hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
分子間力と化学反応の量子化学計算に基づく可視化動画教材開発

平成28年度は,主に2と3を実施する計画となっていたが,前年度の検証結果により分子間相互作用の可視化に対する有効性が示されたNCI法について,新たにプログラムに追加する作業を行った。プログラム開発では,予定にはなかったが,NCI法表示による画像作成を差電子密度やESPマッピング電子密度法などと同じプロセスで行える機能を新たに追加した。理由は,当初は既存のフリーソフトでNCI法表示の画像を作成する予定であったが,一枚の画像を作成するのに手間が掛かりすぎてアニメーション作成に必要な数の画像を出力するための効率化が困難であったためである。また,後回しになった電子雲(ドット)表示法のプログラム開発については,現在も引き続き進行中である。「分子間相互作用」については,前述したNCI法の機能追加作業のため教材作成に遅れが生じているが,新しく実装したNCI法の計算機能による画像作成の効率化が今後期待できる。また,作成可能なESP電子密度表示法の動画教材については計画通り作成できた。したがって,研究は概ね順調に進展しているとした。「酸と塩基の反応」の教材については,分子からイオンへの電荷移動を可視化できるESP電子密度表示の動画教材が主になる。したがって,計画通り「塩酸・酢酸ー水酸化ナトリウム・アンモニア」の中和反応についての画像教材作成を行うことができた。「分子間相互作用」については,前年度実装したNCI法表示法による教材作成を行った。NCI法は計算時間が多くかかったため,ドット表示法は省略した。「無機化学の反応」では,Al金属と水の反応についてのMDシミュレーションを行った。反応を起こすためには金属と水分子の数を増やす必要が生じたため,反応部分が奥に隠れて見えにくい静電ポテンシャルではなく,価電子の移動そのものだけが見えるようにカチオンとの差電子密度によって可視化した。Agの分離反応では,水とアンモニアによる溶解の違いを示すことが教材として重要であったが,本研究での計算レベルでは,この違いをはっきりと示すことが困難であることがわかったため,アンモニアを含めないAgClの沈殿反応のみにとどめた。「有機化学の反応」では,グルコースの異性化反応経路を計算し,Alの場合と同様にカチオンとの差電子密度の動画教材を作成した。また,水1分子がエネルギー障壁を下げる触媒として働くことがわかるものにした。油脂分子のけん化反応の教材では,代替分子の酢酸エチルを用い,OH-による加水分解(けん化)の反応経路を計算した。酸性条件エステル化反応では,酢酸とメタノールのエステル化の反応経路を計算した。これらもAlの場合と同様に,水分子を増やす必要があったため,カチオンとの差電子密度によって動画教材を作成した。研究期間全体では,研究を円滑に進めるためにNCI解析への一本化,メタノールの酸化・ペプチド結合のエステル化反応への変更を行ったが,「分子間相互作用」と「化学反応」の典型的な項目について,これまでになかった目に見えない分子レベルでの反応を観察できる動画教材を作成することができた。この教材はWeb上で公開しているため,教員が簡単に利用することができる。
ミクロ理論からの材料特性モデルによる切削シミュレーション手法の開発

切削シミュレーションを現実の問題に対して適用可能とすることを目的として研究を行った。切削シミュレーションを行うには、材料特性を入力しなければならないが、切削という高ひずみ速度、高温、高圧という条件下で材料の単軸変形特性は、現在のところ実験で求める以外に方法がない。その材料特性を実験ではなくミクロ理論から導きだし、まさに計算機内のみで切削の諸現象を予測し、バーチャルマシニングの実現を試みた。まず逆解析的手法により切削試験から材料特性を推定する試み、そして走査型トンネル顕微鏡による観察に基づいた分子動力学計算の試みを行った。ミクロ理論の有効性は確認されたが、それを現実的問題に適用するには問題点が多いことが明らかになった。一方、切削シミュレーションは、動的陽解法という手法を用いれば、塑性代変形、熱伝導問題などの3次元解析を有限要素法で実現可能であることが明らかになった。すなわち、動的陽解法を用いれば、現実と同レベルの旋削過程がシミュレーションできること、そしてさらにチップブレーカ工具による切削解析にも有効であることを示し(論文掲載予定)、連続体力学的手法による現実的3次元解析を実現した。これは、切削シミュレーションの現実的実用化の第1歩となるものと思われる。本研究によって、ミクロな部分においては、量子論に基づいて原子間力を評価し、分子動力学計算が有効であることがわかり、マクロな部分では、動的陽解法によって現実的3次元解析が実現できることを示すことができた。今後の課題は、そのミクロとマクロの間の橋渡しを体系化することで、それによってバーチャルマシニングの実現が可能になると思われる。本年度の成果を以下にまとめる.1,マクロ理論の再考従来の切削シミュレーションはマクロな観点で定式化された連続体力学に基づいている.それによる塑性理論では,相当応力が,塑性ひずみ,温度,ひずみ速度などにどのように依存するかによって材料特性を表すが,それは全くの理論の外にあり,切削とは独立な材料試験によって定めなければならない.本研究では,逆解析の考え方によって,材料定数を材料試験によらずに決定する手法の開発を試みた.すなわち,定常切削場解析手法を考案し,相当応力がひずみ速度と温度のみの関数と仮定し2つのパラメータを選び,切削速度や切込みをどを変化させて計算機内実験を行い,最も切削実験と合致するパラメータを,逆問題的に定めることを試みた.しかしながら計算には試行錯誤的な要素が多く,効率的にパラメータ求めるには問題が多いことが分かった.2,ミクロ現象のシミュレーション手法の構築原子レベルのミクロな観点では,原子間の相互作用を妥当に取り扱うことができれば,加工硬化,温度,ひずみ速度効果等が,分子動力学法などによって計算可能となる.しかし,原子間カポテンシャルの決定の困難さが,理論を経験的なものから独立させていない.この問題の解決には,量子論に基づく第一原理的な計算が最有力と考えられる.そこで,量子論に基づいて計算されたポテンシャルを用いて,グラファイトの材料除去過程のシミュレーションを行い,実験との比較を試みた.グラファイトは,走査型トンネル顕微鏡によって原子像を観察することが可能であり,走査型トンネル顕微鏡の探針を用いた除去実験の結果と計算を比較したところ両者の対応関係が認められ,原子間ポテンシャルを量子論によって定めることの妥当性が確認された.切削シミュレーションを現実の問題に対して適用可能とすることを目的として研究を行った。
発達中の種子における葉緑体PIIを介した炭素代謝と窒素代謝の代謝制御機構の解明

植物は栄養条件に応じて体内の代謝バランスを変えることで、その生長を制御し、環境への適応を計る。このことからも、植物の代謝と生長は、それぞれの上流に位置するシグナル伝達系の密接な連携により制御されていることが予想されるが、その機構は現在、わかっていない。本研究はこの未知の機構を明らかにすることを目的として、他の生物において、細胞の代謝や生長の制御に関わることが知られている重要な制御因子PIIとTORの植物細胞における機能についての研究を進めている。これらの制御因子は多面的な機能を持つために、遺伝学的な手法による研究は難しいことから、それぞれと相互作用する新規因子の同定と機能の解析を研究の方針とした。3年間をとおして、アラビドプシスの緑葉プロトプラストでのスクリーニング系の確立に取り組んだ。さらに、本スクリーニング系を利用して、植物界にのみ存在するTORの新規候補因子の一つを同定した。また、上記の緑葉プロトプラストでのスクリーニング系の確立と平行して行った、抗TOR抗体と抗PII抗体による免疫沈降やプルダウンアッセイによるスクリーニングによっても、それぞれに対して、複数の候補因子が得られた。PII相互作用新規因子の更なる機能解析を進めるための手法として、葉緑体in vitro転写系を確立した。この葉緑体in vitro転写系は、in vitro転写反応以外にも、葉緑体内の酵素反応を調べるために有効であり、今後の応用が期待できるものになった。植物の種子は、次世代の胚の形成とその成長に必要な栄養の保存に特化した非常にユニークな組織であると同時に、約2週間の発達の過程で、葉緑体の発達と分解がおこることから、植物細胞の生長と老化のモデルとしても興味深い。私は、栄養に応答して代謝、生長の調節に関わるPIIを含む制御因子が種子の発達段階で特徴的な発現パターンを示すことに注目し、それぞれと相互作用する新規因子を同定することで、植物が栄養に応答して生長を制御する機構の一端を明らかにすることを目的として研究を進めている。本年度は、世代時間の長い植物において新規相互作用因子を同定するためのハイスループットスクリーニング系として、アラビドプシスのプロトプラストスクリーニング系の確立に最もカを注いだ。緑葉から単離したプロトプラストで過剰発現したmycタグを融合したTOR活性ドメインに対して、抗myc抗体による免疫沈降を行い、回収した画分をLC/MS/MSで解析することで、いくつかの相互作用因子の候補を得た。現在、これらの候補因子が実際にTORと結合するかどうかについて確認実験を行っており、2年度の早い段階で、ハイスループットスクリーニング系を確立し、新規相互作用因子の同定を行いたいと考えている。上記のプロトプラストスクリニーング系と平行して、TORとPIIにタグを付加した過剰発現体と特異的抗体の作製、プルダウンアッセイを行うことで、新規相互作用因子の同定を進めている。植物は栄養条件に応じて体内の代謝バランスを変えることで。その生長を制御し、環境への適応を計る。最初に、これらの制御因子は多面的な機能を持つために、遺伝学的な手法による研究は難しいことから、それぞれと相互作用する新規因子の同定と機能の解析を研究の方針とした。初年度は、アラビドプシスの緑葉プロトプラストでのスクリーニング系の確立に取り組み、今年度は、上記のスクリーニング系で得られたTORと相互作用すると思われた候補因子が実際にTORと相互作用するかどうかを、プロトプラストでの過剰発現系での免疫沈降、ファーウェスタンブロット、酵母ツーハイブリッド分析等の異なる手法で確認した。その結果、候補因子の一つはTORと相互作用すると考えられたことから、アラビドプシスの緑葉プロトプラストでのスクリーニング系の有効性が確認された。また、この因子の機能は未知であったが、植物に広く保存されていた。最終年度には、TORと候補因子の局在の決定と、候補因子のリン酸化等の有無、ノックアウト株の解析を行う。今年度、上記の緑葉プロトプラストでのスクリーニング系の確立と平行して行った、抗TOR抗体と抗PII抗体による免疫沈降やプルダウンアッセイによるスクリーニングによっても、いくつかの候補因子が得られた。これらについても、相互作用の確認と機能解析を行いたい。

また、上記の緑葉プロトプラストでのスクリーニング系の確立と平行して行った、抗TOR抗体と抗PII抗体による免疫沈降やプルダウンアッセイによるスクリーニングによっても、それぞれに対して、複数の候補因子が得られた。PII相互作用新規因子の更なる機能解析を進めるための手法として、葉緑体in vitro転写系を確立した。この葉緑体in vitro転写系は、in vitro転写反応以外にも、葉緑体内の酵素反応を調べるために有効であり、今後の応用が期待できるものになった。
胃粘膜下腫瘍切除検体を用いた初代細胞の樹立と薬剤耐性機序の解明

樹立した2株のイマチニブ耐性株について薬剤抵抗性機能を評価した結果、ABCトランスポーターであるABCC2及びABCC5の発現強度の亢進、また、Src及びErk1/2のリン酸化亢進が検出された。更に、Srcの阻害剤であるPP2及びイマチニブ併用により耐性株に対する抗腫瘍効果の増強作用が認められた。イマチニブ耐性株は、ABCトランスポーターを高発現させることで薬剤ストレスに対する抵抗性を獲得し、Src及びErk1/2の活性化が耐性株の増殖及び生存を向上させている可能性が示唆された。GIST切除組織(29検体)を用いた培養細胞樹立の結果、GIST7.3(略、G7.3)及びGIST22.D6(略、G22.D6)の2株の樹立(6.9%)に成功した。細胞免疫組織染色法によるKIT発現の判定では、樹立した2株とも陽性であることが示された。また、29例の切除検体から3株のマウス皮下移植モデルの作製に成功した。同様に、組織免疫染色法によるKITの発現解析の結果、全て陽性であることが示された。次に、分子標的薬であるイマチニブ(Greevec,STI571)感受性試験では、2株とも感受性を示しIC_50はそれぞれG7.3で3.71μM、G22.D6では11.0μMを示した。同様に、2株のGIST皮下移植モデルマウスを用いたイマニチブ(Greevec,STI571)の感受性試験における28日間経口持続投与を施行した結果、コントロール群(H_2O)に対し、イマチニブ(Greevec,STI571)投与群において2株とも有意に抗腫瘍効果が得られ、イマチニブ(Greevec,STI571)に対し感受性を有することが示唆された。これらの結果より、樹立した細胞株及びXenograft株は、GISTの増殖能、薬剤耐性機能を研究するにあたり有用な生物材料であることが示唆された。更に、イマチニブ持続曝露により作製した細胞株(G7.3IM-R,G22.D6IM-R)におけるイマチニブ感受性試験では、IC_50は、それぞれ11.8μM(p<0.01)及び41.4μM(p<0.01)を示し、イマチニブに対する抵抗性が示唆された。ABCトランスポーターの発現において、イマチニブ抵抗性細胞株では、ABCC2及びABCC5の発現比が高い傾向にあることが示唆された。GIST切除組織(29検体)より2株の細胞(GK7C及びGK22C)及び3株のXenograft (GK7X,GK15X,GK22X)の作製に成功した。樹立した各細胞及びXenogrftについて免疫組織(細胞)染色法によるKITの発現解析の結果、全ての株について陽性であることが示された。次に、分子標的薬であるイマチニブ感受性試験では、2株とも感受性を示し、IC_<50>値はそれぞれGK7Cで4。6μM、GK22Cでは11.0μMを示した。同様に、3株のGIST皮下移植モデルマウスを用いたイヤチニブの感受性試験における28日間経口持続投与を施行した結果、コントロール群に対し、イマチニブ投与群において3株とも有意に抗腫瘍効果が得られ、イマチニブに対し感受性を有することが示唆された。これらの結果より、樹立した細胞株及びXenogrft株は、GISTの増殖能、薬剤耐性機能を研究するにあたり有用な生物材料であることが示唆された。イマチニブ持続曝露により作製した耐性株(GK7C-IMR,GK22C-IMR)におけるイマチニブ感受性試験では、IC_<50>値は、それぞれ11.7μM(p<0.01)及び41.4μM(p<0.05)を示し、親株に比べイマチニブに対するIC_<50>値が2563.73倍に上昇していることが確認された。この樹立した耐性株について薬剤抵抗性機能を評価した結果、ABCトランスポーターであるABCC2及びABCC5の発現亢進、またSrcのリン酸化亢進が検出された。更に、Srcの阻害剤であるPP2及びイマチニブ併用によりイマチニブ耐性株に対する抗腫瘍効果の増強作用が認められた。イマチニブ耐性株は、薬剤排出トランスポーターであるABCトランスポーターを高発現させることで薬剤ストレスに対する抵抗性を獲得し、更にSrcの活性化が耐性株の増殖及び生存を向上させている可能性が示唆された。
転写因子HNF3βのノード・脊索特異的遺伝子発現の制御機構の解析

脊椎動物の体軸パターン形成には、体軸中央のノード・脊索・神経管底板(以下「底板」と略)が誘導シグナルの源として重要な役割をはたしている。私は、これらの構造の形成に、転写因子HNF-3β(Hepatocyte Nuclear Factor-3β)が中心的な役割をはたしていることに注目し、これまでに初代トランスジェニックマウス胚を用いた解析により、HNF-3βのノード・脊索エンハンサーを5′上流に、底板エンハンサー(FPE)を3′下流に見い出した。FPEの活性に必須な領域の中に、ヒトのzinc finger蛋白質GLI/GLI3の結合配列に類似の配列(3′Gli-BS)が存在した。この配列にはin vitroでGST-GLIが特異的に結合し、さらにエンハンサー内の3′Gli-BS配列にGLIが結合できないような変異を導入すると、in vivoでのFPE活性が失われた。底板でのHNF-3βの発現は、脊索からの誘導シグナル(Sonic hedgehog:Shh)によって誘導されるが、培養細胞を用いて調べると3′Gli-BSはShh応答配列として機能した。また、3′Gli-BSはGLIによって活性化され、GLI3で抑制された。マウスGli,Gli2,Gli3の神経管における発現を調べると、いずれもHNF-3βと一過的な発現の重複が見られるが、主な発現領域はGliは腹側、Gli2は全体、Gli3は背側であった。本研究の結果は、ShhによるHNF-3β誘導の過程でGliが正の転写因子として関与していることを示唆している。これらの結果とGliファミリーの発現様式とを併せて考えると、一般にGliファミリーはShhシグナルの標的遺伝子の発現制御に関与しており、GliおよびGli3はそれぞれ正および負の転写因子として機能していると考えられる。また、ハエではhedgehog(hh)シグナル経路の最も下位にGLI類似遺伝子のcubitus interruptusがあり、脊椎動物とハエとでhhシグナル経路が保存されていると考えられる。
CD4+T細胞を介した抗腫瘍免疫応答に対する可溶性IL-6受容体の影響の解明

担癌個体における免疫機能低下のメカニズムの解明はがんの制圧には必須であるが、未だ不明な点が多い。本研究課題では、担癌個体においてCD4+T細胞の機能分化が抑制される機序について検討した。そして、担癌個体において増加する可溶性IL-6受容体(sIL-6R)が、CD4+T細胞に作用し、腫瘍特異的Th1細胞の分化を抑制することを見出した。さらに、これは、腫瘍特異的CD8+T細胞の誘導を阻害し、結果的に担癌個体では抗腫瘍効果が減弱する、というメカニズムを明らかにした。これらの結果は、担癌個体において、がんに対する免疫療法の感受性低下の是正を目指したアプローチへの基盤的知見を与え得るものである。担癌個体におけるIL-6および、可溶性IL-6受容体(soluble IL-6 receptor; sIL-6R)の増加は、がんの予後不良因子として報告されている。本研究は、担癌個体内におけるIL-6シグナルによる腫瘍特異的Th1細胞の分化抑制の機序について、sIL-6Rに着目して、腫瘍特異的CD4+T細胞に対する担癌個体の免疫抑制機序を解明することを目的とした。これまでの研究結果より我々は、担癌個体では、典型的なIL-6のシグナル伝達様式ではなく、可溶性IL-6受容体(sIL-6R)とIL-6の複合体がリガンドとなり、シグナル伝達を司るgp130と細胞表面で会合して、T細胞内へIL-6シグナルが伝えられる様式(IL-6トランスシグナル)により、T細胞にIL-6シグナルが伝えられるという仮説を立てた。そしてIL-6Rを欠損する担癌マウスをレシピエントとして使用した場合、あるいはsIL-6Rに特異的に結合してgp130への結合を阻害する可溶性gp130(sgp130)を投与した場合、Th1細胞の分化抑制は解除されることを新たに見出した。さらに、担癌個体内の細胞を分画し、それぞれの細胞分画によるsIL-6R産生をELISAにより検討したところ、Gr-1+、またCD11b+の細胞群で、特に高いsIL-6Rの産生を認めた。これと符合して、ミエロイド系細胞特異的IL-6R欠損担癌個体では、血清中のsIL-6Rがコントロール群と比較して減少する一方、CD4+T細胞を介した抗腫瘍効果は、IL-6活性を抑制した場合と同様、コントロール群に比べて増強した。これらの結果より、担癌個体で増加するsIL-6Rは、、IL-6と協調してTh1細胞の分化を抑制することが示唆された。その結果、効果的な抗腫瘍免疫応答の誘導が妨げられると考えられる。このため、IL-6/sIL-6Rを介した免疫抑制を阻止して、Th1細胞の分化を促進するアプローチは、がんに対する免疫療法の効果を増強する方法の一つと考えられる。申請者はこれまで、マウスに癌細胞を移植し作成した担癌マウスを用いて、腫瘍特異的CD4T細胞の機能が抑制されるメカニズムについて検討してきた。そして、腫瘍特異的CD4T細胞が抗腫瘍効果を発揮するために必須のステップであるIFN-gamma産生性Th1細胞への機能的分化が、炎症性サイトカインであるIL-6により阻害されることを見出してきた。さらに、担癌個体におけるIL-6を介した免疫抑制機構、特に腫瘍特異的T細胞のTh1分化抑制の作用機序について検討し、癌免疫療法の効果を増強するアプローチの開発を目指し研究を行ってきた。特に、本研究課題ではIL-6シグナルを安定化させる可溶性IL-6受容体(sIL-6R)が、IL-6同様、担癌個体で増加することに着目し、sIL-6Rが腫瘍特異的CD4T細胞の機能(Th1分化)に与える影響について検討することを主な目的とした。昨年度までに、担癌マウスにおいて、sIL-6Rが腫瘍特異的T細胞のTh1分化抑制に寄与することを、IL-6R遺伝子欠損マウスを用いて明らかにしてきたが、さらに実際の癌患者の末梢血単核細胞、特に単球等ミエロイド系細胞が産生するsIL-6Rが、ヒトCD4T細胞のTh1分化を抑制するという新たな知見を得た。このことは実際に癌患者において、IL-6/sIL-6Rの活性を抑制することにより、抗腫瘍免疫応答を増強できるという可能性を示唆するものである。今後は、癌患者の検体数を増やし、昨年度までに得たデータの再現性を確認するとともに、マウスより得られた結果を含めて、実際に癌患者における癌免疫療法の効果を増強する標的として、IL-6およびsIL-6Rが有力な候補となりえることを実証する。さらに、これらの研究成果を学術論文として発表し、広く一般に公表する予定である。昨年までに樹立したミエロイド系細胞特異的IL-6R欠損マウスを用いて、担癌個体におけるsIL-6RのCD4T細胞の機能に対する影響を検討することができ、その検討の結果、ミエロイド系細胞由来sIL-6RがTh1細胞の分化を抑制することを実証することができた。さらに、IL-6刺激により誘導される転写因子であるc-MafのTh1分化抑制における役割を検討する計画においても、c-Maf変異マウスの検討がほほぼ完了しており、c-MafがIL-6シグナルを介した免疫抑制に関与するという新たな知見を得ることができた。今後は、マウスを用いた検討で得られた知見がヒト検体においても当てはまる現象か否か、を検討することが課題である。

免疫機能の低下は、がんや、感染症等に対する生体防御機構を妨げ、それらによる死亡率を増加させる要因となり、担癌個体における免疫機能の低下のメカニズムの解明は、がんを制圧するための免疫療法の開発する上での急務である。しかし、担癌個体での免疫機能の低下のメカニズムは多段階的であり、未だ全容は不明である。本研究課題では、担癌個体においてCD4+T細胞の機能分化が抑制される機序について検討した。そして、担癌個体において増加する可溶性IL-6受容体(sIL-6R)が、IL-6と協調してしてCD4+T細胞に作用し、腫瘍特異的IFN-gamma産生性Th1細胞の分化を抑制することを見出した。さらに、これは、腫瘍特異的CD8+T細胞の誘導を阻害し、結果的に担癌個体では抗腫瘍効果が減弱する、という免疫抑制機序を明らかにした。また、IL-6/sIL-6Rによる腫瘍特異的CD4+T細胞のTh1細胞分化抑制には、IL-4/IL-21産生を制御する転写因子であるc-Mafが主要な働きをしていることを、c-Maf変異マウスの解析により、明らかにした。これらの結果は、担癌個体において、IL-6/sIL-6Rが、がんに対する免疫療法の感受性低下を是正するための有望な標的となりうることを示唆し、がん免疫療法の効果増強を目指したアプローチへの基盤的知見を与え得るものであると考えられる。この研究成果は、学術雑誌Cancer Research (In press, 2017.)に発表した。来年度以降も、これらの研究成果を発展させ、さらにがんに対するCD4+T細胞の免疫応答について解析を進める予定である。担癌個体における免疫機能低下のメカニズムの解明はがんの制圧には必須であるが、未だ不明な点が多い。そして、担癌個体において増加する可溶性IL-6受容体(sIL-6R)が、CD4+T細胞に作用し、腫瘍特異的Th1細胞の分化を抑制することを見出した。さらに、これは、腫瘍特異的CD8+T細胞の誘導を阻害し、結果的に担癌個体では抗腫瘍効果が減弱する、というメカニズムを明らかにした。これらの結果は、担癌個体において、がんに対する免疫療法の感受性低下の是正を目指したアプローチへの基盤的知見を与え得るものである。研究計画において設定した仮説を、いくつかのマウス腫瘍モデルを用いた検討により一部証明することができた。さらに担癌個体において、抗腫瘍免疫応答を妨げるIL-6シグナルによるT細胞機能不全の分子メカニズムについて、標的となる候補分子を見出すことができた。これらの発見により、新たな研究の発展が期待できると考えられた。これまでの解析では、希少癌である口腔癌患者より癌患者検体として実験サンプルを確保し、sIL-6RによるTh1分化に対する影響について、予備的な検討を行ってきた。この予備的な検討により、sIL-6RのCD4T細胞に対する効果を検討できる実験系をヒト検体においても確立することができた。そのため、今後は、サンプル数を増やし、更なる検討を行う予定である。また、口腔癌患者だけでなく、他の癌種においても同様の検討を行い、どのような癌種において、IL-6/sIL-6Rによる免疫抑制効果が顕著であり、IL-6シグナルの抑制が、癌免疫療法の効果増強に有効であるか、を検討する予定である。免疫学担癌個体におけるIL-
巻き積み型ダイレクトメタノール燃料電池の研究

ダイレクトメタノール型燃料電池(DMFC)は、理論的にはリチウム二次電池の数倍以上のエネルギー密度を実現できるため、ユビキタスネットワークを支えるモバイル機器用電源として期待されている。本研究では、DMFCの量産化・経済化を図るため、電解質膜を挟んで燃料極と空気極とを対峙して形成したMEA(Membrane Electrode Assembly)を、二つ折りにして巻き込むことにより構成する巻き積み型DMFC、および研究過程で新たに考案した二つ折りにしたMEAをジグザグに折り畳むこと(折り紙プロセス)によって構成するジグザグ型DMFCの実現を図った。巻き積み型DMFCでは、燃料極電極と空気極電極を各々2個電解質膜状に形成し、燃料極を内側として二つ折りすることによって形成される単位セルの特性を把握し、その燃料供給法の改善を図った。また、上記単位セルをジグザグ型に重ねることによって形成されるジグザグ型DMFCの特性を把握すると共に、燃料供給法、空気供給法、内部抵抗の低減法などの改善を図った。燃料供給の促進には、供給材にスリットと共に切り込みを設けることで燃料供給を改善できることを明らかにした。さらに、燃料が循環するように供給材を工夫することで出力の落ち込みを大きく改善できることも明かとした。内部抵抗の低減には、AuメッキTiメッシュを用いることが有効であることを示した。また、3セル直列接続による高電圧出力ジグザグ型DMFCを作製し、実際のモバイル機器への適用を試みた。5cm×15cmの電解質膜状に4cm×4cmの空気極と燃料極とを電解質膜を挟んで各々6個形成し、折り紙プロセスを用いてジグザグ型3セル直列接続DMFCを作製した。3セル直列接続DMFCの出力電圧は、単セルの3倍の1.5Vを示し、市販のポータブルカセットプレイヤーに適用してその動作の確認が図れた。ダイレクトメタノール型燃料電池(DMFC)は、リチウム二次電池の数倍のエネルギー密度が期待できるため、ユビキタスネットワークを支えるモバイル機器用電源として期待されている。本研究では、DMFCの量産化・経済化を図るため、電解質膜を挟んで燃料極と空気極とを対峙して形成したMEA (Membrane Electrode Assembly)を、二つ折りにして巻き込むことにより構成する巻き積み型DMFC、および二つ折りにしたMEAをジグザグに折り畳むことによって構成するジグザグ型DMFCを新たに提案し、その実現を図る。本年度は、(1)燃料および空気のセル内への供給メカニズムの解析とその効率化、および(2)セル接続技術の開発と高出力電圧化を目的とした。燃料の供給効率化については、供給材として用いるろ紙にスリットを設けることによって、メタノールがセル面内に均一に供給できる可能性を示した。4cm角のセルにおいて2mm幅のスリットを3本設けることで、電力密度が2倍に向上した。赤外線温度計によりスリットを設けることでセル面内の温度分布も均一化することが確認された。また、空気極においては、3mm程度の間隙を設けて重ね合わせることで反応に必要な酸素を供給できることが示された。セル接続技術の検討は、セル接続にAl箔を用いた3セル直列接続ジグザグ型DMFCで行った。低負荷時のセル電圧は、1.5Vと単セルの約3倍となったが、高負荷においては出力が低下した。燃料極および空気極とAl箔との接触抵抗による抵抗分極が原因として考えられる。今後、接続材料や接続材の表面処理などを検討して接触抵抗の低減を図る。

本研究では、DMFCの量産化・経済化を図るため、電解質膜を挟んで燃料極と空気極とを対峙して形成したMEA(Membrane Electrode Assembly)を、二つ折りにして巻き込むことにより構成する巻き積み型DMFC、および研究過程で新たに考案した二つ折りにしたMEAをジグザグに折り畳むこと(折り紙プロセス)によって構成するジグザグ型DMFCの実現を図る。本年度は、昨年度に引き続き内部抵抗の低減や燃料供給の改善などを図ると共に、3セル直列接続による高電圧出力ジグザグ型DMFCを作製し、実際のモバイル機器へ適用することを目的とした。昨年度Al箔を用いて問題となった接続抵抗の増大については、表面元素分析によりその原因がAl_2O_3の形成に因ることを明かにし、AuメッキTiメッシュを用いることで内部抵抗の低減を果たした。燃料供給については、供給材にスリットと共に切り込みを設けることで燃料供給を改善できることを明らかにした。さらに、燃料が循環するように供給材を工夫することで出力の落ち込みを大きく改善できることも明かとした。また、高出力動作時の課題抽出のため50°Cでの動作実験を行い、室温動作に比べて数十%出力が増加することを示した。以上の結果を基に、5cm×15cmの電解質膜状に4cm×4cmの空気極と燃料極とを電解質膜を挟んで各々6個形成し、折り紙プロセスを用いてジグザグ型3セル直列接続DMFCを作製した。3セル直列接続DMFCの出力電圧は、単セルの3倍の1.5Vを示し、市販のポータブルカセットプレイヤーに適用してその動作の確認が図れた。
多成分凝固系におけるマッシー層内プルーム対流の定量的評価とフレックル形成パターン

本研究では合金の凝固過程において発生するフレックルと呼ばれる偏析現象を模擬するため塩化アンモニウム水溶液を用いて一方向凝固実験を行った。特に偏析と密接に関係する対流現象をいくつかの可視化法を併用し、詳細に検討した。主要な結論は次のとおりである。1)フィンガー対流とプルーム対流の関係:フィンガー対流はプルーム対流発生のトリガーとしての役割を演じ、プルーム対流はフィンガー対流と共存する期間で発生と減衰を繰り返す。フィンガー対流が消失するとプルーム対流は長く持続し、マッシー層内にチャンネルが冷却面に向かって成長する。また、共存期間は初期温度が増加するほど長くなることを見いだした。2)液層部の対流評価:PTVやPIVによる速度計測法を用い、フィンガー対流およびプルーム対流の速度を計測した。特にプルーム対流では上昇流と下降流とが共存する2重構造を有することを見いだした。3)マッシー層部の対流評価:界面近傍の流体を染料で着色し、マッシー層内への染料線の浸透速度を測定し、00.1mm/sの値を得た。この結果はプルーム速度から流体の連続性を考慮して推算した値に近く、計測の妥当性を確認した。4)プルーム対流の発生:プルーム対流発生の位置は一意的に定まらず不安定である。これはマッシー層内の構造、すなわち対流が結晶形態と密接に関連しているためである。本研究ではNH4Cl水溶液を用いて、下方から凝固させ、対流挙動や結晶成長について実験的に検討した。この系において発生する対流は濃度差による浮力に基づくもので、最初にフィンガー型対流がマッシー界面上に発生し、その後マッシー界面の移動速度が低下すると局所的に緒晶が界面近傍から再融解し、プルーム型対流が発生する。さらに再融解はマッシー層内部へ進行し、大きなチャンネルを生じる。そのためプルーム対流はチャンネルがマッシー層底部に到達するまで発達し、その後減衰する。これら2つの対流の速度分布をマイクロスコープを用いた粒子追跡法によって検討した。フィンガー対流は上昇流と下降流からなるが、大きさは等しくなく上昇流が強いことがわかった。その最大速度は0.6mm/sであった。プルーム対流は上昇流の周囲に下降流が存在する2重構造を有し、従来予想されていた速度分布とは大きく異なることが明らかとなった。中心速度の最大値は3.8mm/sであった。フィンガーからプルーム対流の遷移はマッシー界面で起こり、一部のフィンガーが成長してプルームヘ変化することを感温液晶シートの等温線変化より観察した。*フィンガー対流とプルーム対流の関係:フィンガー対流はプルーム対流発生のトリガーとしての役割を演じ、プルーム対流はフィンガー対流と共存する期間では発生と減衰を繰り返す。*対流場における速度の計測:PTVによる速度計測とPIVによる計測と比較し、精度の妥当性を確認し、プルーム対流の2重構造を定量的に評価した。*マッシー層内の対流評価:界面近傍の流体を染料で着色し、マッシー層内への染料の浸透速度を測定し、0.01mm/sの値を得た。この結果はプルーム速度から流体の連続性を考慮して推算された値に近い。特に、対流に及ぼす初期温度の影響を調査した。実験手法には3色露光法、PIV法、染料トレーサ法を使用した。

*フィンガー対流の挙動と定量化:上昇流と下降流の位置がランダムに移動し、プルームの発生によってフィンガー対流は減衰する。さらにPIV法によって、フィンガー対流の速度場を計測することができた。*マッシー層内の流れの可視化:マッシー層内の対流は層全体で発生するのではなく、局所的に界面近傍で発生する。そのため、プルーム対流は消失する場合がある。しかし、フィンガー対流が減衰するとマッシー層内の対流は層全体にその勢力範囲を拡大し、プルーム対流は長く保侍される。このような対流挙動はマッシー層の結晶配列の不均一性(または透過率の非等方性)に起因するもとの考えられる。*初期温度が高いほどフィンガー対流はより長く存在するが、プルーム対流の発生は初期温度の影響をほとんど受けない。また、対流の強度は初期温度が高いほど弱くなる傾向にある。これらの結果はプルーム対流がフィンガー対流を抑制する効果があることを示唆している。しかし、フィンガー対流はプルーム対流を発生させるトリガーの役目は有している。したがって、マッシー層内の対流の発生を決めるレイリー数は一意的には定まらないと思われる。
職業性接触皮膚炎の症例収集と2次、3次予防対策の構築

ドイツ、ザーランド州で2000年から2013年までに職業性接触皮膚炎として申請された1772症例を解析した。ドイツでは、職業性疾患を医師が報告する義務があるため、ザーランド州の労災保険の被保険者全体の統計データである。本邦には、このような包括的な統計は存在しないので、本邦での職業性接触皮膚炎の実態を類推するのに有用である。職業性接触皮膚炎は職業性手湿疹と診断されることが多いが、最近開発された手湿疹特異的QOL尺度(Quality of Life in Hand Eczema Questionnaire:QOLHEQ)の日本語版の開発と検証を行い、計量心理学的特性をもつ尺度であることが示され、本邦でも使用可能となった。食品取扱業の従事者は職業性接触皮膚炎発症のハイリスク職種であるが、パン製造職場に従事する1,183名に自記式質問表を配付し、940名の回答を解析した。手湿疹の年間有病割合は33.4%で、一般集団の有病割合の約10%と比較して高いことがわかった。発症因子の解析を引き続き行う必要がある。本邦の業務上疾病には皮膚病としての分類は存在しない。職業性接触皮膚炎が分類されるとすれば、大分類4の化学物質による疾患であるが、そのうちの小分類、その他の疾患のなかで、接触皮膚炎もしくは湿疹の病名のついた症例を、厚生労働省に情報開示申請の手続きを行い、症例を収集した。20142016年の3年間で33症例が開示され、2017年は申請中である。職種や経過などの情報のほとんどが非開示の黒塗りで、不十分な情報しか得られなかったが、今後集計を行う。熊本県の臨床皮膚科医会の医師に、職業性接触皮膚炎の症例に対して、労災保険を適応した経験の有無、また、労災保険の適応が困難な理由などについての質問紙表を郵送し、無記名にて回答を依頼した。154名中71名から回答が得られ、今後解析する。業務上疾病大分類4に含まれる皮膚障害症例の収集では、小分類9のその他の疾患の2014,2015,2016年分の開示請求を厚生労働省に行い、承認され、収集した。小分類1,3,4に含まれる皮膚障害についても厚生労働省に開示を試みたが、各症例の詳細は、都道府県の労働局に存在するとのことで、熊本県だけでも6か所におよぶ。熊本県の症例は、同じく2014,2015,2016年分の開示請求を労働局をとおして行ったが、皮膚障害と明示していたが、開示された症例の内容がくい違っていた。職業性接触皮膚炎の労災申請にかんする皮膚科医の意識調査について、質問紙表を作成した。ドイツのハイデルベルグ大学Department of Socialmedicineとの共同研究では、手の接触皮膚炎の生活の質に関する質問紙表の英語版の翻訳、検証を行い、論文の投稿を行った。また、ドイツのザーランド州で集積された職業性皮膚障害の申請症例のデータ分析を行った。職業性接触皮膚炎の本邦における症例報告の文献検索による症例収集は、2010年以降を行っている。パン製造職場の職業性接触皮膚炎の実態調査では、データ収集、基礎的な解析が終了した。業務上疾病の症例収集は、大分類4の小分類9のその他の疾患と小分類1,3,4の症例の集計の取り扱いが、厚生労働省一括でおこなっているわけでなないことが判明した。当初は、3年間の皮膚障害の認定症例をすべて収集する予定であったが、困難な印象である。

154名中71名から回答が得られ、今後解析する。業務上疾病の大分類4の小分類1,4,5に含まれる皮膚障害については、熊本の労働局の開示請求の経験で、同じ質のデータを収集するのは難しい印象であった。今後は、小分類9のその他の疾患を毎年蓄積していく予定である。職業性接触皮膚炎の労災申請にかんする皮膚科医の意識調査について、質問紙表を皮膚科医会の理事会に提出し、承認を得る予定である。その後、郵送で回答を依頼し、回収する予定である。共同研究では、手の接触皮膚炎の生活の質に関する日本語版の質問紙表の検証は、本年度日本産業衛生学会で発表予定である。また、ドイツの職業性皮膚障害のデータの分析結果は、本年度10月のESCDでポスター発表の予定である。論文の投稿も早急に行う予定である。職業性接触皮膚炎の症例取集は、まず、2010年以降で集計を試み、その結果をみながら2000年以前の症例収集に進む予定である。パン製造職場の調査は、本年度日本産業衛生学会で発表予定である。さらに、解析をすすめて、危険因子の確定を試みる。質問紙表調査の物品費、郵送費、国際学会発表のための旅費、職業性皮膚障害症例収集のための研究補助費、論文英語の校正費および論文投稿費
BMPシグナル活性化による内耳有毛細胞の再生

ほ乳類では内耳有毛細胞はいったん傷害されると再生することがない。BMP-4は有毛細胞の発生に関わる重要な因子である。本研究ではBMPシグナルの操作による有毛細胞再生の可能性について検討した。BMP-4、Nogginなどは発生中の内耳での発現が確認され、耳胞培養系では培養条件を確立、有毛細胞の評価型として用いることが出来ることを確認した。内耳障害は難聴の主要な原因であり、いったん障害を受けた内耳有毛細胞が再生しないことが難聴の治療を困難にしていると考えられる。本研究の目的は、発生段階における有毛細胞の増殖・運命決定に重要な役割が予想されるBMP-4シグナルを操作することで有毛細胞の再生、難聴の改善の可能性を探ることである。本年度は、下記についての研究を実施した。1)関連遺伝子の正常発現パターンの解析正常胚および生後マウスを用いて、様々な分子の発現を免疫染色で調べた。BMP-4のような分泌因子については、免疫染色でタンパク質の局在を調べるだけではなく、in situ hybridizationでmRNAの局在を調べる必要があるため、これを行うためのセットアップを行い、条件設定を行っているところである。2)ノックアウトマウスBMP4遺伝子アレルの一つをLacZで置換したノックアウトマウス(BMP-4lacZ/+)を入手し、動物実験施設搬入のためのクリーニング、およびホモ接合体作成のための繁殖を行っている。また、有毛細胞発生をより早い段階で、確実に検出できるようにするために、Atho1遺伝子のプロモータ下にEGFPを配したトランスジェニックマウス(Math1-GFP)も同時に導入し、クリーニング、繁殖を行っている。3)耳胞培養様々な発生段階のマウスから耳胞を摘出し、in vitroでの培養条件を検討した。一般的には血清の添加が行われているが、この場合は血清は必ずしも耳胞の生存率を改善せず、代用血清を用いる方が好ましいことが分かった。しかし、代用血清も省略してglucoseのみの添加では十分な発育を得ることが出来なかった。内耳有毛細胞の障害はマウスやヒトでは不可逆で、これが感音難聴の治療が困難である主要な原因である。対してニワトリでは有毛細胞が障害されたときには、細胞が増殖し、有毛細胞が再生し、聴覚が回復する。なぜこのような差が生まれるかは分かっていない。本研究は、内耳有毛細胞の増殖・運命決定に重要な役割を果たす因子について、BMP-4のシグナルを中心に検討し、これを操作することで内耳有毛細胞の再生、感音難聴の改善を目指すものである。本年度は以下の研究を行った。1.ノックアウトマウスBMP4-lacZ/+ノックアウトマウスを入手して、genotypingを行った。またMath1-GFPマウスについても入手し、genotypingを行った。マウス胚においてホールマウントおよび切片でin situ hybdizationを行う実験系を確立し、BMP4やその他の内耳発生関連遣伝子のmRNA発現を検出した。3.耳胞培養発生初期の様々な段階のマウス胚から耳胞を摘出し、in vitroでの培養条件を検討した。代用血清を用いた培地で発生初期の内耳のマーカーであるPax2の発現を指標にして免疫染色で評価したところ、BMP4はPax2発現に何らかの影響があることが分かったがその詳細は現在解析中である。また、ソニックヘッジホッグもPax2発現に対して影響があることが分かった。
地域景況統計の総合的研究

平成14年度から平成17年度にかけて、地域景況統計の実施状況についての調査研究を行った。地方統計については、(財)全国統計協会連合会から『地方統計ガイド』(総務省統計局統計基準部編、1998年)が発行されているが、ここにいう地域景況統計はそのごく一部が捉えられているのみで、全体像がそこから浮かび上がってくるわけでない。したがって、この研究は当初より手探りで進める以外なかった。地域での景況調査というと、まずは中小企業の動向をどう捉えるかが問題になり、そのため、全国規模で実施されている中小企業景況調査のヒアリングから研究を始めた。中小企業基盤整備機構・中小企業庁、中小企業金融公庫、国民生活金融公庫、商工中金、全国信用金庫協会、中小企業家同友会の調査などである。この調査において景況調査の特性を把握した後、地域景況調査の実施状況についての調査に入った。地方行政の関係部署は商工労働部であり、全都道府県、政令市に対し、まずは電話での問い合わせを行った。また、実施しているケースについては直接訪問によるヒアリングを行った。次いで行ったのが各県に設置されている中小企業振興公社、中小企業支援センター、下請振興公社に対する調査である。こちらも同様の方法で全都道府県について調査を試みた。公的機関における実施状況についてはほぼ捉えられたといってよい。研究成果については別途報告書をまとめた。そこでは、各機関の景況調査の実施概要について都道府県別に整理をしている。不十分さは残るとはいえ、地域景況調査について、このように網羅的に整理されたのは初めてのものである。2002年度の研究は、大きく2つの取り組みに分けられる。第1は、景況調査の実施機関にたいする取組状況のヒアリング調査、第2に、最近の経営動向についての中小企業家へのアンケート調査の実施である。後者については、中小企業家同友会・全国協議会と中小商工業研究所の協力をうることが出来た。調査機関のヒアリングについては、中小企業金融公庫『中小企業動向調査』、商工中金『中小企業月次景況調査』、国民生活金融公庫『全国小企業動向調査』、東京都信用金庫協会『都内中小企業景況調査』等について行うことが出来、それぞれの機関の実施状況について貴重なデータが得られた。これらについては、『地域景況統計の総合的研究』(2002年度部内資料)にまとめる予定である。第2の中小企業家へのアンケート調査については、取引先企業の倒産・廃業の影響、地域経済の空洞化の実態、取引先企業ならびに自社企業の海外展開の実態、経営環境変化への対応をテーマに中小企業家への意識調査を実施し、全国4000社余りから回答が得られた。この調査については、いくつか報告書をまとめることが出来た。また、自営業者の『健康と営業実態調査』に関わることができ、現在結果の取りまとめ中である。これらの取り組みと別個に、『同友会景況調査』について個票レベルの整理を行い、ミクロデータ解析のための準備作業に着手した。90年から97年まではある程度整理がされてきていたが、ここで直近のデータまで整理を行うことにした。新しい試みとしては、オプション調査、特別調査などとのリンクをみている点である。2003年度の研究は、2002年度に続き、景況調査の実施機関にたいする取組状況のヒアリング調査と経営動向についての中小企業家へのアンケート調査を実施した。後者については、前年同様、中小企業家同友会・全国協議会と中小商工業研究所の協力をうることが出来た。調査機関のヒアリングについては、2002年度に行なった中小企業金融公庫『中小企業動向調査』、商工中金『中小企業月次景況調査』、国民生活金融公庫『全国小企業動向調査』、東京都信用金庫協会『都内中小企業景況調査』についての調査結果を整理するとともに、本題である地域景況統計についての調査準備として、神奈川県、埼玉県他いくつかの県で実施されている県内の景況調査のヒアリングを行なった。

地域での調査のパターンとしては、埼玉県労働商工部で行なっている県独自の調査、神奈川県中小企業センターで行なっている県外郭団体の調査、横浜市と神奈川総合情報センターで行なっている市と第3セクターの共同調査、地域金融機関の行なっている調査、各地商工会議所の行っている調査などに分かれる。これらについて、インターネット上で公表されている限りでの各地調査の存在について調査を行った。2004年度には、これらの地域景況統計について主だったところのヒアリングを全国規模で行なう予定である。こうした地域景況調査全体についての調査活動はわが国で最初の試みとなる。2004年度の研究は、2003年度末に取り組みを開始した地域景況調査の実施機関に対する調査であった。本研究課題のメインの作業であり、これを全国的規模で実施したのはわが国では初めての試みである。その結果概要については法政大学日本統計研究所の統計所報・参考資料『地域景況調査の実施状況』にまとめた。地域の行政においては、何らかの形で企業調査が行われているが、それを内部資料にとどめているケースと積極的に結果公表を行っているケースの二つに大きく分かれる。本プロジェクトで対象としているのは、調査を独自に実施し、結果を公表している調査である。それは、地域再生の土台は地域における健全な事業活動の発展にあり、その活動状況を行政のみならず、地域の構成員自身が捉えることが大事だからである。こうした観点から、まず、都道府県、政令指定都市、都道府県庁所在市すべてについて、地域景況調査の実施状況を調査した。これは一種の統計調査ではあるが、各地の統計課で実施されているのは稀で、多くは産業労働部、商工労働部といった企業と接する最前線の部署で行われている。こうした本局で行われていない場合、各都道府県に設置されている中小企業支援組織である産業振興公社等(中小企業支援センター)に委託されていることも少なくない。これらの機関についても、47の都道府県すべてについて実施状況を調査した。また、これらの公的機関の調査に劣らず地域企業調査を定期的に実施しているのが地方銀行である。取引先企業の経営動向を把握するのは業務の遂行上必要な面があるが、それを単なる内部資料とするのではなく、報告書を作成したり、WEBで公表したりと、情報を積極的に開示しようとしている姿勢が見られる。この地方銀行についても、第1地銀、第2地銀すべてを調査した。これらの調査はまず電話ヒアリングを行い、調査を実施している機関から調査票及び報告書を取り寄せるという形で進めた。興味深い調査へは、直接訪問し、担当者へのヒアリングを行った。こうして、上記機関に関する限りは、地域景況調査の実施状況をおおよそ掴み取ることが出来たと考えている。ただし、地域でのシンクタンク、信用金庫、商工会議所等の独自の調査については次年度の課題として残っている。次年度はこれらを埋めるとともに、実施内容について類型化を図り、各機関が共通して抱える問題点を明らかにすると共に、地域景況調査の意義、今後の課題について明らかにすることとする。1地域景況調査の実施状況データ一覧の作成