hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
MAPキナーゼ及びカスパーゼを介したエリスロポエチンの抗アポトーシスシグナル解析

赤芽球系前駆細胞の増殖と分化を調節する最も重要なサイトカインであるEPOの作用機序について,特にアポトーシス制御を中心に,EPO依存性ヒト白血病細胞株UT-7/EPO及びヒト胎児血由来CD34陽性造血幹細胞から分化させた赤芽球系前駆細胞を用いて検討し,以下の新知見(A)(B)を得た.(A)EPO存在下のMAPキナーゼ経路は,Bcl-xLのメッセージレベルでの調節と下流のカスパーゼ経路抑制によるBcl-xLの蛋白レベルでの調節の二重の経路で抗アポトーシス作用を発揮する.1.EPO依存性ヒト白血病細胞株UT-7/EPOは,EPO除去後時間依存性アポトーシスが誘導された.2.同アポトーシスでは,Bcl-xL蛋白の発現低下及びカスパーゼ3,6,8の活性化が観察された.3.同アポトーシスは汎カスパーゼ阻害剤VAD添加で抑制され,カスパーゼ経路依存性である.4.EPO添加条件下でもMEK1/2阻害剤U0126前処置にて約40%の細胞にアポトーシスが誘導されるが,同アポトーシスはVAD前処理にて阻止され,蛋白レベルでのBcl-XLの発現は増加した.5.ヒト胎児血からCD34陽性造血幹細胞を回収し,純化した赤芽球系前駆細胞を用いた同様の実験でも,U0126によるERK1/2の活性化阻害で40%以上の細胞にアポトーシスが誘導されるが,VAD前処理にてこれが阻止され,蛋白レベルでのBcl-XLの発現は増加した.(B)EPOが調節するアポトーシスに対して,赤芽球系前駆細胞は細胞周期,特にG0/G1アレストの調節機構により抗アポトーシス作用を発揮する.6.MEK1/2阻害により誘導されるアポトーシスがカスパーゼ阻害剤VAD前処理で抑制される時に,G0/G1期の細胞の割合は35%から67%へと増加し,細胞周期調節蛋白p27/Kip1の発現も増加した.以上より,EPOは複数のシグナル伝達経路を有することで,赤血球系造血の増殖,分化を巧妙に調節しているものと結論した.赤芽球系前駆細胞の増殖と分化を調節する最も重要なサイトカインであるEPOの作用機序について,特にアポトーシス制御を中心に,EPO依存性ヒト白血病細胞株UT-7/EPO及びヒト胎児血由来CD34陽性造血幹細胞から分化させた赤芽球系前駆細胞を用いて検討し,以下の新知見(A)(B)を得た.(A)EPO存在下のMAPキナーゼ経路は,Bcl-xLのメッセージレベルでの調節と下流のカスパーゼ経路抑制によるBcl-xLの蛋白レベルでの調節の二重の経路で抗アポトーシス作用を発揮する.1.EPO依存性ヒト白血病細胞株UT-7/EPOは,EPO除去後時間依存性アポトーシスが誘導された.2.同アポトーシスでは,Bcl-xL蛋白の発現低下及びカスパーゼ3,6,8の活性化が観察された.3.同アポトーシスは汎カスパーゼ阻害剤VAD添加で抑制され,カスパーゼ経路依存性である.4.EPO添加条件下でもMEK1/2阻害剤U0126前処置にて約40%の細胞にアポトーシスが誘導されるが,同アポトーシスはVAD前処理にて阻止され,蛋白レベルでのBcl-XLの発現は増加した.5.ヒト胎児血からCD34陽性造血幹細胞を回収し,純化した赤芽球系前駆細胞を用いた同様の実験でも,U0126によるERK1/2の活性化阻害で40%以上の細胞にアポトーシスが誘導されるが,VAD前処理にてこれが阻止され,蛋白レベルでのBcl-XLの発現は増加した.(B)EPOが調節するアポトーシスに対して,赤芽球系前駆細胞は細胞周期,特にG0/G1アレストの調節機構により抗アポトーシス作用を発揮する.6.MEK1/2阻害により誘導されるアポトーシスがカスパーゼ阻害剤VAD前処理で抑制される時に,G0/G1期の細胞の割合は35%から67%へと増加し,細胞周期調節蛋白p27/Kip1の発現も増加した.以上より,EPOは複数のシグナル伝達経路を有することで,赤血球系造血の増殖,分化を巧妙に調節しているものと結論した.我々は,増殖因子の作用機序のひとつであるアポトーシス制御に注目し,特に赤血球系造血に及ぼすEPOのアポトーシス抑制作用について,EPO依存性ヒト白血病細胞株UT-7/EPO及びヒト胎児血由来CD34陽性造血幹細胞から分化させた赤芽球系前駆細胞を用いて検討し,以下の結論を得た.1.EPO依存性ヒト白血病細胞株UT-7/EPOはEPO除去後,時問依存性にアポトーシスに陥り,その割合は48時間で18.6%,72時間で32.1%,96時間で41.6%であった.2.EPO除去で誘導されるアポトーシスにおいて,著明なBcl-X蛋白の発現低下とカスパーゼ3,6,8の活性化を認めた.3.EPO除去で誘導されるアポトーシスは,汎カスパーゼ阻害剤VAD添加で12.6%にまで抑制できた.4.EPO添加条件下でもMEK1/2阻害剤UO126 100mM前処置にて38.9%の細胞にアポトーシスが誘導されたが,このアポトーシスはVAD前処理にて阻止された.

この時,蛋白レベルでのBcl-XLの発現は増加していた.5.ヒト胎児血から磁気ビーズ法を用いてCD34陽性造血幹細胞を回収し,EPO,lL-3,SCF存在下に培養,分化させて純化した赤芽球系前駆細胞を採取した.6.赤芽球系前駆細胞をEPO添加条件で培養しても,UO126によるERK1/2の活性化阻害で40%以上の細胞にアポトーシスが誘導されたが,VAD前処理にてこれが阻止され,蛋白レベルでのBcl-XLの発現は増加していた.以上より,赤血球系造血における抗アポトーシス作用に関してはMAPキナーゼ経路が重要であり,EPO存在下におけるMAPキナーゼ経路は,Bcl-XLのメッセージレベルでの調節と,下流のカスパーゼ経路を抑制してBcl-XLの蛋自レベルでの切断を抑制する二重の経路により,抗アポトーシス作用を発揮することを明らかにした。赤芽球系前駆細胞の増殖と分化を調節する最も重要なサイトカインであるEPOの作用機序について,特にアポトーシス制御を中心に,EPO依存性ヒト白血病細胞株UT-7/EPO及びヒト胎児血由来CD34陽性造血幹細胞から分化させた赤芽球系前駆細胞を用いて検討し,以下の新知見(A)(B)を得た.(A)EPO存在下のMAPキナーゼ経路は,Bcl-xLのメッセージレベルでの調節と下流のカスパーゼ経路抑制によるBcl-xLの蛋白レベルでの調節の二重の経路で抗アポトーシス作用を発揮する.1.EPO依存性ヒト白血病細胞株UT-7/EPOは,EPO除去後時間依存性アポトーシスが誘導された.2.同アポトーシスでは,Bcl-xL蛋白の発現低下及びカスパーゼ3,6,8の活性化が観察された.3.同アポトーシスは汎カスパーゼ阻害剤VAD添加で抑制され,カスパーゼ経路依存性である.4.EPO添加条件下でもMEK1/2阻害剤U0126前処置にて約40%の細胞にアポトーシスが誘導されるが,同アポトーシスはVAD前処理にて阻止され,蛋白レベルでのBcl-XLの発現は増加した.5.ヒト胎児血からCD34陽性造血幹細胞を回収し,純化した赤芽球系前駆細胞を用いた同様の実験でも,U0126によるERK1/2の活性化阻害で40%以上の細胞にアポトーシスが誘導されるが,VAD前処理にてこれが阻止され,蛋白レベルでのBcl-XLの発現は増加した.(B)EPOが調節するアポトーシスに対して,赤芽球系前駆細胞は細胞周期,特にG0/G1アレストの調節機構により抗アポトーシス作用を発揮する.6.MEK1/2阻害により誘導されるアポトーシスがカスパーゼ阻害剤VAD前処理で抑制される時に、G0/G1期の細胞の割合は35%から67%へと増加し,細胞周期調節蛋白p27/Kip1の発現も増加した.以上より,EPOは複数のシグナル伝達経路を有することで,赤血球系造血の増殖,分化を巧妙に調節しているものと結論した.
メタン発酵液の処理に対応する新規アナモックスプロセスの開発

メタン発酵はバイオマス廃棄物処理およびエネルギー回収に活用できる技術として期待されている。しかし、メタン発酵廃液の処理は重要な課題であり、今後メタン発酵によるバイオマスのエネルギー化利用を推進するために、メタン発酵廃液の適正処理は避けて通れない。本研究は廃棄物系バイオマスのエネルギーを図るためのトータルシステムの合理化と技術革新を目指すため、メタン発酵廃液からの窒素除去に対応する新規アナモックスプロセスを開発しようとするもので、平成27年度では次の成果が得られた。(1)UASB-Anammoxプロセスの安定性に与える阻害因子の影響および回復過程に関して連続実験を通して解析した結果、アンモニアおよび亜硝酸による阻害濃度範囲を明らかにした。また、遊離アンモニアFA < 5 mg/Lかつ遊離亜硝酸FNA < 2 μg/Lの条件においてプロセスは高い除去率が得られた。なお、制御範囲としてpHが7.5-8.5の範囲にあって、FAが10 mg/100 mgNH4+-N以下且つFNAが0.005 mg/100 mg NO2-N以下に最適化された。本研究に構築された制御範囲は工学的な応用価値が高い。(2)ハイブリッド単槽式脱窒素プロセスの研究として完全混合反応槽に担体を投入することにより、好気性アンモニア酸化細菌(AOB)と嫌気性Anammox細菌を共存させ、一槽式Anammoxの連続実験を行い、その脱窒性能、関連細菌の活性および菌体付着した担体の状況を明らかにした。(3)本研究では次世代シーケンスでAnammox反応槽における微生物群集構造を解析した結果、Planctomycetes門は150日目の0.2%から450日目の31.6%に上昇したことを把握したとともに、検出した優占Anammox種はCandidatus BrocadiaとCandidate Kueneniaであった。27年度が最終年度であるため、記入しない。本研究は廃棄物系バイオマスのエネルギーを図るためのトータルシステムの合理化と技術革新を目指すため、メタン発酵廃液からの窒素除去に対応する新規アナモックスプロセスを開発しようとするもので、具体的に次の研究項目に取り組んだ。(1)メタン発酵廃液の水質解析および亜硝酸酸化プロセスの検討:6つの異なるメタン発酵施設から採集したメタン発酵消化液の水質を分析してCOD,全窒素、アンモニア窒素などの水質組成を把握した。全窒素濃度は140mg/Lから4670mg/Lの幅広い範囲にあった。また、クローニング法により6種類の消化液におけるメタン生成古細菌、真正細菌および共生酢酸生成細菌の群集構造を明らかにした。(2)UASB型Anammoxプロセスタートアップと負荷能力の検討:新しい窒素除去プロセスを研究するため、まずその要素ユニットであるUASB型Anammox反応槽を稼働させて微生物の驯致を図り、投入基質濃度と負荷による影響および微生物の活性を把握した。2.4kgN/d/m3の負荷でTN300mg/Lと3.6kgN/d/m3の負荷でTN450mg/Lの条件においてAnammoxプロセスは安定的に運転していた。アンモニアの除去率は95%以上、TN除去率はそれぞれ85.5%と84.4%に達した。また、5.6 kgN/d/m3の負荷でTN濃度を700mg/L、350mg/L、450mg/L及び550mg/Lの4つの段階で変化させて連続実験を行った結果、TN除去率はそれぞれ66.4%、84.1%、83.3%と73.2%であった。Han and Levenspielモデルにより計算した結果、流入基質のTN濃度が459mg/L以上になると、窒素除去速度は10%低下することが分かった。

(3)本研究では次世代シーケンスでAnammox反応槽における微生物群集構造を解析した結果、Planctomycetes門は150日目の0.2%から450日目の31.6%に上昇したことを把握したとともに、検出した優占Anammox種はCandidatus BrocadiaとCandidate Kueneniaであった。平成26年度の計画では、メタン発酵廃液からの窒素除去に対応する新規アナモックスプロセスを開発するため、まずメタン発酵廃液の水質解析およびUASB型Anammoxプロセスタートアップと負荷能力の検討を予定していたが、当初計画した目標はおよそ達成できた。27年度が最終年度であるため、記入しない。平成26年度はおおむね計画通りの成果が得られたので、平成27年度以降は、前年度に実施された消化液水質分析とAnammox連続処理実験によって得られた基礎的知見を基に,次の3項目の小テーマに取り組む予定である。(1)処理水の返送によるAnammox運転安定性の向上:前年度に実施されるUASB型反応槽の連続実験により流入基質濃度が高い場合にはAnammoxの阻害が発生することを踏まえ、処理水の返送による濃度制御を行い、プロセスの安定運転を図る。(2)ハイブリッド単槽式脱窒素プロセスの研究:完全混合反応槽に担体を投入することにより、好気性アンモニア酸化細菌(AOB)と嫌気性Anammox細菌を共存させ、一槽式Anammoxの連続実験を行い、その脱窒性能、関連細菌の活性および菌体付着した担体の状況を検討し、ハイブリッド単槽式脱窒素プロセスを開発する。(3)各ユニットプロセスにおけるAOB、NOB、AHBおよびANAMMOXの微生物群集構造の動態解析を微生物活性および分子生物学的手法で行う。
膠原病様モデルマウスを用いたT細胞活性化をもたらす新規脂質メディエータの同定

本研究では、膠原病モデルマウスを用いて、炎症病態形成に関連し得る新たな脂質メディエーターの同定を目的とした。SLEモデルマウスをLC-MSを用いて解析した結果、同マウスではパルミトイルエタノールアミド(PEA)やオレオイルエタノールアミド(OEA)の血中及び脾臓内の濃度が野生型マウスに比べて低値であることが判明した。また、PEAやOEAは、SLEの病態形成に重要なTLR9刺激による樹状細胞やB細胞からの炎症性サイトカインの産生を抑制した。さらに、同抑制作用はマウスを用いた個体レベルでも認められた。今後、PEAやOEAの病態形成への関与やSLEに対する治療効果の検討が必要である。TRAF6をT細胞特異的に欠損させたマウス(TRAF6-ΔTマウス)では、T細胞が自然に活性化し、膠原病様の全身性炎症性疾患を引き起こす。我々はこのマウスを用いて以下2項目の実験を実施した。(1)スフィンゴシン1リン酸(S1P)が誘導するT細胞活性化のTRAF6による抑制効果の検証S1PがTRAF6-ΔTマウスにおけるT細胞活性化や炎症性疾患発症に関与しているか検証するため、S1P受容体の機能的アンタゴニストであるFTY720(フィンゴリモド)をTRAF6-ΔTマウスに炎症性疾患発症前から計5か月間投与した。投与後の脾臓T細胞のFACS解析では、FTY720投与群と非投与群でT細胞の活性化レベルに違いはみられなかった。また、各臓器の組織学的検査では、FTY720投与による明らかな抗炎症効果は認めなかった。このことから、S1PによるT細胞活性化をTRAF6が抑制するといった仮説は実証されなかった。(2)TRAF6-ΔTマウスにおける膠原病様炎症性疾患に関連する脂質メディエーター・バイオマーカーの探索CE-TOFMS、LC-TOFMSを用いたTRAF6-ΔTマウスの血清メタボローム解析を外部委託にて行った結果、TRAF6-ΔTマウスでは血中の長鎖アシルカルニチン(LCAC)濃度が野生型マウスに比べて高い可能性が示唆された。近年、LCACと炎症性サイトカイン産生との関連や、制御性T細胞(Treg)分化における脂肪酸β酸化の重要性に関する報告があり、我々はLCACに着目し、バイオマーカーとしての有用性やT細胞活性化との関連について検証した。当大学のLC-MSを用いてTRAF6-ΔTマウスの血中LCAC(ミリストイルカルニチン、パルミトイルカルニチン)濃度を再解析した結果、TRAF6-ΔTマウスと野生型マウスの間で明らかな差は認めなかった。また、脾臓由来naiveT細胞のTh17細胞やTregへの分化をLCAC投与下で検証したところ、分化への明らかな影響はみられなかった。以上より、LCACのバイオマーカーとしての有用性やT細胞活性化との関連を実証することはできなかった。T細胞特異的TRAF6欠損マウス(TRAF6-ΔTマウス)で生じるT細胞の異常な活性化や膠原病様の全身性慢性炎症とS1PによるT細胞活性化シグナルとの関連について、機能的アンタゴニストであるFTY720投与による生体内実験を当初の予定通り行った。FTY720投与による抗炎症効果やT細胞活性化抑制効果は認めなかったことから、T細胞におけるTRAF6とS1Pの関連性について生体内で実証することはできなかった。また、TRAF6-ΔTマウスの血清メタボローム解析の結果から、ミリストイルカルニチンやパルミトイルカルニチンといった長鎖アシルカルニチンのバイオマーカーとしての有用性について検証したが、当大学のLC-MSを用いた解析にて有意な結果は得られず、細胞実験においてもT細胞分化との関連を証明することはできなかった。以上から、概ね当初の予定通り実験は遂行しているものの、TRAF6-ΔTマウスでみられる炎症性疾患に関連した脂質メディエーターやバイオマーカーの同定には至っていない。そこで、LC-MSを用いてエイコサノイドやその他の多価不飽和脂肪酸代謝物など計158成分を対象に網羅的に解析する分析方法を立ち上げ、条件検討を繰り返すなどして血中や臓器中の濃度の測定が可能となった。今後、膠原病様のモデルマウスを用いた研究を引き続き遂行する予定である。計158種類の脂質メディエーター関連物質を一斉解析することが可能となる液体クロマトグラフ・質量分析計(LC-MS)を用いた解析方法を前年度に立ち上げた。この手法を用いて、全身性エリテマトーデス(SLE)のモデルマウスであるMRL/lprマウスの各臓器や血液中の脂質メディエーター関連物質を測定し、野生型マウスと比較した。その結果、リンパ節や脾臓、血中において、脂質代謝産物である物質Aの濃度が低下していることが判明した。この脂質代謝産物AがSLEの発症機序と関連しているかどうかを調べるため、マウス骨髄細胞由来の樹状細胞を用いた実験を行った。マウス骨髄細胞由来の樹状細胞に対して、Toll様受容体9(TLR9)刺激を加えることによって産生されるIL-6, IL-12, TNF-αといった炎症性サイトカインの分泌が、脂質代謝産物Aを加えることにより抑制されることを見出した。また、マウス由来のマクロファージ細胞株であるRaw 264.7細胞においても、TLR9刺激を加えた際の炎症性サイトカイン分泌を脂質代謝産物Aは有意に抑制した。

また、Raw 264.7細胞にTLR7刺激を加えた際の補助刺激シグナル分子CD86の発現レベルをFACSにて解析した結果、脂質代謝産物Aを投与することによりCD86の発現が低下することが判明した。以上より、MRL/lprマウスの二次リンパ組織や血中において減少していた脂質代謝産物Aは、マウス樹状細胞やマクロファージなどの抗原提示細胞におけるTLR9刺激による炎症性サイトカイン産生を抑制する抗炎症性の脂質メディエーターである可能性が示唆された。本年度は、膠原病モデルマウスを用いたLC-MS解析により、二次リンパ組織中において脂質代謝産物Aの濃度が低下していることを見出した。また、樹状細胞のToll様受容体刺激に対して脂質代謝産物Aは抑制性の作用を有する可能性が示唆された。脂質代謝産物Aの抑制性作用について、詳細な分子メカニズムの解明は今後の課題である。液体クロマトグラフ・質量分析計(LC-MS)を用いて、全身性エリテマトーデス(SLE)のモデルマウスであるMRL/lprマウスと野生型マウス(MRL/mpjマウス)の各臓器や血液中の脂質メディエーター関連物質を測定する研究を、前年度から継続して行った。その結果、脾臓及び血中において、オレオイルエタノールアミド(OEA)の濃度が低下していることを前年度に見出したが、新たにパルミトイルエタノールアミド(PEA)も血中、脾臓中において野生型マウスに比べてMRL/lprマウスで低値となっていることが判明した。OEAは、マウス由来のマクロファージ細胞株であるRaw 264.7細胞に添加すると、Toll様受容体9(TLR9)刺激を加えた際のIL-6, IL-12といった炎症性サイトカイン産生を抑制する作用があることを前年度に見出し、本年度では同様の抑制効果をPEAも有することが判明した。さらに、マウスの脾臓及びリンパ節由来のB細胞においても、TLR9刺激によるIL-6産生をPEAは抑制した。これらのTLR9刺激に対するPEA、OEAの抑制効果がin vivoにおいてもみられるか、マウスを用いて検討した。TLR9刺激であるCpGと、D-ガラクトサミンを野生型マウス(BALB/c)に腹腔内注射し、その後上昇する血中IL-6濃度を測定したところ、事前にPEAやOEAをマウスに腹腔内注射することで血中IL-6濃度の上昇は有意に抑制されることを見出した。以上より、SLEの病態形成に重要とされるTLR9刺激に対して、PEA及びOEAは細胞実験とマウス生体内のいずれにおいても抑制作用を示す抗炎症性脂質メディエーターであることが判明した。SLEモデルマウスでは両物質が低値となっていることから、病態形成に対する両物質の関与や、SLEにおける治療応用といった研究への発展が期待される。本研究では、膠原病モデルマウスを用いて、炎症病態形成に関連し得る新たな脂質メディエーターの同定を目的とした。SLEモデルマウスをLC-MSを用いて解析した結果、同マウスではパルミトイルエタノールアミド(PEA)やオレオイルエタノールアミド(OEA)の血中及び脾臓内の濃度が野生型マウスに比べて低値であることが判明した。また、PEAやOEAは、SLEの病態形成に重要なTLR9刺激による樹状細胞やB細胞からの炎症性サイトカインの産生を抑制した。さらに、同抑制作用はマウスを用いた個体レベルでも認められた。
ケラチノサイト増殖因子受容体を標的とした卵巣がんの新規分子標的治療薬の開発

(1)パクリタキセル(TXL)耐性遺伝子のスクリーニング卵巣がん細胞株2008を用いTXL耐性株2株を樹立した。また患者の同意を得て採取された漿液性卵巣がんIIIc期手術検体でTXL不応症例4例およびTXL高感受性症例4例を選別した。全株、全症例よりtotal RNAを抽出し、約33,000遺伝子の発現プロファイリングを行った。Hierarchical clustering解析を行った結果TXL耐性群とTXL感受性群間で有意水準5%で発現差が認められた遺伝子は66種類であった。リアルタイムRT-PCRにより再現性が確認されたのはIDO(lndoleamine-2,3-dioxygenase)遺伝子を含む11種類であった。漿液性卵巣癌III-IV期症例28症例におけるIDO蛋白発現を免疫組織学的に検討し、染色パターンおよび強度を考慮したスコアリングを行った。その結果Kaplan-Meier解析によりスコアと予後に有意差をもって相関が認められた(p=0.0001)。以上よりIDOは漿液性卵巣癌におけるTXL耐性獲得能に関与し、IDO蛋白発現パターンは予後の指標となることが示唆された。(2)正常卵巣上皮不死化細胞株および卵巣がん細胞株を用いたトランスフェクションアッセイインフォームドコンセントを得た3例の正常卵巣上皮にSV40Tag, hTERTを導入し、不死化細胞株を樹立した。卵巣細胞株2株とともにKGFR, IDO cDNAセンスをトランスフェクションし、クローンを得た。(3)KGFR低分子阻害剤のスクリーニングKGFRのkinase Domainを大腸菌・昆虫細胞で発現させ、kinase活性のあるRecombinant proteinを得た。現在約3万種類のKGFR低分子阻害剤のスクリーニング施行し、2種類の低分子がスクリーニングされた。1、卵巣がん手術検体を用いたKGF, KGFR蛋白発現変化の検討KGF, KGFR抗体を4種類入手し、免疫組織学的検討の条件をセットアップした。インフォームドコンセントを得た20例の卵巣がん手術検体を用い、KGF, KGFR蛋白発現変化を検討した結果、それぞれ70%(14/20)に発現の増強を認めた。進行期別に検討すると、KGF, KGFR蛋白ともに進行がんで抗がん剤耐性症例に発現の増強が高頻度に認められた。平成16年度は計200例の卵巣がん手術検体を用いて蛋白発現変化と臨床病理病態との相関を検討する。2、正常卵巣上皮不死化細胞株および卵巣がん細胞株を用いたトランスフェクションアッセイインフォームドコンセントを得た3例の正常卵巣上皮にSV40,hTERTを導入し、不死化細胞株を樹立した。卵巣がん細胞株2株とともにKGFR cDNAセンス・アンチセンスをトランスフェクションし、クローンを得た。平成16年度はコロニー形成率、増殖速度の検討、腫瘍原性の検討、抗がん剤感受性試験を行う予定である。3、KGFR低分子阻害剤のスクリーニングKinase活性を阻害する酵素量、基質量、温度、時間などのアッセイ条件のOptimizaticmを行った。平成16年度はこのアッセイ系を用い、約3万種類のKGFR低分子阻害剤のスクリーニングを行う予定である。4、抗がん剤耐性遺伝子のスクリーニング卵巣がん細胞株2008を親株としてパクリタキセル耐性株を2株樹立した。cDNAマイクロアレイ解析により約34000遺伝子をスクリーニングし、12種類の遣伝子に絞り込んだ。平成16年度はインフォームドコンセントを得た臨床上パクリタキセル感受性・耐性群に分類した卵巣がん手術検体を用い絞り込んだ遺伝子の発現変化を検討する。

また患者の同意を得て採取された漿液性卵巣がんIIIc期手術検体でTXL不応症例4例およびTXL高感受性症例4例を選別した。全株、全症例よりtotal RNAを抽出し、約33,000遺伝子の発現プロファイリングを行った。Hierarchical clustering解析を行った結果TXL耐性群とTXL感受性群間で有意水準5%で発現差が認められた遺伝子は66種類であった。リアルタイムRT-PCRにより再現性が確認されたのはIDO (Indoleamine-2,3-dioxygenase)遺伝子を含む11種類であった。漿液性卵巣癌III-IV期症例28症例におけるIDO蛋白発現を免疫組織学的に検討し、染色パターンおよび強度を考慮したスコアリングを行った。その結果Kaplan-Meier解析によりスコアと予後に有意差をもって相関が認められた(p=0.0001)。以上よりIDOは漿液性卵巣癌におけるTXL耐性獲得能に関与し、IDO蛋白発現パターンは予後の指標となることが示唆された。(2)正常卵巣上皮不死化細胞株および卵巣がん細胞株を用いたトランスフェクションアッセイインフォームドコンセントを得た3例の正常卵巣上皮にSV40Tag, hTERTを導入し、不死化細胞株を樹立した。卵巣細胞株2株とともにKGFR, IDO cDNAセンスをトランスフェクションし、クローンを得た。種々の抗がん剤感受性の変化や腫瘍原性の検討を行う予定である。(3)KGFR低分子阻害剤のスクリーニングKGFRのkinase Domainを大腸菌・昆虫細胞で発現させ、kinase活性のあるRecombinant proteinを得た。今後、約3万種類のKGFR低分子阻害剤のスクリーニングを行う予定である。(1)パクリタキセル(TXL)耐性遺伝子のスクリーニング卵巣がん細胞株2008を用いTXL耐性株2株を樹立した。リアルタイムRT-PCRにより再現性が確認されたのはIDO(Indoleamine-2,3-dioxygenase)遺伝子を含む11種類であった。(2)正常卵巣
犬バベシア症に関する臨床病理学的研究

本研究は犬のバベシア症の原因であるB.canisについて諸外国株と我国の株間の差を検索し,その病原性あるいは薬剤耐性などとの関連性を検討することを目的としたが,まず基礎的な検索をマウスのB.microti(ドイツ株)とB.rodhainiについて以下の点を平成23年の2年間検討した。1).宿主の免疫応答:パベシア可溶性抗原により感染マウスの脾臓細胞(とくにT細胞)は増殖反応を示した。また免疫マウスの脾臓細胞は感染防御御効果を示し,この作用はIgGおよびT細胞抗体で消失した。一方,過免疫マウスの脾臓細胞の移入では感染防御効果は認められないものの,各種の抗体で前処理すると効果の発現が観察された。またこのうち,とくに抗Lgtー2.2抗体処理で感染防御効果が著明であった。これらのことから,バベシア感染では宿主の防御反応に脾臓細胞,とくにT細胞が重要であることが判明した。B.microtiとB.rodhainiの脾臓内リンバ球サブポピュレ-ションの比較では,Thyー1陽性細胞数がB.microtiで有意な高値であった。一方L_3T_4陽性細胞数/Lytー2陽性細胞数の比ではB.rodhaini感染で感染初期の増加が観察されず,またその減少が早期に観察され,両者の感染経過の違いはT細胞のうち,とくにサプレッサ-細胞の抑制によるものと考えられた。2)糖代謝関連酵素アイソザイムパタ-ン:B.microtiのmolat dehydragenase活性はB.rodhainiに比較して著明に高く,糖の代謝系が両者で異なる可能性が示唆された。またloctati dehydrogenaseのアイソザイムパタ-ンで両者に差が認められ,B.microtiとB.rodhainiは遺伝子レベルで異なる可能性が示唆された。以上のように,マウスのバベシア症の原因であるB.microtiとB.rodhainiには宿主の免疫応答に差が認められ,さらに酵素アイソザイムにも差が認められることが判明し,犬のバベシア症の原因であるB.canisにおいても,株間に相違が認められるものと推測された。B__ー.<canis>___ー株間の代謝特性について検討を加え,株間の形態学的あるいは酵素学的差異と宿主の免疫応答の相違を総合的に追求し,バベシア感染に対する宿主病態生理の基礎的応答に対する特異抗原の役割について解析することを目的とした。しかしながら犬バベシア症慣患犬を得る事が出来なかったのでマウスを用いた実験的バベシア感染に伴う生体応答をB__ー.<microti>___ーおよびB__ー.<rodheini>___ーの2株について検討することとし,本年度は以下の研究成績を得た。1.Babesia原虫の抗原特異性と宿主感染応答に関する検討(小野.亘.後飯塚・中山):まず感染赤血球からバベシア原虫の分離精製を試みた。実験感染させた場合B__ー.<rodheini>___ーは接種後12日目に,B__ー.<microti>___ーは18日目に最大寄生率を示し,虫体分離に適した条件は各々の株間で異なることが判明した。

また酵素学的な差異について<sarcoaytis>___ー4株のsporzoiteについて検討したところ乳酸脱水素酵素(LDH)とマンニト-ル脱水素酵素と(MDH)のアイソエンザイムパタ-ンに株間の差異が認められ,ほぼ2群に分類される司能性が示唆された。一方,B__ー.<rodheini>___ーを実験感染すると,それらのマウスは例外なく全例死亡するが,感染耐過(感染後抗原虫剤投与)したマウスでは強い抵抗性を示す。これらの抵抗性には,主としてマクロファ-ジ,Tーリンパ球およびTーリンパ球産生リンホカインなどが強く関与することが判明した。2.<in>___ー<vitro>___ー培養赤血球内原虫の代謝機構に関する検討(鈴木,斉藤):各種培養条件(疫組成,アミノ酸添加,塩類添加,温度,溶液中の酸素濃度,pHなど)について検討を加えたが、現在迄のところ示適な培養条件を得るには到っていない。また、赤血球内におけるバベシア原虫のシンクロナイゼ-ションを試みたが,良好な結果を得ることは出来なかった。平成3年度の研究実施計画に基づいて検討し,以下の結果を得た。1.Babesia原虫の抗原特異性と宿主感染応答に関する検討(小野・後飯塚・亘)B.microtiならびにB.rodhainiについて実験感染を行い,脾膵細胞中のリンパ球subpopulationの変動を観察した。全脾膵細胞数,IgM陽性細胞数ならびにIgG陽性細胞数であればB.r.群でその増加が他の2群(B.m群およびB.r.で免疫した群)に比較して早期に認められるものの,その数に有意な差は認められなかった。Thyー1陽性細胞数においても同様の増加傾向が観察されたが,その細胞数は有意な低値であった。一方,L_3T_4陽性細胞/Lytー2陽性細胞比ではB.r.群で,感染初期の増加が認められず,また他の2群に比較してその減少が早期に観察された。これらのことから,2株間に認められる感染経過の違い(B.r感染は致死的であるのに対しB.m感染は慢性に移行する)は主にT細胞の反応性の差によるものと考えられ,とくにサプレッサ-細胞の抑制に関連するものと推察された。2.in vitro培養血球内原虫の代謝機構に関する検討(鈴木・河野・斉藤).B.r.およびB.m.のglucoseー6ーdlehydrogenase(G6PD),malate dehydrogenase(MDH)lactate dehydrogenase(LDH)について酵素活性,アイソザイムパタ-ンを比較検討した結果,B.m.のMDH活性はB.rに比較して著しく高かった。G6PO,LDHとの相対比から考えて,B.m.では好気的な糖代謝を,B.r.では嫌気的な糖代謝を利用している可能性が示唆された。一方,アイソザイムパタ-ンの比較ではG6PDならびにMDHでは差を認めることは出来なかったが,LDHでは明らかな差異が認められた。すなわちB.rでは5本のバンドが観察されるのに対し.B.mでは1本のバンドしか認められなかった。したがってB.rとBmは遺伝子レベルで異なる可能性が示唆された。
犬および猫の肝胆道系疾患の鑑別と重症度評価を目的とした非侵襲的新規検査法の確立

(1)ダイナミックCT検査およびソナゾイドを用いた超音波造影検査は、犬における肝臓腫瘤性病変の良性、悪性の鑑別、さらには肝細胞癌とその他の悪性腫瘍の鑑別に有用であり、侵襲性の少ない診断方法として、臨床上重要な検査であることが示唆された。(2)犬でも、肝線維化においてヒトや実験動物と同様の分子病態が存在することが明らかとなり,今後の肝生検材料を用いた肝線維化の遺伝子検査に有用であることが示唆された。(3)犬の慢性肝疾患症例では血中のヒアルロン酸濃度は上昇しており、とくに、肝硬変の血中マーカーとなりうることが示唆された。(4)超音波診断装置を用いた胆嚢の排泄率計測は比較的簡便であり十分に臨床応用可能な胆嚢機能評価法であり,今回この検査法によって胆泥症時の機能異常も明らかとなった。・新しい超音波造影剤を用いた造影超音波検査による肝腫瘤性病変の診断方法の開発新規超音波造影剤ソナゾイドは静脈注射により血管が造影される(血管相)だけでなく、その後、肝臓のクッパー細胞により造影剤の取り込みがおこることによって、肝臓特異的で持続的な造影効果が得られる特徴がある。今年度の研究で犬の肝腫瘤性病変では良性病変の多くでクッパー細胞が残存し造影される一方、悪性病変ではクッパー細胞が認められないため、造影がおこらず、周囲の肝臓が造影されるために造影欠損像として観察されることが明らかとなった。・分子生物学的マーカーを用いた慢性肝炎・繊維化の診断方法の確立肝臓の線維化・脂肪変性を反映する血中マーカーの検討今年度は血中の肝線維化マーカーとしてヒアルロン酸の検討を行った。結果として犬の組織学的線維化の程度と血中ヒアルロン酸濃度は明らかな相関を認めなかったものの、肝硬変などの末期的な線維化状態の場合には有意にその血中濃度が上昇することが明らかとなった。肝臓の纎維化マーカーに関する研究:犬の慢性肝炎の繊維化マーカーの検討として、ヒト、マウスで繊維化との関与が示唆されている9つの遺伝子(PDGFB, PDGFD, MMP2, TIMP1, THBS1, COL1A1, COL3A1, TGFB1, TGFB2)の発現量を定量PCRによって解析した。9つの遺伝子は組織学的な繊維化の程度と有意に相関(P<.01,r>.70)しており、腹水や黄疸を呈する予後不良群ではさらに発現量が増加していることが判明した(Kanemoto H et al.2010)。慢性胆管炎時の微小胆管数に関する研究:慢性胆管炎ではグリソン鞘における微小胆管数の増加が見られることが多いが、ときとして胆管が消失する破壊性胆管炎が起こる。この疾患の経過と微小胆管数について長期的な観察を行った。その結果破壊性胆管炎で胆管消失している場合には、既存の治療に対する反応性に乏しいが、長期的な治療(肝細胞増殖因子含む)によって微小胆管数が増加することと、それに伴う臨床症状の改善が認められ、微小胆管の再構築が予後因子の一つとなることが示唆された(Ohsumi T et al. 2011)胆嚢の運動性と胆嚢粘液嚢腫、胆嚢炎との関連性に関する研究:胆嚢の運動性について食前食後の胆嚢体積を比較することよる排出率で検討したところ、胆嚢粘液嚢腫では運動性が有意に低下していたが、ある程度液体貯留がある場合にはある程度収縮した。胆泥症は一般的には偶発所見と考えられているが、胆泥症の犬は対症に比較して、胆嚢体積が大きく、運動性が低下していることが示され、疾患との関連性が示唆された。(Tsukagoshi T et al. 2011)肝臓の繊維化マーカーに関する研究:犬の慢性肝炎の繊維化マーカーの検討として、ヒト、マウスで繊維化との関与が示唆されている9つの遺伝子(PDGFB,PDGFD,MMP2,TIMP1,THBS1,COL1A1,COL3A1,TGFB1,TGFB2)の発現量を定量PCRによって解析した。9つの遺伝子は組織学的な繊維化の程度と有意に相関しており、腹水や黄疸を呈する予後不良群ではさらに発現量が増加していることが判明した。

胆嚢の運動性と胆泥症・胆嚢粘液嚢腫との関連性に関する研究:これまで獣医領域では胆嚢疾患時の運動性について全く評価されていないため,まず超音波検査を用いた簡易検査を開発した。それを用いて症例での検討を行ったところ,胆嚢粘液嚢腫だけでなく,胆泥症でも運動性が低下していることが示され,胆道系疾患の評価に今後有用であることが示唆された。肝疾患の重症度と炎症マーカー,栄養マーカーとの関連性に関する研究:重症度マーカーとしてヒトで予後不良因子ともなりうる新たな炎症マーカーとして注目されているhigh-mobility group box 1(HMGB1)と,動的栄養指標として注目されている,トランスサイレチン,トランスフェリンの有用性について検討した。犬でもHMGB1は炎症マーカーとして,トランスフェリン値の低下は栄養状態の悪化マーカーとして有用であることが示されたが,重度肝疾患の予後との関連性については症例数が少なく明らかな結果とはならなかった。犬の肝結節性疾患のCT所見に関する研究:今回の科研費研究で,すでに超音波造影における犬の肝結節性病変の特徴について評価したが,CT造影でも肝細胞癌の動脈相における特徴的な辺縁パターンなどが明らかになり,超音波造影とともに非侵襲的な肝疾患評価として有用であることが示された。肝臓リンパ腫の新規診断法としてのGeneScan解析:PCRに基づいてT細胞受容体のクローナリティ解析をGeneScanを用いて行ったところ,猫の肝臓リンパ腫症例の診断に極めて有用であることが示された。
実解析的方法による非線形発展方程式の解の安定性の研究

1.無限遠方に流速がある場合の非圧縮性粘性流体の安定性に関して次の成果を得た.(a)外部領域でのOseen方程式の定常問題をローレンツ空間で考察し,解の一意存在を示しさらに,解の評価が無限遠方の流速に依存しないことを示した.これを用いて非線形問題の定常解の存在と流速が0に収束にするときの定常解の弱位相での収束を示した.(b)外部領域でのOseen semigroupの時間に関するdecay評価を無限遠方での流速に独立な形で求めた.これを応用して定常解の初期値に関する安定性を示した.これらの研究は空間時限が3次元以上の仮定のもとで行われた.2.平行平板中の非圧縮性粘性流体の流れの安定性に関し次の成果を得た.(a)ストークス作用素に対するレゾルベント問題を領域Ω=R^<n-1>×(0,1)で考えそのL^p理論(l<p<∞)を構築した,X_n方向が有限であることからλ=0もレゾルベント集合に入る事を示した.特にストークス半群は指数安定である事を示した.(b)(a)の結果を用い平行平板中のクエット流やポアズイ流の初期値の摂動に関する安定性を示した.3.圧縮性粘性流体の定常流とその安定性に関する数学的解析に関して次の事を示した.(a)外力が空間変数に依存する場合の定常解を求め,その空間無限遠方での挙動を求めた.(b)上記定常解からの摂動問題として非定常問題を捉え,初期値のH^3ノルムが小である場合に初期値問題を解いた.さらに対応する線形化問題の解のローレンツ空間での評価を求め,これを応用して非定常問題の解の定常解への時間無限での収束のオーダーを求めた.以上の解析は全空間で行った.4.ストークス作用素に対するNeumann境界値問題の研究に関して次の結果を得た.(a)レゾルベント問題を考えL^p(l<p<∞)空間での解の存在,一意性および評価を求めた.(b)同様の手法を用いてストークス作用素の2相問題に対するレゾルベント問題のL^p(l<p<∞)空間での解の存在,一意性および評価を求めた,これらの研究はナヴィエ・ストークス方程式の自由境界値問題を半群の理論を用いて研究をするための出発点となる研究である.1.無限遠方に流速がある場合の非圧縮性粘性流体の安定性に関して次の成果を得た.(a)外部領域でのOseen方程式の定常問題をローレンツ空間で考察し,解の一意存在を示しさらに,解の評価が無限遠方の流速に依存しないことを示した.これを用いて非線形問題の定常解の存在と流速が0に収束にするときの定常解の弱位相での収束を示した.(b)外部領域でのOseen semigroupの時間に関するdecay評価を無限遠方での流速に独立な形で求めた.これを応用して定常解の初期値に関する安定性を示した.これらの研究は空間時限が3次元以上の仮定のもとで行われた.2.平行平板中の非圧縮性粘性流体の流れの安定性に関し次の成果を得た.(a)ストークス作用素に対するレゾルベント問題を領域Ω=R^<n-1>×(0,1)で考えそのL^p理論(l<p<∞)を構築した,X_n方向が有限であることからλ=0もレゾルベント集合に入る事を示した.特にストークス半群は指数安定である事を示した.(b)(a)の結果を用い平行平板中のクエット流やポアズイ流の初期値の摂動に関する安定性を示した.3.圧縮性粘性流体の定常流とその安定性に関する数学的解析に関して次の事を示した.(a)外力が空間変数に依存する場合の定常解を求め,その空間無限遠方での挙動を求めた.(b)上記定常解からの摂動問題として非定常問題を捉え,初期値のH^3ノルムが小である場合に初期値問題を解いた.さらに対応する線形化問題の解のローレンツ空間での評価を求め,これを応用して非定常問題の解の定常解への時間無限での収束のオーダーを求めた.以上の解析は全空間で行った.4.ストークス作用素に対するNeumann境界値問題の研究に関して次の結果を得た.(a)レゾルベント問題を考えL^p(l<p<∞)空間での解の存在,一意性および評価を求めた.(b)同様の手法を用いてストークス作用素の2相問題に対するレゾルベント問題のL^p(l<p<∞)空間での解の存在,一意性および評価を求めた,これらの研究はナヴィエ・ストークス方程式の自由境界値問題を半群の理論を用いて研究をするための出発点となる研究である.1.非圧縮性粘性流体中を運動する物体が,無限遠方で定数速度u_∞を持つ場合の定常問題を記述する方程式の解のu_∞に関する一様評価,及びu_∞→0としたときの極限に関する研究を行った.これは,いわゆるオゼン作用素の一意可解性と解の先験的評価をローレンツ空間を用いる事により求めたところが,研究の中心的部分であり,主な仕事は柴田と山崎の共同研究による.非定常問題への発展が平成13年度における課題である.2.弾性体の方程式に対して2相問題を考えた.

そのレゾルベント問題のL_p評価に関する,詳細な評価を実解析的手法を駆使する簡明な方法により求めた.これは,柴田と清水の共同研究による.ここで開発した手法により,流体の運動を記述するストークス方程式の2相問題に関する研究の応用へとさらに発展させるのが13年度の課題である.これらの研究は,海外協力者のソロニコフ氏のグループと協力して進められている.3.圧縮性粘性流体の外部問題での解の安定性に関する研究を,特に解の時間無限での漸近挙動に関することに焦点をあてて行った.定数定常解の安定性に関しては,小林により最良の結果が得られた.定数定常解ではない場合の研究は,パデューラ氏のグループが先行しているが,彼らの方法とはまったく別の方法による研究を柴田は院生を含めたグループで始めた.我々の研究のポイントは線形化問題の解の先験的評価を重みつきのL_2でまず求め,次に基本解を用いてL_∞での減衰評価を求めるというものである.L_2を上手く使うことでいわゆるderivative lossをさけることが出来る.本年度は全空間での解析を終えた.来年度以降は外部領域に関する研究へと続けていく.この研究は世界に先駆けた重要なものであると確信している.さらに海外協力者のファイズル氏の手法も加味する方向で研究を発展させていく.1.Stokes方程式のNeumann型の境界値問題についての,レゾルベント評価を行った.またレゾルベントパラメータが0であるときの,詳しい解析を有界領域の場合におこない,よってもとの非線形方程式である,Navier-Stokes方程式の定常問題を小さな外力の場合に解いた.2.2枚の板の間の領域(いわゆるinfinite layer domain)において,Stokes作用素のレゾルベント評価を行った.これにより対応するStokes作用素の非定常問題が解析的半群を生成する事を示した.さらに0がレゾルベントの元であることも,示した.よって対応するStokes半群は指数減衰をする.このことから,クエット流や,ポアズイ流の安定性を示した.3.全空間での圧縮性粘性流体の定常問題の解の安定性をL^2の枠内で示した.また,線形化問題の解のよりシャープの評価を与えた.これにより,diffusion waveの解析を明確にした.4.3次元のラプラス方程式のレゾルベント問題をperfectwall boundary conditionの場合に示した.また,この結果を応用して,超伝導状態を記述する,Ginzburg-Landau方程式の定常解の存在とその初期値に関する安定性を有界領域の場合に示した.5.2次元の非圧縮性粘性流体の外部境界値問題の第一次近似として,境界近くではStokes近似が最良であることを示した.この事実は物理的な考察のもとに,Bessel関数の展開を用いて,1950年代に今井先生により示されていた.また,数値解析的シミュレーションによっても知られていた.我々の証明はPotential theoryに基づく数学的に厳密なものである.1.n次元外部領域において,無限遠方での流速が一般にゼロではない定数ベクトルの場合の非圧縮性粘性流体の定常解の安定性を示した.この定常解は前年度の研究によりその存在と無限遠方での可積分性は詳しく求まっていた.証明の基盤は線形化作用素であるOseen方程式のL_p-L_q評価である.これを求めるにはまず境界近傍での局所減衰定理を求める.基本解の詳しい解析とcompact perturbation法によりこの局所減衰定理は求まった.つぎに,cut-offテクニックにより全空間での結果と局所減衰定理をむすびつけて,所求のL_p-L_q評価を求めた.そして,この評価と定常解の無限遠方での可積分性とを上手く使い定常解の安定性を示した.
口腔がんの効率的な末梢循環腫瘍細胞採取法とゲノム解析法の創出

末梢循環腫瘍細胞(CTCs)と腫瘍から血流に放出された循環細胞遊離DNA(ctDNA)から遺伝子変異を確認する効率の良い解析手法の確立に挑戦した。揚力と遠心力によりがん細胞を分離する原理でCTCsを分離した。CTCsの微量DNAは増幅を行った後、患者血液中のctDNAとともに次世代シーケンス(NGS)を行う手法を確立した。頭頸部がん、胃がん、食道がん、大腸がんを含む計37例の末梢血からCTCsを分離した。末梢血1mL中のCTCsの個数は8-77個/mLであり、全例からCTCsを分離できた。増幅されたDNAからNGSを行い、CTCsからのがん遺伝子、がん抑制遺伝子変異プロファイル抽出に成功した。口腔がんはヒト個性にとってもっとも重要な顎顔面部に発症するため、最小限な侵襲で最大の治療効果を発揮する個別化医療の開発が求められている。最適治療の選択には、時間的・空間的に変化するがん細胞の個性を正確かつ非侵襲的に捉える技術の創出が求められる。血中を循環するCTCsや循環細胞フリーDNA(circulating cell free DNA cfDNA)を利用して、腫瘍細胞の情報を非侵襲的に回収するリキッドバイオプシーが注目を集めている。リキッドバイオプシーは、採血検体を利用するため頻回の検査でも患者に対する負担は少ない。われわれは、口腔がん患者から効率的にCTCsやcfDNAを回収し、次世代シーケンス技術(NGS)を使いゲノム変異を検出する方法の開発をすすめてきた。今回の研究から口腔がん患者を前向きに11症例を登録し、CTCsやcfDNAから回収した微量DNAからNGS技術を駆使してp53やp16の変異を解析できる可能性を示した。外科系歯学
複数の音響センサを用いる工具損傷のインプロセスセンシングの研究

加工システムの高度自動化のため,切削工具の加工機能を加工中に自動監視する必要性が高まり,様々な方式によるセンシングの研究が活発に行われてきた.しかし,なお種々の難点があって,確実で簡便な手法が確立していなかった.本研究は切削振動に伴って発生する音響(切削音)の変化に着目し,比較的遠方から非接触で工具損傷を検出監視する方式を確立することを最終目標とし,以下の知見を得た.1.切削音と工具損傷の関係工具損傷による切削音の変化を諸切削条件で調べ,その具体的特性を明らかにした.切削加工の需要の多い炭素鋼S35Cの旋削加工を中心に種々の切削条件で切削加工実験を行い,切削工具の損傷と発生する切削音の特性(レベル,周波数等)および工具振動との関係を実験的に研究した,切削音の主スペクトルのレベルが増大すること,その主スペクトルの周波数が比例的に低下すること,その原因には工具振動の高調波歪が考えられること等が判明した.その結果切削音を用いる工具損傷のインプロセスセンシングは十分可能で有用であることを明らかにした.2.複数の切削音源の弁別複数の音響センサを利用して,音響の到達時間差,到来方向を調べ外来雑音や他の工作機械の切削音を弁別,遮断し,目的とする特定の工作機械の切削音のみを検出する手法を検討した.弁別は音響センサに指向性を持たせることにより行った.指向性を持たせる方法は,パラボラマイクロホンによる方法とマイクロホンアレーによる方法を採用し,比較検討した.切削実験では2台の平行して並んだ旋盤で同時に加工した際の各切削音の弁別の可能性を検討した.その結果,いずれの方法においても複数音源が混在する環境下であっても,特定の音のみを検出できること,音源位置が不明な場合であっても,その位置を推定することが可能であること等を明らかにした.加工システムの高度自動化のため,切削工具の加工機能を加工中に自動監視する必要性が高まり,様々な方式によるセンシングの研究が活発に行われてきた.しかし,なお種々の難点があって,確実で簡便な手法が確立していなかった.本研究は切削振動に伴って発生する音響(切削音)の変化に着目し,比較的遠方から非接触で工具損傷を検出監視する方式を確立することを最終目標とし,以下の知見を得た.1.切削音と工具損傷の関係工具損傷による切削音の変化を諸切削条件で調べ,その具体的特性を明らかにした.切削加工の需要の多い炭素鋼S35Cの旋削加工を中心に種々の切削条件で切削加工実験を行い,切削工具の損傷と発生する切削音の特性(レベル,周波数等)および工具振動との関係を実験的に研究した,切削音の主スペクトルのレベルが増大すること,その主スペクトルの周波数が比例的に低下すること,その原因には工具振動の高調波歪が考えられること等が判明した.その結果切削音を用いる工具損傷のインプロセスセンシングは十分可能で有用であることを明らかにした.2.複数の切削音源の弁別複数の音響センサを利用して,音響の到達時間差,到来方向を調べ外来雑音や他の工作機械の切削音を弁別,遮断し,目的とする特定の工作機械の切削音のみを検出する手法を検討した.弁別は音響センサに指向性を持たせることにより行った.指向性を持たせる方法は,パラボラマイクロホンによる方法とマイクロホンアレーによる方法を採用し,比較検討した.切削実験では2台の平行して並んだ旋盤で同時に加工した際の各切削音の弁別の可能性を検討した.その結果,いずれの方法においても複数音源が混在する環境下であっても,特定の音のみを検出できること,音源位置が不明な場合であっても,その位置を推定することが可能であること等を明らかにした.切削加工の需要の多い炭素鋼(S35C)の旋削加工を対象に種々の切削条件で切削実験を行い、切削に伴って発生する音響(切削音)を切削工具の近傍に置いた2個の音響センサーおよび比較的遠方(約3m)に置かれた2個の音響センサーで採取し、切削工具の逃げ面摩耗との関係をFFT等の音響分析装置を用いて研究した。その結果、(1)切削音は主として、切削工具のシャンクの共振周波数付近に強いピークを持ち、そのピークのラウドネスは工具の逃げ面摩耗の増加に伴って漸増する。(2)ピークの周波数は逆に摩耗の増加に伴い、若干、減少する。(3)したがって、感覚的には摩耗に伴って、周波数が増加するように感じられる。これは熟練技能者が体験していることと一致する。(4)周波数の低下に伴い、切削音の高次高調波の発生が認められる。(5)よって、切削音を監視することにより、工具摩耗の推測が可能であり、この時、監視対象は切削音のピーク周波数、ピークのラウドネス、高調波歪率の何れでも可能性がある。なお、本実験では工作機械の歯車音、軸受音などの一般的な機械音のスベクトルは23kHzまでにあり、これに対し、工具の共振周波数はかなり高い(56kHz以上)ので両者の分離は比較的容易であった。しかし、実際の加工工場を想定すると、同種の工作機械が多数同時に運用されるので、複数の切削音の音源があり、これを分離する必要がある。このため7個の音響センサーを組み合わせたセンサーアレイを試み良好な結果を得ている。今後はセンサー間の最適な重み付け関数やセンサー数についても検討する。