hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
神経細胞死とその防御の分子制御

単一遺伝子異常による神経細胞死の機序解明に関し,Huntington病,歯状核赤核淡蒼球ルイ体萎縮症,Machado-Joseph病のトランスジェニックアニマルの作製に成功し,神経細胞死の分子機構解析を推進した.歯状核赤核淡蒼球ルイ体萎縮症では,伸長CAGリピートを含む変異タンパクの核移行,核内集積を確認.更に核内タンパクが転写因子の1つと結合,CREB-依存性の転写の活性化を障害することを見出した.Parkinson病に関しては,6番染色体長腕に連鎖する常染色体性劣性遺伝の家族性パーキンソン病(PARK2)の原因遺伝子のポジショナルクローニングに成功し,Parkinと命名した.またParkin蛋白がユビキチンリガーゼ(E3)の一種であることを明らかにし,本酵素の基質候補として22kDa-alpha-synucleinとPael receptorを同定した.孤発型パーキンソン病については,発症候補物質として,内因性N-methyl(R)salsolinolと3',4'DHBnTlQを同定した.またParkinson病の遺伝子治療を動物モデルで成功させた.神経細胞死の防御と機能修復に関しては,Bcl-2がSmnと結合し,細胞死抑制活性を相乗的に増進することを明らかにした.またアポトーシス過程で活性化される新規遺伝子DP5を同定した.更に,肝細胞培養上清中に末梢神経再生を促進する因子が存在していることを発見し,この因子が中枢神経再生も促進する活性を持つことを明らかにした.またミクログリアのの活性化機構に関与する新規のカルシウム結合蛋白であるIba1を見出した.単一遺伝子異常による神経細胞死の機序解明に関し,Huntington病,歯状核赤核淡蒼球ルイ体萎縮症,Machado-Joseph病のトランスジェニックアニマルの作製に成功し,神経細胞死の分子機構解析を推進した.歯状核赤核淡蒼球ルイ体萎縮症では,伸長CAGリピートを含む変異タンパクの核移行,核内集積を確認.更に核内タンパクが転写因子の1つと結合,CREB-依存性の転写の活性化を障害することを見出した.Parkinson病に関しては,6番染色体長腕に連鎖する常染色体性劣性遺伝の家族性パーキンソン病(PARK2)の原因遺伝子のポジショナルクローニングに成功し,Parkinと命名した.またParkin蛋白がユビキチンリガーゼ(E3)の一種であることを明らかにし,本酵素の基質候補として22kDa-alpha-synucleinとPael receptorを同定した.孤発型パーキンソン病については,発症候補物質として,内因性N-methyl(R)salsolinolと3',4'DHBnTlQを同定した.またParkinson病の遺伝子治療を動物モデルで成功させた.神経細胞死の防御と機能修復に関しては,Bcl-2がSmnと結合し,細胞死抑制活性を相乗的に増進することを明らかにした.またアポトーシス過程で活性化される新規遺伝子DP5を同定した.更に,肝細胞培養上清中に末梢神経再生を促進する因子が存在していることを発見し,この因子が中枢神経再生も促進する活性を持つことを明らかにした.またミクログリアのの活性化機構に関与する新規のカルシウム結合蛋白であるIba1を見出した.平成9年7月8日9日浜松においてアポトーシスと選択的細胞死を中心にワークショップを行った.また、公募班員全員から研究内容の紹介を受けて討論を行い,共同研究の推進を計った.各計画研究班の成果としては,A班「単一遺伝子異常による神経細胞死」研究班の特筆すべき研究成果は,CAGリピート病遺伝子の特徴であるポリグルタミン鎖の伸長に着目,当該ペプチドによる細胞毒性を培養細胞系を用いて明らかにし,さらに脊髄性筋萎縮症原因遺伝子産物(NAIP)に神経細胞生存・維持に関する新たな機能をラット実験系を用いて明らかにした事である.B班「遺伝的素因と環境因子の相互作用による神経細胞死」研究班の研究成果として,常染色体性劣性遺伝を示す若年性パーキンソニズムの大部分が染色体6番長腕に連鎖することを明らかにし,原因遺伝子のクローニングまであと一歩にせまった.更に内因性黒質毒性物質としてN-methy(R)-salsolinolが黒質ドーパミン細胞に毒性を有し,アポトーシスを誘導し,更にその合成酵素である中性Nメチル転移酵素が上昇するパーキンソン病の一群があることを明らかにした.C班「神経細胞死の防御と機能修復」研究班の特筆すべき研究成果は,新しく見出したアポトーシス遺伝子DP5がコードするDP5蛋白の構造を決定し,またbcl-2結合蛋白として脊髄性筋萎縮症の原因遺伝子smnを同定した.また従来知られていた神経栄養因子とは全く異なる肝細胞由来の神経活性化因子を見出し,その構造決定が進行している.また,総括班会議を開催して,今後の研究の進め方に関して意見を交換した.平成10年7月7日8日浜松において神経変性と神経機能修復を中心にワークショップを行った.また,新規公募班員から研究内容の紹介を受けて討論を行い,共同研究の推進を計った.各計画研究班の成果としては,A班「単一遺伝子異常による神経細胞死」研究班の特筆すべき研究成果として,Machado-Joseph病及び歯状核赤核淡蒼球ルイ体萎縮症の原因遺伝子の変異型ポリグルタミン鎖は単独で細胞核内に凝集し,アポトーシスを誘起することを明らかにした.またハンチントン病のリプレイスメントマウス及びトランスジェニックミニブタの作出に成功した.B班「遺伝的素因と環境因子の相互作用による神経細胞死」研究班の研究成果として,常染色体性劣性遺伝を示す若年性パーキンソン病の原因

遺伝子のクローニングに成功し,多数の患者について変異分析を推進した.更に内因性黒質毒性物質としてN-methyl(R)-salsolinolが黒質ドーパミン細胞に毒性を有し,アポトーシスを誘導し,その合成酵素がパーキンソン病で上昇していることをを明らかにした.C班「神経細胞死の防御と機能修復」研究班の特筆すべき研究成果として,脊髄性筋萎縮症(SMA)原因遺伝子の一つであるSMN遺伝子産物を見出した.また新しいアポトーシス誘導蛋白DP5を発見した.更にCos1細胞由来の新規神経活性化因子を発見した.またリソゾームカテプシン群による神経細胞死の新たな制御機構を発見した.更に,総括班会議を開催し,今後の研究の進め方に関して意見を交換した.平成11年6月29日30日活性酸素と細胞死及び新しい神経変性疾患の1つである家族性前頭側頭型痴呆パーキンソニズムを中心にワークショップを行った。新規公募班員の紹介や細胞周期と細胞死をめぐる話題提供も行い、100名以上の参加で夜遅くまで熱気のこもる討論を行った。本ワークショップは、共同研究の推進にも極めて有意義であった。また12月1314日に、研究成果発表のための班会議及び公開シンポジウムを開催した。各計画研究班の成果としては、A班「単-遺伝子異常による神経細胞死」研究班の特筆すべき研究成果として、ハンチントン病、歯状核赤核淡蒼球ルイ体萎縮症のトランジェニックウスのの作出に成功、これらを使用して遺伝子産物の機能解析を推進できるようになったことである。B班「遺伝的素因と環境因子の相互作用による神経細胞死」研究班の研究成果として、常染色体性劣性遺伝の原因遺伝子であるparkin遺伝子の変異解析を進め、compound heterozygotesが多数存在すること、遺伝子産物であるparkin蛋白が、軸索輸送を受ける蛋白であること、細胞質・Golgi体に局在すること、ユビキチンライゲースの一種の可能性の高いことを明らかにした。また孤発型パーキンソン病の原因に関し、黒質神経毒と核酸の酸化的障害の存在を明らかにした。C班「神経細胞死の防御と機能修復」研究班の特筆すべき研究成果として、アポトーシスの分子機構とその制御に関し、Bcl-2ファミリー蛋白はVDAC(ミトコンドリアポリン)の開閉を直接制御して、アポトーシス誘導因子であるシトクロムcの遊離を調節していることを明らかにした。ハンチントン病遺伝子exon 1のNeuro2A細胞核内凝集体を遠心分画法およびセルソーターを用いて分離することに成功した。ポリグルタミンと物理的に相互作用する蛋白質を精製し,その全長cDNA cloningに成功した。伸長ポリグルタミン鎖と結合する核内タンパクを検索し,TATA-bindingprotein-associated factor(TAF)130と結合して,CREB依存性の転写の活性化を強く抑制し,神経細胞の機能障害を引き起こしている可能性を見いだした.常染色体性劣性遺伝の家族性パーキンソン病の原因蛋白であるParkinがユビキチンリガーゼの一種であることを明らかにした.またParkinは,Golgi装置を経て軸索輸送小胞に結合し,シナプス小胞に運ばれ,その膜に存在することを明らかにした.
慢性閉塞性肺疾患における禁煙補助薬バレニクリンによる心血管イベント発症機序

禁煙補助薬バレニクリンは禁煙成功率が高いが、心血管イベントのリスク上昇が報告された。そこで、バレニクリン服用患者の背景を考慮し慢性閉塞性肺疾患(COPD)におけるバレニクリンの心血管イベント発症リスクを検討した。ブタ膵エラスターゼ(PPE)誘発COPD病態の動脈硬化症モデルマウスにバレニクリンを投与し、動脈硬化巣を評価した。その結果、バレニクリンは動脈硬化巣を増悪させたが、COPD病態ではバレニクリンにより、有意でないが増悪傾向であった。一方、バレニクリンはPPEによる肺胞径拡大を抑制した。このように、バレニクリンによる肺保護作用により、COPDで増悪する動脈硬化巣が抑制されたかもしれない。慢性閉塞性肺疾患(Chronic Obstructive Pulmonary Disease:COPD)患者は、高齢化に伴い増加している。COPDの治療、COPDによる心・血管疾患などの全身性合併症の発症予防には禁煙が最も効果的である。経口禁煙補助薬バレニクリンは、禁煙治療において画期的で有効性の高い医薬品であるが、心血管イベントの発症リスクを上昇させる重篤な副作用が報告された。しかし、この発症機序に関する基礎研究は殆どない。そこで、COPD病態下におけるバレニクリンの心血管イベントの発症機序を解明することを企てた。その結果、ApoE KOモデルマウス(0U PPE)と比較して、ApoE KO / COPDモデルマウスにおける全大動脈の動脈硬化巣の形成は、促進していた。さらに、バレニクリン投与によりApoE KO / COPDモデルマウスにおける全大動脈の動脈硬化巣の形成は増悪していた。よって、COPD病態下においてもバレニクリンは動脈硬化巣の形成を促進させることが示唆された。当初の予定では、3UのPPEをApoE KOマウスに噴霧予定であったが、3UのPPE噴霧によりマウスの死亡率が約70%と高くPPEの噴霧量を検討した。2U PPE噴霧では死亡率は約25%に減少したため、PPEの噴霧量を3Uから2Uへ変更した。また2U PPE噴霧によりCOPDの特長である肺胞径の拡大および動脈血酸素飽和度の減少が認められた。以上のことから、2U PPE噴霧をApoE KO / COPDモデルマウスと決定し、実験を進めた。このApoE / COPDモデルマウスにバレニクリン(0.5mg / kg / day)を3週間投与したところ、バレニクリンにより動脈硬化巣の形成促進が認められた。このように当初の予定とPPEの噴霧量は変更になったが、本研究の目的であるCOPD病態下におけるバレニクリンの心血管イベントの発症機序を解明するための動物実験状況を考慮すれば、研究の進捗状況としてはおおむね順調に進展している。目的:慢性閉塞性肺疾患(COPD)は肺の炎症性疾患で、発症予防、進行抑制には禁煙が最も効果的で経済的な方法である。禁煙補助薬バレニクリンは禁煙治療において有効性の高い薬であるが、心血管イベント発症リスクを上昇させることが報告された。そこで本研究はバレニクリンを服用する患者背景を考慮し、COPD病態下におけるバレニクリンの心血管イベント発症リスクを検討した。結果:PPE 0U群においてバレニクリンは、動脈硬化巣の形成を増悪させた。一方、PPE2U噴霧により動脈硬化巣が増大傾向にあったが、有意な差はなかった。またPPE 2U噴霧群において、バレニクリンにより動脈硬化巣は増悪傾向にあったが有意差はなかった。PPE 2U群はPPE 0U群でと比較して、肺胞径が有意に拡大した。一方、興味深いことに、バレニクリンはPPE誘発による肺胞径の拡大を有意に抑制した。考察:バレニクリンは、ApoE KOマウスにおいて動脈硬化巣の形成を増悪させた。しかし、PPE誘発COPD病態下では、動脈硬化巣は増悪傾向であったが、有意差はなかった。これはPPEによる動脈硬化巣の悪化により、バレニクリンによる増悪が顕著とならなかったと考えられる。また、バレニクリンはPPE誘発による肺胞径の拡大を顕著に抑制したことから、バレニクリンの保護作用によりCOPDに伴う動脈硬化巣の増大が抑制されたかもしれない。バレニクリンは心血管イベントの発症リスクを上昇させる一方で、COPD病態下ではバレニクリンは心血管イベントの発症リスクを上昇させないことが示唆された。ApoE KO / COPDモデルマウスにおいて、バレニクリンによる動脈硬化巣の安定化に対する影響を検討するため、大動脈起始部における動脈硬化巣の凍結切片スライドを作成し、AZAN染色(コラーゲン)、MOMA-2(単球・マクロファージ)、α-SMA (smooth muscle actin)の免疫組織染色を行う。

それぞれの陽性領域面積を測定し、プラーク不安定化スコアにより、動脈硬化巣の不安定性を評価する。また全大動脈における炎症性メディエーター(IL6、TNF-α;など)の発現変化をウエスタンブロット、リアルタイムPCR法で評価する。またCOPD病態下では低酸素状態になることから、動脈硬化症の発症・進展に関連する血管内皮細胞、炎症性細胞、血管平滑筋細胞などを低酸素条件下でバレニクリンを処理することにより、COPD病態下におけるバレニクリンの影響を検証する。また、計画通りに進まない場合は、COPD病態下では血中IL6、TNF-αが上昇することから、動脈硬化症の発症・進展に関与する血管内皮細胞、炎症性細胞、血管平滑筋などを用いてIL6、TNF-α存在下におけるバレニクリンの作用を炎症性サイトカインや生理活性物質の産生、細胞動態(増殖、浸潤・遊走、oxLDL取り込み)を指標として評価する(in vitro実験)。またバレニクリンは、α4β2 nAChR部分作動薬、α7 nAChR完全作動薬であり、α7 nAChRは炎症性細胞、血管内皮細胞、血管平滑筋細胞、血小板などの動脈硬化巣の形成・進展に関与する細胞に発現している。そこで、α7 nAChRに着目し、COPD病態下におけるα7 nAChRを介するバレニクリンの作用を明らかにする。副作用実験物品費の端数の金額が生じたため、交付金額と実支出額との間に130円の差額が生じた。平成28年度の物品費に、今回の繰越金額を使用する予定である。
北京新出資料から見る清代口語の諸相

3年間計14回の北京調査により、次の四つの調査課題、二つの研究課題のそれぞれについて調査と研究を進め、北京語・共通語とその口頭表現に関する新しい知見を得た。(1)北京白話報刊(新聞と定期刊行物)の調査、(2)影戯影詞(影絵芝居とその脚本)の調査、(3)口供供詞(裁判の供述筆記とその引用)の調査、(4)電視劇本(テレビドラマの脚本)の調査、(5)上記(1)(4)により収集された清代から民国期にかけての言語資料を集積する「清民語庫」の構築、(6)(5)に基づく年代の確かな資料による清代民国時期の漢語の演変研究3年間計14回の北京調査により、次の四つの調査課題、二つの研究課題のそれぞれについて調査と研究を進め、北京語・共通語とその口頭表現に関する新しい知見を得た。(1)北京白話報刊(新聞と定期刊行物)の調査、(2)影戯影詞(影絵芝居とその脚本)の調査、(3)口供供詞(裁判の供述筆記とその引用)の調査、(4)電視劇本(テレビドラマの脚本)の調査、(5)上記(1)(4)により収集された清代から民国期にかけての言語資料を集積する「清民語庫」の構築、(6)(5)に基づく年代の確かな資料による清代民国時期の漢語の演変研究2007年度は,計5回の北京調査により,次の四つの調査課題((1)(2)(3)(4)),二つの研究課題((5)(6))のそれぞれについて調査と研究を進めた=(1)北京白話報(北京評書を含む)の調査/(2)影戯影詞の調査/(3)満漢供詞の調査/(4)電視劇本の調査/(5)清民語庫の構築/(6)清民語料の解析その他=.特に,課題(3)では,中国第一歴史档案館(「一館」)所蔵の刑部档案のうち直隷・湖廣・江蘇司の「京畿地區《現審》档案」の簡易目録(1999-2007年の予備調査により作成)にもとづき,その一部档案から事件関係者の供述「口供」と供述書「供詞」の原件を抽出抄写する作業を継続中である,たとえば,乾隆56(1791)年や嘉慶9(1804)年の「偸盗」文書のうちに,旗人/民人関係各位の供述書「供詞」の原件とその直接引用が存在することを確認し,そこには,代名詞《我》、動詞の接尾辞《了》《的》の後ろに目的語を置く《V了O》《V的O》,句末助詞《ni》(<する>),半句末助詞《就是了》(<しただけのこと>)など通常の公文書とは異なる口語的な語法特徴が見られることが判明した.また,課題(4)では,清代口語と比較する口語作品の候補として,『ともにある日々(金婚)』(2007年9月北京電視台),『大佐の娘(大校的女児)』(2007年12月中央電視台),『にっこり笑って(笑着活下去)』(2008年3月北京電視台)などいくつかの連続テレビドラマに取材し,北京語・共通語とその口頭表現に関する新しい知見を得た.2008年度は,計3回の北京調査により,次の四つの調査課題((1)(2)(3)(4)),二つめ研究課題((5)(6))のそれぞれについて調査と研究を進めた=(1)北京白話報(北京評書を含む)の調査/(2)影戯影詞の調査/(3)満漢供詞の調査/(4)電視劇本の調査/(5)清民語庫の構築/(6)清民語料の解析その他=.特に,課題(3)では,中国第一歴史档案館(「一館」)に所蔵される明清档案のうち,刑部档案(直隷司・湖広司・江蘇司)に続き順天府档案の簡易目録を作成(2008年9月)し,その一部档案に含まれる事件関係者の供述書「供詞」の原件またはその引用供述「口供」(「拠○○○供」,女性の場合は「拠□○氏供」の形式)とが含まれることを確認したうえで,それらの「口供」「供詞」の各件を抽出抄写する作業を継続中である.たとえば,乾隆59(1794)年4月,順天府寳抵縣の民人孫習譲が土地の貸借をめぐり自縊身死に至った事件では,その親族及び関係各位十余名の「供詞」を直接引用する漢文档案が複数存在することを確認し,そこには,代名詞《他》《他men》、動詞の接尾辞《了》《的》《過》,介詞(前置詞)《he》や句末助詞《ni》(<する>)など通常の公文書とは異なる口語的な語法特徴が見られることが判明した.

また,課題(4)では,清代口語と比較する口語作品の候補として,『女の気持(女人心事)』(2008年1月北京電視台),『家は天より高し(家比天大)』(2008年9月中央電視台),『春草』(2008年12月北京電視台)などいくつかの連続テレビドラマに取材し,北京語・共通語とその口頭表現に関する新しい知見を得た.2009年度は,計8回の北京調査により,次の四つの調査課題((1)(2)(3)(4)),二つの研究課題((5)(6))のそれぞれについて,調査と研究を進めた=(1)北京白話報刊(北京評書を含む)の調査/(2)影戯影詞の調査/(3)満漢供詞の調査/(4)電視劇本の調査/(5)清民語庫の構築/(6)清民語料の解析その他=.特に,課題(3)では、故宮西華門内の中国第一歴史梢案館(「一館」)に所蔵される明清档案のうち,刑部档案に続き,北京周辺地区(「順天府寳抵県」)の公文書を集順天府档案中の「法律詞訟」案巻の簡易目録(2009年5月)を作成し,その一部梢案に含まれる事件関係者の供述書「供詞」の原件とその引用(「據○○○供」,女性の場合は「據○□氏供」の形式から始まる)とを抽出抄写する作業を継続中である.たとえば,嘉慶25年(1820)2月,天津県小潘庄の民人張幅増が,長期不在の妹夫趙良のもとから,父親が連れ戻した妹を他の男性に売り渡したため,出稼ぎ先から戻り金銭代償を求めた趙良との間でトラブルとなり,10日夜就寝中の趙良の頭部を斧(「鉄釿」)で斬りつけ死亡させた,と自ら述べる事件など,相当数の供述書(「供詞」とその引用)が含まれることが確認された.その多彩な俗字を読み解き抄写検討の結果,発話の引用を示す《説(と言った)》,動詞の接尾辞《了》《着》《過》,代名詞《我》《他》《他們》,介詞(前置詞)《和(に)》,句末助詞《?》,半句末助詞《就是了》や感嘆詞《??(アイヨ)》など同時代の小説《石頭記(紅樓夢)》《児女英雄傳》や現代のドラマとも共通する口語性の強い語法特徴が見られることが判明した.また,課題(4)では,清代口語と比較する口語作品の候補として,《メイリィのこと》(2009年10月),《老大的幸福》(2010年2月)などいくつかの連続テレビドラマや話劇に取材し,北京語・共通語とその口頭表現に関する新しい知見を得た.
スカベンジャー受容体MARCOに着目したIgG4関連疾患の新規分子標的治療の確立

IgG4-RDは、高IgG4血症と病変局所の著明なIgG4陽性形質細胞浸潤を特徴とする。臨床的には罹患臓器の腫大や線維化を認め、治療はステロイドが著効するが、約半数で再発するため、厚生労働省の指定難病にも認定されている。近年、IgG4-RDの病態形成への自然免疫の関与が指摘されており、われわれは、マクロファージなどの自然免疫担当細胞に着目し、顎下腺組織の解析を行った。その結果、新規疾患感受性遺伝子としてMARCOを同定した。本研究では、in vitroからin vivoの検討を行い、最終的にはMARCOやその下流分子を標的とした新規治療法の確立を目指すことを目的とする。
筋肥大制御機構の解明－筋核に着目した検討－

骨格筋は骨格筋細胞である筋線維により構成され、筋線維は1mm線維長あたり100程度の核を有する多核の細胞である.これまでに,レジスタンス運動など骨格筋の肥大を生じさせる運動トレーニングは核を増加させることが報告されてきた.細胞核は核酸合成の中心的なオルガネラであることから,その数は骨格筋量の決定にかかわるタンパク質合成能力にも関与するものと考えられる.本研究ではレジスタンス運動による骨格筋適応である筋肥大における筋核の役割を検討し明らかにすることを目的としている.平成28年度は筋線維体積に対する核数の増加が生じる(即ち核密度の増大)廃用性筋委縮状態に着目し,筋委縮による筋核密度の増大が筋収縮によるタンパク質合成を増大させるか検討した.具体的には実験動物を対象に萎縮筋に対し単回のレジスタンス運動を模倣した電気刺激による筋収縮を行った.その結果,線維あたりの核数が増加した場合であっても単回の運動に伴う筋タンパク質合成の亢進は増大しないことが明らかとなった.今年度は単回運動時のタンパク質合成応答がトレーニングを行った際の骨格筋適応に反映されるかを検討するため,実験動物に廃用性筋委縮を導出した後,単回運動を実施した際と同一の実験系を用いて, 3週間の慢性トレーニングを実施した.その結果トレーニングに伴う骨格筋肥大応答も単回運動後のタンパク質合成亢進と同様に廃用性筋委縮後に増大することはなく,通常状態と同程度であった.したがって廃用性筋委縮によって生じる核密度の増大はレジスタンストレーニングによる筋肥大には影響を及ぼさないことが示唆された.29年度が最終年度であるため、記入しない。29年度が最終年度であるため、記入しない。骨格筋量を維持増大させるための運動としてレジスタンス運動は広く実施されているが、このメカニズムの多くは未だに明らかとなっていない。これまでの多くの研究によってレジスタンス運動を介した骨格筋肥大には運動による筋タンパク質合成の亢進と運動の繰り返しによる筋タンパク質の蓄積が重要であることが明らかとなっている。骨格筋は多核の細胞であり、単一の細胞(成熟筋細胞)内には数百の核が存在する。真核生物では核内のDNAの量とRNA及び細胞内タンパク質量が相関し、この特徴は広く酵母から鳥類まで観察されている。このことから細胞内のタンパク質合成能と関連性を有する核の量がレジスタンス運動による筋タンパク質合成能力を決定する一因子ではないかという仮説を立てた。本仮説を検証するため生理的な条件下で細胞質体積あたりの核数を増加させることのできる筋萎縮状態に着目した。具体的には、動物実験により筋萎縮状態での急性レジスタンス運動負荷が筋タンパク質合成に及ぼす影響を検討した。その結果、翻訳の開始に関与する分子複合体mTORC1の活性化はレジスタンス運動後、筋萎縮状態で通常状態に比較し高く生じるが、翻訳能力に関わるリボソームRNAの発現量は筋萎縮状態ではレジスタンス運動後も通常状態に比較して低値を示した。一方、筋タンパク質合成は筋萎縮状態においても通常状態と同程度にまでレジスタンス運動によって亢進した。以上の結果から筋萎縮により筋細胞質の体積あたりの核は増加し、運動によるmTORC1の活性化は通常状態に比較し増大するもののタンパク質合成は増大しないことが明らかとなった。加えてmTORC1の活性化と筋タンパク質合成の不一致には筋萎縮状態でのリボソームRNAの発現低下が関与している可能性が示唆された。研究計画に従い、生理的条件下における筋核数の違いがレジスタンス運動による筋タンパク質合成による影響を検討した。筋萎縮下では核密度は増加し運動によるmTORC1の活性化は通常状態に比較し増大するもののタンパク質合成は増大しないことが明らかとなった。また筋萎縮下ではリボソームRNAの発現低下が関与していることから筋核数のみならずRNA転写の足場となる筋核の質もレジスタンス運動による筋タンパク質合成に重要な要因である可能性が示された。骨格筋は骨格筋細胞である筋線維により構成され、筋線維は1mm線維長あたり100程度の核を有する多核の細胞である.これまでに,レジスタンス運動など骨格筋の肥大を生じさせる運動トレーニングは核を増加させることが報告されてきた.細胞核は核酸合成の中心的なオルガネラであることから,その数は骨格筋量の決定にかかわるタンパク質合成能力にも関与するものと考えられる.本研究ではレジスタンス運動による骨格筋適応である筋肥大における筋核の役割を検討し明らかにすることを目的としている.平成28年度は筋線維体積に対する核数の増加が生じる(即ち核密度の増大)廃用性筋委縮状態に着目し,筋委縮による筋核密度の増大が筋収縮によるタンパク質合成を増大させるか検討した.具体的には実験動物を対象に萎縮筋に対し単回のレジスタンス運動を模倣した電気刺激による筋収縮を行った.その結果,線維あたりの核数が増加した場合であっても単回の運動に伴う筋タンパク質合成の亢進は増大しないことが明らかとなった.今年度は単回運動時のタンパク質合成応答がトレーニングを行った際の骨格筋適応に反映されるかを検討するため,実験動物に廃用性筋委縮を導出した後,単回運動を実施した際と同一の実験系を用いて, 3週間の慢性トレーニングを実施した.その結果トレーニングに伴う骨格筋肥大応答も単回運動後のタンパク質合成亢進と同様に廃用性筋委縮後に増大することはなく,通常状態と同程度であった.したがって廃用性筋委縮によって生じる核密度の増大はレジスタンストレーニングによる筋肥大には影響を及ぼさないことが示唆された.

今後は筋内の核数とレジスタンス運動による筋タンパク質合成亢進能力との直接的な関係性をより詳細に検討するため、実験動物を用いて単一筋線維レベルで運動による筋タンパク質合成亢進レベルと筋核数の関係を組織化学的に解析する。上記の実験結果から筋核数とレジスタンス運動による筋タンパク質合成亢進能力の関連性が示唆された場合、ヒト骨格筋試料を用いて同様の性質がヒトレベルにまで観察されるか検討を実施する予定である。29年度が最終年度であるため、記入しない。
チオエステル化酵素の高い立体選択性発現機構の解明

「光る虫」といえば「ホタル」とすぐに連想できるほど、我々にとってホタルは身近で、かつ心が惹きつけられる存在である。このようにホタルルシフェラーゼといえば発光反応を触媒する酵素だと思われがちであるが、実は立体選択的なチオエステル化という、もう一つの触媒活性があることを発見した。例えば構造中に1つの不斉点を有するケトプロフェンを基質とした場合、ヘイケボタル由来ルシフェラーゼはR体を優先的にチオエステル体へと変換する。本研究では、本酵素がどのように基質の不斉を識別しているのかを明らかにするために、ホタルルシフェラーゼを用いたチオエステル化反応の詳細な機構解析やMDシミュレーション、および結晶構造解析を試み、その理由の一端を明らかにすることができた。ホタルルシフェラーゼによる立体選択的チオエステル化反応を用いた効率のよい光学活性体調製法の開発と高い立体識別能発現理由を解明することを目標とした。ルシフェラーゼはホタルの発光反応に関わっている酵素である。本酵素は長鎖脂肪酸に対してチオエステル化を行う酵素(Long-chainacyl-CoA synthetase,LACS)とアミノ酸の一次配列レベルにおいて高い相同性を示すことが分かっている。生物発光とチオエステル化は一見すると全く違った反応のように見えるが,共通の反応中間体(アシル-AMP中間体)を経由する。このように,アミノ酸配列や反応機構が似ていることから我々は,ルシフェラーゼは発光活性だけでなくチオエステル化活性も有していると考えた。この予想は的中し,ヘイケボタル由来のルシフェラーゼ(LUC-H)がR体の2-アリールプロパン酸に対して立体選択的なチオエステル化反応を触媒できることを世界に先駆けて報告している。本研究において私は,LUC-Hによるチオエステル化反応の速度論的解析と,酵素が基質の不斉を見分ける理由を解明することを目的とした研究を行った。具体的には,ケトプロフェンの両鏡像体を調製し,これを用いてラインウェーバー・バークプロットを作成,速度論的パラメータを算出した。本解析によってケトプロフェンに対する不斉点識別は,基質が酵素に結合する段階ではなく,補酵素Aが攻撃する段階であることを予想できた。また,反応中間体アナログを合成し,それに関して同様のプロットを行うことで,阻害能および様式を確認した。また,本アナログを用いた,結晶化の検討を行い,構造解析に耐えうる結晶作成条件を探索した。得られた結晶を用いてSpring-8でのX-線照射実験を行ったところ,1.5Åという高解像度にてモデル構築を行うことに成功した。ルシフェラーゼはホタルの発光反応に関わる酵素として有名であるが、我々は本酵素が2-アリールプロパン酸に対して立体選択的なチオエステル化活性を有することを見出している。本研究では、ヘイケボタル由来のルシフェラーゼ(LUC-H)を標的酵素とし、本酵素がどのように基質の不斉を見分けているのかという理由の解明を目的としている。昨年度の検討で、ケトプロフェンの両鏡像体を用いた速度論的パラメータを算出、および反応中間体アナログを用いた基質アナログ-酵素2成分系での結晶化を行った。得られた結晶を用いてSpring-8でのX線照射実験を行ったところ、L5Åという高解像度にてモデル構築を行うことに成功した。今年度は、得られた結晶構造の詳細な解析を行った。その結果、反応中間体アナログはケトプロフェン部位の不斉に関わらず共に取り込まれていることが判明した。これは速度論解析の結果を支持するものであった。以上の解析から、ケトプロフェンに対する不斉点識別は基質が酵素に結合する段階ではなく、補酵素Aが攻撃する段階であることを明らかにできた。そこで、基質アナログー補酵素-A酵素という3成分系での結晶化検討を行った。また、Amberを用いた生体分子シミュレーションにより反応中間体形成後のタンパク質の動きを予測した。その結果基質分子であるケトプロフェンの不斉の違いによって、一部の配列の動きに有意な差が生じることを見出した。さらに、本配列に対する変異導入を行いチオエステル化に与える影響を確認した。

昨年度までの検討で、反応中間体アナログを用いた基質アナログ-酵素2成分系での結晶構造解析に成功している。詳細な解析の結果、反応中間体アナログはケトプロフェン部位の不斉に関わらず共に取り込まれていることが判明した。また、Amberを用いた生体分子シミュレーションにより反応中間体形成後のタンパク質の動きを予測したところ基質分子であるケトプロフェンの不斉の違いによって、一部の配列の動きに有意な差が生じることを見出した。そこで今年度は、本部位(200Ser,201Ser)をアラニンに置換した変異体を作成しチオエステル化への影響を確認した。また、本反応に関わる基質(ケトプロフェン、ATPおよびCoASH)に対する速度論解析を行った。その結果、ケトプロフェン、ATP、CoASH共にケトプロフェンの不斉に違いによってKm値にほとんど差はない一方、kcat値が大きく違っており、この効果によって不斉識別が行われていることが分かった。またSer200,Ser201への変異導入によってチオエステル化活性は大きく低下した。速度論解析より、本変異はkcat項に影響を与えることが確認され、そのことから本部位が立体選択的なチオエステル化反応に必要不可欠な部位であることが分かった。以上の検討によって代表者は、ホタルルシフェラーゼによるケトプロフェンへの不斉点識別が、基質が酵素に結合する段階ではなく補酵素Aが攻撃する直前の段階の酵素構造変化によって引き起こされることを明らかにすることができた。
西洋基督教宣教師による初期漢訳聖書(その語彙と文体)の系譜に関する基礎的研究

近代中国における西洋人宣教師の中国語研究における成果の1つ「聖書の中国語訳」について、語学的な面からのアプローチを試みることが本研究の主旨である。本研究を中国語訳聖書の系譜の総合的な研究の最初歩と位置付け、中国語訳聖書の語彙や文体の特徴を明らかにし、今後、白話作品などの語彙や文体と比較対照を行い、西洋人(宣教師)が学習した19世紀初頭の中国語の一端を解明するための、基本的な環境・条件を整えることを目標としてきた。16年度には、聖書中国語訳最初期の3聖書、バセ訳「四史攸編』(18世紀初頭)、モリソン訳『神天聖書』新約部分(1814-1823)、マーシュマン訳『聖経』新約部分(1815-1822)の3者の全文電子テキスト化を行い完成し、現在は紙媒体版について最終的な文字校正の段階である。さらに、研究の途中経過として口頭発表「初期中国語訳聖書の系譜-初探・『四史攸編』とその語彙について-」(上海同済大学)を行い、同テーマで論文(関西大学中国文学会)を発表した。17年度にはつづいて、3聖書本文対照表(紙媒体およびデータベース)を作成し、これについても最終的な文字校正の段階である。さらに語彙索引の作成作業にはいり、『四史攸編』4福音書該当部分は作業を完了し、文字校正にはいっている。上述した研究内容と、近日中に完成・公開できる成果は以下の通りである。1)「初期中国語訳聖書の系譜-初探・『四史攸編』とその語彙について-」(関西大学中国文学会紀要26号H17.3月)2)3聖書本文対照表1・4福音書該当部分(初稿・文字校正中)、本文対照表2・使徒行傳以下(初稿・文字校正中)3)『四史攸編』(バセ18世紀初頭)全文電子テキスト(完成・公開準備中)4)『神天聖書』(モリソン1813-23新約部分『耶蘇基利斯督我主救者新遺詔書』)全文電子テキスト(完成・公開準備中)5)『聖経』(マーシュマン1815-22新約部分)全文電子テキスト(完成・公開準備中)6)『四史攸編』4福音書該当部分語彙索引(初稿・文字校正中)7)『神天聖書』(『耶蘇基利斯督我主救者新遺詔書』)4福音書と使徒行傳部分語彙索引(初稿・文字校正中)8)『聖経』4福音書と使徒行傳部分語彙索引(初稿・文字校正中)なお、上記68の語彙索引はいずれも最終校正中であり、近日中の公開をめざしている。上記以外の部分も、ひきつづき索引を作成して、3聖書の語彙索引・本文対照表を利用し、具体的な語彙の異同や文体の調査、比較対照によって、西洋人が学んで運用した中国語の特徴を具体例を以て明らかにしたい。さらに本研究は、モリソン訳につづくブリッジマン以降の官話訳聖書に至る中国語訳聖書翻訳の系譜について本格的な語学的調査を行う上での出発点となり得るもので、今後の当該および周辺分野の研究に一定の具体的な方法を提供することができると考える。近代におけるキリスト教来華宣教師の「中国語訳聖書」は、西洋人(宣教師)によって外側から外国語として学習し研究された19世紀初頭の中国語の一端を見ることができる。中国語訳聖書の全訳の嚆矢は、モリソン訳『神天聖書』(1814-1823)で、ほぼ同時期にマーシュマン訳『聖経』(1815-1822)がある。またモリソンが翻訳時に参照したと言われ、18世紀初頭に翻訳されたバセ訳『四史攸編』があり、3者は初期中国語訳聖書の系譜のなかで非常に重要な価値を持っている。3者の本文の比較対照と、語彙索引によって語彙及び文体の異同を調査し、聖書の翻訳にあたり参照されたと思われる白話作品や吏文などを参照しつつ、その継承関係とそれぞれの特徴を明らかにすることが本研究の目的である。その第一歩として本年度は、夏期休暇を利用して、大英図書館、フランス国立図書館にて資料収集を行い、初期中国語訳聖書『神天聖書』『四史攸編』『聖経』等の聖書類原本を閲覧・複写、マイクロフィッシュを作成依頼した。入手後ただちにマイクロフィッシュの複写と印刷、簡易製本、聖書本文のテキスト入力作業を行い、電子ファイルを作成した。17年度で3聖書(約2000葉)の本文入力をほぼ完了し、『四史攸編』については語彙索引(初稿)が完成した。また、東西言語文化接触研究会などで、国内の関連分野の研究者と意見交換し、関西大学増田文庫等の国内図書館で資料閲覧・収集を行った。3月には国際シンポジウム(上海)で研究成果の中間発表を行った。まず『四史攸編』の概要と、『神天聖書』『四史攸編』との関係を調査したうえで、『四史攸編』の4福音書合訳部分である「四史攸編耶甦基利斯督福音之會編」について作成した全語彙索引(初稿)をもとに、使用されている幾つかの語彙と文体について考察を試みた。これまでの論考では、その文体が多分に口語的であると指摘されているが、語彙をみるかぎり、とくに白話の要素がつよい語彙が多く用いられているわけではない。

それでも印象としてはやはり白話的な文体であるのは、句末助詞の多用によるところが大きいことが挙げられようが、興味深いところではある。白話要素の語彙が少ないにも関わらず、文章全体としては白話的なのか。その文体や語彙の特徴の根本的な疑問については、継続して白話、外交資料等の吏文などと比較対照しながら詳細に調査したい。近代中国における西洋人宣教師の中国語研究における成果の1つ「聖書の中国語訳」について、語学的な面からのアプローチを試みることが本研究の主旨である。本研究を中国語訳聖書の系譜の総合的な研究の最初歩と位置付け、中国語訳聖書の語彙や文体の特徴を明らかにし、今後、白話作品などの語彙や文体と比較対照を行い、西洋人(宣教師)が学習した19世紀初頭の中国語の一端を解明するための、基本的な環境・条件を整えることを目標としてきた。16年度には、聖書中国語訳最初期の3聖書、バセ訳「四史攸編』(18世紀初頭)、モリソン訳『神天聖書』新約部分(1814-1823)、マーシュマン訳『聖経』新約部分(1815-1822)の3者の全文電子テキスト化を行い完成し、現在は紙媒体版について最終的な文字校正の段階である。さらに、研究の途中経過として口頭発表「初期中国語訳聖書の系譜-初探・『四史攸編』とその語彙について-」(上海同済大学)を行い、同テーマで論文(関西大学中国文学会)を発表した。17年度にはつづいて、3聖書本文対照表(紙媒体およびデータベース)を作成し、これについても最終的な文字校正の段階である。さらに語彙索引の作成作業にはいり、『四史攸編』4福音書該当部分は作業を完了し、文字校正にはいっている。上述した研究内容と、近日中に完成・公開できる成果は以下の通りである。1)「初期中国語訳聖書の系譜-初探・『四史攸編』とその語彙について-」(関西大学中国文学会紀要26号H17.3月)2)3聖書本文対照表1・4福音書該当部分(初稿・文字校正中)、本文対照表2・使徒行傳以下(初稿・文字校正中)3)『四史攸編』(バセ18世紀初頭)全文電子テキスト(完成・公開準備中)4)『神天聖書』(モリソン1813-23新約部分『耶蘇基利斯督我主救者新遺詔書』)全文電子テキスト(完成・公開準備中)5)『聖経』(マーシュマン1815-22新約部分)全文電子テキスト(完成・公開準備中)6)『四史攸編』4福音書該当部分語彙索引(初稿・文字校正中)7)『神天聖書』(『耶蘇基利斯督我主救者新遺詔書』)4福音書と使徒行傳部分語彙索引(初稿・文字校正中)8)『聖経』4福音書と使徒行傳部分語彙索引(初稿・文字校正中)なお、上記68の語彙索引はいずれも最終校正中であり、近日中の公開をめざしている。上記以外の部分も、ひきつづき索引を作成して、3聖書の語彙索引・本文対照表を利用し、具体的な語彙の異同や文体の調査、比較対照によって、西洋人が学んで運用した中国語の特徴を具体例を以て明らかにしたい。さらに本研究は、モリソン訳につづくブリッジマン以降の官話訳聖書に至る中国語訳聖書翻訳の系譜について本格的な語学的調査を行う上での出発点となり得るもので、今後の当該および周辺分野の研究に一定の具体的な方法を提供することができると考える。
ABC星型共重合体の二次元タイリングとメゾスコピック準結晶構造の構築

ブロック共重合体など、異種高分子が分子内でつながれた複合分子は凝集系では、自己組織化による規則構造-ナノ相分離構造を呈することで知られる。1点から3つの異なる高分子鎖が分岐した星型共重合体では、特に凝集状態におかれると通常の線状共重合体よりも3次元空間での拘束力が大変強く働く。実際、分子の結合点は1次元の線状に並ぶため、棒状の相分離構造を作りやすくなり、その断面は2次元のタイリング構造となる。ここでは、I_<1.0>S_<1.0>P_x,I_<1.0>S_yP_<2.0>(I:polyisoprene,S:polystyrene,P:poly(2-vinylpyridine),X,Yは変数)の二つのシリーズの溶媒キャスト/バルクフィルムに関する研究から、正多角形から構成される規則タイリングである(6.6.6),(4.8.8,(4.6.12)など幾つかのアルキメデスタイリング構造を両方のシリーズにまず見つけた。さらに後者のシリーズでみられた、3角形と4角形からなる複雑規則タイリング(3.3.4.3.4)の組成近傍を詳細に調べ、古典結晶学では説明の出来ない準結晶タイリングを発見した。この構造は実空間で結晶の単位格子を持たないが、散乱実験では30°おきに12個の回折点が明確に現れたため、12回対称準結晶に立置づけられる。タイルの辺の大きさは約50nmであり、これまでに知られるカルコゲンやデンドリマー系のものよりはるかに大きいことが特徴である。3つの異なる高分子成分が1点から分岐したABC型の星型共重合体は、結合点が線状にしか配列できないという分子構造からくる特徴のため、棒状のミクロドメイン構造を形成し易い。実際、ポリイソプレン(I),ポリスチレン(S),ポリ(2-ビニルピリジン)(P)から構成されるI_1,_0S_1,_0P_x(Xは変数)3成分共重合体では、Xの変化に応じていくつかの規則的な棒状構造をとることが知られる。その断面の二次元構造を調べたところ、1つの成分が正多角形になる(6,6,6)構造(X=0.7),(4,8,8)構造(X=1.2)及び(4,6,12)構造(X=1.9)の3つのアルキメデスタイリング構造が見られた。またX=1.3から作られる構造を詳細に調べたところ、Iドメインは6角形と8角形、Sドメインは2種の4角形Pドメインは10角形のみを示すことがわかった。その2種のIドメインの上に正3角形と正方形を敷くと平面が規則的に埋まり、(3,3,4,3,4)アルキメデスタイリング構造の特徴を持つことが明らかとなった。類似の研究としてIP/SH二元ブロック共重合体ブレンド,PIP/SH三元/二元ブロック共重合体ブレンド(Hはポリヒドロキシスチレン,PとHは水素結合によりコンプレックスを形成)から種々の階層構造が構築可能であることも確かめた。それらの断面は広義にはアルキメデスタイリングの特徴を持つ。3つの異なる高分子成分が1点から分岐したABC型の星型共重合体は、結合点が線状にしか配列できないという分子構造上の特徴のため、棒状など異方性のミクロドメイン構造を形成し易い。実際、ポリイソプレン(I),ポリスチレン(S),ポリ(2-ビニルピリジン)(P)から構成されるI_1,_0S_1,_0P_X(Xは変数)3成分共重合体では、Xが1の近傍の値をとるときいくつかの規則的な棒状構造をとることが前年度までに調べられた。本年度はI_<1.0>_0S_YP_<2.0>(Yは変数)の組成を持つシリーズについて詳細に調査した。

(4.6.12)(Y=1.3),(4.8.8)(Y=27)の中間の組成では、(3.3.4.3.4)(Y=2.3)アルキメデスタイリング構造が見られることが透過型電子顕微鏡、X線小角散乱(Spring-8,BL40XU)を用いて明らかにされた。また、I_<1.0>S_<1.8>P_X(XZ4.0)のようにP鎖が長いシリーズでは、Pの体積分率が増えるにつれシリンダーインラメラ(4.0≦X≦12)ラメラインシリンダー(12≦X≦32)、ラメラインスフィア(X=53)などの階層構造が次々に表われた。このモルフォロジー転移をIとSの交互相を中心に考えるとラメラ→シリンダー→スフィアとなっており、階層性を保ちながら本質的には線状ブロック共重合体のものと同様の様式で起こっていることが明らかになった。ブロック共重合体など、異種高分子が分子内でつながれた複合分子は凝集系では、自己組織化による規則構造一ナノ相分離構造を呈することで知られる。1点から3つの異なる高分子鎖が分岐した星型共重合体では、特に凝集状態におかれると通常の線状共重合体よりも3次元空間での拘束力が大変強く働く。実際、分子の結合点は1次元の線状に並ぶため、棒状の相分離構造を作りやすくなり、その断面は2次元のタイリング構造となる。ここでは、・I_1.0S_1.0P_X,I_1.0S_YP_2.0(I:polyisoprene,S:polystyrene,P:poly(2-vinylpyridine),X,Yは変数)の二つのシリーズの溶媒キャスト/バルクフィルムに関する研究から、正多角形から構成される規則タイリングである(6.6.6),(4.8.8,(4.6.12)など幾つかのアルキメデスタイリング構造を両方のシリーズにまず見つけた。さらに後者のシリーズでみられた、3角形と4角形からなる複雑規則タイリング(3.3.4.3.4)の組成近傍を詳細に調べ、古典結晶学では説明の出来ない準結晶タイリングを発見した。この構造は実空間で結晶の単位格子を持たないが、散乱実験では30°おきに12個の回折点が明確に現れたため、12回対称準結晶に位置づけられる。タイルの辺の大きさは約50nmであり、これまでに知られるカルコゲンやデンドリマー系のものよりはるかに大きいことが特徴である。
肝切除術後肝不全におけるHGFレセプター、シグナル伝達経路の障害に関する研究

前年に引き続き,以下の研究を施行した.ラット腹腔内にthioacetamide(200mg/kg)を週3回5週問投与し肝障害ラットを作成した.これに84%肝切除を施行し肝切除後肝不全モデルを作成した.対照群として肝切除を施行しないsham群を設定した.【MAP kinase活性】Dayらの方法に準じ,残肝組織のMAP kinaseのアッセイを施行した.残肝組織のMAP kinase活性は肝木全ラットで上昇する傾向であったが,対照群との間に有意な差は認められなかった.肝不全ラットMAP kinaseに一定の傾向がみられるとは言えなかったことより,これより下流のシグナル伝達経路の障害の有無を検討することには妥当性がないものと判断した.【Rhoを介する経賂の障害の有無】細胞運動に関与するといわれるRhoを介するシグナル障害の有無を検討した.しかし,これもMAP kinaseと同様に肝不全ラットで一定の傾向を示すとは言えなかった.【残肝組織の形態学的検索】術後のラットを犠死させ,摘出残肝の形態的変化を光顕的に観察した.対照群として,非障害肝に8%肝切除を加えた群を設定した.肝切除48時間後の残肝のmitotic indexは,非障害肝切除群と比較して有意な差を認めなかった.したがって,肝不全ラットでは有意に肝再生が抑制されているとは断定できなかった.その他,これまでの実験から得られた結果を検討し解析を加えた.前年に引き続き,以下の研究を施行した.ラット腹腔内にthioacetamide(200mg/kg)を週3回5週問投与し肝障害ラットを作成した.これに84%肝切除を施行し肝切除後肝不全モデルを作成した.対照群として肝切除を施行しないsham群を設定した.【MAP kinase活性】Dayらの方法に準じ,残肝組織のMAP kinaseのアッセイを施行した.残肝組織のMAP kinase活性は肝木全ラットで上昇する傾向であったが,対照群との間に有意な差は認められなかった.肝不全ラットMAP kinaseに一定の傾向がみられるとは言えなかったことより,これより下流のシグナル伝達経路の障害の有無を検討することには妥当性がないものと判断した.【Rhoを介する経賂の障害の有無】細胞運動に関与するといわれるRhoを介するシグナル障害の有無を検討した.しかし,これもMAP kinaseと同様に肝不全ラットで一定の傾向を示すとは言えなかった.【残肝組織の形態学的検索】術後のラットを犠死させ,摘出残肝の形態的変化を光顕的に観察した.対照群として,非障害肝に8%肝切除を加えた群を設定した.肝切除48時間後の残肝のmitotic indexは,非障害肝切除群と比較して有意な差を認めなかった.したがって,肝不全ラットでは有意に肝再生が抑制されているとは断定できなかった.その他,これまでの実験から得られた結果を検討し解析を加えた.【目的】HGF-receptorのシグナル伝達経路には,MAPkinaseを介する経路とrhoを介する経路の少なくとも2つの経路が存在し,前者は細胞増殖に関与し,後者は細胞骨格に作用し細胞運動に関与することが明らかにされている.今回,肝切除後肝不全の動物モデルを作成し,HGF-receptorシグナル伝達経路の障害部位の同定を行った.【方法】1)ラットにおける限界切除率とされる84%肝切除を中心とする肝切除後肝不全モデルを作成した.2)この肝切除後肝不全モデルを用いて,肝切除後,2時間,12時間,24時間,72時間にsacrificeし,肝細胞のHGF-receptorシグナル伝達経路におけるMAP kinaseを会する経路およびrhoを介する経路の障害部位を,蛍光抗体法,生化学的方法,電子顕微鏡による観察により,同定した.【結果】MAP kinaseを介する経路の障害は,細胞増殖抑制すなわち肝再生と関連すると考えられた.またrhoを介する経路の障害は,類洞内皮細胞小孔,gap junction,tihgt junctionなどの細胞接着装置の超微形態変化が認められた.前述した変化は,肝切除後24時間で最も顕著であった.【今後の計画】これらの変化の原因の生理学的指標として,肝組織血流を水素クリアランス法,86Kr-クリアランス法にて平行した解析を試みている.【肝不全モデル動物の作製】ラット腹腔内にthioacetamide(200mg/kg)を週3回投与(1,3,5週間)し肝障害ラットを作製した.次にこれらラットに対し70%および84%肝切除を施行し経過観察,術後1-2週間の生存率を検討した.これにより肝切除後肝不全モデルとしての至適薬剤投与期間,肝実質切除率を決定した.【実験群の設定】本モデルの肝切除直後,2,12,24,48時間後,7日後にラットを犠死させ,以下の項目を検討中である.対照群として肝切除を施行しないsham群をそれぞれに設定した.【検討項目】以下の項目につき検討中である.<HGFおよびそのレセプター発現>血清および残肝組織中のHGF量をELISA法により測定.HGFのレセプターであるc-Metの遺伝子発現状況をwestern blotにて検討.<MAP kinase活性>HGFの細胞増殖活性の主たる伝達経路と考えられているMAP kinaseを介する経路の障害の有無を検討.残肝組織のMAP kinase活性を測定.<Rhoを介する経路の障害の有無>細胞のrufflingに関与するPhoの発現状況をwestern blottにて検討.

<生理学的パラメータの測定>残肝組織血流をレーザードップラー血流計にて測定.energy charge(動脈血中ケトン体比)を測定.<残肝組織の形態学的検索>摘出残肝の形態的変化を光顕,電顕で観察(予定).今後,シグナル伝達経路の障害部位が同定された場合には,さらにその上流の障害部位の同定(Ras,cdc42など)を行なう予定である.【肝不全モデル動物の作製】ラット腹腔内にthioacetamide(200mg/kg)を週3回5週間投与し肝障害ラットを作製した.次にこれらラットに対し84%肝切除を施行し肝切除後肝不全モデルとした.本モデルの肝切除直後,2,12,24,48時間後,7日後にラットを犠死させ,以下の項目を検討中である.対照群として肝切除を施行しないsham群をそれぞれに設定した.【HGFおよびそのレセプター発現】血清および残肝組織中のHGF量をELISA法により測定した.HGFのレセプターであるc-Metの遺伝子発現状況をwestern blotにて検討した.術後肝不全モデルにおいてはHGFは種々のレベルで高発現を示した.【MAP kinase活性】Dayらの方法に準じ,残肝組織のMAP kinaseのアッセイを施行した.残肝組織のMAP kinase活性は上昇傾向だが,なお解析が必要と考えている.【Rhoを介する経路の障害の有無】Rhoを介するシグナル障害の解析は現在検討中である.【生理学的パラメータの測定】残肝組織血流(酸素分圧),energy charge(動脈血中ケトン体比)を測定した.肝組織血流は肝切除直後より増加し,徐々に低下する傾向を認めた.一方,酸素供給もこれに伴い上昇する可能性が示されたが,一定の傾向を示すまでには至らなかった.動脈血中ケトン体比には一定の傾向を認めなかった.【残肝組織の形態学的検索】摘出残肝の形態的変化を光顕で観察中である.今後,シグナル伝達経路の障害部位が同定された場合には,さらにその上流の障害部位の同定(Ras,cdc42など)を行なう予定である.前年に引き続き,以下の研究を施行した.ラット腹腔内にthioacetamide(200mg/kg)を週3回5週間投与し肝障害ラットを作成した.これに84%肝切除を施行し肝切除後肝不全モデルを作成した.対照群として肝切除を施行しないsham群を設定した.【MAP kinase活性】Dayらの方法に準じ,残肝組織のMAP kinaseのアッセイを施行した.残肝組織のMAP kinase活性は肝不全ラットで上昇する傾向であったが,対照群との間に有意な差は認められなかった.肝不全ラットMAP kinaseに一定の傾向がみられるとは言えなかったことより,これより下流のシグナル伝達経路の障害の有無を検討することには妥当性がないものと判断した.【Rhoを介する経路の障害の有無】細胞運動に関与するといわれるRhoを介するシグナル障害の有無を検討した.しかし,これもMAP kinaseと同様に肝不全ラットで一定の傾向を示すとは言えなかった.