hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
含セレン蛋白質合成破綻による神経変性疾患モデルマウスの創出

抗酸化酵素の中心的役割を担う含セレン蛋白質の合成破綻によって神経変性疾患モデルマウスの創出に成功した。含セレン蛋白質合成が破綻した神経組織では転写因子Nrf2が活性化することが明らかとなった。また、Nrf2と含セレン蛋白質の両者の欠失は神経変性を重篤化することが明らかになった。以上の研究成果は、含セレン蛋白質群が神経組織の恒常性維持に必須であり、またその破綻に対してNrf2が保護的に働くことを明らかにした抗酸化酵素の中心的役割を担う含セレン蛋白質の合成破綻によって神経変性疾患モデルマウスの創出に成功した。以上の研究成果は、含セレン蛋白質群が神経組織の恒常性維持に必須であり、またその破綻に対してNrf2が保護的に働くことを明らかにした高齢化社会を迎えつつある我が国では社会的にも医療面でも多くの課題を抱えている。特に、老化に伴い発症頻度が増す神経変性疾患であるアルツハイマー病やパーキンソン病などの原因究明と治療法開発が急務である。こうした神経疾患の原因として、活性酸素種との関わりに注目が集まっている。グルタチオンペルオキシダーゼやチオレドキシン還元酵素を含む含セレン蛋白質群は活性中心にセレノシステイン(SeCys)の形でセレンを含む酵素群であり、抗酸化酵素の中心的役割を担う。この含セレン蛋白質群の合成にはSeCys-tRNAが必須であり、このtRNA欠損は含セレン蛋白質合成が破綻し抗酸化機能低下を引き起こす。本研究では、神経変性疾患の予防と発症メカニズムの理解を最終目的とする。本年度では、まず神経特異的SeCys-tRNA遺伝子破壊マウスを作成し神経変性疾患モデルマウス創出を試みた。その結果、作製されたマウスは生後体重増加が観察されず運動失調が観察され生後3週以内に致死に至った。ウエスタンブロット解析により、このマウスの脳組織において含セレン蛋白質GPx1の発現が著しく低下していることを確認した。また、転写因子Nrf2の蓄積およびその標的遺伝子の活性化が観察されたことから、酸化ストレス応答系Keap1-Nrf2システムによる代償機構の存在が予想された。以上の研究成果は、含セレン蛋白質群が神経組織において恒常性維持に必須な防御機構であり、またその防御機構の破綻状態に対してKeap1-Nrf2システムが保護的に働いていることを示唆する。すなわち、セレン欠乏予防やNrf2誘導剤の摂取が酸化ストレスに起因する神経変性疾患の予防に有効であることを支持する。神経変性疾患の原因として活性酸素種との関わりに注目が集まっている。この含セレン蛋白質群の合成にはSeCys-tRNAが必須であり、このtRNA欠損は含セレン蛋白質合成が破綻し抗酸化機i能低下を引き起こす。本研究では、神神経特異的SeCys-tRNA遺伝子破壊マウスを作成することによって神経変性疾患モデルマウス創出を試みた。その結果、このマウスの脳組織において含セレン蛋白質GPx1の発現が著しく低下していることが確認され、神経特異的含セレン蛋白質合成破綻マウスの作製に成功した。作製されたマウスは生後体重増加が観察されず運動失調が観察され生後3週以内に致死に至ることが明らかとなった。そこで、Nrf2遺伝子欠損マウスと交配し、SeCys-tRNAおよびNrf2の二重欠損マウスを作成したところ、SeCys-tRNA単独欠損マウスと比較して早期に死亡し、特に小脳部位の変性が進行することが明らかになった。以上の研究成果は、含セレン蛋白質群が神経組織において恒常性維持に必須な防御機構であり、またその防御機構の破綻状態に対してNrf2が保護的に働いていることを強く示唆する。特に、小脳における両者の生体防御系の重要性が明らかになったことは、脊髄小脳変性症などの難病治療につながることを示唆しており、セレン欠乏予防やNrf2誘導剤の摂取が酸化ストレスに起因する神経変性疾患の予防に有効であることを支持する。
高静水圧処理による環境負荷の少ない微細構造の洗浄方法に関する研究

モールドと呼ばれる微細構造を持った金型を樹脂に押しつけ微細構造を簡易に低コストで量産できるナノインプリントという加工技術が注目されている。この有用な方法でも転写を繰り返すと樹脂がモールドに付着してしまう問題が指摘されている。そこで本研究では従来の方法よりもより効果的にモールドに付着した樹脂を除去する方法として高静水圧処理検討した。その結果、効率的な除去条件を決定できたとともにそのメカニズムの解明を行うことができた。アクリル樹脂およびUV硬化樹脂をそれぞれモールド表面全体に均一に付着させ除去実験用の樹脂付着モールドを作製した。モールドはライン、ホール、ドットの微細構造を持ったアスペクト比1(高さ10 μm、幅10 μm)のSi製のものを用いた。アクリル樹脂については溶解度パラメーターを参考に酢酸エチル、ベンゼン、トリクロロエチレン、クロロホルム、酢酸メチル、アセトンを洗浄液とし、25と45°Cにおいて常圧で各洗浄液に8時間浸漬した後の洗浄効率を確認した。その結果、最大で70%程度しか除去できなかった。そこで、加圧処理(装置の関係で最大400 MPaで加圧)を行い除去効果があるか洗浄(処理)前と後で電子顕微鏡観察し付着している樹脂の面積から除去率を調べた。その結果、常圧で最も除去率が高かった酢酸エチルではほぼ100%の除去ができた。また、常圧では除去率が低いが体に害が少ないエタノールでも加圧減圧を繰り返すことで効率的に除去できる結果が得られた。一方、UV硬化樹脂ではオゾンが有効との報告もありオゾン水で除去を試した。しかし、12ppmで行った結果では最大15%程度と低い除去率しか得られなかった。そこで、予備実験で比較的高率の良かったフェノール水溶液で除去を行った。フェノール飽和(8 w/v%)水溶液で常圧のもと50および60°Cで10時間浸漬したところ全てのパターンでは高い除去率は得られなかった。そこでフェノール濃度を高めるためにエタノールに溶解させて41 w/v%フェノールエタノール溶液で洗浄を試みた。常圧・45°Cにおいて浸漬4時間した結果、ラインパターンにおいて除去率が45%程度に上がることが分かった。さらに400 MPaで加圧・減圧の繰り返し処理を行うと全てのパターンでほとんど除去することができた。まだ追試は必要であるが加圧処理が樹脂の除去に有効である事が明らかとなった。微細構造の洗浄は今後ますます重要になると考えられ、静水圧処理による洗浄を提案している。微細構造の除去には様々な方法がこれまで提案されているが必ずしも十分な効果が得られていない。超音波は樹脂を除去できる可能性はあるがモールドの微細構造を壊してしまう危険性がある事が指摘されている。そこで、まず、超音波で処理してみたところ微細構造の一部が壊れた。一方、高静水圧処理では見られておらず、高静水圧処理がモールドに対してダメージを与えにくいことが確認できた。本年度はさらに静水圧処理で除去できるメカニズムの解明のためにUV硬化樹脂のブロックを用いて形状変化や質量変化のフェノール濃度(浸漬液)・温度・圧力依存を調べた。その結果、予想に反してひび割れや重量の変化等、常圧のほうが単に樹脂へのダメージという点では影響が大きい可能性が高いことが示唆された。つまり、これまでの結果を総合すると高圧処理で樹脂とモールドの隙間に効率的に洗浄液が浸透する。常圧では効率的に樹脂の中にフェノールが浸透し、樹脂の膨潤やダメージを与える。さらにこのような状態の樹脂に加圧減圧を繰り返すことでモールドから樹脂を剥ぎ取りやすくなる。また、常圧で膨潤・ダメージを受けた状態の樹脂を加圧することで圧縮される。この加圧減圧を繰り返すと樹脂に対してより効率的にダメージを与えることができはがれやすくなっているという除去メカニズムが考えられた。さらにモールドから除去される過程の樹脂を観察してみると、特にライン状の微細構造においてよく観察できたがラインに沿った長い樹脂がきれいに浮いてきてほかの除去された樹脂と絡み合って固まりとなっていることが分かった。したがって、観察結果からもフェノールで樹脂が溶解したのではなくモールドと樹脂の接着性を弱めて除去していることが考えられ前述のメカニズムを示唆していると考えられる。現在までにほぼ当初の予定通りに研究は進捗している。アクリル樹脂およびUV-硬化樹脂において樹脂の種類は異なっても加圧減圧の繰り返しが除去には効率的であるという事はほぼ間違いないことが分かってきた。洗浄液(浸漬液)の選定においては一つの目安として溶解パラメーター(SP値)を当初考えていたが特にUV-硬化樹脂ではSP値との関係は必ずしも無いことが示唆された。そこで、なぜ除去できるかその理由を探るためにUV-硬化樹脂のブロックを用い、浸漬液は効果の高かったフェノールを用いて樹脂へのダメージ等を詳細に調べることとした。まず、常圧で調べた結果樹脂が壊れる、硬度が低下する事が分かった。さらに浸透液のスペクトルから樹脂は溶解していない可能性が高いことが示唆された。一方、400 MPa、50°Cで実験を行ったところ、予想に反して常圧に比べ樹脂の形状変化や硬度低下が観測されなかった。さらに、モールド(ライン構造)に付着したUV-硬化樹脂を観測するとラインに沿った長い樹脂がきれいに浮いてきてほかの除去された樹脂と絡み合って固まりとなっていることが分かった。

従って、当初予定していた浸漬液のNMR、HPLCでの系統的な解析は行わないこととした。以上の結果高静水圧処理で樹脂とモールドの隙間に効率的に洗浄液が浸透する。常圧では効率的に樹脂の中にフェノールが浸透し、樹脂の膨潤やダメージを与える。さらにこのような状態の樹脂に加圧減圧を繰り返すことでモールドから樹脂を剥ぎ取りやすくなる。また、常圧で膨潤・ダメージを受けた状態の樹脂を加圧することで圧縮される。この加圧減圧を繰り返すと樹脂に対してより効率的にダメージを与えることができはがれやすくなる可能性が高いという除去メカニズムが現在までに明らかとなってきた。ナノインプリントリソグラフィーという技術は半導体等の微細構造を安価でかつ簡易に作成する技術として非常に有望であるが樹脂が付着し、作成した微細構造に欠陥が生じる問題がある。そこでこれまでにない方法として高静水圧処理を用いたモールドに付着したUV硬化樹脂の効率的除去条件に関する研究を行った。その結果、まず常圧で浸漬することで樹脂を膨潤・軟化させダメージを与える。続いて、加圧保すると樹脂が圧縮され、さらに樹脂とモールドの微細な隙間に洗浄液が侵入する。最後に急速な減圧により、剥ぎ取り効果が生まれ樹脂がモールドから剥ぎ取られる。これらの処理を繰り返し行うことで効率的に樹脂除去できるという除去メカニズムが前年度までに考えられた。本年度はまず常圧・50°Cで樹脂をフェノール溶液に浸漬したとどれくらいの時間でダメージを受けるか10時間まで詳細に調べた。その結果、形状、重量変化、硬度ともに約90分までは時間と共に変化するがそれ以上10時間まではほぼ変化が観測されなかった。従って、常圧で浸漬する時間は2時間が妥当であることが示唆された。そこで、1高静水圧処理を行わない常圧浸漬10および20時間処理、2これまで行ってきた常圧浸漬15分間の後に加圧保持5分間の繰り返しを10回、3今回得られた至適条件の常圧浸漬2時間の後に加圧保持5分間を10回の条件でホール、ドット、ラインパターンのモールドに付着したUV硬化樹脂の除去実験を行った。その結果、1の処理で5060%、2の処理で5080%、3の処理では8696%(一部再付着と考えられる樹脂が観測されて100%とはならなかった)の樹脂除去率を示した。従って、全パターンにおいて、3常圧浸漬2時間の後に加圧保持5分間を10回繰り返すことで、非常に効果的に付着樹脂を除去できることが示されたと共に提案した効率的樹脂除去メカニズムが妥当であることが示唆された。モールドと呼ばれる微細構造を持った金型を樹脂に押しつけ微細構造を簡易に低コストで量産できるナノインプリントという加工技術が注目されている。この有用な方法でも転写を繰り返すと樹脂がモールドに付着してしまう問題が指摘されている。そこで本研究では従来の方法よりもより効果的にモールドに付着した樹脂を除去する方法として高静水圧処理検討した。その結果、効率的な除去条件を決定できたとともにそのメカニズムの解明を行うことができた。実験の進行状況としては当初の予定通り、アクリル樹脂およびUV硬化樹脂樹脂において付着条件の検討を行い条件が決定された。
重症実験脳損傷における脳水分量、脳局所グルコース代謝及び脳局所血液量の変化

【方法】S-Dラット(雄350450gm)に抱水クロラールで麻酔し、左大腿動静脈にカテーテルを留置後、右側頭部にポリエチレンチューブを固定、fluid-percassion impact (平均5.0 atm)を加えた。ラットは受傷後、I群:15分(n=4)、II群:30分(n=3)、III群:45分(n=4)、IV群:60分(n=3)、V群:120分(n=3)、VI群:24時間(n=3)後に各々2-DGを投与した。optical densityは受傷部、受傷部辺縁(rim)、両側皮質、海馬、視床、基底核、小脳虫部で計側し、Sokoloffの原法に従ってLCGUを計算し、次いで測定各部と小脳虫部とのdevsitygic(ratio)を算出した。【結果】受傷直後挫傷部の2-DGの取り込みは低下しており、経過と共に更に低下し45分で最低となるが、1時間以降若干回復している。挫傷部と非挫傷部の境界領域のrimでは、2-DGの取り込みが受傷後45分1時間で著明に亢進し2時間でも続くが、24時間後では見られなくなる。小脳虫部とのdensityの比は、rimにおいて45分値が極端に上昇していた。【結論】実験頭部外傷後のLCGUの変化は、虚血損傷と類似した経過をたどることより、頭部外傷後の脳代謝には虚血が深く関っていることが示唆された。〔研究目的〕〔対象および方法〕50匹のSpragueーDawley ratsを抱水クロラ-ルで麻酔し、右側頭部にfluid percassion impact(4.2atm)を与えて頭部外傷を作成した。カルシウム拮抗剤の投与法にて実験は2つに分けられた。実験1(外傷前および外傷後投与):受傷10分前にPN200ー110(2.5mg/kg)またはvehileをi.v.bolus投与し、受傷後さらに同量を2時間持続投与した。実験2(受傷及投与):受傷3分後にPN200ー110(2.5mg/kg)またまvehicleをi.v.holusに投与し、さらに同量を受傷後2時間持続投与した。すべてのratは24時間後にneurological evaluationを受けた後,脳specific grovity測定に供された。尚、実験は全てdouble blind mannerで遂行され,統計的処理はMannーWhitney rankーsuntestおよびstudent's+testによった。〔結果〕〔今後の研究の展開に関する計画〕今後は同様の実験系を用いて脳局所ブルマ-ス代謝および脳局所血流量の変化を検討する。又、NMDA受交体拮抗剤・オピアト拮抗剤の効果に関しても検討を加える。【研究目的】カルシウム括抗剤(PN200ー11)の重症実験脳損傷における効果をneurological owfcomeと脳局所グルコ-ス代謝から検討した。【対象および方法】40匹のspragneーDawley ratsを抱水クロア-ルの腹腔内投与にて麻酔し右側頭部にgluid percassion impact(4.2atm)を与えて頭部外傷を作成した。カルシウム括抗剤の投与法にて実験は2つに分けられた。(実験1):外傷前および外傷後投与:受傷10分前にPN200ー11(2.5mg/kg)またはBehiclcを1V bolus投与し,さらに同量を2時間持続投与した。(実験2):受陽後投与:受備3分後にPN200ー11(2.5mg/kg)またはvohicheを1V blous投与し,さらに同量を受持後2時間持続投与した。すべてのratは24時間後に、neuw logocal evalaationを受けた後,2ーDeoxy glucose methodにて脳局所グルコ-ス代謝を測定した。尚、実験は全てdouble blind mannerで遂行され、統計的処理はManuーWhitnayrankーsum testおよびShudent's T田testによった。【結果】2.PN200ー11の受得後投与は、影響を与えなかった【今後の研究の展開に関する計画】今後は同様の実験系において,脳局所血液量の変化を検討する。又NMOA受容体括抗剤匡オビアト括抗剤の効果に関しても検討を加える。

挫傷部と非挫傷部の境界領域のrimでは、2-DGの取り込みが受傷後45分1時間で著明に亢進し2時間でも続くが、24時間後では見られなくなる。小脳虫部とのdensityの比は、rimにおいて45分値が極端に上昇していた。【結論】実験頭部外傷後のLCGUの変化は、虚血損傷と類似した経過をたどることより、頭部外傷後の脳代謝には虚血が深く関っていることが示唆された。
経頭蓋的高頻度磁気刺激の安全性と作用機序に関する基礎的研究

精神科領域における磁気刺激療法は臨床応用が先行し、基礎的研究とその安全性、特に高頻度磁気刺激(rTMS)に関しては試行錯誤の段階が現状である。精神科に置ける電気ショック療法の歴史がその治療機序が解明されないまま、ただ臨床に効果的であるとの理由で実施されてきた。このような理論に裏付けのないrTMS療法とならないよう本研究では以下のように実施した。(1)動物実験に本法を適用し脳にrTMSがいかなる影響を及ぼすかを検討した。(2)次に臨床に置いて健常コントロール群にrTMSが及ぼす作用をこの3年間において検討し、その結果は国際誌に掲載された。まず、rTMSの反復刺激によりラット脳におけるc-Fos発現を分子生物学的に検討した。その結果は、神経活動変化を反映するc-Fosは、脳内の広範囲の部位に出現するが電気ショックと比べて線条体に有意に多くc-Fosが出現するという興味ある結果を得た。次にrTMSの脳機能に与える光誘発電位法(VEP)で経時的に調べた。その結果、家兎対側後頭葉のYEPは潜時(N_2,P_2成分)は短縮しその振幅は有意に増大した。このことは、rTMSの反復刺激は脳に新しい神経回路網すなわち脳の可塑性が形成されることが判明した。また、反復rTMSはヒト脳波を指標として調べた。その結果、健常コントロール群の刺激部位の周辺の脳波周波数が1Hz以上早い周波数に刺激後の2分間位ではみられた。このことはヒトにrTMSで治療する場合、刺激後数分間は脳機能を活性化するので、その間は異常脳波の出現に注意すべきであることが示唆された。上記の結果は、rTMSが脳に新しい可塑性を生じることを意味し、また、rTMS後、短時間で脳を活性化することからrTMSの精神科領域への新しい治療法となることが示唆された。本年度は、高頻度磁気刺激(rTMS)によって脳が受ける影響を主として神経生理学的に検討した。何故なら、本法が精神科領域におけるうつ病などの電気ショック療法に代わる新しい臨床応用としての可能性をみることになるからである。実験には成熟雄性家兎20羽を用いた。深部脳波および皮質脳波では、両側の扁桃核、大脳皮質運動野および視覚領野より誘導記録した。これに対して、高頻度磁気刺激(rTMS)の10Hzを最大誘導電圧の80%で磁気刺激コイル(8の字コイル)を前頭葉に接着して5秒間毎日刺激した。本年度は電気刺激と対比してキンドリング形成(てんかん源性)をみた。その結果、深部の扁桃核を中心に異常波(スパイク)の出現がみられ、それが3ヶ月後経過しても残存した。けいれんなどの臨床発作は出現しないが、皮膚脳波より深部脳波にてんかん源性の波形の出現をみたことは世界で初めての現象である。この結果は、1999年度に開かれた世界臨床神経生理学会(プラハ)および同年東京で開かれた第29回日本脳波筋電図学会で発表した。本年度は、高頻度磁気刺激(rTMS)がてんかんモデルであるキンドリング現象完成家兎にいかなる影響を与えるかを検討した。何故なら、rTMSを臨床で使用する場合留意すべきことはTMS治療中及び治療後に痙攣を誘発したという報告があるからである。このことを視覚誘発電位を指標としてrTMSによる脳の可塑性という視点からも調べた。実験では成熟雄性家兎を用いた。

深部脳波(扁桃核)と皮質脳波(前頭及び後頭部の4部位)から脳波を導出した。rTMSは10Hzで最大誘導電圧の80%で磁気刺激コイルを前頭部に密着して毎日反復rTMSを行いそれを前出の誘発電位および有向コヒーレンス法で解析した。その結果、キンドリング完成家兎(てんかん家兎)は、rTMSによって対照に比べて、異常脳波の誘発がみられた。また誘発電位も対照と比べてその潜時が短縮しかつ振幅も優位に大きくなった。このことから、臨床においてもてんかん患者など痙攣素因のあるものに対しては慎重にrTMSを施行すべきであると考える。この結果は、2001年度の日本生物学的精神医学会(長崎、4月)で発表の予定である。本年度は、ラット脳のいかなる部位に主として作用するかを早期発現遺伝に基づくc-Fosを指標として電気ショック療法(ECS)とその発現量を定量的に解析し、両者を比較検討した。何故ならrTMSは、非侵襲的治療法として侵襲的治療法であるECSに代わり得る可能性があるからである。実験にはラットを用いた。rTMS群、Sham-rTMS群、ECS群およびコントロール群に分けてそれぞれの処置を行い、c-FosをABC法により免疫組織染色を行った。その結果、rTMS群(6回)では、Sham-rTMS群にくらべて前頭皮質、海馬歯状回および扁桃核とで有意に多くのc-Fosが出現した。ECS群では、rTMS群より有意にc-Fosが著明に出現した。しかし、線条体においてのみrTMS群の方がECS群より有意にc-Fosの出現が多いという興味ある結果がえられた。この結果は、NeuroReport, 12:1307-1310, 2001に掲載された。
認知構造と英語の文の韻律構造との対応の研究

平成6年度は、述部/動詞の意味特性と文アクセントとの関係に焦点をあてた研究が中心となった。その研究の結果、述部/動詞の文アクセントの有無に関与しているふたつの意味的要因が明らかになった。ひとつは、述部/動詞が行為を示すか否かであり、もうひとつは、述部/動詞が主語の一時的特性を示すのか永続的な特性を示すのか、ということである。具体的には、現代英語において、述部/動詞が新情報の領域を形成している場合、「行為述語は文アクセントを担うが、非行為述語は、文アクセントを担わない」という一般化が成立する。そして、この一般化を用いれば、今まで別個に説明されてきたいくつかの種類の例を統一的に説明できることが明らかになった。さらに、行為対非行為の対立は、純粋に認知意味論的なものであるので、文法の枠組みに、「意味・音韻写像規則」を設定すべきことも明らかになった。しかしながら、上述の一般化には、例外が存在する。そのうちの多くは語用論的要因によって説明できるが、語用論では説明できない例も存在するので、そのような例の説明を試みた。語用論的要因によって説明できない例は述部が主語の一時的特性を示すか否かという視点から説明できる。具体的には、「非行為述語のうち、主語の一時的特性を示すものは、上述の一般化のとおり文アクセントを担わないが、非行為述語でも主語の永続的特性を示すものは文アクセントを担う」という一般化が成立する。上記二つの研究成果のうち、前者は、日本言語学会の機関誌『言語研究』に論文として投稿し、審査の結果採用され、平成7年中には出版されることが決定している。(現在印刷中。)また、後者は、Tsukuba English Studiesの13巻に、論文として、平成6年度中に発表している。(現在印刷中。
神経・内分泌・免疫系クロストークの視点からみた侵襲反応の解明

侵襲反応において中枢神経・内分泌・免疫系は相互に影響を及ぼしあっているが、その首座は中枢神経にあると考えられる。本研究では、ここに焦点を絞り、以下の4点について研究を行った。(1)侵襲に伴う内因性サイトカインバランスと白血球機能に関する研究、(2)炎症・抗炎症反応のバランスに関する研究(3)脳死患者における異所性抗利尿ホルモン(ADH)産生への末梢血白血球の関与に関する研究、(4)中枢神経傷害時の病態と脳低温療法の効果に関する研充。(1):中枢神経傷害を伴わない急性病態では、血中の炎症性サイトカイン濃度が上昇し、白血球機能の亢進、アポトーシスの抑制がみられ、全身の生体反応が炎症優位となった。一方、中枢神経傷害を伴う場合は血中の抗炎症性サイトカインや炎症性サイトカイン抑制因子が増加し、生体は抗炎症状態に傾いており中枢神経傷害時の免疫能の低下や易感染性の原因となることが示唆された。逆に脳死状態では、中枢神経系の全身への制御が消失しており、生体は強い炎症反応状態になった。(2):急性病態では白血球核内NF-кBが著明に上昇した。この変化は白血球機能と正の相関を示し、白血球が活性化された災症優位の状態と考えられた。また外傷、敗血症時には白血球の熱ショック蛋白(HSP)の発現が亢進し、白血球の機能変化にHSPが重要な役割を果たしていることが示唆された。一方、中枢神経障害時の易感染性には、HSP60の機能低下が関与することを示した。(3):脳死後の血中ADH分泌の機序について末梢血白血球における遺伝子発現をPCR法で検討し、ADHの遺伝子が白血球細胞に誘導されていることを確認した。この結果は免疫機能を司る白血球に、臓器におけるホルモン分泌障害を補助する機能が存在する可能性を示唆するものである。(4):重症頭部外傷患者に中等度能低温療法を施行した結果、中等度脳低温療法は頭蓋内圧の降下作用により効果があることが明らかとなった。一方、頭蓋内圧の高くない重症頭部外傷では、中等度脳低温療法は合併症の頻度を増加させるだけで、頭部外傷の予後には効果がないことが判明した。侵襲反応における中枢神経・内分泌・免疫系の相互について以下ことを明らかにした。(1)中枢神経の傷害を伴わない急性病態(重度外傷・敗血症など)における血中・髄液内サイトカインの変動、ならびに白血球機能の経時的変化を測定し相互関係を明らかにした。外傷急性期や敗血症時には白血球の活性酸素の産生能は、無刺激でも(プライミング)、FMLP刺激時にも亢進した。またこれらの侵襲時には血中の炎症性サイトカインが上昇し、同時に白血球数の増加、貧食能の維持、熱ショック蛋白(HSP)の発現量の亢進、アポー卜シスの抑制等の生体防御機能が高まることを明らかにした。

一方、敗血症から多臓器不全(MODS)の進展過程でこれらの反応性は低下し、白血球機能やサイトカインバランスが破綻することが明らかとなった。この時の反応からは炎症性サイトカイン(IL-6)が異常高値となるfulminate MODSと、炎症性サイトカインの上昇に比し抗炎症性サイトカイン(IL-10)が著しく上昇するpersistent MODSに分けられた。(2)中枢神経の傷害時ならびに脳死前後に同様の測定を行い、免疫反応の制御における中枢神経の役割を明らかにした。重症頭部外傷時にも白血球のプライミング、FMLP反応性は亢進し、アポトシスは抑制された。経過中にセカンドヒットとして感染を合併すると、これらの反応はさらに増加した。重症頭部外傷患者の血液・髄液中のサイトカインならびにグリア細胞の損傷の指標であるS-100蛋白の変化を測定した結果、髄液中のサイトカイン濃度は受傷6から12時間後に上昇した。S-100蛋白はそれよりも先行して上昇する傾向にあった。髄液中と血液中ではサイトカイン濃度に格差を認め、重症頭部外傷時には他の外傷や敗血症時に見られる高サイトカイン血症とは別に、損傷脳からもサイトカインが産生されることが示唆された。また重症頭部外傷患者でもI-ISPが受傷35病日にピークとなり以後正常に復することを報告した。しかし、免疫反応に関与するHSP60は脳低温療法施行時の重症頭部外傷時には初期から低値が持続し、易感染性の原因になることが示唆された。脳死に至る過程で、プライミング指数、FMLP反応性は亢進した。また脳死に伴い著しい血中IL-6の上昇とIL-10の低下を認めた。さらに血中コルチゾール値は低下した。以上より、脳死に伴いサイトカインバランスは炎症性方向に崩れ、白血球は急激に著しいプライミング状態を来す。脳死によるサイトカインバランスの崩壊時には血中コルチゾール値の低下を伴うことが明らかとなった。(3)ステロイド投与寺の細胞内サイトカインと転写因子NF-κB、グルココルチコイドレセプター(GR)の相互関係の研究ステロイドを投与した患者の白血球細胞におけるNF-κBとGR、IL-6の発現をPCR法にて評価した。その結果、投与前にはNF-κBとIL-6は増加しており、GRは抑制されていた。これに対してステロイド投与後は、NF-κB、IL-6値は低下した。この結果より外因性のステロイドが転写活性を抑制し、その結果、炎症性のサイトカインの産生を抑制したと考えられた。侵襲反応における中枢神経・内分泌・免疫系の相互作用より、侵襲に伴う免疫反応の機序について以下のことを明らかにした。1)侵襲時(中枢神経傷害を伴う場合と伴わない場合)の免疫反応の違いについての研究。中枢神経傷害を伴わない場合では、血中の炎症性サイトカインであるIL-1βやTNFα、IL-6,8が上昇し、同時に白血球機能は亢進した。この変化は生体反応が炎症優位の状態にあるものと考えた。中枢神経傷害を伴う場合(多くが頭部外傷)では、損傷の起きた局所(脳)で、上記の炎症性サイトカインが産生され、髄液中の濃度は血中の数十倍から数百倍の高値であった。一方、抗炎症サイトカインのIL-10や炎症性サイトカイン制御因子のsTNFr、IL-1raは、血中の濃度が髄液中の濃度を上回った。この結果は、中枢神経傷害を伴う侵襲時には生体は抗炎症状態に傾いており、中枢神経傷害時の免疫能の低下や易感染性の原因となることが示唆された。この現象は、中枢神経系の全身への制御が消失した脳死状態において完全に逆転した。すなわち、抗炎症性サイトカインが有意に低下し、炎症性サイトカインが著明に増加した。
核内受容体の翻訳後修飾と相互作用因子の局在を介した新たな転写制御機構の解明

核内受容体PPARやLXRは栄養成分である不飽和脂肪酸やコレステロールなどをリガンドとし、脂質の蓄積、代謝などの役割を担っている。今回我々は、新規PPARα活性化化合物の開発に成功し、in vivoにおいて血中トリグリセリド値の低下効果を発揮すること、また、LXRによって遺伝子レベルで発現制御を受ける脂質代謝制御分子LPIN1について、その蛋白質の分解制御機構を解明した。さらに、脂質代謝に関わるヒストンメチル化酵素SETDB1の局在制御機構並びに翻訳後修飾を介した活性制御機構を明らかにした。これら成果は、生活習慣病を予防・治療できる薬剤の開発に繋がる可能性があり、非常に意義深いものである。肥満を基盤とする生活習慣病の発症を予防・改善することは、健康長寿社会を実現するために重要である。PPARγやヒストンメチル化酵素SETDB1は互いに影響を及ぼしながら、脂肪細胞の分化において重要な役割を果たす。これまでに我々は、SETDB1が細胞質に多く存在すること、プロテオーム解析によりSETDB1タンパク質がリン酸化を受けることを明らかにしてきた。これらから、SETDB1のリン酸化の状態が細胞内局在に影響を与える可能性を考えた。そこで、種々のリン酸化酵素阻害剤を細胞に処理した時のSETDB1の局在を解析した。その結果、いずれの阻害剤で処理してもSETDB1は細胞質に多く局在した。次に、SETDB1が細胞質に多く存在する原因として、SETDB1が核から細胞質に排出される可能性やプロテアソームにより分解を受ける可能性を考えた。そこで、それら阻害剤を用いて解析した結果、SETDB1は核内から細胞質に排出されること、核内においてプロテアソームにより分解を受けること、その結果としてSETDB1が細胞質に多く存在することが示された。PPARγもある種のシグナルにより核内から細胞質に排出されることから、これら局在変化の関連性を解析することが新たな活性制御機構の解明に繋がると考えられる。また我々は、PPARの転写活性化能の評価系を独自に開発してきた。そこで、構築したスクリーニング系を用いて植物抽出液からPPARの転写活性を制御する成分を探索した。その結果、PPARの転写活性を上昇させる植物抽出液をいくつか得ることができ、その抽出液から活性成分を単離した。単離した成分を細胞に処理した結果、PPARの標的遺伝子ANGPTL4の発現量が上昇した。従って、本成分を含む植物抽出液が、生活習慣病を予防・治療できる機能性食品や薬剤の開発に繋がる可能性がある。本研究課題では、生活習慣病の予防・治療の標的分子である核内受容体PPARの活性制御機構を相互作用因子や翻訳後修飾などに着目して解明し、新たな活性化剤を開発することでそれら疾患の予防・治療方法の研究基盤を確立することを目的とする。脂肪細胞の分化においてPPARγと共に機能するヒストンメチル化酵素SETDB1に関して、その局在の制御機構について解析した。種々の酵素阻害剤を用いて解析した結果、SETDB1は核内から細胞質に排出されること、また、核内においてプロテアソオームにより分解を受けることを明らかにした。脂肪細胞の分化においては、SETDB1がヒストンH3の9番目のリジンをメチル化することで分化を抑制していると考えられている。今回明らかにしたSETDB1の局在制御のメカニズムは、脂肪細胞の分化の仕組みの解明に繋がる可能性があり、興味深い成果であると考えられる。一方、生活習慣病の予防・治療方法を確立するためには、PPARの活性を制御できる分子の開発が重要である。そこで、独自に構築したスクリーニング系を用いて植物抽出液を評価した結果、PPARの活性を向上させる抽出液が得られ、その主成分を同定した。本成分を含む植物抽出液は、生活習慣病の予防・治療のための食品や医薬品に繋がる可能性があり、非常に意義深いと考えられる。このように本研究は、概ね順調に進展していると考えられる。健康長寿社会を実現するためには、心疾患や脳血管疾患などの原因となる動脈硬化性疾患の発症を防ぐことが重要である。核内受容体PPARやLXRは栄養成分である不飽和脂肪酸やコレステロールなどをリガンドとする転写因子であり、様々な因子と直接あるいは間接的に相互に影響を及ぼし合うことによってその機能が制御されており、脂肪細胞の分化や脂質の蓄積、肝臓や骨格筋での脂質の代謝などの役割を担っている。これまでに我々は、脂肪細胞の分化に関わるヒストンメチル化酵素SETDB1について、リン酸化を受けること、核から細胞質に排出されること、核内においてプロテアソームにより分解を受けることを明らかにし、SETDB1の局在と安定性に関する知見を得てきた。さらに研究を進めた結果、SETDB1のC末端側が翻訳後修飾を受けること、その修飾がユビキチン化修飾であることが示された。さらに、867番目のリジン残基がユビキチン化修飾を受け、その結果ヒストンH3の9番目のリジン残基に対するメチル化酵素活性が増強すると共に、標的遺伝子の発現を制御していることを明らかにした。今後、SETDB1の翻訳後修飾を制御する仕組みが明らかになれば、脂肪細胞の分化を明らかにできる可能性がある。一方、我々は独自に構築したPPARリガンド評価系を用いて、植物抽出液からPPARを活性化する成分の単離を行ってきた。今回、化合物ライブラリーを用いてスクリーニングを実施した結果、既存のリガンドとはまったく異なる構造を持つ化合物が得られた。

実際に本化合物がPPARを活性化することは、培養細胞を用いた標的遺伝子の発現量の変化を解析することで確認することができた。今後、本活性化剤の解析を進めることで、生活習慣病を予防・治療できる薬剤の開発に繋がる可能性がある。本研究課題では、脂質代謝制御に深く関わっている核内受容体やそれらと関連する因子について、翻訳後修飾や局在などに着目して解析し、生活習慣病の予防・治療に繋がる新たな活性化剤を開発するための研究基盤を確立することを目的とする。脂肪細胞において、核内受容体PPARγとヒストンメチル化酵素SETDB1は互いに影響を及ぼし合いながら分化を制御している。今回、SETDB1の翻訳後修飾と活性との関連を解析した結果、SETDB1のユビキチン化がH3K9のメチル化酵素活性を制御していることを明らかにした。SETDB1によるH3K9のメチル化によって脂肪細胞の分化が抑制されていると考えられており、今回明らかにしたSETDB1の翻訳後修飾による活性を制御するシステムは、脂肪細胞分化の制御機構の解明に繋がることから、重要な成果と考えられる。生活習慣病の予防・治療薬を開発するためには、PPARの転写を制御できる活性化剤の開発が重要である。今回我々は、独自に構築したPPAR活性化剤の評価系を用いて、化合物ライブラリーより新規PPAR活性化剤を得た。本化合物はこれまでのPPARリガンドとは全く異なる構造であり、新たな生活習慣病の予防・治療薬になり得る可能性があり、非常に意義深い結果である。このように本研究は、概ね順調に進展していると考えられる。心疾患や脳血管疾患の発症を防ぎ健康長寿を実現するには、エネルギー消費を活性化するメカニズムを解明し、肥満を予防・改善することが重要である。核内受容体PPARやLXRは栄養成分である不飽和脂肪酸やコレステロールなどをリガンドとし、リガンド依存的に標的遺伝子の発現を調節する。さらに、様々な因子と直接あるいは間接的に相互に影響を及ぼし合うことによってその機能が制御されており、脂肪細胞の分化や脂質の蓄積、代謝などの役割を担っている。これまでに我々は、核内においては核内受容体の転写を制御し脂肪酸の燃焼を促し、細胞質においては脂質の生合成を制御するユニークな脂質制御因子LPINが、LXRにより遺伝子発現レベルが誘導されることを明らかにしてきた。本研究では、LPIN蛋白質のDSGXXSモチーフがE3ユビキチンリガーゼであるBTRCによって認識されること、その結果細胞質中のLIPIN蛋白質がユビキチン-プロテアソーム系を介して分解を受けることを明らかにした。今回明らかにした分解制御機構を応用することで、LIPINの脂肪酸燃焼と脂質合成の相反する機能を制御できる可能性があり、興味深い成果であると考える。一方、これまでに見出してきた新規PPARα活性化化合物について、より詳細な解析を実施した。具体的には、フルクトースを付加することで血中トリグリセリド値が上昇したラットを高脂血症モデルとして用い、新規PPARα活性化剤を反復経口投与した時の影響を評価した。その結果、血中トリグリセリド値の低下効果、並びに、肝臓での標的遺伝子の発現上昇が確認できた。
CRISPR/Cas9ゲノム編集による筋ジストロフィー疾患モデルミニブタの開発

ジストロフィン遺伝子を欠損させたデュシェンヌ型筋ジストロフィーマイクロミニブタを開発することを目的にCRISPR/Cas9システムを用いたマイクロミニブタのゲノム編集方法の確立を試みた。マイクロミニブタのジストロフィン遺伝子のエクソン23を切断標的とし、4種類のsgRNAを設計した。DSB-HDRアッセイにおいて、最も切断効率の高かったsgRNA2種類を使用し、合計7回のゲノム編集操作を行ったが、6回目の操作においてのみ、3匹の仔ブタが出生した。各々の仔ブタの皮膚からDNAを抽出し、エクソン23の塩基配列を解析したが、目的の遺伝子欠失等の変異は認められなかった。CRISPR/Cas9システムを用いたマイクロミニブタのゲノム編集方法を確立し、既存の動物モデルであるマウスやイヌでの問題点を克服したジストロフィン遺伝子を欠損させた次世代型デュシェンヌ型筋ジストロフィーマイクロミニブタを開発することを目的に以下の実験を実施した。2)エクソン23の塩基配列から切断標的となる配列を複数決定し、CRISPR/Cas9ベクターであるpX330に20mer切断標的オリゴヌクレオチド(sgRNA)を挿入し、標的DNA切断プラスミドpX330-DMDEx23を4種類構築した。3)pCAG-EGxxFP-DMDEx23と各々のpX330-DMDEx23をHEK293T細胞にco-transfectionし、4種類全てのプラスミドが標的配列を切断することを確認し、最も切断効率が良かったpX330-DMDEx23プラスミドをインジェクションに使用することとした。4)家畜ブタの卵巣から未受精卵子を取り出し、培養することで成熟させた後、体外受精により得た受精卵の前核にpX330-DMDEx23を常法に従いマイクロインジェクションし、胚盤胞まで培養した。その胚盤胞からDNAを抽出し、PCRで目的のDNA断片を増幅し、塩基配列を決定したが、19個の胚盤胞全てにおいてゲノム編集されたことは確認出来なかった。5)3匹の排卵誘発した雌マイクロミニブタに人工授精して得られた約30個の受精卵の前核にpX330-DMDEx23を常法に従いマイクロインジェクションし、約20個の受精卵を1匹の仮親家畜ブタの卵管に移植したが、受胎しなかった。CRISPR/Cas9システムを用いたマイクロミニピッグのゲノム編集方法を確立し、既存の動物モデルであるマウスやイヌでの問題点を克服したジストロフィン遺伝子を欠損させた次世代型デュシェンヌ型筋ジストロフィーマイクロミニピッグを開発することを目的として、以下の実験を実施した。1)ゲノム編集用プラスミドのマイクロミニピッグ受精卵前核へのインジェクションによるゲノム編集操作を3回実施した。1回目は、14個、2回目は3個の胚を移植し受胎しなかった。3回目は、40個の胚を移植したが着床しなかった。2)ゲノム編集用合成crRNA+tracrRNA+Cas9蛋白の受精卵前核へのインジェクションによるゲノム編集操作を実施し、20個の胚を移植したが着床しなかった。3)ゲノム編集用合成sgRNAとCas9 mRNAの細胞質へのインジェクションによるゲノム編集操作を2回実施し、胚の移植をインジェクション当日に変更した。1回目は、104個の胚を移植し妊娠を確認しており、平成28年5月18日の出産予定である。2回目は、85個の胚を移植し着床を確認した。以上の結果から、マイクロミニピッグのゲノム編集方法として、操作が簡単な合成sgRNAとCas9 mRNA或は合成sgRNAと核移行シグナル付きCas9蛋白の受精卵細胞質へのインジェクションを行い、当日に仮親ブタへ40個以上の胚を移植する方法が有望であることが示された。また、将来の疾患モデルマイクロミニピッグを用いた幹細胞移植再生医療モデルシステムの構築のために、骨髄由来間葉系幹細胞の分離・培養方法を確立した。1回目のゲノム編集用プラスミドをインジェクションしたマイクロミニブタ受精卵を移植した仮親ブタで、何らかの理由で受胎できず、平成26年度内に産仔を得られなかったため、当初の計画よりもやや遅れていると自己評価した。実験動物学1)引続きゲノム編集用プラスミドのインジェクションを継続する(平成27年5月と6月に各1回実施予定)。2)異なる部位を切断する2つのゲノム編集用プラスミドのインジェクションについて検討する。3)ゲノム編集用プラスミドに代わり、sgRNAおよびCas9 mRNAの細胞質へのインジェクションについて検討する。マイクロミニブタからの受精卵の採取条件の検討に時間を要し、昨秋の発情期において、ゲノム編集用インジェクションを1回しか実施できず、平成27年度にゲノム編集用インジェクションを集中して実施するために、次年度使用額とした。

平成27年度は、マイクロミニブタの発情期の春秋各2回のゲノム編集用インジェクションを計画しており、採卵用マイクロミニブタ、仮親ブタ及び飼料の購入に使用する予定である。
肥満は父性遺伝するのか？

C57BL/6J(B6)マウスは高脂肪食により肥満や2型糖尿病になりやすく、長年代謝研究に用いられてきた。私達はPWKマウスが食事誘導性肥満になりにくいことを見い出した。そして食事誘導性肥満になりやすいB6と食事誘導性肥満になりにくいPWKを交互に交配して(PWK×B6) F1と(B6×PWK)F1の2種類のF1を作成し、B6が父親である(PWK×B6) F1では食事誘導性肥満になりやすいが、PWKが父親である(B6×PWK) F1では食事誘導性肥満になりにくいということを見出した。さらに、父性遺伝する食事誘導性肥満はインプリント遺伝子の発現と関係していると考え、白色脂肪におけるインプリント遺伝子の発現を解析したところ、父性発現遺伝子のPeg3とIgf2が高脂肪食を摂取することにより、発現が減少することを見出した。そこで、私達はB6、PWK、(PWK×B6) F1、(B6×PWK)F1の白色脂肪組織における次世代シーケンサを用いたRNA-seq解析を行い、父性遺伝する食事誘導性肥満の検証を行った。その結果、B6の父親アレル依存的に炎症やmetal ion transport、ciliumに関連する遺伝子発現変化が見られた。さらに肥満とインプリンティングの関係について解析したところ、父性発現インプリント遺伝子の発現は体重と負の相関を示す傾向があり、母性発現インプリント遺伝子の発現は体重と正の相関を示す傾向があることが明らかとなった。父性遺伝する食事誘導性肥満の候補遺伝子として、現在2つの遺伝子についてノックアウトマウスを作製し、現在解析中である。食事誘導性肥満になりやすいB6マウスと食事誘導性肥満になりにくいPWKマウスを交配し、F1マウスで解析をおこなったところ、食事誘導性肥満は父親から遺伝することを見い出し、さらにこの現象は父性インプリント遺伝子であるIgf2とPeg3の発現が関係していることを明らかにした(Morita S, et al. 2014)。そこで父性由来アレルにおける遺伝子発現変化が食事誘導性肥満を引き起こしているのではないかという仮説のもと、マウス白色脂肪組織における次世代シーケンサを用いたRNA-seq解析を行い、何が次世代に伝わっているのかを明らかにしようとした。平成28年度は1食事誘導性肥満になりやすいB6、2食事誘導性肥満になりにくいPWK、それらを交互に交配した3(PWK×B6) F1と4(B6×PWK)F1の4種類の白色脂肪組織における次世代シーケンサを用いたRNA-seq解析を行った。次に父性遺伝する食事誘導性肥満のメカニズムを明らかにするために、父性アレル依存的に変化する遺伝子群を抽出し、その解析を行った。例えば、食事誘導性肥満によりB6および(PWK×B6) F1で発現変化があるが、PWK、(B6×PWK) F1では発現変化がない遺伝子群を抽出し、その遺伝子群にどのような傾向があるかを調べた。B6の父親アレル依存的に炎症やmetal ion transport、ciliumに関連する遺伝子発現変化があることが明らかとなった。さらにインプリント遺伝子の発現解析を行った結果、父性インプリント遺伝子は食事誘導性肥満において発現が減少している傾向にあることが明らかとなった。また多型を利用して新規インプリント遺伝子を探索したところ、新規インプリント候補遺伝子を見つけることができた。1食事誘導性肥満になりやすいB6、2食事誘導性肥満になりにくいPWK、それらを交互に交配した3(PWK×B6) F1と4(B6×PWK)F1の4種類のマウス白色脂肪組織における次世代シーケンサを用いたRNA-seq解析を行い、遺伝子発現変化の傾向を明らかにすることができた。私達は、食事誘導性肥満になりやすいB6と食事誘導性肥満になりにくいPWKを交配することで、食事誘導性肥満は父親から遺伝することを見出し、さらにこの現象は父性インプリント遺伝子であるIgf2とPeg3の発現と関係していることを見出した(Morita S, et al.2014)。父親由来アレルにおける発現変化が食事誘導性肥満と耐糖能異常を引き起こすという仮説をたて、父性遺伝する食事誘導性肥満のさらなる解析を行うためマウス白色脂肪組織における次世代シーケンサを用いたRNA-seq解析を行い、何が次世代に伝わっているのか、その原因となるものは何かを明らかにしようとした。1:食事誘導性肥満になりやすいB6、2:食事誘導性肥満になりにくいPWK、それらを交互に交配した3:(PWK×B6) F1と4:(B6×PWK)F1の2種類のF1を作成し、白色脂肪組織における次世代RNA-seq解析を行い、父性遺伝する食事誘導性肥満の検証を行った。その結果、B6の父親アレル依存的に炎症やmetal ion transport、ciliumに関連する遺伝子発現変化が見られたが、PWKが父親の場合にはそのような発現変化は見られなかった。食事誘導性肥満になりやすいB6と食事誘導性肥満になりにくいPWKの白色脂肪組織について解析を行った。PWKの白色脂肪組織ではUCP1の発現が非常に高いことが明らかとなった。PWKがHFD摂取しても太りにくいのはこのことによるかもしれない。また父親由来あれるがB6であるとUCP1の発現が低い。父性遺伝する高脂肪食肥満の要因となると考えられる。

1:食事誘導性肥満になりやすいB6、2:食事誘導性肥満になりにくいPWK、それらを交互に交配した3:(PWK×B6) F1と4:(B6×PWK)F1の2種類のF1を作成し、白色脂肪組織における次世代RNA-seq解析を行い、父性遺伝する食事誘導性肥満の検証を行った。そして、父性遺伝する遺伝子群、さらに、食事誘導性肥満になりにくいPWKにおける遺伝子発現の特徴をとらえることができた。C57BL/6J(B6)マウスは高脂肪食により肥満や2型糖尿病になりやすく、長年代謝研究に用いられてきた。私達はPWKマウスが食事誘導性肥満になりにくいことを見い出した。そして食事誘導性肥満になりやすいB6と食事誘導性肥満になりにくいPWKを交互に交配して(PWK×B6) F1と(B6×PWK)F1の2種類のF1を作成し、B6が父親である(PWK×B6) F1では食事誘導性肥満になりやすいが、PWKが父親である(B6×PWK) F1では食事誘導性肥満になりにくいということを見出した。さらに、父性遺伝する食事誘導性肥満はインプリント遺伝子の発現と関係していると考え、白色脂肪におけるインプリント遺伝子の発現を解析したところ、父性発現遺伝子のPeg3とIgf2が高脂肪食を摂取することにより、発現が減少することを見出した。そこで、私達はB6、PWK、(PWK×B6) F1、(B6×PWK)F1の白色脂肪組織における次世代シーケンサを用いたRNA-seq解析を行い、父性遺伝する食事誘導性肥満の検証を行った。その結果、B6の父親アレル依存的に炎症やmetal ion transport、ciliumに関連する遺伝子発現変化が見られた。さらに肥満とインプリンティングの関係について解析したところ、父性発現インプリント遺伝子の発現は体重と負の相関を示す傾向があり、母性発現インプリント遺伝子の発現は体重と正の相関を示す傾向があることが明らかとなった。父性遺伝する食事誘導性肥満の候補遺伝子として、現在2つの遺伝子についてノックアウトマウスを作製し、現在解析中である。次世代シーケンサを用いたRNA-seq解析を行って得られたデータより、食事誘導性肥満において父性アレル依存的に変化する遺伝子群の中から特に重要と思われる遺伝子を取り上げて解析を進めていく。次世代RNA-seq解析より、食事誘導性肥満に関連する遺伝子を明らかにしてきた。それらのノックアウトマウスを作成していく予定である。次世代シーケンサのデータ解析等が順調に進んでいるため、研究分担者の分担金を使用する必要がなかったため。使用する予定だった必要試薬の量が少なくてよかったため。マウスや必要試薬を購入予定である・次世代シーケンサのデータ解析より抽出した遺伝子群の解析に使用する予定である。
基盤研究に基づく体系的がん治療

本研究領域はがんの基礎研究によって得られた知見を駆使し、科学的な基盤的研究に基づく新たながんの治療法の開発を目的とした。ヒト化抗CCR4抗体が再発難治性のCCR4陽性の成人T細胞性白血病リンパ腫であること、脳腫瘍のがん幹細胞に対してTGF-β拮抗剤が有効であること、抗FGFR1MoAbを用いた治療法が新しい肝癌に対する治療法となる可能性が高いことなどが報告された。がんの基礎研究によって得られた成果を臨床治療へ実現化させるための組織運営、応用に関わる話し合い、各領域部門の活性化に向けて、本年はその研究目的に合った研究計画の厳選を行ってきた。「がん・ゲノム・脳領域審査委員会」の聴講会を経て本領域の選択も決定された。平成17年度から本格的に開始される各研究計画を、A01がん化機構を基盤とした分子創薬と分子標的治療、A02遺伝子治療の新戦略、B01免疫・細胞療法の基礎と応用、B02ドラッグデリバリーシステムの開発、B03新しい物理療法の開発の5項目に視点を置いて分類し、各分野長との研究推進に関わる討議を重ねてきた。がんのトランスレーショナルリサーチ(TR)の推進を図るべくTR委員会の設置、TRに関わるシンポジウムを開催し、その重要性の再確認とともにTRへの取り組みへの基本的考え方、及び具体的な事業展開の方法についても検討できた。平成16年度文科省による「がんトランスエーショナルリサーチ事業」の研究公募の中で採択された10件のうち3件が本領域の計画研究者から選出されその研究計画の内容が高く評価された。各代表的な研究計画においてこれまでの臨床治療薬開発のための研究を発展させており、ケモカインレセプターやErbB-2を標的とした抗体療法の前臨床試験、TGF-β-への拮抗低分子化合物による腫瘍浸潤の制御研究、遺伝子治療のための遺伝子置換法、ドラッグデリバリーシステム、標識抗体付加による抗体・化学療法剤の効果増強に対する基盤研究を発展させた。尚、備品としてのパソコンは、今年から開始された特定領域「基盤研究に基づく体系的がん治療」領域の事務局として、情報、データ、報告書の一括把握整理の為必須のものであり、購入した。平成16年度は5領域の正副代表者会議などを開催しつつ統合総括班と連携を取りながら、平成17年度以降に向けて推進体制について議論してきた。具体的には「がん特定領域計画研究代表者とTR応募者の重複について」、「がん特定領域計画研究者の他の研究費への応募について」、「了承事項の周知、実施、改訂等について」などである。また、計画研究費の内約額については充足率が低く、公募研究の充実なども併せ、今後の研究体制のあり方や要望事項について検討を行った。平成17年度はTR検討委員会と連携を取り、5月にトランスレーショナルリサーチワークショップ「がんのTR推進のための連携構築にむけて」では文部科学省・厚生労働省・医薬品機構・日本製薬工業協会とともに、TRの具体的案が提唱され、完成に向け議論していくことが決定された。また、9月には中間報告が実施され、本領域は「A(このまま続けてよい)」という高い評価を受けた。がん・ゲノム・脳領域審査委員会からの審査結果通知や研究費補助金審査部会・統合がん専門委員会での審査状況などを踏まえながら、平成18年度以降の推進方策について検討を行い、次期の計画研究の認定を行った。来年度には6月1日には第5回トランスレーショナルリサーチワークショップを開催する予定である。(各種会議の開催状況)平成17年5月30日第4回TRワークショップ平成17年6月22日第四回「がん特定」5領域正副代表者会議平成17年7月5日第一回「がん特定」5領域研究代表者会議平成17年8月18日第一回「がんのトランスレーショナルリサーチ」小WG会合平成17年8月29日第五回「がん特定」5領域正副代表者会議平成17年9月6日文部科学省による中間ヒヤリング平成18年2月6日第二回領域1「統合がん」統合総括班会議第二回領域4「がん診断と疫学」・領域5「がん治療」合同総括班会議平成18年2月67日厚生労働省がん研究組織と合同シンポジウム平成18年度は、昨年度に引き続き、TR委員会との連携を深め、6月の第5回トランスレーショナル・リサーチワークショップでは、がんTR・創薬促進インフラ整備、がんTRが国民理解・協力を得るための諸課題について、議論を深めた。同月には第6回TR懇談会、7月には第2回がん特定領域研究代表者会議、及び領域別会議開催、平成19年2月には5領域研究班合同公開シンポジウムを開催し、領域を超えての研究協力体制を固めた。また、平成19年秋に行われる中間発表にむけて、来る6月に東京にて全研究責任者参加のもとに合同発表会を東京にて開催する計画とした。