hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
運動習慣が成長期および中・高年期の脳形態におよぼす影響

【目的】近年の脳画像研究では、脳構造が精神疾患にも関与しているとの報告がなされている。動物実験では、成体において、自発的な運動が海馬神経細胞の増殖を促進し、また海馬の細胞増殖が運動による抗うつ効果に関与しているとの報告がなされている。よって、ヒトにおいても、運動が脳構造に影響を与え、精神的健康度の維持・向上に寄与している可能性が考えられる。高齢者では有酸素能力が高い者ほど加齢に伴う脳の変性が少ないことが報告されている。しかし若年者において検討した研究は、我々の知る限り存在しない。そこで本研究では、若年者において、有酸素能力の違いが脳構造とどのような関係にあるか検討するとともに、脳構造と精神的健康度との関係を検討した。【方法】被験者は成人101名(男性80名、女性21名)とした。高解像度のT1強調脳MR画像を撮影し、自記式のアンケートを用いた精神的健康度の測定、推定最大酸素摂取量(VO_2max)の測定を順に行った。撮影した脳MR画像をもとに、voxel-based morphometry (VBM)法を用いて脳の局所灰白質量とVO_2maxの関係を調べた後、さらに精神的健康度との関係を調べた。【結果】有酸素能力と脳局所灰白質量の関係を調べ、眼窩野・島・側島極において正の相関関係、視覚野において負の相関関係がみられた。また、両部位の灰白質量と精神的健康度の関係を調べた結果、主観的幸福感が眼窩野・島・側島極において正の相関関係を示し、視覚野において負の相関関係を示した。【考察】島、側頭極、眼窩野は、いずれも感情に関わる部位として知られており、相互に連絡している。これらの脳領域が、有酸素能力や運動と精神的健康度の関係をつなぐ部位であることを示唆しているのかもしれない。海馬が記憶や学習に関わる部位であることは良く知られているが、感情や情動の制御にも中心的な役割を果たしている。うつ病や外傷後ストレス障害などの精神疾患において、海馬体積が減少することが知られており、精神疾患との関係が注目されている。一方、運動が精神的健康の維持増進に効果的であることが心理学的研究から示唆されているが、そのメカニズムはほとんど分かっていない。本研究では、運動の精神的効果と海馬体積の関係を明らかにすべく、運動経験の異なる被検者間で、海馬の構造を比較した。方法:被検者はすべて右利きで健康な男子大学生および大学院生であった。部活動に熱心に参加している学生をアスリート群(22名)、小学校入学以降、ほとんど定期的な運動を行ってこなかった学生をセデンタリー群(26名)とした。高解像度脳MR画像を撮影し、optimized voxel based morphometry(optimized VBM)という手法を用いて両群の海馬内における部位特異的な灰白質量を比較した。また、心理的健康度を自記式の心理尺度で測定した。結果:optimized VBMの結果、アスリート群の両側の海馬尾部における灰白質量がセデンタリー群よりも多いことが分かった。また、アスリート群はセデンタリー群よりも精神的に健康であった。考察:本研究の結果から、運動経験の違いによって、両側海馬尾部の灰白質量が影響を受けることが分かった。動物実験より、運動が海馬の神経細胞増殖を促進することが知られていることから、ヒトにおいても運動によって神経細胞が増えていると考えられる。

また、海馬体積の大きなアスリート群がより精神的に健康であったことから、運動の精神的効果に海馬が関与している可能性が示唆された。今後は、運動の身体的健康に及ぼす効果のみならず、脳および精神的健康に及ぼす効果も注目されるだろう。本研究では、有酸素トレーニングが、ヒトの脳構造および精神的健康度に及ぼす影響を調べることを目的とした。運動習慣のない大学生30名を、トレーニング群15名(男性10名、女性5名)、コントロール群15名(男性9名、女性6名)に分けた。トレーニング群は有酸素トレーニング(1週間につき23回、1回にっき60分)を行なった。コントロール群は、トレーニングと同じ期間、通常通りの生活を行なった。トレーニングの前後で脳のMR画像を撮影し、optimized voxel-based morphometry法によりトレーニング前後での脳構造を比較した。また、質問紙による精神的健康度の測定(CES-D scale、K6K10うつ尺度、特性的自己効力感測定尺度、自己受容測定尺度、動機付け尺度、主観的幸福感尺度、アイデンティティー尺度)を行った。分散分析の結果、右中側頭回、左島、右眼窩回において、有意な交互作用(p<0.05,FDR)がみられた。トレーニング前後の比較において、上述の部位の灰白質量はコントロール群で有意な減少(P<0.05,FDR)がみられ、トレーニング群では有意な変化がみられなかった。アイデンティティー尺度とCES-D scaleにおいて有意な交互作用がみられ、トレーニング群の精神的健康度はコントロール群と比較して向上した。自己受容測定尺度の下位尺度である精神的自己の受容度にも同様の傾向がみられた。コントロール群における灰白質量の減少率と心理尺度の関係を調べたところ、左の島において精神的自己の受容度と有意な負の相関関係がみられ、アイデンティティー尺度において同様の傾向がみられた。有酸素トレーニングは、灰白質量の減少を抑制する可能性が示された。また、有酸素トレーニングはいくつかの精神的健康度に影響を及ぼし、島の灰白質量の変化は精神的健康度に関係する可能性が示唆された。【目的】本研究では、各年齢層の被験者をそれぞれ運動習慣の有無で分け、脳の形態を、核磁気共鳴画像装置(MRI)を用いて比較することを目的とした。【方法】被験者は、継続的な運動活動を行っていない者32名(非運動群、年齢61.5±4.3歳)と、近年3年間以上持久的トレーニングを継続している者38名(運動群、年齢59.8±3.7歳)を対象とした。両群とも医師による予備検査で社会的に健康と判断された。MRI(GEメディカル,SIGNA HORIZON MRI HI-SPEEDを用い頭部の撮影を行った。磁場強度は1.5テスラ、収集データポイントの数は256×256、有効視野220cm、スライス幅2mm,スライス間隔は0mmである。このMRI画像をSPM2を用いて解剖学的標準脳へ変換し、optimizedvoxel-based morphometry(VBM)法により両群間における脳灰白質量の比較を行った。【結果】被験者の身体的特徴に両群で有意な差は認められなかった。またVBM法による脳灰白質量は両群間で有意な差は認められなかった。この結果は、社会的に健康な中年は、脳の灰白質量は身体運動によって影響されないことを示す。
早期乳癌に対するラジオ波焼灼療法(RFA)の病理学的効果判定基準の開発

肝癌においてはすでにRFAが標準的な治療法のひとつとなっており、高い治療効果をあげているが、他の癌腫については現在のところ未知数である。早期乳癌に対するRFA治療の試みも始められているが、いくつかの問題点が残されており、実用化には至っていない。その問題点の一つとして、RFA後の残存腫瘍の問題がある。乳癌を外科的に切除した際には、切除標本の断端検索を行うことで残存腫瘍の存在が診断できる。しかしながら、外科的切除をしていない場合には、正確な残存腫瘍の診断が不可能となる。今回の研究では、RFA後に外科的切除することなく、残存腫瘍の有無を正確に診断する方法と、その効果判定基準を開発することを目的とする。本年度は早期乳癌患者に対するfeasibility studyの実施と乳癌患者に対する第II相臨床試験を予定していたが、別紙の通り、乳癌に対するRFAの実地臨床には問題を唱える意見が多いため、日本乳癌学会におけるガイドラインの策定を待っているところである。当初ウサギの乳腺組織内にRFA Cool-tipを刺入し、熱凝固実験を開始したが、(1)ウサギ乳腺が小さいこと、(2)皮膚からの距離が十分確保できない、などの理由でウサギでの実験は断念した。そこで、ブタの乳腺組織を用いて同様の実験を試みた。凝固部位におけるHE染色では、小葉構造が破壊され、上皮細胞の著明な空胞化を認めた。しかしながら、乳管組織への傷害は比較的軽微であった。凝固部位から離れた組織では小葉構造・乳管構造ともに保持されていた。熱凝固時間に関しては、3分・6分・9分のタイムコースを設定したが、平均の凝固される範囲が3分では25×12mm、6分では25×20mm、9分では40×22mmとなり、さらに、9分の熱凝固を行うと細胞の融解が観察されたため、6分の熱凝固が至適であると考えられた。熱凝固の後、マンモトームを用いて採取した組織の評価は、HE染色のみでは典型的な壊死像が観察されず、正確な残存腫瘍の有無の判定が困難であった。現在これに加えて、NADH染色・MIB-1染色を行い、腫瘍残存率を算定し解析を行っている段階である。また、熱変性を直接評価するためにHSP(Heat shock protein)47による免疫染色も行っているが、本法を用いると腫瘍組織に対する組織傷害がより詳細に観察できると予測される。今後、このデータを元にfeasibility studyおよび第II相臨床試験を実施し、早期乳癌患者に対する低侵襲治療の実現を目指していく。
NO作動性神経の投射経路および伝達様式の解明

本研究は、血管および陰茎海綿体を密に分布し、同平滑筋を拡張性に調節するNO作動性神経の投射経路と伝達様式を明らかにすることを目的に行われた。その成果は以下の通りである。1.麻酔サルおよびイヌでの血管造影を用いた研究より、血圧中枢から大錐体神経を介して翼口蓋神経節に至るコリン作動性神経が、同神経節でシナプスを形成し、NO作動性神経はその節後神経として脳および眼動脈へ分布していること、また、同神経は絶えず緊張性に同動脈を拡張させていることが分かった。2.摘出ブタあるいはイヌ脳動脈標本における神経性弛緩反応に対し、スーパーオキシド産生薬、スーパーオキシドディスムターゼ(SOD)阻害薬ならびにCaged NO負荷の効果を検討すると、NO作動性神経の神経伝達物質は、安定なNO代謝物ではなく、NOラジカル自体であり、その機能は内因性のSODにより保護されていると考えられた。3.摘出脳動脈における神経性弛緩反応は、低酸素下で抑制されることが知られているが、低温環境では低酸素による抑制は観察されなかった。このことは低温時の脳血流維持にNO作動性神経が重要な役割を果たしていることを示唆している。4.勃起機能に重要な役割を果たしているNO作動性神経は、骨盤神経叢由来であるが、直接海綿体に投射しているのでなく、海綿体近傍にある神経節由来の節後神経であると考えられる。5.摘出イヌ海綿体における神経性弛緩反応が、L型カルシウムチャネル阻害薬では影響を受けず、N+L型カルシウムチャネル阻害薬により抑制されたことから、NO作動性神経機能にN型カルシウムチャネルが重要な役割を果たしていると考えられる。我々はこれ迄に多くのほ乳類の脳動脈に一酸化窒素(NO)作動性神経が分布し、同動脈を拡張性に調節していることを明らかにしてきた。本研究は、脳動脈を中心に、NO作動性神経の投射経路と伝達様式を明らかにする目的で行うものである。本年度の研究により以下のことが明らかになった。1.麻酔サルに脳外科手術を行い、翼口蓋神経節を電気的に刺激すると同側の脳動脈が拡張し、その反応がNO合成酵素阻害薬で消失すること、また、同神経節の破壊により、脳動脈が収縮すること、さらに同神経節の上流に存在する大錐体神経の刺激を生じる血管拡張が神経節遮断薬で消失することなどから、サルでは血圧中枢から大錐体神経を介して翼口蓋神経節に至るコリン作動性神経が、同神経節でシナプスを形成し、NO作動性神経が節後神経として前ならびに中大脳動脈へ分布していることが明らかになった。また、同神経は絶えず緊張性に脳動脈を拡張していると考えられる。2.摘出ブタ脳動脈標本に矩形波電流ならびにニコチンを適用すると、NO合成酵素阻害薬で消失する神経性弛緩反応が観察される。このNO作動性神経刺激によると考えられる弛緩反応は、外因性NOの反応を抑制する量のスーパーオキシド産生薬を処置しても影響を受けなかった。しかし、あらかじめ標本を内因性スーパーオキシド消去酵素阻害薬を前処置しておくと、神経性弛緩反応は、外因性NOと同様に、スーパーオキシド産生薬により著明に抑制された。したがって、NO作動性神経の伝達物質はスーパーオキシドと直接作用しうるラジカル、すなわちNOそのものであり、その機能は内因性スーパーオキシド消去酵素により、保護されていると考えられる。我々はこれ迄に脳動脈を中心に血管拡張神経の存在を明らかにし、その神経伝達物質が一酸化窒素(NO)合成酵素により産生される内因性NOあるいはその類似物質であることを報告してきた。

昨年度の研究により、ブタ脳動脈を支配する拡張神経の伝達物質が、NO自体であり、内因性スーパーオキシド消去酵素により同神経機能が保護されていることを示唆した。同時に、麻酔サルを用いた研究により、中大脳動脈領域を支配するNO作動性神経が、翼口蓋神経節由来の節後神経であり、同領域の脳動脈を絶えず緊張性に拡張させていることを明らかにした。本年度は、麻酔イヌを用いて同様の検討を行うと共に、麻酔サルの眼動脈を支配するNO作動性神経の投射経路についても検討を加えた。1.麻酔イヌに脳外科手術を行い、翼口蓋神経節やその上流の大錐体神経を電気的に刺激すると同側の中大脳動脈の拡張、鼻汁分泌、流涙が生じる。脳動脈拡張はアトロピン処置しても影響ないがNO合成酵素阻害薬で消失するのに対し、鼻汁分泌および流涙は逆にNO合成酵素阻害薬では影響なくアトロピンで消失した。また、同神経節の破壊により、脳動脈は収縮した。大錐体神経刺激による脳動脈拡張は神経節遮断薬で消失した。したがって、イヌでは大錐体神経を介して翼口蓋神経節に至るコリン作動性神経が、同神経節でシナプスを形成し、眼、鼻、脳動脈へ神経を投射しており、脳動脈へはサルと同様にNO作動性神経が節後神経として分布していると考えられる。同神経は常時緊張性に脳動脈を拡張していると考えられる。2.麻酔サルの眼動脈を支配するNO作動性神経も同側の翼口蓋神経節に由来する節後神経であることが明らかになった。昨年度までの研究により、脳動脈および眼動脈が同側のNO作動性神経により、緊張性に拡張性の調節を受けていることを生体位のサルおよびイヌを用いて明らかにしてきた。さらに、これらの動脈を支配するNO作動性神経は、おそらく脳幹部より翼口蓋神経節に投射するコリン作動性の大錐体神経よりインパルスを伝達される節後線維の一つであることも明らかにした。また、その伝達物質は、スーパーオキサイドの産生および消去との関連から、NO自体である可能性が高いことも明らかにした。本年度は、当初より並行して行ってきた陰茎海綿体におけるNO作動性神経について、および脳動脈NO作動性神経機能と病態との関連について得られた成果を報告する。1.陰茎海綿体を拡張性に支配するNO作動性神経は、骨盤神経叢から投射されているが、直接海綿体に到達するのでは無く、海綿体近傍の神経節に由来する節後神経であると考えられた。また、摘出海綿体における神経性弛緩反応が、L型カルシウムチャネル阻害薬では影響がないが、N+L型カルシウムチャネル阻害薬により抑制されることから、NO作動性神経機能にN型カルシウムチャネルが重要な役割を果たしていると考えられる。2.Caged NOを用いて脳動脈内にあらかじめ細胞内NO量を増加させておくと、神経性弛緩反応が抑制された。この成績は、NO自体がNO作動性神経の伝達物質であるとするこれまでの考えを支持するものである。3.摘出脳動脈における神経性弛緩反応はNO作動性であり、低酸素下で抑制されるが、低温環境では低酸素による抑制は観察されなかった。このことは低温時の脳血流維持にNO作動性神経が重要な役割を果たしていることを示唆している。
企業文化の変容とその経営活動および経営成果に与える影響についての調査研究

企業文化が経営活動に対しどのような影響を与えているかについて、昨年度に引き続いて研究を行った。文献にもとづく研究から、企業文化と経営活動、とくに経営戦略との間に強い関係のあることが指摘されていることが明らかとなった。すなわち、企業文化といわれている企業の組織風土の態様が革新的である場合には、その企業は革新的な経営戦略を立案実行しやすいし、実行したさいに、反対考はなく協力的なので新事業は成功しやすいが、逆に企業文化が保守的で失敗を恐れる雰囲気にある場合には、革新的な戦略の計画立案も起りにくく、もしトップが強行しても、革新への抵抗が強く、新事業は失敗に終ることが多いと指摘されている。日本の企業の実態を知るため昨年度末にアンケート調査を実施し、本年度はその結果を集計し分析を行った。この結果、企業文化と経営戦略との間には、文献で指摘されるような密接な関係があること、若干弱いが企業文化と組成の形態の間にも相関が認められ、企業文化の果す重要性が明らかとなった。平成4年度は、企業文化についての理論的考察とアンケート調査を行った。理論的な研究は、文献を集め考察を加えたが、従来の研究で一番問題であるのは、企業文化の概念が多種多様で、このままでは、相互に研究の交換による進歩が不可能で、企業文化の研究を活〓化させるためには、統一的概念を形成することが必要不可欠とのことが判明した。欧米では「経営の志向性あるいはメンタリティー」とか「人間心理の集合的プログラミング」とか多義に用いられるが、わが国の学考の中では、「企業に共有された思考・行動様式」から、それをもう少し厳密に「企業のメンバーに信じ込まれた価値観・考え方および行動のパターン」という定義で考えている者が多い。理論的要請と現実的理解とを合わせると、この方向で、統一的な概念を作り上げることが可能ではないかと思われる。理論の内容について、企業文化と経営活動、成果との関連については、企業の環境、経営活動(戦略と管理行動)が企業文化の態様に大きく影響しているが、同時に企業文化のあり方が、経営活動に大きく影響している相互関係にあることがわかった。企業の環境、経営活動と企業文化の間がうまく適合しているか否かが、経営成果の水準を決定しているというのが一つの理論的結論である。以上の理論モデルを検証するため、日本企業700社に対しアンケート調査を実施し、現在分析中である。
新しい光学活性な立体規則性ポリアセチレン膜による光学分割

1.新しい光学活性な立体規則性アセチレンポリマーの合成p-ブロモ安息香酸またはp-ジブロモベンゼンを用い、これに光学活性な置換基原料としてメントールなどの光学活性なアルコール類またはピネンなどの光学活性なオレフィン類よりのクロロシラン誘導体を反応させ、さらに三重結合を導入することで光学活性な置換基を持つフェニルアセチレンモノマー類を合成した。これらのモノマーはロジウム系触媒により単独重合したところ可溶性の高分子量体を得た。2.高分子固体膜の調製上記で得られるポリマーよりソルベントキャスト法により膜を調製し、製膜条件を検討した。このポリマーは丈夫な膜を与えた。3.高分子固体膜による光学分割この膜にトリプトファンや2-ブタノールなどのラセミ体の水溶液またはアルコール溶液を透過させた。駆動力として濃度差または圧力差を用いた。分離能は旋光光度計または光学分割カラムを接続した高速液体クロマトグラフィーで行った。この膜は高い光学分割能を有していた。4.化学構造と選択透過性の関係の解明透過物および透過溶媒を変えて透過実験を続けデータを得るとともに、膜の構造や性質に関しての知見を得た。これらの結果より分離機構を考察した結果、膜中に分離に有効な不斉な分子間隙が効率良く形成し、ここを溶質が透過する際に透過速度差が生じると考えられた。
脳におけるリポタンパク受容体の機能解析

神経細胞の増殖、神経突起の進展、神経細胞膜の機能維持のためには細胞膜の主要構成成分であるコレステロールは不可欠である。しかし、脳内でのコレステロール輸送と代謝に関する情報はほとんどない。本研究は脳神経系におけるアポE特異的受容体の機能解析を通して、アポE及びコレステロールの脳神経系における役割やアルツハイマー病との関連の解明を目的としている。アポEの脳内における機能及びアルツハイマー病発症における役割を解析する目的でアポE/VLDLR/ApoER2を欠損するトリプルノックアウト(TKO)マウス及びLDLR/VLDLR/ApoER2を欠損するトリプルノックアウト2(TK02)マウスを作製した。TKO及びTKO2マウスではDKOマウスに比べて海馬の層構造形成異常が更に亢進しており、ほぼ生後4週間以内に死亡する。一方、DKOマウスでは約20%が3ヶ月以上生存する。DKOマウスやVLDLR(+/-)/ApoER2(-/-)ではreelerやyotariマウスと同様に海馬CA1領域及びCA3領域のリボン部分の錐体細胞層が2層に分離しているが、アポEがさらに欠損することで錐体細胞層が1層に回復した。一方、小脳や大脳皮質においては、これらマウスにおいてアポEの有無による違いは全く見いだせなかった。この結果はアポEが脳の発達過程において、海馬CA1領域及びCA3領域におけるVLDLRへのreelinの結合を競合的に阻害していることを強く示唆した。TKOやTKO2マウスでは他の遺伝型を持つマウスと比較して、著しく高い血中コレステロール値を示したが、血中リポタンパクのHPLC解析から、これらのマウスに見られる高コレステロール血漿は脳形成の異常によるものではないことを示唆した。
非ヒト霊長類うつ病モデルの脳細胞種特異的エピゲノム解析

2011年に厚生労働省が特に対策を進める5大疾患に精神疾患を加えたように、精神疾患の病態解明が期待されている。これまで、神経細胞を標的とした研究が多く行われてきており、一定の成果を上げているが、未だ病因の解明には至っていない。研究代表者は、大うつ病を含む気分障害患者の死後脳解析で、前頭極灰白質においてオリゴデンドロサイト系譜細胞の減少を認めた。また近年、DNAメチル化などのエピゲノム変化が大うつ病の病態と強く関係すると考えられてきている。一方、C型肝炎などの治療薬として用いられているインターフェロンαは、投与した患者がうつ症状を呈することが報告されている。そこで本研究では、インターフェロンαを慢性投与したカニクイザル死後脳のエピゲノム解析を試みる。昨年度までにインターフェロンαを慢性投与したカニクイザルの死後脳前頭極灰白質から、神経細胞およびオリゴデンドロサイト系譜細胞の細胞核を分取し、得られたDNAから、オリゴデンドロサイト関連因子であるSox10のプロモーター領域のDNAメチル化の解析を行ったところ、オリゴデンドロサイト系譜細胞では、50%程がメチル化されていたが、インターフェロンαの投与でメチル化率が10%程に変化しており、細胞種特異的なエピゲノム変化が生じていることを見いただいた。しかしながら、多くの遺伝子から特定のメチル化異常を見出すことは困難であることから、今年度はインターフェロンαを慢性投与したカニクイザルの死後脳前頭極灰白質のRNA-seq(網羅的遺伝子発現解析)を行った。インターフェロン投与群とコントロール群3頭ずつの解析で、優位に発現量が変化した因子として2因子が同定された。現在、これらの因子のプロモーター領域のメチル化解析を行っている。現在までに、インターフェロンαを慢性投与したカニクイザル(n=3)、コントロールとして生理食塩水を投与したカニクイザル(n=3)の6頭の前頭極灰白質から神経細胞、オリゴデンドロサイト前駆細胞、成熟オリゴデンドロサイト、アストロサイト/マイクログリアなどの残りの細胞の細胞核をフローサイトメーターで分取し、DNAを抽出した。昨年度までにSox10、Slc6a4のプロモーター領域のメチル化解析を行っているが、より疾患特異的な因子を同定するため、今年度は前頭極灰白質のRNA-seq解析を行った。その結果、2つの因子が同定された。RNA-seq解析は、当初の予定になかったが、エピゲノム異常を捉える上で重要な情報を得ることができた。上述したように、インターフェロンαを慢性投与したカニクイザル(n=3)、コントロールとして生理食塩水を投与したカニクイザル(n=3)の6頭の前頭極灰白質を用いてRNA-seq解析を行い、2つの関連因子を同定した。まずは、これらの因子についてプロモーター領域のメチル化解析を行う。また、カニクイザルを用いた解析は、マウスなどのげっ歯類を用いた解析と異なり、サンプル間のばらつきが大きい。そのため、RNA-seq解析において有意差は見られなかったが、コントロール群と比べ発現量の変化が大きい因子の同定を試みる。同時に、n=3ではサンプル数が少ないため、今後さらに投薬を行い、解析個体数を増やすことを予定している。新しくサンプルを得られれば、Sox10のメチル化解析やRNA-seq解析を同様に行う予定である。近年、社会ストレスの増加によって大うつ病が増加しており、通常の社会生活をおくることが困難になるとともに、ついには自殺企図に至ることが、問題視されており、その病態解明が急がれている。また近年、DNAメチル化などのエピゲノム変化が病態と強く関係すると考えられてきている。インターフェロンαを慢性投与したカニクイザルの死後脳前頭極灰白質から、細胞核を抽出し、神経細胞(NeuN)およびオリゴデンドロサイト系譜細胞(Olig2)の染色を行い、フローサイトメーターを用いてそれぞれの細胞核を分取した。得られた細胞核から、DNAを抽出し、バイサルファイト処理により非メチル化シトシンをウラシルに変換した。バイサルファイト処理したDNAを用いて、オリゴデンドロサイト関連因子であるSox10のプロモーター領域のDNAメチル化の解析を行ったところ、神経細胞では高度にメチル化されており、またインターフェロンαの投与でも変化しなかったものの、オリゴデンドロサイト系譜細胞では、50%程がメチル化されていたが、インターフェロンαの投与でメチル化率が10%程に変化しており、細胞種特異的なエピゲノム変化が生じていることを見いただいた。また、セトロニントランスポーター遺伝子(Slc6a4)のプロモーター領域の検討も行ったが、神経細胞、オリゴデンドロサイト系譜細胞ともに低メチル化状態であり、インターフェロンαの投与によっても変化しなかった。現在までに、インターフェロンαを慢性投与したカニクイザル(n=3)、コントロールとして生理食塩水を投与したカニクイザル(n=3)の死後脳を得ており、今年度では当初の予定通り6頭の前頭極灰白質から神経細胞、オリゴデンドロサイト前駆細胞、成熟オリゴデンドロサイト、アストロサイト/マイクログリアなどの残りの細胞の細胞核をフローサイトメーターで分取し、DNAを抽出した。

抽出したDNAをバイサルファイト処理し、オリゴデンドロサイト系譜細胞関連遺伝子であるSox10とセロトニントランスポーター遺伝子であるSlc6a4のプロモーター領域のメチル化解析を行った。Sox10はインターフェロンαの投与によってメチル化率が変化する傾向が見られた。しかし、統計学的に有意ではなかったので、今後解析個体数の増加を検討する必要があると考える。また、他の因子についても、検討を行っていく。2011年に厚生労働省が特に対策を進める5大疾患に精神疾患を加えたように、精神疾患の病態解明が期待されている。これまで、神経細胞を標的とした研究が多く行われてきており、一定の成果を上げているが、未だ病因の解明には至っていない。研究代表者は、大うつ病を含む気分障害患者の死後脳解析で、前頭極灰白質においてオリゴデンドロサイト系譜細胞の減少を認めた。また近年、DNAメチル化などのエピゲノム変化が大うつ病の病態と強く関係すると考えられてきている。一方、C型肝炎などの治療薬として用いられているインターフェロンαは、投与した患者がうつ症状を呈することが報告されている。そこで本研究では、インターフェロンαを慢性投与したカニクイザル死後脳のエピゲノム解析を試みる。昨年度までにインターフェロンαを慢性投与したカニクイザルの死後脳前頭極灰白質から、神経細胞およびオリゴデンドロサイト系譜細胞の細胞核を分取し、得られたDNAから、オリゴデンドロサイト関連因子であるSox10のプロモーター領域のDNAメチル化の解析を行ったところ、オリゴデンドロサイト系譜細胞では、50%程がメチル化されていたが、インターフェロンαの投与でメチル化率が10%程に変化しており、細胞種特異的なエピゲノム変化が生じていることを見いただいた。しかしながら、多くの遺伝子から特定のメチル化異常を見出すことは困難であることから、今年度はインターフェロンαを慢性投与したカニクイザルの死後脳前頭極灰白質のRNA-seq(網羅的遺伝子発現解析)を行った。インターフェロン投与群とコントロール群3頭ずつの解析で、優位に発現量が変化した因子として2因子が同定された。現在、これらの因子のプロモーター領域のメチル化解析を行っている。現在までに、インターフェロンαを慢性投与したカニクイザル(n=3)、コントロールとして生理食塩水を投与したカニクイザル(n=3)の6頭の前頭極灰白質から神経細胞、オリゴデンドロサイト前駆細胞、成熟オリゴデンドロサイト、アストロサイト/マイクログリアなどの残りの細胞の細胞核をフローサイトメーターで分取し、DNAを抽出した。昨年度までにSox10、Slc6a4のプロモーター領域のメチル化解析を行っているが、より疾患特異的な因子を同定するため、今年度は前頭極灰白質のRNA-seq解析を行った。その結果、2つの因子が同定された。RNA-seq解析は、当初の予定になかったが、エピゲノム異常を捉える上で重要な情報を得ることができた。上述したようにインターフェロンαおよびコントロールの個体脳から抽出した細胞種特異的なDNAを既に得ているので、エピゲノム変化が生じてる因子の同定を引き続き行う。
理論的手法と実験的手法を取り入れたハイブリッド道路舗装設計法の開発に関する研究

本研究では,アスファルト混合物の配合設計において,骨材と空隙,およびバインダの体積バランスを最適化するという体積設計法の考え方をわが国の設計法に導入し,合理性を改善してより耐久性の高い舗装構築を目指すことを目的に,体積配合設計法での設計パラメータとその基準値について検討を行っている。わが国は高温多湿で,大型車よりも小・中型車の交通量のほうが支配的であり,このような条件の下ではわだち掘れとともにひび割れに対する抵抗性を考慮して混合物中の空隙の量と質を検討していく必要がある。アスファルト混合物の配合設計において,混合物中の空隙の量と質を管理するためには,空隙率と飽和度,骨材間隙率という,骨材と空隙,およびアスファルトバインダの体積によって決まる体積指標によってこれらの配合量を決定する必要がある。空隙率,飽和度,骨材間隙率によって各材料の体積のバランスが管理できることは,これまでの検討で明らかにされており,わが国の実状に即した空隙に関する体積指標について検討を行った。アスファルト混合物の空隙率,飽和度,骨材間隙率を把握するためには,ジャイレトリーコンパクタ(SGC)という特殊な締固め装置が必要である。この装置を用いて,わが国の骨材とわが国で流通しているアスファルトバインダを使ったアスファルト混合物を多くの配合パターンで作製し,空隙率,飽和度,骨材間隙率を求めるとともに,設計したアスファルト混合物の力学特性を評価した。混合物の力学特性の評価については,わだち掘れ抵抗性とひび割れ抵抗性について検討した。そして,全ての評価試験の結果を総合的に分析し,わが国の気候条件と交通条件に適した上記体積指標の適性値を選定した。これらの結果を中国のデータとも比較し,さらに同一原材料を用いた既往設計法による混合物のものと比較することにより,設計指標の妥当性について評価した。そして,最終的には体積指標の基準値を提案した。本研究は,日本と中国におけるアスファルト舗装の構造設計,配合設計,およびその他設計法構築に関する既往の検討を広範に調査したうえで,両者を比較検討し,諸外国における最新成果も考慮して,理論的手法と実験的手法の両者を取り入れたハイブリッド道路舗装設計法の開発について検討を行っている。アスファルトコンクリートは材料特性を完全にモデル化することが不可能であることから,理論的手法と実験的手法の中間的手法を採る必要があり,それぞれの国で長所として挙げられている点を取り入れて,すなわち同時に問題点として改善が必要とされている事項を補うことになって,より合理的で経済的なアスファルト舖装設計法の構築に寄与できることになる。これまでの検討では,本研究の課題を次の2点に分けて研究業務を進めている。(1)アスファルト舖装の供用性に関する検討(2)アスファルト混合物の物理特性に関する検討(1)の検討の実績については次のとおりである。本検討では,AASHTO設計基準,すなわちわだち掘れ,疲労ひび割れおよび低温ひび割れに対する破壊基準に基づいて,重交通の条件におけるアスファルト舗装の内部応力を解析し,舖装構造が破壊をきたす要因について明らかにした。内部に生じる応力状態を把握することにより,重交通の条件に対する適切な舖装構造について検討している。(2)の検討の実績については次のとおりである。本検討では,アスファルト混合物の配合設計について,Superpave設計法とMarshall設計法の比較を行っている。主要な比較事項は以下の2点である。1点は締め固めたアスファルト混合物の力学特性の違いであり,圧縮試験および引張試験,および対流動試験によって評価している。もう1点は締め固め機構の違いに対する両者の締め固め特性の関係について,空隙率,飽和度,骨材間隙率を指標にして評価している。
脂質代謝調節におけるリンパ球コリン作動系の役割の検討

脂質代謝調節におけるリンパ球コリン作動系の役割を検討した。対照leanマウスと比較して、脂質代謝異常モデルob/obマウスにおいて、アセチルコリン(ACh)、ACh合成酵素(ChAT)の遺伝子発現胸腺および脾臓におけるACh産生量およびChAT活性は低下していた。老化が進むとACh合成およびChATは上昇していた。すなわち、脂質代謝の変化に伴いリンパ球コリン作動系活性が影響を受けることが明らかとなった。代表者らは,M_1/M_5ムスカリン受容体(mAChR)あるいはα7型ニコチン受容体(nAChR)が,リンパ球機能を調節する可能性を報告している.生活習慣病において血管系の機能障害が起こっている.血液・血管系における主なアセチルコリン(ACh)産生細胞は,Tリンパ球である.そこで,肥満モデル動物におけるリンパ球コリン作動系活性とAChのリンパ球機能への影響を検討した.肥満モデル動物として雄性ob/obマウス(12, 20週齢)を用いた.脾臓より単核白血球(MNL)を調製した.T細胞活性化薬コンカナバリンA (ConA, 3 μg/ml)の存在下,24時間MNLを培養した.一部は,mAChR作用薬オキソトレモリン-M (Oxo-M, 100μM)で1時間刺激した. RT-PCR法によりコリンアセチルトランスフェラーゼ(ChAT), M_5mAChR, α7-nAChR,インターロイキン-2 (IL-2)遺伝子発現を解析した.ChAT遺伝子発現は,対照マウスと比較してob/obマウスにおいて有意に低下していた.ConAによるChAT遺伝子発現の増強の程度は,ob/obマウスにおいて弱かった.ob/obマウスでは,ChAT遺伝子発現は20週齢において12週齢と比較して増大していた.M_5 mAChRおよびα7-nAChR遺伝子発現には両群間で差はなかった.12週齢において,ConAによるIL-2遺伝子発現の誘導が,Oxo-Mにより増強されたが,この増強作用には両群間で差はなかった.肥満モデル動物において,MNLにおけるACh産生が増大していることが明らかとなった.すなわち,リンパ球コリン作動系活性が生活習慣病により影響を受けている可能性が考えられた.肥満モデル動物におけるスタチン系薬のリンパ球系コリン作動系活性への影響について解析を進める予定である.代表者らは,M_1/M_5ムスカリン性アセチルコリン受容体(mAChR)あるいはα7型ニコチン性アセチルコリン受容体(nAChR)が,リンパ球機能調節に関与している可能性を報告している.生活習慣病において血管系の機能障害が起こっている.血液・血管系における主なアセチルコリン(ACh)産生細胞は,Tリンパ球である.そこで,肥満モデル動物におけるリンパ球コリン作動系活性の指標としてACh産生量を検討した.肥満モデル動物として雄性ob/obマウス(12,20週齢)を用いた.脾臓より単核白血球(MNL)を調製した.T細胞活性化薬コンカナバリンA(ConA,3μg/ml)の存在下,24時間MNLを培養した.ラジオイムノアッセイ法によりAChを測定した.ACh産生量は,対照マウスと比較してob/obマウスにおいて低下していた.ob/obマウスでは,ChAT遺伝子発現は20週齢において12週齢と比較して増大していた.以前にChAT遺伝子発現は,対照マウスと比較してob/obマウスにおいて有意に低下していること,ob/obマウスでは,ChAT遺伝子発現は20週齢において12週齢と比較して増大していることを報告している.肥満モデル動物において,MNLにおけるACh産生が影響を受けていることが明らかとなった.すなわち,リンパ球コリン作動系活性が生活習慣病により影響を受けている可能性が考えられた.次年度は肥満モデル動物におけるスタチン系薬のリンパ球系コリン作動系活性への影響について解析を進める予定である.代表者らは,リンパ球における非神経性コリン作動系が,M_1/M_5サブタイプのムスカリン性アセチルコリン受容体(mAChR)あるいはα7型のニコチン性アセチルコリン受容体(nAChR)が,リンパ球機能調節に関与している可能性を報告している.血液・血管系における主なアセチルコリン(ACh)産生細胞は,Tリンパ球である.一方,生活習慣病において血管系の機能障害が起こっている.そこで,肥満モデル動物におけるリンパ球コリン作動系活性の指標としてACh産生量と合成酵素活を検討した.肥満モデル動物として雄性ob/obマウス(20週齢)を用いた.脾臓あるいは胸腺を摘出した.ACh量はラジオイムノアッセイ法,Ach合成酵素活性はFonnum法によりそれぞれ測定した.ACh産生量は,対照マウスと比較してob/obマウスにおいて低下していた.

以前にChAT遺伝子発現は,対照マウスと比較してob/obマウスにおいて有意に低下していること,ob/obマウスでは,ChAT遺伝子発現は20週齢において12週齢と比較して増大していることを報告している.ob/obマウスでは,ChAT合成酵素活性は対照マウスと比較して増大していた.肥満モデル動物において,免疫担当細胞におけるACh産生が影響を受けていることが明らかとなった.すなわち,リンパ球コリン作動系活性が生活習慣病により影響を受けている可能性が考えられた.今後はさらに肥満モデル動物におけるスタチン系薬のリンパ球系コリン作動系活性への影響について解析を進めていく予定である.
パルス中性子回折による酵素反応等の水素移動機構解明

光照射によって可逆的に反応を起こし色が変化するサリチリデンアニリン誘導体の水素移動機構を解明するため、水素を高精度に観測できる中性子回折測定を行った。まず、サリチリデンアニリン誘導体の重水素化を行い、長辺0.8mm、薄さ0.1mmの薄い単結晶を作成することに成功し、単結晶の体積も稼ぎつつ、全体の光反応率を稼いだ。これを大強度陽子加速器施設J-PARCに設置された単結晶中性子回折装置iBIXを用いて、単結晶中性子回折を行い、十分な中性子回折強度を得ることに成功した。本研究の手法の最大の特色である中性子回折法は、本研究で用いるサリチリデンアニリン誘導体ような有機物の試料に多く含まれる水素原子からの非干渉性散乱によってバックグラウンドが増大し、大幅にデータのS/N比が下がってしまう。一方、水素原子の同位体である重水素原子は非干渉性散乱がほとんどなく、回折強度に寄与する弾性散乱能も高い。本研究ではサリチリデンアニリン誘導体を結晶中で互変異性反応を起こし、その反応後あるいは反応途中を中性子回折で構造解析を行うため、結晶中に未反応の分子(エノール体)と生成物分子(トランス・ケト体=着色体)が混在して結晶全体の回折強度が減衰することが予想される。エノール体とトランス・ケト体を精度よく構造解析し、水素原子の移動を直接観察するためには、バックグラウンドを低く抑えてデータのS/N比を上げる必要がある。そこで本年度は、水素原子を可能な限り重水素原子に置き換えた試料化合物を合成するスキームの調査、検討を行った。C-H結合のような共有結合の水素原子まで含めての重水素化であるため、多ステップの有機合成が必要となったが、サリチリデンアニリン誘導体の完全重水素体を合成するスキームを構築することができ、軽水素体によるテスト合成に成功した。また、平行して可視・紫外光源による粉末結晶への光照射条件決定や単結晶中性子回折に不可欠な巨大単結晶作成(長辺2mm)を水素体で成功した。本研究の手法の最大の特色である中性子回折法は、本研究で用いるサリチリデンアニリン誘導体のような有機物の試料に多く含まれる水素原子からの非干渉性散乱によってバックグラウンドが増大し、大幅にデータのS/N比が下がってしまう。本年度では前年度に立てた合成スキームを元にサリチリデンアニリン誘導体の重水素化を試み、50%程度の重水素化に成功した。また、平行して単結晶X線回折計上での光照射で単結晶の光反応を均一的に進行させ、その反応率を向上させるための条件検討を行い、0.3mm程度の厚さを持つ単結晶を1020%程度反応させることに成功した。さらに、軽水素体の粉末結晶を用いて粉末中性子回折実験を行った。使用した装置はJ-PARC茨城県材料構造解析装置iMATERIAで、粉末を撹拌しながら十分に光反応を進行させ、-100度に急冷し、バナジウムの試料ホルダーに詰めて5時間の測定を行った。構造解析は現在進行中である。また、J-PARC茨城県生命物質構造解析装置iBIXを用いた単結晶中性子回折測定を年度末に行う予定であったが、震災によりJ-PARC実験施設全体が大きく被災し、実験がキャンセルされた。エノール体とトランス・ケト体を精度よく構造解析し、水素原子の移動を直接観察するためには、できるだけ着色体であるトランス・ケト体の占有率、すなわち単結晶全体の反応率をあげる必要がある。一方で、サリチリデンアニリン誘導体は、単結晶状態で光照射を行う場合、単結晶の表面のみで反応が進行し、内部は未反応のままで残ってしまう。とくに単結晶中性子回折ではミリメートルレベルの大きな単結晶を必要とするため、とくに反応率が低くなる。そこで本年度は、サリチリデンアニリン誘導体の単結晶をできるだけ薄くすることを試み、長辺0.8mmの大きさを持ちながら、0.1mm程度の薄い結晶を作成することに成功した。これを大強度陽子加速器施設J-PARCの物質・生命科学実験施設MLFに設置された単結晶中性子回折装置iBIXを用いて、単結晶中性子回折を行った。測定は1日1フレームと長時間行い、中性子回折強度を十分に稼ぐことに成功した。
RNA結合因子を標的とした神経膠腫予後マーカー開発

グリオブラストーマ(GBM)でEJC関連因子の高い発現の意義を明らかにするために免疫染色し、発現量が高い群と低い群で生存率に差があるかを検討した結果、高発現群では低発現群と比較して有意に全生存期間が短いことが明らかとなった。また、Tet-ONシステムを利用して薬剤誘導による過剰発現(OE)系を作製し、影響を受ける遺伝子を検索したところ、多数の遺伝子の変動を検出できた。これらの遺伝子の機能をデータベースなどにより検索したところ、GBMに関連する遺伝子が多数を占めていた。この結果は、EJC関連因子がGBMに関わる遺伝子群のマスター因子であることを示唆するものと思われる。EJC(Exon Junction Complex)はmRNAに結合するタンパク質複合体で、mRNAの代謝や輸送にかかわる。申請者らは、EJCがRNAの代謝と同時に中心体成熟にかかわることを見いだしてきた。この複合体の異常は、遺伝子発現よりも中心体異常を引き起こすため、染色体の不安定性にかかわると考えている。EJCを標的としてさまざまな遺伝子発現データベースを検索していく過程で、神経膠腫、特に悪性の膠芽腫において発現が変動していることを突き止め、さらに予後データと連結することにより、発現異常が予後マーカーとして有用である可能性を見いだした。本申請では、EJCの診断マーカーとしての有用性を患者由来検体を利用して検討する。さらにEJCの発現が膠芽腫において果たす役割を解明し、より有効な診断・治療標的を探索する。本研究はDNAマイクロアレイのデータベースから、EJCが予後因子となりうる可能性を見いだしたことが仮説の根拠となっている。培養細胞を用いた実験においてマイクロアレイのプローブの再評価を行い、データベースの信頼性を検証した。さらに、EJC因子の発現が膠芽腫細胞に与える影響を解析した。EJCコア因子のうちeIF4A3、Y14とMagohについては完全欠損が致死であるためノックダウンの結果を検討し、欠損が致死性ではないCasc3についてCrispr/Cas9を用いたゲノム編集によるノックアウト(KO)細胞系を複数作出した。さらにTet-ONシステムを利用して薬剤誘導による過剰発現(OE)系を作製中であり、ノックダウン及びノックアウトでの解析結果をまとめている。ヒト検体を用いた実験については、免疫染色実験系を立ち上げ、実験による発現変動と予後との関連を解析中であり、29年度においても継続して結果を得ていく予定である。DNAマイクロアレイにおいては、プローブが必ずしも良好な定量性を示すとは限らないことが知られている。このため、マイクロアレイのデータについては個々のプローブについて定量性を担保しておく必要がある。プローブの定量性を担保するために、各EJC因子のノックダウン細胞においてマイクロアレイ解析を行ったが、いずれのプローブも定量結果は同時に行ったリアルタイムPCRと同等に発現の低下を検出していた。さらに、培養細胞の系ではノックダウン、ノックアウト実験から、EJC因子が発現を失った時に細胞に与える影響については解析が進んだ。一方、強発現系については、Tet-ONシステムを導入して細胞系に与える影響を解析する予定であったが、安定発現誘導系の構築が終了していない。29年度に向けて条件設定を進めて細胞系を構築する予定である。また、ヒト検体における発現変動と予後との相関解析は、特に組織検体の包埋切片における免疫染色実験に良好な結果を得ることができたことから、引き続き症例の数を増やすことでさらに検討を進めていきたい。GBMではEJC関連因子においてmRNA量が増加していることを見いだした。この結果は、正常組織で発現が低いEJC関連因子が腫瘍では発現が高いこと、細胞分裂にEJCが寄与することから、増殖する腫瘍細胞はEJCの発現を獲得することが必要と考えられる。そこでGBM腫瘍組織および周辺部よりタンパク質を抽出し、ウエスタンブロットを行ったところ、腫瘍組織での高発現を見いだした(未発表データ)。この実験結果は、がん化にともなうEJCの活性化がGBM細胞の増殖に必須であることを強く示唆する。次に、EJC関連因子の高い発現の意義を明らかにするために免疫染色し、発現量が高い群と低い群で生存率に差があるかを検討した。46名の腫瘍組織標本について、あるEJC関連因子で染色し、発現量と予後との関係をKaplan-Meierプロットしたところ、高発現群では低発現群と比較して有意に全生存期間が短いことが明らかとなった(p=0.0081)。また、Tet-ONシステムを利用して薬剤誘導による過剰発現(OE)系を作製した。ウエスタンで発現誘導を確認後、DNAマイクロアレイによりトランスクリプトーム解析を行ない、影響を受ける遺伝子を検索したところ、多数の遺伝子の変動を検出できた。また、EJC関連因子について核内への局在についても確認を行なった。

平成28年度に実施した実験をさらに進めていく予定であり、29年度においても目的や実験概要に大きな変更はない。培養細胞を用いたTet-ONシステム系の構築に予想通りの結果が得られていないことから、安定発現誘導系を構築するために、レンチウイルス等の実験系を検討する必要が生じている。この場合でも、組換えDNA実験に関する許可は軽微な変更で済むために、迅速に系の確立を進めることができる。ヒト由来標本の解析については、連携研究者との連絡をより密にして成果を確実なものにしていきたいと考えている。最近、EJCが発がん抑制遺伝子の発現制御に関わること(Tarn et al、Sci Rep誌、2017)、EJCが相互作用する因子とさまざまな疾患やがんとの関連性が指摘されつつあり(Liu et al、J Biol Chem、2014、Chang et al、J Biol Chem、2016など)、更には本申請と類似の検討結果が肝がんで報告される(Liang et al、Int J Clin Exp Med、2017、Oncol Rep、2017、2報)等海外でも活発に研究が進められており、速やかに研究成果の公表を目指したいと考えている。細胞生物学
蛍光標識ATPアナログとケージド化合物による筋収縮及び制御の動力学

ミオシン頭部の構造変化による力発生のメカニズムを明らかにすることを目的として、ケージドATP急速光分解法を用いて筋線維(スキンドファイバー)を賦活し、ミオシン頭部の活性部位(ATP結合ポケット)を蛍光性ATPアナログ(TNPヌクレオチド)で標識することによって、収縮とミオシン頭部の活性部位における構造変化との対応関係を調べることを試みた。二種の蛍光性ヌクレオチド・アナログの間の蛍光エネルギー移動効率の測定結果から、TNPヌクレオチドはミオシン頭部のATP加水分解部位のごく近傍に結合し、この部位の構造の変化を検出していることが明らかになった。その結果、ミオシン頭部のATP加水分解部位(活性部位)における構造変化を蛍光変化として検出することに成功し、これまでにいくつかの重要な事実が明らかになった。すなはち、第一にミオシン頭部がヌクレオチドを結合することによって活性部位の構造が変化すること(この変化は単離された溶液中のミオシンに生じるものとは異なる事を示している)、第二に、カルシウムが存在し線維が収縮するとき、ミオシン頭部における運動に対応して活性部位にさらに構造変化が進行すること(ミオシン頭部のアクチン結合部位に生じる変化が活性部位に影響を及ぼす事を示している)、及び第三にATPが枯渇し線維が硬直状態になるとき、蛍光は元の硬直状態でのレベルに戻ること(クロスブリッジの力発生状態は硬直状態とは異なる事を示している)などである。筋収縮の分子機構は、生体における諸機能にうち未だ未解決のまま残されている重要課題の一つである。ケージドATPなどのケージド化合物利用によって筋線維を対象とするクロスブリッジ反応の動力学的解析を行うことが可能となり、クロスブリッジによる力発生機構の解明のための重要な方法の導入がなされることとなった。本研究は、螢光ATPアナログを用いることによって筋線維の螢光標識を行い、ケージドATPなどを用いる筋線維を対象とする動力学的研究において筋の力学的応答に加えて、収縮蛋白質における力発生に関わる構造変化を検出しようとするものである。トリニトロフエニルATP(TNP-ATP)によりスキンドフアイバーを螢光標識したのち、レーザー光を用いてケージドATPからATPを遊離させると、螢光強度が増大した。この螢光増大は、その速度が硬直クロスブリッジの解離と一致していることから、ATPのアクティブサイトへの結合によって生じた、、ミオシン頭部における構造変化に由来していると考えられる。カルシウムが存在するとき、ATPの光遊離によって、筋は硬直クロスブリッジの解離に引き続いて活性張力を発生するが、このとき上に述べた螢光はさらに増大する。このような螢光信号は、力発生状態におけるクロスブリッジの構造変化を示すものである可能性があるので、さらにこれら螢光信号の性質について研究を進めている。筋収縮の分子機構は、生体における諸機能のうち未だ未解決のまま残されている重要課題の一つである。ケージドATPなどのケージド化合物を利用によって筋線維を対象とするクロスブリッジ反応の動力学的解析を行うことが可能となり、クロスブリッジによる力発生機構の解明のための重要な方法の導入がなされた。本研究は、蛍光ATPアナログを用いることによって筋線維の蛍光標識を行い、ケージドATPなどを用いる筋線維を対象とする動力学的研究であるが、筋線維中のミオシン頭部を蛍光標識することによって、収縮蛋白質における力発生に関わる構造変化を検出しようとするものである。トリニトロフェニルADP(TNP-ADP)によりスキンドファイバーを蛍光標識したのち、レーザー光を用いてケージドATPからATPを遊離させると、蛍光強度が増大した。この蛍光増大は、その速度が硬直クロスブリッジの解離より大きいことから、ATPのアクティブサイトへの結合によって生じた、ミオシン頭部における構造変化に由来していると考えられる。カルシウムが存在するとき、ATPの光遊離によって、筋は硬直クロスブリッジの解離に引き続いて活性張力を発生するが、このとき上に述べた蛍光はさらに増大する。このような蛍光信号は、力発生状態におけるクロスブリッジの構造変化を示すものであると考えられる。現在、筋収縮の分子機構についての重要な結果が得られつつあるところである。

ミオシン頭部の構造変化による力発生のメカニズムを明らかにすることを目的として、ケージドATP急速光分解法を用いて筋線維(スキンドファイバー)を賦活し、ミオシン頭部の活性部位(ATP結合ポケット)を蛍光性ATPアナログで標識することによって、収縮とミオシン頭部の活性部位における構造変化との対応関係を調べることを試みた。その結果、ミオシン頭部のATP加水分解部位(活性部位)における構造変化を蛍光変化として検出することに成功し、これまでにいくつかの重要な事実が明らかになった。すなはち、第一にミオシン頭部がヌクレオチドを結合することによって活性部位の構造が変化すること(この変化は単離された溶液中のミオシンに生じるものとは異なる事を示している)、第二に、カルシウムが存在し線維が収縮するとき、ミオシン頭部における運動に対応して活性部位にさらに構造変化が進行すること(ミオシン頭部のアクチン結合部位に生じる変化が活性部位に影響を及ぼす事を示している)、及び第三にATPが枯渇し線維が硬直状態になるとき、蛍光は元の硬直状態でのレベルに戻ること(クロスブリッジの力発生状態は硬直状態とは異なる事を示している)などである。