hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
骨粗鬆症の分子標的治療を目指したTRAF6蛋白質複合体のシグナル識別機構の解析

【目的】骨粗鬆症は破骨細胞の異常な活性化によって引き起こされる。我々は世界に先駆けて、TRAF6が破骨細胞を誘導するRANKシグナルと細菌感染防御に働くTLRシグナルを識別して伝達する必須のシグナル伝達因子であることを明らかにした。本研究課題では、RANKシグナルにおけるTRAF6蛋白質複合体のプロテオミクス解析を行うことでRANK/TRAF6シグナルの分子機構を明らかにし、それを応用した骨粗鬆症治療法の開発を目指している。【進捗状況】RAW264.7細胞にHA-Tag付加K63Ub発現ベクターを導入した安定発現株を樹立し、得られたクローンがRANKシグナルによる破骨細胞への分化や、TLRシグナルによる炎症性サイトカイン産生が正常であることを確認した。抗HA抗体結合磁性ビーズを利用した精製法により、LPS刺激依存的にK63型ユビキチンに結合したTRAF6、NEM0などのシグナル伝達分子の検出に成功し、このユビキチン複合体めプロテオミクス解析を進めている。また、市販のRANKLに匹敵する破骨細胞誘導能を持つGST付加RANKL(GST-RANKL)の大量精製系を確立した。このGST-RANKLを処理したRAW264.7細胞の細胞抽出液をGST pull-downすることによりTRAF6を含む活性化RANK複合体の精製に成功し、この活性化RANK複合体のプロテオミクス解析も進めている。さらに別のアプローチとして、RANKおよびTLRシグナルにおけるチロシンリン酸化タンパク質の違いを調べる目的で、SlLAC法を用いたプロテオミクス解析を行なった。その結果、TLRシグナル特異的なチロシンリン酸化タンパク質の同定に成功し、現在その機能解析を行なっている。この内容についてはBMB2007第30回分子生物学会年会・第81回日本生化学会大会合同大会で学会発表を行なった。本研究課題では、骨粗鬆症に対する分子標的薬の開発を目指して、TRAF6がRANKシグナルとTLRシグナルを識別する分子機構を最新のプロテオミクス技術-SILAC法-を用いて明らかにする。具体的にはSILAC法を用いて、RANKおよびTLR刺激において活性化されるTRAF6複合体の構成因子を網羅的かつ経時的に定量解析し、RANKシグナルのみを制御出来るタンパク質を同定し、感染防御機能を損なうことなく破骨細胞を抑制するシステムを構築する。【進捗状況】TRAF6タンパク質複合体の精製を高純度かつ容易に行うため、TRAF6に2×FLAG-6×His-Tagを付加した。このTag付加TRAF6(FH-T6)をTRAF6欠損線維芽細胞にレトロウイルスベクターを用いて発現させ、IL-1シグナルが正常に伝達されることを確認した。また、細胞溶解液を抗FLAG抗体及びNi-NTAアガロースにて2段階精製し、TRAF6複合体が精製できることを確認した。次に、RAW264.7細胞にFH-T6発現ベクターを導入した安定発現細胞株を樹立し、得られたクローンがRANKシグナルによる破骨細胞への分化や、TLRシグナルによる炎症性サイトカイン産生が正常であることを確認した。さらに、Myc-TagあるいはHA-Tagを付加したK63型ユビキチンとFH-T6の両者を導入した細胞株を樹立した。現在、この細胞株を用いてTRAF6とK63型ユビキチンに付加したTagを利用した2段階精製を行い、活性化の指標であるK63型ユビキチン化TRAF6複合体を精製する方法について検討している。
eラーニングにおけるオンライン討論を活性化する携帯電話ソフトウェアの開発と評価

本研究では、eラーニングサイト上での学習を促進するため、様々な関連情報等(質的データを含む)を、個々の学習者が所持する携帯電話の待ち受け画面に可視化するソフトウェアを開発し、評価を行うことを目的にした。現在、国内大学の20.8%がeラーニングによって授業を公開しており、そのうり4.6%が単位付与を既に行っている。このような背景のなか、eラーニングを促進する各種のソフトウェアの開発プロジェクトに従事してきた。本研究では、まず第一にヴィジュアルコミュニケーションデザインが学習に果たす役割について、基礎的な研究を行った。その成果はデザイン学会誌は国際会議「CSCL」等において発表を行った。これまでの研究で得られた知見・経験と、近年発展してきたWeb2.0の情報アーキテクチャをもとに、Folkshelfという携帯電話ソフトウェアを開発した。Folkshelfは、複数の学習者が、オンライン上で専門書等についての情報交換を行うオンラインコミュニティである。ある書籍をもとに、オンラインでの情報交換、および討論が行える。また、他の学習者の学習の様子、および、ある専門書に関する周辺情報が、各学習者の携帯電話の待ち受け画面に、適宜表示される仕組みになっている。数名の被験者を使い、Folkshelfの評価実験を2007年1月に行った。その結果、いくつかのインターフェース上の課題は見つかったものの、おおむね、Folkshelfは好意的に評価されていることがわかった。現在、データをまとめ、論文化を行う予定である。本研究の目的は、eラーニングサイトにおける電子掲示板上のディスカッションの内容(質的データ)を、携帯電話に可視化する携帯電話ソフトウェア(iTree plus)を開発し、評価を行うことにある。現在、国内大学の20.8%がeラーニングによって授業を公開しており、そのうち4.6%が単位付与を既に行っている。eラーニングによる学習は、講義ビデオ視聴などの個別学習に加え、ディスカッション(オンライン討論)などが組み合わされて構成される。これまで筆者は、「協調学習」を促進する各種のソフトウェアを開発してきた。そのひとつにeラーニングサイトの電子掲示板の状況変化を、各学習者の所持する携帯電話の待ち受け画面に表示するソフトウェア「iTree」がある。iTreeを用いる学習者が、自分の意見を電子掲示板に書き込んだり、返信を行ったり、他者のメッセージを閲覧すると、携帯電話の待ち受け画面上の木が「成長」する。たとえば、他の学習者からメッセージが寄せられたときには、赤い実が1つ表示される。学習者は、自分の携帯電話に表示される木の変化の様子を通じて、出先であっても、PCを用いずに電子掲示板上の様子を把握することができる。このことで学習者は電子掲示板上のディスカッションにより積極的に関与することができる。比較実験の結果、iTreeを用いた学習者は、より積極的に、電子掲示板上の他者の意見を閲覧するようになった。しかし、自分の意見を表明したり、他人の意見に対して反論を行うなどの投稿活動を促進することに関しては、統計的有意な差が見られなかった。そこで本研究では、従来の仕様に「メッセージ内容の要約文を携帯電話の待ち受け画面に提示する」等の機能を追加して、既述した目的を達成することをめざした。その前段階として、ヴィジュアルコミュニケーションデザインの学習効果に対する影響を調査した。上記の研究成果については、コンピュータによる協調学習の国際会議「CSCL」等にて発表を行った。また、上述した機能、ユーザインタフェースを検討するとともに、それを仕様書のレベルまで具体化する必要があり、仕様書作成を行った。来年はこの仕様書をもとにプロトタイプを開発する。ここ1年でRSS等のXML技術、FLASHCAST等の携帯電話インタフェース構築技術が、本研究を策定した当初の予想をこえてすすんだので、これを盛り込んだ新機能を開発するものとする。
タウ蛋白質の立体構造解析に基づくタングル形成機構の解明

1)マイクロチュブル結合ドメインのX線結晶構造解析タウ蛋白質のマイクロチュブル結合ドメイン領域について、GST蛋白質との融合体として大腸菌中で遺伝子発現させ、その融合蛋白質の結晶化に成功した。ついでその蛋白質結晶の構造解析を試みた。2Å分能までのX-線回折データはSpring8を用いて測定した。結晶は正方晶系に属し、空間群はP4_32_12、格子定数はa=b=92.24Å,c=57.68Åである。構造解析はGSTの立体構造情報を用い、分子置換法により行った。構造の精密化は最小自乗法により行った。現時点での信頼度因子はR=0.258である。解析の結果、GST蛋白の立体構造は明瞭であるのに対し、タウ蛋白のマイクロチュブル結合ドメインは、全体として伸長構造の2量体構造を形成しているものの明瞭に各原子位置を決定するに至っていない。このことは、ドメイン領域の分子揺らぎが大きいことに起因しており、タウ蛋白のタングル形成のコア部分がこのドメイン領域であることから、構造揺らぎとタングル形成との関係を示唆している。このことは重要な知見であり、現在さらに詳細な解析を進めている。2)マイクロチュブル結合ドメインペプチドの溶液構造解析タウ蛋白のマイクロチュブル結合ドメインは類似の32-33残基のアミノ酸配列よりなる4回繰り返し構造(R1-R4)から成っている。各繰り返し構造の構揺らぎを解明するために、R1-R4ペプチドのTFE溶液中での立体構造を核磁気共鳴およびエネルギー計算により解析した。その結果、R1,R2,R4はヘリックス構造をとるのに対し、R3は伸長とヘリックス構造が共存する特徴的な構造を示した。また、いずれの、2次構造もそのアミノ酸側鎖は両親媒性の分布を示した。このことは、PHF形成において、隣接するマイクロチュブル結合ドメイン間での疎水・親水相互作用により分子会合形成を示している。3)マイクロチュブル結合ドメイン間の相互作用マイクロチュブル結合ドメイン間の相互作用について、蛍光法、光散乱法、表面プラズモン共鳴法、電位顕微鏡測定により検討した。得られた結果を基に、タウPHF形成での、マイクロチュブル結合ドメインが核となる各繰り返し構造依存的会合機構モデルを提示することが出来た。即ち、R3の伸長構造間会合が起爆剤となって、R3のヘリックス構造、ついでR2のヘリックス構造、そして最後にR1,R4のヘリックス構造間での分子会合が生じ、あたかも開いた服をジッパで閉じるように、PHFのコア構造が形成されるモデルであり、今後のPHF形成機構解明を考える上で重要な示唆を与える。(1)完全長タウ蛋白質およびMicrotubule結合ドメインの大腸菌中での発現と単離精製の確立(石田、尹、友尾)研究に使川する完全長タウ蛋白質およびそのマイクロチューブル結合ドメインタンパク質の大腸菌からの発現、単離、および精製・取得法を確立した。

(2)マイクロチュブル結合ドメインの結晶作成と結晶学的データの収集(石川、尹、友尾)大腸菌より単離精製した4種類のマイクロチュブル結合ドメインIIVを用い、結晶化条件の検索を行った結果、GSTタンパク質とのFusionとしてマイクロチュブル結合ドメインIIIについては結晶化に成功し、放射光を用いてX-線回折強度データを測定した。構を解明する上で極めて重要な知見であり、現在その研究成果を公表準備中である。(3)マイクロチュブル結合ドメインの溶液構造解析(石田、箕浦)4種類のマイクロチュブル結合ドメインペプチドIIIを用い、NMRにより水溶液およびトリフルオロエタノール(TFE)中での立体構造を解析した。その結果、TFE中では両親媒性のヘリックス構造を形成することを明らかにした.ドメインペプチドIIIはタウ蛋白質の不溶性フィラメントのタングル形成の核になることから、そのフィラメント形成機構を解明する上で極めて重要な知見であり、現在その研究成果を公表準備中である。(4)マイクロチュブル結合ドメイン間の相互作用解析(石田、尹、友尾)4種類のマイクロチュブル結合ドメインIIVを用い、それらの分子間結合をBIAcore(表面プラズモン共鳴)を用いて解析している。ヘパリン存在下と非存在下での相互作用様式に大きな差異のあることを明らかにした。現在、ヘパリンのマイクロチュブル結合ドメインの立体構造に及ぼす影響とドメイン間相互作用の差異について解析を進めている。1)完全長タウ蛋白質、タウ関連機能ドメインならびにマイクロチュブル結合ドメインの結晶作成と結晶学的データの収集ならびに構造解析(石田、戸、友尾)結晶化条件の検索を精力的に行った結果、タウ蛋白質中に含まれ、タングル形成に不可欠な4回繰り返しマイクロリューブル結合ドメイン構造(R1R4)のR3ドメインについてGST(glutathione-s-transferase)蛋白との融合として結晶化に成功し、Spring-8の放射光を用いてX線回折強度データ測定した。現在、構造解析中である。(2)マイクロチュブル結合ドメインの溶液構造解析(石田、箕浦)4種類全てのマイクロチュブル結合ドメイン(R1R4)の水溶液中ならびにトリフルオロエタノール中での立体構造をNMRにより解析し、前者の場合フレッキシブルなランダム構造を、後者の場合両親媒性のヘリックス構造を形成することを明らかにした。現在、リン脂質環境下での構造解析を行っている。(3)マイクロチュブル結合ドメイン間の相互作用解析(石田)Wild-typeおよび3種類のミュータント(N279K, P301L, and S305N)のマイクロチュブル結合ドメインミュータント間の相互作用をBIAcoreを用いて解析し、各変換されたアミノ酸残基のタングル形成のおける重要性を明らかにした。現在は、PKNを用いてタウ蛋白質をリン酸化させ、分子間結合に及ぼす影響を調べている。1)マイクロチュブル結合ドメインのX線結晶構造解析平成14年度で得られたマイクロチュブル結合ドメインのGST融合蛋白質結晶の構造解析を試みた。2Å分解能までのX-線回折データはSpring8で測定した。
地域イノベーション・システムにおける本社機能の集積要因としての信頼の機能の解明

本研究は、わが国の石油化学製品製造業の研究開発マネジメントの実態把握および、イノベーションに結びつけるための要件を明らかにする目的で開始された。初年度には、石油化学製品製造企業の研究開発部門と研究所の長を対象にした質問票調査を実施した。また昨年度は、京葉コンビナート地帯に存する石油化学関連企業の研究開発部門および研究所の長を対象にしたインタビュー調査を行なった。本年度は、2つの調査から得られた知見をもとに成果報告を行った。以下、19年度に行なった活動を、年度研究実施計画の事項に対応させて記述する。1.データの分析企業規模および事業所の規模に注目した分析を行った。分析結果から、規模の大きいことが必ずしもイノベーションを促進するものではないということが示唆された。事業所の規模が大きい研究所および研究開発部門は独立した研究開発施設を有している傾向があるため、本年度は、研究所および研究開発部門の所在に注目した分析を行なった。2.研究報告3.報告書作成本補助金を受けて行なった研究成果をモノグラフという形にまとめ、JAIST-Pressから出版する予定になっている。本研究は筆者がこれまで行なってきた研究の延長線上にあり、地域に存する企業の本社機能の集積要因としての信頼の機能を産業別に明らかにする目的で着手された。筆者は地域イノベーション・システムに関する研究を通して、地域の優良企業が都市に本社機能を移転させない理由として、地域の顧客や供給業者などの多様な主体との間に形成された信頼関係が寄与していることを明らかにした。また、地域企業によるイノベーティブな成果の背景には、協力主体との絶対的な近接性が存在することを明らかにした。一方、並行して行なっている石油化学製品技術の産学官による共同開発に関する研究では、高度に優れた技術が事業化に結びつかない例は少なくないこと、多様な主体の連携による研究開発は時に状況を俯瞰する主体が欠如しそのマネジメントは非常に困難であることを知った。そして、当該産業の研究開発マネジメントに強い関心を持つに至った。ここでは、上記の研究を併合させ、石油化学製品製造業の研究開発マネジメントの実態を把握し、イノベーションに結びつけるための要件を明らかにする。以下、本年度に行なった活動を、本年度研究実施計画の事項に対応させて記述する。1.文献レビュー化学産業に含まれる業種は多岐にわたり、石油化学産業のみを対象にした研究はあまり多くない。しかし、特定のコンビナートに関する研究や周辺地域の経済効果などに注目した研究は散見された。2.質問票調査の企画石油化学製品製造業の研究開発マネジメントに注目し、その実態に関するデータを取得するため、質問票を設計し、2006年2月末に427社の研究開発部門の部門長を対象にした質問票調査を実施した。現在、回収された質問票の入力作業中である。3.研究発表本研究は、わが国の石油化学製品製造業の研究開発マネジメントの実態把握および、イノベーションに結びつけるための要件を明らかにする目的で開始された。一昨年は、石油化学製品製造企業の研究開発部門と研究所の長を対象にした質問票調査を実施した。また昨年は、京葉コンビナート地帯に存する石油化学関連企業の研究開発部門および研究所の長を対象にしたインタビュー調査を行なった。19年度は2つの調査から得られた知見をもとに成果報告を行っていく。以下、18年度に行なった活動を、年度研究実施計画の事項に対応させて記述する。1.文献レビュー石油化学分野に関わる主要企業の歴史的な活動経緯および今後の活動の方向性の把握、石油化学製品に関わるデータの収集を行なった。2.データの分析石油化学製品製造業の研究開発マネジメントの実態を把握し、イノベーションに結びつけるための要件を明らかにする目的で、一昨年度実施した質問票調査から取得したデータをもとに分析を進めている。本年度は、研究開発および事業化の阻害要因に関する分析、技術機会に注目した分析を中心に行なった。3.インタビュー調査の企画と実施質問票調査から得られたデータの分析を通して明らかになったことの確認、および各研究部門・研究所の研究開発の取り組みの実態を把握する目的でインタビュー調査を企画し、実施した。京葉コンビナート地帯は石油化学関連企業が数多く集積しているため、産業集積による近接性から享受しうるメリットなどもインタビューすることを念頭におき、その一帯に存する企業を対象に調査を行なった。4.研究報告本研究は、わが国の石油化学製品製造業の研究開発マネジメントの実態把握および、イノベーションに結びつけるための要件を明らかにする目的で開始された。
粒子分散系複合材料と仮定した場合の凍結過程における岩石.間隙水系の熱伝導率推定式

本研究では,始めに,凍結岩石の熱拡散率は任意加熱法を用いることで測定できることを明らかにした。次に,この測定法を用いて,間隙水の凍結と岩石(砂岩,凝灰岩)の熱拡散率との関係を測定した。最後に,凍結過程における砂岩の熱拡散率変化挙動は,岩石を粒子分散系複合材料と仮定することでシミュレーションできることを示唆した。一方で,凝灰岩は分散系と仮定しても推定不可能なことも明らかにした。低温液化燃料の岩盤内貯蔵施設を設計するための熱伝導解析では,その基本的物性として水や氷が内在する岩盤の熱物性値(熱伝導率,熱拡散率,比熱)を把握する必要がある。本研究では,研究代表者らが常温における岩石の熱拡散率測定の有用性を実証した任意加熱法を用いて,0°C以下における湿潤岩石(飽和含水状態の岩石)の熱拡散率の測定を試みた。供試岩石は,荻野凝灰岩(有効間隙率28.7%),来待砂岩(20.2%),姫神花崗岩(0.97%)である。以下に得られた知見を示す。1.-25°Cにおける湿潤岩石の熱拡散率の測定を試み,その測定精度を検証した。湿潤岩石の熱拡散率は,荻野凝灰岩で0.57±0.038mm2/s(標準誤差±3.8%),来待砂岩で0.64±0.034mm2/s(±2.0%),姫神花崗岩で1.73±0.060mm2/s(±3.5%)となり,任意加熱法を用いることで概ね誤差3%の再現性で計測可能である(1供試体3回計測の場合)。2.間隙水の未凍結状態から凍結終了以降までの温度範囲(0°C-100°C)において,間隙率の大きい砂岩と凝灰岩の熱拡散率を連続的に測定し,その変化挙動を明らかにした。湿潤砂岩の熱拡散率は,間隙水の凍結に伴い0-20°Cで微増し,その後ー20ー50°Cで急増し,その後ー50-90°Cでほぼ一定となる挙動を示し,温度依存性が確認できる。一方,湿潤凝灰岩および乾燥砂岩,乾燥凝灰岩では,温度の低下による熱拡散率の変化(増減)は確認できない。3.岩石を粒子分散系複合材料と仮定し,乾燥岩石・湿潤岩石・凍結岩石の熱拡散率推定式の提案を試みた。砂岩と花崗岩の岩石ー間隙水系については,本研究で提案した推定式の適用が可能であることが示唆される。一方,凝灰岩の岩石ー間隙水系については分散系とは異なる推定式を立てる必要がある。具体的には,荻野凝灰岩(有効間隙率28.7%),来待砂岩(20.2%),姫神花崗岩(0.97%)を供試岩石として用い,始めに,-25°Cにおける湿潤岩石と乾燥岩石(強制乾燥状態の岩石)の熱拡散率の測定を試み,その測定精度を検証した。次に,間隙水の未凍結状態から凍結終了以降までの温度範囲(0°C-100°C)において,湿潤岩石の熱伝導率を連続的に測定し,その変化挙動を明らかにした。その結果,以下の知見を得た。1.-25°Cにおける湿潤岩石(飽和含水状態の岩石)の熱拡散率は,荻野凝灰岩で0.57±0.038mm2/s(標準誤差±3.8%),来待砂岩で0.64±0.034mm2/s(±2.0%),姫神花崗岩で1.73±0.060mm2/s(±3.5%)であり,任意加熱法を用いることで概ね誤差3%の再現性で計測可能である(1供試体3回計測の場合)。2.-25°Cにおける湿潤岩石の熱拡散率を同温度における乾燥岩石(強制乾燥状態にある岩石)の測定結果と比較すると,荻野凝灰岩で150%,来待砂岩で180%,姫神花崗岩で144%と,熱拡散率は湿潤岩石の方が大きい。3.-1000°Cの間の任意の温度で6点を連続的に計測したところ,荻野凝灰岩では,湿潤状態,乾燥状態ともに熱拡散率の変化(増減)は確認できない。当初計画では,荻野凝灰岩,来待砂岩,姫神花崗岩の3岩種について,間隙水の未凍結状態から凍結終了以降までの温度範囲(0°C-100°C)における湿潤岩石の熱拡散率を,連続的に測定する予定であった。

しかし,実験操作の習熟に予定以上の時間が掛かったため,本年度は,荻野凝灰岩の計測を終えるのみとなった。よって,現在までの達成度はやや遅れていると評価する。次年度では,まず始めに今年度やり残した来待砂岩,姫神花崗岩について,間隙水の未凍結状態から凍結終了以降までの温度範囲(0°C-100°C)における湿潤岩石の熱拡散率を測定する。次に,得られた結果を基にして,乾燥岩石,湿潤岩石,および,凍結岩石の熱伝導率推定式の構築を行う。具体的には,岩石を粒子分散型複合材料(母材;造岩鉱物,粒子;間隙)と仮定し,粒子材料の違い(空気,水,氷)で岩石の含水状態・凍結状態を区別することにより岩石の熱伝導率を算出できるモデルを構築する。次年度では,粒子分散系複合材料の熱伝導率モデル化の際に必要となる解析ソフトウェアおよび可視化ソフトを購入する予定である。また,追加実験の際に必要となる冷媒,冷却実験消耗品を購入する予定である。さらに,研究成果を発信する経費として,論文・研究発表と学会誌投稿を行う予定である。
行政の協働化に対する法的統制論の研究

本年度は、研究テーマに関する、著書『不確実性の法的制御』を出版した。本著は、不確実性の法的統制論に関する、日本でまだあまり類を見ない内容であり、その学術的意義は高い。本書では、分析視角として、規制的手法を中心とした「国家による制御」と社会との多様な連携形態を含む「社会による制御」とを設定した上で、両者の機能性と限界、両者の役割分担のあり方を検討した。その結果、不確実性の法的制御には、国家は、事前配慮による直接的な行為命令を中軸として、さらに「社会による制御」による協働を展開し、自己責任の名の下での補完的な義務づけや、行為命令を履行するに適した組織形成の後押し等、トータルに社会に深く入り込む制御をしなければならならず、それを制御領域ごとに細分化しなければならないことが確認された。すなわち、不確実性の法的制御のために、国家は「介入を基軸とした協働」というかたちで制御を精妙化させ、ますます自らを開き社会と密な関係を切り結びつつも、その一方で、あくまで社会を制御する主体として社会との距離を維持し、かつ協働する社会の機能論理に即した「精妙なる制御」を逐一、継続的に施していかなければならないということになる。そして、本書では、こうした「精妙なる制御」モデルを法的に仕組む際に必要となる法的統制論のあり方や機能的な制御を実現するための政策的な機能条件を総論的に提示した。本書は、規制緩和や小さな政府の動向が進む中で、国家の役割を再定位し、それを積極的に位置づけ直した点にも重要性があろう。本研究の目的は、現在、日本(及び欧米)において、行政活動の様々な局面で行政(国家)と私人(社会)が密に関係を切り結びながら活動を展開する現象(=協働)が見られることに鑑み、こうした行政活動の「協働化」に対する法的統制のあり方を解明することにある。協働の類型(責任配分型、合意型、参加型)及び法的統制のあり方一般については、既に、拙稿「協働による環境リスクの法的制御(上)(下)」自治研究83巻3号・4号にて、国家責任のあり方や「法律の留保」論に関する一般論を展開したが、本年は、それをさらに環境リスク規制全体の中に位置づけ、単著として公刊する作業に着手した。また、その前提的考察として、従来の古典的自由主義を基調とした規制システム(典型的には警察規制)が現在の環境リスク規制においてどのような限界に行き当たるのか、そして、その限界が今日の協働化現象にどのように関係しているのかを考察し、論説「不確実性の法的制御・序説」立命館法学321・322号として発表した。概略、古典的自由主義の規制システムは、事象の予見可能性、因果法則の線形性、トライ・アンド・エラーの反復可能性等を前提としており、これは現代の「不確実性」(=事象の複雑性、予見不可能性、動態性等)に満ちた事象を制御するには内在的な限界を抱えていること、他方で、国家の人的・経済的資源の欠乏状況と福祉国家からの撤退不可能性に鑑みれば、国家のみによる独力の規制システムを構築するのも、国家による規制の大胆な緩和も考えられないことが、今日、国家と社会の協働を進展させている背景をなすと分析した。
培養によらない迅速な真菌の定量・同定の試み

真菌感染症の診断・治療を行ううえで病原菌の分離・同定は基本となるステップである。しかし、真菌は(1)培養しても発育しない。(2)発育までに時間がかかる。(3)特徴的な形態の発育がないと同定できない。など様々な問題がある。そこで本研究は真菌を培養せずに、DNA解析によって迅速に診断する技術を開発することを目的とした。検体は造血幹細胞移植後、発熱した患者の血液98サンプルを用いた。DNAの抽出については(1)、既存のDNA抽出キットを使用する方法。(2)、(1)のキットを使用前に超音波と酵素を使用する方法。(3)、化学的・物理的に細胞を破砕し、磁性シリカにてDNAを抽出する方法。(4)血液を化学的・物理的細胞破砕を行った後、DNAをフェノール・クロロホルム法により抽出する方法。(5)市販の検体処理剤を用いた方法など様々な方法を検討した。1番良好な結果をみとめたのは(3)の磁性シリカによる抽出であり、その方法でDNA抽出を開始した。しかし、その後磁性シリカにDNAの混入がみられ途中から(2)の方法で実施した。真菌の定量はITS2領域をターゲットにしたユニバーサルプライマーを用いてReal-time PCR(SYBR Green法)を行った。菌種同定はReal-time PCRで得られた増幅産物をT-cloning法でPCR産物をクローニングし、各検体3コロニーずつシークエンスを決定し、相同性検索によって菌種の同定を行った。98サンプル中16サンプル(16%)で増幅がみとめられた。値は4.758.4 copies/μlであった。1コロニーでも同定できたのは14サンプルで酵母用真菌が6菌種、糸状菌が3菌種であった。その中で特に多い菌種はTrichosporon sp.で次に多いのがCandida glabrataとCandida parapsilosisだった。敗血症の起因菌として多く報告されているCandida albicansは1サンプルから検出されたのみだった。今回検討したサンプルからは定量値が低いことより、起因菌か常在菌叢かの判断はできないが通常検出される真菌の菌種とは異なっており培養法とあわせたより詳細な検討が必要と思われた。また、市販のDNA抽出キットやPCR関連試薬には細菌・真菌のDNAのコンタミが見られることがあり、PCR感度を上げることが難しかった。この点において企業に対しDNA free資材の必要性を要望した。
鉄制御を標的とした抗糖尿病作用の分子機序の解明と新規治療因子の探索

生体内鉄量は内蔵脂肪量や糖尿病発症リスクと関連がある。肥満2型糖尿病マウスを用いた鉄除去の効果を検討した。鉄除去によって1)白色脂肪組織の重量低下と脂肪細胞径の減少、2)マクロファージ浸潤の軽減、3)酸化ストレスと炎症性サイトカインの抑制、4) Akt-IRS経路の亢進、を認めた。肥満、糖尿病において鉄除去は脂肪組織における酸化ストレス制御を介して脂肪細胞肥大進展を抑制して耐糖能の改善につながることが示唆された生体内鉄量は内蔵脂肪量や糖尿病発症リスクと関連がある。肥満、糖尿病において鉄除去は脂肪組織における酸化ストレス制御を介して脂肪細胞肥大進展を抑制して耐糖能の改善につながることが示唆された肥満、糖尿病において生体内鉄量は増加することが報告されており、また内蔵脂肪量と鉄量が相関すること、生体内鉄量は糖尿病発症の危険因子ともいわれている。我々は肥満2型糖尿病マウスを用いて鉄除去の効果について脂肪組織に焦点をあてて解析を行った。鉄キレート薬デフェロキサミン(DFO)の腹腔内投与を連続14日間し、vehicle投与群と比較検討した。DFO投与群では糖負荷試験、インスリン負荷試験によって耐糖能ならびにインスリン感受性の改善が認められた。白色脂肪組織(精巣上体、腸管周囲、後腹膜)重量はDFO投与群において有意に低下しており、病理組織における脂肪細胞径の減少を認めた。DFO投与群においては酸化ストレスマーカーである尿中8-OHdG排泄量の低下、ならびに脂肪組織においてスーパーオキシド産生は低下しており、NADPHoxidasecomponentsであるp22phox subunitのmRNA・蛋白発現の低下が認められた。また炎症性サイトカインであるTNF-alpha,IL-6,MCP-1の発現も減少していた。糖取り込みに関与しているAkt-IRS経路もDFO投与群において亢進していた。以上の結果から、肥満、糖尿病において鉄除去は脂肪組織における酸化ストレスと炎症性サイトカインの抑制ならびにマクロファージ浸潤軽減につながり脂肪細胞肥大を改善すること、その結果、脂肪組織における糖代謝を改善することが示唆された。また下肢虚血モデルマウスを用いた虚血後血管新生の検討においても、鉄除去剤は酸化ストレスならびにアポトーシスを抑制して内皮細胞活性化をもたらして血管新生を促進することを見いだした。肥満、糖尿病において生体内鉄量は増加することが報告されており、また内蔵脂肪量と鉄量が相関すること、生体内鉄量は糖尿病発症の危険因子である。我々は前年度に肥満2型糖尿病マウスを用いて鉄キレート剤デフェロキサミン(DFO)による鉄除去によってDFO投与群では耐糖能ならびにインスリン感受性の改善を認め、白色脂肪組織重量と脂肪細胞径の減少を見出した。またDFO投与群においては脂肪組織酸化ストレ界低下とNADPH oxidasecomponentsであるP22phox発現の低下、炎症性サイトカイン発現の低下も認めた。本年度は、脂肪組織におけるp22phoxと鉄の局在について評価を行った。マクロファージマーカーであるF4/80とP22pho客ならびにFerritin Hの局在は一致しており、浸潤マクロファージは脂肪組織における鉄と酸化ストレスの供給源である可能性が示唆された。また耐糖能とイシスリン抵抗性の改善について、脂肪に加えて骨格筋、肝臓における酸化ストレスマーカーとAkt-IRs経路について検討を行った。骨格筋では白色脂肪と同様にP22phox発現低下とAkt-IRs経路の亢進をみた一方、肝臓ではその変化はみられなかった。以上の結果から、肥満、糖尿病において鉄除去は脂肪組織における酸化ストレスと炎症性サイトカインの抑制ならびにマクロファージ浸潤軽減につながり脂肪細胞肥大を改善すること、その結果、脂肪組織における糖代謝を改善することが示唆され、従来とは異なる作用機序の治療法開発につながる可能性がある。(Am J physiol Endocrinol Metab 2012)。
雷嵐の電波観測と気象観測の融合が拓く、極端気象、雷災害の監視と短期予測の研究

本研究期間全体では,2つの大目標とも期間中におおよそ達成され,世界初の研究成果も得られた.今後も本研究に関連する学術論文等が発表されるとともに,観測も継続しており,さらなる研究成果が見込まれる.また,H30年度(最終年度)に関しては文章中に明示する.(1)雷活動及び電磁波の総合観測を用いた極端気象気象の監視と短期予測学術機関としては国内初のトータル雷観測ネットワークのアップグレードを実施した.次に,日本国内で発生した極端気象現象である複数の竜巻及びダウンバースト両方について,トータル雷活動が事象発生前に顕著に増加することが統計的に示された.一方,極端事象を伴わない雷嵐のトータル雷活動とは統計的な差異が確認された(日本初).また,同様に国内で発生した雷嵐に伴う集中豪雨についてトータル雷活動との対応関係を調査し,降雨量とトータル雷頻度の間に高い相関関係のあることが判明した(日本初),また,両者の定量的関係性が,事象発生時の局所的な気象パラメータを考慮することにより,一般化されることが分かった(H31年度)(世界初).(2)雷エネルギー別,国内落雷時空間特性の導出と雷災害の軽減ELF帯(極超長波)電波観測点(北海道)の新設後,複数点での雷放電起源のELF電波観測や,(1)により展開された国内トータル雷観測データから,落雷位置,落雷極性,落雷の電気的エネルギー(落雷電荷モーメント:電荷量と雷雲内の電荷位置の高さとの積)の時空間分布の導出に成功した.また,気象データから、落雷電荷の高さを仮定することで,日本周辺の落雷電荷量の時空間分布を世界で初めて導出した.これらの研究成果は,特に電荷量の大きな落雷による雷災害が予想される地域における雷災アセスメントにおいて重要な情報を与える.さらに,リアルタイムでの落雷位置と対応する電気的エネルギーの導出にも成功した(H31).平成30年度が最終年度であるため、記入しない。平成30年度が最終年度であるため、記入しない。本年度の研究実施事項については,2つの大目標に関連して以下の事項を実施した.(1)雷活動及び電磁波の複合観測を用いた極端気象現象の監視と短期予測(a)トータル雷標定システムのアップグレードのため,センサーの空白地域である東海地方の候補2地点において,電磁環境調査を実施した.その結果,両地点とも電磁環境は機材設置,観測に良好であることが確認された.(b)レーダエコーデータを用いて雷雲セルの追跡を行うコンピュータプログラムをMATLABにて構築した.このプログラムを用いて,事例解析として日本国内で発生した激しい降雨に伴う雷活動の時空間変化を導出し考察を行った.(2)雷エネルギー別、国内落雷時空間特性の導出と雷災害の軽減.(a)北海道におけるELF帯(極超長波)電波観測点の新設を行い,連続観測を開始した(本観測を母子里から陸別に移設予定).その結果,落雷に伴うELF帯トランジェントが新観測点においても正常に受信されることが確認された.現在,九州観測点も合わせて3観測点が稼働中である.(b)風力発電設備への落雷電荷量と,落雷に伴って発生したELF帯トランジェントより推定された電荷モーメントの比較を実施し,両者に良い相関関係を得た.(c)2つのELF観測点において,ELF帯トランジェントを同時観測することにより,落雷地点を交会法により導出し,電荷モーメントの推定を実施した.また,トータル雷観測データにより得られた落雷位置と比較することによりその落雷位置推定精度の検証を行った(初期解析結果).H28年度中に本来実施を予定していた課題のうち,未だ終了していないものが複数あるため,'やや遅れている'という評価とした.具体的には,トータル雷,ELF観測点の展開の遅れがあげられる.また,データ解析に関しては,雷雲追跡アルゴリズムの実装の遅れと,北海道の新観測点を用いた複数のELF帯トランジェント観測点からの交会法によるデータ解析の遅れがあげられる.本年度の研究実施事項について2つの大目標ごとに述べる。(1)雷活動及び電磁波の総合観測を用いた極端気象気象の監視と短期予測極端気象のうち突風を引き起こした雷嵐と、そうでない雷嵐との相違の調査を実施し、両者の間に有意な差異を得ることが出来た。本研究成果は、国内学会にて口頭発表がなされ、現在学術論文の執筆中である。また、トータル雷と突風との関連性に対する最新の調査結果を国際学会にて発表した。(2)雷エネルギー別、国内落雷時空間特性の導出と雷災害の軽減本課題におけるH29年度の突筆すべき研究成果として、ELF帯電磁波の観測から昨年までに得られた、落雷電荷モーメントからさらに進展し、気象データをもとに、落雷電荷量の時空間分布を世界で初めて導出したことが挙げられる。まら、得られた落雷電荷量について、電荷モーメントの時空間分布との比較を行った。本研究成果も、国内外の学会において発表され、学術論文として近日中に投稿予定である。H28年度(研究初年度)における機材の展開が遅れたため、昨年度はデータの解析が遅れていたが、本年度はデータ解析を含め、ほぼ順調に研究が進んだ。突風を伴う雷嵐の特性に関する研究成果は着実に出ている一方で、激しい降水に伴う雷活動に関する研究の進展がやや遅れ気味であるため、H30年度はこの遅れを取り戻すべく研究を精力的に行いたい。本研究期間全体では,2つの大目標とも期間中におおよそ達成され,世界初の研究成果も得られた.

今後も本研究に関連する学術論文等が発表されるとともに,観測も継続しており,さらなる研究成果が見込まれる.また,H30年度(最終年度)に関しては文章中に明示する.(1)雷活動及び電磁波の総合観測を用いた極端気象気象の監視と短期予測学術機関としては国内初のトータル雷観測ネットワークのアップグレードを実施した.次に,日本国内で発生した極端気象現象である複数の竜巻及びダウンバースト両方について,トータル雷活動が事象発生前に顕著に増加することが統計的に示された.一方,極端事象を伴わない雷嵐のトータル雷活動とは統計的な差異が確認された(日本初).また,同様に国内で発生した雷嵐に伴う集中豪雨についてトータル雷活動との対応関係を調査し,降雨量とトータル雷頻度の間に高い相関関係のあることが判明した(日本初),また,両者の定量的関係性が,事象発生時の局所的な気象パラメータを考慮することにより,一般化されることが分かった(H31年度)(世界初).(2)雷エネルギー別,国内落雷時空間特性の導出と雷災害の軽減ELF帯(極超長波)電波観測点(北海道)の新設後,複数点での雷放電起源のELF電波観測や,(1)により展開された国内トータル雷観測データから,落雷位置,落雷極性,落雷の電気的エネルギー(落雷電荷モーメント:電荷量と雷雲内の電荷位置の高さとの積)の時空間分布の導出に成功した.また,気象データから、落雷電荷の高さを仮定することで,日本周辺の落雷電荷量の時空間分布を世界で初めて導出した.これらの研究成果は,特に電荷量の大きな落雷による雷災害が予想される地域における雷災アセスメントにおいて重要な情報を与える.さらに,リアルタイムでの落雷位置と対応する電気的エネルギーの導出にも成功した(H31).上記11にて述べられた遅れを取り戻すべく,まずはH29年度中に,迅速にトータル雷,ELF観測点の展開を実施し,安定した連続観測データの取得に努める.また,それぞれのデータ解析については,落雷の追跡アルゴリズムの実装がほぼできたので,今後順調に解析が進展することにより,遅れを取り戻す予定である.先に述べたように、本研究はほぼ順調に進んではいるものの、ELF帯観測点の3点目の設置については、適切な候補地探しが難航したため、未だに達成されていない。従って、ELF2観測点を用いた交会法による落雷位置標定となるため、標定精度はあまり良くない。この点に関しては、H29年度に行った電磁環境調査後、候補地がほぼ確定したため3点目の早急な設置を実施する。それ以外の課題についてはH30年度中に遅れを取り戻せる予定である。平成30年度が最終年度であるため、記入しない。
精子エピジェネティックマークを介した子孫への行動異常の伝承

本研究では、まず、母体ストレスが仔マウスおよび孫マウスの行動異常を引き起こすことを明らかにした。さらにこれら行動異常に関わる各因子の仔マウスおよび孫マウスの脳内発現を解析し、数種類の因子の発現の変化を認めた。続いて、仔マウスの精子のメチル化解析を行い、これら因子のうち、数種類の遺伝子のメチル化が減少および増加傾向を示すことを明らかにした。これらの事象は、仔の精子のエピジェネティクス変化(エピジェネティックマーク)を介して孫に異常が受け継がれる可能性を示唆している。今後、詳細なメチル化解析および精子メチル化異常と脳内遺伝子変化の関連性を検討する必要がある。先行研究から、母体ストレスが発達障害発症のリスクファクターであることが示唆されており、さらに近年、孫の世代にまでその負の影響が受け継がれる事象が報告されている。しかしそのメカニズムは不明である。そこで我々は、マウスを用い、母体ストレスが仔および孫に与える影響の解明を試みている。現在、母体ストレスによる仔の行動異常がオスを介してのみ孫に受け継がれるという非常に興味深い結果を得ている。本研究では、行動異常を脳の遺伝子発現の変化から理解し、さらに精子のエピジェネティクス変化(エピジェネティックマーク)を介して孫に異常が受け継がれる可能性を検証し、精子エピジェネティックマークと行動異常という表現型の関連を明らかにすることを目的とする。本年度はまずより詳細な行動学的解析を行った。その結果、仔マウスおよび孫マウスにおける行動異常を確認した。さらに、これら行動異常に関わる各因子の発現を、定量的リアルタイムPCR法にて測定・解析した。その結果数種類の因子の発現が変化していた。おおむね実験計画通りに進展しているため。そこで本研究で我々は、マウスを用い、母体ストレスが仔および孫に与える影響の解明を、生化学的、行動学的およびエピゲノム的解析から試みている。現在、母体ストレスによる仔の行動異常(強迫性行動、社会的インタラクションの低下)がオスを介してのみ孫に受け継がれるという非常に興味深い結果を得ている。本研究では、仔の精子のエピジェネティクス変化(エピジェネティックマーク)を介して孫に異常が受け継がれる可能性を検証し、精子エピジェネティックマークと行動異常という表現型の関連を明らかにすることを目的としている。前年度に、より詳細な行動解析を行い、仔マウスおよび孫マウスにおける行動異常を確認した。さらにこれら行動異常に関わる各因子の脳内発現を解析し、数種類の因子の発現の変化を認めた。そこで本年度は、これら因子の発現変化が精子由来かを検討するために、仔マウスの精子のメチル化解析を行った。その結果、これら因子のうち、数種類の遺伝子のメチル化がコントロールと比べ減少および増加傾向を示すことを明らかにした。現在このメチル化変化を詳細に検討している。上記発現変化が認められた遺伝子のDNAメチル化を仔の精子を用いて解析し、精子を介し行動異常を伝承する原因となるエピジェネティックマークを同定し、表現型(行動異常)へのメカニズムを明らかにする。分子精神医学精子DNAメチル化解析の費用のために翌年に繰り越した精子DNAメチル化解析
有機テルル化合物を触媒とするオレフィン類の新空気酸化系の開発

本研究は、分子状酸素を最も安価かつ多量に供給される重要な酸化剤として捕え、有機テルル化合物を用いるオレフィン類の新しい空気酸化反応系の開発を目的として行なった。その結果、酸性条件下ジフェニルジテルリドを用いることにより、空気雰囲気下種々のオレフィン類が効率よく酸化され、対応する1,2-ジアセトキシ化合物および1,2-ジアルコキシ化合物が収率よく生成することが明らかとなった。また、本反応は酸素の他、酸化剤として、過酸化水素等の種々のパーオキシド、過酸、金属酸化物を用いることができる。この反応機構を詳しく検討した結果本反応はジテルリドと酸化剤との反応により生成するテルレン酸誘導体を鍵活性種として進行することを明らかにした。本反応は、次の各素反応を経て進行するものと考えられる。1.ジテルリドと酸化剤との反応によりテルレン酸またはその誘導体を生成する。2.酸触媒の作用により生成したテルレン酸またはその誘導体とオレフィンが反応し、テルレニルカチオンが付加したカルボニウム中間体、またはエピテルレニル中間体を生成する。3.これに対し溶媒として用いた酢酸またはメタノールが付加しマルコニコフ型付加体を生成する。4.酸触媒ソルボリシスにより、フェニルテルロ基がアセトキシ基またはメトキシ基に置換される。基貭として脂肪族アルケンを用い、メタノール中で反応させると、本反応の中間体である上記マルコニコフ型付加体が単離された。また、この付加反応がアンチ付加で進行し、フェニルテルロ基の置換が反転により進行することより、得られる酸化生成物はシス体が優先的に得られる。また、本反応過程の最終段階で生成するベンゼンテルロールは、共存する酸化剤により容易に酸化され、ジフェニルジテルリドを与えるため、本反応は触媒量のジテルリドを用いても進行し、本反応系は新しい酸素酸化触媒系となることを明らかにした。
遺伝子再集合に起因する新型インフルエンザウイルスの出現に影響する要因の解析

A型インフルエンザウイルスの遺伝子再集合に影響する要因を調べるために、断片化したレポーター蛋白質を発現するHAとNAのゲノム分節でウイルス様粒子(VLP)を作製した。再構築レポーター蛋白質の活性は、蛋白質発現系では野生型に比べ10万分の1の活性に低下して検出され、VLP感染細胞では検出できなかった。再構築レポーター蛋白質の活性の低下に加え、HAとNA分節から発現する蛋白質が著しく異なることも再構築の効率に影響していると考えられたA型インフルエンザウイルスの遺伝子再集合に影響する要因を調べるために、断片化したレポーター蛋白質を発現するHAとNAのゲノム分節でウイルス様粒子(VLP)を作製した。再構築レポーター蛋白質の活性の低下に加え、HAとNA分節から発現する蛋白質が著しく異なることも再構築の効率に影響していると考えられたインフルエンザウイルスの遺伝子再集合は、新型インフルエンザウイルスの出現に直接関与する生物学的現象である。したがって、その機構は、新しい流行を予測する上で重要な知見である。本研究課題では、モデルvRNAを用いたVLP作製と蛋白質断片コンプリメンテーションを組み合わせて、インフルエンザウイルスの増殖においてHA分節遺伝子の維持に影響する要因を、特に他のウイルスゲノム分節の影響に焦点をあてて解析する。そのために本年度は以下の実験を行った。1.モデルvRNA合成のためのプラスミド構築2.モデルvRNAの発現による蛋白質断片コンプリメンテーション作製したモデルvRNA合成プラスミドとインフルエンザウイルスのポリメラーゼとNP蛋白質発現プラスミドをHEK293細胞に導入し、蛍光の発現を確認した。したがって、モデルvRNAから発現して蛋白質断片のコンプリメンテーションにより、レポータ蛋白質の機能回復を確認できた。3.VLPの作製とその検出法の条件設定作製したプラスミドを用いて、リバース・ジェネティクス法に準拠して産生させたVLPをMDCK細胞に感染させた結果、蛍光を観察できた。しかし、発現した蛍光が非常に微弱なため、今後計画する定量的な解析は困難であると予想され、VLPの産生効率ならびに検出方法をさらに検討する必要がある。また、同時に異なる検出系の構築を検討する必要も考えられた。インフルエンザウイルスの遺伝子再集合は、新型インフルエンザウイルスの出現に直接関与する重要な生物学的な現象である。従って、そのメカニズムの解明は、新型インフルエンザウイルスの流行を予測する上で重要な知見となる。本研究課題では、モデルvRNAを用いたVLP作製と蛋白質断片コンプリメンテーションを組み合わせた実験系を構築して、インフルエンザウイルスの増殖においてHA分節遺伝子の維持に影響する要因を、他のウイルスゲノム分節との相互作用の可能性に焦点を当てて解析する。本年度は、以下の実験を行った。1.昨年度は蛍光蛋白質を用いて蛋白質断片コンプリメンテーションを行ったが、VLP感染細胞での蛍光蛋白質再構築による蛍光強度が非常に低いことが分かった。その対策として、ルシフェラーゼを用いた蛋白質断片コンプリメンテーションの検出系を構築した。ホタル由来ならびにウミシイタケ由来のルシフェラーゼを断片化し、蛋白質発現による再構築によりルシフェラーゼ活性が検出されることを確認した。2.断片化蛋白質の再構築による活性の回復効率が非常に低いことから、VLPの各ゲノム分節から発現する蛋白質量をレポータ遺伝子で評価した。その結果、モデルとしているHAとNA分節から発現する蛋白質が10倍程度異なることが示された。この結果から、分節の種類によっては発現する断片化蛋白質の量的なバランスが偏るため再構築の効率が低くなるのではないかと予想された。3.2の予想から、HAとNAの2分節でコンプリメンテーションを行う予定であった実験計画を全ての8分節に拡張することに変更し、その準備のためにプラスミド構築を行った。4.2のVLP感染実験からHAとNA分節からの発現量が異なること示された為、他の6分節からの発現強度についても定量的に測定し基礎データを取得する準備をした。インフルエンザウイルスの遺伝子再集合の解明は、新型インフルエンザウイルスの流行を予測する上で重要な知見となる。そこで、モデルvRNAを用いたVLP作製と蛋白質断片コンプリメンテーションを組み合わせた実験系を構築して、インフルエンザウイルスの増殖においてHA分節遺伝子の維持に影響する要因を、他のウイルスゲノム分節との相互作用の可能性に焦点を当てて解析する。既知の相互作用分子であるMyoD蛋白質とId蛋白質に断片化Firefly luciferase(FL)またはRenilla luciferase(RL)をそれぞれ融合させ、HA、NA、M、NSの4ゲノム分節から発現させた。RNPからの発現実験では、各分節のホモの組み合わせで断片化FLに比べ再構築FLでは180倍以上の顕著な活性を獲得した。次に、断片化FLをHIVNA、HA/M、HA/NSの組み合わせで発現するようにVLPを産生させ、FLの再構築をそれらVLP感染MDCK細胞で検出を試みたが、酵素活性は検出できなかった。再構築FLの低活性が問題と考えられた為、VP16-MyoD、GAL4-Idを発現するVLPを作製し、GAL4結合領域下流に全長luciferase遺伝子を持つ細胞に感染させたが、酵素活性は検出できなかった。

これまでの実験から、再構築luciferaseは全長の場合に比べて活性が顕著に低下すること、VLP産生量の限界により標的細胞への遺伝子導入効率が悪いこと、ゲノム分節の遺伝子発現パターンが分節により異なること(例:HAとNA)などが当初の計画を多大に阻害することがわかった。蛍光蛋白質ではゲノム分節から共発現が確認できる為、再構築luciferaseには検出系を考慮する必要が考えられる。VLP感染による経時的な発現状態を考えると、単一細胞におけるパルス的な活性をリアルタイムで検出することが有効であろう。
免疫学的トレランスを利用する不斉分子確認の高精密化

光学異性薬物のクロマトグラフ分析では、一種の分離モードでは、分子内に複数個の不斉中心をもつ光学対掌体が多数共存する混合試料を一斉に分離計測することは困難である。そこで、_<D->グルタミン酸-_<D->リジンポリマー(_<D->GL)の免疫学的寛容作用を導入し、2種のキラル特異抗体を調製、固定化し、これらとクロマトグラフ法とを相補的に組み合わせ、光学異性薬物並びに複数の不斉中心をもつ代謝光学対掌体のハイブリッド型一斉分析法の構築を目的として、以下の検討を行った。まず、(R)-および(S)-ブフラロールの1位不斉中心から離れた1'代謝部位に架橋基をもつキラルハプテンを用い、抗体産生用抗原としてウシ血清アルブミン結合体を、一方、免疫学的寛容作用導入抗原として_<D->GL結合体を調製後、家兎に免疫し、抗(R)-及び(S)-ブフラロール抗血清を作成した。その結果、期待通りブフラロールの1位不斉中心を高度に認識し1'代謝部位に対しては幅広い親和性を持つ2種のキラル特異抗体が得られた。そこで、IgG画分を調製し、これらをN-スクシンイミジル修飾アガロースに固定化後、これを用いるキラル選択的抽出と高速液体クロマトグラフィー(HPLC)による一斉分離条件を吟味した。その結果、固定化抗体中の吸着分子の溶離液に酢酸アンモニウム(pH5.0)-メタノール(95 : 5)を用いる時、定量的に回収さればかりか、ブフラロール並びに1'位代謝物の1位不斉中心の分子不斉に基づ群特異的キラル選択抽出が可能であり、しかも、キラルカラムにSUMICHIRAL OA-2500を、移動相に酢酸アンモニウム/メタノール混液を用いるHPLCにおいて、これらが明確に分離されることが判った。以上の研究成果は、本法が他の光学異性薬物の体内動態の解析に大きく役立つことを示したものであり、今後の展開が期待される。