hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
メトホルミンによるインスリン抵抗性誘導ヘパトカインLECT2の発現抑制機構の解明

2発現抑制について、前年度はマウス初代培養肝細胞を用いてAMPKまたはPKAのノックダウン実験を行ったが、ノックダウン効率が安定せず結果の再現性を得ることが難しかった。そこで本年度はマウス培養肝細胞AML12細胞を用いてノックダウン実験を行った。その結果、AMPKノックダウンでのみメトホルミンによるLect2遺伝子発現抑制が消失した。この結果は、メトホルミンはAMPK依存的にLect2遺伝子発現を抑制することを示唆する。前年度までにヒトLect2遺伝子上流4.2kbの範囲にメトホルミン応答領域が損じしないことを確認している。今回は、ゲノムデータベースサーチにより発見した予想転写結合領域をリッチに含Lect2遺伝子上流約15kbの領域を、ルシフェラーゼレポーターベクターにクローニングし、メトホルミンに対する応答性を検討した。その結果、この領域はメトホルミン処置によってむしろ転写活性が亢進した。これまでにLect2はWnt/βカテニンシグナルによって遺伝子発現が正に制御されることが知られている。またメトホルミンはβカテニンを負に制御することが知られている。そこでメトホルミンによるLect2遺伝子発現抑制にWnt/βカテニンシグナルが関与するかどうか検討した。その結果、既報の通りWntタンパクはLect2遺伝子発現を亢進したが、メトホルミンの作用を解除できなかった。このことはメトホルミンによるLECT2遺伝子発現抑制はWnt/βカテニンシグナルとは独立していることを示唆する。本研究期間を通じて、メトホルミンがAMPKを介してLect2遺伝子発現を抑制することを示したが、より詳細な制御機構の解明にはさらなる検討を要する。Leukocyte cell-derived chemotaxin 2(LECT2)は肥満に伴って産生が増大し、骨格筋においてインスリン抵抗性を惹起するヘパトカインである。LECT2の産生を抑制することはインスリン抵抗性治療の新規標的となる可能性がある。本研究は、培養肝細胞において血糖降下薬メトホルミンがLect2遺伝子発現ならびにLect2タンパク分泌を抑制すること、その機序にはAMPKの活性化を介していることを明らかにした。また、メトホルミンはLECT2遺伝子プロモーター活性に影響を及ぼさなかったことから、mRNAの不安定化などその他の制御機構が存在すると考えられた。本年度に行った初代培養肝細胞を用いたin vitro実験を推進する。具体的には、PKA siRNAがメトホルミンの作用を解除しうるかどうか検討する。またsiRNAの他にAMPK、PKAの阻害薬がメトホルミンの作用を解除しうるか検討する。
確率ネットワークモデルに基づく高次情報バイオマーカー探索多変量統計手法の開発

平成22年度において、以下の2点の研究成果を得た。[1]がんの多様性を明らかとするため、2群教師有り判別の枠組みにおいて再発の有無や抗がん剤に対する感受性の高低、特定の遺伝子におけるゲノムの変異の有無などの表現型を高い精度で予測する遺伝子セットを探索する研究は数多く行われている。しかしながら、選ばれた遺伝子セットは生物学的に解釈できるものは稀であり、高い予測能力を得るものの次の生物学的解析に繋がるものが決して多くはなかった。そこで、がんの多様性を特徴付ける遺伝子パスウェイを同定するための統計的手法を提案した。マイクロアレイ遺伝子発現データに基づき各遺伝子パスウェイの活性度を導き、得られたパスウェイ活性度を用いたロジスティック判別モデルを構築した。パラメータ推定には、不必要な活性度を自動的に取り除くよう、Elastic Net型正則化法を用いた。提案手法をエストロゲン受容体の高発現由来からなる乳がん患者の判別問題に適用し、関連する遺伝子パスウェイの同定を行った。[2]ヒトの細胞内にある2万以上の遺伝子は、それぞれが独立に働いているのではなく、外部からの刺激などに対して適切に対応するため、必要なとき必要なだけタンパク質を生合成できるようお互いに情報を伝達するネットワークを形成している。ほとんど全ての遺伝子は、このネットワークの関係において働きが制御されていると考えられる。しかしながら、例えば、薬の投与などの外的な刺激を与えたとき、その影響を直接に近い形で受ける遺伝子の働きはネットワーク上で伝播される遺伝子間の働きからは大きく逸脱し、特にネットワーク上においてその上流の遺伝子の挙動とは独立な動きをすることが想定される。この特徴をグラフィカルモデルにおいて捉え、外的刺激を受ける遺伝子を外生変数として非正規性を鍵に探索する方法を開発した。など、昨年度まで集中的に研究を進めていたベイジアンネットワークの構造推定については、ベイジアンネットワークの国際会議(The First International Conference on Advned Methods in Bayesian Networks)において招待講演を行い、その成果をまとめて発表した。平成20年度においては,次の2つの成果を得た:(1)ゲノムレベルでの薬剤作用機序を明らかにするためには,通常,薬剤応答のマイクロアレイデータを計測し,薬剤を投与していないコントロールのデータと比較してどのような遺伝子が有意に発現を変化させているかを調べる.このとき,薬剤の影響は遺伝子のパスウェイを通して伝播するため,どのようなパスウェイが薬剤から影響を受けているのかを明らかにすることが求められてる.この目的のため,統計的グラフィカルモデルの一つであるベイジアンネットワークを用いてマイクロアレイデータを解析し,薬剤に影響を受けた遺伝子のパスウェイをあきらかにする研究が行われている.しかしながら,ベイジアンネットワークの学習はNP困難であるため最適解が求まらず,発見的方法により学習したモデルではその制度にもんだが残っていた.そこで,ベイジアンネットワークの上位構造が与えられたときに最適解を探索できるアルゴリズムを提案した.また,統計的仮説検定に基づき上位構造を推定した場合でも提案したアルゴリズムは他の発見的アルゴリズムよりも優れた性能を示すことを数値実験により確かめた.(2)ある薬剤を投与して遺伝子発現の時系列変化を計測したとき,どの遺伝子が直接薬剤から影響を受けていたのかを検出することは,薬剤非投与のコントロールデータとの単なる比較では不可能である.この問題に対して,薬剤による遺伝子ネットワークの構造変化という観点からアプローチし,状態空間モデルに基づく検出手法を確立した.この方法をヒト上皮肺細胞にイレッサを投与した時系列マイクロアレイデータに適用し,イレッサに直接影響を受ける遺伝子の同定を行った.その結果,遺伝子が受けている影響がイレッサから直接もたらされたものなのか,それとも,遺伝子のパスウェイを介して間接的に伝播されてきたものなのかを区別することが初めて可能となった.平成21年度は以下の2つの成果を得た。[1]タンパク質間相互作用によるネットワークと、遺伝子発現データから推定したトランスクリプトームのネットワークを組み合わせ、薬剤が影響を及ぼしているリガンドー受容体から薬効に関与する重要遺伝子までのパスウェイを探索するための統計学的手法を開発した。その基本的なアイデアは、まず、薬剤投与し計測したマイクロアレイ時系列データから、薬剤影響パスウェイをダイナミックベイジアンネットワークを用いて推定する。次に、推定された遺伝子ネットワークから、ハブ遺伝子など、キーになっている遺伝子を同定し、そこにリガンドから受容体を介し4ステップ以内で繋がるタンパク質乾燥後作用によるパスウェイを枚挙する。枚挙されてたパスウェイがアクティブになっているか否かをマイクロアレイデータを用いて、各遺伝子の薬剤投与の発現状態をコントロールデータと比較し検定し、それらをメタアナリシスで統合し、パスウェイのアクティビティとする。その結果、100万以上の候補パスウェイから、23個のアクティブパスウェイを同定した。[2]高脂血症薬フェノフィブラートは、PPARalphaをターゲットにしていることが知られているが、そのオフターゲットの影響も大きいと言われている。そこで、フェノフィブラートにより誘導されると推定された遺伝子ネットワークの情報と、PPARalphaをノックダウンして計測したマイクロアレイデータを用いて、フェノフィブラートのオフターゲットを同定した。その結果、フェノフィブラートから影響を受ける遺伝子群の約半数はPPARalphaを介した影響であるが、残りはPPARalphaを介さない独立の影響であることを示した。また、オフターゲットの多くを制御している遺伝子GDF15をネットワーク情報から同定した。このGDF15をノックダウンすると、フェノフィブラートと似た影響が細胞に出ることが知られており、ネットワークに基づく薬剤標的遺伝子同定という戦略の将来性を示すことができた。

[1]がんの多様性を明らかとするため、2群教師有り判別の枠組みにおいて再発の有無や抗がん剤に対する感受性の高低、特定の遺伝子におけるゲノムの変異の有無などの表現型を高い精度で予測する遺伝子セットを探索する研究は数多く行われている。しかしながら、選ばれた遺伝子セットは生物学的に解釈できるものは稀であり、高い予測能力を得るものの次の生物学的解析に繋がるものが決して多くはなかった。そこで、がんの多様性を特徴付ける遺伝子パスウェイを同定するための統計的手法を提案した。マイクロアレイ遺伝子発現データに基づき各遺伝子パスウェイの活性度を導き、得られたパスウェイ活性度を用いたロジスティック判別モデルを構築した。パラメータ推定には、不必要な活性度を自動的に取り除くよう、Elastic Net型正則化法を用いた。提案手法をエストロゲン受容体の高発現由来からなる乳がん患者の判別問題に適用し、関連する遺伝子パスウェイの同定を行った。[2]ヒトの細胞内にある2万以上の遺伝子は、それぞれが独立に働いているのではなく、外部からの刺激などに対して適切に対応するため、必要なとき必要なだけタンパク質を生合成できるようお互いに情報を伝達するネットワークを形成している。ほとんど全ての遺伝子は、このネットワークの関係において働きが制御されていると考えられる。しかしながら、例えば、薬の投与などの外的な刺激を与えたとき、その影響を直接に近い形で受ける遺伝子の働きはネットワーク上で伝播される遺伝子間の働きからは大きく逸脱し、特にネットワーク上においてその上流の遺伝子の挙動とは独立な動きをすることが想定される。この特徴をグラフィカルモデルにおいて捉え、外的刺激を受ける遺伝子を外生変数として非正規性を鍵に探索する方法を開発した。など、昨年度まで集中的に研究を進めていたベイジアンネットワークの構造推定については、ベイジアンネットワークの国際会議(The First International Conference on Advned Methods in Bayesian Networks)において招待講演を行い、その成果をまとめて発表した。
自閉症児における自己表現支援のためのデジタルテキストの開発とその評価

本研究の目的は、自閉症児における自己思考の表現を支援するためのデジタルテキストを開発することであった。そこでまず、特別支援教育に携わる現場教師3名により、対象生徒5名の興味・関心について、日々の授業を通してアセスメントした。次に、ここで得られた情報に基づいて、デジタルテキストで使用するテーマを協議した。協議の結果、生徒が実際に活動を行った単元・題材(宿泊学習、運動会、学校祭...など)10項目を本デジタルテキストのテーマとして選択した。続いてこれらのテーマに関連する写真やイラストを収集し、その中から各テーマ毎に5種類の素材を選択した。各素材を、Micro-soft社:power-pointによって編集し、1テーマにつき写真(イラスト)5枚、計10テーマ、計50種類の教材によって、「視覚デジタルテキスト」とした。「視覚デジタルテキスト」の実施は、週1回70分間の「国語」の授業の中で行った。生徒はまず、本時のテーマを聞き、デジタルテキストを活用して自己の思考をパソコン上に打ち込むという学習設定と、同テーマのもとで手書き(或いは口頭)表現するという学習を設定し、それぞれの学習設定における表現語彙数の比較によって、「視覚デジタルテキスト」の学習効果を評価した。結果、5名中4名の生徒に「視覚デジタルテキスト」を活用した場合の方が表現語彙数が増加するという結果が得られた。中でもA児は、1テーマにつき、手書き・口頭による表現語彙数が、最小1語最大5語であったのに対し、デジタルテキスト活用の場合には、最小5語最大15語という増加が見られた。他の生徒も同様に、1語7語の増加が見られた。また彼らに共通した学習態度として、「視覚デジタルテキスト」活用時の方が、学習に取り組む時間が長く、教材に向かう集中度も高いという姿が見られた。生徒にとって「視覚デジタルテキスト」は、興味・関心の高い教材であるといえ、思考表現の成果のみならず、学習意欲の継続、向上にも効果があると考えられる。今後も、自己表現支援教材の一つとしての「デジタルテキスト」を開発していきたいが、本研究で取り上げた視覚素材と併用して、聴覚素材を取り入れたデジタルテキストの開発に着手する必要があると考えられた。これは、彼らの生活を見直したとき、彼らの触れる情報は、視覚素材のみならず、聴覚素材である機会が多い。自閉症児の特性にあげられる視覚優位を活用した視覚素材と、これに対する聴覚素材との両面をデジタルテキストに取り入れることによって、彼らの生活全般における自己思考表現を支援するための学習教材の充実が考えられる。
放射線化学ならびに放射線生物学的観点からの低酸素環境下での細胞致死機構の解析

大気下ならびに低酸素下でのX線誘発OHラジカルによる間接作用が細胞致死にどの程度関与しているかを、OHラジカル捕捉剤であるDMSOを用いて調べ、濃度を無限大へ外挿することで細胞致死への間接作用の寄与率を求めた。HRR修復関連遺伝子変異株である51D1細胞では、野生型であるCHO細胞やAA8細胞と同程度の間接作用による細胞致死寄与率を示したが、NHEJ修復関連遺伝子変異株であるxrs-6細胞では、野生型よりも明らかに低い間接作用による細胞致死寄与率を示すことを明らかにした。野生型培養細胞にCHOならびにV79、NHEJ修復関連遺伝子変異株にxrs6を選び、大気下ならびに低酸素下(酸素分圧: <0.24mmHg)で200kVp X線照射を行い、コロニー形成法を用いて細胞生存率を算出し、感受性の評価を行った。それに加え、放射線のOHラジカル由来の間接作用による細胞致死への寄与率をラジカル捕捉剤であるDMSOとX線防護効果の関係から数字的解析法を用いて導き出した。CHOならびにV79細胞での酸素増感比(OER)は2.8-3.0であった。DSB修復欠損細胞であるxrs6細胞のOERは2.7であった。この結果より、DSB修復機構の1つであるNHEJの有無とOERの関連性は薄いことが示唆された。また、CHO細胞の間接作用による細胞致死寄与率は77%であり、既に報告されている値とほぼ一致した。しかし、低酸素下での細胞致死寄与率は60%であり、過去の報告とは異なることが判明した。さらに、低酸素下ではDMSOによるOHラジカル捕捉効果は大気下よりも小さいことが明らかになった。これらの解釈として、本研究では実験結果を基にしたラジカル濃度を無限大まで外挿することで間接作用の寄与率を算出した。これが本研究の重要な点であり、一定濃度での寄与率よりもより正確な寄与率を算出していると考えられる。さら低酸素下における細胞毒性の少ないDMSO濃度での間接作用の寄与率は算出が難しく、本実験結果とは異なるものと考えられる。よって本研究で用いた細胞致死に対する間接作用の寄与率算出方法は、過去の報告よりもより正確な値を導き出し、特に報告例が少ない低酸素環境下での貴重な知見を与えたものと考える。現在、xrs6細胞での細胞致死に対する間接作用の寄与率の算出を行っており、ほとんど報告の無い、DSB修復欠損細胞における間接作用の影響を知り得る研究になることが期待できる。昨年度に引き続き、HR修復関連遺伝子変異株に51D1細胞を選び、大気下ならびに低酸素下(酸素分圧:<0.24mmHg)で200KvpX線照射を行い、コロニー形成法を用いて細胞生存率を算出し、感受性の評価を行さた。それに加え、NHEJ修復関連遺伝子変異株であるxrs6細胞において、放射線のOHラジカル由来の間接作用による細胞致死への寄与率をラジカル捕捉剤であるDMSOを用いて、X線防護効果の関係から数学的解析法を用いて導き出した。51D1細胞の酸素増感比(OER)は2.5±0.1であった。CHO細胞やxrs6細胞のOERは2.7-2.8であったにとから、DSB修復機構の1つであるHRが酸素による増感効果(酸素効果)と何らかの関係があることが示唆された。また、大気下でのxrs6細胞の間接作用による細胞致死寄与率は49%であり、低酸素下での細胞致死寄与率は31%であった。この値は野生型CHO細胞に比べ、ともに低い値となり、xrs6細胞のX線による細胞致死機構は直接作用が主作用であることが示された。DSB修復欠損細胞の細胞致死機構を放射線作用別に報告した例はほとんどないため、放射線生物学的に新しい知見をもたらしたと言える。また低酸素下での間接作用による細胞致死効果も明らかになり、低酸素下による細胞致死機構に間接作用の寄与が小さいことも明らかになった。現在、51D1細胞での細胞致死に対なる間接作用の寄与率の算出を行っており、ほとんど報告の無い、DSB修復欠損細胞における間接作用の影響を知り得る研究になることが期待でき、放射線の作用別による細胞致死機構とDSB修復機構の関係を明らかにすることで、放射線によって生じた致死損傷の化学的・生物学的特徴を明らかにすることを狙う。本研究の最終年度ではHR修復関連遺伝子変異株(5IDI細胞)での、大気下ならびに低酸素下(酸素分圧:<0.24mmHg)環境における200 kVp X線照射誘発OHラジカル由来の間接作用による細胞致死への寄与率をラジカル捕捉剤であるDMSOを用いて、X線防護効果の関係から数学的解析法を用いて導き出した。大気下でのxrs6細胞の間接作用による細胞致死寄与率は約80%であり、低酸素下での細胞致死寄与率は60%であった。

この値は野生型CHO細胞やAA8細胞の大気下および低酸素下での間接作用による細胞致死率とほぼ同じ割合であることがわかった(大気下では約80-90%、低酸素以下では約50%が間接作用による細胞致死)。昨年度までのデータをまとめると、野生株やHR修復関連遺伝子変異株のX線による細胞致死はOHラジカルによる間接作用が主要因であることが判明し、NHEJ修復関連遺伝子変異株では細胞致死の半分もしくはそれ以上が直接作用に因ることが明らかになった。このことはNHEJ機構がX線の直接作用誘発DSBに対する修復機構として非常に重要であることを示唆している。しかしHR機構はHR修復関連遺伝子変異株と野生株のX線による細胞致死への放射線作用がほぼ同じ割合であることから、HR機構と放射線作用の特異的な関係は無いように思える。本研究ではDSB修復欠損細胞におけるX線の間接作用・直接作用の細胞致死効果を明らかにしたことで、放射線の作用別による細胞致死機構とDSB修復機構の関係を明らかにすることができた。本研究は放射線によって生じた致死損傷の化学的・生物学的特徴の一端を明らかにし、放射線による細胞致死機構やDSB修復欠損株の放射線感受性の違いを、放射線化学ならびに放射線生物学の新たな観点から評価した、ユニークな研究である。
北関東林家の伐採行動にみる情報の伝達過程

2014年度に実施した調査結果の分析を行った。聞き取り調査の結果、普及指導事業においては、林業経営の普及は主に森林組合を通じて行われていた。森林組合は広報誌や会合を利用して情報伝達を行っており、森林経営計画については施業受託地の周辺から広げていく戦略をとっていた。組合員アンケートの結果でも、森林組合の広報誌や会合が主な情報伝達経路であることが裏づけられた。しかし、森林組合員という情報伝達の機会が多いと思われる対象にアンケート票調査を行ったにも関わらず、経営計画や補助金に関する認知度は3割程度である。一方で、情報を取得していない林家の約4割は情報を取得する手段を知らないからであり、より強い働きかけによって情報伝達が改善される可能性が示唆された。組合員アンケートの結果から木材生産行動決定の推定モデルを作成したところ、利用間伐に関しては経営計画の認知に加えて相談相手が重要であると示唆された。このことから、対人でより強い情報伝達の働きかけが可能な形態として、コンサルティングが有効な可能性を指摘した。また、林家に関する先行研究のレビューによって、林家の林業経営に影響を与える要素の整理から、林家の林業経営原理の構造的把握を行った。最も直接的に施業あるいは委託の判断に影響する要素としては、関心、自家労力、素材価格、費用が挙げられた。多くの要素は関心あるいは自家労力に影響を与える形で林業経営に影響していた。自家労力の投入量は家計生産モデルによって説明することができ、自家労力に影響を与える要因は林業とそれ以外の活動の限界効用曲線を変化させるものとして理解できた。そのほか、各要素についても相互関係について整理を行った。研究上の課題としては、多くの研究では造林補助金を林業経営の前提として捉えており、林家が補助金を利用するに至る経緯はほとんど明らかにされていないことを指摘した。27年度が最終年度であるため、記入しない。本研究の目的は、林家の持つ情報に着目し、現在政策上課題になっている伐採行動について1林家の林政情報の獲得過程及び2林家の市場情報の獲得過程の2点を解明することである。情報の伝達に関して森林組合が大きな役割を果たしていると考えられるため、森林組合の加入率の高い地域(鹿沼市旧粟野町)を中心に、今年度の調査を行った。1の課題については、栃木県庁に対して調査を行うことを予定したが、十分な調査協力を得ることができなかった。そのため、全国的な林政情報、特に造林補助金の伝達に関する調査を行った。その結果、全国的に見て、造林補助金の業務は各出先機関において1名の担当者が担っていることが多く、また多くの都道府県において情報伝達が市町村や森林組合の各自の判断にゆだねられていることが判明した。今後は、各都道府県における情報伝達の過程の違いのより詳細な分析、及びそれらの情報伝達過程を形成している条件や要因の解明を進めていくことが課題である。2の課題については、次の点が現在までに示唆されている。1、旧粟野町やその周辺における比較的大規模な林業事業体は、森林組合を含めて、特別な営業行動を行わなくても事業量を十分に確保できている。2、森林組合や素材生産業などの事業体は、一度受託した林地の境界確認を起点として周辺の林地に事業地を拡大していっている。3、林家の多くは森林や林業への関心が低く、補助金も含めて、間伐による実際の収益を、事前には把握していない。4、事業の受委託は、個人の繋がりや信頼関係の影響が非常に大きい。今後は林家側の認識についてより詳細に明らかにすることが課題である。本年度は3つの実地調査と、1つの理論的検討を行った。実地調査は県内の3箇所の環境森林事務所に対して聞き取り調査を行い、協力を得られた県内の4つ森林組合に対して聞き取り調査を行うとともに、これら3つの森林組合の管轄にある4地域の組合員へアンケート調査を行った。これに加えて、造林補助金に密接な関わりのある森林経営計画についても理論的な検討を行った。環境森林事務所に関しては、普及指導員の活動が縮小傾向にあることがわかった。そのため林家個人への普及については、高い効果が期待できる所有者や、波及効果がありそうな所有者を中心に実施されていることが分かった。一方で林業経営に関する普及は、森林組合の位置づけが非常に高いことが明らかになった。県の指導もあり、全ての組合において広報誌を発行していた。広報誌の内容は近隣の市況、決算などの組合運営に関する情報、事業報告が多かった。補助金や制度に関する周知については相対的に少なかったが、入手した広報誌が少ないことが影響していると思われた。説明会・座談会等については、3年に1回は組合員に対して直接説明していることが判明した。森林経営計画の作成過程については、全ての組合において受託地を中心に拡大する戦略を行っていた。森林経営計画制度の成立以前から同様のやりかたで事業地を確保している組合が殆どであったが、一部の組合では森林経営計画制度の成立以降、より大きな面積を団地化するように意識が変わっていた。森林組合員に対するアンケート結果は現在分析中であるが、これまでのところ、森林組合以外の情報伝達経路は非常に少ないこと、林業経営について相談できる人物がいることと、素材生産を行っていることの間には相関が見られることなどが判明している。また、森林経営計画についてはゲーム理論を用いた理論的分析を行った。

聞き取り調査の結果、普及指導事業においては、林業経営の普及は主に森林組合を通じて行われていた。森林組合は広報誌や会合を利用して情報伝達を行っており、森林経営計画については施業受託地の周辺から広げていく戦略をとっていた。組合員アンケートの結果でも、森林組合の広報誌や会合が主な情報伝達経路であることが裏づけられた。しかし、森林組合員という情報伝達の機会が多いと思われる対象にアンケート票調査を行ったにも関わらず、経営計画や補助金に関する認知度は3割程度である。一方で、情報を取得していない林家の約4割は情報を取得する手段を知らないからであり、より強い働きかけによって情報伝達が改善される可能性が示唆された。組合員アンケートの結果から木材生産行動決定の推定モデルを作成したところ、利用間伐に関しては経営計画の認知に加えて相談相手が重要であると示唆された。このことから、対人でより強い情報伝達の働きかけが可能な形態として、コンサルティングが有効な可能性を指摘した。また、林家に関する先行研究のレビューによって、林家の林業経営に影響を与える要素の整理から、林家の林業経営原理の構造的把握を行った。最も直接的に施業あるいは委託の判断に影響する要素としては、関心、自家労力、素材価格、費用が挙げられた。多くの要素は関心あるいは自家労力に影響を与える形で林業経営に影響していた。自家労力の投入量は家計生産モデルによって説明することができ、自家労力に影響を与える要因は林業とそれ以外の活動の限界効用曲線を変化させるものとして理解できた。そのほか、各要素についても相互関係について整理を行った。研究上の課題としては、多くの研究では造林補助金を林業経営の前提として捉えており、林家が補助金を利用するに至る経緯はほとんど明らかにされていないことを指摘した。当初予定していた調査客体への接触が困難であることが判明し、調査計画を若干変更した。先行研究の再検討及び、それまでに得られた聞き取り調査の結果などから、完全な代替とはならないものの、アンケート調査の項目を充実させることで当初の目的が概ね達成できると判断した。最終的に調査としては、3箇所の栃木県環境森林事務所への聞き取り、4箇所の森林組合への聞き取り、及び、4地域におけるアンケート調査が実行できた。また、現地調査を伴わない研究として、森林経営計画のゲーム理論を用いた理論的分析を行った。これらの進捗は変更後の計画通りである。聞き取り調査の結果については2014年度林業経済学会秋季大会にて口頭発表を行い、議論を深めた。アンケート調査の結果については現在、回収・集計が完了し分析中であるが、いくつか興味深い結果が出ている。森林経営計画の理論的分析については、学会誌である林業経済研究に投稿し、現在審査中である。この他、昨年度までの成果をまとめたものとして、2編の査読付論文が掲載された。27年度が最終年度であるため、記入しない。2015年度は採用期間の最終年度であるため、これまでの成果の発表に注力する予定である。まず行う作業としては、2014年度に実施した調査結果を論文として投稿する。特にアンケート結果の分析が第一に取り組むべき作業である。
Klotho老化モデルマウスにおける易発癌性の検討と担癌マウスモデルの確立

(1)マウス尾部より組織を採取し、マウスの表現型を確認し、野生型(+/+)およびヘテロ型(kl/+)を同定可能となった。実験に必要な個体確保に繁殖を行い、十分な個体が確保できる体制を確立した。(2)予備実験として、Klothoマウスに対するDiethylnitrosamine(DEN),N nitrosomethylbenzylamine(NMBA)発癌剤の効果を検討した。DEN投与にて6ヶ月後に肺癌、胃癌の発生を確認した。またNMBA投与により6ヶ月後に口唇に皮膚癌を発症したが、これは通常のマウスにおける発癌がNMBAでは12ヶ月を必要とするのに対して、発生期間が半分に短縮され、易発ガン性を示唆した。(3)以上のことから野生型(+/+)及びヘテロKlothoマウス(kl/+)に、DENおよびマウスに胃癌を発生させるMUN投与を行い、経時的にマウスを犠死させ各種臓器における発癌の有無を組織学的に確認する実験を開始した。現在16週目であり、明らかな差を認めないが、今後、時間経過とともに発ガン性の確認が出来るものと考えている。
反動トルクセンサーを用いた口唇・舌組織の緊張度および硬さデータベースの構築

矯正治療においては治療計画立案時に歯の位置を決定する際、考慮すべき因子の一つとして舌や口唇の圧力、緊張度が挙げられる。しかし、"口唇の緊張度が弱い"とか"舌の圧力が大きい"などと評価を下す際に客観的評価が行われているわけではなく、極めて主観的かつ定性的な判断が行われているのが現実であり、この点を科学的な立場から評価する必要があった。そこで本研究では種々の咬合状態を示す被験者の口唇や舌の緊張度や硬さを振動センサーやトルクセンサーにより測定してデータベースを構築し、安定した咬合状態を提供できるような臨床的に客観的な指標を確立することを目的とした。本研究より得られた結果は以下の通りである。(1)軟組織の硬度に関しては鼻とオトガイが最も硬く、頬と舌がそれに続き、口唇が最も柔らかかった。(2)男性では鼻とオトガイが同程度で最も硬く、次いで舌、頬となり、口唇が最も柔らかかった。一方、女性では鼻とオトガイが同程度で最も硬く、口唇、頬および舌は、同様の硬さを示した。男女間での軟組織硬度では一般に男性の方が軟組織の硬い傾向が認められた。(3)咬合様式の差異による違いでは全般的にcl.III群で軟組織の柔らかい傾向が認められた。(4)軟粗織の緊張度に関してはオトガイが最も低く頬、鼻、口唇が同程度で舌の緊張度が最も高かった。(5)男性では舌の緊張度が最も高く、次いで鼻、頬となり、オトガイと口唇が最も柔らかかった。一方、女性では舌の緊張度が最も高く、次いでと鼻、口唇、頬が続きオトガイが最も低かった。男女間での軟組織緊張は一般に、鼻、オトガイおよび頬で女性の方が軟組織の緊張度が低い傾向が認められたが、舌と口唇は、男性の方が緊張度の低い傾向が認められた。(6)咬合様式の違いによる緊張度の差異に関しては、全般的にcl.III群で軟組織の緊張度が低く、cl.II群で高い傾向が認められた。本システムにより軟組織の硬度と緊張度を客律的に把握することが可能となった。矯正治療においては治療計画立案時に切歯の位置を決定する際、考慮すべき因子の一つとして舌や口唇の圧力、緊張度が挙げられる。しかし、"口唇の緊張度が弱い"とか"舌の圧力が大きい"などと評価を下す際に客観的評価が行われているわけではなく、極めて主観的かつ定性的な判断が行われているのが現実であり、この点を科学的な立場から評価する必要があるものと思われる。そこで本研究では種々の咬合状態を示す被験者の口唇や舌の緊張度や硬さをセンサーにより測定してデータベースを構築し、切歯の位置を決定する際に安定した咬合状態を提供できるような臨床的に客観的な指標を確立することを目的とする。今年度は、口唇・舌の硬度を測定するためのセンサーチップとセンサーシステムを開発し、繰り返し信頼できるデータを得るための条件設定を行った。ここでは緊張を除いた際の軟組織の硬度を測定するため、センサーへ過度に軟組織を押しつけたりした場合には警報音を発するようにしたため、ある程度一定したデータを採得することができた。

また、予備実験の結果より一般に、軟組織の硬度は概ね鼻尖が一番硬く、次いでオトガイや頬部、さらに上唇や下唇と柔らかくなり、舌が最も柔らかいことがわかった。また、発声時の口唇圧と舌圧には大きな違いが認められないが、最大圧力産生時では舌の法が有意に大きい圧力を示すことがわかった。今後、被験者数を増やすとともに口唇・舌の緊張度と硬度の定量的解析、顎顔面咬合形態との関連性について調査を行い結果の臨床応用について考察したい。矯正治療においては治療計画立案時に歯の位置を決定する際、考慮すべき因子の一つとして舌や口唇の圧力、緊張度が挙げられる。しかし、"口唇の緊張度が弱い"とか"舌の圧力が大きい"などと評価を下す際に客観的評価が行われているわけではなく、極めて主観的かつ定性的な判断が行われているのが現実であり、この点を科学的な立場から評価する必要があった。そこで本研究では種々の咬合状態を示す被験者の口唇や舌の緊張度や硬さを振動センサーやトルクセンサーにより測定してデータベースを構築し、安定した咬合状態を提供できるような臨床的に客観的な指標を確立することを目的とした。本研究より得られた結果は以下の通りである。(1)軟組織の硬度に関しては鼻とオトガイが最も硬く、頬と舌がそれに続き、口唇が最も柔らかかった。(2)男性では鼻とオトガイが同程度で最も硬く、次いで舌、頬となり、口唇が最も柔らかかった。一方、女性では鼻とオトガイが同程度で最も硬く、口唇、頬および舌は、同様の硬さを示した。男女間での軟組織硬度では一般に男性の方が軟組織の硬い傾向が認められた。(3)咬合様式の差異による違いでは全般的にcl.III群で軟組織の柔らかい傾向が認められた。(4)軟組織の緊張度に関してはオトガイが最も低く頬、鼻、口唇が同程度で舌の緊張度が最も高かった。(5)男性では舌の緊張度が最も高く、次いで鼻、頬となり、オトガイと口唇が最も柔らかかった。一方、女性では舌の緊張度が最も高く、次いでと鼻、口唇、頬が続きオトガイが最も低かった。男女間での軟組織緊張は一般に、鼻、オトガイおよび頬で女性の方が軟組織の緊張度が低い傾向が認められたが、舌と口唇は、男性の方が緊張度の低い傾向が認められた。(6)咬合様式の違いによる緊張度の差異に関しては、全般的にcl.III群で軟組織の緊張度が低く、cl.II群で高い傾向が認められた。本システムにより軟組織の硬度と緊張度を客観的に把握することが可能となった。今後は、外科的矯正治療に際しての軟組織側貌予想やMFT、舌縮小術の適応や術後の効果判定などを行う際に応用出来るよう、サンプル数を増加させデータベースを完成させたい。
癌細胞uPA産生に対するサイトカインの影響

頭頸部悪性腫瘍細胞の浸潤に関与するuPA、MMPsはIL-6により影響を受けていることを明らかにした。NKO-1(高濃度G-CSF・IL-6産生細胞株:ヒト低分化上顎扁平上皮癌)、MMSI-1(ヒト低分化上顎扁平上皮癌)、NKO-3(ヒト中分化上顎扁平上皮癌)、NKO-4(ヒト高分化中咽頭扁平上皮癌)、NO-2(ヒト上顎悪性黒色腫)の細胞株をもちい以下の研究結果を得られた。1:NKO-1は他の細胞株に比べ高い浸潤能(インベージョンアッセイ)を認めた。2:いずれの細胞株において培養上清中にIL-6を添加すると浸潤能の亢進が認められた。3:NKO-1では培養上清中にG-CSFを添加すると浸潤能の亢進が認められた。4:NKO-1の培養上清中にはuPAやMMPsの活性(ELISA)を認め、IL-6を添加すると活性の亢進が認められた。G-CSF,IL-6により頭頸部悪性腫瘍細胞の浸潤能が直接影響を受けていることを明らかにした。NKO-1(高濃度G-CSF・IL-6産生細胞株:ヒト低分化上顎扁平上皮癌)、MMSI-1(ヒト低分化上顎扁平上皮癌)、NKO-3(ヒト中分化上顎扁平上皮癌)、NKO-4(ヒト高分化中咽頭扁平上皮癌)、NO-2(ヒト-1-顎悪性黒色腫)の細胞胞株をもちい,G-CSF,IL-6の上記頭頸部悪性腫瘍細胞株の浸潤能に対する効果を検討した。浸潤能は24穴BIOCOAT MATRIGEL Invasion Chamberplateをもちいてインベージョンアッセイをおこない測定した。走化因子はfibronec+in(25μg/ml)をもちいた.各細胞株の間においても浸潤能の差を認め,高濃度G-CSF・IL-6産生細胞株NKO-1にNKO-3やNKO-4に比べ有意に高い浸潤能を認めた。またいずれの細胞株においてもIL-6により浸潤能の亢進を認めた。特にMMSI-1、NKO-3、NKO-4、NO-2においてはIL-6濃度50010,000U/mlで濃度依存性に有意な浸潤能の亢進を認めたが、20,000U/mlでは逆に10,000U/mlより低い浸潤細胞数であった.一方G-CSFは有意にNKO-1の浸潤能を亢進させたが、他の細胞株には変化を認めなかった.高濃度G-CSF・IL-6産生NKO-1細胞における抗G-CSF抗体の浸潤能への影響は認めなかったが、抗IL-6抗体100μg/mlでは有意に浸潤能を低下させた.頭頸部悪性腫瘍細胞の浸潤に関与するuPA、MMPsはIL-6により影響を受けていることを明らかにした。
ヒトマスト細胞に発現するMrgX2を標的としたアレルギー免疫疾患の治療戦略

私達は、重症の慢性蕁麻疹患者の皮膚マスト細胞にGタンパク質共役型受容体に属するMas related gene X2 (MrgX2)の発現が健常者と比較して有意に増強していることを報告した。ストレスで神経細胞から分泌されるsubstance PによりMrgX2を介して皮膚マスト細胞は、ヒスタミンを遊離した。すなわちストレスによる慢性蕁麻疹の増悪の機序と考えられる。一方、MrgX2が関節滑膜マスト細胞においても発現しており、関節リウマチにおいてもsubstance Pが病態に関与していることが示唆された。[目的]関節リウマチ(RA)患者と変形性関節症(OA)患者の滑膜組織におけるマスト細胞がサブスタンスP(SP)を産生するかを検討し、滑膜マスト細胞からのSP産生の機序の解明と滑膜マスト細胞におけるSPの責任受容体を同定することを目的とした。[方法]RAとOA患者の滑膜組織より滑膜マスト細胞を分離し、その細胞を10週以上培養し、培養滑膜マスト細胞を樹立した。RAとOA患者の滑膜組織を用いて免疫組織化学染色を行い、共焦点顕微鏡で観察した。遺伝子発現は定量的RT-PCR法、タンパク質の発現はFACSやELISAで測定した。レンチウィルスベクターを用いたshRNA法によりMrgX2遺伝子発現を抑制した。[結果] RAとOA患者の滑膜マスト細胞はSPを発現していたがその陽性数や全マスト細胞における頻度には有意差はなかった。しかし、SPの染色パターンが異なり41%のRAのマスト細胞では細胞膜周辺に93%のOAのマスト細胞ではでは細胞質全体に局在した。この局在の違いは脱顆粒像の有無であった。FcepsilonRIの架橋および凝集IgG刺激でマスト細胞は刺激4時間後にTac1 mRNAが上昇し細胞内SPは増加したが、細胞上清中のSPはマスト細胞から同時に分泌されるproteaseによって分解された。また、滑膜マスト細胞のSPの受容体はNK-1RでなくMrgX2であった。[結論]滑膜マスト細胞はFcgammaを介する刺激によってSPを合成し、マスト細胞周囲の局所で遊離されたSPはauto/paracrineの機序でMrgX2を介して滑膜マスト細胞を活性化し、炎症を増強することが示唆された。関節リウマチ研究はおおむね順調に進展している。関節リウマチ(RA)患者と変形性関節症(OA)患者の滑膜組織におけるマスト細胞がサブスタンスP(SP)を産生するかを検討し、滑膜マスト細胞からのSP産生の機序の解明と滑膜マスト細胞におけるSPの責任受容体を同定した。MrgX2の発現増強機序の検討は進行中であるが、線維芽細胞を慢性蕁麻疹の患者から入手し繰り返し結果の確認をとる必要がある。(背景)慢性蕁麻疹患者血清中のサブスタンスP濃度は、健常人と比較して有意に高いこと、また、慢性蕁麻疹の重症度と相関していることが、ドイツの研究グループから報告された。我々は、最近重症の慢性蕁麻疹患者の皮膚マスト細胞のMrgX2の発現が健常者と比較して有意に増強していることを報告した。(目的)hemokinin-1に特異的な抗体を用いたELISAで慢性蕁麻疹患者と健常人血清中のhemokinin-1濃度を比較すること。また、サブスタンスP濃度を比較すること。hemokinin-1の皮膚マスト細胞脱顆粒能を調べ、受容体を同定すること。血清中のhemokinin-1濃度の高い慢性蕁麻疹患者の臨床的特徴を明らかにすること。(方法)慢性蕁麻疹患者の血清サンプルが68例、健常人44例がを用いた。血清中のサブスタンスP濃度、hemokinin-1濃度、抗IgE自己抗体および抗Fc epsilon RI alpha鎖自己抗体をELISAで測定した。Fc epsilon RI alpha鎖を架橋するレベルをEXiLE法で測定した。レンチウイルスベクターを用いたshRNA法によりMrgX2遺伝子発現を抑制した。(結果)慢性蕁麻疹患者血清中のhemokinin-1濃度は、健常人と比較して有意に高かった。一方、サブスタンスP濃度は両者においてほぼ全例ELISAの感度以下であった。hemokinin-1は皮膚マスト細胞の脱顆粒を惹起し、受容体は、MrgX2であった。血清中のhemokinin-1濃度と抗IgE自己抗体および抗Fc epsilon RI alpha鎖自己抗体の間には有意な相関はなかった。(結論)hemokinin-1は慢性蕁麻疹の新たな薬剤標的であり、血清中のhemokinin-1濃度の高い慢性蕁麻疹患者はいわゆる自己免疫性の蕁麻疹患者とは違う群に含まれることが示唆された。慢性蕁麻疹患者の血清サンプルが68例、健常人44例が集まり血清中のサブスタンスP濃度とhemokinin-1濃度を比較することができた。また、抗IgE自己抗体、抗Fc epsilon RI alpha鎖自己抗体の測定方法が確立できた。さらにFc epsilon RI alpha鎖を架橋するレベルを測定する系も確立できたため。この研究の基盤となる慢性蕁麻疹患者における抗IgE自己抗体および抗Fc epsilon RI alpha鎖自己抗体の病態における役割の研究を平行して行っており、こちらもおおむね順調に進展しているため。

サブスタンスPとhemokinin-1は11個のアミノ酸からなり6個のアミノ酸が同じであるため、抗体は交差性を示す可能性があり、検証が必要であったが、hemokinin-1にのみ反応する抗体によるELISAが購入可能となった。1.重症の慢性蕁麻疹患者のマスト細胞におけるMrgX2の発現の増強の機序の解明:皮膚マスト細胞を皮膚線維芽細胞と共培養し、Mrgx2 mRNA発現レベルとMrgX2のタンパク発現レベルを共培養なしと比較したが皮膚マスト細胞におけるMrgX2の発現が元々高く有意な変化は見られなかった。ヒト肺マスト細胞を線維芽細胞と共培養するとMrgX2が発現してくるが、これはPGD2受容体のDP1のブロックで抑えられた。2. MrgX2の関節滑膜マスト細胞における発現と役割の検討:関節リウマチ(RA)と変形性関節症(OA)患者滑膜組織の免疫組織化学染色を行ったところ両患者の滑膜組織マスト細胞はSPを発現しておりその陽性数や発現頻度には有意差はなかったが、substance P (SP)の染色パターンが異なり、RAでは41%の、OAでは7%のマスト細胞においてSPは細胞膜周辺に局在していた。FcεRIの架橋および凝集IgG刺激で刺激2時間以降にTac1 mRNAが上昇したが、細胞上清中のSPは測定感度以下であった。SPはマスト細胞から分泌されるカイメースによって分解された。マスト細胞内にはSPが700 pg/10E6個が存在し、刺激30分後にそのSP量は有意に減少した。活性化された滑膜マスト細胞は即座にSPを分解し、これはRAにおいてSPを介する滑膜細胞の活性化を抑制していることが示唆された。3. RAおよび慢性蕁麻疹でのマスト細胞のMrgX2の役割の検討:SPは皮膚および滑膜マスト細胞上のMrgX2を介しマスト細胞を活性化し炎症メディエーターを遊離させ炎症を惹起させる。重症慢性蕁麻疹患者の皮膚マスト細胞ではMrgX2の発現が増強しており血中にSPおよびhemokinin-1が存在した。RAの関節滑液中にもSPは存在しSP-MrgX2枢軸が両疾患の炎症の病態に関与していることが示唆された。私達は、重症の慢性蕁麻疹患者の皮膚マスト細胞にGタンパク質共役型受容体に属するMas related gene X2 (MrgX2)の発現が健常者と比較して有意に増強していることを報告した。ストレスで神経細胞から分泌されるsubstance PによりMrgX2を介して皮膚マスト細胞は、ヒスタミンを遊離した。すなわちストレスによる慢性蕁麻疹の増悪の機序と考えられる。一方、MrgX2が関節滑膜マスト細胞においても発現しており、関節リウマチにおいてもsubstance Pが病態に関与していることが示唆された。substance Pは、11個のアミノ酸からなるペプチドであるが、やはり11個のアミノ酸からなるhemokinin1と6個のアミノ酸が同じであり、免疫組織化学染色に使用する抗substance Pモノクローナル抗体が、hemokinin 1と交差する可能性があり、交差性を検証する必要がある。
ミクログリア細胞においてP2X4受容体依存的に誘導される神経因性疼痛遺伝子の特定

神経因性疼痛に重要なP2X4受容体(P2X4R)依存的に発現する神経因性疼痛遺伝子を見出すことを目的に遺伝子発現解析を行い,P2Y12Rやケモカイン類などを検出した。さらに,P2Y12Rの疼痛における新しい役割と,ケモカイン受容体CCR2によるP2X4Rの細胞膜移行メカニズムを明らかにした。P2X4Rによる遺伝子発現およびP2X4Rの細胞膜輸送制御が疼痛の治療標的となる可能性がある。神経因性疼痛に重要な役割を有しているP2X4Rの活動刺激依存的に誘導される神経因性疼痛遺伝子を特定する目的で,まず,野生型C57BL/6マウスおよびP2X4R欠損マウスの第4腰髄神経へ損傷を加え(神経因性疼痛モデル),第35腰髄を摘出し,組織中に含まれているRNAを抽出した.その後, DNAマイクロアレイにより網羅的に解析した結果,野生型マウスの非損傷側脊髄に比較し,神経損傷側脊髄で遺伝子発現が2倍以上増加する分子を約100個検出できた.その中には,ミクログリア細胞マーカー遺伝子のIba1や今まで発現変動が報告された遺伝子(カテプシンS, P2Y12受容体やToll様受容体2など)も含まれていた.また,複数回のDNAマイクロアレイ解析において,上記で検出された発現増加遺伝子の多くが再現性よく検出されたことから,得られた結果の信頼性が確保できたといえる.また,今現在まで報告されていない遺伝子も数多く検出できた.さらに,同様のDNAマイクロアレイ実験を神経損傷P2X4R-KOマウスの脊髄由来RNAを用いて検討した結果,野生型マウスの脊髄で発現増加する遺伝子群の中で,その増加が著明に減弱している遺伝子を見つけることに成功した.野生型およびP2X4R欠損マウスの脊髄におけるそれら遺伝子の発現変動はリアルタイムPCR法によっても確認できた.一方,ミクログリアP2X4R-Tgマウスの作製を目的に,ミクログリア細胞で高発現する分子Ibalのプロモーター領域を挿入したプラスミドベクターに,マウスミクログリア細胞よりクローニングしたP2×4RcDNAを組み込み, Tgマウス創出のためのプラスミドベクターの作製を完了した.神経障害性疼痛に重要な役割を有しているP2X4Rの活動刺激依存的に誘導される疼痛遺伝子を特定するため,cDNAマイクロアレイの結果から候補として選別された遺伝子の精査をreal-time RT-PCR法で行った。その結果,野生型マウスとP2X4R欠損マウス間で差異が認められた遺伝子として,同じATP受容体ファミリーであるP2Y12受容体(P2Y12R)を見出した。脊髄におけるP2Y12Rはミクログリア特異的に発現し,P2Y12R拮抗薬の脊髄くも膜下腔内繰り返し投与およびP2Y12R欠損マウスでは,神経障害性疼痛形成の有意な抑制が認められた。さらに,一端形成した疼痛に対してもP2Y12R拮抗薬は有意な抑制効果を示した。さらに,P2Y12RとP2X4Rとの相互作用について検討した。P2Y12の内因性リガンドであるADPを初代培養ミクログリア細胞へ処置することにより,P2X4R発現の著しい増加が観察され,この効果はP2Y12R拮抗薬の前処置で抑制された。興味深いことに,この発現増加はADP刺激後,短時間で認められることから,P2Y12Rを介した新しいP2X4Rタンパク質制御機構の存在が明らかとなった。一方,ミクログリアP2X4R-Tgマウスでの研究において,Tg作製のために使用するIba1プロモーターベクターでP2X4RのN末端部分にIba1のExon1およびExon2の一部が組み込まれてしまうことから,P2X4Rの機能に影響及ぼしてしまう可能性を回避するため,このExon部分を除去したIba1プロモーターベクターを新たに作製し,P2X4RcDNAを組み込み,Tgマウス創出のための新しいプラスミドベクターの作製を完了した。野生型マウスとP2X4受容体欠損マウス間で発現差異が認められた遺伝子として,ケモカイン類のCCL12やCCL7を検出した。これらはいずれもケモカイン受容体CCR2の内因性リガンドであり,CCR2はP2X4受容体と同様にミクログリアに発現し,神経障害性疼痛にも関与する。さらに,ミクログリアのCCR2刺激後にP2X4受容体タンパク質の細胞膜表面への発現が亢進することを見出した。この作用はCCR2刺激後30分から認められた。また,培養ミクログリア細胞に発現させたGFP融合P2X4受容体の動きをリアルタイムで測定したところ,CCR2刺激細胞ではGFP蛍光粒子の動きが増加し,総移動距離が有意に亢進した。

細胞内におけるP2X4受容体タンパク質はリソソームに存在しているが,CCR2刺激によりリソソームとP2X4タンパク質の細胞内分布の変化およびリソソーム酵素の放出が起こり,またP2X4受容体依存的なAktリン酸化が有意に亢進した。これら一連の成果から,CCR2刺激によってリソソームが細胞膜へ融合し,結果としてP2X4受容体の細胞膜での発現が亢進したものと考えられる。このことは,P2X4受容体の細胞内での動態制御が新しい疼痛治療に繋がる可能性を示唆している。一方,ミクログリアP2X4-TGマウスでの研究において,前年度に作成した改良版Iba1プロモーターベクターの発現特異性を確認し,胚300個にマイクロインジェクションを行った。遺伝子解析の結果,ファウンダーマウス6個体を得ることに成功した。さらに,P2X4受容体が帯状庖疹による疼痛に重要な役割を果たしていることを見出した。この結果は,より臨床に近い慢性疼痛モデルにおけるP2X4受容体の重要性を示しており,P2X4受容体拮抗薬が疼痛治療薬として有用であることを強く示唆するものである。
位置選択的抗体固定化法を利用した環境水中の多種汚染物質の同時センシング

本研究ではPDMS製マイクロチャネルを反応場に用い、チャンネル内表面に酵素および抗体を固定化し、微小体積中での酵素反応や抗原抗体反応を利用した測定法を研究した。フォトリソグラフ・化学エッチング法により作製したPDMS製凸型鋳型流路に、予め光架橋剤であるATFB-SEを結合したGlucose Oxidase(GOD)、Horseradish Peroxidase(HRP)の溶液をブロッキング済みチャネルに満たした。紫外レーザーを任意の位置に照射し、位置選択的に上流側にGOD、下流側にHRPを位置選択的に固定した。応用の一つには、酵素免疫測定法(ELISA)をマイクロチャンネルで行い、それを一般的なELISA法である96穴マイクロプレートを利用した手法と比較し、その測定時間や検出能力について検討した。PDMS製マイクロチャンネルに、第一抗体を吸着させ、次に非特異的吸着を防止した後、試料である抗原(IgA)とHRPをラベル化した第2抗体を添加した。定量はAmplex Redを用いて蛍光法で行なった。マイクロチップを用いる手法では、抗原抗体反応時間1.4分、酵素基質反応時間0.1分のとき、検量線は0250ng/mLで良好な直線性を示した。また、96穴マイクロプレートで同様な測定を行った結果、マイクロチップを用いる手法は、直線範囲はほぼ同等、反応時間は1/100と大幅に短縮が可能なことを示した。また、濃度が未知の試料を測定し、両者の結果がほぼ一致することを確認した。次に、位置選択的固定化法を利用した酵素センサーを開発した。同一流路内に、GOD、HRPの順に別々の場所に固定化し、グルコースの定量を行った。8μM130μMの範囲で直線であることを確認した。その時の反応時間は約5秒であり、96穴マイクロプレートと比較して1/375に短縮できることが示された。本研究ではPDMS製マイクロチャネルを反応場に用い、安価な使い捨てタイプの酵素反応を利用するセンサとしての可能性を検証した。またマイクロチャネルの機能集積化を目的として、光架橋剤と結合させた機能性タンパク質(酵素)をレーザーによって位置選択的にチャネル内壁へ固定する手法(光固定法)を導入し、反応場の耐久性や分析系集積化の可能性などについても検討した。ヘリウムカドミウムレーザーを任意の位置に照射し、位置選択的に上流側にGOD、下流側にHRPを固定した。その後、チャネルを0.1Mリン酸緩衝液(pH7.3)で洗浄した。この様に作製したマイクロチャネルを用いてグルコース分析を行った。Amplex Red/0.1Mリン酸緩衝液を加えたグルコース含有溶液をチャネルに流しながら蛍光強度を測定したところ、チャネルの上流と下流とで蛍光強度に大幅な変化が確認できた。下流における蛍光増加は、含有グルコースと固定GODが反応して過酸化水素を生成し、さらにこれがチャネル内壁に固定化したHRPによりAmplexRedと触媒的に反応して蛍光物質を生成した結果である。また、Glucose濃度を変えたときの下流における蛍光強度増加率にも若干の変化が確認された。以上より、光固定法を用いたマイクロチャネル内壁でのグルコース分析の可能性が示唆された。