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サンゴに共生する褐虫藻核ゲノムのエピゲノミクス

サンゴに共生する渦鞭毛藻類の褐虫藻Symbiodiniaceaeは、少なくとも15のグループに分けることができ、多様である。しかしながら、そのゲノム基盤についてはよく分かっていなかった。本研究において褐虫藻の進化過程において最初に分岐したと考えられているグループと最後に分岐したグループからの2種の全ゲノム概要配列(767 Mbと705 Mb)を決定し、報告した。そのゲノムの比較解析により、特に、二次共生により紅藻から獲得したと考えられる遺伝子の重複や損失が褐虫藻の多様化に大きく影響してきた可能性があることを明らかにした。さらに解読した褐虫藻ゲノムを利用し、毒合成を含む二次代謝に関わる酵素遺伝子群を明らかにした。沖縄に生息する造礁サンゴAcropora digitiferaの多様性について、155個体の全ゲノム情報を用いて詳しく解析が行われ、地域ごとの4つの集団からなることが明らかにされてきている(Shinzato et al., 2016)。しかしそのサンゴに共生している褐虫藻の多様性についてはゲノムレベルでの解析が進んでいなかった。解読してきた褐虫藻ゲノムを参照することにより、サンゴA. digitiferaの150個体に共生している褐虫藻のオルガネラのゲノム配列の多様性を解析した。共生している褐虫藻の集団は、その宿主のサンゴのような地域ごとの4つの集団には分かれず、宿主との共進化は示唆されなかった。またこれまでに報告してきた褐虫藻のオルガネラゲノム(ミトコンドリアと葉緑体)とトランスクリプトームの配列を参照し、RNA機能が関わると考えられるエピジェネティックな機構とオルガネラゲノムの遺伝的多様性との関係を明らかにした。このように本研究は、引き続き沖縄のサンゴに共生する褐虫藻のエピゲノムの多様性の比較解析を行う上での重要なゲノム基盤を明らかにした。サンゴに共生する種や赤潮の原因となる種を含む渦鞭毛藻類は、海洋環境を考えていく上で非常に重要な真核生物のグループである。しかしながらゲノムサイズが他の真核生物に比べ非常に大きいといったことなどから、ゲノムレベルでの研究は、渦鞭毛藻類の姉妹群であるアピコンプレクサ類(マラリア原虫を含む)などに比べると進んでいない。さらに渦鞭毛藻核は、クロマチン構造が観察されてきていないなど、非常にユニックな染色体構造を持ち、真核生物の中で唯一、ヒドロキシメチルウラシルという特殊なDNA修飾を受けていることが40年前から知られている。それにもかかわらず、ゲノムのどの領域がDNA修飾を受けているのかについてはよく分かっていない。本年度はゲノムを解読した、サンゴに共生する褐虫藻3種の核ゲノムが温度や紫外線量の変化に対してどのような反応を示しているのかを解析するための実験を行った。各条件下で培養した褐虫藻のゲノムDNAを抽出し、質量分析による解析を行うことにより、DNA修飾の割合が最も大きく変化する条件を探った。その結果、褐虫藻では通常の培養条件下においてゲノムDNA全体の約5%がヒドロキシメチルウラシルへの修飾を受けていることが明らかになった。一方でメチルシトシンへの修飾は約1%であった。これらの結果から、今後もっともDNA修飾率の割合が変化する条件下のDNAを用いて、DNA修飾を受ける領域の詳細を明らかにしていく上での基盤が整ったと考えられる。3種の褐虫藻を用いた温度や紫外線ストレス下でのDNA修飾の変化を質量分析で調べる実験をすべて終える予定であったが、DNA抽出を行う過程でのミスにより質量分析での解析を平成29年度も続ける必要があるため。サンゴに共生する褐虫藻を含む渦鞭毛藻類のDNAには、ヒドロキシメチルウラシルという、チミンが修飾された塩基が豊富に存在することが、40年以上前から知られている。しかしながらそのDNA修飾の役割についてはよく分かっていない。本研究では、ゲノムを解読した、サンゴに共生する渦鞭毛藻類の褐虫藻を用いて、DNA修飾を受ける領域を網羅的に決定し、渦鞭毛藻がなぜそのような修飾DNAを保持しているのかを解明する。さらにDNA修飾酵素遺伝子の同定を目指す。これを研究の基盤として、ユニークな構造を持つ褐虫藻の核ゲノムがストレスや環境の変化に対しどのように反応しているのかを明らかにする。ゲノムを解読した共生性渦鞭毛藻Symbiodinium minutumのDNAがどの程度のDNA修飾を受けているのかを高速液体クロマトグラフィーを用いて調べた。その結果、25°Cの培養条件下において約10%のチミンがヒドロキシメチルウラシルへと修飾されていた。一方で、シトシンのメチル化は1%以下であった。次にこのDNA修飾率が温度やUVのストレスによりどのように変化するのかを解析した。温度ストレスによりDNA修飾の割合が増加する可能性を示すデータが得られた。さらにS. minutumとは別のSymbiodinium2種のゲノムを解読し、それら2種のDNA修飾についての解析を行った。また寄生性トリパノソーマ類において、ヒドロキシメチルへの修飾に関わる酵素が同定されてきている。それらのゲノムとの比較解析から、DNA修飾に関わる可能性のある酵素遺伝子が褐虫藻のゲノムには3個コードされていることが明らかとなった。DNA修飾の変化が温度ストレスにより起こる可能性が質量分析の結果から示唆された。このため、DNA修飾領域を1分子リアルタイムシーケンサーにより決定していくことは現時点では困難であると考えた。一方で、イルミナシーケンサーによりDNA修飾領域を決定する方法が報告されてきており、計画とは異なる新しい方法で解析を行うことにした。

イルミナシーケンサーを用いることにより、ゲノムに対して高カバーレッジのデータを得ることが可能となる。より信頼性の高い結果を得ることを目指し、新しい手法のための予備実験に時間を要しているため。サンゴに共生する渦鞭毛藻類の褐虫藻Symbiodiniaceaeは、少なくとも15のグループに分けることができ、多様である。しかしながら、そのゲノム基盤についてはよく分かっていなかった。本研究において褐虫藻の進化過程において最初に分岐したと考えられているグループと最後に分岐したグループからの2種の全ゲノム概要配列(767 Mbと705 Mb)を決定し、報告した。そのゲノムの比較解析により、特に、二次共生により紅藻から獲得したと考えられる遺伝子の重複や損失が褐虫藻の多様化に大きく影響してきた可能性があることを明らかにした。さらに解読した褐虫藻ゲノムを利用し、毒合成を含む二次代謝に関わる酵素遺伝子群を明らかにした。沖縄に生息する造礁サンゴAcropora digitiferaの多様性について、155個体の全ゲノム情報を用いて詳しく解析が行われ、地域ごとの4つの集団からなることが明らかにされてきている(Shinzato et al., 2016)。しかしそのサンゴに共生している褐虫藻の多様性についてはゲノムレベルでの解析が進んでいなかった。解読してきた褐虫藻ゲノムを参照することにより、サンゴA. digitiferaの150個体に共生している褐虫藻のオルガネラのゲノム配列の多様性を解析した。共生している褐虫藻の集団は、その宿主のサンゴのような地域ごとの4つの集団には分かれず、宿主との共進化は示唆されなかった。またこれまでに報告してきた褐虫藻のオルガネラゲノム(ミトコンドリアと葉緑体)とトランスクリプトームの配列を参照し、RNA機能が関わると考えられるエピジェネティックな機構とオルガネラゲノムの遺伝的多様性との関係を明らかにした。このように本研究は、引き続き沖縄のサンゴに共生する褐虫藻のエピゲノムの多様性の比較解析を行う上での重要なゲノム基盤を明らかにした。平成28年度に予定していたストレス実験とDNA抽出の部分をパートタイムの技術員にサポートしてもらうことにより、29年度は計画通りに進めることが可能であると考えている。またPacBioシーケンサーによりDNA修飾領域を特定する予定であるが、質をあげるために、ナノポアシーケンサー等、さらに最新の技術も用いることができないかを検討していく。最近になって報告されてきているヒドロキシメチルウラシル領域をイルミナによって決定するためのライブラリ作成を検討していく。またチミンのヒドロキシメチルウラシルへの修飾に関わる酵素遺伝子の機能解析をバクテリアや酵母細胞での発現系を構築することにより行う。研究発表:1分子リアルタイムDNAシーケンサー(PacBio)によるヒドロキシメチルウラシル修飾領域の決定が困難であることが分かった。このためPacBio RSIIシーケンシング用試薬類を購入する予定であったが、それをとりやめた。
『遼史』の再構築─契丹文墓誌を主資料として─

本研究課題は、漢文史料にもっぱら依存した従来の研究の限界を超え、『契丹文墓誌より見た遼史』(松香堂、2006年)公刊後出土の契丹文墓誌を主資料として、『遼史』の全面的な校勘整理に対する堅実な基盤を作り上げることを目的とする。契丹文墓誌を全面的に活用した契丹(遼)史の再構築は、前人未踏の領域を開拓するものとして、大きな意義をもつ。3年間の着実かつ豊富な契丹文字研究の成果を踏まえ、考古学的現地調査を加えたうえ、『遼史』世表・皇族表・外戚表並びに営衛志、百官志・列伝の一部の再構成を達成した。本課題「遼史の再構築ー契丹文墓誌を主資料としてー」は、前著『契丹文墓誌より見た遼史』(松香堂、2006)公刊後の新資料の増加、研究の深化を踏まえ、墓誌出土地の現地調査を通じて、確実な知見を蓄積することで、『遼史』の枢要部分に対する全面的な再検討を試みるものである。本年度は研究計画の二年目として、初年度の実績を受けて最終年度の礎を築くという重要な期間にあたるものであり、新出墓誌のある地区において現地調査を行い、出土資料の収集・分析に基づき、それに反映される文献史料に未解明の諸問題に引き続き取り組んだ。本年度においては以下のような作業を進めた。1新出墓誌の所在地に赴き、墓誌の記載に基づき墓地の地理的方位・墓室に納める副葬品などを綿密に調査し、大量の新知見を得た。2新出墓誌を全体的に翻訳するにあたって、大量の新出単語を既存のデータベースに補充し、契丹大小字の音価推定・契丹語文法の構造分析に向かって大きく前進した。3以上の資料と正史の双方に現れる契丹人について、記述内容の比較研究を行った。4墓誌出土地における詳細な情報を整理したうえ、次年度の現地調査の細目を決定した。以上の作業によって、新出契丹文墓誌および漢文墓誌と正史その他の漢文史料の記述内容との比較研究を行った。以上の作業に併行して、『遼史』関連の文献史料並びに関連研究を包括的に整理し、『遼史』の世表・皇族表・外戚表の全面的再構成を成し遂げたうえで、営衛志・百官志・列伝を中心に検討を行った。本研究課題「遼史の再構築ー契丹文墓誌を主資料としてー」は、前著『契丹文墓誌より見た遼史』(松香堂、2006)公刊後の新資料の増加、研究の深化を踏まえ、墓誌出土地の現地調査を通じて、確実な知見を蓄積することで、『遼史』の枢要部分に対する全面的な再検討を試みるものである。本年度は研究計画の最終年度であり、前年度の調査研究を継続して、新出墓誌の報告された地区において現地調査を行い、出土資料の収集、分析に基づき、それに反映される文献史料だけでは未解明であった諸問題の解明に取り組んだ。本年度においては、以下のような作業を進めた。1これまでに実施した契丹に関する歴史学的作業に基づき、新出考古学的資料と関連文献の記述を比較検討し、前年度に収めた研究成果に引き続き、『遼史』の列伝に重点を置いてその再構築に取り組んだ。2中国内蒙古自治区敖漢旗人民政府及び敖漢旗博物館・新州博物館の協力で、日中合同「契丹発祥地の考古学的調査研究」を組織し、契丹遙輦可汗の本帳所在区域を4回にわたり調査し、豊富な収穫を収めた。3これまでに実施した契丹に関する言語学的作業に基づき、新出契丹文墓誌の解読・翻訳を進め、契丹大字1028字(異体字を数えない)の内839字、契丹小字345字(異体字を数えない)の内310字の解読を達成した。現在までに発見された契丹大字墓誌16件と契丹小字墓誌43件の原文をローマ字に転写したのち、対訳・意訳を附することで、『契丹大小字石刻全釈』という膨大な研究成果が獲得された。以上の作業に併行して、遼代契丹人に関係する漢文墓誌をリストアップし、あらためて原石との比較検討を行い、最新の注釈をつけたことによって、今後の継続的な『遼史』研究に資する。本年度は研究計画の初年度として、次年度以降の調査のための基礎を築く。

既調査地区を基礎に、墓誌出土の情報のある未調査地区に調査範囲を拡大することで、最新の情報を把握した。本年度においては研究の基本的な準備段階として以下のような作業を進めた。(1)新出資料を精査・分析し、コンピューターに入力した。(2)以上の資料を全面的に解読するにあたって、大量の新出単語を既存のデータベースに補充した。(3)単語の解読と併行し、契丹語諸形態の研究に関する最新の認識を得た。(4)以上の資料に記される契丹人に関わる記述の比較研究を行った。(5)次年度の研究の準備を行うため、資料の所蔵地における調査を実施した。以上の作業によって、契丹語の単語の意味を推定すると同時に、契丹文資料の全面的解読、收集しえた契丹文資料の全体的翻訳、及び正史その他の漢文史料及び漢文墓誌の記述との比較研究を行った。以上の作業に併行して、『遼史』関連の文献史料並びに関連研究を包括的に整理し、墓誌に記述される人物・族帳に重点を置いて、『遼史』の皇子表・公主表・皇族表・外戚表を中心に検討を行った。今年度は新出墓誌の豊富さに恵まれ、大量の契丹語彙が一斉に解読できたことで、契丹大小字の音価推定及び契丹語文法再建の深化につながり、契丹文に現れる契丹人自身の歴史認識を一層深く理解できるようになった。こうした成果を遼史研究に全面的に運用した成果の一端として、『新出契丹史料の研究』(吉本道雅と共著。松香堂、2012)を科研費学術成果公開促進費(学術図書)によって刊行した。この書物では、『契丹文墓誌より見た遼史』公刊以降出土した7件の契丹文墓誌と9件の漢文墓誌に全面的な翻訳・研究を施すことによって、遼朝成立以前の契丹部族連盟の構成及び建国後の皇族帳と国舅帳の実態、とりわけ遙輦氏と耶律氏の発祥地とされる陶猥思迭剌部の形成過程について多数の史実を解明した。それによってもたらされる豊富な新知見は、契丹(遼)史のみならず、広く東ユーラシア各民族史を対象とする研究にも大きく裨益するものになると言える。今年度は新出資料の豊富さに恵まれて、大量の未解読単語が一斉に解読できるようになり、単語の解読は文法認識の深化につながり、長編の資料翻訳が可能となった。こうした成果を遼史研究に全面的に運用した成果の一端として、『韓半島から眺めた契丹・女真』(吉本道雅と共著。京都大学学術出版会、2011)を刊行した。この書物では、いままで解明されなかった遼史と高麗史に記述される契丹人の多数の系譜を解明し、契丹文字研究史上初めて韓国国立博物館所蔵の銅鏡銘文を解読し、いままでさまざまに誤釈された突厥碑文のcholglが実際には契丹語shulwurと女真語solgorの同源語であり、新羅を指すことを確認し、これはテュルク学にも絶大な寄与を遂げた。本年度は、(1)これまでに実施した契丹に関する歴史学的作業に基づき、新出の考古学的資料と関連文献の記述を比較検討し、「『遼史』の再構築」という総括的課題のもとに、すでに膨大な研究成果(2011年度の著書『韓半島から眺めた契丹・女真』と本年度の著書『新出契丹史料の研究』に代表される)が獲得された『遼史』の世表・皇族表・外戚表及び一部の列伝・営衛志・百官志に引き続き、他の志・表・列伝の全面的な再構築に取り組む。(2)これまでに実施した契丹に関する言語学的作業に基づき、新出契丹文資料の解読・翻訳を進め、それに基づき『契丹語辞典II』の編纂につとめる。(3)契丹発祥地の考古学的調査に関する日中共同研究を発足させ、進展をはかる。初年度でおさめた実績を基礎に、既存のデータベースをさらに充実するため、出土資料の所蔵地における調査・収集を継続的に実施する。調査対象は引き続き契丹文字資料が大量に出現する中国内モンゴル自治区を重点区域とするほかに、その周辺地域における最新の考古的情報にも留意し、随時に拡大調査を実施する予定である。それと併行して、『遼史』関連の文献史料並びに関連研究を包括的に整理し、初年度における表部分の再構築に継続的に取り組む。平成24年度において、中心的に検討を行うのは列伝・営衛志・百官志である。
宇宙環境における生物個体ホメオスタシス攪乱の可視化

現在、国際宇宙ステーションISSおよび日本実験棟「きぼう」は、ヒトが微小重力環境下において長期滞在し種々の船内外の宇宙実験を実施する唯一の建造物である。NASAアメリカ航空宇宙局は先日、火星有人探査を2033年に実現すると表明した。JAXA宇宙航空研究開発機構も“将来の国際有人宇宙探査と今後の地球低軌道宇宙活動に関する検討"を重点的に推進している。我々は、ISS/「きぼう」において、生命現象可視化(On-site direct visualization)の実現を目指し、近未来に人類が遭遇するであろう宇宙環境(微小重力、宇宙放射線暴露など)における生命恒常性を理解するための技術革新を狙う。
アリルシアナートの転位反応を活用した生体機能分子の実用的合成

アリルシアナートの転位反応を用いた生体機能分子の効率的な合成法の確立を目的として,海洋天然物であり,高度に縮環した4環性ピロール骨格を有するアゲラスタチンAを標的化合物として合成研究を行った。アゲラスタチンAの合成計画に関しては,光学活性な1,2-ジアミノ構造をもつシクロペンテン中間体をもちいる合成ルートを立案した。アラビトールを出発原料として,アリルシアナートの転位反応を用いてアリルアミン骨格を構築した。そして,ルテニウム触媒を用いた閉環メタセシス(RCM)反応を用いて,シクロペンテン環の構築に成功した。さらに2回目の転位反応によりアリルアミン合成を行った。これにより,ジアミノ骨格を有するシクロペンテン中間体の合成に成功した。次に,ピロールの分子内マイケル付加反応を用いたB環の構築を検討した。この反応において,ピロールの酸性度を高めるために臭素をピロール骨格に導入した。またIBX酸化によって生成する中間体のシクロペンテノンは不安定であり取り扱いが難しい。そこで,単離することなくワンポットでアミンを加えて分子内マイケル付加反応を行った。これにより高収率で3環性化合物を得ることに成功した。さいごにCbz基とピロール上の臭素置換基を加水素分解で除去する。生成するアミノケトンは2量化を起こしやすいので,単離することなくメチルイソシアナートを加えてウレアとして4環性化合物を合成した。さらにFeldmanの手法を用いて,ピロールに臭素を導入してアゲラスタチンAの全合成を完結した。海洋生物である海綿よりPietra等はアゲラスタチンAを見いだした。その構造は臭素化されたピロールをもつ四環性のアルカロイドであり,多様な生物活性を示す。しかし天然から得られる量が限られており,化学合成による供給が望まれている。最初のラセミ体の全合成は,1999年にWeinreb等が報告している。そこで,アリルシアナートの転位反応を鍵反応とした光学活性なアゲラスタチンAの全合成を計画した。レアラビトールを出発原料としてα,β-不飽和アルデヒドを合成した。Soai等によって報告されているジエチル亜鉛の不斉付加反応を用い,アリルアルコールとした。引き続き,アリルシアナートの転位反応による不斉転写によってカルバメートを得た。閉環メタセシス反応を用いシクロペンテン骨格の構築を行い,2回目の転位反応を行い1,2-ジアミノ骨格をもつシクロペンテン中間体の合成に成功した。さらに臭素原子を2つ有するピロール環を導入して,分子内マイケル反応を用いてB環を構築した。最後にCbz基の除去を行いメチルイソシアナートとの反応によってN-メチルウレア基を合成した。最後にNBSを用いてブロム基をピロール環に導入して全合成を完成した。
樹木の一斉開花結実の進化を統合的に理解するための理論的研究

研究計画[1]について、樹木が種子捕食者からの被食回避をするために、マスティングが進化したという捕食者飽食仮説について、研究を行った。種子捕食者は樹木がマスティングによりつくりだす変動した種子生産のもとでは、リスク回避戦略を取る事が知られている。例えばニホンクロクマは夏に繁殖期を迎えるが、秋の堅果類生産が予測できない為に、妊娠にはリスクが伴う。そこで、着床遅延を進化させ、秋の堅果類生産量をみて、次年度に妊娠・出産を行うかを決定する。一方、堅果類の代表的散布前種子捕食寄生者であるゾウムシ類は豊作年の翌年以降にいつ次の豊作年が来るのかが予測できないため、翌年すべての幼虫が羽化するのではなく、ある割合の幼虫は土壌中での休眠期間を延長する。つまり、羽化タイミングに分布を持たせる事で、不確実な未来に対してリスク回避をとっている。このように、樹木は種子の被食を回避するためにマスティングを進化させ、一方で種子捕食者もリスク回避戦略を進化させる、共進化的軍拡競争が観察される。申請者はこのようなタイプの共進化的軍拡競争が引き起こされる進化的条件についてこれまでの研究の拡張として数理モデルを用いて取り組んだ。その結果、樹木実生の生存率が正で、捕食者の捕食効率が十分に高いときにこのような共進化が起こる事を示した。これは、樹木と種子捕食者の時間的戦略の共進化的軍拡競争について理論的に検討した初めての研究である。また、ササ・タケ類に見られる一斉開花枯死の進化について二次元空間格子モデルを用いて研究を行った。ササ・タケ類は非常に長い期間栄養成長のみで専有面積を増大させ、或る時に複数の個体(ジェネット)が揃って繁殖枯死することが知られている。この様な生活史を見せる植物はササ・タケ類以外には数が非常に少なく、その進化史については謎が多く残されている。申請者は第一に、空間構造を考慮しない数理モデルを用いて栄養成長効率と種子繁殖効率の二つのパラメータのうち、効率の高い戦略のみを取る事が適応的である事を示した。次に、空間構造を導入することで、中間のパラメータレンジでササ・タケ類のような一斉開花枯死型の生活史が進化的に出現する事を示した。これは,空間構造が存在することにより、同一ジェネットに由来するラメット(桿とも呼ばれる)が空間的にクラスタを形成する事によって栄養繁殖効率が時間的に現状する事に起因していた。これにより、栄養成長と種子繁殖のバランスが重要であること初めて理論的にしめした。また、ササ・タケ類の地下茎の構造に大きく2種類存在する事に注目し、すぐ近くにラメットを生産するタイプは遠くにラメットを生産するタイプに比べて、栄養繁殖期間が短くなることを示した。これは、熱帯から温帯にまで分布するササ・タケ類の生活史の違いを地下茎構造の違いによって説明した初めての研究である。研究目的[1]に関しては、種子捕食者が開花結実の進化に与える影響について解析し、種子捕食者のマスティング進化促進効果を理論的に示した。現在まで、野外研究や実験で明らかにされてきた内容は、樹木の種子生産がインターバルを持つ事で、種子捕食者の個体数が変動しているという事であった。我々の研究では、理論的にそこから一歩進んで、実際に一斉開花を進化させうるだけの進化的圧力(selection pressure)を持つのかまで議論した。結果的には、種子捕食者は、「実生の生存率がある程度高いとき」樹木の一斉開花を促進しうるという結論に達した,この結果は、今までの野外データのみでは、間接的にも捕食者飽食仮説を明らかにした事にはなっていない事を意味しており、この条件を満たすかどうかも併せて議論しなければならないという問題提起を発信する事になる。この内容は論文を執筆後、Journal of Ecology誌に掲載された。論文執筆後は、研究計画後半の内容に関して解析を進めている。平成22年度中に研究計画[3]に関して一定の成果を得た。東南アジア熱帯で観察されている。General flowering現象を説明する新規数理モデル開発を行った。熱帯林と温帯林の最も大きく異なる点は2点であり、一つ目は、熱帯林は植物種数が大きく、種ごとの密度が小さいことであり、もう一つはジェネラリスト送粉者によって送粉される種が多いということである。この二つの条件がある事で、東南アジア熱帯林が温帯林と比べて、非常にgeneral floweringが起こりやすい状況にある事を数理的に示した、この研究は北海道大学の佐竹暁子准教授との共同研究として行い.Journal of Theoretical Biology誌に掲載された。研究計画[1]について、樹木がマスティングを進化するときの集団サイズの効果についての数理的研究を行った。無限に大きな集団においては、適応度が進化の方向性を決定付ける直接的な要因になる。適応動態の枠組みでは、適応度は長期の1個体あたりの個体群増殖率であると定義される。突然変異体が集団に侵入してきた時の増殖率が先住者の一個体あたりの増殖率と比べて大きくなるときは、その変異体は集団に侵入可能であると言うことができる。進化の方向性は、先住者の形質値を引数としてもつ適応度関数をその形質値で微分した時の傾き、(適応度勾配、選択勾配)をもとに決定される。これは連続的に起こる、微小な突然変異の蓄積によって進化がおこるという仮定のもとで計算される。選択勾配が0になるような形質値は微小な突然変異によって生じた変異体の適応度は先住者のそれと比べて大きいとは言えず、進化によって形質の置換が起こるとは言えない。

このような先住者の形質をESS(進化的に安定な戦略)とよぶ。集団サイズが小さいときに現れる浮動の効果が形質のランダムなゆらぎを生む。無限に大きな集団で解析された適応度は決定論的な進化の方向性を決めるものになるが、集団サイズが小さいときには、浮動のランダム効果によってESSに形質が留まるようなことが無い。その結果、ESSまわりで形質が揺らぐことになる。ランダムなゆらぎの効果は時に、形質がESSから大きく逸脱する事を許す。その結果、複数のESSが存在する形質空間ではあるESSから別のESSへの遷移が見られることがある。ランダム効果によるESS間の遷移は一時的に非適応的な形質を通過するので、一見実現不可能な進化が可能になる為のイノベーションを引き起こす要因になると考えられる。この結果はTheoretical Population Biology誌に掲載された。研究計画[1]について、樹木が種子捕食者からの被食回避をするために、マスティングが進化したという捕食者飽食仮説について、研究を行った。種子捕食者は樹木がマスティングによりつくりだす変動した種子生産のもとでは、リスク回避戦略を取る事が知られている。例えばニホンクロクマは夏に繁殖期を迎えるが、秋の堅果類生産が予測できない為に、妊娠にはリスクが伴う。そこで、着床遅延を進化させ、秋の堅果類生産量をみて、次年度に妊娠・出産を行うかを決定する。一方、堅果類の代表的散布前種子捕食寄生者であるゾウムシ類は豊作年の翌年以降にいつ次の豊作年が来るのかが予測できないため、翌年すべての幼虫が羽化するのではなく、ある割合の幼虫は土壌中での休眠期間を延長する。つまり、羽化タイミングに分布を持たせる事で、不確実な未来に対してリスク回避をとっている。このように、樹木は種子の被食を回避するためにマスティングを進化させ、一方で種子捕食者もリスク回避戦略を進化させる、共進化的軍拡競争が観察される。申請者はこのようなタイプの共進化的軍拡競争が引き起こされる進化的条件についてこれまでの研究の拡張として数理モデルを用いて取り組んだ。その結果、樹木実生の生存率が正で、捕食者の捕食効率が十分に高いときにこのような共進化が起こる事を示した。これは、樹木と種子捕食者の時間的戦略の共進化的軍拡競争について理論的に検討した初めての研究である。また、ササ・タケ類に見られる一斉開花枯死の進化について二次元空間格子モデルを用いて研究を行った。ササ・タケ類は非常に長い期間栄養成長のみで専有面積を増大させ、或る時に複数の個体(ジェネット)が揃って繁殖枯死することが知られている。この様な生活史を見せる植物はササ・タケ類以外には数が非常に少なく、その進化史については謎が多く残されている。申請者は第一に、空間構造を考慮しない数理モデルを用いて栄養成長効率と種子繁殖効率の二つのパラメータのうち、効率の高い戦略のみを取る事が適応的である事を示した。次に、空間構造を導入することで、中間のパラメータレンジでササ・タケ類のような一斉開花枯死型の生活史が進化的に出現する事を示した。
ハイパーメディアを指向する分散OSに関する研究

本年度の研究により、ハイパーメディアを指向する分散OSの中でも、特に分散型のハイパーメディア型オペレーティングシステムの全般的な研究へと発展させた。この成果によって、以下のことが実現された。1)HTTPやFTPとコンパチビリテイを持つハイパーメデイア型の分散ファイルシステム。2)リンクの管理をOSが行うため、リンクの一貫性の保証やリンクされていないオブジェクトのガーベジコレクションなどはOSが一括して効率よく行うこと。3)複数のアプリケーションの間で、ハイパーメデイアを扱う部分のAPIまた、エンドユーザからみたユーザインタフェースを一貫したものを提供できる。4)アプリケーションによらずOSにより一括したキャッシュが行えるため、既存のインターネット上のアプリケーション毎のハイパーメディアシステム体系よりも、効率的なキャッシュが行える。5)ハイパーメディアを思考のための道具として利用した時に不可欠になる、頻繁なコンテンツ変更をサポートするための、ロバストなリンク管理機能。6)ハイパーメディアを情報発信のための道具として利用したときに不可欠となる、高いユーザビリティを実現するためのKIOSK機能や、リンク追跡機能。これらの性質をもった分散ファイルシステムを既存のBTRON仕様のオペレーティングシステムに組み込み、それを「NetBTRON」と名づけて試験的な実装を行い、その機能と性能を実証的に評価した。その成果は、情報処理学会論文誌で発表した。本年度の研究により、ハイパーメディアを指向する分散OSの中でも、特に分散型のハイパーメディア型の分散ファイルシステムの研究を進めた。1)ハイパーメディア型の分散ファイルシステム2)分散ファイルシステムを実現するトランスファープロトコル部分をHTTPやFTPなど、自由に交換することが可能。3)上記の性質より、既存の分散ハイパーメディアであるWWWと本システムをシームレスに結合することが可能になった。4)リンクの管理をOSが行うため、リンクの一貫性の保証やリンクされていないオブジェクトのガーベジコレクションなどはOSが一括して効率よく行うことが可能である。5)複数のアプリケーションの間で、ハイパーメディアを扱う部分のAPIまた、エンドユーザからみたユーザインタフェースを一貫したものを提供できる6)アプリケーションによらずOSにより一括したキャッシュが行えるため、既存のインターネット上のアプリケーション毎のハイパーメディアシステム体系よりも、効率的なキャッシュが行える。その成果は、3年に一度開催されるコンピュータ世界会議であるIFIP World Congress2000で発表した。
固相放射線重合のための結晶場の設計

1,4-ジエチニネベンゼンは最も簡単な分子構造を持つ結晶性アセチレン化合物と考えられる。その単結晶をγ線照射することにより共役ポリエンを主鎖とする重合体が生成する。エチニル基の水素をアセトキシメチル基に置き換え、芳香核にメチル基やメトキシ基を置換基として持つ種々の結晶性のジエチニルベンゼン誘導体を合成した。これらの単量体の固相放射線重合における反応性は芳香核の置換基の種類や位置により著しく異った。X線結晶構造解析により重合反応性と結晶構造との相関関係が明らかになった。特に重合反応性の高かった単量体は1,2-ジメチル-4,5-ビス(3-アセトキシ-1-プロピニル)ベンゼンおよび1-メチル-3-メトキシ-4,6-ビス(3-アセトキシ-1-プロピニル)ベンゼンである。前者では、二つの三重結合が非等価な配置にあり、片方の三重結合のみが付加重合に適した配置を取っている。後者は、このような二つの三重結合の非等価な配置を期待して合成された非対称な分子構造を持つ単量体である。この単量体では、重合初期過程において選択的に二量体が連鎖反応で生成し、重合体は二量体からの二次的な生成物である。二量体を同定し、結晶構造との比較を行った。ジエチニルベンゼン誘導体については固相重合に適した半量体の分子設計が可能となった。被照射試料のESRスペクトルの測定により、結晶中に蓄積される初期ラジカルの量と重合収率との間に良い対応が見られた。重合反応性の高い結晶からは微量の生長ラジカルのみが検出された。ジエチニルベンゼン誘導体から生成する重合体はペンダントに片方の三重結合が残存している。この重合体の膜状態および溶液における光ゲル化を試みた。以上のように、ジエチニルベンゼン誘導体の分子構造と固相重合に適した結晶構造の関係について知見を得て、結晶場を利用した機能性高分子の合成を試みた。
保型形式に付随するｐ進Ｌ関数とｐ進周期の研究

この研究では楕円保型形式に付随する(p進)L関数の特殊値や(p進)周期の性質を調べ,岩澤主予想やBeilinson予想の研究を行なった.その結果,M.-L. Hsieh氏との共同研究により楕円保型形式に対して反円分的p進L関数を構成し,反円分的岩澤主予想の片方の包含関係を多くの場合に示した.またF. Brunault氏との共同研究により,楕円保型形式のRankin-Selberg積に対するBeilinson予想についての結果を得た.また近藤智氏,山内卓也氏と共同で関数体上のGL(2)型の曲線に対するK群の研究を行ない, boundary写像の全射性に関する結果を示した.今年度は国立台湾大学のMing-Lun Hsieh氏と楕円保型形式に対する反円分的岩澤主予想についての共同研究を行い,素数pで良い通常還元をもつ偶数の重さの楕円保型形式に対して,比較的緩い仮定の下で反円分的p進L関数によって生成されるidealが対応するSelmer群の特性idealに含まれるという結果を得ることができた.この結果は有理数体上の楕円曲線の場合に反円分的岩澤主予想に関して同様の結果を証明したBertolini-Darmonによる仕事の楕円保型形式の場合への一般化となっている.さらに,この結果を応用することにより,楕円保型形式に付随するL関数の中心値に対するBloch-加藤予想についての部分的な結果も得ることができた.岩澤主予想とはL関数の特殊値をp進的に補間したp進L関数によって生成されるidealがGalois表現を用いて代数的に定義されるSelmer群の特性idealと一致するであろうという予想であり,岩澤理論において非常に重要な予想のひとつといえる.今年度に得られた結果とSkinner-Urbanによる三変数岩澤主予想の結果を組み合わせることで,多くの場合に反円分的岩澤主予想が示されることが期待される.さらに,この結果は本研究の動機の一つであるp進BSD予想の保型形式の場合への一般化とも関係しており,関連する様々な問題にも応用が見込まれる.これらの結果は昨年度の研究で導入された四元数環上の保型形式の合同を応用することによって証明され,特に志村曲線上のCM点から作られるGaloisコホモロジーの類から保型形式のある種の合同を用いることで一般の重さの保型形式の場合にEuler systemを構成することが証明の鍵となっている.今年度はフランスのLyon高等師範学校のFrancois Brunault氏と楕円保型形式に対するRankin-Selberg L関数の整数点での特殊値に関するBeilinson予想についての共同研究を行った.Beilinson予想は代数多様体の代数的K群からDeligneコホモロジーへのregulator写像とnon-criticalな整数点におけるL関数の特殊値の関係を述べた予想であるが多くの場合は未解決である.楕円保型形式のRankin-Selberg L関数の場合はBeilinson, Baba-Sreekantan, Bertolini-Darmon-Rotgerらによって重さが2の保型形式の組の場合に対し結果が知られており,今年度のBrunault氏との共同研究において,彼らのregulator写像についての計算結果を一般の重さの保型形式の組に対して拡張することができた.重さが2の場合は二つのmodular曲線の直積に対するK群にmodular単数を用いて元の構成が行われていたが,今回の研究においては二つの久賀-佐藤多様体の直積に対するK群にBeilinsonによるEisenstein symbolの理論と対角埋め込みの手法を用いることでL関数の特殊値と関連を持つ元を構成することに成功した.さらに新しい構成法を与えたことにより,扱えるL関数の整数点の範囲を広げることにも成功した.今回得られた結果はRankin-Selberg L関数の玉河数予想の研究において重要なステップを与えており,この結果のp進類似が本研究課題の中心的な研究対象であるp進L関数の特殊値を求めることに他ならない.さらに今回構成したK群の元は反円分的p進L関数とも関係していると考えられ,反円分的岩澤理論への応用も期待される.この研究では楕円保型形式に付随する(p進)L関数の特殊値や(p進)周期の性質を調べ,岩澤主予想やBeilinson予想の研究を行なった.その結果,M.-L. Hsieh氏との共同研究により楕円保型形式に対して反円分的p進L関数を構成し,反円分的岩澤主予想の片方の包含関係を多くの場合に示した.またF. Brunault氏との共同研究により,楕円保型形式のRankin-Selberg積に対するBeilinson予想についての結果を得た.また近藤智氏,山内卓也氏と共同で関数体上のGL(2)型の曲線に対するK群の研究を行ない, boundary写像の全射性に関する結果を示した.今年度は楕円保型形式に付随する反円分的p進L関数の構成及びp進L関数から定まる岩澤不変量について研究を行った.BertoliniとDarmonは反円分的岩澤理論に関する一連の研究の中で楕円曲線に付随する反円分的p進

L関数を構成し,Vatsalは楕円曲線に付随する反円分的p進L関数の岩澤μ不変量が多くの場合に零になることを証明した.以上の背景を元に国立台湾大学のMing-Lun Hsieh氏と共同研究を行い,Bertolini-Darmonによる反円分的p進L関数の構成を重さが偶数の楕円保型形式の場合に一般化し,今まで(重さが2の場合を含む)あらゆる場合に未解決であった古典的なL関数の特殊値との関係(補間性質)を一般的に証明した.この結果は反円分的p進L関数に対して例外的零点予想の研究を行ったBertolini-Darmon-Iovita-Spiessらによる予想の解決を含んでおり,本研究課題の中心的テーマである例外的零点予想の研究の基礎になっていくと考えられる.さらにHsieh氏との共同研究において,上記のVatsalの結果を重さが偶数の保型形式の場合に一般化し,反円分的p進L関数から定まる岩澤μ不変量が多くの場合に零になることを証明した.Vatsal氏の結果はSkinner-Urbanによる保型形式に対する岩澤主予想の研究においても鍵となる部分で用いられており,今年度得られた結果はSkinner-Urbanの結果を一般化する上で今後重要になっていくと思われる.またHsieh氏との共同研究ではPollackとWestonによる保型形式に伴うp進周期の比較を一般化することにも成功した.これはSkinner-Urbanによる3変数p進L関数との比較を行うときなどにも必要となる結果である.今年度も昨年度に引き続きLyon高等師範学校のFrancois Brunault氏とRankin-Selberg L関数の特殊値に関するBeilinson予想について共同研究を行い,昨年度の研究により構成された(一般化された)Beilinson-Flach元が久賀-佐藤多様体のboundaryまで拡張されることを証明した.昨年度に行った研究により, Beilinsonがmodular曲線の二つの直積に対するregulatorの研究で用いた元(Beilinson-Flach元)をより一般の重さの保型形式のRankin-Selberg積に対応する久賀-佐藤多様体のK群の場合に一般化できることがわかったが,実際にBeilinson予想に応用するためにはその元を久賀・佐藤多様体のboundaryまで拡張する必要があった.この研究は主に二つのステップからなり,一つ目は(一般化された)Beilinson-Flach元を普遍楕円曲線のfiber積のNeron modelに拡張することであり,二つ目はその元をさらにDeligneの構成したsmooth compactificationまで拡張することである.一つ目のステップはSchappacher-Schollの結果及びDegliseによるresidue写像の性質を用いることで証明され,二つ目のステップはWildeshausによる久賀-佐藤多様体のmotiveに関する結果とVoevodskyによる幾何的motiveの理論を用いることで証明することが出来た.Beilinson予想のp進類似であるp進Beilinson予想についてもKings-Loeffler-Zerbesらが研究を行っており,彼らの用いた元も我々の手法により, boundaryに拡張することが可能である.整数論今年度は本研究の中心的な研究対象である保型形式から定まるp進L関数についての重要な予想のひとつである岩澤主予想に関して大きく研究を進めることができた.
免疫学的ハイリスク腎移植における抗CD20抗体投与後のB細胞免疫応答機構の解明

当初予定していた動物実験では思う様な結果が得られなかったため、ヒト検体(移植腎病理標本)での再検証を行うこととした。近年、移植腎内の3次リンパ節形成という概念がある。移植腎間質の線維化は単に線維化のみでは移植腎予後に影響しないが、そこに炎症細胞浸潤を伴った場合に移植腎の予後を悪化させるという報告(Park WD et al, J Am Soc Nephrol 2010)もある。そこで2004年7月から2014年12月の期間に当科で腎移植療法を行った204症例のうち、明らかな拒絶反応を伴わない181例を対象に3次リンパ節の検討を行った。移植後1か月、6カ月、12か月後の定期腎生検標本を用いて3次リンパ節形成を伴っている症例について、その移植腎機能、危険因子、などについて検討した。3次リンパ節の定義はSato Y etal, JCI insight 2016の基準を参照した。これまでに得られた結果では、移植腎に3次リンパ節形成があり且つその成熟度が高い症例では、3次リンパ節形成が無い、もしくはあってもその成熟度が低い症例と比較して、移植後5年までの移植腎機能が有意に低いことが判明した。これはRituximab (RIT)投与の有無にかかわらなかった。RIT投与を受けている場合、B細胞が著明に減少しているため、理論的には3次リンパ節形成は起こりにくいはずである。従って免疫学的リスクが高い症例のみならず、これまで通常の免疫抑制プロトコールで腎移植を行っていた症例も、RITを術前に投与しておいた方が移植腎予後が改善する可能性が示唆された。今後はRIT投与症例における3次リンパ節形成が症例によって異なる原因は何か、3次リンパ節形成後に何らかの治療介入を行うことで移植腎予後が改善するのか否かなどについて、更に研究を行っていく予定である。まず、マウスの脾臓細胞を用いたフローサイトメトリー解析を施行した。別の実験系でも用いているCD4やFoxp3陽性のregulatoryT cellなどのproportionを測定することが可能となり、methodologyが安定した。また、脾臓中のFoxp3陽性のregulatoryT cellなど、免疫染色も可能となった。これが確認出来たら感作・非感作マウスにそれぞれ抗CD20抗体(RIT)やproteosome inhibitorを投与し、BAFF濃度の推移と2次リンパ組織中のB細胞レパートリーとの関係性を評価する。我々の仮説が正しければ、感作マウスでは2次リンパ組織中の形質細胞数が多数存在し、BAFF濃度は非感作マウスと比較して低く維持されているはずである。マウスの脾臓細胞を用いたフローサイトメトリーの設定(抗体の濃度やゲーティングの調整など)に予想以上に時間がかかってしまい、まだ予備実験の段階である。マウスの脾臓を用いたフローサイトメトリー解析によるCD4/Foxp3陽性細胞のpopulationの解析は安定してできるようになった。また血清中の炎症性サイトカイン(IL-6, IL-10, IL-2, TNF-alpha等)測定や、qRT-PCRによる腎臓・脾臓中の炎症性サイトカインおよび免疫関連抗原分子のmRNA(IL-6, IL-10, Foxp3, TGF-beta, CD80, CD86, ICAM-1等)の測定も安定してできるようになった。さらにウエスタンブロッティング法により腎臓中の免疫関連抗原分子(CD80, CD86, ICAM-1等)のタンパク発現量も安定して可視化できるようになった。これが確認できたら感作・非感作マウスにそれぞれ抗CD20抗体(rituximab)やproteosome inhibitor (bortezomib)を投与し、BAFF濃度の推移と2次リンパ組織中のB細胞レパートリーとの関連性を評価する。我々の仮説が正しければ感作マウスでは2次リンパ組織中の形質細胞数が多数存在し、B細胞系のホメオスターシスが保たれているため、BAFF濃度は非感作マウスと比較して低く維持されているはずである。本研究に関連するさまざまなmethodologyを確立すべく多くの予備実験を行ったことで予想以上に時間がかかってしまったため。マウスの脾臓またはリンパ節、血液等を用いたリンパ球(CD3、CD4、CD8、CD20、CD138等のレパトア)のフローサイトメトリー解析は、安定して結果が得られるようになり、同リンパ球レパトアの免疫組織染色及びその評価も可能となった。病理組織標本において免疫組織染色で染色される各リンパ球レパトアのpopulationを、画像解析ソフト(Winroof2015)を用いて定量化できるようになった。また、血清中の炎症性・抗炎症性サイトカイン(IL-6、IL-10、IL-12、TNF-alpha等)の測定やquantitative real time RT-PCRによる腎臓および脾臓中の炎症性・抗炎症性サイトカイン・副刺激シグナル関連抗原分子(CD80、CD86、ICAM-1等)のmRNAの測定も可能となった。さらにウエスタンブロッティング法による副刺激シグナル関連抗原分子のタンパク発現量も安定して評価できるようになった。

移植腎間質の線維化は単に線維化のみでは移植腎予後に影響しないが、そこに炎症細胞浸潤を伴った場合に移植腎の予後を悪化させるという報告(Park WD et al, J Am Soc Nephrol 2010)もある。そこで2004年7月から2014年12月の期間に当科で腎移植療法を行った204症例のうち、明らかな拒絶反応を伴わない181例を対象に3次リンパ節の検討を行った。移植後1か月、6カ月、12か月後の定期腎生検標本を用いて3次リンパ節形成を伴っている症例について、その移植腎機能、危険因子、などについて検討した。3次リンパ節の定義はSato Y etal, JCI insight 2016の基準を参照した。これまでに得られた結果では、移植腎に3次リンパ節形成があり且つその成熟度が高い症例では、3次リンパ節形成が無い、もしくはあってもその成熟度が低い症例と比較して、移植後5年までの移植腎機能が有意に低いことが判明した。これはRituximab (RIT)投与の有無にかかわらなかった。RIT投与を受けている場合、B細胞が著明に減少しているため、理論的には3次リンパ節形成は起こりにくいはずである。従って免疫学的リスクが高い症例のみならず、これまで通常の免疫抑制プロトコールで腎移植を行っていた症例も、RITを術前に投与しておいた方が移植腎予後が改善する可能性が示唆された。今後はRIT投与症例における3次リンパ節形成が症例によって異なる原因は何か、3次リンパ節形成後に何らかの治療介入を行うことで移植腎予後が改善するのか否かなどについて、更に研究を行っていく予定である。予備実験として施行していたフローサイトメトリー解析や、ELISA、ウエスタンブロットなどによる血清中のサイトカイン、免疫抗原関連分子などの測定、比較が可能となった。今後は上述の通り本実験の実施に移る予定である。予備実験として施行していたさまざまなmethodologyがようやく確立し、安定して結果が得られるようになったため、今後は上述の通り本実験の実施に移る予定である。これまで予備実験を施行してきたが、実験動物の使用が予想よりも少なかったため。またmethodologyの確立のために使用した薬剤などの使用も予想よりも少なかったため。本実験では多くの実験動物を使用する予定であり、またそれに伴い薬剤などの消耗品の使用も多くなるため、多くの出費が見込まれる。本実験では多くの実験動物を使用する予定であり、それに伴い薬剤などの消耗品の使用も多くなるため、次年度の出費はかなり多くなる見込みである。
培養細胞系を用いたWnt/Winglessシグナル伝達経路の生化学的解析

形態形成にかかわるシグナル分子Wnt/Wingless (Wg)のいわゆるCanonical Wnt/Wgシグナル伝達経路について解析した。Xenopus胚でのCasein kinase I(CKI)の強制発現の結果より、CKIは、Wntシグナル伝達の正の制御因子であるとされていた。そこで、本研究では、Drosophilaの系を用いて、CKIのWgシグナル伝達経路における役割の解析を行った。DrosophilaのSchneider S2R+細胞をCKIα及びεのdouble stranded RNA (dsRNA)の存在下で培養するin vitroRNAi法を行って、CKIα及びε蛋白の産生を阻止すると、Xenopusの結果に反して、著しいArmadillo (Arm)蛋白質の蓄積が生じた。Pulse chase解析より、このCKIα-RNAiによるArm蛋白質の蓄積はCKIα-RNAiによるArm蛋白質の分解速度の低下に起因していることが明らかになった。さらにDrosophilaの胚に同じdsRNAを注入して、胚におけるCKI蛋白の産生を阻止したところ、Wgシグナルが過剰に流れた事を意味するNaked cuticleの表現型を持つ胚が発生した。CKIの作用点を知る為にエピスタシス解析を行ったところ、CKIα-RNAiによるArm蛋白の蓄積にはDishevelledもZeste-White 3 (ZW3)も必要でなかった。更に、Armはin vitroでCKIの良い基質であり、S2R+細胞内でのCKIの強制発現は高度リン酸化型のArm蛋白質を誘導した。CKIα-RNAiによるArm蛋白質の蓄積の標的部位はArmのZW3のリン酸化配列であった。これらの結果は、ハエのCKIはArm蛋白質のN末端のリン酸化を介して、そのプロテアソーム系での分解を促進している事を強く示唆した。形態形成にかかわるシグナル分子Wnt/Wingless(Wg)の生物活性については、様々なモデル動物を用いて分子生物学的研究がなされいる。また各種のWntシグナル伝達異常によって引き起こされたβ-cateninの蓄積が細胞のの癌化の原因となっている事も知られている。本研究の目的は、Wnt/Wgに感受性を持つDrosophilaや哺乳動物の培養細胞と、可溶性のWnt/wg蛋白を用いて、Wnt/Wgシグナル伝達に関わる遺伝子産物の生化学的相互作用の実体を解明する事である。最近Xenopus胚を用いた解析から、Casein Kinase I(CKI)が、Wntシグナル伝達の正の制御因子であるとの報告がなされたが、その普遍性は他の動物系を用いて、検証されているわけではなかった。そこで、本研究ではDrosophilaの系を用いて、CKIのWgシグナル伝達経路における役割の解析を行った。Schneider S2R+細胞をDrosophilaのCKIα及びεのdouble stranded RNA(dsRNA)の存在下で培養するin vitroRNAi法を行って、CKIα及びε蛋白の産生を阻止した。するとXenopus胚を用いた結果に反し、著しいArmadillo(Arm)蛋白質の蓄積が生じた。なおRNAiによってArmのmRNAの変化は認められない事からCKIα及びε、はArm蛋白質の安定性を負に制御していることが明らかとなった。これらの結果は、Drosophilaでは、CKIはWgシグナル伝達の負の制御因子として働いている事を示すものであった。形態形成にかかわるシグナル分子Wnt/Wingless(Wg)のいわゆるCanonical Wnt/Wgシグナル伝達経路について解析した。

Xenopus胚でのCasein kinase I(CKI)の強制発現の結果より、CKIは、Wntシグナル伝達の正の制御因子であるとされていた。そこで、本研究ではDrosophilaの系を用いて、CKIのWgシグナル伝達経路における役割の解析を行った。DrosophilaのSchneider S2R+細胞をCKIα及びεのdouble stranded RNA(dsRNA)の存在下で培養するin vitroRNAi法を行って、CKIα及びε蛋白の産生を阻止すると、Xenopusの結果に反して、著しいArmadillo(Arm)蛋白質の蓄積が生じた。Pulse chase解析より、このCKIα-RNAiによるArm蛋白質の蓄積は、CKIα-RNAiによるArm蛋白質の分解速度の低下に起因していることが明らかになった。さらにDrosophilaの胚に同じdsRNAを注入して、胚におけるCKI蛋白の産生を阻止したところ、Wgシグナルが過剰に流れた事を意味するNaked cuticleの表現型を持つ胚が発生した。CKIの作用点を知る為にエピスタシス解析を行ったところ、CKIα-RNAiによるArm蛋白の蓄積にはDishevelledもZeste-white 3(ZW3)も必要でなかった。更に、Armはin vitroでCKIの良い基質であり、S2R+細胞内でのCKIの強制発現は高度リン酸化型のArm蛋白質を誘導した。CKIα-RNAiによるArm蛋白質の蓄積の標的部位はArmのZW3のリン酸化配列であった。これらの結果は、ハエのCKIはArm蛋白質のN末端のリン酸化を介して、そのプロテアソーム系での分解を促進している事を強く示唆した。