hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
歯冠修復材料に含まれる内分泌攪乱物質が発達期の脳に及ぼす影響とその分子機構

1)新生ラット脳での遺伝子発現に及ぼすビスフェノールAの影響生後1日齢の雄ラットにビスフェノールA(BPA)100μgを皮下投与したのち2,6時間後に断頭して脳組織を摘出し、視床下部、小脳、大脳皮質、脳幹の4つの部位毎に全RNAを抽出した。抽出したRNAから逆転写によりcDNAを合成、これを鋳型として蛍光ラベルしたcRNAを作製した。このcRNAについて、遺伝子発現プロファイルをAffimetrix社製DNAマイクロアレイ(GeneChip)を用いて解析したところ、いずれの部位においてもBPA投与6時間後のcatechol-O-methyltransferase (COMT) mRNAの発現量が低下していた。BPAが脳内のエストロジェン受容体(ER)を介してCOMT遺伝子発現を抑制するメカニズムを想定して、ERのアゴニストである17β-エストラジオール(E2)、ERαのアゴニストであるpropylpyrazole triol (PPT)、ERのアンタゴニストであるICI182780をBPAと同様の方法で生後1日齢の雄ラットに投与した。その結果、E2ならびにPPTはBPAと同様に脳でのCOMT mRNAの発現を抑制すること、またICI182780はその作用を部分的に阻害することが明らかになった。このことは、BPAによるCOMT mRNA発現の抑制にERαを介する核内メカニズムが関与していることを示している。2)新生ラット視床下部でのCOMT遺伝子発現生後116日齢のラットについて、視床下部でのCOMT mRNAの発現分布とそのレベルをin situ hybridization法により調べた。その結果、生後1,2日齢では視交叉上核でCOMT mRNAの強い発現が認められ、silver grainの局在から、COMT mRNAは視交叉上核の神経細胞に強く発現していることが分かった。生後5日より視交叉上核でのCOMT mRNA発現は弱まり、生後16日では生後1日齢に比べその強度は半分以下に低下した。免疫組織染色法によりCOMT蛋白の局在を調べたところ、COMTは視交叉上核の神経細胞のほか、脳室上衣細胞やミクログリアにも強く発現していることが明らかになった。これらの結果より、新生仔の視床下部の神経細胞に発現するCOMTは、神経終末より放出されるカテコールアミンの代謝に直接関与している可能性が示唆された。1)新生児期ラット脳での遺伝子発現に及ぼすビスフェノールAの影響生後1日齢の雄ラットにコーンオイルに溶解したビスフェノールA(BPA)100μgを皮下投与したBPA投与後2, 6時間後に断頭して脳組織を摘出し、視床下部、小脳、大脳皮質、脳幹の4つの部位毎に全RNAを抽出した。抽出したRNAから逆転写によりcDNAを合成、さらにこれを2本鎖にして鋳型とし、蛍光ラベルしたcRNAを作製した。このcRNAについて、遺伝子発現プロファイルをAffimetrix社製DNAマイクロアレイ(GeneChip)を用いて解析したところ、いずれの部位においてもBPA投与6時間後のcatechol-o-methyltransferase(COMT)の発現量が低下していた。この酵素は神経伝達物質であるドーパミンやノルアドレナリンなどのカテコールアミンの不活化に関与しており、BPAがエストロジェン受容体を介してCOMT遺伝子発現を抑制することでラットの神経機能に影響を与える可能性が考えられた。2)新生児期ラット脳でのエストロジェン受容体の発現分布生後1日齢の雄ラットの脳内でのエストロジェン受容体(ERαおよびERβ)の発現分布を、それぞれの受容体を特異的に認識するウサギ抗体を用いて免疫組織染色法により調べた。ERαおよびERβはともに視床下部視索前野において強い発現を認め、これらはいずれも神経細胞に発現していることが確認された。また、ERβは神経細胞のみならずミクログリア細胞においても発現が認められた。現在、COMT陽性細胞ならびにER陽性細胞の関連について検討中である。

その結果、生後1,2日齢では視交叉上核でCOMT mRNAの強い発現が認められ、silver grainの局在から、COMT mRNAは視交叉上核の神経細胞に強く発現していることが分かった。生後5日より視交叉上核でのCOMT mRNA発現は弱まり、生後16日では生後1日齢に比べその強度は半分以下に低下した。免疫組織染色法によりCOMT蛋白の局在を調べたところ、COMTは視交叉上核の神経細胞のほか、脳室上衣細胞やミクログリアにも強く発現していることが明らかになった。これらの結果より、新生仔の視床下部の神経細胞に発現するCOMTは、神経終末より放出されるカテコールアミンの代謝に直接関与している可能性が示唆された。
新しい修飾核酸の合成とその人工RNA制限酵素創製への応用

本研究では蛍光物質などの標識化合物、キレート化剤、触媒、酵素などの種々の機能性物質が容易、かつ効率的に導入可能な新しい修飾核酸の合成を進めた。修飾DNA合成の鍵化合物となる5一位置換チミジン誘導体の簡便な合成法を検討し、大量合成法を確立した。特に、このチミヂン誘導体を用いた修飾核酸合成の最終段階で、種々の機能性物質を一気に導入出来るポスト・モデフィケーション法の開発をはかり、2種の異なった機能性物質を導入する事も可能となった。蛍光物質を導入した修飾DNAについては蛍光挙動によるDNAとDNA結合たんぱく質との相互作用の研究への展開、キレート化剤を導入した修飾DNAについては癌遺伝子に対する新しいアンチセンス医薬、診断薬への応用のための基礎研究を進めた。また、上記5位置換チミヂン誘導体を導入した修飾DNAの他、3種の新しいタイプの修飾DNA、α-ヌクレオシドを持つ修飾RNA,(1)糖部2'一位に置換基を持つデオキシウリヂン誘導体、アラビノ型ウリヂン誘導体を組み込んだ修飾DNA、(2)5位に置換基を持つα-デオキシウリヂン誘導体を組み込んだ修飾DNA、(3)デオキシグアノシンの2位に置換基を有する修飾DNA、の新規合成を進めた。これらの種々の修飾DNAについて、2重鎖形成能などの性質を明らかにした。さらに。新規修飾DNAにRNAを分解する触媒として作用する化合物を導入して、特定のRNAのみを分解する新しい人工RNA分解制限酵素の創製の研究を進めた。触媒基としてトリス(2-アミノエチルアミン)を導入した種々の修飾DNAについてRNA切断活性を検討した結果、1種の新規修飾DNAがターゲットとなる配列を持つRNAを位置特異的に強く切断する事を認められ、人工RNA制限酵素としての応用が期待できる。さらに。新しい修飾核酸の鍵化合物となる5位置換ウリヂン誘導体(1)をアラビノース、シアンアミド、臭化フマル酸ジメチルより簡便な操作での大量合成法を確立した。1より5位に活性なシアノメチルエステルを導入した5位置換ウリヂン誘導体(2)とした。2は活性なシアノメチル基を持つが室温で長期間保存可能であり、DNA合成条件下では分解しないことを確認した。2を定法により、アミダイト化した誘導体および市販のモノマーより、DNA合成機を用いて、癌遺伝子あるいはエイズ遺伝子に相補的な配列を持ち、所定の位置のチミヂンの代わりに2を導入したアンチセンスDNA15-20量体を合成した。この際、オリゴDNAとしてホスホロチオエ-ト結合及び天然型のホスホヂエステル結合のものを合成した。2を組み込んだDNAが固相担体で結合した状態で、ヒスタミン、チラミンなどの機能性基を持つモノアミン類、ジアミン類、ポリアミン類など種々のアミン類と穏和な条件で反応することにより、機能性基を導入した修飾DNAを簡便な操作で多種、一気に合成出来ることを明らかにした。これらDNAは高速液体クロマトグラフィーで分離精製後、酵素分解反応あるいはイオンスプレー質量分析機で機能性分子が完全に導入されていることを確認した。これら合成した修飾DNAのうち、ジアミン、ポリアミンあるいはインターカレター分子を導入したものはターゲットとなるDNAあるいはRNAと高い結合能力を有することを明らかにした。また、チラミンを導入したDNAに放射性ヨウ素(I-125)による標識化を行い、新規な標識化DNAプローブとしてターゲット核酸の検出に有用であることを示した。さらに、癌遺伝子N-Mycに相補的で、キレート化剤であるEDTAを導入した修飾DNA合成した。昨年度までの研究で、大量合成法を確立した、新しい修飾核酸合成の鍵化合物となる5位に活性な置換基を有するデオキシウリヂン誘導体を組み込んだ修飾

オリゴDNAをDNA合成機を用いて合成した。次いでこのオリゴDNAを固相担体に結合した状態で,トリス(2-アミノエチルアミン)で処理することにより、デオキシウリヂンの5位にRNA切断活性を有すると認められたトリス(2-アミノエチルアミン)を導入した新規修飾オリゴDNAを合成した。この修飾オリゴDNAは対応する相補的なターゲットRNAの切断活性を示すことが認められた。しかし、その活性は弱かった。そこで、新たに、非天然型のα-グリコシド結合を持つ、トリスアミン導入修飾オリゴDNAの合成とそのRNA切断活性についての検討を進めた。まず、5-位に活性な置換基を持つα-デオキシウリヂン誘導体の立体選択的で簡便な大量合成法を確立した。さらに、このα-デオキシウリヂン誘導体の5位にトリス(2-アミノエチルアミン)を導入後、修飾オリゴDNAの内部及び末端部に組み込んだ。内部にα-デオキシウリヂン誘導体を組み込んだ修飾オリゴDNAは対応する相補鎖DNAあるいはRNAとの2重鎖形成能が大きく低下する事が認められた。この修飾オリゴDNAを用いて、ターゲットRNAの切断反応を検討した。RNAのうち、修飾オリゴDNAに導入したα-デオキシウリヂン誘導体の触媒のトリスアミンが作用したと考えられる一カ所が配列特異的に切断される事を認めた。この修飾オリゴDNAはターゲットRNAと2重鎖を形成した時、α-デオキシウリヂン誘導体のため部分的に2重鎖の形成が出来なくなり、RNAが局所的にゆがみを生じ切断を受けやすくなっている事が、分子動力学の計算から示唆された。しかし、切断効率は未だ満足行くものでなく、さらに新しいタイプの修飾オリゴDNAの設計、合成を進めている。昨年度までの研究で、5位に活性な置換基を有する新しいデオキシウリヂン誘導体を組み込んだ修飾オリゴDNAをDNA合成機を用いて合成した。次いでこのオリゴDNAを固相担体に結合した状態で、トリス(2-アミノエチルアミン)で処理することにより、デオキシウリヂンの5位にRNA切断活性を有するトリス(2-アミノエチルアミン)を導入した修飾オリゴDNAを合成し、そのRNA切断活性を研究した。しかし、切断効率は満足行くものでなかった。そこで、さらに新しいタイプで強い触媒活性が期待される修飾オリゴDNAの設計、合成を2種の観点から進めた。最初のアプローチとして、5位に置換基を有するデオキシウリヂン誘導体の代わりに2位に活性な置換基を有するデオキシグアノシン誘導体を合成し、この誘導体を組み込んだ修飾DNAをDNA合成機を用いて合成した。序で、トリス(2-アミノエチルアミン)などポリアミン類で処理することにより、デオキシグアノシンの2位にRNA切断活性を有するトリス(2-アミノエチルアミン)などを導入した新規修飾オリゴDNAを合成した。5位置換デオキシウリヂン誘導体の場合と異なり、2位置換グアノシンの2位の置換基はDNAを形成した時、2重鎖のマイナーグループ側に位置する。この新しい修飾DNAは対応する相補鎖DNAとの2重鎖形成能がわずかであるが強くなる事が認められた。
心筋虚血耐性獲得におけるアデノシン産生酵素-受容体活性化とその情報伝達機構の解明

我々はアデノシン産生酵素であるecto-5'-nucleotidaseを過剰発現させたマウスの作成に成功した。in vivoの系にて冠動脈を30分虚血・2時間再灌流した後に心筋梗塞サイズを測定したところ、コントロール群の49%に比べ、24%と著明に心筋梗塞サイズが縮小した。虚血刺激でecto-5'-nucleotidaseはすばやく活性化され、アデノシン産生が増加していた。またこれを用いて虚血再灌流に伴う遺伝子発現の変化をcDNAマイクロアレイにて評価した。虚血時に産生されるアデノシンは虚血に対して保護的に作用していることが示された。健常ビーグル犬のプレコンディショニングモデルでは90分虚血・6時間再灌流に伴う心筋梗塞サイズが著明に縮小し、それらがPKC阻害剤・ecto-5'-nucleotidase阻害剤・アデノシンAl受容体阻害剤・P38MAPK阻害剤で完全に消失、あるいは細胞膜/ミトコンドリアKATPチャネル阻害剤で各々部分的に消失することを見出した。これらは虚血再灌流で確かに活性化される為、プレコンディショニングの心筋保護メカニズムにこれらの因子が重要な役割を担っていることが判明した。また48時間後に発生するセカンドウィンドウに関してp70S6Kを阻害すると、その効果が消失することも見出した。よって、狭義のプレコンディショニングとは異なる経路を介して心筋保護効果を発現していることが見出された。次に、健常ビーグル犬の心筋組織より採取したmRNAから犬遺伝子ライブラリーを作成し、10000種類のメッセンジャー解析が同時に出来る犬cDNAアレイシステムを構築中で、その前段階として約100種類の既知メッセンジャーRNAが一度に解析できるcDNAアレイ試作品の開発に成功した為、麻酔開胸犬にて3時間の選択的冠動脈低灌流モデルから得られた虚血部心筋組織と非虚血部心筋組織の遺伝子発現を比較し、そのうち約15種類の遺伝子に有意な増減が見られた。臨床的検討においては、我々は(アデノシンに体内ですばやく代謝される)ATP製剤、及びKATPチャネル開口剤・ヒトANP製剤をそれぞれ心筋梗塞症例の超急性期に投与する多施設臨床試験(前者:COATスタディー、後者:J-WINDスタディー)、あるいはアデノシン再取り込み阻害剤ジピリダモールを軽度症候性の慢性心不全症例に継続投与して左心機能予後、運動耐容能予後、生命予後を検討する多施設臨床試験(ROADスタディー)を、各施設倫理委員会の承認の下に開始した。COATスタディーでは約40例のエントリーにて心筋梗塞発症1年後の左心機能予後が有意に改善している事が確認された。ROADスタディーでは現在5名が1年の経過観察を終了し、実薬群でいずれも運動耐容能の増大と血漿BNP値の低下および血中アルドステロン値の低下を認め、さらに試験を進行中である。

ROADスタディーでは現在5名が1年の経過観察を終了し、実薬群でいずれも運動耐容能の増大と血漿BNP値の低下および血中アルドステロン値の低下を認め、さらに試験を進行中である。我々は、心筋特異的にアデノシン産生酵素ecto-5'-nucleotidaseをTet onシステムで過剰発現するマウスをまもなく完成する。これを用いて虚血再灌流に伴う心筋梗塞サイズの変化、及びPKC・MAPK・S6K等の活性変化を追跡予定である。大動物のプレコンディショニングモデルでは90分虚血・6時間再灌流に伴う心筋梗塞サイズが著明に縮小することを確認し、それらがPKC阻害剤・ecto-5'-nucleotidase阻害剤・アデノシンA1受容体阻害剤・P38MAPK阻害剤で完全に消失、あるいは細胞膜/ミトコンドリアKATPチャネル阻害剤で各々部分的に消失することを見出した。これらは虚血再灌流で確かに活性化される為、プレコンディショニングの心筋保護メカニズムにこれらの因子が重要な役割を担っていることが判明した。また、48時間後に発生するSWOP(セカンドウィンドウ)に関してp70S6Kを阻害すると、その効果が消失することも見出した。よって、狭義のプレコンディショニングとSWOPは異なる経路を介して心筋保護効果を発現していることが見出された。HVJリポゾーム法によるecto-5'-nucleotidase遺伝子導入モデルは現在作成中である。臨床的検討においては、急性心筋梗塞再灌流療法時にアデノシン前駆体のATPを冠注あるいは静注して、プラセボと機能予後を比較追跡するCOAT(Cooperative Osaka Adenosine Trial)studyを開始し、エントリーした約40症例にて、冠注あるいは静注群で有意に1年後の機能予後(運動耐容能・心収縮率)が改善する事を見出した。今後症例を増やしつつ、さらに予後を追跡する予定である。1.我々はアデノシン産生酵素であるecto-5'-nucleotidaseを過剰発現させたマウスの作成に成功した。そのマウスを用い、in vivoの系にて冠動脈を30分虚血・2時間再灌流した後にエバンスブルー・TTC2重染色を行って心筋梗塞サイズを測定したところ、コントロール群の49%に比べ、24%と著明に心筋梗塞サイズが縮小した。虚血刺激でecto-5'-nucleotidaseがすばやく活性化され、アデノシン産生が増加することは既に昨年までの実績にて報告しているため、これで虚血時に産生されるアデノシンは虚血に対して保護的に作用していることが示された。2.次に、我々は健常ビーグル犬の心筋組織より採取したメッセンジャーRNAから犬遺伝子ライブラリーを作成し、10000種類のメッセンジャー解析が同時に出来る犬cDNAアレイシステムを構築中で、その前段階として約100種類の既知メッセンジャーRNAが一度に解析できるcDNAアレイ試作品の開発に成功した為、麻酔開胸犬における3時問の選択的冠動脈低灌流モデルから得られた虚血部心筋組織と非虚血部心筋組織の遺伝子発現を比較したところ、そのうち約15種類の遺伝子に有意な増減が見られた(論文報告済)。3.臨床的検討においては、我々は(アデノシンに体内ですばやく代謝される)ATP製剤、及びKATPチャネル開口剤・ヒト
スポ-ツにおけるメディアルチェックとそのフィ-ドバックに関する研究

スポ-ツにおけるメディカルチェックとそのフィ-ドバックについて1)競技スポ-ツにおけるメディカルチェックおよび競技特性を考慮したフィ-ドバックシステムの確立とその実践、2)健康スポ-ツにおける健康教育的な色彩を持ったフィ-ドバックシステムの確立とその実践の2つの視点から研究を行なった。競技スポ-ツにおけるメディカルチェックシステムとして問題志向型システム(Problem Oriented System)が適していると判断し、これに基づきシステムを構築した。いくつかの競技についてシステムを実践し、チェックからフィ-ドバックの流れを効果的に行なうことができることを明らかとすることができた。また、女子競技選手における貧血の問題をとりあげ実践的に研究を行い、特定の問題について焦点を当ててフォロ-する場合にも本システムが有効であることを明らかとした。加えて、競技スポ-ツ選手のメディカルチェクなどのデ-タベ-スの処理にコンピュ-タネットワ-クを利用した方法の導入を試み、増加する情報の処理についても検討した。健康チェック、体力チェック、生活様式チェックなどをもとに健康の保持・増進のための運動処方の作成とフィ-ドバックシステムの構築を行なった。16名の成人を対象にシステムを実践した。メディカルチェックにより15名に何らかの異常所見を、また運動負荷試験では4人に異常所見を認めた。体力測定では4人にフィットネスの低下を認めた。これらの所見をもとに2000kcal/週以上の身体活動を行なうように運動処方を作成し、運動を継続させた結果、この運動処方およびフィ-ドバックシステムが有効であることが確認された。1.競技スポ-ツにおいては球技系競技と陸上競技を中心にシ-ズン前にメディカルチェックを施行した。その結果女子選手に貧血の頻度が高いことが判明したのでこの問題についてフィ-ドバックを実行するシステムを検討し試行した。スポ-ツドクタ-から選手自身へのフィ-ドバックとスポ-ツドクタ-からコ-チへのフィ-ドバックの2方向からなるフィ-ドバックシステムを構築し選手の健康管理と同時に競技力向上に役立つことを目指した。このメディカルチェックからフィ-ドバックシステムを利用した貧血への対応により、シ-ズン後のヘモグロビン濃度はほぼ全員正常化した。以上のことから、競技スポ-ツにおけるメディカルチェックとフィ-ドバックを有効なものとするためには選手、コ-チそしてスポ-ツドクタ-が協力して選手のコンディショニングをサポ-トすることがとりわけ重要であることが明らかとなった。2.健康スポ-ツにおいては、応募した大学職員を対象にして、メディカルチェック、体力測定、食生活、身体活動度の調査を一定期間に3回行い、健康状態、生活様式、体力水準を評価した。その成績と、それに基づいて処方した生活・運動プログラムを各対象者に経時的にフィ-ドバックした。その結果、次のような効果が認められた。1)身体活動度は、始めは不充分であったが、2回目の評価では充分なレベルに到達し、3回目にはさらに増加した。2)摂取カロリ-量と、そのうちの脂肪摂取による割合が減少する傾向にあった。3)体力が増加する傾向にあった。4)3回目の評価が終わった時点で、対象者の多くは、健康状態と生活様式の問題点および適切な処方を知ることが、身体活動度と食生活を改善するうえに役立ったと感じていた。このように、健康状態および生活様式の評価と処方を経時的にフィ-ドバックして行った運動プログラミングは、健康の維持・増進の上に望ましい効果をもたらした。1.競技スポ-ツにおけるメディカルチェックを本年度も継続して実施した。本年度は、その結果をもとに健康管理を継続させることに力点をおき活動した。具体的には、シ-ズン始めに行ったチェックの結果を、デ-タベ-スとして、夏合宿前、秋の2回フォロ-のためメディカルチェックをいくつかのクラブに対して実施した。このシステムにより、健康管理合体も充実したものとなり、H1初年度に計画したフィ-ドバックシステムも円滑に機能するようになった。2.体育学部女子選手における貧血に焦点をしぼりチェックとフィ-ドバック活動についても、初年度より継続した。

この結果、本年度はシ-ズン当初よりよい健康状態で競技することができ、相応の成績につなげることができた。3.デ-タベ-スとネットワ-クについて、コンセプトを完成させた。デ-タ処理とデ-タのやりとりについて、LANを利用して実験的活動を行い、LANなどのネットワ-クを構築することがメディカルチェックのフィ-ドバックに役立つことが明らかとなった。4.健康の維持・増進にための運動プログラムについては、前年度より引き続き、一般健康人を対象とした活動を実施した。健康状態、生活様式、体力水準を評価し、メディカルチェック・体力測定の結果などと合せて運動プログラムを作成し、対象者に経時的にフィ-ドバックした。この結果、身体活動、摂取カロリ-、健康状態、生活様式などの評価からみて、処方した運動プログラムが適切であり、充分にフィ-ドバックされていることが推察された。
ヨーロッパ統合における民主主義の問題の検討

本年度は平成9年度に引き続き、ナショナルの枠と伝統的に結びついてきた政治学的諸概念(民主主義・公共性・市民権)を批判的に再検討し、ポスト・ナショナルな政治思想の在り方を探った。それ以前の数年に及ぶ国際統合リーダーシップの研究は、英国マクミラン社から公刊された英文著書に結実した(研究業績参照)。同作業が基本的に統合を進める側のテクノクラシーに焦点を当ててきたのに対して、本研究課題(ヨーロッパ統合における民主主義の問題の検討)は、統合される側の民衆について考えてきた。この背景には、民主主義がナショナルの枠の中でしか作動しておらず、公共空間は国境ごとに分断され、「市民」は「国民」とほぼ同義語化しているという現状がある。これらの点に留意して、主に政治思想史・法哲学の専攻者たちと市民権や民主主義について研究会(月1回)を組織し、議論してきた。基本文献のリストアップ・輪読を通じて、ようやく全体の議論の見取り図ができ、焦点が絞れてきたといえよう。この成果は、上記英文著作の中でも、部分的に活用され、リーダーシップ研究に厚みを持たせることができた。英文著作によって、研究成果の還元を図るという本研究目的の一部は、これで果たせたと思う。のみならず、いくつかの関連論考をこの2年間で発表した。なかでも、「さまよえるヨーロッパ統合:デモクラシーとテクノクラシーの狭間」『世界』論文(1997年11月号)は、本研究プロジェクトの成果を要約的に世に問うたものとなった。本研究は、根本的には、民主主義・市民権・公共性といった政治学の基本概念を、長らく呪縛しつづけたナショナルな枠から解放するという意味を持つ。申請時の研究目的にも述べたことだが、この大きな課題に対して、本研究は小さいけれども重要な一歩を踏み出すことを意味した。2年間での成果は、その課題に照らせば不十分ものであるけれども、今後に活かして、さらに論考を深めてゆきたい。1997年(平成9年)年度は、研究計画に合わせて、ひろく市民権・ナショナリティ・民主主義関連の文献をサ-ヴェイし、読んでいった。その際、法哲学や政治思想の専門家と共同の研究会を組織し、お互いの議論の中から様々なことを学んだ。このなかで明らかになったことは以下の2点である。まず、民主主義の理論(たとえば社会契約説)がいかに国民国家という単位を前提とし、しかも無自覚的にそうしてきたか、ということであった。そして次に、この国民国家の理論的な結合は、市民権に関しても同様に生起しており、そこでは市民権は国籍(ナショナリティ)やそれに伴う権利義務関係と同一視されがちである。これらは概念的な発見に止まらず、現に問題となっている。というのも、第1に、グローバリゼーションや地域主義が興隆する中、国際的な政府間協力がどの地域でも進行し、一国民主主義のコントロールの及ばない政府間決定の領域が飛躍的に増大しているからである。第2に、移難民や在留外国人に対して、当該国の国籍(ナショナリティ)がないという理由で市民権(あるいは人権)をも賦与しない状態を生じさせうることが挙げられる。この第1の点を、ヨーロッパ統合の現状に即して発表したのが『世界』に発表した「さまよえるヨーロッパ統合:デモクラシーとテクノクラシーの狭間」であった。研究計画によれば、本来、次年度に発表するはずであったが、編集者の要望と現地ヨーロッパの動きによって現段階で執筆することになった。次年度は、原理的な問題とともに、通貨危機後におけるアジア太平洋諸国の動向を踏まえ、一国デモクラシーに関する検討を続けてゆきたい。
ダイオキシンレセプター活性化に及ぼす環境中の含窒素芳香族の影響とその阻害剤の開発

1研究の背景環境中に多種存在する含窒素芳香族類によるダイオキシンレセプター(AhR)活性化能を測定し、そのリスク評価を行うと共に、それらの構造活性相関より、AhR阻害剤としての構造的特色の検討を目的とした。2研究方法環境発癌物質の1つであるキノリンを母核とした二五環性含窒素芳香族類と、それらのハロゲン置換体約50種について、ヒトAhR/Arnt二重発現酵母株を用いたヒトAhR活性化能を測定し、構造活性相関を検討した。さらに、活性の高い化合物については大気粉塵中の濃度の分析や、鰯歯類を用いたCYP1A1誘導活性などのin vivo試験系での検討を行った。また、AhR結合性が高いにも拘わらずCYP1A1誘導能が著しく低い誘導体を選定し、AhR阻害剤候補物質のリード化合物と位置づけin vivoの試験系を用いた阻害実験を実施した。3研究成果多環芳香族化合物及びアゾ色素類の計15化合物を母核としたハロゲン置換誘導体84種についてヒトAhR活性化能の検討を行い、AhRがある種の含窒素芳香族類に対して非常に高い親和性(TCDDと同程度)を有していることを明らかにした。最も高い活性を示したアザベンズピレンは大気中には極微量しか存在しなかったが、そのAhR親和性は、窒素非含有母核(ベンズピレン)よりも100倍高い事を明らかにした。一方で、ある種の窒素含有芳香族アミド化合物が、酵母レポーター試験系においては非常に高いAhR活性化能を有しているにも拘わらず、マウスCypla誘導能を示さないことを明らかにした。中でもベンゾイルアミノキノリン(BzAQ)は、ベンズピレンによるマウスCypla誘導に対し1/10量の併用により阻害的に作用することが示された。なお、BzAQは内在性AhRリガンドであるインディルビンとの構造的類似性があり、その生理活性について興味が持たれた。1研究の背景Ahレセプター(AhR;別名ダイオキシンレセプター)は、ダイオキシン類による毒性発現や、ベンゾ[a]ピレンによる発癌への関与が示唆されている。本研究では、環境中に多種存在する含窒素芳香族化合物によるAhR活性化について検討し、その構造活性相関より、すぐれたAhR阻害剤の開発を目指し以下の検討を行った。2研究成果(1)環境中の含窒素芳香族化合物によるAhR活性化について(ヒトAhR/Amt二重発現酵母株を用いた検討)環境発癌物質の1つであるキノリンを母核とした三五環性含窒素芳香族類について、その窒素非含有化合物(ベンゾ[a]ピレンなど)とのAhR活性化能の比較を行った。その結果、多くの母核において環内窒素によるAhR活性化能の増強(最大約100倍)が見られ、その増強度は窒素の置換位置により変化した。この結果は、AhRの基質認識においてこれまであまり注目されていない分子内塩基性部位の重要性を示唆するものである。(2)ハロゲン置換によるAhR活性化能への影響キノリン、ベンゾキノリン及びフェナンスロリンを母核とし、ハロゲン置換体約50種についてAhR活性化能を(1)と同様に測定した結果、F≪Cl≦Brの順にAhR活性化能増強効果が高かったほか、ハロゲン置換数の増加に伴い増強効果が高くなる傾向が見られた。しかし、検討例の中には1個のBr置換によって親化合物の250倍ものAhR活性化能を示した例もあり、これまでにダイオキシン類などで知られているハロゲン置換効果とは明らかに異なる影響が見られた。(3)CYP1A1誘導能の検討マウス肝CYP1A1誘導能を検討した結果、酵母発現系におけるAhR活性化能に比べ著しく低いCYP1A1誘導活性しか示さない化合物が見られた。これらの化合物のAhR阻害剤としての有用性について、現在さらに検討中である。

最も高い活性を示したアザベンズピレンは大気中には極微量しか存在しなかったが、そのAhR親和性は、窒素非含有母核(ベンズピレン)よりも100倍高い事を明らかにした。一方で、ある種の窒素含有芳香族アミド化合物が、酵母レポーター試験系においては非常に高いAhR活性化能を有しているにも拘わらず、マウスCypla誘導能を示さないことを明らかにした。中でもベンゾイルアミノキノリン(BzAQ)は、ベンズピレンによるマウスCypla誘導に対し1/10量の併用により阻害的に作用することが示された。なお、BzAQは内在性AhRリガンドであるインディルビンとの構造的類似性があり、その生理活性について興味が持たれた。
新規足細胞保護因子および傷害因子の同定と新たな糸球体再生・修復治療法の開発

人工腎臓(透析)治療中の末期腎不全患者は国内で27万人を突破し、その右肩上がりの増加にもかかわらず腎臓病の根本的治療法は存在しない。これは腎臓病特異的な傷害機序が十分に解明されていないことに起因するが、特に腎臓の血液濾過装置を構成する糸球体足細胞(podocyte)の傷害は新しい腎臓特異的な治療標的として注目されている。そこで足細胞に焦点を絞り「足細胞傷害因子」および「足細胞保護因子」の探索を行い、候補因子の同定に成功した。A)楽状糸球体硬化症に関わる新規「腎臓傷害因子」の探索1)巣状糸球体硬化症の腎臓移植後再発患者血漿および巣状糸球体硬化症のLDLアフェレーシスカラム吸着因子を用いた因子の探索腎臓移植後に巣状糸球体硬化症再発患者血漿およびLDLアフェレーシスカラム溶出液を,ゲル濾過,各種逆相HPLCにより数百の分画に分離し,各種腎培養細胞に対する反応性を,細胞内カルシウム・cAMP変化を指標として活性因子を含む分画を同定,HPLCにて純化した。現在,プロテインシークエンサーや質量分析機を用いて構造解析を行なっている。B)腎機能維持に関わる新規「腎臓保護因子」の探索1)正常ヒト血漿ならびに動物組織抽出液を用いた因子の探索ラットおよびブタの組織抽出画分ならびに,正常ヒト血漿において,それぞれの画分をゲル濾過にて分画し,それぞれの画分に対する各種腎培養細胞の反応性を指標に,活性因子を含む画分を同定し,HPLCを用いて生理活性因子の単離を完了した。2)Podocyteに発現するオーファンG蛋白質共役型受容体のリガンド探索作用するリガンドがいまだに同定されていない「オーファン」G蛋白質共役型受容体(GPCR)のうち,ゲノム解析から特に重要度が高く,RT-PCRおよびNorthern blot法でヒトpodocyteにおける発現の確認された新規のGPCRの遺伝子クローニング,およびGPCR発現細胞株(主にCHO細胞)の構築を完了し,上記動物組織から得た抽出液を用いた内在性リガンドのスクリーニングを行っている。A)巣状糸球体硬化症に関わる新規「腎傷害因子」の探索巣状糸球体硬化症再発患者血漿ならびにLDL-A吸着因子をイオン交換、逆相HPLCにより数百の分画に分離し、それぞれの画分に対する培養足細胞、メサンギウム細胞、尿細管細胞に対する反応性を、細胞内カルシウム・cAMP変化で検討し、活性因子を含む分画を同定、純化後、プロテインシークエンサーや質量分析機を用いて構造決定を行なった。培養足細胞に関しては、細胞内カルシウム変化を来す主成分はブラジキニンおよびヒドロキシプロリルブラジキニンであることが判明した。また、疾患再発時患者血漿中には高分子量キニノーゲンが正常コントロールおよび患者寛解期血漿中と比較して有意に多く含まれていた。現在その病態的意義に関して研究中である。B)糸球体細胞、尿細管細胞の機能維持に関わる新規「腎保護因子」の探索動物組織抽出液を用いた因子の同定と解析ラットおよびブタの組織を煮沸後、抽出液をアセトン沈殿し、その上清を分離し、凍結乾燥する。これをSP sepharoseカラム、ゲル濾過にて分画し、それぞれの画分に対する培養足細胞、メサンギウム細胞、尿細管細胞の反応性を指標に、活性因子を含む画分を同定し、HPLCを用いて新規生理活性因子の単離・同定を行なった。活性因子としては、既知のものとしてリジンバゾプレッシン、アルギニンバゾプレッシン、EGF、プロスタグランジンE2などが同定され、引き続き解析を続けている。
農業施策における競争型助成金の導入可能性と条件整備に関する研究

第一に,わが国における条件型助成金に関して農業者戸別所得補償制度を対象にその課題と問題,効果と限界を明らかにした.第二に,米国の社会的背景を踏まえつつ,小規模農場支援の実態把握をとおして同国における競争型助成金の特質を明らかにした.とくに,混合福祉経済社会における予算制約と優れたNPOの組み合わせを分析した.第三に,第一と第二の成果を踏まえつつ,わが国における競争的助成金の導入のための条件に関して検討を行った.第一に,わが国における条件型助成金に関して農業者戸別所得補償制度を対象にその課題と問題,効果と限界を明らかにした.第二に,米国の社会的背景を踏まえつつ,小規模農場支援の実態把握をとおして同国における競争型助成金の特質を明らかにした.とくに,混合福祉経済社会における予算制約と優れたNPOの組み合わせを分析した.第三に,第一と第二の成果を踏まえつつ,わが国における競争的助成金の導入のための条件に関して検討を行った.今年度は、主に米国の小規模農場に関わる競争型助成金に関して調査を行い、大きくは二つの視点からの研究成果を得た。第一の視点は、NPOによる小規模農場支援と競争型助成金制度の効率性についてである。具体的には、第一に、NPOが有する高い専門的知識や技術により、小規模農場に対する競争型助成金制度が効率化している。第二に、小規模農場はセーフティネットとして機能するネットワークを形成し、競争型助成金の獲得リスクの低減を図っている。第三に、アドボカシー組織は小規模農場に対する効果的で適切な政策と競争型助成金の策定に重要な役割を果たしている。以上のことは、低額の予算と混合福祉経済社会という条件下においては、競争的助成金と優れた支援NPOの組み合わせにより小規模農場に対する支援が効果的かつ効率的に行われえることを意味する。次に、第二の視点は、新たな事業に取り組む上での助成金の非効率性と競争型助成金の効果についてである。具体的には、第一に、新たな事業への取り組みに対する使途制限の緩やかな助成金は、少額ではあってもブースターとして機能することが可能である。ただし、そのためには農業者の事業への関心や意欲の高さが必要条件となる。第二に、事業量に比例した変動費への助成は、柔軟な事業構造の形成を促進する。第三に、初期投資に関わる農業者の負担を、助成金に依存せず自己責任を伴う方法で軽減することは、事業への取り組みのブースターになると同時に、採算性を確保することが事業運営の最優先課題となる。この結果、柔軟性、臨機応変性を備えた事業運営が行われるこというメリットを生み出す。以上のことから、初期投資助成型の非効率化が進む分野においては、変動費助成型ヘシフトすることと、変動費助成型の適正な運用がはかれる制度設計が必要であることが帰結できる。今年度は主には次の三つの研究活動を行い、それぞれに成果を得た。第一に、日本の農業施策の中心となる戸別所得補償制度に関しての調査を行い、その成果を専門誌論文2編として公表した。一編は、小規模農業経営が同制度に加入する要因として「激変緩和措置」の機能に焦点を当て分析を行い、全国一律条件交付型と位置づけられる助成金の効果、限界、課題を明らかにした。もう一編は、同制度が集落営農に与える影響に関して、三つの視点((1)集落内農家の組織活動への参加の確保、(2)事業の採算性の確保、(3)これまで構築してきた地域営農体系の再編の必要性)から分析を行い、制度変更に直面しての集落営農の経営上の課題を明らかにした。第二に、日本における農村社会の組織的な取り組みに対する一律的な補助施策である「農地・水・環境保全向上対策」に関しての調査・分析を行い、国際学会(米国・アトランタ)において発表を行った。その主な内容として、非農家住民による地域農業資源の維持のための協力を得るためには、それに見合った誘因を提供することの必要性を明らかにした。具体的には、これまで農業者組織のクラブ財であった地域農業資源を地域社会の公共財として位置づけ、地域住民による利活用を可能とすることが必要となる。第三に、前年度に行った調査・分析から得た成果を学会誌論文2編として公表した。一編は、米国の小規模農場に関わる競争型助成金に関する研究成果であり、低額の予算と混合福祉経済社会という条件下においては、競争的助成金と優れた支援NPOの組み合わせにより小規模農場に対する支援が効果的かつ効率的に行われえることを明らかにした。もう一編は、新たな事業に取り組む上での助成金の非効率性と競争型助成金の効果に関する研究成果であり、初期投資助成型助成金の非効率化が進む分野においては、変動費助成型助成金へシフトすることと、変動費助成型助成金の適正な運用がはかれる制度設計が必要であることを結論とした。研究の最終年となる平成23年度は、これまでの研究を補完する調査・分析を行うとともに、その成果を踏まえて研究全体のとりまとめを行った。とくに、次の2点は、日米両国の助成金に関わっての新たな視点からの接近である。第一は、米国において教育ファーム事業を展開する小規模農場に関して経営形態を視点とする接近であり、実態調査・分析の結果を国内学会(日本農業経営学会)において発表した。具体的には、非営利組織形態をとることにより、寄付金の獲得や不動産の購入等のためのファンドレイジング(基金の創設)が可能となること、学校教育と連携がとりやすくなること、種々の助成金への応募に有利になること等の効果が明らかとなった。

このような利点は、農産物の販売収入の少額性や不安定性を補い、教育ファーム事業の安定的な実施に大きく貢献している。第二は、国内の助成金に関して、農地・水・環境保全向上対策に取り組む集落を対象とするアンケート調査から助成金の効果的な活用のあり方と地域社会の活性化に与える影響を分析し、国際学会(Rural Sociological Society)において発表した。具体的には、当該事業を推進するプロセスにおける社会的関心の醸成とソーシャルキャピタルの蓄積の相互関係を明らかにした。研究全体のとりまとめとしては、図書(日本農業年報57)において、日本国内における現行の助成金の運営実態と問題点を、条件不利地域の集落営農および小規模兼業農家の制度対応を中心的な視点としつつ明らかにした。さらに、その結果から、現行の助成金制度である農業者戸別所得補償制度の運用上の今後の課題を整理した。すなわち、第一に、全国一律に同じ額を補助する制度が米価下落を引き起こすのであれば、その防止策を講じるか、もしくは全国一律方式を再検討すべきであること、第二に、農業経営の支援施策が直接所得補償方式へと移行する中で、制度転換に対する生産者の理解の醸成の必要性である。
Toll様受容体4RNA遺伝子導入による樹状細胞の活性化と中耳局所免疫能の賦活化

1)急性中耳炎モデルにおける検討SPF下にて飼育した、雄性、TLR4変異マウスであるC3H/HeJマウス、およびそのwildtypeであるC3H/HeNマウスを用いた。中耳炎モデル作成後6、12、24、48、72時間後に、経鼓膜的に中耳洗浄液(250ml)を採取し、PLP固定液にて経心臓的に灌流固定し、マウス頭部を脱灰後、凍結切片(10mm)を作成した。作成した切片は抗マウスThy1.2抗体およびB220抗体にて免疫染色を行った。採取した中耳洗浄液は遠心分離し、上清はELISAに使用し、沈渣した炎症細胞は抗マウスCD3、CD4、CD8、CD25、B220抗体にて染色後、Flowcytometerにて中耳腔に遊走したリンパ球の動態について検討した。また、炎症細胞よりmRNAを抽出した後にIL-10mRNAの表出についてRT-PCRを行った。インフルエンザ菌性急性中耳炎モデルにおいて、TLR4は炎症早期より中耳腔へのリンパ球の遊走を誘導し、中耳炎急性期における、炎症反応抑制に関与するサイトカインであるIL-10の産生に関与しているものと推察された。また、TLR4欠損マウスにおいて、炎症増悪時のIL-10に対する炎症制御反応性が乏しいことからも、TLR4はIL-10に対する感受性にも関与していることが推察された。中耳腔への遊走炎症細胞の検討においては、マクロファージや樹状細胞を中心とした急性炎症を抑制する細胞である、制御性T細胞やCD4CD8共陰性であるγδT細胞が中耳の炎症に伴い増加することが今回の検討において示唆され、中耳炎との関連が示唆された。しかし、実際の中耳の炎症においては、以前我々が報告したように両マウス間での炎症反応の差は明らかであるにも関わらず、中耳腔に遊走してきたリンパ球の分画や動態においてはTLR4の関与に関わらず明らかな相違を認められなかった。今後、TLR4がどのようにこれらの細胞に関わっているのか、また炎症病態の差にどのように繋がっていくのか、さらに検討が必要であると思われた。特異的抗原に対する2次免疫応答において、樹上細胞は重要な働きを有するが、TLR4との関連を調べるため、免疫下における鼻粘膜関連リンパ組織、頸部リンパ節、脾臓の樹上細胞の分布について検討した。樹上細胞の分布をしらべるため、C3H/HeJおよびC3H/HeNマウスにおける各リンパ組織より単核球を分離後、I-A/I-EおよびCD11cの2重染色を行い、flow cytometryにて解析を行った。各種リンパ組織中の樹上細胞の比率は、C3H/HeNマウスでは、経鼻免疫後には、I-A/I-EおよびCD11共陽性細胞、特に成熟した樹状細胞の増加を認めた。しかし、C3H/HeJマウスでは発現が抑制されていた。また、サイトカインmRNAの発現においては、両マウスともに,TGF-β,IL-5,IL-10,IL-6mRNAの発現増強を頸部リンパ節主体に認めたが、系統差は認めなかった。特異的抗原に対する2次免疫応答において、樹上細胞は重要な働きを有するが、TLR4との関連を調べるため、ます、非免疫下における鼻粘膜関連リンパ組織、頸部リンパ節、脾臓の樹上細胞の分布について検討した。各種リンパ組織中の樹上細胞の比率は、C3H/HeNマウスでは、C3H/HeJマウスと比較し、より多く存在する事が示唆されたが、インフルエンザ菌外膜蛋白(OMP)にて特異的免疫を誘導したのちでは、その差は縮小していた。インフルエンザ菌を用いて、上記各マウスに中耳炎を惹起した後に、6、24、72時間後に中耳組織を採取し、IL-1beta、TNF-alpha、IFN-gamma mRNAにおけるin-situ hybridizationを施行した。炎症早期における6時間、および24時間においては、C3H/HeNマウスにおいては好中球主体として各種サイトカインmRNA陽性部位を認めたが、TLR4欠損マウスであるC3H/HeJマウスではその発現は軽微であった。しかし、72時間後では、C3H/HeJマウスにおいても遊走したマクロファージにおいた各種サイトカイン陽性部位を認めた。両者のマウスにおいての炎症反応に細胞レベルにおいて差を認めた。

また、炎症細胞よりmRNAを抽出した後にIL-10mRNAの表出についてRT-PCRを行った。インフルエンザ菌性急性中耳炎モデルにおいて、TLR4は炎症早期より中耳腔へのリンパ球の遊走を誘導し、中耳炎急性期における、炎症反応抑制に関与するサイトカインであるIL-10の産生に関与しているものと推察された。また、TLR4欠損マウスにおいて、炎症増悪時のIL-10に対する炎症制御反応性が乏しいことからも、TLR4はIL-10に対する感受性にも関与していることが推察された。中耳腔への遊走炎症細胞の検討においては、マクロファージや樹状細胞を中心とした急性炎症を抑制する細胞である、制御性T細胞やCD4CD8共陰性であるγδT細胞が中耳の炎症に伴い増加することが今回の検討において示唆され、中耳炎との関連が示唆された。しかし、実際の中耳の炎症においては、以前我々が報告したように両マウス間での炎症反応の差は明らかであるにも関わらず、中耳腔に遊走してきたリンパ球の分画や動態においてはTLR4の関与に関わらず明らかな相違を認められなかった。今後、TLR4がどのようにこれらの細胞に関わっているのか、また炎症病態の差にどのように繋がっていくのか、さらに検討が必要であると思われた。特異的抗原に対する2次免疫応答において、樹上細胞は重要な働きを有するが、TLR4との関連を調べるため、免疫下における鼻粘膜関連リンパ組織、頸部リンパ節、脾臓の樹上細胞の分布について検討した。樹上細胞の分布をしらべるため、C3H/HeJおよびC3H/HeNマウスにおける各リンパ組織より単核球を分離後、I-A/I-EおよびCD11cの2重染色を行い、flow cytometryにて解析を行った。各種リンパ組織中の樹上細胞の比率は、C3H/HeNマウスでは、経鼻免疫後には、I-A/I-EおよびCD11共陽性細胞、特に成熟した樹状細胞の増加を認めた。しかし、C3H/HeJマウスでは発現が抑制されていた。また、サイトカインmRNAの発現においては、両マウスともに,TGF-β,IL-5,IL-10,IL-6mRNAの発現増強を頸部リンパ節主体に認めたが、系統差は認めなかった。
光合成初期反応におけるチトクロム間およびチトクロム内の電子伝達機構の研究

紅色光合成細菌Rubrivivax gelatinosusの光化学反応中心複合体に結合するチトクロムサブユニットを、立体構造の解明されているBlastochlorisviridisのものに置き換えたキメラ反応中心を材料に、このサブユニットの主に荷電アミノ酸に対して網羅的な部位特異的変異導入を行った。得られた約50種の変異チトクロムに対する時間分解分光測定により、以下の新しい知見を得た。(1)生理的電子供与体である水溶性のチトクロムc_2からの電子伝達は、反応中心結合チトクロムに4つ含まれるc型ヘムのうち、最も末端に位置するヘムが直接の電子受容体として働いていること、また、その分子認識には静電的な相互作用が最も重要であることを示した。認識に必要な点電荷の位置を立体構造上に特定することが可能となった。(2)サブユニット内部でヘム近傍に位置するアミノ酸の荷電を変えることで、ヘムの酸化還元中点電位を最大400mVまで変化させることに成功した。また、ヘム中央に位置する鉄分子への軸配位子であるメチオニンまたはシステインを他のアミノ酸に置換することにより約450mVもの中点電位の変化が引き起こされることを示した。(3)4つのヘムの酸化還元中点電位は、変異導入無しのキメラ反応中心では-60,310,60,400(mV)の順に並んでいるが、(2)の変異株では400mVの高電位ヘムが0mVとなった。すなわち、低-高-低-高の中点電位配置が低-高-低-低となり、これによりクロロフィル二量体への電子伝達速度が約100倍遅くなった。このことは、エネルギー的に不利に見える低電位ヘムを経た電子伝達が実際に起こっていることを示すと共に、両末端の電子供与体・受容体の間に有意な電位差があれば、最終的に電子はあたかも熱力学的なローラーコースターを滑るように伝達されるというモデルを支持した。すでに確立している紅色光合成細菌の変異導入系を用いて、反応中心複合体のチトクロムムサブユニットに対して部位特異的変異導入を行った。変異はサブユニット表面および内部に位置する荷電アミノ酸を中心に導入し、今年度半ばまでに約30種の変異株を作成した。生理的電子供与体からこれら変異チトクロムへの電子伝達速度を比較することにより、4つ含まれるc型ヘムのうち、サブユニットの最も末端に位置するヘムが直接の電子受容体として働いていることが明らかとなった。また、生理的電子供与体との分子認識には静電的な相互作用が最も重要であることが示唆され、そこに働く点電荷の位置を立体構造上に具体的に推測することが可能となった。本研究のもう一つの目的である酸化還元中点電位の変化が電子伝達速度に与える影響に関しても新たな知見が得られつつある。サブユニット内部でヘム近傍に位置するアミノ酸を異なる荷電を持つように変異させたとき、ヘムの中点電位を最大250mVまで変化させることができた。また、ヘム中央の鉄分子への配位子であるメチオニンをシステインに置換した場合では450mVもの電位低下が観察された。電子伝達経路の中途に位置するヘムの中点電位をこのように大きく変化させたとき、光合成電子伝達速度は数10倍遅くなった。本研究で得られたこれら一連の変異株は、タンパク質内部での長距離かつ方向性を持った電子伝達の機構を物理学的に解明するための優れた材料となる。また、これら変異株の光合成による生育速度は野生株に比べ極端に低下していた。

このことはヘムの中点電位が進化の過程で適切に調節されてきたことを示す。紅色光合成細菌Rubrivivax gelatinosusの反応中心複合体に結合するチトクロムサブユニットをBlastochlorisviridisのものに置き換えたキメラ反応中心を材料に、含まれている4つのヘムcの酸化還元中点電位を変える部位特異的変異の評価をコンピーターシミュレーションにより詳細に行った。予測値は、主に昨年度に作製した実際の変異タンパクでの測定値と良い一致を示した。光酸化された反応中心のバクテリオクロロフィル二量体(スペシャルペア)を還元するこれら4つのヘムの酸化還元中点電位は、変異導入無しのキメラ反応中心では-60,310,60,400(mV)の順に並んでいるが、変異導入した株のひとつでは400mVの高電位ヘムが0mVとなった。これに伴う静電的相互作用により60mVのヘムが130mVとなり、低-高-低-高の中点電位配置が低-高-低-低となった。閃光照射による電子伝達速度の測定の結果、この変異によりスペシャルペアの還元速度は約100倍遅くなった。このことは、エネルギー的に不利に見える低電位ヘムを経た電子伝達が実際に起こっていることを示すと共に、両末端の電子供与体・受容体の間に有意な電位差があれば、最終的に電子はあたかも熱力学的なローラーコースターを滑るように伝達されるというモデルを支持した。一方、本来マイクロ秒オーダーで完結するこの反応が100倍遅くなっても光合成電子伝達の順向き方向への全過程に及ぼす影響、さらには細胞の生育に及ぼす影響は小さいものであった。4つのヘムの中点電位が低-高-低-高となる配置を進化の過程でかたくなに保存してきた理由を明らかにするためのさらなる変異導入が必要である。