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20世紀のイエズス会人文主義思想の展開－B.ロナガンの倫理・教育思想を中心に―

本研究では、20世紀の代表的なイエズス会神学者、哲学者の一人であるバーナー・ロナガンの思想の中でも、特に倫理思想・教育思想の発展可能性に注目してきた。最終年度では、1)「倫理における方法」、2)「歴史」と「世界」観、3)北米でのイエズス会教育の動向を軸に据え、ロナガンに見られるイエズス会の人文主義思想の特徴を描き出すことを目指した。1)前年度の研究課題2で扱った、「倫理的であることを明確にする三つの問い」の内、第三番目の「倫理的であることによって何がもたらされるのか」という問いに取り組んだ。先行研究を参照しつつ、特にロナガンがMethod in Theologyにおいて展開した「神学における方法」の「倫理における方法」への応用可能性に特化した形で検証した。2)イエズス会ならでは成しえた正義の促進に重点をおいた人文主義の展開の独自性の一端を、いかにロナガンの「歴史」と「世界」観の内に見出すことができるかという問いに取り組んだ。ロナガンが、どのような思想的遍歴を経て、「本性」を重視した従来のアリストテレス及びトマス・アクイナス的パラダイムを継承しつつも、近代以降の「歴史」理解と、「自然科学」的方法論とを統合することを試みたかを考察した。そこで、ロナガンが倫理的な「識別」のプロセスにおいて、人間の「本性」的あり方のみならず「世界」の「進化」のプロセスを見据えている点を浮き彫りにした。3)ロナガンの倫理思想が21世紀のイエズス会教育へ与えうる影響について、「社会正義」という観点から検証した。本研究では、特に北米のイエズス会が展開している中等教育の中でも、特に最新の動向として注目されているChrist Rey Schoolsに焦点をあて、そこで展開されている「社会正義」の実践を、ロナガンが展開した「人間的善」の構造理解を手掛かりに分析する試みをした。平成30年度が最終年度であるため、記入しない。初年度は、20世紀の代表的なイエズス会神学者、哲学者の一人であるバーナー・ロナガンの思想の倫理思想・教育思想の検証の基礎となる「認識論」の展開可能性について以下の三つの点から検証した。a)ロナガンの認識論に内包される「倫理思想」と「教育思想」の特徴を明確する為に、主著であるInsightとMethod in Theologyの翻訳と分析を行った。加えてロナガンの認識論における倫理思想の発展可能性について論じている先行研究の収集と分析を行った。b)a)での取り組みを土台として、1)認識者としてのあり方を問う三つの問い:「私は認識している時に何をしているのか(認知理論)」、「なぜそれらの行為をすることが認識なのか(認識の客観性)」、「それらの行為をなす時、私は何を知るのか(形而上学)」と、パラレルな形で措定されている人間の行為者としてのあり方を問う問い、つまり「私が倫理的である時、何をしているのか」,「なぜそれらの行為をすることが倫理的なのか」,「倫理的であることによって何がもたらされるのか」という三つの問いの有意性について検証した。2)さらに「Emergent probability(創発的蓋然性」という自然科学的概念を基にしたロナガン固有の進化論的な世界観・歴史観の倫理への応用可能性について考察した。c)イエズス会の霊性史の中でのロナガンの思想の位置づけを探る為の下準備に取り組んだ。その最初の手掛かりとして、日本人イエズス会であり哲学者である門脇佳吉が展開した禅仏教とキリスト教との対話の姿勢をロナガンの認識論に照らし合わせて検証した。申請書に明示した研究計画に基づき、以下の三つ研究項目、1)認識者としてのあり方を問う三つの問いとパラレルな形で措定されている人間の行為者としてのあり方を問う問いについて、2)「Emergent probability(創発的蓋然性」の内にみられる倫理思想の萌芽について、3)20世紀のイエズス会霊性について、それぞれ学会等で口頭発表を行い、次年度の研究のための下準備を行うことが出来た為。

3)ロナガンの倫理思想が21世紀のイエズス会教育へ与えうる影響について、「社会正義」という観点から検証した。本研究では、特に北米のイエズス会が展開している中等教育の中でも、特に最新の動向として注目されているChrist Rey Schoolsに焦点をあて、そこで展開されている「社会正義」の実践を、ロナガンが展開した「人間的善」の構造理解を手掛かりに分析する試みをした。申請書に記載した研究項目に沿って文献・資料の分析・研究を継続し、その結果を学会・研究会等で発表していくが、その一部を博士論文としてまとめ提出する予定である。また特に北米を中心とした高等教育の中で、ロナガンの思想に感化された教育者の動向(実践的取組と文書)を調査し、ロナガンの思想の最新の現代的解釈を探る予定である。平成30年度が最終年度であるため、記入しない。
遺伝子治療による糸球体硬化抑制に関する実験的研究

【目的】末期腎不全に共通する腎病理像は糸球体硬化と尿細管・間質の線維化で、不可逆性変化とされている。HGF(肝細胞増殖因子)は線維化を促進するTGF-βに拮抗し、尿細管細胞の再生を促進させる。尿細管・間質線維化ラットモデルを用いて将来の臨床応用の前段階としてヒトHGF遺伝子治療を施行した。【対象と方法】1.腎尿細管間質線維化モデルの作成一側尿管結紮ラットを作成し、腎機能、腎組織を結紮後2週と4週で検索する。in situ hybridizationを用いて組織内におけるHGF, c-metのmRNAの発現とその局在についてPCR法を用いて確認する。HGFのレセプターであるc-metの発現も確認し、成長因子であるHGFの作用機序を推測する。抗HGF抗体、αSMA抗体,抗マクロファージ抗体を用いて腎間質の線維化抑制,マクロファージの浸潤抑制を確認する。3.HGF遺伝子治療ヒトHGF遺伝子をHVJ-リポゾーム法を用いて、一側尿管結紮ラットに週1回、4回筋注する。【結果】1.遺伝子治療ラットでは、腎内の内因性ラットHGFとその受容体であるc-metの発現を増加させた。2.遺伝子治療ラットでは対照群に比し、腎間質の線維化とマクロファージの浸潤が有意に抑制された。3.結紮後2週、とくに4週後では尿細管細胞の増殖が亢進し、アポトーシスが抑制された。4.アポトーシス抑制機序はBclXL, Baxによるとの従来の報告と異なり、Bcl2が主と推測された。【結論】HGF遺伝子治療は慢性閉塞性腎症において尿細管細胞の生存率を高め、尿細管・間質の線維化の進行を抑制する。目的:平成12年度はHGF(Hepatocyte growth factor)遺伝子治療が一側尿管結紮ラットモデルで、腎尿細管・間質の線維化を抑制し得るかを検討する。方法:SDラットの左側尿管を完全結紮した後、リポゾーム法を用いてHGF遺伝子(40μg)を毎週1回筋注した。結紮2週、4週後に屠殺し、対照群と比較した。検討項目は光顕所見(PAS,PAM,Masson染色)、免疫染色と組織蛋白量(α-SMA、PCNA,ED-1,HGF,OPN,MCP-1)、RNAレベル(RT-PCR法あるいはin-situハイブリダイゼーション法)である。結果:治療群では血清HGFの上昇と尿細管・間質でのHGFとその受容体であるc-METの発現が増強した。結紮後2週の組織では光顕での変化や各種サイトカインに対照群と著変は認めなかったが、結紮4週後ではα-SMAの組織でのタンパク量は非治療群では7倍増加していた。また、マクロファージの間質への浸潤は治療群で著明に減少し、PCNA蛋白量は増加していた。MCP-1,OPNのmRNAレベルは治療群で著明に減少していた。結論:HGF遺伝子治療は一側尿管結紮ラットモデルで腎間質の線維化を抑制した。次年度の計画:HGF治療を結紮3日前に前処置する。あるいは、アンギオテンシン変換酵素阻害剤の併用するなどの実験計画を予定している。

平成13年度は下記の実験を行い、週1回の遺伝子治療で尿細管・間質の不可逆性変化である線維化を抑制する結果が得られた。【対象と方法】1.腎尿細管間質線維化モデルの作成一側尿管結紮ラットを作成し、腎機能、腎組織を結紮後2週と4週で検索する。3.HGF遺伝子治療ヒトHGF遺伝子をsendaiウイルス(HVJ)の膜蛋白をあわせリポゾームを使うHVJ-リポゾーム法を用いて、一側尿管結紮ラットに週1回、4回筋注する。【結果】1.遺伝子治療ラットでは、腎内の内因性ラットHGFとその受容体であるc-metの発現を増加させた。2.遺伝子治療ラットでは対照群に比し、腎間質の線維化とマクロファージの浸潤が有意に抑制された。3.結紮後2週、とくに4週後では尿細管細胞の増殖が亢進し、アポトーシスが抑制された。【結論】HGF遺伝子治療は慢性閉塞性腎症において尿細管細胞の生存率を高め、その線維化の進行を抑制する。平成14年度は13年度に得られた1-3の結果に加え、4.に記述した如く、アポトーシスの抑制機序はBcl-xL,Baxによるとの従来の報告と異なり、Bcl2による抑制が主である結果が得られた。3.HGF遺伝子治療ヒトHGF遺伝子をHVJ-リポゾーム法を用いて、一側尿管結紮ラットに週1回、4回筋注する。4.Bcl-2はHGF遺伝子導入群において増強されていたが、Bcl-xLやBaxには変化がみられなかった..【結論】HGF遺伝子治療は慢性閉塞性腎症において尿細管細胞の生存率を高め、その線維化の進行を抑制する。BaxやBcl-xLよりもBcl-2が、HGFの抗アポトーシス作用に貢献している。
モノマー配列でプログラミングされたらせんキラルポリラジカル磁気秩序と磁気光学機能

磁性を持たないプラスチックのような普通の高分子に対し、磁性源となる安定ラジカルを有する高分子ポリラジカルなど磁性高分子では、分子設計により様々な構造とそれに伴う新しい機能を付与できると考えられる。例えば、高分子の光学活性ならせん構造と磁性高分子を組み合わせることで新しい磁気光学効果が期待できる。本研究では、複数のモノマーの規則的な配列順序に基づいて安定な片巻きらせん構造と磁気秩序が期待できるポリラジカルの合成に成功し、モノマーの配列順序に依存して反強磁性的相互作用が制御されることを見出した。本研究では、ポリラジカルの磁気的性質とらせん構造高分子の光学活性との融合による新しい磁気機能および磁気光学機能を創出することを目的としている。この目的を達成するため、具体的には、ポリラジカル連鎖のモノマー配列としてプログラムされた精密ならせん構造を構築し、その磁気秩序構造制御の深化を目指した。本年度は、次の項目について明らかにした。1.モノマー配列を制御したキラルポリ(1,3-フェニレンエチニレン)型ポリラジカルの合成3,5-ジヨードフェニルヒドロガルビノキシルと2,6-ジ-t-ブチルフェノール残基と光学活性な1-フェニルエチルアミノカルボニル基を有する3,5-ビス[(3-エチニルフェニル)エチニル]ベンゼン誘導体をPd(PPh_3)_4触媒によりクロスカップリング反応させることで対応するポリ(1,3-フェニレンエチニレン)誘導体を新規に合成した。モノマー単位として1量体と3量体を重合させることで、らせん折り畳み構造形成時にヒドロガルビノキシル残基とフェノール残基が交互に積層する構造のポリマーを合成できた。また、水素結合性の光学活性基を有することから、ジクロロメタン溶液中で片巻優先のらせん折り畳み構造を形成した。さらに貧溶媒であるメタノールを過剰に加えることで、疎溶媒効果によりよりらせん構造形成側に平衡が偏った。ガルビノキシルアニオンを形成させることで90%メタノール溶媒でも可溶となり、CDシグナル強度が増大すると共にガルビノキシルアニオンの吸収領域にもCD吸収が観測された。これを化学酸化することでキラルポリラジカルが得られたが、CDシグナル強度は減少した。2.ポリ(1,2-フェニレンエチニレン-1,2-フェニレンビニレン)誘導体の合成フェノール残基を有する2量体マクロモノマーを合成・重合することで、フェニレンエチニレンユニットとフェニレンビニレンユニットが交互に結合した共役ポリマーを合成した。2-ブロモ-2'-エチニルスチルベン誘導体をモノマーとしてPd(PPh_3)_4触媒存在下重合することで、2-ブロモ-2'-ビニルトラン誘導体をモノマーとした場合に比べて高分子量体が得られた。紫外可視およびNMRスペクトルから、クロロホルム溶液にメタノールを加えることで疎溶媒効果によりらせん構造形成側に平衡が偏ることが示唆された。3.水素結合でモノマー配列をプログラムしたオリゴアントリレンエチニレン誘導体の合成エチニル基にN, N'-ジメチルベンズアミジンを結合した1,8-ジエチニルアントラセンとエチニル基に安息香酸を結合した9,10-ジエチニルアントラセンを混合することで、9,10-ジエチニルアントラセンユニットが水素結合により折り畳まれた構造を形成することを可視スペクトルの淡色効果から明らかにした。1.モノマー配列を制御したキラルポリ(1,3-フェニレンエチニレン)型ポリラジカルの合成3,5-ジヨードフェニルヒドロガルビノキシルと2,6-ジ-t-ブチルフェノール残基2つを有するアントリルアセチレンを置換した3,5-ビス[(3-エチニルフェニル)エチニル]ベンゼン誘導体をパラジウム錯体触媒によりクロスカップリング反応させることで対応するポリ(1,3-フェニレンエチニレン)誘導体を新規に合成した。モノマー単位として1量体と3量体を重合させることで、らせん折り畳み構造形成時にヒドロガルビノキシル残基とアントラセンユニットが交互に積層する構造のポリマーを合成できた。ジクロロメタン溶液に貧溶媒であるメタノールを加えることで、疎溶媒効果によりよりらせん構造形成側に平衡が偏った。対応するポリラジカルのESRシグナルの二回積分値および磁化率測定から、らせん折り畳み構造形成により分子内で強く反強磁性カップリングを生じている事が示唆された。2.水素結合によってらせん主鎖構造がプログラムされたポリアセチレン型ポリラジカルの合成メタ位またはパラ位にガルビノキシル骨格を有する4-フェニル-3,5-ビス(ヒドロキシメチル)フェニルアセチレンを新規に合成し、光学活性なフェニルエチルアミン存在下、ロジウム錯体触媒により重合させた。パラ位置換体は、剛直で自由度の小さい構造のため、かさ高い側鎖の立体反発により有効な水素結合が得られず、静的な片巻きらせん構造が達成できなかったのに対し、メタ位置換体では、より側鎖の自由度が上がることで立体反発を避け、弱い分子内水素結合でcis-cisoidal構造の片巻らせん構造が生成するようにらせん選択重合が進行した。1.モノマー配列を制御したキラルポリ(1,3-フェニレンエチニレン)型ポリラジカルの合成4-(3,5-ジエチニルフェニル)フェニルニトロニルニトロキシドとニトロニルニトロキシド残基と光学活性な1-フェニルエチルアミノカルボニル基を有する3,5-ビス[(3-ヨードフェニル)エチニル]ベンゼン誘導体をPd(PPh3)4触媒によりクロスカップリング反応させることで対応するポリ(1,3-フェニレンエチニレン)

誘導体を新規に合成した。モノマー単位として1量体と3量体を重合させることで、らせん折り畳み構造形成時にフェニルニトロニルニトロキシド残基とニトロニルニトロキシド残基が交互に積層する構造のポリマーを合成できた。また、水素結合性の光学活性基を有することから、クロロホルム溶液中でも片巻優先のらせん折り畳み構造を形成した。2.ポリ(9,10-アントリレンエチニレン)型ポリラジカルの主鎖スピン分極構造の設計2,6位に2,6-ジ-t-ブチルフェノール残基を有するポリ(9,10-アントリレンエチニレン)を合成し、化学酸化条件とスピン状態の関係を明らかにした。3.モノマー配列をプログラムしたオリゴアントリレンエチニレン誘導体の合成2,7位に2,6-ジ-t-ブチルフェノール残基を有する9,10-ジエチニルアントラセンのエチニル基にN,N'-ジメチルアニリンとニトロベンゼンをそれぞれ置換することで、ドナー・アクセプター相互作用により反平行に配列してH会合することを明らかにした。対応するオリゴラジカルの磁気的性質を明らかにした。また、1,3-ビス(4-ブロモフェニル)プロパンと重合することで、2,6-ジ-t-ブチルフェノール残基を有する9,10-ジエチニルアントラセン構造が折りたたまれたポリマーを合成できた。1.水素結合によってらせん主鎖構造がプログラムされたポリアセチレン型ポリラジカルの合成光学活性なフェニルエチルアミン存在下、ロジウム錯体触媒を用い、4-位に剛直な共役置換基を導入した3,5-ビス(ヒロドキシメチル)フェニルアセチレンを重合させた。分子内の水素結合が、主鎖の片巻らせんコンフォメーションの安定化に寄与するものの、それらの安定性は剛直な側鎖の鎖長と置換構造に依存した。例えば、(エチニルフェニル)ヒドロガルビノキシルが置換したポリマーでは、パラ置換体がCD不活性であったのに対し、メタ置換体は片巻優先らせんコンフォメーションを示した。2.モノマー配列を制御したキラルポリ(1,3-フェニレンエチニレン)型ポリラジカルの磁気的性質4-(3,5-ジエチニルフェニル)フェニルニトロニルニトロキシドとニトロニルニトロキシド残基と光学活性な1-フェニルエチルアミノカルボニル基を有する3,5-ビス[(3-ヨードフェニル)エチニル]ベンゼン誘導体をPd(PPh3)4触媒によりクロスカップリング反応させることで得られたポリ(1,3-フェニレンエチニレン)誘導体について磁化率を測定した。粉末X線回折測定より、らせんコンフォメーションの割合の高いと推定される試料の方が、より強い反強磁性を示した。3.モノマー配列により分子内架橋を制御したポリ(1,3-フェニレンエチニレン)の合成メンチルカルボニル基を有するジエチニルベンゼンとヒドロキシメチル基を有するジヨードベンゼンを合成し、これらを重合することで得たポリマーにマロニルクロリドを反応させることでヒドロキシル基間に分子内架橋が生じ、クロロホルム中においても片巻優先のらせん折り畳み構造を安定化することができた。
視神経軸索障害におけるγセクレターゼとオートファジーの分子制御機構の解明

視神経軸索障害が細胞体死より先行するTNFモデルを用いて、γセクレターゼの主な構成因子である、presenilin-1(PS-1)や、分解を受ける側の因子であるamyloid precursor protein (APP)の変化を調べた。視神経においてリン酸化PS-1は上昇しており、その局在はグリア細胞の核にあることが分かった。またAPPも視神経のグリアに存在し、TNFモデルでγセクレターゼの抑制により視神経軸索保護に向かう。またオートファジー関連因子のp62は視神経変性で上昇しオートファジー活性で低下する。p62抑制もしくはオートファジー活性によって軸索保護に向かうことがわかった。ラット高眼圧モデルにおいて、視神経をサンプルにimmuno blottingを施行。オートファジーのマーカーである、LC3-IIが高眼圧後1週間で上昇していることを見出した。高眼圧モデルの視神経は3週間後には軸索変性をおこしているが、オートファジー誘導体であるrapamycinを硝子体注射することで有意に軸索数減少を抑制した。逆にオートファジー阻害薬である3-methyladenineにより、高眼圧による軸索数減少は悪化した。なお、rapamycinでも3-methyladenineでも高眼圧は維持されており、眼圧は高眼圧単独群と差を認めていない。このことは、高眼圧による視神経障害においては、オートファジーの活性は軸索保護に向かうことを示している。さらに、p62蛋白の発現は、高眼圧の視神経において上昇しており、rapamycinによりその上昇は抑制された。高眼圧における視神経でのLC3-IIの上昇はrapamycinによりさらに上昇した。これらのことは、rapamycinの軸索保護作用に、p62の抑制とLC3-IIのさらなる上昇が関与していることを示唆している。過去の報告ではp62は蓄積すると神経変性に関与するとの報告があり、我々はRGC-5 cellを用いてその局在を調べた。Starvation下でp62はミトコンドリアと共存していることが確認できた。電子顕微鏡所見では高眼圧の視神経軸索内に異常なミトコンドリアを多数確認している。現在p62を単独で抑制した場合軸索保護に向かうのかどうか検討している。ラットTNF誘発視神経障害モデルを用いて、γ-セクレターゼの構成因子であるPS1の局在を免疫染色で検討した。PS1は視神経では核に存在し、グリアの核であると考えられ、さらに二重染色によりアストログリアの核に存在することが判明した。リン酸化PS1の発現の変化をウェスタンブロットで検討した。TNF硝子体注射後1週後2週後の視神経において、リン酸化PS1は上昇していた。アミロイド前駆蛋白(APP)の局在を検討した。APPも視神経ではアストログリアに存在していることが判明した。次に6E10抗体を用いて視神経をサンプルに免疫沈降法を行い、AICDでウェスタンブロットを行った。TNFによりCTFβが減少したことで、APPの特異的部位での切断を確認した。Notch-sparingγ-セクレターゼ阻害剤であるBMS299897によりその切断は抑制された。更にBMS299897投与により、TNF誘発視神経障害での軸索が影響を受けるかを検討した。TNFにより2週間後に軸索数減少が確認され、BMS299897によりその減少は有意に抑制された。以上により、視神経軸索障害にリン酸化PS1の上昇とγ-セクレターゼ活性の上昇が関与しており、その抑制により軸索保護効果を得ることが判明した。つまり、今まで神経保護と言えば網膜神経節細胞の因子が重要視されてきたわけだが、グリア側の因子も軸索保護には重要であることが示唆された。最終年度にはp62を単独で抑制した場合軸索がどうなるのかを検討した。軸索障害モデルであるTNFモデルラットを用いて、まず視神経をサンプルにp62のimmuno blotを行った。硝子体注射1週間後においてコントロールに比してTNF群では視神経のp62蛋白の発現が有意に上昇していた。この上昇は、オートファジー誘導体であるrapamycinにより有意に抑制された。またp62 siRNAの硝子体注射によっても有意に抑制された。これらの群の2週間での軸索数の定量の結果、TNFによる軸索減少はrapamycinにより有意に保護された。この保護効果よりは弱いものの、p62 siRNAによってもTNFによる軸索減少は有意に抑制されたことより、p62を単独で抑制しても、部分的な保護効果があることが分かった。研究期間全体を通して、緑内障とアルツハイマー病の関連性から、視神経でのアミロイド前駆蛋白を調べ、グリアに存在することを示し、γ-セクレターゼがTNFで活性化されることを報告した。

アルツハイマー病でオートファジーが障害され、蛋白のクリアランスがうまくいかず、様々な異常蛋白が蓄積することが報告されている。我々の緑内障モデルではオートファジーのfluxが障害され、軸索変性に向かうことを明らかにした。さらにオートファジーは加齢でもその活性が変化することが知られており、緑内障も加齢が関与していることから、我々は老化マウスを用いて、視神経障害において、オートファジーのfluxが障害されていることを示した。医歯薬学γセクレターゼを調節することで、視神経軸索保護が得られることが判明し、その過程でグリア細胞の因子の重要性が明らかとなった。これらの成果も論文化することができた。またオートファジーを誘導することでp-PS1が影響をうけるデータがでつつある。TNF軸索障害モデルや老化促進マウスをもちいて軸索変性の機序を詳細に検討する。P62やLC3-IIがこれらのモデルでも変化するか検討する。そしてそれらの因子がγ-セクレターゼ阻害剤で調節を受けるか明らかにする。siRNAを用いてp62抑制単独で、軸索保護に向かうか検討する。これらによりオートファジー調節により軸索保護治療につながるか明らかにする。現在オートファジーとγセクレターゼやその構成因子の関係を研究しており、今後γセクレターゼ阻害薬で、p63やLC-3が影響を受けるかを、視神経や網膜神経節細胞で検討していく。更にオートファジー誘導で、他の軸索内物質とグリア因子が影響を受けるかを明らかにしていく。またRGC-5も使用し、オートファジックfluxの検討もしていく。一貫して計画は進行しているが、試薬や抗体の消費のタイミングで年度間で購入金額に多少バラつきが生じる。動物も、たとえば、いったん切片にするとしばらく新しい動物から組織切片をつくらなくても免疫染色の研究ができ、使用金額は時期により異なってくる。高額なsiRNAなどの使用が続くとその時期は購入金額がかさむ。今回の次年度への使用予定額はこのようなバラつきの範囲内のものであり、予定通り、次年度の計画実行のために適切に使用されるべきものである。現在p62のsiRNAを用いて、視神経組織やwesternのサンプル作りをしており、抗体やsiRNA、また障害モデルのためのTNFを継続して購入予定である。そのための動物も新たに必要とする。westernやPCR用の試薬も消費間近であり、一通り再度購入予定である。当初の予定通り、消耗品、試薬、動物購入のみで予算は使用される予定であり、順調に研究成果を発表できる予定である。研究は一貫して持続中であり、定期的に動物購入や、試薬の購入が発生している状態である。次年度も引き続き適切な使用に努めていく。
抗菌ペプチドによる泌尿生殖器マイコプラズマの定着・感染および炎症抑制機構の解明

マイコプラズマ・ホミニスの感染あるいは定着マウスモデルの確立を試みるところであったが動物実験施設の移動があったため、外部業者に委託して飼育維持していたCRAMP KOマウスを受精卵化して保存した。この時点でin vivoの実験が一時的に中断された。今後のマイコプラズマの培養に必要なウマ血清の購入費用を計上し、マイコプラズマ・ホミニスが炎症誘導に必要なタンパクの同定のためのin vitroの実験を前年度に引き続き準備を進めた。しかしながら、研究者の一身上の都合により研究を継続するのが困難と判断し、今年度で研究を廃止した。Mycoplasma hominis(Mh)はヒトの泌尿生殖器に定着している菌であり、時に産褥熱、新生児の髄膜炎、腹腔内膿瘍などを引き起こす。Mhが定着するには接着が必須である。Mhの接着因子は病原因子でもあり、その抗原性が変化すると言われている。Cathelicidin Antimicrobial Peptide(CAMP)は抗菌ペプチドの一つであり、細菌の殺菌作用および炎症抑制作用を有する。しかしCAMPによるMhの定着・感染および炎症抑制のメカニズムは明らかではない。CAMPによる治療は、自然免疫が減弱する、抗菌薬の使用が抗菌ペプチド耐性を惹起する、などの問題点を指摘されている。定着したMhの治療は抗菌薬が第一選択である。しかし、Mhによる妊婦の羊水感染では羊水中のCAMPが上昇しており、CAMPがMhに対して何らかの生体防御に働くと考えられている。過去の報告ではマウスのCAMPであるcathelicidin-related antimicrobial peptide(CRAMP)がMpに対する殺菌効果を示した。そこで「CAMPがMhの定着・感染および炎症を抑制する」という仮説を立て研究を開始した。本研究は「Mh感染におけるCAMPの抗菌効果および炎症抑制効果を、Mh感染に対する宿主の炎症応答を中心に解析し、抗菌薬によらない感染症治療を目指すこと」を目的とする。CAMPのMhと宿主への作用が明らかになり、定着・感染および炎症における有効なCAMPの使用につながるだろう。2Mhが感染したマクロファージにおけるCAMPの殺菌効果:BALB/cおよびCAMP欠損マウスから好中球を採取しMhを感染させ一定時間培養後PPLO寒天培地に植菌し生菌数を比較した。4LPSおよびリポペプチドに対するCAMPの結合について、BIACOREシステムを用いて解析した。LPSに対してCAMPの結合力が強かったがリポペプチドに対しては結合してすぐに解離してしまう傾向を認めた。以上の実験を行い結果を得られたが、in vivoであるMhの定着マウスモデルを作成するのに時間がかかっているため代替の方法が可能かどうか検討中であり、当初の予定からやや遅れている。今後もCAMPによるMhの定着・感染の抑制効果、Mhが感染したマクロファージにおけるCAMPの炎症抑制効果、Mhのタンパクによる炎症誘導およびCAMPによる炎症抑制効果について、Mhのタンパクが結合する宿主のタンパクの同定および結合についての解析を行っていく予定である。初年度に行った実験がこれまで使用していた実験材料および実験機器の周辺物品であったため、新規に購入する物品がほとんどなかったため。また、実験が予定通りに進まなかったことも原因である。1年目の残りの予定と2年目の予定に沿って予算を執行する予定である。
Gingipainによって切断される歯周病原性細菌病原因子の解析および同定

前年度は、gingipainによって切断されるCDl4依存性かつTLR2およびTLR4非依存性に自然免疫系を活性化する病原因子をP.gingivalis33277株由来gingipain完全欠損株(KDP136)より精製した。得られた精製標品をSDS-PAGEに展開し、認められたバンドをマススペクトロメトリーにより解析後、ATCC33277株のゲノム配列と照合すると、目的の病原因子はORF PGNU0748と同定された。本年度は、PGNU0748のリコンビナント蛋白(rPGNU0748)をHis tagを付与した発現ベクターにクローニングし、IPTGを添加して大腸菌で発現後、精製した。現在、全長および部分領域ごとのrPGNU0748を作成し、どの領域が7.19細胞(TLR2およびTLR4の両方の刺激伝達経路を欠くCHO細胞由来のNF-κBレポーター細胞)を活性化するのか検討している。更に、これらのrPGNU 0748を用いてポリクローナル抗体を作成し、どの領域に対するポリクローナル抗体が、rPGNU0748およびKDP136よる細胞の活性化を抑制するのか検討する予定である。また、33277株以外のP.gingivalis株におけるPGNU0748の存在様式をサザンプロッティング法で検討した。その結果、6株中3株に相似な遺伝子が認められ、PGNU0748の存在は、P.gingivalis菌株間で異なることが示された。Gingipainによって切断される歯周病原性細菌病原因子を、P. gingivalis gingipain完全欠損株(KDP136)から精製した。これまでの研究から、この病原因子の少なくとも1つはCD14依存性かつTLR2およびTLR4非依存性に自然免疫系を活性化することが分かっている。嫌気下で培養したKDP136を集菌し、Triton X114を用いて表層タンパクを抽出後、陰イオン交換クロマトグラフィーにより分画した。分画後の試料で7.19細胞(TLR2およびTLR4の両方の刺激伝達経路を欠くCHO細胞由来のNF-κBレポーター細胞)を刺激し、フローサイトメトリーにてレポーター分子の発現を解析し、活性の認められる画分を同定した。その後、同画分をゲル濾過クロマトグラフィーにより更に精製し、SDS-PAGEに展開したところ、2本のバンドを認めた。また、陰イオン交換クロマトグラフィーにより分画した部分精製標品を用いて、マウスのポリクローナル抗体を作成した。この抗体は、KDP136による7.19細胞の活性化を阻害したことから、目的の活性化因子を認識すると考えられた。Western blotによる解析で、この抗体は上述の2本のバンドのうち、123kDaのバンドとのみ反応した。このバンドをマススペクトロメトリーにより解析後、ATCC33277株のゲノム配列と照合したところ、ORF PGNU 0748と同定された。更に、His tagを付加したORF PGNU 0748のリコンビナントタンパク(rPGNU 0748)を大腸菌で発現し、ニッケルカラムにより精製した。rPGNU 0748は上述のマウスポリクローナル抗体と反応し、rPGNU 0748が目的の活性化因子であることが示唆された。現在、rPGNU 0748の7.19細胞刺激性、gingipainに対する感受性について検討中である。
放線菌の生理活性物質生合成における置換型シグマ因子の関与についての研究

Mycinamicin生産菌Micromonospora griseorubida A11725およびerythromycin生産菌Saccharopolyspora erythraea JCM 4748の置換型シグマ因子遺伝子破壊株取得を試みた。各菌株からPCRで増幅した約500bpの置換型シグマ因子遺伝子の部分的DNA断片にapramycin耐性遺伝子を挿入したDNA断片を接合用プラスミドpDN19に入れたpDN11725およびpDN4748を構築した。pDN19は放線菌のoriを持たないため、効率的に組換え株を取得できる。E.coli S17-1を供与菌とした接合にて、それぞれのプラスミドを導入したところM.griseorubida A11725では3株、S.erythraea JCM 4748では2株のapramycin耐性株が出現した。M.griseorubida A11725の耐性株のうち1株でmycinamicin IIの生産の減少が確認された。また、S.erythraea JCM 4748の耐性株2株にはerythromycin生産の変化は認められなかったが、うち1株にYM寒天培地およびTS寒天培地上での生育障害が認められた。
生物を利用した医薬品等由来難分解性化学物質（ＰＰＣＰｓ）分解処理技術の開発

PPCPs分解菌として、医薬品や化粧品の乳化剤や皮膜形成剤として用いられるポリオキシエチレンアルキルエーテル(POE-AE)、沈痛剤のフェネチジンとアセトフェネチジンの原料で、指示薬、殺菌剤として利用されている4-ニトロフェノール(4-NP)を効率よく分解できる微生物の取得に成功した。このうちPOE-AE分解菌に関しては、活性汚泥への添加を想定した微生物製剤として有効利用できることを示した。また、4-NP分解菌に関しては浮遊性の水生植物であるウキクサとの相互作用を利用した持続的植生浄化ユニットの開発に成功した。本研究では環境中に放出されたパーソナルケア製品(Pharmaceutical and Personal Care Products; PPCPs(医薬品、化粧品、芳香剤等の関連物質))をターゲットとした微生物単独あるいは微生物と水生植物のコラボレーションによる生物学的処理技術の開発を目的としている。平成25年度はまず、前年度までに取得したPPCPs分解菌(医薬品や化粧品の乳化剤や皮膜形成剤として用いられるポリオキシエチレンアルキルエーテル(POE-AE)、沈痛剤のフェネチジンとアセトフェネチジンの原料で、指示薬、殺菌剤として利用されている4-ニトロフェノール(4-NP)を効率よく分解できる微生物)の分解経路を代謝産物の解析、遺伝子レベルの解析を実施した。POE-AE分解菌については、昨年度までに比色法によって当該物質の界面活性剤としての分解性(一次分解)を確認していたが、今年度はTOC測定により、この分解菌がPOE-AEを単一炭素源として完全分解することを明らかにした。また、遺伝子解析により、POE-AE分解に関わる遺伝子群がトランスポゾン上に分布することを示唆する結果を得た。4-NP分解菌については、4-NPが水酸化反応とカテコール開裂反応を通じて分解され、最終的に分解菌の細胞増殖基質と二酸化炭素に変換されることを突き止めた。さらに、その水酸化反応の酵素遺伝子(nitorophenol monooxygenase遺伝子)を特定した。次に、水生植物根圏へのPPCPs分解菌導入実験を試みた。具体的には、4-NP分解菌を根圏に導入したウキクサの4-NP分解実験を行ったところ、48時間以内での3 mg/L 4-NPの完全分解を達成した。また、2日間栽培を1バッチとした計5回の連続バッチ栽培後も分解菌はウキクサ根圏に定着し、4-NP分解活性も発揮し続けることを明らかにした。本研究では環境中に放出されたパーソナルケア製品(Pharmaceutical and Personal Care Products; PPCPs(医薬品、化粧品、日焼け止め、芳香剤等))をターゲットとした微生物単独あるいは微生物と水生植物のコラボレーションによる生物学的処理技術の開発を目的としている。平成24年度はPPCPsを分解できる微生物の取得と系統解析、優れた浄化能力を有する水生植物の検索を実施した。まず、PPCPs分解菌の取得に関しては、医薬品や化粧品の乳化剤や皮膜形成剤として用いられるポリオキシエチレンアルキルエーテル(POE-AE)、沈痛剤のフェネチジンとアセトフェネチジンの原料で、指示薬、殺菌剤として利用されている4-ニトロフェノール(4-NP)を効率よく分解できる微生物を本研究グループ独自の培養手法により取得することに成功した(POE-AE分解菌;計15株、4-NP分解菌;計5株)。これらの分解菌を16S rRNA遺伝子をベースとした系統解析に供したところ、POE-AE分解菌にはNovosphingobium属、Sphingobium属、Pseudoxanthomonas属、Pelomonas属、Prosthecomicrobium属細菌に加え、既知菌種との相同性が88%と新規性の高い菌株も含まれていた。一方、4-NP分解菌はPseudomonas属、Nocardioides属、Rhodococcus属のいずれかに属していることが分かった。次に、優れた浄化能力を有する水生植物の検索に関しては、栄養塩吸収能を指標とし、浮遊性のウキクサ、コウキクサ、抽水性のミソハギ、ヨシについて各植物の浄化能力を測定した。その結果、ミソハギは他の供試植物に比べて低濃度条件でも高い比生育速度が得られ、広い濃度条件で高い浄化作用を示すことを明らかにした。1.微生物製剤の開発医薬品や化粧品の乳化剤や皮膜形成剤として用いられるポリオキシエチレンアルキルエーテル(POE-AE)を高効率で分解できるS45Y株(Sphingomonas属;昨年度までに取得)をラボスケールの活性汚泥処理システムに添加することで50 ppmのPOE-AEを含む人工下水の処理能力にどのような影響を及ぼすかについて検討した。その結果、本菌株の非添加区ではPOE-AE量に相当する有機物が反応開始48時間後も処理水中に残存していたが、S45Y添加区ではすべての有機物が12時間以内に完全分解し、本菌株がPOE-AEを含む排水処理のための微生物製剤として有効であることを明らかにした。2.植生浄化ユニットの開発沈痛

剤のフェネチジンとアセトフェネチジンの原料で、指示薬、殺菌剤として利用されている4-ニトロフェノール(4-NP)を効率よく分解できるPKR1株とDNR2株(いずれもRhodococcus属)を根圏に導入した浮遊性の水生植物であるウキクサを用いた簡易型の植生浄化ユニットを作製した。実際の下水処理に本ユニットを適用するケースを想定し、3 ppmの4-NPを添加した下水二次処理水の処理を試みたところ、高い4-NP分解活性(2日間で100%分解)が長期間にわたって維持されることが明らかとなり、本浄化ユニットの有効性が示された。環境微生物学本年度、1前年度までに取得したPPCPs分解菌の代謝産物解析と、2当該分解菌を用いた根圏機能強化水生植物根圏の創製を研究実施目標としていたが、それぞれについての達成度は次の通りである。1PPCPs分解菌の代謝産物解析: POE-AE分解菌であるS45Y株については、代謝産物の同定はできなかったものの、POE-AEを二酸化炭素まで完全分解することを明らかにした。また、4-NP分解菌のDNR2株についてはnitorophenol monooxygenaseが関与する代謝経路を有しており、4-NPを細胞増殖基質と二酸化炭素に変換することを明らかにした。本実験項目の目的は、取得した分解菌が代謝産物として毒性を有する化合物を産出するか否かをチェックすることであるが、この点に関しては上記の結果からいずれの菌株も毒性化合物の産出は無いことが確認されたといえる。従って、本項目については「おおむね順調に進展している」と判断した。2根圏機能強化水生植物根圏の創製:研究実績の概要に示したように、4-NP分解に関する根圏機能を強化したウキクサの創製に成功した。従って、本項目についても「おおむね順調に進展している」と判断できる。本年度は、1PPCPs分解菌の分離・培養、2PPCPs分解菌の系統解析、3リン・窒素吸収能の高い水生植物の検索を研究実施目標としていたが、それぞれについての達成度は次の通りである。1PPCPs分解菌の分離・培養:本年度はまず、難分解性とされる鎮痛解熱剤のメフェナム酸、ジクロフェナク、医薬品や化粧品の乳化剤や皮膜形成剤として用いられるポリオキシエチレンアルキルエーテル(POE-AE)をターゲット物質とし、これらを分解できる微生物の検索を試みた。その結果、メフェナム酸、ジクロフェナクの分解菌については取得できなかったものの、POE-AEを高効率で分解する菌株の取得に成功した。メフェナム酸、ジクロフェナクの代替ターゲット物質として、沈痛剤のフェネチジンとアセトフェネチジンの原料として利用されており、難分解性化合物として知られる4-ニトロフェノール(4-NP)を新たな候補とし、これを分解する微生物の分離・培養を試みたところ、本研究グループ独自の微生物分離培養法を駆使することにより、当該物質を分解する微生物の分離・培養にも成功した。従って、本項目に関してはおおむね順調に進展していると判断できる。2PPCPs分解菌の系統解析:取得したPPCPs分解菌の系統解析はすべて終了している。従って、本項目についてもおおむね順調に進展しているといえる。
24時間観測可能なインターネット望遠鏡ネットワークの構築と探求型学習への活用

ニューヨークに設置してあるインターネット望遠鏡装置をリプレイスするための機材(望遠鏡、冷却CCDカメラ、PCなど)を購入した。購入した機材は組み立て、望遠鏡とカメラの制御用プログラムをLinuxで開発中である。インターネット望遠鏡を利用した探求型学習として、山形県立鶴岡南高校の2年生4名を対象にゼミ指導を行った。テーマは「インターネット望遠鏡を用いた食変光星の多色測光」である。この時点のニューヨークの望遠鏡には多色測光に必要なフィルタがついていないため、フィルタのついている東海大学湘南キャンパスのインターネット望遠鏡を用いて食変光星U Sgeを観測した。観測画像から測光を行って光度曲線を描き、ソフトウェアを用いて連星系の軌道傾角、質量比、表面温度などの物理パラメータの分析を行った。研究成果は生徒達が学内の全体発表会で発表し、生徒達は食変光星への理解を深めることができたと思われる。今後、ニューヨークのインターネット望遠鏡のリプレイスでフィルタが使えるようになれば、観測機会が増えて観測が楽になると期待する。鶴岡南高校における前年度のゼミ指導の成果を第8回インターネット望遠鏡プロジェクト・シンポジウムで発表した。今年度のゼミ指導の成果は次年度に発表の予定である。インターネット望遠鏡の普及活動として、科学イベントである「青少年のための科学の祭典2018」の全国大会と名古屋大会にブースで出展し、来場者にインターネット望遠鏡の操作を体験してもらった。全国大会には鶴岡南高校の生徒達も参加し、多様な来場者への対応を経験することで生徒達の成長が見られた。来場者には子どもだけでなく学校教員も何名か含まれており、学校の授業等でインターネット望遠鏡をうまく活用してもらえることを期待する。リプレイスに先立ち、ニューヨークの望遠鏡の現状を調査するため、望遠鏡が設置してある慶應義塾ニューヨーク学院を2月か3月に訪問する予定であった。しかし、望遠鏡が設置してあるカフェテリア屋上に雪が積もると安全のため屋上に上れなくなるとのことだったので、雪の降らない次年度6月に先延ばしすることにした。6月に慶應義塾ニューヨーク学院を訪問し、望遠鏡の現状を調査して、リプレイスに足りないものはないか確認を行う。リプレイス用の望遠鏡とカメラを制御するプログラムは開発中であり、開発が順調に進めば秋頃には全システムが完成する予定である。完成した機材はニューヨークに輸送してリプレイス作業を行いたいところだが、冬は降雪の問題があるため、完成時期によってはリプレイス作業を春まで延期することも考えている。山形県立鶴岡南高校では引き続きインターネット望遠鏡を用いた新たなテーマでゼミ指導を行う予定である。我々のインターネット望遠鏡プロジェクト(Internet Telescope Project)では、「ITP課題バンク」というインターネット望遠鏡の活用例や観測例を蓄積していく仕組みを立ち上げる予定であり、鶴岡南高校におけるゼミの成果もそこに蓄積して公表する予定である。インターネット望遠鏡の普及活動として、科学イベントにも積極的に出展する。次年度は宮城県仙台市、富山県立大学、愛知県名古屋市などで開催予定の科学イベントに出展予定である。

リプレイス用の望遠鏡とカメラを制御するプログラムは開発中であり、開発が順調に進めば秋頃には全システムが完成する予定である。完成した機材はニューヨークに輸送してリプレイス作業を行いたいところだが、冬は降雪の問題があるため、完成時期によってはリプレイス作業を春まで延期することも考えている。山形県立鶴岡南高校では引き続きインターネット望遠鏡を用いた新たなテーマでゼミ指導を行う予定である。我々のインターネット望遠鏡プロジェクト(Internet Telescope Project)では、「ITP課題バンク」というインターネット望遠鏡の活用例や観測例を蓄積していく仕組みを立ち上げる予定であり、鶴岡南高校におけるゼミの成果もそこに蓄積して公表する予定である。インターネット望遠鏡の普及活動として、科学イベントにも積極的に出展する。次年度は宮城県仙台市、富山県立大学、愛知県名古屋市などで開催予定の科学イベントに出展予定である。ニューヨークの望遠鏡の現状を調査するため、望遠鏡が設置してある慶應義塾ニューヨーク学院を2月か3月に訪問する予定であった。しかし、望遠鏡が設置してあるカフェテリア屋上に雪が積もると安全面を考慮して屋上に上れなくなるとのことだったので、雪の降らない次年度6月に先延ばしすることにした。ニューヨークの現状調査でリプレイスに足りない機材があることが判明すれば、その機材の購入を行う予定である。インターネット望遠鏡のシステムが完成すれば、望遠鏡一式を慶應義塾ニューヨーク学院へ輸送してリプレイス作業を行う予定で、そのための運送費と旅費が必要である。また、いくつかの科学イベントに出展する予定があるため、そのための旅費として使用する。
栽培および野生オオムギのBACライブラリー構築

BAC(Bacterial Artificial Chromosome)ライブラリーをはじめとした巨大インサートゲノムライブラリーは,今やゲノム解析の基本ツールの一つである.ゲノムサイズがイネの10倍以上もあるオオムギは,世界的にも重要な穀物の一つであるにも関わらず,北米の六条醸造用品種'Morex'で作製されたもの以外に適当なゲノムカバー率を持つ巨大DNAライブラリーは報告されていない.本研究ではわが国独自のオオムギゲノム研究の基盤構築を目指して,国産オオムギを用いたBACライブラリーを新たに構築した.日本の醸造用品種「はるな二条」を用いて,Nakamura et al.(1997)の方法を参考にした.本研究で作製した「はるな二条」BACライブラリーは,約28万クローンからなり平均インサート長は115.2kbである.これは,6ゲノム相当であることが期待される.巨大ゲノムを持つ生物種の場合,ゲノムライブラリー作製の過程で生じるライゲーション反応のバイアスが,ゲノムのカバー程度に深刻に影響することが予想される.研究の過程でこの点を重点的に検討した結果,本研究では一度のライゲーション反応で,オオムギゲノムの約62%に相当するクローンを得ることが可能となった.実際のBACクローンのゲノムカバー程度を調査する目的で,「はるな二条」BACクローン73,728(1.8ゲノム相当)に対して,29のSSRマーカーによるスクリーニングを行った結果,1マーカーあたり2.3のBACクローンを単離することができた.以上の結果から,本研究で作製したオオムギBACライブラリーはゲノム解析に利用可能であると判断した.今後,迅速な目的クローンの選抜実験系を確立し,また分譲のための環境を整備した上で,国内外での共同研究に広く利用していく予定である.オオムギBACライブラリーの作製は,Nakamura et al.(1997)を参考にした.本年は,醸造用オオムギ「はるな二条」を材料にして研究を進めた.幼緑葉由来のプロトプラストから単離した高分子量DNAを制限酵素Hind IIIで部分消化後,CHEF DRIIIで分画し,Hind III消化し末端を脱リン酸化したpBAC-LACベクター内にライゲーションした.これを大腸菌DH10Bに導入し,クロラムフェニコールを含む培地上で組換えコロニーを青白選抜した.組換え体の一部に関して,BAC DNAを抽出し,インサート長を調査し,適当であるものに関して384ウェルマイクロタイタープレートに回した.2002年2月現在,得られた組換えコロニーのうちランダムに選抜した174コロニーについてそのインサート長を調査した結果,平均インサート長105.4kb、(49.5kb177.1kb)の組換えコロニーを概算で約84,O00(約1.8ゲノム相当,非組換え体;<2%)得ている.オオムギBACライブラリーを構築する過程で,形質転換効率に大きく影響を与えるライゲーション反応の幾つかのパラメータについて形質転興効率による比鞍を行い,最適な条件の探索を試みた.本研究では,ライゲーション溶液中のDNA濃度が形質転換効率に与える影響およびライゲーションの反応時間について検討した.その結果,ライゲーション溶液中のDNA濃度で約7倍の違いが,形質転換効率では100倍程度の差を生み出すこと,また,ライゲーション時間でも反応時間が形質転換効率に大きく影響するという結果を得た.これらの結果をふまえ,今後さらに高い形質転換効率を得るための条件検討を進めている.BAC(Bacterial Artificial Chromosome)ライブラリーをはじめとした巨大インサートゲノムライブラリーは,今やゲノム解析の基本ツールの一つである.ゲノムサイズがイネの10倍以上もあるオオムギは,世界的にも重要な穀物の一つであるにも関わらず,北米の六条醸造用品種'Morex'で作製されたもの以外に適当なゲノムカバー率を持つ巨大DNAライブラリーは報告されていない.本研究ではわが国独自のオオムギゲノム研究の基盤構築を目指して,国産オオムギを用いたBACライブラリーを新たに構築した.日本の醸造用品種「はるな二条」を用いて,Nakamura et al.(1997)の方法を参考にした.本研究で作製した「はるな二条」BACライブラリーは,約28万クローンからなり平均インサート長は115.2kbである.これは,6ゲノム相当であることが期待される.巨大ゲノムを持つ生物種の場合,ゲノムライブラリー作製の過程で生じるライゲーション反応のバイアスが,ゲノムのカバー程度に深刻に影響することが予想される.研究の過程でこの点を重点的に検討した結果,本研究では一度のライゲーション反応で,オオムギゲノムの約62%に相当するクローンを得ることが可能となった.実際のBACクローンのゲノムカバー程度を調査する目的で,「はるな二条」BACクローン73,728(1.8ゲノム相当)に対して,29のSSRマーカーによるスクリーニングを行った結果,1マーカーあたり2.3のBACクローンを単離することができた.以上の結果から,本研究で作製したオオムギBACライブラリーはゲノム解析に利用可能であると判断した.今後,迅速な目的クローンの選抜実験系を確立し,また分譲のための環境を整備した上で,国内外での共同研究に広く利用していく予定である.
MRIから見る高齢者における口腔の形態的・機能的要要と脳灰白質容積の関連

公衆衛生状態の改善や医療技術の進歩などを背景として高齢化の進む現代において、認知症予防は医学的、社会的に非常に関心の高い問題である。アルツハイマー型認知症と歯の喪失の関連を示唆する研究報告が近年相次いで発表されているが、それらは疫学研究や動物実験によるものであり、ヒトにおける歯の喪失と脳の形態的変化の関連については未だ解明されていない。本研究は高齢者の脳MR画像から得られる灰白質容積と現在歯数の関連を調査することを目的とするものであり、今年度は8020運動を踏まえて現在歯20本以上と19本以下の高齢者における灰白質容積について分析を行った。被験者は、脳疾患の既往および現症がなく、うつ状態および認知障害のスクリーニング検査の基準を満たした健常高齢者162名(男性88人、女性74人、6979歳)である。被験者には研究の趣旨と内容および安全性について口頭および書面にて十分説明し、インフォームドコンセントを得ている。脳画像解析ソフト(Statistical Parametric Mapping 2;SPM2)を用いて撮像された被験者の脳MR画像(T1強調像)の画像処理を行い、その後同ソフトにて現在歯19本以下と20本以上の2群における灰白質容積の違いを検討した。なお、2群間の年齢、男女比、認知機能、うつ傾向は同程度である。その結果、現在歯20本以上の群に対して19本以下の群では、島皮質、前頭・頭頂連合野、側頭葉内側部など広い領域で灰白質容積が小さい傾向にあった。島皮質は味覚や内臓感覚が投射する領域であり、前頭・頭頂連合野や側頭葉内側部はアルツハイマー型認知症で萎縮が観察される領域としてよく知られている。これらの結果は高齢者における現在歯数と味覚、および現在歯数と認知症の関連を示唆するものであると考えられる。社会構造の高齢化に伴う認知症患者の増加は大きな社会問題となっている。本邦ではアルツハイマー病患者が増加傾向にあり、その早期発見や治療に関する研究が精力的に行われている。近年、歯の喪失と認知症との関連を示す疫学研究や動物実験の結果が報告された。しかし、ヒトにおける歯の喪失が、いかなる脳の形態的変化を惹起するのかは未だ不明である。そこで今年度は、高齢者の脳MRI画像から得られる脳灰白質容積と現在歯数との関連について分析を行った。被験者は、脳疾患の既往および現症がなく、うつ状態および認知障害のスクリーニング検査の基準を満たした健常高齢者195名(男性93人、女性102人、6975歳)とした。被験者には研究の趣旨と内容および安全性について口頭および書面にて十分説明し、インフォームドコンセントを得た。撮像したMRI画像(T1強調像)を脳画像解析ソフト(Statistical Parametric Mapping 99;SPM99)を用いて画像処理を行い、現在歯数を独立変数とした際の回帰分析を行った。その結果、側頭葉内側部、前頭連合野および頭頂連合野に現在歯数と正の相関を有する領域が観察された。側頭葉内側部は海馬付近にほぼ相当すると考えられ、記憶の形成や変換過程に重要な役割を担う。前頭・頭頂連合野は、計算や思考、空間認識などの高次機能と関係することが知られている。これらの領域はアルツハイマー病で萎縮が観察される領域でもある。以上の結果は、高齢者における歯数と認知症の発症との関連におけるevidenceを提供するものと考えられる。