hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
脂肪滴による心筋Gap junctionリモデリング機序の解明

マウス心筋におけるPlin2の過剰発現は、心房筋細胞内に過剰な脂肪滴の蓄積をきたしてコネキシン43のリモデリングを惹起し、心房細動(AF)の誘発性を増加させる。コネキシン43のリモデリング機序を解明するため以下の実験を行った。1. AFの原因物質が脂質か蛋白かを絞り込む:Plin2蛋白を過剰発現するが脂肪滴を蓄積しないPlin2+HSL-TgマウスでAF発生率と心筋TG含量を検討した。その結果、Plin2+HSL-Tgマウスでは心筋TG含量の低下に伴いAF発生率が野生型(Wt)マウスと同等まで低下することを確認した。この結果よりAF発症には脂質が重要であることが示唆された。Plin2+HSL-Tgマウスの心房筋においてコネキシン43のリモデリングが改善されているかを検証するため、免疫染色と位相差顕微鏡を用いて観察した。しかしながらコネキシン43の発現量が減少しているためか、WtやPlin2-Tgとの差を評価することが困難であった。実験系を工夫して再検討している。2.コネキシン43のリモデリングに関与する脂質シグナルを探索する:月齢12か月以上のPlin2+HSL-Tg、Plin2-Tg、野生型マウスを作製し、心房を採取してをプールしている。目標数に達した時点で心房筋より脂質を抽出し、液体クロマトグラフィー/質量分析(LC-MS)により変化している脂質を解析する予定である。3.トランスクリプトーム解析:Plin2-Tgマウスの心室で行ったmicroarrayデータを用いてパスウェイ解析とGene ontology解析を行った。その結果よりコネキシン43のリモデリングに関与する候補遺伝子を探索している。Plin2+HSL-Tgマウスの左心房におけるコネキシン43のリモデリングを位相差顕微鏡で解析した。しかしながらコネキシン43の局在性の評価は困難であった。原因のひとつとして月齢12か月以上の高齢マウスを用いているため、コネキシン43の発現量が低下していることが影響している可能性がある。その他の実験に関してはほぼ順調に進んでいる。1.コネキシン43のリモデリングには脂質が重要であることを、Plin2+HSL-Tg、Plin2-Tg、野生型マウスを用いて検証する。老齢マウスでは評価が困難であったため、月齢6-10か月のマウスを用いてコネキシン43の局在性を免疫染色と位相差顕微鏡を用いて観察し、定量する。2.心房筋のリピドーム解析を行い、コネキシン43のリモデリングに関与する脂質シグナルを探索する。Plin2+HSL-Tg、Plin2-Tg、野生型マウスの心房をプールし、脂質を抽出して液体クロマトグラフィー/質量分析(LC-MS)により変化している脂質を網羅的に解析する。3.トランスクリプトーム解析:Plin2-Tgのmicroarrayデータよりコネキシン43のリモデリングに関与する候補遺伝子をパスウェイ解析、Geneontology解析を行い抽出する。

老齢マウスでは評価が困難であったため、月齢6-10か月のマウスを用いてコネキシン43の局在性を免疫染色と位相差顕微鏡を用いて観察し、定量する。2.心房筋のリピドーム解析を行い、コネキシン43のリモデリングに関与する脂質シグナルを探索する。Plin2+HSL-Tg、Plin2-Tg、野生型マウスの心房をプールし、脂質を抽出して液体クロマトグラフィー/質量分析(LC-MS)により変化している脂質を網羅的に解析する。3.トランスクリプトーム解析:Plin2-Tgのmicroarrayデータよりコネキシン43のリモデリングに関与する候補遺伝子をパスウェイ解析、Geneontology解析を行い抽出する。本年度は心房細動惹起物質の同定が終了しなかったため、研究分担者弘瀬によるマウス心房細動誘発実験は殆ど行われず、その準備のみであった。次年度に心房細動惹起物質を同定してマウスに投与し、心房細動誘発実験を行う予定である。この実験にその予算を使用する予定である。
ras遺伝子産物とその標的蛋白質の相互作用の機構

1出芽酵母アデニル酸シクラ-ゼの<ras>___ー相互作用部位の同定:出芽酵母アデニル酸シクラ-ゼ遺伝子に種々の欠損および2アミノ酸挿入変異を導入して<ras>___ー蛋白による活性化に対する影響を調べた所,シクラ-ゼ中央部の600残基を占めPXXαXXLXXLXXLXLXXNXαXXα(P:プロリン,L:ロイシン,N:アスパラギン,α:脂肪族アミノ酸,X:アミノ酸不特定)という23残基の反復より構成される領域(Leucineーrich repeatsと呼ぶ)が<ras>___ー蛋白との相互作用に必須である事が判明した。Leucineーrich repeatsは,その中の何処の部位に2アミノ酸の挿入を行っても<ras>___ー蛋白との反応性が完全に破壊されるので、たぶん非常にrigidな超立体構造をとっていると考えられた.更に,repeatsの単位配列に点突然変異を導入し1アミノ酸の置換を行った所、単位配列コンセンサス配列中のロイシンが一定の間隔をおいて存在する事が重要である事が判明した。以上の結果はLeucineーrich repeatsがロイシンジッパ-配列のように蛋白質一蛋白質間の相互作用に必要な配列である事を示唆した。更にLeucineーrich repeats部の後半200残基の領域に,<ras>___ー蛋白のエフェクタ-結合領域に結合するとされる<ras>___ーの調節蛋白質GAP,NFー1と配列の相同性が発見されたので,この領域が<ras>___ー蛋白の結合部位であると考え現在徹底的に点突然変異を導入して解析を行っている。2出芽酵母と分裂酵母のアデニル酸シクラ-ゼ分子間のキメラの作製:上記2種類の生物の<ras>___ー蛋白との反応性の異なるアデニル酸シクラ-ゼ分子間のキメラを作製して解析した所,出芽酵母シクラ-ゼのLeucineーrich repeatsを含む領域を,<ras>___ー蛋白によって制御されない出芽酵母シクラ-ゼ活性ドメインに連結すると<ras>___ー蛋白に対する反応性が賦与される事が判明した。以上の結果は我々が提唱する“出芽酵母シクラ-ゼの<ras>___ー相互作用ドメインが進化の過程で転位して別の蛋白質へ連結された"というモデルを支持している。
リモートセンシングとGISを用いた土地劣化モニタリング手法の開発に関する研究

時系列の人工衛星データを用いる事により全球的植生劣化のモニタリング手法の開発を行った。既往研究より数年(10年くらいまで)の土地被覆変化から砂漠化・土地荒廃の判定が困難なこと、また、砂漠化・土地荒廃の様々な現象を、低解像度の画像から判定するのは困難であること、が明らかにされているので、本研究では、土地荒廃と深い関わりがあると考えられる植生変動をグローバルに且つできるだけ長期間モニタリングする事で、植生の劣化状況を判定し、砂漠化・土地荒廃危険地域の選定を行った。利用データはNASA-Global-Change-Data-Centerより入手できる'81年7月から'92年までの10日毎・8kmグリッドのNOAA画像編集データであり、この中のNVI(正規化植生指標)を時系列に分析した。NVI値は気候条件により、季節・年変動を繰り返しているが、10年程度のスパンで見れば安定した植生状態では、ほぼ横ばいの傾向を示す事が予想され、実際低緯度地域ではその様な結果が得られ、土地荒廃が進んでいると言われている地域で、減衰傾向を見た。しかし、高緯度地域では安定した植被状態であっても減衰傾向が見られた。これは、衛星の代替わり(NOAA6号14号)のために、センサー特性が変化しているためと思われ、今後補正法の検討を必要とする。当初の研究計画では、パキスタンで事例研究を行う予定であったが、都合により現地調査が実施できず、グローバルデータセットによるモデル構築に留まった。処理データが膨大なため4Gバイトの補助記憶装置及び処理結果をPC上で表示・編集するため17インチCRTおよびソフトウェアを科学研究費より購入した。また、東大生産技術・柴崎助教授に研究指導、データ・情報の提供を頂いた。
昆虫休眠誘導現象をアッセ係に用いる記憶形成分子機構の解析

本研究の目的は、短日飼育条件で休眠誘導される昆虫において、その短日記憶が中枢神経系でどのように保持されるかを分子レベルで明らかにすることである。蛹休眠性を持つヨトウガ幼虫を用いたこれまでの研究によって、休眠誘導にはドーパミンが何らかの形で関与していることが分かっている。そこで、まず市販のドーパミン抗体および自作のドーパミン生合成酵素dopadecarboxylase抗体用い、短日、長日に置かれた幼虫脳組織免疫染色を行った。その結果、背側中央域の前大脳表層に近い2対の神経細胞で短日特異的なドーパミン濃度上昇が見られることが明らかになった。また、この短日飼育条件下の幼虫脳内では、コントロールの長日条件下の幼虫脳よりもDNA合成能が高まっていることが分かった。BRDUの取り込みから細胞増殖が盛んな領域が上記のドーパミン産生ニューロン近傍の細胞群であることも確認した。次に、短日飼育幼虫と長日飼育ながらL-DOPA経口投与昆虫休眠は、各々の昆虫が経験した日長時間や気温といった環境条件を認知記憶し、種に固有の発達段階で誘導される生理現象である。本研究では、特に、短日条件で休眠誘導される昆虫において、その短日記憶が中枢神経系でどのように保持されるかを明らかにすることを目的とする。そのため、蛹休眠性のヨトウガを実験材料に用い、休眠誘導に関係すると考えられる2つのファクター、ドーパミンとGBP(growth-blocking peptide)、の中枢神経系における分布および濃度の変化を解析した。結果を各々のファクター毎に記す。<ドーパミン>ヨトウガのドーパミン生合成酵素dopadecarboxylaseに対する抗体を作成し、組織免疫染色を行った。その結果、脳内では片側おおよそ4カ所にドーパミン産生細胞群が、食道下神経節及び前顎神経節に産生細胞が各々4個と3個存在することが明らかになった。脳内ドーパミン産生細胞の中には、短日飼育条件下でdopadecarboxylase濃度がより高まる傾向を示す細胞も存在する。ただ、現時点では、まだどの細胞あるは細胞群が、短日条件と休眠誘導を直接結び付けているものか明らかになっていない。<GBP>ヨトウガGBPmRNAをプローブに用いin situ hybridizationをおこなった。その結果、GBPmRNAは、脳表層に近いタイプ1及びタイプ2グリア細胞で発現していることが明らかになった。さらに、その発現量は、短日条件飼育によって増加することが明らかになった。短日飼育下での脳内ドーパミン濃度の上昇、および、単離脳培養系におけるGBPの脳内ドーパミン濃度上昇活性については、これまでの研究によって証明している。今回明らかにした短日条件飼育による脳内GBPmRNAの発現量増加の事実は、短日→GBP発現上昇→ドーパミン濃度上昇を関節的にではあるが証明したことになる。次に、短日飼育幼虫と長日飼育ながらL-DOPA経口投与
遺伝子改変マウスを用いた肝線維化の発症機序の解明と新規治療法の開発

アルコール性肝障害は、エタノール自体による肝毒性のみではなく、免疫異常が発症要因となっている。NKT細胞はCD1dを認識する免疫細胞であるが、アルコール性肝障害の病態形成への関与も推定されている。一方、プロテインSは肝で産生されるビタミンK依存性蛋白であるが、凝固阻害の他、アポトーシス抑制作用が注目されている。今回、臨床的・基礎的研究を施行し、急性アルコール性肝障害では、プロテインSの産生亢進、エタノールによる肝細胞のCD1d発現亢進、過剰なプロテインSによるNKT細胞のアポトーシス抑制が相互に作用し病態を形成し、プロテインSの制御がアルコール性肝障害の治療ターゲットとなり得ることを見出した。ヒトプロテインS(PS)過剰発現マウスにエタノール(EtOH)を短期間投与する急性アルコール性肝障害モデルを用いて検討したところ、PSは肝NKT細胞のアポトーシスを抑制することでアルコール性肝障害(ALD)の発症・進展に関与するという新しい知見が得られたので、25年度は肝生検組織、NKT細胞と肝細胞の相互作用に関する実験を加え、ALDにおけるNKT細胞の関与を検討した。肝生検が施行されたALD患者15例を対象に肝内PSおよびCD1d発現量を免疫染色にて検討したところ、ALD患者肝におけるPSおよびCD1dの発現は、手術時などに得られた健常者肝と比較し有意に増加していた。WTマウスより肝細胞を分離培養し、ヒトPS、EtOHを添加し、肝細胞におけるCD1dの発現をPCRとFACSで解析したところ、PS処理後EtOH添加された肝細胞におけるCD1dの発現は、EtOH単独処理された肝細胞に比較して有意に増強していた。以上より、ALD患者肝組織ではPS、CD1dが高発現しており、肝障害への関与が示唆された。さらに、PSはNKT細胞のアポトーシスを抑制するとともに、肝細胞のCD1dの発現を増強することによりNKT細胞の活性化を高め、ALDを増悪させると考えられた。また、thrombin-activatable fibrinolysis inhibitor (TAFI)欠損マウスにCCl4を長期間投与する実験を行ったところ、TAFI欠損マウスでは線維化が促進されていた。さらに、ヒト血漿を用いてTAFIと臨床検査値との関係を検討したところ、肝病変進展例でTAFI値が低く、TAFIと補体、特にC5とは逆相関していた。以上より、慢性肝疾患では肝で産生されるTAFIの低下が起こり、TAFIが有する補体制御能が低下した結果、炎症、線維化が進展するとの考えに至り、検証実験を行っている。平成24年度の研究実施計画に従い、プロテインS遺伝子改変マウスを四塩化炭素(CCl4)で処理して線維化を惹起し、プロテインSの抑制効果の検討を行ったが、2度の実験で異なる結果であったことから、現在再現性を確認するとともに、並行して、エタノール(EtOH)投与実験を施行した。以下に後者の結果を記す。study1:ヒトProtein Sトランスジェニック(hPSTG)マウスにEtOHを腹腔内投与し、血清AST、ALT、肝内TNF-α、IL-4、IL-13、osteopontinが著増した。FACS解析では、肝NKT細胞数が増加し、これらはAnnexin-V陽性の減少、FasL陽性の増加を示し、NKT細胞のアポトーシスの抑制の結果と考えられた。study2:hPSTGマウスより分離培養したNKT細胞ではFasL陽性NKT細胞が有意に増加し、アポトーシスが抑制されていた。study3:WTマウス肝より分離培養した単核細胞にhPSを添加後、α-Galactosylceramide(GalCer、NKT細胞リガンド)を加えたところ、上清中のIFN-γ、osteopontinは有意に上昇した。study4:hPSTG、WTマウス肝より分離した単核細胞にGalCer添加しFACS解析をした。GalCer添加によりhPSTG群ではNKT細胞数が増加し、NKT細胞のアポトーシスは抑制されていた。また、GalCerを添加したhPSTGマウス細胞上清中のTNF-α、IL-4、IL-13、osteopontinは有意に上昇していた。以上の結果から、Protein Sは肝NKT細胞のアポトーシスを抑制することでアルコール性肝障害の発症・進展に関与するという新しい知見が得られ、Protein Sの制御によりアルコール性肝障害の治療に繋がる可能性が示唆された。【目的】アルコール性肝障害(ALD)は、エタノール(EtOH)自体による肝毒性のみではなく、免疫異常が発症要因となっている。NKT細胞はCD1dを認識しIFNやIL-4を分泌する免疫細胞であるが、ALDの病態形成への関与も推定されている。一方、Protein S(PS)は肝で産生されるビタミンK依存性蛋白であるが、アポトーシス抑制作用が注目されている。

本研究では、PSが急性ALDにおいてアポトーシス抑制を介して肝保護的に働くという作業仮説に基づき臨床的・基礎的研究を施行した。【方法】臨床検討:アルコール性肝炎、健常者を対象に、肝生検、肝切除検体を用いたPS、CD1dの組織染色、PCRによる発現量評価、血漿を用いたPS濃度測定を行った。基礎検討:ヒトPS過剰発現(TG)マウスにEtOHを腹腔内投与する急性ALDモデル、同マウスの単核細胞MNCsを用いたin vitroの検討を施行した。【考案】急性ALDでは、PSの産生亢進、EtOHによる肝細胞のCD1d発現亢進、過剰なPSによるNKT細胞のアポトーシス抑制が相互に作用し病態を形成している。慢性期におけるPSの関与が課題に残るが、PSの制御がALDの治療ターゲットとなり得る。肝臓病学以上、申請時の作業仮説とは異なる部分があるものの新たな知見も得られており、満足できる結果と考えている。急性アルコール性肝障害(ALD)モデルでは、プロテインS(PS)はNKT細胞のアポトーシスを抑制するとともに、肝細胞のCD1dの発現を増強することによりNKT細胞の活性化を高め、ALDを増悪させるという知見が得られたので、論文作成を行う。thrombin-activatable fibrinolysis inhibitor (TAFI)欠損マウスに四塩化炭素を長期間投与する実験、ヒト血漿を用いたTAFIの測定から、慢性肝疾患ではTAFI低下が起こり、TAFIによる補体制御が困難となった結果、炎症、線維化が進展することが示唆されたため、26年度研究実施計画に従い、これを検証する実験を行う。以下に検討項目を記す。TAFI遺伝子改変マウスを用いたTAFIの肝線維化に及ぼす影響培養細胞を用いたTAFIによる炎症性サイトカイン産生の検討培養細胞を用いたTAFIの線維化に及ぼす影響ヒト肝組織を用いたTAFI、補体の免疫染色プロテインSの肝NKT細胞抑制作用による肝障害進展が、異なる肝障害モデルで普遍的に存在するか確定する必要があることから、平成25年度は、当初の研究実施計画に従い、引き続きプロテインS遺伝子改変マウスを長期間CCl4で処理して線維化を惹起し、プロテインSの関与を検証する。並行して、培養細胞での検討を行う。#1.プロテインS遺伝子改変マウスを用いたプロテインSの肝線維化に及ぼす影響#2.培養星細胞を用いたプロテインSによる炎症性サイトカイン産生の検討#3.培養星細胞を用いたプロテインSの線維化に及ぼす影響#4. FκB経路に対するプロテインSの作用の検討#5.プロテインS処理によるアポトーシスの抑制効果#6. TAFI遺伝子改変マウスを用いたTAFIの肝線維化に及ぼす影響の検討急性アルコール性肝障害(ALD)モデルでは、プロテインS(PS)はNKT細胞のアポトーシスを抑制するとともに、肝細胞のCD1dの発現を増強することによりNKT細胞の活性化を高め、ALDを増悪させるという知見が得られた。
高速通信回線によるアクセスを可能とする超高性能大規模地球環境データベースの構築

本研究では従来本研究者らがクイックルック画像(原画像を間引いて縮小化した画像)の支援を目的として8mmテープア-カバを中心に構築してきた地球環境データベースシステムに対し、階層構造ファイルシステムを導入することにより、ファイルシステムのアクセス性能を大幅に強化することで、ATM通信による原画像の直接操作を可能とするシステムの構築を目的としている。平成7年度は,高速通信回線からのアクセスを可能とするとともに、テンポラルデータアクセス並びに、動画転送機構を有する階層構造ファイルシステムの設計として,高速通信回線からアクセスに対して耐え得る十分高性能なファイルシステムの検討を行い、また,ATM通信回線からのアクセスを支援する階層化通信プロトコルの設計として,ATM通信回線に対するATMスイッチを導入すると共に、高効率通信ドライバを作成し、階層化通信プロトコルを設計することにより、その有効性を明らかにした.また階層構造ファイルシステムと階層化通信プロトコルの整合性について検討を行なった.さらに,実際にATM通信回線を通して単純な大規模データのアクセス実験を開始した。平成8年度は,平成7年度から引続きATM通信回線を通して単純な大規模データのアクセス実験を行ない、大規模データのバルク転送時におけるデータ転送レートなどの基本データを得た。さらに、得られた情報を基に効率のよいデータ転送のためのATM高効率通信ドライバの改良を試み、複数のアクセスポイントからATMを通じて試作中の階層ファイルシステムへのアクセス実験を行った。また、階層ファイルシステム実装の一貫として、構築された階層ファイルシステムおよびその上で構築されている衛星画像データベースシステムの特性をいかし、高速通信回線上でのユーザが容易にデータベースシステムへのアクセス、とりわけ大規模画像の類似検索を可能とするユーザインタフェースの検討と開発を行い、ユーザが容易かつ迅速に必要な画像を得ることを可能とした。以上より、来るべき高速通信時代に備え、高速通信回線によるアクセスを可能とし、大規模画像データの問合せ・取得の即時処理を実現する地球環境衛星画像データベースを試験的に構築し、高速通信回線を用いた超大規模画像データベースの実用化に必要な情報を得るとともに、その可能性と有効性を明らかにした。本研究では従来本研究者らがクイックルック画像(原画像を間引いて縮小化した画像)の支援を目的として8mmテープア-カバを中心に構築してきた地球環境データベースシステムに対し、階層構造ファイルシステムを導入することにより、ファイルシステムのアクセス性能を大幅に強化することで、ATM通信による原画像の直接操作を可能とする。即ち、来るべき高速通信時代に備え、高速通信回線によるアクセスを可能とし、大規模画像データの問合せ・取得の即時処理を実現する地球環境衛星画像データベースを試験的に構築し、高速通信回線を用いた超大規模画像データベースの実用化へ向けて、その可能性と有効性を明らかにすることを目的とする。本年度は,高速通信回線からのアクセスを可能とするとともに、テンポラルデータアクセス並びに、動画転送機構を有する階層構造ファイルシステムの設計として,高速通信回路からアクセスに対して耐え得る十分高性能なファイルシステムの検討を行なった.とりわけ、ディスクアレイを用い、高いスループットを実現するファイルマイグレーションアルゴリズムを確立するために,テンポラルデータアクセスを可能とする時系列アクセスに適したファイル編成法ならびにアクセスメソッドの検討をした.さらに,ATM通信回線からのアクセスを支援する階層化通信プロトコルの設計として,ATM通信回線に対するATMスイッチを導入すると共に、高効率通信ドライバを作成し、階層化通信プロトコルを設計することにより、その有効性を明らかにした.また階層構造ファイルシステムと階層化通信プロトコルの整合性について検討を行なった.また,実際にATM通信回線を通して単純な大規模データのアクセスを行なうことにより,大規模データのバルク転送時におけるデータ転送レートなどの基本データを得ることにより,設計しているファイル方式へのフィードバックを行ないつつある.

本研究では従来本研究者らがクイックルック画像(原画像を間引いて縮小化した画像)の支援を目的として8mmテープア-カバを中心に構築してきた地球環境データベースシステムに対し、階層構造ファイルシステムを導入することにより、ファイルシステムのアクセス性能を大幅に強化することで、ATM通信による原画像の直接操作を可能とする。即ち、来るべき高速通信時代に備え、高速通信回線によるアクセスを可能とし、大規模画像データの問合せ・取得の即時処理を実現する地球環境衛星画像データベースを試験的に構築し、高速通信回線を用いた超大規模画像データベースの実用化へ向けて、その可能性と有効性を明らかにすることを目的とする。本年度は,まず、高速通信回線からのアクセスを可能とする階層構造ファイルシステムの実装のためのパラメタを具体化するために、昨年度から引続き実際にATM通信回線を通して単純な大規模データのアクセスを行なうことにより,大規模データのバルク転送時におけるデータ転送レートなどの基本データを得た。さらに、得られた情報を基に効率のよいデータ転送のためのATM高効率通信ドライバの改良を試み、複数のアクセスポイントからATMを通じて試作中の階層ファイルシステムへのアクセス実験を行った。とりわけ、ディスクアレイを用い、高いスループットを実現するファイルマイグレーションアルゴリズムを確立することで,テンポラルデータアクセスを可能とする時系列アクセスに適したファイル編成法を確率することで性能向上が得られることを確認した。また、階層ファイルシステム実装の一貫として、構築された階層ファイルシステムおよびその上で構築されている衛星画像データベースシステムの特性をいかし、高速通信回線上でのユーザが容易にデータベースシステムへのアクセス、とりわけ大規模画像の検索と取り込みを可能とするユーザインタフェースの検討と開発を行った。その結果、あらかじめユーザが必要な選択項目を設定し衛星画像への類似検索を行う一方、高速回線通信の特性を活かし、クイックルック画像などの加工された処理結果を同時に転送することで、不必要な原画像データの転送を避けるとともに、ユーザが容易かつ迅速に必要な画像を得ることを可能とした。
新しいワクチン開発を目指した口腔真菌感染症の免疫制御機構の解明

Candida albicans(C. albicans)は健常なヒトに常在する代表的な真菌だが高齢者やAIDSなどの易感染性宿主においては、再発する難治性の口腔カンジダ症を引き起こす。口腔カンジダ症の治療は抗真菌薬が主体だが、薬の数は非常に限られており、薬剤耐性菌の問題もあり効果的な治療成果をあげる事が難しい現状にある。申請者はこのC. albicansに対する防御免疫の中核を担うヘルパーT細胞であるTh17細胞に着目し、C. albicansに対しTh17細胞分化を担う抗原を特定・利用する事でTh17細胞の病体制御機構の解析を行い、新しい治療・予防法の基盤の確率を目指している。Candida albicans(C. albicans )は通常はヒトに常在する害のない真菌であるが、高齢者や後天性免疫不全症候群の患者など易感染性の宿主においては口腔領域で口腔カンジダ症を引き起こす。これに対し、C. albicansに対する防御を担う細胞としてヘルパーT細胞の一種であるTh17細胞がよく知られている。しかし上皮のバリアを破り体内に侵入してきたC. albicansをどのようにして生態が感知、Th17細胞を分化誘導しているのかは未だ不明である。研究代表者がこれまでの研究の成果で得た、Th17細胞を強く誘導し、口腔カンジダ症を抑制するC. albicans菌糸形膜画分由来のタンパク質を、高速液体クロマトグラフィー(HPLC)を利用し更に何種類かの画分に分け、野生型マウス抹消リンパ節より分離したT細胞と、骨髄由来樹状細胞と共培養することで、そのTh17細胞分化誘導能を評価して有用なタンパク質が含まれているかを調査した。この結果から、強いTh17細胞分化能を示した画分を2次元ゲル電気泳動を用いて他の画分と比較し、他の画分に見られない特徴的なドットをプロテオミクス解析にかけた。Candida albicansゲノムデータベースと照合することにより、このドットよりMSスコアが他の画分より高い何種類かの候補タンパク質を絞り込むことが出来た。菌体そのものからのタンパク質の精製は非常に困難であったため、ゲノムデータベースから候補タンパク質のcDNAライブラリーを構築し、一部のタンパク質は大腸菌発現系を利用してタンパク精製まで行った。当該年度に予定していた研究項目について以下の点が明らかになった。1)HPLCにて更に分画されたCandida albicans(C. albicans)菌糸形細胞膜タンパク質のTh17細胞分化誘導能に関して検討し、有力なフラクションに関して、二次元ゲル電気泳動を用いて更に解析し、Candidaゲノムデータベースに照合する事で候補タンパク質の絞り込みを行った。2)一部の候補タンパク質の抽出を行った。C. albicans菌体そのものからの候補タンパク質の精製が非常に困難であったため、計画書でも予定していた大腸菌を利用したタンパク精製方法へと計画を修正した。C. albicans候補タンパク質の精製を完了させる。大腸菌からの発現・精製が困難であった場合は、他の酵母や蚕などを利用したタンパク質精製方法を利用する。各タンパク質の野生型マウス由来ナイーブT細胞及び樹状細胞との共培養の系を利用したTh17細胞分化誘導能の評価および口腔カンジダ症病態モデルマウスを利用した病態抑制効果について評価し、Th17細胞への分化誘導の要因となるタンパク質の絞り込みを行う。タンパク質が決定した後は、抗原をペプチドまで絞るためにオーバーラッピングペプチドを作成し、上記と同様のTh17細胞分化誘導能と、病態抑制効果を評価する予定である。また、C. albicansは常在真菌であるため、普段は生態においては排除されず、寛容の状態で常在しているためその寛容を管理する制御性T細胞に関しても調査を行う予定である。

この結果から、強いTh17細胞分化能を示した画分を2次元ゲル電気泳動を用いて他の画分と比較し、他の画分に見られない特徴的なドットをプロテオミクス解析にかけた。Candida albicansゲノムデータベースと照合することにより、このドットよりMSスコアが他の画分より高い何種類かの候補タンパク質を絞り込むことが出来た。菌体そのものからのタンパク質の精製は非常に困難であったため、ゲノムデータベースから候補タンパク質のcDNAライブラリーを構築し、一部のタンパク質は大腸菌発現系を利用してタンパク精製まで行った。当該年度に予定していた研究項目について以下の点が明らかになった。1)HPLCにて更に分画されたCandida albicans(C. albicans)菌糸形細胞膜タンパク質のTh17細胞分化誘導能に関して検討し、有力なフラクションに関して、二次元ゲル電気泳動を用いて更に解析し、Candidaゲノムデータベースに照合する事で候補タンパク質の絞り込みを行った。2)一部の候補タンパク質の抽出を行った。C. albicans菌体そのものからの候補タンパク質の精製が非常に困難であったため、計画書でも予定していた大腸菌を利用したタンパク精製方法へと計画を修正した。C. albicans候補タンパク質の精製を完了させる。大腸菌からの発現・精製が困難であった場合は、他の酵母や蚕などを利用したタンパク質精製方法を利用する。各タンパク質の野生型マウス由来ナイーブT細胞及び樹状細胞との共培養の系を利用したTh17細胞分化誘導能の評価および口腔カンジダ症病態モデルマウスを利用した病態抑制効果について評価し、Th17細胞への分化誘導の要因となるタンパク質の絞り込みを行う。タンパク質が決定した後は、抗原をペプチドまで絞るためにオーバーラッピングペプチドを作成し、上記と同様のTh17細胞分化誘導能と、病態抑制効果を評価する予定である。また、C. albicansは常在真菌であるため、普段は生態においては排除されず、寛容の状態で常在しているためその寛容を管理する制御性T細胞に関しても調査を行う予定である。
ガラス布平織りエポキシ樹脂積層板の小径加工穴の品質評価法の提案

1.加工穴表面性状と層間はく離の関係(1)表面粗さ計およびGFRPに対して光を透過させ、その陰ではく離を評価する本光透過法を用いて加工穴の壁面状態を評価した結果、平織り材の特徴として加工穴壁面の表面性状と層間はく離に異方性が存在すること示された。(2)さらに表面粗さと層間はく離の大きさには相関関係があることも判明した。(3)穴の小径化が進行しても、光透過法は実体顕微鏡レベルの観察で品質が評価可能であり、接触式の表面粗さ計による評価と同程度の精度で、かつ迅速に評価可能であることが示された。2.小径穴あけ時の加工現象の解明(1)加工時の切削抵抗を水晶圧電素子を利用した高感度の動力計で調べた結果、積層されているガラス材とエポキシ樹脂の切削特性の差により、切削抵抗に著しく変動成分を含むことが分かった。(2)ドリル加工条件を変化させてさらに調査した結果、ドリル加工時の送り量(ドリル一回転当たりの切削厚さ)が増大すると、その変動成分は著しく増大することが分かった。3.加工穴品質の定量化(1)光透過法を採用することにより、短時間に多数のサンプルの評価が可能となり、ガラス布の織り位置の差異による品質(層間はく離)のばらつきも定量化可能となった。(2)穴あけ時の切削抵抗の変動成分が穴品質に大きく影響していることが判明し、加工時の切削抵抗の中でも特にその変動成分の低減が品質向上に有効であることが分かった。
地域防犯をめぐる都市住民の活動・参加とネットワークの構造に関する社会学的研究

本研究では、紙地図を用いた犯罪不安調査など、地理的な観点を含むアプローチを新規に導入し、犯罪不安や防犯行動の構造と背景について、次のことを明らかにした。防犯行動は、犯罪不安の高さによって促進されることが見出された。さらに、道路や特定の空間を回避する防犯行動の背景要因は、年齢や性別により異なることが明らかになった。他方で、地域での犯罪問題の共同解決に期待する程度を示す集合的効力感は、紐帯や地域活動への参加によって規定されることが示された。近年、ボランティアによる自主防犯パトロールや子どもの登下校時の見守り活動、あるいは近所どうしの声かけ運動などを通じて、地域防犯をめぐる人々の行動変容や組織化が進展している状況が顕著であると考えられる。だが、その実態や地区別の相違の程度については、研究が不足しているといえる。従来、防犯や犯罪予防は、実際の犯罪水準の現象や将来の犯罪増加の予防という考えにとどまることが多かった。これに対して、Lab(2006、訳書)は、犯罪予防とは、実際の犯罪水準や知覚された犯罪不安を減少させるために企図された対策全てを指す、と定義している。地域防犯をめぐる問題を社会学的に捉える上で、犯罪予防とは知覚された犯罪不安を減少させるために企図された対策を含むという定義は、急速に重要な意味を持ち始めているといえる。しかしながら、市民の犯罪被害防止活動を基軸とする、近年のこうした人々の行動変容や組織化といった状況が、広義の犯罪予防との関係においてどのような布置状況にあるのかを検証した研究はほとんど皆無である。本研究では、地域住民の相互扶助(互助)にもとづくパーソナルな基盤を新たに射程に入れて、その実態や犯罪被害の防止機能との関わりを明らかにする。さらに、社会的な結びつきの強さや社会統合と犯罪予防との関係について検討を試みる。本研究は3カ年の計画であり、本年度はその1年目にあたる。本年度は、犯罪社会学や都市社会学の分野における内外の文献・資料を収集し・整理を行った。調査項目の検討などを踏まえ、首都圏において都市住民の防犯活動への参加に関する調査を実施した。現在、その分析を実施中である。これに対して、Lab (2006、訳書)は、犯罪予防とは、実際の犯罪水準や知覚された犯罪不安を減少させるために企図された対策全てを指す、と定義している。本研究は3カ年の計画であり、本年度はその2年目にあたる。本年度は住民調査等の結果を分折中である。基礎的な分析により、個人が取り結ぶ紐帯と犯罪不安との間に有意な正の関係が見られること、被害に関する情報接触などがその関係の間に介在している可能性などが示唆された。国内外の先行研究もふまえて、さらに分析と考察を深めていくこととしたい。本研究は3カ年の計画であり、本年度は3年目にあたる。昨年度までに引き続き、本年度も都市住民のネットワーク、犯罪不安、地域防犯活動に関する内外の文献(図書、論文、報告書等)ならびに新聞記事データベースによる資料、防犯パンフレット等の各種資料を収集・整理した。都市住民の日常生活において、犯罪不安は生活の質の阻害や行動制約をもたらしうる重要な問題である。本年度はとくに犯罪不安を中心に検討し、地域防犯活動ならびに個人のリスク回避行動との関わりを検討した。この検討のもとにしたのは、2009年の1月から2月にかけて郵送法で実施した、20歳から69歳までの成人を対象とする住民調査(n=1082)である。研究結果から、以下の2点が明らかになった。第一に、従来、社会思想研究の立場からの議論が想定していたのとは異なり、地域での犯罪問題の共同解決に期待する程度を示す集合的効力感は、犯罪不安ではなく、パーソナルネットワークおよびソーシャルサポートなどの紐帯や地域活動参加によって規定されることが明らかになった。

一方、人々の犯罪不安は、大人による自分自身や家族のためのリスク回避行動に結びつく可能性が示唆された。これらの研究成果を、日本都市社会学会および日本犯罪社会学会において報告した。
臨床応用に向けた温熱療法と分子標的薬の併用療法の開発

今回我々は、安全性が高くかつより高い抗腫瘍効果が得られる治療法の開発を目的に、分子標的薬に温熱療法を加えることにより標的分子の発現誘導と腫瘍抑制に対する相乗効果、さらに早期の臨床応用を目指し、トランスレーショナル研究を行った。具体的な研究成果は、Tunnel assayを用いたアポトーシスの検討で、温熱療法とIL13-PEの併用群において、HSC-3、SCC-25の両細胞株でアポトーシスを誘導している細胞がコントロール群と比較して有意に多いことが観察された。またマウスを用いたin vivoでの実験においては、併用療法による抗腫瘍効果が観察された。本研究ではすでに臨床応用されている温熱療法を用いる事で標的分子の誘導を行うことから、より安全性が高く、臨床応用への可能性はより高いと思われる。また、温熱療法自身にも抗腫瘍効果があり分子標的薬と併用することで相乗効果も期待できる。さらに本研究により、温熱効果で誘導される新たな標的分子の候補をスクリーニングすることも可能で、将来的な研究の発展を望むことができる。本研究により分子標的薬を用いた口腔癌研究の向上に大きく貢献するだけでなく、他領域の癌への応用も考えられ、学術的観点からも大変意義深いと思われる。平成26年度は、上記目的にあるトランスレーショナルな観点からin vivoを中心に実験を進めた。マウスモデルにおいて、温熱療法とIL13-PE分子標的薬併用による抗腫瘍効果が確認できた。研究の成果を、第31回ハイパーサーミア学会で発表した。またハイパーサーミア関東研究会で発表した際には、最優秀研究賞を受賞した。これまでの研究を引き続き行い、論文での研究成果を報告する。進行口腔癌に対する治療は外科的療法が主体となるが、術後の機能・審美障害など抱える問題は多く、これらを解決するためには化学療法、放射線療法、手術を主体とした従来の方法に加え、新たな治療法の開発が必要である。現在多くの領域で注目され、研究・開発が進められているものの一つに分子標的治療がある。この分子標的治療は癌細胞に特異的に発現する分子を標的とするため、副作用を最小限に抑えることが可能となる。今回の研究では、安全性が高くかつより高い抗腫瘍効果が得られる治療法の開発を目的に、分子標的薬に温熱療法を加えることにより標的分子の発現誘導と腫瘍抑制に対する相乗効果、さらに早期の臨床応用を目指し、トランスレーショナルな研究に取り組んだ。我々が標的分子として注目したInterleukin 13 Receptor Alpha 2 (IL-13Ra2)は、脳腫瘍、頭頸部癌、卵巣癌などに高発現することが報告されているが、ほとんどの正常組織には認められない。近年我々は口腔扁平上皮癌においても,IL-13Ra2が高発現していることを見出し報告した。そこで我々は、IL-13と殺細胞効果のある緑膿菌毒素Pseudomonas Exotoxin (PE)の2つのたんぱく質を遺伝子組み換え技術により1つにした分子標的薬であるIL13-PEを実験に用いた。これまでの研究で、加温により口腔癌細胞株におけるIL-13Ra2の発現レベルの上昇を認めた。そこで温熱療法にIL13-PEを用いた分子標的療法を組み合わせることにより、従来から知られている温熱療法の効果だけでなく、標的分子の発現上昇を図ることでIL13-PEに対する癌細胞の感受性を高める効果が観察された。マウスを用いたin vivoでの実験において、併用療法により抗腫瘍効果が観察された。これまでの研究から、今後の口腔癌に対して温熱療法と分子標的薬(IL13-PE)の併用療法が臨床応用に向けて期待できると考える。これまでの研究でin vitroにおいて温熱療法とIL13-PEの併用療法による、HSC-3,SCC-25の口腔扁平上皮癌細胞株を用いた細胞レベルでの抗腫瘍効果を観察した。残るin vitroの実験として、TUNEL assayを用いたアポトーシスの誘導による抗腫瘍効果のメカニズムについて研究を行い、温熱療法とIL13-PEの併用療法によって有意にアポトーシスを誘導している結果が観察された。In vitroで抗腫瘍効果が確認できたことで、マウスの皮下腫瘍モデルを用いて併用療法を実施した。マウスの大腿に腫瘍を移植し、ウォーターバスにて加温を行い、IL13-PEを腫瘍に直接投与した。経時的に腫瘍のサイズを計測し、併用療法による腫瘍抑制効果を観察することができた。腫瘍ならびに臓器を摘出して免疫組織学的に治療効果のメカニズムや副作用については現在解析中である。進行口腔癌に対する治療は外科的療法が主体となるが、術後の機能・審美障害など抱える問題は多く、新たな治療法の開発が必要とされている。分子標的薬は近年臨床応用され、高い期待を集めているが、現時点で頭頸部癌に対して承認されているものは一つのみである。その理由の一つとして有効な標的分子の欠如が挙げられる。本研究では、安全性が高くかつより高い抗腫瘍効果が得られる治療法の開発を目的に、分子標的薬に温熱療法を加えることにより標的分子の発現誘導と腫瘍抑制に対する相乗効果、さらに早期の臨床応用を目指し、トランスレーショナル研究に取り組んだ。我々が分子標的薬として注目したInterleukin 13 Receptor Alpha 2(IL-13Ra2)は、脳腫瘍、頭頸部癌、卵巣癌などに高発現することが報告されているが、ほとんどの正常組織には認められない。そ近年我々は口腔扁平上皮癌においても、IL-13Ra2が高発現していることを見出し、報告してきた。

そこで我々はIL-13と緑膿菌外毒素(PE)の2つのたんぱく質を遺伝子組み換え技術により融合させた分子標的薬であるIL13-PEを分子標的薬として用いて研究を行った。これまでの研究で、加温により癌細胞のIL-13Ra2の発現レベルが上昇を認めた。そこで、温熱療法にIL13-PEを用いた分子標的療法を組み合わせることにより、従来から知られている温熱療法の効果だけでなく、標的分子の発現上昇を図ることでIL13-PEに対する癌細胞の感受性を高める効果が観察された。マウスを用いたin vivoでの実験において、併用療法により抗腫瘍効果が観察された。これまでの研究から、今後の口腔癌に対して温熱療法と分子標的薬(IL13-PE)の併用療法が臨床応用に向けて期待できると考える。今回我々は、安全性が高くかつより高い抗腫瘍効果が得られる治療法の開発を目的に、分子標的薬に温熱療法を加えることにより標的分子の発現誘導と腫瘍抑制に対する相乗効果、さらに早期の臨床応用を目指し、トランスレーショナル研究を行った。具体的な研究成果は、Tunnel assayを用いたアポトーシスの検討で、温熱療法とIL13-PEの併用群において、HSC-3、SCC-25の両細胞株でアポトーシスを誘導している細胞がコントロール群と比較して有意に多いことが観察された。またマウスを用いたin vivoでの実験においては、併用療法による抗腫瘍効果が観察された。我々はこれまでに、「温熱療法と分子標的薬の併用療法の開発」(若手研究B,平成2425年度)の研究テーマでin vitroにおいて、その抗腫瘍効果を報告してきた。今回の研究の目的は、少しでも早く温熱療法と分子標的薬の併用療法を臨床応用するため、in vivoマウス腫瘍移植モデルを中心に標的分子の発現誘導と腫瘍抑制に対する相乗効果を検討することである。これまでの到達度としては、予定をしていたin vivoの実験を開始し温熱療法と分子標的薬の併用療法によって、抗腫瘍効果を確認できた。実際に施行したin vivo実験は2回で、1回目に至適条件を検討し、それを軸に2回目に治療モデルとして皮下腫瘍の増殖を各グループごとで比較検討した。またそれぞれの群のマウスから、腫瘍および臓器を採取し、組織切片ならびにRNA抽出のための準備を行った。これまでの研究成果を、現在論文投稿を目指して執筆中である。併せて、in vivoで得られたサンプルについて、副作用の有無と、抗腫瘍効果のメカニズムについて免疫組織学的、細胞生物学的に検討を行う。今回の研究を臨床応用に向けて考えた場合に、何が必要か、どんな工夫が必要かを検討する。口腔癌今回の研究目的であるin vivoマウスモデルによる抗腫瘍効果の検討から、さらにそのメカニズムについても解明する必要がある。今後の推進方策については、(1)確固たるin vivoでの抗腫瘍効果の確認のため、現在1回のみ行ったマウスモデル実験を、もう一度リピートし同様の効果が得られるかを確認する。(2)マウスの治療モデルから採取した資料(腫瘍や臓器の切片、RNA)について解析し、治療による副作用の有無ならびに、抗腫瘍効果のメカニズムについて検討する。
土壌環境条件から根毛形態制御に至るシグナル伝達機構

PIP5K3は、シロイヌナズナにおいてホスファチジルイノシトール-4,5-ニリン酸を生成する酵素であるホスファチジルイノシトール4リン酸5キナーゼ(PIP5K)をコードする遺伝子の一つである。これまでの研究の結果、PIP5K3は根毛の伸長を正に制御することが判明している。今回、根における転写レベルでの発現が確認されたPIP5K2およびPIP5K4についても根毛伸長への関わりが解析された。まず、それらの遺伝子のプロモーター活性をGUSレポーター遺伝子により組織化学的に調べた結果、PIP5K4のプロモーターはPIP5K3のプロモーターと同様に根毛細胞列に選択的な活性が見られた。また、PIP5K2のプロモーターは根の表皮細胞で一様な弱い活性を示した。つぎにそれぞれのT-DNA挿入変異体を用い、根毛伸長についての遺伝学的な解析を行った。その結果、pip5k2、pip5k4ともに野生型株に比べて有意に根毛が短い表現型を示した。さらに、pip5k2pip5k3およびpip5k3pip5k4二重変異体ではpip5k3よりも激しい根毛伸長の抑制が見られた。このことはPIP5K2、PIP5K3およびPIP5K4が根毛伸長において重複的な機能を有することを示している。PLDζ2は、シロイヌナズナにおいてホスファチジン酸を生成する酵素であるボスホリパーゼD(PLD)をコードする遺伝子の一つであり、リン酸欠乏およびオーキシン処理によって転写レベルで発現の促進を受ける。PLDζ2の新たな生物学的機能を調べるために、PLDζ2プロモーターの詳しい組織化学的解析を行なった。その結果、通常生育条件下での根における主な発現組織は側方根冠細胞であること、その発現は乾燥処理、およびABAの添加により上昇することが明らかとなった。つぎに根冠における遺伝子機能の解析を行なった結果、変異体では重力屈性に対するABAの抑制効果が失われること、および根の水分屈性応答が遅延することが明らかになった。これらのことから、根端における乾燥ストレスがABAを介して根冠におけるPLDζ2の発現を上昇させ、その遺伝子機能として、重力屈性応答を抑制するとともに水分屈性応答を促進することが示唆された。PLDζ2遺伝子はリン酸欠乏条件下において転写レベルで著しい活性化を受ける。PLDζ2の生物学的機能を調べるために、その詳しい発現解析を行った。その結果、PLDζ2は通常の生育条件下においてラテラルルートキャップ細胞で強く発現することが判明した。ラテラルルートキャップ細胞は、根の重力屈性応答においてルートキャップで偏って分配されたオーキシンを細胞神長領域の表皮細胞へと輸送する径路となることが知られている。また、pldζ2変異体では根の重力屈性が弱まることが報告されているこのことから、PLDζ2がラテラルルートキャップ細胞においてオーキシンの極性輸送を促進することが強く示唆された。このPLDζ2のラテラルルートキャップ細胞での発現はABAによって促進された。このことはPLDζ2が根の水分屈性応答にも関わることを示唆している。これを支持するものとして、予備的な実験においてpldζ2変異体の根の水分屈性応答は野生型に較べて弱いことが明らかとなった。phrlが変異体においてはPLDζ2のリン酸欠乏条件下における発現上昇が弱められる。また、PLDζ2のプロモーターにはPHR1結合配列が複数存在することから、その転写活性化にPHR1が直接関わることが考えられた。そこで、PLDζ2プロモーター中のPHR1結合配列の全に塩基置換を施した変異プロモーターを作成し、その活性を調べたところ、リン酸欠乏に対する応答性が完全に消失していた。これらのことは、PLDζ2プロモーターのリン酸欠乏応答はPHR1結合配列を認識する複数のPHR1ファミリー転写因子を介していることを示している。さらに、この変異プロモーターではオーキシンに対する応答性も著しく弱められていたことから、PHR1ファミリー転写因子がオーキシンのシグナル伝達径路下流にも位置することが示唆された。

このことはPIP5K2、PIP5K3およびPIP5K4が根毛伸長において重複的な機能を有することを示している。PLDζ2は、シロイヌナズナにおいてホスファチジン酸を生成する酵素であるボスホリパーゼD(PLD)をコードする遺伝子の一つであり、リン酸欠乏およびオーキシン処理によって転写レベルで発現の促進を受ける。PLDζ2の新たな生物学的機能を調べるために、PLDζ2プロモーターの詳しい組織化学的解析を行なった。その結果、通常生育条件下での根における主な発現組織は側方根冠細胞であること、その発現は乾燥処理、およびABAの添加により上昇することが明らかとなった。つぎに根冠における遺伝子機能の解析を行なった結果、変異体では重力屈性に対するABAの抑制効果が失われること、および根の水分屈性応答が遅延することが明らかになった。これらのことから、根端における乾燥ストレスがABAを介して根冠におけるPLDζ2の発現を上昇させ、その遺伝子機能として、重力屈性応答を抑制するとともに水分屈性応答を促進することが示唆された。
特異的前駆細胞移植による肺再生法の構築

本研究では、特に肺の組織にのみに分化する肺の前駆細胞を安定的に調製する方法に関して研究を行った。肺の前駆細胞を作製するために使用する転写因子群ついては、発生期の肺の組織サンプルで特異的に発現する転写因子群をマイクロアレイ解析とバイオインフォマティクス解析により絞り込むとともに、既に論文等で報告されている重要転写因子を候補因子利用した。これらの候補因子を混合してレトロウイルス法でマウス線維芽細胞に遺伝子導入したところ、肺前駆細胞マーカーの発現の上昇が確認された。現在さらに、肺前駆細胞マーカーの発現を指標に因子の絞り込みを行っており、その性状の解析を進めている。分化した細胞から多分化能を持つ未分化ES細胞様の細胞(iPS細胞)を作成することが可能になったが、実際にはこのような方法で作成したiPS細胞を元にしても、未だ分化のしくみが十分解明されていない多くの分化段階を慎重にコントロールしながら目的細胞を作成するのは容易ではない。特定の細胞についてあたかも初期胚から成体までの発生段階を試験管内で再現するかのように、多段階の分化制御を完全にコントロールし定量的な分化細胞を作成するのは現状では困難な作業であり、リーズナブルなコストと十分な完成度で実用化するには非常に多くの技術的課題を解決せねばならない。我々は、目的組織にのみに分化する組織細胞を成体体細胞から直接作成する分化転換方法を開発する方法を開発することで、上記の問題点を解決すべく研究を開始した。本研究では、特に、肺を構成する細胞を作成する方法を開発することを目的にしている。まず最初に、マウスの肺及び食道、消化管組織からRNAを抽出し、肺特異的に発現する遺伝子群をマイクロアレイ解析により同定した。その中で、特に特異性が高く十分な発現量のある因子や文献上関与が示唆されている因子20個についてウイルスベクターにクローニングした。現在、繊維芽細胞にこれらのウイルスを感染させ、肺関連細胞へと分化するか解析作業を開始している。また、ES細胞からの分化も並行して行うため、先行論文に基づき、ES細胞から内胚葉細胞を分化させ、その後、先方内胚葉細胞、さらにその先の肺方向への細胞分化条件の検討中である。本研究では、肺前駆細胞を調製するための必要因子群を同定し、作成した肺前駆細胞の安定培養条件を探索する検討を進めている。マウスの肺及び食道、消化管組織からRNAを抽出し、肺特異的に発現する遺伝子群をマイクロアレイ解析により同定し、その中で、特に特異性が高く十分な発現量のある因子や文献上関与が示唆されている因子13個について繊維芽細胞にウイルスを感染させ、肺関連細胞へと分化するか検討したところ、複数の肺前駆細胞特異的遺伝子発現が確認され、これらの因子の中に有望な因子が存在していることが示唆された。さらにそれらの中から必須因子を取捨選択を進めており、現在数個の因子まで絞り込んでも肺前駆細胞を作製できることを確認している。現在これらの分化能の検証を進めているところである。本研究では、肺を構成する細胞を作製する方法を開発する。まず肺特異的に発現する遺伝子群をマイクロアレイ解析により同定し、特に特異性が高く十分な発現量のある因子や文献上関与が示唆されている因子14個を用いて、繊維芽細胞にこれらのウイルスを感染させた。肺前駆細胞のマーカーであるNkx2.1の発現を指標に解析を行ったところ、4つの転写因子を導入することにより、Nkx2.1陽性の細胞が出現する条件が確認できた。現在、この細胞の機能性について確認中である。一方、ES細胞からの肺細胞分化も行うため、先行論文に基づき、ES細胞から内胚葉細胞を分化させ、その後、先方内胚葉細胞、さらにその先の肺方向への細胞分化条件の検討した。12種類の細胞増殖因子を様々な濃度で処理することにより、肺胞上皮I型細胞、II型細胞、繊毛細胞、粘液分泌細胞、基底細胞、クララ細胞などの分化特異性を検討した。その結果、BMP4がマウスES細胞をin vitroで肺細胞へ分化させる場合に極めて重要な抑制因子であることが明らかとなった。BMPの阻害剤であるnogginは、肺前駆細胞で発現するNkx2.1の発現を上昇させた。また、アクチビンは中胚葉と内胚葉マーカー遺伝子の発現上昇と共にNkx2.1の発現を上昇させる活性を示した。nodalはより特異的な影響を示し、中胚葉マーカー遺伝子の発現上昇を伴うことなく内胚葉マーカー遺伝子の発現上昇とNkx2.1の発現を上昇させた。高濃度のFGF1またはFGF2で処理しても、Nkx2.1の発現を上昇させることができた。一方、成熟肺細胞については、BMP4は、濃度依存的に肺細胞の分化を制御していることが示された。本結果をまとめ、論文で誌上発表した。複合新領域当初の研究計画の転写因子候補