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大正新教育におけるカリキュラム改革の史的再検討―成城小学校を中心に―

考証のために、1930年代初頭の新潟県中蒲原郡の公立小学校の児童文集についての分析にも取り組んだ。その結果、満州事変後の公立小学校において、多くの教師が、児童に対して、国内外の情勢に関する科学的・実証的な認識を育むのではなく、情緒的・徳育的な指導を推進していたことが分かった。前任校の任期満了に伴う勤務校の異動と業務内容・エフォートの変化により、当該年度の進捗状況は当初想定していたよりもやや遅れている。ただし、刊行・発表された研究業績は少ないものの、調査・収集した資史料の分析は継続的に進めており、2018年度中の発表に向けて準備を進めている。引き続き、前年度までに収集した史資料の分析に当たるとともに、1930年代初頭成城小学校において推進されたカリキュラム改革の内実と位置づけについて検討を進めた。やや具体的に述べると、成城小創設者の沢柳政太郎の著作、同校の教師たちが著した書物や論考、機関誌『教育問題研究』に掲載された種々の記事、さらには成城学園教育研究所に所蔵されている当時の学園内部の史資料の分析を進めた結果、次の諸点が明らかになってきた。採択された研究計画において焦点を当てた小林茂や内田庄次といった教師たちが成城小着任後に展開した教育論には、当時の郷土教育連盟の指導者の一人であった小田内通敏の理論の影響があったことが判明した。とりわけ、小林の「郷土」概念は、小田内のそれから強い影響を受けて形成されたものと考えられ、小林が米国の動向から学んだカリキュラム改革の方向性を実現するための鍵概念となっていた。他方で、成城小の教師たちが残した論考群や教職員会議の内部資料から、彼らが1930年代に入ると、当時の日本の教育界における新教育への「ブルジョワ教育」批判、郷土教育運動の動向やマルクス主義思潮の影響などを受けながら、従来から学校全体で掲げてきた「自学主義」を相対化し、新たに様々な教育方法を総合した「成城学習」なるものを打ち出して「学習の個別化」から「生活の社会化」へというカリキュラム改革の全体方針の転回がなされていたことが解明されつつある。収集した史資料の分析を進めたところ、採択された研究計画において提起した作業仮説に妥当性があったことが確かめられつつある。ただし、成城小学校の教師たちが学校劇を芸術教育として教育的意義のあるものから、社会性や協同性を涵養するための教育方法へと評価を改めていったかどうかについては、今のところ、やや検討が遅れている。今後も当初の研究計画に即して課題を遂行する。やや具体的には、前年度に調査・収集した海外文献と成城学園所蔵史料などを中心に分析し、個別学習と集団的創造的活動とを柱とするウィネトカ・プランのカリキュラム構造が、成城小学校の教師たちのカリキュラム観に与えた影響を実証的に考察する。また、成城小学校の教師である小林茂と内田庄次が主たる担い手となった郷土教育に関する研究と、そこからの影響関係を解明するために、『郷土』や『地理歴史教育』などの教育雑誌を中心として必要な一次史料を収集・検討する。引き続き、採択された研究計画に沿って作業を進める。やや具体的には、成城小学校の教師である小林茂と内田庄次の共著『郷土教育と国史地理の取扱』をはじめとする諸論考に示されたカリキュラム観を、前年度に収集した一次史料の分析を通じて解明された同時代の郷土教育連盟の動向やその指導者の一人であった小田内通敏の理論との関連性を考慮しつつ分析する。
環境自律型バイオミメティック(生物模擬)建築の開発と評価に関する研究

人体・生物が持つ環境生理機能を建築に模擬応用する「バイオミメティック(生物模擬)建築」を実現するために必要となる要素技術、複合技術、評価法を構築し、その環境・エネルギー性能を評価した。ここでは、有望機能である「発汗機能」、「植物導管揚水機能」、「衣替え機能」の他、「自律調光窓」、「日射制御外壁」を建築要素技術として構築し、実験と解析に基づき性能を確認評価するとともに、人体エクセルギー消費の考え方に基づく室内環境評価結果を示した。人体・生物が持つ環境生理機能を建築に模擬応用した「バイオミメティック建築」を構築するために必要となる要素技術、複合技術、評価法について研究を進め、今年度に得られた主な研究成果は以下の通りである。(1)生物の生息環境と人体・生物の持つ環境生理機能についての調査を行ない、その形態や機構の環境共生や建築環境制御への模擬性や適用性を検討した。(2)有望な環境生理要素技術の提案とモデル化として、「鳥肌・起毛機能」、「サーモクロミック機能」、「植物導管揚水機能」、「発汗機能」等を抽出し、以下の成果を得た。1)表面で選択吸収・選択放射機能を持たせた各種の外壁試験体を構築し、夏季・冬季の熱性能を実験的に求め、非選択性外壁と比較して、その熱(衣替え)効果を示した。2)自律型調光窓材として有力な候補である、二酸化バナジウム薄膜のサーモクロミック挙動を、光学膜設計と材料整合性の観点から、非晶質シリコン酸化物と多層膜化し、シリコンの酸化数と膜厚の調整によって近赤外透過スペクトルの調光制御性を高めることで高性能化した。3)植物の揚水機能をモデル化するため半透膜や溶質を検討し、MF膜を用いた揚水実験モデルを構築して揚水量を実験的に求めた。4)感温性高分子材を使用し発汗機能を持つ「汗かき屋根」を構築し、同一気象条件下で一対の実験小屋(汗かき屋根を敷設した発汗小屋と非発汗小屋)を用いた蒸発冷却実験を行い、「汗かき屋根」の自然冷房効果を定量的に示した。(3)バイオミメティック建築の評価に関連して、人体のエクセルギー収支の夏における特徴を明らかにする解析を行なうとともに、人の感覚-行動プロセス研究の一環として、エアコン装置の使用状況と室内温熱環境、使用者の温熱環境履歴との関係を明らかにした。(1)「汗かき屋根」の感温性高分子材とバインダーの吸排水性能を実験により確認した。また、一対の実験小屋(汗かき屋根を敷設した発汗小屋と非発汗小屋)を作成し、壁体の断熱性能を変えて同一気象条件下で蒸発冷却実験を行い、「汗かき屋根」の自然冷房効果を定量的に示した。(2)表面で選択吸収・選択放射機能を持たせた新規の外壁試験体を構築し、夏季・冬季の熱性能を実験的に求め、非選択性外壁と比較して、その熱(衣替え)効果を示した。(3)VO_2膜のサーモクロミズムを幅広く制御するため、TiO_2との複合酸化物化の効果を調べ、VO_2に新しい熱光学的機能を持たせるため、化学的手法による作製技術の開発を試みた。一方、VO_2以外の新規省エネ建材(日射制御タイルと新規感温型調光窓材)を探索した。(4)植物の水搬送機能を模した浸透圧利用の揚水装置について、濃度差によって駆動するポンプの働きを維持するために、持続的に濃度差を維持することが可能かどうかについて検討した。システムシミュレーションにより、ポンプの配管を環状とし溶液を循環させることによって、この水搬送システムが持続的に機能することを確認した。(5)各種要素技術の複合効果を評価する手法を理論的に検討した。(6)バイオミメティック建築の環境評価として、人が暑熱な屋外をしばらく歩行した後に室内に滞在した場合の温熱生理量の変化と快適性との関係を通風室とエアコン室で比較した。通風室ではヒトの発汗蒸泄機能により、皮膚表面温度が徐々に低下するとともに不快申告も減少するため、「涼しさ」は空気温度が高めで、風がほどよく揺らいでいる状態において得られる感覚・知覚であること、また、通風室のような非定常性の強い環境を評価する場合は、人体エクセルギー収支の特にエクセルギー消費の大きさが、ヒトの不快とよく対応することを明らかにした。「バイオミメティック建築」を構築するために必要となる要素技術、複合技術、評価法について、今年度に得られた主な研究成果は以下の通りである。(1)発汗機能を模した新構成の「汗かき屋根(感温性高分子材マット+タイル)」を構築し、実験小屋を用いた蒸発冷却実験により、その自然冷房効果を定量的に示した。

(2)三角柱形状の異形タイルを用い日射制御外壁の入射太陽光と反射光の分光分布を測定し、異形タイル外壁の太陽光吸収率の変化の季節依存性(夏の低吸収率、冬の高吸収率)を明らかにし、その適用性を示した。(3)サーモクロミック材料である二酸化バナジウム(VO_2)を自律型調光窓材に応用する際に重要となるVO_2の屈折率および光吸収は、チタン添加量によって緩やかかつ安定に制御できること、さらにVO_2内に入ったチタンの役割を示した。(4)植物の導管揚水機能を模した揚水システムについて、シミュレーションにより自律循環が機能するための設計条件を求め、適切なシステム諸元で構成した装置実験により揚水を確認した。(5)温熱環境の最適化のための手段の選択や順序決定への適用に向けて、社会性昆虫である蟻の群知能としての意思決定システムを模した最適化アルゴリズムを考案した。このアルゴリズムは、組み合わせ問題の最適解探索に向いており、その性能を検証した。(6)屋外の暑熱環境下からエアコン冷房室あるいは通風室へ移動する際の人体エクセルギー収支の変動に関する数値解析を行ない、エアコン冷房室では人体エクセルギー消費が入室直後に著しく大きくなるが、通風室ではあまり大きくならない事、また両者の差は主に汗水の持つ湿エクセルギーの大小による事を明らかにした。(7)「汗かき機能」と「衣替え機能」を複合模擬した住宅をモデルとして、各地域における環境・エネルギー性能を解析し、複合化による環境改善・省エネルギー効果が大きいことを示した。
潰瘍性大腸炎の癌化に関わる遺伝子異常と細胞粘液形質

外科切除潰瘍性大腸炎合併大腸癌(colitic cancer)およびdysplasiaを対象とした本研究により、その遺伝子異常、細胞形質変化ついて以下の結果を得た。1.p53がん抑制遺伝子の異常は、colitic cancerの3/4、随伴するdysplasiaの4/4例で認められた。3.Colitic cancer合併大腸粘膜では、7/9例でMUC5ACのびまん性発現がみられた。その頻度は年齢、潰瘍性大腸炎罹患期間を適合させた大腸癌非合併潰瘍性大腸炎に比べ高い傾向があった。4.Colitic cancer5例を検討した限りでは、癌部、非癌部いずれにもMSIは認められなかった。以上より、潰瘍性大腸炎における癌発生には以下の過程が想定された。慢性持続性炎症→大腸陰窩stem cellの胃型(MUC5AC発現)への細胞形質転換→p53遺伝子異常→dysplasiaの発生→癌へのprogression。Colitic cancer発生メカニズムの解明には、大腸陰窩のStem cellレベルでの細胞形質転換(胃型への転換)の背景にある遺伝子異常や分子メカニズムを明らかにする必要がある。また、潰瘍性大腸炎粘膜の胃型への細胞形質転換は、癌発生のリスクマーカーとしての意義があると考えられた。1潰瘍性大腸炎(UC)に合併した大腸癌(UCAC)の粘液形質sm以深浸潤癌の5/8(62.5%)、粘膜内癌(もしくはdysplasia)の4/6(66.7%)はMUC2+/MUC5AC+であった。対照としての炎症性腸疾患非併存大腸癌で同mucin phenotypeを呈したものはなく(0/60)、その42/60(70%)はMUC2-/MUC5AC-であった。MUC2とMUC5ACの共発現は、潰瘍性大腸炎を発生母地とする大腸癌の特徴的粘液形質と考えられた。2大腸癌合併UC粘膜のMUC5AC発現大腸癌を合併したUCではその7/9(22.2%)で、非腫瘍性陰窩にMUC5ACのびまん性発現がみられた。一方、年齢・UC罹病期間をマッチングさせた大腸癌非合併UCにおける陰窩のびまん性MUC5AC発現は2/9(22.2%)であった。潰瘍性大腸炎粘膜におけるMUC5ACのびまん性発現は、大腸癌発生のリスクマーカーの一つとしての意義が期待される。3 dysplasiaの胃型形質分化dysplasiaの9/17(53%)は、胃腺窩上皮型および幽門腺型粘液のcore proteinであるMUC5AC、MUC6を共発現しており、それらの腺管内分布は胃幽門腺粘膜と同様に、MUC5ACが粘膜中層表層、MUC6が粘膜深層であった。UCに発生する大腸癌は、胃幽門腺粘膜に類似した2方向性胃型形質分化を特徴としており、その発生母地として大腸粘膜の胃化生の存在が想定される。4 UCACのDNA抽出癌の深達度(sm以深、粘膜内)とp53免疫染色態度別にパラフィン切片からDNAを抽出した。現在7病変119箇所のDNA抽出が終了し、それらのK-ras,p53 mutationの有無、MSIを検索中である。1.潰瘍性大腸炎に合併する癌とdysplasiaのp53遺伝子変異パラフィンブロックからsm以深癌4例とそれに随伴するdysplasia部のそれぞれ3箇所からDNAを抽出し、p53遺伝子変異(exon5-8)の有無を検索した。p53遺伝子変異は4例の癌、dysplasia全てに認められた。癌部のp53 mutationのパターンにはheterogeneityはなかったが、2病変のdysplasiaでは抽出箇所により異なるmutationのパターンがみられた。p53遺伝子異常は潰瘍性大腸炎の癌化に重要な役割を果たしているが、dysplasiaの段階では異なるp53遺伝子異常パターンを来した複数のsubcloneが存在していると推定された。2.潰瘍性大腸炎に合併する癌とdysplasiaのK-ras遺伝子異常p53遺伝子変異の検索と同じDNAを用いて、K-ras codon 12変異の有無を検索した。sm以深浸潤癌、dysplasia、いずれにも変異は認められなかった。

sm以深浸潤癌6例とそれに随伴するdysplasia部からそれぞれ3箇所以上の領域を選び、DNAを抽出した。D2S123、D5S346、D17S250、BAT25、BAT26の5つのmicrosatellite markerを用い、MS1の有無を検索した。癌、dysplasiaともにMSI-H(2つ以上のmarkerにreplication errorあり)を示したものはなかった。
新規TA system、YjhXQの生理機能およびトポイソメラーゼI阻害機構

大腸菌において新規のTA systemであるYjhX-YjhQ TAsystemを同定した。YjhXの過剰発現によってDNAおよびRNA合成が同程度阻害された。その後、YjhXはトポイソメラーゼI活性を阻害するがDNAジャイレースおよびトポイソメラーゼIII活性は阻害しないことが示され、YjhXはトポイソメラーゼIを特異的に阻害するタンパク質であることが明らかとなった。トポイソメラーゼI特異的阻害タンパク質はこれが初めての発見である。YjhXによるトポイソメラーゼI活性阻害機構の解明は、新規抗生物質創成の基盤となりうると考えています。YjhXの過剰発現によってDNAおよびRNA合成が同程度阻害されたことからYjhXはDNAジャイレースまたはトポイソメラーゼIを阻害していることが示唆された。その後、YjhXはトポイソメラーゼI活性を阻害するがDNAジャイレースおよびトポイソメラーゼIII活性は阻害しないことが示された。以上の結果から、YjhXはトポイソメラーゼIを特異的に阻害するタンパク質であることを明らかにした。トポイソメラーゼI活性を特異的に阻害するタンパク質はこれが初めての発見である。現在までにDNAジャイレースおよびトポイソメラーゼIVに対する抗生物質は数多く開発されているが、トポイソメラーゼIに対する抗生物質はほとんど存在しない。真核生物のトポイソメラーゼIは原核生物とはその構造が全く異なることから、トポイソメラーゼIは抗生物質の標的となりうる。今回発見したYjhXによるトポイソメラーゼI活性阻害機構の解明は、新規抗生物質創成の基盤となりうる。本年度は申請時に計画した5つの実験をすべて終了し、来年度(27年度)の予定を前倒して実施できた。欠損株の作成は幾つかの異なる大腸菌のyjhX-yjhQ欠損株をすでに作成済みであり、また、YjhX-TopAの相互作用の詳細な解析についても必要なタンパク質はすべて精製を終了しタンパク質標品を得ている。平成27年度の実験に必要な材料の準備をすべて26年度に終えることができた。27年度が最終年度であるため、記入しない。応用微生物申請時の研究計画に変更はない。これまでどおり粛々と実験を行い、得られた結果を発表する予定である。結晶構造解析については外部研究者と話し合いを続けている。27年度は以下の実験を予定している。Persister形成におけるYjhXの役割YjhXはTopA活性を阻害することで生育を阻害し、persister状態を誘導する可能性が示唆される。この休眠状態では菌は抗生物質による致死効果を回避することができる。よって、YjhXがTopAを阻害することで休眠状態を誘導するために重要な役割を果たしている可能性がある。私はyjhXyjhQ欠損株を作成し、生育、形態変化、およびpersister形成を抗生物質添加後の生菌数を測定することで解析する。菌体を異なる濃度の抗生物質で処理した後経時的にサンプルを採取し、生菌数を測定する。さらに、TopA発現プラスミドを野生株および欠損株に導入し、その後上記の実験を行う。この仮説が証明されれば、TopAの新規機能発見であり、病原菌のpersister形成による多剤薬剤耐性機構に新たな知見が得られる。
全ゲノム重複におけるエピゲノムの進化と制御の解明

エピゲノム情報が進化を推進するプライマリーな要素だと考えられる。本研究では、メダカを使ってエピゲノム情報を収集・解析し、それらの進化を詳しく調べた。その結果、パラログ遺伝子領域に関して、ゲノム配列の保存度と配列のDNAメチル化の保存度とは相関していないことを見出した。さらに、ロングリードを用いて細胞間のDNAメチル化の多様性をより効率的に捉える手法を提案し、細胞集団におけるDNAメチル化の不均一性を解明した。具体的には、ゲノム全域にわたって低メチル化領域のDNAメチル化の不均一性が抑えられたことを明らかにし、高・低メチル化領域の境界における漸次的に変化するメチル化パターンを最初に発見した。進化の中心要素であるゲノム配列より、遥かに環境要因に柔軟に適応するエピゲノムのほうが、進化を推進するプライマリーな要素だと考えられる。しかし、エピジェネティック情報と生命現象の制御との関係は未解決な問題が多く、特に進化上の重要プロセスである全ゲノム重複について、網羅的なエピゲノム研究はほとんど行われておらず、その保存パターンと制御の詳細についてまだ解明されていない。本研究では、メダカを使ってDNAメチル化や、クロマチン修飾因子などのエピジェネティック情報を収集解析し、全ゲノム重複によって形成されたパラログ領域におけるエピジェネティック情報の進化と制御を解明することを目指している。平成25年度は、所属する研究室の並列計算機を用いて、収集したメダカのDNAメチル化とクロマチン修飾マークなどのエピジェネティック情報の解析と、DNAメチル化のlinkage情報を得られるための実験を試みた。具体的には、バイオインフォマティクスの手法を使って、Ka/Ks解析によって全ゲノム重複に由来する染色体ブロックの同定と、パラログ遺伝子のゲノム配列の保存度の比較と、進化的に保存された低メチル化領域のエピゲノムの特徴を分析した。その結果として、パラログ遺伝子領域に関して、ゲノム配列の保存度と配列上のDNAメチル化の保存度とは相関していないことを見出し、DNAメチル化の進化にはトランスエレメントが関与することが示唆された。情報解析に使われているデータには、所属する研究室に別経費で収集したメダカのクロマチン修飾マーク(H3K4me2、H3K27me3)や、公開済みのデータなども含められている。現在はエピジェネティック情報と進化・制御との関係を解析しながら、DNAメチル化のlinkage情報を得られるためのIllumina社MiSeqSystemsを使う全ゲノムバイサルファイトシーケンシング実験の設計をし、予備実験と情報解析を進めている。本研究では、メダカを使ってDNAメチル化や、クロマチン修飾因子などのエピジェネティック情報を収集解析し、エピジェネティック情報の進化と制御を解明することを目指していた。平成25年度は、所属する研究室の並列計算機を用いて、収集したメダカのDNAメチル化とクロマチン修飾マークなどのエピジェネティック情報の解析をした。最終年度の平成26年度はDNAメチル化の連鎖情報を得られるためのIllumina社MiSeqSystemsを使う全ゲノムバイサルファイトシーケンシング実験の設計・実行をし、具体的にはメダカの肝臓細胞を使った実験と情報解析を行った。細胞集団におけるDNAメチル化の不均一性・多様性の解明は、エピゲノミクスレベルの細胞摂動とその分子機構の理解に関わっているが、われわれは、ロングリードにおける連鎖するシトシンメチル化(CpGサイト)を解析し、細胞間のDNAメチル化の多様性をより効率的に捉える手法を提案した。この手法を用いて、ゲノム全域にわたって低メチル化領域のDNAメチル化の不均一性が抑えられたことが明らかになり、高・低メチル化領域の境界における漸次的に変化するメチル化パターンを最初に発見した。これらの成果をまとめて、現在投稿中である。バイオインフォマティクス次世代シーケンサー(Illumina社HiSeq Systems)で解読されるエピジェネティック情報の実験データの収集については、研究協力者から支援されながら順調に進行している。所属する研究室の並列計算機を使う情報解析の進捗もおおむね順調である。Illumina社MiSeqSystemsを使うDNAメチル化のlinkage情報の収集は、まだ予備実験を行っている段階で、平成26年度に完了する見込みである。

本研究を遂行するあたり、平成26年度はトランスクリプトーム情報を得られるためのRNA-Seq実験と、DNAメチル化のlinkage情報得られるための全ゲノムバイサルファイトシーケンシング実験を行い、エピジェネティック情報の情報解析を推進する予定である。本研究を遂行するあたり、平成26年度はトランスクリプトーム情報を得られるためのRNA-Seq実験と、DNAメチル化のlinkage情報得られるための全ゲノムバイサルファイトシーケンシング実験を行い、エピジェネティック情報の情報解析を推進する必要がある。引き続き、全ゲノムの発現量情報と、DNAメチル化のlinkage情報を収集するために必要な試薬や消耗品の購入、成果発表のための論文投稿費用と旅費として使用する計画である。
光合成蛋白における生体分子スピン系の量子情報操作に向けた研究

光合成における高効率なエネルギー変換プロセスが、長寿命の量子コヒーレンスに関連している可能性が、複数のグループによって示されてきた。さらに最近では光合成のモデル系として、室温においても光励起状態で量子コヒーレンスを示すヘテロダイマー型分子の合成が報告された。我々はこれまで、高時間分解EPR(Electron Paramagnetic Resonance)実験から、光合成反応における光エネルギー変換の初期過程において、純粋な一重項状態をとるスピン相関ラジカル対(correlated spin pair)が光誘起電子移動によって生成され、室温においても比較的長寿命のコヒーレンスを有していることを示してきた。また、シアノバクテリアタンパク質中の置換可能な水素および窒素を重水素化および15N置換することで、コヒーレンス時間が主に周辺の核スピンによって影響を受けていることを明らかにした。光合成の電子移動経路は各タンパク質中に2つあるが、一方のラジカル対について、量子コヒーレンス時間は同位体置換によって600ナノから1.2マイクロ秒まで伸びることを明らかにした。しかし、もう一方のラジカル対は、同じような化学的環境下に置かれているにもかかわらず、量子コヒーレンス時間は半分であり、熱的に常に揺らいでいる多数の水分子やアミノ酸分子などが存在する生物的環境において、長寿命の量子コヒーレンスを維持する別の要因も示唆された。今後、太陽電池に利用されるチオフェンオリゴマーを対象に、光合成のモデル分子の合成と高時間分解EPRによる特性化を行い、生物機能と量子コヒーレンスとの関係を分子論的に詳細に明らかにしていく予定である。25年度が最終年度であるため、記入しない。近年、光合成に参加する分子が常温においてもエンタングルド状態を保持している可能性が示され、天然の光合成タンパクは量子情報科学分野において注目を集めつつある。光合成反応における光エネルギー変換の初期過程では、生体膜に特異的に結合したタンパク質(いわゆる反応中心と呼ばれるタンパク質)の中で、一連の光誘起電子移動が生じ、その初期電荷分離過程において純粋な一重項状態をとるスピン相関ラジカル対が生成される。そのラジカル対の固有状態間にコヒーレンスが存在し、本研究では我々がこれまでに開発してきた超高速時間分解EPR装置より量子ビートとして、そのコヒーレンス観測を行ってきた。なお、我々のEPR装置の時間分解能は、世界でもトップレベルである5nsを実現している。光合成タンパク内のコヒーレンスは室温においてさえ観測されることは特筆すべきであり、現在その長時間のコヒーレンスがいかにして保持されるのか、様々な化学的環境下における実験で追跡している。実際これまでに、シアノバクテリアタンパク質中で置換可能な水素および窒素を、重水素化および15N置換することで、数百nsまでコヒーレンス時間を改善してきた。我々はまた、生体分子スピン系の量子情報を検出および操作を可能とするため、電流検出型高時間分解高周波パルスEPR装置の構築も行ってきた。これまでに、Bruker社製E600分光器に自作のパルス制御システムと、高出力(280mW)マイクロ波パルス増幅器を備えたマイクロ波ブリッジを導入することにより、高時間分解高周波パルスEPR装置の構築を終え、さらに改良型共振器の試作を終了し、標準試料による性能評価を行った。本研究の目的は、高時間分解高周波(95GHz)パルスESR分光器を発展させ、高時間・スペクトル分解能を有し、かつ超高感度な電流検出型高周波パルスESR法を確立するとともに、光合成タンパク内のスピン相関ラジカル対に対して量子コヒーレンスの安定化および量子スピン状態の制御と観測を行うことである。

具体的には、1)光合成タンパクの緩衝剤(pH調整試薬)、溶媒、あるいは同位体の置換など化学的な処理を通して量子コヒーレンスの安定化を行うこと、2)電流検出ESRに適用可能な微小なデバイス試料の作成を行うこと、3)微小試料と並行して、比較的大きな試料にも適用可能なESR共振器を新たに作製すること、4)高時間分解能化を図るため、マイクロ波発振器を改良し、マイクロ波パルスの高強度化を行うこと、5)光電流の検出と同期した高周波パルスESR実験を実現し、光合成タンパクにおけるスピン状態の制御と観測を行うことである。1)については、重水素化置換などでコヒーレンスの安定化を図ることができ、現在さらに他の条件下においても測定を行っているところダル。2)については、モデル化合物(フラーレン誘導体および伝導性高分子)を用いて、様々な試料形状のデバイス作成が可能となった。3)については、まだ標準試料に対する測定しか行っていないが、比較的大きな試料にも適応可能な共振器のプロトタイプの作製をすでに終えた。4)については、マイクロ波発振器を高強度化した。5)については、次年度の課題として残っている。本研究の目的のひとつ「光合成タンパクの緩衝剤(pH調整試薬)、溶媒、あるいは同位体の置換など化学的な処理を通して量子コヒーレンスの安定化を行うこと」については、可変の化学的条件が多岐に渡るため、より系統的な条件探索ができるよう模索していく予定である。また、「電流検出ESRに適用可能な微小なデバイス試料の作成を行う」という目的については、デバイス作製時の生体試料の安定性が問題となるので、適切な保護剤の検討を今後行っていく。そして、「光電流の検出と同期した高周波パルスESR実験を実現し、光合成タンパクにおけるスピン状態の制御と観測を行うこと」についても、試料作成と共振器の改良がキーとなるので引き続き行っていく予定である。25年度が最終年度であるため、記入しない。
抗ＮＭＤＡＲ脳炎における病的自己抗原提示細胞の検索研究

正常卵巣におけるNMDAR抗原の発現を検索するため、ウシの卵巣と未受精卵を検索した。免疫組織化学的に原始卵胞の細胞質と未受精卵の細胞膜にNR2B抗原の発現が認められた。次に凍結卵巣と未受精卵1031個を集めて蛋白化学的分析を行った。Immunoblottingではこれら組織にNR1とNR2Bの蛋白分画があることが見出された。そこで未受精卵の細胞膜から抽出した蛋白分画をLC-MS/MSで解析したところ、SPFGRFK, KNLQDR, GVEDALVSLK, QPTVAGAPK, NEVMSSKの5個のペプチドを得た。これらはNR1、NR2A、NR2B、NR2Cの部分アミノ酸配列と一致した。抗NMDAR脳炎はその疾患概念が提唱された当初は若い女性に好発して、卵巣奇形腫を基礎疾患として有していることが強調された。しかし最近の多数例の検索では女性患者における卵巣奇形腫の合併率は40%以下であり、また全患者の10%が男性であることも判明している。そこで平成24年度はヒトの正常卵巣と精巣におけるNMDAR関連抗原の発現を免疫組織化学的に検索した。剖検で得られたヒト卵巣11個(年齢1829歳)と精巣3個(年齢1934歳)のパラフィンブロックから連続切片を作成して、NMDAR関連抗原に対する3種類の抗体(抗NR1抗体、抗NR2A抗体、抗NR2B抗体)と抗glial fibrillary acidic protein (GFAP)抗体を用いて免疫組織化学的染色を行った。その結果、卵巣11個の全ての原始卵胞細胞の胞体内にNR2B抗原の発現が見出された。しかしこれらの原始卵胞細胞におけるNR1、NR2A、GFAPの発現は確認されなかった。一方、精巣3個においてはこれら4種類の蛋白の発現は全くみられなかった。以上よりヒト正常卵巣においてはNMDAR関連抗原が発現していることが示唆され、この蛋白抗原が何らかの免疫学的機序により抗NMDAR抗体を産生して、重篤な脳炎を引き起こすことが推測される。研究方法:対象として剖検で得られたウシ5頭(年齢26歳)の正常卵巣、ウシ未受精卵1031個を用いた。1.ウシ卵巣と未受精卵をそれぞれPBS溶液でホモゲナイズし遠心分離。沈殿分画をさらにRIPA溶液でホモゲナイズし遠心上清をNMDA受容体サブユニットの各抗体で免疫沈降した。得られた沈降物を用いウエスタンブロッティングを行った。2.ウシ未受精卵を準備し、沈降物をトリプシン消化した後、液体クロマトグラフィー質量分析器で分析した。3.ウシ未受精卵と抗NMDA受容体脳炎患者の血清IgGを反応させ、両者の親和性を免疫蛍光抗体法で検討した。考察:従来抗NMDA受容体脳炎の抗原提示部位は卵巣奇形腫内の神経組織とされてきたが、正常卵胞にNMDA受容体の発現が示されたことから、本症女性例では卵巣奇形腫の合併・非合併を問わず卵巣における何らかの刺激が抗原提示を誘発し抗NMDA受容体抗体の産生につながる。平成23年度は抗NMDAR脳炎患者から摘出した卵巣奇形腫21例(平均年齢23.7歳)と非脳炎患者10例(平均年齢21.6歳)の卵巣奇形腫を対象にglial fibrillary acidic protein (GFAP)で免疫染色される神経組織の含有面積をコンピューター解析した。その結果、同腫瘍に占める神経組織の割合は4.731.2%と個々の例でばらつきが大きかったが、この割合は両群間で差がなかった。次に卵巣奇形腫における炎症細胞浸潤の程度を軽度、中等度、高度の3段階で評価し、また浸潤単核細胞をCD3, 20, 45RO抗原で免疫染色して、リンパ球のサブグループの検索も行った。炎症細胞浸潤の陽性率は脳炎合併例で71.4%、非脳炎合併例で70.0%と両群間に差がなく、またその程度にも違いはなかった。さらにリンパ球の表面抗原の解析からも、両群における浸潤炎症細胞において、T細胞、B細胞、memory T細胞のいずれの細胞においてもその優位性は見出せなかった。正常卵巣におけるNMDAR抗原の検索としては、35歳で死亡したウシ5頭の卵巣を免疫組織化学的に検索して、全例の卵胞細胞(特に原始卵細胞)の細胞質にNR2B抗原の発現があることが確認された。今年度はヒトの剖検組織を対象として免疫組織化学的検索を行い、従来、2例の正常卵巣組織のみで見出していたNMDAR関連抗原の発現を、多数例において確認することができた。昨年度既に同様の所見をウシの複数個の卵巣においても見出しており、

正常卵巣組織においてNMDAR関連抗原が発現しているとする免疫組織化学的根拠を十分に得た。卵巣奇形腫は抗NMDAR脳炎患者から摘出した同腫瘍21例と対照とする非脳炎患者から摘出した同腫瘍20例が収集できており、同腫瘍に含まれる神経組織ならび炎症細胞浸潤の検索は予定どおり進んでいる。またヒトの正常卵巣組織ならび卵細胞を研究対象とすることは倫理的側面から困難であるため、ウシの同組織を対象に選んだ。今年度入手したウシの卵巣組織においても既にヒトの組織で見出されているNR2B抗原の発現を確認することができ、今後の卵細胞を用いたNMDAR関連蛋白の生化学的分析はウシの体外受精用の卵細胞を用いて行う方針が確立できた。後者については長野県の畜産試験場から不要となったウシの体外受精用の卵細胞を上記の研究目的で入手できる予定である。本研究の重要課題は抗NMDAR脳炎が何故女性に好発するのかを解明することである。われわれは仮説として女性の正常卵巣組織、特に卵細胞にNMDAR関連抗原が含まれており、何らかの免疫学的機序によりこの蛋白の抗原提示が起こり、抗NMDAR抗体が産生されて重篤な脳炎を引き起こすと考えている。従来の免疫組織化学的検索で得られた所見を基に、今後はウシの未受精卵ならびに凍結保存してある卵巣を用いてNMDAR関連蛋白を蛋白化学的に分離・同定することを計画している。本研究の重要課題は抗NMDAR脳炎が何故女性のみに発生するかを解き明かすことである。我々は仮説として女性の卵巣組織、特に卵細胞にNMDAR関連抗原が含まれており、何らかの炎症機序でこの抗原提示が起こり、抗NMDAR抗体の産生、次いで抗NMDAR脳炎が発生すると考えている。今回、ウシの体外受精用の卵細胞を生きた状態で入手することが可能となり、in vivoの細胞を用いて蛋白化学的検索が出来ることは本研究の大きな推進力になることが期待される。研究費の大部分は試薬品代として使用する。研究試薬はウシの未受精卵、卵巣組織からNMDAR関連蛋白を分離・精製する際の電気泳動ならびに免疫化学的反応を行うために使用する。また、平成24年度には当初予定していた研究試薬が安価で購入できた為、次年度使用額が生じた。研究試薬はヒト卵巣奇形腫の免疫組織化学的検索とウシの卵細胞からNMDAR関連蛋白を回収、精製、電気泳動ならびに免疫化学的反応を行うために使用する。尚、平成23年度には当初計画時よりも研究試薬を安価で購入できたため、次年度使用額が生じた。
上方照明による腹腔鏡手術照明システムの有用性の検討

これまでの研究成果として,動物実験に使用できる「陰影の手がかり」をもたらし,腹腔鏡手術映像に奥行き知覚が得られる照明システムを確立した.しかしながら,問題点として,照明光が腹腔鏡レンズに入射することで「白うき」という現象が発生することがわかった.「白うき」が生じると,被写体が見えなくなり,手術が遂行できない.それは,特に腹腔鏡下肝切除術で顕著であった.そこで,照明器具に実装したLEDパネルの配置を変更することで,この問題を解決し,動物実験において,安全に手術が遂行できることを確認した.なお,この照明器具については,手術用照明装置として,平成25年6月3日に実用新案権を出願し,これを取得した.これまでの研究成果として,動物実験に使用できる「陰影の手がかり」をもたらし,腹腔鏡手術映像に奥行き知覚が得られる照明システムを確立した.しかしながら,問題点として,照明光が腹腔鏡レンズに入射することで「白うき」という現象が発生することがわかった.「白うき」が生じると,被写体が見えなくなり,手術が遂行できない.それは,特に腹腔鏡下肝切除術で顕著であった.そこで,照明器具に実装したLEDパネルの配置を変更することで,この問題を解決し,動物実験において,安全に手術が遂行できることを確認した.なお,この照明器具については,手術用照明装置として,平成25年6月3日に実用新案権を出願し,これを取得した.今回の研究の目標は,新しい腹腔鏡手術照明システムの有用性を客観的に検証することである.まずは,平成23年度までの研究によりわかっていた問題である「白うき」のない照明器具の改良をおこなった.平成24年9月にスタートアップ支援を受けて,デザインの見直し・照明範囲・照度の強さのシミュレーションなどを行い,平成24年12月に改良型照明デバイスを完成させた.その後,平成25年1,3月に2回の動物実験を行った結果,特に腹腔鏡下肝切除術時に問題になっていた「白うき」の問題が解決されることを確認した.これにより,照明デバイスの「白うき」が原因によって,手術の進行が妨げられるかもしれないといった問題が解決されるため,高難易度手術が可能となり,平成25年度の研究では,より臨床に近い研究データが得られる可能性が高くなったと考えられる.一方,平成24年度は,本照明システムによる術者の手術中のストレス軽減の有無の測定を目標のひとつとしていた.しかし,照明デバイスの完成がやや遅れたこともあり,平成24年11月からの動物実験は3回しか施行できておらず,現在,パイロットスタディの段階である.ただ,これまでのデータでは,照明方法による明らかなストレスの違いが,はっきりと見えてきておらず,今しばらく,データ収集が必要と考えられる.今回の研究の目的は,第1世代照明デバイス(以下,旧照明)で問題であった「白うき」を解決する第2世代の照明デバイス(以下,新照明)の有用性,および,新照明を用いた手術システムの有用性を客観的に検証することが,2本柱であった.そこで,新照明を用いて,平成25年度もブタを用いた動物実験を行った.動物実験では,常備されている標準画質の腹腔鏡ではなく,ハイビジョン画質の腹腔鏡を借用し,記録媒体も通常のDVDから,ブルーレイディスクを用いた.これにより,通常の臨床と同質の手術映像で手術を行い,記録することができた.その結果,2点のことがわかった.まず,旧照明では「白うき」のために手術困難であった腹腔鏡下肝切除術において,「白うき」が解決され手術が可能となったことである.旧照明において,唯一手術困難であったのが肝切除術であったことから,これにより,ほとんどの腹腔鏡手術が可能となったことを意味する.次に,主観的評価ではあるが,新照明により,立体感や奥行き知覚の欠如が改善されたことに加え,手術映像に精細さが増したことや,開腹手術で,臓器を直接見ているかのような自然な見え方をすることがわかった.こういった美しい手術映像は,これまでの腹腔鏡手術映像では見られず,新照明を用いた,ハイビジョン撮影によってしか得られなかった映像であり,非常に重要な結果であったと思われる.すなわち,手術チーム全体が手術中の体腔内の情報をより正確に共有することが可能となることが期待できる点で,画期的と思われる.なお,本研究の成果については,平成25年6月の第21回欧州内視鏡外科学会において,口演発表した.しかしながら,もう1つの柱であった,手術システムの有用性の客観的評価まではいたらなかった.術者のストレスを測定するときの手術の平均的手技として消化管縫合を想定していた.しかし,この手技は,多くの被験者が行うには,やや難易度が高いことがわかった.したがって,平均的手技を決定するための試行錯誤と,その手技によるパイロットスタディが必要となったため,計画がやや遅れている.25年度が最終年度であるため、記入しない。上方照明による腹腔鏡手術照明システムの有用性を検証する方策のひとつであるストレス測定は,明らかな違いは検出が困難かもしれず,手術の質的評価指標である手術時間や出血などを,主評価項目とする方向への転換が必要かもしれない.一方,本システムの有用性の証明方法のひとつとして,手術映像の照度分布を取り入れる予定にしている.

これは,開腹手術映像を基準とし,上方照明と通常照明映像をランダムにピックアップし,その照度分布を,肉眼視と同等な開腹手術映像と比較検討するものである.どちらがより肉眼視に近い,自然な映像であるかという指標になると考える.25年度が最終年度であるため、記入しない。
磁性体におけるスピン軌道トルクの研究

今年度はFe/MgO/Vヘテロエピタキシャルトンネル接合における巨大な界面スピン軌道トルクの発現条件最適化と機構解明を目的として研究を押し進めた。まずトンネル接合の規格化面積抵抗の大きさを様々に変えてスピントルクを評価した。これによりFe/MgO/V接合で得られたトルクはほぼ電圧誘起であることがわかった。界面スピン軌道相互作用に起因する通称ラッシュバトルクと呼ばれる電流誘起トルクがほぼ観測されなかったこと、そして非常に薄い酸化マグネシウムを採用したときのみに大きな電圧誘起トルクが観測されたことは驚くべき発見である。また、このトルクのバイアス電圧依存特性を精査すると、非線形でありゼロバイアス付近でピークを持つことがわかった。これは非線形電圧スピントルクの発現に関してフェルミ面付近の電子状態が重要であることを示唆している。次にスピントルクの発現機構を探るため、トンネル異方性磁気抵抗効果のバイアス及び磁化角度依存特性を精査した。本研究ではFe/MgO/Vと対抗電極に非磁性Vを用いているため、両極性バイアスに対してトンネル異方性磁気抵抗効果を評価できるてんが特徴である。トンネル異方性磁気抵抗効果の2回対称成分と4回対称成分のバイアス依存特性を精査した結果、フェルミ面付近にFe/MgOの界面準位があることを見出した。従って得られたスピントルクとこの界面準位に密接な関係がある可能性が大きい。このようにFe/MgOというシンプルながら非常に高品質な金属/絶縁体界面を用意し、本研究課題では強磁性金属と絶縁体の界面準位に起因する高効率なスピントルクの発現を見出した。これは今後の界面物性研究の新しい可能性を切り開くものと期待される。28年度が最終年度であるため、記入しない。これまでにCoFeB/MgO、Fe/MgO、IrMn/MgO等の各トンネル接合においてトンネル異方性磁気抵抗(トンネルAMR)が発現することを見出した。またCoFeB/MgO/Taトンネル接合においてCoFeB/MgOのトンネルAMRを用いたスピントルクダイオード効果の測定にも成功した。(2015年Applied Physics Leters誌に発表)これにより界面スピン軌道トルクを評価できる実験環境が整った。またMgOに埋め込まれたFeナノ粒子においてもトンネルAMRが発現することを見出した。(2016年Journal of Electronic Materials誌に発表)スパッタ法によるCoFeB/MgO/Ta接合よりも、分子線エピタキシー法を用いたFe/MgOエピタキシャル接合の方が耐電圧や電流安定性において優れていることがわかったため、年度の後半ではFe/MgO接合に注力した。Fe/MgO接合においてV/Fe/MgO/Vエピタキシャル成長、トンネルAMRの発現、そしてCoFeB/MgOよりも大きな信号雑音比でのトンネルAMRによるスピントルクダイオード効果を実現した。Fe/MgO接合におけるスピントルクダイオード効果からFe/MgO接合では4,000,000,000 (1/Vs)もの巨大な界面スピン軌道トルクが存在することを見出した。このトルクの大きさは規格化面積抵抗3 Ωμm2のトンネル接合におけるスピントランスファートルク同等であり非常に大きい。これにより界面スピン軌道トルクを評価できる実験環境が整った。またFe/MgO接合においてV/Fe/MgO/Vエピタキシャル成長、トンネルAMRの発現、そしてCoFeB/MgOよりも大きな信号雑音比でのトンネルAMRによるスピントルクダイオード効果を実現した。Fe/MgO接合におけるスピントルクダイオード効果からFe/MgO接合では4×10^9 (1/Vs)もの巨大な界面スピン軌道トルクが存在することを見出した。トルクの大きさは規格化面積抵抗3Ωμm2のトンネル接合におけるスピントランスファートルク同等である。このように研究は非常に順調に進んでいる。今年度は巨大なスピン軌道トルクの起源解明と更なるトルクの増大を目指す。

トンネル異方性磁気抵抗効果の2回対称成分と4回対称成分のバイアス依存特性を精査した結果、フェルミ面付近にFe/MgOの界面準位があることを見出した。従って得られたスピントルクとこの界面準位に密接な関係がある可能性が大きい。このようにFe/MgOというシンプルながら非常に高品質な金属/絶縁体界面を用意し、本研究課題では強磁性金属と絶縁体の界面準位に起因する高効率なスピントルクの発現を見出した。これは今後の界面物性研究の新しい可能性を切り開くものと期待される。前年度に発見したV/Fe/MgO/Vトンネルにおける巨大な界面スピン軌道トルクの発現条件最適化と機構解明を目指す。具体的には下記の3つを行う。(1)トンネル接合の規格化面積抵抗の大きさを変えてスピン軌道トルクを評価する。これによりトルクの電流誘起成分と電圧誘起機成分を分離する。(2)トンネル異方性磁気抵抗効果(TAMR)と界面スピン軌道トルクの大きさを比較する。特にそれぞれのバイアス電圧依存特性を評価する。これにより界面電子状態と界面スピン軌道トルクの相関を議論する。(3)Fe/MgO接合の間に異種原子を1原子層挿入し、トンネルAMR効果と界面スピン起動トルクの相関を評価する。28年度が最終年度であるため、記入しない。
抗がん剤によるアポトーシス誘導機序の解析と誘導因子を標的としたがん化学療法の開発

胃癌細胞をモデルとして,抗癌剤によるアポトーシス誘導機序を解析し,誘導因子を標的とした新しい癌化学療法の開発を目的にし,平成10年度に記載された実験計画書により得られた知見は以下の通りである.(1)アポトーシス誘導関連遺伝子gadd153導入による抗癌剤感受性の増強はアポトーシス誘導に一致し,従来の抗癌剤感受性規定因子MDR1,MRP,Topoisomeraseの発現に変化は認められなかった.すなわち,アポトーシス誘導シグナル伝達の修飾による感受性の増強であることが示唆された.(2)アポトーシス誘導関連遺伝子gadd153,bcl-Xs,bax導入により,複数の抗癌剤に対する感受性が増強され,また抗癌剤による関与遺伝子の相違の存在が示唆された.(3)各誘導関連遺伝子導入により,他の関連遺伝子の発現量の増加がみられ,誘導関連遺伝子間のアポトーシス誘導への相互作用の存在が示唆された.(4)アポトーシス誘導遺伝子導入クローンのヌードマウス皮下移植腫瘍に対する抗癌剤投与は,アポトーシス誘導による腫瘍増殖1制効果を認めた.以上から,癌化学療法におけるアポトーシス誘導遺伝子を分子標的とした導入あるいは修飾による抗腫瘍効果増強の可能性が示唆された.胃癌細胞をモデルとして,抗癌剤によるアポトーシス誘導機序を解析し,誘導因子を標的とした新しい癌化学療法の開発を目的にし,平成9年度に記載された実験計画書により得られた知見は以下の通りである.(1)胃癌細胞株に対する新規抗癌剤Taxotere処理による転写因子AP-1の活性化は,用量,時間依存性であり,抗癌剤感受性及びDNAの断片化によるアポトーシス誘導度に相関がみられた.(2)胃癌細胞株におけるアポトーシスの誘導は,p53の遺伝子型に関連は認めらず,p53非依存性に誘導されるAP-1活性化に相関性が認められた.(3)AP-1活性化は,還元剤との併用により増加し,アポトーシスの誘導が増強された.(4)AP-1関連遺伝子gadd153およびp21^<WAF1>の発現量はアポトーシス誘導と相関性がみられた,(5)胃癌細胞株へのgadd153の遺伝子導入は,AP-1依存性抗癌剤CDDP,VP-16に対してアポトーシスの誘導増強,感受性の増加が認められた.現在,引き続き,多の抗癌剤感受性規定因子およびアポトーシス誘導関連遺伝子との関連について研究を進ていめる.胃癌細胞をモデルとして,抗癌剤によるアポトーシス誘導機序を解析し,誘導因子を標的とした新しい癌化学療法の開発を目的にし,平成10年度に記載された実験計画書により得られた知見は以下の通りである.(1)アポトーシス誘導関連遺伝子gadd153導入による抗癌剤感受性の増強はアポトーシス誘導に一致し,従来の抗癌剤感受性規定因子MDR1,MRP,Topoisomeraseの発現に変化は認められなかった.すなわち,アポトーシス誘導シグナル伝達の修飾による感受性の増強であることが示唆された.(2)アポトーシス誘導関連遺伝子gadd153,bcl-Xs,bax導入により,複数の抗癌剤に対する感受性が増強され,また抗癌剤による関与遺伝子の相違の存在が示唆された.(3)各誘導関連遺伝子導入により,他の関連遺伝子の発現量の増加がみられ,誘導関連遺伝子間のアポトーシス誘導への相互作用の存在が示唆された.(4)アポトーシス誘導遺伝子導入クローンのヌードマウス皮下移植腫瘍に対する抗癌剤投与は,アポトーシス誘導による腫瘍増殖1制効果を認めた.以上から,癌化学療法におけるアポトーシス誘導遺伝子を分子標的とした導入あるいは修飾による抗腫瘍効果増強の可能性が示唆された.
染色体分配に必須なセントロメアの核内機能構築の分子基盤

遺伝情報をコードするDNAは、細胞核内の染色体に収納され、セントロメアを制御拠点として子孫細胞に伝達される。本研究では、分裂酵母および高等真核細胞をモデル系にして、進化的に保存されたセントロメア核内機能と染色体分配における新規制御機構を分子的に明らかにした。これらセントロメア機能の制御破綻が、細胞がん化などの病態にどのように関わるかを探ることで、新たな治療戦略の考案に資することが期待できよう。セントロメア複合体と染色体機能発現に重要なRNAi装置および染色体制御に必須なスピンドルチェックポイント機構がどのようなクロストークをしているかについて解析した。(1)進化的に保存されたセントロメアサブ複合体Mis6-Sim4がMad2スピンドル結合チェックポイント蛋白質のセントロメア局在に必須であること、及びその物理的結合を示した。また染色体維持に重要なGATA転写因子Ams2の破壊株中では、セントロメア特異的ピストンCENP-AのS期依存的局在が起こらないこと、G2期に再ローディング経路が存在するためにCENP-A局在が細胞周期依存的になるという驚くべき結果を得た。(2)異所的ヘテロクロマチンを誘導するゲノム配列を分裂酵母セントロメアDNAより抽出した。セントロメアの反復配列ユニット中の独立な2領域にその活性は限局された。分裂酵母セントロメアでのヘテロクロマチン形成にはRNAi機構が関わることが指摘されているが、分裂酵母セントロメア由来のsiRNAを詳細にマッピングした結果、2領域はともにsiRNAの特異的産生元に相当することが判明した。RNA配列を介したヘテロクロマチン領域決定の作用機序について解析を進めている。(3)ヒト21番染色体由来の人工染色体を保持するDT40細胞を対象にして、RNAiマジーナリーに関与するDicer遺伝子の条件的ノックアウト細胞を樹立した。Dicerの発現が失われた細胞で、ヒト人工染色体のセントロメア領域からのRNA転写が確認できた。RNaseプロテクションアッセイの結果、2本鎖RNAを形成することが示唆された。また、Dicerノックアウト細胞で、ヘテロクロマチンタンパク質やコヒーシンタンパク質の局在異常が観察されたことから、Dicerは高等動物細胞においてヘテロクロマチンの形成に重要な働きを担っていることが示唆された。セントロメア複合体と染色体機能発現に重要なRNAi装置および染色体制御に必須なスピンドル形成チェックポイント(SAC)の分子機構について解析した。(1)SACのメディエーター分子であるMad2のキネトコア局在機構について、張力チェックポイント分子Bub1およびDASH複合体が協調的に働いていることを見いだし、そのM期における機能ダイナミクスを張力が発生しないキネトコアを人為的に作り出すことにより検証した。またCENP-AのG2ローディング機構についてヒストンシャペロンHIRAの関与を同定した。(2)分裂酵母セントロメアDNA中で異所的ヘテロクロマチン誘導能力を持つ部分は、セントロメアでのsiRNAの産生源に相当していたが、異所的ヘテロクロマチンの近傍への拡大反応はsiRNAの配列に拘束されないことを示した。siRNA産生経路は主にヘテロクロマチンの確立に寄与しており、siRNAの前駆体RNAの転写はそのDNA部位のヘテロクロマチン化を引き起こすことを明らかにした。また、分裂酵母で内因性siRNAが相同な転写産物の二次的siRNA産生を誘起することを示した。(3)DT40細胞を用いたセントロメアおよびヘテロクロマチン構築の解析として、RNAi装置関連タンパク質のArgonaute3および4のノックアウト細胞株を樹立して、ノックアウト株の網羅的な転写物の解析を行った。その結果、RNAi装置の破壊で転写が向上する遺伝子を複数同定したが、ヘテロクロマチン構築との関連は現時点で不明である。また、新しく同定したセントロメアタンパク質については、複数のノックアウト細胞を樹立して表現型を解析した結果、CENP-Hを含む複合体が少なくとも3種類のサブ複合体から成ることを明らかにできた。これらのノックアウト細胞を用いて、高等動物のセントロメア構築に関する分子機構の解明を進めている。セントロメア複合体、染色体機能発現に重要なRNAi装置、ゲノムに散在する反復配列について以下の結果を得た。(1)分裂酵母DASH複合体破壊株およびセントロメア蛋白質伽8変異株群の分子遺伝学的解析から、DASH複合体がセントロメア機能異常により誘起されるチェックポイントのサイレンシング過程に関与することを示した。(2)分裂酵母ゲノムに3コピー散在するヒストンH3、H4遺伝子の転写制御を定量的に解析、3つの全く同じ蛋白質をコードする遺伝子が異なった転写制御を受け、反復遺伝子間に複雑なフィードバック制御が存在することを示した。(3)分裂酵母セントロメアヘテロクロマチンDNAから産出されるsiRNAの作用機序を解析、内因性siRNAを含むRNA干渉エフェクター複合体は、相同なRNAに配列依存的に強く作用し、RNA発生源であるDNA領域のクロマチン構造制御には弱い効果のみを示すことを見いだした。細胞質で機能するsiRNA