hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
汚染地域における水銀の環境動態と生態系への影響

河川水においては、原子状水銀(Hg0)、水銀イオン(Hg2+)及び総水銀(T-Hg)濃度を測定した。揮発しやすいHg0は、現地で測定を行い、より信頼性の高い値を得られる様にした。総水銀濃度は、中流域では、8000 ng L-1を超える値が見られ、金精錬活動によって放出された水銀の影響があきらかであった。河川水をろ過したフィルターに残った粒子は、懸濁体として、河川水によって輸送されるものと考えられる。その水銀濃度は数百mg kg-1にもなり、河川系における水銀の輸送に懸濁粒子が重要な役割を担っている事が確認された。これらの粒子は、河川水が灌漑用水として引かれた水田において沈降し、水田土壌中の水銀濃度を上昇させる要因ともなりうる。これら水銀の拡散と生態系影響については今後もさらに調査を進める必要がある。スロベニア、イドリヤ旧水銀鉱山周辺において、土壌中総水銀及び有機水銀濃度分布を調べ、土壌化学組成、有機炭素量、窒素含有量等との関係を詳細に追跡した。そして、エチル水銀の存在を初めて明らかにするとともに、有機水銀の存在に有機炭素量が重要な因子である事を示した。また、大気と生葉及び土壌中水銀濃度の間に相関が見られ、これらの間での水銀循環が示唆された。インドネシアでは金精錬活動による水銀の河川系における輸送拡散に、懸濁物質が重要な役割を担っている事が乾季および雨季の調査から示された。また、水田土壌に生育する巻貝筋肉中有機水銀濃度及び割合は、周辺土壌に比べて明らかに高かく、生態系への影響が示された。スロベニアでは、新しい採取点の設定により水銀の拡散状況をさらに広く評価する事ができた。また、水銀の存在化学形に対して情報を蓄積する事が出来ている。土壌・底質試料に関する水銀の化学形別分析法の信頼性評価について、データの解析を行い、その内容の一部を書籍としてまとめ出版する事ができた。さらにデータの解釈と整理をすすめ、学術誌への投稿を準備している。インドネシアでの調査でも河川を通じた水銀の拡散について調査範囲を広げたことで水銀の輸送挙動について新しい知見を得られた。これらの成果は国際学会での発表を行う予定である。また、3月にはパプア州において金採掘現場周辺での予備調査を実施した。金精錬を行っていないが、水銀濃度の高い底質も見出されており、金鉱山周辺に於けるバックグラウンドとしての水銀濃度を把握する事ができると期待できる。以上より、計画に沿って順調に進んでいると判断している。27年度が最終年度であるため、記入しない。環境分析化学昨年度の調査によって得られた試料の分析を進める。また、あらたにパプア州に於ける金採掘現場周辺での試料採取を行い、水銀を使用しない金採掘現場における水銀濃度データの蓄積をはかる。また、西ジャワ州においては乾季に於ける水銀の輸送量を評価するために8月に調査を実施する。これにより、昨年3月の雨季のデータと合わせ季節変動も考慮に入れた評価を試みる。スロベニアにおいては、11月の調査を予定している。水銀鉱山周辺において、昨年5月に実施した調査では気温が30°C前後であった。今年度は気温の下がる11月の土壌中水銀化学形を調査することで、化学形変化における季節変動に関する知見が得られると期待している。これらの知見を合わせ、汚染地域に於ける水銀の挙動について総合的な解釈を試みる。
自然感染に対する魚の生体防御へのバクテリオファージの関与

本年度実施した研究の結果は以下のように要約される。(1)昨年度(平成16年度)に淡水魚類養殖環境から分離したFlavobacterium psychlophilim(細菌性冷水病原因菌)ファージを用いて、人為感させたアユに対する感染防御効果を調べた。注射(筋肉内)または浸漬のいずれの方法で感染を図った魚に対しても、浸漬法でファージ処理を行った場合、対照区(ファージ処理なし)に比べて、有意に死亡率が低下した。また予め体表に傷をつけた魚に菌を感染(浸漬法)させ、その後ファージ処理を行った場合、傷口の炎症部が治癒した。(2)昨年度に海産魚類養殖環境から分離したEdwardsieela tarda(エドワジエラ症原因菌)ファージを用いて、人為感染魚(ヒラメ)に対する感染防御効果を調べた。注射感染(腹腔内)させた魚にファージ処理(経口投与)を行った場合、対照区(ファージ処理なし)に比べて、有意に死亡率が低下した。経口投与されたファージは速やかに(10分以内)に循環系に出現した。(3)昨年度にヒラメ養殖環境から分離したStreptococcus iniae(β溶血性レンサ球菌症原因菌)ファージを用いて、人為感染魚(ヒラメ)に対する感染防御効果を調べた。注射感染(腹腔内)させた魚にファージ処理(腹腔内注射)を行った場合、対照区(ファージ処理なし)に比べて、有意に死亡率が低下した。ファージ接種による防御効果は、菌感染24時間後でも認められた。また、接種されたファージは速やかに脳内に出現した。(4)以上、3種類の細菌感染症に対するファージ治療試験結果から、自然界に細菌の天敵として存在するファージが、経口的および経皮的に容易に魚体内に侵入し、循環系を介して、病原体の増殖部位に到達しうることが明らかとなった。1.養殖アユ、ニジマスおよびアマゴ病魚、また野生のオイカワおよびフナ病魚から改変サイトファーガ寒天培地上で黄色コロニーを形成する128菌株を得た。DNAgyraseを標的としたPCRによってこれらはすべてFlavobacterium psychlophilumに同定された。徳島県下のアユ養殖場の飼育水および冷水病罹病アユを材料として、集殖法により感染性の異なるF.psychlophilumファージ5株が得られ、これらのファージはその形態学的特徴から、Myoviridae科,Podoviridae科およびSiphoviridae科に分類された。F.psychlophilum128株のファージ感受性を調べた結果、アユ由来株では8種類のファージ型が確認されたが、ニジマスなどサケ科魚類から分離された菌はいずれのファージにも全く感受性を示さず、オイカワとフナ由来株は一部に感受性が認められた。即ち、アユ由来株は限られたファージ型を有し、サケ科魚類由来株とはファージ型が異なることが明らかとなった。2.エドワジエラ症(Edwardsiella tarda感染症)が多発している愛媛、広島および三重県下のヒラメ、マダイおよびクロダイ養殖場において、病魚と飼育水から集殖法により合計90株のE.tardaファージを得た。これらのファージはその形態学的特徴から、Myovilidae科とPodoviridae科に分類された。ヒラメ、マダイ、クロダイおよびウナギ由来のE.tarda34株のファージ感受性を調ぺた結果、本菌のファージ型は多型であったが、菌の由来(分離宿主あるいは場所)とファージ型にはある程度相関性が認められた。特に、ヒラメ、マダイおよびクロダイ由来E.tardaの80%以上はヒラメ由来ファージに感受性を示した。即ち、ヒラメ由来のE.tarda株のファージ型はかなり限られていることが明らかとなった。3.愛媛県下のヒラメ養殖場において、レンサ球菌症(Streptococcus iniae感染症)罹病魚からS.iniaeファージ2株を分離した。ヒラメその他の魚から分離されたS.iniae27株のファージ感受性を調べた結果、すべての株がいずれのファージにも感受性を示した。即ち、S.iniaeのファージ型は均一であることが明らかとなった。(3)昨年度にヒラメ養殖環境から分離したStreptococcus iniae(β溶血性レンサ球菌症原因菌)

ファージを用いて、人為感染魚(ヒラメ)に対する感染防御効果を調べた。注射感染(腹腔内)させた魚にファージ処理(腹腔内注射)を行った場合、対照区(ファージ処理なし)に比べて、有意に死亡率が低下した。ファージ接種による防御効果は、菌感染24時間後でも認められた。また、接種されたファージは速やかに脳内に出現した。(4)以上、3種類の細菌感染症に対するファージ治療試験結果から、自然界に細菌の天敵として存在するファージが、経口的および経皮的に容易に魚体内に侵入し、循環系を介して、病原体の増殖部位に到達しうることが明らかとなった。
界面電流測定法の開発と電気浸透流駆動機構の解明

固液界面の電気二重層内を流れる界面電流は,電気浸透流を駆動している.電気二重層厚さが数十ナノメーターと極めて薄いのでこの電流を測定することは困難であった.本研究では,隙間が可変のマイクロ流路と拡散二重層モデルを用いた測定法を開発し,これを測定した.純水の実験ではこの電流のジュール熱のため電気二重層の温度が46°C上昇した.また電気二重層内のH+の移動度が著しく増大していることが分かった.固液界面の電気二重層内を流れる界面電流は,電気浸透流を駆動している.電気二重層厚さが数十ナノメーターと極めて薄いのでこの電流を測定することは困難であった.本研究では,隙間が可変のマイクロ流路と拡散二重層モデルを用いた測定法を開発し,これを測定した.純水の実験ではこの電流のジュール熱のため電気二重層の温度が46°C上昇した.また電気二重層内のH+の移動度が著しく増大していることが分かった.電気二重層厚さが極めて薄いと仮定することにより、流路高さが可変のドーナツ型流路を用いて電気浸透流中を流れる電流から界面電流を分離して定量的に測定する方法を開発した。この結果測定された蒸留水とガラスの界面の場合、界面電流密度はバルクの電流密度に比べ50倍程度大きいことを示した。電気二重層に対し平行平板コンデンサーモデルを用いて求められた界面電流と電気浸透速度の関係を実験により確かめ、この関係により電気二重層厚さ等を推定できることを示した。引き続いて、電気二重層を拡散二重層モデルにより分析した。初めに二重層モデルに基づき界面電流を定義し、その定式化を行った。拡散二重層では、電気二重層厚さが有限の厚さとなるため、ここで開発した界面電流測定法の仮定が保証されない。このため実験的に求められる界面電流と定義に基づく界面電流は厳密に一致しない。この二つの界面電流の関係を拡散二重層に基づいて厳密に求めた。この関係を用いることにより、実験的に求められた界面電流から定義に基づく界面電流を得ることができることを示した。つぎに求められた界面電流と電気浸透則の関係から、界面電流のジュール加熱により電気二重層における温度上昇を推定することができることを示した。電気二重層は通常100ナノメートル以下の厚さのため、そこの温度変化を求めることが困難であったが、ここでの方法により定量的に推定できることが示された。前年度は特別に作成されに実験装置を用い,電気浸透流の界面電流測定法を開発した.また得られた実験結果に拡散二重層モデルによる分析結果を考慮することにより定義に基づく界面電流を求める方法を示した.さらに電気浸透速度と界面電流の関係を理論的に定式化し,両者が正比例の関係になることを示した.今年度の研究では,はじめに理論により定式化された関係と実験結果の定量的比較を行った.このため,バルクでのイオン濃度が正確に指定できるNaCl溶液を用いた実験を行った.この場合の電気二重層内の支配イオンはNa+イオンである.その結果,理論と実験結果は極めてよく一致することが示された.これより,測定された界面電流が精度良く測定されていること,および定式化された関係が定量的に正しいことが証明された.次に,純水を用いた実験をおこなった.この場合の電気二重層内の支配イオンはH+である.純水での実験結果は理論と大きく異なった.この原因として,電気二重層内のH+イオンのイオン移動度が著しく大きいことが理論から推測された.水分子はバルクにおいても単独の分子として存在せず,いくつかの分子が水素結合によりクラスターを形成することが知られている,電気二重層内での水分子は,狭い領域内で壁垂直方向の強い電場の作用により秩序構造を形成し,壁に平行に長いクラスターを形成しているものと予想される.H+イオンは,よく知られたプロトンジャンプ機構により,このクラスターを効率よく移動する.このため,H+イオンのイオン移動度がバルクのそれに比べ著しく大きくなるものと理解される.このように,界面電流と電気浸透速度の実験から,電気二重層内の水分子の構造を推定できることが分かった.1.これまで純水を用いた電気浸透流実験と同じドーナツ型マイクロ流路を用いて、希釈食塩水に対する電気浸透実験をおこない純水の場合と比較した。その結果、(1)直流電圧を印加した場合にバルクを流れる電流が、測定された電気伝導度から計算される結果と一致した。またこれはイオン移動度(Na,Cl)とイオンモル濃度から求められる理論値にも一致した。この結果は実験装置および測定系が正しく作動していることを示している。これより、純水においてバルク電流が電気伝導度から計算される値より35倍大きかった結果は、直流電場における水素イオンの特異な移動機構の存在によることを示している。(2)希釈食塩水における界面電流は測定条件下において、0.1μAオーダーで純水の場合に比べ一桁小さかった(拡散二重層モデル理論結果と同じ)ため電流測定分解能が十分でなく定量的結論を得ることができなかった。2.前年度までに得られた純水に対する電気浸透流量対印加電圧データの再検討を行なった。特に電流によるジュール加熱の結果生ずる電気二重層内での温度上昇△Tを定量的再評価により精密化した。△Tは印加電圧にほぼ比例し、25[V]で56°Cであった。

一方、バルクでの温度上昇の推定値は1°C程度であった。すなわち、バルクより電気二重層内が温度が45°C高い。これは、純水では電気二重層内での電流密度がバルクのそれに比べ著しく大きいことによる。3.純水の場合の界面電流の大きさは、電気伝導度のわずかな違い(1.54μS/cm)により550μA/mと大きく変化することがわかった。この理由として電気二重層での水分子クラスターの変化、スターン層の電気伝導の可能性等が考えられるが、現段階ではその機構は不明である。
内発的、学習獲得的、生理的な報酬の機能と作用機序に関する生理心理学的研究

学習を強化する報酬には、生理的、学習獲得的、内発的なものがある。本研究では生理的あるいは学習獲得的報酬が、「ゲーム」あるいは「競争」という社会的、内発的な要因によって異なった意味をもつことをサルの行動と前頭連合野ニューロンの活動レベルで明らかにした。また、報酬はそれが学習行動の結果として与えられるのか、学習行動とは無関係に与えられるのかにより、前頭連合野内ドーパミン放出に違いがあることを見出した。本研究は、報酬に関係した活動がよく見られる線条体と前頭連合野に焦点をあて、これらの脳部位は3種類の報酬にどのように応じるのかをサルとヒトにおいて詳しく調べ、これらの異なった種類の報酬の機能的相違を脳メカニズムのレベルで解明しようとするものである。本年度はまず、生理的、学習獲得的、内発的報酬の3つのタイプの報酬に支配されるオペラント反応をサルに学習させるための装置作成と予備的訓練を行った。(1)生理的報酬に基づく学習では、サルにコンピューターディスプレイ上の特定の図形刺激を選ぶと、餌または液体報酬が得られる、という訓練装置を作成した。(2)学習獲得的報酬に基づく学習では、同じくコンピューターディスプレイを用いた。ディスプレイ画面の左右に異なった色の視覚刺激が呈示されると、サルはどちらを選んでもよく、一方を選ぶと、そこでは報酬は与えられず、「貯金」されることになり、画面上の数直線における表示(ポイントに相当)が長くなり、もう一方の選択肢を選ぶと、それまでの貯金に相当する報酬が一気に与えられるという課題にした。重要な点として、貯金選択を続ければ続けるほど貯金額は全体として多くなるようにした。(3)内発的報酬に基づく学習では、これまでにサルに内発的報酬になることが示されている、仲間のサルのビデオや、激しい動きが伴う実写あるいはアニメの作成を行った。サルにはキー押しをするとこうした画像が得られるという学習課題とした。(1)本研究が採択された後の1-2年の間に内発的報酬の脳メカニズムに関するfMRI研究が多数現れたことから、fMRI研究については当初の予定を変更して、まずそうして発表された研究を詳しく分析し、より本質にせまる研究をすべくこの分野の文献的研究を行った。(2)内発的動機づけのメカニズムをニューロンレベルで調べる研究も現れたことから、当初の計画を変更し、内発的動機づけを直接にではなく、餌や水のような外発的報酬の価値が内発的動機づけにより変容する側面に着目した実験を考案した。サルに競争的ゲームを行わせ、競争という生理的あるいは学習獲得的ではない操作が報酬の価値を高める現象について、行動レベル(反応時間など)とニューロンレベルで検討する実験を行った。(3)報酬行動に対する薬物の影響を調べるため、ADHDの治療薬にも用いられるメチルフェニデートが報酬応答と、その報酬を得ようとする行動に関係して、脳内神経伝達物質にどのような変化をもたらすのかをマイクロダイアリシス実験によって調べた。その結果、この薬物は前頭連合野のドーパミンを増加すること、適量の投与は報酬獲得行動を促進することが明らかになった。(4)異なった価値をもつ報酬が、生理的か学習獲得的かにより脳内で異なった内容の報酬応答を促す可能性に関し、報酬の有無、報酬が学習行動によるのか、受動的に与えられるものなのか、という違いに着目して神経伝達物質の変化を調べるマイクロダイアリシス研究を行った。(1)内発的報酬の脳メカニズムに関するfMRI研究がここ1ー2年に多数現れたことから、こうした研究を詳しく分析し、文献的研究を行った。(2)内発的動機づけのメカニズムをニューロンレベルで調べる研究が現れたことから、内発的動機づけを直接にではなく、餌や水のような生理的報酬の価値が内発的動機づけにより変容する側面に着目した実験をした。サルに競争的ゲームを行わせ、競争という生理的あるいは学習獲得的ではない操作が報酬の価値を高める現象について、行動レベル(反応時間など)とニューロンレベルで検討した。(3)報酬行動に対する薬物の影響を調べるため、ADHDの治療薬にも用いられるメチルフェニデートが報酬応答と、その報酬を得ようとする行動に関係して、脳内神経伝達物質にどのような変化をもたらすのかをサルにおけるマイクロダイアリシス実験によって調べた。

その結果、この薬物投与により前頭連合野のドーパミンが増加すること、適量の投与は報酬獲得行動を促進することを示した。(4)異なった価値をもつ報酬が、生理的か学習獲得的かにより脳内で異なった内容の報酬応答を促す可能性に関し、報酬の有無、報酬が学習行動によるのか、受動的に与えられるものなのか、という違いに着目してサルにおける神経伝達物質の変化を調べるマイクロダイアリシス研究を行い、報酬の価値、報酬が学習行動によるのか受動的に与えられるのかにより前頭連合野のドーパミン放出が異なることを明らかにした。3つの異なった種類の報酬のうち、とりわけ内発的報酬の脳メカニズムを詳しく調べ、他の報酬の脳メカニズムと比較することを目指したが、この研究が採択された直後からこのトピックに関する人のfMRI研究が数多く現れ、かつサルにおけるニューロン活動の研究も出始めたことから、当初の計画通りの実験では独創性を生かせないと考え、他の研究者とは異なる方法を用いた研究計画に基づく実験を始めたことで計画にはやや遅れが出ている。24年度が最終年度であるため、記入しない。人のfMRI研究で得られた成果をもとに、3つの報酬の脳メカニズムを比較する研究を文献的にも進めることとする。また、報酬の脳メカニズムの研究をfMRIやニューロンレベルのものから、我々の研究室で発展させてきたマイクロダイアリシス法を駆使して、神経伝達物質レベルで調べるものに重点を移して研究を発展させる。
HIV遺伝子発現調節機構と潜伏・持続感染機構に関する研究

TatによるCIITAの抑制:Tatは、転写伸長促進作用に際しCDK7とともにP-TEFbを要求する。Tatが同じくP-TEFbを要求するCIITAよりP-TEFbを競合奪取してCIITA活性を抑制し、class II MHCの転写を抑え、抗原提示細胞機能を抑制して免疫不全状態の進行を促進することを見いだしたが、今年度は、CIITAの誘導因子であるIFN-γが逆にTat作用を抑え、その結果HIVの増殖を抑制することを見出し、HIV感染に伴う免役不全病態の進行が可逆的に制御可能であることを示した。NF-κB活性化シグナル:PKAによるリン酸化カスケードがC/EBPβを誘導し、p65サブユニットと結合することによりその活性を抑制することを明らかにした。また、リンフォトキシンによるNF-κB活性化シグナル伝達系にNIKとIKKαが必須であることを初めて明らかにした。NF-κBのp65サブユニット相互作用因子の包括的遺伝子スクリーニング:すでに、酵母two-hybrid法によりNF-κBの転写活性調節に関わる複数の核内因子(RAI,AESとTLE1,TLS、など)を同定した。このうち、今年度はRelA-associated inhibitor(RAI)は核内でp65のみならずSp1に対しても強く抑制し、HIV転写活性とウイルス複製を抑制することを明らかにした。新たな相互作用因子スクリーニングシステムCytoTrap法を適用し、ユビキチンE2リガーゼ活性を持つと報告されている蛋白AO7をNF-κB活性化因子として同定した。AO7は核内に存在し、p65と相互作用してむしろ転写活性化を促進する。最近、転写活性化反応過程にユビキチン化が正に関与することが提唱されているが、転写レベルでのHIV活性化の分子標的として注目される。
薬用植物の機能性含硫黄成分の生合成機構の解明と応用

ネギ属等の植物が含むシステインスルホキシド誘導体やその生合成中間体や、組織損傷時にシステインスルホキシド誘導体から生じる硫黄化合物群は、癌や循環器系疾患の予防や改善に役立つ薬学的に有用な成分である。本研究では、ディープ・トランスクリプトームと含硫黄代謝物プロファイルの統合解析に基づいたシステインスルホキシド誘導体生合成酵素遺伝子群の網羅的同定と、分子生物学的・生化学的手法による各遺伝子の機能解析を行い、その結果を異種生物における機能性含硫黄成分の生合成系構築に応用する。平成30年度に行った主な研究内容は以下のとおりである。1.平成29年度に探索したニンニクのシステインスルホキシド誘導体の生合成における脱グリシル化酵素候補AおよびBについて、N末にHisタグを付加した大腸菌組換えタンパク質を発現させた。空ベクターを導入した大腸菌の粗タンパク質と比較して、AおよびBを発現させた大腸菌の粗タンパク質は、推定生合成基質に対して顕著な脱グリシル化活性を示した。しかし、AおよびBのHisタグ付加組換えタンパク質をNiレジンを用いてアフィニティ精製したところ、脱グリシル化活性は激しく低下した。詳細な機能解析のためには、精製用のタグの位置や種類、精製方法の検討が必要であると考えられる。2.平成29年度に探索したタマネギのシステインスルホキシド誘導体生合成における脱グルタミル化酵素候補3種、S-酸化酵素候補1種について、酵母組換えタンパク質を作製して機能を解析した。その結果、タマネギの脱グルタミル化酵素やS-酸化酵素は、ニンニクの同様の酵素とは機能の特徴が異なることが示された。3.平成29年度に探索したニンニクのシステインスルホキシド誘導体生合成における酸化的脱炭酸酵素候補2種について、酵母組換えタンパク質を作製してin vitro酵素反応を行ったが、目的とする酵素反応は検出されなかった。ディープ・トランスクリプトームデータと含硫黄代謝物プロファイルの統合解析によるシステインスルホキシド誘導体の生合成に関わる酵素遺伝子の探索と候補遺伝子クローニングは予定どおり進んでいる。ニンニクの脱グリシル化酵素、タマネギの脱グリシル化酵素とS-酸化酵素については既に目的とする酵素活性が観察されている。それ以外の酵素候補遺伝子についてもin vitro解析系の構築や酵素反応の予備実験が予定どおり進んでいる。このため、おおむね順調に進展していると判断した。平成30年度に引き続き、酵素遺伝子の探索と候補遺伝子クローニング、機能解析を進める。ニンニクの脱グリシル化酵素については、組換えタンパク質の精製用のタグの位置や種類、精製方法の検討を行い、精製タンパク質を用いて詳細な機能解析を行う。脱グルタミル化酵素とS-酸化酵素については、ニンニクとタマネギ由来の酵素の触媒機能の詳細な比較を行い、植物間の含硫黄化合物プロファイルの差異との関連を明らかにする。酸化的脱炭酸酵素候補については、予備実験で活性が検出されなかった2種の候補以外の候補も含めて、組換えタンパク質発現系や酵素精製法を複数試し、着目する酵素活性の検出を目指す。また、in vitro解析系において目的とする酵素活性がみられた酵素と宿主の組み合わせを用いて、複数遺伝子の同時導入による生合成系の異種生物における構築を試みる。システインスルホキシド誘導体はネギ属やツルバギア属、ニンニクカズラ属等の植物が生産する含硫黄成分であり、植物組織の損傷に伴い酵素的および非酵素的な反応を経て多様な硫黄化合物群に変換される。こうして生じた硫黄化合物群や、システインスルホキシド誘導体やその生合成中間体は、癌や循環器系疾患の予防や改善に関わる生物活性を示す。本研究では、ディープ・トランスクリプトームと含硫黄代謝物プロファイルの統合解析に基づいて、進化系統学的に離れた複数の薬用植物の機能性含硫黄成分の生合成に関わる酵素遺伝子群を網羅的に同定し、各酵素遺伝子の機能解明と植物の含硫黄成分生合成能獲得の進化機構の解析を行うと同時に、合成生物学的手法によって機能性含硫黄成分の生合成システムを異種生物で構築し、機能性含硫黄成分の化学的多様性の合理的エンジニアリングを試みる。平成29年度に行った研究内容は以下のとおりである。1.ニンニクのシステインスルホキシド誘導体の生合成において、脱グリシル化反応、硫黄原子への炭素鎖付加反応、酸化反応を触媒する酵素をコードする可能性が示唆される遺伝子の候補を探索した。2.1で探索した遺伝子群をクローニングし、in vitro機能解析系を立ち上げた。そのうち脱グリシル化酵素については、予備実験において目的酵素活性が観察された。3.タマネギのシステインスルホキシド誘導体の生合成において、脱グルタミル化反応、S-酸化反応を行う酵素をコードすると考えられる遺伝子群を探索し、クローニングした。さらに、in vitro機能解析系を立ち上げた。4.ツルバギアのシステインスルホキシド誘導体の生合成においてS-酸化反応を行う酵素をコードすると考えられる遺伝子を探索し、クローニングした。ニンニクの脱グリシル化酵素については既に予備実験において目的とする酵素活性が観察されており、それ以外の酵素についてもin vitro解析系の構築が予定どおり進んでいる。

本研究では、ディープ・トランスクリプトームと含硫黄代謝物プロファイルの統合解析に基づいたシステインスルホキシド誘導体生合成酵素遺伝子群の網羅的同定と、分子生物学的・生化学的手法による各遺伝子の機能解析を行い、その結果を異種生物における機能性含硫黄成分の生合成系構築に応用する。平成30年度に行った主な研究内容は以下のとおりである。1.平成29年度に探索したニンニクのシステインスルホキシド誘導体の生合成における脱グリシル化酵素候補AおよびBについて、N末にHisタグを付加した大腸菌組換えタンパク質を発現させた。空ベクターを導入した大腸菌の粗タンパク質と比較して、AおよびBを発現させた大腸菌の粗タンパク質は、推定生合成基質に対して顕著な脱グリシル化活性を示した。しかし、AおよびBのHisタグ付加組換えタンパク質をNiレジンを用いてアフィニティ精製したところ、脱グリシル化活性は激しく低下した。詳細な機能解析のためには、精製用のタグの位置や種類、精製方法の検討が必要であると考えられる。2.平成29年度に探索したタマネギのシステインスルホキシド誘導体生合成における脱グルタミル化酵素候補3種、S-酸化酵素候補1種について、酵母組換えタンパク質を作製して機能を解析した。その結果、タマネギの脱グルタミル化酵素やS-酸化酵素は、ニンニクの同様の酵素とは機能の特徴が異なることが示された。3.平成29年度に探索したニンニクのシステインスルホキシド誘導体生合成における酸化的脱炭酸酵素候補2種について、酵母組換えタンパク質を作製してin vitro酵素反応を行ったが、目的とする酵素反応は検出されなかった。ディープ・トランスクリプトームデータと含硫黄代謝物プロファイルの統合解析によるシステインスルホキシド誘導体の生合成に関わる酵素遺伝子の探索と候補遺伝子クローニングは予定どおり進んでいる。ニンニクの脱グリシル化酵素、タマネギの脱グリシル化酵素とS-酸化酵素については既に目的とする酵素活性が観察されている。それ以外の酵素候補遺伝子についてもin vitro解析系の構築や酵素反応の予備実験が予定どおり進んでいる。このため、おおむね順調に進展していると判断した。平成29年度に引き続き、酵素遺伝子の探索と候補遺伝子クローニング、機能解析を進める。脱グルタミル化酵素とS-酸化酵素については、ニンニク、タマネギ、ツルバギア由来の酵素の触媒機能の比較を行い、植物間の含硫黄化合物プロファイルの差異との関連を明らかにする。平成30年度に引き続き、酵素遺伝子の探索と候補遺伝子クローニング、機能解析を進める。ニンニクの脱グリシル化酵素については、組換えタンパク質の精製用のタグの位置や種類、精製方法の検討を行い、精製タンパク質を用いて詳細な機能解析を行う。脱グルタミル化酵素とS-酸化酵素については、ニンニクとタマネギ由来の酵素の触媒機能の詳細な比較を行い、植物間の含硫黄化合物プロファイルの差異との関連を明らかにする。
ラングミュア膜を用いた繊維-染料間相互作用の研究

染色メカニズムに関する分子レベルの新しい知見を得ることを目的として、染料分子を水に溶解させ、その水面上に、親水基と疎水基からなる両親媒性物質のラングミュア膜(水面上展開単分子膜)を作製し、水中に染料が無い場合と比較してラングミュア膜にどのような構造変化が起こっているかを明らかにすることが本研究の課題である。まずその前段階として、前年度に引き続き、亜鉛イオンを水中に混入させたときの、ステアリン酸ラングミュア膜の構造の経時変化を調べた。赤外外部反射スペクトルを測定したところ、ステアリン酸のメチレンの伸縮振動バンドは、時間が経過するにつれて、波数、吸光度ともに低下した。これは炭化水素鎖に構造変化が起こっていること示しており、ラングミュア膜のパッキングが変化しているものと推測される。これは亜鉛イオンが水中に無い場合とは異なる結果であり、ステアリン酸と亜鉛イオンとの間の強い相互作用のためであると考えられる。また、カルボキシレートの伸縮振動バンドの波数にも変化が見られた。このことから、カルポキシレートの構造も時間により変化することが明らかとなった。続いて、代表的な直接染料であるコンゴーレッドを水に溶かし、ラングミュア膜としては、セルロース系の繊維との対応から、ヒドロキシ基を持つ長鎖脂肪アルコールのオクタデカノールを用い、表面圧-表面積曲線(π-A等温線)の測定を行った。その結果、水中に染料がない場合のπ-A等温線と比較し、有意な差が生じた。これはコンゴーレッドとオクタデカノール分子との相互作用の結果であると考えられる。それぞれの場合の極限面積は、22.5Å、20.5Åとなり、コンゴーレッドが水中に含まれている場合の方が、極限面積が広くなった。コンゴーレッドがオクタデカノールのラングミュア膜中に入り込んでいることが推測される。またアルコール分子の、炭化水素鎖の長さを変えた場合も同じような傾向を示した。本研究は繊維に対する染料の吸着状態を明らかにすることを目的として、繊維と同じ親水基を持つ両親媒性物質のラングミュア膜を作製し、水中に染料分子を種々の濃度で混入し、ラングミュア膜の構造変化を観測する、というものである。分子レベルでの吸着状態を明らかにすることが目的であるが、染料分子は比較的大きな分子であるため、基礎的な知見を得るためにまず小さな分子を用いて実験を行った。分子としては亜鉛イオンを使用し、脂肪酸であるステアリン酸と12-ヒドロキシステアリン酸のラングミュア膜との相互作用を、主に赤外外部反射法を用いて調べた。現在のところ得られている結果は次のようなものである。1.亜鉛イオンを水中に入れたステアリン酸のラングミュア膜において赤外外部反射スペクトルを測定したところ、膜の表面積の変化に対してステアリン酸のメチレンの伸縮振動バンドは、波数、吸光度ともに変化は見られなかった。このことから炭化水素鎖の配向とコンフォメーションは表面積に依存しないことが明らかとなった。これは亜鉛を入れなかった場合とは異なる結果であり、ステアリン酸と亜鉛との間の強い相互作用によるものである。2.表面積の変化に対し、カルボキシレートの伸縮振動バンドの波数に変化が見られた。このことから、カルボキシレートの構造は表面積に依存することが明らかとなった。3.12-ヒドロキシステアリン酸亜鉛とステアリン酸亜鉛のラングミュア膜とでは、メチレンの伸縮振動バンドの吸光度に大きな差が見られた.炭化水素鎖軸の、膜面の法線方向に対する配向の違いによるものと考えられる。次は実際に使われている染料を用いて実験を行い、今回得られた知見を元にして解析を行う予定である。

コンゴーレッドがオクタデカノールのラングミュア膜中に入り込んでいることが推測される。またアルコール分子の、炭化水素鎖の長さを変えた場合も同じような傾向を示した。
頭頸部扁平上皮癌への新たな多剤併用療法の試み

BRAK/CXCL14は、多くの正常組織で発現しているケモカインで生体のホメオスタシス維持に重要と考えられている。BRAKには血管新生抑制作用や単球、マクロファージの遊走活性などの機能があることが報告されている。また、頭頸部扁平上皮癌細胞(HNSCC)では、上皮細胞増殖因子(EGF)刺激によりBRAKの発現が抑制されることがわかっており、通常BRAKの発現が低下または消失している。このことが、癌の増殖・進展に密接に関与していることが示唆されている。さらに、遺伝子導入によりBRAKを高発現させた細胞やBRAK高発現トランスジェニックマウスを用いた腫瘍移植実験から、BRAKが抗腫瘍効果を示す標的分子として注目されている。本研究では、頭頸部扁平上皮癌で見られるBRAKの発現低下が、BRAK遺伝子のプロモーター領域のメチル化による変異により引き起こされていること、BRAK低発現細胞はメチル化阻害剤処理によりその発現が回復できること、BRAKを発現した扁平上皮癌細胞はEGF受容体阻害剤(ゲフィチニブ)処理によりその発現がさらに増強され、他の抗腫瘍薬剤との併用で相乗的な抗腫瘍効果が期待できることがわかった。我々はこれまでに、ケモカインBRAKが上皮増殖因子受容体(EGFR)刺激によって発現が低下すること、さらには発現ベクターを用いて発現を上昇させるとin vivo実験系で頭頸部扁平上皮癌の造腫瘍性を低下させることを見出した。一般的にBRAKは頭頸部扁平上皮癌において発現の低下及び消失が確認されている。そこで我々は頭頸部扁平上皮癌細胞株18株を用いて発現頻度について検討した。まず18株中BRAKの発現が確認される群、確認されない群に分類し、それぞれの群でゲフィチニブ(EGFR阻害剤)がBRAKの遺伝子発現を回復するか、またゲフィチニブによる腫瘍縮小効果にBRAKが関与するかを検討した。またBRAKの遺伝子発現が確認されない癌細胞株ではゲフィチニブ投与においても、BRAKの遺伝子発現は確認されなかった。このような癌細胞株に対して、脱メチル化剤5-アザデオキシシチジン(DAC)を添加し、BRAKの遺伝子発現が回復する結果を得た。このことからBRAKのプロモーター領域のメチル化検出がゲフィチニブ投与前の効果予測の新たなマーカーとなり、さらにゲフィチニブ単剤では効果を示さない癌において、DACとの併用療法が有効である可能性を示した。さらに既知のBRAKの遺伝子発現に変化を示す刺激を癌細胞株に与え、cDNAマイクロアレイ解析を行った結果より、BRAKの遺伝子発現に変化を及ぼす21個の候補転写因子群を抽出した。22年度に終了したBRAKのプロモーター領域の特定に基づき、メチル化及び非メテル化癌細胞群のスクリーニングをし、また、この現象が、BRAKの作用によるものであるかどうかを検討することを目的としていた。以前に、予備実験ではあるが、メチル化を受け、ゲフィチニブによってBRAKの発現が回復しない癌細胞では、ゲフィチニブはin vivoで抗腫瘍効果を示さない結果を我々は得た。一方、デシタビン腹腔投与によってBRAKのプロモーターが回復しているがん細胞においては、デシタビンで抗腫瘍効果が確認でき、さらにゲフィチニブがその効果を増強する結果を得ている。本結果が、BRAKの遺伝子発現によるものであるかどうかを検討するため、YCU-H891のBRAK強制発現細胞をウイルスベクターを用いて作製し、ヌードマウスの背部皮下に移植し確認した。結果として、BRAKを強制発現している細胞においてはin vivoにおける腫瘍増殖能が低下する結果を得た。また、22年度に明らかにしたメチル化部位については、スクリーニングに用いるためのプライマー(MSP用)を作製するためアライアンスバイオシステムズの委託サービスを用いて作製を行った。われわれは、ケモカインCXCL14・BRAKが、頭頸部扁平上皮癌に対する多剤併用化学療法の効果発現にどのような影響を及ぼすのか研究を進めてきた。これまでBRAKのプロモーター領域のメチル化及び非メチル化癌細胞群のスクリーニング結果より、メチル化を起こした細胞ではin vivoの実験系において、ゲフィチニブ単剤での抗腫瘍効果は得られないであろうとするのが我々の仮定であった。

実際にBRAKのプロモーター領域のメチル化により、ゲフィチニブ存在下でBRAKの発現が回復しない癌細胞株では、in vivoの移植実験系でゲフィチニブが抗腫瘍効果を示さない結果を得ている。一方、メチル化阻害薬であるデシタビンの腹腔内投与によって、BRAKの発現が回復する癌細胞においては、デシタビンで抗腫瘍効果が確認でき、さらにゲフィチニブ投与がその抗腫瘍効果を増強する結果を得た。本結果が、実験で使用した癌細胞YCU-H891特有の結果ではなく、スクリーニングによってBRAKのプロモーター領域にメチル化を起こしていることを確認したすべての扁平上皮癌細胞株でも同様の結果が得られたことから、ゲフィチニブを応用した扁平上皮癌の治療効果に、BRAKのプロモーター領域のメチル化の有無が重要であることを見出した。また、治療効果の予測にBRAKのプロモーター領域のメチル化の有無が利用できることを証明した。
進化分子工学的手法を用いたリーシュマニア原虫の細胞内侵入機序の解明

本研究は、細胞内寄生病原体であるリーシュマニア原虫の細胞内侵入機序を進化分子工学的手法を用いて遺伝子レベルで解明しようとするものである。リーシュマニア原虫(Leishmania amazonensis;GO4)のゲノムDNA及びcDNAライブラリーを作成し、プラスミド(pBluescript IISK+)に組み込み、そのプラスミドを非病原性大腸菌(DH5α)に入れた。本来この大腸菌は、細胞侵入能力をもたないが、培養細胞(VA-13)と大腸菌を混合して培養した後、抗生物質を含んだ液で洗浄し、細胞外の大腸菌を洗い流し、細胞内に侵入した大腸菌だけを細胞を壊すことにより、侵入力をもった特定のリーシュマニア遺伝子が組み込まれたプラスミドを有する大腸菌を選択することに成功した。ゲノムDNAライブラリーを用いて行った実験で、細胞に侵入した大腸菌に含まれるプラスミドのインサートを解析したところ、11クローンの中で4クローンに、同一の614bpのシークエンスが含まれていた。更にデリーション変異株を作成し、この遺伝子のなかでどの部位が最も侵入力に関与しているかを調べたところ、N端側の130bpほどが、重要と考えられた。そこで、このインサートのデリーション変異株の、約130bp遺伝子を蛋白質発現ベクターに組み直し、大腸菌に導入しグルタチオン・S・Tランスフェラーゼ融合蛋白を作らせ精製した。この蛋白をアガロースビーズにコートし、細胞への付着試験を試みたところ、対照群と比較し有意にビーズの付着現象が高くなった。この約130bpの遺伝子をコンピュータのよるホモロジー解析を試みたところ、その相同性よりリーシュマニア原虫のキネトプラストDNAの遺伝子配列と考えられた。リーシュマニア原虫の細胞内侵入機序解明するため、リーシュマニア原虫(Leishmania amazonensis;G04)のゲノムDNAライブラリーもしくは、cDNAライブラリーを作成し、プラスミド(pBluescript IISK+)に組み込み、そのプラスミドを非病原性大腸菌(DH5α)に入れた。本来この大腸菌は、細胞侵入能力をもたないが、ある特定のリーシュマニア遺伝子が組み込まれたプラスミドを有する大腸菌は、細胞に侵入する能力を獲得した。これは、培養細胞(VA-13)と大腸菌を混合して培養した後、抗生物質を含んだ液で洗浄することにより、細胞外の大腸菌を洗い流し、細胞内に侵入した大腸菌だけを細胞を壊してとりだした。ここにおいて、まずcDNAの作成であるが、培養したリーシュマニア原虫からmRNAを分離した後、cDNAを作成したが、おそらく、knetoplast(k)DNAからできてくると思われる非常に小さいmRNAが大量にでてくるため、500bp以下のcDNAライブラリーが多く出現し、なかなか有効なcDNAライブラリーが作成されず、現在、方法を変えて作成中である。一方、ゲノムDNAライブラリーを用いて行った実験では、細胞に侵入した大腸菌に含まれるプラスミドのインサートに、11クローンの中で4クローンが、同一の614bpのシークエンスが含まれていた。このインサートのデリーション変異株を作成し、約130bpの重要と考えられるシークエンスを蛋白質発現ベクターに組み直し、大腸菌に導入しグルタチオン・S・トランスフェラーゼ(GST)融合蛋白を作らせ、グルタチオン・アガロースビーズにて蛋白を精製した。この蛋白をアガロースビーズにコートし、細胞への付着試験を試みたところ、コントロール群と比較し有意にビーズの付着現象が強くなった。リーシュマニア原虫(Leishmania amazonensis,G04)のゲノムDNA及びcDNAライブラリーを作成し、プラスミド(pBluescriptIISK+)に組み込み、そのプラスミドを非病原性大腸菌(DH5α)に入れた。

本来この大腸菌は、細胞侵入能カをもたないが、培養細胞(VA-13)と大腸菌を混合して培養した後、抗生物質を含んだ液で洗浄し、細胞外の大腸菌を洗い流し、細胞内に侵入した大腸菌だけを細胞を壊すことにより、侵入力をもった特定のリーシュマニア遺伝子が組み込まれたプラスミドを有する大腸菌を選択することに成功した。ゲノムDNAライブラリーを用いて行った実験で、細胞に侵入した大腸菌に含まれるプラスミドのインサートを解析したところ、11クローンの中で4クローンに、同一の614bpのシークエンスが含まれていた。更にデリーション変異株を作成し、この遺伝子のなかでどの部位が最も侵入力に関与しているかを調べたところ、N端側の130bpほどが、重要と考えられた。そこで、このインサートのデリーション変異株の、約130bp遺伝子を蛋白質発現ベクターに組み直し、大腸菌に導入しグルタチオン・S・Tランスフェラーゼ融合蛋白を作らせ精製した。この蛋白をアガロースビーズにコートし、細胞への付着試験を試みたところ、対照群と比較し有意にビーズの付着現象が高くなった。この約130bpの遺伝子をコンピュータのよるホモロジー解析を試みたところ、その相同性よりリーシュマニア原虫のキネトプラストDNAの遺伝子配列と考えられた。
遷移金属酸化合物の多孔構造形成とナノ構造フォトニクスへの展開

コヒーレント後方散乱測定と時間分解光子輸送測定を組み合わせることでランダム媒質として用いたTiO_2多孔体内での光の平均自由行程と光の拡散定数を測定し、その多孔構造依存性を評価した。媒質に吸収がある場合、光が局在した場合と類似した散乱光分布を示すため、光の散乱現象を観測するためには、正確な測定と注意深いデータ解析が必要となる。そのため、コヒーレント後方散乱においては広い角度範囲が測定可能な光学系を作製して、より正確に散乱光分布を測定することを目指した。時間分解透過光測定においては、媒質内での光の拡散定数を求めた。入射パルスを応答関数として得られたスペクトルをデゴンボリューションすることで、拡散定数の時間変化を調べることが可能となった。後方散乱測定において最も光の平均自由行程が短い試料において、拡散定数を定数とした場合よりも時間依存を導入することによって測定スペクトルを正確に再現することができたため、光の局在近傍の状態であることが示唆された。また、TiO_2多孔体の細孔内に蛍光色素溶液を浸透させることでランダムレーザを作製し、散乱強度の高い多孔体においてレーザ発振を確認した。散乱強度が高い材料中では、多重散乱光は時間反転成分との干渉により強め合うため、ループが形成される。そのため、利得媒質内での滞在時間が長くなり、光増幅が起こったものと考えられる。光の波長程度の空間スケールで屈折率(誘電率)がランダムに変化した構造に光が入射すると、通常はその光は散乱されて媒質中を拡散するだけであるが、散乱強度が高くなるにつれて光の伝播、閉じ込め、回帰が起こり、極限的には「光のアンダーソン局在」と呼ばれる光の進行が許されない極限状態へ転移することが知られている。媒質の散乱強度は光の波長領域での媒質の構造と屈折率によって変わる。光の局在状態を実現するには構造の正確な制御と、二相間の大きな屈折率比が必要である。多孔体を用いることで細孔径と気孔率を任意に制御可能であり、構造と散乱強度の系統的な解析が可能となる。本年度はチタンアルコキシドを出発成分として用い、相分離を伴うゾル-ゲル系においてチタニア多孔体を作製・構造制御を行った。チタニアは屈折率が非常に高いため、散乱媒質として適しているが、出発成分であるチタンアルコキシドは、チタン原子上の部分電荷が大きいため水との反応性が高く、一般にゾル-ゲル系において構造制御を行うことは困難とされてきた。本研究では無機酸を重縮合反応に対する反応抑制剤として用いることで、ゾル-ゲル転移とスピノーダル分解による相分離を並行して誘起し、マイクロメートル領域で揃った細孔径を有するマクロ多孔体を作製できることを見出した。強酸条件化ではチタンアルコキシドは加水分解された後、ヒドロキシル基はプロトン化され正に帯電するため静電的反発により重縮合反応が抑制されると考えられる。また、出発組成によって細孔径は自由に変化可能である。作製したチタニア多孔体を用いて、コヒーレント後方散乱測定によって光の平均自由行程を測定すると、細孔径が光の波長程度になるに従い光を閉じ込める効果が大きくなり、光の局在化に近づいたと考えられる。これまでにチタンアルコキシドを出発成分として用い、相分離を伴うゾル-ゲル系においてチタニア多孔体を作製・構造制御を行ってきた。本年度は得られた多孔体を用い、多孔体内での光の平均自由行程を求めるため、コヒーレント後方散乱測定、また、相補的な実験として時間分解光子輸送測定を行った。コヒーレント後方散乱測定においては、新しい光学系を構築し、広い角い角度範囲での散乱光強度の測定を行った。また、媒質境界面での反射を考慮することでこれまでより正確に光の平均自由行程を測定することが可能となった。光の局在状態を観測するためには、ドメインサイズのより小さい多孔体の作製、または波長の選択を行う必要があることが分かった。次年度は多孔体の構造、測定系の最適化を行う予定である。また、得られたチタニア多孔体を液体クロマトグラフィー用カラムとしての利用するために試作を行った。シリカ多孔体をチタニアでコーティングしたものより高い分離性能を示すことが分かった。

そのため、コヒーレント後方散乱においては広い角度範囲が測定可能な光学系を作製して、より正確に散乱光分布を測定することを目指した。時間分解透過光測定においては、媒質内での光の拡散定数を求めた。入射パルスを応答関数として得られたスペクトルをデゴンボリューションすることで、拡散定数の時間変化を調べることが可能となった。後方散乱測定において最も光の平均自由行程が短い試料において、拡散定数を定数とした場合よりも時間依存を導入することによって測定スペクトルを正確に再現することができたため、光の局在近傍の状態であることが示唆された。また、TiO_2多孔体の細孔内に蛍光色素溶液を浸透させることでランダムレーザを作製し、散乱強度の高い多孔体においてレーザ発振を確認した。散乱強度が高い材料中では、多重散乱光は時間反転成分との干渉により強め合うため、ループが形成される。そのため、利得媒質内での滞在時間が長くなり、光増幅が起こったものと考えられる。
オレキシン神経特異的機能操作による動機づけ神経回路の解明と意志力検証技術の開発

報酬に対する動機づけとしてギャンブル試験を、課題に対する動機づけとしてタッチスクリーン式弁別試験を用いることで、意志力を検証できるシステムを構築した。また、orexin BAC-Creラットを用いて、オレキシン神経特異的にDesigner Receptors Exclusively Activated by Designer Drugs (DREADD)を発現させ、動機づけ行動におけるオレキシン神経の役割を明らかにしてきた。特に平成30年度は、オレキシン神経の活性化は諦めない行動や確率逆転学習にも影響することを見つけ、課題に対する動機づけ行動に影響を及ぼすことが分かった。また、ギャンブル試験の行動データを計算論モデリングしたところ、オレキシン神経を活性化させるとハイリターンに対する期待値が高くなることが分かった。これらの事から、オレキシン神経はやる気・意志力に関わる神経回路の一旦を担う可能性が示され、特に、オレキシン神経は不確実な状況下における報酬に対する期待値に影響を及ぼす可能性があることが分かった。また、オレキシン神経の活性化は摂食量、摂水量を増加させることが分かった。しかし、行動量については影響なかった。これらの結果から、オレキシン神経の活性化は既報と同じように本能行動に影響することが示された。また、現在検討中であるが、蛍光イメージングシステム(ファイバーフォトメトリー)を用いて、動機づけにおけるオレキシン神経活動を測定し、オレキシン神経を光操作したときの動機づけ行動について検討している。このイメージング実験についてはシステムの工夫が必要であると考えている。平成30年度が最終年度であるため、記入しない。意志力は自己をコントロールし、難局を打開するのに必要な力である。意志力の著しい消耗や欠如はうつ病などの精神疾患の発症に繋がる。そのため、意志力を強化することは、ストレス社会を生き抜き、より良い生活を育むうえで優れた方法であり、自らを守り抜く術である。一方、本研究で取り上げるオレキシンは覚醒維持や摂食を含む動機づけ行動に対して促進的に働くことが知られている。オレキシンはエネルギー産生・効率に関与するだけでなく、やる気の根幹をなすドーパミン神経を中心とした報酬回路システムを調節することから、意志力との関係性が連想される。そこで本研究では、独自に考案した計算論に基づく行動解析システムと神経活動測定から意志力検証技術を開発し、意志力による自己コントロールにおけるオレキシン神経系の機能的役割を解明する。平成29年度において、課題に対する動機づけ行動を検討するため、タッチスクリーン式弁別試験を確立させることができた。これにより、報酬に対する動機づけとしてギャンブル試験を、課題に対する動機づけとして弁別試験を用いることで、意志力を検証できるシステムを構築できた。次に、オレキシン-Creラットを用いて、オレキシン神経特異的にDesigner Receptors Exclusively Activated by Designer Drugs (DREADD)を発現させた。このラットにclozapine-N-oxideを投与するとオレキシン神経を特異的に活性化させることができる。このラットを用いて、動機づけ行動におけるオレキシン神経の役割について検討したところ、オレキシン神経の活性化は、報酬に対する動機づけ行動、課題に対する動機づけ行動に影響を及ぼした。この事から、オレキシン神経はやる気・意志力に関わる神経回路の一旦を担う可能性が示された。動機づけ行動におけるオレキシン神経の役割について行動学的に評価できた。平成30年度は、蛍光イメージングシステム(ファイバーフォトメトリー)を用いて、動機づけにおけるオレキシン神経活動を測定し、オレキシン神経を光操作したときの動機づけ行動について検討する。また、DREADD制御下の動機づけ行動について計算論によるオレキシン神経機能のパラメーター推定(報酬価値を計算、学習係数、逆温度など)を行う。計算理論を土台にすることで、意志力に関わる脳活動の意味付けを行う。また、摂食行動、摂水行動におけるオレキシン神経の役割についても検討する。