hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
ABO血液型不適合移植腎障害におけるADAMTS13、vWFと免疫学的順応

1ABO血液型不適合腎移植症例の腎生検標本におけるADAMTS13、vWFをはじめとする凝固線溶系および補体関連分子の免疫組織学的検討は、症例数が限られる上に、近年の免疫抑制療法の進歩によって高度のAMRやTMAを発症する症例数が減っており、重症例と軽症例・無反応例の定量的な比較解析に困難が生じている。2In Vitro培養細胞系で血管内皮細胞特異的蛋白であるvWF, PECAM-1(アンカー蛋白)と血液型糖鎖抗原を共発現する系の作成に時間がかかった。ようやく平成28年度後半になってこの系を安定して作成することができるようになり、これらの分子を抽出し、糖鎖アレイを構築し、患者血清中ならびに正常対照中抗A抗B抗体の結合特異性の解析が緒についたところである。ABO血液型不適合腎移植の成績は、われわれが開発した術前脱感作療法によって飛躍的に向上した。多くの症例は抗体関連型拒絶反応(AMR)や血栓性微小血管障害(TMA)を起こさず免疫学的順応に至るが、その誘導・維持機構は不明である。新潟大学で1988年3月から2018年1月までに行ったABO不適合腎移植90例中、4例にAMRが、5例にTMAが発生し、うち3例と2例が移植腎機能を喪失した。TMA症例ではADAMTS13活性が著明に低下しており、移植腎の病理組織学的検討と合わせ、AMR・TMAは抗ドナー血液型抗体が血管内皮細胞の血液型抗原に結合し、補体活性化が起こり、アンカー蛋白であるPECAM1やvWFを介してvWF凝集、ADAMTS13の消費と血小板血栓、Fibrin血栓形成から微小血管障害を生じて惹起される可能性が示唆された。一方、免疫学的順応が成立した患者のBリンパ球培養系では、抗ドナー血液型抗体産生が特異的に抑制されていることを見出した。末梢血中の調節性B細胞と推測される細胞集団(IL-10産生B細胞、CD24+CD38+B細胞、CD5+B細胞)をABO不適合群・適合群、健常者の3群で比較すると、不適合群ではアナジー(免疫学的不応答性)に陥った末梢血CD5+B細胞が有意に多く、繰り返す抗原刺激により抗体産生が抑制されることが推測された。しかし実臨床では高抗体価でもAMR・TMAを惹起しない症例と低抗体価でも惹起する症例があり、抗血液型抗体の特異性が推測された。そこでHEK293細胞膜上に血液型糖鎖とCD31(PECAM-1)を共発現させた細胞を作成し、抽出糖鎖を固相化した糖鎖アレイを開発した。本アレイにより従来の標準赤血球による抗血液型抗体価測定では峻別が難しかった、腎傷害性の高い抗体を測定できる可能性が示唆された。ABO血液型不適合腎移植では多くの症例で免疫学的順応が成立するが、その成立維持機構は不明である。一方いまだに一部の症例では抗体関連拒絶反応や血栓性微小血管障害による腎障害がおこる。われわれはこの現象に着目しグラフト側因子としての腎血管内皮血液型糖鎖抗原とアンカー蛋白であるPECAM-1、vWF,ADAMTS13の役割について明らかにするとともに、レシピエント側因子として、免疫学的順応成立患者においてはドナー血液型抗原特異的な抗体産生の抑制が起こっていること、その本態はB細胞性アナジー(免疫学的不応答性)誘導の結果であることを新たに見出し、免疫学的順応誘導機構の解明に一歩近づいた。
溶液相分子の非共鳴5次光学応答の液体論による解析

5次光学応答の重要性の一つは、従来の吸収スペクトル・3次非共鳴応答などは違い2次元的なスペクトルが得られるということである。同様の認識は数十年前よりNMRの分野でされ始め、その重要性は創始者にノーベル賞が与えられていることからも明らかである。我々は、このいわば「2次元NMRの光学版」としての側面に早くから注目している。光を使うことの利点はNMRには期待できない早い時間分解能である。実際、昨年度はテラヘルツパルス源をもちた溶液2次元分光法を提唱した論文を発表し、また5次分光法を複雑分子の構造解析に利用できることをまとめた論文を提出していた。後者も今年度、正式に発表され世界の研究者の知るところとなった。また、今年度はあらたに溶液からのフォトンエコーを2次元的に測定し、解析することの重要性を明らかにする論文を発表した。さらに、国際学会において我々の近年の成果を発表することなどにより、今後の研究に重要な、他の研究グループ、特に実験グループからの刺激を受けることもできた。昨年度に続き3次光学応答のMD計算も行った。この研究は5次光学応答の分子レベルからの解析的理論を作るには避けて通ることのできない重要な問題である。このMD計算によって、我々の提唱していた世界ではじめての分子レベルからの解析理論の妥当性が示され、ようやく5次応答の分子レベルの解析的理論への道がつけられた。今後は、この研究を出発点として、分子レベルから液体論的要素を取り入れた理論の構築に挑戦していくつもりである。本研究においては、実験家との協力が極めて大切であり、多くの人に非共鳴5次分光法あるいは2次元ラマン分光法について知ってもらうことが重要である。この目的のために化学会誌上で我々の研究のこれまでの成果について紹介させてもらう機会を得た。同様の2次元の分光法が、最近実用化してきたテラヘルツのパルス源を使っても可能であり、有用な分子の情報を与えることが、我々の研究によりわかった。この結果は既に学術誌に発表された。この分光法では、ラマン過程を使わずに振動励起を直接に行えるため、2次元ラマン分光法とは相補的な情報を与える。この論文発表後、内外の実験家・理論家たちと交流する機会を得たが、とても新しく有望なこの取り組みに対し大きな関心が寄せられている。アメリカの実験家との交流が契機となり、2次元ラマン分光法を複雑な分子の構造解析に使えることに着目し研究を進め論文にまとめた。最近学術誌に投稿し、現在査読をしていただいている。この「構造ツール」としての2次元ラマン分光法の発展は、2次元NMRでの同様の発展に対しノーベル賞が与えられた事でもわかるように、今後きわめて重要な方向となっていくと思われる。これからの本研究において、もっとも重要な方向として取り組んでいきたい。また3次光学過程についてのMD計算を行い、液体論による我々の理論がどの程度うまく働いているかを検証している。この結果も近く論文にまとめる予定である。
細胞競合力学制御の解明のための力推定法の開発と応用

細胞競合は、細胞の適応度の差を認識してより高い質の細胞を選別する、多細胞生物の発生・維持に必須の過程である。ここ数年で、分泌性因子などを介した化学的相互作用に加えて、力学的相互作用が細胞競合に必須の役割を果たすことが示唆されつつある。しかしながら、細胞競合過程における力の時空間動態の定量化が技術的に難しいことから、既存研究の多くは、細胞競合と力の関連性を示すにとどまっている。本研究は、上皮細胞競合解析に最適化された力のベイズ推定法を開発し、細胞競合の力学制御の研究を推進することを目的とする。力のベイズ推定法は、力の釣り合い(尤度)と系に対する事前知識(事前分布)のかけ算を最大にするように、力を推定する(最大事後確率推定) (Ishihara and Sugimura. 2012)。今回、我々は、細胞競合のwinnerとloserが力学的に異なる特性を持ちうるという事前分布を導入することで、細胞競合解析に最適化された手法を定式化した。開発した手法の性能を数値計算データを用いて評価したところ、新手法は旧手法に比べて、推定の正確性が向上していることが確認できた。(理論的な改良の余地は残されているものの、)既存手法よりも優れた二種細胞系力推定法を定式化できたため。開発手法の生体内評価に取り組む。具体的には、レーザーレーサ破壊法などの侵襲的な手法による力の見積もりやミオシンなどの力を生成する分子の細胞内局在と力の推定値を比較する予定である。さらに、領域内の共同研究により、開発した力推定法を様々な上皮組織に適用し、上皮細胞競合過程における力の動態を定量的に解析する。
運動に伴う血圧変化メカニズムの解明

本研究は、運動中に生じる血圧上昇ならびに運動終了後に生じる血圧低下のメカニズムについて、動脈血圧反射調節の観点から明らかにすることを目的とした。動脈血圧反射応答は、大動脈動脈血圧反射と頸動脈圧受容器反射が同程度に寄与することが明らかとなった。運動終了後に生じる血圧低下については、動脈血圧反射の頸動脈洞ー心拍数反射ではなく、頸動脈洞ー血圧反射が関与することが明らかとなった。運動中の動脈血圧反射機能を調べるために、頸部陰圧陽圧負荷を用いて頸部に存在する血圧反射受容器を刺激する装置が必要であった。そこで、頸部を覆うカラーと、頸部カラーに対して陰圧を加えるポンプ、および陽圧を加えるポンプから構成する装置に対して、陰圧・陽圧をコントロールし、血圧反射受容器を様々な方法で刺激する制御機構を作成した。特に、頸部の血圧反射受容器を刺激するだけでなく、末梢で得られる血圧情報を頸部カラーにフィードバックすることで、頸部血圧受容器を刺激せず、大動脈弓血圧受容器のみを刺激する制御方法を検討した。具体的には、以下のような点を検討した。目的とする大きさの陰圧、陽圧を頸部に負荷し、任意の時間の間、目的圧力を維持する陰圧から陽圧、または陽圧から陰圧という負荷を連続的に、かつ素早く切り替えられる血圧変化情報を頸部カラーにフィードバックし、頸動脈圧受容器を刺激する推定圧力を一定に保つ上記1および2については、制御プログラムの設定によりコントロールすることができた。3については、急激かつ大幅な血圧変化が生じた時には、制御プログラムのみでは対応困難な場合があることが判明した。対応策としては、制御プログラムとハードウェア(ポンプ、モーター)の両方をコントロールする方法、あらかじめ急激な血圧変化を想定した頸部カラーへの圧力操作を加えた後、血圧情報のフィードバックをかけてコントロールする方法などがあげられた。昨年度作成した血圧調節機能を調べる装置ならびにプログラムを用いて、血圧調節に関する実験を行った。具体的には、頸動脈に存在する血圧反射受容器と、大動脈弓に存在する血圧反射受容器が血管・血圧調節に果たす役割の違いを検討した。特に、それぞれの血圧反射受容器が、大動脈から先の全身の血管調節と、脳血管調節に対してどのような影響があるかについて検討した。末梢で計測した動脈血圧の値をモニタリングし、変化した血圧に対応する圧力を頸部カラーにフィードバックして、頸動脈圧受容器を刺激する圧力を一定に保った。動脈血圧を低下させて、頸動脈圧受容器には刺激を加えず、大動脈弓圧受容器のみを刺激すると、動脈血圧反射応答としての心拍数の上昇がみられた。心拍数変化に対する血圧変化を算出して動脈血圧反射感受性を評価すると、大動脈圧受容器のみが機能する場合の動脈血圧反射感受性は、頸動脈圧受容器と大動脈圧受容器の両方が機能する場合と比較して、約5割程度に低下した。この結果は、頸動脈圧受容器と大動脈弓圧受容器は心拍数制御に対して同程度の寄与度を持つ可能性を示唆する。また、末梢で計測した動脈血圧の値をモニタリングし、変化した血圧に対応する圧力を頸部カラーにフィードバックして頸動脈圧受容器を刺激する圧力を一定に保ちながら脳血流(中大脳動脈血流速度)を計測した。頸部カラーに血圧変化分の圧フィードバックを加えない場合にみられた脳血管応答は、頸部カラーに圧フィードバックを加えると消失した。この結果は、頸動脈圧受容器が脳血管制御に対して重要な働きを持つことを示唆する。運動後に生じる血圧低下のメカニズムについて、動脈血圧反射特性の観点から検討した。若年者を対象に1時間の自転車運動を行い、その前後で動脈血圧反射特性を調べた。動脈血圧反射特性は、頸部陰圧陽圧負荷装置を用いて、+40mmHg-80mmHgの圧力を頸部に負荷した時の心拍、血圧応答を調べて評価した。心拍数は心電図を記録して算出し、血圧は指尖脈波を用いてbeat-by-beatで連続記録した。血圧と頸部に負荷した圧力から、頸動脈洞にある血圧受容器に加わる圧力を推定した(推定頸動脈洞圧)。+40mmHg-80mmHgの圧力変化を頸部に加えたところ、圧力変化に応じた心拍、血圧応答がみられた。これら連続圧力負荷に対する心拍、血圧応答から、推定頸動脈洞圧ー心拍応答曲線および推定頸動脈洞圧ー血圧応答曲線を求めた。1時間の自転車運動を行うと、運動前と比較して運動後に血圧が低下しない者と、運動後に血圧が低下する者がいた。運動後に血圧が低下する、低下しないにかかわらず、推定頸動脈洞圧ー心拍応答曲線のゲインは変わらず、曲線が高心拍方向にシフトした。推定頸動脈洞圧ー血圧応答曲線は、運動後に血圧が低下する場合には曲線はシフトせず、ゲインも変化しなかった。一方、運動後に血圧が低下する場合、動脈洞圧ー血圧応答曲線のゲインは変わらないが、曲線が低血圧方向へシフトした。以上の結果は、運動後の血圧低下メカニズムとして、動脈血圧反射の頸動脈洞ー心拍数反射ではなく、頸動脈洞ー血圧反射が関与することを示唆する。

血圧受容器を制御する装置を完成させ、血圧制御メカニズムを解明する1つの結果を得ることができた。循環生理学、リハビリテーション作成した頸部陰圧用圧圧刺激装置を用いて、より詳細な血圧制御メカニズムを検討する。頸部陰圧陽圧刺激制御については達成したが、運動時昇圧応答と血圧反射の関係検討に関する課題が残ったため。購入を想定していた機器が他の機器で代用できたことと、次年度実施する実験で必要な物品購入費にあてるため作成した頸部陰圧陽圧刺激装置および制御プログラムを用いて、運動時昇圧応答と動脈血圧反射との関係を検討する。次年度、血圧調節制御メカニズムを解明する実験実施する。その際に必要な機器を購入する。本年度、装置制御の検証に時間を割く必要が生じ、ヒトを対象とした実験を次年度に実施することにしたためヒトを対象とした実験を実施するために必要な機器の購入、および実験実施に伴って生じる装置制御プログラムの改修費用に充当する。
EGFR分解におけるエンドソームERKスキャフォールドの機能解析

後期エンドソームに存在するp18はがん原遺伝子産物Srcチロシンキナーゼの基質であり、またMAPKやmTORなどのキナーゼを後期エンドソームにリクルートするアンカータンパク質として働く。後期エンドソームにおけるこれらのキナーゼシグナルは、メンブレントラフィックや増殖など、細胞の機能と増殖の調節において重要な役割を果たすことが徐々に明らかとなってきた。そこで本研究では主にメンブレントラフィック、特にリソソーム分解系に焦点を絞ってp18の生物学的意義を追及した。リソソーム分解系での機能評価の指標として、オートファジーマーカーであるLC3の細胞内局在と分解について、細胞生物学的、および生化学的な解析を行ったところ、p18を遺伝子的に欠失した細胞ではオートファジー誘導後のLC3分解が低下し、後期エンドソームにLC3が蓄積する傾向が観察された。正常細胞にMAPK経路の阻害剤処理を行うと同様のLC3の分解抑制が観察されるのに対し、SrcやmTORの阻害剤ではそのような効果は観察されなかった。また後期エンドソームへ局在化する人工的なMEK1融合遺伝子を発現させて、後期エンドソームのMAPK経路のみを復活させたp18欠損細胞を作製したところ、この細胞ではLC3分解が正常化する結果も観察された。これらの結果から、後期エンドソームに存在するMAPKシグナルがメンブレントラフィックに関わる確証を得た。後期エンドソームMAPKの具体的な基質タンパク質については、同定途上となった。細胞の増殖やガン化に関与する細胞内チロシンリン酸化シグナルの一因子として同定されたp18は、その遺伝子欠損が上皮細胞の機能不全や増殖抑制を引き起こし、結果として生体に致死的影響を及ぼすことが明らかとなっている。また、p18ノックアウト(KO)細胞ではエンドソーム経路を介した膜蛋白の分解やリサイクリングに異常が見られた。その異常の詳細を把握するために、エンドソーム経路により分解される代表的な膜蛋白であるEGFRに焦点を絞って、その細胞内挙動を解析した。p18KO細胞ではEGF刺激により誘導されるEGFR分解の速度が低下していることが確認された。この時の細胞内EGFRの分布を、初期・後期エンドソーム、リソソーム、リサイクリングベシクルなどのマーカーを用いて蛍光顕微鏡により観察し、得られた蛍光画像データをAutodeblurとMetamorphソフトウェアを用いて半定量的な解析を行った。その結果、p18KO細胞ではリソソームに局在するEGFRの量が増加し、リサイクリングベシクルに局在するEGFRの量は減少していることが判明した。これはそれぞれ、後期エンドソームとリソソームの膜融合過程の効率低下と、エンドソームからリサイクリングベシクルへの膜蛋白輸送経路の効率低下によるものと考えられた。p18とその下流シグナル(ERKカスケード)が後期エンドソームとリソソームあるいはリサイクリングベシクルとの膜融合を含む相互作用を調節している可能性が本研究により初めて示唆された。
Cyathane骨格を持つ天然有機化合物の合成と生物有機化学的研究

(目的)Cyathane骨格を持つ天然有機化合物長野県に生息するきのこのケロウジ(Sarcodon scabrosus)やかびの一種であるCyathusearliなどに含まれ、抗菌、炎症抑制、神経細胞生長促進活性などの生理活性を示す。特にSarcodon scabrosusからはマウス耳の炎症抑制活性がID_<50>=44nmと非常に低濃度で活性を示す化合物も単離されている。この担子菌は松の木の下にのみ生息するため、培養が困難であり自然からの供給が限られている。従って、効率的な合成経路の確立と絶対構造の決定、新規な生物活性の探索が急がれる。本研究ではSarcodonin類の全合成を行うことを目的とした。(方法と結果)Ethyl 2-oxocyclopentanecarboxylateを出発物質としてホモアリルヨージドと種々の塩基を用いてアルキル化を行った。条件検討の結果、KHを塩基として用いると55%程度の収率で目的化合物を得られた。続いてエステルの還元を行いアルコールとし、ケトンのα位にイソプロピル基を導入した。次に1級水酸基を保護しケトンをビニルトリフラートに変換後、Pd触媒を用いたカルボニレーション反応を行った。この反応は昨年困難を極めたが触媒などの検討を行った結果60%程度の収率で目的物である2環性のエステルを得た。エステルの還元後脱離基を導入してオレフィンとして酸化的に開裂しさらに酸化してカルボン酸を得た。その後エステル化を行い,α位にヨードエチルを導入した後にSmI_2を用いて環拡大反応を行い7員環を得た。今後は既知の合成手法でSarcodonin類の合成が完成できると考えられる。また種々カルボニレーション反応を検討しα,β-不飽和γ-ラクトンの合成も行った。ただし光学活性体の場合は乳酸エチルからの合成法が容易であることがわかりバンレイシ科アセトゲニンの合成に応用した。(目的)Cyathane骨格を持つ天然有機化合物長野県に生息するきのこのケロウジ(Sarcodon scabrosus)やかびの一種であるCyathusearliなどに含まれ、抗菌、炎症抑制、神経細胞生長促進活性などの興味深い生理活性を示す。特にSarcodon scabrosusからは40種類近い化合物が見出されており、信州大学の柴田・廣田らはSarcodoninと命名した。この化合物群の中にはマウス耳の炎症抑制活性がID_<50>=44nmと非常に低濃度で活性を示す化合物も含まれている。また、マウスの経口投与により毒性が低いこともわかっている。本研究ではSarcodoninの全合成をPd触媒によるカルボニレーション反応を用いて行うことを目的とした。ホモアリレーションの実用的な方法はいまだに報告例が少なくさらなる条件を行っている。次に1級水酸基を保護したあとにケトンをビニルトリフラートに変換後、トリスクロヘキシルホスフィンをリガンドとしてPd触媒を用いたカルボニレーション反応を行った。現在、詳細な生成物の構造決定を行っている。今後は7員環の構築を行いSarcodoninの全合成を行う予定である。また、この研究の過程でPd触媒によるカルボニレーション反応を種々検討した。その結果α、β-不飽和γ-ラクトンを効率的に合成する方法を見出し、台湾産の植物Litseaakoensisから単離された抗腫瘍物質Akolactone Aの両鏡像体の合成を行い、絶対構造を決定し報告した。また、バンレイシ科アセトゲニンのα、β-不飽和γ-ラクトン部分の合成にも応用を展開している。

次に1級水酸基を保護したあとにケトンをビニルトリフラートに変換後、Pd触媒を用いたカルボニレーション反応を行った。種々検討を行ったが収率が悪いため合成経路を根本的に見直した。まず1,4-ブタンジオールから数工程で末端オレフィンと末端に置換オレフィンを有する化合物を合成しring closing metathesisを用いて閉環反応を試みた。その結果Grubbsの第二世代触媒が有効であった。その後先に合成したビニルトリフラートとHeck反応を行いDiels-Alder反応などを用いてSarcodonin Sを合成する予定である。またSarcodonin Aの19位に様々なアシル基を導入して炎症抑制活性を調べた結果アシル基の導入により活性が低下することがわかった。(目的)Cyathane骨格を持つ天然有機化合物長野県に生息するきのこのケロウジ(Sarcodon scabrosus)やかびの一種であるCyathusearliなどに含まれ、抗菌、炎症抑制、神経細胞生長促進活性などの生理活性を示す。特にSarcodon scabrosusからはマウス耳の炎症抑制活性がID_<50>=44nmと非常に低濃度で活性を示す化合物も単離されている。この担子菌は松の木の下にのみ生息するため、培養が困難であり自然からの供給が限られている。従って、効率的な合成経路の確立と絶対構造の決定、新規な生物活性の探索が急がれる。本研究ではSarcodonin類の全合成を行うことを目的とした。(方法と結果)Ethyl 2-oxocyclopentanecarboxylateを出発物質としてホモアリルヨージドと種々の塩基を用いてアルキル化を行った。条件検討の結果、KHを塩基として用いると55%程度の収率で目的化合物を得られた。続いてエステルの還元を行いアルコールとし、ケトンのα位にイソプロピル基を導入した。次に1級水酸基を保護しケトンをビニルトリフラートに変換後、Pd触媒を用いたカルボニレーション反応を行った。この反応は昨年困難を極めたが触媒などの検討を行った結果60%程度の収率で目的物である2環性のエステルを得た。エステルの還元後脱離基を導入してオレフィンとして酸化的に開裂しさらに酸化してカルボン酸を得た。その後エステル化を行い,α位にヨードエチルを導入した後にSmI_2を用いて環拡大反応を行い7員環を得た。今後は既知の合成手法でSarcodonin類の合成が完成できると考えられる。また種々カルボニレーション反応を検討しα,β-不飽和γ-ラクトンの合成も行った。ただし光学活性体の場合は乳酸エチルからの合成法が容易であることがわかりバンレイシ科アセトゲニンの合成に応用した。
d電子軌道の磁場制御に基づく磁気形状記憶効果の創出

スピネル型化合物Fe_<1-x>Mn_xCr_2O_4において、組成xと温度の関数として結晶構造と磁気構造がどのように変化するのかを明らかにした。この知見に基づいて、3d電子軌道の占有に関する秩序がスピンの容易軸の方向を支配しているという仮説を得た。この考えに基づいて、より大きな磁気機械結合が期待できるMnV_2O_4において研究を行い、応力の代わりに磁場のみを外場として用いることによる形状記憶効果(磁気形状記憶効果)の実現に成功した。FeCr_2O_4はFe^<2+>の軌道自由度に基づいた立方晶から正方晶への構造相転移を示すことが知られていたが、さらに温度を下げると斜方晶へと構造が変化することを低温X線回折実験により明らかにした。この結果を磁化測定と比較することにより、スピン系のフェリ磁性秩序が軌道の形状を変化させていることが示唆された。さらに定量的な考察によって、スピンの向きが固定された状態では3z^2-r^2軌道よりもx^2-y^2軌道のほうがスピン軌道相互作用によるエネルギー利得が大きいことを明らかにした。この結果、フェリ磁性相で軌道形状が変化すると考えられる。結晶構造や結晶歪みが外部磁場の印加によって受けることが期待できる。詳細な物性測定のために結晶試料の育成を試み、塩化クロムを輸送剤とする化学的気相輸送法での結晶育成に成功した。育成した単結晶試料を用いて、磁揚を立方晶の<100>方位に印加して低温強磁場下の単結晶X線回折実験を行った。その結果、フェリ磁性相では35テスラの磁場によってc軸が磁場方向と垂直に向く強弾性的な応答が発現した。この強弾性分域の変化は磁場を切っても元に戻らないため、磁場掃引による形状記憶効果の発現が期待できる。そこで、ひずみゲージを用いて結晶歪みの外部磁場依存性を測定し、確かに磁気形状記憶効果が生じていることを確認した。さらに、磁化曲線においても、同じ磁場で履歴現象が観測されたことから、この物質のFeイオンの軌道とスピンが強く結合していることがわかった。スピネル型構造のFeV_2O_4は、四面体配位のAサイトにFe^<2+>が、八面体配位のBサイトにV^<3+>がそれぞれ位置する。これらはともに軌道自由度を有する磁性イオンである。この物質のスピンと軌道がどのように秩序化を起こすかを低温X線回折実験により調べた。その結果、約30Kで立方晶からc軸の縮んだ正方晶への構造相転移、約110Kでフェリ磁性転移および正方晶から斜方晶への構造相転移、約80Kで斜方晶からc軸の伸びた正方晶への構造相転移、約60Kで磁化と格子定数の異常、約30Kで正方晶から斜方晶への構造相転移、というように大変複雑な逐次相転移を起こすことが分かった。昨年までに行ったFeCr_2O_4やMnV_2O_4との比較から、130Kの構造相転移はFe^<2+>の強的軌道整列に伴う協同ヤーンテラー歪みと解釈できる。格子ひずみエネルギーの非線形性によって、c軸方向に縮む。一方、V^<3+>の軌道整列がMnV_2O_4と同型ならば、やはりc軸方向に縮む格子ひずみと結合するはずであるが、今回得た結果はそれを否定するものであり、軌道整列パターンが異なる可能性がある。また、構造の逐次相転移と磁化の異常が現れる温度が一致している様子から、磁気構造の逐次相転移が絡んでいる可能性があることもわかった。このように、マクロな格子ひずみと磁気秩序が結合している系では、特有の磁歪と磁気形状記憶効果が期待できる。また、MnV_2O_4とFeV_2O_4でVの軌道整列のパターンがあることから、その混晶系ではミクロな相分離に起因するような巨大な軌道構造物性が期待できる。これまで、スピネル型酸化物Fe_<1-x>MnxCr_2O_4において、組成xと温度の関数として結晶構造と磁気構造がどのように変化するのかを明らかにしてきた。また、理論的考察を行い、四面体サイトを占めるFe_2+イオンの3d電子軌道に関する秩序配列がスピンの容易軸の方向を支配しているという仮説を得てきた。この機構が八面体サイトを占めるイオンに対しても有効であれば、大きな磁気機械結合が期待できる。そこで、八面体サイトに軌道の自由度を有するV_3+イオンを入れたMnV_2O_4について、磁歪および磁場中でのX線回折の測定を行った。その結果、応力の代わりに磁場のみを外場として用いることによる形状記憶効果(磁気形状記憶効果)の実現に成功した。

また、昨年度見出したFeV_2O_4の逐次相転移について、その微視的な機構を明らかにするために低温での精密な単結晶構造解析を行った。この物質では、四面体配位のAサイトにFe_2+が、八面体配位のBサイトにV_3+がそれぞれ位置する。これらはともに軌道自由度を有する磁性イオンである。その結果、130Kでの構造相転移はFe_2+イオンの共同ヤーンテラー歪みであることが明らかになった。110Kでの転移はフェリ磁性転移であり、上述したスピン軌道結合機構による斜方晶への構造相転移を伴っている。60Kでの相転移はV_3+イオンの軌道秩序化に伴う正方晶への構造変化であるが、MnV_2O_4とは異なり、軌道がすべてのVサイトで強的に配列していることも分かった。
細胞の形態と運動性を制御する細胞センシング機構

アクチン細胞骨格の再構築は細胞の形態変化、移動、分裂などにおいて重要な役割を果たしている。本研究では、LIMキナーゼ(LIMK)とSlingshot(SSH)によるコフィリンのリン酸化、脱リン酸化経路を中心に、細胞骨格を制御するシグナル伝達機構の解明と、細胞運動、形態変化を時間的、空間的に統御するシステムの解明を目的に研究を行い、以下の結果を得た。1)ケモカインによるT細胞の遊走におけるコフィリンのリン酸化の時間的、空間的制御の重要性を解明した。細胞遊走因子SDF1によるJurkat細胞の刺激において、コフィリンの一過的なリン酸化の誘導、SSH1とコフィリンの先導端への集積を明らかにした。また、LIMK1、コフィリンの発現抑制は細胞運動、遊走を抑制したが、SSH1の発現抑制は遊走のみを抑制した。LIMK1、SSH1、コフィリンのsiRNA細胞のタイムラプス観察の結果、LIMK1はラメリポディア形成能により,コフィリンはアクチン再編成能により、細胞運動に必須であり、SSH1は膜突起を一方向に制限することにより、細胞の極性形成と方向性のある運動(遊走)に必須であることを解明した。2)LIMK1を活性化する新たなシグナル経路を解明した。血管新生因子であるVEGFによる血管内皮細胞のアクチン骨格再編成、運動能促進において、LIMK1の活性化が必要であることを示した。また、p38MAPキナーゼの下流で活性化されるMAPKAPK-2によりLIMK1がリン酸化,活性化されることを見出した。リン酸化部位を変異したLIMK1はVEGFによる血管内皮細胞の運動と管腔形成を阻害することを見出し,本シグナル経路の重要性を解明した。3)SSH1はFアクチンとの結合によって活性化されることを報告したが、今年度はSSH1分子内の3カ所のFアクチン結合部位を同定し、活性化に必要な領域を同定した。アクチン細胞骨格系は、細胞内外のシグナルに応答してダイナミックに再構築され、細胞の形態変化、移動、接着、分裂など細胞の動的基本活動を支える重要な役割を果たしている。本研究では、LIMキナーゼ(LIMK)-コフィリン経路を中心に、細胞骨格を制御するシグナル伝達機構の解明と、細胞骨格を時間的、空間的に統御するシステムの解明を目的として、以下の結果を得た。1)コフィリンをリン酸化するキナーゼとして、LIMK以外にTESK1,TESK2を同定した。TESK結合蛋白質として14-3-3を同定した。2)ケモカインSDF-1によるT細胞の遊走過程において、LIMKによるコフィリンのリン酸化が重要な役割を果たしていることを解明した。また、LIMKの活性化には、Gタンパク質ベータガンマ複合体、Rac経路が関与していることを明らかにした。3)ショウジョウバエの変異体の解析から、コフィリン脱リン酸化酵素Slingshotを同定した。Slingshot変異体では、上皮細胞の形態異常、アクチンの集積、コフイリンの過剰リン酸化が認められる。Slingshotのヒトホモログは、LIMKによるコフィリンのリン酸化とアクチンの重合を阻害し、また、試験管内ではコフィリンの脱リン酸化を促進した。4)細胞分裂期において、LIMKの活性化とリン酸化が促進され、同時にコフィリンのリン酸化が促進されることを見出した。5)活性型(Thr-508リン酸化型)LIMキナーゼに対する特異抗体を用いた時空的解析を行い、極性をもった細胞の運動や形態変化における活性型LIMKの細胞内動態を解明した。また、GFP技術を用いたリアルタイム解析系を構築し、細胞運動、神経成長円錐の運動性の解析を開始した。本研究では、LIMキナーゼ(LIMK)とSlingshotによるコフィリンのリン酸化、脱リン酸化経路を中心に、細胞骨格を制御するシグナル伝達機構の解明と、細胞運動、形態変化を時間的、空間的に統御するシステムの解明の研究を行い、以下の結果を得た。1)培養脊髄後根神経節ニューロンに、LIMK, Slingshot,コフィリンを強制発現させ、神経成長円錐の運動性と形態変化をタイムラプス観察した。その結果、LIMKは成長円錐の運動性と伸展速度を著しく減少させ、Slingshotとコフィリンは運動性と伸展速度を増加させた。また、LIMK1による運動性と伸展速度の減少は、Slingshotやコフイリンの共発現によって回復した。これらの結果から、Slingshotはコフィリンホスファターゼとして成長円錐の運動性の維持に関与していることが示唆された。2)コフィリンをリン酸化するキナーゼとしてTESK1を同定したが、TESK1結合蛋白質としてSprouty-4を同定した。TESK1とSprouty-4は細胞内で共局在し、TESK1の活性を負に制御していることを明らかにした。3)LIMK1とコフィリンの細胞周期依存的な活性変化を解析し、分裂期特異的にLIMK1の活性化とコフィリンリン酸化レベルの上昇を明らかにした。また、LIMK1の過剰発現によって多核細胞が高頻度で出現することを見出し、細胞質分裂におけるコフィリンの重要性を明らかにした。4)マウスのSlingshot cDNAの3種を単離し、コフィリンホスファターゼ活性、アクチン結合活性、LIMK機能の阻害活性、細胞内局在、組織分布の相違を明らかにした。

アクチン細胞骨格系は、細胞内外のシグナルに応答してダイナミックに再構築され、細胞の形態変化・移動、接着、分裂など細胞の動的基本活動を支える重要な役割を果たしている。本研究では、LIMキナーゼ(LIMK)とSlingshotによるコフィリンのリン酸化、脱リン酸化経路を中心に、細胞骨格を制御するシグナル伝達機構の解明と、細胞運動、形態変化を時間的、空間的に統御するシステムの解明の研究を行い、以下の結果を得た。1)コフィリンのリン酸化レベルは分裂期前中期で高く、後期終期で低く、細胞周期依存的に変化することを明らかにした。LIMKの活性はこれとほぼ並行に変化し、分裂期前中期で高く、後期終期で低く、Slingshotの活性は逆に分裂期前中期で低く、後期終期で高いことを見出した。HeLa細胞にホスファターゼ不活性型Slingshotを発現すると、終期の収縮環近傍に異常なアクチンの集積が観察され、細胞は多核化した。これらの結果から、Slingshotの終期での活性化はコフィリン活性化、収縮環の崩壊、細胞質分裂に重要であることが示唆された。2)マウスおよびヒトの3種のSlingshot cDNAを単離し、コフィリンホスファターゼ活性、アクチン結合活性、LIMK機能の阻害活性、細胞内局在、組織分布の相違を明らかにした。また、Slingshot-1と-2において、N末端部はコフィリン脱リン酸化に重要なドメインであり、C末端部はアクチン結合に重要なドメインであることを明らかにした。3)Slingshot-1の活性を制御するシグナル経路を解析し、インスリンの下流でSlingshot-1の活性化と細胞膜への局在化を介してコフィリンが脱リン酸化されることを明らかにした。また、コフィリンの脱リン酸化はPI3-kinaseの阻害剤やPTENで抑制されることから、PI3-kinaseがSlingshotの活性化に関与することが明らかとなった。アクチン細胞骨格は、細胞内外のシグナルに応答してダイナミックに再構築され、細胞の形態変化、移動、接着、分裂など細胞の動的活動を支える重要な役割を果たしている。本研究では、LIMキナーゼ(LIMK)とSlingshot(SSH)によるコフィリンのリン酸化、脱リン酸化経路を中心に、細胞骨格を制御するシグナル伝達機構の解明と、細胞運動、形態変化を時間的、空間的に統御するシステムの解明の研究を行い、以下の結果を得た。1)SSH1の活性を制御する新たなシグナル伝達経路を解明した。EGFファミリー増殖因子であるニューレグリンは、MCF-7細胞のラメリポディア形成と運動性を促進する。このとき、コフィリンのリン酸化レベルが減少し、SSH1と非リン酸化型コフィリンはラメリポディアに集積することを明らかにした。また、SSH1はF-アクチンにより約10倍活性化されることを見出した。さらに、SSH1がSer-937とSer-978のリン酸化依存的に14-3-3蛋白質と結合することを明らかにした。Ser-978のリン酸化はニューレグリン刺激によって減少することから、ニューレグリン刺激はSSH1と14-3-3の解離を引き起こし、これによってラメリポディアへのSSH1の集積と活性化が誘導されると考えられる。
ミクロデータによる家計の住宅需要行動の理論的・実証的分析

日本の住宅市場には不完全性が存在するが、それを改善すべき現行の住宅租税政策や住宅金融政策はかえって政策上の歪みを生じている可能性がある。そこで、本研究の目的は、ミクロデータを用いて、現行の住宅租税政策や住宅金融政策による政策上の歪みがどの程度どのような家計に生じているかを理論モデルに基づいて実証的に分析、その研究成果をベースとして、今後の住宅政策の方向性を探ることにある。本研究では、高齢化社会における住宅政策のあり方を探るという観点に立って、持ち家にするか借家にするかという現在の居住形態の選択と、将来の相続の可能性の有無が同時に決定されているか否かを分析した。本研究は、我が国の家計の持ち家にするか借家にするかという現在の居住形態の選択と、将来の相続計画の有無が同時に決定されているか否か、また、同時に決定されている場合には両者間にどのような関係があるかを分析した初めての試みである。多項ロジットモデルに基づいた推定結果より、将来相続できる住宅・土地がある世帯のほうが、現在借家を選択する傾向が強いということが判明した。本分析は、家計の現在の居住形態の選択と将来の相続の可能性の有無が同時に決定されているか否かという仮説を検定する結合ロジット確率モデルを提示した初めての研究である。実証分析によって、現在の持ち家所有と将来の相続の可能性との間に負の相関があり、かつこれらが結合的に決定されているということが示されている(つまり、推定結果より、将来相続できる住宅・土地がある世帯のほうが、現在借家を選択する傾向が強いということが判明している)。また、世帯主の年齢が高くなるほど、持ち家を選択する確率も、将来の相続計画ありとする確率も上昇するということも示されている。
軟化海藻類の分子調理学的変化の解析とメタボリック症候群の発生制御機構

本研究は昆布とひじきを異なる煮沸条件で処理した際の軟化への影響に関する実験および、特徴的な昆布、昆布加工品(とろろ昆布)、ひじきによるメタボリック症候群への影響に関する実験を行った。その結果、同程度の煮沸時間でも佃煮処理と出汁処理では、昆布軟化度が異なることが示された。とろろ昆布は本実験で用いたその他の海藻類に比べて腹腔内脂肪の蓄積を抑制した。本結果から機能性発現には食品の形状も重要であることが示唆された。本実験は乾燥昆布およびひじきを試料として用いた。乾燥昆布は出汁および佃煮作成法で調理加工した際の軟化および組織形態の変化を中心に解析を行った。その結果,昆布の残存率は佃煮風昆布では90%であったのに対し,だし昆布では20分加熱,1時間加熱,2時間加熱では佃煮風昆布の約半分であった。破断強度は出汁昆布の1時間や2時間加熱は,20分加熱に比べて有意に軟化した。水中沈定体積の結果は,佃煮風昆布が乾燥昆布と同程度であったのに対し,出汁昆布の2時間加熱は約4倍に増加した。佃煮風昆布と出汁昆布の20分加熱の煮沸時間は同定度であるが,調理法の違いにより残存率や破断強度,水中沈定体積の値が異なったことから,佃煮風昆布は煮沸により溶液中に流出した成分が煮詰めることによって再度昆布表面に付着し,出汁昆布の20分加熱とは異なる組織・組成になったことが推察された。乾燥ひじきはシュウ酸NaやEDTA2Na溶液で煮沸し,軟化機構について検証を行った。その結果,先行研究で行った乾燥昆布と同様にひじきでもシュウ酸Na溶液で煮沸すると一定濃度までは軟化するが,それ以降は溶液の濃度が濃くなると硬くなる傾向が確認できた。また,溶液中のCa量はシュウ酸Na溶液の濃度が濃くなるにつれて減少する傾向であった。一方,EDTA 2Na溶液で煮沸したひじきは,濃度依存的に軟化が亢進し,軟化したひじきの溶液中ほどアルギン酸やCa量が増加した。ヒトが乾燥海藻類を摂取するには調理加工する必要があることから,本実験で得られた結果は次年度以降に予定している調理加工海藻類のメタボリック症候群の発生制御機構を解明するためにも意義がある内容であり,人間栄養学の観点から調理加工海藻類の機能性を調理学から栄養学まで一貫して明らかにするためにも重要なデータとなる。乾燥昆布では食生活で行われている出汁および佃煮の作成法で乾燥昆布を調理加工し,その際の軟化度と食物繊維や組織形態の変化を確認することができた。また,乾燥ひじきではシュウ酸NaやEDTA2Naによる軟化機構を明らかにすることができた。当初HPLCを用いて乾燥海藻類を煮沸した際の溶液中に溶出した食物繊維の分子量を測定し,軟化による食物繊維の分子量の変化を明らかにする予定であった。そこで,予備実験としてアルギン酸をシュウ酸Na溶液で煮沸し,食物繊維の分子量の変化についてHPLCによる分析で試みたが,明確な結果を得ることができなかった。したがって,この点については次年度以降に測定条件を検討して,再度検証する予定である。今年度は、出汁や調理に利用される日高昆布や強い粘りを有するフコイダンを多く含むガゴメ昆布を水煮したもの、昆布を酢で軟らかくした後に薄切したとろろ昆布、水煮ひじきを食物繊維が5%になるように高脂肪食に添加した飼料を食餌誘発性肥満モデルマウスに摂取させ、含有する多糖類や摂取形態が異なる昆布および昆布と同じ褐藻類であるひじきによるメタボリックシンドローム関連指標への影響を検証することを目的とした。その結果、5%セルロースを添加したコントロール群に比べて、すべての試験群の体重増加が有意に抑制されていることが確認できた。内臓脂肪蓄積量はコントロール群に比べて、日高昆布群、とろろこんぶ群、ひじき群のみ有意に蓄積が抑制された。血清生化学検査ではとろろ昆布群のみコントロール群に比べて有意にコレステロール値が低下し、耐糖能試試験においても、とろろ昆布群のみ有意に血糖が低下した。飼料摂取量から海藻類に含まれる食物繊維の一種であるアルギン酸摂取量を求めた結果、日高昆布摂取群は他の試験群に比べて有意にアルギン酸摂取量が多いことが確認できた。以上の結果から、1)海藻類を食物繊維源として5%摂取すると体重増加が抑制されることが示唆され、2)とろろ昆布のように形態が変化した昆布は水煮しただけの昆布に比べてメタボリックシンドローム関連指標改善作用が強い可能性が考えられ、3)昆布によるメタボリック関連指標改善作用には昆布中のアルギン酸の量ではなく、消化管におけるアルギン酸の流出のしやすさが関与している可能性が推察された。今年度実施した含有する多糖類や摂取形態が異なる昆布および昆布と同じ褐藻類であるひじきによるメタボリックシンドローム関連指標への影響に関する実験において、メタボリックシンドローム関連指標の改善作用を有することが確認できた試料については、現在その作用機作を検証している。また、平成29年度に実施する予定である、昆布に含まれるカロテノイド系色素であるフコキサンチンを除去した試料を用いた実験の飼料作成も開始していることから、実験はおおむね順調に遂行している。最終年度は昨年度の分析の続き、および結果の統計解析を行い、摂取した海藻類の脂質代謝への機能性について検証を行った。実験結果から、糞中の脂質排泄量はコントロール群に比べてとろろ昆布摂取群のみ有意に増加した。

肝臓のトリグリセリド量はコントロール群に比べてとろろ昆布摂取群のみ有意に低下したことから、とろろ昆布摂取群の肝臓トリグリセリド量の低下は糞への脂質排泄が関与していることが推察された。また、血清レプチン濃度もとろろ昆布摂取群のみ有意に低下した。以上より、とろろ昆布摂取群は他の海藻摂取群に比べて、脂質代謝への機能性を有していることが示唆された。研究期間を通して、以下の内容について確認することができた。1)昆布の調理法である出汁抽出法および佃煮作成法で加熱調理すると昆布の組織・形態は変化し、煮沸条件によって残存率、水中沈定体積、軟化度は異なった。2)ひじきをシュウ酸NaやEDTA2Na溶液で煮沸すると昆布と同様に軟化が亢進した。3)日高昆布、成分や形状に特徴を有する昆布(がごめ・とろろ)、ひじきを添加した高脂肪食をマウスに摂取させると、とろろ昆布を摂取した群は他の海藻類を摂取した群に比べて、腹腔内脂肪組織重量が有意に低下し、血清コレステロール濃度や肝臓トリグリセリド量もコントロール群に比べて有意に低下することが確認できた。その要因として、とろろ昆布の形状により食物繊維が消化管内で溶出しやすい状態であることが示唆された。3)の結果から、乾燥海藻類の機能性を効果的に発現させるには、食品の形状も考慮する重要性が示された。調理条件の違いによる海藻類の組織・組成変化を確認し、それらの結果を踏まえて、ヒトが摂取する形態を考慮した際の昆布やひじきの機能性を検証した本実験は、人間栄養学の点から意義がある内容と言える。本研究は昆布とひじきを異なる煮沸条件で処理した際の軟化への影響に関する実験および、特徴的な昆布、昆布加工品(とろろ昆布)、ひじきによるメタボリック症候群への影響に関する実験を行った。その結果、同程度の煮沸時間でも佃煮処理と出汁処理では、昆布軟化度が異なることが示された。とろろ昆布は本実験で用いたその他の海藻類に比べて腹腔内脂肪の蓄積を抑制した。本結果から機能性発現には食品の形状も重要であることが示唆された。今後は異なる加工調理法で調理した乾燥昆布,わかめ,ひじきを食餌性肥満モデルマウスに摂取させ,調理加工した乾燥海藻類によるメタボリック症候群への抑制効果の有無とその制御機構について明らかにする予定である。動物実験で得られたデータを今年度得られた乾燥海藻類の調理加工による変化の結果と照合して解析することにより,調理加工海藻類のメタボリック症候群の発生制御機構に対するキーポイントとなる点を探索し,同定したいと考えている。さらに,海藻類に含まれる機能性成分であるフコキサンチン,マンニトール,グルタミン酸Naを食餌性肥満モデルマウスに摂取させ,メタボリック症候群に対する機能性発現の違いについても検証する予定である。これらの動物実験と並行して,平成27年度に明らかにすることができなかったシュウ酸Naで煮沸した際の溶液中および昆布中の食物繊維の分子量の変化についても,引き続き実験を行う予定である。昆布にはアルギン酸以外にも、機能性成分としてフコキサンチンが含まれる。フコキサンチンはカロテノイド系色素の一種であり、内臓脂肪蓄積抑制、血糖上昇抑制作用や脂質代謝改善作用を有することが報告されている。また、先行研究で出汁浸出物はメタボリックシンドローム関連指標の改善作用が強いことが示唆され、出汁浸出物中にはグルタミン酸が多く含まれていたことから、グルタミン酸も昆布摂取による機能性発現に寄与している可能性が考えられる。
未熟な造血細胞に発現する新規の5回膜貫通型分子M83の機能の解析

本研究は未熟なヒト血液細胞であるF36P細胞から新規に同定した細胞膜上発現分子であるM83分子の機能を解析するものである。M83分子は既知の分子と全く類似性がない新しい分子であるため、遺伝子ターゲティングマウスを作成して、その機能を調べるのが効果的であると考えた。昨年度においては、M83遺伝子のゲノム構造を明らかにし、細胞膜貫通領域と細胞内領域をコードしている1013番目のエクソンを欠損できるようなターゲティングベクターを作製した。本年度においてはこのターゲティングベクターを相同組み換えによりES細胞E14-1に組み入れ、M83遺伝子欠損ES細胞を5クローン作製することができた。また、このES細胞をマウス初期胚に導入して、キメラマウスの作製にも成功した。現在、導入したES細胞がキメラマウス内で生殖系列に分化できるかどうかを確認中であり、確認でき次第、ヘテロとホモのM83遺伝子欠損マウスを作成する予定である。M83の臓器での発現はRT-PCRによって腎臓、肺、肝臓、脾臓、リンパ節、胸腺、骨髄で強く認められる。このことからM83の抗体を作製して免疫組織染色をおこなって実際の臓器での発現を詳細に調べようと考えた。M83の細胞内領域C末端の12アミノ酸からなるペプチドを合成し、これを用いてウサギを免役して、M83細胞内領域に対するポリクローナル抗体の作成に成功した。このポリクローナル抗体を用いて各種の組織切片の免疫染色を現在実行中である。同時にM83に対するモノクローナル抗体の作成にも着手しているが、本年度においてはラットの免疫に用いるM83細胞外領域とのFcキメラタンパク質の精製を試みた。M83分子は既知の分子と類似性が全くない新しい膜貫通型分子であるため、その機能解析を十分に行うためにはターゲティングマウスを作成して、マウスの臓器の変異や造血系、免疫系の異常を調べるのが効果的であると考えた。そこでまずマウスM83のゲノムをマウス129SvJゲノムライブラリーから単離し解析を行った。解析の結果、M83のゲノムは13個のエクソンより構成され、機能的領域と考えられる細胞膜貫通領域および細胞内領域は各々1013番目のエクソン、13番目エクソンにコードされていることを解明した。このゲノム情報をもとにM83の1013番目のエクソンがネオマイシン耐性遺伝子で置き換わることにより細胞膜貫通領域及び細胞内領域を欠損できるようなターゲティングベクターの構築を完了させた。M83の発現はRT-PCRによって骨髄中の非常に幼若な血液細胞である分化抗原(Lin)陰性Sca-1陽性c-kit陽性細胞から認められる。このことからM83のモノクローナル抗体を作成して、どの分化段階でM83の発現が開始されるかを詳細に調べ、なおかつ骨髄中のM83陽性細胞を単離してin vitroの培養で増殖能、分化能を詳細に調べ、血球細胞での機能を解明しようと考えた。本年度においてはラットの免疫に用いるM83細胞外領域とのFcキメラコンストラクトを構築し、蛋白の精製を試みた。
イオン液体を利用した革新的経皮デリバリー技術の開発

タンパクや核酸など高分子医薬品の低侵襲的投与法として経皮投与技術の開発が切望されている。最大のバリアである皮膚の角質層を突破させるため、透過促進剤やマイクロニードルの活用、超音波や電気などの物理的な刺激を利用する方法などが提案されてきた。しかし、高分子医薬品の透過に成功した報告は乏しく、実用化に進む可能性のある技術の開発は未達である。イオン液体は陽イオンと陰イオンからなる常温で液体の物質であり、その特徴的な性質から、新たな電池材料や溶剤としてなどグリーンケミストリーの素材として活用されてきている。しかし、医療応用に向けた試みは行われていない。本研究の目的は、イオン液体をキャリアとし、皮膚角質層の突破という最も大きな課題を一気に解決するための高分子医薬品の低侵襲的投与法を開発することである。本年度はモデル抗原としてインスリンを用い、in vitroでの皮膚透過性試験を行った。その結果、ある種のイオン液体と混合することで、インスリンの皮膚透過性が飛躍的に向上することが確認できた。次いでin vivoでの皮膚透過性試験を行った。その結果、インスリンが角質層を透過し、血中ににまで移行していることを血糖降下作用によって確認した。現在、がんペプチドであるWT1を用いて同様の検討を行っているが、同様に良好な結果が得られつつあり、当初の目的である画期的な低侵襲性の経皮型がんワクチンの開発に繋げていく予定である。平成30年度に予定した検討内容を達成し、想定した成果がでてきているため。仮説に基づいた計画通りに研究が進捗しており、特に問題はない。今後も計画にしたがって検討を進めていく。
歯周病原細菌菌体表面タンパクの心血管系および骨代謝系に及ぼす影響

2)BCG菌をosteoblastic cellに感染させるとTNFaレセプターファミリーの一つである4-1BBの発現が亢進することを見いだした。この発現亢進は大腸菌、ネズミチフス菌、黄色ブドウ球菌の感染および大腸菌由来LPSや熱処理死菌BCG菌でも生じることがわかった。4-1BBのリガンド分子は骨髄細胞、マクロファージ様株化細胞に発現していることから4-1BBの破骨細胞分化への影響を骨髄細胞を用いて解析した。その結果、固層化した4-1BBは1ng/mlという低濃度でもRANKL/M-CSF誘導破骨細胞分化を抑制することがわかった。さらにRANKL/M-CSFによるI-kB,ERK1/2,p38,JNKのリン酸化には4-1BB処理は影響しなかったがAKTのリン酸化は4-1BB処理により抑制されることがわかった(Saito et al.,J.Biol.Chem.,in press)。3)全骨髄細胞を用いたM-CSF/RANKL誘導性破骨細胞分化システムにおいてはIL-12はアポトーシスは起こさないが破骨細胞分化を抑制することがわかった。この抑制作用は破骨細胞前駆細胞に直接IL-12が作用するのではなく、IL-12の働きで他の骨髄細胞から液性因子を放出させることにより起こることがわかり、この液性因子の有力な因子がIFN-gであることが抗IFN-g抗体やIFN-g receptor knockout mouse実験から示唆された。また、IFN-gの産生細胞は非T細胞系である可能性が示唆された(Nagata et al.,Bone,2003;33:712-32)。