hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
蛍光ビーズによる胃癌センチネルリンパ節同定の有用性に関する検討

前年度センチネルリンパ節同定のための新しいトレーサーとして、当院倫理委員会の承認を経て蛍光ビーズ使用に同意の得られた胃癌症例に対し蛍光ビーズを用いた胃癌センチネルリンパ節(S:N)同定を行いその有効性について報告した。今回、症例数を加え報告する。手術前日、上部消化管内視鏡下で内視鏡病変粘膜下4箇所に蛍光ビーズをそれぞれ1mlずつ注入し手術時紫外線照射し蛍光発光したリンパ節をSNとした。また、漿膜側からのICG注入による色素法でのSN同定も同時に試みた。SN検索後は標準郭清を行い摘出組織に対しても紫外線照射を行いSNの検索を行った。蛍光ビーズの使用に同意の得られた胃癌31例中蛍光ビーズSNが同定されたのは23例、同定率74.1%であった。早期胃癌25例に限ると蛍光ビーズSNは19例で同定され同定率76%であった。同定された平均SN個数は2.3個であった。早期胃癌症例における蛍光ビーズSNの正診率は94.7%(18/19)であった。術中併用したICGと蛍光ビーズを合わせた同定率は92%であった。蛍光ビーズ単独では同定率が低いことからICGとの併用が必要と考えられた。しかし、蛍光ビーズ単独でもリンパ節転移を的確に捉えているかという点では正診率が94.7%と良好であった。また、術野に紫外線照射して蛍光ビーズの発光を試みたが、脂肪組織深部にあるリンパ節は不明瞭であった。加えて脂肪組織、神経など自己蛍光発光を示す組織がありリンパ管との判別を惑わすことがあった。全ての症例で術中に蛍光ビーズのSNを同定することは困難で、切除摘出組織への紫外線照射でSNを同定する事は可能であった。今後蛍光ビーズを臨床応用するには術中紫外線照射によるSN同定を可能にする機器の開発が必要と思われた。また、摘出された全リンパ節に対し抗サイトケラチン(AE1/AE3)を用い免疫組織染色を行い微小転移の検索を行った。25例中1例(4%)に微小転移を認めた。その1例の微小転移の位置はSNの存在するstation外であった。しかし、この症例は初期症例であった為SN同定手技が安定していなかった事も考慮すべきと思われた。粒子径が癌細胞に近い蛍光ビーズを手術前日に使用する事で癌細胞に類似したリンパ管への流出動態を反映する事を期待し、蛍光ビーズ使用に同意の得られた胃癌症例に対し胃癌センチネルリンパ節(SN)同定を行いその有効性について検討した。手術前日、病変粘膜下4箇所に蛍光ビーズを1mlずつ注入、手術時紫外線照射し蛍光発光したリンパ節を蛍光ビーズSNとした。同時に術中、漿膜側からICGを注入しICG・SNの同定も試みた。蛍光ビーズに限定したSN同定率は74.1%であった。早期胃癌25例に限ると蛍光ビーズSN同定率は76%、同定された平均SN個数は2.3個、正診率は94.7%であった。早期癌症例で術中併用したICGと蛍光ビーズを合わせたSN同定率は92%、平均SN個数は3.1個、正診率は95.4%であった。早期癌症例で蛍光ビーズSNの分布を原発巣の部位別にみたところ、上部(U)は1例のみで1群リンパ節にのみ認めた。中部(M)14例では1群リンパ節に76%,2群に24%、下部(L)5例では1群に88%、2群に12%の率でSNを認めた。1例で偽陰性を認め、ICGを併用してもSN以外に転移を認めた症例であった。この転移を認めたリンパ節は、SNの存在するリンパ節領域(station)外にあった。早期癌症例での転移陽性例は、この偽陰性症例1例のみであり、症例数も少ない事から正診率の評価は困難と思われ、多数例での検討が必要であると同時に微小転移という点からの検討も必要と考えられた。そこで、摘出された全リンパ節に対し抗サイトケラチン(AE1/AE3)を用い免疫組織染色を行い微小転移の検索を行った。
地方独立制移行期マダガスカルにおける資源をめぐる戦略と不平等の比較研究

2002年から2006年に渡り、研究分担者それぞれが、マダガスカルを中心に、<マダガスカル人>と深い歴史的あるいは政治-経済的な繋がりを持つフランス、レユニオン、モーリシャス、マレーシアの各地域において実地調査を行い、資料を独自に収集した。2002年にマダガスカルにおいては、地方独立制を導入した大統領を選挙で破り、新大統領が就任した。しかしながら、新大統領も地方独立制政策を継承したのみならず、顕著な新自由主義的な経済政策を採用したため、マダガスカルに生活する人びとの間における貧富の格差はこの調査期間中にさらに増大し、生活のための資源の獲得をめぐる競争はますます激化する様相を呈している。このような生活をめぐる状況の中で、私たちが調査を行ってきたマダガスカルの人びとが資源の獲得と配分について共通に生み出しつつある生活戦略の特徴は、<アドホック>と<小規模性>の二語に集約されるであろう。経済学のようなマクロな視点から捉えるならば、このような単語には効率化や計画性の対極に位置されるべき否定的な属性だけが付与されるかもしれない。けれども、<生活者>としての個体に視点を据えるならば、経済学的な<資本>を持たない人びとにとって、自分の身近にあるありとあらゆる<物>を生存資源とし、さらには売買される<商品>と化すことの可能性を常に保持しておくことこそが、あたかも自己の手の届かないところから突然降ってくるような米をはじめとする物価の急上昇および法律と言う名で課せられるさまざまな拘束あるいは剥奪に対し、自己の生存を保障してくれる唯一と言ってよい生活戦略に他ならない。現在の政治・経済状況の中では、国家公務員でさえこのような生活戦略と無縁ではない。一つの生産活動や生活形態に依存しないこと、何時でも他の生産活動や生活形態に従事したり移行したりすること、余剰生産を目指すわけではないが余剰のある時はその物をすばやく<商品>として提供すること、このような生活様式は、農村であれ都市であれ現代マダガスカルの大半の人びとの中に、深くしみこんだものである。それゆえ現代マダガスカルの人びとの間では、めまぐるしく<資源>となる物が新しく登場しあるいは移り変わっている。本研究は、このような現象に対し一つの道筋をつけたと言えるが、人間の想像力が生み出す多彩な生活戦略の一端に触れたにすぎず、さらなる資料の蓄積と分析の深化が必要である。マダガスカルでは、2001年12月に行われた大統領選挙の結果をめぐり、それまでの現職と対立候補の二人が、2002年1月よりマダガスカル各地において、政治集会、支持者の襲撃首都圏の経済的封鎖、軍隊同士の銃撃戦などの対立、抗争を行い、社会的不安定状態が2002年7月まで続いた。この抗争は現職の海外脱出によって終焉しその後はゆるやかに政治的、経済的回復をたどったものの、8月の大学休業時期にはまだ完全に状況が沈静化したわけではなかったため、森山・杉本・飯田はマダガスカル現地における調査を断念し、この時期、フランス国立公文書館における文献調査、パリにおける在フランスマダガスカル系住民の生活調査、フランス海外県レユニオンにおけるマダガスカル系住民およびマダガスカル国籍保持者の儀礼および職業についての調査、モーリシャスにおける、インドーパキスタン系住民のインド洋におけるネットワークの調査を行った。

事態が完全に沈静化した、11月から12月にかけて内堀が焼き畑耕作民の生活・生業調査、また2003年2月から3月に深澤がマダガスカルで稲作と政治状況の調査、同期間菊澤はフランスとマダガスカルにおける言語使用実態の調査を行った。以上のように2002年はマダガスカルの政治的状況が科研費を申請した時点と比べ大きく変わったため、現在はその変化を政治レヴェルおよび人びとの生活レヴェルの双方においてできうる限り微視的に把握することにつとめている。しかしながら、この政治状況の変化は、マダガスカルの人びとの間における資源の獲得競争を緩和するどころか、政争によるマダガスカル国家経済全体の疲弊と落ち込みを引き起こし、資源的配分の不平等は今後ますます切迫し先鋭化する様相を見せている、それゆえ、表記の研究課題についてはいささかの変更も必要としないばかりか、その重要性が一層高まっているものと考え、自負している。2003年度は、研究代表者の深澤が、2003年9月から12月および2004年3月に、マダガスカルのマジュンガ州の都市部において金細工師の技術体系、同じくマジュンガ州の農村部においてツィミヘティ族の稲作技術の変化とそれに対応した耕作組織の実地調査を行い、研究課題にかかわる資料を収集した。また、深澤は、2004年3月16日に、本研究のマダガスカル側共同研究機関である国立アンタナナリグ大学考古-芸術博物館・文明研究所において、ツィミヘティ族調査報告:祖先による憑依について」の口頭報告を大学教員・研究員および学生の前で行った。内堀は、2004年1月にマダガスカルのフィアナランツア州の農村部において、焼き畑耕作民であるザフィマニリ族の人びとの生業の変化を減少しつつある森林との関係において実地調査を行い、研究課題にかかわる資料を収集した。この成果は、マダガスカル研究懇談会における口頭報告および同会のニュースレターの記事として、公開された。菊澤は、2003年9月から11月にかけて、マダガスカルのタマタヴ州の農村部において、焼き畑耕作民であると共に近年急速に水田稲作が普及しつつあるベツィミサラカ族の言語資料および口頭伝承資料を、実地調査によって収集した。この調査成果は、Journal of Asian and African Studiesに2004年度中に発表される予定である。森山は、2003年10月にフランスのパリを訪れ、パリ大学・国立東洋語学院・人類博物館などにおいてマダガスカル東南部に居住するアンタイサカ族などについての文献資料を収集し、アラビア文字によって表記されたマダガスカル語文書を保有するこれらの民族の間における資源としての知織の配分と伝承を考察するための資料を補足した。また、パリに在住するマダガスカル人についての実地調査を行い、国籍・学歴・親族関係がどのように資源として活用されているかについての資料を収集した。杉本は、2003年12月から2004年1月にかけて、モーリシャスおよびマダガスカルのアンタナナリヴ州において、布の販売とファッション、および養蚕による絹織物の技術の伝承と開発についての実地調査を行い資料を収集した。研究成果の一部は、『京都文教大学人間学部研究報告』および『国立民族学博物館調査報告』において、既に公開されている。
核内レセプターを介した活性化膵星細胞の抑制と膵線維化治療への応用に関する研究

Sparmannら(Gastroenterology 112:1664,1997)の方法に従い、雌性ラット(150-180g前後)20匹に対しDibutyltin Dichlorideを12mg/kg(尾静脈より静注)投与群10匹(P群)と、コントロール群(生理食塩水投与)10匹(C群)に分けて飼育し七、膵線維化モデルを作成し、2週間後に下大静脈、門脈から滅菌的に採血するとともに、膵臓を摘出し下記の検討を行った。1.下大静脈より採取した血液から血漿を分離し、血漿アミラーゼ、リパーゼを測定したところ、P群ではC群に比べ血漿アミラーゼは増加傾向にあったが有意差は認めなかった。また血漿リパーゼは両群間で差を認めなかった。2.滅菌的に門脈血を採血し、血漿エンドトキシン、TNFαを測定した。血漿エンドトキシン値はばらつきが多く、また測定感度以下のラットもあり、両群間で差を認めなかった。血漿TNFαはP群ではC群に比べ有意に高値を示した。3.膵臓を摘出し組織学的に検討した。P群ではC群に比べ膵臓内の線維化が顕著であった。またP群では膵星細胞の活性化のマーカーであるα平滑筋アクチンの発現が増加していた。4.両群の膵臓を摘出し、膵組織をsucroseにてhomogenate後、その上清を用い過酸化脂質を測定したところ、P群ではC群に比べ有意に増加していた。また膵hydroxypmline量、膵内レチノイド含有量は現在検討中である。
高機能ポリオレフィンの精密合成を可能とする高性能遷移金属錯体触媒の設計と合成

本課題はポストメタロセン型のバナジウム錯体触媒の構造や電子・立体的性質の特徴を生かして、従来にない新しい高機能ポリマーを創製することを主目的としている。また、新規高性能触媒の候補として、(触媒性能に関する報告例のない)キレート4座配位子を有するチタン錯体に注目し、オレフィン重合触媒としての可能性を追求している。平成17年度の主な成果は以下の通りである。バナジウム錯体、VCl_2(N-2,6-Me_2C_6H_3)(OAr)(Ar=2,6-Me_2C_6H_3など)、によるエチレンと各種オレフィンとの共重合を検討し、同錯体触媒がエチレンと環状オレフィンとの共重合に極めて高い触媒活性を示し、超高分子量ポリマーを与えることを見出した。エチレン重合や同共重合における触媒活性やオレフィンの相対反応性、生成ポリマーの分子量は、使用するアリロキソ配位子よりもむしろ使用する助触媒(有機Al化合物)や溶媒の影響を強く受け、さらに有効な助触媒、溶媒が反応により異なることも明らかになった。これは触媒活性(カチオン)種と助触媒(アニオン種)との相互作用に起因すると考えた。特にジクロロメタン溶媒中でEtAlCl_2助触媒を用いるエチレン重合では、従来の遷移金属触媒による重合で最も高いレベルの触媒活性を示した。キレートアリロキソ配位チタン錯体触媒によるオレフィン重合のための触媒設計に関する知見を得ることを目的に、シクロペンタジエニル-アリロキソチタン錯体触媒によるエチレンと環状オレフィン(ノルボルネンやシクロペンテン)との共重合を検討した。特定の配位子の組み合わせによるチタン錯体触媒を用いると、従来の触媒技術では進行しなかった、エチレンとシクロヘキセンとの共重合がはじめて進行する事実を見出した。本課題は、ポストメタロセン型のバナジウム錯体触媒の構造や電子・立体的性質の特徴を生かして、従来にはない新しい高機能ポリマーを創製することを主目的としている。また、新規高性能錯体触媒の候補として、(触媒性能に関する報告例のない)キレート4座配位子を有するチタン錯体に注目し、オレフィン重合触媒としての可能性を追求している。平成16年度の主な成果は以下の通りである。バナジウム錯体、VCl_2(N-2,6-Me_2C_6H_3)(OAr)(Ar=2,6-Me_2C_6H_3など)、によるエチレンと各種オレフィンとの共重合を検討し、同錯体触媒がエチレンと環状オレフィンとの共重合に極めて高い触媒活性を示し、超高分子量ポリマーを与えることを見出した(論文投稿予定)。触媒活性やオレフィンの相対反応性、生成ポリマーの分子量は使用する助触媒(有機Al化合物)の影響を強く受け、これは触媒活性(カチオン)種と助触媒(アニオン種)との相互作用に起因することを明らかにした。また、芳香族ビニルモノマーの重合は進行せず、エチレンとの共重合でも直鎖状ポリエチレンを与えた。ノルボルネンとの共重合では、モノマーの相対反応性や生成ポリマーのミクロ構造が使用する配位子に大きく依存した。また、シクロペンテン(CPE)との共重合も進行し、高選択的にCPEが1,2-挿入した均一組成の共重合体を与えた。従来技術では達成できなかったシクロヘキセンとの共重合も進行するようになった。現在、新しい配位子の合成と単離及び触媒性能評価を検討している。
気動上皮に発現するAQP3水4チャンネルのプロモーター領域の解析

ヒト胎盤由来の遺伝子ライブラリーよりスクリーニングを行い転写シス領域をふくむ遺伝子クローンを単離した.プローブとしては既に翻訳開始点より上流に300bpの遺伝子断片を用い、転写開始点より約2.8kbの遺伝子断片を単離した.この遺伝子断片をシークエンス用ベクターにサブクローニングした後、exonucleaselllを用いてdeletion colonyを作製し塩基配列を決定し応答配列の有無について検討したが、GRE(gicocortcoid response element)は存在を確認できなかった.転写シス領域を含む遺伝子断片を翻訳開始点より上流のsiteを固定した上で種々の長さに断片した後、シルフェラーゼアッセイ用レポーターベクターにサブクローニングし、細胞株をsab-confluentな状態まで培養した後、エレクトロポレーション法により用意したプラスミドをトランスフェクトし、転写活性をルシフェラーゼ活性を指標にして測定した.転写活性は-0.5kbで最大の活性値(pGL2-Controlの20%程度)をしめした後-2.8kbまでプラトーとなりまたAQP3水チャンネルを発現する細胞株(A549 cells)とこれを発現しない細胞株(NIH3T3 cells)において差異を認めず、この2.8kbの領域は非特異的なプロモーターを含むと考えられた.A549cells(ヒト気動上皮細胞株)にこのAQP3水チャンネルのプロモーターをトランスフェクトした後、後半の24時間dexamethasone(100nM)で刺激しルシフェラーゼ活性について検討したところ、転写シス領域にGREを含まないにもかかわらず、ルシフェラーゼ活性はdexamethasoneにより約1.5倍に上昇することが示された.このことは、GRE以外の機序によるステロイドホルモンのAQP3水チャンネルの誘導の存在を示唆しており興味深い知見と考えられる.ヒト胎盤由来の遺伝子ライブラリーよりスクリーニングを行い転写シス領域をふくむ遺伝子クローンを単離した.プローブとしては既に翻訳開始点より上流に300bpの遺伝子断片を用い、転写開始点より約2.8kbの遺伝子断片を単離した.この遺伝子断片をシークエンス用ベクターにサブクローニングした後、exonucleaselllを用いてdeletion colonyを作製し塩基配列を決定し応答配列の有無について検討したが、GRE(gicocortcoid response element)は存在を確認できなかった.転写シス領域を含む遺伝子断片を翻訳開始点より上流のsiteを固定した上で種々の長さに断片した後、シルフェラーゼアッセイ用レポーターベクターにサブクローニングし、細胞株をsab-confluentな状態まで培養した後、エレクトロポレーション法により用意したプラスミドをトランスフェクトし、転写活性をルシフェラーゼ活性を指標にして測定した.転写活性は-0.5kbで最大の活性値(pGL2-Controlの20%程度)をしめした後-2.8kbまでプラトーとなりまたAQP3水チャンネルを発現する細胞株(A549 cells)とこれを発現しない細胞株(NIH3T3 cells)において差異を認めず、この2.8kbの領域は非特異的なプロモーターを含むと考えられた.A549cells(ヒト気動上皮細胞株)にこのAQP3水チャンネルのプロモーターをトランスフェクトした後、後半の24時間dexamethasone(100nM)で刺激しルシフェラーゼ活性について検討したところ、転写シス領域にGREを含まないにもかかわらず、ルシフェラーゼ活性はdexamethasoneにより約1.5倍に上昇することが示された.このことは、GRE以外の機序によるステロイドホルモンのAQP3水チャンネルの誘導の存在を示唆しており興味深い知見と考えられる.
多次元データ解析の新しい枠組み：構造推定と判別解析

平成30年度は,最もシンプルな判別法の一つである対角線形判別解析(diagonal linear discriminate analysis; DLDA)について前年度までの検討(事前分布に逆ガンマ分布を用いた分散安定化法等)を継続する一方で、生存時間解析への拡張について検討を行った.併せて,予測精度改善の試みとして,L1ノルムを用いた正則化法(特に,線形回帰の設定におけるleast angle regression (Efron et al., 2004)のstage-wise変数選択の切り口)の枠組みで縮小推定量を用いた拡張を試みた.また,二群判別における不等分散を考慮したセミパラメトリック法についても検討した.一方で,本研究の方法論の礎である階層混合モデリングとその推定法の評価の一環として,ゲノムワイド関連研究の一塩基多型データ解析を想定した大規模なシミュレーション実験を行い,モデル推定が概ね安定していることを確認した.前年度に開発した入れ子型混合モデルに基づくがんの異質性解析については,米国の研究者との共同研究として多発性骨髄腫の解析を実施した.これは,健常人,二種類の前がん患者,多発性骨髄腫患者間で網羅的遺伝子発現データを比較することでがん化メカニズムの異質性の解明を目的とする.健常人と多発性骨髄腫の比較については,複数個のがん関連遺伝子群の同定,及び,これに基づくがん患者のクラスタリングを行った.その一方で、健常人、二つの前がん患者,多発性骨髄腫という疾患進行(順序性)を想定したモデルについても検討を行った.平成28年度は、本研究の基礎となる階層混合モデルと経験ベイズ推定の評価を中心に行った。マイクロアレー遺伝子発現データ(正規的変量)と二つのクラスをもつ表現型変数の関連解析において、クラス間の平均、クラス内の分散を階層モデリングの対象として両者の縮小推定を行う方法を開発した。併せて、統計的有意性の高い一部のマーカーセットを用いた対角線形判別解析(diagonal linear discriminant analysis)を縮小推定量に基づいて構成することで判別式の安定化を試みた。別のアイデアとして、縮小推定量に基づく線形変換を学習データに施すことで、マーカー選択のバイアスを補正した人工データを作製し、これを用いて(テストデータを用いることなしに)判別精度を評価する方法を検討した。シミュレーション実験の結果、判別精度の偏りのない推定のためには、クラス内分散の縮小推定量の使用が有効であることがわかった(特に小標本のもとで)。がん患者間に見られる遺伝的異質性を考慮した遺伝子発現解析に関しては、遺伝的異質性を反映した入れ子型の正規混合モデリングに基づくパラメトリックな方法を開発し、基本性能の評価を比較的単純なデータ構造を想定したシミュレーション実験により行った。別の方法として、健常人集団の遺伝子発現量の分布をリファレンスとしたときの分位点を遺伝子別に求め、全遺伝子を通しての分位点の分布と一様分布の乖離をみることでがんの判別を行うノンパラメトリックな方法を開発した。平成28年度は当初計画した研究課題のほぼすべてについて基礎的な検討を行うことができ、おおむね順調に進展している。萌芽研究としての本研究の難しさを改めて認識したが、一方で解決が可能と思われる個別の課題を見出すことができた。前年度に引き続き,最もシンプルな判別法の一つである対角線形判別解析について検討を行った.形質クラス内分散の縮小推定量の良さが敏感に性能に影響したことから,分散の縮小推定量の改善を図った.逆ガンマ分布を事前分布に用いた方法を中心に検討し,小サンプルのもとで一定の改善を確認した.ノンパラメトリックな事前分布も検討したが,計算負荷が大きくなったことからごく限られた条件下でのみしか性能を確認できなかった.一方,判別精度改善の試みとして,より複雑な判別式である分散共分散行列の正則化を伴う判別解析(Guo Y et al., 2007),L1ノルムを用いた正則化法(特に,線形回帰の設定におけるleast angle regression (Efron et al., 2004)のstage-wise変数選択の切り口)についても縮小推定量を用いた拡張を試みたが,後者については実装に至っていない.推定した入れ子型混合モデルに基づいて,がんと健常人の判別解析法の開発を行った.新たなサンプルの発現量データが与えられたとき,がん関連遺伝子の各コンポーネントに対してそのサンプルががんである事後確率を計算した.このとき,全コンポーネントに関して様々な組み合わせの確率が考えられるが,実在しない組み合わせも多く存在すると考えられるため,各コンポーネントの併合の方法をいくつか検討した.数値実験や実データ(白血病,大腸がん,膵がんの診断研究のデータ)への適用により,従来の判別法(Fisherの線形判別分析,サポートベクターマシンなど)との性能比較を行った.なお,選抜した遺伝子セットの偽陽性の評価については,並べ替え法などを用いた簡易的な方法しか存在しないことから,入れ子型混合モデルに基づく偽陽性率の判定基準とその推定法について検討した.H29年度は前年度の課題を引き続き検討し、数値実験や実データによる手法の評価を広範囲に行うことができ、本研究によって何が達成可能で、何が達成困難か、その見通しをほぼ立てることができたと考えている。具体的には、線形判別解析での階層モデルに基づく予測精度の評価体系の開発、疾患異質性の検出・判別解析については今後さらに検討を進めることで一定の成果を見込んでいる。以上より、おおむね順調に進展していると判断する。

平成30年度は,最もシンプルな判別法の一つである対角線形判別解析(diagonal linear discriminate analysis; DLDA)について前年度までの検討(事前分布に逆ガンマ分布を用いた分散安定化法等)を継続する一方で、生存時間解析への拡張について検討を行った.併せて,予測精度改善の試みとして,L1ノルムを用いた正則化法(特に,線形回帰の設定におけるleast angle regression (Efron et al., 2004)のstage-wise変数選択の切り口)の枠組みで縮小推定量を用いた拡張を試みた.また,二群判別における不等分散を考慮したセミパラメトリック法についても検討した.一方で,本研究の方法論の礎である階層混合モデリングとその推定法の評価の一環として,ゲノムワイド関連研究の一塩基多型データ解析を想定した大規模なシミュレーション実験を行い,モデル推定が概ね安定していることを確認した.前年度に開発した入れ子型混合モデルに基づくがんの異質性解析については,米国の研究者との共同研究として多発性骨髄腫の解析を実施した.これは,健常人,二種類の前がん患者,多発性骨髄腫患者間で網羅的遺伝子発現データを比較することでがん化メカニズムの異質性の解明を目的とする.健常人と多発性骨髄腫の比較については,複数個のがん関連遺伝子群の同定,及び,これに基づくがん患者のクラスタリングを行った.その一方で、健常人、二つの前がん患者,多発性骨髄腫という疾患進行(順序性)を想定したモデルについても検討を行った.縮小推定量を用いた判別解析の安定化については、単純な対角線形判別解析のみならず、lassoやAdaBoostなどのstage-wise回帰への応用が考えられる。cross-validationなどの標本再抽出法を用いた従来の判別精度評価とは異なるアプローチとして、階層モデリングと縮小推定量に基づく判別解析の可能性を更に追求したい。一方、縮小推定量に基づく学習データの変換法は、H28年度の検討によって、少なくとも対角線形判別解析において有効である可能性が示唆された。表現型クラス内分散の縮小推定の改良等を図ることで更なる性能向上をめざしたい。がんの遺伝的異質性の解析に関しては、がんの判別解析への応用を視野に入れて、平成28年度に開発した正規混合モデルを用いたパラメトリック解析、及び、ノンパラメトリック法の基本性能をシミュレーション実験や実データへの適用を通して評価したい。今年度に続き、線形判別解析における階層モデルを用いた学習データの変換に基づく予測精度の評価体系の構築を進める。併せて、がんの第二相臨床試験でゲノムデータを用いた薬剤奏効判別などを想定し、標準的なクロスバリデーションに基づく判別精度推定との比較を試みる。L1ノルムを用いた正則化法への応用とその実装にも引き続き取り組む。疾患の異質性解析については、パラメトリックな入れ子型混合モデル解析にしぼり、今年度に引き続き、疾患異質性の構造を有さない従来の判別解析法との比較を、数値実験、実データ解析の両面で行う。その際、海外の研究協力者から提供される予定である多発性骨髄腫の病型と遺伝子発現データの関連解析のデータを新たに加える。一方、疾患異質性を規定するマーカー検出における偽陽性度の推定、及び、多重検定の方法を新たに開発し、数値実験、実データ解析の両面で性能を評価する。
磁化率周波数スペクトル解析法の開発と応用

磁性ナノ粒子の動的磁化過程を明らかにするための機器開発と基礎実験を行った。その結果、ヒステリシスに相当するM-H曲線が得られ、従来の振動磁力計による方法よりもはるかに短時間で自然試料の飽和磁化や保磁力を測定することが可能となった。これら一連の研究成果をもとに、中国黄土層を対象に磁化率周波数スペクトル研究をすすめ、最終氷期以降の全球気候変動の解明に役立つ高分解能の気候変動指標を提案した磁性ナノ粒子の交流磁化率周波数依存性に関する理論的考察と実験を継続するとともに、時間領域での動的磁化過程を明らかにするための機器開発と基礎実験を行った。その結果、パルス磁場による短時間(10ms)の磁化過程と同時に、磁場遮断直後の磁気緩和を計測することに成功した。このパルス磁場中の測定によって、ヒステリシスに相当するM-H曲線が得られ、従来の振動磁力計による方法よりもはるかに短時間で自然試料の飽和磁化や保磁力を測定することが可能となった。一方、付随する磁気緩和測定から求められる緩和時間は、広帯域交流磁化率測定から推定される特徴的周波数に対応することが分かった。これらの結果は、一部の火山岩の10kHz帯にみられる磁化率のピークが、多磁区粒子の磁壁移動に起因する磁気共鳴現象であることを強く示唆する。これら基礎研究の一方、中国黄土層を対象に磁化率周波数スペクトル研究をすすめ、最終氷期以降の全球気候変動の解明に役立つ高分解能の気候変動指標を提案した。この結果を論文としてまとめ、国際誌に投稿中である。これら一連の研究成果をもとに、中国黄土層を対象に磁化率周波数スペクトル研究をすすめ、最終氷期以降の全球気候変動の解明に役立つ高分解能の気候変動指標を提案した本研究の基礎となる磁性ナノ粒子の交流磁化周波数依存性に関する理論的考察と基礎実験を行った。その結果、複素磁化率の実数成分を100 Hz500 kHzの広帯域で測定することにより、磁性ナノ粒子のサイズ分布を推定できることがわかった。この方法は、特に中国黄土層など、ナノ粒子を比較的多量に含む試料において有効であり、その周波数スペクトルから導かれるパラメータが高分解能の気候変動指標となる可能性が高いことが判明した。一方、火山岩を対象とした同様の研究から、一部の試料に磁気共鳴現象と思われるスペクトル異常が存在することがわかった。この現象は、これまで知られていない磁気特性で、一般的な組成の陸上火山岩に普遍的に存在する可能性が高い。低温測定結果と総合的に検討した結果、多磁区粒子の磁壁振動に起因する熱磁気緩和現象と密接に関連した、新たな磁気共鳴現象と推定される。これら一連の実験の基礎となる磁化率測定機器は、ロックインアンプ以外はすべて自作し、試料の磁化率特性に応じた最適の検出コイル系を用いることによって、感度の向上を図った。これまでの結果から、100 kHz以上になるとS/N比が悪化する傾向があり、これは使用するロックイン検出器の限界でもある。PLL回路を利用した共鳴発振周波数型のコイル検出系を検討する必要がある。なお、これらの結果の一部は、以下の論文に印刷公表した。本研究の目的は、超常磁性(SP)ナノ粒子の交流磁化率周波数依存性に関する理論的考察、機器開発、基礎実験である.その結果、100Hz-10kHzの周波数帯での交流複素磁化率(k', k")を測定することによって、超常磁性(SP)粒子のサイズ分布を推定できることがわかった.さらに、実数成分k'のみを利用することによって、10kHz帯までのスペクトルを計測する技術と解析アルゴリズムを開発した.この方法を一部の火山岩に適用した結果、10kHz帯に顕著な磁化率のピークが見いだされ、これが多磁区粒子の磁壁移動に起因する新しい磁気共鳴現象を示す可能性のあることがわかった.同様の方法を、典型的な気候変動研究試料の中国黄土試料に適用したところ、従来の方法を上回る高精度の環境変化を復元することができた.これらの結果をもとに、パルス磁場を利用した時間領域の磁気緩和測定法を発案するに至り、その試作器を製作した.現段階では十分な感度を得られていないが、比較的強磁化の火山岩試料を対象として、M-H曲線や磁化緩和過程を測定することに成功した.これら一連の結果と機器試作経験は、時間領域測定データの離散フーリエ変換による周波数スペクトル構築という新たな研究方法の発案に至った.岩石磁気学理論的研究と基礎実験は当初の計画以上に進展した。特に、パルス磁場を利用した動的磁化測定方法の開発は、これまでの岩石磁気学的方法では得られなかった新しい磁気パラメーターの提案であり、今後の展開が大いに期待できる。これらの結果は、国際学会(AOGS2014)で講演発表するとともに国際誌に投稿予定である。中国黄土層を対象とした応用研究の成果も国際学会(AGU2013)で発表するとともに、論文としてまとめることができた。今後の展開へ向けた基礎理論の構築と実証実験をほぼ計画どおりに完了した。これらの結果は国際学会(AOGS2012)で講演発表するとともに、国際誌(上記)に印刷公表した。

理論的考察と並行して測定機器の開発を行い、基礎データを取得可能なプロトタイプの製作はほぼ当初目的どおりに進行した。初年度は理論研究に重きをおいたため、機器開発はプロトタイプ製作にとどまらざるを得なかった。ただし、事前の予想よりも高い周波数帯域での測定が重要で、このような高周波域で高精度測定可能なロックインアンプが市販されていないことが課題として残された。これを解決するための方策として、PLLフィードバックと高分解能カウンターを利用した共鳴発振型の高周波検出コイル系製作が有効であろう。いずれにしても、今後の応用研究でのルーチン測定に耐える機器設計に必要なノウハウを蓄積することができたので、次年度以降は計画に沿った研究展開が期待できる。1)中国黄土層を対象とした環境磁気学的研究。Kodama(2013)によって明らかになった黄土層のナノ磁性粒子特性をもとに、最終氷期以降の高解像度環境変動を復元可能な複数サイトの相互対比を行う。2)上記の陸上黄土層の結果と比較検討するため、IODP Exp.346(日本海・東シナ海)掘削試料を対象とした環境磁気学的研究を行い、東アジアのダスト伝搬・供給源を明らかにする。3)これらのルーチン測定に適した計測器の開発。100個単位の試料を処理可能な自動サンプルハンドラーを備えた全自動測定システムを開発する。4)多量の試料を短時間に処理できる時間領域の磁気緩和測定方法を確立し、これまでに開発した周波数領域での測定法と併用して、上記の環境磁気学的研究へ応用する。1)ルーチン測定に適した計測器の開発。100個単位の試料を処理可能な自動サンプルハンドラーと検出コイル系の製作。2)中国黄土層を対象とした環境磁気学的研究。Kodama(2013)によって明らかになった黄土層のナノ磁性粒子特性をもとに、最終氷期・間氷期の高解像度環境変動を復元可能な複数サイトの相互対比を行う。3)2013年9月に予定されるIODP Exp.346(日本海・東シナ海)掘削試料を対象とした環境磁気学的研究。上記の陸上黄土層の結果と比較検討するため、当該年代の海底堆積物を測定し、東アジアのダスト伝搬・供給源推定のための基礎データを得る。4)ナノ磁性粒子の総量に相当する磁性パラメータ決定に特化した簡便な測定機器の開発。Kodama(2013)によれば、黄土層中のナノ磁性粒子(超常磁性粒子)は約500 kHz以上で周波数依存性を消失し、磁気的に安定な単磁区粒子的振る舞いを示すようになる。このことから、100 Hzと500 kHzの高低ふたつの周波数での測定値を用いるだけで、ナノ磁性粒子の総量を決定することができよう。理論的考察の進展と測定器製作のノウハウ蓄積により、当初の予定よりも高性能の測定器を製作できることがわかったが、そのためには費用の一部(主として電子部品購入費)を次年度以降に繰り越して、より詳細に設計を再検討することが必要となった。磁気緩和測定用の機器製作費(電子部品および関連するソフトウェア・ドライバー購入費)主たる支出費目は、測定機器開発のための消耗品・ルーチン計測補助の非常勤雇用謝金・研究試料採取旅費・内外学会参加費などである。現段階では、高額測定器の購入は予定していないが、研究の進展によっては既存測定器(ロックインアンプ・デジタルオシロスコープ)のオプション部品として若干の支出が必要になるかもしれない。
マウスROSA26 ES細胞に相当する「霊長類ES 細胞の恒常的発現部位」の同定と利用。

高い増殖能と分化能をもつES細胞は、移植治療への応用が期待されている。その為の効率の良い分化方法や遺伝子導入には、恒常的遺伝子発現部位の発見と移植細胞の純化法の確立が必要となる。始めに、「遺伝子導入部位」についての検討を行った。マウスES細胞株(ROSA26)は、未分化状態三胚葉分化後も、ROSA部位の発現は低下しない。しかし、霊長類ES細胞では、ROSAの様な恒常的遺伝子発現部位がみつかっていない。そこで、恒常的遺伝子発現部位をもつ細胞を探索し、恒常的発現部位を検討することを試みた。しかし、恒常的発現サルES細胞株からの発現部位を同定したが、恒常的発現部位の特定には至らなかった。次に、「ES細胞の純化法」について検討を行った。純化を行う為には、単細胞培養が必須である。サル・ヒトES細胞は、単細胞継代すると効率にアポトーシスを起こすことが知られている。一方、マウスES細胞は、サル・ヒトES細胞に比べて増殖能が高く、単細胞継代が可能である。そこで、ROCK阻害薬の効果が、サルES細胞でも応用できるかどうかを検討した。その結果、サルES細胞は、ROCK阻害薬の使用により、単細胞培養が可能であることを発見した。さらに、マウスとサルES細胞の違いを検討することを試みた。ヒトES細胞・体細胞では発現がしないが、マウスES細胞のみに発現が認められる「ERas遺伝子」に着目した。マウスでは、ERas遺伝子は個体発生やES細胞の未分化性維持には関与しないもののES細胞にのみ発現し、ES細胞の増殖性に関与する。しかし、サル細胞・組織におけるERas発現は、調べられていない。そこで、カニクイザルにおけるERasの発現を調べた。その結果、ERas遺伝子の発現は、カニクイザルES細胞・体細胞では発現していることを発見した。さらに、ERas遺伝子の細胞増殖能を調べた結果、増腫瘍性に関係無いことがわかった。目的:ES細胞に導入した遺伝子は、分化後にsilencingを起こしやすい性質がある。そのため、ES細胞の遺伝子導入において、安全な上に分化後の恒常的発現が期待できる特異的部位の発見が必要である。マウスES細胞株(ROSA26)は、ROSA(mouse Chromosone6)という部位に、β-Gal遺伝子が組見込まれており、未分化三胚葉分化後も、β-galの発現は低下しない。そのため、このROSA部位は、恒常的遺伝子発現部位として、「相同組換え」に利用されている。一方、サルを含む霊長類ES細胞では、恒常的発現部位(ROSA相当部位)が見つかっていない。そこで、平成19年度は、サルES細胞における恒常的発現部位の発見と同定を行った。方法・結果:蛍光タンパク(GFP)発現サルES細胞株を用い、未分化状態、さらに、免疫不全マウスに移植し奇形腫(テラトーマ)を作製した。その結果、このサルES細胞株は、未分化三胚葉分化後も、GFPを恒常的に発現しており、発現低下もみられないことを確認した。この細胞株に遺伝子導入されているGFPの部位を、Inverted-PCR法等を用いて、解析を行っている。ヒトやサルES細胞の株化は、単細胞培養ができない為、困難である。しかし、ヒトES細胞にROCK阻害剤を作用させることにより、単細胞培養が可能(Watanabe, Nature biotech, 2007)になったという報告があった。

そこで、我々は、サルES細胞でも、同様の結果が得られるかどうかも検討した。その結果、サルES細胞でも、ROCK-inhibitorにより単細胞培養が可能であることがわかった。考察:平成20年度は、部位の同定ができ次第、自殺遺伝子搭載の相同組換えベクターの構築を行い、さらに、ROCK-inhibitorを用いて、相同組換え法を行う予定である。高い増殖能と分化能をもつES細胞は、移植治療への応用が期待されている。その為の効率の良い分化方法や遺伝子導入には、恒常的遺伝子発現部位の発見と移植細胞の純化法の確立が必要となる。始めに、「遺伝子導入部位」についての検討を行った。マウスES細胞株(ROSA26)は、未分化状態三胚葉分化後も、ROSA部位の発現は低下しない。しかし、霊長類ES細胞では、ROSAの様な恒常的遺伝子発現部位がみつかっていない。そこで、恒常的遺伝子発現部位をもつ細胞を探索し、恒常的発現部位を検討することを試みた。しかし、恒常的発現サルES細胞株からの発現部位を同定したが、恒常的発現部位の特定には至らなかった。次に、「ES細胞の純化法」について検討を行った。純化を行う為には、単細胞培養が必須である。サル・ヒトES細胞は、単細胞継代すると効率にアポトーシスを起こすことが知られている。一方、マウスES細胞は、サル・ヒトES細胞に比べて増殖能が高く、単細胞継代が可能である。そこで、ROCK阻害薬の効果が、サルES細胞でも応用できるかどうかを検討した。その結果、サルES細胞は、ROCK阻害薬の使用により、単細胞培養が可能であることを発見した。さらに、マウスとサルES細胞の違いを検討することを試みた。ヒトES細胞・体細胞では発現がしないが、マウスES細胞のみに発現が認められる「ERas遺伝子」に着目した。マウスでは、ERas遺伝子は個体発生やES細胞の未分化性維持には関与しないもののES細胞にのみ発現し、ES細胞の増殖性に関与する。しかし、サル細胞・組織におけるERas発現は、調べられていない。そこで、カニクイザルにおけるERasの発現を調べた。その結果、ERas遺伝子の発現は、カニクイザルES細胞・体細胞では発現が認められた。さらに、ERas遺伝子の細胞増殖能を調べた結果、増腫瘍性に関係無いことを発見した。
振動格子乱流における乱れエネルギの伝達過程と物質拡散機構の解明

本研究では、主に画像処理を用いた可視化実験について行った。画像処理には、カラー流跡線法を独自に開発し、これを適用した。カラー流跡線法は、写真撮影時の露光時間中に光源の色を変化させることによって、流跡線上の色を時間とともに変化させる方法である。あらかじめ光源の色と時刻の関係を設定しておけば、流跡線の色からトレーサがその点に到達した時刻の判定ができる。したがってこの方法は、逆流を含む複雑な流れにも適用できる。本研究ではカラー流跡線法を用いることによって、振動格子乱流中の二次元平面内の速度ベクトル分布、および渦度分布を求めることができた。その結果、振動格子からの距離と渦度の関係が明らかとなった。本研究で得られた結果を要約すると以下の通りである。1.カラー流跡線法は、逆流を含む複雑な流れにも適用でき、可視化画像処理には有効な手法である。2.カラー流跡線法に関する今後の課題としては、明瞭な流跡線撮影法の確立、交差した流跡線の分離、カラー成分解析による変色点判定アルゴリズムの高信頼性化等が挙げられる。3.振動格子乱流の速度ベクトル分布、渦度分布を明らかにした。その結果、振動格子からの距離が増加すると、渦の平均スケールは大きくなるが、渦度は減少することが確認できた。4.今後の課題としては、得られた速度ベクトルの時間的変化から、乱流エネルギの伝達過程と渦構造との関係を明らかにすること、および渦のエントレインメント機構から乱流渦による物質拡散機構を明らかにすることが必要であると思われる。
腎細胞がん微小環境における骨髄由来間葉系幹細胞の機能解明

骨髄由来間葉系幹細胞(MSC)にPKH Red Fluorescentにより標識をした。ルシフェラーゼ安定発現株の腎細胞癌株であるCaki-1を用いて同所移植モデルマウスを作成し、尾静脈から標識したMSCを経静脈投与した。現在、共焦点顕微鏡を用いた免疫染色により、MSCの分化した細胞を特定中である。Caki-1とMSCを、IncuCyte Zoom 2015の観察下で共培養した。Caki-1はMSCのCondition mediumによる培養では、細胞増殖能の上昇を認めず、MSCとの直接接触により上昇を認めた。引き続き、遊走能の変化について検討中である。腎癌細胞株のCaki-1を主に用いて研究を行っている。腎被膜下にCaki-1細胞を1000000個ほど30Gy針を用いて注入して、腎癌同所移植モデルマウスを作成した。これらの実験系はこれまでの研究と同様であり、当科では確立された実験手技となっている。また、腫瘍が形成されたと思われる移植実験から2週間後にIn Vivo Imaging Systemを用いてがん細胞の生着を確認している。2週間で腫瘍が形成されていなければ、4週間後に再度確認している。癌細胞が腎被膜下に生着して腫瘍形成ができていれば、尾静脈から生食もしくは骨髄由来間葉系幹細胞(mesenchymal stem cell:以下、MSC)を注入し、MSCの癌間質での分布について確認する予定である。現在まで、腎癌同所移植モデルを作成して、尾静脈から生食を注入してコントロール群を作成した状況である。研究の主たる目的は、腎細胞癌の間質におけるMSCの役割を解明する事である。そのため、現在は腎癌同所移植モデルマウスの作成後にMSCを注入しており、コントロール群と比較していく予定である。またin vitro実験として、Caki-1細胞に対して細胞増殖に働くか、MTT assayなどを施行している。さらには、Boyden chamberを用いたMSCの運動能の解明や、がん細胞とMSCの間に起こるシグナル経路の解明を、がん細胞とMSCを共培養して、あるいはがん細胞のコンディションメディウムをMSCの培養液にしてMSCがどういった細胞に分化するか経時的に評価する。またMSCの分化には液性因子だけでよいか、がん細胞との接着によるシグナル応答が必要か検討する。そして、がん細胞とMSCを共培養することで過剰産生される増殖因子やサイトカインを網羅的に解析するサイトカインアレイを行っていく予定である。腎癌細胞株Caki-1を用いて同所移植モデルを作成しているが、これまでの研究から当研究室では確立した手技の一つであった。ただし本研究においてがん細胞が生着するマウスと生着しないマウスがあり、ここ最近は生着しないマウスが多くみられる。これまでにCaki-1細胞の同所移植を複数回施行しているが、これまでの研究内容と比較して成功率が芳しくない。そのため本研究で使用しているCaki-1細胞を、凍結している他のCaki-1細胞に変更して同所移植モデルの作成を行っている。骨髄由来間葉系幹細胞(以下、MSC)と腎癌細胞株Caki-1をIncuCyteを用いて共培養することにより、腎癌細胞株Caki-1の細胞増殖を促すことが明らかになった。これは、MSCのコンディションメディウムを用いた腎癌細胞株の培養と比較して、有意に細胞数の増加を認めた、これらの結果によりMSCと腎癌細胞株の直接的な接触により、腎癌細胞は増殖する事が明らかになった。動物モデルの実験を行うのに先立ち、MSCにウイルスベクターを用いてGFPの組み込みを試みたが、細胞分裂が乏しかったため、腎癌細胞株Caki-1に組み込んだ。またMSCには赤色色素を用いて標識した。これらを使用して腎同所移植モデルを作製し、MSCを尾静脈から投与して、癌の増殖が促されるか検討した。これらの評価は、In Vino Imaging System(以下IVIS)、と腫瘍重量の比較により検討した。結果、MSCを投与していないコントロール群と比較して、MSCを尾静脈投与した群では、IVISにおける集積は有意に高く、また摘出した腫瘍重量も増大していた。これらの結果から、MSCは腎癌細胞株の細胞増殖を促す事が示唆された。現在は、コントロール群とMSCを尾静脈から投与した群に同所移植して作成した腫瘍を用いて、免疫染色を施行している。先行研究で、癌線維芽細胞や周皮細胞が血小板由来成長因子受容体βを発現する事を明らかにしており、現在は共焦点顕微鏡を用いた2重免疫染色にて、MSCがどのような細胞に分化しているか検索中であり、今後、分化する細胞が特定されれば、治療標的にMSCがなりうる可能性が明らかになると考えている。まずは、同所移植モデルの作成を進めていき、さらに尾静脈から細胞の注入していく手技を確立して、安定して同所移植モデルと尾静脈注入モデルを作成する事が喫緊の課題である。これらは研究協力者に助言をもらいながら取り組んでいる。
冷受容器系のイオン機構・分子機構の解明

末梢の冷受容器の活性化は冷感覚を誘発する。冷受容器の温度受容メカニズムは不明であった。近年、冷受容体の候補遺伝子が2種(非選択的陽イオンチャネルであるTransient Receptor Potentialのファミリーに属するTRPM8とTRPA1)同定されたが、その詳細な分子メカニズムは不明な点が多い。本年度は、侵害閾の熱が逆説的に冷感覚を引き起こすメカニズムとして、冷受容体と熱受容体が感覚神経で共発現していることだと、示唆した(Neuroscience letters 359(1-2),2004 33-36)。また、TRPM8とTRPA1は冷却以外に冷感物質にも応答することから冷受容体の候補遺伝子と考えられているが、TRPM8と冷感物質との関係は系統立てて調べられていない。また、TRPA1は刺激物質allylisothiocyanateにも応答することからTRPA1の活性化が冷感を誘発しているかどうかわからない。そこで、冷感を引き起こす受容体を明らかにするべく、TRPM8とTRPA1の新規アゴニストを同定し、それらの物質が冷感を引き起こすかどうか心理学的に解析し、受容体活性化と冷感の関係を調べた。その結果、TRPM8の新規アゴニストを9種類TRPA1の新規アゴニストを4種類同定した。そして、冷感はTRPA1ではなく、TRPM8が活性化することが必要であることが明らかにした。この結果は、第78回日本薬理学会(2005年3月、横浜)で口頭発表するとともにEuropean Journal of Neuroscienceに投稿中である。末梢の冷受容器は冷覚を誘発する。しかし、冷受容器の温度受容機構は不明である。冷受容器は冷却だけでなくメントールにも反応することがin vivoの実験で報告されている。本研究の目的は、冷およびメントールの受容器を冷受容器系と捉えて、そのイオン機構、分子機構を解明することである。14年度は冷受容器のイオン機構を解析した。冷受容器は冷却でインパルスに同調して[Ca^<2+>]_i上昇が起こることがわかった。細胞外のCa^<2+>を除くと[Ca^<2+>]_i上昇が消失し、カドミウム存在下で大部分抑制されたので、Ca^<2+>は大部分がインパルス発生時の電位依存性カルシウムチャネルを介して流入していることがわかった。細胞内のCa^<2+>をBAPTAでキレートすると不活性化しなかったことから、細胞内のCa^<2+>がチャネルを不活性化していることがわかった。また、冷受容器のイオン選択性は、P_<Na> : P_<Li> : P_K : P_<Cs> : P_<Ca>=1.02:0.95:1.04:1.00:8.36で、一価のカチオンには選択性をしめさず、二価のカチオンであるCa^<2+>は透過性が高かった。また、電流-電圧曲線は外向き整流性を示した。これらのことはこのイオンチャネルがTRPファミリーに属することが予想された。閾温度は細胞によってことなり、平均約28度で正規分布に近い形に分布した。これは、同じ受容機構のばらつきで説明できる。Inside-out記録でも冷チャネルは活性化し、Ca^<2+>は冷チャネルを直接不活性化した。これらの結果は、J.Neuroscienceに報告した(Okazawa, M.,et al. J.Neurosci.,22,3994-4001,2002.)。また、第32回北米神経科学会(オーランド、アメリカ、2002年11月)、第25回神経科学会(東京、2002年7月)、第三回環境生理シンポジウム(福岡、2002年3月)にて報告した。しかし、冷受容器の温度受容機構はいまだに不明な点が多い。本研究では、冷およびメントールの受容器を冷受容器系と捉えて、そのイオン機構、分子機構を解明する。冷点を45度以上に熱すると冷感を生じる、いわゆる"逆説的冷感"が生じる。In Vivoの報告では冷受容器は45度以上の熱にも応答する(Paradoxical discharge)を説明すると考えられている。しかしながらその分子メカニズムは依然不明である。冷受容器を同定した研究者らの報告では冷受容体、CMR1 (TRPM8)は熱受容体,VR1と共存しない。そこで、本年度は、これらの点を明らかにすることを目的とした。具体的には、末梢神経の細胞体が存在するDRG(後根神経節)にCMR1と熱受容器、VR1が共発現するかどうかをIn situ hybridyzationと免疫組織的手法を用いて解析した。彼らの方法では検出シグナルが弱いものは損なわれるため、検出シグナルを損なわない方法で行った。その結果、CMR1の発現する神経の29%がVR1を共発現することがわかった。また、DRGの培養系を用い,細胞内カルシウム測定、およびパッチクランプ法により解析したところ、多くの冷細胞が熱により、活性化することがわかった。その域温度は44±0.35°Cだった。これは、In vivoでの報告に近い、また、これらの細胞にVR1が発現するか調べたところ、熱に反応した冷細胞の全てがVR1を発現することがわかった。

以上のことから、冷受容器、CMR1は熱受容器、VR1と共発現することが明らかとなった。これが、逆説的冷感を引き起こすメカニズムと考えられる。この研究結果はNeuroscience lettersに報告した(in press)。末梢の冷受容器の活性化は冷感覚を誘発する。冷受容器の温度受容メカニズムは不明であった。近年、冷受容体の候補遺伝子が2種(非選択的陽イオンチャネルであるTransient Receptor Potentialのファミリーに属するTRPM8とTRPA1)同定されたが、その詳細な分子メカニズムは不明な点が多い。本年度は、侵害閾の熱が逆説的に冷感覚を引き起こすメカニズムとして、冷受容体と熱受容体が感覚神経で共発現していることだと、示唆した(Neuroscience letters 359(1-2),2004 33-36)。また、TRPM8とTRPA1は冷却以外に冷感物質にも応答することから冷受容体の候補遺伝子と考えられているが、TRPM8と冷感物質との関係は系統立てて調べられていない。また、TRPA1は刺激物質allylisothiocyanateにも応答することからTRPA1の活性化が冷感を誘発しているかどうかわからない。そこで、冷感を引き起こす受容体を明らかにするべく、TRPM8とTRPA1の新規アゴニストを同定し、それらの物質が冷感を引き起こすかどうか心理学的に解析し、受容体活性化と冷感の関係を調べた。その結果、TRPM8の新規アゴニストを9種類TRPA1の新規アゴニストを4種類同定した。そして、冷感はTRPA1ではなく、TRPM8が活性化することが必要であることが明らかにした。この結果は、第78回日本薬理学会(2005年3月、横浜)で口頭発表するとともにEuropean Journal of Neuroscienceに投稿中である。