hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
超音波水熱合成粉末による鉛フリー圧電材料の研究

非鉛圧電セラミックスの代表として,優れた圧電特性と温度特性を持つ(K, Na) NbO_3(以下KNN)セラミックスに注目した.通常,圧電セラミックスは固相反応法を用いて原料となるセラミックス粉末を得る.しかし, KNNの合成で,固相反応法を用いて高品質なセラミックス粉末を得ることは困難である.まず,原料粉末の炭酸カリウムには潮解性があるため,精密な秤量が困難である.また,仮焼きの際にNaとKが蒸発し,合成後の粉末中のNbと(K+Na)の組成が1:1にならないため,得られる焼結体の誘電損失が増加する.さらに,ボールミル処理では,毎回20時間以上かかること,不純物が混入することが問題である.そこで,水熱合成法を用いて粉末の合成を行うことで,それらの問題を解決できる.水熱合成法はイオン反応を利用しており,最終的に得られるKNbO_3中のNbとKの組成比は自動的に1:1となる.さらに,水溶液中のイオン反応において微細な粉末を得ることができることも報告されている.本研究では高品質粉末が合成できる水熱合成法を用いて, KNN系セラミックスの合成実験を行った.また,合成した材料をハイドロホンとしての応用も行った.水熱合成法によって得たKNbO_3,粉末とNaNbO_3粉末にLiNbO_3を粉砕することで得られたLiNbO_3粉末を添加し,圧電特性の制御を行った.その結果, (Li, K, Na) NbO_3セラミックスは高い圧電定数d_<33>=203pC/Nを示し,キュリー点は482°Cであった.水熱合成法による(K_<0.48>Na_<O. 52>)NbO_3セラミックス焼結体は密度98%以上の高密度焼結体が得られ,優れた圧電出力定数g_<33>=28.8×10^<-3>Vm/Nを示し,キュリー点温度がTc>420°Cと高く,温度に対する動作範囲が広いこと, Qm値が低いために広範囲の周波数での応答が滑らかなソフトな材料であった. (Ko_<48>Nao_<52>)NbO_3をハイドロホンとして応用すると, PZTのハイドロホンと互換性のある出力が得られることが分かった.また,ハイドロホンとして応用できたことで,ソナーのようなトランスデューサや,医療用超音波診断装置などに用いることができると期待できる.(抄録なし)(抄録なし)本研究では環境に優しい非鉛圧電材料の合成を行っており,高い圧電性,電気機械結合定数,キュリー点を持つニオブ酸カリウムナトリウム(K,NN:(KNa)NbO_3)セラミックスに注目している.通常,固相反応法を用いて原料となるセラミックス粉末を得るが,水熱合成法を用いて粉末の合成を行えば,より高品質な粉末得ることができる.水熱合成法とは圧力容器を用いて,高温・高圧・強アルカリの条件での水溶液イオン反応のことである.特徴として,(1)'200°C程度で低温合成ができる.(2)'炭酸カリウムを使わずに合成できるため,原料を精密に秤量できる.(3)'KNbO_3中のNbと(K,Na)の組成比は水溶液中で自動的に1:1となる.(4)'水溶液中のイオン反応のため微細な粉末を得ることができる.本研究では、高品質水熱合成粉末を利用した高い圧電特性を持つKNNセラミックスの合成を目的とする.本研究では今までに,KNNの水熱合成条件と分極条件等の改善により圧電定数d_<33>=130pC/N,Qm=50を達成した.しかし,工業応用上はd_<33>>200pC/N,Qm>200が必要である.そこで本研究では初めに圧電定数d_<33>の改善を行うため,(K,N)NbO_3にLiNbO_3添加物を加えることでMPBを狙い,組成としての圧電特性を向上させた.水熱合成(K_<0.48>Na_<0.52>)NbO_3にLiNbO_3を添加し(Li_x(Na_<0.52>K_<0.48>)_<1-x>)NbO_3セラミックスを合成した.xが0.06以上の時,c/a値が1.016から1.024の値を示したため,結晶構造が結晶構造が斜方晶系から正方晶系に変化するMPBであることがわかった.また,MPBで圧電定数の向上が確認され,d_<33>=203pC/Nに達した.現在、圧電材料の多くは環境負荷の大きい鉛を含むPZTが使われており,鉛を使わない圧電材料の開発が精力的に行われている。本研究では高品質粉末が合成できる水熱合成法を用いて、良好な圧電特性を示す非鉛圧電セラミックスであるニオブ酸カリウムナトリウム系材料の合成を行う.通常,固相反応法を用いて原料となるセラミックス粉末を得るが,下記のような問題が生じる.原料粉末の炭酸カリウムは潮解性のために精密な秤量が困難である.

熱処理の際,カリウム原子とナトリウム原子が蒸発するため合成後の粉末中のNbとKの組成が1:1になりにくく,焼結体は吸湿性を持ってしまう.仮焼により粉末粒子が粗大化し,ボールミルによる粉砕が必要になるため,粉砕の時間がかかり(20時間程度),粉砕工程でも不純物が混入してしまう.ここで,水熱合成法を用いて粉末の合成を行えば下記の様に固相反応の問題を解決できる.200°C程度の低温合成ができる.炭酸カリウムを使わずに合成できるため,原料を精密に秤量できる.KNbO_3中のNbとKの組成比は水溶液中で自動的に1:1となる.水溶液中のイオン反応のため微細な粉末を得ることができる.本研究では、高品質水熱合成粉末を利用した高い圧電特性を持つNKLNセラミックスの合成を目的とする.最終的に,作成した非鉛圧電セラミックスを用いてハイドロホンセンサの実験を行い,非鉛圧電材料に関する基礎的知見を得る.非鉛圧電セラミックスの代表として,優れた圧電特性と温度特性を持つ(K, Na) NbO_3(以下KNN)セラミックスに注目した.通常,圧電セラミックスは固相反応法を用いて原料となるセラミックス粉末を得る.しかし, KNNの合成で,固相反応法を用いて高品質なセラミックス粉末を得ることは困難である.まず,原料粉末の炭酸カリウムには潮解性があるため,精密な秤量が困難である.また,仮焼きの際にNaとKが蒸発し,合成後の粉末中のNbと(K+Na)の組成が1:1にならないため,得られる焼結体の誘電損失が増加する.さらに,ボールミル処理では,毎回20時間以上かかること,不純物が混入することが問題である.そこで,水熱合成法を用いて粉末の合成を行うことで,それらの問題を解決できる.水熱合成法はイオン反応を利用しており,最終的に得られるKNbO_3中のNbとKの組成比は自動的に1:1となる.さらに,水溶液中のイオン反応において微細な粉末を得ることができることも報告されている.本研究では高品質粉末が合成できる水熱合成法を用いて, KNN系セラミックスの合成実験を行った.また,合成した材料をハイドロホンとしての応用も行った.水熱合成法によって得たKNbO_3,粉末とNaNbO_3粉末にLiNbO_3を粉砕することで得られたLiNbO_3粉末を添加し,圧電特性の制御を行った.その結果, (Li, K, Na) NbO_3セラミックスは高い圧電定数d_<33>=203pC/Nを示し,キュリー点は482°Cであった.水熱合成法による(K_<0.48>Na_<O. 52>)NbO_3セラミックス焼結体は密度98%以上の高密度焼結体が得られ,優れた圧電出力定数g_<33>=28.8×10^<-3>Vm/Nを示し,キュリー点温度がTc>420°Cと高く,温度に対する動作範囲が広いこと, Qm値が低いために広範囲の周波数での応答が滑らかなソフトな材料であった. (Ko_<48>Nao_<52>)NbO_3をハイドロホンとして応用すると, PZTのハイドロホンと互換性のある出力が得られることが分かった.また,ハイドロホンとして応用できたことで,ソナーのようなトランスデューサや,医療用超音波診断装置などに用いることができると期待できる.水熱合成法により,高品質粉末の合成に成功し,その粉末を用いて高密度KNNセラミックスの合成に成功した.その絶成にLiNbO_3を添加し結晶構造を変化させることで当初圧電特性の目標値であるd_<33>>200pC/Nを達成したので計画以上に進展しているといえる.水熱合成(K,Na)NbO_3とLiNbO_3のMPBを発見し,圧電定数を200pC/Nを超えることができた,また,合成した非鉛圧電セラミックスを用いて超音波モータとハイドロホンの試作に成功した.合成した非鉛圧電セラミックスのアプリケーション応用まで完了させることができたため.(抄録なし)今後は下記2点を検討している。1.機械品質係数であるQ値を改善させるため。組成に添加物を加えて調整する.
地域包括ケアにおける連携・協働のコア学習内容に基づいた個別学習プログラムの開発

地域包括ケアにおける連携・協働の個別学習プログラムの開発は、初年度、先駆的に実践活動を行っている専門家に対するヒアリング、加えて文献検討から得られた連携に必要な要件を見出し、連携・協働に関する学習のコアとなるものを学習指標として示した。それは、「自分づくり」「チーム作り」「地域づくり」の3段階からなる構造的な学習すべき内容を整理したもので、自身での連携・協働能力を評価するシートとした。次年度は、この学習指標の精錬のために、保健、医療、看護、介護福祉の実践者による専門家会議を開催し、一つ一つの学習指標項目を精錬した。さらに、看護学の学会で最も規模の大きな日本看護科学学会の学術集会において、作成した3段階の学習指標を交流集会の場で提示説明し、教育研究者に広く意見を求めた。最終年度は、精錬した学習指標と交流集会で得られた意見をもとに、学習指標のシートのさらなる精錬とともに、個別学習プログラムとしての学習指標の活用プロセス、活用の手引きを作成し、実際に地域において療養者支援にかかわる実践者での試行を計画した。試行は学習指標や個別学習プログラムの趣旨に理解を得られるところとした。連携協力者の所属する新見公立大学は、公立の保健医療福祉の機関に限らず、民間事業者等との関係ができていた。地域看護学、公衆衛生看護学、在宅看護学の実習の受け入れが良く、大学と共同して教育研究に当たっていた。在宅看護学においては学生が継続して在宅療養者への看護が提供できる体制をとっており、療養者支援において以前より地域の事業所の専門職との良い関係を持っていたので、この地域での試行事業を計画した。しかし、2018年の西日本豪雨で、近隣の真備町や倉敷市とともに大きな影響を受け、実施困難となり、研究機関を延長することとした。最終年度は、作成した3段階の構造的な学習指標を用いた個別学習プログラムの試行を計画していた。新見公立大学看護学部の連携研究者は、教育研究において地域の事業所との良い関係が気づけており、試行事業の協力をお願いすることになっていたが、2018年西日本豪雨で、近隣の真備町や倉敷市とともに大きな影響を受け、交通途絶等により日常生活もままならない状況になった。この状態で試行事業を進めることができず、研究期間を延ばすこととなった。研究の最終段階である個別学習プログラムの試行を新見市で実施する。作成した3段階「自分づくり」「チームづくり」「地域づくり」の3段階の学習指標の内容、及びプログラムの運用について検証を行う。初年度の研究は、連携協働に特化したコア学習内容を創出することを目的とし、文献検討に加えて、先駆的に多職種連携の実践や教育に関わっている専門職へのヒアリングを行うことを計画した。対象は、連携協働に関連した在宅ケアや在宅療養者支援、及びその実践者教育に先駆的に取り組んでいる集団、組織、個人を選定し、研究協力者のネットワークを活用し、地理的に最も近い者がヒアリングを担当することとした。およそ12程度の組織、集団を候補として挙げたが、ヒアリング協力の同意が得られ、実施できたのは10名であった。ヒアリングでは「実践している連携や協働」「連携や協働で必要な能力」「連携や協働で必要な能力の育成」等、連携協働において、今後学び身に着けることが求められる学習内容を聴取した。聴取した内容の分析については、当初研究計画では連携タイプを設定し、タイプ別の連携能力の獲得、人材育成を考えていたが、得られたデータからは、職種や利用者の状況の違いに関わらず、地域で療養を継続できることを目的とした基本的、かつ包括的な学びの方向性が示唆された。よって、分析の方向性として、タイプ別を避け、どの職種であっても、またどのような状況にある利用者や職種であっても、身に着けるべき基本的学習内容を提示することとした。逐語録より、身に着けるべき学習内容を行動レベルの表現で抽出し、類似の意味内容で分類、統合を繰り返し、23のサブカテゴリー、7のカテゴリーが得られ、利用者中心とした到達点として「利用者が地域で暮らし続けることができる体制を作ることができる」を挙げたプロセス図で学習内容を説明することができた。今後は、示された構造的な連携協働の学習内容から、自主的、自律的学習方法を展開することが可能となる学習プログラム案を作成し、専門家会議、学会等交流集会での意見聴取・意見交換を経て、試案の検証に繋げていく予定である。計画通りにヒアリング調査実施に向けて学内研究倫理審査の承認を得ることができた。しかし、目的に合った調査対象が全国に散在しており、研究協力者によるヒアリング実施の日程等の調整に時間がかかり、29年2月に分析作業に取り掛かることとなった。得られた結果をプログラム案とすること、専門家会議や交流集会で精錬することは、比較的短期間集中で実施できると考えられ、次年度計画は当初より順当に進むことが予想される。初年度に先駆的に実践活動の中で効果的な連携をとっている人々を対象に、地域活動の実際、人材育成等の聞き取り調査を実施した。本年度は、その分析結果をもとに次の段階に進んだ。1他職種連携・協働を推進する能力育成のための学習ガイドライン案作成:聞き取り調査の逐語録を質的に分析し、「連携に必要な要素」と抽出、統合し、「連携・協働のためのコア学習内容」として構造化した。

連携・協働にまつわる能力獲得には段階があると考え、それに応じて「連携・協働推進の自分づくり」「連携・協働推進のチームづくり」「連携・協働推進の地域づくり」の3つの学習ガイドラインを考案した。身につけたい能力:コンピテンー、能力獲得の要素:学習目標、評価できる学習行動:行動目標として、具体的な学習内容を示すシートをした。2連携・協働の学習ガイドライン精錬のための専門家会議の実施:平成29年9月16日作成した学習ガイドラインについては、学識経験者(専門職教育者、保健師、医師、社会福祉士、介護士)により、表現や学習内容としての適切性などを検討した。3連携・協働の学習ガイドライン精錬のための教育者・実践家による検討会の実施:平成29年12月16日日本看護科学学会第37回学術会議交流集会「ケアチームの『つながる力』『つなげる力』を強める人材育成」において、一般参加者に連携・協働の学習ガイドラインの作成の目的、作成経過、そして3つの学習内容のシートを提示し、それぞれの立場での利用可能性、修正改善点等について意見を集約した。今後、作成した連携・協働の学習ガイドラインをどのような対象に、どのようなタイミングで、またどのような方法で活用することができるかを共同研究者、および研究協力者と検討し、具体的な活用の手引きの作成を行うとともに、試行的に学習ガイドラインの使用を協力施設で実施し、評価をする予定である。当初の平成29年度計画では、療養状況等のタイプ別の連携・協働に関するコア学習内容を作成することとなっていたが、先駆的実践者の聞き取り調査の分析から、療養状況のタイプ別ではなく、連携・協働の実践力獲得には段階があることがわかり、「自分づくり」「チームづくり」「地域づくり」の3つの段階での学習が可能となるプログラムの作成となった。これは学習者中心の考えによるものであり、実践の場での人材育成への活用が期待できるものと考える。地域包括ケアにおける連携・協働の個別学習プログラムの開発は、初年度、先駆的に実践活動を行っている専門家に対するヒアリング、加えて文献検討から得られた連携に必要な要件を見出し、連携・協働に関する学習のコアとなるものを学習指標として示した。それは、「自分づくり」「チーム作り」「地域づくり」の3段階からなる構造的な学習すべき内容を整理したもので、自身での連携・協働能力を評価するシートとした。次年度は、この学習指標の精錬のために、保健、医療、看護、介護福祉の実践者による専門家会議を開催し、一つ一つの学習指標項目を精錬した。さらに、看護学の学会で最も規模の大きな日本看護科学学会の学術集会において、作成した3段階の学習指標を交流集会の場で提示説明し、教育研究者に広く意見を求めた。最終年度は、精錬した学習指標と交流集会で得られた意見をもとに、学習指標のシートのさらなる精錬とともに、個別学習プログラムとしての学習指標の活用プロセス、活用の手引きを作成し、実際に地域において療養者支援にかかわる実践者での試行を計画した。試行は学習指標や個別学習プログラムの趣旨に理解を得られるところとした。連携協力者の所属する新見公立大学は、公立の保健医療福祉の機関に限らず、民間事業者等との関係ができていた。地域看護学、公衆衛生看護学、在宅看護学の実習の受け入れが良く、大学と共同して教育研究に当たっていた。在宅看護学においては学生が継続して在宅療養者への看護が提供できる体制をとっており、療養者支援において以前より地域の事業所の専門職との良い関係を持っていたので、この地域での試行事業を計画した。
ヒトミトコンドリア・DNAヌクレオイド構成成分の網羅的同定

(目的)ヒトmtDNAの維持におけるヌクレオイド構造の役割を明らかにするため、まずヌクレオイド構成成分の同定を目的とした。ヒトmtDNAヌクレオイドの精製には、その主要構成成分であるミトコンドリア転写因子A(TFAM)に対する抗体で免疫沈降するというアプローチを取った。特にヌクレオイドのコアな構成成分を明らかにする目的で、架橋剤を用い、mtDNAにクロスリンクされるタンパク質の同定を試みた。(成果)1)ヒトmtDNAに結合タンパク質ホルムアルデヒドによる架橋反応後、mtDNA-タンパク質複合体を抗TFAM抗体で免疫沈降し、1次元SDS-PAGEに展開後、ゲル全体を40に細切し、トリプシン消化後LC/MS/MSにてすべての切片に含まれるタンパク質を同定した。HelaおよびJurkat細胞を用いてそれぞれ2回計4回のすべての実験において、架橋剤プラス時のみに見出されるタンパク質はわずか5分類に集約できた。(4)TCAサイクル関連(5)脂肪酸β酸化系このように、非常に限られたグループに分類できることはこのクロスリンク免疫沈降系の特異性の高さを示している。また、mtDNAがTCAサイクルと脂肪酸β酸化系代謝経路の効率的な進行のための足場となっている可能性と両代謝経路タンパク質のいくつかは、ヌクレオイドの維持にも働くbifunctinalなタンパク質である可能性を示唆している。2)ヌクレオイドのmtDNA維持における役割TFAM過剰発現細胞株の作製とRNAiノックダウンにより、TFAMが主要なmtDNAコピー数の制御因子であり、ヌクレオイド構造がmtDNA安定性に必須であることを明らかにした(目的)ヒトmtDNAの維持におけるヌクレオイド構造の役割を明らかにするため、まずヌクレオイド構成成分の同定を目的とした。2)ヌクレオイドのmtDNA維持における役割TFAM過剰発現細胞株の作製とRNAiノックダウンにより、TFAMが主要なmtDNAコピー数の制御因子であり、ヌクレオイド構造がmtDNA安定性に必須であることを明らかにした
電気生理の手法を用いた微生物のイオン排出システムの解析と新規排出システムの創製

様々な有用化合物を生産する微生物細胞工場の創製が望まれているが、目的有用化合物の全てに対してそれを特異的に細胞外へ排出する担体が予め天然に存在する可能性は低いと考えられる。また、その合理的デザインも現時点では極めて困難である。我々は、これまで困難であった排出活性を直接、1細胞、リアルタイムで計測するパッチクランプ法を微生物細胞に適用する独自のシステムを構築した。次に、そのシステムを用いて実際に排出活性を確認した上で、排出担体遺伝子の微生物細胞工場への導入を行い、Exporter Engineeringが「合成生物学」による微生物生産工場の創製において重要な因子の一つでことを示した。独自に開発した微生物パッチクランプシステムを活用したCorynebacterium glutamicumのNCgl1221チャネルの解析並びに、NCgl1221チャネルの発酵法による物質生産への活用についての研究を実施した。微生物パッチクランプシステムによる解析は、NCgl1221チャネル遺伝子をBacillus subtilisで発現させ、得られた株より調製した巨大液胞様構造体を用いて行った。その結果、当該チャネルは既に報告したグルタミン酸やアスパラギン酸に加え、リジンとフェニルアラニンのアナログも当該物質濃度勾配以外のエネルギーを必要とせずに輸送することを明らかにした。従って、昨年度報告した変異型NCgl1221遺伝子のE. coliフェニルアラニン生産菌への導入によるフェニルアラニン生産量の顕著な向上は、フェニルアラニンがNCgl1221チャネルを通じて排出されることによるものと考えられた。上記基質のNCgl1221チャネルによる輸送活性に差異がないか確認する目的で、上記の解析を単一の液胞様構造体を用いて連続的に実施したところ、NCgl1221チャネルは輸送基質としてGluやAspよりphenyl propionic acidやLysを好むと考えられる結果を得た。この点について今後更に検討を重ねる予定である。NCgl1221チャネルの物質生産への活用についての研究は、特許出願の関係でここでは開示しないが、上記解析結果を基にNCgl1221チャネルの有用性を示す結果を得ている。独自に開発した微生物パッチクランプシステムを活用して、Corynebacterium glutamicum由来NCgl1221チャネルの解析を行った。NCgl1221チャネル遺伝子を全てのメカノセンシティブ遺伝子を破壊したBacillus subtilisのamyE領域に当該遺伝子領域を挿入し、得られた株より調製した巨大液胞様構造体を用いて解析を行った。当該チャネルはこれまでに我々が明らかにしているグルタミン酸に加え、アスパラギン酸も濃度勾配以外のエネルギーを必要とせずに輸送することを明らかにした。C. glutamicum NCgl1221チャネルは、E. coliなどのものと比べるとN末側の約半分は相同であるが、C末側は独特の領域を有する。このC末領域の機能を探る目的で、C末端領域を切り縮めた変異型NCgl1221チャネルについてパッチクランプ法による解析を行った。変異型チャネル遺伝子は東工大の和地先生らによって作製されたものを用いた。C末端領域を切り縮めた変異型NCgl1221チャネルも膜張力依存的に開孔すること、開孔に必要な膜張力は野生型のものに比べ低いこと、グルタミン酸を濃度勾配以外のエネルギーを必要とせずに輸送することを明らかにした。上記のように、C. glutamicum NCgl1221チャネルはグルタミン酸の他アスパラギン酸も輸送する活性を持つことから、他の有用物質の輸送担体としても機能する可能性が考えられた。そこで、C. glutamicumのグルタミン酸生産を誘導する変異を有する変異型NCgl1221遺伝子を代謝工学的手法により育種されたE. coliフェニルアラニン生産菌にプラスミドで導入したところ、生育とフェニルアラニン生産量が顕著に向上した。このことから、当該輸送系の更なる応用展開が期待できる。このことは、目的化合物の生合成経路がデザインされた微生物細胞工場が期待通りの性能を発揮できない場合の原因のひとつと考えられ、この問題の解決のためのブレークスルーが求められている。本研究で我々は、グルタミン酸の工業生産に用いられているCorynebacterium glutamicumのグルタミン酸生産への関与が示されていた遺伝子について、我々が独自に開発した微生物パッチクランプシステムを活用した解析によって、当該遺伝子産物が直接グルタミン酸排出を担っていること、その排出にはグルタミン酸の濃度勾配以外のエネルギーは必ずしも必要が無いことを明らかにした(BBB, 76, 1422 (2012))。

また、このタンパク質がグルタミン酸以外にも、同様の負電荷を有するAsp、大きな側鎖を有するPhe(実際の実験に用いたものは、その誘導体であるフェニルプロピオン酸)、正電荷を有するLysも、それらの濃度勾配のみで輸送することを明らかにした(投稿準備中)。更に、C. glutamicumにおいてグルタミン酸生産を誘導する変異型当該遺伝子をE. coliのPhe生産菌、Lys生産菌、イノシン生産菌に導入すると、いずれの生産菌においても生産性が向上することを見出した(投稿準備中)。上記は、当該タンパク質が様々な物質の排出担体として有用である可能性を強く示すものである。本研究成果は上記問題の解決法のひとつとなる可能性があり、システム生物学や合成生物学の手法を活用した有用化合物を生産する微生物細胞工場の創製に大きく貢献すると考えられる。応用微生物学独自に開発した微生物パッチクランプシステムを活用して微生物のイオン排出系を解析し、その結果を基に応用展開を行うことを研究の第一の目的としているが、Corynebacterium glutamicumのNCgl1221チャネルを解析しその特性を明らかにすると共に、当該チャネルの発酵法による物質生産における有用性を示す結果を得ているため。独自に開発した微生物パッチクランプシステムを活用して微生物のイオン排出系を解析し、その結果を基に応用展開を行うことを本研究の第一の目的としているが、Corynebacterium glutamicumのグルタミン酸生産に関与するNCgl1221チャネルを解析し、その特性を明らかにすると共に、当該チャネル遺伝子をE. coliフェニルアラニン生産菌に導入し生産量の顕著な向上を見出すなど、おおむね計画通りに進展していると判断できる結果が得られている。上記のように、現在までのところほぼ順調に進展していることから、今後もこれまでの研究計画に沿って研究を推進する。上記のように、現在までのところほぼ順調に進展してしていることから、今後についても、これまでの研究実施計画に沿って研究を推進していく。生じた額は3,235円と少額であり、ほとんど予定通りの進捗と捉えている。若干ではあるが発生した理由は、0以下とすることよりも繰り越して次年度に有効に活用することを優先したためである。ほぼ予定通りの進捗であり、使用計画の特段の変更は考えていない。予定通り必要な試薬類を計画的かつ効率的に購入し、研究を推進する。収支状況報告書の次年度使用額は0円ではないが、この金額は622円である。これは、基金化して繰り越せることから、0円とするために必要性の低いものを購入することを控えたためであり、予定通り研究推進に必要な試薬等の物品を購入に充ててきた。
質量顕微鏡を用いた低分子メタボローム解析の、前立腺癌画像診断への応用

前立腺特異抗原(PSA)は広く使われている前立腺癌の腫瘍マーカーだが、特異度が低く悪性度と相関しない等の短所があり、PSAを補完する新たな腫瘍マーカーが望まれている。本研究では高感度質量顕微鏡を用いた低分子メタボローム解析を行い、癌特異的に発現している分子を同定し画像診断への応用を目指した。前立腺癌組織では正常前立腺上皮に比べ特定の3種類のフォスファチジルイノシトール(PI)の発現亢進を同定し、これらのPI発現プロファイルの違いが新たな前立腺癌診断ツールとして期待された。しかし、MRスペクトロメトリーではこれらの分子を認識することは困難であった。今後は同定した分子の機能解析を検討している。前立腺癌において、PSAを補完しうるマーカーが求められているものの、真に有用な新規マーカーの開発には至っていない。また、MRIは前立腺癌の局在診断に有用な検査であるが、その感度に限界がある。一方、癌組織におけるリン脂質などの小分子物質の重要性は、近年しばしば報告されているが、その詳細については明らかにされていない。本研究において我々は、高解像度の質量顕微鏡(Imaging Mass Spectrometry以下IMS)を用いて、前立腺癌細胞において特異的に発現しているリン脂質を同定し、その代謝をMagnetic Resonance Spectroscopy(以下MRS)の技術で画像化することにより、前立腺癌の新たな診断方法の開発を目指している。平成25年度研究において我々は、前立腺全摘を施行した前立腺癌患者の前立腺組織に対して、高解像度IMSによる解析を行った。Discovery set(14例)の解析により、前立腺によく発現する26分子を同定し、MS/MS解析により、それらのうち14分子はホスファチジルイノシトール(PI)と同定された。また、PI(18:0/18:1)とPI(18:0/20:3)、PI(18:0/20:2)は正常腺管と比べて癌部で有意に発現が亢進していた。さらに、Discovery setを用いた多変量解析により組織上でのPIの発現プロファイルによる癌部の診断アルゴリズムを作成し、Validation set(24例)において、このアルゴリズムは感度87.5%、特異度91.7%の診断率であった。以上より、高解像度IMSにより、正常腺管よりも前立腺癌部で高発現するPIを数種類同定したこと及び、これらのPIの発現プロファイルの差異は、前立腺癌の新たな診断マーカーとなり得ることを論文発表した。また、発現している脂質と予後の関係を解析することで、リゾフォスファチジルコリン(LPC)の発現が正常前立腺上皮に対し前立腺癌部で有意に低下していた。この知見に関し現在論文投稿中である。泌尿器科腫瘍高解像度質量顕微鏡を用いた解析により、正常腺管よりも前立腺癌部で高発現するリン脂質を数種類同定したこと及び、これらのリン脂質の発現プロファイルの差異は、前立腺癌の新たな診断マーカーとなり得ることを平成25年度中に論文発表しており研究計画は順調に遂行されていると考える。

現在、同定したリン脂質が合成されるde novo pathwayと再構成に関わるremodeling pathwayにおける分子生物学的意義を文献的に考察している。また、同定したリン脂質そのものあるいは各経路に関わる酵素を、正常前立腺細胞株や前立腺癌細胞株に添加することにより、その増殖能や浸潤能の変化をin vitroでの評価も検討する。MRSではphosphocholine(PC)などが検出できるようになってきている。IMS解析でPCも同定されており、PCの組織上での発現をMRSで描出しうる条件検討を計画していく。
日本の木綿文化ー染織技法の発展と継承ー

かつて国内で盛んに栽培された和綿は日本の気候に合った特性を持ち、その布は様々な染織技法で彩られて衣服や布団として人を包み、庶民の生活を豊かにしたが、大量生産の製織には適していなかったために衰退していった。本研究は、国産木綿の成り立ちと歴史をもとに、日本で生成された木綿文化の検証を行う。日本の伝統工芸として、それぞれの地域や風土のなかで独自に発展した木綿染織がどのように継承されているのかを調査し、考察する。また、和綿栽培復興の事例から、現代の工業化された消費社会において人の手で作られる布の魅力を再考し、伝統技術を伝えていくことの意味を明らかにして行く。
血小板特異的インテグリンαIIbβ3はマスト細胞で何をしているか?

われわれは、血小板特異的に発現すると考えられてきたインテグリンaIIbb3がマスト細胞に高発現すること、マスト細胞はSCFやIgEの刺激により活性化するとインテグリンaIIbb3を介してファイブリノーゲンに接着すること、その際マスト細胞の増殖・サイトカイン産生・遊走が増強されることを示した。マスト細胞の関与が知られている皮膚の炎症モデル実験においては、第一相(ヒスタミンが関与)及び第二相(サイトカイン産生が関与)の炎症反応(耳の皮膚の厚さを測定)がインテグリンaIIbの欠損マウスで減弱することを示した。これにより、マスト細胞の反応性にインテグリンaIIbが関与することが、in vivoでも証明された。一方、マスト細胞の局在については、背中の皮膚に存在するマスト細胞数の低下がインテグリンaIIbの欠損マウスで認められたが、耳の皮膚に存在するマスト細胞数に差はなかった。この理由は現時点で不明であるが、インテグリンaIIbがマスト細胞の局在に影響を及ぼしていることは示唆された。また、われわれはインテグリンaIIbがインテグリンaVと競合的にインテグリンb3に結合することを、インテグリンaIIb欠損マスト細胞にインテグリンaIIbを再構築する実験により証明した。これは、インテグリンaIIb欠損状態では、相対的にインテグリンaVb3の発現量が増加していることを意味し、インテグリンaIIbノックアウトマウスの解析上、留意すべき点である。これらの研究結果からマスト細胞の関与する炎症やアレルギーの病態にインテグリンaIIbが関与することが証明された。インテグリンaIIbを標的にした局所的な治療への応用も考えられ、本研究における臨床的な意義と重要性が示されたと思われる。我々は、巨核球・血小板特異的なマーカーと考えられてきたIntegrinαIIbβ3がマスト細胞に高発現していることを見出した。まず、マウス骨髄由来マスト細胞、腹腔マスト細胞、皮膚・肺由来マスト細胞を使用してマウスの粘膜型及び結合織型マスト細胞に高発現していることを示し、さらに、ヒト臍帯血由来マスト細胞を利用してヒトマスト細胞にも高発現していることを確認した。機能的には、このIntegrinαIIbβ3を介して、マスト細胞は種々の刺激(IgEレセプターの架橋、SCFなど)により、ファイブリノーゲンやフォンビルブランドファクターに接着することを明らかにした。特に、ファイブリノーゲンへの接着は、はぼ完全に、IntegrinαIIbβ3依存的であり、その生理的意義の探求に焦点を移した。現時点で確認された現象は、マスト細胞は、SCF刺激によるIntegrinαIIbβ3依存的なファイブリノーゲンへの接着を介して、増殖・遊走・サイトカイン産生を高めることであり、組織におけるファイブリノーゲンの漏出に伴いマスト細胞が炎症を増悪させると考えられた。また、可溶性のファイブリノーゲンをIntegrinαIIbβ3を介して細胞内に取り込む現象も確認されたことより、一旦生じた炎症の修復機構にも関与している可能性が示唆された。現在、炎症の増悪・修復双方の観点から、さらに研究を進めている。次に、IntegrinαIIbノックアウトマウスの解析を開始した。その結果、IntegrinαIIbを欠損したマスト細胞では、IntegrinαVβ3が高発現し、刺激でファイブリンーゲンに対する接着を認めないが、ビトロネクチンへの接着は亢進した。このマスト細胞にIntegrinαIIbをレトロウイルストランスフェクションを利用して再構築するとIntegrinαIIbβ3の発現とともにIntegrinαVβ3の発現が減少し、ファイブリノーゲンへの接着が回復する一方で、ビトロネクチンへの接着は正常化した。

これらの結果より、マスト細胞では、IntegrinαIIbとIntegrinαVが競合的にIntegrinβ3と結合すること、ファイブリノーゲンへの接着はIntegrinαIIbβ3を介して、ビトロネクチンへの接着はIntegrinαVβ3を介し、フォンビルブランドファクターへの接着はIntegrinαIIbβ3とIntegrinαVβ3の両方を介していることが明らかとなった。われわれは血小板・巨核球に特異的に発現すると考えられてきたintegrin αIIbβ3がマスト細胞に発現していることをRNA及び蛋白レベルで明らかにした。種々のマスト細胞株、マウスの骨髄、腹腔、肺及び皮膚由来のマスト細胞、さらにヒト臍帯血由来のマスト細胞におけるintegrin αIIbβ3の発現を確認した。興味深いことに、マスト細胞と同様に高親和性IgEリセプターをもつ好塩基球(マウス骨髄由来)にもその発現が認められた。しかし、他の成熟血球細胞(リンパ球、単球、好中球など)には発現が認められなかった。integrin αIIbβ3に対する中和抗体を使った実験やintegrin αIIbノックアウトマウスの解析により、IgEやSCFの刺激で活性化されたマスト細胞はintegrin αIIbβ3を介してファイブリノーゲンに対して接着することが証明された。一方、フォンビルブランドファクターに対する接着はintegrin αIIbβ3とintegrin αVβ3の双方を介することが示された。また、マスト細胞はファイブリノーゲンに接着するとその増殖、サイトカイン産生、遊走能を増強させることも証明された。In vivo実験では、integrin αIIbのノックアウトマウスにおいてPCA反応の減弱、IgE依存性三相性皮膚反応における第一相及び第二相反応の減弱を認めた。FACSや共焦点顕微鏡を使用した実験では、活性化したマスト細胞は可溶化ファイブリノーゲンをintegrin αIIbβ3を介して細胞内に取り込むことも証明された。一方、integrin αIIbの欠損マスト細胞ではプラスミノーゲンからプラスミンへの変換を抑制するPAI-1の発現が増強していることが示された。結果として、フィブリンの分解抑制とそれに伴うフィブリン沈着の増強が想定され、マスト細胞のintegrin αIIbがアレルギーや炎症の増悪のみならずその組織修復にも関与していることが示唆された。われわれは,血小板特異的に発現すると考えられてきたインテグリンaIIbb3がマスト細胞に高発現すること,マスト細胞はSCFやIgEの刺激により活性化するとインテグリンaIIbb3を介してファイブリノーゲンに接着すること,その際マスト細胞の増殖,サイトカイン産生,遊走が増強されることを示した。マスト細胞の関与が知られている皮膚の炎症モデル実験においては,第一相(ヒスタミンが関与)及び第二相(サイトカイン産生が関与)の炎症反応(耳の皮膚の厚さを測定)がインテグリンaIIbの欠損マウスで減弱することを示した。これにより,マスト細胞の反応性にインテグリンaIIbが関与することが,in vivoでも証明された。一方,マスト細胞の局在については,背中の皮膚に存在するマスト細胞数の低下がインテグリンaIIbの欠損マウスで認められたが,耳の皮膚に存在するマスト細胞数に差はなかった。
半導体微細加工技術による人工せん毛形マイクロポンプの開発

まず人工せん毛を駆動するアクチュエ-タについて、静電形、形状記憶合金形、バイメタル形を比較した。静電形は駆動に強い電界を利用するため、導電性の液体はもとより、絶縁性の液体でも絶縁破壊を生ずるので実用的でないことが分かった。形状記憶合金については、IC技術によって薄膜状に形成することが問題となる。IC技術で広く使われる製膜法のスパッタ法を用いて、薄膜のTiNi合金を作り、その組成・結晶構造・抵抗率の温度変化等を計測した。この結果、タ-ゲットとして適当なTiとNiの比を選べば、形状記憶効果が現われる温度を室温よりやや高い程度の温度に定められることがわかった。また、製膜後の熱処理により、アモルファス状態から、望ましい相へと結晶化させられることも明らかになった。現在、形状記憶効果によるアクチュエ-タ動作を確認している段階である。バイメタル形は、二つの異った熱膨張率を持つ薄膜を重ね合わせて作り、温度を上昇した時の熱膨張の差でたわみを得るものである。二つの材料として、高分子材料の一種のポリイミドと、金属(NiもしくはCr)を考えた。ポリイミドは熱膨張率が金属の十倍程度と大きく、また絶縁性なので金属膜そのものをパタ-ニングして、ヒ-タを兼用できる長所がある。しかしヤング率が金属に比べて小さいため、厚みの比について最適化する必要がある。理論式に基づいて最適値を求めると、ポリイミドとNiの厚みの比を4:1にすれば良いことが分かった。製作プロセスを種々検討し、長さ500μm、幅180μm、厚み2μmのポリイミドとNiからなる片持ち梁を作った。温度の上昇につれ、片持ち梁が上にそり返ることを確認した。この片持ち梁は、フォトリングラフィ-により多数個を基板上に同時に形成できる。これをせん毛のように協調動作させるための極めて簡単な制御回路を考案した。現在、ポンプとして使えるような動作をさせる実験を行っている。
肺癌の抗癌剤耐性獲得機序における組織因子のアポトーシス抑制作用の分子細胞学的研究

[背景]肺癌患者には抗癌剤の併用療法が行われているが、多くの場合抗癌剤耐性により早々に抗癌剤が無効となり、治療対策の確立のためにも抗癌剤耐性の分子機構の解明が要望されている。我々はこれまで主に呼吸器疾患の病態と血液凝固系組織因子の関係を解析し、次の研究成果を得てきた。肺癌患者において血液中の組織因子濃度が患者の生存期間、臨床病期と有意に相関し組織因子による癌細胞の凝固促進作用が癌の悪性度と密接に関係していることを見いだした。[結果]抗癌剤耐性の肺癌細胞株では、耐性のない肺癌細胞株にくらべ、組織因子の活性とその発現が亢進していた。逆に、抗癌剤耐性の肺癌細胞株では、耐性のない肺癌細胞株にくらべ、TAFIの発現が低下していた。また、抗癌剤耐性の肺癌細胞株では、耐性のない肺癌細胞株にくらべ、細胞内アポトーシス伝達機構の経路が抑制されていることが明らかになった。[結論]以上の結果より肺癌細胞における組織因子とTAFI抗原の発現が抗癌剤耐性に関与していることが示唆された。組織因子とTAFIの発現は抗癌剤耐性の指標や予後因子として日常臨床で有用である可能性も示唆された。肺癌患者にはシスプラチンを含む抗癌剤併用療法が施行されているが、多くの場合抗癌剤耐性により早々に抗癌剤が効かなくなり、治療対策の確立のために抗癌剤耐性の分子機構を明らかにすることが必要である。アポトーシスの抑制は癌における抗癌剤耐性の中心的な機構と考えられ、我々の従来の研究においては血液凝固系組織因子(TF)の発現が抗癌剤耐性に関与している可能性を示唆するものである。従来、TFについては外因系凝固の活性化における役割を中心に研究されてきたが、最近になって、TFのアポトーシス抑制作用が注目されてきた。しかし、TFによるアポトーシス誘導と抗癌剤耐性の関係については明らかではない。抗癌剤耐性とTFによるアポトーシスの関連を明らかにするために我々は平成13年度に先ず野生型TF(wild-TF)cDNA及び自己リン酸化を阻害する細胞内ドメインの変異型TF(mutant-TF)cDNA高発現ベクター(pCR3.1)をTAクロニング法で作製した。ベクターのTFcDNAのオリエンテイションとシクエンスを確認した後にそれぞれの発現ベクターを抗癌剤感受性でTF発現の少ないPC9/P肺癌細胞殊にcationic liposome法で導入し、形質変換細胞を調整している。mutant-TF,wild-TFまたはベクターのみのある形質変換細胞を分離している。一方、最近我々は癌患者において血液中の線溶系の阻害剤であるthrombin-activatable fibrinolysis inhibitor(TAFl)はTF活性化の機序に重要な役割果たしていることを報告した。現在、in vitroの実験系で抗癌剤耐性の分子機構におけるTFの関与を検討し、TFとTAFl等の凝固因子との関連も検討している。
早産児の慢性肺疾患進展に対する細菌学的要因の特定と発症予防法の確立

新生児期の呼吸障害に引き続く慢性的な呼吸障害の総称である慢性肺疾患発症の危険因子として出生前後の感染症の関与が指摘されている。われわれは、出生時より人工呼吸器管理を必要とした新生児の気道分泌物を定期的に採取し、細菌の16S ribosomal RNA遺伝子をPCR法によって増幅して得られた産物をクローニングし、その塩基配列から細菌を同定する手法を用いて、慢性肺疾患に進展に対する細菌学的要因を明らかにし、それを予防する最適な治療の確立を行うことを目的とする研究を行った。出生時から呼吸障害を呈し、人工呼吸器管理を行った早産児を対象とし、出生時は胃液を採取し、その後は抜管されるまで定期的に気道分泌物を採取した。出生直後に採取した胃液を解析すると、母体に切迫兆候があり早産となった児の約40%で、PCR法の解析結果から細菌の存在が示唆された。この検体をさらに解析すると、Lactobacillus属の細菌が多くの症例で検出されていた。しかし、Lactobacillus属の細菌は、その後も人工呼吸器管理されている症例の気管洗浄液からは検出されず、慢性肺疾患発症への関与を証明することはできなかった。一方、解析できた症例数は少なかったものの、長期間にわたる人工呼吸器管理を必要とした症例の気管分泌物からは、Staphylococcus epidermidisが検出される頻度が高く、慢性肺疾患発症との関連が疑われた。われわれは、出生時より人工呼吸器管理を必要とした新生児の気道分泌物を定期的に採取し、細菌の16S ribosomal RNA遺伝子をPCR法によって増幅して得られた産物をクローニングし、その塩基配列から細菌を同定する手法を用いて、慢性肺疾患に進展に対する細菌学的要因を明らかにし、それを予防する最適な治療の確立を行うことを目的とする研究を開始した。出生直後の検体は、ほとんどの症例で獲得できるため、まずは、出生時に採取した胃液を用いた解析を行った。その結果、母体に切迫兆候があり早産となった児の約40%で、PCR法の解析結果から細菌の存在が示唆された。この検体をさらに解析すると、Lactobacillus属の細菌が多くの症例で検出されており、これらの細菌が早産に関連している可能性が示唆された。一方、慢性肺疾患の要因を検索するためには、出生後の気道細菌叢の解析を行う必要がある。しかし、現在まで長期間にわたる人工呼吸器管理を必要とした症例が少ないため、出生時と同様の細菌が長期間気道内に存在し続けるかは解析できていない。今後は、こうした症例をより多く集積する必要がある。得られた結果を解析し、結論を導くのに必要な対象者数には達していないが、一定の傾向がわかる程度までには達している。現在は、対象症例を増やし、検討すべき項目の測定を行っている。症例数は少ないものの、長期間にわたる人工呼吸器管理を必要とした症例の気管分泌物の解析を行ったところ、S. epidermidisが検出される頻度が高く、慢性肺疾患との関連が疑われた。今後は、さらに症例数を増やし同様の解析を行う予定である。

出生時から呼吸障害を呈し、人工呼吸器管理を行った早産児を対象とし、出生時は胃液を採取し、その後は抜管されるまで定期的に気道分泌物を採取した。出生直後に採取した胃液を解析すると、母体に切迫兆候があり早産となった児の約40%で、PCR法の解析結果から細菌の存在が示唆された。この検体をさらに解析すると、Lactobacillus属の細菌が多くの症例で検出されていた。しかし、Lactobacillus属の細菌は、その後も人工呼吸器管理されている症例の気管洗浄液からは検出されず、慢性肺疾患発症への関与を証明することはできなかった。一方、解析できた症例数は少なかったものの、長期間にわたる人工呼吸器管理を必要とした症例の気管分泌物からは、Staphylococcus epidermidisが検出される頻度が高く、慢性肺疾患発症との関連が疑われた。引き続き、対象症例を増やし、検討すべき項目の測定およびデータ解析を行い、得られた結果の解釈を行う。当初の予定よりも、実験試薬および実験器具にかかる費用が少なかったことが考えられる。次年度以降、実験やデータ解析にかかる費用については不確定な部分もあるため、次年度予算に加えて前年度の繰越金を使用する。
ＣＣＮ２のメタボリックサポーターとしての機能解明とその臨床応用研究

CCN2は軟骨細胞の増殖と分化をともに促進するが、この一見矛盾する分子機能を可能とするメカニズムは明らかではなかった。本研究では、CCN2が軟骨細胞における代謝全般、特にエネルギー産生に与える影響、ならびにその背景にある分子基盤を解明することを目的とした。その結果、CCN2欠損により軟骨細胞内ATP量が低下し、その原因が解糖系の抑制にあることが解明され、CCN2は軟骨細胞のATP産生を支えるメタボリック・サポーターであることが示された。また動物OAモデルにおいて関節軟骨再生効果が確認できたことからOA軟骨治療への応用が期待される。CCN2はCTGF(connective tissue growth factor)とも呼ばれるCCNファミリーの代表的なメンバーであり、細胞外シグナルを統合・指揮している多機能分子と考えられている。この分子は特に間葉系組織の発生や再生に重要で、CCN2欠損マウスでは骨格形成異常がみられ、骨芽細胞・軟骨細胞の基質産生能や増殖能が著しく低下する。したがって我々はこのCCN2が骨軟骨代謝の根幹に関与しているのではないかと考え、CCN2の代謝システム全般における役割を解明することを目的として解析を行った。CCN2欠損マウスと野生型のマウスの軟骨細胞を用い、遺伝子プロファイル、ATP量の比較解析を行った。遺伝子発現プロファイルは同細胞からRNAを抽出してDNAマイクロアレイにより解析し、細胞抽出液中のATP量はbioluminescence assay法にて定量した。DNAマイクロアレイの結果から、CCN2欠損軟骨細胞では多くのリボソームタンパク質遺伝子の発現が亢進すること、ATP合成酵素γサブユニット遺伝子の発現が低下することが明らかとなった。ATP定量ではCCN2欠損マウスで細胞内ATP濃度が低値であった。また、HCS-2/8細胞において、一時的にCCN2をノックダウンした場合でもATP合成酵素γサブユニットの発現抑制が認められた。以上より、CCN2がATP産生を支えることにより軟骨細胞のエネルギー代謝において重要な役割を担っているということが示唆された。昨年度までの研究で、CCN2欠損マウス軟骨細胞においてはATPの細胞内濃度低下、ならびにATG合成酵素γサブユニットの遺伝子発現の低下がみられることがわかっていた。ゆえに今年度はCCN2欠損マウス軟骨細胞と野性型マウス軟骨細胞から代謝産物を抽出し、メタボローム解析によって網羅的に代謝産物の比較定量を行い、より多くの情報を得た。重要なことに、この解析でも細胞内ATP量はCCN2欠損軟骨細胞において50%にまで低下していることが示され、昨年度までの成果は裏付けられた。さらにCCN2欠損により引き起されたこのATP量減少は、細胞外からCCN2を供給することにより回復しうることも明らかとなった。しかしその一方で、ミトコンドリア膜電位の測定結果からは、ミトコンドリア内での酸化的リン酸化による好気的ATP産生活動にはCCN2欠損の有意な影響はみられなかった。またメタボローム解析の結果は、嫌気的ATP産生の主代謝経路である解糖系代謝産物が、CCN2欠損で軒並み低下することも示していた。そこで解糖系に関与する酵素群の遺伝子発現状況をCCN2欠損、ならびに野性型軟骨細胞で比較した結果、エノラーゼを始めとして解糖系後半で活躍する複数の酵素遺伝子発現が、CCN2欠損で低下することを見出した。つまり、ここで見られたATP量の低下は、ミトコンドリアにおける好気的ATP産生より、むしろ解糖系による嫌気的ATP産生がCCN2欠損により低下したためと考えられる。軟骨組織には血管がないため、そこにいる軟骨細胞は低酸素状況に適応した代謝システムを有している。今年度得られた成果は軟骨細胞のこういった特性をよく反映している。以上の成果は、CCN2による骨・軟骨再生治療に理論的根拠を与えるもので、事実今年度はCCN2誘導体を用いたより効率的なOA軟骨再生実験にも成功している。変形性関節症(OA)は現在社会の高齢化に伴い年々増加の一途を辿っている運動器疾患であり、患者のQOLを大きく損ない、また社会に対する負担を増大させる。従ってその予防と治療は今日の医学的急務である。最近の研究で結合組織成長因子(CTGF)という名でも知られるCCN2が、このOAの予防および治療に有効であるとの報告があり臨床応用が期待されているが、新奇な性質を持つ分子だけにその作用機序については未解明の部分が多い。本研究では申請者らが最近得た知見を突破口として、このCCN2分子の持つ軟骨代謝を根底から支えるメタボリックサポーターとしての重要な新機能を明らかにする。そしてその成果を生かし、より適切なOA治療戦略の樹立と、OAに留まらない広範囲な臨床応用にむけての基礎を築くことが本研究の目的である。まず、野性型マウスとCCN2ノックアウトマウスの肋軟骨細胞からRNAを抽出してマイクロアレイによる比較解析を行ったところ、ATPシンターゼsubunit γ遺伝子の著明な発現低下、そして数多いリボソームタンパク質遺伝子群の著しい発現上昇が観察された。

そこでまず、逆転写リアルタイムPCR法により当該遺伝子mRNAを定量したところ、網羅的解析の結果と同様の結果が得られた。次に、CCN2遺伝子ノックダウンが上記遺伝子群の発現に与える影響のヒト細胞での検討を行った。ヒト軟骨細胞様HCS-2/8細胞株に対してRNA干渉の手法で一過性のCCN2遺伝子ノックダウンを行ったところ、同様の効果が再現された。CCN2遺伝子発現抑制が軟骨細胞ミトコンドリアの酸化的リン酸化能力に与える影響を評価するため、CCN2をノックダウンしたHCS-2/8細胞からミトコンドリアを分離し、それらによる試験管内でのATP合成能力を定量評価している。前年度に計画していたCCN2遺伝子発現抑制が、軟骨細胞ミトコンドリアの酸化的リン酸化能力に与える影響の評価を行い、重要な成果を得た。CCN2遺伝子発現抑制が軟骨細胞ミトコンドリアの酸化的リン酸化能力に与える影響を評価するため、CCN2をノックダウンしたHCS-2/8細胞からミトコンドリアを分離し、それらによる試験管内でのATP合成能力を定量評価を現在、行っているところである。H24年度に行ったCCN2遺伝子発現抑制を引き続き行い、H25年度は以下の項目について検討を進める。(1)CCN2遺伝子代謝産物の比較定量(2)ヒト軟骨細胞様HCS-2/8細胞を用いて、CCN2遺伝子代謝関連遺伝子のノックダウンを行い、定量RCR法にてその影響を解析する。(1)CCN2遺伝子発現抑制が軟骨細胞ミトコンドリアの酸化的リン酸化能力に与える影響の評価:CCN2をノックダウンしたHCS-2/8細胞からミトコンドリアを分離し、それらによる試験管内でのATP合成能力を定量評価する。ミトコンドリアの分離は通法に従って行い、ATP合成量は市販の実験キットによって行う。(2)CCN2遺伝子発現抑制が軟骨細胞の他のミトコンドリア機能に与える影響の評価:CCN2ノックアウト軟骨細胞を透過性電子顕微鏡で観察し、ミトコンドリアの構造を野性型と比較検討する。並行してクエン酸回路や、ミトコンドリア外で行われるが密接な関連のある解糖系などの代謝経路の活動性の生化学的評価も行う。(3)CCN2遺伝子過剰発現・添加が上記ミトコンドリア機能に及ぼす影響の解析:CCN2の過剰発現プラスミド、ならびにリコンビナントタンパク質をHCS-2/8細胞に遺伝子導入、あるいは外部から添加し、ノックダウン実験でみられたような代謝関連遺伝子の変動と逆の現象がみられるかを定量的に検証する。またその結果として現れるミトコンドリア機能の変化に関しても、ノックダウン実験の場合と逆の効果が現れるか否かを同様の方法で検証する。H24年度の残額を含め、H25年度と合わせて、研究消耗品80%、旅費20%の使用を計画している。研究消耗品80%、旅費20%の使用を計画している。