hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
細胞接着因子によるウイルス細胞傷害作用制御の分子機構

パラミクソウイルスやHIVによる細胞傷害の主要な機序の一つは細胞融合、多核巨細胞形成、である。ウイルス誘導および生理的細胞融合に細胞融合を制御している宿主因子としてFusion Regulatory Factor-1(FRP-1、CD98)見い出した。抗FRP-1抗体を細胞に作用させるとパラミクソウイルスやHIVによる細胞融合が増強される。本年度はFRP-1発現L929細胞を用いて、新たな抗FRP-1モノクローナル抗体を3個作製した。そのうちの一つ、18-1-2、は抗FRP-1抗体処理U2ME-7細胞(HI Vgp160発現U937-2細胞)の細胞凝集には影響を与えることなく、細胞融合、多核巨細胞形成、を抑制した。このことはFRP-1分子をManipulationすることによってパラミクソウイルスやHIVの細胞傷害作用を制御できることを示唆している。抗β1インテグリン抗体やファイブロネクチンを抗FRP-1抗体処理U2ME-7細胞に作用させると多核巨細胞形成を抑制した。抗FRP-1抗体による細胞融合誘導の分子機構を解析するために、Protein Kinase阻害剤の効果を調べた。H-7、HerbimicinやGenisteinは抗FRP-1抗体による細胞融合誘導を阻害した。抗Phosphotyrosine抗体で解析すると抗FRP-1抗体によって幾つかの蛋白のTyrosineが燐酸化されていた。これらの事実は抗FRP-1抗体による細胞融合誘導にはProtein Kinase、特にTyrosine Protein Kinase、が関与していることを示している。このことから、細胞接着因子によるウイルス細胞傷害作業制御におけるTyrosine Protein Kinaseの役割の重要性が浮かび上がってきた。
膀胱癌細胞の増殖と運動を促進する新しい尿中および組織内因子

膀胱癌細胞が産生しautocrine的にその増殖と運動を促進する因子を検索することを目的として、担胱癌ラット尿中の因子を分析した。ラットをBBNで処理し、様々な発癌過程にある動物の尿を採集し、膀胱癌(ラット、BBN発癌)由来細胞株、NBT-IIを標的細胞として用いてscatter factor活性(SF活性)を調べた。ラット尿中には比較的強いSF活性が存在しており、この活性は分子篩クロマトグラフイによって高分子量と低分子量の二つの成分に分離された。両画分の活性をさらに逆相NPLC、FPLCによって精製した結果、高分子量画分からは高分子量EGF(54kDaと74kDa)、低分子量画分からは低分子量EGF(6kDa)が得られた。さらに、ラット顎下腺から精製した低分子量EGFがNBT-IIに対して明らかなSF活性を示すこと、抗EGF抗体が尿中のSF活性を阻害することから、ラット尿中のSF活性のはとんどはEGF(6kDa、54kDaおよび74kDa)によるものであることが明らかとなった。ヒト尿についても分子篩クロマトグラフィによる分画と抗EGF抗体を用いたウェスタンブロットを行い、ラットと同様の結果を得た。一方、ラット尿中のSF活性は、発癌過程とは相関性を示さず、また、正常人と膀胱癌患者の間で、あるいは膀胱癌患者において膀胱摘出手術前後で、尿中のSF活性に有意な差を認めなかった。これらの結果は、予想に反して尿中SF活性の大部分が膀胱癌細胞に由来するものでないことを示しているが、尿中の主要な増殖因子であるEGFが膀胱癌細胞の運動を促進し、その浸潤、転移に関与する可能性を示している。尿中SF活性に関するこのような研究結果に加えて、ウェスタンブロットによる低分子量EGFの検出感度を飛躍的に向上させる新しい手技を開発し、今回のラット尿中SF活性の分析に応用した。ラットをBBNで処理し、様々な発癌過程にある動物の尿を採集し、膀胱癌(ラット、BBN発癌)由来細胞株、NBT-IIを標的細胞として用いて尿中のscatter factor活性(SF活性)を調べた。ラット尿中には比較的強いSF活性が存在しており、この活性は分子篩クロマトグラフィによって高分子量と低分子量の二つの成分に分離された。いずれの画分の活性も熱と酸に対して比較的安定で、ヘパリンに対して親和性を示さなかった。このような性質は、尿中の主要な増殖因子の一つであるEGFの性質と類似しているため、抗EGF抗体を用いて両画分のウェスタンブロットを行った結果、高分子量画分には高分子量EGF(74kDaと54kDa)と低分子量EGF(6kDa)が、低分子量画分には低分子量EGFのみが検出された。逆相HPLCによって低分子量画分の活性をさらに精製すると、SF活性はほぼ純粋な低分子量EGFの画分に回収された。さらに、ラット顎下腺から精製した低分子量EGFはNBT-IIに対して明らかなSF活性を示した。これら結果は、ラット尿中のSF活性がEGFに基づくものであることを強く示唆している。これは、尿中SF活性の大部分が膀胱癌細胞に由来するものではないことを示している。SF活性に関するこのような研究結果に加えて、ウェスタンブロットによる低分子量

EGF検出の感度を飛躍的に向上させる新しい手技を開発し、今回のラット尿中SF活性の分析に応用した。前年度の研究結果から、尿中のscatter factor活性(SF活性)のうち低分子量画分の活性は低分子量EGFに基づくことが分かった。高分子量画分の活性が高分子量EGFによるものか否かを調べるため、分子篩クロマトグラフィによって得られた高分子量画分をそらに逆相HPLCとMono Qカラムを用いたFPLCによって分画し、ほぼ純粋な高分子量EGF(54kDaと74kDa)を得た。これら2種類の高分子量EGFはともにNBT-IIに対してSF活性を示し、また、抗EGF抗体は高分子量画分中のSF活性を阻害した。これらの結果から、ラット尿中のSF活性のほとんどはEGF(6kDa、54kDaおよび74kDa)によるものであることが明らかとなった。ヒト尿についても分子篩クロマトグラフィによる分画と抗EGF抗体を用いたウエスタンブロットを行い、ラットと同様の結果を得た。EGFのSF活性に対する細胞外基質の影響を調べた結果、ラミニン、フィブロネクチン、I型コラーゲン、IV型コラーゲンで培養プレートをコートすることにより、NBT-IIに対するEGFのSF活性が増強されることが分かった。調べた細胞外基質成分の中ではI型コラーゲンの効果が最も大きかった。EGF以外の増殖因子の中では、すでに報告されているとおりHGFがNBT-IIに対して強いSF活性を示し、bFGF、IGF-II、PDGFの作用はEGFよりも低かった。TGF-β1は単独では活性を示さなかったが、TGF-β1の共存によりEGFのSF活性が増強された。これらの結果は、尿中のSF活性の本体であるEGFの作用が、細胞外基質や他の増殖因子の共存によって変化することを示している。
IGTにおける細胞内脂質量と糖代謝病態との関連性に関する研究

前回までに我々は、BMI30以上の3040代の男性肥満症患者20名を、週1回来院させ、栄養指導と運動療法を3か月間継続することで、どのような代謝変化が起こるかに関して検討した。その結果、3ヶ月間の介入により、平均6.2kgの減量が達成されたが、この際、運動量の明らかな増加は観察されず、食事量の減少が認められた。この変化に応じて、糖質代謝、脂質代謝、血圧といった動脈硬化のリスクファクターはいずれも有意な改善を認めた。75g-OGTTにより評価した耐糖能についても、介入後では介入前に比較して有意に血中インスリン濃度、血糖値が低下し、インスリン抵抗性の改善による変化であると考えられた。骨格筋細胞内脂質量と骨格筋のインスリン感受性の指標である糖注入率にも有意な変化を認めなかった。しかし肝細胞内脂質は著明に減少し、それに伴って肝糖取り込みも有意な改善を認めた。以上より、主に食事量の減少による、肥満者を対象とした約6.2kgの減量は、骨格筋ではなく、主に肝臓における糖質、脂質代謝を改善することが明らかとなった。この変化に伴い、どのような、血中アディポサイトカインの変化が認められるかに関して検討した。その結果、血中総アディポネクチン、レプチンには有意な変化が認められなかった。以上より、軽度の食事療法の結果に認められるドラマティックなインスリン抵抗性の改善にはアディポサイトカインの変化を伴わない肝脂肪量の変化が関与する可能性が示唆された。【方法】対象者はBMI30以上の3040代の男性肥満症患者20名。週1回来院させ、栄養指導と運動療法を3か月間継続した。この介入前後で75g-OGTT、^1H-MRSによる骨格筋および肝細胞内脂質量の定量的評価、ガス希釈法による体脂肪率の測定、栄養摂取調査、メモリー付加速度計による日常身体活動度をそれぞれ評価した。またインスリン抵抗性は人工膵臓を用いたグルコースクランプ法に経口ブドウ糖負荷を併用した生理学的検査法により評価した。【結果】3ヶ月間の介入により、平均6.2kgの減量が達成された。また、糖質代謝、脂質代謝、血圧といった動脈硬化のリスクファクターはいずれも有意な改善を認めた。【結論】肥満患者に対する3ヶ月の指導により、軽度の体重減少がなされた。骨格筋のインスリン抵抗性、細胞内脂質はともに改善を認めなかったが、肝臓については、細胞内脂質は著明に減少し、同時にインスリン抵抗性も有意に改善した。以上より、肥満者に対する6.2kgの減量は、骨格筋ではなく、主に肝臓における糖質、脂質代謝を改善することが明らかとなった。
血管新生抑制シグナルを指標にした新規腫瘍休眠療法薬の同定

エンドスタチンやアンジオスタチンなどの血管新生抑制因子は最も有用な腫瘍休眠療法薬と位置づけられ、実験動物の固形腫瘍を著明に退縮させ、従来の抗癌剤のような薬剤耐性を示さないため注目を集めたがそのメカニズムは長く不明であった。研究代表者らはエンドスタチンによる血管新生抑制に関わる分子機構を発見し、その強力かっ広範な細胞内応答を「血管新生抑制シグナル」と命名したが、高感度real-time定量的PCR法にて類似のシグナルを示す物質を選択することにより、血管新生抑制作用を有する物質を効率的1に見いだす方法を考案した。今回、医薬品、化合物、合成ペプチドを含む多数の物質を探索すると同時に、従来の研究で得られた新規腫瘍休眠療法候補薬剤の抗腫瘍効果、転移抑制効果についても比較検討を行い、「血管新生抑制シグナル」を惹起する物質を多数見出すに至った。これらの中から血管内皮細胞において強力な遊走阻止作用、増殖抑制作用を示すものについて、ヒト癌細胞を用いて作成したマウスxenograftモデルにおいて腫瘍増殖抑制作用を有するか、癌細胞に対するの直接の増殖抑制作用や転移抑制作用を示すかどうかなどの検討を行った結果、アンサマイシン系抗生物質群の中に、きわめて有望な作用と安全性を備えた物質が見いだされた。現在、臨床応用をめざして、企業による製剤開発へと進展しており、発見された作用の一部について特許出願を終えている。研究代表者らはエンドスタチンにより血管新生抑制に関わる分子機構を発見し、その強力かつ広範な細胞内応答を「血管新生抑制シグナル」と命名したが、高感度real-time定量的PCR法にて類似のシグナルを示す物質を選択することにより、血管新生抑制作用を有する物質を効率的に見いだす方法を考案した。今回、医薬品、化合物、合成ペプチドを含む多数の物質を探索すると同時に、従来の研究で得られた新規腫瘍休眠療法候補薬剤の抗腫瘍効果、転移抑制効果についても比較検討している。すでに培養毛細血管内皮細胞において「血管新生抑制シグナル」を惹起する物質については多数見出すに至っているが、これらの中から血管内皮細胞において強力な遊走阻止作用、増殖抑制作用を示すものについては、ヒト癌細胞を用いて作成したマウスxenograftモデルにおいて腫瘍増殖抑制作用を有する物質がないかどうか、順次探索を行う予定である。現時点で最も強力な因子については、ヒトへの投与時の各組織への移行と組織中濃度と、その作用、副作用の可能性を含めて検討を継続しており、さらに血管新生阻害作用以外の抗腫瘍作用メカニズムがないかどうかも検索し、臨床応用可能な薬剤の発見をめざしている。研究代表者らはエンドスタチンによる血管新生抑制に関わる分子機構を発見し、その強力かつ広範囲な細胞内応答を「血管新生抑制シグナル」と命名したが、高感度real-time定量的PCR法にて類似のシグナルを示す物質を選択することにより、血管新生抑制作用を有する物質を効率的に見いだす方法を考案した。さらに、医薬品や合成ペプチドにもエンドスタチン型の血管新生抑制シグナルを示すものが一定の頻度で存在し、少なくともその一部は強力な抗腫瘍作用を示すことを見いだした。本研究ではこれまでの研究成果を発展させ、多数の薬剤、合成ペプチド、化合物の中から血管新生抑制シグナルを惹起する因子を探索し、これら新規腫瘍休眠療法候補薬剤の抗腫瘍効果、転移抑制効果についても腫瘍移植実験動物を用いて比較検討し、血管新生阻害作用以外の抗腫瘍作用メカニズムがないかどうかも検索しつつ、総合的な抗腫瘍薬としての作用の詳細を検討したところ、アンサマイシン系の抗生物質の中に長期経口投与可能できわめて有効な抗腫瘍効果を示す薬剤群を見いだした。これらは血管新生抑制作用を有するばかりでなく、直接の抗腫瘍効果を示すとともに、移植腫瘍の転移抑制効果も示すなど、最近のメトロノーム抗腫瘍療法の概念に合致した効果を示すものと考えられた。
文化外交としての対外言語普及政策と国内少数言語に関する基礎研究

2018年度は、前年度までに得られた情報をもとに、資料を分析し、考察を行った。その研究成果をまとめ、報告を行う活動を中心に実施した。セルバンテス文化センターによるスペイン語対外普及活動の基盤となりうるスペイン語の規範整備についての研究成果を研究分担者である安達が研究会(第421回関西スペイン語学研究会)において口頭による報告を行った。スペイン王立言語アカデミアによる規範整備について歴史的考察を行なってきた安達は、具体事例として冗長語の扱いについて報告した。また、国家内の地域少数言語に関する扱いについて、具体例としてガリシア語と対外普及政策およびガリシア移民との関係について、研究代表者である柿原が国際学会(XII Congreso da Asociacion Internacional de Estudos Galegos:第12回国際ガリシア研究学会)における報告を行った。主に移住先の移民社会の高齢化と移民互助組織の統廃合に関する問題と、新たな文化・言語普及活動を始めている組織の事例を取り上げ、ガリシア自治政府やセルバンテス協会との協力関係について現地調査の結果を報告した。また本研究の過程で明らかになった外国語教育における諸問題、特にそのイデオロギー性の問題点について研究分担者の仲が論文、書籍、学会(第71回公開セミナー・シンポジウム、韓国日語教育学会)により報告を行った。さらに仲は主にフィールドをアジアの外国語教育に置いており、具体例として外国語教育と日本語教育、国語教育の反グローバル性について問い直し、教材分析を通して、言語学習者がいかに振舞い、コミュニケーションをとることが期待されているかについて批判的考察を行なった。本年度は、本研究の第1の目的である国家の言語文化の対外普及活動の具体的な施策について明らかにするために、東京及びマニラにおける現地調査を実施した。4月30日に第1回目の研究打合せを行い、研究計画と役割分担について確認した。その結果、アジアにおけるセルバンテス文化センターの活動を調査するためには、最大規模のセンターである東京での事前調査が有用であると考え、9月6日に聞き取り調査を実施した。これによりアジア諸国におけるセルバンテス文化センターの設立経緯や各センターの活動について最新の情報を収集した。次に、スペインによる植民地であった歴史を有し、その繋がりの深さから、アジアで最初にセルバンテス文化センターが設立されたフィリピンにおける現地調査を行った。具体的には2017年3月にマニラのセルバンテス文化センター、アテネオ・デ・マニラ大学現代言語部、フィリピン大学ヨーロッパ言語部において聞き取り調査および資料収集を実施した。セルバンテス文化センター・マニラでは、スペイン大使館附属スペイン文化センターから改組されて1994年に同センターが誕生した経緯や、近年の同センターにおけるスペイン語及び公用語である地域言語の教育活動について聞き取り調査を実施した。また、アテネオ・デ・マニラ大学およびフィリピン大学では、スペイン語教育の実施実態について教育現場の観察及び関係者に対する聞き取り調査を実施した。これにより、マニラを中心とするフィリピンでのスペイン語教育の実態を明らかにするための基礎的情報が収集できた。当初は欧州でも現地調査を行う予定であったが、初年度はアジア、特にフィリピンに絞って研究を進めることとした。現地調査と並行して言語の対外普及に欠かせない規範整備の歴史や、言語教育と異文化理解などの理論に関する文献調査も進めた。これらの調査の成果の一部をまとめ口頭研究報告及び論文執筆を行なった。研究代表者及び研究分担者の所属が変更となり、新しい環境で研究基盤を整える必要があり、現地調査の実施計画を変更せざるをえなくなったため。本年度は、前年度(平成28年度)の調査に引き続き、現地調査を実施した。8月に、当初平成28年度に予定していたヨーロッパにおける現地調査を代表者および分担者で実施し、ドイツ、スペインにおいて資料収集と聞き取り調査を行った。また3月に代表者がアメリカ合衆国(ニューヨークおよびマイアミ)での調査を行なった。ドイツではフランクフルト・ガリシア・センター(Centro Gallego)、セルバンテス文化センターフランクフルトにおいて教育・文化活動の担当者に聞き取りを実施した。ガリシアセンターでは、ドイツにおける近年のスペイン人移民、特にガリシア出身者を取り巻く社会環境について、最新の情報が得られた。また近年の移民の言語に対する態度が、1960年代頃のガリシア出身移民とは異なる点など興味深い情報が得られた。また、現在は諸般の事情からガリシアセンターの運営、文化活動の維持が困難である現状についても説明を得られた。セルバンテス文化センターでは、2008年の開所以来の活動内容についての詳細な情報が得られた。スペインの地域言語の中ではカタルーニャ語の講座が定期的に開講されてきているとの情報が得られた。スペインではガリシア自治政府言語政策局長、サンチアゴ大学教授に対する聞き取り調査を行い、最新の動向について情報収集を行った。アメリカでは、セルバンテス文化センターニューヨーク、Casa Galicia NY、Centro Orensano Newark、マイアミ・キューバディアスポラ美術館で聞き取り調査を実施した。その結果、ニューヨークのガリシア移民社会においても近年は高齢化などにより互助組織の維持が困難である点など問題点が明らかになった。マイアミではキューバ人亡命者の多くがガリシア系であることから、本研究に関連する情報が得られた。前年度は当初予定していた現地調査が十分に行えず、やや遅れていたが、今年度にヨーロッパ(ドイツ、スペイン)およびアメリカ合衆国での調査を実施することができたため、ほぼ当初の予定通り推移している。

セルバンテス文化センターによるスペイン語対外普及活動の基盤となりうるスペイン語の規範整備についての研究成果を研究分担者である安達が研究会(第421回関西スペイン語学研究会)において口頭による報告を行った。スペイン王立言語アカデミアによる規範整備について歴史的考察を行なってきた安達は、具体事例として冗長語の扱いについて報告した。また、国家内の地域少数言語に関する扱いについて、具体例としてガリシア語と対外普及政策およびガリシア移民との関係について、研究代表者である柿原が国際学会(XII Congreso da Asociacion Internacional de Estudos Galegos:第12回国際ガリシア研究学会)における報告を行った。主に移住先の移民社会の高齢化と移民互助組織の統廃合に関する問題と、新たな文化・言語普及活動を始めている組織の事例を取り上げ、ガリシア自治政府やセルバンテス協会との協力関係について現地調査の結果を報告した。また本研究の過程で明らかになった外国語教育における諸問題、特にそのイデオロギー性の問題点について研究分担者の仲が論文、書籍、学会(第71回公開セミナー・シンポジウム、韓国日語教育学会)により報告を行った。さらに仲は主にフィールドをアジアの外国語教育に置いており、具体例として外国語教育と日本語教育、国語教育の反グローバル性について問い直し、教材分析を通して、言語学習者がいかに振舞い、コミュニケーションをとることが期待されているかについて批判的考察を行なった。本年度実施できなかった欧州における現地調査を行い、さらに当初予定していた米州地域での現地調査も可能な限り実施する。その際、初年度のアジアにおける調査ではあまりクローズアップできなかった、国内少数言語であるスペインの併用公用語の教育活動や普及活動についても実態調査を行う。これらにより、第1の目的である「世界各地で実施されている対外言語普及政策の具体的な施策について明らかにすること」に加え、第2の目的である「国家語普及機関が国内少数言語を普及することの意義と問題点を解明すること」についても研究を進めていく予定である。そのためには、少数言語の対外普及活動、教育活動が実施されている欧州及びに米州地域おけるセルバンテス文化センターでの現地調査を行う必要がある。また、少数言語対外普及政策の実施主体であるスペインの関係機関(ガリシア自治政府など)での現地調査も必要に応じて実施していくこととする。最終年度である平成30年度は、これまでの現地調査で収集した資料を整理、分析するなど調査を継続するとともに、研究成果の報告を行う予定である。9月にスペイン・マドリードで行われる国際学会での報告を予定している。そのほかに関連分野の学会や研究会の機関誌における論文などで成果の報告を行う予定である。現地調査の実施
遺伝子改変マウスを用いた細胞内プロテアーゼ・カルパイン系の解析

様々な病態において活性化が観察される細胞内タンパク質分解酵素「カルパイン」の遺伝子改変マウスを作製し、これまでに解明されていないカルパインの生理的機能の解析を行った。カルパイン遺伝子欠損マウスが胎生期に死亡することから、カルパインが個体発生において不可欠な存在であることが分かった。また、生理的条件下でカルパインが細胞死を抑制することが示された。内容細胞内プロテアーゼである「カルパイン」の生体内における機能解析のため、遺伝子欠損マウスを作成すると、受精14日後に心血管系の異常により死亡する。更に詳細な解析を行うと、細胞死を誘導するプロテアーゼとして知られる「カスパーゼ」が過剰活性化を伴う細胞死が起きていることが観察された。また、細胞死が起きる組織特異的にカルパインの発現欠損を行うと期待された通りに胎生致死となることから、欠損マウスの死因となる組織異常を特定した。また、ヒト培養細胞を用いて、カルパイン阻害が細胞死を引き起こし、カスパーゼ阻害剤により細胞死を抑制することができ、更に詳細な分子機序を解析している。別の実験として、脳内におけるカルパインの基質を同定するため、欠損マウスと野生型マウス間のプロテオーム解析を行っており、今年度では基質の候補を絞りこみを行った。意義カルパインの過剰な活性化は細胞死を促進することがしられていたが、本研究によりカルパインの適度な活性が個体発生において重要な役割をしていることを示し、生体内におけるカルパインの生理的な役割を解明した。また、基質の同定に関しては、カルパインを介する細胞内シグナル伝達系が明らかになることで、その機能の解明につながるものと思われる。重要性これまで詳細な解析が行われていなかった生体内でのカルパインの機能を明らかにした。また、カルパインはアルツハイマー病や心筋梗塞時における神経細胞死を加速する因子として認められており、阻害剤の投与により細胞死を食い止める試みが行われている。本研究は、カルパインの持続的な阻害が悪影響を及ぼす可能性を示唆している。これまでに多くのカルパインに関する研究が行われているが、多くが特異性の低い阻害剤を用いている。本研究では、遺伝子改変マウスを用いることで、これまでに得られている知見を再評価し、新たな発見につながるものと思われる。内容細胞内タンパク質分解系の一員である「カルパイン系」の生体内における機能解析のため、カルパイン系遺伝子多重欠損マウスを作製した。カルパイン-1欠損マウスは正常に発育し、カルパイン-2欠損マウスは受精14日後に死亡する。更にカルパイン-1と2の両欠損マウスを作製すると、このマウスは、より早期の受精11日後に死亡する。Cre-flox系によるカルパイン-2条件特異的欠損マウスを、胚組織特異的にCre遺伝子を発現するMeox2-Creトランスジェニックマウスと交配させた結果、ホモ欠損が生育する事が明らかになった。一方で、カルパインの阻害タンパク質であるガルパスタチンとカルパイン-2の両遺伝子欠損マウスは、一部生育する。この胎生致死は胎盤で細胞死によって引き起こされ、カルパイン欠損マウスでは細胞死実行に重要な働きをするカスパーゼ-3が活性化していることが明らかになった。意義これまでカルパイン系の生理的な意義については不明であったが、本研究は発生におけるカルパインを明らかにした。重要性カルパインはアルツハイマー病や心筋梗塞時など病理的状態において細胞死を促進する因子として認められており、阻害剤の投与により病態を改善しようと言う試みが行われている。そのようなカルパインの健康体にとって悪い働きが注目されている一方で、善の働きについては明らかにされていなかった。本研究は、カルパインの生理的役割を解明し、カルパインが細胞死を抑制するという働きを発見し新たな細胞死調節メカニズムにつながるものである。
身体活動推進のためのポピュレーション・アプローチ：地域無作為化試験

身体活動推進のための地域介入(ソーシャルマーケッティングの手法を用いたコミュニティワイドキャンペーン(CWC))の効果をクラスター(地区)ランダム化試験にて検討した。無作為抽出した住民を5年間追跡した結果、介入地域では身体活動ガイドライン充足者の割合(%)が増える傾向(調整後の両群間の変化の差:+4.5% (95%CI: -0.3, 9.3), P=0.066)が認められた。副次的アウトカムの検討で、柔軟運動実施者は介入地域で有意に増加し、歩行実施者は増加する傾向(P=0.058)が認められた。以上の結果より、ポピュレーションアプローチとしてのCWCの有効性が示唆された。本研究は身体活動推進のポピュレーション・アプローチの効果を質の高い研究デザイン(クラスターランダム化試験による地域介入研究)で検討するもので、介入手法はソーシャルマーケティング理論に立脚したコミュニティ・ワイド・キャンペーンとする。研究は平成21年10月から開始されている。平成25年度は、1)地域介入の継続、2)これまでに収集した結果の分析、を行った。1)地域介入の継続:公民館区を単位として、対照地区3地区、介入地区9地区が設定されている。介入は、1情報提供(マーケティング理論に立脚した情報提供の展開、チラシ、ポスター、のぼり等の活用、町内放送の活用など)、2教育機会(お祭り、健診、地域の集まり等を活用したミニ教室など)、3サポート環境(医師や地域のキーパーソンを活用したソーシャルサポートの強化など)の3つの側面に整理して実施した。可能な限り既存の事業を活用し、少ないスタッフで多くの対象者の行動変容を図る住民参加型の介入を行っている。2)これまでに収集した結果の分析:本研究では、地域からランダムに抽出した住民を対象とした追跡調査を行っているが、介入1年後調査では、住民の「介入への認知」「知識」において効果が認められたが、「信念」「意図」「行動」レベルでは十分な効果が認められていない(kamada2013)。地域住民へのインタビュー調査、プロセス評価では行動変容における「口コミ」「ソーシャルサポート」の重要性が明らかとなった。口コミを活用したマーケティング戦略は経営学においてインフルエンサー・マーケティングと呼ばれており、近年の話題となっている。この分析をもとに、口コミ、地域のインフルエンサーの影響力を活用した介入を強化している。引き続き、平成26年10月まで介入を継続し、最終評価を行う予定である。本研究は身体活動推進のポピュレーション・アプローチの効果を質の高い研究デザイン(クラスターランダム化試験による地域介入研究)で検討するもので、介入期間は5年間、介入手法はソーシャルマーケティング理論に立脚したコミュニティ・ワイド・キャンペーンとする。研究は平成21年10月から開始されており、平成26年10月まで介入を継続し、10月に5年後調査を行った。また、死亡情報、要介護認定に関する情報の収集を開始した。1)地域介入の継続(10月まで):公民館区を単位として、対照地区3地区、介入地区9地区が設定されている。介入は、1情報提供、2教育機会、3サポート環境、の3つの側面に整理して実施した。2)5年後調査の実施:平成26年10月に地域住民4249名を対象に追跡調査を実施した。調査は質問紙を用いた郵送調査である。また、対象者は平成21年に調査地域の住民より6000名を無作為に抽出したが、当時のベースライン調査(平成21年調査)に回答した者であり、これらの対象者を追跡している。今回実施した5年後調査では3533名より回答を得た(回答率83.1%)。データ入力を行い、データクリーニングを開始した。3)死亡、要介護認定情報の把握:死亡情報、および介護認定の情報を自治体の協力を得て取得した(対象者からのインフォームドコンセントは取得されている)。また、主治医意見書より要介護認定に関連する情報の抽出を開始した。研究結果はベースラインおよび1年後、3年後評価のデータを分析することで、適宜、論文化を進めている。研究は予定通り進行しており、最終年度にあたる平成27年度は5年後調査も含めてデータベースを確定し、分析を行う予定である。本研究は平成21年10月に開始された5年間の地域介入研究である。平成26年10月に地域介入を終了し、最終評価(介入5年後)のための質問紙調査を実施した。平成27年度は、1)主要アウトカムを用いた地域介入の効果の分析、2)死亡、要介護認定情報の取得とデータベース化、3)地域介入のプロセス評価と広域展開に向けた介入手法の整理を行った。その結果、1)地域介入の効果:対象地域の住民より無作為抽出した住民6000人のうち、平成21年のベースライン調査に回答した4559名を追跡して介入効果の検討を行った。介入1年後の効果は2013年に学術誌に発表した。本年は介入3年後の効果を論文化した。さらに、論文未発表だが5年後評価の分析を行った。その結果、介入地域では対照地域と比較して身体活動実施者が増える傾向(調整後の両群間の変化の差+4.5 (-0.3, 9.3) %, P=0.066)が認められた。

副次的アウトカムだが、柔軟運動実施者は介入地域で有意に増加し(同+3.9 (0.0, 7.8)%, P=0.0499)、歩行実施者は増加する傾向(同+4.3(-0.1, 8.7)%, P=0.058)が認められた。発表された論文は身体活動の地域介入に関するコクラン・レビューに収載され、抽出された33論文中で最もバイアスリスクの小さい研究と評価された。ポピュレーションレベルで地域介入の効果を示すことができた。2)死亡、要介護認定の状態の把握:行政との協力を得て評価対象者の死亡および要介護認定データを取得し(インフォームドコンセントは取得済み)、データベース化した。今後、副次的アウトカムとして分析を進める。身体活動推進のための地域介入(ソーシャルマーケッティングの手法を用いたコミュニティワイドキャンペーン(CWC))の効果をクラスター(地区)ランダム化試験にて検討した。無作為抽出した住民を5年間追跡した結果、介入地域では身体活動ガイドライン充足者の割合(%)が増える傾向(調整後の両群間の変化の差:+4.5% (95%CI: -0.3, 9.3), P=0.066)が認められた。副次的アウトカムの検討で、柔軟運動実施者は介入地域で有意に増加し、歩行実施者は増加する傾向(P=0.058)が認められた。以上の結果より、ポピュレーションアプローチとしてのCWCの有効性が示唆された。計画は予定通りに実施されている。本研究は地域介入研究であり、既に平成21年10月から開始されている。平成26年度は10月まで介入継続し、10月には最終評価(5年後評価)のための調査を行う計画であった。当初の計画通りに達成された。また、本研究では副次的アウトカムとして、死亡、要介護認定の状況を設定しているが、自治体の協力を得て、いずれも入手することができた。1)介入は順調に継続して終了した。本研究では公民館区を単位として、対照地区3地区、介入地区9地区が設定されているが、介入は1情報提供、2教育機会、3サポート環境、の3つの側面に整理して実施した。適宜、介入戦略会議を開催して研究者代表者、分担者と現地スタッフ(研究協力者)で介入の方向性を確認した。平成25年度は4月、6月、10月に現地での会議を行った。2)5年後調査を計画通りに終了した。4249名に調査票を郵送し、3533名から回答を得た。データ入力を行い、現在データクリーニング中である。3)これまで収集したデータの分析を進めた。ベースライン評価のデータを用いた論文が採択された。また、3年後評価データを用いた論文を投稿し、現在under review(再投稿済み)である。その他、体力科学、運動疫学研究、介護福祉・健康づくり、運輸と経済等の雑誌に関連する論文を発表した。また、日本公衆衛生学会においてポピュレーション・アプローチに関するシンポジウムを行った。以上のように、研究は計画通り進んでいる。27年度が最終年度であるため、記入しない。公衆衛生学計画通りに進行しており、平成27年度も当初の計画に沿って研究を実施する。1)死亡、要介護認定の状態の把握:行政情報により介入開始5年後(平成26年10月)時点における死亡・要介護認定状態の確認作業を進める。要介護認定状態については、要介護度のみならず、主治医の意見書より情報を抽出し、データベース化する。3)論文化:現在、平成24年度調査結果(3年後調査結果)を分析し論文として投稿中である。本年は、5年後調査結果についても分析を進め、適宜論文化を行う。
縄文系弥生人と渡来系弥生人の耳垢型決定遺伝子の解析

2006年にABCC11遺伝子上の一塩基多型(rs17822931)が耳垢の湿型、乾型のタイプを決定していると明らかにされたのを受けて、弥生時代人骨への応用を試みた。佐賀県鳥栖市の安永田遺跡出土の渡来系弥生人骨51例について、試行錯誤の中、微量の核DNAからでも高感度なタイ。ピング結果を得られるTaqMan-PCR法による遺伝子解析を行った結果、5例の耳垢遺伝子の型を決定することができた。その内訳はGA(表現型は湿型)が3例、AA(表現型は乾型)が2例であった。今年度前半期は、佐賀県鳥栖市安永田遺跡出土の渡来系弥生人骨31体の試料から耳垢型決定遺伝子(ABCC11上のrs17822931)の解析を試みて、12体の耳垢型を導き出し、渡来系弥生人にも乾型だけではなく湿型も存在していることが示された。その成果の一部は、日本人類遺伝学会第52回大会で発表した。渡来系弥生人の耳垢の乾型、湿型頻度は、渡来系弥生人の原郷や移動の問題とも関連しており、その意義は大きい。古人骨のDNA解析の作業過程において、起こりうる最大の問題はコンタミネーション(DNAの汚染)である。私たちは、作業環境や器具を清潔にすることはもちろん、ディスポーダブルの白衣、手袋、帽子、マスクの着用、DNA抽出とPCRの作業でピペットを別にすること、クリーンベンチあるいは隔離された部屋での作業、フィルターチップの使用などを講じており、コンタミネーションの原因をできるだけ排除している。しかしながら学会発表において、コンタミネーションの可能性も否定できないのではないかとの指摘を受け、新たに次のような基準を設けた。(1)耳垢型決定遺伝子を解析する前にミトコンドリアDNAが解析されている。解析の結果、スタッフおよび古人骨の整理等に携わった人と塩基配列が一致した場合には除外する。(2)古人骨の耳垢型遺伝子の特定には、少なくとも5回以上の解析結果から行う。現在、この基準の下に、安永田遺跡出土の弥生人骨試料を再度解析しているところである。来年度は渡来系弥生人骨の解析数を増やすとともに、縄文系弥生人の解析にも着手したい。昨年度設定した基準((1)耳垢型決定遺伝子を解析する前にミトコンドリアDNAが解析され、スタッフおよび古人骨の整理等に携わった人と塩基配列が一致した場合には除外する、(2)耳垢型遺伝子の特定には、少なくとも5回以上の解析結果から行う)にしたがって、佐賀県安永田遺跡出土の渡来系弥生人骨43体の試料から耳垢型決定遺伝子(ABCC11上のrs17822931)の解析を試みた。ミトコンドリアDNA解析は、D-loop HV1領域を行った。43例中26例で増輻がみられたが、実験者と塩基配列が一致した4例を除く22例のDNAサンプルについて、耳垢遺伝子の解析を進めた。PCRは2段階で行い、1段目で123塩基対(プライマーを含む)、2段目で94塩基対を増幅した。それぞれのサンプルについて18回のPCRを行った結果、1回以上増幅したものは14例であったが、基準の5回をクリアしたのは2例であった。2例の遺伝子型はGA(湿型)が1例、AA(乾型)が1例である。これらの成果は日本人類遺伝学会第53回大会で発表したが、上記の方法では効率が悪いことが明らかとなったので、現在はPCRで増幅させる塩基対をさらに短くして解析を進めているところである。昨年度および今年度の研究で、古人骨のゲノムDNA解析は、ミトコンドリアDNA解析に比べると極端にPCR増幅率が低下することが明らかとなった。しかしながら、古人骨からも耳垢遺伝子の解析が可能であることも、また明らかとなった。本研究は、日本人の由来や形成の問題にも関わることなので、慎重にまた辛抱強く行っていきたい。昨年に引き続き、設定した基準((1)耳垢型決定遺伝子を解析する前にミトコンドリアDNAが解析され、スタッフおよび古人骨の整理等に携わった人と塩基配列が一致した場合には除外する、(2)耳垢型遺伝子の特定には、少なくとも5回以上の解析結果から行う)にしたがって、佐賀県安永田遺跡出土の渡来系弥生人骨試料から耳垢型決定遺伝子(16番染色体ABCC11遺伝子上のrs17822931)の解析を試みた。

昨年度の方法(PCRは2段階で行い、1段目で123塩基対(プライマーを含む)、2段目で94塩基対を増幅)では、各サンプルについて18回のPCRを行った結果、1回以上増幅したものは22例中14例で、そのうち基準の5回をクリアしたのは2例と極端に効率が悪かったので、今年度は増幅させる塩基対を最大限短く設定(プライマーを含めて46塩基対)するとともに、少量のゲノムDNAからでも高感度なタイピング結果を得られるTaqMan-PCR法を用いて解析を行うことにした。この方法では複数のプライマーセットを用いて、Multiplex PCRも可能であり、サンプルを有効に活用できる利点もある。現在も分析は進行中であり、現段階で大きな成果を得ることはできていないが、少なくとも本研究を進める中で渡来系弥生人の耳垢のタイプは乾型がほとんどを占めているわけではなく、湿型もある程度存在していることが明らかとなった。本研究は、日本人の由来や形成の問題にも関わることなので、今後も慎重にまた辛抱強く行っていきたい。
高品質ミカン安定栽培に資する深層強化学習かん水技術開発

三重県熊野市の極早生ミカンは東紀州地域の特産品であり皮が青い時季に食べられ、出荷時期が早いことから他産地品種との競争力が高い。しかし、高齢化に伴う人手不足から高品質ミカンの安定生産が難しいことが、大きな課題となっている。本研究では安価な可視光画像を用いる強化学習ディープラーニングネットワークによって、熟練者のかん水技術に匹敵する自動かん水制御を実現し「高品質ミカンの安定生産」を可能にするものである。また、本研究により得られた知見を横展開することで、全国の果樹生産技術の向上を目指す。本研究による安価な自律かん水システムは、日本における様々な分野の農業において、応用可能な可能性を秘めた技術である。
電磁・圧電ハイブリット・アクチュエーション・システムの研究

本研究で最も重要な要素である、高速で動作する圧電ブレーキの検討を中心に行った。本年度計画していたディスクブレーキを検討したが、実現可能な変位と発生力を得るためには積層圧電アクチュエータ(MPA)が多数必要で実現性の乏しい大型構造になることがわかった。そのため、小さな接触力でも自己倍力作用によって大きなブレーキトルクが望めるドラムブレーキの検討を、昨年度までの研究で明らかになっていた問題点の改善を中心に試みた。1つのMPAと変位拡大機構からなるブレーキアクチュエータ(BA)と回転ドラムを接触させブレーキトルクを発生する構成である。改善点を以下に示す。1.MPAが発生できる変位は微小であるため、本年度は弾性ヒンジと剛体梁を用いて2段階に変位を拡大する、従来の変位拡大機構より効果的な構造を考案した。2.また、BAに取り付けたブレーキシューを摩擦力の大きな材質に変更し、接触面の加工精度を向上させた。予圧による引っ張り力に耐えられるMPAを用いて直径10cm程度のネガティブ・ドラム型圧電ブレーキを有限要素法解析により設計・試作した。実験の結果、変位拡大機構は計算どおりに動作し、高速応答性に優れていた。残留振動が大きかったが駆動波形により低減できた。しかし、ブレーキトルクは僅かにしか変化しなかった。変位拡大機構で拡大された変位が摩擦面で吸収されたことが原因であった。また、組立精度も精密に要求されるため、直径が10cm程度の圧電ブレーキの実現は容易でないと思われる。しかし、小型なブレーキであれば実現の可能性が高いと考えられ、マイクロ・電磁・圧電ハイブリット・アクチュエーション・システムの発想に至った。また、ACサーボモータと超音波モータのダイナミックスを考慮して、購入したDSPにより制御システムの構築を試みたが圧電ブレーキ/クラッチが実現していないため、有効性は確認できていない。積層圧電アクチュエータ(MPA)を用いてドラム型圧電ブレーキの設計および試作を行った。無電界でブレーキが作動する構成である。設計は購入したパーソナルコンピュータにより有限要素法を用いて行った。試作したブレーキの構成を以下に述べる。このブレーキはMPAと変位拡大機構からなるブレーキアクチュエータ(BA)、ホイール、固定治具、与圧調節器から構成されている。変位拡大機構はSUS製あり、二等辺三角形状の底辺付近にMPAを配置し、MPAの伸びによって、向い合う頂点を大きく変位させる。頂点部分はT字状になっており、先端にはブレーキシューが配置されている。同じBAを2つ作成し、治具に与圧調節器を介して固定し、同心配置された直径131mmのホイールの内側にブレーキシューを与圧調節して接触させる。MPAに電界を加えるとホイールとブレーキシューが分離して、ブレーキを解除する。購入したピエゾドライバーによってBAを駆動させたところ、変位拡大機構はMPAの発生変位を3倍程度に拡大させることができた。また、立上がり、立下りの変位応答時間はそれぞれ530μs、445μsであり,高速な応答特性が実現できた。さらに、圧接力変化は25Nであり、立上がり時220μs、立下り時240μsで高速に応答した。また,0.85Nmのブレーキトルクが得られた。これは小型電磁モータを制動するに十分なブレーキトルクと思われ、電磁・圧電ハイプリット・システムに応用可能な高速圧電ブレーキが実現できた。しかし、ホイールの回転位置により圧接力が変化するため、ブレーキトルクの回転ムラが生じていた。数μmの微小変位を取り扱うため、部品の製作精度および組み立て精度が本試作・実験では不十分であったためと思われる。また、ピエゾドライバーの定格電流を超えたため電流が抑制され、応答速度がやや遅くなったと考えられる。今後、製作精度の向上とより高速なドライバーの検討を行い、性能を改善する必要がある。昨年度に設計・試作した積層圧電アクチュエータ(MPA)を用いたドラム型圧電ブレーキの改良を行った。前回試作したブレーキはMPAを数多く使用するため、静電容量が非常に大きく、大きな突入電流が流れた。したがって、駆動回路の電流容量を大きくする必要があり、消費電力、応答性、回路の小型化に関して問題点があった。今年度はこれらの問題点を解決すべく、基本構成の再検討も含めて、性能向上を試みた。設計は前年度購入したパーソナルコンピュータにより有限要素法を用いて行った。変更点を以下に述べる。以前のブレーキではMPAを8個使用していたが、1個のMPAと変位拡大機構からなるブレーキアクチュエータ(BA)の構成を考案した。変位拡大機構はSUS製の弾性梁の作用点変位をてこの原理を用いて拡大するシンプルな構造である。弾性梁の片端にMPAを配置し、MPAの伸び変位によって、先端にブレーキシューが接着された他端を大きく変位させる。弾性梁の他端を予めバネによりホイールに予圧し、MPAに電界を加えるとホイールとブレーキシューが分離して、ブレーキを解除する構成である。荷重と変位の関係を計算し、梁の長さ、予圧の位置等を決定した。変位拡大機構は計算どおりに動作したが、ブレーキトルクは僅かにしか変化しなかった。有限要素法解析により、弾性梁の曲げ変位によりブレーキシュー表面に回転変位が発生し、ホイールと分離しない部分があることが、ブレーキトルクが変化しない原因と判明した。しかし、実証にはまだ至っていない。

また、購入したACサーボモータと超音波モータのダイナミックスを考慮し、連動・制御させる場合の制御要素の同定を試みたが未だ完了していない。ブレーキおよびクラッチに要求される性能を理論上において洗い出し、理想時において、購入したDSPにより制御可能であるかの理論的検証を行った。未だ検討中である。本研究で最も重要な要素である、高速で動作する圧電ブレーキの検討を中心に行った。本年度計画していたディスクブレーキを検討したが、実現可能な変位と発生力を得るためには積層圧電アクチュエータ(MPA)が多数必要で実現性の乏しい大型構造になることがわかった。そのため、小さな接触力でも自己倍力作用によって大きなブレーキトルクが望めるドラムブレーキの検討を、昨年度までの研究で明らかになっていた問題点の改善を中心に試みた。1つのMPAと変位拡大機構からなるブレーキアクチュエータ(BA)と回転ドラムを接触させブレーキトルクを発生する構成である。改善点を以下に示す。1.MPAが発生できる変位は微小であるため、本年度は弾性ヒンジと剛体梁を用いて2段階に変位を拡大する、従来の変位拡大機構より効果的な構造を考案した。2.また、BAに取り付けたブレーキシューを摩擦力の大きな材質に変更し、接触面の加工精度を向上させた。予圧による引っ張り力に耐えられるMPAを用いて直径10cm程度のネガティブ・ドラム型圧電ブレーキを有限要素法解析により設計・試作した。実験の結果、変位拡大機構は計算どおりに動作し、高速応答性に優れていた。残留振動が大きかったが駆動波形により低減できた。しかし、ブレーキトルクは僅かにしか変化しなかった。変位拡大機構で拡大された変位が摩擦面で吸収されたことが原因であった。また、組立精度も精密に要求されるため、直径が10cm程度の圧電ブレーキの実現は容易でないと思われる。しかし、小型なブレーキであれば実現の可能性が高いと考えられ、マイクロ・電磁・圧電ハイブリット・アクチュエーション・システムの発想に至った。また、ACサーボモータと超音波モータのダイナミックスを考慮して、購入したDSPにより制御システムの構築を試みたが圧電ブレーキ/クラッチが実現していないため、有効性は確認できていない。
タンパク質脱リン酸化酵素選択的阻害剤としてのカリクリンＡ誘導体ライブラリーの構築

特異的かつ強力なタンパク質脱リン酸化酵素阻害剤であるカリクリンAの構造から、まず活性発現に必須な部分構造を抽出し、ライブラリー化の基盤となる合成目的分子を設定した。その構造には酵素阻害活性に重要なリン酸エステル基、1,3ージオールを含み、さらにテトラエンに相当する疎水性部分構造を種々入れかえることで、ライブラリーの作製を目指した。疎水性側鎖の導入には官能基共存性の高いクリックケミストリーを利用するために、末端アルキンを合成目的分子に導入し、市販のアジド化合物との縮合を計画した。従来の方法では市販のD-グルタミン酸を出発原料に用いてラクトン環形成後、メタノリシス、位置選択的DIBAL還元、アリルインジウム試薬を用いた立体選択的プレニル化反応、オゾン酸化、不斉クロチル化を経て、13位に相当する水酸基の側鎖を含む誘導体の合成を行っている。この方法はスピロケタール環の合成にも展開可能なことから、より天然物に近い構造を目指した合成経路として立案した。しかし、この経路には位置選択的DIBAL還元等の収率の低い行程が含まれているため、簡便なライブラリー合成を目指すには、より短行程の合成経路が望ましい。そこで、出発原料を市販のパントラクトンに変更し、新たな合成経路を立案した。パントラクトンを出発原料とする新たな合成経路では工程数が従来の半分で済む事から、より簡便なライブラリー合成が期待できる。さらに新たな合成経路の確立を目指して各種条件を検討した。26年度が最終年度であるため、記入しない。その構造には酵素阻害活性に重要なリン酸エステル基、1,3ージオールを含み、さらにテトラエンに相当する疎水性部分構造を種々入れかえることで、ライブラリーの作製を目指す。疎水性側鎖の導入には官能基共存性の高いクリックケミストリーを利用するために、末端アルキンを合成目的分子に導入し、市販のアジド化合物との縮合を行う。現在、新たな合成経路の確立を目指して条件検討を進めている。パントラクトンを出発原料とする合成経路の確立に向けて鋭意検討を進めている。新たな合成経路が確立できれば、より簡便にライブラリー作製が可能となる。新たに立案したパントラクトンを出発原料とする合成経路では従来の合成経路よりも工程数が大幅に削減されていることから、より簡便なライブラリー合成が期待できる。まずはこの新たな合成経路を確立し、第一世代ライブラリーを作製して、阻害活性評価を行う。その結果をもとに、第二世代ライブラリーではより高精度な阻害剤設計を目指す。
Toxin-antitoxin分子基盤の解明と核酸編集技術・細胞応答制御への応用

Toxin-Antitoxin (TA)システムは、原核生物において、ストレス応答やプログラム細胞死を担うとされる。そのTAシステムの中で、RNAを配列特異的に切断するtoxinであるMazF(エンドリボヌクレアーゼ)に着目し、病原性微生物、難培養微生物、極限環境微生物由来のMazFを調製し、次世代シーケンサーを用いて、それらの認識・切断RNA配列の同定することに成功した。そこから得られた知見に基づき、TAシステムの分子認識機能や生理機能を考察するとともに、取得した各種MazFをベースとする核酸編集技術への応用や、細胞外致死因子の探索システムの構築などを試みた。本研究は、原核生物におけるプログラム細胞死を担うToxin-Antitoxin (TA)システムのうち、RNAを標的とし、特異的なRNAを切断するtoxin(RNAインターフェレンス)と、その標的RNAならびにantitoxinの相互作用に焦点を当て、それらの分子認識機構を原子レベルで考察し、獲得した知見を、核酸編集技術・細胞応答制御に応用することを目的とする。当該年度においては、様々な生物種由来のTA遺伝子群のうち、病原菌由来のtoxinと、難培養微生物由来toxinを複数選定し、それらがコードするtoxin蛋白質分子(RNAインターフェレンス)の発現・精製を行った。そして、調製したRNAインターフェレンスと、標準RNAを反応させ、次世代シークエンサーを用いて、RNAインターフェレンスの認識配列を同定することに成功した。多種多様なtoxinを取得し、RNAインターフェレンスライブラリーを構築することで、遺伝子工学ツール(RNA制限酵素)としての利用や、特異的な遺伝子発現の制御、さらにはRNA分子標的医薬品の開発などへの応用が期待される。今後はTAシステムに関する既存のデータや配列情報、変異解析などを組み合わせ、RNAインターフェレンスの特異性変換、高活性化、高安定化などに挑戦し、RNA切断レパートリーの拡充と高機能化に取り組む。また、現在、病原菌由来のtoxin(RNAインターフェレンス)を活性化させる(毒性を誘起する)細胞外致死因子候補を、迅速に取得できるようなスクリーニングシステムの構築に着手している。それと並行して、toxin/antitoxin/標的(認識)RNAについて、その機能や安定性、特異性・親和性の創出機構について多角的に解析し、細胞増殖促進/抑制因子に関する分子基盤的知見を獲得することで、将来的に新規抗生物質の開発などに繋げることを目指す。当初のH27年度の計画としては、「I.Toxin(RNAインターフェレンス)、Antitoxin分子の選択と調製」と、「II.RNAインターフェレンスの標的RNA配列の同定とライブラリー化」を予定していた。Iについては、様々な生物種由来のTA遺伝子群のうち、toxinがRNAインターフェレンスの機能を有するtoxin-antitoxin蛋白質ペアの中から、“病原菌由来TA;RNAインターフェレンスを活性化させる(毒性を誘起する)細胞外致死因子の探索"と“難培養微生物由来TA;毒性(成長阻害)抑制因子の探索"という視点から複数のターゲットを選定し、それらTAシステムについて、toxin分子を中心に、発現ベクターの作製を行い、各種蛋白質分子(RNAインターフェレンス)の培養・精製に成功した。IIについては、上記Iで精製したRNAインターフェレンス(toxin)を使用して、標準RNAの切断反応を行った。そして、次世代シークエンサーでそのRNA切断部位を解読し、RNAインターフェレンスの認識配列を同定した。並行して任意の(特異的な)RNAに対する切断活性についても蛍光消光現象を用いて評価した。これら一連の実験・解析により、認識・切断配列が異なる複数種の新規RNAインターフェレンスの取得に成功した。現在は、RNAインターフェレンスライブラリーの拡充と新規RNAインターフェレンスの創製を視野に入れて、“特徴的な生物種由来あるいは特徴的な配列をコードするTAシステム"についても選定を行い、発現・精製の準備を進めているところである。以上の進捗を踏まえ、(2)おおむね順調に進展している、という評価に至った。本研究は、原核生物におけるプログラム細胞死を担うToxin-Antitoxin (TA)システムのうち、RNAを標的とし、特異的なRNAを切断するtoxin(RNA interferase)と、その標的RNAならびにantitoxinの相互作用に焦点を当て、それらの分子認識機構を原子レベルで考察し、獲得した知見を、核酸編集技術・細胞応答制御に応用することを目的とする。当該年度においては、難培養微生物である硝化細菌Nitrosomonaseuropaeaの染色体上に存在する遺伝子座(NE1181)がコードするtoxinタンパク質MazF(NE1181)が、RNA配列AAUを特異的に認識・切断すること、そしてペアであるantitoxinタンパク質MazE(NE1182)共存下において、そのRNA切断活性(毒性)が抑制されること、を明らかにした。今後もこのような難培養微生物のTAシステムについて検証を重ね、毒性活性の抑制(TAシステムの制御)に関する知見を蓄積することで、これまでは未利用であった有用な難培養微生物の産業応用が期待される。さらに、複数の病原菌由来のtoxinについて、次世代シークエンサーを用いて、その特異的な認識・切断RNA配列を同定することにも成功した。それらtoxinに対するantitoxinの結合(中和化・無毒化)を阻害し、toxinを活性化させる(毒性を誘起する)細胞外致死因子候補を探索することで、新規抗生物質の開発の足がかりとなる情報の提供に貢献していく。そして、多種多様なtoxinを取得することで、RNA interferaseライブラリーを構築し、遺伝子工学ツール(RNA制限酵素)の実現化を目指す。