hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
次世代新型電池「プロトン電池」を目指した高分子電極材料の開発

申請者らが独立に開発したフェニルアゾメチン高分子を活用して、高速応答で作動する高エネルギー出力のプロトン電池を目指したポリマー電極の構築と性能試験を目的とした。具体的には、次の3項目を期間内に推進した。1)ポリマー構造と電子過程の相関解明2)ポリマーのレドックス過程の解析3)プロトン電池の作製と性能試験1)ポリマー構造と電子過程の相関解明フェニレンジアミと1,4-ジベンゾイルベンゼンの四塩化チタン、または、触媒量のパラトルエンスルホン酸による共縮重合により得たフェニルアゾメチンポリマー誘導体の合成法を確立した。分子軌道計算法に基づき、一段階多電子移動のレドックス応答するイミン骨格を選定した。特に単一分子量・単一構造を有するフェニルアゾメチインデンドリマー、フェニレンジイミン、環状イミンを合成した。2)ポリマーのレドックス過程の解析π共役高分子連鎖上に配列したレドックス集積場では一段階多電子移動効率よく進行する。一段階多電子移動の生起には、各段階の酸化還元電位差に大差が無いことが条件となる。微分パルス法による酸化還元電位(差)ΔE(M^+-M^+-e=M^+-M^<2+>E1;M^+-M^<2+>-e=M^<2+>-M^<2+>E2,E2-E1=ΔE)の決定から均化定数(Kc=[M^+-M^<2+>]2/[M^+-M^+][M^<2+>-M^<2+>])を算出し、ポリフェニルアゾメチン電子系の一段階多電子移動の割合(Kc=exp[ΔEF/RT])を評価した。パルスボルタンメトリーのシュミレーションより、1段目と2段目の酸化還元電位が100mVも逆転していることを突き止めた。3)プロトン電池の作製と性能試験高プロトン電導性を示すナフィオンフィルムを固体電解質として利用した簡易的な高分子プロトン電池[フェニルアゾメチンポリマー‖ナフィオン‖ポリアニリン]を作製、連続放電特性の評価システムを構築した。酸性中、高速応答性を確認した。1)ポリマー構造と電子過程の相関解明フェニレンジアミンと1,4-ジベンゾイルベンゼンの四塩化チタン、または、触媒量のパラトルエンスルホン酸による共縮重合により得たフェニルアゾメチンポリマー誘導体の合成法を確立した。特に単一分子量・単一構造を有する分岐型特殊構造のフェニルアゾメチンデンドリマーの合成に成功、この高効率条件を確定した。2)ポリマーのレドックス過程の解析微分パルス法による酸化還元電位(差)ΔEの決定から均化定数を算出し、ポリフェニルアゾメチン電子系の一段階多電子移動の割合(Kc=exp[ΔEF/RT])を評価した。NCCNでイミン結合が連結した化合物は1段目と2段目の酸化還元が逆転し、一段階で2電子移動が生起することを発見した。申請者らが独立に開発したフェニルアゾメチン高分子を活用して、高速応答で作動する高エネルギー出力のプロトン電池を目指したポリマー電極の合成と電子応答性能試験を目的とする。具体的には、次の2項目を推進した。(1)ポリマーのレドックス過程の解析

(2)プロトン電池の作製と性能試験(1)ポリマーのレドックス過程の解析π共役高分子連鎖上に配列したレドックス集積場では一段階多電子移動効率よく進行する。一段階多電子移動の生起には、各段階の酸化還元電位差に大差が無いことが条件となる。微分パルス法による酸化還元電位(差)ΔE(M^+ -M^+ -e = M^+ M^<2+>E1; M^+ -M^<2+>-e = M^<2+>-M^<2+>E2,E2 -E1 = ΔE)の決定から均化定数(Kc =[M^+ -M^<2+>]2/[M^+ -M^+][M^<2+> -M^<2+>])を算出し、ポリフェニルアゾメチン電子系の一段階多電子移動の割合(Kc = exp[ΔEF/RT])を評価した。パルスボルタンメトリーのシュミレーションより、1段目と2段目の酸化還元電位が100mVも逆転していることを突き止めた。(2)プロトン電池の作製と性能試験高プロトン電導性を示すナフィオンフィルムを固体電解質として利用した簡易的な高分子プロトン電池[フェニルアゾメチンポリマー‖ナフィオン‖ポリアニリン]を作製、連続放電特性の評価システムを構築した。酸性中、高速応答性を確認した。
立体構造に基づく蛋白質合成マシーナリーの動作機構の解明

本研究の目的は、遺伝情報の変換過程(複製、転写、翻訳)に携わる酵素およびRNAの高次構造を決定し、生物マシーナリーとしての動作機構を解明することにある。本年は、まず超好熱古細菌Methanococcus jannashii由来のチロシルtRNA合成酵素(TyrRS)とtRNA^<Tyr>とL-チロシンの複合体の結晶構造を2.0解能で決定し、真核型TyrRSによるtRNAの認識機構を解明し、さらにアンバーサプレッサーtRNA^<Tyr>を効率よくチャージするTyrRS変異体をデザイン、調製することに成功した(論文投稿中)。本古細菌のTyrRSは、大腸菌のtRNA^<Tyr>とクロスリアクトすることがないため、本TyrRSとアンバーサプレッサーtRNA^<Tyr>を大腸菌内で発現させることによって、アンバー終止コドンに21番目の非天然型アミノ酸を取り込ませることが本研究により可能になった。さらに、大腸菌由来TyrRSに2つの変異を入れることによって3-ヨードチロシンをtRNA^<Tyr>にチャージする変異体TyrRSを作り出すことに成功し、この変異体TyrRSと3-ヨードチロシンとの複合体の結晶構造解析を行い、変異体TyrRSが非天然型アミノ酸を認識する構造的基盤を明らかにした。tRNAの3ユ末端のトリミングを行うRNase PHの結晶構造を2.7解能で決定し、3ユ末端のCCA配列直前まで正確に削りこむ機構を推定した(論文改訂中)。また、古細菌由来のクラスICCA付加酵素の結晶構造を2.0解能で決定し、CCA付加酵素の分子進化機構を解明した(論文準備中)。tRNAの修飾過程に関しては、古細菌のtRNAのG15にアーケオシンを導入するアーケオシングアニントランスグリコシラーゼとtRNAの複合体の結晶構造を決定し、酵素がtRNAを大きく変形して、配列非特異的かつ位置特異的に、G15に修飾を入れる機構を解明した(論文改訂中)。さらに、tRNAのG18をメチル化するspoUに関して、酵素とメチル基供与体であるSAMとの複合体の結晶構造を1.5解能で決定し、触媒ドメインに存在する特徴的な結び目構造の持つ役割を解明した(論文準備中)。ヘミメチル化DNAに結合することで、細胞分裂に伴うDNA複製の回数を調節するSeqAタンパク質とDNAの複合体を2.5解能で決定し、ヘミメチル化DNAの認識機構を明らかにした(論文投稿中)。また、DNAの複製開始に関わるDnaAタンパク質とDNAの複合体の結晶構造を2.0&ェ解能で決定し、DNA認識機構を解明した(Nucleic Acid Res., in press)。さらに、ヒト由来EGFとEGFレセプターの複合体の結晶構造を解明し、リガンドによる新規のレセプター活性化機構を明らかにした(Cell,2002)。遺伝子から蛋白質合成にいたる各過程に携わる酵素、RNAの高次構造を片端から決定し、生物マシーナリーとしての動作機構を解明するのが、本研究の目的である。本年はまず、mRNA前駆体のスプライシングを制御し、ショウジョウバエの性決定に関わるSxl蛋白質と標的となるmRNA前駆体の複合体の結晶構造を2.6A分解能で決定し、複数のRNA結合ドメインが協同して特定の構造をとらない単鎖RNAを特異的に認識する機構を世界に先駆けて解明した。次に、tRNAに特異的にアミノ酸を結合し、蛋白質合成の前半の反応を触媒するアミノアシルtRNA合成酵素に関して、基質との複合体の形で広範に結晶構造解析を行った。まず、高度好熱菌由来メチオニルtRNA合成酵素(MetRS)について2.OA分解能の結晶構造を決定し、さらにtRNAとの複合体の結晶化にも予備的であるが成功した。また、高度好熱菌由来のバリルtRNA合成酵素(VaIRS):tRNA^<Val>・バリルAMPアナログ3重複合体(分子量25万)の結晶構造を2.8A分解能で決定し、tRNAの認識機構およびそれと連携した酵素のアミノ酸校正機構に関して全世界に先駆けて新しい知見を得た(論文投稿中)。また超好熱古細菌Pyrococcus horikoshii由来のロイシルtRNA合成酵素(LeuRS)、リジルtRNA合成酵素(LysRS)について酵素単独およびtRNAとの複合体の結晶化に成功した。さらにまた、tRNAおよびリボソームRNA(rRNA)の転写後修飾を触媒する酵素に関しても構造解析を始めている。まず、超好熱古細菌由来のtRNAグアニントランスグリコシラーゼ(tRNAのDループに保存されているグアニンをアーケオシンに置換する)については高分解能結晶の作成に成功し、重原子同型置換法による位相決定を遂行している。また、rRNAメチルトランスフェラーゼに関しては、セレノメチニル化蛋白質を用いてSeの多波長異常分散法による位相決定に成功し、解釈可能な電子密度図の導出に成功した。また、遺伝子の複製の分野においては、ヒト染色体のセントロメアに結合する蛋白質とDNAの複合体の結晶構造解析に成功し、また、複製開始に関わるプライマーゼの結晶構造解析が進行中である。高度好熱菌Thermus thermophilus由来のバリルtRNA合成酵素(ValRS)・tRNA^<Val>・バリルAMPアナログ3重複合体(分子量25万)の結晶構造を2.8Åで決定した(Cell 2000;103:793-803)。

本構造は、酵素が誤って活性化した非特異的なアミノ酸を校正する状態を示した最初の構造であり、tRNAの認識と連携した酵素のアミノ酸校正機構に関して全世界に先駆けて新しい知見を得た。また、高度好熱菌由来グルタミルtRNA合成酵素(GluRS)とtRNA^<Glu>の複合体の結晶構造を2.4Åで決定した(Nature Structural Biol.;3,in press)。本構造では、tRNA^<Glu>のアンチコドン3字目のC36がArg358により水素結合で認識されていたが、このArg残基をGln残基に置換することで、変異体GluRSは非識別性GluRSに変換されることがわかり、わずか1残基のアミノ酸置換でtRNA認識が変換された分子進化の過程を実証することに成功した。また超好熱古細菌PyrococcushorikoshiiのリジルtRNA合成酵素(古細菌以外ではクラスIIに属するが、古細菌由来の本酵素はクラスIのATP結合モチーフを持ち、進化的に興味深い)の結晶構造をMAD法により解析し、モデルの構築を行っている。さらに、古細菌由来tRNAのG15を、塩基置換反応によりqueuosine置換体に修飾するarcTGTと基質塩基との複合体の結晶構造を2.2Å分解能で決定し、塩基置換反応の詳細なメカニズムを解明した(論文準備中)。また、リボソームRNAのメチル化を触媒する2'-O-MTaseの結晶構造を2.4Å分解能で決定し、本酵素ファミリーの触媒部位には明瞭な結び目(knot)構造があることを発見し、これが酵素活性部位の構築に重要であることを示唆した(論文準備中)。さらにDNAの複製の際にRNA primerを合成するDNAプライマーゼの結晶構造を1.8Å分解能で決定した(論文準備中)。また、セントロメアにおけるクロマチンの構築に必須なCENP-BとDNAの複合体の結晶構造を2.5Å分解能で決定した(論文投稿中)。本研究の目的は、遺伝情報の変換過程(複製、転写、翻訳)に携わる酵素およびRNAの高次構造を決定し、生物マシーナリーとしての動作機構を解明することにある。本年は、まず高度好熱菌由来のグルタミルtRNA合成酵素(GluRs)とtRNAGluの複合体の結晶構造を2.4Å解能で決定し、tRNAのアンチコドンの認識機構を解明した(Nature Structural Biol.,2001)。本構造では、tRNAGluのアンチコドン3字目のC36がArg358により水素結合で認識されていたが、このArg残基をGlnに置換することで、変異体GluRSはtRNAGln型のアンチコドン(34YUG36)を認識する非識別性GluRSに変換されることがわかり、わずか1残基のアミノ酸置換でtRNAの認識が変換されるという分子進化の過程を実証することに成功した。また、高度好熱菌由来アルギニルtRNA合成酵素(ArgRs)の2.3Å分解能の結晶構造を決定し、系統的な変異体解析の結果、tRNAArgのA20の特異的な認識機構を解明した(Proc. Natl. Acad. Sci. USA,2001)。また超好熱古細菌Pyrococcus horikoshiiのリジルtRNA合成酵素(LysRS)
難治性根尖性歯周炎の病原因子としての細菌バイオフィルムの解析

難治性根尖性歯周炎罹患歯より採取した抜去歯,過剰根管充填材あるいは根尖部歯牙断片を微細形態学的に検索し以下の知見を得た。微細形態学的検索に供した11試料中9試料の根尖病巣内の根尖孔外部歯面および根管充填材表面には,glycocalyx様構造物に被覆された細菌バイオフィルムが観察された。バイオフィルム構成細菌の形態型は糸状菌とラセン状菌が優位であり,いくつかの部位では,浮遊細胞と推察される細菌菌体のフィルム内からの遊出がみられた。次いで,Modified Robbins device(以下MRD)を用いてPorphyromonas gingivalisバイオフィルムを形成し,その生物学的活性をATP測定法により測定して浮遊系細菌と比較検討するとともに,その実態を形態学的に検索した。浮遊系細菌における対数増殖期のATP量の変化率は13.88nmol/hであるのに対し,成熟したバイオフィルムが観察された14日目以降のATP量の変化率は5.05X10^<-2>pmol/hとバイオフィルム中のP.gingivalisは浮遊系の約31万分の1の増殖速度であった。微細形態的にはMRD灌流開始7日目よりバイオフィルム形成がみられ,その後経時的なバイオフィルムの形態的変化とATP量の変化には相関が認められた。さらに,P.gingivalisバイオフィルムに対する化学療法剤の抗菌効果をMRDを用いたATP測定法により検討した。3種の化学療法剤,すなわちグルコン酸クロルヘキシジン,ミノサイクリン塩酸塩,メトロニダゾールのうち,クロルヘキシジン作用時には,1日後にATP量が約1/1000まで減少し,その後も7日後まで減少傾向を示した。一方,ミノサイクリンおよびメトロニダゾール作用時のATP量の変化は,7日後で約1/2であった。これらより,バイオフィルム中のP.gingivalisは増殖速度が遅く,浮遊系のP.gingivalisに抗菌効果を有するミノサイクリンやメトロニダゾールもP.gingivalisバイオフィルムには顕著な抗菌効果を示さないことを明らかにした。根尖性歯周炎の難治性・慢性化因子の1つと推察される根管内外の残存細菌の定着・増殖における細菌バイオフィルムの関与について解明するため,以下の実験を行った。歯根端切除術により切除された根尖部歯牙断片や抜去歯,あるいはX線的に根尖病変部に逸出した過剰根管充填剤(ガッタパーチャポイント:GP)を対象とし,得られた試料を走査型電子顕微鏡にて微細形態学的に検索した。被験5試料中4試料の根尖孔外に,グリコカリックス様のフィルム上の外被に関連して細菌が観察された。根尖孔外に逸出したGP断片試料では,フィルム状の外被内から糸状菌やラセン菌の遊出(矢印)がみられた。根尖孔外突出部のGP表面には糸状菌が優位に存在していた。抜去歯上では,根尖孔外の凹窩周辺に露出したセメント質表層に,多数の細菌が凝集しバイオフィルムを形成していた。抜去歯試料の根尖部孔外においても球状菌が優位にみられ,その他長・短桿菌が散在性に観察された。しかしながら,いずれの試料においても糸状菌はあまり観察されなかった。

抜去歯の根尖孔外で観察された細菌は,副根管や根管治療により除去できずに残存した細菌がバイオフィルムを形成し,生体防御の影響をあまり受けずに根尖孔外に侵入したのではないかと推察される。また,不適切な根管充填がなされた場合,根管内に残存した細菌や新たに歯冠部から侵入した細菌がバイオフィルムを形成し,GPを感染経路として根尖孔外に侵入し,根尖性歯周炎を慢性化・難治化する可能性が示唆された。一方,ヒトの重度成人性歯周炎罹冠抜去歯上で,免疫走査電顕法にてバイオフィルム形成細菌を検索し,歯周ポケット底部に位置するいわゆプラークフリーゾーンにおいて,バイオフィルムを形成したPorphyromon as gingivalisおよびActinomyces viscosusを検出した。難治性根尖性歯周炎罹患歯より採取した抜去歯,過剰根管充填材あるいは根尖部歯牙断片を微細形態学的に検索し以下の知見を得た。微細形態学的検索に供した11試料中9試料の根尖病巣内の根尖孔外部歯面および根管充填材表面には,glycocalyx様構造物に被覆された細菌バイオフィルムが観察された。バイオフィルム構成細菌の形態型は糸状菌とラセン状菌が優位であり,いくつかの部位では,浮遊細胞と推察される細菌菌体のフィルム内からの遊出がみられた。次いで,Modified Robbins device(以下MRD)を用いてPorphyromonas gingivalisバイオフィルムを形成し,その生物学的活性をATP測定法により測定して浮遊系細菌と比較検討するとともに,その実態を形態学的に検索した。浮遊系細菌における対数増殖期のATP量の変化率は13.88nmol/hであるのに対し,成熟したバイオフィルムが観察された14日目以降のATP量の変化率は5.05X10^<-2>pmol/hとバイオフィルム中のP.gingivalisは浮遊系の約31万分の1の増殖速度であった。微細形態的にはMRD灌流開始7日目よりバイオフィルム形成がみられ,その後経時的なバイオフィルムの形態的変化とATP量の変化には相関が認められた。さらに,P.gingivalisバイオフィルムに対する化学療法剤の抗菌効果をMRDを用いたATP測定法により検討した。3種の化学療法剤,すなわちグルコン酸クロルヘキシジン,ミノサイクリン塩酸塩,メトロニダゾールのうち,クロルヘキシジン作用時には,1日後にATP量が約1/1000まで減少し,その後も7日後まで減少傾向を示した。一方,ミノサイクリンおよびメトロニダゾール作用時のATP量の変化は,7日後で約1/2であった。これらより,バイオフィルム中のP.gingivalisは増殖速度が遅く,浮遊系のP.gingivalisに抗菌効果を有するミノサイクリンやメトロニダゾールもP.gingivalisバイオフィルムには顕著な抗菌効果を示さないことを明らかにした。
がん生殖医療の視点で取り組む「がん患者の妊孕性温存の意思決定支援モデル」の開発

本研究は、がん生殖医療の視点で取り組む、がん患者の妊孕性温存に対する意思決定支援モデルを開発することを目的としている。平成30年度は、引き続き妊孕性温存に対するがん患者の意思決定および意思決定支援の様相を明らかにする、という目標に加え、妊孕性温存に対するがん患者の意思決定を支援するモデルを構築する、という目標達成へ向け、下記を実施した。1.がん患者の意思決定支援の様相:【看護師への質問紙調査】を分析した結果、妊孕性温存に関する情報提供のあり方、意思決定に向けた支援についての課題が明確になり、看護師の準備状況を整えることの必要性が明らかになった。2.妊孕性温存に対するがん患者の意思決定を支援するモデルを構築(1)モデル案の作成:関連文献の検討およびこれまでの調査結果の検討をもとに、がん医療と生殖医療が連携を図りながら進める妊孕性温存に対するがん患者の意思決定支援モデル案を作成した。モデル案は、がんの診断を受け、がん医療機関で行う「妊孕性温存療法を考えるがん患者・カップルへの支援」から生殖医療機関を受診後、「妊孕性温存療法を受けるがん患者・カップルへの支援」、その後凍結期間にがん医療と生殖医療機関で行う「不妊治療の再開に向けた支援」、がん完治後に生殖医療機関で行う「不妊治療を受けるカップルの支援」「不妊治療後に妊娠したカップルへの支援」「不妊治療終結の意思決定への支援」「不妊治療を終結したカップルの支援」で構成された。また、患者の個別性に応じて必要な「妊孕性温存療法が困難ながん患者・カップルへの支援」もモデルに包含した。(2)モデル案の精製:がん看護専門看護師、生殖看護認定看護師、がん生殖心理士をエキスパートモデルとしたフォーカスグループインタビューをもとに検討した。平成30年度が最終年度であるため、記入しない。そこで、平成26年度は、1.妊孕性温存に対するがん患者の意思決定の様相を明らかにする、2.妊孕性温存に対するがん患者の意思決定支援の様相を明らかにする、という2つの目標達成へ向け、下記を実施した。1.文献検討及び最新知見について情報収集・検討:がん治療に伴う妊孕性保護、がん患者(主には乳がん患者、若年患者)の妊孕性温存に対する意思決定の実態、妊孕性温存の意思決定に対する医療者・看護職による支援に関する国内外の文献を検討した。また、「日本看護科学学会学術集会」では「がん治療に携わる医師の妊孕性温存に対するがん患者の意思決定支援の実態調査」を発表し、参加者と情報共有及び今後の課題について情報交換を行った。加えて、「がんと生殖に関するシンポジウム2015」、「日本乳がん看護研究会」、「日本がん看護学会学術集会」では、最新知見や問題点の情報収集を行った。2.患者の実態調査【患者へのインタビュー調査】:上記1の検討をふまえ、インタビューガイドの作成を検討し、研究倫理委員会への申請準備を進めているところである。研究協力者への依頼については、シンポジウムで紹介いただいた研究会の患者ネットワーク担当者を介して、患者様をご紹介いただく手配をした。また、インタビューは、対象の都合に合わせ、平成27年度上半期の週末および大学夏季休暇中を利用して実施する予定である。3.看護の実態調査【看護師への質問紙調査】:上記1の検討をふまえ、概念枠組みを検討し、質問紙調査の準備、研究倫理委員会への申請準備を進めているところである。質問紙調査の送付は、新年度で所属等の変更が落ち着いた平成27年度夏前をめどに計画している。平成27年度は、引き続き妊孕性温存に対するがん患者の意思決定および意思決定支援の様相を明らかにする、という2つの目標に加え、妊孕性温存に対するがん患者の意思決定を支援するモデル案を構築する、という目標達成へ向け、下記を実施した。1.患者の実態調査【患者へのインタビュー調査】:がん生殖医療研究会の患者ネットワークを介して、8人のインタビュー調査を実施した。その結果、妊孕性温存に関する情報提供のあり方、意思決定に向けた支援についての課題が明らかになった。2.看護の実態調査【看護師への質問紙調査】:患者および医師の実態調査の結果も踏まえ概念枠組みを検討し、質問紙調査の準備、研究倫理委員会への申請準備を進めているところである。質問紙調査の送付は、新年度で所属等の変更が落ち着いた平成28年度夏前をめどに計画している。27年度は、文献検討をふまえ、看護師への質問紙調査、意思決定支援モデル案の構築を着手する予定であった。しかし、計画よりも遅れている理由として、下記の2点が考えられる。1.がん患者および医師の実態調査の結果をふまえ、看護師の実態調査の概念枠組を検討するところであった。しかし、がん患者へのインタビュー実施までに時間を要したため、概念枠組みの検討の着手が遅れた。2.調査の回答率を上げるために、調査用紙の配布時期として看護師の移動(退職、転職など)が考えられる年度末を避けたため、時間が空いてしまった。

平成28年度は、引き続き妊孕性温存に対するがん患者の意思決定および意思決定支援の様相を明らかにする、という目標に加え、妊孕性温存に対するがん患者の意思決定を支援するモデル案を構築する、という目標達成へ向け、下記を実施した。1.がん患者の意思決定の様相【がん患者へのインタビュー調査】(1)方法:同意の得られたがん患者8人を対象に、半構成式インタビュー調査を実施し、内容分析を行った。(2)結果:【不妊治療と遺伝】(不妊治療への諦め・継続・難しさ、がんの遺伝性による影響)、【医療者】(対応が与える影響や対応の不満)、【情報入手とそれに基づく行動】(情報提供の時期、方法、情報提供の不足)、【サポート・相談】(相談の難しさ、サポート体制への要望、連携体制)、【気持ち】(難しさ、迷い)のカテゴリーが明らかになった。2.がん患者の意思決定支援の様相【看護師への質問紙調査】(1)方法:無作為に抽出されたがん看護専門看護師、がん化学療法看護認定看護師、乳がん看護認定看護師、不妊症看護認定看護師の中で同意の得られた者を対象に、無記名の調査用紙を郵送法で配布・回収した。調査内容は1施設や職場の環境、2看護師の背景、3妊孕性温存の意思決定支援、4妊孕性ケアの困難、5専門家への相談と連携である。(2)結果:1,478部発送し603部回収(回収率51.1%)。妊孕性温存に関する情報提供のあり方、意思決定に向けた支援についての課題が明らかになった。さらに意思決定を促進する因子を明らかにする予定である。3.がん患者の意思決定を支援するモデル案の構築:上記の結果および関連文献の検討を加え、エキスパートパネルによるグループインタビューに向けてフィールドの調整、協力者の依頼等の準備を進めている。今年度は、文献検討をふまえ、看護師への質問紙調査、意思決定支援モデル案の構築を着手する予定であった。しかし、計画よりも遅れている理由として、下記の2点が考えられる。1.がん患者へのインタビュー調査の結果をふまえ、看護師の実態調査の概念枠組を検討するところであった。しかし、がん患者へのインタビュー数の確保までに時間を要したため、その分析の着手が遅れ、調査用紙の概念枠組みの検討が遅れた。2.調査用紙を確実に配布し回収率を上げるため、調査者のピックアップをする際に認定看護師および専門看護師の新規承認・更新承認時期を待っており、時間が空いてしまった。本研究は、がん生殖医療の視点で取り組む、がん患者の妊孕性温存に対する意思決定支援モデルを開発することを目的としている。平成29年度は、引き続き妊孕性温存に対するがん患者の意思決定および意思決定支援の様相を明らかにする、という目標に加え、妊孕性温存に対するがん患者の意思決定を支援するモデル案を構築する、という目標達成へ向け、下記を実施した。1.がん患者の意思決定支援の様相【看護師への質問紙調査】(1)方法:無作為に抽出されたがん看護専門看護師、がん化学療法看護認定看護師、乳がん看護認定看護師、不妊症看護認定看護師の中で同意の得られた者を対象に、無記名の調査用紙を郵送法で配布・回収した。
イオウ-イリドを応用する新しいジエンの開発研究

安定イオウ-イリドの合成化学的応用の一環として、本研究を行った。ジメチルスルホニウム-ジアセチルメチリド(la)と塩化アセチルとの反応によって得られた3-メチルチオ-2,4-ペンタンジオン(2)及び2-アセトキシ-3-メチルチオ-2-ペンテン-4-オン(3)をクロロトリメチルシラン-トリエチルアミン-塩化亜鉛の系、いわゆるDanishefsky法により、O-シリル化を行い、それぞれ、2,4-ビス(トリメチルシロキシ)-3-メチルチオ-1,3-ペンタジエン(4)及び2-アセトキシ-3-メチルチオ-4-トリメチルシロキシ-1,3-ペンタジエン(5)を得た。この方法による(la)からジエン(4)の合成は数工程を要し、合成化学的応用の価値は少い。そこで、イリド(la)からジエン(4)への直接的なジエノールシリルエーテル化を種々検討した。その結果、クロロトリメチルシラン-トリエチルアミン-ジクロロメタン系で、ほぼ定量的にジエン(4)を得ることに成功した。一方、ジメチルスルホニウム-アセチルメトキシカルボニルメチリド(lb)は、クロロトリメチルシラン-ヨウ化ナトリウム-アセトニトリル系を応用することにより、直接的なシロキシ化が進行し、2-メチルチオ-3-トリメチルシロキシクロトナート(6)を合成した。(6)を強塩基存在下にジシロキシ化を試みたが、目的とするジシロキシジエンは得られなかった。本実験によって新しく得られたジエン(4)及び(5)の立体配置は決定できなかった。ジエン(4)は、Diels-Alder環化付加反応及びカルボニル化合物、イミン類に対して、ルイス酸存在下、マイケル形付加反応が予想通り進行することを確認した。以上の結果は、イオウ-イリドよりアルキルチオ基を有する他の有用なジエン類の開発に価値ある知見を与えるものと評価することができる。
ガンマヘルペスウイルスによる自己抗体産生誘導機序の解明

本課題では、マウスにて自己抗体産生を誘導するmurine gamma-herpesvirus 68 (MHV68)を使用し、自己反応性B細胞出現の機構メカニズムを解明することを目的とした。単一B細胞からの抗体遺伝子クローニングにより、感染時におけるマウス脾臓IgG+胚中心B細胞には、複数の自己抗原とウイルス抗原に反応する多分子反応性B細胞が含まれることを見出した。本課題では、自己抗体産生を認めるmurine gamma-herpesvirus 68 (MHV68)感染マウス利用し、感染マウス脾臓において、自己反応性B細胞が出現する機構を解明することを目的としている。昨年度、MHV68が誘導するIgG自己抗体は、主に脾臓胚中心反応にて出現する自己反応性B細胞に由来する可能性を示唆する結果を得た。すなわち、単一細胞からの免疫グロブリン遺伝子クローニングにより、感染時におけるマウス脾臓IgG+胚中心B細胞には、複数の自己抗原とウイルス抗原に反応する多分子反応性B細胞が約30%含まれることを見出した。この多分子反応性B細胞の出現が他の免疫反応でも認められるかを明らかにする為、モデル抗原免疫やインフルエンザ感染でも同様の解析を行ったが、多分子反応性B細胞は認められなかった。MHV68はB細胞に感染することから、MHV68感染細胞の反応性を調べたが、予想に反し、感染と非感染細胞群で自己反応性および多分子反応性クローンの出現頻度に差は認められなかった。以上の理由から、多分子反応性B細胞の出現は、B細胞への直接の感染ではなく、MHV68特有の感染動態(systemic infectionや潜伏・持続感染)に起因するものと推測している。また、マウスモデルにて認められた多分子反応性B細胞について、ヒトヘルペスウイルス感染でも同様のことが認められるかを確かめるため、思春期以降のEBV初感染で発症する伝染性単核球症患者検体から、形質細胞を分離し、同様の解析を行った。急性期の患者由来形質細胞では、多分子反応性IgG産生細胞が認められたが、EBV抗原に明らかに反応しているクローンは獲得することができなかった。得られた抗体クローンの反応性については、今後さらに詳しく解析する必要があると考えている。本研究の開始時点では、ウイルス感染B細胞において有意に自己反応性B細胞が認められるのではないかと、予想していた。計画していたGFPなどの蛍光タンパク質発現カセットを挿入したリコンビナントウイルスについては、その作製に成功したが、in vivoにおけるB細胞での感染で、蛍光タンパク質を検出レベルまで発現させることができず、感染細胞をFACSによって分取できなかった。そこで、MHV68が感染する胚中心B細胞について、感染の有無をRT-PCRで確認し、感染細胞群と非感染細胞郡に分類したところ、いずれのグループでも自己反応性クローンの出現頻度はほぼ変わりなかった。MHV68感染マウスの脾臓胚中心B細胞について、単一細胞からの遺伝子クローニングを行い、得られた抗体遺伝子を培養細胞に導入することで組換え抗体を作製し、その反応性を調べた。その結果、感染マウス脾臓胚中心B細胞において、ウイルス抗原に反応するクローンの約30%がdsDNAなどの自己抗原にも反応することがわかった。ウイルス反応性抗体のSHMを元の配列に戻した場合、ほとんどのクローンはその反応性に変わりはなかった。また、自己反応性については、反応性を失うものが多かった。すなわち、胚中心反応におけるSHMによって自己反応性を獲得するという機構が存在している可能性が示唆された。並行して、SLEなどの自己免疫疾患患者末梢血について、EBV感染細胞を検出する技術の開発を行なった。培養細胞では、EBV感染細胞を特異的に検出できる手法を開発したが、それを健常人やSLE患者からの検体によって行なった。しかし、in vivoでの潜伏感染は培養細胞でのそれとは異なるのか、ウイルス感染の検出は困難であることがわかった。当初の予想に反し、ウイルス感染が間接的に胚中心でのクローン選択に影響を与えている可能性が示唆された。その為、計画していた実験のいくつかを変更し、産生される抗ウイルス抗体の特性、特にpolyreactivityについての詳細を調べた。この解析には、時間と労力を必要とする為、研究進度は計画よりもやや遅れていると考えている。しかし、得られている結果は、免疫学的に興味深いものであり、さらに展開させていきたい。すなわち、VDJ組換えレパトアで既にウイルス抗原に反応するクローンが更にSHMを得て、自己反応性を持ってしまうことが考えられる。より厳密なクローン選択が行われていると、そのような抗体は産生されないと考えられるが、このウイルスの間接的な影響によって、クローン選択が曖昧になっているのではないかと考えている。今後は、このような状態を引き起こす要因を宿主、ウイルスの両面の候補因子について、解析を進める。一般試薬、フローサイトメーター用試薬、DNA合成、PCR関連試薬、プラスチック器具などの消耗品とC57B/Lマウスの購入費を計上している。あわせて、国内外の学会への参加における旅費も計上する。
多国籍軍をめぐる包括的データセットの構築とその分析:国際法と国際政治の視点から

アメリカが主導する多国籍軍について包括的なデータセットを整備し、それを計量手法と事例比較手法を用いて科学的に分析した。日本らしい国際関係論の研究として、国際政治における力の要素だけではなく、国際法や外交規範の重要性を意識した議論を心がけ、複数の英語論文を執筆・公表した。また、チューリヒ大学とNATOに所属する共同研究者とともに有志連合に関する最新研究を開始し、研究代表者の単著論文と合わせて、多国籍軍・有志連合をめぐる国内政治と国際政治に関する因果メカニズムの解明も行った。本研究プロジェクトは、多国籍軍(または有志連合)をめぐるデータセットを構築し、それを国際政治学に依拠しつつも国際法に対して十分な配慮を払い、多面的に分析する試みである。研究の最終目標は、英語によって論文を作成し、それを査読審査を経て国際的な学術雑誌を通じ公表することにある。本プロジェクトは、多国籍軍をめぐるデータセットを構築し、計量分析による包括的な仮説検証の実施を目的としている。初年度は、基盤データセットの構築が主な課題であった。その課題達成のため、学生アルバイトを雇用して資料収集を実施するとともに、データの入力を年度前半に重点的に進めた。他方、同時並行的に試験的な計量分析も行い、アメリカのみに特化した形になるが、多国籍軍への参加と不参加がその援助政策とリンクしているのかを検討した実証論文を執筆した。それはアメリカ政治学会で発表し、また、英文雑誌で公表することができた。なお、学会に参加したことで、海外での類似研究プロジェクトの情報を得られたが、ライバルと言えるプロジェクトの存在を複数発見するに至り、ゆえに、一部方針転換を迫られている。具体的には、いわゆるMIDsデータセットやICBデータセットをベースにした多国籍軍データの構築はすでに他の研究者がほぼ完成させており、これから先(日本から海外に向けて発信できる研究を行うためには)、海外の研究者があまり着想しないような、しかし重要な国際関係論の論点をめぐる付加的データ項目を見つけ出して整備することが欠かせないことがわかった。それゆえ、本プロジェクトでは、今後多国籍軍と国際法の論点に焦点を絞り、追加データの構築を行うこととし、作業を進めている。たとえば武力行使の法的位置づけに関するデータの入手を行い、データセット化を図っている。平成21年度は前年度の成果を受け、多国籍軍の政治学をめぐる論点の再整理とそれを踏まえてのデータセット構築に力を注いだ(なお、再整理を進める作業については単著『武力行使の政治学』をまとめる中で進めた)。このうち、多国籍軍・有志連合の維持と変質を計量的にとらえるデータセット構築をめぐっては、法的な観点からいわゆる集団的自衛権行使の具体的事例について情報を集めて整理することを重視した。こういった多国籍軍をめぐる法的な側面への注目は、諸外国で行われている類似研究との差別化をはかるという意図による(なお、国際学会で本データセットを用いて作成したペーパーを発表するため、目下エントリーを行っている)。他方、同盟制度と多国籍軍とのかかわりでは同盟条約を根拠とする基地・兵力の海外駐留をデータ化するための準備を進めた。こちらについてもすでに類似研究プロジェクトが存在することから、それとの差別化をどのようにはかるのかが課題といえる。また、新しい論点として、外交における有志連合と軍事における有志連合の関係性が補完的なのか代替的なのかをめぐる研究を進める必要性・重要性を見出し、そのための新しいデータセット作成の準備を行った(国連が発行する公式資料を用いることができることがわかり、それを第一段階として入手し、変数のコーディングルールのあり方を検討する段階にある)。来年度は、さらに多国籍軍をめぐるデータセット拡充を、海外の類似研究との差別化をうまくはかりながら進め、成果をまとめることに注力する必要がある。研究プロジェクトの3年目に当たる平成22年度は、平成21年度までに作り上げたデータセットをもとに複数の実証分析を進め、最終目標である英語による成果発表に向けて準備を主に進めた。この数年で多国籍軍・有志連合をめぐる理論・実証研究が増えてきているため、類似研究との差別化を考えることが前年度同様に課題であった。たとえば、研究代表者が発表した研究を引用した学術論文・書籍・ワーキングペーパーが複数確認でき(例、Lake 2009 ; Thompson 2009 ; Wivel and Oest 2010 ; Ulrich 2010 ; Vucetic 2011)、これらとの関連を明示し、かつうまく違いを出しながら研究成果をまとめることが重要になってきている。特に、2009年に発表したJournal of Peace Research誌の成果を踏まえ、選挙サイクルが有志連合への参加に与える影響を分析し、それをワーキングペーパーの形にまとめた(2011年6月にアイルランド・ダブリンで開催されるEuropean Political Science Association年次大会で発表することが決まっている)。なお、論文を完成させるには事例分析も欠かせず、そのための追加の資料収集が必要になってきていると感じる。

他方、国際法と国際政治との有機的な連関を目指すとの目的に沿い、集団的自衛権行使による多国籍軍を取り上げた論文も書き上げ、英語の専門学術雑誌へ投稿した(2011年3月の時点で査読審査中)。国連安保理の情報伝達機能が他国政府だけではなく他国国内のアクター(例、議会)にも影響することが見出された点が学術的貢献として強調できる。次年度の課題は査読を経て論文の掲載を実現することにある。最終年度にあっては、研究計画の究極的目標として申請当初に掲げた「英語によって論文を作成し、それを国際的な学術雑誌を通じ公表すること」を達成するため、特に成果発表の面に力を注いだ。多国籍軍・有志連合をめぐる研究はこの5年で急速に進んできたが、本プロジェクトは類似研究との差別化を図るべく、(1)多国籍軍一般の「形成段階」に関する計量分析、(2)多国籍軍と外交(法的承認)における連合の連関性に関する計量分析、(3)多国籍軍参加に関する国内政治・国内経済要因の影響をめぐる再検討を進めた。(1)についてはスイス・チューリヒ工科大学のTobias Boehmelt講師とNATOのUlrich Pilster研究員と、(2)については神戸大学大学院の藪恭兵氏(院生)との共同研究の形をとって早期に着実に成果が公刊できるように工夫を行った。(1)の研究成果は年度中盤には完成し、International Studies Quarterly誌に投稿したものの、Revise and Resubmitを得るには至らず、現在他の雑誌(投稿中のために具体的な雑誌名は伏せる)に投稿している(なお、2012年4月にInternational Studies Association年次大会において発表予定)。(2)の成果は英国・エセックス大学と神戸大学の二国間研究交流セミナー(2012年3月)においてポスター形式で発表し意見を求めた段階である。(3)については、すでに論文が完成し、これも北米の専門雑誌に投稿中である(これについてはチューリヒ工科大学で2012年3月に口頭発表を行った)。残念ながら査読審査を通った論文(またはRevise and Resubmitになった論文)は年度末までに出なかった。当然ながら、科研費受領後(=来年度以降)もこれら成果が雑誌掲載になるまで研究を継続する。なお、北米の学術雑誌の場合、(どの言語であれ)初出の内容であることが求められるため、研究成果を紀要または国内雑誌で刊行することは行っていない。
レトロウイルス感染によるT細胞受容体を介した情報伝達機構異常の解析

目的:ヒトレトロウイルス感染によって惹起される免疫不全症の病態を解明する目的で、ヒトT細胞クロ-ンにHTLVーIを感染させ、細胞の機能的変化とそのメカニズムを検討した。方法:単純ヘルペスウイルス特異的CD4陽性およびCD8陽性細胞障害性T細胞クロ-ン、ならびに抗原非特異的細胞障害活性を有するT細胞受容体(TCR)γδ陽性T細胞クロ-ンを樹立し、HTLVーI産生細胞株と混合培養することにより、HTLVーI感染T細胞クロ-ンを作製した。これらのHTLVーI感染クロ-ンの、細胞障害性、表面抗原の発現ならびにTCRを介した細胞内情報伝達機構などの変化を検討した。結果:HTLVーIは、樹立した全てのクロ-ンに感染可能であり、プロウイルスDNAの組み込みを認めた。HTLVーI感染T細胞クロ-ンは全て、感染早期よりその細胞障害活性を失った。しかしこの時期には、レクチンを添加し標的細胞に密に接着させることにより細胞障害性は回復した。他方感染後期には、レクチン添加によっても細胞障害性の回復は認められなかった。さらに、細胞障害惹起物質であるパ-フォリンの発現を調べたところ、感染早期には発現量に差を認めなかったが、感染後期には低下していた。また、感染早期には細胞表面抗原の発現に明らかな差を認めなかったが、後期にはCD3・TCR複合体の発現量の著明な減少を認めた。さらに、感染後期には、抗受容体抗体添加による細胞内遊離カルシウムイオン濃度の上昇率も著しく低下していることが明らかとなった。結論:HTLVーIは種々のT細胞サブセットに感染可能であり、全てのT細胞亜集団に対して、TCRの機能異常を含んだ共通のメカニズムで重篤な機能不全を惹起させることが明らかとなった。現在さらに、そのメカニズムを種々のセカンド・メッセンジャ-に焦点を当てて解析中である。目的:ヒトレトロウイルス感染によって惹起される免疫不全症の病態を解明するために,ヒトT細胞クロ-ンにHTLVーIを感染させ,その機能的変化とメカニズムを明らかにする.方法:単純ヘルペスウイルス特異的CD4陽性およびCD8陽性T細胞クロ-ン,ならびに抗原非特異的細胞障害性を有するT細胞レセプタ-(TCR)γδ陽性T細胞クロ-ンを樹立し,HTLVーI産生細胞と混合培養してそれぞれのHTLVーI感染T細胞クロ-ンを樹立した。これらのHTLVーI感染および非感染T細胞クロ-ンを用いて,細胞障害活性,細胞表面抗原の発現,TCRを介した細胞内情報伝達機構等の変化を観察した。結果:HTLVーIは,CD4陽性およびCD8陽性TCRαβ陽性T細胞ならびにTCRγδ陽性T細胞すべてに対して感染可能であり,プロウイルスDNAの細胞内への組み込みを認めた。これら3種のT細胞サブセットはすべてHTLVーI感染早期よりその細胞障害性を失った。しかし,レクチンを添加し標的細胞に接着させることにより,細胞障害性は回復した。他方,感染後期ではレクチン添加によっても細胞障害性の回復は認められなかった。細胞障害惹起物質であるパ-フォリンの産生を検討したところ,感染早期では細胞質内量に変化を認めなかったが、感染後期には産生が低下していた。細胞表面抗原の発現は,感染早期には全く変化を認めなかったが、感染後期ではCD3ーTCR複合体の発現量の著明な減少を認めた。また,感染後期には,CD3およびTCRに対するモノクロ-ナル抗体添加による細胞内カルシウムイオン濃度の上昇も著明に低下していた。

結論:以上の結果より,HTLVーIは,種々のT細胞サブセットに感染可能であり,少なくとも2段階を経た共通のメカニズムによって機能不全を惹起させることが明らかとなった。現在さらにそのメカニズムを詳細に検討中である。昨年度までに私どもは、ヒトレトロウイルス感染によって惹起される免疫不全症の病態を明らかにする目的で、単純ヘルペスウイルス特異的CD4陽性およびCD8陽性細胞障害性T細胞(CTL)クロ-ンに、in vitroでhuman Tー1lymphotropic virus type I(HTLVーI)を感染させ、感染後の機能的変化とそのメカニズムを検討し、以下の結果を得た。1)CD4陽性およびCD8陽性CTLはHTLVーI感染早期から細胞障害活性の著しい滅弱を認めた。2)感染早期には、CD3・T細胞受容体(TCR)複合体の発現量に変化を認めなかったが、感染後期には、その発現が著明に低下することが明らかとなった。3)それに伴い、CD3・TCR複合展を介した情報伝達機構も異常を来すことが示された。今年度は、このようなHTLVーI感染による機能的変化の普遍性とそのメカニズムをより明らかにするために、TCRγδ陽性CTLクロ-ンを樹立し、そのHTLVーI感染による機能的変化を検討し、以下の結果を得た。1)HTLVーIはTCRγδ陽性T細胞に感染可能であることが初めて明らかとなった。2)HTLVーI感染TCRγδ陽性T細胞は、TCRαβ陽性CTLの場合と同様に、感染早期より細胞障害性の滅弱を認めたが、この時期にはレクチン添加によって標的細胞との接着を密にすることにより、細胞障害性の回復が認められた。3)感染後期には、もはやレクチン添加によっても細胞障害性の回復は認められず、CD3・TCR複合体の発現量の著しい滅少を認めた。4)抗CD3および抗TCR抗体添加による細胞内カルシウムイオン濃度の上昇率は感染早期には変化を認めなかったが、後期には著明な低下を認めた。以上の結果より、T細胞機能はHTLVーI感染により著しく変化することが示された。また、CD3・TCR複合体を介した情報伝達機構の異常が園原因の1つであることが推察された。
マウスモデルを用いた大腸がん転移機構の解明

本研究では、マウス生体での機能に基づいた探索により大腸がんの転移制御因子の同定を試み、HNRNPLLというRNA結合タンパクを見出した。大腸がん細胞でHNRNPLLの発現を低下させると転移能や浸潤能が亢進した。さらにHNRNPLLは、(1) CD44というタンパクをコードするpre-mRNAの選択的スプライシングを調節して大腸がん細胞の浸潤を抑制すること、(2)大腸がん細胞の上皮間葉転換の際に発現が低下すること、(3) DNA複製因子をコードするmRNAの安定性を高めて大腸がん細胞の増殖を促進することを明らかにした。1.レンチウイルスshRNAライブラリーを用いた転移抑制因子の同定先行研究で確立したshRNAライブラリーを用いた生体内スクリーニング系により、新たに36個の大腸がん転移抑制遺伝子候補を同定した。先行研究で複数個体の転移巣から検出されたHnrpll(heterogeneous nuclear ribonucleoprotein L-like)について検証を行った。低転移性マウス大腸がん細胞株CMT93のHnrpllをshRNAでノックダウンすると、マトリゲル浸潤能と生体内での肺転移能が亢進したことから、Hnrpllは大腸がんの転移抑制遺伝子である可能性が強く示唆された。HNRPLLはpre-mRNAスプライシングを制御するRNA結合タンパクである。CMT93細胞でHnrpllをノックダウンすると、転移を促進することで知られるCd44 variant exon 6 (Cd44v6)の発現増加を認め、Cd44v6に対する中和抗体でマトリゲル浸潤能が抑制された。2.トランスポゾンを用いた転移制御因子の同定6-8週齢のVB及びLBマウスにタモキシフェン0.1mgを1回腹腔内投与したところ、VBマウスは投与後2ヶ月前後で衰弱し始め、十二指腸から空腸を埋め尽くす程の腫瘍が形成された。一方、LBマウスでは、投与後5ヶ月で100個程のポリープが回腸を中心に確認できた。以上の結果から、VBマウスでは、より少ないポリープ数を発症し長期間生存可能なタモキシフェン投与量を検討する必要がある。LBマウスでは半年近く生存できるため、LBAPマウスを優先的に繁殖させ、タモキシフェンを投与したところ、4ヶ月前後で衰弱し始めたが、ポリープの数や大きさは、対照となるLBと差が認められなかった。組織学的解析を行ったところ、LBAPマウスの一部のポリープで、腫瘍上皮細胞の浸潤像や血管内侵入像が確認できた。1.レンチウイルスshRNAライブラリーを用いた転移抑制因子の同定前年度までに、マウス大腸がん細胞株CMT93においてHnrnpllがCd44 pre-mRNAの選択的スプライシングを制御することを見出した。本年度はヒト大腸がん細胞でも同様の現象がみられるか検証したところ、複数のヒト大腸がん細胞株において、HNRNPLLがCD44 pre-mRNAと結合し、HNRNPLLのノックダウンによってCD44のエキソンv6の発現が増加する結果を得た。一方、がん細胞の浸潤促進要因として知られる上皮間葉転換(Epithelial-mesenchymal transition: EMT)とHNRNPLLの関係を検討した。大腸がん細胞株にin vitroでEMTを誘導するとHNRNPLLの発現が抑制された。さらに、臨床検体の免疫染色によって、浸潤先端のE-cadherinの発現が低下したがん細胞の一部でHNRNPLLの発現低下が認められ、HNRNPLLの発現低下とEMTの関係が示唆された。2.トランスポゾンを用いた転移制御因子の同定昨年度の予備検討で浸潤が認められたLBAPマウスについてさらに解析した。7匹のマウスにタモキシフェンを投与し、47ヶ月後に腸管腫瘍形成・浸潤・転移を調べたが、遠隔転移は認められなかった。組織学的解析により2匹のマウスで浸潤性腺がんを認めたが粘膜下層に達する程度であった。一方、腫瘍DNAの解析からPiggyBacトランスポゾンの転移自体は確認できた。以上の結果から、LBAP(VBAP)を用いたPiggyBacトランスポゾンによる転移関連遺伝子の探索は、時間的制約(浸潤・転移に必要な変異が蓄積する期間)の点から困難と考えられ、当初の予定通りLBAPにSmad4の変異を加えたLBSAPおよびVBSAPマウスを用いた解析を行うべく交配を進めており、最終段階まで来ている。「1.レンチウイルスshRNAライブラリーを用いた転移抑制因子の同定」については順調に進展しており、shRNAライブラリを用いたスクリーニングにより同定された転移抑制因子候補HNRNPLLについて、ヒト大腸がん細胞においても、その発現低下がCD44のエクソン6の発現増加を誘導して浸潤・転移能亢進を引き起こすことを示すことができた。また、大腸がん細胞の上皮間葉転換(EMT)に伴ってHNRNPLLの発現が低下することも見出し、臨床検体を用いた解析においても浸潤先端にE-cadherinとHNRNPLLの発現が低下したがん細胞が存在することを示すことができた。「2.トランスポゾンを用いた転移制御因子の同定」については当初の予定よりやや遅れている。これは、beta-catenin変異のみにより発症した腸管腫瘍にトランスポゾンを導入しただけでは転移の成立に至らなかったことによるもので、想定されていた範囲内である。さらにSmad4・Kras・p53などの変異を導入したマウスの作出は順調に進んでおり、それらのマウスを用いた解析により遅れを取り戻すことは可能であると考えている。以上を総合的に判断して、本研究計画はおおむね順調に進展していると判断した。

1.レンチウイルスshRNAライブラリーを用いた転移抑制因子の同定前年度までの研究成果のうち、1新規大腸がん転移抑制因子HNRNPLLの同定、2HNRNPLLのCD44v6のスプライシングへの関与、3HNRNPLLの発現低下と上皮間葉転換とのリンクについて、本年度末に「Gut」誌に論文発表した。本年度はその続きとして、HNRNPLLによってスプライシング制御を受ける遺伝子群の網羅的同定を試みた。次世代シーケンシングとRNA免疫沈降法を用いた検討により、HNRNPLLによってスプライスバリアントの発現量比が変化する遺伝子群、そして遺伝子のトータルの発現量自体が変化する群の存在を確認した。興味深いことに、それらの変化の少なくとも一部は上皮間葉転換によって生じる細胞の性質変化を説明し得るものであった。2.トランスポゾンを用いた転移制御因子の同定前年度までにLBAPマウスを作出し、腸管腫瘍の浸潤を認めていたが、転移は確認できなかった。今年度はさらに転移が発生しやすい環境を整備するため、大腸がんで高頻度に変異が認められる3つの遺伝子の変異マウス(KrasLSLG12D/p53lox/lox/Smad4lox/loxマウス:KPSマウス)とVillin-creERT2マウスとを導入し、VBAPKPSマウスを作出した。興味深いことに、VBAPKPSマウスでは肝臓に転移した個体が認められたが(14匹中7匹)、作成する過程において産まれて来たVBAPPSでは転移した個体が認められなかった(5匹中0匹)ことから、大腸がん転移においてKras変異が重要であること、およびトランスポゾンによって影響を受ける遺伝子の関与することが示唆された。「1.レンチウイルスshRNAライブラリーを用いた転移抑制因子の同定」については順調に進展しており、本年度の目標である「HNRNPLLによって制御を受けるCD44以外の遺伝子群の同定」は概ね達成できた。同定した遺伝子の発現変化あるいはスプライシング変化が大腸がん細胞の浸潤・転移能にどのような影響を与えるのかについては、次年度も引き続き検証を進める。「2.トランスポゾンを用いた転移制御因子の同定」についても、当初の予定よりはやや遅れているものの、かなり遅れを取り戻したと考えている。本研究項目を進める上で、トランスポゾンによって転移するマウスを作出することが最も重要であるが、ようやく約50%の頻度で転移するマウスを作出することができた。トランスポゾンによって影響を受ける遺伝子が大腸がんの転移に深く関わることが裏付けられたことから、次年度はそれらの遺伝子群の同定を進める。以上を総合的に判断して、本研究計画はおおむね順調に進展していると判断した。1.レンチウイルスshRNAライブラリーを用いた転移抑制因子の同定前年度論文発表した新規大腸がん転移抑制因子HNRNPLLについて、さらなる機能解析をおこなった。大腸がん細胞株SW480にHNRNPLLを強制発現すると細胞増殖が促進し、S/G2/M期の割合の増加を認めた。