hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
放射光を用いた腫瘍の微小血管構築と血流動態と低酸素細胞分布のイメージング

平成13年度に施行された、マウス皮膚透明観察窓および放射光を用いた腫瘍血管構築と血流動態の研究により、腫瘍の放射線抵抗性に寄与する腫瘍内低酸素の発生機序と、個々の腫瘍内での酸素状態の空間的不均一性を視覚的に捉えることに成功した。平成14年度は、腫瘍内の低酸素細胞を、分子生物学的手法でさらに定量的に視覚化することを目的として、GFP(Green Fluorescence Protein)を発現する低酸素応答性ベクターの開発に成功した。まず、マウス細胞株(SCCVII)およびヒト腫瘍細胞株(HT1080、Bellなど)に、d2EGFP(生体内半減期が短い蛍光タンパク質)を連結した低酸素応答性ベクター、およびコントロールとしてCMVプロモーターベクターを導入し、各々安定組み込み株を得た。低酸素応答性ベクターを導入して得られたクローンを、嫌気性培養装置により低酸素培養を行った後、蛍光顕微鏡で観察した。使用した細胞株によって異なるものの数十%の安定組込み株がGFPの細胞内発現を示した。マウス腫瘍に比べヒト腫瘍株において大きな低酸素誘導性を示す傾向が認められた。次に、良好な発現誘導が観察されたクローンを選択し、低酸素培養条件を様々に変化させて、フローサイトメトリーによるGFP発現の定量解析を行った。酸素濃度を変化させた解析では、2%の低酸素培養で蛍光を発し始め、0.2%以下では、1000倍以上の蛍光増強を示した。一方、低酸素培養時間を変化させると、低酸素曝露開始2時間後にてGFP発現の上昇が検出可能であり、その後経時的に蛍光強度が増加した。このクローンを移植したヌードマウスにおいて、適切な励起光とフィルターを利用することにより生体腫瘍内の蛍光の描出も可能であった。以上から我々のGFP誘導発現系は腫瘍内低酸素分画の生体内動態解析において有用な実験モデルとなりうることが示唆された。マウス背部皮膚透明観察窓を用いて、3種類の腫瘍血管の成長を顕微鏡下に写真撮影し、顕微鏡写真をもとにそれぞれ腫瘍血管の経時的な変化を検討した。腫瘍移植後、腫瘍塊周囲の血管の拡張がまず認められた。SCCVIIは7日目に、EMT6は4日目に新生血管が認められ、後者は前者より腫瘍血管径が有意に大きく径不整で、屈曲蛇行した腫瘍血管がみられた。C3Hマウス自然発生乳癌はより高分化で、籠状の拡張した腫瘍血管を認めた。異なる再酸素化のパターンを持つSCCVIIとEMT6を移植したマウスに、蛍光標識赤血球の血管内投与後約90分連続して顕微鏡下にビデオ撮影し、赤血球fluxを測定した。両腫瘍とも15分から20分周期の変動が認められ、間欠的血流の存在が確認された。EMT6ではfluxの変動は各血管の間でランダムであったのに対し、SCCVIIではその他に同期したflux変動をとる血管群が観察され、この現象は急性低酸素の成因の一つと考えられた。移植後10日から12日目のマウスの腫瘍を、放射光による微小血管造影下に撮影した。大動脈弓内留置カテーテルより造影剤を急速注入した。撮影対象が500μmと均一な薄さであるため9keVという低圧撮影にて血行動態が観察可能であった。直径10-20μmまでの腫瘍内毛細血管が描出され、いずれの腫瘍も顕微鏡下での観察と血管構築は一致した。動静脈瘻が認められ、毛細血管から細静脈への連続は不明瞭であり、その部位に一致して造影剤漏出がみられた。これらは顕微鏡による観察では得られない所見であった。放射線・抗癌剤抵抗性に寄与する腫瘍内低酸素の発生機序には、拡散に依存する慢性低酸素と血流変動に起因する急性低酸素の関与が提唱されてきたが、透明観察窓を用いた本研究の結果から、血管構築と血流動態による両メカニズムが視覚的に確認された。また、個々の腫瘍内でも血管の多寡や、血流の同期現象の有無から、酸素状態の空間的不均一性が示された。

一方、低酸素培養時間を変化させると、低酸素曝露開始2時間後にてGFP発現の上昇が検出可能であり、その後経時的に蛍光強度が増加した。このクローンを移植したヌードマウスにおいて、適切な励起光とフィルターを利用することにより生体腫瘍内の蛍光の描出も可能であった。以上から我々のGFP誘導発現系は腫瘍内低酸素分画の生体内動態解析において有用な実験モデルとなりうることが示唆された。
緑茶カテキンと各種薬物との相互作用に関する研究

塩酸リトドリン内服後の血漿リトドリン定量の目的で、HPLC-電気化学検出法で測定を試みた。緑茶カテキンの検出条件は、電極ポテンシャルが200mVであったが、リトドリン検出では750mVで最適なピークが得られた。血漿に塩酸リトドリンを添加後、酢酸エチルで回収したところ、13ng/mLの濃度まで測定可能であった(S/N=3)。生体内の夾雑物の中で特定の化合物を定量するには、選択的検出が不可欠である。構造の中に水酸基を持つ緑茶カテキンのような化合物の場合電気化学検出が適している。一方、塩酸リトドリンも水酸基を持つ化合物であり、摂取後は緑茶カテキン同様、硫酸抱合を受けやすい。つまり、緑茶カテキンとリトドリン同時に摂取すると、生体内では代謝過程において競合的な拮抗が起こる可能性がある。今回の検討で、構造的類似点から、電気化学検出という同一の方法で定量が可能となったことは意義がある。今後健常人ボランティアの協力を得て、緑茶とリトドリン錠を同時に服用した場合のリトドリンの血中濃度に与える影響について確認する予定である。一方、in vitro培養実験で、緑茶カテキン(EGCG)による抗腫瘍活性を確認した。ヒト乳癌細胞株:MCF-7、ヒト大腸がん細胞株:SW-620、ヒトメラノーマ細胞株:KHm5を用いてMTTアッセイにより、細胞増殖抑制率を比較した。その結果、MCF-7のIC_<50>は、8.6±1.2μM、KHm5のIC_<50>は、8.2±0.2μM、SW-620のIC_<50>は、0.007±0.001μMであり、大腸がん細胞に特に高い感受性が見られた。カテキンがSW-620細胞に高い感受性を示したメカニズムは不明であるが、EGCGはMRP-2の基質になることが判明しており、トランスポーターの影響も考えられた。今後、トランスポーターの発現の違いによるカテキンの抗腫瘍効果の影響について確認していく予定である。
擬似虚血下における末梢神経初代培養細胞軸索内ミトコンドリアの変化

虚血による神経の損傷は、中枢や末梢に関わらず、リハビリテーションの対象となり、そのメカニズムを解明することは非常に重要である。我々は、細胞内の低酸素性誘導因子(HIF-1a)を誘発するとされるコバルト(Co)が、培養末梢神経細胞の軸索内ミトコンドリア(Mt)および軸索変性に与える影響を観察した。その結果、高濃度のCoは軸索内の輸送Mtの数および停留Mtの長さを減少させ、軸索変性の指標の1つである軸索腫脹の数を増加させた。また、電子顕微鏡による観察の結果、Mtの構造が破壊されていた。現在、本結果がCoにより誘発された低酸素性誘導因子の影響か、Coそのものの影響なのかを検討中である。ミトコンドリアは細胞内小器官の1つであり、ATP生成の中心的役割を果たし、細胞内カルシウム濃度の調節にも関与している。近年、神経細胞内、特に軸索内のミトコンドリアの異常が種々の神経疾患に関与していることが明らかになっている。また、外的要因による脱髄がミトコンドリアの動態に大きく関与していることも報告されている。本研究は、末梢神経初代培養細胞とウイルスを用いて、軸索内のミトコンドリアを蛍光色素により標識し、塩化コバルトを用いた疑似虚血環境下における、軸索内ミトコンドリアの動態を観察し、疑似低酸素状態が軸索内のミトコンドリアにどのような影響を及ぼすのかを考察することを目的とした。本年度は、ミトコンドリア標的シグナルと赤色蛍光タンパクをコードする核酸をプラスミドベクター内に組込み、レンチウイルス内に構築した。このウイルスを用いて、実際の末梢神経初代培養細胞へ感染させ、ミトコンドリアのタイムラプスイメージングの取得を行った。予備実験として、種々の濃度の塩化コバルト含有培地で、軸索内のミトコンドリアの動態を観察した。その結果、塩化コバルト濃度が10nMの時にはミトコンドリアの動きは抑制されず、濃度が100nMを超えると、ミトコンドリアの動きは完全に抑制された。軸索内の停留ミトコンドリアは、蛍光顕微鏡下の観察において、大きな変化はみられなかった。過去の報告では、塩化コバルト濃度が100-200μMの濃度で、種々の細胞応答を観察しているものもあるが、本研究で用いた塩化コバルト濃度はこれらの報告と比較して低濃度であった。以上のことから、軸索内のミトコンドリアの運搬は低濃度の塩化コバルトでも抑制されることが示唆された。コバルトは重金属であり、ビタミンB12を構成する主要元素であるが、高濃度のコバルトは人体に有害である。近年、コバルトが低酸素誘導因子(hypoxia inducible factor)を誘導することが報告されている。そこで、我々は培養系を用い、末梢神経軸索内のミトコンドリアの動態を観察し、コバルトが軸索内ミトコンドリアにどのような影響を及ぼし、さらに、軸索の変性を引き起こすのかを観察した。コバルトに暴露する前の軸索内ミトコンドリアの動態をタイムラプスイメージングにて観察し、コバルト濃度が0μM(対照群)、200μM、400μM、600μM、800μMの培養液を用意し、24時間暴露した。その結果、600μM以上で、移動ミトコンドリアの数が有意に減少し、移動ミトコンドリアが完全に抑制された軸索もみられ、800μMでは軸索内ミトコンドリアの移動自体が完全に抑制された。また、軸索の変化を観察するために、免疫組織化学染色法によって、神経線維を染色した。軸索長100μmあたりの腫脹の数を計測したところ、コバルト濃度が600μM以上で優位に腫脹が増えていた。軸索の腫脹は、軸索病変の初期段階であると考えられていることから、コバルトにより、軸索の変性が誘発されたと考えられた。以上のことから現在のところ、600μM以上のコバルト濃度で、24時間、初代末梢神経培養細胞を暴露すると軸索内のミトコンドリアの移動が抑制され、軸索の腫脹が有意に増加することが分かった。また、コバルトにより誘導されるHIF1αについても現在解析中であり、今回観察された結果が、疑似低酸素環境の影響なのか、あるいはコバルト自体が直接的に軸索に影響しているのかを観察中である。コバルト(Co)はビタミンB12に含まれる必須微量元素である。細胞へ少量のCoを暴露すると、低酸素環境で誘導されるHIF-1aとよばれる因子を活性する。当初、我々はCoによる疑似低酸素刺激が、末梢神経初代培養細胞におよぼす影響についての研究を企画した。しかし、近年、血中Coの濃度上昇が末梢神経障害を引き起こしている可能性が示唆された。このことから、CoはHIF-1aを活性するだけではなく、Co自体が末梢神経に何らかの影響を与える可能性が強く示唆された。そこで我々は、高濃度のCoが末梢神経の軸索および軸索内のミトコンドリアへ与える影響を観察することとした。ミトコンドリアを蛍光標識した後根神経節初代培養細胞に各濃度(0、200uM、400uM、600uM、800uM)のCoを24時間暴露し、軸索内の輸送ミトコンドリアの数、停留ミトコンドリアの長さを計測した。軸索変性は軸索100umあたりの軸索の膨隆している部分(腫脹)の数を計測した。

その結果、Co濃度の上昇に伴い、輸送ミトコンドリアの数と停留ミトコンドリアのサイズが減少し、軸索腫脹の数が増加した。以上のことより、高濃度の塩化コバルトは軸索内の輸送、停留ミトコンドリアに影響するとともに軸索の変性も引き起こすことが示された。現在、論文投稿準備中である。また、低酸素環境による末梢神経及びミトコンドリアの動態観察に関しては、低酸素発生装置を購入し、実際の低酸素環境をつくりだし、研究を継続している。虚血による神経の損傷は、中枢や末梢に関わらず、リハビリテーションの対象となり、そのメカニズムを解明することは非常に重要である。我々は、細胞内の低酸素性誘導因子(HIF-1a)を誘発するとされるコバルト(Co)が、培養末梢神経細胞の軸索内ミトコンドリア(Mt)および軸索変性に与える影響を観察した。その結果、高濃度のCoは軸索内の輸送Mtの数および停留Mtの長さを減少させ、軸索変性の指標の1つである軸索腫脹の数を増加させた。また、電子顕微鏡による観察の結果、Mtの構造が破壊されていた。現在、本結果がCoにより誘発された低酸素性誘導因子の影響か、Coそのものの影響なのかを検討中である。タイムラプスイメージングを取得するための機器設置に時間を要したことが、研究進行状況が遅れている主たる原因である。その後も、機器のトラブルがあり、データの取得自体ができない期間があった。そのため、当該期間内に目標としたデータ数を得ることができなかった。本研究費による成果の発表は第120回解剖学会総会で発表しているのみであるが、今後、サンプル数を増やすことにより、学術誌への投稿も考えている。よって、更に研究を遂行するため、研究期間の延長を申請し、予定データ数を収集するとともに、成果をまとめることに努めることとした。リハビリテーション現在は、当該機器も安定して使用できるようになり、データの取得自体は問題ない。なので、細胞培養も含めて、データの収集に努め、結果をできるだけ早急に発表する予定である。加えて、低酸素誘導因子のマーカーであるHIF1αのWestern blottingの解析も行っており、今回得られた結果が疑似低酸素によるものなのか、コバルト自体の影響なのかを明らかにする予定である。当初の計画では、米国の研究機関よりレンチウイルス作製用のプラスミドベクター内にミトコンドリア移行シグナルと蛍光色素タンパクをコードした核酸が組込まれたものを供与される予定であったが、Clontech社より、ミトコンドリア移行シグナルと蛍光色素をコードしたプラスミドを購入し、PCR、クローニング等を行い、レンチウイルス内にミトコンドリア移行シグナルと蛍光色素をコードした核酸を構築することができた。また、タイムラプスイメージングを行い、顕微鏡下での軸索内ミトコンドリアの動きを観察することができた。加えて、100nM以上の塩化コバルトにより、軸索内ミトコンドリアの運搬が抑制されることが明らかとなった。当初の研究計画も、レンチウイルスベクターの作製、神経細胞への感染と観察、塩化コバルトの影響の評価を初年度の研究計画としていたので、おおむね順調に進展していると評価した。タイムラプスイメージングを取得する機器の導入が遅れたのが主たる原因である。その後、機器の不具合により、データの取得ができない状態が続いた。このため、当該期間内に予定していた培養実験をすることができず、目的としたデータ数を収集することができなかった。よって、培養に関する消耗品費用が予定よりも下回ったため、次年度使用額が生じた。塩化コバルトに暴露されたミトコンドリアの動きを定量的に計測する。
鎖状ブロック化合物のコンホメーション転移の圧力依存性

通常オキシエチレン(OE)鎖は固体状態においてヘリックス構造をとるが、アルキルオキシエチレン系ブロックオリゴマー(C_nE_m,C_nE_mC_<n'>)結晶では平面ジグザグ変態をとる場合がある。これは平面ジグザグアルキル鎖格子の凝集力によるOE鎖のコンホメーション転移であると考えられている。格子凝集力の代わりに圧力によりコンホメーション転移を誘起できる可能性があるが,このような研究は行われていない。本研究では約4GPaまでの超高圧力によりジブロック系C_nE_m化合物の圧力誘起コンホメーション転移の観測を試みた。圧力誘起コンホメーション転移の観測には本課題で購入したダイヤモンドアンビル超高圧赤外セルを用いた。試料の赤外吸収強度の調節と静水圧を発生させるための圧力媒体を数種テストし、CaF_2が本研究に適していることがわかった。圧力測定にはルビー蛍光法を採用した。C_<10>E_mシリーズの化合物は約1GPaで結晶化し,OE鎖のコンホメーションはOEユニット数m=1-4では平面ジグザグ,m=7,8ではヘリックスであった。m=5,6の場合は得られるコンホメーションに加圧速度依存性が見られ,加圧速度が小さいときはヘリックス,大きいときには平面ジグザグであった。これらの構造は少なくとも3 GPa程度までは安定であったが,それ以上の圧力になると,ヘリックス構造を持つ分子の結晶ではスペクトルのブロードニングが観測され,超高圧による結晶転移またはアモルファス化が示唆された。いっぽう,平面ジグザグ構造を持つ分子では若干のブロードニングは見られたものの,結晶構造は不変であった。これらの結果により今回初めてC_nE_m化合物の圧力誘起コンホメーション転移が観測され,また,この系列の化合物では最長のOEユニット数6個の平面ジグザグ構造が超高圧化において見出された。通常オキシエチレン鎖は固体状態においてヘリックス構造をとるが、高分子量オキシエチレン繊維に張力をかけた場合などに平面ジグザグ変態をとることが報告されている。ヘリックス構造よりも平面ジグザグ変態の結晶密度が高いので、圧力によりコンホメーション転移を誘起できる可能性があるが、このような研究は行われていない。本研究では約70kbarまでの超高圧力によりオキシエチレン関連化合物の圧力誘起コンホメーション転移の観測を試みた。試料の赤外吸収強度の調節と静水圧を発生させるための圧力媒体を数種テストし、フッ化カルシウムおよびヨウ化銀が本研究に適していることがわかった。圧力誘起コンホメーション転移の研究を開始するにあたり、オキシエチレンユニット数が4以上のオリゴオキシエチレンアルキルエーテルのコンホメーションの圧力依存性を調べた。この同族体は常圧下では、アノレキル鎖は平面ジグザグでオキシエチレン鎖はヘリックス構造の結晶構造をとる。室温で徐々に加圧することによりこれらの化合物は約10kbarで結晶化したが、分子コンホメーションは常圧での構造に類似していた。また、この構造は少なくとも40kbar程度までは安定であった。いっぽう、比較的急速に加圧するとこの分子は約18kbarで結晶化するが、そのコンホメーションは通常と異なり、分子全体が完全に伸びた平面ジグザグコンホメーションをとることが明らかになった。

このコンホメーションはこれまで常圧下では確認されておらず、今回初めて高圧下のコンホメーションとして確認できた。現在赤外スペクトルのS/N比を改善するために光学系の改良を行っている。通常オキシエチレン(OE)鎖は固体状態においてヘリックス構造をとるが、アルキルオキシエチレン系ブロックオリゴマー(C_nE_m,C_nE_mC_n)結晶では平面ジグザグ変態をとる場合がある。これは平面ジグザグアルキル鎖格子の凝集力によるOE鎖のコンホメーション転移であると考えられている。格子凝集力の代わりに圧力によりコンホメーション転移を誘起できる可能性があるが,このような研究は行われていない。本研究では約4GPaまでの超高圧力によりジブロック系C_nE_m化合物の圧力誘起コンホメーション転移の観測を試みた。圧力誘起コンホメーション転移の観測には本課題で購入したダイヤモンドアンビル超高圧赤外セルを用いた。試料の赤外吸収強度の調節と静水圧を発生させるための圧力媒体を数種テストし、CaF_2が本研究に適していることがわかった。圧力測定にはルビー蛍光法を採用した。C_<10>E_mシリーズの化合物は約1GPaで結晶化し,OE鎖のコンホメーションはOEユニット数m=1-4では平面ジグザグ,m=7,8ではヘリックスであった.m=5,6の場合は得られるコンホメーションに加圧速度依存性が見られ,加圧速度が小さいときはヘリックス,大きいときには平面ジグザグであった。これらの構造は少なくとも3GPa程度までは安定であったが,それ以上の圧力になると,ヘリックス構造を持つ分子の結晶ではスペクトルのブロードニングが観測され,超高圧による結晶転移またはアモルファス化が示唆された。いっぽう,平面ジグザグ構造を持つ分子では若干のブロードニングは見られたものの,結晶構造は不変であった。これらの結果により今回初めてC_nE_m化合物の圧力誘起コンホメーション転移が観測され,また,この系列の化合物では最長のOEユニット数6個の平面ジグザグ構造が超高圧下において見出された。
薬剤関連顎骨壊死の骨髄微小環境と大腸菌由来BMP-2の応用

「薬剤関連顎骨壊死(MRONJ)」の病態は不明な点が多く病態発生メカニズムの解明や治療法の開発が急務である.近年,MRONJの実験動物モデル(マウス)が開発され,生体内での骨芽細胞,破骨細胞,間葉系幹細胞の挙動を解析することが可能となった.一方,MRONJモデルマウスの抜歯窩において,大腸菌由来ヒト遺伝子組換え骨形成タンパク質(rhBMP)-2が強力な骨形成能を有していることが予備的検討により明らかになった.そこで,マウスMRONJモデルの抜歯窩に対するrhBMP-2局所投与の効果とその用量の検討後,MRONJの病態やrhBMP-2の効果機序の解明をマウスで,非臨床POC取得を目指したブタMRONJモデルにおけるrhBMP-2の応用を行う.「薬剤関連顎骨壊死(MRONJ)」の病態は不明な点が多く病態発生メカニズムの解明や治療法の開発が急務である.近年,MRONJの実験動物モデル(マウス)が開発され,生体内での骨芽細胞,破骨細胞,間葉系幹細胞の挙動を解析することが可能となった.一方,MRONJモデルマウスの抜歯窩において,大腸菌由来ヒト遺伝子組換え骨形成タンパク質(rhBMP)-2が強力な骨形成能を有していることが予備的検討により明らかになった.そこで,マウスMRONJモデルの抜歯窩に対するrhBMP-2局所投与の効果とその用量の検討後,MRONJの病態やrhBMP-2の効果機序の解明をマウスで,非臨床POC取得を目指したブタMRONJモデルにおけるrhBMP-2の応用を行う.
尿路癌における血管新生因子の局在および二層培養システムでの血管新生阻害物質の検索

(1)ヒトVEGFの免疫染色で、正常腎の近位及び遠位尿細管と腎細胞癌に、また副腎腫瘍のうち褐色細胞腫の細胞質にVEGFが陽性であった。(3)ヌードマウスにKPK-13を皮下移植し腫瘍径が5mmを越えたところで、interleukin-1、interferone-α、angiostatinを投与したところ、いづれも腫瘍の増殖が抑えられ、マウスの生存日数が延長した.(4) (3)の腫瘍でVEGFとマクロファージの発現を免疫染色で調べたところ、両者の発現強度は正の相関を示した.また第87回日本泌尿器科学会総会などで発表する予定である.当教室では、ヒト大網由来の血管内皮細胞(HOME)とヒト尿路癌細胞を同時培養し、尿路癌が分泌する血管新生物質により形成されるHOME細胞の管腔の長さを測定し、血管新生を定量化する系を確立した。現在、controlに対して、interleukin-1等の血管新生組阻害剤を種々の濃度と反応時間で投与して、管腔形成の差を検討中である。次に、VEGFの免疫組織学的および分子生物学的検討を行い、以下の知見を得た。(1)抗ヒトVEGF抗体を用いた免疫組織染色で、腎細胞癌の細胞質にVEGFは存在し、症例で発現に差が見られた。正常副腎および副腎腫瘍でVEGFの発現は無かった。(2)ヒトVEGFcDNAを用いたnorthern blot法で、免疫組織染色と同様に腎細胞癌に発現が見られたが症例で差が有った。また、循環調節因子Adrenomedullin(ADM)について、同様にヒトの組織を用いて免疫組織学的および分子生物学的検討を行い、以下の知見を得た。(1)抗ヒトADM抗体を用いた免疫組織染色で、正常腎および腎腫瘍でADMの発現は無かった。ヒトADMcDNAを用いたnorthern blot法でも同様の結果であった。(2)免疫染色でADMは正常副腎皮質網状層の細胞および髄質細胞に局在していた。また副腎皮質腫瘍の一部の細胞および褐色細胞腫に局在していた。(3)ヌードマウスにKPK-13を皮下移植し腫瘍径が5mmを越えたところで、interleukin-1、interferone-α、angiostatinを投与したところ、いづれも腫瘍の増殖が抑えられ、マウスの生存日数が延長した.(4) (3)の腫瘍でVEGFとマクロファージの発現を免疫染色で調べたところ、両者の発現強度は正の相関を示した.また第87回日本泌尿器科学会総会などで発表する予定である.
卵寄生蜂の寄主と餌の探索機構

本年度はクズ群落とダイズ畑において野外調査を行い、カメムシタマゴトビコバチのトラップ誘因数の季節的消長を調べ本種の生活史を解明すると共に、寄主探索における飛翔行動の分析を行った。また、ダイズ畑において、誘因物質であるホソヘリカメムシの集合フェロモンの合成物を設置することによる寄生率向上の可能性も調べた。まず、カメムシタマゴトビコバチのトラップへの誘因数調査では、5月中旬からクズおよびダイズ畑で本種が捕獲された。その後、9月まで一週間当たり30頭以上が捕獲されたが、以降10月以降捕獲個体数は減少し、11月以降捕獲されなかった。この結果は昨年のものとほぼ一致しており、本種が11月5月に活動していないことを示唆している。次に、ダイズ畑において、異なる高さのところ(地上1m、2m、3m)にトラップを設置して、捕獲数を比較したところ、地上1mのところが最も捕獲数が多く、3mではほとんど本種は捕獲されなかった。また、風の強い日にはトラップ誘因個体はほとんどなかった。この結果から、無風あるいは弱風の時、地表1m以内の高さ、つまり植物の丈内の範囲で植物から植物へ飛び移りながら移動していると考えられた。熊本県西合志町にある九州農業試験場内のダイズ畑に誘因物質であるホソヘリカメムシの集合フェロモン合成物を設置してホソヘリカメムシ卵に対する寄生率を調べた。その結果、誘因物質を設置した直後は、誘因物質を置いた区画はコントロール区画に比べ探索蜂の個体数と寄生率が有意に高かった。しかし、2週間連続して誘因物質を置いた場合、2週間目に探索蜂個体数は急激に減少した。この結果から、長期間寄主に遭遇することなく寄主の手がかりであるカメムシの集合フエロモンを経験し続けると、寄生蜂はその物質に対して馴化し、その匂いに対する選好性を消失する可能性が示唆された。カメムシの卵寄生蜂、カメムシタマゴトビコバチの寄主探索機構を明らかにするため、まず、室内でオルファクトメーターおよび風洞実験装置を用いてどのような匂いを手がかりとして寄主を探しているのかを調べた。Y字管オルファックトメータで風速20cm/s以上の風速では静止し動かなかったため、20cm/s以下の風速で実験を行った。ホソヘリカメムシ雌成虫および雄成虫の匂いには誘引されなかった。また、雄成虫の集合フェロモンの合成剤にも誘引されなかった。野外では雄成虫の集合フェロモンに誘引されていることが確認されているため、照度やそれ以外の要因が蜂の歩行行動に影響した可能性がある。また、風洞実験装置内で、蜂が飛翔するかどうかを調べたが、どの風速条件下でも飛翔は観察されなかったため、現在幼植物を設置した風洞内での歩行による寄主探索行動を調査中である。野外調査では、大学構内、付属農場、およびその近郊のクズ群落および大豆畑でカメムシ成虫の集合フェロモンを用いた粘着トラップにより成虫の季節的消長を調べるとともに植物部位ごとの寄生率を調査した。野外トラップは1996年10月から現在に至るまで設置され、毎週捕獲頭数を記録した。カメムシタマゴトビコバチは1996年10月から11月上旬まで、1997 5月中旬から1997年11月中旬までの間捕獲された。11月中旬以降、5月までトラップに捕獲されないことから、本寄生蜂は11月以降ダイズ畑やクズ群落から分散すること、マルカメムシがクズ群落で繁殖を始める5月以降に寄生活動を始めること、がわかった。本寄生蜂は成虫越冬であると考えられているが、この間どこで越冬しているのかはわかっていない。また、捕獲された成虫のサイズを計測したところ、5月中旬から6月にかけてはホソヘリカメムシ卵やホシハラビロヘリカメムシ卵など大型寄主から羽化した成虫のみが活動しており、それ以降マルカメムシ卵から羽化した成虫がみられるようになった。この結果から、大型の蜂のみが越冬できること、5月にクズ上のマルカメムシ卵で増殖した蜂が6-7月にダイズ畑に移動して繁殖を行うこと、が明らかになった。

熊本県西合志町にある九州農業試験場内のダイズ畑に誘因物質であるホソヘリカメムシの集合フェロモン合成物を設置してホソヘリカメムシ卵に対する寄生率を調べた。その結果、誘因物質を設置した直後は、誘因物質を置いた区画はコントロール区画に比べ探索蜂の個体数と寄生率が有意に高かった。しかし、2週間連続して誘因物質を置いた場合、2週間目に探索蜂個体数は急激に減少した。この結果から、長期間寄主に遭遇することなく寄主の手がかりであるカメムシの集合フエロモンを経験し続けると、寄生蜂はその物質に対して馴化し、その匂いに対する選好性を消失する可能性が示唆された。
ヒト生命萌芽の分子機構の解明～生殖補助医療の向上及び安全性を目指して～

これまでに行われたマウス着床前期胚の遺伝子発現プロファイリングの結果、未受精卵では停止していた遺伝子発現は受精後に胚性ゲノム活性化により再開され、ステージ特異的な発現がグローバルに観察されている。胚性ゲノムの活性化のステージ初期から特異的に発現している転写因子は、その後の転写増幅に重要な役目を果たしている可能性がある。しかし一方で、着床前期特異的に発現している遺伝子はわずかにZscan4のみが報告されているだけである。着床前期における遺伝子発現レベルの制御機構は未だ解明されておらず、これを明らかにすることは初期胚発生のメカニズムのみならず、分化全能性のメカニズムの解明に繋がると考えられる。そこでマウス着床前期胚の遺伝子発現プロファイリングデータおよびUnigene cDNA libraryにおけるマウス各臓器のExpressed sequencetag発現頻度を解析することにより、着床前期特異的に発現する新規遺伝子を抽出した。その中でも二つのhigh-mobility-group boxを持つクロマチンタンパクHmgpi(an HMG-box protein, preimplantation-embryo-specific)を研究対象とし、その発現と機能を明らかにすることを目的とした。Hmgpiは胚性ゲノムの活性化に伴い胚性に転写される一方、着床後には転写されなかった。HMGPIタンパクはmRNAレベルから遅れて4細胞期から発現し、以後の着床前期胚のすべての期間を通して高い発現を持続した。興味深いことにHMGPIタンパクは胚盤胞の内細胞塊および栄養外胚葉の両方に発現し、胚盤胞期において細胞質から核内へと局在を移行させた。このことは胚盤胞期以前と以後でHmgpiが異なる機能を有していることを示唆する。siRNA(siHmgpi)を用いてHmgpiの転写レベルを抑制すると、着床前期胚の胚発生の低下および着床不全を引き起こした。さらにHmgpiの転写抑制は胚性幹細胞の樹立につながる胚盤胞のin vitrooutgrowthを低下させた。siHmgpiを注入した胚から発生した胚盤胞について、内細胞塊および栄養外胚葉のマーカーであるOct4、NanogおよびCdx2で免疫組織染色を行うといずれの発現も低下しており、内細胞塊および栄養外胚葉におけるBrdUの取り込みも低下していた。従って、内細胞塊および栄養外胚葉のいずれの細胞の発生にもHmgpiが不可欠であると考えられた。これらの解析結果から初期胚発生においてHmgpiが重要な役割を果たしていることが明らかとなった。今後ノックアウトマウスの作製、あるいは、Hmgpiが結合するcofactorや上流、下流の遺伝子ネットワークを解析することにより、Hmgpiの機能解明に努めたい。また、これらの研究を通じて、健常な胚盤胞、ES細胞の樹立、未分化性の維持および分化するための培養方法を改善することができると考えている。

着床前期胚発生は、受精、胚性ゲノム活性化、コンパクション、胚盤胞腔の形成、内細胞塊と栄養外胚葉への分化および分化全能性の獲得など、生殖生物学及び再生医学において極めて重要な事象を含む。本研究では、着床前期胚に特異的に発現する新規遺伝子Hmgpに注目し、着床前期胚の分割停止モデル、あるいは着床不全モデルの作成とその分子生物学的機構の解明を目指す。Hmgpは胚性ゲノムの活性化に伴い胚性に転写される一方、着床後には転写されなかった。HMGPタンパクはmRNAレベルから遅れて4細胞期から発現し、以後の着床前期胚のすべての期間を通して高い発現を持続した。興味深いことにHMGPタンパクは胚盤胞の内細胞塊および栄養外胚葉の両方に発現し、胚盤胞期において細胞質から核内へと局在を移行させた。このことは胚盤胞期以前と以後でHmgpが異なる機能を有していることを示唆する。siRNA(siHmgp)を用いてHmgpの転写レベルを抑制すると、着床前期胚の胚発生の低下および着床不全を引き起こした。さらにHmgpの転写抑制は胚性幹細胞の樹立につながる胚盤胞のin vitro outgrowthを低下させた。これらの解析結果から初期胚発生においてHmgpが重要な役割を果たしていることが明らかとなった。今後ノックアウトマウスの作製、あるいは、Hmgpが結合するcofactorや上流、下流の遺伝子ネットワークを解析することにより、Hmgpの機能解明に努めたい。さらには着床前期胚特異的に発現する遺伝子の研究は、初期胚発生の分子メカニズム、ES細胞の樹立あるいは未分化性および分化多能性を規定する分子メカニズムの解明に大きく貢献できると考えられる。さらには不妊症の病因メカニズムを分子レベルで解明し、生殖医療の向上に寄与すると考えられる。本研究では、着床前期胚に特異的に発現する新規遺伝子Hmgpに注目し、詳細な発現解析を行った。これまでに、胚盤胞において細胞質から核内へとHmgpタンパクが移行することも明らかとなっている。今回RNA干渉法を用いて、Hmgpによる着床前期および周辺期発生の制御メカニズムを明らかにすることを目的とした。siRNAによりHmgpの発現をノックダウンした結果、69.2%しか胚盤胞に発生せず、着床率は25.4%、outgrowth発育率は19.0%だった(コントロール注入群:95.3%、75.0%、91.8%)。胚盤胞における免疫染色の結果、内細胞塊のマーカーであるNanogの発現が低下する一方、栄養外胚葉のマーカーであるCdx2の発現も低下した。
哺乳動物中枢神経系の発生と分化における転写制御因子の生理機能

哺乳動物の脳は、発生過程で生み出される多様な細胞群より構成されている。この脳細胞の多様性創造に関与する分子の候補として、脳の特定の領域に限局した発現パターンを有する多くの転写制御因子がこれまで同定されてきた。これら転写因子の発現制御およびその機能を明らかにすることは、脳の形態形成の分子機構を明らかにしていく上で、極めて重要な課題である。本研究では初代神経上皮細胞ならびにその不死化細胞株を用いて、領域特異的転写制御因子の発現制御機構を解析するための試験管内実験系を世界に先駆けて開発しその解析を行った。まず胎生11.5日のラット前脳・中脳の異なる領域より神経上皮細胞を単離し、それぞれについて試験管内初代培養を行う前後で各種領域特異的遺伝子の発現を比較した。その結果、各領域において見られる特異的遺伝子発現は、細胞を試験管内で培養した際にも維持されることが明らかになった。次に我々が樹立した神経上皮細胞株について、どのような領域特異的遺伝子が発現しているかを解析した。それぞれ異なる単一の神経上皮細胞に由来した細胞株においては異なるセットの領域特異的遺伝子が発現しており、さらにそのパターンは、細胞が未分化な状態で増殖・分化する際にも厳密に保存されていた。また、脳細胞の領域特異性を制御する環境シグナルのひとつであるSonicHedgehogの存在下に各細胞株を培養すると、腹側神経上皮細胞特異的なIslet-1,Nkx-2.1,Nkx-2.2遺伝子が、異なるパターンで発現誘導された。上記の結果より、脳の領域特異性を制御する転写因子の発現制御においては、外界環境に依存した機構とともに、細胞系譜に依存した細胞内在的な機構もまた重要な役割を果たしていることを明らかにした。
篤農家の換気判断を伝承するミニパイプハウス栽培支援システムの開発

圃場ごとのミニパイプハウス内の環境データと生育状況から,ハウスの穴開け換気量の最適値を指示する農家向け栽培支援システムの開発を進めている。2年目となる平成30年度の研究実績は次の通りである。1)ミニパイプハウス用低価格環境センサの開発においては、初年度のゲートウェイ経由でのデータアップタイプから、IoTプラットフォームを採用し、ゲートウェイレスで直接インターネット上にアップできるように改良し、システム全体の大幅なコストダウンを達成した。2)IoTプラットフォームの利用に加え、Googleスプレッドシートを活用することで、独自のサーバを構築する必要が無い、Webデータ共有システムを確立し、換気率の記録と日々のハウス内最高気温を分かりやすく表示し、さらに他の農家データとも比較表示可能なシステムとした。3)徳島県立農林水産総合技術支援センターの試験圃場で実施した換気率別の外気温とハウス内の最高温度の関係データを解析し、ハウス外の環境データからハウス内の温度予測について検討した。実際に換気率を上げる前に、翌日以降のハウス内最高温度を予測する機能の開発に着手した。4)翌日以降のハウス内最高温度を推定するために、農研機構の1kmメッシュデータを活用可能なシステムを開発した。5)ニンジン栽培中の葉の画像から、ハウス内最高温度の管理が適切かどうかを、ディープラーニングによる判断システムを構築した。6)開発したシステムを徳島県立農林水産総合技術支援センターの試験圃場に設置して、実証実験を実施した。7)研究成果を、農業環境工学関連5学会2018年合同大会および平成30年度計測自動制御学会四国支部で発表した。また2019年度農業情報学会で発表予定である。低価格なミニパイプハウス栽培用環境センサの開発は進み、開発した環境センサによる生育環境情報(ハウス内気温,湿度,日射量)は取得でき、取得したデータをブラウザで確認できるようになった。Googleアカウントを用いて農家間で共有できるシステムを構築した。また、換気率をシステム上で記録可能としたことで,実際のニンジン栽培の生育環境データと、換気率との関連がひも付け可能となった。ニンジンの生育情報との関連付けするためのアプリの開発が遅れている。市販カメラによるニンジンの葉の画像から生育状況を判断するディープラーニングによる判断の研究は進められた。しかし、ハウス内生育判断用カメラシステムの開発が遅れている。また、生育環境データとニンジンの生育データとのひも付けも遅れている。ミニパイプハウスにおけるニンジン栽培が、冬季の11月3月と期間が限定されているため、開発が遅れている生育情報判別用カメラの開発を進め11月までに生育モニタ用カメラの開発を優先的に進め、11月からの栽培開始から環境情報と換気率と生育情報を関連づけて記録できるシステムを構築できるように研究を推進する。生育情報判別用カメラとミニパイプハウス用環境センサの連携システムの開発を行う。農家への栽培支援システムとしての実用化を目指し栽培支援情報を表示するシステムの開発を進める。徳島県立農林水産総合技術支援センターの圃場にて、実証実験を行う。圃場ごとのミニパイプハウス内の環境データと生育状況から,ハウスの穴開け換気量の最適値を指示しめす農家向け栽培支援システムの開発を目指し、研究を開始している。初年度となる平成29年度の研究実績は次の通りである。1)ミニパイプハウス用低価格環境センサの開発においては、農業用低価格環境センサをミニパイプハウス栽培用に改良したプロトタイプからさらに低価格化を進めて開発し、独立電源込み1台2万円以下の目標に対して、1台1万円の材料費で、温度・日射量・土壌水分を測定する環境センサを開発した。2)開発したミニパイプハウス用低価格環境センサを、徳島県立農林水産総合技術支援センターの試験圃場の複数のミニパイプハウスに設置し、換気率を5パターン変えて外気とハウス内の温度の関係を計測した。計測したデータから外気温と換気率の違いによるハウス内温度の傾向を解析した。3)ニンジン栽培協力農家の圃場に設置し、ニンジン栽培期間(11月上旬3月上旬)のハウス内の環境データを測定し、同時にハウス外にもウェザーステーションを設置して、外気温度を計測した。4)計測した温度データを、換気率判断に使いやすい1日単位の最高温度・最低温度・平均温度で分かりやすく表示するシステムを開発した。5)ニンジン栽培ハウス内にカメラを設置して、ニンジン生育情報を収集した。6)研究成果を、農業情報学会2017年度年次大会および2017年農業施設学会で発表した。低価格なミニパイプハウス栽培用環境センサの開発は進んでおり、開発した環境センサにより生育環境情報は取得でき、環境情報をタブレットで確認する表示システムは開発できている状況だが、ニンジンの生育情報との関連付けするためのアプリの開発が遅れている。このことにより、実際のニンジン栽培の生育環境データ記録はできたが、換気率との関連がひも付けできなかった。また、ハウス内生育判断用カメラシステムの開発が遅れているため、今年度は市販のカメラによる生育情報を取得した。画像から生育状況を判断する解析の研究については進められているが、生育環境データとニンジンの生育データとのひも付けもできなかった。

2)IoTプラットフォームの利用に加え、Googleスプレッドシートを活用することで、独自のサーバを構築する必要が無い、Webデータ共有システムを確立し、換気率の記録と日々のハウス内最高気温を分かりやすく表示し、さらに他の農家データとも比較表示可能なシステムとした。3)徳島県立農林水産総合技術支援センターの試験圃場で実施した換気率別の外気温とハウス内の最高温度の関係データを解析し、ハウス外の環境データからハウス内の温度予測について検討した。実際に換気率を上げる前に、翌日以降のハウス内最高温度を予測する機能の開発に着手した。4)翌日以降のハウス内最高温度を推定するために、農研機構の1kmメッシュデータを活用可能なシステムを開発した。5)ニンジン栽培中の葉の画像から、ハウス内最高温度の管理が適切かどうかを、ディープラーニングによる判断システムを構築した。6)開発したシステムを徳島県立農林水産総合技術支援センターの試験圃場に設置して、実証実験を実施した。7)研究成果を、農業環境工学関連5学会2018年合同大会および平成30年度計測自動制御学会四国支部で発表した。また2019年度農業情報学会で発表予定である。低価格なミニパイプハウス栽培用環境センサの開発は進み、開発した環境センサによる生育環境情報(ハウス内気温,湿度,日射量)は取得でき、取得したデータをブラウザで確認できるようになった。Googleアカウントを用いて農家間で共有できるシステムを構築した。また、換気率をシステム上で記録可能としたことで,実際のニンジン栽培の生育環境データと、換気率との関連がひも付け可能となった。ニンジンの生育情報との関連付けするためのアプリの開発が遅れている。市販カメラによるニンジンの葉の画像から生育状況を判断するディープラーニングによる判断の研究は進められた。しかし、ハウス内生育判断用カメラシステムの開発が遅れている。また、生育環境データとニンジンの生育データとのひも付けも遅れている。ミニパイプハウスにおけるニンジン栽培が、冬季の11月3月と期間が限定されているため、初年度に開発が遅れた生育情報判別用カメラの開発を進め11月までに生育モニタ用カメラの開発と、換気率を記録するアプリの開発を優先的に進め、11月からの栽培開始から環境情報と換気率と生育情報を関連づけて記録できるシステムを構築できるように研究を推進する。また、開発した生育情報判別用カメラを備えたミニパイプハウス用環境センサの開発を行う。農家への栽培支援システムとしての実用化を目指し栽培支援情報を表示するタブレットアプリの開発を進める。徳島県立農林水産総合技術支援センターから換気率と環境情報とニンジンの生育情報のデータ提供による、関係性の解析を進める。
北日本における春季／夏季気温の強い負相関に関する気候学的要因の解明

1998年以降の北日本における4月8月気温の負の相関関係は、それ以前の暖候期に卓越していた熱帯北西太平洋から日本付近へのテレコネクション(PJパターン)が、海水面温度(SST)の太平洋10年規模振動(IPO)のマイナスの位相(ラニーニャモード)の卓越とともに不明瞭になり、熱帯太平洋のSSTが直接的もしくは間接的に中緯度偏西風帯に影響を及ぼして発生した現象であることが明らかになった。特にエルニーニョ監視海域NINO.3のSSTは北日本における春と夏の気温に逆符号の影響を及ぼしており、作用中心的な役割を担っていることが示唆された。北日本における4月8月気温の強い負の相関関係について最新年までみたところ、2014年は1998年以降の直性回帰式線上に乗っており、1998年から2014年までの17年間の相関係数は-0.84、決定係数は0.70と、依然として有意な関係を維持していた。南半球におけるENSOの寄与を判定するために、インドネシアジャワ島中部グヌンキドル地方に気象観測装置を設置し、詳細な気象データの取得を開始した。この気象観測装置は風向風速、温湿度、気圧、日射量、降水量を1時間値で取得する。同地域は標高が高く、天水農業が行われており、ENSOにより影響を受けることがBayu et al. (2013)で明らかにされている。同地域では降水量の他は気象要素が観測されておらず、今回取得する風、気圧等の気象要素は、4月8月の天候の変化を敏感に判定すると期待される。現地における農業気象観測所での雨量データを収集した。北日本の4月8月気温のコントラストが明瞭であった2002年と2006年について月平均降水量を比較したところ、年による差が明瞭であったが、地点間の差も大きく、また欠測のある可能性があり、今後確認する必要がある。CMIP5の各種実験データのうち、産業革命前基準(Pre-industrial Control)実験と過去再現実験(Historical)データの取得と整備を行った。力学的な観点から4月8月気温の時空間遠隔相関をもたらす原因について解析するために、メソ気象モデルWRFを用いて、インドネシアのグヌンキドルにおける20142015年雨季の数値シミュレーションを行った。当該地域は地形が複雑なため、1kmメッシュまでダウンスケールした。風や気温の日変化は良く表現することが出来た。また、JRA25を用いてテレコネクションパターンについて解析し、北日本のイネいもち病を例として考察を行った。北日本における4月/8月気温の強い負の相関関係について、2015年まで確認したところ、2015年の実況は、1998年以降の回帰直線からやや離れているものの、4月が正、8月が負の気温偏差のグループに属しており、1998年2015年の相関係数は-0.82と、依然として有意な負の相関関係が続いている。一方、過去100年に遡って調べたところ、そのような強い相関関係は近年特有の傾向であることが分かった。北日本8月気温とそれに先行する4月の熱帯海洋を中心とした大気場との関係について再解析データを用いて調べたところ、下層500hPa以下の東西風(u成分)と明瞭な正の相関が見られた。対流についても、OLR(上向き長波放射)が有意な正の相関を示しており、東西風の変動は対流活動の変化を伴っていた。高解像度全球大気モデル(MRI-AGCM3.2)による100メンバーAMIP実験(観測された海面水温で強制)を解析したところ、観測で見られた北日本付近の4月/8月気温の相関関係はアンサンブル平均(シグナル)としては再現されなかった。このことは、観測された強い相関関係は熱帯海面水温からの強制ではなく大気の内部変動(ノイズ)で生じていることを示唆する。上述の熱帯対流相関域のほぼ中心に位置している、インドネシア共和国ジャワ島における現地の気象観測データを回収・解析した。その結果、降水、大気場ともに4月末頃に不連続的に変化しており、雨季の終わりがその期間に判定できることが明らかとなった。メソ気象モデルWRFによるシミュレーションを、現地気象観測の期間と並行して行った。現地気象観測点(Wonosari)における大気の時間ー高度断面をみたところ、地上観測で明瞭に把握されたu成分の4月末5月初めの西風成分の消失が、大気下層に限定された現象であり、500hPa以上では一転して西風になることが示された。北日本における4月/8月気温の負の相関関係について、2015年も成り立っていることが明らかとなり、また日本の他の地域や期間についても類似の現象があることから、本研究による解析手法がより実用性のあることを確認することができた。一方で、過去100年のデータ解析からこのような相関関係は近年特有の傾向であることが分かった。4月8月気温におよぼす熱帯からの影響を明らかにする目的に関して、先行する4月の熱帯海洋域での下層風および対流場に、北日本8月気温との間に有意な相関が認められた。一方、全球大気モデルによる100メンバーAMIP実験(観測された海面水温で強制)では北日本付近の4月8月気温の強い相関関係は再現されないことが分かった。Wonosariにおける気象観測点は、熱帯域での有意な相関域の中心に位置していることから、大規模な現象に密接に関連した有用なデータが得られることとなった。

ここでは、降水量の変化から、雨季が4月末頃に終わること、同時に風向や日射量など大気の状態も不連続的に変化することが明らかとなった。このように、地上データから雨季の特徴が明瞭に把握できたことは一段の進捗である。地上気象観測点を中心として、インドネシア周辺に領域気候モデルによる数値シミュレーションを実行できた。Wonosariの上空では、風向は500400hPa付近を境界としてその上下で入れ替わっていた。すなわち、4月末までは地上400hPa付近まで西風成分が頻出していたのに対して、5月上旬以降は、6月中旬まで上空の西風が明瞭になり、地上付近は東風が卓越している。これは地上気象観測データと整合的である。このほか、絶対湿度などについても同様に、地上気象観測と整合的に大気の鉛直構造の時間変化がシミュレートできたことは今後の解析に意義がある結果である。以上、27年度は計画通りの達成度であると判断する。北日本における4月と8月気温の2016年の実況は、両月とも正の偏差を示し、これまでの傾向から外れる結果となった。これは、19982013年頃のラニーニャが卓越していた期間が終わり、2014年夏2016年春の大規模エルニーニョが発生した時期と一致していることから、ラニーニャが卓越した約18年間に、4月と8月気温の負相関が顕出した可能性がある。全球で統計解析を行った結果、1998年以降に日本付近を通るジェット気流が太平洋海水面温度と強い相関を示した。すなわち、2015年まで明瞭に現れていた4月/8月気温の関係は、ラニーニャモードの卓越と、それに伴う北半球ジェットの固有の変動で説明できると推測される。また、冷夏と関係の深いテレコネクションPJパターンについては、北日本の8月気温との関係が1998年以降は全くみられず、日本付近のジェット気流が、南からの影響が小さいため、4月から8月まで中緯度帯に卓越する準定常的な変動を示していたと考えた。高解像度全球大気モデルによる多数メンバーAMIP実験データ(観測の海面水温(SST)を境界値として異なる大気初期値を与えている)を用いて、大気の全体の変動のうちSST変動によって起きている変動の割合を推定した。日本付近の対流圏下層気温変動では、4月は1020%、8月は2040%がSST変動で強制されることが分かった。また、太平洋東部赤道域SST偏差と日本付近の気温偏差の関係は、観測では冬季春季(夏季秋季)は正(負)相関であるが、モデルはこのような関係を概ね再現することが分かった。インドネシアの現地気象観測データを2雨季分解析したが、ともにエルニーニョに対応しており、2013年以前の総観場を反映していない。そこで、研究期間を1年延長し、熱帯海洋がノーマルモードであった2016年以降の雨季データも加えて、総合的に比較検討することとした。北日本における4月/8月気温の負の相関関係について、2016年はこれまでとは異なった年であったことが明らかとなった。これについては、4月/8月気温の負の相関関係は、IPO(太平洋準10年周期変動)がマイナスの気候ステージ中に発生した現象であることが明らかとなりつつある。その原因を調べたところ、2015年まで明瞭に現れていた4月/8月気温の関係は、ラニーニャモードの卓越と、それに伴う北半球ジェットの固有の変動で説明できる可能性がある。特に8月の北日本平均気温とPJパターンとの関係が見られなくなっており、1997以前とは異なった状況であることが明らかとなった。