hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
階層的ゆらぎを考慮した確率過程に基づく遺伝子発現の統計解析

本研究課題では,環境の時間的不均一さに由来するゆらぎの強度自体の時間変動(高次ゆらぎ)が遺伝子発現系へ及ぼす影響について,統計解析及び計算機シミュレーションを用いて明らかにした.高次ゆらぎのある系における解析手法を開発し,その手法を様々なモデルに適用した.また,遺伝的振動子における構造的な不均一さに注目し,周期の異なる振動子の結合により生じる現象を解析的に計算し,周期ミスマッチのメリットを明らかにした.本研究課題では,環境の時間的不均一さに由来するゆらぎの強度自体の時間変動(高次ゆらぎ)が遺伝子発現へ及ぼす影響について,統計解析及び計算機シミュレーションを用いて明らかにした.高次ゆらぎのある系における解析手法を開発し,その手法を遺伝子発現系に適用することで,タンパク質濃度の定常的振る舞い,入力刺激に対する応答,安定性を計算し,遺伝子発現における高次ゆらぎの影響の解析を行った.具体的には,平成23年度の研究で確率微分方程式における高次ゆらぎの解析法を開発した.開発した手法を用い,様々な特徴量(外部刺激に対する応答,情報伝達におけるスペクトル増幅率や安定性)の解析的計算を行い,その成果を査読付き論文誌PhysicsLetters Aにおいて発表した.また,高次ゆらぎが本質的な影響を及ぼす例として,系の詳細釣り合いの破れについての解析を行った.高次ゆらぎを受けた系は詳細釣り合いが成り立たず輸送現象が起こることを明らかとし,非対称なラチェット系においてその流れの計算を解析的手法及び計算機シミュレーションにより行った.これらの成果を査読付き論文誌Journal of the Royal Society Interfaceにおいて発表した.生命現象におけるゆらぎは,時間的なゆらぎの他に構造的なゆらぎも存在する.そこで平成24年度の研究では,遺伝的振動子における構造的なゆらぎに注目し,周期の異なる振動子の結合によりおこる現象を解析的に計算した.その結果,周期のミスマッチがあることで振動子の外界信号への同期性能が向上することを明らかにし,査読付き論文誌Journal of the Royal Society Interface誌において発表した.本研究課題では,環境の時間的不均一さに由来するゆらぎの強度自体の時間変動(高次ゆらぎ)が遺伝子発現系へ及ぼす影響について,統計解析及び計算機シミュレーションを用いて明らかにした.高次ゆらぎのある系における解析手法を開発し,その手法を様々なモデルに適用した.また,遺伝的振動子における構造的な不均一さに注目し,周期の異なる振動子の結合により生じる現象を解析的に計算し,周期ミスマッチのメリットを明らかにした.本研究は,環境の時間的不均一さに由来するゆらぎの強度自体の時間変動(高次ゆらぎ)が遺伝子発現へ及ぼす影響について,統計解析及びモンテカルロシミュレーションを用いて明らかにするものである.高次ゆらぎのある系における解析手法を開発し,その手法を遺伝子発現系に適用することで,タンパク質濃度の定常的振る舞い,入力刺激に対する応答,安定性を計算し,遺伝子発現における高次ゆらぎの影響の全容を解明することを目的としている.平成23年度の研究では,確率微分方程式において,ゆらぎ強度の時間変動スケールがどのような場合でも適用可能な解析法を開発した.具体的な手法としては,分布関数の時間発展方程式を直交多項式による展開で解く手法を用いた.様々な特徴量(外部刺激に対する応答,情報伝達におけるスペクトル増幅率や安定性)の解析的計算も目的としていたが,これらの特徴量の計算にも成功した.これらの成果を査読付き論文誌(Physics Letters A)に発表した.また,高次ゆらぎが本質的な影響を及ぼす例として,系の詳細釣り合いの破れについての解析を行った.高次ゆらぎを受けた系は詳細釣り合いが成り立たず輸送現象が起こることを明らかとし,非対称なラチェット系においてその流れの計算を解析的手法及びモンテカルロシミュレーションにより行った.これらの成果を国内の研究会で発表し,まとめたものを査読付き論文誌(Royal Society Interface)に投稿中である.平成23年度の研究計画では,確率微分方程式においてゆらぎ強度の時間変動スケールがどのような場合でも適用可能な解析法開発を目標としていたが,目標通り開発することに成功した.遺伝子発現系では遺伝子スイッチが重要な役割を担っているため,双安定ポテンシャルにおける特徴量計算が重要となる.開発した手法を用いることで,双安定ポテンシャルにおける特徴量(応答(平均第一通過時間)や情報伝達のシグナルノイズ比)の解析的計算が可能となった.その結果,高次ゆらぎの強さに対して応答と情報伝達はトレードオフの関係であることを明らかとした.開発した計算手法及び双安定系での計算結果を査読付きジャーナルに発表することが出来た.以上のように,平成23年度に行う予定であった研究計画を遂行することが出来た.また,平成23年度の研究によって,高次ゆらぎが系の詳細釣り合いに本質的な影響を及ぼすことが判明し,系の詳細釣り合いについての解析を行った.詳細釣り合いの破れは生体でのモーター蛋白やイオンポンプで重要な役割を担っている.高次ゆらぎによって起こる詳細釣り合いの破れは,研究計画段階では明らかではなかったものであるが,ラチェット系における計算を行い,輸送現象についての計算を行った.この結果,遺伝子発現系で実際に観測されているゆらぎの速さで輸送現象が最大化されていることが明らかとなった.これらの成果を国内の研究会で発表し,査読付きジャーナルに投稿することが出来た.[現在までの達成度]で記述したように,平成23年度の研究によって,高次ゆらぎが系の詳細

釣り合いに本質的な影響を及ぼすことが判明したが,この現象は研究計画段階では明らかではなかった点である.既にラチェット系における計算を行い査読付き論文誌に投稿したが,今後詳細な解析を行う予定である.詳細釣り合いの破れは生体におけるモーター蛋白やイオンポンプなどの基礎となっている現象であり,遺伝子発現系においても非常に重要な役割を担っていると考えている.そこで,遺伝子発現系における転写翻訳において輸送現象がどのような役割を担っているかより具体的なモデルを用いて解析する予定である.研究計画段階では遺伝子スイッチにおける解析に主眼をおいていたが,平成23年度の研究を通して,遺伝子振動子における解析の重要さを認識した.遺伝子振動子は遺伝子スイッチとならび最も重要な遺伝子回路モチーフである.遺伝子振動子における解析については現在解析を行なっているが,今後さらに詳細な解析を進め,学会発表や論文投稿を行う予定である.研究計画では平成24年度に多遺伝子系における解析を予定していたが,計画通り多遺伝子系における高次ゆらぎの影響解析も行う.これらの解析は主にモンテカルロを用いて行う予定である.生物における確率過程の最新の研究動向を調査し,いままでの研究成果を発表するために国際会議に参加する予定であり,そのための予算を使用予定である.国内の学会についても参加する予定であり,そのための予算も必要である.現在投稿中の論文(Royal Society Interface誌)が採録された場合,投稿料として予算を使用する予定である.また,今後執筆予定の論文の英文校正費及び投稿料に予算を使用する.研究を進めるために必要な文献購入にも予算を使用する.
旧石器の層位攪乱をもたらす最終氷期の乾裂・凍結割れ目の形成機構に関する比較研究

旧石器の層位を撹乱する原因のひとつである地層の割れ目に関して、野外における観察と室内での分析により、朝鮮半島のソイルウェッジと本州中央部の更新統に見られる乾裂痕、北海道の氷楔痕とを比較し、凍結割れ目と乾裂との構造・形成機構の相違と移行性を検討した。1.朝鮮半島の上部更新統の対比朝鮮半島のソイルウェッジを含む更新統上部では、割れ目の上限付近で極細粒砂サイズ以下に球状石英をはじめとする球状鉱物が比較的多く認められることにより、風成の黄砂に由来した鉱物である可能性が指摘できる。また、AT火山灰に由来する火山ガラスが割れ目充填物に比較的多く含まれることも明らかとなった。これらのことは、最上位の割れ目が最終氷期極寒期前後に形成されていたことを示唆する。さらに、暗色帯や赤褐色帯を手がかりにして、更新統上部の割れ目を対比し、4時期に区分した。2.割れ目の構造と形成要因朝鮮半島のソイルウェッジ・カストと本州中央部の乾裂痕は、現地での観察においても、不撹乱試料の研磨面での観察においても、割れ目の最上郡付近を除けば充填物は雨水によるとみられる泥のベインだけであり、ほとんど開口しなかったことが推定される。また、共に垂直方向の割れとともに水平方向の割れも観察された。この割れ目現象は北海道の活動層を伴う氷楔痕には見られない構造であり、周氷河現象の氷楔痕の主たる成因が凍結によるものであるのに対して、ソイルウェッジや本州中央部の乾裂痕は最終氷期の寒冷条件に支配されつつも、乾燥による収縮が主要な成因であったと考えられ、いわゆるソイルウェッジとは異なる割れ目だと結論される。平成15年度の野外調査では、いずれも旧石器時代遺跡である韓国慶尚北道の尚州新上里遺跡と居昌正莊里遺跡、全羅南道の和順道山遺跡で、割れ目の層準(年代)、割れ目内・外の堆積物、周辺の地形・地質を調査するとともに、室内分析用の不撹乱試料を含む試料を採取した。また、過去の周氷河地域の典型的な凍結割れ目現象であるアイスウェッジカストを、日本列島で数少ない密集地として報告されている北海道宗谷支庁猿払村において、割れ目の構造と割れ目充填物、および周囲の地層との関係を詳しく観察した。韓国に於ける調査では、24層準の割れ目が認められ、割れ目の規模および古土壌や風成堆積層の特徴から、その形成年代が最終氷期やそれ以前の氷期と関連すると考えられた。また、見かけが幅太く見えるが、割れ目自体はごく幅が狭くて灰色粘土が充填し、外側は白く脱色しており、さらにその外側には酸化鉄により褐色を呈する多くの割れ目があることを確認した。幅広く見える原因は割れ目を伝わった地下水の浸透により、微量元素が割れ目の外側に溶脱したものと考えられた。また、北海道では、最大で割れ幅が約30cm・長さ2.5m以上あるアイスウェッジのほか、小規模の割れ目を観察し、過去の季節的凍土地帯における割れ目形成に係わるいくつかの未報告現象があることを確認した。室内研究では、割れ目充填物質と割れ目周囲の地層の微細構造を顕微鏡レベルで記載するための薄片作成は現在進行中である。また、韓国の地層中には、黄砂起源の石英粒が多数含まれることが明らかとなり、石英粒の含有率により割れ目の形成年代を氷期編年と比較検討し得ることを認めている。野外調査では、韓国の著名な旧石器時代である京畿道全谷里遺跡をはじめ、南楊州好坪洞遺跡、驪州淵陽里遺跡、全北益山市射徳遺跡、慶南晋州市耳谷里遺跡で、割れ目の層準、割れ目内・外の堆積物、周辺の地形・地質を調査するとともに、粒度分析用の試料を採取した。

また、昨年度、北海道宗谷支庁猿払村において観察した凍結割れ目を再調査するとともに、道北・道東地域の複数地点で割れ目の構造と割れ目充填物、および周囲の地層との関係を観察した。全谷里遺跡で観察した割れ目は、暗色帯である暗黄灰色シルト質粘土層と暗赤褐色粘土層の2層準に発達し、両層準ともに黒灰色の極薄い粘土フィルムを充填物としていた。好坪洞遺跡、驪州淵陽里遺跡においても充填物の様子はよく似ていた。これら3遺跡は、昨年度に調査した韓国中南部の慶北、全南の諸遺跡より緯度が高く、割れ目現象に周氷河地域の影響がより色濃く見られると予想していたが、実際は大きな差異は認められなかった。一方、西海岸に近い射徳遺跡や南海岸に近い耳谷里遺跡と比較して、驪州や慶北の尚州と居昌、大邱などの比較的内陸にある地域では、割れ目の密度が高く、かつ著しい傾向があることが明らかとなった。また、全谷里遺跡で帯磁率測定を行い、暗色帯で帯磁率が高いことがわかった。猿払村ではアイスウェッジとともに見つけた小規模の割れ目の構造について詳しく観察し直し、割れ目と並行する開口していない複数のフィッシャーを認めた。室内研究では、割れ目充填物質と割れ目周囲の地層の微細構造を顕微鏡レベルで記載するための薄片作成を継続中である。また、黄砂起源と推定される石英粒の含有率により割れ目の形成年代を氷期編年と比較検討するための粒度分析も進めている。旧石器の層位を撹乱する原因のひとつである地層の割れ目に関して、朝鮮半島のソイルウェッジ・カストと本州の乾裂痕、北海道の氷楔痕とを比較検討することにより、凍結割れ目と乾裂との構造・形成機構の相違と移行性を明らかにするために、この年度は大雪山で現世の凍結割れ目を観察し、室内で分析作業と解析を行った。1.割れ目充填物と基盤層堆積物の粒度と組成全羅南道の全南和順道山遺跡ほか2地点の試料を分析した。その結果、ほとんどの試料が砂とシルトに双峯性のモードを示すとともに、更新統最上位の割れ目付近で極細粒砂サイズ以下に球状石英をはじめとする球状鉱物が認められ、その含有率は半島の東から西へ顕著な増加傾向が認められた。さらに、AT火山灰に由来する火山ガラスが割れ目充填物に比較的多く含まれることが明らかとなった。これらのことは、球状鉱物が風成の黄砂に由来するものであること、また、更新統最上位の割れ目は最終氷期極寒期より前に形成されはじめていたことを示唆する。2.割れ目の構造と形成要因慶尚北道の尚州新上里遺跡ほかのソイルウェッジ・カストと大阪市長原遺跡の乾裂痕の不撹乱試料を固化し研磨して観察した。その結果、両地域の試料は現地で観察したように、割れ目の最上部付近を除けば充填物は雨水によるとみられる泥の薄層だけであり、ほとんど開口しなかったことが推定される。また、共に垂直方向の割れとともに水平方向の割れも観察された。この割れ目現象は活動層を伴う氷楔痕には見られない構造であり、周氷河現象の氷楔痕の主たる成因が凍結によるものであるのに対して、ソイルウェッジや乾裂は最終氷期の寒冷条件に支配されつつも、乾燥による収縮が主要な成因であったと考えられる。
有機燐農薬による第三の神経毒性「中間症候群」

有機燐農薬は急性毒性を殺虫剤に応用している。ところが少数の有機燐農薬では急性中毒から回復して数週後に発症する麻痺が認められ、遅発性神経毒性といわれる。本毒性が証明された農薬は生産が中止されるため、入手困難になる。そこで本毒性のモデル物質として、トリオルトトリル燐酸(TOTP)あるいは亜燐酸トリフェニル(TPP)が用いられている。近年、有機燐農薬の急性中毒患者の中に発症の14日後に躯幹部の筋肉が麻痺している患者がいることがわかり、これが有機燐による第三の神経毒性「中間症候群」といわれるようになった。ところで、TOTPによる麻痺とTPPによる麻痺は異なるという指摘がある。筆者らはTPPは「中間症候群」のモデル物質ではないかと疑い、ウズラを用いてTOTPとの比較実験を試みた。毒性試験では毒物の投与方法が要点になる。経口投与、皮下または静脈注射などが用いられているが、これらの方法では急性中毒死がしばしば発生し、急性中毒から回復した後に発症する神経毒性を検出するという目的の妨げになっている。そこでStumpfらが報告(1989)した経皮投与法を用いることにした。TOTPおよびTPPを99%エタノールに溶解し、マイクロ・ピペットで定量してウズラの背部皮膚に滴下するという方法は、急性中毒を抑えて遅発性の神経障害を強く発現させる優れた投与法である。その結果として、TOTPでは1週以上の潜伏期の後にまず運動失調が現われ次第に悪化して麻痺に進行するのに対して、TPPの場合は、投与当日は全く異常がなく、翌日から2日後に突然重症の麻痺が発症することが明らかになった。
生殖機能を司る中枢性ネットワーク機構の解明

視床下部キスペプチンニューロンは視床下部ー下垂体ー性腺軸の最上位に位置し、GnRH分泌を制御しているとされる。しかしながら、GnRH産生ニューロン株GT1-7細胞においてキスペプチンはERK及びcAMP/PKA経路を活性化させるが、GnRH発現を変化させない。これはGT1-7細胞が腫瘍細胞由来の不死化細胞であるためではないかと考えられる。そこでラット胎児脳神経細胞の初代培養を行い、キスペプチンによるGnRH発現について検討した。妊娠16-18日ラットの子宮より胎仔を取り出し、胎仔脳を採取して初代培養を行った。この初代培養細胞を用い、エストラジオール、キスペプチン(KP-10)、GnRH刺激によるGnRH及びキスペプチンmRNA発現をリアルタイムPCRにて検討した。ラット胎仔脳神経初代培養細胞にGnRH及びキスペプチンが存在を免疫染色で確認した。エストラジオールを初代培養細胞に添加すると、キスペプチンmRNA発現は有意に増加した。GnRH mRNA発現はエストラジオールで変化しなかった。脳神経初代培養細胞をKP-10で刺激するとGnRH mRNA発現は増加した。GnRH発現はGnRH刺激によって増加した。一方KP-10刺激でキスペプチンmRNA発現は増加し、GnRH刺激でも増加した。今回の結果はGnRH発現はキスペプチン及びGnRH自身により制御されていること、またキスペプチン発現はGnRH及びキスペプチン自身で制御されている可能性を示している。我々はこれまでGnRH産生モデル細胞として使用されているマウス視床下部腫瘍由来のGT1-7細胞を用いて実験を行ってきた。GT1-7細胞はキスペプチン受容体(Kiss1R)を発現しているがキスペプチン刺激によりGnRH発現は認められなかった。これはGT1-7細胞が腫瘍細胞由来の不死化細胞であるためではないかと考えられたため、ラット胎仔脳神経細胞初代培養を行い、キスペプチンによる作用を確認することができた。今後は今回使用したラット胎仔脳神経細胞初代培養および、細胞株を用いた実験から、摂食/代謝調節因子、ストレス関連因子のキスペプチンニューロン及びGnRHニューロンへの影響について検討する予定である。
中枢神経機能解析のための弱毒単純ヘルペスウイルスベクター系の開発

中枢神経系内で、外来遺伝子を発現する実験系あるいは遺伝子治療のベクターとして、私たちは,単純ヘルペスウイルス(HSV)の神経親和性の特徴から、βガラクトシダーゼ(β-gal)を発現する弱毒単純ヘルペスウイルス(HSV)をベクター作製し、広範囲への遺伝子導入が可能で,中枢神経系での長期にわたる安定した遺伝子発現が可能なベクターを開発した(Neurosci Lett 245:69-72、Gene Ther 7:934-941)。本ベクターでは弱毒性によりほぼ病原性をコントロールし各遺伝子の発現を望む領域を制御できることを本研究で明らかにした。すなわち、筋肉内接種により、病原性を示すことなく、脊髄前角神経細胞で外来遺伝子を長期にわたり発現できることを確認した(Gene Therapy 7:934-941)。そして,HSVに免疫を有する動物でも遺伝子発現ができることと同じ接種ルートを使用して複数個の遺伝子を導入できる可能性を確認した(Gene Therapy 8:1180-1187)。さらに,抗ウイルス薬ガンシクロビル(GCV)により、発現領域の制御でき、本ウイルスベクターの増殖・発現領域の制御・潜伏感染化の過程における外来遺伝子発現と生理学的機能(Acoustic Startle ResponseとPrepulse Inhibition)に影響しないことを確認した(Neurosci Res 45:233-241、この論文は「hottopic」journal articleとされた)。また、脊髄前角細胞での遺伝子発現に伴う前角細胞機能と神経伝導速度の変化と筋肉における遺伝子発現について検討をほぼ終えて、投稿を準備している。この過程で、このベクターにより、ヌードマウスで移植脳腫瘍の治療に使用できることを明らかにした(Cancer Sci 95:990-998)。本研究に用いる単純ヘルペスウイルス(HSV)ベクターの特徴は神経親和性と弱毒性にあり、皮下接種で脊髄後根感覚神経節へ、筋肉内接種により脊髄前角運動神経細胞に、外来遺伝子導入でき、炎症や組織破壊を起こすことなく、長期にわたり(少なくとも6ヶ月)安定して外来遺伝子を発現できることである。レトロやアデノウイルスなど他の遺伝子発現ベクターでは、免疫の存在下では遺伝子発現に顕著な問題を生ずる。そこで、あらかじめ免疫を有する動物に対しての遺伝子導入について検討した。免疫を有するラットの右腓腹筋に接種すると両側脊髄前角細胞に、他のウイルスベクターと異なり、遺伝子導入が可能で炎症や組織は改造を示すことなく、免疫を有する動物に対しても免疫を持たない動物と同様に、やや効率は落ちるが、遺伝子導入が可能であることを示した。これは、transneural spreadという広がり方をするため、免疫を回避できると考えられた(Gene therapy, 8, 1180-7, 2001)。つぎに、ベクターによる遺伝子導入の範囲と生理学的機能に関する検討を行った。このベクターをCaudate Putamenに接種して、その遺伝子発現の範囲を接種日から抗ウイルス剤ガンシクロビル投与開始日による期間により制御した。そして、これらの過程における生理学的な機能Acoustic Startling Response(ASR)とPrepulse Inhibition(PPI)への影響について検討した。その結果、遺伝子発現の範囲は、caudate putamenからamygdalaなどを含むtemporal lobeなどへ進展した。その進展により発現領域はウイルスベクター接種とガンシクロビル投与開始日による期間により制御できた。さらに、この外来遺伝子の発現期間は、ガンシクロビル投与終了後も持続した。このように、HSVベクターを用いた遺伝子発現領域の制御を行う過程で、ASRとPPIに有意な変化を認めず神経機能に対する弱毒性が確認できた。このベクターは、HSV潜伏感染時に神経細胞で転写されるlatency associated transcripts遺伝子(LAT)遺伝子内にβ-gal遺伝子を挿入した弱毒HSVウイルス(βH)である。βHをラットの右腓腹筋に接種すると、片側接種にもかかわらず筋支配領域の両側の脊髄前角運動神経細胞にβ-galの発現が少なくとも約半年間認められた。

したがって、筋に接種したHSVベクターが脊髄前角細胞で継続的に外来遺伝子を発現することをはじめて明らかにし、前角神経細胞の脱落をともなう筋萎縮性側索硬化症などの脊髄前角細胞の遺伝子治療に本ベクターが利用できる可能性を示した。また、通常宿主が免疫を有する場合ウイルスが不活化されウイルスベクターによる遺伝子導入が困難である。しかし、本ベクターは免疫存在の有無に関わらずtransneural感染により炎症像を伴わず脊髄両側前角細胞に潜伏感染することを明らかにした。さらに、本ベクターをラット脳内接種後の抗HSV剤(ガンシクロビル)の投与によりβ-gal発現領域を制御できたこと、また、大脳での本ベクターの増殖・潜伏化過程で生理機能に影響が認められず、本ベクターの中枢神経系での発現に対する安全性、有用性が確認できた(Neuroscience Research 45 233-241,2003)。この論文は、Editor推薦の論文として、ElsevirのWeb-siteに掲載された。このように、種々の接種法により本ベクターの病原性や生理学的機能への影響、外来遺伝子の発現期間と発現領域の制御などについて検討し、本ウイルスベクターの安全性、有用性を確認した。今後、この基礎実験に基づいて、BDNF(神経栄養因子)、NGF(神経成長因子)、bcl-2などの外来遺伝子を組み込んだHSVベクターを作製し、神経機能の解析や遺伝子治療への可能性を明らかにしたい。中枢神経系で外来遺伝子であるβ-ガラクトシダーゼを長期的に発現できる弱毒単純ヘルペスウイルス(HSV)ベクター(βH)を用いて、神経保護作用のあるBDNF(神経栄養因子)、NGF(神経成長因子)遺伝子を外来遺伝子として本ベクターに挿入し、将来の遺伝子治療への応用の可能性を検討している。今年度は、脊髄前角細胞における遺伝子発現の特徴を中心に研究を行った。Caudate Putamenにウイルスを接種した場合の遺伝子発現領域と生理機能に関する検討結果を論文として報告した(Fukuda et al. Neurosc Res 45,233-241)。この論文はEditor推薦の論文としてElsevierのサイトに紹介された。また、これと平行してこれまで解析してきたラットの腓腹筋接種モデルを用いて、中枢神経系に導入されたβHベクターのウィルス抗原の分布と感染性ウイルス粒子形成の可能性を脊髄と脊髄後根神経節で比較検討し、脊髄前角細胞での遺伝子発現の特徴を明らかにした。βHをラットの右腓腹筋に接種後10ヶ月後でも両側脊髄前角神経細胞にβ-gal活性、β-galm RNA,ウイルス蛋白質gC,TKとそれらのmRNAが検出できた。しかし、脊髄には感染性ウイルスが認められなかった。
ファシリティーマネジメントよりみた地域施設の活性化に関する研究

市民生活に密着した社会資本としての地域施設は、利用者がより質の高いサービスを享受すべく、アクティビティの高い運営とそれに関連した施設計画がなされるべきである。本研究においては従来の建築計画では十分とらえられてこなかった動的な施設の活動状況を把握すべく、施設の活性化を論ずるための指標を得るために病院、劇場、学校、社会教育施設を対象として施設に関連する運営状況をとらえた。病院においては、従来規模計画などで用いられてきた病床数や手術室の利用率に代わるものとして、入院や検査の回転率を重要な指標ととらえ、それに関連する在院期間の長短が病院運営に重要な影響を与えることを指摘した。劇場を対象とした研究では、演劇公演における制作業務の組織と内容を調査することにより、質の高い芸術公演の基盤整備のためには芸術ホール自体の建設以上にそれを支える制作業務に関わる人・スペース・運営とホールとの密接な関係が必要であることを指摘した。学校を対象とした研究においては、体験的に自ら学ぶ学習活動に焦点を絞り、従来のオープンスペース・特別教室・普通教室のあり方を再考し、実習スペースを総合的に見直すことにより、活発な学習活動を支える条件の一端を提示した。社会教育施設を対象とした研究では、新規利用者と定着利用者の利用特性を把握することで生涯学習基盤としての施設のあり方を追求した。以上のように、本研究においてはいくつかの地域施設の活動状況を施設種毎の視点から把握し、施設を活性化するための建築的条件の一部をとらえた。さらにこれらの指標の共通化を図ることで施設種をこえた横断的研究に発展させることが可能である。
飼育動物の生殖器疾患等におけるINSL3測定の臨床検査への応用と同受容体発現解析

本研究では、妊娠牛の母体血中・尿中INSL3測定による胎子雌雄判別への臨床応用について検討し、妊娠中期・後期の複数時点の血中テストステロンとINSL3濃度を測定することによって、約90%の的中率で胎子雌雄を判別できることを見出した。精液性状不良牛および卵巣嚢腫牛の血中INSL3濃度は正常牛との顕著な差はみられなかった。また潜在精巣犬の停留精巣のINSL3と同受容体の発現を調べた結果、停留精巣では十分量のINSL3が発現しているが、受容体であるRXFP2の発現は消失していることが判明した。子宮蓄膿症犬の卵巣・子宮のINSL3とRXFP2の遺伝子発現は正常子宮犬との間に顕著な差は見出せなかった。平成25年度は、ウシ血中インスリン様ペプチド3(INSL3)測定による繁殖障害・生殖器疾患の検査・診断および妊娠牛の母体血中・尿中INSL3測定による胎子の雌雄判別への応用について検討した。詳細は以下の通り。1ー1.精液性状不良牛と正常雄ウシの血中INSL3濃度の比較:黒毛和種雄ウの性成熟期から性成熟後まで約1ヵ月間隔で血液採取を行った。精液を採取して検査を行い、精液性状が正常あるいは不良を判別した。血漿INSL3およびテストステロン濃度を酵素免疫測定法で測定し、精液性状不良例と正常例のホルモン動態を比較した。その結果、黒毛和種雄ウシの血中INSL3濃度は性成熟期から性成熟後にかけて増加するが、テストステロン濃度は顕著に増加しないことがわかった。一方、精液性状が不良(精子奇形や凍結融解後異常)であった雄ウシの血中INSL3およびテストステロン濃度は、同時期の正常な雄ウシにくらべて、顕著な異常はみられないことがわかった。1ー2.卵巣嚢腫牛と正常雌ウシの血中INSL3濃度の比較:ホルスタイン種乳牛の卵巣嚢腫牛および正常牛を用いた。卵巣嚢腫牛は血漿中プロジェステロン濃度から卵胞嚢腫牛と黄体嚢腫(嚢腫様黄体を含む)牛に分類し、血漿INSL3濃度を測定した。卵胞嚢腫および黄体嚢腫の血中INSL3濃度に異常はみられないことが判明した。2妊娠牛の母体のINSL3測定による胎子雌雄判別の検討:ホルスタイン種妊娠牛の妊娠3ヵ月から9ヵ月齢まで1ヵ月間隔で母体の血液および尿の採取を行い、胎子の性別は最終的に出生時に確認した。例数を増やすために次年度も材料採取を継続し、精巣ホルモンの測定を行う。平成26年度は以下の24の項目を実施し、下記のような結果がえられた。2妊娠牛の母体のINSL3測定による胎子雌雄判別の検討:雄胎子を持つホルスタイン種妊娠牛の血漿インスリン様ペプチド3(INSL3)濃度は、妊娠中期(56ヵ月齢)において、雌胎子を持つそれよりも有意に高い値を示した。また雄胎子を持つ妊娠牛のテストステロン濃度は、妊娠中期(46ヵ月)と後期(78ヵ月)において、雌胎子を持つそれよりも有意に高い値を示した。3正常犬と潜在精巣犬の精巣・精巣上体のINSL3ー同受容体システムの発現解析:正常な小型雄犬の精巣内INSL3のmRNA濃度は性成熟期(612ヵ月齢)から性成熟後(15歳齢)に、さらに壮齢期(510歳齢)にかけて有意に減少した。INSL3受容体のRXFP2のmRNA濃度は性成熟期から性成熟後にかけて有意に増加した。潜在精巣犬の停留精巣のINSL3のmRNA濃度は正常犬の正常精巣よりも有意に高かった。停留精巣のRXFP2のmRNA濃度はほとんど存在しないレベルであり、正常精巣よりも極めて低い値を示した。INSL3の免疫染色を行った結果、正常精巣および停留精巣ともに精巣間質(ライディッヒ)細胞にのみ発現がみられた。4正常犬と子宮蓄膿症犬の卵巣・子宮内INSL3ー同受容体システムの発現解析:正常犬の黄体期の卵巣INSL3のmRNA濃度は、非黄体期のそれよりも有意に高い値を示した。子宮蓄膿症罹患犬の卵巣INSL3のmRNA濃度は正常犬の黄体期と同程度の値を示したが、非黄体期のそれよりも有意に高い値を示した。正常犬および子宮蓄膿症犬の卵巣と子宮のRXFP2のmRNA濃度は各群間で有意な差はみられなかった。In situ hybridizationにより卵巣の黄体や卵胞、子宮の腺上皮と内膜上皮および子宮筋層にRXFP2のmRNAの発現がみられた。平成27年度は以下の交付申請書記載の2と5の項目を実施し、下記のような結果がえられた。2妊娠牛の母体のINSL3測定による胎子雌雄判別の検討本研究では、ホルスタイン種および黒毛和種の両品種において妊娠初期から末期までの母牛の血中テストステロンとINSL3濃度を雌雄胎子間で比較して、雌雄判別への応用を検討した。さらに、ホルスタイン種妊娠牛において妊娠中期から後期まで尿中テストステロン濃度の雌雄胎子間の比較を行った。

その結果、雄胎子を受胎したホルスタイン種(n=31)および黒毛和種(n=33)の母牛の末梢血中テストステロンとINSL3濃度は、妊娠の中期もしくは後期において、雌胎子を受胎したウシに比べて高いことが判明した。ホルスタイン種妊娠牛の尿中テストステロン濃度は、胎子の雌雄間で顕著な差はみられなかった。胎子雌雄判別の的中率は、テストステロンでは約8割、INSL3では約7割であるが、両ホルモン濃度の複数時点のデータを組み合わせることによって、的中率は9割程度まで高くなることが判明した。以上の成績から、ホルスタイン種および黒毛和種牛の妊娠中期・後期の母体血中のテストステロンとINSL3濃度を測定することによって、胎子雌雄を良好な的中率で予測できることが示された。5性成熟後のヤギ精巣ホルモン分泌におけるINSL3の役割の解明精巣内分泌機能におけるINSL3の役割を解明するため、INSL3の拮抗剤を雄シバヤギ(n=2)の精巣内に投与し、血中テストステロン濃度に及ぼす影響を調べたが、血中濃度の顕著な減少はみられなかった。したがって、今回の実験においては、INSL3の精巣テストステロン分泌における役割を解明することはできなかった。本研究では、妊娠牛の母体血中・尿中INSL3測定による胎子雌雄判別への臨床応用について検討し、妊娠中期・後期の複数時点の血中テストステロンとINSL3濃度を測定することによって、約90%の的中率で胎子雌雄を判別できることを見出した。精液性状不良牛および卵巣嚢腫牛の血中INSL3濃度は正常牛との顕著な差はみられなかった。また潜在精巣犬の停留精巣のINSL3と同受容体の発現を調べた結果、停留精巣では十分量のINSL3が発現しているが、受容体であるRXFP2の発現は消失していることが判明した。子宮蓄膿症犬の卵巣・子宮のINSL3とRXFP2の遺伝子発現は正常子宮犬との間に顕著な差は見出せなかった。平成26年度に実施する予定の三項目、2妊娠牛の母体のインスリン様ペプチド3(INSL3)測定による胎子雌雄判別の検討、3正常犬と潜在精巣犬の精巣・精巣上体のINSL3ー同受容体システムの発現解析、および4正常犬と子宮蓄膿症犬の卵巣・子宮内INSL3ー同受容体システムの発現解析、を全て遂行することができ、それらの結果がえられた(詳細は上記9の研究実績の概要を参照)。2の結果からは、ホルスタイン種乳牛において妊娠中期の末梢血液のINSL3およびテストステロン濃度を測定することにより、胎子の雌雄を判定できる可能性が示唆された。3の結果からは、小型正常犬の性成熟とその後の精巣内のINSL3およびその受容体RXFP2の遺伝子発現動態が明らかになるとともに、潜在精巣犬の停留精巣では正常精巣と異なる発現がみられることが解明された。また犬の精巣内のINSL3の産生部位は間質細胞に限られることがわかった。4の結果からは、子宮蓄膿症犬の卵巣のINSL3、卵巣・子宮のRXFP2の遺伝子発現量は正常犬と顕著な差異はみられないことがわかった。以上の理由から、本研究課題は、おおむね順調に進展していると考えられる。獣医繁殖学平成26年度の本研究課題の進捗状況ならびに今後の研究計画の内容等を勘案して、次年度の研究計画として、以下のような内容を現在立案している。平成27年度の研究実施計画2妊娠牛の母体のINSL3測定による胎子雌雄判別の検討:実験に供するウシの例数をさらに増やすために、次年度も共同研究機関(ホルスタイン種妊娠牛)および他機関(黒毛和種妊娠牛)での材料採取(ホルスタインは血液と尿を採取;黒毛和種牛は血液のみ採取)を継続し、妊娠牛末梢血中の精巣ホルモン(INSL3とテストステロン)の測定を行う。
肺炎マイコプラズマ感染診断プローブの開発研究

マイコプラズマ肺炎菌は非常に小さな細菌で、強い抗原提示をすることなく、ヒト免疫系を逃れて感染を繰り返し行う。そのことが早期診断が難しい理由になっていた。最近、我々は、肺炎マイコプラズマの細胞膜に一対の新規糖脂抗原が存在することを見出し、マイコプラズマGGLsと命名した。本研究では、脂質部位を様々変化させたGGLsを合成して、診断プローブとしての有用性を評価した。その結果、合成GGLsを利用した新規診断法を開発することができた。また、GGLs分子の動的挙動を解析した結果、これら細胞膜脂質は細胞膜で自己組織化すること、また、ナトリウムイオンを捕捉する潜在能力をもつことを確認した。水溶性糖脂質抗原の化学合成と三次元構造解析:これまで、肺炎マイコプラズマの脂質抗原としてGGL(C16)に着目した研究を行ってきたが、水や有機溶媒中で自己集合化して巨大化分子となるため、単分子状態での立体構造や機能の解析が困難であった。そこで、水に溶けるGGLアナローグ分子として、脂肪酸部位にアセチル基を導入したGGL(Ac)を新たに分子設計した。水溶性GGLの化学合成は、既に報告している天然物GGL(C16)の合成法を適用して行なうことができた。合成したGGL(Ac)は、水のほか、メタノールなどの各種有機溶媒に可溶であり、さらに、結晶化させて、純粋な化合物として得ることができた。この化合物に対して、溶媒を変えてスペクトル解析(NMR)を行った。その結果、GGLの三次元構造とその動的挙動は溶媒によって大きく変動し、細胞膜リン脂質とは明らかに異なることが判明した。一般に、リン脂質と同じ脂質を持つグリセロ型糖脂質は、細胞膜リン脂質に似た動的挙動をとり、細胞膜全体に分散していると考えられてきた。しかし、マイコプラズマGGLは、ガングリオシド糖脂質と同様、細胞膜中で孤立した(相分離)マイクロドメイン(当該分野では、ラフトと呼ばれている)を形成する可能性が強く示唆された。GGLは、マイクロドメインを形成して、細胞膜に「脂溶性分子」、例えば、脂肪酸などを通過させる「穴」を形成すると考えられる。一見、何気ない分子構造を持つGGLであるが、生理条件下で、思いも拠らない分子集合体構造を提示する可能性がある。マイコプラズマにとって、GGLは、ホスト細胞の脂肪酸を取り込むドメインとして機能する一方で、ホストの免疫細胞を刺激して炎症を引き起こす原因物質であると考えられる(2013年6月、国際複合糖質学会で発表)。-マイコプラズマ糖脂質抗原(GGLs)同属体の合成と機能評価-肺炎マイコプラズマの細胞膜には脂肪酸の長さがことなるGGL(C16)とGGL(C18)の2種が存在している。平成26年度は、診断法や将来のワクチン開発にむけて、脂肪酸の長さが異なる一連のGGL同属体(C12,C14,C16,C18)を合成することにした。化学合成は、市販のD-ガラクトースと光学活性(S)-グリセロール誘導体を出発原料にして行なうことにした。最終段階の脱ベンジ化反応(水素化反応)の収率がC18同属体で低下したが、おおむね良好な収率で、目的とする4種のGGLs誘導体が合成できた。次に、合成GGLをもちいて、診断用ELISAプレートを作成し、抗GGLモノクロナール抗体と蛍光標識化二次抗体を用いて、評価試験を行なった。その結果、脂肪酸が大きくなるにともない、モノクロナール抗体の結合量が増えた。GGL-C12の結合量に対してGGL-C16の結合量は約1.2倍、GGL-C18では、1.5倍も多く結合することが判明した。-フルオラス法を用いた診断プローブの合成開発- GGLを利用する診断法の難点は、化学合成に時間と経費がかかることである。今後、全世界に向けて診断法を普及するには、GGLの生産工程を短くする新技術の開発が必要である。また、診断に十分な機能をもちながら、合成と供給が格段と容易な糖脂質プローブを新たに開発することが重要である。平成25年度から、野口研究所との共同研究でフルオラス法を利用したGGL生産法の開発研究を開始し、平成26年末にGGLの二糖抗原をフルオラス法で化学合成する技術を開発することげできた(国際雑誌Carbohydrate Res., 2015に発表)。1)昨年度までの研究で、マイコプラズマ肺炎の診断プローブとして、炭素鎖長が異なる一連のGGLs誘導体を化学合成した。モノクロナール抗体を用いた機能評価を行なったところ、鎖長が短いGGLsよりも、鎖長が長い脂肪酸(GGL-C16、C18)を持つGGLsホモローグが、診断プローブとして有効であることが判明した。さらに、研究協力者が実際のヒト血清による評価(ELISA試験法)を行った結果、合成GGLs (C16)を用いることで、感染早期にマイコプラズマ感染の確定診断ができることが判明した。合成GGLsを利用した診断法開発が大きく前進した。2)前年度から進めてるNMRを用いた解析で、GGLsなどのβ-ガラクト型グリセロ糖脂質は、リン脂質と明確に異なる動的挙動を示すことがわかってきた。このことは、細胞膜内で、糖脂質同士がリン脂質と層分離を起こして細胞膜内に自己集合化構造(マイクロドメイン)を形成する可能性を高い。

グリセロ脂質は、セラミドを脂質とするスフィンゴ脂質と異なり、リン脂質細胞膜に拡散して存在すると考えられていることから、なぜ、そのような特徴的な挙動をとるのか、その原因を明らかにすることが、新たな課題に浮上した。3)溶解性などの問題から、化学合成が困難であったコレステロール型GGLsについて、コレステロール誘導体の各種溶媒へ溶解性を調べながら反応条件の検討を行った。その結果、コレステリルβ-グリコシシドを、ルイス酸を用いる簡便な操作で化学合成できるようになった。4)糖脂質抗原GGLsを、直接、質量分析装置(TOF-MS)で検出する手法について検討を行った。GGLs脂肪酸末端のメチル基(-CH3)が重水素置換されたGGLs-CD3を新たに分子設計し、その化学合成に成功した。次年度より、合成した重水素標識化GGLsを内部標準に用いた質量分析法の開発研究をスタートすることにした。マイコプラズマ肺炎菌は非常に小さな細菌で、強い抗原提示をすることなく、ヒト免疫系を逃れて感染を繰り返し行う。そのことが早期診断が難しい理由になっていた。最近、我々は、肺炎マイコプラズマの細胞膜に一対の新規糖脂抗原が存在することを見出し、マイコプラズマGGLsと命名した。本研究では、脂質部位を様々変化させたGGLsを合成して、診断プローブとしての有用性を評価した。その結果、合成GGLsを利用した新規診断法を開発することができた。また、GGLs分子の動的挙動を解析した結果、これら細胞膜脂質は細胞膜で自己組織化すること、また、ナトリウムイオンを捕捉する潜在能力をもつことを確認した。順調に推移している点:1.脂質部位の脂肪酸が異なる4種のGGLsホモローグの化学合成を、当初の予定通り完了し、基礎的な機能評価を行うことができた。2.これまで糖脂質抗原(GGLs)の二糖部分の化学合成には、各段階においてシリカゲルカラム精製操作が必要であった。今回、フルオラス法を適用した糖鎖合成法を確立することができ、GGLs抗原糖鎖の合成が、比較的容易に行えるようになった。この結果は、申請時に予想されていなかった進展である。難航している点:グリセロ糖脂質GGLsをコレステロール配糖体に置き換えた新規診断プローブ(GGLs-コレステロール)の合成を進めてきた。当初、26年度中に新規プローブの化学合成を完了する予定であったが、難航している。特に、コレステロール水酸基へのβ-選択的なグリコシル化反応に苦慮している。脱離基が異なる数種の糖供与体を試してみたが、目的とするコレステリルβ-グリコシド誘導体を高収量で得る条件が、未だに設定できていない。生物有機化学1)マイコプラズマ肺炎の診断プローブとして、炭素鎖長が異なる一連のGGLs誘導体を化学合成した。予備的な機能評価によって、C16よりもC18 (ステアリン酸)を脂質部位に持つGGLsホモローグが、診断プローブとして高いポテンシャルを持つことが判明した。今後、実際の血清試料を用いて、合成糖脂質抗原用いた診断法の有効性を明らかにしたい。2)前年度までの研究で、GGLsなどのβ-ガラクトグリセロ糖脂質はリン脂質とは異なる分子どう力学特性を示すことがわかってきた。このことは、細胞膜内で、糖脂質同士が集合化してラフと(マイクロドメイン)を形成する可能性を強く示唆する。グリセロ糖脂質は、セラミドを脂質とするスフィンゴ糖質と異なり、リン脂質とおなじグリセロ脂質であることから、細胞膜全体に広がって存在すると考えられている。
シリア出身の日本語学習者の学習環境とアイデンティティ形成過程の動態について

本研究では,シリアに留まり日本語を学び続ける日本語学習者,海外に難民,移民として移住したシリア出身の日本語学習者の日本語学習環境の実態とアイデンティティ形成過程を明らかにしていく。これらを総合的に考察した上で,内戦状況下にある日本語学習者のための支援方略を構築することを目指す。
ワンポット／ワンフロー合成による68Ga-DOTA標識の懸案解決と生体分子PET

報告者は、アジド・歪んだアセチレン間のクリック反応と理研クリック反応を融合した2つの高効率的なワンポット標識法を確立し、生体分子のPET標識における懸案を解決した。すなわち、68Gaを代表とする放射線を含む配位子分子に対して、報告者が開発した理研クリック反応の分子プローブ、そして標的とするペプチドやタンパク質、あるいは抗体や生細胞を温和な条件下で単に順番に作用させることにより、これらの生体分子を簡便に放射線で標識することが可能となった。さらに、この方法を用いて実際にPETイメージングに成功するとともに、MRイメージングの標識基や蛍光基にも展開し、診断や治療に適応できる一般的技術として確立した。生体分子の一般的な68Ga-DOTA標識の実現を目的とする本研究において、独自の「高速アザ電子環状反応」を駆使した2つの方法論を評価するが、平成25年度は以下の二重電子環状反応による方法を検討した。すなわち、これまでに報告者が開発した共役エステルアルデヒドを二量化することによって、アミノ基を持つ68Ga-DOTAとタンパク質や細胞表層のリジン残基を二回の段階的なアザ電子環状反応によってワンポットで効率的に繋ぐことを検討した。ポジトロン放出金属である68Gaを使用する前に、まずはコールドのGaを用いて検討した。アミノ官能基を持つ安定なDOTA分子に対して、予めGaを100度、30分の反応時間で導入した(ステップ1)。次いで、得られたGa-DOTAアミンの溶液をそのまま用い、これに対してアルデヒド二量化プローブを作用させ、1つ目の高速アザ電子環状反応を数分以内で実施した(ステップ2)。この際に、濃度を厳密に制御することで、1分子のアミンと選択的に反応させることを検討した。高濃度のGaを用いて実験を行った際には、濃度を厳密に調節でき、2量体の生成を防ぐことができたが、低濃度のGaを用いた場合には、濃度による反応性の調節ができず、目的とする化合物を効率的に得ることはできなかった。高濃度で調製したGa-DOTAアミン溶液に対して、さらに続けてモデルペプチドを室温、短時間作用させたところ、2つ目の高速アザ電子環状反応が進行し(ステップ3)、高速なGa-DOTA標識を実施することができた。しかしながら、実際にポジトロン放出金属である68Gaを使用する際には、極低濃度の溶液を使用しなければならない。そこで、平成26年度に実施する2つ目の研究結果を待って、最終的な手法とすることとした。平成25年度に検討した二重電子環状反応による68Ga-DOTAワンポット標識法は問題を残していたので、第2のワンポット法を検討した。本法では、電子環状反応の基質であるアルデヒドプローブに対して、まず68Ga-DOTAを結合させる。続けて、生体分子のリジン残基と反応させることにより、生体分子の効率的なワンポット68Ga-DOTA標識を検討した。既に平成25年度の結果により、報告者のアルデヒド分子は歪んだ活性化アセチレンとは反応しないことが分かっていた。そこで、アルデヒドプローブに8員環アセチレン基を導入し、あらかじめ調製したコールドのGaを導入したアジド官能基を持つDOTAに対して、歪み解消クリック反応により結合させた。この場合には、実際にPET実験に使用する極微量の68Ga-DOTAの濃度でも十分対応可能であることが判明した。さらに、続けてワンポットでペプチドやタンパク質を作用させることにより、電子環状反応を効率的に進行させ、コールドのGa-DOTAで標識することに成功した。これらのコールドのGaを用いた検討を基にして、ポジトロン放出核種である68Gaを用いて標識実験を実施した。種々検討を行った結果、まず、アジド基を有するDOTA配位子に対して、68Ga3+を塩酸中、100 oCで15分間反応させることにより配位させた。HPLCにより速やかに精製した後、さらに歪んだアセチレンを有する共役アルデヒドプローブへの結合(75 oC、15分、100%)、さらに続けてペプチドやタンパク質のアミノ基へほぼ定量的に標識することに成功した。本法を活用して、68Ga-DOTAだけではなく、64Cu-NOTA、あるいはMRイメージングの標識基として使用するGd-DOTや蛍光基にも展開できることを示し、不安定な生体分子や細胞表面にも使用しうる汎用的な標識法として実現した。全研究期間を通して報告者は、(1)二重アザ電子環状反応による68Ga-DOTAワンポット標識法、および(2)アジド・歪んだアセチレン間のクリック反応とアザ電子環状反応を融合した2つの手法を検討することにより、これまでの懸案を解決する効率的なワンポット68Ga-DOTA標識法の確立を目指した。種々検討の結果、実際のホット標識実験で用いる低濃度条件を鑑みて、最終的に第2のワンポット法を採用した。すなわちまず、アジド基を有するDOTA配位子に対して、ポジトロン放出核種である68Ga3+を配位させた。HPLCにより速やかに精製した後、さらに歪んだアセチレンを有する共役アルデヒドプローブへの結合、さらに続けてペプチドやタンパク質のアミノ基へほぼ定量的に標識することに成功した。本法を64Cu-NOTA、あるいはMRイメージングの標識基であるGd-DOTAや蛍光基にも展開し、ペプチドや抗体、あるいはタンパク質への効率的な標識を実現した。さらに生体内イメージングへの応用として、RGDペプチドに対して効率的に68Ga-DOTA標識を施し、ヌードマウスを用いたがんのPETイメージングに成功した。

研究期間の最終年度では、更なる効率性と利便性を追求して、放射線取扱いのための使い捨てチップ上でのワンフロー標識技術も併せて検討した。しかし、アジドと歪んだアセチレン間の歪み解消クリック反応が高温を必要とし、室温では長い反応時間を必要とすることから、エッペンドルフ内での実施が実用的な観点から適当であると判断した。そこで、標識化技術をさらに発展させるために、歪み解消クリック反応の代わりにDiels-Alder反応を用いることで、プローブ調製時間の軽減と他放射核種への汎用性を向上させた。68Ga-DOTA標識基に関わらず、イメージングや治療にも適応できる様々な標識基を導入できる一般的技術として確立した。報告者は、アジド・歪んだアセチレン間のクリック反応と理研クリック反応を融合した2つの高効率的なワンポット標識法を確立し、生体分子のPET標識における懸案を解決した。すなわち、68Gaを代表とする放射線を含む配位子分子に対して、報告者が開発した理研クリック反応の分子プローブ、そして標的とするペプチドやタンパク質、あるいは抗体や生細胞を温和な条件下で単に順番に作用させることにより、これらの生体分子を簡便に放射線で標識することが可能となった。さらに、この方法を用いて実際にPETイメージングに成功するとともに、MRイメージングの標識基や蛍光基にも展開し、診断や治療に適応できる一般的技術として確立した。当初の計画通りに、不安定な生体分子や細胞表面にも使用できる高効率的かつ汎用的なワンポット68Ga-DOTA PET標識技術を実現した。生体分子のイメージングを変える革新的な技術を確立した。有機合成化学、ケミカルバイオロジー平成26年度に確立したワンポット合成法を基にして、実際に様々なペプチドや微量タンパク質、あるいは生細胞のPETイメージングを実現し、ライフサイエンス分野における革新的な汎用技術として実現する。効率性に不安は残るものの、予定どおり1つ目の方法論を評価することができた。平成26年度に検討する別法との比較を以て、生体分子への68Ga-DOTA標識の一般手法として、さらに精査、確立する。平成26年度では、まず官能基を持つDOTAに対してGaを5分以内で配位させた後(ステップ1)、これを続けて共役アルデヒドに対して官能基選択的な反応を用いて結合させる(ステップ2)。さらに、アザ電子環状反応により、標的の生体アミンに対して短時間で全段階をワンポットで標識する(ステップ3)。平成25ー26年度で実施する第1、第2両者のワンポット法の実施を基に、生体分子への68Ga-DOTA標識の一般手法としてどちらが適当かを判断し、手法を精査、確立する。最終的にポジトロン放出金属である68Gaを用いて生体分子への68Ga-DOTA標識を実現する。平成25年度で使用した試薬類がごくわずかではあるが、予定より安価に入手できたため。主に、試薬や溶剤の確保のための物品費として使用する。平成25年度で生じた使用額の差額分は、平成26年度で実施する手法に必要不可欠な反応基質(化合物)を購入するため使用する。一方、国内外での成果発表やディスカッションのための旅費、さらに印刷費などその他の経費として使用する。
帝国形成期におけるイングリッシュネスと国家表象の諸相

本研究は、イングリッシュネスすなわちイングランド覇権を容認したブリテン体制を基盤にして帝国をめざしたイギリスの国家形成において、自国意識を醸成するために大きな役割を果たした国家表象の諸相について論述したものである。序章においてはブリテン体制の実態はイングランドを中心においたイングリッシュネスの構想に他ならないことを考察した。第1章においては貨幣の意匠における国家表象の役割について考察した。第2章においては風刺画に現れるブリタニア像のさまざまな様態を概観し、それらが自国意識の醸成に果たした役割を考察した。第3章においては第二の国歌とも言われる「ルール・ブリタニア」の起源について考察し、隷属を恐れ、自由を希求する願望の歌が、帝国としての発展とともに支配的で好戦的な歌に変貌することを論述した。第4章においては文明化の使命を具体化したとも言える大英博物館の創設の目的とその展示物に次第に膨張する自国意識が見られることを、特にパルテノン・マーブルの問題に焦点をあてて論じた。第5章においては1851年にロンドンで開催された万国博覧会もまた、産業国家としての発展を誇示し、自国意識を醸成する一つの国家表象であったことを論述した。第6章においては、『パンチ』に頻出するブリタニア像が自国意識を高揚させるためだけではなく、社会矛盾を批判するものとしても存在することを分析し、その国家表象としての意味について論述した。このように国家表象をさまざまな側面から分析することにより、帝国形成期のイングリッシュネスの本質に追ることができたものと考える。今後の課題は、個別的に論じたこれらのテーマを有機的に結びつけ、よりダイナミックに論じることである。また、帝国形成に果たした国家表象の意味を、西洋の列強にならって近代化をはかった当時の日本における国家表象の実態との関連でより詳しく論じることが残されている。自国意識を醸成する国家表象の役割の重要性に言及しながらイギリス帝国の形成過程を辿る本研究において、本年度は主にエリザベス朝における自国意識と比較検討しながらステュアート朝のブリテン体制の特質について考察し、その後の帝国意識の発展を辿った。すなわち、ユニオン・フラッグや「ルール・ブリタニア」成立の背景には、イギリス帝国のあり方についての根本的な二つの方向である「閉鎖海洋論」と「自由海洋論」が反映していること、さらに、これがいわゆる「イングリッシュネス」と「ブリティッシュネス」の二つの概念にも関係していることを考察し、イングランド中心のブリテン意識が帝国意識に転換されてゆく過程を当時の風刺画や政治的なジャーナルに登場する国家表象やそれについての記事によって実証的に検討した。具体的には、国家表象のひとつであるブリタニアについて、その意匠をもつコインの起源を辿るとともに、チャールズ二世の治世にその意匠がイギリスの硬貨に登場する経緯を考察し、その後の意匠の変化を風刺画に盛んに登場するブリタニアの図像の変化などと関連させて検討した。同時に、これらの国家表象が単に排他的な愛国心を煽るために使われるだけでなく、ジャーナルの発達や新しい富裕階層の誕生などの社会的、文化的な要因によって変化することにも留意した。資料の収集にあたっては、主としてオックスフォード大学ボドレアン図書館所蔵の一次資料を利用したほか、とくに18世紀の風刺画や19世紀のさまざまなジャーナルの記事や国家表象にかかわる図版については大英博物館のプリント部門および国会図書館所蔵の資料によって確認をすすめた。