hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
鉄欠乏で惹起される小腸粘膜のフェリチン非依存的抗酸化メカニズムの解明

貧血ラット小腸では、グルタチオン濃度が鉄充足群に比べて高く維持され、脂質の過酸化を抑制するフェリチン非依存的な抗酸化メカニズムが働くことを見いだした。結紮した腸管に鉄を投与すると、細胞内の遊離鉄は貧血群で高くなった。鉄充足群、貧血群ともに、鉄の投与によって還元型GSHの割合は減少したが、その減少率は通常群に比べて貧血群で有意に大きかった。GSHの合成阻害剤を投与し、小腸粘膜細胞の総GSHを低下させたラットに鉄を投与すると、鉄充足群、貧血群ともに脂質の酸化が促進した。鉄はFenton反応を介してヒドロキシラジカルを発生するため、通常は細胞内のフェリチンと結合することで反応が抑制されている。一方、鉄欠乏状態では鉄吸収が亢進し、同時にフェリチン発現量が低下するため、十二指腸粘膜細胞内で遊離鉄が増加し、酸化ストレスが発生する可能性がある。Fenton反応で生成されたヒドロキシラジカルを消去する代表的な抗酸化物質であるグルタチオンは細胞内濃度が高く、酸化還元状態を維持するために最も重要な細胞性抗酸化物質とされている。貧血ラットでは、このグルタチオン濃度が鉄充足群に比べて高く維持され、脂質の過酸化を抑制するフェリチン非依存的な抗酸化システムが働くこと見いだした。小腸粘膜の総グルタチオン(tGSH)に占める還元型GSHの割合(GSH/tGSH)は99%以上であった。結紮した腸管に鉄を投与すると、細胞内の遊離鉄(labile iron pool:LIP)は貧血群で高くなった。鉄充足群、貧血群ともに、鉄の投与によって還元型グルタチオンの割合は減少したが、その減少率は通常群に比べて貧血群で有意に大きかった。グルタチオン合成阻害剤L-ブチオニン(S,R)-スルホキシミン(BSO)を投与し、小腸粘膜細胞のグルタチオンを低下させたラットに鉄を投与すると、鉄充足群、貧血群共に脂質の酸化が促進した。貧血ラットの小腸では、フェリチン非依存的な抗酸化システムが働いていることが示唆された。鉄欠乏性貧血では生体内で鉄を貯蔵するフェリチンが極めて低く保たれており、小腸粘膜細胞も例外ではない。フェリチンは鉄を結合することで酸化ストレスの発生を抑制すると考えられており、そのため貧血状態の小腸では鉄の投与で酸化ストレスが高くなる可能性がある。粘膜細胞の酸化ストレス関連因子を測定し、細胞内抗酸化物質であるグルタチオンが通常群に比べ極めて高い可能性を見出していたが、本研究でその再現性を確認した。鉄投与から数時間ではフェリチン発現量は変化しない(B.B.B.,74:655-658,2010)ため、貧血ラットの小腸には通常群とは異なるグルタチオンを中心とした抗酸化メカニズムが働くと推測している。貧血時の小腸で過剰な鉄に応答する抗酸化メカニズムを明らかにするため、平成23年度は、ラットの鉄欠乏状態と小腸粘膜細胞のグルタチオン濃度、鉄投与時の小腸粘膜細胞における還元型(GSH)および酸化型(GSSG)グルタチオンの変動と細胞内の脂質の酸化について検討した。研究の成果として、貧血時の小腸粘膜ではGSH濃度が通常ラットの1.52倍になること、過剰鉄投与でGSH/GSSH比率が低下すると共に総グルタチオン(GSH+GSSH)量が急速に低下すること、貧血ラットでは鉄投与により粘膜細胞内の不安低な鉄が増加するが脂質の酸化は抑制されていることを明らかにした。貧血ラットの小腸粘膜細胞の酸化ストレス関連因子を測定したところ、通常群とは異なる抗酸化メカニズムが働くと推察された。本年度は、鉄栄養状態の異なるラットを作成し、鉄欠乏による十二指腸粘膜細胞内のグルタチオン濃度の上昇について再現性を確認した。また、鉄投与時の小腸粘膜細胞における還元型(GSH)および酸化型(GSSG)グルタチオンの変動について検討した。ラットの鉄栄養状態および鉄投与が十二指腸粘膜細胞のグルタチオン濃度に及ぼす影響については、再現性も含め目的をほぼ達成した。貧血ラットの粘膜細胞では、鉄投与時の脂質の酸化(TBARS)が通常群に比べて有意に抑制されることを確認した。そこで核酸損傷(8-OHdG)を検討する前に、脂質過酸化に関連するTBARS以外の指標についても検討することとし、H2O2については測定を終了している。脂質過酸化についても概ね目標に達している。平成24年度は、貧血ラットへGSH枯渇剤を投与して粘膜細胞内酸化ストレスの変動を調べる。GSH枯渇剤としてPhorone、Acetaminophen、L-ブチオニン(S,R)-スルホキシミンの胃内投与により十二指腸粘膜細胞のグルタチオン濃度を低下させる投与条件について検討する。

最適化された条件によって、小腸粘膜内のGSH発現量が低下した貧血ラットを作製し、各群(通常群、GSH高発現貧血群、GSH低発現貧血群)のラット消化管へ鉄を投与して、脂質過酸化の変動について検討する。GSH合成酵素、その他酸化ストレスで変動する遺伝子の発現や、酸化ストレスに関連する諸因子についても検討し、鉄欠乏によってフェリチンが低下しGSHが増加するメカニズムの解析へ繋げたい。ラットおよび特殊精製飼料の購入に約45万円、GSSG/GSH測定キット、Hydrogen Peroxide測定キット、Ferritin Elisaキット等の購入に約55万円、研究補助謝金として10万円を予定している。実験動物および特殊精製飼料の購入費が本年度申請額の約40%を占める。鉄欠乏ラットを得るために最低3週間の鉄無添加飼料での飼育が必要である。また、ラット1匹の十二指腸から得られる上皮粘膜は約70150μgであり、GHSやフェリチン測定に必要な粘膜を確保するために相当数のラットが必要である。細胞内へ鉄が取り込まれた際のFerritin量の変動はImmunology Consultants Laboratory社のRat Ferritin Elisa(単価\78,000)で、脂質の酸化(TBARS)はTBARSアッセイキット(単価\89,000)で測定する。また、貧血状態の指標として、血清鉄、UIBCをキットで測定している。
自己入射的環を中心とした環論の研究

原田環(Harada ring)の一般化である、準原田環の構造とMorita dualityについて研究を行い、様々な結果を得た。原田環の場合と同様に、すべての準原田環はQF環から構成させることを示した。すなわち、QF環から出発し、本研究代表者が対角完備(diagonally complete)と名づけた部分環とその剰余環を取ることを繰り返せば、すべての準原田環が得られることを証明した。一方、good self-dualityと呼ばれる特別なself-dualityとの関連も研究し、準原田環の構造の研究の応用として、すべての局所分配的右serial環はgood self-dualityをもつことや、すべての局所分配的右QF-2環はself-dualityの一般化であるalmost self-dualityをもつという結果を得た。これらは「すべての完全アルチン環はself-dualityをもつ」と主張する東屋の予想の部分的な回答を与えている。また、準原田環の構造の研究の別の応用として、最近の馬場のserial環のAuslander環のself-dualityに関する定理を改良した。Morita dualityをもつ環Aの拡大環RがMorita dualityをもつための条件を与えるB.J.Mullerの結果がある。環Aと環BがMorita dualのとき、ある種のAの拡大環の圏とある種のBの拡大環の圏が圏同値であることを示すことによって、Mullerの結果を改良した。また、A上自由である有限中心的拡大Rについて、BとRとMoritadualな環Sとの関係を決定した。この結果は、有限中心的拡大のself-dualityに関する真野の定理と半群環のMorita dualityに関するHaack-Fullerの定理を統合・一般化するものである。原田環(Harada ring)の一般化である、擬原田環の構造を研究した。原田環の場合と同様に、すべての擬原田環はQF環から構成されることを示した。すなわち、QF環から出発し、本研究代表者が対角完備(diagonally complete)と名付けた部分環とその剰余環を取ることを繰り返せば、すべての擬原田環は得られることの証明に成功した。一方、good self-dualityと呼ばれる特別self-dualityとの関連も研究し、今回の擬原田環の構造の研究の応用として、すべての局所分配的右serial環はgood self-dualityを持つことや、すべての局所分配的右QF-2環はself-dualityの一般化であるalmost self-dualityを持つという結果を得ることに成功した。これらは「すべての全アルチン環はself-dualityをもつ」と主張する東屋の予想の部分的な回答を与えている。また、擬原田環の構造の研究の別の応用として、馬場氏の最近のserial環のAuslander環のself-dualityに関する定理の改良に成功した。環のMorita dualityがどのような拡大環に遺伝するかを研究した。環拡大へのMorita dualityやself-dualityへの遺伝については、有限生成自由加群としての拡大で生成元が中心的である場合に、特に詳しく研究されてきており、self-dualityの遺伝について述べた真野の定理や、群環に関するHaack-Fullerの定理があるが、一見無関係に見えるこれらの結果を統合・一般化することに成功した。現在は、この結果のさらなる一般化・改良について検討中である。本年度は,昨年度に引き続き,環のMorita dualityがどのような拡大環に遺伝するかを研究し,その成果を発表した。環AがMorita dualityをもつとき,Aの拡大環RがいつMorita dualityをもつかという問題は,古くから多くの研究者によって調べられてきた。これについては,「Aが(B,A)両側加群Uによって定められるMorita dualityをもつとする。Aの拡大

環Rが右A加群としてlinearly compactで,右A加群としてのRのU双対が右A加群としてlinearly compactのとき,RはMorita dualityをもつ」というB.J.Mullerの結果が基本的である。今回の研究では,Morita dualityをもつ環AとMorita dualityを与える(B,A)両側加群Uを固定したとき,上のMullerの定理を満たすA環R(すなわち,環RとAからRへの環準同型写像の対)全体の圏と,AとMoritadualな環Bについてのある種のB環Sの圏は圏同値であることを示すことに成功した。これはMullerの結果の改良である。今回の研究では,圏同値を与える圏手としてU双対を2回取る圏手に注目した。これによって拡大環RとMoritadualな環Sの構造やSとBの関係を調べることが容易になり,特にA上自由であるようなAの有限中心的拡大Rについて,RとMorita dualな環Sの構造を決定することができた。この結果は,一見無関係に見えるself-dualityの遺伝に関する真野の定理と半群環のMorita dualityに関するHaack-Fullerの定理を統合・一般化したものである。これらの成果について,2004年9月3日-5日に信州大学において開催された「第37回環論および表現論シンポジウム」で発表した。
タンパク質分解制御による酸化ストレス応答機構の解明

Keap1-Nrf2システムは,生体の酸化ストレス・親電子性物質応答に関わる遺伝子発現制御システムである。Keap1は,酸化ストレスに対するセンサーであり,一方Nrf2は酸化ストレス防御遺伝子の発現を活性化する転写因子として機能する。最近申請者は,酸化ストレスセンサーであるKeap1が, Cul3型ユビキチンライゲースのアダプターとしての機能も持ち,転写因子Nrf2をプロテアソーム依存的にすみやかに分解していることを,世界に先駆けて明らかにした。さらに,酸化ストレスによるNrf2の活性化の実態は, Keap1-Cul3ユビキチンライゲースによる分解抑制からの脱抑制であることを示していた。本研究では,この酸化ストレスによるKeap1依存的ユビキチン化反応の阻害機構とさらに他のシグナル系とのクロストークについて解析を行った。まずKeap1とM2の相互作用は, Nrf2のNeh2ドメイン内にあるDLGモチーフとETGEモチーフがそれぞれKeap1のDGRドメインと相互作用することを示した。DLG-DGR間の結合親和性はETGE-DGR間よりも低く,この結合が解離してもNrf2のユビキチン化が阻害され,安定化することを見出した。したがって,酸化ストレスによるNrf2の活性化機構の実態は, Keap1のシステイン残基の酸化修飾によりKeap1二量体の構造変換をもたらし, DLG-DGR間の結合が解離することにあるという申請者の仮説を支持した。さらにこのDLG-DGR間の結合を阻害する因子としてオートファジーに関わるp62を同定した。p62は, Keap1のDGRドメインに結合することで, Nrf2とKeap1の相互作用を競合的に阻害した。すなわち,細胞内のバルクなタンパク質分解機構であるオートファジーとKeap1-Nrf2システムのクロストークの存在を明らかにした。高等真核生物における酸化ストレス応答の制御において、Keap1-Nrf2システムは極めて重要な機能を有する。Nrf2は酸化ストレス応答遺伝子の発現を強力に活性化する転写因子であり、一方Keap1は酸化ストレスのセンサーであり、またNrf2の抑制性因子である。このNrf2抑制機構は、Keap1がCul3とユビキチンライゲース複合体を形成することで、Nrf2をユビキチン化しタンパク質分解にもたらす。さらに申請者は、酸化ストレスによるNrf2の活性化は、このKeap1依存的なNrf2タンパク質分解の阻害であることを示している。本研究では、この酸化ストレスがどのようにKeap1依存的なタンパク質分解機構を阻害するのかを解明することを目的としている。本年度において解明した点は、この点において重要な意味を持つと予想されるKeap1のNrf2認識機構を、構造生物学的解析により明らかにした。すなわち、Nrf2のKeap1との相互作用ドメインであるNeh2ドメインは、さらにDLIDモチーフとETGEモチーフに分けられ、それぞれKeap1のDGR/Kelchドメインと静電的に相互作用することを明らかにした。既報によりKeap1はホモニ量体を形成することが示されているため、上記の結果は2分子のKeap1と1分子のNrf2が相互作用するモデルを示唆している。さらに物理化学的な解析から、DLIDとDGR/Kelchドメインの相互作用は、ETGEのそれに比して、弱いことが分かった。したがって、酸化ストレスがKeap1の酸化ストレスセンサーであるシステイン残基の酸化修飾することで構造変化をもたらし、DLIDモチーフがDGR/Kelchドメインから解離し、ユビキチン化が阻害されることが、Nrf2活性化機構の実態であると予想された。
ヘテロ型ネットワークシステムにおける診断知識の獲得とモデル化に関する研究

平成5年度から平成6年度にわたる研究により以下のような成果を得た。1.専門家の故障診断事例の分析故障診断の専門家が有する、代表的な診断事例を分析することにより、専門家の利用する推論方式、知識構造に関する共通性を確認した。2.故障診断エキスパートシステムの概念モデルの構築上記知見をふまえて、故障診断の原理を「プロトコルスタックの探索問題」であると同定し、エキスパートシステムの概念モデルを構築した。3.プロトタイプ第1版の開発ネットワークプロトコルに関する知識を入力とし、徴候と故障仮説間の可能な因果関係すべてを故障木の形で出力する知識コンパイラを開発した。これにより、故障したハードウェアが特定できれば、そのハードウェア上のソフトウェアにおける故障箇所が特定できることが確認された。また、ネットワークハードウェア構成に関る知識の整備と実装が新たな課題として認識された。4.故障診断モデルの精密化平成6年度においては、ネットワークハードウェア構成に関する知識を組み込むことにより、ソフトウェアにおける故障箇所を特定できるのみならず、診断初期に故障対象として仮定したネットワークハードウェア構成に関して仮説の変更を指示できるように、モデルの表現能力を改善した。5.故障診断エキスパートシステムの改良(4)で述べた診断モデルを組み込んだ故障診断エキスパートシステムの改良版を開発した。上記により、プロトコルおよびハードウェア構成の知識を保持し、徴候と故障仮説間の可能な因果関係のすべてを故障木の形で出力する知識コンパイラを開発することに成功した。平成5年度は、以下にのべる4点にわたって研究を実施し、それぞれ当初の目的を達成する成果を得た。1.専門家の故障診断事例の収集と分析ネットワーク故障診断の専門家に対して、知識工学の専門家がインタビューをおこない、代表的な故障診断事例に関するデータを収集・整理した。その結果、故障事例の違いにも関らず、専門家の利用する推論方式、知識構造に共通性があることが確認された。2.故障診断エキスパートシステムの概念モデルの構築上記の共通性とは、故障仮説の生成/テスト/修正において利用される手順とそこで利用される知識のとりあつかい方にある。この知見をふまえて、故障診断の原理を「プロトコルスタックの探索問題」であると同定した上で、エキスパートシステムの概念モデルを構築した。この時、探索開始点の決定/探索移行点の決定/テスト手段の生成等のサブタスクを実現することが、効率的なシステム構築の基本となることもわかった。3.プロトタイプも開発ネットワークプロトコルに関する知識を入力とし、兆候と故障仮説間の可能な因果関係すべてを故障木の形で出力する知識コンパイラを利用して、上記モデルに基づくプロトタイプを開発した。4.専門家の故障診断法の比較による、故障診断木の評価故障診断の事例手順(成果1)と、故障木(成果3)を比較することにより、本年度研究の全体的評価をおこなった。故障木の刈り込みのために「経験により得られる知識」を活用することにより効率面まで考慮したエキスパートシステムの構築が可能であることが確認され、本研究の方向性の正しさが確認された。上記成果は学会等ですべて公開した。ネットワークハードウェア構成に関る知識の整備と実装が次年度の課題である。平成6年度は、以下に述べる2点について、当初の目的を達成する成果を得た。1.「故障診断モデルの精密化」故障診断モデルは、以下の5種類の知識から成るドメインモデルとして定義される。(1)対象世界の構造を表現する知識,(2)対象世界を支配する法則性に関する知識,(3)対象世界の構造の探索を制御する知識,(4)モデル構成要素を解釈する知識,(5)故障メカニズムの汎化知識。平成5年度の研究で、(1)から(5)に関する知識を、プロトコルスタックの探索問題として定式化することにより、故障したハードウェアが特定できれば、そのハードウェア上のソフトウェアにおける故障箇所が特定できるという成果が既に得られていた。平成6年度においては、(1)から(5)に関する知識に、さらに、ネットワークハードウェア構成に関する知識を組み込むことにより、以下のように、モデルの表現能力を顕著に改善した。ソフトウェアにおける故障箇所と特定できるのみならず、診断初期に故障対象として仮定したネットワークハードウェア構成に関して仮説の変更を指示できる。

すなわち、ネットワークプロトコル、ネットワークハードウェア構成の双方を取り扱える故障診断モデルを開発する、という本研究の目的は達成された。2.「故障診断エキスパートシステムの改良」1.で述べた診断モデルを組み込んだ、故障診断エキスパートシステムの改良版を開発し、ネットワークプロトコル、ネットワークハードウェア構成の双方にわたって、兆候と故障仮説間の可能な因果関係のすべてを故障木の形で出力する知識コンパイラを開発した。また、知識記述量の増加に伴ない発生した知識記述コストの軽減をはかるため、知識をオブジェクト指向に基づいて記述する手段も開発した。上記成果により、ネットワーク故障診断エキスパートシステムについて、基礎的理論TOSONO現可能性を保証するプロトタイプの開発がなされた。
不確実性下の集団的意思決定と、私的情報の集計と活用

本論文の研究対象は,結論がいくつかの前提条件に依存するような複雑な集団的意思決定の問題である.このような問題に直面した時,どのような意見集約のルールを採用するかによって,最終的な決議が変わってくることが社会的選択理論における逆理として知られてきた.本論文では条件ベースのルール(PDW)と結論ベースのルール(CDW)の2つを比較検討し,どちらの方法がより高い確率で集団にとって正しい結論を選ぶかを考察した.この考察によって主に2つのことが明らかになった.まず第一に,集団の直面する問題が論理積タイプの場合にはCDWが,論理和タイプの問題の場合にはPDWが他方に比べて冤罪を防ぎやすいことが示された.これらの結果から,PDWとCDWの答えがつねに一致する,すなわち集団がdoctrinal paradoxを回避できるのは,問題が退化した場合のみであるという不可能性定理が得られた.第二に,投票者の数が増加したときに優れたパフォーマンスを発揮するのはPDWであることが明らかになった.通常仮定される緩い仮定のもとでPDWの正答確率は1に収束する一方で, CDWの収束には比較的強い条件が必要となる.29年度が最終年度であるため、記入しない。29年度が最終年度であるため、記入しない。
網膜リボンシナプスにおける2種類の開口放出と情報伝達機能に関する研究

視細胞・網膜双極細胞・有毛細胞などの感覚ニューロンは緩電位応答を発生し、終末部にはシナプス小胞が多数繋留されたシナプスリボンという構造が観察されることから、シナプスリボンの機能は伝達物質の持続性放出に関与していると仮定されている。この仮説を検討するために、キンギョ網膜から単離したMb1型双極細胞を膜電位固定し、全反射蛍光顕微鏡で終末部の膜直下を蛍光イメージングした。シナプスリボンを蛍光性標識ペプチドで可視化し、Ca2+流入部位を蛍光性Ca2+指示薬で観察したところ、脱分極刺激によるCa2+流入はシナプスリボン直下で生じることが明らかになった。また、伝達物質の開口放出部位を調べるために、FM色素で可視化したシナプス小胞の融合イベントを観察したところ、脱分極刺激を与えると、融合イベントはシナプスリボン直下で一過性に増加するのに対し、シナプスリボンから離れた領域では遅れて増加することが明らかになった。また、プロテインキナーゼCを活性化させると融合イベントはシナプスリボンから離れた領域で顕著に増加することがわかった。シナプス小胞の融合イベントは、シナプスリボン直下でもシナプスリボンから離れた領域でも、集中的に生じていた。Mb1型双極細胞の終末部を電子顕微鏡で観察した結果、シナプスリボン直下のdyadというリボンシナプス以外にも、シナプス小胞が集積し、ポスト側にPSDのある1本のプロセスがのびている「リボン無しシナプス」が見っかり、両者はほぼ同数存在することがわかった。以上の結果から、Mb1型双極細胞からの開口放出は、シナプスリボン直下のアクティブ・ゾーンで一過性に生じ、シナプスリボンの無いアクティブ・ゾーンでは持続性に生じると結論した。双極細胞からの視覚情報は、リボンシナプスで一過性に、リボン無しシナプスで持続性に伝達されることが示唆された。網膜第2次ニューロンである双極細胞からのシナプス出力様式を明らかにするために、伝達物質であるグルタミン酸が軸索終末部のどの部位から開口放出されるかを検討した。キンギョ網膜から単離したMb1型双極細胞を膜電位固定し、パッチ電極からシナプスリボンに特異的に結合する蛍光標識したペプチドと蛍光性Ca指示薬を導入した。全反射蛍光顕微鏡を用いて膜直下の蛍光変化を計測した結果、Caイオンの流入部位はシナプスリボンの直下に局在していることが明らかになった。次に、シナプス小胞をFM色素で蛍光標識し、脱分極によってCa電流が活性化された時に、シナプス小胞の形質膜への融合がどの部位で生じるかを検討した。その結果、シナプス小胞の融合イベントは、脱分極直後にはシナプスリボン近傍で一過性に生じるが、その後、シナプスリボンから離れた場所で持続的に生じることが明らかになった。また、双極細胞軸索終末部に存在するプロテインキナーゼCを活性化させるとシナプス小胞の融合イベントはシナプスリボンから離れた場所で選択的に増加することを見いだした。さらに、シナプス小胞の融合イベントはランダムな場所で生じるのか否かをモデルシミュレーションで検討した結果、シナプスリボン近傍のみならずシナプスリボンから離れた場所でも局所的に集中して生じることが明らかになった。電子顕微鏡を用いてキンギョ網膜の双極細胞軸索終末部の微細構造を観察した結果、シナプス小胞はシナプスリボン直下のみならずシナプスリボンから離れた部位にも繋留されていること、また、シナプス小胞の凝集部位の対面にシナプス後細胞のプロセスがのびておりシナプス特有の構造があることを見いだした。

以上の結果から、双極細胞にはリボンシナプスとリボン無しシナプスという2種類の出力シナプスが存在し、それぞれ一過性と持続性のシナプス伝達に関与しているとの新たな知見が得られた。緩電位を発生する感覚系神経細胞(網膜の視細胞や双極細胞,蝸牛の有毛細胞,側線器の有毛細胞など)のシナプス前終末部にはシナプスリボンという微細構造が1個から数十個存在し,その周辺にシナプス小胞が集積している。また,シナプスリボンの近傍の形質膜にCa^<2+>チャネルが密集しており,相対するシナプス後膜にはpostsynapticdensity(PSD)が存在するので,シナプスリボン直下の形質膜がactive zoneであろうと推測されている。しかし,最近,active zone以外での異所性開口放出が小脳の神経細胞等で報告された。そこで,キンギョ網膜から単離したMb1型双極細胞の軸索終末部に全反射蛍光顕微鏡を適用し,膜電位固定下で,Ca^<2+>の流入部位,リボンの位置,シナプス小胞の形質膜への融合イベントの時空間分布を検討した。その結果,Ca^<2+>チャネルはリボン近傍に密集していること,シナプス小胞の融合イベントはリボン近傍で一過性に生じるのみならず,リボンから離れた特定の部位で持続性に生じることが明らかとなった。また,連続超薄切片を電子顕微鏡で観察し,Mb1型双極細胞軸索終末部を3次元再構築したところ,dyadを形成するリボンシナプスと1本の神経突起と結合するリボン無しシナプスはほぼ同数存在することがわかった。以上の結果から,キンギョ網膜のMb1型双極細胞は,軸索終末部内に存在する多数のリボンシナプスを介してCa^<2+>チャネルの活性化に同期した一過性の情報を中枢に送り,一方,リボン無しシナプスを介して持続性の情報を中枢に送ることが示唆された。また,マウス網膜の桿体型双極細胞の軸索終末部におけるシナプスを電子顕微鏡で観察した結果,リボンシナプス以外に,少数のリボン無しシナプスの存在を確認することができた。
結晶構造解析による赤痢菌エフェクターの作用機構の解明とその応用

病原菌は感染に際し、エフェクターと呼ばれる約30種類のタンパク質を宿主細胞へ分泌し、宿主の持つ防御機構を妨げることで感染を成立させる。これらの中で、脱アミド化酵素OspI及びユビキチンリガーゼIpaHファミリータンパク質は自然免疫応答を抑制することが、報告されている。先行研究として赤痢菌エフェクターOspIの構造研究を行い、OspIによる特異的なUbc13認識機構を明らかにした。しかし、赤痢菌による宿主免疫系の制御にはIpaHファミリーも関わっており、OspI単独の研究だけでは病原性細菌による宿主の免疫系阻害機構の理解およびこのエフェクターを制御することによる薬剤の開発には不十分である。そこで、OspIの研究と共にIpaHの構造解析を行うことにより、病原性細菌による宿主免疫系の抑制機構の理解および、エフェクターの機能を制御する薬剤開発の基盤構築を目的として本研究を行った。IpaHに関しては、26年度に行ったIpaH4との相互作用解析により結合が示唆されていた3種類の化合物をもちいて、これらの阻害活性を検証したが、何れの化合物も有意な阻害活性を持たなかった。しかし、IpaH4、IpaH3の活性の詳細を明らかにするために、ユビキチン変異体を用いたin vitroユビキチン化実験を行ったところ、これまで報告になかった連結様式のユビキチン鎖も伸長することが示唆された。OspIは、類似の活性を持つ酵素を阻害することが報告されている化合物を用いて、化合物との複合体結晶構造解析を行った。その結果、複合体構造を分解能2.6Åで決定することに成功した。OspIは活性残基が化合物と共有結合を形成した阻害型構造を形成しており、OspIと阻害剤の原子レベルの構造情報を得ることができた。28年度が最終年度であるため、記入しない。病原菌は感染に際し、エフェクターと呼ばれる約30種類のタンパク質を宿主細胞に分泌し、宿主の持つ防御機構を妨げることで感染を成立させる。この中でも、脱アミド化酵素OspI及びユビキチンリガーゼIpaHファミリータンパク質が自然免疫を抑制することが、報告されている。OspIはジアシルグリセロール依存性のTRAF6を介した転写因子Nucler factor-κB(NF-κB)の活性化を抑制する。IpaHファミリータンパク質はN末端領域のLeucine Rich Repeat(LRR)ドメインとC末端領域Novel E3 Ligase(NEL)ドメインから構成されるE3ユビキチンリガーゼ活性を持ったタンパク質であり、標的タンパク質へユビキチン鎖を修飾しプロテアソームによる分解を誘導し、宿主免疫系を抑制する。先行研究で赤痢菌エフェクターOspIの構造研究を行っており、OspIによる特異的なUbc13認識機構を明らかにした。しかし、赤痢菌による宿主免疫系の制御にはIpaHファミリーも関わっており、OspI単独の研究だけでは病原性細菌による宿主の免疫系阻害機構の理解およびこれらエフェクターを制御することによる薬剤の開発には不十分である。そこで、OspIの研究と共にIpaHの構造解析を行うことにより、病原性細菌による宿主免疫系の抑制機構の理解およびエフェクターの機能を制御する薬剤開発の基盤構築を目的として本研究計画を行った。昨年度、本研究で対称とした3種類のIpaHファミリータンパク質のうちIpaH4の単独全長構造を分解能3.7Åで決定することに成功した。IpaH4の構造は既に報告されたIpaH3全長構造と異なり、IpaHファミリータンパク質の活性調節機構に関して新たな知見を与えるものであった。また、IpaH4.5においてはN末端ドメイン、C末端ドメインの個別発現系と精製系を確立した。IpaH4の低分解能結晶構造は26年度研究に決定したが、27年度の研究において結晶化条件を検討することにより分解能を3.4Åに向上した。これにより以前の電子密度では決定できなかった領域の分子モデルを新たに決定し、モデルの改善に成功した。また、IpaH4と相互作用することが示唆されているE2酵素Ubc13との相互作用解析を行った。さらに、IpaHファミリーの活性制御機構を明らかにするため、X線小角散乱を用いてIpaH4およびユビキチン化活性の特徴が異なるIpaH3、IpaH9.8の3種類のIpaHファミリータンパク質の溶液構造解析を行った。阻害剤探索では、26年度研究で相互作用が示唆されていた化合物を使用したユビキチン化活性測定により、ユビキチン化活性への化合物の影響を検証した。

26年度研究によりIpaH4の単独結晶構造を3.7Å分解能で決定したが、分解能の向上を目的とした結晶化条件の検討を行った。その結果、旧結晶とは異なる結晶系で、IpaH4の単独結晶構造を分解能3.4Åで決定することに成功した。新規結晶では、旧結晶では電子密度の確認できなかったN末端826番目までのアミノ酸残基、C末端NELドメイン、535547番目の電子密度が確認でき、これらの領域のモデルを新たに構築することができた。また、IpaH4はK63型ユビキチン鎖合成活性を示し、K63型ユビキチン鎖合成に関与するE2酵素Ubc13との相互作用が示唆された。そこで、IpaH4とUbc13との相互作用を、Pulldown解析及びゲルろ過クロマトグラフィーにより解析をした。本研究で決定したIpaH4単独構造はN末端LRRドメインとC末端NELドメインが直列に連なった構造を形成していたが、IpaHファミリーは自身の活性を制御するためにLRRドメインがNELドメインを覆う様に配置する自己阻害型構造をとると考えられてきた。そこで活性の異なる、IpaH4、IpaH3、IpaH9.8の3種のIpaHファミリーを用いてX線小角散乱解析を行った。その結果、どのIpaHファミリーにおいても溶液中では伸びた構造を形成しており、報告されていた自己阻害型構造が活性制御に関与しないことが示唆された。阻害剤探索については、タンパク質の変性温度を利用した相互作用解析Thermal Shift Assayにより結合が示唆されていた化合物を用いて、IpaH4.5のNELドメインのユビキチン化活性への影響を検証した。病原菌は感染に際し、エフェクターと呼ばれる約30種類のタンパク質を宿主細胞へ分泌し、宿主の持つ防御機構を妨げることで感染を成立させる。これらの中で、脱アミド化酵素OspI及びユビキチンリガーゼIpaHファミリータンパク質は自然免疫応答を抑制することが、報告されている。先行研究として赤痢菌エフェクターOspIの構造研究を行い、OspIによる特異的なUbc13認識機構を明らかにした。しかし、赤痢菌による宿主免疫系の制御にはIpaHファミリーも関わっており、OspI単独の研究だけでは病原性細菌による宿主の免疫系阻害機構の理解およびこのエフェクターを制御することによる薬剤の開発には不十分である。そこで、OspIの研究と共にIpaHの構造解析を行うことにより、病原性細菌による宿主免疫系の抑制機構の理解および、エフェクターの機能を制御する薬剤開発の基盤構築を目的として本研究を行った。IpaHに関しては、26年度に行ったIpaH4との相互作用解析により結合が示唆されていた3種類の化合物をもちいて、これらの阻害活性を検証したが、何れの化合物も有意な阻害活性を持たなかった。しかし、IpaH4、IpaH3の活性の詳細を明らかにするために、ユビキチン変異体を用いたin vitroユビキチン化実験を行ったところ、これまで報告になかった連結様式のユビキチン鎖も伸長することが示唆された。OspIは、類似の活性を持つ酵素を阻害することが報告されている化合物を用いて、化合物との複合体結晶構造解析を行った。その結果、複合体構造を分解能2.6Åで決定することに成功した。
棘皮動物胚の形態形成におけるシグナル分子・受容体間相互作用とその遺伝子の発現解析

(1)一次間充織細胞移入、移動、原腸形成における受容体型チロシンキナーゼの関与:一次間充織細胞移動開始に当たって哺乳類抗FAK抗体と結合する2量体蛋白が一方のサブユニットのみチロシンリン酸化を引き起こすことを発見した。この蛋白は分子形態から既知のFAK蛋白とは全く異なることから、SUp62と命名した。SUp62のチロシンリン酸化は一次間充織細胞において顕著で、in vitroで一次間充織細胞の接着蛋白であるパムリンと接触することによって同様にチロシン残基のリン酸化を引き起こす。SUp62のチロシンリン酸化は受容体型チロシンキナーゼ阻害剤のハービマイシンA処理によって過剰リン酸化を引き起こす。一次間充織細胞の移動阻害、一次間充織細胞パターン形成阻害、原腸形成阻害を引き起こすことから、初期胚形態形成運動に重要な蛋白である。(2)上皮/間充織転換における上皮細胞表面特異蛋白Epith-1の細胞内取り込み:ウニ胚上皮細胞の側面にはEpith-1と我々が命名した蛋白が存在することを我々が作製したモノクローン抗体によって発見した。さらに、Epith-1は一次間充織細胞及び二次間充織細胞が上皮から間充織へと転換するときにこれらの細胞の表面から消失する。このとき、細胞質内への取込みが起きていることを免疫細胞化学によって解明した。細胞表面蛋白のこのような取込みが細胞内へのシグナル伝達機構として働いている可能性が指摘される。(3)セロトニン神経節の形成:ウニ幼生の高度なシグナル伝達系としてこれまで実体が不明であった幼生の神経節形成を抗セロトニン抗体を用いて免疫化学的に明らかにした。さらに、セロトニン合成酵素の遺伝子を単離し、その部分配列を決定し、これをプローブとしたin situ hybridizationを行い、セロトニン神経節形成部位と一致した遺伝子発現部位を解明した。
メカニカルストレスセンサーTRPV2による関節軟骨細胞の制御メカニズムの解明

軟骨細胞におけるTrpv2の作用を検証するため、生後12週の野生型マウスを用いてdestabilization of the medial meniscus(DMM)マウスを作成し評価した.Trpv2は正常関節軟骨では表層に強く発現していたが,OA進行とともに発現は減弱した.成長後に軟骨細胞においてTrpv2をノックアウトするためCol2a1-CreERT2;Trpv2fl/fl(cKO)マウスを作出し生後12週でDMM手術を施行,術後16週で組織切片の解析を行った.OARSIスコアにて変形性関節症(OA)の進行を定量評価した結果cKOマウスではOAの進行が有意に促進しており表層の破綻が目立ったほか異所性の軟骨増生が顕著であった.in vitroにおいて,cKOマウスの初代軟骨細胞を用いた解析ではTrpv2のノックアウトによってアリザリンレッド,ALPの染色性が増加するなど軟骨細胞の分化が促進した.またcKO細胞では関節軟骨の表層の潤滑性を担う基質であるLubricinの発現が減少し,逆にアデノウイルスを用いたTrpv2の過剰発現や,Trpv2 agonist O1821の投与によってLubricinの発現は増加した.中でもLubricinの誘導に深く関わる転写因子CREBのリン酸化がO1821の濃度に依存して亢進していた.さらにLubricinはFluid Flow Shear Stress刺激によって発現が増加するが,cKO細胞ではその発現増加が有意に減弱した.以上より、Trpv2は関節軟骨表層に発現しLubricinの誘導を介して関節軟骨を保護することが示され,また軟骨分化を抑制することで表層の異所性軟骨の増生を抑制する可能性も示唆された.Trpv2はシェアストレスによるLubricinの誘導を仲介するメカノトランスデューサーである可能性も考えられる.研究計画で述べた関節軟骨の変性過程におけるTRPV2の発現と下流シグナル活性の評価については、おおむね計画通りに進んでおり、前述のとおりマウス膝関節におけるTRPV2の発現解析、またマウス関節軟骨変性におけるTRPV2の発現の推移についても知見が得られている。さらに、メカノトランスダクションにおけるTrpv2の働きについては、Shear stressにおけるLubricinの発現および発現の変容に大きく関与することを突き止めた。今後は培養軟骨細胞を用いたTRPV2のin vitro機能解析において、Trpv2のイオンチャネル活性、すわなち細胞内Caシグナル変動が、どのようなシグナル経路に影響を与えた結果、これまで同定した表現型を呈するに至るかを解析していく予定である。総じて、おおむね順調に進展していると考えられる。関節におけるTRPV2のメカノセンシングを介した機能を解析すべく、Fluid Flow Shear Stress刺激に加えて過剰な伸展刺激負荷やLPS投与などのストレス下におけるTRPV2の発現について解析を進めていく。またTRPV2特異的agonist、TRPV2の発現ベクターを用いたTRPV2のgain-of-functionの解析を行っていく。得られた結果からTRPV2の上流・下流のシグナルを探っていきTRPV2を取り巻くシグナル群を網羅的に解析する。具体的には、マイクロアレイにより発現の変容を網羅的に解析し下流のシグナル経路を見出す。またChip-seqにより上流のエピゲノム解析を行っていく。さらに、関節表層、滑膜組織においてTRPV2が発現しているという結果を受けて、滑膜組織でのTrpv2機能解析を行うべく、Trpv2-floxとPrg4-CreERT2マウスとの交配を進めすでに解析を始めている。さらにdevelopingにおけるTRPV2の機能解析を行うべく、Trpv2-floxマウスとconventionalなCol2a1-Creマウス、およびPrx1-Creマウスとの交配を進めそれぞれの段階でのTRPV2の機能について検証予定である。TRPV2にはいくつかの有用な阻害薬・agonistが同定されており、得られた知見を併せて安全かつ有効な治療標的を探索する。メカノセンサーTRPV2の機能解析をすべく、まずwlid typeマウスの内側側副靭帯・内側半月板切除によって関節不安定性を惹起させる変形性関節症モデルを作成しその膝関節サンプルを用いて軟骨の変性過程におけるTRPV2の発現を解析した。その結果正常マウス膝関節ではTRPV2は軟骨の表層、滑膜組織に発現していることが確認された。これらは軟骨細胞前駆細胞の存在部位であるとされ、TRPV2はこれらの細胞群で発現している可能性が示唆された。続いてOAモデル手術術後では早期から関節表層のTRPV2発現が消失し、また経時的に近傍の滑膜組織での発現が増加することが判明した。次にTrpv2-floxマウスの関節軟骨、肋軟骨から軟骨細胞を単離・培養し、CreのアデノウイルスベクターによってTRPV2をノックアウトしTRPV2のloss-of-functionについて解析した。通常の平面培養下では、TRPV2のノックアウトによる各種軟骨形成マーカー遺伝子発現に有意差は見られなかったが、いくつかのcatabolicマーカー発現上昇が確認された。以上よりTRPV2は関節軟骨において保護的に作用しており、既知のTRPV2の機能からメカノセンシングを介してその作用を発揮しているという仮説を立て検証中である。現在は、過剰な伸展刺激負荷やLPS投与などのストレス下におけるTRPV2の発現について解析を進めている。一方でTRPV2特異的agonistの入手およびTRPV2のアデノウイルスベクター作成が終了しておりこれらを用いたTRPV2のgain-of-functionの解析も進行中である。

さらに、Trpv2-floxマウスをCol2a1-CreERT2マウスと交配させ、骨格成長後に軟骨特異的にTRPV2をノックアウトし、先のOAモデル手術を行い軟骨変性に与える影響を検証予定である。研究計画で述べた関節軟骨の変性過程におけるTRPV2の発現と下流シグナル活性の評価については、おおむね計画通りに進んでおり、前述のとおりマウス膝関節におけるTRPV2の発現解析、またマウス関節軟骨変性におけるTRPV2の発現の推移についても知見が得られている。培養軟骨細胞を用いたTRPV2のin vitro機能解析においては現在のところTRPV2のノックアウトによる大きな変化は見いだせていない。一方でin vivoでの発現解析の結果、滑膜組織でのTPRV2発現やその変化が確認されており、滑膜細胞でのTRPV2機能解析も視野に入れて検証中である。総じて、おおむね順調に進展していると考えられる。軟骨細胞におけるTrpv2の作用を検証するため、生後12週の野生型マウスを用いてdestabilization of the medial meniscus(DMM)マウスを作成し評価した.Trpv2は正常関節軟骨では表層に強く発現していたが,OA進行とともに発現は減弱した.成長後に軟骨細胞においてTrpv2をノックアウトするためCol2a1-CreERT2;Trpv2fl/fl(cKO)マウスを作出し生後12週でDMM手術を施行,術後16週で組織切片の解析を行った.OARSIスコアにて変形性関節症(OA)の進行を定量評価した結果cKOマウスではOAの進行が有意に促進しており表層の破綻が目立ったほか異所性の軟骨増生が顕著であった.in vitroにおいて,cKOマウスの初代軟骨細胞を用いた解析ではTrpv2のノックアウトによってアリザリンレッド,ALPの染色性が増加するなど軟骨細胞の分化が促進した.またcKO細胞では関節軟骨の表層の潤滑性を担う基質であるLubricinの発現が減少し,逆にアデノウイルスを用いたTrpv2の過剰発現や,Trpv2 agonist O1821の投与によってLubricinの発現は増加した.中でもLubricinの誘導に深く関わる転写因子CREBのリン酸化がO1821の濃度に依存して亢進していた.さらにLubricinはFluid Flow Shear Stress刺激によって発現が増加するが,cKO細胞ではその発現増加が有意に減弱した.以上より、Trpv2は関節軟骨表層に発現しLubricinの誘導を介して関節軟骨を保護することが示され,また軟骨分化を抑制することで表層の異所性軟骨の増生を抑制する可能性も示唆された.
癌抑制遺伝子のプロモーター領域異常メチル化を用した癌の早期診断への臨床応用

この研究における目的は消化器癌、特に大腸癌において癌関連遺伝子の異常メチル化プロファイルを作成し、癌の診断に用いることが可能なマーカーを探索することである。我々の研究では多数の癌関連遺伝子における異常メチル化を解析した結果、3-OST-2遺伝子が大腸癌症例の52.7%と最も異常メチル化の頻度が高いことを証明した。大腸癌細胞株において3-OST-2遺伝子の発現低下と異常メチル化とが相関することも検証した。大腸癌切除標本の洗浄液からDNAを抽出し、3-OST-2遺伝子の異常メチル化を調べたところ原発巣で異常メチル化を認めた67%に腸管洗浄液から異常メチル化を同定可能であった。新たな早期診断に用いるマーカーとなる可能性を示唆し、便を用いた早期診断の足がかりとなる研究である。癌抑制遺伝子のプロモーター領域の異常メチル化は発現低下を導き、遺伝子の不活化をきたすことは報告されてきている。この研究における目的は癌抑制遺伝子(関連遺伝子)の異常メチル化に注目し、将来的に消化器癌の診断、特に早期癌診断への応用につなげることである。まず本研究に関し本学の倫理委員会で承認され、患者様の同意を得た上で大腸癌症例の癌および正常組織標本を採取した。約200サンプル(100正常大腸組織、100大腸癌組織)からDNAを抽出した。現在もサンプルが増加しているためDNA抽出を継続的に施行している。DNA量を計測し、DNAの質をチェックし、バイサルファイト処理を行った。RUNX3,CHFR,3OST2,CDH13(H-cadherin)についてMethylation Specific PCR(MSP)にて異常メチル化の有無を解析することとした。9種類の大腸癌細胞株(LoVo、LS174T、SW1417、SW480、COLO320DM、RKO、HCT116、DLD1、HCT15)を用いて、MSPの条件設定を行い、CDH13を除き、3種類の癌関連遺伝子のMSP条件は設定しえた。大腸癌組織、および同一症例の対応する正常大腸粘膜を30サンプル(15症例)でそれぞれの遺伝子の異常メチル化の有無を解析した。3OST2遺伝子は15大腸癌検体中9例(60%)が陽性であった。しかし正常組織においても15検体中3例(20%)が陽性となった。正常組織でメチル化を認めた症例は癌組織においても同様にメチル化していた。RUNX3はメチル化の頻度が低く、大腸癌15検体中1例(7%)のみ陽性を示し、正常組織では全例陰性であった。CHFRは、大腸癌15検体中3例(20%)が陽性を示し、正常組織では全例陰性であった。現在残りのサンプルのMSPデータ解析中である。岐阜大学の129症例の大腸癌組織、大腸正常粘膜サンプルのDNA抽出を行い、RNA抽出まで施行。4遺伝子(3-OST2, CHFR, RUNX, P16)における大腸癌組織、正常大腸粘膜組織での各遺伝子の異常メチル化は3-OST2遺伝子で52.7%、17.0%、CHFR遺伝子で26.3%,2.3%、RUNX3遺伝子で3.8%,1.5%、P16遺伝子で8.4%,3.7%に認め,いずれの遺伝子においても大腸癌組織において正常組織より異常メチル化を高頻度に認めた。また各遺伝子の異常メチル化の有無と性別、年齢、ステージ(深達度、リンパ節転移、遠隔転移)など臨床病理学的諸因子との相関を調べたが有意な相関関係は認めなかった。アメリカ人における大腸癌サンプル、大腸正常粘膜サンプルを用い、同様に3-OST2, CHFR, RUNX遺伝子の異常メチル化を調べた。その結果では3-OST-2遺伝子はアメリカ人、日本人においても大腸癌では高頻度に異常メチル化を認めたが、アメリカ人が日本人より有意に高頻度の異常メチル化を示した。CHFR遺伝子はアメリカ人、日本人において有意な差は認めず、ともに大腸癌は大腸正常粘膜と比較し、有意に異常メチル化の頻度は高かった。RUNX3遺伝子においては日本人において有意に大腸癌における異常メチル化の頻度が低かった。我々の研究では日本人において3-OST-2遺伝子が最も大腸癌で異常メチル化の頻度が高いことを証明した(3-OST2遺伝子における129大腸癌組織、129正常大腸粘膜組織での異常メチル化は52.7%、17.0%)。大腸癌細胞株にて3-OST-2遺伝子の発現低下と異常メチル化とが相関することも検証した。大腸癌は肝転移をきたすことが多い。

そこで肝転移巣での3-OST-2異常メチル化を調べた。原発巣と肝転移巣を両方切除した14例を用いて検討したところ、5症例は原発巣および肝転移巣も異常メチル化を認めた。一方6例は原発巣および肝転移巣とも異常メチル化を認めなかった。2例は原発巣に異常メチル化を認めたが、肝転移巣では異常メチル化を認めず、1例は原発巣に異常メチル化を認めなかったが、肝転移巣では異常メチル化を認めた。ほとんどの症例は原発巣と肝転移巣はパラレルに動くが少数ではあるが原発巣と転移巣の異常メチル化ステータスが異なる場合がある。次に異常メチル化を用いた大腸癌の早期診断への応用について検討した。大腸癌切除標本を生食100mlで洗浄し、その液からDNAを抽出し、3-OST-2のMSPを行った。21例で施行し、8例(38%)に異常メチル化を同定した。原発巣で異常メチル化を認めた9例中6例(67%)に腸管洗浄液から異常メチル化を同定可能であった。今後便を用いて検出可能かどうか検討を行う。またドレナージベインから血液を採取し同様にMSPを行ったところ21例中1例のみであった。腫瘍の大きさ、ステージ、深達度などの臨床病例学的因子との相関は認めなかった。
口腔細菌の各種抗菌成分に対する耐性化の網羅的検索

近年、新たな薬剤耐性菌の出現とその拡大が医療上の大きな問題となっているが、歯科領域で使用される抗菌成分に対する口腔細菌の薬剤耐性の獲得についてはまだ十分に解明されていない。そこで本研究では、実際に口腔内で使用されている抗菌成分を対象に、口腔細菌の薬剤耐性獲得の有無を検討するとともに、その耐性獲得機構を詳細に解析することを目的とする。すなわち、クロルヘキシジン、塩化セチルピリジニウム、ホウ酸イオン等に対する代表的な2種の口腔細菌の耐性獲得の有無についてmicro dilution assay法によって検討し、耐性獲得を示す口腔細菌に対して遺伝子発現解析を行うことで、耐性獲得機構の解明を目指す。