hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
漢方治療による腎機能改善メカニズムの解明と臨床応用

そこでシスプラチン腹腔投与によるAKIモデルを用い、上記の週齢による薬効の差異を統計学的に検討した。老齢マウスに黄耆を投与しておくと、シスプラチンによる実験的AKIでも血中マーカーであるBUN, CREは上昇が有意に低下し、黄耆投与により急性腎不全症状が引き起こされず、正常状態が維持された可能性が考えられた。一方、大黄では健常マウスでBUNが低下することが認められたことから、急性腎不全によるBUNを改善したという結果には至らず、別の原因で一過性にBUNが低下した可能性も考えられた。本研究計画の開始から、慢性腎臓病(CKD)の原因が長期にわたる急性腎障害(AKI)などの急性症状の積み重ねにより発症するというプロセスを考え、これら個々の急性症状の対処療法として漢方薬が重要な役割を果たす可能性を考えた。従って、急性腎障害に効果を示す漢方薬を見出し、その薬効の詳細を実験的に明らかにすることができた。特に、老齢マウスのAKIに黄耆が有効であることが認められ、おそらく老齢による代謝不良を改善するメカニズムがAKIに有効な可能性が伺えられた。シスプラチン投与による急性腎障害(シスプラチンAKI)を用いて、前年度の腎虚血再還流AKIで薬効を認めた黄耆について解析を行った。まずCKDの発症頻度が高い老齢時期に注目し、老齢マウス(生後1年以上)での黄耆の効果を検討した。当初、20 mg/kgシスプラチンを投与してAKIモデルを作成しようとしたが、若年マウス(10週齢)と比較して、ほとんどの老齢マウス(生後1年のマウス)は投与3日目までに致死に至った。そこでシスプラチン投与量を14 mg/kgにしたところ老齢マウスが生存でき、さらに腎組織切片を用いた解析で、老齢マウスでのみ明らかなAKI症状が引き起こされることを確認した。通常の飼料で飼育した老齢マウスでは、14 mg/kgシスプラチン投与後3日目で血清クレアチニン(CRE)や血清尿素窒素(BUN)が有意に上昇し、腎組織障害についても尿細管の血液細胞浸出が顕著に認められる組織像であった。一方、この老齢マウスに予め黄耆含有飼料で飼育した(黄耆100 mg/kg/1日)ところ、黄耆投与を2週間以上続けたマウスでは、14 mg/kgシスプラチン投与後3日目のCRE・BUNの上昇は認められず、健常レベルと有意差がなかった。またシスプラチンによる腎組織障害も明らかに軽減していた。既に黄耆がシスプラチンの副作用に有効であることが報告され、またシスプラチンの副作用の主病態が腎障害であることから、黄耆薬効と腎障害改善の関連性が強く示唆される。おそらく老齢マウスでのみ発現するシスプラチン感受性因子が存在し、それが黄耆によって発現抑制されるか不活性化する分子メカニズムの可能性が考えられた。(1)黄耆の急性腎不全に対する薬効の検討については、前年度に行った黄耆投与方法での急性腎不全の改善効果で、腎臓の組織学的または組織化学的検討により黄耆投与に改善効果が組織レベルで確認できるかを検討する。(2)生薬黄耆の投与方法に関する検討については、これまでのスポット的な投与方法とは異なり、少ない投与量で時間をかけて投与する方法で急性症状の発症が抑えられるかについて検討する。黄耆を含有させたマウス飼料を作製し、マウスに長期間投与させる。一定時間投与させたマウスを用いて腎虚血再還流実験を行い、マウス血清よりBUNやCRを測定してその効果について検討する。
欠陥制御・界面制御に基づく窒化ガリウム系デバイス構造の高信頼化

GaNおよびAlGaN混晶の表面結晶欠陥および不純物の振舞いを詳細に評価し、金属界面特性・絶縁体界面特性との相関、および、デバイスの電流崩壊、漏れ電流および劣化・破壊現象との関連性を系統的に調べてこれらの機構を明らかにし、表面欠陥制御・界面制御に基づきデバイスの信頼性・安定性の向上に直結する知見を得ることを目的とした。1)Al<0.26>Ga_<0.74>N混晶にショットキー接合を形成し、過渡容量応答解析を行ない、深い準位を評価した。秒オーダーの時間領域で解析することにより、伝導帯下端より0.9eVの位置に電子捕獲準位が1x10^<16>cm^<-3>程度の高密度で存在することを明らかにした。2)CN_x/SiN_x複合膜構造を利用した拡散プロセスを開発し、GaNへの炭素ドーピングを行なった。N_2雰囲気中で1000°C程度の熱処理を行なうことにより、炭素がGaN中へ拡散することを確認し、拡散した炭素は主として深い準位として振る舞うことを明らかにした。3)窒素ラジカル処理、超薄Al膜堆積、真空アニールにより、AlGaN表面近傍の窒素空孔欠陥と酸素不純物を低減する表面制御プロセスを開発し、Ni/AlGaNショットキー接合において、逆方向漏れ電流の大幅な低減と電流-電圧特性の明確な温度依存性を実現した。4)GaNおよびAlGaNとの絶縁膜界面を種々のプロセスにより形成し、高温および光照射下での容量-電圧測定により、禁制帯中央から価電子帯上端に分布する界面準位のふるまいを初めて明らかにした。また、界面準位の抑制には、超薄Al酸化膜制御層が有効であることを示した。5)AlGaN/GaNヘテロ構造トランジスターを製作し、高温におけるoff-stateバイアスストレスによりDC特性がどのように変化するかを調べた。SiN_x膜のみの表面保護を行なった場合、ストレス後にドレイン抵抗の増加による特性劣化が見られたが、Al超薄膜を利用した表面制御プロセスを施したデバイスでは劣化が全く見られなかった。GaNおよびAIGaN混晶の表面結晶欠陥および不純物の振舞いを詳細に評価し、金属界面特性・絶縁体界面特性との相関、および、デバイスの電流崩壊、漏れ電流および劣化・破壊現象との関連性を系統的に調べてこれらの機構を明らかにし、表面欠陥制御・界面制御に基づきデバイスの信頼性・安定性の向上に直結する知見を得ることを目的として、研究を行った。得られた主な成果を以下にまとめる。1)窒素ラジカル処理、超薄Al膜堆積、真空アニールにより、AlGaN表面近傍の窒素空孔欠陥と酸素不純物を低減する表面制御プロセスを開発し、Ni/AlGaNショットキー接合において、逆方向漏れ電流の大幅な低減と電流-電圧特性の明確な温度依存性を実現した。2)GaNおよびAlGaNとの絶縁膜界面を種々のプロセスにより形成し、高温および光照射下での容量-電圧測定により、禁制帯中央から価電子帯上端に分布する界面準位のふるまいを初めて明らかにした。3)AlGaN/GaNヘテロ構造トランジスターを製作し、ゲートにパルスバイアスを加えた場合のドレイン電流の過渡応答を詳細に解析した結果、エネルギー的に連続分布を持つ表面準位が電流不安定性の主因であることを明らかにした。

4)上述1)の表面制御プロセスをPd/AlGaN/GaN構造に適用し、漏れ電流の抑制されたショットキー接合型水素センサーを作製し、高感度動作および高温安定動作を確認した。5)オープンゲート型のAlGaN/GaN化学センサーを試作し、種々の溶液中におけるAlGaN表面のポテンシャル制御性を詳細に評価した。その結果、溶液のpH値変化に線形的に対応したポテンシャル制御が確認され、高感度・高安定化学センサーとしての応用が有望であることを見いだした。AlGaN混晶の表面結晶欠陥および不純物の振舞いを詳細に評価し、金属界面特性・絶縁体界面特性との相関、および、デバイスの電流崩壊、漏れ電流および劣化・破壊現象との関連性を系統的に調べてこれらの機構を明らかにし、表面欠陥制御・界面制御に基づきデバイスの信頼性・安定性の向上に直結する知見を得ることを目的として、研究を行った。今年度得られた主な成果を以下にまとめる。2)CN_x/SiN_x複合膜構造を利用した拡散プロセスを開発し、GaNへの炭素ドーピングを行なった。N2雰囲気中で1000°C以上の熱処理を行なうことにより、炭素がGaN中へ拡散することを確認し、拡散した炭素は主として深い準位として振る舞うことを明らかにした。3)O_2プラズマおよびN_2Oプラズマを利用し、故意にAlGaN表面に薄い酸化膜を形成して、ショットキー接合の電流-電圧特性の変化を調べた。両プラズマプロセスともに表面に2nm程度の酸化膜を形成したが、N_2Oプラズマを照射した試料で漏れ電流が劇的に減少した。AlGaN表面のN-O結合の存在が電気的特性に大きく影響を及ぼすことを明らかにした。4)AlGaN/GaNヘテロ構造トランジスターを製作し、高温におけるoff-stateバイアスストレスによりDC特性がどのように変化するかを調べた。SiN_x膜のみの表面保護を行なった場合、ストレス後にドレイン抵抗の増加による特性劣化が見られたが、Al超薄膜を利用した表面制御プロセスを施したデバイスでは劣化が全く見られなかった。表面制御プロセスによりAlGaN表面の電子準位が抑制され、ストレス中の表面状態が安定に保持されたことを示唆する結果を得た。
アクティブ・ラーニングの質を高めるアーギュメント構成能力育成教師教育方略の開発

教師がアーギュメント構成能力の育成に自信をもって取り組むには,自らアーギュメントの指導法を具体的に立案したり実践したりする活動が必要である(McNeillら, 2016)。山本・神山(2017)の研究によって,アーギュメントを構成,評価する教師の能力向上が報告されているが,そのプログラムは主に講義とワークショップで構成されており,授業実践を伴う教師教育方略は未開発であった。そこで,本研究では,アーギュメントを小学校理科授業に導入するための授業実践を伴う教師教育方略を開発した。対象は,アーギュメントを指導した経験のない現職小学校教員Mの1名であった。プログラムの概要は,以下の通りであった。授業準備段階では, 4つの活動を設定した。まず,アーギュメントに関する研修会(90分)を行い, 1理科教育におけるアーギュメントの定義や意義が理解できるような講義とワークショップ(90分)を行った。次に,単元の検討会(90分)において, 2指導するアーギュメント構造を決定した。構造は,主張・証拠・理由付けからなる単純なバリエーションとした。その際は, 3アーギュメント各構成要素の内容を決定した。具体的には,「主張」に対する適切な学習問題,「証拠」で児童が収集するデータの量や質,「理由付け」として位置付く科学的原理をそれぞれ学習内容と具体的に照らし合わせて検討することであった。単元の検討会では,さらに, 4アーギュメントを単元や1時間の授業の中に導入するタイミングの吟味を行った。授業実施段階では,授業(45分)についてリフレクション(120分)を行った。その際は, 3つの活動を設定した。活動は, 5授業の動画記録を視聴してアーギュメントの指導場面を特定し, 6考察場面でなされた児童の発言をアーギュメントの構成要素に分類することであった。さらに,リフレクションでは, 7授業記録を基に,板書やワークシートでの支援方法の吟味を行った。
ダム建設によって滅失する集落の移転再生計画に関する調査研究-新潟県東蒲原群上川村の場合-

新潟県上川村室谷集落は、ダム建設のため全31戸が300m離れた高台に集団移転をした。1993年12月までにほぼ全戸が新集落に移転し、1年半の生活を送った。新旧両集落を比較して次のことがいえる。(1)共通して言える事は、新しい家屋は総二階になり床面積は相当増加した。中門が消滅して中央の玄関に変わり、そこから奥へ廊下が作られた。この廊下によってハレとケの領域が明確に分割された。ハレの領域は伝統的食い違い四間取りが踏襲されたが、その部分も横に延びる廊下で表座と裏座に分割されている。ケの部分では水場が一箇所に集まり、居間がヨリツキとして玄関脇に移動し、かつて無かった押入が出現し、便所も水洗となり、設備や居住環境が大きく改善された。(2)新集落の各家の敷地面積は、旧集落と同程度であり、その中で屋は敷地の西側でいっぱいに、旧集落と同じように東向きに置き、東を前庭にして付属屋を建てている。各家の外観は多種多様であるが、総じて寒冷地に適合する立方体型になった。東、西、北の壁面は窓が増えたが、南面は逆に減少している。南面を押し入れにした家が多いからである。屋根の形態は雪止めの無いコロニアルタイプが最も多いが、瓦葺きも二件あり、新たに暖房融雪型が二件出現した。また、高床式が15軒ある。(3)新集落において大きく変化したものとして次の事項が挙げられる。(1)敷地を舗装し、ホ-スで常時散水し、融雪している。(2)作業小屋を敷地内に取り込んで、かつての土間と同じ目的で使用している。(3)敷地の一部を囲ったりして敷地環境が明確になった。(4)花壇、庭が作られ、鑑賞用の樹木が植えられた。このように、集落は利便さといわゆる都会風を求めた方向に向かっている。自然落雪型の屋根によって、屋根に雪はなく、かつての雪国の景観は変わった。生活の必要性から、母屋に下屋を出窓を付け加え始めた。この新生活に人々は大いに満足している。旧集落は平成5年の早期で完全に消滅した。我々は平成3年から旧集落の実測調査を開始していたため、旧集落の形態と全家屋の形態と全家屋の詳細な記録をはじめ、旧集落・民家の温熱風環境についての計測も完了した。平成5年度までに行った調査・研究は以下のとおりである。(1)旧集落の形態、集落の道路の構成、池、水路、樹木などを調査し、図面を作成した。(2)旧集落の全家屋についての平面図及び敷地周辺図を作成した。(3)旧集落の伝統的家屋の室内温熱風環境及び新旧両集落の風柱状を継続計測した。(4)旧集落の住習慣を調査し、また、旧集落及び家屋の発展過程を追求した。(5)平成5年の時点での新集落の全家屋の間取りを採集し、旧家屋と比較、分析した。(6)新集落が作られ、さらに改善されていく過程を3年間に渡って記録した。

また、この間の人々の意識の変化や新集落・新家屋に対する満足度および不満足度を調査した。(7)解体移築家屋の構造、構法、材料などについて実測調査し、図面を作成した。(8)家屋の各部位の腐朽状態を調査し、腐朽度合いの計測方法を追求した。得られた主な知見は以下のとおりである。【.encircled1.】旧集落の特徴の一つである水路と池は、融雪や防火用水の役割ばかりでなく温熱環境に良い影響を与えている。【.encircled2.】旧家屋の茅茸き屋根、火棚、厚い板戸、室内に置かれた様々な生活用品は温熱環境に対して有利に作用している。【.encircled3.】旧集落の民家は18世紀末以降のものである。【.encircled4.】新集落の道の構成や家屋の配置は旧集落の形態を継承した。【.encircled5.】新集落の家屋の外観は多種多様で伝統的中門造りの形態は全く消滅した。【.encircled6.】間取りは食違い四間取りを継承した家と全く新しい形態に変えた家があり、その中でも幾つかに分類が出来る。一般に日常生活の場の改善が著しい。平成6年度に行った実測調査及び研究は以下のとおりである。(1)新集落における全家屋の形態と間取り、池、水路、囲い、花壇など内部及び外部空間構成を調査し、旧集落と比較分析した。図面などは完成している。(2)新家屋の屋根形態と積雪状況、除雪、融雪など冬の実生活を調査し、雪対策の観点から屋根形態や高床式の効果などを評価分析した。(3)新家屋の室内温熱環境を実測し、旧家屋と比較して改善された部分と未改善の部分を明確にした。(4)解体移築家屋を中心に、構法、仕口、継手等を調査し、地域的特徴を明らかにした。得られた知見:集落が移転して2年経過した状態を調査したわけであるが、人々は移転前に持っていた不安が少しずつ解消され、それぞれ選択した家屋の形態や間取りに対して、大部分の人は満足している。それは現代の技術を駆使した利便性が入ってきたからである。改善されたものは多く、特に間取りは台所や風呂場などが改善され、温熱居住環境や水周りを中心とした利便性は旧家屋と比較にならない程である。屋根は自然落雪型を採用し、敷地を舗装して屋根から落ちた雪を散水で融雪する方法も新たに生まれた。かつて積雪地域にはなかった複雑な屋根形態も多く現れて、建物の外観は現代風に変わった。高床にしたことで雪囲いが不要になり床下は車庫になった。人々は利便さと都会風を求めた集落造りに努めている。一方、一部には間取りに対する不満が現れたり、最新の暖房形式として選択したものが意外に不満であったりして、新たな問題が浮き彫りになりつつある。人々は実生活の必要性から新家屋に様々な物を付加し始めている。試行錯誤を繰り返しながら、新しい集落の形成に努めている過程が明確に見られる。平成7年度に行った実測調査及び研究は以下のとおりである。(1)新集落の発展の経過を追跡調査して、経年変化の様子を記録し、分析した。(2)地形の変化によって、新集落の気象、住環境が受ける影響を明らかにした。(3)サートレーサによる木材の非破壊腐朽計測法を追求した。(4)19年前にダム建設によって集団移転した下郷町沼尾集落を調査し、室谷の事例と比較分析した。得られた結果:(1)室谷・鍵取集落は移転して2年経過した。人々の評価は新集落・家屋に満足している。沼尾も現在の生活に満足している。それは両集落とも現代的設備による利便性の向上が最大の理由である。山深い集落にその利便性をもたらした最大の要因は車社会が到来したことに帰着する。
イオン会合体のサ-モクロミズムによるイオン識別とその機構の解析

ブロモフェノ-ルブル-(BPB),ブロモクレゾ-ルグリ-ン(BCG),テトラブロモフェノ-ルフタレインエチルステル(TBPE)などのトリフェニルメタン系陰イオン染料は第四級アンモニウムイオン(R_4N^+)又はアミン(R_3N)とイオン会合する。この会合がフェノ-ル基のOHに依存すると,アミンとのみ電荷移動錯体を形成する。R_4N^+とは1:1の単純イオン会合体を形成するが,これは電荷移動錯体ではない。前者は,1,2ーDCEやCHCl_3中において完全会合し,後者は解離状態にある。電荷移動錯体形成はアミノの塩基性度にその結合が依存することを見い出した。従ってアミンの構造により解離エネルギ-が異ることを利用すれば,サ-モクロミズムによる分子識別が可能となる。又,R_4N^+は解離しているので熱の影響は現れない。このことからイオンの識別が可能となる。この原理を利用することにより,まずR_3N^+の識別が可能であり,エネルギ-差を利用すればR_3N間の識別もできる。この化学反応を分離分析技術として導入したところ,別添のAnal,Chim,Acta 255,135(1991),Anal,Sci,7,297(1991),Analyst(in press)に見られる結果が得られた。例えば生体関連物質として注目されいるアセチルコリンとコリンを10^<ー6>Mオ-ダ-で検出でき,しかも他の生体アミンの影響を受けない。又殺菌消毒薬として最近幅広く利用されているセチルピリジニウムクロライドもアミノ共存下においても分別分析が可能となった。この反応でのサ-モクロミズムは温度が2540°Cと低いことから,装置としては簡便なものでよい。報告者らは温度調節機能を持ったフロ-セルを考案した。このセルの容量は8μlであり,材質をアルミニウムブロックとしていることから,温度変化に伴う熱伝導性に優れ,温度を変数とする分析化学的技法に十分に耐え得るものである。
半導体量子構造における表面音響波を用いた電子・光物性制御

超短光パルス照射によって半導体試料に励起された表面音響波を用いて試料中の励起子を輸送しまたその寿命を制御することを目的とした。このためにGHz領域の表面音響波伝播の時間分解2次元イメージングとフォトルミネッセンス2次元イメージングを試料の同一領域にて低温(10K)で行える測定装置を開発した。また、イメージングにおいて励起光と検出光を共に変調するヘテロダイン法を発展させた。さらに偏光を用いて音響波の歪成分を解析する方法を構築した。本研究の目的は、超短光パルス照射によって半導体試料に励起された表面音響波を用いて、半導体試料中の励起子を自在に輸送し、またその励起子の寿命を制御する手法を開発・発展させることである。半導体量子井戸層を表面近傍に持つ試料における表面音響波は、量子井戸層の伝導帯および価電子帯エネルギー準位を変調し、光励起された励起子を面内方向に閉じ込め輸送する動的なポテンシャル井戸を形成する。変調された伝導帯・価電子帯ポテンシャルの山同士・谷同士が同じ位置にできる場合は、励起子を構成する電子と正孔が空間的に分離され励起子の寿命が著しく増大する。何らかの方法でこの動的ポテンシャル井戸を消滅させることにより、励起子を再結合させることができる。このような動的ポテンシャル井戸による励起子輸送の研究はこれまで主として電気的に発生された表面波を用いて進められてきた。これに対して本研究では、表面音響波の生成をサブピコ秒程度の超短光パルスを試料に照射することによって行う。生成する表面音響波の典型的な波長は110μm程度である。表面音響波生成のための光あるいは別途照射された光によって生成された励起子を、音響波によって輸送する。その様子を発光および過渡的反射スペクトルの時間・空間分解イメージとして観測・解析する。本研究の目的は、超短光パルス照射にようて半導体試料に励起された表面音響波を用いて、半導体試料中の励起子を自在に輸送し、またその励起子の寿命を制御する手法を開発・発展させることである。半導体量子井戸層を表面近傍に持つ試料における表面音響波は、6量子井戸層の伝導帯および価電子帯エネルギー準位を変調し、光励起された励起子を面内方向に閉じ込め輸送する動的なポテンシャル井戸を形成する。今年度は、励起子再結合を検出するためのフォトルミネッセンス観測装置の立ち上げを行った。試料を液体ヘリウム温度に保持するクライオスタットと2次元CCD検出器を用いた1次元空間分解能を有する分光システムを構築し、空間分解フォトルミネッセンスの測定を行った。試料としてはGaAs基板およびGaAs/AIGaAs量子井戸構造を用いた。キャリアおよび音響波を励起するためのパルス光を試料上の2本の平行な直線状領域に照射し、発生するフォトルミネッセンスの空間的な分布を調べた。2本の励起領域の間隔は100μmのオーダーで、個別に遮断できるようになっている。1本だけで励起した場合と2本で励起した場合を比較すると、後者の場合の発光効率が低下することを見出した。これは一方の励起部位から伝播する表面音響波が、他方の励起部位の生成キャリアを掠め取っていくことによると考えられる。今年度は、前年度に立ち上げたフォトルミネッセンス観測装置の空間分解能を高めた新しいフォトルミネッセンスイメージング測定装置を開発した。これは表面音響波の時間分解イメージング装置と組み合わさったもので、共通の実験配置によりフォトルミネッセンスと音響波の2種類のイメージングを行うことができる。ミクロンスケールの空間分解能を有しつつ、クライオスタットによる低温測定も可能なように試料と試料直前の対物レンズ間の距離を10mm程度確保できるように設計されている。この装置によりパルス光励起によるGaAs試料表面のルミネッセンスイメージングの予備実験を行い、励起電子正孔対の拡散に対応すると考えられる特徴的なパターンを観測した。

またあわせて表面音響波検出に光弾性効果による複屈折現象を用いた場合の理論構築を行い、表面音響波イメージング結果から試料中の歪モードを同定することを可能にした。本研究の目的は、超短光パルス照射によって半導体試料に励起された表面音響波を用いて、半導体試料中の励起子を自在に輸送し、またその励起子の寿命を制御する手法を開発・発展させることである。量子井戸層を表面近傍に持つ圧電性半導体試料における表面音響波は、量子井戸層の伝導帯および価電子帯エネルギー準位を変調し、光励起された励起子を面内方向に閉じ込め輸送する動的なポテンシャル井戸を形成する。変調された伝導帯・価電子帯ポテンシャルの山同士・谷同士が同じ位置にできる場合は、励起子を構成する電子と正孔が空間的に分離され励起子の寿命が著しく増大する。対向する波の干渉や、金属膜による圧電場の短絡などの方法でこの動的ポテンシャル井戸を消滅させることにより、励起子を再結合させることができる。前年度に開発した時間分解表面音響波2次元イメージングとフォトルミネッセンス2次元イメージングを試料の同一部位に対して行える装置を改良し、ルミネッセンスイメージングの空間分解能を10μm程度にまで高めた。同装置と低温測定用のクライオスタットを組み合わせGaAs基板を用いた予備実験を行い、10K程度の温度で音響波・ルミネッセンスイメージを取得できることを確認した。また、ビームスプリッタとシリンドリカルレンズを用い、平行な2本の線状の領域を励起できる励起光学系を構築し、予備的な測定を開始した。さらに前年度に構築した光弾性効果による複屈折現象を用いた音響場検出の理論を整理し、専門学術雑誌Journal of the Optical Society of America Bに投稿、掲載された。この方法は試料面内方向に平行な変位にも感度を持ち、音響場の定量的測定にも有効である。前年度に開発・改良した時間分解表面音響波2次元イメージングとフォトルミネッセンス2次元イメージングを試料の同一部位に対して行える装置を用いて、試料上の一点に音響波励起用の光パルスを集光し、別の点にフォトルミネッセンス励起光パルスを集光して照射し、音響波伝播によってフォトルミネッセンス強度が変化するかどうかを調べた。各光の集光パターン、2点間の距離および光パルスの試料到達時間差を変化させながら詳細な測定を行ったが、音響波伝播によってフォトルミネッセンス強度が変調されていると明確に示す信号は得られなかった。
プロテインキナ-ゼによる酵母リン脂質代謝調節機構の解明

酵母のリン脂質代謝調節におけるプロテインキナ-ゼの役割を明らかにするために、プロテインキナ-ゼの変異株を用いてリン脂質合成酵素の活性を調べ、さらに合成酵素の遺伝子の発現についても検討した。まず酵素活性については、PS合成酵素の活性が、プロテインキナ-ゼの活性が低くなっている変異株においては、3-4倍上昇していることがわかった。このことから、プロテインキナ-ゼによりPS合成酵素がリン酸化をうけ、活性が低下することが強く示唆された。このプロテインキナ-ゼによる酵素活性の調節は、PS合成酵素に特異的であり、PI合成酵素、CDPコリン合成酵素の活性に変化はみられなかった。次にPS合成酵素の活性の変動が転写・翻訳レベルか、それ以後であるかを明らかにするために、PS合成酵素の遺伝子と大腸菌のlacZ遺伝子との融合遺伝子を作り、lacZにコ-ドされるβ-ガラクトシダ-ゼの活性を指標として、PS合成酵素遺伝子の発現の程度を調べた。その結果PS合成酵素の発現は、プロテインキナ-ゼの活性が高くなった株でも、低くなった株でもそれほど大きな差はみられなかった。このことから、プロテインキナ-ゼはPS合成酵素の発現には影響を与えず、翻訳後の修飾、おそらくは直接リン酸化を介して活性を調節していると考えらえる。しかしながら、これとは別に、増殖停止期においてはプロテインキナ-ゼの活性が高くなった株では低くなっている株に比べて、PS合成酵素の発現が25倍高くなっていたことから、増殖時期におけるPS合成酵素活性の調節には、プロテインキナ-ゼを介した遺伝子発現の変動が関与している可能性も考えられる。この点については現在検討中である。
微量金属元素が口腔扁平苔癬などの口腔粘膜疾患に及ぼす影響と診断基準の新規確立

本研究は口腔扁平苔癬などの口腔内に高頻度に出現する粘膜疾患の病態を組織中の元素分布分析の観点より解明することを目的に,国内にある大型放射光施設を利用して遂行した。平成27年度は口腔扁平苔癬(OLP)および口腔扁平苔癬様疾患(OLL),正常粘膜(Control)組織に対して元素分布分析と検出元素に対する化学状態分析,定量分析を行った。SR-XRF分析においては,OLP/Control群では外来および生体由来の微量元素の局在は認めなかったのに対し,OLL群では歯科用合金の主要合金成分が検出された。そして,XAFSによる化学状態分析では,OLL組織中での検出元素が水和イオンや硫化物,酸化物状態として存在していることが明らかとなった。濃度換算評価では,OLPやContorol組織に対してOLL群ではNiやCu,Zn,Crが12桁高い濃度であった。OLPやOLLは口腔外科領域では高頻度に出現する角化異常を伴う慢性炎症性病変で,前者は原因不明,後者はある程度原因が予測できるものとして区別されている。しかし,OLPとOLLの臨床像や病理組織像は極めて酷似しており,両者を鑑別することは困難である。また一部の病態においては癌化するとの報告もあり,臨床現場では両者の鑑別診断と治療法の確立が強く望まれている。本研究に用いた新たな高感度分析手法の導入により,これまでのOLLという概念から,metal-induced OLLという概念へ改めることが可能となり,これまでのOLLに対する対症療法から脱却し,原因金属を除去するという根治的な治療の実現が期待される。これは,潜在的癌化リスクの軽減にも繋がるものと考えられた。27年度が最終年度であるため、記入しない。本研究は口腔扁平苔癬などの口腔内に高頻度に出現する粘膜疾患の病態を組織中の元素分布分析の観点より解明することを目的に,国内の大型放射光施設を利用して遂行している。平成26年度は,放射光施設での分析における最適条件(試料の厚さやバッキング材料等)を確立し,これまで生物試料においては困難とされていた検出元素の定量評価を可能にする標準試料を作製した。また,実際の試料分析では口腔扁平苔癬(OLP)および口腔扁平苔癬様疾患(OLL)に対して研究を行った。OLP・OLLは臨床像・病理像が類似しているためその診断に苦慮する疾患である。また口腔外科領域では高頻度に遭遇する疾患で,一部の病態は癌化するとの報告もあり,両者の診断基準と現在の対症療法から脱却した治療法の確立は強く望まれている。我々の研究では,OLPやControl群では明らかな金属元素の検出が認められなかったのに対し,OLL群では歯科用材料に由来する金属成分が局在性に検出され,かつ金属状態ではなくイオン状態もしくは酸化状態で存在する傾向にあることが明らかとなった。これはOLLと歯科用合金との相関を示唆する結果であり,根治的な治療法の確立が期待される結果であった。さらに,OLPやOLLを疑う症例の場合,臨床現場では金属アレルギーパッチテストが施行されるが,これは必ずしも信頼生の高い検査ではない。そこで,ナノサイズの金属微粒子を用いて,現在使用されているパッチテスト試薬が有する欠点(高濃度金属塩水溶液,強酸性等)を克服した新規パッチテスト試薬の開発に成功した。大型放射光を用いた分析は医学応用では稀であるが,最適な分析条件を確立することができ,当初の予定よりも早期に実際の口腔粘膜疾患の分析に取り組むことが可能であった。OLPおよびOLLの有意差を認める結果は治療法の改善が期待され,また新規パッチテストの開発は実用が強く望まれる結果といえた。口腔粘膜疾患の試料数を追加し,金属元素と口腔粘膜疾患の病態発症の機序について解明し,診断基準および治療法の確立を目指す。さらにパッチテストの実用化に向けて他金属および合金に対しての試薬を開発する。
アンチセンスオリゴヌクレオチド血管内投与による悪性脳腫瘍遺伝子治療の試み

1.悪性脳腫瘍の遺伝子学的特性の検討:悪性脳腫瘍の遺伝子を抽出して、マイクロサテライト不安定性を検討し、10番染色体上のマイクロサテライト不安定性(DNA修復酵素の異常)が悪性度に関与しているという結果を得た。また、アポトーシスの免疫染色で、悪性脳腫瘍にはアポトーシスが少ないという結果も得られた。このことから、脳腫瘍の悪性化には遺伝子の異常が強く関与していることが伺われた。2.ラット生体内に投与した、臓器内アンチセンスオリゴヌクレオチドの定量法の確立:脳および肝臓・腎臓をラットより採取した後、フィルターを用いてDNA分画に生成した後、アクリルアミドゲル上で電気泳動を行い、メンブレン上にブロティングして固定した。このメンブレンに対して、RIで標識したセンスオリゴヌクレオチドを用いて定量した。われわれが確立したこの方法によって、生体内に投与した任意のアンチセンスオリゴヌクレオチドを抽出定量可能となった。3.ブラディキニン併用投与によるラット悪性脳腫瘍へのアンチセンスオリゴヌクレオチドの到達度増強:前述の手法を用いて、内頚動脈より投与したアンチセンスオリゴヌクレオチドの脳および脳腫瘍内到達度を検討した。ブラディキニンを併用投与することにより、脳腫瘍組織内へ1.4倍の任意のアンチセンスオリゴヌクレオチド到達率を増強することが可能であった。4.犬によるブラディキニン内頚動脈投与の安全性の確認:成犬20頭を用いてブラディキニン内頚動脈投与の安全性を確認した。犬の脳血流、血圧、脈をモニターしながらブラディキニンの内頚動脈投与を4つの異なる濃度で検討した。1r、2.5rではバイタルサインの大きな変化は認めなかったが、5r、10rではブラディキニン投与初期に脳血流の変化を認めた。はじめに我々が以前報告した、ブラディキニン内頚動脈内投与による脳腫瘍の選択的血管透過性亢進の方法が、アンチセンスオリゴの脳腫瘍内への選択的運搬が可能であるかを検討した。材料および方法生体内へ投与されたアンチセンスオリゴの抽出・定量法は確立しておらず、まず抽出・定量法を確立した。RG2グリオーマ培養細胞を用いてラット脳腫瘍モデルを作製し、アンチセンスオリゴの腫瘍内到達率を検討した。ブラディキニン内頚動脈投与群の対照群では生食を投与した。投与したアンチセンスオリゴはラット生体内に存在しない配列20塩基長を使用した。投与実験終了後直ちに脳組織を取り出し、腫瘍組織内と正常脳内のアンチセンスオリゴを定量した。結果生体内へ投与されたアンチセンスオリゴは、ます生体試料をフェノールで粗精製した後、メンブレンフィルター上に固定し、標識したアンチセンスオリゴに対するアンチセンスオリゴ(センスオリゴ)をハイブリさせ、フィルムに感光して定量を行った。アンチセンスオリゴの腫瘍内到達率は、対照群に比ベブラディキニン投与群で約2倍の到達率を示した。正常脳ではアンチセンス到達率に差はなかった。考察生体試料からのアンチセンスオリゴの定量法に確立したものはなかったが、今回われわれはあらたな方法を確立した。我々が以前報告した、ブラディキニン内頚動脈内投与による脳腫瘍の選択的血管透過性亢進の方法が、高分子化合物であるアンチセンスオリゴヌクレオチドも脳腫瘍内に選択的に運搬することを示した。次年度はこの研究をさらに進める予定である。アンチセンスオリゴヌクレオチドを用いた遺伝子療法の欠点は、アンチセンスオリゴが高分子であるため血管内投与では血管内にとどまるため、組織内到達率が低いことである。

今回我々はラット脳腫瘍モデルにおいて、ブラディキニンの内頚動脈内投与による腫瘍組織内選択的血管透過性亢進が、血管内投与されたアンチセンスオリゴの腫瘍内到達率を向上させることに応用できるかを検討した。[材料と方法]RG2 rat gliomacell lineをラット脳内に移植し、ラット脳腫瘍モデルを作成した。血管内投与するアンチセンスオリゴはラット生体内に存在しない20塩基配列を合成した。ラットの内頚動脈をカテーテルで確保し、ここからブラディキニン(10μg/kg/min)を投与し、アンチセンスオリゴを同時に投与した。対照群ではブラディキニンの代わりに生理食塩水を投与した。15分後にラット脳を取り出し、腫瘍組織、正常脳を採取し、DNAを抽出した。抽出したDNAをメンブレン上に固定し、アンチセンスオリゴに相補的なオリゴを用いて定量した。[結果]アンチセンスオリゴの組織内到達率は組織より定量したアンチセンスオリゴの量を組織の重さで除し、さらに血漿中のアンチセンスオリゴの濃度で除した値で評価した。ブラディキニン投与群では対照群に比べ、腫瘍組織内到達率は2.7倍であった。正常脳の部分では両群間に差はなかった。血管内投与されたアンチセンスオリゴは肝臓、腎臓に迅速に取り込まれるが、両群間で肝臓、腎臓内へのアンチセンスオリゴの取込に差はなかった。[考察]脳腫瘍の遺伝子療法は、その担体が高分子であるため血管内投与では組織内到達率が悪く、局所投与が行われているのが現状である。我々は、ブラディキニンによる腫瘍組織内選択的血管透過性亢進が低分子の物質(化学療法剤)だけでなく、高分子にも有効であることを示してきた。今回の結果より、この選択的血管透過性亢進法がアンチセンスオリゴヌクレオチドの腫瘍組織内到達率を向上させることにも有効であることが判明した。この方法によって、特定の遺伝子の発現を抑制するアンチセンスオリゴを血管内より脳腫瘍組織内に到達させることができると思われる。1.悪性脳腫瘍の遺伝子学的特性の検討:悪性脳腫瘍の遺伝子を抽出して、マイクロサテライト不安定性を検討し、10番染色体上のマイクロサテライト不安定性(DNA修復酵素の異常)が悪性度に関与しているという結果を得た。また、アポトーシスの免疫染色で、悪性脳腫瘍にはアポトーシスが少ないという結果も得られた。このことから、脳腫瘍の悪性化には遺伝子の異常が強く関与していることが伺われた。2.ラット生体内に投与した、臓器内アンチセンスオリゴヌクレオチドの定量法の確立:脳および肝臓・腎臓をラットより採取した後、フィルターを用いてDNA分画に生成した後、アクリルアミドゲル上で電気泳動を行い、メンブレン上にプロティングして固定した。このメンブレンに対して、RIで標識したセンスオリゴヌクレオチドを用いて定量した。われわれが確立したこの方法によって、生体内に投与した任意のアンチセンスオリゴヌクレオチドを抽出定量可能となった。3.ブラディキニン併用投与によるラット悪性脳腫瘍へのアンチセンスオリゴヌクレオチドの到達度増強:前述の手法を用いて、内頚動脈より投与したアンチセンスオリゴヌクレオチドの脳および脳腫瘍内到達度を検討した。ブラデイキニンを併用投与することにより、脳腫瘍組織内へ1.4倍の任意のアンチセンスオリゴヌクレオチド到達率を増強することが可能であった。
ローレンツカによる回転体の非線形振動に関する研究

理論解析と実験により検討したことを要約すると次のようになる.1,測定した磁場Bから解析的に求めた減衰係数と打撃試験から求めた減衰係数はほぼ一致した.ただし,実験で求めた減衰係数の誤差が大きいので,さらなる検討が必要と思われる.2,磁場Bの分布を実際に測定することにより,解析モデルで仮定した1組の電流ループによる磁場のモデルが妥当であることを確認した.3,実験では,不安定振動は必ず1次の固有振動数以上で発生し,ゆっくり成長するが,一度発生すると振動はおさまらなかった.4,理論解析では,不安定振動が発生する回転数は1次の固有振動数以下でもあり得る結果となった.5,理論解析により,不安定振動は,磁場Bの分布が非線形であることが原因で剛性項の非対角要素に正負の非対称項が存在するために発生することがわかった.磁場Bが一定値の場合はこの非対称項が存在しないため,不安定振動は発生しない.6,電流の強さを強くすると,安定限界の回転数が低くなった.これは理論解析でも同様の結果となった.7,理論解析では,1次の固有振動数以下で不安定振動が発生し得るので,今後さらに解析モデルを検討することが必要である。
生体修復用金属材料の生体適合性の定量的評価

生体修復用金属材料のin vitroな評価法を確立する第一歩として、歯科用、整形用実用材およびその基本となる二元、三元合金の分極実験を行い、これらの金属材料の化学的安定性を定量的に評価した。得られた主要な結果は以下の通りである。1AuーCu二元合金の定電位分極において、電流密度の積分値(Q)から計算されたCu溶出量と、原子吸光分析結果が一致し、Q値の耐食性パラメ-タとしての妥当性が示された。2耐食性に対する合金組織の影響を知る目的で、時効処理によって完全にnoduleで覆われた二相合金と、各相の組成を持つ二種の単相合金の動的分極曲線を測定したところ、一見複雑な二相合金の分極曲線もそれを構成する二つの単相合金の曲線の重ね合わせによって説明できる、すなわち加成性が成り立つことが判った。3Cuー30at%Au合金は、700mVの定電位分極において大きなQ値を示し、分極後の試料表面からの各元素の濃度分布をESCAによって調べた結果、表面層がAuーrich、Cuーpoorとなっていることから、表面からのCuイオンの活発な溶出が示唆された。しかし、Auの一部をPdで置換すると、Pd510at%ではQ値は著しく減少し、それ以上の置換では再び増加した。わずかなPd添加による耐食性の顕著な改善については、現在その原因を検討中である。4現在実用に供されている純Ti、Tiー4A1ー6V合金およびNiー9Cr合金の分極実験では、安定な表面皮膜の形成による高耐食性が示された。
非線形分光法を用いた中高密度流体中での溶媒和のダイナミクスの研究

本研究では、中高密度流体中にとけた溶質分子に対する溶媒和エネルギーおよびその揺らぎの効果を検討するために、以下に述べる二つの実験的研究をおこなった。(1)超臨界流体に対する時間分解光カー効果の測定3次の非線形分光法である時間分解光カー効果の測定を超臨界流体である二酸化炭素および亜酸化窒素に対しておこなうことにより、その密度揺らぎおよび配向揺らぎの密度変化ならびに温度変化を検討した。いずれの流体においても光カー信号の時間変化は、比較的速い減衰を示す分子間振動に由来する成分と、長時間の回転緩和を示す成分から構成され、溶媒密度の増加によって回転成分の寄与が増大していくことがわかった。また臨界点近傍の測定により、これらの信号は臨界点近傍で見られる長距離の分子間相関にはあまり影響されないことが明らかになった。(2)フェノールブルーの共鳴ラマンスペクトルの励起波長依存性典型的なソルバトクロミズムを示す分子であるフェノールブルーの共鳴ラマンスペクトルは、その電子状態が溶媒によって大きく変化することを反映して、大きな溶媒効果を示す。極性あるいは水素結合性の溶媒で共鳴ラマンスペクトルの励起波長依存性を検討したところ、顕著な溶媒効果を示すC=OおよびC=N伸縮振動バンドが励起エネルギーに依存して変化することが明らかとなった。この現象は電子遷移エネルギーの揺らぎと振動遷移エネルギーの揺らぎが相関しているために生じたものと考えられる。実際に電子遷移と振動遷移がともに同じ熱浴モードに線形に結合した単純なモデル系に対して、3次の非線形光学感受率の表式に基づいて共鳴ラマンスペクトルを計算とたところ、共鳴ラマンスペクトルが励起エネルギーとともにシフトしうることがわかった。
立体構造に基づく全長σ因子の複合体によるプロモーター認識機構の解明

本研究は、全長σ因子のプロモーター特異的なDNA認識機構、および酵素複合体としてどのように相互作用し機能を発揮しているのかを、X線回折法により詳細な立体構造を得て、原子レベルで解明することを目的とした。平成11年度は、解析に適した単結晶を得ることを目標とした。効率のよい蛋白質の発現と精製の手順は確立できたが、σ因子あるいはσ因子と合成DNAとの複合体での結晶化は、広範な検索を行ったが成功しなかった。次に、σ因子と強く相互作用して複合体を形成するanti-σ因子に着目し、蛋白質複合体としての発現と精製条件を詳細に検討し、結晶化に適した高純度の標品を得ることが可能となった。平成12年度は、得られた単結晶から立体構造解析を進める予定であったが、平成11年度中に解析に適した単結晶を再現性よく得ることができなかったため、σ因子とanti-σ因子の複合体による結晶化条件の検索を続行した。現在までに、全長σ因子とそのanti-σ因子の複合体の単結晶を再現性よく得ることに成功している。ただし、結晶のサイズが大変小さく、放射光を用いなければ解析を進めることが不可能であるため、より大きな単結晶の作成を試みている。放射光を利用した場合、現状の単結晶のサイズ(20ミクロン程度)でも、複合体の回折強度データを集めることに成功した。今後、継続して位相決定のための重原子置換体あるいはSe-Met置換体の調製を行い、早期の構造解析の成功を目指す。本研究は、細菌において遺伝子発現過程の第一段階である転写開始に関わる最も重要な蛋白質の1つであるシグマ(σ)因子の立体構造をX線回折法を用いて原子分解能で決定することにより、プロモーター特異的なDNA認識機構を初め、酵素複合体としての分子集合様式や反応機構を構造化学的に議論することを目的とするもので、本年度の目標は、X線結晶構造解析に適した単結晶を得ることであった。数種類あるσ因子のうちσ^<28>、σ^<32>、σ^<38>を全長で効率良く発現/精製する系の確立はほぼ達成されたので、様々な条件下で結晶化を試みたが現在までに良好な単結晶を得るには至っていない。しかし、より安定な構造を得る目的で、σ^<28>の全長anti-σ因子(FlgM)の発現/精製法を確立し、複合体による結晶化を試みた。さらに、σ^<28>はFlgMのC末端側ドメイン(CTD)と高親和性で安定な複合体を形成する事が分かったので、CTD-FlgMの発現/精製法を確立し結晶化を試みた。最終的な精製標品が分解されていない安定な蛋白質複合体である事を、電気泳動/マススペクトル/動的光散乱/CDスペクトル/N末端アミノ酸分析など種々の測定により確認した。結晶化は主に蒸気拡散法を適用し、pHを変えながら沈殿剤/塩/添加剤などのパラメータをスクリーニングした結果、沈殿剤としてポリエチレングリコールを使った条件で微小結晶を得る事に成功した。この結晶は数回のシーディングを行った後で、最大で0.1x0.1x0.8mm^3の大きさにまで成長した。現在、国内の放射光施設を使い、得られた結晶のX線回折能を調べると共に強度データ収集を試みている。今後、現条件で得られた結晶を使った回折強度データ収集が可能である事が明らかになれば、原子分解能での構造解析に向け、さらなる結晶化条件の最適化を行い、構造解析を進める予定である。
シリアンハムスターにおける低温ショックタンパク質の冬眠特異的遺伝子発現

冬眠する哺乳動物は低体温時にも生命活動を維持することができる。冬眠動物のもつ低体温耐性メカニズムを解明し、ヒトを含めた非冬眠動物に適用することができれば、低体温のメリットを医療応用できると期待される。これまで、冬眠動物であるハムスターを用いた実験により、Cold-inducible RNA-binding protein(CIRP)において、平常時と冬眠時にはCIRPの選択的スプライシングのパターンが変化していることが明らかとなった。この選択的スプライシングにより冬眠時に効率よくCIRPタンパク質が機能していると示唆される。CIRPには細胞のアポトーシスを抑制する作用があることから、冬眠動物のもつ低体温耐性にCIRPが重要な役割を果たす可能性がある。本研究の目的は、CIRP遺伝子のスプライシング発現調節機構および機能を明らかにすることと、CIRPによる機能を非冬眠動物に応用することである。研究2年目にあたる平成30年度においては、シリアンハムスターにおいて冬眠時のCIRPの選択的スプライシングの変化を引き起こす要因について明らかにし、その結果について詳細な解析を行った。また、非冬眠動物であるマウス及びラットにおいても、人為的にマイルドな低体温に誘導することによって冬眠様の選択的スプライシングが再現することに成功した。一方、急激に冷却すると、CIRPの選択的スプライシングは冬眠様に変化しないままであった。CIRPが冬眠様の発現様式であることによって低温耐性機能が発揮されるとすれば、今後低温への誘導方法を検討することにより非冬眠動物であるマウスやラットにおいても低温での障害を回避することができる可能性がある。今後、選択的スプライシングの調節によるCIRPの機能を明らかにすることにより、臓器の低温保存、低体温療法及び感染症の治療へ応用できる重要な結果となる。当初の計画では、平成30年度にはCIRPタンパク質及びスプライシングバリアントコードするタンパク質について解析を行う予定であった。そのために、ウェスタンブロッティング法によりタンパク質の検出を試みたものの、スプライシングバリアントのコードするタンパク質の検出には至っていない。そこで、スプライシングバリアントがmRNAであるのか詳細に検討するため、これまでのRTーPCR法を見直し、mRNA特異的に検出できるようにオリゴdTプライマーを用いた解析を行った。結果として、オリゴdTプライマーを使った場合にもスプライシングバリアントを検出することができたため、スプライシングバリアントはmRNAとして存在していると確認することができた。また、非冬眠動物であるマウス及びラットにおいても冬眠様のCIRPの選択的スプライシングを再現する条件についても詳細に検討した。RTーPCR法によって、マウス及びラットにおいてもハムスターと類似したサイズのスプライシングバリアントが検出された。そこで、ダイレクトシークエンスによってマウスにおけるcDNA配列を解析した。スプライシングバリアントの構造は、ハムスターのものと類似していたため、ハムスターと同様にマウスにおいてもCIRPの選択的スプライシングの変化によって低温時にCIRPの機能が発揮されている可能性が示唆された。当初の予定通りではないものの、選択的スプライシングの調節によるCIRPの発現機構と機能を明らかにするという研究の目的に対しては、研究は進展していると考えている。本年度は、CIRPの選択的スプライシング調節によりもたらされるタンパク質発現の変化について解析する。しかし、これまで、CIRPのスプライシングバリアントのコードするタンパク質についてはまだ検出ができていない。そのため、今年度は、選択的スプライシングの調節によってCIRPのタンパク質自体に量的な変化があることを予想し、CIRPタンパク質をターゲットにウェスタンブロッティング法を行い、より詳細に定量的解析を行うこととする。昨年度の結果として、非冬眠動物であるマウスやラットについてもシリアンハムスターと同様の冬眠様の選択的スプライシング調節が再現できることを明らかとした。このことから、非冬眠動物にもCIRPの低温耐性機能が潜在的に存在する可能性がある。そこでCIRPの選択的スプラシング調節のもたらす機能についてマウスの細胞を用いた実験を行う。選択的スプライシングの調節を再現し、冬眠様の発現様式の細胞と、平常時の発現様式の細胞では、低温ストレスでの培養により細胞の生存率に違いがあるかどうかを解析する。また、非冬眠動物における低体温時の致命的な現象として、心臓機能の障害が挙げられる。冬眠動物では、CIRPの選択的スプライシングの変化によって低体温時の心臓機能が障害から保護されている可能性があると考えた。そこで、人為的にCIRPの選択的スプライシングを調節した場合の、ハムスター及び非冬眠動物における心臓機能を解析し、違いがあるのかどうか明らかにする。心臓の組織を利用し、収縮に関与するチャネルのmRNA、タンパク質の解析を行う。研究結果公表のため、日本獣医学会学術集会にて発表を行う。また、英語論文として発表する。本研究は、冬眠する動物の低体温耐性メカニズムについて明らかにすることを最終的な目標としている。これまで、冬眠動物であるシリアンハムスターにおいてCold-inducible RNA-binding protein(CIRP)の冬眠時特異的なスプライシング調節の存在と、その要因を明らかにしてきた。本研究の目的は、CIRPのスプライシング調節によって、冬眠時にどのような機能を発揮するのかを解明することと、解明したCIRPの機能(冬眠時の低温耐性への寄与を予想)を冬眠しない動物に応用することである。まず、CIRPタンパク質及び関連する細胞内伝達系の解析を行なった。現在までの結果として、細胞の保護や増殖に関与する細胞内シグナル伝達系の重要な因子であるAktのリン酸化について、平常時と比較して、冬眠時に減少することが明らかとなった。

この結果は、CIRPが冬眠時にどのような機能を発揮するのかを解明するために重要なステップとなった。また、CIRPが冬眠様のスプライシング変化を起こす時点での心臓に発生する異常について解析を行なった。強制的な低体温時には異常心電図が観察されるが、人為的にCIRPのスプライシングを変化させた状態での低体温時には、冬眠時と同様に異常心電図の発生がないことが明らかとなった。これらの結果は、CIRPによる低温耐性が期待される結果である。次に、非冬眠動物における冬眠様CIRPmRNA発現の誘導法を確立した。非冬眠動物であるマウスを人為的な低体温へ誘導したところ、シリアンハムスターと同様の温度域でCIRPのスプライシング調節が引き起こされることが明らかとなった。また、ラットにおいても同じようなスプライシング調節の存在が示唆された。この結果は、冬眠動物におけるCIRPの機能を冬眠しない動物に応用できる可能性を示すものである。当初の計画では、病理組織学的手法を用いて、低体温による組織障害と、CIRP及びCIRPのスプライシングバリアント発現の局在の関連を評価する予定であった。そのため、免疫染色法及びin situハイブリダイゼーションを行うため、CIRPとCIRPのスプライシングバリアントに特異的な抗体及びプローブを作成する必要があった。しかし、冬眠動物を用いた実験では抗体作成に時間がかかると考え、一般的な実験動物であるマウスやラットを用いることとした。そのため、まずはマウスやラットにおける冬眠様CIRPmRNA発現の誘導法の確立するための実験を行なった。実験の結果、非冬眠動物であるマウスやラットにおいても、冬眠動物に類似したスプライシング調節を人為的に引き起こすことができた。今後はCIRPのスプライシング調節による低体温耐性について、マウスやラットの個体または細胞を用いて実験を計画していく予定である。また、ハムスターを用いて、低体温による組織障害と、CIRPのスプライシングバリアント発現の関連を評価するため、病理組織学的解析に代わり、心電図により評価した。この方法においても、CIRPによる低温耐性が期待される結果が得られている。CIRPタンパク質と、スプライシングバリアントから翻訳されるタンパク質の発現量を、平常時と冬眠時で比較するため、ウェスタンブロッティング法での解析を行なった。しかし、現時点ではスプライシングバリアントがコードすると予想されるタンパク質を検出することはできていない。そのため、新規の抗体の作成に着手すると共に、スプライシングバリアントはタンパク質に翻訳されておらずpre-mRNAとして存在する可能性を考え、より厳密なRNA解析実験を行う予定である。
運動療法降圧機序における一酸化窒素の役割

運動療法によるインシュリン抵抗性改善は神経性因子を介して血圧降下をもたらす。インシュリン抵抗性に高インシュリン血症をもたらし、末梢交感神経活性亢進や圧反射低下を介して高血圧発症に関与することが示唆されている。高血圧患者に対し運動療法を行うとインシュリン抵抗性の改善が認められるが、これが運動療法の降圧に果たす役割については明らかでない。そこで、高血圧患者の運動療法前後において、インシュリン抵抗性と神経性因子の関連を検討することにより、運動療法におけるインシュリン抵抗性改善による神経性降圧機序を明らかにする。未治療の本態性高血圧患者30例(男性17例女性13例、平均年齢43±2歳)に対しVO2max75%の運動を6分間1日4回3週間施行し、その前後で24時間血圧により降圧度を評価し、頚動脈圧反射(BSI)、血漿レニン活性(PRA)、アルドステロン(PAC)を測定した。運動療法前後の経口糖負荷試験によりインシュリン反応直線下面積を測定しインシュリン抵抗性の指標とした。運動療法により24時間平均血圧は有意に下降し、AUCIは明らかに減少、BSIは明らかに改善した。降圧度とAUCIの減少度には有意な相関が見られ、運動療法による降圧に伴いインシュリン抵抗性が改善した。このインシュリン抵抗性の改善の改善と、運動療法によるBSIの改善度、PRAの低下度、及び24時間平均心拍数の低下度は有意に相関した。運動療法による降圧に伴いインシュリン抵抗性が改善した。インシュリン抵抗性の改善に伴い圧反射が改善し心拍数減少と血漿レニン活性の低下がみられたことより、運動療法による降圧に、インシュリン抵抗性の改善を介した神経性血圧調節機序の関与がHypertensionにfull manuscriptとして受理されている。