hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
下肢静脈瘤の発症に関与する疾患感受性遺伝子の探索とリスク要因の解明

下肢静脈瘤は、下肢の表在静脈の拡張や弁不全によって静脈が拡張、屈曲蛇行したものである。一度生じると不可逆的であり、発症当初に症状がない場合でも徐々に進行して、下肢のむくみや重圧感、血管痛、かゆみ、こむら返りなどの下肢諸症状を生じる。下肢静脈瘤の疫学は、本邦における文献的情報に限りがあり、大規模な調査報告は皆無である。下肢静脈瘤は加齢とともに有病率が高まり、不快な症状を伴う事から、単独の疾患のみならず変形性膝関節炎などの整形外科疾患と重なることでさらに自覚症状が悪化する。超高齢化社会を迎えて健康寿命の延伸を政策目標に掲げる我が国において、高齢者における有病率が高い下肢静脈瘤の実態把握を行うことは極め重要である。こうした中で、本研究では、高齢化の進む島根県中山間地域で地域住民を対象とした持続的疫学調査基盤Shimane CoHRE Studyの一環として、下肢静脈瘤の実態把握と要因研究を行うことを試みた。下肢静脈瘤の疫学調査の実施にあたっては、静脈血の逆流を厳密に測定して診断することが可能なエコー検査を用いた。年齢、性別、既往歴、居住地などの基礎的項目と併せて下肢自覚症状や生活習慣、SF-8を用いた健康関連QOL調査を行い、下肢静脈瘤の罹患との関連を解析した。成果として、立ち仕事の中でも立位で動きの少ない立ち仕事が静脈瘤の罹患と関連することや、立ち仕事と肥満が重なることで下肢静脈瘤のリスクが高まることを解明した。また、生活習慣のうち、喫煙やアルコール摂取なども影響することが明らかとなり、臨床的な情報を加味して考えると、再発予防には患者への適切な生活指導が重要であることが示された。今後はさらに、社会疫学的観点から下肢静脈瘤の予防法について考案したい。下肢静脈瘤は,様々な下肢の自覚症状の原因となり得,患者のQuality of lifeを下げて本邦の労働生産性を低下させる。高齢者で実に20%の有病率を示し,肥満や立ち仕事等の生活環境要因が発症に関与する。一方で,遺伝要因(家族歴)は下肢静脈瘤のリスク全体のうち約10%を説明する。その寄与は,原因遺伝子が解明されている静脈血栓塞栓症より強いが,下肢静脈瘤の発症に関わる具体的な遺伝子は未知である。本研究は,下肢静脈瘤の原因遺伝子を探索的に解明することを目的とする。さらに,島根県の疫学調査基盤(Shimane CoHREStudy)を活用して,下肢静脈瘤のリスク要因を包括的に解明することを目的とした。2016年度は新たに約350名に対して下肢静脈瘤に関連する検査を行った。2012-2016年度までに収集したデータは総計で1000名を超え、疫学的解析に供するデータ収集は一段落した。臨床サンプルについては、2016年11月に島根大学医の倫理委員会にて審査を経た後に受理された。臨床サンプルのデータ収集は現在までに約30例を収集した。さらにスウェーデンのLund大学の共同研究者らと共に、下肢静脈瘤の要因に関する共同研究の推進を行い、下肢静脈瘤の発症には遺伝要因が強く関連するが、家族内の生活環境要因が重なる事で発症リスクが高まる事を解明し、国際誌に論文が掲載された(Kohno et al., JACS 2016, IF:4.3)。2017年度も引き続き、Lund大学の共同研究者らと共に研究推進に向けて共同研究を行う予定である。疫学調査では2016年度に新たに約350名より血液を採取し、DNAを抽出した。また、生活環境に関するアンケート調査も同時に行い、データベースを構築した。臨床研究では、新たに島根大学医学部医の倫理委員会を経て、臨床検体および生活環境に関するデータを収集した。スウェーデンLund大学との共同研究により、下肢静脈瘤の発症には遺伝要因が強く影響する事を確認し、さらに生活環境要因が重なる事で発症リスクが高まる事を明らかにした。本研究の目的は、下肢静脈瘤の遺伝要因を解明し、さらに生活環境要因を含めて下肢静脈瘤のリスクを包括的に解明する事である。昨年度までに、中山間地域の住民を対象とした健康調査の一環で、下肢静脈瘤の疫学調査を行い、収集したデータは1000名を超え、疫学的解析に供するデータ収集は一段落している。そうした中で本年度においては、新たに遺伝要因の解析に供する臨床サンプルを収集するとともに、疫学調査で得られたデータから下肢静脈瘤の要因について詳細な解析および検討を行い、それらの結果に基づき、下肢静脈瘤の予防戦略の在り方を模索した。一連の活動を通して、本研究の目的の一つであった下肢静脈瘤の生活要因がより詳細に示された。これらの成果は、これまでの研究成果をさらに発展させる内容となっていることから、下肢静脈瘤の生活環境要因はより明確となり、予防戦略立案への道標を一つ得る事が出来た。また、スウェーデンのルンド大学との国際共同研究を通して、下肢静脈瘤と深部静脈血栓症との関りについても重要な示唆を得ることができた。この知見については、今後英文誌に成果を発表する予定である。以上の研究成果を基盤として、次年度の研究活動においては、本課題における研究成果の取りまとめを実施する予定である。本年度実施する予定であった研究内容について、スケジュール調整に支障があり、当初の予定を変更した部分があったが、研究遂行に影響はなかった。

また、当初の予定を超える成果が得られている部分と、当初の予定通りの解析の準備が整わない部分があった。しかし総合すると「おおむね順調に進展している」と考えられた。下肢静脈瘤は、下肢の表在静脈の拡張や弁不全によって静脈が拡張、屈曲蛇行したものである。一度生じると不可逆的であり、発症当初に症状がない場合でも徐々に進行して、下肢のむくみや重圧感、血管痛、かゆみ、こむら返りなどの下肢諸症状を生じる。下肢静脈瘤の疫学は、本邦における文献的情報に限りがあり、大規模な調査報告は皆無である。下肢静脈瘤は加齢とともに有病率が高まり、不快な症状を伴う事から、単独の疾患のみならず変形性膝関節炎などの整形外科疾患と重なることでさらに自覚症状が悪化する。超高齢化社会を迎えて健康寿命の延伸を政策目標に掲げる我が国において、高齢者における有病率が高い下肢静脈瘤の実態把握を行うことは極め重要である。こうした中で、本研究では、高齢化の進む島根県中山間地域で地域住民を対象とした持続的疫学調査基盤Shimane CoHRE Studyの一環として、下肢静脈瘤の実態把握と要因研究を行うことを試みた。下肢静脈瘤の疫学調査の実施にあたっては、静脈血の逆流を厳密に測定して診断することが可能なエコー検査を用いた。年齢、性別、既往歴、居住地などの基礎的項目と併せて下肢自覚症状や生活習慣、SF-8を用いた健康関連QOL調査を行い、下肢静脈瘤の罹患との関連を解析した。成果として、立ち仕事の中でも立位で動きの少ない立ち仕事が静脈瘤の罹患と関連することや、立ち仕事と肥満が重なることで下肢静脈瘤のリスクが高まることを解明した。また、生活習慣のうち、喫煙やアルコール摂取なども影響することが明らかとなり、臨床的な情報を加味して考えると、再発予防には患者への適切な生活指導が重要であることが示された。今後はさらに、社会疫学的観点から下肢静脈瘤の予防法について考案したい。臨床サンプルの収集を継続して行い、検体を集めた後に遺伝子解析を行う。収集し得た検体より抽出したDNA溶液をもとに、下肢静脈瘤に関連する遺伝子検索を行う。2012年度から収集した下肢静脈瘤に関する疫学データについて、これまでに構築したデータベースをもとに疫学的な解析を行い、下肢静脈瘤に寄与する要因の検索を行う。2017年度は、スウェーデンLund大学の共同研究者らと共にさらに下肢静脈瘤の要因検索を行うととも他の疾患との関わりを明らかにする予定である。次年度は、延長申請を行い最終年度となるため、当初の研究計画に基づいた研究の執行を行うとともに、変更部分についても当初の研究計画を全うするよう努める。遺伝要因の検索のための試薬費用は、2017年度に購入する予定である。H29年度における地域調査スケジュールの調整が難航したため、予定していた金額の執行は一部行わなかった。H30年度は、遺伝要因の解析のため、臨床サンプルの収集に引き続き行う必要がある。H29年度に地域調査に使用しなかった予算は今年度、遺伝要因の解析に用いる予定である。物品費:遺伝要因の検索に用いる試薬費用として用いる。旅費:2017年6月に共同研究者らの研究施設を訪問し、研究打ち合わせ会を行うための旅費として用いる。人件費・謝金:データベースの構築に当たり研究補助業務が発生した場合に用いる。その他:英文校正などに用いる
1960年代の雑誌にみるニュージーランド女性の表象と意識変化

平成19年度は、資料分析及び18年度の調査を補足する形での資料収集を行った。1.調査:主にオークランド大学図書館において、18年度に収集し切れなかった雑誌/新聞記事・政府関連資料・女性史/社会史関連の論文の収集に当たった。また、日本国内では入手・検索が難しいオセアニア史関連のジャーナルを直接検索・論文収集を行い、研究対象時代である1960年代以降のニュージーランドにおける家族分析の動向を網羅することができた。2.資料整理・分析:TVが完全には普及していなかった1960年代のニュージーランドにおいて、女性雑誌は重要な視覚的メディアとして一般女性たちのネットワーク作りに寄与していた。夫婦間における家事に対する意識のずれについて考察した最近の研究では、70年代の女性解放運動を越えてもなお現代に至るまで特定の男女別役割意識が維持されていることが示唆されている。現代に連なる「女性のあり方」は、記事・広告・そして特に活発であった投書を通じて、女性雑誌という「コミュニティ」で60年代に構築された言説に端を発している部分が大きい。国土に拡散した人口、(当時から)女性編集者を中心とした誌面づくりといった特徴ゆえに、雑誌というメディアが生み出す女性同士のつながり即ち「コミュニティ」の影響力は日本の雑誌等と比べても大きかったことが伺われる。3.発表等:本研究の分析を踏まえ、津田塾大学英文学科研究会"都市・女性・モダニティ"(2007年6月)に招待された際、ニュージーランドの女性雑誌に見られるコミュニティ性についての発表を行った。また、同月、日本ニュージーランド学会シンポジウムのコメンテーターとして、雑誌等に見られる母性について紹介を行った。平成18年度は主として資料収集およびその整理を行った。1.調査:ニュージーランドではウェリントンの国立ターンブル図書館等において、本研究の主要資料であるNZ Woman's Weeklyのバックナンバーを始め、1960年代の女性・育児に関る団体の資料を収集した。日本国内では、女性・生活情報に特化した東京のお茶の水図書館での資料収集を2回にかけて行い、NZとの比較研究のため日本およびアメリカの代表的女性雑誌の資料を集めた。2.資料整理・分析:ニュージーランドにおいて「変わりゆく女性」の時代と称される1960年代には、家事・育児・夫婦関係・職業に対する女性の姿勢が確かに少しずつ変化しつつあったが、他方で幾度となく因習的な価値観への揺り返しが見られた。女性のいわゆる社会参加の動きにおいて、ベクトルは一方向だけを指していた訳ではなく、伝統的に求められる(社会そして女性自身の抱く)女性観と折り合いをつけることにより、変わりゆく女性像が徐々に定着していったと考えられる。ニュージーランド社会に特有なのは革新性ではなくむしろ伝統的意識とかち合わないような形で社会変化に対応しようとする実際性ではないかというのはこれまでの研究でも考えてきたことであるが、同時代の日本・アメリカの雑誌と比較すると更にその特質が顕著に現れてくる。平成19年度は更に精密な比較分析を進めると同時に、研究目的の一つに掲げている、ニュージーランド女性史における雑誌資料の中核的な位置づけの明確化を図りたい。3.発表等:平成18年度は、国内のニュージーランド研究者との意見交換は数度行うことが出来たが、改まった発表の機会はなかった。19年度は国内学会においてこれまでの分析結果についての発表を行う予定である。
障害乳幼児に関わる専門職の多職種連携・協働（IPW）に関する実証的研究

本研究の目的は、障害乳幼児を支える専門職(保育士・保健師・言語聴覚士・医師等)による多職種連携・協働(IPW)の実態を明らかにし、特別な保育・教育的ニーズが考えられる乳幼児の包括的支援に向けた連携支援体制のモデルを構築することである。上記の目的を達成するために、平成30年度は、特に研究計画書に記した「保育所・幼稚園から小学校への移行支援のモデルの構築」を進めるために、大学の位置する埼玉県朝霞市と、研究代表者が関わる埼玉県羽生市の保育所、幼稚園と協働しながら、関係者へのヒアリング調査を実施した。研究代表者は埼玉県の特別支援教育巡回支援員として、県内の幼稚園・保育所等の巡回支援に携わっているが、関係する保育園の園長へのヒアリングでは、特に小学校への就学に際して、適切な判断に基づく移行支援が進めにくい状況にあることなどが示唆された。具体的には、地域によって就学支援委員会の位置づけが形骸化している点、就学先の判断を下す際に、医師の診断基準のみに偏りがちで、当該児童の状態や保護者の意向が反映しにくい点、さらには幼稚園・保育所と小学校との連携が、個人情報保護の観点などから、形式的な連携に限定されがちな点などが挙げられた。他方、教育委員会等の行政関係者からは、公務員という性質から、地域によって1年2年程度で職場が異動となり、継続的な連携体制が組織化しにくい点、一人担当の地域が多く、一人で数多くの業務を担わなければならないことから、特別なニーズのある子どものことだけに限定して対応できない点などが挙げられた。ヒアリング調査からは、就学支援委員会などの既存の組織の質的充実を図ることや、要録などの文書のやり取りだけではない、face to faceの連携の必要性、さらには行政と民間とが、組織としての垣根を越えて連携する意識の向上を図る必要性などが示唆された。上記の目的を達成するために、平成28年度は埼玉県、千葉県、神奈川県、東京都を中心とする保育所、幼稚園、認定こども園に対するアンケート調査を実施した。現在、1,229園からデータを回収しており、今後分析を進めながら、首都圏近郊における障害乳幼児の多職種連携・協働の実態を明らかにしていく予定である。また、「国内外の先進地域のヒアリング調査」に関しては、保幼小連携で一定の成果を上げている山形県の保育所等を視察し、東北地域における移行支援の現状や課題について聞き取り調査を行った。他方、国外の調査に関しては、ノーマライゼーションの発祥地でもあるデンマーク王国の保育所、幼稚園、障害児保育所、移行先である小学校(特別支援学級を含む)、特別支援学校の視察を行った。デンマークでは1981年に障害のある子どもの就学義務が法律として認められ、全ての子どもに教育を補償する制度が確立されている。視察では、障害のある子どもを育ててきた保護者へのヒアリングを実施したが、地域の行政改革により、障害の程度が重度な子どもに比べ、軽度な障害のある子ども(学習障害、ADHD等)の支援が不十分な状況になっているとのことである。就学前の多職種連携・協働に関しては、障害が認定されると同時に、在住地域のソーシャルワーカーが指名され、手厚い支援が展開されていくという情報提供があった。今後は、アンケート調査の結果も踏まえながら、障害乳幼児の多職種連携・協働(IPW)のキーステーションとして考えられる児童発達支援センター(各市に1ヶ所設置)にアンケートをかけていく予定である。研究計画に示した「乳幼児期段階における専門職の多職種連携・協働(IPW)に関する実態調査」と「幼稚園・保育所等と小学校との縦軸(移行)連携に関する実態調査」は、両調査の内容を一部組み合わせて、首都圏近郊の保育所・幼稚園を対象にアンケート調査を実施した(配布総数3,085件、アンケート回収数1,229件、回収率39.8%)。今後、データ入力と統計分析を進めながら、幼保小連携の実態や障害幼児が小学校に移行する際の課題及び対策等について解明していく予定である。「先進地域の視察」に関しては、国内1箇所(山形県)、国外1ヶ所(デンマーク王国)の視察を行った。国内視察に関しては、保育所でのヒアリングを行ったが、就学先の小学校との連携に関しては、時間的な制約があり、十分な連携が取りにくいことなどが課題として明らかとなった。また、国外視察(デンマーク王国)に関しては、特に、生後、障害が認定されるとすぐに地域のソーシャルワーカー(SW)が指名され、そのSWが家族支援のキーパーソンとなり、種々のサービスを立案、調整していくことや、学校教育段階においてはペタゴー(生活支援員)という専門職が、授業のサポートを行ったり教材の作成や準備にも携わったりするなど、有機的に子どもの支援に関わっていくことなどの知見が得られた。デンマークは高福祉のシステムが確立しており(税金を43%納めるなど)、教育や福祉、介護の領域を国が全てカバーする仕組みとなっている。日本の学校教育制度や福祉システムなどとの相違もあるため、単純な比較はできないが、応用可能なシステムも散見され、今後のIPWモデルの構築に向けた研究に生かしていきたいと考える。なお、「保育・教育現場における多職種連携・協働(IPW)モデルの構築」に関しては、研究代表者・研究分担者が関わる埼玉県朝霞市と羽生市を中心に取り組んでいくための準備を進めている段階にある。

上記が主な判断理由である。本研究の目的は、障害乳幼児を支える専門職(保健師・保育士・言語聴覚士・医師等)の多職種連携・協働(IPW)の実態を明らかにし、特別なニーズのある乳幼児の包括的支援に向けた連携支援体制のモデルを構築することであった。平成29年度は、前年度(平成28年度)に実施した首都圏近郊の幼稚園・保育所を対象としたアンケート調査(3,085件発送)の内容を詳細に分析することを試みた。また、その成果の一部を学部紀要(ライフデザイン学研究13号)としてまとめた。主な分析結果は、以下の通りである。(1)特別なニーズのある子どもの在園状況は、医学診断のある子どもを含めて極めて高い割合であった。(2)医学診断を受けている子どもでは、自閉症スペクトラム障害(ASD)の診断を受けている子どもの割合が高かった(約3割)。(3)各園での特別なニーズのある子どもに対する支援方法に関しては、専門機関との連携を深めたり、対象児に対するきめ細かな配慮を実施したり、園全体で保育(指導)体制を工夫したりするなどして、実際の支援にあたっている状況がうかがえた。(4)他機関との連携(IPW)では、「児童発達支援センター」や「保健センター(保健所)」と連携している割合の高いことが示された。(5)個別の保育(指導)計画の作成は、保育園において作成している割合が有意に高く(62.5%対33.6%)、特別支援教育コーディネーターの指名は、幼稚園で指名している割合が有意に高かった(41.4%対10.1%)。(6)就学前機関と小学校との接続連携に関しては、移行先との情報共有の必要性や就学支援委員会のあり方に関する多様な意見が示された。最終年度(平成30年度)は、アンケート調査の結果を受けて、当初から実施予定であった「児童発達支援センター」の一部機関にアンケート調査を試みながら、同時に、ヒアリングによる現状調査を進めていく予定である。研究計画に示した「障害乳幼児に関わる専門職の多職種連携・協働(IPW)の実態調査」に関しては、首都圏の幼稚園・保育所等の実態調査により、多くの課題(乳幼児期における気になる子どもの割合の高さ、保幼小連携の地域差、人的なつながりの希薄さなど)があることが示された。また、昨年の3月に実施したデンマークの現地調査では、地域における障害乳幼児の有機的な連携システムの実際を垣間見ることができた。なお、この調査の詳細については、大学の学部紀要(ライフデザイン学研究第13号)に研究ノートとして掲載し、今後、WEB公開を進める予定である。平成29年度から実施予定であった「幼保小連携に関するアクション・リサーチを展開する」に関しては、研究代表者が関係する埼玉県羽生市の「いずみ保育園」において、まずは研究代表者が、定期的に保育園を訪問し、外部の相談支援員として、気になる子どもに関して、保育士の相談に乗ったりしてきた(年間で7回程度)。また、発達障害(自閉症スペクトラム症)の診断を受けている卒園児の小学校に出向き、小学校への移行支援の実情等の聞き取り調査を実施した。特に埼玉県北部地区では、保護者の意識も様々で、市内の就学委員会の判断が、子どもの進路先の決定に大きく影響を及ぼしているなどの課題が明らかとなっている。上記に示したことが、主な判断の理由である。
中国系ニューカマー第二世代の学業達成に関する集団内比較研究

本研究の目的は、日本社会で育つ中国系移民第二世代の学業達成プロセスを「集団内比較」の視点から検討することである。高い学業達成を遂げる集団として特徴づけられてきた中国系移民集団の「成功」の背景には、しばしば「漢字圏」という言語的側面が盛んに注目されてきた。しかし親世代の渡日経緯は多様化の一途をたどり、中国系移民家族には階層的地位の多様化が顕著に進んでいる。そこで本研究では、既存研究が十分に注目してこなかった同一エスニック集団内を比較する視点に立ちながら、家族の教育戦略やトランスナショナリズム、さらに「成功」への意味付与の分析を通して多様化が進む中国系移民第二世代の学業達成を比較考察する。
真空放電管演示実験時の授業者・生徒のX線被ばく量の測定及び防護方法の確立

学習指導要領改定により中学校理科で真空放電管(クルックス管)の高圧放電実験が扱われることとなった。クルックス管は通電時、低レベルX線を放出することが知られているが、このX線の測定はほとんど行われていない。このため、実験を取りやめたり、逆に、X線が低レベルであるという認識から防護の必要性が認識されていなかったりと、対応がまちまちである。本研究では、クルックス管の漏洩放射線量の測定方法を開発し、本中学校に設置されている装置の漏洩線量の測定と、安全な実施方法の開発(離隔距離、演示時間、遮蔽)を行った。さらに、生徒及び学生実験の放射線防護基準の確立のための基礎資料を提供することを目的として、近隣中学校に設置されるクルックス管の漏洩線量を測定し、測定方法と安全な実験方法についての一般化を試みた。まず、Ge半導体放射線検出器によって漏洩放射線のスペクトル分布を明らかにしようとしたが、電源及びクルックス管の特性が不安定であることと、低レベルであったことから望ましいデータは得られなかった。次に、イメージングプレート(IP)を用いて、クルックス管の漏えい放射線量と放射線の空間分布状況を測定し、傾向を捉えた。この上で、個人線量計をクルックス管表面と周辺空間に配置することで、漏洩線量の測定に成功し、簡易な測定方法を確立した。計測した5つの中学校で、全測点(推定発生源から212cm程度)の平均値は、0.04mSv/分程度であったが、2つの中学校の装置至近(推定発生源から38cm程度)では強い放射線、約0.7mSv/分(5分間の演示実験では約3.5mSvとなる)を観測する点がそれぞれ1か所あった。この5分間値は、約70cmの離隔を取ったとして、胸部X線集団検診1回分(0.05mSv)程度となる可能性のある強度で、実験者には放射線の空間分布特性の理解と個別装置の漏洩線量の理解及び防護の対策が望まれる状況であるといえ、本研究成果の活用が望まれる。また、アクリル板による防護のある程度の効果を確認した。
革新的サンプル採取・分析法による大山山麓縄文時代の人間活動と環境変化の解明

計画通り、鳥取県西伯郡大山町岩伏し遺跡で2018年9月に発掘調査を実施した。発掘調査の成果として、第8トレンチの南側を中心とする焼土遺構の状況がある程度判明してきた。赤褐色化した黒ボク層は炭化した木片を含むこと、ブロック状ないし層状の明赤褐色土を伴うことから、かなりの規模の燃焼によって焼土が形成されたと見られる。現状で復元される遺構の大きさは住居跡とみてもよさそうであるが、床面がほとんど明らかになっていないため可能性に留まる。火が焚かれたと思しき地点も確認されておらず、遺構の性格については来年度以降の調査で検討する必要がある。赤褐色化した黒ボク層より、後期末から晩期にかけてのものと見られる黒色磨研土器が出土したことから、遺構の時期についての手がかりが得られたことは重要な成果である。この時期の黒色磨研土器はこの地域では稀であり、地域間交流についても貴重な手がかりとなる。それに先行する凹線文系土器と判断した土器は、いずれも小片である上に作りが粗く、同定が正しいかどうかは引き続き検討する必要があるが、この同定が正しいとすれば、後期後葉から晩期にかけて継続的な活動があったことを示す。発掘調査と並行して、遺構検出地点を中心に10mメッシュを組んで合計12本のボーリングサンプルを採取した。層相観察の結果、下位から砂礫層、ローム、漸移層、黒ボクという一連の層相変化が認められた。12本中3本は、砂礫層、ロームからいきなり「造成土と考えられる乱れた状態の黒ボク」に変わることから、分割の対象から除き、残りのサンプルを層相によって51cmで分割し、更に植物珪酸体、花粉、微粒炭(予備)用に分割した。トレンチ壁面から採取したサンプルについて植物珪酸体分析を実施し、漸移層から黒ボク形成期にかけて草原環境が形成・維持されており、人間による植生干渉があった可能性があることが分かった。当初の計画通りに発掘調査と土壌サンプル採取を実施した。調査期間中に台風や秋雨により作業不能となることが多かったこと、予想以上に遺物が出土したことから、発掘調査の進捗は予定より遅れたが、一定の成果を上げることができた。2019年度も予定通り発掘調査と体系的な土壌サンプリングを実施するとともに、土壌サンプルを分割して、花粉分析、微粒炭分析、植物珪酸体分析を進める。また、発掘調査で採取した炭化物の放射性炭素年代測定も実施する。植物珪酸体分析経費が予定より若干安かったために生じたものである。小額であり、次年度経費の一部として使用する。
未熟児低酸素性虚血性脳障害におけるミクログリアの生理機能の解明

モノアシルグリセロールリパーゼ(MAGL)は脳発達期の回路形成に関わることが知られていたが、脳内炎症時の機能は不明な点が多い。我々は虚血ストレスを与えた発達期の脳組織でMAGLの転写発現が抑制され、LPS刺激によってミクログリアにおける転写発現が抑制されると同時にプロテアソームによる分解から免れて安定化することを見出した。定常状態のMAGLはStat6によって発現が制御されるが、MAGLは酸素濃度によらずLPSで活性化される転写因子NFκBによるIL-6等のサイトカインの誘導には必須ではないことが示された。またMAGLはミクログリアのFcγレセプターを介した貪食能を亢進することを見出した。モノアシルグリセロール分解酵素の一つモノアシルグリセロールリパーゼ(MAGL)は、脳における主要なアラキドン酸(AA)等の産生酵素である。MAGLノックアウトマウスにLPSを投与した場合やAPPモデルマウスにおいてMAGL阻害剤を投与した場合にプロスタグランジン類の産生が組織レベルで抑制され、炎症を誘導しないことが示されていたが、グリア細胞におけるMAGLの機能は不明な点が多い。昨年度はラット低酸素性虚血性脳症(PVL)動物モデルにおいてLPS及び低酸素処理によりMAGLの発現が転写レベルで低下し、上記モデルを模した初代培養ミクログリアでもLPS及び低酸素処理により同様な変化が認められることを報告した。しかしながら、蛋白質レベルでは通常酸素濃度においてLPSによる発現の増加が見られた。この点についてMAGL安定発現BV-2細胞株を作製し、MAGLの発現機構を検討した結果、LPS処理によりMAGLは蛋白質レベルで安定化が見られ、MAGLはミクログリアにおいて炎症時に転写抑制が起こるがプロテアソームによる分解から免れることが示唆された。アストロサイト及びミクログリアにおいてMAGLの機能を阻害した場合に通常酸素濃度及び低酸素条件でLPS処理を施したが、IL6、TNFα等の炎症性サイトカインの発現誘導はコントロールと比較して差が見られなかった。またMAGLノックダウンミクログリア細胞では突起数が減少し、細胞形態が変化すると共にFcγレセプターを介した貪食能が低下した。以上の結果よりミクログリア内在性のMAGLは貪食能を促進するが、LPS依存的な炎症性サイトカインの誘導には関与しないことが示された。モノアシルグリセロール分解酵素であるモノアシルグリセロールリパーゼ(MAGL)は、アラキドン酸(AA)等の遊離脂肪酸の産生酵素である。全身性のMAGLノックアウトマウスを用いた実験から、LPS投与によるプロスタグランジン類や炎症性サイトカインの産生が組織レベルで抑制されることが報告されているが、ミクログリアにおけるMAGLの機能は明らかにされていなかった。我々はLPS投与後に右頸動脈結紮術及び低酸素負荷(H/I処理)を施したラット低酸素性虚血性脳症(PVL)動物モデルにおいて、LPS及び低酸素処理によりMAGLの発現が転写レベルで低下することを見出した。上記モデルを模した初代培養系ミクログリアでもLPS及び低酸素処理により同様な変化が認められる。レンチウィルス発現系によりMAGLをノックダウン(KD)した初代培養ミクログリアに通常酸素濃度及び低酸素濃度(1% O2)下でLPS処理を施したところ、IL6、TNFα等の炎症性サイトカインの発現誘導はコントロール細胞と比較して差が見られなかった。またMAGL特異的阻害剤JZL-184を用いた場合も同様な結果が得られた。しかしMAGLKD細胞では突起数が減少し、細胞形態が変化するとともにFcγレセプターを介した貪食能が低下した。内在性MAGLを発現しない株化ミクログリアBV-2細胞にFLAG-MAGLを一過性に発現させると、低酸素及びLPS処理によらずFcγレセプター依存的な貪食能の亢進が見られた。即ちミクログリア内在性のMAGLは貪食能を促進するが、LPS依存的な炎症性サイトカインの誘導には影響を及ぼさないことが示された。ミクログリアにおいてモノアシルグリセロールリパーゼ(MAGL)はLPS依存的に転写が抑制されるが、プロテアソームによる分解から免れて安定化する。MAGLの発現制御を担う転写因子を明らかにする目的で種々の特異的阻害剤で処理した結果、Stat6がMAGLの転写調節を担っていることを明らかにした。更にStat6阻害剤AS1517499で処理した場合はLPS依存的なIL6及びTNFαの転写誘導の亢進が見られた。NFκB/IκB阻害剤

BAY11-7082で処理した場合には、LPSによるMAGLの転写抑制からの部分的な回復が見られたことから、定常状態下のStat6依存的なMAGLの転写因子複合体は、LPSで活性化するNF-κB複合体の一部の因子を共有することが示唆された。またミクログリアにおいてMAGLをsiRNAにより発現阻害した場合や内在性MAGLを有しないBV2細胞にMAGLを発現させた場合にコントロールと比較して炎症性サイトカインの発現誘導に影響が見られなかった。即ちLPS依存的なミクログリア自律的な炎症性サイトカインの産生にはMAGLが必須ではないことが示された。またミクログリア由来のABHD12(α/βhydrolase-domain containing 12)の発現はBV2細胞のCSF1依存的な増殖活性を負に制御し、その発現阻害もまた血清依存的な増殖を阻害した。更に初代培養ミクログリアの単離培養系においてABHD12の発現を阻害すると細胞死が誘導された。炎症条件下におけるABHD12の機能を調べるために、虚血状態でのミクログリアの活性化状態を模倣するlipotichoic acid(LTA)でBV2細胞を処理し、ABHD12の機能を阻害した時の細胞増殖に対する抑圧ストレスに関わる種々の分子やシグナル経路について解析を行った。細胞生物学、生化学、病理学昨年度前半はMAGLの生理機能を中心に解析を行ってきたが、今回はもう一つのモノアシルグリセロール分解酵素ABHD12(abhydrolase domain containing protein 12)のPVLとの関連性について調べている。ミクログリアに多く局在するABHD12はPHARCと呼ばれる神経変性疾患の原因遺伝子であるが、ノックアウトマウスを用いた解析によりphosphatidylserine(PS)及びlysophosphatidylserine(LPS)の分解に関与することが昨年報告された。ミクログリアを単離培養してレンチウィルス発現系によりABHD12をノックダウンすると細胞死が誘導されることから細胞自律的な生存シグナルにABHD12が関与している可能性が考えられた。またFLAG-ABHD12をBV2ミクログリア細胞株に発現させるとCSF1(colony stimulating factor1)依存的な細胞増殖が抑制された。PSはAkt等を介した細胞増殖に重要であることが最近示されており、ABHD12がCSF1の機能に関わることを示す。またCSF1レセプター(CSF1R)はミクログリアに発現するが、遺伝性白質脳症(HDLS)の原因遺伝子であることが最近報告され、CSF1Rがオリゴデンドロサイトの分化や生存維持に重要であることが推察される。CSF1シグナルによりlipoteichoic acid(LTA)存在下或いは低酸素処理によりABHD12の局在や機能がどのように変化し、またオリゴデンドロサイトとの共培養によりどのような効果が生じるかについて現在解析を行っている。単離したミクログリアをLPS処理後、低酸素条件で培養した場合にMAGLの発現低下が認められたが、蛋白質レベルでは通常酸素濃度においてLPS処理による発現の増加が見られた。
リスク評価とリスク管理にかんする比較経済分析

本研究の研究目的は、リスク評価とリスク管理に関する問題を比較経済分析の立場から理論的かつ実証的に解明することである。とりわけ、リスクに直面する人間行動と社会風土の組み合い、およびリスク、マネジメントにおける情報入手の問題などが、本研究の中心課題であった。平成9年度では、本研究の総仕上げとして、上記の研究を完成させ、研究成果を内外の学会で発表するとともに、内外の学術雑誌に発表した。本研究は、リスク評価とリスク管理の理論と実際のあり方に関して、比較経済学的な分析を行うことを目的としている。本研究がカバーする期間は、平成7年度9年度の3年間である。本年度は、第2年次にあたるので、前年度の研究成果を踏まえて、一層の理論的展開と実証的研究を行うように努めた。その上、リスク評価・管理に及ぼす国民文化的要素のインパクトを積極的に考慮した。より具体的には、筑波大学で毎週一回ワークショップを開いたほか、Society for Risk Aralysis(ハワイ)、生活経済学会(立正大学)など内外の学会で研究報告を行った。また、研究成果は、多くの学術署や学術論文の形で公表することができた。次年度には、本研究を完成させたいと思っている。本研究の目的は、リスク評価とリスク管理の理論と実際のあり方に関して、比較経済学的な分析を行うことである。本研究の研究期間は、平成7年度9年度の3年間である。さらに、リスク評価、管理に及ぼす国民文化的要素のインパクトを積極的に考慮した。より具体的には、筑波大学で毎週一回ワークショップを開いたほか、生活経済学会(高千穂商科大学)、日本リスク研究学会(住友海上保険株式会社)など内外の学会で研究報告を行った。また、研究成果は、多くの学術書や学術論文の形で公表することができた。来年度は最終年度にあたるので本研究を完成させたいと思っている。本研究の目的は,リスク評価とリスク管理にかんする問題を,比較経済分析の立場から理論的かつ実証的に解明することである。特に問題となるのは,リスクに直面する人間行動と社会風土の絡み合い,およびリスク・マネジメントにおける情報入手の役割である。平成9年度においては,上記の問題にかんして幾多の著書と研究論文を公表することができた。
傾角熱反射法に基づくSi/NiFe/AlN機能性薄膜の熱的3次元構造測定装置の開発

下記に示す光学系の変更および改良を行い、試作したポンプープローブ型熱反射信号測定装置のS/Nを改善した。1.偏向および入射角度に対する反射率の検討を行い、加熱用パルスレーザーとしてp偏光、計測用パルスレーザーとしてs偏光を用い、それぞれの入射角度を35°と15°とした。2.ビームエキスパンダーを通常と逆に用いて加熱用パルスレーザーの直径を小さくしてAOMに導入し、AOMにおける回折によって生じるレーザー中の強度変調の位相差を小さくした。3.チタンサファイアレーザーの微小出力変動の影響を除去するため、試料照射前の計測用パルスレーザーの一部をフォトディテクターで電圧値として捕らえ、計測用パルスレーザーの反射光強度変化をこの電圧値で規格化して出力変動補正した熱反射信号を得た。以上のような改善により下記の結論を得た。1.開発した装置で測定した熱反射信号は薄膜の熱拡散率を求めるのに十分な精度を持っており、バルクの測定結果と比較しても、フェムト秒パルスレーザー・熱反射法は薄膜の膜厚方向の熱移動現象を定量的に評価する有効な手段である。2.開発した装置はパルス加熱面の温度変化を計測する手法を用いているため、基板が不透明な実用薄膜の熱移動現象を測定することが容易である。3.開発した装置で用いているレーザーが超短光パルスレーザーであるため、パルス加熱直後の極短時間領域における物質中の電子やフォノン散乱に起因する熱移動現象を測定することができる。4.XPS測定や分光エリプソメーターによる構造解析により、各試料表面には酸化物が存在することを確認したが、これらの酸化物は本測定結果に影響を及ぼすことはないと考えられる。本年度は装置の試作および検出系の時間応答性の検討を中心に研究を行った。新規に設置したYAGレーザーを用いて固体表面を瞬間的に加熱し、その後熱エネルギーが固体内へ拡散する速さから物質の熱拡散率を求める装置を試作した。試料表面の温度変化を赤外線検出器により非接触に計測し、試料表面の温度の減衰の速さから固体の熱拡散率を導出することに成功した。また、赤外線検出器の時間応答性を新規に導入したプログラマブルフィルター、シンセイサイザー、オシロスコープ等を用いて詳細に検討し、70KHz程度の時間応答性があることが明らかとなった。以上のように試料表面での温度計測および熱物性の導出法をほぼ確立することができた。薄膜の測定では、固体の表面の計測の場合と同様に試料の表面での温度の減衰を測定するが、さらに速い時間分解能が要求されるので、フェムト秒パルスレーザーを用いたポンプ・プローブ法により検討を行った。この手法で必要とされる光学遅延回路等必要な設備を試作が終了した。また、基板上に作成されたアルミニウム薄膜を測定例として、エリプソメータにより薄膜表面の光学定数を測定し、測定用レーザー光および計測用レーザー光の最適入射角度を理論的に検討した。以上の検討を踏まえて、測定系の最適化を行い、ポンブ・プローブ法による薄膜表面の温度応答がピコ秒の時間分解能で行える装置の試作を終了することができた。今後は、測定データのレーザー光入射角度依存性をさらに検討するとともに、固体表面の温度応答の解析方法の検討を推進する今年度は下記に示す光学系の変更および改良を行い、試作したポンプープローブ型熱反射信号測定装置のS/Nを改善した。1.偏光および入射角度に対する反射率の検討を行い、加熱用パルスレーザーとしてp偏光、計測用パルスレーザーとしてs偏光を用い、それぞれの入射角度を35°と15°とした。2.ビームエキスパンダーを通常と逆に用いて加熱用パスルレーザーの直径を小さくしてAOMに導入し、AOMにおける回折によって生じるレーザー中の強度変調の位相差を小さくした。

3.チタンサファイアレーザーの微小出力変動の影響を除去するため、試料照射前の計測用パルスレーザーの一部をフォトディテクターで電圧値として捕らえ、計測用パルスレーザーの反射光度変化をこの電圧値で規格化して出力変動補正した熱反射信号を得た。以上のような改善により下記の結論を得た。1.開発した装置で測定した熱反射信号は薄膜の熱拡散率を求めるのに十分な精度を持っており、バルクの測定結果と比較しても、フェムト秒パルスレーザー・熱反射法は薄膜の膜厚方向の熱移動現象を定量的に評価する有効な手段である。2.開発した装置はパルス加熱面の温度変化を計測する手法を用いているため、基板が不透明な実用薄膜の熱移動現象を測定することが容易である。3.開発した装置で用いているレーザーが超短光パルスレーザーであるため、パルス加熱直後の極短時間領域における物質中の電子やフォノン散乱に起因する熱移動現象を測定することができる。4.XPS測定や分光エリプソメーターによる構造解析により、各試料表面には酸化物が存在することを確認したが、これらの酸化物は本測定結果に影響を及ぼすことはないと考えられる。
クロマチン構造変換に導く核内受容体関連蛋白質の構造基盤

環境変化に応答する遺伝子発現制御機構の最上流に位置する核内受容体について、真核生物のクロマチンの基本構成単位であるヌクレオソームとの相互作用の構造基盤を得ることを目的として研究を行った。その結果、ヌクレオソームが強い障壁として働き、核内受容体の標的配列への特異的な結合が妨げられることが判明した。この事実は、核内受容体と応答配列の結合には、クロマチンリモデリングが必須であることを示唆している。本年度は核内受容体の発現精製系を確立することに集中した。糖尿病等、生活習慣病に最も重要なPPARγ/RXRα複合体については、安定な複合体を精製することに成功した。また、これまで機能不明であるAF1領域の欠失変異体で構成された複合体も取得でき、全長分子との差異を解析する準備が整った。また、RARα/RXRα複合体は、大腸菌を用いた発現系の確立に成功し、精製系も確立しつつある。しかし、まだ安定な複合体の取得には至っていない。次に、非常に強いヌクレオソームポジショニング配列をもつ601配列を基に、核内受容体応答配列をヌクレオソーム構造から見て望む位置に組み込み、核内受容体とヌクレオソームの結合を解析した。まず、応答配列を適切な位置に組み込んだ数種類のDNAを構築した。これらのDNAを用いて、ヌクレオソームを再構成し、それに対するPPARγ/RXRαの結合実験を行った。その結果、PPARγ/RXRαは、応答配列がヒストンに結合しないリンカーDNA領域に存在する場合に、相対的に強く結合する事がわかった。ヒストンと相互作用したヌクレオソーム部分の応答配列に対しては、PPARγ/RXRαは有意に弱く結合する事実が判明した。さらに、ヌクレオソーム立体構造におけるPPARγ/RXRαの結合位置の選択性を明らかにするために、応答配列のヌクレオソーム上の位置を様々に変えたヌクレオソームとPPARγ/RXRαの親和性を調べた。その結果、親和性は応答配列がヌクレオソーム内部に存在するものほど弱くなることがわかった。加えて、最も強い結合を示したヌクレオソーム上の応答配列でさえ、10-100μMレベルの解離定数であったために、これ以上の詳細な解析は不可能であった。一方、これらの相互作用はリガンドの有無、リガンドの種類、転写共役因子ペプチドの有無、核内受容体AF-1領域の有無などでほとんど変化しなかった。このように、今後当該研究の最終目標、ヌクレオソームと核内受容体の構造解析に向けて有益な知見が得られた。本年度も昨年度に引き続き、核内受容体の一つであるRARα/RXRαについて、全長受容体と応答配列(DR1, DR5)を含むDNA断片、リガンド(9-cis retinoic acid)からなる複合体を作成し、結晶化スクリーニングを行った。様々な長さと末端の形状を持つDNA断片を使用し、数多くの条件でスクリーニングを試みた。しかし、複合体が不安定なためか、結晶化ドロップの気液界面でタンパク質が変性して膜を形成してしまう問題に直面し、結局、複合体の結晶を得ることには成功しなかった。また、RARα/RXRαのDNA結合ドメインと、応答配列(DR5)を含むDNA断片についても結晶化を試みた。こちらについては幾つかの条件で結晶を得ることができ、大型放射光施設SPring8にて回折実験を行った。結晶の一つについて2Åを切る高分解能の測定データを得たが、解析の結果、インタクトな複合体ではなくDNAが分解してできた不完全な複合体であることが判明し、以降の解析を断念した。また、ERαやNRF1、GRなどのコアクティベーターであることが報告されているPGC1-βについて、ヌクレオソームとの特異的な相互作用を調べるため、大腸菌による発現系を構築し、予想される結合部位を含むフラグメントを精製した。試験管内再構成したヌクレオソームとの相互作用をゲルシフト法により検討したが、アフィニティが低いためか両者の結合を確認することはできなかった。本年度は、まず大腸菌によるRARα/RXRαの発現精製系の確立を行った。コールドショックベクターを用いて低温下で発現誘導を行うことにより、十分量のRARαとRXRαを得ることができた。次に、任意の位置に応答配列を挿入したDNA断片を用いてヌクレオソームを再構成し、RARα/RXRαとの相互作用をゲルシフトによって調べた。その結果、応答配列以外への非特異的な相互作用が顕著にみられ、相互作用の特異性が不十分なことが示唆された。ヌクレオソーム上での応答配列の位置を変えて実験を行ったが、結果は同様であった。以上の結果から、ヌクレオソームとRARα/RXRαについて構造解析に適した安定な複合体を得ることは困難であると判断した。そこで研究計画を変更し、ヌクレオソームではなく、短いDNA断片を用いて複合体を作製し、構造解析を行うことにした。

RARα/RXRαと応答配列を含むDNA断片、リガンド、コアクティベーター由来のペプチドを試験管内で混合し、ゲル濾過カラムで精製を行うことにより、安定な複合体を取得することに成功した。得られた複合体を用いて結晶化スクリーニングを行ったが、これまでのところ結晶は得られていない。今後はDNA断片の長さや末端の塩基を変えて、スクリーニング実験を続行する予定である。並行して、DNA結合ドメインと応答配列(DR5)との複合体の結晶化も行った。こちらについては、複数の条件下で結晶が得られ、大型放射光施設SPring8において回折実験を行った。しかし、いずれの結晶においても十分な分解能が得られず、これまで構造決定には至っていない。今後は分解能の向上を目指して、引き続きスクリーニングを行う予定である。PPARγ/RXRαとヌクレオソームの相互作用は初めに予想したほど強くなかったため、より強く結合する解析に適した条件を探索する事が必要となった。さらに、結合が弱いため、フットプリント解析によるヌクレオソーム構造上の核内受容体結合位置の同定や細胞内における核内受容体応答配列のヌクレオソームポジショニングの解析など詳細な実験を進めることができなかった。25年度が最終年度であるため、記入しない。PPARγ/RXRα, RARα/RXRαのいずれも、ヌクレオソームとの安定な複合体を取得することが困難であり、研究計画の変更を余儀なくされた。今後はヌクレオソームと強い結合がみられないPPARγ/RXRαにこだわらず、RARα/RXRαとヌクレオソームの結合実験にシフトしていく予定である。RARα/RXRαは、すでにヌクレオソーム上の応答配列に強く結合するという報告があり、この再現性を調べることを直近の目標とする。報告されたDNA配列は生体内のプロモーター配列である。もし、PPARγ/RXRαと同様に、601配列で作製したヌクレオソーム上の応答配列に対してRARα/RXRαが強く結合できないという結果となった場合、DNA配列に対応してなぜそのような変化が起こるのかを解析する必要がある。例えば、生体内プロモーター配列では、核内受容体の結合に伴って、ヌクレオソームスライディングが起こり、応答配列のヌクレオソーム上の位置が変化する可能性がある。それを確かめるために、DNaseフットプリント実験、MNase消化ポジショニング解析、さらにはヒストンとDNAのそれぞれに蛍光色素を導入し、核内受容体結合に応じて引き起こされるFRET変化からヌクレオソームスライディングを解析する方法も考慮に入れる。これまでに報告されている全長の核内受容体の結晶構造(PPARγ/RXRα. HNF-4α)、RXRαを含むDNA結合ドメインの結晶構造(PPARγ/RXRα, TRα/RXRα, RARα/RXRα)は例外なくPEG/NH4Cl/MgCl2の組み合わせで結晶化している。実際、現在行っているRARα/RXRαのDNA結合ドメインとDR5の複合体も同様の条件下で結晶化した。そこで、PEG/NH4Cl/MgCl2、PEGの分子量、pHを系統的に変化させて、グリッドスクリーニングを行う。また、蛋白質とDNA複合体の結晶化においては、DNAの長さと末端の塩基が最重要なパラメーターである。そこで、長さと末端の塩基が異なる様々なDNA断片を用いて結晶化を行う。また、全長のRARα/RXR
抗腫瘍活性化合物タキソ-ルの不斉全合成

1971年に西洋イチイの樹皮より単離されたタキソ-ルは米国国立癌研究所において強い抗腫瘍活性を示すことが見いだされ、抗癌剤としての利用が期待される微量天然有機化合物である。筆者はタキソ-ルの中心骨格である光学活性な炭素八員環をまず最初に構築した後に引き続きAおよびC環を導入する従来報告された合成法と全く異なる新しい合成戦略を考案し、この計画に基いてタキソ-ルの不斉全合成を達成することを目的として研究を行っている。本年度はこれまでに合成した炭素八員環状化合物を出発物質とし、ここからタキソ-ルの基本骨格を合成する手法の開発を目的として種々の検討を行った。その結果、タキソ-ルのBC環部、さらにABC環部骨格の効率的な構築法を明らかとすることができた。すなわち、上記八員環状化合物に対するγ-アルコキシビニル銅錯体のマイケル付加反応によりタキソ-ルのC環部位を八員環上に導入した後ケトアルデヒドへ導き、分子内アルドール反応によって立体選択的にタキソ-ルのBC環部位が構築できることを見い出した。また、A環部位の構築については以下の新しい導入法を考案した。すなわち、まず八員環状ケトンに対しホモアリル化剤を求核付加させて高立体選択的にタキソ-ルの1位にホモアリル基および三級水酸基を導入した。さらに、シリレン架橋体を活用しここで生じる三級水酸基にシリル保護基を高収率で導入する手法を確立することができた。引き続き二重結合部位のWacker型酸化を行った後、低原子価チタンを用いる分子内閉環反応によりタキソ-ルのABC環に相当する誘導体を効率的に合成することができた。今後この新規タキサン系化合物の炭素8位に対するメチル基の立体選択的導入および炭素13位の酸素官能基化を経てすでに筆者らの明らかにしている鍵合成中間体に導くことによりタキソ-ルの不斉全合成を完結する予定である。
遺伝子マーキングを用いた細胞運命追跡による血液細胞分化経路全体像の解明

申請者は、T細胞、B細胞、エリスロイド細胞それぞれの系列への分化途上にミエロイド系細胞の分化能が保持されるというモデル(ミエロイド基本型モデル)を提唱して来た。本研究では、このモデルの実証をさらに進めることを目的とした。ミエロイド-B前駆細胞の存在の検証については、胎生期の造血細胞においてはほぼ検証を完了し、論文作成注である。分化停止誘導培養系でミエロイド-Tという分化能をもつステージを固定した成果は報告することができた(Ikawa et al, Science, 2010)。フェイトマッピングで分化経路を追跡する実験に関しては、期間内に遺伝子マーキングに使える有用なマウス(Flt3-ER-Crマウス)の作製に成功しており、これを用いた予備実験の結果から極めて重要な知見が得られている。総合的には、計画以上の進展が得られたと考えている。本研究チームは、これまで独自の造血分化経路モデルを提唱し、検証してきた。本研究では、1)ミエロイド-B前駆細胞の存在を検証する、2)T細胞、B細胞、エリスロイド細胞へ向う分化途上で派生するミエロイド細胞がどのように分布するか、何らかの機能的違いがあるかをフェイトマッピングの手法を用いて解析する、という2点を目標とする。これらの研究により、造血の分化経路図を完成させることを目指す。まず1)であるが、21年度はまずマウス胎仔肝臓中のプレプロB前駆細胞(c-kit+IL-7R+B220-CD19-)、プロB細胞(c-kit+IL-7R+B220+CD19+)を精製分離し、その分化能を詳細に調べた。これらの細胞をNotchリガンドを強制発現させたストローマ細胞(Tst-4/DLL1細胞)とシングルセルレベルで共培養した結果、プロB細胞はB細胞にしかならなかったのに対し、プレプロB細胞はB細胞を生成しなかった。代わりに、T細胞ではなくマクロファージを生成した。これは、B細胞分化経路上においてミエロイド系分化能より早くT細胞分化能が停止されること、すなわちミエロイド-B前駆細胞が存在することを示している。2)については、ミエロイド、T、B各系列のごく初期の段階、すなわち、M-T-B、M-T、M-B各前駆細胞段階から特異的に発現するCreマウスを作製にとりかかった。すなわち、Flt3-Cre,PIR-Cre,IL-7R-Creのトランスジーンのコンストラクトを作製した。本研究では、1)ミエロイド-B前駆細胞ミエロイド-T前駆細胞などの存在を検証する、2)T細胞、B細胞、エリスロイド細胞へ向う分化途上で派生するミエロイド細胞がどのように分布するか、何らかの機能的違いがあるかをフェイトマッピングの手法を用いて解析する、という2点を目標とする。まず1)であるが、22年度は分化停止を誘導することによって分化段階を固定するという研究法を進めた。特にミエロイド-T前駆細胞についてデータが得られた。マウスの造血前駆細胞をノッチリガンドを固相化したディッシュの上でIL-7などのサイトカインの存在下に培養すると、ミエロイド-T前駆細胞という段階で分化停止して自己複製サイクルに入ることを見いだした。この分化停止/自己複製細胞は適切な環境に移すとミエロイド系細胞やT細胞を生成した。さらにBclllbという転写因子がミエロイド-T前駆細胞階から次のT前駆細胞階への決定に必須であることも明らかにした。ミエロイド-T前駆細胞という段階を単なる経過的な段階ではなく安定な分化段階であることを示した。2)については、ミエロイド、T、B各系列のごく初期の段階、すなわち、M-T-B、M-T、M-B各前駆細胞段階から特異的に発現するCreマウス(lt3-Cre,PIR-Cre,IL-7R-Cre)を作製を進めている。そのうちIL-7R-Creマウスのひとつのラインは作製が終了したので解析を進めたが、Cre-Loxの組み換え率があまりよくなかったので、別なラインの作製を進めている。本年度は、誘導的に特定の細胞分画のマーキングをすることができるコンストラクトを導入したマウスを作製することに成功した。Flt3は、ミエロイド-リンフォイド系前駆細胞に強く発現する表面分子である。この分子の発現に伴ってCreを発現するコンストラクトを作製し、Tgマウスを作製することはこの研究費の当初からの計画にあった。

ただ、その後のわれわれ自身の詳細な研究により、Flt3は造血幹細胞から分化する方向に進んだごく初期の多能前駆細胞の段階でも少量ではあるが発現することが判明し、Flt3-Creを使用するのはfate mappingには適さないと考えられた。そこで、Creの代わりにEr-Creを入れることを考えた。この系であれば、tamoxifenの投与量を調整することにより、Er-Creを高発現する細胞だけをマークできると考えたのである。23年度のうちに、作成に成功し、現在、lox-GFPマウスと交配中である。いくつか生まれたFlt3-ErCre-lox-GFPマウスを用いた予備的実験からは、リンフォイド系とミエロイド系はマークされるがエリスロイド系はマークされないという極めて興味深い結果が得られている。3年間の研究機関を終え、必ずしも当初の研究通りには進まなかった点はあるが、予備実験ながら最終的にはとても重要な知見を得られたと考えている。従って、このテーマの延長線上に、基盤(A)を申請している。