hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
廃棄物原点処理に基づく系統的水環境学習の実験教材開発と教員研修

平成22年度は、系統性のある水環境学習とそれに用いる環境負荷の小さな実験教材開発及び教員研修についての実証研究を行った。研究分担者、連携研究者と共に次の5項目の研究を進めた。1.教員及び学校への情報提供資料の収集とデータベース作成水環境、廃棄物処理、環境、安全及びヒトの健康に関する市販書籍や論文、資料等のリストアップとデータベース化をし、さらに学校等からの問い合わせ対応システム構築の研究を行った。2.水環境学習に関する教員の意識調査教員対象の水環境調査実習を行い、アンケート調査で体験を伴う実習の有効性が明らかになった。3.系統性のある水環境学習プログラムの実証研究学校教員の協力を得て、地域や学校の実態に即した水環境学習プログラムの作成と実証授業を行った。身近な河川やため池など、地域の水を対象にした学習プログラムが有効であることが分かった。4.系統的な水環境学習実験教材の開発と改良キットを使わず、比色分析の測定原理を押さえた水質分析実験教材を開発し、教員研修で用いた。5.廃棄物原点処理に基づく水環境実験法の開発毒性の低い試薬の利用と土壌微生物による実験廃棄物の分解を組み合わせて、実験者自らが廃棄物を処理できる水環境実験法を考案し、理科の教員研修において環境学習と関連させて実施した。平成21年度は、系統性のある水環境学習とそれに用いる環境負荷の小さな実験教材の開発及び教員研修についての以下の基礎研究を行った。1.水環境学習に関する教員の意識調査水環境学習の実施状況、児童・生徒の意識、授業を行う上での課題、教員が必要とする資料、実習機材などのアンケート調査を行った結果、水環境学習で利用できる適切な教材の不足と教員自身の実験観察力の向上が課題であることが明らかになった。2.系統性のある水環境学習プログラムの作成に関わる基礎研究学校教員と連携して、理科カリキュラムと関連させた連続性・系統性のある水環境学習プログラム案を作成し、必要な実験法及び実習・実験機材の明確化を行った。3.水環境学習実験教材の開発「ものづくり」の観点から安価な光電比色計の試作など、水環境学習に用いる教材開発を行った。4.廃棄物原点処理に基づく水環境実験法の開発環境負荷を抑えた水環境実験の開発のため、マイクロスケール化実験と既存実験法における安全な試薬への変更などの基礎的研究を行った。
近赤外分光法（ＮＩＲＳ）を使った脳機能研究に内在する皮膚血流問題の解決

精神医学分野では、言語流暢性課題時に額で計測される近赤外分光(NIRS)信号のパターンの違いによる欝の鑑別診断がなされている。本研究では、同課題中のNIRS応答には、直接的な脳活動よりも皮膚血流変化が大きく影響していることを示した。さらに、同課題中に額と指の脈波信号を同時計測することにより、心的負荷による額の皮膚血液動態は、指のものとは異なるパターンになることを示し、額の皮膚血管の拡縮には、複雑な生理機序が存在することを示す結果を得た。これらは、認知課題負荷時の額の皮膚血流信号が、臨床応用上有用な情報を有することを示す。また、NIRS信号中の脳活動由来成分を分離するための基礎的知見を与える。当初の計画では、課題による自律神経活動が引き起こす皮膚血流の時空間分布の計測を目的とし、多チャンネルの接触型Dopplerレーザ組織血流計(Doppler血流計)を用いて多点同時計測実験を行う予定であったが、交付額の都合で多チャンネルDoppler血流計を購入できず、手段を変えて目的の達成を目指すこととした。すなわち、大学病院のMRIを用いて、課題遂行中のMRI信号変化と前額部1点のみの皮膚血流変化との相関関係を調べることで、頭部全体の血流変化および、そのような課題負荷による皮膚血流変化を引き起こす脳活動を詳しく調べることとした。当該年度は、14名の健常被験者に対し、fMRI実験を行った。具体的には、MRI撮影中に言語流暢性課題を遂行中の被験者から、前額部から1チャネルDoppler皮膚血流計による皮膚血流および手指からパルスオキシメータによる血流のfMRIとの同時計測を行った。データ解析は、まず、前額部と手指のそれぞれの皮膚血流データの時間周波数解析を行い、脈波成分の振幅変化と周波数変化とに分離した。現在これらを時系列テンプレートとしてfMRIデータ解析を実施しているところである。また並行して、皮膚の血液動態モデルの構築を進めている。具体的には、光伝播モンテカルロシミュレーションによる頭皮浅層の組織の光学パラメータ変化がNIRS信号への反映のされ方を調べるとともに、一方で、頭皮血管の脳血液動態モデルを検討している。近赤外分光法(NIRS)を用いた脳機能計測では、その計測信号に脳活動由来の成分の他に、課題の心的負荷に伴う自律神経性の血流動態の影響が少なからず存在することを明らかにした研究成果を、本研究期間にまとめ、論文発表した(Takahashi et al., 2011)。本研究の目的は、この一連の成果をさらに掘り下げ、自律神経性の前額部皮膚血流の生理機序の理解を目指すことであった。最終年度は、課題中の前額部皮膚血液動態が他の部位の皮膚血液動態とは異なることを明らかにした。具体的には、言語課題中の前額部と指尖の皮膚血液動態を比較するために、8名の健常被験者に対し、前額部のDoppler皮膚血流計と指尖部のpulse oximeterの同時計測データを調べ、それぞれの計測信号に含まれる脈波成分の課題による変化を詳しく解析した。その結果、脈波の頻度変化は両部位とも同相であるのに対し、振幅変動が逆相であることを示した。また、頻度および指の振幅と異なり、額の振幅変化にのみ課題の繰り返しによる順応がみられた。これは課題負荷に伴う交感神経亢進による前額部皮膚血液動態が、他の部位のものとは異なる複雑な生理機序を持つことを示す。また課題に伴う皮膚血流の時空間分布を調べるため、14名の健常被験者に対し課題中のfMRI信号変化と前額部1点のDoppler皮膚血流計による皮膚血流変化とを同時計測した。しかし前頭洞による磁化率アーティファクトの影響のため、種々に計測の工夫を行ったものの、正確な位置の同定を保証できる良好な計測には今一歩至らなかった。精神医学領域では、前額部のNIRS応答波形によるうつの鑑別診断が行われているが、本研究からこれは前額部特有の複雑な皮膚血液動態も反映している可能性が考えられる。従って、認知課題負荷時の前額部皮膚血液動態の生理機序の解明は、臨床応用においても重要であると考えられる。初年度である平成23年度は、課題による自律神経活動が引き起こす皮膚血流の時空間分布の計測を目的とし、多チャンネルの接触型Dopplerレーザ組織血流計(Doppler血流計)を用いて多点同時計測を行うことを計画した。しかし、実際の交付額が多チャンネルDoppler血流計を購入できる額ではなかったため、大学のMRIを用いて、課題中の皮膚血流の時空間分布の計測という目的の達成を試みることにした。

平成23年7月に順天堂大学医学部から大阪大学大学院生命機能研究科に転任したが、順天堂大学在任中に3名の健常被験者に対し予備的なMRIによる計測実験を行い、撮影法を工夫してspin-echo型EPI法を用いることにより、明瞭とは言えないまでも皮膚血液動態を反映するとみなせる結果を得た。大阪大学に着任してからは付属病院のMRIを倫理審査等の手続きを経て使用可能になったのが年度末であったが、さらに精密な計測方法を計画し実施を始めた。単チャンネルのDoppler血流計(所属研究室の備品)をMRIで使用可能にするための専用プローブを新たに購入し、被験者の頭皮血流とMRI信号との同時計測をできる環境を整えた。またMRIによる頭皮血液動態をEPI法により撮影する際には、生体組織と空気との境界の磁化率変化により大きな歪みノイズが画質の著しい劣化を引き起こすという問題があるが、フロリナートを頭皮に(容器を介して)密着させる方法を用いることで、大幅な改善が図れることを見出した(被験者1名)。大阪大学に着任してから上記のMRI計測実験の準備が開始できるまでの期間は、次年度に予定していた「皮膚の血液動態モデルの構築」の一部を前倒して着手した。具体的には、光伝播モンテカルロシミュレーションのための並列計算シミュレータの使用環境を整えるとともに、脳血液動態モデルの先行研究を頭皮血管に適用したモデルを構築中である。当初、多チャンネルの接触型Dopplerレーザ組織血流計を用いて頭皮血流分布の多点同時計測を行うことを計画したが、交付額が同装置を購入できる額ではなかった。そのため、代替手段として大学病院のMRI装置を用いて研究目標を達成することにしたが、途中、研究機関を異動となり、着任地でMRI装置が使用可能になるまでの手続きに時間がかかった。このことが、やや遅延の理由である。そのため、代替手段として大学病院のMRI装置を用いて研究目標を達成することにしたが、年度途中で研究機関を異動となり、着任地でMRI装置が使用可能になるまでの手続きに時間がかかった。最終年度であるH25年度は、これまで進めて実験および解析をまとめてゆく。(1)前額部と手指のそれぞれの、課題遂行中の皮膚血流の時間周波数特性解析を行い、fMRIデータ解析の説明変数となりうるものを特定し、頭部全体の、課題による自律神経活動に由来するfMRI信号の分布を推定する。必要に応じて補足の実験を行う。(2)また、並行して光伝播モンテカルロシミュレーション研究とともに皮膚の血液動態モデルの構築を行ない、頭皮浅部のNIRS信号とそれに含まれる脈波成分との関係を定量的に扱う方法を探る。頭皮血液動態の時空間分布をMRIで広範に調べる手法は確立されていない。まずはこれに取り組みたい。具体的には、磁化率アーティファクトを如何に回避するかが根本的な課題である。この解決のために(1)spin-echo型EPIのパラメータ調整、(2)フロリナートの装着法、(3)位相イメージによる歪みノイズの評価を行う。また、MRIを使用するので課題中の脳活動の同時評価が可能となる。その際、SpO2モニタによる指尖脈波とDoppler皮膚血流計による(1点の)頭皮血流とをMRI信号と同時計測する。
高齢者の嚥下障害メカニズムの解析と嚥下訓練への応用

健常成人と呼吸障害患者における嚥下開始直前と終了直後および嚥下中の呼吸状態を定量的に解析し比較検討した。対象は健常成人10名と慢性呼吸障害者4名である。まず、健常成人8名に対して、一側のオトガイ舌骨筋(GH)と甲状舌骨筋(TH)および甲状咽頭筋に表面電極を貼付し、対側の同3筋に双極有鉤電極を刺入し同時記録を行い、表面筋電図の有効性を確認する検討を行った。その上で、嚥下活動の指標はオトガイ舌骨筋と甲状舌骨筋の表面筋電図による筋活動とした。さらに、呼吸活動は鼻腔熱量センサーの感熱変換点および呼吸バンドの圧波形を参考に呼吸の位相や持続を決定した。対象に空嚥下、水5ml嚥下、水10ml嚥下を行わせ、同時記録した。嚥下開始直前および終了直後の呼吸の状態をa)呼気-嚥下-呼気、b)吸気-嚥下-呼気、c)呼気-嚥下-吸気、d)吸気-嚥下-吸気の4つのパターンに分類した。嚥下による呼吸運動が停止する点を基準とし、(1)嚥下直前の呼気あるいは吸気の持続時間、(2)GH活動開始から基準までの時間、(3)TH活動開始から基準までの時間、(4)基準からTH活動停止までの時間、(5)嚥下時に無呼吸になる時間、(6)基準から呼吸の再開までの時間を測定した。その結果、健常者では各嚥下動作においてa)およびb)のパターンを多く認めた。一方、呼吸障害者ではほとんどがa)のパターンであった。また、TH活動時間は嚥下時無呼吸時間に一致する傾向にあった。さらに、呼吸障害者ではTH活動時間、嚥下時の無呼吸時間、呼吸再開までの時間が延長する傾向にあった。つまり、呼吸障害者では、嚥下活動時間と嚥下時無呼吸時間の延長があり、嚥下終了直後には呼気をすることから、意識的に誤嚥を防止するメカニズムがあるものと考えられた。(1)オトガイ舌骨筋、甲状舌骨筋、甲状舌骨筋、輪状咽頭筋において双極有鉤電極と表面筋電図の同時記録を行ない、オトガイ舌骨筋、甲状舌骨筋、甲状舌骨筋に関しては筋活動が一致することを確認した。(2)単独の嚥下と呼吸の関係:(健常者)呼気相-嚥下-無呼吸-呼気相パターン3名、呼気相-嚥下-無呼吸-吸気相パターン1名、吸気相-嚥下-無呼吸-吸気相パターンが1名であった。(嚥下障害患者)呼気相-嚥下-無呼吸-呼気相パターン2名、呼気相-嚥下-呼吸-吸気相パターン2名であった。(3)連続嚥下と呼吸の関係:(健常者)100mlの水分で検討。5名中4名が呼気相-連続嚥下-無呼吸-呼気相であった。最後の嚥下の直前に吸気相-呼気相-嚥下-無呼吸-呼気相のパターンがほとんどであった。(嚥下障害患者)3050mlの水分で検討。吸気相-呼気相-嚥下-無呼吸-吸気相パターンを多く認めた。連続嚥下の際の息止めが十分に出来ない。吸気と嚥下を同時にするなどのパターンを認めた。(4)嚥下時の無呼吸持続時間・健常人に比べ嚥下障害患者では延長する傾向にあった.(5)誤嚥について:嚥下障害のある2名では吸気時に嚥下し、誤嚥している様子が観察できた。

その結果、健常者では各嚥下動作においてa)およびb)のパターンを多く認めた。一方、呼吸障害者ではほとんどがa)のパターンであった。また、TH活動時間は嚥下時無呼吸時間に一致する傾向にあった。さらに、呼吸障害者ではTH活動時間、嚥下時の無呼吸時間、呼吸再開までの時間が延長する傾向にあった。つまり、呼吸障害者では、嚥下活動時間と嚥下時無呼吸時間の延長があり、嚥下終了直後には呼気をすることから、意識的に誤嚥を防止するメカニズムがあるものと考えられた。
廃用性骨委縮における細胞質酸化ストレスの役割の解明

廃用性骨萎縮を再現するためにマウスの尾部懸垂モデルを用いた。骨への機械的刺激の低下により骨髄内の活性酸素産生量が増大し、抗酸化酵素であるSOD1の発現上昇を認めた。SOD1欠損マウスにて骨量減少が増悪したことにより、SOD1は廃用性骨萎縮に対し防御的に働いていることが明らかとなった。さらにビタミンC投与によるレスキュー実験において廃用性骨萎縮の抑制が認められた。酸化ストレスが廃用による筋萎縮に関与することは知られているが、骨萎縮への関与は不明である。また、われわれは主要な抗酸化酵素で細胞質に局在するSOD1の欠損マウスで骨量が減少することを過去に報告(2009・2010 ASBMR)したが、廃用性骨萎縮へのSODの関与は不明である。今回は、廃用性骨萎縮における活性酸素とSODの関与を検討した。廃用性骨萎縮のモデルとしてマウスの尾部懸垂を行い、7日後に採取した骨髄細胞での活性酸素産生量を蛍光試薬を用いたFCMにて測定したところ、荷重群に比し有意に蛍光強度が増強していた(p<0.05)。尾部懸垂後7日の骨髄細胞では、ALP・Runx2など骨芽細胞分化関連遺伝子のmRNA発現レベルの低下と破骨細胞分化マーカー(Cathepsin K)の発現レベル上昇が認められた。同時に、細胞内SODのうち主に細胞質に存在するSOD1の有意な上昇が認められたが、SOD2(ミトコンドリアに局在)の発現レベルの変化は見られなかった。これらから、尾部懸垂による骨髄内活性酸素の増加に対するSOD1の関与が示唆された。そこで、SOD1欠損マウスにて尾部懸垂を行い、3DマイクロCT解析を行った。欠損マウスの大腿骨で骨量(BV/TV)の減少が増強された(野生型:-23.9、欠損マウス:-47.5)。骨形態計測においては、欠損マウス尾部懸垂において骨形成率の減少が有意に増強されていたが、尾部懸垂による骨吸収活性上昇率には有意差は認められなかった。そして欠損マウス尾部懸垂による骨量減少変化はビタミンCの腹腔内投与で有意に改善した。骨への刺激低下により骨髄内の活性酸素産生量が増大し、抗酸化酵素SOD1の発現上昇を認めた。SOD1欠損マウスにて廃用性骨萎縮が増悪したことにより、SOD1は廃用性骨萎縮に対し抑制的に働いていることが明らかとなった。廃用性骨萎縮は疾病または外傷により、機械的ストレスが減少することで引き起こされるがこのメカニズムは未だに解決されず、治療戦略も確立していないのが現状である。酸化ストレスは様々な病態に影響を及ぼすことが知られているが廃用性骨萎縮に対する関与は全く知られていない。我々は廃用性骨萎縮に対する酸化ストレスの影響を解析するために機械的ストレスの減少状態を導く尾部懸垂病態モデルの実験を行った。まずは野生型マウスの尾部懸垂を2週間行い、懸垂中の後肢を採取し骨中の活性酸素種(酸化ストレス)を測定したところ有意な上昇を認めた。またその骨においてDNAや蛋白質の酸化修飾マーカーも上昇が確認された。さらに骨内の内在性抗酸化酵素群の動向を調べてみると遺伝子発現、蛋白質レベルともに細胞質内の主要な抗酸化酵素であるスーパーオキサイドディスムターゼ1 (Sod1)の特異的な上昇が認められた。そこでSod1を欠損させたマウス(Sod1KO)にて尾部懸垂を行ったところ著明な骨量減少の増悪が認められた。以上のことからSod1は廃用性骨萎縮における防御因子の一つであることが示唆された。さらに懸垂後のSod1KOマウスの骨代謝を解析すると野生型マウスに比べて骨形成能の有意な増悪が認められたが、破骨細胞の活性や機能には影響せず骨吸収能の増悪はなかった。これまでの結果から廃用時の骨では酸化ストレスが惹起され骨形成能の低下から骨量が減少すること、そして内在性の抗酸化酵素Sod1がその調節因子として関与していることが明確になった。現在、この尾部懸垂モデルを用いて薬剤、栄養剤等のレスキュー実験を行っている。更なる研究により活動性の低下した高齢者、または外傷・疾病罹患者の骨委縮の発症機序を酸化ストレスという側面から攻略し、新たな予防または治療介入の確立に有益な情報を示していきたいと考えている。交付申請書の平成24年度欄で計画した実験が遂行できた。酸化ストレスの病態への関与はまだまだ未知なことが多く、今後は骨内の発生細胞の同定や発生機序の解明にアドレスしていきたい。さらに将来的な臨床応用も念頭に置きながら本実験モデルまたは遺伝子欠損マウスを用いた薬剤、栄養剤などのレスキュー実験を行いたい。その大半は試薬、物品での使用予定である。海外学術研究会での発表に伴う渡航費用に100,000円、論文作成準備費とその他の雑費などに100,000円を予定している。
日本列島東半部における最終氷期極相期の適応戦略・資源利用技術に関する研究

石器使用痕分析は、使用によって生じる物理的・化学的変化の痕跡を観察し、石器の使用方法や被加工物を推定する分析法である。日本列島の旧石器時代を対象とした使用痕分析は、個々の石器の使用方法や被加工物の推定を目指した事例分析がその多くを占めてきた。本研究では、石器使用痕分析の成果と古環境情報を比較することで、最終氷期極相期の日本列島東半部における人類の適応戦略や資源利用技術を考察した。本研究は,最終氷期極相期における日本列島東半部の環境に適応した人類の行動戦略や資源利用技術の特徴を浮彫することを目的に,石器使用痕分析および古環境情報の比較を行う.平成22年度では,1.石器使用痕分析,2.古環境情報の整理,3。石器使用痕分析と古環境情報の成果に関する予備的な比較検討を実施した.1については,(1)最終氷期極相期の本州東北部に展開した杉久保石器群,(2)最終氷期極相期の本州中央部に展開した有樋尖頭器石器群,(3)完新世初頭の北海道に展開した石刃鏃石器群,を対象に使用痕分析を実施した.このうち(1)と(3)については研究成果を公表している.また(1)の分析に並行して,新潟県小千谷市真人原遺跡D地点の発掘を研究協力者(首都大学東京:山岡拓也氏)とともに実施し,遺跡の時期を特定する上で指標となる資料を得ることができた.2については,後期更新世後半における気候,植物相,動物相関する既存のデータの集成・整理を行った.特に後期更新世後半の大型哺乳動物の絶滅年代とその要因について研究成果を公表した.3については,最終氷期極相期の本州東北部に展開した杉久保石器群を対象に,石器使用痕分析の成果と古環境情報(特に植生)の予備的な比較を行った.分析の結果,動物性の硬質な素材(角や骨)の加工を示す痕跡はほとんど認められなかった.当時は寒冷だが比較的森林が残る環境にあったと推定される.動物性の硬質な素材の加工を示す痕跡の不在は,こうした環境(木材資源の比較的豊富な環境)へ適応した技術を反映していると考える.この成果は1の(1)とともに公表している.本研究は,最終氷期極相期(LGM)における日本列島東半部の環境に適応した人類の行動戦略や資源利用技術の特徴を浮彫することを目的に,1.石器使用痕分析,2.古環境情報の整理,3.石器使用痕分析と古環境情報の成果に関する比較検討を実施した.1について,(1)LGMの本州東北部に展開した杉久保石器群,(2)晩氷期の本州東半部に展開した北方系削片系細石刃石器群,(3)LGMの北海道に展開した石刃石器群,そして(4)晩氷期の北海道に展開した札滑型細石刃核を伴う石器群を対象に使用痕分析を実施した.(1)に関する研究成果を公表し,(2)(4)についても研究成果の公表を準備中である.2について,後期更新世後半における気候,植物相,動物相に関する既存のデータの集成・整理を行った.特に後期更新世後半の大型哺乳動物の絶滅に関する研究成果を公表し,また陸生哺乳動物に関する文献を集成し,その公表を行った.3について,杉久保石器群と,札滑型細石刃核を伴う石器群および北方系削片系細石刃石器群を対象とした石器使用痕分析を比較し,それぞれの石器使用や資源利用の相対的な特徴を考察した.そして杉久保石器群には骨や角の加工を示す痕跡がほとんど観察されない一方で,札滑型細石刃核を伴う石器群や北方系削片系細石刃石器群には,骨や角の加工を示す痕跡が高頻度に観察されることを指摘した.この結果は,相対的に木質資源の豊富な環境に適応した集団は,骨や角を道具資源として利用する技術を高度に発達させなかったこと,一方で木質資源の乏しい環境に適応していた集団はそうした技術を高度に発達させた可能性を示唆している.集団の適応した環境に応じて,石器の使用方法や被加工物に差異が生じていた可能性を示唆し,また石器使用痕分析が地域的あるいは時期的な技術適応の差異を考察するために,少なからず貢献できることを示している.
発現遺伝子のカタログ化による維管束組織分化初期過程の分子機構の解析

維管束組織分化の初期過程に発現する遺伝子をその発現様式や機能をもとにカタログ化することを通して、維管束組織分化の初期過程おける分子機構に迫ることを目的とした解析を行った。まず、ヒャクニチソウin vitro管状要素分化系の形態形成に先立つ過程で発現する遺伝子を単離し、次に、単離した遺伝子の維管束組織における発現様式を明らかにする。そして、これまでに単離しているTED遺伝子群の発現様式を含めて、発現様式と機能による遺伝子のカタログ化を試みる。このような発現遺伝子のカタログ化により、これまで明らかにされてこなかった維管束組織分化の初期過程で進行している分子機構の一側面に迫れるものと考えた。1 TED4タンパク質の機能解析を試みた。TED4タンパク質はオオムギの糊粉層特異的脂質輸送タンパク質(LTP2)の配列と類似している。LTP2はシステインプロテアーゼの阻害活性を持つことが報告されており、TED4タンパク質が管状要素分化の細胞死に関連して発現するシステインプロテアーゼ活性を阻害することが予想された。そして、大腸菌を用いて発現させた組み換えTED4タンパク質がシステインプロテアーゼ活性の一部を阻害することを明らかにした。また、ヒャクニチソウin vitro管状要素分化系を用いたトランジェントアッセイ法を開発し、TED3プロモーターの詳細な解析を行った。TED3タンパク質が新規のアラビノガラクタンタンパク質をコードしている可能性を明らかにした。2ヒャクニチソウin vitro管状要素分化系を用いて、維管束組織分化の初期過程に発現する新たな遺伝子の単離を試みた。このために、PCRを併用するサブトラクション法と均一化ライブラリーの構築を行った。まず、ヒャクニチソウin vitro管状要素分化系の形態形成を先立つ過程で発現する遺伝子を単離し、次に、単離した遺伝子の維管束組織における発現様式を明らかにする。そして、これまでに単離しているTED群の発現様式を含めて、発現様式と機能による遺伝子のカタログ化を試みる。このような発現遺伝子のカタログ化により、これまで明らかにされてこなかった維管束素組織分化の初期過程で進行している分子機構の一側面に迫れるものと考えた。1 TED遺伝子群の発現様式を再検討した。特に、TED4タンパク質の局在様式を免疫組織染色法により明らかにするために、TED4タンパク質に対する抗血清を作製し、更に、TED4タンパク質に特異的な抗体を精製した。この抗体を用いて、ヒャクニチソウin vitro管状要素分化系とヒャクニニチソウ植物体におけるTED4タンパク質の局在を詳細に調べたところ、TED4タンパク質が細胞壁に分泌されること、植物体ではmRNAと同様に維管束組織に局在すること、そして、TED4遺伝子の発現が転写レベルで調節されていることが明らかとなった。更に、TED遺伝子群のプロモーター解析として、TED3プロモーター上の維管束組織特異的な発現制御を行う領域を同定を試みた。その結果、TED3プロモーター上にはポジティブ因子とネガティブ因子の両方が存在することが明らかとなった。このために、PCRを併用するサブトラクション法の確立を目指した。現在までに、サブトラクションライブラリーがほぼ完成し、これをもとに、維管束組織分化の初期過程に発現する新たな遺伝子のスクリーニングを行っている。
マルコフ過程の特異性を持つ変換,汎関数および遠足の研究

マルコフ過程の変換および遠足(周遊,エクスカーション,excursion)こついて,特にその特異性に着目して研究を行ってきた.(a)ウィーナー測度に対する非適合的測度変換をマリアヴァン解析の手法で研究してきたが,その概要を要約して発表した(Malliavin解析に関する話題).この発表が新しい理論を生む手掛かりとなることが期待される.(b)ベッセル橋および安定周遊に関する滞在時間の分布の滑らかさと漸近挙動について矢野裕子氏と共同で研究し,結果を論文に纏めて投稿した(Statist.Probab.Letters,to appear).ベッセル橋および安定周遊の分布は一般化スチルチェス変換の形で与えられるが,その変換核の特異性をうまく処理しながら分布の滑らかさを示したことは注目に値する結果であると言える.(c)半直線上のマルコフ過程の極限定理を周遊点過程を用いて論じ,退化する場合を含むかなり一般の場合に精密な極限定理得た.その結果を学会等で発表し,また論文投稿した(J.Theoret.Probab.;Bernoulli,to appear).周游点過程を用いて極限定理における標本路の収束の様子を明らかにする試みは極めて新しい接近法であり,かつ結果も著しいと言える.(d)安定レヴィ過程に関する周遊測度について研究し,またその処罰問題への応用について矢野裕子氏およびMarc Yor氏と共同で研究した.現存までの結果を学会等で発表し,論文を準備中である.安定過程の周遊測度は原点死滅過程の調和変換と密接な関係にあるが,これらの中にはブラウン運動や拡散過程にはなかった新しい現象が潜んでいることがわかってきた.マルコフ過程の変換および遠足(周遊,エクスカーション,excursion)こついて,特にその特異性に着目して研究を行ってきた.(a)ウィーナー測度に対する非適合的測度変換をマリアヴァン解析の手法で研究してきたが,その概要を要約して発表した(Malliavin解析に関する話題).この発表が新しい理論を生む手掛かりとなることが期待される.(b)ベッセル橋および安定周遊に関する滞在時間の分布の滑らかさと漸近挙動について矢野裕子氏と共同で研究し,結果を論文に纏めて投稿した(Statist.Probab.Letters,to appear).ベッセル橋および安定周遊の分布は一般化スチルチェス変換の形で与えられるが,その変換核の特異性をうまく処理しながら分布の滑らかさを示したことは注目に値する結果であると言える.(c)半直線上のマルコフ過程の極限定理を周遊点過程を用いて論じ,退化する場合を含むかなり一般の場合に精密な極限定理得た.その結果を学会等で発表し,また論文投稿した(J.Theoret.Probab.;Bernoulli,to appear).周游点過程を用いて極限定理における標本路の収束の様子を明らかにする試みは極めて新しい接近法であり,かつ結果も著しいと言える.(d)安定レヴィ過程に関する周遊測度について研究し,またその処罰問題への応用について矢野裕子氏およびMarc Yor氏と共同で研究した.現存までの結果を学会等で発表し,論文を準備中である.安定過程の周遊測度は原点死滅過程の調和変換と密接な関係にあるが,これらの中にはブラウン運動や拡散過程にはなかった新しい現象が潜んでいることがわかってきた.
クラスター構造をもつ準結晶における多極子伝導系の研究

強相関電子系における並進対称性(大きな構造として周期性・準周期性)の役割の解明するため、電子状態の特異性が顕著に表れる希土類を含むTsai-typeクラスター構造をもつ量子臨界物質Au-Al-Yb準結晶・近似結晶や超伝導物質のような強相関電子系準結晶の物性について同じ局所構造を持つ準結晶(準周期)・近似結晶(周期)を作成し、対照実験を行い、準結晶特有の強相関電子物性を明らかにする研究を進めた。(1)前年の研究でAu-Al-Yb準結晶が静水圧に対し「硬い」量子臨界物質であることと対照的に、Au-Al-Yb近似結晶は圧力に「敏感な」重い電子系の近似結晶であること発見した。そこで、Yb原子の配位原子を置換により変化させて、元素置換効果に着目して準結晶に特有の物性を調べた。Au(Al)をCu(Ga)に部分置換した(Au,Cu)-Al-Yb、Au-(Al,Ga)-Yb準結晶でも準結晶の量子臨界現象は置換効果(化学圧力)に対して「硬さ」を示すことが明らかとなり、準結晶特有の電子状態がAu-Al-Yb準結晶の量子臨界現象・磁性と密接に結びついていることがわかった。(2)Au-Ge-Yb近似結晶の超伝導の研究を一歩進め、Al-Mg-Zn準結晶において50mKでバルクの超伝導が発現することを明らかにして、準結晶の超伝導の研究の端緒をつかんだ。NatureCommunicationsに論文発表し[1]、“ノーベル賞間違いなし、日本発「準結晶超伝導転移」"(伊東乾, JBpress)のようにニュースとして取り上げられた。29年度が最終年度であるため、記入しない。強相関電子系における並進対称性(大きな構造として周期性・準周期性)の役割の解明するため、電子状態の特異性が顕著に表れる希土類を含むTsai-t ypeクラスター構造をもつ量子臨界物質Au-Al-Yb準結晶・近似結晶や超伝導物質Au-Ge-Yb近似結晶のような強相関電子系準結晶の物性について同じ局所構造を持つ準結晶(準周期)・近似結晶(周期)を作成し、対照実験を行い、準結晶特有の強相関電子物性を明らかにする研究を進めた。(1)Au-Al-Yb準結晶と近似結晶について、磁化、交流磁化率、比熱を極低温まで測定し、臨界指数・スケーリングから準結晶の量子臨界現象の性質を明らかにした。また、Au-Al-Yb準結晶・近似結晶について静水圧下の磁化率測定を極低温まで行うことにより、Au-Al-Yb準結晶が静水圧に対し「硬い」量子臨界物質であることと対照的に、Au-Al-Yb近似結晶は圧力に「敏感な」重い電子系の近似結晶であること発見した。準結晶の量子臨界現象は準周期性・回転対称性を変えないような静水圧に対して「硬さ」を示すことが明らかとなった。(3)Au-Ge-Yb近似結晶の超伝導の研究を一歩進め、Al-Mg-Zn準結晶において50mKでバルクの超伝導が発言することを明らかにして、準結晶の超伝導の研究の端緒をつかんだ。Ybを含むTsai-typeのクラスター構造をもつ新しい強相関電子系の近似結晶を他のTsai-typeのクラスター構造をもつ準結晶・近似結晶比較する研究を行った。局在電子系のAu-Al-Tm系準結晶・近似結晶では通常の磁性体でみられる振る舞いが観測されたのに対し、Ybを含む準結晶・近似結晶では非従来型の磁性が観測され、f電子が局在・遍歴の中間状態にある中間価数のYbの価数ゆらぎが原因であることを示唆する結果が得られた。Au-Al-Yb系準結晶で観測された準結晶の量子臨界現象を理解するための重要な手がかりとなり、準結晶の特殊な原子配置の規則と関係した「局在」でも「遍歴」でもない準周期系特有の電子状態「Critical State」と関係した強相関準結晶の電子状態の解明につながると考えている。また、近似結晶の研究を推し進めてAu-Al-Yb準結晶についてもYb以外の元素置換によりYbの磁性を制御することがわかった。磁気長距離秩序の有無について調べ、f電子が局在・遍歴の中間状態にあるYbの価数を制御して「Critical State」とAu-Al-Yb準結晶における量子臨界現象との関係を調べる研究を進めている。以上のことから研究計画の進捗状況は良好であると判断した。

Au(Al)をCu(Ga)に部分置換した(Au,Cu)-Al-Yb、Au-(Al,Ga)-Yb準結晶でも準結晶の量子臨界現象は置換効果(化学圧力)に対して「硬さ」を示すことが明らかとなり、準結晶特有の電子状態がAu-Al-Yb準結晶の量子臨界現象・磁性と密接に結びついていることがわかった。(2)Au-Ge-Yb近似結晶の超伝導の研究を一歩進め、Al-Mg-Zn準結晶において50mKでバルクの超伝導が発現することを明らかにして、準結晶の超伝導の研究の端緒をつかんだ。NatureCommunicationsに論文発表し[1]、“ノーベル賞間違いなし、日本発「準結晶超伝導転移」"(伊東乾, JBpress)のようにニュースとして取り上げられた。(1)Tsai-typeクラスター構造をもつ強相関電子系の準結晶・近似結晶の開発Tsai-typeクラスター構造をもつ準結晶・近似結晶についての物質開発を引き続き行う。3元系の準結晶・近似結晶の物質開発を引き続き行い、強相関電子系の準結晶・近似結晶の探索を行う。極低温・高圧・強磁場下の物性測定を行いTsai-typeクラスター構造をもつ準結晶・近似結晶で強相関電子系を探索する。(2)価数揺動系の準結晶・近似結晶の電子状態の研究強相関電子系の準結晶・近似結晶に対して対照実験を行い、温度・磁場・圧力・元素置換をパタメータとした電子状態の相図から、外部摂動(圧力・置換)に対する準結晶の物理現象のRobustnessにアプローチする。特に近似結晶との対照実験を系統的にまとめることにより、並進対称性・回転対称性と準結晶の物理現象のRobustnessの関係に知見が得られると考えている。(3)準結晶における超伝導の研究Au-Ge-Yb近似結晶の超伝導の研究を一歩進め、Al-Mg-Zn準結晶において50mKでバルクの超伝導が発言することを明らかにして、準結晶の超伝導の研究の端緒をつかんだ。他の超伝導準結晶探索を含め、準結晶における超伝導の研究を進める。29年度が最終年度であるため、記入しない。
材料内部の微視組織形成と巨視的力学特性評価に関する数値解析モデルの構築

本研究では,工学的に利用される金属材料における微視組織形成過程のシミュレーションと,形成された微視組織を持つ材料の巨視的力学特性評価に関する数値解析モデルの構築を行うことを目的とし,主にフェーズフィールドモデルによる微視組織形成過程における相・温度・応力/ひずみの連成解析に関する基礎式を構築した.また,有限要素法による数値解析を行うことによって,微視組織が形成される過程における応力変化および残留応力生成のシミュレーションを行った.特に,本年度においては,従来の固相変態モデルに加え,凝固組織形成過程における応力生成過程のシミュレーションを行い,デンドライトのような複雑な形態を有する微視組織内の応力分布を明らかにした.全体が凝固した状態における残留応力は,デンドライトの形状や分布に依存し,平均的には同程度の応力でも,局所的な応力の最大値が大きく異なることを示した.これによって,巨視的材料強度が微視組織に大きく依存していることが明らかになった,また,より微視的なアプローチから,結晶粒界における材料挙動のモデル化を図るため,結晶粒界をモデル化した分子動力学シミュレーションを行い,微視組織形成過程における粒界挙動を調べた.様々な結晶方位を有する粒界モデルを作成し,粒界を成す結晶方位差に依存した粒界エネルギーを求めるとともに,原子の再配列による粒界の形状,形態変化の解析を行った.その結果,粒界エネルギーを用いることによって,粒界の安定性や動的な結晶再配列の予測がある程度可能であることを示した.本研究は,大きく分けると,メゾスケール解析モデルの構築,ナノスケール解析による特性評価,従来手法による解析との比較,検討,実用材料の解析への応用と検証,の4段階で構成しているが,初年度においては,まずメゾスケール解析モデルの構築について,フェーズフィールドモデルに基づいた基礎式の導出を行った.固液界面エネルギーや,結晶粒界エネルギーなど,既に用いられている界面エネルギーに加え,弾性ひずみエネルギーや塑性変形に伴う散逸エネルギーなど,力学的エネルギー項を考慮した導出によって,相変態・温度・応力の連成関係を考慮した解析が可能となった.この基礎式を用いて,デンドライトや多結晶体など,複雑な形態をもつ凝固組織形成過程の解析を行い,微視組織内部に生じる応力変化や残留応力分布を再現した.これらの組織形成過程においては,核生成から結晶粒成長および粒の衝突による粒界形成によって,複雑な応力が発生することを示した.また,ナノスケール解析による特性評価として,分子動力学モデルによる解析を行い,結晶粒界の形成と,その安定性についての考察を行った.静的な粒界エネルギーの評価では,界面を形成する結晶方位による粒界エネルギーの異方性が生じ,特定の方位関係をもつ粒界が低いエネルギーを持つことを確認した.また,動的な粒界形成シミュレーションでは,粒界近傍の原子を一旦融解させ,再凝固させたときに形成される粒界の構造について検討した.この解析によって,安定な粒界構造は,粒界をなす2結晶の方位差に強く依存することを確認した.本研究では,工学的に利用される金属材料における微視組織形成過程のシミュレーションと,形成された微視組織を持つ材料の巨視的力学特性評価に関する数値解析モデルの構築を行うことを目的とし,主にフェーズフィールドモデルによる微視組織形成過程における相・温度・応力/ひずみの連成解析に関する基礎式を構築した.また,有限要素法による数値解析を行うことによって,微視組織が形成される過程における応力変化および残留応力生成のシミュレーションを行った.特に,本年度においては,従来の固相変態モデルに加え,凝固組織形成過程における応力生成過程のシミュレーションを行い,デンドライトのような複雑な形態を有する微視組織内の応力分布を明らかにした.全体が凝固した状態における残留応力は,デンドライトの形状や分布に依存し,平均的には同程度の応力でも,局所的な応力の最大値が大きく異なることを示した.これによって,巨視的材料強度が微視組織に大きく依存していることが明らかになった,また,より微視的なアプローチから,結晶粒界における材料挙動のモデル化を図るため,結晶粒界をモデル化した分子動力学シミュレーションを行い,微視組織形成過程における粒界挙動を調べた.様々な結晶方位を有する粒界モデルを作成し,粒界を成す結晶方位差に依存した粒界エネルギーを求めるとともに,原子の再配列による粒界の形状,形態変化の解析を行った.その結果,粒界エネルギーを用いることによって,粒界の安定性や動的な結晶再配列の予測がある程度可能であることを示した.
人工内耳装用児者の英語教育：映像、音声、振動を用いた遠隔授業と国際交流

2010年から人工内耳装用児者に対する英語教育が実施された。この研究の目標は、1)人工内耳を装用した中高生を対象とし、ヴェルボトナル法に基づいた英語授業をスカイプにより実施すること2)ホームステイによる英語研修を実施すること3)シドニー在住の人工内耳装用児者と交流し、継続的な英語での交流がスカイプによって可能となるように環境を整えることであった。日本のMさんとシドニー在住の大学生で人工内耳装用者のCさんとの交流が開始され、英語を媒体としながら、二人が英語と日本語を交えて自由に楽しく語り合う場がスカイプを通して実現され、人工内耳装用児者の国際交流のモデルが誕生した。平成24年度の第一目標は、シドニーの人工内耳装用児、者の自宅でのホームステイ研修の実施であった。この研修を通して英語で意思疎通することの楽しさを体験してもらうために研究代表者の増田、研究分担者の浅野、研究協力者のキャンベルの3名で分担し参加者に対してコミュニケーションを重視したスカイプ授業を出発直前まで毎週行った。夏休みに実施した研修では、様々な体験を通してシドニーの普通学校や職場で活躍する人工内耳装用児、者との交流を深めることができ非常に有意義なホームステイとなった。第二目標は、日本在住の人口内耳装用児、者がシドニー在住の、人工内耳装用児、者とスカイプを通して会話を始めることであった。これは、23年度に達成できなかった目標であるが、7月から開始することができた。研修前にはシドニー在住の日本人女性で人工内耳装用者のH氏によって研修の準備の会話、研修後からは英語レッスンを継続して行っている。なお、シドニー在住の同年代の人工内耳装用児とのスカイプ会話については、日本在住の人工内耳装用児達の英語コミュニケーション能力がまだ不十分であると判断した。よってこの目標は達成されていない。第三目標は、専用のウェブページを活用し、楽しく英語能力を向上させることであった。これは、ウェブページにサイコロゲームを作成し、サイコロを振るために必要なポイントを英作文することで獲得するシステムとした。iPadで写真を撮り、英文を付けてウェブページへ投稿する作業を通して英作文力が強化できるようにした。第四の目標は、遠隔授業の動画データベースから学習者の音声分析と談話分析を行い、教育効果を測定することであった。現在、人工内耳装用児、者同士の会話をいくつかの角度から検証中である。第一段階(2011年5月2012年6月)は教師対生徒のアプローチで、遠隔英語授業の習慣化と上昇ピッチの訓練が行われた。第二段階(2012年7月2013年8月)はシドニーでの生活体験で、現地の人工内耳装用児・者の方々との交流により、参加者の英語学習に対する意欲が向上した。第三段階(2012年7月2013年8月)は教師対生徒のアプローチであるが、シドニーと日本を結ぶ英語教育が7歳で人工内耳の手術を受けた高校生のMさんと66歳で人工内耳の手術をシドニーで受けたSさんとの間で開始され、第四段階への準備が周到にされた。第四段階(2013年9月2014年3月)は友人対友人型のアプローチで、日本のMさんとシドニー在住の大学生で人工内耳装用者のCさんとの交流が開始された。英語を媒体としながら、自由に楽しく語り合う場がスカイプを通して実現された。世界中の人工内耳装用児者が英語を媒体としながら、自由に語り合う場を創造するのが私たち研究グループの最終目標です。教師から生徒へという一方的な意思疎通パターンではなく、二人が自由に英語で好きな事を語り合うことが出来れば、自然と英語力は培われる。私たちの研究期間は2014年3月で完了したが、スカイプによって国際交流を継続するネットワークを構築していくのが今後の目標である。平成23年度の第一目標は日本在住の人工内耳装用児、者がシドニー在住の人工内耳装用児、者とスカイプトークにより円滑なコミュニケーションが出来るように独自のカリキュラムを作成し、遠隔授業により彼らを育成することであった。この目標達成のために研究協力者のキャンベルを中心とし、前期10週間、後期7週間にわたり直接教授法によりスカイプで授業を行なった。

2度、群馬在住の人工内耳装用児たちの自宅を訪問し、スカイプを円滑に行なうためパソコンの設置状態とスカイプ時における部屋の状況などについても調査および指導を行なった。スカイプ授業においては、ホームステイにおける基本的英会話の練習のみならず、英語発話における上昇イントネーションの訓練に焦点が置かれた。第二目標は、スカイプ上での授業動画を、リアルタイムに研究グループのサーバーに記録して学習者、ご父兄、研究グループ並び特定の人々へ専用のウエブページを通して即時に配信できることであった。研究グループのホームページが作成され、授業動画はリアルタイムでアップロードされている状況である。第三の目標は、日本在住の人工内耳装用児、者がシドニー在住の人工内耳装用児、者とスカイプを通して会話を始めることであった。これは、シドニー在住の人工内耳装用児が未だ決定されていないだけでなく、日本在住の人工内耳装用児達の英語コミュニケーション能力がまだ不十分であると判断した。よってこの目標は達成されていない。第四の目標は、遠隔授業の動画データベースから学習者の音声分析と発話分析を行い教育効果測定することである。現在、約80サンプルを実際の授業から抽出し、身体運動を伴わない場合と伴う場合における違いなどを音声分析と認知テストによって検証中である。本研究開始から1年半の間実施した遠隔授業の実践の場としてのホームステイ研修では、シドニー在住の人工内耳装用児、者との国際交流を深めることができ、有意義なものとなった。シドニー在住の同世代の人工内耳装用児とのスカイプ会話に関しては、まだ学習者の能力が不十分であるため開始することができていないが、来年度半ば頃から始められるよう準備中である。本研究のデータベースとなるスカイプレッスンの動画を自動アップロードし、データの共有化が研究者、学習者および関係するご父兄において可能となった。毎回のレッスンが30分という限定された中において多くの教材を網羅することは不可能であったが、平叙文と疑問文の違いを発話訓練し、これらの違いを識別可能なカ訓練プログラムが実施された。最終年度は、これまでに実施してきた遠隔英語授業からシドニー在住の同年代の人工内耳装用児とのスカイプ会話へと移行していく計画である。スカイプ会話についても録画を行い、データとして保存する予定である。また専用のウェブサイトに関しては、学習者が楽しく英語の力を伸ばせるよう引き続き整備し、活用していく。これまで採集したデータについては、特に前年度後半からの動画データを中心に人工内耳装用児、者の音声分析や談話分析を行い、教育効果を測定していく予定である。*ホームステイプログラム(シドニー・オーストラリア)(研究代表者、分担者、連携研究者の3名)(交通費、宿泊費)(資料収集と各種調査)、第12回人工内耳と関連科学に関する国際会議2名(メリーランド、アメリカ)(研究代表者、連携研究者の2名)(成果発表)(交通費、宿泊費)、夏期講習会、群馬)(研究代表者、分担者、連携研究者の3名)(研究の打ち合わせ)(交通費と宿泊費)、アルバイト費用(映像、音声処理)(2名×40時間)、ホームページ及びサーバーの保守、管理当該助成金が生じた状況:当初予定していた物品(パソコン)を購入しなかったため。1回の国内出張をとりやめたため。旅費:5月中旬にクロアチア、ザグレブで行われる学会に参加。その他:専用のウェブサイトのメンテナンス、及びインターネット使用料金。調査旅行(シドニー、オーストラリア)
アコヤガイ外套膜上皮細胞移植による真珠生産法と真珠黄色度調節技術の開発

真珠養殖ではアコヤガイの外套膜(貝殻を作る組織)の小片(ピース)を、貝殻で出来た小球(真珠核)と共に別のアコヤガイの体内に移植する。するとピースに含まれる外面上皮細胞が真珠核をとりまく濾胞(真珠袋)を作り、真珠核表面に真珠を形成する。この研究ではピースに換えて外面上皮細胞を移植して真珠を生産する技術を開発し、黄色度の異なる真珠を形成する外面上皮細胞を混合して移植することで、生産される真珠の黄色度が人為的に調節できることを明らかにした。この結果は品質が優良な真珠を形成する外面上皮細胞を混合移植することで、優良品質を併せ持つ真珠を生産できる可能性を示している。この研究は真珠を作るアコヤガイ外套膜外面上皮細胞を培養しその培養細胞を移植して真珠を生産する技術を開発する事と、真珠の品質を決める重要な要因である黄色味について、その実体である黄色色素とその産生に関わる遺伝子の解明を目的とする。24年度は上皮細胞移植法の最適化、貝殻真珠層黄色度の異なる貝から得た上皮細胞の混合移植、上皮細胞凍結保存法の検討、上皮細胞増殖条件の解明、黄色色素の構造解析、色素産生に関わる遺伝子のスクリーニングを進め以下の結果を得た。1.貝殻真珠層黄色系統と白色系統から得た上皮細胞を比率を変えて混合し60万細胞/核で移植すると、移植した真珠核の75から88%で真珠層が形成された。その中でシミの面積が3割以下の珠について真珠層の黄色度を測定したところ、混合比に応じ真珠の黄色度が変化した。2.凍結保存法の検討では、外套膜から分離した上皮細胞をDMSO生理塩類液(濃度2M)を用い、ー2°C/分で冷却し凍結した。解凍後移植して真珠形成を確認する実験を現在進めている。3.上皮細胞増殖条件の解明ではアコヤガイ血清、哺乳類インスリンを培養液に添加して効果を検討したが、細胞増殖促進効果は認められなかった。一方、実験の過程で、上皮細胞により濾胞状構造が形成されることが見いだされた。4.アコヤガイ真珠層から黄色色素を抽出し、2種類の主成分(E1およびE2)を分離した。各成分の顕微赤外分光(FT-IR)分析、エネルギー分散型X線S(XMA)分析の結果から、主成分E1は金属(鉄)酸化物・水酸化物を主組成とする無機色素、主成分E2はポリアミド等を主組成とする有機色素と推察された。また、黄色色素産生関連遺伝子を調べるために、黄色真珠層系統と白色真珠層系統のアコヤガイ外套膜間でcDNAサブトラクションを行った。その結果、両系統外套膜間で発現差のある約600種の遺伝子cDNAが抽出された。この研究は真珠を作るアコヤガイ外套膜外面上皮細胞を培養しその培養細胞を移植して真珠を生産する技術を開発する事と、真珠の品質を決める重要な要因である黄色味について、その実体である黄色色素とその産生にかかわる遺伝子の解明を目的とする。25年度は凍結保存および培養外面上皮細胞による真珠形成、外面上皮細胞が培養下で形成する濾胞状構造の形成条件と微細構造の検討、黄色色素の構造解析、黄色色素産生関連遺伝子の解析を進め以下の結果を得た。1.凍結保存外面上皮細胞は解凍後の細胞生残率が低く、細胞数1万の移植で真珠形成率は約12%と低かった。培養外面上皮細胞の移植では培養に伴い細胞数が減少し、培養開始2週間および4週間後の細胞の移植では、細胞数3-4千の移植で真珠形成率は10%以下と低かった。2.外面上皮細胞を培養して形成される濾胞状構造は主に1層から数層の外面上皮細胞で構成され、それらの上皮細胞は極性を有し一部を除き頂端側が培養液側を向いていた。濾胞形成率には培養液による差が認められた。3.アコヤガイ真珠層から塩酸含有メタノールで3種の黄色色素(E1E3)が抽出され、抽出液のpHを変化させると主要成分であるE1およびE2がそれぞれ異なるpHで沈殿し、両色素が分離できた。両色素は酸加水分解により水溶性となることが分かった。4.黄色真珠層系統と白色真珠層系統アコヤガイの外套膜間でcDNAサブトラクションを行い、両系統で発現差のある約600種cDNAの配列を解析した。既知遺伝子との類似性が認められた10種の遺伝子の発現解析を行った結果、3種の遺伝子で黄色系統外套膜で高発現している傾向が認められた。しかし個体毎の発現差が大きく色素産生関連遺伝子を同定するには至らなかった。本研究によりアコヤガイ外套膜外面上皮細胞移植で真珠生産し黄色度を調節する技術が開発されたが、黄色色素の実体解明には至らなかった。

この結果は品質が優良な真珠を形成する外面上皮細胞を混合移植することで、優良品質を併せ持つ真珠を生産できる可能性を示している。この研究の目的は真珠を作るアコヤガイ外套膜外面上皮細胞を培養条件下で増殖させ、その培養細胞の移植により真珠を生産する技術を開発することと、真珠の品質を決める重要な要因である黄色味について、その実体である黄色色素とその産生に関わる遺伝子を明らかにすることである。23年度は上皮細胞移植法の最適化、外面上皮細胞用培養液と基質の検討、黄色色素産生に関連する遺伝子のスクリーニングを計画し、以下の結果を得た。1.アコヤガイ外套膜から分離した外面上皮細胞をそのまま移植して真珠形成率を比較することにより上皮細胞移植方法を検討した。その結果、酵素処理により分離した上皮細胞を、アコヤガイの生体防御反応を誘起する物質および粘性を高める物質を含む生理塩類液に懸濁し、真珠核の一部に付着させて移植することにより、80%前後の真珠核で真珠形成が認められた。真珠形成に必要な移植細胞数は直径4.5mmの真珠核に対し約5000細胞であり、予想より少ない細胞数で真珠形成が認められた。この結果は、従来の外套膜組織片移植ではアコヤガイ1貝から真珠核約40個分の組織片しか得られないのに対し、上皮細胞移植では1貝から真珠核約400個分の細胞を得ることができることを示している。2.外面上皮細胞用培養液、基質の検討では、培養器への細胞の接着にポリリジンが有効であることが示された。3.アコヤガイ真珠層から黄色色素を抽出、分離する方法を確立した。真珠層粉末を脱灰し、各種有機溶媒で抽出することで黄色色素が分離できた。その溶解性、安定性を検討し化学構造解析を進めたが、MALDIーTOF/MS、アミノ酸分析、NMR等の一般的な解析手法では構造を明らかにできなかった。この結果は真珠層中の黄色色素は従来の研究から予想されていた物質(ペプチド)とは化学構造が大きく異なる可能性を示している。色素産生関連遺伝子のスクリーニングには至らなかった。上皮細胞移植法の検討は順調に進捗しているが、上皮細胞増殖条件の解明と黄色色素の産生に関わる遺伝子の解明はやや遅れている。そのため(3)やや遅れていると評価した。上皮細胞移植法の最適化、外面上皮細胞用培養液と基質の検討についてはおおむね順調に進展しているが、真珠層に含まれる黄色色素の実体とその産生に関わる遺伝子の解明はやや遅れている。そのため「やや遅れている」と評価した。研究計画の大きな変更はなく、25年度は1.上皮細胞移植法についてはこれまで結果を基にして、成果の取りまとめに必要なデータの収集を進める。また外面上皮細胞の凍結保存については、凍結保存した細胞による真珠形成を確認する。2.外面上皮細胞の培養については、実験の過程で見いだされた濾胞状構造の形成条件の検討と微細構造の観察を行い、細胞増殖の有無を検討する。3.黄色色素の構造解析については,色素主成分の各種溶媒に対する溶解性が大きな障害となっていたが,酸加水分解により溶解性が改善されることが分かっている.今後は主成分の酸加水分解物を対象とし,核磁気共鳴(NMR)分析等により構造解析を進めていく.また,黄色色素産生関連遺伝子を同定するために,cDNAサブトラクションによるスクリーニングで抽出されたcDNA群の塩基配列解析等を進めてゆく。真珠層に含まれる黄色色素の実体解明には予想より時間がかかっているが、研究計画の大きな変更はない。24年度は以下の3項目を進める。1.上皮細胞移植法については23年度に得られた結果を基にして、その最適化を進める。また外面上皮細胞の凍結保存条件を確立するため凍結保護剤の種類、凍結および解凍の温度条件を検討し、凍結保存条件を最適化する。