hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
小児用人工心臓実現を目的とした磁気軸受システムの研究

血液細胞に対して低侵襲な小児用人工心臓の実現を目的として、小児血液循環補助を可能とする遠心式血液ポンプ、インペラを非接触で支持する磁気軸受機構、血液室内で浮上するインペラを回転させるためのトルク付与機構の開発と評価を行った。40Wt%グリセリン水溶液を用いた水力実験の結果、揚程:50-200mmHgに対して流量:0.1-3.0L/minの吐出が確認され、小児循環を十分補助できる水力特性が確認された。また、豚新鮮血液を用いた溶血試験の結果、BP-50 Bio-Pumpと同様の溶血特性を示した。4時間の溶血試験の前後で、磁気軸受を構成する電磁石の表面温度に有意な変化は観測されなかった。研究計画1年目の平成26年度は、実現目標である小児用磁気浮上型人工心臓開発の第1段階である「2軸(X-Y)能動制御+3軸(Z-θ-φ)受動制御式の磁気軸受の開発」を行った。この開発における中心的課題である2軸能動制御を実現するため、制御対象である永久磁石を内包するインペラと、インペラを能動磁気支持するための電磁石4対を組み合わせた磁気軸受の設計と試作を行った。永久磁石と電磁石の磁気剛性は3次元磁場解析ソフトウェアを用いて行い、人工心臓として磁気軸受を組み込みためのデバイス設計には3D CADソフトウェアSolidWorksを用いた。また、制御対象であるインペラ(永久磁石)の位置検出には、渦電流センサ(電子応用株式会社)を用い、センサから得られた電圧信号からインペラ位置を検出し、X-Y軸中心からの変位を修正する方向に電磁石から磁場をかけるための制御回路の作成も行った。制御アルゴリズムの設計はシステム開発ソフトウェアLabViewを用いて行い、実装には同DAQを用いた。自作した電磁石の通電電流に対する発生磁力(磁気剛性)の関係、インペラ-渦電流センサプローブ距離に対するセンサ電圧の関係が不明であるため、これらを定量するための実験システム構築を行った。この結果は、前述の制御アルゴリズムにおいて係数入力に必須のパラメタとなる。平成27年6月18日付けで、ドイツ製・単回使用体外設置式補助人工心臓ポンプ「EXCOR Pediatric小児用体外設置式補助人工心臓システム」の製造販売が承認されたことにより、本邦の小児循環器医療において新しい治療方法が確立することとなった。当該システムは、従来の投薬治療や外科手術及び人工心肺を用いた補助循環では治療効果が望めなかった患児を対象として、心移植までの橋渡しあるいは心機能の回復を目的として長期間使用されるもの(VAD: Ventricular Assist Device)である。つまり、開心手術時や急性心不全への治療用として用いる小児用の人工心臓(CPB: Cardio Pulmonary Bypass,ECMO: Extra Corporeal Membrane Oxygenation)は本邦に存在していない。さらに、上述のBerlin Heart EXCORPediatricは旧式の拍動型人工心臓であり、循環器医療において世界的に主に使用されている小型で低侵襲な連続流型人工心臓ではない。そこで本研究では、体重10kg未満の小児心疾患患児に対する開心手術時の人工心肺(CPB)、中長期の機械的補助循環(ECMO)への応用を目的とした連続流型の磁気浮上式人工心臓の開発および評価を行っている。昨年度までに、小児の体循環流量と血圧を駆出可能であり血液適合性の高い(低溶血、低血栓)人工心臓血液室形状の設計および試作、連続流ポンプのインペラを血液室内部で磁気浮上させる磁気軸受の設計および試作が完了している。本年度は、試作した磁気軸受の制御機構に関する評価を行った後に人工心臓システムを完成させ、磁気軸受を構成する永久磁石と電磁石が血液に及ぼす影響についての検討を行う予定である。予算の都合で、磁気軸受制御システムにおける渦電流センサ信号から電磁石への通電をコントロールするハードウェアには既製品を用いず、自作でハードウェアとソフトウェアの設計を行っている。このため、当初計画では平成27年度中にデバイスと制御システムが完成する予定であったが、現時点では磁気軸受システムの試作が完了した状態である。本年度、試作した磁気軸受システムの評価を行い、遠心ポンプインペラの磁気剛性が適正であると確認された後、インペラに回転トルクを付与するドライブ機構の設計に移行する予定である。我が国の小児心臓血管外科医療において、臨床での使用が認可されている唯一の人工心臓システムであるベルリンハートEXCORPediatricには、1)第1世代の補助人工心臓(体外設置型・拍動流型)である、2)心臓移植までの橋渡し使用に限定されており、先天性心奇形手術時における人工心肺装置としての使用ができない、などの課題がある。一般に、定常流型の人工心臓と比較して拍動流型の人工心臓では血液適合性(溶血特性・抗血栓性)が劣るとされており、特に血液総量の少ない小児では人工心臓による赤血球損傷(溶血)が致命的な問題となることも知られている。一方、成人の心疾患に対しては、磁気浮上型や動圧軸受型などの接触ベアリングを持たない第3世代人工心臓が開発されており、成人の重症心不全患者に対する有用性が報告されている。そこで本研究では、小児の血液循環に最適な血液ポンプ形状を有すると共に、磁気軸受を搭載した血液に対して低侵襲な「小児用磁気浮上式血液ポンプ」の開発と評価を行った。

人工肺、脱血・送血カニュレを接続すると共に、小児血液循環を補助・代替できるポンプ性能として、インペラ回転数:3000[rpm]において、流量:1.0[L/min]、揚程:200[mmHg]を仕様とした遠心ポンプ(血液室、インペラ)を設計し、接触式軸受けとマグネットカップリングによるモータトルク伝達機構により試作1号機を製作した。これを用いて水力試験・溶血試験を行い、血液室形状とインペラ形状の妥当性が確認された。試作1号機のインペラを非接触的に血液室中心で磁気浮上させるため、インペラ内部にサマコバ永久磁石を内包し、インペラ外周に純鉄コアの電磁石を4個設置することで磁気軸受の設計を行った。ポンプ内に生理食塩水を充填してインペラが回転した条件下で評価実験を行った結果、磁気によるインペラの安定浮上が確認された。血液細胞に対して低侵襲な小児用人工心臓の実現を目的として、小児血液循環補助を可能とする遠心式血液ポンプ、インペラを非接触で支持する磁気軸受機構、血液室内で浮上するインペラを回転させるためのトルク付与機構の開発と評価を行った。40Wt%グリセリン水溶液を用いた水力実験の結果、揚程:50-200mmHgに対して流量:0.1-3.0L/minの吐出が確認され、小児循環を十分補助できる水力特性が確認された。また、豚新鮮血液を用いた溶血試験の結果、BP-50 Bio-Pumpと同様の溶血特性を示した。4時間の溶血試験の前後で、磁気軸受を構成する電磁石の表面温度に有意な変化は観測されなかった。本研究は高専本科5年生の卒業研究とリンクする形で行っている。工学的知識や技術が未熟である高専生に、デバイス設計のためのCAD技術、磁場解析のためのシミュレーション手法、磁気制御を実現するための制御理論を教授しつつ研究を遂行するため遅延が生じている。特に、1年目に行うべき内容(人工心臓の設計、磁気軸受の設計とシミュレーション、試作機の制作)は高難易度であったため時間を要した。しかし、本研究をモチーフにした研究教育の効果は絶大であり、今後も学生とともに1段階ずつ着実に研究を進めていく予定である。本年度はまず、磁気浮上するインペラに対して回転トルクを付与する機構の追加を行う。当初の予定では、ダイレクトドライブ方式により薄型軽量のシステム実現を目標としていたが、試作段階では市販DCモータを用いたマグネットカップリング方式によりインペラに回転力を伝達するものとする。本開発においては、研究教育の観点より、当該研究者の運営する研究室所属学生を補助として設計と評価を行うものとする。人工臓器工学本研究2年目にあたる平成27年度は、初年度に設計・試作した磁気軸受を完成させた後、第2段階として、磁気軸受により浮上した状態のインペラ(永久磁石を内包)を回転させるための「ダイレクトドライブ機構」を設計・試作する。本段階はインペラをロータ、内側にステータを配置したモータを設計することにほかならず、難関となる点としては、磁気軸受とダイレクトドライブの磁気干渉が挙げられる。しかし、磁気軸受設計および磁場解析の段階において、インペラ外部に磁気軸受、インペラ内部にダイレクトドライブ機構を配置することで、磁場干渉を最小限にする設計としたため、前述の問題点は回避可能と考えられる。平成27年度も、卒業研究の一環として、高専本科5年生の協力の元、本研究を遂行していく予定である。
線形系及び双線形系に対するシステム構造を考慮した状態フィードバック則の設計開発

本研究は、線形系及び双線形系に対して、システムの構造を考慮に入れた上で良好な応答特性を実現する状態フィードバック則の設計法を検討しようというもので、各システムの構造に依存したふさわしい制御則を試行錯誤なしに構成することを目指している。システムの構造も積極的に設計の際に取り入れ、それに応じた制御則を設計することができれば、さらに効果的な設計法となることが期待されることから、状態フィードバックによる制御系の構造の変換可能性を解明し、それに基づいて制御側を構成することは興味深い。そこでまず静止エネルギー変換器の分野で多く見うけられる双線形系の出力レギュレーション問題を念頭に置き、目標値と出力との偏差を状態変数に取り込んだ拡大系(非線形系)に対して、双線形系がどのような構造のときに正定2次形式のリアプノフ関数が構成でき、状態フィードバックのみで出力レギュレーション可能かについて検討を行なった。その結果、もとの双線形系のシステム係数行列がある条件を満たしている場合には、拡大系に対して正定2次形式のリアプノフ関数が構成でき、状態フィードバック則(偏差の積分項も含む非線形状態フィードバック則)のみで出力レギュレーションが理論的には可能であることがわかった。得られた結果をDC-DC変換器に応用して出力電圧の制御を行なった結果、計算機シミュレーション及び実機での応答特性も極めて良好であった。引き続き、線形定係数系において最適レギュレータ問題(LQ問題)を用いて構成されたシステムの構造的特徴と構成されるリアプノフ関数の形について研究中である。これに関しては、一般的な結果が得られるかどうかは明確でないが、システムに条件を付加することにより、構成されるリアプノフ関数の形が制限されるというような見込みを得ている。
ベンゾジアゼピン受容体イメージング製剤による不安状態と回復過程の画像解析

ラット(Wistar,male,約250g)18匹をストレスをかける度合いに応じて以下の3群に分類した。1.コントロール群(6匹)、2.コミュニケーションボックスに連続3日間入れる群(6匹)、3.コミュニケーションボックスに連続5日間入れる群(6匹)。コミュニケーションボックスは、電撃ショックを受ける部屋と受けない部屋に区分した。対象としたラットは、電撃ショックを受けない部屋に毎日1時間入れ、電撃ショックを受けるラットを見せることで、肉体的ストレスを伴わない情動ストレスを与えた。ラットに^<125>I-Iomazenil(約0.05mCi)を尾静脈より静注し、3時間後に解剖した。すばやく大脳を摘出し、凍結させた。クライオスタットで、20マイクロメートルの厚みの冠状断の切片を得、イメージングプレートに約2週間貼りつけ、イメージングアナライザーで解析した。3日間入れた群では、6匹中1匹に視床下部の集積に局所的な低下を認めた。5日間入れた群では、6匹中3匹に視床下部の集積に局所的な低下を認めた。受けたストレス量の指標として、同時に血中コルチコステロン濃度を測定した。血中コルチコステロン濃度は、ストレスをかける前と解剖時に測定し、その変化を算出した。血中コルチコステロン濃度の上昇の程度は、5日間入れた群、3日間入れた群、コントロール群の順に高かった。情動ストレスは視床下部の中枢性ベンゾジアゼピン受容体の分布に影響を与えることが示唆された。科研費採択後、第一回目の^<125>I-Iomazenilの配給が3月18日で、3月中に6匹のラットに対して実験を行った。うち、4匹はコントロール群で、^<125>I-Iomazenil(0.04mCi)静注後、3時間後に解剖し、同時に、血中放射能濃度、血中コルチコステロン濃度の測定を行った。解剖後、大脳を検出し、凍結切片をイメージングプレートに張り付けて冠状断の画像を作成した。残りの2匹はストレス負荷群で、血中コルチコステロン濃度の測定を行った後、連日3日間、コミュニケーションボックスに入れてストレスを与えた。3日後、コントロール群と同様に^<125>I-Iomazenil(0.04mCi)静注後、3時間後に解剖し、同時に、血中放射能濃度、血中コルチコステロン濃度の測定を行った。さらに、解剖後、大脳を摘出し、コントロール群と同様な手法で冠状断の画像を作成した。今後、ストレス負荷群の例数を増やして比較検討する予定である。
重症複合免疫不全症の分子生物学的診断、治療法の開発

重症複合免疫不全症(SCID)は細胞性、液性両免疫能の重篤な障害を呈する多様な遺伝性疾患の総称であるが、B細胞を有する伴性劣性遺伝型SCID(B(+)SCID)の責任遺伝子はIL-2、IL-7などのレセプターに共通なコンポーネントcommon γ(γc)鎖であることが証明されている。本症は早期に診断し、骨髄移植に成功すれば根治が可能であるが、最適な骨髄ドナーを得ることは容易ではなく、わずかなHLA不適合があっても、種々の程度の免疫不全が残る場合が多い。本研究ではSCIDの治療におけるこうした問題点を解決するために、B(+)SCID患者のγc鎖遺伝子の解析を行い、早期診断法、保因者診断法を確立するとともに、骨髄移植後長期にわたるキメラ状態について解析し、移植後の免疫不全状態の病態解明を試みた。B(+)SCID 8例のγc鎖遺伝子解析を行ったところ1例にγc鎖遺伝子全体に及ぶ大欠失、1例に19bpの小欠失、1例にナンセンス変異、4例にミスセンス変異を認めた。しかしながら、残る1例では本遺伝子に異常が認められず、B(+)SCIDの病因の多様性が示唆された。最近、γc鎖からのシグナル伝達に関与すると考えられるJAK-3分子の障害によりB(+)SCIDが発症するとの報告なされ、この症例についてもJAK-3遺伝子の解析を進めている。B(+)SCIDに骨髄移植を行う場合、HLAが近似であれば前処置を行わない場合が多い。HLAが遺伝型一致の場合には移植後に免疫能は全く正常化すると考えられるが、遺伝型一致でない場合には、低γグロブリン血症など免疫不全を残す場合が多い。今回の検討により、前処置を行わないために移植後長期にわたり患者由来B細胞が残存し、B細胞アナジー類似の状態におかれていることが示唆された。移植後の免疫不全の病態についてさらに検討し、治療法の改善に努める必要があろう。6例中1例はcDNAおよびゲノム断片をプローブに用いたサザン法、ノザン法でバンドが検出されず本遺伝子領域の大きな欠失が考えられた。1例はコドン83のチロシンが終止コドンに変異していた。本症例の家系を、変異に特異的なプライマーを用いたPCRにより解析したところ、家族歴より保因者であることが明らかな3女性以外に患者の妹も保因者であることが判明した。他の3例は各々コドン44,92,204のミスセンス変異であった。これらの部位はサイトカインレセプターファミリーに共通してみられ機能発現に必須と考えられる、conserved cystein,WSXWSmotifに近接する部位であり、発症の原因と考えられた。また、内1例では変異により新たな制限酵素AluI切断部位が出現するためこれを用いて家系分析を行い、変異と発症が連鎖することを確認した。残る1例は、B細胞における遺伝子発現が正常者と差が認められず、かつcDNAおよびエクソン-イントロン接合部の塩基配列に変異が認められないため、IL-2Rγ鎖遺伝子以外の異常が考えられ、SCID with B cellの病因の多様性を示唆するものと考えられた。重症複合免疫

不全症(SCLD)は細胞性、液性両免疫能の重篤な障害を呈する多様な遺伝性疾患の総称であるが、B細胞を有する伴性劣化遺伝型SCID(B(+)SCID)の責任遺伝子はIL-2、IL-4、IL-7などのレセプターに共通なコンポーネントcommon γ(γc)鎖であることが証明されている。本症は早期に診断し、骨髄移植に成功すれば根治が可能であるが、最適な骨髄ドナーを得ることは容易ではなく、わずかなHLA不適合があっても、種々の程度の免疫不全が残る場合が多い。本研究ではSCIDの治療におけるこうした問題点を解決するために、B(+)SCID患者のγc鎖遺伝子の解析を行い、早期診断法、保因者診断法を確立するとともに、骨髄移植後長期にわたるキメラ状態について解析し、移植後の免疫不全状態の病態解明を試みた。B(+)SCID8例のγc鎖遺伝子解析を行ったところ1例にγc鎖遺伝子全体に及ぶ大欠失、1例に19bpの小欠失、1例にナンセンス変異、4例にミスセンス変異を認めた。しかしながら、残る1例では本遺伝子に異常が認められず、B(+)SCIDの病因の多様性が示唆された。最近、γc鎖からのシグナル伝達に関与すると考えられるJAK-3分子の障害によりB(+)SCIDが発症するとの報告なされ、この症例についてもJAK-3遺伝子の解析を進めている。B(+)SCIDに骨髄移植を行う場合、HLAが近似であれば前処置を行わない場合が多い。HLAが遺伝型一致の場合には移植後に免疫能は全く正常化すると考えられるが、遺伝型一致でない場合には、低γグロブリン血症など免疫不全を残す場合が多い。今回の検討により、前処置を行わないために移植後長期にわたり患者由来B細胞が残存し、B細胞アナジー類似の状態におかれていることが示唆されて。移植後の免疫不全の病態についてさらに検討し、治療法の改善に努める必要があろう。
神経伝達機構の解明に関する生化学的研究-アセチルコリン受容体の構造と機能を中心に-

ヘビ神経毒の生理作用を活用して神経筋接合部のニコチン性アセチルコリン受容体(AChR)が比較的容易に分離されるようになり,その構造と機能との関係を解明しようとする研究は近年盛んに行われている.特に最近AChRの各サブユニットの一次構造が遺伝子操作の技術により明らかにされこの領域の研究は益々盛んである.しかしすべて糖蛋白から成るAChRの糖鎖の構造やその機能についての知見は全く得られていなかった.そこで申請者らは神経伝達機構を生化学的に解明する研究の一環として,まず神経伝達物質の受容体の一つであるAChR分子を中心に糖鎖の構造と糖鎖の神経機能に果す役割や最近AChRの近傍に存在しAChRの機能発現に重要な役割を担っていると云われている分子量43,000の蛋白群(43K)の生化学的特性などを明らかにする目的で本研究を行ない以下に示す興味ある知見を得た.(1)コブラ科のヘビ毒より分離した神経毒を活用するアフイニテイクロマトグラフィーでシビレエイ電気器官から高収率高純度でAChRを分離する方法を確立した.(2)得られたAChRの各サブユニットの主要な糖鎖の構造がハイマンノース型であることを世界に先がけて明らかにした. (3)AChRへのAChの結合に糖鎖が関与しているか否かを調べシアル酸がAChRへのヘビ神経毒の結合を阻害したが別途調製したアシアロAChRに,もとのAChRへと同程度にヘビ神経毒が結合することからAChR分子上の糖鎖はAChの結合性の機能的役割ではなくAChRの各サブユニットの生合成部位から後シナプス膜上への輸送,あるいはそれらサブユニットの会合に関与していることが示唆された.(4)43K蛋白群中プロテインキナーゼ(V1),クレアチンキナーゼ(V2)を夫々均一に分離し, V1はAChRやAChRを含む膜画分をリン酸化するプロテインキナーゼであること, V2のアミノ末端配列は他の動物のクレアチンキナーゼと相同生が極めて高いことを明らかにした.以上AChRについて多くの新しい知見を得た.ヘビ神経毒の生理作用を活用して神経筋接合部のニコチン性アセチルコリン受容体(AChR)が比較的容易に分離されるようになり,その構造と機能との関係を解明しようとする研究は近年盛んに行われている.特に最近AChRの各サブユニットの一次構造が遺伝子操作の技術により明らかにされこの領域の研究は益々盛んである.しかしすべて糖蛋白から成るAChRの糖鎖の構造やその機能についての知見は全く得られていなかった.そこで申請者らは神経伝達機構を生化学的に解明する研究の一環として,まず神経伝達物質の受容体の一つであるAChR分子を中心に糖鎖の構造と糖鎖の神経機能に果す役割や最近AChRの近傍に存在しAChRの機能発現に重要な役割を担っていると云われている分子量43,000の蛋白群(43K)の生化学的特性などを明らかにする目的で本研究を行ない以下に示す興味ある知見を得た.(1)コブラ科のヘビ毒より分離した神経毒を活用するアフイニテイクロマトグラフィーでシビレエイ電気器官から高収率高純度でAChRを分離する方法を確立した.(2)得られたAChRの各サブユニットの主要な糖鎖の構造がハイマンノース型であることを世界に先がけて明らかにした. (3)AChRへのAChの結合に糖鎖が関与しているか否かを調べシアル酸がAChRへのヘビ神経毒の結合を阻害したが別途調製したアシアロAChRに,もとのAChRへと同程度にヘビ神経毒が結合することからAChR分子上の糖鎖はAChの結合性の機能的役割ではなくAChRの各サブユニットの生合成部位から後シナプス膜上への輸送,あるいはそれらサブユニットの会合に関与していることが示唆された.(4)43K蛋白群中プロテインキナーゼ(V1),クレアチンキナーゼ(V2)を夫々均一に分離し, V1はAChRやAChRを含む膜画分をリン酸化するプロテインキナーゼであること, V2のアミノ末端配列は他の動物のクレアチンキナーゼと相同生が極めて高いことを明らかにした.以上AChRについて多くの新しい知見を得た.ニコチン性アセチルコリン受容体(AChR)は近年その構造と機能の解明が著しく進展している生体高分子である。われわれは特にシビレエイ電気器官からAChRを調製し、これを用いて構造と機能の相関に関する生化学的研究を行ない以下の新しい知見を得た。1;神経伝達物質の受容体蛋白の糖鎖構造はこれまで全く不明であったがわれわれはAChRの糖鎖構造を世界に先がけて解明することに成功した。すなわちシビレエイのAChRの糖鎖は70%以上がマンノースを8個と9個含むハイマンノース型糖鎖で受容体分子を構成するすべてのサブユニットに含まれていた。各サブユニットに結合している糖鎖の数はそれぞれα,β,γ,δに1,1,2,3と推定され、γとδサブユニットでは上記ハイマンノース型糖鎖の他にコンプレックス型糖鎖も含まれていた。2;コリン性リガンドのAChRとの結合における糖鎖の関与を調べた。その結果αブンガロトキシンとAChRとの結合は高濃度のシアル酸やガングリオシド,卵白アルブミンなどにより阻害された。

しかしAChRをシアリダーゼやエンドグリコシダーゼHで処理してもαブンガロトキシンやカルバミルコリンとの結合に変化は見られず糖鎖がリガンドとの結合に直接関与している可能性は小さいことがわかった。3;シビレエイ電気器官中にAChRと類似しているが性質の異なる蛋白が存在していることを見出した。この蛋白はヘビ神経毒やカルバミルコリンとAChRに近いkd値で結合するが界面活性剤を用いなくても緩衝液中に回収されること,中性域で陰イオン交換体に結合しないこと、ConAカラムに吸着しないことなどAChRの性質と異っている。4;AChRの生理機能発現に関与していると考えられている分子量43,000(43k)の蛋白をシビレエイから2種分離した。これらは43k蛋白中の【V_1】および【V_2】と考えられるのでこれらの蛋白の生理機能や分布を詳しく解析するため精製した【V_1】,【V_2】蛋白を抗原としてウサギを用いて抗体を作製中である。
マルコフ決定過程における分散および期待効用に関する最適化の研究

マルコフ決定過程(MDP)の期待値最大化の下での分散最小化に関して次の結果を得た。MDPを可算状態空間S,有限決定空間A(i),推移確率p=(p(a)_<ij>;i,j∈S),一様有界な直接利得{r(i,a);i∈S,a∈A(i)}で定義する。政策をπ=(π_0,π_1,...),特に定常政策をfで表わす。初期状態i∈Sと政策πによって定まる標本空間上の確率をP^π_iとし,P^π_iによる期待値と分散を,それぞれE^π_i(・),V^π_i(・)と表わす。平均期待利得と(平均)分散をによって定義する。x(i,π^*)=max{x(i,π);πはすべての政策}を満たすπ^*を平均最適政策と呼ぶ。Theorem 1.定数b>0と状態0∈Sが存在して,任意の定常政策fに対してが成立すると仮定する。(i)定常政策f^が存在して、政策πが任意のi∈Sについて(ii)Sが有限ならば、(i)のf^は,平均最適政策の中で最小の分散を与える。また,(iii)ψ(i,f)をdeviation行列を使ってexplicitに求めた。(iv)過渡的状態i∈Sから出発して2つ以上の再帰的クラスに到達するとき,ψ(i,f)=∞となることを示した。上記では,r(i,a)は関数であるが,これを確率変数として与えた場合にも、類似の結果が得られることを示した。
c-Myc標的遺伝子ATF3の細胞増殖と発がんに関する研究

転写因子ATF3は、血清刺激による細胞増殖誘導時に発がん遺伝子c-mycの下流で誘導される。同時に種々のストレス刺激によっても誘導されることから、細胞増殖と細胞死に関わっており細胞運命の決定に働いているがそのメカニズムと意義については不明な点が多い。本研究期間において、次の点を明らかにした。1)ATF3遺伝子のalternate promoterは、ヒドとマウスで保存されており、各種ストレス刺激や血清誘導に応答すること、2)発がん性RasやTGF-bにも応答すること、3)ATF3高発現がん細胞LNCaPやホジキン細胞では、上流のプロモーターが活性化されていることを見出した。4)がん細胞におけるプロモーターの活性化はクロマチン構造の変化を伴っていることを見出した。さらに、5)皮膚細胞での紫外線によるATF3誘導では、Hif2aを介する新たなシグナル経路によること、6)ところが、より弱い紫外線照射によるATF3誘導は、p15を標的遺伝子として誘導し、CpGダイマーの修複を促進することを見出した。以上の結果は、ATF3遺伝子のalternate promoterによる発現制御を明らかにし、がん細胞での恒常的発現が遺伝子プロモーターのエピジェネティックな変化を伴っていることを示すものであり、さらに、ATF3誘導が、発がんとがん抑制に同時に関わることを示すものである。さらに、ATF3の個体レベルの生物機能を解析する目的のために組織特異的ATF3ノックアウトマウスを作成し、germline KOマウス作成とp53とのダブルノックアウトマウスを作成している。1)強いストレス刺激に反応して誘導されるスプライシングバリアントZip2が、NF-kB、p65(Re1A)と直接結合すること、2)2)その結合は、co-regulator bindingmotifにホモロジーを持つC-末の19アミノ酸配列が関与すること、3) 3)p65結合の結果、コアクチベーターCBP/p300との結合を弦弱すること、4) Zip2は、NF-kB依存性転写を抑制し抗アポトーシス遺伝子を阻害すること、を見出した。この結果は、ATFの細胞抑制機能がそのスプライシングによっても制御されていることを始めて見出したものである。抗がん剤はじめDNA障害時にもZip2が誘導されることから、in vivoにおいてもZip2がATF3による細胞死に深く関わっている可能性がある。PI3キナーゼ阻害剤は、細胞増殖や細胞生存を阻害することにより、抗がん剤として期待されている。そのひとつLY294002の大腸がん細胞死のマイクロアレイ発現解析により、本阻害剤が、ATF3を誘導することを見出した。その作用機序を解析したところ、1)LY294002は、本来のPI3 kinase阻害剤としての機能と非依存性にEgr1を誘導し、それがATFプロモーターを活性化することを明らかにした。以上の結果は、ATFが発がん、がん抑制に関わることを示すものである。さらに、ATF3の生物機能をさらに解析するために組織特異的ATF3ノックアウトマウスを作成中である。
大気海洋生物化学循環モデルを用いた地球表層酸化還元環境史の解明

地球誕生直後にはほぼゼロであった大気酸素濃度は,原生代初期に急激に上昇したことが地質記録から示唆されている(大酸化イベント).大酸化イベントは,当時の地球表層に生息していた生命に多大な影響を与えたことが予想される.そこで本研究では,大酸化イベントのメカニズムや規模を明らかにし,酸素濃度変動の生命進化への寄与を評価することを目指した.昨年度までの研究では,大気海洋生物化学循環モデルを用いた数値シミュレーションを行い,酸素濃度上昇の原因,変動の規模や時間スケールを定量的に明らかにした.その結果,全球凍結後の温暖気候下で生じるシアノバクテリアの大繁殖を引き金として,低濃度から高濃度への,大気酸素濃度の多重安定状態間遷移が起きうることが示された.計算結果と地球化学記録との比較からは,遷移に伴って,酸素濃度は一時的に現在と同じレベルにまで上昇し,その状態が1億年程度継続したらしいこともわかった(酸素濃度の『オーバーシュート』).本年度は,このような大規模かつ長期的な酸素濃度の変動が,生命進化どのように寄与したかを推定した.酸素濃度変動に対する生命の応答を知る手がかりとして,シアノバクテリアの抗酸化酵素[SOD(Superoxide dismutase)]の進化に着目した.酸素濃度の変動は,SODの発現量に変化をあたえたはずである.タンパク質の発現量は一般に,プロモーター配列とよばれるDNA配列によって制御されている.本研究では,分子系統解析によって,過去のプロモーター配列(祖先型プロモーター配列)を推定し,そのDNA配列から過去の酵素の発現量の変化を見積もった.その結果,SODの発現量は,シアノバクテリア誕生時には低かったものが,大酸化イベントと同時期に増加していたことが明らかになった.これは,大酸化イベントが直接的に生命の進化に影響を与えていたことを示す初めての研究例といえる.27年度が最終年度であるため、記入しない。27年度が最終年度であるため、記入しない。地球大気の酸素濃度上昇史の解明は,地球史学における長年の重要課題である.地球誕生直後にはほぼゼロであった大気中酸素濃度は,原生代初期と後期の全球凍結直後に上昇し,生命進化に寄与したと考えられている.しかし,実際の上昇過程は未だ明らかでない.本研究では,酸素濃度の変動と密接な関わりをもつ微量金属元素の挙動に着目し,酸素濃度変動史の解明を目指す.地球表層(大気・海洋・岩石圏)における微量金属元素の存在度は,酸素濃度の指標となるだけでなく,生物活動を介して酸素濃度と相互作用する.そのため,本研究では新しい試みとして,微量金属元素,生物活動,および酸素濃度の三者の変動を統合的に解く数理モデルを開発する.そして,数値計算と地質記録との比較から酸素濃度上昇過程を解明することを目指す.本年度は,まず微量金属元素の挙動を計算する土台となる鉛直一次元大気海洋化学循環モデルを開発した.本研究が対象とする原生代の大気海洋にも対応可能なモデルとするため,既存の海洋モデルに対し以下の改良を加えた:(1)大気ボックスモデルの結合,(2)メタン循環導入, (3)貧酸素環境下の硫黄循環導入(4)鉄(Fe)・マンガン(Mn)酸化還元反応の導入を行った.作成したモデルを用いて,原生代初期全球凍結直後を模擬した数値計算を行い,結果を地質記録と比較した.計算の結果,退氷直後の海洋中では,酸素濃度上昇に伴ってFe, Mn酸化物の沈殿が1万年程度の時間スケールで起きることが明らかになった.約10万年後には炭酸塩鉱物の沈殿が起こり,さらにその後には海洋中の硫酸濃度が数千万年の長期にわたって上昇し,硫酸塩の沈殿が起こりうる可能性も示した.この結果は,全球凍結後の一連の地質記録(南アフリカ共和国,トランスバール累層群)を,初めて定量的かつ整合的に説明するものである.本研究からは,全球凍結後に酸素濃度の上昇に対し重要な役割を担っていたことが強く示唆される.地球大気中の酸素は,地球誕生直後にはほとんど存在しなかったが,原生代初期(約22億年前)と原生代後期(約6億年前)の全球凍結イベント後に急激に増大したことが地質記録から示唆されている.酸素濃度上昇イベントと同時代には最古の真核生物と多細胞動物の化石がそれぞれ産出していることから,全球凍結イベント,酸素濃度上昇,そして生命進化との間の関連性が古くから注目されてきた.酸素濃度上昇イベンの原因,メカニズム.全球凍結との因果関係を明らかにすることは,地球生命史を理解する上で非常に重要である.さらに近年の新しい知見として,原生代初期酸素濃度上昇イベントが単なる一方向的・短期的なものではなく,億年スケールの大規模なオーバーシュートを伴っていたらしいことが明らかになってきた.本年度はこの“オーバーシュート仮説"に着目し,全球凍結によってこのような大規模酸素濃度変動を示す地球化学記録を説明できるか検証した.鉛直一次元海洋生物化学循環モデルと大気光化学反応を組み込んだ大気-海洋結合ボックスモデルを用いて計算したところ,スノーボールアース・イベント後には急激な酸素濃度上昇に伴って,海洋中硫酸イオン濃度が大きく上昇することが分かった.硫酸イオン濃度が上昇した環境は約1億年継続する.一方,酸素濃度のオーバーシュートに伴って,海洋の深層まで富酸素化することも明らかになった.

さまざまな氷河時代の規模を想定して感度実験を行った結果,前述の地球化学記録を最もよく説明するのは,全球が完全に凍結する“ハードスノーボールアース"を想定した場合の計算結果のみであることもわかった.以上の結果からは,全球凍結イベントが地球化学記録によって示唆される酸素濃度オーバーシュートの原因となりうることが示唆される.地球誕生直後にはほぼゼロであった大気酸素濃度は,原生代初期に急激に上昇したことが地質記録から示唆されている(大酸化イベント).大酸化イベントは,当時の地球表層に生息していた生命に多大な影響を与えたことが予想される.そこで本研究では,大酸化イベントのメカニズムや規模を明らかにし,酸素濃度変動の生命進化への寄与を評価することを目指した.昨年度までの研究では,大気海洋生物化学循環モデルを用いた数値シミュレーションを行い,酸素濃度上昇の原因,変動の規模や時間スケールを定量的に明らかにした.その結果,全球凍結後の温暖気候下で生じるシアノバクテリアの大繁殖を引き金として,低濃度から高濃度への,大気酸素濃度の多重安定状態間遷移が起きうることが示された.計算結果と地球化学記録との比較からは,遷移に伴って,酸素濃度は一時的に現在と同じレベルにまで上昇し,その状態が1億年程度継続したらしいこともわかった(酸素濃度の『オーバーシュート』).本年度は,このような大規模かつ長期的な酸素濃度の変動が,生命進化どのように寄与したかを推定した.酸素濃度変動に対する生命の応答を知る手がかりとして,シアノバクテリアの抗酸化酵素[SOD(Superoxide dismutase)]の進化に着目した.酸素濃度の変動は,SODの発現量に変化をあたえたはずである.タンパク質の発現量は一般に,プロモーター配列とよばれるDNA配列によって制御されている.本研究では,分子系統解析によって,過去のプロモーター配列(祖先型プロモーター配列)を推定し,そのDNA配列から過去の酵素の発現量の変化を見積もった.その結果,SODの発現量は,シアノバクテリア誕生時には低かったものが,大酸化イベントと同時期に増加していたことが明らかになった.これは,大酸化イベントが直接的に生命の進化に影響を与えていたことを示す初めての研究例といえる.本年度は近年提唱されるようになってきた酸素濃度のオーバーシュート仮説に着目し,研究を行った,当初計画では,海洋鉛直一次元モデルに微量金属元素であるモリブデンの挙動を導入することにより計算結果と地質記録との比較を行なう予定であった.しかし,オーバーシュート仮説検証には貧酸素環境下における硫黄循環をモデルに導入することがより本質的であったため,本年度は既存の海洋鉛直一次元モデルの硫黄循環を改良することを主な目的として研究を行なった.その結果,スノーボールアース・イベントによって酸素濃度オーバーシュート仮説が説明できることを示すことができた.この研究の一部は国際誌に論文として投稿し,掲載された.また,国際学会で口頭発表・およびポスター発表を行なったほか,国内学会においても口頭発表した.したがって,酸素濃度上昇イベントを数理モデルにより定量的に理解し,地質記録と比較するという本研究は,おおむね順調に進展しているといえる.27年度が最終年度であるため、記入しない。本年度の研究によって,原生代初期酸素濃度イベントの理解が大きく進んだと言える.今後の課題は,原生代後期酸素濃度上昇イベントの原因・メカニズム・上昇レベルや時間スケールを定量的に明らかにすることである.また,これら酸素濃度上昇イベントが生命進化に与えた影響についても,明らかにする必要が有る.
人工的な代謝酵素複合体（人工メタボロン）の構築と分子設計基盤の確立

代謝酵素複合体(メタボロン)とは、細胞内において代謝生合成経路を構成する酵素群が集合することで形成される巨大な酵素複合体である。このメタボロン形成によって、代謝反応を担う各酵素間で、基質と生成物が円滑に受け渡されることにより、代謝中間体が細胞質中に拡散することなく、低濃度の基質・酵素存在下においても代謝反応が効率良く進行すると考えられている(基質チャネリング効果)。本研究では、植物バイオマス分解酵素複合体(セルロソーム)の骨格タンパク質ー酵素間相互作用を利用して、人工的な代謝酵素複合体(人工メタボロン)を試験管内・細胞内において構築し、メタボロン形成効果と基質チャネリング効果の解析を行うことを目的とした。平成30年度は、酵素複合体化による生合成量改善効果の汎用性を検討するため、従来研究対象にしていた微生物由来色素化合物の生合成系や、植物由来抗腫瘍活性物質の生合成系に加え、植物由来抗酸化活性物質の生合成系を対象に、植物バイオマス分解酵素複合体の骨格タンパク質を用いて、大腸菌内における人工代謝酵素複合体(人工メタボロン)の細胞内形成を試みた。その際、酵素複合体化による生合成量の更なる改善を目的として、従来から用いていたサイズの小さな複合体を形成する短鎖骨格に加え、サイズの大きな複合体を形成できる長鎖骨格の使用を検討した。放線菌ファージ由来インテグラーゼを用いて、大腸菌ゲノムへの植物由来抗酸化活性物質の生合成酵素遺伝子群の導入を行い、大腸菌による植物由来抗酸化活性物質の生合成と、複合体骨格遺伝子(短鎖骨格遺伝子と長鎖骨格遺伝子)の大腸菌への導入を確認した。また、試験管内においてメタボロン形成効果と基質チャネリング効果を解析するため、微生物由来色素化合物生合成系の試験管内再構成を行い、微生物由来色素化合物の試験管内生合成を確認した。平成30年度が最終年度であるため、記入しない。平成28年度は、微生物由来色素化合物の生合成系をモデルとして、植物バイオマス分解酵素複合体の骨格タンパク質を用いて、大腸菌内において人工代謝酵素複合体(人工メタボロン)の細胞内形成を行い、メタボロン形成効果の評価アッセイ系の構築を行った。放線菌ファージ由来インテグラーゼを用いて、大腸菌ゲノムへ生合成酵素遺伝子群の導入を行い、複合体骨格遺伝子を導入した細胞と、導入していない細胞の生合成産物の合成量の比から、メタボロン形成効果を評価した。その結果、植物バイオマス分解酵素複合体の骨格タンパク質を用いて生合成酵素を複合体化した場合、複合体化していない場合と比較して、色素化合物の生合成量が増加する結果を得た。ゲノム上への遺伝子導入は、プラスミドへの遺伝子導入よりも、長鎖のDNAが導入可能であるため、生合成遺伝子数の多い生合成系への適用が可能になると期待される。微生物由来色素化合物の生合成系をモデルとして、植物バイオマス分解酵素複合体の骨格タンパク質を用いて、大腸菌内において人工メタボロンの細胞内形成を行った。生合成酵素を複合体化した場合、複合体化していない場合と比較して、色素化合物の生合成量が増加する結果を得た。この系は、次年度以降、試験管内において人工メタボロンを形成し、生合成量の改善効果を解析してゆく対象となるため、研究はおおむね順調に進展していると言える。平成29年度は、植物由来抗腫瘍活性物質の生合成系をモデルとして、植物バイオマス分解酵素複合体の骨格タンパク質を用いて、大腸菌内において人工代謝酵素複合体(人工メタボロン)の細胞内形成を行い、メタボロン形成効果の評価アッセイ系の構築を行った。前年度に行った微生物由来色素化合物の生合成系酵素遺伝子群のゲノム導入と同様の手法で、放線菌ファージ由来インテグラーゼを用いて、大腸菌ゲノムへ生合成酵素遺伝子群の導入を行い、複合体骨格遺伝子を導入した細胞と、導入していない細胞の生合成産物の合成量の比から、メタボロン形成効果を評価した。

その結果、生合成酵素を複合体化した場合と、複合体化していない場合を比較して、前年度に試験した色素化合物と同様に、抗腫瘍活性物質においても生合成量が増加する結果を得た。微生物由来色素化合物、並びに植物由来抗腫瘍活性物質の生合成系をモデルとして、植物バイオマス分解酵素複合体の骨格タンパク質を用いて、大腸菌内において人工的な代謝酵素複合体(人工メタボロン)の細胞内形成を行った。生合成酵素を複合体化した場合と、複合体化していない場合を比較して、色素化合物、抗腫瘍活性物質共に生合成量が増加する結果を得た。一方、複合体化に必要な骨格結合ドメインの融合が、酵素種によっては酵素活性に不利に働く場合があることが判明したが、複合体化による生合成量の改善効果は、いずれの生合成系においても確認されているため、研究はおおむね順調に進展していると言える。代謝酵素複合体(メタボロン)とは、細胞内において代謝生合成経路を構成する酵素群が集合することで形成される巨大な酵素複合体である。このメタボロン形成によって、代謝反応を担う各酵素間で、基質と生成物が円滑に受け渡されることにより、代謝中間体が細胞質中に拡散することなく、低濃度の基質・酵素存在下においても代謝反応が効率良く進行すると考えられている(基質チャネリング効果)。本研究では、植物バイオマス分解酵素複合体(セルロソーム)の骨格タンパク質ー酵素間相互作用を利用して、人工的な代謝酵素複合体(人工メタボロン)を試験管内・細胞内において構築し、メタボロン形成効果と基質チャネリング効果の解析を行うことを目的とした。平成30年度は、酵素複合体化による生合成量改善効果の汎用性を検討するため、従来研究対象にしていた微生物由来色素化合物の生合成系や、植物由来抗腫瘍活性物質の生合成系に加え、植物由来抗酸化活性物質の生合成系を対象に、植物バイオマス分解酵素複合体の骨格タンパク質を用いて、大腸菌内における人工代謝酵素複合体(人工メタボロン)の細胞内形成を試みた。その際、酵素複合体化による生合成量の更なる改善を目的として、従来から用いていたサイズの小さな複合体を形成する短鎖骨格に加え、サイズの大きな複合体を形成できる長鎖骨格の使用を検討した。放線菌ファージ由来インテグラーゼを用いて、大腸菌ゲノムへの植物由来抗酸化活性物質の生合成酵素遺伝子群の導入を行い、大腸菌による植物由来抗酸化活性物質の生合成と、複合体骨格遺伝子(短鎖骨格遺伝子と長鎖骨格遺伝子)の大腸菌への導入を確認した。また、試験管内においてメタボロン形成効果と基質チャネリング効果を解析するため、微生物由来色素化合物生合成系の試験管内再構成を行い、微生物由来色素化合物の試験管内生合成を確認した。大腸菌細胞内において確認した人工メタボロン形成による生合成量の改善効果を解析するため、試験管内での人工メタボロン形成を行う。試験管内において、生合成酵素群を複合体化した場合と、複合体化していない場合の生合成産物の合成速度の比から、メタボロン形成効果を評価する。また、植物由来抗腫瘍活性物質を対象に、大腸菌細胞内における人工メタボロン形成を行い、色素化合物の生合成系を対象に確認した、酵素複合体化による生合成量の改善効果が生じるか検討する。
細胞間接着弛緩による肝再生開始機構の解明-ヘパリン結合性FGF様増殖因子遺伝子発現機構の検討

HB-EGFは強力な肝細胞増殖促進作用を有し、部分肝切除後の残存肝において他の増殖因子と異なりDNA合成に先立ち発現することから、肝再生早期に重要な役割を果たしていることを報告してきた。肝再生の分子機構を考える上で、その開始機構を明らかにする必要がある。肝切除後や肝壊死後には肝内細胞間の接着が弛緩することが知られておりこの細胞間接着の弛緩が肝再生開始の契機となり得るかをHB-EGF遺伝子発現に着目し検討した。まず、肝組織内でのHB-EGF産生細胞を同定するため70%肝切除後の残存肝をコラ-ゲナーゼ肝内潅流後、エリトリエーターにて各細胞を分画後ノーザン法にてHB-EGF遺伝子発現を検討した。その結果、類洞内皮細胞とクッパー細胞において肝切除後HB-EGF遺伝子発現の上昇を認め、これらの細胞が肝内における主なHB-EGFの産生細胞であることが明らかになった。そこで肝内におけるHB-EGFの産生細胞の1つである類洞内皮細胞のモデルとしてヒト臍帯静脈内皮細胞を用い、その単層培養系に抗カドヘリン抗体を添加し、HB-EGF遺伝子の発現を検討した。抗体の添加により細胞間接着の弛緩が観察され、抗体添加後2時間でHB-EGF遺伝子発現の著明な上昇を認めた。現在、マウス門脈に抗カドヘリン抗体を投与し、in vivoにおけるHB-EGF遺伝子発現の誘導と肝細胞増殖に関し検討中である。今回の検討により細胞間接着の弛緩によりHB-EGF遺伝子発現が誘導されることが明らかになり、これらのイベントが肝再生開始の契機となり得ることが示された。
ヒストンメチル化酵素結合阻害剤の開発と白血病治療への応用

エピジェネティック異常は様々な疾患に関与することが明らかとなり、それに伴いエピジェネティック分子を標的とした創薬(エピドラッグ)開発が加速している。中でもヒストンメチル化酵素DOT1Lの阻害剤は、様々な血液腫瘍の治療に有用であることが示されている。本研究ではRaPIDシステムと呼ばれる環状ペプチドライブラリスクリーニングの系を用いて、新規のDOT1L阻害剤を探索した結果、従来の低分子化合物とは異なる環状ペプチドを同定し、培養細胞でその効果を確認した。エピドラッグ開発における中分子化合物の前例は少なく、今後更なる発展応用が期待される。現在開発が進められているエピドラッグは標的エピジェネティック分子の酵素活性阻害を目的としたものが主体であるが、それら分子の多くは生命維持に不可欠であることから副作用が懸念される。本研究ではMLL融合白血病の発症がヒストンメチル化酵素DOT1LとMLL融合蛋白質との結合に依存することに着目し、この結合を阻害する低分子化合物を、ラージスケールの環状ペプチドライブラリーを用いて同定することを目的とする。H25年度はライブラリースクリーニングに用いる蛋白ドメインの決定を予定しており、複数の候補ドメインを提案していたが、最近の論文発表等から再度候補因子の見直しが必要となった。現在その作業が終了し、組換え蛋白の作製に入る予定である。一方同時進行でDOT1Lの酵素活性ドメインを用いて、ライブラリースクリーニング系の確認を行った。その結果、酵素活性阻害効果を有する化合物が得られ、現在その改変体などを作成して細胞への導入効果上昇を検討している。上記におけるライブラリースクリーニングは、東京大学理学研究科菅研究室との共同研究である。現在開発がすすめられているエピドラッグの多くは、標的となるエピジェネティック分子の酵素活性阻害を狙ったものが主体である。しかし多くの場合、エピジェネティック分子の酵素活性は細胞の恒常性維持や個体の生命維持に不可欠であることから、臨床応用の際に副作用が懸念される。本研究ではMLL融合白血病の発症が、ヒストンメチル化酵素DOT1LとMLL融合蛋白質との結合に依存することに着目し、この結合を阻害する低分子化合物を、ラージスケールの環状ペプチドライブラリーを用いて同定することを目的とする。H25年度からの継続研究で7種類の候補ペプチドが得られており、これら候補ペプチドについて、試験管内アッセイでその効力を評価検討した。その結果、1種類の有力な候補が絞り込めた。次にこの最有力候補について、細胞株を用いた効力の評価を行う予定であった。しかしこれが化学的に水や培地等に難溶解性であった。この候補を捨てて再スクリーニングを行うことも選択肢のひとつであったが、試験管内アッセイの結果が顕著であったことから、溶解性を上げるための改変を施す策を選択した。共同研究者によって、基本構造とその活性を保持したまま溶解性を改善すると予想される複数の改変体が作製された。それらを再度試験管内アッセイに供し、その活性を確認した。さらに複数の候補に普遍的に対応できるように、試験管内アッセイの最適化も並行して行った。次のステップとしてこの化合物を細胞に適用するために、培地への溶解性と毒性を確認予定である。最初のスクリーニングで7種類の候補ペプチドが得られたが、試験管内アッセイによる評価で有力な候補は1種類のみとなり、これが化学的に水や培地等に難溶解性であった。今後細胞株や個体への適用には溶解性を上げるための改変を施すことが必要不可欠であり、さらにこの難溶解性のために、試験管内アッセイの結果も実際の効力より低くなっている可能性が考えられた(=実際は10100倍の効力を有する可能性がある)。従って再スクリーニングを行うよりはこの最有力候補の改変体を作製し、そのうえで再度試験管内アッセイで効力を確認する戦略を選択した。現在のエピドラッグは標的分子の酵素活性阻害を目的としたものが主体であるが、それら分子の多くは生命維持に不可欠であることから副作用が懸念される。本研究ではMLL融合白血病の発症がヒストンメチル化酵素DOT1LとMLL融合蛋白質との結合に依存することに着目し、この結合を阻害する低分子化合物の同定を目的とした。DOT1Lと相互作用するMLL融合蛋白には複数存在し、DOT1Lとの結合ドメインが不明な分子が多い。DOT1Lとの結合ドメインが既知の分子であっても、結合ドメインがその分子本来の機能に必須であれば、そこに結合する化合物はその機能を阻害することから、本来の目的である「副作用の軽減」を満たさない可能性がある。そこで標的分子および標的ドメインを慎重に検討していた一方で、スクリーニングの陽性コントロールとして実施したDOT1L酵素活性阻害剤の方で陽性ヒットが得られた。さらに、既報のDOT1L酵素活性阻害剤が一部の非MLL白血病にも有効であると報告され、白血病治療に対してより普遍的な効果が期待されたことから、この新規に得られたDOT1L阻害剤(DOT1Li_#2)の評価を並行して継続することとした。DOT1Li_#2の阻害効果をin vitroで確認した後に、細胞株に添加したときの効果を確認する実験を行った。細胞株には、MLL融合蛋白依存性白血病細胞株(THP-1、U937)と非依存性白血病細胞株(K562、HL60)それぞれ2種類を用い、それらにおけるヒストンメチル化阻害の程度を検討した。その結果、DOT1Li_#2はMLL融合蛋白依存性白血病細胞株で顕著なメチル化阻害を呈した。しかしDOT1Li_#2添加時に軽度の沈殿物が認められたことから、DOT1Li_#2の水溶性向上のために改変体の作製が必要であると考えられる。

スクリーンングで得られた候補化合物が培地に難溶性を示したことから、予定していた細胞株の実験をさらに進めるためには、水溶性を改善する改変を施す必要が生じた。本研究ではMLL白血病治療に有効なDOT1L阻害剤の探索を目的としている。MLL融合蛋白質との結合阻害剤とDOT1Lの酵素活性阻害剤の2方面からアプローチしていたが、前者の設計上の問題と後者の普遍的有用性により、H27年度からは後者により注力して研究を進めている。その結果、環状ペプチドから成る新規DOT1L阻害剤DOT1Li_#2を同定し、細胞株におけるDOT1L活性阻害効果を確認した。しかし更なる検討評価のためには水溶性の改善が不可欠と判断したことから、H28年度は水溶性向上を目的として、DOT1Li_#2を基本骨格とした12種類の改変体を作製し、細胞株における評価を行った。その結果、1種類において水溶性の改善が認められたが、その阻害活性はDOT1Li_#2に比べて低下していた。その他11種類は水溶性が改善されなかったが、うち2種類において、DOT1Li_#2に比べて阻害活性が向上していた。さらにこの阻害活性はMLL融合白血病由来細胞株においてのみ認められ、その特異性が確認された。従って、これら2種類におけるin vivo応用に向けたさらなる改変が今後の課題であると考えられた。エピジェネティック異常は様々な疾患に関与することが明らかとなり、それに伴いエピジェネティック分子を標的とした創薬(エピドラッグ)開発が加速している。中でもヒストンメチル化酵素DOT1Lの阻害剤は、様々な血液腫瘍の治療に有用であることが示されている。本研究ではRaPIDシステムと呼ばれる環状ペプチドライブラリスクリーニングの系を用いて、新規のDOT1L阻害剤を探索した結果、従来の低分子化合物とは異なる環状ペプチドを同定し、培養細胞でその効果を確認した。エピドラッグ開発における中分子化合物の前例は少なく、今後更なる発展応用が期待される。溶解性などの問題点はあるが、有力な候補がえられたので、今後はこの候補とその改変体に注力してそれらの効力と毒性を細胞株を用いて確認していく。検討するサンプル数は多くないと考えられるため、試験管内アッセイの後は当初絞り込みのために計画していたELISAを経ずにそのまま細胞株での評価を行うことでスピードアップを図る。一方動物個体での検討のために新たな遺伝子改変マウスの作製を計画していたが、時間的な問題から、まずは既存のMLL白血病モデルマウスを用いる予定である。当初はDOT1Lと相互作用するMLL融合蛋白の結合阻害剤と、DOT1Lの酵素活性阻害剤(どちらも環状ペプチド)を並行して推し進める予定であったが、後者の難溶性改善のために時間を要していいること、さらに文献的に後者のより普遍的な有用性が高まったことから、残りの期間は後者の評価に専念することとする。28年度が最終年度であるため、記入しない。