hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
小グループでの学習に関する教師の実践知の検討

本研究の目的は、小グループでの学習に関する教師の実践知を明らかにすることであった。小グループでの学習時における教師の支援やその際の思考の特徴を検討した結果、(1)教師は直接関わらないで学習者を見取り、その後の支援を検討することに多くの時間を費やしていること、(2)その際に学習者についての知識や教材に関する知識を基に学習者の問題解決過程および関わりの様子を見取り、驚きや後悔といった情動を経験しながら、学習者に委ねる、あるいは思考や関わりを促す支援を行うなどの判断をしていることが示された。これらの知見は、小グループでの学習の質を高めるための教師の実践知であると同時に、実践を省察する視点となる。第1に、小グループでの学習時における教師による学習者への働きかけにはどのような特徴があるのか、小グループでの学習時における教師の即興的思考にはどのような特徴があるのかを明らかにするために、本年度は年間にわたりデータ収集を行った。具体的には、授業観察および授業についての半構造化面接を7名の教師(小学校4名、中学校3名)を対象に実施した。第2に、これらのデータのうちの一部を分析し、小グループでの学習時における教師の即興的思考にはどのような特徴があるのかを探索的に検討した。結果、小グループでの学習時における教師の即興的思考の特徴として,個人レベルだけでなく,グループレベル,教室全体レベルで子どもの学習状況を見取っていること,学習内容の理解だけでなくグループ内での関わり方について,個々の子どもの特性を踏まえながら判断し,それに基づいて個人,グループ,全体へと支援を行なっていることが示された。これらの知見は、日本発達心理学会第27回大会にて発表予定である。当初の予定どおり、本年度は小グループでの学習時における教師による学習者への働きかけにはどのような特徴があるのか、小グループでの学習時における教師の即興的思考にはどのような特徴があるのかを明らかにするために、年間にわたりデータ収集を行うことができた。さらには、その一部についてまとめ学会発表を行う予定である。加えて、次年度以降のためのフィールドとのラポールも十分に形成することができ、観察が可能な状態となっている。以上のことから、おおむね順調に進展していると捉えられる。第1に、小グループでの学習時における教師による学習者への働きかけにはどのような特徴があるのか、小グループでの学習時における教師の即興的思考にはどのような特徴があるのかを明らかにするために、前年度から継続してデータ収集を行なった。具体的には、授業観察及び授業についての半構造化面接を3名の教師(小学校2名、中学校1名)を対象に実施した。第2に、昨年度収集したデータのうち4名の教師のデータを分析し、小グループでの学習時における教師の即興的思考にはどのような特徴があるのかを、勤務校の文化(研究主題、授業検討の仕方等)や勤務年数、小グループでの学習の経験年数による違いから比較検討した。その結果、勤務年数が同じでも勤務校により即興的思考の特徴が異なることから勤務校の文化が影響していること、小グループでの学習の経験年数が多い教師のほうが、状況に応じて授業展開を変更する判断を行なっていることが示された。これらの知見は、日本教育心理学会第58回総会において発表された第3に、縦断的に小グループでの学習時における教師による学習者への働きかけおよび即興的思考の特徴を検討することで、小グループでの学習に関して,教師がどのような実践知をどのように形成していくのかを明らかにするために、上記3名の教師のうち小学校教師1名に対して、2回の追加調査を行なった。さらには、その一部を成果としてまとめることができた。第2に、昨年度までに収集した9名の教師のデータを分析し、小グループでの学習時における教師の即興的思考にはどのような特徴があるのかを修正版グラウンデットセオリーに基づき分析を行い、モデルの作成を行った。「見取りの焦点化」「問題解決過程の見取り」「関わりの見取り」「情動を伴う思考」「支援の決定」「後続の展開の検討」の6カテゴリーが抽出された。また、授業前や小グループでの活動前に持っていた知識や授業計画に基づいて支援や展開を考えていく思考と、その場の子どもの様子や状況に応じて支援や展開をその場で修正し、デザインしていく思考を行なっていることが示された。これらの知見は、ISCAR第5回大会において発表された。

第3に、縦断的に小グループでの学習時における教師による学習者への働きかけおよび即興的思考の特徴を検討することで、小グループでの学習に関して,教師がどのような実践知をどのように形成していくのかを明らかにするために、上記3名の教師のうち2名(小学校1名、中学校1名)に対して、2回の追加調査を行なった。本研究の目的は、小グループでの学習に関する教師の実践知を明らかにすることであった。小グループでの学習時における教師の支援やその際の思考の特徴を検討した結果、(1)教師は直接関わらないで学習者を見取り、その後の支援を検討することに多くの時間を費やしていること、(2)その際に学習者についての知識や教材に関する知識を基に学習者の問題解決過程および関わりの様子を見取り、驚きや後悔といった情動を経験しながら、学習者に委ねる、あるいは思考や関わりを促す支援を行うなどの判断をしていることが示された。これらの知見は、小グループでの学習の質を高めるための教師の実践知であると同時に、実践を省察する視点となる。まず、継続してデータ収集を行う。次に、収集したデータを順次分析していき、研究知見をまとめていく。さらに、小グループでの学習に関して,教師がどのような実践知をどのように形成していくのかを明らかにするために、縦断的に小グループでの学習時における教師による学習者への働きかけおよび即興的思考の特徴を調査することを開始する。まず、継続的にデータ収集を行う。さらに、小グループでの学習に関して、教師がどのような実践知をどのように形成していくのかを明らかにするために、今年度継続的に観察を行なった小学校教師を対象に、継続的に調査を行う。教育心理学データ収集時期が協力者の都合により年度末に重なり、補助業務(データ整理)の依頼を行うことができなかったためである。他の業務との兼ね合いで学会発表をする機会が少なくなってしまったため、旅費の使用が少なくなった。また、補助業務(データ整理)を依頼する補助者を確保することができなかったため、人件費を使用できなかった。次年度においては、本年度収集したデータについて、早期にデータ整理業務を依頼する。すでに国際学会での発表を予定している。また、その他においても計画的に学会等での発表を行う予定である。また、早期に補助業務を依頼する補助者を確保する。
生体内容量負荷・圧負荷を定量的に再現する心筋機械的刺激装置の開発

生体内の心室負荷を心筋の負荷に変換する枠組みの開発を行った。まず有限要素法で非線形均質等方性の材料特性を用い、中空球の形状で解析を試みた。有限要素法では、心内膜側と心外膜側おのおのの心筋歪み・応力を求められた。計算量が少ないラプラスの法則では壁内心筋歪み・応力分布が求められない一方、壁内心筋歪み・応力分布が求められる有限要素法では計算コストが大きく現時点で利用可能なコンピュータでは実時間計算が不可能であった。そのため私たちはさらにラプラスの法則による計算を多層化心筋モデルの各層に適応する新しい歪み・応力計算法を開発した。この計算法は計算量を過度に増加させることなく壁内心筋歪み・応力分布を求めることができ、非線形の材料特性や心室変形による幾何非線形を考慮に入れたものである。ただし心室形状は球形、材料特性は均質等方に限定された。有限要素法と同様に、心内膜側の歪み・応力が心外膜側に比して大きいこと、大動脈弁逆流(容量負荷)では拡張後期駆出早期に心筋の伸展がより顕著であること、大動脈弁狭窄で(圧負荷)は駆出期の応力が極端に大きくなることが明らかになった。これらの検討の結果、現有のコンピュータでも、容量負荷・圧負荷の程度に応じて心筋片に負荷する心内膜下、心外膜下での歪み(心筋長の相対変化)の大きさを定量的に実時間で計算可能であった。また高速コンピュータからの制御信号によって心筋に機械的刺激を与えるためのプログラムおよび制御回路を自作し動作の確認をおこなった。本年度は生体内の心室負荷を心筋の負荷に変換する枠組みを構築した。麻酔イヌから得られた心室圧(カテ先血圧計)・心室容積(コンダクタンスカテーテル)の経時的変化および時変エラスタンス-3要素ウィンドケッセルによるモデルから得られた心室圧・心室容積の経時的変化から、ラプラスの法則および有限要素法を用いて、心筋歪みおよび心筋応力を求めた。有限要素法は非線形均質等方性の材料特性を用い、中空球の形状で解析した。有限要素法による解析は市販プログラムと自ら開発したプログラムを組みあわせて行った。ラプラスの法則で求められる心室壁中層の歪み・応力は心筋片から得られる実測値に類似していた。有限要素法では、心内膜側と心外膜側おのおのの心筋歪み・応力を求められるが、心内膜側の歪みおよび応力は実測値に比して極端に大きかった。したがって球以外のより現実的な形状や異方性の導入が必要であることが明らかになった。またモデル上で、容量負荷の代表として大動脈弁逆流、圧負荷の代表として大動脈弁狭窄を模擬し、心筋中層の歪み・応力を求めた。大動脈弁逆流では拡張期に心筋の伸展がより顕著であること、大動脈弁狭窄では駆出期の心筋の短縮が阻害され応力が極端に大きくなることが明らかになった。これらの検討の結果、高速コンピュータを用いれば、容量負荷・圧負荷の程度に応じて摘出心筋片に負荷すべき歪み(心筋長の相対変化)の大きさを定量的に実時間で計算可能であることが明らかになった。次年度は改良した有限要素法においても実時間での計算が可能か検討する必要がある。また本年度は、高速コンピュータからの制御信号によってオフラインで心筋に機械的刺激を与えるためのプログラムおよび制御回路を自作した。本年度も引き続き、生体内の心室負荷を心筋の負荷に変換する枠組みの改良を行った。心室圧・心室容積から心筋歪みおよび心筋応力を求める方法にはラプラスの法則と有限要素法がある。

計算量が少ないラプラスの法則では壁内心筋歪み・応力分布が求められない一方、壁内心筋歪み・応力分布が求められる有限要素法では計算コストが大きく現時点で利用可能なコンピュータでは実時間計算が不可能であった。そのため本年度、私たちはラプラスの法則による計算を多層化する新しい歪み・応力計算法を開発した。この計算法は計算量をあまり増加させることなく壁内心筋歪み・応力分布を求めることができ、非線形の材料特性や心室変形による幾何非線形を考慮に入れたものである。ただし心室形状は中空球、材料特性は均質等方に限定された。同じ解析を本法と有限要素法で比較した。心内膜側の歪み・応力が心外膜側に比して大きいこと、大動脈弁逆流(容量負荷)では拡張期に心筋の伸展がより顕著であること、大動脈弁狭窄で(圧負荷)は駆出期の応力が極端に大きくなることが有限要素法と同様に明らかになった。これらの検討の結果、現有のコンピュータでも、容量負荷・圧負荷の程度に応じて摘出心筋片に心内膜下、心外膜下での歪み(心筋長の相対変化)の大きさを定量的に実時間で計算可能であることが明らかになった。さらに本年度は、すでに自作したプログラムおよび制御回路を組み合わせて動作の確認をおこなった。
ミトコンドリア病の表現型とその成因の解析-遺伝子治療への基礎的研究

ミトコンドリア病はミトコンドリアDNA(mtDNA)異常に基づく遺伝性疾患で、生体の主要なエネルギー産生系が障害され全身の機能異常mitochondrialcytopathyを呈するがその根治療法、発症前療法は現時点ではない。本研究において我々は本症における膵外分泌機能について検討した。ミトコンドリア病の3家系についてbentiromide testにおいて正常者81.9±8.5%、糖尿病患者77±12.6%に対し、ミトコンドリア遺伝子異常者では19-68%と低下していた。しかしながら、mutant mtDNAの異常率と尿PABA回収率との間には相関関係は認められなかった。necropcyの症例は下痢等の膵外分泌障害の臨床症状を認めた症例であったが、その電子顕微鏡所見は粗面小胞体と分泌顆粒の喪失と空胞変性しミトコンドリアの所見を呈していた。さらにtransferRNALue(UUR)変異の症例において、うつ病の原因となっていることを示唆する症例を報告した。さらに生殖にも重大な影響を及ぼし、胎児の発育障害、自然流産の頻度が高いことを明らかにしてきた。また、胃酸分泌機能、腸管運動機能など消化器機能の研究をすすめ、mutant mtDNAのを有する症例に麻痺性腸閉塞を起こしうること、実際穿孔症例を報告した。細胞レベルの検討ではインスリン作用の主要な標的臓器である筋肉と脂肪組織の培養細胞系であるC2C12細胞と3T3-L1細胞を用いて実験を行った。各々の培養細胞を分化させる前にエチジウムブロマイド(EB)処理を7日間行い、分化誘導を行うと、いずれの細胞においてもmtRNAの発現は検出されず、筋細胞への分化、脂肪滴の貯留は抑制された。また、分化したC2C12細胞にEBを添加し3日間培養するとインスリン刺激による糖輸送活性は約40%抑制された。これらの結果はmtDNA異常が直接にインスリン作用を障害し、また筋肉の異常を示唆すると考えられる。さらにmtDNA遺伝子を導入し、これらの障害を改善しうるか検討をしている。ミトコンドリア病はミトコンドリアDNA(mtDNA)異常に基づく遺伝性疾患で、生体の主要なエネルギー産生系が障害された全身の機能異常mitochondrialcytopathyを呈する。しかしながら、その根冶療法、発症前療法は現時点ではなく、悲惨な経過をとる患者への対策は医学にとって重要な課題である。本疾患は全身臓器障害であるが、まず我々は本症における膵外分泌機能について検討した。ミトコンドリア病の3家系についてbentiromide testを施行し、また1家系のnecropcyより得た標本から膵外分泌細胞の電子顕微鏡像について報告した(J Med Genetics,in press)。benzoyl-tyrosyl-p-aminobenzoicacid(PABA)を用いたbentiromide testにおいて正常者81.9±8.5%、糖尿病患者77±12.6%に対し、ミトコンドリア遺伝子異常者では19から68%と低下していた。しかしながら、mutantmtDNAの異常率と尿PABA回収率との間には相関関係は認められなかった。現在、さらに本症の表現型の解析に関し、胃酸分泌機能、腸管運動機能など消化器機能の研究と女性の流産の頻度の疫学的研究の検討をすすめている。

また、全ミトコンドリアtRNA mutationのスクリーニングを解析中である。動物実験モデルの確立に関してもミトコンドリアDNA異常培養細胞のstable cloneの樹立を行っている。ミトコンドリア病はミトコンドリアDNA(mtDNA)異常に基ずく遺伝性疾患で、生体の主要なエネルギー産生系が障害され全身の機能異常mitochondorialcyopathyを呈する。本研究では未だ充分に明らかにされていない全身の表現型を解析するとともに、その遺伝子治療の基礎となる動物実験モデルの研究を行った。細胞レベルの検討ではインスリン作用の主要な標的臓器である筋肉と脂肪組織の代表的な培養細胞系であるC_2C_<12>細胞と3T3-L1細胞を用いて実験を行った。各々の培養細胞を分化させる前にエチジウムブロマイド(EB) (1-1000ng/ml)処理を継代中7日間行い、各々2%ウマ血清培養液、thiazolidinedioneで分化誘導を行うと、いずれの細胞においても100ng/ml以上の濃度で筋細胞、脂肪滴の貯留は抑制された。EB処理後は高濃度ブドウ糖、ピルビン酸、ウリジン培養液に添加した。分化したC_2C_<12>細胞に250ng/mlのEBを3日間培養処理するとインスリン刺激による糖輸送活性は約40%抑制された。これらの結果はmtDNA異常が筋肉、脂肪細胞の分化の障害をもたらし、さらに成熟細胞においてもインスリン作用を障害することを示唆すると考えられる。さらに、本症のヒトでの表現型の解析をすすめたが、mtDNA異常により胎児の発育障害、流産の頻度の増加、消化管機能異常として腸閉塞をおこすことを見い出した。
可逆凝集・多段超高圧脱水による有機汚泥の超減量化

可逆凝集を取り入れた多段超高圧圧搾脱水法により有機汚泥の超減量化を達成した。下水余剰汚泥を例に、多価イオンの無機電解質の添加による可逆凝集操作と50 MPaの超高圧圧搾とを組み合わせた一連の操作により、ケーク含水率は23 %まで低減された。汚泥原液を基準とすると、99.87%もの減量化を達成したこととなる。脱水ケークの平均空隙率と圧搾圧力との関係から、圧力を更に大きくすることで、より高度な脱水が可能となることが示唆された。また、超高圧下における活性汚泥の圧搾挙動は、提案する多段クリープモデルで記述でき、様々な操作条件下におけるケーク脱水挙動の評価に有用である。本研究では、産業廃棄物の中で最大の排出量割合の汚泥を減量化するための革新的脱水技術として、可逆凝集と多段超高圧圧搾とを融合させた脱水法を提案し、難脱水性汚泥の高速減量化の可能性を探究する。具体的には、汚泥を緩く凝集させて粗大フロックを形成させ、0.10.5 MPaの低圧下で圧搾して自由水を迅速に除去し脱水ケークを得た後、可逆凝集によりフロックを崩壊させ、さらに圧力のステップ増加により550 MPaの超高圧を多段で作用させ束縛水を除去し極低含水率ケークを得て、汚泥の高速減量化を図る。代表的な難脱水性有機汚泥の下水余剰汚泥を用いて、本研究で提案する高効率高速脱水法の有効性を検証した。様々な可逆凝集法について検討を行った結果、純水透過を行うことで一旦形成したフロックが崩壊することが確認され、中でも多価イオンのポリ塩化アルミニウム(PACl)を用いる場合に圧密脱水速度が最も大きくなることがわかった。可逆凝集操作後に種々の圧力で圧搾脱水したところ、圧搾圧力が大きいほど脱水速度・脱水度とも大きくなり、50 MPaで超高圧圧搾した場合には、ケーク含水率は23 %となり、現存技術の60 70%を遙かに凌ぎ、前例のない極めて小さな値が得られた。なお、可逆凝集法が脱水速度に与える影響は大きいが、最終的な脱水度については超高圧を作用させると可逆凝集の方法によらず充分な効果が望めることが明らかとなった。脱水ケークの空隙率と圧搾圧力との関係は、両対数プロットで直線関係となり、圧搾圧力を大きくすることで更なる脱水度の向上が期待できる。また、このようなデータの整理により従来法では不正確であった空隙率の推算がより正確にできることを示した。以上より、本法により難脱水性有機汚泥の高速減量化が実現でき、今後、スケールアップ等、実用化に向けた取組みを行うことで、現在の汚泥処理問題への貢献が期待できる。難脱水性有機汚泥として下水余剰汚泥を例にとり、pH調整や電解質添加による可逆凝集法を検討し、低圧圧搾での高速脱水と超高圧圧搾での含水率低減化への効果を確認した。その結果、多価イオンの無機電解質の添加による凝集操作が、低圧圧搾速度の顕著な増大を引き起こすことが明らかとなった。また、透水による可逆凝集の効果も顕著で、引き続いて行った50 MPaの超高圧圧搾と組み合わせて、ケーク含水率を最終的に23 %まで低減でき、減量化の程度で数値化すると、99.87 %の減量化が達成された。この結果は、現存技術の最高水準である60 70 %を遙かに凌いでおり、併せて脱水速度の観点からも満足のいくもので、本技術が脱水時間と脱水度の両面から、現存技術に比べ格段に優れていることを実証した。また、微生物細胞内の水分が70 80 %であることを考えると、この23 %という低い含水率は、単にフロックの崩壊による汚泥粒子間の自由水や粒子表面の付着水だけでなく、細胞内に含まれる束縛水も除去されていることを示している。

超高圧圧搾におけるケーク脱水挙動のモデル化も可能となり、種々の操作条件における脱水性能の推算に寄与するものと期待される。従来技術と比較して、含水率を大幅に小さくすることができる脱水法が確立でき、提案プロセスの最適操作のための指針が得られつつある。順調に成果が得られているので、当初の計画に従って研究を進める。本年度は当初の計画より低予算で成果を得ることができた。次年度は繰越金を利用して技術補佐員を雇い、様々な手法の検討を行い、最適な脱水法および操作条件を確立する。
固体ニュートリノ検出器を用いた原子炉プルトニウムモニターの開発

原子炉ではウラン燃料が消費されると共にプルトニウムが生成される。危険なプルトニウムの量をモニターできる原子炉ニュートリノ検出器の開発をGd含有新型プラスチックシンチレータを用いて行った。Am241/Be線源からのガンマ線,中性子をニュートリノ疑似信号として用い,82kgのプロトタイプ検出器の性能を評価した。得られた実験データを基に,Geant4シミュレーションによって1トンの原子炉モニターの性能について評価した。熱出力3GWの原子炉の燃料交換前後でのプルトニウム量に関して、11日間の測定で6%の燃料(プルトニウム90kg相当)の取り出しを2σの有意度で確認できるという結果を得た。素粒子物理学の分野では、ニュートリノに質量が有ることを示すニュートリノ振動の測定が、最重要研究テーマの一つである。ニュートリノ振動角θ13は小さいので、原子炉ニュートリノの測定を行うときの系統誤差(1%程度)をより小さくするために、小型で安全で原子炉建屋内で使うことができる固体原子炉ニュートリノ検出器の開発を行ってきた。本研究はこれをさらに進めて、ウランとプルトニウムの核分裂によるニュートリノフラックスとエネルギースペクトルの違いから、原子炉燃料中のプルトニウム量を10%の精度でモニターできるシステムを開発しようとするものである。Gdをドープした安価なシンチレータの開発をミンダナオ大学の研究者と共に行う計画であるが、その前に、材料系の日本企業が試作したシンチレータサンプルを用いて、小型のプロトタイプ検出器を製作し、その性能評価テストを行った。また、ニュートリノ検出器の小型プロトタイプについてのシミュレーションも行った。1)企業の協力のもと、厚さ3mm程度のGd入りプラスチックシンチレータ板を試作した。このGd入りプラスチックシンチレータ板について、その発光量や光の減衰長の測定などをβ線源を用いて行った。この結果を現在、投稿論文としてまとめている。2)Gd入りプラスチックシンチレータを用いて、ベンチテスト用の小型プロトタイプ検出器を製作した。これに対して中性子線源(Am/Be線源)を用いて、擬似ニュートリノ反応検出のベンチテストを行った。検出器に対する空気中や床からの中性子、γ線バックグラウンドを遮蔽するために、全体を鉛ブロックやボロン入りポリエチレンブロックで覆い実験を行った。その結果、擬似ニュートリノ反応イベントで生じる中性子を検出できた。また、この検出器のMCシミュレーションを行い、実験で測定された中性子捕獲時間(約20マイクロ秒)をほぼ再現した。本研究は原子炉建屋内で安全に使うことができる固体原子炉ニュートリノ検出器について、原子炉燃料中のプルトニウム量を10%の精度でモニターできるシステムの開発を目指している。現在、開発している安価な新型プラスチックシンチレータについて、日本企業の協力のもとに、Gd入りシンチレータ板やシンチレータブロックを製作し、その性能評価を行った。製作されたシンチレータ板について、β線源を用いて、その発光量や光の減衰長の測定を行った。また、Gd入りシンチレータブロックに光電子増倍管を取り付けて、ニュートリノ検出器とした。Gdは中性子に対する吸収断面積が非常に大きく、ニュートリノの逆β崩壊反応によって生じた中性子を捕獲して、合計8MeVのガンマ線を数個放出する。よってGd入りシンチレータは、原子炉ニュートリノの検出に適している。本研究ではニュートリノの代わりに、中性子線源であるAm(241)/Beを用いて、擬似的なニュートリノ事象の測定を行った。実際のニュートリノを測定する場合と同様に、先発信号と後発信号の同期をとる遅延同時計数法を用いて測定した。また、実験データとGeant4を用いたモンテカルロ・シミュレーションにおける平均中性子捕獲時間を比較した。Gd入りシンチレータブロック検出器について、実験データの平均中性子捕獲時間は21±2μsec、この検出器のシミュレーションでの値は17±1μsecと求められ、実験データとほぼ一致し、中性子を検出できていることがわかった。しかし、現在Gd入り新型プラスチックシンチレータの光量は、Gdを含まないものの半分程度であり、検出器のエネルギー分解能を良くするためにも、より発光量が多いシンチレータの開発が必要であることが分かった。本研究は原子炉建屋内で使うことができる安全で小型の固体原子炉ニュートリノ検出器の開発を行った。本研究に適した国内の商用原子炉がすべて停止中であることから、中性子線源を用いた擬似ニュートリノ反応や宇宙線、自然放射線などのバックグラウンドのデータを新潟大学の実験室において十分に取得し、これを解析してニュートリノ検出器の性能評価を行った。1)Gd含有の新型プラスチックシンチレータを用いた4個のプロトタイプニュートリノ検出器(合計重量82kg)の周囲に配置した宇宙線VETOカウンターの調整、環境γ線や中性子バックグラウンドの遮蔽増強を行った。ニュートリノ反応事象に対応するデータの取得には、擬似ニュートリノ反応線源として、中性子とγ線を同時に放出するAm/Be線源[4.4MeV(γ)+48MeV(中性子)]を用いた。

2)この線源を使用したテスト実験によって得られた擬似ニュートリノデータを解析し、プロトタイプ検出器の性能評価を行った。その結果、平均中性子捕獲時間としては、22.3±1.4μsと求まった。これはGeant4によるシミュレーション結果(23.0±0.9μs)と誤差の範囲で一致した。また、検出器のエネルギー分解能(30%)などの量を求めた。3)プロトタイプ検出器(重量約20kg)から得られた性能の情報を用いてシミュレーターを調整し、この検出器を50個並べて約1トンの検出器とした場合の原子炉モニターの性能を評価した。その結果、現在の検出器デザインでは、一般的な商用原子炉の核燃料交換の前後におけるニュートリノ量の差を有意(3σ)に確認するためには、15日間の測定が必要であることがわかった。また、使用済核燃料(150トン)の6%(Pu-239:約90kg相当)が不正に取り出された場合、これに伴うニュートリノ数の減少を11日間の測定で2σの有意度で検知可能であることがわかった。本研究は、小型で安全で原子炉建屋内で使うことができる固体原子炉ニュートリノ検出器の開発を行っている。国内で稼働している商用原子炉がほとんどなく、また原子炉建屋内への検出器の設置が許可されないことから、中性子線源を用いた擬似ニュートリノ反応事象や宇宙線、自然放射線によるバックグラウンド事象を新潟大学理学部の実験室において観測することにした。1)固体検出器本体のニュートリノターゲットの周囲に宇宙線ミュー粒子のVETOカウンターであるプラスチック・シンチレーションカウンターを配置し、その外側を鉛板やポリエチレン・ブロックで覆い、環境γ線や中性子バックグラウンドを低減した。ニュートリノ検出器の較正は、Co60などの放射線源を用いて行った。ニュートリノ反応事象相当のデータの取得には、擬似ニュートリノ反応線源として、中性子とγ線を同時に放出する中性子線源(Am/Be線源)[4.4MeV (γ) + 48 MeV (中性子)]を用いた。2)擬似ニュートリノ反応線源を用いたテスト実験によって得られた擬似ニュートリノデータを解析し、固体ニュートリノ検出器の性能評価を行った。その結果、Gd含有新型プラスチックシンチレータを用いたプロトタイプ・ニュートリノ検出器(重量約20kg)について、平均中性子捕獲時間が28±4μsと求まった。市販のプラスチックシンチレータとGdシートをサンドイッチ状に束ねて作ったプロトタイプ検出器の場合には、平均中性子捕獲時間は37±3μsであった。Gd含有新型プラスチックシンチレータを用いた検出器の方が平均中性子捕獲時間が短いのは、シンチレータ中にGdが一様に混ざっていることによると考えられる。3)Geant4シミュレーションを行い、中性子捕獲時間の再現を試みた。26年度が最終年度であるため、記入しない。
高解像度インピーダンスマノメトリーを用いた嚥下評価と食道刺激による訓練法の開発

(1)嚥下障害の生理・運動学的現象の解明および誤嚥と咽頭残留の予測嚥下障害患者における嚥下反射中の高解像度インピーダンスマノメトリー計測から得られるパラメータ(上咽頭内圧、舌根部内圧、上部食道括約筋弛緩時間・弛緩圧など)を解析する。これらのパラメータの時間・空間的なパターン認識を行うことにより誤嚥や咽頭残留が予測可能かどうかを検討する。(2)嚥下障害患者に対する新たな治療法の開発食道刺激による嚥下反射誘発を利用した嚥下障害治療の開発を行う。健常者で最も効果的に嚥下反射を誘発する食道刺激の条件を確定した上で、嚥下障害患者でのパイロット研究を検討する。
労働倫理の国際比較ー東アジアへの経済思想史的接近ー

平成2年度は、2年の交付期間の初年度にあたり、次の諸点を課題としていた。第一に、当該研究課題に関する基礎的文献の収集とそのサ-ヴェイ。第二に、東アジア,東南アジア諸国の当該研究課題に関係する研究者との研究文流。第三に、交付に先立つ準備期間における研究成果の発表。第一点については、国別では韓国,台湾,香港,シンガポ-ルのいわゆるアジアNIES及びヴェトナムとマレ-シア,更に東南アジア華僑を資料収集の対象とした。文化・宗教では、儒教,仏教,道教,イスラム教,そしてキリスト教までを収集の範囲とした。言語からは、邦文文献と英文文献、及び若干のマレ-語の文献を含むこととなった。第二点については、順不同で以下の研究機関に直接赴き、討論を行い、文献資料の紹介を受けた。ソウル国立大学校社会科学大学:姜命圭教授、シンガポ-ル国立大学アジア哲学研究所:J・ウォン教授,マラヤ大学経済・行政学部:モハメッド・アリフ教授,ジョモ・K・S博士。なお91年4月初旬に台北大学にも赴く予定。なお,平成3年度は学外研究のため、2年目の交付は返上となる。
葉酸依存性ＲＮＡメチル化酵素はＤＮＡ複製の制御因子なのか

本研究は、葉酸依存性RNAメチル化酵素(TrmFO)が、基質である5,10-メチレンテトラヒドロ葉酸を消費することにより、DNA合成系の制御因子として働くのではないかという仮説を検証しようとするものであった。貧栄養条件下では、高度好熱菌trmFO遺伝子破壊株は、野生株よりも生育速度が速く、野生株の生育速度はチミンやチミジル酸添加により加速した。これらの実験結果は、上記仮説を支持するものであった。そこでさらに、TrmFO、5,10-メチレンテトラヒドロ葉酸合成酵素、チミジル酸合成酵素の細胞内モル比を決定し、試験管内でTrmFOと5,10-メチレンテトラヒドロ葉酸合成酵素が競合することも確認した。本研究では、葉酸依存性RNAメチル化酵素が、DNA合成系に及ぼす影響(RNA修飾とDNA合成がリンクしているのかどうか?)を調べることを究極の目標としている。研究期間は3年であり、平成25年度は2年目にあたった。初年度の平成24年度に、葉酸依存性RNAメチル化酵素の基質特異性に関する論文をまとめることができ、第一目標がクリアできたので、平成25年度はその遺伝子破壊株を野生株と比較しながら、培養実験を行なった。最初、この培養実験では、栄養豊富な培地を使用していたが、葉酸やアミノ酸の供給量が葉酸依存性RNAメチル化酵素のメチレンテトラヒドロ葉酸消費量を上回ってしまうことが判った。すなわち、メチレンテトラヒドロ葉酸の細胞内循環(再生)経路からの補給量以上に外部からの供給量が多い条件では、遺伝子破壊株と野生株の間に明確な差異を見出せない。そこで、幾つかの合成培地を試し、葉酸およびアミノ酸供給量がぎりぎり生存可能なレベルを探した。ほぼ3か月かけて最適条件を探すことができた。この培養システムを用い、放射性標識したチミジル酸、チミジン、セリンなどを用い、tRNAおよびDNAへのメチル基供給量を測定した。その結果、野生株の場合、セリンに由来するメチル基は1:4の割合でtRNAのメチル化とDNA合成に割り振られるという結果が得られた。葉酸依存性RNAメチル化酵素遺伝子破壊株では、すべてがDNA合成に供給される。幾つかのデータベースを探したが、このようにtRNAとDNA合成へのメチル基供給量を調べた文献はなく、これはかなり新しい知見ではないかと思っている。現在、種々の培養条件を調べ、生育曲線に合わせて、いかにメチル基供給割合が変化するのかを調べている。なお、学会発表では初年度に得られた知見のみを発表した。本研究は、多くの真正細菌が保持する葉酸依存性RNAメチル化酵素が基質であるメチレテトラヒドロ葉酸を奪うことにより、DNA複製系に影響を及ぼしているのではないかという仮説を検証することを最終目標に据えている。平成24年度は、その初年度であるが、葉酸依存性RNAメチル化酵素のRNA基質認識機構を明らかにし、非常に幸いなことに、国際的学術誌(J. Biol. Chem.誌)に投稿論文を受理されるに至った。着実に第一目標をクリアしたと言える。ついで、葉酸依存性RNAメチル化酵素の遺伝子破壊株の作成に成功し、チミジル酸合成酵素の精製法を確立した。また、セリンハイドロキシメチルトランスフェラーゼを用いた二段階酵素活性測定法が、チミジル酸合成酵素の酵素活性測定法にも利用できることを確認することができた。ここは、研究計画では難所の一つと想定していたので、短期間に酵素活性測定の最適条件を探し当てれたことは、予想以上の進捗である。さらに、生育フェーズごとに、葉酸依存性RNAメチル化酵素が産生するtRNAの5-メチルウリジンの含有量を測定したところ、ほぼすべての生育フェーズで100%近いメチル化状態であることを確認することができた。この結果は、対数増殖初期に存在する葉酸依存性RNAメチル化酵素の存在量でtRNAをメチル化するのに十分であることを示しており、対数増殖後期に本酵素mRNA量が上昇し、過剰な葉酸依存性RNAメチル化酵素が生産されているのではという冒頭の仮説と矛盾しない結果である。平成24年度末には、これら研究の進捗を受けて、予定を前倒しし、葉酸依存性RNAメチル化酵素、チミジル酸合成酵素、セリンハイドロキシメチルトランスフェラーゼを抗原とするポリクローナル抗体の作成に取りかかった。本研究は、葉酸依存性RNAメチル化酵素(TrmFO)が、基質である5, 10-メチレンテトラヒドロ葉酸をDNA合成の律速因子であるチミジル酸合成酵素(ThyX)と奪いあうことにより、DNA合成系の制御因子として機能しているのではないか?という仮説の可否を検証することを目的とした。本研究の着想は、高度好熱菌Thermus thermophilusのTrmFO遺伝子破壊株を作成したところ、高栄養条件下では、野生株よりも濃い濁度で定常期に達するという観察に由来する。

そこで、様々な栄養条件下で生育を観察することから本研究を開始した。貧栄養下で、trmFO遺伝子破壊株と野生株の生育を比較したところ、trmFO遺伝子破壊株のほうが生育が早いということが判った。そこで、この野生株の生育の遅さが、本当にDNA合成に由来するのか確かめるべく、チミジンもしくはチミジル酸を培地に添加したことろ、予想通り、野生株の生育速度が遺伝子破壊株に近づくことが判った。すなわち、高度好熱菌ではtrmFO遺伝子を保持することにより、生育速度を犠牲にしてtRNAをメチル化していることが判った。次に、同位体標識セリンを基質にし、tRNAのメチル化とDNA合成に消費される5, 10-メチレンテトラヒドロ葉酸の量比を測定したところ、2:5の割合であることが判った。また、細胞内のセリンヒドロキシメチルトランスフェラーゼ(5, 10-メチレンテトラヒドロ葉酸合成酵素)、TrmFO、ThyXの量比は、5:1:1.5であり、この割合で各酵素が存在した場合、テストしたすべての条件下で、TrmFOとThyXが5, 10-メチレンテトラヒドロ葉酸を奪いあうことが判り、冒頭の仮説を支持する結果が得られた。これらの結果は、国際学術誌への投稿論文としてまとめ、現在、投稿中である。分子生物学平成25年度は、研究計画の2年目であり、初年度に達成した目標をスタート地点とし、最終的なゴールに導くまでの過渡期であると考えている。研究実績の概要に述べたように、葉酸依存性RNAメチル化酵素遺伝子破壊株の培養実験に着手し、幾つかの障害はあったものの最適条件を探りあてることに成功し、順調に解析が進んでいる。これは、ほぼ申請時に想定していたペースであり、「おおむね順調に進展している。」と判断した。また、学会発表も行えており、研究成果の公開状況も、まずまずであると自己評価している。研究実績の概要に記述したように、本研究課題の成果の一部を初年度であるにも関わらず、国際的学術誌に投稿論文として受理されるに至った。葉酸依存性RNAメチル化酵素の基質tRNA認識機構の解明は、海外のグループとの競争になっていただけに一本取った形になっている。なお、葉酸依存性RNAメチル化酵素を保持する真正細菌には、破傷風菌やレンサ球菌など、感染性バクテリアが多く含まれており、この研究成果は抗菌剤開発や感染性微生物防除の分野にも貢献しうるものである。次いで、葉酸依存性RNAメチル化酵素の遺伝子破壊株の作成に成功した。また、チミジル酸合成酵素の活性測定系にセリンハイドロキシメチルトランスフェラーゼを使用した二段階酵素活性法が利用できることを確認することができた。研究計画段階では、遺伝子破壊株の作成が根本的にうまくいかない、チミジル酸合成酵素の活性測定がうまくいかないなどの困難もありえると考えていただけに、ごく短期間で、これらの部分を突破できたのは望外であった。さらに、tRNA中の5-メチルウリジンの量をきちんと定量することができ、最終目標とする仮説と矛盾しないことが確認できた。これらの進捗を受け、平成25年度に予定していた抗体作成を平成24年度末に着手することができた。
インドシアニングリーン・ラクトソームを用いたがん診断・治療技術の開発

最近になり、多くの抗癌剤や術式が開発されているが、肝細胞癌患者の予後改善には不十分である。このため、肝細胞癌に対する新たな診断、治療が予後改善のために必要とされている。光感受性物質であるICGは近赤外線による励起により蛍光を発し、光線力学療法のためにも用いられる薬剤である。今回の研究では、ラクトソームと呼ばれるナノキャリアを用いて、腫瘍特異的にICGを集積させ、肝細胞癌に対する診断能及びPDTによる治療効果を調査し、その結果、有意な腫瘍蓄積性と抗腫瘍効果を認める事が出来た。まず始めにヒト肝細胞癌高分化型細胞株、Huh-7を用いて比較実験を行なった。上記モデルを作成し、ICG群及びICGラクトソーム群にグループ分けし、各々に薬剤投与を行った。その後、IVIS imaging systemを用いて経時的に腫瘍における蛍光を観察、その光量を測定した。その結果、腫瘍への薬剤集積性は有意差をもってICGラクトソームで高い結果が観察された。次に、ヒト肝細胞癌において分化型以外での集積性を検討した。前述の高分化型株に加え、中分化型細胞株、PLC/PRF/5と低分化型細胞株、KYN-2を用いて比較実験を行なった。この結果、中分化型細胞株においては有意な集積を認めたが、低分化型では有意差は認められなかった。最後に今後のin vivoにおけるPDT実験に向けて、in vitroでのPDT実験を行なった。腫瘍細胞に対してレーザー単独、ICGラクトソーム単独及びPDTを施行し、その細胞障害度をMTT assayにて測定した。その結果、PDT群において著明ない細胞障害性を観察する事ができた。PDTにおける光源の出力設定の最適化に時間を要し、進行はやや遅れている。今後、設定を早期に調整し実験を継続する。本年度は前年度で得られたin vitroでの検討結果を踏まえて、in vivoでの光線力学療法を行い、ICGとICGラクトソームを比較した。実験はBALB/c nude mouseの皮下にHuh-7を植え付け、異所性モデルを作成。このモデルに対してICG投与群とICGラクトソーム群に割り付けて、各々の薬剤を投与し腫瘍部に光線照射し光線力学療法を施行した。始めに、光線の照射条件をいくつか設定して実験を行い、照射量を調整しながら最適な条件を検索した。最適な条件設定を判断した後に、改めて比較実験を行いICGラクトソームによる光線力学療法の腫瘍効果を検討した。この結果、ICGラクトソームを投与したマウスにおいて、ICG投与群と比べて有意な腫瘍増大抑制効果が得られた。以上の結果より、ICGラクトソームは特異的に腫瘍にICGを蓄積させ、その結果として光線力学療法を行う事による腫瘍効果が得られたものと考える。異所性モデルでのin vitro光線力学療法の実験において、照射条件の設定が難しく、進行が遅れた。前年度ではICGラクトソームは特異的に腫瘍にICGを蓄積させ、その結果として光線力学療法を行う事による腫瘍効果が得られた。本年度は前年度で得られたin vivoでの光線力学療法の結果をもとに、その機序の考察を行った。同様の光線力学療法を行った実験を行い、この際に照射による温度上昇をサーモカメラを用いて測定した。この結果、ICGラクトソームを投与した群において有意な温度上昇を観察することができた。これにより、ICGラクトソームを用いた光線力学療法では、温熱効果の重要性が考えられた。また、治療部位の病理組織を比較検討し、アポトーシス指数がICGラクトソーム群で有意に高いことも判明した。これにより、腫瘍効果の機序としてアポトーシスの存在が判明した。iv vitroでのPDTで一定の細胞障害性が得られたので、今後はin vivoにて異所性モデルに対しPDT実験を行い、その腫瘍効果を比較検討する。その後、同所モデルの作成を行い、これに対するPDT実験を行なう。可能であれば同所モデルや腹膜播種モデルなどを作成し、同様に腫瘍効果の検討を行う。また、モデル作成が困難であれば、癌腫を変更し、他癌腫での治療効果も検討する。消化器外科
種子貯蔵物質の高蓄積に関わる転写活性化機構の解明-分子農業の基礎的研究

本研究ではタイプの異なる種子貯蔵物質のタンパク質と油脂について、イネとゴマを用いて種子特異的な高蓄積に関わる転写活性化機構を調査した。その結果、イネの種子貯蔵タンパク質遺伝子の高発現は、少なくとも2種の転写因子間の相互作用が関与すること、加えて、両転写因子は貯蔵油脂や貯蔵デンプンの蓄積にも関与することも明らかとなった。また、ほとんど知見の得られていなかった、ゴマの貯蔵油脂生合成系遺伝子の発現解析に必要な遺伝子群の単離、解析を行った。本研究ではタイプの異なる種子貯蔵物質であるタンパク質と脂質に関して、イネおよびゴマを用いて、種子特異的な高蓄積に関わる転写活性化機構の解明を試みている。本年度の研究成果は以下の通りである。(1)イネの種子貯蔵タンパク質遺伝子の発現には、少なくとも2種の転写活性化因子(RISBZ1とRPBF)が関与することが、in vitroの実験系や培養細胞を用いた研究によって明らかとなっている。RISBZ1とRPBFのin vivoにおける作用を調査するため、両転写因子の発現抑制株の解析を行った。その結果、これら2種の転写因子がin vivoにおいても種々の種子貯蔵タンパク質遺伝子の発現に関与すること、および転写活性化の際に互いに相乗的に作用することを明らかとした。加えて、RISBZ1とRPBFは貯蔵油脂や貯蔵デンプンの発現にも直接的もしくは間接的に関与することも明らかとなった。(2)ゴマ種子の含油率は約50%と他の油糧作物と比べて高い。しかし、ゴマの種子貯蔵油脂生合成系遺伝子に関する知見は極めて少ない。そこで、本年度は(i)ゴマより貯蔵油脂の生合成に関与すると考えられる遺伝子10種の部分配列を単離し、そのうち3種についてプロモーター領域を決定した。また、これと併せて種子貯蔵タンパク質遺伝子6種のプロモーター領域についても決定した。(ii)シロイヌナズナで種子貯蔵油脂生合成酵素遺伝子の転写を活性化すると報告されているWrinkled1(WRI1)のゴマにおける相同遺伝子についてもcDNAおよびゲノム配列を決定した。(iii)ゴマ緑葉を用いた一過的発現実験系を確立した。今後はプロモーター領域および転写活性化因子のクローニングを続けるとともに、一過的発現実験により、クローニングした転写活性化因子が貯蔵油脂生合成系遺伝子の発現制御に関与するか否かについて解析を行う予定である。本研究ではタイプの異なる種子貯蔵物質であるタンパク質と脂質に関して、イネおよびゴマを用いて、種子特異的な高蓄積に関わる転写活性化機構について調査を行った。1.前年度までの研究で、イネ種子貯蔵タンパク質遺伝子の転写活性化の際に、少なくとも2種の転写活性化因子(RISBZ1とRPBF)が相乗的に働くことが示された。本年度は、この転写因子間の相乗作用の分子的メカニズムに関する知見を得るために、RPBFの転写活性化ドメインの調査を試みた。その結果、C末端側に存在する疎水性アミノ酸に富む2つの領域の双方がRPBFの転写活性化に必要であることが明らかとなった。今後は未同定の転写活性化因子のクローニングを進め、上述の2種の因子との相互作用について解析していく予定である。2.ゴマ種子の含油率は約50%と他の油糧作物と比べて高いが、ゴマの種子貯蔵油脂生合成系遺伝子に関する知見は極めて少ない。そこで本年度は、これまでにゴマより単離した4種の貯蔵油脂生合成系遺伝子のプロモータ領域に対する転写活性化因子の作用を、ゴマ緑葉を用いた一過的発現実験系を用いて調査した。解析には、貯蔵油脂生合成系遺伝子の発現に関与すると考えられる2種の転写活性化因子(SeWRI,AtFUS)および、ゴマにおいてオレイン酸不飽和化酵素FAD2遺伝子の転写活性化に関与すると報告されているSebHLHを用いた。その結果、いずれの転写活性化因子も油脂生合成系遺伝子の発現に関与することが示された。今後は、引き続きゴマより種子貯蔵油脂生合成系遺伝子のプロモータ領域の単離を行うとともに、油脂生合成系遺伝子に対する、登熟種子で発現する種々の転写因子の転写活性化作用の調査を行う。加えて、転写活性化因子間の相互作用についても検討していく予定である。
ある区分線形電気回路にみられる特異な分岐現象

非線形系の解析は一般的にいって難しい。非線形問題への強力なアプローチの1つに、区分線形化法、すなわち非線形特性を折れ線近似する方法がある。現在、非線形系の解析において区分線形化法が多用される傾向にある。これに対し、本研究は、ある簡単な電気回路から導かれる区分線形系において、滑らかな系、すなわち実在する系には決して観測されるはずのない分岐現象が至るところで発生するという興味深い事実を明かにしたものである。まず、本研究では、区分線形系とその折れ線接続部をわずかに丸めた滑らかな系の分岐ダイヤグラムを作成した。分岐ダイヤグラムは、適当なポアンカレ写像を定義し、その解の定常状態をプロットすることにより作成した。周期解からカオスへの転移に着目して計算機実験を行ったところ、滑らかな系では周期倍分岐と呼ばれる滑らかなカオスへの転移減少が観察されたのに対し、区分線形系では周期解から突然カオスへの転移する現象が観察された。区分線形系において折れ線接続を細かくして実験を行ったがこの違いは変わらなかった。この現象を理論的に解析するため、申請者がすでに提案している特異摂動法を適用を試みた。この方法を用いると系は劇的に簡略化されるため解析が簡単になる。この系を用いて数値実験を行ったところこの系にも同様な現象が発生することが確認された。この特異摂動された系を用い、区分線形系に生じる現象を理論的に解明することができた。
２１トリソミーから考える新規アルツハイマー病治療薬の開発

アルツハイマー病(Alzheimer's disease, AD)の一次原因物質であるアミロイドβペプチド(amyloid-βpeptide, Aβ)は前駆体APP(amyloid precursor protein)からβおよびγセクレターゼによって産生される。産生されたAβは主にネプリライシン(neprilysin, NEP)によって分解され、健常者脳ではAβ量が産生と分解の均衡の割合が保たれている。ADに対する根本的治療薬としてセクレターゼ阻害剤の治験が次々と中止となっていくことから、新たな標的に対する治療薬の開発が望まれている。そこで、ダウン症者脳では早期からAD病理が観察されることから、ダウン症者でトリソミーになっている21番染色体に存在するキナーゼDYRK1A(dual-specificity tyrosine-(Y)-phosphorylation-regulated kinase 1A)に着目し、Aβの分解系への影響を検討した。神経系細胞にDYRK1Aを過剰発現させると、NEP活性が低下した。NEPの細胞内領域の部分ペプチドとリコンビナントDYRK1Aによるin vitroキナーゼアッセイでは一部のアミノ酸残基でリン酸化反応が検出された。また、ダウン症者由来の線維芽細胞では健常者由来の線維芽細胞と比較してNEPの発現および活性が有意に低下していた。これらのことから、ダウン症者では21番染色体に存在するAPPが1.5倍発現することによりAβ産生が増加するばかりでなく、Aβ分解能も低下することにより、AD発症が早期から起こることが示唆された。また、DYRK1Aの阻害剤がADの有用な治療薬になり得ると考えられた。DYRK1Aはアルツハイマー病関連分子でタウや、Aβの前駆体タンパク質であるAPP(amyloid precursor protein)、Aβ産生を担うプレセニリン1をリン酸化することが報告されていることから、DYRK1Aによるネプリライシンの細胞内領域のリン酸化を詳細に解析した。神経系株化細胞にDYRK1Aを過剰発現させリン酸化特異的抗体を用いたウェスタンブロット解析によって、ネプリライシンの6番目のSer、15番目のThr、25番目のThrのリン酸化が亢進した。さらに、リコンビナントDYRK1Aとネプリライシンの細胞内領域の合成ペプチドを用いたin vitroキナーゼアッセイによって、11番目、15番目、25番目のThrの直接的なリン酸化が確認された。本研究から、DYRK1Aはネプリライシンの15番目、25番目のThrを直接リン酸化すること、また6番目のSerについては他のキナーゼを介したプライミングキナーゼとしての作用であることが示唆された。またDYRK1Aはアルツハイマー病に対して増悪因子であることから、その阻害剤は有用な治療薬となり得る。そこで、DYRK1A阻害剤のスクリーニングを行うためにAlphaLISAを利用した実験系の確立を目指している。DYRK1Aによるネプリライシンのリン酸化部位を培養細胞およびin vitroでの試験管の実験系で同定し、AlphaLISAを利用したDYRK1A阻害剤のスクリーニング系の立ち上げの目処が立ったため。ダウン症は、主に21番染色体がトリソミーになることに起因する。ダウン症者は40代という早期からアルツハイマー病(Alzheimer's disease, AD)を発症し、この原因は「一次原因物質であるアミロイドβペプチド(amyloid-βpeptide, Aβ)のアミロイド前駆体タンパク質(amyloid precursor protein, APP)をコードする遺伝子が21番染色体に存在するから」と考えられてきた。しかしながら、APP遺伝子に変異を有する家族性AD家系の解析からAβの産生量とADの発症年齢は必ずしも相関せず、21番染色体にAD増悪因子の存在を示唆された。そこで本研究課題では、ダウン症の表現型に関連深い二重特異性チロシンリン酸化調節キナーゼ1A(dual-specificity tyrosine-(Y)-phosphorylation-regulated kinase 1A, DYRK1A)に着目し、Aβの主要分解酵素であるネプリライシン(neprilsyin, NEP)へのリン酸化について解析した。DYRK1Aの過剰発現によりNEP細胞内領域内の5つの推定リン酸化部位のうち、6番目のSer、11、15、25番目のThrのリン酸化が亢進した。リコンビナントDYRK1AとNEP細胞内領域部分ペプチドのin vitroキナーゼアッセイでは4つのリン酸化がすべて起きるわけではなかった。このことから、DYRK1Aはプライミングキナーゼとして作用することが示唆された。また、NEPの推定リン酸化部位のAla変異体は、野生型NEPよりも発現が亢進、または分解が抑制することがわかった。AlphaLISAによるDYRK1A阻害剤のスクリーニング系を確立するために、NEP細胞内領域にdPEG11をスペーサーとして結合させたビオチン化化合物を合成した。

産生されたAβは主にネプリライシン(neprilysin, NEP)によって分解され、健常者脳ではAβ量が産生と分解の均衡の割合が保たれている。ADに対する根本的治療薬としてセクレターゼ阻害剤の治験が次々と中止となっていくことから、新たな標的に対する治療薬の開発が望まれている。そこで、ダウン症者脳では早期からAD病理が観察されることから、ダウン症者でトリソミーになっている21番染色体に存在するキナーゼDYRK1A(dual-specificity tyrosine-(Y)-phosphorylation-regulated kinase 1A)に着目し、Aβの分解系への影響を検討した。神経系細胞にDYRK1Aを過剰発現させると、NEP活性が低下した。NEPの細胞内領域の部分ペプチドとリコンビナントDYRK1Aによるin vitroキナーゼアッセイでは一部のアミノ酸残基でリン酸化反応が検出された。また、ダウン症者由来の線維芽細胞では健常者由来の線維芽細胞と比較してNEPの発現および活性が有意に低下していた。これらのことから、ダウン症者では21番染色体に存在するAPPが1.5倍発現することによりAβ産生が増加するばかりでなく、Aβ分解能も低下することにより、AD発症が早期から起こることが示唆された。また、DYRK1Aの阻害剤がADの有用な治療薬になり得ると考えられた。DYRK1AのsiRNAを用いたノックダウンや既存の阻害剤を用いた薬理的作用によってDYRK1Aのキナーゼ活性阻害位を行い、その際の培養上清中のAβ量をサンドイッチELISAで定量する。またAβ量とネプリライシン活性の相関を解析する。リコンビナントDYRK1Aおよびネプリライシンの細胞内領域にビオチンを付加した合成ペプチドを用いたAlphaLISAによるDYRK1Aの阻害化合物のスクリーニング系を確立し、化合物ライブラリーから新規DYRK1A阻害剤のスクリーニングを行う。スクリーニングでヒットした化合物処理による培養細胞系でのネプリライシンのリン酸化、活性、発現を解析し、既存の阻害剤と比較する。DYRK1Aの酵素活性を除いた変異体を用いて、NEPのリン酸化および活性低下が誘導されないか解析する。また、NEPの推定リン酸化部位に変異を導入した変異体の活性および局在、半減期を野生型と比較する。長崎大学大学院医歯薬学総合研究科生命薬科学専攻分子創薬科学講座ゲノム創薬学研究室ホームページ所属機関を変更するにあたり、年度末に計画していた変異体の実験を翌年度に繰り越したため、この実験に関する費用について次年度使用とした。