hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
細胞複製を制御する細胞内情報伝達系と遺伝子発現の制御機構

最近の私共や他の研究室の解析により、ras p21が遺伝子発現系を介して細胞の増殖や分化を制御していることが明らかになりつつある。本年度は、ras p21の標的蛋白質の同定および活性化機構について解析を行い、以下の結果を得た。最近、ras p21が細胞レベルでMAPキナーゼを活性化することが報告されているが、本年度、私共はツメガエル卵の細胞質画分にKi-ras p21に依存してMAPキナーゼを活性化する因子が存在することを明らかにし、これをREKSと命名して部分精製した。REKは分子量150kDaの蛋白質で、細胞質に存在していた。ras p21はそのC末端に脂質による翻訳後修飾を受けることが知られているが、Ki-ras p21がREKSを活性化するのにこの翻訳後修飾が必須であった。私共はすでに、smg GDS(GDS解離促進蛋白質)がKi-ras p21のGDP/GTP交換反応を促進して活性化することを見出して報告しているが、最近ras p21に作用する新たなGDSとしてGRFが他の研究室によって見出されている。本年度は、これら二種類のGDSによるras p21の活性化機構を比較解析した。smg GDSとGRFは同一条件下でほぼ同程度の初速度でKi-ras p21のGDP/GTP交換反応を促進した。私共のこれまでの解析から、smg GDSは翻訳後修飾を受けているras p21にのみ作用することが明らかとなっているが、GRFも翻訳後修飾を受けているras p21のほうにより高い活性を示した。GRFはsmg GDSが有する今一つの活性であるKi-ras p21を細胞膜から遊離させる活性も有していた。本年度の私共の研究結果から、ras p21の標的蛋白質と活性制御機構について着実な成果をあげることができ、本年度の研究計画はほぼ達成することができたと考えている。
チャネルロドプシンのイオン輸送の理論化学

申請課題「チャネルロドプシンのイオン透過の理論化学」では,生体分子の溶媒和理論(3D-RISM)および分子シミュレーション(MD)を用いて,チャネルの閉構造および初期開構造におけるイオン輸送経路の解明と,チャネルの遅い構造変化とイオン輸送経路の統計力学的探索を行い,チャネルタンパク質構造の柔らかさとイオン分布の柔らかさの相関を分子論的に明らかにすることを目的とした。チャネル閉構造でのイオン輸送経路とイオンの自由エネルギープロファイルを明らかにし,さらにチャネル初期開状態の構造についても明らかにしつつある。チャネルの開閉は,レチナールの光異性化からはじまり,その後チャネル内の解離性アミノ酸残基間のプロトン移動により進んでいくが,これまでの研究で閉状態から開状態に至る初期段階(D470, P500,およびP390状態)のプロトン化状態を提案し,対応するイオン分布,イオン輸送経路およびイオンの自由エネルギープロファイルを示した。これまで,チャネルの開閉にはチャネル内の2つの狭窄部位の存在と,その外れ方が実験で示唆されていたが,申請者らの結果は,ヘリックスと連動してソルトブリッジが外れる様子など,実験結果を強く支持するものであった。27年度が最終年度であるため、記入しない。チャネルロドプシンは,緑藻類から単離された光駆動陽イオンチャネルであり,青色光の吸収により陽イオン(とくにNa+)の輸送活性を示すことが知られている。このタンパク質はオプトジェネティクスの有用なツールとして着目を浴び,すでに利用が進みつつある。にもかかわらず,イオン輸送経路や開閉のメカニズムなど,まだ未知の部分が多く残されている。本研究課題では,液体の統計力学理論(3D-RISM)と分子シミュレーションを用いて,(1)チャネルの閉構造および初期開構造におけるイオン輸送経路の解明,(2)チャネルの遅い構造変化とイオン輸送経路の統計力学的探索を行い,チャネルタンパク質構造の柔らかさとイオン分布の柔らかさの相関を分子論的に明らかにすることを目的とする。上記のような目的のもと,これまでに,(1)分子シミュレーションによりチャネルロドプシンの閉構造および初期開構造を求め,得られた構造に対して3D-RISM計算を行い,チャネル内の水分子分布およびイオン分布を評価し,チャネル経路を明らかにしつつある。(A01林グループとの共同研究)(2) ABCトランスポーターの二量体形成過程におけるATPおよび水の役割を分子シミュレーションおよび3D-RISMにより明らかにした。(A01櫻井グループとの共同研究)(3)分子認識過程におけるタンパク質-リガンド間相互作用の高精度解析を目指し,フラグメント分子軌道法と3D-RISMの連成計算手法を開発した。当初予定していた閉構造および開構造のイオン分布を評価を行い,開構造におけるイオン透過のメカニズムを明らかにしつつある。この中で,輸送経路に沿ったイオンの自由エネルギープロファイルから透過能についても知見を得ることができた。また,領域内共同研究をすすめ,そのうち一件では論文の発表を行うなど領域内の共同研究推進にも寄与した。今後は,開構造におけるイオン透過メカニズムの解析を一層進め,チャネル輸送の分子論を明らかにする。また,イオン種による輸送能の違いを検討する。タンパク質内の物質輸送経路探索の新しい手法の提案を行い,チャネルロドプシンへ応用する。この手法では3D-RISMで求めたイオンの平均場ポテンシャル面をもとに,ストリング法を用いて準安定点間のイオン移動経路を求める。この手法によりこれまでは難しかった経路上のバリアを評価することが可能となる。領域内共同研究として,これまでの共同研究に加え,A01苙口グループ,A02関谷グループ,A02飯野グループ,A03神取グループとの共同研究を推進する。
下垂体分化誘導遺伝子に対するアルコール作用点の決定

研究実績の概要本研究の目的は、アルコール曝露による視床下部-下垂体系の正常確立が逸脱する遺伝子発現パターンを同定し下垂体分化誘導遺伝子に対するアルコール作用点を示すものである。平成15年度はラットを用いたモデル実験動物を作成し、視床下部の神経ペプチドである成長ホルモン放出刺激ホルモン:GHRH、ソマトスタチン:SRIH及び脳由来神経成長因子:BDNFに着眼し遺伝子発現の定量解析及び免疫組織化学法を用いて評価した。Wistar系雄ラットの新生仔を10日齢から15日齢まで6日間連続して、1日あたり3時間アルコール蒸気に曝露(血中アルコール濃度;約430mg/dL)し実験動物モデルとした。曝露終了後から出生16、20、30、60日目に当たる日を材料採取日と定め、同条件における対照ラットとして母性剥離ラットおよび同週例の対照ラットの解析を同時に行った。材料採取は、組織内のRNAを効率的に回収するためにRNase非存在下で視床下部領域を採取し、total RNAの評価には吸光度比が260/280において1.61.8であることを確認し、すべてのmRNA濃度を統一してからcDNA合成を行った。日本ロシュ社のRealtime PCRをもちいて視床下部領域で転写されるmRNA量を28S ribosomal RNA配列を内部標準として定量解析を行った。本研究および予備実験の結果として、アルコール曝露終了後出生16日齢対照ラット群の値を100とした場合には、SRIHmRNA発現で雌雄ともに上昇、BDNFmRNA発現量では雄のみ上昇していた。しかしながら、アルコール曝露群対照ラットにあたる母性剥離ラットのSRIH,BDNFmRNA発現量は、アルコール曝露後出生20日齢において実験動物モデルラットよりも高い値を示した。対照ラットの環境要因を明確にするために母性剥離による影響を下垂体重量で検討した結果、対照ラットに比べて母性剥離ラットで出生20,30日齢で減少し,出生60日令においては増加していた。さらに、母性剥離ラットの視床下部GHRH及びSRIH受容体mRNA発現は、出生20日齢よりも60日齢で高い値を示した。以上の結果から、アルコール曝露直後のSRIH, BDNFmRNA発現は性差が生じていた。一方、曝露後20日齢では、対照としての母性剥離ラットにおける発現量の上昇により、複雑な環境要因がもたらしたと考えられる。これらの事は、母性剥離ラットの解析結果として、環境要因がもたらす重要な所見として投稿準備中であり、アルコール作用を含む出生後の胎児における環境要因の解明へと発展するものである。研究実績の概要本研究の目的は、アルコール曝露による視床下部・下垂体系の正常確立が逸脱する遺伝子発現パターンを同定し下垂体分化誘導遺伝子に対するアルコール作用点を示すものである。平成14年度はモデル実験動物を作成し、視床下部の神経ペプチドである成長ホルモン放出刺激ホルモン:GHRH、ソマトスタチン:SRIHに着眼し遺伝子発現の定量解析及び免疫組織化学法を用いて評価した。1、胎生期へのアルコール曝露モデル異なる2系統の妊娠マウス(DBA2/J, C57BL6/J)を用い、胎生11日齢から14日齢まで4日間連続して、1日あたり3時間アルコール蒸気に曝露し実験動物モデルとした。2、周性期へのアルコール曝露モデルWistar系雄ラットの新生仔を10日齢から15日齢まで6日間連続して、1日あたり3時間アルコール蒸気に曝露(血中アルコール濃度;約430mg/dL)し実験動物モデルとした。本研究の予備実験では、胎生12日齢から16日齢にかけて外的環境要因としてX腺照射は、体成長及び中枢神経機能の発達に重篤な影響を及ぼした。本研究の胎生期マウスへのアルコール曝露動物では、DBA2/JよりC57BL6/Jで高い胎児生存率を示す一方で、GHRHとSRIH遺伝子発現頻度は正常胎仔よりアルコール曝露胎仔で遺伝子発現量にばらつきが生じた。遺伝子発現率の算出では、インターナルコントロールとして28Sribosomal RNA配列をハウスキーピング遺伝子(HKG)とした場合に、良好な結果が得られた。以上の結果から、遺伝子発現量にばらつきが見られたことは、アルコールの刺激によりHKG発現が変動したと考えられ、視床下部・下垂体の胎生発達時期へのアルコール作用は、適切なHKGの使用により評価できると考える。現在、周性期ラットへのアルコール曝露動物の体成長・生殖機能の確立に着眼し解析中である。

材料採取は、組織内のRNAを効率的に回収するためにRNase非存在下で視床下部領域を採取し、total RNAの評価には吸光度比が260/280において1.61.8であることを確認し、すべてのmRNA濃度を統一してからcDNA合成を行った。日本ロシュ社のRealtime PCRをもちいて視床下部領域で転写されるmRNA量を28S ribosomal RNA配列を内部標準として定量解析を行った。本研究および予備実験の結果として、アルコール曝露終了後出生16日齢対照ラット群の値を100とした場合には、SRIHmRNA発現で雌雄ともに上昇、BDNFmRNA発現量では雄のみ上昇していた。しかしながら、アルコール曝露群対照ラットにあたる母性剥離ラットのSRIH,BDNFmRNA発現量は、アルコール曝露後出生20日齢において実験動物モデルラットよりも高い値を示した。対照ラットの環境要因を明確にするために母性剥離による影響を下垂体重量で検討した結果、対照ラットに比べて母性剥離ラットで出生20,30日齢で減少し,出生60日令においては増加していた。さらに、母性剥離ラットの視床下部GHRH及びSRIH受容体mRNA発現は、出生20日齢よりも60日齢で高い値を示した。以上の結果から、アルコール曝露直後のSRIH, BDNFmRNA発現は性差が生じていた。一方、曝露後20日齢では、対照としての母性剥離ラットにおける発現量の上昇により、複雑な環境要因がもたらしたと考えられる。これらの事は、母性剥離ラットの解析結果として、環境要因がもたらす重要な所見として投稿準備中であり、アルコール作用を含む出生後の胎児における環境要因の解明へと発展するものである。
L２習得過程における音韻処理変化と知覚スペースの再調整

L2音韻習得の分野では,選択的注意や明示的な知識が学習効果に影響を与えるのかの研究がひろがりつつある. Guion & Pederson (2007), Hisagi & Strange (2011), Porretta & Tucker (2015)などでは,明示的な指示を行うことで,音声知覚成績が向上したと報告している.本研究の目的は,明示的知識と注意が, L1の影響を抑制し, L2音の知覚が向上するのか,また,学習者の選択指向性を抑制するのかを調査することであった.本年度は,先行研究とは異なり,明示的な教示ではなく,回答選択肢の呈示タイミングの調整という,非直接的な方法で注意の誘導を行った.たとえば,日本語話者のLとRの知覚の場合,音声呈示の前に, LとRの弁別問題であることを示唆する選択肢を先に呈示する群と,音声刺激後に呈示する群を設け,成績を比較した. 2018年度は,日本語をL1とする英語学習者を対象とした知覚実験と,中国語を母語とする日本語L2学習者を対象とした知覚実験を行った.知覚すべきL2の音声刺激を聴く前に,選択肢にて文字表記情報を呈示することで,学習者の選択的注意が音声知覚に必要な音響情報に向けられるのかどうか,そしてL2ターゲット音声の知覚成績に向上は見られるのかを調査した.2018年度に行った調査では,日本語母語話者,中国語母語話者を対象とした全ての実験で,選択肢呈示を音声刺激の前に行うことで知覚成績の向上が見られた.ターゲット語の文中のポジションにより,知覚成績に影響を与えることも分かった.また選択的注意の誘導は,知覚成績の向上のみならず,プリファレンス効果の抑制という形でも現れることが示唆された.本研究の結果は,日本認知科学会第35回大会にて発表した.本研究の目的である明示的知識の影響については, 2つの言語の母語話者を対象とした実験を行い,成果を発表した.また,もう一方の目的であるL2習得のL1への影響の研究については, 2018年終盤より母語にL2がどのように影響するのかについての研究会を定期的に開催している(月に1度).異なる研究機関に所属する研究者・学生があつまり,論文の購読や討論を行っている.現在,意見交換を行いつつ,新たな実験の構築を進めているところである.母語の第二言語への影響についての研究は,月例研究会を継続し、様々な研究者の意見を取り入れつつ、進めていく予定である.今年度は、異なるレベルのL2学習者の, L1の発話、および知覚を調査し, L2を学ぶことで, L1への影響は見られるのか,また,異なるレベルの学習者の間では, L1はどのように変化するのかを調査する予定である.L2のL1への影響の研究は,音韻論・音声学の分野ではこれまでVoice Onset Time,母音のフォルマント分析のみがなされてきた.本研究では2019年度から2020年度にかけ,我々がこれまで研究を続けてきた,摩擦音を対象とした知覚・発話の調査を行う方向である.L2音韻習得の分野では,選択的注意や明示的な知識が学習効果に影響を与えるのかの研究がひろがりつつある. Guion & Pederson (2007), Hisagi & Strange (2011), Porretta & Tucker (2015)などでは,明示的な指示を行うことで,音声知覚成績が向上したと報告している.本研究の目的は,明示的知識と注意が, L1の影響を抑制し, L2音の知覚が向上するのか,また,学習者の選択指向性を抑制するのかを調査することであった.本年度は,先行研究とは異なり,明示的な教示ではなく,回答選択肢の呈示タイミングの調整という,非直接的な方法で注意の誘導を行った.たとえば,日本語話者のLとRの知覚の場合,音声呈示の前に, LとRの弁別問題であることを示唆する選択肢を先に呈示する群と,音声刺激後に呈示する群を設け,成績を比較した. 2018年度は,日本語をL1とする英語学習者を対象とした知覚実験と,中国語を母語とする日本語L2学習者を対象とした知覚実験を行った.知覚すべきL2の音声刺激を聴く前に,選択肢にて文字表記情報を呈示することで,学習者の選択的注意が音声知覚に必要な音響情報に向けられるのかどうか,そしてL2ターゲット音声の知覚成績に向上は見られるのかを調査した.2018年度に行った調査では,日本語母語話者,中国語母語話者を対象とした全ての実験で,選択肢呈示を音声刺激の前に行うことで知覚成績の向上が見られた.ターゲット語の文中のポジションにより,知覚成績に影響を与えることも分かった.また選択的注意の誘導は,知覚成績の向上のみならず,プリファレンス効果の抑制という形でも現れることが示唆された.本研究の結果は,日本認知科学会第35回大会にて発表した.本研究の目的である明示的知識の影響については, 2つの言語の母語話者を対象とした実験を行い,成果を発表した.また,もう一方の目的であるL2習得のL1への影響の研究については, 2018年終盤より母語にL2がどのように影響するのかについての研究会を定期的に開催している(月に1度).異なる研究機関に所属する研究者・学生があつまり,論文の購読や討論を行っている.現在,意見交換を行いつつ,新たな実験の構築を進めているところである.

母語の第二言語への影響についての研究は,月例研究会を継続し、様々な研究者の意見を取り入れつつ、進めていく予定である.今年度は、異なるレベルのL2学習者の, L1の発話、および知覚を調査し, L2を学ぶことで, L1への影響は見られるのか,また,異なるレベルの学習者の間では, L1はどのように変化するのかを調査する予定である.L2のL1への影響の研究は,音韻論・音声学の分野ではこれまでVoice Onset Time,母音のフォルマント分析のみがなされてきた.本研究では2019年度から2020年度にかけ,我々がこれまで研究を続けてきた,摩擦音を対象とした知覚・発話の調査を行う方向である.2018年度に行った実験が予定よりも小規模なものであったため,謝金の支払いが少額となった.2019年度に追加実験を行うため,翌年度に使用金額を持ち越した.また, 2018年度の学会発表が国内の学会1つであったため,旅費も少額となった.2019年度はNew Soundsという国際学会にて発表を予定している.2019年度の開催国が日本であり,当該学会への参加旅費は高額にならないが, 1名あたりの参加費が比較的高額であるため, 2019年度は学会参加費の支出が増える予定である.また,今年度はまだWebサーバーを経由してのInquisitを使用する実験の構築が完成しておらず, InquisitのWeb版のライセンスを購入していない.Web実験が2019年度となる予定であるため, 2019年度に購入する予定である.
転写因子Bach2の発現量に依存したB細胞分化制御の解明

「外的要因」である抗原により活性化されるとBリンパ球(B細胞)は、細胞増殖しつつ胚中心B細胞へ分化する。胚中心B細胞は、抗体の機能の向上を目的とした胚中心応答を経て、選抜されたのちに、抗体を分泌する形質細胞へ分化する。一方で、B細胞の「内的要因」である転写因子Bach2の発現量の違いが細胞運命を決定することを示してきた。そこで、本研究では胚中心B細胞でのBach2の標的遺伝子は何か、Bach2と協調的または拮抗的に転写調節に関わる因子は何かを解析している。平成29年度には、Bach2がB細胞受容体(BCR)刺激で誘導される増殖応答において、重要な役割を担うことをあきらかにしてThe Journal of Immunology誌に報告できた。Bach2遺伝子ノックアウトマウスの脾臓B細胞はBCR応答性の増殖に障害がある。しかし、BCRの下流のリン酸化シグナル経路は野生型B細胞と同等であることを明らかにした。Bach2は、抗アポトーシス因子のBclXLの遺伝子発現の活性化に貢献してアポトーシスを抑制することを明らかにした。さらにBach2は、CDK阻害タンパク質をコードする遺伝子群Cdkn1a (p21)、Cdkn2a (Arf)およびCdkn2b (p15INK4b)の転写を直接抑制して細胞増殖を促進することをマウス脾臓B細胞を用いたクロマチン免疫沈降法で明らかにした。本年度はマウス脾臓B細胞を用いることで更に生理的な条件下で検討できた。本研究からBach2は成熟B細胞で細胞増殖制御をおこなう重要な転写因子であると考えられる。以前に見出した、形質細胞分化に必須の転写因子Blimp-1の遺伝子発現を抑制する分化におけるBach2の役割に加え、Bach2の異常を原因とする病態を解明できる可能性があるがある。平成29年度には、前述の転写因子Bach2の標的遺伝子の機能解析に加え、Bach2タンパク質に結合する複合体を精製し構成因子を同定する研究計画であった。現在までに、B細胞株にペプチドTag付きBach2を過剰発現させ、複合体の精製を済ませている。ここで、Tagの種類およびBach2の発現量の異なる2種類の条件で精製し、質量分析解析の結果から再現性を検討し、複数の転写因子や転写調節因子を見出している。以前に報告したヒストン脱アセチル化酵素HDAC3も含まれていたことから、精製および質量分析解析による因子の同定は成功していると考えられる。しかし、当初予定していたマウス脾臓B細胞からの複合体精製は、マウスから得られるB細胞数と抗Bach2抗体の免疫沈降効率の問題から、すぐには実験の実施ができないと考えている。従って、現状B細胞株で得られた実験結果をもとに検証する形で進めていく。研究実績欄に記載したことに加えて、形質細胞分化の過程においてBach2と協調的に機能することが予想される転写因子の機能解析も進めている。現在、候補の2因子について、脾臓B細胞分化誘導系でshRNA発現によるノックダウンの系で発現を低下させた場合とレトロウィルスの系で発現を上昇させた場合の両方のアプローチで検証を進めている。さらに、B細胞から形質細胞への分化過程において定量質量分析解析法であるSILAC法にてタンパク質レベルでの発現解析の系はすでに確立しており、現在解析を進めている段階である。平成30年度は、転写因子Bach2がどのような因子と協調的に形質細胞への分化を調節するという解析を進める。そこで、以下の3つのカテゴリーの因子群の機能解析を実施していく。第一に、シングルセル(単一細胞)レベルでBach2の発現と協調的に機能すると予想される転写因子群。第二に、抗Bach2抗体を用いたクロマチン免疫沈降法と次世代シークエンス法(ChIP-seq)の結果から、Bach2の結合領域の近傍に高頻度に見出される転写因子の結合モチーフに結合する転写因子群。第三に、質量分析解析の結果から、Bach2タンパク質と直接相互作用する転写調節因子群。第三群で同定された複合体構成因子群のなかには、Bach2タンパク質の機能自体を調節する可能性のあるタンパク質が同定された。そこで、Bach2タンパク質量は減少することおよび、Bach2は細胞内局在変化で活性調節を受けていることを踏まえて成熟B細胞から形質細胞へ分化する過程で翻訳後調節のメカニズムの解明も並行して解明する予定である。体内への抗原の侵入により活性化されるとBリンパ球は細胞増殖の後に胚中心B細胞へ分化する。次に、抗体の機能の向上を目的とした胚中心応答を経て選抜された胚中心B細胞は抗体を分泌する形質細胞へ分化し、一部はメモリーB細胞へ分化する。以前に転写因子Bach2の発現量の違いが、B細胞の運命を決定する内的要因であることを示してきた。その結果を踏まえて本研究では胚中心B細胞でのBach2依存的な標的遺伝子は何か、Bach2と協調的または拮抗的に転写調節に関わる因子は何かを解析し、Bach2が制御する胚中心B細胞の細胞運命決定機構の解明を目指している。平成28年度はBach2の直接標的遺伝子の同定を目的として研究をすすめた。先ず、野生型およびBach2ノックアウトマウスの脾臓B細胞を培養系にてB細胞受容体(BCR)刺激をおこない、遺伝子発現様式を比較した。得られた遺伝子発現データをクラスター解析および遺伝子オントロジー解析を組み合わせたところ、Bach2ノックアウトB細胞では細胞増殖に関連した遺伝子群の発現が有意に変動していた。

さらに、B細胞株に対して、抗Bach2抗体を用いたクロマチン免疫沈降実験によりBach2が直接結合する遺伝子を探索したところ、前述の細胞増殖関連遺伝子の幾つかがBach2の直接標的遺伝子であることを突き止めた。胚中心B細胞への分化課程では、前胚中心B細胞の段階および胚中心B細胞に分化した後の暗帯B細胞では細胞増殖することが重要な応答である。Bach2ノックアウトマウスでは、抗原投与に応じて胚中心ができないことを考え合わせるとBach2は成熟B細胞で細胞増殖制御をおこなう重要な転写因子であると考えられる。これまで私たちが見出してきた形質細胞分化に必須の転写因子Blimp-1の遺伝子発現を抑制する役割に加えて、Bach2の機能解明に新展開をもたらす意義がある。当初には、マウスに抗原を投与し胚中心B細胞を分化誘導したうえで胚中心B細胞を採取し、抗Bach2抗体を用いたクロマチン免疫沈降実験と引き続くシークエンス(ChIP-seq)をおこなうことにより、直接標的遺伝子の同定を試みる研究計画であった。しかしながら、抗Bach2抗体の特性から直接採取したB細胞でシークエンスに十分なサンプル量を得るのが困難であった。そこで、初期分化段階に相当するB細胞株での実施に切り替えた。この細胞株を選定した理由は、ほかにも多くのB細胞分化に必須の転写因子のChIP-seq解析に用いられてきたことから、今後はそれらの公開されたデータを活用することで、他の転写因子とBach2と転写調節ネットワークを明らかにする際に有利である。ただし、本研究ではBach2標的遺伝子を同定した後に特定の遺伝子座におけるBach2の結合を個別に検証するためには、マウス脾臓B細胞を用いて定量PCR法にて実験を行ったことから、当初の目的であるより生理的な条件下で検討は、これらの実験の組み合わせによっておおむね達成されたと考えられる。また、Bach2の結合配列の近傍に頻回に見出されるほかの転写因子のモチーフについては現在解析を進めている。また、研究計画第二項目のBach2複合体の精製と同定も進めているが、こちらも抗Bach2抗体の特性から内在性の複合体を免疫沈降させることは難しく、細胞株でタンパク質タグ付きのBach2を発現させ複合体を沈降させ同定する実験を試み、特異的に結合する因子を同定している。転写因子モチーフ検索および、複合体で同定された転写調節因子の中には胚中心応答に重要な転写因子の関連因子が含まれることを突き止めている。「外的要因」である抗原により活性化されるとBリンパ球(B細胞)は、細胞増殖しつつ胚中心B細胞へ分化する。胚中心B細胞は、抗体の機能の向上を目的とした胚中心応答を経て、選抜されたのちに、抗体を分泌する形質細胞へ分化する。一方で、B細胞の「内的要因」である転写因子Bach2の発現量の違いが細胞運命を決定することを示してきた。そこで、本研究では胚中心B細胞でのBach2の標的遺伝子は何か、Bach2と協調的または拮抗的に転写調節に関わる因子は何かを解析している。
魚類のDNAワクチンの開発

ヒラメラブドウイルス(HRV)およびウイルス性出血症ウイルス(VHSV)の外膜糖タンパク質(Gタンパク質)、イリドウイルス(RSIV)の主要外殻タンパク質およびアタッチメントタンパク質、Pasteurella piscicidaの3種類の主要抗原タンパク質、海産養殖魚の病原菌Mycobacterium sp.のAntigen85複合体遺伝子を発現する組換えプラスミドを構築し、DNAワクチンを作製した。また、アジュバント遺伝子としてヒラメのインターロイキン1遺伝子を発現する組換えプラスミドも構築した。HIRRVのグリコプロテイン遺伝子DNAを遺伝子銃あるいは注射により接種したヒラメの累積死亡率はグリコプロテイン遺伝子DNAを接種していないヒラメに比較して有意に低く、ワクチン効果が認められた。マダイにイリドウイルスのアタツチチメントタンパク質および主要外殻タンパク質遺伝子を接種し、DNAワクチン試験を行なったところ、コントロールと比較して累積死亡率は有意に低かったが、RPSは約50であり、今後、改良が必要であることと考えられた。オールフィッシュDNAワクチンベクターを構築するためにヒラメの補体C3遺伝子、ケラチン遺伝子、βアクチン遺伝子、ゲラチナーゼ遺伝子および腫瘍壊死因子α遺伝子のプロモーター領域をクローン化し、これに緑色蛍光タンパク質GFP遺伝子を繋いだ組換えプラスミドを構築し、トランスジェニックゼブラフィッシュの系で解析したところ、ケラチンあるいはゲラチナーゼ遺伝子のプロモーターが全身的な発現パターンを示し、これらがDNAワクチンへの利用に有効であると考えられた。DNAワクチン接種による免疫関連遺伝子の発現を定量的に比較解析するために、リアルタイムPCR法により24種類の免疫関連遺伝子の遺伝子発現量定量法を構築した。ヒラメラブドウイルス(HRV)およびウイルス性出血症ウイルス(VHSV)の外膜糖タンパク質(Gタンパク質)、イリドウイルス(RSIV)の主要外殻タンパク質およびアタッチメントタンパク質、Pasteurella piscicidaの3種類の主要抗原タンパク質(外膜タンパク質、外膜リポタンパク質、セリンプロテアーゼ)を発現する組換えプラスミドを構築し、DNAワクチンを作製した。これらの内、HRV-Gタンパク質あるいはインターロイキン1遺伝子単独およびHRV-Gタンパク質とインターロイキン1遺伝子を組み合わせたDNAワクチンをヒラメに接種し、DNAワクチン試験を開始した。RSIVのDNAワクチンについてはイリドウイルスに感受性のあるパールグラミーを用いてDNAワクチン試験を開始した。オールフィッシュDNAワクチンベクターを構築するためにヒラメの補体C3遺伝子、ケラチン遺伝子、βアクチン遺伝子、ゲラチナーゼ遺伝子および腫瘍壊死因子α遺伝子のプロモーター領域をクローン化し、これに緑色蛍光タンパク質GFP遺伝子を繋いだ組換えプラスミドを構築し、トランスジェニックゼブラフィッシュの系で解析したところ、ケラチンあるいはゲラチナーゼ遺伝子のプロモーターが全身的な発現パターンを示し、これらがDNAワクチンへの利用が有効であると考えられた。ヒラメの病原ウイルスであるヒラメラブドウイルス(HIRRV)およびブリ、マダイ等の病原ウイルスであるイリドウイルスに対するDNAワクチンの有効性を調べるとともに、海産養殖魚の病原菌Mycobacterium sp.のDNAワクチン候補遺伝子であるAntigen85複合体遺伝子の構造解析を行なった。さらに、サイトカインの一種であるインターロイキン-1のアジュバント効果についても検討した。HIRRVのグリコプロテイン遺伝子DNAを遺伝子銃により接種したヒラメの累積死亡率はグリコプロテイン遺伝子DNAを接種していないヒラメに比較して有意に低かった。0.01μg、0.1μg、1.0μg、10.0μgのpCMV-HRVgDNAをヒラメに注射法によって接種したワクチン魚に攻撃試験を行ったところ、Relative percent survival(RPS)が順に0、16.2、71.2および91.2の順であった。

1.0μg以上のpCMV-HRVgDNAを接種することにより防御反応が認められ、ワクチン効果が認められた。また、マダイにイリドウイルスのアタッチチメントタンパク質および主要外殻タンパク質遺伝子を接種し、DNAワクチン試験を行なったところ、コントロールと比較して累積死亡率は有意に低かったが、RPSは約50であり、今後、改良が必要であることと考えられた。Mycobacterium sp.からAntigen85複合体遺伝子のA、B、Cの3タイプがクローン化された。AタイプのORFは1,014bp、BタイプのORFは978bpおよびCタイプのORFは1,035bpで、いずれのタイプも既知のMycobacterium種のものと相同性が高く、魚類のDNAワクチンとしての利用が可能と考えられた。インターロイキン-1遺伝子を接種すると細胞性免疫に重要なMHC-1遺伝子の発現の増強と、液性免疫に関与する免疫グロブリンIgD遺伝子の発現が増強されたことから、インターロイキン-1はアジュバントとして有効であると考えられた。
初期ハイデガー哲学の発展過程におけるキリスト教神学の位置づけについて

今年度は課程博士論文の執筆に専念した。初期マルティン・ハイデガー哲学における根本主題である「事実的な生」と、ハイデガーの出自であったキリスト教神学との関連について考察した。そのために、最初期ハイデガーが批判したヴィルヘルム・ディルタイの全集を購入し、活用した。また、ハイデガーが哲学における無神論的な態度を表明するひとつの契機となったと考えられる、教会史家フランツ・オーヴァーベックの著作集も購入し、博士論文の重要な材料として利用した。内容としては、『存在と時間』(1927年)期までのハイデガー哲学の形成過程を、とりわけ彼の出自でもあったキリスト教神学、ひいては「キリスト教的なもの」一般との関係を顧慮しつつ読み解く試みである。博士論文執筆に当たり、内外の先行研究を多数参照した。ハイデガー研究文献や、周辺テーマの研究文献を収集するためにも、科学研究費補助金を活用した。課程博士論文は、「事実的な生の解釈学と方法的無神論-初期ハイデガー哲学とキリスト教との関係をめぐって-」という標題にて提出し、博士号授与をすでに承認されている。博士論文執筆の過程では、科学研究費補助金にて購入した付箋等の文具を活用した。なお申請した旅費については、博士論文執筆に殆どの時間を費やしたため、及び、唯一研究発表を行った「北海道哲学会」が札幌市内で開催され、旅費の申請を要しなかったため、使用する機会を持たなかった。
パニック障害の病態解明と臨床応用

我々は、Wistar系ラットの中に不安の強いグループと弱いグループが存在することを見出し、識別をさらに鮮明にするために継代した。継代後、各グループの脳の海馬を摘出し、RNAを抽出しGene Tipを用いてラット25000遺伝子の発現を検討した。その結果、8遺伝子が候補としてあがった。これらの遺伝子の機能解析のため、不安候補遺伝子のアンチセンスやsiRNAを作成し、ラットの側脳室に投与し、その後、高架十時迷路・明暗箱・恐怖条件付けなどの「不安動物モデル」を用いて不安の程度を測定している。またこれらの遺伝子のSNPsを用いてパニック障害患者における画像関連研究も行っている。視覚刺激法としてビデオ画像を用いているが、この画像は我々が自ら作成した画像である。画像としては、「喜び」「悲しみ」「驚き」「怒り」「恐れ」の表情を作成したが、今回は「恐れ」を中心にしておこなっている。これらの画像は、MRI機器内に臥床している被験者が眼前の鏡を通して見るものである。また、これと平行して被験者にハミルトン不安尺度(HAS)、Panic Disorder Severity Scale、STAI ; STATE-TRAIT ANXIETY INVENTORYを行い不安状態の評価をおこなっている。パニック障害患者とコントロールとの不安状態の比較をおこなっている。すべての被験者に同意を得たうえで、上記の不安関連遺伝子の遺伝子多型を調べている。fMRIの中で特に不安と関連したビデオ画像と脳賦活部位との関連も調べている。肝細胞成長因子(HGF)とは肝実質細胞をはじめ、諸組織の細胞の増殖を行う。最近になって神経成長因子としての働きがあることがわかってきた。また脳虚血予防効果等が報告されている。以前、我々は「HGFをラットの側脳室に投与することで不安が抑制される」という報告をされた。ここで「HGFのアンチセンスを、ラットの脳に投与すると不安が惹起されるのではないか」という仮説のもと、実験を行った。高架十字迷路におけるOpen armでの滞在時間、Hard Dips回数において、アンチセンス群は、スクランブル群およびコントロール群に比べて、有意にFreezing回数が増加していた。これらのことから、HGFの作用を抑制することは、不安の惹起することが明らかとなった。また、セロトニン3Aレセプターはグレリン遺伝子多型とパニック障害の関連研究を行ったが、有意な関連を見いだすことは、できなかった。
ショウジョウバエの分子神経生物学に関する共同研究

1.視細胞の分化を調節するargos遺伝子解析代表者の谷村、東大の岡野、ジョンズホプキンス大学のモンテルの共同研究により同定されたargos遺伝子の機能を明らかにする研究を行った。argosはその機能欠損型の突然変異体では、複眼視細胞の数が増加し、規則的な複眼構造が乱れることが電顕による組織学的研究などからわかった。遺伝子クローニングによって、argosは細胞成長因子と一部相同性をもつ分泌性のタンパク質をコードしていることが明らかとなり、視細胞、神経系で発現していることがわかった。熱ショックタンパク質のプロモーターの下流にargos遺伝子をつないだベクターをP因子井形質転換法でハエのゲノムに導入して、argos遺伝子の過剰発現を誘導できる形質転換系統を確立した。突然変異体においてargos遺伝子の過剰発現を行ったところ、複眼の形態異常が回復した。したがって、クローニングされた遺伝子の異常によって複眼異常が生ずることが証明された。野生型において、複眼の細胞が発生分化する幼虫後期においてargos遺伝子の過剰発現をおこなったところ、視細胞、色素細胞、晶体細胞の減少が観察された。したがって、argos遺伝子は抑制性のシグナルを近隣の細胞に伝達し他の細胞の分化を制御していると考えられた。さらに、argos突然変異体では、視細胞の発生異常とともに視神経の走行が異常となることが明らかになった。この異常も、突然変異体においてargos遺伝子の過剰発現を行ったところ回復したことから、argos遺伝子は視神経の走行にも関与していると考えられる。argos遺伝子がこの過程にどのようなメカニズムで関わっているかを解明するために、細胞特異的な抗体をマーカーとしてを用いた免疫組織学的な研究を行ったところ、argos突然変異体では成虫原基において視神経が投射すべき領域でのグリア細胞の発生に異常があることがわかった。この事実から、発生過程における神経の走行にグリア細胞が関わっていることが明らかとなった。2.末梢神経細胞の分化に関わるmusashi遺伝子の解析ジョンズホプキンス大学の中村が中心となり、エンハンサートラップ法のスクリーニングから分離されたmusashi遺伝子の解析を行った。musashi遺伝子の突然変異体を分離したところ、突然変異体では、成虫の剛毛に異常が見られ、その一部では2本となり重複することがわかった。剛毛は、4つの細胞から形成されるが、蛹期の発生過程を抗体染色によって調べたところ、前駆細胞の分裂に異常があり、通常1個発生するソケット-鞘細胞が2個生じていることがわかった。musashiは、遺伝子のクローニングによって新規のRNA結合タンパク質をコードすることがわかった。musashi遺伝子は神経特異的に発現しており、RNA結合タンパク質が神経細胞の分化において細胞運命の選択に重要な役割を果たしていることが解明された。musashi遺伝子の標的遺伝子の同定が今後の課題である。3.グリア細胞の分化を制御するrepo遺伝子repo突然変異体は網膜電図法(ERG)で記録される視細胞の電位が逆転していることから分離された。ジョンズホプキンス大学のモンテル研と東大の岡野の共同研究により、repo遺伝子はホメオボックスタンパク質をコードしておりグリア細胞の終分化に関与していることを明らかにした。細胞内記録法で視細胞の電位変化を調べたところ正常な位相の電位が記録されたことから、ERGの電位の逆転は、視細胞と視神経との絶縁の異常にあると推定された。谷村はrepo突然変異体の概日リズムの異常の有無を調べたところ、一部の個体で周期の異常が見出された。このことは、グリア細胞の異常が概日リズム機構と関わっていることを示唆するが、今後さらなる解析が必要である。

2.末梢神経細胞の分化に関わるmusashi遺伝子の解析ジョンズホプキンス大学の中村が中心となり、エンハンサートラップ法のスクリーニングから分離されたmusashi遺伝子の解析を行った。musashi遺伝子の突然変異体を分離したところ、突然変異体では、成虫の剛毛に異常が見られ、その一部では2本となり重複することがわかった。剛毛は、4つの細胞から形成されるが、蛹期の発生過程を抗体染色によって調べたところ、前駆細胞の分裂に異常があり、通常1個発生するソケット-鞘細胞が2個生じていることがわかった。musashiは、遺伝子のクローニングによって新規のRNA結合タンパク質をコードすることがわかった。musashi遺伝子は神経特異的に発現しており、RNA結合タンパク質が神経細胞の分化において細胞運命の選択に重要な役割を果たしていることが解明された。musashi遺伝子の標的遺伝子の同定が今後の課題である。3.グリア細胞の分化を制御するrepo遺伝子repo突然変異体は網膜電図法(ERG)で記録される視細胞の電位が逆転していることから分離された。ジョンズホプキンス大学のモンテル研と東大の岡野の共同研究により、repo遺伝子はホメオボックスタンパク質をコードしておりグリア細胞の終分化に関与していることを明らかにした。細胞内記録法で視細胞の電位変化を調べたところ正常な位相の電位が記録されたことから、ERGの電位の逆転は、視細胞と視神経との絶縁の異常にあると推定された。谷村はrepo突然変異体の概日リズムの異常の有無を調べたところ、一部の個体で周期の異常が見出された。このことは、グリア細胞の異常が概日リズム機構と関わっていることを示唆するが、今後さらなる解析が必要である。エンハンサートラップ法によって分離されたrepo,musashi-spike,argos突然変異体についての共同研究を行った。網膜電位が逆転するrepo突然変異体についてサーカディアンリズムの異常があることが谷村らによって明らかにされた。モンテルらは、repo遺伝子のクローニングおよびその発現パターンに関する研究を行い、repoではグリア細胞の分化に異常があることが明らかになった。リズム異常の原因がrepo突然変異体のグリア細胞の異常によるかを検討するのが次の研究課題である。spike突然変異体は網膜電位に異常があり、羽化後数日後のハエでは網膜が変性し網膜電位がスパイク様となる。このような異常が他の感覚器にも起こっているかを調べるために、味覚、嗅覚の感覚器からの神経応答を電気生理学的に記録した。複眼視細胞の発生分化にかかわるargos遺伝子をクローニングし、その塩基配列の決定からこの遺伝子はEGFモチーフをもつ分泌性のタンパク質をコードすることを明らかにした。argos遺伝子の発現パターンおよび突然変異体の解析から、抑制性のシグナルとして視細胞の分化にかかわっていることを明らかにした。
アダプティブサイトプロテクションにおけるCGRPの関与とPGE_2,PGI_2の役割

粘膜傷害面積,胃内腔液のCGRPを測定1M NaClによるEtOH粘膜傷害の抑制はIDM又はCGRP拮抗薬(CGRP(8-37))にて減少した.1M NaCl投与後のEtOH投与でCGRPが遊離されるようになり,その遊離はIDM前投与で消失した.PGE_2潅流後にEtOHを投与しても内因性CGRPは遊離しないが傷害は抑制された.PGI_2灌流後のEtOH投与でCGRPが遊離し傷害面積は抑制され,その抑制はCGRP(8-37)で消失した.ワイルドタイプマウス,IPレセプターノックアウトマウス(IPKO),EP3レセプターノックアウトマウス(EP3KO)とも1M NaClにより内因性PGE_2,I_2を産生した.1M NaCl後のEtOHによりワイルドタイプ,EP3KOでは内因性CGRPが遊離され胃粘膜傷害が抑制された.しかしIPKOでは内因性CGRPが遊離されず胃粘膜傷害が抑制されなかった.胃粘膜基底部微小循環観察法を用いて1M NaCl粘膜投与の効果は,IDMでほぼ消失するがCGRP(8-37)では変化は起こらなかった.1M NaCl前投与で起こるEtOHによる細静脈の収縮の完全に抑制(即ちEtOH胃粘膜傷害の原因である鬱血の予防)は,IDM,CGRP(8-37)により消失した.微小血管に変化を与えない用量のPGE_2,I_2を微小循環に投与し,粘膜面にEtOHを投与すると,EtOHによる細静脈の収縮を完全に抑制.これに対してCGRP(8-37)を観察窓に投与すると,PGI_2前投与による変化は消失したが,PGE_2によるものは影響無かった.結論粘膜傷害面積,胃内腔液のCGRPを測定1M NaClによるEtOH粘膜傷害の抑制はIDM又はCGRP拮抗薬(CGRP(8-37))にて減少した.1M NaCl投与後のEtOH投与でCGRPが遊離されるようになり,その遊離はIDM前投与で消失した.PGE_2潅流後にEtOHを投与しても内因性CGRPは遊離しないが傷害は抑制された.PGI_2灌流後のEtOH投与でCGRPが遊離し傷害面積は抑制され,その抑制はCGRP(8-37)で消失した.ワイルドタイプマウス,IPレセプターノックアウトマウス(IPKO),EP3レセプターノックアウトマウス(EP3KO)とも1M NaClにより内因性PGE_2,I_2を産生した.1M NaCl後のEtOHによりワイルドタイプ,EP3KOでは内因性CGRPが遊離され胃粘膜傷害が抑制された.しかしIPKOでは内因性CGRPが遊離されず胃粘膜傷害が抑制されなかった.胃粘膜基底部微小循環観察法を用いて1M NaCl粘膜投与の効果は,IDMでほぼ消失するがCGRP(8-37)では変化は起こらなかった.1M NaCl前投与で起こるEtOHによる細静脈の収縮の完全に抑制(即ちEtOH胃粘膜傷害の原因である鬱血の予防)は,IDM,CGRP(8-37)により消失した.微小血管に変化を与えない用量のPGE_2,I_2を微小循環に投与し,粘膜面にEtOHを投与すると,EtOHによる細静脈の収縮を完全に抑制.これに対してCGRP(8-37)を観察窓に投与すると,PGI_2前投与による変化は消失したが,PGE_2によるものは影響無かった.結論1.粘膜傷害面積の測定2.胃内腔液のCGRPを測定1M NaCl粘膜投与単独,EtOH投与単独ではCGRPは遊離されなかったが,1M NaCl投与後のEtOH投与でCGRPが遊離されるようになり,その遊離はIDM前投与で消失した.3.胃粘膜基底部微小循環観察法を用いて1).1M NaCl粘膜投与の効果(細動脈:拡張,細静脈:軽度収縮)は,a.IDM(10mg/kg,i.v.)(PGsの効果を消失)により細静脈の収縮を完全に消失し,細動脈の拡張はほぼ消失した.b.CGRP(8-37)(1-10μM,観察窓投与)(CGRPの効果を消失)により変化は起こらなかった.2).1M NaCl粘膜投与後のEtOH投与の変化(EtOHによる細静脈の収縮を1M NaCl前投与は完全に抑制,即ちEtOH胃粘膜傷害の原因である鬱血の予防)は,a.IDMにより,1M NaCl前投与による完全抑制がかからなくなった.b.CGRP(8-37)により,1M NaCl前投与による完全抑制がかからなくなった.以上より1M NaCl投与で内因性PGsが産生され,その結果EtOH刺激により内因性CGRPが遊離される様になり,その内因性CGRPがEtOH胃粘膜傷害を抑制していると考えられた.アダプティブサイトプロテクションにおけるPGE2,PGI2の役割.粘膜傷害面積の測定,胃内腔液のCGRPの測定A.外因性PGの効果.a.PGE2灌流後にEtOHを投与しても内因性CGRPは遊離しないが傷害は抑制された.またその抑制はCGRP(8-37)を投与しても消失しなかった.

b.PGI2灌流後のEtOH投与でCGRPは遊離し,傷害面積は抑制され,その抑制はCGRP(8-37)投与で消失した。B.1M NaClによるEtOH粘膜傷害の抑制に対してIPレセプターノックアウトマウス(IPKO),EP3KOを用いて実験した.a.ワイルドタイプ,IPKO,EP3KOとも1M NaClにより内因性PGE2,I2を産生した.b.1M NaCl後のEtOHによりワイルドタイプ,EP3KOでは内因性CGRPが遊離され胃粘膜傷害が抑制された.しかしIPKOでは内因性CGRPが遊離されず胃粘膜傷害が抑制されなかった.胃粘膜基底部微小循環観察法を用いてa.PGE2,I2を微小循環に投与するとPGE2は細動脈:拡張,細静脈:軽度収縮,PGI2は細動脈:拡張,細静脈:変化なし.b.微小血管に変化を与えない用量のPGE2,I2を微小循環に投与し,粘膜面にEtOHを投与すると,EtOHによる細静脈の収縮を完全に抑制(即ちEtOH胃粘膜傷害の原因である鬱血の予防).c.b.の変化に対してCGRP(8-37)を観察窓に投与(CGRPの効果を消失)すると,PGI2前投与によるEtOHの細静脈の収縮完全抑制は消失したが,PGE2によるものは影響無かった.
哺乳類の柔軟な性決定機構の進化ー有袋類のオスはどのように遺伝的に決められるのかー

本研究では、有袋類のオスがどのように遺伝的に決められるのかについて明らかにすることを目的として、これまで有袋類でのオス決定遺伝子SRYの進化・機能、オス精巣で発現する遺伝子の網羅的同定等を行ってきた。本研究の成果から、有袋類(ワラビー、コアラ等)SRYの配列は真獣類(ヒト、マウス等)のものと異なるが、有袋類SRYの機能は真獣類のものと類似していることが示唆された。以上の結果成果から、有袋類の性決定遺伝子は、SRYである可能性が高いことが示唆された。本研究では、有袋類のオスがどのように遺伝的に決められるのかについて明らかにするために、これまで有袋類でのオス決定遺伝子SRYの分子進化・機能、オス精巣での網羅的な遺伝子発現様式を調べてきた。有袋類を用いた実験・解析により、すなわち哺乳類の性決定機構がいつ、どのように進化して、SRY遺伝子がどのようにオス決定能を獲得したのかについて議論できると考えている。性決定とは、未分化な生殖腺が精巣(オス)になるか、卵巣(メス)になるかを決める最も重要なプロセスのことである。哺乳類のなかでも初期に分岐した有袋類は、ヒトやマウスなどの系統(真獣類)とは異なる性決定、性分化機構をもつのかどうかについてこれまでの研究により議論されてきた。本研究では、まず哺乳類のオス決定に直接関与しているSRY遺伝子の進化的背景を調べるために、有袋類数種からSRY遺伝子を新たに同定し、真獣類のSRYとの配列比較を中心とした分子進化学的解析を行った。そして、有袋類のSRYの機能が真獣類のものと同じかどうか調べるために、SRYタンパク質の生化学的解析を行った。その結果、有袋類SRYの機能は、真獣類のものと類似していることが示唆された。さらに、ワラビーオス精巣の網羅的な発現解析により、精巣で発現する遺伝子を同定し、有袋類独自の性決定、性分化のしくみがあるかどうかについて現在検討している。以上の結果成果から、有袋類の性決定遺伝子は、SRYである可能性が非常に高いことが示唆された。本結果は、我々の予想とは異なるものであったが、今後は、さらに本結果を実験的に強く示すために、遺伝子改変ワラビーの作成を共同研究者とともに検討していきたいと考えている。これまでの研究成果の一部は、すでに研究論文・総説としてそれぞれ国際査読誌で発表しているが、さらに二報の論文を現在執筆中である。本研究では、有袋類のオスがどのように遺伝的に決められるのかについて明らかにすることを目的とする。哺乳類のなかでも初期に分岐した有袋類は、ヒトやマウスなどの系統(真獣類)とは異なる性決定機構をもつ可能性がこれまでの研究により示されている。有袋類を用いた実験・解析により、哺乳類の雄性決定遺伝子(SRY)はいつ、どのようにオス決定の機能を獲得し、進化してきたのか、有袋類独自のオス決定•分化のしくみは何かを明らかにする。そして、哺乳類の柔軟な性決定機構の生物学的意義を進化の視点から理解したい。具体的には、有袋類SRYの分子進化学的解析により、有袋類SRYが真獣類とは異なる機能分化を経て進化してきた可能性を検討する。データ解析により示された系統間で異なるSRYのアミノ酸置換の意義、有袋類SRYがオス決定能をもっているかどうかについて実験的に評価する。本研究で用いる有袋類は、オーストラリアとアメリカ大陸にのみ生息し、形態的・生理的に独自の進化を遂げた。特に、性分化においては、精巣のホルモンに依存せずにオスは陰嚢、メスは袋・乳腺を獲得する。そのため、本研究で対象としている有袋類のオス決定・分化は進化生物学・生殖生物学の分野においてとても興味深い。有袋類のオスが遺伝的に決められるしくみがわかると、有袋類独自の性決定機構を説明するだけではなく、哺乳類進化のなかで性決定機構がどのように変化してきたかについて説明する事ができる。また、本研究は遺伝子・生殖・進化と3つの分野をまたがる研究で、新しい学問分野の開拓につながる可能性があり、本研究を通して得られる成果は、「私たちの性の決まる仕組みがどのように発達してきたか」といった社会的にも関心の高い問題に回答を与えることができる。現在までに以下の4つの解析を行ってきた。それぞれの進捗状況について説明する。1有袋類SRY遺伝子の塩基配列同定:有袋類SRYの塩基配列は、データベースから入手できる種が限られているため、現有の有袋類DNAサンプルを用いて、新たにSRYの塩基配列を周辺領域を含めて同定した。2分子進化学的解析(有袋類と真獣類SRYの進化プロセス):有袋類・真獣類SRYのアミノ酸配列を整列・比較し、系統解析を行い、アミノ酸の置換速度や祖先配列等を推測した。その一部の研究成果をPLoSONE

誌に発表した(Katsura & Satta 2012)。また、1の解析から新たに得られた有袋類複数種のSRY遺伝子の配列情報を用いて、有袋類特異的なアミノ酸置換を同定した。これらの結果から、有袋類SRYの機能が真獣類のものと異なる可能性が強く示唆された。以上の研究成果を論文としてまとめる準備を行っている。3生化学的機能解析(有袋類SRYタンパク質の機能予測・オス決定能の評価):有袋類SRYが真獣類と同様の生化学的特徴をもっているかどうかを生化学的解析(ビアコア、レポーターアッセイ)により調べている。オーストラリアの共同研究者と有袋類SRYの生化学的解析に関する実験計画を話合い、現在、実験に必要なコンストラクトの作成を行っている。また、ビアコアの使用については、総合研究大学院大学で機械の立ち上げを行い、試運転を数回行い、本実験を開始している。4発現解析(有袋類の精巣発現遺伝子の網羅的同定):次世代シークエンサーを用いたRNA-Seq法により、有袋類2種の精巣・脳に発現する遺伝子を網羅的に同定する。現在までにmRNAを精製し、精巣・脳に発現するmRNAの配列を同定した。先行研究のデータとの比較により、222遺伝子が有袋類に特異的な精巣発現遺伝子であることがわかった。今後は、それぞれの研究項目から得られた成果を学会で発表し、論文としてまとめる予定である。研究目的の3にあげている生化学的機能解析を本年度達成することを目指す。また、本研究の成果から、有袋類のSRYが真獣類のものと生化学的に機能が異なることが示されたら、有袋類(ワラビー)組織を用いた発現抑制解析により有袋類SRYの機能を調べる事を計画している。ヒトやマウスでは、SRYの発現を低下させると、オスからメスへの性転換がおきることが知られている。有袋類(ワラビー)でSRYの発現をRNA干渉法により低下させたときに、性転換がおきるかどうかを調べる。もし、SRYが性転換を誘導しない、つまり有袋類のSRYがオス決定能をもっていないならば、有袋類は別の雄性決定遺伝子をもつ可能性が高いその場合、有袋類の新たな性決定遺伝子を探索したいと考えている。その他の候補遺伝子の機能を同様の方法により調べ、有袋類の雄性決定遺伝子の同定を試みる。次年度は、研究項目3の生化学的機能解析について集中して行う予定である。そのため、オーストラリアの共同研究研究者の研究室に長期滞在し、実験を遂行する必要があるので、科研費の一部を旅費として利用することを計画している。また、本研究の成果を学会や雑誌で発表するために必要な経費として科研費を利用する事も計画している。