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分子連鎖配列系のコヒーレント光化学反応とその制御

特定領域研究(B)(平成1113年度)の結果、目標とした分子配列系光化学反応の量子コヒーレンス予測を確実に検証することができ、いくつかの世界初の実験研究をなすことができた。本特定領域研究「とりまとめ」では、3年間の成果のとりまとめ作業に関わる、次の3項目について行われた。(1)最終ヒアリングに向けたとりまとめ作業研究代表者の間で最終的な打ち合わせを行い、その成果のまとめと意義について確認作業を行った。人工および生体系の分子配列系コヒーレント光化学」を理論および実験の両面から確立したことに集約される。平成14年7月に研究成果の評価に関わる最終ヒアリングを受けるに際して、その結果「A+」の評価を受けることができた。(2)論文作成と印刷公表計画研究の間の共同研究について、期間内に印刷公表されなかった論文について、引き続きまとめの共同作業を続け、いくつかの論文をアメリカ化学会誌J.Am.Chem.Soc.およびAngew.Chem.Int.Ed.等の国際誌へ発表することができた。(3)公開シンポジウム「コヒーレント光化学とその分子デバイスへの応用」の開催取りまとめに際して、これらの研究成果を広く異なる分野の研究者に知ってもらうことが重要であると考え、標記のタイトルで公開シンポジウムを開催した。平成14年11月21日(木)・22日(金)両日にわたって、北海道大学において開催した。講師は本特定領域班員をはじめ、精密有機合成化学とくに超分子に関わる研究者、無機半導体デバイスの単一量子素子の開発に携わる研究者、生物物理の研究者を含む150名の参加者があった。本特定領域研究は、反応分子が連鎖的に配列した分子配列系におけるコヒーレント光化学を実験的理論的に確立し、その反応機構と制御機構を取り入れた新しい分子素子原理を生み出すこと、に向かった進められる。総括班は、本領域研究をこの目標に向かうべく各計画研究を総括し企画調整を行う。そのために総括班の中に評価グループを設置し、評価委員として長倉三郎教授、馬場宏明教授、丸山和博教授に委嘱した。これらの諸先生は分子科学および光化学の礎石をつくった方々であり、本領域研究が新しい分子科学・光化学への展開を計るうえで、厳しい評価と指導を仰ぐのに最適であると判断した。本年度は、2回の総括班会議を開催した。第1回総括班会議(平成11年11月1日)では、本領域研究の概要を関係者全員の間で確認をし、各計画研究代表者から具体的な研究内容と研究目標を提示され、それらについて検討を行った。第2回総括班会議(平成12年2月21日)では、本年度の研究成果を互いに検討するとともに、次年度における研究目標を定めた。総括班の研究成果としては、本領域研究の4つの問題、すなわち(1)生体および人工分子連鎖配列系における反応機構の解明、(2)量子干渉効果による反応の制御、(3)外部電場による連鎖反応の制御、(4)量子演算素子への展開、の中で最も基本的な問題であるコヒーレント光化学の機構について検討を行い、理論の構築に向けておおよその方針を明確にした。またこの1年間における国内外からの報文、45編の研究報告について検討を行い、本研究における目標、研究内容との関連について議論し、本研究の目標が適正であることを確認した。本特定領域研究の目的は、反応分子が配列した分子配列系におけるコヒーレント光化学を実験的理論的に確立し、その反応機構と制御機構を取り入れた新しい分子素子原理を生み出すことである。本年度は、第1回公開シンポジウム(平成12年6月19日、京都・芝蘭会館)を開催した。本領域研究の班員の中から7名が研究成果を発表した。

評価委員3名全員のご出席をいただき、また関西地域の大学研究機関および企業の研究者130名の参加者を得、超満員の会場において盛んな質疑応答をもって了えることができた。前日の午後には第3回総括班会議(平成10年6月18日)が行われ、本領域研究の概要を関係者全員の間で再確認をし、各計画研究代表者から研究進捗状況が提示され、それらについて検討を行った。この公開シンポジウムにおいて、特筆すべきことは、本領域研究の最も基本的な実験であるコヒーレント光化学反応の検証が、第一段階として実現されたことである。それは平成13年度3月の段階では確証されて論文投稿に至っている。第4回総括班会議(平成12年9月26日)では、コヒーレント光化学の原理に関するシンポジウム(光化学討論会ワークショップ)に合わせて開催し、本年度の研究成果を互いに検討するとともに、次年度における研究目標を定めた。本年は本領域研究の第2年度にあたり、学術審議会中間ヒアリングを受けた(平成12年9月27日)。その結果、本研究が、研究成果のうえでまた研究連携のうえでも順調に進んでおり、今後もその活性を保つべし、という非常に良い評価を得ることができた。本特定領域研究の目標は、反応分子が連鎖的に配列した分子配列系におけるコヒーレント光化学を実験的理論的に確立し、その反応機構と制御機構を取り入れた新しい分子素子原理を生み出すことである。総括班は、各計画研究がこの主題にそって進まれるように企画調整を行う。総括斑は、各計画研究代表者とともに外部より評価委員として、長倉三郎博士(神奈川科学技術アカデミー理事長、東大名誉教授)、馬場宏明博士(北大名誉教授)、丸山和博博士(京大名誉教授)、またアドバイザーとしてPill-Soon Song博士(ネブラスカ大学化学科長、クムホ生命科学研究所所長)に委嘱した。本年度は、2回の総括班会議(平成13年10月および平成14年1月)と第2回公開シンポジウム(平成14年1月)を実施し、本特定領域研究の進捗状況を確認をし、最終年度にあたって、目標への達成度について意見交換し総括を行った。その結果、本領域研究の目標達成度について次のように総括された。先ず主要な研究目標である「分子配列系コヒーレント光化学反応における量子干渉効果の観測と解析」については、当初の予測を実証する実験結果が得られ、また外国研究者によって認知されたことからみて、充分な成果があげられたこと、また「コヒーレント光化学反応の外部電場による制御」についても、新しい認識が得られつつあることが確認された。「光合成系の電子伝達と励起子伝達の理論的解明」についても、決定的な機構理論が構築され、国際的にも認知されたことは本研究の大きな成果であることが確認された。さらにこれらの結果をふまえた「量子演算素子への展開」について、今後の研究進展に期待されることが確認された。本特定領域研究は平成1113年度において遂行され、平成14年度はその「成果取りまとめ」に関わる事業について行われた。
HTRA1によるTGF-Βファミリーシグナルの伝達抑制機構の解明

セリンプロテアーゼの一種であるHTRA1はTGF-βファミリーであるTGF-βやBMPのシグナルを抑制するが,その機序は不明である.TGF-βやBMPは前駆体として産生され,トランスゴルジネットワークでfurinによる切断を受けて成熟型になる.本研究では,HTRA1が小胞体内で前駆体を切断することによって,furinによる切断を阻害する結果,成熟型の量が減少し,シグナルが減弱することを明らかにした.セリンプロテアーゼの一種であるHTRA1はTGF-βファミリーであるTGF-βやBMPのシグナルを抑制するが,その機序は不明である.TGF-βやBMPは前駆体として産生され,トランスゴルジネットワークでfurinによる切断を受けて成熟型になる.本研究では,HTRA1が小胞体内で前駆体を切断することによって,furinによる切断を阻害する結果,成熟型の量が減少し,シグナルが減弱することを明らかにした.Cerebral autosomalrecessive arteriopathy with subcortical infarctsand leukoencephalopathy(CARASIL)は,HTRA1遺伝子の変異によっておこる遺伝性脳梗塞である.野生型HTRA1はTGF-βファミリーシグナルを抑制する機能を持つが,CARASILで発見された変異型HTRA1はこのシグナルを抑制できない.TGF-βファミリーシグナルは血管新生やリモデリングに重要な役割を持っており,その異常によって,遺伝性血管病を引き起こすことが知られている.このため,CARASIL患者の体内では,TGF-βファミリーシグナルの慢性的な亢進がおこり,その結果,CARASILを発症することが想定されている.CARASILの治療法を考える場合,HTRA1によるTGF-βファミリーシグナルの抑制機構を明らかにすることが重要である.そこで,TGF-βファミリーであるTGF-β,BMP-2,BMP-4の前駆体タンパクを用いて,そのプロセッシングに対して,HTRA1がどのような影響を与えるかを検討した.まず,ヒトHTRA1発現ベクターとTGF-β1前駆体,BMP-2前駆体,もしくはBMP-4前駆体発現ベクターをHEK293T細胞に共発現した.細胞からタンパク質を抽出し,抗TGF-β1抗体,抗BMP-2抗体,抗BMP-4抗体を用いたWestern Blotting法によって解析した.その結果,いずれの前駆体においても,HtrA1依存性の断片の出現を認めた.この結果は,TGF-βファミリータンパクがHTRA1の器質になる可能性を示唆する.TGF-βファミリーであるTGF-βやBMPは前駆体として産生され,トランスゴルジネットワークでfurinによるプロセッシングを受けて成熟型になる.分泌された成熟型蛋白は細胞表面の受容体に結合し,シグナルを伝達する.セリンプロテアーゼの一種であるHTRA1はTGF-βやBMPシグナルを抑制するが,その機序は不明である.本研究では,HTRA1がTGF-βファミリーのプロセッシングを阻害することによってシグナルを抑制するという仮説を立て,検証した.まず,HTRA1とTGF-β1,BMP-2,あるいはBMP-4前駆体をHEK293T細胞に共発現させ,小胞体-ゴルジ装置間の輸送阻害剤で処理した後に,免疫染色および細胞溶解液のウェスタンブロット法によって解析した.その結果,HTRA1は小胞体内で前駆体を切断していた.また,HTRA1とTGF-β1,BMP-2,あるいはBMP-4前駆体を共発現したHEK293T細胞を小胞体関連分解の阻害剤で処理したところ,HTRA1によって切断された前駆体の断片は小胞体関連分解を受けることが明らかになった.次に,HTRA1とTGF-β1,BMP-2,あるいはBMP-4前駆体を共発現したHEK293T細胞の培養液をウェスタンブロット法によって解析したところ,HTRA1の発現によって成熟型の量は減少した.さらに,HTRA1発現HEK293T細胞と前駆体発現HEK293T細胞の混合培養を行ったところ,HTRA1の発現による成熟型の減少は認めなかった.これらの結果は,HTRA1が小胞体でTGF-βファミリーの前駆体を切断することによってfurinによる前駆体のプロセッシングを阻害し,その結果,分泌される成熟型が減少することでシグナルが抑制されることを示している.HTRA1によるTGF-βファミリー前駆体の切断は,新たなTGF-β制御機構であると考えられる.
現代語との対照に基づく近世江戸語文法形式の意味・機能に関する研究

本研究課題では、現代語でも近世後期江戸語でも用いられる複数の文法形式(助動詞など、文法機能を果たす形式、たとえば、ハズダやカモシレナイなど)について、当該形式の近世江戸語での意味・機能的な特徴を、近世後期江戸語と文法体系の似通っている現代語との比較・対照という手法を用いることで明らかにした。また、本研究課題における文法形式の分析の中心は、モダリティ形式であったが、この分析の過程で、先行研究において議論の錯綜している「モダリティ」という文法概念の再検討も行った。さらに、江戸語資料の資料ジャンルの多様性や言語量の確保のため、他の研究課題と連携しつつ、人情本・洒落本のコーパス化も行った。1.近世江戸語のモダリティ形式を分析する前提として、日本語学における「モダリティ」という文法概念について、先行研究を批判的に参照しつつ、再検討を行い、本研究なりの概念規定を行った。また、その成果を「モダリティに関する覚え書き」『語文論叢』(千葉大学文学部日本文化学会)28号、2013年)として公表した。また、個別のモダリティ形式のうち、現代語および江戸語におけるハズダとカモシレナイに関する先行論文を収集し、その内容を批判的に検討した。2.モダリティ形式のうち、ハズダとカモシレナイを主な対象として、現代語および江戸語の用例収集を実施した。現代語に関しては、主に、「現代書き言葉均衡コーパス」と『新潮文庫の百冊CD-ROM』を利用し、江戸語に関しては、研究代表者が構築した電子化テキスト(人情本など)や『岩波古典文学大系』所収の洒落本・滑稽本・人情本などを利用した。さらに、現代語および江戸語のハズダの個々の用例については、意味・機能的観点から検討を加え、意味・用法別に用例数を集計した。そして、その結果をもとに、現代語との対照という観点からの江戸語におけるハズダの意味・機能的特徴を明らかにした。その成果は平成26年度内に論文として公表予定である。3.江戸語資料の資料ジャンルの多様性および言語量の確保のために、人情本刊行会編『人情本集』所収の人情本『玉菊全傳花街鑑』(文政5(1822)年、鼻山人著)および『廓鑑余興花街壽々女』(文政9(1826)年、鼻山人)の電子テキストデータ化を行った。ただし、予定していた電子化テキストの本文校訂作業は達成できなかった。1.昨年度に引き続き、認識的モダリティ形式のハズダとカモシレナイ(カシラヌ、カシラ)における現代語と江戸語との意味・機能的差異について検討を行い、その成果を「近世江戸語のハズダに関する一考察ー現代語との対照からー」青木博史ほか編『日本語文法史研究2』(ひつじ書房、2014年10月)として公表した。2.昨年度に構築した人情本の電子テキスト『玉菊全傳花街鑑』(文政5(1822)年、鼻山人)および『廓鑑余興花街壽々女』(文政9(1826)年、鼻山人)の本文校訂作業を、原本(研究代表者架蔵版本)によって行った。3.「当為判断・価値判断」という文法概念に関して、先行論文を収集し、概念内容の整理と検討を行った。また、「当為判断・価値判断」形式とされるナケレバナラナイとシテモイイの現代語および江戸語の用例を収集した。現代語の用例収集は「現代書き言葉均衡コーパス」(BCCWJ)に、江戸語の用例収集は研究代表者が構築した人情本テキストよった。さらに収集した用例の整理と用法分類を現在行っている。4.現代語と江戸語における場所・方向を表す格助詞「に」と「へ」の使用傾向を、研究代表者が構築した人情本データや、岡部が研究分担者として参画している科学研究費課題で構築した洒落本コーパスなどを用いて、実証的に検証し、その成果を「洒落本コーパスにおける格助詞「に」と「へ」についてー洒落本コーパスを資料としてー」(国立国語研究所共同研究プロジェクト「通時コーパスの設計」研究発表会、東京都、国立国語研究所、2014年11月9日)において口頭発表した。(1)昨年度に引き続き、「当為判断・価値判断」という文法概念に関して、広く日本語学以外の領域の先行研究を収集し、概念内容の成立と検討を行った。また、「当為判断・価値判断」形式とされるスレバイイ、スルトイイ、シタライイの現代語および江戸語の用例を収集した。現代語の用例収集は「現代語書き言葉均衡コーパス」(BCCWJ)に、江戸語の用例収集は研究者が構築した人情本テキストによった。(2)江戸語の調査資料の拡充のため、新たに、人情本『浮世新形恋の花染』(松亭禁水、天保3(1832)年)、『鶯塚千代の初声』(松亭禁水、山々亭有人、安政3(1856)年)の電子テキスト化および本文校訂作業を行った。(3)国立国語研究所と連携して、人情本『比翼連理花廼志満台』(松亭金水、天保7(1836)-天保9(1838)年)のコーパス化を行い、その成果を、日本語学会2015年度秋季大会(山口大学、山口県教育会館、山口県立図書館、2015年10月31日-11月1日)において発表した。

(4)大正期から昭和前期にかけての講演・演説における丁寧表現マスの終止・連体形マス/マスル両形の使い分けの様相を調査した上でその使い分けの条件を分析し、その成果を「大正昭和前期における助動詞マスの終止・連体形についてーマスルの使用状況を中心に」相澤正夫・金澤裕之編『SP盤演説レコードがひらく日本語研究』(笠間書院、2016年3月)として公表した。さらに、現在、近世江戸語における丁寧表現マスの終止・連体形マス/マスル両形の使い分けに関しても調査を行っている。本研究課題申請時には予定していなかった、大学院専攻長(副研究科長)就任により、大学内の管理業務および大学院改組に関わる業務に携わることになり、本研究のための予定エフォートを達成することが困難になった。また、本研究に必要な江戸語テキスト(人情本)の電子化とその校訂作業に関しても、作業適任者の選定に手間取り、作業の開始が計画より遅れてしまい、それらの電子テキストを用いた用例収集および分析作業にまで至らなかった。(1)昨年度用例を収集した「当為判断・価値判断」形式とされるスレバイイ、スルトイイ、シタライイの現代語および江戸語の用例の分析を行い、現代語から見た江戸語の諸形式の特徴について一定の見解を得た。(2)江戸語における用例調査の正確性を高めるため、国立国語研究所と連携し、昨年度以来構築をしてきた「人情本コーパス」の設計と構築に関して議論を行った。さらに、その成果を、藤本灯、北﨑勇帆、市村太郎、岡部嘉幸、小木曽智信、高田智和「「人情本コーパス」の設計と構築」(『国立国語研究所論集』12、2017年)として公開した。(3)近世以前の日本語における「非情の受身」に関して、近世語と中古語との比較を考慮に入れながら、検討を行い、その成果を、研究発表会「バリエーションの中での日本語史」(大阪大学文学研究科日本文学・国語学研究室主催、2016年4月30日-5月1日、大阪大学)内でのシンポジウム「「非情の受身」の発達をめぐって」において、「いわゆる「非情の受身」の諸類型ー中古語と近世語との対照も含めてー」というタイトルで発表した。(4)近世期および明治・大正期における指定表現の否定形態(ジャナイ、ジャアナイ、デハナイ、デナイなど)に注目し、それぞれの期における指定表現の否定形態の特徴を調査した。調査にあたっては、上方語と江戸語(京阪語と東京語)という東西対立にも考慮し、江戸語および東京語における否定形態の特徴を、上方語(京阪語)との対照という観点から、明らかにした。その成果は、「近世江戸語における指定表現の否定形ー近世上方語、近代東京語・京阪語との比較ー」(金澤裕之・矢島正浩編『SP盤落語レコードが拓く近代日本語研究』、笠間書院、近刊)として公開予定である。本研究課題では、現代語でも近世後期江戸語でも用いられる複数の文法形式(助動詞など、文法機能を果たす形式、たとえば、ハズダやカモシレナイなど)について、当該形式の近世江戸語での意味・機能的な特徴を、近世後期江戸語と文法体系の似通っている現代語との比較・対照という手法を用いることで明らかにした。また、本研究課題における文法形式の分析の中心は、モダリティ形式であったが、この分析の過程で、先行研究において議論の錯綜している「モダリティ」という文法概念の再検討も行った。さらに、江戸語資料の資料ジャンルの多様性や言語量の確保のため、他の研究課題と連携しつつ、人情本・洒落本のコーパス化も行った。本研究の目的は、近世後期江戸語の文法形式の意味・機能的特徴を、現代語と対照するという手法を用いることで、精密に分析・記述すること、また、多様な形式の分析を通じて、現代語との対照という手法が有効であることを示すことにある。
知的好奇心の本質と処理機構の解明-認知神経科学的観点から-

本研究では,人の学習を支える知的好奇心を感情という観点から捉え,実験心理学的手法と神経科学的手法を併用し,感情が学習にどのような影響を与えるのかを明らかにすることを目的とする。本年度は,前年度から継続中の実験を引き続き行った。まず,一口に感情と言っても,その内容によって認知的処理には異なる影響を与える可能性がある。そこで感情的刺激の種類の違いに関する行動実験とfMRI実験を行った。その結果,人間の生存に関係する感情刺激(生存関連感情刺激:死体・食べ物)は,社会生活に関連した感情刺激(社会関連感情刺激:偏見・笑顔)に比べて,自動的に注意を向けられやすいこと,自動的に記憶がなされやすいことが明らかになった。先行研究では感情が注意や記憶に与える影響を覚醒という概念で説明してきたが,覚醒の影響を統計的に統制しても,生存関連感情刺激の効果が認められることも明らかとなった。また,生存関連感情刺激に比べて,社会関連感情刺激はより高次の脳領域(前頭葉内側部など)に支えられていることが示された。第二に,感情が認知的処理に与える影響の文化的な側面を検討するため,日米のサンプルを用いて,感情が記憶に与える影響の文化差を調べた。その結果,日本人はネガティブ刺激を自動的に記憶しやすいのに対して,アメリカ人はポジティブ刺激を自動的に記憶しやすい傾向があることが示された。ここまで述べた研究では,感情を喚起する刺激自体に関する認知的処理に焦点を当ててきた。それでは,感情的刺激は他の刺激の処理にはどのような影響を与えるのだろうか。この点について検討するため,感情が他の刺激の処理に与える影響について,行動実験による検討を行った。その結果,ネガティブ感情が喚起されると,他の刺激に対する意味的処理が阻害されることが明らかになった。ただし,ネガティブ感情は知覚的処理には影響を与えないことが明らかになった。最後に,知的好奇心そのものに関する神経科学的研究を行った。具体的にはfMRIを用いて,知的好奇心を喚起する課題と,喚起しない課題とで,どのような脳部位が活動するのかを検討した。その結果,知的好奇心には,尾状核といった低次の報酬に関わる脳部位が関与していることが明らかになった。本研究では,人の学習を支える知的好奇心を感情という観点から捉え,実験心理学的手法と神経科学的手法を併用し,感情が学習にどのような影響を与えるのかを明らかにすることを目的としている。人の学習には,記憶・問題解決・注意といった様々な認知的処理が含まれている。本年度はまず感情が洞察的問題解決にどのような影響を与えるのかを検討した。その結果,実験心理学研究では,ポジティブ感情が洞察的問題解決を促進するのに対して,ネガティブ感情が洞察的問題解決を阻害することが明らかになった。また,脳イメージング実験においては,ポジティブ感情が洞察的問題解決に関わる脳領域の活動を促進するのに対して,ネガティブ感情はこうした促進効果を示さないことが示された。次に,ネガティブ感情が様々な認知的処理に一様に影響を与えるのかどうかを検討した。その結果,ネガティブ感情は感覚的処理には影響を与えないのに対して,意味的処理を阻害することが明らかになった。以上のことから,ポジティブ感情が洞察的問題解決を促進するのに対して,ネガティブ感情は洞察的問題解決や意味的処理を阻害し,その結果,人の学習に負の影響を与えると言える。更に,現実社会においては,多くの学習者が学習対象に対して知的好奇心や興味を失いがちである。このことから,学習者にとっては「学習」という活動自体はそれほど強く感情を喚起するものではないと言える。そして,学習者が学習対象に喜びを感じるためには,当該学習者自身が「学ぶことは喜びをもたらすものである」ということを獲得していく必要があると考えられる。しかし,感情がどのように学習されるのかは十分に明らかになっていない。そこで本年度は,生まれながらに獲得されている本能的な感情と,社会生活の中で獲得される社会的感情の違いについて検討を行った。その結果,人は本能的感情を自動的に処理することができることが明らかになった。それに対して,社会的感情の処理には認知的資源を必要としており,自動的に処理するのは難しいことが明らかになった。本年度はこうした目的意識のもとに,以下の3つの点を明らかにした。第一に,感情が知覚的処理と意味的処理に与える影響に関して2つの実験を行い,ネガティブ感情は意味的処理を阻害するが,知覚的処理には影響を与えないことを明らかにした。第二に,感情が記憶に与える影響に関する日米の比較文化研究を行った。その結果,日本人はネガティブ刺激が自動的に記憶されやすいのに対して,ポジティブ刺激の記憶は注意資源に依存していることが明らかになった。それに対して,アメリカ人においては,ポジティブ刺激が自動的に記憶されやすく,ネガティブ刺激の記憶は注意資源に依存していることが明らかになった。第三に,感情の種類に関する研究が挙げられる。感情は種の保存や個体の生存とだけでなく,社会生活とも密接に関連している。そして,一口に「感情的刺激」と言っても,個体の生存と密接に関連した生存関連刺激(例.死体・食べ物)もあれば,社会生活に関連した社会関連刺激(例.偏見・笑顔)もある。そこで生存関連感情と社会関連感情がどのように処理されているのかに関するfMRI研究を行った。

その結果,生存関連感情刺激が視床の活動を促すのに対して,社会関連感情刺激には,前頭葉内側部,後部帯状回,側頭葉前部といった高次の皮質領域も関与していることが明らかとなった。更に,社会関連感情刺激の場合には,言語的刺激(単語)でも,写真刺激でも,同じ領域が関わっているのに対して,生存関連感情刺激に関してはモダリティ固有の活動が認められた。これらのことから,生存関連感情が自動的に処理されるのに対して,社会関連感情の処理システムは生存関連感情の処理システムの上に成り立っていると言う可能性が示唆される。本研究では,人の学習を支える知的好奇心を感情という観点から捉え,実験心理学的手法と神経科学的手法を併用し,感情が学習にどのような影響を与えるのかを明らかにすることを目的とする。本年度は,前年度から継続中の実験を引き続き行った。まず,一口に感情と言っても,その内容によって認知的処理には異なる影響を与える可能性がある。そこで感情的刺激の種類の違いに関する行動実験とfMRI実験を行った。その結果,人間の生存に関係する感情刺激(生存関連感情刺激:死体・食べ物)は,社会生活に関連した感情刺激(社会関連感情刺激:偏見・笑顔)に比べて,自動的に注意を向けられやすいこと,自動的に記憶がなされやすいことが明らかになった。先行研究では感情が注意や記憶に与える影響を覚醒という概念で説明してきたが,覚醒の影響を統計的に統制しても,生存関連感情刺激の効果が認められることも明らかとなった。また,生存関連感情刺激に比べて,社会関連感情刺激はより高次の脳領域(前頭葉内側部など)に支えられていることが示された。第二に,感情が認知的処理に与える影響の文化的な側面を検討するため,日米のサンプルを用いて,感情が記憶に与える影響の文化差を調べた。その結果,日本人はネガティブ刺激を自動的に記憶しやすいのに対して,アメリカ人はポジティブ刺激を自動的に記憶しやすい傾向があることが示された。ここまで述べた研究では,感情を喚起する刺激自体に関する認知的処理に焦点を当ててきた。それでは,感情的刺激は他の刺激の処理にはどのような影響を与えるのだろうか。この点について検討するため,感情が他の刺激の処理に与える影響について,行動実験による検討を行った。その結果,ネガティブ感情が喚起されると,他の刺激に対する意味的処理が阻害されることが明らかになった。ただし,ネガティブ感情は知覚的処理には影響を与えないことが明らかになった。最後に,知的好奇心そのものに関する神経科学的研究を行った。具体的にはfMRIを用いて,知的好奇心を喚起する課題と,喚起しない課題とで,どのような脳部位が活動するのかを検討した。その結果,知的好奇心には,尾状核といった低次の報酬に関わる脳部位が関与していることが明らかになった。
非代謝型合成脂質を用いて解き明かす脂質多様性の意義

本年度は前年度と引き続き多様なPG分子種の存在意義の解明を目的として、有機合成した特殊なホスファチジルグリセロール(PG)を用いた実験を行った。脂肪酸結合部位をエーテル結合に改変した、細胞内で代謝できないエーテル型PGを作製した。さらにエーテル型PGのsn-2位を様々な飽和脂肪酸に改変し(sn-1位は18:2の脂肪酸で固定)、それをSynechocystis sp. PCC 6803のPG合成欠損株(pgsA株)と共に培養した。この変異株はエーテル型PGを培地から取り込み、生育できることが明らかになった。前年度は主に、細胞の増殖速度と光合成活性を中心に解析を行ったため、本年度は合成PGを利用したときの細胞の膜構造の変化を調査した。PGのsn-2位を12:0, 14:0, 16:0, 18:0, 20:0の脂肪酸に改変したエーテル型PGを培地に添加して、pgsA変異株を7日間培養した。pgsA変異株では7日間目的のPGを添加して培養することで、細胞内のPGが完全に置き換わることがわかっている。培養液から各変異株の細胞を遠心によって回収し、細胞の形状や細胞内の微細構造を電子顕微鏡で観察した。その結果、16:0よりも短鎖の飽和脂肪酸導入したエーテル型PGを添加して培養した細胞では、細胞全体の大きさが若干ではあるが大きくなっていた。また、特に12:0の脂肪酸を導入したエーテル型PGの場合は、チラコイド膜が細胞の中心に介入する傾向があった。しかし、エーテル型PGを取り込んだ細胞の全てでチラコイド膜の形成はある程度維持されていることから、PGのsn-2位の脂肪酸種の変化がチラコイド膜形成に重大な影響を与えないことが明らかになった。29年度が最終年度であるため、記入しない。本年度は多様なホスファチジルグリセロール(PG)分子種の存在意義の解明を目的として、有機合成した非代謝型のPGを用いた実験系の確立を行った。シアノバクテリアであるSynechocystis sp. PCC 6803のPG合成欠損株(pgsA株)は外部からPGを細胞内に取り込めるため、特定の脂肪酸が結合したPGを添加した培地で育てた変異株の細胞の性質を解析することで、PG分子種の機能の違いを解析できると考えられる。しかし、通常のPGは脂肪酸がエステル結合で結合しているため、細胞内に取り込まれた後、リパーゼによる加水分解を受けてリモデリング(脂肪酸を取り替える反応)される。そこで、細胞内でリモデリングによる脂肪酸の付け替えが起こらない、脂肪酸がエーテル結合で導入されたPG分子を共同研究者に有機合成してもらって解析を行った。sn-1位に18:2、sn-2位に16:0をエーテル結合で導入したPGでpgsA株を培養したとき、エステル型PGを添加したときと比べて生育に多少影響があるものの、合成したエーテル型PGを利用して変異株が増殖できることが判明した。さらにsn-2位の脂肪酸を12:0, 14:0, 18:0, 20:0に改変したエーテル型PGで変異株の細胞を培養したところ、sn-2位の脂肪酸の鎖長に応じて細胞の増殖速度に違いが出ることが明らかとなった。sn-2位の脂肪酸が16:0であるときに他の鎖長の脂肪酸と比べて増殖速度が速くなり、sn-2位を12:0に改変したPGでは生育が大きく阻害された。このことからPGのsn-2位に16:0の脂肪酸が結合していることが重要であることが明らかになった。本年度は脂肪酸結合部位をエーテル結合に改変したPGの有機合成を依頼し、当研究室においてシSynechocystis sp. PCC 6803のPG合成欠損株(pgsA)に取り込ませ、その時の細胞の増殖、光合成活性を解析した。通常、光合成生物ではエーテル型脂質は生体内に存在しておらず、本研究でシアノバクテリアが人工的に合成したPGを取り込んで、生育できることがあきらかになった。非代謝型の脂質を使用して、任意の脂肪酸を導入したPGを生体内に取り込ませる実験系を始めて確立できた。また、sn-2位の脂肪酸を本来PGに結合している16:0の脂肪酸を基準として、短鎖脂肪酸である12:0, 14:0や長鎖脂肪酸である18:0, 20:0に改変した。これらのエーテル型PGをpgsAに取り込ませた結果、Synechocystisには存在していない12:0と20:0の脂肪酸に改変した時に、20:0はある程度生育を相補できるのに対して、12:0では生育が大きく阻害されることが明らかとなった。これにより、sn-2が16:0の脂肪酸であることにより、PGが生体内で正しく機能することがわかった。今後はsn-2の脂肪酸が他の脂肪酸に変わった時に生体内にどのような影響を及ぼしているかを解析することで、sn-2の脂肪酸が16:0である意義を解明できると考える。

この変異株はエーテル型PGを培地から取り込み、生育できることが明らかになった。前年度は主に、細胞の増殖速度と光合成活性を中心に解析を行ったため、本年度は合成PGを利用したときの細胞の膜構造の変化を調査した。PGのsn-2位を12:0, 14:0, 16:0, 18:0, 20:0の脂肪酸に改変したエーテル型PGを培地に添加して、pgsA変異株を7日間培養した。pgsA変異株では7日間目的のPGを添加して培養することで、細胞内のPGが完全に置き換わることがわかっている。培養液から各変異株の細胞を遠心によって回収し、細胞の形状や細胞内の微細構造を電子顕微鏡で観察した。その結果、16:0よりも短鎖の飽和脂肪酸導入したエーテル型PGを添加して培養した細胞では、細胞全体の大きさが若干ではあるが大きくなっていた。また、特に12:0の脂肪酸を導入したエーテル型PGの場合は、チラコイド膜が細胞の中心に介入する傾向があった。しかし、エーテル型PGを取り込んだ細胞の全てでチラコイド膜の形成はある程度維持されていることから、PGのsn-2位の脂肪酸種の変化がチラコイド膜形成に重大な影響を与えないことが明らかになった。sn-2を様々な脂肪酸種に改変したPGをSynechocystisに取り込ませることで細胞の増殖や光合成に影響が確認された。光合成生物ではPGは主要なチラコイド膜脂質の1種であり、脂質二重層を形成する重要な脂質である。脂肪酸種の変化することで膜の流動性が変化して、チラコイド膜の形成や膜タンパク質の機能に影響を及ぼす可能性が考えられる。そこで各エーテルPGを添加した時の細胞を電子顕微鏡で解析することで、チラコイド膜の構造変化を確認できると考える。また膜の流動性が変化した場合、この細胞では光、熱ストレスにおける感受性が変化することが考えられる。sn-2の脂肪酸を短鎖または長鎖の飽和脂肪酸に改変したPGを添加したpgsA株の細胞に、様々な条件のストレスを与えて光合成活性を測定することで、脂肪酸の鎖長の重要性を明らかにする。sn-2を12:0の脂肪酸に改変したPGを利用して増殖した細胞では、細胞あたりのクロロフィル含量が劇的に低下していた。この時の細胞ではクロロフィルの合成が阻害されているか、もしくは、クロロフィルの分解が促進されている可能性が考えられる。今後はクロロフィルの合成か分解のどちらが影響を受けているかを、クロロフィル含量の経時変化をモニターすることではっきりさせる。もし、クロロフィル合成が阻害されている場合、クロロフィル中間体を定量することで、12:0型PGがクロロフィル合成経路のどの部分に関わっているか明らかにする。29年度が最終年度であるため、記入しない。
有機-無機複合ナノカプセルを用いる人工多細胞組織体の構築と機能

本研究では、我々が開発した高強度の人工細胞膜「セラソーム」の特徴を活かして、人工の多細胞組織体を構築し、その有機-無機複合界面の分子認識特性を利用して、分子デバイスとしての新機能を探索するとともにその相互作用や機能因子の体系化を目指した。本研究で得られた成果を以下にまとめる。1.人工細胞作製のための新規脂質分子の開発及びその作製法の体系化セラソームのサイズや構造を自在に制御できる脂質の分子設計指針の確立を目指して、セラソーム形成脂質を種々新たに合成し、様々な条件下において簡便かつ粒径制御が可能なセラソームの作製法を開発した。2.人工細胞の階層的集積化のための相互作用の体系化人工細胞の組織化には、セラソームのような構造安定性に優れた人工細胞膜が極めて有効である。そのための階層的集積化の手法としては、静電相互作用や配位相互作用などの分子間相互作用を多点で複合的に活用することが重要であることを、水中ならびに基板上への様々な人工細胞の集積挙動の例を提示することで明らかにした。3.人工細胞膜系での分子デバイス機能発現のための機能因子の体系化セラソーム等の人工細胞膜を基板に用いた分子デバイスの有効性を、人工受容体と天然酵素の分子間コミュニケーションシステムの構築とその応答機能から明らかにした。また、分子認識の論理応答にもとづいた人工細胞の可逆的集積系の構築も可能であることを見いだした。高効率での電荷分離が可能なフラーレンを組み込んだ人工細胞膜を分子デバイスとして利用できることもわかった。このような分子デバイスとしての人工細胞の機能は、分子、イオン、光、熱などの入力信号によって制御できることを多くの例で提示した。以上のことから、有機-無機複合体の概念をとりいれた人工細胞は、バイオ・ナノサイエンスの融合領域研究において、分子デバイスなどの自己集積材料として有効であることを明らかにした。本研究では、我々が最近独自に開発した人工細胞膜「セラソーム」を用いて、人工多細胞体を構築し、その有機-無機複合界面の分子認識場特性を利用した分子デバイス機能の発現を目指した。今年度は以下の成果を得ている。1.リン脂質が水中で形成する二分子膜ベシクルはリポソームとよばれ、従来から人工細胞膜として利用されてきたが、その構造安定性には大きな問題があった。我々は、このリポソームと類似構造を有し、ベシクル表面をシリカセラミックスの基本骨格であるシロキサン結合で架橋した有機-無機複合ベシクルを開発し、「セラソーム」と名付けている。今年度は、脂質の分子構造のうちで、特にコネクター部位の構造を種々変化させたセラソーム形成脂質を新たに開発した。2.今年度に新たに合成したセラソーム形成脂質を用いて、セラソームを作製し、それらのキャラクタリゼーションを行った。透過型ならびに走査型電子顕微鏡観察、動的光散乱測定から、セラソームの形成が確認された。また、その構造安定性について、ベシクル崩壊能をもつ界面活性剤に対する耐性から評価したところ、セラソームは従来型のリポソームに比べて驚異的な安定性を示すことがわかった。さらに、セラソームの表面荷電状態やゲル-液晶相転移挙動を、ゼータ電位測定ならびに示差走査熱量分析から定量的に明らかにした。3.人工多細胞体を構築するために、交互積層法を利用して、基板上へのセラソームの階層的集積化について検討した。原子間力顕微鏡や水晶発振子を用いた生体分子間相互作用測定装置による測定から、セラソームの基板上への集積化を確認し、その集積化の際に興味深いサイズ選別効果を発見した。

また、二分子膜ベシクル上で、脂質シグナルの分子認識と酵素による触媒作用を連動させた人工シグナル伝達系の構築が可能であり、このような分子デバイスはセラソームを用いても可能であることを新たに見出した。本研究では、我々が独自に開発した人工細胞膜「セラソーム」を用いて、人工多細胞組織体を構築し、その有機-無機複合界面の分子認識場特性を利用した分子デバイス機能の発現を目的としている。今年度は以下の成果を得ている。1.新規セラソームの作製前年度の研究成果として、いくつかのセラソーム形成脂質を新たに合成し、これらが安定な人工細胞膜を形成することを明らかにした。今年度は、セラソームのサイズや構造を自在に制御できる脂質の分子設計指針の確立を目指した。透過型ならびに走査型電子顕微鏡、原子間力顕微鏡、光学顕微鏡等による多面的な構造評価を行った結果、より簡便な分子設計で、セラソームのサイズを数十nmから数μmの範囲で制御する手法を開発した。2.セラソームの階層的集積化交互積層法を用いて、基板上に複数の種類のセラソームを階層的に集積化し、積層過程を生体分子間相互作用測定装置等により詳細に検討した。また、交互積層法の基本原理である静電的多点相互作用を活用することで、水溶液中においてもセラソームの集積構造体を形成できることを新たに見いだした。3.セラソームの分子デバイス機能セラソームを基板に用いて、複数の機能分子を集積化し、分子間のコミュニケーションが可能な分子デバイスをいくつか開発した。その結果、入力信号に化学シグナルや光シグナルを用い、その信号を変換、増幅して、別の化学シグナルや更には電気シグナルとして出力が可能な新規ナノデバイスの構築に成功した。現在、セラソームの階層的集積体を用いる分子デバイス機能の発現について、さらに検討を加えている。本研究では、我々が開発した高強度の人工細胞膜「セラソーム」の特徴を活かして、人工の多細胞組織体を構築し、その有機-無機複合界面の分子認識特性を利用して、分子デバイスとしての新規機能を探索するとともにその相互作用や機能因子の体系化を目指した。すなわち、これまで人工系では取り扱うことが困難であった分子組織体としての高次の細胞機能を、セラソームのような人工細胞系を用いて具現化しようとするものであり、本年度は以下の成果が得られた。1.人工細胞の階層的集積化のための相互作用の体系化脂質二分子膜構造をもつ人工細胞の組織化には、セラソームのような構造安定性に優れた人工細胞膜が極めて有効であり、そのための階層的集積化の手法としては、静電相互作用や配位相互作用などの分子間相互作用を多点で複合的に活用することが重要であることを、水中ならびに基板上への様々な人工細胞の集積挙動の例を提示することで明らかにした。2.人工細胞膜系での分子デバイス機能発現のための機能因子の体系化セラソーム等の人工細胞膜を基板に用いた分子デバイスの有効性を、人工受容体と天然酵素の分子間コミュニケーションシステムの構築とその論理応答機能の発現から明らかにした。また、分子認識の論理応答にもとづいた人工細胞の可逆的集積系の構築も可能であることを示した。高効率での電荷分離が可能なフラーレンを組み込んだ人工細胞を分子デバイスとして利用できることもわかった。このような分子デバイスとしての人工細胞の機能は、分子、イオン、光、熱などの入力信号によって制御できることを多くの例で提示した。
コロネン熱分解による炭素ナノ薄膜の形成及びそのリチウムイオン電池への応用

これまでLiFePO4電極材料に対してコロネンを添加し、加熱分解させてカーボンコートを行ってきたが、熱処理時のカーボンコートに伴ってLiFePO4電極粉末が凝集するという問題点があった。そこで本年度はより低温で熱分解すると思われるアントラセン(C14H10)をカーボンソースに選び、実験を進めた。LiFePO4粉末とC14H10粉末とを混合し、石英管に真空封入して熱処理した。C14H10の添加量はコロネン添加時の類推からカーボン量として2wt%に固定した。熱処理温度としては、コロネン添加のときよりも低い温度を選び、500°C、550°C、589°Cおよび650°Cとした。炭素コートした電極粉末の微細構造は、透過電顕観察によって評価し、炭素コートしない電極粉末、ならびにコロネン添加した電極粉末と比較した。その結果、500°Cならびに550°Cで熱処理した場合は電極粉末表面上に十分なカーボン層が形成されていないが、589°Cの場合は厚さが1.2nm程度の、また650°Cの場合は1.6nm程度の厚みのカーボン層が形成されているのが判った。これらの粉末について粒度分布を計測した。いずれの熱処理温度でも、これまでのコロネン添加電極粉末より平均粒径は若干小さことがわかった。次に、作製した炭素コート電極粉末を用いて電極を作製し、さらにこれを用いてハーフセルのリチウムイオン電池を作製して充・放電容量を評価した。熱処理温度が650°C、589°Cの場合はコロネンによりカーボンコートしたLiFePO4の場合とほぼ同様の容量(約150 mAh/g)が得られたが、550°C処理サンプルは若干小さい容量が観測された。このようにコロネン添加よりも若干小さな粒径が得られたが放電容量はコロネン添加の場合と同等であり、更なる容量の増大には、カーボンコート法の更なる改善が必要と思われる。平成30年度が最終年度であるため、記入しない。電極材料としてLiFePO4を選び、これまでの予備実験(科研費以前)における粒径数マイクロメートルのLiFePO4粉末をボールミルにて1マイクロメートルの粉末に粉砕した。粒径が小さくなったことに対応して粉末の表面積が増大するので、それに対応して電極粉末と混合するコロネン量を1wt%から6wt%に増大させ、石英管に真空封入して700oCで1時間の熱処理を行った。得られた混合粉末を透過電顕にて観察したところ、アモルファス層が電極粉末表面に形成されているのがわかり、元素分析からこれはカーボン層と判明したが、その厚さは3-4nmレベルで予備実験の時よりもやや厚いことがわかった。また、カーボンによって電極粉末同士が結合して大きな塊となっているものが予備実験の時よりも頻繁に観察されただけでなく、電極粉末の間にもアモルファス状のカーボンがかなり頻繁に存在することも判明した。さらに、一部の電極粉末粒にはカーボンコート層が剥がれおちている様子も観察された。この電極粉末を使って作製した電池においては、放電容量がカーボンコート無しの電極材をつかった場合の約10倍に向上したが、これは予備実験の時の放電容量の改善(8倍程度)に比べて少しだけ大きいレベルであり、電極粉末の微細化の効果が十分に得られていないことがわかった。また、カーボンコート層が厚いにも関わらず予備実験の時に比べて電池の抵抗がかなり大きいことも判明した。これについては、透過電顕観察で見られた電極粉末の結合や単独で存在するカーボンが影響していると考えられる。以上より、添加するコロネン量によってカーボンコート層の厚さのみならず、電極粉末の結合や単独に存在するカーボン量も変化することがわかり、これらが電池特性に大きく影響すると考えられ、これらのことがらも考慮に入れたコロネン添加量の最適化が重要であることがわかった。平成28年度は、正電極粉末に添加するコロネン量を種々に変化させて実験を行う予定であり、まずコロネン量の多い6wt%の添加を試みた。その結果、1wt%添加の時よりも厚いアモルファスカーボン層が各ボロン粉末粒子の表面に形成されることを確認したが、同時に正電極粉末同士がカーボンによって結合するとともに、電極に付着していないアモルファス状のカーボンがかなりの量存在することもわかった。また、このカーボンコート電極材を用いてLiイオン電池を作製し、放電容量を測定したところ、カーボンコートによる放電容量の増大が認められたが、電池の抵抗がかなり大きいことも判明し、電池として問題のあることがわかった。この大きな電気抵抗については、電極粉末に付着しないで単独で存在しているカーボンの影響であると考えられた。このような予期しなかった電極粉末粒子の結合や単独で存在するカーボンについての解析を行うのに時間がかかり、最近になってようやくコロネン添加量を変化させた電極粉末を作製することが出来た。現在はこの電極を用いて電池の作製を進めている。本年度は、LiFePO4電極材料に対して、コロネン添加量を系統的に変化させて炭素コートを試み、得られた炭素コート電極粉末を用いて電池を作製して電池特性を評価し、コロネン添加量と炭素コート膜厚や電池特性との関係を調査した。ボールミルした電極材料粉末とC24H12を混合し、ガラス管に真空封入した。C24H12の添加量はLiFePO4に対して1wt%, 2wt%, 3wt%および4wt%とした。

封入したガラス管はC24H12の分解温度以上である700oCで1時間熱処理した。炭素コートした電極粉末の微細構造は、透過電顕ならびにX線回折によって炭素コートしない電極粉末と比較して評価した。透過電顕観察では、特に炭素コートの層厚とその均一性ならびにコート層の構造を調べた。炭素コート層厚はC24H12添加量とともに増大する傾向を示し、仕込み組成によって炭素コート層厚を有る程度制御出来ることが判った。また、生成した炭素コート層は全ての仕込み組成でアモルファス状であることが判明した。作製した種々の炭素コート電極粉末を用いてリチウムイオン電池(ハーフセルならびにフルセル)を作製し、充・放電容量、充・放電レート、及びサイクル寿命などの性能を評価し、電池特性のC24H12添加量依存性について考察した。LiFePO4へのC24H12添加量とともに充・放電容量が増大し、3wt%添加で最大の容量が得られた。その放電容量は152mAh/gで理論値の91%である。この値は商用LFPを用いた電池の値159mAh/gよりも若干小さいが、これはわれわれが用いたLiFePO4粉末の粒径が大きいためと考えられ、今後より粒径の小さい電極粉末を用いることで、理論容量に近い容量が得られると考えられる。このように、我々の簡便なカーボンコート法が実用的に有望であることが判った。平成28年度に、6wt%のコロネン添加を試みたが、厚いアモルファスカーボン層が各ボロン粉末粒子の表面に形成されるとともに正電極粉末同士がカーボンによって結合することが判明した。また、電極に付着していないアモルファス状のカーボンがかなりの量存在し、これが電池の抵抗を大きくすると言う予期しない問題点の有ることが判明した。そこで、平成29年度は、コロネン量として6wt%よりも少ない1-4wt%とすることによってこれらの問題点を軽減することに成功し、LiFePO4正極を用いた場合の理論放電容量に近い電池特性を得ることに成功した。しかしながら正極粉末同士の結合が解消されたわけではない。この問題を解決するためには、カーボンコート法に対して種々の工夫を凝らす必要があると判断される。これによって研究の進捗状況は遅れ気味である。これまでLiFePO4電極材料に対してコロネンを添加し、加熱分解させてカーボンコートを行ってきたが、熱処理時のカーボンコートに伴ってLiFePO4電極粉末が凝集するという問題点があった。そこで本年度はより低温で熱分解すると思われるアントラセン(C14H10)をカーボンソースに選び、実験を進めた。LiFePO4粉末とC14H10粉末とを混合し、石英管に真空封入して熱処理した。C14H10の添加量はコロネン添加時の類推からカーボン量として2wt%に固定した。熱処理温度としては、コロネン添加のときよりも低い温度を選び、500°C、550°C、589°Cおよび650°Cとした。炭素コートした電極粉末の微細構造は、透過電顕観察によって評価し、炭素コートしない電極粉末、ならびにコロネン添加した電極粉末と比較した。
マウス熱射病モデルにおける遺伝子組み換えトロンボモジュリンの神経保護作用の解明

これまでの実験で、マウス熱中症モデルでは、熱中症直後から13週間後にかけて脳内における炎症性サイトカイン(IL-6, TNF-α)が増加し、一方抗炎症性サイトカインである(IL-10)はあまり大きくは変化しないことがわかってきた。また、初年度におこなった協調運動を評価する行動実験では、熱中症直後よりも、熱中症から1週間から徐々に協調運動障害が出現し、3週間後にピークを迎え、その後徐々に改善を認めた。上記から熱中症の神経傷害は脳梗塞のような恒久的な神経細胞死ではなく、熱中症後に中枢神経で炎症が惹起され、一時的な神経細胞および軸索の機能傷害による機序の可能性が高いいことが考えられた。炎症性サイトカインによる一時的な神経細胞・軸索傷害の機序を解明するために、熱中症直後・1週間・3週間後に神経細胞をみるHE染色・TB染色、軸索を染色するKB染色をおこなった。結果、あきらかな神経細胞死はなく、神経細胞傷害を考える核の変形のみであった。また、あきらかな脱髄所見はなかった。このため、現在、改めてモデルを作成し、コントロール群、熱中症直後・1週間・3週間で免疫染色(NeuN, GFAP, IBa-1)をおこない、熱中症後の神経細胞傷害の機序を解明中である。これらにより、熱中症後にグリオーシスがおこっているのか、またIba-1を発現するマイクログリアがどのような変化をしているのかが明らかななる。さらに、Elisaでは検出できない量の炎症性サイトカインをとらえるために、大脳皮質・小脳・脳幹にわけてReal time PCRをおこない、熱中症による変化とrTMの及ぼす影響について検討をおこなったいる。さらに、今年度は遅れていた、TNF-αKOマウスを用いて、中枢神経傷害における炎症性サイトカインの役割について解明をおこなう予定である。前年度までの経過で、熱中症の中枢神経傷害にはTNF-αが関与している可能性が考えられた。このため、TNF-αKOマウスの熱中症モデルを作成する計画を立てていた。TNF-αの繁殖過程で、動物舎でセンダイウイルス感染が蔓延し、一旦、動物を処分せざるおえない状態となった。このため、感染がおさまるまで一旦動物を増やすことができず、実験がやや遅れ気味である。現在、感染は落ち着き、マウスを繁殖させ実験をおこなう予定である。これまでの結果から、熱中症後に惹起される神経炎症が熱中症後の神経傷害にかかわっていることがわかってきた。このため、神経炎症が中枢神経のどこでおこっているのか?つまり、神経細胞なのか、グリア細胞なのか、マイクログリアなのか、もしくは軸索なのかを免疫染色をおこなうことによりあきらかなする。また、炎症性サイトカインの中でももっとも変化が大きく、神経傷害のおきる時期にダイナミックに変動するTNF-αが神経炎症におよぼす役割をあきらかにするためにTNF-αKOマウスを用いて機序を解明していく。熱射病後,体内では自然免疫炎症反応(炎症反応),神経内分泌・自律神経反応(抗炎症反応),凝固線溶反応が起こる。申請者は2010年から熱射病モデルの作成をおこない,遺伝子組み換えトロンボモジュリン(rTM)投与が熱射病後3週間の運動機能(Rotarod)を有意に改善することを発見した。上記機序を解明するために、生理食塩水群・rTM投与群(熱射病後からrTm 6mg/kg,ip+is 5日間連続)投与した2群にわけて熱射病後1週間・3週間に動物を犠牲にし脳・血清を摘出した。摘出した脳はすぐに、大脳皮質・脳幹・小脳に顕微鏡下分離し凍結した。凍結した標本を用いてサンプルを作成し、ELISAを用いてTNF-α, IL-6, IL-10, IL-1βの測定をおこなった。対照群としては暑熱暴露をおこなっていない動物の脳・血清を用いた。結果、rTM群は熱射病後1週間の脳幹で生理食塩水投与群と比較して有意にTNF-αを抑制した。小脳・大脳皮質でも低下傾向であったがあきらかな有意差は認めなかった。一方、IL-6, 10では2群で有意な差は認めなかった。IL-1βについては測定感度以下のために測定できなかった。このため今後は、PCRにより熱射病後の変化について検討する予定である。また、一般に報告されている血清のサイトカインでは暑熱暴露後、数時間で上昇を認め24時間では低下を認めている。ただ、中枢神経では熱射病後1週間でもTNFαが対照群に比べて高いレベルにあり、3週間後にようやく対照群と有意差がないレベルにまで低下した。このことから、暑熱暴露後、中枢神経の炎症性サイトカインは血清とは異なった動態を示す可能性が考えられた。今後、より詳しく暑熱暴露6時間・24時間後について検討をおこない、中枢神経における詳細なサイトカインの動態について検討をおこなう予定である。上記機序を解明するために、生理食塩水群・rTM投与群(熱射病後から6mg/kg,ip+is 5日連続)