hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
モデル動物と患者検体の比較解析によるHAMの病因・病態解明と新規治療法の開発

ヒトT細胞白血病ウイルス1型(Human T-cell leukemia virus type1:HTLV-1)関連脊髄症(HTLV-1 associated myelopathy:HAM)は、HTLV-1感染者の一部に発症する臓器特異的自己免疫疾患類似の病態を示す慢性炎症性疾患であるが、末梢血中に多種の自己抗体が高頻度に検出され、自己免疫疾患を含む他の炎症性疾患の合併例も多いため、従来よりHTLV-1感染CD4陽性Tリンパ球の機能的変化が宿主免疫系の異常をきたし、発症の原因となる可能性が指摘されている。本研究では、先行研究で作製したHAM類似の下肢対麻痺を自然発症する、ミエリンオリゴデンドロサイト糖タンパク質(myelin oligodendrocyte glycoprotein:MOG)特異的CD4陽性T細胞にHTLV-1の転写制御因子TaxまたはHBZを発現するTgマウスと患者検体を材料に、「HAMはHTLV-1の転写制御因子が自己抗原特異的T細胞の免疫寛容を破綻させ、慢性炎症を惹起することで発症する」という仮説を検証する。本年度は、以下の成果を得た。1テトラサイクリン遺伝子発現調節システムを用いてヒトCD4陽性T細胞にTaxまたはHBZを発現誘導し、多くの新規標的遺伝子を網羅的に同定した。特に、HBZが多種多様なnon-coding RNAを強力に発現誘導することをはじめて明らかにした。2同定した標的遺伝子の一部について、HAM患者の臨床検体を用いて発現動態を解析し、患者生体内で病態に伴って変動する多くの細胞性因子を見出した。3血清中の免疫複合体をProtein G固定化磁気ビーズで捕集後、還元/アルキル化とトリプシン処理した消化物をナノLC-MSシステムにより分析してデータベース検索することで、自己抗原候補を同定する実験系の構築を行った。テトラサイクリン応答プロモーターの下流に全長のTaxまたはHBZ遺伝子を組み込んだコンストラクトをCD4陽性T細胞株であるJurkat Tet-ON細胞に導入し、TaxまたはHBZの発現誘導前後で変動する遺伝子群をマイクロアレイで網羅的に解析した。その結果、HAM発症への関与が報告されているCXCL10を含め、多数のTax標的遺伝子の強力な発現誘導を確認できた。興味深いことに、この研究で新たに見出した未報告のTax標的遺伝子の中には、HAMの臨床病態の変化に伴って変動する細胞性因子が多数含まれており、その一部はHAM類似の下肢対麻痺を自然発症するTgマウスにおいて血中濃度が上昇していた。また、HBZにより強力に発現誘導される標的遺伝子として、多種多様なnon-coding RNAを同定した。これら標的遺伝子は、HAMの新規治療標的となりうる可能性があるため、HTLV-1感染細胞株や患者検体を用いた機能解析を進めていく予定である。一方、血清中の免疫複合体をProtein G固定化磁気ビーズで捕集後、還元/アルキル化とトリプシン処理した消化物を作製する実験系を構築した。今後は、ナノLC-MSシステムにより分析してデータベース検索することで、実際に自己抗原候補を同定することが可能かどうか検証する予定である。引き続き研究を遂行することで当初の目的を達成できるものと考えている。引き続きHTLV-1感染細胞株や患者検体を用いて、同定したTaxまたはHBZの新規標的遺伝子について、その病因的意義の検証を行う。HAM特異的自己抗体を同定するための実験系構築を進め、HAM病態マウスモデルおよび感染者の血清を用いて、未発症マウス群および無症候性HTLV-1キャリアー(Healthy Carrier: HC)群では検出されず、発症マウス群およびHAM群で高頻度に検出される自己抗原の同定を試みる。さらに、HAM群およびHC群で同定した自己抗体の有無と検出頻度を比較解析して、疾患バイオマーカーとしての意義を検証する。HAM発症におけるTCR特異性の意義を明らかにするため、次世代シーケンサーによるHAM患者CD4陽性T細胞の多様性解析(レパトア解析)を行い、同定した自己抗原でT細胞を刺激した際に増殖してくるレパトアと比較する。下肢麻痺を発症したHAMモデルマウスから病態関連T細胞候補と考えられるサブセットをセルソーターにより分離採取して、培養液中でMOGペプチドによる再刺激を行った後に野生型(C57BL6)マウスへ細胞移入する。細胞移入したマウスにMOGペプチド免疫によって脊髄炎を誘導し、次世代シーケンサーによるCD4陽性T細胞のレパトア解析を行う。マウスにおいて発症を増強する細胞群が同定できたら、ヒトにおける相同サブセットが実際のHAM患者およびHCにおいてどのような動態を示すか、臨床経過や病勢との関連はどうかについて解析する。さらに、各種薬剤、HTLV-1蛋白や細胞表面マーカーに対する抗体、核酸等による病態関連T細胞群制御の可能性についても検討する。以上、一連の解析を通して本研究の目的であるHAM発症作業仮説の検証と、HAMの新規診断法・治療法開発のための新規創薬シーズ・バイオマーカーの発見、将来の臨床応用に向けた研究基盤の構築を目指す。ヒトT細胞白血病ウイルス1型(Human T-cell leukemia virus type1:HTLV-1)関連脊髄症(HTLV-1 associated myelopathy:HAM)は、HTLV-1感染者の一部に発症する臓器特異的自己免疫疾患類似の病態を示す慢性炎症性疾患であるが、末梢血中に多種の自己抗体が高頻度に検出され、自己免疫疾患を含む他の炎症性疾患の合併例も多いため、従来よりHTLV-1感染CD

4陽性Tリンパ球の機能的変化が宿主免疫系の異常をきたし、発症の原因となる可能性が指摘されている。本研究では、先行研究で作製したHAM類似の下肢対麻痺を自然発症する、ミエリンオリゴデンドロサイト糖タンパク質(myelin oligodendrocyte glycoprotein:MOG)特異的CD4陽性T細胞にHTLV-1の転写制御因子TaxまたはHBZを発現するTgマウスと患者検体を材料に、「HAMはHTLV-1の転写制御因子が自己抗原特異的T細胞の免疫寛容を破綻させ、慢性炎症を惹起することで発症する」という仮説を検証する。本年度は、以下の成果を得た。1テトラサイクリン遺伝子発現調節システムを用いてヒトCD4陽性T細胞にTaxまたはHBZを発現誘導し、多くの新規標的遺伝子を網羅的に同定した。特に、HBZが多種多様なnon-coding RNAを強力に発現誘導することをはじめて明らかにした。2同定した標的遺伝子の一部について、HAM患者の臨床検体を用いて発現動態を解析し、患者生体内で病態に伴って変動する多くの細胞性因子を見出した。3血清中の免疫複合体をProtein G固定化磁気ビーズで捕集後、還元/アルキル化とトリプシン処理した消化物をナノLC-MSシステムにより分析してデータベース検索することで、自己抗原候補を同定する実験系の構築を行った。テトラサイクリン応答プロモーターの下流に全長のTaxまたはHBZ遺伝子を組み込んだコンストラクトをCD4陽性T細胞株であるJurkat Tet-ON細胞に導入し、TaxまたはHBZの発現誘導前後で変動する遺伝子群をマイクロアレイで網羅的に解析した。その結果、HAM発症への関与が報告されているCXCL10を含め、多数のTax標的遺伝子の強力な発現誘導を確認できた。興味深いことに、この研究で新たに見出した未報告のTax標的遺伝子の中には、HAMの臨床病態の変化に伴って変動する細胞性因子が多数含まれており、その一部はHAM類似の下肢対麻痺を自然発症するTgマウスにおいて血中濃度が上昇していた。また、HBZにより強力に発現誘導される標的遺伝子として、多種多様なnon-coding RNAを同定した。これら標的遺伝子は、HAMの新規治療標的となりうる可能性があるため、HTLV-1感染細胞株や患者検体を用いた機能解析を進めていく予定である。一方、血清中の免疫複合体をProtein G固定化磁気ビーズで捕集後、還元/アルキル化とトリプシン処理した消化物を作製する実験系を構築した。今後は、ナノLC-MSシステムにより分析してデータベース検索することで、実際に自己抗原候補を同定することが可能かどうか検証する予定である。引き続き研究を遂行することで当初の目的を達成できるものと考えている。引き続きHTLV-
マキシマムエントロピー法による超イオン伝導体の非調和熱振動とイオンの拡散の研究

本研究は、情報理論に基礎を置くマキシマムエントロピー法を用いて、中性子回折データから非調和熱振動の様子を視覚化し、そのポテンシャルパラメータを決定することを目的とした。本年度の研究では、ルチル構造のTiO_2とペロブスカイト構造のCsPbCl_3の解析を行った。TiO_2については、室温に於いても酸素原子に三次の非調和性が見いだされ、熱振動分布が大きく歪んでいることを視覚的に明らかにした。この成果は、昨年十月に仙台で行われた国際中性子散乱会議(ICNS ́94)で発表を行い、Acta Cryst A誌上(項目11参照)にも論文発表を行った。CsPbCl_3は321Kで構造相転移を起こすことが知られているが、相転移点近傍から高温(621K)のデータを解析した結果、転移点付近では熱振動ポテンシャルが異常な振る舞いを示していることを明らかにした。現在この異常性が何に起因するかを検討研究中である。今後は、この解析法を応用し、熱振動の異常性に関与する物性メカニズムの解明に役立てたいと考えている。
HIV-1感染細胞特異的遺伝子導入法の開発に関する研究。

HIV-1感染細胞特異的遺伝子導入のためのレトロウイルスベクター開発を目的として、HIV-1レセプターであるヒトCD4とエコトロピック・フレンドマウス白血病ウイルス(FMLV)エンベロープ(Env)とのキメラ蛋白(CD4-Env)を作成し、このCD4-Envをウイルス表面に有するハイブリッドMLVベクターを産生ずるパッケージ細胞を得た。このハイブリッドMLVベクターは、HIV-Env発現細胞に特異的に結合したが、その細胞への侵入効率は低かった。そこで、レトロウイルスが標的細胞に侵入する際の、Envとレセプターとの相互作用を介する細胞膜融合機構を解析した。この膜融合は、「レセプターとの結合過程」およびそれに引き続く「結合後膜融合過程」の2つのステップに分けられ、Envが細胞表面上のレセプターと結合することにより立体構造変化を生じ結合後膜融合過程が進行すると考えられている。レセプター結合能を有するが結合後膜融合能を欠くFMLVEnvのTM変異体と、FMLVレセプターへの結合能を欠くCD4-Envとの共発現により細胞膜融合が生じたことから、FMLVEnvのレセプターへの結合が、CD4-Envによる結合後膜融合を誘発しうることが示された。さらに、アンホトロピックMLV(AMLV)EnvのAMLVレセブターへの結合も、CD4-Envによる結合後膜融合を誘発しうることが明らかとなった。CD4-Envによる結合後膜融合が、FMLVEnv-レセプター間相互作用だけでなく、別のEnv-レセプター間相互作用によっても誘発されたことにより、標的細胞特異的遺伝子導入のための、新しいリリガンド-レセプタ一間相互作用辷よる結合後膜融合過程誘導の可能性が示唆された。1 HIV-1感染細胞特異的遺伝子導入法の開発を目的としたレトロウイルスベクター作成を試みた。我々はこれまで、HIV-1レセプターであるヒトCD4とマウス白血病ウイルス(MLV)エンベロープ(Env)とのキメラ蛋白(CD4-Env)を作成したが、このCD4-Env発現ベクターDNAを、MLVを基にしたパッケージ細胞に遺伝子導入し、CD4-Envをウイルス表面に有するハイブリッドMLVベクターを産生するパッケージ細胞を作成した。この培養上清を用いて、HIV-1を発現するヒトHeLa細胞への特異的遺伝子導入を行ったが、導入効率は非常に低かった。2この特異的遺伝子導入効率の改善を目的として、レトロウイルスベクターが標的細胞に侵入する際の細胞膜融合機構を解析した。EnvとMLVレセプターとの相互作用を介する膜融合は、「レセプターとの結合過程」およびそれに引き続く「結合後膜融合過程」の2つのステップに分けられ、Env細胞外サブユニット(SU)が細胞表面上の「レセプターと結合」することにより、Env膜貫通サブユニット(TM)の立体構造変化が生じ「結合後膜融合過程」が進行すると考えられている。そこで、「レセプター結合能」は有するが「結合後膜融合能」を欠くEnvのTM変異体を作成し、「レセプター結合能」を欠くCD4-Envと共発現させたところ細胞膜融合が生じた。よって、CD4-Envは「結合後膜融合能」を有することが明らかとなった。HIV-1感染細胞特異的遺伝子導入においては、CD-4-EnvとHIV-1Envとの相互作用による膜融合が必要であるが、以上の結果から、CD4-Envは「HIV-1Envとの結合能」および「結合後膜融合能」の両方とも有するにかかわらず、CD4のHIV-1Envとの結合がTMの立体構造変化を正しく引き起こさないため、膜融合を効率よく生じないことが示された。
精子受精能と細胞内カルシウムについての研究

hyperactivationはcapacitationの完了によりおこり、acrosome reactionとともに精子の受精能獲得のために必要な変化である。hyperactivated spermの比率を測定し、プロゲステロン添加後の[Ca^<2+>]iの変化との関係について検討した。また、精漿添加による精子[Ca^<2+>]iの上昇とmotility、hyperactivation、acrosome reactionとの関係について検討した。hyperactivated spermの比率をBurkmanの基準の平均値により二群に分けたところ、プロゲステロン添加によるbaselineからpeakまでおよびbaselineからplateauまでの[Ca^<2+>]iの増加率はともにhyperactivated sperm高値群で高かった。精漿添加によりbaselineからpeakまでの精子[Ca^<2+>]iの増加率およびbaselineからplateauまでの増加率は用量依存性に上昇した。また、精漿添加によりacrosome reactionは用量依存性に増加した。capacitationの過程で精子が受精能を獲得する現象は、精子[Ca^<2+>]iの反応性が増加することにより、hyperactivationやacrosome reactionが増加することが関与していると思われる。また、swim upで精漿を除去後に精漿を添加したことによりacrosome reactionは上昇したことにより精漿除去がcapacitationを促進したと考えられるが、精漿そのものにも精子受精能を高める可能性がある。1.プロゲステロン添加による精子細胞内カルシウムイオン濃度([Ca^<2+>]i)の変化とhyperactivationとの関係Hyperactivationはcapacitationの完了によりおこり、精子の受精能獲得のために必要な変化である。capacitationもacrosome reactionと同様に[Ca^<2+>]iの変化が関係しているといわれている。今回、hyperactivated spermの比率を測定し、プロゲステロン添加後の[Ca^<2+>]iの変化との関係について検討した。swim up後の精子についてhyperactivated spermの比率をBurkmanの基準の平均値(6.92%)により二群に分けたところ、プロゲステロン添加によるbaselineからpeakまでの[Ca^<2+>]iの増加率はhyperactivated sperm高値群(n=20)では348±204(M±S.D.)%、低値群(n=29)では275±398%で高値群で高かった(p=0.016)。また、baselineからplateauまでの[Ca^<2+>]iの増加率はhyperactivated sperm高値群(n=20)では184±153%、低値群(n=29)では95±107%で高値群で高かった(p=0.003)(Mann-WhitneyのU検定)。以上の結果よりプロゲステロンによる精子[Ca^<2+>]iの上昇はhyperactivationを多く起こした精子群で高かったと結論された。1)精子へのCa^<2+>流入は受精に必須とされており、電位依存性Ca^<2+>チャネルはこのCa^<2+>流入経路として重要である。なかでもCav2.3(α1E)チャネルは哺乳類の雄性生殖細胞に発現しており、以前は精母細胞の低閾値活性型電流に関与する可能性が考えられていたが、我々はノックアウトマウスの一次精母細胞を用いた電気生理学的検討を行い、この可能性は否定した。むしろ、その局在から、先体反応、受精能獲得、運動性などに関与する可能性がクローズアップされつつある。我々はこのチャネル機能を調べるために、ノックアウトマウスを用いて雄性生殖細胞におけるCav2.3チャネルの機能を解析し、透明帯の代替えとしてしばしぱ用いられるmannose-BSAにより引き起こされる頭部のCa^<2+>上昇および精子運動性にこのチャネルが関与していることをはじめて明らかにした。2)hyperactivationはcapacitationの完了によりおこり、精子の受精能獲得のために必要な変化である。我々はhyperactivated spermの比率を測定し、プロゲステロン添加後の[Ca^<2+>]iの変化との関係について検討した。

18時間培養後の精子についてhyperactivated spermの比率をBurkmanの基準の平均値(6.92%)により二群に分けたところ、プロゲステロン添加によるbaselineからpeakまでの[Ca^<2+>]iの増加率はhyperactivated sperm高値群(n=20)では348±204(M±S.D.)%、低値群(n=29)では275±398%で高値群で高かった。【目的】私達はプロゲステロンによる精子[Ca2+]iの反応性はcapacitationにより増加すること、精子[Ca2+]iの上昇はhyperactivationを多く起こした精子群で高いことを報告した。今回、各濃度のプロゲステロン添加による精子[Ca2+]iの上昇とhyperactivation、acrosome reacrionの関係について検討した。【成績】1.hyperactivated spermの比率はswim up直後よりも18時間培養後で高かった。18時間培養後ではプロゲステロンにより用量依存性にhyperactivated spermの比率は増加した。2.プロゲステロン添加によりbaselineからpeakまでの精子[Ca2+]iの増加率およびbaselineからplateauまでの増加率は用量依存性に上昇した。3.先体反応率はswim up直後よりも18時間培養後で高かった。swim up直後および18時間培養後いずれでもプロゲステロンにより用量依存性に先体反応率は増加した。【結論】Capacitationの過程で精子が受精能を獲得する現象は、精子[Ca2+]iの反応性が増加することにより、hyperactivationやacrosome reactionが増加することが関与していると思われる。【目的】私達はプロゲステロンによる精子[Ca^<2+>]_iの反応性はcapacitationにより増加すること、精子[Ca^<2+>]_iの上昇とhyperactivationに相関があることを報告した。今回、精漿添加による精子[Ca^<2+>]_iの上昇とmotility, hyperactivation、先体反応の関係について検討した。【成績】1.hyperactivated spermの比率は10%精漿添加によりswim up後では上昇し、18時間培養後では低下した。
甲状腺腫瘍の分子生物学的研究

ラット癌化甲状腺細胞株(FRTL-Tc)cDNAライブラリーよりクローニングしたcDNAであるclone140(C140)に対応するmRNAの発現は、ラット正常甲状腺細胞株(FRTL細胞)に比して、FRTL-Tc細胞において、5.8倍の発現量を認めた。われわれは、このC140をプローブとして用い、Northen blot法により、各種ヒト甲状腺組織において、C140に対応するmRNAの発現について検討を加えた。使用した組織は、手術時に得られたヒト甲状腺癌、甲状腺腺腫、およびその周囲の正常甲状腺組織、加えてGraves'diseaseの甲状腺組織を用い検討した。その結果、C140に対応するmRNAの発現は、正常甲状腺組織においてはほとんどの検体において認められなかったのに対して、甲状腺癌、甲状腺腺腫、Graves'diseaseの甲状腺組織においては、全例にその発現を認め、とりわけ甲状腺癌において発現量が著増を示していた。これに対して、コントロールとしたbeta-actin,mRNAの発現量は、各種甲状腺組織において発現量に有為な差を認めなかった。以上の事実は、C140遺伝子の発現が甲状腺組織の増殖において重要な働きを担っていることを示唆するものであり、今後C140蛋白の機能についてさらに検討を要するものと考えられた。
超薄壁多孔体としてのナノ配位空間における流体相挙動の特異性検討

配位空間は,通常の多孔体の対極とも言うべき「空間の中に薄い壁or柱が発達した」構造を持ち,また壁は原子オーダーで極めて薄い。従って,ある細孔空間内の分子が,壁を隔てた隣接する細孔内分子の相互作用を感じることが可能と思われ,一般的な多孔体内部での相挙動の理解とは異なる特異性が生じ得る。本研究は,このような配位空間内での相挙動の特異性に着目し,分子シミュレーションによる現象把握と,その機序解明を目指すものである。1.配位空間の超薄壁多孔体としてのモデル構築ナノ配位空間の本質的な特徴を見出すべく,錯体の詳細な原子構造には拘泥せずに,現実系の特徴を踏まえた単純な空間として2次元正方格子型の錯体がスタックした1次元チャンネル群を第一のモデルとし,平衡バルク相状態を設定可能なGCMC法により,Lennard-Jones流体の相挙動を検討した。2.特異性検討グラファイト面相当の壁に囲まれた約4分子ほどの有効空間(4.7σ)内のLJメタンは,185K付近という,バルク流体の臨界温度に相当する極めて高い温度で,固体相当の密度を示した。このような非等法的な分子集団についても,我々は各チャンネル内での二体相関を得ることに成功し,185K付近の構造は,さらに高温での液体的状態とは明確に異なり,六方配置構造をとっていることを明らかにした。このような極めて高温での固化は,第一には狭隘空間ゆえのポテンシャルの重畳に起因すると思われるが,第二には,壁を越えた分子間の相互作用も顕著な寄与を与えていること,さらに,第三の効果として,二方向に制限壁があることによる移動度の低減が寄与している可能性が示唆された。1年での検討ですでに極めて特異な相挙動が見出されており,今後のさらなる知見の蓄積による,現象把握の深化,モデル化を経て,配位空間応用のための基礎知見の充実が大いに期待されると考える。
1910-20年代ヨーロッパ前衛芸術とモードの交流:ソニア・ドローネーの服飾芸術

本年度は、昨年3月に提出した博士論文に基づき、アール・デコ期のデザインと同時代の女性表象の関係性という新たな課題に着手した。2008年7月に開催されたデザイン史学研究会の研究発表会では、1920年代に衣服制作を展開した画家のソニア・ドローネーのテキスタイル・デザインに注目し、そこに見出される幾何学模様が、その視覚作用によって、曲線と共に強調されてきた女性身体を、平らで直線的な身体に作り変えるものであったことを指摘した。また、彼女が幾何学的形態と色彩によって、新しい女性身体の創造を試みていたことを、彼女の一連の制作活動をたどる中、検証した。9月のパリ出張では、メゾン・エルメスのアーカイブ責任者のメネウル・ドゥ・シャテル氏を訪問し、1920年代にソニア・ドローネーがエルメスのために手がけたポスターや装飾品などについて意見交換を行った。その中で、エルメスが馬具や鞄の専門店という地位を固める一方で、同時代の前衛芸術にも目を向けた革新的な商品展開を試みていたことが明らかになった。またそれとは別に、博士論文の調査の中で見出した、1925年にパリで開催されたアール・デコ展開催時のエルメスの展示スタンドの写真を提供したところ、そこで使われていた家具の一部が1980年代中頃までパリのエルメス本店で実際に使われていたものと同じデザインであったことが判明した。さらにパリ出張では、ダダ研究で著名なマルク・ダーシー氏と面会し、ソニア・ドローネーが1920年代初頭に友人の前衛詩人たちと共同で制作した「ローブ・ポエム(詩-ドレス)」について意見交換を行った。本年度は、テーマの拡充を図り、ソニア・ドローネーと同時代にパリのモード界で活躍した服飾デザイナーのポール・ポワレに関する研究にも着手した。2007年5月20日に開催された服飾文化学会大会では、1925年にパリで開催されたアール・デコ展でポワレが行った展示について口頭発表を行い、これまで主にモード界での仕事が評価されてきたこのデザイナーが、20世紀初頭の装飾芸術振興運動にも貢献していたことを指摘した。また、パリ市立ガリエラ美術館で開催された「狂乱の時代1919-29年」展(2007年10月17日2008年2月28日迄)図録に、アール・デコ展におけるドローネーとポワレに関する論考を2本発表した。その中で、同博覧会におけるふたりの展示を、モードと芸術という二つの観点から読み解き、画家、あるいは服飾デザイナーという肩書きに収まらない彼らの特異な位置付けについて検証した。10月のパリ出張では、フランス前衛映画研究の衣装と装飾の研究で知られるミレイユ・ボーリウ氏と会見し、ドローネーが1926年に参加した2本の映画に関する資料や、前衛映画研究の現状についての意見交換を行った。また、パリ出張では、ドローネー・コレクションを有すフランス国立図書館およびポンピドゥー・センターで資料調査も実施した。これらの調査に基づき、ドローネーが1924年のサロン・ドートンヌに出展したブティックと、1927年に販売した既製服「ティッシュ・パトロン(型紙-布)」に関する論考を完成させた。そして、これまでの研究成果を「ソニア・ドローネーの服飾芸術-1910-20年代ヨーロッパ前衛芸術とモードの交流」と題する博士論文にまとめ提出し、2008年3月に博士の学位(人文科学)を取得した。
ラット神経細胞およびグリア細胞に対する亜鉛および他微量元素の作用に関する研究

平成16-17年度における本研究では、程度の異なる亜鉛欠乏ラットを用いた組織学的検討を行い、三叉神経舌枝有髄神経線維髄鞘の厚さと軸策の太さを比較した。その結果、重篤な亜鉛欠乏ラットでは、コントロール(亜鉛添加食をペアフィーディングさせた)ラットに比べて、三叉神経舌枝有髄神経線維髄鞘の厚さは有意に薄く、軸策の太さは有意に細いことが示された。また、潜在的亜鉛欠乏ラットの髄鞘の厚さと軸策の太さは、重篤な亜鉛欠乏ラットとコントロールラットの中間の値であり、髄鞘の厚さと軸策の太さは食餌中亜鉛含量に依存していることが明らかとなった。これらの結果から、亜鉛は髄鞘形成に関与する可能性が示唆される。グリア細胞(神経膠細胞)は、神経細胞の周囲で神経細胞を保護していることが知られている。そこで本研究では、ラットグリア細胞由来のC6細胞を用い、亜鉛および他微量元素がC6細胞に及ぼす影響を明らかにすることを目的とした。C6細胞(細胞培養用に樹立された神経膠腫の細胞株)は、ラット脳由来の星状膠腫(アストロサイトーマ)で、継代可能な細胞株である。正常のアストログリア(星状膠細胞)の細胞形質を保持し、細胞内にはS-100タンパク質、グリア細胞繊維性酸性タンパク質(GFAP)を多量に発現し、細胞膜表面には各種神経伝達物質受容体をもち、細胞内情報伝達系としてGTP結合タンパク質、アデニル酸シクラーゼ、グルココルチコイド受容体などが存在すると報告されている。そこで本研究では、培地(Ham'sF-10培地)中の亜鉛含量を変化させ、新位相差型培養倒立顕微鏡(平成16年度科研費補助金にて購i入)にて、C6細胞の増殖の様子を詳細に観察した。C6細胞は線維芽細胞様であり、核、明るい細胞質、多数の突起(紡錘形)が観察された。紡錘形突起が細長く伸びる様子、および伸長速度は、培地への亜鉛添加の程度に影響を受けることが観察された。初代培養したグリア細胞を用い、亜鉛および他微量元素がグリア細胞に及ぼす影響について、更に検討する必要があると考えている。亜鉛は必須微量元素の一つであり、人における潜在的欠乏症としては味覚障害が知られている。食生活の乱れや欧米化(微量元素を多く含む食材の減少)、化学肥料過剰投入(農作物中微量元素の減少)、高齢化や生活習慣病に伴う服薬(微量元素の吸収阻害)などにより、こうした微量元素の潜在的欠乏が増加している。申請者らは亜鉛欠乏(味覚障害)ラットを用いた神経生理学的研究により、亜鉛欠乏が末梢での味受容能を低下させることを明らかにした。亜鉛は海馬に高濃度に含まれ、神経伝達物質放出を調節する作用が明らかにされている。しかし神経細胞やダリア細胞(特に髄鞘形成に関与するオリゴデンドロサイトやシュワン細胞)に対する亜鉛の作用については、不明な点が多い。そこで本研究では、神経細胞およびダリア細胞に対する亜鉛の作用を明らかにすることを目的とし、ラットにおいて検討した。実験1では程度の異なる亜鉛欠乏ラットを作出し、三叉神経舌枝有髄神経線維の組織学的観察を行った。その結果、亜鉛欠乏(重篤な亜鉛欠乏)ラットの三叉神経舌枝有髄神経線維髄鞘の厚さは、コントロールラットに比べて有意に薄かった。低亜鉛(潜在的亜鉛欠乏)ラットでは、亜鉛欠乏ラットとコントロールラットの中間の厚さであり、髄鞘の厚さは食餌中亜鉛含量に依存していることが示唆された。そこで実験2では、ラットダリア細胞に対する亜鉛および他微量元素の作用を検討することを目的とした。ラット胎児(胎生17日)大脳由来のダリア細胞を、購入したCO、インキュベーター(UVランプ付)を用いて培養し、亜鉛および他微量元素が及ぼす影響について、新位相差セットを備えた培養倒立顕微鏡にて観察した。申請者らは亜鉛欠乏(味覚障害)ラットを用いた神経生理学的研究により、亜鉛欠乏が末梢での味受容能を低下させることを明らかにしてきた。しかし、神経細胞やグリア細胞(特に髄鞘形成に関与するオリゴデンドロサイトやシュワン細胞)に対する亜鉛の作用については不明な点が多い。申請者は平成16年度の本研究において、程度の異なる亜鉛欠乏ラットを作出し、亜鉛欠乏ラットの三叉神経舌枝有髄神経線維髄鞘の厚さがコントロール(亜鉛添加食、Pair-fed)ラットに比べて有意に薄いこと、低亜鉛(潜在的亜鉛欠乏)ラットの三叉神経舌枝有髄神経線維髄鞘の厚さは亜鉛欠乏ラットとコントロールラットの中間の厚さである(髄鞘の厚さが食餌中亜鉛含量に依存している)ことを観察した。そこで本研究では、ラット神経細胞およびグリア細胞に対する亜鉛の作用を明らかにすることを目的とした。ラットグリア細胞(S100プロテイン産生)由来C6細胞、ラット副腎褐色細胞腫由来PC-12細胞、ラット肝由来BRL-3A細胞、ラット(胎生17日)

大脳皮質由来CX(R)細胞に対する亜鉛および他微量元素の作用を明らかにするため、継代培養法について検討した。その結果、安定して継代培養できるようになり、適する培地組成や添加刺激条件などが得られた。現在、さらに検討を進めている。平成16-17年度における本研究では、程度の異なる亜鉛欠乏ラットを用いた組織学的検討を行い、三叉神経舌枝有髄神経線維髄鞘の厚さと軸策の太さを比較した。その結果、重篤な亜鉛欠乏ラットでは、コントロール(亜鉛添加食をペアフィーディングさせた)ラットに比べて、三叉神経舌枝有髄神経線維髄鞘の厚さは有意に薄く、軸策の太さは有意に細いことが示された。また、潜在的亜鉛欠乏ラットの髄鞘の厚さと軸策の太さは、重篤な亜鉛欠乏ラットとコントロールラットの中間の値であり、髄鞘の厚さと軸策の太さは食餌中亜鉛含量に依存していることが明らかとなった。これらの結果から、亜鉛は髄鞘形成に関与する可能性が示唆される。グリア細胞(神経膠細胞)は、神経細胞の周囲で神経細胞を保護していることが知られている。そこで本研究では、ラットグリア細胞由来のC6細胞を用い、亜鉛および他微量元素がC6細胞に及ぼす影響を明らかにすることを目的とした。C6細胞(細胞培養用に樹立された神経膠腫の細胞株)は、ラット脳由来の星状膠腫(アストロサイトーマ)で、継代可能な細胞株である。正常のアストログリア(星状膠細胞)の細胞形質を保持し、細胞内にはS-100タンパク質、グリア細胞繊維性酸性タンパク質(GFAP)を多量に発現し、細胞膜表面には各種神経伝達物質受容体をもち、細胞内情報伝達系としてGTP結合タンパク質、アデニル酸シクラーゼ、グルココルチコイド受容体などが存在すると報告されている。そこで本研究では、培地(Ham'sF-10培地)中の亜鉛含量を変化させ、新位相差型培養倒立顕微鏡(平成16年度科研費補助金にて購i入)にて、C6細胞の増殖の様子を詳細に観察した。C6細胞は線維芽細胞様であり、核、明るい細胞質、多数の突起(紡錘形)が観察された。紡錘形突起が細長く伸びる様子、および伸長速度は、培地への亜鉛添加の程度に影響を受けることが観察された。初代培養したグリア細胞を用い、亜鉛および他微量元素がグリア細胞に及ぼす影響について、更に検討する必要があると考えている。
lpr及びaly突然変異遺伝子の機能の解析:新しい方法論の確立に向けて

【研究成績1】lpr変異遺伝子によるリンパ節腫大移入モデルの応用この実験系の原型([lpr-BM->5Gy-MRL/+]+lpr-LN)において、Thy1コンジェニックマウスを用いても結果には差がないこと、即ち、Thyl alleleはlpr遺伝子の効果発現に影響しないことを踏まえて、Thy1コルジェニックMRL/lpr及びMRL/+マウスを可及的に利用した。そして、以下に列挙する成績を得た。・著明に腫大するリンパ節グラフトに集積する細胞は移植骨髄に由来する。・宿主由来のTリンパ球は、胸腺中にごく僅かに残存する。・放射線照射は必須である。しかし、照射線量は2Gyでも十分である。・lpr骨髄の移植はリンパ節グラフトの腫大には必須ではない。・lpr骨髄の移植はlpr-GvHDには必須である。・リンパ節の移植は、腎被膜下でも鼠径部皮下でも同様に腫大する。・原型実験において、骨髄ドナー、リンパ節ドナー、宿主の週齢による著明な差はないこれらの基本的な成績に則って、更に2変数を同時に変化させる予備的な実験も並列して行った。その結果、lpr骨髄の移植を加えない実験系で、lpr由来LNグラフトの週齢がその腫大の程度に署明な影響を及ぼすことを示唆する結果を得た。現在、この点の確認を行っている。【研究成績2】ALYマウスALYマウスそのもの、及び骨髄移植を応用した研究により、変異aly遺伝子の効果発現の場に関して若干の知見を得た。変異aly遺伝子の効果は(1)リンパ節環境細胞、(2)Bリンパ球系造血前駆細胞、(3)骨髄造血環境細胞、等で発現されること、即ち、正常動物ではそれらの多彩な細胞が正常aly遺伝子機能を必要としていることが強く示唆された。〔研究成績3〕T1-Tリンパ球。一連の研究を通じて、その副産物として、B1aリンパ球に相当すると推定されるT1リンパ球とも呼ぶべきTリンパ球亜集団の存在が強く示唆された。これは非常に重要な点であるので、十分な追試確認が必要である。
局所的パターン形成機構をもつパターン形成問題とノイズに関する数理的研究

本研究では、パターン形成が移動する局所的な場所においてなされ、それが定着するという特徴を持つ系を扱った。そのようなパターン形成の例としてはリーゼガング型沈殿現象が有名である。リーゼガング型沈殿現象については、ゲルの濃度や性質によって最終パターンが異なる事が知られており、その数理的な理解は自己組織化機構のコントロールに繋がると期待されている。本研究では、シミュレーションを中心とした研究を行い、システムに加わるノイズと最終パターンの関係を見た。数理的な解析を目指した縮約に関しては残念ながらよい成果が得られていないが、シミュレーションから得られた示唆を元に今後の発展が期待される。本年度は昨年度に構築したGPGPUシミュレーション環境を活用し,3次元沈殿系のシミュレーション解析を中心とした研究を推進した。2次元領域における,沈殿系の核形成の頻度と最終パターンの関係は,前年度のシミュレーション解析によって明らかになっているが,3次元への拡張においてはテクニカルな問題が生じた。具体的にはGPGPU計算において,3次元計算領域を記憶する必要があるが,1台のGPGPUボード上のローカルメモリを超える記憶容量が必要となり,工夫無しにはGPGPU計算の高速性を発揮することができず,複数のGPGPUボードを用いた並列化等の施策が必要となる。本年度は,特に3次元計算に向けた並列化に関して,複数のGPGPUボードを用いた並列化を行った。これは,本研究内容に特化したものではなく,他の反応拡散系におけるシミュレーション解析にも適応可能である。また,本研究の付加的な成果として,反応拡散系の持つ自己組織化機構を応用した自動メッシュ生成手法を提案し,論文公表を行った。これは,本研究においても中心的なテーマである自己組織化機構の解明に向けた研究成果を,シミュレーション等で利用するメッシュの生成に応用したものであり,これまでに無いものである。生成されたメッシュに関しては,複数の指標で評価され,既存の方法に比べて良好な性能を持つものであると確認された。今後,シミュレーション分野において活用されるものと期待しており,本研究のシミュレーションにおいても活用する予定である。本年度は、初年度に導入したGPGPUシミュレーション環境にGPGPUボードを増設することから、より大きな計算を可能とする環境を確保し局所的パターン形成機構を持つ3次元沈殿系のシミュレーション解析を行った。また、実験的なアプローチをより進めるために、実験を専門とする共同研究者を海外から招聘し、実験のノウハウ等を得た。それによって、シミュレーション的なアプローチに加えて、実験的なアプローチが可能となり、モデルと実現象の比較検討が容易になった。局所的パターン形成機構を持つパターン形成においては、限られた領域においてパターン形成が行われるため、計算領域をその形成領域の周辺に限ることが可能と考えられる。しかしながら、例えばリーゼガング型の沈殿現象においては境界条件は固定した上で、パターン形成領域が移動するため、その領域の切り抜きは容易ではない。当面は、比較的大きな計算領域の確保しシミュレーションを行うこととした。今後の研究においては、移動するパターン形成領域に追従した計算領域の確保による計算とその有効性の検証が求められ、そのことは理論的な解析の可能性を広げる事にもつながると考えられる。本研究においては、局所性を活かした理論的なアプローチを目指しているが、移動と共に維持されるパターン形成機構において、その状況が時々刻々と変わることが困難につながっている。比較的簡単な系においてはパターン形成を主となる反応系と従となる反応系に分離できると考えられるため、上記の様なシミュレーションをベースとした研究の発展によって、解析的なアプローチの可能性を示す事が重要となるが、一定の研究の方向性を得ることができた。またパターン形成におけるノイズの影響は本研究の主要なテーマの一つであるが、空間的なノイズである空間非一様性に関する実験とシミュレーションを組み合わせた新たな研究への発展が生じた。本年度は研究のスタートアップに向けた計算機環境の構築と、研究のベースとなるモデルの構築を行った。Liesegang型沈殿現象の基礎モデルは既に申請者等によって作成されているが、モデルに含まれるノイズ項に関して、その性質とパターンの関係について主に検証を行った。ノイズ項は、沈殿現象におけるランダムな核形成を表現しているが、核形成の原因としては主に二種類が考えられる。一つ目は、ゲル由来の核形成で、ゲル内の不純物や欠陥によるものと考えられる。二つ目は、コロイド粒子間衝突が原因となるものである。これらはそれぞれ、空間に固定されたノイズ項、時空間ノイズ項で表現できると考え、異なるノイズ項によって最終的なパターンがどのように変化するかを考察した。また、ノイズの種類によっても違いが見られるかについても検証を行った。結果として、Liesegang型沈殿現象において特徴的なパターンであるバンドパターンには、時空間ノイズが必要であり、空間固定のノイズではバンドパターンは生じ無い事が判明した。またノイズの種類については、生成パターンに大きな影響は与えないことも判明した。

現状、計算量の関係から全て2次元領域における検証であるが、実現象が3次元領域における問題である事から、本研究の3次元問題への拡張が必要となる。その為には、高速な計算が必要となるが、現在科学技術計算分野において脚光を浴びているGPGPUは本研究においても最適である。3次元計算については複数のGPGPUボードを用いた並列計算が必要となるため、2枚のGPGPUボードを搭載したGPGPUシミュレーションサーバを購入した。また、既存の計算コードをそのまま利用できるPGIコンパイラを購入し、来年度以降の3次元計算に向けた環境構築が完成した。3次元計算に向けた並列化に関して進展が有り,おおむね計画通り進行している。しかしながら,シミュレーション精度の向上が課題の一つであったが,提案モデル自身が持つ特性がシミュレーションの難しさにつながっており,理論的な検討が必要である。本年度はモデルの検討に関して理論的な研究推進を行うと共に,複数GPGPUボードを用いたシミュレーションの具体的なコーディングに関して研究を推進した。本年度は、既にあるモデル方程式に対して、これまでその検討が十分ではなかったノイズ項について、主にシミュレーション結果から評価を行った。また、シミュレーション設備の導入と、その動作確認ができており、次年度に向けた本格的な中規模シミュレーションの準備が整った。但し、計画にある、反応拡散系GPGPU計算のノウハウの公開は限定的なものとなっている。理由は、具体的な問題に対するノウハウの公開では無く、より一般的な公開を目指しているためで、今後有用な情報の蓄積を待って公開を行う予定である。本年度の計画として行う予定であった実験系の構築はできなかった。実験家とのコミュニケーションにあてる時間を確保することができず、十分な検討ができていない。本研究で問題とするノイズの影響をコントロールできる実験系の構築は難しく、今後も実験家とのコミュニケーションを行い、継続して検討を行う。今年度の研究を継続しつつ,特に3次元問題を対象としたシミュレーション研究を行う。まず,前年度導入したGPGPUシミュレーション設備に,最新のGPGPUボードを追加する。これによって,複数世代のGPGPUボードが混在する環境となるが,適切に領域を分割することで対応し,精度の高いシミュレーションをより高速に行う。さらなる高速化の為にはボード間の通信の削減など,専門的な知識が必要となり,専門家の助言を得る予定である。また,付加的な成果として公表したメッシュ生成手法で生成したメッシュを用いることで,計算メッシュの異方性を取り除いたシミュレーションを行う。本研究の主要な目的である,ノイズの影響に関しては,これまでの研究によって,場に固定されたノイズと,時間的に変化するノイズとでは結果が大きく異なることが明らかになっている。
SOCS遺伝子抑制によるRSV感染症の新たな治療法確立の検討

RSV感染によるSOCS1、SOCS3、CISの発現がJAK-STAT系の活性化を抑制し、感染初期の抗ウイルス作用から逃れるため、si-RNAによるSOCS1、SOCS3、CISの発現抑制が抗ウイルス効果を誘導すると考えられた。一方、マウス正常肺においてSOCS3は細気管支上皮でのみ発現していた。RSV感染により細気管支上皮でのSOCS3発現は減少し、一方で肺胞レベルでの発現誘導が観察された。以上の結果はRSVウイルスの感染初期の抗ウイルス効果からの回避機序、およびRSV感染下気道炎の病態を明らかにする一助となると思われる。研究初年度は(1)正常肺におけるSOCSの発現、(2)肺でのsiRNAの取り込みについて検討した。(1)正常肺におけるSOCSの発現。マウスの正常肺組織を用いて、SOCS-1、SOCS-3の発現について免疫組織学的に検討した。パラフィン包埋した肺標本を抗SOCS-1抗体、抗SOCS-3抗体を用いて染色した。線毛上皮、非線毛上皮を問わず細気管支上皮ではSOCS-1、SOCS-3の陽性シグナルが認められた。しかし、肺胞気管支、また扁平上皮化生を認める主気管支レベルでのSOCS-1、SOCS-3のシグナルは観察されなかった。RSV感染後のSOCS-1、SOCS-3の発現についてはRNAレベル、蛋白レベルで解析中である。(2)肺でのsiRNAの取り込みについて。蛍光(Cy3)標識したsiRNAを用いsiRNAの肺組織への取り込みについて検討した。全身麻酔したマウスに500nMのCy3-siRNA100ul(50pmol)を鼻より自発呼吸により吸飲させた。投与4時間後、24時間後に肺を摘出し、パラフィン包埋した肺標本を用いsiRNA取り込みの局在、siRNA投与の際の遺伝子導入薬存在の必要性、蛍光シグナルの持続時間について蛍光顕微鏡を用い検討した。siRNAの蛍光シグナルは全肺野の80%に認められ、局在としては気道上皮、肺胞上皮に観察された。また遺伝子導入薬を用いなかった場合、投与4時間後に蛍光シグナルは認められたが非常に微弱であった。一方、蛍光の局在は遺伝子導入薬存在の有無には関係なかった。さらに、遺伝子導入薬を用いた場合siRNA投与24時間後も蛍光シグナルは認められ、遺伝子導入薬を用いなかった投与4時間後より強いシグナルが観察された。研究第二年度はRSV感染マウスの肺におけるSOCSの発現を検討した。RSV感染後のSOCS-3の発現について経時的に免疫組織学的で検討した。8週齢の雌のBalb/cマウスにRSV-A2株を経鼻より10^7pfu感染させ、感染後2時間、24時間、4日目、8日目に肺を採取し、4%パラホルムアルデヒドで固定し、パラフィン包埋した肺標本を抗SOCS-3抗体を用いて染色した。昨年度同様、感染直前の標本では線毛上皮、非線毛上皮を問わず細気管支上皮ではSOCS-3の陽性シグナルが認められたが、肺胞気管支、また扁平上皮化生を認める主気管支レペルでのSOCS-3のシグナルは観察されなかった。SOCS-3の発現はRSV感染後では感染前を100%とした場合、感染2時間では50-70%、感染24時間では10-30%、感染4日目では30%、感染8日目では10-30%であった。同時に行った紫外線不活化RSVを用いた実験では、感染後2時間から4日目までの発現は同様であったが、8日目の時点では70-80%に回復していた。一方、培養上清に含まれる生理活性物質によるSOCS3発現への影響が考えられるため、超遠心による精製RSVを用い感染後2時間、4時間、8時間、24時間、2日目、4日目、8日目、14日目に標本を採取した。免疫染色、RNAレベル、蛋白レベルで解析中である。また、年度早々にSOCSに対するsiRNAを用いた動物実験を実施するため、現在準備中である。研究最終年度は超遠心により精製したRSVを用い、感染マウス肺におけるSOCS-3の発現、およびSOCS-3に対するsiRNAを用い、肺におけるSOCS-3の発現を検討した。8週齢の雌のBalb/cマウスにRSVを経鼻より10^7pfu感染させ、感染後2時間、4時間、8時間、24時間、2日目、4日目、8日目、14日目に肺を採取し、抗SOCS-3抗体を用い免疫染色した。感染前の細気管支上皮ではSOCS-3の陽性シグナルが認められたが、肺胞、肺胞気管支、また扁平上皮化生を認める主気管支レベルでのSOCS-3のシグナルは観察されなかった。細気管支上皮でのSOCS-

3の発現は、感染後では感染前を100%とした場合、紫外線不活化RSV(UV-RSV)、非処理RSV(alive-RSV)ともに感染24時間で30-4%まで減少し、alive-RSVでは感染後48時間まで発現減少が遷延し、感染4日目で感染前に回復した。II型肺胞上皮ではUV-RSV、alive-RSVともにSOCS-3の誘導がみられたが、特にalive-RSVは感染8時間以内においてUV-RSVに比較し強く誘導が観察された。既報の論文を参考にSOCS-3に対するsiRNAを連日4日間投与したが、肺の免疫組織学検討ではSOCS-3の発現抑制効果は観察されなかった。RSV感染におけるSOCS-3の肺組織局所での発現の違いが観察された。これらの知見はこれまで報告がない。感染病理への関与のついての更なる検討が、RSV感染の重症化、感染による気道過敏症発生の機序を解明する手がかりとなる。
有機安定ニトロキシドラジカルの電荷輸送特性と磁気抵抗効果の発現

本研究では、有機安定ニトロキシドラジカルの電荷輸送能とその磁気抵抗効果の発現を目的としている。ラジカルスピン自身の安定化、電荷移動度の向上、膜の安定性を分子骨格に反映させながら、一連のラジカル誘導体を合成した。新しく合成した熱的に安定なニトロニルニトロキシドラジカル分子をホール輸送層として真空蒸着により成膜し、そのホール輸送性を明らかにした。通常、TEMPOのようなニトロキシドラジカルは非常に安定ではあるが、電荷のトラップサイトとして働くためその電荷移動度は極めて低い。しかしラジカルスピン密度が分子上に広く共役した(つまり多くの共鳴構造を取り得る)分子では、ラジカル不対電子自身が酸化還元を繰り返し電荷をホッピング輸送する。特に、アリールアミンと共役したニトロキシドラジカルでは、ラジカルスピンはアミン窒素核上へも共鳴するため、隣接分子との波動関数の重なり合いが大きくなり、高い電荷の移動度が期待される。ラジカルスピン自身の安定化、電荷移動度の向上、スピン問の強磁性的相互作用の増大、膜の安定性を分子骨格に反映させながら、一連のラジカル誘導体群を合成している。ニトロキシドラジカル誘導体の合成において、ニトロキシド基の保護・脱保護条件およびラジカル発生条件、ラジカル生成後の精製方法は非常に重要であり、詳細な検討を重ねた。電子スピン共鳴測定により磁気特性およびラジカルの熱安定性を、Time of Flight法により電荷輸送特性を定量した。陽極/有機膜/陰極のサンドイッチ型素子において、それぞれの材料特性による影響を独立的かつ系統的に調べる必要がある。まず電極には仕事関数の違う金属を用い注入キャリア種およびキャリアバランスを規制する。ラジカルスピン自身の安定化、電荷移動度の向上、スピン間の強磁性的相互作用の増大、膜の安定性を分子骨格に反映させながら、一連のラジカル誘導体群を合成している。ニトロキシドラジカルについて真空蒸着後に質量分析およびESR測定した結果、酸素原子が一つ脱離した分子構造に変化していた。一方、ニトロニルニトロキシドラジカルにおいては分子構造の変化やラジカル純度の低下は見られなかった。また、真空蒸着により成膜した薄膜状態と溶液状態の紫外可視吸収スペクトルからもラジカル分子の真空蒸着性を明らかにした。真空蒸着によりニトロニルニトロキシドラジカルをホール輸送層として成膜した有機EL素子においてEL発光を確認し、ニトロニルニトロキシドラジカルのホール輸送性を明らかにした。
家兎頭部外傷モデルにおける低温暴露中の腎臓交感神経活動の変化とその機序解明

実験1:正常群神経温存群:家兎に麻酔を施し、気管切開後筋弛緩剤を投与し調節呼吸とした。動静脈を確保した後、右下側臥位で後腹膜腔経由にて左腎動静脈を露出し、その間にある腎臓交感神経を剥離・露出した。結合織を除き末梢端を切璃した後、専用電極に神経を掛け、腎臓交感神経活動(RNA)を導出した。状態の安定化の後、表面冷却にて食道温を38から25°Cまで、1°C/30分程度の速度で、低下させ、その際の血圧、心拍数、中心静脈圧、RNAを観察記録した。対照群:上記手術操作を行い、体温を37から38°Cに維持し、約3時間保持した際の血圧、心拍数、中心静脈圧、RNAを観察記録した。結果:低温暴露時の腎臓交感神経活動の経時的変化の検討から、低体温時には、交感神経活動は初期から上昇し、食道温約30°C前後で最高値を取り、その後、冷却前値に復するという2相性反応が出現した。一方対象群では交感神経活動はほぼ一定で循環状態もほとんど変化しなかった。実験2:頭部外傷群神経温存:家兎に正常群と同様の手術操作を行い、腎臓交感神経も導出した。その後さらに前頭部にドリルで穴を開け、頭部外傷モデルを作成した。結果:体温低下に伴い頭部からと剥離部からの出血が続き、循環状態が安定しなかった。また腎臓交感神経活動電位は出血による血液が神経導出部に流れ込み、正確な導出に困難を極めた。このため反応の方向性もばらばらで結果の統計的解析には至っていない。今後のさらなる実験が必要と思われる。両側迷走神経切離群と両側頚動脈洞神経切離群:神経温存群と同様の手術操作と体温低下を行い、血圧、心拍数、中心静脈圧、RNAの変化を観察する予定であったが、未だ実験に至っていない。今後の研究を要する。平成15年度の実験:本年度は日本白色家兎を用い以下のような研究を行った。日本白色家兎を神経温存群と対照群の2群に分け実験を行った。神経温存群とした日本白色家兎にウレタンを腹腔内投与して麻酔を施した。その後気管切開を施し筋弛緩剤を投与して調節呼吸とした。さらに右の内頚静脈にカニュレーションして中心静脈圧のモニターとした。その後動脈路と静脈路を確保し、動脈路は観血的な体血圧のモニターとし、静脈路は薬剤の投与経路とした。その後さらに右下の側臥位で経後腹膜的に左の腎臓を露出した。そして腎動脈と腎静脈の間にある腎臓交感神経を神経が損傷しないように剥離・露出した。結合織を除き末梢端を切璃した後、専用電極に神経を掛け、腎臓交感神経活動を直接導出した。状態の安定化の後、体表面を冷却して食道温を38から25°Cまで、1°C/30分程度の速度で低下させ、その際の血圧、心拍数、中心静脈圧、腎臓交感神経活動を観察記録した。一方、対照群に対しては神経温存群と同様の手術操作を行った上で、体温を37から38°Cで保持し、その際の体血圧、心拍数、中心静脈圧、腎臓交感神経活動を観察記録した。結果は、対照群(常温群)で血圧、心拍数、中心静脈圧、腎臓交感神経活動の変動が無かったのに対し、神経温存群の低温暴露群では体温が低下するにつれ、交感神経活動が賦活しているのもかかわらず、心拍数が低下した。このことから低体温時の心拍数の低下には、交感・副交感神経系双方の賦活が関与していると考えられる。次年度以降はさらに調圧神経を切離した群を作成して同様の実験を行い、低温暴露時の調圧神経系の調節機序を究明していく予定である。

状態の安定化の後、表面冷却にて食道温を38から25°Cまで、1°C/30分程度の速度で、低下させ、その際の血圧、心拍数、中心静脈圧、RNAを観察記録した。結果:体温低下に伴い頭部からと剥離部からの出血が続き、循環状態が安定しなかった。また腎臓交感神経活動電位は出血による血液が神経導出部に流れ込み、正確な導出に困難を極めた。このため反応の方向性もばらばらで結果の統計的解析には至っていない。今後のさらなる実験が必要と思われる。両側迷走神経切離群と両側頚動脈洞神経切離群:神経温存群と同様の手術操作と体温低下を行い、血圧、心拍数、中心静脈圧、RNAの変化を観察する予定であったが、未だ実験に至っていない。今後の研究を要する。