hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
予測微生物学的手法による食品流通システムの衛生管理

本研究ではアグリフードチェーンにおける微生物の成長・死滅、微生物が共生するバイオフィルム形成過程を予測する方法を確立し、微生物リスク評価を行うことを目的とするため、個々の要素技術について予測精度の向上に努めるとともに、要素技術の統合化を目指す。この統合化されたシステムによって、例えば、青果物の流通工程でひとつの菌に着目し、その増減を予測し、リスクを評価するなどの工夫も行う。24年度が最終年度であるため、記入しない。
ヒトｉＰＳ技術を用いた網膜色素変性症に対する新規神経保護治療の開発に向けた研究

網膜色素変性症は、遺伝子異常による進行性疾患で、失明原因の上位を占める。早期に診断が付いても進行を抑制する安定した治療法はないのが現状である。本研究では、患者の異常遺伝子を持つ人工多能性細胞を用いて、新規の神経保護治療法の開発に向けた病態メカニズムを解析を行った。具体的には、網膜色素変性症患者の皮膚細胞由来のiPS細胞を樹立し、これを網膜細胞に分化誘導した。そして、視細胞特異的に発現するNRL遺伝子のプロモーター支配下にGFPを発現するベクターを、分化誘導中の細胞にウイルスを用いて感染させ標識し、病態の分子メカニズムを解析すると共に、治療のための薬剤スクリーニングの可能性を示した。網膜色素変性症は、遺伝子異常を原因とし、徐々に進行する疾患で、失明原因の上位を占める。異常遺伝子が明らかになっていても、網膜神経細胞障害(死)のメカニズムは今のところ、わかっていないものが多いためである。その理由の一つが、患者網膜を採取して、培養したり解析したりすることが困難であることである。そこで、患者の異常遺伝子を持つ人工多能性細胞(induced-pluripotent stem cell; iPS細胞)を用いて病態メカニズムを解析し、新規の神経保護治療法の開発に向けた研究を開始した。また、コントロールiPS細胞からも網膜細胞を分化誘導した。我々は次に、この網膜細胞の中で視細胞だけに注目して解析を行うために、視細胞のみを標識する方法を樹立した。すなわち、視細胞特異的に発現するNRL遺伝子のプロモーター支配下にGFPを発現するベクターを、分化誘導中の細胞にウイルスを用いて感染させ、標識することに成功した。このベクターを発現している細胞はGFPを指標にフローサイトメトリーを用いて選択的に回収することが可能であり、iPS細胞から分化誘導し視細胞数を計測したり、遺伝子発現を定量的に解析することが可能となる。患者由来iPS細胞から、もしくはコントロールiPS細胞から誘導した視細胞を比べることで,その背景にあるメカニズムを解析する。そして、視細胞をはじめとした網膜細胞に安定した分化誘導が得られるようになった。この網膜細胞は、患者遺伝子異常を保持した細胞であり、これを用いて細胞死のメカニズムを解析することで、上述のこれまでの研究上の問題点を解消する可能性があった。このベクターを発現している細胞はGFPを指標にフローサイトメトリーを用いて選択的に回収することが可能であった。現在はこの細胞を回収してその性質を分子レベルで解析している。

これらの網膜細胞の中で視細胞だけに注目して解析を行うために、視細胞特異的に発現するNRL遺伝子のプロモーター支配下にGFPを発現するベクターを、分化誘導中の細胞にウイルスを用いて感染させ標識し、フローサイトメトリーを用いて選択的に回収した。生存細胞を測定するとともに、回収した細胞のアポトーシスマーカー、小胞体ストレスマーカーを比較解析したところ、患者由来細胞では、生存細胞が少なく、アポトーシスマーカー、小胞体ストレスマーカーが亢進していた。また、回収した視細胞の培養にラパマイシンを投与すると、生存細胞は増加し、アポトーシスマーカー、小胞体ストレスマーカーの発現が抑制されるという結果を得た。眼科学ヒトiPS細胞の培養には、時間とコストがかかることが知られるが、分化誘導や分子機構の解析は概ね予定通り達成中である。ヒトiPS細胞の培養には、時間とコストがかかることが知られるが、研究は概ね予定通り達成中である。患者皮膚細胞由来のiPS細胞を網膜細胞に分化誘導して標識した視細胞を回収し、視細胞の細胞死のメカニズムを解析する。遺伝子異常により異常タンパクが蓄積すると、小胞体ストレスを生じさらに酸化ストレスが惹起されることが予想されるため、まずはこれに注目して解析する。細胞内シグナル伝達機構等の観点から解析し、将来的に、その視細胞死のメカニズムを解消するための創薬につながる研究を行う。標識した視細胞はフローサイトメトリーを用いて選択的に回収する。既に当大学施設内にあるフローサイトメトリーしサンプルを回収する実験を開始した。得られたサンプルを用いて、小胞体ストレスのマーカーであるIre1、CHOP、Bipなどの分子を免疫細胞染色および分子生物学的手法で検出する。これらの手法は習得済である。必要な抗体およびリアルタイムRT-PCRプライマーは、既に一部入手済みで他の物も手配中である。患者皮膚細胞由来のiPS細胞を網膜細胞に分化誘導し、さらに視細胞を標識したうえで、その視細胞の細胞死のメカニズムを解析する。今後は、標識した視細胞における酸化ストレスマーカーの解析を行う。そのためにジヒドロエチジウム・DCF-DAなどの色素による活性酸素種の検出を行う。すでに申請者はその方法を確立し、発表した論文にもデータを載せた(Sasaki Ozawa et al. Diabetologia 2010)。また、標識した視細胞はフローサイトメトリーを用いて選択的に回収することとする。既に当大学施設内にあるフローサイトメトリーを利用する許可は得てあり、予備実験ののち、視細胞回収の実験を開始する。未使用額の発生は、効率的な物品調達を行った結果である。
PCRおよびMLRを用いた放射線照射後のヒト口腔癌患者における癌細胞の変態推移

SiHa cellのin situ hybridizationおよびin situ PCRを行い、HPV#16のsingle copyの検出に成功した。PCR direct sequenceを用いヒトN-ras61領域103bpをPVC18、HincIIsiteにvector insentし、Dye terminator反応を行ったところ、controlと比較して、267bp(base pair)に明らかなpositivityを確認した。P53、ras-1領域の放射線照射前および照射後のpoint mutationの有無PCR-SSCP法を用いて、検索しようと試みた。whole tissueからDNAのみを取り出すことは難しく、DNAのpurificationの正確度を上げるのに時間を費やした。SiHa cellのin situ Hybridizationおよびin situ PCRの実験をH9、8、188、22に行い,HPV #16のsingle copyの検出に成功した。この手技を、p53およびRas 1の今後の検出に用いる予定である。H9、8、258、30に、PCR direct sequencingを用い,ヒトN-ras 61/領域103bp(base pair)をpvc18 HincII siteにinsertし、Dye terminator反応をみたところ,267bpに、明らかなpositivityをみた。今後、このdirect sequencingをp53に用いる。
発痛時の神経伝達物質受容体,セカンドメッセンジャー,DNA結合蛋白動態の解析

痛覚のモデル動物を作成し、発痛時の各受容体の発現動態や三叉神経系での特異的なプローブを用いて検索した。ホルマリン顔面部片側注入により片側疼痛モデル動物を作成後、148時間後および7日後の三叉神経節や脳を取り出し組織切片を作成しアミノ酸需要体の核酸プローブを合成しinsituhybridization法を行った。その結果、痛覚刺激によって受容体の産生能は、変化しないことがわかった。また、三叉神経節での抑制性アミノ酸受容体(GABA_A receptor)のサブユニットの共存についても検索を行った結果、三叉神経節細胞においてγ1、γ2サブユニットが約75%の細胞で共存していた。このことにより、三叉神経の知覚を司る神経細胞は、γ-aminobutyricacid(GABA)の入力を受けていることが示唆された。さらに、三叉神経痛覚伝導二次路である三叉神経脊髄路核尾側核(TNC)の視床後内側腹側核(VPM)へ投射しているニューロンがどんな入力をうけているかを検索した。その結果、VPMへ投射しているニューロンは、TNCの辺縁層に多く認められ、この投射ニューロンは、GABA_Areceptorγ1サブユニット抗体に対し陽性を示し、投射ニューロンもGABA入力を受けている可能性が示唆された。以上より三叉神経系の知覚伝導路の一次及び二次経路の間でGABAを有する介在ニューロンによる情報修飾が行われていることが示唆された。一方、上記のモデルを用いて疼痛時に発現する未知の(あるいは既知の)遺伝子の検索も分子生物学的手法(Differencial Display法)によって行っている。発痛時の三叉神経節より総RNAを抽出,精製しPCR法にて増幅し電気泳動にて展開した。その結果5本のバンドを回収し,現在insituhybridization法によりスクリーニングを行うと同時に塩基配列を決定中である。三叉神経系における神経伝達物質受容体の役割を明かにするべく次の項目に関して検索した。2)視床へ投射するニューロンに対するアミノ酸入力GABA_A受容体には,多くのsubunitが存在し,それらがcomplexを作って受容体を形成していることが明かとなった。今回は,特に生理活性作用発現に重要とされるgammasubunitに関してそのmRNAをin situhybridization法を用いて検索した。さらに連続切片を作成し同一細胞での共存発現に関しても検索した。その結果,三叉神経節全細胞のうちほとんどの細胞がgamma2subunitを発現し,gamma1とgamma2subunitの共存率は,約75%であった。また,免疫組織化学にて受容体蛋白の存在も明かとした。2)視床へ投射するニューロンに対するアミノ酸入力三叉神経系の二次路として三叉神経脊髄路核から視床後内側腹側核への経路が存在する。まず,その経路を明かにするべく視床後内側腹側核へretrogradetraceであるFluoro-Gold(FG)を注入し3-5日後に脊髄路核を含めた延髄を摘出した。摘出標本を15-20mumの切片に切り出しAMPA型glutamate receptor(GluR1,GluR2/3)およびGABA_Areceptorgamma1,gamma2subunitの各抗体にて反応させた。その結果,FG陽性細胞のほとんどがGABA_Areceptorgamma1およびgamma2subunit陽性であった。また,GluR1,GluR2/3陽性反応は,FG陽性細胞の一部でのみ認められた。

これは,視床へと投射するニューロンはGABA作働性システムである事を示し,AMPA型受容体を介するグルタミン酸作働性システムは,多くが介在神経を介していることが明かとなった。尚,介在神経のマーカーとなるenkephalinとGluR1,GluR2/3との共存を連続切片にて明かにもした。痛覚のモデル動物を作成し、発痛時の各種受容体の発現動態や三叉神経系での分布を特異的なプローブを用いて検索した。ホルマリン顔面部片側注入により片側疼痛モデル動物を作成後、148時間後および7日後の三叉神経節や脳を取り出し組織切片を作成しアミノ酸受容体の核酸プローブを合成しinsituhybridization法を行った。その結果、痛覚刺激によって受容体の産生能は、変化しないことがわかった。また、三叉神経節での抑制性アミノ酸受容体(GABA_Areceptor)のサブユニットの共存についても検索を行った結果、三叉神経の知覚を司る神経細胞は、γ-aminobutyricacid(GABA)の入力を受けていることが示唆された。さらに、三叉神経節痛覚伝導二次路である三叉神経脊髄路核尾側核(TNC)の視床後内側腹側核(VPM)へ投射しているニューロンがどんな入力を受けているかを検索した。その結果、VPMへ投射しているニューロンは、TNCの辺縁層に多く認められ、この投射ニューロンは、GABA_Areceptorγ1サブユニット抗体に対し陽性を示し、投射ニューロンもGABA入力を受けている可能性が示唆された。以上より三叉神経系の知覚伝導路の一次及び二次経路の間でGABAを有する介在ニューロンによる情報修飾が行なわれていることが示唆された。一方,上記のモデルを用いて疼痛時に発現する未知の(あるいは既知の)遺伝子の検索も分子生物学的手法(Differencial Display法)によって行っている。発痛時の三叉神経節より総RNAを抽出,精製しPCR法にて増幅し電気泳動にて展開した.その結果5本のバンドを回収し,現在insituhybridization法によりスクリーニングを行うと同時に塩基配列を決定中である.
皮膚の光シグナル変換機序の解明とその機能の探索

われわれはこれまでに皮膚の光受容に関する研究を行ってきた。現在までに、哺乳類では網膜の神経節細胞に発現が確認されているメラノプシン(OPN4)がヒト皮膚に発現していることを組織レベルおよび単離された細胞(線維芽細胞、メラノサイト、ケラチノサイト)において確認した。さらにこれらはセカンドメッセンジャーであるGnaqとも共役していることを免疫沈降実験で確認した。本研究課題ではこれらのシグナルトランスダクションがどの程度細胞内において変換され、それらがどのようは表現系を持つのか、ということに焦点を当てている。本年度はこれまで行ってきた実験データの補強を中心に行った。これらの多くが論文投稿に際し査読者からのコメントへの対応となる。まず、免疫染色においては共焦点レーザー顕微鏡により高解像度の蛍光画像を得た。これにより、OPN4が細胞膜を中心に極在化しており、Gnaqはその内側に主に局在することが明らかとなった。また、表皮を構成する細胞マーカー(cytokeratine 5)およびメラノサイトマーカー(Tyrosinase)を用いてOPN4を発現している細胞が明らかにケラチノサイトおよびメラノサイトであることを確認した。なお、OPN4は表皮基底層に多く発現しており、表層ではその発現が乏しくなることが明らかとなった。さらにヒト網膜組織を購入し、これによりポジティブコントロールを得た。次にBmal1およびPer2の発現について、光照射によりサーカディアンリズムが形成されることを示すため、検体数(n数)を増やし、検定を行った。これにより、明らかに青色光(480nm)の照射によりリズムがリセットされることを示した。また、光照射によるカルシウム取り込みがOPN4を介することを間接的に示すため、Gqの特異的阻害薬YM-254890を用いてカルシウム取り込みが阻害されることも示した。われわれは現在、皮膚の光受容に関する研究を行っている。以前よりわれわれは、網膜で発現が確認されている視物質の一つであるメラノプシンが皮膚に発現していることを発見した。一方で、この光需要タンパク質が実際に機能しているのか、あるいは異所性に発現をしているのみであるのか、についての探索を行った。まず、われわれはヒト皮膚より単離・継代培養された繊維芽細胞においてメラノプシンの発現を確認した。またそのセカンドメッセンジャーであるGnaqの共発現も確認した。一方で、これらが実際に細胞内で共役しているのか、を確認しるためにメラノプシンおよびGnaqそれぞれで免疫沈降実験を行い、それぞれのカウンターとなるタンパク質でのウェスタンブロッティングにより、これらの共役の確認を行った。その結果、いずれにおいても共役していることが明らかとなった。つまり、皮膚線維芽細胞において発現しているメラノプシンは少なくともセカンドメッセンジャーであるGタンパク質と共役しており、GPCRとしての機能を持つことが示唆された。次に、網膜の細胞においてはGPCRである視物質が光により活性化した場合、細胞外からのカルシウムイオンの取り込みおよび小胞体からのカルシウムイオンの放出があること、また、それにより神経細胞としての活動電位をもつことが示されている。皮膚線維芽細胞は神経細胞ではないがイオンチャネルが存在しており、光照射によって同様の所見が得られる可能性がある。われわれはカルシウム指示薬を用いて光照射、とくにメラノプシンの感受性波長とされる480nm近傍の光を照射することでカルシウムを取り込むのか、の検討を行った。その結果、光照射により細胞にカルシウムの取り込みが確認され、その後、経時的にはカルシウムを放出することが明らかとなった。カルシウムアッセイの立ち上げ・実際のデータ採取まで到達しており、当初の計画通りである。昨年度はカルシウムアッセイを行い、OPN4感受性光を細胞に照射することで細胞はカルシウムイオンを取り込むことが明らかとなった。これにより皮膚細胞は光受容を行い、これを細胞内シグナルへと変換し、利用していることが強く示唆される結果となった。ただし、その表現形はどのようになるのか、については不明である。われわれはそこでOPN4が中枢で行っている役割、つまり、このOpsinは視機能には関連せず(すくなくとも脊椎動物では)、体内時計に関連することから、皮膚細胞においても体内時計を司るのではないか、と推測し、Per2およびBmal1といった時計遺伝子の発現量の日内リズム形成を探った。5日間の暗順応ののち、コントロールとしてデキサメタゾンを加えることで、細胞集団としての時計のリセットが確認された。次に暗順応をおこなった細胞に10分間の480nmの光照射を行ったところ、これら遺伝子の発現量の日内変動が形成されることが明らかとなった。本結果により、皮膚の光受容は末梢性生体時計のリセットであることが示唆された。時計遺伝子の解析まで行えた。これは研究開始当初に想定していたよりも大幅な進展である。

現在までに、哺乳類では網膜の神経節細胞に発現が確認されているメラノプシン(OPN4)がヒト皮膚に発現していることを組織レベルおよび単離された細胞(線維芽細胞、メラノサイト、ケラチノサイト)において確認した。さらにこれらはセカンドメッセンジャーであるGnaqとも共役していることを免疫沈降実験で確認した。本研究課題ではこれらのシグナルトランスダクションがどの程度細胞内において変換され、それらがどのようは表現系を持つのか、ということに焦点を当てている。本年度はこれまで行ってきた実験データの補強を中心に行った。これらの多くが論文投稿に際し査読者からのコメントへの対応となる。まず、免疫染色においては共焦点レーザー顕微鏡により高解像度の蛍光画像を得た。これにより、OPN4が細胞膜を中心に極在化しており、Gnaqはその内側に主に局在することが明らかとなった。また、表皮を構成する細胞マーカー(cytokeratine 5)およびメラノサイトマーカー(Tyrosinase)を用いてOPN4を発現している細胞が明らかにケラチノサイトおよびメラノサイトであることを確認した。なお、OPN4は表皮基底層に多く発現しており、表層ではその発現が乏しくなることが明らかとなった。さらにヒト網膜組織を購入し、これによりポジティブコントロールを得た。次にBmal1およびPer2の発現について、光照射によりサーカディアンリズムが形成されることを示すため、検体数(n数)を増やし、検定を行った。これにより、明らかに青色光(480nm)の照射によりリズムがリセットされることを示した。また、光照射によるカルシウム取り込みがOPN4を介することを間接的に示すため、Gqの特異的阻害薬YM-254890を用いてカルシウム取り込みが阻害されることも示した。皮膚組織においてのカルシウムアッセイを行い、実際に取り込みが生理的条件下で行われているのか、あるいはその細胞の分極は隣接する細胞に伝播されるのか、について検討を行いたい。また同様の研究をケラチノサイト・メラノサイトについても行う予定である。さらに研究成果については現在、国際誌投稿にむけて論文執筆中である。今後、これらのデータのbrush upを行う必要がある。今回の時計の確認は線維芽細胞において行ったが、これらの現象が普遍的に他の細胞でも見られることを確認する必要がある。また、現在、本研究内容の公表にあたり国際誌への投稿を準備しているが、これを作成することも今後の方針である。抗体やカルシウム指示薬などの再利用によりコストの削減を行ったこと、学会出張旅費を計上しなかったことによる。抗体や試薬などの再利用によりコストの削減を行ったこと、学会出張旅費を計上しなかったことによる。来年度は抗体の購入・細胞培養関連試薬の購入に用いる。今後も最大限のコスト削減を図るが、さらに研究を進めるとともに得られたデータを学会発表を通して公開する。また、皮膚細胞におけるvivo実験が困難な場合、培養皮膚モデルの購入を行うなどの経費に充てる。
特別支援学校（聾学校）の「話し合い」活動の基本技術に関する研究

聴覚障害幼児の言語指導法である口声模倣に焦点を当て研究を進めた。教師が示す言葉のモデルを模倣によって学習する口声模倣は、子供の言語発達に応じて意図的に行われており、これは直接には表出にかかわる練習場面であるが、内容理解にも関連が深いこと、対象となる言葉は、授業展開や子供の非言語表現から必然性の高いものが選択されていることが確認された。教師は、視覚的手がかりを駆使して指導に当たっていること、口声模倣場面の中では言葉の意味の確認作業が頻繁に行われることが明らかになり、口声模倣という方法が、聴覚障害幼児の日本語習得に有効な手法であることが示唆された。聴覚障害のある幼児の言語指導法の中心的手法となる口声模倣について中心に研究を進めた。まず第一に先行研究や授業実践記録から、口声模倣の定義を明らかにし、その前提となる事柄、言葉の選択の問題、方法上の問題、評価の問題についてまとめた(日本特殊教育学会第51回大会にて報告)。第二に、研究協力校(大学の倫理審査で承認を受け、関係者からの同意を得た)を訪問(3回)し、指導場面等を記録し、分析、検討を実施した。この記録に際しては、記録を補完する目的で予定通り一部録画を行った。本期間で収集した記録のうち36場面について、目的や手法の分析を行った。このうち、前半に集めた9場面について、論文としてまとめた(「教職研究」弟6号、信州大学全学教育機構教職教育部、2013)。第三に、講師を招聘し、学習会「難聴児のための発音指導」を企画(当日、大雪のため予定通りの開催は断念し、規模を大幅に縮小せざるを得なかった)、資料冊子として「難聴児のための発音指導」(全133頁)を作成し、参加者及び長野県内特別支援学校(聾学校)の校内研修用資料として配布した。執筆は、聴覚障害児の発音指導の研究及び実践に取り組んでいる筑波大学の板橋安人氏他1名に依頼し、研究代表者も加わり、発音発語指導の基礎的事柄、指導の意義、方法、評価方法等について最新情報を交えた構成とした。この資料は、聴覚障害幼児の言語指導に関する研究の今後の方向性を示したものと言える。なお、作成した資料冊子は、一部、研究代表者が関連する県外校にも配布し、新しい年度以降の校内研修の資料としての活用をお願いしている。前年度の研究成果を踏まえ、継続して聴覚障害のある幼児の言語指導法として活用される口声模倣に焦点を当て研究を進めた。まず、前年度に作成した資料冊子「難聴児のための発音指導」をもとに講師2名を招聘し学習会を企画、開催した(6月)。学習会には長野県内および隣県である山梨県から合計約50名の参加者を得た。また、北海道教育オーディオロジー研究協議会講習会(8月)において「言語指導」について講演を行い、その中で,本研究の成果の一部を報告した。さらに日本特殊教育学会第52回大会(9月)において口声模倣場面36場面について、場面数、言葉の選択、教師の指導意図、手法の4つの観点から分析を行った。さらに、口声模倣の前提として補聴器や人工内耳の活用など子供の聴覚活用を促すことが不可欠であること等から、教育オーディオロジーの学習会を企画し(2月開催)、資料冊子「教育オーディオロジー山梨学習会講座資料」を編集、発行した。この中で口声模倣についての研究のまとめを掲載した。研究全体の成果として、口声模倣が子供の言語発達に応じて意図的に行われていること、口声模倣は直接には表出にかかわるが内容理解に関連していること、対象の言葉は授業展開で必要や言葉、子供の非言語表現の言語化、単語から文への拡充等、授業の展開や子供の表現上必然性が高いものが選択されていること、場面の中では言葉の意味の確認作業が頻繁に行われること、教師は視覚的手がかりを活用する等様々に手法を駆使すること等が確認され、聴覚障害幼児の日本語習得に有効な手法として口声模倣が位置づけられることを明らかにできた。特別支援教育過去の授業実践に関する資料がすでに多くあること、現在の授業実践についても訪問先の学校から協力を得られていることが概ね順調であることの主な要因である。また、様々な言語指導の指導技術の中から「口声模倣」の指導技術に絞ったことによって、分析が行いやすくなったことも良かったと考えている。一方、このことによって、収集できる資料が限定されてしまうという側面もあった。平成25年度と同様に、口声模倣を中心に具体的な言語指導場面について分析を行う。資料については、頻繁に口声模倣が行われている過去の録画資料も積極的に活用する。具体的な指導場面については、さらに分析を進め、指導者の指導意図、対象となる言葉の選択、発達段階における手法の特徴等について明らかにする。

また、言語指導にかかわる背景的な事項として、聴覚活用の意義や方法、学習のレディネスを形成方法、さらに前言語期段階における言語発達につながる発達支援についても考察を行い、今後の課題を明らかにしていく。ほぼ予定通りに執行できたが、当初計画より安価に航空券を購入できたこと、2月15日に企画していた学習会が大雪のために予定を大幅に変更した実施になったことから手話通訳者の派遣を中止したこと等により、次年度使用額が生じた。物品費として70,000円(内訳:DVDディスク、SDカード、USBメモリ、資料保存用ハードディスクほか)、旅費として270,000円(内訳:調査旅費4回(北海道旭川市1回、千葉県市川市2回、兵庫県西宮市1回ずつを予定)、講師旅費4名分を予定)、人件費として120,000円(講師謝金、手話通訳費ほか)、その他として183,508円(報告資料製本、発送ほか)を予定。(金額はおおよその額)
肥満におけるアディポサイトカイン異常と病態発症機構の解析

肥満形成過程早期より脂肪組織マクロファージはダイナミックに活動しS100A8阻害により抑制された。アディポネクチンは定常状態より脂肪組織間質細胞や大動脈内皮細胞に結合しており、肥満では脂肪組織間質への集積が増加、動脈硬化ではプラーク内平滑筋細胞に集積した。大動脈局在にはT-cadherinが必須であった。急性冠症候群では低アディポネクチン血症にも関わらず流血中でC1qとの複合体濃度が増加していた。アディポネクチンは新たな概念の内分泌因子と考えられた。2型糖尿病症例で全身血管エコーや内臓脂肪評価を行いメタボリックシンドローム型は特に多発性動脈硬化病変やアディポサイトカイン異常と関連していた。わが国は欧米にくらべ高度肥満者は少ないが、肥満度が軽度でも腹腔内腸間膜周囲の内臓脂肪蓄積が、インスリン抵抗性、2型糖尿病、脂質異常、高血圧、脂肪肝炎、慢性腎臓病、高尿酸血症、さらに動脈硬化疾患等、多彩な病態と関わる。内臓脂肪蓄積による病態発症のメカニズムは未だ明らかでないが、脂肪細胞絶対量より機能異常が問題と考えられる。私達は脂肪組織局所の炎症、低酸素、酸化ストレス蓄積などの機序を示してきた。これらにより脂肪細胞の機能異常、特にアディポサイトカインと呼ぶ脂肪細胞内分泌因子の異常がおこる。私達が発見し機能解析を進めてきたアディポネクチンは血中濃度が低下し、種々の臓器の酸化ストレス蓄積や線維化などの病態に関与する。本研究は、これら一連の異常を一つの病態として確立し、効率的な予防医学に繋げるため、内臓脂肪蓄積および特にアディポネクチンの物性に着目し、低アディポネクチン血症の成因、アディポネクチンの血中での動態、低アディポネクチン血症による病態発症機構について検討を進める。本年度は、アディポネクチン分泌に関わる低酸素の影響を内臓脂肪、皮下脂肪別に示した(JAT2010)。さらにアディポネクチンと慢性腎臓病(アルブミン尿)との関連を検討し、内臓脂肪蓄積の重要性を示した(Atherosclerosis 2010,Diabetes Care 2010)。内臓脂肪蓄積の性差と肥満関連動脈硬化疾患危険因子の関係、内臓脂肪蓄積抑制による心血管疾患抑制について示した(JAT 2010,Atherosclerosis 2010)。またアディポネクチンの組織結合性、血中での複合体形成に関わる検討を進めた。2型糖尿病、動脈硬化疾患は現代の大きな健康問題である。本研究は肥満におけるアディポサイトカイン異常と病態発症機構を解明しようとするものである。本年度は全身血管プラーク評価を中心に解析した。2型糖尿病例に頚動脈、腎、大動脈、総腸骨動脈の血管プラークを定性的評価し罹患血管数によりプラークスコアを算出。63%が複数の血管にプラーク病変を有するpolyvascular disease(PVD)であった。多変量解析ではPVDの存在が冠動脈疾患の予測因子となった。内臓脂肪蓄積に加え他のリスクファクターを有するメタボリックシンドローム(MetS)型は61%を占め、PVDの予測因子はMetSの存在であった。S100A8-S100A9複合体はカルプロテクチンと呼ばれtoll-like-4受容体に作用し動脈硬化症とも関連するとされる。人間ドック健診受診者500例で、血中S100A8-S100A9複合体濃度はBMI、内臓脂肪面積、皮下脂肪面積、白血球数と正相関した。マウスにおいて、S100A8、S100A9は脂肪組織に発現していた。肥満マウスでmRNA量は増加したが、驚いたことにS100A8 mRNAは成熟脂肪細胞画分で、S100A9 mRNAはStromal vascular画分(macrophagesを含む)で高発現し、血中濃度の上昇を認めた。脂肪組織内で異種細胞に由来する分子が複合体を形成し、脂肪組織炎症や流血を介し動脈硬化プラーク形成に関与する新たなアディポサイトカイン機構が示唆された。アディポネクチンの臓器集積、血中タンパク結合性についても解析を進めた。心筋梗塞などの動脈硬化疾患は生命予後や生活の質に関わり、特に糖尿病に伴っておこる病態への対策は我が国を始め世界的健康課題である。教室では内臓脂肪蓄積が血糖、脂質、血圧の異常を伴う頻度の高い動脈硬化疾患基盤であり、多彩な脂肪細胞由来因子(アディポサイトカインと呼ぶ)の異常がマルチプルリスクを介し、あるいは直接的に血管傷害に関わる可能性を示してきた。

本研究は1)アディポサイトカイン、特に教室で見出したアディポネクチンを中心に分子特性や血管病態に関する基礎研究を行い、平行して2)内臓脂肪と血管病に関する臨床研究を行って、メタボリックシンドローム型糖尿病に対する動脈硬化疾患予防に貢献しようとするものである。アディポネクチンは血中に多量存在し動脈硬化巣や傷害臓器に集積し抗動脈硬化、抗炎症作用を示すことを報告してきた。本年度の検討で、1)アディポネクチン蛋白が定常状態より大動脈血管内皮細胞上に多量存在し血管防御に関わることを示した。さらに主要産生臓器である脂肪組織でマクロファージを含む間質細胞画分にアディポネクチン蛋白が存在し肥満で増加した。KOマウスに野生型血清を静注すると外来性アディポネクチンは大動脈に加え脂肪組織間質細胞に分布し後者は肥満で増加した。大動脈や肥満脂肪組織への集積という新たな特性を示した。2)糖尿病や冠動脈疾患では血中アディポネクチン濃度が低下している。詳細に検討するとアディポネクチンの一部は補体C1qと複合体を形成し、糖尿病の中でも冠動脈疾患合併例では総アディポネクチンに占めるC1q-アディポネクチン複合体の比率が高く質的異常をきたしていると考えられた。3)臨床病院との共同研究で、内臓脂肪蓄積が疑われる腹部肥満糖尿病に脂質や血圧異常、さらに心血管疾患合併頻度が高いことを報告した。このような例では成人以後の体重増加が大きく、若年期からの予防医学が重要と考えられた。心筋梗塞を始めとする動脈硬化疾患は生活の質と予後に影響を与える重要な疾患である。現在、脂質代謝・血圧の異常を合併するメタボリックシンドローム(MetS)型糖尿病が頻度の高い基盤となっている。MetS型糖尿病は内臓脂肪蓄積による脂肪細胞機能異常が背景にあると考えられる。本研究は1)アディポサイトカイン、特に教室で見いだしたアディポネクチンの特性や血管病態に関する研究を進め、2)内臓脂肪蓄積と血管病に関する臨床研究を行って効率良い対策に繋げようとするものである。1)動脈硬化は一種の炎症プロセスと捉えられる。アディポネクチンと構造的相同性をもつ補体C1qとの複合体が血中に存在し、急性冠症候群では低アディポネクチン血症にも関わらずC1q-アディポネクチン複合体が相対的に増加しアディポネクチンの質的異常がみられた。アディポネクチンは炎症関連分子であるC1qをトラップする可能性が考えられた。2)アディポネクチンの心血管系における微細局在を検討した。アディポネクチンは定常状態から心臓や大動脈に存在した。大動脈では血管内皮細胞管腔惻に存在し、細胞内や基底膜惻にも検出された。この局在にはT-cadherinが必須であり、アディポネクチン欠損では大動脈T-cadherin蛋白が減少するpositive feedback機構が存在した。動脈硬化巣(apoE KO)では内皮細胞に加え、プラーク内の平滑筋細胞に集積していた。3)糖尿病症例に内臓脂肪評価、全身血管エコー、食行動の調査を行う臨床研究をおこなった。内臓脂肪蓄積群は非蓄積群に比べ、全身プラークスコアが高く、アディポネクチン濃度が低かった。また特に男性で食行動の偏りが強かった。一連の研究よりアディポネクチンの特性が明らかになった。また内臓脂肪評価、血管エコーを活用して食行動、生活習慣の改善に繋げていくことは重要である可能性が示された。動脈硬化性疾患の予防は重要な健康課題である。
多様な筋幹細胞による新奇筋線維型制御機構の解明

骨格筋細胞の筋線維型(遅筋および速筋)は、食肉の質と深い繋がりがあるため、これを自在に制御出来れば食肉生産技術向上へ大きく貢献できる。筋線維型を決定する主な要因は、成熟した筋細胞を取り巻く運動神経支配による影響だと広く定義されている。しかし、筋成長、肥大および再生の過程で重要な役割を担う筋幹細胞(衛星細胞)が、互いに融合して新たに形成する筋細胞(筋管)の筋線維型は、神経支配の影響を受ける前に衛星細胞からの分泌因子によって制御される「早期決定機構」が存在するという仮説を着想した。これまでに、遅筋から単離した衛星細胞において速筋よりも多量に分泌される多機能性細胞制御因子semaphorin 3A(Sema3A)が、筋管の遅筋化を誘導することを突き止めたが(Tatsumi et al. 2017. STEMCELLS;鈴木貴弘2018.食肉の科学)、速筋化誘導因子に関しては全く不明である。そこで本研究では、候補因子として、筋芽細胞で発現しかつ神経系や骨系などにおいてSema3Aと拮抗した生理機能を発揮するNetrin familyに着目した。平成30年度は、前年度において速筋化誘導因子の有力な候補としてピックアップしたNetrin-1に着目した研究活動を展開した。衛星細胞由来の筋芽細胞が、融合して筋管を形成する過程において、RNA干渉法によりNetrin-1の発現を抑制した。その際、筋線維型のマーカーとなるミオシン重鎖(myosin heavy chain; MyHC)アイソフォームのうち、速筋型MyHCのタンパク質発現量が減少した。さらに、速筋型MyHCの中でも超速筋型としてカテゴライズされるMyHC IIb型が特異的に減少しており、Netrin-1は筋管の速筋化誘導に関与することが明らかとなった。なお、遅筋型MyHCの発現量の変化は認められなかった。骨格筋細胞の筋線維型(遅筋・速筋・中間型筋)は食肉の質と深い繋がりがあるため、これを自在に制御出来れば食肉生産技術向上へ大きく貢献できる。筋線維型を決定する主な要因は、成熟した筋細胞を取り巻く運動神経支配による影響だと定義されている。しかし、筋成長・肥大・再生に重要な役割を担う筋幹細胞(衛星細胞)が、互いに融合して新たに形成する筋細胞(筋管)の筋線維型は、神経支配の影響を受ける前に衛星細胞からの分泌因子によって制御される「早期決定機構」が存在するという仮説を着想した。これまでに、遅筋から単離した衛星細胞から速筋よりも多量に分泌される多機能性細胞制御因子semaphorin 3A(Sema3A)が、筋管の遅筋化を誘導することを突き止めたが(本機能に関しては論文投稿中)、速筋化誘導因子に関しては全く不明であるため、本研究ではその候補因子の探索ならびに仮説の妥当性を検証する。平成28年度は、速筋化誘導因子候補の同定とその発現パターンの変化を調べた。その候補として、Sema3Aと同様に多機能性であるnetrinfamily(netrin-1, 3および4)に着目した。netrin familyは筋芽細胞にて発現することがすでに報告されていることに加えて、神経系においてnetrin familyはSema3Aとは正反対の生理機能を発揮することが報告されていることから、筋線維型の制御においてもSema3Aとは逆の速筋化誘導作用を有すると期待された。実際に、分化期の衛星細胞においてnetrin familyの発現が増加することや、速筋由来の衛星細胞では遅筋よりもnetrin familyの発現が高い傾向にあることを突き止めた。さらに、Sema3A発現を抑制した筋芽細胞株においてnetrinの発現が代替的に増加する現象が認められた。遅筋および速筋それぞれの衛星細胞におけるnetrin familyの発現パターンを突き止めたが、速筋化誘導機能の検証に至らなかったため。これまでに、遅筋から単離した衛星細胞において速筋よりも多量に分泌される多機能性細胞制御因子semaphorin 3A(Sema3A)が、筋管の遅筋化を誘導することを突き止めたが(Tatsumi et al. 2017. STEM CELLS)、速筋化誘導因子に関しては全く不明である。そこで本研究では、その候補因子として、筋芽細胞で発現し、かつ神経系においてSema3Aと拮抗した生理機能を発揮することが報告されているnetrin familyに着目した。平成29年度は、netrin-1, 3, 4および5とその受容体(neogenin, BOC, CDO, UNC5A, UNC5B, UNC5CおよびUNC5D)の発現パターンを詳細に調べた。その結果、Sema3Aと同様に衛星細胞の分化誘導後に発現量が増加し、筋管形成期から成熟期にかけて減少する様相を示したnetrin familyのサブタイプは、netrin-1であることを明らかにした。

興味深いことにnetrin-1の発現パターンは、Sema3Aとは逆に速筋から単離した衛星細胞において遅筋よりも高かったため、速筋化誘導因子として機能する可能性が高いと考えられた。その他のサブタイプでは、大きな発現変動は認められなかった。また、衛星細胞において発現が認められたnetrin familyの受容体はneogenin, BOC, CDO, UNC5BおよびUNC5Cであった。しかし、速筋および遅筋から単離した衛星細胞における発現量の差は認められなかった。netrin familyの速筋化誘導機能の有無の直接的な検証には至らなかったが、詳細な発現パターンの検証によりnetrin-1が有力な候補因子となることを明らかにした。また、衛星細胞で発現するnetrin familyの受容体を絞り込めたため、次年度以降の検証作業がスムーズに進めることが期待される。骨格筋細胞の筋線維型(遅筋および速筋)は、食肉の質と深い繋がりがあるため、これを自在に制御出来れば食肉生産技術向上へ大きく貢献できる。筋線維型を決定する主な要因は、成熟した筋細胞を取り巻く運動神経支配による影響だと広く定義されている。しかし、筋成長、肥大および再生の過程で重要な役割を担う筋幹細胞(衛星細胞)が、互いに融合して新たに形成する筋細胞(筋管)の筋線維型は、神経支配の影響を受ける前に衛星細胞からの分泌因子によって制御される「早期決定機構」が存在するという仮説を着想した。これまでに、遅筋から単離した衛星細胞において速筋よりも多量に分泌される多機能性細胞制御因子semaphorin 3A(Sema3A)が、筋管の遅筋化を誘導することを突き止めたが(Tatsumi et al. 2017. STEMCELLS;鈴木貴弘2018.食肉の科学)、速筋化誘導因子に関しては全く不明である。そこで本研究では、候補因子として、筋芽細胞で発現しかつ神経系や骨系などにおいてSema3Aと拮抗した生理機能を発揮するNetrin familyに着目した。平成30年度は、前年度において速筋化誘導因子の有力な候補としてピックアップしたNetrin-1に着目した研究活動を展開した。衛星細胞由来の筋芽細胞が、融合して筋管を形成する過程において、RNA干渉法によりNetrin-1の発現を抑制した。その際、筋線維型のマーカーとなるミオシン重鎖(myosin heavy chain; MyHC)アイソフォームのうち、速筋型MyHCのタンパク質発現量が減少した。さらに、速筋型MyHCの中でも超速筋型としてカテゴライズされるMyHC IIb型が特異的に減少しており、Netrin-1は筋管の速筋化誘導に関与することが明らかとなった。なお、遅筋型MyHCの発現量の変化は認められなかった。筋芽細胞株を用いたnetrinノックダウンまたは過剰発現実験系を確立し、筋管における各筋線維型特異的マーカーの発現変化を調べることで、直接的に速筋化誘導作用の有無を検証する。さらに、遅筋および速筋に局在する衛星細胞のnetrin familyとその受容体の発現パターンをより詳細に比較するため、組織化学的手法を用いた検証を行う予定である。衛星細胞の初代培養系や筋芽細胞株を用いたnetrin-1の過剰発現または発現抑制の両実験系を確立し、筋線維型のマーカーとなる成熟型ミオシン
放射性廃棄物の地層処分におけるセメント溶出物質の粘土バリア材料に及ぼす影響評価

放射性廃棄物の地層処分において、地下水等からもたらされるCa^<2+>イオンによるベントナイト緩衝材の性能劣化に関する検討を行うため、ベントナイトの主たる構成鉱物であるNa型モンモリロナイト中のCa^<2+>イオンの拡散係数を測定した。乾燥密度1.01.8Mgm^<-3>に圧密したNa型モンモリロナイト中で得られた見かけの拡散係数は、拡散温度298Kにおいて1.7×10^<-11>6.0×10^<-12>m^2s^<-1>であった。Ca^<2+>イオンの拡散係数は、それぞれの乾燥密度において、Na^+イオンの拡散係数の約4分の1であり、このことからNa型モンモリロナイトのCa型化への変質にはCa^<2+>イオンの拡散が律速となることが示唆された。一方、見かけの拡散係数の温度依存性から求めた活性化エネルギーは、乾燥密度1.01.6Mgm^<-3>において自由水中の値(17.3kJmol^<-1>)とほぼ等しいほぼ一定の値(18.319.7kJmol^<-1>)となったのに対し、乾燥密度1.8Mgm^<-3>では、活性化エネルギーは25.1kJmol^<-1>に急激に増加した。このようなCa^<2+>イオンの拡散の活性化エネルギーの乾燥密度依存性は、他の陽イオン(Na^+、Sr^<2+>イオン)のものと異なっており、特に乾燥密度1.8Mgm^<-3>における急激な増加は、従来の拡散モデルである細孔拡散モデルでは説明できない。そこで、X線回折法によって求めたモンモリロナイトの底面間隔の乾燥密度依存性に関するデータと併せて検討を加えた。その結果、Ca^<2+>イオンは乾燥密度1.01.8Mg m^<-3>においてモンモリロナイト層間を拡散していること、また乾燥密度1.8Mg m^<-3>における活性化エネルギーの急激な増加は、層間距離が3水分子層から2水分子層に減少したことに起因するものであることが示唆された。放射性廃棄物の地層処分において、地下水等からもたらされるCa^<2+>イオンによるベントナイト緩衝材の性能劣化に関する検討を行うため、研究初年度である平成11年度は、ベントナイトの主たる構成鉱物であるNa型モンモリロナイト中のCa^<2+>イオンの拡張係数を測定した。また、その温度依存性から求めた活性化エネルギーは、乾燥密度1.01.6Mgm^<-3>において自由水中の値(17.3kJmol^<-1>)とほぼ等しいほぼ一定の値(18.319.7kjmol^<-1>)となったのに対し、乾燥密度1.8Mgm^<-3>では、活性化エネルギーは25.1kJmol^<-1>に急激に増加した。こうしたCa^<2+>イオンの拡散の活性化エネルギーの乾燥密度依存性は、他の陽イオン(Na^+、Sr^<2+>イオン)のものと異なっており、特に乾燥密度1.8Mgm^<-3>における急激な増加は、従来の拡散モデルである細孔拡散モデルでは説明できない。ここでは、Na型およびCa型モンモリロナイトを混合した懸濁液の場合Ca^<2+>イオンは選択的に層間に入るとされていることなどから、Na型モンモリロナイト中のCa^<2+>イオンは層間内拡散によって移行している可能があると考え、X線回折法によって求めたモンモリロナイトの底面間隔の乾燥密度依存性に関するデータと併せて、検討を加えた。このようなCa^<2+>

イオンの拡散の活性化エネルギーの乾燥密度依存性は、他の陽イオン(Na^+、Sr^<2+>イオン)のものと異なっており、特に乾燥密度1.8Mgm^<-3>における急激な増加は、従来の拡散モデルである細孔拡散モデルでは説明できない。そこで、X線回折法によって求めたモンモリロナイトの底面間隔の乾燥密度依存性に関するデータと併せて検討を加えた。その結果、Ca^<2+>イオンは乾燥密度1.01.8Mg m^<-3>においてモンモリロナイト層間を拡散していること、また乾燥密度1.8Mg m^<-3>における活性化エネルギーの急激な増加は、層間距離が3水分子層から2水分子層に減少したことに起因するものであることが示唆された。
北陸地域における古代窯業開始期の須恵器生産に関する基礎研究

北陸の古代窯業を考える上で、その成立事情や定着の様相を解明することは重要である。その趣旨のもと、本研究では北陸の須恵器生産開始期の各窯群資料(興道寺窯、金津窯、南加賀窯、羽咋窯、鳥屋窯、園カンデ窯、射水窯)及び消費遺跡資料について、観察記録付記、実測図作成、写真撮影を行い、北陸諸窯の基礎資料作成に努めた。また、北陸と同時期に成立する播磨、丹波、近江の畿内周縁諸窯の資料調査を行うことで、生産開始期の特徴や北陸諸窯との類似性などを探った。本調査により、須恵器生産開始期の北陸諸窯には6世紀を通じて継続生産する窯群と6世紀前半をもって衰退する窯群とがあることを確認した。前者は若狭、越前、加賀の窯群、後者は能登、越中の窯群で、その生産動向の違いには、生産開始期における5世紀末の在地窯出現の画期と6世紀2/4期の須恵器生産の地方定着(地方窯成立)の画期の、2つの画期が作用していることを確認した。在地窯出現期は須恵器生産の国内中枢窯である陶邑窯からの直接的技術導入により行われ、陶邑窯産須恵器を地方で忠実に再現することが基本であった。陶邑窯に匹敵する高水準の優品生産と稚拙な須恵器生産とが併存することがその特徴で、それは当期の試行的な生産状況を反映したものと理解した。須恵器生産の地方拡散により、陶邑窯産須恵器の付加価値は次第に薄れ、地方における陶邑窯模倣生産は衰退する。能登・越中の窯群衰退は陶邑窯産の付加価値低下とともに興ったものであり、北陸西部諸窯は陶邑窯型須恵器からの解脱を図る中で、独自の生産形態を生み出すことで発展したと理解した。これが地方窯成立の画期であり、そこには陶邑窯とは異なる窯業技術が介在し、朝鮮半島を含む、広域地方間の技術交流が生み出したものと性格づけるに至った。また、以上の在地窯出現から地方窯成立までの過程は畿内周縁諸窯においても確認でき、類型化できることがわかった。
MR画像をベースとした深層学習による脳循環画像の予測・生成の試み

脳卒中で損傷した脳組織が治療可能かを見極めるバイオマーカーとして,PETやMRIを用いた脳循環の評価が行われているが,撮像時間の延長や被検者への負担など困難が伴う.本研究課題ではルーチンで撮像されるMR画像をベースとした深層学習による脳循環画像の予測・生成を試み,簡便・正確に脳循環を評価できる方法の提案を目指す.脳卒中で損傷した脳組織が治療可能かを見極めるバイオマーカーとして,PETやMRIを用いた脳循環の評価が行われているが,撮像時間の延長や被検者への負担など困難が伴う.本研究課題ではルーチンで撮像されるMR画像をベースとした深層学習による脳循環画像の予測・生成を試み,簡便・正確に脳循環を評価できる方法の提案を目指す.
神経インターフェイス技法にもとづく重症心不全治療法の開発

目的:全く新しい治療戦略として、迷走神経の電気刺激による心不全治療法を提案し、実験的にその効果を検証する。また、本療法の作用機序をあきらかにし、薬物によるVNS療法の代替療法を開発する。結論:塩酸ドネペジルは心筋梗塞後心不全のリモデリングを防止し、心機能を改善する。これらの作用は、VNS療法と同様であった。したがって、塩酸ドネペジルは、VNSの代替的薬物療法の有力な候補と考えられる。また、本療法の作用機序をあきらかにし、治療プロトコールを最適化するために、本療法が不全心における機械的、電気的、および微小循環的リモデリングに与える影響を評価する。方法:左冠状動脈起始部の結紮により、左室の40-50%が梗塞におちいった慢性心不全ラットの右迷走神経に刺激電極を固定し、植え込み型電気刺激装置と接続した。刺激強度は、心拍数が10-20%低下する程度にした。迷走神経刺激療法は6週間でうち切り、血行動態・心臓リモデリングに与える影響と140日間の長期生存率を観察した。結果:(1)血圧は、梗塞後心不全群は、健常群に比べ、有意に低かった。梗塞後心不全群は、健常群に比べ、左室拡張末期圧の有意な上昇と左室圧一次微分最大値の有意な低下を示したが、迷走神経刺激療法により、左室拡張末期圧の有意な減少と左室圧一次微分最大値の有意な上昇が認められた。両心室重量が、梗塞後心不全群では有意な増加を示したが、迷走神経刺激療法により有意に減少した。以上の結果は、6週間の迷走神経刺激療法によってポンプ機能が改善し心室リモデリングが予防されたことを示唆する。(2)刺激群22例のうち死亡は3例、非刺激群30例のうち死亡は15例であった(P=0.008)。このように、迷走神経刺激療法は相対的死亡リスクを73%も減少させた。この効果は、アンジオテンシン変換酵素阻害薬によるものよりもさらに良好な成績であった。平成20年度は迷走神経刺激療法(VNS)の心不全ラットの生命予後と心機能に与える影響の評価を行った。H21.4H22.10は迷走神経刺激(VNS)療法が心不全ラットにおける運動負荷中の心機能に与える影響の評価を行った。迷走神経の役割を解明するための"心臓のアセチルコリン(ACh)合成系を増強したマウスの作成"が遅れたため実験計画に6ヶ月の遅延が生じた。結果:1.VNSは、心筋細胞内のACh合成に関わる律速酵素コリンアセチルトランスフェラーゼ(ChAT)を誘導した。2.VNSは、心筋細胞内のAChレベルを12時間以内に上昇させた。3.心筋細胞内のACh合成系を増強したマウスは、強い虚血耐性を示した。4.VNSと同様の効果をアセチルコリンエステラーゼ(ACh-E)阻害薬により再現できた。5.ACh-E阻害薬の中で、塩酸ドネペジルが最も強い心保護作用を示したが、その作用は、ニコチン受容体阻害薬、ムスカリン受容体阻害薬あるいは、両者の同時投与によっても抑制することができなかった。結論:VNSは、心筋細胞内のACh合成を誘導し、細胞内AChレベルを上昇させることによって、心保護作用を発揮する。また、塩酸ドネペジルは、ACh受容体を介さずに、心筋細胞内AChレベルを上昇させ、心保護作用を発揮する。前年度までの成果:1.VNSは、心筋細胞内のACh合成に関わる律速酵素コリンアセチルトランスフェラーゼを誘導した。

以上の結果から、VNSは、心筋細胞内のACh合成を誘導し、細胞内AChレベルを上昇させることによって、心保護作用を発揮する、また、塩酸ドネペジルは、ACh受容体を介さずに、心筋細胞内AChレベルを上昇させ、心保護作用を発揮することがあきらかになっている。方法:塩酸ドネペジルを飲料水に溶解し、一日用量が、5mg/kg相当になるようにし、無作為に割り符けた心筋梗塞心不全マウスと偽手術マウスに投与し、心不全発症12週後にランゲンドルフ潅流心で心機能を評価した。結果:塩酸ドネペジルは、収縮期末圧容積関係における容積軸切片を減少させ、収縮期末エラスタンスを上昇させた。また、左室拡張期末圧容積関係を緩徐にし、心重量を減少させた。結論:塩酸ドネペジルは心筋梗塞後心不全のリモデリングを防止し、心機能を改善する。これらの作用は、VNS療法と同様であった。したがって、塩酸ドネペジルは、VNSの代替的薬物療法の有力な候補と考えられる。