hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
メチル化DNAを含むヌクレオソームの構造生物学的解析

本研究の目的は、DNAのメチル化がクロマチンの高次構造へ与える影響を構造生物学的手法によって明らかにすることである。これまでの報告により、様々ながん細胞におけるDNAメチル化の異常とヘテロクロマチン構造の不安定性が示されたが、その詳細は明らかにされていなかった。そこで、本研究を遂行するために、肝臓がん細胞における低メチル化が報告されているサテライト2配列に着目し、メチル化DNAを含むヌクレオソームを再構成した。再構成ヌクレオソームを用いた生化学的解析およびX線結晶構造解析を行った結果、DNAのメチル化はヌクレオソームのポジションおよびDNA末端領域の運動性に影響を与えることが明らかになった。本研究の目的は、メチル化DNAがクロマチンの高次構造形成に与える影響を、構造生物学的手法によって明らかにすることである。真核生物において、CpGダイヌクレオチドのメチル化が遺伝子発現の制御と深く関与することから、遺伝情報を担うゲノムDNAのメチル化機構はエピジェネティクス研究分野において重要である。一方、真核生物において、遺伝子発現などの核内で行われる全てのDNA反応に対応して、クロマチンがダイナミックに構造変換する。これまでの報告から、DNAのメチル化がクロマチンのダイナミクスやそれに伴うDNAの機能発現制御に重要であると考えられている。しかし、DNAのメチル化がクロマチンの構造へ与える影響は依然不明である。そこで本研究では、セントロメア周辺領域(ペリセントロメア)に存在し、DNAメチル基転移酵素であるDNMT3Bによってメチル化されることが知られている160塩基対のサテライト2配列に着目した。リコンビナントタンパク質として精製したヒストン複合体と試験管内でM.SssI DNAメチル基転移酵素によってメチル化したサテライト2 DNAを用いて、ヌクレオソームを試験管内で再構成した。次に、再構成したヌクレオソームに対してヌクレアーゼを加え、ヌクレオソームの形成によって保護される146塩基対程度のDNA断片を取得した。得られたDNA断片を次世代シーケンサーによって塩基配列の解析を行った結果、DNAのメチル化によってヌクレオソームの配置が変化することが示唆された。さらに、次世代シーケンサーによる解析から得られた知見をもとに、ヌクレオソームの配置が確認された146塩基対のDNA断片を大量調製した。その後、試験管内でメチル化反応を施したDNA断片を含むヌクレオソームを再構成・精製し、結晶化を行った。その結果、メチル化DNAを含むヌクレオソームの単結晶を得ることに成功した。本研究の目的は、重要なエピジェネティックマークの一つであるDNAのメチル化がヌクレオソーム構造へ与える影響を、生化学および構造生物学的手法によって明らかにすることである。真核生物において、CpGダイヌクレオチドのシトシン塩基のメチル化が、発生や分化などにおける遺伝子の発現を制御する。さらに、がん細胞において、DNAのメチル化の異常によってヘテロクロマチン構造が不安定になることが示された。従って、DNAのメチル化がゲノムの恒常性維持に極めて重要であることが考えられるが、DNAのメチル化がクロマチン構造へ与える影響は不明であった。そこで本研究では、肝臓がん細胞での低メチル化が報告されているサテライト2配列に着目し、DNAのメチル化がクロマチンの基盤構造であるヌクレオソームの構造や安定性へ与える影響を、試験管内再構成ヌクレオソームを用いた生化学的および構造生物学的手法によって解析した。まず、サテライト2配列を含む再構成ヌクレオソームのポジションを、次世代シーケンサーを用いて網羅的に解析した。その結果、ヌクレオソームのポジションがDNAのメチル化によって変化することが明らかになった。次に、マイクロコッカルヌクレアーゼを用いて、溶液中におけるヌクレオソームの末端DNAの運動性を生化学的に解析した。その結果、非メチル化状態では各ポジションにおけるヌクレオソームの末端DNAの運動性が異なった一方、メチル化によって各ポジションにおける違いが解消されることが明らかになった。また、メチル化DNAを含むヌクレオソームのX線結晶構造解析を行った結果、DNAのメチル化はヌクレオソーム構造へ大きな影響を与えないことが明らかになった。以上より、DNAのメチル化はヌクレオソームのポジションの違いによる末端DNAの運動性を解消することで、安定かつ均一なヘテロクロマチンの形成に重要であることが示唆された。本研究によって、特定の塩基に試験管内でメチル化反応を施したDNAの高純度精製を行い、メチル化DNAを含むヌクレオソームを試験管内で再構成した。再構成ヌクレオソームを用いた生化学的解析から、メチル化DNAの導入によってヌクレオソームの配置が変化することを新たに見出した。このことから、エピジェネティクス制御に重要なマークであるDNAのメチル化がクロマチン構造の変換に直接的に作用することが示唆された。さらに、DNAのメチル化がヌクレオソームの立体構造へ与える影響を構造生物学的に解析するために、ヌクレオソームの再構成に用いるDNA断片を次世代シーケンサーによる解析から決定し、大量に調製した。

調製したDNAを本研究で確立した手法によって試験管内メチル化反応を行い、146塩基対のメチル化DNAを含むヌクレオソームの再構成および高純度精製を行った。精製後、ハンギングドロップ蒸気拡散法によってメチル化DNAを含むヌクレオソームの結晶化を行った。その結果、メチル化DNAを含むヌクレオソームの単結晶を得ることに成功した。今後の研究展開により、メチル化DNAを含むヌクレオソームの原子分解能での立体構造を、世界に先駆けて発表することができると確信している。以上より、これらの成果は当初の計画を大きく上回り、本研究の進展が得られたと考える。分子生物学、生化学、構造生物学本研究により、メチル化DNAを含むヌクレオソームの結晶化に成功した。今後、得られた単結晶を大型放射光施設SPring-8もしくはPhoton FactoryにてX線回折データを取得する。得られた回折データを基に電子密度を求め、メチル化DNAを含むヌクレオソームの立体構造を決定する。決定した立体構造と非メチル化DNAを含むヌクレオソームの立体構造との比較を行い、DNAのメチル化がヌクレオソームへ及ぼす構造的影響を明らかにする。さらに、近年の報告から、DNAのメチル化とヒストンの非対立遺伝子的な亜種(バリアント)との間でクロマチンの高次構造形成等における関連性が示唆されている。そこで、本研究で用いた手法を用いて、ヒストンバリアントとメチル化DNAを含むヌクレオソームを試験管内で再構成し、これらがヌクレオソーム構造へ与える影響を生化学的手法や構造生物学的手法によって明らかにする。さらに、平成26年度に行われた研究により、メチル化DNAがヌクレオソームの配置を変化させることが示唆された。このことから、DNAのメチル化がヌクレオソーム中のメチル化シトシンの位置を規定し、メチル化DNA認識タンパク質によるヌクレオソーム中のメチル化シトシンへの結合に影響を与えることが考えられる。今後、メチル化DNA認識タンパク質をリコンビナントタンパク質として精製し、メチル化もしくは非メチル化DNAを含むヌクレオソームへの結合活性をゲルシフトアッセイ等の生化学的解析によって評価する。これらの解析によって、DNAのメチル化によるクロマチン構造の変換機構とその意義を明らかにしたいと考えている。
ナノNMRセンシングを可能とする高機能ダイヤモンド合成

ナノNMRセンシングを可能とする高機能ダイヤモンド合成法の開発に向け、従来のマグネトロン方式に代えて、マイクロ波プラズマCVD法によるダイヤモンド薄膜合成でほとんど試されていない高純度マイクロ波(ソリッドステート方式)に着目したホモエピタキシャルダイヤモンド薄膜合成を研究した。薄膜合成の系統的実験により、従来のマグネトロン方式では達成できなかった結晶欠陥の抑制と高品質な極浅NVペア形成を実証するとともに、ソリッドステート方式のCVD法の特徴を明確化した。本研究の目標は、単一プロトン検出に要求される磁場検出感度と空間分解能となる、ダイヤモンドNVペアの表面近傍配置(5nm以下)とその電子スピン位相保持時間(T2=45μs以上)を両立させるダイヤモンドの窒素ドーピングと極浅NVペア形成技術を開発することである。初年度は、マイクロ波プラズマ発生システムに必要となる要件を検討・設計し、基礎データとなる、既存マイクロ波のスペクトル評価およびプラズマ分析装置を完備し、予備実験を行った。この結果、マイクロ波伝送の最適化の実現が有効となる可能性が確認された。加えて、ダイヤモンドの成長速度と不純物の取り込みに相関があることに着目し、成長速度制御因子となる以下2つの取り組みを実施した。(1)ダイヤモンド(001)基板表面の微細溝加工ダイヤモンド表面にデバイス作製技術を利用し、微細な溝構造を作りこむことによりプラズ発生条件を変化させることなく局所的な成長速度とNVペア濃度を増大させることができることがわかった。この微細構造の断面SIMSイメージ分析とCLマッピングを実施したところ、(溝成長/溝無成長)の速度比は4であり、溝構造周辺にはBand Aに相当する特徴的な分布を示す発光があることが明らかになった。この結果を受け最適条件模索のため様々な溝パターンの設計とダイヤモンド基板への加工を実施した。(2)ダイヤモンド(111)基板への成長(111)面のホモエピタキシャル成長で、基板加工処理と合成条件の組み合わせにより、(001)面成長に匹敵する約60nm/hの極低成長速度の制御に成功した。これまで高い成長速度のため品質とナノメートルオーダの膜厚制御に問題があったが、この技術により膜厚、品質だけでなく(111)基板特有のNV配向性を兼ね備えたシングルNVペア形成に有効になると期待される。今後系統的な窒素ドープおよびスピン寿命の評価を試みる。本研究の目標は、単一プロトン検出に要求される磁場検出感度と空間分解能となる、ダイヤモンドNVペアのダイヤモンド表面近傍配置(5nm以下)とその電子スピン位相保持時間(T2=45μs以上)を両立させるダイヤモンドの窒素ドーピングと表面近傍の極浅NVペア形成技術を開発することである。本年度は、世界に先駆け、高出力高純度でマイクロ波を発生し供給することができるマイクロ波プラズマ発生用増幅器、および本増幅器からの出力を効率よくチャンバーへ伝送するための、立体回路素子の設計・試作を行った。これにより、従来装置(マグネトロン方式)では不可能であった、50Wから1500Wのマイクロ波出力において発振周波数の出力依存性=ゼロ、SSB位相雑音性能=-85dB/Hz以下のマイクロ波によるプラズマ発生およびダイヤモンド成長条件を実現した。従来方式と同様にダイヤモンドの堆積が確認され、窒素ドーピングではガス中のN(窒素)/C(炭素)比に対してダイヤモンド薄膜中のN濃度が比例することを確認した。以上の結果を基に、ダイヤモンドNVペアの表面近傍配置への応用を図った。マイクロ波パワー750W、CH4濃度0.5%、基板温度800°C、ガス圧力25Torr、N/C比=15%の条件により膜厚5nm, 2nmのダイヤモンド薄膜合成を行った。現在、NVペアの観察が進行中であり、電子スピン位相保持時間の確認は得られていないが、SIMS評価から従来法と比較し、N/C比1%以下での窒素の薄膜への取り込まれる効率が上がっている。低N/C比ドーピングでも高い効率で窒素の取り込みが行われれば、次年度計画している膜厚1nm, 0.5nmへのNV配置の実現性が期待される。本課題の2年目に計画した、主要目標である、(1)ナローバンドスプリアスマイクロ波発生源の設計・試作(2)マイクロ波スペクトル純度とドーピング効率変化の実証、における項目に対して期待される成果を得ている。本研究では、マイクロ波プラズマCVD法によるダイヤモンド合成でほとんど試されていない高純度マイクロ波に着目したホモエピタキシャルダイヤモンド薄膜合成法の開発により、量子センシングのリソースとなるダイヤモンドNVペアの表面近傍配置(<5nm)とその電子スピン位相保持時間(>45μs)を両立させるダイヤモンドの窒素ドーピングと表面近傍の極浅NVペア形成技術の開発を目的とした。最終年度であるFY28の成果は以下のようにまとめられる。【ソリッドステートマイクロ波源を通じたダイヤモンド薄膜合成の高度化】設計・開発した高パワー(1500W)のソリッドステートマイクロ波源により、不要な周波数広がりや周波数変動による不要なガス励起およびプラズマ発生を抑制したした中で、ダイヤモンドをホモエピタキシャル成長させる技術が確立された。この技術により、NVペア密度を保ちつつ電子スピンの外乱要因となる不要な欠陥構造の抑制が可能となった。結果的に、ガス励起およびプラズマ発生のためのマイクロ波の位相雑音やスプリアスによる不要波が、結晶性に加えドーパント原子の取込みやそれによる電子状態の形成に影響を与えている可能性が見出された。材料合成でマイクロ波源のソリッドステート化が進むにつれ、これまで試されてきた様々なドーピングや結晶成長技術の未解決課題に対しても新たな合成パラメータとなることが期待できる。

【NV電子スピン特性の向上】CVD層5nmのダイヤモンド量子磁気センサーを試作した。PL評価より、基板としたバルクダイヤモンドではなく、CVD層のみにNVセンターが形成されていることを確認し、T2=71μsを得た。これは、我々の従来技術と比べて、約7倍の延伸を示し、ソリッドステートマイクロ波源を通じたダイヤモンド薄膜合成の高度化により、NV電子スピン特性の向上を実証することができた。ナノNMRセンシングを可能とする高機能ダイヤモンド合成法の開発に向け、従来のマグネトロン方式に代えて、マイクロ波プラズマCVD法によるダイヤモンド薄膜合成でほとんど試されていない高純度マイクロ波(ソリッドステート方式)に着目したホモエピタキシャルダイヤモンド薄膜合成を研究した。薄膜合成の系統的実験により、従来のマグネトロン方式では達成できなかった結晶欠陥の抑制と高品質な極浅NVペア形成を実証するとともに、ソリッドステート方式のCVD法の特徴を明確化した。本課題の初年度に計画した、主要目標である、新規マイクロ波プラズマ発生システムの基本指針・設計を完了し、それに伴う基礎データの取得では、本計画の成否を左右する期待以上の成果を得ている。この結果により、本課題が極限成長の克服に非常に有効になることが期待され、高機能ダイヤモンド合成の突破口となる指針が確認されている。現在進行中となる、NVペアの観察、電子スピン位相保持時間の確認を行い、当初の計画に従って研究を進める。具体的には、CVD法による薄膜形成の限界に挑戦すると共に、マイクロ波スペクトル純度と結晶成長及びドーピング効率についての指針提示を主な課題とする。28年度が最終年度であるため、記入しない。物質工学当初の計画に従って研究を推進してゆく。特に2年目の主目標である、新規マイクロ波システムを完成させ、極浅NVペア形成の指針を獲得する。また、当初の計画に加えて、初年度の成果をさらに深化させるため、溝構造、および特殊(111)基板の加工処理状況を見ながらエピタキシャル薄膜の検証を継続し研究を推進する。
細胞膜安定性維持システムの破綻によるトランスポートソーム異常と病態

細胞膜の脆弱化は、細胞内カルシウム動態を変化させ、細胞変性や筋ジストロフィーを引き起こす。従って、細胞膜の安定性を担うシステムは、トランスポートソームの機能・恒常性に必須であり、その異常が病態発症の要因と考えられる。細胞膜の安定性に関わるタンパク質として、ジストログリカンとジスフェルリンが挙げられる。ジストログリカンは、細胞骨格と細胞外マトリックスを結ぶことで細胞膜に強度を与え、ジスフェルリンは破綻した細胞膜の修復を担っている。本研究は、ジストログリカンやジスフェルリンが細胞膜の維持における役割の解明、また、それぞれの変異に起因する細胞膜の脆弱化によって、異常をきたし、病態発症に関与するトランスポート成分の同定を目的とした。ジストログリカンの機能不全マウス(Hpマウス)と、ジスフェルリン変異マウス(SJLマウス)を掛け合わせることで得られた二重変異マウスの病態解析を行った。Hpマウスは、顕著な病態を示さず、SJLマウスは、非常にマイルドな病態を呈す。二重変異マウスは、SJLマウスより悪化した病態を示した。この結果は、Hpマウスでは、極軽度の膜脆弱化が生じているが、ジスフェルリン依存の膜修復能によって、発症に至らないことを示唆している。つまり、ジストログリカン依存の細胞膜強度とジスフェルリン依存の膜修復システムは、トランスポートソームの恒常性に重要であることが示された。また、ジストログリカン機能不全による病態発症の新たなモデルとして、ジストログリカン機能に必須な糖鎖修飾を欠如するコンディショナルノックアウトマウスを作成した。このモデルマウスにおいて、細胞膜の脆弱化が観察され、また、筋ジストロフィーが発症した。よって、このモデルを用いて、発現に変化をきたすトランスポートソーム成分を同定し、病態とトランスポートソーム異常の相関を明らかにする研究の遂行が可能となり、将来的に解明されるであろう分子病態に基づく治療戦略の構築が期待される。本研究では、ジストログリカンやジスフェルリン変異に起因する細胞膜の脆弱化によって、異常をきたし、病態発症に関与するトランスポート成分を同定する。更に、ジスフェルリン依存の細胞膜修復機構の解明に迫る。今年度は、ジストマグリカンの機能不全マウス(Hpマウス)と、ジスフェルリン変異マウス(SJLマウス)を掛け合わせることで得られた二重変異マウスの病態解析を行った。この結果は、Hpマウスでは、極軽度の膜脆弱指が生じているが、ジスフェルリン依存の膜修復能によって、発症に至らないことを示唆している。現在、ジストログリカン機能をHpマウスより低下させた筋特異的フクチンノックアウトマウスを解析中であり、これらのマウスにおいて発現量に変化をきたすトランスポートソーム成分を同定する予定である。また、ジスフェルリン含有膜標品のプロテオミクス解析を行い、膜修復機構の解明のみならず、膜輸送分子の機能発現・調節機構の理解を目指す予定である。

よって、このモデルを用いて、発現に変化をきたすトランスポートソーム成分を同定し、病態とトランスポートソーム異常の相関を明らかにする研究の遂行が可能となり、将来的に解明されるであろう分子病態に基づく治療戦略の構築が期待される。
懸濁態リンの藻類利用可能性測定のための環境水中懸濁物質の分離手法の開発と応用

河川・湖沼水中の懸濁物質を密度の違いをもとに分離する手法について検討を行った。連続遠心分離により、分離濃縮した懸濁物質、沈降捕集物質、底泥を密度勾配遠心法で分離する手法について、密度勾配媒体としてpercoll、塩化セシウム、Thoulet液(ヨウ化第2水銀/ヨウ化カリウム)を用いて検討した。無機物質の密度は2g/cm^3以上と高いが、細胞分離で多用されているPercollは密度1.3g/cm^3までしか密度勾配が形成できないため、懸濁物質の分離には適さないことが解った。塩化セシウム65%溶液(密度、1.9g/cm^3)とThoulet液(密度、2.4g/cm^3)を用いて分離を行い、電子顕微鏡での観察の結果、密度1.9以下の有機物質、密度1.9から2.4の硅藻及びその殻、2.4以上の粘土等の無機物質の3つに分離することができた。密度2.4以上の物質の中には、多少硅藻の殻が含まれるが、懸濁物質や底泥を大きく3つのグループに分離することが可能になった。密度1.9以下の物質の全懸濁物質に占める質量比は、霞ヶ浦湖水で5080%、霞ヶ浦流入農耕地河川で3050%、都市河川で7090%であった。また、茨戸湖の水深別の水中懸濁物質では、水深が深いほど密度1.9以下の物質の比率が低くなった。底泥では、密度2.4以上の物質が4060%を占めるのに対して、沈降捕集物質では密度1.92.4の物質の比率が高くなった。これらの結果から、水中懸濁物質や底泥は、密度の異なる物質の混合物であり、それぞれの場でその存在比は異なること、それぞれの密度によって湖内での沈降、底泥の再懸濁化等の循環経路・速度が異なることが解った。河川水・湖沼水中の懸濁物質を水から分離・濃縮するための連続遠心分離法についてろ過操作で捕集される量との比較検討を行った。連続遠心分離前後の試水をろ過することによって、連続遠心による懸濁物質の捕集率を求めた。連続遠心時の流量が一定の場合は回転数が大きいほど懸濁物質の捕集率は増加し、18,000rpm(26,500g)では95%遍捕集された。ろ過前後の試水の差を懸濁態とした場合のリンと炭素の捕集率は、18,000rpmでそれぞれ96%、92%であったが、回転数が大きくなるとともに逆に若干低くなる傾向が見られた。これは、回転数が大きくなるほど連続遠心分離後の試水で溶存態のリン・炭素濃度が高くなったためであるが、溶存態反応性リン濃度には変化はなかった。この原因については、連続遠心分離による藻類等の細胞の破壊、懸濁物質の微細化等による影響もあるが、連続遠心分離前の試水の方が連続遠心分離後の試水より、ろ紙の孔径より小さい粒子がろ紙上に捕捉される確率が高いことが大きく影響していることがわかった。孔径の異なるろ紙を用いて連続遠心分離した前後の試水をろ過して懸濁物質の粒径別の捕集率を求めた。ろ紙の孔径が大きいほど懸濁物質の捕集率は大きくなった。10μm以上の懸濁物質はほぼ100%捕集され、懸濁態と溶存態を分けるのに通常用いられている0.45μmでは95%が捕集された。連続遠心分離によって、従来から用いられているろ紙による分別とほぼ同様の懸濁物質を分離・濃縮することができた。連続遠心分離法は、取扱いやすい形で懸濁物質を濃縮できる、多量の懸濁物質を捕集することができる等の利点がろ過法に比べてあり、河川・湖沼水中の懸濁物質を水から分離し、濃縮するための有効な手段であることがわかった。

底泥では、密度2.4以上の物質が4060%を占めるのに対して、沈降捕集物質では密度1.92.4の物質の比率が高くなった。これらの結果から、水中懸濁物質や底泥は、密度の異なる物質の混合物であり、それぞれの場でその存在比は異なること、それぞれの密度によって湖内での沈降、底泥の再懸濁化等の循環経路・速度が異なることが解った。
前癌病変、潜在癌および顕在癌の特性に関する分子病理学的追求

伊東はラット前立腺癌モデルを用いて前立腺癌発生過程における癌遺伝子の変化についてPCR-SSCP法およびdirect sequence法を用いて検討し、癌遺伝子の点突然変異が実験的前立腺癌に少ない頻度ながら認められことを明かにした。津田は化学発癌物質誘発のラット腸腫瘍を用いて、Ha,kiおよびN-ras遺伝子および抑制癌遺伝子p53の点突然変異を検索し、これらの変異は極めて低頻度か全く検出されなかったことから実験的腸腫瘍の発生にはこれらの癌遺伝子の関与は極めて低いことを示した。森はラット大腸発癌に及ぼす水酸化マグネシウムの抑制作用について検討し、大腸発癌過程の初期に増加するc^-myシウム投与によりその発現を抑制することを示した。樋野はヒト成人型腎癌を100%発生させる遺伝性腎癌ラットを用い、腫瘍の発生は単一遺伝子による常染色体優性遺伝の形式であることを明らかにした。江角はDMHによるラット大腸のaberrant cryptを指標としたアザチロシンによるその抑制作用を見出し、aberrant cryptにおけるki-rasの活性化について検討中である。本年度は実験的腫瘍の発生並びにその進展過程における癌遺伝子の関与について検討し、低頻度ながらも癌遺伝子の点突然変異を証明できた腫瘍もあるが、ras,p53などの癌遺伝子の関与がヒトの腫瘍に比較すると非常に低い腫瘍も見つかっており、これらの事実は臓器特異性によるものか、用いた化学発癌物質に依存するものか、あるいはそれぞれの腫瘍のもつ特性によるのかの検討が必要と考えられた。今後これらの点について更に種々の腫瘍での検討を進める他、前癌病変、潜在癌、顕在癌それぞれの進展に伴う遺伝子の変化の検討を進める予定である。
固体地球モデルによる氷期の南極氷床変動復元とその変動メカニズムの解明

将来の地球温暖化に伴う海面変動が危惧されており、その大きな要因として南極氷床をはじめとする大陸氷床の融解が挙げられる。南極氷床は将来の海面変動の主要因であるが、過去の南極氷床変動史は十分に復元されておらず、その変動メカニズムは解明されていない。特に、約2万年前の最終氷期最盛期からその後の融氷期は南極氷床変動の直接的な記録の地域・時間的な欠損のため、過去の2万年間の南極氷床変動史は不確実性が大きいのが現状である。本研究では、氷床変動史の復元に有用なGIAモデルを用いた手法の一つであるフィンガープリントの特色を活かし、最終氷期最盛期前後の南極氷床史に着目し研究を行う。GIAモデルによるフィンガープリントは、南極から離れた海水準データを用いて南極氷床変動史に制約を加えることが可能であり、南極における海水準・氷床変動データの地域・時間的な欠損を克服できる手法である。本課題では、復元した南極氷床変動史と日射量変動パターン、海水温、二酸化炭素濃度などの古気候記録と比較、検討し、氷期における南極氷床変動メカニズムの解明を目指す。GIAモデルによるフィンガープリントは全球的な氷床変動史の構築が不可欠であり、当該年度では全球的な氷床変動史を確立することを目指した。北西オーストラリアのボナパルト湾は旧氷床域から遠く、ローカルな海水準は海水量の変化を反映している。つまり、ボナパルト湾は全球的な氷床変動史の復元に適した地域である。当該年度では、ボナパルト湾の堆積物試料とGIAモデルを組み合わせ、全球的な氷床変動史の構築し、GIAモデルによるフィンガープリントによる実験を開始した。GIAモデルによるフィンガープリントに不可欠な全球的な氷床変動史を北西オーストラリア・ボナパルト湾の海洋堆積物試料とGIAモデルから構築し、その成果を国際誌に発表した。また、氷期における南極氷床変動史の構築も進んでおり、次年度に繋がる成果が得られている。構築した全球的な氷床変動史も元にGIAモデルのフィンガープリントによる南極氷床変動史の復元を行う。また、研究成果を国内外の学会で発表し、他の研究者と議論を行い、南極氷床変動メカニズムの解明を目指す。当該年度に参加予定であった学会に参加できなかったため、次年度の学会参加の旅費および諸経費として使用する。
蔗糖が誘発する鎮痛効果を探求する基礎的研究

本研究は、代表的な甘味物質である蔗糖が誘発する鎮痛効果について探求することを目的に実施した。従来、蔗糖の甘味を利用した痛み抑制効果の検討は新生児領域では多く行われているに対して、それ以外の対象ではほとんど検討されていない。本年度は昨年に引き続き、成人を対象に、実験的疼痛による侵害受容刺激に対する蔗糖溶液の効果を検証した。実験的疼痛には、冷水を用いて痛みを誘発する方法、Cold Pressor Test (CPT)を用いた。被験者は2°Cに維持された冷水中に手を浸すことで、痛み(冷痛)を感じた。使用溶液には24%蔗糖溶液と蒸留水(control)を用いて、各溶液による痛み反応の違いを検討した。各溶液はクロスーバーデザインを用いて被験者に無作為に割り付けた。その結果、蒸留水に比べて、蔗糖溶液を口に含んでいる時の方が有意に痛覚潜時(冷水中に手を浸けて痛みとして感じてまでの時間(秒))が延長した。また、蔗糖溶液は蒸留水に比べて、その味が有意に心地よいと評価されていた。よって、蔗糖の甘味刺激による鎮痛効果は新生児同様、成人でも一時的ではあるが得られることが明らかになった。また、この鎮痛機序には甘味による心地良さ、つまり情動への影響が鎮痛に関与している可能性がある。今後は成人を対象に得られた鎮痛効果が、どのような機序によってもたらされるかを検討する。また、甘味以外の味質を用いて、味刺激による痛みへの影響を検証する。以上から、本研究申請時における目標は全て達成された。本研究の目的は、成人を対象に、代表的な甘味物質である蔗糖が誘発する鎮痛について検証することである。本研究は山口大学医学部附属病院医薬品等治験・臨床研究等審査委員会から事前に研究実施について承認を得て行なっている。科学研究費助成開始に伴い、平成18年8月9月の間に計画書通りに予備実験を実施した。予備実験では、健康な成人男性7名を対象に、冷水の中に手を浸けることで痛みを生じさせるCold pressor test(CPT)を用いて冷痛に対する蔗糖の影響について検証した。その結果、蔗糖溶液を口腔内に含んだ上でCPTを行うと、冷感覚から冷痛覚に変化するまで時間(潜時)が蒸留水を含んだ時に比べて有意に延長した。つまり、蔗糖溶液による甘味刺激によって痛覚感受性は低下し、痛みに対する除痛効果が期待できることが明らかになった。この予備実験結果については既にデータをまとめて、今春(平成19年6月)開催予定の看護系国際学会(International Council of Nursing Conference)に演題登録した。演題は受理されており、現在は発表準備作業を行っている。また、この予備実験結果については可及的に短報として近く投稿する予定である。予備実験を経て、現在は科学研究費の申請書に計画した通り、健康な大学生男女を対象に実験を進行中である。これまでのところ、被験者における有害事象などは生じておらず、また使用機器に関する不備等も生じていない。実験実施人数(平成19年4月現在)はこれまでのところ目標被験者数の2割程度(約20名)であるが、5月の連休、大学生の夏季休暇および冬季休暇の休暇日を中心に実験を継続していく予定である。
強誘電性・反強誘電性液晶の相転移に伴う層構造形成に関する研究

1.SmA相、SmC^*相の圧力に対する影響を調べるため、強誘電性液晶CS-1017(Chisso)に圧力を印加し、複素誘電率測定を行った。SmA-SmC^*相転移点Tcは圧力増加とともにdTc/dp=0.19K/MPaの割合で増加する。圧力増加に伴い、ゴールドストーンモードの緩和周波数は短調に減少するが、緩和強度は単調には減少せず、一定値に近づく。ソフトモードの緩和強度も減少するが、緩和周波数の変化は見出せなかった。これらは粘性増加に伴う現象であるが、SmC^*相では圧力下でも緩和モードが消滅することはない。2.強誘電性液晶FLC-031(Chisso)では圧力が300MPa以上で強誘電相が消失した。これにより圧力印加はSmC^*相の安定性を下げ、SmA相は広がることから安定性が高まる。300MPa以下ではゴールドストーンモード、ソフトモードは存在しており1.の結果を裏付ける。この液晶ではソフトモードの緩和周波数の減少が確認され、一般的にはいずれのモードでも緩和周波数は単調減少を示し、緩和強度は初期減少のみを示すことが示唆された。3.反強誘電性液晶MHPOBCに非極性分子を添加し、相互作用を弱めた系を作り、各Sm相の相形成に対する影響を調べた。n-エイコサン、n-オクタコサンを10mol%程度まで添加すると、副次相は消滅し、SmA-SmC^*転移点は降下する。SmC^*相は多少広がり、SmC_A^*相は急激にその領域を減少させた。添加分子は液晶層内に分布していると考えられ、SmC^*相形成の障害になっているため転移点は降下し、SmC_A^*相を形成する層間の相互作用、例えば分子の2量体化を形成しにくくしているため、SmC_A^*相は減少したことが説明できる。極性分子DANSを添加した系では逆にSmC^*相が消滅した結果とは対照的であり、これらの結果は興味深く、現在も研究は進行中である。本年度の研究実施計画では圧力下での実験を行う予定であったが、装置の納期が遅れたため、次年度実施予定であった密度測定等を中心に研究を行った。得られた結果は以下の通りである。1.強誘電性液晶を含むN(^+)-SmA相転移は層構造が形成される相転移である。この相転移では、N(^+)相の温度幅の広さとN(^+)相の熱膨張係数αの間に強い相関があり、N相が広いとαの値はSmA相やIso.相の値に近づく。N相の幅の減少とともにαの値は増加するが、N相の幅をゼロに外挿してもαの値は発散しない。この結果はN相の密度がIso.相とSmA相との密度差を埋めるように変化していることを示しており、N相の幅が狭いときは密度差を埋められず、密度の不連続変化を伴う一次転移をすることを示している。2.反強誘電性液晶に不純物をドープすると、液晶分子の長さLと不純物の長さRの比r=L/Rにより、不純物の分散する領域が異なることを示唆する結果を得た。つまり、不純物の増加により、SmAからSmC^α_+、SmC^+相への転移点が下がる。rが1に近い場合、不純物が液晶層の中に分布して双極子-誘起双極子相互作用を弱めるためSmC^α_+、SmC^+相のような傾いた相が形成しにくくなると考えられる。また、予備的実験よりrが大きいと不純物は層間に分布することが示唆され、層間の相互作用が弱められる。このように特別の相互作用を弱め、層形成との関係を調べていく予定である。3.静水圧印加は相互作用を強めるため、これとの併用により層形成・再配列について調べるため、圧力印加装置の立ち上げを行っている。すでに、動作確認はほぼ終了しており、測定精度を高めるための調整後に誘電率・D-Eヒステリシスの測定を予定している。

3.反強誘電性液晶MHPOBCに非極性分子を添加し、相互作用を弱めた系を作り、各Sm相の相形成に対する影響を調べた。n-エイコサン、n-オクタコサンを10mol%程度まで添加すると、副次相は消滅し、SmA-SmC^*転移点は降下する。SmC^*相は多少広がり、SmC_A^*相は急激にその領域を減少させた。添加分子は液晶層内に分布していると考えられ、SmC^*相形成の障害になっているため転移点は降下し、SmC_A^*相を形成する層間の相互作用、例えば分子の2量体化を形成しにくくしているため、SmC_A^*相は減少したことが説明できる。極性分子DANSを添加した系では逆にSmC^*相が消滅した結果とは対照的であり、これらの結果は興味深く、現在も研究は進行中である。
ソフィスト思潮の歴史的・哲学的考察

本年度は、前五四世紀の「ソフィスト思潮」の全体像について、前年度の研究を引き継いで、次の六点の研究を行った。(1)ソフィストに関する伝承資料の扱いについて、特に、ディールス・クランツによる断片編集がもつ基本的な問題を調査した。(2)ゴルギアスの『ヘレネ頌』の翻訳を行い、そこに見られるゴルギアスの「弁論術(レトリック)」の理念について検討した。ゴルギアスが表明する「力」の行使という理念に対して、プラトンが『ゴルギアス』篇(特に第1部)で哲学の立場から徹底した批判を加えている様を明らかにし、論文にまとめた。(3)つづいて、ゴルギアスの『無について』を取り上げ、偽アリストテレス『メリッソス・クセノファネス、ゴルギアス』に報告されるヴァージョンからの復元作業を試みた。セクストス・エンペイリコスが報告するヴァージョンとの異同は、今後の研究課題とした。(4)アルキダマスの『書かれた言論を書く人々について、あるいは、ソフィストについて』を翻訳し、研究会においてその思想史的重要性を発表して、哲学・西洋古典学・文学・歴史学の専門家と意見を交換した。(5)プロタゴラス、『両論』に見られる古代相対主義の特徴について、現代の相対主義についての議論を参照しながら検討を加えた。(6)ゴルギアスとアルキダマスを中心にした、欧米(特に、イタリア)の研究状況を調査し、必要な賛料を英国・ケンブリッジ大学図書館において収集した。本年度は、前五四世紀ギリシアにおけるソフィスト思潮について、歴史的・社会的基盤をおさえつつ、彼等の思想背景を探ることから始めた。(1)ソフィストに関する資料について、従来のディールス・クランツの『ソクラテス以前の哲学者断片集』に依拠する際の問題点を検証した。個々のソフィストについて、例えば、プロタゴラスのように極端に断片資料が少ないケースには、その理由を、ゴルギアスのように比較的多い場合は、その伝承を確認した。また、前四世紀のソフィストで、従来の編集から外れていたアルキダマスについて、その研究文献とテクストを調査した。(2)ゴルギアスの残された著作『ヘレネ頌』『パラメデスの弁明』を検討し、「弁論(レトリック)」を中心としたr言葉(ロゴス)」に対する彼の理論を検討した。また、ゴルギアスの弟子で弁論家アルキダマスの『書かれた言葉を書く人々について、あるいは、ソフィストについて』という論考を詳細に検討し、前五四世紀における「即興演説」と「書物」との関係を、ソフィストの社会活動という面から考察した。(3)紀元後三世紀のソフィスト・フィロストラトスの『ソフィスト列伝』に描かれる、古典期ソフィストたちの活動の特徴を整理した。(4)今後の方向を視野にいれて、ソフィスト研究の位置づけを、関連する他分野即ち、歴史、文学や、とりわけレトリック研究との関係から検討した。(5)二〇〇一年八月には、イスラエルでこの分野の専門研究者たちと意見交換し、これまでの本研究について有益なコメントを得た。
実用的な前腕用筋電義手制御システムの設計に関する研究

本研究は,少数電極位置推定とロバストな動作認識法に基づく実用的筋電義手制御システムの開発を目指す.1つ目の課題は前腕部動作の高精度識別法の開発と,筋疲労など様々な外乱要素に対するロバスト性向上である.2つ目の課題は,前腕切断者の残存筋の状況により個人ごとに異なると考えられる少数の最適電極位置を推定する手法の開発であり,いくつかの統計的手法を用いてこれを実現する.複数の健常者による実験によりこれらの開発手法の有効性を確認した。本研究はヒトの前腕部運動時に筋線維から発生される筋電位信号によるロバストな動作パターン認識に基づく筋電義手制御システムの開発を目指し,これまでほとんど考慮されてこなかったいくつかの問題を解決し,より実用的なシステム設計を実現することを目指した。1つ目の重要な課題は,前腕部動作の高精度識別法の開発と,筋疲労や姿勢変動など様々な外乱要素に対するロバスト性向上である。自己組織化マップ,ニューラルネットワーク,適応型ファジィ推論,ダミー変数型特徴量などを応用した動作認識法により高い認識率を実現し,さらに筋疲労や姿勢変動などの外乱要素への対応も考慮した。いずれの被験者についても認識率向上を実現することができた.2つ目の課題は,前腕切断者の残存筋の状況により個人ごとに異なると考えられる最適電極位置を推定する手法の開発であり,少数でかつ最適位置の電極使用で高精度動作認識が実現できれば,コスト面の優位性のみならずユーザごとのきめ細かい支援も期待できる。重回帰分析やウィルクスΛに基づく判別分析を用いた電極選択手法を検討し,前腕部動作に対する影響力の大きい順に選択し被験者ごとに異なる最適位置を発見した。測定箇所を16箇所とし,その中から24箇所を推定する検証を行った。いずれの被験者についても統計的な電極選択による効果が見られ,また2CHという極めて少数の電極であっても測定箇所次第で70%以上の認識率が得られることも明らかになった。このように本研究では,少数かつ最適電極位置の筋電位測定信号から,計算量の少ない簡潔な識別法により高精度かつロバストな前腕部動作認識を実現し,実用的な筋電義手システムの設計に寄与する成果を得た.本研究は,少数電極位置推定とロバストな動作認識法に基づく実用的筋電義手制御システムの開発を目指す.1つ目の課題は前腕部動作の高精度識別法の開発と,筋疲労など様々な外乱要素に対するロバスト性向上である.2つ目の課題は,前腕切断者の残存筋の状況により個人ごとに異なると考えられる少数の最適電極位置を推定する手法の開発であり,いくつかの統計的手法を用いてこれを実現する.複数の健常者による実験によりこれらの開発手法の有効性を確認した。本研究はヒトの前腕部運動時に筋線維から発生される筋電位信号によるロバストな動作パターン認識に基づく筋電義手制御システムの開発を目指し,これまでほとんど考慮されてこなかったいくつかの問題を解決し,より実用的なシステム設計を実現することを目的としている。本研究では,トーラス型自己組織化マップ,ニューラルネットワーク,適応型ファジィ推論などを用いた動作認識法をそれぞれ提案し,認識率の比較実験も行った。いずれにおいても従来の手法に新規の改良を施し,80%以上の認識率を獲得することができたが,特にファジィ推論法を用いた手法は,四則演算のみの低計算量であるにもかかわらず98%以上という高い認識率を示し,また筋電位信号の平均値と標準偏差を更新しメンバーシップ関数を逐次再設計していくことで筋疲労にもロバストに対応可能であることも示した。2つ目の課題は,前腕切断者の残存筋の状況により個人ごとに異なると考えられる最適電極位置を推定する手法の開発であり,少数でかつ最適位置の電極使用で高精度動作認識が実現できれば,コスト面の優位性のみならずユーザごとのきめ細かい支援も期待できる。本研究では統計的解析手法である重回帰分析と,ウィルクスΛに基づく判別分析を用いた電極選択手法をそれぞれ提案し,8あるいは16個の測定位置から前腕部動作に対する影響力の大きい順に選択し被験者ごとに異なる最適位置を発見した。最適位置であれば3つの電極でも4つの標準位置測定時と同等あるいはそれ以上の識別率が得られることを示した。このように本研究では,少数かつ最適電極位置の筋電位測定信号から,計算量の少ない簡潔な識別法により高精度かつロバストな前腕部動作認識を実現し,実用的な筋電義手システムの設計を成し遂げた.平成23年度における研究計画について,当初の予定は,(1)少数電極使用を目的とした最適電極位置推定法の開発,(2)前腕部動作のロバスト認識手法の開発,(3)義手制御実験システムの製作,の3つであった。(1)については前項でも述べたように2つの統計的推定手法を提案し,多くの被験者に対する実証実験によりその有効性を確認できた。特徴量としてスペクトル情報を用いることや,他の統計手法の適用は次年度への課題となったが,(1)に関しては80%程度,当初の計画を遂行できたと考えている。(2)についても前項で述べたとおり,3つの新しいロバスト動作認識手法を提案し,多くの被験者による実証実験により最大98%以上の高い認識率を実現できた。

日常生活動作などを考慮し対象動作数を増やすことや,姿勢変動に対するロバスト性の検討について,23年度は基礎的検証に留まったため,次年度への継続課題となったが,(2)に関しては90%程度,当初の計画を遂行できたと言える。(3)について23年度には,海外メーカの義手装置の購入を無事行い,その分析と装置製作を開始している。当初の計画では24年度に装置製作の完成と,制御実験,評価試験を行う予定としており,そのとおりのペースで遂行できていると言える。以上のことから,23年度の研究達成度は80%以上であり,「おおむね順調に進展している」と判断した。平成24年度までが研究期間となっており,研究を継続する予定である。その研究内容は当初の計画どおり,(1)義手制御実験システムの製作の続き,(2)筋電義手の制御システム設計,(3)設計・開発した筋電義手の実地評価試験,となるが,これに23年度の研究内容からの継続課題となった,(4)姿勢変動に対するロバスト性向上,(5)各種の統計解析手法による最適電極位置選択,の2つと,新たに(6)視覚フィードバックを用いたトレーニングによる動作認識精度向上,も追加し,複数の大学院生や学部4年生の協力のもと,これらを並行して行っていく予定である。(1)(3)については,当初計画どおり,義手制御実験装置の完成後,開くや握るなどの動作を人間らしい滑らかな動きとして実現する課題,さらにこれらが使用者に違和感を与えないようなリアルタイム制御として実現できるかどうかの検討,最後に可能であれば実際の前腕切断者による評価実験も計画している。(4)と(5)については23年度にすでに基礎的検討を行った実績があり,(4)についてはファジィ推論法に再設計の考えを導入したものを検討する予定であり,(5)については主成分分析による変数選択法を適用することを考えている。また(6)については,筋電信号を出すためのトレーニング効果は動作認識精度に大きな影響を与える重要な要素であり,本研究でこれまで開発してきた認識手法と組み合わせることでさらなる精度向上が期待できると判断し,研究課題として追加した。24年度はこれらの研究課題に取り組み,計2年間に亘る「実用的筋電義手システムの設計」に関する研究を完結させることを目指す。24年度には前項で述べた6つの研究課題に取り組むこととなり,研究費については,まず(1)(3)の義手制御実験に関するものとして,筋電義手のリアルタイム制御を行うためのPC,義手の動作を測定する角度センサや圧力センサ,その他の部品類,などに主に使用する予定である。次に(4)(6)の動作認識実験に関するものとして,被験者の肩や肘の姿勢変動を測定するための角度センサ,多電極測定を行うための筋電センサなどに主に使用する予定である。また人件費や,いくつかの研究成果を発表するための旅費などにも使用する予定である。
キニノ-ゲン・チオ-ルプロテイナ-ゼ複合体の病態生化学的意義

昭和63年度および平成元年度に与えられた科研費(一般研究C)により、高分子および低分子キニノ-ゲンとカルパインIの精製が完了した。現在、人肝臓よりカルパインIIとカテプシンB、H、L(特にL)の精製を試みている。また複合体形成の予備実験を行ったが、カルパインIと高分子キニノ-ゲンは70μMのCa^<2+>の存在下において、モル比1:1で容易に複合体形成を行うことを確認した。特に高分子キニノ-ゲン・カルパインI複合体を特異的に認識するモノクロ-ナル抗体の作製を試み、数種類(HCl15)得ることもできた。またその量的調整も終えることができた。これらを用いて酵素免疫測定法をサンドイッチ法で行ったが、各疾患のうち、特に肝疾患(慢性疾患、肝硬変、肝癌)において、血漿中のこの複合体が高値(100700ng/ml)を示すことが明らかとなり(正常値は50ng/ml)、癌やその他の疾患の場における細胞破壊の程度がこの複合体に反映することが判明した。キニノ-ゲン・カルパインI複合体に見られる様な非共有結合による複合体の安定化には架橋剤(disuccinimidyl suberate)を用いることが有効であったが、この方法を用いることによって、キニノ-ゲンとカルパインII、カテプシンB、H、L等の複合体の安定化も可能となり、更にこれら複合体に対するモノクロ-ナル抗体も作製可能となった。今後、更に症例数、検体数ともに増し、キニノ-ゲン・カルパイン複合体の種々の疾患での動態の正確な把握に努める予定である。63年度の研究において得られた成果は以下の通りである。1.高分子キニノーゲン・カルパインI複合体の安定化:高分子キニノーゲン・カルパインI複合体は、二架橋剤disuccinimidylsubrateを用いることにより、非解離性の安定な複合体とすることができた。得られた架橋複合体は凍結、融解にもきわめて安定であり、抗原およびELISA用標準サンプルとして有用であった。2.モノクロナール抗体の作製:上記架橋複合体を抗原としてBALB/cマウスに免疫し、常法に従いモノクロナール抗体を作製した。その結果、高分子キニノーゲンおよびカルパインIを認識せず、架橋複合体のみを認織する抗体産生ハイブリドーマを5個(HCC-1HCC-5)得た。さらに、非架橋複合体を認織するものはHCC-3とHCC-4の2種のハイブリドーマ産生抗体であった。また、これら2種の抗体は、低分子キニノーゲン・カルパインI複合体、高分子キニノーゲン・カルパインII複合体および低分子キニノーゲン・カルパインII複合体をも認織した。3.ELISA糸の確立:固相化抗体として抗カルパインIポリクロナール抗体、二次抗体としてビオチニル化HCC-3抗体を用いたサンドイッチ法により標準曲線を作成した。その結果、測定限界は100ng/mlであった。4.スクリーニング:ヘパリン採血を行った正常人血漿12例、患者血漿53例を用いて、上記ELISA法にて測定を行った。その結果、正常人血漿で100ng/ml以上のものは1例であった。一方患者血漿では600ng/ml以上が1例、500600ng/mlが2例、400500ng/mlが2例、300400ng/mlが7例、200300ng/mlが5例、100200ng/mlが13例であった。また疾患別では、肝癌、肝炎で高値を示傾向が見られた。今後、さらに症例数、検体数ともに増し、キニノーゲン・カルパイン複合体の種々疾患での動態の正確な把握に努めたいと考える。63年度においてキニノ-ゲン及びカルパインの精製、それらの複合体形成さらにモノクロ-ナル抗体の作製が完了した。調整したモノクロ-ナル抗体を用いて、64年度の研究を推進した。

〔1〕モノクロ-ナル抗体を用いた複合体の微量定量法(酵素免疫測定法)の確立:血漿中に出現してくる複合体は極めて微量と考えられるので、高感度定量法を新たに開発した。多検体を処理するために固相としてポリステレン製マイクロタイタ-プレ-トを用い、反応ウェル内にキニノ-ゲンに対するポリクロ-ナル抗体(アフィニティ-精製したIgG)をコ-トレ、被検体血漿を加えた。次いでHRPO標識したそれぞれの複合体に対するモノクロ-ナル抗体を加えて反応を行った。基質としてO-フェニレンジィアミンを用い、492nmで2波長マイクトタイタ-プレ-ト光度計を用いて行った。〔2〕複合体の測定と臨床応用:種々の炎症、癌、筋疾患、自己免疫疾患等の患者及び正常人から血漿を採取し、複合体の濃度の測定を行い、上記疾患での複合体の動態と疾患の重症度との関連性を解析し、診断、病態の把握、治療方針決定等への臨床応用を試みた。特に種々の肝疾患の血漿中の複合体量を測定したが、正常人血漿中における複合体量が100ng/ml以下(n=17)であるのに対し、肝癌患者では10例中5例において、肝硬変3例中2例で複合体の異常な高値(最大426ng/ml)が観察された。このことは細胞破壊や炎症が起こっている組織から多量のチオ-ルプロティナ-ゼが逸脱し、それらキニノ-ゲンが補捉することによって生体防御機構が働いていること示していると考えられた。
下等脊椎動物および無脊椎動物の初期発生におけるアクチビン関連分子の役割

本研究ではアフリカツメガエル胚の発生におけるアクチビンの役割をさらに探るため、はじめに抗アクチビン抗体を作成して胚中でのアクチビン様抗原の分布を調べ、次いでアクチビンの活性を抑制する遺伝子の過剰発現を行って、胚発生への影響を調べた。まずアクチビンAおよびBのC末端側のアミノ酸13残基に対するウサギ抗血清をアフィニティー精製し,交差性の見られない抗体を得た.この抗体を用いてツメガエル成体脳下垂体を染色した。抗アクチビンA抗体は下垂体の一部を弱く染めただけだったが、抗アクチビンB抗体は脳下垂体前葉を幅広く染色した。この染色される細胞は、LH細胞、TSH細胞、GH細胞であった。この結果はラットや金魚との共通点を含みながらも相違点をもっていた。同抗体を用いて卵母細胞および胚を染色すると、胚全体にシグナルが見られ,背側および腹側陥入部位の染色がやや強かった。電子顕微鏡による観察の結果、染色部位の少なくとも一部は卵黄小板内であった。次にドミナントネガティブアクチビン受容体のmRNAの注射を行った。背側帯域に注射すると、尾が短縮し2本に別れて背側へと反り返った。植物極に注射すると頭部及び眼の縮小が見られ,腹側帯域に注射すると、適度なdoseの時に2次胚が形成された。フォリスタチンを背側帯域および植物極に注射したときには陥入阻害が見られ、尾が縮小して腹側へ湾曲した。腹側帯域に注射すると、2次胚の形成が見られた。この2次胚の内部には、体節、前腎、間充織、脊索が見られた。フォリスタチンによる2次胚形成能は、BMP4mRNAの同時注入により抑制された。フォリスタチンを腹側帯域に注射すると、注射部位にgoosecoidやNCAMが発現すること、およびBMP4の同時注射によりこれらの遺伝子発現が抑えられることがわかった。
最小固有値に制限を加えたグラフの研究

最小固有値が-3以上であるグラフ全体がどのような構造を持つか理解することを目標としていた。まず最小固有値が-3より真に大きいホフマングラフを解析するために、最小固有値が-2より真に大きいグラフの辺に符号をつけたグラフを考察した。このようなグラフの中には木のライングラフがあり、その最小固有値の振る舞いに関するホフマン予想を昨年度肯定的に解決していた。今年度は、それをさらに一般化して定式化し、その証明も与えた。辺に符号をつけたグラフは最小固有値が-3以上であるホフマングラフから自然に得られ、この成果は最小固有値が-3より真に大きいグラフの分類へ大きな一歩となると考えられる。この研究成果は6月に静岡大学で、7月に英国で学会発表を行い、9月に論文を完成させて学術雑誌に投稿済みである。また10月以降は等角直線族の研究を始め、特に直線族の表すサイデル行列の固有値に注目した研究を行なった。固有値が代数的整数であること、行列式の偶奇に注目することで固有値の可能性に制限を与えることを利用して、過去に知られていた14次元における等角直線族の最大数の上界を改良することに成功した。この研究成果は11月に中国と日本で、1月に韓国でそれぞれ発表を行なった。2月になってさらなる研究の進展があり、他の次元においても上界の改良が可能であることがわかった。この結果をすべて含めた論文が3月に完成し、学術雑誌に投稿済みである。当初目標としていたホフマンの予想は肯定的な解決を見ることができ、その問題を機により一般化した設定で辺に符号をつけたグラフにおけるホフマンの問題を定式化し、それを解いた共著論文を完成し、9月に公表、学術雑誌に投稿した。さらに、等角直線族に関する論文も完成し、3月に公表、学術雑誌に投稿した。ホフマン予想、等角直線族ともに、論文が完成したので、今後はこれまでの技術を使って新たな問題に取り組む予定である。特に、距離正則グラフの固有値の重複度の研究を行なう。最小固有値が-3以上であるグラフ全体がどのような構造を持つか理解することを目標として、これまで受入研究者が行ってきた研究に参加した。最小固有値が-2以上であるグラフは、ルート系と呼ばれるベクトルの集合で実現することができ、この知識を共有しているため共同研究をスムーズに開始することができた。ホフマンの予想と呼ばれる、実質的には後にホフマングラフの概念を用いて自然に定式化される予想を肯定的に解決した。しかしこの問題はさらに広く解釈することができ、より広いグラフのクラスである、辺に符号をつけたグラフに対して定式化すべきということになった。そのため短い論文を急いで仕上げるのではなく、十分な一般的な設定の下で可能な限り強力な定理を証明することを目標とし、現在約12ページの論文の下書きが完成している。一方、固有値として現れる代数的整数に関する研究も引き続き行い、三重対角行列に注目して研究を行っている。三重対角行列の専門家と意見交換をするため島根大学を訪問した。また、得られた研究成果は名古屋大学、福岡市において開催された研究集会において発表した。さらに神戸学院大学においては、固有値に制限をつけたグラフに関する招待講演を行った。これらの研究集会に参加することで得られた研究交流のうち、実ユークリッド空問内の等角直線集合の研究がグラフの最小固有値と関連していることに気づき、新たなアプローチの研究を開始するとともに、新たな分野の未解決問題にも挑戦している。当初目標としていたホフマンの予想は肯定的な解決を見ることができ、その問題を機にさらに研究目的が明確になってきた。共著論文を執筆中であり、すでに12ページが完成し、まもなく公表できる。

さらに、等角直線族に関する論文も完成し、3月に公表、学術雑誌に投稿した。今後は、まず目標として、最小固有値が-2より真に大きい、辺に符号のついたグラフの完全な分類を目指す。また、そのようなグラフに対するホフマンの予想の類似が成り立つかどうかを決定する。ホフマン予想、等角直線族ともに、論文が完成したので、今後はこれまでの技術を使って新たな問題に取り組む予定である。特に、距離正則グラフの固有値の重複度の研究を行なう。