hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
虚血性心筋症におけるユビキチン転移酵素ITCHの機能解明

ユビキチン転移酵素ITCHは、Thioredoxin-interacting protein(TXNIP)をユビキチン化し、タンパク質分解を促した。TXNIPは酸化ストレスとアポトーシスの増悪因子である。培養心筋細胞において、ITCHを過剰発現し、TXNIPを強力に抑制することで、活性酸素種刺激に対して、酸化ストレスやアポトーシスを抑制した。更に、心筋特異的ITCH過剰発現マウスを用いて、ドキソルビシン心筋症や急性心筋梗塞モデルを検討したところ、心保護効果や生存率の改善を認めた。ITCHは、酸化ストレスやアポトーシスの内在性調節因子であり、新たな治療ターゲットとなる可能性が示唆された。虚血性心筋症は、心筋梗塞後にさまざまな細胞内シグナルが複雑に絡み合い発症する。HECT型ユビキチン転移酵素は、タンパク質をユビキチン修飾することで分解し、細胞内シグナルを調節することが報告された。HECT型ユビキチン転移酵素ITCHは、標的タンパク質を分解することで、細胞死や細胞形態を調節する。本研究では、ITCHが標的タンパク質を分解することで、心筋細胞内シグナルに与える影響を検討するとともに、マウス心筋梗塞モデルや虚血再灌流モデルを作成し、心保護的に働くか検討を行うことを目的とした。平成26年度は、HECT型ユビキチン転移酵素ITCHを過剰発現したITCHトランスジェニックマウスを確立した。こちらに対して冠動脈結紮による心筋梗塞モデルを作成し、心機能評価および生存率を比較検討した。ITCH過剰発現マウスは、野生型マウスと比較して、7日、14日、28日のいずれの段階においても、有意に心収縮能が保持されており、左室拡大は軽度であった。ITCH過剰発現マウスは心筋のリモデリングを抑制することを発見した。また、心筋梗塞作成後28日における生存率を比較したところ、ITCH過剰発現マウスは野生型マウスに比較して有意に生存率が高率であった。これらの結果を踏まえて、ITCHを心筋特異的に過剰発現することで心筋保護的に働くことが示された。ITCHが虚血性心筋症発症に関与していること、心保護的に働く可能性が示唆され、新たな治療標的となる可能性が示唆された。HECT型ユビキチン転移酵素は、タンパク質をユビキチン修飾することで分解し、細胞内シグナルを調節する。また、HECT型ユビキチン転移酵素ITCHは、標的タンパク質を分解することで、細胞死や細胞形態を調節する。ITCHが標的タンパク質を分解することで、心筋細胞内シグナルに与える影響を検討するとともに、マウス心筋梗塞モデルや虚血再灌流モデルを作成し、心保護的に働くか検討を行った。研究過程で、ITCHがp73やDvl-1を分解し、Wnt/βカテニンシグナルを調節していることを示した。これらのシグナルの確立が実験期間内に検証するには期間が不十分であったため、標的タンパク質としてを酸化ストレスとアポトーシスによる細胞死を調節するTXNIPを追加し、詳細なシグナルを検討した。最終的に、ユビキチン転移酵素ITCHを心筋細胞に過剰発現することで、TXNIPとp73を分解し、p38MAPKとp53のリン酸化を抑制し、intrinsic pathwayによる心筋細胞のアポトーシスを抑制することを発見した。以上を踏まえて、心筋特異的ITCH過剰発現マウスを作成し、心筋梗塞におけるITCHの意義を検討した。ITCH過剰発現マウスは、野生型マウスに比較して心筋梗塞巣を縮小し、心筋のリモデリングを抑制した。心筋梗塞後、28日の生存率を比較したところ、ITCH過剰発現マウスは有意に生存率が高率であった。以上からユビキチン転移酵素ITCHは標的タンパク質を分解することで酸化ストレスを抑制し、心筋細胞のアポトーシスを抑制することを介して心筋保護的に働くことが示された。ITCHは新たな治療ターゲットになりうる可能性が示唆された。本研究の実験系は、細胞培養による細胞実験とITCH過剰発現マウスに対する冠動脈結紮による虚血再灌流モデルおよび心筋梗塞モデルを作成する動物実験から構成される。心筋梗塞モデル作成は、技術を要すること、経時変化を観察する必要があり、最も時間が必要な実験系であった。平成26年は、ITCH過剰発現マウスに対して心筋梗塞モデルを作成し、経時的な心機能を観察し、ITCHを心筋特異的に発現することで心機能が保持されることを示した。また、ITCH過剰発現マウスは野生型マウスに比較し、心筋梗塞後28日における生存率が改善した。以上からITCHを過剰発現すると心筋保護的に働くことが明らかになった。心筋梗塞後28日に、マウスを屠殺し、心臓を摘出し、サンプルを凍結保存した。

今後は、ITCHが心筋組織においてp73やDvlと相互作用するかこれらのサンプルを用いて、ImmunoprecipitationやWestern blotで解析を行っていく。また、ITCHと標的タンパク質のmRNAに関しても、RealtimePCR法を用いて解析を行っていく予定である。他方、細胞実験は、p73やDvlの抗体や試薬が先述したITCHの機能解析と同様のものを使用予定である。細胞実験は新生仔ラット心筋培養の技術やITCHのプラスミド、siRNAを導入する技術を確立しており、細胞実験は開始している。細胞実験の実験系は約1週間で完了するため、心筋組織での検討と平行して効率的に行っていく予定である。また、虚血再灌流モデルを同様に作成していく、心筋梗塞モデルと比較して時間的には短時間で作成し、サンプルを回収することが可能である。27年度が最終年度であるため、記入しない。心不全平成27年の実験計画は、細胞実験を中心に施行していく。まず、心筋細胞刺激に対するITCHと標的タンパク質の発現量の変化を検討する。新生仔ラットの初代培養心筋細胞を用いて、H2O2刺激や低酸素刺激に対するITCHや標的タンパク質の発現量の変化を、ウェスタンブロット法やリアルタイムPCR法でタンパク質レベルおよびmRNAレベルで確認する。低酸素刺激やアンギオテンシン刺激に対してITCHが減少するか検討する。また、H2O2刺激や低酸素刺激に対して、p73、BID、Dvl-1の発現量の変化を検討する。次に、ITCHと標的タンパク質の相互作用を検討する。まず、免疫沈降法で、ITCHと標的タンパク質の結合を確認する。次に、アデノウィルスベクターを用いて、ITCHを心筋細胞へ導入し、標的タンパク質の発現量の変化をタンパク質レベルおよびmRNAレベルで検討する。リポフェクタミン3000を用いて、ITCH siRNAを心筋細胞へ導入し、同様に標的タンパク質の発現量を検討する。ITCHを過剰発現することで、標的タンパク質の発現量が低下した場合、非特異的プロテアソーム阻害剤(MG-132)を用いて標的タンパク質であるp73、BID、Dvl-1がユビキチン修飾によるタンパク質分解を受けるか検討する。最後に、ITCHノックダウンもしくは過剰発現後、心筋負荷刺激を行った際の細胞内シグナルの検討を行う。新生仔ラット心筋細胞において、ITCHの過剰発現やsiRNAを用いて機能的に抑制した際に、H2O2刺激や低酸素刺激に対する心筋細胞のアポトーシスを評価する。ITCH過剰発現が、エンドセリンやアンギオテンシンといった心筋肥大刺激に対してWnt signalを調節するか検討する。また、ITCHの過剰発現が心筋細胞の肥大に与える影響を小麦麦芽レクチン染色を用いて組織学的に検討する。
腫瘍抗原の発現と免疫系の認識に関する分子免疫学的解析

分子免疫学的手法を用いて、がん遺伝子の活性化に続くがん抗原遺伝子の活性化、がん抗原の発現、さらには免疫系による認識といった一連のプロセスを解明することを目的とし次の4つの計画を行い下記の成果を納めた。1.免疫系において重要な細胞膜腫瘍抗原の解析マウスメラノーマモデルでは腫瘍抗原がGM3(NeuAc)ガングリオシド様物質と蛋白分子が複合体を形成している分子で、抗体、CTLが認識する快定基が共に同一分子上に存在することを証明した。またモノクロナル抗体を用いてメラノーマ抗原遺伝子のクロン化にも成功した。その他、線維眼細胞肉腫や肝癌、骨髄腫細胞系を用いて抗原の多様性とそれによって誘導される反応型の相異を解析した。また腫瘍抗原に対する抗イデイオタイプ抗体を用いてそれが免疫系に重要な快定基となり得るか同定した。一方細胞の活性化に伴なって発現される抗原(110KD)も新らたに同定した。2.がん遺伝子およびがん化に伴なって変化する遺伝子の発現フィブロネクチン遺伝子、ras遺伝子を用いて発現調節に重要な頒域を同定し、5′未端プロモーター領域とExon1,2をクロン化し解析してる。3.細胞の分化脱分化過程に発現される内因性抗原と腫瘍抗原の相関白血病細胞系を用い脱がん化状態での膜蛋白遺伝子の発現変動を蛋白、mRNAレベルで検索し、そのいくつかの遺伝子単離を行なっている。4.腫瘍抗原遺伝子のクロン化に必要なベクター系の開発ウイルスプロモーターを両側端に持つ発現クローニングベクターの開発に成功し、効率良く機能することも確認した。一方モノクロナル抗体とpCV103コスミドベクターを用いてgenomicクローニングが可能であった。この系でメラノーマ抗原遺伝子のクロン化にも世界ではじめて成功した。
亜硝酸と食品成分との反応によって生じる変異原物質の固定

1.亜硝酸と反応させた食品たん白質の変化カゼイン、卵白アルブミンに亜硝酸を酸性下で反応させると、リヂン,アルギニン,チロシン殘基と共にトリプトファン殘基が著るしく損傷し、通常とは異なる5つの新しいアミノ酸が、アミノ酸溶出パターン上に現われる。そのうち3つはシステイン酸,メチオニンスルフオキシド,ニトロチロシンと推定した。2.亜硝酸とトリプトファンの反応から生じる変異原物質トリプトファンは酸性下で亜硝酸と反応すると多種類の変異原物質を生じ、その変異原性は他のアミノ酸からの生成物に比べて著るしく高かった。反応液をTLCに供すると8つのスポットを与えたので各スポットからの抽出殘さについて変異原性(Ames test),DNA損傷性(Rec-assay)を測定した。2つのスポットが強い変異原性を示したので今回は最も強い活性を示したスポットからの物質の分離・同定を試みた。この物質をメチル化後GCに供すると2つのピークを与えたが、主生成物と思われるピークのMSから、この物質はN-ニトロソインドールプロピオン酸と推定した。3.酸性下で亜硝酸と反応したBHAから生じた変異原物質食品成分とはいえないが、食品添加物として油脂食品に用いられてきたBHAも酸性下で亜硝酸と反応し、強い変異原活性を生じることを見出した。この反応液のTLCは9つのスポットを与えたが、各スポットからの抽出殘さについてAmes testを行い、2つのスポットに変異原活性が認められた。このうちより活性の強かった物質を結晶化し、機器分析値から、2-tert-butyl-p-quinone(t-BQ)と同定した。このt-BQは以前に我々がDNA損傷性はあるが、変異原性は認められないと報告した物質であるが、今回濃度を変えてAmes testを行い、0.11μmol/plate投与で顕著な変異原性を有することを明らかにした。
中赤外フェムト秒パルスの波形整形と量子制御への応用

1.中赤外極短パルス光源の開発中赤外フェムト秒パルスの光源開発では、量子制御実験に望まれるコヒーレントかつ広帯域な中赤外光源の開発にむけて、2波長化チタンサファイアレーザーパルスの差周波混合を試みた。波長変換用の非線型光学結晶としてAgGaS_2を用い、広い帯域幅の中赤外光発生をめざして2波長非同軸入射による差周波混合を試みた。結果として中心波長10μm、半値全幅200cm^<-1>以上の広帯域中赤外光を得た。中心波数で割った相対的な帯域幅は20%を越えており、分子振動の励起に用いた場合、高振動励起状態にアクセスするために充分な帯域を確保できたと思われる。2.波形整形による量子制御基礎実験波形整形技術の開発と応用をめざした研究では、波形整形による選択的励起のデモンストレーションとしてセシウム原子の^7D_<3/2>及び^7D_<5/2>状態を選択する2光子励起確率の制御を試みた。パルス幅86fs、パルスエネルギー1nJの単一パルスを光変調器により位相相関パルス対に整形し、その位相差及び遅延時間を掃引して一方の遷移のみ励起確率がほぼゼロになるような条件があることを確認した。選択比のコントラストは、300fs程度の遅延時間でも10^3以上になることを見いだした。単一パルスの帯域幅が380cm^<-1>、スピン軌道分裂幅が21cm^<-1>であることを考えると、1パルスあたりの励起確率が充分小さい条件下では、不確定性限界以内の時間でも高選択的に光反応を起こせることを示した。また、任意のリニアチャープパルス対を対象として、パラメータを絞り込んだ最適制御実験を行い、ほぼ同じ選択比を示す同じメカニズム由来と思われるパルス波形に到達した。
高度な分子配列制御を指向した新規歪みフタロシアニンの創製

有機薄膜太陽電池や有機半導体デバイスにおいて、ドナー・アクセプター分子を目的に応じて、分子レベルで配列制御することは素子効率向上のために重要である。本研究ではドナー・アクセプターの組み合わせとして有望なフタロシアニンとフラーレンの配列制御を指向して、フラーレンと構造的に親和性の高い歪み構造を有するフタロシアニンの外周部に水素結合や配位結合などの分子間相互作用部位の導入を試みた。いくつかの目的としていた新規歪みフタロシアニンの合成には成功したものの、最終的なフラーレンとの構造体の構築には至っていない。しかしながら本研究で得られた知見は今後につながるものであり、継続して研究を行っていく。本研究では有機薄膜太陽電池や有機半導体への応用が期待されているフタロシアニン(Pc)とフラーレンのドナー・アクセプターの組み合わせにおいて、その効率向上を指向して、置換基により高度に歪んだ構造を持つPcを用いることで、両分子の配列制御を分子レベルで行うことを目的としている。Pc間の相互作用としては、配位結合および水素結合などの超分子相互作用を考えている。研究初年度の本年は、基盤となる分子の合成を主に行っており、これまでに歪みPcのα位の置換基をフェニルからピリジル基あるいはp-メトキシフェニル基に置き換えた分子の合成を試みた。それぞれ前駆体であるフタロニトリルの合成には成功しており、各種測定により同定している。しかしながら、これらのフタロニトリルの反応性は予想よりも低かったために、目的のPcの合成には至っていない。そこで8カ所あるα位の4カ所にピリジル基あるいはp-カルボキシフェニル基を有するPcでも同様の検討を行えると考えて、他のフタロニトリルとの混合縮合により、部分的にこれらの置換基を有するPcの合成を試み、その生成を質量分析等で確認した。現在、ピリジル基を有するPcで外部配位によるmetal-organic-frameworkの合成を検討している。また超分子相互作用を利用した構造体の構築ではゲル特性を持つPcも有用であると考え、ゲル化作用を有する置換基の導入を行うために、まず軸配位性を有する金属錯体の合成に着手している。研究計画2年目の本年度は、初年度に合成した3,6位に配位部位としてピリジル基を、あるいは超分子結合部位としてカルボキシフェニル基を有するフタロニトリルを用いて、フタロシアニン合成を行ったが、鋳型金属イオンにこれらの官能基が配位するためか、フタロシアニン自体の合成が困難であることがわかった。そこでオクタカルボキシフタロシアニンを用いて、酸無水物とした後にアミド化することで配位部位の導入を試みた。目的のカルボキシフェニル基を有するフタロシアニンの合成に最終的には成功したが、遷移金属イオンを用いた配位高分子化にはこれまでのところ成功していない。本萌芽研究で得られた知見を基にさらに多くの金属イオンや水素結合を用いた集合体の形成を試みる。有機物理化学・錯体化学研究初年度は、Pc合成の前駆体であるフタロニトリルが既知では無かったために、その合成にかなりの期間がかかってしまった。最終的に合成反応に用いることが可能な量のフタロニトリルが得られたが、予想に反して、これらのフタロニトリルの反応性が低く、目的のPc合成には至っていない。これは研究が萌芽的であることから、起こりうる事態であり、その解決策として部分的にピリジル基あるいはp-カルボキシフェニル基を有するPcに目的化合物を切り替えて合成研究を行った。最終的にこれらのPcの合成に成功したことから、当初研究計画まで研究の進捗を回復出来たと考えている。またこの合成研究に必要なフタロニトリルの合成法の開発や反応性などの基本的な知見が得られたことも重要な研究成果である。さらにゲル特性を持つPcの合成にも着手していることから、当初研究計画で予定していた構造体の構築には至っていないが、萌芽的な研究内容であることを考慮すると、総合的にはまずまずの進捗状況であると言える。研究2年目は、まず初年度に行うことが出来なかった構造体の構築を優先して行う。また初年度のフタロニトリルの合成は多段階であったので、より簡便な合成法の開発も併せて行う。原料合成に研究期間の大半を割くことになるが、これは構造体構築に適したPc骨格を作り上げることが、この分野のブレークスルーとなることから、不可避であるからである。

具体的にはフタロニトリルの3,6位をハロゲン化し、各種反応により、その部分への置換基導入を行う。研究期間内に構造体構築まで達成して、構造体に予想される各種物性(光エネルギー変換能、伝導特性)についての評価を行いたい。今年度の研究を効率的に進めたことに伴い発生した未使用額である。平成26年度請求額と合わせて、平成26年度の研究遂行に必要な物品費と謝金に使用する。
地層処分・余裕深度処分のためのベントナイト緩衝材の水分拡散係数データベースの構築

高レベル放射性廃棄物地層処分や余裕深度処分の地下施設におけるベントナイト系緩衝材は,地下水の浸入に伴い不飽和から飽和へと遷移する.不飽和状態における緩衝材の挙動は,飽和状態に比べ十分な検討がなされていないのが現状であり,定量的な評価が求められている.そこで本研究では,各種ベントナイトの吸水特性を調査し,緩衝材の水分移動特性を評価する手法を提案した.本研究で提案した水分拡散係数評価手法は,緩衝材の仕様や材料となるベントナイトの基本的性質,周囲の水質から,緩衝材となるベントナイトの水分拡散係数を算出できるため,緩衝材の効率的な材料選定に貢献できる.H24年度では,新たに4連式の吸水量測定用差圧計付きビュレット管パネルを製作し,既設の「高鉛直圧(500kPa10000kPa)・標準口径(直径60mm)供試体用膨潤圧・膨潤変形特性試験装置」に接続し,水分拡散係数データが比較的取得されている国産のクニゲルV1を用いて,実験方法の妥当性を確認した.具体的には,既往の測定結果(遠藤さち恵,小峯秀雄らの第9回環境地盤工学シンポジウム発表論文等)と比較し,妥当であることを確認した.そして,代表的な4種類の粉体状ベントナイト試料を用いて,上記の吸水量測定実験を行い,算出される水分拡散係数のデータ・ベースの基本形・プロトタイプを構築した.また,今回製作した4連式吸水量測定用差圧計付きビュレット管パネルでは,実際の処分施設における地下水圧相当の圧力を負荷できるように,二重管ビュレットとして設計・製作を行った.この機能を活用し,実処分環境を模擬して,00.7MPaの範囲で地下水圧を負荷した状態での吸水量の経時変化を測定し,種々の拘束圧,地下水圧条件における水分拡散係数データの取得を開始した.現段階のデータでは,地下水圧の値に依存せず,水分拡散係数の値は,材料仕様条件に応じて一定であることが示唆される.これについては,次年度以降の測定データに基づき,その再現性を確認の上,精査した結論を得る予定である以上の実験的検討により得られたデータに基づき整理した結果,いずれも水分拡散係数も,初期乾燥密度による影響は小さいことが推察された.次年度以降は,より多くの実験条件での水分拡散データの取得を進め,データの再現性を確認するとともに,測定データの変動幅を詳細に調査し,測定精度を考慮した水分拡散データの使用方法を検討する.H25年度は,前年度に設計・製作した4連式の吸水量測定用差圧計付きビュレット管パネルを「高鉛直圧(500kPa10000kPa)・標準口径(直径60mm)供試体用膨潤圧・膨潤変形特性試験装置」に接続し,次に示す条件での実験を進め,得られたデータに基づき算出される水分拡散係数のデータ・ベースの拡充を進めた.【平成25年度前半】1粒状ベントナイトの水分拡散係数データベースの基本形構築開始,20.20.4MPaの水圧環境下での5種類の粉体状ベントナイトの水分拡散係数データの測定,3模擬海水環境下での5種類の粉体状ベントナイト水分拡散係数データの測定【平成25年度後半】1粒状ベントナイトの水分拡散係数データの拡充,20.50.7MPaの水圧環境下での5種類の粉体状ベントナイトの水分拡散係数データの測定,3模擬コンクリート溶脱水環境下での5種類の粉体状ベントナイト水分拡散係数データの測定現段階での水圧環境下での水分拡散係数データから,いずれの種類のベントナイトとも,水圧の値に依存せず,水分拡散係数の値は,材料仕様条件に応じて一定であることが示唆される.現段階までに得られた水質条件を考慮した水分拡散係数データからは,乾燥密度の高い条件では,水質の影響は小さいことが示唆されている.次年度以降も,より多くの実験条件,水質条件での水分拡散データの取得を進め,データの再現性を確認するとともに,測定データの変動幅を詳細に調査し,測定精度を考慮した水分拡散データの使用方法を検討する.平成26年度は,4連式の吸水量測定用差圧計付きビュレット管パネルを「高鉛直圧(500kPa10000kPa)・標準口径(直径60mm)供試体用膨潤圧・膨潤変形特性試験装置」に接続し,以下の実験条件において水分拡散係数データの取得を行った.平成26年度前半は,以下の項目を実施した.すなわち,1中型口径実験による粒状ベントナイトの水分拡散係数データの拡充,20.1MPaの水圧環境下での粒状ベントナイトの水分拡散係数データの測定,3模擬海水環境下での粒状ベントナイト水分拡散係数データの測定平成26年度後半は,以下の項目を実施した.すなわち,1中型口径実験による粒状ベントナイトの水分拡散係数データの拡充,20.20.4MPaの水圧環境下での粒状ベントナイトの水分拡散係数データの測定,3模擬コンクリート溶脱水環境下での粒状ベントナイト水分拡散係数データの測定平成26年度までに得られた実験データから,いずれの種類のベントナイトとも,本実験で設定している水圧条件下では,水分拡散係数の値には大きな変動は認められていない.

また,乾燥密度の高い条件においては,水分拡散係数に及ぼす水質の影響は小さいものと推察される.次年度は,今まで得られた実験条件において得られた水分拡散係数データを取りまとめ,材料仕様や応力条件に応じて水分拡散係数が設定できるデータベースの構築を行う.これらのデータベースの構築では,地層処分施設の再冠水時の数値解析で利用できるデータベースを目指す.緩衝材の水分移動特性を評価する手法を提案することを目的に,昨年度までの実験的結果と本年度の実験結果を総合的に取りまとめ,次の結論を得た.1蒸留水環境における各種ベントナイトの吸水特性を実験的に調査した結果,ベントナイトの吸水特性は,供試体に含まれるモンモリロナイトおよび空気間隙の量に依存することがわかった.同一の空気間隙率においては,モンモリロナイトの体積含有率が高いものほど,高い吸水度を示す傾向がある.ただし,粒状ベントナイトは,相対的に乾燥密度が高い粒状体を多く含有することによって,粉体状ベントナイトにに比べて低い吸水度を示すと考えられる.2各種ベントナイトの人工海水環境下における吸水特性の実験的な調査結果から,ベントナイトのモンモリロナイト含有率が低い試料の場合,供試体の乾燥密度が低いほど,吸水特性に及ぼす人工海水の影響が大きく,吸水度が増加することがわかった.3モンモリロナイト結晶層の濾過機能の観点からは,有効モンモリロナイト密度が約1.45 Mg/m3以上の範囲では,海水成分が吸水特性に及ぼす影響は小さいと考えられる.4単位断面積のモンモリロナイトに対する吸水度Sm (m/√sec)を用いて吸水特性を評価する手法を提案した.また,地下水環境下においては,蒸留水環境下における吸水度を基準とした吸水度の比を求め,蒸留水環境下における吸水度に乗じることで吸水特性を表現する手法を提案した.5以上の成果から,地下水環境に拡張可能な水分拡散係数評価手法を提案した.高レベル放射性廃棄物地層処分や余裕深度処分の地下施設におけるベントナイト系緩衝材は,地下水の浸入に伴い不飽和から飽和へと遷移する.不飽和状態における緩衝材の挙動は,飽和状態に比べ十分な検討がなされていないのが現状であり,定量的な評価が求められている.そこで本研究では,各種ベントナイトの吸水特性を調査し,緩衝材の水分移動特性を評価する手法を提案した.本研究で提案した水分拡散係数評価手法は,緩衝材の仕様や材料となるベントナイトの基本的性質,周囲の水質から,緩衝材となるベントナイトの水分拡散係数を算出できるため,緩衝材の効率的な材料選定に貢献できる.研究申請時の計画の通りに設定した実験条件で実験を進めた.以上からおおむね順調に進展していると自己評価した.27年度が最終年度であるため、記入しない。地盤工学申請時の研究計画に準拠して進める.水分拡散係数データの信頼性をさらに向上させるため,同条件での実験も行い,データの再現性を確認する.研究初年度の計画の通りに,実験装置の整備と測定精度の再現性の確認を行えた.また,代表的な粉体状ベントナイト試料の水分拡散係数のデータベースの基本形・プロトタイプの構築を行えた.以上から,おおむね順調に進展していると自己評価した.研究申請時の計画の通りに設定した実験条件,水質条件での実験を実施できた.以上から,おおむね順調に進展していると自己評価した.27年度が最終年度であるため、記入しない。所属大学の異動に伴い,実験装置の設置および調整を行う必要が生じた.本年度は主に,実験装置の移設を行い,次年度に調整をしながら実験を進める必要があることから,次年度使用額(繰り越し分)1,872,627円の繰り越しの必要が生じた.27年度が最終年度であるため、記入しない。申請時の研究計画にしたがって進める.また,水分拡散係数に関するデータベースの信頼性は,データ量に依存するので,再現性を確認するための実験の充実を行う.
ランタン六方ホウ化物ナノワイヤを用いた新型電子エミッタの開発に関する研究

最近、我々は、世界ではじめで化学気相堆積(CVD)法で希土類六ホウ化物の単結晶ナノワイヤの作製に成功した。このような六ホウ化物のナノワイヤは先端の直径が100nmで、長さは数μmである。本研究は、これらのナノワイヤを用いて、高輝度・ナノサイズ高分解能電界放射型陰極および熱放射エミッタを試作することと希土類六ホウ化物の単結晶ナノワイヤの特性評価を行い、一次元ナノ材料の新奇物性及び応用を探索することを目的とする。今年度では、LaB_6をナノワイヤ等にナノ構造化する技術を確立することとLaB_6ナノワイヤ電子源の作製及び特性評価また、ナノワイヤの表面のクリーニングを行った。具体的に、1)我々が世界で初めて開発したシステムによるナノワイヤのピックアップでは、水平と垂直に設置された光学顕微鏡により、大気中で、耐熱金属支持針へ選択されたナノワイヤを配置させ、左右と上下の配向調整ができ、また、付着している不要なナノワイヤを除くこともできた。2)また、LaB_6ナノワイヤの基板への装着および電子源作製プロセスを確立し、電子源の特性評価には欠かせない装置であるナノ構造電子源電界放出型特性装置の開発も進んだ。3)コンタミネーションのあるLaB_6試料にクリーニング処理を行った結果、電圧の上昇とともにナノワイヤ表面の原子像が明瞭化している様子がわかる。表面の清浄化とともにワイヤ先端の形状が変化していることも別途確認されている。電界蒸発により、LaB_6単結晶ナノワイヤは清浄化され、明瞭なフィールドエミッションパターンが得られている。希土類六ホウ化物の応用の一つとして電界放射型陰極がある。電界放射型陰極は、熱陰極に較べ輝度が約1,000倍も高いため、走査型電子顕微鏡をはじめ、各種の電子線装置にすでに適用されている。電界放射型陰極の材料に一般的に望まれる性質は、機械的強度が大であること、イオンスパッタ率が小さいこと、高融点であること、蒸気圧が低いことなどである。希土類六ホウ化物はこれらの条件を満たす材料の一つである。例えば、硬度はWより4倍硬く、イオン衝撃に強い。また、仕事関数はWが4.5eVであるが、LaB_6は2.8であり、Wと較べて優れた電界放射特性を示している。単結晶LaB_6の熱陰極の輝度はWの100倍あり、よく知られているように熱陰極として現在実用化されている。しかし、単結晶LaB_6は加工性が悪く、チップの最小先端径が5-100μmと、シャープなチップの作製が困難なために、電界放射型陰極の素材として使えない。最近、われわれは世界で初めて、化学気相堆積(CVD)法による希土類ホウ化物(LaB_6)単結晶ナノワイヤの作製に成功した。これらのホウ化物ナノワイヤは、先端の直径が数十nmで長さは数μmあり、電界放射型陰極として非常に有望である。本研究では、これらのナノワイヤを用いて、ナノサイズ高分解能電界放射型陰極を試作することと希土類ホウ化物の単結晶ナノワイヤの他の応用及び基礎物性を探索することを目的とした。内容としては、1)高品質ホウ化物の単結晶ナノワイヤを作製し、その電界放射特性や力学特性を測定した。2)ナノサイズ高分解能電界放射型陰極の作製を試みた。これまでの研究により、汎用電界放射型陰極の場合より一桁低い真空度を使用するにもかかわらず、希土類ホウ化物の単結晶ナノワイヤエミッタで輝度が一桁上がり、また、電流安定性がはるかに増加するという結果が得られた。最近、我々は、世界ではじめて化学気相堆積(CVD)法で希土類六ホウ化物の単結晶ナノワイヤの作製に成功した。今年度では、LaB_6をナノワイヤ等にナノ構造化する技術を確立することとLaB_6ナノワイヤの特性評価し、ナノワイヤの熱特性、電気的な特性、力学特性などを解明することを行った。具体的に、(1)化学気相堆積(CVD)法による六ホウ化物の単結晶ナノワイヤの作製プロセスの最適条件を確立した;CVD法によるLaB_6生成における基板上の触媒粒子の形状と分布やLaB_6生成原料のLaやBの導入量を最進化した。基板の加熱温度を均一化した。単結晶ナノワイヤ成長の最適化のための基板と触媒を選択した。(2)高品質希土類ホウ化物の単結晶ナノワイヤの作製と組織評価を行った;高品質サンプルの作製プロセスを確立すると同時に高分解能電子顕微鏡による希土類ホウ化物の単結晶ナノワイヤの組織及び形成機構の評価を行った。また、独自に開発したナノ精度を持つマニピュレータ制御システムを用いて、作製したLaB6ナワイヤの4端子電気抵抗測定、引っ張り強度測定などを行い、ナノワイヤの電気的な特性と力学特性を初めて明らかにした。(3)LaB_6電子源の作製

LaB_6を電界放射型電子源として用いるため、直径20nm300nm、長さ数μmの一本のナノワイヤを光学式ナノアセンブル技術により、金属針の先端に付着させ、電子ビームで接合させた。また、ナノ精度を持つマニピュレータ制御システムを立ち上げ、そのシステムを利用して、高精度光学顕微鏡下で、単一のLaB_6の単結晶ナノワイヤをピックアップし、電子源プローブと作製した。最近、我々は、世界ではじめで化学気相堆積(CVD)法で希土類六ホウ化物の単結晶ナノワイヤの作製に成功した。このような六ホウ化物のナノワイヤは先端の直径が100nmで、長さは数μmである。本研究は、これらのナノワイヤを用いて、高輝度・ナノサイズ高分解能電界放射型陰極および熱放射エミッタを試作することと希土類六ホウ化物の単結晶ナノワイヤの特性評価を行い、一次元ナノ材料の新奇物性及び応用を探索することを目的とする。今年度では、LaB_6をナノワイヤ等にナノ構造化する技術を確立することとLaB_6ナノワイヤ電子源の作製及び特性評価また、ナノワイヤの表面のクリーニングを行った。具体的に、1)我々が世界で初めて開発したシステムによるナノワイヤのピックアップでは、水平と垂直に設置された光学顕微鏡により、大気中で、耐熱金属支持針へ選択されたナノワイヤを配置させ、左右と上下の配向調整ができ、また、付着している不要なナノワイヤを除くこともできた。2)また、LaB_6ナノワイヤの基板への装着および電子源作製プロセスを確立し、電子源の特性評価には欠かせない装置であるナノ構造電子源電界放出型特性装置の開発も進んだ。3)コンタミネーションのあるLaB_6試料にクリーニング処理を行った結果、電圧の上昇とともにナノワイヤ表面の原子像が明瞭化している様子がわかる。表面の清浄化とともにワイヤ先端の形状が変化していることも別途確認されている。電界蒸発により、LaB_6単結晶ナノワイヤは清浄化され、明瞭なフィールドエミッションパターンが得られている。
多機能増殖制御因子／新規ヒストンシャペロンGRWD1の新規機能解明

GRWD1は、RPL11-MDM2経路およびRPL23-MDM2経路を介してp53を抑制し、発がんを促進する新規がん遺伝子であることが明らかとなった。また、がん患者臨床サンプルを用いた解析から、ある種のがんにおいてはGRWD1の発現量が多い場合は予後不良となることが示唆された。今後、GRWD1発現量の検査が、有用な診断法となる可能性がある。また、GRWD1とRPL11(あるいはRPL23)の結合を阻害できる化合物を創出できたなら、有力な新規抗がん剤となる可能性も期待できる。(1)転写因子Puraの機能・制御へのGRWD1の関与の解明:まず、p53、GRWD1、Pura間の物理的相互作用が確認された。いくつかの細胞株で、GRWD1あるいはPuraをsiRNAで抑制すると、DNAダメージによるp53上昇レベルに変化がないにもかかわらずp21発現誘導が促進された。また、p53反応性p21プロモーターにおいて、GRWD1とPuraの過剰発現がp53発現による転写活性化を抑制することがわかった。ただ、現時点では影響は相乗的ではない。一方、GRWD1のChIP-Seqデータの解析から、p21プロモーター領域でp53結合部位とGRWD1結合部位の一部が近接していることが示唆された。以上結果は、GRWD1がp53と共にプロモーター部位に結合し、その転写活性化能を抑制制御している可能性を示唆している。GRWD1ががん細胞で過剰発現していることを考えると、これはp53機能を抑制することにより、発がん促進的に働いているのかもしれない。(2)ユビキチンリガーゼEDDの機能・制御へのGRWD1の関与の解明:GRWD1抑制によりEDD量が増加することがわかったが、これは転写レベルあるいは蛋白質分解レベルではないことが示唆されつつある。そこで、EDDの翻訳制御へ影響を与えている可能性を検討している。(3)GRWD1の核小体機能への関与の検討:GRWD1が核小体蛋白質RPL5やRPL23と強固に結合していることが明らかになりつつある。そこで、GRWD1が核小体機能・制御に関与している可能性の検討も新たに始めた。(1)転写因子Puraの機能・制御へのGRWD1の関与の解明これまでの結果から、GRWD1がp53と共にp53反応性プロモーター部位に結合し、その転写活性化能を抑制制御している可能性が示唆された。そこで、ChIPによりこの仮説の検証を試みたが、GRWD1抗体のロットの違いでChIPがうまく働かないトラブルがあり結果を得られなかった。この問題が最近解決したので、今後この点を明らかにして行きたい。加えて本年度は、1GRWD1の過剰発現が細胞においてp53応答経路を抑制することが明らかとなった。これは、p53の転写能抑制に加えて、下述する核小体ストレス応答経路の抑制の結果だと現在考えている。さらに、2GRWD1とHPV E7の発現により、ヒト正常線維芽細胞が足場非依存性増殖能を獲得することが明らかとなった。GRWD1が各種がん細胞株で過剰発現していることも併せ、GRWD1は新規のがん遺伝子であると考えている。(2)ユビキチンリガーゼEDDの機能・制御へのGRWD1の関与の解明EDDはDDB1及びVprBPと共にEDVP E3ユビキチンリガーゼ複合体を形成している。また、RPL23はMDM2ユビキチンリガーゼに結合しその活性を抑制することでp53を誘導し、核小体ストレス応答を引き起こす。そこで、EDD-DDB1-GRWD1がユビキチンリガーゼとしてRPL23の量的制御を行っている可能性を考えた。GRWD1の過剰発現によりRPL23タンパク質量が減少し、これはMG132添加により抑制された。次にsiRNAを用いてGRWD1を発現抑制した後、核小体ストレスを誘導したところ、RPL23量の増加が見られた。さらに、EDDの過剰発現でもRPL23量が減少し、GRWD1およびEDDの共発現で相乗的なRPL23量の減少が見られた。また、DDB1の過剰発現によってもRPL23量は減少した。加えてRPL23が細胞内でユビキチン化を受けており、それはGRWD1およびEDDの過剰発現で増加することも判明した。(1)転写因子Puraの機能・制御へのGRWD1の関与の解明これまでに、1GRWD1/PuraをsiRNAで抑制すると、DNAダメージ時にp21発現誘導が促進されること、2GRWD1/Puraの過剰発現がp53による転写活性化を抑制すること、等が明らかとなっていた。そこで、GRWD1のp53反応性プロモーター部位への結合をChIP法で解析しようとしたが、バックグラウンドシグナルが強く、抗GRWD1を使用した解析が上手くいっていない。一方、Puraに関しては、当該プロモーターへの結合を観察することができた。加えて、GRWD1の過剰発現が細胞においてp53応答経路を抑制することが明らかとなった。これは、p53転写能の抑制に加えて、下述する核小体ストレス応答経路の抑制の結果だと考えている。さらに、GRWD1とHPV E7、活性型RASの共発現により、ヒト正常線維芽細胞ががん化することも明らかとなった。

また、GRWD1の過剰発現はがん患者において予後不良の予測因子となり得る可能性も示唆された。(2)ユビキチンリガーゼEDDの機能・制御へのGRWD1の関与の解明GRWD1はEDDユビキチンリガーゼおよび核小体蛋白質RPL23と結合している。RPL23はMDM2ユビキチンリガーゼに結合しその活性を抑制することでp53を誘導し、核小体ストレス応答を正に制御していると考えられている。そこで、EDD-GRWD1がユビキチンリガーゼとしてRPL23の量的制御を行っているという作業仮説で検討を行っている。昨年度までの解析で、1GRWD1およびEDDの共発現で相乗的なRPL23減少が見られること、3RPL23は細胞内でユビキチン化を受けており、そのユビキチン化がGRWD1およびEDDの過剰発現で増加すること、等が明らかとなっていた。本年度は、1精製EDDに組換えGRWD1を加えることで、試験管内でRPL23ユビキチン化を誘導できること、2RPL23過剰発現によるMDM2活性の抑制を、GRWD1過剰発現は部分的に打ち消すことができること、などを明らかにした。全体的に、概ね順調に進んでいると考えている。まず、「転写因子Puraの機能・制御へのGRWD1の関与の解明」については、上述のようにp53の転写能に対してGRWD1がPuraと共に抑制的に働き得るという極めて興味深い結果を得ており、さらに研究を進めている。次に、「ユビキチンリガーゼEDDの機能・制御へのGRWD1の関与の解明」についてであるが、EDD-GRWD1がユビキチンリガーゼとしてRPL23の量的制御を行っているということが明らかとなりつつある。RPL23はp53制御に関与する可能性が指摘されており、そのRPL23量の制御機構の解明は重要であろう。これら二つの新たなGRWD1の機能は、いずれもp53機能の抑制に結びつく。その結果として、GRWD1の過剰発現によるp53応答経路の抑制とがん化能促進が起こると考えられる。本研究費の支援を受けた研究から、総合的に以下のことが明らかとなった。1GRWD1はがん抑制因子RPL11と直接結合することでRPL11によるMDM2抑制を阻害し、結果としてp53誘導に対して抑制的に働く。2GRWD1をHPV16 E7、活性化Ras G12Vと共にヒト正常細胞に発現させると、細胞をtransformする。3このGRWD1のtransform活性は、RPL11との結合に依存している。以上から、GRWD1は新たながん遺伝子として機能していることが明らかとなった。更に、4transforming活性と一致して、GRWD1の過剰発現はp53が野生型のグリオーマ患者において予後不良と強く相関していた。変異p53をもつ同患者では、そのような相関は認められなかった。(2)GRWD1はユビキチンリガーゼEDDと共にRPL23を分解制御しており、本経路もp53抑制活性に寄与している加えて以下のことも明らかとなった。1GRWD1の過剰発現はRPL23のプロテアソームを介した分解を促進する。2siRNAによるGRWD1発現抑制は、核小体ストレス誘導時にRPL23量を増加させる。3EDDの過剰発現でもRPL23タンパク質量が減少し、GRWD1およびEDDの共発現で相乗的なRPL23量の減少が見られる。
哺乳類減数分裂におけるコンデンシンの役割

申請者は、マウス卵母細胞の減数分裂において、コンデンシンIとコンデンシンIIの時空間的な動態を明らかにした。また、二価染色体が形成されるときに、2つのコンデンシンが染色体の凝縮や分離、姉妹動原体の一方向性の確立に関与することを示した。それと平行して、減数分裂特異的な新規のコヒーシンサブユニットRAD21Lを発見した。RAD21Lは、第一減数分裂前期にだけ発現し、シナプトネマ複合体上に局在することから、相同染色体の対合や組換えに関与することが示唆された。本申請課題の目標は、哺乳類の減数分裂におけるコンデンシンと呼ばれるタンパク質複合体の役割を明らかにすることである。哺乳類の体細胞ではコンデンシンIとIIの2つのタイプが存在することが知られているが、卵母細胞におけるそれらの発現は調べられていない。そこで、まずマウスのコンデンシンサブユニットに対する抗体を作製して蛍光免疫染色法により、減数分裂過程におけるコンデンシンIとIIの動態を調べた。それぞれのコンデンシンに特異的な抗体を用いた免疫蛍光染色によると、卵核胞(GV)期では、コンデンシンI(mCAP-G)は細胞質に、コンデンシンII(mCAP-D3)は核内に存在することがわかった。GV崩壊後、第一分裂の前中期(Prometa-I)から中期(Meta-I)にかけて、コンデンシンIはキネトコア近辺に局在し、腕部にはほとんど検出されなかった。一方、コンデンシンIIは、Prometa-Iでは染色体全体に微弱なシグナルとして、Meta-Iでは染色体腕部の中心軸に沿って観察された。さらに、第一分裂後期(Ana-I)から第二分裂中期(Meta-II)にかけて、コンデンシンIは染色体腕部にも観察されるようになり、コンデンシンIIも染色体腕部の軸により明瞭に観察されるようになった。このように、コンデンシンIの腕部への局在化のタイミングは、体細胞における動態から予想されるよりも遅かった。また、減数分裂で昼、コンデンシンIIはGV崩壊後のMeta-I(すなわち二価染色体の形成が完了する時期)になってようやく染色体軸に集中してくるように見える。これらの結果は、コンデンシンが減数分裂において体細胞分裂とは異なる時空間制御を受けることを示している。さらに第一減数分裂におけるコンデンシンの機能をさぐるため、現在抗体のマイクロインジェクションによる機能阻害実験を行なっており、良好な結果を得つつある。哺乳類の体細胞ではコンデンシンIとIIの2つのタイプが存在することが知られているが、卵母細胞におけるそれらの発現は調べられていなかった。申請者は、コンデンシンIとIIのサブユニットの動態をマウス卵母細胞の減数分裂過程において調べることにより、コンデンシンIとIIは共に減数分裂過程において発現しているが、体細胞分裂とは異なる時空間制御を受けることをこれまでに明らかにしてきた。今年度は、卵母細胞内の機能を明らかにするために、コンデンシンの抗体を顕微注入して、減数分裂の進行と染色体の凝縮や分離にどのような影響が出るかを調べた。コントロールとして、IgGを顕微注入した卵母細胞は、16時間の成熟培養後には、ほとんどのものが第二減数分裂中期へと現数分裂が正常に進行した。これに対し、コンデンシンIとIIの共通サブユニットであるmSMC2に対する特異的抗体を顕微注入したときには、抗体量に依存して、mSMC2の過剰な染色体への凝集が観察されるようになり、キネトコアの配向や染色体の形成・分離に異常が見られた。一方、コンデンシンI(mCAP-H)やコンデンシンII(mCAP-D3)の抗体を顕微注入した場合には、前者ではコンデンシンIがセントロメア周辺部へ過剰に凝集し、後者ではコンデンシンIIの染色体への局在が阻害された。また、両者に共通して染色体の形状(凝縮度)に異常が見られた。これらの結果から、2つのコンデンシン複合体は、哺乳類減数分裂においても、正常な染色体の構築や分離に必要であることが示唆された。また、各種のコンデンシンサブユニットに対する抗体を卵母細胞に顕微注入することにより、コンデンシンは減数分裂期のキネトコアの配向や染色体の凝縮・分離に関わることが示唆された。キネトコアの配向や染色体の形成・分離に異常が見られた。

また、二価染色体形成過程におけるコヒーシンとコンデンシンの動態も調べた。現在、これらの結果をまとめた論文を作成中である。これと平行して、バイオインフォマティクス的手法により、減数分裂特異的な新規コヒーシンサブユニットRAD21Lを発見した。その動態を調べたところ、既存のどのコヒーシンサブユニットとも異なり、第一減数分裂前期にのみ特異的に発現することから、RAD21Lは、相同染色体間の結合に特化した機能を持つことが示唆された。また、RAD21Lは、他のコヒーシンサブユニットであるSMC3,STAG3,そしてSMC1α/SMC1βのどちらか一方と複合体を形成することを、免疫沈降実験により明らかにした。この結果をまとめて、論文として発表した(Lee and Hirano,J Cell Biol,2011)。
非線形固有値を用いた制御理論の構築

本研究では,非線形制御システムに対して,非線形固有値・固有ベクトルを用いた新たな解析・制御手法の構築を目指している.本年度では,当初の予定どおり,最適制御問題の新たな解析手法を提案した.この結果に基づいて,非線形固有値のcontraction理論やモデル低次元化理論への応用可能性を見出した.応用への準備として,モデル低次元化問題に取り組んだ.また,可制御性/可観測性解析に対しても新たな知見を与えた.本研究では,非線形システムの固有値を用いた新たな解析・制御手法の構築を目指している.平成27年度では,非線形固有値を用いて,(1)非線形システムの可到達性や可観測性の判別条件,(2)対角化可能な非線形システムの安定判別条件,の2つを導出した.上記の結果は,線形システム制御理論における結果の自然な拡張であり,非線形固有値が線形代数学における固有値と同様の働きを行うことを示唆するものである.申請書に記載の通り,非線形固有値の基礎的な性質を明らかにでき,安定判別条件を導出できた.また,最適制御問題の解法への応用にも着手している.本研究では,非線形制御システムに対して,非線形固有値・固有ベクトルを用いた新たな解析・制御手法の構築を目指している.本年度では,当初の予定どおり,最適制御問題の新たな解析手法を提案した.この結果に基づいて,非線形固有値のcontraction理論やモデル低次元化理論への応用可能性を見出した.応用への準備として,モデル低次元化問題に取り組んだ.また,可制御性/可観測性解析に対しても新たな知見を与えた.交付申請書に記載の通り,本年度に得られた結果と関連付けて,最適制御問題の解析を非線形固有値を用いて行う.
上皮性硬組織形成における硫酸化複合糖質の役割

ラット小柱エナメル質形成時多量の硫酸化複合糖質がゴルジ装置,分泌果粒経由でエナメル質表層部に分泌されていること,さらに急速凍結固定エナメル質表層部で各針状結晶を等間隔で連絡する梯子状構造物が認められることを示してきた。今年度さらにアメロゲニン(免疫組織化学)と硫酸化複合糖質(H1D染色)の分布様式について検討を加えた。従来アメロゲニンは基質形成期エナメル質全層にほぼ均一に分布すると考えられていた。しかしながら,その基質形成側すなわちトームス突起指状陥入面に沿ってラベリングの極めて弱い領域を確認した。この部位は硫酸化複合糖質が高密度に局在しているところでその役割を考える上で興味ある知見といえる。さらにライソゾーム内でも通常アメロゲニンは中央部に硫酸化複合糖質は辺縁部にみられ両者が混在することはなかった。また、将来のエナメル・セメント境界付近のエナメル質には層状に硫酸化複合糖質高密度分布帯が現われることを確認した。このことは同部位のエナメル芽細胞の機能と密接に関連しており,今後硫酸化複合糖質の脱却機構を研究する上で重要である。一方,大部分に分泌果粒内では上記両成分が共存しており,従って分泌後アメロゲニンは速やかにエナメル質最表層を通過し全層に移送されるものと思われる。さらに,両生類イモリの無柱エナメル質についても同様の実験を試みた結果,基質形成期エナメル質全層を通じて(最深層の象牙基質と一部エナメル基質の混在部を除く)硫酸化複合糖質は検出されず,またアメロゲニンはエナメル基質全層に観察された。このように少なくとも上皮性硬組織形成にとって硫酸化複合糖質の合成分泌は必要条件ではなく,小柱エナメル質の形成と密接に関連していることが示唆された。プロパンにより急速凍結固定したラット基質形成期エナメル質(小柱エナメル質)に,従来普通化学固定標本では観察されない構造物が確認された。すなわち,エナメル芽細胞のト-ムス突起に近い領域のエナメル質針状結晶を横方向に連絡する梯子状構造物,さらにエナメル質針状結晶横断面ではその周縁部を被覆する中程度の電子密度を有する構造物がみられた。エナメル質のハイドロキシアパタイト結晶は,エナメルタンパクにより被覆されていることが知られているので上記エナメル質結晶周縁にみられる構造物はエナメルタンパクと考えられ,急速凍結置換固定により電顕的に可視化されることが示唆された。一方,イモリの形成期エナメル質(無柱エナメル質)では上記梯子状構造物は観察されなかった。ラットエナメル質針状結晶は規則正しく配列しているが,イモリの無柱エナメル質のそれはかなり不規則となっている。このことは,上記梯子状構造物がエナメル質針状結晶の配列を規制している可能性を示唆している。さらに,HIDーTCHーSP染色(硫酸化複合糖質検出法)によれば,HIDーTCHーSP染色顆粒は,ラット基質形成期エナメル質表層部に限局しているのに対して,イモリ基質形成期無柱エナメル質ではその全層を通して染色顆粒は認められなかったことから,梯子状構造物がある種の硫酸化複合糖質である可能性が高い。イモリ腹腔内に^<35>SーSO_4を投与した光顕オ-トラジオグラフィ-によると,骨組織および象牙質領域に銀粒子がみられたが形成期無柱エナメル質に銀粒子は検出されなかった。以上の所見は,ラットエナメル質形成に関連して合成分泌される硫酸化複合糖質は,小柱エナメル質の形成,殊にエナメル質針状結晶を互いに等間隔に連絡することにより針状結晶を規則的に配列させる機能を有しているものと考えられる。

先に我々はある種の硫酸化複合糖質が基質形成期エナメル質表層部ならびにエナメル芽細胞の分泌果粒、ゴルジ領域および一部ライソゾ-ムに局在していることを示し、さらに急速凍結固定エナメル質表層部において各針状結晶を連絡する梯子状構造物を認めた。今年度さらに、アメロゲニン(免疫組織化学)と硫酸化複合糖質(高鉄ジアミン)の分布様式について検討を加えた。従来アメロゲニンは基質形成期エナメル質全層にほぼ均一に分布すると考えられていた。しかしながら、その基質形成側すなわちト-ムス突起に面してラベリングの極めて弱い領域を確認した。この部位は、硫酸化複合糖質が高密度に局在していることろで、硫酸化複合糖質の役割を考える上で興味ある知見といえる。さらに、ライソゾ-ム内においても、通常前者はその中央部に後者は辺緑部にみられ、両者が混在することはなかった。また、将来のエナメル・セメント境界付近のエナメル質には数層の硫酸化複合糖質高密度分布帯が現れた。このことは、同部位のエナメル芽細胞の機能と密接に関連しており、今後硫酸化複合糖質の脱却機構を研究する上で重要である。一方、大部分の分泌果粒内では上記成分が共存しており、従って分泌後アメロゲニンは硫酸化複合糖質とは異なり速やかにト-ムス突起から一定距離(約200ー500nm)離れた領域に移送されるものと思われる。さらに、両生類(イモリ)の無柱エナメル質についても同様の実験を試みた結果、基質形成期エナメル質全層を通じて(最深層の象牙質とエナメル質の混在部を除く)硫酸化複合糖質は検出されず、一方エナメル質表層部においても哺乳類小柱エナメル質にみられたようなアメロゲニン低密度分布領域は観察されなかった。このように少なくとも上皮性硬組織形成にとって硫酸化複合糖質は必須条件ではなく、小柱エナメル質の形成にみの関与している可能性が示唆された。