hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
塩害・地盤変状発生機構の解析と環境負荷汚泥焼成物を用いた防止技術の開発

ユーラシア大陸地下には,広く岩塩層が堆積していることが知られる.地層褶曲などにより岩塩層が比較的地表近くまで迫出している場合には,表層地下水にまで塩分が含まれていることが多い.典型的な事例をタイ東北部(内陸)に見ることができる.乾期,雨期の乾湿繰返しに伴って地表面への塩の析出と塩害に伴う農業生産の低下を引き起こしている.一方,東南アジアの国々では,製紙業から排出されるPS(ペーパースラッジ)や浄水場発生汚泥の処理は深刻な環境問題となっている.このような汚泥を1300度程度で焼くと,微細な多孔構造を持つ安定した多孔質材とすることができる.本研究課題は,タイ東北部をフィールドに,この多孔質材料を塩害防止・対策に用い,塩害防止と農耕地保全に役立てることを目的とし, 1.水収支の狂いによる塩分析出シミュレータの高度化, 2.タイ東北部で計測された塩害,地盤変状の解析, 3. PS焼成材,浄水場排出焼成材の力学特性の把握, 4.塩害防止,農耕地保全の構造体の提案を行った.ユーラシア大陸地下には,広く岩塩層が堆積していることが知られる.地層褶曲などにより岩塩層が比較的地表近くまで迫出している場合には,表層地下水にまで塩分が含まれていることが多い.典型的な事例をタイ東北部(内陸)に見ることができる.乾期,雨期の乾湿繰返しに伴って地表面への塩の析出と塩害に伴う農業生産の低下を引き起こしている.一方,東南アジアの国々では,製紙業から排出されるPS(ペーパースラッジ)や浄水場発生汚泥の処理は深刻な環境問題となっている.このような汚泥を1300度程度で焼くと,微細な多孔構造を持つ安定した多孔質材とすることができる.本研究課題は,タイ東北部をフィールドに,この多孔質材料を塩害防止・対策に用い,塩害防止と農耕地保全に役立てることを目的とし, 1.水収支の狂いによる塩分析出シミュレータの高度化, 2.タイ東北部で計測された塩害,地盤変状の解析, 3. PS焼成材,浄水場排出焼成材の力学特性の把握, 4.塩害防止,農耕地保全の構造体の提案を行った.ユーラシア大陸地下には,広く岩塩層が堆積していることが知られる.地層褶曲などにより岩塩層が比較的地表近くまで迫出している場合には,表層地下水にまで塩分が含まれていることが多い.典型的な事例をタイ東北部(内陸)に見ることができる.乾期,雨期の乾湿繰返しに伴って地表面への塩の析出と塩害に伴う農業生産の低下を引き起こしている.一方,東南アジアの国々では,製紙業から排出されるPS(ペーパースラッジ)や浄水場発生汚泥の処理は深刻な環境問題となっている.このような汚泥を1300度程度で焼くと,微細な多孔構造を持つ安定した多孔質材とすることができる.本研究課題は,タイ東北部をフィールドに,この多孔質材料を塩害防止・対策に用い,塩害防止と農耕地保全に役立てることを目的とし,1.水収支の狂いによる塩分析出シミュレータの高度化,2.タイ東北部で計測された塩害,地盤変状の解析,3.PS焼成材,浄水場排出焼成材の力学特性の把握,4.塩害防止,農耕地保全の構造体の提案を行おうとするものである.平成21年度は,研究実施計画に従い,数理モデルの体系の高度化と整備,実地フィールド情報の収集・分析,多孔質セラミック材の力学特性の把握を実施し,地盤環境シミュレータを開発し,塩害過程シミュレーションを開始している.このような技術体系の構築は,地盤工学が,土木分野における構造物の設計や施工に役立たせるだけでなく,農学,理学との相互補完型の学際連携を可能とし,地球環境問題への積極的な貢献をはたせるものと期待できる.タイ東北部(内陸)では,乾期,雨期の乾湿繰返しに伴って地表面への塩の析出と農業生産の低下が生じている.さらに,塩分を含んだ地下水を利用した塩の生産が行われ,その地下水の汲み上げが地盤変状をもたらしている.このような塩害発生メカニズムを模擬できる数値シミュレータの開発が目的のひとつである.一方,製紙業から排出されるPS(ペーパースラッジ)や浄水場発生汚泥の処理は深刻な環境問題となっている.このような汚泥を1300度程度で焼くと,微細な多孔質構造を持つ安定した(有害金属などがガラス質で強固に密閉された)セラミックとすることができる.この多孔質材はレキ材としての透水性と微細多孔構造ゆえの高い保水性を持つ材料となる.この材料を塩害防止・対策に用いることも目的としている.塩害といった現地の地球環境問題の解決をはかる工学的技術を提供する.このような研究は極めって地盤力学的であって,地盤工学の地球環境問題への積極的な寄与と言える.本年度の成果は以下の通りである.1.圧縮,吸気等の配管接続を必要とせず,電源供給により単独で駆動する精密三軸試験装置(スマート三軸)を改良し,性能を検証した.この装置は移設・運搬が可能であり,タイ東北部へ持参し,現地で地盤特性の把握に利用できる.2.土/水/空気/移流分散連成場における力学挙動を記述できる数学モデルを構築し,有限要素離散化手法を用いた塩害シミュレータを開発した.

従来の塩分などの移流分散挙動に限らず,気象条件の変化に伴う不飽和/飽和地盤の変形・応力変化も表現できるものである.3.開発した塩害シミュレータを用いて,マルティング,改良マルティングなどの塩害抑止補助工法の検討を行ったユーラシア大陸地下には,広く岩塩層が堆積していることが知られる.タイ東北部(内陸)では、大陸移動前には赤道下の海底であった場所が,プレート移動と地盤隆起に伴って高濃度塩分の集積による岩塩層となった.しかも,地表面下約100mから,浅いところでは約40m深にあって,森林伐採以降の農耕地開墾において,乾期,雨期の乾湿繰返しに伴って地表面への塩の析出と塩害に伴う農業生産の低下を引き起こしている.さらに,細る農業収入を補うために,塩分を含んだ地下水を人為的に汲み上げ,塩田を成して塩を生産している.地下水の汲み上げは深刻な地盤変状をもたらし,塩田で不要となった塩水は農業潅概路に放出され,塩害を深刻化させている.一方,我が国も同様であるが,特に,東南アジアの国々では,需要の高まる製紙業から排出されるPS(ペーパースラッジ)や浄水場発生汚泥の処理は深刻な環境問題となっている.このような汚泥を1300度程度で焼くと,微細な多孔構造を持つ安定した(有害金属などがガラス質で強固に密閉された)多孔質材とすることができる.この多孔質材はレキ材としての透水性と微細多孔構造ゆえの高い保水性を持つ材料となる.これを塩害防止・対策に用いることも目的としていた.本研究は,大きくは次の内容からなる.基礎研究に基づき,有限要素法を用いた塩害過程シミュレータを高度化・整備した.これを用いて,塩害防止・農耕地保全構造体の検討を行った.この時,塩害防止・農耕地保全に環境汚泥のリサイクル材(焼成多孔質セラミック材)を用いて,環境負荷の軽減も同時に図った.以上の成果に基づき,実地フィーシビリティーの検討,経済性の検討を行い,その成果を,2011年11月(洪水被害のため2012年3月に延期・開催)にタイ・パタヤで開催される国際会議にて発表し,討議した.
気孔の青色光情報伝達の遺伝学的・生化学的解析

本研究ではフォトトロピンと細胞膜H+-ATPaseを繋ぐ新奇情報伝達因子を同定することを目的として、青色光特異的な気孔開口に異常を示すシロイヌナズナ突然変異体の選抜を進めてきた。これまでに赤外線サーモグラフィを用いて20万個体の変異体における葉面温度変化を測定した結果、60ラインの気孔開口変異体を単離することに成功した。今年度はこれらの中から気孔開口が顕著に阻害されたG39-50変異体に着目して研究を進めた。G39-50では青色光によるH+放出およびH+-ATPaseのリン酸化が野生株の半分以下に低下していることが分かった。さらにこの変異体ではH+-ATPaseのタンパク質量が野生株の30%程度に減少していることを見出した。次世代シーケンスを用いたゲノムリシーケンス解析により原因遺伝子の同定を行ったところ、この変異体ではH+-ATPaseをコードするAHA1遺伝子内にミスセンス変異をもつことが分かった。AHA1遺伝子にT-DNAが挿入された別の変異体を入手し気孔の青色光反応を調べたところ、この変異体でも気孔開口およびH+-ATPaseの活性が阻害されG39-50と同様の表現型を示すことが分かった。さらいG39-50変異体に野生型のAHA1遺伝子を導入すると気孔開口が相補されることが分かり、この変異体の原因遺伝子がAHA1であることが確定された。シロイヌナズナにはH+-ATPaseをコードする遺伝子が11存在し、これらは機能重複して働くと考えられていた。本結果は気孔開口におけるH+-ATPaseの重要性を順遺伝学的解析により初めて示した例となるとともに、組織によりアイソフォーム間に発現量の違いがありH+-ATPase活性に占める寄与が異なる可能性を示唆している。26年度が最終年度であるため、記入しない。フォトトロピンにより受容された光シグナルは、未知の情報伝達を経て細胞膜H+-ATPaseを活性化させ気孔を開口させる。本研究では上記情報伝達に関わる新奇因子を同定することを目的として、赤外線サーモグラフィによる変異体スクリーニングを行い、気孔開口の鍵因子BLUS1キナーゼを単離した。本年度はBLUS1が青色光シグナルを伝達する分子機構について研究を進め、以下の成果を得た。昨年度のリン酸化プロテオーム解析から、BLUS1のC末端側のSer残基が青色光に応じてリン酸化されること、このリン酸化は気孔開口に必須であることを示した。そこで、このリン酸化Serを特異的に認識する抗体を作製し、BLUS1のリン酸化タイムコースを詳細に調べた。孔辺細胞に青色光パルスを照射すると、BLUS1は青色光照射15秒目で既にリン酸化が開始され、1分目で最大、5分目で脱リン酸化されることが分かり、このタイムコースはフォトトロピンの自己リン酸化とよく対応していた。そこでBLUS1がフォトトロピンのリン酸化基質となる可能性についてin vitroキナーゼアッセイにより調べたところ、BLUS1は青色光依存的にphot1により直接リン酸化される証拠を得た。また孔辺細胞を用いた共免疫沈降解析から、両者は細胞内で複合体を形成していることを見出した。さらにin vitro pull-downアッセイによりphot1とBLUS1の結合を調べたところ、両者は直接相互作用することが明らかとなった。以上の結果から、BLUS1はフォトトロピンの基質であり、フォトトロピンによるBLUS1のリン酸化は青色光情報伝達の初期過程であると結論づけた。

フォトトロピンのリン酸化基質としてBLUS1を同定し、フォトトロピン情報伝達の初期過程の一端を解明できた。本成果は、植物の光環境感覚の理解において重要な知見をもたらすものと考える。今後は引き続きスクリーニングで単離された他の変異体の解析を進めるとともに、次世代シーケンスやマッピングにより原因遺伝子を同定する。リン酸化プロテオームにより同定された因子に関して、気孔開口に関与する因子の特定を進める。またアミノ酸置換の手法を用い、気孔開口におけるリン酸化の意義を明らかにする。
RNAポリメラーゼの構造変化による転写調節の解明

本研究課題ではRNAポリメラーゼの構造変化によって行われる転写調節のメカニズムを解明するために生化学実験,構造解析を行った.転写反応は複雑な多段階反応であり,その中でRNAポリメラーゼの状態(構造)も変化するのではないかと考えられていた.本研究開始以前に,申請者の研究によってRNAポリメラーゼの中心部分が大きく回転するような構造変化が起こることが報告されていた.ここで観察さわた構造変化とこれまでに報告されていた生化学的解析の結果を照らし合わせて,RNAポリメラーゼの構造変化と転写メカニズム関連を総説として発表した(研究発表・雑誌論文).このような観察をもとに生化学的解析を行った.まず,これまでに観察されていたRNAポリメラーゼの2つの構造状態のそれそれを安定化する目的で,RNAポリメラーゼの内部にジスルフィド結合を導入した.次に,これらの変異体RNAポリメラーゼを用いて転写反応の生化学的解析をおこなった.その結果,RNA伸長反応等において,ジスルフィド結合の導入によってRNAポリメラーゼの活性が変化した.この結果はRNAポリメラーゼの構造変化と転写のメカニズムに密接な関連があることを示唆している.またこの他こ,RNAポリメラーゼと新規の転写因子の複合体の構造解析にも取り組み,転写因子の結合によって引き起こされる構造変化を観察した.これにより,この転写因子による転写調節機構を明らかにすることができた(投稿準備中).以上の結果は,転写のメカニズムにおけるRNAポリメラーゼの構造変化の役割を解明する上で非常に有用な情報になる.本研究課題ではRNAポリメラーゼの構造変化によって行われる転写調節のメカニズムを解明するために生化学実験,構造解析を行った.転写反応は複雑な多段階反応であり,その中でRNAポリメラーゼの状態(構造)も変化するのではないかと考えられていた.本研究開始以前に,申請者の研究によってRNAポリメラーゼの中心部分が大きく回転するような構造変化が起こることが報告されていた.ここで観察さわた構造変化とこれまでに報告されていた生化学的解析の結果を照らし合わせて,RNAポリメラーゼの構造変化と転写メカニズム関連を総説として発表した(研究発表・雑誌論文).このような観察をもとに生化学的解析を行った.まず,これまでに観察されていたRNAポリメラーゼの2つの構造状態のそれそれを安定化する目的で,RNAポリメラーゼの内部にジスルフィド結合を導入した.次に,これらの変異体RNAポリメラーゼを用いて転写反応の生化学的解析をおこなった.その結果,RNA伸長反応等において,ジスルフィド結合の導入によってRNAポリメラーゼの活性が変化した.この結果はRNAポリメラーゼの構造変化と転写のメカニズムに密接な関連があることを示唆している.またこの他こ,RNAポリメラーゼと新規の転写因子の複合体の構造解析にも取り組み,転写因子の結合によって引き起こされる構造変化を観察した.これにより,この転写因子による転写調節機構を明らかにすることができた(投稿準備中).以上の結果は,転写のメカニズムにおけるRNAポリメラーゼの構造変化の役割を解明する上で非常に有用な情報になる.
中枢神経系幹細胞移植による脳梗塞モデルラットの運動能および能血流回復に関する研究

本研究は、移植という手技を用いて脳梗塞によって失われた機能および脳血流を回復できるかを極討することにより、脳梗塞に対する外科的治療の確立を追究するものである。移植ドナーとして、胎仔ラット中脳胞部神経板組織と胎仔ラット中胚葉組織を用い、l)移植片-宿主間の解剖学的・生理的神経回路網再構築の確認、2)移植片内における血管新生および血流供給、そしてpenumbra領域の血流回復、3)移植された実験動物の運動能および学習能の回復、の3点を明らかにすることを目的とした。2) Hematoxylin eosin染色にてgrart内およびgraft周囲に多数の血管新生を認め、血管原基である胎仔ラット中胚葉組織が血管新生の誘導に何らかの影響を及ぼしている可能性が示唆された。3)移植1か月後にMorris water-maze法を行い、移植された実験動物の運動能および学習能は、脳梗塞のみの動物群よりも優れている傾向があった。grart内およびgraft周囲の血管新生が胎仔ラット中胚葉組織由来のものか証明しえなかったが、今後胎仔ラット中脳胞部神経板組織に、中胚葉組織を付着させたものとさせないもので血管新生の程度を比較検討することで証明することができるであろう。我々は血管内注入物質(Microfil)を用いて血管構築を調べ、血管新生の程度をマイクロアナライザーにて定量する予定である。本研究は、移植という手技を用いて脳梗塞によって失われた機能および能血流を回復できるかを検討することにより、脳梗塞に対する外科的治療の確立を追求するものである。したがって、研究の焦点は、1)移植片-宿主間の解剖学的・生理的神経回路網再構築の確認、2)移植片内における血管新生および血流供給、そしてpenumbra領域の血流回復、3)移植された実験動物の運動能の回復にある。これらの点を解明すべく、胎生10.5日ラット中脳胞部神経板組織を摘出直後に、小泉-Longa法にて作製した梗塞巣へ定位的に移植し、1ケ月後に移植片の生着を形態学的検索(組織学・免疫組織化学)および行動学的解析(Water-Maze法によるラット運動学習能)により評価した。2:Water-Maze法では、移植群は脳梗塞群に比し運動学習能において優っている傾向が認められた。以上より、胎生10.5日ラット中脳胞部神経板組織は脳梗塞モデルラット脳内においても生着し、血管新生を促すことが確認され、さらにラットの運動学習能の改善傾向が認められた。今後は、1)アイソトープを用いて脳血流の定量を行い、移植による脳血流回復を確認すること、2)移植片の細胞がドナー由来のものかホスト由来のものかを判別すること、以上の2点に留意して実験を進める予定である。
レトロトランスポゾンMAGGYのアクチベーションタギングへの利用

前年度の結果より、MAGGYをPyricularia属菌ゲノムに導入して42C、2時間の熱処理をすると、効率よくそのプロモーターを活性化できることが明らかとなった。そこで、MAGGY全長を含むプラスミドpMGY70をハイグロマイシン耐性遺伝子を持つプラスミドpSH75とともにコムギいもち病菌Br48にco-transformationし、約100個の形質転換体を得た。これらと母菌Br48を熱処理し、生育、胞子の形態などを比較検討した。ある形質転換体は、母菌より強い熱耐性有するように思われたが、その差は小さく遺伝子単離実験に進むには不十分であった。つぎに、これらを熱処理後エンバク、コムギに接種し、接種後20Cおよび26Cで培養して病徴を比較検討した。母菌との差が見られるもの、すなわち母菌よりコムギに対する病原性が低下したものおよび母菌よりエンバクに対する病原性が増高したものがいくつか認められたが、繰り返し実験の結果、遺伝子単離に進めるほどの有意差は認められなかった。いくつかの形質転換体についてMAGGY挿入部位の塩基配列を検討したところ、いずれもAT richなnon-coding領域であった。以上のことから、MAGGYはタギングツールとして開発するには、(i)ゲノムにランダムに挿入する(ii)大量の形質転換体から望むものをスクリーニングするためにさらなる工夫が必要であると考えられた。レトロトランスポゾンMAGGYをタギングツールとして有効に利用するためには、その転移を人為的に効率よく制御できることが必要である。その条件を明らかにするため、MAGGYのLTRに存在するプロモーターにGUS(β-glucronidase)遺伝子をin flameに連結したコンストラクトを、MAGGYを持たないコムギいもち病菌(Pyricularia grisea)に導入し、種々のストレスを与えて発現様相を検討した。熱処理、重金属処理、メチルビオロゲン処理、抗菌性物質処理、プロトプラスト化、UV照射を行ったところ、GUSの活性化が認められたのは熱処理、重金属処理、酸化ストレス処理であった。処理の容易さを考慮し、MAGGYの活性化には熱処理が最も適切であると考えた。一方、同コンストラクトを他のいもち病菌、ウリ類炭疽病菌に導入し、同様に活性化条件を検討したところ、いもち病菌においてはコムギ菌内と同様のストレス応答性を示したが、ウリ類炭疽病菌においてはほとんどストレスによる活性化は認められなかった。これらのことより、MAGGYのタギングツールとしての適用範囲はいもち病菌集団(Pyricularia属菌内)に限定されると考えた。
がん細胞膜抗原を認識するヒトモノクローナル抗体の網羅的作成

SCID-huマウスを用いた肝細胞癌特異的ヒト抗体phageライブラリーについて、panning、回収されたファージクローンの検討を行ったが、特異性に関して十分なものが、得られなかった。肝細胞とファージの親和性の強さが示唆されたため、細胞株の変更と、より容易な系によるpanning状況の検討を行った。1.培養細胞株を使用したpanning法の再検討より容易な系にてpanning条件を検討する目的で、CD26をSCID-huマウスで免疫、作製したヒト抗体phageライブラリーを用い、CD26発現、Jurkat細胞に特異的に結合するscFvクローンを得た。この時、本来CD26を発現していないJurkat細胞による非特異的クローンの吸収を行った。2.肺小細胞癌特異的ヒト抗体phageライブラリーの作製1.肺小細胞癌株H889をSCID-huマウスに免疫し、ヒト抗体phageライブラリーを作製した。細胞株をそのままアジュバントともに腹腔内投与し、膜分画の精製は行わなかった。2.H889に対するpanningの前に、上記、Jurkatで検討した条件で、肺腺癌細胞株A549による非特異的クローンの吸収を行った。吸収、Panning操作を3回繰り返すことで、H889に結合するクローンを多数得た。スクリーニングにはwhole-cell ELISAを用いた。3.上記クローンのうち、A549に対して、H889により結合力が強いクローンを選別、獲得した。確率としては、2.で得られたクローンの約1/3であった。2.cDNAをphagemidに組み込み、約10^8個のphageライブラリーを作成した。3.KIM1をpanning tube上に固定し、panningを行った。Panningの際非特異的結合が抑えられる条件決めを行った。2.scFvライブラリーから全長immunoglobulin発現系の確立作成したライブラリークローンのphageELISAと、同様のscFv蛋白によるELISAの陽性率が異なることが分かり、一つの理由として、作成されたscFvの蛋白としての不安定性、unfoldingが示唆された。Fvは本来の抗体の抗原認識部位のみであり、可溶化その他の面で不利な構造と考えられる。そこで、phage抗体より直接全長immunoglobulinを発現する系を確立した。2.既存のscFvよりFv領域をPCR法にて増幅し、上記ベクターにクローニングした。3。発現ベクターをCHO細胞に導入し、約140-150kDaのIgG蛋白の発現を確認した。
虚血脳のくも膜変性における慢性炎症の解析　新規治療の開発にむけて

本研究の目的は、慢性炎症を背景とする動脈硬化などの種々の要因が及ぼす慢性脳虚血状態によって生じたくも膜の組織変性を病理学的な観点から解析し、脳虚血の活動性や脳卒中の再発リスクの予測を可能にすることとしている。当該年度では、基礎疾患によらず広く検体を収集し、くも膜とはなにか?くも膜の厚さとは?を解析することから開始した。検体はくも膜のみの場合は微小検体でありパラフィンブロック作成時に脱落する症例があり、約100症例のうち病理解析が可能であったのは74例であった。病理スライド上で厚さと線維芽細胞数、CD68陽性細胞数、CD86陽性細胞数、CD206陽性細胞数の平均値を測定した。くも膜の厚さは年齢・線維芽細胞数、CD68陽性細胞数、CD86陽性細胞数、CD206陽性細胞数と統計学的有意差をもって弱い相関がみられた。また、一部残存検体があった58例でrt-PCRを行い、TGFβ、TNFα、VEGFαのmRNA発現量を測定した。各種サイトカインは互いに強相関を示した。検体は順調に収集できているため。当初はくも膜のみの検体の病理固定に苦慮し、検体の微小さによる組織の脱落や熱負荷による変性などがみられたが、手技を獲得するうちに脱落症例がなくなったため。当該年度までは、多種多様な基礎疾患を母集団として解析をおこなっていた。今後は疾患ごとに解析をおこない、慢性脳虚血状態を生成するような動脈硬化性疾患、難病指定である原因不明の頭蓋内主幹動脈狭窄を呈するもやもや病を主題にとりあげ、研究をすすめていく。
昆虫細胞とその細胞内共生微生物の相互認識に関する分子機構

ウンカはイネの葉面微生物を細胞内に選択的に取り込んで新たな共生関係を成立させ,さらに卵を通じて共生微生物を子孫に伝える。トビイロウンカとその細胞内共生微生物との相互認識に関する分子機構の基礎的知見を得るため,共生微生物菌体表面物質を抽出・精製してウンカ虫体成分との相互作用について調べた。ウンカの卵から単離した細胞内共生微生物Enterobacter sp.NlーTーC1ー1Wを48時間培養後菌体を洗浄し,超音波処理して菌体を破砕した。細胞壁を精製し,1%オクチルβーDーグルコシドにより抽出した。抽出物をDETAーTOYOPEARL 650SおよびQーセファロ-スによるクロマトグラフィにより共生微生物の宿主認識物質を精製した。精製の各階段で得た菌体表面物質を酵素(西洋ワサビペルオキシダ-ゼ)およびテトラメチルロ-ダミンイソチオシアネ-トで標識し,ウンカ虫体凍結切片に対する結合活性を前者はペルオキシダ-ゼ活性により,後者は蛍光により測定した。菌体表面物質の精製において,DEAEイオン交換クロマトグラフィにより4つの画分を得,そのうちI画分に結合活性を認めた。これをさらにQーセファロ-スにより精製した。このように精製した共生微生物の宿主認識物質は,ウンカのダ液腺細胞の一部や3胞細胞の一部など特定組識の特定細胞に特異的に結合した。これらのことから,共生微生物の細胞壁にはウンカ虫体の特定細胞と相互認識しあう物質が存在することが明らかになった。
動物細胞におけるCdc7/Dbf4類似キナーゼによる染色体複製制御の研究

主にヒトCdc7/ASKキナーゼ複合体の細胞周期における活性状態や細胞内局在を検討し、S期の進行にこのキナーゼが重要な役割を果たしていることを示した。また、特に私はこのキナーゼの生理学的な基質MCM2のりん酸化がCdc7/ASKキナーゼ複合体依存性に起こることをin vivoの系においても示し、さらにリン酸化されたMCM2がクロマチンから遊離しやすいことを示した。また、ASK分子の機能的なドメインマッピングを行い、核局在に必要な領域、Cdc7触媒サブユニット結合部位、Cdc7触媒サブユニット活性化制御領域、高リン酸化型状態に必要なリン酸化部位などを同定したデータも最近得たので論文準備中である。染色体DNAの複製の開始は、制御蛋白質間の相互作用を介した活性のOn/Offによってのみならず、核内における染色体上複製起点の3次元的な構造の制御によっても調節されていると考えられる。さらに各々の複製起点の活性化されるタイミングや様式は細胞周期上でも調節をうけているが、さらに発生過程や癌化過程で大きく変化するものと考えられる。Cdc7/Dbf4キナーゼは出芽酵母でそれぞれの複製起点の発火過程に重要な役割を担うと考えられており、その機能はヒトに至る高等真核生物にまで保存されていると考えられている。私はこの点に着目し、ヒト、マウス、カエルのCdc7キナーゼ遺伝子を単離し、その機能解析を行っている。特に哺乳動物培養細胞では、培養系のin vivo DNA複製系で主にクロマチン結合蛋白質の挙動とDNA複製との関係を、またカエル卵抽出液を用いては、幼若型のin vitro DNA複製系で核構造形成過程とDNA複製との関連を研究している。これまで、ヒトCdc7の制御サブユニットH37とCdc7キナーゼの基質であるMCM2がCdc7によるリン酸化をうけることにより、クロマチンから乖離することを示した。また、カエルCdc7が核形成、DNA複製開始に先立ち、クロマチン結合し始め、複製進行中もクロマチン上に存在することを示した。
プラス鎖RNAウイルスの複製複合体形成過程の生化学的解析

プラス鎖RNAウイルスの一種であるトマトモザイクウイルス(ToMV)のRNA複製複合体前駆体を、脱液胞化植物プロトプラスト抽出液を用いた試験管内反応により形成させた。当該複合体の構成要素であるウイルス複製タンパク質に付したタグを利用して精製し、共精製された宿主タンパク質を6種類同定した。対応する宿主遺伝子がノックアウトされたシロイヌナズナを構築し、ToMVの増殖を調べたが、いずれにおいても野生株と同様に増殖した。現在までのところ、これらの宿主タンパク質がToMV RNAの複製に関与することを積極的に示唆する結果は得られていない。我々は、タバコ細胞抽出液(BYL)を用いた試験管内トマトモザイクウイルス(ToMV)RNA翻訳・複製系を確立した。生体膜を除去したBYLでToMV RNAを翻訳すると、ウイルスがコードする130K,180K複製タンパク質とゲノムRNAを含む、沈降係数約70Sの複合体(pre-membrane-targeting complex:PMTC)が形成され、これが膜結合複製複合体の前駆体となっていることを明らかにした。本研究は、PMTCを精製し、含まれる宿主因子を同定し、それらの因子がPMTCあるいは複製複合体形成過程において果たす役割を解明することを目的とする。180Kタンパク質のC末端にタグをもつToMV誘導体RNAを、生体膜除去BYLで翻訳し、PMTCの精製を試みたが、共精製されたタンパク質の同定を行うのに十分な量を確保することが困難であった。収量が低い原因のひとつとして、180Kタンパク質が130Kタンパク質のリードスルー産物であり、少量しか合成されないことが考えられた。PMTCの形成過程では、先ず130Kタンパク質が翻訳に共役してゲノムRNAに結合し(core PMTC)、これに引き続き180Kタンパク質が翻訳とは独立して結合することによりPMTCを形成することがわかっている。そこで、130Kタンパク質のC末端にタグをもつToMV誘導体RNAを、生体膜除去BYLで翻訳し、core PMTCを精製した。さらに、共精製されたタンパク質をSDS-PAGEにより分離後、LC-MS/MS法により同定した。現在同定された因子をコードする遺伝子がアグロバクテリウムのTransfer-DNAの挿入により不活化されたシロイヌナズナにおけるToMVの増殖の可否を調べている。植物プラス鎖RNAウイルスであるトマトモザイクウイルス(ToMV)は、130Kおよびそのリードスルー産物である180K複製タンパク質をコードする。これまでの研究から、ToMVゲノムRNAは翻訳と共役して130Kタンパク質と結合し、core pre-membrane-targeting complex (core PMTC)と呼ばれる複合体を形成し、さらにこれに180Kタンパク質が結合して複合体PMTCを形成してから、生体膜に結合して複製複合体を形成することが示唆されている。本年度は、タグを付した130Kタンパク質を利用してcore PMTCを精製し、共精製された5種のタンパク質のToMV増殖への関与を調べた。5種のタンパク質に対応する遺伝子(それぞれ2個あるいは3個の相同な遺伝子から構成される)についてシロイヌナズナのノックアウト変異株を入手した。これらを交配し、3個のタンパク質についてはメンバー全てがノックアウトされた多重変異株を作製した。他の2個のタンパク質については全ての遺伝子メンバーをノックアウトすると致死になったので、最も発現レベルの低いメンバーのみ野生型アリルをホモあるいはヘテロでもつ多重ノックアウト株を作製した。これらにToMVを接種したところ、いずれの株においてもToMVは野生株と同様の増殖を示した。このうちのひとつDNA/RNA-binding Alba-related proteinを試験管内翻訳反応により合成し、脱液胞化プロトプラスト抽出液を用いた試験管内植物ウイルスRNA翻訳・複製系に添加したところ、ウイルスRNAの翻訳阻害が観察された。しかし、この効果はToMV RNA特異的ではなかった。以上の結果から、解析したタンパク質はいずれもToMV RNAの複製に関与しないと考えられた。
暖地型牧草における「酢酸発酵型」サイレージの生成機作の解明

暖地型牧草をサイレージ調製すると,一般的な寒地型牧草とは異なり,pHが高く,乳酸含量が低く,酢酸含量が高い「酢酸発酵型」サイレージとなることがある。しかし現在までこのサイレージが調製される諸条件についての詳細な検討は少ない。そこで本研究代表者は,「酢酸発酵型」サイレージが調製される条件に関して,まずヘミセルロースの分解について着目した。なぜならば,ヘミセルロースは大部分が五炭糖で,五炭糖1分子は発酵に伴い乳酸と酢酸を1分子ずつ生成する。また五炭糖を添加すると酢酸が増加するという報告例があり,本研究代表者は先の研究で,暖地型牧草のギニアグラスについて「酢酸発酵型」サイレージが調製されることを示すとともに,発酵に伴うヘミセルロースの分解と酢酸生成の関係を示唆した。そこで暖地型牧草サイレージにおける酢酸生成源を解明するため,本研究では放射性同位元素の^<14>Cで標識したヘミセルロースを添加し,サイレージ発酵における酢酸生成とヘミセルロース消失の関係を検討した。サイレージはギニアグラスを使用し,開花期に刈取り,^<14>Cで標識したヘミセルロースを1%添加し,7,15,30および90日間室温で貯蔵して調製した。分析は開封後常法により抽出液を調製して測定した。まず初めにpHを測定した結果,本研究では,これまでに暖地型牧草から調製された「酢酸発酵型」サイレージとは異なり,pHが4.2以下に低下した良質サイレージとなった。この原因としては,まずヘミセルロースの添加量が多く良質発酵するのに十分な量となった事が考えられるが,本研究代表者が行った先の研究では,同量の糖を添加してサイレージを調製した場合,発酵には影響を及ぼさず「酢酸発酵型」サイレージが調製され,本研究の結果と相反していた。詳細は不明であるが,本研究では,ヘミセルロースの消失と酢酸生成の関係を解明するに至らなかった。今後再検討が必要である。一般に寒地型牧草をサイレージ調製した場合,乳酸菌が材料草の可溶性の糖を分解して乳酸を生成し,高乳酸含量の良質サイレージになる。一方暖地型牧草では可溶性の糖含量が低いため,乳酸は十分生成されず,低乳酸含量となるが,安定して貯蔵され,また多量の酢酸を含む,即ち「酢酸発酵型」サイレージになることがある。しかしこれまで暖地型牧草から「酢酸発酵型」サイレージが調製される要因に関する報告は少ない。そこで本研究代表者は,それらの要因について,まずヘミセルロースの分解に着目した。ヘミセルロースは主に五炭糖で構成され,五炭糖はヘテロ発酵されて乳酸と酢酸をそれぞれ1分子ずつ生成する。また五炭糖を添加してサイレージを調製すると酢酸含量が高くなるという報告例があり,本研究代表者の先の研究において,ギニアグラスサイレージが「酢酸発酵型」を示すとともに,ヘミセルロースの消失率が高いことを併せて示している。これらのことから暖地型牧草サイレージではヘミセルロースの分解と酢酸生成の関与が考えられる。そこで今年度は,暖地型イネ科牧草のギニアグラスを供し,放射性同位元素の^<14>Cを用いて標識植物体を調製した後,細胞壁構成成分のヘミセルロースの標識確認を行った。標識植物体の調製は,ワグネルポットで開花期まで栽培した後,^<14>CO_2を取り込ませ,刈り取り,乾燥し,粉砕して行った。ヘミセルロースの標識確認は,粉砕試料をα-アミラーゼおよび有機溶媒で処理して細胞壁を調製し,2N硫酸加水分解溶液の放射線量を液体シンチレーションカウンターで計測して行った。以上の操作により,ヘミセルロース中の炭素原子の一部は^<14>Cにより標識されたことが確認され,来年度この植物体のヘミセルロースを用いてサイレージを調製し,発酵に伴うヘミセルロースの消失と酢酸生成について検討する予定である。まず初めにpHを測定した結果,本研究では,これまでに暖地型牧草から調製された「酢酸発酵型」

サイレージとは異なり,pHが4.2以下に低下した良質サイレージとなった。この原因としては,まずヘミセルロースの添加量が多く良質発酵するのに十分な量となった事が考えられるが,本研究代表者が行った先の研究では,同量の糖を添加してサイレージを調製した場合,発酵には影響を及ぼさず「酢酸発酵型」サイレージが調製され,本研究の結果と相反していた。詳細は不明であるが,本研究では,ヘミセルロースの消失と酢酸生成の関係を解明するに至らなかった。今後再検討が必要である。
エイコサノイドによる肥満制御機構の解明とその制御機構に基づく新規治療法の探索

肥満は多くの生活習慣病の発症原因とされ、肥満の解消や防止は重要な課題とされる。これまでに画期的な抗肥満薬が開発されていないことから、我々は肥満の制御機構の解明を目的として本研究を行った。これまでにプロスタグランジン(PG)やロイコトリエン(LT)などのエイコサノイドが脂肪細胞の分化制御に関わることが明らかとなってきた。本研究では、細胞および遺伝子改変動物を用いて、肥満制御におけるエイコサノイドの生理的意義とその制御機構の解明を行った。我々は、Cre/loxシステムを用いて、脂肪細胞特異的PGD2合成酵素遺伝子欠損マウスを作製し、高脂肪食摂餌における肥満への影響を解析した。その結果、脂肪細胞でPGD合成酵素を特異的に欠損させると、食事性肥満が約20%抑制され、インスリン抵抗性も改善された。また、脂肪組織における炎症関連遺伝子の発現も抑制されており、脂肪細胞におけるPGD合成酵素の抑制は、抗肥満およびインスリン感受性の改善に寄与するものと考えられた。一方、PGD2による肥満促進機構の解析では、脂肪細胞においてPGD2はDP2受容体に結合し、protein kinase Aの活性化を抑制することが分かった。さらに、脂肪分解系の律速酵素であるホルモン感受性リパーゼの活性化が抑制され、結果として脂肪蓄積が促進されることが分かった。脂肪細胞におけるLT類の機能を解析したところ、LTC4合成酵素は脂肪細胞の分化の進展とともに発現レベルが上昇することが分かった。しかし、脂肪細胞ではLTC4の受容体の発現レベルは低いことから、脂肪細胞で産生されたLTC4は、パラクライン的に機能すると考えられた。肥満は多くの生活習慣病の発症原因とされ、肥満の解消や防止法の開発は重要な課題とされる。現在、画期的な抗肥満薬が開発されていない理由の一つとして、肥満の制御機構が明確でないことが挙げられる。これまでに、プロスタグランジン(PG)などのエイコサノイドが脂肪細胞の分化制御に関わることが明らかとなってきた。本研究では、細胞および遺伝子改変動物を用いて、肥満制御におけるエイコサノイドの生理的意義とその制御機構を解明する。さらに、エイコサノイドの機能調節を目的とした抗肥満薬の開発を目指している。我々は、PGE2の食事性肥満への影響を調べるために、PGE2合成酵素(mPGES-1)遺伝子欠損マウスを高脂肪食で2ヶ月間飼育したところ、有意な体重増加は認められなかったが、体重は増加傾向にあった。さらに解析を進めるために、mPGES-1の脂肪組織特異的遺伝子欠損マウスの作製を進めている。また、PGD2による肥満促進機構について解析したところ、PGD2はDP2受容体に結合し、細胞内のcAMPの濃度を低下させることにより脂肪分解系の酵素の活性化を抑制し、脂肪蓄積を促進していることが分かった。脂肪細胞におけるPGD2の機能解析をさらに進めるために、CRISPR/Cas9法によりDP2遺伝子欠損脂肪細胞の作製を行い、現在解析を進めている。脂肪細胞の分化制御におけるロイコトリエン類の影響を調べるために、脂肪細胞の分化過程におけるロイコトリエン合成系酵素の遺伝子発現調節について解析を開始した。今年度実施予定であったmPGES-1遺伝子欠損マウスの肥満への影響について解析を終了した。さらに、脂肪細胞特異的mPGES-1遺伝子欠損マウスの作製を行っている。また、PGD2による脂肪蓄積促進機構を解明した。肥満は多くの生活習慣病の発症原因とされ、肥満の解消や防止は重要である。これまでに、プロスタグランジン(PG)やロイコトリエン(LT)などのエイコサノイドが脂肪細胞の分化制御に関わることが明らかとなってきた。

本研究では、細胞および遺伝子改変動物を用いて、肥満制御におけるエイコサノイドの生理的意義とその制御機構を解明する。さらに、エイコサノイドの機能調節を目的とした抗肥満薬の開発を目指している。PGD2による肥満促進機構について解析したところ、PGD2はPGD2受容体の一つであるDP2受容体に結合し、protein kinase Aの活性化の抑制を介して脂肪分解系の律速酵素であるhormone-sensitive lipaseの活性化を抑制し、脂肪蓄積を促進するメカニズムを明らかにした。さらに脂肪細胞の分化制御におけるLT類の影響を調べるために、脂肪細胞の分化過程におけるLT生合成酵素遺伝子の発現について調べた。その結果、LT生合成酵素の一つであるLTC4合成酵素(LTC4S)の遺伝子発現が、脂肪細胞の分化の進展とともに上昇し、また、肥満マウスの内臓脂肪組織においてもLTC4S遺伝子の発現が上昇することが分かった。また、LTC4Sの遺伝子発現が脂肪細胞分化制御のマスター因子であるPPARγに依存することが分かった。LTC4S遺伝子プロモーターを検索し、PPAR結合配列を見出し、PPAR結合配列にPPARγが結合することをクロマチン免疫沈降法により明らかにした。PGD2により脂肪蓄積機構の分子メカニズムを解明した。また、ロイコトリエン生合成酵素の一つであるLTC4Sの遺伝子の脂肪細胞における遺伝子発現活性化機構の一部を明らかにした。肥満マウスの内臓脂肪組織において、LTC4S遺伝子の発現が亢進していることが分かった。一方で、LTC4の受容体であるCysLT1,2の発現は脂肪細胞では極めて低いものの、マクロファージではいずれも発現していることが分かった。DP2遺伝子欠損マウスおよび脂肪細胞特異的PGD合成酵素遺伝子欠損マウスを用いて、脂肪組織におけるPGD2の機能について解析する。さらに、作製したDP2遺伝子欠損脂肪細胞を用いて、細胞レベルでのPGD2の脂肪蓄積の詳細なメカニズムを明らかにする。また、ロイコトリエン類の脂肪細胞の分化制御における役割を解明する。脂肪細胞におけるLTC4S遺伝子の発現調節機構を解明する。また、肥満の脂肪組織に浸潤したマクロファージにおけるLTC4の機能を解明する。創成したPGD2合成酵素の一つであるリポカリン型PGD合成酵素の阻害剤を用いて肥満抑制効果を検討する。遺伝子改変マウスの費用の支払いがまだのため肥満マウスを用いた実験の実施が平成30年度に延びたため。平成30年度に入り、既に上記実験を開始している。作製が終了次第支払う
下部地殻部分溶融体のレオロジーと弾性波速度に関する実験的研究

本研究では下部地殻の主要鉱物である斜長石多結晶体を用いて、メルトの存在に伴う流動特性の変化と水の効果を高圧岩石変形実験により調べた。含水下での流動強度は、メルト量の増加に伴い減少する。また、外部から加える水の量と歪速度に依存し、流動強度と変形機構は変化する。軟化が見られた実験で加えた水の量は、これまで地球物理学的観測から報告されている下部地殻での含水量の下限値に等しい。また軟化した試料の実験後の含水量は、天然の塑性変形した斜長石中の含水量にほぼ等しい。これらの事実は、含水下で、下部地殻中に存在する含水量と溶け込む水の量を決め、下部地殻の変形特性と流動強度を決めていることを示唆している。本研究の目的は、下部地殻岩石の変形強度及び弾性波速度特性に及ぼす部分溶融(メルト)の影響を調べることにあるが、今年度は部分溶融しない条件下での、下部地殻を構成する主要構成鉱物である斜長石の強度および弾性波速度を調べることを目的に研究を行った。そこで、今年度は、東北大学現有のGriggs型試験機を弾性波速度測定が可能なように改造した。また圧力容器、実験アセンブリを、超音波測定が可能なように改造した。試料には、下部地殻を代表する鉱物である斜長石からなる斜長岩(灰長石成分100のガラス粉末を真空で焼結したもの)のドライ多結晶体を使い、含水下で斜長岩の塑性変形強度を調べた。含水量が0.2wt%の実験では、ドライの試料に比べて、顕著な軟化は見られないが、鏡下においては、円筒形試料の表面部分にのみ著しい塑性変形が認められた。この部分は、強い格子定向配列(LPO)を持つことから、含水下にて試料表面に拡散した水が、局所的な塑性変形を促し、塑性歪が表面に集中したと考えられる。一方、約1wt%の水を加えた実験では、著しい強度の低下が見られたが、回収した試料には、強いLPOの発達に加え、多数のクラックの発達が見られた。このことは、1.2GPa、900度において、1wt%の水は、斜長岩の水圧破砕を引き起こす可能性があることを示唆している。さらに、下部地殻岩石のこれまで報告されている下部地殻岩石の構成則を使い、東北日本弧の強度分布を作製した。地震学・岩石学的に推定されている地殻の構造をもとに推定された粘性率は、1896年に起きた陸羽地震後の余効変動から推定される粘性率に比べて12桁ほど高いが、下部地殻での部分溶融体や細粒岩石の存在を仮定することでこの差を説明できる可能性を指摘した。以上から部分溶融体などの低強度帯への歪集中は、地震後の余効変動に大きな影響を持つ可能性を指摘した。東北大学現有のGriggs型試験機を用いて、下部地殻を構成する主要構成鉱物(灰長石)の変形実験を行った。人工的に合成した灰長石多結晶体に、水を加え、そのレオロジー特性に及ぼす水の効果を調べた。含水量0.2wt%の実験では、ドライの試料に比べて、顕著な軟化は見られない(両者とも1GPa,900C,10^<-5>/sにおいて差応力800MPaで降伏)が、鏡下においては、円筒形試料の表面部分にのみ著しい塑性変形が認められ、石膏検板下で干渉色の変化が認められた。含水下にて試料表面に拡散した水が、局所的な塑性変形を捉し、塑性歪が表面に集中したと考えられる。そこで、回収試料を顕微赤外分光法を用いて、含水量を測定し、電子顕微鏡および電子後方散乱分析(EBSD)を用いて、化学組成と微細組織を観察した。赤外スペクトルから、波長3400cm^<-1>に特徴的な吸収を持つゾイサイトのスペクトルが得られた。また電子顕微鏡観察から、塑性変形部の粒界にSiO_2組成のメルトが存在し、ゾイサイトの晶出も見られた。しかし、ゾイサイトの形態には定向配列がみられず、変形に寄与せずに成長しているように見える。またEBSDを用いた灰長石の結晶方位測定から、塑性歪の集中した部分はランダムなLPOパターンを示すことが明らかになった。変形実験は灰長石+水の安定領域で行われたが、差応力下で軸圧縮方向のみ高圧側のゾイサイト+カイアナイト+SiO_2メルトの領域に進み、局所的な軟化を引き起こし、塑性変形が集中したことが推定される。

また、次年度以降の弾性波速度測定実験にむけて、圧電素子の選定およびアセンブリの開発を開始した。金蒸着した圧電素子を金属円柱に貼り付け、反射波の周波数特性を調べたところ、2MHzで最も反射が強くなることが観測された。今後は、小型化した圧電素子をアセンブリに導入し、高圧・低温(400度程度)での弾性波速度測定法の確立を目指す。下部地殻の流動特性に及ぼす水の効果を明らかにするために、水が存在する環境下での下部地殻の主要較正鉱物である長石多結晶体の塑性流動特性についての検討を行った。無水の人工アノーサイト多結晶体に、最大0.5 wt%の水を外部から導入させ流動特性を調べた。出発試料は、真空焼結法により作成したもので、粒径が1ー3μm、粒界にシリカに富むメルトを最大6%含むものと含まないものの二種類を用いた。固体圧変形試験機を用いて、下部地殻条件下(封圧1GPa、温度900度)で行われた変形実験から、水の存在下で無水の長石多結晶体試料の強度が低下することが明らかになった。含水下での強度の低下量は、外部から加えた水の量に比例しひずみ速度に反比例する。またメルトを含むものは同じひずみ速度でもメルトを含まないものに比べ、強度低下が大きい。微細組織観察とFTIRを用いた含水量測定から、メルトを含む試料および含まない試料の両方において、塑性ひずみの局所化と含水量の不均質性が認められ、微小試料内においても、含水量の不均質性が粘性率の変化を引き起こすことを示唆している。従って、天然の断層帯においても、水の非平衡な拡散に伴い、変形挙動やレオロジー特性(粘性率など)が変化することが推察できる。またメルトを含む試料の方が強度低下が大きいことから、含水条件においてはメルトを含む下部地殻のほうが大きな強度低下を引き起こす可能性が示唆された。本研究では下部地殻の主要構成鉱物である斜長石の変形特性に及ぼすメルトや水の効果を明らかにするために、無水の人工アノーサイト多結晶体に、微量の水(0.10.5wt%)を導入させながら流動特性を調べた。細粒で5 vol%のシリカリッチなメルトを含む多結晶体を、固体圧試験機を使い900度、封圧1 GPaで剪断変形実験を行った。0.1-0.3wt%の水を加えた実験では、差応力がドライの試料と同程度の1000 MPaまで達するが、0.5 wt%の水を加えたときのみ、顕著な弱化が見られた。回収試料の微細組織観察から、添加した水が少ないほど破砕流動が卓越することが明らかになった。0.5 wt%の水を添加した試料では塑性変形が卓越しており、歪の局所化も認められた。赤外分光法面分析から、流動強度の低い試料ほど高い含水量を持つことが明らかになった。また鏡下にて歪の局所化の認められた領域は周囲より高い含水量を持つことも明らかになった。このように、微小試料内においても、含水量の不均質性によって、脆性変形から塑性流動までの変形機構の遷移が認められた。また軸圧縮変形実験により得られた試料の赤外分光法面分析を行い、実験条件下での水の拡散係数を決定した。水の拡散に伴い歪軟化を起こした領域の含水量分布から、一次元拡散方程式を用いて得られた拡散係数は、これまでに報告されている長石中の粒界での水の拡散係数と調和的であった。従って、水の存在する下部地殻条件下において、メルトを含む細粒斜長石多結晶体の変形は、水の粒界拡散によって律速されていることを示唆する。以上から、断層周辺に存在する高圧の間隙流体がメルトを含む断層岩の粒界を通じ断層中へと供給され、その濃度に応じて、変形挙動が変化することが推定される。本研究は、下部地殻岩石を対象に、そのレオロジーと弾性波速度特性を高圧下で同時測定することで、直接評価することを最終目的としている。それに対し、これまでの達成度は、中間年度において、まだレオロジー的な実験および試料の解析のみしか行えていない。
血管内皮細胞における接着分子P-セレクチンの遺伝子発現調節機構の解明-炎症性疾患の新規治療法創生をめざして

本研究は転写因子NF-κBとSp1との相互作用から血管内皮細胞におけるP-セレクチン遺伝子の転写調節機構を解明し、白血球のrollingを制御する新たな抗炎症療法をめざそうとするものである。P-セレクチンの発現は蛋白レベルと転写レベルで制御され、慢性炎症に対しては主として転写レベルで制御されていることが知られている。昨年度、血管内皮細胞においてインターロイキン4によってP-セレクチン遺伝子の発現が蛋白・転写レベルで正に調節されていることを明らかにし、さらにその調節機構に転写因子Sp1の関与を見いだした。そこで、本年度、P-セレクチン遺伝子のプロモーター解析を介して、P-セレクチン発現制御における新規治療法開発への可能性について検討した。その結果、1、インターロイキン4によって誘導される転写因子Stat6が、P-セレクチン遺伝子発現に関与していること、2、Stat6のDNA結合部位は従来から知られているNF-κB/Sp1結合部位の近傍に存在すること、3、これらの転写因子に相互作用が認められること、4、慢性炎症局所を想定した酸化還元状態がこれら転写因子の相互作用と遺伝子発現レベルに密接に関連していることなどを明らかにした。すなわち、P-セレクチン遺伝子発現を正に調節しているStat6、NF-κBの作用をSp1は負に調節していることが判明し、Sp1の細胞内蓄積量と活性化の制御が新規治療法開発への標的となる可能性を見いだした。従来から検討されているStat6、NF-κBなどを直接抑制する治療法に加えて、その抑制分子Sp1を新規治療法の標的にすることは作用機構の異なった治療法であり今後のさらなる展開が期待される。本研究は転写因子NF-κBとSP1との相互作用から血管内皮細胞におけるP-セレクチン遺伝子の転写調節機構を解明し、白血球のrollingを制御する新たな抗炎症療法をめざそうとするものである。すでに、研究者はショウジョウバエ細胞、He1a細胞などを用いてP-セレクチン遺伝子の転写調節がNF-κB応答性DNA配列を介して、p50/p50、Bcl-3、Sp1の相互作用の上に極めて精緻に制御されていることを明らかにした(F.Hirano,et al.Mol.Cell.Biol.,1998).すなわち、P-セレクチン遺伝子を正に制御するNF-κBのDNA結合領域にはSp1が直接結合することを明らかにした。Sp1はP-セレクチン遺伝子を正に制御するがこの転写誘導作用はNF-κB(p50/p50/Bcl-3あるいはp52/p52/Bcl-3)よりも弱く、NF-κBによる正の転写制御を抑制することを証明した。さらに、これらの現象が、内因性の転写因子によっても制御されているかどうかについて検討した。その結果、1、血管内皮細胞においてインターロイキン4によってP-セレクチン遺伝子は誘導され(RT-PCR法)、細胞膜上に表出されること(フローサイトメトリー、HL-60細胞を用いた接着実験)、2、非刺激下で内因性Sp1の発現量によってP-セレクチン遺伝子の発現量に差があること、3、内因性SP1のDNA結合活性を低下させることによってP-セレクチン遺伝子の発現量に差があることなどが明らかとなった。現在、インターロイキン4刺激下で誘導される転写因子の同定とP-セレクチン遺伝子発現におけるプロモーター上の結合部位および相互作用について検討している。