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近世琉球の儀礼に関する研究

本研究は、琉球国王の権威のあり方を、近世琉球・琉球国王を中心に広範に展開した儀礼行為から分析し、近世琉球における国王権威の所在とその実体を明らかにすることを目的とする。具体的には、史料残存の比較的多い王国末期から明治初期を中心として、中城王子の元服儀礼・国王の即位儀礼・国王の葬送儀礼などを、琉球王権を象徴する儀礼として捉えて分析する。その際、日中の儀礼観念をいかに導入し琉球独自のものとして転換したかを明確にすることにより、諸儀礼の特質と国王権威の意義についても考究する。本年度は、尚家文書をはじめとする本研究にかかる基本的な史料の収集に努めた。それを踏まえて次の三点についての分析を行った。第一に、尚育の中城王子への着任、元服、王位への即位儀礼を分析である。まず関係史料である尚家文書中の「尚育様御即位日記」、「尚育様御元服日記」、「僉議」(438号)などを収集し、テキストデータとした。また、譲位がいかに士族層に受け入れられていったかを分析するため家譜史料の収集もおこなった。これらを踏まえ、尚育王が王位を継承する過程を検討した。第二に、服属誓約文書ともいえる「起請文」の分析を行った。関係史料として「両先島御検使日記」(1856年)、「両先島御検使日記」(1857年)、「嘉永四年太守様就御家督摂政・三司官改誓詞日記」、「安政五年太守様就御相続摂政・三司官改誓詞日記」、「太守様就御相続上様改誓詞日記」などを収集し、テキスト化をおこなった。分析により、琉球における起請文の運用を広汎な使用実態について把握することができた。この成果は、「近世琉球の起請文-全体像の把握と儀礼的意義の解明をめざして-」として学会発表した。第三に、災害に関する祈念の意味を考察した。この成果は「近世琉球の災害と祈りに関する覚書き」として発表した。
Activatableラマンイメージングプローブの開発による生体分子の多重検出

本研究では、生きた状態の試料中における生体分子と反応して初めてラマン信号を発するActivatable型ラマンプローブの分子設計法を確立し、酵素活性や生体分子の濃度変動などの生きた細胞のみが有する質的な生体分子情報をライブで検出することを目的とする。さらに、多重検出が可能であるラマンイメージングの特長を最大限に活用し、蛍光イメージングでは同時に観察することが難しい多数の生体分子を同時に検出することもあわせて本研究の目的とする。
標本から評価する絶滅危惧種が失った遺伝的多様性

トンボ目に属するベッコウトンボは日本国内において生息地が急激に減少し、数えるほどの沼地にしか安定的な個体群が維持されていない。絶滅の渦(Extinction Vortex)の概念から現在まで継続している個体群が遺伝的多様性をどの程度維持しているかは、非常に保全上重要な情報である。「種の保存法」で保護されているため、DNA抽出に用いる組織サンプルの入手が困難であったが、抜け殻内に残存する組織片を用いることによってPCRなどの実験に十分であることが判明した。また、静岡県内の地域集団についてミトコンドリアのハプロタイプを調べたところ、非常に良好なハプロタイプ多様度が維持されていることがわかった。平成24年度に引き続き、静岡県磐田市産のベッコウトンボ集団から採取された抜け殻からDNA抽出を行い、ミトコンドリアのCOI遺伝子周辺の約800塩基対についてハプロタイプの決定をおこなった。抜け殻に付着する泥などに起因する重篤なコンタミネーションについては、抜け殻内部に付着する組織片をごく微量採取することによって避けることができ、抽出されるDNAの質と量もともにミトコンドリア遺伝子のハプロタイプの決定に関して十分であることが明らかになった。これらの成果については学会誌において論文が受理されている。博物館に収蔵されている約40年前のベッコウトンボ標本の筋肉からDNA抽出を行ったが、抽出されたDNAサンプルを直接用いてのミトコンドリア遺伝子のPCRは成功しなかった。ゲノム増幅を行うため、DOP (Degenerate Oligonucleotide Primer)-PCRおよびゲノム増幅試薬処理の2つの手法を用いた。新鮮なトンボ標本と古いベッコウトンボ標本それぞれの筋肉からDNA抽出を行い、両手法を用いた後の産物をアガロースゲル電気泳動にかけ、DNA産物の確認をおこなったところ、古いベッコウトンボからの産物は増幅された長さ、量ともに非常に劣っていた。ただ、ゲノム増幅試薬処理した産物の数個体分についてはミトコンドリア遺伝子のPCRによる増幅が成功し、配列の決定が可能であった。博物館標本に含まれるDNAの経年劣化や、保存処理・害虫燻蒸処理に用いる化学薬品の影響によりDNAの損失が生じていることが想定されるが、ゲノム増幅試薬による処理は一応の効果を見せた。絶滅のおそれのある生物は過去から現在に向かって遺伝的多様性が減少してきたと考えられる。博物館にはそういった絶滅危惧種の標本が収蔵されている場合があり、過去にどのような遺伝的多様性が保持されていたかを推定する材料として活用することができる。本研究ではベッコウトンボをはじめとした、日本国内で絶滅のおそれが指摘されているトンボ類について、過去に採取された標本から遺伝的な情報を抽出して、現在の遺伝的多様性と比較することを目的としている。特に国立科学博物館には多数の絶滅危惧種のトンボ類標本が収蔵されており、それらを活用しようとしている。博物館に収蔵されている標本は燻蒸処理や経年劣化等からDNAを抽出しても、遺伝子配列の決定が困難な場合が多く、遺伝情報を取得するための手段として利用されることが比較的少ない。こういった問題を克服することも今度の博物資料の活用にむけた重要な取り組みであると考えている。平成24年度はベッコウトンボの遺伝的多様性について研究をおこなった。静岡県桶ヶ谷沼産のベッコウトンボの抜け殻(脱殻)からDNA抽出を試み、ミトコンドリアのハプロタイプの決定をおこなった。COI遺伝子の後半約700塩基対の配列決定を行った結果、20個の抜け殻から10個のハプロタイプが検出された。少なくとも10個の母系列が維持されていることになる。また、ベッコウトンボの生体ではなく、抜け殻から遺伝情報が取得できたため、生体を傷つけて生存能力に影響を与える必要がなくなった。トンボ類の絶滅危惧種全般の遺伝的多様性を探るための手法としても有用であると考えている。また、すでに絶滅していると考えられている地域集団から過去に採取された標本からもDNAを抽出して、ハプロタイプを決定することにも成功している。平成24年度の研究成果として一番大きいのは、抜け殻からDNAを抽出し、遺伝情報を引き出すことに成功したことである。これは、博物館に収蔵されている資料の活用だけでなく、トンボ類の絶滅危惧種の保全遺伝学について有用な手法である。ただ、泥などの混入により、DNAサンプルのコンタミネーションが生じている場合が多々あったため、改善の余地が有る。博物館に収蔵されているその他のベッコウトンボ標本についても、DNA抽出を行い、ミトコンドリアのハプロタイプ決定を行なっている。現在のところ、標本の採集時からの経年の度合いにより、実験の成功度が大きく違っており、DNAの断片化が進むためと考えている。アガロースゲルによる電気泳動を行って、長い断片を抽出した場合、成功度が若干向上する。今後はゲノム増幅試薬などを用いて検証を行う。

平成25年度は、すでに絶滅していると考えられている地域のベッコウトンボ標本をもちいて、ミトコンドリアのハプロタイプの決定を行う予定である。ただ、平成24年度の結果を踏まえると、個体数に対するハプロタイプ決定の成功率は、このままの方法でいくと、それほど高くないものと考えられる。そこで、ゲノム増幅試薬や、PCR産物の大腸菌を用いた分離などを行うことを計画している。最終的には現存するベッコウトンボ集団の遺伝的多様性と、集団の絶滅により失われた遺伝的多様性とを比較することを考えている。ほとんどが遺伝子実験のための薬品やチューブなどの消耗品費として使用される。
器械出し業務における技術習得の定量化および評価指標の構築

手術現場において,看護師が医師へ手術器械を効率的に受け渡しできることは,手術時間の削減や医療安全の向上に寄与する.本研究では看護師の手術器械操作の教育に着目し,操作方法の定量評価およびそれを基盤とした学習支援システムを提案する.具体的には,手術中の看護業務を定量的かつ自動的に計測・評価し,数学的解析手法を用いてモデル化を実現する.これにより,新人看護師は手術室以外での技能評価および器械出し学習を可能とし,医療安全と教育の質の双方の向上を目指す.本年度の成果として,(1)手術室内でRFIDタグ付き手術器械の自動認証を行うため情報取得システムを開発し,臨床評価試験を実施した.結果として,乳腺外科手術の4例,ソケイヘルニア手術で2例の情報取得を行った.これらの成果は投稿論文として発表した.さらに,(2)複数器械台でRFIDタグ付き手術器械の情報取得をおこなうためのアンテナを設計した.さらに,手術進行状況に関する状態遷移モデルを試作し,その仕様について検討した.2019年度は,手術中の作業モデルを改善し,そのモデルの評価を行う.国内外で手術中のワークフローを解析する手法は構築されているものの,手術器械(特に鋼製小物)を使用した研究はなく,新規性は高いと考えられる.さらに,技能評価手法と学習支援システムの有効性を検証し,これらの成果を論文としてまとめる.本年度の目的として,(1)機械学習を用いた器械出し技能の評価モデルの構築,(2) RFIDタグ付き手術器械を用いた器械出し業務の学習支援システムの開発を行うこととした.(1)手術室内でRFIDタグ付き手術器械の自動認証を行うため情報取得システムを開発し,臨床評価試験を実施した.結果として,乳腺外科手術の4例,ソケイヘルニア手術で2例の情報取得を行った.ソケイヘルニア手術については,セット内の手術器械使用率について算出でき,平均で50%となった.これは,先行研究で得られた使用率58%の報告と同様の結果であり,手術器械セットの最適化に向けた検討を行う.さらに,手術器械の使用状況(手術での使用の有無)について検知可能なソフトウェアを開発し,セット組み中でも手術器械の使用率を記録できることとなった.(2)複数器械台でRFIDタグ付き手術器械の情報取得をおこなうためのアンテナを設計した.本デバイスが実現することで,手術中の手術器械が「使用中」または「器械台上」なのかを判断できる.本年度中にデバイス完成予定だったものの,設計・調整に時間を要したため,本年度中の臨床使用は実現しなかった.引き続き調整を進め,2019年度中の完成・臨床応用を試みる.さらに,MATLABを用いて手術進行状況に関する状態遷移モデルを試作し,その仕様について検討した.分析に使用した手術件数が少ないため,個人差による影響を受けやすく過学習状態となった.使用するモデル開発手法を検討する.また,データの分析手法についてドイツのスマート治療室を開発する研究チームとディスカッションを行い,そのデータ連携を進めることとなった.本年度に引き続き,新人看護師および熟練看護師の器械出し作業を取得する.さらに,器械出し技能の評価モデルを構築するため,機械学習を用いて,熟練看護師による理想的な器械出し作業モデルと新人看護師による作業の分類を行う.具体的には,手術中のRFIDタグ付き手術器械の情報から,使用手術器械の特徴量抽出手法について検討する.たとえば,Business Process Simulation等を参考に,熟練者モデルの検討を進める.本モデルの開発後は,RFIDタグ付き手術器械を用いた,器械出し業務の学習支援システムを開発する.現在,乳腺外科手術やソケイヘルニア手術の器械出し映像データが蓄積されつつあり,熟練看護師と未熟練看護師の器械出しに特有のパタン(器械本数,準備状況など)が存在することがわかった.観測された情報を中心に,データからその特徴点を抽出するためのソフトウェアを開発する.さらに,本システムに必要な情報取得用アンテナの開発も並行して進める.手術現場において,看護師が医師へ手術器械を効率的に受け渡しできることは,手術時間の削減や医療安全の向上に寄与する.本研究では看護師の手術器械操作の教育に着目し,操作方法の定量評価およびそれを基盤とした学習支援システムを提案する.具体的には,手術中の看護業務を定量的かつ自動的に計測・評価し,数学的解析手法を用いてモデル化を実現する.これにより,新人看護師は手術室以外での技能評価および器械出し学習を可能とし,医療安全と教育の質の双方の向上を目指す.本年度に得られた結果として,(1)手術室内で手術器械の自動認証を行うため情報取得システムを開発し,手術中に器械台へ載せられたRFIDタグ付き手術器械を認識できた.さらに,臨床評価試験を実施し,実際の手術環境において情報取得精度を検証した.結果として,乳腺外科手術の15例で本システムを使用し,95.7%以上の認識精度が得られた.一般のアンテナを用いた場合,認識精度は50%以下であったことから,手術器械の操作を自動取得する手法として,本システムは有効であることが示された.また,(2)新人看護師と熟練看護師の手術中の手術器械操作に関する情報取得を行い,操作方法の違いを検討した.特に,新人であるほど手術器械の本数や直前操作の残存器械などが多いと考えられる.さらに,手術進行に応じて使用する手術器械の使用傾向が取得できた.

平成30年度は,手術室内で取得した情報を用いて工程評価および技能分類を行う.また,器械出し技能の評価モデルを構築するため客観的評価手法を検討する.本年度の目的として,(1) RFIDタグ付き手術器械とその情報取得システムを開発し,臨床評価試験から手術中の手術器械情報を取得する,(2)定量評価手法による理想的な器械出し業務の抽出を行うため,統計的手法による工程解析の基礎的検討を行うこととした.(1)RFIDタグは個体識別ができることから,メイヨー台に載せられた手術器械の種類を特定できる.これまでに,本研究ではメイヨー台に載せて使用可能なアンテナを開発し,手術室内で手術器械情報の取得を試みた.本年度は,RFIDタグ付き手術器械の情報取得システムを用いて,乳腺外科手術15例において臨床評価試験を行った.操作者の看護師は5名であり,当初予定した熟練看護師だけでなく,新人看護師の操作状況も取得できた.一方で,ソケイヘルニア術式の情報取得においては,内視鏡下手術の適用が多いことから,モデル化のために必要なデータが十分に得られていない.来年度は,本年度に引き続き基礎データの取得を行うとともに,熟練看護師のモデル作成およびその有効性を検証する.(2)手術中に得られた手術器械情報から,各手術工程を4種類程度(切開,腫瘍摘出・検体提出,結果返却,縫合)に分けられることがわかった.さらに,器械出し業務の特徴量抽出では,手術器械の種類やメイヨー台上での滞在時間等をパラメータは現在検討中である.手術の進行状況に応じて,メイヨー台に載せられる手術器械の種類に一定の傾向が見られることから,特徴量のパラメータとして検証を行う.一方で,ビデオ撮影した動画から正解データの抽出を進めており,モデル作成については引き続き検討を進める.手術現場において,看護師が医師へ手術器械を効率的に受け渡しできることは,手術時間の削減や医療安全の向上に寄与する.本研究では看護師の手術器械操作の教育に着目し,操作方法の定量評価およびそれを基盤とした学習支援システムを提案する.具体的には,手術中の看護業務を定量的かつ自動的に計測・評価し,数学的解析手法を用いてモデル化を実現する.これにより,新人看護師は手術室以外での技能評価および器械出し学習を可能とし,医療安全と教育の質の双方の向上を目指す.本年度の成果として,(1)手術室内でRFIDタグ付き手術器械の自動認証を行うため情報取得システムを開発し,臨床評価試験を実施した.結果として,乳腺外科手術の4例,ソケイヘルニア手術で2例の情報取得を行った.これらの成果は投稿論文として発表した.さらに,(2)複数器械台でRFIDタグ付き手術器械の情報取得をおこなうためのアンテナを設計した.さらに,手術進行状況に関する状態遷移モデルを試作し,その仕様について検討した.2019年度は,手術中の作業モデルを改善し,そのモデルの評価を行う.国内外で手術中のワークフローを解析する手法は構築されているものの,手術器械(特に鋼製小物)を使用した研究はなく,新規性は高いと考えられる.さらに,技能評価手法と学習支援システムの有効性を検証し,これらの成果を論文としてまとめる.本年度の目的として,(1)機械学習を用いた器械出し技能の評価モデルの構築,(2) RFIDタグ付き手術器械を用いた器械出し業務の学習支援システムの開発を行うこととした.(1)手術室内でRFID
インドシナ半島におけるマカク属の進化:アカゲザルとカニクイザルを主として

アカゲザル(Macaca mulatta、以下Mm)とカニクイザル(M. fascicularis、Mf)はアジアに広く分布する、成功した種である。この2種は系統発生学的に近縁で、東南アジアの北緯15-20度付近に境界域をもっている。Mmの地理的変異集団は亜種ではなく、グループとして扱われ(Fooden,2000)、東・西グループはそれぞれ中国とインドを中心とする諸国に分布し、その間の識別徴は尾長しかない。中間地域のインドシナ半島のMm集団は、以前から、東西グループとは異なることが知られ、それに関して1)Mf(尾長は頭胴長の110-130%)から起源後、尾が短縮化していない古系統、2)Mfからの遺伝子浸透(introgression)を蒙った交雑集団とする二つの仮説がある。クラ地峡(北緯10°付近)以北に分布するM. f. fascicularis亜種にもMmからの遺伝子浸透が推測されている。これらの仮説の検証と、遺伝子浸透パターンの解明がこの研究課題の目的であり、以下の事実を明らかにした:1)交雑を疑わせる中間的形質状態を持つMmとMfはそれぞれ、ベトナム、ラオス、タイ(東北地方)の境界域に、クラ地峡以北に広く分布する。主としてミャンマーに分布するM. f. aurea亜種とその近くに生息するMmには、遺伝子浸透は形態面では示唆されない。2)遺伝子浸透のパターンはベトナムとタイ東北地方および近傍のラオスの間で異なる。これらの事実から、遺伝子浸透は更新世の氷期(乾燥・季節性気候)に祖先がレフュジアに逼塞していた時期に起こり、レフュジアの地理的広がりや隔離状態が両地域間で遺伝子浸透パターンに違いをもたらしたと考えられる。タイの西半地域とミャンマーでは、両種は同一のレフュジアに生息しなかった、或はレフュジア間で遺伝子流動(浸透)が存在しなかったと考えられる。インドシナ半島の調査対象諸国で、準備状況に応じて次のような調査・研究・研究協力体制の確立を行った。1.タイ:アンケート調査を実施し、回収された回答の分析結果に基づいて、東北地方と西地方での分布・実態調査を行い、これまでに報告されていない人づけされたブタオザル群の確認などの情報が得られた。Huai Kha Kaen野生生物保護区では調査許可を得て、生息実態調査を開始した。東北地方のバンサン小中学校とパッタナジット寺で、アカゲザル半野生群の捕獲調査を行い、それぞれ65頭、59頭より形態学・遺伝学・獣医学的データと資料を得た。これらのデータ・サンプルの分析を行い、一部を「霊長類研究」誌に報告した。来年度、開催するマカク多様性に関する国際シンポジウム準備を行った。2.ラオス:ナショナル大学理学部と京都大学霊長類研究所(PRI)の間で学術研究交流協定(いわゆるMoU)を締結し、分布・実態調査準備を開始し、マカクの写真・説明文などをもりこんだパンフレットの印刷などを行い、南部四県の対象地域に関する情報収集を行った。3.ミャンマー:ヤンゴン大学動物学科とPRIの間でMoUを締結すべく協議し、文書をヤンゴン大学当局へ提出した。短期調査をヤンゴン市近郊、および下ミャンマー地方(ヤンゴン・モンユワ間)で行い、マカクの分布と生息実態に関する情報を収集し、これまでに報告の無いマカク種の分布情報を得た。4.ベトナム:サイゴン動植物園とPRIの間でMoUを締結した。これにより、入境許可の必要な中部高原特別地域での調査が可能になる。短期調査を(1)ダナン・フエ・アルイ地域、

(2)中部高原地域(ダクラック・コンツム県など)で行い、5種マカクのおおよその分布状態についての情報を収集した。バングラデシュ:研究協力体制を確立すべく、ダッカ大学野生生物研究室とコンタクトをとり、意見交換を行っている。インドシナ半島の5カ国で、下記のよりなマカクに関する調査を行った。また10月にバンコクで本計画の分担者・協力者も参加した国際シンポジウムを開催し、現状と分析中間結果について発表・議論した。ワークショップで研究方法に関する実習を行った。1.ベトナム:南部海岸地方でカニクイザル3群を確定し、うち最南部のカマウ省で捕獲調査を行った。中部(北緯15-17度)海岸地方では、カニクイザルとアカゲザルの同所的分布情報が得られた。ラム・ドン省のDaLat大学農林学部スタッフと協議し、共同研究として同省を中心とする中西部高原地方高地地方のマカク分布に関する調査を開始した。2.ラオス:ナショナル大学生物学科スタッフ、栗田博之(協力者、大分市教育委員会)とともに中部から南部にかけて巡回調査を行った。アカゲザル、ベニガオザル、ブタオザルが主で、カニクイザルは最南部(北緯15度以南)にしか分布していないと思われる。由来の明確なペットマカクより遺伝資料を収集し、mtDNA塩基配列の予備的分析を行った。3.タイ:西部、南部で綿密な巡回調査を行った。そのうちラノン県のアンダマン海に点在する島々で、主としてミャンマーにしか分布しないアウレア亜種(カニクイザル)を見出し、さらに南部他地域でも基亜種との混血らしい個体を多く見出した。西部カンチャナブリ県でカニクイザル1群の捕獲調査を行った。4.ミャンマー:ヤンゴン大学動物学科と京都大学霊長類研究所との間で学術交流協定を締結し、本格的な調査を可能とした。中西部で広域巡回調査を行い(分担者の大井)、分布・生息実態情報を収集するとともに、4箇所で7群以上のアカゲザルを見出し、これらから遺伝解析用の資料を収集した。ヤンゴン大スタッフがカニクイザルの調査を継続している。5.バングラデシュ:予備調査として、研究協力校のダッカ大学動物学科が文献調査を行い、東南部・東北部の山岳森林にマカクの分布を認めた。ダッカ大学動物学科とジャハンギルナガール大学生物学科スタッフとともに、ダッカ市内および近郊の町で人と共存しているアカゲザルについて予備調査を行い、集団動態と遺伝特性の調査を開始した。調査対象5カ国で以下のような捕獲調査を行った。1.ベトナム:中部地方、チャム島で野生のマカク個体群を観察し、体色が上半身が灰色、下半身が黄色っぽいアカゲザルと同様のパターンであるが、尾が座高の約60-80%であり、頭顔部の毛並みがカニクイザルに似る、という両種の交雑を推測させる形態特徴を示した。これらの個体の糞を収集したので、遺伝的特徴の解明が期待される。2.ラオス:北部では、森林被覆率がかなり低下しているが、アッサム・アカゲ・ブタオ・ベニガオザルがテナガザルやラングールとともに広範に分布している。ペットアカゲザルの観察から、北部地域のアカゲザルは、同種の西グループに近い尾長を認めた。南部の調査から、カニクイザルはラオスの最南部にしか分布していないことが確かめられた。3.タイ:北部・西部でマカクの分布調査を行い、南部では4地域個体群、東部で1個体群の捕獲調査を行った。
絶滅危惧種ヤシャゲンゴロウを材料とした環境教育に関する研究

本研究は絶滅危惧種のヤシャゲンゴロウを用いた環境教育に関する研究を行った.まず,人工増殖技術の確立を目指した.本種は自然界では冷水域に生息し,温度環境が重要であると考えられた.また,幼虫のエサであるミジンコ類の確保も課題となった.さらに,ヤシャゲンゴロウを環境教育の材料として利用可能かどうか研究を行った.本種は小型水生昆虫類であるが,教材の工夫によって,大きな教育効果が得られることがわかった.本研究は絶滅危惧種のヤシャゲンゴロウを用いた環境教育に関する研究を行った.まず,人工増殖技術の確立を目指した.本種は自然界では冷水域に生息し,温度環境が重要であると考えられた.また,幼虫のエサであるミジンコ類の確保も課題となった.さらに,ヤシャゲンゴロウを環境教育の材料として利用可能かどうか研究を行った.本種は小型水生昆虫類であるが,教材の工夫によって,大きな教育効果が得られることがわかった.ヤシャゲンゴロウは,ゲンゴロウ科の「種の保存法」対象の水生コウチュウ類の1種である.当然,絶滅の危機にある.その最大の要因は,元々の自然分布域が福井県南越前町の夜叉が池のみに限定されることにある.その夜叉が池で,ヤシャゲンゴロウの幼虫の餌であるケンミジンコが近年著しく減少しているが,その原因も特定できていない.そこで,プランクトンネットを利用したケンミジンコ類の相対的個体数のモニタリング調査を10月に行った.その結果,56年前と比べ1リットルあたりのケンミジンコ類の個体数が,1/10程度に激減していることがわかった.また,コドラートを用いた成虫の個体数調査による,池全体のヤシャゲンゴロウの個体数の推定値は数百頭であり,絶滅のリスクが下がっていないことが判明した.夜叉が池が位置する国有林を管轄する農林水産省森林管理署が,常時水温を測定し,水質調査を定期的に行っている.それらからは,温暖化による影響や水質悪化などの影響は検出されておらず,ケンミジンコ類が減っている原因は,未だ不明である.これらの状況をふまえ,本年度は南越前町にある南条小学校と今庄小学校で,ヤシャゲンゴロウを材料とした出前講義を行った.うち南条小学校は,12年の低学年を対象にした授業を行った.児童たちの学習進行度は,昆虫の基本的な知識を,まだ授業で習っていない段階であったが,地方に位置する小学校児童と言うことで,都市部の児童と比べて,経験的に多くの昆虫の情報を持っていた.ヤシャゲンゴロウは決してメジャーな昆虫ではないが,温暖化や絶滅危惧と言う用語を避けつつ,平易な単語で説明すると,かなりの理解を得られたものと考えられた.たとえ,マイナーな生物であっても,地元の材料であれば,児童達はそれをきっかけとして,環境問題に強い関心を抱くことが解った.本年は,種の保存法対象種であるヤシャゲンゴロウの環境省助成による人工増殖が始まって,5年目である.しかし,昨年までには全く見られなかった卵期におけるカビの大量発生により,羽化した成虫数は,ほとんどなかったと言う事態に追い込まれた.写真を撮って菌類の専門家に同定を依頼したが,カビの培養を行わない限り,種の確定はできないことが判明した.カビの発生理由は,よくわからなかったが,成虫自体が保菌者と言う可能性もあるため,来年度の人工増殖時には,塩浴の実施を試み,カビ対策に全力を挙げることを決定した.本年度は,記録的な猛暑・残暑の年となったが,自然条件下におけるヤシャゲンゴロウの個体数や,幼虫時の主要な餌であるミジンコ類の発生量については,昨年度に近い個体数を維持していたと思われる.また,ハイイロゲンゴロウやミズカマキリなどのかつては見られなかった平地性水生昆虫類の侵入が,近年確認されるようになっていたが,本年度は,特にその傾向が強くなったと言うことは見られなかった.前述の通り,本年度は,羽化成虫が極端に少なくなったため,当所予定していた,地元小学生を,人工飼育場に招いた環境教育は断念し,翌年度以降に使用する教育用テキストの作成を行った.各地の図書館で,様々な環境教育資料を調査したが,最も簡潔でなおかつ子供達の理解を高めるのは,写真入り下敷きであるとの結論に達した.そこで,本年度は,ヤシャゲンゴロウの生態を紹介し,その保全を訴える下敷きを試作した.他の普及啓発用の下敷きを参考とし,ヤシャゲンゴロウに加えて,他の関連水生動物の写真を多く使用した下敷きが完成した.来年度は,これを配布した環境教育の試験的実施を行う予定である.1)確立した人工増殖技術の向上世界で,福井県南越前町にしか生息しないヤシャゲンゴロウは,種の保存法対象種に指定されている絶滅危惧種である.その自然個体群は著しく減少しており,絶滅のリスクを回避するためにも,人工増殖技術の確立は急務である.平成22年度までに行われていた人工増殖で,最も大きな問題となっているのが,幼虫時の死亡率や蛹化の失敗率の高さであった.しかし,平成23年度は初夏に幼虫の餌であるミジンコ類の大量死があったものの,代替の餌を利用することで,幼虫の死亡数を低く抑えことに生息した.

蛹化の成功率も高くすることができたが,その反面,羽化後の新成虫の越冬失敗率が高く,人工増殖技術は完成したとは言えない状況である.2)科学&環境教育カリキュラムに組み込むための教材化の研究ヤシャゲンゴロウは,地元ではシンボル的な存在であり,希少種であるとの認識は,多くの住民や小中学生の間であるが,旧北区のAcilius属(ヤシャゲンゴロウが含まれる属)の最も南限に生息すると言う生物地理学的な重要性や,行動の特異性などはほとんど知られていない.平成22年度と同様,本年度も,わかりやすいカラー写真をもとにした教材用の下敷きを作成した.そして,本年は,各地の図書館や環境教育分野を持つ国内他大学が所有する参考資料を収集し,国内研究機関が持つ生物標本を調査し,さらに,本年度の野外調査の結果を基として,教材の改良を行った.また,23年秋に名古屋市で開かれた生物多様性条約の国際会議で展示するヤシャゲンゴロウの紹介映像を,地元ケーブルテレビ局と共同で作成した.この映像資料などを中心とし,地元小学生を対象とした環境教育施設「ヤシャゲンゴロウ資料館」(仮)の準備に取り掛かった.この資料館は,24年度初夏以降に公開できる予定である.種の保存法対象種であるヤシャゲンゴロウの自然個体群は著しく減少している.絶滅のリスクを回避するためにも,人工増殖技術の確立は急務である.これまでの飼育で大きな問題となっていたのが,幼虫時の死亡率や蛹化の失敗率の高さであった.蛹化の失敗については不明な点がいまだに多いが,幼虫の大量死亡の大きな原因は,餌不足である.平成24年度は,餌であるミジンコの大量養殖が順調であり,また河川性の淡水魚の稚魚の活用もできた.ヤシャゲンゴロウの幼虫の飼育に関してはだいたいめどがついた状況であるが,冬季越冬中に成虫が多く死ぬことがあり,飼育技術についてはまだ改善の余地を残す.野外個体群の調査も行われた.平成24年度は従来のコドラート法のほか,水中カメラによる撮影法の採用も検討された.コドラーと法による個体数推定の精度はあまり高いとは言えないが,ヤシャゲンゴロウの自然個体群はおおよそ1000頭以下で構成されると推計される.もともと予定していた全頭捕獲については,関係省庁との協議が終了せず,残念ながら以降に持ち越しとなった.種の保存法対象種なので,調査に関する制限は厳しいものがある.ヤシャゲンゴロウの環境教育への活用としては,昨年度までの配布物等の教材のほか,同種の飼育施設をミニ資料館として整備することが進められている.同種の生態紹介パネルの作成や巨大模型などが展示されている.各地の図書館等で文献調査を行い,他地域における希少種を利用した環境教育の事例と比較を行った.一部の鳥を除き,種の保存法対象種が大量に飼育され,なおかつ生体展示されているところはヤシャゲンゴロウ以外にはほとんど事例がない.今回の試みは希少種保全と環境教育の両面から見て貴重な成果をあげることができた.本年は,初夏に,ヤシャゲシゴロウの幼虫の餌となるミジンコの大量死があり,得られた人工増殖個体数は多くなかった.しかし,環境教育用の施設開館にめどが立つなど,大きな進展が見られた.24年度が最終年度であるため、記入しない。環境教育の充実には,教育委員会を管轄する地元自治体の協力が不可欠である.地元自治体の理解はあるが,財政的な支援が得られているとは言い難い.それは,ヤシャゲンゴロウが国指定の種の保存法対象種と言うことで,国依存の傾向があるからである.本研究を完成させ,環境教育の材料として,本種が確実に活用できれば,この状況が打破できるものと考えられる.24年度が最終年度であるため、記入しない。
マウスモデルを用いた歯科用重金属における遅延型アレルギー反応の病態解明

これまで金属アレルギーの診断はパッチテストが主とされているが,単一の金属溶液のみならず複数の金属溶液に陽性反応を示すいわゆる交差反応が起こることが多く必ずしも臨床症状を反映していないことが多い.この交差反応をマウスで行っている実験の報告はあるがいずれも腫脹の評価のみであり,アレルギーの主体であるT細胞の詳細な解析を行っている報告はない.そこで,金属アレルギーモデルマウスを用いて異種金属間での交差反応に関与するT細胞のTCRを詳細に解析することで,複数の金属から成る歯科用金属材料のアレルギー発症に関与するT細胞の抗原特異的な免疫応答を解明することを目的とした.感作Pd-誘導Ni群,感作Pd-誘導Cr群,感作Ni-誘導Pd群,感作Ni-誘導Cr群,感作Cr-誘導Ni群,感作Cr-誘導Pd群の金属アレルギーマウスモデルを作製した.経時的な足底部腫脹の変化を測定した.足底部腫脹は,誘導後1日後に最大となった.感作Cr-誘導Pd群・感作Ni-誘導Pd群・感作Pd-誘導Cr群・感作Ni-誘導Cr群の抗CD4抗体および抗CD8抗体を用いた免疫組織化学的検討を行ったところ,4つすべての群で,上皮内および上皮化結合組織に,CD4陽性T細胞の浸潤を認めた.また,これら4群の局所炎症巣での炎症性サイトカイン・T細胞関連因子のmRNA発現量の定量解析をReal time PCR法を用いて行った.その結果,感作Cr-誘導Pd群と感作Ni-誘導Pd群において,TNF-α・IL-4・IL-5・IL-6・Granzame AおよびGranzame Bの有意な発現量の増加を認めた.感作Cr-誘導Pd群と感作Ni-誘導Pd群の局所炎症巣に浸潤しているT細胞のTCRレパトア解析を次世代シークエンサーを用いて行った.その結果,両群ともにiNKT細胞および複数の同一塩基配列をもつTCRが認められた.金属アレルギーの診断はパッチテストが主とされているが,単一の金属溶液のみならず複数の金属溶液に陽性反応を示すいわゆる交差反応が起こることが多く,必ずしも臨床症状を反映していないことが多い.この交差反応をマウスで行っている実験の報告はあるがいずれも腫脹の評価のみであり,アレルギーの主体であるT細胞の詳細な解析を行っている報告はない.そこで本研究では,金属溶液の膝窩リンパ節への感作,および感作で使用した金属溶液とは異なる種類の金属溶液を足底部へ注射することで誘導を行い金属アレルギー交差反応マウスモデルの製作し,異種金属間での交差反応に関与するT細胞のTCRを詳細に解析することで,複数の金属から成る歯科用金属材料のアレルギー発症に関与するT細胞の抗原特異的な免疫応答の解明することを目的とした.本年度は,感作パラジウム(以下Pd)-誘導ニッケル(以下Ni)群,感作Pd-誘導クロム(以下Cr)群,感作Ni-誘導Pd群,感作Ni-誘導Cr群,感作Cr-誘導Ni群,感作Cr-誘導Pd群の金属アレルギーマウスモデルを作製し,経時的な足底部腫脹の変化,病理組織学的ならびに免疫組織化学的検討を行った.足底部腫脹は,誘導後1日後に最大となり,7日後にむかい経時的に減少を認めた.最も腫脹を認めたのは,感作Niー誘導Cr群であり,続いて感作Crー誘導Pd群であった.HE染色において,感作Cr-誘導Pd群・感作Ni-誘導Cr群・感作Ni-誘導Pd群・感作Pd-誘導Cr群に表皮の海面状浮腫や肥厚を認めた.抗CD3抗体を用いた免疫組織化学的解析では,感作Cr-誘導Pd群・感作Ni-誘導Pd群・感作Pd-誘導Cr群において,表皮および皮下組織へのCD3陽性T細胞浸潤を認めた.一方,感作Pd-誘導Ni群・感作Ni-誘導Cr群・感作Cr-誘導Ni群では,CD3陽性T細胞浸潤は殆ど認められなかった.平成28年度に予定していた金属アレルギー交差反応モデルマウスの作製・足底部腫脹測定・病理組織学的および免疫組織化学的解析まで終了しているため.これまで金属アレルギーの診断はパッチテストが主とされているが,単一の金属溶液のみならず複数の金属溶液に陽性反応を示すいわゆる交差反応が起こることが多く必ずしも臨床症状を反映していないことが多い.この交差反応をマウスで行っている実験の報告はあるがいずれも腫脹の評価のみであり,アレルギーの主体であるT細胞の詳細な解析を行っている報告はない.そこで,申請者が製作した金属アレルギーモデルマウスを用いて異種金属間での交差反応に関与するT細胞のTCRを詳細に解析することで,複数の金属から成る歯科用金属材料のアレルギー発症に関与するT細胞の抗原特異的な免疫応答の解明することを目的とした.本年度は,感作Cr-誘導Pd群・感作Ni-誘導Pd群・感作Pd-誘導Cr群・感作Ni-誘導Cr群の抗CD4抗体および抗CD8抗体を用いた免疫組織化学的検討を行った.その結果,4つすべての群で,上皮内および上皮化結合組織に,CD4陽性T細胞の浸潤を認めた.一方,CD8陽性T細胞の浸潤は殆ど認めなかった.また,これら4群の局所炎症巣での炎症性サイトカイン・T細胞関連因子のmRNA発現量の定量解析をReal time PCR法を用いて行った.

その結果,感作Cr-誘導Pd群と感作Ni-誘導Pd群において,TNF-α・IL-4・IL-5・IL-6・Granzame AおよびGranzame Bの有意な発現量の増加を認めた.感作Pd-誘導Cr群・感作Ni-誘導Cr群では,FAS Lの有意な発現量の増加を認めた.金属アレルギー交叉反応モデルマウスの製作・足底部腫脹側底・病理組織学的および免疫組織化学的解析・Real time PCR法による局所炎症巣での炎症性サイトカイン・T細胞関連因子のmRNA発現量の定量解析まで終了しているため.これまで金属アレルギーの診断はパッチテストが主とされているが,単一の金属溶液のみならず複数の金属溶液に陽性反応を示すいわゆる交差反応が起こることが多く必ずしも臨床症状を反映していないことが多い.この交差反応をマウスで行っている実験の報告はあるがいずれも腫脹の評価のみであり,アレルギーの主体であるT細胞の詳細な解析を行っている報告はない.そこで,金属アレルギーモデルマウスを用いて異種金属間での交差反応に関与するT細胞のTCRを詳細に解析することで,複数の金属から成る歯科用金属材料のアレルギー発症に関与するT細胞の抗原特異的な免疫応答を解明することを目的とした.感作Pd-誘導Ni群,感作Pd-誘導Cr群,感作Ni-誘導Pd群,感作Ni-誘導Cr群,感作Cr-誘導Ni群,感作Cr-誘導Pd群の金属アレルギーマウスモデルを作製した.経時的な足底部腫脹の変化を測定した.足底部腫脹は,誘導後1日後に最大となった.感作Cr-誘導Pd群・感作Ni-誘導Pd群・感作Pd-誘導Cr群・感作Ni-誘導Cr群の抗CD4抗体および抗CD8抗体を用いた免疫組織化学的検討を行ったところ,4つすべての群で,上皮内および上皮化結合組織に,CD4陽性T細胞の浸潤を認めた.また,これら4群の局所炎症巣での炎症性サイトカイン・T細胞関連因子のmRNA発現量の定量解析をReal time PCR法を用いて行った.その結果,感作Cr-誘導Pd群と感作Ni-誘導Pd群において,TNF-α・IL-4・IL-5・IL-6・Granzame AおよびGranzame Bの有意な発現量の増加を認めた.感作Cr-誘導Pd群と感作Ni-誘導Pd群の局所炎症巣に浸潤しているT細胞のTCRレパトア解析を次世代シークエンサーを用いて行った.その結果,両群ともにiNKT細胞および複数の同一塩基配列をもつTCRが認められた.免疫組織化学的解析において,T細胞浸潤を著明に認めた感作Cr-誘導Pd群・感作Ni-誘導Pd群・感作Pd-誘導Cr群の抗CD4および抗CD8抗原の免疫組織化学的解析の追加を行う予定である.平成28年度に作製した金属アレルギー交差反応モデルマウスは,複数回誘導しているため,誘導回数を1回にした場合の足底部腫脹測定・病理組織学的および免疫組織化学的解析を行う予定である.適切な感作・誘導回数が決定次第,浸潤しているT細胞に対して,次世代シークエンサーを用いたT細胞受容体のレパトア解析やReal time PCR法による局所炎症巣での炎症性サイトカインおよびT細胞関連因子のmRNA発現量の定量解析を行う計画である.本年度は次世代シークエンサーを用いたT細胞受容体のレパトア解析および,研究成果の学会発表,論文投稿を予定している.金属アレルギー交差反応モデルマウスの条件検討(適切な感作および誘導回数)を行ったため次年度使用額が生じた.金属アレルギー交叉反応モデルマウスの条件検討を行ったため,次年度使用額が生じた.平成30年度の消耗品購入に充てる予定である.金属アレルギー交差反応
ピロリ菌固有の独自進化した細胞分裂システム（細胞死含）とその病原性の解明

ピロリ菌固有の細胞分裂機構の解析をminC,D,E遺伝子を中心に行った。MinC,D,Eは形態形成(伸長化)の制御に関与していた。さらに、各遺伝子破壊株を作成し免疫染色(FtsZ抗体)にて比較解析した結果、MinCはFtsZの凝集(Z-ring polymerization)に関与しMinDはnucleic occlusion制御作用を有すると考えられた。MinEはFtsZの局在や凝集に影響は与えなかったが、coccoid形成には重要な役割を担っていると思われた。また、遺伝子多型性に関与していると思われるピロリ菌ファージ(球形ファージ)を世界で最初に発見し報告した。ピロリ菌の細胞分裂機序を解明する目的でminとftsZ遺伝子を中心に解析している。H24年度に各min遺伝子の作用機序を形態・増殖・分裂において解析し幾つかの知見を見出した。H25年度はピロリ菌体内での各Min蛋白(MinC, D, E)とFtsZ間の分子相互作用を解析した。先ず野生株HPK5の遺伝子情報を基に各遺伝子をクローニング、His融合蛋白を作成しウサギ免疫にて各4種類の抗体(MinC, D, E, FtsZ)を作成した。それら各抗体を使用してHPK5株を中心に免疫沈降後にウエスタンブロット解析を実施し各分子間の菌体内動態(結合)を証明した。興味深いことに、FtsZと各Min蛋白の結合は強固であったが、各Min蛋白間同士の結合はFtsZに比べると弱く、このような報告は認められない。これらの現象を再確認しながら生物学的意義を検証している。また、各min遺伝子破壊株での分子間結合性及び精製した各His融合蛋白を使用した菌体外での分子間作用(介在分子の必要性の有無等の確認)についても解析している。ピロリ菌は他細菌よりもgenetic diversityが強く機能不明遺伝子も多い。胃内に定着する本菌の増殖様式や細胞分裂も全く不明である。我々が見出したピロリ菌固有のcdrA遺伝子は細胞分裂に関与することが示唆された。一方で正常な細胞分裂に必要で、かつ広く菌種間で保存されている分裂関連遺伝子(ftsZ, minC, minD, minE)もピロリ菌には存在しており、それらのピロリ菌体内での作用機序とcdrA遺伝子機能との関連性も考慮しながら解析を進めている。数株のピロリ菌からminC, minD, minEをクローニングし、その塩基配列を大腸菌と比較した結果、minCは20%程度、minDとminEでも50%程度の相同性しか認めなかった。ピロリ菌株間では90%以上の高い相同性を示した。ピロリ菌の細胞増殖・分裂における各遺伝子機能を解析するためHPK5株で各遺伝子(minC, minD, minE)の破壊株をKmrとCmr遺伝子挿入により作成した。全ての破壊株で菌体は有意に伸長化するがΔminE株はその中でもあまり伸長化しなかった(ΔminD株が最も伸長化)。しかし、定常期以降で出現するcoccoidの出現が遅延しCFUも確認された。また全株とも分裂は行われていたが、電子顕微鏡観察でその分裂部位がΔminC株とΔminD株では大きく中心部からずれており、分裂部位の制御が破綻していると考えられた。以上より、3遺伝子とも菌体長軸形成に影響すると共に、minEはcoccoid形成、minCとminDは分裂部位の制御に関与すると思われ大腸菌とは全く異なる作用機序と考えられた。さらに、double破壊株(minCDとminDE)が作成できたので、ftsZやcdrAと共に本菌固有の細胞分裂について詳細な機能解析を進める。胃内に持続感染するピロリ菌はgeneticdiversityが強く機能不明遺伝子も多く、増殖様式や細胞分裂機序も不明である。我々が発見した本菌固有cdrA遺伝子が存在する一方、分裂関連遺伝子(ftsZ, minC, minD, minE)も存在する。そこで、それらのピロリ菌体内での作用機序を解析した。各min遺伝子破壊株を作成し比較解析(形態・増殖・CFU)した結果、全破壊株で有意に菌体が伸長化した(ΔminD株が最も伸長化)。ΔminE株は定常期以降のcoccoid出現が遅延しCFUも確認された。全破壊株とも増殖・分裂は野性株と同様だが、電子顕微鏡観察でΔminC株とΔminD株は分裂部位が中心を外れていた。すなわち、3遺伝子とも菌体長軸形成に影響し、さらにminEはcoccoid形成、minCとminDは分裂部位の制御に関与すると考えられた。さらに、double破壊株(minCDとminDE)は著しいviabilityの低下を認め菌体の生命維持に影響した。

各抗体(His融合蛋白を作成し抗原として使用)を作成して菌体内の分布および分子間相互作用を解析した。免疫沈降ウエスタンブロット解析からFtsZと各Min蛋白の菌体内結合を証明しMin蛋白間でも菌体内結合を認めた。これらの分子間結合における他の介在分子の必要性は今後の解析が必要である。H26年度は特に免疫染色にて各Min蛋白とFtsZの菌体内分布を解析した。ΔminE株は野生株と同様であった。ΔminC株は野生株とほぼ同位置にFtsZはリクルートするが強い凝集は見られずdiffuseしていた。ΔminD株は染色体の存在に無関係で菌体内全体にdisperseした。以上より、MinCはFtsZの凝集(Z-ring polymerization)に関与しMinDはnucleic occlusion制御作用を有すると考えた。臨床検査医学(微生物・感染症学)ピロリ菌の細胞分裂に関する報告はなくゲノム解析による機能予測だけであったが、我々の解析によりピロリ菌のminシステムの作用は形態・増殖・分裂やFtsZ局在制御の点で大腸菌とは全く異なる可能性を示した。さらに、それら蛋白のHis融合蛋白を作成しウサギ免疫にてようやく4つの抗体を作成することができた。これによりピロリ菌体内での分子相互作用(結合性)の解析が進み、免疫沈降ーウエスタンブロット解析にて各蛋白間の分子相互作用を証明した。その結果、これまでに報告のない興味深い知見を得た(上記概要で記載)。ピロリ菌の細胞分裂に関する報告はなくゲノム解析による機能予測だけであったが、我々はピロリ菌固有の細胞分裂の機序を解明しつつある。現在までに、概要に記述したように、ピロリ菌のminシステムの作用は大腸菌とは全く異なる可能性を示した。minC, D, Eは共に正常形態形成に必要であることが判明したが、特にminEがピロリ菌のcoccoid(球状化)に関与する可能性はその生物学的動態(「生」と環境応答による「死」あるいは「休眠」)や感染様式の解明に重要な知見である。また電子顕微鏡学的解析により、minEは分裂部位の制御には関与せず、minCやminDが関与することはこれまでに報告がなく、ピロリ菌固有の細胞分裂機序を除々に明らかにしている。さらに解析を進めるために複数の遺伝子破壊株の作成に取り組み、予想以上に時間を費やしたが、想定外の電子顕微鏡解析を実施するなど計画以上の進展もあった。得られた知見・結果をさらに検証・解明するために各遺伝子破壊株(特にminC, D, E遺伝子破壊株)を使用し、分子間相互作用を野生株と比較して解明を進めている。また、菌体内と菌体外(精製蛋白使用)での分子相互作用を比較することによりそれらの作用に関与あるいは介在する分子の存在等を明らかにする予定である。複数の遺伝子破壊株が作成できたため、ピロリ菌におけるminシステム(minC, D, E)の固有の作用機序を詳細に解析する。また、各遺伝子破壊株にてFtsZとCdrAの発現や細胞内局在の解析を行いminシステムとの分子相互作用の解析を予定通りに進める方針である。今年度の計画実施自体はほぼ予定通りに順調に進行した。しかし、初年度のピロリ菌における複数の細胞分裂関連遺伝子を変異させた破壊株の作成に予想以上の時間を費やしやや遅れた影響で、遺伝子破壊株での分子相互作用の解析が途中であり、繰越金が生じた。
心血管細胞内Caイオン代謝蛋白の細胞工学的および遺伝子工学的解析とその臨床応用

現在心筋および血管平滑筋細胞内Ca動態を規定する各種Caチャンネル、CaポンプであるCaATPaseおよびNa^+-Ca^<2+>交換体を遺伝子レヴェルで解析するためその準備を進めているが、まだその結果を供覧する段階に至っていない。本報告では並行して行っている血管平滑筋内Caストアの筋小胞体からのCa2+の放出機構の発現機構に関する研究の進展を報告する。この研究の背景には心筋と血管のCa^<2+>調節系には現在大きな相違は報告されていないので実験結果の解析の容易な血管平滑筋を用いて得られる結果は将来の心筋を用いる研究の重要なヒントとなると予想される。今回血管作動性物質としてエンドセリンー1(ET)を用いた。ごく最近の薬理学実験と遺伝子工学を用いた実験により心筋自身に対しETー1が陽性変力作用と変時作用を示し、また固有の受容体が心筋に発現しており、ETー1が何等かの作用を心にする事は確実であろう。またETは電位依存Caチャンネルに直接作用すると当初考えられたが、その後直接作用は無く、特有の受容体とIP_3による細胞内情報伝達系を介して細胞内Ca^<2+>濃度を変化させると現在考えられている。【方法および結果】細胞内のCa^<2+>の二次元観測法の詳細は既に昨年度報告した。今回は血管平滑筋が細胞増殖や分化の過程でその表現型が変わる事に注目し、(1)細胞分裂を極めて遅くするため0.5%のウシ胎児血清(FCS)を含む培養液、(2)この中の成長因子などを完全に取り除くため、全く血清を含まず、代わりにインシュリン等を含んだ完全無血清培養液、および(3)この系にPDGFを10ng/ml含んだ培養液の3種類の系でエンドセリン(ET)、バゾプレッシン(V)および40mMのK脱分極刺激を行った。なお今回も細胞内Ca^<2+>の筋小胞体(SR)からの放出機構を解析するために前2者では細胞外液に生理的な1mMのCa^<2+>が存在する場合と、Ca^<2+>を外から加えず、かつCa^<2+>を完全にキレ-トするために1mMのEGTAを加えた場合を用いた。K刺激の時には電位依存性Caチャンネルの機能を確認し、かつ一端SRから放出されたCa^<2+>をSRに再度取り込ませる目的で1mMのCa^<2+>共存下で行った。【結果の要約および考案】(1)FCSを0.5%含む培養液で2日間培養後ETには細胞外にCa^<2+>が存在する時は全ての細胞が反応したが、その様式にはET添加後一過性の細胞内Ca^<2+>の上昇相を示した後、平坦な相の2種の反応を呈する群を約半数の細胞が示し、残りの半数の細胞は一過性の相を呈さず、後の平坦相のみ呈した。(2)細胞外にCa^<2+>が存在しない時は一過性の反応のみ呈する約半数の細胞と全く反応しない約半数の細胞とが同一視野内に共存した。次に細胞外に1mMのCa^<2+>が存在し、かつ電位依存性Caチャンネルの阻害薬であるジルチアゼム30myuuM共存する時は、先の細胞外にCa^<2+>の存在しない時と全く同様一過性のCa^<2+>の上昇を示す細胞と示さない無反応の細胞とが共存した。以上から(1)最初の一過性の反応は細胞内のSRから放出されるCa^<2+>の放出を、(2)次の平坦相は、電位依存性Caチャンネルを通過して細胞内に流入するCa^<2+>を観測していると考えた。そして(3)その両方のCa^<2+>動員系は約半分の細胞が占め、残りの半数は電位依存性Caチャンネルのみ有していると考えられた。次に細胞の分化の影響を観察するため、完全無血清培養液で細胞分裂を完全に阻止した場合、95%以上の細胞がETに反応し、PDGFを加えて増殖を起こさせた場合は全ての細胞が全く反応しなくなった。この際だった細胞のCa反応はETに対して選択的に示され、その他のK脱分局による電位依存性Caチャンネルによる細胞内へのCa^<2+>流入の系やETと同じ細胞内信号伝達にIP_3を介すると考えられているVの場合には、こうした細胞周期の影響を全く受けず、無血清培養液でもPDGFの存在する時でも殆ど全ての細胞が反応を呈した。従ってETに対しては無反応でも電位依存性CaチャンネルとIP_3の動員系は完全に保持している事が示された。細胞工学的な実験は順調に進み、心筋細胞由来のCaチャンネル蛋白の分離・精製と、これを人工脂質膜のリポソ-ムに再構成してその機能を同定することができた。また組織培養平滑筋の細胞内Caイオン