hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
F因子DNA分配に関与する大腸菌遺伝子の検索

[目的]本研究の目的は、大腸菌の性決定(F)因子を材料として、大腸菌におけるDNA分配装置と分配過程に関与する因子、特に大腸菌染色体上の遺伝子によりコードされる因子を明らかにすることである。「研究成果]F因子DNAの分離・分配には、F因子上のletA(ccdA)、letD(ccdB)遺伝子群が関与すること、これら遺伝子のコードする蛋白質が宿主大腸菌のDNAジャイレースの活性を特異的に制御する活性を持つことはすでに報告した。LetD蛋白質は、直接の相互作用によってDNAジャイレースのAサブユニットを不活性化する。この阻害過程に関与する宿主因子の同定を、LetD蛋白質による増殖阻害(DNAジャイレースの活性阻害の結果による)を受けなくなった大腸菌異変株を分離し、変異が生じた遺伝子を解析することにより行った。その結果、すでに報告したシャペロン蛋白質をコードするgroE遺伝子に加えて、新たに、tldD、tldE、zfiA遺伝子と名付けた3つの遺伝子が関与することを見いだした。tldD、tldE遺伝子変異株は、groE遺伝子と同様に、letD蛋白質による増殖阻害に耐性を示す。これに対し、zfiA遺伝子異変は、tldD、tldE、及びgeoE異変を再びLetD蛋白質感受性に戻す。これらの遺伝子産物は、LetD蛋白質と共に、DNAジャイトレースの活性をmodulateする因子であって、ZfiA蛋白質は、LetD蛋白質とDNAジャイレースの相互作用を阻害するが、TldD、TldE、GroE蛋白質はZfiA蛋白質の阻害活性を抑圧する活性を持つものと考えられる。tldD,tldE、zfiAはそれぞれ、大腸菌染色体上70.4分、96.0分、58.2分に位置する遺伝子で、それぞれ分子量51,000、48,000、6800蛋白質をコードする。tldE遺伝子はpmbA(production of MicrocinB17)遺伝子、zfiA遺伝子は、csrA(carbon storage regulator)遺伝子と同一であった。尚、DNAジャイレース活性の調節に関与する大腸菌遺伝子はこれまで報告がなく、上記遺伝子は、全く新しい型の活性を持つ遺伝子である。〔目的〕本研究の目的は、大腸菌の性決定(F)因子を材料として、大腸菌におけるDNA分配装置と分配過程に関与する因子を明らかにすることである。F因子は、大腸菌染色体同様、自律的複製システムに加え、複製が終了したDNA分子を2つの娘細胞に分配するシステムを持つ。F因子分配には、F因子上のsopA、sopB2つの遺伝子とセントロメア機能を持つsopC(incD)遺伝子領域が関与することが報告にされているが、これら遺伝子作用の分子機構は全くわかっていない。〔研究成果〕担当者は、自律増殖に関与するF因子変異株を解析している際、分配遺伝子sopBに変異を持つ新しい型の変異株を見いだした。sop遺伝子を欠失したmini-Fプラスミドを持つ大腸菌は、分配が正常に行われないため。大腸菌の増殖に伴ってプラスミドを失った細胞を生じる。これに対し、letB変異株は、宿主大腸菌の増殖を阻害するものであった。これを用いて、大腸菌におけるDNA分配に関与するF因子、宿主大腸菌遺伝子の検索を行い以下の結果を得た。(1)F因子letB変異株による増殖阻害には、分配されるDNA分子の長さが関与することを見いだした。

折り畳み構造を持つ長いDNAの分配には、小さなDNAの分配とは違った機能を必要とする可能性を示唆するものであろう。15EA04:(2)F因子letB変異株による増殖阻害に耐性を示す大腸菌変異株を解析し、ペプチドグリカン合成の調節遺伝子pbpA(ペニシリン結合蛋白質2)、rodA(棹菌形態維持)、dacA(ペニシリン結合蛋白質5)が関与することを見いだした。細菌の細胞骨格であるペプチドグリカンがDNA分配装置として働いている可能性を示唆したはじめての結果である。本研究は、これまで手の付けようがなかった原核生物におけるDNA分配の分子機構の解明への手掛かりを与えた点で、特にDNAの長さが分配過程に関与する可能性を示した点において、評価されるべき研究である。
巨大シナプス前終末の培養系の確立と発展

本研究課題の中で新規の培養系の確立を行った。主要な目的は巨大なシナプス前終末を培養条件下で再現することである。この目的のため、胎児期または新生マウスの脳幹を摘出し、さらに蝸牛神経核と台形体内側核を切り出してきて、これをパパインで分散しカバーグラス上で培養を行った。以上のステップの条件を詳細に検討することによって、実際に培養カリックス様シナプス前終末の形成に成功した。この培養シナプス前終末はCalyx of Held同様細胞体を取り巻くような形態をしており、シナプス小胞を含んでいることを免疫細胞化学的に確かめた。また、開口放出に必要な一連のタンパス質の局在も確認した。さらに、電気生理学的手法により、グルタミン作動性のシナプス伝達が行われていること、またFM dyeを用いた研究によりリサシナプス小胞のリサイクリングが行われていることも確認できた。遺伝子導入はリポフェクション法によって2,3%の神経細胞に導入が可能であった。この方法によって、培養カリックスにGFP等の蛍光タンパクを発現させることによって、長時間に渡るイメージングも可能である。これまで遺伝子工学的手法が容易に適用できる、巨大な(光学的に検出可能な)シナプス前終末はなかった。多くのシナプス前終末は光学顕微鏡下で観察するにはあまりに小さく、このためシナプス伝達におけるシナプス前終末の役割は解明が立ち後れている。本研究課題の実績によって、この分野に新しいモデルシナプス(前終末)を提供できるものと考えている。中枢神経系における情報処理は、主に神経細胞同士の接点(シナプス)を介して行われる。シナプス伝達の効率は、その送り側(前シナプス)及び受け手(後シナプス)の両者の要因で決定できる。後シナプスに比べ、前シナプスのシナプス伝達を制御する分子メカニズムは研究が立ち後れている。その主たる原因は、シナプス前終末のサイズが非常に小さく(1μm^3以下)、実験が困難であるからと考えられる。この問題を克服するためには、少なくとも数百μm^3以上の大きさのシナプス前終末が見やすい状態で、尚かつ長期にわたって維持できる必要がある。つまり、分散培養条件下で大きなシナプス前終末を形成させることが出来れば、非常に有用な標本となる。これまでに、聴覚系1次中継核であるAVCNを用いて、初代神経分散培養を行った。培養条件を適正化することによって、少なくとも細胞体を取り巻くようなシナプス前終末が形成されることを免疫細胞染色法、FM dyeを用いたシナプス小胞の取り込みの可視化などから確認した。また、同培養条件下においてシナプス伝達が起きていること、またその電気生理学的特性はCalyx-MNTBシナプスに酷似していることを確認した。巨大なシナプス前終末を形成する遺伝子を明らかにすることを目的として、AVCNと聴覚系2次中継核であるMNTBの発現パターンをGeneChipを用いて比較解析した。EbfやMath2といった特徴的な転写因子がAVCNでは高発現していることが明らかになった。巨大なシナプス前終末(Calyx)を形成する上でこれらの転写因子が重要な役割を担っている可能性が考えられる。PKAやEPACの配列を元にcAMPの濃度を検出できるタンパク性プローブの開発を行っている。
ヒト糖尿病性腎症糸球体硬化におけるapoptosisの関与についての検討

各種apoptosis関連蛋白であるBax、Bcl-2、caspase-3のoligonucleotide probeを用いて非放射性標識法によるin situ hybridization法を行った。今回のin situ hybridization法に使用したプローベの核酸配列はヒトBax、Bcl-2、caspase-3 mRNAからコンピュータホモロジー検索の結果、特異的と思われる領域の配列からアンチセンスプローベを作成し、digoxigenineで標識した。Bax、Bcl-2、caspase-3のmRNAの発現は、糸球体内では主に上皮細胞とメサンギウム細胞の一部にその発現が確認された。各プローブのmRNAの発現の程度を定量化するため、それぞれの糸球体での総細胞数を数え、次に各種mRNAの陽性細胞数を数えて、総細胞数に対する陽性細胞数の百分率として評価した。3.組織群間での比較正常腎組織と糖尿病性腎症腎組織での比較では、糸球体内でのBax、Bcl-2、caspase-3のmRNAの発現に有意差は認められなかった。しかしながら、糖尿病性腎症群を糸球体メサンギウム基質の増加の軽度なDN1群と中等度以上のDN2群に分類し、正常腎組織との3群間で比較検討したところ、メサンギウム基質増加が大きいDN2群においてBcl-2陽性率、Bcl-2/Bax比に有意な低下を認めた4.以上の結果からは、DNの糸球体内細胞におけるアポトーシスのメカニズムの経路には、Bcl-2 mRNA発現の低下がそのメカニズムの一部に関与している可能性が示唆された。5.TUNEL陽性細胞の検出apoptosis細胞を腎組織で検出するためTUNEL法を用いて検討した。その結果、糖尿病性腎症腎組織では尿細管細胞に陽性細胞が確認されたものの、糸球体内部において陽性細胞は確認されず更なる検討の必要性が示唆された。
サルコメア合成機構の解明に基づいた新規的筋萎縮治療法の開発

本研究はサルコメアの合成機構を明らかとすることを目的とする。具体的には、最初に顆粒球コロニー刺激因子欠損マウスのサルコメア合成抵抗性マウスの樹立と解析を行う。次に、サルコメア合成のメカニズム解明を行う。さらに、サルコメア合成に関与する顆粒球コロニー刺激因子の下流因子の特定とその作用機序解明する。そして最終的には筋萎縮モデルマウスにサルコメア合成促進剤を投与し有効性を検証することである。これら成果は、従来サルコメアの過剰な分解に対しては、サルコメア分解抑制(Nakao R et al. Mol Cell Biol. 2009)、もしくは筋量を増加させるが副作用の強い蛋白同化ホルモンによる治療研究が主流であるのに対し、本研究の独自性は、合成促進剤によってサルコメア合成を促進させ、筋萎縮を改善する新たなアプローチである。なお、本研究による合成機構の解明は「サルコメア合成・促進機序」という新しい課題を突破し、当該専門分野の発展に寄与する研究である。サルコメアの合成は骨格筋の再生・促進のみならず、生体における生理的肥大に必要不可欠であり、その応用は幅広い。さらに、合成促進剤が同定できれば、ヒトにおいて重症の糖尿病、心臓病、末期のエイズ、ガン、筋ジストロフィー、フレイルといった重篤な筋萎縮を呈する治療法の確立されていない疾患の新しい治療法開発への波及効果が期待される。現在までにサルコメアに注目し、筋再生・筋萎縮の治療への応用は前例がなく本研究は極めて挑戦的なものである。平成30年度は、顆粒球コロニー刺激因子がサルコメアを合成に関する下流のシグナルの因子の同定に成功し、その詳細の検討を行った。まず最初に、当該因子が欠損したマウスにおいて出生直後の横隔膜のサルコメア構造に異常をきすことを発見した。次に、当該因子欠損マウスの成体の骨格筋では中心核をもつ再生筋や大同不同など筋線維に異常が認められ、さらに筋力の低下など骨格筋に異常がおこることが確認された。電子顕微鏡でも、ミトコンドリアの異常蓄積、サルコメア構造の異常が認められた。また、当該因子のヘテロマウスにカルディオトキシンによる急性筋損傷をおこさせると異常な筋再生、筋湿重量の低下、筋力の低下が顕著に認められるなどハプロ不全な表現型が現れた。これららの結果は、当該因子がサルコメア合成及び筋再生に重要な因子であることを強く示唆している。次に、顆粒球コロニー刺激因子が、サルコメア合成に関与するメカニズムを解明するために骨格筋前駆細胞であるC2C12に顆粒球コロニー刺激因子因子を添加し分化誘導を行った。結果、DystrophinやCreatinine Kinaseといった筋分化成熟遺伝子の発現が亢進し、一本当たりの筋管の核の数、筋線維の太さなど筋融合を促進する作用をもつことを発見した。一方、顆粒球コロニー刺激因子の下流に関与している因子の阻害剤を添加し筋分化誘導を行うと、筋分化融合能が低下し、筋分化成熟因子の発現が低下することを確認した。顆粒球コロニー刺激因子受容体欠損マウスも当該因子欠損マウスも全身性の欠損を用いた組織・機能解析であるため、両作用が骨格筋特定的な要因によりサルコメアに関与しているかは不明である。このため、顆粒球コロニー刺激印受容体と当該因子の骨格筋特異的欠損マウスを作製し、解析する必要がある。骨格筋特異的欠損マウス作製後は、両マウスの筋発生、筋再生を含むサルコメア合成における両因子の作用を明確化する。さらに、筋衛星細胞から筋管形成、筋線維形成に両因子がどのように関与しているかを解明する予定である。さらに、In vitroでの解析を進めるために現在までにC2C12にsiRNAや阻害剤を用いて解析に取り組んできたが、さらにCRISPR Cas9システムを用いて顆粒球コロニー刺激、顆粒球コロニー刺激因子受容体、当該因子の欠損株を樹立し、遺伝子発現やタンパク発現に変化が現れるかを評価する事を予定している。他にも、解析方法としては筋管形成時や骨格筋の分化成熟に関する遺伝子発現とタンパクの発現の差を比較する。さらに、顆粒球コロニー刺激因子の下流因子のシグナルカスケードを明確化する。現在までに顆粒球コロニー刺激因子の下流因子の発現を亢進させる薬剤や低分子化合物の報告はない。もし、当該因子の発現を促進する低分子化合物を特定することができれば、筋ジストロフィーやサルコペニア、カヘキシーといった筋萎縮を呈する疾患に対する新しい治療法に繋がることが期待される。

サルコメアの合成は骨格筋の再生・促進のみならず、生体における生理的肥大に必要不可欠であり、その応用は幅広い。さらに、合成促進剤が同定できれば、ヒトにおいて重症の糖尿病、心臓病、末期のエイズ、ガン、筋ジストロフィー、フレイルといった重篤な筋萎縮を呈する治療法の確立されていない疾患の新しい治療法開発への波及効果が期待される。現在までにサルコメアに注目し、筋再生・筋萎縮の治療への応用は前例がなく本研究は極めて挑戦的なものである。平成30年度は、顆粒球コロニー刺激因子がサルコメアを合成に関する下流のシグナルの因子の同定に成功し、その詳細の検討を行った。まず最初に、当該因子が欠損したマウスにおいて出生直後の横隔膜のサルコメア構造に異常をきすことを発見した。次に、当該因子欠損マウスの成体の骨格筋では中心核をもつ再生筋や大同不同など筋線維に異常が認められ、さらに筋力の低下など骨格筋に異常がおこることが確認された。電子顕微鏡でも、ミトコンドリアの異常蓄積、サルコメア構造の異常が認められた。また、当該因子のヘテロマウスにカルディオトキシンによる急性筋損傷をおこさせると異常な筋再生、筋湿重量の低下、筋力の低下が顕著に認められるなどハプロ不全な表現型が現れた。これららの結果は、当該因子がサルコメア合成及び筋再生に重要な因子であることを強く示唆している。次に、顆粒球コロニー刺激因子が、サルコメア合成に関与するメカニズムを解明するために骨格筋前駆細胞であるC2C12に顆粒球コロニー刺激因子因子を添加し分化誘導を行った。結果、DystrophinやCreatinine Kinaseといった筋分化成熟遺伝子の発現が亢進し、一本当たりの筋管の核の数、筋線維の太さなど筋融合を促進する作用をもつことを発見した。一方、顆粒球コロニー刺激因子の下流に関与している因子の阻害剤を添加し筋分化誘導を行うと、筋分化融合能が低下し、筋分化成熟因子の発現が低下することを確認した。顆粒球コロニー刺激因子受容体欠損マウスも当該因子欠損マウスも全身性の欠損を用いた組織・機能解析であるため、両作用が骨格筋特定的な要因によりサルコメアに関与しているかは不明である。このため、顆粒球コロニー刺激印受容体と当該因子の骨格筋特異的欠損マウスを作製し、解析する必要がある。骨格筋特異的欠損マウス作製後は、両マウスの筋発生、筋再生を含むサルコメア合成における両因子の作用を明確化する。さらに、筋衛星細胞から筋管形成、筋線維形成に両因子がどのように関与しているかを解明する予定である。さらに、In vitroでの解析を進めるために現在までにC2C12にsiRNAや阻害剤を用いて解析に取り組んできたが、さらにCRISPR Cas9システムを用いて顆粒球コロニー刺激、顆粒球コロニー刺激因子受容体、当該因子の欠損株を樹立し、遺伝子発現やタンパク発現に変化が現れるかを評価する事を予定している。他にも、解析方法としては筋管形成時や骨格筋の分化成熟に関する遺伝子発現とタンパクの発現の差を比較する。さらに、顆粒球コロニー刺激因子の下流因子のシグナルカスケードを明確化する。現在までに顆粒球コロニー刺激因子の下流因子の発現を亢進させる薬剤や低分子化合物の報告はない。
ヒトの運動時における筋交感神経活動の役割に関する研究

ヒトの運動時に筋交感神経活動がどのような役割を担うかを明らかにすることを目的とした.健康人を対象として,臥位での随意的な掌握運動と前腕の屈曲運動,および立位での随意的な足の底屈運動と背屈運動の負荷時における筋交感神経活動を脛骨神経からニューログラム法により記録して解析した.同時に,活動筋の表面筋電図と自覚的な筋疲労感覚,および血圧を測定した.足の底・背屈運動としては,等尺性の持続性運動と律動性運動の両者を負荷し,筋交感神経活動の変化を比較した.このほか,律動的な不随意運動としての振戦の発現時における筋交感神経活動,血圧変動,下腿容積(静脈貯留量)の変化を解析した.1.臥位での持続性掌握運動時にも,前腕の持続性屈曲運動時にも,脛骨神経から記録した筋交感神経活動は緊張力,筋放電量,筋疲労感覚に応じて促進され,血圧上昇を伴った.2.立位での足の持続性底屈運動時にも背屈運動時にも,同側の脛骨神経から記録した筋交感神経活動がほぼ同様に促進された.しかし,足の律動性底・背屈運動時にはこの活動が逆に抑制された.3.筋交感神経活動の促進された状態で振戦が発現したが,振戦の発現に応じて下腿容積の減少と血圧上昇が一過性に引き起こされ,これと共に筋交感神経活動が抑制された.振戦と血圧変動との間には有意な正の相関が認められた.以上の結果から次のように結論した.持続性運動時には非活動筋と活動筋の両者を支配する筋交感神経活動が促進され,この促進反応は筋疲労に拮抗する役割と,血圧を上昇させて大脳や活動筋への血流を増加する役割を担う.持続性運動時には主動筋と拮抗筋支配の交感神経活動が同様に促進され,体性神経でみられるような相反性支配は認められない.随意的および不随意的な律動性運動時には筋交感神経活動が抑制される.この抑制反応には静脈還流の促進と血圧上昇が関連し,律動的な筋収縮に伴う筋ポンプ作用が関与する.ヒトの運動時に筋交感神経活動がどのような役割を担うかを明らかにすることを目的とした.健康人を対象として,臥位での随意的な掌握運動と前腕の屈曲運動,および立位での随意的な足の底屈運動と背屈運動の負荷時における筋交感神経活動を脛骨神経からニューログラム法により記録して解析した.同時に,活動筋の表面筋電図と自覚的な筋疲労感覚,および血圧を測定した.足の底・背屈運動としては,等尺性の持続性運動と律動性運動の両者を負荷し,筋交感神経活動の変化を比較した.このほか,律動的な不随意運動としての振戦の発現時における筋交感神経活動,血圧変動,下腿容積(静脈貯留量)の変化を解析した.1.臥位での持続性掌握運動時にも,前腕の持続性屈曲運動時にも,脛骨神経から記録した筋交感神経活動は緊張力,筋放電量,筋疲労感覚に応じて促進され,血圧上昇を伴った.2.立位での足の持続性底屈運動時にも背屈運動時にも,同側の脛骨神経から記録した筋交感神経活動がほぼ同様に促進された.しかし,足の律動性底・背屈運動時にはこの活動が逆に抑制された.3.筋交感神経活動の促進された状態で振戦が発現したが,振戦の発現に応じて下腿容積の減少と血圧上昇が一過性に引き起こされ,これと共に筋交感神経活動が抑制された.振戦と血圧変動との間には有意な正の相関が認められた.以上の結果から次のように結論した.持続性運動時には非活動筋と活動筋の両者を支配する筋交感神経活動が促進され,この促進反応は筋疲労に拮抗する役割と,血圧を上昇させて大脳や活動筋への血流を増加する役割を担う.持続性運動時には主動筋と拮抗筋支配の交感神経活動が同様に促進され,体性神経でみられるような相反性支配は認められない.随意的および不随意的な律動性運動時には筋交感神経活動が抑制される.この抑制反応には静脈還流の促進と血圧上昇が関連し,律動的な筋収縮に伴う筋ポンプ作用が関与する.〔目的〕ヒトの随意的な運動時には非活動筋支配の交感神経活動が促進されるが,活動筋支配の交感神経活動が促進されるか否かについてはまだよく分かっていない.本研究は随意運動時に,活動筋、とくに抗重力筋支配の交感神経活動がどのように反応するかを明らかにすることを目的とした.〔対象と方法〕研究の目的と内容に関する詳しい説明を受けた後,被験者となることを承諾した健康成人を対象として実験を行った.背臥位にて下腿三頭筋支配の脛骨神経から先端直径1μm,インピーダンス35MΩのタングステン微小電極を用いて筋交感神経活動を記録した.同時に下腿三頭筋の筋放電を表面電極を用いて記録した。背臥位での測定の後,傾斜台を用いて受動的なhead-up tiltを負荷し,立位でも同様の記録を行った.立位で筋交感神経活動記録側の下腿三頭筋に随意的な持続性収縮と,約1秒周期での律動性収縮を負荷した際の筋交感神経活動の反応をも観察した.

〔結果〕1.脛骨神経から記録した筋交感神経活動は受動的なhead-up tilt時の,下腿三頭筋に筋放電のみられない状態では,体位傾斜角度に応じて促進されたが,立位で下腿三頭筋に筋放電が僅かに出現する状態では軽度に抑制された.2.脛骨神経から記録した筋交感神経活動は立位で下腿三頭筋に持続性収縮を負荷すると促進されたが,律動性収縮を負荷すると逆に抑制された.〔結論〕立位での抗重力筋支配の交感神経活動は抗重力筋の持続性収縮により促進されるが,律動性収縮によって抑制される.この機序には律動性収縮に伴う筋ポンプ作用が関与すると思われる.ヒトの運動時に筋交感神経活動がどのような役割を担うかを明らかにすることを目的とした.健康人を対象として,臥位での随意的な掌握運動と前腕の屈曲運動,および立位での随意的な足の底屈運動と背屈運動の負荷時における筋交感神経活動を脛骨神経からニューログラム法により記録して解析した.同時に,活動筋の表面筋電図と自覚的な筋疲労感覚,および血圧を測定した.足の底・背屈運動としては,等尺性の持続性運動と律動性運動の両者を負荷し,筋交感神経活動の変化を比較した.このほか,律動的な不随意運動としての振戦の発現時における筋交感神経活動,血圧変動,下腿容積(静脈貯留量)の変化を解析した.1.臥位での持続性掌握運動時にも,前腕の持続性屈曲運動時にも,脛骨神経から記録した筋交感神経活動は緊張力,筋放電量,筋疲労感覚に応じて促進され,血圧上昇を伴った.2.立位での足の持続性底屈運動時にも背屈運動時にも,同側の脛骨神経から記録した筋交感神経活動がほぼ同様に促進された.しかし,足の律動性底・背屈運動時にはこの活動が逆に抑制された.3.筋交感神経活動の促進された状態で振戦が発現したが,振戦の発現に応じて下腿容積の減少と血圧上昇が一過性に引き起こされ,これと共に筋交感神経活動が抑制された.振戦と血圧変動との間には有意な正の相関が認められた.以上の結果から次のように結論した.持続性運動時には非活動筋と活動筋の両者を支配する筋交感神経活動が促進され,この促進反応は筋疲労に拮抗する役割と,血圧を上昇させて大脳や活動筋への血流を増加する役割を担う.持続性運動時には主動筋と拮抗筋支配の交感神経活動が同様に促進され,体性神経でみられるような相反性支配は認められない.随意的および不随意的な律動性運動時には筋交感神経活動が抑制される.この抑制反応には静脈還流の促進と血圧上昇が関連し,律動的な筋収縮に伴う筋ポンプ作用が関与する.
白血病細胞のMAPキナーゼの恒常的活性化-その機序と意義の解明に関する研究

我々は多くのヒト新鮮骨髄系,リンパ系造血器腫瘍細胞を用いて以下のことを明らかにしてきた。1.骨髄系造血器腫瘍細胞の増殖とMAPK活性2.リンパ系造血器腫瘍細胞とMAPK活性約100例の種々のリンパ系造血器腫瘍細胞のMAPK活性は正常対象と比較すると全例有意な高値を示し,恒常的な活性化が確認された。Aktのリン酸化は75%の症例で確認された。多発性骨髄腫では,治療抵抗性,骨破壊,高カルシウム血症と相関性が見られた。MAPK活性は種々の造血因子で活性化され,PKCあるいはチロシンキナーゼ・インヒビターで部分的に抑制されたがwortmanninでは抑制されなかった。更に生存率とMAPK活性との関係を検討中である。3.造血器腫瘍細胞のMAPK活性と血管新生因子遺伝子発現様々な造血器腫瘍により異なった血管新生因子が産生される事が明らかにされている。MAPKは造血細胞のautocrine増殖血管新生因子遺伝子発現接着因子のシグナル伝達matrix metalloproteinase産生に重要であり,造血器腫瘍細胞の増殖進展を促進すると予測される。我々は造血器腫瘍細胞による血管新生因子,血管新生抑制因子の遺伝子発現のMAPKを介した調節をサリドマイドを含めて検討中である。70例のリンパ系腫瘍のMAPK活性、PKC、Aktキナーゼ、IP3を測定した(T Takahashi et al.Blood 92:376a,1998)。正常リンパ球と比較して、全例でMAPKは有意な高値であったがPKC、IP3の増加はなかった。Aktのリン酸化は78%の症例でみられた。腫瘍細胞に於けるアポトーシスと細胞周期の回転を制御するシグナル伝達系の異常を明確にすることが新たな治療法の確立には極めて重要である。DrosophilaのERK1/ERK2 mitogen-activated proteinkinase(MAPK)はアポトーシス誘導遺伝子であるhead involution defective(hid)発現を抑制することが明らかにされた(cell 95:331,1998)。我々は約100例の急性骨髄性白血病を解析し、アポトーシスを抑制して増殖を促進するサイトカイン(IL-3,SCF,flt-3Lなど)はMAPK活性を有意に増強することを示した。又、autonomousな増殖を示す症例はそれ以外の症例と比較してMAPK活性は有意な高値であった。更に、約100例のリンパ系腫瘍症例のMAPK活性を測定し、正常対象群と比較して全例で有意な高値を示す事を明らかにした。Aktのリン酸化は78%の症例で認められた。多発性骨髄腫では、治療抵抗性、骨破壊、高カルシウム血症と相関性を示した。リンパ系疾患のMAPK活性はwortmanninでは抑制されず、PKCあるいはチロシンキナーゼ・インヒビターで部分的に抑制された。最近MAPKはRskを活性化し、次いでBADのSer112をリン酸して生存を促進する事が示された。又、Bcl2のSer70をリン酸化して生存を促進する事も明らかにされた。リンパ系腫瘍では、種々のインテグリンの発現、血管新生促進は予後不良因子である事が示されてきた。インテグリンを介するシグナル伝達はMAPK活性を促進する事、MAPKは血管新生を促進する事が明らかにされてきている。急性骨髄性白血病、リンパ系腫瘍に於けるMAPKの標的遺伝子、蛋白を明らかにし、アポトーシス抑制、血管新生促進などの作用機構を更に明確にする。Src-PI3キナーゼとの対比、クロストークの有無の解明も目標とする。悪性腫瘍に対する新たな治療法の確立には,腫瘍細胞のアポトーシスと増殖を制御するシグナル伝達系の異常を明確にする事が重要である。ERK_1/ERK_2 mitogen-activated protein kinase(MAPK)はRskを活性化してBADやCREBをリン酸化すること,ヒストンH3に作用することなどにより細胞のアポトーシスを抑制し,転写を促進する可能性が示された。

しかし急性骨髄性白血病の増殖にMAPKの活性化は必要ないとの報告もある。我々は急性骨髄性白血病(AML)症例から得た細胞及びAML細胞株を用いて,種々の造血因子によるMAPK活性と増殖作用との関連性を検討した。G-CSF,IL-3は有意な正の相関性をもってMAPK活性と増殖を促進した。一方,SCF,flt-3Lは正の相関傾向を示したが有意ではなく,TNF-αは全く相関傾向を示さなかった。複数の造血因子による増殖の相乗作用にはMAPKはほとんど関与していなかった。現在MAPKとJNK/P38の両者のバランスを明らかにしている。MAPKは腫瘍細胞のautocrine増殖,血管新生,接着因子のシグナル伝達,matrix metalloproteinase産生に重要であることが明らかにされつつある。我々は種々の血液腫瘍細胞がangiopoietin-1やVEGFをはじめとする様々な血管新生促進因子遺伝子を発現し,蛋白を産生することを明らかにしている。どのような因子を産生するかは各血液疾患群で異なる。またサリドマイドはVEGFなどの血管新生因子産生を抑制した。MAPKが血管新生因子産生にどのように関与するかさらに検討中である。
年少者に対する多文化教育としての日本語・日本文化適応教育についての調査研究

本研究の目的は,現在日本の学校教育現場等で行われている外国人等の子どもたちへの日本語教育や日本文化適応教育について,広く日本人等の子どもも対象とした「多文化教育」の一つとして実践するための方法論の開発に資することである。本研究を続けてきた3年間,学校現場はもちろん地域社会においても,外国人等の子どもたちの受け入れを問題ととらえ何らかの対応を模索する動きが徐々に進展してきた。それにつれて,当該の子どもたちの深刻な状況も次第に明らかになってきていている。本研究では,大阪地域でのアクションリサーチを中心に,広島,群馬など十数の都府県の教育現場等を尋ね関連の情報を収集した。その結果,小学校に比べ中学校はより問題が深刻であること,子どもたちの中でも出身国によって状況の違いがあること,受け入れ対応のよし悪しは教師等の関係者個人の意識と行動力によっていてシステムとして確立していないことなどが,改めて明らかになった。また,これらの子どもたちが学校や地域社会で十全な発達と自己実現を果たしていくために,当該の子どもたちに対する基本的な教育では,子どものアイデンティティーに配慮しながら母語と日本語双方での「学習言語」の習得を目指す必要があると確信するに至った。さらに,そのためには,日本人等を含めすべての子どもたちに対する人権意識や多文化受容能力の向上が必要であるという思いは強まった。今後,それらのシステムの確立に向けて,さらに調査研究を続けたいと考える。日本語を第一言語としない年少者の受け入れを円滑に進めることは,それら当事者の十全な発達を保障するためにも,日本社会が現在直面していて,今後さらに求められる「多文化共生」を進めるためにも必要不可欠のことと認識している。本調査研究は,その方策を考えるために,それぞれの地域や個々の取り組み事例を収集し,分析することを主眼としている。今年度の調査研究では,大阪地域を中心に,先進的な取り組みを行っている地域を訪問し関係者から情報を収集することを続けてきた。それは,日々連携をとってともに実践活動を行っている大阪府池田市や豊中市の学校現場等だけでなく,大阪府在日外国人教育研究協議会事務局,大阪市在日外国人教育研究協議会,大阪府立学校在日外国人教育研究会(府立高校教員の研究会),大阪府八尾市在日外国人教育研究会,大阪市立中央図書館,大阪府羽曳野市高鷲南中学校などの訪問を行った。このような大阪大学近隣地域関係機関への情報収集とあわせて,日系ブラジル人の集住地域である広島県深安郡神辺町立神辺小学校や群馬県太田市立沢野小学校への訪問取材を行った。これらの情報収集で得られたものは少なくなかった。これらの情報についての分析はこれからのことではあるが,それぞれの機関の関係者のほとんどから得られ共通しているものがある。それは,いわゆる「学習言語」としての日本語の習得の難しさと,日本社会での子どもたちの学校への適応の難しさというものであった。これまでの情報集での感触の域を超えないが,子どもたちの第一言語での対応こそ求められてるとの感触をつかんだことは,言及しておきたい。今後,さらに調査研究を通して,このことを検証していきたいと考える。本調査研究は,外国から来た子どもたちを学校や地域社会がいかに受け入れたらよいかを考えることが目的である。また,受け入れには,外国から来た子どもたちに何をどう教えるかだけではなく,これらの子どもたちと日本人等の子どもとがともに学ぶための教育環境をいかに作っていくかが重要という立場を採り,これらを目指した学校や地域社会における「多文化教育」の実践事例等を収集分析し,そのあるべき方向を考えることを目標としている。初年度(平成10年度)の事例収集では,大阪府,広島県,群馬県,茨城県の学校や関係地域機関や個人から貴重な情報を集めることができた。今年度(平成11年度)は,文部省の「総合学習」の試行によるものも増え,大阪府内の取り組みに優れたものがあることも分かってきたため,主に大阪府内及びその近接地域の学校等で事例等の情報収集を続けた。これらの情報収集を通じて,小学校と中学校とではその対応に大きな違いがあることが改めて理解された。小学校に比べ中学校の取り組み事例が少なくかつ個人の教師まかせになっている場合が多いことなどである。

来年度(平成12年度)は,多文化教育の取り組みと進路問題の関係や高等学校での事例,一般校といわゆる「指定校」とで相違があるかどうかなど,これまでの調査研究であらたな課題となったことについての調査をするとともに,これまでの知見をまとめ何らかの形で公表したい。本科学研究費による調査研究の最終年度である本年度は,大阪地域でのメインのアクションリサーチを続けながら,近畿圏数地域および他地域数か所の状況について訪問調査等を行った。また,研究者や教育現場関係者,当事者等から情報収集を行った。これらを通じて,外国から来た子どもたちの多くが日本社会への十全な適応に苦慮しているという状況は,いぜんとして続いていることが分かった。むしろ,「不登校」や「問題行動」などの状況の把握が進むにつれ,その問題の深刻さが指摘されてきている。日本の教育現場における当該子どもたちへの日本語教育等は,かなりの進展があったと思われる。しかし,それらは,教師からの日本語での指示等が理解できるとか,子どもたち同士の意志疎通が何とかできるという域を超えるものではなく,各教科の学習で一定水準以上の成果が修められるというレベルから見ると,いまだ不十分でしかない。このような現状からいって,外国から来た子どもたちが自己のアイデンティティーを保ちながら,日本での学力伸張を図るためには,母語と日本語双方での「学習言語」の習得を目指す教育実践を進めながら,バイリンガル,バイカルチュラル(二言語,二文化)能力を養成する教育方法を確立することが必要ではないかと考えるに至った。また,これらの子どもたちの日本社会への適応は,ホスト社会である日本社会側の教育現場や子どもたちの多文化受容能力を向上させることと不可分であり,今後,併せてそのための教育プログラムの確立ための調査研究も行いたい。
B型肝炎ウイルスによるエピジェネティック修飾異常と肝発癌に関する検討

B型肝炎ウイルス(HBV)キャリアからの肝発がんにおけるHBVの遺伝子変異の関与を検討するため、千葉大学大学院腫瘍内科学教室に保管されているB型慢性肝炎、肝がん症例それぞれ20例ずつの血清からHBV genomeを抽出し、PCR-direct sequencing法によりHBV PreS領域、Xプロモーター領域の塩基配列を検討した。その結果、肝発がん例においてXプロモーター内のG1317A、T1341C/A/G変異とpreS2欠失変異が高頻度に認められ、肝発がんと関連していることが分かった。これらの変異の生物学的効果については野生型のXプロモーターにそれぞれの変異を人工的に導入し、肝がん培養細胞HepG2におけるプロモーター活性をルシフェラーゼアッセイを用いて検討した。その結果、変異を導入するとプロモーター活性が2-3倍に上昇することが分かり、HBV増殖と関連することが示唆された。次にDNAメチル化機序として最近注目されている分子としてポリコーム遺伝子群の主要メンバーであるEZH2蛋白について肝がん組織を用いて検討した。肝がん患者86例から得られた癌部および非癌部肝組織のパラフィン包埋切片に対して抗EZH2抗体を用いた免疫組織化学染色を行い、EZH2蛋白の発現状態を比較検討した結果、57症例(66.3%)において癌部におけるEZH2蛋白の高発現を認めた。またEZH2蛋白の高発現例ではがん再発のリスクが高いことが分かった。さらにリアルタイムRT-PCR法を用いた検討によりEZH2の高発現はmRNAレベルで発現が上昇していることが示された。HBVとEZH2発現調節との関連を検討するため、PCR法にて野生型HBV組み込みプラスミドからHBX遺伝子領域、PreS/S遺伝子領域を増幅し、クローニングを行った。
角膜創傷治癒機構におけるSPARCの作用機序について

家兎角膜でのSPARCの局在について免疫組織学的に検討した。正常家兎角膜では内皮細胞層にのみに認められたが、創傷角膜では損傷部の上皮細胞や角膜実質部に出現することが観察された。SPARCの角膜実質細胞によるコラーゲンゲル収縮に対する促進作用はTransforming growth factorβ(TGFβ)に対する抗体によって阻害された。TGFβも実質細胞によるコラーゲンゲル収縮を促進し、この作用はLatency Associated Peptide(LAP)によって阻害された。一方、SPARCにはLAPによるTGFβに対する抑制作用に拮抗し、培養上清中ではSPARCとLAPが結合して存在していることが認められた。これらの結果はSPARCが角膜創傷治癒に重要な役割を演じていることを示唆し、その機序にはTGFβとの相互作用が関与している可能性が示唆された。家兎角膜を摘出し,角膜実質コラーゲンをコラゲナーゼで溶解し,得られた実質細胞を継代培養した.角膜実質細胞をコラーゲンゲル内に包理し,ヒト血小板由来のSPARCを添加して培養し,実質細胞によるコラーゲンゲル収縮を計測した.その結果,角膜実質細胞によるコラーゲン収縮は,添加したSPARCの濃度に依存して促進することが認められた.また,プラスチック培養皿上に培養した角膜実質細胞の培養液中にSPARCを添加すると,細胞の収縮が生じ,細胞がプラスチック皿上から遊離することを観察した.倍溶液からSPARCを除去すること細胞は再接着することから,SPARCによるこの細胞の遊離作用は可逆的であることが明らかとなった.このような実質細胞によるコラーゲンゲル収縮作用や実質細胞自身の収縮に,細胞内骨格の1つであるαーsmooth muscle actin(αSMA)が関与しているのではないかという仮説の元に,角膜実質細胞のαSMA発現に対するSPARCの影響について免疫組織学的に検討した.SPARC無添加で培養した場合,約10%前後の細胞にαSMAの発現が認められた.一方,SPARC(10μg/ml)を添加して培養すると,約20-25%の細胞がαSMAを発現していることを認めた.さらにαSMA発現量をWestern Blot方を用いて検討すると,SPARC添加培養によって細胞数100,000個当たりのαSMA発現量は増加していることが認められた.現在,CompetitiveRT-PCR法を用いて,mRNAレベルでのαSMA発現にSPARCが影響しているかについて検討中である.角膜創傷治癒過程におけるSPARCの役割については,家兎角膜に切開創を加えて経時的にSPARCの局在について免疫組織学的に検討している.正常家兎角膜ではSPARCは内皮細胞層にのみ認められた.一方,創傷角膜では損傷直後から損傷部の上皮細胞や角膜実質部に出現することが観察された.家兎角膜より得られた実質細胞によるコラーゲンゲル収縮が角膜上皮細胞由来のSPARC(SecretedProtein Which Is Acidic And Rich In Cysteine)によって促進されることを報告した。SPARCによる角膜実質細胞のコラーゲンゲル収縮に対する促進作用の機序についてさらに検討を加えた。角膜実質細胞のコラーゲンゲル収縮に対するSPARCの作用はサイトカインのl種であるTransforming growthfactorβ(TGFβ)に対する抗体によって阻害された。また,TGFβはSPARCと同様に角膜実質細胞によるコラーゲンゲル収縮を促進し、この作用はTGFβの関連ペプチドであるLatency Associated Peptide(LAP)によって阻害された。一方、SPARCを同時に添加すると、LAPによるTGFβに対する抑制作用が消失することを認めた。さらに、培養上清中ではSPARCとLAPが結合して存在していることが認められた。また、角膜上皮細胞によるSPARC産生の調節機構を培養上皮細胞をもちいて検討したところ、上皮細胞のSAPRC産生はEGF(Epidermal Growth Factor)によって抑制され、TGFβによって促進されることが認められた。これらの結果は角膜においてSPARCとTGFβは上皮細胞や実質細胞を解して相互に影響しあって各々の作用を調製する因子として作用している可能性が示唆された。

一方、SPARCにはLAPによるTGFβに対する抑制作用に拮抗し、培養上清中ではSPARCとLAPが結合して存在していることが認められた。これらの結果はSPARCが角膜創傷治癒に重要な役割を演じていることを示唆し、その機序にはTGFβとの相互作用が関与している可能性が示唆された。
アパタイトスパッタ膜の新規アニール処理による高生体活性付与

今年度は擬似生体環境下における水酸アパタイト(HAp)表面への骨類似アパタイト層の形成過程を水晶振動子マイクロバランス(QCM)法によるその場質量変化分析法を用いて検討することを最大の目的とした。研究課題との関連は、人工材料の高生体活性を評価するための一手法として、人の体液の無機イオン濃度に等しく調整された擬似体液下での材料表面への骨類似アパタイト層の形成に伴う重量変化をQCM法により追跡することにある。なお、ここでの高生体活性とは材料表面に早期に骨類似アパタイト層を形成することを意味する。QCM法とは圧電性を有する水晶の共振周波数変化を利用した微小重量測定法である。本研究では共振周波数6MHz、ATカットの水晶振動子を用いたため、1Hzの周波数の減少は12.3ngの堆積重量の増加に相当する。HAp薄膜試料は水晶振動子上に高周波マグネトロンスパッタ法と新規な低温アニール法を併用することで作製した。得られた試料は擬似体液(36°C,pH7.4)を含むQCMセルに配置し、その共振周波数の経時変化を周波数カウンターにて追跡した。HApがコートされていない水晶振動子単独では共振周波数の経時変化が観測されないのに対し、HApを被覆した試料においては浸漬時間の経過と共に周波数が顕著に減少していることが確認された。この周波数の減少は、HAp試料表面上への堆積物の重量増加を反映したものであると考えられる。その堆積物はX線回折パターンと赤外吸収スペクトルの結果から骨類似アパタイトであることを確認している。QCM法を用いることにより擬似体液浸漬におけるアパタイト結晶成長に対し、その重量変化をin situにてモニタリング可能であることを確認した。QCM法は連続的なin situ重量変化が測定可能であることから、初期段階におけるアパタイト結晶成長機構の解明に応用できるものと考えられる。本研究では、生体活性な多結晶ヒドロキシアパタイト膜をアモルファスリン酸カルシウム膜から新規な低温アニール処理を経て得ることに成功した。通常のアニール法では、アモルファスリン酸カルシウム膜の結晶化には大気圧雰囲気下において600°C以上の高温処理を必要とする。しかしながら、生体インプラント材として臨床現場で多様されているチタン金属を基材に用いた場合、通常の高温アニール法では金属の酸化という問題がおこる。そこで、従来のアニール法とは異なる新規な低温アニールプロセスを確立する必要がある。まず、高周波マグネトロンスパッタリング法によりチタン金属表面に厚さ5μm程度のアモルファスリン酸カルシウム薄膜を作製した。ついで、オートクレープ装置内にアモルファス試料と蒸留水を含む試験管をセットし、所定の温度と時間で高圧水蒸気雰囲気にてアニール処理を施した。X線回折装置にて膜の結晶化を追跡した結果、たかだか140°Cという低温においてヒドロキシアパタイトに結晶化していることが明らかとなった。既往の報告によれば、結晶化温度には最低でも600°Cを要することから本水熱アニール法がアモルファス膜の結晶化に有効な手法であることが示唆される。また、通常の高温アニール法では多結晶アパタイト膜内の水酸イオンの欠損が著しいのに対し、本法では高圧水蒸気雰囲気での処理のため膜内に水酸イオンが含まれることがFT-IRの結果から明らかとなった。本低温アニール法は成膜法がスパッタ法に限らずアモルファスリン酸カルシウム膜を結晶化させるのに適用可能と考える。
口腔癌の転移抑制を目指したMMPインヒビター療法開発のための基礎的研究

本年度申請者らは、昨年度の研究結果を踏まえ、MMP・COX-2発現の調節機構を利用した口腔癌の浸潤・転移抑制を目指し以下の検討を行った。昨年度の定量PCRの検討結果、舌癌由来のHSC-3(高転移性細胞株)において、COX-2とMMP-9 mRNAの相関関係が示唆され、舌癌由来のHSC-4(低転移性細胞株)ではMMP-2 mRNAが高発現であった。以上を踏まえ、舌癌由来のHSC-3とHSC-4を用いて、COX-2インヒビターによるMMP発現調節の検討を行った。COX-2インヒビターはインドメタシン、セレコキシブ、デキサメタゾンを用いて検討を行った。HSC-3とHSC-4において上記薬剤を培養上清中に添加し、細胞よりRNAを回収した後COX-2 mRNAの発現を検討したところ、デキサメタゾンで発現が抑制された。MMP-2 mRNAの発現について検討したところ、HSC-3にインドメタシン、セレコキシブ、デキサメタゾン4時間添加で発現が抑制された。HSC-4では、発現に変化は認められなかった。MMP-9 mRNAの発現については、HSC-3にセレコキシブ、デキサメタゾン4時間添加で発現が抑制された。ELISA法ならびにWestern blot法でMMP-2ならびにMMP-9のタンパク産生を検討したところ、mRNAと同様の結果が得られ、タンパク産生も抑制していることが分かった。以上の検討結果により、高転移性舌癌細胞株であるHSC-3において、MMP-2、MMP-9の発現にCOX-2の発現が一部関与していることが示唆された。MMP-2、MMP-9は癌の浸潤・転移に重要であることが知られており、口腔癌組織におけるCOX-2の発現について今後検討をすすめることにより、口腔癌の浸潤・転移のマーカーとなりうることが考えられた。本年度申請者らは、MMP・COX-2発現の調節機構を利用した口腔癌の浸潤・転移抑制を目指し以下の検討を行った。ヒト口腔癌由来細胞株として舌癌由来のHSC-3(高転移性細胞株)、HSC-4(低転移性細胞株)、歯肉癌由来のCa9-22、また、口腔以外で高頻度に頚部リンパ節転移をきたす代表的な頭頚部腫瘍としてヒト甲状腺癌由来細胞株の8505Cを用いて比較検討を行った。各種癌細胞を培養ディッシュ上で培養を行い、細胞よりRNAを回収し、MMLVを逆転写酵素として一本鎖cDNAを合成した。同cDNAを試料として、Light Cyclerを用いた定量PCRにより、COX-2 mRNA発現量ならびにMMP-1、2、9 mRNA発現量を測定した。その結果、COX-2 mRNAの発現量は、HSC-3において最も高発現を認めたが、同じ舌癌由来細胞株であるHSC-4においては、Ca9-22および8505Cより発現量が小さいことが明らかとなった。この傾向はMMP-9 mRNAの発現量においても認められ、COX-2ならびにMMP-9の発現が舌癌の転移において重要な役割を果している可能性が示唆された。また、甲状腺癌由来細胞株8505CにおいてMMP-1、MMP-2の発現量が舌癌や歯肉癌由来細胞株より高いことが明らかとなった。甲状腺癌はリンパ節転移巣において浸潤増殖能が低く、口腔癌に比較して予後良好であることが知られているが、MMP-1、MMP-2の発現が転移巣における癌の浸潤機構に関与していることも示唆された。以上の結果をふまえ、今後、上記遺伝子のinhibitorを用いた腫瘍細胞の浸潤ならびに転移の抑制を検討する予定である。さらに、上記遺伝子を用いた転移や転移後の予後を予測しうるマーカーの特定も今後の検討課題としてあがった。

以上の検討結果により、高転移性舌癌細胞株であるHSC-3において、MMP-2、MMP-9の発現にCOX-2の発現が一部関与していることが示唆された。MMP-2、MMP-9は癌の浸潤・転移に重要であることが知られており、口腔癌組織におけるCOX-2の発現について今後検討をすすめることにより、口腔癌の浸潤・転移のマーカーとなりうることが考えられた。
HIV由来のNefと結合する細胞性蛋白質の同定とそのAIDS発症における意義の解析

TryptaseTL_2の6個のアイソマ-のうち、5個のcDNAクロンを得た。そのうち27Kdのもの2個、及、32Kdのもの1個を用い、GSTフィユ-ジョン蛋白を大腸菌にて発現させグルタチオンビーズにて精製した。また2つの株のHIV-1Nef蛋白を大腸菌にて発現させた。各々のTryptaseTL_2のアイソマ-GSTフィユ-ジョン蛋白を結合させたグルタチオンビーズと、各々2つの株のHIV-1Nef蛋白を発現させた大腸菌ライセ-トと反応させ、結合させたものをSDS-PAGEにて展開し、Western Blotを行ないanti-Nef抗体で検出を試みたが、検出できず、大腸菌で作成した3個のTryptaseTL_2のアイソマ-GSTフィユ-ジョン蛋白は大腸菌で作成したHIV-1Nef蛋白と結合しないことが判明した。次に、Cos7細胞で大量発現させたTryptaseTL_2、27Kdのもの2個、及、32Kdのもの1個のライセ-トをHIV-1NefとGSTフィユ-ジョン蛋白を結合させたグルタチオンビーズと反応させ、結合させたものをSDS-PAGEにて展開し、Western Blotを行いanti-tryptase抗体で検出を試みたが、検出できなかった。由に他のTryptaseTL_2アイソマ-との、HIV-1Nef蛋白の結合が、想定される。或は、これらのアイソマ-が複合体としてHIV-1Nefと結合することが推定される。現在までに、HIV-1NefとSrc familyのHckがHckのSH3domainとNefのプロリンリピートP-x-x-Pモチーフで結合すること、HIVの増殖にプロリンリピートP-x-x-Pモチーフが、重要な機能を果たしていることが明らかになっている。このNefのプロリンリピートP-x-x-Pモチーフのプロリンをアラニンに置換すると、T cellから精製したnative TryptaseTL_2との結合も阻害されることを新たに示した。
色素材料の耐光性に関する基礎的・総合的研究

各研究班によって次のような成果が得られた。1.色素光退色の光化学的研究(飛田、徳丸、北尾):高分子基質の構造を取り入れた色素の光退色、多環状化合物の光反応、一重項酸素のはたらきについて明らかにした。2.色素光退色の物理有機化学的研究(城田、正泉寺):顔料を分散したポリマー薄膜の光電変換、基本的なヒドロキシアゾ色素の光酸化機構を明らかにした。3.色素光退色の界面化学的研究(荻野、須沢):界面活性剤と油溶性染料との相互作用、高分子ラテックスと繊維との相互作用の機構を明らかにした。4.色素光退色における基質効果に関する研究(平嶋、古賀):各種染色物の耐光性に及ぼす基質効果を明らかにした。5.色素光退色における固着・染着状態の効果に関する研究(渋沢、滝沢、安藤、片山):イオン性染料、非イオン性染料の各種基質上の固着性と光退色、側鎖に色素を持つポリアミノ酸からなる薄膜の光に対する応答、反応性染料の絹への固着と耐光性、金属鎖塩化した植物色素の耐光性などについて明らかにした。6.色素光退色における共存物質の効果に関する研究(森田、駒城、木村):反応染料/セルロース系の異常退色、含銅反応染料の光退色に及ぼす汗とくにアミノ酸成分の影響、天然色素の耐光性に及ぼす添加物効果を明らかにした。7.表示材料色素・画像形成色素の光安定性に関する研究(内田):大環状化合物金属錯体の光電特性を明らかにした。8.色彩の計測評価に関する研究(寺主、村田):色素の耐光性評価の際の諸問題を明らかにして、評価の標準色濃度測定法、短時間の露光結果から長時間露光後の色彩変動を推定する方法を提案。1.合成繊維基貭中のクリスタルバイオレットの光退色を,染料をとりまく環境の多様性を考慮し,アセトニトリル中のアントラキノンスルホン酸の光反応を水分の効果を考慮して,光化学的に解析した.2.可視・紫外・レーザー光による色素の退色,アゾベンゼン系色素の銅錯体の有桟溶媒中の退色桟構,またペリレン系顔料を分散したポリ(Nービニルカルバゾール)の光電変換を調べ物理化学的に解析した.3.染料モデル物貭の水溶液中からの活性剤の収着,アニオン/非イオン界面活性剤混合水溶液の色素の退色を界面化学的に明らかにした.4.ナイロン6・酸性染料系の光退色に及ぼす温度効果,羊毛・ロイコナフタザリン系の酸化反応,血清アルブミン・酸性染料系の耐光性を調べて,色素光退色に及ぼす基貭効果として総括した.5.染料を側鎖に結合したポリグルタミン酸共重合体の光特性,反応染料の絹上の固着状態と耐光性を調べて,色素光退色に及ぼす色素の固着・染着状態の効果を議論した.6.フタロシアニン系青色染料とアミノピラゾリン系黄色アゾ染料の混合染色セルロース上の異常光退色,反応染料・セルロース系の光退色におけるヒスチジンの効果を調べて,色素光退色に及ぼす共存物貭効果を明らかにした.7.天然色素・絹染色系の光退色におけるアルミニウムその他各種金属塩の効果を調べて,色素光退色における金属イオンの効果を明らかにした.8.耐光性色素材料として,平面大環状の新規化合物を設計合成し,その構造を解明した.9.ブルースケールの光退色を変退色の計測評価値で定量的にとらえ,耐光性評価規準を確立した.10.これらを総括して,展開を計画した.1.色素光退色の光化学的研究:色素の光退色における温湿度効果(飛田)