hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
分子分解能を有する３次元構造センサの開発と細胞固液界面構造解析への応用

さらに局所の温度を計測できるようにした点も今後の研究の展開に極めて大きな意義があるものと言える。以上のような今年度得られた種々の成果より、研究は概ね順調に進んでいると判断した。本研究はサブnmオーダーの空間分解能で固液界面、特に細胞など生体表面をラベルフリーで観察・解析できる新規なセンシング手法の確立を目的としている。表面増強ラマン散乱分光法(SERS)に着目し、独自に開発した金属ナノ粒子を配したナノ構造体(プラズモンセンサ)を試料表面に接触させ、その近傍の局所電界勾配の急峻化の利用により深さ方向空間分解能0.1nm、面分解能数nmオーダーを実現し、細胞表面の分子レベルの解析に資する手法の確立を目指している。本年度は最終年度であり、これまでの成果を基にプラズモンセンサを用いて細胞膜に近い脂質2層膜の解析を進め、1nmステップ以下の深さ分解能でのラマンスペクトルのプロファイル測定に成功した。感度も通常のラマン分光法の20倍以上が得られ、その結果、膜両端のコレステロールとその間の炭化水素鎖の分布を精密に解析できることを確認した。またCHO-k1細胞膜表面のSERSスペクトルの酵素による変化の観察にも成功し、通常のラマンでは観察できない表面の化学構造変化の明瞭な観察を達成した。また、SERSを計測するプラズモンセンサについても、プラズモン粒子形成条件の最適化により、生体試料において通常のラマン分光法に比べ数十倍の感度と1,000分の1以下の高分解能で数十nmの細胞膜の精密な化学構造測定が可能になった。このように本研究により得られた測定系は当初の目的に対し十分な性能が得られたといえる。特にタンパク質分解酵素による細胞膜表面の分子構造変化を分子レベルで測定できたことは、本研究の成果の有用性を実証したものとして特筆すべき成果である。以上のように3年間の研究でSERSによる細胞表面の高精度観察を実証したが、今後は本研究の成果を基に生細胞表面の動的観察や様々な環境に対する応答などを始め、幅広い応用に向けた研究を進めて行きたいと考えている。本研究は、極薄有機膜や固液界面近傍の深さ方向の分子構造変化をナノスケールで観察し、in vivo(生体内)観察・解析をラベルフリーで可能とする革新的なセンシング手法を確立し、分子レベルからの細胞生理機構の研究への応用の可能性を探ることを目的とした。表面増強ラマンを極めて高感度かつ汎用的に適用可能とする透過型プラズモンセンサを用い、自己集積化単分子膜や脂質二重膜、細胞等の表面近傍の化学構造測定に成功した。また膜の深さ方向の構造分布の0.1nmレベルでの測定を実現した。さらに表面修飾によりpH変化の測定にも成功した。本手法は種々の細胞腫の識別や動的測定による代謝の解析など幅広い応用が期待される。本年度は初年度であり、本研究推進のための要素技術の確立を念頭に研究を進めた。その主眼は、本解析に適した三次元ナノ構造を有するプラズモンセンサの形成、および細胞表面解析手法の最適化である。特に前者については今後検討を進めるための前提条件となるため重点的に検討した。従来型のセンサの課題は、感度増強発現のための金属ナノ粒子(Ag, Au等)の粒径および表面分散状態の均一性、また試料表面に対する接触性および耐久性であった。
紫外線感受性の異なるイネのシクロブタン型ピリミジンニ量体光回復酵素の構造の違い

(1)UVB抵抗性の異なるイネ品種のCPD光回復酵素の構造・機能の解析CPD光回復酵素タンパク質を、日本型イネ品種ササニシキの可溶性タンパク質から、硫酸アンモニウム沈殿、陰イオン交換カラム、ヘパリンカラム、CPD誘導DNA結合磁気ビーズを用いて精製した。CPD光回復酵素は、青色光を受容してCPDを修復した後、DNAから遊離することが知られている。そのため、CPD誘導DNA結合磁気ビーズに結合したタンパク質に、青色光を照射することで、修復活性をもつCPD光回復酵素をDNAから遊離させ、磁石を使用して磁気ビーズを沈殿させることで、上清画分にCPD光回復酵素を特異的に得ることができた。この精製タンパク質は、タンパク質量あたりの酵素活性が、可溶性タンパク質画分と比較して約8100倍に上昇しており、また、ササニシキCPD光回復酵素遺伝子を大腸菌にて発現・精製したタンパク質と比較して、高い活性を有していた。また、精製タンパク質の吸収スペクトルと蛍光スペクトルを測定したところ、FADを含むと考えられた。(2)CPD光回復酵素の違いがUVB抵抗性を左右する主要因であることの検証ササニシキのCPD光回復酵素遺伝子を、センス、またはアンチセンス方向に導入したバイナリーベクターを用い、アグロバクテリウム法にてササニシキ、農林1号、Surjamkhiの種子胚から誘導したカルスに遺伝子導入を行い、形質転換体を作成した。ササニシキに対しセンス方向に導入した系統(過剰発現体)においては、酵素活性は約545倍に上昇しており、アンチセンス方向に導入した系統(発現抑制体)においては、酵素活性はほとんど検出されなかった。これらの系統のUVB付加条件下での生育検走を行ったところ、野生型と比較して、過剰発現体は高いUVB抵抗性を示し、発現抑制体はUVB感受性を示すことを見出した。(1)UVB抵抗性の異なるイネ品種のCPD光回復酵素の構造・機能の解析UVB抵抗性の異なるイネ品種の中で、日本型品種ササニシキとインド型品種Surjamkhiの葉から可溶性タンパク質を抽出した。CPD光回復酵素を、酵素活性を指標として次のように精製した。硫酸アンモニウム濃度3070%で沈殿するタンパク質画分を取得し、脱塩操作後、陰イオン交換カラムに供し、80mM NaCl,pH7.0の条件下において結合しない画分を取得した。この画分をヘパリンカラムに供し、ヘパリンカラムに結合した画分を取得した。ヘパリン結合画分では、タンパク質量あたりの酵素活性が、可溶性タンパク質画分と比較して約50倍濃縮された。可溶性タンパク質画分と同様に、ヘパリン結合画分においても、ササニシキから精製したタンパク質は、Surjamkhiから精製したタンパク質と比較して、酵素活性が約2倍高かった。現在、さらなる精製を進めている。(2)CPD光回復酵素の違いがUVB抵抗性を左右する主要因であることの検証マルチクローニングサイト上流にカリフラワーモザイクウイルスの35Sプロモーター配列をもつバイナリーベクター(pPZP2Ha3+)に、ササニシキのCPD光回復酵素遺伝子を導入し、センス方向に転写される発現ベクターを作成した。この発現ベクターを用い、ササニシキ、農林1号、Surjamkhiの種子胚から誘導したカルスに、アグロバクテリウム法にて遺伝子導入を行うことで、形質転換体の作成を進めている。(3)CPD光回復酵素の発現を抑制した形質転換体のUVB感受性の解析上記(2)と同様の方法を用い、ササニシキのCPD光回復酵素遺伝子をアンチセンス方向に発現する形質転換体の作成を進めている。(1)UVB抵抗性の異なるイネ品種のCPD光回復酵素の構造・機能の解析CPD光回復酵素タンパク質を、日本型イネ品種ササニシキの可溶性タンパク質から、次のように精製した。硫酸アンモニウム濃度30-70%で沈殿するタンパク質画分を取得し、脱塩操作後、陰イオン交換カラムに供し、80mM NaCl,pH7.2の条件下において結合しない画分を取得した。この画分をヘパリンカラムに供し、結合した画分を1M NaClを含む緩衝液で溶出したのち、脱塩操作を行った。この画分を、CPDを含むDNAを結合させた磁気ビーズと混合した。そのため、CPDを含むDNAを結合させた磁気ビーズに結合したタンパク質に、青色光を照射することで、修復活性をもつCPD光回復酵素をDNAから遊離させ、磁石を使用して磁気ビーズを沈殿させることで、上清画分にCPD光回復酵素を特異的に得ることができた。この精製タンパク質は、タンパク質量あたりの酵素活性が、可溶性タンパク質画分と比較して約8100倍に上昇していた。得られたタンパク質には2種類のCPD光回復酵素が含まれていたため、2種類のCPD光回復酵素の分離解析を進めている。(2)CPD光回復酵素の違いがUVB抵抗性を左右する主要因であることの検証ササニシキのCPD光回復酵素遺伝子を、センス、またはアンチセンス方向に導入したバイナリーベクターを用い、アグロバクテリウム法にてササニシキ、農林1号、Surjamkhiの種子胚から誘導したカルスに遺伝子導入を行い、形質転換体の作成を行った。カルスから再分化させ得た植物体を生育させ、その後代世代の種子を取得した。

後代世代の種子を取得するとともに、遺伝子発現量の解析、酵素活性の測定、UVB感受性の検定を進めている。(1)UVB抵抗性の異なるイネ品種のCPD光回復酵素の構造・機能の解析CPD光回復酵素タンパク質を、日本型イネ品種ササニシキの可溶性タンパク質から、硫酸アンモニウム沈殿、陰イオン交換カラム、ヘパリンカラム、CPD誘導DNA結合磁気ビーズを用いて精製した。CPD光回復酵素は、青色光を受容してCPDを修復した後、DNAから遊離することが知られている。そのため、CPD誘導DNA結合磁気ビーズに結合したタンパク質に、青色光を照射することで、修復活性をもつCPD光回復酵素をDNAから遊離させ、磁石を使用して磁気ビーズを沈殿させることで、上清画分にCPD光回復酵素を特異的に得ることができた。この精製タンパク質は、タンパク質量あたりの酵素活性が、可溶性タンパク質画分と比較して約8100倍に上昇しており、また、ササニシキCPD光回復酵素遺伝子を大腸菌にて発現・精製したタンパク質と比較して、高い活性を有していた。また、精製タンパク質の吸収スペクトルと蛍光スペクトルを測定したところ、FADを含むと考えられた。(2)CPD光回復酵素の違いがUVB抵抗性を左右する主要因であることの検証ササニシキのCPD光回復酵素遺伝子を、センス、またはアンチセンス方向に導入したバイナリーベクターを用い、アグロバクテリウム法にてササニシキ、農林1号、Surjamkhiの種子胚から誘導したカルスに遺伝子導入を行い、形質転換体を作成した。ササニシキに対しセンス方向に導入した系統(過剰発現体)においては、酵素活性は約545倍に上昇しており、アンチセンス方向に導入した系統(発現抑制体)においては、酵素活性はほとんど検出されなかった。これらの系統のUVB付加条件下での生育検走を行ったところ、野生型と比較して、過剰発現体は高いUVB抵抗性を示し、発現抑制体はUVB感受性を示すことを見出した。
国際貿易・産業集積と企業の競争力

本研究課題の3つのテーマについて以下の成果を得た。国際貿易と企業の競争力については、1)労働市場の不完全性を許した上でも輸出企業のマークアップが非輸出企業よりも高いことを示すことで、輸出企業、さらには直接投資を行う企業の競争力が高いことを示した(Dobbelaere and Kiyota, 2018)。2)石油の輸入国による権益獲得が石油価格に及ぼす影響について、2期間理論モデルを開発し、それを動学的パネル分析により実証することで、権益獲得は、現在の石油価格を上げ、将来の石油価格を下げることを示した(Morita, Higashida, Takarada, and Managi, 2018)。3)生産による汚染に対して異なる環境規制を課している国の間での、国際的な排出量取引の厚生効果を考察し、未解明であった経済厚生の改善条件を明示した(Tsubuku, Okimoto, and Takarada, 2019)。4)中国における貿易自由化の進展による競争圧力により、日本企業が中国における現地法人のイノベーション活動を活発化させ競争力強化を図っていることを明らかとした(Yang, Matsuura and Ito, 2019)。産業集積と企業の競争力については、特に商業部門における集積が企業競争力に与える影響についての研究を進展させた(Nakajima and Teshima, 2018)。国際貿易と産業集積の相互依存については、これまで開発されてきた多くの定量空間経済モデルについて、代表的なモデルの均衡は全てMcFaddenモデルから生成されることを明らかにし(Behrens and Murata, 2018)、その結果の一般性や頑健性を確認している。また、関税の撤廃が国内産業立地に与える影響を分析した(Nakajima and Okazaki, 2018)。平成30年度が最終年度であるため、記入しない。本研究の目的は、国際貿易と産業集積という視点から、企業の競争力、すなわち生産性、マークアップ、品質に注目し、その源泉を探求することにある。■国際貿易と企業の競争力国際貿易と企業の競争力については、たとえばアジア6か国の国際産業連関表を用いてGlobal Value Chainに注目して国際競争力の推移を検討する分析を行った。また、企業レベル・データを用いた分析として輸出企業の生産性を国際比較する枠組みの構築を進めており、日仏の企業レベル・データを事例とした分析を行っている。また貿易政策と企業競争力の観点から、環境規制と貿易についての分析も進めている。具体的には、輸出振興政策の下で一律の環境規制を進めた場合のその影響と解決策について理論的な分析を行った。■産業集積と企業の競争力産業集積と企業の競争力に関しては、集積の経済性の源泉を探るため日本の企業ー品目レベルのデータを利用し製品の品質の推計、ならびに産業集積が生産性および製品品質改善にもたらす影響についての分析を行った。また、集積形成メカニズムを明らかにするため、労働移動を考慮した上で地域間の取引・移動コストが生産性やマークアップに及ぼす影響を理論的に分析し、さらに米国の地域間取引のデータを用いた構造推計を通じてこのメカニズムを実証的に検証した。■国際貿易と産業集積の相互依存これに加えて国際貿易・産業集積と企業の競争力の二つの枠組みを統合した研究も進めており、貿易自由化が企業競争力に影響した結果、経済活動の地理的分布にどのような影響を与えたのかについての研究を行った。特に戦前の日本の状況に注目し、貿易自由化によって自由化された国に地理的に近接する地域、およびその地域の中でも、自由化された品目の生産に特化した地域の経済活動が活発化したことを示した。本年度の研究実績としては4件の雑誌論文、9件の学会報告と書籍刊行1件があった。その成果の一部は国内外の学会やセミナー、本プロジェクト・メンバーによる研究ワークショップ(平成28年12月、慶應義塾大学)で報告され、今後、分析の精緻化、および学術誌への投稿を進めていく予定である。このため、プロジェクト1年目の平成28年度は年度当初の研究計画に従って研究を進めることができていると言える。■国際貿易と企業の競争力国際産業連関表を用いてGlobal Value Chainを分析し,日本の製造業の国際競争力は付加価値ベースで低下していることを明らかにした(Kiyota et al. 2017)。また,輸出企業は生産性やマークアップが高いという既存の結果は,労働市場の完全性を前提としているため,その仮定を緩めて生産関数を推定した(Dobelaere and Kiyota 2017)。さらに,インドネシアのデータを利用して,貿易自由化に伴う価格,数量,品質の変化を分析し(Hayakawa et al. 2017),市場シェアの変化や参入退出が集計生産性に与える影響を分析した(Hayakawa and Matsuura 2017)。この他,環境関連財の貿易自由化が企業の収益力に与える影響を分析し,適切な規制下で自由化されるべきであることを明らかにした(Rui et al. 2018)。■産業集積と企業の競争力商業集積と企業の競争力に注目した実証研究を行った。商業集積における周辺企業の多様性など,周辺企業の属性が,企業の売上を向上させ,企業の競争力を高めることを明らかにした(Nakajima and Teshima 2018)。■国際貿易と産業集積の相互依存国際経済環境の変化が産業集積や企業の生産性に与える影響について,日本のデータを用いて実証分析を行った。

特に自国と近接国間の関税引き下げは,市場近接性に影響を与え,産業立地を変化させることを明らかにした(Nakajima and Okazaki forthcoming)。国際貿易と産業集積を分析するために,さまざまな定量的空間経済モデルが開発されてきたが,代表的なモデルの均衡は,McFaddenモデルから生成されることを明らかにした(Behrens and Murata 2018)。本年度は8件の論文(うち査読付き論文7件),1件の図書を公刊し,26件の学会報告(うち国際学会18回)を行った。また,査読なしの雑誌ではあるものの,今後の研究の指針となるサーベイ論文を1件執筆した。本研究は,「国際貿易と企業の競争力」,「産業集積と企業の競争力」,「国際貿易と産業集積の相互依存」の3つのテーマで構成されているが,その全てのテーマに関して,査読付き雑誌やその他の学術誌・図書への掲載,あるいは学会報告があった。未公刊の研究成果については,今後も国内外の学会やセミナーで報告し,分析を精緻化した後に,学術誌へ投稿する予定である。本研究の成果の中には,Journal of Urban EconomicsやJournal of Public Economicsといった経済学の分野でも定評のある査読付き雑誌に掲載されているものもある。さらに当初2019年に開催を予定していた国際研究集会を,1年前倒しで2018年にフランスのパリでEHESS-Keio University Workshopとして開催することができた。この国際研究集会では,Paris School of EconomicsやOECDで活躍する研究者と本研究プロジェクトのメンバーの間で,国際経済学・都市経済学の最新の研究に関する議論が交わされた。これらの成果を踏まえると,プロジェクト2年目の平成29年度は年度当初の研究計画以上に進展していると言える。本研究課題の3つのテーマについて以下の成果を得た。国際貿易と企業の競争力については、1)労働市場の不完全性を許した上でも輸出企業のマークアップが非輸出企業よりも高いことを示すことで、輸出企業、さらには直接投資を行う企業の競争力が高いことを示した(Dobbelaere and Kiyota, 2018)。2)石油の輸入国による権益獲得が石油価格に及ぼす影響について、2期間理論モデルを開発し、それを動学的パネル分析により実証することで、権益獲得は、現在の石油価格を上げ、将来の石油価格を下げることを示した(Morita, Higashida, Takarada, and Managi, 2018)。3)生産による汚染に対して異なる環境規制を課している国の間での、国際的な排出量取引の厚生効果を考察し、未解明であった経済厚生の改善条件を明示した(Tsubuku, Okimoto, and Takarada, 2019)。4)中国における貿易自由化の進展による競争圧力により、日本企業が中国における現地法人のイノベーション活動を活発化させ競争力強化を図っていることを明らかとした(Yang, Matsuura and Ito, 2019)。
近代における情報構造:ディスクール分析と映像分析

本研究の中心成果は『言語態分析』としてまとめられた。主に前半期に進められたこの研究では、ミシェル・フーコーの「知の考古学」における言説の概念、エミール・バンヴェニストの1960年代の仕事における発話の概念、そしてエリゼオ・ヴェロンの「創始の言説」のアイディアを柱として、「ことばの集合を分析する」ための道具立てをまずは徹底的に整理し直した。この際、文学や政治などの諸言説ジャンルを宙づりにして、発話に内在するリズムと、より大きな歴史的単位である言説におけるリズムを比較することで、歴史的分析の位置を明らかにした。また人文学を中心としながらもゲシュタルト心理学やアーヴィング・ゴフマンの相互作用の社会学などを参照しながら、メディア論として「映像」を中心としたマルチモダリティの情報をいかに分析するのかを、写真や新聞記事などを用いながら具体的に呈示した。研究の後半部は、ふたつの部分に分けられる。まずは1830年代のフランス社会を「後期近代」の開始と位置づけて、その消費社会のあり方を、市場の形成、視覚要素の強調、通信・交通のテクノロジーの発展から位置づけた。そして、同時代の社会主義やロマン派の言説を分析することに着手した。その一方で、現代のグローバリゼーションにおけるマルチモダリティ情報の分析という観点から、ドキュメンタリー映画と物語映画を分かつもの、またニュース、さらに史実と、諸言説がどのように適合し、どのように齟齬を起こすのかを分析した。最後に情報分析における倫理的な問いを、現代政治の場面に照合しながら、カントの「道徳」、デリダの「正義」から、<想像力>の問題として、具体的にはフォーク・ソングやハリウッド映画を題材に、ジャンル分けした。本年度は基礎的な研究を行った。まず20世紀の<言語理論>を検討するなかで、「発話」と「言説編成」との関係を整理した。個別・具体的な状況で発せられたことばの分析から、歴史のなかのことばの集まりへと、連続した歴史学(「考古学」)的な視点を手に入れることを重視した。「発話」はつねに複数者間の社会的関係(役割や相互行為、効果-力の関係)から成立している。また同時に「発話」は歴史のなかで、対立する言説(発話群)や同調する言説との関係で、一定のかたち、あるいはリズムを有している。「創始」の言説から言説編成への展開を、以下の分析要素により一貫した道具とすることにつとめた。言語理論、社会学、哲学、論理学、詩学など、また言語理論のなかでも、スピーチ・アクト(語用論)と論理の分析を、いかに言語外の社会関係と結びつけるかを考慮した。その上で、ことばの集積からなる歴史次元を「言説編成」として、個々の「発話」同士がいかに同調や反論のリズムをともないながら、同じテーマの上で構成されるのかを検証した。この基盤の上で、現代のことば(情報)である映像と音声を中心に、マルチモーダルな視点からテレビ番組、ドキュメンタリー映画、写真入り雑誌、都市のかたりなどを分析しつつ、方法論の有効性を問うこととした(以上、主に『言語態分析』として成果を刊行)。次年度に向けて、パリ、ニューヨーク、東京と、<近代>の構成における市場経済とヴィジュアルな要素の擡頭を歴史的に研究するための、方法論(道具)の確立を重視し、基礎研究の段階が終わったところである。同時に、今後の研究方向のための史料調査・文献調査、映像アーカイヴを中心に情報を収集し、実地研究の準備が整えられた。
希少性、秘匿性、新奇性をめざす絵画―北方マニエリスムにおける絵画形態多様化の諸相

本研究は、北方ヨーロッパの画家たちによって16世紀後半から17世紀にかけて制作された特殊絵画の包括的な研究を行うものである。金属板油彩画および石板油彩画が生み出された歴史的背景を検証し、それらが当初イタリアで制作され、その後、イタリア在住の北方画家たちによって北方ヨーロッパにもたらされたことを明らかにした。加えて、こうした特殊絵画に好まれた主題傾向や、支持体が作品に与えた象徴的意味、特殊絵画の展示形態などについて解明した。こうした成果に基づき、絵画形態の多様化は、画家たちが新奇で希少な絵画作品を産み出すために様々な素材を実験したマニエリスム美術を特徴づける現象であると結論づけたのである。本研究は、16世紀後半から17世紀にかけて北方ヨーロッパで流行した、石板や金属板、高価な布材に描かれた特殊絵画について包括的な研究を行い、新たな絵画の在り方を模索した北方マニエリスム美術特有の文化現象と位置づけることを目的とする。初年度である平成26年度は、石板油彩画について、現存作品のデータベース化を行うとともに、1絵画形態の誕生の経緯と北方ヨーロッパへの伝播2主題選択との関連性3特殊な支持体が芸術作品に与える象徴的価値4鑑賞形態のあり方5同時代の芸術理論との関係という5つの観点から、北方ヨーロッパにおける石板油彩画流行の発信地であった神聖ローマ皇帝ルドルフ2世の宮廷を中心に、調査研究を行った。その結果、1530年代のローマでイタリア人画家セバスティアーノ・デル・ピオンボによって初めて描かれた石板油彩画がアルプス以北に流布する上で大きな役割を果たしたのが、イタリアを訪れた北方画家たちであったことが、改めて確認された。また、アラバスターなどの斑紋は、聖人や怪物など超常的な存在の出現や奇跡を効果的に演出するために好んで用いられたことも判明した。プリニウスが『博物誌』で伝える、斑紋がアポロとムーサたちの姿を象るピュロス王の瑪瑙の指輪など、何等かの象形を示す石の斑紋は、自然自身の手による極めて貴重な芸術作品と捉えられていたこともあり、石の斑紋を絵画表現に巧みに転用することで、画家は、絵筆の力で自然と技を競うという意識も有していたと推測される。こうした石板油彩画は、プラハ城では、キャンバスや板に描かれた通常の油彩画が展示される回廊や広間ではなく、珍品、貴品が収められた「珍品室」に収蔵されていたことが、財産目録より確認される。石の斑紋が画家の構想力を鍛錬するのに役立つとするレオナルドの見解も当時の画家の間で知られており、石板油彩画の流行を後押ししたと考えられる。本研究は、16世紀後半から17世紀にかけて北方ヨーロッパで流行した、石板や金属板、高価な布材に描かれた特殊絵画について包括的な研究を行い、新たな絵画のあり方を模索した北方マニエリスム美術特有の文化現象と位置付けることを目的とする。2年次にあたる平成27年度は、リネン・絹本水彩画について調査研究を行った。その結果、絹本水彩画の現存作例は極めて少ないことが、改めて確認された。これは、カンヴァスに比べ絹やリネンは脆弱で保存に適さないことに加え、描かれた作品数そのものが実際に少なかったためと推測される。北方ヨーロッパにおける絵画の支持体としての布の使用に関しては、中世以来、カンヴァスに丁寧な地塗りを施さず、テンペラや油絵具を粗く直塗りする「布絵(Tuechlein)」と呼ばれる絵画が存在した。丁寧な地塗りの上から絵具層を幾重にも重ねて完成させる通常の板絵に比べ、制作時間を短縮できる「布絵」は、安価で軽量なことから、タペストリーの代わりに壁に掛けられたり、板絵を覆うカバーとして用いられたりすることもあった。一方、絹やリネンといった薄く高価な布地に透明水彩および不透明水彩絵具で描くリネン・絹本水彩画は、紙や羊皮紙を用いる通常の水彩画に比べ、敢えて高価で脆い素材を用いることにより生じる特別感を狙ったものと考えられる。ドイツの画家デューラーは、友人への贈答品として紙や羊皮紙の水彩画を好んで制作した。デューラーがラファエロに贈呈した《自画像》(現存せず)は最初期のリネン水彩画であるが、これは友人への贈呈品としての水彩画の延長線上に生まれたものといえる。その際、デューラーは、上質なリネンがもつ光の半透過性を利用して「ヴェロニカの聖顔布」を想起させる仕方で自画像を描いてみせたが、この逸話が、芸術的技量の卓越さを奇蹟画になぞらえて披露するという絹本水彩画の一つの在り方の原点となったと推測される。「研究実績の概要」でも述べたように、平成27年度は当初の研究実施計画通り、絹本水彩画の北方ヨーロッパにおける誕生の経緯、制作目的、象徴性等について、集中して調査研究を行い、新たな知見を得ることができた。これに加えて、平成26年度前半に、京都大学若手人材海外派遣事業研究者派遣プログラムを利用してドイツのトリーア大学に研究滞在して行った、16世紀後半以降の特殊絵画の隆盛を準備した15世紀の先駆的事例についての調査研究の成果を、英語論文に取りまとめて刊行した。

こうした過程で、デューラーなどの創意溢れる画家達が、中世以来の伝統的実践を十分に咀嚼した上で、支持体の物質性を操作して斬新な絵画表現を目指す試みを意欲的に行っており、こうした15世紀から16世紀初頭にかけての先駆的実験が、16世紀後半の特殊絵画興隆の素地となったことが明らかとなった。一方、本研究が扱う特殊絵画の中でも現存作例が最も多いのが、銅板油彩画である。当初の研究実施計画では、最終年度にあたる平成28年度を銅板油彩画の調査研究に当てる予定であった。しかし、作例数の多さに加えて、安土桃山時代に宣教師やキリシタンによって日本にも伝来していた銅板油彩画については、その重要性を鑑み、平成27年度に前倒しして予備調査を行った。その中で、銅板油彩画の流布については、1トスカーナ大公フランチェスコ1世の宮廷2アレッサンドロ・ファルネーゼ枢機卿と教皇ピウス5世の宗教観と美的趣味3北方ヨーロッパで盛んに制作されたキャビネット用はめ込み画の3点が重要な論点であるとの知見を得た。これにより、来年度、研究を一層効率よく進めることができるようになった。以上、本研究はおおむね順調に進展していると判断される。本研究は、16世紀後半から17世紀にかけて北方ヨーロッパで流行した、石板や金属板、高価な布材などに描かれた特殊絵画について包括的な研究を行い、新たな絵画のあり方を模索した北方マニエリスム美術特有の文化現象と位置付けることを目的とする。3年次にあたる平成28年度は、研究の総括に向けて、本現象を準備した15世紀以前の状況について、主たる調査研究を行った。本研究が主たる対象とする金属板や石板を支持体とする特殊絵画は、1530年代のイタリアで初めて描かれたが、それに類似した実践は15世紀以前にもごくわずかではあるが確認される。テオフィルス著『様々な技術についての提要』には、木板に貼った金属箔に油性顔料で絵を描く手法が紹介されており、これに該当すると推測される中世の遺物もわずかながら現存する。また、エナメル細工の中心地リモージュでは、無色透明なエナメルで金属板を包んで焼き、色付きのエナメル粉を筆で塗ってさらに焼成するエマーユ・パンの技法が15世紀には開発され、フランスの画家ジャン・フーケはこの技法を用いて、独創的なメダル型自画像を制作した(1450年頃、現ルーヴル美術館蔵)。一方、ドイツのデューラーは、板絵を金属板に見立てて錆の描写を加えることで、聖なる存在の現前を現実的かつ神秘的に表現する試みを行っている(1496年頃、カールスルーエ州立美術館蔵)。このように、15世紀、進取の画家たちが絵画作品の支持体に着目して、それを操作することで、今までにない斬新な表現を目指したのである。レオナルドも『絵画論』において、エマーユ・パン技法で制作された「絵画」は彫刻に比する耐久性を有すること、また、石の斑紋は画家の創造力を訓練するのに適した素材であることなど、16世紀の特殊絵画の展開を予見するような言説を残しており、こうした15世紀の諸々の試みが、16世紀の特殊絵画隆盛の素地を整えたといえる。「研究実績の概要」でも述べたように、平成28年度は、平成27年度に新たに得られた成果を受けて、16世紀の特殊絵画の隆盛の下地となった、15世紀以前の歴史的状況について、より踏み込んだ調査研究を行った。その結果、ドイツのアルブレヒト・デューラーに加えて、フランスのジャン・フーケ、イタリアのレオナルドなど、ヨーロッパ各地の進取の気風に富んだ画家たちが、絵画の物質性、とりわけ支持体に対する鋭敏な意識を形成していたことが確認された。これらに加えて、ヒエロニムス・ボスをはじめとするネーデルラントの画家たちの中には、甲冑に油彩で絵を描いたとの伝承を持つ者もおり、この点については、次年度、引き続き、追加調査する必要があると考える。
分子レベルでの膜構造変化から迫る力学的要因による溶血メカニズムの解明

コレステロールを含むリン脂質二重膜と含まない膜に対して,様々な速さで引張を与える分子動力学シミュレーション(MDS)を行った.その結果,コレステロールを含む膜かつ引張速さが遅い場合のみ膜の指組構造ゲル相への相転移が起こることが明らかになった.また,孔形成に必要な面積ひずみは引張速さの増加とコレステロールの含有のそれぞれの影響とそれらの交互作用効果を受けることが統計的に明らかになった.孔形成の初期段階である水分子の膜内への侵入のしやすさが引張による膜の相転移でどのように変化するかを明らかにするために,引張を受けた膜の水分子透過性を見積るMDSを行った.水分子透過性は引張に伴って,増加するが,膜の相転移が起こると,急激に減少した.このことから,引張による膜の相転移は水分子の膜内への侵入を妨げ,孔が形成しにくくなることが示唆された.秩序液相のリン脂質二重膜が引張を受けることにより指組構造ゲル相へ相転移するメカニズムを記述する数理モデルを構築した.数理モデルから予想された引張による膜面積の増加に伴う相転移進行度合いの変化は前述の引張シミュレーションから得られたものと一致した.本モデルは,膜の力学特性とその周囲の力学的環境がどのような場合において指組構造ゲル相への引張による相転移が起こるかを推測する上で有用となると考えられる.以上から,引張による相転移の詳細を明らかにするとともに,それが孔の形成に与える影響を明らかにした.このことから,赤血球膜破断の初期段階である孔の形成の分子レベルでのメカニズムが明らかになった.また,平成28年度行う予定であった膜破断の第二段階である孔の成長に関しても,成長のしやすさを決める膜の材料定数である孔壁での線張力係数の推定をMDSを用いて行った.その結果から,コレステロール分子には線張力係数を増加させ,孔の成長を妨げる働きがあることを分子レベルで明らかにした.27年度が最終年度であるため、記入しない。27年度が最終年度であるため、記入しない。
花器形質の画像情報に基づく定量的評価ならびに統計遺伝学的研究

花器形質などの作物の外観形質の遺伝性や多様化機構の解明を目的として、これまで定性的な評価がなされてきた作物器官の種々の外観形質を、デジタル画像から得られる多変量データの統計解析により定量的に評価した。デジタル画像からのデータの抽出にはコンピュータ言語Javaを用いて新たに作成したプログラムを用い、多変量データの解析には主に統計言語Rを用いた。トルコギキョウでは、花を側面から撮影し、花の形態を楕円フーリエ法および主成分分析により定量的に評価した。トルコギキョウの花冠形態の主要素である花の長幅比や花弁の曲がり具合などの形態的特徴は、遺伝子型の効果が大きな形質であることが明らかになった。ナタネでは、紫外線光下で撮影した花の画像のヒストグラム解析により、人間の目には黄色に見えるナタネの花は花弁の紫外線反射に大きな変異をもつことが明らかになった。また、コンピュータグラフィクスを利用した行動生態学的実験により、主要な花粉媒介昆虫である蜂が、実際のアブラナの花にみられる模様や形の変異を見分ける能力をもつことが明らかになった。さらにイネの不完全米について、デジタル画像から得られた色彩情報の多変量解析により、これまで人間の目では捉えることができなかった微細な変異を含めて、特徴量別に定量的な評価が可能になり、得られた評価値に基づいて、玄米の外観品質の精度の高い遺伝学的解析や、他の形質との相関分析などができるようになった。外観形質の定量的評価が可能になったことにより、今後、外観形質の形成に関わる遺伝子の同定や、優れた外観形質を安定的に形成する系統育成や最適な栽培・管理手法の構築が可能になると考えられる。
環境汚染物質に対する肺プロテオーム・メタボロームの応答に関するバイオインフォマティクス研究

本研究の目的は、データベース開発・構築の技術を習得することと、それを利用して2つのクラスの大気汚染物質間のメカニズムの違いと相乗効果による毒性を明らかにすることである。特に、以前からの研究テーマであるオゾンと1-ニトロナフタレンのラットに対する影響解析によって得られたメタボロームとプロテオームのデータを関連付けるための統合データベースの開発を提案した。データベースの設計は完了し、MySQLを用いてLungToxデータベースとして実装した。このデータベースの重要な部分は、発現パターンの影響を受けた部分をKEGGパスウェイ中で表示するところである。もともとトランスクリプトームデータ用に設計されたKegArrayがこの目的に適当であることが判明したので、プロテオーム・メタボロームデータを扱えるように拡張することを提案した。現在、この提案に沿ってKegArrayの改良が進められているところである。さらに、本研究に関連する代謝系のデータをKEGGプロジェクトに提供し、KEGGパスウェイデータに統合された。ラットの気道におけるプロテオーム解析は、以前所属していた研究室との共同研究が進められており、実験が終了次第LungToxデータベースに統合し、インターネットで公開する。今年度は、2次元電気泳動(2DE)における実験後の定量解析時に生じる変動誤差に関する研究も行った。以前の研究室で開始した研究を完了して論文としてまとめたところiHUPOでの年次総会のキーノートスピーチに招待された。この後2つのレビュー論文としてまとめた。1つ目はこれまでの研究の拡張で、新しくリリースされたImageMaster 2D Platinumの評価を含めたものである。2つ目は現状の2DE解析における変動誤差の原因を議論した招待論文である。ここでは2DEが有力な定量プロテオミクス手法となる原動力となった可視化を含めたソフトウェアアルゴリズムの改良についてレビューした。具体的な内容以下の通り。(1)タンパク質の可視化と画像認識、(2)内部標準化手法、(3)バックグラウンド除去アルゴリズム、(4)分布の正規性、(5)2DE解析ソフトウェアパッケージを評価するための標準化されたテストの必要性。本研究の目的は、大気汚染物質であるオゾンと1-ニトロナフタレンの相乗効果による毒性がどのようなメカニズムによるものかを明らかにすることである。研究分担者は以前の所属先であるカリフォルニア大学デービス校で、ラットにオゾンと1-ニトロナフタレンに照射し、プロテオームデータを収集する実験を行なってきた。京都大学では、これらのデータを解析するためのデータベースを開発し、既に京都大学で開発しているゲノムとパスウェイのデータベースであるKEGGと統合してメカニズムの解明に応用する。本年度は、プロテオーム解析の拡張として、気道内腔における炎症伝達物質のメタボローム解析を行なった。ここではデービス校のKara Schmeltzerの協力のもと、18のラットクループにおいてアラキドン酸・リノレン酸経路の35化合物と19種類のサイトカイン・ケモカインを解析した。その結果、長期的なオゾンの照射により、1-ニトロナフタレンを原因とする炎症応答が上昇することが明らかになった。特に、16種類のオキシリピンと7種類のサイトカインの濃度が統計的に有意な変化を見せた。このようにオゾンと1-ニトロナフタレンの相乗効果による肺に対する毒性を明らかにするためにはメタボロームデータが有効であることが分かった。プロテオームデータの方は、本年度購入したPhoretix 2D Expressionソフトウェアを用いた216枚の2Dゲルイメージの解析を進めている。現在、1,024個のスポットに対応するタンパク質の同定、アノテーション、定量化を行なっている。この作業が完了し次第、メタボロームデータとプロテオームデータを統合解析するためのデータベース化に取りかかる予定である。

(1)タンパク質の可視化と画像認識、(2)内部標準化手法、(3)バックグラウンド除去アルゴリズム、(4)分布の正規性、(5)2DE解析ソフトウェアパッケージを評価するための標準化されたテストの必要性。
悪性リンパ腫でのエピジェネティクス関連遺伝子異常とNFkBシグナルとの関係

(1)びまん性大細胞型リンパ腫で、長期の完全寛解の後に再発した腫瘍で初発時と再発時とで遺伝子変化を比較し、再発の機序を推定した。ターゲットシークエンスは、計18の対検体で解析可能であった。そのうち、9対ではMYD88, CD79B, RHOA, TNFRSF14, PIM,MLL2, CREBBP, PRDM1, MEF2Bが共通でそれぞれに、初発時のみ、再発時のみに変異があった遺伝子が加わっていた。他の9対では、免疫グロブリンの共通再構成を見つけられたにもかかわらず、共通の遺伝子変異がなかった。2例が再発時のみに腫瘍にPD-L1陽性を示し、そのうち1人はFISHで9p24の増幅を認めた。また、5例が再発時にMYCの陽性化を認め、急速に腫瘍増大をみた。(2)晩期再発後の急速な腫瘍の増大は、一部はmycの変異活性化、一部は免疫学的監視機構からの離脱である。1例のALK陽性未分化大細胞リンパ腫でエクソン2から17までのスキッピングがあることが判明した。検体で、ALK遺伝子の両端を認識するprobeを用いてFISH法を行うと5'のみの欠失を生じていることが判明した。Western blot解析でALK産物は、正常の220kDより、小さい100kDであった。Taqman法でゲノムの定量化を行い、エクソン2から17あたりの欠失を想定し、エクソン1と18とでPCRを行うと欠失していることが確認された。欠失したALK遺伝子をNIH3T3細胞に導入することにより造腫瘍性を確認し、さらに恒常的に下流のALK, STAT3のリン酸化を認めたため、あらたな、ALK遺伝子の活性化であると結論した.悪性リンパ腫細胞でのHLA発現、NFkB関連遺伝子の異常と周囲、末梢血のリンパ球数、浸潤細胞の種類を検討した。144例のR-CHOP療法を施行されたDLBCLで検討した。多変量解析でHLA-Class II発現の低いことは予後不良と抽出された。一方でHLA Class I発現の低いことは単独では予後不良因子とはならなかった。Rituximabの併用によりClass I陰性であってもADCCによって細胞障害を受けるためと考えると説明可能であった。しかし,末梢血リンパ球数,CD3数が少ない場合には、発現が高いことが予後不良因子となっていた。NK細胞による細胞障害効果の有無が予後に関係する可能性が有り,リンパ球が少ないとClass Iの陽性細胞でNK細胞による免疫細胞からの認識がなくなってしまい予後が逆転したのであろう。Class IITA遺伝子あるいは,PDL1, L2遺伝子の発現及び,転座dataの有無をホジキンリンパ腫、縦隔B細胞リンパ腫,その中間型灰色リンパ腫で検討した。既報と異なり日本人ではClass IIITA遺伝子の転座による失活は少なく、ホジキンリンパ腫では,PDL1の発現が高久、縦隔B細胞リンパ腫ではPDL2が高く,PDL1, L2の発現は相互排他的であった。灰色リンパ腫では,縦隔B細胞リンパ腫のパターンであった。ホジキンリンパ腫ではその半数が陰性調節遺伝子であるTNFAIP3遺伝子が変異あるいは,欠失を生じている。周囲の浸潤細胞との関係ではCD25遺陽性細胞でみたTreg細胞,CD68圧砕棒陽性細胞,PD1陽性細胞はそれぞれ,半数のホジキンリンパ腫で認めたがこれらの関係ははっきりしなかった。臨床検体とその臨床情報の収集を行い、1999年以降,現在まで国立がん研究センター中央病院で悪性リンパ腫と診断された患者のうち核酸抽出が可能な十分量の凍結細胞あるいは,ホルマリン固定パラフィン包埋標本が保存されている患者を対象として,診断のために採取された検体から日常診療に供された後の残余FFPEまたは,凍結組織標本が核酸抽出に用いられる検体を収集した。免疫染色,FISH法、FICTION法を行い、NFkB関連遺伝子のA20, Blimp1遺伝子の欠失有無とヒストンリジン脱メチル化酵素であるJMJD2C遺伝子の増幅の有無を調べる。ホジキンリンパ腫は50例、縦隔原発びまん性大細胞型B細胞リンパ腫では30例程度である。p50,p52, p65, RelB, c-Relの核内発現の有無は未染である。悪性リンパ腫で、ターゲットシークエンスを行った。そのうち、9対ではMYD88, CD79B, RHOA, TNFRSF14, PIM,MLL2, CREBBP, PRDM1, MEF2Bが共通で、初発時のみ、再発時のみに遺伝子変異がが加わっていた。他の9対では、免疫グロブリンの共通再構成を見つけられたにもかかわらず、共通の遺伝子変異がなく、パネルに含まれていなかった「ドライバー」遺伝子の変異を検出出来なかったことが考えられた。late relapseは不均一であり、多くはnon-GCBタイプで、サブクローンによる。明らかに、別クローンであるものが含まれる。免疫遺伝子再構成でのクローンの同一性を最初に調べたがlate relapseであり、得られたDNAの質、特に過去の検体の質が悪く、検討できた対検体は思ったより少なくなってしまった。

しかし、ターゲットシークエンスでは、そのような検体でも解析可能であったため、計18対で意味がありそうな結果が出てきている。研究者の所属先異動もにより、多少の遅れにつながった。(1)びまん性大細胞型リンパ腫で、長期の完全寛解の後に再発した腫瘍で初発時と再発時とで遺伝子変化を比較し、再発の機序を推定した。ターゲットシークエンスは、計18の対検体で解析可能であった。そのうち、9対ではMYD88, CD79B, RHOA, TNFRSF14, PIM,MLL2, CREBBP, PRDM1, MEF2Bが共通でそれぞれに、初発時のみ、再発時のみに変異があった遺伝子が加わっていた。他の9対では、免疫グロブリンの共通再構成を見つけられたにもかかわらず、共通の遺伝子変異がなかった。2例が再発時のみに腫瘍にPD-L1陽性を示し、そのうち1人はFISHで9p24の増幅を認めた。また、5例が再発時にMYCの陽性化を認め、急速に腫瘍増大をみた。(2)晩期再発後の急速な腫瘍の増大は、一部はmycの変異活性化、一部は免疫学的監視機構からの離脱である。1例のALK陽性未分化大細胞リンパ腫でエクソン2から17までのスキッピングがあることが判明した。検体で、ALK遺伝子の両端を認識するprobeを用いてFISH法を行うと5'のみの欠失を生じていることが判明した。Western blot解析でALK産物は、正常の220kDより、小さい100kDであった。Taqman法でゲノムの定量化を行い、エクソン2から17あたりの欠失を想定し、エクソン1と18とでPCRを行うと欠失していることが確認された。欠失したALK遺伝子をNIH3T3細胞に導入することにより造腫瘍性を確認し、さらに恒常的に下流のALK, STAT3のリン酸化を認めたため、あらたな、ALK遺伝子の活性化であると結論した.次世代シークエンス解析にはLife technology社のIon Torrentシステムを使用する。検体から抽出したDNAを用いてライブラリーを作製する。症例ごとにエマルジョンPCRでタグ付けを行い、マイクロチップを用いたシークエンス反応をする。各遺伝子で変異や融合を検出した検体に関しては、変異・融合検出の感度・正確性を把握するため、サンガーシークエンスによりコール結果を確認する。VDJ再構成をNGSで検討できないかと考えている。PCR法の限界で、増幅されないDNAでも、NGSによるターゲットシークエンスでは変異遺伝子が検討出来た対サンプルがあったためである。リンパ性腫瘍では抗原受容体遺伝子再構成の解析はまず、最初におこなうべきである。次年度中に代表研究者が異動することになり,研究設備のセットアップなどの経費が必要になることが予想されたため,次年度に一部を回した。申請者異動により、研究費の執行が遅れた。旧所属先の所属研究者の使用予定として、論文化のための費用として使用される。異動の際のインフラを整える。
光合成単細胞真核生物(ユ-グレナ)プロテインキナーゼCの機能解析と分子進化

細胞内情報伝達過程において蛋白質リン酸化酵素(プロテインキナーゼ)は重要な役割を演じている。プロテインキナーゼは5つのグループに分類されるが、その中でも、主にセカンドメッセンジャーと呼ばれる分子を情報仲介役として必要とするAGCキナーゼグループは特に多種多様な機能、制御機構を持ち、生命の維持を司る主要なものであるといえる。哺乳類や酵母ではその構造、機能などの研究は進展しているが、植物や原生植物などにおいては未知の部分が多い。そこで本研究では、分類学上動物、植物の双方に位置する原生生物、Euglena gracilisを材料とし、AGCキナーゼファミリー遺伝子に注目し、進化の道筋をその根源的な形を有する生命体までさかのぼることによって、その原始的な存在状態を解析することを目的とした。既知のプロテインキナーゼにおける相同性の高いアミノ酸配列領域に基づいて設計されたオリゴヌクレオチド混合プライマーを用いて、対数増殖期にあるEuglena gracilisより抽出したmRNAを鋳型としてReverse Transcriptase Polymerase Chain Reaction(RT-PCR)を行った。得られたPCR産物をサブクローニングし、その塩基配列を解析した。さらにcDNAライブラリーを作成し、^<32>PでラベルしたRT-PCRプローブを用いプラークハイブリダイゼーションによるスクリーニングを行った。陽性クローンからプラスミドを回収し、インサートDNAの塩基配列を解析した。PT-PCRの結果、12種類の異なるPCR産物を得た(PK-1-12)。いずれもAGCキナーゼファミリーと最も高い相同性が認められた。その内PK-8を用いてcDNAライブラリーからのスクリーニングを行った結果、挿入断片がそれぞれ1.6、1.4、2.5、1.6kbpの大きさの4種類のキナーゼクローン(EPK-3、EPK-4、EPK-16、EPK-19)を得た。そのキナーゼ触媒ドメインの部分配列はPKC、PKA、RACなどのAGCキナーゼと部分的に高い相同性が認められた。またこれらEPK遺伝子群に既存のAGCキナーゼを加えクラスター分析を行った結果、AGCキナーゼはPKA、PKC、RAC等のそれぞれがクラスターを形成したが、EPK遺伝子群はAGCキナーゼグループに対してアウトグループを形成した。これらのことからEPK遺伝子群はAGCキナーゼの起源的な構造を持つ可能性があることが示唆された。本年度の本研究では、ミドリムシ(Euglena gracilis Z)からPKCの分離、精製を試み、硫安沈殿及び二段階のカラムクロマトグラフィー(陰イオン交換カラムクロマトグラフィー、疎水性カラムクロマトグラフィー)により、リン脂質依存性/カルシウム依存性PK活性画分を得、これについて免疫化学的解析及び自己リン酸化能を行った。その結果、ミドリムシにはPKC活性が発現されていることが判明した。次に、既知のPKC遺伝子のアミノ酸配列のアライメントをもとに、その保存領域の混合プライマーを作製し、それらを組み合わせて、ミドリムシmRNAを鋳型に用いてReverse Transcriptase-Polymerase Chain Reaction(RT-PCR)を行った。得られたPCR産物をクローン化シ、その塩基配列の解析を現在行っている。

その結果、プロテインキナーゼと考えられる配列を持つクローンを確認している。このキナーゼは小麦由来のアプシジン酸誘導プロテインキナーゼのキナーゼドメインの一部とアミノ酸レベルで92.5%の相同性を有していた。現在、RT-PCRフラグメントクローンの塩基配列の決定を繰り返し、PKCホモローグ遺伝子の同定を目的に研究を行っている。細胞内情報伝達過程において蛋白質リン酸化酵素(プロテインキナーゼ)は重要な役割を演じている。プロテインキナーゼは5つのグループに分類されるが、その中でも、主にセカンドメッセンジャーと呼ばれる分子を情報仲介役として必要とするAGCキナーゼグループは特に多種多様な機能、制御機構を持ち、生命の維持を司る主要なものであるといえる。哺乳類や酵母ではその構造、機能などの研究は進展しているが、植物や原生生物などにおいては未知の部分が多い。そこで本研究では、分類学上動物、植物の双方に位置する原生生物、Euglena gracilisを材料とし、AGCキナーゼファミリー遺伝子に注目し、進化の道筋をその根源的な形を有する生命体までさかのぼることによって、その原始的な存在状態を解析することを目的とした。既知のプロテインキナーゼにおける相同性の高いアミノ酸配列領域に基づいて設計されたオリゴヌクレオチド混合プライマーを用いて、対数増殖期にあるEuglena gracilisより抽出したmRNAを鋳型として、Reverse Transcriptase Polymerase Chain Reaction (RT-PCR)を行った。得られたPCR産物をサブクローニングし、その塩基配列を解析した。さらにcDNAライブラリーを作成し、^<32>PでラベルしたRT-PCRプローブを用いプラークハイブリダイゼーションによるスクリーニングを行った。陽性クローンからプラスミドを回収し、インサートDNAの塩基配列を解析した。RT-PCRの結果、12種類の異なるPCR産物を得た(PK-1-12)。いずれもAGCキナーゼファミリーと最も高い相同性が認められた。その内PK-8を用いてcDNAライブラリーからのスクリーニングを行った結果、挿入断片がそれぞれ1.6、1.4、2.5、1.6kbpの大きさの4種類のキナーゼクローン(EPK-3、EPK-4、EPK-16、EPK-19)を得た。そのキナーゼ触媒ドメインの部分配列はPKC、PKA、RACなどのAGCキナーゼと部分的に高い相同性が認められた。またこれらEPK遺伝子群に既存のAGCキナーゼを加えクラスター分析を行った結果、AGCキナーゼはPKA、PKC、RAC等のそれぞれがクラスターを形成したが、EPK遺伝子群はAGCキナーゼグループに対してアウトグループを形成した。これらのことからEPK遺伝子群はAGCキナーゼの起源的な構造を持つ可能性があることが示唆された。
ヒト炎症細胞上のニューロペプタイドレセプターの分子生物学的解析

はじめに、当初予定していた炎症細胞上のニューロペプタイドレセプター数の直接的測定に関しては、実際には手技上の問題等にて、現時点では詳細な解析に耐えうる精度が得られないと判断したため中断し、Substance P(SP)等のニューロペプタイドがI型アレルギーに際して実際に炎症細胞に対してレセプターを介して作用しているかどうかを確認するために、以下の如き検討を行なった。すなわち、鼻アレルギー患者及び正常者の末梢血中好酸球、好中球膜表面上の、1)Adhesion molecule(LFA-1、Mac-1、VLA-4)の発現及び、2)好酸球自体の活性化(EG2陽性率)に対するSPの作用につき検討した。SPは10-810-4M、30min、incubation及び10-7Mにて30、60、120min、incubationにて検討した。また、Adhesion moleculeの発現はFlow cytometryにて、EG2陽性率は免疫染色にて測定した。結果は1)では、アレルギー患者群、正常者群共に各Adhesion moleculeの発現にいずれのSP dose、incnbation timeにても有意な変化は認められなかった。ただ、同様に好中球をSPにて刺激した際にSP10-4Mという高濃度刺激時のみMac-1の発現に増強が見られた。2)においても、SP刺激による活性化好酸球の有意な増加は、アレルギー患者、正常者いずれの群においても認められなかった。以上の如く、今回施行した実験結果はいずれもnegative dataであったため、研究発表や著作へは直接的には結びつかなかったが、ニューロペプタイドの分子生物学的解析のさらなる発展のためにも意義のある研究であったと考えられる。