hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
味覚障害の解明を目指す基礎研究

我々の生活に必須である味覚が障害されると、食事摂取低下を招く危険性がある。初発症状が味覚障害で始まる精神疾患の報告が散見されてはいるが、因果関係を示す基礎研究報告は殆どない。そこで本研究では、味覚障害と精神疾患関連遺伝子との関連性を調べることにより、本障害に寄与する発症メカニズムの解明を目指した。まず、成体マウスにおいてKIAA2022遺伝子が舌表面・延髄孤束核にも存在することを突き止めた。また、軸索異常が本遺伝子機能低下により生じる事から、グリア細胞における機序解明を行った。その結果、KIAA2022遺伝子を本細胞内でノックダウンすると、コントロール群と比較して種々の変化が認められた。quality of lifeの支柱である味覚が障害されると食事摂取低下や偏食を招き、さらには生命の危機に関わる状態に陥る可能性があるが、現時点で機序は不明である。また、臨床面に視座を移すと味覚障害を初発症状とする精神疾患の報告が散見されるが、味覚障害と精神疾患との関連性を示す基礎研究報告は殆どない。そこで本研究では、精神疾患関連遺伝子と味覚障害の関連性を調べることにより、本疾患に纏わる発症メカニズムの解明を目指している。メカニズムを解明する事で、味覚障害の治療法の開発に繋がり患者の精神面・身体面を大きく改善する可能性もある。我々は従前に、機能が未知である重度の精神遅滞患者より同定されたKIAA2022遺伝子が細胞接着及び細胞遊走に影響することを報告している。(Magome T,Hattori T et al., Neurochem Int.63(6):561-569(2013)本研究の研究実績として、上記の脆弱性因子が成体マウスにおいてが舌表面・延髄孤束核にも存在することを突き止めた。さらに研究を進捗していく中で、本遺伝子のバリアント自体が存在する可能性も示唆されている。また神経系での、グリア細胞に関連する別実験系よりもKIAA2022遺伝子をノックダウンすると、コントロールと比較して種々の変化が認められている。また本遺伝子をノックダウンさせ機能を抑制させると神経で分岐減少や軸索における異常が報告されている(Van MaldergemL,et al. ,Hum Mol Genet.15;22(16):3306-14(2013))事を鑑みると、我々はこれらの実験結果より、発達障がい患者の味覚障害の発症にやはり、KIAA2022遺伝子が関連している可能性が高いと考えている。そこで今後も多角的なベクトルから精神疾患関連遺伝子と味覚障害の関連性を調べる事とする。従来の味覚基礎研究の中心は味蕾などの末梢感覚組織であったため、より中枢の味覚伝導路における精神遅滞原因遺伝子の関連性は現在まで注目されていない。本研究の予想される結果であるが、KIAA2022遺伝子が機能不全等の異常を引き起こすと味覚低下や組織形態異常が出現する可能性が高い。現在までの進捗状況として、味覚組織におけるKIAA2022遺伝子発現の局在をIn situ hybridizationで成体マウスの舌表面及び延髄孤束核に強く発現しており、味覚伝導路に局在していることを確認している。さらには本研究を進捗していく中で、成体マウスの脳での発現解析により、本遺伝子のバリアント自体が存在する可能性も示唆されている。さらには、グリア細胞に関連する別実験系よりもKIAA2022遺伝子をノックダウンするとコントロールと比較して種々の変化(RNA及びタンパクレベルにおいて)が認められている。グリア細胞に関連するタンパクの発現量を変化させている可能性が示唆されている。ただし、KIAA2022遺伝子ノックアウトマウスにおける味覚組織形態の経時変化、ノックアウトマウスの胎生期から老齢までの味覚伝導路組織形態を観察することで、KIAA2022遺伝子の味覚伝導路組織における発達分化および形態維持に及ぼす役割を推定するアプローチであるが、現在までの進捗状況から、本遺伝子がX染色体上に存在していることにより難化が予想される。そこで今後の進捗としても多角的なベクトルから精神疾患関連遺伝子と味覚障害の関連性を調べる事とする。我々の生活に必須である五感の一つである味覚が障害されると、食事摂取低下を招く危険性がある。例えば、統合失調症患者では意欲低下により食事を拒むケースも見られる。これらは人体の維持を困難とし味覚障害へのリスクも内包している。機序を解明する事で、味覚障害の治療法の開発に繋がり患者の精神面・身体面を大きく改善する可能性もある。さらには、本遺伝子の機能を抑制させると神経で分岐減少や軸索における異常が判明した。我々は上記の変化に着目し本研究を遂行した。また、神経系の中でもグリア細胞と発達障害並びに統合失調症両疾患のトリガーとなる因子との高い関連性は示唆されている。さらには軸索異常が本遺伝子機能低下により生じる事から、グリア細胞における機序解明を行った。

その結果、KIAA2022遺伝子を本細胞内でノックダウンすると、コントロールと比較して種々の変化が、RNAやタンパクレベル下において認められた。我々はこれらの研究結果より、発達障がい患者の味覚障害の発症にやはり、KIAA2022遺伝子が関連している可能性が高いと考えている。今後も多角的なベクトルから精神疾患関連遺伝子と味覚障害をはじめとした感覚異常のメカニズムについて関連性を調べる事とする。我々の生活に必須である味覚が障害されると、食事摂取低下を招く危険性がある。初発症状が味覚障害で始まる精神疾患の報告が散見されてはいるが、因果関係を示す基礎研究報告は殆どない。そこで本研究では、味覚障害と精神疾患関連遺伝子との関連性を調べることにより、本障害に寄与する発症メカニズムの解明を目指した。まず、成体マウスにおいてKIAA2022遺伝子が舌表面・延髄孤束核にも存在することを突き止めた。また、軸索異常が本遺伝子機能低下により生じる事から、グリア細胞における機序解明を行った。その結果、KIAA2022遺伝子を本細胞内でノックダウンすると、コントロール群と比較して種々の変化が認められた。今後の本研究における推進方法であるが、中枢の味覚伝導路が障害されることで、味蕾などの末梢の感覚組織の減少や形態変化が出現することが考えられるので現在までの進捗状況を鑑みながら、引き続き精神疾患関連遺伝子と味覚障害の関連性を調べていきたいと考えている。ただし、KIAA2022遺伝子ノックアウトマウス作製自体がX染色体上に存在していることにより難化が予想されるので本研究と並行して行っている基礎研究とリンクさせて推進していきたい。具体的には、神経膠細胞に関する研究との関連性である。神経系の実験に落とし込む事により、相互作用が大きく取れる可能性が高いため、本研究とも結果を統合し解析を進めることで、更なる味覚障害治療へ向けての応用も出来ると考えている。味覚伝導路神経との比較等が出来るため、神経として俯瞰的な、新しい知見が得れるはずである。また本研究者は、耳鼻咽喉科医が複数所属している神経細胞生物学教室のスタッフとして勤務していたため、耳鼻咽喉科医師による助言指導を常時いただける環境に引き続きある。さらに、現在は上記の経歴に続き、同医学系研究科のスポーツ医学教室に所属している。本教室にも多分野の専門医が所属しており、多角的な観点から、適宜助言を受け研究を遂行することができる。一つの視座からアプローチしていくのではなく、基礎的な面においても臨床的面においても様々な角度から、味覚障害に対して多角的なベクトルから研究を推進していく。精神疾患KIAA2022遺伝子ノックアウトマウスにおける味覚組織形態の経時変化、ノックアウトマウスの胎生期から老齢までの味覚伝導路組織形態を観察することで、KIAA2022遺伝子の味覚伝導路組織における発達分化および形態維持に及ぼす役割を推定するアプローチしていく予定であったが、その作製が難化している。そこでノックアウトマウスをはじめとしたマウスに関連する研究費が減額している。そのために、次年度使用額が生じている。
インドネシアにおけるマングローブ林生態系の種生物学に関する研究(調査研究総括)

熱帯・亜熱帯地方の内湾や河口付近および沿岸域の潮感帯に発達するマングローブ林生態林の,特殊な立地に対する適応,独得の構造,特異な生態生理を明らかにするため,東インドネシアにおいて調査をおこなった.現地調査は,昭和60年8月1日から9月15日に予備調査を,昭和61年7月30日から10月12日に本調査を,および昭和62年3月4日から26日までの期間に追加調査を実施した.調査はインドネシア国立生物研究所と共同して,同国立海洋学研究所の協力を得ておこなった.予備調査においては,マルク州カオ湾(ハルマヘラ島東岸)沿岸のソソボック川河口の,原生状態を保ったマングローブ林に8.4haをマークし, 30×30mの永久調査区を5カ所に設置することができた.本調査は1カ年後に,カオ湾において,マングローブ林の構造と機能,動・植物特に藻類,カニ類,貝類の分類と生態および行動に関する調査をおこなった.ソムラキ他いくつかの地点で,広域的な比較調査のための標本・試料の採集をおこなった.追加調査はジャワ,バリなどをくわえた調査地で,マングローブ林の構造と機能の調査をおこなった.採集した動・植物標本は乾燥,液浸あわせて約3500点,種子標本約100点,分析用植物試料約450点,土壌試料約280点で,現地の国立生物学研究所,国立海洋学研究所に残置したほか,愛媛,筑波,岐阜,京都各大学で保管されている.調査総括は(1)藻類の分類と生態,(2)底生動物,特にカニ類,腹足類の生態と行動,(3)マングローブ林生態系の構造と機能についておこなった.研究成果の概要は以下のとおりである.(1)藻類の分類と生態主として, Bostrychia, Calogloss, Catenella属のものから成り,世界の他の地域のマングローブ林のそれとよく似ていること,マングローブの支柱根に着生して,潮感帯の上,中,下部にそれぞれ固有の群落をつくりだしているが,出現様式は他の地域と共通することがわかった.大型藻類は38種が同定されたが, 6種が緑藻類, 7種が褐藻類, 25種が紅藻類に属するものであった.イドプールで認められる種類相と酷似していること,個々の種は外洋性のものと形態的に明瞭に区別できることがあきらかにされたが,マングローブ林域にはには淡水起源のものが存在することが注目すべき点である.(2)底生動物,特にカニ類,腹足類の生態と行動った.注目すべきは日本の沿岸域のものと共通種が半数を占めたことであろう.腹足類は40種のうち24種がマングローブ固有種で,分布生態を観察したところ,庇蔭度,潮汐,タイドプール,枯死木の有無などが,強く影響することを示した.ratia alba林内に生息するOcypodidsが気根上にはいのぼって,採食するのが発見され,マングローブ域でも強い動物ー植物関係が存在することが確認された.(3)マングローブ林生態系の構造と機能が異なる.これが局部的な優占種をきめ, Sonneratia帯,砂丘帯, RhizophoraーBruguiera混交帯, NypaーR.stylosa帯をつくっていることが確認できた.告されているいくつかの例とあわせて,マングローブ林の相対生長式は, Rhizophora属のものと,それ以外の樹種については分離するが,地域による分離は認められないことが確かめられた.地上部現存量の推定結果は, Sonneratia,Rhizophora,Bruguiera林でそれぞれ, 170,300ー360,410ー440t/haに達することがわかった.地下部現存量をソイル・ブロックによる根密度法によって推定したところ, 40,180ー200,110ー180t/ha・mと算出された.熱帯・亜熱帯地方の内湾や河口付近および沿岸域の潮感帯に発達するマングローブ林生態林の,特殊な立地に対する適応,独得の構造,特異な生態生理を明らかにするため,東インドネシアにおいて調査をおこなった.現地調査は,昭和60年8月1日から9月15日に予備調査を,昭和61年7月30日から10月12日に本調査を,および昭和62年3月4日から26日までの期間に追加調査を実施した.調査はインドネシア国立生物研究所と共同して,同国立海洋学研究所の協力を得ておこなった.予備調査においては,マルク州カオ湾(ハルマヘラ島東岸)沿岸のソソボック川河口の,原生状態を保ったマングローブ林に8.4haをマークし, 30×30mの永久調査区を5カ所に設置することができた.本調査は1カ年後に,カオ湾において,マングローブ林の構造と機能,動・植物特に藻類,カニ類,貝類の分類と生態および行動に関する調査をおこなった.ソムラキ他いくつかの地点で,広域的な比較調査のための標本・試料の採集をおこなった.追加調査はジャワ,バリなどをくわえた調査地で,マングローブ林の構造と機能の調査をおこなった.

採集した動・植物標本は乾燥,液浸あわせて約3500点,種子標本約100点,分析用植物試料約450点,土壌試料約280点で,現地の国立生物学研究所,国立海洋学研究所に残置したほか,愛媛,筑波,岐阜,京都各大学で保管されている.調査総括は(1)藻類の分類と生態,(2)底生動物,特にカニ類,腹足類の生態と行動,(3)マングローブ林生態系の構造と機能についておこなった.研究成果の概要は以下のとおりである.(1)藻類の分類と生態主として, Bostrychia, Calogloss, Catenella属のものから成り,世界の他の地域のマングローブ林のそれとよく似ていること,マングローブの支柱根に着生して,潮感帯の上,中,下部にそれぞれ固有の群落をつくりだしているが,出現様式は他の地域と共通することがわかった.大型藻類は38種が同定されたが, 6種が緑藻類, 7種が褐藻類, 25種が紅藻類に属するものであった.イドプールで認められる種類相と酷似していること,個々の種は外洋性のものと形態的に明瞭に区別できることがあきらかにされたが,マングローブ林域にはには淡水起源のものが存在することが注目すべき点である.(2)底生動物,特にカニ類,腹足類の生態と行動った.注目すべきは日本の沿岸域のものと共通種が半数を占めたことであろう.腹足類は40種のうち24種がマングローブ固有種で,分布生態を観察したところ,庇蔭度,潮汐,タイドプール,枯死木の有無などが,強く影響することを示した.ratia alba林内に生息するOcypodidsが気根上にはいのぼって,採食するのが発見され,マングローブ域でも強い動物ー植物関係が存在することが確認された.(3)マングローブ林生態系の構造と機能が異なる.これが局部的な優占種をきめ, Sonneratia帯,砂丘帯, RhizophoraーBruguiera混交帯, NypaーR.stylosa帯をつくっていることが確認できた.告されているいくつかの例とあわせて,マングローブ林の相対生長式は, Rhizophora属のものと,それ以外の樹種については分離するが,地域による分離は認められないことが確かめられた.地上部現存量の推定結果は, Sonneratia,Rhizophora,Bruguiera林でそれぞれ, 170,300ー360,410ー440t/haに達することがわかった.地下部現存量をソイル・ブロックによる根密度法によって推定したところ, 40,180ー200,110ー180t/ha・mと算出された.
日本語書記意識史の研究

本年度は主に以下の点に関して研究を行った。1.日本語書記意識史を研究する際、時代、書記者、ジャンル、社会背景など様々な要因を考え併せ、各資料ごとに見られる書記意識を掴む必要があるが、書記意識が強く反映される仮名遺書や文字研究書を調査対象にするのが先決であると考えた。調査対象を拡げながら、作業を積み重ねることで、時代、書記者の流派(学派)など諸要素内での書記意識史を大まかに捉え、それら個別の書記意識史を統合させることで、日本語全体の書記意識史を捉えることができよう。今年度は、その初歩的な作業として、九州大学音無文庫、松濤文庫に所蔵されている書物の調査・目録の作成に努めた。2.今年度は、「仮名字体の規範意識」に注目した。従来、変体仮名は、明治33年の小学校令施行規則により定まった、現行平仮名字体以外を指す名称とされてきた。しかし、本研究では、空海真筆のいろは歌が要因となって、既に近世期から、仮名の正体である基本字体(空海真筆いろは歌の書写字体)とそれ以外の字体(変体)を区別する意識が存在していたことを明らかにした。具体的には、岡島隆紀『仮字考』(享保11年)に(基本字体:仮字正字/それ以外の字体:四十七字之外平仮字並イ呂ハ異體)、伴信友『仮字本末』(嘉永3年)に(空海の書定めたるいろは假字/いろは假字ならぬ草假字)、中根淑『日本文典』(明治9年)に(平假名/中假名)といった二分類が見られる。本研究により、新たに「変体仮名」の定義として、以下の説明を加えた。仮名の正体に対して変体(別体)とされる仮名。古くはいろは歌所用の仮名字体が正体とされたので、それ以外の字体の仮名を指した。小学校令施行規則により現行の平仮名字体が正体とされた明治33年以降は、現行の平仮名字体以外のものを指す。(以上の内容は、第197回筑紫国語学談話会、第91回訓点語学会研究発表会にて口頭発表を行った)本年度は主に以下の点に関して研究を行った。(以上の内容は、第197回筑紫国語学談話会、第91回訓点語学会研究発表会にて口頭発表を行った)
顆頭安定位を指標としたスプリントの咬合位決定法

本研究の目的は,患者の顎関節多層断層X線写真で得られた顆頭の3次元的形態データを元に,コンピュータグラフィック上で適切な顆頭位を模索し,スプリントの咬合位を決定する臨床応用可能なシステムを開発することである.昨年度は,適正な顆頭安定位を検討するために,健常者群,有病者群,患者群,各25名,合計75名について顆頭中央部における顆頭位を比較検討し,その結果を第10回日本顎関節学会にて発表した.本年度は同一被験者における左右顆頭位を比較検討し,顆頭に形態変化のない側は形態変化のある側より中央位にあるという結果を得,第76回IADRにて発表した.その一方,本研究の主旨に同意し,インフォームドコンセントの得られた徳島大学歯学部の顎機能障害患者のうち,顎関節部に形態変化のないものを被験者として選択し,被験者の顎関節断層X線写真をX線フィルムディジタイザ(Vidar社製VHR-12)で,パーソナルコンピュータに取り込み,得られた画像データを3次元画像解析ソフトMiniCAD7により3次元形態データに変換し,顎関節の3次元再構築像を作製した.本方法では,簡便に3次元再構築が可能となったが,顎関節多層断層X線写真をディジタル化する時点でのX線写真のトレースの方法に改善の余地があると考えらた.また,健常者の顆頭位を参考にして,患者の顆頭位を評価し,関節窩内において顆頭が中央で安定して位置する顆頭安定位をグラフィックターミナル上に求めた.得られた顎位でスプリントを製作する方法については,更なる咬合器の改良が必要と考えられる.今後引き続き,シュミレーションによって求めた顆頭安定位と患者のスプリント装着時の顆頭位を比較検討し,求めた咬合位の治療効果を評価し,術式を確立する予定である.本研究の目的は,患者の顎関節多層断層X線写真で得られた顆頭の3次元的形態データを元に,コンピュータグラフィック上で適切な顆頭位を模索し,スプリントの咬合位を決定する臨床応用可能なシステムを開発することである.そこで本年度は,適正な顆頭安定位を検討するために,健常者群,有病者群,患者群,各25名,合計75名について顆頭中央部における顆頭位を比較検討し,その結果を第10回日本顎関節学会にて発表した.その一方,顎関節多層断層X線撮影による診査が必要とされ,本研究の主旨に同意し,インフォームドコンセントの得られた徳島大学歯学部の顎機能障害患者のうち,顎関節部に形態変化のないものを被験者として選択し,被験者の顎関節断層X線写真をX繰フィルムディジタイザ(Vidar社製VHR-12)で,パーソナルコンピュータに取り込んだ.現在,得られた画像データを3次元画像解析ソフトにより3次元形態データに変換し,顎関節の3次元再構築像を作製中である.次年度は,健常者の顆頭位を参考にして,患者の顆頭位を評価し,関節窩内において顆頭が中央で安定して位置する顆頭安定位をグラフィックターミナル上に求め,得られた顎位でスプリントを製作し,患者に装着.さらに,スプリントを装着した状態で顎関節多層断層X線撮影を行い,この顎位とシュミレーションによって求めた顆頭安定位を比較検討し,求めた咬合位の治療効果を評価し,術式を確立する予定である.本研究の目的は,患者の顎関節多層断層X線写真で得られた顆頭の3次元的形態データを元に,コンピュータグラフィック上で適切な顆頭位を模索し,スプリントの咬合位を決定する臨床応用可能なシステムを開発することである.昨年度は,適正な顆頭安定位を検討するために,健常者群,有病者群,患者群,各25名,合計75名について顆頭中央部における顆頭位を比較検討し,その結果を第10回日本顎関節学会にて発表した.本年度は同一被験者における左右顆頭位を比較検討し,顆頭に形態変化のない側は形態変化のある側より中央位にあるという結果を得,第76回IADRにて発表した.その一方,本研究の主旨に同意し,インフォームドコンセントの得られた徳島大学歯学部の顎機能障害患者のうち,顎関節部に形態変化のないものを被験者として選択し,被験者の顎関節断層X線写真をX線フィルムディジタイザ(Vidar社製VHR-12)で,パーソナルコンピュータに取り込み,得られた画像データを3次元画像解析ソフトMiniCAD7により3次元形態データに変換し,顎関節の3次元再構築像を作製した.本方法では,簡便に3次元再構築が可能となったが,顎関節多層断層X線写真をディジタル化する時点でのX線写真のトレースの方法に改善の余地があると考えらた.また,健常者の顆頭位を参考にして,患者の顆頭位を評価し,関節窩内において顆頭が中央で安定して位置する顆頭安定位をグラフィックターミナル上に求めた.得られた顎位でスプリントを製作する方法については,更なる咬合器の改良が必要と考えられる.今後引き続き,シュミレーションによって求めた顆頭安定位と患者のスプリント装着時の顆頭位を比較検討し,求めた咬合位の治療効果を評価し,術式を確立する予定である.
脳血管障害患者のリハビリテーションにおける咀嚼機能

香川県三豊郡における一ヶ所のリハビリテーション病院において,脳血管障害の既往を有する療養型病床入院患者で嚥下障害をもつ者10名(男性5名,女性5名,平均年齢79.4歳),嚥下障害をもたない者46名(男性19名,女性27名,平均年齢79.0歳)およびデイサービスを受けている在宅高齢者21名(男性9名,女性12名,平均年齢80.6歳)について対面調査を行った.調査項目は,口腔および摂食機能に関する自覚症状の問診,口腔内診査(歯,歯周組織,舌),口腔周囲の診査(口唇,頬,顎関節),義歯の診査,嚥下機能検査,唾液検査,咀嚼能力診査とし,さらに病院側の協力を得て,ADL,摂食嚥下能力に関するグレード,看護度,食事形態,服用薬剤について調査した.その中から,天然歯もしくは義歯によって臼歯部の咬合支持が確立している者を選択し,入院患者28名(男性14名,女性14名,平均年齢76.5歳)とデイサービス患者14名(男性7名,女性7名,平均年齢81.3歳)との間で,唾液分泌速度,唾液緩衝能,唾液中のカンジダ菌数,咬合力,咀嚼能率(グミゼリー)について比較を行った.その結果,入院患者群はデイサービス群と比較して唾液分泌速度,唾液緩衝能が低下する傾向が見られた.唾液中のカンジダ菌数については,両群とも一般の高齢者と比較して非常に菌数が多かった.唾液量については、摂食嚥下能力に関するグレードや食事形態と相関する傾向が見られた.咬合力および咀嚼能率についても,入院患者群はデイサービス群と比較して低下する傾向が見られたが,個人間のばらつきが大きくさらに因子の検索が必要と思われた.本調査から,リハビリテーション病院における脳血管障害患者の咀嚼機能のプロフィールが把握され,その影響因子に関する示唆が得られた.香川県三豊郡における一ヶ所のリハビリテーション病院において,脳血管障害の既往を有する療養型病床入院患者で嚥下障害をもつ者10名(男性5名,女性5名,平均年齢79.4歳),嚥下障害をもたない者46名(男性19名,女性27名,平均年齢79.0歳)およびデイサービスを受けている在宅高齢者21名(男性9名,女性12名,平均年齢80.6歳)について対面調査を行った.調査項目は,口腔および摂食機能に関する自覚症状の問診,口腔内診査(歯,歯周組織,舌),口腔周囲の診査(口唇,頬,顎関節),義歯の診査,嚥下機能検査,唾液検査,咀嚼能力診査とし,さらに病院側の協力を得て,ADL,摂食嚥下能力に関するグレード,看護度,食事形態,服用薬剤について調査した.その中から,天然歯もしくは義歯によって臼歯部の咬合支持が確立している者を選択し,入院患者28名(男性14名,女性14名,平均年齢76.5歳)とデイサービス患者14名(男性7名,女性7名,平均年齢81.3歳)との間で,唾液分泌速度,唾液緩衝能,唾液中のカンジダ菌数,咬合力,咀嚼能率(グミゼリー)について比較を行った.その結果,入院患者群はデイサービス群と比較して唾液分泌速度,唾液緩衝能が低下する傾向が見られた.唾液中のカンジダ菌数については,両群とも一般の高齢者と比較して非常に菌数が多かった.唾液量については、摂食嚥下能力に関するグレードや食事形態と相関する傾向が見られた.咬合力および咀嚼能率についても,入院患者群はデイサービス群と比較して低下する傾向が見られたが,個人間のばらつきが大きくさらに因子の検索が必要と思われた.本調査から,リハビリテーション病院における脳血管障害患者の咀嚼機能のプロフィールが把握され,その影響因子に関する示唆が得られた.本年度は,予定していたリハビリテーション病院における脳血管障害患者の調査が,病院の事情で平成11年4月からに延期されたため,対象群として現在健康で社会的な日常生活を送っている高齢者(大阪府老人大学受講生のうち協力の得られたボランティア)の調査を先行した.対象は,65歳以上の高齢者171名(男性88名,女性83名,平均年齢66.3歳)で,口腔内診査,義歯装着状況,咬合力測定,咀嚼能率測定を行った.その結果,上下顎間に咬合支持を有する群と比較して,咬合支持を喪失した群では咬合力および咀嚼能率が約50%低下することが明らかとなり,高齢者の咀嚼機能に対して咬合支持が大きな影響を及ぼしていることが明らかとなった.

一方,平成10年度研究者らの診療科(大阪大学歯学部附属病院第二補綴科)に来院した高齢患者(65歳以上)の中で脳血管障害の既往歴を有する者18名(男性11名,女性7名,平均年齢73.9歳)をリストアップし,口腔内状況と咀嚼機能における問題点を調査した.18名中10名が咬合支持を喪失しており,同時に義歯の機能性に問題を認め,上記の健康な高齢者と比較して低い咬合力ならびに咀嚼能率を示した.本年度における以上の調査から,高齢者の咀嚼機能の標準値が得られるとともに,脳血管障害患者の調査において,咬合支持と咀嚼機能の関係に焦点を当てて分析すべきであるという示唆が得られた.本年度は,香川県三豊郡における1ヶ所のリハビリテーション病院において,脳血管障害の既往を有する療養型病床入院患者およびデイサービス患者(総計80名)について対面調査を行った.調査項目は,口腔内診査,口腔および摂食機能に関する自覚症状の問診,唾液検査,咀嚼能力診査とし,さらに病院側の協力を得て,ADL,摂食嚥下能力に関するグレード,看護度,食事形態,服用薬剤について調査した.その中から,天然歯もしくは義歯によって臼歯部の咬合支持が確立している者を選択し,入院患者28名(男性14名,女性14名,平均年齢76.5歳)とデイサービス患者14名(男性7名,女性7名,平均年齢81.3歳)との間で,唾液分泌速度,唾液緩衝能,唾液中のカンジダ菌数,咬合力,咀嚼能率(グミゼリー)について比較を行った.その結果,入院患者群はデイサービス群と比較して唾液分泌速度,唾液緩衝能が低下する傾向が見られた.唾液中のカンジダ菌数については,両群とも一般の高齢者と比較して非常に菌数が多かった.唾液量については,摂食嚥下能力に関するグレードや食事形態と相関する傾向が見られた.咬合力および咀嚼能率についても,入院患者群はデイサービス群と比較して低下する傾向が見られたが,個人間のばらつきが大きくさらに因子の検索が必要と思われた.本年度における調査から,リハビリテーション病院における脳血管障害患者の咀嚼機能のプロフィールが把握され,その影響因子に関する示唆が得られた.
活性型ビタミンD3新規誘導体の合成を目指した新合成法の開発

活性型vitamin D_3は、ホルモン性生理活性化合物であり、カルシウム調節、細胞分化誘導、細胞増殖抑制など多様な作用を示すことが知られている。現在、これをリードとする医薬開発研究が盛んに行われており、19-Nor型や2-alkyl体など多くの有用な誘導体が報告されている。有機合成は、こうした誘導体を必要量合成する唯一の手法であるため、盛んにその合成法の開発が行われてきた。しかし、製薬企業などで、実際に使われている実用的な合成法はTrost法とHoffmann-LaRoche法の2つしかなく不十分であると考えた。そこで、私は、新規A環と対応するCD環との鈴木宮浦カップリング反応による第3の実用的合成法の開発を計画し、成功した。以下に、詳細を述べる。まず、新規A環は当研究室で開発した2価チタン錯体を用いる環化反応を鍵反応として、安価なエピクロロヒドリンから全収率20%で合成を達成した。さらに、このA環に対して対応するCD環との鈴木宮浦カップリング反応を行い、活性型vitamin D_3を合成した。また、最近、構造上注目されているDes-CD vitaminD_3誘導体の合成も高収率で達成した。さらに、A環部の1位と3位のヒドロキシル基部分の立体が活性に大きく関わるので、活性型vitamin D_3の1-epi体、3-epi体、1,3-epi体をそれぞれ対応するA環から合成した。本合成法は、収率、ステップ数や用いる試薬の面からも冒頭に述べた2つの合成法と同等であることから、相補的に用いられる第3の合成法になったと考えている。現在、これををリードとする医薬開発研究が盛んに行われており、多くの有用な誘導体が報告されている。私は、乾癬の薬や抗癌剤として医薬品化が進められている19-nor型のvitamin D_3の新規合成法を報告し、本年度は次のような展開を行ってきた。(2)6位にMe,Fを有した新規A-ring中間体を合成し、これを用いて6-Meおよび6-F-19-nor-vitamin D_3の合成を計画し達成した。本合成法は、様々な置換基の導入が可能な合成手法となっていることから、vitamin D_3の分野において意義のあるものだと考えている。なかでも、すでに合成を達成した6-F-19-nor-vitamin D_3はカルシウム調節、細胞増殖抑制などの薬理作用に関して興味深いものである。(3)天然型のvitamin D_3においてもC-6とC-7位でのA-ring中間体とC,D-ring中間体との鈴木カップリング反応による新規合成法を計画した。新規A-ring中間体の合成は2価チタン反応剤を用いる環化反応を鍵反応とし、合成を達成した。さらに、この中間体を用いて鈴木カップリング反応により活性型vitamin D_3の合成に成功した。
母体に対する経腸栄養および完全静脈栄養が胎児肝へ及ぼす影響

新生児は抗酸化酵素活性が低いためフリーラジカルに対する防御能が弱いとされており、このことが完全静脈栄養(以下PN)時に肝障害が起こりやすいこととも関係していると考えられる。昨年度の研究にて確立した新生仔家兎PN肝障害モデルを用いて、PN肝障害に対するフリーラジカルや過酸化脂質の関与を検討するため、以下の実験を行った。生後24時間以内の新生仔家兎を投与カロリーにより高カロリー群と通常カロリー群の2群に分け8日間のPNを行い、PN終了時に血液、肝を採取し血液を一般肝機能検査に、肝をSOD(superoxide dismutase)活性、GSH-Px(glutathione peroxidase)活性、グルタチオン、過酸化脂質の定量と病理組織学的検索に供した。その結果、高カロリー群に胆汁うっ滞性の肝障害を認め、肝SOD活性は通常カロリー群に比し有意に低値をとり、また肝障害の程度と肝SOD活性との間に負の相関を認めた。しかし等しいカロリーの投与によっても個々の肝障害の程度にはかなりの差があり、この原因としてbacterial、translocation(腸内細菌の腸管外への移行、以下BTと略)の関与が推察された。そこでPN終了時に腸間膜リンパ節、肝を倍養しBTの評価を行った。その結果、BTは高カロリー群に高頻度に起こる傾向を認めた。またBTの有無で検討するとBT陽性群では肝SOD活性が有意に低値をとり、また肝障害が高度になる傾向を認めた。この意義についてはさらに検討を要すが、BTにより肝へ移行した細菌やエンドトキシンを処理する過程で生じたフリーラジカルの消去のための消耗性のSOD活性低下、また肝SOD活性の低下によるBTの惹起が推測される。妊娠ウサギの母体の高カロリ-負荷に関しては、飼料の脂肪含量の操作により通常群と高カロリ-群に分け、胎児に対する影響を一般肝機能や肝組織中の抗酸化酵素の測定により評価した。しかし二群間に有意な差は認められなかった。妊娠ウサギは神経質で飼料の変化に敏感であり、予想していた摂取量を得られなかったため、十分なカロリ-負荷とならず、モデルとして不適切であった可能性がある。十分なカロリ-負荷のモデルとして経静脈栄養実験の必要性を痛感したが、妊娠ウサギはストレスに弱いため流産しやすく、これまで十分なデ-タが得られていない。一方、諸家の報告にて胎児ではSOD、GSHーPx等のフリ-ラジカル消去酵素の活性が低く、出生後に速やかに誘導されていくことが明らかにされているが、新生児でこのような酵素ストレスに対する防御系が発達していないことと、新生児で完全静脈栄養(以下PN)を開始すると肝障害が起こりやすいこととはなんらかの関連があるようにも考えられる。しかしPN時に於ける肝障害にフリ-ラジカルや脂質の過酸化反応が関与しているかどうかという点に付いては、いまだ十分に明らかにされていない。そこで我々は、帝王切開によって得られた新生仔ウサギに8日間完全絶食下でPNを行い、高カロリ-負荷によるPN肝障害モデルの作成を試み、肝の過酸化脂質や肝組織中SOD活性等のフリ-ラジカル消去酵素活性を通常カロリ-のPN群との間で比較した。その結果、高カロリ-PN群では肝過酸化脂質は有意差を認めないものの高値をとる傾向を認めたが、肝組織中SOD活性には有意な変化を認めなかった。いまだモデルの個体間のばらつきが多く、今後さらに安定したモデルの確立にむけ輸液内容、輸液システム等を検討中である。
物質使用障害の家族に対するＣＲＡＦＴの効果検討

Community Reinforcement and Family Training(CRAFT)は物質使用者の家族を対象とした支援方法であり,物質使用者の相談機関の利用促進,物質使用者の物質使用量の低下,および家族の精神的健康の回復を目的とする。CRAFTは行動理論に基づいているが,家族のどのような行動が変化しているのかは明らかではない。研究1ではシステマティックレビューを用いて家族の行動の変化を整理した。英語論文13編,邦文論文1件の計14件を対象に行ったシステマティックレビューの結果,家族の行動の変化を測定している研究は2編であり,社会的活動の増加と物質使用者の物質使用行動を強化する家族の行動の減少が確認された。物質使用者の向社会的な行動を強化する家族の行動は検討されていたが変化は確認されなかった。一方,物質使用行動を強化する家族の行動および向社会的行動を強化する家族の行動が変化する前提として,家族が機能分析の手続きを理解していることが必要になると考えられた。研究2では,物質使用行動を機能分析の視点からどの程度理解しているのかを確認する「機能分析の理解度チェックリスト」を作成した。地方都市の大学生と行動理論を学んだ専門家を対象として信頼性と妥当性を確認した結果,十分な信頼性(Kuder-Richardson係数= 0.72)が確認され,大学生と専門家間のチェックリストの合計得点に有意な差が確認されたことから妥当性を有しているチェックリストであることが示された。CRAFTによって変化する家族の行動を明らかにすることによって,CRAFTを行う上でどのような家族の行動に着目し支援を行えばよいのかを検討することが可能となる。また,家族が物質使用行動を機能分析の視点からどの程度理解しているのかを明らかにすることで,家族の理解度に応じたより適切な支援を行うことが可能となる。CRAFTは行動理論に基づいており家族の行動の変化が重要視されるが,CRAFTによってどのような行動の変化が家族に生じているのか,またどのような家族の行動がCRAFTの目的とする,物質使用者の相談機関の利用促進,物質使用者の物質使用量の低下,および家族の精神的健康の回復と関連しているのかは明らかではない。実際にCRAFTを実施する前に,システマティックレビューを行い,家族のどのような行動について検討されているのかを明らかにし,CRAFTを行う上で焦点を当てる家族の行動について整理する必要が生じた。また,システマティックレビューを行った結果,家族の社会的活動と物質使用者の物質使用行動を強化する家族の行動および物質使用者の向社会的な行動を強化する家族の行動に焦点が当てられていたことが明らかとなった。一方,CRAFTでは家族に機能分析の教育を行う手続きも含まれている。物質使用者の行動を強化する家族の行動は機能分析の手続きをどの程度理解しているのかによっても変化すると考えられたため,家族の機能分析の理解度を確認するツールを作成することが有効であると考えられた。システマティックレビューおよび,機能分析の理解度を確認するチェックリストの作成は当初の予定には含まれていないが,当初の研究目的である,CRAFTによる物質使用者の相談機関の利用促進,物質使用者の物質使用量の低下,および家族の精神的健康の回復といった効果を検討する際に考慮すべき重要な点であると考えられた。システマティックレビューの結果,家族の行動の変化を確認している論文が2編のみであり,CRAFTでは家族の行動の変化を重要視する一方で,客観的な指標を用いた検討は十分に行われていないことが示された。今後はシステマティックレビューの結果から検討する必要性が示唆された,「社会的活動」,「物質使用者の物質使用行動を強化する家族の行動」,「物質使用者の向社会的な行動を強化する家族の行動」といった家族の行動に焦点をあてる。また,CRAFTには家族のコミュニケーション・スキルを改善する手続きも含まれ,かつ,CRAFTでは重要な手続きと考えられるため,家族の「コミュニケーション・スキル」にも焦点を当て検討を行う。CRAFTを行うことによる家族の行動の変化に関する知見を収集すると共に,家族の行動の変化と物質使用者の相談機関の利用促進,物質使用者の物質使用量の低下,および家族の精神的健康の回復の関連についても検討する。また,物質使用者の行動を強化する家族の行動の変化については,機能分析の手続きの理解度も考慮しながら詳細に検討する。さらに,家族の行動と物質使用者の相談機関の利用促進,物質使用者の物質使用量の低下,および家族の精神的健康の回復の関連を詳細に検討するため,本研究では一事例研究法を用いる。一事例研究デザインにおける標準化平均値差の算出には,最低3人以上が必要とされるため,本研究ではドロップアウトも考慮し5名を対象とする。家族の行動と物質使用者の相談機関の利用促進,物質使用者の物質使用量の低下,および家族の精神的健康の回復の関連が明らかになることによって,家族のニーズに応じてどの行動に着目すればよいのかを検討することが出来るため,より柔軟で効果的な支援を行うことが可能となると考えられる。

英語論文13編,邦文論文1件の計14件を対象に行ったシステマティックレビューの結果,家族の行動の変化を測定している研究は2編であり,社会的活動の増加と物質使用者の物質使用行動を強化する家族の行動の減少が確認された。物質使用者の向社会的な行動を強化する家族の行動は検討されていたが変化は確認されなかった。一方,物質使用行動を強化する家族の行動および向社会的行動を強化する家族の行動が変化する前提として,家族が機能分析の手続きを理解していることが必要になると考えられた。研究2では,物質使用行動を機能分析の視点からどの程度理解しているのかを確認する「機能分析の理解度チェックリスト」を作成した。地方都市の大学生と行動理論を学んだ専門家を対象として信頼性と妥当性を確認した結果,十分な信頼性(Kuder-Richardson係数= 0.72)が確認され,大学生と専門家間のチェックリストの合計得点に有意な差が確認されたことから妥当性を有しているチェックリストであることが示された。CRAFTによって変化する家族の行動を明らかにすることによって,CRAFTを行う上でどのような家族の行動に着目し支援を行えばよいのかを検討することが可能となる。また,家族が物質使用行動を機能分析の視点からどの程度理解しているのかを明らかにすることで,家族の理解度に応じたより適切な支援を行うことが可能となる。CRAFTは行動理論に基づいており家族の行動の変化が重要視されるが,CRAFTによってどのような行動の変化が家族に生じているのか,またどのような家族の行動がCRAFTの目的とする,物質使用者の相談機関の利用促進,物質使用者の物質使用量の低下,および家族の精神的健康の回復と関連しているのかは明らかではない。実際にCRAFTを実施する前に,システマティックレビューを行い,家族のどのような行動について検討されているのかを明らかにし,CRAFTを行う上で焦点を当てる家族の行動について整理する必要が生じた。また,システマティックレビューを行った結果,家族の社会的活動と物質使用者の物質使用行動を強化する家族の行動および物質使用者の向社会的な行動を強化する家族の行動に焦点が当てられていたことが明らかとなった。一方,CRAFTでは家族に機能分析の教育を行う手続きも含まれている。物質使用者の行動を強化する家族の行動は機能分析の手続きをどの程度理解しているのかによっても変化すると考えられたため,家族の機能分析の理解度を確認するツールを作成することが有効であると考えられた。システマティックレビューおよび,機能分析の理解度を確認するチェックリストの作成は当初の予定には含まれていないが,当初の研究目的である,CRAFTによる物質使用者の相談機関の利用促進,物質使用者の物質使用量の低下,および家族の精神的健康の回復といった効果を検討する際に考慮すべき重要な点であると考えられた。システマティックレビューの結果,家族の行動の変化を確認している論文が2編のみであり,CRAFTでは家族の行動の変化を重要視する一方で,客観的な指標を用いた検討は十分に行われていないことが示された。
遺伝子発現の脳可塑性形成への必須性に関する研究

神経インパルス,神経伝達物質,活性ペプチド,ホルモン,オータコイド,細胞増殖因子などは,神経細胞においてシナプス膜に存在する受容体を刺激し,細胞内に細胞外からの情報を伝達している。その反応は,受容体に構成されたイオンチャネル,電位依存性イオンチャネル,代謝性受容体刺激によるいわゆるセカンドメッセンジャーの産生,チロシンキナーゼ活性化反応など多岐にわたっている。細胞内低濃度のカルシウムイオン(Ca^<2+>)は,セカンドメッセンジャーの一つとして,細胞内で重要な役割を演じている。本研究では,とくに,受容体刺激に基づくCa^<2+>の細胞内反応に焦点を絞り,脳内での作用を機能的な面から明らかにすることを目的とした。したがって,よりin vivoに近い反応を調べるために,ラット海馬初代培養細胞を用い,海馬での興奮性神経伝達物質として重要な役割を演じているグルタミン酸刺激に基づく反応を調べた。生後1日目のラット海馬を摘出し,初代培養細胞を当教室の定法にて培養し,実験に用いた。10μMグルタミン酸を投与し,時間的経過で,CaMキナーゼII,IV活性化反応を比較,検討した。グルタミン酸投与後,CaMキナーゼII自己燐酸化反応は急激に上昇し,刺激後30分で上昇は維持されていた。一方,CaMキナーゼIV燐酸化反応もまた急激な上昇を示し,3分でピークを示した後,10分では元のレベルに戻った。活性化反応と考えられた。シクロスポリンAの投与によってグルタミン酸刺激CaMキナーゼIV燐酸化反応は上昇し,CaMキナーゼII自己燐酸化反応は上昇しなかった。この結果は,燐酸化CaMキナーゼIVはカルシニューリンによって脱燐酸化され,自己燐酸化CaMキナーゼIIは脱燐酸化されないことを示し,事実,in vitro実験で確認した。CaMキナーゼII,IVの細胞内動態を解析することができた。
アポトーシス誘導におけるセラミドの役割

セラミドは,サイトカイン刺激や環境ストレスに伴うアポトーシスのセカンドメッセンジャーとして位置づけられている.しかしながら,細胞内に局在するセラミドのターゲット分子は不明である.本研究では,セラミド固相化カラムを使ったクロマトグラフィーによりBimを同定した.リコンビナントBimを使ったセラミド結合試験の結果,BimのKd値は,21.71 nMであった.また,本分子のC末端側の疎水性領域を欠如した変異体では,野生型と比べて最大結合数は低下し,アポトーシス誘導能が低下した.以上から,セラミドの役割は,Bimタンパク質と相互作用し,ミトコンドリア崩壊を伴うアポトーシスを誘導する機構が推定された.スフィンゴ脂質セラミドは,熱や紫外線,化学物質等のストレス,TNFα,インターフェロンγ,Fasリガンドなどの炎症性サイトカインの刺激に応答して細胞内で生成され,神経系,血管系形成,免疫系および性分化におけるアポトーシスに関与する。しかしながら,セラミドがアポトーシスを誘導する機序は依然不明である。そこで,本研究では,セラミドを輸送し,カスパーゼ前駆体を活性化して,アポトーシスを誘導する未知分子を単離する。この分子が,セラミドの細胞内分布・局在性を決定し,セラミドのセカンドメッセンジャーとしての作用を促進することを,バイオアッセイによって解析する。アポトソームは,ミトコンドリア崩壊により放出されたチトクロームCと細胞質に局在するApaf-1とが会合して形成される多量体(分子量680K以上)である。アポトソームは,前駆カスパーゼ9をリクルートして,カスパーゼ9が活性化し,カスパーゼ3などの下流のカスパーゼを活性化し,アポトーシスが誘導されると考えられている。よって,本年度は,ヒト培養細胞へストレスを暴露してアポトソーム形成を観察し,分離・精製法を確立した。そこで,ZE細胞およびJurkat細胞へUVストレスを暴露して,細胞を破砕して除核後,超遠心法によって細胞質画分を調整した。ゲル濾過クロマトグラフィーによって分画し,ウエスタンブロット解析よりカスパーゼ9活性化やチトクロームCおよびカスパーゼ9のタンパク質発現をを調べた。すなわち,アポトソームの分離・精製できる試験条件を決定した。また,アポトソーム画分のおけるセラミド含量を測定した結果,アポトソーム画分にセラミドが含有することを突き止めた。以上のことから,アポトーシス誘導時においてセラミドが細胞質画分,とくにアポトソーム画分にセラミドが分布することを見出した。セラミドは,熱や紫外線,化学物質等のストレス,TNFα,インターフェロンγ,Fasリガンドなどの炎症性サイトカインの刺激に応答して生成され,神経系,血管系形成,免疫系および性分化におけるアポトーシスに関与する.これまで研究では,スフィンゴミエリナーゼ群によるセラミド生成機構を明らかにしてきたが,セラミドがアポトーシスを誘導する機序は依然不明である.そこで,本研究では,セラミドを輸送し,カスパーゼ前駆体を活性化して,アポトーシスを誘導する未知分子を単離する。この分子が,セラミドの細胞内分布・局在性を決定し,セラミドのセカンドメッセンジャーとしての作用を促進することを,バイオアッセイによって解析する.これまでに発見されているセラミド結合タンパク質は,セラミドアフィニティークロマトグラフィーによりカテプシンDが同定されている.カテプシンDは,リソソームに局在するプロテアーゼで,細胞質に局在しないため,本研究の対象外となる.しかしながら,セラミドと結合性を持つ酵素として同定された。この方法論を活用して,セラミド結合分子の特定に使用できるものと考えられる.そこで,本年度では,セラミドの骨格のアミノ酸セリン残基を有する特徴を利用して,官能基アミノ基と反応性が高い,CH-Sepharose 4Bを使ってセラミドカラムを作製した.セラミド結合性タンパク質の精製は,ストレス処理したヒト培養細胞から調整した細胞質画分を使ってFPLCで分画し,SDS-PAGEゲルで分離後,ウエスタンブロット解析により溶出したタンパク質を調べた.その結果,セラミドに結合する可能性ある分子は9種であった.その中には,アポトーシス誘導分子,アポトーシス抑制分子や酸化還元反応に関わる分子が存在した.また,これまでに報告されているカテプシンDやセラミド輸送体の存在も確認され,本アッセイが成立しているものと強く示唆するものであった.セラミド結合タンパク質の同定に成功したこと.さらに,本分子のリコンビナントタンパク質を作製して,セラミドとの結合性を再度確認後,セラミドとの結合率を算出することが可能となったこと.次年度以降から,セラミド結合性タンパク質の解析が,分子が同定できたことから,より具体的になり,試験管レベル,細胞内小器官レベル,細胞レベル,および個体レベルで可能となったこと.セラミドは,サイトカイン刺激や環境ストレスに伴うアポトーシスのセカンドメッセンジャーとして位置づけられている.しかしながら,細胞内に局在するセラミドのターゲット分子は不明である.本研究では,セラミド固相化カラムを使ったクロマトグラフィーによりBimを同定した.リコンビナントBimを使ったセラミド結合試験の結果,BimのKd値は,21.71 nMであった.

また,本分子のC末端側の疎水性領域を欠如した変異体では,野生型と比べて最大結合数は低下し,アポトーシス誘導能が低下した.以上から,セラミドの役割は,Bimタンパク質と相互作用し,ミトコンドリア崩壊を伴うアポトーシスを誘導する機構が推定された.セラミドは,化学物質等のストレス,あるいは炎症性サイトカインの刺激に応答して生成され,神経系,血管系,免疫系の形成および性分化におけるアポトーシスに関与する.申請者らは,中性スフィンゴミエリナーゼ群によるセラミド生成機構を明らかにしてきたが,セラミドがアポトーシスを誘導する機序は依然不明である.そこで,本研究では,セラミドを輸送し,カスパーゼ前駆体を活性化して,アポトーシスを誘導する未知分子を単離する.この分子が,セラミドの細胞内分布・局在性を決定し,セラミドのセカンドメッセンジャーとしての作用を促進することを,生物活性によって解析した.本研究では,セラミドの骨格のアミノ酸セリン残基を有する特徴を利用して,官能基アミノ基と反応性が高いCH-Sepharose 4Bを使ってセラミドカラムを作製した.セラミド結合性タンパク質の精製は,ストレス処理したヒト培養細胞から調製した細胞質画分を使って分画し,SDS-PAGEポリアクリルアミドゲルで分離後,ウエスタンブロット解析によってセラミドにより溶出したタンパク質を調べた.その結果,セラミドに結合した可能性がある分子が9種であった.その中には,アポトーシス誘導分子,アポトーシス抑制分子や酸化還元反応に関わる分子が存在した.また,これまでに報告されたカテプシンDやセラミド輸送体の存在も確認できることからも,本アッセイが非常に優れているものと強く示唆された.本セラミド結合性分子のリコンビナントタンパク質を作製し,解離定数,細胞内でのセラミドとの相互作用について解析した.細胞における本分子の役割を調べるため,本遺伝子を培養細胞へ発現させて,アポトーシス誘導能を確認した.アポトソームの分離・精製できる試験条件を決定したこと。ストレス応答に関わるセラミドがアポトソーム画分に分布することを突き止めたこと。これらのことから,次年度以降から,セラミド結合性タンパク質の精製に取り組むことが可能となった。今後の研究として,本セラミド結合タンパク質を作製して,セラミドとの結合率,細胞内でのセラミドとの相互作用について解析に取り組む.また,ミトコンドリアを精製して,本分子とセラミドとの複合体が,呼吸鎖へ影響を調べる.また,細胞内から本分子を抽出し,どのような脂質が相互作用しているかを調べる.細胞における本分子の役割を調べるため,本遺伝子を導入した発現ベクターを作製して,培養細胞へ導入し過剰発現させて,アポトーシス誘導能を調べる.また,本遺伝子の翻訳阻害試験を試みて,セラミド結合分子(本分子)に依存してアポトーシスが抑制されることを確認する.セラミド結合分子のゼブラフィッシュにおける機能を調べるため,突然変異体を使って,セラミド結合遺伝子の機能異常によって誘発される初期胚の表現型を解析して,遺伝子機能を解明する以上の計画に基づいて,「セラミドを介する新規アポトーシスの分子機構」を解明する.水産化学脂質生化学今後の研究として,セラミドカラムを作製後,細胞質画分あるいはアポトソーム画分からアフィニティークロマトグラフィーおよびイオン交換クロマトグラフィーによってセラミド結合性タンパク質を精製する。セラミド結合分子は,FPLCまたはSDS-PAGEで分離後,質量分析やウエスタンブロット解析によりタンパク質の組成を同定するとともに,脂質化やリン酸化などの化学修飾も調べる。