hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
法律エキスパートシステムの基礎的研究--法的思考へのAIアプローチ--

本研究は、実定法の言語分析を通じて法的知識の論理構造を明らかにするとともに、それに基づいて、実際に即して法的正当化の推論を行なう法律エキスパートシステムの基礎を確立することを目的とする。原理と方法の解明と実証を行なうために、AIワークステーション上に知識ベースと推論機構ならびに最小限のインターフェースからなる実験用のプロトタイプを作成する。三年間の研究において上記の研究目的はほぼ達成された。すなわ、(1)法的知識の構造については、ウィーン売買条件(一部)および民法(一部)の条文を法規範文単位に要件・効果の内的構造において解明するとともに、諸法規範文間の論理的結合関係を明かした。その際とくに法の適用を制御する推論の知識構造を法規範文とその効力を規定しているメタ法規範文の関係として解明した。(2)法律知識ベースとしては、上記分野において、上記原理に基づいて、法規範文とメタ法規範文を複合的述語論理式で表現し、サンプルシステムをAIワークステーションPSI-II上に作成した。(3)法的推論機構としては、a)適用すべき法規範文を決定する推論を、上記法的メタ法規範文を適用した演繹的正当化の推論として構成し、そのための法的メタ推論機構を完成した。また、b)この推論過程を理解・説明するためのユーザフレンドリーな説明機構を作成した。さらに、c)有限なルールを用いて多様な事件に対して法的解決を与えるための拡大解釈や類推適用の工学的モデルを、法的シソ-ラスの構造にしたがった仮説生成の推論として計算機上実装し、その有効性および問題点を検討した。また法的概念辞書の基礎を明らかにした。上記の研究に関連する論理学的、法哲学定、法社会学的、民法学的および情報・知識工学的的基礎付けを行った。本研究によって本格的な法律エキスパートシステムの開発研究の基礎が提供されたと言える。本研究は、実定法の言語分析を通じて法的知識の論理構造を明らかにするとともに、それに基づいて法的正当化の推論をその実際に即して行なうことのできる法律エキスパ-トシステムの基礎を確立することを目的とする。本研究は、対象法分野を民法の財産法と国際統一売買法とする。原理と方法の解明と実証を行なうためにAIワ-クステ-ション上に知識ベ-スと推論機構ならびに最小限のインタ-フェ-スからなる実験用のプロトタイプを作成する。本研究は、平成2年度を初年度とする3年計画の研究である。平成2年度の研究実施計画において掲げられた研究項目は、(1)法的知識の構造の解明、(2)法的知識ベ-スの作成、および(3)法的推論機構の作成、である。(1)法的知識の構造の解明としては、a.国際統一売買法の条文の要件・効果の内的構造を詳細に分析した。そして諸法規範文の論理的性格とその相互関係が明らかとなった。b.権利義務概念の論理的関係については、Siggの所論を検討し、Coridesを研究中である。c.法的メタ知識の基本構造がメタ述語である「効力」の概念を中心にして明らかになった。さらに、法的概念の一部についてどの格が重要であるかが明らかにされた。裁判官のヒアリングにより裁判官の判断過程についての分析が行なわれた。また事実認定の推論におけるファジ-性の契機の検討がなされた。(2)法的知識ベ-スの作成としては、論理式化の標準フォ-マットを作成し、国際統一売買法の約20条文の命題論理式化・述語論理式化を行なった。これにより、知識ベ-ス構築のための法的知識分析と述語論理式化の手法が得られた。効力の概念を中心に法的メタ知識が部分的にル-ル化された。

(3)法的推論機構の作成としては、推論機能の拡張点についてメタ推論機構の吟味と設計を行なった。さらに、法的メタ推論機構の実験システムを作成した。本研究は、実定法の言語分析を通じて法的知識の論理構造を明らかにするとともに、それに基づいて法的正当化の推論をその実際に即して行なうことのできる法律エキスパ-トシステムの基礎を確立することを目的とする。本研究は、平成2年度を初年度とする3年計画の研究である。平成3年度の研究実施計画において掲げられた研究項目は、(1)法的知識の構造の解明、(2)法的知識ベ-スの作成、および(3)法的推論機構の作成、である。(1)法的知識の構造の解明:(1)法規範文自体の論理構造の解明として、(a)主要述語の格とその値の確定と法規範文の論理構造分析と隠れた知識の発見の作業を継続して行い、(b)権利・義務等の規範的様相既念の分析と論理的関係の形式化を行った。(2)法的推論の論理構造の解明として、(a)推論制御のメタ推論のメタ法規範文を起点とした論理形式化を行い、さらに、(b)法的探索的知識の形式化と(c)包摂判断のファジイ性の分析とその形式化に関する基礎的研究を行った。(2)法的知識ベ-スの作成:(1)法規範文の知識ベ-ス化の研究としては、前年度及び当年度の上記(1)および前年度(2)によって基礎付けられた成果に基づいてAIワ-クステ-ション上に法的知識ベ-スをインプリメントするための研究を行った。(2)法律的概念辞書の作成の研究としては、法律文から法律用語を抽出しその内的格構造と概念間の階層構造をサンプルを用いて明らかにした。(3)法的推論機構の作成:(1)法的推論のための推論機能の拡充としては、論理的推論概念をどこまで必要とするか明らかにし、その実現方法を検討した。さらに、類推による仮説生成の実験システムの作成に着手した。(2)法的メタ推論機構の作成研究としては、法的メタ明機能の検討を行った。(3)法的ファジイ推論機構については、その導入の可能性を検討した。本研究は、実定法の言語分析を通じて法的知識の論理構造を明らかにするとともに、それに基づいて法的正当化の推論をその実際に即して行なうことのできる法律エキスパートシステムの基礎を確立することを目的とする。原理と方法の解明と実証を行なうためにAIワークステーション上に知識ベースと推論機構ならびに最小限のインターフェースからなる実験用のプロトタイプを作成する。本年度は、平成2年度を初年度とする3年計画の研究の最終年度である。本年度の研究において上記の研究目的はほぼ達成された。すなわち(1)法的知識の構造については、国際統一売買法および民法(一部)の条文を法規範文単位に要件・効果の内的構造において解明するとともに、諸法規範文間の論理的結合関係を明かした。その際とくに法の適用を制御する推論の知識構造を法規範文とその効力を規定しているメタ法規範文の関係として解明した。(2)法的知識ベースを、上記法分野において、法規範文とメタ法規範文を複合的述語論理式として表現したルールベースとしてサンプル的に、AIワークステーションPSI-II上に作成した。同様な形式でいくつかの事例も表現した。
E型肝炎ウイルスの増殖機構のin vitroでの解析とE型肝炎治療薬への応用

E型肝炎ウイルス(HEV)は、近年日本でもブタやイノシシの肉を食べることによる感染が多発し、早急な対策が望まれてきている。本研究では、ブタ肝臓よりHEVを分離し、培養細胞系で増殖できるシステムを確立した。また、本クローンをカニクイザルに接種することにより肝炎を発症させることにも成功した。本クローンを用いた培養システムは抗HEV剤のスクリーニングにも応用可能であり、E型肝炎の治療法の確立に役立つと考えられる。昨年度は、培養細胞系で増殖することができるHEVクローンの取得を試みた。ヒトおよびブタの糞便材料、ブタの肝臓から乳剤を作ってヒト肝臓由来培養細胞に接種し、長期間培養を行なった。経時的に培養上清を回収し、ELISA法を用いて培養上清中のHEV粒子量を測定したところ、感染後1ヶ月程度から抗原量の上昇が見られるサンプルを見出した。本クローンは培養細胞系で増殖性があると考えられる。RT-PCR法を用いて本クローンのcDNAをクローニングし、接続して全長クローンを作成した。定量PCR装置を用いた高感度HEV RNA測定系の確立にも成功した。本クローンよりRNAを合成し、培養細胞に導入して上記の測定系を用いて感染性かどうかの確認を行なっている。同時に感染細胞の培養上清および合成RNAをカニクイザルに接種し、本クローンの動物モデルへの感染性の検討も行っている。クローンの感染性が確認できれば、reverse geneticsの手法を用いてHEVの増殖に重要な領域を調べることが可能になる。また、全長クローンの構造蛋白をコードする領域を薬剤耐性遺伝子に置換したレプリコンを作成し、RNAを合成して培養細胞に導入し、薬剤耐性細胞が得られるかどうか確認している。レプリコン細胞を樹立することができれば、HEV増殖阻害剤のスクリーニングを本細胞を用いて行なうことができ、簡便に阻害剤のスクリーニングが行なえると考えられる。昨年度は、一昨年度に取得した培養細胞系で増殖することができるHEVクローンからRT-PCR法を用いて本クローンのcDNAをクローニングし、接続して全長クローンを作成した。一方、感染細胞の培養上清をカニクイザルに接種し本クローンの動物モデルへの感染性の検討を行ったところ、サル便中に粒子の放出が確認され、本クローンがサルに感染性であることが証明された。また、培養上清中の粒子からウイルスRNAを精製しヒト肝臓由来細胞にトランスフェクションしたところウイルスの増殖と粒子の培養上清中への放出が確認され、RNAも感染性であることが示された。現在本クローンよりRNAを合成し、培養細胞に導入して感染性を示すかどうかの確認を行なっており、クローンの感染性が確認できれば、reverse geneticsの手法を用いてHEVの増殖に重要な領域を調べることが可能になる。また、全長クローンの構造蛋白をコードする領域を薬剤耐性遺伝子に置換したレプリコンを作成し、RNAを合成して培養細胞に導入して薬剤耐性細胞の樹立に成功した。HEV増殖阻害剤のスクリーニングを本細胞を用いて行なうことができ、簡便に阻害剤のスクリーニングが行なえると考えられる。
単調作用素の構造の解明と選好理論への応用

位相空間上の関数fに対し、連続関数u(f)を上から対応させる単調作用素uを考える。関数の終域Rを順序位相ベクトル空間へ拡張する場合、作用素uのもつ位相的・代数的性質に加え、凸保存性や単調性(順序保存性)等の諸性質が研究対象となってくる。本研究では、順序構造が全順序から半順序へ変わることで現れる内点条件を考察することにより、無限次元ベクトル値の単調作用素の構造を明らかにすることを目指す。更に、単調作用素に関して得られた結果・手法を、選好理論への数学的モデルとして適応することも目指す。
批判的思考力育成のための同期的・非同期的な複合的ディスカッション環境の開発

本研究課題では,批判的思考力育成のための同期的・非同期的な複合的ディスカッション環境の開発を目指した。3年間の研究の結果,以下の3点を明らかにした。まず,大学生の批判的思考力育成のためには,対面環境とインターネットなどの非同期環境を用いた多様なディスカッション環境を提供することが有用であることであった。次に, Moodleなどの非同期ディスカッションプラットフォームの利用は,学生の非同期環境利用に対する効用評価を高めるということであった。最後に,複合的なディスカッション環境の利用は,学生の批判的思考態度を向上させるということであった。平成21年度は,2つの教員養成学部間での遠隔教育のツールとしてMoodleを用いたディスカッションを実施した。本研究では,これをジョイントディスカッションと称している。とりわけ,批判的思考態度の中の「探究心」が高い学生にとって,このジョイントディスカッションは,理解が困難な心理学理論の習得に寄与したことが明らかになった。また,批判的思考態度の準備性を確認するために,心理学を専門とする学部学生1年生を対象とした場合,学生が前期の心理学実験の授業で獲得した批判的思考態度は,後期の心理学の講義科目の知識理解にも影響を及ぼすことが明らかとなった。このような成果は,これまで研究の重要性が指摘されてきたCSCLを用いた遠隔教育の教育効果を示す基礎資料となるものであり,今後の教授学習プログラムの開発に意義深いと考えられる。本研究では,これまで,大学での心理学の専門教育に対して,準備段階として導入期に批判的思考態度を高めておくことが重要であることを示してきた(例えば,藤木・沖林,2007;沖林ら,2010)。平成21年度は,批判的思考態度と自我同一性地位の関係を明らかにした。また,批判的思考態度を構成する要因の相互関係について再検討を行った。このような研究は,批判的思考態度を構成する認知的構成要素の構造と機能を明らかにする手掛かりとなる。批判的思考態度の構造と機能について研究を進めることによって,学習者や情報の受け取り手の認知特性に応じた適切な教育的介入や情報提供が可能となる。これまで,本科研における研究プロジェクトとしては,下記の研究を展開してきた。1.2大学間における非同期ディスカッション環境の構築,2.大学専門教育および共通教育において有用な批判的思考態度尺度の開発である。まず,1の「2大学間における非同期ディスカッション環境の構築」では,愛媛大学教育学部富田英司講師,および上智大学理工学部田村恭久准教授との共同研究を展開してきた。その成果は,2010年に開催された第26回日本教育工学会および,第27回日本認知科学会で発表を行った。次の2の「大学専門教育および共通教育において有用な批判的思考態度尺度の開発」については,第74回日本心理学会大会での研究発表やワークショップならびに,第52回日本教育心理学会総会におけるシンポジウムなどで研究発表を行ってきた。平成22年度の実践研究の結果,批判的思考態度と成績(知識量)の関連としては,全体としては関連があることが明らかとなった。また,高成績者は探究心の得点が高いことが明らかとなった。2大学間における非同期ディスカッション環境に関する研究として,そのうちの1つの大学における2つの授業における授業実践の効果検証を行った。まず,授業後の理解度テストにおいては知識的側面については,クラス間の違いがなかった。一方,理解度に応じてMoodleに投稿されたメッセージのテキストマイニングによる解析を行ったところ,高理解者は,反省的あるいは省察的なメッセージ内容を投稿しているのに対し,低理解者は,素朴な感想をそのままメッセージとしているようなことが明らかとなった。平成23年度は,本研究課題の完成年度にあたる。本研究は,基本的には先行研究の知見に基づきながらも本研究のために開発した標準ツールやデバイスを用いた開発研究という特徴を持つ。すなわち,本研究の展開は,教育心理学的知見に基づく標準ツールの開発に関する基礎的研究と,プログラム・ロジックモデルに基づく教育プログラムの開発と評価という実践的研究の2つの側面により構成される。本研究では,大学での授業実践を通した批判的思考力の育成プログラムを開発してきたが,平成23年度は,研究成果の発表を行った。まず,大学専門教育課程における,効果的なレポート作成支援の事例と,CSCLを用いた専門的文章の協同的読解活動の成果を,楠見・道田・子安(201D「批判的思考力を育む」に掲載した。また,批判的思考態度尺度の構成要素とその教育実践への応用例を,日本教育心理学会の自主シンポジウムで紹介した。この自主シンポジウムには,本研究課題の共同研究者である,京都大学の楠見孝教授,愛知教育大学の藤木大介講師にそれぞれ指定討論と話題提供として登壇していただいた。次に,認知科学特集号「批判的思考」のゲストエディタとして特集号の編集に携わった。これは,2011年3月に刊行されている。この中で,研究代表者の沖林は巻頭に掲載論文の紹介論文を掲載した。

認知科学誌に限らず,これまでに日本の学術雑誌で批判的思考が特集されたことはないため,この特集号の発行は,批判的思考研究に対して重要な役割を果たすものである。
共鳴トンネル素子を用いた広帯域アナログ/デジタル変換器

マイクロ波信号を直接デジタル信号に変換できるA/D変換技術の確立を目指し、共鳴トンネルダイオード(RTD)を用いた高速・高分解能A/D変換器(ADC)の構成方法を明らかにすることを目的として研究を行い、以下の結果を得た。1)並列比較型ADCRTDとHFET(ヘテロ接合電界効果型トランジスタ)を組み合わせた新しい超高速機能回路を考案し、フロントエンド部分の量子化器だけでなく、エンコーダ回路ブロックに適用した並列比較型ADCを設計した。コンパクトな(約1/2の素子数)ADC回路が実現できた結果、SPICEシミュレーションにより消費電力を評価したところ、4ビット10GS/s動作で0.3W(従来の約1/2に相当)と、大幅な低減化が可能であることが分かった。また、RTDのラッチ機能に基づくパイプライン処理を組み込んだフラッシュ型5ビットADCを提案し、10GHzで実効分解能4.6bit(SNR=29.4dB)が得られる可能性を明らかにした。無線応用で特に有効とされている連続時間バンドパスΔΣ型ADCに着目し、量子化器として上記フラッシュ型ADCを組み込んだΔΣ変調器を検討した結果、RTD量子化器出力のデューティ比の低下に応じてフィードバックゲインを高めることで、高速化・高精度化が実現できる見通しが得られた。実際に、InP系HEMTを想定したGm-C型バンドパスフィルタ(中心周波数500MHz)を利用して回路シミュレーシヨγを行った結果、4GHz動作で実効分解能8bitが得られた。更に、安定性に優れたカスケード方式バンドパスΔΣ変調器を提案し、多レベル信号導入(多ビット化)、動的要素整合により16bitの分解能が得られる可能性を示した。以上の結果から、カスケード方式バンドパス型ΔΣ変調器を基本に、RTD多値量子化器を用いた並列比較型ADCブロック、HEMTバンドパスフィルタ回路を組み込み、動的要素整合を採用してADCを構成すれば、当初の目標性能(中心周波数2GHz、帯域幅100MHz、分解能16bit)が達成できる可能性があることを明らかにした。1.共鳴トンネルダイオード(RTD)を用いた並列比較型アナログ/デジタル変換器(ADC)の設計を行なった。具体的には、RTDとHFET(ヘテロ接合電界効果型トランジスタ)を組み合わせた新しい超高速機能回路を考案し、フロントエンド部分の量子化器だけでなく、エンコーダ回路ブロックに適用した。その結果、ADC全体のコンパクト化(約1/2の素子数)が実現できた。更にSPICEシミュレーションにより消費電力を評価したところ、素子数削減に加えて定常的電流経路数も削減できたため、4ビット10GS/s動作で0.3W(従来の約1/2に相当)と、大幅な低減化が可能であることが判った。2.RTD機能回路の速度限界を決める超高速動作時のエラーモードについて、RTDのデバイスモデルとの関係をSPICE解析により考察した。その結果、RTDの寄生抵抗が回路の不安定性と密接に関連しており、寄生抵抗の増加によりエラー発生頻度が高まる現象を見出した。3.並列比較型では6ビット以上の高分解能化を実現することが困難である。これを解決する方法として、無線応用で特に有効とされている連続時間バンドパスΔΣ型ADCに着目し、来年度計画の前倒しの形で予備検討を開始した。2次連続時間ΔΣ変調器の量子化器にRTDを組み込む方法を検討した結果、RTD量子化器出力のデューティ比の低下に応じてフィードバックゲインを高めることで、高速化・高精度化が実現できる見通しが得られた。

マイクロ波信号を直接デジタル信号に変換できるA/D変換技術の確立を目指し、共鳴トンネルダイオード(RTD)を用いた高速・高分解能A/D変換器(ADC)の構成方法を明らかにすることを目的として研究を行った。1.昨年度考案したRTDエンコーダ回路とRTD多値量子化器を採用し、更にRTDのラッチ機能に基づくパイプライン処理を組み込んだフラッシュ型5ビットADCを提案した。SPICEシミュレーションに基づき、回路設計、性能評価を行った結果、10GHz動作で実効分解能4.6bit(SNR=29.4dB)が確認できた。また、回路簡素化の結果、コア回路の消費電力が従来技術の約1/2(0.5W)に低減化できる見通しを得た。2.InP系HEMTを想定したGm-C型バンドパスフィルタ(中心周波数500MHz)の設計を行った。更に、これを利用してバンドパスΔΣ変調器を設計し、回路シミュレーションを行った結果、4GHz動作で実効分解能8bitが得られた。3.安定性に優れたカスケード方式バンドパスΔΣ変調器を提案し、多レベル信号導入(多ビット化)、動的要素整合により、素子特性変動があっても16bitの分解能が得られる可能性を示した。また、上述のRTD多値量子化回路をモデル化したシミュレーションにより、16bit動作が確認できた。以上の結果から、カスケード方式バンドパス型ΔΣ変調器を基本に、RTD多値量子化器、HEMTバンドパスフィルタ回路を組み込み、動的要素整合を採用してADCを構成すれば、回路設計の更なる最適化により、当初の目標性能(中心周波数2GHz、帯域幅100MHz、分解能16bit)が達成できる可能性があることを明らかにした。
ｉＰＳ細胞由来Ｖγ９Ｖδ２Ｔ細胞を用いた消化器がんの新規治療開発

本研究の目的は、iPS細胞由来γ9δ2T細胞を用いた消化器がんに対する新規治療法を開発することである。iPS細胞からγ9δ2T細胞を作製することができれば、従来のγ9δ2T細胞を用いた免疫療法の欠点である、細胞数確保の困難性と細胞の疲弊(exhaustion)といった問題が解決される。当初の研究実施計画では、当該年度は、1.ヒトγ9δ2T細胞からのiPS細胞樹立(樹立条件の最適化)、2.誘導したγ9δ2T細胞由来iPS細胞を用いたγ9δ2T細胞への誘導、3.誘導したγ9δ2T細胞由来iPS細胞を用いたγ9δ2T細胞への誘導について、研究実施することを予定していた。1.については、具体的には、末梢血からγ9δ2T細胞を増幅培養し、増幅培養したγ9δ2T細胞を用いて、iPS細胞を樹立した。本実験は、計4回施行し、全4回で、作製したiPS細胞の複数株において、Vγ9 Vδ2-TCR領域の遺伝子再構成が確認できた。Vγ9 Vδ2-TCR領域の遺伝子再構成の有無は、ゲノムPCR・フラグメント解析で評価した。さらにシークエンス解析により、相補性決定領域(CDR)3領域の配列を決定した。また、未分化マーカーの発現を、免疫染色法・RT-PCR法・リアルタイムPCR法で評価し、センダイウイルスベクターの遺残を、免疫染色法・RT-PCR法・リアルタイムPCR法で評価し、三胚葉系への分化能の有無を、胚様体形成法で評価した。2.について、具体的には、過去の既報を参考に、OP9細胞上に、樹立したγ9δ2T細胞由来iPS細胞から作製した胚葉体を播種することで、分化誘導を試みた。フローサイトメトリー解析で、CD34+/CD43+血液前駆細胞を確認することが出来たが、本研究では、成熟T細胞は誘導できなかった。3.については、計画2.を完遂できなかったため、評価できなかった。28年度が最終年度であるため、記入しない。iPS細胞からγ9δ2T細胞を作製することで、従来のγ9δ2T細胞を用いた免疫療法の欠点である、細胞数確保の困難性と細胞の疲弊(exhaustion)といった問題が解決できる。研究開始当初の研究実施計画では、初年度は、1.ヒトγ9δ2T細胞からiPS細胞を樹立すること(樹立条件の最適化)、2.既報に則ったiPS細胞からT細胞への誘導系を確認すること、3.末梢血由来γ9δ2T細胞を用いた抗腫瘍効果の評価法の確立を行うことを予定した。1.について、具体的には、末梢血からγ9δ2T細胞を増幅培養する条件の最適化と、増幅培養したγ9δ2T細胞からiPS細胞を樹立する条件の最適化を行った。それに加えて、初期化遺伝子導入により得られたiPS細胞について、Vγ9 Vδ2-TCR領域の遺伝子再構成の有無を、ゲノムPCR・シークエンス解析・フラグメント解析で評価した。さらに、未分化マーカーの発現を、免疫染色法・RT-PCR法・リアルタイムPCR法で評価し、センダイウイルスベクターの遺残を、免疫染色法・RT-PCR法・リアルタイムPCR法で評価し、三胚葉系への分化能の有無を、胚様体形成法で評価した。2.について、具体的には、以前の報告(Cell Stem Cell. 2013,12:31-6)を参考に、既報のiPS細胞(409B2)を用いて、分化誘導を試みた。また、新たに、フィーダーフリーの条件で誘導したiPS細胞を用いた分化誘導法の確立を目指して、低接着ディッシュを用いて、分化誘導を試みた。3.について、具体的には、タイムラプスイメージングあるいは7-AAD/CFSEを用いたFlow cytometry(FCM)による細胞障害アッセイで、抗腫瘍効果が評価できるか確認した。1.ヒトγ9δ2T細胞からiPS細胞の樹立末梢血からγ9δ2T細胞の増幅培養を、既報に則り行った。遺伝子導入を、センダイウイルス(SeV)を用いて行うことで、活性化されたγ9δ2T細胞に、特異的に導入することができた。iPS細胞作製は、SeVのウイルス量をMOI 10, 20, 30の条件で、足場細胞を、マウス胎児由来線維芽細胞を用いた条件とフィーダーフリー培養基材を用いた条件で検討した。いずれの条件でも、遺伝子導入後、1-2週間で多数のコロニーが出現した。フィーダーフリーの条件下では、19株のiPS細胞株を得ることができた。得られた19株の再構成を、ゲノムPCR法・フラグメント解析で確認し、19株中12株(63.2%)がVγ9領域とVδ2領域の両者に再構成を有した。また、同一の再構成を有する株は19株のうち2株1組のみであり、他の株は互いに異なる配列であった。再構成を確認した細胞株の未分化マーカー発現を、免疫染色法等で評価し、既報のiPS細胞株(409B2)と同等であった。さらにSeVベクターの遺残がないことを、免疫染色法等を用いて確認した。胚葉体形成法による多能性評価では、作製した細胞株は、三胚葉への分化能を有した。2. iPS細胞からT細胞への誘導系の確認

以前の報告を参考にして、既報のiPS細胞(409B2)を用いて分化誘導を行い、血液前駆細胞が誘導できた。また、フィーダーフリーの条件で得たiPS細胞を用いた分化誘導では、低接着ディッシュを用いて、血液前駆細胞が誘導できた。3.末梢血由来γ9δ2T細胞を用いた抗腫瘍効果の確認γ9δ2T細胞とHuH-7細胞を共培養し、タイムラプスイメージングで評価すると、HuH-7細胞が障害される様子を観察することができた。また、7-AAD/CFSEを用いたFCMによる細胞障害アッセイで、γ9δ2T細胞の抗腫瘍効果を評価できた。本研究の目的は、iPS細胞由来γ9δ2T細胞を用いた消化器がんに対する新規治療法を開発することである。iPS細胞からγ9δ2T細胞を作製することができれば、従来のγ9δ2T細胞を用いた免疫療法の欠点である、細胞数確保の困難性と細胞の疲弊(exhaustion)といった問題が解決される。当初の研究実施計画では、当該年度は、1.ヒトγ9δ2T細胞からのiPS細胞樹立(樹立条件の最適化)、2.誘導したγ9δ2T細胞由来iPS細胞を用いたγ9δ2T細胞への誘導、3.誘導したγ9δ2T細胞由来iPS細胞を用いたγ9δ2T細胞への誘導について、研究実施することを予定していた。1.については、具体的には、末梢血からγ9δ2T細胞を増幅培養し、増幅培養したγ9δ2T細胞を用いて、iPS細胞を樹立した。本実験は、計4回施行し、全4回で、作製したiPS細胞の複数株において、Vγ9 Vδ2-TCR領域の遺伝子再構成が確認できた。Vγ9 Vδ2-TCR領域の遺伝子再構成の有無は、ゲノムPCR・フラグメント解析で評価した。さらにシークエンス解析により、相補性決定領域(CDR)3領域の配列を決定した。また、未分化マーカーの発現を、免疫染色法・RT-PCR法・リアルタイムPCR法で評価し、センダイウイルスベクターの遺残を、免疫染色法・RT-PCR法・リアルタイムPCR法で評価し、三胚葉系への分化能の有無を、胚様体形成法で評価した。2.について、具体的には、過去の既報を参考に、OP9細胞上に、樹立したγ9δ2T細胞由来iPS細胞から作製した胚葉体を播種することで、分化誘導を試みた。フローサイトメトリー解析で、CD34+/CD43+血液前駆細胞を確認することが出来たが、本研究では、成熟T細胞は誘導できなかった。3.については、計画2.を完遂できなかったため、評価できなかった。iPS細胞由来γ9δ2T細胞を用いたがん免疫療法の開発は、具体的には、iPS細胞からγ9δ2T細胞を作製することが目的となる。その第一段階として、γ9δ2T細胞由来iPS細胞の作製が必要であるが、その作製については、現段階で出来ているものと考える。作製したiPS細胞がγ9δ2T細胞由来であることを、各TCR領域の遺伝子再構成を評価することで確認し、iPS細胞の品質評価を、未分化マーカーの発現の確認と胚様体形成法による多能性を評価することで行っており、作製したγ9δ2T細胞由来iPS細胞は、γ9δ2T細胞への分化誘導に供するiPS細胞として有用であると考える。以上より、今後の計画は、γ9δ2T細胞由来iPS細胞を用いてγ9δ2T細胞へ分化誘導を行うこと、誘導したγ9δ2T細胞がもつ抗腫瘍効果を検討することを中心とする。iPS細胞からγ9δ2T細胞への誘導については、現段階で、血液前駆細胞(CD34+/CD43+)細胞までは誘導できており、その後の誘導を既報(OP9-N/DLL1細胞上に播き直す事で誘導を行う)に則り行う。
卵巣性ステロイドホルモン分泌調節機構に関する研究

1)ラット下垂体からのゴナドトロピン分泌はプロゲスチンにより抑制されるが、抗P剤RU486はこの抑制を解除する。我々はこの現象をinviro,inuitroで確認した。また各種プロゲスチンのうち、デポ剤であるdesogestrel (DG)はそれ自身は作用がなく、代謝物の3KetoーDGのみか作用を示した。2)ラット卵巣のステロイド合成酵素に対する各種合成ステロイドの作用を検討したところ、3βーHSDはgestrinone,3KetoーDGで,17,20lyuseはdanayol,DGで強く阻害された。この実験からDG自身か卵巣で直接ステロイド合成を阻害している可能性が示唆された。3)妊婦ラット黄体にはEGFレセプタ-が存在するが、黄体細胞をEGF存在下で2日間培養したところ、P_4,20αーOHーP_4,CAMPの基礎値は変わらなかったものの、stimulantに対する反応は抑制された。4)妊婦ラット黄体にはInsulin,IGFレセプタ-が存在するが、この細胞をInsulin,IGFsと培養したところ、IBMX併用時にPu,20αOHP_4,CAMPが増加した。この作用はIBMX非存在下では出にくかったが、これはInsulin等により、CAMP Phosphodiesteruse活性が亢進するためであった。5)RU486は培養黄体細胞に対してはluteolytic作用があるが、下垂体摘除PMSーhCGラットを用いた実験では弱いluteolytic作用しかなく、inviroでの強力なluteolytic作用は主に下垂体経由によることがわかった。1.未成熟ラット卵巣をホモゲナイズし、R5020、estradiolをリガンドに用いてcytosol分画のRRAを行なった。その結果、ラット卵巣のプロゲステロンレセプター(PR)、エストロゲンレセプター(ER)の存在が証明された。これらのレセプターは卵胞の成長に従って増加し、黄体化すると減少することがわかった。2.ラットの黄体細胞を培養したさいの、合成ステロイド剤(合成プロゲスチン、RU486)のP_4、20αOHP_4におよぼす作用が明らかになった。合成プロゲスチンは黄体細胞のP_4放出を増加させたが、それは20αOHase活性の低下によるものではなく、P_4合成量そのものの増加(すなわち3βーHSD,CSCC活性の上昇)が原因であった。RU486はこの合成プロゲスチンの作用をブロックしたが、その一因として黄体ホルモンのプロゲステロンレセプター(PR)経由の作用が考えられた。また、RU486をPMS-hCG前処置下垂体摘除未成熟ラットにs.c.で投与した場合、血中P_4に低下傾向はみられるものの、有意に低下しなかったことから、妊娠ラットにRUを投与したさいのluteolysisは主に下垂体や胎盤のホルモンの影響によるものであることが示唆された。3.ラットでproestrusに分泌されるP_4はestrusのLHサージを阻止しているといわれている。我々がdiestrusにRU486を投与したところ、estrusにLHサージが出現し、上記のP_4の効果が証明された。また、E_2前処置去勢雌ラットでは連日LHサージが出現するが、これはP_4の投与で消失した。P_4と同時にRUを投与するとLHサージの消失は起きず、RUがP_4の効果を阻止したことがわかった。1)ラット卵巣のステロイド合成酵素に対する各種合成ステロイドの作用を検討(in vitro)したところ、3β-HSDはgestsinone,3-keto-desogestvel(3-keto-DG)で、17,20lyaseはDanazol,Desogestrel(DG)で強く阻害された。17α-hydroxylaseはdanazol,DGでわずかに阻害が認められるのみだった。

DGはPRに結合せず、3keto-DGに代謝されて初めて活性型になると考えられていたが、この実験からDG自身が卵巣で直接ステロイド合成を阻害している可能性が考えられた。妊娠ラット卵巣粗膜分画に対する^<125>Iーinsulin,^<125>IーIGFーIの結合を検討したところ、それぞれのレセプタ-の存在が確認され、Irsulinレセプタ-はKd=0.031nM,Bmax=1.24fmol/mg tissue,IGFーIレセプタ-はKd=0.024nM,Bmax=0.338fmol/mg tissueであった。Insulinレセプタ-に対する結合の強さはInsulin,IGFーII,Iの順でIGFーIレセプタ-に関してはIGFーI,II,Insulinの順だった。妊娠ラット卵巣細胞をInsulin,IGFーI,IIとともに培養したところ,CAMP Phosphodiesteruse阻害剤であるIBMX併用時に、P^4,20αーOHーP^4,CAMPが増加した。この作用はIBMX非存在時には出にくかったので、Irsulin等により、Phosphodiesteruse活性が亢進していることが考えられた。そこで、^3HーCAMPを基質として卵巣粗膜分画のPhosphodiesteruse活性を測定したところ、機序は不明だったが、5分間のインキュベ-トでInsulinとIGFsが酵素活性を亢進させることが判明した。
マルチニューロンデータのスパイク高次相関の解析

近年,数百本の電極により多数の神経細胞からスパイクを同時記録する手法が確立してきた.しかし,現状では,単一細胞記録の効率化として利用するか,解釈のしやすい細胞ペアの相互相関ヒストグラムを調べるのが主流であり,多数の細胞から同時記録している利点を十分に生かしているとは言い難い.この問題に対し,「複数の神経細胞で過去に発生したスパイクパターンから,ある神経細胞で次の瞬間にスパイクが発生するかどうかを予測する」モデルを構成し,「予測成功率」というわかりやすい指標を用いて全細胞ペアのスパイク相関の全体的な性質を明らかにすることを考える.次の瞬間のスパイクを予測する問題は,次の瞬間にスパイクを発生するかしないかを決定する問題になっているため,工学の分野でよく直面する判別問題に帰着する.判別問題では,様々な場面に有効な手法が開発されている.本研究では,データの中から特徴的な高次の相関を効率的に抽出して非線形な判別を行う手法として知られている「サポートベクタマシン」を用いて,ラソト海馬からカルシウム光学計測した神経細胞の活動データに適用し,その有効性を確認してきた.平成19年度は,スパイクの発生の有無を予測するのではなく,確率的な見方をして,スパイク発生率を予測するように拡張し、その有効性を確認した。近年,数百本の電極により多数の神経細胞からスパイクを同時記録する手法が確立してきた.しかし,現状では,単一細胞記録の効率化として利用するか,解釈のしやすい細胞ペアの相互相関ヒストグラムを調べるのが主流であり,多数の細胞から同時記録している利点を十分に生かしているとは言い難い.この問題に対し,「複数の神経細胞で過去に発生したスパイクパターンから,ある神経細胞で次の瞬間にスパイクが発生するかどうかを予測する」モデルを構成し,「予測成功率」というわかりやすい指標を用いて全細胞ペアのスパイク相関の全体的な性質を明らかにすることを考える.次の瞬間のスパイクを予測する問題は,次の瞬間にスパイクを発生するかしないかを決定する問題になっているため,工学の分野でよく直面する判別問題に帰着する.判別問題では,様々な場面に有効な手法が開発されている.本研究では,データの中から特徴的な高次の相関を効率的に抽出して非線形な判別を行う手法として知られている「サポートベクタマシン」を用いて,ラット海馬からカルシウム光学計測した神経細胞の活動データに適用した.前半1秒間のデータで予測成功率が最も良くなる予測器を構成し,後半9秒間のデータでその予測成功率を評価した.その結果,予測に用いる細胞数を減らしていくと,相互相関しか用いない手法より,高次相関を用いた方が予測成功率が良くなることがわかった.活動を維持するほとんどの細胞の活動を記録できている場合,相互相関だけで神経活動の関係性を調べることができるが,一部しか記録できていない場合,高次相関を用いる本手法が有効であることがわかった.近年,数百本の電極により多数の神経細胞からスパイクを同時記録する手法が確立してきた.しかし,現状では,単一細胞記録の効率化として利用するか,解釈のしやすい細胞ペアの相互相関ヒストグラムを調べるのが主流であり,多数の細胞から同時記録している利点を十分に生かしているとは言い難い.この問題に対し,「複数の神経細胞で過去に発生したスパイクパターンから,ある神経細胞で次の瞬間にスパイクが発生するかどうかを予測する」モデルを構成し,「予測成功率」というわかりやすい指標を用いて全細胞ペアのスパイク相関の全体的な性質を明らかにすることを考える.次の瞬間のスパイクを予測する問題は,次の瞬間にスパイクを発生するかしないかを決定する問題になっているため,工学の分野でよく直面する判別問題に帰着する.判別問題では,様々な場面に有効な手法が開発されている.本研究では,データの中から特徴的な高次の相関を効率的に抽出して非線形な判別を行う手法として知られている「サポートベクタマシン」を用いて,ラソト海馬からカルシウム光学計測した神経細胞の活動データに適用し,その有効性を確認してきた.平成19年度は,スパイクの発生の有無を予測するのではなく,確率的な見方をして,スパイク発生率を予測するように拡張し、その有効性を確認した。
マルチレドックスサイト型オリゴマー中分子による生物機能分子創出

有機酸化還元系は、生体電子伝達系への関与やDNAインターカレーション能などの特性により、医農薬分野で活躍する生物機能分子として高いポテンシャルを持つ。π電子系化合物を利用した分子創薬に於いては、新規な低分子酸化還元系分子骨格の開発ばかりでなく、その骨格の中分子化による酸化還元機能/生理活性の調節が有効なアプローチであると考えた。このようなマルチレドックスサイトをもつオリゴマーは、電子授受以外の外部刺激によっても分子構造の変調が可能なため、モノマーには無い特異な制御性を持つ。本研究では、カスケード環化やフロー合成を利用して効率よく合成される低分子酸化還元骨格を、共有結合で複数連結したマルチレドックス型中分子において、リンカーや連結数に応じた摂動の様子をパラメータ化して理解する。またその基礎的知見を基づき、分子創薬に望ましいパラメータを持つよう特性をチューニングし、生物機能分子開発につなげることを目的として研究を展開している。新規低分子モノマーとして、平面ディスク形状を持つπ縮環型パラフェニレンジアミンであるbenz[a]indolo[2,3-c]carbazole(BIC)を用い、メタキシリレン型スペーサーで6つまで連結された一連の電子供与体を合成した。BIC骨格の酸化状態は積層構造形成による安定化を受け、BICユニット個数の半分が陽イオン種となった状態を取りやすいことが明らかとなった。またピラジン縮環キノン類の生理活性は分子構造の特徴についての、領域内共同研究成果を論文発表することができた。29年度が最終年度であるため、記入しない。新規低分子モノマーとして、平面ディスク形状を持つπ縮環型パラフェニレンジアミンであるbenz[a]indolo[2,3-c]carbazole(BIC)を用い、これらが2つから4つまで連結された一連の電子供与体を合成した。BIC骨格を連結するスペーサーに応じた特徴的な電子的相互作用は、主にディスク状BICの積層/非積層構造によるものと理解され、電解酸化をUV-VisーNIRスペクトルで追跡した際の吸収変化からも支持された。研究計画にそった結果が得られた。4重の鈴木カップリング反応を鍵ステップとして短段階で合成されるテトラアリールアントラキノジメタンオリゴマー化中分子、ならびに、ヘキサアリールブタジエンのオリゴマー化中分子を対象とした研究を展開する。前者は、ジアリールメチレン基と縮合ベンゼン環との立体反発によりバタフライ型に変形した分子であるが、凸面同士、また凹面同士を合わせるように積層することが可能である。一方、ほぼ同時の2電子酸化で生じたジカチオン種では、中央のアントラセンに対して、2つのジアリールメチリウム部位が直交する形になることから、酸化により積層構造が一気に解消される系になり得る。また後者は、ねじれたπ骨格を持つが、二電子酸化で生じるジカチオンでは、trans-スチルベン骨格が共平面になるよう構造変化する。

即ちオリゴマーは、中性状態及び酸化状態のどちららも積層不能ではあるものの、主鎖に沿った共役の切断/伸長が可能な中分子となり得る。スチルベン骨格に対するフッ素置換基の導入で溶解性の向上を、供与性アリール基としてテトラエチレングリコール側鎖を持つアニリン部位の利用で水溶性を獲得することで、酸化還元挙動以外のパラメータも制御する。いずれのオリゴマーも、重要なパラメータである連結数は、厳密に制御して合成/精製を行う。それぞれのオリゴマーの段階的多段階電子移動挙動は各種ボルタンメトリーから、電荷による構造変化は単離した化学種のX線構造解析及びMacroModel計算から、電荷分布はDFT計算から求める。UV-Vis-NIR、FL、キラル誘導体でのCDスペクトルを系統的に比較から、積層/会合状態に関する情報を得、計算結果と合わせることで、パラメータ化に基づいた分子設計の精度を上げる。29年度が最終年度であるため、記入しない。
抗Robo1抗体イムノトキシンの光化学内在化法併用による頭頸部癌新規治療法の開発

本研究は、細胞膜貫通型受容体であるRobo(Roundabout homolog)1を標的とした抗Robo1抗体イムノトキシン(Immunotoxin,IT)による頭頸部扁平上皮癌(Head and neck squamous cell carcinoma, HNSCC)における治療効果とその特異性の向上による副作用の少ない治療法の開発を目的とした。申請者らは、H29年度までの研究[Komatsu et al. Arch Cancer Res 2017]をもとに、抗Robo1抗体IT (IT-Robo1)単独と比較して、IT-Robo1に内在化を促進する因子としてPCI (AlPcS2aおよびそれを励起する波長(650nm))を併用した際に、高い癌細胞傷害効果を示すことを明らかにした。また、申請者らの予備的検討では、生体透過深度の高い近赤外線(780nm)およびその波長で励起する既存の蛍光物質Cy7.5や既にFDAに承認されて臨床で使用されているインドシアニングリーン(ICG)のIT-Robo1への結合方法を使用してきた。平成30年度は、これらの結合方法やその生成物の活性化チェック方法を応用して、本学先端科学技術センター生命反応化学の岡本晃充教授らが独自に開発を行った、蛍光量子効率の高い蛍光物質をIT-Robo1に効率よく標識できる方法を検討し、その方法を選定した。平成30年度が最終年度であるため、記入しない。
テーラーメイド型細胞分離システムの構築による次世代糖尿病治療の創成

膵島移植は、安全・簡便・低侵襲であり患者に優しい画期的治療法であるが、現状においては質の高い十分量の膵島細胞を安定的に得る事が困難であるため、未だ一般医療に至っていない。本研究においては、時代を先取りする"テーラーメイド型細胞分離システムの構築"により膵島移植が抱える課題の解決を図り、膵島移植を糖尿病に対する理想的な次世代細胞療法として確立する事を目的としている。本年度は、これまでの二年間の研究成果を踏まえ、コラゲナーゼの二つのサブタイプであるコラゲナーゼG(ColG)とコラゲナーゼH(ColH)の特異的対象基質であることが判明したコラーゲンVとコラーゲンIIIの膵組織内発現量を半定量化することで、ColG/ColH比率の最適化を図ることが可能であるかについて実際に各種比率条件下で膵島分離試験を実施し検証を行った。その結果、膵組織におけるコラーゲンサブタイプの組成比を正確に評価するためには、コラーゲンの特徴である三重らせん構造を考慮した適切な検査法を必要とすることが明らかとなった。特に質量分析法を用いてコラーゲンIIIの発現量およびコラーゲンIに占めるホモ三量体の比率を評価することが、膵島分離に用いるコラゲナーゼサブタイプの組成比の至適化に有用な可能性が示唆された(論文投稿中)。本研究の最終年度計画として、H30年度には海外連携機関であるSwedenのUppsala大学にて本年度までに達成した上記成果に関するヒト膵組織を用いた探索的臨床研究を実施する事を掲げていたが、本基盤研究B単独で臨床研究を完遂する事は経費的に困難であり、その後本研究の成果が認められ、AMEDの産学連携医療イノベーション創出グラントの支援を受ける事が可能となった。それにより、本研究で計画していた臨床研究は予定より早く遂行する事が可能な見込みとなり、本研究はH29年度をもって終了することとなった。29年度が最終年度であるため、記入しない。膵島移植は、安全・簡便・低侵襲であり患者に優しい画期的治療法であるため、今後の糖尿病治療の中心を担っていくと期待されている。しかし、現状においては質の高い十分量の膵島細胞を効果的かつ安定的に得る事が困難であるという致命的課題を有しているため、未だ一般医療に至っていない。本研究においては、移植外科学・酵素工学・分子生物学・タンパク構造解析学の最新知見を革新的に融合させ、時代を先取りする"テーラーメイド型細胞分離システムの構築"により膵島移植が抱える課題の解決を図り、膵島移植を国民病である糖尿病に対する理想的な次世代細胞療法として確立することを目的としている。本年度は、まずコラゲナーゼサブタイプの役割に関する検証を実施し、コラゲナーゼHは消化工程を強力に推進するのに対し、コラゲナーゼGは消化工程初期においてはコラゲナーゼHと連携し膵組織の消化を促進するものの、消化後半の過消化状況においては、分解された膵外分泌組織由来の内因性プロテアーゼによる膵島障害から膵島を保護する作用を有していることが判明した。次に消化工程初期においてコラゲナーゼGが膵組織を消化する際に対象となり得る基質について検証を行った。TMPPによる二段階修飾を導入した膵組織の質量分析とin vitro基質消化試験の検証により、コラゲナーゼGの有力な対象基質としてコラーゲンIVとコラーゲンVを同定することができた。コラーゲンIVに関しては、膵組織のみならず肝組織の免疫組織化学染色においても同様の所見を見出すことができた。さらに本年度は、開発中のクロストリジウム由来中性プロテアーゼ(NP)とバチルス由来のサーモリシンの作用機序に関する比較検証を実施し、ラミニン511のα5鎖の消化様式が両者で大きく異なることを見出すことに成功した。本年度の重要な解決課題と設定していたコラゲナーゼGの特異的基質同定に関し、質量分析と基質消化試験を組み合わせる解析法の至適化に成功できた点が最大の理由である。これまでのところ、このassay系を用いることにより、コラーゲンIVとコラーゲンVが候補対象基質であることを明らかとし、学会ならびに論文発表を済ませることができた。各種中性プロテアーゼの作用機序・対象基質同定に関しては、申請時の計画通り、来年度継続して検証していく予定である。本年度は、まず前年度に引き続きコラゲナーゼG(ColG)が膵組織を消化する際に対象となる基質について検証を行った。その結果、ColGのV型コラーゲンに対する特異性は極めて高く、ColHが殆ど消化できないのに対し、ColGはV型コラーゲンを良好に消化し得ることが明らかとなった。また切断部位を詳細に観察したところ、ColGによる消化はコラーゲントリプルヘリクス構造のN末側1/31/2付近での消化が顕著である事が判明した。この事はテーラーメイド化においてドナー特有のマーカー探索の大きな手がかりになると考えられる。次に各種中性プロテアーゼの対象基質の検証を目的とし、プロテオグリカンやコラーゲンといった膵島分離の鍵となる因子に関わるタンパクとしてラミニンに着目し、基質消化実験を実施した。

その結果、従来の中性プロテアーゼであるサーモライシンに比較し、新規開発中性プロテアーゼであるChNPやCPによるラミニンの消化はマイルドであり、511、411といったサブタイプに対してα鎖の切断を示す事が明らかとなった。最後に上記検討結果を踏まえ、ラミニンα鎖について相補ペプチド10個を設計し質量分析による結合の確認、中性プロテアーゼによる消化阻害を解析したが、これまでのところ著効を示すペプチドは確認できていない。相補ペプチドは配列のみから導かれるものであり、出来上がったものの性状について考慮できないため、更なる検討が必要である。昨年度から本年度にかけての重要な解決課題と設定していたコラゲナーゼGの特異的基質同定に関し、質量分析と基質消化試験を組み合わせる解析法の至適化に成功できた点が最大の理由である。これまでのところ、このassay系を用いることにより、特にコラーゲンVが特異性の高い候補対象基質であることを明らかとし、学会ならびに論文発表を済ませることができた。さらに本年度は、中性プロテアーゼの対象基質の一つとしてラミニンに着目し、その切除部位が中性プロテアーゼの種により異なる事を見出すことができた。今後、さらに網羅的検証が必要となるが、計画はおおむね順調に推移していると判定できる。膵島移植は、安全・簡便・低侵襲であり患者に優しい画期的治療法であるが、現状においては質の高い十分量の膵島細胞を安定的に得る事が困難であるため、未だ一般医療に至っていない。本研究においては、時代を先取りする"テーラーメイド型細胞分離システムの構築"により膵島移植が抱える課題の解決を図り、膵島移植を糖尿病に対する理想的な次世代細胞療法として確立する事を目的としている。本年度は、これまでの二年間の研究成果を踏まえ、コラゲナーゼの二つのサブタイプであるコラゲナーゼG(ColG)とコラゲナーゼH(ColH)の特異的対象基質であることが判明したコラーゲンVとコラーゲンIIIの膵組織内発現量を半定量化することで、ColG/ColH比率の最適化を図ることが可能であるかについて実際に各種比率条件下で膵島分離試験を実施し検証を行った。その結果、膵組織におけるコラーゲンサブタイプの組成比を正確に評価するためには、コラーゲンの特徴である三重らせん構造を考慮した適切な検査法を必要とすることが明らかとなった。特に質量分析法を用いてコラーゲンIIIの発現量およびコラーゲンIに占めるホモ三量体の比率を評価することが、膵島分離に用いるコラゲナーゼサブタイプの組成比の至適化に有用な可能性が示唆された(論文投稿中)。本研究の最終年度計画として、H30年度には海外連携機関であるSwedenのUppsala大学にて本年度までに達成した上記成果に関するヒト膵組織を用いた探索的臨床研究を実施する事を掲げていたが、本基盤研究B単独で臨床研究を完遂する事は経費的に困難であり、その後本研究の成果が認められ、AMEDの産学連携医療イノベーション創出グラントの支援を受ける事が可能となった。それにより、本研究で計画していた臨床研究は予定より早く遂行する事が可能な見込みとなり、本研究はH29年度をもって終了することとなった。初年度は当初の計画通り順調に推移しているため、来年度も申請の計画に従い、コラゲナーゼGの特異的基質同定を継続し本年度中に完成させる予定である。