hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
パッチクランプ法を併用した有毛細胞イオンチャンネルの遺伝子解析

外有毛細胞において新しい電位依存性カリウムチャンネルがパイロット実験により予想されたために、これにかなりの時間を費やした。しかしながら、測定条件などがうまく合わず、成果を期間内にえることができなかった。研究費を無駄に使うことを避けるために、有毛細胞からの神経信号を受け取るラセン神経節細胞を実験材料に用いた。ラセン神経節細胞も聴覚では情報伝達にかかわる中心的な役割をはたしている。このため今回の研究の主目的である蝸牛内での神経伝達に関わる細胞の膜イオンチャンネルの特性を解析することと同義である。本年度の実験の成果は、ラセン神経節細胞の電位依存性イオンチャンネルの電気的特性を明らかにしたことである。ナトリウムチャンネルの活性化される膜電位かなり過分極側に位置している。それにも関わらず不活性化される膜電位は他の神経細胞と同様であった。また、過分極側で活性化される内向き整流カリウムチャンネルがあることもわかった。研究代表者は以前電依存性カルシウムチャンネルを報告している。これらの結果をあわせると、聴神経の発火には以下の様にイオンチャンネルが働いていることがわかる。ナトリウムチャンネルが過分極側で容易に活性化され、細胞が発火すると電位依存性カルシウムチャンネルが活性化される。これにともないカルシウム依存性カリウムチャンネルが働き、膜電位を過分極させる。すると内向き整流カリウムチャンネルが開き、細胞膜を静止状態にすばやく引き戻す。聴神経は音である周波数情報を伝えるために、すばやい応答が必要とされている。今回の実験の結果は理にかなっている。これら電位依存性イオンチャンネルの電気的特性は他の組織で報告されている同様のチャンネルとは同一ではない。このことから、チャンネルを形成するsubunitの構成が異なっていることが示唆された。本年度は、神経伝達物質を用いた実験を行った。外有毛細抱の神経伝達物質を用いた実験は、研究代表者を含めすでにいくつかの報告がなされている。このために材料には有毛細胞からの神経信号を受け取るラセン神経節細胞をもちいた。ラセン神経節細胞も聴覚の感覚器の中では神経伝達にかかわる中心的な役割りをはたしており、蝸牛内の部位によりそれぞれ特徴周波数が決まっている。このため今回の研究の目的とした蝸牛内での膜イオンチャンネルのそれぞれの部位での遺伝子構造を解明することと同義である。今年の実験の結果はラセン神経節細胞が抑制性神経伝達物質であるGABAに応答することを明らかにしたことである。しかも、GABAは蝸牛求心性神経に直接シナプスを作っている遠心性神経から放出される。このことは蝸牛からの神経信号が受容器細胞の後シナプス側で制御をうけている可能性を強く示唆する結果である。今までに外有毛細胞を介した中枢からの信号の制御は多数の報告がなされているが、求心性神経に対する制御は全く報告が認められていない。この点でこの研究結果は大きな意義をもつ。しかも、ラセン神経節細胞によってはGABA応答を有するもの、有さないもの、大きさにも差があり、これが蝸牛内の部位差による可能性が推測された。しかも、GABA受容体も薬理学的実験からγsubunitを含んでいることが示唆された。
日本人クロ-ン病のバイオマーカーの確立

phagedisplay法により日本人クローン病(CD)患者に有用な抗原ペプチド(TCP353)を確立した。TCP353は既存の抗原とは相同性を認めず、TCP353で末梢血単核球を刺激するとCD単核球での炎症性サイトカインであるtumornecrosisfactor-α,interleukin-1,interleukin-6の産生亢進がみられ、対応抗原がCDの病態に関与することが示唆された。TCP353に対する抗体はCDに対する特異度90%、感度61.7%であり、有用なバイオマーカーとなることが示唆された。欧米人クローン病の疾患特異的バイオマーカーの日本人クローン病患者における感度・特異度は満足できるものではなく、日本人クローン病特有のマーカーの確立が望まれている。我々は、ファージディスプレイ法により、抗TCPペプチド抗体がその候補となり得ることを見出した。さらに、TCPペプチドの相同性検索では、米由来タンパク(RCCP : rice chloride channel protein)との相同性が極めて高いことを明らかにした。本年度は、TCPペプチドの対応抗原を決定することを目的として検討を行った。RCCPのcDNAを人工合成遺伝子として作製し、カイコ発現ウィルス作製用ベクターに組み込んでカイコ発現ウィルスを作製し、カイコによりRCCPを発現させた。つぎに、得られたRCCPを精製し、抗TCPペプチド抗体(ウサギポリクローナル抗体、患者由来抗体)との反応性をウェスタンブロット解析により確認した。その結果、微量ながらTCP353ペプチド抗体と反応するバンドが90kDa付近に見出した。ペプチド添加による阻害実験での特異性の確認はまだ実施していない。一方、発現させたRCCPのC末端にHisタグをつけたHisタグ抗体によるウェスタンブロットでも発現を確認したが、この場合には100kDa付近に弱いシグナルが認められ、TCP353ペプチド抗体と反応するシグナルとは異なっていた。これらの結果より、現時点ではRCCPとTCP353ペプチド抗体との反応については疑わしい状態である。今後、RCCPの精製(Hisタグを利用した部分精製)をさらに進め、RCCP抗体を測定するELISAを作製し、クローン病を含めた各種疾患患者血清にてRCCP抗体の抗体価を測定し、クローン病での特異性・感度を検討するとともに、腸炎モデルマウスを用いた動物実験により、RCCPのクローン病の病因・病態への関与を検討する予定である。欧米人クローン病の疾患特異的バイオマーカーの日本人クローン病患者における感度・特異度は満足できるものではなく、日本人クローン病特有のマーカーの確立が必要である。我々は、大腸癌cDNAを用いて作製したT7ファージディスプレイライブラリーを、クローン病患者血清中のIgGを用いてスクリーニングを行ない、クローン病患者血清と特異的かつ高率に結合するファージを選別し、さらに発現ペプチドのアミノ酸配列を決定した(TCPペプチド)。さらに、クローン病患者の単核球を合成TCPペプチドで刺激すると炎症性サイトカイン産生が促進することから、本ペプチドの関連抗原がクローン病の病態に深く関与している可能性があることを見い出し、TCPペプチドの相同性検索で得られた抗原のなかでもOryza sativa (rice chloride channel protein:RCCP)とのアミノ酸配列の相同性が最も高かったため、RCCPがTCPペプチドの対応抗原である可能性を検討した。まずRCCPのcDNAを人工合成遺伝子として作製し、カイコ発現ウィルス作製用ベクターに組み込んでカイコ発現ウィルスを作製し、カイコによりRCCPを発現させた。その結果、90kDa付近にTCP353ペプチド抗体と反応するバンドを微量ながら見出した。さらに、ペプチド添加による阻害実験による特異性の確認を実施する必要がある。一方、発現させたRCCPのC末端にHisタグをつけたHisタグ抗体によるウェスタンブロットでも発現を確認したが、この実験では100kDa付近に弱いシグナルが認められ、TCP353ペプチド抗体と反応するシグナルとは異なっていた。これらの結果から、RCCPとTCP353ペプチド抗体との反応についてはさらなる検討が必要である。現在、RCCPの精製(Hisタグを利用した部分精製)をさらに進め、RCCP抗体を測定するELISAを作製し、クローン病を含めた各種疾患患者血清にてRCCP抗体の抗体価を測定し、クローン病での特異性・感度を検討中である。さらに、腸炎モデルマウスを用いた動物実験により、RCCPのクローン病の病因・病態への関与を検討する予定である。RCCPの作製に多少時間を要したが、それ以外は概ね順調に経過している。24年度が最終年度であるため、記入しない。RCCPのクローン病の病因・病態への関与を検討するために、RCCPならびにRCCP抗体を用いた実験を予定している。
乾燥及び温度ストレスに対する植物の時空間的応答と記憶の分子機構

平成29年度は以下の4つの研究を進めた。1)サブクラスI SnRK2キナーゼの上流因子の探索:水分欠乏ストレスによって活性化するサブクラスI SnRK2キナーゼは、mRNAの脱キャップ複合体の構成因子をリン酸化することで、ストレス下において不要なmRNAの分解を促進する。このSnRK2キナーゼの上流因子の候補として、数種のタンパク質キナーゼが同定された。2)転写因子DREB2Aの活性化機構の解明:乾燥及び高温ストレスによる遺伝子発現を活性化する転写因子DREB2Aは、通常条件下では速やかに分解される。DREB2Aの中央部の短いアミノ酸配列(NRD)を除くと、安定な活性型(DREB2A CA)に変換される。このNRDはタンパク質の分解系であるBPM-CUL3 E3リガーゼが認識して結合する配列であり、その結合によりDREB2Aの分解機構が働くことを明らかにした。3)低温誘導性遺伝子発現制御機構の解明:季節変化などに起こる緩やかな温度低下と異常気象時や夜間に起こる急激な温度低下を、植物は別々の機構で感知して耐性機構を制御していることを明らかにした。急激な温度低下時にはCAMTAが転写因子として機能しており、緩やかな温度低下では時計関連因子が働いて低温応答のマスタースイッチであるDREB1遺伝子の発現を誘導していることを示した。4)高温ストレス活性型レトロトランスポゾンONSENの転写制御:シロイヌナズナのエコタイプKyotoではONSENの発現量が高い。KyotoではCol-0と比較し、エピジェネティックに抑制されている因子の発現が上昇していた。また、クロマチン構造解析の結果、熱ストレスによってセントロメアヘテロクロマチンの脱凝縮が観察された。ヒストン修飾解析の結果、Kyotoでは、ヒストン修飾がゲノム全体でみられ、トランスポゾン配列では特に顕著であった。1)サブクラスI SnRK2キナーゼの上流因子の探索:水分欠乏ストレスによって活性化するサブクラスI SnRK2キナーゼの上流因子の同定を目指した相互作用因子の探索では、極めて有望な候補因子として、数種のタンパク質キナーゼとホスファターゼが同定されている。今後の解析により、サブクラスI SnRK2キナーゼの水分欠乏ストレスによる活性化機構が解明されると期待できる。2)転写因子DREB2Aの活性化機構の解明:DREB2A CAがなぜ活性型に変換するのか、その分子機構は10年以上も不明であったが、NRDはタンパク質の分解系であるBPM-CUL3 E3リガーゼが認識して結合する配列であり、その結合によりDREB2Aの分解機構が働くことを解明した。この研究成果を論文としてまとめ、米国アカデミー紀要(PNAS)に投稿し受理されるなど、研究は当初の計画以上に進展し画期的研究成果を得た。3)低温誘導性遺伝子発現制御機構の解明:季節変化などに起こる緩やかな温度低下には時計関連遺伝子が転写因子として働き、異常気象時や夜間などに起こる急激な温度低下時にはカルシウムが関わる転写因子であるCAMTAが機能してことを解明した。これらの研究成果をまとめた論文は、植物関連の著名な国際雑誌であるPlant Cellに受理されるなど画期的成果を得た。4)高温ストレス活性型レトロトランスポゾンONSENの転写制御因子の同定:シロイヌナズナのエコタイであるプKyotoではONSENの発現量が顕著に高い。種々のゲノム解析法で、KyotoとCol-0を比較し、ヒストン修飾に違いがあることを明らかにするなど、今後に繋がる成果を得た。1)サブクラスI SnRK2キナーゼの上流因子の探索:シロイヌナズナの水分欠乏ストレスの初期にABAを介さずに活性化するサブクスI SnRK2キナーゼの上流で働くと考えられる相互作用因子として、数種のタンパク質キナーゼが同定されている。これらの因子の機能を解析することで、サブクスI SnRK2キナーゼの活性化の分子機構の解明を図る。2)転写因子DREB2Aの活性化機構の解明:リン酸化などのDREB2Aタンパク質の修飾機構を解析することにより、高温と乾燥の両方のストレスに応答したDREB2Aの安定化や活性化の分子機構を解明する。3)低温誘導性遺伝子発現制御機構の解明:低温ストレスによる遺伝子発現機構で働く転写因子CAMTAの解析では、CAMTAの相互作用因子などを同定することでカルシウムとCAMTAの活性化との関係を解明する。時計関連因子としてCCA1やLHY以外の転写因子を探索することで、緩やかな温度低下に応答する遺伝子発現機構を解明する。4)高温ストレス活性型レトロトランスポゾンONSENの転写制御因子の同定:シロイヌナズナのエコタイプKyotoで高温ストレス応答性遺伝子の発現が上昇する原因因子を遺伝学的な手法を用いて同定し、KyotoにおけるONSENの発現量の増加の機構を解明する。本研究では乾燥や温度ストレスに対する植物の局所的応答の分子機構を解明するとともに、ストレスの長距離シグナル伝達因子が維管束を介して植物全体に情報を伝達する機構を解明したり、ストレスに対する植物の長期的な記憶の機構を明らかにしたりすることで、植物の持つ自立分散型環境応答統御システムの全体像を理解することを目的としている。本年度は温度ストレスに対する植物の局所的応答の分子機構の解明を目指し、高温ストレス応答に必須の因子である転写因子HsfA1の活性化の機構を詳細に解析し、高温ストレス誘導性遺伝子発現には複雑な制御ネットワークが関与していることを示した。

一方、高温ストレスが組織間で伝達されるか調べるため、地上部と地下部を異なる温度で処理する実験を行い、高温ストレスの情報が伝達されている可能性を示した。また、組織間の高温シグナル伝達に関わる可能性のある因子としてペプチドに着目し、in silico解析及び質量分析計による解析から候補となるペプチドを選抜した。乾燥ストレス時の植物の成長制御機構を明らかにするために、種々の土壌水分条件下でイネの幼苗を生育させ、生理学的特性や代謝産物、遺伝子発現を網羅的に調べた。茎頂において多くの遺伝子の発現抑制が観察され、乾燥時の成長抑制に直接的に関わっていると考えられた。高温ストレス活性型レトロトランスポゾンONSENの転写制御因子を同定するために、ONSENのプロモーターにGFPを繋いだコンストラクトをシロイヌナズナに導入し、形質転換植物を作成した。形質転換植物における高温ストレス応答を確認したのち、変異原(EMS)処理を行い、変異集団を作成した。変異集団の中からGFPシグナルを指標に導入遺伝子が高発現する変異体を単離した。単離した変異体では、内在性のONSENも高く発現していることが明らかになった。転写因子HsfA1のドメイン解析と相互作用因子解析から、Temperature-dependent repression (TDR)domainと名付けた領域が、HSP70との相互作用を介してHsfA1の活性を負に制御することを見出した。この領域を欠失した活性型HsfA1の過剰発現体は極めて高い高温ストレス耐性を示した。現在はこの領域の機能を明らかにするため、質量分析系を用いてリン酸化等の修飾部位を解析している。地上部を37度で高温ストレス処理しつつ地下部を22度に保った場合、地上部だけでなく地下部においても高温ストレス誘導性遺伝子の発現上昇が見られた。また、組織間の高温シグナル伝達に関わる可能性のある因子としてペプチドに着目し、in silico解析及び質量分析計による解析から候補となるペプチドを選抜し、これらのペプチドをコードする遺伝子について過剰発現体の作出を行っている。乾燥ストレス時の植物の成長制御機構に関する研究において、光合成活性は影響されないようなマイルドな乾燥ストレス下においても、既に葉が展開しない等の顕著な生育の遅れが生じることが示された。また、葉の生育の遅れに伴い茎頂及びその周辺を含む基部において、多数の細胞分裂関連遺伝子の発現量の減少が認められた。茎頂におけるこれらの遺伝子の発現抑制が乾燥時の成長抑制に直接的に関わっていると考えられた。これらの遺伝子の発現抑制機構に関して組換え植物を用いて解析している。GFPを指標とした変異体の同定はスクリーニングを行い、次世代シーケンサーを用いたマッピングを行うことで,現在単離した変異体の原因遺伝子の同定に取り組んでいる。また、単離した変異体では高温ストレスによる内在性のONSENの発現が上昇することから、転移の可能性も視野にいれ、世代を超えたONSENの転移の解析を行う準備をしている。平成28年度は以下の4つの研究を進めた。
シスタチンCが腎臓や種々の臓器に及ぼす影響の検討

腎不全で蓄積するクレアチニンよりも、シスタチンCの方が動脈硬化性疾患のリスクにより相関するということがわかっている。そこで、この腎不全で蓄積する物質シスタチンCが、腎障害時にどのような作用をもたらすかを検討している。虚血再潅流のin vitroの系として、マウス尿細管上皮細胞を培養し、レコンビナントのシスタチンCを添加あり、なしの条件下で、低酸素・再酸素化(1%酸素で48時間、その後再酸素化8時間)を行った。その培養液を回収し、LDHアッセイを行ったところ、シスタチンCを添加したほうが細胞傷害性が強いことが当初示唆された。ただ測定方法を変更し、最大障害を示す対照をおいてLDHアッセイを行うと、逆にシスタチンCを添加した方が、細胞傷害性が軽度である傾向が示唆された。そのため、現在、シスタチンCが低酸素・再酸素化の条件において、尿細管上皮細胞に対して細胞傷害性を有するか否かは決着していない。そこで、今後は尿細管上皮細胞を対象とするのではなく、内皮細胞を対象とした場合に、シスタチンCが影響を及ぼすか否かを、検討したいと考えている。腎機能が低下すると、弾力のあるしなやか血管が傷害され、最終的には石灰化が著名となり血管拡張の機能が低下してくる。ただ石灰化に到達しなくてもそれ以前の段階で、尿毒症物質により血管拡張性が傷害されるかを否か検討することを目的として、シスタチンCが血管拡張に及ぼす影響を検討した。野生型のマウスの大動脈を採取し、血管拡張物質を添加して血管拡張度合を検討した。その際にシスタチンCを添加することで、これらの血管拡張物質の効果が減弱するかどうかを検討し始めている。シスタチンCは腎機能が低下すると血液中など体液中に蓄積する物質であり、腎臓の糸球体濾過量(GFR)の推測に用いられている。しかし、腎不全で蓄積する物質シスタチンCが生体にどのような影響を与えるかについてはほとんど検討されていない。明らかにわかっていることは、クレアチニンよりもはるかにシスタチンCの方が、動脈硬化性疾患のリスクにより相関するということがわかっている。そこでまず、シスタチンCは分泌蛋白であるが、腎不全で血液中に増加するシスタチンCが細胞内に移行するのかを検討した。方法としては、シスタチンCをKOしたマウス由来のsplenocyteを用いて、通常のWTの血清(シスタチンCを含有する)を添加して培養し、そのsplenocyteから蛋白を抽出し、シスタチンCに対する抗体でWestern blotを行った結果、シスタチンCが検出された。非癌細胞においてこのように、シスタチンCが実際に取り込まれることが確認された。次に、シスタチンCはシステインプロテアーゼ阻害作用などの生理活性を持つため、取り込まれた細胞においてどのような機能をもつのかが重要となる。癌細胞ではシスタチンCがカテプシンなどの酵素を阻害することが既に報告されているが、非癌細胞においてどのような効果を持つかを検討している。今回、尿細管上皮細胞を培養し、その細胞を低酸素、再酸素化の刺激を加えた際に、培養液中に添加したシスタチンCがどのような効果をもつか、細胞傷害アッセイで検討している。その結果、シスタチンCが低酸素、再酸素刺激において細胞保護効果を持つ可能性が示唆されつつある。シスタチンC KOマウスを用いて種々の腎障害を起こすという検討をいろいろ行ってきたが、nをふやすにつれて、結果にばらつきが出て安定した結果が得にくくなった。そこで、コントロールとやWTとの遺伝背景をより揃えるため、バッククロスをさらに行っており、vivoにおける腎傷害刺激などにおける影響を検討するにはもう少し時間がかかる。

培養尿細管上皮細胞において低酸素、再酸素化の刺激を加えたin vitroの系において、培養液中に添加したレコンビナントのシスタチンCが細胞保護効果を持つ可能性が示唆されつつある。これまでの報告ではマクロファージにおいてシスタチンCがNF-kBなどの発現に影響を及ぼすことが報告されているので、培養尿細管上皮細胞においても、蛋白やRNAなどを回収し、種々のシグナルの変化を調べ、シスタチンCが細胞内シグナル伝達に及ぼす影響を調べていく。また尿細管上皮細胞以外にも内皮細胞でのin vitroの系において、同様に細胞保護効果があるのか、またその際の細胞内シグナル伝達についても検討したい。
カルシウム感受性のあるミオシン分子のモータードメインの機能的発現の試み

本研究はCa^<2+>結合性があるフィザルム・ミオシン重鎖の「モータードメイン」(「制御ドメイン」を含む)を組換体発現蛋白質として得て、軽鎖を組込ませS1を再構成しようとするものである。1)「制御ドメイン」はCa^<2+>結合性を有する(但し、Ca^<2+>の作用は逆である)ホタテ貝ミオシンの成功例にならい、私どもは大腸菌で発現させることに成功した。軽鎖を組込んだ上で結晶化を試み、重原子置換→X線回折により高分解能で立体構造を決定できる途が開く。結晶化はCa^<2+>存在下で行なわれるので、ホタテ貝では「on」の状態で結晶化されている。フィザルムでは「off」の情報を与えることになり、必須軽鎖のGly117近傍の変化に注目する。2)「モータードメイン」をメチロトローフ酵母の系を用い分泌蛋白として大量に得る。軽鎖を組込んだ上、Motility assayにより機能を検定する。特に、ホタテ貝ミオシン軽鎖とのhybridによるCa^<2+>の作用の変化を検出する点に重点をおく。本研究はこの様な内容を実施するものであるが、本年度の成果を以下に示す。A.フィザルム・ミオシンの「制御ドメイン」をコードするcDNAクローニング1)フィザルム変形体より精製したミオシンの重鎖をトリプシンにより限定分解した。70/60K、28K、17Kの各々のドメインよりアミノ酸部分配列を決定した。次に、粘菌フィザルムよりのmRNAを得て、このfirst strand cDNAを鋳型に、部分アミノ酸配列から推定される塩基配列をプローブにRT・PCRにより、望む部位のDNAを増幅した。2)TAクローニングキット(lnvitrogen社)によりPCR産物のクローンを得て、塩基配列を決定した。B.「制御ドメイン」の大腸菌内の発現1)Aで得られたcDNAのうち、28KドメインのcDNAをPCR法により増幅した。2)近年開発された強力なT7プロモーターを有するプラスミド:pET21に組み込み、これを大腸菌内(BL21株)に発現させた。3)大量培養のうち、蛋白質化学的手法で精製した。C.「制御ドメイン」のCa^<2+>結合測定並びに結晶化の試み1)Bの方法に準じて、すでにフィザルム・ミオシンの必須軽鎖及び制御軽鎖が機能あるかたちで得られているが、「制御ドメイン」とこれら軽鎖を結合させる。流動透析法にてCa^<2+>結合を測定したところ、良いCa結合値が得られた。
有機触媒を用いる精密分子変換法の開発

α位に分岐のない脂肪族アルデヒド間のクロスアルドール反応を目的とした触媒開発に取り組んだ。標的反応はアセトアルデヒドと3-アシルアミノプロピオンアルデヒド(RCONHCH_2CH_2CHO)とのクロスアルドール反応で、生成物は高脂血症治療薬リピトールの合成中間体となる。本触媒ではアルデヒドのエナミンへの活性化にプロリン骨格ではなく、ピペリジンを用いた。ピペリジンはプロリンのアミン部分であるピロリジンに比べて、生成するエナミンの反応性が低い。これにより反応性の高いアセトアルデヒドのみをドナーアルデヒドとして活性化できると期待した。一方、3-アシルアミノプロピオンアルデヒドのアクセプターとしての選択的活性化は、触媒分子のピペリジン4位に組み込んだアミノ基による基質のアミドNH基との水素結合形成を介して基質のホルミル基が反応点近傍に配置された触媒側鎖のカルボン酸によりプロトン化を受けることで達成したいと考えた。想定通り、3-アシルアミノプロピオンアルデヒドをアクセプターとし、アセトアルデヒドをドナーとするクロスアルドール反応が進行したが、過反応により脱水が起こり、アルドール縮合体が得られた。現在、脱水を起こさず、アルドール反応の段階に留めて制御する反応系を検討中である。また位置選択的ハロゲン化触媒の開発を目指し、スルフィド及びチオアミドを活性中心とする有機触媒を開発した。これらはオレフィン類のハロアミノ化の良好な触媒となることわかったが、位置選択性の獲得にはまだ至っていない。
科学のオーセンティックアセスメントを浸透させるデジタルポートフォリオ・ライブラリ

1.デジタルポートフォリオ・ライブラリ構築システムの開発科学のオーセンティックアセスメントを手軽に実現できるシステムを開発した.このシステムには,児童・生徒の学習履歴を記録する「デジタルポートフォリオ作成機能」,学習履歴を分析する「アセスメント機能」,学習履歴を公開する「ライブラリ機能」が実装されている.2.教師のオーセンティックアセスメント支援宮崎県内の小学校にシステムを導入し,教師を対象とした実証実験を行った.その結果,システムが教師のオーセンティックアセスメント支援に対して有効であることを明らかにできた.公立小学校6年生の理科「電流と電磁石」で本システムを利用した教師は,児童の学習履歴を分析し,児童の磁力に対する考えの変容のプロセスを単元の展開に即して評価できていた.また,公立小学校5年生の理科「てんびんとてこ」で本システムを利用した教師は,児童の思考過程に基づいて次時以降の授業を計画する,すなわち,学習指導に活かされるオーセンティックアセスメントを実現できていた.3.児童・生徒の興味・関心と学力の向上兵庫県内の中学校にシステムを導入した実証実験の結果,システムが生徒の興味・関心と学力の向上に対して有効であることを明らかにできた.例えば,システムを導入しなかった「自由落下」については,調査校の正答率と全国の正答率との差が有意ではなかった.これに対して,システムを導入した「力学的エネルギー」については,調査対象の正答率が全国の正答率よりも有意に上回った.4.科学のオーセンティックアセスメントの浸透システム公開,公開型ワークショップ,公開型シンポジウム,公開授業を通して開発したシステムと活用ノウハウを幅広く普及した結果,22都道府県,計41の学校・教育センターに科学のオーセンティックアセスメントを浸透させる手がかりを得た.1.デジタルポートフォリオ作成システムの機能拡張2002年度に開発したデジタルポートフォリオ作成システムについて,学校や家庭などで本システムを利用しているユーザーのニーズを反映し,現在の学校における学習環境との親和性を高めるための機能拡張を行った.ライブラリに蓄積するためのデジタルポートフォリオ作成がより効果的かつ容易になった.2.オーセンティックアセスメントの浸透(1)ワークショップ開催システムを利用したオーセンティックアセスメントが体験できるワークショップを開催した.20名が参加し,模擬授業形式のオーセンティックアセスメントを体験した.また,普段の授業においてオーセンティックアセスメントを実施するという観点から,システムの有効性について議論した.オーセンティックアセスメントを参加者に浸透させ,本システムを利用する教師間,学校間連携のための基盤を整備することができた.(2)授業導入と小学校教師による利用報告本システムを2つの公立小学校に導入し,普段の授業におけるオーセンティックアセスメント支援を試みた.1つの学校では第5学年の「てんびんとてこ」,もう1つでは第6学年「電流と電磁石」を実施した.日本科学教育学会の研究会でも小学校教師の協力を得て,システム利用効果を報告した.教師が自分の授業を他の教師に対して体験的に語るという機会を設定することで,オーセンティックアセスメント支援におけるシステムの有効性を実践的に提示できた.3.ライブラリ構築システムのデザイン・開発児童・生徒が作成したデジタルポートフォリオを遠隔地から閲覧可能な形で公開するためのライブラリ構築システムをデザインし,開発に着手した.このシステムには,2002年度のシステムで作成したデジタルポートフォリオをQuickTime Movieに変換できる機能が実装される.今年度は,β版が完成した.1.デジタルポートフォリオ・ライブラリ構築システムの開発科学のオーセンティックアセスメントを手軽に実現できるシステムを開発した.このシステムには,児童・生徒の学習履歴を記録する「デジタルポートフォリオ作成機能」,学習履歴を分析する「アセスメント機能」,学習履歴を公開する「ライブラリ機能」が実装されている.2.教師のオーセンティックアセスメント支援宮崎県内の小学校にシステムを導入し,教師を対象とした実証実験を行った.その結果,システムが教師のオーセンティックアセスメント支援に対して有効であることを明らかにできた.公立小学校6年生の理科「電流と電磁石」で本システムを利用した教師は,児童の学習履歴を分析し,児童の磁力に対する考えの変容のプロセスを単元の展開に即して評価できていた.また,公立小学校5年生の理科「てんびんとてこ」で本システムを利用した教師は,児童の思考過程に基づいて次時以降の授業を計画する,すなわち,学習指導に活かされるオーセンティックアセスメントを実現できていた.3.児童・生徒の興味・関心と学力の向上兵庫県内の中学校にシステムを導入した実証実験の結果,システムが生徒の興味・関心と学力の向上に対して有効であることを明らかにできた.例えば,システムを導入しなかった「自由落下」については,調査校の正答率と全国の正答率との差が有意ではなかった.これに対して,システムを導入した「力学的エネルギー」については,調査対象の正答率が全国の正答率よりも有意に上回った.4.科学のオーセンティックアセスメントの浸透システム公開,公開型ワークショップ,公開型シンポジウム,公開授業を通して開発したシステムと活用ノウハウを幅広く普及した結果,22都道府県,計41の学校・教育センターに科学のオーセンティックアセスメントを浸透させる手がかりを得た.
分離論理を用いたソフトウェア検証の基礎理論

(1)単項帰納的定義と暗黙存在のある分離論理のエンテイルメントの決定可能性を証明した。この体系は、有界木幅分離論理SLRDbtwから、暗黙存在変数を追加し、帰納的定義を単項に制限することにより得られる。(2)単項帰納的定義をもつ記号ヒープのエンテイルメント判定器を実装した。効率的実装のためのアイデアとして、木のノード間の同値関係に関する最適化を説明した。(3)相互再帰手続きをもつポインタープログラムにホーア論理と分離論理の拡張した体系の完全性を証明した。(4)プレスバーガー算術と帰納的定義をもつ分離論理における記号ヒープの充足可能性問題を解いた。一般的帰納的定義}の条件で次の(1)(2)を満たすものを発見し、その性質を証明する研究を行った。(1)記号ヒープ体系にその条件下の一般的帰納的定義を追加しても、エンテイルメントの真偽が決定可能である,(2)リストセグメントなどのよく使用される基本的なデータ構造が記述できる.本研究の実用的な意義は、メモリーエラーを自動定理証明により検証する方法に対して、リストセグメントのようなよく使われる基本的なデータ構造を扱うプログラムを対話的入力なしに全自動で検証できる方法をはじめて与えることである。平成27年度の実績は次のようである。論文Iosif et al 2013の証明の条件を吟味し、その条件を緩めて、データフィールドを扱えるようにした。単項二階論理への翻訳を可能とする条件として、単項帰納的定義の条件を発見した。この条件を用いて、エンテイルメントの決定手続きを設計し決定可能性定理を証明した。このシステムのパソコンへ実装した。平成27年度にやるように当初計画していたことは全て達成できた。また、bounded treewidthの条件下で循環証明体系を構築し、その決定可能性を証明した。また、その実装も開始した。以上から進捗状況はよいといえる。一般的帰納的定義の条件で次の(1)(2)を満たすものを発見し、その性質を証明する研究を行った。平成28年度の実績は次のようである。前年度の成果を拡張し、一般的帰納的定義を算術を含む体系に拡張した場合の充足可能性判定が決定可能であることを証明した.(1)単項帰納的定義と暗黙存在のある分離論理のエンテイルメントの決定可能性を証明した。(1)平成27年度に構成した検証システムの決定手続きのパソコン上への実装を完成する。実装は、O'Hearnらのグループの2005, 2006年の論文をはじめとする分離論理の検証システムの実装の論文のアイデアを参考にして、検証システムのプロトタイプを作成する。(2)実装した検証システムに,ベンチマークなどを走らせ実験する。(3)平成27年度に発見した条件と理論をさらに洗練する。検証システムの実装および実験のために、平成28年度には研究補助者を週1日雇用する。最新の状況を捉えるために、成果発表とは別に年1回トップ会議に出席して情報収集する。国内の関連した研究を行っているグループを訪問し、途中の成果を発表し、研究討論を行ってフィードバックを得る。研究成果を権威ある国際会議で発表し研究討論を行う。理論計算機科学および数理論理学実装および実験のための研究補助の支出のため追加交付を受けたが、発表旅費が予定より少なかったため次年度使用額が生じた。理論研究が予定よりよく進み、また実験から得るデータが予想より研究に役立つことがわかったため、実装とそのシステムによる実験にも重きを置くこととし、そのために研究員または研究補助員を雇用する。その他の点については当初予定通り進める。
タンパク質内電子伝達とプロトンポンプ機構解明のための超高精度電子状態動力学法

超高精度分のElongation法プログラムによって電子状態計算を行ない、得られた高分子反応末端分のActive部分のカのを分子動力学法プログラムに受け渡す手法を開発し、分子動力学(MD)に量子力学(QM)に基づくオーダーN電子状態計算法を導入するルーチンを構築した。これにより、高分子末端に集まった領域局在化分子軌道を用いたab initio局所分子動力学法による効率的構造最適化と局所振動解析が可能となり、幾つかのタンパク質に適用を行なった。生体内におけるアロステリック効果など、遠距離相互作用を正確扱うためには、電子相関効果を無視してその機能を論じることはできない。そこで、我々がオリジナルに提唱したユニット毎の領域軌道の特徴を活かし、これに絡み合い系への応用を行った。ポリエチレンモデル系や環状タンパク質やインスリン等の巨大バイオ系に適用し、その有効性を確認した。効率よく電子相関効果をMP2法や局所的なCI法のレベルで局所励起状態や局所電子相関効果を計算できるように開発中で、簡単なペプチド系に対しては成功している。例えばシクロアミロースのように、空間的に相互作用が近づいた場合にその部分のRLMOを解凍して計算に取り込む計算はほぼ可能になっており、これを種々の生体系に適用し、その信頼性や効率性を検証している段階である。次に、これに対して上で述べたRLMO基底で電子相関効果を組み込む手法を導入することにより、TDDFT法による絡み合った系における吸収スペクトルの高精度計算を手掛けている。一方で、プロトンポンプのメカニズムを解明するために分子動力学法との結合に着手し始めた。非経験的分子軌道により得られた静電ポテンシャルから、より精度のたかい電荷密度を各原子に割り当て、これを分子動力学法プログラムに送り込んで、ダイナミクスを行う手法をプログラムGAMESSに組み込みつつある。電子状態計算から得られた局所的なRLMO基底で定義される力の定数を動力学手法に受け渡し、プロトンポンプのメカニズム解析が可能となるよう開発を始めたところである。生体内におけるアロステリック効果など、遠距離相互作用を正確扱うために、我々がオリジナルに提唱したユニット毎の領域軌道の特徴を活かし、N^<56>もの演算時間を要する電子相関効果の計算をN^1で行う手法を開発した。まず、これまで開発してきた、局所的電子相関効果(LocalMP2)評価方法を完成させ、絡み合い高分子の例としてインスリンを取り上げ、今まで開発してきたGeneralized Elongation法を適用して良好な結果が得られた。高分子鎖が巻いて戻ってきたときに化学結合がない場合は問題なく解けるが、新たな問題として化学結合が生じた場合(インスリンの場合はS-S結合など)には、従来法との一致が悪くなるという問題が判明したが、原因が明らかとなり解決のめどがついた。絡み合い化学結合系でも、全系に非局在化した系でも、軌道を活性軌道に取り込む手法を新しく盛り込み、従来法との全エネルギーの誤差が10^<-8>a.u./atom程度となるよう改良を行った。三次元的に絡み合ったタンパク質への本方法の信頼性を確認したあと、分子動力学報による取扱により、溶媒効果の導入を試みた。まず現有のGaussianやGAMESSなどの非経験分子軌道プログラムから電子状態計算をおこない、得られた静電ポテンシャルを分子動力学法プログラムに受け渡す手法を組み込んだ。分子動力学(MD)に量子力学(QM)に基づく電子状態計算を導入するルーチンをプログラム開発中で、さらに大事な部分のみ高い基底関数で取り扱う手法を発展させている。QM部分については、我々が開発してきたLMP2-Elongation法に置き換えることにより、巨大な生体高分子でも、Activeな反応領域に特異的に溶媒効果を導入できるようにも開発中である。生体内プロトン輸送問題も取り扱える手法の開発を行い、酵素等タンパク質中プロトン移動機構を明らかにする信頼性の極めて高い高精度な方法を完成させて、実際に起こっている生体内現象光合成におけるエネルギー変換メカニズムを解明に役立つツールを構築することが目的である。そのために、超高精度かつ超効率的Elongation法に動力学的手法を組み込み、ポリグリシンなどで動作確認を行なっている。得られた静電ポテンシャルを分子動力学法(MD)プログラムに受け渡し、さらに電子状態計算に戻って構造最適化を行なう手法を開発し、効率的に安定構造のグローバルミニマムを検索するルーチンを構築した、QM部分について、我々が開発してきたLMP2-Elongation法に置きi換えることも可能どなり、励起状態を取り込むための局所的配置間相互作用法の計算も可能となっている。また、溶媒効果の評価のためのPCM法も合わせて稼働できることを確認し、現段階で巨大な生体高分子でも、Acitiveな反応領域に特異的に溶媒効果を導入することは可能となっている。一方、反応を取り扱うための遷移状態計算法も、Activeサイトのみに局在化した軌道を用いて稼働することを確認している。そこでは、全系の振動解析を避けるために、反応サイトだけの振動解析が可能となることが肝心である。

そこで、局在化軌道を基底とした局所密度行列をエネルギーの二次微分であるHessian行列に用いることにより、水クラスター程度の簡単なモデル系に対して、局所的な振動モードが全系のもあと良好に一致する結果は得られている。こしかし、これらの様々な手法を統合することについては現在も進行中である。
小胞体ストレス応答のメカニズムの解明

本研究では、矯正力によって圧迫される歯周組織に低酸素状態が惹起され、小胞体ストレスと小胞体ストレス応答が生じるかを検討した。その結果、歯槽骨中で、低酸素マーカーであるピモニダゾールが示す低酸素状態となる組織部位を特定した。さらに、小胞体ストレスマーカーであるXbp1おおよびChopのmRNAの発現をin situ hybridyzationによって確認した。さらに詳細な解析が進めば、これまで明らかにされていない歯の移動における小胞体ストレスのメカニズムが解明されることが期待され、矯正治療のリスクとされている歯根吸収や歯槽骨レベルの低下等の解決の糸口となる基盤的所見が得られることが期待される。歯に矯正力が加わると歯根膜は圧迫される。その結果、圧迫された一部の組織は虚血状態となり硝子様変性が生じる。矯正力は一時的に歯根膜組織に障害を与えるにもかかわらず、これまで、その細胞・分子機構や、障害に対する細胞の生体防御反応について十分な検討はされてこなかった。一般的に細胞が虚血や酸化ストレスなどの様々な異常環境に曝露されると、不良タンパク質が小胞体に蓄積し細胞にダメージが加わる(小胞体ストレス)。同時に、細胞は障害を回避するために不良タンパク質の修復や分解を行うシステムを駆動させ、障害から身を守り恒常性を維持する。そこで、本研究では、矯正力によって圧迫される歯周組織に小胞体ストレスと小胞体ストレス応答が生じるか、その詳細を検討するため、実験的歯の移動による歯根膜の圧迫が組織の低酸素状態を惹起するか、また、それがいつどこに生じるのかを明確にすることを計画していた。本研究初年度は、実験的歯の移動モデルを用いた低酸素状態となる組織部位を特定することを計画していた。ラット(P2)を用い、Wald法に基づいて歯の移動を行い、低酸素マーカーであるピモニダゾールにより低酸素状態となる組織部位を特定した。さらに平成27年度の計画としては、小胞体ストレスマーカーのmRNA発現レベルをin situ hybridizationで観察し、realtime RT-PCRで測定することを計画しており、これまでに、小胞体ストレスマーカーであるCHOPおよびGRP78のmRNAの発現をin situ hybridizationで確認することができた。さらに詳細な解析を進めることによりこれまで明らかにされていない歯の移動における小胞体ストレスのメカニズムが解明されることで、矯正治療のリスクとされている歯根吸収や歯槽骨レベルの低下等に対する問題の解決の糸口となる基盤的所見が得られることが期待される。一般的に細胞が虚血や酸化ストレスなどの様々な異常環境に曝露されると、不良タンパク質が小胞体に蓄積し細胞に小胞体ストレスが加わる。そこで、本研究では、矯正力によって圧迫される歯周組織に小胞体ストレスと小胞体ストレス応答が生じるか、その詳細を検討するため、実験的歯の移動による歯根膜の圧迫が組織の低酸素状態を惹起するか、また、それがいつどこに生じるのかを明確にすることを計画した。実験的歯の移動モでルを用いた低酸素状態となる組織部位を特定した結果、ラットの実験的歯の移動モデルにおいて低酸素マーカーであるピモニダゾールにより低酸素状態となる組織部位を特定した。さらに、小胞体ストレスマーカーのmRNA発現レベルをin situ hybridizationで観察した結果、これまでに、小胞体ストレスマーカーであるCHOP、GRP78おおよびAft4のmRNAの発現をin situ hybridizationで確認することができた。昨年度の研究は、実験的歯の移動モデルを用いた低酸素状態となる組織部位を特定することを計画していた。現在までに、ラット(P2)を用いWald法に基づいて歯の移動を行い、低酸素マーカーにより低酸素状態となる組織部位を特定し、小胞体ストレスマーカーのmRNA発現レベルをin situ hybridizationで観察するところまで完了しており、研究計画どおり順調に進展している。

歯科矯正学昨年度と同様の方法で実験的歯の移動を行い、マイクロダイセクションにより歯根膜の圧迫側の組織を切り出し、Bip/Grp78、Chop/Gadda153、Atf4等のmRNAの発現レベルをrealtime RT-PCRにて測定する。このような実験により歯の移動に伴う歯根膜の圧迫により生じるストレス小胞体応答の詳細なメカニズムが解明することが予想される。額面としては小さいが、次年度の実験に使用する器具等の費用に充てるため。平成27年度に計画している実験の実験器具等の費用に充てる予定である。
植物DNAウイルスの性状究明

植物で希少なDNAウイルスについて病原学的性状を探究した。一本鎖DNAウイルスでは双球状のGeminiviridaeのコナジラミ伝搬のサツマイモ葉巻ウイルス(SPLCV)の純化と理化学的性状の究明を試み、これらBegomovirusの遺伝子診断のためのプライマーをデザインしPCR診断を行った。また本邦で新たに発生したtomato yellow leaf curl virus(TYLCV)について、純化、細胞内所在、遺伝子診断などを調べた。Mastrevirusでは本邦で唯一のオギ条斑ウイルス(MiSV)の媒介者の探索と遺伝子解析を行った。また、小球状分節ゲノムを有するCircovirusではレンゲ萎縮ウイルス(MDV)をアブラムシ伝搬で増殖し純化、細胞内所在を探究し、さらにsubterranean vlover stunt virus(SCSV)との血清学的関係を検討した。二本鎖DNAウイルスでは大型球状の各種Caulimovirusを本邦各地より採集しそれらの構造・形態、細胞内所在を詳細に比較研究した。ウイルスの寄生性や遺伝子機能等を解明するために、ウイルスがコードする移行蛋白質に注目し、ダイズ退緑斑紋ウイルス(SoyCMV)の遺伝子操作を種々行い、またカリフラワーモザイクウイルス(CaMV)との遺伝子キメラを作出し性状を調べた。また、両ウイルスのDNAプロモーターの生物工学的利用のために、これらを用いて病害抵抗性のための形質転換植物の作出を行った。桿菌状のBadnavirusではクジャクサボテン桿菌状ウイルス(EqBV)およびアオキ輪紋ウイルス(ARSV)について純化を行い、遺伝子解析を試みた。植物で希少なDNAウイルスについて病原学的性状を主に探究した。(1)1本鎖DNAウイルスについては、双球状のGeminivirus属のサツマイモ葉巻ウイルス(SPLCV)の細胞内所在を電顕観察しその純化を試み、さらに静岡県に本邦未記載の新たなトマトの双球状ウイルスの発生を認めた。オギ条斑ウイルス(MiSV)については伝搬虫の探索とともに遺伝子の解析を行った。また、今後新分類群と期待されるレンゲ萎縮ウイルス(MDV)を野外より採取しアブラムシ伝搬を確かめ、南半球のクローバのウイルス(SCSV)との血清学的関係を調べた。(2)2本鎖DNAウイルスについては、大型球状のCaulimovirus属のペチュニア葉脈透化ウイルス(PVCV)の微細構造とともに本属では最初に種子伝染する可能性を示し、オダマキえそ斑紋ウイルス(ANMV)の細胞内増殖とともに多数の核内所在を明らかにした。ダイズ退緑斑紋ウイルス(SoyCMV)については遺伝子構造とともに植物体内、移行蛋白質についてRNAウイルスと比較しながら解析した。また、被膜を欠く桿菌状のBadnavirus属のカンナ黄色斑紋ウイルス(CYMV)およびクジャクサボテン桿菌状ウイルス(EpBV)について純化、所在様式を解明し、遺伝子解析を試みた。
胎児造血幹細胞移植治療に関する基盤研究

伴性劣性重症複合型免疫不全症(X-SCID)に対する胎児造血幹細胞移植が欧米で実施され成功を収めている。しかし、X-SCIDと異なり移植細胞に増殖優位性のない他の疾患では、移植後の生着効率が低く、十分な治療効果が得られない。この問題に対し、本研究では、ヒツジ子宮内移植系を用いて、移植後の造血細胞の生着効率を向上できないか検討を行った。その結果、(1)ブスルファン投与による移植前処置、(2)移植細胞におけるHoxB4遺伝子の一過性強制発現、(3)サイトカイン投与による移植後処置によって、移植後の造血細胞の生着効率の向上を示すことが出来た。欧米の臨床において、伴性劣性重症複合型免疫不全症(X-SCID)に対する胎児造血幹細胞移植が成功を収めた。しかし、X-SCIDと異なり移植細胞に増殖優位性のない他の疾患では、移植後の生着効率(ドナー由来造血キメラ率)が低く、十分な治療効果が得られない。一方、マウス胎仔への造血幹細胞移植では、生後のドナーリンパ球輸注療法(DLI)や追加移植によって、ほぼ100%のドナー由来造血キメラ率が得られている。ヒト臨床でも、移植前後に同様の処置を施すことによって、様々な先天性疾患で出生前胎児治療が可能になるのではないか。本研究では、このことを大型動物(主にヒツジ)実験で検証する。研究代表者は、ヒツジ胎仔にヒト造血幹細胞を移植することによって、ヒトの造血をヒツジ体内で再構築する実験を行ってきた。ヒツジを用いるのは、移植後の流産が少なく、胎児サイズがヒトに近く、マウス実験より観察期間を長く設定できるからである。昨年度(平成24年度)は、骨髄移植で移植前処置剤として使用されているブスルファン(BU)をヒツジ胎仔に投与する実験を行った。すなわち、ヒツジ本来の造血を抑制することによって、移植細胞に相対的な増殖優位性を付与できないかどうかを検討した。BUを投与したヒツジ胎仔にヒト臍帯血CD34陽性細胞を移植した結果、ヒト/ヒツジ造血キメラ率を有意に上昇させることに成功した。本年度(平成25年度)は、生後のヒト/ヒツジ造血キメラヒツジにドナーリンパ球(DLI)を輸注することによってヒト/ヒツジ造血キメラ率が上がるという予備的結果が得られた。今後、n数を増やしてその再現性を検証するとともに、もしDLIがヒト/ヒツジ造血キメラ率上昇に効果があるとすれば、それはなぜ効くのか、その作用機序の解析を図る。しかし、X-SCIDと異なり移植細胞に増殖優位性のない疾患では、移植後の生着効率(ドナー由来造血キメラ率)が低く、十分な治療効果が得られない。ヒト臨床でも、移植前後に同様の処置を施すことによって、様々な先天性疾患で出生前胎児治療が可能ではないか。本研究では、このことを大型動物(サルやヒツジ)実験で検証する。これまでに、造血幹細胞の自己複製能を高めるHoxB4遺伝子をあらかじめ移植細胞に導入する実験を行った。その結果、HoxB4遺伝子導入によって、移植後のドナー由来造血キメラ率を高められることを示した。本年度は、骨髄移植で移植前処置剤として使用されているブスルファン(BU)をヒツジ胎仔に投与する実験を行った。しかしBUには、ヒツジならびに胎仔で用いた報告はない。そこでまずは、ヒツジ胎仔における至適投与条件(投与量・投与ルート)を検討し、母体静脈経由での安全な前処置法を開発した。BUを投与したヒツジ胎仔にヒト臍帯血CD34陽性細胞を移植した結果、ヒト造血キメラ率を有意に向上させることに成功した。

しかし、X-SCIDと異なり移植細胞に増殖優位性のないような他の疾患では、移植後の生着効率(ドナー由来造血キメラ率)が低く、十分な治療効果が得られない。この問題に対し、本研究では大型動物(主にヒツジ)の子宮内移植系(胎仔への移植系)を用いて、移植後の造血細胞の生着効率を向上できないか検討を行った。(1)移植前処置:成人の骨髄移植で行われている移植前処置を、ヒツジ子宮内移植系に応用した。すなわち、化学療法剤ブスルファンを移植前のヒツジ胎仔に投与し、ヒツジ体内におけるヒト造血細胞の生着スペースの拡張を試みた。その結果、ヒツジ骨髄内のヒト造血細胞の比率ならびに造血キメラヒツジの出現率を有意に向上させることができた。(2)グラフトへの処置:造血幹細胞の自己複製遺伝子HoxB4をヒト造血幹細胞(CD34細胞)に一過性強制発現させることで、グラフトの増殖力の強化を試みた。その結果、ヒツジ骨髄内でのヒト造血細胞の比率を約5倍に上昇させることができた。(3)移植後処置:ヒトやサルの造血細胞に増殖効果を及ぼす(ヒツジに交叉しない)ヒト幹細胞因子(SCF)を、サル造血細胞を生着したヒツジに投与することで、ヒツジ体内におけるサル造血細胞の選択的増幅を試みた。その結果、ヒツジ骨髄中のサル造血細胞の比率を最大で約12倍に上昇させることができた。上述の3つの方法は、いずれも異なる作用機序を有するため、組み合わせて用いれば相乗効果が期待できる。再生医学、血液学平成24年度(昨年度)はブスルファン投与など「移植前処置」によって、平成25年度(本年度)はドナーリンパ球輸注(DLI)など「移植後処置」によって、子宮内移植後の造血キメラ率向上をめざすのが目標であった。ヒツジ子宮内移植の系を用いて、ブスルファン投与による移植前処置と、DLIによる移植後処置によって、ヒト/ヒツジ造血キメラ率の上昇を実際に示すことが出来たので、当初の目標は達成されており、研究は順調に進展していると言える。研究はほぼ計画通りに進んだ。平成24年度の交付申請書に記載した研究計画は以下の3点だが、いずれも実施できた。(1)サル・ヒツジの胎仔への移植:本年度はヒツジを用いた移植実験を行った。(2)有効性と安全性の検証:ブスルファン投与による前処置を行った胎児造血幹細胞移植の動物実験として、ヒツジを用いてその有効性と安全性を検討できた。(3)移植前処置:ブスルファン投与によって、移植後のドナー由来造血キメラ率の改善を示すことが出来た。以上の実験において移植する造血幹細胞として、以前取得済の臍帯血CD34陽性細胞を利用できた。ヒツジ胎仔への細胞移植実験の実施にあたっては、宇都宮大学農学部長尾慶和教授や東京マザーズクリニック林聡博士の協力が得られたことで、直接経費を執行せず研究を円滑に進めることが出来た。移植後のDLIによって移植後のキメラ率上昇が見られるという予備的結果が得られたので、これについてさらに研究を進めたい。すなわち、DLI実施のn数を増やして、この効果の再現性および有意性について調べる。また、本DLIがなぜ効くのか、その作用機序について解析を進める。なお、本研究では、大型動物の子宮内移植系としてヒツジを用いているが、今後実験用ミニブタでも同様の実験が出来るように準備を進めたい。今後も主にヒツジを用いて、計画通り研究を進める。本年度(平成24年度)繰越した研究費は、移植後のヒツジの解析等に充てる。また、必要に応じてサルも使用する。来年度(平成25年度)の研究費は、ヒツジ及びサルの実験にかかる諸費用、細胞の培養、移植後の解析等に使用する。また、学会へ発表する場合の旅費に使用する。