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出雲系神話の成立と変容―ヤマタノヲロチ神話を中心に―

今年度は、ノートパソコン、スキャナー、大漢和辞典デジタル版、『日本書紀』写本の影印本などを購入し、研究環境の整備を行った後、研究室におけるデスクワークとして、『日本書紀』に記された神話全体に解釈を加え、全容の把握に努めると共に、ヲロチ退治神話について、本文並びに異伝の比較検討を行った。7月7日に島根県立古代出雲歴史博物館において開催した研究協力者との研究協議では、ヲロチ退治の神話を狭いエリアの出雲だけで見るのではなく、出雲と国境を接していた安芸・備中・伯耆などの範囲を視野に入れて中国山地全体の中で捉え直す必要があることが指摘された。これを受けて11月3日4日に、研究協力者と共同で、中国山地の広島県安芸高田市へ移動しヲロチ退治伝承地を踏査した。まず、郡山山麓にあるスサノヲを祭る清神社の周囲の環境を調査し、『日本書紀』の異伝に見える安芸を舞台としたヲロチ退治伝承に関わる地名が残されていることを確認できた。また、安芸高田市歴史民俗資料館において正徳6年安芸国高田郡図を閲覧し、釈文を入手できた。今後、絵図の分析を行うことでヲロチ退治に関わる地域の歴史的景観を復元したい。2月23日の研究協力者との研究協議では、森田が『日本書紀』神話の全体像に関わる報告を行い、スサノヲやオオナムチを含めた出雲系神話の神々は、天下経営に深く関わっており、カムヤマトイワレヒコは、そのような出雲系の神々の系譜を引く女性を正妻にしたので初代天皇になれたという『日本書紀』の論理を抽出できた。また、研究協力者の品川知彦氏は「大蛇退治と鉄生産との関係」というタイトルで報告を行った。品川氏の報告では、ヤマタノヲロチ退治神話と製鉄を結びつける見解は、大正年間以降に成立したものであり、記紀批判の研究で著名な津田左右吉がこの学説を引用したことにより、地元出雲では権威ある説として受け入れられたことを明らかにした。当初は、初年度に出雲山間部の遺跡やヲロチ退治伝承地及び神楽調査を予定していたが研究協力員との共同研究に基づき、出雲を舞台とした神話は、ヲロチ退治神話の一部に過ぎず、狭い意味での出雲だけを調査してもヲロチ退治神話の本質に迫ることができないことが明らかになった。そこで中国山地を境に出雲国に接する安芸国のヲロチ退治伝承地の調査研究を実施したが、そのことにより、ヲロチ退治の神話を中国山地全体の中で研究するための基礎が構築できた。また、今年度はヲロチ退治神話の内容そのものの分析に入る前提として、『日本書紀』の神話の全体像を分析したことで、『古事記』とは異なる『日本書紀』神話の論理を浮かびあがらせることに成功した。また、『日本書紀』の神話全体の中でのヲロチ退治神話の位置、神々の系図、神統譜の中でのスサノヲの位置が明らかになった。そのことにより、『日本書紀』のヲロチ退治神話を『古事記』のヲロチ退治神話と比較検討する際の基盤が構築できた。さらに研究協力者との共同研究により、ヤマタノヲロチ退治神話と製鉄を結びつけるような説が、近代以降に成立したことが判明したが、このことにより、ヲロチ退治神話の変容や地域社会における神話の機能を解明する際に中世や近世だけではなく、近代における神話変容の解明が必要とされることが明らかになった。また、ヲロチ退治の意味について、漠然と製鉄や洪水との関わりで説明されてきたが、それ以外の可能性について考える必要があるという現状も明らかになった。上記の4つの成果により、今後の年次計画を大幅に修正する必要が出てきたが、これは本研究の当初の目的の変更や逸脱を意味するものではない。ヤマタノヲロチ退治神話成立の歴史的背景、ヲロチ退治神話の変容という二つの課題を解明するために取り組むべき作業内容について、漠然としていた部分が、初年度の研究成果により、クリアーになった。昨年度、平成30年度の研究成果を踏まえ、今後はヲロチ退治神話成立の歴史的背景と変容の過程を狭い意味での出雲だけではなく、中国地方山間部全体の中で再考していく。今年度、令和元年度の現地調査については、当初は出雲山間部のたたら製鉄遺跡の踏査を予定していた。しかし、研究協力員品川知彦氏の研究により、ヲロチ退治神話がたたら製鉄と関係するという言説は、近代以降に成立したという事実が判明したため、調査地を変更することとした。今年度は出雲地方山間部の中でも、備中国や備後国と境を接している島根県奥出雲町のヲロチ退治神話の伝承地の調査を行い、関連する文献を収集すると共に現地の景観をデジタルカメラ等で撮影する。その上で、現地調査の成果を、『天淵八又大蛇記』や『雲陽誌』など中・近世の地誌と対比させながら、出雲地方山間部におけるヲロチ退治の伝承が、どの段階まで遡ることができるのか、この点を明らかにしていく。このような作業を行うことにより、『古事記』や『日本書紀』に記されたヲロチ退治の神話がどのような形で、中国地方山間部に受容されていくのか、そのプロセスが明らかにできると考える。次に今年度の研究協議の場において、研究協力員岡宏三氏に依頼し、ヲロチ退治にまつわる神楽台本の分析に関わる報告を行っていただき、ヲロチ退治神話の受容と変容の過程について討議する。

また、ヲロチ退治神話成立当初の中国山地一帯の状況を確認するために、研究協力員仁木聡氏に依頼して、中国山地に接する自治体の遺跡や遺物など考古資料のデータを収集し整理した報告を行っていただき、中国山地一帯の古代地域社会の状況について確認しヲロチ退治神話成立の歴史的背景について考える。次年度、令和2年度以降は、今年度の調査研究をさらに深化させる形で、中国地方山間部の古代の祭祀関連遺跡や古墳の調査、ヲロチ退治を題材とした神楽の調査などを実施する。今年度は、ノートパソコン、スキャナー、大漢和辞典デジタル版、『日本書紀』写本の影印本などを購入し、研究環境の整備を行った後、研究室におけるデスクワークとして、『日本書紀』に記された神話全体に解釈を加え、全容の把握に努めると共に、ヲロチ退治神話について、本文並びに異伝の比較検討を行った。7月7日に島根県立古代出雲歴史博物館において開催した研究協力者との研究協議では、ヲロチ退治の神話を狭いエリアの出雲だけで見るのではなく、出雲と国境を接していた安芸・備中・伯耆などの範囲を視野に入れて中国山地全体の中で捉え直す必要があることが指摘された。これを受けて11月3日4日に、研究協力者と共同で、中国山地の広島県安芸高田市へ移動しヲロチ退治伝承地を踏査した。まず、郡山山麓にあるスサノヲを祭る清神社の周囲の環境を調査し、『日本書紀』の異伝に見える安芸を舞台としたヲロチ退治伝承に関わる地名が残されていることを確認できた。また、安芸高田市歴史民俗資料館において正徳6年安芸国高田郡図を閲覧し、釈文を入手できた。今後、絵図の分析を行うことでヲロチ退治に関わる地域の歴史的景観を復元したい。2月23日の研究協力者との研究協議では、森田が『日本書紀』神話の全体像に関わる報告を行い、スサノヲやオオナムチを含めた出雲系神話の神々は、天下経営に深く関わっており、カムヤマトイワレヒコは、そのような出雲系の神々の系譜を引く女性を正妻にしたので初代天皇になれたという『日本書紀』の論理を抽出できた。また、研究協力者の品川知彦氏は「大蛇退治と鉄生産との関係」というタイトルで報告を行った。品川氏の報告では、ヤマタノヲロチ退治神話と製鉄を結びつける見解は、大正年間以降に成立したものであり、記紀批判の研究で著名な津田左右吉がこの学説を引用したことにより、地元出雲では権威ある説として受け入れられたことを明らかにした。当初は、初年度に出雲山間部の遺跡やヲロチ退治伝承地及び神楽調査を予定していたが研究協力員との共同研究に基づき、出雲を舞台とした神話は、ヲロチ退治神話の一部に過ぎず、狭い意味での出雲だけを調査してもヲロチ退治神話の本質に迫ることができないことが明らかになった。そこで中国山地を境に出雲国に接する安芸国のヲロチ退治伝承地の調査研究を実施したが、そのことにより、ヲロチ退治の神話を中国山地全体の中で研究するための基礎が構築できた。また、今年度はヲロチ退治神話の内容そのものの分析に入る前提として、『日本書紀』の神話の全体像を分析したことで、『古事記』とは異なる『日本書紀』神話の論理を浮かびあがらせることに成功した。また、『日本書紀』の神話全体の中でのヲロチ退治神話の位置、神々の系図、神統譜の中でのスサノヲの位置が明らかになった。そのことにより、『日本書紀』のヲロチ退治神話を『古事記』のヲロチ退治神話と比較検討する際の基盤が構築できた。さらに研究協力者との共同研究により、ヤマタノヲロチ退治神話と製鉄を結びつけるような説が、近代以降に成立したことが判明したが、このことにより、ヲロチ退治神話の変容や地域社会における神話の機能を解明する際に中世や近世だけではなく、近代における神話変容の解明が必要とされることが明らかになった。
自己免疫抑制ペプチドの系統的検索

BCGペプチドを認識するヒトT細胞クローンとして樹立したクローンのうち3つは、HLADRB1405拘束性にコネキシンという自己抗原由来のペプチドも認識するαβT細胞であった。このクローンを自己免疫疾患を抑制するペプチドの探索のモデルとして用いるために、3つのT細胞クローンから、それぞれTCRA、BcDNA遺伝子を単離した。それぞれのクローンは全く異なったTCRB遺伝子、TCRA遺伝子を使用し、V遺伝子ファミリーも異なっていた。これらの遺伝子を用いて、リンカーペプチドを介して直列につながる遺伝子を構築した。この遺伝子の末端には、c-mycのタグを付加した。この遺伝子をもつベクターをバキュロウイルスに組み込んで、Sf9細胞で発現させて培養上清に組換えTCR蛋白を得て、発現蛋白を、抗c-myc抗体カラムで精製したところ、SDS-PAGEで一本のバンドに泳動される蛋白を得た。さらに、T細胞クローンが認識するHLADR分子をもつB細胞株から、HLADRA(α)鎖、HLADRB(β)鎖cDNAを単離して、リンカーペプチドを介して直列につながる遺伝子を構築した。この遺伝子の末端には、ヒスチジンのタグを付加して、同様にバキュロウイルスに組み込んで、昆虫細胞で発現させて培養上清に組換えTCR蛋白を得た。産生された蛋白を、ニッケルカラムで精製したところ、やはりSDS-PAGEで一本のバンドに泳動される蛋白を得た。精製したHLA分子と合成抗原ペプチドを混合し、リコンビナントMHC/抗原ペプチド複合物を得ることができる。これらのリコンビナント蛋白の結合性をBIACOREシステムで解析したところ単一TCRリガンドと異なるTCRでは、異なった結合キネティクスがあることが明らかにあんったが、3種のクローンの生物学的反応の差異を必ずしも反映するものではなかった。他の因子が絡んでいるものと考えられる。これらの遺伝子を用いて、、リンカーペプチドを介して直列につながる遺伝子を構築すた。この遺伝子をもつベクターをバキュロウイルスに組み込んで、Sf9細胞で発現させて培養上清に組換えTCR蛋白を得て、発現蛋白を、抗c-myc抗体カラムで精製すしたところ、SDS-PAGEで一本のバンドに泳動される蛋白を得た。さらに、T細胞クローンが認識するHLADR分子をもつB細胞株から、HLADRA(α)鎖、HLADRB(β)鎖cDNAを単離して、リンカーペプチドを介して直列につながる遺伝子を構築すした。
注意欠陥多動性障害モデル動物での豊かな環境飼育による脳内ドパミン神経系の変化

注意欠陥多動性障害モデルラのSHRラットを用い、発育期の外部環境(豊かな環境飼育、通常飼育、孤独な環境飼育)による情動行動の変化と脳内ドパミン神経系の変化をコカイン&アンフェタミン調節性転写物(CART)に注目し解析した。その結果、豊かな環境飼育(EE)群では、他群に比べオープンフィールド試験で多動性が減少、社会性試験で社会性が亢進していた。EE群では、CART発現が扁桃体で上昇し、免疫染色により中心核での強い発現が確認された。さらにパルブアルブミン非陽性のGABA陽性細胞に共発現することも確認された。本研究から、発育期の環境がCARTを介して情動行動の形成に影響することが示された。本研究の目的は、注意欠陥多動性障害(ADHD)モデルのSHRラットを用い、“発育期の外部刺激の多い飼育(豊かな環境)が如何に情動行動の形成に影響を与えるのか?"について、特にドパミン(DA)受容体およびcocaine- and amphetamine -regulated transcript (CA RT)に注目し、脳内DA神経系との関連性から取り組み、また遺伝要因および環境要因の違いにより変動するADHDバイオマーカー候補物質を側坐核などから探索することである。平成24年度は、環境要因の違いにより変動するADHDバイオマーカー候補物質を側坐核のメタボローム解析を実施した。具体的には、離乳直後から通常の環境飼育(SE)、豊かな環境飼育(EE)、孤独な環境飼育(IE)の異なる環境条件下で5週間飼育したSHRラットの側坐核組織のメタボローム解析を行った。その結果、EEやIEにのみ発現増加または低下する化合物が約20種類あること、側坐核においてノルアドレナリンの発現がEE>SE>IEの順に多いこと、3群間において総じて代謝的に大きな変化はないこと、などが明らかになった。一方、内側前頭野(PFC)におけるCART蛋白をウェスタン法により検討し、その発現は微量であるがPFCにおいてCART蛋白が増加している傾向をした。またPFCにおいてCART陽性細胞がGAD67と共存することを免疫染色にて確認したが、カルレチニンおよびパルブアルブミンとの共局在はまだ確証できていない。今後さらにサブタイプの同定について解析を進めていく予定である。またPFCにおけるCART蛋白の発現増加が、結果として側坐核における脳内各部から入力統合に及ぼす影響について解析を行う。本研究の目的は、注意欠陥多動性障害(ADHD)モデルのSHRラットを用い、“発育期の外部刺激が如何に情動行動の形成に影響を与えるのか?"について、脳内DA神経系との関連性から取り組むことである。H25年度は、豊かな環境飼育(EE)の実験系に"うま味経口摂取“による情動行動変化の実験系を新たに加え、情動行動形成メカニズムの解析を行った。EEの実験系では、cocaine- and amphetamine -regulated transcript (CART)のmRNA発現レベルが高く、EEにより有意に発現が増加する扁桃体(Amy)に焦点を絞り研究を進めた。CART免疫染色によりAmy内での発現局在が示され、基底外側核には発現しないが扁桃体中心核(CeA)にのみ染色されることが明らかになった。またCARTはGABAと共発現するものの、パルブアルブミン陽性細胞には発現しないことも明らかになった。CeAにおけるCART発現が、EEによる不安様行動の減少および社会性の亢進という情動行動の変化と関連することが明らかになってきた。一方、孤独環境で飼育(IE)したSHRラットに対しうま味物質のグルタミン酸ナトリウム(MSG)を経口投与すると、社会性(攻撃性の低下)が変化することが明らかになった。この変化は、胃迷走神経の切除により消失することも示した。すなわち、胃から延髄弧束核(NST)への入力が社会性の変化に関係することを明確に示した。NSTからCeAへの投射が報告されているので、CeAにおけるドパミン受容体(DAR)の発現を調べた結果、D1RおよびD2Rともにその発現が著しく増加していた。すなわち攻撃性の低下とAmyにおけるDARとの関係が示された。今後この点について解析を進めたい。本研究の目的は、注意欠陥多動性障害(ADHD)モデルのSHRラットを用い、"発育期の外部刺激の多い飼育(豊かな環境)が如何に情動行動の形成に影響を与えるのか?"について、特にドパミン(DA)受容体およびcocaine- and amphetamine -regulated transcript (CART)に注目し、脳内DA神経系との関連性から取り組むことである。また遺伝要因および環境要因の違いにより変動するADHDバイオマーカー候補物質を側坐核や扁桃体などのメタボローム解析から探索する。

平成23年度は、離乳直後(生後25日令)のSHRラットを、通常の環境飼育(SE)、豊かな環境飼育(EE)、孤独な環境飼育(IE)の異なる環境条件下で5週間飼育したのち、行動実験、分子生物学的実験などを行った。SHRにおいても発育期のEEが、SEおよびIE飼育の動物に比べ、総移動距離および歩行速度の減少、rearing回数の減少等の不安様行動の減弱、ソーシャルテストでの社会性の亢進をもたらすことが明らかになった。この行動学的変化は、Wistarラットの実験結果と類似していた。遺伝子発現の変化では、EEにり側坐核および内側前頭野(PFC)におけるDA受容体4型の遺伝子発現に変化は認められなかったが、CART遺伝子の有意な発現上昇がPFCにのみ認められた。この変化は、Wistarの実験結果とは大きく異なっていた。現在、内側前頭野におけるCART蛋白の発現上昇をウェスタン法により、CARTを発現する細胞とそのサブタイプの同定について免疫染色法により解析を進めている。これにより、側坐核における内側前頭野、海馬、扁桃体、腹側被蓋野から入力統合に及ぼす影響、さらには行動発現に与える影響を解析していく予定である。オープンフィールドテスト、シリンダーテスト、ソーシャルテストによる行動実験は順調に進み、興味深い結果が得られている。また、ドパミン関連遺伝子の遺伝子発現についても順調に解析が進み、CART蛋白レベルでの発現についての確証もほぼ達成した。内側前頭皮質においてCARTはGABA作動性の抑制性細胞に発現することが明らかになった。今後どのような作用機構により行動と結びついていくのかを解析することとなる。側坐核におけるメタボローム解析も実施し、今後この結果をもとに解析を進める必要がある。しかし、全体としては概ね順調に進展していると考えている。また、ドパミン関連遺伝子の遺伝子発現についても順調に解析が進んでおり、現在蛋白レベルでの確証を検討している。現在、内側前頭皮質のどの細胞にCARTが発現されているのかを検討しているが、この結果が明らかになればCARTが行動発現においてどのような作用を及ぼすのかが明らかになってくる。脳内ドパミン量のリアルタイム測定についての実験は、前述の実験に重点を置いていたため実施できなかった。当初の計画どおり概ね順調に進んでいると考えるが、豊かな環境飼育による内側前頭葉のGABA作動性抑制性神経におけるCARTの発現増加が、どのように側坐核における統合に影響が及び、その結果としてADHDモデル動物のSHRラットにおける多動性の減少や不安様行動の減弱という情動行動にどのように作用するのかについて、さらに解析を進めていく。具体的には、1)CART蛋白の投与による行動変化、2)ドパミンアゴニストやアンタゴニストを用いた薬理学的検討の実施が益々必要になってきたと考えている。さらに、メタボローム解析の結果を基に情動行動の変化への関連性やADHDバイオマーカーの可能性を探索したい。
環境汚染物質アルキルベンゼンスルホン酸の細胞性免疫に対する影響の基礎的研究

細胞性免疫に関与するカルシニューリン(CN)の阻害物質として、アクリロニトリルブタジエンゴム中から同定した直鎖アルキルベンゼンスルホン酸(LAS)は、環境汚染物質として知られている。LASアナログを用いてCN活性阻害に関する詳細な検討を行ったところ、アルキル鎖の長さに依存して阻害作用は強くなり、陰イオン界面活性剤はLASによるCN阻害を回復させた。またLASは、非競合阻害によりCNを阻害することが示された。Jurkat細胞を使用して、ConA誘導性のIL-2を指標にLASの細胞性免疫に対する影響について検討したところ、LASは転写調節因子NFATを介してIL-2産生を抑制することが示された。細胞性免疫に関与するカルシニューリン(CN)の阻害物質として、日常で流通・使用されているプラスチック・ゴム製品中から同定した直鎖型アルキルベンゼンスルホン酸(LAS)は、環境汚染物質として知られている。平成26年度の研究では、LASやその同族体および類縁化合物によるCN活性阻害のin vitroにおける詳細な検討と、合成ポリマー製品中からのCN活性阻害物質のスクリーニングを新たに行った。LASの類縁化合物であるドデシル硫酸ナトリウム、ベンゼンスルホン酸、p-オクチルベンゼンスルホン酸では顕著なCN活性の阻害は認められなかったが、市販標準品のドデシルベンゼンスルホン酸(C12-LAS)では阻害が10 μMから認められ、40 μM以上ではCNを完全に阻害し、50%阻害濃度(IC50)は約13.5 μMであった。また、市販標準品を使用したアルキル側鎖の長さによる阻害の検討では、デシルベンゼンスルホン酸(C10-LAS)およびウンデシルベンゼンスルホン酸(C11-LAS)では阻害が観察されなかったが、C12-LAS、トリデシルベンゼンスルホン酸(C13-LAS)、テトラデシルベンゼンスルホン酸(C14-LAS)では、アルキル側鎖の長さにより阻害作用が強くなった。また、C12-LASを使用してキネティクス解析により、阻害様式を検討したところ、C12-LASは、非競合阻害によりCNを阻害することが明らかとなった。次に、合成ポリマー製品中から新たなCN活性阻害物質のスクリーニングを行った。その結果、シリンジ先端ゴムのエタノール抽出物がCN活性を低下させることが示唆された。平成27年度の研究では、LASの同族体を新たに化学合成し、CN活性に対する阻害作用を調べ、市販標準品のC12-LASと比較検討を行った。また、市販標準品のC12-LASを使用して、ヒトT細胞様株Jurkat細胞に対する毒性効果、LC/MSによる細胞内への取込量の検討、Jurkat細胞が産生するインターロイキン-2(IL-2)を指標とした細胞性免疫に対する影響について検討を行った。市販標準品のLASはアルキル鎖上のフェニル基の置換位置の異なる異性体の混合物であったことから、新たに直鎖型C12-LASである4-ドデシルベンゼンスルホン酸の純物質を化学合成し、ウシ脳CNに対する影響について市販標準品との比較検討を行った。その結果、市販標準品のC12-LASと4-ドデシルベンゼンスルホン酸は、アルキル鎖の炭素数が12と同じであるにも関わらず、ウシ脳CNに対する阻害作用に違いが見られた。従って、アルキル鎖に結合している芳香環の位置によって、ウシ脳CNに対する阻害効果が異なることが予想された。次に、Jurkat細胞を使用して、市販標準品のC12-LASの毒性作用を検討したところ、0.2mM前後の濃度で毒性作用が見られた。また、0.1mMの濃度のC12-LASを用いて細胞内に取り込まれたC12-LASをLC/MSで解析したところ、細胞の培養時間に依存して取込量が上昇した。さらに細胞が産生するコンカナバリンA誘導性のIL-2に対するC12-LASの影響を検討したところ、毒性のない濃度でIL-2産生の低下を認めた。従って、C12-LASは細胞性免疫に影響を与えることが細胞レベルで示唆された。研究計画の通り、4-ドデシルベンゼンスルホン酸の化学合成を行い、CN活性に対する評価を行った。また市販標準品のC12-LASのJurkat細胞への取り込み、毒性解析およびJurkat細胞のIL-2産生を指標としたLASの細胞性免疫に対する影響解析の評価を行うことができた。しかしながら、市販のLASの誘導体を用いたCN活性の検討が遅れていることから上記のような達成区分を選択した。平成28年度の研究では、新たにアルキル側鎖の長さが異なる直鎖型LASを数種類化学合成し、CN活性に対する阻害作用を検討した。また、市販標準品のC12-LASを用いて、CN活性阻害における陰イオン界面活性剤の影響を検討した。

さらにヒトT細胞様株Jurkat細胞を使用して、細胞が産生するインターロイキン-2(IL-2)を指標に市販標準品のC12-LASの細胞性免疫に対する影響について調べ、その作用機序の検討を行った。市販標準品のLASはアルキル鎖上のフェニル基の置換位置の異なる異性体の混合物であったことから、昨年度、直鎖型C12-LASである4-ドデシルベンゼンスルホン酸の純物質を化学合成したが、本年度は4-テトラデシルベンゼンスルホン酸(4-C14-LAS)、4-ヘキサデシルベンゼンスルホン酸(4-C16-LAS)、4-オクタデシルベンゼンスルホン酸(4-C18-LAS)を新たに化学合成し、ウシ脳CNに対する影響を検討した。その結果、アルキル鎖の炭素数が長いほどウシ脳CN活性への阻害作用が大きいことが明らかとなった。また市販標準品のC12-LASのCN活性阻害に対する陰イオン界面活性剤(NP-40、Brij35、Tween20)の影響を検討したところ、これらの界面活性剤ではCN活性を回復させる効果があることが判明した。次に、Jurkat細胞が産生するコンカナバリンA誘導性のIL-2に対する市販標準品のC12-LASの影響について検討を行ったところ、毒性のない濃度でIL-2産生の低下を認めた。また、その作用機序の一つとしてIL-2 mRNA発現に関与する転写調節因子NFATがC12-LASにより低下することが明らかとなった。細胞性免疫に関与するカルシニューリン(CN)の阻害物質として、アクリロニトリルブタジエンゴム中から同定した直鎖アルキルベンゼンスルホン酸(LAS)は、環境汚染物質として知られている。LASアナログを用いてCN活性阻害に関する詳細な検討を行ったところ、アルキル鎖の長さに依存して阻害作用は強くなり、陰イオン界面活性剤はLASによるCN阻害を回復させた。またLASは、非競合阻害によりCNを阻害することが示された。Jurkat細胞を使用して、ConA誘導性のIL-2を指標にLASの細胞性免疫に対する影響について検討したところ、LASは転写調節因子NFATを介してIL-2産生を抑制することが示された。研究計画の通り、酵素キネティクス解析により、市販標準品のドデシルベンゼンスルホン酸(C12-LAS)のCNに対する阻害様式が決定され、また、シリンジ先端ゴムのエタノール抽出物がCN活性を低下させることが示された。しかしながら市販のLASの誘導体を使用し、CN活性の検討を行う研究計画が遅れていることから上記のような達成度の区分を選択した。1.炭素数14、16、18の直鎖型アルキルベンゼンスルホン酸を化学合成し、CN活性に対する評価を行う。2. LASは、Jurkat細胞のIL-2産生を低下させる作用があることを見出したが、この作用機序の検討を行う。3.市販のLASの誘導体を使用し、CN活性の検討を行う。生化学研究計画の通り、以下の検討を行う。1.直鎖型アルキルベンゼンスルホン酸(LAS)のJurkat細胞への取り込みと毒性解析。2.Jurkat細胞のインターロイキン-2(IL-2)産生を指標としたLASの細胞性免疫に対する影響解析。国内および海外在庫の欠品のため、予定していた研究試薬が購入できず、次年度使用額が生じた。現在の状況では、欠品は解消されており、研究の進展に影響はないと思われる。また、もう一つの理由としてメーカー側のキャンペーンなどがあり、想定していた経費よりも安く試薬が購入できた。次年度使用額は1円であり、これは計算ミスにより発生した金額である。
水産練り製品の咀嚼による破砕特性とレオロジー特性の関係

前年度までの研究結果から、カマボコを食べるときに嚥下衝動を起こすまでの咀嚼行動に影響を及ぼす要因として、カマボコのレオロジーパラメータと水分含量が大きく関与していることが明らかとなった。そこで本年度は、嚥下衝動を起こすまでに何回の咀嚼を必要とするかを、この二つのパラメータから推測してみることにした。すなわち、咀嚼困難者を対象とした食品の設計を想定し、咀嚼を要しない条件を探ることにした。また、咀嚼行動の試料サイズ依存性についても検討を加えた。試料には水分含量および体積の異なるカマボコを調製した。前年度までの試料は市販品よりもかたいテクスチュアを有していたので、本年度は、瞬間弾性率が市販品と同等およびそれ以下となるような試料を調製した。調製した試料を用いてパネラーによる咀嚼試験を行い、嚥下衝動を起こすまでの咀嚼回数を計測した。咀嚼回数の推測式は、今回の試料およびこれまでの研究結果で得られているカマボコのレオロジーパラメータ、試料の水分含量から算出した咀嚼時間、および実際の咀嚼回数をパラメータとした重回帰分析から予測した。以上の実験ならびに解析結果から、重回帰分析により予測した咀嚼回数を求める式は、試料の大きさの違いの影響を受けずに、実際の咀嚼回数とかなり高い相関で推測することができた(R^2=0.968)。ただし、今回調製した試料のなかには咀嚼を要さず舌で押しつぶせるものがあったが、このような試料に対して今回立てた予測式では咀嚼を数回要する結果を算出した。このことから式を修正するためさらなる検討が必要となった。本研究では、試料にカマボコ3種、魚肉ソーセージ、ハンペンを使用し、咀嚼物の粒子数および粒子の大きさの分布(破砕特性)と食品のかたさ・やわらかさ(粘弾性)との関係を明らかにすることを目的とした。破砕特性評価には嚥下衝動直前の咀嚼物を試料とし、咀嚼時間、咀嚼回数、唾液量、咀嚼物粒子数と粒子径を計測した。レオロジー特性については、応力緩和測定を行った。咀嚼物粒子の平均の大きさは食品によって異なったが、食品を嚥下するためには咀嚼物粒子のうち80%以上が直径およそ0.7cm以下の大きさになるまで咀嚼する必要があることが分かった。また、今回使用した試料において、食品の水分含量と咀嚼物中の唾液量を足した値はほぼ同じで、口腔内の水分含量が食品の乾燥重量に対しておよそ110%以上に到達すると嚥下していた。ハンペンは咀嚼により極端に変形して粒子が小さくなったために咀嚼回数が比較的少なく、カマボコおよび魚肉ソーセージは、比較的密度の高いゲルであるので、嚥下可能な大きさになるまでの咀嚼回数を多く要していた。レオロジー特性値と咀嚼回数との関係は、瞬間弾性率および粘性率において相関関係が認められ、食品のかたさ・やわらかさと人の咀嚼行動とを関係付けることができた。これらのことから、食品のかたさ・やわらかさに応じてある粒子サイズになるまで、かつ口腔内の水分含量がある一定量を超えるまで咀嚼し続けなければならないということを、嚥下の必要条件として定量的に表現することができた。本年度は前年度の研究から分かった嚥下の必要条件は妥当であるのかを検証することを目的として、ゲル状食品を食べるときの口腔内の咀嚼物の流動性を調べた。咀嚼物の流動性の測定を試みたところ、誤差が非常に大きく、測定法の改良を今後検討していく必要があった。そこで、嚥下の必要条件を満たすような食品を調整し、これが口腔内で流動できるのか、すなわち嚥下可能であるかどうかを調べることとした。瞬間弾性率および水分含量の異なるカマボコを調製し、これらのカマボコを細断して大きさの異なる粒子を作成し、咀嚼物粒子を模した。この粒子に水を足して、口腔内の咀嚼物を模して、硬さ、粒子の大きな、水分含量のそれぞれが異なるカマボコ咀嚼物モデルを試料とし、これらの試料を20代の学生をパネラーとして嚥下実験を行った。その結果、以下のことが分かった。1.試料の水分量が一定量を超えると嚥下しやすかったことから、嚥下衝動には水分含量が大きく寄与していることが分かった。2.硬いカマボコから調製した試料は、加水量を多くしても嚥下しにくかったことから、咀嚼する前の食品の硬さは嚥下衝動に関係しているとわかった。3.粒子サイズが大きすぎると嚥下しにくいが、ある程度細かくなると粒子の大きさにそれほど依存せずに嚥下出来ることがわかった。4.嚥下しやすい試料について、瞬間弾性率と粒子断面積と試料を調整する際に加えた水分量を乗じると一定値を示すことがわかった。

5.嚥下衝動には、物理的要因だけでなく、日常の食生活やパネラーの味の好み、視覚的要因なども大きく影響していることがわかった。以上のことから、食品のかたさ・やわらかさに応じてある粒子サイズになるまで、かつ口腔内の水分含量がある一定量を超えるまで咀嚼し続けなければならないという、嚥下の必要条件は妥当であり、食品の嚥下可能な状態を定量的に表現できると言える。前年度までの研究結果から、カマボコを食べるときに嚥下衝動を起こすまでの咀嚼行動に影響を及ぼす要因として、カマボコのレオロジーパラメータと水分含量が大きく関与していることが明らかとなった。そこで本年度は、嚥下衝動を起こすまでに何回の咀嚼を必要とするかを、この二つのパラメータから推測してみることにした。すなわち、咀嚼困難者を対象とした食品の設計を想定し、咀嚼を要しない条件を探ることにした。また、咀嚼行動の試料サイズ依存性についても検討を加えた。試料には水分含量および体積の異なるカマボコを調製した。前年度までの試料は市販品よりもかたいテクスチュアを有していたので、本年度は、瞬間弾性率が市販品と同等およびそれ以下となるような試料を調製した。調製した試料を用いてパネラーによる咀嚼試験を行い、嚥下衝動を起こすまでの咀嚼回数を計測した。咀嚼回数の推測式は、今回の試料およびこれまでの研究結果で得られているカマボコのレオロジーパラメータ、試料の水分含量から算出した咀嚼時間、および実際の咀嚼回数をパラメータとした重回帰分析から予測した。以上の実験ならびに解析結果から、重回帰分析により予測した咀嚼回数を求める式は、試料の大きさの違いの影響を受けずに、実際の咀嚼回数とかなり高い相関で推測することができた(R^2=0.968)。ただし、今回調製した試料のなかには咀嚼を要さず舌で押しつぶせるものがあったが、このような試料に対して今回立てた予測式では咀嚼を数回要する結果を算出した。このことから式を修正するためさらなる検討が必要となった。
カルデラ形成噴火の発生時期と海水準変動に伴う地殻内応力の変化との関係

この研究では,主に九州の鮮新世から中期更新世の大規模火砕流堆積物,?海トラフの海底堆積物コアに挟まる後期中新世から中期更新世のテフラ層について,火山ガラス,斜方輝石やホルンブレンドの主元素組成などの岩石学的特徴を系統的に明らかにした.これらの層序や年代学的研究により,過去約800万年間にわたって九州のカルデラ形成噴火や伊豆?マリアナ弧の珪長質爆発的噴火についての発生頻度を検討できる.この研究では,主に九州の鮮新世から中期更新世の大規模火砕流堆積物,?海トラフの海底堆積物コアに挟まる後期中新世から中期更新世のテフラ層について,火山ガラス,斜方輝石やホルンブレンドの主元素組成などの岩石学的特徴を系統的に明らかにした.これらの層序や年代学的研究により,過去約800万年間にわたって九州のカルデラ形成噴火や伊豆?マリアナ弧の珪長質爆発的噴火についての発生頻度を検討できる.本年度は,九州の火砕流堆積物の試料採取,火砕流堆積物の年代測定,新しいEDS検出器とアナライザーの納入・調整を行った.九州の火砕流堆積物は,大分県・宮崎県・鹿児島県の後期鮮新世中期更新世の火砕流堆積物について,合計58試料を採取した.また,火砕流堆積物の年代測定は,鹿児島県の鮮新世中期更新世の火砕流堆積物4試料に対して,フィッション・トラック年代測定を行った.さらに,これと同一の1試料と宮崎県の中期更新世火砕流堆積物の1試料の合計2試料について,K-Ar年代測定を行った.これらの火砕流堆積物は遠方に拡散した広域テフラ層を形成したと考えられており,大阪地域や房総半島などの鮮新・更新統や海底堆積物コア中において広域テフラ層を同定するための参照標準(岩石学的特性および年代)として重要である.海底堆積物コアのテフラ層としては,日本海で採取されたピストンコア試料にはさまるテフラ試料を国内外の研究協力者から提供していただいた.新EDSシステムは,取り付けるSEM本体が古いため,インターフェースを特注することにより当初の要望通りSEMステージを自動制御することが可能になった.自動分析は,ステージ移動の機械精度に限界があるので10μm程度の誤差があるが,細粒砂程度の火山ガラスや鉱物については問題なく自動分析が行える.また,化学分析結果についても,標準としている鉱物や火山ガラスを多数分析し,従来以上に精度良くまた短時間で分析できることを確認した.よって,九州および海底堆積物コア中のテフラについての岩石学的分析を効率的に進めることができるようになった.本年度は,平成21・22年度に採取した中部・南九州の火砕流堆積物試料と日本海の海底堆積物コアに挟まるテフラ層について,SEM-EDSによる火山ガラスの主元素組成分析を行った.九州の火砕流堆積物試料は平成21・22年度に採取した計85試料である.これらの試料は非溶結試料と溶結試料があり,非溶結試料は軽石と火山灰に分けて分析の前処理を行った.火砕流堆積物試料のうち一部についてはSEM-EDS分析を行い,火山ガラスの主元素組成の結果を得ている.日本海の海底堆積物コアに挟まるテフラ層については,鳥取沖の過去64万年間のコア(MD01-2407:Chun et al.,2004;Kido et al.,2007)に挟まる22層のテフラ層についてSEM-EDS分析を行った.既に公表されているATやAso-4などの広域テフラ層を再確認するとともに,陸域の広域テフラ層との対比が未だなされていない試料についても分析結果を得た.その他にも,連携研究者の池原氏(産総研)からは,日本海の海底堆積物コア試料の後期更新世から完新世のテフラ試料の提供を受けた.そのうちの37試料についてSEM-EDS分析を行い,8カ所のコア試料間におけるテフラ対比を構築した.以上の分析結果を含む研究は検討途上であるが,日本海海底堆積物コアにおける過去64万年間の広域テフラ層の層序と陸域の広域テフラ層との対比について新たな知見が得られる見通しを得た.また,日本海の後期更新世から完新世のテフラ層序とその編年学的研究を進めることにより,カルデラ形成噴火だけでなく,プリニー式噴火によるテフラ層と海水準変動との関係を詳しく検討できる.平成21・22年度に九州の火砕流堆積物試料を計85試料採取した.今年度は,それらについてSEM-EDSによる火山ガラスと斜方輝石の主元素組成を明らかにし,また卓上走査電子顕微鏡による火山ガラスの形態を撮影した.これらの分析結果は遠方に堆積した広域テフラ層との対比を検討する基礎資料となる.平成22年12月13日平成23年1月10日に,10DPちきゅうExp.333研究航海に乗船研究者として参加した.この研究航海では紀伊半島沖南海トラフの3サイトでコア試料を採取した.このうちSitesCOO11とCOO12は,南海トラフ掘削計画において,沈み込む前の物質の年代・物性・組成を知るリファレンス(インプットサイト)として位置づけられている.また,SiteCOO18は深海斜面において海底地すべり堆積物の採取を目的として実施した.3サイトから採取した合計356個のテフラ試料(COO18:88試料,COO11=188試料,COO12:80試料)全てについて,卓上走査電子顕微鏡による火山ガラスの形状観察と写真撮影,SEM-EDSによる火山ガラスと斜方輝石・角閃石の主元素組成分析を行った.

これらテフラ層のデータの整理を行い,標準層序となるCOO11サイトのテフラ層と陸域の広域テフラ層との対比について検討した.その結果,船上で対比したアズキ火山灰層・ピンク火山灰層と太田火山灰層以外に,20層のテフラ層が大阪層群・古琵琶湖層群・東海層群・上総層群のテフラ層と対比されることが分かった.また,爆発的噴火史の観点では,火山ガラスの主元素組成において高シリカ・低カリウム組成のテフラ層が比較的多く挟まることが明らかになった.これは,陸域のテフラ層ではあまり知られていない特徴であり,おそらく伊豆-マリアナ弧起源のテフラ層と考えられる.COO11コア試料は過去約800万年間のテフラ層を保存しており,今後,他のテフラ層と合わせて,その年代と頻度を明らかにすることにより,西南日本のカルデラ火山や伊豆-マリアナ弧の火山の爆発的噴火史を検討することができる.
植物ホルモン分泌性根圏微生物における有用菌株選抜法の開発

1、北農研内の小麦植物体から、キングB培地の蛍光色素を基準にして蛍光性シュードモナス様菌を、RC培地を使ってアゾスピリラム様菌を単離して、オーキシン生産量を調査した結果、その値は菌株間で大きく異なるとともに、分離源り(地域等)や分離法によっても変動した。特に、RC培地ポジティブ菌株の生産量は、他の菌株のそれより高かった。2、シュードモナス属とアゾスピリラム属細菌のオーキシン関連遺伝子、及び、アゾスピリラムの窒素固定関連遺伝子の塩基配列情報に基づいて、多数のPCRプライマーを設計して、既知のリファレンス菌株に適用した結果、一部のPCRプライマーは当該遺伝子を増幅させた。3、収集した菌株やリファレンス菌株のDNAをボイル法にて抽出し、設計したPCRプライマーで当該遺伝子を増幅した結果、その増幅によりアゾスピリラム属菌株を識別できるとともに、DNAバンドの泳動距離からA.brasilenceとlipoferumをも区別することが可能であった。4、設計したPCRプライマーを用いて、当該遺伝子を増幅し、制限酵素処理により一塩基多型を解析した結果、A.brasilenceとlipoferumを区別できるPCR-RFLP法を開発できた。5、開発したDNAフィンガープリンティング法により、十勝菌株のほとんどがA.brasilenceであること、生物研の菌株にはlipoferumが多数含まれること、RC培地ポジティブや蛍光性の菌株の多くは、アゾスピリラム属でないこと、が推測された。ただし、DNAフィンガープリント法の結果とオーキシン生産量などの生理形質の相関関係は明確でなかった。十勝農業協同組合連合会・農産化学研究所(以下、十勝農協連)から取寄せたアゾスヒリラム様菌株のコロニー形状、グラム染色性、顕微鏡下の形態等の生理形態的特徴を調査して、アゾスピリラム属の可能性が極めて高い約70菌株を選抜した。これら菌株のオーキシン分泌量を評価した結果、分泌速度や最終的な分泌量に菌株間差があることが明らかとなった。上記のアゾスヒリラム菌のゲノムDNAをボイル法と市販のキットで抽出した結果、簡易で低コストなボイル法でも良好なゲノムDNAが得られた。そこで、(独)理化学研究所から取寄せたリファレンス菌株をも含めてDNAを抽出して、既知のPCRプライマーを用いて16SrRNA遺伝子の増幅を試みたところ、良好な増幅が確認できた。これらのことから、PCR法によりアゾスピリラム菌株の遺伝子型を敏速、容易に評価できると考えられた。窒素固定とオーキシン生成に関連する機能性遺伝子(nifH、nifA、ipdCなど)の塩基配列情報から、これら遺伝子に特異的なPCRフライマーを多数設計した。これらPCRプライマーの中から、リファレンス菌株の機能性遺伝子を確実且つ良好に増幅するプライマーセットを見出した。このプライマーセットを十勝農協連の菌株に適用した結果、ほぼ全ての菌株でnif遺伝子が増幅したが、ipdC遺伝子は半数程度の菌株のみで増幅した。さらに、nif遺伝子の一塩基多型を検出する制限酵素を見出して、アゾスピリラム菌株を2種(A. brasilenseとA. lipoferum)に識別するDNAフィンガープリンティング法を開発した。
広葉樹における幹の傾斜によるあて材形成と組織化学的特徴に関する研究

本研究では,木本被子植物における,幹の傾斜角度があての発達程度に与える影響を明らかにするため,カツラ,ヤマグルマ,キリ,ユリノキおよびキンモクセイの苗木の幹を,鉛直方向に対して30,50および70度に傾斜させ,人為的にあて材を形成させた.いずれの傾斜角度で形成されたあて材においても,リグニン量は正常材と比較して低い値を示した.カツラにおいては,いずれのあて材においても,正常材と比較して,低いリグニンおよびキシロース含有量と高いグルコース,アラビノースおよびガラクトース含有量を示した.加えて,50および70度で傾斜させて形成したあて材では,30度で傾斜させて形成したあて材と比較して,高いグルコース量と低いキシロース量を示した.また,50度で傾斜させて形成したヤマグルマおよびユリノキのあて材において,正常材と比較して,リグニンおよびキシロース量の減少とグルコース量が増加する傾向が認められた.一方,キリにおいては,あて材と正常材の間のリグニン量と単糖量に著しい差は認められなかった.カツラ,ヤマグルマおよびユリノキのあて材における化学成分量は,あて材形成時の角度によって異なる傾向が認められ,幹の傾斜角度が,あて材の化学成分量の変化に影響を与えることが示唆された.成長応力,細胞形態,細胞壁構造およびリグニン分布から考えた場合のあての程度が高い傾向を示した,50および70度で傾斜させて形成したカツラ,50度で傾斜させて形成したヤマグルマおよびユリノキのあて材において,高いグルコース量と低いキシロース量が確認された.本年度は、木本被子植物における幹の傾斜角度が、組織学的特徴ならびに化学成分量に及ぼす影響について、研究の総括がなされ、樹種ごとにあての程度が最大となる傾斜角度が異なる事を明らかにした。また、萌芽幹の出現とあての程度の関係についても考察を進めたことから、当初予定していた研究と比較して、期待通りの研究が進展したと考えられる。本研究では,クローン植物体の入手ができなかったため,実生苗を用いたが,今後は,クローン植物体を用いた実験系を確立することにより,より正確な結果を得ることが可能になると考えられる。また,木本被子植物における幹の傾斜角の感知機構を解明することを目的として,幹の傾斜角と重力刺激を感知すると考えられている平衡細胞内のアミロプラストの挙動の関係について調査すること,遺伝子発現,植物ホルモンの分布について調査する必要があると考えられる。本研究では,木本被子植物における,幹の傾斜角度があての発達程度に与える影響を明らかにするため,あて材形成に伴いゼラチン(G)層を形成するカツラ(Cercidiphyllum japonicum Sieb. et Zucc.)およびヤマグルマ(Trochodendron aralioides Sieb. et Zucc-),G層を形成しないキリ(Paulownia tomentosa Steud.),ユリノキ(Liriodendron tulipifera Linn.)およびキンモクセイ(Osmanthus fragrans Lour. var. aurantiacus Makino)の苗木の幹を,鉛直方向に対して30,50および70度に傾斜させ,人為的にあて材を形成させた.本研究で用いた5種の傾斜個体(あて材)において,引張の表面解放ひずみ値の増加および横断面における上側への成長量の増加が認められた.また,傾斜刺激により,木繊維および道管形態が変化することが認められた.カツラおよびヤマグルマあて材において,木繊維最内層にG層の存在が確認され,G層の横断面積率の増加に伴い,引張の表面解放ひずみ値が増加することが確認された.他の3種における木繊維S_2層においては,リグニン量およびミクロフィブリル傾角の減少というG層に類似した変化を示した.また,各樹種において,上述の変化は幹の傾斜角間で差異が認められ,正常材と比較して,最も変化が大きかった幹の傾斜角は,カツラでは50および70度,キリでは30度,他の3種(ヤマグルマ,ユリノキおよびキンモクセイ)では50度であった.以上のことから,木本被子植物において,幹の傾斜角は,成長応力,組織学的特徴およびリグニン分布から判断したあての発達程度に影響を与えることが示唆された.また,あて材形成による木部細胞壁構造の変化は,樹種によって異なることが判明した.本研究では,木本被子植物における,幹の傾斜角度があての発達程度に与える影響を明らかにするため,カツラ,ヤマグルマ,キリ,ユリノキおよびキンモクセイの苗木の幹を,鉛直方向に対して30,50および70度に傾斜させ,人為的にあて材を形成させた.いずれの傾斜角度で形成されたあて材においても,リグニン量は正常材と比較して低い値を示した.カツラにおいては,いずれのあて材においても,正常材と比較して,低いリグニンおよびキシロース含有量と高いグルコース,アラビノースおよびガラクトース含有量を示した.加えて,50および70度で傾斜させて形成したあて材では,30度で傾斜させて形成したあて材と比較して,高いグルコース量と低いキシロース量を示した.また,50度で傾斜させて形成したヤマグルマおよびユリノキのあて材において,正常材と比較して,リグニンおよびキシロース量の減少とグルコース量が増加する傾向が認められた.一方,キリにおいては,あて材と正常材の間のリグニン量と単糖量に著しい差は認められなかった.

カツラ,ヤマグルマおよびユリノキのあて材における化学成分量は,あて材形成時の角度によって異なる傾向が認められ,幹の傾斜角度が,あて材の化学成分量の変化に影響を与えることが示唆された.成長応力,細胞形態,細胞壁構造およびリグニン分布から考えた場合のあての程度が高い傾向を示した,50および70度で傾斜させて形成したカツラ,50度で傾斜させて形成したヤマグルマおよびユリノキのあて材において,高いグルコース量と低いキシロース量が確認された.幹の傾斜角(鉛直方向に対して30,50および70度)木本被子植物5種のあて材において,表面解放ひずみの測定および顕微鏡観察を実施し,傾斜刺激による成長応力の発生および組織化学学的特徴の変化について明らかにした.このことから,現在までの達成度を"おおむね順調に進展している"と判断した.本年度は、木本被子植物における幹の傾斜角度が、組織学的特徴ならびに化学成分量に及ぼす影響について、研究の総括がなされ、樹種ごとにあての程度が最大となる傾斜角度が異なる事を明らかにした。また、萌芽幹の出現とあての程度の関係についても考察を進めたことから、当初予定していた研究と比較して、期待通りの研究が進展したと考えられる。当初、化学成分量は,クラーソンリグニン、ホロセルロースおよびα-セルロースを定量する予定だったが,充分な量の試料木粉を得ることが困難であった.今後は,試料の作製法および化学成分量の定量法を変更し,15μm厚の横断面切片を用いて,アセチルブロマイド法によるリグニン量およびホロセルロースの糖組成を分析し,幹の傾斜角が化学成分量に与える影響について調査する予定である.また,木本被子植物における幹の傾斜角の感知機構を解明することを目的として,幹の傾斜角と重力刺激を感知すると考えられている平衡細胞内のアミロプラストの挙動の関係について調査することを検討中である。本研究では,クローン植物体の入手ができなかったため,実生苗を用いたが,今後は,クローン植物体を用いた実験系を確立することにより,より正確な結果を得ることが可能になると考えられる。また,木本被子植物における幹の傾斜角の感知機構を解明することを目的として,幹の傾斜角と重力刺激を感知すると考えられている平衡細胞内のアミロプラストの挙動の関係について調査すること,遺伝子発現,植物ホルモンの分布について調査する必要があると考えられる。
long non-coding RNAの内耳発生・再生における機能

1.まず、lnc RNAの一つであるMalat1の内耳発生における発現をin situ hybridizationを用いて検定するため、Probeを作成した。作成したProbeを使って、Malat1の発現部位を調べたところ、マウス胎生13.5日では内耳のうち、聴覚を担う蝸牛の上皮全体に発現を認め、その後の時期も胎生15.5日、17.5日と蝸牛上皮全体での発現は続いていた。胎生13.5日から17.5日は蝸牛上皮において機械電気変換を行って音振動を静止膜電位の脱分極による電気信号に変換する役割を果たし、聴力を知覚する細胞である有毛細胞が、その周囲の支持細胞との共通の前駆細胞から分化を遂げ機能を持ち始める時期である。この時期を通じてMalat1は蝸牛神経上皮以外の間質には発現を認めず、Malat1が蝸牛上皮の発生においてなんらかの機能を果たしているものと考えられた。胎生13日目の蝸牛の細胞を用いてMalat1の発現量をRT-PCRで検討した。蝸牛の細胞のうち、有毛細胞、支持細胞の共通の前駆細胞のマーカーであるSox2陽性の細胞と陰性の細胞とを別に調整してMalat1の発現量の比較を行ったところ、Malat1の発現はSox2陽性細胞においてSox2陰性細胞の4倍の発現量であった。このことから、Malat1は、蝸牛の上皮の中でも、その主な機能を担う有毛細胞の発生に重要な役割を果たすと推測される。2.別のlnc RNAであるGomafu KOマウスの聴力を測定した。聴性脳幹反応を用いて10、20、40 kHzの聴力を測定した。6週齢、12週齢では同腹の野生型のコントロールマウスと比較して聴力の差はなかった。lnc RNAの一つであるMalat1の内耳蝸牛の連続した発生期における発現を確認することができ、Malat1が内耳蝸牛有毛細胞の発生に関わっていることを示唆できた。一方、もう一つのlnc RNAであるGomafuのKOマウスの聴力は12週齢まででは同腹の野生型マウスと差がなかった。現在のところ予定した実験を進めていくことができている。Malat1に関しては、胎生期13日よりも前における蝸牛による発現を確認する。また、定量的RT-PCRを内耳発生期全体に経時的に行って、内耳発生に伴っておこる発現量の変化を検定する。Gomafuに関しては、今後は聴力を測定するマウスの数を増やし、オス、メスを分けて聴力の測定を行う。また、加齢によっておこる難聴の程度に差がないかどうか、6ヶ月齢、12ヶ月齢まで観察を行う。