hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
脱ヨード酵素遺伝子転写調節機構を利用した選択的甲状腺ホルモン作用調節因子の探索

ヒト末梢白血球よりゲノムを抽出し,PCR法を用いてヒト脱ヨード酵素1型(D1)遺伝子5'上流域(2kbp)をクローニングした。これを鋳型としてPCR法により種々の長さの欠失を有するヒトD1遺伝子5'上流域をルシフェラーゼ遺伝子をレポーター遺伝子とするプラスミドに組み込んでコンストラクトを作成した。これらのコンストラクトをヒト肝臓由来細胞株へ一過性に導入しレポーター活性を測定したところ,翻訳開始点より-225177bpの間で活性が変化した。一方,ヒト腎臓由来細胞株および子宮頚癌由来細胞株では上記領域での活性変化はほとんど認めたなかったことから,これらの領域は肝臓特異的にヒトD1遺伝子プロモーター活性が変化する領域であると考えられた。コンピューター検索により上記領域には肝臓特異的な転写因子であるC/EBPの結合領域が存在したため,当該部位に変異を導入したコンストラクトを作製し同様にレポーター活性を測定したところ,変異を導入していない(野生型)コンストラクトと比較して活性が変化した。この結果に基づきc/EBPαのsiRNAを作製し肝臓由来細胞株へ一過性に導入しヒトD1遺伝子発現の変化を定量PCR法で検討を行ったが,ヒトD1遺伝子発現に変化を認めなかった。また,当該結合領域をプローブとし肝臓由来細胞株から抽出した核タンパクを用いて行ったゲルシフトアッセイにても当該領域への核タンパクの結合は認められなかった。以上の結果より,上記の領域へのC/EBPαの直接的結合は認められず,C/EBPαがヒトD1遺伝子の転写調節に関与している可能性は低いと考えられ,同領域にC/EBPの他のアイソフォームもしくは他の(転写)因子が結合することによりヒトD1遺伝子の転写調節に関与している可能性が考えられた。1.ヒト末梢白血球よりゲノムを抽出し,PCR法を用いてヒト脱ヨード酵素1型(D1)遺伝子5'上流域(2kbp)をクローニングした。2.上記のコンストラクトをヒト肝臓由来細胞株へ一過性に導入しレポーター活性を測定したところ,翻訳開始点より-177132および-131-103bpの間で活性が変化した。一方,ヒト腎臓由来細胞株では上記領域での活性変化は極めて軽度であったことから,これらの領域は肝臓特異的にヒトD1遺伝子プロモーター活性が変化する領域であると考えられた。3.コンピューター検索により上記領域には肝臓特異的な(転写)因子が結合するような,候補となるシスエレメントが複数存在したため,それぞれの部位に変異を導入したコンストラクトを作製し2.と同様にレポーター活性を測定したところ,変異を導入していない(野生型)コンストラクトと比較して活性が変化した。4.3の結果に基づきそれぞれの候補となる肝臓特異的因子について順にsiRNAを作製し,(1)肝臓由来細胞株へ一過性に導入しヒトD1遺伝子発現の変化を定量PCR法で検討し,(2)上記コンストラクトと共に同細胞株へ一過性に導入しレポーター活性を見た。しかし,現時点ではヒトD1遺伝子発現およびプロモーター活性が変化するような因子は同定できていない(候補となる因子について順次同様の実験を継続中である)。
拡散過程の構成と分解

ヘルダーカスプのあるリプシッツ境界をもつd次元ユークリッド空間の領域D上の、拡散過程の構成と分解についての研究を行った。境界は局所的にある種のヘルダー関数で表現出来、カスプの開き方を定めるヘルダー指数についての下限γは真に正であることが必要である。このような領域上や定義された有界可測な係数a_<ij>をもつ一様楕円型2階偏微分作用素に対応し、H^1(D)を定義域にもつ対称ディリクレ形弐εが研究の対象である。εに対応するL^2(D)上の強連続なリゾルベントを{G_λ}とすると、(i)G_λ(L^2(D)∩L^p(D))⊂C(D),p>1+(d-1)/γ,(ii)G_λ(C_∞(D))はC_∞(D)の稠密部分空間、となるので、εに対応するD上の拡散過程Mが存在する。これは、反射壁拡散過程と呼ぶべきものである。上記のリゾルベントは、D×Dの対角線部分を除いて連続なリゾルベント密度をもち、従って、Mは推移密度関数をもつ。この密度関数のカスプ点近くでの上からの評価も得られ、それは、カスプの開き方に依存していることが分かる。我々が得た拡散過程は、D全体で定義されているので、M.Fukushimaによる拡散過程の標本関数の分解定理が、除外集合なしにすべての点を出発する標本関数に対して適用できる。即ち、標本関数は、連続マルチンゲール汎関数の部分と、エネルギー零の汎関数の部分に分解される。更に、a_<ij>∈C^1(D)であり、カスプのヘルダー指数が1/2以上の場合、エネルギー零の汎関数部分は、有界な時間区間上の有界変動関数となる。これは次元dに依存しない性質であり、興味ある結果と思われる。ヘルダー指数が1/2未満の場合には有界変動とはならないと予想される。またMは、対応するサブマルチンゲール問題の解になっているが、2次元の場合に、係数a_<ij>がC^<1,α>-classであるならば、解の一意性も証明出来る。歪対称なカスプ領域上でのソボレフ不等式を証明した。これは、同種の領域上の拡散過程の構成に不可欠のものである。適当な正規化を行って得られる拡散過程の列は、標準ブラウン運動に収束する。このことについて、未解決であった部分、即ち、環境ごとの収束定理と、全確率の下での収束定理では正規化常数が異なるということについて証明した。離散時間ガウス型通信路においてフィードバックをつけることにより一般的には容量が増加することが知られており、1984年にCoverが与えた予想に対して、2次元のときに肯定的に解決した。次にフィードバックをもつときの容量の上界として同じくCoverにより得られた結果の精密化を与えた。球対称の圧縮性粘性気体に対する自由境界問題の時間大域解の時間を無限大にしたときの定常解への収束について、エネルギー法を用いて示すことができた。また、粘性係数が密度の関数となっている場合の時間大域解の存在、一意性、漸近挙動についても、数値実験の結果から同様にいえるのではないかという予想を得た。

与えられたベルトラミ係数に対して、0、1、∞を固定する擬等角写像構成法について,現在知られている局所解の張り合せる方法では無く,大域的に構成する方法について研究を行い、擬等角写像の変分公式を得た。モノトーンフォック空間上に非可換ポアソン過程を構成し、小数の法則とポアソン分布の非可換アナローグを得た。モノトーンフォック空間上の作用素過程に関する量子伊藤公式を積分核の方法によって導いた。また、中心極限分布はウイグナ-半円則であるが自由ブラウン運動とは同型とはならないものを構成した。ヘルダーカスプのあるリプシッツ境界をもつd次元ユークリッド空間の領域D上の、拡散過程の構成と分解についての研究を行った。境界は局所的にある種のヘルダー関数で表現出来、カスプの開き方を定めるヘルダー指数についての下限γは真に正であることが必要である。このような領域上で定義された有界可測な係数a_<ij>をもつ一様楕円型2階偏微分作用素に対応し、H^1(D)を定義域にもつ対称ディリクレ形式εが研究の対象である。εに対応するL^2(D)上の強連続なリゾルベントを{G_λ}とすると、(i)G_λ(L^2(D)∩L^P(D))⊂C(D^^-),p>1+(d-1)/γ,(ii)G_λ(C_∞(D^^-))はC_∞(D^^-)の稠密部分空間、となるので、εに対応するD^^-上の拡散過程Mが存在する。これは、反射壁拡散過程と呼ぶべきものである。上記のリゾルベントは、D^^-×D^^-の対角線部分を除いて連続なリゾルベント密度をもち、従って、Mは推移密度関数をもつ。この密度関数のカスプ点近くでの上からの評価も得られ、それは、カスプの開き方に依存していることが分かる。我々が得た拡散過程は、D^^-全体で定義されているので、M.Fukushimaによる拡散過程の標本関数の分解定理が、除外集合なしにすべての点を出発する標本関数に対して適用できる。即ち、標本関数は、連続マルチンゲール汎関数の部分と、エネルギー零の汎関数の部分に分解される。更に、a_<ij>∈C^1(D^^-)であり、カスプのヘルダー指数が1/2以上の場合、エネルギー零の汎関数部分は、有界な時間区間上の有界変動関数となる。これは次元dに依存しない性質であり、興味ある結果と思われる。ヘルダー指数が1/2未満の場合には有界変動とはならないと予想される。またMは、対応するサブマルチンゲール問題の解になっているが、2次元の場合に、係数a_<ij>がC^<1,α>-classであるならば、解の一意性も証明出来る。
カウンリングの観察学習における提示モデルの効果的なメディア表現の研究

本研究の目的は、モデリング理論の観点からカウンセリング学習における効果的なメディア利用を実証的に検討することにある。本年度は、昨年度作成した面接映像、及び、カウンセラー行動の認知に関する諸測度を利用し、実験2として映像の撮影アングルの違いによるカウンセラー行動の認知の比較、実験3として複数アングル映像の選択行動を指標にした学習者の主体的な観察過程の分析を実施した。具体的には次の通りである。1.異なる映像表現の比較(実験2)カウンセラー中心映像、クライアント中心映像、全体映像、及び、3つの画面を一画面に同時提示するように合成した映像の4条件を設定し、各条件に臨床心理専攻の大学生、大学院生、熟練カウンセラー20名程度を割当て(計160名程度)、カウンセラー行動の認知について比較した。その結果、映像の種類と観察者のレベルによる複雑な交互作用がみられた。2.マルチアングル映像による観察プロセスの検討(実験3)カウンセラー中心映像、クライアント中心映像、全体映像の各アングルを再生中に自由に切り換えられるとともに、その操作過程を記録できるプログラムを作成し、臨床心理専攻の大学生、大学院生、熟練カウンセラー各20名程度を対象に面接映像の選択行動について記録、分析した。その結果、個々の観察者によって多様な観察パターンがみられた。以上、2つの実験結果から、映像を利用したカウンセリングの観察学習では、学習者の個人差の影響が大きいことが明らかになり、モデル提示には多様な操作が可能なメディア表現が望ましいことが示唆された。なお、これらの結果の一部は、著書として公表し、また、日本心理学会において公表予定である。本年度は、後の実験のための予備的検討、及び、提示モデルの異なるメディア表現の比較実験(実験1)を実施した。1.予備的検討(1)カウンセリングの観察学習の理論的検討モデリング理論からカウンセラー教育を再考し、象徴的モデリングにおける効果的な映像構成を検討した。以上の成果は日本心理学会で公表し、メディア教育開発センター研究報告で公表予定である。(2)実験用面接場面の作成(3)カウンセラー行動の認知・評価・記憶に関する測度の作成欧米で標準的に使用されているカウンセラー評価用尺度(Counselor Rating Form)の日本語版を作成し、大学院生・大学生、現職カウンセラー300名を対象に、その妥当性・信頼性の検証を行った。また、臨床心理専攻の大学院生・大学生、熟練カウンセラー20名程度を対象に、(2)で作成した面接ビデオの視聴後の自由記述を収集し、プロトコル分析から、カウンセラー行動の記憶測定用の項目を作成した。以上の成果は日本心理学会で公表予定である。2.異なるメディア表現の比較(実験1)上記で作成した2種類の面接を、ビデオ記録、逐語記録、音声記録の3条件で提示し、各条件に臨床心理専攻の大学院生・大学生、熟練カウンセラー20名程度づつを割当て(計120名程度)、カウンセラー行動の認知・評価・記憶について比較した。現在、データ解析中で、国内外の学会で発表する予定である。
運動学習および感覚学習過程における皮質内抑制回路の役割

一次運動野(M1)および一次体性感覚野(S1)の興奮性・抑制性の機能に焦点をあて複数の実験を行った結果,(1)示指先端に電気刺激を高頻度で与えると,感覚機能が一時的に向上するとともに,S1抑制機能を示す二連発刺激抑制(PPD)の20ミリ秒成分のみが減弱することが判明した.(2)他動運動を反復することにより,一時的にM1興奮性が減弱する現象(PED)が認められるが,このPEDは,1他動運動の回数に影響され,他動運動回数が多くなるとその後のPEDが長時間にわたること,2運動と休息の組み合わせの有無はPEDに影響しないこと,3他動運動肢に注意を向けることによりPEDが消失するだけでなく,反対にM1興奮性が増大することが判明した.さらに,43Hzの他動運動を10分間行った場合は,PEDが認められないが,S1興奮性が減弱することが判明した.(3)反復的な他動運動後ではなく,一回の他動運動の直後のM1興奮性変動を解析した結果,他動運動開始から60ミリ秒から150ミリ秒後にM1興奮性が増大する現象(AF)が認められることと,運動速度に依存してAFの大きさが変動することが判明した.(4)M1抑制機能の評価には,経頭蓋磁気刺激を用いた二連発TMSによる短潜時皮質内抑制(SICI)と長潜時皮質内抑制(LICI),TMSと末梢電気刺激を組み合わせた短潜時求心性抑制(SAI)と長潜時求心性抑制(LAI)がある.これらの評価指標の再現性と各指標の関連性,および個人間のバラツキ度合いを解析した.結果,いずれの評価指標も級内相関係数は中等度から高度の値を示すことと,SICIとLICI,SAIの程度に正の相関関係を認めることが判明した.さらに,これらの抑制機能の個人間のバラツキとBDNF遺伝子多型との関係性を解析し,一定の知見を得ている.平成30年度が最終年度であるため、記入しない。平成30年度が最終年度であるため、記入しない。運動学習過程における皮質内興奮性・抑制性の振る舞い明らかにすることを目的として,まず,単純な随意運動・他動運動および末梢神経刺激後の皮質活動の変動を調査し,5つの主要な結果を得た.(1)軽負荷の反復的随意運動後に一次運動野(M1)の興奮性が一次的に減弱する現象(PED)が見られる.このPED期間中における皮質内の抑制回路の振る舞いを計測・解析した結果,PED期間中にM1内の抑制回路の活動が増大していることが明らかになった(論文受理,Brain and Behavior).(2)運動出力を要しない他動運動中のM1興奮性の変動を計測・解析した結果,他動運動中のM1興奮性は,運動開始(筋伸張開始)からの時間によって変動し,運動開始から約120ミリ秒時点で一時的に興奮性が増大することが明らかになった.(3)また,反復的な他動運動後には,M1興奮性が一時的に減弱することと,その減弱は他動運動の運動範囲に影響されないことが明らかになった(under review,Neuroreport).(4)加えて,他動運動後のM1興奮性減弱は他動運動速度に影響され,5Hz頻度の他動運動後にはM1興奮性が10分以上減弱するが,0.5Hzや1Hz頻度の他動運動後にはM1興奮性の減弱が2分程度で回復することと,3Hz頻度の他動運動後にはM1の興奮性が変動しないことが明らかになった(under review,Neuroscience).(5)最後に,末梢神経電気刺激によるM1興奮性の変動を計測・解析し,筋収縮を誘発する末梢神経刺激後にはM1興奮性が増大するが,筋収縮を誘発しない末梢神経刺激後にはM1興奮性が減弱することが判明した.運動学習過程における皮質内抑制回路の振る舞いに関する研究は順調に推移している.単純な随意運動・他動運動によってもM1興奮性が増減することと,その増減にはM1内の抑制回路の振る舞いが影響していることを明らかにした.また,末梢神経電気刺激による皮質興奮性の変動について,同じ電気刺激強度であっても筋収縮を誘発するか否かでその後のM1興奮性の振る舞いが異なることも明らかになった.感覚学習過程の皮質内抑制回路の振る舞いに関する研究については,複数種類の機械的触覚刺激がM1興奮性を増減させることを確認しているが,S1興奮性の変動については現在実験を進めている段階である.また,前年度に特別注文で作成した二点式別覚を評価する装置を利用して感覚機能の検査を開始している.今年度は機械的触覚刺激による感覚機能の変動とS1・M1興奮性の変動および皮質内抑制回路の変動を解析する.M1内の抑制回路の変動については,短潜時求心性抑制および短間隔皮質内抑制を利用し,順調に計測・解析できている.一方,S1内の抑制回路の変動を評価するための手法として利用するPair Pulse inhibition(PPI)のバラツキ度合いを現在確認している段階であり,今年度中にバラツキの原因解明と安定したS1抑制回路の評価指標(PPI変法)を確立する予定である.

また,平成29年度から他施設の協力を得てMRSによるM1・S1内のGABA濃度計測実験を開始する予定であったが,平成30年度に所属機関がMRSを計測できるMRI装置を購入することになった為,次年度に実験を開始することに変更した.他動運動や機械的触覚刺激が皮質脊髄路興奮性に及ぼす影響を調査し,5つの主要な結果を得た.(1)反復的他動運動後に観察される一次運動野(M1)の興奮性低下(PED)は,運動範囲(関節角度)に影響されないことが明らかになった(Neuroscience letter, 2017).(2)他動運動後のPEDは他動運動頻度に影響され,5Hzの他動運動後にはPEDが15分以上持続するが,0.5Hzや1Hz頻度の他動運動後にはPEDが2分程度で回復することと,3Hz頻度の他動運動後にはPEDが認められないことが明らかになった.加えて,他動運動後のPED期間中には脊髄興奮性は変化していないことと,皮質内短間隔皮質内抑制(SICI)が強くなることが明らかになった(Neuroscience, 2017).(3)他動運動によって引き起こされるPEDは,運動継続時間や運動回数によっても変動し,240回程度の他動運動ではPEDが引き起こされないことや,運動と休息を組み合わせたDuty cycleの有無はPEDに影響を及ぼさないこと,他動運動に注意を向けるとM1興奮性が増大することが明らかになった(投稿準備中).(4)機械的触覚刺激が皮質脊髄路興奮性と運動遂行能に及ぼす影響を調査した結果,単純な触覚刺激を20分間与えるとM1興奮性が減弱し,指腹を擦るような複雑な触覚刺激を与えるとM1興奮性が増大することとを明らかにした(Neural Plasticity, 2018).さらに,M1興奮性増大に伴い巧緻動作遂行時間が短縮することが明らかになった(Under review).(5)機械的触覚刺激が二点識別覚に及ぼす影響も調査し,能動的触覚刺激を10分間与えた後二点識別覚の閾値が低下するが,単純な触覚刺激を行った後には二点識別覚の閾値は変化しないことも明らかになった(投稿準備中).他動運動や機械的触覚刺激によってM1興奮性が増減することと,その増減にはM1内の抑制回路の振る舞いが影響していることや,刺激の与え方によってその振る舞いが変動することを明らかにした.さらに,その増減は運動学習に影響を及ぼしている可能性を明らかにした.初年度特別注文で作成した二点式別覚を評価する装置を利用して感覚学習過程の皮質内抑制回路の振る舞いについても研究し,複数種類の機械的触覚刺激が二点識別覚閾値に影響を与えていることを明らかにした.これらに加えて,一次体性感覚野内の抑制回路を評価するための指標の一つである二連発電気刺激による体性感覚誘発磁界(SEF)の皮質内抑制反応(PPD)の個人間のバラツキおよび個人内のバラツキや,そのバラツキに影響を及ぼす要因についても調査した.その結果,3種類のSEF成分(N20m,P35m,P60m)のPPDには,脳由来神経栄養因子(BDNF)遺伝子多型の影響は認められない可能性が高いことと,末梢神経刺激後に誘発される事象関連脱同期の大きさとP60mのPPDの大きさに関係性があること,P35mのPPDの再現性は高いがN20mやP60mのPPDの再現性は低いことを明らかにした(2018年度業績.Brain Topography, 2018).さらに,PPD実験と同様の被験者を対象にして,一次運動野(M1)抑制回路を評価する指標である,短潜時求心性抑制(SAI)や長潜時求心性抑制(LAI),短間隔皮質内抑制(SICI),長間隔皮質内抑制(LICI)を計測し,各評価指標による運動誘発電位の減弱率(抑制度合)を解析し,SAI,LAI,SICI,LICIの抑制度合いの個人間のバラツキ度合いとその関連性や個人内の再現性を確認している(投稿準備中).
時間分解可視ポンプ-赤外プローブ分光法による固/液界面電子移動ダイナミクス

本年度は主として、均一系であるRu三核錯体およびプルシアンブルーナノ粒子の光励起振動ダイナミクスの計測と光励起時間分解和周波発生分光系の構築に注力した。Ru三核錯体の光励起振動ダイナミクス計測については、これまでよりもより高い時間分解測定を行ったところ、従来観測されていた配位COのホットバンド(本来の吸収バンドと比較して若干低波数側に観測されていた)は、最初から低波数側に現れるのではなく、まずバンドの広がりが認められ、数百フェムト秒以内に波数シフトを示していることがわかった。これは、以前報告されている、Ru単結晶表面に吸着したCO分子の光パルス照射後のフォノン変換現象と酷似しており、おそらく三核といえどもRu30格子内でフォノンの生成が起こっているためと考えられる。また、プルシアンブルー(PB)ナノ粒子については、PBの電荷移動バンドを励起した際に、生成する緩和した双安定状態と目される、近赤外領域の吸収と、中赤外領域の吸収バンドが明確に観測された。この吸収バンドの時間分解応答は、以前報告されている、水溶性のPBコロイドと比較して遙かに長寿命であり、ナノサイズ化の影響が明確に観測されたと考えられる。一方、時間分解光励起和周波発生(SFG)分光システムの構築については、現在、ようやく可視-赤外SFG測定が可能になった段階であり、新たにポンプ光のラインを増設することができたが、ポンプ光の波長が限定されるために、対象とする測定系を適切に設定できなかった。今後、電極/溶液界面における水の時間分解挙動に着目して実験を展開する予定である。フェムト秒時間分解可視光ポンプ-赤外光プローブ(TRIR)分光法は、可視光超短パルスによって生成した分子の電子励起状態や半導体のキャリアがどのように推移・消滅してゆくかを赤外分光による分子振動モードやキャリアのバンド内遷移等を利用して評価することが可能な、先端的な分光法である。特に、フェムト秒パルスは不確定性原理による制限から、エネルギー幅が200cm-1程度広がっており、マルチチャンネル検出器を利用すれば、その範囲のスペクトルが短時間で得られ、従来の可視ポンプ-可視プローブ分光法に比べてダイナミクスの詳細を明らかにすることが出来る。本研究では、主としてCdSナノ粒子の光励起キャリアダイナミクスおよび多核金属錯体(Ru三核錯体)やプルシアンブルー(PB)ナノ粒子等の光励起振動ダイナミクスの計測を行った。CdSナノ粒子の場合、赤外スペクトル測定により光励起により伝導帯に存在する電子のダイナミクスを評価できることがわかっている。今回、透明電極に積層したCdSナノ粒子内の光励起キャリアダイナミクスが電極電位により影響されることを直接観測できた。一方、Ru三核錯体やPBナノ粒子では、可視光励起により電子励起状態が生成するが、パルスの通過とともに励起状態は失活し、振動励起状態として数数十ピコ秒の時間範囲で減衰してゆくことがわかった。錯体分子については配位子を、PBナノ粒子については粒径を変化させることで、その寿命が大きく変化し、それは分子の電子状態に影響された結果であることがわかった。
中英語と初期近代英語の連続性に関する研究―コーパス言語学と歴史社会言語学の融合

中英語と初期近代英語期は、いずれも英語史研究で重要な意味をもつ変動期であるが、それぞれ独立に研究されることが多い。本研究ではその連続性に着目し、以下のような分野の研究を行った。まず、中英語の否定構文の変化と初期近代英語の助動詞doの拡張を連続的に捉える研究、次に動詞の補文の構造(that節、不定詞、動名詞構文等)についての研究、最後にalwaysの語尾に付加されている-sなど、形態に関する研究である。中英語から初期近代英語期にかけての連続性に焦点を当てるとともに、この時期の変化を英語史全体の枠組みで解釈し、現代英語へのインパクトについても考察した。2014年度は、すでにパイロット版の作成を終えているコーパス、EMEPES (Early Modern English Prose Selections), ver. 1を利用して、初期近代英語期における動詞の不定詞構文について言語研究を行い、その成果をInternational Conference on English Historical Lingusitics(KU・ルーヴェン大学、2014年7月)において発表した。発表では特に使役動詞、中でも使役のmakeに重点をおき、その構文の揺れについて、1500年から1700年までの変化をたどった。調査研究の結果、中英語に見られるようなto不定詞構文と原形不定詞構文の揺れは、初期近代英語期にも引き継がれており、使役動詞の史的変化を明らかにするためには、初期近代英語期についてのさらなる調査が必要であることが明らかになった。特に16世紀は、構文の揺れが顕著であり、本研究課題の主要なテーマである中英語期から初期近代英語期にかけての接続部分は、動詞の構文の発達においても興味深い時期であることが再確認できた。上記の他にも、2014年度は、新たなコーパスの構築に取り組んだ。Early English Books Online等のデータベースを用いて、現在、中英語および初期近代英語のさらなるコーパスの構築を進めているところである。また、すでにパイロット版の作成が終わっているEMEPSについても、コーパスに含まれる一部のテキストの差し替えが必要であるなど、コーパスの具体的な利用の中から改善の余地があることが明らかになった。2015年度は、中英語と初期近代英語の接続部分に焦点を当てるために、いくつかの方向からのアプローチを試みた。一つは、中英語側からのアプローチである。初期近代英語期の印刷本のデータベースであるEarly English Books Onlineを利用して、個人研究目的のコーパスとして言語データを集積する試みは前年度より続けているが、2015年度は特に中英語の印刷本を中心にデータ整備を行った。さらに、そのデータをもとに、副詞的属格の拡大との関係で以前より関心をもっているalgates, alwaysの語彙選択および語形についての分析を行った。もう一方のアプローチは、近現代英語方向からのアプローチ、すなわち新しい時代からさかのぼる形で当該の時代の英語を明らかにする方法である。中英語期から初期近代英語期にかけての変化の多くは、現代英語においても変動という形でその姿を現していることが多い。そこで、現代英語も視野に入れながら、現代英語を英語史全般との関係で論じる試みを行った。2015年度に特に力を入れたのは、現代英語の動詞の構文の変動であり、forbidについての2つの研究成果は、それぞれ2015年11月に関西外国語大学で開催された学会、2016年1月にハワイ大学で開催された国際学会において報告した。現在forbidは、to不定詞を取る構文から動名詞の-ingを取る構文に急速に変化しつつあるが、その萌芽は、中英語期から初期近代英語期にすでに観察できるものである。観察する時代の幅を広げることで、中英語から初期近代英語への接続点の英語の実態を明らかにするとともに、その現代的な意味を明らかにすることが出来た。なお、forbidの研究はこれまでにも続けてきたが、2015年度は、ジャンルと言語変化の関係について議論の幅を広げた。研究はおおむね順調に進展しているといってよい。前年度までにパイロット版が完成していたEarly Modern English Prose Selectionsについては、一部の変更を行って、更に研究目的に合致したものに完成しつつある。また、2015年度においては、同様に中英語の印刷本についても、テキストの集積を進め、ケーススタディとして、algates, alwaysについての分析を行うことが出来た。その過程で、印刷本が成立する際に写本のテキストがどのような役割を果たしてきたか等、今後の研究の発展にもつながる知見を得ることもできた。また、中英語と初期近代英語の接続点の英語を明らかにしていくために、現代英語側からのアプローチも開始することが出来たので、今後、中英語側と現代英語側の両方から本研究課題が中心的に扱う時代を観察するための基盤が出来上がりつつあるといってもよい。2016年度は、昨年度までの研究成果を踏まえながら、引き続き、中英語と初期近代英語の接続部分に焦点をあてた研究を行った。昨年度は、中英語についてはEarly English Books Onlineを利用した電子コーパスの作成を中心に行ったが、2016年度は、Early English Books Online以外についても、まだ電子化が進んでいない写本の調査に着手した。ただしこちらの研究成果があらわれるのには、若干の時間がかかりそうである。一方、初期近代英語については、一般公開されているArcher Corpusを利用し、これまで研究を続けてきた否定構文と助動詞doの発達を扱い、現在多くの研究者が取り組んでいるJespersen's Cycleについての考察も行った。その研究成果は、2016年11月に金沢大学で開催された日本英語学会第34回大会のシンポジウムで報告した。

また2016年度は、これらの中英語から初期近代英語にかけての言語変化を、英語史全般においてどのように位置づけることができるかについても考察を行った。2016年6月に関西言語学会で行った歴史社会言語学についての研究報告はその一つである。英語史研究が社会という概念を取り込みながら近年新たな展開を見せている背景として、コーパス言語学の進展がある。一方で、コーパスを含む研究方法の開拓の結果として、英語史研究の成果と現代英語研究の成果が相互に関連しながら連続性をもつようになってきた。本研究が取り組む中英語から初期近代英語の連続性は、その多くが現代英語にも波及するものであり、実際に、昨年から継続的に調査をしている動詞forbidの現代英語語法は、中英語期、初期近代英語期の言語変化との関連性なくして十分に説明することは難しい。2016年度は、このような視点からも研究を進めた。中英語、初期近代英語の両方について、一般公開されているコーパスの利用、本研究のためのコーパスの作成など、研究対象を確実に広げながら研究を展開することができている。また、英語史全般という広い視野に立って、中英語から初期近代英語の変化に焦点を当てることが可能になってきている点でも、研究は発展的に進んでいると感じる。特に歴史社会言語学のような研究のフレームワークについても考察を進めてきたことで、同じ資料を扱う場合でも、そのアプローチの幅が広がった。最終年度も、これまでの年度と同様、中英語から初期近代英語にかけての言語変化と連続性全般を研究の対象としながら、特に綴り字の変化、動詞の構文の変化に焦点を当てて研究を進めた。初期近代英語期はラテン語やギリシャ語への関心が高まった時代で、すでに中英語までに「崩れて」いたラテン語・ギリシャ語等からの借用語の綴り字が、初期近代英語期に語源に忠実な形に変更されることは知られている。この語源的綴り字の復活は、一般に初期近代英語期の現象とされるが、実際にはすでに中英語期にも観察されることがわかっており、中英語・初期近代英語の両方の視点からの議論が必要である。2017年度は、名詞と動詞のdoubtを例に、中英語期に一般的であったdouteなどのbを用いない綴り字がbを獲得していく過程を分析し、論文として発表した。また2014年度から行っている動詞の構文の史的変化についても、さらに研究を深めた。動詞forbidの構文の中英語から初期近代英語にかけての変化、およびその史的変化と現代英語との関係については、すでに2016年度までに論文を作成している。一方、2014年に口頭発表を行った使役動詞makeの初期近代英語期の変化(makeがto不定詞を取る構文から原形不定詞を使用する構文への推移)については、2016年度2017年度にかけてさらに継続的に分析を行った。2017年度までに論文は完成したが、この報告書の作成段階では、印刷中である。
カーボンアロイ-炭素材料の空間制御と新機能の展開-

本研究は、平成9年度から11年度まで実施され、平成12年度は取り纏めの年である。カーボンアロイの研究は制御サイトの観点から、分子・結晶空間レベル、界面・微構造空間レベル、表面・裏面空間レベル並びに全空間レベルでの新機能探索の四つの研究班で行ってきた。計画班が22名、公募班が47名で研究を進めてきたが、本年度はこれまでの三年間の研究成果を全員が纏めて執筆し、これを編集、印刷した。すなわち、成果報告書としては560頁以上に及ぶ大作となり、研究成果の公表論文は350件を超え、班員による共同研究の成果としての共著論文も20件を超えた。日本から発信したカーボンアロイが世界に認知されはじめ、国際会議はもちろん、学会誌の論文のタイトルにも取り入れられつつある。これをより広めることが科研費の成果として重要事項であると考え、海外の著名な出版社から英語の本を出版するべく、そのための準備を行った。まず章立てを次のように行った。第一章はカーボンアロイの定義付け、第二章は科研費の各班の総まとめを中心とした空間制御、第三章はカーボンアロイの最新の研究手法、第四章はカーボンアロイの最新の研究トピックスである。原稿は80%揃っており、現在原稿のチェック並びに未入稿の督促を行い、来年度の成果促進費の申請に備えている。また、今年度は炭素用語辞典(炭素材料学会編)の編集を全員で協力して行い、平成12年10月に出版することができた。以上を要するに、本特定領域研究によるカーボンアロイの研究は、当初の期待以上の成果が得られ、炭素関連の大型プロジェクト等へと繋がり、その輪が次第に大きくなっている。空間制御によるカ一ボンアロイの探索並びに新機能の展開について評価担当の先生方から大所高所からのご意見を頂き、検討した。

すなわち、原子・結晶レベル、表面/裏面レベル、界面/微構造レベルて空間制御を行うと共に、新機能の展開を行う4つの班の(計画班21名+公募班41名)の連携をとり、議論を噛み合わせるためのいくつかの会合並びに海外の著名な研究者の招聘を行った、また、研究領域の広さをカバーするために、4つの班に加えて、多孔質材料、層間化合物、C/C複合材料、新しい複合系の4つの材料に絞り研究を押し進めた。本年度は、7月2日に新橋の藏前工業会館で公開シンポジウムを開催し、研究計画の進め方について説明し、意見聴取を行った。10月には各班の分担者会議を開催し、各研究者の研究の進捗犬況について報告し合い、意見交換を行うとともに共同研究の可能性を探った。12月3日に愛媛大学で成果報告会を公開で開催した。この成果報告会は、日本学術振興会・未来開拓研究の成果報告会と合同で行ない、ポスタープレビューと、ポスターによる成果の議論を行い、次年度に向けて以下の様な問題点の整理を行った。1:異なる分野のメンバーが集まったことによる用語の違いを解消するための手段(例えば用語集)の心要性。2:各班のレビューをしっかりやって全員の理解を深める事の重要性。3:泊まり込みで班会議を行い、とことん勉強をし、親睦を深める事の必要性。4:理論屋と実験屋の共同研究を積極的に進めることの重要性。また、1月には海外の著名な研究者を4名ほど招聘して研究集会を公開で開催した。カーボンアロイのメンバーは勿論一般の研究者も交えて活発な議論が進められた。また、3月には次年度の公募班の構成について検討を行った。計画班29名、公募班48名の計77名を原子・結晶アロイ班、界面・微構造アロイ班、表面・裏面アロイ班、機能展開班ならびに総括班に分け、それぞれの分担者会議を3回、全体会議を2回、総括班会議を2回開催した。その中で、今年度の特徴は炭素分野以外からのメンバーが多いことから分担者会議でカーボンの基本のセミナーを開催し、1泊2日で、全員同じ宿舎に泊まり、夜遅くまで議論を深めることができた。また、炭素の用語辞典が世界的に無かったことから、用語辞典の編集の第一段階としての用語の洗い出しを行った。シンポジウムは7月28日・29日に群馬県桐生市において行った。また、成果報告会は千葉大学で炭素材料学会の研究会と合同で行った。70件以上の発表を全員で勉強し、議論を可能とするように1人2分のポスタープレビューを行い、その後ポスターで約3時間の個別な質疑が交わされた。これにより、幅広い議論が可能であった。成果報告会での全体会議において井口洋夫・元分子研所長の講演があり、炭素に関する研究の重要性に関してお話を伺うことができた。以上の全体会議、分担者会議、総括班会議によりカーボンアロイ学の検討、先端研究の進展、共同研究の実施により新分野の展開等が可能となった。計画班30名、公募班46名の計76名を原子・結晶アロイ班、界面・微構造アロイ班、表面・裏面アロイ班、機能展開班ならびに総括班に分け、それぞれの分担者会議を2回、全体会議を2回、総括班会議を2回開催した。その中で、今年度の特徴は、本研究から発展しそうな新分野として「B-C-N物質」「生物関連物質」「新しい反応系」の3つを取り上げ、検討を行った。また、昨年同様、分担者会議でカーボンの基本のセミナーを開催し、1泊2日で、全員同じ宿舎に泊まり、夜遅くまで議論を深めることができた。また、炭素の用語辞典が世界的に無かったことから、用語辞典の編集の第一段階としての用語の洗い出しを行ない、研究費とは別に編集委員会を作り、この委員会に洗い出した用語を引き継いだ。
フェンタニルの肝臓中CYP代謝阻害による薬物間相互作用の予測に関する研究

フェンタニルは近年,癌性疼痛治療に多く用いられている医療用麻薬である.しかしその治療濃度範囲は狭く(血中濃度:0.6ng/mL-3ng/mL),2ng/mL以上で有害反応が発生すると報告されている.臨床においてもフェンタニルパッチと比較的弱いCYP3A4阻害作用を有するフルコナゾールとの併用により呼吸不全で死亡した症例が報告されている.本研究では,フェンタニルとの薬物間相互作用予測の基礎情報を得るためにフェンタニルと併用される可能性の高い薬剤を選出し,ヒト肝ミクロソームを用いて,フェンタニル代謝反応に対する阻害効果を定量的に予測することを目的とした.阻害薬にはフェンタニルと臨床上,高頻度に併用されるアセトアミノフェンとジクロフェナクを選出した。フェンタニルとその主要代謝物であるノルフェンタニルは,HPLC法をも用いて,カラムWaters Spherisorb 5.0μm CN-RP 4.6mmx250mm Column,移動相0.01M KH_2PO_4(pH=2.8):アセトニトリル=80:20,流速1.4mL/min,カラム温度25°C,UV波長195nmとすることで分析可能となった.フェンタニル酸化的脱アルキル化酵素活性値は,Km=ll7μM,Vmax=3.86nmol norfentanyl formed/min/P450であった.代謝反応実験による各薬物のフェンタニルに対する阻害効果は,アセトアミノフェンとジクロフェナクでは,IC_<50>=3.82mM,IC_<50>=0.189mMであった.各薬剤の血中濃度は,0.13mM,2.8μMであり,この2薬物に関してはフェンタニルとの相互作用発現の可能性は低いことが示唆された.フェンタニルは近年,癌性疼痛治療に多く用いられている医療用麻薬である.しかしその治療濃度範囲は狭く(血中濃度:0.6ng/mL-3ng/mL),2ng/mL以上で有害反応が発生すると報告されている.臨床においてもフェンタニルパッチと比較的弱いCYP3A4阻害作用を有するフルコナゾールとの併用により呼吸不全で死亡した症例が報告されている.本研究では,フェンタニルとの薬物間相互作用予測の基礎情報を得るためにフェンタニルと併用される可能性の高い薬剤を選出し,ヒト肝ミクロソームを用いて,フェンタニル代謝反応に対する阻害効果を定量的に予測することを目的とした.阻害薬にはフェンタニルと臨床上,高頻度に併用されるアセトアミノフェンとジクロフェナクを選出した。フェンタニルとその主要代謝物であるノルフェンタニルは,HPLC法をも用いて,カラムWaters Spherisorb 5.0μm CN-RP 4.6mmx250mm Column,移動相0.01M KH_2PO_4(pH=2.8):アセトニトリル=80:20,流速1.4mL/min,カラム温度25°C,UV波長195nmとすることで分析可能となった.フェンタニル酸化的脱アルキル化酵素活性値は,Km=ll7μM,Vmax=3.86nmol norfentanyl formed/min/P450であった.代謝反応実験による各薬物のフェンタニルに対する阻害効果は,アセトアミノフェンとジクロフェナクでは,IC_<50>=3.82mM,IC_<50>=0.189mMであった.各薬剤の血中濃度は,0.13mM,2.8μMであり,この2薬物に関してはフェンタニルとの相互作用発現の可能性は低いことが示唆された.
新しい３次元培養法とiTRAQ法を用いた子宮頸部小細胞癌特異的膜蛋白質の探索

子宮頸がんの1種で難治性の子宮頸部小細胞癌について、特異的な蛋白質を見出し、新たな治療法などを探るため、手術で採取した組織から新しい培養法; CTOS(Cancer tissue- originated spheroid)法で癌細胞を培養した。培養した子宮頸部小細胞癌と子宮頸部扁平上皮癌、子宮頸部粘液性腺癌、肺小細胞癌と肺扁平上皮癌、肺粘液性腺癌の蛋白の量を比較した。小細胞癌でその他の癌に比べて多く発現している蛋白を14個認め、そのうち4個について調べることにした。手術で摘出した子宮頸癌の組織で比較したところ、選んだ4個の蛋白は小細胞癌で扁平上皮癌に比べて多く認められた。子宮頸部小細胞癌は稀な腫瘍であるが、最も予後の悪い疾患の一つであり、その治療法は確立されておらず、新しい治療法が求められている。そこで、新たな治療標的や診断の鍵となる蛋白質を同定することを目的とした。子宮頸部小細胞癌に特異的に発現する蛋白質を解析するため、子宮頸部小細胞癌、子宮頸部粘液性腺癌、子宮頸部扁平上皮癌、肺小細胞癌、肺粘液性腺癌の手術検体から作成した3次元培養細胞塊(CTOS)と子宮頸部小細胞癌と子宮頸部粘液性腺癌細胞株を用いて、iTRAQ法を行ない、網羅的蛋白解析を行った。このiTRAQにおいて、粘液性腺癌、扁平上皮癌の両方に比して小細胞癌で発現が増強している蛋白質を14種類同定した。これらの蛋白質について文献的検索を行い、続いて標的とする蛋白質の評価を行うこととした。まず、その一つのsecretagoginに着目し、免疫組織化学染色を行ったが、iTRAQ法に使用したうち、2種類の子宮頸部小細胞癌については発現を認めたが、その他の臨床検体では発現が陰性であった。そのため、臨床検体では、再度染色の条件について検討を行うこととした。続いて、14種類の蛋白質のうち、IGFBP-2について検討を行う予定としている。またiTRAQによる網羅的な蛋白解析により、肺、子宮における、小細胞癌、粘液性腺癌の蛋白質の発現パターンは臓器特異性を超えて、組織型でそのパターンが共通することが判明した。iTRAQによる網羅的な蛋白解析により、肺、子宮における、小細胞癌、粘液性腺癌の蛋白質の発現パターンは臓器特異性を超え、組織型でそのパターンが共通することが判明した。また、粘液性腺癌、扁平上皮癌の両方に比して小細胞癌で発現が増強している蛋白質を14種類同定した。これらの蛋白質について文献的検索を行い、標的とする数個の蛋白質の評価を行うこととした。続いて、IGFBP-2、CKBB、VRK-1について子宮頸部の扁平上皮癌、小細胞がん、粘液性腺癌について免疫染色にて検討したところ、いずれも小細胞がんと扁平上皮癌を比べると、小細胞がんの方が陽性の症例が有意差をもって陽性率が高いことが分かった。小細胞がんと粘液性癌、粘液性腺癌と扁平上皮癌は陽性率について有意差を認めなかった。また、IGFBP-2, VRK-1については子宮頸部小細胞がんの細胞株を用いてsiRNAを用いて検討し、それぞれの発現を抑制することにより細胞の増殖が抑制されることが示された。手術検体の3次元培養細胞塊と細胞株の網羅的iTRAQにより、子宮頸部扁平上皮癌、子宮頸部粘液性腺癌に比して、子宮頸部小細胞癌に特異的に発現が増加している蛋白質を14個同定することができており、おおむね順調に進展していると考えられる。同定された14個の蛋白質についての検討がまだ十分ではなく、今後の検討が必要と考えられる。

婦人科腫瘍今後の推進方策としては、同定された蛋白についてさらに文献的考察を加え、さらにターゲットとする蛋白質の個数をしぼっていく予定である。手術標本について、免疫組織化学染色を行い、細胞株を用いて、蛋白質の機能解析、選定蛋白質の遺伝子導入及び発現抑制を行う。また、選定蛋白質の分子標的薬の同定、中和抗体の作成を行っていく予定である。選定蛋白質の分子標的薬の同定、中和抗体の作成、免疫組織化学染色、細胞株を用いた蛋白質の機能解析、選定蛋白質の遺伝子導入及び発現抑制を次年度に行う予定であるため、物品の購入を控えた。研究を円滑に進めるために必要物品を購入する予定である。
環北極雪氷圏気候・環境変動研究

環北極雪氷圏として極域カナダ、極域ロシア、ノルウェー域城、東部シベリア、グリーンランドを研究地域に設定した。調査観測隊員を派遣し、各地域で各種環境試料の採取を実施し、北極域での環境変化の現状を調査した。具体的には以下の通りである。1.極域カナダについては、カナダ地質調査所との共同研究として同地域から採取した雪氷コアの物理解析を実施している。氷期から現代までの北極雪氷圏気候・環境変動研究を行うことに成功した。2.極域ロシアでは、採取した雪氷試料の解析によって物質輸送経路の解明を行った。3.東部シベリヤにおけるシベリヤ高気圧の発達に伴う雪氷現象の解明として、広域雪氷観測により採取した雪氷試料の解析によって極域環境を抽出した。4.グリーンランドでは国際共同研究(North GRIP)に参加し、デンマーク・コペンハーゲン大学、ドイツ・アルフレッドウェゲナー研究所と共同観測を実施した。雪氷層掘削を行い、コアの一部を国内に持ち帰り解析を進めている。今後、我が国の南極における雪氷深層掘削コア解析研究と連携し、両極域を対象としたグローバルな地球環境の研究を展開していく。5.ノルウエー極域では、環北極雪氷圏の低温下を妨げている海洋圏影響の解明を目的とし、海洋圏の影響を大きく受けているノルウェー・スバールバル諸島北東島東氷河で雪氷コアの掘削を実施した。以上に述べたように環北極雪氷圏気候・環境変動研究として幅広い調査・研究を実施した。人間活動の影響が集約的に現れている環北極雪氷圏全体を研究対象とし、各地域の雪氷環境特性を比較研究した。雪氷コア解析データを検討し、環北極雪氷圏の気候・環境変動研究を進めた。さらに、雪氷圏における物質フラックスの解明の観点から雪氷試料中の環境指標シグナルを抽出するとともに、その発現の地域特性を明らかにした。環北極雪氷圏として極域カナダ、極域ロシア、ノルウェー極域、東部シベリア、グリーンランドを研究地域に設定した。極域ロシア、ノルウェー極域、東部シベリア、グリーンランドには調査観測隊員を派遣した。各地域で各種環境試料の採取を実施し、北極域での環境変化の現況を調査した。ノルウェー極域では雪氷圏と海洋圏を取り扱い、各種環境指標物質の現在の輸送状況の解明に焦点を当てた。同時に同地域の雪氷コアの解析を実施した。極域カナダについてはカナダ地質調査所との共同研究のもと同地域の雪氷コアを国内に輸送し主に雪氷物理解析の準備を行った。ここでは過去の環境試料として現間氷期の雪氷コア試料のみならず氷期の氷まで取り扱うことが出来た。極域ロシアでは過去の雪氷試料の採取・解析によって過去の物質輸送経路の解明を行った。東部シベリアでは極域環境を支配するシベリア高気圧の発達に伴う雪氷現象を、広域雪氷観測によって捉えることに努めた。グリーンランドでは国際共同研究(North Grip)の一翼をデンマーク・コペンハーゲン大学、ドイツ・アルフレッドウェゲナー研究所とともに担い雪氷深層掘削に参加した。今後のコア解析に備えるとともに、日本の南極氷床深層掘削と連係し両極域を対象としたグローバルな地球環境の研究を展開していく。上に述べたように環北極雪氷圏気候・環境変動研究として幅広い調査・観測を実施したが、今後取得される雪氷コア解析データを議論する過程で環北極雪氷圏の気候・環境変動研究として集約させていきたい。また雪氷圏における物質フラックスの解明に努力し雪氷試料中の環境指標シグナルを明らかにする。グリーンランド、ノルウェー極域には調査観測隊員を派遣した。

1.極域カナダについてはカナダ地質調査所との共同研究のもと同地域から採取した雪氷コアの物理解析を実施している。ここでは過去の環境試料として現間氷期の雪氷コア試料のみならず氷期の氷まで取り扱い、氷期の北極雪氷圏気候・環境変動研究を行うことに成功した。2.極域ロシアでは昨年度本補助金によって採取した雪氷試料の解析によって、物質輸送経路の解明を行った。3.東部シベリアにおけるシベリア高気圧の発達に伴う雪氷現象の解明は、国内解析によって極域環境の抽出と広域雪氷観測の融合に努めた。4.グリーンランドでは国際共同研究(North Grip)に参加し、デンマーク・コペンハーゲン大学、ドイツ・アルフレッド・ウェゲナー研究所と共同観測を実施した。雪氷層掘削を行ない、コアの一部を国内に持ち帰り解析を進めている。今後わが国の南極における雪氷深層掘削コア解析研究と連携し、両極域を対象としたグローバルな地球環境の研究を展開していく。5.ノルウェー極域では現北極雪氷圏の低温化を妨げている海洋圏影響の解明を目的とし、海洋圏の影響を大きく受けているノルウェー・スバールバル諸島北東島東氷河で雪氷コアの掘削を実施した。以上に述べたように現北極雪氷圏気候・環境変動研究として幅広い調査・観測を実施した。人間活動の影響が集約的に現れている環北極雪氷圏全体を研究対象とし、各地域の雪氷環境特性を比較研究した。雪氷コア解析データを検討し、環北極雪氷圏の気候・環境変動研究を進める。また雪氷圏における物質フラックスの解明の観点から雪氷雪試料中の環境指標シグナルを抽出するとともに、その発現の地域特性を明らかにする。
受精可能なラット精子の大量保存技術の確立

ラットは、生体機能モデルや疾患モデルとして利用される重要な実験動物である。しかし、多種多様なラット遺伝資源の効率的確保、安定した供給や保存において極めて重要な技術である精子の凍結保存技術は未だ実用化に至っていない。それ故、ラット精子の凍結保存技術の開発は急務となっており、その技術が実用可能になれば、開発の意義は計り知れない。そこで本研究では、極めて困難であるとされるラット精子凍結保存法の開発と凍結精子による体外受精技術の確立を目的として実験を行った。その結果、1)概知のラクトース卵黄保存液に代わる新たな精子の凍結保存液として基盤となる、ラフィノース・卵黄-修正クレブス-リンガー重炭酸液(modified Krebs-Ringer Bicarbonate;mKRB)保存液を開発した。2)ラット精子のエネルギー利用と供給に着目した、乳酸、およびエネルギー源であるATPを添加したラフィノース・卵黄-mKRB凍結保存液を改良した。3)精子運動活性化作用を有する物質に着目し、精子内のcAMP濃度を上昇させる効果のあるdbcAMPをさらに添加したdbcAMP・ATP・乳酸・ラフィノース・卵黄-mKRB保存液を開発した。4)新鮮精子を用いた体外受精および培養法において、ATPおよびdbcAMPを添加した受精培地を改良・開発し、従来の方法に比較して、高い受精率と胚の発生率を得ることが可能になった。さらに、凍結保存した精子においても、開発した受精培地を用いることにより、受精可能であることを証明した。以上、本研究において開発されたラット精子凍結保存法は、精子の凍結保存に有効な技術であるはかりではなく、保存精子を用いた体外受精においても有効な技術であることを示した。これらのことから、本研究の新たな知見と技術は、重要な実験動物であるラット遺伝資源の効率的維持、保存や安定した供給のため貢献するものである。【目的】ラットはそのゲノム配列が明らかになり、また、多種多様な遺伝子改変ラットが作製され、遺伝資源の維持・提供のため精子の保存技術の開発が急務となっている。しかし、公表論文ではラット精子の凍結融解後の運動性が15%前後であり、精子の凍結保存技術は未だ確立された技術には至っていない。そこで本実験では、より運動性や耐凍能の高い精子の保存技術を開発することを目的として、糖類を修正クレブスーリンガー重炭酸(modified Krebs-Ringer Bicarbonate; mKRB)緩衝液に添加した凍結保存液が耐凍能に及ぼす影響について検討した。【方法】Wistar Imamichi系成熟オスラットの精巣上体から精子を採取した。精子の一次希釈は、20%卵黄を含むmKRB溶液に0.1Mラフィノース、トレハロース、ラクトース、フラクトースおよびグルコースを添加したものを用いた。希釈した精子は、1時間30分で5°Cまで冷却した。二次希釈は、0.75%Equex STMを含む卵黄希釈液で等量希釈を行い、15分間平衡化を施した。その後、0.5mlのストローに充填し、液体窒素液面上に10分間静置し、液体窒素中に精子を凍結した。凍結精子は37°Cの温水で融解し、運動性および先体の正常性を測定した。【結果】ラフィノース(38.0%±4.1%)およびトレハロース(34.3%±2.3%)を添加した卵黄-mKRB希釈液を用いて精子を凍結すると、融解後の運動性および先体の正常性は、ラクトース(22.6%±5.3%)、フラクトース(9.3%±0.6%)およびグルコース(7.0±1.0%)を添加した卵黄-mKRB希釈液に比較して高い値を示した。これらの結果から、ラフィノースを卵黄-mKRB希釈液を用いてラット精子を凍結すると、その耐凍能が向上することが明らかになった。

以上、本研究において開発されたラット精子凍結保存法は、精子の凍結保存に有効な技術であるはかりではなく、保存精子を用いた体外受精においても有効な技術であることを示した。これらのことから、本研究の新たな知見と技術は、重要な実験動物であるラット遺伝資源の効率的維持、保存や安定した供給のため貢献するものである。