hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
無細胞翻訳系を用いた生化学反応への反応場サイズの寄与の解明

本研究では,様々な体積のマイクロチャンバー内でタンパク質合成を行い,反応場サイズが反応に与える影響を調べた.ポリジメチルシロキサン(PDMS)製マイクロチャンバーではタンパク質合成量は検出感度以下であったが,石英ガラス製マイクロチャンバーでは反応効率が大幅に改善され,バルクの41%の収量が得られた.体積の異なるチャンバーに無細胞翻訳系を封入し一定分子数のDNAからタンパク質合成を行ったところ,その過程が高次反応の場合に体積依存的な振る舞いが見られた.更に,高次反応では反応産物の収量が最大となる最適な反応場サイズが存在することが分かった.本研究は、細胞の内部環境を再現した微小反応場において、その内部で起こる生化学反応に対して反応場サイズが与える影響を実験的に明らかにすることを目的としている。前年度までに、新奇な設計コンセプトに基づいて作製したガラス製マイクロチャンバーを用いて、生化学反応を高い精度で観察することに成功している。今年度は、体積の異なるガラス製マイクロチャンバーでタンパク質合成を行い、生化学反応が反応場サイズに影響を受けることを実験的に明らかにした。ガラス製マイクロチャンバーに再構成無細胞翻訳系を封入し、二種類のタンパク質(βグルクロニダーゼ(GUS)、βガラクトシダーゼ(GAL))の合成反応をそれぞれ観察した。GAL、GUSはいずれも四量体を形成して初めて活性を持つ酵素であるが、律速段階の違いから合成反応はそれぞれ一次反応、四次反応であることが分かっている。タンパク質合成の様子は、酵素反応の進行に伴って生成される蛍光物質を通して行った。実験の結果、マイクロチャンバー内での反応でも、GAL、GUSの合成反応はそれぞれ一次反応、四次反応であることが確認された。次に、体積の異なるマイクロチャンバーにDNAを平均70分子封入し、再構成無細胞翻訳系を用いてGALまたはGUS合成を行った。DNA以外の反応因子は体積に依らず一定濃度で封入した。実験の結果、GAL合成では反応の様子に体積依存的な違いは見られなかったが、GUS合成では体積が小さいほど反応が早く進行することが分かった。この結果をもとに、GUS合成では反応産物の収量が最大となる最適なチャンバー体積が存在することを明らかにした。考察の結果、これらの現象はGUS合成反応だけではなく高次反応一般で普遍的に現れる可能性が示唆された。以上の成果は、論文、学会発表を通して公表した。本研究では,様々な体積のマイクロチャンバー内でタンパク質合成を行い,反応場サイズが反応に与える影響を調べた.ポリジメチルシロキサン(PDMS)製マイクロチャンバーではタンパク質合成量は検出感度以下であったが,石英ガラス製マイクロチャンバーでは反応効率が大幅に改善され,バルクの41%の収量が得られた.体積の異なるチャンバーに無細胞翻訳系を封入し一定分子数のDNAからタンパク質合成を行ったところ,その過程が高次反応の場合に体積依存的な振る舞いが見られた.更に,高次反応では反応産物の収量が最大となる最適な反応場サイズが存在することが分かった.本研究は、微小反応場に細胞の内部環境を再現し、反応場サイズと内部で起こる生化学反応の関係性を実験的に明らかにすることを目的としている。これを推進するため、今年度は、新奇な設計コンセプトに基づいたガラス製マイクロチャンバーを作製し、微小反応場として用いた。ここに再構成無細胞翻訳系を封入し、DNA一分子からのタンパク質合成を観察することに成功した。マイクロチャンバーの多くは、ポリジメチルシロキサン(PDMS)で作製されている。しかし、PDMSが疎水性・多孔質材料であるために、無細胞翻訳系を用いたタンパク質合成はほとんど進行しないことが予備実験より明らかになっていた。そこで、親水性・無孔質材料であるガラスでマイクロチャンバーを作製した。このチャンバーは、顕微鏡観察の要請からカバーガラスで密封する必要がある。しかし、ガラス同士の接着は容易ではない。そこで接着層として、PDMS薄膜をチャンバー基板表面に形成した。これにより、PDMSによる反応阻害を最小限に抑えつつ、チャンバー区画の密封・顕微鏡観察が可能なガラス製マイクロチャンバーを得た。このマイクロチャンバーの微小反応場としての性能を評価するため、40fLから7pLのチャンバー内で無細胞翻訳系を用いて緑色蛍光タンパク質(GFP)の合成を行った。その結果、GFP合成量がPDMS製マイクロチャンバーと比べて約12倍向上した。この実験のチャンバー間誤差は非常に小さく、その変動係数は5.5%であった。更に、体積40fLのチャンバーで、DNA一分子からのタンパク質合成の検出を試みた。レポータータンパク質として広く利用されているGFP、βガラクトシダーゼの合成を行ったところ、DNAの封入数に応じて量子化された、離散的な反応産物のシグナルを検出することに成功した。今年度の当初計画は、(1)ガラス製マイクロチャンバーの作製、(2)チャンバー内でのタンパク質合成反応の観察/問題点の検証、の二つから成る。これらはいずれも今年度内に実施され、計画通りの進展がみられた。今年度は、当初計画通りに研究を実施した。今後の研究を推進するにあたって、研究目的の達成に障害になるような問題点・課題はなく、今後の研究も当初計画通りに実施する。研究推進にあたり必要に応じて研究費を執行したため当初の見込額と執行額が異なったが、今後の研究計画に変更はなく、前年度の研究費も含め、当初予定通りの計画を進めていく。
プロトン伝導性固体電解質として機能する新規ポリ酸イオンの分子設計

これまでにalpha-Keggin構造のAタイプ3欠損構造を持つNa3[PMo9O31(H2O)3]・13H2O(PMo9)の固体状態における電気伝導性をインピーダンス測定によって評価してきたが、その温度依存性は不規則で、無加湿状態においてPMo9は50°Cで最も高い1.3×10-3 S・cm-1の伝導性を示すものの75°C以上で完全なalpha-Keggin構造に構造変化するために伝導性は100°Cで6.2×10-6 S・cm-1まで低下した。より高温での電気伝導性の向上を目指し、PMo9とランタン化合物(La)を固体状態で混合してその電気伝導の温度依存性を評価した。質量比PMo9:La= 8.5:1.5で混合した場合、混合試料の電気伝導性は75°Cで1.1×10-3 S・cm-1、100°Cで2.1×10-4 S・cm-1を示し、PMo9のみのサンプルよりも高温で電気伝導性を向上させることが明らかとなった。インピーダンス測定後のサンプルのIRスペクトルを測定したところ、混合試料では150°Cの測定後でもPMo9の骨格が保持されていることが確認された。質量比PMo9:La= 9.0:1.0で混合した試料や質量比PMo9:La= 7.0:3.0で混合した試料に関しても同様に電気伝導性の温度依存性ついて検討したが、いずれも1.3×10-3 S・cm-1を超える伝導性は得られなかったものの75°C以上の高温ではPMo9のみのサンプルよりも高い電気伝導性を示した。またモリブデン酸イオンの光化学反応を用いて電気伝導性の向上を目指した希土類金属を取り込んだ混合原子価ポリモリブデン酸イオンの合成と結晶化に成功し、単結晶X線構造解析を試みている。alpha-ケギン型[PMo12O40]3-から頂点共有する3個のMoサイトが脱離して欠損部分に3個の水分子が直接配位したalpha-A Na3[PMo9O31(H2O)3]・13H2Oのプロトン伝導の機構を明らかにした。alpha-A Na3[PMo9O31(H2O)3]・13H2Oは50°Cで最高値の1.3×10-3 S・cm-1を示す。しかし伝導度は変則的な温度依存性を示し、50°C以上では伝導性は低下するものの100°C以上で伝導性は向上し400 °Cで2.8×10-4 S・cm-1まで復活した。alpha-A Na3[PMo9O31(H2O)3]・13H2Oの構造の熱安定性を検討したところ、75°C以上でアニオン構造がalpha-[PMo12O40]3-へ変化することが確認された。alpha-A Na3[PMo9O31(H2O)3]・13H2Oの結晶格子中、c軸方向に結晶水とアニオン骨格の酸素原子で構成されるチャネル構造が存在する。50°C以下で観測された伝導性はalpha-A [PMo9O31(H2O)3]3-骨格内のアニオンに直接配位した水分子からH+が脱離してキャリアとなり、チャネル構造中の酸素原子を介して伝導するGrotthus機構が主のプロトン伝導であると考えた。75°C以上ではアニオン構造がalpha-[PMo12O40]3-へ変化するが、結晶格子内の酸素原子によるチャネル構造は保持されて、これを介したプロトン伝導が観測されたと考察した。骨格内に希土類金属を取り込み、水分子が希土類金属を介して直接骨格に配位しているepsilon-[PMo12O36(OH)4{La(H2O)4}4]Br5・16H2Oの電気伝導性に関してもその機構を検討し、骨格に配位している水分子がプロトン伝導に大きく関与していることが確認された。無機化学これまでにalpha-A Na3[PMo9O31(H2O)3]・13H2O(PMo9)やepsilon-[PMo12O36(OH)4{La(H2O)4}4]Br5・16H2Oが電気伝導性を示すことを見出し、これらの電気伝導性は高温ではポリ酸骨格が変化するために著しく低下することや、水分子と親和性の高い希土類金属イオンを骨格に取り込んだポリ酸は電気伝導性が向上することを明らかにしてきた。これらの知見を基にPMo9とランタン化合物(La)を固体状態で混合して高温での電気伝導性を向上させる発想に至り、実際に75°C以上の高温ではPMo9のみのサンプルよりも高い電気伝導性を示すことが確認された。また弱酸性条件下でのポリモリブデン酸イオンの光誘起自己集合化反応をコントロールすることによって、希土類金属としてランタンやイットリウムなどを取り込んだ混合原子価ポリモリブデン酸イオンの合成と結晶化に成功し、単結晶X線構造解析を試みている。現時点では十分な解析結果が得られていないが、単離に成功しているので今後、これらの電気伝導性も評価していきたい。このように研究はおおむね順調に進展している。申請者がこれまでの研究で電気伝導性を見出してきたalpha-A Na3[PMo9O31(H2O)3]・13H2Oとepsilon-[PMo12O36(OH)

4{La(H2O)4}4]Br5・16H2Oに関してその電気伝導性のメカニズムを明らかにした。いずれの場合も結晶水よりもポリ酸骨格に直接配位している水分子がプロトン伝導に大きな役割を果たすこと、高温での伝導性の低下はポリ酸骨格が高温で不安定になることや直接骨格に配位していた水分子が外れるためであることが確認された。ここで得られた知見はポリ酸のプロトン伝導性の向上に骨格に親水性の高い希土類金属を取り込ませることが有効であることを支持するもので重要な知見となった。現在、pH 36の条件下でのポリモリブデン酸の光誘起自己集合化反応をコントロールし、希土類金属としてLa3+を取り込んだ混合原子価ポリモリブデン酸の合成を進めている。現時点ではまだ生成物の単離に成功していないが、等温滴下型マイクロカロリーメトリーやESI-MSのデータからLa3+が配位したポリモリブデン酸が形成されている可能性が高い反応系を見出すことに成功しており、それぞれの単離と結晶化を目指して奮闘中である。このように本研究はおおむね順調に進展している。前年度までの研究でalpha-A Na3[PMo9O31(H2O)3]・13H2O(PMo9)とランタン化合物(La)を固体状態で混合することによって、高温でPMo9の構造が安定して電気伝導性が向上することが明らかとなった。そこで本年度はPMo9とLaの最適な混合比を求め、無加湿状態や加湿状態での電気伝導度の温度依存性を評価する。またepsilon-[PMo12O36(OH)4{La(H2O)4}4]Br5・16H2O(PMo12La4)に関しても同様の効果が期待されることからLaを固体状態で混合し、その電気伝導度の温度依存性を求める。合わせてこれらの電気伝導性のメカニズムを固体NMRスペクトルやESI-MSなどの測定結果を基に明らかにする。また現在、構造解析を進めている希土類金属を取り込んだ混合原子価ポリモリブデン酸イオンの物性評価を行い、新しいプロトン伝導性物質としての可能性を検討する。本研究は最終年度を迎えるためH26年度はこれまでの成果を総括し、今後より高温で高い電気伝導性を示すポリ酸イオンを得るための指針となる知見を得ることを目標とする。前年度の研究で、pH36の条件下でのポリモリブデン酸の光誘起自己集合化反応をコントロールすることで、希土類金属としてLa3+を取り込んだ混合原子価ポリモリブデン酸が形成されることが明らかになった。形成するポリモリブデン酸はpHによって変化することも確認されたので、これらを粉末の状態でも単離してそれぞれの固体状態での電気伝導性を検討する。交流インピーダンス測定による無加湿条件下、加湿条件下での電気伝導性の温度依存性の評価、反応機構の検討に必要な固体NMR測定(既存装置利用)などは所属大学で行うが、燃料電池の固体電解質としての発電特性の検討など、より実用的な評価を行うための測定は燃料電池の開発を行っている名古屋市工業研究場の宮田康史氏に依頼する。また現在、電気伝導性評価に用いているインピーダンスメーターでは測定限界の値に近い、高いプロトン伝導性を持つポリ酸もあり、より高い電気伝導性が評価できる交流インピーダンス測定システムを申請した。またLa3+以外の希土類金属に関しても同様に混合原子価状態のポリモリブデン酸の合成を試み、伝導性の違いを検討してより高いプロトン伝導性を示すポリ酸の合成を目指す。ポリ酸の電気伝導性の伝導機構を詳細に考察するためにはその結晶構造を明らかにすることは必須である。そのため伝導性の評価と同時にこれらの結晶化も継続して試み、単結晶X線構造解析によってその構造の詳細を明らかにすることを目標とする。
気候・地理条件による流況曲線形状の推定と全日本地下水涵養ポテンシャルマップの作成

本研究は,河川における日流量を大きさ順に並べ替えて描かれる「流況曲線」の形状は流域の気候・地理条件を用いて大まかに推定できることを示すことにより,流量データが不足している流域でも河川の流況を推定する方法論を提示した.また,得られた知見を利用して,地下水が涵養されやすいと推定される場所を日本地図上で示した「全日本地下水涵養ポテンシャルマップ」を作成し,水資源の保全上で重要な地域を明示した.本研究は,河川における日流量を大きさ順に並べ替えて描かれる「流況曲線」の形状は流域の気候・地理条件を用いて大まかに推定できることを示すことにより,流量データが不足している流域でも河川の流況を推定する方法論を提示した.また,得られた知見を利用して,地下水が涵養されやすいと推定される場所を日本地図上で示した「全日本地下水涵養ポテンシャルマップ」を作成し,水資源の保全上で重要な地域を明示した.平成21年度は,(1)気候・地理条件に関する無次元数の抽出,(2)流況曲線のモデル表現と4つのパラメータ同定,(3)モデルパラメータと無次元数の相関解析の3項目に取り組んだ.その結果,(3)において明確な相関が見出せなかった.これは,流域の気候・地理条件に関する無次元数の大きさに対する流況曲線モデルのパラメータの感度が敏感でないことが原因であった.流況曲線の形状は流域の気候・地理条件に応じて明らかに変化しているため,流況曲線を4つのパラメータでモデル化する方法自体に限界がある可能性が高い.そこで,流況曲線形状を特徴付ける豊水量,平水量,低水量,渇水量と,気候・地理条件に関する無次元数との関係を調べる方法を採用した結果,以下の多くの知見を得た.(1)雨の多い湿潤な気候下では,日降水量の変動が大きな流域ほど流量が大きくなる.(2)大起伏,火山性地,シラス台地,砂礫台地が多く分布する流域では低水量や渇水量が大きくなるが,小起伏山地が広がる流域では逆に低水量や渇水量が減少する.(3)「地下水流出酒養に対する貢献度」が大きい土壌が多い流域は流量を増加させる効果が高く,その効果は流量が少ないときにより顕著となる.一方,「貢献度」が小さい土壌が多く分布する流域では,流量が全体的に少なくなる.(4)第四紀層や火山岩の多い流域で低水量や渇水量が多い.(5)水田は豊水量・平水量を減少させ,畑は低水量・渇水量を増加させる.以上の成果は,土木学会水工学論文集に掲載し,土木学会第54回水工学講演会にて発表した.本研究は,流況曲線の形状と気候・地理条件の包括的関係を整理し,気候・地理条件から流況曲線形状を推定する方法の確立とその副産物としての全日本地下水涵養ポテンシャルマップの作成に取り組む.平成22年度は,(1)全日本地下水涵養ポテンシャルマップの試作,(2)日本全国のダム流入量データを対象とした解析の2点に主に取り組んだ.(1)では,「渇水比流量が多いところでは地下水涵養ポテンシャルが大きくなる」という仮定の下,渇水比流量が多くなる気候・地理条件を多く満たす場所をマッピングした「地下水涵養ポテンシャルマップ」を作成した.その結果,年間降水量が多く,標高が高く,第四紀層の地質・黒ボク土壌・畑地が多く分布するところでは渇水比流量が大きくなり,地下水涵養ポテンシャルが大きくなるとの知見を得た.このマップと大規模湧水地点の分布との比較を行った結果,このマップの有効性が期待できることがわかった.以上の結果は,土木学会水工学論文集の第55巻に掲載した.上記(1)の「地下水ポテンシャルマップ」の作成基盤となったのは西日本のダム流域におけるデータ解析結果であった.このため,「全日本」のマップとして公開するには問題があった.そこで(2)では,日本全国のダム流域データを対象として再解析を行った.その結果,年間降水量が渇水比流量の重要な増加要因であるとの結果は変わらなかったが,地形,土壌,地質,土地利用が渇水比流量に与える影響は(1)とは異なることがわかった.また,渇水比流量に豊水・平水・低水に関する比流量を加えて,流域の気候・地理条件を独立変数とした重回帰分析を行った結果,流域の気候・地理条件から流況曲線形状を高精度に推定できることが判明した.以上の結果は,東北地域災害科学研究の第47巻に掲載した.本研究は,河川流量の年間の累積頻度分布である"流況曲線の形状"と流域の気候・地理条件の包括的関係を整理し,気候・地理条件から流況曲線形状を推定する方法を確立することを目的としながら,その副産物として,全日本地下水涵養ポテンシャルマップの作成を行うものである.昨年度までに,流況曲線形状と流域の気候・地理条件の関係を日本の山地流域を対象として検討し,日本の山地河川の流況を流域の気候・地理条件から推定する方法を確立した.さらに,"渇水比流量が大きい地域では地下水涵養ポテンシャルが大きい"と仮定し,渇水比流量を増加させる地理条件を割り出し,それらの条件を多く満たす場所を地下水涵養ポテンシャルが大きい地域とし,それを全日本地下水涵養ポテンシャルマップとしてまとめた.ただし,これらの手法や知見の適用範囲は日本と気候条件が似ている地域に限定されていた.

そこで本年度は,日本とは気候条件が大きく異なるオーストラリアの流域において,流況曲線形状と流域の気候条件の関係を検討した(横尾,2011,小松・横尾,2012).その結果,流況曲線形状は流域の気候を特徴づける乾燥指数や季節性指数と明確な相関があることが分かった.これにより,流域の乾燥指数や季節性指数から流況曲線形状を大まかに推定できる可能性が出てきた.また,全日本地下水涵養ポテンシャルマップを,時々刻々と変化する気象条件に対応して変化する動的な地下水涵養マップに発展させるため,流域の貯留変動量の推定法の検討に着手した(小林・横尾,2012,横尾ら,2012).この手法はKirchner(2009)の手法の日本における適用性を検討するものである.その結果,毎時の流域の貯留量変化を時々刻々と推定できる可能性が確認された.これにより,日本の山地流域における渇水時の水資源管理や降雨時の土砂災害予測に本研究の成果を応用する道が開けた.
β-ラクタム系抗生物質の遷移状態類似体の合成とその生理活性に関する研究

ペニシリンやセファロスポリンなどのβ-ラクタム系抗生物質は、細菌に対してのみ高い選択性を示すため副作用が少なく、今日の化学療法剤の主流をなす重要な医薬品である。しかし、これらのβ-ラクタム系抗生物質に対する耐性菌の出現が医療上の大きな問題となっている。著者らは、ペニシリン耐性菌対策の一つの試みとして、ペニシリン環7位を選択的に化学修飾した化合物、7位環元型ペニシリン(【!1】),7位スピロオキシラン型ペニシリン(【!2】)や7位エキソメチレン型ペニシリン(【!3】)を合成し、それらの抗菌活性やβ-ラクタマーゼ阻害作用を調べる目的で本研究を行った。なお、これらの化合物のうち、(【!1】,R'=H)と(【!2】,R'=H)はβ-ラクタム環カルボニル炭素をS【P^3】炭素に変換したものであり、ペニシリンが細菌の細胞壁合成酵素阻害作用を示す際の遷移状態類似体と見なされる。ペニシリンのβ-ラクタム環カルボニル基は、アミドカルボニル基としては、非常に高い化学反応を示す。すなわち、カルボニル基としての本来の性質を具備している。それ故、β-ラクタム環カルボニル基の選択的な化学修飾はカルボニル基反応試薬を用いることにより達成できると考えられる。そこで、ペニシリン(【!4】)と種々のカルボニル基反応試薬との反応を詳細に検討した。その結果、7位還元型ペニシリン(【!1】)と7位スピロオキシラン型ペニシリン(【!2】)の合成に関しては、用いた条件下での反応中間体の不安定性のために、その目的を達成できなかったが、7位エキソメチレン型ペニシリン(【!3】A,R'=H)と(【!3】,R'=H)を合成することができた。また、本研究の途上、光学活性物質の合成中間体として利用可能なアルコール体(【!5】)と硫黄イリド(【!12】)の簡便な合成法を確立することができた。なお、得られた7位エキソメチレン型ペニシリン(【!3】,R'=H,Z-異性体)には、弱いながら、β-ラクタマーゼ阻害活性が認められた。
ベシクルの変形の物理と数理――接触から接着，融合，出芽まで

一つの分子内に疎水性の部分と親水性の部分が共存するような分子が集まり,疎水部同士が接して親水部が外部に面する二層膜をつくる.その二層膜が閉曲面を形成してできたものがベシクル(嚢胞)である.ベシクルは浸透圧差を変えると曲面の形状が変わる.また,ベシクル同士の接着や融合が起こるだけでなく,一つのベシクルからもう一つのベシクルが発芽することも観察されている.本研究は,このような形態変換や変形のダイナミクスを数学的に定式化し,より定量的な扱いを可能にすることを目指して行なっている.本年度は,基礎となる面積差弾性エネルギーモデルの数学解析と二成分ベシクルの相分離に関連する反応拡散系の解の挙動を調べた.また,後者の解の長時間挙動を追跡するため,モデルの単純化を進めて,拡散係数が無限大になった極限系に対する解の挙動を詳しく調べた.この過程で,ある反応拡散系に対し,単調な初期値から出発する解の長時間挙動を正確に把握することができることが判明した.一方,分担者は,様々なベシクルの変形を系統的に調べる実験を進めた.特に今年度は多細胞系の形態形成のモデル系として複数のベシクルが凝集した状態での変形挙動を接着力,曲げ弾性,表面張力をパラメータにして実験し,その結果をSurface Evolverで再現することに成功した.また,「ベシクルの変形の物理と数理勉強会」を開催し,実験,モデリング,数学解析の各分野の専門家の知見を学び,討論し,本研究の研究方法の見直しの一助とした.本研究は,数学的には幾何学的変分問題の範疇に属する.類似の問題を論じた研究としては,Willmore汎函数の臨界点の存在と正則性,その勾配流の挙動などがある.当初,本研究はそのような先行研究を基盤にして発展させればよいという見通しであったが,トポロジーの変化を伴うような状況を含めて厳密な解析ができるような理論的枠組みの構築という目標の一つについて,問題が元来非常に複雑であるため,技術的困難がいくつかあり,なかなか突破できないでいる.当初の目的を少しでも達成するために,研究組織の強化を行う:1)幾何学的変分問題の専門家に連携研究者として参加してもらう.2)トポロジーの変化を伴う変形を調べるため,位相場モデルによる数値シミュレーションの専門家の助力を求める.なお,1)に関しては,すでに昨秋から一人の専門家の協力を得ている.2)に関しては,ハイデルベルグ大学の研究者との連携を進めることにした.疎水性の部分と親水性の部分が一つの分子内に共存するような分子が集まり,疎水部同士が接して親水性の部分が外部に面する二層膜をつくる.その二層膜が閉曲面を形成してできたものがベシクル(嚢泡)である.これは,細胞膜のモデルとして生物学的にも非常に興味ぶかいものである.赤血球膜はそれが包む内部と外部の液体の浸透圧差に依存して,その形状が変化する.ベシクルもやはり浸透圧差を変えることにより,その曲面の形状が変わり,赤血球膜で観察される形状をほぼ同様に実現することができる.また,ベシクル同士の接着や融合が起るだけではなく,一つのベシクルからもう一つのベシクルが発芽することも観察されている.このような複雑な形態変換や変形のダイナミクスを数学的に定式化し,より定量的な扱いを可能にすることが本研究の目指すところである.本年度は,準備としてまず最も基本的な単一ベシクルの形態変換を記述する数理モデルを厳密に論じる枠組みを設定することに取組んだ.数学的には,Willmore汎函数として知られている平均曲率の平方積分に面積差弾性エネルギーと呼ばれる量を加えて定められる汎函数に対する(体積と表面積が一定という制約条件下での)幾何学的変分問題として定式化される.面積差弾性エネルギーは,平均曲率の積分から定数を減じたものの平方で表される.Euler-Lagrange方程式の導出を試みた.数値的解法に関しては,既知の結果の整理にとどまった.なお,8月に研究チーム立ち上げにあたり,一日ワークショップを開き,問題点の洗い出しなどを行った.また,2月に反応拡散系の専門家によるパターン形成の研究集会を開いた.多成分のベシクルの形態変換は,曲面上の反応拡散系が生成するパターンによって制御されるものと考えられるので,その方面の研究情報を得るためである.当初から今年度は準備期間として位置づけていたが,少なくとも,幾何学的変分問題を取扱う数学的枠組み(函数空間の設定など)を完成させる心づもりでいた.残念ながら,問題が予想以上の複雑さを含んでいたため,そこまで至らなかった.疎水性の部分と親水性の部分が一つの分子内に共存するような分子が集まり,疎水部同士が接して親水性の部分が外部に面する二層膜をつくる.その二層膜が閉曲面を形成してできたものがベシクル(嚢泡)である.ベシクルは浸透圧差を変えることにより,曲面の形状が変わる.また,ベシクル同士の接着や融合が起るだけではなく,一つのベシクルからもう一つのベシクルが発芽することも観察されている.本研究は,このような複雑な形態変換や変形のダイナミクスを数学的に定式化し,より定量的な扱いを可能にすることを目指して行なっている.ベシクルの形状に関する数理モデルとして,面積差弾性エネルギーモデル(ADEモデル)が実験をよく説明するものとして,確立している.

これは膜の曲げエネルギーを表す平均曲率の平方積分に,表裏両面の面積差に由来する弾性エネルギーを記述する平均曲率の積分の平方などから構成される項を加えたエネルギー汎函数を(表面積一定かつ囲む体積一定の条件下で)極小にする閉曲面である.今年度,研究代表者は,この変分問題と,膜の形状のもう一つのモデルとして知られている自発曲率モデルとの比較を行い,ADEモデルにおいて散逸性が強まる原因を探った.また,二成分ベシクルの相分離の研究の準備として,閉曲面上の反応拡散方程式によるパターン形成,特に,拡散の非等方性,反応の非一様性の影響を調べた.一方,分担者は,実験を通してベシクルの分裂を研究した.ベシクルの分裂は一成分ベシクルでは安定的に観察されないが二成分ベシクルでは分子形状を制御することにより,安定した分裂が観察される.その鍵となる分子形状とガウス曲率の結合によるベシクルの分裂を分子シミュレーションから再現し,そのメカニズムが膜弾性理論からの予言と一致することを明らかにした.先行研究が殆どない中で,この幾何学的変分問題を取り扱う理論的枠組みの構築は予想したよりも難しい問題であった.本研究では,この基礎的問題を解決しないことには,本質的な進展がないので,そこに集中して研究したが,もう少し時間が必要である.一つの分子内に疎水性の部分と親水性の部分が共存するような分子が集まり,疎水部同士が接して親水部が外部に面する二層膜をつくる.その二層膜が閉曲面を形成してできたものがベシクル(嚢胞)である.ベシクルは浸透圧差を変えると曲面の形状が変わる.また,ベシクル同士の接着や融合が起こるだけでなく,一つのベシクルからもう一つのベシクルが発芽することも観察されている.本研究は,このような形態変換や変形のダイナミクスを数学的に定式化し,より定量的な扱いを可能にすることを目指して行なっている.本年度は,基礎となる面積差弾性エネルギーモデルの数学解析と二成分ベシクルの相分離に関連する反応拡散系の解の挙動を調べた.また,後者の解の長時間挙動を追跡するため,モデルの単純化を進めて,拡散係数が無限大になった極限系に対する解の挙動を詳しく調べた.この過程で,ある反応拡散系に対し,単調な初期値から出発する解の長時間挙動を正確に把握することができることが判明した.一方,分担者は,様々なベシクルの変形を系統的に調べる実験を進めた.特に今年度は多細胞系の形態形成のモデル系として複数のベシクルが凝集した状態での変形挙動を接着力,曲げ弾性,表面張力をパラメータにして実験し,その結果をSurface Evolverで再現することに成功した.また,「ベシクルの変形の物理と数理勉強会」を開催し,実験,モデリング,数学解析の各分野の専門家の知見を学び,討論し,本研究の研究方法の見直しの一助とした.本研究は,数学的には幾何学的変分問題の範疇に属する.類似の問題を論じた研究としては,Willmore汎函数の臨界点の存在と正則性,その勾配流の挙動などがある.当初,本研究はそのような先行研究を基盤にして発展させればよいという見通しであったが,トポロジーの変化を伴うような状況を含めて厳密な解析ができるような理論的枠組みの構築という目標の一つについて,問題が元来非常に複雑であるため,技術的困難がいくつかあり,なかなか突破できないでいる.まずは,本研究課題の中心である面積差弾性モデルを取扱うための理論的枠組みの構築の問題に集中することにする.以前束縛条件附き変分問題として定式化される赤血球膜の形態変換を研究した経験を踏まえて,本問題との相違点を詳細に点検して行く.それが解決すれば,数値的解法の開発など具体的な作業を始められる.なお,場合によっては数値的方法の専門家を研究組織に追加するなどし,遅れを挽回する方策を講じたい.焦点を絞って,研究組織の強化をする.
縦渦の崩壊過程に関する研究

本研究の目的は,バブル型渦崩壊現象からスパイラル型渦崩壊現象への遷移過程の解明,バブル型渦崩壊現象につながる縦渦の膨張過程の解明の二点である.ここでは前者について1圧縮性流体且つ軸対称性の破れたバブル型渦崩壊の全体安定性解析・感度解析を行い,後者について2座標変換について不変な特徴量を用いて,縦渦の膨張及び渦崩壊の発生を特徴づけた.1まず基準流れについて,従来の手法に加えて軸対称性の破れを計算パラメータとして導入することで,軸対称性の破れたバブル型渦崩壊現象の基準解が新たに得られた.この結果を基準に,世界的に例がないフル三次元圧縮性流体の全体安定性解析・感度解析のプログラムを開発し解析を行った.結果,軸対称状態では渦崩壊領域上流に高い感度領域が見られ,非圧縮性流体における結果と良く一致することが確認された.一方,軸対称性の破れた状態では渦崩壊領域上流というのは同様だが,さらに渦崩壊領域内部に入り込む流線と渦崩壊領域に入り込まず周回する流線の境界(分離流線)付近で高い感度領域が存在すると示された.本研究は宇宙航空研究開発機構の大道勇哉博士と共同で行われ,これらの結果から渦崩壊現象の制御手法への応用が期待される.2縦渦の膨張からバブル型渦崩壊の発生にかけて,速さや速度勾配のテンソル不変量といった座標変換について不変な特徴量の分布に次のような特徴的な構造が見られた.・縦渦は回転の効果が強いためQ値(第二不変量)は大きな値を取るが,膨張によってその値が弱まる.(回転はしているため零にはならない.)・膨張領域の中心部には速度の停留点があるため,第三不変量の値が零となる面が必ず膨張領域を通る.これらの結果に基くと,渦崩壊現象の発生は縦渦の膨張を伴う淀み点の発生であることから,不変量のみを用いて渦崩壊発生の定義が出来ると示された.本結果から渦崩壊現象の自動検知への応用が期待される.翌年度、交付申請を辞退するため、記入しない。翌年度、交付申請を辞退するため、記入しない。
企業関係者間の利益分配問題に関する実証研究（日米英の比較）

司法に国民の意思を反映させるという理念の下に、司法制度の改革が行われた。急激な弁護士数の増加や弁護士報酬の改定が訴訟にもたらした影響は、民事訴訟の件数の増加や弁護士利用率の増加につながっている。本研究によれば、これまで弁護士は、潜在的な需要があるのにも関わらず積極的に需要を掘り起こそうとはしなかった。だが、近年の弁護士数の増加により、簡易裁判で扱う訴訟について弁護士が関与するようになり誘発需要を喚起していることがわかった。平成24年度は、利害関係者間の紛争問題解決手段のひとつである、日本の民事訴訟にテーマを絞り、弁護士と依頼者の訴訟契約についての実証研究を実施した。日本では近年、司法に国民の意思を反映させるという理念の下に、さまざまな司法制度の改革が行われた。急激な弁護士数の増加や弁護士報酬の改定が訴訟にもたらした影響は、民事訴訟の件数の増加や弁護士利用率の増加につながっていることが、司法統計年報の資料により把握することができた。訴訟データを時系列的に概観するだけでなく、弁護士の民事訴訟に関わる割合の増加、弁護士数の増加などの要因がきっかけとなり、弁護士による誘発需要が引き起こされているかどうかについて考察する必要がある。そこで、リスク回避度に着目して構築した前年度のモデルを精緻化する作業を進め、そこから仮説を新たに2つ導出した。そして、都道府県データや日本弁護士連合会を通して集計した弁護士報酬のアンケートに基づいたデータによる実証分析を行った。本年度の実証分析の実施により、分かったことは以下のことである。これまで弁護士は、潜在的な需要があるのにも関わらず積極的に需要を掘り起こそうとはしなかった。しかし、近年の司法制度改革により、利害関係者間の紛争解決のため、弁護士が関与するようになり、訴訟活用意欲に応じた訴訟拡大をもたらした点で政策の有用性は認められる。たとえば、近年の司法制度改革により弁護士だけでなく司法書士が訴訟代理サービス市場に参入できるようになったこと、さらに弁護士報酬規定の廃止により、以前よりも着手金を安くする代わりに、成功報酬率を引き上げるという形で法的サービスが提供されるようになったことが原因で、誘発需要を喚起していることが確かめられた。なお、これらの成果は、査読付の学術雑誌、日本経済研究において次年度に公表される予定である。弁護士の訴訟に関わる割合の増加、弁護士数の増加などの要因がきっかけとなり、弁護士による誘発需要が引き起こされているかどうかについて、リスク回避度に着目したモデル分析を通して、都道府県データや弁護士アンケートに基づいたデータによる実証分析を行った。分析結果によれば、近年の弁護士数の増加により、簡易裁判で扱う訴訟について弁護士が関与するようになり、着手金を下げて代わりに成功報酬を高めるという形で誘発需要を喚起していることが分かった。今年度は、依頼者が弁護士に訴訟を依頼するプリンシパル・エージェントモデルを用いて定式化し、裁判に関する予測が依頼者と弁護士の間で異なるといった情報の非対称性の下、弁護士の情報提供によって、潜在的需要を誘発するという理論モデルを精緻化するのに成功した。また、最高裁判所事務総局から提供していただいた、民事訴訟件数、弁護士の裁判に関わった割合、一件あたりの訴訟金額等の、都道府県ベースでの資料を電子データ化し、パネルデータとして実証分析に用いた。これまで弁護士は、簡易裁判では訴訟額が低額ゆえ、潜在的な需要があるのにも関わらず積極的に需要を掘り起こそうとはしなかった。だが、近年の司法制度改革により弁護士だけでなく司法書士が訴訟代理サービス市場に参入できるようになったこと、以前よりも着手金を安くする司法サービスが提供されるようになったことが原因で、誘発需要を喚起している。また、弁護士の増加によって利用率は増加している結果も得られていることを、日本弁護士連合会の協力の下に行ったアンケートからも、今回の申請者の研究の結果が間違っていなかったことを示せた。これらの研究結果は、査読有りの学術雑誌である日本経済研究に、[司法制度改革による民事訴訟誘発需要仮説の実証分析」、大阪大学出版会から刊行された「法と紛争解決の実証分析-法と経済学のアプローチ-」に公表されている。日本では近年、司法に国民の意思を反映させるという理念の下に、様々な司法制度の改革が行なわれた。なかでも、急激な弁護士数の増加や弁護士報酬の改定が訴訟にもたらした影響は、民事訴訟の件数の増加や弁護士利用率の増加につながっている可能性が高いことが予想される。平成23年度では、翌24年度から実証的に検討するためのデータ・セットの構築を行うための事前調査、さらに文献精査等の基本的な分析を行った。第一に、計量分析を行う上で必要となる、海外を中心とした先行研究の詳細なサーベイである。具体的には、計量分析を行う上で必要となる先行研究、たとえば、World Bank[2002],Buscaglia[1999],Posner[1996],Breen[2002],Botero,La Porta,Lopez-de-Silanes,Shleifer and Volokh[2003]etcを参考にして詳細なサーベイを行った。

これにより、専ら訴訟件数を減らすことで裁判の遅れを解消することを考察している先行研究と本研究の違いを明確化することができるなど、また、分析モデル、計量分析の手法に関する有益な情報を得ることができた。第二に、分析で用いるデータベースの構築である。ここでは、具体的な作業として、民事訴訟に関する司法統計データと弁護士報酬に関するアンケート調査結果など異なるデータセットを作成するため、電子化されていない数値データの入力及び共通項として利用できる項目の整理と対応させる作業などで、かなりの労力を要した。作成したデータベースの一部(クロスセクションデータ)を用いて、簡単な分析を行い、概観について、法と経済学のワークショップで報告を行った。こうした一連の作業工程を経ることにより、計量分析の一連の流れ、研究を遂行するに当たっての問題点等を把握することができた。平成24年度は、前年度の資料収集に関する司法統計に関するデータベースの構築作業を進行しつつ、法制度の変更(たとえば、2004年の弁護士報酬規定の自由化)によって、従来の弁護士の訴訟引受け行動に変化が生じているか、計量分析及びモデルの構築に時間を費やした。この研究成果は、最終年度にあたる平成25年7月に査読付き学術雑誌、日本経済研究において公表される予定である。また、申請者は、本研究課題の交付申請書に基づき、我が国の企業の利害関係者間の紛争解決の方法の模索をしながら、ゲーム理論を用いた別のプロジェクト(平成20年に採択された科研のテーマで遣り残していた企業不祥事の解決策に関する研究)を同時に平行して進めてきた。その成果が、研究論文集ー教育系・文系の九州地区国立大学間連携論文集ーVol.6, No.1(2012)に査読を経て受理された。この研究論文の内容は、1992年の証券取引法改正により、株式市場における損失補てんを禁止する立法が施行された。その後、株式市場への投資は伸び悩み、現状では株式投資収益率が国債保有による収益率を下回る状況となった。ここでは、過去に行われていた証券会社による損失補てんが、シグナリング効果によって情報に対する品質保証をもたらし、損失補てんを受けない個人投資家を株式投資に呼び込む効果があることを理論モデルによって示したものである。さらに、上記の論文とは別の研究論文4本を収録した著書「法と紛争解決の実証分析-法と経済学のアプローチ-」が、査読付きの学術図書である大阪大学出版会から、2013年2月末に総389頁の内容で刊行された。以上の点から、研究課題に沿って順調に研究成果が公表できていると考えられる。H23年度は、本研究の初年度であったことから、日本における民事訴訟の実態をまず掴むことが必要であった。その際、弁護士会からの協力を得て、訴訟の現場で活躍している弁護士の情報を収集することができたことは、何よりも大きい成果であった。また、都道府県単位ではあるが、弁護士の民事訴訟に関わる割合etcの資料を新たに入手できたことにより、当初の研究では想定していなかった、別の視点から考察する機会に恵まれることになった。
昆虫・ダニ類における薬剤抵抗性とAChEの薬剤感受性低下機構の解明

殺虫剤に対して抵抗性を発達させた昆虫・ダニ類で、薬剤の作用点である°ンクロ(アセチルコリンエステラーゼ)の感受性は°ンクロに生じている部分変異(アミノ酸残基の置換)によることが分かった。・.昆虫・ダニ類における°ンクロ遺伝子の解析ツマグロヨコバイ、イネドロオイムシ、コナガにおいて°ンクロの一次構造を決定し、°ンクロの一次構造に存在するアミノ酸残基の置換の有無を明らかにした。最近、有機リン剤抵抗性を新たに発達させつつあるAlphitobiusdiaperinusについて°ンクロュの一次構造を決定した。・.°ンクロの薬剤感受性低下を伴うアミノ酸残基の置換をin vitroで検証既にいくつかの昆虫で見つかっているアミノ酸残基の置換のうち、°ンクロの活性部位に存在する置換の効果を導入したコガタアカイエカの°ンクロを発現するバキュウロウィルスを作製し、ヘコ-細胞でタンパク質を発現した。また各種阻害剤を用いて、発現した°ンクロの阻害試験を行い、アミノ酸残基の置換の効果をin vitroで検証した。・.構造遺伝子の変異によらない°ンクロの感受性低下機構の解明本研究やそれに関わる研究者の結果から昆虫、ダニ類から第二の°ンクロが報告された。部分変異を導入した°ンクロを用いた感受性試験から、第二の°ンクロの°ンクロに生じたアミノ酸残基の置換によって薬剤に対する感受性の低下を説明できることが分かった。これらの置換についての考察は立体構造予測アプリケーションのひとつであるモムロ(菱化システム)を用いて行った。AChE(アセチルコリンエステラーゼ)の薬剤感受性を低下させる機構はAChE前駆体におけるアミノ酸残基の置換とAChE前駆体に生じる何らかの翻訳後修飾の存在が考えられる。本研究では昆虫・ダニ類に見られるAChEの薬剤感受性低下の機構を解明し、その研究成果を応用するための基礎作りを試みた。1.昆虫・ダニ類におけるAChE遺伝子の解析ツマグロヨコバイ、イネドロオイムシ、コナガにおいてAChEの一次構造を決定した。AChEが薬剤に対して感受性を低下させている個体もしくは薬剤に対して抵抗性を発達させている野外集団の個体において、ツマグロヨコバイ、モモアカブラムシ、コナガのAChEの一次構造に存在するアミノ酸残基の置換の有無を明らかにした。2.AChEの薬剤感受性低下を伴うアミノ酸残基の置換をin vitroで検証AChEの一次構造に存在するアミノ酸残基の置換のうち、AChEの活性部位に存在する置換の効果をコガタアカイエカのAChEで検証するため、変異を導入したAChEcDNAの作製した。現在、バキュウロウィルス・Sf9細胞系でAChEを発現、薬剤による阻害試験の予備試験を行っている。3.構造遺伝子の変異によらないAChEの感受性低下機構の解明AChE立体構造モデルを用いて、修飾部位を推測した。本年度は立体構造予測をMOE(菱化システム)をもちいて、シビレエイTorpedo californicaのAChEを生体内で存在していると思われる状態に再構築をし、AChEの本来の基質であるアセチルコリンと代表的な阻害剤であるフェニトロオクソンを活性部位にドッキングさせる計算を行った。また本研究で対象としている昆虫・ダニ類のAChEは、結晶のX線解析による立体構造のデータが不足しているため、このようなデータが解析されているシビレエィのAChEから昆虫のAChEを再現する作業を進めた。殺虫剤に対して抵抗性を発達させた昆虫・ダニ類で、薬剤の作用点であるAChE(アセチルコリンエステラーゼ)の感受性はAChEに生じている部分変異(アミノ酸残基の置換)によることが分かった。平成16年度はそのメカニズムをさらに詳しく調べた。1.昆虫・ダニ類におけるAChE遺伝子の解析ツマグロヨコバイ、イネドロオイムシ、コナガにおいてAChEの一次構造を決定し、AChEの一次構造に存在するアミノ酸残基の置換の有無を明らかにした。最近、有機リン剤抵抗性を新たに発達させつつあるAlphitobiusdiaperinusのAChEについてもAChEの一次構造を決定しはじめた。2.AChEの薬剤感受性低下を伴うアミノ酸残基の置換をin vitroで検証既にいくつかの昆虫で見つかっているアミノ酸残基の置換のうち、AChEの活性部位に存在する置換の効果を導入したコガタアカイエカのAChEを発現するバキュウロウィルス・Sf9細胞系を確立した。現在、酵素試験の最適化をしている。3.構造遺伝子の変異によらないAChEの感受性低下機構の解明本研究やそれに関わる研究者の結果から新規のAChEが発見され、構造遺伝子の変異によらないAChEの感受性低下と考えられていた事象は、新規のAChEで見つかったアミノ酸残基の置換によって説明できる可能性がでてきた。これらの置換についての考察は引き続き立体構造予測アプリケーションのひとつであるMOE(菱化システム)をもちいて、阻害剤や基質との関係を見ていく。最近、有機リン剤抵抗性を新たに発達させつつあるAlphitobius

diaperinusについて°ンクロュの一次構造を決定した。・.°ンクロの薬剤感受性低下を伴うアミノ酸残基の置換をin vitroで検証既にいくつかの昆虫で見つかっているアミノ酸残基の置換のうち、°ンクロの活性部位に存在する置換の効果を導入したコガタアカイエカの°ンクロを発現するバキュウロウィルスを作製し、ヘコ-細胞でタンパク質を発現した。また各種阻害剤を用いて、発現した°ンクロの阻害試験を行い、アミノ酸残基の置換の効果をin vitroで検証した。・.構造遺伝子の変異によらない°ンクロの感受性低下機構の解明本研究やそれに関わる研究者の結果から昆虫、ダニ類から第二の°ンクロが報告された。部分変異を導入した°ンクロを用いた感受性試験から、第二の°ンクロの°ンクロに生じたアミノ酸残基の置換によって薬剤に対する感受性の低下を説明できることが分かった。これらの置換についての考察は立体構造予測アプリケーションのひとつであるモムロ(菱化システム)を用いて行った。
乳牛の産後起立不能症とくに周産期心臓病(仮称)の病因に関する研究

本研究は,最近,北海道および岩手県において高泌乳牛が突然,起立不能に陥り,苦悶・呻吟し,著しい低Ca血症と心臓の巣状性壊死を呈して急死する疾患の原因究明を目的としたものである.研究計画に基づき,得られた成果は以下の通りである.症例13頭について,臨床学的,病理学的および免疫学的に検討した.その結果,(1)全症例に共通した臨床所見は,起立不能症,苦悶,心悸亢進および呼吸困難であり,それらの所見は,従来までの起立不能症の所見とは異なっていることを明らかにした.(2)検査所見では,著しい低Ca血症(3.6±1.3mg/dl)とECGの心房細動を呈していた.(3)心筋の共通した病理組織学的所見では好中球の浸潤をともなった巣状性壊死が見られた.これらの結果は,従来からの低Ca血症を特徴とする乳熱や乳牛の起立不能症とは異なった疾患と位置づけられる可能性が示唆された.2.実験的研究(第121回日本獣医学会発表)本研究は,低Ca血症と本症との関連性を究明する目的で山羊を用いて血液透析を施し,低Ca血症を作出したものである.その結果,血漿Ca濃度およびイオンCa濃度は対照群と比較して作出群は明らかに低下し,その臨床症状は自然発症例の報告と一致した.したがって,本方法は今後本症例および乳熱などの低Ca血症の病因を究明するための実験的方法として,極めて有用であることが判明した.現在,本方法によって得た低Ca血症例についての病理組織を検索中である.3.実態的調査研究(J.Vet.Med.Sci.発表予定)岩手県における二農場を一年間にわたり調査し,その間に6例の同様の症例を得ることが出来た.それらの分娩前後の経過を血中ホルモンを中心に詳細に観察するとともに,心筋の電子顕微鏡学的検索を現在行っているところである.以上のごとく,本症の病因は著しい低Ca血症によって誘発された心筋異常と考えられる.しかし,その要因は単一ではなく高泌乳牛における脂質代謝の亢進異常などが複雑に関与している可能性が本研究によって示唆された.今後は現在検索中のデータを加え,本症の病因を明らかにして行く考えである.本研究は,最近,北海道および岩手県において高泌乳牛が突然,起立不能に陥り,苦悶・呻吟し,著しい低Ca血症と心臓の巣状性壊死を呈して急死する疾患の原因究明を目的としたものである.研究計画に基づき,得られた成果は以下の通りである.症例13頭について,臨床学的,病理学的および免疫学的に検討した.その結果,(1)全症例に共通した臨床所見は,起立不能症,苦悶,心悸亢進および呼吸困難であり,それらの所見は,従来までの起立不能症の所見とは異なっていることを明らかにした.(2)検査所見では,著しい低Ca血症(3.6±1.3mg/dl)とECGの心房細動を呈していた.(3)心筋の共通した病理組織学的所見では好中球の浸潤をともなった巣状性壊死が見られた.これらの結果は,従来からの低Ca血症を特徴とする乳熱や乳牛の起立不能症とは異なった疾患と位置づけられる可能性が示唆された.2.実験的研究(第121回日本獣医学会発表)本研究は,低Ca血症と本症との関連性を究明する目的で山羊を用いて血液透析を施し,低Ca血症を作出したものである.その結果,血漿Ca濃度およびイオンCa濃度は対照群と比較して作出群は明らかに低下し,その臨床症状は自然発症例の報告と一致した.したがって,本方法は今後本症例および乳熱などの低Ca血症の病因を究明するための実験的方法として,極めて有用であることが判明した.現在,本方法によって得た低Ca血症例についての病理組織を検索中である.3.実態的調査研究(J.Vet.Med.Sci.発表予定)岩手県における二農場を一年間にわたり調査し,その間に6例の同様の症例を得ることが出来た.それらの分娩前後の経過を血中ホルモンを中心に詳細に観察するとともに,心筋の電子顕微鏡学的検索を現在行っているところである.以上のごとく,本症の病因は著しい低Ca血症によって誘発された心筋異常と考えられる.しかし,その要因は単一ではなく高泌乳牛における脂質代謝の亢進異常などが複雑に関与している可能性が本研究によって示唆された.今後は現在検索中のデータを加え,本症の病因を明らかにして行く考えである.
ヒトナイーブPS細胞とアデノウイルスを利用した高効率遺伝子ターゲティング法の開発

ヒトナイーブ多能性幹(PS)細胞の誘導をおこない、誘導したヒトナイーブPS細胞にヘルパー依存型アデノウイルスベクターを用いて遺伝子ターゲッティング(GT)をおこなった。しかしながら、GT効率の有意な改善は見られなかった。ヒトナイーブPS細胞におけるGT効率を律速する原因のひとつにフィーダー細胞の混入が考えられたため、ヒトナイーブPS細胞をフィーダー細胞無しで培養する方法の開発に取り組み、その培養法を確立した。今後、フィーダー細胞無し条件で培養したヒトナイーブPS細胞にヘルパー依存型アデノウイルスベクターを用いて遺伝子ターゲッティングをおこなう。近年、ヒトにおいてマウスiPS細胞と同様の分化状態を持つナイーブ多能性幹細胞の開発が多数報告された。マウスiPS細胞は、ヒトiPS細胞に比べて、遺伝子ターゲティングの効率が高いため、マウスiPS細胞と同様の分化状態を持つナイーブ多能性幹細胞に対して遺伝子ターゲティングをおこなえば、ヒト細胞で、マウス並に高効率な遺伝子ターゲティングを達成できる可能性が考えられる。これを実験的に検証し、ヒト細胞において高効率な遺伝子ターゲティング方法を開発することを目的として、ヒトのナイーブ多能性幹細胞に遺伝子ターゲティングをおこなう。2013年に報告されたヒトナイーブ多能性幹細胞(Chan et al., 2013, Cell Stem Cell)の誘導方法を参考に、ヒトナイーブ多能性幹細胞の誘導をおこなった。現在、誘導したヒトナイーブ多能性幹細胞様の細胞にヘルパー依存型アデノウイルスベクターによる遺伝子ターゲティング実験をおこなっている途中である。本研究では、ヒト細胞に対する高効率な遺伝子ターゲティング法を開発することを目的として、ヒトのナイーブ多能性幹細胞にアデノウイルスベクターを用いた遺伝子導入を試みた。先行研究で報告された方法(Chan et al., 2013, Cell Stem Cell)を参考にして、ヒトナイーブPS細胞の誘導をおこなった。このヒトナイーブPS細胞の誘導法の確立に予定以上に時間がかかったが、ヒトナイーブPS細胞様の細胞の作製に成功した。この細胞とHDAdVを用いて遺伝子ターゲティングをおこなった。しかしながら、期待に反してGT効率の優位な改善は見られなかった。本研究で用いたヒトナイーブPS細胞誘導法では細胞培養にフィーダー細胞を必要とした。HDAdVを標的細胞に感染させる際には、フィーダー細胞の混入は、標的細胞への感染効率を下げるため望ましくない。上記のGT実験でGT効率の優位な改善が見られなかった一つの原因がフィーダー細胞の混入にあると考え、ヒトナイーブPS細胞をフィーダー細胞無しで誘導する培養方法の開発に取り組んでいる。今後、フィーダー細胞無しの培養条件で誘導したヒトナイーブPS細胞HDAdVを用いて遺伝子ターゲティングをおこなう予定である。ヒトナイーブ多能性幹細胞の誘導が難航した。遺伝子ターゲティング実験の完了を目指していたが、完了には至っていない。27年度が最終年度であるため、記入しない。遺伝子ターゲティング実験を引き続きおこなう。ヒトナイーブ多能性幹細胞の誘導が難航したため、実験にやや遅れが生じている。今後は、細胞の誘導に難航する可能性を避けるために、他の研究室からヒトナイーブ多能性幹細胞を譲受する予定である。受け取った細胞に対して、ヘルパー依存型アデノウイルスベクターによる遺伝子ターゲティング実験をおこなう予定である。