニル基が大きすぎで生体膜透過に関わるキャリア蛋白にアスコルビン酸として認識されなかった可能性が考えられる。そこでこの問題を解決するために、より小さなヨウ素官能基としていくつかの新規ヨウ素標識アスコルビン酸誘導体をデザインした。そのうち、6-deoxy-6-iodo-L-ascorbic acidの合成を達成した。その放射性ヨウ素標識体合成法開発については現在検討中である。外部から与えられた抗酸化剤のインビボ動態から局所組織の酸化状態あるいは抗酸化能を評価するための核医学診断薬としての可能性を追求する目的で,6位に放射性ヨウ素を導入したAsA分子として,6-iodophenyloxy-L-ascorbic acid(6-IPA)を設計した。6-IPAの合成は,cyclic sulfate体からiodophenyl基の導入と酸加水分解-異性化反応により収率44%で得ることに成功した。DPPH法を用いた6-IPAのインビトロ還元活性は72%であり,アスコルビン酸の抗酸化活性をある程度保持していることが示唆された。また,pH=7.4の中性条件におけるoctanol/水分配係数はlogP値で-0.42であり,アスコルビン酸よりも脂溶性が増大した。次に6-IPAのヨウ素標識体合成を検討した。6-IPAをトリメチルスズ体にしたのち,クロラミンT法によるヨウ素125標識を試みた。この結果,フェニル基のメタ位にヨウ素125を有する酸化型のアスコルビン酸,すなわちdehydro6-IPAとして放射化学的収率76%で得られた。Dehydro体の還元を種々試みたが,還元体である6-^<125>IPAは得られなかったため,6-IPAのヒドロキシ基を保護したMOM体を前駆体として,同位体置換反応による標識合成と脱保護反応を行い,目的とする6-^<125>IPAを効率よく得ることに成功した。Dehydro6-^<125>IPAについてfibrosarcoma移植マウスにおけるインビボ体内動態を調べた。血中,肺への分布が大きく,脳,腫瘍への分布は低かったが,腫瘍/筋肉比が最大で1.7倍であり,ある程度の選択性を示した。また脱ヨウ素代謝を受けやすいことが示唆された。6-^<125>IPAのインビボ評価については現在検討中である。
侵襲性肺炎球菌感染症に対する創薬基盤となるオートファジー誘導機構解明とその展開

我々は現在までに、細胞内に侵入した肺炎球菌は感染2時間後に選択的オートファジーによって捕捉・殺菌されることを明らかにしている。我々は最近、感染30分から1時間という初期にFIP200に依存しないノンカノニカルなオートファジー(Pneumococcus-containing LAP-like Vacuoles (PcLAP) )が一過性に誘導されることを見出した。そこで本研究では、PcLAP形成に関与する宿主側、菌側因子の探索を行い、PcLAP誘導機構、肺炎球菌感染成立または防御におけるPcLAPの意義を明らかにし、オートファジーで肺炎球菌感染を制御することを目指す。
ABCトランスポーターの網膜血管新生における役割の解明

Multidrug resistance protein 4(MRP4)はABCトランスポーターファミリーに属する膜蛋白である。ヒト網膜毛細血管内皮細胞を用いた細胞培養実験では、MRP4ノックダウンによって細胞遊走増加、アポトーシス抑制、異常凝集形態、が認められた。ノックアウトマウスを用いた実験ではMrp4の基質であるcAMPの細胞内濃度を上昇させる薬剤であるフォルスコリンの腹腔内注射によって網膜毛細血管の異常増生が認められた。これらの結果からMRP4が網膜血管新生に対して抑制的に働いていると推測される。1.研究内容(2)細胞増殖アッセイでは、5_-bromo-2_-deoxyuridine (BrdU)の取り込みはMRP4ノックダウン細胞とコントロール細胞で同等であった(P=0.320)。遊走アッセイでは、MRP4ノックダウン細胞はコントロール細胞に対して31%の遊走増加を示した(P=0.048)。(3)MRP4ノックダウン後のアポトーシスについては、MRP4ノックダウン細胞ではコントロールと比較して、血清除去後12時間では54%(P<0.001)、24時間では27%(P=0.004)、とcleavod-caspase3陽性細胞は有意に減少していた。(4)チューブ形成アッセイでは、MRP4ノックダウン細胞は集簇してチューブに沿った異常凝集形態を呈した。チューブ長についてはMRP4ノックダウン細胞でコントロールに比べて53%長いという結果であったが有意差は認められなかった(P=0.411)。MRP4ノックダウン細胞における異常凝集についてVE-cadherinを介した細胞間接着の関与を疑ったが、免疫染色ではアクチンフィラメントの重合や細胞間接着部位へのVE-cadherinの動員は認められなかった。2.研究の意義本研究は、MRP4が網膜血管新生において特異な形で抑制的に働いているというエビデンスを初めて示した点で斬新である。3.研究の重要性MRP4の発現が病的網膜新生血管でのみ低下しているという過去の我々のデータと併せて考えると、MRP4が糖尿病網膜症などの網膜血管新生疾患において重要な役割をしている可能性が高く、将来の臨床応用への足がかりになると思われる。Multidrug resistance protein 4(MRP4)はABCトランスポーターファミリーに属する膜蛋白であり,生理物質や薬剤などの細胞外排泄を介して各組織の保護に働いている。我々はMRP4の網膜血管新生における役割を明らかにするために動物実験を行った。1.研究内容生理的網膜血管新生におけるMrp4の機能解析につきノックアウトマウスを用いた動物実験を行い以下の結果が得られた。Mrp^<+/+>,Mrp4^<+/->,Mrp4^<-/->マウスにおいて、生後3日、7日、14日時点における網膜のフラットマウントを作成し血管内皮細胞のマーカーであるPECAM1による免疫染色を行ったところ、いずれのマヴスのいずれの時点においても網膜血管の形態に明らかな差は認められなかった。(2)(1)の結果からMrp4の重要な基質の一つであるcAMPに注目し細胞内cAMP濃度を上昇させる薬剤であるフォルスコリンの腹腔内注射をMrp4^<+/+>マウスに行ったところdose-dependetに網膜血管の異常(網膜毛細血管の異常増生)が認められた。(3)生後4,5日にフォルスコリン腹腔内注射を行い生後6日の網膜血管の形態を免疫染色で評価したところ、Mrp4^<-/->なマウスではMrp4^<+/+>,Mrp4^<+/->に比べて網膜毛細血管の異常増生が著しいことが判明した。2.研究の意義本研究は、cAMPを細胞外に排出する機能をもつMrp4が網膜血管新生において抑制的に働いているというエビデンスを功in vivoで初めて示した点で斬新である。3.研究の重要性今回の研究結果から、Mrp4が糖尿病網膜症をはじめとする網膜血管新生疾患において抑制的に働いている可能性が考えられ、網膜血管におけるMrp4機能評価やMrp4保護薬の開発を通じで将来の臨床応用への大きな足がかりになると思われる。
免疫系の組織幹細胞干渉による組織恒常性の維持と破綻

皮膚や腸上皮の幹細胞性維持や加齢に伴う変化を、免疫系の組織幹細胞干渉による組織恒常性修飾という視点から検討することを目的とした。特にインターフェロン(IFN)シグナルを負に制御する転写因子IRF2の役割に着目した。IRF2-/-マウス皮膚においては、IFNシグナル依存性の加齢に伴う脱毛と表皮の肥厚が観察されることが報告されていたが、毛包幹細胞の解析は皆無であった。研究代表者は、同マウス毛包幹細胞が加齢に伴いIFNシグナル依存性に減少することを見出した。さらに抜毛実験系を用いて同マウスの毛の再生不全を再現し、毛包幹細胞の運命追跡実験を行ったところ、本来毛の再生を担う毛包幹細胞が表皮に異常分化するという極めて重要な知見を得た。現在、IFNの作用点を含め詳細な分子基盤を追求中である。IRF2-/-マウス腸上皮においては、腸上皮幹細胞の減少と5-FU腸炎における上皮の再生不全を見出している。また、腸上皮幹細胞の再生機能を評価できるオルガノイド培養系を用いて、同マウス腸上皮幹細胞のオルガノイド形成不全を確認している。さらにIRF2-floxマウスを作製し、Villin-Cre(腸上皮特異的)、Ah-Cre(パネート細胞以外の腸上皮特異的)と交配してVillin-Cre/IRF2-flox、Ah-Cre/IRF2-floxマウスを得た。そして、それらマウスでも5-FU腸炎における上皮の再生不全を見出している。現在、皮膚ならびに腸上皮の幹細胞を用いて行ったマイクロアレイデータに基づき各種解析を行い、詳細な分子メカ二ズムを解析中である。平成27年度は主に腸上皮幹細胞の幹細胞性維持におけるIFNシグナル・IRF2の役割を検討する予定であったが、併行して毛包幹細胞の解析を進めることができた。その結果、慢性的なIFNシグナルによって毛包幹細胞が性状変化を起こし、本来毛の再生に関わるべき幹細胞が表皮に分化するという重要な知見を得ることができた。一方、腸上皮幹細胞の解析も概ね順調に行った。IRF2-/-マウス毛包幹細胞の加齢に伴う機能不全・異常がI型あるいはII型IFNR-/-マウスとの交配(IRF2-/-IFNAR1-/-, IRF2-/-IFNGR1-/-, )によって解消されるのとは対照的に、IRF2-/-マウスの腸上皮再生不全はIRF2-/-IFNAR1-/-マウスで回復しない。この予想外の結果を検証するために、現在、CRISPR/CAS9システムを用いて、IRF2-/-IFNAR1-/-IFNGR1-/-マウスを作製中である。皮膚毛包幹細胞の場合には、慢性的なIFNシグナルが同細胞の異常分化につながる因果関係が明確である。残された課題は、IFNの作用点と毛包幹細胞の異常分化を引き起こす機構の解明になる。IFNの作用点を明確にするために、表皮組織にIFNシグナルが入らないIRF2-/-マウス(IRF2-/-K14-Cre/IFNAR1-flox/IFNGR1-flox)を作製中である。腸上皮幹細胞の場合には、すでに述べたようにIRF2-/-IFNAR1-/-IFNGR1-/-マウスを作製中である。同マウスを解析することによってIFNシグナル依存性が明らかになる。また、IRF2-/-マウスを用いるだけでなく、野生型マウス皮膚にImiqimodを塗布、あるいは野生型マウスにPoly ICを頻回投与することによってIFN産生を慢性的に誘導し、皮膚や腸の幹細胞に同様な機能不全が誘導されるか検討することも重要である。さらに、IFNに限らず慢性炎症が毛包幹細胞の異常分化につながる可能性を、表皮特異的に活性化型STAT3を発現するマウスで検証する。これらの検討により、IFNをはじめとする慢性炎症刺激が組織幹細胞の異常分化の原因になることが証明できれば、皮膚や腸における多くの慢性疾患の病態解明につながることが期待できる。

さらにIRF2-floxマウスを作製し、Villin-Cre(腸上皮特異的)、Ah-Cre(パネート細胞以外の腸上皮特異的)と交配してVillin-Cre/IRF2-flox、Ah-Cre/IRF2-floxマウスを得た。そして、それらマウスでも5-FU腸炎における上皮の再生不全を見出している。現在、皮膚ならびに腸上皮の幹細胞を用いて行ったマイクロアレイデータに基づき各種解析を行い、詳細な分子メカ二ズムを解析中である。平成27年度は主に腸上皮幹細胞の幹細胞性維持におけるIFNシグナル・IRF2の役割を検討する予定であったが、併行して毛包幹細胞の解析を進めることができた。その結果、慢性的なIFNシグナルによって毛包幹細胞が性状変化を起こし、本来毛の再生に関わるべき幹細胞が表皮に分化するという重要な知見を得ることができた。一方、腸上皮幹細胞の解析も概ね順調に行った。IRF2-/-マウス毛包幹細胞の加齢に伴う機能不全・異常がI型あるいはII型IFNR-/-マウスとの交配(IRF2-/-IFNAR1-/-, IRF2-/-IFNGR1-/-, )によって解消されるのとは対照的に、IRF2-/-マウスの腸上皮再生不全はIRF2-/-IFNAR1-/-マウスで回復しない。この予想外の結果を検証するために、現在、CRISPR/CAS9システムを用いて、IRF2-/-IFNAR1-/-IFNGR1-/-マウスを作製中である。皮膚毛包幹細胞の場合には、慢性的なIFNシグナルが同細胞の異常分化につながる因果関係が明確である。残された課題は、IFNの作用点と毛包幹細胞の異常分化を引き起こす機構の解明になる。IFNの作用点を明確にするために、表皮組織にIFNシグナルが入らないIRF2-/-マウス(IRF2-/-K14-Cre/IFNAR1-flox/IFNGR1-flox)を作製中である。腸上皮幹細胞の場合には、すでに述べたようにIRF2-/-IFNAR1-/-IFNGR1-/-マウスを作製中である。同マウスを解析することによってIFNシグナル依存性が明らかになる。また、IRF2-/-マウスを用いるだけでなく、野生型マウス皮膚にImiqimodを塗布、あるいは野生型マウスにPoly ICを頻回投与することによってIFN産生を慢性的に誘導し、皮膚や腸の幹細胞に同様な機能不全が誘導されるか検討することも重要である。さらに、IFNに限らず慢性炎症が毛包幹細胞の異常分化につながる可能性を、表皮特異的に活性化型STAT3を発現するマウスで検証する。これらの検討により、IFNをはじめとする慢性炎症刺激が組織幹細胞の異常分化の原因になることが証明できれば、皮膚や腸における多くの慢性疾患の病態解明につながることが期待できる。
神経軸索内におけるアクチンの輸送機構の解明

アクチンは細胞内に最も多く存在するタンパク質のひとつであり、細胞の形態形成に非常に重要な分子であるが、その細胞内における輸送メカニズムは不明である。本研究では、動的に重合・脱重合するアクチン線維を細胞外基質につなぎ止めることにより、アクチン線維が移動し、そのアクチン線維にアクチン結合タンパク質が結合することにより共に輸送されるという、軸索内タンパク質輸送モデルを提唱し、その検証を行った。具体的には、ラットの初代培養海馬神経細胞を用いて、1アクチンネットワークの重合阻害によるアクチン輸送への影響、2アクチン輸送におけるMysosinIIの影響、3アクチン輸送の基質依存性、4数理モデルを用いたアクチンとアクチン結合タンパク質の輸送メカニズムについて検証した。その結果、1アクチンネットワークの重合阻害を阻害すると、アクチンの輸送速度が遅くなること、2MyosinIIを阻害するアクチン輸送速度が遅くなり、そのとき基質へ生じる力は小さくなること、3アクチン線維の移動は細胞外基質への連結に依存しており、アクチン線維の移動に伴う軸索輸送は軸索伸長に必要であることがわかった。さらに、数理モデルを用いた検証から、4確かにアクチンと共にアクチン結合タンパク質も輸送されることがわかった。以上の結果より、本研究で着目した神経軸索内におけるアクチン輸送は、アクチン線維の方向性をもった重合・脱重合と細胞外基質への連結によって起こり、アクチン結合タンパク質は、移動するアクチン線維と結合することにより、共に輸送されることがわかった。さらに、アクチン線維の移動を阻害すると軸索の伸長も阻害されたことから、アクチン線維の移動に伴う軸索輸送は軸索伸長に重要な役割を果たすと考えられた。これらの結果は、全て本研究で提唱する神経軸索内におけるアクチン輸送機構のモデルを支持するものである。26年度が最終年度であるため、記入しない。アクチンは細胞内に最も多く存在するタンパク質のひとつであり、細胞の形態形成に非常に重要な分子でありながら、その細胞内輸送機構は未だ不明である。本研究では、培養海馬神経細胞を用いて、動的に重合・脱重合するアクチン線維をクラッチ分子Shootin1を介して細胞外基質にっなぎ止めることによりアクチン線維が移動するというアクチン輸送モデルを提唱し、その検証行った。具体的には、ラット培養海馬神経細胞を用いて、1アクチンの輸送形態、2Shootin1リン酸化によるアクチン輸送への影響、3アクチン輸送の際に生じる駆動力、4アクチン結合タンパク質の輸送、5アクチン輸送と突起伸長の関係について解析を行った。また、マウスの培養大脳組織を用いて、6脳内におけるアクチン輸送を検証した。その結果、1軸索内のアクチンの輸送機構にはアクチン線維が重要であること、2Shootin1のリン酸化によりアクチン輸送が促進されること、3アクチン輸送の際には基質に進行方向とは反対向きの力が生じていること、4アクチン結合タンパク質もアクチンと共に軸索内を輸送されることがわかった。さらに、アクチンの輸送と突起伸長の関係を定量解析すると6アクチンの塊が突起先端に到達すると先端でのアクチン量が増加し、突起が急激に伸長することがわかった。また、in vivoにおけるアクチン輸送の検証として、マウスの大脳組織に蛍光タンパク質を融合したアクチンを発現させてタイムラプス観察をした結果、6培養神経細胞と同様に大脳組織内の神経細胞の軸索内をアクチン塊が移動する様子が観察された。これらの結果は、本研究で提唱する神経軸索内におけるアクチン輸送機構のモデルを指示するものである。この1年間の解析を通じて、これまで長らく不明であった神経軸索内におけるアクチンの輸送機構のメカニズムを検証し、本研究で提唱する輸送モデルを指示するようなデータを順調に得ることができた。

また、学会発表を通して、細胞内アクチン動態の第一人者James R. Bamburg博士と実験データに関する建設的な議論を重ね、現在これらの議論に基づいて論文の投稿に向けて追い込みにかかっている。これまでの検証により、本研究で提唱する軸索内におけるアクチンの輸送機構のモデルを指示するようなデータを得ることが出来ている。そのため今後はさらにそれらをサポートするようなデータを得ていく予定である。具体的には、神経突起の先端でアクチン線維と相互作用することが知られているモータータンパク質MyosinIIのについて軸索内のアクチン輸送に関係しているのかどうかを検証する。
脳内ドーパミン神経の脱落により生じる低体重の機序解明

パーキンソン病は、高齢になると発病率が増加する疾病で、脳内ドーパミン神経の脱落によって発症する。これまで、運動障害に関しては多くの研究がなされ、ドーパミン不足による大脳基底核神経回路の機能変調が運動障害の原因であることがわかっている。しかし、体重減少など運動機能以外の症状に関してはほとんど研究が進んでいない。研究代表者は、最近、脳内ドーパミン神経を脱落させたラットが低体重になることを見出した。これまでの予備実験から、このラットは胃腸の運動機能が低下して低体重となっているのではないかと考えている。しかし、脳内ドーパミン神経の脱落が消化管機能に与える影響や、体重減少のメカニズムは全く不明である。そこで、本研究では、幼若期にカテコールアミン神経毒である6-OHDAを脳内に投与して、成熟するまで育てた脳内ドーパミン神経を脱落させたラットを用い、ドーパミン神経の脱落が胃腸機能に与える影響を明らかにするとともに、体重減少のメカニズムを解明することを目的に研究を遂行している。平成29年度にはケトン食の餌を使用することにより体重増加傾向がみられたので、平成30年度は、研究開始当初から行っているマイクロ浸透圧ポンプを用いた種々のホルモンの効果を検討するとともに、ケトン食についてもその効果について検証を行った。ケトン食とは、餌に含まれる糖質を減少させる一方、脂質やタンパク質を多く含む餌である。これまでの検討から、生後7週齢くらいから正常食との体重差が生じる可能性が示唆されており、今後はケトン食を与える時期についても検討したいと考えている。昨年度の計画は、高脂肪ケトン食、高タンパク質ケトン食、など餌の種類を変更して体重に与える影響を検討する計画であったが、高脂肪ケトン食のみしか検討できなかった。本研究は脳内ドーパミン神経を薬剤(6ーOHDA)により脱落させたラットを使用するものであるが、2018年7月11月に作製したラットは十分にドーパミン神経が脱落しなかった。2018年12月にはドーパミン神経の脱落が不十分となった原因を解明したものの、高脂肪ケトン食のさらなる検証のみしか行うことができず、高タンパク質ケトン食の効果を検証できなかった。これらのことから本研究の進捗状況はやや遅れていると判断した。そのため、研究期間を延長することにより当初の目的を達成したいと考えている。前年度に引き続き、生後5日目以内にドーパミン神経毒である6-OHDAを脳内に投与して脳内ドーパミン神経を傷害して成長させたラットを用いる。また、昨年度まで行った浸透圧ポンプを用いたスクリーニングを継続し、脳内ドーパミン神経脱落による体重減少の原因に関するあらゆる可能性について検討を行う。昨年度は、モデル動物の作成が失敗に終わる期間があり、高脂肪をベースとしたケトン食(糖質ゼロ食)の効果のみしか検討できなかったので、本年度は、高タンパク質をベースとしたケトン食の影響や餌の形状(ペレット状、固形)の影響についても検証する。なお、食餌の摂取量とカロリー摂取量との関連も含め検討する予定である。また、発達時期のどの段階でケトン食の効果があるのかについても、ケトン食を与える時期を変更することにより検証する。さらに、この現象の責任部位を明らかにするため、食の種類を変更した際や断食を行った際の腸管運動機能や脳内のcFos発現等についても検証を行う。以上の項目に関して検討を行い、効果が認められた処置に関して、生化学的手法や電気生理学的手法を用いてそのメカニズムを明らかにするとともに生理学的意義を明らかにする。長期の薬物投与が必要な場合は、マイクロ浸透圧ポンプを用いた検討を行うが、中枢への薬物投与が必要な場合には、中枢カテーテルを用いて中枢への直接投与を行う。浸透圧ポンプでは不都合な場合には、高分子ポリマーELVAXを用いた徐放性投与を行う。申請者は、最近、脳内ドーパミン神経を脱落させたラットが低体重になることを見出した。そこで、本研究では、脳内ドーパミン神経を脱落させたラットを用い、ドーパミン神経の脱落が胃腸機能に与える影響を明らかにするとともに、体重減少のメカニズムを解明することを目的に研究を遂行している。平成28年度は、まず餌の摂取量と体重の変化との関係に着目して検討を行った。その結果、ドーパミン欠損群では餌の摂取量が低く体重が増加しにくいことが明らかになった。また、空腹時血糖値は、ドーパミン欠損群で顕著な減少がみられたものの、摂食亢進にはつながらなかった。消化器官の重量に関しては、肝臓はコントロール群と優位な変化は見られなかったが、消化管では顕著に高く、消化管の運動機能の低下が示唆された。また、いくつかのホルモンを浸透圧ポンプを用いて長期間投与してみたが、著明な効果は認められなかった。今後は、ホルモンを投与する時期や投与方法、餌の質、飼育環境などについても検討を行いたいと考えている。

生後10齢以上のラットのドーパミン神経を破壊すると死亡するので、妊娠14日目の妊娠ラットを購入し、生後5日以内にドーパミン神経毒である6-OHDAを脳内に投与し、脳内ドーパミン神経を傷害して研究を遂行した。なお、このようにして作成したモデルラットは、成長後にドーパミン神経が脱落しているにもかかわらず、パーキンソン病の様な運動症状は示さない。また、実験に使用したすべての動物は、実験終了後、免疫染色により脳内ドーパミン神経の脱落程度を確認した。偽処置(sham処置)ラットおよび脳内ドーパミン神経を脱落させたラットを用いて、餌摂取量および体重の変化を観察したところ、ドーパミン欠損群で明らかに摂餌量が少ないことがわかった。また、生後7週目から、アルゼット浸透圧ポンプを用い、甲状腺ホルモンの持続投与を行った。通常、この週齢のラットは1週間に約30グラム程度の体重増加があるが、溶媒投与群および甲状腺ホルモン投与群はともに15グラム程度の体重増加しか起こらず、甲状腺ホルモンでは体重低下を改善することが難しいのではないかと考えられた。平成28年度末の段階で、脳内ドーパミン神経の脱落による低体重を改善する治療法は発見できていないが、今後本研究で用いている方法によって、それが発見できる可能性を感じており、本研究はおおむね順調に推移していると考えている。平成29年度以降、ホルモンの種類を増加させるとともに、投与を開始する時期、えさの質、飼育環境、腸管の運動機能についても注目していきたいと考えている。パーキンソン病は、高齢になると発病率が増加する疾病で、脳内ドーパミン神経の脱落によって発症する。これまで、運動障害に関しては多くの研究がなされ、ドーパミン不足による大脳基底核神経回路の機能変調が運動障害の原因であることがわかっている。しかし、体重減少など運動機能以外の症状に関してはほとんど研究が進んでいない。研究代表者は、最近、脳内ドーパミン神経を脱落させたラットが低体重になることを見出した。これまでの予備実験から、このラットは胃腸の運動機能が低下して低体重となっているのではないかと考えている。しかし、脳内ドーパミン神経の脱落が消化管機能に与える影響や、体重減少のメカニズムは全く不明である。そこで、本研究では、脳内ドーパミン神経を脱落させたラットを用い、ドーパミン神経の脱落が胃腸機能に与える影響を明らかにするとともに、体重減少のメカニズムを解明することを目的に研究を遂行している。平成29年度は、マイクロ浸透圧ポンプを用いて種々のホルモン・神経伝達物質を長期投与し、体重の変化がみられるかについて検討を行った。いくつかのホルモンについては体重増加傾向を示したが、有意な差とまではならず、さらに検討を続ける必要性が明らかとなった。消化管の運動機能については、マグヌス法を用いた検討を行ったが、顕著な差は認められなかった。一方、餌をケトジェニックに変更したところ、体重増加傾向が認められたので今後の検討課題として研究を遂行したいと考えている。生後10日齢以上のラットのドーパミン神経を破壊すると死亡するので、妊娠14日目の妊娠ラットを購入し、生後5日目以内にドーパミン神経毒である6-OHDAを脳内に投与し、脳内ドーパミン神経を傷害して研究を遂行した。
RAS/MAPK症候群の原因・病態の解明とその治療戦略

RAS/MAPK症候群は、ヌーナン症候群類縁疾患を含む先天性疾患であり、生殖細胞系列におけるRAS/MAPKシグナル伝達経路の遺伝子変異を原因とする。研究代表者らはこれまでにNoonan症候群類縁疾患の遺伝子診断を行ってきたが、本研究では原因遺伝子を網羅的に解析する系を確立した。また2013年に研究代表者らNoonan症候群の新規原因遺伝子として報告したRIT1遺伝子変異陽性患者をさらに同定した。RIT1変異陽性者を含むNoonan症候群の詳細な臨床症状を収集し、RIT1変異陽性者に特徴的な臨床像を確立した。また、RAS/MAPK症候群モデルマウスを作製し、その病態を解明した。本研究は、2013年に新しく同定された新規原因遺伝子RIT1変異陽性患者を同定し、その臨床症状の詳細(心奇形・癌合併)を明らかにし、RIT1の機能を明らかにすることを目的とする。またRASopathyマウスモデルの作製とその病態解明をめざす。1新規原因遺伝子RIT1変異患者の臨床像の確立:RASopathy患者に対して遺伝子診断を行なった。既知の遺伝子変異陰性患者においてRIT1のスクリーニングを行い、新たにRIT1遺伝子変異を同定した。その詳細な臨床症状を収集し解析を行った。2RIT1変異蛋白が活性化する下流のシグナル同定:患者で同定され、これまでにまだ機能解析をおこなっていない遺伝子変異を有するRIT1 cDNAをもつ発現ベクターを作成した。293細胞にトランスフェクションを行い、蛋白の発現を確認した。その下流のシグナル分子を解析したところ変異を導入した細胞においてリン酸化ERKの上昇は見られなかった。次にRAS/MAPKシグナル伝達経路の下流にあると考えられる複数の転写因子の転写活性を解析を行った。3RASopathyモデルマウスの病態解析:BRAF遺伝子変異ノックインマウスは、先天性心疾患・浮腫・骨格の異常などを呈して胎生致死であることが明らかになった。その遺伝的背景を変えることで胎生致死を回避し成獣まで生きるマウスを現在作成・検討中である。4新規原因遺伝子検索:RIT1遺伝変異同定後に他の研究室から報告された新規原因遺伝子の有無をこれまで収集したサンプルにて解析中である。1)新規原因遺伝子RIT1変異患者の臨床像の確立:RIT1遺伝子変異陽性者の詳細な臨床症状の検討を行なった。これまでの遺伝子診断で変異が同定されなかった患者186人についてRIT1遺伝子解析を行ったところ14人に7種類のミスセンス変異が同定された。そのうちp.A77S変異とp.A77Tはこれまでに報告の無い新規の変異だった。RIT1陽性患者の臨床症状の詳細を検討したところ、RIT1陽性患者では胎児水腫・胸水などリンパ形成不全の頻度が高いことが明らかになった。またこれまでに論文として報告されているPTPN11, SOS1, RAF1, KRAS, RIT1変異を持つヌーナン症候群患者の臨床症状を比較したいところ、RIT1変異陽性患者はRAF1遺伝子変異陽性患者と同様、肥大型心筋症の頻度が高いことが明らかになった。肺動脈弁狭窄、心房・心室壁中隔欠損の頻度はRIT1陽性患者が最も高かった。しかしながら低身長、知的障害の頻度は低いことが明らかになった。遺伝子解析と詳細な臨床症状検討により、遺伝子特異的な臨床症状が明らかになり、起こりうる合併症の予測や今後の治療方針の決定に貢献すると考えられる。2)RIT1変異蛋白が活性化する下流のシグナル同定:今回同定した変異と以前の論文で解析していない変異全6種を細胞に発現させ下流のELK転写活性を調べたところ、正常RIT1に比べてELK転写活性を上昇させることがわかった。c-jun転写活性も弱いながら活性化した。3)モデルマウスの作製:BRAF遺伝子ノックインマウスはC57black/6の遺伝的背景では胎生致死であるが、MEK阻害剤投与により生まれてきたマウスをICR系統へ交配したところ、ICR系統では継代ができ成獣まで生存することが明らかになった。ICRマウスは骨格の異常、成長障害などを示した。今回はヌーナン症候群における原因遺伝子毎の詳細な文献的考察を行い、その遺伝子・臨床症状連関を明らかにした。最初に考えていたよりもRIT1遺伝子変異陽性患者はヌーナン症候群の中で頻度が高く、PTPN11、SOS1、RAF1についで34番目に頻度が高いことが明らかになった。詳細な臨床症状を聴取しその臨床症状を検討したところ、胎児水腫や胸水などリンパ管形成異常の頻度が高いことや肥大型心筋症の頻度が多いことが明らかになった。今後ヌーナン症候群において遺伝子特異的な症状が明らかになることにより、起こりうる合併症の予測や今後の治療方針の決定に貢献すると考えられる。機能解析を行い、ヌーナン症候群で同定された変異が機能獲得性変異であることも報告した。RAS/MAPK症候群(ヌーナン症候群・コステロ症候群・CFC症候群)は心疾患・精神遅滞・易発がん性を示す先天奇形症候群である。本研究の目的は、これまでに収集した、あるいはこれから収集するRAS/MAPK症候群患者検体を解析し、新規原因遺伝子を同定することである。これまでに、RIT1遺伝子変異陽性患者の臨床症状を明らかにし、他のヌーナン症候群と比較して肥大型心筋症の頻度が高いことを明らかにし、論文として報告した。患者で同定された複数の変異の培養細胞における解析にて、RIT1変異を導入した細胞では弱いながらもELK転写活性が亢進することも明らかにした。

また、すでに作製しているモデルマウスにおいて、患者と同様に先天性心疾患、浮腫、骨格の異常、成長障害などを呈することを明らかにし、既に報告してきた。今年度はヌーナン症候群とその類縁疾患について、遺伝子解析を継続した。さらに次世代シークエンサーを用いてヌーナン症候群類縁疾患とその類似疾患の複数の原因遺伝子を網羅的に解析する系を確立した。陽性コントロールにて条件を検討した後にこれまでのサンガー法の解析系で変異を同定しなかった104例の解析を行い、2013年度以降に同定されてきた新規原因遺伝子を含む新しいバリアントを同定した。それらの変異陽性者の詳細な臨床症状の検討や両親の検索を行い、培養細胞を用いた機能解析系を立ち上げバリアントの機能的変化を解析した。網羅的遺伝子解析系は、サンガー法に比べると多くの遺伝子を一度に解析することができ簡便である。今後ルーチンの遺伝子解析に導入することは有用と考えられた。ICRの背景をもつCFC症候群モデルマウスについての表現型解析を継続し、その成長障害の原因を検索した。RAS/MAPK症候群は、ヌーナン症候群類縁疾患を含む先天性疾患であり、生殖細胞系列におけるRAS/MAPKシグナル伝達経路の遺伝子変異を原因とする。研究代表者らはこれまでにNoonan症候群類縁疾患の遺伝子診断を行ってきたが、本研究では原因遺伝子を網羅的に解析する系を確立した。また2013年に研究代表者らNoonan症候群の新規原因遺伝子として報告したRIT1遺伝子変異陽性患者をさらに同定した。RIT1変異陽性者を含むNoonan症候群の詳細な臨床症状を収集し、RIT1変異陽性者に特徴的な臨床像を確立した。また、RAS/MAPK症候群モデルマウスを作製し、その病態を解明した。2013年にヌーナン症候群においてRIT1変異を同定したが、RIT1遺伝子変異を持つ患者は予想より多く、ヌーナン症候群の約5%程度を占めることがわかってきた。また第2コホートの患者の詳細な臨床症状を収集することにより、RIT1遺伝子変異をもつ患者の臨床的な特徴を明確にすることができると考えられる。細胞培養におけるRIT1機能解析や、BRAF変異をもつ成獣マウスモデルの作製もおおむね順調に進んでいる。RIT1 GTPaseは未だにその機能が明らかではない。今回は、RIT1遺伝子変異を細胞培養系に導入してELK転写活性が上昇することが明らかになったが、RIT1の心臓における機能や、他のRASとの機能の違いなどは明らかではない。細胞培養系でその下流の分子やシグナル伝達を明らかにするとともに、その遺伝子発現部位や、in vivoにおける機能を解析していく必要があると考えられた。28年度が最終年度であるため、記入しない。先天異常症の分子遺伝学本研究分野では、次々と新規原因遺伝子と考えられる遺伝子が報告されてきており、遺伝子診断に対応しながら新規原因遺伝子解析を行っていく必要がある。そのためには次世代シークエンサーを用いた網羅的な解析系を整備し、新たに報告された新規原因遺伝子についてスクリーニングを継続していく。
径方向偏光レーザー光による新しい不透明微粒子精密操作法の実現と応用

本年度は,簡便かつ高効率な径方向偏光(以下,径偏光とする)レーザー光発生手法として,同心円構造のフォトニック結晶ミラーを用いたレーザー共振器からの径偏光ビーム直接発振を新たに試み,単一横モードでの径偏光ビーム発生に成功し,最大で2.7Wの出力が得られた.また,実際に径偏光レーザー光源を用いて光トラッピング実験を実施した.従来の光トラッピングでは,光の偏光状態がもたらす効果についてはほとんど議論されていない.そこで,径偏光ビームを光トラッピングの捕捉ビームとした場合の効果について明らかにするため,トラップ効率の偏光依存性に関して実験的な検証を試みた.粒径が数μm程度のホウ珪酸ガラスおよびポリスチレン粒子について,軸方向トラップカ,および横方向トラップ力測定を行った.これらの測定により,特に鉛直方向に粒子を持ち上げる力となる軸方向トラップ力では,径偏光ビームが最も大きな効率を示す結果が得られた.捕捉ビームが径偏光の場合,粒子表面に入射する全ての光線がp偏光となることに起因し,粒子表面での反射に起因した散乱力が径偏光では最も小さくなるためと考えられる.実際に,幾何光学モデルを用いた軸方向トラップ効率の計算により,本実験結果と一致する数値計算結果が得られており,捕捉ビームの偏光状態に起因したトラップ効率の差異を本研究により初めて実証した.これらの結果は,媒質との相対屈折率がより大きな粒子を対象とした光トラッピングにおいて,径偏光ビームが極めて有効であることを示唆しており,従来法では困難であった半導体等の微粒子に対する径偏光ビームを用いた3次元的な光トラッピングの可能性が十分期待される結果と言える.本年度は,径方向偏光(径偏光)レーザー光を直接発生させるためのレーザー共振器の開発を行った.これまで偏光選択素子として円錐ブリュースタープリズムによる径偏光発振レーザー共振器の開発を行ってきたが,より簡便な方法として一軸結晶の複屈折性を利用した径偏光発生の可能性について着目した.そこで,大きな複屈折性を示すYVO4結晶を,その光学軸がレーザー共振器軸と平行になるように共振器内に配置したNd : YAGレーザー共振器を構築した.特に,共振器が凹面ミラーと平面ミラーからなる半球面系共振器の安定限界長付近において,中心に穴の開いたドーナツ形状の強度分布を有する径偏光ビームの選択的発振を得ることに成功した.この手法を用いることで,出力が1W以上のシングル横モード径偏光レーザー発振が得られた.これにより,当初のレーザー出力目標を達成したため,次年度以降ではこのビームを用いた不透明微粒子の光トラッピング実験を進める.また,異なる曲率の凹面ミラー対からなる共振器中に複屈折結晶が存在する場合には,レーザー共振器の安定境界において複屈折結晶の常光線および異常光線に相当する方位偏光・径偏光のそれぞれについて選択的な発振が得られた.これと並行して,高次径偏光ビームの集光特性に関する知見を得るため,ベクトル回折理論に基づく数値計算を行った.特に,二重リングの強度分布をもつ高次径偏光ビームは,高開口数レンズにより集光することで,その集光点におけるスポットの半値全幅が波長の0.4倍程度となる結果が得られた.これは直線偏光ガウスビームおよび基本径偏光ビームにおける集光時のスポット径よりも小さなスポットが得られる可能性を示唆しており,高分解能レーザー顕微鏡や高密度光記録への応用が期待される.本年度は,簡便かつ高効率な径方向偏光(以下,径偏光とする)レーザー光発生手法として,同心円構造のフォトニック結晶ミラーを用いたレーザー共振器からの径偏光ビーム直接発振を新たに試み,単一横モードでの径偏光ビーム発生に成功し,最大で2.7Wの出力が得られた.また,実際に径偏光レーザー光源を用いて光トラッピング実験を実施した.従来の光トラッピングでは,光の偏光状態がもたらす効果についてはほとんど議論されていない.そこで,径偏光ビームを光トラッピングの捕捉ビームとした場合の効果について明らかにするため,トラップ効率の偏光依存性に関して実験的な検証を試みた.粒径が数μm程度のホウ珪酸ガラスおよびポリスチレン粒子について,軸方向トラップカ,および横方向トラップ力測定を行った.これらの測定により,特に鉛直方向に粒子を持ち上げる力となる軸方向トラップ力では,径偏光ビームが最も大きな効率を示す結果が得られた.捕捉ビームが径偏光の場合,粒子表面に入射する全ての光線がp偏光となることに起因し,粒子表面での反射に起因した散乱力が径偏光では最も小さくなるためと考えられる.実際に,幾何光学モデルを用いた軸方向トラップ効率の計算により,本実験結果と一致する数値計算結果が得られており,捕捉ビームの偏光状態に起因したトラップ効率の差異を本研究により初めて実証した.これらの結果は,媒質との相対屈折率がより大きな粒子を対象とした光トラッピングにおいて,径偏光ビームが極めて有効であることを示唆しており,従来法では困難であった半導体等の微粒子に対する径偏光ビームを用いた3次元的な光トラッピングの可能性が十分期待される結果と言える.
グルタチオントランスフェラーゼ検出プローブを用いた細胞内スクリーニング創薬

本研究ではアリールスルフォニル基を保護基に用いてGST検出のためのプローブ開発を行った。開発したプローブは、基質自身はGSH修飾を受けず排出機構の影響を受けないため、細胞内で安定してシグナルを発生させることが可能である。このアリールスルフォニル基を用いて、GSTで活性化される蛍光、化学発光、19F-NMRプローブおよびプロドラックの合成に成功した。グルタチオン-S-トランスフェラーゼ(GST)は、フェーズIIに属する解毒系酵素であり、疎水性化合物に対するグルタチオン(GSH)の求核攻撃を触媒する。このGSTの過剰発現が腫瘍の薬剤耐性の一因となっているため、細胞内のGST活性レベルを知ることは、抗がん治療において投与する薬剤選定等の決定のための重要な指針になる。しかし、既存のGST検出プローブは蛍光を発する際に基質がGSH抱合体となり、多剤耐性タンパク質により速やかに体外に排出されてしまうことから、生体への応用は困難であった。このことから、GST/GSH薬剤排出機構の影響を受けないGST検出プローブの開発は、GSTを標的とした細胞内イメージング等へと研究展開を図る上で非常に重要である。本研究ではアリールスルホニル基を保護基に用いて、基質自身はGSH修飾を受けず排出機構の影響を受けない、細胞内で定量性に優れた検出プローブ開発を試みた。本年度は、アリールスルホニル基に求電子性の異なる様々な置換基を導入し、各種アリールスルホニル基で保護したプローブとGSTの反応性について検討を行った。結果、p位アセチル基もしくはシアノ基を用いたアリールスルホニル基を保護基に用いることで高いシグナル・バックグラウンド比を持つGST検出用蛍光プローブを得ることができた。さらに色素にクマリン、ローダミンおよびクレシルバイオレットを用いることで、450から650nmまでの異なる色調のGST検出プローブの開発に成功した。また、Karolinska研究所と共同で各種GSTのサブタイプに対するプローブの反応性についても検討を行った。その結果、今回合成したプローブは、特にGSTA1-1に対し高い特異性を示すことが明らかとなった。本年度は、前年度に開発したアリールスルホニル保護基を蛍光以外のシグナル発生分子へと応用した。化学発光および19F-NMRを用いたGST検出プローブを開発した。これらのプローブを用いて大腸菌内のGSTのイメージングに成功した。また、抗がん剤の一種であるドキソルビシンのアミノ基へアリールスルホニル基を導入し、プロドラック化を試みた。この結果、アリールスルホニル保護ドキソルビシンはGST高発現株でより高い薬効を示すことを確認できた。
ホイスラー合金におけるスピンダイナミクスの解明と多機能デバイスへの展開

平成28年度はまず、ホイスラー合金において高効率に磁化ダイナミクスを誘起・検出すること、すなわち「発信」及び「受信」に重点をおいて研究に取り組んだ。高効率化を図る上で特に重要となるのが、材料のスピン分極率、及び熱擾乱への耐性である。そこで、デバイス材料としては高いスピン分極率を有するCo2(Fe,Mn)Si(CFMS)合金を用い、幾何学的に安定な磁区構造である磁気ボルテックスを用いて研究を行った。超高真空対応のマグネトロンスパッタリング装置を用いて高品質なCFMS薄膜を成膜し、電子線リソグラフィー等を用いて直径数百ナノメートルのピラー構造からなるデバイスに加工した。作製したデバイスに直流電流を印加することにより磁化ダイナミクスを誘起し、磁化ダイナミクスによって生じる高周波のシグナルはスペクトラムアナライザを用いて検出した。直径及び高さの異なるデバイスを作製し、実験を重ねていった結果、直径240ナノメートル、高さ30ナノメートル程度のデバイスにおいてCFMS中に安定な磁化ダイナミクスを誘起することに成功した。さらに、CFMS合金のFe-Mn組成比を最適化することによって10.2 nWの高出力(パーマロイなどの既存材料を用いた場合に比べておよそ1万倍)、そしてまた5,000を超えるQ値を得ることに成功した。以上の結果はPhysical Review B誌に掲載された。デバイスから得られた高周波シグナルのより詳細な解析の結果、さらなる高Q実現のためには長周期的なダイナミクスの揺らぎを抑制する必要性が示唆された。そこで、デバイス中に2つの磁気ボルテックスを形成し、それらの静磁結合を利用してダイナミクスの安定化を図った。デバイスの膜構成及び測定条件を最適化することによって、23,000という非常に高い(現在世界最高)Q値を得ることに成功した(論文準備中)。翌年度、交付申請を辞退するため、記入しない。
成育場の劣化が熱帯域魚類資源の加入成功に及ぼす影響

サンゴ礁や海草藻場などの成育場の劣化・消失が,仔稚魚の着底場選択や着底後の生残・成長に与える影響を野外観察と室内実験によって調べた。その結果,成育場の劣化や消失は,多くの種の仔稚魚の着底場選択や着底後の成長や生残に負の影響を与える可能性が高いことが明らかになった。以上の結果から,健全な成育場の確保は,魚類の新規加入と着底後の資源を維持する上で不可欠であることが示された。1.(海草藻場)沖縄県西表島網取湾において、海草藻場の消失が魚類に与える影響を明らかにした。2009年の8月に海草藻場が消失した場所に1m×20mのベルトトランセクトを7本設定し、目視観察でトランセクト内に出現した各魚種の個体数と体長を記録した。そして、海草藻場が消失する前の2000年と2001年と2005年の8月の魚類群集と比較した。その結果、海草藻場が消失すると藻場を稚魚の成育場として利用するフエフキダイ類や餌場として利用するヒメジ類など多くの種の個体数が有意に減少したことが明らかになった。また、海草を摂食するブダイ類やアイゴ類も海草の消失に伴って姿を消した。一方で、海草藻場の消失はタカノハハゼなどの底生性ハゼ類の個体数にはあまり影響を及ぼさなかった。以上の結果から、海草藻場魚類の大部分は海草が消失した場所には生活することができないと考えられた。また水産有用種であるフエフキダイ類の稚魚の姿が他の生息場所でも認められなかったことから、海草藻場の消失は沿岸漁業にも負の影響を及ぼすことが示唆された。2.(サンゴ礁)生存サンゴ域と死滅サンゴ域に着底する魚種を2009年8月と10月にそれぞれ調べた。その結果、生存サンゴ域に主に着底する魚種(例えば、ネッタイスズメダイ)と、生存サンゴ域と死滅サンゴ域の両方に着底する魚種(例えば、ルリスズメダイ)がいることが確認された。したがって、サンゴ礁の劣化は魚類の着底パターンに影響を及ぼすことが示唆された。1.生存サンゴ域と死滅サンゴ域の成魚と稚魚の生息密度を2地域で調べた。その結果,20m^2あたりの稚魚の種数と個体数は,生存サンゴ域では平均して14種90個体であったのに対して,死滅サンゴ域では5.7種16個体であった。また,成魚の種数と個体数についてみてみると,生存サンゴ域では7種12個体であったのに対して,死滅サンゴ域では1.8種2個体であった。したがって,両生息場における成魚の資源量の違いは,稚魚期に大きく決定しているものと考えられた。2.生存サンゴ域と死滅サンゴ域における稚魚の加入パターンと,加入後の稚魚の生残などを野外実験で調べた。サンゴ礁内に生存サンゴパッチと死滅サンゴパッチを設置して,稚魚の加入パターンを2ヶ月間継続してみたところ,着底稚魚は生存サンゴパッチのみで確認された。また,着底後の被食率を操作実験によって生存サンゴパッチと死滅サンゴパッチで調べたところ,どの種も前者での生残が高かった。また,生残の割合は,底生雑食魚よりもプランクトン食魚の方が高かった。したがって、多くのサンゴ礁魚類は,着底する際に,着底後の生残率が高い生存サンゴ域を選んでいるものと考えられた。3.生存サンゴ域と死滅サンゴ域の海水に対する仔魚の反応を水槽実験で調べたところ,多くの種が前者に対して正の反応を示した。したがって,サンゴ礁に来遊する仔魚は,着底前に生存サンゴ域と死滅サンゴ域の水質を認識して,加入してきているものと考えられた。1.浮遊期を終えた仔稚魚のサンゴ礁への加入は主に夜間に行われるため、着底場選択には嗅覚が重要な役割を果たしていると考えられている。本研究では、仔稚魚が加入の際に生サンゴが優占するサンゴ礁(以下、健全サンゴ礁)と死サンゴが優占するサンゴ礁を嗅覚で識別しているのかどうかを水槽実験によって調べた。両タイプのサンゴ礁の外縁部および沖合1kmと2kmの海水をそれぞれ採取し、各海水に対する仔稚魚の選好性を水槽内で調べた。魚類8種に対して調べたところ、4種において健全サンゴ礁周辺の海水を好む種が確認された。また、これらの種はサンゴ礁外縁部と沖合1kmの海水に対して顕著な反応を示していたことから、嗅覚による着底場認識は健全サンゴ礁の外縁部から1kmの範囲内で起きていることが示唆された。

本研究によって、成育場への資源加入には健全な成育場から発せられる化学物質の存在が重要であることが明らかになった。したがって、サンゴ礁の健全性の確保は、仔稚魚のサンゴ礁への加入を継続させていく上で不可欠であると考えられた。2.成育場の劣化が稚魚の分布と成長に与える影響を明らかにするために、赤土流出によって劣化した海草藻場と赤土の影響を全く受けない健全な海草藻場において、海草藻場を稚魚成育場として利用するマトフエフキ稚魚の分布、食性、成長量の違いを調べた。両藻場で食性には違いが認められなかったものの、サイズ分布には違いが認められ、劣化した海草藻場には小型個体しか出現しなかったのに対して、健全藻場には小型個体だけでなく大型個体も出現した。耳石日周輪分析によって両藻場における稚魚の成長量を比較したところ、大きな違いは認められなかった。したがって、藻場の劣化は稚魚期初期の成長には大きな影響を与えないものの、大型の個体にとっては好適な成育場でなくなることが示唆された。