hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
ため池堤体の弾性波速度モニタリングを活用した耐震性評価手法の開発

ため池堤体の耐震性評価を精度よく実施するには、小・中規模地震時における対象ため池の挙動をフィードバックし、大規模地震時の挙動を推測することが有効である。本研究では、ため池が地震動を受けた際に生じる堤体の弾性波速度変化に着目し、ため池堤体土が非排水繰返し載荷を受けた時の弾性波速度変化を詳細に求めた。その結果、同じ地震動を受けた場合、ため池堤体土の密度が低いほど弾性波速度の低下率が大きくなることが分かった。また、累積損傷度理論を用いて不規則な地震荷重が作用した時の弾性波速度の推定を試みた。平成25年度の研究計画および目的は、1.予備試験により弾性波速度を測定する頻度および応力状態を設定する、2.拘束圧が繰返し載荷中における弾性波速度変化へ与える影響を明らかにする、3.載荷速度が繰返し載荷中における弾性波速度変化へ与える影響を明らかにする、であった。繰返し載荷中の応力状態と弾性波速度の関係については、繰返し載荷中に等方、圧縮および伸張といった様々な応力状態で弾性波速度を計測することにより、弾性波速度の低下が等方応力状態よりもせん断力が作用している圧縮および伸張状態で大きくなることを明らかにした。弾性波速度の拘束圧依存性については、圧密応力を段階的に載荷しながら弾性波速度を計測することにより、拘束圧と弾性波速度の関係を明らかにした。また、繰返し載荷前の拘束圧に異なる値を採用した試験を実施し、初期拘束圧の相違が繰返し載荷中の弾性波速度変化に与える影響を明らかにした。圧密時と同じ等方応力状態の場合、繰返し載荷前の拘束圧が異なっていても拘束圧と弾性波速度の関係はほぼ同一のものとなった。ただし、せん断力が作用している圧縮および伸張応力条件では、等方応力条件よりも弾性波速度は小さくなった。繰返し載荷時の載荷速度が弾性波速度に与える影響については、繰返し載荷の載荷周波数を変化させることにより検討を行った。異なる載荷周波数を採用した試験結果を比較すると、いずれも同じ傾向で弾性波速度は低下した。これより、繰返し載荷中における弾性波速度の低下に対する載荷周波数依存性は小さいことが明らかとなった。平成26年度の研究計画および目的は、1.ため池堤体土の物性が弾性波速度変化へ与える影響の解明、2.ため池堤体土の密度が弾性波速度変化へ与える影響の解明、3.繰返し載荷に伴う弾性波速度変化メカニズムの解明、であった。物性が弾性波速度変化へ与える影響については、砂試料と細粒分を含む試料に対して繰返し載荷中の弾性波速度変化を計測する実験を行った。その結果、本実験で用いた試料の物性の範囲では、物性が繰返し載荷中の弾性波速度変化に与える明確な影響は確認されなかった。密度が弾性波速度変化へ与える影響については、同一の試料を異なる乾燥密度に締固めた供試体を用いた実験を行った。その結果、同じ繰返し応力振幅比で同じ弾性波速度低下率を生じさせるのに要する繰返し載荷回数は、乾燥密度の増加に伴って大きくなった。これは、同じ地震動を受けた時、堤体土の密度が低いほどため池堤体の弾性波速度が大きく低下し、不安定になることを示している。これより、本研究で用いた試料の物性の範囲では、試料の物性よりも乾燥密度の方が繰返し載荷中の弾性波速度変化へ影響を与える影響が大きいことが明らかとなった。繰返し載荷に伴う弾性波速度変化メカニズムについては、弾性波速度の低下率と平均有効主応力の間に明確な相関性が確認されたことから、間隙水圧の上昇に伴う有効応力の減少が弾性波速度変化の主な原因であることが明らかとなった。しかしながら、供試体にせん断応力が作用している圧縮および伸張応力状態では、弾性波速度が平均有効応力の減少に応じた値よりも小さくなっており、その減少率は供試体に発生したひずみが大きいほど大きくなった。これより、繰返し載荷に伴う弾性波速度の減少は、間隙水圧の上昇による有効応力の減少と供試体が変形することによる構造の変化に起因することが明らかとなった。H27年度の目的は、1.実際のため池で観測された地震動および堤体の弾性波速度変化データを標準劣化モデルと対応させるため、地震動のような不規則荷重を与える繰返し載荷試験を実施すること、2.研究期間内に蓄積した知見を整理し、ため池堤体材料の物性および密度から繰返し載荷に伴う弾性波速度変化を推定する標準劣化モデルを作成する、であった。不規則荷重を与える繰返し載荷試験については、阪神・淡路大震災および東北地方太平洋沖地震で観測された不規則な地震波形を対象に繰返し載荷試験を実施した。sin波形を用いた試験結果(H26年度に実施)に累積損傷度理論を適用して推定した地震時の弾性波速度変化と、実際に不規則荷重を与えた際の弾性波速度変化を比較したところ、繰返し載荷回数の累積に伴う弾性波速度の変化傾向は類似したものとなった。しかしながら、推定値と実測値の値そのものを比較すると、両者には差が残されたため精度の高い推定のためにはさらなる検討が必要である。標準劣化モデルの作成については、繰返し載荷に伴う弾性波速度の変化が当初想定していたよりも複雑であったため、ため池堤体材料の物性および密度に応じて類型化し、標準劣化モデルを作成するには至らなかった。

しかしながら、物性と密度に応じた弾性波速度の変化に関する基本的な傾向については把握することができたため、今後のデータの蓄積と分析により標準劣化モデルを作成できるものと考えている。ため池堤体の耐震性評価を精度よく実施するには、小・中規模地震時における対象ため池の挙動をフィードバックし、大規模地震時の挙動を推測することが有効である。本研究では、ため池が地震動を受けた際に生じる堤体の弾性波速度変化に着目し、ため池堤体土が非排水繰返し載荷を受けた時の弾性波速度変化を詳細に求めた。その結果、同じ地震動を受けた場合、ため池堤体土の密度が低いほど弾性波速度の低下率が大きくなることが分かった。また、累積損傷度理論を用いて不規則な地震荷重が作用した時の弾性波速度の推定を試みた。平成26年度に実施予定の試験を計画通り行い、繰返し載荷に伴う弾性波速度変化にため池堤体土の物性と乾燥密度が与える影響を明らかにしたため、平成26年度の研究は順調に進展している。平成26年度の研究目的を計画通り達成し、ため池堤体土の条件が繰返し載荷に伴う弾性波速度変化に与える影響を明らかにしたことから、平成27年度に外力側の影響因子である地震荷重の不規則性について検討を行うことができる。地盤工学平成27年度は、1.弾性波速度を指標とした不規則荷重から規則的荷重への変換手法の開発、2.弾性波速度変化の観測データを活用した耐震性評価手法の開発、を目的として検討を行う。具体的には、同じ条件の供試体に規則的な荷重と地震荷重を模擬した不規則な荷重を作用させる実験を行う。それら実験の結果を比較し、弾性波速度変化に繰返し荷重の不規則性が与える影響を明らかにする。また、本研究課題で実施した実験データを総合的に分析し、地震動および弾性波速度変化の観測データを活用したため池の耐震性評価手法を開発する。平成25年度に実施予定の試験を計画通り行い、作用応力状態と弾性波速度の関係、拘束圧と弾性波速度の関係、載荷速度と弾性波速度の関係を明らかにしたため、平成25年度の研究は順調に進展している。平成25年度の研究目的を計画通り達成できたことから、平成26年度に実施予定の、「材料の物性と繰返し載荷に伴う弾性波速度変化の関係を評価」での試験条件を設定することができる。平成27年度の目標である「弾性波速度を指標とした不規則荷重から規則的荷重への変換手法の開発」をより高い精度で達成するため、実験にかかる経費として使用するため。また、成果発表のための旅費および論文投稿料を確保するため。平成26年度は、1.ため池堤体土の物性が弾性波速度変化へ与える影響の解明、2.ため池堤体土の密度が弾性波速度変化へ与える影響の解明、を目的として検討を行う。具体的には、1.ため池堤体土の物性調査結果に基づき、堤体土として想定される材料を複数選定する。2.それらの材料を用いて繰返し載荷試験を実施し、材料の物性と繰返し載荷に伴う弾性波速度変化の関係を明らかにする。3.上記の材料を異なる密度で締固めた供試体を用いて繰返し載荷試験を実施し、密度の相違と繰返し載荷に伴う弾性波速度変化の関係を明らかにする。次年度使用額は、同じ条件の供試体に規則的な荷重と地震荷重を模擬した不規則な荷重を作用させる実験にかかる経費および成果発表のための旅費および論文投稿料にあてる。購入した機器の想定価格(カタログでの値)と実際に見積りをとった際の価格が完全に一致せず、端数が生じたため。次年度使用額は、平成26年度に行う実験で使用する消耗品の購入にあてる。
冠状動脈バイパスグラフトのMR Angiographyの研究

【目的】冠状動脈バイパスグラフト(coronary artery bypass grart:CABG)術は、虚血性心疾患の外科的治療法として確立されている。このCABGの開存性の評価は術後患者の経過観察の上で重要である。その評価には血管造影法が用いられているが侵襲を伴う検査法であるために、非侵襲的な診断法の確立が望まれていた。そこで近年発展の著しいMRangiography(MRA)を用いて、これを血管造影にかわり得る精度の高い非侵襲的検査法として臨床的に使用可能にすることを目的とした。【方法・成果】基礎的研究: 34本の内胸動脈グラフト(ITA)と23本の伏在静脈グラフト(SVG)に対して術中に径と血流速度の計測を行った。ITAの平均径は2.0mmで、平均血流速度は45.2ml/minであった。SVGの平均径は吻合部での計測で2.1mm、平均血流速度は68.6ml/minであった。血管径・血流速度ともに吻合した冠状動脈の還流領域の広さによって規定される傾向が見られた。臨床的研究:装置はGE製Signa(1.5T)を用いた。108本のCABGを対象にtime-of-flight法(FASTCARD法)で撮像した結果では、ITAはsensitivity、specificityともに100%で、SVGではsensitivityが95%、specificityが83%であり、臨床的な使用も可能と考えられた。また、ごく最近になり可能となった造影剤(Gd-DTPA)を用いた3D-MRAも5本のグラフトに対して試みたが、FASTCARD法と比較して高空間分解能の画像を短時間で得ることが可能であり、今後の発展が期待された。MRAの欠点としてはグラフトと冠状動脈の吻合部の描出が30%程度と低い点があげらられ、今後さらに検討を加えて描出率の改善を図りたい。平成9年度の研究実施計画に則り冠状動脈バイパスグラフト術が施行された。28例57本のグラフト(計画では20例40本)について解剖学的・生理学的な測定を行った。57本のグラフトの内訳は、内胸動脈グラフトが34本(左側24本、右側10本)で、動脈グラフトが23本であった。動脈グラフトの径は1.5mm4.5mmで平均(2.1mm)で、術中に計測した流量は10110ml/min(平均45.2ml/min)であった。有意な左右差は見られなかった。一方、静脈グラフトの径は27mm(平均4.4mm)であったが、冠状動脈との吻合部の径は平均2.0mmであった。、流量は17140ml/min(平均68.6ml/min)であった。動脈グラフト、静脈グラフトともに流量に強い偏差が見られた。この結果をもとにMRAの撮像シーケンスを検討した。具体的にはグラフトの最小径が1.5mmであったので、空間分解能をこれに対応するためphase encodeを従来の128から192あるいは224へと変更した。流量については流量の多いものについてはエコー時間の短縮のみで対応が可能であったが、流量の遅いものについては、flow compensationの付加とslice厚を薄くすることで対応したが十分な結果が得られなかった。これについては、造影剤の使用が有効であることが判明しつつあるので、今後も重ねて検討したい。これらの結果を踏まえ、25例60本のグラフトについて臨床応用を行った。有病正診率および無病正診率を血管造影法との比較により検討を行うための症例を順調に蓄積しつつある。また、画像表示法についてはMIP法や3D表示法などの具体的な画像表現方法を購入したコンピュータを用いてカラー表示も含めて検討中である。

また、ごく最近になり可能となった造影剤(Gd-DTPA)を用いた3D-MRAも5本のグラフトに対して試みたが、FASTCARD法と比較して高空間分解能の画像を短時間で得ることが可能であり、今後の発展が期待された。MRAの欠点としてはグラフトと冠状動脈の吻合部の描出が30%程度と低い点があげらられ、今後さらに検討を加えて描出率の改善を図りたい。
Ｓ１Ｐ受容体アンタゴニストとIL-2・抗IL-2免疫複合体による関節リウマチ治療

マウス関節炎に対するIL-2IC(免疫複合体)の有効性を調べた。免疫後IL-2ICを21-23日目に投与した。早期効果を見るには免疫後0ー2日後迄IL-2ICを投与した。CIAマウスの関節炎発症の頻度と炎症の程度はどちらの実験でも抑制された。IL-2ICはコントロールより血中の制御性T細胞(Treg)を2倍に増やし滑膜へのTh1とTh17の浸潤を抑制した。IL-2IC処置した脾臓でCD4+T細胞によるIL-10産生が4倍増強した。IFN-γ産生Th1とTh17産生ヘルパーT細胞(Th17)は有意に減少した。IL-2ICはTregを誘導しIL-10産生を増強することでTreg機能を増強させる。S1P受容体アンタゴニストとIL-2/IL-2抗体免疫複合体の併用投与による新規RA治療法の開発を検討している。今回、DBA/1マウスにII型コラーゲンとComplete Adjuvant Freundをエマルジョンにして尾根部に皮下注射し一次免疫を行った。一次免疫21日後に、II型コラーゲンとIncomplete AdjuvantFreundを同様にエマルジョンにして皮下注射し二次免疫を行い、関節炎を誘導した。マウスrecombinant IL-2(1μg)と抗マウスIL-2抗体(JES-6.1:5μg)を15分間試験管内で反応させ、IL-2ICを作成し投与した。実験群は1)コントロール群(PBS投与群)、2)IL-2IC投与群に分けた。PBSとIL-2ICの投与は一次免疫後投与する群と二次免疫後に投与する群に分け、3日間連続腹腔内投与を行った。RAの治療効果は、関節腫脹スコアと病理組織学的解析で評価した。病理組織学的解析は手関節をHE染色ならびにIL-6、IL-17、TNFαで免疫染色し、評価した。Tregの解析は治療後末梢血、脾臓、ならびにリンパ節を関連抗体によるで多重染色しフローサイトメトリーにて解析した。その結果、IL-2IC投与1週間後の末梢血中のCD4+CD25+Foxp3+Tregの割合は、コントロールPBS投与群の約2倍に増加していた。関節腫脹スコアはIL-2ICを一次免疫後投与した群、二次免疫後投与した群、いずれにおいても、PBS群と比較して優位に抑制できていた。また、病理組織学的所見でも、HE染色ではPBS投与群と比較してIL-2IC投与群で優位に関節組織へのリンパ球浸潤が抑制できていた。免疫染色ではIL-6、IL-17、TNFαの発現はIL-2IC群で抑制されていた。上記のように、関節炎のモデルマウスにS1P受容体アンタゴニストとIL-2/IL-2抗体免疫複合体の併用投与し、関節炎の抑制効果とその機序について、研究を行い成果が出てきつつある。一部は学会で発表している。今後、さらにその成果を発展させるため研究を行っている。【方法】DBA/1マウスにII型コラーゲンとComplete Adjuvant Freundをエマルジョンにして尾根部に皮下注射し一次免疫を行う。一次免疫21日後に、II型コラーゲンとIncomplete AdjuvantFreundを同様にエマルジョンにして皮下注射し二次免疫を行い、関節炎を誘導する。IL-2IC投与による治療効果は関節腫脹スコア並びに病理組織学的に評価する。Tregの抑制能は各群のマウス脾臓から調整したCD4+CD25-細胞をCFSEで標識し、CD4+CD25+細胞を共培養しFACSで解析した。細胞内サイトカインはリンパ節と脾臓から調整した細胞を染色し、FACSで解析する。【結果】関節腫脹スコアはIL-2IC群において、PBS群より有意に抑制された。また、病理組織学的所見でも、IL-2IC群で有意に関節組織へのリンパ球浸潤が抑制された。脾臓及びリンパ節のTreg細胞数とTregのIL-10発現は、IL-2IC投与により有意に増加していた。また、脾臓CD4+T細胞のIFN-g,IL-17の発現はIL-2IC投与により減少していた。【考察】CIAにおいて、IL-2ICは関節炎を抑制した。その作用機序としてTreg細胞数のみならず、Treg活性も増強し、IFN-g、IL-17の発現を抑制することが示唆された。CIAにおいて、IL-2ICは関節炎を抑制することを証明した。さらに、その作用機序としてIL-2ICによりTreg細胞数のみならず、Treg活性も増強し、CIAにおいてTh1とTh17を抑制することにより、CIAにおける関節炎を抑制することを各種実験で明らかにしている。このように、本研究は当初の計画通り、順調に進展している。【方法】DBA/1マウスに2型コラーゲンを免疫し関節炎を誘導してIL-2ICを投与した。治療効果は関節腫脹スコアで評価した。マウスの関節をFoxp3抗体で免疫染色し、関節におけるTregの発現を観察した。Tregの抑制能はコントロールマウスのCD4+CD25-細胞をCFSEで標識し、各群のマウス脾臓から調整したCD

4+CD25+細胞を共培養しFACSでCFSEの発現を測定し解析した。細胞内サイトカインは脾臓から調整した細胞を刺激・染色しFACSで解析した。【結果】関節腫脹スコアはIL-2IC群において、PBS群より有意に抑制された。IL-2IC投与1週間後の末梢血中のCD4+CD25+Foxp3+Tregの割合は、コントロールPBS投与群の約2倍に増加した。また病理組織学的所見でも、IL-2IC群で有意に関節組織へのリンパ球浸潤が抑制された。IL-2IC群で関節内のFoxp3陽性細胞を有意に多く認めた。脾臓Treg数とTregのIL-10発現は、IL-2IC投与により有意に増加し、脾臓CD4+T細胞のIFN-γ,IL-17の発現はIL-2IC投与により減少していた。IL-2IC投与によりTregの抑制能は増強していた。【結論】CIAにおいて、IL-2IC投与により、Treg細胞数のみならず、Treg活性も増強し、IFN-γ、IL-17の発現を抑制することが示唆される。マウス関節炎に対するIL-2IC(免疫複合体)の有効性を調べた。免疫後IL-2ICを21-23日目に投与した。早期効果を見るには免疫後0ー2日後迄IL-2ICを投与した。CIAマウスの関節炎発症の頻度と炎症の程度はどちらの実験でも抑制された。IL-2ICはコントロールより血中の制御性T細胞(Treg)を2倍に増やし滑膜へのTh1とTh17の浸潤を抑制した。IL-2IC処置した脾臓でCD4+T細胞によるIL-10産生が4倍増強した。IFN-γ産生Th1とTh17産生ヘルパーT細胞(Th17)は有意に減少した。IL-2ICはTregを誘導しIL-10産生を増強することでTreg機能を増強させる。IL-2IC投与により、発症前後の両時期に治療を開始してもCIA関節炎の制御が可能であることが明らかとなった。また病理学的解析においても、関節組織における炎症細胞浸潤を抑制できており、関節腔内でのTregの増加の可能性も考えられた。現在、CTLA-4やIL-17等の細胞内サイトカインの評価やIL-2ICにより増加したTregの免疫制御機能について検討する予定にしている。2.関節炎局所でのTregの直接的な作用について検討する:関節局所をFoxp3で免疫染色しリンパ節や脾臓、末梢血で増加したTregの関節局所における作用について検討する。3.CIAの抗原抗体反応にIL-2が及ぼす影響について検討: IL-2IC投与による、CIAのtype2 collagen抗体への影響を、末梢血中のELISAにより検討する。リウマチ学研究分担者の分担金の使用額が予定より少なかった。次年度の研究に必要な抗体などの実験試薬費に合わせて使用する予定である。次年度が最終年度のため、研究を完結し、論文作成するため、文献検索、英文のチェック、スライド作成など研究費を少し繰り越して、使用したいと考えた。そのため、約10万円を繰り越した。関節炎のモデルマウスの血液や関節局所の病変の改善について、サイトカインの抗体や血球の同定に使う抗体などに使用する予定である。研究の完成のための、文献検索、英文を外人にチェックしてもらう、スライド作成、顕微鏡写真の作成などに使用したい。
腎血管内皮細胞と赤血球における血液型糖鎖抗原の特異性の解析と移植への応用

ABO血液型不適合移植において、「抗ドナー血液型抗体が血液中に存在しても拒絶反応が起こらない、Accommodation(免疫学的順応)が成立する、という事実」が明らかになったが、その誘導・成立メカニズムは未だ謎につつまれている。よりヒト腎血管内皮細胞のABO糖鎖抗原を模倣した糖タンパクアレイを開発し、赤血球のABO糖鎖抗原に対する反応(凝集反応)と腎血管内皮細胞のABO糖タンパク抗原に対する反応が必ずしも一致しないことが確認できた。本研究により、ABO不適合腎移植後には腎血管内皮細胞に発現するABO糖鎖抗原に対しては、抗体産生が特異的に抑制される可能性が示唆された。ABO血液型の異なるABO血液型不適合移植の成績は、ABO血液型適合移植と遜色ないことがわかっている。ABO血液型不適合腎移植では、自身と異なるABO血液型抗原(移植腎)が体内に存在し、それに対応する抗体を患者が所有していても移植後ある一定期間を過ぎると臨床的には問題が起こらないが、そのメカニズムは今尚わかっていない。本研究の目的は、『ABO不適合腎移植におけるABO抗原と抗ドナー血液型抗体の多様性について解析し、抗原と抗体が共存できるメカニズムを追究する』ことである。我々は、ヒト腎血管内皮細胞の表面に発現するABO抗原を持つ糖蛋白質の解析を報告している。臨床の現場でABO血液型に反応する抗体の指標には、赤血球の凝集反応を用いているが、我々の解析では赤血球のABO血液型抗原の存在様式と腎血管内皮細胞のそれとは同一ではないことが分かった。そこで、ヒトがもつ抗A/B抗体の多様性を様々な角度から検証し、腎臓の血管内皮細胞に特異的に反応する抗体を測定する方法を確立、実際の臨床現場で拒絶反応が起こりやすい患者を識別できることを目標に研究を遂行している。さらに、ABO血液型不適合腎移植後、臨床上何も問題がないメカニズムについて解析を進めている。本研究では、腎臓と赤血球に発現するABO血液型抗原のサブタイプ解析を行い、抗原側との相違を検討する。また、同時にヒトが保有する抗A/B抗体のサブクラスを解析する。さらに、我々の過去の研究結果より腎血管内皮細胞を模倣したABO血液型糖鎖抗原を合成し、赤血球を用いた表集反応との違いを検証する。研究協力者である産業技術総合研究所の糖鎖創薬技術研究センターにてA型、B型、O(H)型それぞれのType1-Type4のcore structureを導入したアレイを用いて、抗体のサブクラス解析を行える状態である。初年度は、実際のヒト血清を使用した作成したアレイの特異性の検討を行った。また、当科で行ったABO不適合腎移植患者の血清サンプルを収集し、測定準備が完了した状態である。また、過去の我々の解析でヒト腎血管内皮細胞のABO血液型抗原がPECAM1に発現していることから、培養血管内皮細胞にPECAM1とABO血液型抗原を強制発現させて、その培養細胞から分泌される蛋白質を利用した抗A/B抗体の測定系を完成させた。さらに、ABO血液型抗原のサブクラスを識別できる抗体を各種検証している最中である。ABO血液型不適合移植において、「抗ドナー血液型抗体が血液中に存在しても拒絶反応が起こらない、すなわち抗原と抗体が共存しているが抗原抗体反応が起こらない、Accommodation(免疫学的順応)が成立する、という事実」が明らかになったが、その誘導・成立メカニズムは未だ謎につつまれている。ABO血液型抗原には多くのサブグループがあり、抗血液型抗体もポリクローナルであるが、ABO不適合腎移植における抗原・抗体の多様性については検討されたことがない。本研究の目的は、『ABO不適合腎移植におけるABO血液型抗原と抗ドナー血液型抗体の多様性について解析し、抗原と抗体が共存できるメカニズムを追究する』ことである。我々は、研究協力者である産業技術総合研究所の糖鎖創薬技術研究センターの協力を得て、A型、B型のtype 1-4のsubstructure合成糖鎖抗原を固相化した糖鎖アレイを開発し、実際の腎移植患者血清を用いて、ABO不適合腎移植前後の抗A抗体、抗B抗体の解析を行った。ABO不適合腎移植後はtype 2血液型抗原に対する抗体が減弱する傾向があることが分かった。また、免疫染色法により腎血管内皮細胞のA抗原、B抗原のsubstructureはtype 2がメインであることが示唆された。次に、腎血管内皮細胞でABO糖鎖抗原を所持するタンパク質がCD31であることを利用して、CD31にA、B糖鎖抗原を発現させたリコンビナント糖タンパク質を合成し、糖タンパクアレイを開発した。少数例の検討ではあるが、ABO不適合腎移植後の患者血清を使用し、ドナー血液型抗原に対する抗A抗体、抗B抗体の反応を解析した結果、ABO不適合腎移植後、拒絶反応が起こらない患者の血清は非常に弱い反応を示した。赤血球を使用した凝集反応は陽性であっても、腎家間内皮細胞を模倣した我々のCD31糖タンパクアレイを用いた解析では、抗体が腎臓に反応しないことが示唆された。これがAccommodationのメカニズムである可能性がある。

よりヒト腎血管内皮細胞のABO糖鎖抗原を模倣した糖タンパクアレイを開発し、赤血球のABO糖鎖抗原に対する反応(凝集反応)と腎血管内皮細胞のABO糖タンパク抗原に対する反応が必ずしも一致しないことが確認できた。本研究により、ABO不適合腎移植後には腎血管内皮細胞に発現するABO糖鎖抗原に対しては、抗体産生が特異的に抑制される可能性が示唆された。今後は、腎移植患者の持つ抗A/B抗体のサブクラス解析、腎血管内皮細胞を模倣したABO抗原に対する抗体の反応との比較、さらに実際の移植腎に発現するABO血液型抗原との対比を行い、ABO血液型不適合腎移植において、拒絶反応が起こる可能性がある患者の識別ができるか検証する予定である。移植免疫学初年度に行う予定だった実験のうち実施できなかったものがあり(ヒト腎血管内皮細胞のABO血液型抗原の解析に使用する抗体の購入や質量分析計の解析)、その分の研究費用が余ったため。次年度に、ヒト腎血管内皮細胞のABO血液型抗原の解析に使用する抗体の購入(多数あり)、質量分析計を用いた解析依頼を行うため、その研究に前年度の助成金の余りを使用する予定である。
電子機器産業の構造変化と東アジア経済の相互依存メカニズム

本研究では、アジア諸国のマクロ経済統計に電子機器産業の活動がどのように反映されているかを検討した上で域内諸国の経済相互依存関係を分析した。主な結果は以下の通り。(1)アジアの域内貿易の成長の鈍化は主として電子機器産業の分業体制の変化を反映している。(2)各国の輸出入や貿易収支の所得弾力性や価格弾力性の計測時に電子機器の国際市況の影響を考慮する必要がある。(3)既存の経済統計には商品の変化が激しい電子機器の取引が適切に反映されておらず、マクロの物価変動率などにも無視できない影響を与えている。平成21年度の4月から6月にかけて、情報通信機器と電子部品の特性に注意しつつ、主として国連統計を用いて東アジアにおけるこれらの品目の取引状況を整理した。同時に、国連統計に抱える問題点とそれを克服するための手法を考案し、その結果を和文と英文の論文にまとめて発表した。さらに、これらの結果とそれ以前の研究成果をもとに2000年代以降の東アジアの貿易構造の変化とそのマクロ経済の関係への影響を検証し、和文による別稿にまとめた。2008年から2009年にかけて我が国の輸出が未曾有の落ち込みを経験したことを考慮し、当初の予定であった円の実質為替レートとマクロ経済に関する研究の一環として、7月以降、それ以前の成果を手がかりとして我が国の輸出関数を再考する試みを行った。その結果、中国など近隣諸国との間で電子機器産業の生産工程分業が進展し、我が国の輸出財の中心が半導体製造機器や電子部品などにシフトしているため、電子機器の国際市況の変化とそれによる在庫変動を考慮することにより、マクロの輸出関数のパフォーマンスが向上することを確認した。この研究の成果はすでに和・英文のディスカッション・ペーパーにまとめ、学内外のセミナーにおいて報告している。また、現在は同様の手法を用いて輸入関数の推計を行うと同時に、価格変動の大きい電子部品に注目しつつ、輸出入価格と国内価格の品目を厳密にマッチさせた実質為替レートの作成を試みている。平成22年度は、国際的な電子機器の生産ネットワークの広がりと構造変化に注目しつつ、主として日本の輸出入関数の推計を行った。2008年後半から2009年初頭にかけて世界的に貿易額が急減したが、日本の輸出の落ち込みは諸外国と比較しても大きかった。また、日本では輸入もかつて経験したことのない大きな落ち込みを経験した。この時期には同時に円高が進行しており、輸出の減少の一部が日本企業の価格競争力の低下によるものだった可能性が考えられるが、その数量的な効果は十分に把握されていない。また、輸入の減少は輸出の落ち込みによる内需減少の影響だと考えられているが、それだけで十分に説明できるか否かは明らかでなく、また、円高による価格効果が働かなかったのか、働かなかったとしたらなぜなのかも明らかにされていない。平成21年度中の研究によって電子機器の国際市況が日本のマクロ輸出入数量や円の為替レート、近隣諸国の景気循環に影響を与えていることが示唆されたため、これらの要素を考慮して輸出入関数の定式化を行い、短期の所得・価格弾力性の推定に力点を置いた推計を試みた。輸出関数の推計結果と輸入関数に関する推計結果を別個にとりまとめ、それぞれに関して和文と英文で論文を執筆した。輸出関数の和文論文は11に掲げたものである。輸入関数に関する和文論文は平成23年度に公表予定である。英文論文は査読中、研究代表者のホームページにおいてワークング・ペーパー版を公開している(http://www.econ.osaka-cu.ac.jp/Kumakura/index.html)。平成23年度は、平成22年度から取り組んでいる日本の輸出入関数に関して、再推計とパフォーマンスの評価を実施した。また、それに関連する課題として、電子機器の貿易構造の変化が輸出物価の計測方法に与える影響を分析し、適切な物価指数の要件を検討した。平成22年度以前の分析により、日本の輸出と輸入の双方の動態が電子機器の国際市況から強い影響を受けていること、集計化されたマクロ的な輸出需要関数や輸入需要関数を推計する場合であっても、電子機器産業固有の要因をコントロールする必要があることが明らかになった。平成23年度前半は輸入需要関数の推計の仕上げを行い、内閣府のマクロ計量モデルの輸入需要関数などとの比較を行った上で、その成果を論文にとりまとめた。また、平成22年度中に査読誌に投稿していた輸出需要関数に関してレフェリーからいくつかの問題点を指摘されたため、輸入関数の推計の過程で得た知見も取り込みつつ、計量モデルの再構築を行った上ですべての推計をやり直し、新たな論文としてとりまとめた。輸出入需要関数の被説明変数である実質輸出入のデータを作成する際には、適切なデフレーターが必要となる。

日本の輸出入物価指数としては、日本銀行が作成している物価指数以外に、財務省が税関貿易統計をもとに集計している単価指数が存在するが、上記の研究の過程でこれらの統計的性質が著しく異なっていることが明らかになった。そこでその原因を詳細に検討したところ、これら二つの指数の理論的性質の違いだけでなく、其々に理論的な指数と必ずしも合致しない点があること、それが一部の電子機器の集計価格にきわめて大きな影響を与えていることが見出された。これらの結果にはより厳密な検討の余地が残されているが、これまでに得られた成果をワーキング・ペーパーにとりまとめた。
ステロイド膜受容体の機能・構造解析を中心とした卵成熟・排卵誘導機構の解明

これまでステロイド膜受容体(mPR)が卵成熟誘起ホルモンの受容体であることをモルフォリノアンチセンスオリゴによるノックダウン実験等により示してきた。しかし、膜受容体の機能については相反する報告もなされ、世界的な議論にあることから遺伝子変異メダカを樹立することで生理機能の証明を目指す。一方、新技術である排卵誘導法を用いて排卵誘導に必要な遺伝子群の同定を目指す。本年度はこれまで樹立したメダカゲノム中に存在する4種類のmPRの遺伝子変異メダカ系統の4重の変異体の系統樹立を進めると伴に、遺伝子編集技術であるCRISPR/Cas9システムによりゼブラフィッシュを材料として確実な機能欠失系統の樹立を進めた。一方、当研究室で独自に開発した手法により排卵誘導の鍵遺伝子候補11遺伝子を選択した。これらの候補遺伝子について順次、遺伝子編集技術であるCRISPR/Cas9システムにより機能欠失系統の樹立を進め、全ての遺伝子について変異系統の樹立が出来た。いくつかの系統については表現型解析を開始した。最初に系統樹立に成功したstm遺伝子ノックアウト系統では排卵には異常が見られなかったものの受精率に低下が見られ、stm遺伝子が耳石形成だけでは無く受精にも関与するという新たな知見が得られた。他方、予想外の結果としてstm遺伝子変異系統においても耳石の形態異常は確認されたものの行動には異常が見られないことが明らかとなった。また、pax2a遺伝子ノックアウト系統でも排卵が停止することは無かったが、受精率の低下、受精卵においても発生異常が観察された。pax2aについてもこれまで知られてきた中脳後脳境界における初期発生での機能以外に受精から胞胚形成期の初期段階での機能に関する新たな知見が得られた。本年度はこれまで樹立したメダカゲノム中に存在する4種類のmPRの遺伝子変異メダカ系統の4重の変異体の系統樹立を進めると伴に、遺伝子編集技術であるCRISPR/Cas9システムにより確実な機能欠失系統の樹立を始めた。人工合成に成功したmPRタンパク質については結晶化に向けた精製法の改良を進めた。ステロイドホルモンや内分泌かく乱物質を飼育水に直接に添加し、サカナの生体そのものに作用させる新しい手法を確立した。この手法により排卵誘導の鍵遺伝子の探索を進めている。これまでmRNA発現レベルの解析はマイクロアレイを使用して行ってきた。しかし、マイクロアレイ解析では偽陽性がみられる他、配列情報の不正確さの問題があり、その後のリアルタイムPCRによる各遺伝子の発現解析との不一致が見られた。ところが平成26,27年度とゲノム支援プロジェクトに採択され、ゲノムシークエンサーによるRNA-seqによる解析が実施できた。RNA-seqの場合はシークエンスデータとともにその遺伝子の発現量の変動が調べられることからより正確なデータが得られる。本研究では27年度分のRNA-seqのデータを含めて候補遺伝子を選択し、リアルタイムPCRによる発現変動の確認を進める。本年度は特にインビボ卵成熟・排卵誘導法による排卵誘導遺伝子の同定の項目で進展が見られた。マイクロアレイ法による排卵誘導遺伝子候補のリストアップの結果を論文として公表できた。また、RNA-seq法によりリストアップした候補遺伝子も含め、ゲノム編集技術による機能解析を開始できた。一部の遺伝子については遺伝子破壊系統の樹立に成功している。ノックアウトメダカについても系統の樹立は順調に進み、3重変異体は得られているものの特に異常は見られない。4重変異体の樹立を開始している。mPRタンパク質の大量合成についても主要設備であるタンパク質精製装置の導入により効率的に進められるようになったが、構造解析のためにはさらなるスケールアップが必要である。本年度はこれまで樹立したメダカゲノム中に存在する4種類のmPRの遺伝子変異メダカ系統の4重の変異体の系統樹立を進めると伴に、遺伝子編集技術であるCRISPR/Cas9システムにより確実な機能欠失系統の樹立を進めた。一方、ステロイドホルモンや内分泌かく乱物質を飼育水に直接に添加し、サカナの生体そのものに作用させる新しい手法を確立した。平成26,27年度にゲノム支援プロジェクトにより実施したRNA-seqにより選択できた11遺伝子についてリアルタイムPCRによる発現変動の確認ができた。これらの候補遺伝子について順次、遺伝子編集技術であるCRISPR/Cas9システムにより機能欠失系統の樹立を進めた。これらの結果については原著論文として発表できた。

RNA-seq法による排卵誘導遺伝子候補のリストアップの結果も論文として公表できた。また、マイクロアレイ法、RNA-seq法によりリストアップした候補遺伝子についてゲノム編集技術による機能解析を開始できた。ノックアウトメダカについて4重変異体の樹立に成功したものの特段の異常は観察されなかった。一部の遺伝子で点突然変異による機能欠失が不十分であると考えられる。ゲノム編集によるノックアウト系統の作出が順調に進んでいることからメダカに加えゼブラフィッシュにおいてもmPR遺伝子群のノックアウト系統の作出を開始した。これまでステロイド膜受容体(mPR)が卵成熟誘起ホルモンの受容体であることをモルフォリノアンチセンスオリゴによるノックダウン実験等により示してきた。しかし、膜受容体の機能については相反する報告もなされ、世界的な議論にあることから遺伝子変異メダカを樹立することで生理機能の証明を目指す。一方、新技術である排卵誘導法を用いて排卵誘導に必要な遺伝子群の同定を目指す。本年度はこれまで樹立したメダカゲノム中に存在する4種類のmPRの遺伝子変異メダカ系統の4重の変異体の系統樹立を進めると伴に、遺伝子編集技術であるCRISPR/Cas9システムによりゼブラフィッシュを材料として確実な機能欠失系統の樹立を進めた。一方、当研究室で独自に開発した手法により排卵誘導の鍵遺伝子候補11遺伝子を選択した。これらの候補遺伝子について順次、遺伝子編集技術であるCRISPR/Cas9システムにより機能欠失系統の樹立を進め、全ての遺伝子について変異系統の樹立が出来た。いくつかの系統については表現型解析を開始した。最初に系統樹立に成功したstm遺伝子ノックアウト系統では排卵には異常が見られなかったものの受精率に低下が見られ、stm遺伝子が耳石形成だけでは無く受精にも関与するという新たな知見が得られた。他方、予想外の結果としてstm遺伝子変異系統においても耳石の形態異常は確認されたものの行動には異常が見られないことが明らかとなった。また、pax2a遺伝子ノックアウト系統でも排卵が停止することは無かったが、受精率の低下、受精卵においても発生異常が観察された。pax2aについてもこれまで知られてきた中脳後脳境界における初期発生での機能以外に受精から胞胚形成期の初期段階での機能に関する新たな知見が得られた。ノックアウトメダカの4重変異体系統の樹立を進めると同時にCRISPR/Cas9法によるゲノム編集技術による機能解析も同時に進める。同手法は排卵誘導遺伝子の解析においてゼブラフィッシュでは導入に成功している。非常に高い確率で遺伝子破壊に成功していることからメダカにおいても短期間での成功が期待される。排卵誘導遺伝子候補については引き続きゲノム編集系統の作出を進め、排卵誘導の鍵遺伝子の解明を目指す。
分裂酵母をを用いた試験管内複製系の構築

分裂酵母の抽出液を用いた試験管内複製系の構築を目指している。ます、faithfulな複製のためには鋳型DNAがクロマチン構造を取ることが重要と考え、第一段階として試験管内でプラスミドDNAを用いたクロマチン再構成系の構築を試みた。すでに出芽酵母で試験家内クロマチン再構成系の報告があるのでこれを元に分裂酵母の系の構築を行った。その結果効率は低いものの再構成系の構築ができた。そこで、分裂酵母複製開始点を含むプラスミドDNAを用い、クロマチンの再構成を行った後に基質を加え、DNA複製反応を行わせることを試みた。基質の鋳型DNAへの取りこみは観察できたが、複製開始点への依存性はなく非特異的に反応が起こっていた。詳細な解析の結果、この取り込みは鋳型DNAに元から存在するnickに依存する修復反応であることがわかった。つまり、ここで得た抽出液は強い修復活性を持っていることになり、当初の目的とは異なるが、修復反応の解析にこの系を使うことは可能であろう。次の段階として、再構成したクロマチンを単離しこれを鋳型として複製を行わせる系の構築を試みる必要があると考えた。まず、容易にクロマチンDNAを単離するために鋳型DNAにlacl蛋白質の結合配列を挿入し、あらかじめ精製したlacl-GST融合タンパク質を結合させておき、クロマチン形成反応ののち、グルタチオンカラムを用いて融合タンパク質と結合したDNAを効率よく回収することを試みた。予備的な結果ではかなり効率よく回収できることを確かめている。
ヘテロ並列分散計算環境による統計計算アルゴリズムの効率化に関する研究

研究室内の多様なPCをLANで結合した形での並列分散計算環境で,統計計算アルゴリズムの並列化の検討を行った.まず,モンテカルロ積分を中心にタスク配分の基礎的な枠組みとして,事前分配法・ワークプール法での並列化効率とその改善について検討し,その後,ロジスティック回帰分析での計算を中心とした正確推論・ベイズ推論,樹木接近法での計算アルゴリズムの並列化のアプローチについてその適否について検討した.研究室内の多様なPCをLANで結合した形での並列分散計算環境で,統計計算アルゴリズムの並列化の検討を行った.まず,モンテカルロ積分を中心にタスク配分の基礎的な枠組みとして,事前分配法・ワークプール法での並列化効率とその改善について検討し,その後,ロジスティック回帰分析での計算を中心とした正確推論・ベイズ推論,樹木接近法での計算アルゴリズムの並列化のアプローチについてその適否について検討した.研究者代表者の所属する研究室において,本研究での計算処理のため,新規に計算機を導入するとともに,導入より年度が経過し,計算処理の著しく低い既存計算機を改修し,計算機能を更新して新たな計算機群を構築し,ネットワーク環境,ファイルサーバー環境を調整することにより分散計算環境を構築した。これらの計算機群のOSとしてはRedHat系Linuxパッケージの一つであるFedora12を採用することとし,C,Fortran言語等のコンパイラ環境を整えるほか数値計算ライブラリを使える開発環境を整備し,MPI準拠の分散並列計算環境としてLAMを導入することにより当該研究の開発基盤を整備した。この計算環境の整備の際には,モンテカルロ法を応用基盤としてシミュレーション的技法に関するタスクの分割と代行の観点について検討を行った。ここでは,基本的にはワークプール法と時間予測法の効率の観点,ならびに今後の実験環境下でのネットワーク障害への対応方法に関わる検討を行うことにより,並列プログラム実行時の基礎環境としての確認を行っている。さらに,並列アルゴリズムに関する検討として,離散データ解析における正確推測法における例数列挙法の並列化に関するアルゴリズムを検討し,その実装化を行った。加えて,ロジスティック回帰モデルに基づく回帰パラメータの正確推測の検討においては,局外母数での最適化について,目的関数の不連続性や多峯性に伴う最適解の大域的探索が重要な問題点である事を確認した。このため,基本となる最適化アルゴリズムと大域解探索戦略に関わる既存手法のレビューを行い,その並列化に関する検討を行った。このうち並列化の観点,線形モデルの探索の観点について,それぞれシンポジウムで,成果の一部を発表した。平成21年度に研究代表者の所属する研究室に構築した計算機環境において,いくつかの具体的な統計計算における並列計算アルゴリズムの検討を行った。離散データの分析,特に2値反応における共変量効果の評価の際に用いられる,ロジスティック回帰モデルの条件付正確推測について,十分統計量に制約を置いた例数の数え上げの並列化アルゴリズムの検討を行った。同時に,条件付・条件無し正確推測での検定に関して,モンテカルロ法を基礎とする確率評価法についても,精度と計算コストの評価を行った。このことにより,計算コストならびに並列化の容易さの観点から,モンテカルロ法は有利であり,その精度評価においても,計算コストを考慮に入れると,十分な代替法であることを確認した。また,複数パラメータをもつ場合の検出力計算では,最適化問題を考える必要があり,その問題では多重局所解が生じることがあることを確認した。このために,焼きなまし法やトンネリング法等の大域的最適化法の並列化についても検討を加えた。ただこの検討では,用いた計算機環境と作成した粗粒度の並列化アルゴリズムによっては,確率的な探索空間の拡張以上の特徴的な並列化による差異は現在のところ確認できていない。さらに,ベイズ推測,EMアルゴリズムなどの数値計算上の手法を駆使することが求められる分析法として,階層データへの線形・一般化線形モデルでのパラメータ推定問題における計算法の確認を行った。その検討では,一部プログラムを作成し,分析と計算効率の評価を行う事により,並列化アルゴリズムの設計を開始した。平成21年度に構築した並列計算機環境を用い,平成21・22年度に実施した統計計算におけるアルゴリズムの並列化の試行に基づいて,その効率の観点から検討を加えた。離散データの分析においては,まずロジスティック回帰分析での正確推測における2値系列生成とその十分統計量の数え上げの手法について,条件無し・条件付推測における計算上の並列化可能領域の同定とその計算タスク分配の方策に検討を加えた。さらに,共変量効果での確率変動を基礎とした,超過変動モデルにおけるアルゴリズムの並列可能性について検討を加えた。ここでは,基礎モデルの尤度における混合化効果を表現・定量する技法が求められ,モンテカルロ積分のような求積法を基礎とするパラメトリックアプローチがその一つである。一方で,基礎モデルを指標集約の手段と考え,ブートストラップ法等により,データの持つ経験分布をもとにシミュレーションを行うノンパラメトリック推測上の方法も存在する。これらの数値解析上の技法の並列化とヘテロ環境でのスケジューリングの特性を評価した。さらに,上記のモデルのパラメータの推測問題をベイズ推測によるアプローチととらえてその並列化について検討した。ここで複数パラメータを考慮する場合,パラメータ間の相関を考慮して,その数値計算上の技法としてMCMCを使う場合の並列化の可能性について検討した。ここでは,その基礎乱数の生成方法の問題とMCMC系列のバーンインの調整がその効率を大きく左右することが確かめられた。さらに,多コアCPUの登場により並列化計算の基本パラダイムが多様化している。特にこの環境下では,共有メモリ下での並列化が可能になるが,本研究ではこの環境下での統計計算アルゴリズムの並列化にも検討を加えた。
頭頸部癌に対するＤＮＡ修復阻害遺伝子導入による化学療法および放射線療法増感効果

2本鎖DNA切断(DSB)修復に関わる蛋白NBS1の変異型遺伝子(mNBS1)を導入したウイルスベクターAd-NBS1の腫瘍細胞への導入効率、抗腫瘍効果、シスプラチン治療増感効果を確認した。また1本鎖DNA切断(SSB)修復に関わるPARPの阻害薬を併用することでさらに著明な抗腫瘍効果の増強を確認した。シスプラチン耐性のメカニズムは転写因子p63を介したDNA修復蛋白の産生亢進が関与するが、Ad-NBS1の作用機序はp63を介さず直接MRN蛋白の発現抑制を引き起こし、DSB近傍でのγH2AX発現を端緒としたDNA修復機構の不活化がシスプラチン増感効果のメカニズムであることが示された。本年度はまず2本鎖DNA切断修復に関わる蛋白NBS1の変異遺伝子(mNBS1)を組み込んだウイルスベクター(Ad-NBS1)のヒト頭頸部癌細胞株に対する放射線増感効果を検討した。細胞増殖に関してはWST-8アッセイを用いて検討を行った。X線放射線照射装置で2Gy連日5日間照射および8Gy単独照射のいずれかとAd-NBS1との併用療法を、放射線単独および放射線+コントロールベクター(Ad-GFP)の双方と比較したがいずれも明らかな放射線増感効果を認めなかった。以上より変異NBS1遺伝子導入は放射線増感作用をもたないと判断された。従って以後は前年度にすでに証明されたAd-NBS1のシスプラチン増感効果をさらに増強する治療戦略を考え実験を行った。具体的には以下の如くである。シスプラチンはまず腫瘍細胞において1本鎖DNA損傷を引き起こすことが知られている。この1本鎖DNA損傷が修復されなければ、細胞分裂時に2本鎖DNA切断という細胞致死的なDNA損傷を引き起こす。そこで2本鎖DNA修復に関わるNBS1の変異遺伝子導入に加えPARP-1という1本鎖DNA修復酵素の阻害剤を用いてin vitroにおいてヒト頭頸部扁平上皮癌の増殖抑制効果をMTT assayで検討した。結果、予想通りシスプラチンに併用した際、変異型NBS-1導入単独に比べPARP阻害薬を併用した群において細胞増殖抑制効果が強く見られた。また、アルカリおよび中性条件下のコメットアッセイによりPARP阻害薬を併用した群では、変異NBS1導入のみの群と比較して1本鎖DNA損傷の量が増加しただけでなく2本鎖DNA損傷の量も有意に増加した。これはPARP阻害薬によりシスプラチンにより形成された1本鎖DNA損傷の修復が阻害されたままに残り、細胞分裂時により多くの2本鎖DNA損傷を生み出し細胞死へ導かれたと考えることができる。本年度は、一昨年および昨年の研究において得られた、in vitroでのAd-NBS1によるNBS1阻害によるシスプラチン増感効果、およびシスプラチン耐性機構のメカニズムの解明のための研究を行った。p63はNBS1と複合体を形成するMre11, Rad50の転写因子であることが報告されている。そこでまず頭頸部扁平上皮癌由来のシスプラチン感受性細胞株とシスプラチン耐性細胞株に対し、in vitroでシスプラチンによる刺激を行い各mRNA,蛋白の発現変化をRT-PCRおよびウエスタンブロットでみた。シスプラチン投与前のベースラインでは発現量に大きな差は認めなかったが、シスプラチン刺激後mRNAは24時間後をピークとする発現亢進が、蛋白は24時間72時間後まで、感受性株に比較し耐性株において各蛋白(p63,Mre11,Rad50,NBS1)の発現亢進が見られ、DNA修復機能が亢進していると考えられた。次にsiRNAにてp63をノックダウンするとMre11, Rad50の蛋白産生が抑制されることが示された。またAd-NBS1をシスプラチンとともに加えると変異型NBS1(mNBS1)蛋白の発現を確認でき、またそれに伴い野生型NBS1の発現の抑制が起こることが示された。この時、Mre11, Rad50の発現も抑制されているがp63の発現には変化がなかった。以上の結果より、シスプラチン耐性には転写因子p63を介したDNA修復蛋白の産生更新が関与するがAd-NBS1の作用機序はp63を介さずMRN蛋白の発現抑制が起こっていることが判明した。NBS1阻害によるシスプラチン増感効果についての理論的根拠となるデータは蓄積されてきており、次年度の研究発展に期待が持てる結果であると考えている。まず二本鎖DNA切断修復に関わる主要蛋白NBS1の変異遺伝子(mNBS1)を導入したウイルスベクターAd-NBS1-GFPおよびコントロールベクターAd-GFPの各種頭頸部扁平上皮癌細胞株に対する導入効率を検討した。その結果、検討したすべての細胞株でMOI=5以上で、ほぼ100%の細胞にベクター由来のGFP蛍光を確認できた。

次に使用する細胞株のNBS-1蛋白発現をWestern blottigにて確認した。いずれの細胞株でもNBS1は恒常的に発現していることを確認した。続いてMTTアッセイにて頭頸部扁平上皮癌細胞株に対するAd-NBS1-GFPおよびAd-GFPの抗腫瘍効果をin vitroで検討した。その結果、コントロールベクターAd-GFPは、無治療コントロールに比較しても抗腫瘍効果を示さなかったが、Ad-NBS1-GFPはMOI=5で有意な抗腫瘍効果を示し、またシスプラチンとの併用でさらに抗腫瘍効果を認めた。また中世条件下コメットアッセイを用いて、それぞれの治療群の細胞における二本鎖DNA切断の量を測定した。その結果Ad-NBS1-GFP治療群において二本鎖DNA切断量が有意に高いことが判明した。このことはウイルスベクターにより導入された変異型NBS1が、腫瘍細胞の持つ二本鎖DNA切断修復能を阻害したことが示唆される。またシスプラチン耐性株と感受性株を用いた同様の検討で、Ad-NBS1-GFPはシスプラチン耐性株のシスプラチンに対する感受性を増強することが分かった。以上in vitroの検討において、変異型NBS1遺伝子の頭頸部癌細胞株への導入は、二本鎖DNA切断修復阻害効果を介して抗腫瘍効果を示すことが判明した。今までの研究において、変異型NBS1導入アデノウイルス(Ad-NBS1)によるNBS1阻害効果、シスプラチン増感効果がin vitroで証明されている。またそのシスプラチン耐性のメカニズムの一機序として、シスプラチン耐性の頭頸部癌細胞株ではシスプラチン刺激に対してp63を介したDNA修復に関わるmRNAおよび蛋白(MRN蛋白)の産生亢進が見られ、シスプラチンによるDNA損傷の修復機能が亢進していること、しかしAd-NBS1投与ではMRN蛋白の発現抑制が起こっているが、その機序としてはp63を介していないことが判明していた。本年度はまず、Ad-NBS1のシスプラチン増感効果の作用機序として、p63以外の経路であるH2AXに着目した。二本鎖DNA障害(DSB)が生じると、その物理的近傍でH2AXのリン酸化が起こりγH2AXとなる。今年度ウエスタンブロットにて、頭頸部癌細胞株に対するシスプラチン投与によりγH2AXが増加していること、コメットアッセイにより、これがDSBの増加に比例していることが判明した。また共役免疫沈降法にて野生型NBS1はγH2AXに結合するが、Ad-NBS1に挿入した変異型NBS1はγH2AXとの結合部位を有さずH2AXのリン酸化を維持できないことが示された。以上よりAd-NBS1投与によりDSB近傍でのγH2AX発現を端緒としたDNA修復機構が働かないことがAd-NBS1によるシスプラチン増感効果のメカニズムと考えられた。もう一つの今年度の目標であったAd-NBS1およびPARP阻害薬併用でのシスプラチン増感についての相乗効果については、Ad-NBS1によるDSB修復阻害およびPARP阻害薬によるSSB修復阻害の併用により統計学的有意差のあるシスプラチン増感における相乗効果が得られた。In vitroで予測された相乗効果がin vivoでも証明された。遺伝子治療放射線治療が腫瘍細胞死へ導く主なメカニズムは、放射線により腫瘍細胞のDNA損傷、とくに2本鎖DNA切断を導くことであると理解されている。