hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
腸管病原性大腸菌によって誘導される癌転移抑制作用の解析および抗転移ワクチンの創製

マウスに大腸炎を誘導するCitrobacter rodentiumと癌転移の相関関係について研究を行った。一度C. rodentiumに感染したマウスでは、その後の黒色腫細胞移入による肺への癌転移が有意に抑制された。この抑制作用は、C. rodentiumに対する何らかの抗体が、癌細胞の表面抗原に交差反応をして見られる現象であることを明らかにした。本研究課題では、腸管病原性大腸菌のマウス感受性細菌であるCitrobacter rodentiumがマウスに感染すると、その後、癌の転移に対して抵抗性を示すという発見に基づいて研究を遂行した。本年度では、この癌転移作用の詳細なメカニズムの解明と、ワクチンとしての候補株をスクリーニングするための変異株作成を行った。まず、C. rodentiumをマウスに感染させた後、36週間後に、マウス悪性黒色腫であるB16F10細胞を尾静脈より静注し、2週間後に肺に転移したB16F10細胞の転移巣の数を数えた。その結果、6週間たっても依然として、転移の阻害作用を保っていた。また、感染後3週間では、C. rodentiumはほぼ完全に除去されており、完治に近い状態であるため、感染による炎症反応によって阻害されたのではないことが明らかとなった。次に、癌の転移作用は、何によって引き起こされているのかを検討した。その結果、腫瘍免疫で中心的な役割を果たしている、腫瘍特異的細胞障害性T細胞(CTL)、ナチュラルキラー細胞(NK)およびNKT細胞などについて活性化を検討したが、C. rodentiumが感染したマウスと非感染マウスの間には、大きな差は認められなかった。しかし、C. rodentiumに感染したマウスより採取した血清を、B16F10細胞とともに静注すると、肺への転移は大きく阻害された。つまり、血清中の何かの成分によって阻害作用が引き起こされていることが明らかとなった。以上の結果を、第81回日本細菌学会総会において、発表予定する抗転移ワクチン株の探索として、マクロファージや樹状細胞に細胞死を引き起こさない変異株を検討中である。そのために、現在知られているIII型分泌装置より分泌されるエフェクターの変異株を作成した。今後、これらを用いて、各種アッセイをしていく予定である。本研究において、腸管病原性大腸菌のマウス感受性細菌であるCitrobacter rodentiumに一度感染したマウスは、癌転移が減少するという現象をもとに、そのメカニズムの解明と、それを応用した抗転移ワクチンの創製を目指して研究を行った。現在まで、転移抑制メカニズムとして、感染に伴う自然免疫の活性化によるガン細胞の排除などではなく、Citrobacter rodentium感染によって生成される抗体が重要であることが明らかとなっている。そこで、この抗体が何を認識しているのかプロテオーム解析を行った。ガン細胞として用いたB16細胞の細胞表面をビオチン化した後、ストレプトアビジンビーズを用いて細胞膜を単離した。これをSDS-PAGEをして分離し、感染および非感染血清を用いてウェスタンブロットを行った。これにより、感染したことでB16細胞表面にクロス反応するバンドをいくつか検出することに成功した。次に、このクロス反応したバンドを、ゲルから切り出し、質量分析により蛋白質を同定した。その結果、癌転移に重要であることが知られているいくつかの蛋白質が候補に挙がった。今後これらのどの蛋白質が重要であるかを検証する。次に、抗転移ワクチン株の作成にあたり、組織障害性、特に抗原提示細胞に対する傷害性問題であると考えた。そこで、様々なIII型分泌装置分泌蛋白質の変異株を作成し、食食細胞にたいする細胞傷害活性を測定した。しかし、どの変異株も野生株と同様の傷害性を示した。
運動神経の特定機能単位選択的に働く新規遺伝子群の解析

我々は運動神経をモデル系とし、その軸索伸長・経路選択・標的認識機構を、こうした過程に関与しうる因子を探索し解析することから明らかにしようとしている。16年度は、LMCm運動ニューロンに選択的に発現し、これまでにその軸索ガイド因子としての基本的な性質を明らかにしたFY29について、その作用の分子機構を探るべく解析を加えた。FY29は複数のIgドメインとMAMドメインをもつGPI結合型の細胞外タンパクであるが、欠失変異体を作製し解析した結果、MAMドメインを介して軸索上のco-receptorと、また、Igドメインを含むN末側の領域を介してligandと結合するものと考えられた。さらに、N末側4つのIgドメインはligandとの結合に必要であり、これらを欠失させると、軸索上のco-receptorとの結合が顕著に増強されることを明らかにした。こうしたことから、この因子のIgドメインを含むN末側の領域がligandと結合することにより、そのMAMドメインとco-receptorとの結合が増強されることでシグナルの伝達が行われるものと推測された。これらco-receptorとligandの同定が今後の課題である。また、未だ不明な点の多い運動神経の神経管からの遊出機構を探る目的で、運動神経の誕生直後から運動神経に特異的に発現する因子群の単離を試みた。その結果、いくつかの候補因子を単離したが、そのうちの一つは運動神経に高度に特異的に、しかもその誕生時に一過的に発現するという興味深い発現パターンを示した。解析を進めたところ、この因子は進化上高度に保存された細胞質性因子をコードしていることが明らかになった。培養細胞において大過剰に発現させると、その形態と運動性に著しい変化をもたらすことから、細胞骨格系の制御を通じて、運動神経の軸索伸長時において重要な役割を果たしていることが推察された。
球面超音波モータを使った宇宙用アクチュエータの研究と設計開発

科学の進歩に伴い国内外で宇宙開発が活発におこなわれている.人工衛星や国際宇宙ステーションなどの宇宙機の姿勢制御にはスラスタが用いられている.運用後の宇宙機がスペースデブリにならないように,大気圏へ再突入させ焼却する方法や高高度へ軌道を修正する方法が提唱されており,廃棄の目的でもスラスタが用いられている.現在多くの宇宙機のスラスタは向きが固定されているため,宇宙機に複数個の設定が必要でペイロードを圧迫している.本研究では,スラスタの向きを自由に可変でき,複数個あるスラスタの機能を1つにまとめられ,少ない個数で冗長性を持たせることができる宇宙用多自由度アクチュエータ「球面超音波モータ(SUSM:Spherical Ultrasonic Motor)」を研究し,設計開発することである.2013年に打ち上げられたイプシロンロケットの衛星搭載環境の設定としてJAXAでは,準静的加速度,正弦波振動,音響,衝撃,ランダム振動を挙げている.最終年度は,作成した宇宙用SUSMを宇宙空間で利用するためには,ロケット打ち上げ時に受ける機械的環境を満たす必要があるため,耐振動性と耐衝撃性の評価をおこなった.作成した宇宙用SUSMの固有振動数を算出し,打ち上げ時の振動が宇宙用SUSMに及ぼす影響を明らかにした.そして,耐振動性の評価として,一般的にロケット打ち上げ時の評価試験に用いられる準静的加速度,正弦波振動,ランダム振動による加振実験をおこなった.また,耐衝撃性の評価として,宇宙用SUSMに重力加速度の20倍から40倍の加速度が加わったことを想定した加振実験をおこなった.科学技術の進歩に伴い国内外で宇宙開発が活発に行われている。人工衛星や国際宇宙ステーションなどの宇宙機の姿勢制御にはスラスタが用いられている。運用後の宇宙機がスペースデブリにならないように、大気圏へ再突入させ焼却する方法や高高度へ軌道を修正する方法が提唱されており、廃棄の目的でもスラスタが用いられている。現在多くの宇宙機のスラスタは向きが固定されているため、宇宙機に複数個の設置が必要でペイロードを圧迫している。本研究では、スラスタの向きを自由に可変でき、複数個あるスラスタの機能を1つにまとめられ、少ない個数で冗長性を持たせることができる宇宙用多自由度アクチュエータ「球面超音波モータ(SUSM:Spherical Ultrasonic Motor)」を研究し、設計開発することである。本年度は基本特性試験として、回転数、トルク、耐久性における各測定の確立を行うため、SUSMの実験装置を作成した。作成した実験装置を用いて、大気中で回転数の測定を行った。運動に一番負荷のかかる駆動として、宇宙用SUSMに(ステータ1、ステータ2、ステータ3)=(0度、60度、ー60度)の各位相差をもった交流信号を印加し、Y軸正方向の繰り返し運動をさせた。その際の出力棒の運動をビデオカメラで撮影し、圧電素子の温度を熱電対で計測した。温度可変の恒温槽において低温域・高温域にさらした熱サイクルを行い、回転数、トルク、耐久性に関する実験を行った。研究期間の半年を経過し、外注依頼で作成する圧電ユニットは各工程に多くの時間を有することがわかったため、加工が可能な部品から早期作成を行った。当初予定していた平成29年度以降に行う圧電素子のライニング材の検討において、圧電素子ユニットやそれらに関する実験装置の早期作成に着手した。圧電素子ユニットは耐久性試験において作成個数が30個以上と大変多く、ばらついた性能のユニットは使用できないものとなる。同じ性能のロット作成、時間的ロスの低減、研究の進展などを図った。作成した圧電ユニットはさまざまな熱衝撃試験での特性を評価するために用いる。各種実験を通じて、圧電素子の性能を確認するためにインピーダンス計測を行っているが、その時間がかかりすぎる問題が生じたため、小型で安価なインピーダンスアナライザを代替計測器に利用し、計測環境のソフトウェア開発を行うことにする。科学の進歩に伴い国内外で宇宙開発が活発におこなわれている.人工衛星や国際宇宙ステーションなどの宇宙機の姿勢制御にはスラスタが用いられている.運用後の宇宙機がスペースデブリにならないように,大気圏へ再突入させ焼却する方法や高高度へ軌道を修正する方法が提唱されており,廃棄の目的でもスラスタが用いられている.現在多くの宇宙機のスラスタは向きが固定されているため,宇宙機に複数個の設定が必要でペイロードを圧迫している.本研究では,スラスタの向きを自由に可変でき,複数個あるスラスタの機能を1つにまとめられ,少ない個数で冗長性を持たせることができる宇宙用多自由度アクチュエータ「球面超音波モータ(SUSM:Spherical Ultrasonic Motor)」を研究し,設計開発することである.本年度は昨年度作成したSUSMの実験装置を用いて,高温・低温が繰り返される温度サイクルを長時間にわたっておこなった.実験条件は昨年度と引き続き同じ条件で,運動に一番負荷のかかる駆動として,宇宙用SUSMに(ステータ1,ステータ2,ステータ3)=(0度,60度,ー60度)の各位相差をもった交流信号を印加し,Y軸正方向の繰り返し駆動をした.大気中において,常温の20°Cから高温の120°Cまで上昇し,その後常温に戻して,低温-50°Cまで冷やし,そこから常温に戻す実験である.温度サイクルは1°C1分になるようにゆっくりとおこなった.

出力棒の運動をビデオカメラで撮影し,圧電素子の温度を熱電対で測定した.温度可変の恒温槽において回転速度,トルク,耐久性に関する実験をおこなった.圧電素子の性能を確認するためにはインピーダンス計測が必要である.昨年度,手軽に利用可能なインピーダンスアナライザを代替計測器にすることにしたため,計測環境のソフトウェアをLabVIEWで製作した.従来のSUSMリモコンが故障したため,新たなSUSMリモコンを追加発注した.リモコン以外に,SUSM本体が壊れると実験ができないことから,SUSM装置を再作成した.SUSMリモコンは8方向ジョイスティックで動作させるが,PCキーボードやテンキーでの操作ができるように改良を加えるプログラム開発に取りかかる.未完成のため,今年度の完成を目指す.科学の進歩に伴い国内外で宇宙開発が活発におこなわれている.人工衛星や国際宇宙ステーションなどの宇宙機の姿勢制御にはスラスタが用いられている.運用後の宇宙機がスペースデブリにならないように,大気圏へ再突入させ焼却する方法や高高度へ軌道を修正する方法が提唱されており,廃棄の目的でもスラスタが用いられている.現在多くの宇宙機のスラスタは向きが固定されているため,宇宙機に複数個の設定が必要でペイロードを圧迫している.本研究では,スラスタの向きを自由に可変でき,複数個あるスラスタの機能を1つにまとめられ,少ない個数で冗長性を持たせることができる宇宙用多自由度アクチュエータ「球面超音波モータ(SUSM:Spherical Ultrasonic Motor)」を研究し,設計開発することである.2013年に打ち上げられたイプシロンロケットの衛星搭載環境の設定としてJAXAでは,準静的加速度,正弦波振動,音響,衝撃,ランダム振動を挙げている.最終年度は,作成した宇宙用SUSMを宇宙空間で利用するためには,ロケット打ち上げ時に受ける機械的環境を満たす必要があるため,耐振動性と耐衝撃性の評価をおこなった.作成した宇宙用SUSMの固有振動数を算出し,打ち上げ時の振動が宇宙用SUSMに及ぼす影響を明らかにした.そして,耐振動性の評価として,一般的にロケット打ち上げ時の評価試験に用いられる準静的加速度,正弦波振動,ランダム振動による加振実験をおこなった.また,耐衝撃性の評価として,宇宙用SUSMに重力加速度の20倍から40倍の加速度が加わったことを想定した加振実験をおこなった.SUSMの出力が最大となるように、印加電圧の周波数を共振周波数と同じ値にして実験を行う。この周波数は出力が最大になると同時に、最も熱の発生がしやすく過酷な条件である。印加周波数を共振周波数から動かすとインピーダンスは低下する。このことは目標のトルクを維持した状態で、圧電素子の発熱を抑えることにつながるため、印加周波数の検討は超音波モータの耐久性向上にもつながる。真空チャンバー内はインピーダンスアナライザを用いた直接測定ができないため、コイルやコンデンサを用いた等価回路式から、真空中での周波数をSUSM出力特性の経時変化や温度特性と共に計測し、駆動周波数を検討する。SUSMを宇宙空間で利用するためには,ロケットで打ち上げられる際の振動と衝撃に耐えた後,正常に駆動する必要がある.ロケット打ち上げ時には,順静的加速度,正弦波振動,ランダム振動などの振動をうけることがわかっている.振動時の振動周波数がSUSMの固有振動数と一致すると共振現象によりSUSMを破壊してしまうため,振動と衝撃に対する検討が必要になる.
三次元鉄ヒ化物超伝導体の創成

鉄系超伝導体の新しい物質系開発を目指して物質探索を行った。従来の鉄系超伝導体は二次元構造が特徴だが、申請者が先行研究で発見した物質は鉄系超伝導体の特徴を色濃く持ちつつも三次元的なネットワーク構造を有する。対応する電子構造にも違いが現れると期待されることから、鉄系超伝導の謎を解く鍵となりうると期待し、物質・物性探索を行った。研究の結果、6-3-11-10系と名付けた三次元鉄ヒ化物が非バルクの超伝導転移を示すことを突き止めた。バルク性が現れない原因はドープ量に由来すると考えている。また、物質探索の過程で、申請者が開発した112型Ca1-xLaxFeAs2の2種の類縁物質を発見することに成功した。三次元鉄ヒ化物Ca3Pt(Fe,Pt)Pt(Fe,Pt)8As6(以下、3-1-8-6系)とCa6Pt3(Fe,Pt)11As10(以下、6-3-11-10系)の物性測定を行った。3-1-8-6系は最低温まで金属的な伝導を示さないが、6-3-11-10系において約30 Kで超伝導の出現を示唆する電気抵抗率の急激な低下を見出した。磁化率の反磁性成分が小さいことから、今後は超伝導成分を増やす物質開発が課題となる。抵抗率の温度依存性には強いサンプル依存性があることから、FeサイトへのPt置換量がサンプルに依存して大きく異なっている可能性を考えている。現在、複数試料に対する放射光X線構造解析を実施中である。超伝導性のカギとなる原因サイトを特定し、Pt置換量の制御に伴う電子状態の制御へと繋げたい。BaFe2As2やSrFe2As2などでは、静水圧下で超伝導発現することを念頭に、6-3-11-10系の圧力下磁化測定を行ったが、1.4 GPaまでの圧力下でバルク超伝導の出現は見られなかった。従来の鉄系超伝導体との比較を目的として、WIEN2Kを用いたバンド構造計算を行った結果、5d遷移金属のPtを含むにもかかわらず、フェルミ面はFe 3d軌道が支配的になっており、従来の鉄系超伝導体と共通した特徴を持っていることが明らかになった。フェルミ面の形状そのものは結晶構造を反映した三次元的な形状になっており、従来の鉄系超伝導体に特徴的なシリンドリカルな形状の面影はない。三次元鉄ヒ化物超伝導体の創成という本研究の目的に対し、反磁性成分が大きくないとはいえ、6-3-11-10系においてバルク超伝導実現への手がかりを得たことは大きな成果である。従来の鉄系超伝導体と同じく、Fe 3d軌道のFermi面への寄与が支配的であることを明らかにした点も重要である。今後は6-3-11-10系をベースとした物質・物性開拓を中心に進めたい。三次元鉄ヒ化物Can(n+1)/2(Fe1-xPtx)(2+3n)Ptn(n-1)/2As(n+1)(n+2)/2 (n = 2 (3-1-8-6系), 3 (6-3-11-10系))の物質・物性開拓を展開し、研究範囲を周辺物質へと広げた。Pt/Pd置換を中心とした物質探索から、Ca1-xLaxFe1-yPdyAs2の組成を持つ2種類の新しい鉄ヒ化物を得ることに成功した。置換の影響のために、従来のX線回折法では構造を一意に同定できないという問題が生じ、構造解析の難度の高い物質ではあったが、KEK PFにおける放射光単結晶X線回折実験を駆使して、As吸収端近傍における原子散乱因子異常分散項の不連続な変化を利用して結晶構造を突き止めることに成功した。得られた構造は、申請者が中心となってこれまでに開発を行ってきた112型Ca1-xLaxFeAs2 (Tc = 34 K)の類縁構造であり、112型鉄ヒ化物が多様な類縁構造を持つ物質系であることを示す成果となった。また、両物質の電子状態が超伝導を示すCa1-xLaxFeAs2と似通っていることをXAFS測定から明らかにしており、さらなる物性開拓により高温超伝導の発現が期待される。本年度は本研究で得られた成果を取りまとめ、論文報告することにも注力した。三次元鉄ヒ化物に関する成果は申請者を筆頭著者としてScientific Reports誌に報告し、新たに発見した112型鉄ヒ化物については申請者の指導する学生を筆頭著者としてInorganic Chemistry誌に論文報告を行っている。また、本研究の成果に関して、国際学会における招待講演(2017年3月)を行うなど、研究成果を積極的に普及するよう努めた。

バルク性が現れない原因はドープ量に由来すると考えている。また、物質探索の過程で、申請者が開発した112型Ca1-xLaxFeAs2の2種の類縁物質を発見することに成功した。昨年度の知見をもとに、体積分率の大きな三次元鉄ヒ化物超伝導体の実現を目指したい。本系は、一般式Ca3nPtn(n+1)/2(Fe,Pt)3n+5As4n+2で表すことができ、3-1-8-6系はn = 1, 6-3-11-10系はn = 2となる。nが大きいほど、鉄ヒ素層の平坦部分が多くなり、このことが6-3-11-10系で超伝導の兆候が見られた原因と考えている。今後はn = 3,4などの物質開発を中心に進めたい。固体化学X線源のオーバーホール回数が少なかったことから、予定費用の一部を浮かせることに成功した。X線源のオーバーホールが次年度持ち越しとなるため、予定より一回多くのオーバーホール代が必要と見込まれる。持ち越し額は追加オーバーホール費用に充てる予定である。
重イオンビームによる高頻度変異誘発の分子基盤の解明

植物への重イオンビーム照射では、変異率が最も高くなる線エネルギー付与(至適LET)が存在する。申請者らは至適LET照射時に過剰なRPA1Eタンパク質がRAD51タンパク質の働きを阻害し、Polθタンパク質が関与する誤りやすいDNA修復経路による修復を促進させるという仮説を立てた。本研究では、全ゲノムシーケンスおよび生化学的アプローチにより、至適LET照射におけるPolθとRAD51の役割を明らかにする。
低侵襲アプローチによる糖尿病大血管症リスク層別化システムの構築

糖尿病患者においては、いわゆる古典的危険因子の評価のみでは心血管疾患ハイリスク群を効率よく抽出することはできない。本研究では、エコー検査による頸動脈内膜中膜複合体肥厚度(IMT)やプラーク組織性状の定量的評価、脈波伝播速度(PWV)といった全身の動脈硬化進展度を非侵襲的、簡便、低コストで評価可能なツールを活用することによって、心血管疾患ハイリスク群の検出能が向上することを明らかにした。また、複数の因子の遺伝子多型の集積効果を評価することによって、心血管疾患リスクが高い糖尿病患者を診断可能であることを明らかにした。本年度の主たる研究実績は以下である。【方法】CVDの既往がない40歳以上の2型糖尿病患者に頚動脈エコー検査を施行し、頚動脈にプラーク病変を認めた287例を対象とし、CVDの発症について追跡調査を行った。【総括】本検討の結果、CVDの既往がない2型糖尿病患者において、頸動脈低輝度プラークの存在はCVDの独立した予測因子となること、FRSやプラーク厚に低輝度プラークの有無を付加することでCVDの予測能が向上することが明らかとなった。2型糖尿病患者において、GSMによる頚動脈プラーク組織性状の評価はCVDのハイリスク患者抽出に有用であることが示された。【背景・目的】心血管疾患は糖尿病患者の重大な合併症である。一方、上腕ー足首間脈波伝播速度(baPWV)は安全・簡便・低コストで血管弾性を評価することができるため、我が国で広く行われている検査であるが、baPWVが心血管疾患ハイリスク群の予測に有用かどうかについては十分なエビデンスがない。baPWVおよびエコー検査で評価した頚動脈内膜中膜複合体肥厚度(IMT)が2型糖尿病患者における心血管イベント発症の予測に有用であるかどうかを検討した。【方法】心疾患の既往がない無症候2型糖尿病患者を対象に、観察開始時に測定したbaPWVおよびmaxIMTと心血管イベント発症との関連を前向きに観察した。baPWV高値群(≥1550 cm/s)ではbaPWV低値群(【結論】無症候2型糖尿病患者において、古典的危険因子、頸動脈IMTに加えて、脈波伝播速度(baPWV)を評価することで、心血管イベント発症ハイリスク群の予測能は向上する。頸動脈エコー検査は、全身の動脈硬化進展度を非侵襲的、簡便、低コストで評価可能なツールであり、心血管疾患(CVD)ハイリスク群を効率よく抽出するための検査として期待できる。本研究では、CVDの既往がない2型糖尿病患者を対象とし、Gray-scale median (GSM)で評価した頸動脈プラークの組織性状とCVDとの関連を調査した。その結果、CVDを発症した群では有意にGSMが低く、低輝度(低GSM)プラークの存在は他の因子で補正してもCVDの独立した予測因子であった。また、時間依存性ROC曲線解析の結果、Framingham risk scoreと頸動脈プラーク厚に頸動脈低輝度プラークの存在を付加すると、CVD発症リスク予測能は有意に向上した(p<0.05)。さらに、2型糖尿病患者1040例を対象に、baPWVとCVDとの関連を7.5年間にわたり観察したところ、古典的な冠危険因子を調整しても、baPWV値はCVD発症の独立した予測因子であった(HR=1.35, [95%CI: 1.11-1.64]; p=0.003)。時間依存性ROC曲線解析の結果、Framingham risk scoreにbaPWV値を付加して予測するとCVD発症リスク予測能は有意に向上する(p<0.05)ことが示された。一方、動脈硬化の発症には炎症反応が重要な役割を担う。日本人2型糖尿病患者4321人を対象に、炎症に関連する5つの機能的なSNPと心血管疾患(虚血性心疾患・脳血管障害・末梢動脈疾患)との関連を統計学的に評価した。各多型は単独では心血管疾患と有意な関連はなかったが、炎症促進方向に作用するアレルを多く持つ患者ほど心血管疾患の有病率が高く(p=0.021)、炎症に関連する遺伝子多型の集積は、心血管疾患と関連することが示唆された。データの取得はほぼ順調に進んでおり、中間解析でも想定内の結果が得られたため。医歯薬学本研究プロジェクトでは、サブクリニカルな動脈硬化を反映する血管機能検査と遺伝子多型情報を活用した糖尿病大血管症ハイリスク群早期診断システムの開発を主目的としている。

本年度までに、サブクリニカルな動脈硬化を反映し、かつ、安全・簡便・低コストで実施可能である頸動脈エコー検査とbaPWV検査を併用することの有用性を明らかにすることができた。H27年度以降は、遺伝子多型情報と糖尿病大血管症との関連についてデータ収集・解析を行うことが中心となる。(現在、糖尿病患者のコホートを対象に、100種を超える遺伝子多型と糖尿病大血管症との関連を追跡中であり、ベースラインデータを用いた横断的解析は終了しつつある。さらに、縦断的解析を進める予定である。)データの取得はほぼ順調に進んでおり、中間解析でも想定範囲内の結果が得られたため。本年度は、既に収集済みのデータを用いた中間解析の結果、エコーで非侵襲的に評価した頸動脈の動脈硬化度の指標が心血管疾患発症ハイリスク群の予測指標となることを示唆するデータを得た。今後は、全より多数例を対象とした解析を行うことによって、仮説の検証に努めたい。また、現在、100種を超える遺伝子多型と糖尿病大血管症との関連を解析中であり、来年度中に横断的解析の結果をまとめる予定である。さらに、引き続き前向き観察を続け、データを収集していく予定である。
赤外コヒーレント制御による固体中の多段階振動励起とプロトン移動反応の操作

昨年までの研究で、KTaO3結晶中のOH/OD振動の極めて細い赤外吸収スペクトルの起源は、結晶の格子振動(フォノン)が与える周波数揺動が原因であることが明らかになった。また、スペクトルの線幅が極めて細かったのは、OH/OD振動のエネルギー緩和時間(T1)が長かったことに加えて、KTaO3結晶の構造が対称性の高い立方晶であり不均一性が小さかったことも要因である。一方、強誘電性の酸化物結晶では、結晶構造が立方晶から歪むことで対称性が崩れるため、プロトンの位置するサイトが複数存在するようになり、スペクトルの不均一幅が大きくなる。このような対象では、振動モードの緩和寿命(寿命幅)とその統計的な分布(static disorder)、さらにスペクトル拡散が全体の線幅に寄与しており、従来の赤外ポンプ・プローブ分光でその詳細を議論することは難しい。このような問題を明らかにする方法に2次元赤外分光(2DIR)がある。2DIRは励起光と測定光それぞれの周波数の2次元周波数マップを得る方法であり、スペクトルの均一幅と不均一幅を明瞭に見分けることができると同時に、スペクトル拡散の生じる時間スケールを明らかにすることもできる。研究代表者はStanford大学に滞在してこの実験方法を学ぶとともに、強誘電性結晶中のOD振動モードに対して2DIRを実行した。実験の結果、得られた2DIRスペクトルは非常に強い不均一性を示した。これは従来行われてきた液体の2DIRスペクトルとは極めて対照的であり、固体の構造ゆらぎが液体よりも遥かに小さいことを示している。しかし、結晶の温度を室温から高温にすると、スペクトル拡散の影響が顕著になる様子も観察された。固体中のプロトン伝導は、液体中とは違い通常高温で生じるが、本研究から得られた知見は、そのような固体と液体でのプロトン伝導メカニズムの違いを説明することに貢献するものと考えている。現在論文出版へ向けて詳細を検討中である。平成30年度が最終年度であるため、記入しない。プロトン(水素イオン:H+)移動反応は酸・塩基反応、燃料電池の電解質反応、生体系のエネルギー変換など、物理・化学・生命現象において重要な役割を果たす。そのため、プロトン移動反応を制御できれば、反応の高効率化など、広範な応用の可能性が期待される。またプロトン移動の反応過程を実時間で観測すれば、ポテンシャル面や緩和経路など、プロトン移動機構の詳細な情報を得ることができる。本研究では、固体酸化物中にドープされた重水素のOD伸縮モードの赤外ポンプ・プローブ分光を行った。対象とした固体酸化物はタンタル酸カリウム(KTaO3)である。この物質はペロブスカイト構造をもち、ドープされた水素(重水素)は、最も近い酸素原子と共有結合、次に近い酸素原子と水素結合をする。プロトン移動は1次元の二重井戸型ポテンシャルで記述される。そのため、二重井戸の振動準位に共鳴する赤外パルスを照射すれば、振動励起を引き起こし、プロトン移動を促進することができると考えられる。測定の結果、0-1振動のブリーチング信号と、1-2遷移の励起状態吸収信号が観測された。1-2遷移の吸収が、固体酸化物中の振動モードで観測されたのは今回が初めてある。またブリーチング・励起状態吸収信号ともに200ピコ秒程度の緩和時間を示し、これは凝縮相中の振動モードの励起寿命としては極めて長かった。このことから、OD振動モードは、KTaO3の格子振動から極めて孤立した状態にあることが示唆された。加えて、1-2遷移周波数は、0-1周波数に対して92cm-1レッドシフトしていたので、OD伸縮振動の非調和性は3.6%と同定された。これからO-H...Oと記述されるプロトン移動のポテンシャル面のプロファイルを、水素結合モデルに基づいて推定した。これらの情報は、プロトン移動の制御を考慮する際の足がかりとなる重要な知見である。今年度は、固体中にドープされた重水素に対してポンプ・プローブ分光を行い、プロトン移動のポテンシャル形状、ならびに緩和寿命の知見を得ることに成功した。これらは本研究の目標である赤外コヒーレント制御を行う上で必須となる重要な情報である。また試料の選定、水素ドープなどの準備も一貫して自ら行い、選定した材料が今回の研究に理想的な系であることを確かめた。本研究は、試料準備から光学系のセットアップ、そして分光実験へといたる作業量の多い実験であるが、研究員は精力的に課題に取り組み、着実に成果を上げることができた。途中、測定器の故障で3ヶ月間、分光実験が止まってしまう事態にも見舞われたが、その間に他の材料の検討を行い、材料の選択肢を広げることもできた。これらを総じて評価すれば、着実な研究の進展があったものと認められる。

一方、強誘電性の酸化物結晶では、結晶構造が立方晶から歪むことで対称性が崩れるため、プロトンの位置するサイトが複数存在するようになり、スペクトルの不均一幅が大きくなる。このような対象では、振動モードの緩和寿命(寿命幅)とその統計的な分布(static disorder)、さらにスペクトル拡散が全体の線幅に寄与しており、従来の赤外ポンプ・プローブ分光でその詳細を議論することは難しい。このような問題を明らかにする方法に2次元赤外分光(2DIR)がある。2DIRは励起光と測定光それぞれの周波数の2次元周波数マップを得る方法であり、スペクトルの均一幅と不均一幅を明瞭に見分けることができると同時に、スペクトル拡散の生じる時間スケールを明らかにすることもできる。研究代表者はStanford大学に滞在してこの実験方法を学ぶとともに、強誘電性結晶中のOD振動モードに対して2DIRを実行した。実験の結果、得られた2DIRスペクトルは非常に強い不均一性を示した。これは従来行われてきた液体の2DIRスペクトルとは極めて対照的であり、固体の構造ゆらぎが液体よりも遥かに小さいことを示している。しかし、結晶の温度を室温から高温にすると、スペクトル拡散の影響が顕著になる様子も観察された。固体中のプロトン伝導は、液体中とは違い通常高温で生じるが、本研究から得られた知見は、そのような固体と液体でのプロトン伝導メカニズムの違いを説明することに貢献するものと考えている。現在論文出版へ向けて詳細を検討中である。本年度は、昨年の研究を発展させて、固体酸化物中のプロトン伝導に影響を与える格子振動(フォノン)について調べた。15Kの極低温から300Kまで試料温度を変えながら、KTaO3結晶中のOH/OD振動モードの赤外吸収スペクトルを調べることで、プロトン移動に影響を与えるフォノンモードを調べた。前年度の赤外ポンプ・プローブ分光の結果から、OD振動モードのエネルギー緩和時間(T1)は200ps程度であることがわかっている。一方、赤外吸収スペクトルの線幅は4cm-1程度なので、位相緩和時間(T2)は3.5psである。よって、スペクトルの線幅の起源は、純粋位相緩和時間(T2*)が支配的であることがわかる。このような場合、OH/OD振動モードとフォノンの結合は十分弱いとみなせるので、weak phonon couplingモデルを用いて、赤外吸収スペクトルのピーク周波数と、その線幅の温度依存性を解析した。その結果、OH/OD振動に周波数変調を与えているフォノンモードの周波数は150cm-1であることがわかった。さらに中性子散乱の先行研究の結果と比較すると、このフォノンモードはO-Ta-Oの変角振動であると同定された。このフォノンモードは、O...O間距離を実効的に変化させることで、プロトン移動の活性化障壁を下げ、プロトン移動をアシストしていると考えられる。以上の結果は、昨年度の研究内容と合わせて、現在論文投稿中である。昨年度の赤外ポンプ・プローブ分光の実験系を改善することで、信号のS/N比を向上させるとともに、OH/OD振動の赤外吸収スペクトルの温度依存性を調べることで、固体酸化物中のプロトン移動メカニズムの詳細を分光学的に初めて明らかにした。これまであまり取り組まれて来なかった研究対象に対して、試料準備から、光学系のセットアップ、測定とその観測データの解析を研究員自らが一貫して行ったことを考慮すれば、着実な研究の進展があったものと考えられる。
再分化植物およびその後代系統におけるオルガネラDNAのRFLPに関する研究

イネの組織培養による変異について制限酵素断片長多型(RFLP)を分析することにより検出した。イネ6品種のカルスおよび再分化植物とその後代系統を用い、葉緑体DNAの2種のプロープ、ミトコンドリアDNAの8種のプロープによって、変異の検出を行った結果、以下のことが明らかになった。1.イネカルスでは継代培養4ヶ月のもので葉緑体DNAおよびミトコンドリアDNAともに変異が認められ、長時間培養するにしたがって変異カルスの割合が増加した。長時間培養したカルス(33回継代後)における変異した固体数の割合は、用いるプロープによってまた品種によって大きく異なり、葉緑体DNAのpst2の断片をプロープにした場合は1222%、ミトコンドリアDNAのatp6をプロープにした場合は2637%であった。ミトコンドリアDNAではrrn26でも変異は認められたが、その他のプロープでは検出できなかった。2.カルスからの再分化植物およびその後代植物のオルガネラDNAのRFLPを分析するとカルスで見られたのと同様の変異が認められた。このことからカルスでの変異が、そのまま再分化当代植物や後代植物に受け継がれることが明かとなった。但し、カルスの場合と違い、変異固体の出現率は低くいずれも10%以下であった。3.変異の型でみると、葉緑体DNAおよびミトコンドリアDNAとに、正常の分子種の他に正常とは異なった分子種(DNA断片)が認められる型が最も多かった。個体によっては葉緑体DNAのpasAおよびpasB領域やミトコンドリアDNAのrrn26領域をプロープに用いたときに見られるように、あるDNA領域の明らかな欠失や挿入の伴う変異も観察された。今後これらの変異と転写・翻訳への影響、タンパク質の変異、さらに実用形質との関係を明らかにしていく必要がある。本研究はイネの組織培養中に生じる変異を培養カルスおよびそれからの再分化植物を用いて調べ、分子育種に役立てようとするものである。まずイネ種子由来カルス(品種:Tadukan)を継代培養し、継代培養期間の異なるカルスより全DNAを抽出しアガロ-スゲル電気泳動後にDNAをナイロンメンブレンにトランスファ-しジコキシゲニンにより非放射性ラベルを行なったイネ日本晴ミトコンドリアDNA断片とサザンハイブリダイゼ-ションを行なってRFLPパタ-ンを調べた。その結果、18ヶ月継代培養した一部のカルスにおいてミトコンドリアDNAのcoxI遺伝子近傍に挿入変異のあるものが認められた。次に継代培養期間の異なるカルスから再分化を行なった結果、18ヶ月間培養したカルスからの再分化率は低く(4%)調査することが出来なかったが、培養期間が60日のカルスの再分化率は比較的高く18個体(18%)を得た。この18個体につき8葉期に葉身より全DNAを抽出し、同様の方法で変異を解析した。その結果、coxI領域近傍にカルスにおける変異とは異なった変異分子種の存在が認められ、さらにこの個体はcob遺伝子領域でも異なったパタ-ンを示した。ただしこのミトコンドリアDNAにおいて変異を示す個体の外部形態および種子稔性に特別の異常は見いだせなかった。以上のことはミトコンドリアDNAの変異分子種の存在が、直接外部形態の異常に結びつかないということを示しているが、生理・生化学的な変異のある可能性もありさらに研究を要する。現在、ミトコンドリアDNAばかりでなく葉緑体DNAも含め、カルスおよび再分化植物におけるさらなる変異を検索中である。

また本年度の研究実施計画では変異個所を含む領域の塩基配列も調べる予定であったが、次代において変異が固定していることを確認してから行った方が良いとの判断からシ-クエンスは来年度以降に行なう考えである。イネの組織培養による変異について制限酵素断片長多型(RFLP)を分析することにより検出した。イネ6品種のカルスおよび再分化植物とその後代系統を用い、葉緑体DNAの2種のプローブ、ミトコンドリアDNAの8種のプローブよって、変異の検出を行なった結果、以下のことが明かとなった。(1)イネカルスでは継代培養4ヶ月のもので葉緑体DNAおよびミトコンドリアDNA共に変異が認められ長期間培養するにしたがって変異したカルスの割合が増加した。長期間培養したカルス(33回継代後)における変異した個体数の割合は、用いるプローブによってまた品種によって大きく異なり、葉緑体DNAのPst2の断片をプローブにした場合は1222%、ミトコンドリアDNAのatp6をプローブにした場合2637であった。ミトコンドリアDNAではrrn26でも変異が認められたが、その他のプローブでは検出できなかった。(2)カルスからの再分化植物およびその後代植物のオルガネラDNAのRFLPを分析するとカルスで見られたのと同様の変異が認められた。このことからカルスでの変異が、そのまま再分化当代植物や後代植物にに受け継がれることが明かとなった。但し、カルスの場合と違い、変異個体の出現率は低くいずれも10%以下であった。(3)変異の型をみると、葉緑体DNAおよびミトコンドリアDNAともに正常の分子種の他に正常と異なった分子種(DNA断片)が認められる型が最も多かったが、個体によっては葉緑体DNAのpsaAおよびpsaB領域やミトコンドリアDNAのrrn26領域をプローブに用いたときに見られるように、あるDNA領域の明かな欠失や挿入の伴う変異も観察された。今後、これらの変異と転写・翻訳への影響、タンパク質の変異、さらに実用形質との関係を明らかにしていく必要がある。
骨格筋グルココルチコイドレセプターへのシグナル集積の意義と機構に関する研究

グルココルチコイド-グルココルチコイドレセプター(GR)軸をカギとする遺伝子転写制御を介した骨格筋タンパク質代謝調節(Shimizu NらCell Metabolism 2011)が、骨格筋(Muscle)-肝臓(Liver)-脂肪組織(Adipose)連携(MLA軸)によって、個体レベルのエネルギーフロー制御の重要な一翼を担っていることを明らかにした(Shimizu NらNature Communications 2015)。体内のエネルギーフローは、生活習慣病予防をはじめとした適切な体組成維持に重要であることは明白である。またその制御は摂取栄養の種類・タイミング・量、運動の強度・種類のほか、性ホルモン(エストロゲン・アンドロゲン)の影響を受ける。本研究では、これらシグナルの骨格筋GRとのクロストークに着目し、骨格筋に入力されうる様々なシグナルのエネルギーフロー制御機構における生理的意義を究明することを目的とした。筋力負荷により筋肥大が惹起されたマウス骨格筋および合成グルココルチコイドを投与した骨格筋特異的PGC1alpha4トランスジェニックマウス骨格筋においてmRNA発現解析を行い、これらに共通した発現変動を示す遺伝子候補群および特徴的な発現変動を示す遺伝子候補群を同定した。また、骨格筋特異的アンドロゲンレセプターノックアウトマウス、骨格筋特異的エストロゲンレセプターαノックアウトマウスの骨格筋においてmRNA発現解析を行い、これらに共通した発現変動を示す遺伝子候補群および特徴的な発現変動を示す遺伝子候補群を同定した。今後これら遺伝子群の機能を解析することで、副腎皮質ホルモンシグナル、性ホルモンシグナル、筋力負荷シグナルといった様々なシグナルの集積が、骨格筋代謝制御および個体レベルのエネルギーフロー制御において果たす生理的な役割が明らかになると考えられる。
アレルギー性鼻炎発症機序の解明

申請者はマウスに腹腔内感作を行わず、ブタクサ花粉を経鼻的に連続投与することで、従来のものとは全く異なる新規アレルギー性鼻炎モデルマウスを作製した。このモデルマウスでは、くしゃみ回数の上昇を認める点鼻開始7日目の時点において、血清IgEの上昇を認めず、鼻局所でのIgEのみ上昇していた。これはLocal Allergic Rhinitis (LAR)と非常によく似た兆候を示している。最も初期に現れる兆候は鼻局所へのTh2細胞の集積であり、活性化Th2細胞が病態形成の中心的な役割を果たしていた。Th2細胞を基点としたアプローチがLARの診断と治療において非常に重要であると考えられた。これまで申請者はマウスに腹腔内感作を行わずにブタクサ花粉を経鼻的に連続投与を行うことで、これまでとは全く異なる新規のアレルギー性鼻炎モデルマウスを作製した。この新規アレルギー性鼻炎モデルマウスにおいて、マウスのくしゃみ回数は7日目に上昇した。この鼻炎症状が比較的早期に出現するという点に着目し、解析を行うと、点鼻開始後7日目までにくしゃみ回数の増加、鼻や頸部リンパ節へのTh2細胞の集積、鼻粘膜への好酸球浸潤を認めることが明らかとなった。この時点において、血清IgEの上昇は認めず、局所IgEの産生を認めた。ヒトにおいて鼻炎症状を認めるが、血清特異的IgEの上昇を認めず、鼻汁中でのみIgEの上昇を認める状態はlocal allergic rhinitis (LAR)として分類されている。新規アレルギー性鼻炎モデルマウスにおいて、点鼻開始後7日目の状態はヒトLARと似た兆候を示していると考えられた。また、この反応における最初の徴候として点鼻開始後3日目には活性化Th2細胞の出現を認めた。3週間連続的に経鼻感作を行うと、血清特異的IgE陽性のアレルギー性鼻炎を発症した。従って、元々アトピー体質を持たない個人においても、抗原の曝露により、LARや全身性アレルギー性鼻炎を発症し得ると考えられた。更にIgEを介したシグナリングが抑制されているFcεR1KOマウスでは、野生型マウスに比べて明らかなくしゃみ回数の低下を認めた。申請者が作成した新規アレルギー性鼻炎モデルマウスにおいて、鼻炎症状にはIgEが必須の役割を担っていることが明らかとなった。一方でIgEシグナリング非存在下においても、Th2細胞の活性化、好酸球浸潤は十分認められた。B細胞やIgEよりもむしろ、活性化Th2細胞が好酸球浸潤において重要な役割を果たしていると考えられた。申請者は自らが作製した新規アレルギー性鼻炎モデルマウスに関して、マウスのくしゃみ回数の増加が早期であり、5日目以降に上昇する過程に着目していた。この時点において血清IgEが上昇しているかに関しては全く解明されていなかったが、今回の研究において、点鼻開始後7日目においても血清IgEは上昇していないことが明らかとなった。しかし、血清IgEが陰性であっても局所IgEが上昇している可能性も考えられた。マウスにおける鼻局所でのIgE産生の解析に関してはこれまでほとんど報告がない。申請者は次の方法で局所IgEの同定を行うことに成功した。鼻組織や頸部リンパ節からB細胞をMACSやFACSを用いて精製し、PCR、リアルタイムPCRを用いて、εやγ1のgerm line transcriptやpost switch transcriptの発現、またActivation-induced cytidine deaminase(AID)やB-cell lymphoma 6 (Bcl6)、B-lymphocyte-induced maturation protein 1 (Blimp1)などの発現を調べ、局所でのIgE産生、クラススイッチの有無を解析した。この解析方法により、点鼻開始後7日目の時点において、血清IgEの上昇は認めず、局所IgEの産生を認めることが明らかとなった。以上より、新規アレルギー性鼻炎モデルマウスにおける病態解明が進んでおり、本研究課題の進捗状況として、おおむね順調に進展している。マウスに腹腔内感作を行わずブタクサ花粉を経鼻的に連続投与することで、これまでと異なる新規アレルギー性鼻炎モデルマウスを作製した。このモデルマウスでは、くしゃみ回数の上昇を認める点鼻開始7日目において、血清IgEの上昇を認めず、鼻局所IgEのみ上昇していた。IgEを介したシグナリングが抑制されているFcεR1KOマウスではくしゃみ回数が有意に抑制され、この反応は抗原特異的であると考えられた。2型炎症性疾患に関わりが深い細胞として、2型自然リンパ球(type2 innate lymphoid cells, ILC2s)が注目されている。獲得免疫がない状態でもILC2sの働きによりアレルギー性炎症を引き起こしうることが気管支喘息やアトピー性皮膚炎などで示されている。申請者はILC2sが鼻に存在することをフローサイトメトリーで発見した。そこでアレルギー性鼻炎における自然免疫系の関与を調べるため、T細胞B細胞を欠くRAG2KOマウスを用いてWTマウスとの比較を行った。新規アレルギー性鼻炎モデルマウスにおいて、RAG2KOマウスではくしゃみ回数の上昇を認めなかった。一方で点鼻開始早期の段階において好酸球の浸潤を認めた。RAG2KOマウスは、T細胞B細胞は存在しないがILC2sが存在する。

従って、鼻炎に対するILC2sの役割として、早期の段階における好酸球性炎症に関与している可能性が示唆された。一方で、鼻炎症状に関しては、獲得免疫、特にTh2細胞の働きが重要であると考えられた。最も初期に現れる兆候は鼻局所へのTh2細胞の集積であり、活性化Th2細胞が病態形成の中心的な役割を果たしていた。Th2細胞を基点としたアプローチがLARの診断と治療において非常に重要であると考えられた。申請者はマウスに腹腔内感作を行わず、ブタクサ花粉を経鼻的に連続投与することで、従来のものとは全く異なる新規アレルギー性鼻炎モデルマウスを作製した。このモデルマウスでは、くしゃみ回数の上昇を認める点鼻開始7日目の時点において、血清IgEの上昇を認めず、鼻局所でのIgEのみ上昇していた。これはLocal Allergic Rhinitis (LAR)と非常によく似た兆候を示している。アレルギー性鼻炎における自然免疫系の関与を調べるために、T細胞B細胞を欠くRAG2KOマウスを用いてWTマウスとの比較を行う。近年、2型炎症性疾患に関わりが深い細胞として2型自然リンパ球(type2 innate lymphoid cells, ILC2s)が注目されている。ヒトやマウスにおいて獲得免疫がない状態でもILC2sの働きにより、アレルギー性炎症を引き起こすことが気管支喘息やアトピー性皮膚炎などで示されている。アレルギー性鼻炎におけるILC2sの関与に関しては全く不明である。まずはILC2sが鼻に存在するのかをフローサイトメトリーで検討する。RAG2KOマウスにはILC2sが存在するので、RAG2KOマウスに、抗原を暴露させることで、ILC2sの鼻への集積を認めるかを評価する。さらに、ILC2sを抗CD25抗体、抗CD90抗体を用いて不活化させ、ILC2sとアレルギー性鼻炎との関与を調べる。2型炎症性疾患に関わりが深いとされる上皮由来のサイトカインであるIL-33、TSLPとの関与をIL-33KOマウス、TSLPKOマウスを用いて評価を行う。アレルギー性鼻炎発症への早期介入に有効な物質、遺伝子を、新規アレルギー性鼻炎モデルマウスを用いて検討し、臨床への応用、新規治療薬開発への可能性を追求する。具体案として乳酸菌によりアレルギー性鼻炎症状が緩和される可能性が注目されている。乳酸菌投与による介入がどのように影響を与えるか検討する。また、申請者の研究室では、ヒト鼻粘膜上皮擦過細胞の網羅的遺伝子発現解析においてスギ花粉症患者が健常人に比べてCystatinSN(CST1)とIntelectin1(ITLN1)が有意に高発現であることを見出している。これらの新規モデルマウスにおける関与を遺伝子改変マウスを用いて追及する。アレルギー性鼻炎本年度の研究計画を遂行するために必要な各種機器、物品、試薬を準備した。また、成果を発表するための国内旅費が必要であった。本研究はマウスを対象とした実験が主体であり、マウスの購入や飼育のために研究費を使用した。
外有毛細胞のmotilityにより発生する力の計測

ヒトの聴覚は鋭敏な判別機能を有する.この機能は,聴覚の感覚細胞である外有毛細胞(Outer Hair Cell:OHC)のmotility,すなわち可動性に基づく,内耳蝸牛の増幅機構により達成されていると考えられている.これまで,増幅機構解明にあたり,単離した外有毛細胞の可動性計測に関する研究は多く行われてきた.しかし,実際には細胞は生体内で拘束された状態にあると考えられており,拘束された細胞の伸縮運動,さらにはそれに伴い発生する力は不明である.そこで本研究では,拘束された単離外有毛細胞が発生する変位および力を計測するシステムを以下のように構築した.1.微小電極製作装置を用いガラス管を引き伸ばすことにより,外有毛細胞が発生する力計測用プローブを作製した.さらに,既知のスティフネスを有するプローブと作製したプローブの先端を互いに合わせて力を負荷し,その際のたわみ量を比較することにより,作製した力計測用プローブのスティフネスを求めた.2.力計測用プローブをナノメートル・オーダで駆動するために,圧電アクチュエータを用いてプローブ駆動用マニピュレータを作製した.作製したマニピュレータを用いることにより,プローブ先端を,最小数100ナノメートルで位置決めすることができ,さらに100pN程度の力を細胞に負荷することが可能である.現在は構築した計測装置を用い,外有毛細胞に拘束力を負荷した際,細胞の伸縮運動および発生する力の計測を試みている.ヒトの聴覚は鋭敏な判別機能を有する.この機能は,聴覚の感覚細胞である外有毛細胞(Outer Hair Cell:OHC)のmotility,すなわち可動性に基づく,内耳蝸牛の増幅機構により達成されていると考えられている.これまで,増幅機構解明にあたり,単離した外有毛細胞の可動性計測に関する研究は多く行われてきた.しかし,実際には細胞は生体内で拘束された状態にあると考えられており,拘束された細胞の伸縮運動,さらにはそれに伴い発生する力は不明である.そこで本研究では,拘束された単離外有毛細胞が発生する変位および力を計測するシステムを以下のように構築した.1.微小電極製作装置を用いガラス管を引き伸ばすことにより,外有毛細胞が発生する力計測用プローブを作製した.さらに,既知のスティフネスを有するプローブと作製したプローブの先端を互いに合わせて力を負荷し,その際のたわみ量を比較することにより,作製した力計測用プローブのスティフネスを求めた.2.力計測用プローブをナノメートル・オーダで駆動するために,圧電アクチュエータを用いてプローブ駆動用マニピュレータを作製した.作製したマニピュレータを用いることにより,プローブ先端を,最小数100ナノメートルで位置決めすることができ,さらに100pN程度の力を細胞に負荷することが可能である.現在は構築した計測装置を用い,外有毛細胞に拘束力を負荷した際,細胞の伸縮運動および発生する力の計測を試みている.
血管運動ニューロンのエンドセリン感受性

我々のこれまでの研究から、エンドセリン(ET)が中枢性循環・呼吸調節を修飾すること、その作用部位として血管運動中枢とされる吻側延髄腹外側部(rostral ventrolateral medulla;RVLM)に隣接している延髄腹側表面が下部脳幹では最も重要であることが既に明らかになっている。本研究の目的はこれをさらに進めてニューロン単位でETの作用を検証することであった。実験は麻酔、非動化、人工呼吸したラットを用いた。血管運動ニューロン(vasomotor neuron;VMN)の同定は、自発活動の存在、動脈圧受容器からの入力、脊髄中間外側核の刺激による逆行性興奮などの生理学的指標の確認と、記録ニューロンがRVLMに存在することの組織学的確認によって行った。VMNの大多数(19/21;90%)は、ET-1の電気泳動投与によって興奮した。ET-1投与の通電量を増やすと、42%(8/19)のVMNで更に大きな興奮とそれに引き続く抑制反応が観察された。これらの反応はET-1を大槽内投与または延髄腹側表面に局所投与した時の血圧、心拍数、VMN活動の変化と良く一致していた。一部のVMN(2/21)はET-1の投与に反応しなかった。また、RVLMに存在する呼吸関連ニューロンの大多数(20/27;75%)は、ET-1の投与によって、低用量では興奮反応、高用量では興奮とそれに引き続く抑制反応という、VMNの場合と同様の反応を示した。循環・呼吸には無関係の痛覚関連ニューロンの大多数(9/10;90%)は、ET-1に反応しなかった。ETに対する反応性の有無は、RVLMにおけるニューロンの存在部位よりもニューロンの種類との相関の方が強かった。以上から、RVLMに存在するVMNおよび呼吸関連ニューロンの多くはET-1に直接反応することが知れた。これらの結果から、脳脊髄液中および細胞外液中のETは、RVLMのVMNおよび呼吸関連ニューロンの活動変化を介して循環・呼吸調節に関与する可能性があると考えられた。