hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
難培養微生物用新規バルブレス一菌体分離・ゲノム増幅マイクロ流体チップの開発

マイクロ流路内で菌体やDNAを分離するために,ナノファイバーフィルタ(目付け量0.54 mg/cm2)を作製し,λ/HindIII DNAマーカーサンプルの分離を試みたが,DNAがナノファイバー膜を透過したため,今後は目付け量の増加やDNA吸着性のナイロン・ナノファイバー膜などを作製する.【3.分離予備実験】(1)フローフォーカシング:シース流を用いた菌体の分離と流路壁面への付着紡糸のため,テスト用マイクロ流路(W50μm×D 50μm.3流路が一本に合流.両端:シース,中央:サンプル)を用い,Φ1μm蛍光ビーズ(FB)の分離を試みたところ,シース流によるFBの分離とフォーカシングを確認した.(2)分離用電磁バルブ:分離用分岐流路の先端に超小型電磁バルブを接続し,FBの分離を試みた.しかし観察用低流速条件(100-nL/min)下では,電磁弁配管抵抗が高く,弁を開いても分離できなかった.ただし排出口のチューブを直接押さえるとFBを止められるため,適切な位置にピンチバルブを設置することで微生物分離が可能になると考えられる.予備実験により実験に必要な機材を選定する予定だったが,時間が足りず購入が間に合わなかった.これらの未使用額およびH24年度請求額は,実験を早急にすすめ,今年度実験に必要な機材(バルブ,ポンプ,消耗品)等に使用したい.これまで環境中の難培養微生物を,目視下で簡便に単離し,微細な反応槽内での全ゲノム増幅(Whole Genome Amplification, WGA)により,バイアスの少ない増幅DNAを得るマイクロ流体デバイスの開発を行った.本デバイスでは,ナノファイバー膜によるDNA分離により,バルブのない簡便な構造を図った.しかしナノファイバー膜の孔径は約300nmと比較的大きく,抽出時に生じるゲノムDNA断片の分離保持が困難だった.そこでナノファイバー膜よりも孔径の小さい,アガロースゲル内への菌体の包埋と,レーザーによる菌体の単離を試みた.アガロースゲルに,モデル微生物として大腸菌と,レーザーを吸収する色素を添加した.ゲルは,ハンドリング性向上と切断後の再付着防止のために,乾燥させ,フィルム化した.得られたアガロースフィルムより,Laser Microdissection (LMD)(Leica)で,目視で確認しつつ,一菌体を含む約100 x 100 μmの切片を切り出した.しかしこの切片は乾燥によりアガロース繊維が互いに密着し,高い透明性を示すが,酵素やプライマーが内部に浸透しにくくWGAが困難だった.そこでアガロース繊維の密着を防ぐ試薬を検討したところ,ポリビニルアルコール(PVA)やポリビニルピロリドン(PVP)の添加により,乾燥後水溶液に浸漬するとPVAやPVPの溶出によりフィルムが膨潤した.そこでこれらのフィルムを用いてWGAを行うと,膨潤によるアガロース孔径の拡大による,フィルム内への酵素やプライマーの拡散により,大腸菌の染色体DNAが増幅された.以上の結果から,アガロースフィルムを用い,目視下で簡便に菌体を単離し,微細なゲル内で酵素増幅をする系を確立した.今後次世代シーケンサーによる増幅ゲノムDNAのバイアス評価などを行い,本法の有用性について評価したい.本研究課題から得られた成果に対し,2015/5/13特許出願予定複合新領域これまでマイクロ流路内で細胞分離を行うセルソーターの報告が行われ,多数の細胞をハイスループットに分離するため,高速な送液と蛍光強度による自動分離技術は研究されていたが,逆に低速での送液は困難だった.
ポストモダンと呼ばれる時代のテレビ番組における方言の表象に関する研究

神奈川県横浜市にある放送ライブラリーにて1「福井のお米で10キロ痩せたタミーの322日」(福井放送、1983)、2「岩手に生きる和賀のねってしバンザイ」(IBC岩手放送、1984)、3「おもしろおかしザ・話芸」(関西テレビ放送、1986)、4「正しい東北弁話し方講座」(NHK、1987)の4本を視聴し分析した。「方言」の表象という観点で以上の4本の番組をまとめると、結果は次のようになる。1では、アメリカからの留学生が日本での高校生活を通して新しいアイデンティティを獲得した証として「方言」が表象されている。2では、失われつつある地域の文化としてだけでなく、取り戻したい日本人の自由な精神を象徴する言葉として「方言」が取り上げられている。34は娯楽番組と教養番組という位置づけは異なるものの、両番組とも伊奈かっぺい氏による津軽弁の発音に関する話芸が登場することから、当時方言の話芸が一定の人気を集めていたことがうかがえる。だが、伊奈かっぺい氏による津軽弁の発音に関する話芸は共通語の音声や文字表記との対比のなかでおこなわれており、「方言」が娯楽の対象になったというよりも、「日本語」の多様性が娯楽の素材として扱われたと見ることができる。なお、「方言」をタイトルに用いながらも、結果的に「日本語・日本人」論になっている4は、前代以上に「個性」や「多元性」を志向しながらも、その志向が多数派の論理のなかで展開されていた1980年代を象徴する番組であると言える。年度の途中で所属機関を異動したことで、視聴調査を進める予定であった長期休暇の計画を変更した。また、視聴対象のテレビ番組の内容や構成によって分析のための書き取りに予定以上の時間を要する場合があったため、当初の研究計画よりもやや遅れる結果となった。初年度にテレビ番組における「方言」の表象について大方の傾向を把握することができたことを踏まえ、今年度は教養として「方言」を取り上げた東日本放送「週刊ことばマガジン」(2005年2011年)を中心に分析する。また、初年度の視聴調査を通して、放送ライブラリーで視聴できる番組の分析だけではポストモダンと呼ばれる時代における「方言」の表象の全体像が把握できないことが明らかになったため、少し遡って1970年代以降の「方言」をテーマにしたNHKの教養番組の視聴分析を実施したいとも考えている。だが、これはNHKアーカイブスを利用した学術トライアルの審査を通過しなければ実施できない。なお、仮に審査に通過したとしても視聴調査のための移動経費はかからない。所属機関の異動により研究計画が遅れたことで、データの整理を依頼する補助員の手配ができなかったことをはじめ、放送ライブラリーでの視聴回数を変更せざるをえなかったため、次年度使用額が生じた。今年度は、研究の遅れを取り戻すべく補助員によるデータの入力作業(6月から)と放送ライブラリーでの視聴回数を計画通り実行する予定である。
内因性抗菌ペプチドcathelicidinによる敗血症性ショックの分子病態制御

【目的】敗血症は救急救命治療の発達した先進国においても致死的経過をたどる重篤な病態であり、その多くに細菌感染が関与している。好中球は感染防御において重要な働きをしているが、敗血症ではその寿命が延長し、活性化された好中球が組織・臓器障害に関わると考えられている。一方、cathelicidin(LL-37)やhBDs(human β-defensins)などの内因性抗菌ペプチドは殺菌作用の他に免疫担当細胞の機能を調節することが近年注目されている。そこで我々は、これら抗菌ペプチドの好中球アポトーシスに及ぼす影響について検討した。【結果】LL-37とhBD-3は好中球の自発的なアポトーシスを強く抑制することがわかった。また、LL-37とhBD-3の作用によって、ERKのリン酸化、抗アポトーシスタンパク質Bcl-XLの発現、さらにカスパーゼの活性低下が誘導されことがわかった。さらに、LL-37とhBD-3による好中球アポトーシスの抑制は、ホルミルペプチド受容体FPRL1(formyl-peptide receptor-like 1)やヌクレオチド受容体P2×_7の阻害剤、およびケモカイン受容体CCR6に対する中和抗体によってそれぞれブロックされることがわかった。【考察】cathelicidinやデフェンシン等の抗菌ペプチドは殺菌作用によって生体を微生物感染から守るだけでなく、特異的な受容体に作用して好中球のアポトーシスを抑制し、食細胞としての機能を維持することによって微生物感染に対して防御的に働くと考えられる。しかし、これらの抗菌ペプチドは好中球を活性化し、その寿命を延長することによって敗血症等の病態において組織・臓器障害を増悪させる可能性も考えられる。[目的]真核細胞は生体を微生物感染から守るため種々の殺菌ペプチドを発現している。我々はこれまでに、cathelicidinファミリーに属するモルモット由来のCAP11(cationic antibacterial polypeptide of 11-kDa)が、細胞表面のCD14に対するLPSの結合を阻害し、エンドトキシンショックに対して防御的に働くことを明らかにしている。一方、内因性カンナビノイドであるアナンダミドはLPS刺激によりマクロファージ系細胞より産生され、エンドトキシンショックの患者血中では高値を示すことが知られている。そして、アナンダミドは血圧低下等を引き起こし、エンドトキシンショックの病態に関与する可能性が示唆されている。そこで本実験ではLPS刺激によるマクロファージ系細胞からのアナンダミド生成に対し、CAP11がどのような効果を及ぼすかについて検討した。[方法]マクロファージ系細胞RAW264.7をCAP11存在下、非存在下にLPS刺激し、細胞および上清中のアナンダミドをBligh & Dyer法により抽出し、蛍光ラベル化した後、HPLCを用いて定量を行った。また、RAW264.7細胞上のCD14に対するLPS結合に及ぼすCAP11の作用をFACSで解析した。また、アナンダミド分解酵素であるFAAHの活性を、[^3H]標識アナンダミドを基質として測定した。[結果・考察]LPSの刺激によるRAW264.7細胞からのアナンダミド生成に対して、CAP11(1μg/ml)はアナンダミド生成を有意に抑制した。さらに、CAP11はLPSのRAW264.7細胞への結合に対してもほぼ完全に抑制した。一方、CAP11並びにLPSは、FAAHの活性には影響を及ぼさなかった。以上の結果から、CAP11のエンドトキシンショックに対する防御作用の機序の一つとして、アナンダミドの生成抑制が関与することが示唆された。【目的】敗血症は救急救命治療の発達した先進国においても致死的経過をたどる重篤な病態であり、その多くにグラム陰性菌、陽性菌感染が関与している。グラム陰性菌

由来のLPSが炎症細胞を刺激すると、内因性カンナビノイドであるアナンダミドが細胞外に放出され、さらに、細胞がサイトカイン刺激を受けるとHMGB(high mobility group box)-1が細胞外に放出される。そして、アナンダミドは早期メディエーターとして敗血症における低血圧性ショックに、また、HMGB-1は後期メディエーター"death mediator"として多臓器不全に深く関わっている。一方、申請者は今までに、自然免疫に関わる抗菌ペプチドcathelicidinが、エンドトキシンショックにおいて防御的に働くことを示している。以上のような研究経過から、申請者は、cathelicidinを用いることによって、アナンダミドやHMGB-1の動態を抑制し、敗血症性ショックを安全かつ有効に制御できるのではないかという着想に至った。そこで本研究では、アナンダミド生成とHMGB-1放出に及ぼすcathelicidinの影響をin vitroで検討した。【結果・考察】CAP11は、LPSの刺激によるRAW264.7細胞からのアナンダミド生成とHMGB-1の放出を1μg/mlで有意に抑制した。さらに、CAP11はLPSのCD14に対する結合を1μg/mlでほぼ完全に抑制した。以上の結果から、CAP11のエンドトキシンショックに対する防御作用の機序として、アナンダミド生成とHMGB-1放出の抑制が関与することが示唆された。【目的】敗血症は救急救命治療の発達した先進国においても致死的経過をたどる重篤な病態であり、その多くにグラム陰性菌、陽性菌感染が関与している。グラム陰性菌由来のリボ多糖LPSが炎症細胞を刺激すると、HMGB(high mobility group box)-1が細胞外に放出される。そして、HMGB-1は"death mediator"として多臓器不全に深く関わっている。そこで本研究では、HMGB-1放出に及ぼすcathelicidinの影響をin vitroとin vivoで検討した。【方法】RAW264.7細胞をcathelicidinであるCAPllの存在下、非存在下でLPS刺激した後、HMGB-1の放出をwestem blot法で定量した。また、エンドトキシンショックモデルを用いて、末梢血.中におけるHMGB-1の動態を評価するとともに、CAPllの効果をin vivoで判定した。【結果・考察】LPS刺激によりRAW264,7細胞の上清中へのHMGB-1の放出がLPSの濃度依存的に増加した。興味深いことに、CAPllは、RAW264.7細胞へのLPSの結合を阻害し、HMGBIの放出を有意に抑制した。ガラクトサミン負荷エンドトキシンショックモデルマウスでは、投与後5時間において血清中のHMGB-1は上昇傾向にあったが、CAPllはこれに対して抑制効果を示した。
血小板由来成長因子(PDGF)のシグナル伝達機構及び癌化調節機構の検討

ヒトDFSP由来腫瘍細胞をskin biopsy時に収集し、in vitro培養系にて継代培養した後、6つのprimary cultureを樹立した。これら腫瘍細胞におけるCOL1A1/PDGFBfusion遺伝子の発現を特異的なprobeを作製し、RT-PCR法及びノーザンブロット法にて確認した。腫瘍細胞におけるPDGF β型受容体の発現及びそのリン酸化の程度を検討するため、抗PDGF β型受容体血清にて免疫沈降した後抗tyrosine抗体を用いてウエスタンブロット法を行ったところ、全例でPDGF β型受容体の発現及び活性化を認めた。次にPDGF β型受容体の特異的阻害剤(STI-571)によるin vitroでの増殖能に関する影響を検討したところ、60-75%の増殖抑制が認められた。in vitroにおいてCOL1A1/PDGFBfusion遺伝子を発現しているDFSP腫瘍細胞をnude miceの皮下に移植し、in vivoでの腫瘍形成能を検討したところ、6例中1例の腫瘍細胞が皮下に腫瘍を形成した。PDGF β型受容体阻害剤を投与し、腫瘍の増殖能に及ぼす影響を検討したところ、腫瘍の増殖が阻害され、TUNEL法によりアポトーシスが誘導されていることが確認された。ヒトDFSP腫瘍の発生、増殖においてPDGFBによるautocrine PDGF β型受容体の活性化が関与している可能性が示唆された。PDGF β型受容体の特異的阻害剤であるSTI-571は、生物毒性なども少なく、現在CMLなどの白血病治療薬となっており、今後ヒトDFSP腫瘍の薬物的治療として有用である可能性が示唆される。隆起性皮膚線維肉腫(DFSP ; dermatofibrosarcoma protuberance)は皮下に浸潤性に増殖し局所再発傾向が強い、中間度の悪性度を示す腫瘍である。DFSPは第17、22染色体間の再編成により、conagen typeIα1遺伝子とPDGFB遺伝子が融合したfusion遺伝子(COL1A1/PDGFB gene)が存在することが知られている。これら腫瘍細胞におけるCOL1A1/PDGFBfusion遺伝子の発現を特異的なprobeを作製し、RT-PCR法及ぴノーザンプロツト法にて確認した。腫瘍細胞におけるPDGFβ型受容体の発現及びそのリン酸化の程度を検討するため、抗PDGFβ型受容体血清にて免疫沈降した後抗tyrosine抗体を用いてウェスタンプロット法を行ったところ、全例でPDGFβ型受容体の発現及び活性化を認めた。次にPDGFβ型受容体の特異的阻害剤(STI-571)によるin vitroでの増殖能に関する影響を検討したところ、60-75%の増殖抑制が認められた。in vitroにおいてCOL1A1/PDGFBfusion遺伝子を発現しているDFSP腫瘍細胞をnudemiceの皮下に移植し、in vivoでの腫瘍形成能を検討したところ、6例中1例の腫瘍細胞が皮下に腫瘍を形成した。PDGFβ型受容体阻害剤を投与し、腫瘍の増殖能に及ぼす影響を検討したところ、腫瘍の増殖が阻害され、TUNEL法によりアポトーシスが誘導されていることが確認された。ヒトDFSP腫瘍の発生、増殖においてPDGFBによるautocrine PDGFβ型受容体の活性化が関与している可能性が示唆された。PDGFβ型受容体の特異的阻害剤であるSTI-571は、生物毒性なども少なく、現在CMLなどの白血病治療薬となっており、今後ヒトDFSP腫瘍の薬物的治療として有用である可能性が示唆される。
中国都市の経済発展と環境-成都、瀋陽、鞍山市の研究

中国内陸部の環境と経済発展の調和を実現ための共同研究の一環として、本研究では環境の総合的研究を行うと共に経済発展の環境影響についても調査研究を行っている。本年度は、経済解析の分野では主要な成果は主要環境汚染産業についての二酸化硫黄排出量のデータを収集して解析を開始した。環境汚染の人体影響の調査面では、鞍山市において年平均値を指標にして高度汚染地区(0.037ppm)、中汚染地区(0.027ppm)および低汚染地区(0.014ppm)を選択し、各地区内の小学校の学童4318人およびその両親を対象として健康影響調査を開始した結果、各種呼吸器症状の有症率は持続性咳は男児6.4%、女児5.0%、持続性ゼロゼロは5.2%と3.5%、喘鳴2.1%と1.7%、喘息様症状・現在は0.9%と0.3%であった。成人8256人の解析では、持続性セキ・タンの有症率は男子の非喫煙者は0.7%、現喫煙者は2.6%、女子では1.6%と6.5%であった。一方、喘息様症状・現在は男子は0.0%と0.1%、女子では0.8%と0.8%であった。大気汚染の簡易計測法では現地における測定設備の整備を7割程度終了し、SO_2およびNO_2の測定法についての測定精度を検討中である。また、大気汚染ガスの吸収剤については、中国全土で使用するためには低温度の吸収効率の不足が認められたので、吸収剤を検討中である。また、大気汚染物質を先駆物質とする酸性雨の発生状態を調査するために成都市および周辺地域における酸性雨のデータを収集中である。
幼稚園給食による食育の効果－卒後10年間の追跡調査－

本研究では、食に関する非認知的スキルや主観的健康観に着目して、幼児期における学校給食を活用した食育の効果を検証した。幼稚園や保育所を卒園した子どもたちの現在(小学1年生から高校1年生)の非認知的スキルに影響する要因を、ロジスティックス回帰分析にて解析した。その結果、小学生では、家庭の食事が好き、食への興味関心が高い、主観的健康観が高い児童は、それぞれそうでない児童と比べて、高い非認知的スキルを持っていた。また、中高生では、食への興味関心が高い、主観的健康観が高い、いらいらしない生徒は、それぞれそうでない生徒と比べて、高い非認知的スキルを持っていた。このように、現在の非認知的スキルに影響を与える要因として、現在の健康観や食事に対する意識がある可能性が示唆された。幼児期の給食の記憶や小学校の給食が楽しみであったかどうかも分析の対象としたが、現在の上記に示した要因の方が強い影響を与えている可能性が示唆された。さらに、食育に力を入れていた園とその他の園に通園していた児童生徒の現在の生活習慣・食習慣・食意識の関連性の検討では、朝食摂取頻度、食に関する話、味に関する話、食事中にテレビを付けない、現在の料理の手伝い、いろいろな国へ行ってみたいの6項目で有意な関連がみられた。他の分析も含めて、総合的に判断すると、幼児期の食育は、現在の健康観や食習慣と関連がある可能性があるが、現在の非認知的スキルには現在の主観的健康観や現在の食意識が影響を与えていたため、過去の食育より現在の健康観や食意識が優先される可能性が示唆された。これらのことより、良い健康習慣を身に付けさせるためには、各ライフステージに合わせた食育を常に実施していくことが重要であると提案したい。本研究は、幼児期において学校給食を活用した食育の効果を検証するため、食に関する非認知的スキルに着目して、過去の基礎データを生かして現在までの10年間の追跡調査を行うものである。一般的に学校で児童生徒が客観的に評価される際に使われる指標はテストの点数である。また、頭の良さとされる知能指数はIQテストで測られる。これらの指標が、我々を評価してきた。しかし、近年、非認知的スキルと呼ばれる新しい評価指標が注目を集めている。非認知的スキルとは、社会経済学や心理学の分野では、学業、進路決定等への影響が示唆されている。具体的には、自尊心、共感性、協調性、粘り強さ、社会性など、幅広い要素が含まれている。言い換えるとこれらは全て、幼児・児童・生徒の心情や意欲に関連するものと理解でき、非認知的スキルと言葉は異なるが、これまでの日本の教育現場で重要視されてきた心情・意欲・態度と重複するものと考えることができる。現在、新しい能力として世界で注目されているが、日本ではこれまでも大切にされてきた概念と考えられる。私たちはこれまで、どのような意識や態度が食事と関連しているのかを検討してきた。特に、「食べ物への興味関心」と「食べ物を尊重する心」について検討を重ねてきた(以下、食に関する非認知的スキル)。そして、冒頭に示した目的を達成するため、まず10年間の幼稚園児のデータの分析を実施した。その結果、10年間の幼児の変化について、身長や体重、好き嫌いの有無や食に関する非認知的スキルで大きな変化は見られなかった。一方、10年間の幼児の食に関する非認知的スキルの高低と食習慣・食行動との間に有意な関連が認められた。食に関する非認知的スキルの高低は食習慣や食行動の全ての要因と関連がある可能性が示唆された。今後、幼児の習慣や行動が継続しているのか現在の食意識が優先されるのかを検討する予定である。今年度は2つの調査を行うことを主な計画としていた。そのため、まず、調査を実施するためのアンケート項目の選定や倫理委員会承認を経て調査を開始した。調査1として、幼児期の食習慣の継続性を確認するため、過去に在籍していた園児(現在は小学生・中学生・高校生)約900名とその保護者を対象にアンケート調査を郵送にて配布した。また、調査2として、研究データを一般化するため、便宜的抽出法により、介入園に在籍していない小学生・中学生・高校生、約1,200名とその保護者にも郵送にて介入園に在籍していた児童・生徒とその保護者に配布したものと同様のアンケート用紙を配布し調査を行った。回収率が想定を下回ったが、分析を行うには十分な数を確保できたと考えているため、追加の調査などは実施しない予定である。そして、調査1、2により得られたデータ、過去に取得済みのデータの整理や分析を行った。このように、本年度予定していた通り、2つの調査によるデータの収集とデータ整理、さらに一部のデータの解析を行うことができた。従って、研究は計画通り概ね順調に進んでいると考える。

このように、現在の非認知的スキルに影響を与える要因として、現在の健康観や食事に対する意識がある可能性が示唆された。幼児期の給食の記憶や小学校の給食が楽しみであったかどうかも分析の対象としたが、現在の上記に示した要因の方が強い影響を与えている可能性が示唆された。さらに、食育に力を入れていた園とその他の園に通園していた児童生徒の現在の生活習慣・食習慣・食意識の関連性の検討では、朝食摂取頻度、食に関する話、味に関する話、食事中にテレビを付けない、現在の料理の手伝い、いろいろな国へ行ってみたいの6項目で有意な関連がみられた。他の分析も含めて、総合的に判断すると、幼児期の食育は、現在の健康観や食習慣と関連がある可能性があるが、現在の非認知的スキルには現在の主観的健康観や現在の食意識が影響を与えていたため、過去の食育より現在の健康観や食意識が優先される可能性が示唆された。これらのことより、良い健康習慣を身に付けさせるためには、各ライフステージに合わせた食育を常に実施していくことが重要であると提案したい。今後は、本研究に関して得られたデータを詳細に分析いく予定である。現在まで、過去のデータの整理、そのデータの分析、全体の中学生の主観的健康観に対する影響を調べたところである。また、小学生の主観的健康観に対する影響を確認しているところであるので、今後はそのデータの公表に向けての作業を行う予定である。さらに、非認知的スキルに対するライフステージごと(小学生・中学生・高校生)の分析結果も公表に向けて準備する予定である。また、介入園とその他の園に通園していた者との比較や介入園に通園していた幼児が現在どのような食習慣を行っているのか、食意識の継続性についても検討が必要である。さらに、私はこれまで、幼児と母親の食意識や食態度の関連について研究を実施してきたので、本研究のデータをその視点でも分析したいと考えている。そして、現在の児童・生徒に幼児期の食育や給食の内容について記述して頂いているので、その部分についてはテキストマイニングの手法を用いて分析し、どのような食育や給食の内容が将来(現在)の記憶に繋がっているのかを確認したい。全体的な分析と細かな分析を行うことで、将来の健康に与える影響や要因、それらにどの程度幼児期の給食や食育が関与しているかどうかを明らかすることができると考える。そして、得られた結果は一般の保護者や児童・生徒が読んでもわかる内容へと書き換え、データの開示を希望している被検者に対して個別に返却する予定である。また、協力を得た対象校の教諭にも配布予定である。そして、今回の調査の結果が、被検者のみでなく一般の児童・生徒にも伝わるような工夫を考え、国民が将来健康になるための一助となるように努めたい。データの入力、整理のために予定していた人件費が少ない経費で実施できたため、本年度の予算を削減することができた。また、アンケート郵送に関わる通信費については、研究計画の段階では返信用封筒に切手を貼り送付する予定で金額を見積もっていたが、料金受取人払を利用したため、大幅に予算を削減することができた。次年度は今年度得られたデータの分析、まとめを行う作業が主となるため、成果の発表に必要な経費として使用したい。さらに、研究協力者への返却資料としてリーフレット作成を予定しているが、その質の向上に向けて、画像編集ソフトや上質用紙購入に使用できればと考えている。
脳皮質異形成で発現が特異的に変化している遺伝子の同定とその機能解析

近年てんかんの原因として、脳細胞の分化・移動の障害である皮質異形成(cortical dysplasia;CD)が注目されている。われわれは、CDの構成やてんかん原性のメカニズムを解析することを目的とし、CD組織で発現が変化している遺伝子の同定を試みた。切除されたCD及び正常脳組織からmRNAを抽出、Subtraction法を用いて発現に差のある遺伝子をクローニングし、塩基配列を決定した。今までに15種類の既知の遺伝子を同定した。発現が増強しているものには、GFAP、S100、MlC2などのアストロサイトマーカーがあり、CD組織で増加している異形グリア細胞がアストロサイト由来であることを示唆している。また、clusterin、VDJP1(vitamin D3 up-regurated protein 1)の発現が増強していた。clusterinはストレスに対して神経細胞保護作用を有すると考えられており、てんかんの原因である神経細胞の過剰放電に対する反応と考えられた。VDJP1は、最近thioredoxinと結合しその作用を抑制することが証明された。thioredoxinには種々の活性があり、細胞の分化にも関わることがわかっている。CDが脳細胞の分化の障害であることを考えると興味深い。発現が減弱しているものにcalmodulin、カリウムチャネルがあった。calmodulinは興奮抑制系に働くGABA作動性ニューロンに発現しており、その減少は神経細胞の興奮性を高めると考えられる。またカリウムチャネルも神経細胞の興奮について抑制的に働いており、てんかん原性に関わっている可能性が考えられた。発現が増強している2つの新規遺伝子については完全長cDNAを単離した。それぞれ265、745アミノ酸をコードしており、zinc finger motif、ring fingermotifを有していた。近年、画像および脳電気生理の進歩にともない、てんかんの原因として皮質異形成(cortical dysplasia;CD)が多くみられることがわかってきた。CDは脳細胞の分化、移動の障害であり、てんかん原性を有すると考えられている。われわれは、CDの成りたちやてんかん原性のメカニズムを解析することを目的とし、まずCD組織で特異的に発現が増強、減弱している遺伝子について同定を試みた。切除されたCDおよび正常脳皮質からメッセンジャーRNAを抽出、Subtraction法を用いて発現に差のある遺伝子をクローニングし、塩基配列を決定した。今までに約20種類の遺伝子を同定した。発現が増強しているものには、GFAP、S100、MIC2などのアストロサイトマー力ーがあり、CD組織で増加している異形グリア細胞がアストロサイト由来であることを示唆している。また、多くのリボゾーム蛋白が増加しておりCDでは細胞の増殖(代謝)が正常皮質よりも盛んであることが考えられた。逆に現弱しているものの中にカリウムチャンネルがあり、カリウムチャンネルが神経細胞の興奮について抑制的に働くことを考えると興味深い。このほか、発現に差異のある数種類の未知の遺伝子断片をそれぞれクローニングしている。今後はin situ hybridizationや免疫染色を用いて今までクローニングした遺伝子の組織上での発現について検討を加えるとともに、未知の遺伝子については全長cDNAのクローニングを試みる予定である。
知的通信用CG手話画像作成システム構築と通信衛星ネットワークでの手話動画像伝送実験

知的通信の概念に基づいた手話画像伝送技術の開発と、通信衛星を用いた実験検証を目的にして研究を行なった。知的画像通信は、1)送信したい画像データの解析とそれに基ずく知的コーディング、2)コーディングされたテキストやパラメータ・データの送信、3)受信後のCG技法を利用した知的デ-コーディングによる元の画像データの手話画像の復元、の3つの過程で行われる。本研究においては、1)については手話動作の解析と解析結果を利用しての手話単語との対応、直方体を組み合わせた手や腕の3次元CGモデルの2次元平面への投影シルエットと手話の動画像とのマッチングによる手話動作の解析、意味情報空間の概念の提案と手話画像と意味情報と結び付ける方式の基礎的研究を行った。2)については通信衛星利用システムを整備し、ひろく通信衛星による静止画や動画の伝送実験を行った。通信衛星を利用したインターネットによるテレビ会議システムを構築し、実際の手話動画像の伝送実験を行い、身障者による理解度の評価実験を行った。衛星通信を介してコンピュータ間でのデータ転送を効率的に行う目的で、クライアント・サーバの実験システムを構成して実験を行い、将来の手話動画像データのサーバ・システム構築のための基礎データを得た。3)についてはコンピュータ・グラフィクス(CG)により手話画像を作成する技法について新しい方式の開発を試みた。例えば、手話画像生成の高速化をはかるため、テクスチャ・マッピング法などによる手法を考案し実験した。3次元直方体を組み合わせた腕のモデルのCG画像表示による腕の動作のCG表現も実験し、良好な結果を得た。手話のアニメーションを制作する際に、ネットワーク・モデルにより、指や手の動きの自然さを出す方法についても考案した。各過程での研究成果で新知見が得られた一方、画像認識、CG技術、衛星通信技術を一体化した研究は今後の課題として残された。知的手話画像伝送のため、キーボードからの日本語入力に対して、その意味を表わす手話画像を生成するコンピュータグラフィックス(CG)システムの構築を試みた。まず、従来の研究を踏襲しながらCGシステムの改良を行った。実時間に近づけたCG手話画像表示も研究の最終目的で、そのためにCG手話画像表示の高速化が問題となっている。これに対処するため、マスク合成による高速化の研究を進めており、成果が得られた。この方法は、手話のテクスチャデータを変形合成し、マッピングを行う方法であり、従来のパッチの張り合せにより手の形を表示するCG技法に比べると、表示速度を格段に向上させることができるようになった。通信衛星による手話画像伝送については、研究室にある実験地球局を利用して、日本サテライトシステムズの通信衛星用トランスポンダを利用した折り返し通信により、手話画像生成のCGプログラムのテキストデータを送受信することで、CG静止画像を等価的に伝送する知的通信の基礎実験を行なった。この実験では、予想通り、受信データからCGの手話画像を再生して表示できた。これらのプログラム伝送によるCG画像伝送実験と平行して、今後の手話の動画像伝送の予備的実験として、医療画像の動画の伝送実験を行って結果を得ている。衛星通信実験の次の段階として、現在コンピュータネットワークと衛星通信をつなげるためのインターフェース部分の開発を行っており、他大学の実験地球局との通信実験の準備を進めている。この準備により他大学の実験地球局との通信実験が行える見通しが立っている。さらに衛星通信実験がよりスムーズに行えるように、地球局の整備を行ったのも本年度の成果である。前年度からの研究を発展させ,手話動作をCG表現する新しい技法の開発を行った。

本研究では手話の知的通信のため,最終的には手話画像の解析および意味データへの変換と送信,受信後の意味データからの手話画像の再生を行うため,手話画像の解析とCG技法による再生の過程をつなぎ合わせた実験として,手話の動画像解析により腕の動きを抜き出し,ポリゴンを貼り合せた腕のモデルで動作を表現できるシステムの開発を行った。手話動作は腕の他,手や指の動作も必要で,さらに性能を向上させ,手や指の細かな動きがCG画像として再生できるシステムにするのは次年度の課題とした。手話の動きを直接的に計測して,動作と意味を結びつける研究として、カラー手袋を用いた手話の認識を行う方法を新しく検討して,実験を行い成果を得た。これらの成果は,知的手話画像伝送の基本的データとして有効であることを確認した。次に,通信衛星を用いた手話の伝送実験のため,通信衛星を介したクライアント・サーバシステムを立ち上げ,(株)日本サテライトシステムズの通信衛星JCSATを用いて実験を行った。通信時実験は北大工学部と北見工業大学のコンピュータシステムを結んで,主に知識ベースの検索から始めており,通信実験は成功している。これに手話画像を付加したシステムにレベルアップして,次年度は本格的な手話画像を対象にして通信実験を行う予定である。衛星による通信実験については,北海道工業大学とも基礎的なデータを得るために継続的に行っており,こちらもクライアント・サーバシステムの構築が完了次第手話画像通信実験を行うように準備を整えた。さらに,通信衛星による手話画像伝送実験の打ち合わせ等に必要なため,簡易テレビ会議システムの立ち上げに成功しており,次年度の実験に利用できる見通しを得た。本研究の知的通信の基本は知的デコーディングとコーディングであり、手話においてこれらの処理を有効に行う方法として、直方体等の基本立体を組み合わせた3次元モデルを構成し、このモデルの2次元投影と実際の手話の動画像から画像処理により抜き出した手のシルエットとのマッチングを行うことにより手や腕の動きを解析し、関節角による手話動画像のコーディングを行う方法を新しく開発し、実験でも成功している。デコーディングはこの3次元モデルを利用して、受信後の関節角パラメータでCGアニメーションを作成すればよく、これも実験を行い手話のCGアニメーション化に成功している。この手法の難点は、手話の動画解析に時間がかかる点で、この点の改良として、腕や手にマ-カを取り付けて腕の運動の解析を容易にして、高速な処理を可能にする方法も開発した。手話のアニメーションを制作する際に、指や手の動きをなるべく自然にするため、指の骨格をニューラル・ネットワークの原理による処理を採用して、ある指の動きを他の指に伝え指の動きの自然さを出す方法についても考案し、コンピュータ・シミュレーションによりその有効性を確かめた。通信衛星JCSATを介してインターネットの利用を可能にして、この通信システムによりテレビ会議システムの構築を行い画像伝送実験に成功している。この通信衛星経由のテレビ会議システムを利用して、室蘭工業大学と通信衛星介して両大学のコンピュータ間を結んでの手話の実画像伝送実験を行い、聴覚・発声障害者による評価実験も行った。
６位硫酸化コンドロイチン硫酸欠損による統合失調症様症状発現機構の解明

本研究では、コンドロイチン硫酸(CS)の硫酸化異常による統合失調症様症状発現の分子メカニズムの解明を目的として、コンドロイチン6-O-硫酸基転移酵素-1(C6ST-1)のノックアウト(KO)マウスの解析を行った。CSは中枢神経系の主要な細胞外マトリクス成分であり、C6ST-1は、6位硫酸化CSの生合成を担う酵素である。6位硫酸化CSの欠損による統合失調症様症状の発現機構を明らかにするため、神経系、免疫系の2つの視点からC6ST-1 KOマウスの脳・神経系の詳細な表現型解析を行った。2018年度は、胎仔期のストレスに対する脆弱性および、ミクログリアを介した脳内免疫応答へのC6ST-1欠損の影響の検討を中心に研究を行った。その結果、研究期間全体を通じて下記の知見を得た。1)精神疾患との関連が示唆されている各種抑制性神経細胞の数について、野生型マウスと比較したところ、C6ST-1 KOマウスでは成体になるとPV陽性細胞が特異的に減少していた。2)精神・認知障害において脳内炎症の関与が示唆されていることから、C6ST-1 KOマウスの脳におけるミクログリアの数を調べたところ、野生型マウスに比べむしろ減少傾向にあった。3)統合失調症の発症リスクを高める要因の一つとして、妊娠期の母体へのストレスが報告されていることから、妊娠中のストレス負荷により胎仔の脳におけるCSの硫酸化パターンが変化する可能性を検討したところ、ストレス負荷により発現が変化していた。また、野生型マウスとC6ST-1 KOマウスの胎仔期ストレスに対する脆弱性の比較も行った。本研究は、中枢神経系の主要な細胞外マトリクス成分であるコンドロイチン硫酸(CS)の構造多様性による脳・神経系の制御機構の解明を目指し、CSの硫酸化異常による統合失調症様症状発現の分子メカニズムを解明することを目的としている。予備的研究において、6位硫酸化CSの生合成を担うコンドロイチン6-O-硫酸基転移酵素-1(C6ST-1)のノックアウトマウスがプレパルス抑制の低下等の統合失調症様症状を示すことが示唆された。このCS硫酸化パターン異常による統合失調症様症状の発現機構を明らかにするため、神経系、免疫系の2つの視点からC6ST-1 KOマウスの脳・神経系の詳細な表現型解析を行っている。今年度は、一部、平成29年度と平成30年度の研究計画を入れ替えて、以下の研究を行った。1) 6位硫酸化CSによる抑制性神経細胞の分化・成熟・維持の制御機構:抑制性神経細胞の異常と精神疾患との関連が示唆されていることから、各種抑制性神経細胞の数について、野生型マウスとC6ST-1 KOマウスにおける差を明らかにした。2)妊娠マウスへのストレス負荷が胎仔脳でのC6ST-1発現に及ぼす影響:統合失調症の発症リスクを高める要因の一つとして、妊娠期の母体へのストレスが報告されていることから、妊娠中のストレス負荷により胎仔の脳におけるCSの硫酸化パターンが変化する可能性を検討した結果、ストレス負荷の影響を受けることが示唆された。3) C6ST-1欠損が脳内免疫応答にもたらす影響:精神・認知障害においても脳内炎症の関与が示唆されていることから、C6ST-1欠損マウスにおいてミクログリアの数に変動があるか調べた。動物の都合等により、一部計画とは順番を入れ替えて研究を進めているが、全体の進捗状況としては順調であると思われる。残っている課題について、計画通り実験を進める予定である。当初の予定と順番を入れ替えて実験を行なったため、次年度使用額が生じた。次年度に残っている課題に取り組むため、次年度請求分と合わせて使用する予定である。
細粒度四次元熱解析に基づく回路設計に関する研究

細粒度四次元熱解析に基づく回路設計に関する研究の研究実績は以下の通りである.本年度は本研究で確立を目的としている細粒度熱解析手法,及び熱を考慮した回路設計に関する調査研究を主に行った.はじめに,2006年6月に米国ボストンにおいて開催された,3^<rd> workshop on Temperature Aware Computer Systems,およびInternational Symposium on Computer Architecture 33等に参加し,近年のマイクロプロセッサにおける発熱解析の動向について調査した.近年のマイクロプロセッサにおける熱解析は,未だ,機能ブロックを発熱源とした熱解析が主流となっている.しかし,チップ上の部分的な高温領域は機能ブロック内にも存在することから,既存の手法更に詳細な発熱解析が強く求められている.しかし,現実的な時間で,今までよりも詳細,かつ高精度な発熱解析を実現にするには,新たな発熱モデルの構築が必要となる.これらより,コンパクトな発熱モデルを構築することが,今後,マイクロプロセッサの発熱解析に関する研究を発展させるには必要であることを調査により明らかにした.一方,熱を考慮した回路設計実現の為には,マイクロプロセッサの発熱源となる電力の削減が有効である.このため,研究代表者は近年のマイクロプロセッサの消費電力の傾向について調査し,発表論文において電力効率に基づくマイクロプロセッサの低消費電力化,少発熱化の設計指針を示した.また,発熱問題が顕著になることが予想される将来の半導体加工技術下における組み合わせ論理回路の評価を行うことで,高速,低消費,かつ少発熱な演算回路設計の為には,従来の性能評価指標だけでは不十分であることを示し,新たなマイクロプロセッサの設計指針の必要性を明らかにした.細粒度四次元熱解析に基づく回路設計に関する研究の研究実績は以下の通りである.本年度は本研究で確立を目的としている細粒度熱解析手法,及び熱を考慮した回路設計に関する調査研究を主に行った.はじめに,2006年6月に米国ボストンにおいて開催された,3^<rd> workshop on Temperature Aware Computer Systems,およびInternational Symposium on Computer Architecture 33等に参加し,近年のマイクロプロセッサにおける発熱解析の動向について調査した.近年のマイクロプロセッサにおける熱解析は,未だ,機能ブロックを発熱源とした熱解析が主流となっている.しかし,チップ上の部分的な高温領域は機能ブロック内にも存在することから,既存の手法更に詳細な発熱解析が強く求められている.しかし,現実的な時間で,今までよりも詳細,かつ高精度な発熱解析を実現にするには,新たな発熱モデルの構築が必要となる.これらより,コンパクトな発熱モデルを構築することが,今後,マイクロプロセッサの発熱解析に関する研究を発展させるには必要であることを調査により明らかにした.一方,熱を考慮した回路設計実現の為には,マイクロプロセッサの発熱源となる電力の削減が有効である.このため,研究代表者は近年のマイクロプロセッサの消費電力の傾向について調査し,発表論文において電力効率に基づくマイクロプロセッサの低消費電力化,少発熱化の設計指針を示した.また,発熱問題が顕著になることが予想される将来の半導体加工技術下における組み合わせ論理回路の評価を行うことで,高速,低消費,かつ少発熱な演算回路設計の為には,従来の性能評価指標だけでは不十分であることを示し,新たなマイクロプロセッサの設計指針の必要性を明らかにした.
温度受容を中心とした痛み受容機構の解明

熱受容体VR1,VRL-1がヘテロマーを形成する可能性の検討と冷刺激受容体遺伝子のクローニングを目標に研究を進めてきた。VR1,VRL-1はヘテロマーを形成しないことが明らかとなり、後者は未だ単離に至っていない(平成14年3月に米国のグループから遺伝子単離の報告がNature誌になされた)。細胞外からのみ作用することが知られていたプロトンによるVR1活性化のEC_<50>がおよそpH5.4であることから、プロトンのVR1に対する作用には細胞外ドメインの酸性アミノ酸が関与することが推定された。そこで、それらの酸性アミノ酸を中性もしくは塩基性アミノ酸に変える点変異体を作製して電気生理学的な解析を行うことによって、第5,6膜貫通領域間の600番目のグルタミン酸がプロトンによるカプサイシン活性化電流、熱活性化電流の制御に、634番目のグルタミン酸がプロトンによるVR1の活性化に関与することが明らかとなった。この酸性アミノ酸の点変異によって活性化閾値が10度も低下した。また、感作物質もしくは発痛物質として作用するATPがGqにcoupleする代謝型受容体活性化からPLC・PKC活性化を介してVR1活性を増大させることが明らかとなった。ATPはVR1の有効刺激であるカプサイシンやプロトン(低濃度)によって惹起された電流を著しく増大させるのみならず、熱による活性化温度閾値を43度から30-35度へと大きく変化させた。これは、ATPが存在すれば体温以下でもVR1が活性化して痛みを惹起することを示し、VR1が代謝型受容体とともに全く新しい疼痛発生システムを形成していることがわかった。カプサイシン受容体は生体において痛み刺激となる43度で活性するのにならず、組織傷害に伴う感覚神経の環境変化からその活性化温度を変化させて体温で侵害刺激を監視しているのではないかと考えられる。痛みは化学的・熱・機械的刺激によって感覚神経終末が活性化されることによって惹起されるが、遺伝子クローニングされたカプサイシン受容体(VR1)はカプサイシンのみならず痛みを惹起するとされる熱(43度以上)や酸(プロトン)によっても活性化されることが明らかとなり、また、そのホモログVRL-1がより高温(52度以上)の熱によって活性化される新たな痛み受容体であることが明らかになった。高温刺激によって活性化する2つの熱受容体が明らかになったが、高温刺激のみならず低温刺激(約10度以下)も痛みを惹起することから、本申請では、温度感受性を中心として感覚神経終末での痛み受容機構を明らかにすることを目的として申請した。研究計画に挙げた「熱受容体がヘテロマーを形成する可能性の検討」は発現パターンの解析と共発現系での機能解析によって否定された。第2の計画である「VR1、VRL-1のホモログの検索」では、現在のところ見つかっていない。第3の計画「冷刺激受容体の発現クローニング」は現在遂行中である。これらの計画の他に、疼痛発生の分子機構を解析する目的で、VR1活性の制御機構を検討した。その結果、プロトンによるVR1活性の制御に重要な細胞外ドメインのアミノ酸を同定した(論文発表)。また、炎症関連メデイエイターの1つである細胞外ATPのVR1活性に対する作用を検討した結果、これまで知られているイオンチャネル型(P2X)受容体のみならず代謝型(P2Y)受容体にも作用してPKCの活性化を介してVR1活性を制御していることが明らかとなった。これは、ATPによる全く新しい疼痛発生メカニズムとして注目される(論文はunder revision)。
レット症候群病態におけるNFーkBシグナル関与の解析

本研究計画においてはPCRアレイを用いてMecp2欠失マウスの病態におけるNF-kBシグナルの関与に関して解析を行った。NF-kBシグナル関連遺伝子84個を網羅したPCRアレイを用いて、Mecp2欠失脳におけるNF-kBシグナル関連因子の発現変化を解析したところ、Il6やTnfを含む多数の下流因子がMecp2欠失大脳新皮質において発現が上昇していることを明らかにした。研究代表者のこれまでの研究結果よりMeCP2の新規標的遺伝子としてNF-κBシグナルの構成因子の1つであるIrak1を同定し、NF-κBシグナルの異常亢進がMecp2欠失マウスの表現型に関与していることを明らかにした。本研究計画においてはPCRアレイを用いてMecp2欠失マウスにおけるNF-κBシグナル関連遺伝子の発現解析を行い、どの下流因子がMecp2欠失マウスの表現型に関与しているか解析を行った。NF-κBシグナル関連遺伝子84個を網羅したSABiosciences社のPCRアレイを用いて、Mecp2ノックアウトマウス脳におけるNF-κBシグナル関連因子の発現変化を解析した。8週齢(個体レベルでの表現型が顕著に表れている時期)で野生型とMecp2ノックアウトcortexから3つずつRNAを採取し、野生型とMecp2ノックアウト(Mecp2 -/y)のlittermate3組について上記のPCRアレイを用いて比較解析を行った。その結果、IL6やTNFを含む多数の下流因子がMecp2ノックアウトcortexにおいて発現が上昇していることを明らかにした。そのうちTnfに関しては研究代表者が設計したプライマーを用いて個別のqPCRを行い、Mecp2 -/y cortexで上昇していることを再確認した。これらの結果より、MeCP2欠失により過剰発現したIrak1によりNF-kBシグナルが亢進し、その下流に位置するTnf遺伝子の発現異常を通じて、Mecp2ノックアウトマウスの病態が引き起こされている可能性を裏付けることができた。近年、自閉症患者おいて免疫系遺伝子の脳における異常発現が指摘されており、自閉症スペクトラム障害の1つであるレット症候群においても同様の発症メカニズムが関与していることが示唆される。申請者のこれまでの研究結果よりMeCP2の新規標的遺伝子としてNF-κBシグナルの構成因子の1つであるIrak1を同定し、NF-κBシグナルの異常亢進がMecp2欠失マウスの表現型に関与していることを明らかにした。本研究計画においてはPCRアレイを用いてMecp2欠失マウスにおけるNF-κBシグナル関連因子の発現解析を行い、どの下流因子がMecp2欠失マウスの表現型に関与しているか解析を行った。NF-κBシグナル関連遺伝子84個を網羅したSABiosciences社のPCRアレイを用いて、Mecp2ノックアウトマウス脳におけるNF-κBシグナル関連因子の発現変化の解析を行った。そこでまず、Mecp2ノックアウトマウスを得るために、Jackson LabよりMecp2ヘテロ雌マウスを6匹購入し、野生型の雄マウスと交配することにより繁殖コロニーを拡大させていった。平成23年度は生後14日目(個体レベルの表現型は検出されないが、遺伝子レベルでは異常が検出される時期)と8週齢(個体レベルでの表現型が顕著な時期)で野生型とMecp2ノックアウトcortexから各々3組ずつRNAの採取を行った。現在までに8週齢のwild-typeとMecp2ノックアウト(Mecp2 -/y)のlittermate3組について上記のPCRアレイ解析アレイを用いて比較解析を行った。その結果、IL6やTNFを含む多数の下流因子がMecp2ノックアウトcortexにおいて発現が上昇していることを明らかになり、MeCP2欠失により過剰発現したIrak1によるNF-kBシグナル異常亢進が、Mecp2ノックアウトマウスの病態に関与しているという仮説を裏付けることができた。平成23年度はMecp2ノックアウトマウスの繁殖に多くの時間を割いた。Mecp2遺伝子はX染色体上にあり、ヘミ接合体(Mecp2 -/y)は性成熟する前に致死になるため繁殖用には使用できない。そこで我々は米国のJackson LabよりMecp2ヘテロマウスを6匹購入し、Mecp2ヘテロ雌マウスと野生型雄マウスを交配することによりコロニーの拡大を図った。しかしながら、Mecp2の変異はドミナントに表現型を表す上、X染色体のランダムな不活化により表現型が軽いものから重いものまで様々な表現型を呈す。最終的に購入したMecp2ヘテロマウス6匹の内、2匹は一度も出産に至らなかった。また残り4匹についても出産した新生仔を母親が育児放棄、あるいは食殺してしまうことがしばしば見受けられ、コロニー拡大に予想以上の時間を費やした。しかしながら、何とかPCRアレイ解析を行うだけの必要個体数を確保し、8週齢に関しては既に解析を終えている。現在、もう一つの解析ポイントである生後14日目のサンプルも既に採取しており、PCRアレイ解析の準備中である。平成23年度の実験計画ではPCRアレイ解析まで行う予定になっており、ほぼ達成できたと考えている。

平成24年度は平成23年度の成果を踏まえ、前年度行うことができなかった生後14日目(個体レベルの表現型は検出されないが、遺伝子レベルでは異常が検出される時期)のNF-kBシグナル関連遺伝子のPCRアレイ解析をまず最初に行う。生後14日目、8週目のPCRアレイの結果をもとに、Mecp2ノックアウト脳で特異的に発現が増加、あるいは減少している遺伝子についてその発現の増減を確認するため、特異的なプライマーを設計して再度PCRを行い、統計学的にその増減が有意であることを確かめる。MeCP2はIrak1の発現を抑制することによってNF-kBシグナルを抑制していると考えられているので、Mecp2ノックアウト脳において発現が上昇している遺伝子は表現型との関連が強く示唆されるので、それらの遺伝子については、以前申請者が確立した神経幹細胞の培養系を用いて更にレット症候群との関連を検討する。レット症候群の患者、モデルマウスにおいては、大脳新皮質の錐体ニューロンの樹状突起の進展が縮小されていることが知られている。マウス胎仔脳より採取した神経幹細胞を培養し、そこにこれらの遺伝子を強制発現し、培養下でニューロンに分化させ、野生型のニューロンと比較して樹状突起の伸展がどのように変化したかを解析することによって、レット症候群の病因との関連性について検討する。このin vitroでの解析の結果をもとに、更にin vivoエレクトロポレーション法を用いて、マウス胎仔脳に直接遺伝子を強制発現させてNF-kB関連遺伝子の神経発生過程における発現異常がin vivoにおいてもニューロンの発達の異常を引き起こすことを証明する。これらの実験結果を平成24年度中に得て、これらの成果を論文にまとめて発表する予定である。平成23年度は9575円の未使用額が発生したが、これは効率的な物品調達を行った結果であり、翌年度の消耗品購入に充てる予定である。すなわち、平成24年度は、実験用動物購入費として、200000円、生化学実験試薬購入費として309575円、生化学実験器具購入費として300000円、ソフトウェア購入費として100000円、研究打ち合わせあるいは研究成果発表のための国内旅費として100000円、研究成果発表あるいは情報収集のための国外旅費として400000円、英文校正などの謝金として100000円、通信費や印刷費などのために100000円、合計1609575円を使用する予定である。