hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
ヒト血小板におけるホスホリパーゼとCの活性制御機構

種々のアゴニスト刺激により血小板は凝集・分泌の生理機能を引き起こすが、その詳細な分子メカニズムは十分明らかでない。多くの細胞系で各種アゴニスト刺激により異なる種類のホスホイノシチド特異性ホスホリパーゼC(PI-PLC)が活性化されることが知られており、ヒト血小板には4種のPI-PLCアイソザイム(PLC-β2,-β3,-γ1,-γ2)が存在することを各種抗体を用いて同定した。ヒト血小板ではトロンビンやトロンボキサンA2受容体にはG蛋白質(Gq,Gi2)がカップルしていることが明らかにされており、PLC-βの活性化が関与している。ヒト血小板から精製したPLC-β3(155kDa)はウシ脳から精製したG蛋白質βγサブユニットにより著しく活性化された。さらに、ヒト血小板からPLC-β3の部分分解産物である100kDaのPLC-β3が単離され、155kDaPLC-β3に比べてGβγにより30倍ほど強く活性化されることを明らかにした。さらに、155kDaPLC-β3はカルパイン処理により限定分解を受け100kDaのPLC-βとなり、Gβγによる活性化が増加することがわかった。細胞内でのアゴニスト刺激によるPLC-β3の動態を、PLC-β3の特異的アミノ酸配列に対する抗体を用いて検討した。ヒト血小板のカルパイン活性化剤であるジギトニンやA23187処理によりカルパインの活性化に伴うPLC-β3の限定分解が見られた。また、ヒト血小板可溶性画分には140kDaのPLC-β3が存在することが特異的抗体により検出され、カルパイン活性化により分解されることを明らかにした。コラーゲンやトロンビンなどのアゴニスト刺激により、カルパインの活性化によるPLC-β3の限定分解が生じ、Gβγによる感受性が高まるることが血小板凝集の後期になんらかの役割を果たすことを示唆した。ホスファチジルイノシトール特異的ホスホリパーゼC(PI-PLC)は情報変換酵素として重要な位置を占め、二つのセカンドメッセンジャー(イノシトール三リン酸とジアシルグリセロール)を産生する。本酵素はすでに9種類ものアイソザイムがクローニングされており多様性であり、アイソザイムの種類によりそれぞれの活性調節機構が異なることが多くの細胞系で明らかにされている。ヒト血小板は種々のアゴニスト刺激により迅速な応答を示し、イノシトールリン脂質代謝の活性化を検討した。特にトロンビン受容体とカップルしたPI-PLCの活性化機構を明らかにするために、ヒト血小板におけるPLCアイソザイムの分離・同定を目的として大量ヒト血小板からPLCの精製を試みた。サイトゾル画分からPLC-γ1、γ2、を分離精製した。他に未同定の2つの活性画分も単離した。また、膜画分からは3種類のPLCを分離し、その同定を抗体を用いたウエスタンブロッチング法により行なったところ、一つはPLC-β3であることが同定された。しかし、他の2種類のPLCは同定されなかった。また、ウシ悩より分離精製したG蛋白質βγにより膜画分より精製したPLC-β3が特異的に活性化されることを見いだした。またPLC-β3はカルパインにより限定分解されて100kのフラグメントになるが、基のPLC-β3(150k)よりGβγによりさらに活性化されることを見いだした。

この結果からヒト血小板には非常に強いカルパインが存在し、トロンビン刺激により活性化されることが示されているので、トロンビン刺激によるPLC-β3の活性化機構にカルパインによる限定分解の関与の可能性が示唆された。種々のアゴニスト刺激により血小板は凝集・分泌の生理機能を引き起こすが、その詳細な分子メカニズムは十分明らかでない。多くの細胞系で各種アゴニスト刺激により異なる種類のホスホイノシチド特異性ホスホリパーゼC(PI-PLC)が活性化されることが知られており、ヒト血小板には4種のPI-PLCアイソザム(PLC-β2,-β3,-γ1,-γ2)が存在することを各種抗体を用いて同定した。ヒト血小板ではトロンビンやトロンボキサンA2受容体にはG蛋白質(Gq,Gi2)がカップルしていることが明らかにされており、PLC-βの活性化が関与している。ヒト血小板から精製したPLC-β3(155kDa)はウシ脳から精製したG蛋白質βγサブユニットにより著しく活性化された。さらに、ヒト血小板からPLC-β3の部分分解産物である100kDaのPLC-β3が単離され、155kDaPLC-β3に比べてGβγにより30倍ほど強く活性化されることを明らかにした。さらに、155kDsPLC-β3はカルパイン処理により限定分解を受け100kDaのPLC-βとなり、Gβγによる活性化が増加することがわかった。細胞内でのアゴニスト刺激によるPLC-β3の動態を、PLC-β3のC末端側とX,Y領域さらにその間のそれぞれ特異的な12-16個のアミノ酸配列に対する抗体を用いて検討した。ヒト血小板のカルパイン活性化剤であるジギトニンやA23187処理によりカルパインの活性化に伴うPLC-β3の限定分解が見られた。また、ヒト血小板可溶性画分には140kDaのPLC-β3が存在することが特異的抗体により検出され、カルパイン活性化により分解されることを明らかにした。コラーゲンやトロンビンなどのアゴニスト刺激により、カルパインの活性化によるPLC-β3の限定分解が生じ、ヒト血小板における後期凝集になんらかの役割を果たすことを示唆した。
雨水吐き口における水位と電気伝導度の変化に基づく雨天時越流水汚濁負荷量の評価

本研究は、合流式下水道雨天時越流水由来の汚濁負荷の発生やその挙動を把握することを目的として、分布型下水道モデルによって管路内堆積物の蓄積・掃流・輸送を解析した。その結果、晴天時の蓄積,雨天時の掃流ともに空間的差異が大きく,越流負荷の起源の特定には空間的な蓄積・掃流特性の両面を考慮する必要があることが推察された.また、管路内の水位と水温と電気伝導度を計測して、汚濁負荷の発生などを実測した。その結果、最大水位と降雨強度の相関関係から浸水対策施設への越流有無の判定が可能となること、電気伝導度計測データから、雨天時の下水の希釈状況やファーストフラッシュの影響を検討できることが明らかとなった。雨天時汚濁負荷源として重要なCSOの発生に着目して、管路内や越流箇所に電気伝導度(EC)計、水位計を設置することにより、CSO観測を連続的に行うことを試みること、そして温度とECの連続的な変化情報から、CSO発生の有無、発生期間、汚濁負荷の大小を評価する方法を検討すること目的として,下記の項目について研究を実施した。1.目黒川排水区における吐き口の選定:東京都下水道局からすでに提供をいただいている下水道台帳データ(SEMIS)を入力した分布型下水道モデル(InfoWorks ICM)による雨水流出計算を行い、越流量の大きなウエイトを占めている雨水吐口の中から数か所を選定した。2.機器の設置と雨天時流出センサデータの取得:東京都下水道局と選定箇所における水位計とセンサ付きEC計の設置をお願いしたが、危険性が高いことから設置許可が得られなかた。代替として、他の研究プロジェクトにおける研究対象である横浜市鶴見川流域のポンプ排水区において、雨水幹線から新羽末広幹線への越流箇所4か所にセンサを設置した。そして、連続的なデータ収集を行った。3.センサデータ解析と分布型下水道モデル計算の試行:設置個所は、豪雨の際にしか下水は流入しないことから、降雨強度との関係から、間欠的な水位変化と電気伝導度(EC)の変化の関係を整理した。また、ポンプ所の運転管理情報を組み込んだ下水道モデルにより、水位変化の再現性について検討したところ、解像度の高い時空間降雨分布データを入力することが重要であることが明らかとなった。目黒川排水区の分布型下水道モデルを構築して、降雨に伴う越流状況やその越流量の大小を評価することが可能となった。東京都下水道局との協議により、管路内や越流箇所へのセンサ設置は危険性が高いことから、当該排水区へのセンサ設置は実施できなかったものの、その代替として横浜市鶴見川排水区において、雨水幹線から雨水貯留管への越流箇所に水位計とEC計の設置を他の研究プロジェクトとの連携により実施することができたことは、非常に大きな成果である。そして、連続的に水位とECデータの取得が継続できている。また、鶴見川流域の下水道モデルを構築して、降雨における水位変化の再現性も検討できる状況になっていることから、研究は順調に進展している。合流式下水道における雨天時越流水由来の汚濁負荷量の評価に関連して、横浜市鶴見川排水区のポンプ場(江ヶ崎、北綱島、港北水再生センター第3)へ流入する雨水幹線から新羽末広幹線への分水箇所付近において、雨天時下水水質(温度、EC)の連続的な計測を行い、下記の項目について研究を実施した。1.水位変化と降雨特性との関係整理:2016年7月から9月にかけて顕著な水位上昇が5回計測されており、江ヶ崎地点では、計測水位から3回の越流が想定されたが、北綱島と港北3地点では越流が発生していないものと推定された。水位変化と降雨特性との関係整理として最大水位の時点からの遡行時間の平均降雨強度と最大水位との間に高い相関性が得られた。また、両者の回帰式を用いることで最大水位が推定できる可能性が示された。2.水位変化とECとの関係整理:北綱島地点において取得できた7月14日と15日における水位とECの経時変化を解析した結果、7月14日では、水位が計測され始めた時点で最も高いEC値(238μS/cm)が計測され、その後の水位低下とともにEC値が段階的に低下して、最終的には70-80μS/cmとなった。一方、7月15日でも、高いEC値(124μS/cm)が最初に計測されたものの、すぐに70-80μS/cmまで低下した。水位に対するECの時系列変化から、下水が流出雨水により希釈される現象のほかに、ファーストフラッシュに伴う管路内堆積物に起因するEC値の上昇の影響があるものと推察された3.分布型下水道モデルの検定と精緻化:8月22日の降雨イベントに着目し、時空間的に精緻なXRAINデータを用いて流出解析を実施したところ水位変化を良好に再現できた。一方で、ティーセン分割法によるテレメータ観測雨量を用いた再現計算の結果ではピーク時間は再現できたものの、水位や排水量を過小評価する傾向が見られ、ポンプ排水区内の降雨の時空間分布を反映できるXRAINによる計算の有効性が確認できた。その結果、晴天時の蓄積,雨天時の掃流ともに空間的差異が大きく,越流負荷の起源の特定には空間的な蓄積・掃流特性の両面を考慮する必要があることが推察された.

また、管路内の水位と水温と電気伝導度を計測して、汚濁負荷の発生などを実測した。その結果、最大水位と降雨強度の相関関係から浸水対策施設への越流有無の判定が可能となること、電気伝導度計測データから、雨天時の下水の希釈状況やファーストフラッシュの影響を検討できることが明らかとなった。1.センサデータの継続取得と降雨特性と関係整理前年度に引き続き、横浜市鶴見川排水区において雨天時における水温と電気伝導度の変化データを、水位変化とともに継続して取得する。XRAINデータを入手して、降雨強度などのパターンと雨水幹線から貯留管への越流発生との関係整理をクラスター解析などにより実施する。2.水位変化とECとの関係整理降雨に伴う水位上昇やEC変化の関係を整理して、雨水による下水の希釈と管路内堆積物由来の電解質上昇の影響が、ECにどのように反映されるかの評価を試みる。これにより、下水の希釈の影響と堆積物由来の汚染増加の両者を統合した汚濁負荷濃度としてECが活用できるかどうかを検討する。3.分布型下水道モデルの検定と精緻化蓄積した水位観測データを基に、分布型下水道モデルのシミュレーションを実施して、ポンプ運転による水位変化への影響評価、管路の集約化に伴う流出過程のパラメータの精緻化を行う。特に、入力降雨情報としては、1分間隔、250mメッシュで与えられるXRAINの活用の在り方を検討する。また、ECデータを活用して、管路堆積物を考慮した水質シミュレーションモデルの在り方を検討する。水環境保全・制御東京都下水道局との協議の結果、当初予定していた東京都目黒川排水区におけるセンサ設置の許可が得られず、センサ購入を実施したものの、設置のための費用が執行できなかった。その結果、当該排水区におけるデータ取得ができず、当初予定した学会への参加も見送った。次年度では、横浜市鶴見川排水区内の雨水幹線における水位と電気伝導度のセンサの設置が、他のプロジェクトとの連携により可能となったことから、比較的降雨量の大きなイベントに対して、水位やECの測定が実施可能となった。したがって、鶴見川排水区における連続観測に関連した、センサ回収作業などのその他費の執行、学会参加に伴う旅費の執行を行う予定である。
新規二相性リン酸カルシウムセメントの歯内療法への応用に関する基礎的研究

Mineral Trioxide Aggregate(MTA)は歯内療法領域における代表的なセメントであり,重要な特徴として生体親和性と辺縁封鎖性および硬組織形成促進作用を有することが挙げられる。しかしながら,硬化時間や操作性を改善する必要性なども指摘されており,価格自体も他のセメントと比較して高価な材料となっている。現在では後継材料の開発も様々な工夫のもと行われているが,臨床的および基礎的な解析は未だ十分ではない。本研究の目的は,近年開発された単峰性粒度分布を示しながら均一な二相性の特徴を持つ新規Calcium Phosphate Cement(CPC)に着目し,MTAの問題点を改善するために本材料の歯内療法への有用性を検討し,新しい歯内療法用セメントとして実用化の一助にすることである。平成30年度では,平成29年度から継続して行ってきた辺縁封鎖性試験をヒト新鮮抜去歯(日本大学歯学部付属歯科病院倫理委員会許可番号:EP17D103)にてsplit chamber法を用いて行った。その結果,新規CPCは対照材料であるMTAと同等な辺縁封鎖性を示し,新たな歯内療法用セメントとしての有用性が示された。さらに骨芽細胞由来の細胞株であるMC3T3-E1細胞と新規CPCを共培養したところ,細胞の増殖状態やアルカリフォスファターゼ活性に与える影響もMTAと同等であり,高い生体親和性が推察された。また,同培養条件にて細胞の分化マーカーであるRunx2,アルカリフォスファターゼの遺伝子発現をreal-time PCR法にて解析し,コントロールであるセメント非存在下と比較すると上昇していることを確認することができた。以上の研究結果は歯内療法用セメントの要件として非常に重要と考えられ,新規CPCの基礎的データーに成りうるものである。本研究の目的は,歯内療法領域で広く使用されているMTAの問題点を改善するため,単峰性粒度分布を示しながら均一な二相性の特徴を持つ新規Calcium Phosphate Cement(CPC)の歯内療法領域への応用である。そのため,これまでに歯内療法用セメントに重要な要件である辺縁封鎖性および生体親和性についてin vitroの実験系で確認できていることから,現在のところおおむね順調に進展していると考えられる。今後の研究の推進方策としては,平成29年度および30年度内に行っていた研究の一部を継続する予定である。とくに辺縁封鎖性試験に使用するヒト新鮮抜去歯は,本研究に協力していただけることを了承した患者より供与を受けている。そのため,一度に多くを入手できない貴重な試料であるため,継続的に患者に協力を仰ぐ予定である。また,新規CPCが細胞に与える影響についても細胞分化マーカーの種類を増やして解析し,詳細なデーターを取得する。さらに本年度では実験動物としてラットを使用して臼歯部に歯内療法処置を施行し,病理組織学的解析を行う予定である。これらの結果から新規CPCの歯内療法用セメントへの応用について,in vitroとin vivoの両側面から基礎的データーを得ることができると思われる。歯内療法領域の代表的なセメントであるMineral Trioxide Aggregate(MTA)は高い生体親和性,辺縁封鎖性および硬組織形成促進作用が認められ,国内外で広く使用されている。しかしながら硬化時間や操作性を改善する必要性などが指摘されており,価格自体も他のセメントと比較して高価な材料である。現在では後継材料の開発も行われているが,臨床的および基礎的な解析は未だ十分ではない。本研究の目的は,近年開発された単峰性粒度分布を示しながら均一な二相性の特徴を持つ新規Calcium Phosphate Cement(CPC)に着目し,MTAの問題点を改善するために本材料の歯内療法への有用性をin vitroおよびin vivoで解析し,新しい歯内療法用セメントとして実用化の一助にすることである。平成29年度は新規CPCを用いて,歯内療法用セメントとして重要な要件である辺縁封鎖性試験をヒト新鮮抜去歯(日本大学歯学部付属歯科病院倫理委員会許可番号:EP17D103)にてsplit chamber法でヒト唾液を用いて行った。供試材料としては新規CPCセメントとし,対照材料として代表的な歯内療法用セメントであるMTA(ProRoot MTA, Dentsply)を使用した。その結果,ヒト唾液を用いた場合,新規CPCは対照材料であるMTAと同等な辺縁封鎖性を示し,新たな歯内療法用セメントとしての有用性が示唆された。現在,難治性根尖性歯周炎の原因菌であるEnterococcus faecalisの懸濁液を使用し,より歯内療法に特異的なデーターを得るために研究を継続している。現在までの達成度としては,おおむね順調に進展していると考えられる。そのため,ヒト唾液を用いた方法であったが,初年度において歯内療法用セメントとして重要な要件である辺縁封鎖性が代表的な歯内療法セメントであるMTAと同等に示されたことは,大きな意義があると考えている。

しかしながら,硬化時間や操作性を改善する必要性なども指摘されており,価格自体も他のセメントと比較して高価な材料となっている。現在では後継材料の開発も様々な工夫のもと行われているが,臨床的および基礎的な解析は未だ十分ではない。本研究の目的は,近年開発された単峰性粒度分布を示しながら均一な二相性の特徴を持つ新規Calcium Phosphate Cement(CPC)に着目し,MTAの問題点を改善するために本材料の歯内療法への有用性を検討し,新しい歯内療法用セメントとして実用化の一助にすることである。平成30年度では,平成29年度から継続して行ってきた辺縁封鎖性試験をヒト新鮮抜去歯(日本大学歯学部付属歯科病院倫理委員会許可番号:EP17D103)にてsplit chamber法を用いて行った。その結果,新規CPCは対照材料であるMTAと同等な辺縁封鎖性を示し,新たな歯内療法用セメントとしての有用性が示された。さらに骨芽細胞由来の細胞株であるMC3T3-E1細胞と新規CPCを共培養したところ,細胞の増殖状態やアルカリフォスファターゼ活性に与える影響もMTAと同等であり,高い生体親和性が推察された。また,同培養条件にて細胞の分化マーカーであるRunx2,アルカリフォスファターゼの遺伝子発現をreal-time PCR法にて解析し,コントロールであるセメント非存在下と比較すると上昇していることを確認することができた。以上の研究結果は歯内療法用セメントの要件として非常に重要と考えられ,新規CPCの基礎的データーに成りうるものである。本研究の目的は,歯内療法領域で広く使用されているMTAの問題点を改善するため,単峰性粒度分布を示しながら均一な二相性の特徴を持つ新規Calcium Phosphate Cement(CPC)の歯内療法領域への応用である。そのため,これまでに歯内療法用セメントに重要な要件である辺縁封鎖性および生体親和性についてin vitroの実験系で確認できていることから,現在のところおおむね順調に進展していると考えられる。今後の研究の推進方策としては,平成29年度内に行っていた研究の一部を継続する予定である。研究に使用するヒト新鮮抜去歯は,本研究に協力していただけることを了承した患者より供与を受けている。そのため,必要な本数の抜去歯入手には時間を要してしまい,研究期間が延長してしまう傾向にある。しかしながら,平成29年度ですでに実験モデルを確立できたため,研究遂行に問題はないと考える。さらに本年度では,新規CPCを骨芽細胞などの硬組織形成細胞と共培養し,細胞に与える影響について分子生物学的手法にて解析し,臨床応用に向けた基礎的データーを取得する予定である。今後の研究の推進方策としては,平成29年度および30年度内に行っていた研究の一部を継続する予定である。とくに辺縁封鎖性試験に使用するヒト新鮮抜去歯は,本研究に協力していただけることを了承した患者より供与を受けている。そのため,一度に多くを入手できない貴重な試料であるため,継続的に患者に協力を仰ぐ予定である。また,新規CPCが細胞に与える影響についても細胞分化マーカーの種類を増やして解析し,詳細なデーターを取得する。
導電体を介した反応(EMR)制御によるチタンの新しい製造プロセス

チタンの還元反応における電子やイオンの動きの重要性を実験的に立証し、その反応メカニズムを解明することにより反応生成物の析出形態や部位の関連を明確にした。具体的には、チタンのマグネシウム還元反応メカニズムの解析に焦点を絞り、金属生産プロセス原理の微視的理解に必要な新しい手法の確立に主眼を置き、金属熱還元おけるEMR(Electronically Mediated Reaction)すなわち「導電体を介した反応」の重要性を実験的に定量化し、電子の移動経路と析出メカニズムを解明した。基礎実験の具体的例としては、原料と還元剤の投入部位間の電極電圧を測定することにより還元反応の電気化学的特性を測定し、外部電流をモニタすることによりチタンの還元反応におけるEMRの割合を測定した。さらに、原料投入部位の電極に付着した析出物を観察することによってERと析出形態との関係を定量的に検討した。以上要するに、申請者が独自に開発した導電体を介した反応(EMR)制御によるチタンの新しい製造プロセスの確立を目的とした基礎的研究を行い、反応浴の溶融塩の組成や温度を制御し積極的にEMRを制御することによって金属熱還元プロセスを連続化する新しい概念および手法を開発した。導電体を介した反応(EMR)制御によるチタンの新しい製造プロセスの確立を目的とした基礎研究を行い、チタン粉末の効果的な合成方法を開発した。具体的には、還元力のある媒体塩を介したチタン塩化物のマグネシウム熱還元実験を行い、Dy^<2+>イオンを含む1073Kの溶融塩にTiCl_4を吹き込み、反応浴や吹き込み電極の酸化還元電位をMg/Mg^<2+>参照極に対し連続的に計測しながらチタン粉末を合成した。反応媒体塩を効果的に利用することにより、還元剤のマグネシウムと物理的な接触がなくても反応浴全体で導電体を介した反応(EMR)によりチタン粉末を合成できること実験的に示し、反応経路を等温化学ポテンシャル図を用いて考察した。さらに、等温化学ポテンシャル図からチタンの還元に伴って生成するDy^<3+>はマグネシウムにより還元力のあるDy^<2+>に再生できることを明らかにし、Dy^<2+>イオンを含む反応媒体塩介した還元反応の総括反応は、見かけ上クロール法と同一となることを示した。また、電気化学的手法を用いて反応メカニズムを解析した結果、反応メカニズムに関しては、従来のマグネシウム還元材による還元プロセスと本質的に異なることが明らかとなった。また、金属熱還元反応おけるイオンと電子の動きの重要性を示し、電子の移動経路が溶融塩である反応は、チタン粉末の合成に適していることも明らかにした。
胸郭筋群に対する筋硬度計の再現性と有用性の検証―呼吸理学療法評価の確立に向けて―

胸郭筋群に対する筋硬度計を新たに製作した.本筋硬度計は胸郭筋群に常に一定の圧力が加わるように工夫し,呼吸時の吸気と呼気の差が胸郭の拡張差となるように製作した.健常成人男性12名に対し,胸郭に筋硬度計の接触子をあて呼吸時の胸郭拡張差を測定した結果,深呼吸時に有意な拡張差を認めた.しかしながら,対象者間や接触子面の圧力の違いにより,筋硬度計の動きに差が認められたため,引き続き改良の検討が必要である.本研究の目的は,製作した胸郭筋群に対する筋硬度計の再現性と有用性を基礎的に検証することである.当該年度は,対象を健常成人とし,フローセンサー(ルドルフ社製リニアニューモタコ)を用いて安静呼吸時,最大呼吸時,深呼吸時での呼吸のタイミングをそれぞれモニタリングしながら,製作した筋硬度計の接触子を直接測定部位に当て,吸気・呼気位での変位量を測定した.なお,測定部位は対象者の鎖骨内側1/2の第1肋間,胸骨内側2cmの第3肋間,胸骨内側10cmの第3肋間,胸骨内側15cmの第5肋間の4部位とした.また,本筋硬度計の接触面に対する圧は,1cm2あたり約500gとした.その結果,どの部位においても変位量にほとんど変化が認められなかった.そのため,本筋硬度計の接触面に対する圧を,1cm2あたり約750g,250gとし同様に測定を行ったがほとんど変化がなかった.この問題点として,健常成人の胸郭筋群が柔軟であること,本筋硬度計の接触面に対する圧が低いことが考えられる.しかしながら,本筋硬度計の接触面に対する圧が1cm2あたり約750gでは接触面にわずかな痛みを訴える者もあるため,改良する必要性の有無を含め再度検討した.そこで,呼気抵抗を加えることで胸郭筋群の筋緊張を高めることができれば,変位量も測定できると予測し,呼気抵抗を加える装置を製作した.測定部位により異なるが,フローと同期して変位量が変化しており,現在解析を急いでいる.本筋硬度計が重症COPDなどの胸郭筋群の筋緊張が高い疾患に対し,測定の可能性が期待されることは意義深い.胸郭筋群に対する筋硬度計を新たに製作した.本筋硬度計は胸郭筋群に常に一定の圧力が加わるように工夫し,呼吸時の吸気と呼気の差が胸郭の拡張差となるように製作した.健常成人男性12名に対し,胸郭に筋硬度計の接触子をあて呼吸時の胸郭拡張差を測定した結果,深呼吸時に有意な拡張差を認めた.しかしながら,対象者間や接触子面の圧力の違いにより,筋硬度計の動きに差が認められたため,引き続き改良の検討が必要である.本研究の目的は,製作した胸郭筋群に対する筋硬度計の再現性と有用性を基礎的に検証することである.本年度は,日本ゴム協会標準規格に規定されている硬度(アスカーC)の超軟質ウレタン樹脂を用いて,実験を行った.超軟質ウレタン樹脂は,人間の胸郭をイメージし平面のものではなく半球面のものを選択した.また,硬度については軟部組織の硬度を考慮した上で,異なる3種類の硬度(硬度0,硬度5,硬度15)とした.測定方法は,接触子を直接測定部位に当て,5秒間一定の圧をかけ,超軟質ウレタン樹脂に対する接触子の長さを測定した.なお,接触子はピストン運動を行うよう設定している.測定は硬度毎に100回ずつ行った.加えて,筋硬度計の問題点を抽出し,改良する必要性の有無を含め検討した.結果,測定値は超軟質ウレタン樹脂の硬度差によって異なり,硬度5,硬度15,硬度0の順で筋硬度計の接触子のストロークは短かった.測定にあたり,エアリークの問題が浮上し,改良を行った.既製の筋硬度計の接触面に対する圧は約1.5kgであり,安全性が確認され,すでに市販化されている.本筋硬度計の接触面に対する圧は,1cm2あたり約500gであることから,安全性に問題はないため,対象者に使用可能である.予定通り進行しているため.文書による同意が可能な健常成人(本学学生)を対象とし,筋硬度計を用いて引き続き研究を継続する.さらに,フローセンサにて呼吸様式を確認しながらデータ収集を行う.次年度計画に挙げていた予定通り,フローセンサを購入し,呼吸様式を確認しながらデータ収集を行う.
極低温モノクロメータ収差補正STEMによる強相関電子秩序の実空間原子スケール解析

プローブ形成用球面収差補正装置及び電子線単色化モノクロメーターを搭載した透過型電子顕微鏡を用い、強相関電子系物質の電子自由度の秩序状態を実空間で解析することを試みた。K2NiF4型層状マンガン酸化物Nd1-xSr1+xMnO4の低温で形成される強的軌道秩序相について、角度分解電子エネルギー損失分光(EELS)法を用いて分析することを試みた。バルク試料をArイオンミリング法により薄膜化し電顕観察試料を作製した。液体窒素冷却二軸傾斜試料ホルダーを用いて透過型電子顕微鏡の鏡筒内で電顕観察試料を冷却し、強的軌道秩序相における各ドメインの軌道配列パターンを低温電子回折により解析し、各ドメインにおける軌道方向を同定した。単一ドメインを透過した電子波について、EELS検出器に入射する散乱波の方向を変えながらEELS分析を行った。また、室温で反強的軌道秩序を有するペロブスカイト型マンガン酸化物TbMnO3について電顕観察試料を作製し、原子分解能STEM-EELS法および角度分解EELS法を用いて実空間での解析を試みた。本物質の構成原子について、プローブ形成用球面収差補正装置を用いた原子分解能HAADF-STEM法およびSTEM-EELS法により実空間観察することが可能であることが確認された。また、ペロブスカイト型酸化物を構成する酸素原子を原子分解能ABF-STEM法により実空間観察することに成功した。強相関電子系物質の構成原子について、プローブ形成用球面収差補正装置を用いたHAADF-STEM法およびSTEM-EELS法により実空間観察することが可能であることが確認された。また、ペロブスカイト型酸化物を構成する酸素原子をABF-STEM法により実空間観察することに成功した。さらに、K2NiF4型層状マンガン酸化物Nd1-xSr1+xMnO4の強的軌道秩序相における各ドメインの軌道配列パターンを低温電子回折法により解析した。214型層状マンガン酸化物R1-xA1+xMnO4及び113型ペロブスカイト型マンガン酸化物R1-xAxMnO3(R:希土類元素、A:アルカリ土類金属元素)の電荷軌道秩序相におけるヤーンテラー変形、電荷及び軌道の配列パターンを原子分解能HAADF-STEM法、ABF-STEM法、STEM-EELS法、角度分解EELS法により実空間観察することを試みる。球面収差補正装置及び電子線単色化モノクロメーターを搭載した透過型電子顕微鏡を用い、強相関電子系物質の電子自由度の秩序状態を実空間で解析することを試みた。K2NiF4型層状結晶構造を有するマンガン酸化物Nd1-xSr1+xMnO4の低温で形成される軌道秩序相(強的軌道秩序相)について、角度分解電子エネルギー損失分光(EELS)法を用いて分析することを試みた。バルク試料をイオンミリング法により薄膜化し電顕観察用試料を作製した。液体窒素冷却試料二軸ホルダーを用いて透過型電子顕微鏡内で試料を冷却し、制限電子回折法により強的軌道秩序を有するドメインの同定と軌道方向の同定を行った。このドメインに対して電子線を照射し、EELS検出器に入射する散乱波の角度を変えながら、角度分解EELS分析を行った。また、スピン磁気モーメントの実空間観察のために、モノクロメータ収差補正ローレンツ電子顕微鏡法の開発を行った。弱励磁のローレンツレンズを励磁させ、これに対して球面収差補正を行った。さらにモノクロメータを作動させて電子線を単色化することにより色収差を低下させ、ローレンツ電顕像の情報限界を0.6nmまで向上させた。これにより、試料に対して磁場を印加しない状態で、層状マンガン酸化物Nd1-xSr1+xMnO4の結晶格子を観察し、0.62nm周期の格子縞を観察することに成功した。また、希土類金属ジスプロシウムDyの低温で形成されるらせん磁性相を本方法で観察し、1.4nm離れた反転する磁気モーメントと磁気ソリトン、磁場誘起ナノスケール磁気相分離を観察することに成功した。強相関電子系物質の構成原子についてHAADF-STEM法およびSTEM-EELS法により実空間観察することは可能であることが確認された。また、スピン状態の実空間観察のために取り組んだモノクロメーターと球面収差補正装置を併用したローレンツ顕微鏡法を開発し、ローレンツ電顕像の情報限界を0.6nmまで向上させ、0.62nm周期の格子縞を観察することに成功した。この高分解能低温ローレンツ顕微鏡法を用いて、らせん磁性を示す希土類金属ジスプロシウムDyの観察を行い、1.4nm離れた反転する磁気モーメントと磁気ソリトン、磁場誘起ナノスケール磁気相分離を観察することに成功した。全体的におおむね順調に進展していると考えられる。液体窒素冷却二軸傾斜試料ホルダーを用いて透過型電子顕微鏡の鏡筒内で電顕観察試料を冷却し、強的軌道秩序相における各ドメインの軌道

配列パターンを低温電子回折により解析し、各ドメインにおける軌道方向を同定した。単一ドメインを透過した電子波について、EELS検出器に入射する散乱波の方向を変えながらEELS分析を行った。また、室温で反強的軌道秩序を有するペロブスカイト型マンガン酸化物TbMnO3について電顕観察試料を作製し、原子分解能STEM-EELS法および角度分解EELS法を用いて実空間での解析を試みた。本物質の構成原子について、プローブ形成用球面収差補正装置を用いた原子分解能HAADF-STEM法およびSTEM-EELS法により実空間観察することが可能であることが確認された。また、ペロブスカイト型酸化物を構成する酸素原子を原子分解能ABF-STEM法により実空間観察することに成功した。強相関電子系物質の構成原子について、プローブ形成用球面収差補正装置を用いたHAADF-STEM法およびSTEM-EELS法により実空間観察することが可能であることが確認された。また、ペロブスカイト型酸化物を構成する酸素原子をABF-STEM法により実空間観察することに成功した。さらに、K2NiF4型層状マンガン酸化物Nd1-xSr1+xMnO4の強的軌道秩序相における各ドメインの軌道配列パターンを低温電子回折法により解析した。214型層状マンガン酸化物R1-xA1+xMnO4(R:希土類元素、A:アルカリ土類金属元素)の低温で形成される電荷軌道秩序相におけるヤーンテラー変形、電荷及び軌道の配列パターンをHAADF・ABF-STEM法、STEM-EELS法および角度分解EELS法により実空間観察することを試みる。高分解能ローレンツ電顕法を用いて外部磁場印加実験を行い、希土類金属におけるらせん磁性等の変調磁気構造について、磁気モーメントの外部磁場応答を実空間観察することを試みる。得られたローレンツ像を用いて強度輸送方程式法により磁化分布解析を行い、磁気モーメントの実空間観察を行う。214型層状マンガン酸化物R1-xA1+xMnO4及び113型ペロブスカイト型マンガン酸化物R1-xAxMnO3(R:希土類元素、A:アルカリ土類金属元素)の電荷軌道秩序相におけるヤーンテラー変形、電荷及び軌道の配列パターンを原子分解能HAADF-STEM法、ABF-STEM法、STEM-EELS法、角度分解EELS法により実空間観察することを試みる。試料合成用の試薬および電顕試料作製のためのFIB用消耗品に使用可能な予備があり、購入額が少なかったため、次年度使用額が生じた。論文校閲に係る費用及び論文投稿費を使用する。電顕試料作製のためのFIB用消耗品(イオンソース、マイクロサンプリングプローブ)に使用可能な予備があり購入額が少なかったため、次年度使用額が生じた。
良性腫瘍から悪性腫瘍へと老化細胞が形質転換するメカニズムの解明

私たちは細胞老化を起こすようなDNA損傷シグナルがクロマチンにエピジェネティックな変化をもたらすことを見出してきた。そこで細胞老化でおこる核構造の変化に着目して詳細な解析を行った結果、老化細胞では核膜の裏打ち蛋白であるLamin B1の発現レベルが低下するだけではなくMicronucleus(微小核)やBud(出芽核)といった異常な核形態が観察される頻度が顕著に増加し、それによってゲノムDNAが細胞質に多く存在することを見出した。さらに細胞質に存在するゲノムDNAは、細胞質DNAセンサー(cGAS-STING)によって認識され自然免疫応答を引き起こし、cGASやSTINGのノックダウンではSASP遺伝子の発現が抑えられることから、これらの経路の活性化が老化細胞におけるSASPの誘導に重要な働きをすることが明らかとなった。そこでSASPによって肝がんが発症することが確立しているモデルである高脂肪食負荷実験を野生型マウスとSTINGノックアウトマウスに対して行った結果、STINGノックアウトマウスの肝臓ではSASP遺伝子の発現誘導とがんの発症率が顕著に低下していることを見出し報告した(Takahashi et al., Nature Communications, 2018)。さらに、細胞老化でおこる染色体の構造変化を解析したところ、老化細胞特異的なnon-coding RNAが染色体構造を維持する重要な因子の機能を阻害することを見出した。そのため、老化細胞特異的なnon-coding RNAは細胞の染色体数を変化させ腫瘍細胞へと形質転換させることを見出した。また多くのがん細胞ではこのnon-coding RNAの発現が顕著に認められることから、良性腫瘍から悪性腫瘍へと老化細胞が形質転換するメカニズムの一つとしてダイナミックな染色体構造の変化が関与している可能性が示された。平成30年度が最終年度であるため、記入しない。細胞老化は生体にとって重要ながん抑制機構であることが知られているが、近年加齢に伴い体内に蓄積した老化細胞が悪性腫瘍へと形質転換する危険性が注目されている。そのメカニズムの一つとして、老化細胞が炎症や発がんを促進する様々な炎症性蛋白質を分泌するSASP(Senescence-associated secretory phenotype)と呼ばれる現象を起こしていることが指摘されている。私たちはこれまでに、SASPが起こる分子メカニズムの解析を行い、細胞老化を起こすようなDNA損傷シグナルが、クロマチンにエピジェネティックな変化をもたらすことで、SASP因子の遺伝子発現が誘導されることを報告してきた(Takahashi et al., Mol Cell, 2012)。さらに私たちは、良性腫瘍から悪性腫瘍へと老化細胞が形質転換するメカニズムの一つとして、細胞老化でおこるダイナミックな染色体構造の変化と老化細胞が分泌するSASP因子に着目して解析を行った。その結果、老化細胞が分泌するSASP因子の中でも、特に細胞外分泌膜小胞の一つであるエクソソームの分泌が非常に亢進しており、さらにエクソソームの中にはゲノムDNA断片が含まれて細胞外へと分泌されていることを見出した。つまり、通常はクロマチン構造をとることで安定に保護されているはずの染色体が、老化細胞では断片化して細胞質へと出ていると考えられる。さらに、細胞質に存在するDNA断片は細胞に自然免疫応答を引き起こしDNAダメージを与えてしまうので、それを防ぐために正常な細胞は細胞質DNA断片をエクソソームに格納して細胞外へと分泌していることを明らかにした。そして、このような細胞の恒常性維持機構が破綻してしまうと、老化細胞が形質転換を起こし悪性腫瘍化してしまう可能性が示唆された。今年度は良性腫瘍から悪性腫瘍へと老化細胞が形質転換するメカニズムの一つとして、核内のゲノムDNAの断片化がおこりエクソソームに含まれて細胞外へと分泌される現象について解析を行い、論文としてその成果を発表した。私たちは細胞老化を起こすようなDNA損傷シグナルがクロマチンにエピジェネティックな変化をもたらし、SASP因子やnon-coding RNAの遺伝子発現が誘導されることを見出してきた。平成28年度は、細胞老化のダイナミックな染色体構造変化により断片化したゲノムDNAを含むエクソソーム(細胞外分泌膜小胞)の分泌が亢進すること明らかにして報告しており(Takahashi et al., Nature Communications, 2017)、平成29年度はさらに細胞老化でおこる細胞の核構造の変化に着目して詳細な解析を行った結果、老化細胞では核膜の裏打ち蛋白であるLamin B1の発現レベルが低下することは知られていたが、MicronucleusやBudといった異常な核形態が観察される頻度が顕著に増加し、それによって細胞質にゲノムDNAが多く存在することを見出した。さらに細胞質に存在するゲノムDNAは、細胞質DNAセンサー(cGAS-STING)によって認識され自然免疫応答を引き起こし、これらの経路の活性化が老化細胞におけるSASPの誘導に重要な働きをすることが確認された。そこでSASPによって肝がんが発症することが確立しているモデルである高脂肪食負荷実験を野生型マウスとSTINGノックアウトマウスに対して行った結果、STINGノックアウトマウスの肝臓では脂肪肝になる頻度は変わらないもののSASPの誘導とがんの発症率が顕著に低下していることを見出した。さらに、老化細胞特異的なnon-coding RNAが正常細胞の染色体数を変化させ、腫瘍細胞へと形質転換させることを見出し、良性腫瘍から悪性腫瘍へと老化細胞が形質転換するメカニズムの一つとしてダイナミックな染色体構造の変化が関与している可能性が示唆された。

今年度は、老化細胞ではダイナミックな染色体構造の変化により細胞質に移行したゲノムDNAによって自然免疫応答が誘導され、SASPをおこすことで発がんに関わる新たな分子メカニズムを明らかにし、論文としてその成果を発表した。私たちは細胞老化を起こすようなDNA損傷シグナルがクロマチンにエピジェネティックな変化をもたらすことを見出してきた。そこで細胞老化でおこる核構造の変化に着目して詳細な解析を行った結果、老化細胞では核膜の裏打ち蛋白であるLamin B1の発現レベルが低下するだけではなくMicronucleus(微小核)やBud(出芽核)といった異常な核形態が観察される頻度が顕著に増加し、それによってゲノムDNAが細胞質に多く存在することを見出した。さらに細胞質に存在するゲノムDNAは、細胞質DNAセンサー(cGAS-STING)によって認識され自然免疫応答を引き起こし、cGASやSTINGのノックダウンではSASP遺伝子の発現が抑えられることから、これらの経路の活性化が老化細胞におけるSASPの誘導に重要な働きをすることが明らかとなった。そこでSASPによって肝がんが発症することが確立しているモデルである高脂肪食負荷実験を野生型マウスとSTINGノックアウトマウスに対して行った結果、STINGノックアウトマウスの肝臓ではSASP遺伝子の発現誘導とがんの発症率が顕著に低下していることを見出し報告した(Takahashi et al., Nature Communications, 2018)。さらに、細胞老化でおこる染色体の構造変化を解析したところ、老化細胞特異的なnon-coding RNAが染色体構造を維持する重要な因子の機能を阻害することを見出した。そのため、老化細胞特異的なnon-coding RNAは細胞の染色体数を変化させ腫瘍細胞へと形質転換させることを見出した。また多くのがん細胞ではこのnon-coding RNAの発現が顕著に認められることから、良性腫瘍から悪性腫瘍へと老化細胞が形質転換するメカニズムの一つとしてダイナミックな染色体構造の変化が関与している可能性が示された。私たちは細胞老化ではクロマチン構造やエピジェネティックな修飾がダイナミックに変化することを見出しているので、今後はさらに老化細胞で高発現しているnoncoding RNAの解析やクロマチン断片化の分子機構を解析することで、良性腫瘍から悪性腫瘍へと老化細胞が形質転換する分子メカニズムを明らかにしたい。私たちはこれまでの研究から、細胞老化でおこるダイナミックなクロマチン構造の変化が発がんに関与することを見出している。さらに、老化細胞で高発現しているnon-coding RNAによって正常細胞が悪性形質を獲得するという結果を得ているので、今後はその詳細な分子メカニズムを解析することで、良性腫瘍から悪性腫瘍へと形質転換する分子機構を明らかにしたい。平成30年度が最終年度であるため、記入しない。
大腸癌細胞の生化学・分子薬理学的特性の系統的解析とその理論に立脚した新治療法の開発

進行大腸癌に対する標準的な化学療法は確立されていない。そこでヒト大腸癌細胞樹立株の生物学・生化学・分子薬理的特性を分子生物学的、細胞工学的手法を用いて系統的に解析をすすめ、薬剤感受性、耐性との関連性を有機的に解明し、併せて臨床サンプルにおいても同様の検討をすすめることから得られる知見に立脚した新しい治療戦略を開発することが本プロジェクトの目標である。薬池療法の主軸はフッ化ピリミジン系抗癌剤であることから、平成4年度はヒト大腸癌細胞7株を用いて感受性決定要因及び耐性因子を総括的に解析した。すなわち薬剤感受性には、Thymidylate synthase(TS)の酵素阻害が最も重要であり、また核酸(特にRNA)への取り込みも有意の相関が認められた。そしてこの背景には、抗腫瘍活性を有するヌクレオチド、特に5-fluorodeoxyuridine 5'-monophosphate(FdUMP)と5-fluorouridine 5'-triphosphate(FUTP)の産生量の多寡が重要であった。このことは代謝酵素の活性特性に起因していることが示唆された。すなわちフッ化ピリミジン系薬剤耐性株においては、同化酵素活性は低値であり、このためFdUMP,FUTP等の活性ヌクレオチドの生成が不充分であった。この結果、核酸への転入は相対的に少なく、またTS阻害も不充分となり、殺細胞効果の減弱、ひいては耐性化へとつながった。以上のin vitroの検討よりフッ化ピリミジン耐性に関与する2大要因が示唆された。一方臨床サンプルを用いての予備的検討では、大腸癌組織と正常粘膜とにおけるピリミジン代謝酵素活性の分析を試みた。TSに関しては癌と正常組織間に酵素量、酵素活性ともに有意差は認めなかったが、thymidine/uridine kinase,thymidine/uridine phospholylase,oroticphosphorybosil transferase等では有意差を認めた。癌化とピリミジン代謝酵素活性の増強相関について次年度は、細胞株を用いて検討をすすめる予定である。
グルタチオンはβ-細胞の機能をどのように制御するか

活性酸素は生体を障害する因子であり、細胞の情報伝達の担い手である。活性酸素を消去する抗酸化機構は活性酸素を消去することによって恒常的に細胞の生理機能を維持している。グルタチオン(GSH)はこの抗酸化分子の中心をなす。更にレドックス制御を介して細胞の情報伝達を調節している。本研究は膵β細胞の機能調節に及ぼすGSHの役割を明らかにすることを目的としている。本年度は次の2点について検討を加え新しい知見を得た。(1)膵β-細胞の特徴はGSH濃度が低く保たれていることである。γ-グルタミルシステイン合成酵素(γ-GCS)はGSH合成の律速酵素である。活性基を有するγ-GCSheavy subunitと調節サブユニットのlight subunitの各々に対するアンチセンスヌクレオチドをハンマーヘッドリボザイムに結合させて、マウス膵β-細胞株MIN-6に導入し、GSH合成低下がβ-細胞の機能に及ぼす影響を検討した。b)GSHの持続的低下によって、MIN-6細胞でのインスリン分泌の亢進が認められた。c)GSH低下でβ-細胞内のCa^<2+>濃度の上昇が認められ、このことがインスリン分泌亢進の一因であると思われた。d)プロインスリンのリポーター遺伝子を導入すると、リボザイムを用いたGSH低下は、プロモーター活性を上昇させることが明らかとなった。(2)MIN-6細胞を高濃度グルコース下で培養(27mM Glc)し正常(5.5mM Glc)と酸化ストレスに対する反応性を検討したところ、高Glc下にH_2O_2を負荷すると、P13-キナーゼ/Aktを介したアンチアポトーシスのカスケードが障害され、細胞傷害が強く生じることを明らかにした。GSH濃度を上昇させるとこの障害が改善したことから、GSH濃度のβ-細胞における抗酸化作用と情報伝達における重要性が示された。細胞内の還元力にグルタチオン(GSH)は重要な役割を果たしているが、β細胞ではGSH濃度が他の組織細胞に比較して約20%以下に低下している。しかし、なぜβ細胞が低いGSH濃度を保たなければならないのかは不明である。申請者は、GSHを低く維持することが外からの刺激に鋭敏に反応してインスリンを合成分泌させているβ細胞の戦略でないかと予想している。β細胞の機能、即ちインスリンの合成と分泌に及ぼすGSHのレドックス制御機構を明らかにすることは、糖尿病発症予防や治療法の開発にも大きな貢献をすると思われる。以上の観点より、初年度は以下の3点を具体的な到達目標とした。(1) β細胞においてGSHを維持する機構を、特にGSH合成の律速酵素、γ-グルタミルシステイン合成酵素(γ-GCS)の遺伝子発現の面から解析する。γ-GCS遺伝子のプロモーター領域をクローニングして、ルシフェラーゼベクターに組み込み、β細胞に導入してγ-GCS遺伝子発現調達の研究を行った。特にγ-GCSプロモーターは、酸化的ストレスに反応するエレメント、AP-1やSP-1の結合部位を有していることが明らかになった。TNF-αやIL-1βなどのサイトカイン刺激に対しては、NF-κBのDNA結合による転写活性が上昇していた。インスリン分泌を引起す高グルコースによってもγ-GCS遺伝子の発現誘導が認められたが、その転写調節領域は検討中である。(2) γ-GCS

heavy subunit(活性中心部位)とlight subunit(安定化部位)の遺伝子をクローニングして、そのアンチセンスcDNAの一部をリボザイムに結合させ、β細胞に導入してGSH合成を低下させる。その条件下で細胞の機能変化を解析する。β細胞に導入したγ-GCS遺伝子は、GSH濃度を約50%低下させ、細胞内還元力を変化させた。この結果インスリン分泌能は上昇し、同時に細胞内にカルシウム濃度上昇も認められた。(3)スルフォニルウレア剤やグルコースで促進されるインスリン合成と分泌に関与する細胞内情報伝達カスケードを解明する。GSHはプロテインキナーゼCやMAPK活性、更に転写因子の活性化に負の制御を与えると考えられる、β細胞においてそのGSHの役割を明らかにする。GSH負荷によって細胞内情報伝達機構が負の制御を引起すことを明らかにした。このGSHのインスリン合成分泌作用に及ぼす役割を検討中である。活性酸素は生体を障害する因子であり、細胞の情報伝達の担い手である。活性酸素を消去する抗酸化機構は活性酸素を消去することによって恒常的に細胞の生理機能を維持している。グルタチオン(GSH)はこの抗酸化分子の中心をなす。更にレドックス制御を介して細胞の情報伝達を調節している。本研究は膵β細胞の機能調節に及ぼすGSHの役割を明らかにすることを目的としている。本年度は次の3点について検討を加え新しい知見を得た。(1)GSH合成の律速酵素γ-グルタミルシステイン合成酵素(γ-GCS)遺伝子の解析。前年度の活性部位を有する重鎖の解析に加えて、活性を調節する軽鎖のcDNAを調製して両鎖の発現をNorthern blotsで測定した。その結果、多くの酸化的ストレスに反応して両鎖の遺伝子発現が同時に起こることを明らかにした。次に、両鎖遺伝子のプロモーター領域の解析を行っている。即ち、両鎖の転写調節領域には、酸化的ストレスに反応する、TRE,MRE,AP-1,AP-2,SP-1,NF-κB等の結合部位を有していることを明らかにした。(2)膵β細胞株MIN-6にγ-GCS重鎖のアンチセンスCDNAをリボザイムに結合させた構築物を導入して、持続的にGSH濃度を約50%に低下させる新しい細胞株を樹立した。前年度明らかにした低GSH下でのインスリン分泌増加の機構を更にATP合成の面から検討した。(3)膵β細胞株β-TCに酸化的ストレスを加えると、低GSH下でも活性酸素を消去する機構が働く。その役割を担う新しい分子の同定を進めるとともに、GSHとの関連性を検討している。本年度は次の2点について検討を加え新しい知見を得た。(1)膵β-細胞の特徴はGSH濃度が低く保たれていることである。γ-グルタミルシステイン合成酵素
「伝えあい保育」の理論と実践における人間観・社会観の関連に関する思想史的研究

保育問題研究会が主導した保育理論・実践の相対である「伝えあい保育」の理論的・実践的遺産について、個別の論者の事例に即して検討した。具体的には、斎藤公子の「リズムあそび」における集団保育の思想、高橋さやかの児童文学教育論を検討の俎上に載せた。加えて、保育問題研究会の会員でありながら、直接的には伝えあい保育を標榜しなかったものの、保育構造論という形で集団保育の意義づけを検討した大場牧夫の保育カリキュラム論における人間関係論も検討を行った。これら3者のうち、斎藤、高橋に関する研究成果については、学会における口頭での研究発表を経て論文化され、既に投稿済みである。大場の保育思想に関しても、学際的な研究会における研究発表を経て、論文2報として投稿済み(1本は既刊、2本目は査読を通過し印刷中である)。これら三者の保育思想・理論的検討は、わが国においてはほとんど初の試みであり、その学問的意義は大きい。特に、伝えあい保育の理論的前提としてのクルプスカヤ、ヴィゴツキー、マカレンコら、ロシア系の教育理論の摂取の態様について、論者の事例に即しながら具体的に明らかにすることができたと考えられる。三者共に、保育思想を方法化する際には、規範化された子ども観に基づいた思索が行われていることが明らかになってきた。この、「伝えあい保育」の理論的・思想的前提としての子ども観に関する更なる検討、特にその思想的背景の追跡は、次年度以降の課題となる。本研究計画の核心ともいうべき、宍戸健夫の保育カリキュラム論は、本年度は本格的に検討することができなかった。宍戸の所論は、検討に多くの時間が費やされるべきことが予想されるため、研究の進捗具合の向上に努めたい。平成31年度においては、上記の宍戸健夫の保育カリキュラム論、および宍戸の盟友ともいうべき保育実践家の安部富士男の保育実践論、中沢和子の科学教育論の三つの保育理論を検討を進めていく予定である。既に、検討対象となるべき資料、文献の収集を開始しており、安部に関する研究成果は、8月の教育学会において発表できるよう鋭意努力中である。初年度である2017年度は、伝えあい保育の思想の発展過程を明らかにする最も初期の課題である、1960年代における保育思想の萌芽を対象として分析した。具体的には、1近藤薫樹の保育思想、2高橋さやかの保育思想、3斎藤公子の保育思想、保育実践について、3名の単行本を読解し、そこにおける保育思想の構造を摘出することを試みた。近藤薫樹は、動物学専攻という異色のバックグラウンドを活かしながら、人間論と保育論を接合した人間-保育論ともいうべき保育の存在論を提示した。高橋さやかは、古典的な児童文化財との対峙により、子どもは人間形成(倫理性の涵養を含む)を行うと考え、絵本・紙芝居を読む、そして読んだ絵本等についての子どもの創作活動を重視する、創作活動の成果について子ども同士、子どもと保育者の間でディスカッションを行うという三つの段階からなる独特の保育カリキュラム案を提示した。斎藤公子は、障碍児保育からキャリアをスタートさせ、進化論的生物学、生理学、脳科学、小児医学など、主に自然科学に属する研究成果を摂取して、子どもの成長・発達と人類史をオーバーラップさせる特異な保育実践論を展開した。この斎藤の保育実践論は、自然科学各分野の第一人者との対話の結果として形成されたものである。今年度取り入れた3名とも、子どもの集団の中における発達の重要性、および、集団の中における言葉を介したコミュニケーション力の涵養を重視している点が共通していることを明らかにしえた。本年度扱った3名のうち、近藤薫樹に関しては、関西教育学会、関東教育学会における研究発表でその成果を発表し、それを踏まえて、関西教育学会年報、神戸松蔭女子学院大学研究紀要に、近藤薫樹の保育思想の概略を示す原著論文を投稿した。後者については既に刊行済みであり、全者については2018年8月に刊行される予定である。重要な文献の収集・読解もおおむね順調に進捗していると考えられ、現在までの成果は来年度以降、続々と発表することを予定している。