hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
ヒト性腺刺激ホルモンの構造と機能に関する研究

ヒト性腺刺激ホルモンであるヒト絨毛性ゴナドトロピン(hCG)、黄体化ホルモン(LH)、卵胞刺激ホルモン(FSH)の構造と機能の関連を研究するため、塩基特異的突然変異作製法および遺伝子導入法を用い、各β鎖のSS結合を形成するシステイン残基を他のアミノ酸に変挿することにより、個々のSS結合が切断された変異蛋白を作製し、その特性を検討した。その結果(1)hCGβ鎖のどのSS結合を切断しても、α鎖との結合が障害された。しかしながら、その割合は各々のSS結合によって差異があることが明らかとなった。(2)hCG、LHにおいてはβ鎖のシステイン26/110間のSS結合が、当蛋白の分泌調節に関与していると考えられたが、FSHではその関与が明らかではなかった。(3)hCGβ鎖のシステイン23/72間のSS結合を切断した場合には、各種の抗体により異った免疫性を示した。すなわち、このSS結合がβ鎖の立体構造の決定に重要な役割を果していると推察された。(4)生物学的活性は、そのレセプター結合能と同様に、hCGβのSS切断によって大きな影響を受けなかった。(5)これらの変異β鎖を用いることによりhCGβ鎖のSS結合形成過程が明らかとなった。今後、さらにこれらの変異蛋白を詳細に検討することにより、産婦人科臨床領域への応用の可能性も示唆される。また当技術は、性腺刺激ホルモンのみならず他の蛋白にも応用できるため、各種の蛋白の構造と機能の解明にも有用であると考えられる。ヒト黄体化ホルモン(LH)および卵胞刺激ホルモン(FSH)のβ鎖をコ-ドする遺伝子DNAをM13ファ-ジに挿入し、大腸菌株JM109に感染させることにより一本鎖のDNAを得た。この一本鎖DNAを鋳型とし、システイン・コドン(TGTあるいはTGC)をアラニン・コドン(GCTあるいはGCC)に変換した27塩基の合成ヌクレオチドを結合させ、二本鎖DNAを合成した。ウラシル選別法によりシステイン変異DNAを選択した。これはLHに関してはシステインー23,26,72,110,23/72,26/110の変異DNAを、FSHは72,110,を作製することに成功した。LHβの変異DNA断片を分離・精製後、発現ベクタ-に挿入した。この変異LHのDNA断片を含むベクタ-を大量に調製後、チャイニ-ズ・ハムスタ-卵巣(CHO)細胞に導入した。この際、β鎖DNA単独と同時に、非変異α鎖DNAもβ鎖DNAと共に導入した。CHO細胞株よりβ鎖およびα・β両鎖を合成分泌する株を、^<35>Sーシステインの取り込み実験、および免疫学的沈澱法により選別した。以上の実験により、LHβ鎖システイン変異株をシステイン23,26,72,110,26/110の変異株で得ることに成功した。現在LHβ鎖のシステイン23/72の変異株を作製中であり、またFSHβ鎖に関してはシステイン23,26,23/72,26/110の変異DNAを作製中である。尚、FSHβ鎖のシステイン番号はLHおよびヒト絨毛性ゴナドトロピン(hCG)のシステイン位置に各々対応する番号としたため、実際のアミノ酸番号としては各々、23→17,26→20,72→66,110→104となる。ヒト卵胞刺激ホルモン(FSH)のβ鎖をコ-ドする遺伝子DNAをM13ファ-ジに挿入し、大腸菌株JM109に感染させることにより一本鎖のDNAを得た。

この方法によりFSHβは、アミノ酸番号17,20,66,104,17166,20/104のシステイン変異DNAを作製することに成功した。この変異DNA断片を分離・精製後、発現ベクタ-に挿入した。変異FSHβ断片を含むベクタ-を大量に調製後、チャイニ-ズ・ハムスタ-卵巣(CHO)細胞に導入した。この際、β鎖DNA単独と同時に、非変異の鎖DNAもβ鎖DNAと共に導入した。CHO細胞株よりβ鎖およびの・β岡鎖を合成分泌する株を、^<35>Sーシステインの取り込み実験および免疫学的沈澱法により選別した。以上の実験により、FSHβ鎖システイン変異6種類を得た。そこで前年度に作製した黄体化ホルモン(LH)β鎖のシステイン変異株とFSHβ変異株を用いて、ホルモン分泌速度に対するSーS結合の意義を検討した。その結果LHβ鎖におけるシステイン26/110間のSーS結合はヒト絨毛性ゴナドトロピン(hCG)と同様、分泌速度を増加させたが、FSHβ鎖(20/104)ではその増加が認められず、LH,hCGとは異なる役割である可能性が考えられた。現在そのシ-クエンスを確認中である。ヒト繊毛性ゴナドトロピン(hCG)のβ鎖のシステイン変異蛋白、すなわちSS結合が切断されたβ鎖では、すべてα鎖との結合が阻害されたが、システイン26/110,23/72,9/90では一部α鎖との結合が認められた。そこで、これらの変異β鎖を含むhCGの免疫学的活性をフリーαおよびβとは反応しないhCGダイマー特異的なモノクローナル抗体であるB107およびB109を用い、ラジオイムノアッセイにて測定した。その結果、23/72を切断したβ鎖を含むhCGではB107を用いた場合に、B109の約3倍の測定値を示した。他の2種類の変異hCGおよび非変異hCGでは、両抗体によってほぼ同一の測定値であった。すなわち、β鎖の23/72のSS結合は、hCGの立体構造の決定に重要な役割を果していると推察された。また、これらの変異hCGのレセプターへの結合能を検討するため、マウス・ライデッヒ細胞由来の細胞株であるMA-10、あるいはラット睾丸を用い、^<125>I-hCGとの競合反応により測定を行った。その結果、hCGレセプターへの結合能は、SS結合の切断によって阻害されなかった。同様にこれら変異hCGの生物学的活性を、MA-10細胞からのプロゲステロン分泌により測定したが、どの変異hCGも非変異hCGの場合とほぼ同様であった。以上の結果より、β鎖のSS結合の切断はα鎖との結合を阻害することによりhCGの合成自体を抑制するが、結合したhCGの生物学的活性は維持されると考えられた。
低エネルギー超高分解能光電子分光によるコバルト酸化物超伝導体の電子構造の研究

比較的大きなブリルアンゾーンサイズを有するNa_xCoO_2において、単一試料劈開表面で全ブリルアンゾーンにおける電子状態を決定する事を目的として、前年度に引き続きARPES用低温試料多軸回転装置の開発を行った。前年度製作した回転機構を新たに製作した試料冷凍機に組み込み、性能評価を行った。各回転軸における角度精度はARPES測定に十分な0.1゚以下であり、液体^4Heによる冷却時の試料上の温度は25Kである事を確認した。これを用いて高ドープ領域の高い熱電能や比熱等に現れる物性異常や磁気転移の起源を明らかにする目的で、高分解能ARPES測定を行いNa_xCoO_2の電子状態のドープ量依存性を3次元的に決定した。低ドープ領域では2次元円筒型のトポロジーを示すフェルミ面は、ドープ量の増大に伴って強いk_z依存性を示すようになり、x=0.75を超える高ドープ試料においてはΓ点を中心とした3次元的に閉じたフェルミ面が出現し、さらにx=0.85程度までドープ量を増大させると、これらのフェルミ面が結合し、A点中心の閉じた一つの3次元的なフェルミ面を形成する事を見出した。このようなフェルミ面の変化は、ゾーン中心に極小構造を有するα_<1g>ホールバンドのリジッドシフトにより説明できると結論した。この結果から、新たなフェルミ面の出現が電子比熱係数の増大に、α_<1g>バンドの特殊な形状が高ドープ領域における熱電能の上昇に、フェルミ面のトポロジーの変化が磁気転移の出現に各々対応すると考察した。さらに、水和試料における超伝導機構の解明を目的として、Na_<0.35>CoO_2・1.4H_2Oの高分解能ARPESを行い、非水和Na_<0.35>CoO_2との電子構造の比較を行った。非水和試料と同様に、Γ(A)点中心のα_<1g>ホール面のみが存在しており、K(H)点近傍の小さなe_g'ホール面は欠如している事を見出した。この結果は、Na_<0.35>CoO_2・1.4H_20超伝導が、α_<1g>ホール面のみで起こる単一バンド超伝導である事を示唆しており、理論モデルと他の実験の比較から、超伝導対称性はs波もしくはd波である可能性が高いと結論した。水和Co酸化物超伝導体における超伝導状態(T_c=4.5K)における電子状態の測定を目的として高分解能光電子分光装置における試料冷却機構の改良を行った。液体ヘリウムクライオスタットの小容量化・高熱コンダクタンス化、多重熱輻射シールドおよび、極低温用試料基板の設計・製作を行うことにより、最低到達温度3.8Kを達成した。また、装置の高分解能化を図る目的で、電子分析器の電源の安定化、試料測定槽における磁場の漏洩及びアースの強化を行い、現段階で、1meVを切る分解能を達成した。また、装置の改良と並行して、同装置及び、高エネルギー加速器研究機構Photon-Factoryにおける光電子分光装置を用い、非水和Na_xCoO_2の角度分解光電子分光(ARPES)測定を行い、(i)金属-絶縁体転移(x=0.5)、(ii)スピン密度波(SDW)転移(x>0.75)、の起源に関する知見を得た。(i)Na_<0.5>CoO_2における金属-絶縁体転移の起源を探る目的で、高分解能ARPESを行い、広温度範囲においてフェルミ準位(E_F)近傍の準粒子構造及び、フェルミ面の決定に成功した。その結果、低温絶縁相において顕著な波数依存性を示すエネルギーギャップが形成され、さらにフェルミ面形状が顕著な温度依存性を示し、特に低温では中性子散乱等から報告されている磁気構造による再構成を示唆する形状を有することを見い出した。以上の結果から、この系では、転移温度以下で磁気ポテンシャル散乱による電子-ホール不安定性が誘発されていると結論した。(ii)Na_xCoO_2(x>0.75)におけるSDW転移の起源を探る目的で、Na_<0.77>CoO_2の高分解能ARPES測定を行い、E_F近傍の準粒子構造及びフェルミ面を決定することに成功した。その結果、高ドープ試料においてはΓ点中心の3次元的に閉じたトポロジーを有するフェルミ面が出現する事を見い出した。この結果から、高ドープ試料におけるSDWはk_z方向に大きな成分を有するネスティングベクトルに誘起されている可能性が高いと結論した。水和Co酸化物超伝導体における全ブリルアンゾーン中での電子状態を単一試料壁開表面上で測定する事を目的として、低温多軸回転装置の設計・製作及び評価を行い、高精度な実験に対して十分な精度が出ている事を確認した。極低温冷却装置とのマッチングの設計を行い、現在製作を行っている。これと平行して、分子科学研究所放射光施設UVSOR及び高エネルギー加速器研究機構PhotonFactory、米国ウィスコンシン放射光施設SRCにおける光電子分光装置を用いて非水和Na_xCoO_2の角度分解光電子分光(ARPES)測定を行い、幾つかの知見を得た。(i)高ドープ領域におけるスピン密度波(SDW)転移と電子構造の関係を探る目的で、ARPES測定を行い、3次元的にフェルミ準位(E_F)近傍の準粒子構造及びフェルミ面を決定する事に成功した。

フェルミ面は低ドープ試料においては擬2次元的なトポロジーを有する一方で、SDWを示す高ドープ試料においては、顕著な3次元性が現れ、トポロジーが転移する事を見出した。この結果から、SDW転移の起源には3次元成分を強く持ったネスティングによるフェルミ面の電子-ホール不安定性が密接に関係していると結論した。(ii)高ドープ領域における電子状態の詳細なドープ量依存性を調べる目的で、ドープ量を系統的に変化させた試料(x:0.35-0.85)においてARPES測定を行った。その結果、a_<1g>バンドはドープ量の関数に対応したケミカルポテンシャルシフトによりリジットバンドシフトを示し、高ドープ領域におけるc軸長の縮みに対応した顕著な面間相関が出現する事を見出した。特に、非常に高いドーピング領域においては、k_zに依存してa_<1g>バンド全体がE_Fより下に沈み込む振る舞いを示し、フェルミ面のトポロジーがさらに変化する事が示唆される。比較的大きなブリルアンゾーンサイズを有するNa_xCoO_2において、単一試料劈開表面で全ブリルアンゾーンにおける電子状態を決定する事を目的として、前年度に引き続きARPES用低温試料多軸回転装置の開発を行った。前年度製作した回転機構を新たに製作した試料冷凍機に組み込み、性能評価を行った。各回転軸における角度精度はARPES測定に十分な0.1゚以下であり、液体^4Heによる冷却時の試料上の温度は25Kである事を確認した。これを用いて高ドープ領域の高い熱電能や比熱等に現れる物性異常や磁気転移の起源を明らかにする目的で、高分解能ARPES測定を行いNa_xCoO_2の電子状態のドープ量依存性を3次元的に決定した。低ドープ領域では2次元円筒型のトポロジーを示すフェルミ面は、ドープ量の増大に伴って強いk_z依存性を示すようになり、x=0.75を超える高ドープ試料においてはΓ点を中心とした3次元的に閉じたフェルミ面が出現し、さらにx=0.85程度までドープ量を増大させると、これらのフェルミ面が結合し、A点中心の閉じた一つの3次元的なフェルミ面を形成する事を見出した。このようなフェルミ面の変化は、ゾーン中心に極小構造を有するα_<1g>ホールバンドのリジッドシフトにより説明できると結論した。この結果から、新たなフェルミ面の出現が電子比熱係数の増大に、α_<1g>バンドの特殊な形状が高ドープ領域における熱電能の上昇に、フェルミ面のトポロジーの変化が磁気転移の出現に各々対応すると考察した。さらに、水和試料における超伝導機構の解明を目的として、Na_<0.35>CoO_2・1.4H_2Oの高分解能ARPESを行い、非水和Na_<0.35>CoO_2との電子構造の比較を行った。非水和試料と同様に、Γ(A)点中心のα_<1g>ホール面のみが存在しており、K(H)点近傍の小さなe_g'ホール面は欠如している事を見出した。この結果は、Na_<0.35>CoO_2・1.4H_20超伝導が、α_<1g>ホール面のみで起こる単一バンド超伝導である事を示唆しており、理論モデルと他の実験の比較から、超伝導対称性はs波もしくはd波である可能性が高いと結論した。
ハイブリッド解析による極低落差用エコ水車の開発

本研究では実験と粒子法による開放型貫流水車の性能向上と振動・騒音予測の可能性評価に注力した。その結果、粒子法におけるランナ内外部の流動現象を再現することを可能とし、時間平均速度分布をもとにした角運動量の変化からランナに作用するトルクを算出することで、実験と良好に一致する水車性能曲線を得ることができた。その一方で、振動・騒音を予測するためには、ブレード表面圧力の時系列データを得る必要があると考え、その算出精度について検討した。その結果、現在のアルゴリズムでは実際には生じ得ない過大な変動圧力が観測された。この原因解明までには至らなかったが、水粒子と壁粒子との異常接近が関係していることが示唆された。本年度はランナー効率向上のための形状最適化を実施した。ケーシングやガイドベーンを有する一般的なクロスフローランナーが部分負荷特性に優れることに着目して、幅広い落差と流量条件での運転が可能となるエコ水車を目指して、本研究でのランナーを開放型のクロスフロー式とした。これまでの開発が実験のみのアプローチであり、ランナー形状を変更するたびにランナーの出力評価とランナー内部流動現象の可視化を繰り返して好適な値を見出してきた。しかしながら、「開放型」では流量が変化すると水流の流入角度と位置、貫流角度、水流の流出角度と位置のすべてが変化する。これらの水流状況の詳細な変化を実験的に捉えることは困難である。そこで、実験で得やすい物理量(水流の流入角度、位置、厚み)を実験で評価し、その値を粒子法の境界条件として利用することでシミュレーションの精度向上と現象把握を実施した。そのうえで、ランナー内部の流動現象、入口羽根と出口羽根での出力分配の割合、ブレード表面の圧力分布など実験では得ることが困難な値をシミュレーションで明らかにすることで効率的にランナー形状の最適化を試みた。粒子法は2次元モデルで実施した。また、シミュレーション結果の妥当性を実験で得た水車出力との比較で検証することができた。ランナー内外部の流れを可視化計測し、ランナーへの水流の流入角度や厚み、位置について評価した。本年度は水車性能と水流条件との関係解明に注力した。ケーシングやガイドベーンを有する一般的なクロスフローランナが部分負荷特性に優れることに着目して、幅広い落差と流量条件での運転が可能となるエコ水車の実現を目指して、本研究でのランナを開放型のクロスフロー式とした。ケーシングを有するクロスフロー水車に関する研究、実用化は数多く存在するものの、ケーシングを持たない開放型のクロスフロー水車に関してその内部流動現象については、未解明な点が多く残されている。クロスフロー水車の内部流れは気液界面を有するため、その流動様相を実験的に解明することは極めて難しい。そのため、本研究では、粒子法シミュレーションに注目している。同手法はメッシュフリーであり、計算負荷も小さいため、クロスフロー水車の内部流動評価に適している。開放型ランナはランナに対する水流流入条件(厚み、流速等)により速度三角形が変化するため、ランナ内部の流動現象は水流条件で大きく変化する。また、それとともに水車性能も変化する。これまで実験的に水流条件と水車性能との関係は評価してきたが、肝心の内部流動状況については不明な点が多く残されている。そこで、本年度は水車性能が水流条件で変化する機構解明を目的として、2次元粒子法シミュレーションによる内部流動現象の解明に注力し、水車性能との関係を評価した。本年度は二次元MPS法による水車性能シミュレーション結果の精度検証、ブレード表面圧力情報の評価を実施した。実験で得やすい物理量(水流の流入角度、位置、厚み)は実験で評価し、その値の一部を粒子法の境界条件として利用することでシミュレーションの精度向上とその検証を実施した。MPS法では、ランナ回転数を与え、回転数が一定の条件でランナに水流(水粒子)を作用させたときの、ランナ部(検査領域)における水流の角運動量変化からトルクを算出している。これまでは時間平均された速度情報による角運動量を採用していたが、この場合には当初の目的である騒音や振動の評価ができないため不十分である。そこで、計算ステップ毎に得られるブレード表面の圧力分布を積分することで、トルクの時間変動の評価を試みた。粒子数や粒子径をパラメータとして、圧力算出精度を検討したが、パラメータの条件によらずブレード表面圧力分布を積分する方法では正確なトルク情報を得ることはできなかった。任意ブレードの特定の位置に着目し、その点における表面圧力がランナ回転とともに時間的に変化する値を評価したところ、実際には生じ得ない過大な変動圧力が散見された。その際の水粒子の分布状況を調べたところ、水粒子が不自然に弾けていることが確認できた。これは、水粒子と壁粒子との突発的な異常接近によるバースト現象であり、その発生抑制には至らなかったが原因を解明することができた。

粒子法によるシミュレーションで内部流動現象と水車性能との関係を評価する当初の目的は達成しており、おおむね順調に進展していると言える。研究代表者情報流体工学粒子法によるシミュレーションを継続する。衝動形である開放型クロスフロー水車の性能評価においてブレード面上に作用する圧力情報の算出精度の向上に努めている。圧力情報を精度よく評価できるようになり次第、騒音や振動評価の指針獲得を目指す。実験と粒子法によるシミュレーションで相互補完しながら水車性能の向上を目指す当初の目的は達成しており、おおむね順調に進展していると言える。粒子法による解析結果について、圧力の解析精度が低く、騒音評価を実施するための障害となっている。そのため、圧力値を粒子法でより正確に求める方法としてアルゴリズムの検討をおこなっていく。変動圧力測定結果に妥当性が確認でき次第、騒音抑制の指針獲得ならびに水車性能の向上につながる因子の獲得を進める。当初予定していた実験条件において、一部の水車形状条件での実験が未了であり、その分の材料費等を次年度に使用することとした。平成25年度に未了の実験を実施するとともに、平成26年度は粒子法によるシミュレーションの深耕および得られた成果の学会発表、論文発表をおこなう。
カテプシンシグナル経路の制御によるウシ胚の発生およびガラス化後生存性の向上

本年度は、特別研究員Ahmed Z Balboura博士が別ポストへの採用のため、研究機期間が短縮たため、昨年度の研究の継続に注力した。特に、本研究で期待される凍結保存後のウシ胚の生存性向上への効果に関しては、前年度に明らかとなったガラス化保存胚の生存性向上へのカテプシン阻害剤の効果の検証を行い、カテプシンB阻害剤であるe-64および、カテプシンK阻害剤であるOdanactib、それぞれが凍結後の生存性への向上効果が確認された。実際にガラス化処理後の胚盤胞において、カテプシンBの活性を詳細に観察したところ、無処理胚と比べてガラス化処理胚では、胚盤胞外周を構成し、胎盤に分化する栄養膜細胞(TE)において、胚の内部に位置し、将来胎児に分化する内部細胞塊(ICM)と比べてカテプシン活性の増加が検出された。同時に、TUNEL染色によるDNA損傷の検出では、TE細胞でのDNA損傷の増加が確認された。また、同時にアポトーシス関連遺伝子であるcaspase9の有意な増加が確認された。これらのことから、ガラス化処理を含む凍結処理によって保存液に直接接する栄養膜細胞への物理的な障害が細胞への損傷を直接的に引き起こし、それを受けた細胞内のカテプシンの活性化ーその下流のシグナルとして知られているアポトーシスの経路が活性化することが示唆された。今後は、ICMとTEの異なった細胞における応答性への際の研究が今後、必要である。29年度が最終年度であるため、記入しない。本年度は応募者の着任した2015年11月末より研究を開始した。本年度の研究は大きく分けて1.カテプシン阻害剤添加によって作出した胚盤胞のガラス化保存後生存性への影響、2.マウス卵子生存性に及ぼすガラス化の影響、の2項目について研究を実施した。成果1.我々が既に報告しているウシ卵子の体外成熟時へのカテプシン阻害剤E-64による発生、品質向上効果が見られた胚盤胞に対してガラス化保存を行ったところ、加温後の生存性には差は見られなかったが、E-64添加作成胚盤胞では、透明帯脱出率が有意に増加した。このことから、カテプシン阻害によって得られた胚盤胞の品質はガラス化保存後の増殖性が高い品質が得られることが明らかとなった。成果2.マウスGV卵子を用いてガラス化保存を行い、加温後の影響を解析したところ、卵子成熟率の低下が見られた。染色体像を解析したところ、紡錘体形成チェックポイントに異常が見られ、染色体分離異常も顕著に見られた。また、ガラス化後の卵子細胞質では、カテプシンBとカスパーゼ3の活性が増加した。加えて、加温後のDNAの損傷が顕著に見られ、γ-H2AX抗体を用いたDNA損傷検出によって加温後1時間後よりも12時間後に顕著な損傷が見られた。非常に興味深いことに、損傷DNA部位にカテプシンB活性とオートファジー活性が集中していることが検出された。ガラス化後卵子にオートファジー誘導剤であるRapamycinを添加することでDNA損傷の低下が見られた。本研究においては当初計画通り、ガラス化保存後の卵子、はい品質に及ぼすカテプシンの影響を解析してきているが、カテプシン貯蔵されているリソソーム機能とも大きく関わるオートファジーが、特にガラス化後の卵子DNA損傷部位に集中的に集合することで、DNA損傷に関わることが判明したと共に、オートファジーの誘導によってDNA損傷が低下したという新たな結果が判明した。このことは、今後、ガラス化のみにかかわらず、他の因子によるDNA損傷との関係並びにオートファジー誘導によるDNA損傷軽減化と胚の高生存性、高品質化への手法として期待されると思われる。本年度は、ガラス化保存処理後の卵母細胞への影響を解析するために、1)減数分裂に深く関わる紡錘体形成チェックポイントに及ぼすガラス化処理の影響とカテプシンの関与、2)二本鎖DNA損傷に及ぼすガラス化処理の影響および、損傷防除に果たすオートファジー機構の役割、並びに3)胚発生と品質に果たすカテプシンKの役割および、その活性阻害による発生率向上について解析を行った。1)ガラス化によってマウス卵子の成熟培養後、MII染色体分離異常の率が増加したが、その増加は、動原体を認識するチェックポイントの構成因子のひとつであるMad2が散在的に検出され、その働きが不十分になっていることが示唆された。cathepsinBの活性を阻害するとガラス化処理後のMad2の偏在が正常化された。このことから、ガラス化処理によって撹乱された染色体分離機構は、細胞内でのリソソームシステインプロテアーゼを活性化し、その酵素による影響を受けたことが一因と推察された。しかし、cathepsinBの活性阻害材を活用することで、機能の回復の可能性が示唆された。2)マウス卵子へのガラス化処理によって核内二本鎖DNAの損傷が増加したが、合わせてオートファジー活性の増加がLC3IIおよびATGタンパクの増加と共に観察された。DNA損傷はラパマイシンによるオートファジー阻害によって低減した。3)我々が既に明らかにしたウシ卵子、胚においてカテプシンBの活性と品質との逆相関と同様に、カテプシンKも低品質卵子、胚でその活性が増加し、その阻害剤であるOdanactibの添加によって胚盤胞発生率および細胞数が有意に増加した。

当初計画通り、ガラス化による卵子への影響が細胞質内カテプシンの活性化を起こし、それが原因である卵子成熟中の染色体分離異常を引き起こすことが示された。さらに、カテプシン阻害剤の添加によって撹乱された染色体分離機構の回復が認められた。また、興味深いことにオートファジーの制御によってもガラス化によって受ける障害からの回復が期待される。このことは、今後、哺乳動未成熟物卵子のガラス化による障害を比較的簡易に防除できる培養法の確立につながることが期待される。本年度は、特別研究員Ahmed Z Balboura博士が別ポストへの採用のため、研究機期間が短縮たため、昨年度の研究の継続に注力した。特に、本研究で期待される凍結保存後のウシ胚の生存性向上への効果に関しては、前年度に明らかとなったガラス化保存胚の生存性向上へのカテプシン阻害剤の効果の検証を行い、カテプシンB阻害剤であるe-64および、カテプシンK阻害剤であるOdanactib、それぞれが凍結後の生存性への向上効果が確認された。実際にガラス化処理後の胚盤胞において、カテプシンBの活性を詳細に観察したところ、無処理胚と比べてガラス化処理胚では、胚盤胞外周を構成し、胎盤に分化する栄養膜細胞(TE)において、胚の内部に位置し、将来胎児に分化する内部細胞塊(ICM)と比べてカテプシン活性の増加が検出された。同時に、TUNEL染色によるDNA損傷の検出では、TE細胞でのDNA損傷の増加が確認された。また、同時にアポトーシス関連遺伝子であるcaspase9の有意な増加が確認された。これらのことから、ガラス化処理を含む凍結処理によって保存液に直接接する栄養膜細胞への物理的な障害が細胞への損傷を直接的に引き起こし、それを受けた細胞内のカテプシンの活性化ーその下流のシグナルとして知られているアポトーシスの経路が活性化することが示唆された。今後は、ICMとTEの異なった細胞における応答性への際の研究が今後、必要である。当初の計画通り進めると共に、オートファジーの役割を制御した胚のガラス化後生存性向上に関わる知見の収集も進める。本年度で二年間の研究期間は終了することになるが、新たに得られた研究知見をさらに深化することで家畜のみならずヒトの生殖に関わる卵子生存性向上への展開を予定している。29年度が最終年度であるため、記入しない。
超音波を利用した接触熱抵抗の新しい測定法の開発

平成6年度は、黄銅製円柱試験片を用いて接触面における超音波の反射・透過特性と平均接触熱コンダクタンス(平均接触熱抵抗)との関係を明らかにするするための基礎的実験を行った。平成7年度は、異種金属どうし(本研究では黄銅とステンレス)を接触させた場合に生じる接触熱抵抗の整流作用、本測定法の測定限界などを主要課題として実験的・理論的検討を行った。以下、本研究で得られた主な成果を列挙する。1.うねりがない場合について、接触面における入射超音波の反射波と透過波の平均接触圧力依存性を調べた結果、接触面における真実接触面積割合の評価方法として超音波透過法が有効であることが明らかになった。2.平均接触熱コンダクタンスは、うねりによる接触面での局所熱コンダクタンスの変化を見掛けの接触面に関して平均化した量として測定されるのに対し、超音波の透過エネルギは使用した振動子のサイズに依存する。3.接触面にうねりがない場合には、超音波の透過エネルギ割合の測定という簡単な方法により、平均接触熱コンダクタンスを誤差±50%程度以内で評価できることを示し、その相関式を提案した。4.マクロな凸状のうねりを持つ異種金属どうし(黄銅とステンレス)を接触させた場合、本実験においても従来から報告されている整流作用が見られることを確認した。そして、本実験のようにうねりが大きい場合は、接触熱コンダクタンスに及ぼす接触面の温度レベルの影響が大きいことを明らかにした。5.超音波を利用した接触熱コンダクタンスの評価において、荷重依存性に関しては伝熱実験と同じ傾向が得られたが、整流作用の評価においては逆の傾向が見られた。これには、大きなうねりがある場合の本測定法の適用限界のほかに、振動子の温度依存性を考慮する必要があることを示した。本年度は、直径40mm、45mm、中心線平均粗さ0.23.8μm、うねり03μm、接触面の仕上げ方法として研削、フライスおよび旋盤を施した黄銅製円柱試験片を用いて、接触面における超音波の反射・透過特性と接触面間の真実接触面積、すなわち平均接触熱コンダクタンス(平均接触熱抵抗)との関係を明らかにするための基礎的実験を行った。以下に、本研究で得られた主な成果を列挙する。1.うねりがない場合について、接触面における入射超音波の反射波と透過波の平均接触圧力依存性を調べた結果、ミクロな粗さどうしで接触する面を通過する超音波の透過エネルギーは、平均接触圧力の増大に伴う真実接触面積(ミクロな粗さどうしの接触)の増加とともに増大することが確かめられた。この結果、接触面における真実接触面積割合の評価方法として超音波透過法が有効であることが明らかになった。2.接触面に凸状あるいは凹状のうねりがある場合の平均接触熱コンダクタンスと平均接触圧力の関係ならびに超音波の透過エネルギーと平均接触圧力の関係を実験的に調べた。また、凸状のうねりの影響を考慮した二次元伝熱モデルに基づく数値解析を行い、平均接触熱コンダクタンスと平均接触圧力の関係について理論的に検討した。その結果、平均接触熱コンダクタンスは、うねりによる接触面での局所熱コンダクタンスの変化を見掛けの接触面に関して平均化した量として測定されるのに対し、超音波の透過エネルギーは使用した振動子の直径に依存することがわかった。3.接触面における超音波の透過エネルギー割合と伝熱実験から得られる平均接触熱コンダクタンスとの関係について整理、検討した。

その結果、接触面にうねりがない場合には、超音波の透過エネルギー割合の測定という簡単な方法により平均接触熱コンダクタンスを誤差±50%程度以内で評価できることを示した。研究計画および前年度の研究実績をふまえ、本年度は境界面にミクロな凹凸とマクロなうねりが同時に存在する場合の接触熱コンダクタンス、異種金属どうしを接触させた場合に生じる接触熱抵抗の整流作用、本測定法の測定限界などを主要課題として実験的・理論的検討を行った。以下、本年度に得られた主な研究成果を列挙する。1.接触境界面にミクロな凹凸とマクロな凸状のうねりが同時に存在する場合、この面での平均接触熱コンダクタンスは、接触円半径内での熱コンダクタンスと半径外の部分における熱コンダクタンスの算術和とするモデルにより評価できる。一方、超音波の透過波による評価においては、接触円半径と超音波振動子のサイズとの間に相互依存性があることがわかった。2.マクロな凸状のうねりを持つ異種金属どうし(黄銅とステンレス)を接触させた場合、熱伝導率の小さいステンレス側から熱伝導率がほぼ1桁大きい黄銅側に熱を流した方が高い接触熱コンダクタンスが得られ、本実験においても従来から報告されている整流作用が見られることを確認した。そして、本実験のようにうねりが大きい場合は、接触熱コンダクタンスに及ぼす接触面の温度レベルの影響が大きいことを明らかにした。3.超音波を利用した接触熱コンダクタンスの評価においては、荷重依存性に関しては伝熱実験と同じ傾向が得られたが、整流作用の評価においては逆の傾向が見られた。これには、大きなうねりがある場合の本測定法の適用限界のほかに、振動子の温度依存性を考慮する必要があることを示した。
アレルギー疾患重症度指標の確立-ヒスチジン炭酸酵素活性測定の臨床検体への応用-

BSAで感作したモルモットに2週間BSAを投与すると、皮膚、肺、肝臓、腎臓、血液でのヒスタミンの含量の変化(血液のみ増加、他は減少)が観察された。また、このときこれらの組織のヒスタミン合成酵素であるヒスチジン脱炭酸酵素(HDC)は後いずれの部位においても著明に増大した。皮膚、肺、肝臓、腎臓は肥満細胞が多く存在しまた血液には好塩基球が含まれるヒスタミン含量が臓器で低下のは肥満細胞からのヒスタミンの放出によるものであり,血液での含量の増大は臓器からのヒスタミンによるものと考えられる。肥満細胞や好塩基球にふくまれるヒスタミンは1型アレルギー反応により放出されるが、上記の結果はヒスタミンの放出とHDCの活性化が相関していることを示唆する。また正常人とアトピー性皮膚炎の患者の血液HDC活性を比べると軽症のアトピー性皮膚炎患者でHDC活性が高く、また尿中排泄量もアトピー性皮膚炎の患者のほうが多かった。さらに抗アレルギー薬(アゼラスチンなど)の投与による症状の改善に伴い、ヒスタミン尿中排泄量の減少、血液HDC活性の低下がおこった。血液HDCはアレルギー症状の指標になることがわかった。しかし、アトピー性皮膚炎の患者内での重症度と血液HDCとの間には有意な相関は見られなかった。これらの結果から、血液HDC活性は各患者内での1型アレルギー症状の指標になり、抗アレルギー薬の効果判定に応用可能と考えられる。
中山間地域における農地問題に関する実証的研究-不在地主所有農地に焦点を当てて-

中山間地域水田地帯の典型である大分県緒方町における不在地主の農地利用状況を、同町農業委員会が実施した一筆調査を県内居住者・県外居住者、田・畑に分類しながら再集計を行い、分析を試みた。その集計結果と分析結果の概要(字数の関係のため田に限定する)は以下の通りである。(1)田の現在の利用状況...県内居住者が所有する田は246775m^2だが、そのうち自作面積は90280m^2(36.6%)、貸付面積は117682m^2(47.7%)であり、既に宅地となっているのが3651m^2(1.5%)、山林となっているのが3366m^2(1.4%)、遊休農地となっているのが14384m^2(5.8%)で、現状不明が17412m^2(7.1%)となっている。これに対し、県外居住者が所有する田は83933m^2だが、そのうち自作面積は6228m^2(7.4%)、貸付面積は66922m^2(79.7%)であり、既に山林となっているのが769m^2(0.9%)、遊休農地となっているのが7041m^2(8.4%)で、宅地となっているものはなく、現状不明が2973m^2(3.5%)となっている。(2)分析結果の概要...不在地主と言っても県内居住者と県外居住者では大きな違いがある。前者は自作面積が3分の1以上を占めているのに対し、後者は貸付面積が78割を占めている。緒方町では県外居住者の農地ではあってもかなり有効利用されている点は注目される。また、後者の方が遊休農地となる割合が若干高い。以上は、不在地主に対して積極的にはたらきかけることで農地流動化を進めることが可能であり、現在自作している不在地主に対してもその把握につとめることで彼らのリタイアを的確に捉え、農業委員会が農地銀行としての機能を果たすことで農地流動化の推進が可能であることを示唆していると考えられる。
微小平滑筋におけるシグナル伝達の高感度定量解析法の開発

平滑筋の収縮・弛緩調節の分子機序を明らかにするため、新規の高感度リン酸化解析法の開発を目指した。ウシ毛様体平滑筋のリン酸化MYPT1をphos-tag電気泳動法を用いて分離・定量を試みている。カルバコールで収縮刺激を行った毛様体筋では高いレベルのmyosinのリン酸化が観察されたが、予想に反して弛緩状態のmyosinのリン酸化レベルも高いままに保たれていた。これらの結果はウシ毛様体筋ではmyosinリン酸化以外の未同定のCa^<2+>依存性収縮調節因子が存在する可能性を示唆している。平滑筋の収縮・弛緩の制御には種々のタンパク質のリン酸化・脱リン酸化が重要な役割を果たしている。従って、収縮・弛緩制御の分子機序を理解するためには、これらのタンパク質のリン酸化状態を定量する事が不可欠である。しかし、技術的困難のため、現状ではリン酸化状態の変化を相対的に検出する定性分析が主流となっている。本研究では多くの平滑筋収縮制御において重要な役割を果たしているミオシンフォスファターゼの調節サブユニットMYPT1のリン酸化定量法を開発を目指している。更に、開発した新規リン酸化定量法を用いて、高度に機能分化している微小平滑筋、特に、毛様体平滑筋の収縮制御機構の解明を試みる。実験試料として用いているウシ毛様体筋におけるMYPT1の発現をウェスタンブロッティングで確認したところ、大きさの異なる2種類のバンドが検出された。この2種類のバンドのリン酸化状態を、MYPT1のリン酸化特異抗体(抗pThr696-MYPT1抗体、及び抗pThr850-MYPT1抗体)を用いて確認したところ、いずれも両リン酸化部位がリン酸化されているものが含まれることが明らかとなった。このことから毛様体平滑筋の収縮・弛緩制御にMYPT1のリン酸化が重要な役割を果たしている可能性が示された。新規MYPT1リン酸化定量法を開発するには、生体試料を用いるよりもin vitroで任意のキナーゼを用いてリン酸化した試料を用いた方が効率的であることから、ウシ毛様体筋MYPT1の大腸菌発現系の構築を行っている。ウシMYPT1の全長cDNAはデータベースに登録されていないので、相同性が高いと思われるヒトMYPT1の配列を参考にして完全長cDNAのクローニングを試みている。現在までにいくつかの候補となる断片が得られており、配列分析を行っている。本研究では(1)多くの平滑筋収縮制御において重要な役割を果たしているミオシンフォスファターゼの調節サブユニットMYPT1のリン酸化定量法を開発を目指し、(2)更に、開発した新規リン酸化定量法を用いて、高度に機能分化している微小平滑筋、特に、毛様体平滑筋の収縮制御機構の解明を試みる。(1)MYPT1についてリン酸親和性電気泳動法であるPhos-tagSDS電気泳動法を用いて、リン酸化状態に応じた分離・定量の条件検討を行った。Phos-tag電気泳動によりリン酸化量に応じたMYPT1の泳動度の変化が観察されたが、現在までに定量可能なシャープなバンドの分離条件は確立していない。(2)ウシ毛様体筋に於ける収縮・弛緩調節のシグナル伝達経路を明らかにするためPhos-tagSDS電気泳動法を用いてミオシン軽鎖LC20のリン酸化定量解析を行った。ウシ毛様体筋はカルバコール刺激によりCa^<2+>依存的に収縮するため、他の平滑筋と同様に、細胞内Ca^<2+>依存的なLC20のリン酸化によって収縮・弛緩調節が行われていると予想された。しかし驚いたことに、実際にLC20のリン酸化状態を測定してみると、カルバコール刺激の有無に因らず、LC20のリン酸化量は常に高い状態(40-50%)に維持されていた。また、ミオシン軽鎖キナーゼの阻害剤ML7はカルバコール誘導収縮をほとんど阻害しなかった。これらの結果からウシ毛様体筋の収縮・弛緩調節にはLC20のリン酸化以外のCa^<2+>依存性因子が関わっている可能性が示された。
フランス旧植民地「アフリカ系」女性移住者の社会編入-越境する女性の地位向上戦略

旧植民地サブサハラ・アフリカ出身の女性移住者らは、「女性性器切除(Female Genital Mutilation :以下FGMと略)」はじめ出身社会の規範的習慣に対抗するとともに、2000年代には受け入れ側の移民政策の厳格化に直面している。そのため市民団体のネットワーク形成により、送出国への人道支援、啓発運動を行っている。2007-2008年には、滞在条件の厳格化により滞在資格を得られない超過滞在の女性のため、調査先団体はFGMからの保護を理由に難民・庇護権申請を行った。聞き取りによるとこの時期、難民資格についての規定改正があり、FGMからの保護を目的とする申請は、難民ではなく「補完的保護」だけを認められることになっていた。この「補完的保護」はごく少数が関係する地位だが、出身社会・受入社会の国境を越え、どちらの国民国家にも帰属しない新たな地位を模索する女性たちが見いだしたトランスナショナルな市民権として捉えられる。本研究は、フランスにおける「アフリカ系」女性移住者の滞在資格獲得と行為者としての社会編入過程を分析し、女性移住者の地位向上戦略を明らかにすることを目的とする。フランスでは、2006年以降に制限的な新移民法が施行され、家族統合の制限や超過滞在者の正規化の制限など、移民の権利の後退が危惧される。また「アフリカ系」移民の存在は、量的・質的に重要度を増している。本年度は移民の地位をめぐる議論について、社会学文献の収集、分析を中心に行った。2009年には、イスラム教徒女性が全身を覆う「ブルカ」を着用していることを理由にフランス国籍取得を却下されるなど、イスラム教徒の移民のフランス社会における地位は不安定で、社会的統合が議論されている。このなかで政府は「ナショナル・アイデンティティについての国民的議論」を提起し、左派系政党、移民研究者や移民支援団体等の反発を招いた。「移民はフランスのナショナル・アイデンティティに対する脅威である」という言説は、ヨーロッパ統合を安価な労働力の流入という経済的な脅威として認識する世論を、共通移民政策を模索し始めたヨーロッパの統合は、そうした移民の流入を統制することによってフランスのアイデンティティの砦となる、という認識へ導こうとするものだという分析もある。このなかで調査先のアフリカ出身女性移住者団体は、フランスにおける女性移住者の社会的・経済的統合の支援に加え、送出国の女性支援に活動を広げている。西アフリカの女性がフランスでスティグマ化される一因となっている「女性性器切除」の根絶のため、フランスの医療系人道団体と協力して現地でキャンペーン活動を行った。この活動は移住女性の「異質性」を強調する議論に対抗するものと捉えることができるが、それが移民の社会統合にどのような効果をもたらすかについて、引き続き調査する必要がある。「アフリカ系」女性移住者による滞在資格取得と行為者としての社会編入過程を分析し、女性移住者の地位向上戦略を明らかにするため、文献調査及び1ヶ月の現地調査を行った。調査は前年度に引き続き、パリ市内の「アフリカ系」女性移住者による社会・文化的仲介を行う市民団体において聞き取り、参与観察を行った。調査先団体の仲介者は、地区の学校など行政と連携し、そこで移民第一世代向けの通訳や情報伝達の役割を果たしている。この活動は、親世代を子の教育や地域生活に呼び込み、地域コミュニティと移民の意思疎通を円滑にする。フランスでは「親のあり方(parentalite)」をめぐる議論が盛んで、移民出身仲介者が特に移民の多い地区で果たしているこのコミュニケーション機能が、受入社会と移民の間の双方向的な「統合」の鍵となっている。また、サブサハラ・アフリカにおける「女性性器切除(FGM)」の実践は、女性の生活の質や地位向上を妨げる重要な課題のひとつである。受入社会と移民コミュニティにおいてしばしば提起されてきたこの問題に対処するため、調査先団体はフランスの人道援助NGOと連携して送出社会における啓発運動を始めた。この連携には、受入社会で経済的・社会的に困難な地区に居住する移住者が、受入社会の人権思想に基づく越境的な人道援助活動への参入を、受入社会における権利と地位向上の資本に転換する構図が見られる。移住者はこの連携を受入社会における社会的資本の構築のために戦略的に利用し、出身社会のNGOともネットワークを形成するとともに、世界社会フォーラムへの参加等を通じて自らのエンパワーメントに繋げていることが分かった。以上の2つの活動から、調査先団体が女性の受入社会における移住者としての社会編入条件と送出国での資本獲得において果たす役割を、フランスの移民をめぐる法改正の動きから分析することが今後の課題となる。

女性移住者の滞在の地位および社会的権利について、制度上の変更点と市民団体の取り組みを把握し女性移住者団体において参与観察を行うため、パリ市において現地調査を行った。(1)パリ市の男女平等監督機関、(2)難民・移民支援団体La Cimade、ADRIC等で聞き取りを行った。(1)はパリ市の現社会党政権が創設した男女平等の専門部署で、女性に対する暴力への取り組みに力を入れている。特に移住者家庭の強制結婚に対する啓発を行っている。フランスでは婚姻を執り行うのは地方自治体で、市では各区の議員向けに強制結婚予防の手引き書を配布している。また女性性器切除(FGM)についても2011年にシンポジウムを開き、母子センター(PMI)を中心に市のソーシャル・ワーカーに研修を行うなど、市による取り組みが進んでいることも分かった。(2)への聞き取りでは、FGMからの保護を目的とする庇護権申請について、2000年代に大きな動きがあったことが分かった。2005年の「安全な国リスト」に西アフリカのFGM実践国が入ったが、判例によりこれらの国出身の女性と娘に対しては2003年に新設された「補完的保護」が適応されている。本研究が着目してきた、2007年2008年の比較的多数の旧植民地出身女性とその娘への「補完的保護」付与は、一連の流れにおいて捉えられることが分かった。ただし従来の難民よりは不安定な地位であり、FGMと女性の滞在資格は、引き続き地位交渉の争点となる。また調査先の女性移住者団体では、移住者への健康相談会の実施、送出国ではFGM廃止と女性の地位改善に向けた啓発運動を継続している。送出国で児童施設の改修支援を計画し、建設関係の免状を取得した移民家庭の若者を参加させて社会参加を促すとともに、送出国・受入国の交流を目指すトランスナショナルな取り組みを強化している。
ヒトｉＰＳ細胞の誘導効率を高める新規初期化因子の発見

我々は、種々の形成段階にある抜去智歯より歯髄細胞(DPCs)を多数樹立し、その初期化能について解析・検討を行ってきた。その結果DPCsの初期化能は由来するドナー歯の形成段階に大きく依存し、歯根未完成期DPCsは歯根完成期DPCsに比べて、著明に初期化能が高いことが分かった。DNAマイクロアレイを用いて、両群の遺伝子発現量について網羅的に解析したところ、歯根未完成期DPCsは歯根完成期に比べ、DLX4の発現レベルが著明に高く、実際にDLX4を誘導因子として用いると、歯根完成期DPCsだけでなく、ヒト皮膚線維芽細胞の初期化を促進する効果があることを発見した。我々はさまざまな歯の発達段階の歯髄細胞(DPC)株を200株ほど樹立し保有してきた。この中から9株のDPC株を選んで、レトロウィル法を用いて山中4因子(OCT3/4、SOX2、KLF4、c-MYC;OSKM)を遺伝子導入し、iPS細胞の誘導効率について検討したところ、歯根完成期DPCに比べ、歯根未完成期DPCでは著明に誘導効率が高いことが分かった。次に誘導効率に影響を与える遺伝子の特定を試みるため、DNAマイクロアレイを用いて網羅的に2群の遺伝子発現解析を行い、5倍以上歯根未完成期のDPC株群で発現が高い遺伝子を28個程ピックアップした。その中で、転写因子として最も発現量の差が大きかったDLX4について、誘導効率への影響を検討した。Real-time PCRでさまざまなDPC株のDLX4の発現量を解析したところ、歯根完成期DPCに比べ、歯根未完成期DPCは著しくDLX4の発現が高いことが確認できた。次にDLX4がiPS細胞誘導において、重要な役割を担うかどうか検討するために、pMXベースのDLX4発現レトロウィルベクターを作製した。まず誘導効率が低いDP75(歯根完成歯DPC)にDLX4の強制発現で誘導効率が改善するかどうか検討した。DP75はOCT3/4とSOX2(OS)の2因子ではiPS細胞の誘導はできないため、誘導の際にDLX4を加えたOSDの3因子を試みたが、iPS細胞の誘導はできなかった。しかし、KLF4を加えた従来の3因子(OSK)にDLX4を加えたOSKDはOSKに比べ、著明に誘導効率が促進され、OSKMと同程度まで誘導効率を高めることが分かった。次に、歯根未完成歯DPCであるDP31を用いた場合、OSKDだけでなくOSDの場合でも、OSを用いた場合に比べ、誘導効率が促進されOSKを用いた場合と同程度の誘導効率を示した。最後に皮膚線維芽細胞(HDF)でもDLX4の効果を検討したところ、DP75同様KLF4の存在下(OSKD)では誘導効率が著明に促進されるのが確認できた。我々はさまざまな歯の発達段階(歯冠完成期; CC、歯根形成期; RF、歯根完成期;RC)由来のDPC株を200株ほど樹立し、保有してきた。この中から9ラインのDPC株を選んで、レトロウィル法を用いて山中4因子を遺伝子導入し、iPS細胞の誘導効率について検討したところ、RC期に比べCC期やRF期では著明に誘導効率が高いことが分かった。次にCC期とRF期から4株、RC期から4株の細胞株を選び、DNAマイクロアレイ解析を行い、CC期とRF期のグループに特異的に高発現している遺伝子をピックアップした(5倍以上の遺伝子をピックアップ)。ピックアップした遺伝子の中に、Tgf-bシグナルを抑制するDlx4という遺伝子があるのが分かった。Tgf-bシグナルを抑制することでiPS細胞の誘導効率が向上することはいくつかの論文で報告されているため、我々はこれに注目し、real-time PCRでさまざまなDPC株のDlx4の発現量を解析した。するとDNAマイクロアレイと一致して、RC期に比べ、CC期やRF期は著しくDlx4の発現が高いことが確認できた。次にDlx4がiPS細胞誘導において、重要な役割を担うあどうか検討するために、pMXベースのDlx4発現レトロウィルベクターを作製した。DP31という株を用いてDlx4の効果を解析した。DP31はOct3/4とSox2(OS)の2因子のみでもiPS細胞への誘導が可能だが、この場合の誘導効率は著しく低い。しかしOSにDlx4を加えた3因子(OSD)は著しく誘導効率を上げることができた。誘導効率は従来の3因子(OS+Klf4;OSK)と同程度まで高めることができた。さらにOSKにDlx4を加えた場合でも誘導効率は著明に高まり、山中4因子(OSKM)と同程度まで高めることができることが分かった。次に皮膚線維芽

細胞でもDlx4の効果があることを確認した。これまでの研究で、DLX4はヒト体細胞の初期化を促進することが分かった。本年度はDLX4がどのようにヒト体細胞の初期化過程を促進しているのか、そのメカニズム解明に取り組んだ。先行論文で、DLX4はTGF-bシグナルを阻害し、その結果c-MYCの発現量を誘導したり、細胞増殖を促進することが報告されている。またマウスやヒトの体細胞の初期化では、TGF-bシグナルの阻害剤を投与することで、初期化が促進されることが報告されている。そこで、まずDLX4による初期化促進作用が、TGF-bシグナルの阻害によるものかどうか検討した。代表的な根未完成歯歯髄細胞株(DP31)のDLX4高発現株とDLX4ノックダウン株を樹立し、増殖能を比べたが大きな差はなかった。これを裏付けるように、DLX4の高発現株では、c-MYCの発現促進は観察されず、cell cycleに関与する遺伝子の発現量にも著明な変化は認められなかった。しかし、実際にDP31の初期化過程で、継続的にTGF-b阻害剤を投与すると、iPS細胞コロニーの形成は著しく低下することが分かった。さらにDP31にTGF-bを加えると、DLX4の発現量が半減することがわかった。本年度ではDLX4による初期化促進効果のメカニズムははっきり解明できず、今後の課題となったが、これまで解明した結果をまとめて、Scientific Reportsに投稿し掲載された。ヒト体細胞の初期化2年目ですでにiPS細胞の誘導効率を高める新遺伝子の同定ができ、この遺伝子が歯髄細胞や皮膚線維芽細胞のiPS細胞化に効果があることを確認した。さらにOSDで誘導されたiPS細胞の未分化性と多分化能について解析を行った(Dlx4は誘導効率を高めるだけでなく、成熟したiPS細胞にまで誘導できることを確認した)。これらの結果をまとめて、Nature Communicationsに投稿まで行った(結果は採択されなかったが、現在は他誌への投稿準備を行っている)。1年目ですでにiPS細胞の誘導効率を高める新遺伝子の同定ができた。またこの遺伝子が歯髄細胞や皮膚線維芽細胞のiPS細胞化に効果があることを確認した。我々はDLX4がどのようにヒト体細胞の初期化を促進させるのかを解明するために、DLX4ノックダウンDP31株を樹立し、誘導効率の検討を行う予定である。また、先行論文でマウス体細胞ではTgf-βシグナルを抑制することでiPS細胞の誘導効率が促進されるとの報告があり、さらにDLX4はTgf-βシグナルを抑制するとの報告もあるために、DLX4がTgf-βシグナルを抑制して、初期化を促進いているかどうかの検討も行う予定である。今後はDlx4がIPS細胞化の際に必須因子であるかどうかの検討を行う。すでにDlx4に対するsiRNA発現レトロウィルベクターを作製し、DP31のsiRNA-Dlx4株を樹立した。今後この細胞株のiPS誘導効率を検討していく。またDlxは本当にTgf-bシグナルを抑制することで、iPS細胞化の効率を高めているのかどうか今後検討する必要がある。1年目の研究の進行が予想よりも速かったことから、予定していた予算よりも少ない額で予定していた解析を終えることができた。