hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
ヒト血球系細胞における薬物代謝酵素の動態とその機能に関する研究

本研究は,免疫担当細胞などの生体にとって重要な細胞種を含む血液細胞について,薬物代謝酵素の発現様式とその生理的機能を明らかにすることを目的とした.6種のヒト血球系培養細胞について,cytochrome P450(P450,CYP)および抱合酵素の発現解析を行った.CYPについては,CYP1A1,1A2,1B1,2A6,2A7,2D6,2E1の発現がすべての細胞で確認された.また,2A13,2C9は検出されなかった.肝臓で強く発現しているCYP3Aサブファミリーについては,CYP3A4,3A5の発現がMOLT4,K562で見られた.また、CYP3A7の発現はK562で弱い発現が認められたのみであった。さらに、HL-60やK562の分化を誘導した場合,発現しているCYPの種類、量には大きな変化は見られなかったが,K562をヘミンで誘導した際,CYP3A7の発現に若干の減少が見られた.硫酸転移酵素(SULT)については,フェノール性基質を抱合するP-ST(SULT1A1,1A3)の発現がすべての細胞で確認された.また,発癌物質の代謝的活性化に関与すると考えられるSULT1C2の強い発現も全ての細胞で観察された.しかし、甲状腺ホルモンなどを抱合するSULT1B1はU937およびJurkatで発現し、ステロイドホルモンを抱合するSULT2A1はK562でのみ発現が認められた。グルクロン酸転移酵素(UGT)では,多くの薬物・異物の抱合に関係するUGT1Aファミリーの発現はリンパ球系のMOLT4,BALL-1でのみで見られた.BALL-1では8種のUGT1Aサブタイプが発現し,MOLT4では2種のUGT1Aサブタイプの発現が見られた.ステロイドの抱合を行うUGT2Bファミリーの発現はほとんどの細胞種で見られたが,UGT2B10は4種のリンパ球系細胞のみに,また,UGT2B17はK562細胞にのみ発現していた.また,グルタチオンS-転移酵素(GST)の発現に関しては,GSTA4,GSTP1,GSTT1の発現がすべての細胞種で確認されたが,タバコの発癌物質の解毒に関係するGSTM1の発現はMOLT4にのみ発現が見られた.過酸化水素水(100μM)による過酸化ストレスの影響をK562細胞で見たところ,CYP3A4で7倍,GSTP1で10倍の発現の増加が観察された.また,MOLT4について肝臓の薬物代謝酵素を誘導する化学物質の影響を見たところ,β-ナフトフラボンや3-メチルコラントレンによりCYP1A1の発現が34倍増加し,フェノバルビタールによりCYP3A4の発現が抑制され,また,UGT2B4の発現は5倍上昇した.本研究は,免疫担当細胞などの生体にとって重要な細胞種を含む血液細胞について,薬物代謝酵素の発現様式とその生理的機能を明らかにすることを目的とした.6種のヒト血球系培養細胞について,cytochrome P450(P450,CYP)および抱合酵素の発現解析を行った.CYPについては,CYP1A1,1A2,1B1,2A6,2A7,2D6,2E1の発現がすべての細胞で確認された.また,2A13,2C9は検出されなかった.肝臓で強く発現しているCYP3Aサブファミリーについては,CYP3A4,3A5の発現がMOLT4,K562で見られた.また、CYP3A7の発現はK562で弱い発現が認められたのみであった。グルクロン酸転移酵素(UGT)では,多くの薬物・異物の抱合に関係するUGT1Aファミリーの発現はリンパ球系のMOLT4,BALL-1でのみで見られた.BALL-1では8種のUGT1Aサブタイプが発現し,MOLT4では2種のUGT1Aサブタイプの発現が見られた.ステロイドの抱合を行うUGT2Bファミリーの発現はほとんどの細胞種で見られたが,UGT2B10は4種のリンパ球系細胞のみに,また,UGT2B17はK562細胞にのみ発現していた.また,グルタチオンS-転移酵素(GST)の発現に関しては,GSTA4,GSTP1,GSTT1の発現がすべての細胞種で確認されたが,タバコの発癌物質の解毒に関係するGSTM1の発現はMOLT4にのみ発現が見られた.過酸化水素水(100μM)による過酸化ストレスの影響をK562細胞で見たところ,CYP3A4で7倍,GSTP1で10倍の発現の増加が観察された.

また,MOLT4について肝臓の薬物代謝酵素を誘導する化学物質の影響を見たところ,β-ナフトフラボンや3-メチルコラントレンによりCYP1A1の発現が34倍増加し,フェノバルビタールによりCYP3A4の発現が抑制され,また,UGT2B4の発現は5倍上昇した.ヒトの肝臓以外の臓器・組織における薬物代謝酵素に関しては不明な点が多い。特に,免疫担当細胞などの血球系の細胞における薬物代謝酵素に関しては、十分には明らかになっていない。投与された薬物や吸収された異物の血球系細胞による代謝は、それら薬物や異物の体内動態や薬効・毒性に大きな影響を与えると予想される。そこで本研究では、ヒトの血球系細胞の薬物代謝を調べるモデル系として、ヒト血球系幹細胞由来の培養細胞を用いて、その薬物代謝酵素の発現の有無、あるいはその活性を調べ,その生理的機能を明らかにすることを目的とした。ヒトの血球系薬物代謝を調べるモデル系として、ヒト血球系幹細胞由来で分化誘導可能な培養細胞(HL-60,K562,MOLT4,BALL-1,U-937,Jurkat)を用いた.細胞よりRNAを単離し,各酵素に特異的なプライマーを用いたRT-PCR法により,それらの細胞における薬物代謝酵素(P-450,硫酸転移酵素)の発現の有無、その種類を調べた.その結果,P-450に関しては,CYP1A1,1A2,1B1,2D6,2E1の発現がすべての細胞で確認された.また,CYP2A6,2A13,2C9はほとんど検出されなかった.肝臓で強く発現しているCYP3Aについては,3A3および3A7の発現は見られなかったが,3A4,3A5についてはMOLT4,K562で発現が見られた.HL-60やK562の分化を誘導した場合,CYPの発現には大きな変化は見られなかったが,K562をヘミンで誘導した際,発現の若干の減少が認められた.硫酸転移酵素に関しては,フェノール性基質を抱合するP-ST(ST1A1,1A3)の発現がすべての細胞で確認された.また,発癌物質の代謝的活性化に関与すると考えられるST1C2の強い発現も全ての細胞で観察された.以上の結果より,血球系細胞における薬物代謝酵素の発現は肝臓とは異なること,さらに,細胞特異性があることが明らかとなった.UDP-グルクロン酸転移酵素の発現については現在検討中である.本研究は,免疫担当細胞などの生体にとって重要な細胞種を含む血液細胞について,薬物代謝酵素の発現様式とその生理的機能を明らかにすることを目的とした.6種のヒト血球系培養細胞について,13年度は,12年度のP-450(CYP)の発現解析に続き,第II相の薬物代謝酵素である抱合酵素の発現解析を行った12年度は,硫酸転移酵素(SULT)について報告したが,本年度はグルクロン酸転移酵素(UGT)およぴグルタチオンS-転移酵素(GST)について解析を行った.多くの薬物・異物の抱合に関係するUGT1Aファミリーの発現はリンパ球系のMOLT4,BALL-1でのみで見られた.BALL-1では8種のUGT1Aサブタイプが発現し,MOLT4では2種のUGT1Aサブタイプの発現が見られた.ステロイドの抱合を行うUGT2Bファミリーの発現はほとんどの細胞種で見られたが,UGT2B10は4種のリンパ球系細胞のみに,また,UGT2B17はK562細胞にのみ発現していた.また,GSTの発現に関しては,GSTA4,GSTP1,GSTT1の発現がすべての細胞種で確認されたが,タバコの発癌物質の解毒に関係するGSTM1の発現はMOLT4にのみ発現が見られた.以上の結果から,SULTの結果とあわせて,抱合酵素の発現は細胞種により異なり,細胞特異的に発現するサブファミリーの存在が明らかとなった.このような細胞種による抱合酵素の発現の違いは,薬物や環境汚染物質の毒性に対する感受性に影響するものと考えられ,安全な薬物治療や環境汚染物質の毒性評価に指針となるものである.
筋組織由来蛋白の法医診断への応用に関する研究

15例の剖検例について心筋中及び全身19箇所の骨格筋中の筋由来物質含有量を調べた。心筋では、心筋特異的トロポニンT(TnT)含有量は事例によるばらつきがあり、また当該事例の心臓血中濃度との間に相関はなかった。心筋中ミオグロビン(Mb)含有量も事例による差を認めた。また、これら15例について骨格筋に含まれる筋肉由来の各種蛋白やその他の物質の含有量も、事例により差が認められたほか、同一事例における骨格筋の部位による違いも、認められる場合と認められない場合とがあった。従って、筋由来物質の筋肉内含有量を死因診断、死後経過時間推定、年齢推定などに結びつけることは困難であった。血液中筋由来物質含有量を血液の部位別に検討すると、心筋特異的なTnTやトロポニンI(TnI)は、心臓血、大血管血、末梢血管血の順に、また右心系(静脈系)より左心系(動脈系)で含有量が多かった。これに対し心筋より骨格筋に含有量の多いCPKやクレアチンではこの傾向は逆となった。また、肝臓に多量に含まれるGOTやGPTは心臓血や末梢血より大血管血で活性が高かった。これらの結果は、血液の死後循環、筋肉からの物質の死後洩出メカニズム、中毒事例における薬物の死後拡散を考える上で示唆に富むものと思われた。しかし血中Mb濃度は、心臓血、末梢血管血、大血管血の順で高いという独特の特徴を示し、このメカニズムや意義については解明は今後の課題となった。また心臓血中の心筋特異的なTnTやTnI濃度は、溺死事例では左心血より右心血で高濃度である傾向が認められた。これは溺死の補助診断として有意義と考えられたが、そのメカニズムについては今回の研究では解明できなかった。血液以外の体液では、脳脊髄液や硝子体中クレアチン濃度が死後の時間経過とともに上昇し、心嚢液中クレアチニン濃度もまた死後経過時間と正の相関があった。従ってこれらのパラメーターは死後経過時間推定に役立つものと思われた。筋組織由来蛋白のうち、特にMbについて遺伝子分析の法医診断への応用を試みたところ、第2エクソンにおけるSNPが個人識別や親子鑑定への応用が考えられたほか、第3エクソンにおけるヒト特異的塩基配列の検出が人獣鑑別に有用であった。本研究は、複数の筋蛋白について種々の部位の血液や筋肉などにおける含有量(活性)を測定し、その成績を様々な観点から詳細に分析して、種々の法医診断に役立てることを目指すものである。本年度は、筋蛋白としてはトロポニンT、トロポニンI、ミオシン軽鎖I、CPK、CPK-アイソザイム、CPK-MMアイソフォームの6項目を中心に、試料としては剖検死体から部位別に彩取した血液やその他の体液を中心に検討を進めた。。尚、血液等体液以外の試料については、本年度は、屈筋及び伸筋、赤筋及び白筋を取り混ぜた全身約20ヶ所から骨格筋の収集を行い、現在約30の剖検例からこれらを採取し超低温に保存している。

死体血液に関して、上記各筋蛋白のうち前3項目については約260検体、後3項目を含めると約650検体を対象として、部位別にその濃度について検討したところ、一般的には、右心血より左心血、静脈血より動脈血、末梢血より心臓血で高い傾向があり、本研究が死後経過時間の推定や死後循環の実態解明につながることが示唆された。一方、溺死事例では左心血と右心血で各筋蛋白濃度が逆転する傾向があり、死因診断にも応用できる可能性が示された。また、若干数ながら、血液中の各筋蛋白濃度が採取部位の如何に拘わらず極端に高い事例があり、この意義付けについては今後の課題である。尿、脳脊髄液、硝子体液中の各筋蛋白濃度は一般に低く、事例による差は殆どみられなかった。しかし、硝子体液ではミオシン軽鎖Iの濃度が上昇している例があり、この意義付けについても今後検査例数を増やして検討する必要がある。脳脊髄液では、微量でも血液が混入するとその影響が極めて大きいことが判明し、試料採取は極めて慎重に行う必要があることや、CPK-MMの比率で混入程度を評価しうることが分かった。本年度は、各種事例における横紋筋内の筋蛋白(ミオグロビン、トロポニンT、トロポニンI、ミオシン軽鎖I、CPK、CPK-アイソザイム、CPK-MMアイソフォーム、GOT、GPT、LDH、LDH-アイソザイム、ALD)の活性ないし含有量を調べ、その法医学的意義を検討した。横紋筋の採取部位は側頭筋、胸鎖乳突筋、大胸筋、横隔膜、腹直筋、僧坊筋、広背筋、上腕二頭筋、上腕三頭筋、腕橈骨筋、長指伸筋、拇指球筋、大臀筋、腸腰筋、大腿四頭筋、大腿二頭筋、前脛骨筋、腓腹筋、拇趾球筋に心筋を加えた20ヶ所とした。また、骨格筋特異的ミオシンなどについての検討は、必要な試薬の入手が困難であったため、蛋白ではないが筋肉内に多量に含まれているクレアチンに変更した。これら筋蛋白の横紋筋内含有量(活性)は事例ごとに違いがあったが、死因、死後経過時間などとの間に特定の関係は見出されなかった。また年齢、性別による明らかな差異も認められなかった。横紋筋の筋蛋白含有量は、骨格筋では部位による差は明瞭ではなく、また心筋では、何れの部位の骨格筋と比較してもGOT活性が高かったが、CPKやALD活性は低く、ミオグロビン、クレアチン含有量は少なかった。GPTやLDHの活性、CPK-MMアイソフォームパターンは心筋と骨格筋の間に大きな差はなかった。心筋トロポニンTは、心筋中には40-160μg/g・wetが含有されており、骨格筋中にも種々の程度に含有が認められたが、骨格筋中濃度の意義については今後の検討課題である。更に、各種体液中筋蛋白濃度の法医学的意義に関する検討を前年度から継続して行ったところ、心筋トロポニンTの血中濃度は慢性心疾患や胸部に外力が作用した事例で上昇が高度で、そのような濃度上昇事例の内因・外因の鑑別は、心嚢液中CPK総活性上昇程度から可能と思われた。脳脊髄液では、クレアチン濃度が経時的に高くなる傾向を一般に認めた。全身19箇所の骨格筋及び心筋中の筋由来物質含有量は、最終的に15例の剖検例について調べた。心筋中の心筋特異的トロポニンT含有量は事例によるばらつきを認め、また心臓血中濃度との間に相関はなかった。ミオグロビン含有量も事例による差があった。骨格筋に含まれるトロポニンTやミオグロビン量も事例により差を認め、また同一事例における骨格筋の部位による違いも、認められる場合と認められない場合とがあった。この傾向はその他の筋由来物質についても同様であり、筋由来物質の筋肉内含有量を死因診断、死後経過時間推定、年齢推定などに結びつけることは困難であった。
イオンが移動するときのエネルギー障壁は陽イオンのネットワークである程度決まるため,高いイオン移動度は,蛍石型(8配位:立方体)やペロブスカイト型(6配位:八面体)など特定の結晶構造型と配位多面体で発現する.殆どのイオン伝導体は偶然発見されてきたが,本研究課題では,膨大な既存の結晶構造データから5配位や7配位,複数の混合配位など今までイオン伝導体として注目されてこなかった物質群を抽出し,候補物質を高速スクリーニングし,従来注目されてこなかった配位多面体によるイオン伝導を示す,新型イオン伝導体を探索することを目的としている.また,そのような珍しい配位多面体を有するイオン伝導体の伝導機構を明らかにすることも目的としている.今年度はBa,Zn,Gaを含む酸化物系を中心に探索した.結合原子価法により酸化物イオンが移動するエネルギー障壁を計算した結果,エネルギー障壁が比較的低い候補化合物がいくつか見いだされた.そこで,実際に試料を固相反応法で合成し,構造解析を行った. Si3O10グループを含む酸化物イオン伝導体を発見し,ドーピングにより酸化物イオン伝導度を向上させた.結合原子価法によりSi3O10グループの陵に沿って酸化物イオンが移動することが示された.また,Znが5配位でZnO5ピラミッドを含む酸化物イオン伝導体BaHo2ZnO5にドーピングを行い,酸化物イオン伝導性を向上させることに成功した.Ndが7配位多面体NdO7を形成するというユニークな構造的特徴を有しているBaNdInO4関連物質BaRMO4において,MO6八面体の回転がTolerance Factorで説明できることも見出し,J. Ceram. Soc. Jpn.に発表した.また,配位状態が珍しいBa3MoNbO8.5のイオン伝導機構を明らかにした.さらに一つの陽イオンが二種類の配位状態を時間に依存して両方とることにより高い酸化物イオン伝導度を示す画期的な新物質も発見しつつあり,特許も出願した.理由1:本課題ではZnO5配位多面体, NdO7配位多面体やSi3O10グループといった特異な配位多面体を有するイオン伝導体を次々に発見しており,当初の計画以上に課題が進展している.Znが5配位でZnO5ピラミッドを含む酸化物イオン伝導体BaHo2ZnO5にドーピングを行い,酸化物イオン伝導性を向上させることに成功したことは意義深い.さらにSi3O10グループの陵に沿って酸化物イオンが移動するという稀有なイオン伝導体の発見は,ACSの一流誌に成果が掲載され,新聞で大きく報道されると共に,政府系シンクタンクでもレクチャーを行った.理由2:2014年に代表者のグループが発見したBaNdInO4はNdO7という特異な配位状態を持つ.この関連物質BaRMO4のMO6八面体の回転がTolerance Factorで説明できることも見出したことも大きな成果の一つである.理由3:特異な配位多面体を有するイオン伝導体の結晶構造とイオン伝導経路を高温でその場測定した中性子回折データのリートベルト解析と最大エントロピー法による解析により解明した.これらの成果は四面体と八面体のハイブリッド構造のため,四面体酸素と八面体酸素を経由するイオン伝導機構を実験で明確に示し,価値が高いものと世界で認められ,J. Mater. Chem. A(インパクトファクター9.931)にCommunications(速報)として掲載された.これはハイブリッド構造のイオン伝導経路を可視化した世界で初めての例であり,論文のレフリーからも高く評価された.理由4:上記3に基づいて新物質探索を行い,一つの陽イオンが二種類の配位状態を時間に依存して両方とることにより高い酸化物イオン伝導度を示す画期的な新物質も発見しつつあり,特許も出願した.このように特異な配位多面体の新型イオン伝導体を発見したこと,また,特異な配位多面体を介したユニークなイオン伝導機構を解明したことから,当初の計画以上に課題が進展しているといえる.イオン伝導が報告されていない基本物質について配位多面体の連結様式を調べて候補物質を選定する.結合原子価(BV: Bond Valence)法に基づいて単位胞内におけるテスト酸化物イオンのエネルギー図(BVE図)を計算する.計算したBVE図において格子を横切ってイオン伝導経路が連結するか否かを精査する.連結しなければその物質を候補から棄却し,連結すれば次の手順へ進む.BV法で拡散経路が確認された候補物質群のいくつかについて,第一原理計算によりイオン伝導のエネルギー障壁を計算する.BV法あるいは第一原理計算でスクリーニングした候補物質を合成する.X線回折(リートベルト解析)と蛍光X線分析とICP発光分析により組成と生成相を評価する.昨年度に引き続きZn等を含む化合物を合成し,直流四端子法により電気伝導度の温度依存性を空気中で測定する.電気伝導度が高い組成については,電気伝導度の酸素分圧依存性および輸率を測定する.イオン伝導度が比較的高い試料を大量に合成し,中性子回折および放射光X線回折測定を実施する.回折データを用いて,リートベルト法と最大エントロピー法により核密度分布(中性子),電子密度分布(放射光X線),BVE図,第一原理計算による拡散経路を求め,イオン拡散経路と化学結合を研究する.中性子回折実験を,原子力機構内のJ-PARCのiMATERIAとSuperHRPD,海外の施設(オーストラリアANSTOのEchidnaにて実施する予定である.放射光X線回折実験はつくばの放射光研究施設
PFまたは兵庫県のSPring-8にて実施する.発見した新型イオン伝導体の組成を変えて,イオン伝導度が高い組成を探索する.解明した結晶構造を基に,キャリア濃度とイオン伝導度が高い組成を設計し,系統的に組成が異なる試料を多数合成して,電気的な性質を研究する.以上の様に,引き続き特異な配位状態を持つ新型イオン伝導体を探索していく.酸化物イオンが結晶の単位胞を横切って隣りのサイト(結晶学的な席)に移動するときのエネルギー障壁は陽イオンのネットワークである程度決まるため,高いイオン伝導度は,蛍石型(8配位:立方体)やペロブスカイト型(6配位:八面体)など特定の結晶構造型と配位多面体で発現する.殆どのイオン伝導体は偶然発見されてきたが,本研究課題では,膨大な既存の結晶構造データから5配位ピラミッドや7配位など今までイオン伝導体として注目されてこなかった物質群を抽出し,候補物質を高速スクリーニングすることにより,5配位や7配位といった従来注目されてこなかった配位多面体によるイオン伝導を示す,新型イオン伝導体を探索し,発見した新型イオン伝導体のイオン伝導度を向上させることを目的としている.2017年度はZnを含む酸化物系を探索した.その理由はZnの資源が豊富である上にZn2+陽イオンの電子配置がd10であり,他のd10電子配置を示すGa3+のように優れたイオン伝導体が発見できる可能性があるからである.しかもZn2+を主成分として含む酸化物イオン伝導体は殆ど無いからである.Znを含む酸化物においてほとんどの場合,Znは4配位でZnO4四面体を形成する.本課題ではBaY2CuO5型構造を持つBaR2ZnO5(R = Sm, Gd, Dy, Ho, Er)に着目した.なぜならBaY2CuO5型BaZnR2O5ではZnが5配位でZnO4ピラミッドを形成するのでユニークなイオン伝導性を示す可能性があるからである.2017年度にBaR2ZnO5(R = Sm, Gd, Dy, Ho, Er)を合成し,結晶構造,電気的性質および光学的性質を調べた.2017年度はこの他にも,Ndが7配位というユニークな特徴をもった,Baを過剰に含む固溶体Ba1+xNd1-xInO4-x/2を初めて合成し,構造と電気的性質を研究した.2017年度はZnを含む酸化物系を中心に探索した.結合原子価法により酸化物イオンが移動するエネルギー障壁を計算した結果,BaY2CuO5型構造を持つBaR2ZnO5(R = Sm, Gd, Dy, Ho, Er)のエネルギー障壁が比較的低いことがわかった.そこで, BaR2ZnO5 (R = Sm, Gd, Dy, Ho, Er)を固相反応法で合成した.得られた試料の放射光X線回折データを測定してリートベルト解析を行い,格子定数が希土類のイオン半径と共に増加すること,化学膨張に異方性が殆ど無いことを見出した.BaR2ZnO5(R = Sm, Gd, Dy, Ho, Er)の中でBaHo2ZnO5の電気伝導度が最も高いことがわかった.BaHo2ZnO5の電気伝導度は酸素分圧に依らず一定である酸素分圧の領域が存在し,バンドギャップが広かった.よって,BaY2CuO5型BaHo2ZnO5が酸化物イオン伝導体の新構造ファミリーであることを発見した.また,我々が発見した酸化物イオン伝導体の新構造ファミリーBaNdInO4は,Ndが7配位多面体NdO7を形成するというユニークな構造的特徴を有している.
共有仮想空間のための高信頼マルチキャストシステムに関する研究

マルチキャスト通信は、効率的に多人数に情報を配布できる技術として注目されているが、従来の1対1の通信で培われてきた高信頼化技術やセキュリティ技術が直接適用できない。特に、我々はリアルタイムに仮想空間を共有するための高信頼マルチキャスト技術を開発してきた。我々の提案するマルチキャストシステムでは、利用者をいくつかのドメインに分割し、同期した乱数生成機1構とドメイン毎のシーケンスサーバを前提として、メッセージの全順序性、信頼性を与えている。本研究では、まず全順序性決定に使われるドメイン毎のメッセージ送信率情報の配布間隔やドメイン数を変化させたときの、通信遅延や余分な制御メッセージの量を評価した。この結果から、同じクライアント数でもドメイン構成を導入し場合、特にその分割数を少なくすると制御メッセージ数が減少し、通信遅延が減少することが判明した。これは、利用者個々の送信率の変動が、ドメイン構成の効果で平均化されたことによる。また、マルチキャストにとって特定のメンバにのみ情報を伝達するための暗号化が非常に重要となるが、メンバシップが変更するのに応じて鍵を新しくするためには、効率的な鍵の配送方法が必要となる。我々は、複数の鍵配布サーバに非同期に鍵を発行させ、配布させるフレームワークを提案し、それをシミュレーションによって評価した。この鍵配布方法は、複数の鍵を同時に管理する手間が生じるが、鍵更新時にシステム停止がなく、効率的であることが確認できた。最後に、マルチキャストの再送処理について、再送サーバと呼ばれる再送処理専用のノードを用意する方法を提案し、再送木と呼ばれる再送サーバ間を連携させる木の構築方法を考案した。特に、バックアップリンクと呼ぶ再送サーバ間のリンクが切れた場合の代替リンクを用意する方法を提案し、再送木の信頼性を向上させることができた。我々の提案するマルチキャストシステムでは、利用者をいくつかのドメインに分割し、同期した乱数生成機構とドメイン毎のシーケンスサーバを前提として、メッセージの全順序性、信頼性を与えている。今年度の研究は、全順序性決定に使われるドメイン毎のメッセージ送信率情報の配布間隔やドメイン数を変化させたときの、通信遅延や余分な制御メッセージの量をシミュレーションによって評価した。また、マルチキャストにとって特定のメンバにのみ情報を伝達するための暗号化が非常に重要となるが、このメンバシップが頻繁に変化する環境での暗号鍵の配送方法の研究は少なかった。しかし、メンバシップが変更するのに応じて鍵を新しくするためには、効率的な鍵の配送方法が必要となる。これらの成果は、2件の論文と2件の国際会議に報告を行った。マルチキャスト通信は、効率的に多人数に情報を配布できる技術として注目されているが、従来の1対1の通信で培われた高信頼化技術やセキュリティ技術が直接適用できない。

我々の提案するマルチキャストシステムでは、利用者をいくつかのドメインに分割し、同期した乱数生成機構とドメイン毎のシーケンスサーバを前提として、メッセージの全順序性、信頼性を与えている。今年度の研究は、マルチキャストコンテンツの暗号化モジュールの開発と、メッセージ送信率制御機構の開発、及び再送のための木を動的に構築する手法の開発を行った。マルチキャストコンテンツ暗号化モジュールは、マルチキャストの通信チャネルを暗号化するための機構であり、マルチキャストをビジネスやプライベートな情報交換に利用するための機構である。我々は、更に暗号化のデータの管理方式として、閾値暗号を用いて、複数のサーバに情報を分散配置することにより信頼性を更に高める方式を開発した。また、メッセージ送信率制御機構は、再送サーバというマルチキャスト木の中間ノードに設置したサーバによってメッセージ損失率やドメイン毎の送信率から、ドメイン単位で送信量削減率を割り当てる方式を提案した。また、その方式でTCPと親和性のある制御ができることを確認した。再送木の構築手法は、木の概略の大きさを示す情報と、木のノードの枝数と、新たに参加するノードとの間の通信遅延をもとに、木を増分的に構築していく手法を開発し、従来の方法と比較してコンパクトで負荷の偏りがない再送木が構築できることを示した。これらの成果は、国内の研究会、国際会議で報告を行った。マルチキャスト通信は、効率的に多人数に情報を配布できる技術として注目されているが、従来の1対1の通信で培われた高信頼化技術やセキュリティ技術が直接適用できない。特に、我々はリアルタイムに仮想空間を共有するための高信頼マルチキャスト技術を開発してきた。我々の提案するマルチキャストシステムでは、利用者をいくつかのドメインに分割して、同期した乱数生成機構とドメイン毎のシーケンスサーバを前提として、メッセージの全順序性、信頼性を与えている。昨年度までは、マルチキャストの再送処理について、再送サーバと呼ばれる再送処理専門のノードを用意する方法を提案し、そのノード間を木構造で結んで再送要求をその木に沿ってフィードバックしていくシステムを提案してきた。また、その木構造を高信頼に構築するために、バックアップリンクと呼ばれる補助的なリンクを木に追加するアルゴリズムを提案し、評価してきた。今年度は、その木を構築する際に、できるだけ均質で、少ない負荷で構築するための性能評価をおこなった。まず、再送サーバを新しく導入するときは、既にある再送木に接続する形式で行うが、その際の接続先の検索範囲を徐々に広げていくリングサーチを用いることにより、コストが少なく従来の木とそれほど遜色ない木ができることをシミュレーションで評価した。また、木のリンク方向の大きさを示す情報を各ノードは保持するが、その変更を伝播する必要がある。その伝播頻度を変更した場合の木の性質を、シミュレーションにより評価した。その結果、従来の半分の伝播頻度でも従来の木の性質と遜色ない木を生成できることを示した。この成果は、国際会議、及び学会論文誌に発表した。
脳血管内遠隔治療支援システムの構築

1)脳血管のスーパーコンピューターを利用した三次元再構築:解像度と時間分解能が圧倒的に優れている3D-DSAを用いて、スーパーコンピューターによる流体力学的各種パラメーターの解析が、データー取得から数時間で可能になった。Computer Fluid Dynamicsapplicationの応用・開発により、心臓サイクルの時間軸を加えた四次元の解析を行い、病態の異なる病変について有用な臨床情報が提供された。2)脳血管障害のコンピューターシミュレーションによる解析と治療への応用:脳動脈瘤、動脈硬化、動静脈瘻などの解析を進め、動脈瘤の成長・発育、破裂に関する重要な知見をはじめ、臨床的に貴重な情報が得られた。3)脳血管内治療のバーチャルリアリティを応用したシミュレーションシステムの開発:反力フィードバックが可能な入出力デバイスPHANToMを用いて三次元血管モデルでのバーチャルリアリティ上のシミュレーションが可能になり、三次元の血管内でのガイドワイヤーが操作できる脳血管内治療のシミュレーションソフトを開発した。4)近未来展望:バーチャルリアリティの脳血管内治療訓練への応用、micro-robotics技術などを応用した各種マスタースレーブシステムの開発を経て、脳血管内遠隔治療が可能になる。また、脳血管障害の病態解明に科学的根拠を与えるコンピューターシミュレーションの開発に本研究の成果が広く応用されることが期待される。平成12年度は1)三次元空間での脳血管情報の再構築、2)コンピューターを用いた血流解析、3)バーチャルリアリティの応用、の三方向から研究に取り組んだ。1)三次元画像(主として三次元脳血管撮影画像)をスーパーコンピューターに取り込む方法を確立した。この方法を用いると、臨床データーからスーパーコンピューターで分析可能なモデルを迅速に構築できる。これまで種々の三次元血管情報をスーパーコンピューターで解析した報告はあるが、全て三次元CTやMRIのデーターに基づくものであり、より詳細で正確な血管情報が得られる三次元血管撮影(3D-DSA)のデーターを使った方法は未だ報告がない。2)脳動脈瘤や動脈硬化性の狭窄病変について、種々の流体力学的情報(血管表面の静的・動的圧力、血管内での血流のベクトル情報、血管表面のずり応力)を分析することができるようになった。脳動脈瘤ではその発生、成長、破裂に血流動態が密接に関係していると考えられる。これら血流動態の要因を実際の臨床例を元に即座に分析することは脳動脈瘤の病態理解に有用で、適切な治療を行う上で必要不可欠である。またコンピューターシミュレーションに必要な種々のデーター(流入・流出動脈の血流情報など)を同じ症例から得ることで、より現実的な解析が可能となった。3)2)で得られた情報を元に、バーチャルリアリティの手法を用いてコンピューター内で脳血管内治療をシミュレートするソフトウェアを開発中である。入力には三次元の反力機構を備えた装置(PHANTom)を用いている。単純な血管モデルを用いたカテーテル操作のシミュレーションができるようになった。実際の臨床データーを用いたモデルの構築、反力データーの抽出とデーターベースの構築などのための基礎的開発が完了した。平成13年度は昨年度に引き続き、以下の二点を中心に研究を進めた。1)三次元血管モデルの構築:まず三次元の血管モデルを実際の患者のデーターから構築する研究については、三次元デジタルサブトラクション血管撮影(3D-DSA)のデーターを、スーパーコンピューターで処理するためのルーチンを作製した。その結果、ほぼリアルタイムに三次元データーを処理可能になった。このモデルにおいて、心臓側から脈圧を持つ血流を流すシミュレーションができるようになり、頭蓋内脳動脈癌など様々な脳血管疾患の種々の病態について、動脈壁の静水圧分布、ダイナミック圧分布や動脈壁のずり応力の変化、管膣内での血流パターンの解析が行える様になった。これまでの検討では破裂動脈癌と未破裂動脈癌についてえ、検討したパラメーターでは大きな違いがないことが判明した。2)脳血管内治療のコンピューターシミュレーション:1)で得られたデーターを利用して、仮想空間上でカテーテルやガイドワイヤーを操作するソフトウェアを開発中である。実際の脳血管内治療のデーターをフィードバックする方法についても更にデーター収集を行い、シミュレーションに反映しつつある。これら基礎的研究に加えて、血管内治療における遠隔操作の方法について、更に検討した。従来は能動カテーテル、能動ガイドワイヤーのような操作される機器が自ら動くものを想定していた。

しかし、非常に屈曲蛇行が強く、また細径ので繊細な構造を持つ頭蓋内血管内での制御を考えると、もう一つのオプションとして頭蓋外からの磁場によるコントロールも大いに将来性のある方法と考えられた。磁場と用いた血管内機器のコントロールについて基礎的な研究を開始した。本年度は具体的な脳動脈病変について、患者から得られた三次元脳血管撮影のデーターをもとに血流動態を含む多角的総合的なコンピューター解析を行った。対象は主として脳動脈瘤で部虚血性脳血管障害は動静脈奇形、動静脈瘻なども含まれた。脳動脈瘤については、多数例の検討から、破裂脳動脈瘤と未破裂脳動脈瘤の各種パラメーターの差異を検討した。現在判明しているパラメーターを用いて、直接未破裂脳動脈瘤の破裂予測をすることは困難だったが、いくつかの重要な知見が得られた。特に動脈の分岐パターンと脳動脈瘤の成長についてあらたな知見が得られた。また、論文として発表したように、個々の症例において、治療方針の決定や病態解明に役立つ種々の知見が得られた。頚部内頚動脈狭窄症の動脈硬化病変の解析や、動静脈瘻の解析においても有用な知見が得られた。またコンピューター解析の開頭手術による実際の血管の状態での評価や、血管モデルを用いての妥当性の検討も行い、その妥当性が検証された。今年度新たに導入したソフトウェアにより、力覚フィードバックを付加したバーチャルリアリティシステムを構築した。簡単な血管内操作を実際の患者から得られた脳動脈内で再現することが可能になった。
ランゲルハンス細胞ニッシェの同定とアンカリングポイントの解析

本研究課題では、表皮の樹状細胞であるランゲルハンス細胞(LC)の前駆細胞を同定し、毛嚢が物理的刺激に応答してケモカインを発現し、LC前駆細胞を皮膚に動員する免疫機能を有することを明らかにした。この過程で無毛マウスであるTACE cKOマウスを解析し、独立した研究論文として発表した。本研究の流れで、LC機能を解析し、LCは表皮タイトジャンクションの間から樹状突起を伸ばして細菌抗原を獲得し、液性免疫を誘導することを証明した。この免疫応答は実験的ブドウ球菌性熱傷様皮膚剥脱症を予防した。経皮的に侵入した抗原や、皮膚関連自己抗原への免疫応答の調節は樹状細胞が行っていると考えられている。皮膚の代表的な樹状細胞であるランゲルハンス細胞(LC)がどのような経路で皮膚に入っているのか、また、その分子メカニズムはどうなっているのか。これらを明らかにすることにより将来炎症性疾患で免疫をコントロールする新たな糸口が見つかるはずである。我々はランゲルハンス細胞を一過性に消去しうるLangerin-DTRマウスを用い、LCが消去してから復帰する動態を解析し、2経路存在することを確立した。一つは復帰当初からLCの表面マーカーを全て発現し、島状に復帰する経路、もう一つはMHC class IIのみを発現し、個細胞の状態で復帰する新しい経路であり、この両者とも毛嚢を経由していた。本年度計画の一つはLangerin-DTRに細胞分裂周期を可視化できるFucciマウスと交配し、分裂中のLCを捉えることであった。その予備実験としてFucciマウス骨髄をLangerin-DTRマウスに移植し、可視か出来るかを2-photon microscopyを用いたin vivo imagingで評価した。残念ながら、Fucciマウス由来の細胞は蛍光輝度がin vivo imagingを行うには十分でなく、LCを解析に耐えうる程可視化出来なかった。もう一つの計画であったLangerin-DTRマウス(当初CD45.2背景)をCD45.1にバッククロスすることが出来た。これにより、CD45.2の骨髄をLangerin-DTRマウスに移入し、ドナー由来の骨髄が確かにLCに分化することが確認できた。この実験系にを用いて、ドナー由来のMHC class II陽性LC前駆細胞をフローサイトメトリーを用いて確認、セルソーターで分離することが可能となった。この系を用いて、MHC class II陽性LC前駆細胞がどのように表皮内にホーミングしているのかを解析したい。皮膚は外界と接する最外層のバリアであり、ここでは微生物やアレルゲンに対する活発な免疫応答が行われる。表皮唯一の樹状細胞であるランゲルハンス細胞は経皮免疫の起点となる重要な役割を担うと考えられており、ランゲルハンス細胞の再生・生理学を解析することは経皮免疫を理解する上で必須のことと言えよう。しかし、ランゲルハンス細胞がどこから供給され、どのようにして維持されているのかは多くのところ不明であり、この問いは樹状細胞領域の最大の関心の一つである。我々の目的は、ランゲルハンス細胞がどのような経路および機序で皮膚へ到達するのかを解析することにより、経皮免疫の仕組みをより深く理解することである。平成22年度は骨髄由来のランゲルハンス細胞を区別するシステムの構築が終了した。すなわち、ランゲルハンス細胞を一過性に消去しうるLangerin-DTR (diphtheria toxin receptor)をCD45.1背景にバッククロスした。このマウスにCD45.2マウス由来の骨髄を移植することによりCD45.2陽性のランゲルハンス細胞を皮膚で同定することに成功した。また、このシステムを用いることにより、種々のノックアウトマウス(多くの場合CD45.2)の骨髄を移植し、ランゲルハンス細胞への影響を観察できるようになった.同様に、蛍光色素(eGFP)を全身に発現するマウスの骨髄をLangerin-DTRマウスに移植することにより、移植した骨髄由来の血球細胞を蛍光色素にて識別できるようになった。このシステムを利用し、2光子顕微鏡のシステムを立ち上げ、ランゲルハンス細胞の皮膚に到達するまでの動態を生きたまま観察することができる基盤が整った。本研究課題では、表皮唯一の樹状細胞であるランゲルハンス細胞の前駆細胞を同定し(pre-LC)、毛嚢がこれらの細胞を動員する免疫機能を有することを明らかにした。毛嚢の免疫機能を明らかにしたのは本研究が初めてである。骨髄移植の系を駆使し、pre-LCがMLysozymeでfate mapしうる細胞であることを突き止め、これらの細胞は炎症に反応して表皮に動員されることが分かった。以前骨髄のGr-1high CD115high細胞がランゲルハンス細胞の起源として報告されたが、我々が同定したpre-LCはこの細胞に由来することが分かった。Pre-LCは表皮に動員される際、ケモカインレセプターであるCCR2とCCR6を必要とし、CCR8を欠損するとランゲルハンス細胞の数がむしろ増加した。

CAG-GFPマウスの骨髄をランゲルハンス細胞欠損マウスに骨髄移植し、テープストリップ刺激を受けた耳にGFP陽性の白血球が浸潤する様子を2光子顕微鏡で観察すると、pre-LCを含む骨髄系細胞は1時間以内に劇的に毛嚢に集積した。これは、毛嚢が骨髄系細胞を動員するメカニズムを有していることが強く示唆された。我々が発見した毛嚢マーカーであるEpCAMと既存のマーカーを利用し、毛嚢と表皮細胞を5サブセットに分離したところ、pre-LCの動員に必要なケモカインが異なる場所で発現していることが分かった。進行性に脱毛を来すTACE cKOマウス皮膚を利用し、pre-LCの復帰のためには毛嚢が必須であることを証明した。また、ヒト毛嚢内でもケモカインの発現は分担されており、ランゲルハンス細胞の維持には毛嚢が必須であることを示した。これらは現在投稿中である。また、本研究のためにTACEcKOを解析したが、これも独立した研究論文として投稿中である。本研究の流れで、ランゲルハンス細胞の液性免疫の機能を解析し、ランゲルハンス細胞は表皮タイトジャンクションの間から樹状突起を伸ばして細菌抗原を獲得し、液性免疫を誘導することを証明した。この免疫応答は実験的ブドウ球菌性熱傷様皮膚剥脱症を予防した(Ouchi et al. JEM, 2011)。
アンダーソン・モット転移の理論的研究

強相関電子系の金属絶縁体転移を遍歴-局在双対性モデルに基づいて理解することを目指した理論的研究を行った。1.スピンゆらぎの集団運動に起因するコーラー則の破れ銅酸化物高温超伝導体の異常金属相では、通常のフェルミ流体が満たす磁気輸送に関するコーラー則が著しく破れている。これは、通常のフェルミ流体論に立脚したボルツマン輸送方程式が、準粒子に還元できる過程しか考慮していないためで、ボルツマン方程式を越えたスピンゆらぎの集団運動の寄与を遍歴-局在双対性モデルに基づいて計算することにより、実験を説明することに成功した。このことは、我々が以前から主張しているように、銅酸化物の金属絶縁体転移が、従来主張されているような局所相関が重要な(狭義の)モット転移ではなく、非局所的なスピンゆらぎの集団運動が重要となる転移であることを示す事例となっている。2.アンダーソン・モット転移の自己無撞着理論乱雑さが存在する強相関電子系の金属絶縁体転移(アンダーソン・モット転移)について予備的考察を行った。銅酸化物高温超伝導体等に対する、我々の遍歴-局在双対性モデルに基づいた解析では、スピンゆらぎの自己無撞着理論を用いて、遍歴と局在という2つの自由度を記述してきた。乱雑さのある系では、この2つの自由度が分離する傾向が著しく、2流体モデル的記述が不可欠であるが、我々の理論がこの場合の記述にも適していることを見い出しつつある。
配位結合性ナノチューブの動的自己集合と機能化

生体内におけるペプチド鎖の認識は、オリゴペプチドを介した細胞内外での情報伝達や、タンパク-タンパク間相互作用など、生命活動における極めて重要な役割を果たしている。ペプチド鎖は種々のアミノ酸残基からなり、さらにその配列によつて様々な配座をとり得る。そのため、ペプチド配列を選択的に認識するとともに、その立体配座を制御することが実用的な観点から重要であると考えられる。我々は前年度までの研究で、配位結合性チューブ状錯体および立方八面体かご型錯体が、各種トリペプチドを配列選択的に認識することを見いだしている。そこで本年度は、配位結合性錯体のチューブ状内部空間内にペプチド鎖を包接することにより、その立体配座を制御することに成功した。本研究で用いたチューブ状錯体は、ポルフィリン多座配位子3分子とシス位を保護したパラジウム錯体6分子から自己集合する。^1H NMRよりポルフィリンチューブ錯体は、アラニンのみからなるトリペプチド(Ala-Ala-Ala配列)を効率良く包接することが分かった。さらにNMRのNOESY測定による詳細な解析を行ったところ、Ala-Ala-Ala配列の立体配座が一義的に規制されていることが示唆された。一方、より長鎖のペプチドを包接するため、さらに大きな筒状内部空間を有する中空錯体を用いて検討を行った。両末端にトリプトファン残基を有する9残基のペプチド鎖(Trp-Ala-Glu-Ala-Ala-Ala-Glu-Ala-Trp配列)と、お椀型の中空構造を有するボウル型錯体を水中で混合したところ、2分子のボウル型錯体が両末端のトリプトファン残基を認識することがNMR滴定およびDOSY測定から示唆された。その際、9残基のペプチド鎖に由来する全ての^1H NMRシグナルが高磁場シフトしていたことから、ペプチド鎖はボウル型錯体2分子から形成される筒状内部空間内にほぼ完全に取り込まれていると考えられる。さらに各種2次元NMRおよびNOESY測定から、筒状空間内に取り込まれたペプチド鎖の立体配座を検討したところ、9残基のペプチドはヘリカル構造を形成していることが示唆された。9残基のペプチド単独では水中でランダムな配座をとっているため、筒状内部空間に包接されることで本来不利なヘリカル構造が安定化されたと考えられる。近年、分子認識における機能化の観点からペプチドの認識が注目を集めている。ペプチド認識において最も重要なことは、あるアミノ酸配列のみを選択的に認識する「ペプチドの配列認識」であると考えられる。本研究では、チューブ状錯体の特異な内部空間をペプチド認識に適用することによって、顕著な配列選択性を見いだした。NMRよりポルフィリンチューブ錯体は、チロシンを含むオリゴペプチドを効率良く包接することを見いだした。吸収スペクトルとNMR競争実験からペプチドとの会合定数を算出したところ、ポルフィリンチューブ錯体は類似した配列の中でもTyr-Tyr-Ala配列を選択的に強く認識することを見いだした。一方、立方八面体構造を有する中空かご型錯体においても同様の検討を行ったところ、ポルフィリンチューブ錯体とは異なった選択性を見いだした。すなわち、かご型錯体の場合ではTyr-Tyr-Ala配列よりもTrp-Trp-Ala配列を100倍以上強く認識することが分かった。そこで、かご型錯体とTrp-Trp-Ala包接体の単結晶を作成しX線結晶構造解析を行ったところ、トリプトファンのインドール環とアラニンのメチル基が、かご型錯体とπ-π、およびCH-π相互作用していることが明らかとなった。さらにNMRより、溶液中でも同様の構造が保たれていることが示唆された。このことから、錯体とペプチドが協同的に多点相互作用することによって、ポルフィリンチューブ錯体、およびかご型錯体における顕著な配列選択性が観測されたと考えられる。

両末端にトリプトファン残基を有する9残基のペプチド鎖(Trp-Ala-Glu-Ala-Ala-Ala-Glu-Ala-Trp配列)と、お椀型の中空構造を有するボウル型錯体を水中で混合したところ、2分子のボウル型錯体が両末端のトリプトファン残基を認識することがNMR滴定およびDOSY測定から示唆された。その際、9残基のペプチド鎖に由来する全ての^1H NMRシグナルが高磁場シフトしていたことから、ペプチド鎖はボウル型錯体2分子から形成される筒状内部空間内にほぼ完全に取り込まれていると考えられる。さらに各種2次元NMRおよびNOESY測定から、筒状空間内に取り込まれたペプチド鎖の立体配座を検討したところ、9残基のペプチドはヘリカル構造を形成していることが示唆された。9残基のペプチド単独では水中でランダムな配座をとっているため、筒状内部空間に包接されることで本来不利なヘリカル構造が安定化されたと考えられる。
MEL1-EVI1遺伝子群による白血病発症機構の検討

1.t(1;3)転座を有する白血病の責任遺伝子MEL1には未だ不明な点が多い(Mochizuki,2000;Nishikata,2003)。これまでの解析から、MEL1SはCtBPの有無に関わらずHDAC群と相互作用すること、少なくとも一部のHDACはCtBPと相互作用しないことから、MEL1SとHDACの相互作用にはCtBPに替わる新たな因子の関与が示唆され、探索中である。G9Aは転写抑制に関与するメチル化転移酵素で、MEL1が属するPRDMのPRDI-BF1やPRISMとの相互作用が最近報告され、実際にRT-PCR法によりL-G3細胞での発現が確認された。免疫沈降WA法による解析から、MEL1SはG9Aと反応し、CtBP存在下で相互作用はさらに強まったが、CtBP非結合型変異体ASではほとんど反応を認めなかったことから、少なくとも、L-G3細胞での分化誘導阻止に関係する因子ではないことが示唆された。2.転写因子としての機能を明らかにするため、病態的、構造的、機能的に酷似したEVI1の標的遺伝子GATA-2ISに関するプロモーターアッセイ(Yuasa,2005)を用い、遺伝子産物MEL1SおよびASについて調べた。293TやCOS7、HeLa、CHO細胞の場合、MEL1Sは弱い転写抑制(^30%)を示すが、ASではほとんど効果が無かった。L-G3の場合、MEL1Sが強い抑制(^80%)を示し、ASでも効果を認めた(^45%)。両蛋白質を安定発現させたL-G3細胞でGCSFによる分化誘導が阻止され、これをTSA添加で解除できた(課題番号16590950)ことから、HDAC群のリクルートを介してMEL1SがGATA-2の転写を抑制することがL-G3細胞での分化誘導阻止に関係することが想起されるが、関与する他の因子とその機構については更なる検討が必要である。1、MEL1Sが有するGATA2遺伝子発現に関する転写制御能を調べるため、MEL1S野生およびCtBP非結合(AS)変異体を発現させた293T細胞に対し、同族EVI1が結合するとされる、GATA2遺伝子5'非翻訳嶺域上流67kbを用いたレポーターアッセイを行った。野生型では30-40%、AS変異体では10-20%の発現低下を認めた。介在する種々のファクターの影響をみる必要があるが、MEL1SによるGATA2遺伝子の発現抑制が示唆された。2、MEL1SがHDAC-1(2,3も)と相互作用することを以前報告したが、MEL1S上の結合部位を特定するため、全長MEL1Sから種々のドメイン欠失変異体(FLAGタグ)を作製、HAタグHDAC2との相互作用について293T細胞での発現産物を免疫沈降Western法で現在解析中である。またAS変異体との解析から、CtBP2の有無に関わらず相互作用しうることも報告した。293T細胞でFLAGタグCtBP2へのHAタグHDAC2の結合を調べた結果、HDAC2は検出されず、MEL1SとHDAC2との相互作用にはCtBP2に替わる新たなコファクターの関与が示唆された。3、G9A(EHMT2)は転写抑制に関与するヒストンH3-Lys9メチル基転移酵素であり、MEL1と同族のPRDI-BF1やPRISMとの相互作用が最近報告された。

t(1;3)転座を有するヒト白血病細胞およびマウスIL3依存性骨髄細胞(L-G3)-MEL1S安定発現株に関してG9A特異的プライマーを用いたRT-PCR法による解析を行い、両細胞にG9Aの発現を認め、ヒトではG9Aのメチル基転移活性に必須とされる複合体パートナーEHMT1の発現も明らかとなった。現在、MEL1SによるGATA2遺伝子発現制御についてCtBPにかわる替わる候補としてG9Aとの相互作用を検討中である。1. G9Aは転写抑制に関与するヒストンH3-K9及び非ヒストン(自己メチル化)のメチル化転移酵素であり、MEL1やEVI1と同じグループのPRDI-BP1やPRISMとの相互作用が最近報告された。293T細胞で、FLAGタグMEL1S及びHAタグG9Aを一過性に共発現させ、免疫沈降Western法で解析した。FLAG抗体沈降でHAタグG9A、HA抗体沈降でFLAGタグMEL1Sが相互に検出された。またFLAGタグMEL1S-CtBP非結合型変異体(AS)とHAタグG9Aの間でも、FLAGタグMEL1SとHAタグCtBP2の間でも相互に検出されたが、FLAGタグ同ASとHAタグCtBP2との相互作用は無視し得る程度であった。2. MEL1Sが有するGATA2遺伝子発現に関する転写抑制能を更に調べるため、MEL1S野生(WT)及びCtBP非結合型変異体(AS)を一過性に発現させたIL3依存性L-G3骨髄細胞株に対して同族EVI1が結合するGATA2遺伝子IS-5'非翻訳領域上流6-7kbを用いたレポーターアッセイを行った。用量依存的に、WTでは70-90%まで、ASでは60%まで達する強い発現抑制を認めた。またMEL1S-WT及びASを恒常的に発現させたL-G3骨髄細胞株でも、95%近いほぼ完全な抑制効果が見られた。一方、HeLa細胞での一過性発現では、前回報告の293T細胞と同様、WTでは30-40%程度、ASでは10-20%程度の抑制であった。いずれの細胞株においても、G9AまたはCtBP2の共発現により抑制効果は増強されたことから、少なくとも、L-G3骨髄細胞株では、GATA2遺伝子発現についてコリプレッサーと協調したMEL1Sの発現抑制機構の存在が示唆された。以上、MEL1Sが示すGATA2遺伝子発現への転写抑制能にG9Aも関与し得ることが示唆された。