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単一企業都市における企業の盛衰と権力構造の変動に関する研究-チッソ(株)と水俣

本年度は、主として、地域リーダーとくに自治体機構の担い手の変遷と自治体における政策決定プロセスの二点について調査を行った。チッソ(株)は、企業規模の拡大に伴って自治体への直接的関与を強化していった。それが顕著になったのは、第1次世界大戦の好景気で一段と規模が拡大した直後の1925年からである。この年には、町会議員に工場長をはじめ7名(定員30名)が当選、加えて工場出身者が町長になるという進出ぶりであった。戦後も工場の復興・拡大に応じて、元水俣工場長が1950年から20年間の内1期を除き長期にわたり市長の座を占め、また、市議会でも1950年代から70年代前半まではチッソ関係者(現・元従業員、子会社従業員など)が多い時期には7割弱(1967年66.7%)、また現職者だけをみても23割(1963年33.3%)という大きな割合を占めていた。そして、そうした議会でのチッソのウエイトが低下するのは、企業規模の縮小の時期より一定のタイムラグがみられる。こうした直接的関与に加えて、市税構造におけるチッソのウェイトがさらに自治体への影響力を強め、その結果、企業よりの政策決定がなされることになる。1932年の町議会による工場用地買収費の贈与議決や、1956年の水俣湾の貿易港指定への市当局の奔走、1959年の港湾修築事業のチッソ分担金分の市による肩代り支出、チッソ再建のため1967年に再提出された工場誘致条例などその事例の一部として挙げられるが、さらに、水俣病事件関連の政策決定にもそうした姿勢は貫ぬかれており、結果的に、患者や漁民などのチッソによる被害者に対する救済を少なからず解怠させることになったのである。本年度は, (1)水俣市におけるチッソ株式会社(以下チッソと略)の経済的ウエイト, (2)水俣病事件で顕在化した地域権力構造,(3)住民の企業意識の3点について,主要には調査を行った.以下,それぞれの項目に対応させて,研究の実績を概括する.1.チッソの水俣市における経済的ウエイトを就業者数・製造品出荷額などからみると, 1960年代前半を境に低下してきているが,関連企業を含めて依然として,相対的には優越した地位を占めている.水利権や土地などの資源に関しても,所有の度合いは高い.2.水俣病事件では,チッソを頂点とする地域権力構造は,患者や漁民などの被害者に対して抑圧的に機能してきているが,この構造には,自治体機構はもとより地域の諸団体・組織のほとんどが包摂されている.チッソの排水による漁場破壊ゆえに利害が敵対していると思われる漁協までも,長年の排水補償を介して従属的関係を余儀なくされている.そうした状況のなかで,被害患者と支援者の自立した運動が台頭してきているが,未だ,従来の権力構造を動態化させるまでにはいたっていない.なみ目下,権力構造の変動を長期的に解明するために,一つの手がかりとして,チッソ設立以前まで遡って,自治体三役と議員の属性調査を進行中である.3.チッソの経済的ウエイトが低下してきているとはいえ,住民のチッソ運命共同体意識は依然として根強く,今後とも,チッソの経営拡大による地域経済の再生が少なからず望まれている.なお,この面の調査では,アンケートが予定通り実施できていないために,現時点までは主としてケーススタディーに依拠しており,今後さらに究明に力を入れていくことにしている.本年度は、主として、地域リーダーとくに自治体機構の担い手の変遷と自治体における政策決定プロセスの二点について調査を行った。
ＧＰＩアンカーの膜環境下における立体構造と相互作用の解明

生体での役割が未解明なGPIアンカー関連糖鎖やタンパク質の構造と機能に関する研究を分野複合的な手法を用いておこなった。GPIアンカー糖鎖の部分構造を化学合成にて調製し、その生合成、輸送に関与するタンパク質PGAP5との結合性を酵素活性を用いて評価し、その機能と機構に迫った。結核菌のGPI糖鎖類縁体PIMとヒト消化管タンパク質ZG16pとの複合体構造をNMRを用いて詳細に明らかにし、新しい粘膜免疫機構の可能性を示した。GPIアンカーは特徴的な糖鎖構造をもち、哺乳動物、酵母、菌類や病原性原虫類に広く存在するが、その機能はアンカーとしてタンパク質を繋ぎ止めておく役割以外いまだ不明である。申請者は、化学生物学的アプローチと構造生物学的アプローチを併せてGPIアンカーの立体構造を解明し未だ不明な機能にせまることを目的に研究を遂行した。2013年度は、GPIアンカー糖鎖の化学合成を継続して行い、四糖ならびにGPIアンカー糖鎖の糖鎖主骨格である五糖ユニットの合成を達成した。得られたGPI糖鎖の立体構造はその生理機能と深い関連があると予想しており、その主骨格の立体構造をNMRを用いて解析した。2012年度に引き続き、マンノース三糖とグルコサミンからなる四糖骨格の2箇所あるいは3箇所のマンノースのヒドロキシ基へエタノールアミンユニットを導入した。続いて脱保護をおこない、目的の四糖ユニットの合成を達成した。この合成を基盤として先の四糖にイノシトールを有する五糖ユニットを合成した。まずグルコースからFerrier反応を経て合成したイノシトール保護体に、グルコサミンを導入した。反応は立体選択性の完全な制御が困難であったが、2:1の選択性でα-体を優先的に得ることができた。ここで得られた二糖ユニットを受容体へと導いたのち、先に合成したトリマンノース供与体と縮合して、目的の五糖骨格を得た。得られた五糖骨格へエタノールアミンユニットの導入をおこない、続く脱保護を経て、目的の五糖ユニットの合成を達成した。合成したGPI糖鎖の立体構造をNOEを用いて解析した。選択励起パルスを用いた一次元のNOESY測定により、高感度かつ短時間でNOE相関シグナルのセットを取得した。その結果、特に非還元末端側のマンノースの回転が制限されて回転異性体が存在している可能性を示唆した。GPI-アンカーは特徴的な糖鎖構造をもち、哺乳動物、酵母、菌類や病原性原虫類に広く存在するが、その機能はアンカーとしてタンパク質を繋ぎ止めておく役割以外いまだ不明である。申請者は、GPI-アンカーの運動性を含めた膜表面上での立体構造がこの機能の鍵を握ると考えている。そこで、化学生物学的アプローチと構造生物学的アプローチを併せてGPI-アンカーの立体構造を解明し未だ不明な機能にせまることを目的に研究を遂行している。本年度は、GPIアンカー糖鎖の化学合成ならびにNMR測定に向けた条件検討をおこなった。1. GPIアンカー部分構造の合成GPIアンカーは、マンノース、グルコサミン、イノシトールとエタノールアミン構造からなる五糖を骨格とする。初年度はGPIの部分構造となるマンノース三糖、マンノース三糖+グルコサミン四糖の化学合成をおこなった。還元末端をメチル基で保護した三糖を合成した後、還元末端をSPh基で保護したマンノース三糖とグルコサミンを結合することで四糖骨格の化学合成を達成した。現在ホスホエタノールアミン部分の導入を検討している。2. NMR測定GPI糖鎖を用いたNMR測定の準備実験を以下のようにおこなった。モデル系として哺乳動物の自然免疫に関与するDectin-1と、様々な鎖長のベータグルカンのSTD-NMRを測定してその鎖長依存的な結合を評価した。その結果、鎖の短いベータグルカンの結合はかなり限定的であったが、鎖長が中程度以上のものには充分な結合性を示した。この結果より、STD-NMRを用いた測定条件を確立して、GPI糖鎖に用いることが可能になった。2014年度は、合成した糖鎖を用い、NMRを用いて糖鎖コンホメーション解析を進めるとともに、受容体タンパク質との相互作用解析をおこなった。結核菌のPIMは、GPIアンカーと共通のコア構造であるホスファチジルイノシトールを有する。このPIMコア構造の糖鎖部分を精密に化学合成して、ヒトの腸管タンパク質ZG16pとの相互作用をNMRにより詳細に調べて、その複合体構造を決定した。GPI生合成に関与する膜タンパク質PGAP5は、in vitroでの発現が難しいこともありそのリガンド認識機構は不明であった。

そこで、共同研究者により作成いただいたPGAP5が細胞膜表面に発現する細胞株を用いることにした。On-Cell NMR条件下でSaturation transferdouble difference (STDD)-NMRを測定することで、その相互作用のNMRによる検出を試みた。その結果、タンパク質とリガンドの結合に由来すると考えられるシグナルの取得に成功した。しかしながら細胞に由来するバックグラウンドのシグナルを効率的に除くことが困難であったため、詳細な解析のためには更なる測定条件の検討が必要であった。生物有機化学糖鎖部分の化学合成をほぼ達成した。また昨年度のNMRの予備的検討に続き、本年度はGPI主骨格五糖の立体構造を明らかにし、On cell NMRの測定への基盤を確立した。化学合成に関しては、順調に進捗しており、次年度には各部分構造の合成を達成するとともに、全長の合成に目途がつくと予想される。NMR測定条件に関しては、予定したもののうち、主要な測定の基本的条件を検討して、その有用性を確認した。合成糖鎖骨格を用いて、大阪大学微生物病研究所の藤田盛久博士に調製いただいたPGAP5を表面に発現する細胞を用いてOn Cell NMRにより合成糖鎖とPGAP5相互作用の検出を試みる。GPIアンカー糖鎖の化学合成をさらに進め、次年度においては目的としたGPIの部分構造合成を達成する。さらに五糖全長の化学合成に着手する。現在はマンノース三糖部分ならびに、マンノースーグルコサミン四糖部分の化学合成を進めている。合成において、エタノールアミン部分を3か所同時に導入する事が本合成の鍵となるので、この導入条件を精査して、次年度内に部分構造ならびに五糖全長の化学合成を達成する。次年度においてはNMRによる相互作用解析の実現に向けてSTD-NMRの条件をさらに精査するとともに、DOSY等の拡散NMR条件の検討をもおこなうことで、NMRを基軸としつつタンパク質と糖鎖の相互作用を多面的に解析できる実験系を整備また構築する。これらの進捗を基に最終年度はGPI糖鎖の膜面上での挙動と相互作用を解明する。該当なし
伸展刺激に対する培養メサンギウム細胞の認識機構と細胞内シグナル伝達系の検討

慢性腎不全の進展機序の一つとして、系球体内高血圧によるメサンギウム細胞(MCs)の伸展が提唱されている。我々はこの進展刺激がどのような機構で細胞内に伝達され、細胞の変化として発現されるのかについて明らかにする目的で、培養MCsを周期的に伸展させ、細胞に生じる変化について検討した。MCsを受動的に伸展させると、細胞骨格であるストレスファイバーの細胞膜側末端に形成される焦点接着(Focal adhesion)に局在するチロシンキナーゼであるfocal adhesion kinase(P125^<FAX>)と、その基質であるpaxillinのチロシンリン酸化が10分から15分以内に生じ、そのリン酸化はGF109203X,BAAPTA-AMにより抑制された。つまり、伸展刺激のシグナル伝達にはプロテインキナーゼ(PKC)およびカルシウムイオンが関与していることが理解された。さらに、受動的に伸展させたMCs内のアクチンストレスファイバーをFITC-phalloidinで染色し、伸展刺激によるアクチンストレスファイバー合成を検討した。ストレスファイバー合成は、細胞伸展後5分から10分後に増加し、さらにはこのアクチンストレスファイバー合成にもPKCおよびカルシウムイオンが関与していることが同様に示唆された。さらに本年度は、この受動的伸展においてのカルシウムイオンの細胞内動員経路を確認する目的で、P125^<FAX>・paxillinのチロシンリン酸化とアクチンストレスファイバー合成が様々なカルシウムチャンネルのインヒビターにより抑制されるかどうかを検討した。その結果、voltage operated calcium channel(VOC)インヒビターであるニフェジビンとstress-activatedchannel(SAC)インヒビターである塩化ガドリニウムを用いると、これらの変化はそれぞれ単独では抑制されないが、両者の併用により抑制されることが示された。したがって、MCsの受動的伸展により、VOCおよびSACを介して細胞内にカルシウムが動員され、このカルシウムにより細胞内のPKCを含めた細胞内シグナル伝達系が働き、細胞内のチロシンリン酸化やアクチンストレスファイバー合成が生じることが明らかとなった。この成果から考えると、系球体高血圧を伴う慢性腎不全に対して、VOCおよびSACを抑制させ、腎不全進展が抑制できる可能性が示唆された。慢性腎不全の進展機序の一つとして、糸球体内高血圧によるメサンギウム細胞(MCs)の伸展が提唱されている。先ず細胞内シグナル伝達系について、細胞を伸展後、細胞内で生じるチロシンリン酸化について検討した。細胞骨格であるストレスファイバーの細胞膜側末端に形成される焦点接着(Focal adhesion)に局在するチロシンキナーゼであるfocalsdhesion kinase(P125^<FAK>)と、その基質であるpaxillinのリン酸化をウェスタンブロット法で検討し、さらに、そのリン酸化に関与するシグナル伝達系を調べるため、インヒビター添加後のリン酸化抑制を検討した。その結果、P125^<FAK>・paxillinはMCsの伸展後、10分から15分後にリン酸化され、それらのリン酸化はGF109203X,BAPTA-AMにより抑制された。続いて機械的に伸展させたMCs内のアクチンストレスファイバーをFITC-phalloidinで染色し、伸展刺激によるアクチンストレスファイバー合成を検討した。その結果、細胞伸展後5分から10分後にストレスファイバー合成が増加することが証明された。続いてこの実験にもシグナル伝達系のインヒビターを添加し、アクチンストレスファイバー合成の抑制について検討した。その結果、PKCおよびカルシウムイオンが関与していることが同様に示唆された。現在カルシウムイオンの細胞内動員経路を確認するため、voltage operated calcium channelインヒビターであるニフェジピンとstress-activated channelインヒビターである塩化ガドリニウムを添加し、伸展実験を行っている。

その結果、voltage operated calcium channel(VOC)インヒビターであるニフェジビンとstress-activatedchannel(SAC)インヒビターである塩化ガドリニウムを用いると、これらの変化はそれぞれ単独では抑制されないが、両者の併用により抑制されることが示された。したがって、MCsの受動的伸展により、VOCおよびSACを介して細胞内にカルシウムが動員され、このカルシウムにより細胞内のPKCを含めた細胞内シグナル伝達系が働き、細胞内のチロシンリン酸化やアクチンストレスファイバー合成が生じることが明らかとなった。この成果から考えると、系球体高血圧を伴う慢性腎不全に対して、VOCおよびSACを抑制させ、腎不全進展が抑制できる可能性が示唆された。
チエノピリジン系薬剤の血中濃度及びP2Y12結合量測定による薬効評価法の探索

臨床現場で主に使用されるADP受容体P2Y12阻害薬の血小板凝集抑制作用は、さまざまな要因によって大きく変動することが知られている。一方で統一した凝集能評価法は構築されておらず、血小板凝集能の維持時間が短いため、臨床現場では採血後即座に凝集能の測定を行う必要がある。そのため、血小板凝集能の評価が行われないまま多くの患者に対して抗血小板療法が行われている。血小板凝集能を評価しながらより効果的かつ安全に抗血小板薬を使用するためには、血液サンプルの保存方法等による影響を受けない血小板凝集抑制作用の評価法を確立することが重要である。初めに、チエノピリジン系薬剤のP2Y12阻害薬の受容体への結合量が薬効を反映すると考え、質量分析計による分析を試みたが、困難であることが明らかとなった。抗血小板薬は血小板凝集カスケードの最下流に位置するIntegrinαIIbβIIIの活性化を阻害することでその凝集抑制作用を発揮する。そこで、血小板凝集カスケードの下流に位置するTalin、IntegrinαIIbβIIIを標的とし、それらのリン酸化レベルが血小板凝集能を反映すると考え、既存の凝集能評価法との関係を評価することとした。リン酸化レベルの測定のために、定量性に優れる質量分析装置を用いることとし、Talin、IntegrinαIIbβIIIのアミノ酸配列のうち、特異性が確認でき、リン酸化ペプチドの報告のある標的リン酸化ペプチドを決定した。その後、それら標的リン酸化ペプチドの測定系を確立するために、多血小板血漿と乏血小板血漿を精密質量分析装置で測定し、多血小板血漿特異的なピークを多変量解析により求め、その中からTalinの標的ペプチドが測定可能であることを見出した。現在は、IntegrinαIIbβIIIの測定系の確立を試みつつ、Talinのリン酸化レベルと光透過性により血小板凝集能を測定するaggregometerによる既存の凝集能評価法との関係を解析中である。
神経細胞のアポトーシス初期過程で活性化する遺伝子の探索

1)生後12日のラットから単離し、培養7日後の上頚神経節(SCG)細胞を用いてNGF除去後の神経細胞死(アポトーシス)の初期に発現の変化する遺伝子を探索した。NGF除去により細胞死を誘発したSCG細胞から、6時間後RNAを単離し、mRNAをRAP-PCR法を用いて調べ、対照(4時間NGF非存在下に置いた後2時間40mMカリウムで脱分極処理し細胞死を抑制したもの)と比較したところ、25本のバンドに変化が見られた。それらのクローニングにより得られた約50個のプラスミドについて、リバースノーザン法を行った結果、細胞死抑制で発現の減少する3種のクローンと発現の増加する3種のクローンについて再現性が確かめられた。うち4本に付いてシークエンシング、ホモロジー検索を行ったが、3本は未知であることがわかった。ノーザンブロット法を用いて発現変化の確認を進めている。2)ベラトリジンはNa_+チャンネルの活性化剤で、細胞内へのNa_+またはCa2_+の流入、すなわち細胞の脱分極を誘導する。ベラトリジンによる脱分極の神経細胞生存/細胞死への効果を検討した。生後12日のラットから単離し、培養7日後のSCG細胞では、1μM以上の濃度で用いるとNa_+,Ca2_+両イオンの流入をもたらすが、それより低い濃度ではNa_+に対し特異的に対し特異的に作用することがわかった。更に、このSCG細胞のNGF除去に伴う細胞死について調べたところ、低濃度のベラトリジン(0.25^0.75μM)は細胞死の進行を遅らせることがわかった。この細胞死遅延効果は明らかに細胞外のNa_+に依存しており、ベラトリジンによる細胞内Na_+濃度の増加と相関していた。このことは、神経細胞の生存/細胞死制御に関しNa_+を介した機構が存在することを示唆している。
培養シナプスモデルを用いた神経筋接合部の機能構造に関わる分子動態の相関顕微鏡解析

神経筋接合部のポストシナプスには特徴的なひだ構造があり、神経伝達物質受容体とその結合タンパク質によるクラスターが形成されている。これらは、シナプスの形成に伴い成熟し、老化や神経筋疾患により急激に退化することから、シナプスの機能に重要な役割を果たしている。そこで本研究では、(1)受容体クラスターの成熟と崩壊に関わる分子メカニズム、(2)シナプスに非常に多い細胞内小胞の機能的な役割、(3)ひだ構造の形成と構造学的な意義、の解明を目指す。そのため、培養細胞を用いた神経筋接合部のシナプスモデルを作製し、分子レベルでの計測のために光学顕微鏡とクライオ電子顕微鏡による相関顕微鏡法を確立し、解析を行う。
フーリエ変換型圧電素子光熱変換分光法による多層超薄膜半導体評価技術の開発

本研究課題は、従来の光学的手法が測定してこなかった非発光電子遷移過程に着目し、それを高感度で検出することで、多層超薄膜半導体各層の光吸収スペクトルを非破壊かつ高感度に測定する手法を開発することを目標とした。研究者代表者らが新規開発・発展させてきた圧電素子光熱分光(PPTS)法では照射光の断続周波数変化によって発生した熱の拡散長を変化させて深さ方向の情報が得られるが、その分解能は数百ミクロン程度が限界であった。ステップスキャン機能付きフーリエ変換型分光系(FTIR)の導入で様々な問題が解決され、深さ方向分解能が格段に向上できると期待される。今年度は以下の実績が得られた。1.PPTS法にて評価実績のあるGaAsとSi単晶試料を標準試料として用い、現行PPTS法とFTIR-PPTS法で一致したスペクトルが得られるかどうかの確認を行なった。発生した熱の熱拡散長が試料厚さと同程度になる条件での測定の結果、FTIR-PPTS法で得られる信号強度がPPTS法の信号強度の数倍数十倍になることが分かった。2.単一バルク試料に対するステップスキャン機能を用いた熱拡散長を変えての深さ方向スキャンでは、表面近傍に相当する信号と試料内部に相当する信号に違いが見出された。これは再結合せずに試料表面に到達した光励起キャリアによる光表面起電力が関与している可能性が指摘され、今後の研究で検討する必要がある。3.市販FTIRではステップスキャンの周波数は離散的な値に固定されている。スキャン位置を決める熱拡散長は断続周波数と試料物性値に依存するため、任意の周波数に設定できるよう改訂が必要である。現状ではリニアスキャンを実施して各波数のデータを抽出し整理することで対処できるが、より精度の高い深さ方向スキャンには機器メーカーとの調整が不可欠であり、今後の課題として残された。本研究課題は、従来の光学的手法が測定してこなかった非発光電子遷移過程に注目し、それを高感度で検出することで、多層超薄膜半導体各層の光吸収スペクトルを非破壊かつ高感度に測定する手法を開発することを目標とした。研究者代表者らが新規開発・発展させてきた圧電素子光熱分光(PPTS)法では照射光の断続周波数変化によって深さ方向の情報が得られるが、その分解能は数百ミクロン程度が限界であった。ステップスキャン機能付きフーリエ変換型分光系(FTIR)の導入で様々の問題が解決され、深さ方向分解能が格段に向上することが期待できる。まずはFIIRを新規導入し、FTIR-PPTS法を構築した。我々独自の検出器(圧電素子)を外部に設置し信号を取り込むよう制御システムの改編が必要である。この作業は納入業者との綿密な打ち合わせの元に行なった。次に、PPTS法にて評価実績のあるGaAsとSi単晶試料を標準試料として用い、現行PPTS法とFTIR-PPTS法で一致したスペクトルが得られるかどうかの確認を行なった。次年度以降に実施する予定の深さ方向解析においては深さ方向分解能が向上するにつれて、信号強度の指数関数的減少が予測されることから、今回のこの結果は期待通りであった。FTIRの導入によってもたらされたもうひとつの効果として、対象試料の透過率および反射率を簡便且つ高感度に実施できたことが挙げられる。半導体材料中の非発光電子遷移過程を検出、解析する際には試料内部にどれだけの光エネルギーが取り込まれたかの情報が不可欠であり、同一試料の透過率および反射率の情報は解析結果の定量性に不可欠である。

現状ではリニアスキャンを実施して各波数のデータを抽出し整理することで対処できるが、より精度の高い深さ方向スキャンには機器メーカーとの調整が不可欠であり、今後の課題として残された。
プロバイオティクスがう蝕にもたらす影響の解明

Lactobacillis salivarius WB21株(WB21)は歯周病や口臭の改善効果をもたらすことが報告されている。本研究では乳酸菌の口腔利用に際し、齲蝕に対する影響についてもさらに確認するため、齲蝕原因菌Streptococcus mutans (Sm)に対するWB21の作用を調べた。混合培養実験において、WB21はSm増殖を抑制することがわかった。また、不溶性グルカンに対する影響ではWB21の添加によりSmが産生する不溶性グルカンが減少することがわかった。本研究において、WB21は齲蝕のリスクを高めないだけでなく、齲蝕抑制効果を持つ可能性があることが示唆された。急速に進む高齢化社会において、病気になってから治そうとするのではなく、普段から健康を保ち病気を予防する「予防医学」の考え方が重要視されるようになってきている。その中の一つとして、期待されているのがプロバイオティクスである。口腔内に利用されるプロバイオティクスとしては、Lactobacillus属が知られている。本研究では、う蝕原因菌に対するL.salivarius WB21株の働きを明らかにし、本菌のプロバイオティクスとしての有用性を明らかにすることを目的としている。プロバイオティクスは、「消化管内の細菌叢を改善し、宿主に有益な作用をもたらす有能な微生物とそれらの増殖促進物質」と定義されており、近年、プロバイオティクスを用いた予防医学の考えが広まってきている。様々なプロバイオティクスが存在するが、我々はLactobacillus salivarius WB21株を用いて、本菌の口腔内投与により口臭や歯周病に対して有効であることを明らかにしてきた。う蝕病原菌に対しては、Streptococcus mutansは濃度依存的に抗菌作用があることが示唆された。他のう蝕病原菌に対してもLactobacillus salivarius WB21株が濃度依存的であることが示唆された。今後は、う蝕病原菌に対する付着阻害能や、不溶性グルカン産生抑制能の確認を行っていく次第である。現在研究に加え、診療業務および学生教育を行っており、研究が予定通りに行えていない。また、データの蓄積も不足した状態である。その為、当初2年間の予定であった研究期間を1年延長申請を行い、研究計画を見直し平成28年度も引き続き本研究を行っていく次第である。プロバイオティクスは、消化管内の細菌叢を改善し、宿主に有益な作用をもたらしうる有能な微生物とそれらの増殖促進物質と定義されている。プロバイオティクスの摂取により消化管内のフローラに作用し、フローラの健常化を図りながら疾病の予防、改善を行うというものであり、代表的なものとしてLactbacillus属やBifidobacterium属等が知られている。申請者はこれまでに、プロバイオティクスの投与により口腔内において歯周病や口臭に対する効果について検証し、口臭や歯周組織の炎症の改善に有効であることを報告した。本研究において、申請者はプロバイオティクスのう蝕に対する効果について検証を行った。プロバイオティクスの1つであるLactobacillus salivarius WB21株(WB21)を用いてう蝕病原細菌のStreptococcus mutans (Sm)の増殖抑制効果を確認した。その結果、Sm菌数はWB21の添加菌数依存的に減少した。また、Smが形成する不溶性グルカンの形成抑制作用も確認した。その結果、WB21の添加によりSmが形成する不溶性グルカン減少することが明らかになった。本研究において、プロバイオティクスは齲蝕のリスクを高めないだけでなく、う蝕抑制効果を持つ可能性があることが示唆された。これまでに、L.salivarius WB21株の抗菌性については、う蝕と関連の強いStreptococcus mutansにおいて濃度依存的に抗菌作用があることが示唆された。また、他のう蝕原因菌であるS.sobrinusやS.sanguinisにおいても、L.salivarius WB21株が濃度依存的に抗菌性を示す可能性が示されており、現在確認中である。今後は基礎研究において、また臨床的評価においてもデータの蓄積およびデータの解析をさらに進めていく。歯科保存修復学今後はやや遅れている基礎研究と平成27年度の研究目標であるL.salivarius WB21株による口腔内環境への臨床的評価と並行して行っていく予定である。所属している講座において、既に所有している研究機材や器具を使用したため、物品費が当初の予定より金額が安価であった。既に所属講座において所有していた研究機材や器具を使用していたため、物品費が予定の金額より安価であった。基礎研究において、消耗品に使用する事が予想される。臨床研究においては、WB21株含有タブレットをの購入にあたり物品費が発生することが予想される。

また、学会発表も予定しているため、旅費が発生すると思われる。今後は臨床研究も行っていく。その際にL.salivarius WB21株含有タブレットを用いる予定であり、タブレットの購入にあたり物品費が発生する。
末梢血管収縮度モニタ開発の研究-光波長により組織透過深さが異なる性質を利用した光電脈波法-

1.はじめに生体組織では、可視光や近赤外光は波長が長くなるほどへ光が深く透過する性質を持っている。この領域の光を用いて、生体での吸収・反射スペクトルを調べることにより皮膚表面付近での深さ方向の血流分布を把握できる可能性がある。本研究では基礎的知見を得ることを目的として、皮膚表面組織を模擬したモデルを作製し、可視から近赤外領域の反射光スペクトルを測定した。2.実験方法送光面と受光面がそれぞれ平行に配置された先端部を持つ2分岐型光ファイバ(特別性)を用いて、Xeランプからの白色光をモデルファントムに照射した。そしてファントムからの反射光を光スペクトルアナライザ(AQ-6310B,ANDO)へ導き、波長400nmから1400nmまでのスペクトルを測定した。組織と末梢血流のモデルとして、テフロンシートと新鮮な牛血液を用いた。テフロンシートの厚さは0.1mmから3.0mmまで変化させた。血液試料には抗凝固剤を加え十分に空気を通じ酸素加したものを用い、マグネチックスターラーで撹拌しながらスペクトルを計測した。3.結果と考察(1)テフロンシート、(2)血液、(3)テフロンシートの厚さが0.7mmから3.0mmまで変化させたものに血液を接触させたモデル、それぞれのスペクトルを計測した。そして、(3)のスペクトルを(1)と(2)を用いて表現できる(1)の厚さを変数とした多重散乱光を考慮しモデル式を提案した。これより可視から近赤外領域で光吸収スペクトルを得れば、深さ方向の末梢血流分布を評価できる可能性が示唆された。4.まとめ皮膚表面組織を模擬したモデルを作製し、その光スペクトルを測定した。そして、提案したモデル式によりテフロンシートの厚みを変数としたモデル式を用いて、ファントムのスペクトルを表現した。これにより可視から近赤外領域で反射光の吸収スペクトルを得れば、深さ方向の末梢血流分布を評価できる可能性が示唆された。
グローバル・イノベーション・モデルの構築とその実証研究

平成28年度ならびに29年度の研究取り組みを踏まえ、本年度は以下の取り組みを実施した。(1)平成29年度の研究成果である「日本企業における海外R&D活動撤退の分析」(研究・イノベーション学会第32回年次学術大会発表)と「日本企業における海外R&D活動撤退の実態について」(江戸川大学紀要第28号掲載)において実施した分析を更に精査し、日本企業の海外R&D拠点の生存可能性について詳細な検討を行った。この結果、次のような特徴が新たに判明した。(i)中核的技術を日本本社から導入した海外R&D拠点の生存可能性は高くなる。(ii)世界市場を志向する海外R&D拠点の生存可能性も同様に高い傾向が見られる。他方、(iii)事業部系現地R&D拠点の生存可能性は、コーポレート系R&D拠点に比べると有意に低い。といった知見が得られた。特に、(iii)の特徴はこれまでの先行研究等でも指摘されていない新たな発見であったと言えるだろう。(2)これまでの研究取り組みの結果からすると、日本企業における海外R&D活動から生じるグローバル・イノベーションの実現可能性は、偶発的・散発的に実現する段階に止まっている事が示唆される。このような状態に留まる理由として、日本企業の伝統的な海外R&Dマネジメントのあり方や、各企業の国際的なマネジメントそれ自体が阻害要因であることなどが考えられる。このような問題点については、更なる分析を行って確認をする必要があると言える。当初計画では、日本企業ならびに日本に所在する外資系企業に対して、アンケート調査を早急に実施する予定であった。これまでの研究取り組みが当初計画より遅れていたため、平成30年度中にアンケート調査を実施する予定であったが、様々な事情により平成30年度もアンケート調査を実施することが不可能となってしまった。また、予定していた企業訪問調査などにも遅れが生じている。以上のような理由から、当初計画した研究目的の達成が、現時点、未達となっている。本研究計画の実施状況は、計画立案当初に想定したタイムラインを大幅に超過する結果となっている。研究計画の打ち切り等も選択肢の一つであったが、やはり研究計画を完遂する事が重要であると考えたため、研究計画を延長し、本年度中に当初計画の目標を達成させる予定である。既に、十分な予備調査と先行的な分析を行っているので、本研究計画立案当初の研究目標については、変更を要しないと考えている。本研究の分析視覚を明確化するため、従来の研究で得られたデータ並びに成果の徹底的な整理・再分析を行った。こうした取り組みを通じて、今後の研究遂行上、留意すべき課題として以下のようなポイントが浮かび上がった。次年度以降の取組では、これらの課題を踏まえた研究計画の推進が必要と考えている。(1)日本企業の海外R&Dマネジメント上の課題ーかつて行った日本企業の海外R&D活動アンケート調査(2006年と2014年に実施)を再分析した結果、日本企業の海外R&Dマネジメントに構造的な大きな変化がないことを見いだした。従って、日本企業による海外R&D活動が段階的に発展しているのかどうか、改めて確認する必要性があると言える。また、海外R&D活動の目的・機能によって必要なマネジメント要件が異なる。海外R&D活動を展開している日本企業が、実際にどのような対応を取っているのか、という点についても確認する必要性がある。(2)日本企業におけるグローバル・イノベーションの実践ー(1)にも関連するが、日本企業のリバース・イノベーションに関する分析を行った。この結果、Govindarajan & Trimble(2012)らで示された新興国におけるイノベーションが本国や先進国に環流するケースが、日本企業ではきわめて例外的である可能性が示された。仮に、リバース・イノベーションがグローバル・イノベーションを構成する一つの要素であると考えるならば、日本企業でグローバル・イノベーションを実現するために、克服すべき課題が存在することになる。なお、今年度の取組を通じて得られた上記研究成果については、報告書、論文、学会発表で公表を行った。当初計画では、初年度に日本企業本社と在日外資系企業に対するグローバル・イノベーションに関する調査票調査を予定していた。しかしながら、これまでの研究成果の取り纏めと分析視覚の明確化に予想以上の時間を要したため、計画していた調査票調査を実施できなかった。他方、従来の研究成果の整理と入手済データの整理・再分析により、予想以上の成果を得ることが出来た。この結果を今後の研究遂行に役立てていきたい。平成28年度の研究取組を踏まえ、本年度は以下の取組を行った。(1)日本企業の海外R&Dマネジメント上の課題ー昨年度までの研究取組によって、日本企業における海外R&Dマネジメントには、経年的に見て、大きな変化がないことを確認できた。本年度は、日本企業による海外R&D活動の機能や役割が段階的に進展しているのかどうか、改めて分析を行った。分析結果は、(i)一つの拠点が段階的に機能を発展するケースは少ない可能性が高い。他方、拠点の活動目的・機能を研究から製品開発・事業支援に変更する例が観察される。(ii)現地拠点と第三国拠点との連携も強化されているとは、言い難い状況にある。といった特徴を示した。従って、日本企業における海外R&D活動が、段階的に発展してきたとは断言できない。

(2)日本企業におけるグローバル・イノベーションの実践ーGovindarajan & Trimble(2012)らで示された新興国発イノベーションが実現する可能性は、日本企業の場合、低い事が予想される。こうした原因を探るために、本年度は日本企業の海外R&D拠点生存率について分析を行った。海外R&D拠点の閉鎖・統合などが頻繁に繰り返されれば、現地発のイノベーションが実現しにくいことが予想される。分析の結果、2006年3月に調査を行った海外R&D拠点39拠点のうち、7拠点が廃止されていた。このため生存率は82%となる。さらに1991年末に存在していた日本企業の海外R&D拠点の生存率を分析した結果、24.5%という数値が得られた。これらの結果を欧米企業を対象とした分析結果と比較すると、生存率がやや低いように見える。今後は、海外R&D拠点閉鎖要因の精査を行う必要もあるだろう。なお、今年度の取組を通じて得られた上記研究成果については、論文、学会発表で公表を行った。当初計画では、初年度に日本企業と在日外資系企業に対するグローバル・イノベーションに関する調査票調査を実施し、次年度に日本企業在外子会社に対するグローバル・イノベーションに関する調査票調査を予定していた。加えて、同時並行的に訪問インタビュー調査を実施し、計画二年度目終了までに分析用データの収集を行う予定であった。しかしながら、これまでの研究成果の取り纏め並びに再分析によって、当初計画の分析方針・研究推進方針を修正・精査する必要性が生じた。このため、当初、計画していた調査票調査ならびに訪問インタビュー調査の実施が遅れている。本年度はこうした調査を早急に進め、研究の推進を図る。平成28年度ならびに29年度の研究取り組みを踏まえ、本年度は以下の取り組みを実施した。(1)平成29年度の研究成果である「日本企業における海外R&D活動撤退の分析」(研究・イノベーション学会第32回年次学術大会発表)と「日本企業における海外R&D活動撤退の実態について」(江戸川大学紀要第28号掲載)において実施した分析を更に精査し、日本企業の海外R&D拠点の生存可能性について詳細な検討を行った。この結果、次のような特徴が新たに判明した。(i)中核的技術を日本本社から導入した海外R&D拠点の生存可能性は高くなる。(ii)世界市場を志向する海外R&D拠点の生存可能性も同様に高い傾向が見られる。他方、(iii)事業部系現地R&D拠点の生存可能性は、コーポレート系R&D拠点に比べると有意に低い。といった知見が得られた。特に、(iii)の特徴はこれまでの先行研究等でも指摘されていない新たな発見であったと言えるだろう。(2)これまでの研究取り組みの結果からすると、日本企業における海外R&D活動から生じるグローバル・イノベーションの実現可能性は、偶発的・散発的に実現する段階に止まっている事が示唆される。このような状態に留まる理由として、日本企業の伝統的な海外R&Dマネジメントのあり方や、各企業の国際的なマネジメントそれ自体が阻害要因であることなどが考えられる。このような問題点については、更なる分析を行って確認をする必要があると言える。
患者由来乳癌幹細胞の同定と治療標的探索

乳癌幹細胞マーカー候補としてLGR5を選択。LGR5(+)細胞は患者乳癌組織における小細胞集団であり、Stage IVの患者の血中で高率に検出され、化学療法抵抗性の可能性を示したため、乳癌幹細胞の特徴を有すると考えられた。乳癌患者から手術検体を提供いただき、免疫不全マウスに移植し、3 lineのPDXマウス樹立に成功した。LGR5(+)細胞が癌幹細胞であることを証明するために、PDXマウスの腫瘍からLGR5(+)細胞とLGR5(-)細胞をFlow cytometry法にて分離し、それぞれ少数の細胞を別の免疫不全マウスに移植した。その結果、予想と反してLGR5(-)細胞は腫瘍を形成し、しかもLGR5(+)細胞由来の腫瘍よりも増大速度が早かった。さらにLGR5(-)細胞由来の腫瘍にLGR5(+)細胞が出現していた(LGR5(+)細胞由来の腫瘍とLGR5(-)細胞由来の腫瘍では、LGR5(+)細胞の割合はほぼ同じであった)。したがって、PDXマウスの腫瘍を使ってLGR5(+)細胞が癌幹細胞の特徴としての腫瘍形成の起源であるということを証明することはできなかった。一方でCD44(+)CD24(-)細胞が乳癌幹細胞であると報告されている。そこで、LGR5とCD44の関係をPDXマウスの腫瘍で調べた。その結果、CD44はLGR5に含まれており、LGR5(-)細胞には含まれていなかった。これは、CD44(-)細胞も腫瘍形成能を持つ可能性を示唆しており、既報告とは一致しない可能性が考えられた。乳癌患者の検体(原発腫瘍、血液、転移巣)を用いて検討した結果、LGR5の乳癌幹細胞マーカーの可能性に矛盾がなかった。しかし、in vivoでの腫瘍形成能を調べた結果、LGR5だけでなくCD44も乳癌幹細胞マーカーでない可能性が示唆された。これは癌幹細胞仮説を否定しうる結果である。現在、癌幹細胞マーカーとして別の遺伝子の選択を検討している。一方で、血中膜型ER(+)細胞の検出が内分泌療法の効果予測や有効性判定に利用できる可能性を見出した。癌幹細胞仮説が否定的と判断した場合、血中膜型ER(+)細胞の解析に集中することを検討している。LGR5(+)細胞は患者原発腫瘍や癌性胸水中に少数存在し、PDXマウスではLGR5(+)細胞が1個以上存在する肺転移腫瘍塊は74%と高頻度に認め、LGR5(+)細胞が乳癌幹細胞である可能性が示唆された。乳癌患者における血中腫瘍細胞(CTC)を採取したところ、LGR5(+)細胞はStage IVの患者で高率に検出された。術前化学療法前に認めた血中LGR5(+)細胞は、抗がん剤治療によって減少したが、化学療法後に手術した原発腫瘍においては、一部LGR5(+)細胞が濃縮された部分が存在した。これはLGR5(+)細胞が治療抵抗性の可能性を示唆しており、癌幹細胞の特徴に一致する。癌幹細胞を標的とする分子の探索過程で、まずLGR5(+)細胞がHER2とERを発現するか検討した。血液中でHER2を発現するLGR5(+)細胞を調べたところ、原発腫瘍がHER2 typeのときだけでなくHER2陰性のLuminal typeでも検出された。Luminal typeの原発腫瘍には、stromaにHER2(+)LGR5(+)細胞が存在する症例があり、浸潤過程でHER2を発現する可能性が示唆された。抗HER2療法により血中LGR5(+)細胞が消失したHER2 typeの症例では、原発巣がかなり縮小し、リンパ節転移が消失した。一方、Luminal type患者の62%で血中ER(+)細胞を検出した。ERは細胞表面に発現していたため原発腫瘍を確認したところ、ERはtumorclusterでは核に発現していたが、stromaでは細胞表面に発現していた。LGR5(+)細胞は原発腫瘍のstromaと血中ではERを発現していた。これまで9人の乳癌患者から手術検体を提供いただき、免疫不全マウスに移植し、2 lineのPDXマウス樹立に成功した。癌幹細胞を証明するためには、in vivoでの腫瘍形成能を示す必要がある。そのためにPDXマウスモデルの樹立が必要であり、それまでの期間(2017年度)はLGR5の癌幹細胞マーカーの可能性について乳癌患者の検体(原発腫瘍、血液、転移巣)を用いて検討した。その結果はLGR5が癌幹細胞マーカーである可能性を示唆しており、乳癌転移の新たなメカニズムの発見に繋がると考えられた。

その結果、予想と反してLGR5(-)細胞は腫瘍を形成し、しかもLGR5(+)細胞由来の腫瘍よりも増大速度が早かった。さらにLGR5(-)細胞由来の腫瘍にLGR5(+)細胞が出現していた(LGR5(+)細胞由来の腫瘍とLGR5(-)細胞由来の腫瘍では、LGR5(+)細胞の割合はほぼ同じであった)。したがって、PDXマウスの腫瘍を使ってLGR5(+)細胞が癌幹細胞の特徴としての腫瘍形成の起源であるということを証明することはできなかった。一方でCD44(+)CD24(-)細胞が乳癌幹細胞であると報告されている。そこで、LGR5とCD44の関係をPDXマウスの腫瘍で調べた。その結果、CD44はLGR5に含まれており、LGR5(-)細胞には含まれていなかった。これは、CD44(-)細胞も腫瘍形成能を持つ可能性を示唆しており、既報告とは一致しない可能性が考えられた。乳癌患者の検体(原発腫瘍、血液、転移巣)を用いて検討した結果、LGR5の乳癌幹細胞マーカーの可能性に矛盾がなかった。しかし、in vivoでの腫瘍形成能を調べた結果、LGR5だけでなくCD44も乳癌幹細胞マーカーでない可能性が示唆された。これは癌幹細胞仮説を否定しうる結果である。当院で樹立したPDXマウスの腫瘍よりLGR5陽性細胞分画をFlow cytometry法で分離する。この少数の細胞を別のマウスに移植し腫瘍・転移形成させることで、癌幹細胞分画を決定する。PDXと患者の腫瘍・CTCを用いて免疫染色及びqPCRを施行し、網羅的に乳癌幹細胞の標的分子の探索を行う(PDXマウスへの標的治療薬の効果検討は2019年度に予定)。LGR5が癌幹細胞マーカーであることを証明できなかった場合は、別の遺伝子を選択する。引き続き、PDXマウスモデルの樹立を継続する。現在、癌幹細胞マーカーとして別の遺伝子の選択を検討している。一方で、血中膜型ER(+)細胞の検出が内分泌療法の効果予測や有効性判定に利用できる可能性を見出した。癌幹細胞仮説が否定的と判断した場合、血中膜型ER(+)細胞の解析に集中することを検討している。2017年度はin vitro実験が中心であったため、計画より実験補助員の人件費が抑制された。2018年度以降はin vivo実験が中心となるため、人件費は計画通りとなる予定である。予算はほぼ計画通りに使用しており、マイナスにならないように注意した結果、若干残った。
平原ハタネズミを用いた、オキシトシンの単回・継続投与が妊娠胎児へ与える影響の解析

動物の"社会行動、向社会性"を担う神経修飾因子として注目されるオキシトシン(OXT)は、社会性低下を特徴とするASD(自閉症スペクトラム障害)の治療薬として期待されている。一方でOXTは以前より分娩誘発・促進剤として産科領域で広く用いられてきたが、最近外来OXTの胎児への暴露が自閉症発症のリスク因子となる可能性を示す疫学調査が報告され、マウスを用いた動物実験で外来OXTの胎児への影響を検討した。妊娠後期での高濃度OXT投与は胎児脳での虚血と幾つかの脳領域での細胞死を誘導している可能性を示したが、産仔の社会行動等に異常は見られなかった。引き続き妊娠期OXTの胎児への影響を精査する必要がある。妊娠平原ハタネズミに浸透圧ポンプを埋め込み、継続的に任意濃度のオキシトシンを継続的に投与する実験系を確立した。また、本計画の中心に位置する、新規に開発したOXTR遺伝子欠損平原ハタネズミに関し、この遺伝子に導入された小規模な欠失変異、及びフレームシフト変異により、何れもOXTR機能が完全に喪失されている事を、in vitro実験により証明する事に成功した。行動解析実験系の樹立に関しては、ペア形成行動測定解析系、共感性行動測定解析系(foot shockを元にした慰め行動測定)、ハタネズミ仔マウス(14 DOB)に対する超音波測定条件確定などの行動計測解析システムを樹立した。また、複数個体による行動のコンピュータソフトによる自動解析系の開発を新たに開始しており、29年度中により誤差の少ない行動解析系が樹立出来る者と予想している。これまで飼育繁殖していた平原ハタネズミの繁殖効率が、昨年度にかけ大きく悪化したので、昨年7月に米国より新たに12ペアのハタネズミ雄雌を導入した結果、繁殖効率や毛並みなどの概観、CRISPR/Cas9用の受精卵取得効率などが何れも大幅に改善した。平原ハタネズミ脳内に発現分布するオキシトシン受容体蛋白を容易に検出、又その分布や発現強度を容易に評価するため、受精卵へのCRISPR/Cas9技術の応用によりOXTR遺伝子座へのFlag配列のノックインを試みている。これまでin vitroで合成したmRNAにより供給していたCas9蛋白に付き、新たにrecombinat蛋白を用いることで、効率の大幅な改善を見ており、こうした系の改善により新規遺伝子修飾平原ハタネズミの開発実験を継続している。1.妊娠野生型雌平原ハタネズミ胎児へ、OXTを単回、又は長期投与を行った場合の出産後の産子の成長後の社会行動へ与える影響の評価・解析これまで飼育繁殖して来たハタネズミの繁殖効率が28年度に極めて低下した。繁殖コロニー規模の縮小と、これに伴う遺伝的不均質性の低下が原因と思われる。対策として7月に米国より新たに12ペアのハタネズミ雄雌を導入、これらの導入で繁殖効率の改善に成功した。一方、当研究科の移転(昨年12月に市街地旧校舎から離れた郊外の新棟へ移転)に伴い、蟯虫駆虫薬と殺ダニ剤処理が行われ、その為個体数が減少、又妊娠個体も死産するなど大きな影響を受け、実験が中断してしまった。一方、行動解析に関しては奈良先端大学の駒井先生の協力によりペア形成行動測定ビデオの自動解析システム構築を進めている。共感性行動解析ではfoot shockを元にした慰め行動測定の計測系を樹立、他に仔ハタネズミ(14 DOB)に対する超音波測定条件確定に至った。ハタネズミ脳内のOXTRの検出は、マウスOXTRに対し強い検出力が発表されている抗OXTR抗体をNew York大Froemke教授より入手し試行した。マウスOXTRと極めて相同なハタネズミOXTRへの強い検出力が期待されたが、最良の条件確立には至っていない。上記の背景もあり、各種操作したハタネズミ脳内のOXTRの分布や発現強度を容易に検出するためOXTR(+Flag/+)ハタネズミの開発を継続した。しかし上記理由から、受精卵取得用の雌平原ハタネズミ十分確保出来ず、又一時期受精卵取得効率が大きく低下した事より、28年中のOXTR(+Flag/+)ハタネズミには至らなかったが29年度も継続し行っている。これまでの研究で妊娠平原ハタネズミに浸透圧ポンプを埋め込み、継続的に任意濃度のOXTを継続的に投与する実験系を確立した。しかし、29年度に行ったハタネズミの社会行動・向社会行動の測定系の樹立は不十分であり、1昨年に開発したOXTR(-/-)ハタネズミにつき、自閉症的な行動異常のポジティブコントロールとして最適、と判断し、これを用い、野生型ハタネズミと比較対照する方法で、ペア形成行動、共感性行動、社会記憶、USV(Ultra Sonic Vocalization)測定、Marble burryテスト(固執性測定)などの測定法がハタネズミに適用可能かを確認すると共に、その最適化を行った。社会行動・向社会行動異常を示すモデルリソースとして適格な、新規開発したOXTR遺伝子欠損ハタネズミに関し、導入された異常がOXTR遺伝子コード領域第1膜外ドメインの60bp長(20 a.a.)の欠損である変異ハタネズミから得た変異型OXTRcDNAを用いたin vitro実験(TGFαshedding測定法)により、受容体活性の完全喪失を確認した。29年度は、新たにこのOXTR(-/-)ハタネズミを用い、ペア形成行動、共感性行動(foot shockを元にした慰め行動測定)、ハタネズミ仔マウス(14 DOB)に対する超音波コール(USV)、Marble Buryテスト、社会記憶異常などの各測定解析系を適用した。

この結果、共感性行動、社会記憶、Marble Bury試験で明瞭な行動異常が確認された一方、USV測定では異常は検出されなかった。これらの結果は、これまでOXTR(-/-)マウスで報告されていた行動異常が全て同様にOXTR(-/-)ハタネズミでも観察されるわけでは無い事をも示し、齧歯類でも種間で様々な社会行動・向社会行動のOXT・受容体系への依存機構が同一とは限らない事実が示された。動物の"社会行動、向社会性"を担う神経修飾因子として注目されるオキシトシン(OXT)は、社会性低下を特徴とするASD(自閉症スペクトラム障害)の治療薬として期待されている。一方でOXTは以前より分娩誘発・促進剤として産科領域で広く用いられてきたが、最近外来OXTの胎児への暴露が自閉症発症のリスク因子となる可能性を示す疫学調査が報告され、マウスを用いた動物実験で外来OXTの胎児への影響を検討した。妊娠後期での高濃度OXT投与は胎児脳での虚血と幾つかの脳領域での細胞死を誘導している可能性を示したが、産仔の社会行動等に異常は見られなかった。引き続き妊娠期OXTの胎児への影響を精査する必要がある。妊娠野生型雌平原ハタネズミ胎児へ、OXTを単回、又は長期投与を行った場合の出産後の産子の成長後の社会行動へ与える影響の評価・解析に関して:まずは、野性型、及びOXTR遺伝子ヘテロ、ホモ欠損平原ハタネズミの増産のため、飼育スケールの拡大に努める。又、過剰投与による胎児マウスの発生への過剰な影響やその停止が危惧され、より詳細な投与濃度の検討により最適実験(投与期間と投与単位)の検討を更に進める。妊娠平原ハタネズミにオキシトシン投与して出産した仔の成長後の行動解析系の樹立・改善に関しては、既に平原ハタネズミにおいて代表的なペア形成行動解析、共感性行動解析(consolation行動解析)、超音波発声解析に関して実験系の調整が進んでいるが、ペア形成行動解析や共感性行動解析に付いて、ビデオ撮影後、ヒトによる映像観察によりその定量操作を行っており、誤差等を考慮して、ペア形成行動撮影ビデオの自動解析システムによる解析系構築を、奈良先端大学の駒井先生と共同開発していく。CRISPR/Cas9技術を応用したOXTR遺伝子座へのTag蛋白挿入ハタネズミ開発に関して:妊娠平原ハタネズミにオキシトシン投与して出産した仔の脳への過剰オキシトシンの影響を解剖・病理学的に、且つ容易に観察できるハタネズミ開発に関しては、生殖腺刺激ホルモン投与濃度や、非投与ハタネズミ雌の日齢の検討などをおこなって、その受精卵取得効率の改善に努める。既に、培養受精卵に於いてはFlag配列の挿入を確認しており、29年度中の開発が可能と考えている。これとは別個に、胎児期オキシトシン処理ハタネズミ脳の社会行動制御脳領域(側坐核、外側中隔、扁桃体内側核など)に関し、神経活性化マーカーのc-fos活性化に付き、抗体染色により活性化領域の変化を解析する。行動神経内分泌学、分子神経生理学、分子生物学