hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
Theranosticsの精度と内照射療法時の安全性を向上する放射性薬剤の開発

これまでにRI標識オクトレオチド誘導体を用いたPRRTの有効性が報告されているものの、RI標識オクトレトチド誘導体は投与後早期から、正常な腎臓に対して高い放射能集積を示すことが問題となっている。すなわち高い腎集積を原因とした不必要な腎被ばくが腎障害を惹起するため、がん選択的な集積かつ低い腎集積を示す新たな薬剤の開発が求められている。これまでに申請者らは、既存のRI標識オクトレオチド誘導体に化学修飾を施すことで、腎集積を半減するとともに腫瘍集積を410倍に増大する新たな放射性ペプチドを見出してきた。平成30年度は、これまでの研究で得られてきた「腎集積を低減し、腎集積を増大する化学修飾法」を応用し、精度の高いTheranosticsを実現可能な新たな化合物群をデザインし、合成に着手した。その結果、5種の新規RI標識オクトレオチド誘導体の合成を達成した。得られたRI標識ペプチドの放射化学的純度は、どの化合物でも95%以上を示し、それ以上の精製を必要とすることなく細胞実験や動物実験へ供給が可能であった。新たにデザインした化合物の合成が計画通りに進行している。平成30年度に合成した5種類のインジウム標識オクトレオチド誘導体について、標的受容体を発現する培養がん細胞を用いてin vitroでの腫瘍集積性を評価する。In vitro評価を通して、優れた腫瘍集積性を有する化合物を選定し、続いて正常マウスやがん移植モデルマウスを用いて体内分布を評価する。これら生物学的アッセイを通して、高い診断精度と治療効果を兼ねそなえる新たなRI標識オクトレオチド誘導体の開発を目指す。平成30年度内に購入予定だった物品のメーカー在庫がなく、年度内に購入できなかったため。
レプチン・メラノコルチン系摂食調節回路と迷走神経の連関を形態学的に解析する

メラノコルチン4受容体(MC4R)がキイロールを果たすとされる中枢レプチン・メラノコルチン情報伝達系は、摂食行動やエネルギー消費のみならず、血糖値やインスリンの恒常性にも重要な役割を担っている。MC4Rプロモーターの支配下に緑色蛍光蛋白を発現する遺伝子導入マウスを用いて、研究代表者らは迷走神経背側運動核(DMV)が多数のMC4R発現ニューロンを含むこと、またこれらのニューロンの中に胃や十二指腸の壁内神経節あるいは膵内神経節のニューロンにシナプス形成するものを見いだした。これらのことから、MC4R発現DMVニューロンからの投射線維は胃腸や膵臓の機能調節に密接に関与することが示唆された。今年度は、引き続きメラノコルチン4受容体(MC4-R)プロモーターの支配下に緑色蛍光蛋白(GFP)を発現する遺伝子導入マウス(MC4-R/GFPマウス)を用いて、膵島内に分布するGFP陽性軸索終末の由来とそのシナプス後要素について逆行性標識法と免疫組織化学的手法の併用により解析した。昨年度の解析により、膵臓内に分布するGFP陽性線維は迷走神経由来であることが判明したため、膵島内のGFP陽性線維は迷走神経節状神経節由来であることが予想された。よって、逆行性標識物質としてコレラトキシンBサブユニット(CTb)を膵臓内に注入し、迷走神経節状神経節内でのGFP陽性かつCTbで標識されるニューロンを検索した結果、CTb標識ニューロンのうち約25%がGFP陽性であることが明らかになった。これらのCTb/GFP陽性ニューロンは一般に小型で、節状神経節内ではより尾側方に位置していた。一方、膵島内でのGFP陽性線維は明瞭な念珠状の軸索終末様構造を形成しながら膵島辺縁部のみならず膵島中心部にも分布していた。しかしながら、GFP陽性線維による支配を受ける膵島の分布は膵臓全体で均質ではなく、十二指腸寄りの腺体に限局していることが明らかになった。膵島内でのGFP陽性線維のターゲットを調べるために膵島細胞のマーカー(A細胞:グルカゴン、B細胞:インシュリン、D細胞:ソマトスタチン)を用いた二重蛍光標識法を行うと、GFP陽性線維は膵島辺縁部ではA細胞やD細胞に、膵島中心部ではB細胞に接着していることが明らかになった。さらにPre-embedding法を用いて膵島内でのGFP陽性軸索終末部を電顕下で観察すると、これらの軸索終末部は腺細胞に直接接していることが明らかになった。今年度は、引き続きメラノコルチン4受容体(MC4-R)プロモーターの支配下に緑色蛍光蛋白(GFP)を発現する遺伝子導入マウス(MC4-R/GFPマウス)を用いて、迷走神経節状神経節に含まれるMC4-R発現ニューロン(GFP陽性ニューロン)からの軸索終末が、胃・十二指腸の粘膜内でどのように分布し、何をターゲットにしているのかを共焦点レーザー顕微鏡を用いて検索した。その結果、特に胃の幽門部から十二指腸近位部の粘膜において、GFP陽性線維が明瞭な念珠状の軸索終末様構造を形成しながら多数分布していることが明らかになった。またそれらの終末部の中には、粘膜上皮の基底部に近接して存在するものが見られた。これらの結果から、胃・十二指腸からの求心性線維には、MC4-Rを発現する迷走神経節状神経節ニューロン由来のものが含まれ、MC4-Rを発現する迷走神経背側運動核ニューロン由来の節前線維(H23年度の研究成果)の存在と併せて、消化管運動制御におけるメラノコルチン制御系の密接な関わりが示唆された。さらに今年度は、MC4-R/GFPマウスを使用した予備実験により、迷走神経節状神経節以外の脳神経付属神経節にもGFP発現ニューロンが存在すること、弧束核には豊富なGFP陽性線維終末が存在すること、舌の味蕾には豊富なGFP陽性線維終末が存在することが明らかになったことから、本研究のテーマを発展させて味覚の情報伝達に関わる神経路とメラノコルチン摂食調節系との関連についても調べることにした。その結果、MC4-R/GFPマウス舌内の有郭乳頭と茸状乳頭内の味蕾内線維は、それぞれ錐体神経節および膝神経節内のGFP陽性ニューロン由来であることが、逆行性標識法により明らかになった。これらのことから、MC4-R発現ニューロン由来の味蕾内線維は、味細胞における味覚の感受調節に関わる可能性が推察された。今年度は、まずメラノコルチン4受容体(MC4-R)プロモーターの支配下に緑色蛍光蛋白(GFP)を発現する遺伝子導入マウス(MC4-R/GFPマウス)を用いて、腹部内臓への副交感神経節前線維の起始核である延髄の迷走

神経背側運動核(DMV)がMC4-Rを発現する上部消化管あるいは膵臓投射ニューロンを含むかどうかを、逆行性標識法と免疫組織化学的手法を組み合わせて共焦点レーザー顕微鏡を用いて検討した。その結果、DMVに含まれる胃・十二指腸・膵臓投射ニューロンのそれぞれ約半数近くがMC4-Rを発現することが明らかになった。各臓器内においては、胃・十二指腸の筋叢間神経叢の神経節、あるいは膵内神経節の節後ニューロン周囲に、多数のGFP陽性軸索終末(すなわち、MC4Rを発現するニューロンの軸索終末)が接着しているのが認められた。これらのGFP陽性軸索終末は、横隔膜直下で両側の迷走神経を切断して10日経過した動物ではほとんど消失していたことから、迷走神経由来であることが確認された。さらに、Pre-embedding法を用いて電子顕微鏡下で観察すると、迷走神経由来のGFP陽性軸索終末は壁内神経節あるいは膵内神経節ニューロンとシナプスを構築していることが明らかになった。一方で、胃・十二指腸・膵臓内に分布するGFP陽性軸索終末は、臓器内の神経節のみならず胃・十二指腸の粘膜上皮下あるいは膵臓のランゲルハンス島内にも観察されたことから、迷走神経節状神経節由来の求心性線維の可能性が推察された。よって、逆行性標識法と免疫組織化学的手法を組み合わせて共焦点レーザー顕微鏡を用いて検討した結果、迷走神経節状神経節の胃・十二指腸・膵臓投射ニューロンのそれぞれ一部がGFP陽性を示すことが明らかになった。当初予定していた迷走神経節状神経節内のMC4-R発現膵臓投射ニューロン(GFP陽性ニューロン)の確認と膵島内でのGFP陽性神経線維終末のターゲット確認作業に加えて、新たに膵臓内でのGFP陽性神経支配を受ける膵島の分布に関する解析も追加して実施したが、概ね予定通りに進行している。当初予定していた迷走神経背側運動核のMC4-R発現ニューロン由来の遠心性線維と臓器内ニューロンとの連絡路確認だけでなく、迷走神経節状神経節のMC4-R発現ニューロン由来の臓器内求心性線維の存在の発見とその確認作業も加わったが概ね予定通りに進行している。今後も引き続きMC4-R/GFPマウスを用いて、神経路標識法および免疫電子顕微鏡法により以下の通り研究を進めて行く。25年度はまず、迷走神経節状神経節に含まれるMC4-R発現ニューロン(GFP陽性ニューロン)からの軸索終末が、胃・十二指腸の粘膜内でそれぞれ何をターゲットにしているのかを共焦点レーザー顕微鏡を用いて検索する。次にpre-embedding法を用いて、これらのGFP陽性軸索終末部とターゲット間とのシナプス構築を電子顕微鏡下で明らかにする。24年度はまず、迷走神経節状神経節に含まれるMC4-R発現ニューロン(GFP陽性ニューロン)からの軸索終末が、胃・十二指腸の粘膜内、膵臓のランゲルハンス島内でそれぞれ何をターゲットにしているのかを共焦点レーザー顕微鏡を用いて検索する。次にPre-embedding法を用いて、これらのGFP陽性軸索終末部とターゲット間とのシナプス構築を電子顕微鏡下で明らかにする。25年度分研究費800,000円について、物品費(すべて薬品などの消耗品に使用)として600,000円、旅費(学会参加費用)として約150,000円、その他(論文投稿費用・別刷り代など)として約50,000円を振り分けて使用予定である。
肺癌におけるゲノムワイドなメチル化プロファイルの作成と異常メチル化遺伝子の解析

これまでの研究により、4500個のBACクローンを搭載したin-houseゲノムアレイを用いて、癌細胞株のゲノム解析を行ってきた。1つはゲノムコピー数解析であり、もう1つは、エピゲノム解析としてDNAメチル化領域の網羅的探索法(BAC array-based MCA (BAMCA)法)と、クロマチン免疫沈降法をBACアレイ上で展開した蛋白結合配列の網羅的探索法(ChIP on BAC-array法)である。抗ヒストンH3K9メチル化抗体および、メチル化DNA結合蛋白質であるMeCP2に対する抗体を用いたChIP on BAC-array法とBAMCA法を重ね合わせることにより、ヒストンおよびDNAメチル化により発現抑制を受ける癌関連遺伝子の解析方法を確立し、メチル化プロファイルを作製した。肺小細胞癌細胞株において高頻度に発現抑制されていたTSSCl (labo name)は、DNA脱メチル化剤である5-azadC処理により発現が回復した。CpGアイランドのDNAメチル化は発現低下と一致しており、メチル化により発現抑制される新規の肺癌関連遺伝子候補として解析を進めている。一方、肺腺癌細胞株における14q11.2増幅領域において活性化を受ける標的遺伝子BCL2L2を見出した。BCL2L2はアポトーシス阻害因子であり、RNA干渉法により発現を抑制すると肺腺癌細胞株の増殖は抑制され、肺癌における新たな癌関連遺伝子と考えられた。また、ChIP on BAC-array法により、癌に関わる転写因子E2Flを解析したところ、E2F1の既知の標的遺伝子を含まない領域が検出された。それらの領域内に座位し、プロモーターにE2F1の結合配列を持ち、E2Fl転写活性化される新規の標的遺伝子を同定した。以上より、研究目的は達成されたと考える。申請者は、4500個のBACクローンを搭載したin-houseゲノムアレイを用いて、癌細胞株のゲノム解析を行っている。1つはゲノムコピー数解析であり、もう1つは、DNAメチル化領域の特異的増幅法であるMCA(methylated CpG island amplification)法を、BACアレイ上で展開することにより、癌においてDNAメチル化異常をきたす領域の網羅的探索法(BAC array-based MCA (BAMCA)法)である。また、クロマチン免疫沈降法をBACアレイ上で展開することにより、特定蛋白のゲノム上の結合領域の網羅的探索法(ChIP on BAC-array法)を確立した。この方法は、生細胞内でゲノムとそこに結合している蛋白との間に架橋を形成し、目的の蛋白に対する抗体で免疫沈降し、回収したDNA-蛋白複合体からDNAを抽出して蛍光標識し、BACアレイにハイブリダイズするものである。今回、ヒストンおよびDNAメチル化領域を探索する目的で、抗ヒストンH3K9メチル化抗体および、メチル化DNA結合蛋白質であるMeCP2に対する抗体を用いたクロマチン免疫沈降法を行った。これをin-houseゲノムアレイによるChIP onBAC-array法を用いて解析し、ヒストンおよびDNAメチル化領域を検索した。肺非小細胞癌細胞株の解析の結果、13q21.2領域に存在するPCDH20は、そのプロモーター領域が高頻度にメチル化を受けることにより発現抑制されていた。また、PCDH20を肺癌細胞株に強制発現させるとコロニー形成能が低下し、肺癌における新たな癌抑制遺伝子と考えられた(Imoto I et al.Caner Res 2006)。
細粒度並列処理における粒度調整メカニズムの研究

本研究の目的は、分散記憶型並列計算機を利用する場合に、実行するプログラムのもつ並列性を十分に引き出し、適正な処理粒度に計算負荷を分割・統合し、個々の要素プロセッサに適正に分配・配置するメカニズムを明らかにすることである。それによって、並列計算機のハードウェアがもつ並列処理性能を十分に発揮させ、システム全体としての高速化が実現可能であることを検証する。本研究では、並列処理粒度の調整メカニズムの研究として、(1)自動並列化コンパイラ、(2)並列プログラムの性能デバッギング、(3)並列事象のアニメーション表示、について研究を推進した。コンパイル時に静的に命令の統合を行いスレッドの粒度単位を調整する方法を提案した。与えられた並列プログラムと並列計算機の特性によって定まる最適な処理粒度を計算し、その結果に基づいて、命令列を静的に最適粒度となるようにコンパイルする。有効性の検証にあたっては、電子技術総合研究所が開発した細粒度並列処理アーキテクチャをもつデータ駆動型並列計算機を使用した。並列ループおよび関数呼び出しについて静的な粒度調整効果が得られ、コンパイラへの組み込みについて見通しを得た。他の並列計算機への同粒度調整メカニズムの適用については今後の課題とした。また、並列処理における性能のボトルネックを表示し、並列プログラムの並列処理粒度を画面上で会話的に調整する性能デバッギングシステムを作成した。さらに、並列事象を3次元アニメーションとして画面表示する方法として、力学系モデルに基づく手法を考案した。同手法をプログラミングツール化し、並列プログラムの性能デバッギングへの有用性を確認した。(研究の目的)本研究は、分散記憶型並列計算機を利用する場合に、実行するプログラムのもつ並列性を十分に引き出し、適正な処理粒度に計算負荷を分割調整し、個々の並列要素プロセッサに分配・配置するメカニズムを明らかにすることを目的とする。具体的には、分散記憶型並列計算機上での効率的なプログラム実行を可能とする並列処理粒度(スレッド)を調整し、要素プロセッサに適正配置するメカニズムを解明し、その有効性を評価検証する。同メカニズムを現実の並列計算機の基本ソフトウェアに実装することにより、並列計算機の潜在的高速性を引き出す。(本年度の研究実績)当該研究の初年度においては、並列処理の効率化につながる処理粒度として、命令水準・命令ブロック水準・プロセス水準の各スレッドにおける粒度調整の方法を検討した。命令水準のスレッドでは、通信性能の高いEM-4においても、要素プロセッサでの計算量と通信コストとの適切なバランスをとることが困難であることが明らかとなった。命令ブロック水準では、ループの分割による手続き化、データの分割による並列化など、処理粒度を可変とすることが可能である。この粒度の可変性を用いて、対象とする並列計算機をもっとも効率よく動作させる最適粒度を解析的(静的)に求める方法を、いくつかの並列ベンチマークプログラムについて提案した。プロセス水準では、単一プログラムをプロセスに分割しての並列実行では、処理時間の優位性は期待できないことが判明した。次年度以降、本研究においては、命令ブロック水準における処理粒度調整を対象とすることとした。適正配置メカニズムについては、並列計算機アークテクチャの違いがもたらす動的な適正配置基準への影響を調べた。並列ベンチマークプログラムを実行することによって、同メカニズムの有効性を評価した。なお、研究対象とする分散記憶型並列計算機として、電子技術総合研究所のデータ駆動型並列計算機EM-4および本学共用計算機Cenju-3をとりあげた。また、本研究を進めるための設備として、本年度は並列計算機のシミュレーションを行う高性能ワークステーション環境を整備した。本研究では、分散記憶型並列計算機を利用する場合に、実行するプログラムのもつ並列性を十分に引き出し、適正な処理粒度に計算負荷を分割・統合し、個々の要素プロセッサに適正に分配・配置するメカニズムを明らかにする。本年度は、粒度調整を静的に行うメカニズムについて重点的に研究を推進した。調整を行う処理

粒度をスレッド水準として、コンパイル時に静的に命令の統合を行いスレッドの粒度単位を調整する方法を提案した。同方法では、並列計算機の実行モデルとしてLogPモデルを採用した。コンパイラは、与えられた並列プログラムと並列計算機の特性によって定まる最適な処理粒度を同モデルを用いて計算する。その結果に基づいて、命令列を静的に最適粒度となるようにコンパイルする。本研究においては、電子技術総合研究所が開発した並列計算機EM-Xを使用した。EM-Xは命令水準の並列性抽出が可能なデータ駆動型並列計算機であり、プログラムの1部をフォンノイマン的に逐次実行することが可能なアーキテクチャをもつ。同計算機を用いてコンパイラによる静的粒度調整メカニズムの有効性について、予備的な解析・評価を行った。並列ループおよび関数呼び出しについて充分な粒度調整効果が得られた。本研究の目的は、分散記憶型並列計算機を利用する場合に、実行するプログラムのもつ並列性を十分に引き出し、適正な処理粒度に計算負荷を分割・統合し、個々の要素プロセッサに適正に分配・配置するメカニズムを明らかにすることである。それによって、並列計算機のハードウェアがもつ並列処理性能を十分に発揮させ、システム全体としての高速化が実現可能であることを検証する。本研究の最終年度にあたり、並列処理粒度の調整メカニズムの研究として、(1)自動並列化コンパイラ、(2)並列性能デバッギング、(3)並列事象のアニメーション表示、について研究を推進した。コンパイル時に静的に命令の統合を行いスレッドの粒度単位を調整する方法を提案した。与えられた並列プログラムと並列計算機の特性によって定まる最適な処理粒度を計算し、その結果に基づいて、命令列を静的に最適粒度となるようにコンパイルする。有効性の検証にあたっては、電子技術総合研究所が開発した細粒度並列処理アーキテクチャをもつデータ駆動型並列計算機EM-Xを使用した。Doall型とDoacross型の並列ループおよび関数呼び出しについて粒度調整効果が得られ、コンパイラへの組み込みについて見通しを得た。他の並列計算機への同粒度調整メカニズムの適用については今後の課題とした。また、並列処理における性能のボトルネックを表示し、並列処理粒度を画面上で会話的に調整する性能デバッギングシステムを作成した。さらに、並列事象を3次元アニメーションとして画面表示する方法として、力学系モデルに基づく手法を考案した。プログラミングツールを開発し、並列性能でバッギングへの有効性を認識した。
新世紀数学の教育課程開発研究:テクノロジーによる代数・幾何・微積ForA11-総合的な学習の時間・総合学科・工業科も視野に/新教具活用と新ソフトウエアの日本語版開発-

最終年度として次のような成果を得た。1)自身の先行研究「関数・微積ForAll」で得た教材群・教育課程の素案を、「総合的な学習の時間」等をも視野に、各学校で実現できる形で再考し、作図ツール、LEGO、グラフ電卓などの既存教具を活用して実践し、具体化し、附属学校、県立高等学校、公立中学校、実業高校等にて実験授業を行った。3)グラフィングツールとして、Michal YerushalmyのCalculus Unlimitedを垣花京子の支援を得て日本語化し、Asian Technology Conference 1998で発表した。4)以上を通じて得られた成果を基に、421名が登録したAsian Technology Conferenceでは研究発表と講習会を行った。また、韓国で行われた東アジア会議でも研究発表を行った。5)最終年度として報告書を作成し、広く参照されるようにした。3年間の研究成果は膨大で、研究報告は1000ページを越える。その成果を今後継続的に広めることに勤めたい。特に、日本語化したソフトウエアの実用化のための研究と報告書をふまえた実践研究の出版等を推進する。また、LEGOを利用したリンケージの成果をホームページに掲示するなどして、学校の先生方が利用できる情報としたい。1、自身の先行研究「関数・微積ForAll」で得た教材群・教育課程の素案を、「総合的な学習の時間」等をも視野に、各学校で実現できる形で再考し、作図ツール、LEGO、グラフ電卓などの既存教具を活用して実践し、具体化し、付属学校等にて実験授業を行った。実験授業の主題は、代数、幾何・微積の関連づけであり、表、式、グラフ、作図、実現象、という諸表現を活用しての調和的探究である。3、1、2を通じて得られた成果を基に、Asian Technology Conferenceでは研究発表を行い、科学教育学会では課題研究分科会を主催し、T^3Japanでは研究発表を、また、日本数学教育学会論文発表会では口頭発表(実験授業を行った院生の報告も含めて11件)を行った。また、科学教育学会、日本数学教育学会大会、日本数学教育学会論文発表会では、テクノロジーを前提としたカリキュラム像の提言を行い、新算数教育研究会セミナーでは、テクノロジー時代の算数指導のあり方について助言をした。8月には、テクノロジー利用法の公開講座を経験者編、初心者編とあわせておこなった。他に、授業研究図書「テクノロジーを活用した新しい数学教育」を明治図書から、佐伯昭彦、清水克彦との共編にて出版した。
外分泌腺組織で恒常的に産生されるケモカインMEC/CCL28の生物学的機能の解析

MEC/CCL28は2000年に報告された最も新しいケモカインである.唾液腺のみならず,乳腺,前立腺,膵臓などの外分泌組織で発現し,特に乳腺に関しては,乳癌細胞でCCL28の産生が消失していることから,癌原性との関わりも示唆されている.外分泌腺におけるCCL28の機能解析は,生体防御におけるケモカインの新たな役割の解明へと繋がる.さらに,CCL28は気管支,大腸,直腸などの粘膜上皮でも発現を認めており,外分泌腺組織を含めた大きな意味での粘膜免疫にCCL28が深く関わっていることを示唆している.その受容体であるCCR10を発現する細胞としては,これまで皮膚指向性メモリー/エフェクターT細胞が報告されているのみで,外分泌腺や粘膜組織での発現細胞はほとんどわかっていなかった.研究代表者らは,CCL28が唾液腺腺房上皮細胞で構成的に産生され,唾液中に多量に分泌されることを証明した.またCCL28のカルボキシル末端が抗菌ペプチドのヒトヒスタチン-5に高い相同性を示すことを見いだし,その抗菌作用を検討した結果,CCL28がグラム陽性菌,グラム陰性菌,真菌にまたがる広範な抗菌活性を示すことを明らかにした.一方,CCR10はIgA形質細胞で機能的な発現がみられ,CCR10陽性形質細胞は腸管全般と唾液腺で確認されたことから,CCL28陽性の粘膜上皮全般へのIgA形質細胞のホーミングに関わっている可能性が示唆された.これまで粘膜局所におけるIgA形質細胞の移動はCCL25が小腸特異的な遊走能を示すのみであった.CCL28はこれを全身の粘膜系に広げた点さ極めて重要な知見と考えられた.以上の結果より,CCL28は粘膜局所で抗菌タンパクとして作用する一方で,IgA形質細胞の粘膜局所へのホーミングに関わる,自然免疫と獲得免疫にまたがって作用するケモカインであることが示された.MEC/CCL28は2000年に報告された最も新しいケモカインである.唾液腺のみならず,乳腺,前立腺,膵臓などの外分泌組織で発現し,特に乳腺に関しては,乳癌細胞でCCL28の産生が消失していることから,癌原性との関わりも示唆されている.外分泌腺におけるCCL28の機能解析は,生体防御におけるケモカインの新たな役割の解明へと繋がる.さらに,CCL28は気管支,大腸,直腸などの粘膜上皮でも発現を認めており,外分泌腺組織を含めた大きな意味での粘膜免疫にCCL28が深く関わっていることを示唆している.その受容体であるCCR10を発現する細胞としては,これまで皮膚指向性メモリー/エフェクターT細胞が報告されているのみで,外分泌腺や粘膜組織での発現細胞はほとんどわかっていなかった.研究代表者らは,CCL28が唾液腺腺房上皮細胞で構成的に産生され,唾液中に多量に分泌されることを証明した.またCCL28のカルボキシル末端が抗菌ペプチドのヒトヒスタチン-5に高い相同性を示すことを見いだし,その抗菌作用を検討した結果,CCL28がグラム陽性菌,グラム陰性菌,真菌にまたがる広範な抗菌活性を示すことを明らかにした.一方,CCR10はIgA形質細胞で機能的な発現がみられ,CCR10陽性形質細胞は腸管全般と唾液腺で確認されたことから,CCL28陽性の粘膜上皮全般へのIgA形質細胞のホーミングに関わっている可能性が示唆された.これまで粘膜局所におけるIgA形質細胞の移動はCCL25が小腸特異的な遊走能を示すのみであった.CCL28はこれを全身の粘膜系に広げた点さ極めて重要な知見と考えられた.以上の結果より,CCL28は粘膜局所で抗菌タンパクとして作用する一方で,IgA形質細胞の粘膜局所へのホーミングに関わる,自然免疫と獲得免疫にまたがって作用するケモカインであることが示された.CCL28は各種外分泌腺及び粘膜上皮で発現が認められ、これら組織における機能と未知の標的細胞の解明が急がれていた。これまでに研究代表者らが明らかにしたことを以下に列記する。使用したマウスは全てBALB/cマウス(1216週齢、メス)である。1.マウス各組織におけるCCL28mRNAの発現検討:マウスの唾液腺(耳下腺、顎下腺、舌下腺)では各種腸管組織と比較してCCL28の発現がCCR10やCCR3よりも数倍十数倍上昇していた。2.ELISA法による唾液中のCCL28の濃度検討:健常成人の耳下腺より採取した耳下腺唾液のCCL28の濃度は65232nM(Ave. 112nM、n=5)となり、これまで報告されていたケモカインの中でも最高のレベルであった。3.組織染色:抗ヒト及び抗マウスCCL28抗体を用いた免疫染色では、ヒト及びマウスで唾液腺腺膀細胞が陽性に染まり、免疫電子顕微鏡では上皮内顧粒が陽性であった。4.コロニー形成法によるCCL28の抗菌活性の検討:ミュータンス菌、溶血性連鎖球菌、黄色ブドウ球菌、緑膿菌、肺炎桿菌、カンジダ菌を用いてCCL28の抗菌活性を検討したところ、IC_<50>が0.33.0μMの有意な抗菌能を確認した。5.CCR10結合リガンド-Fcキメラの作製:ヒトCCL28-Fc及びヒトCCL

27-Fcキメラを作製した。どちらもCCR10発現細胞に結合したが、安定性と特異性の点からヒトCCL27-Fcを採用した。6.唾液腺におけるCCR10発現細胞の同定:マウス耳下腺細胞を調整し、上記CCL27-Fcで染色したところ、CD3-B220lowのIgA産生形質細胞であることが判明し、この細胞はCCL28への細胞遊走能も確認された。今後はCCL28の抗菌動態の解析<時間、塩濃度、相乗効果)、CCR10発現細胞の解析を継続する。MEC/CCL28は2000年に報告された最も新しいケモカインである.唾液腺のみならず,乳腺,前立腺,膵臓などの外分泌組織で発現し,特に乳腺に関しては,乳癌細胞でCCL28の産生が消失していることから,癌原性との関わりも示唆されている.外分泌腺におけるCCL28の機能解析は,生体防御におけるケモカインの新たな役割の解明へと繋がる.さらに,CCL28は気管支,大腸,直腸などの粘膜上皮でも発現を認めており,外分泌腺組織を含めた大きな意味での粘膜免疫にCCL28が深く関わっていることを示唆している.その受容体であるCCR10を発現する細胞としては,これまで皮膚指向性メモリー/エフェクターT細胞が報告されているのみで,外分泌腺や粘膜組織での発現細胞はほとんどわかっていなかった.研究代表者らは,CCL28が唾液腺腺房上皮細胞で構成的に産生され,唾液中に多量に分泌されることを証明した.またCCL28のカルボキシル末端が抗菌ペプチドのヒトヒスタチン-5に高い相同性を示すことを見いだし,その抗菌作用を検討した結果,CCL28がグラム陽性菌,グラム陰性菌,真菌にまたがる広範な抗菌活性を示すことを明らかにした.一方,CCR10はIgA形質細胞で機能的な発現がみられ,CCR10陽性形質細胞は腸管全般と唾液腺で確認されたことから,CCL28陽性の粘膜上皮全般へのIgA形質細胞のホーミングに関わっている可能性が示唆された.これまで粘膜局所におけるIgA形質細胞の移動はCCL25が小腸特異的な遊走能を示すのみであった.CCL28はこれを全身の粘膜系に広げた点で極めて重要な知見と考えられた.以上の結果より,CCL28は粘膜局所で抗菌タンパクとして作用する一方で,IgA形質細胞の粘膜局所へのホーミングに関わる,自然免疫と獲得免疫にまたがって作用するケモカインであることが示された.
病原性及び非病原性結核菌感染防御における、CD1を介した脂質抗原提示の重要性

主要組織適合抗原(MHC分子)は、蛋白由来のペプチド抗原を結合してT細胞に提示することにより、ペプチド抗原特異的な免疫反応を誘導する。これに対して、結核菌などの抗酸菌が有する脂質抗原を結合してT細胞に提示する新しいタイプの抗原分子としてCD1分子(CD1a、CD1b、CD1c)が同定され、感染制御における役割が注目されている。BCGはウシ型結核菌の弱毒株であり、抗結核ワクチンとして長年にわたり広く世界中で使用されてきたが、その免疫誘導の指標として、ツベルクリン反応など蛋白抗原に対する細胞性免疫のみが用いられ、脂質抗原に対するT細胞反応の詳細は不明であった。そこで、BCGに感染したCD1陽性樹状細胞を抗原提示細胞として用い、それによって,活性化されるCD1拘束性T細胞の存在と機能を解析する研究を展開した。BCG既接種者より得た末梢血T細胞をCD4陽性T細胞とCD8陽性T細胞に分画し、生菌あるいは死菌BCG感染樹状細胞に対するそれぞれの反応をインターフェロンガンマエリスポット法を用いて解析した。その結果、CD8陽性T細胞は生菌BCG感染樹状細胞に有意な反応を示し、その反応は抗CD1b抗体で顕著に阻止された。これとは対照的に、CD4陽性T細胞は、生菌よりもむしろ死菌に対して強い反応を示し、その反応は抗MHCクラス2抗体により阻止された。このことから、BCG既接種者において、生菌BCGを特異的に認識して、結核菌制御に重要なサイトカインであるインターフェロンガンマを産生するCD1b拘束性CD8陽性T細胞プールが存在することが明らかとなった。以上の結果は、BCG接種により脂質抗原をターゲットにした感染防御反応が誘導される可能性を示唆しており、蛋白に対する免疫反応を評価するツベルクリン反応に加え、脂質に対する免疫反応を臨床的に評価する方法の開発が必要であると考えられた。
新しいCaged化合物のためのリン酸の保護基の開発

c-AMPなど、生理活性リン酸類のCaged化合物として実際に応用例が報告されているのは、ニトロベンジルエステル誘導体のみである。光放出の効率と毒性に問題があるにもかかわらず、この型の化合物ばかりが用いられているのは、リン酸エステルの合成法と光反応性の検討が立ち後れているからである。私は、これとは全く異なる構造を持ち異なる機構で光分解する保護基の開発を目指して研究を続けているが、平成5年度の研究で、リン酸の新しい光分解性保護基として1-ピレニルメチル基が有効であることを見いだした。まず、簡単な構造のリン酸をモデルに選び、その放出効率を従来報告されている他の保護基と比較したところ1-ピレニルメチル基が圧倒的に速く、これが長波長領域で大きなモル吸光計数を持つことと分解の量子収率が比較的大きいことによることを明らかにした。さらにこの過程で、リン酸を中性条件下、直接誘導体化する簡単な方法も開発した。この方法はリン酸とハロゲン化物を酸化銀で縮合するもので、難溶性のハロゲン化銀と水が副生するだけなので、ろ過するだけで生成物を単離精製できる。またこの方法で無保護のcAMPのリン酸部分にベンジル、2-ニトロベンジル、7-メトキシクマリンなどの光感受性基を60%程度の単離収率で導入することもできた。しかし、リン酸の1-ピレニルメチルエステルは酸や塩基に弱く、光を遮断しても水溶液中で徐々に分解してしまうこともわかった。この不安定性はベンジル型であることに起因しており、置換基による修飾では抜本的な改善は望めなく、Caged化合物への応用を考えると大きなマイナス要素である。事実ベンジル基ですらcAMPに導入した場合、pH7の水溶液中での半減期が4時間と非常に短い。現在これらの基礎的なデータを基に更により良いCaged化合物の開発を目指して研究を続けている。
高齢者難治性疾患に対する脱分化脂肪細胞を用いた細胞治療の確立

成熟脂肪細胞に由来する脱分化脂肪細胞(DFAT)を高齢者に好発する種々の疾患モデル動物に移植し、その治療効果と安全性を検証した。ウサギおよびブタ下肢虚血モデルに自家DFATを移植したところ、虚血部位の有意な血流改善と血管密度の増加が認められた。ウサギ骨欠損モデルや卵巣摘出による骨粗鬆症モデルにおいて、自家DFAT移植は高い骨再生効果を示した。これらの動物実験においてDFAT移植による腫瘍形成や異常分化の所見は認められなかった。DFAT細胞治療は、高齢者難治性疾患に対する有効で安全な治療法となりうる可能性が示唆された。(1)大動物を用いた細胞治療の前臨床試験・ウサギ下肢虚血モデルに対する治療効果の検討日本白色家兎の大腿動脈を結紮・切除し、下肢虚血モデルを作成。自家DFATを虚血部位に筋注し(DFAT群)、生理食塩水を筋注した群(Control群)と血流改善の程度を比較検討した。その結果、Control群に比べDFTA群では、移植1週後より有意に血流が改善し、移植4週間後には虚血部位における血管密度の増加が認められた。・ウサギ骨欠損モデルに対する治療効果の検討日本白色家兎の両側頸骨欠損を作成後、自家DFAT・人工骨基質複合体(DFAT肢)または人工骨基質のみ(Control肢)を欠損部に移植した。移植4週間後に頸骨を摘出し、骨強度の測定、マイクロCTによる骨密度の定量など行い、DFAT移植の効果を検討した。その結果、Control肢に比べDFAT肢では、有意に骨強度・骨密度の増加と皮質骨の再生が認められた。・ウサギ骨粗鬆症モデルの作製雌性日本白色家兎の両側卵巣摘出を行い、X線学的に骨密度の変化を経時的に測定した。その結果、6ヶ月以後に大腿骨の骨密度低下が再現性よく認められ、骨粗鬆症モデルを確立するに至った。・ブタ下肢虚血モデルに対する治療効果の検討ブタの両下肢大腿動脈を5cm長にわたり結紮切除し、虚血肢の経皮酸素分圧を経時的に計測した結果、4週間以上持続する下肢虚血モデルの作成に成功した。(2)高齢者難治性疾患に対するDFAT細胞治療の有効性の検討・椎間板変性症に対する効果ウサギ椎間板より単離培養した髄核細胞とウサギDFATとの共培養を行い、髄核細胞の増殖活性や細胞外基質産生能の変化を評価した。その結果、DFATと共培養した髄核細胞は、共培養しない髄核細胞に比べ、増殖活性が有意に高くなることが明らかになった。1.大動物を用いた細胞治療の前臨床試験・ブタ下肢虚血モデルに対する治療効果の検討:ブタ両下肢大腿動脈を5cm長にわたり結紮切除し、片側の虚血筋組織に同一個体の皮下脂肪組織から調製したDFATを移植した。経時的に経皮酸素分圧や血管密度を測定し、血流改善の程度を対側Control肢と比較した。その結果、DFAT移植肢はControl肢に比べ、移植1,2週後より虚血部位の経皮酸素分圧が有意に高値となり、移植4週間後の虚血筋組織の血管密度が有意に増加した。以上の結果より自家DFATの虚血組織への移植は、高い血流改善効果を示すことが明らかとなった。・ウサギ骨粗鬆症に対する治療効果の検討:雌性日本白色家兎の両側卵巣を摘出後6ヶ月間飼育し、骨粗鬆症を誘導した。片側大腿骨にDFATを骨髄内投与し(DFAT肢)、対側大腿骨には生理食塩水を注入した(Control肢)。1ヶ月後に両側大腿骨を摘出し、骨構造解析を行った。その結果、DFAT移植肢はControl肢に比べ、海面骨密度の有意な増加が認められた。移植したDFATの一部は骨内に生着し、骨芽細胞マーカーであるOsteocalcinを発現していた。以上の結果より、骨粗鬆症モデル動物に対するDFAT骨髄内投与は、骨再生に寄与し骨密度改善効果があることが明らかになった。2.高齢者難治性疾患に対するDFAT細胞治療の有効性の検討・腹圧性尿失禁に対する効果:ラットに膣拡張術と両側卵巣摘出を行い、持続的腹圧性尿失禁モデルを作成した。このモデルの尿道周囲の結合組織にDFAT(DFAT群)、または線維芽細胞(Control群)を移植し、その治療効果を比較検討した。その結果、DFAT移植群ではControl群に比べ、移植6週間後のLeak point pressureが有意に増加し、組織学的にも尿道平滑筋や尿道横紋筋の菲薄化が有意に抑制された。以上の結果より、尿道括約筋障害に伴う腹圧性尿失禁に対するDFAT移植の有効性が明らかになった。

大動物を用いた細胞治療の前臨床試験・ウサギ下肢虚血モデルに対する治療効果の検討:ウサギ下肢虚血モデルを作成し、1週間後に自家DFAT(DFAT群)、末梢血単核球(PBMNC群)、線維芽細胞(fibroblast群)、または生理食塩水(Control群)を虚血部位に筋注し、血流改善の程度を比較検討した。その結果、DFAT群は、Control群と比較して移植後1-3週目において有意な血流増加を認めた。またFibroblast群に対しても移植後1, 2週目において有意な血流増加を認めた。DFAT群とPB-MNC群では、観察期間中に有意な差は認められなかった。以上の結果より、DFATは線維芽細胞に比べて高い血管新生能を有することが明らかになった。2.高齢者難治性疾患に対するDFAT細胞治療の有効性の検討・椎間板変性症に対する効果:ウサギ脊椎椎間板より採取培養した髄核(NP)細胞とウサギDFATのトランスウェルを介した共培養を行い、それぞれの細胞の形質変化を評価した。その結果、培養後のNPの細胞数は単層培養(C)群と比較して間接的共培養(IC)群および直接的共培養(DC)群で有意に増加していた。遺伝子発現解析ではDFATはC群に比べIC群およびDC群で各種髄核細胞マーカー遺伝子の発現量が有意に増加していた。上記結果より、NP細胞とDFATの共培養により、NP細胞の細胞増殖能が高まり、一方、DFATはNP様細胞へ分化する可能性が示唆された。・腹圧性尿失禁に対する効果:ラットに膣拡張術(VD)と両側卵巣摘出(OVX)を行い、持続的腹圧性尿失禁モデルの作成を試みた。その結果、VDと両側OVXを併用することにより、傷害2週間後から6週間以上の長期にわたっては排尿機能障害が持続する新しいラット腹圧性尿失禁モデルの作出に成功した。本年度の研究実施計画にある「(1)大動物を用いた細胞治療の前臨床試験」では、ウサギ下肢虚血モデルおよびウサギ骨欠損モデルに対するDFAT自家移植の有効性を確認し、ウサギ骨粗鬆症モデルの確立に成功した。また次年度実施予定だったブタの下肢虚血モデルの作成も実施することができた。「(2)高齢者難治性疾患に対するDFAT細胞治療の有効性の検討」では、ウサギ髄核細胞とDFATの共培養実験を実施した。これらの進捗状況より、おおむね順調に進展していると判断した。25年度が最終年度であるため、記入しない。「ウサギ骨粗鬆症に対する治療効果の検討」では、両側卵巣摘出(OVX)にて骨粗鬆症の誘導を試みたが、骨密度の低下は非常に緩除であり、大腿骨骨密度が有意に低下するまでに7ヶ月以上かかることが明らかになった。このため、本年度は骨粗鬆症を誘導するにとどまり、DFAT移植実験は次年度に繰り越すことにした。他の研究課題「ウサギ下肢虚血モデルに対する治療効果の検討」や「椎間板変性症に対するDFAT移植の効果」については順調に研究が進み、DFATの治療効果が明らかになった。これらの進捗状況により、おおむね順調に経過していると判断した。本年度の検討において、ウサギを用いた下肢虚血モデルは再現性の高い均質なモデルが得られる一方、ブタの下肢虚血モデルは個体差が大きく、群間比較が困難であることが明らかになった。このため今後、群間比較が必要な実験はウサギのモデルを用い、ブタのモデルは主にDFAT移植の移植安全性を評価する実験に使用したいと考えている。
角層の水分含有機能の生体計測工学に基づく総合評価法の開発

正常の皮膚は柔軟で滑らかである。一方病的皮膚の表面は硬くてもろく、亀裂や鱗屑で履われる。これらは皮表の角層の水分含有量の多寡により決まる現象である。角層の水分保持の状態は私たちの開発した高周波伝導度測定装置を用いて測定が可能である。さらに、角層の剥離の状態バリア機能、層数、水分と結びつくアミノ酸含有量の測定、皮膚の弾性、硬さの測定、皮表の顕微鏡的観察などの検索を加えることで角層の機能を総合的に評価することをめざし、本研究を行った。その結果以下のような成果がえられた。1.新生児は出生後乾燥した大気に触れるため皮膚は乾燥してくる。生後、一週間目までは発汗もみられず、それも乾燥の状態を助長させる。2.アトピー性皮膚炎患者の無疹部の皮膚は乾燥が著明であり、アトピー性乾皮症と呼ばれる。その角層は水分と結びつくアミノ酸の量が低下しているため正常よりも多量の経表皮水分喪失がみられる。病理組織学的にもリンパ球の浸潤がみられることから本症は軽度の炎症の存在によっておこる変化と考えた。3.皮膚は老化とともに乾燥し、老人性乾皮症と呼ばれる変化を生じる。これは角層のバリアー機能は老化によっても低下しないのに、角層の水分と結合する物質が低下するため、とくに冬、空気が乾燥すると生じてくる。一方長年の紫外線曝露による光老化のある皮膚では、このような角層の変化はそれほど顕著ではない。4.レチノイド酸外用、あるいはレチノイド(エトレチナート)の内服は角層の水分保持機能を高めるだけでなく、角層の剥離効果によるバリア機能の低下を生じ、経皮水分喪失を上昇させる。これらのことが治療を受けた皮膚の柔軟性の上昇に関係すると考えられる。(1)アトピ-性皮膚炎の患者では正常とみえる非病変部の皮膚が乾燥しており,アトピ-性乾皮症(atopic zerosis)と呼ばれる。この部位を組織学的に検索すると軽い炎症性変化を皮膚の上層に認める。角層の経表皮水分喪失量は上昇し,そのバリア-機能の低下が明らかとなった。一方,高周波伝導度,角層表層の水溶性アミノ酸含有量も低下しており皮表の乾燥を裏付ける変化がみられた。また角層表面を200倍の拡大のもとに観察すると,正常皮膚に比し,大きな角層細胞の集塊か落屑しかかって存在することが確かめられた。角層,層数全体は,正常の前腕屈側で14層とすると,アトピ-性乾皮症では21層と厚く,一方その置き換わりに要する期間(turrover time)は正常が14日であるのに7日と短縮しており,計算上からも,正常では1日1層の円層が剥離するのに対し,アトピ-性乾皮症では1日3層,角層が剥離していることになる。すなわち,表皮が軽い炎症の影響により増殖が盛んとなり,不十分な分化のままに角化し,その結果,バリア-機能,水分保持機能も低く,また大きな集塊をなして角層が剥離するために,臨床的に乾燥して感じられるようになることが明らかになった。(2)正常角層シ-トを用い,湿った濾紙を覆って作製した生体角層シミュレイションモデルに,ワセリン,親水軟膏,尿素クリ-ムを塗布し,乾燥あるいは湿った環境において,外用剤がその下の角層の水分含有状態にどのような影響を与えるのかを検索した。その結果,とくに油脂性製剤は密封効果も高く,水分の角層と環境の間での移動を抑えるような働きをすること,したがって高湿度下では,むしろ角層内水分含有量が低くなる傾向がある一方,低湿度下ではそれが高くでる傾向があることが確かめられた。

(1)新生児は約1週間にわたって発汗も低下しているだけでなく、乾皮症の症状を呈する。これは角層の水分結合能の低下によるものであることが角層水負荷試験により証明された。今後は角層内の水分結合性物質の検索が急がれる。(2)老人性乾皮症において形態的ならびに生化学的検索を続行中である。老人においては形態的に表皮上層のケラトヒアリン顆粒の減少が著明であり、またライソソ-ム酵素の分泌や角層細胞間脂質の分泌を司どるオドラント小体(層板顆粒)の減少が認められる。一方、皮表角層で検索した限りにおいては皮脂成分、とくに中性脂肪の低下が目立つが、細胞間脂質であるセラミドの量に関しては大きな変化は若者との間にみられなかった。アミノ酸の量も著明な低下は認められない。(3)レチノイン酸外用、あるいはレチノイド(エトレチナ-ト)の内服は角層の水分保持機能を亢めるだけでなく、経表皮水分喪失の上昇、すなわち皮膚のバリア機能の低下を来す。平行して行ったモルモットの皮膚の検索からは、角層の剥離効果、表皮の分化への影響が示唆された。(4)現在、使用可能な皮表水分測定装置にはSkicon-200およびCorneometerがある。前者は皮膚の高周波伝導度を測るもの、後者は低周波電流で皮膚の電気容量を測るものである。角層シミュレイション・モデルを用いた検索では正常角層内の水分含有量との相関は前者で非常に高かった。後者はこのような相関は高くないが、鱗層性病変など乾燥し、角層内の結合水の減少した状態を測定するのは適していることが確かめられた。(1)病変部角層の生体内シュミレイションモデルを作製するべく,乾癬の病変部より剥離してきた鱗屑を濾紙を湿らした上に置き,工学装置を用い計測を試みにが,湿ったものの上に直接置くかぎりは,正常角層とちがい,容易に湿って脆弱化してしまい,反復する計測には耐ええなかった。病度部の場合,表皮表層自体がすでに乾燥化しはじめているため,試験内でのモデルのように、もろく浸軟してしまうこともないと推察される.(2)老人性乾皮症の角層の性状を明らかにするため,そのターン・オーハー時間をダンシル・クロライトで染色された角層の蛍光強度がどれだけの日数で消失するかを測定することで計測した,その結果,下腿において若者においては平均14±3日であったのに対し,老人では21日±4日と有意に延長していた。また,剥離の遅延した角層細胞同士の固著性は高く,接着性の弱いポスト・イットをはりつけて取れてくる角層細胞の状態を比較すると,6個以上の塊りをなすものは若者では全細胞の5%でしかなかったが,老人では23%と有意に多かった。(3)新型の触覚センサーを用い,高周波伝導度との相関を調らべたところ,両者の間に高い相関が認められた。相たちが皮膚をさわり,硬さ軟らかさを感じることは,皮表の角層中の水分含有量により大きく影響されるということが示された。
ELF弱磁界の生物の生長助成効果に関する基礎研究

1植物(ミツバ)の種子の発芽促進に及ぼす磁界の影響周波数が0Hz(DC)、3.5Hz,7Hz,10.5Hz,14Hzで、磁界強度が400A/m,600A/mのすべての組み合わせの場合について、ミツバの種子の発芽に及ぼすELF弱磁界の効果について実験した。その際に、差動増幅器やオシロスコープを用いて上記の磁界が発生しているかを確認した。実験結果は発芽率と平均発芽日数についてまとめ、磁界を印加していない場合と比較した。周波数7Hz,強度600A/mの磁界環境は発芽を促進することが統計的にわかった。2天然酵母パンの発酵に及ぼす磁界の影響ホシノ天然酵母パン種を水に溶かして、水種を作る際に周波数7Hz,強度200、400、600、800、1000A/mの磁界を印加して、磁界の影響について実験した。その際にビデオ装置一式とICレコーダを用いて発酵の様子を観察した。同時にPH計を用いて発酵度を測定した。また、その水種を小麦粉に加えて実際に食パンを焼いて、コントロールと比較した。その結果、周波数7Hz,強度600A/mの磁界環境は発酵を促進させているのではないかとの感触を得た。3その他、植物(ミツバ)の初期生長、金魚の稚魚期の生長、ラン藻とアゾラの共生体の窒素固定繁殖などに及ぼす磁界の影響についても実験した。しかし、バラツキが大きくて、はっきりした結果を得るまでには至らなかった。
ビタミンEおよびタウリンの自律神経系に及ぼす影響について

1.ラット摘出精管の副睾丸側の交感神経刺激により得られたノルアドレメリン(NA)を介する収縮反応に対して著明な抑制が,対照に比較して,ビタミンE投与(最初の5日間100mg/kg・体重,後半5日間200ng/kg・体重)標本でみられた。一方,NA及びKclによる収縮に対しては影響はみられなかった。また精嚢側の電気的刺激によるATPを介する収縮反応に対しても同様に抑制がみられたが,ATP,Kclによる収縮に対しては影響はみられなかった。さらにビタミンE40日間投与(100mg/kg・体重/日)標本においてもこれ等とほぼ同様の結果が得られた。これらの結果はビタミンEの短期大量投与は交感神経終末部にける神経伝達に抑制作用を及ぼすことを示唆する。2.含硫アミノ酸の血管に対する影響について,正常ラットの摘出大動脈輪切り標本に対して,高濃度NA(10^<ー5>M)により収縮下Ach(10^<ー5>M)投与により弱い弛緩作用がみられた。この弛緩反応に対して,メチオニン,システィン,システィン酸およびグルタチオン前処置により,それぞれ著明な弛緩増強作用がみられた。しかしながら,グルタチオンの場合において低濃度のNA(10^<ー7>,3×10^<ー7>M)収縮下のAch(10^<ー8>10^<ー5>M)による血管弛緩作用に対して増強作用は起こりにくなったが,ビタミンE投与(精管の実験で使用した10日間投与例)標本では,著明な弛緩増強がみられた。また,タウリンの前処置及びビタミンE投与血管ではNAの収縮反応の抑制もみられた。これ等の結果から,含硫アミノ酸はAchによる内皮依存性血管拡張反応に対して増強作用を有するものと考えられるが,その作用機序ならびに降圧作用等に対する関与についてはさらに検討を要すると思われる。
唾液モデルを用いた補綴材料の細胞毒性試験法の開発について

補綴物の生物学的影響を考える際に,唾液因子を無視できない.しかし,これまでにin vitroにおいて細胞毒性試験を行う際に,この点はほとんど配慮されてこなかった.すなわち,ヒト混合唾液あるいは人工唾液の成分が,細胞培養液としては必ずしも適切ではないことによってきたものと思われる.そこで,細胞培養が可能な唾液モデルの細胞培養液を開発して細胞毒性試験を行い,口腔内における補綴材料の生物学的性質に関する基礎データを得ることを研究の目的とした.第1段階として,唾液因子を導入した細胞培養液の試作を試みた.すなわち,Greenwood氏人工唾液,サリベートおよびヒト混合唾液を培養液にそれぞれ添加した結果,添加濃度の上昇につれて細胞回復度が低下し,人工唾液45%添加群で約7割以上の細胞回復度を示した.また,ヒト混合唾液添加群は僅かに細胞回復度の低下が認められた.第2段階として,第1段階の結果を基に,45%添加条件で補綴材料の細胞回復度試験を行った.HEp-2細胞とGin-1細胞の結果から,組織培養液のみの場合と比較して,Ag-In-Zn合金,Ni-Cr合金,Ni-Cu-Ga合金でやや細胞回復の低下が認められた.レジン材料については唾液因子添加による差が認められなかった.一方,組織モデルによる細胞回復度もHEp-2細胞やGin-1細胞と類似の結果を示したが,Co-Cr合金は中等度の細胞回復を示した.また,常温重合レジンはほとんど細胞回復を示さなかった.ヒト混合唾液添加群ではNi-Cr合金とCuがほとんど細胞回復を示さなかった.一方,組織モデルでは唾液因子添加による影響が少なく,常温重合レジンでは粉末状の試料はバルク状の試料と異なってほとんど細胞回復を示さなかった.今後,口腔内環境をより反映させた細胞毒性試験用培養液を製作すべく,(1)口腔内での腐食機構解明に必要な硫化因子をさらに導入する,(2)唾液のpH緩衝能への類似化,(3)唾液粘度,比重等の物理的性質への近似化などに向けた改善が求められる.補綴物の生物学的影響を考える際に,唾液因子を無視できない.しかし,これまでにin vitroにおいて細胞毒性試験を行う際に,この点はほとんど配慮されてこなかった.すなわち,ヒト混合唾液あるいは人工唾液の成分が,細胞培養液としては必ずしも適切ではないことによってきたものと思われる.そこで,細胞培養が可能な唾液モデルの細胞培養液を開発して細胞毒性試験を行い,口腔内における補綴材料の生物学的性質に関する基礎データを得ることを研究の目的とした.第1段階として,唾液因子を導入した細胞培養液の試作を試みた.すなわち,Greenwood氏人工唾液,サリベートおよびヒト混合唾液を培養液にそれぞれ添加した結果,添加濃度の上昇につれて細胞回復度が低下し,人工唾液45%添加群で約7割以上の細胞回復度を示した.また,ヒト混合唾液添加群は僅かに細胞回復度の低下が認められた.第2段階として,第1段階の結果を基に,45%添加条件で補綴材料の細胞回復度試験を行った.HEp-2細胞とGin-1細胞の結果から,組織培養液のみの場合と比較して,Ag-In-Zn合金,Ni-Cr合金,Ni-Cu-Ga合金でやや細胞回復の低下が認められた.レジン材料については唾液因子添加による差が認められなかった.一方,組織モデルによる細胞回復度もHEp-2細胞やGin-1細胞と類似の結果を示したが,Co-Cr合金は中等度の細胞回復を示した.また,常温重合レジンはほとんど細胞回復を示さなかった.ヒト混合唾液添加群ではNi-Cr合金とCuがほとんど細胞回復を示さなかった.一方,組織モデルでは唾液因子添加による影響が少なく,常温重合レジンでは粉末状の試料はバルク状の試料と異なってほとんど細胞回復を示さなかった.今後,口腔内環境をより反映させた細胞毒性試験用培養液を製作すべく,(1)口腔内での腐食機構解明に必要な硫化因子をさらに導入する,(2)唾液のpH緩衝能への類似化,(3)唾液粘度,比重等の物理的性質への近似化などに向けた改善が求められる.初年度の研究実施計画を以下の2段階とした.(1)唾液因子を導入した細胞培養液の試作唾液は組織培養液と異なり緩衝能は低く,pHは不安定である.まず,唾液と同等の緩衝能で細胞培養が可能かどうか検討する目的で,唾液ならびにグリーンウッド氏の人工唾液,および市販人工唾液(サリベート)を添加した培養液で,L-929細胞,HEp-2細胞,RC2細胞,Chang Liver細胞を培養した結果,唾液では25%添加で,2種の人工唾液では50%以上の添加でそれぞれ細胞増殖が大きく抑制された.また,炭酸ガス恒温器内でHanks平衡塩類溶液の緩衝能以下に調整した場合には,いずれの細胞も24時間以上の培養は不可能であったものの,閉鎖環境における培養系では4日間の培養が可能であった.さらに,Eagle MEMの硫化成分を基本組成の5倍程度の添加,ならびにタンパク質として従来のアルブミンの他にムチンの添加も可能である知見が得られた.(2)種々の補綴材料の細胞毒性評価上記の結果を踏まえて,Eagle MEMに人工唾液(グリーンウッドまたはサリベート)を50vol%添加した培養液を用いて,密閉容器中で粉末状のAu-Ag-Pd合金,Ag-In合金,Ag-Sn合金,Co-Cr合金,Ni-Cr合金,TiおよびCuを抽出しつつ,HEp-2細胞を最大5日間培養し,細胞回復度を調べた.