hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
生物の環境センシング機能を基盤とした高感度な環境汚染物質検出システムの構築

本研究では、高感度な環境汚染物質検出システム構築のために必須となる、環境汚染物質をセンシングするセンサータンパク質調製のための構造基盤解明を行った。具体的には、鉄錯体の一種であるヘム(鉄ポルフィリン錯体)をセンシングするための構造基盤を明らかにするため、ヘムセンシング能を有する二種のヘム輸送タンパク質(Listeria monocytogenes由来のHupDおよびCorynebacterium glutamicum由来のHmuT)を対象とし、X線結晶構造解析、および各種分光学的手法を用い、これらヘム輸送タンパク質によるヘム分子のセンシング、ならびにヘム結合反応の分子機構解明を行った。本研究では、重金属汚染の有無を簡便かつ高感度に判定するシステムの開発を目的として研究を行う。重金属が存在する場合にのみ選択的に何らかのシグナルが発生するプローブ分子があれば、重金属の存在を選択的に検出することが可能である。そこで本研究では、重金属結合タンパク質中に存在する重金属結合モチーフと蛍光タンパク質を構成要素とする、FRET型蛍光プローブの設計・合成を目的として研究を行った。本年度は、効率的な重金属イオンセンサーモチーフを選択するため、各種細菌中で重金属イオンセンサーとして機能すると考えられている一連の転写調節因子の発現・精製系に関する検討を行った。その結果、Streptococcuspneumoniae中に含まれ、亜鉛センサーとして機能すると推定される転写調節因子SczA、およびLactococcus lactis中に含まれ、ヘム(鉄ポルフィリン錯体)センサーとして機能すると推定される転写調節因子HrtRの発現・精製系を確立することに成功した。大腸菌で発現したSczAの精製を行ったところ、SczAは鉄硫黄クラスターに特徴的な電子吸収スペクトルを示した。通常の条件下で精製を進めた場合、鉄硫黄クラスターに基づく吸収は次第に消失したことから、SczA中の鉄硫黄クラスターは、酸素に対して不安定であり、鉄硫黄クラスターの分解反応が進行していると考えられる。HrtRはホモダイマーとして存在しており、各サブユニット中の2つのヒスチジン(His72とHis149)がヘム軸配位子として機能することにより、ヘム分子をセンシング・結合することが分かった。高感度な重金属検出用プローブ分子の開発を目的とし、鉄錯体の一種であるヘム(鉄プロトポルフィリン錯体)センシング機能を有する新規なタンパク質の探索と、その詳細な性質解明を行った。病原性細菌であるL. monocytogenesは、鉄ポルフィリン錯体であるヘムの取込み系を有している。本研究では、このヘム取込み系においてヘムを選択的に認識するヘム結合タンパク質として機能し、ヘムトランスポータータンパク質に対してヘムを輸送する機能をもつと推定されるHupDタンパク質を研究対象とし、HupDによるヘムセンシング挙動の評価を行った。大腸菌を用いてHupDを発現させた場合、HupDはアポ型とホロ型の混合物として発現していることがわかった。精製したHupDは、412、530 nmにヘムに特徴的な吸収極大を示した。また、ここにヘミンを追加していくと、観測された吸収スペクトルの吸光度が増加した。ITCによりヘム結合反応を解析した結果、タンパク質あたり1分子のヘムが結合することが明らかとなった。HupDのESRおよびラマンスペクトルより、HupDに結合したヘムには2つのHisが軸配位していると推定された。HupD中に存在する3つのHisにそれぞれ変異を導入した変異体を調製し、それらのヘム結合挙動を調べた結果、His105およびHis259がヘム軸配位子であると推定される結果を得た。さらに別のヘム結合タンパク質として、Corynebacterium glutamicum由来のHmuT (CgHmuT)を対象とした研究も実施した。CgHmuTの結晶構造を1.4オングスローム分解能で決定し、得られた結晶構造をもとに、CgHmuTによるヘムセンシング機構の解明を行った。生体機能関連化学効率的な重金属イオンセンサーモチーフ設計の鍵となる二種の金属イオンセンサータンパク質の発現・精製系の確立に成功している。さらに、そのうちの一つであるHrtRタンパク質については、金属錯体センシング・結合反応に関与する金属イオン配位子の同定にも成功している。亜鉛センサーとして機能すると推定していたSczAが、鉄硫黄クラスターを結合しているという予期せぬ実験結果が得られた。SczA中に結合している鉄硫黄クラスターは、酸素に対して不安定であり、現時点では鉄硫黄クラスター結合型SczAを安定に精製し、その詳細な性質を解明するにはいたっていない。今後は、嫌気条件下で精製を進めることにより、精製途中での鉄硫黄クラスターの分解を回避し、鉄硫黄クラスター結合型SczAの精製標品を得て、その構造・機能の解明を進める予定である。

亜鉛センサーとして機能すると推定していたSczAが、鉄硫黄クラスターを結合しているという予期せぬ実験結果が得られたため、当初予定していた亜鉛タンパク質としてのSczAの精製、機能解析の実験を変更する必要が生じたため。当初の計画で予定していた使途に加え、酸素に対して不安定な鉄硫黄クラスター結合型SczAを精製するためのタンパク質精製用試薬の購入、およびSczAの構造解析のためのタンパク質結晶化用試薬の購入に使用する。
染色体導入・除去技術による迅速コンソミックマウス作製システムの構築

コンソミックマウス系統は多因子疾患の原因遺伝子の絞り込み・遺伝子の単離に大きな役割を果たしてきた。しかしながら、その作製過程には数年単位の時間と労力がかかることが課題であった。本研究では、染色体導入技術と染色体除去技術を組み合わせることで、細胞レベルでコンソミック系統を樹立し、その細胞を用いて迅速にコンソミックマウスを作製するためのシステム構築を目指した。具体的には細胞融合技術、染色体導入技術を駆使することで11番染色体が除去可能な129系統マウスES細胞にB6系統の11番染色体断片を導入することに成功した。本システムは迅速にコンソミックマウスを作製するための有用なシステムになると期待される。しかしながら、その作製過程には数年単位の時間と労力がかかる上に妊性低下などが原因で目的のマウスが得られないことが課題であった。本研究の目的は、染色体導入技術と染色体除去技術を組み合わせることで、細胞レベルでコンソミック系統を樹立し、短期間にコンソミックマウスを作製するためのシステム構築を目指す。本年は以下のステップで研究を進めた。1)薬剤耐性遺伝子(neo耐性)を挿入したB6マウス由来の胎仔線維芽細胞のFISH解析を行ったところ、マウス11番染色体に薬剤耐性遺伝子が挿入されていることを確認した。2)次に上記線維芽細胞と微小核細胞形成能を有するマウスA9細胞(BS耐性)とをポリエチレングリコールを用いて細胞融合した。その後、G418およびBSの二重薬剤選択により、A9形質を持った細胞株を取得し、PCR法、FISH法により、目的の染色体が導入されたドナーA9ハイブリッド細胞を作製した。本研究では、上記課題を解決するため染色体導入技術と染色体除去技術を組み合わせることで、細胞レベルでコンソミック系統を樹立し、短期間にコンソミックマウスを作製するためのシステム構築を目指した。昨年度に作製したマウス11番染色体を保持するA9細胞クローンからCHO細胞に微小核細胞融合法にてマウス11番染色体を導入した。BS耐性株をクローニングし、拡大培養後にPCR解析、FISH解析を行い、目的のマウス11番染色体がCHO細胞に導入できたクローンを選抜した。研究計画にかかげたステップを実行し、目的のマウス11番導入CHO細胞を獲得できたことから順調に進展したといえる。昨年度に作製したB6系統由来のマウス11番染色体を保持するCHO細胞クローンから129系統由来のマウスES細胞に微小核細胞融合法にてマウス11番染色体を導入した。薬剤耐性株をクローニングし、拡大培養後にPCR解析、FISH解析を行ったところ、129系統由来のマウスES細胞にB6系統由来のマウス11番染色体が導入できたものの、断片化したマウス11番染色体が導入されたクローンしか得られなかった。計画にかかげたステップを実行し、目的の染色体が導入されたドナーA9ハイブリッド細胞を作製できたことから、順調に進展したといえる。今後は上記B6系統由来のマウス11番染色体を129系統由来のマウスES細胞に導入し、129系統由来のマウス11番染色体を除去し、コンソミック細胞およびマウスを作製する予定である。染色体工学今後はB6系統由来マウス11番染色体を129系統由来マウスES細胞に導入し、129系統由来の11番染色体を除去する予定である。また、Y染色体など他の染色体のコンソミックES細胞も樹立する予定である。
細胞質リン酸ホメオスタシスに対して、液胞が果たす緩衝作用の分子的基盤の解析

リン酸イオンは、植物成長における三大栄養素の一つである。自然界で植物が利用可能なリン酸の土壌含有量は極めて小さいため(通常10μM以下)、多くの植物は常にリン酸飢餓状態にある。植物が生理機能を正常に遂行するためには、細胞質リン酸濃度を一定の値に保つ必要がある。この濃度維持機構をリン酸ホメオスタシスと呼び、細胞質のリン酸濃度を一定に保つために、液胞がリン酸のreservoirとして緩衝機能を持つことが知られている。本研究では、液胞がリン酸を蓄える機構および細胞質の必要に応じて液胞からリン酸を放出する機構がどの様に制御されているかを、特に液胞膜のリン酸輸送機構と細胞質のリン酸濃度認知機構に焦点を当てて明らかにすることを目的とする。この4年間のニチニチソウ培養細胞の単離液胞を用いた研究で、液胞のリン酸取り込み活性が、ATP、PPiによる液胞膜のエネルギー化に依存し、膜電位依存のチャネル輸送体を通して行われることが明らかになった。すでにこの輸送系の分子実体の解析を開始し、輸送体に共有結合すると思われるリン酸取り込み阻害剤を見いだし、その阻害剤をマーカーにリン酸輸送体の同定を進めている。本年度は、ゲノム情報が明らかになっているシロイヌナズナ培養細胞からの液胞単離条件を決定し、シロイヌナズナでも同様にリン酸輸送体の分子解析が進められることを明らかにできたので、液胞膜のプロテオーム解析が可能になるように膜標品の確保につとめるとともに、かずさDNA研究所の佐塚博士、RITEの横田博士、嶋岡博士の協力を得て、膜タンパク質のプロテオーム解析を可能にするための条件検討を行った。現在、一次元SDS泳動標品から質量分析計を用いてタンパク質の同定をするための可能性を検討している。さらに、車軸藻細胞を用いて、液胞膜・細胞膜のリン酸放出活性の実験を開始し、細胞膜からのリン酸放出に外部リン酸の存在が必要なことを見いだした。これについては、現在詳細を検討中である。自然界でのリン酸の土壌含有量は極めて小さいため(通常10μM以下)、多くの植物は常にリン酸飢餓状態にある。本研究では、液胞がリン酸を畜える機構および細胞質の必要に応じて液胞からリン酸を放出する機構がどの様に制御されているかを、特に液胞膜のリン酸輸送機構と細胞質のリン酸濃度認知機構に焦点を当てて明らかにすることを目的として研究を行っている。すでにこの数年間液胞膜を介したリン酸取り込み機構の解析を進めて来た。これまでは、主に大麦葉肉細胞の単離液胞膜を用いて検討を行ってきたが、リン酸の取り込み活性が必ずしも十分に高くないため、なかなか明確なデータを得ることが出来なかった。そこで、今年度は、^<31>P-NMRを用いたin vivo測定から液胞膜のリン酸輸送活性が極めて高いと考えられるニチニチソウの培養細胞を用いて実験を進めた。ニチニチソウの培養細胞は、大麦葉肉細胞と異なり、液胞単離系が知られていない。そこで、浸透圧ショックと密度勾配遠心法を用いて、可能な限り純粋な液胞をintactに近い状態で単離する系を確立することに成功した。この単離液胞を利用して、リン酸取り込み系とATP活性化機構について調べた。大麦液胞膜のリン酸輸送系が、リン酸欠乏状態でATPによって活性化されることはすでに我々が明らかにしている。ニチニチソウ単離液胞も、ATP及びPPiによってリン酸取り込みが活性化された。ATP依存性リン酸取り込み系のリン酸濃度依存性を調べたところ、液胞のリン酸取り込みは、濃度に依存して直線的に上昇した。H^+-ATPaseの特異的阻害剤であるBafilomycinがリン酸取り込みのATPによる活性下を阻害した。また、Kチオシアン酸もこれを阻害したことから、リン酸の液胞への取り込みが電位依存で、チャンネル様輸送体を経由することが強く示唆された。本研究では、液胞がリン酸を蓄える機構および細胞質の必要に応じて液胞からリン酸を放出する機構がどの様に制御されているかを、特に液胞膜のリン酸輸送機構と細胞質のリン酸濃度認知機構に焦点を当てて明らかにすることを目的として研究を行っている。すでに昨年度の研究で、ニチニチソウ培養細胞液胞膜のリン酸輸送活性が極めて高いことを見いだし、単離液胞を用いたリン酸取り込み活性測定系を確立した。本年度は、この液胞へのリン酸取り込み活性の生理機構と分子レベルの性質を検討した。リン酸は取り込みは、ATP及びPPiによって活性化され、H^+-

ATPaseの特異的阻害剤であるBafilomycinで阻害される。ATPに対するK_mはおよそ5mMであった。Kチオシアン酸で強く阻害されるが、NH_<24>Clでは阻害がかからないことから、リン酸は、H^+ポンプによって液胞膜に形成された膜電位に依存して、液胞内に取り込まれることが明らかとなった。また、硫酸イオンやリン酸イオンのアナログと考えられるクロム酸によって強い阻害がかかった。さらに、各種アニオン輸送体の阻害剤の内、DIDSが特異的にリン酸輸送活性を阻害した。現在、この阻害剤反応性を利用して、輸送担体の同定を進めている。また、リン酸欠乏下でのリン酸輸送活性の変動を調べたところ、リン酸欠乏下で単離液胞のリン酸取り込み活性が顕著に上昇することが明らかとなった。現在この活性化機構についても検討中である。リン酸イオンは、植物成長における三大栄養素の一つである。自然界でのリン酸の土壌含有量は極めて小さいため(通常10μM以下)、多くの植物は常にリン酸飢餓状態にある。植物が生理機能を正常に遂行するためには、細胞質リン酸濃度を一定の値に保つ必要がある。この濃度維持機構をリン酸ホメオスタシスと呼び、細胞質のリン酸濃度を一定に保つために、液胞がリン酸のreservoirとして緩衝機能を持つことが知られている。本研究では、液胞がリン酸を蓄える機構および細胞質の必要に応じて液胞からリン酸を放出する機構がどの様に制御されているかを、特に液胞膜のリン酸輸送機構と細胞質のリン酸濃度認知機構に焦点を当てて明らかにすることを目的として研究を行っている。昨年度までの研究で、ニチニチソウ培養細胞液胞膜のリン酸輸送活性が極めて高いことを見いだし、単離液胞を用いたリン酸取り込み活性測定系を確立することで、リン酸輸送の生理機構、リン酸輸送体のリン酸分子に対する親和性、濃度依存性、阻害剤感受性などを明らかにした。今年度は、昨年度からの続きで、リン酸欠乏下でのリン酸輸送活性の変動を調べ、リン酸欠乏下で単離液胞のリン酸取り込み活性が顕著に上昇することが明らかにするとともに、その活性化機構の一部が、液胞膜リン酸輸送系のエネルギー供給に機能するプロトンポンプの活性化に由来することを明らかにした。また、この際の活性化が、単なるポンプタンパク質の量的変動ではなく、タンパク質レベルの機能修飾によることを見いだした。現在、このリン酸欠乏下における液胞膜プロトンポンプの機能修飾機構を検討するとともに、リン酸輸送体の同定を進めている。
機能エレメントと深層学習に基づく長鎖ノンコーディングRNAの機能分類

ヒトなどの高等生物では,タンパク質に翻訳されずにRNAのまま機能を発揮する長鎖ノンコーディングRNA(lncRNA)が数多く存在していることが示唆されているがその大部分の機能は未解明である.lncRNAの機能エレメントを同定するための研究として,下記の研究を行った.-リピートに結合するRBPの網羅的同定:我々の過去の研究で,lncRNAの組織特異的発現にリピート要素が関連していることを示したが,さらなる機能解析を進めるために,リピートに結合するlncRNAの同定を行った.現在結果を詳細に検討中であり,今年中に論文として出版することを計画している.m6A,リボソーム結合,タンパク質結合,RNA結合など様々な機能エレメントの同定に向けた情報解析や解析に必要な情報技術の構築を行うことができたためこれまでに得られた知見を基づいて,lncRNAの機能推定に寄与するデータベースを構築する-lncRNAの組織特異的発現に関与する機能エレメントとしてトランスポゾンを同定:lncRNAはmRNAと比べると組織特異的な発現を示しやすいことが特徴の一つである。またlncRNAにはmRNAとは異なり多くのトランスポゾン由来の配列が含まれていることが知られている。申請者はこの点に着目し、トランスポゾンと組織特異的発現について網羅的に調べた結果、複数のトランスポゾンがlncRNAの組織特異的発現に寄与していることが明らかとなった。また、トランスポゾンL1PA2がlncRNAの胎盤特異的な発現に寄与していることが判明し、その生物学的メカニズムについて詳細に解析を行った。-RNA-RNA相互作用データベースLncRRIdb(http://rtools.cbrc.jp/LncRRIdb/xsearch.cgi)を構築した:RNA-RNA相互作用を網羅的に格納したデータベースを構築し一般に公開した。このデータベースでは、発現情報および細胞内局在の情報が含まれ、これらを用いて絞込が行えるようになっている(論文投稿中)。- RNA修飾がlncRNAの機能エレメントとなっている可能性が示唆されている。そこで、深層学習技術を用いてm6AをRNAの配列から推定する手法の開発を行い、既存手法に比べて高精度で推定が行えることが示せた(論文準備中)- robosomeが結合するlncRNAをRibo-seqのデータから定義を行い、その特徴について詳細に調べた(論文印刷中)。ribosomeは翻訳のためにmRNAに結合することが一般的であるが、lncRNAに対してもribosomeが結合していることが知られている。このようなribosomeが結合するlncRNAを実験データより定義しその性質を詳細に調べた機能エレメントの同定および同定につながる複数の研究を行い、成果が得られているためヒトなどの高等生物では,タンパク質に翻訳されずにRNAのまま機能を発揮する長鎖ノンコーディングRNA(lncRNA)が数多く存在していることが示唆されているがその大部分の機能は未解明である.lncRNAの機能エレメントを同定するための研究として,下記の研究を行った.-リピートに結合するRBPの網羅的同定:我々の過去の研究で,lncRNAの組織特異的発現にリピート要素が関連していることを示したが,さらなる機能解析を進めるために,リピートに結合するlncRNAの同定を行った.現在結果を詳細に検討中であり,今年中に論文として出版することを計画している.m6A,リボソーム結合,タンパク質結合,RNA結合など様々な機能エレメントの同定に向けた情報解析や解析に必要な情報技術の構築を行うことができたため機能エレメントの同定はこれまで通り進める。さらに、エレメントの組み合わせと機能の関連性を明らかにするための研究を行うこれまでに得られた知見を基づいて,lncRNAの機能推定に寄与するデータベースを構築する
皮膚系機能解析のための簡易的バイオマーカー計測法の開発

ヒト皮膚表面には脂肪酸や糖化物質などの生理的状態のマーカーとなる分子が現れるので、それらを非侵襲的かつ非破壊的に簡便に計測する(皮膚機能解析)方法を開発することを目標として研究を行った。その結果、主要な成果として3つ得られた:1)乳酸マグネシウムは定常的に皮膚表面に出てそれは効果的に皮下のヒスタミン合成を低下させた、2)摂取したDHA脂肪酸が口唇表面に現れる様子には男女差があった、3)糖尿病のマーカーであるHbA1c値をFTIR測定法で予測することができるようになった。当初H22年度の研究実施計画には脂肪酸代謝の測定と口唇の脂肪酸組成解析方法を明らかにし、23年度には糖尿病の診断のために口唇や皮膚での糖化物質の解析を行うこととしたが、糖尿病診断法開発の緊急性に鑑み、実施順序を入れ替えることとし、22年度に前倒しで糖尿病診断法開発の研究を行った。【H22年度の実施研究内容】H22年3月までに医学系研究科倫理審査委員会の承諾を得て、当研究室で開発した口唇測定用FTIR-ATR装置を病院外来に持ち込み、医師の指導のもと、5月までに糖尿病などの患者28名の口唇および顔面皮膚の赤外スペクトル測定を行った。そのスペクトルデータと、被験者の血液データ(血糖値、HbAlc値など)と比較し、スペクトルデータから被験者の糖尿病のマーカー分子であるHbAlc値を実用的なレベルで予測できるPLSプログラムを開発した。また、HbAlc値の予想に使った赤外スペクトルの内、最も敏感に変動する赤外吸収波数を検討し、その物質的根拠の探索を行った。【結果と意義】口唇および顔面(顎)皮膚の赤外スペクトルから、様々なピーク波数を組み合わせて比率の計算値を求め、被験者の血糖値やHbAlc値との相関を見たところ、有意に正の相関を示す波数の組み合わせを見出した。さらに、PLS法を使って、検出力88%で被験者のHbAlc値を予想することができた。赤外スペクトルのうち、1300cm-1前後にあるピークがHbAlc値の変動に敏感な赤外吸収の一つであったが、その由来を探索したところ、カルボキシメチルルリジン(AGEsの一つ)にもそのようなピークがあることを見出した。これらのことは、口唇や皮膚の赤外スペクトル変化で糖尿病のマーカー分子を捉えられたことを示唆している。【重要性】糖尿病の病態診断に口唇や皮膚の赤外分析が使えるので、新しい診断装置開発の基礎が築かれた。H22年度に糖尿病診断法開発の研究を行ない、口唇や皮膚の赤外スペクトル変化で糖尿病患者を含めた被験者のHbAlc値の予測を、有意に行うことができることが分かった。しかし、まだ十分には予測手法を確立できていなかったので、論文がまだペンディング状態でいた。【H23年度の実施研究内容】H23年度には、引き続き予測手法の開発をすすめ、ようやくPLS法の核心的なキャリブレーション領域を複数見出すことができた(投稿準備中)。この進展の背景には、口唇や皮膚表面の糖化物質(糖尿病のマーカー分子)としてカルボキシメチル(CM)化アミノ酸やCM化エタノールアミンリン脂質が赤外スペクトル変化にかなり寄与していることが解析できたことがある。また、血清中の極長鎖脂肪酸の蓄積症を赤外分析で簡便迅速に予測できるかの検討もおこなった。さらに、被験者7名でDHA(ドコサヘキサエン酸)入ヨーグルト摂取により、口唇表面にDHAが摂取後どれくらいの時間で現れるかを測定したところ、30分後から増加傾向があり3時間後に有意にDHAが口唇表面に現れることを確認できた。【結果と意義】PLS法を改良し、さらにHbAlcの検出感度を高めることが出来て、糖尿病スクリーニング検査として赤外分析が有用であることを示すことができた。さらに、血清や口唇組織をin situで非破壊的に脂肪酸代謝の変化の測定に使うことができることを再確認することができた。【重要性】皮膚という簡易的に測定することの出来る部位を使うと、糖尿病に関連する糖化物質の変化をモニターすることで診断に使うことが出来、さらに様々な脂肪酸代謝を定量的非侵襲的に測定することができることが分かり、より実用性に近づいた。H24年度はその前の年度に行った糖尿病の診断のための臨床試験のデータをより確実なものとするために、補足的な実験を行い、論文発表を早期に行うことを目標とした。方法としては、大学病院の外来で,担当医師の協力を得ながら,測定装置を持ち込んで糖尿病の患者を含む被験者28名の口唇の赤外スペクトルを測定した。特に最終糖化産物であるカルボキシ

メチル(CM)化アミノ酸(Arg)やCM-リン脂質(PE)は13001400cm-1付近に比較的強い赤外吸収を持っているのでその辺りの波数領域を含んでPLS解析を行なってHbA1c値の予想をおこなった。その結果、糖尿病の診断、特にHbA1c値6.5%以上のスクリーニングのためにFTIRによる口唇の測定を行った。その結果、まずHbA1c値が6.5%以上のグループとそれ以下のグループの口唇の赤外スペクトルを比較すると,その差スペクトルパターンはカルボキシメチル化体など一部のAGEsの赤外スペクトルとよく似ていた。測定スペクトルに,PLS法を適用して各被験者のHbA1c値を予測した所,相関係数R=0.82と非常に良く予測することができた(n=25)。またその予測のときに出た擬陰性の人たち2名(16名中)は,さらに口唇のトランス型不飽和脂肪酸由来の968cm-1の赤外吸収強度による分類を付け加えることですべて見出し,高HbA1c値(6.5%以上)の被験者を100%スクリーニングすることが可能であった。このことは、口唇表面に出てくるCM化生体分子は糖尿病のマーカー分子として有用であることを示している。これらの成果は、米国薬学会のJ. Pharm. Biomed. Anal.誌(76 (2013) 169-176.)に発表することができた。目的は、皮膚に現れる脂肪酸などの生理的状態のマーカーとなる分子を非侵襲的かつ容易に測定できる方法を開発し病態診断あるいは体調管理に応用する、ということであった。これまでの研究で、口唇表面を使った赤外分析により、糖尿病のマーカーであるHbAlc値を予想したり、脂肪酸の変動を測定できるようになったので、順調に進展していると判断できる。24年度が最終年度であるため、記入しない。今後、最後の年度では、予測的多変量解析であるPLS法をさらに最適化して実用に結びつける研究をおこない、糖尿病診断の根拠となる皮膚に現れるカルボキシメチル化物質の定量的分析をおこない、さらにDHAや極長鎖脂肪酸の変動を予測するアルゴリズムを開発することを目指す。そして、できるだけ論文としてまとめ、早く出版していく。
船体構造に作用する荷重の位相差を考慮した船体疲労強度設計法に関する研究

船体に作用する様々な荷重によって船体構造部材に発生する応力を求めるためには、各波条件ごとにすべての荷重を重畳させて船体構造解析を行う必要がある。これは、それぞれの荷重が様々な位相差を持って船体に作用するため、単一荷重ごとの応力応答がわかったとしても、それぞれの応力をどのような位相差で重ね合せるのか、という問題が生ずるからである。しかしながら、このような各荷重の組み合わせを考慮して応力の応答関数を計算するには莫大な量の構造解析を伴う。本研究では、まず、このような構造解析を忠実に実行し、各荷重間の位相差を厳密に考慮した応力の応答関数を求める。次に、その結果を踏まえ、応力応答関数の簡易的重畳法を考案し、実際の船体構造設計に適用できる実用的な設計法の開発を行うことを目的とする。検討対象をダブルハルVLCCとして、波浪変動圧(外圧)と船倉内変動圧(内圧)が同時に作用する場合について、位相情報を含まないそれぞれの荷重による応力応答関数が求められているとして、これらの応答関数を重畳してある部材の応力応答関数を推定する方法について検討を行った。検討の結果、波浪変動圧については、その代表位相を波上側の静止喫水線での圧力の位相と定め、船倉内の変動圧についてはその代表位相を載荷状態と応力点により適宜定め、応力の重畳式によって応力応答関数を重ね合わせる手法を提案した。試解析の結果、推定された応力応答関数より計算された短期パラメータは、厳密に求めた短期パラメータとほぼ良好な一致を示すことがわかった。ただし、満載状態においては、センタータンクとウィングタンクの境の縦通隔壁近傍の構造部材応力の推定精度には若干の問題があることが判明したため、今後、より詳細な検討が必要であると考える。船体に作用する荷重には、波浪による生ずる断面力の他に、船体断面に働く波浪変動圧と船倉内変動圧があり、船体構造にはこれらの荷重がさまざまな位相差を持って作用する。この内、波浪変動圧については、その分布形状が空間的・時間的に変化するため、船体構造部材に発生する応力を求めるためには、波条件ごとに構造解析を行う必要が生ずる。さらに、複数の荷重が作用する場合には、単一荷重によるの応力応答が求められたとしても、それぞれの応力の位相差を考慮して応答関数を重畳させる必要があるが、この位相差をどう取るかは人きな問題である。このように、各荷重の組み合わせを考慮して応力の応答関数を求めるには、通常、莫大な量の構造解析を伴う。本研究では、各荷重による応力の応答関数を求め、その結果より、簡易的に応力応答関数を重ねあわせ、実際の船体構造設計に適用できる実用的な設計法の開発を行うことを目的とする。本年度は、まず、船体構造に作用する荷重として波浪変動圧と船倉内変動圧を取り上げ、それぞれの荷重による応力の応答関数を求めた。次に、波浪変動圧および船倉内変動圧の代表位相差を仮定することによって、各応力応答関数を重ねあわせ、内・外圧が共に加わる場合の応力応答関数を近似的に計算した。ここで、波浪変動圧の代表位相差としては、研究代表者が以前に考案した「波上側静止喫水線上の圧力の位相差」を用い、船倉内変動圧の代位表位相差としては、各加速度成分の位相差を用いて、結果を考察した。これより、船倉内変動圧の代表位相差は、船倉の位置によって一意に決まらないことが判明した。来年度以降は、この船倉内変動圧の代表位相差についてより詳細に検討を行い、船倉内変動圧の代表位相差について考察を行い、さらに波浪断面力との重畳も考慮して、簡易的な応力の応答関数重畳法の検討を行う予定である。最近の船体疲労強度検討では疲労き裂伝播解析に基づく手法が用いられている。

波浪中を航行する船舶のき裂伝播解析を行う場合、波浪の性質により統計的取り扱いが不可欠となり、各部材に働く応力の応答関数を求める必要が生ずる。ところが、たとえば波浪変動圧による応力の応答関数を厳密に求めるためには、圧力分布形状が空間的・時間的に変化するため、各波条件ごとに時系列で構造解析を行う必要が生ずる。これは現実の船体構造設計においては不可能に近い。また、単一荷重による応力応答関数が求まったとしても、複数の荷重が重畳する場合には荷重の位相差を考慮して応力応答関数を重ね合わせる必要が生ずるが、この位相差をどのように定めるかは大きな問題である。このように、現状では船体強度設計に用いることができる応力応答関数の推定法は確立されていない。本研究では、簡易的に応力応答関数を求め、実際の船体構造設計に適用できる実用的な設計法の開発を行うことを目的とするが、本年度は、新たにダブルハルタンカーを対象として、DISAMという計算手法にしたがって厳密な構造解析を行い、波浪変動圧、槽内変動圧による応力応答関数を単一荷重による場合と複数荷重が重畳した場合とについて求めた。また、この解析と並行して、研究代表者が日本代表委員を務めるISSC 2003STCVl.1(疲労強度解析のための荷重委員会)において、他の研究機関の解析手法を調査し解析も行った。この結果、波浪変動圧による応力応答関数の簡易推定法として、これまでバルクキャリアーに対して有効性が示された研究代表者が提案した相似応答関数法をダブルハルタンカーに適用する場合、これまで考慮していなかった船底中央部の波浪変動圧の応答関数を考慮に入れれば、精度の良い推定が可能になることが分かつた。船体疲労強度設計に対してき裂伝播解析法を適用する場合、本来不規則である波浪の性質のために統計的取り扱いが必要となり、各部材に働く応力は「伝達関数(応力応答関数)」の形で求める必要が生ずる。一方、船体に作用する荷重には波浪によって生ずる波浪断面力の他に船体断面に働く波浪変動圧や船倉内変動圧などがあり、これらの荷重がさまざまな位相差をもって作用する。この内波浪変動圧についてはその分布形状が空間的・時間的に変化するため、船体構造部材に発生する応力を求めるためには各波条件ごとの莫大な量の構造解析を行う必要が生ずる。さらに複数の荷重が作用する場合には、単一荷重によるの応力応答をそれぞれの位相差を考慮して重畳させる必要があるが、この位相差をどう定めるかが大きな問題である。本研究では、各荷重による応力の応答関数を簡便に計算し、それらの応力応答関数を簡易的に重ねあわせ、実際の船体構造設計に適用できる実用的な設計法の開発を行うことを目的とする。平成15年度は、前年度までの研究で簡易的に計算できるようになった波浪変動圧と船倉内変動圧それぞれの応力応答関数を用い、波浪変動圧および船倉内変動圧の代表位相差を仮定することによって各応力応答関数を重ねあわせ、内・外圧が共に加わる場合の応力応答関数を近似的に計算した。特に、船倉内変動圧の代表位相差については、前年度までに決定できなかった代表位相についてより詳細に検討を行い、船倉内変動圧の代表位相差と部材位置の関係について考察を行った。これらの結果をまとめることによって、波浪変動圧と船倉内変動圧が共に作用した場合のそれぞれの応力応答関数とそれらが重畳した場合の応力応答関数の簡易推定法を提案した。
代数解析学の総合的研究

柏原正樹はカッツム-ディ-リ-環の場合にカジダンルフティヒ予想の一般化を証明した。また量子群の表現に対してgがoでよい性質を持つ特別な基底の存在を証名し、それを結晶基底と名付けその理論を展開した。三輪哲二はミスラと共に結晶基底が可解格子模型の1点函数の計算に現われるパスと同等であることを示し、それを用いてA型のアフィンリ-環に対する結晶基底を構成した。また神保道夫・伊達悦朗・三木敬らと共に量子群のgが1のべき根の場合の表現論及び対応する可解格子模型の研究を進めた。gが1のべき根の時、量子群は大きな中心を持ち既約表現はその中心の値で分類される。R行列が存在するためには表現を特別に選ぶことが必要でそこからリ-マン面が必要条件として現われ、対応する模型としてカイラル・ポッツ模型の一般化が得られた。斎藤盛彦はドリ-ニュ等による混合ホッジ理論の標数0の類似を混合ホッジ加群という形で定式化し理論を完成させた。河合隆裕は青木貴史・竹井義次と共に、非庁和振動子に端を発するWKBとボレル変換について代数解析的アプロ-チにより単純転回点が1または2個の場合の標準形を得た。高崎金久は、同じくWKB法について、オルバ-の方法と散乱理倫におけるヨスト解を用いる方法とを結びつけ、多重積分の級数の形にボロス系数を表示した。中西襄は阿部光雄と共に、量子重力の正準量子化の研究を行ない、C数の背景距離を使わずに、アインシュタイン重力定数による展開の第1次近似まで矛盾なく求めることに成功した。1.無限次元グラスマン多様体と無限次元リー環の関連に関して次の進展があった。無限次元グラスマン多様体上の微分方程式系を用いて、無限次元リー環の表現を構成することに成功した。これによって、最高ウェイトをもつバーマ加群の組成列の長さを、ワイル群の組み合わせ論的構造により計算が可能となったことは著しい成果である。2.統計力学における可解モデルの研究は、リー環の展開環の変形をもちいて進められ共変量子力学との関連についても新しい結果が得られつつある。特に、展開環の変形の表現論が、共変量子力学における相関函数の性質を記述する有効な方法となる事が明らかになってきた。3.又、共変量子力学における相関函数の研究の進展にともなって、曲線のモシュライ空間の幾何学は重要性をましている。フックス群をもちいてのその構造の研究も成果をあげている。4.これからの重要課題として、共変量子力学と無限次元グラスマン多様体との関連、作用素環の理論をもちいたり一環の展開環の変形、共変量子力学における相函関数の研究に、特に焦点をあて、研究を進めていきたい。1.無限自由度をもつ系の一例として、無限次元り一環に付随した無限次元多様体が構成され、その幾何学的性質がくわしく研究された。その結果、有限次元の場合にあらわれなかった新しい組合せ的構造が明らかになりつつある。特にそのSchubert多様体の幾何学的性質が、対応するワイル群のHecke-Iwahori環の双対を用いて記述される事がわかった。2.統計力学における絶対零度において系の構造が単純化するという事実の類推から、量子群の絶対零度にあたるq=0でのふるまいを研究し、結晶基底という新しい考えが提出された。この考えを種々の分野に応用した。特に可解格子模型における重要な量・1点函数が、結晶基底をもちいて量子群の表現と直接関連付ける事に成功した。又、一般線型群の場合にLittlewood-Richardson規則という名で古典的にしられていた表現のテンソル積の既約分解の組み合せ論的記述も、結晶基底を用いて他の古典群の場合に拡張されたこともいちじるしい。

一方、D-加群の変型として非線型微分方程式をとらえる立場からハイパ-ケ-ラ-多様体を研究し、そのモジュライ空間の性質が明らかになった。3.共形場の理論においては、SUn-対称性をもつ射影平面上の共形場の相関函数の代数解析的構造を研究し、その積分表示を得る事に成功した。その簡単な場合は、Riemannの超幾何函数として既に古典的に知られている結果であるが、一般の場合は多重積分となってその性質は複雑である。4.D-加群をホッジ理論に応用して、混合ホッジ加群の概念を導入し、その性質を研究した。又、それは1に述べた無限次元Schubert多様体の幾何学的構造の研究に応用されている。柏原正樹はカッツム-ディ-リ-環の場合にカジダンルフティヒ予想の一般化を証明した。また量子群の表現に対してqがoでよい性質を持つ特別な基底の存在を証明し、それを結晶基底と名付けその理論を展開した。三輪哲二はミスラと共に結晶基底が可解格子模型の1点函数の計算に現われるパスと同等であることを示し、それを用いてA型のアフィンリ-環に対する結晶基底を構成した。また神保道夫・伊達悦朗・三木敬らと共に量子群のqがlのべき根の場合の表現論及び対応する可解格子模型の研究を進めた。qがlのべき根の時、量子群は大きな中心を持ち既約表現はその中心の値で分類される。R行列が存在するためには表現を特別に選ぶことが必要でそこからリ-マン面が必要条件として現われ、対応する模型としてカイラル・ポッツ模型の一般化が得られた。斎藤盛彦はドリ-ニュ等による混合ホッジ理論の標数Oの類以を混合ホッジ加群という形で定式化し理論を完成させた。河合隆裕は青木貴史・竹井義次と共に、非調和振動子に端を発するWKB法とボレル変換について代数解析的アプロ-チにより単純転回点が1または2個の場合の標準形を得た。高崎金久は、同じくWKB法について、オルバ-の方法と散乱理論におけるヨスト解を用いる方法とを結びつけ、多重積分の級数の形にボロス係数を表示した。中西襄は阿部光雄と共に、量子重力の正準量子化の研究を行ない、C数の背景距離を使わずに、アインシュタイン重力定数による展開の第1次近似まで矛盾なく求めることに成功した。
ガンマセクレターゼ阻害剤および作用機構探索に用いる分子の開発

筆者は、これまでに安定なヘリックスをとる(S,S)-2-Aminocyclopentanecarboxylic acid(ACPC)からなる12merのフォルダマー(S-12)が強いγセクレターゼ阻害活性を示すことを明らかにしている。さらに活性の高いフォルダマーの開発およびγセクレターゼが基質をどのように認識しているかを明らかにする目的で研究を進めている。これまでにN末から3,6,9番目を置換したフォルダマーを合成し、3番目を置換したフォルダマーが強い活性を示したことから1,2,4,5番目のアミノ酸残基を置換したフォルダマーを合成することとした。置換したアミノ酸は、3番目を置換した際に活性の高かったセリン、アスパラギンと同様の側鎖を有するβアミノ酸を用いた。Fmoc固相合成により目的のβペプチドを合成し、HPLCを用いて精製を行った。目的物ができているかはMALDI-MSを用いて分子量を測定しそれぞれ目的物ができていることが確認された。阻害活性を測定したところ、3番目を置換したβペプチドが最も阻害活性が強く、γセクレターゼは側鎖の官能基の位置を厳密に認識していることが明らかとなった。さらに、細胞系で阻害活性を測定したところ、3番目のアミノ酸残基をセリンに置換したβペプチドは阻害活性が向上するとともに基質選択性も向上していることが明らかとなった。また、S-12の光親和性ブローブS-12-Bpaを用いて光親和性競合実験を行った。光親和性競合実験とは、作用部位が明らかとなっている既知の阻害剤と光親和性プローブの作用部位が競合するかを確認することで、光親和性プローブの作用部位を明らかにする手法である。フォルダマーは、基質結合部位に作用する阻害剤およびアロステリック部位に作用することが明らかとなった。このアロステリック部位への親和性の差が、フォルダマー間での基質選択性の差であると考えられる。筆者は、これまでに安定なヘリックスをとる(S, S)-2-Aminocyclopentanecarboxylic acid (ACPC)からなる12merのβペプチド(S-12)が強いγセクレターゼ阻害活性を示すことを明らかにしている。さらに活性の高いβペプチドの開発およびγセクレターゼが基質をどのように認識しているかを明らかにする目的で研究を進めている。そこで、S-12の一部を側鎖官能基を有するβアミノ酸に置換したβペプチドを合成した。まず、S-12のどの部位が認識に重要かが明らかになっていないため、N末から3、6、9番目のアミノ酸残基をそれぞれトレオニン、セリン、グルタミン、アスパラギン、チロシン、グルタミン酸、リシン、ロイシンと同様の側鎖を有するβアミノ酸に置換したβペプチドを合成した。モノマーであるFmoc-βアミノ酸はそれぞれ対応側鎖を有するαアミノ酸からArndt-Eistert合成を用いて合成した。合成したモノマーを用いてFmoc固相合成により目的のβペプチドを合成し、HPLCを用いて精製を行った。目的物ができているかはMALDI-MSを用いて分子量を測定し、それぞれ目的物ができていることが確認された。合成したβペプチドの阻害活性を測定したところ、3番目を置換したものはS-12と同程度かそれ以上の活性を示したのに対し、6,9番目を置換したものはすべて阻害活性が低下した。そのため、N末から3番目のアミノ酸残基が阻害活性には重要であることが明らかとなった。この結果はいまだ明らかになっていないγセクレターゼの基質認識部位の構造に関して新たな知見を与えるものである。筆者は、これまでに安定なヘリックスをとる(S,S)-2-Aminocyclopentanecarboxylic acid(ACPC)からなる12merのβペプチド(S-12)が強いγセクレターゼ阻害活性を示すことを明らかにしている。さらに活性の高いβペプチドの開発およびγセクレターゼが基質をどのように認識しているかを明らかにする目的で研究を進めた。これまでの結果から、N末から3番目のアミノ酸残基が重要であることが明らかとなったため、N末から3番目のアミノ酸残基を様々なβアミノ酸に置換した誘導体を合成し、阻害活性を評価した。その結果、S-12と比べ10倍程度高い阻害活性を示すものを見出した。そして、側鎖がコンパクトなものが活性が高いことが明らかとなり、γセクレターゼはコンパクトな側鎖を認識しやすいことが示唆された。また、非天然の側鎖を有するβアミノ酸の合成をスイス連邦工科大学チューリッヒ校のJefferey Bode教授のもとで行った。今後非天然の側鎖を有するβアミノ酸に置換した誘導体を用いることでさらに活性の高い阻害剤を見出すことができる可能性があるため、非天然の側鎖を含んだ阻害剤を合成する予定である。また、低分子のヘリックスミミックを用いた阻害剤の開発にも着手した。疎水性のアミノ酸残基からなるβペプチドで強い阻害活性を示していたため、γセクレターゼはペプチドの疎水性の面を認識していると考え、疎水性の面を形成するヘリックスミミックをデザインした。骨格はこれまでにヘリックスミミックとなることが報告されているベンゾイルウレアを用い、側鎖は疎水性の高いイソブチル基を導入したものを合成した。阻害活性を検討したが、低分子ヘリックスミミックでは全く阻害活性を示さなかった。この結果から、γセクレターゼが単純に一つの疎水性の面のみを認識しているわけではないことが示唆された。

筆者は、これまでに安定なヘリックスをとる(S,S)-2-Aminocyclopentanecarboxylic acid(ACPC)からなる12merのフォルダマー(S-12)が強いγセクレターゼ阻害活性を示すことを明らかにしている。さらに活性の高いフォルダマーの開発およびγセクレターゼが基質をどのように認識しているかを明らかにする目的で研究を進めている。これまでにN末から3,6,9番目を置換したフォルダマーを合成し、3番目を置換したフォルダマーが強い活性を示したことから1,2,4,5番目のアミノ酸残基を置換したフォルダマーを合成することとした。置換したアミノ酸は、3番目を置換した際に活性の高かったセリン、アスパラギンと同様の側鎖を有するβアミノ酸を用いた。Fmoc固相合成により目的のβペプチドを合成し、HPLCを用いて精製を行った。目的物ができているかはMALDI-MSを用いて分子量を測定しそれぞれ目的物ができていることが確認された。阻害活性を測定したところ、3番目を置換したβペプチドが最も阻害活性が強く、γセクレターゼは側鎖の官能基の位置を厳密に認識していることが明らかとなった。さらに、細胞系で阻害活性を測定したところ、3番目のアミノ酸残基をセリンに置換したβペプチドは阻害活性が向上するとともに基質選択性も向上していることが明らかとなった。また、S-12の光親和性ブローブS-12-Bpaを用いて光親和性競合実験を行った。光親和性競合実験とは、作用部位が明らかとなっている既知の阻害剤と光親和性プローブの作用部位が競合するかを確認することで、光親和性プローブの作用部位を明らかにする手法である。フォルダマーは、基質結合部位に作用する阻害剤およびアロステリック部位に作用することが明らかとなった。このアロステリック部位への親和性の差が、フォルダマー間での基質選択性の差であると考えられる。リードとなるβペプチドよりも10倍程度阻害活性の高い化合物を見出すことに成功しており、それらは細胞系において異なる基質選択性を示すことを明らかにしたため。活性は向上したものの、基質の選択性はそれほど良好ではない、そのため、異なるヘリックスの形、非天然の側鎖を含む阻害剤などをデザインし基質選択的な阻害剤の開発を目的に研究を進める。
妊娠高血圧症候群の発症契機となる初期免疫不適合の解明

妊娠高血圧症候群(HDP)は胎児機能不全や早産を誘発する母子共に影響の大きい妊娠合併症であり、発症の契機に母子間の何らかの免疫不適応が原因と考えられている。Natural kille T(NKT)細胞は妊娠時の免疫応答にも重要な役割を果たしており、限られた種類のT細胞受容体を発現し、CD1dを認識している。本研究では、HDPの初期におきるらせん動脈への絨毛外トロホブラスト(EVT)浸潤不全とNKT細胞に着目し、EVTに発現しているCD1dを介して提示されるリガンドが正常妊娠とHDPで異なるため病態が惹起されるという作業仮説のもとに解析をすすめる。
古代東北地方北部および北海道間における鉄の物質文化交流に関する研究

本研究は、東北地方北部および北海道に点在する遺跡から出土した武具、農工具、および漁具などに分類される鉄器の自然科学的調査を実施し、その結果に考古学の形態学的研究結果を重ね合わせ、7世紀から10世紀代における東北地方北部と北海道の間の鉄に関する物質文化交流の実態を解明することを目的とした。東北地方北部および北海道の遺跡から出土した鉄器を保管する機関において調査対象資料のデジタル画像を作成した後、残存状況が良好な部位から微小試料を摘出した。摘出した試料を2分し、一方についてはその化学組成をICP-AES法で求めた。もう一方については、EPMAで組織解析した。岩手県立博物館に搬入された資料については、X線透過写真撮影を実施し、錆化前の形態も確認した。自然科学的調査結果に形態学的研究結果を加味し資料分類した結果、以下の3点が明らかになった。(1)北海道の厚真川および沙流川流域に点在するに擦文文化期の遺跡やオホーツク文化に伴う遺跡から出土する鉄器の中には、東北地方北部の太平洋側に点在する末期古墳、城柵遺跡、および平安時代の住居跡から出土する鉄器とほぼ同じ組成を有するものが相当数認められた。(2)(1)の中には搬入された鉄器を加工した資料もみられた。北海道の日常生活に必要な鉄器獲得方法の一つとして、利用目的を果たした鉄器の素材としての活用が確認された。(3)北海道の石狩低地帯に点在する7世紀代の墓壙から出土した鉄器の中にも(1)と同様の状況を確認できたが、調査資料全体に占める割合は少なく、組成の異なるものがその多くを占めた。太平洋側と日本海側とでは鉄に関する別の獲得ルートが出来上がっていた可能性がある。今後、大陸からの鉄器搬入をも考慮に入れ研究を進めることにより、北方地域における鉄器獲得と使用の実態が一層明確になるものと考えられる。
骨形成蛋白による筋弁内の異所性誘導骨における血管系の実験的検討

ラットで一定規格のThorachodorsal arteryを栄養血管とする広背筋弁を挙上できる態勢を作った。さらに、同じくラットにおいて上大動脈からゼラチンを含む硫酸バリウムを注入して全身の血管造影が一様にできるようになった。以上より、広背筋弁の先端の筋肉部分を折り返した筋肉腔内にコラーゲンを担体とした骨形成蛋白を埋入し、経時的に骨誘導を観察した。それぞれの時点の血管造影所見を観察検討した。誘導骨の経過は、7から10日で一部軟骨と多くは骨が誘導され、14日から21日で誘導骨は完成される。この間に、筋層内に被膜、骨梁、血管を含む骨髄および担体のコラーゲンが認められるようになる。軟X線撮影では、筋弁内のThorachodorsal arteryからの主軸型血行と、誘導骨周囲の血管増生を認めた。また、誘導骨には垂直に流入する多くの血管を認めた。組織学的には骨が誘導される早期から血管が認められ、骨髄中に血管の増生を認めた。血管の管腔内に造影剤が認められたことは、Thorachodorsal arteryを栄養血管とする筋弁として主軸型血行が骨や骨髄も含めて成立したことが示された。これによって、将来、誘導骨である骨を含む有茎筋弁や遊離筋弁などの応用が行えることが想定され、自己骨組織を犠牲にすることなく、有血行の骨を含む筋弁による骨格再建を行っていくことができる。以上を学会および英文論文(in press)にて発表した。骨形成蛋白(BMP)は、異所性に骨を誘導でき、骨再建に期待されている。今年度は、ラット下腿筋肉内と背部広背筋筋弁内に、recombinant human BMP-2とcollagenを担体として埋入し、埋入3,7,14、21日後に、血管造影による放射線学的、かつ、切り出した組織は組織学的(HE染色)に検討を行った。埋入7日後までは、血管陰影の著しい増加や集積は見られなかった。埋入14日後には明らかな骨陰影と骨陰影に集まる血管陰影を認めた。さらに埋入21日ではその所見は強調された。これらは下腿筋肉内と広背筋筋弁内の両者に認められたが、やや筋肉内が早期に血管完成が生じた。一方、組織学的には、埋入5日後で、血管が埋入インプラントに認められ出し、7日、14日と増加が見られた。同時に、組織学的にも血管内に造影剤が認められ、結果により骨、骨髄が栄養されていることが示唆された。これによりBMPを応用することで、筋弁が主軸状(Axial pattern)の骨付き筋弁として応用されることを示している。
口腔癌の微小環境におけるリンパ管新生機構の解析

口腔癌微小環境の再現のため、数種の培養細胞株を用い、組み合わせることにより、腫瘍増殖能とリンパ管新生能を観察し、定量化し、その変化がどの細胞の相互作用による影響が強いのか、またどのタンパクにより生じているのかを定量化し、確認し、中和抗体を用い阻害されることを確認。臨床検体を用い、免疫染色により、腫瘍浸潤尖端のリンパ管新生関連因子の発現とリンパ節転移の様相・後発転移発生の有無について関連を調べた。前年に引き続き、本研究の目的は、口腔癌における重要な予後決定因子である「リンパ行性転移」のメカニズムを明らかにするため、口腔癌の微小環境を口腔癌培養細胞株・リンパ管内皮細胞培養細胞株・ならびにマクロファージ培養細胞株・線維芽細胞株を用いた、共培養細胞システムを構築し、より実臨床に近い培養細胞実験系を確立し、中和抗体、si-RNAを用いそのシステムを抑制することで、中心的に作用するタンパクを同定することにある。発展的目的としてそのシステムを応用することで、オーダーメイド医療に資する、リンパ行性転移抑制系構築の基礎を築くことにある。1)当科で樹立した、数種の口腔癌培養細胞株(HSC2.3.4.7)ならびに他の研究者から既に供与され、当科で保管している口腔癌培養細胞株と、培養マクロファージ・線維芽細胞培養株を単独、2種の共培養・3種の共培養を行い培養上清をELISA法・Western blot法にてタンパクレベルの発現量を定量評価し、中和抗体ならびにsi-RNA導入による抑制実験を行った。本研究の目的は、口腔癌における重要な予後決定因子である「リンパ行性転移」のメカニズムを明らかにするため、口腔癌の微小環境を口腔癌培養細胞株・リンパ管内皮細胞培養細胞株・ならびにマクロファージ培養細胞株・線維芽細胞株を用いた、共培養細胞システムを構築し、より実臨床に近い培養細胞実験系を確立し、中和抗体やsi-RNAなどを用いそのシステムを抑制することで、中心的に作用するタンパクを同定することにある。1)当科で樹立した、数種の口腔癌培養細胞株(HSC2.3.4.7)ならびに他の研究者から既に供与され、当科で保管している口腔癌培養細胞株と、培養マクロファージ・線維芽細胞培養株を単独、2種の共培養・3種の共培養を行い、培養上清を得た。その際、共培養に用いる細胞数を癌細胞:線維芽細胞:マクロファージで種々の割合に変更し、腫瘍細胞の増殖の多かったもの、などの条件の検討を行った。2)得られた培養上清をリンパ管内皮細胞培養細胞液に加え、リンパ管新生への影響の違いを定量評価した。(この系では、共培養系細胞内のタンパク発現に関する影響は評価出来ない)4)各共培養系の組み合わせにより生じた、細胞内に含まれる炎症性サイトカインと、VEGF-A,-C,-Dなどのリンパ管新生因子のmRNA量の違いについてリアルタイムPCR法を用い、定量評価を行った。4)培養上清のVEGF-A・CをELISA法を用い、タンパクレベルの発現量を定量評価した。培養細胞株については順調に進展している。臨床検体については、培養細胞株の実験結果を踏まえて行うので、準備段階にある。培養細胞系の確認実験を早期に完了させ、臨床検体を用いた実験に速やかに移行するよう推進する。平成23年度の研究にかかわる消耗品と同様の使用のほか、臨床検体に関する免疫染色にかかわる抗体ならびにSi実験にかかるRNA合成費用などが見込まれる。