hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
ユビキチン様分子ＩＳＧ１５依存性タンパク質翻訳制御と自然免疫応答の関連性の解析

ユビキチン様分子ISG15はインターフェロンや細菌・ウイルス感染などにより急速に発現誘導され、タンパク質の翻訳後修飾に用いられるが、その生理的役割はほとんどわかっていない。本申請課題はタンパク質翻訳制御分子eIF4E2(4EHP)とPKRに焦点を絞り、ISG15修飾の生理的役割を解析することで、ISG15修飾が初期免疫応答(自然免疫)にどのように関与するのかを明らかにする。ISG15修飾を受けた4EHPに結合する候補mRNA群を同定した。そのうちのひとつの候補遺伝子が細胞傷害やインターフェロンにより誘導されることが示唆されており、現在、解析に適した条件を設定中である。また、市販抗体の質が良くないので作製を試みている。2. PKRのISG15修飾がもたらす生理的役割の解明昨年度までにPKRが生理的刺激によりISG15修飾を受けることを明らかにした。またISG15修飾を受けたPKRはウイルス由来の二本鎖RNA非存在下においても活性化を受け、標的分子であるeIF2alphaのリン酸化を引き起こすことを示した。eIF2alphaのリン酸化はキャップ依存的なタンパク質翻訳を抑制するので、それを確認するためにキャップ依存的・非依存的な翻訳を定量できるルシフェラーゼアッセイシステムを用いて定量した結果、ISG15修飾を受けたPKRはキャップ依存的なタンパク質翻訳を選択的に抑制していることを明らかにした。本年度は投稿後に受けたいくつかの質問(内在性のISG15修飾、定量的PCRによる再評価、PKRの活性化状態の確認など)に答える解析を加えJBC誌に掲載された。これらの結果は今まで知られていなかったPKRの新規活性化メカニズムを提唱するもので、ウイルス感染以外にもPKRの活性化機構があることを示すものである。25年度が最終年度であるため、記入しない。ISG15修飾を受けた4EHPに結合するmRNAを再同定中である。2. PKRのISG15修飾がもたらす生理的役割の解明PKRが生理的刺激によりISG15修飾を受けることを明らかにした。eIF2alphaのリン酸化はキャップ構造依存的なタンパク質翻訳の抑制を意味するので、それを確認するためにキャップ構造依存的・非依存的な翻訳を定量化できるルシフェラーゼアッセイシステムを用いて定量した結果、確かにISG15修飾を受けたPKRはキャップ構造依存的なタンパク質翻訳を選択的に抑制していることを明らかにした。この結果は今まで知られていなかったPKRの新規活性化メカニズムを提唱するもので、ウイルス感染以外にもPKRの活性化機構があることを示すものである。現在投稿準備中である。ISG15修飾を受けた4EHPに結合するmRNAの同定を試みているが、その確認作業まで至っていない。ISG15修飾を受けた4EHPと標的mRNAの結合が非常に不安定である可能性、もしくは真に標的となるmRNAがウイルス由来の可能性がある。PKRに関する研究については予定通り進行している。

1マイクロアレイ解析で同定した候補遺伝子群がISG15修飾を受けた4EHPにより翻訳制御を受けていることを別の細胞株で検証したので、マイクロアレイ解析に用いた細胞株で再解析する。2ポリソームを回収しマイクロアレイ解析を再度行う。PKRに関する解析は当初予定通り行う。25年度が最終年度であるため、記入しない。
感温性生体高分子によるハイブリッド組織体の作成およびその医用材料への応用

本研究では、コラーゲンの変性タンパク質であるゼラチンに感温性の合成高分子であるポリ(N-イソプロピルアクリルアミド)(PNIPAM)をグラフトしたPNIPAM化ゼラチンを合成し、組織構築用マトリックス材料および医用材料への応用を検討した。前年度は組成の異なるPNIPAM化ゼラチン(PNIPAM/ゼラチン重量比(P/G):1.4-49)を合成し、PNIPAM組成の高いゲルは細胞の足場として機能できることを示した。本年度は、マトリックス材料として機能するゲルを物理的見地から調べることを目的とし、ゲル表面の微細構造・物性を原子間力顕微鏡(AFM)により調べ、ゲル表面での細胞接着性との相関を調べた。PNIPAM化ゼラチンゲル表面を水中にてAFMにより観察すると、ゲルの組成や濃度に関わらず観察範囲全体に直径数μm程度のくぼみを多数有した。表面の弾性率はと表面の凹凸には相関がなかったが、弾性率は測定点ごとに分布を有し、PNIPAM組成の増加に従って増加した。このゲルは水和したゼラチンによる柔らかい部分と凝集したPNIPAM部による堅い部分が不均一に分布し、PNIPAM組成の増加により強く凝集したPNIPAM部の割合が大きくなったと考えられる。一方、このゲルの上で血管内皮細胞を播種・培養すると、PNIPAMの組成が高いゲル(P/G>12)で細胞が接着・伸展が観察できた。このゲルは細胞接着性部のゼラチン部と構造維持部のPNIPAM部により構成されていることから、PNIPAM組成が高くなることでゲルの構造を維持でき、細胞が接着・伸展できるゲル強度を有したと考えられる。本研究では、PNIPAM化ゼラチンゲルを用いることでゲル表面の微細構造・物性と細胞接着性との相関を調べることができた。本研究で得た知見は今後のマトリックス設計の際の指針となりうると期待できる。本研究では、生体高分子に感温性の合成高分子であるポリ(N-イソプロピルアクリルアミド)(PNIPAM)を導入した感温性生体高分子を合成し、その組織工学用マトリックス材料および医用材料への応用することを目的とした。本年度は感温性ゼラチンの合成とそのマトリックス材料としての機能性の評価を行った。まず、PNIPAM鎖長、導入量の異なる9種のPNIPAM化ゼラチンを合成した。ゼラチンに重合開始剤として作用するジチオカルバミル基を導入し、ジチオカルバミル化ゼラチンを合成した。続いてNIPAMのグラフト重合により、PNIPAM化ゼラチンを合成した。牛大動脈由来血管平滑筋細胞を懸濁させたPNIPAM化ゼラチンの水溶液(濃度:20%)を37°Cに加温すると、PNIPAM/ゼラチン重量比(P/G比)の最も低いゲル(P/G=1.4)を除き、溶液全体が体積変化を伴わずに硬化し、細胞を含むゲルを形成した。P/G比10以上のゲル内部の細胞は伸展、増殖し、培養14日後には内部にコラーゲンの産生を認めた。P/G比の高いPNIPAM化ゼラチンゲルはマトリックスとして機能できたと言える。ラット繊維芽細胞を懸濁させたPNIPAM化ゼラチン(P/G=19、濃度5%)の培養液をラット皮下組織に注入すると、体温により速やかにゲル形成し、細胞を包埋できた。ゲルは皮下組織にて14日間、形状を保持し、内部の細胞は伸展・増殖し、コラーゲンを産生した。このゲルはin vivoにおいてマトリックスとして機能できたと言える。PNIPAM化ゼラチンの使用により、種々のハイブリッド組織体構築が期待できる。次年度では、PNIPAM化ゼラチンゲルの生体との相互作用を詳細に検討し、種々のハイブリッド組織体の構築を検討するとともに、PNIPAM化ゼラチンゲルの微細な表面構造・物性を原子間力顕微鏡により調べ、マトリックス機能との相関を調べる予定である。

このゲルは細胞接着性部のゼラチン部と構造維持部のPNIPAM部により構成されていることから、PNIPAM組成が高くなることでゲルの構造を維持でき、細胞が接着・伸展できるゲル強度を有したと考えられる。本研究では、PNIPAM化ゼラチンゲルを用いることでゲル表面の微細構造・物性と細胞接着性との相関を調べることができた。本研究で得た知見は今後のマトリックス設計の際の指針となりうると期待できる。
着雪氷防止皮膜と溶射法の応用

本研究は、着雪氷防止機能を有する皮膜の開発を目的に、超撥水性を有するフッ素化カーボンと溶射皮膜との複合化について検討を行った。前年度では複合化法として含浸法を用いたが、本年度はフッ素化カーボンを充填したワイヤを用いる複合ワイヤ法について検討を行い、以下のような結果を得た。(1)接触角の測定:複合ワイヤはアルミニウム及び銅チューブに充填したものの2種類を用いた。得られた皮膜の接触角を5mmピッチで全56点測定したが、多少のばらつきは見られたもののいずれの複合ワイヤにおいても平均140度の接触角を示した。(2) EPMA、ESCAによる表面分析:EPMAによって面分析を行った結果、一部偏析が認められるものの良好に分散している。また、ESCAによる分析からアルミニウムとフッ素が結合したAlF_3・3H_2O、炭素とフッ素が結合したP-(CF_2=CF_2)のピークスペクトルが見られ、フッ素が1sの軌道でアルミニウム及び炭素と結合しているという新たな知見を得た。(3)促進暴露試験:紫外線蛍光灯式耐候性試験機を用いて促進暴露試験を行った。暴露時間は4時間紫外線照射、4時間暗黒湿潤を1サイクルとして126サイクル(1008時間)まで行った。銅チューブを用いた複合皮膜では126サイクルにおいても125度以上の接触角を示しているが、アルミニウムチューブを用いた皮膜では暴露サイクルとともにバラツキが大きくなり、それにともない接触角の平均値は100度まで低下した。(4)密着強度試験:複合皮膜の密着強度の測定をJIS H 8667に準拠して行った。基材にはφ25mmのアルミニウム丸棒を用い、皮膜厚さ300μm、N数は15とした。密着強度はアルミニウム、銅チューブともにソリッドワイヤでの皮膜強度の半分程度に低下している。これは、皮膜内部にフッ素化カーボンが存在しているために、その部分で強度が落ちるためであると考えられる。本研究は,超撥水性を有するフッ素化カーボンを有効に利用した着雪氷防止機能を有する皮膜の開発を試み,容射皮膜との複合化について検討を行ったものである。フッ素化カーボンと容射皮膜の複合化方法としては,高分子系樹脂材と混合したフッ素化カーボンを容射皮膜上に塗布・含浸させる方法(含浸法)と,フッ素化カーボンを充填したワイヤを用い容射と同時に直接複合化させる方法(複合ワイヤ法)の2種類を採用した。[含浸法]含浸法で作製の複合皮膜は接触角が大きく,耐候性にも優れていることがこれまでに明らかとなっている。ここでは,含浸法で作製の試験片を対象に着氷状況と着氷力の観察を行った。試験片はアルミニウム丸棒(φ25×150 )に所定の処理を施したものが主であり,各試験片を-20°Cの冷凍室内に24時間放置後,30分間隔で5°Cの蒸留水中に長手方向から30回浸漬を繰り返し,観察に供した。氷はフッ素化カーボンを混入したもので若干少ないものの,いずれの試験片も5580程度付着した。これは,何らかの要因によって一旦氷が付着すると,その上に順次付着するようになるため材料表面の性状には影響されなくなるためだと思われる。しかし,氷の付着した試験片を1mの高さからコンクリート平板上に落下させた場合の残存付着量は,フッ素化カーボンを混合塗布したものでは極めて少なく,付着強度が小さいことを示した。[複合ワイヤ法]フッ素化カーボン入り複合ワイヤを試作し,アルミニウム板上に皮膜を被覆し試験片とした。50×20の範囲内を4間隔で接触角の測定を行った結果,バラツキはあるものの120°前後の値が得られた。また,EPMAによってフッ素の面分析を行った結果,濃度に違いはあるもののフッ素化カーボンが分散し複合化しているのが確認された。

(4)密着強度試験:複合皮膜の密着強度の測定をJIS H 8667に準拠して行った。基材にはφ25mmのアルミニウム丸棒を用い、皮膜厚さ300μm、N数は15とした。密着強度はアルミニウム、銅チューブともにソリッドワイヤでの皮膜強度の半分程度に低下している。これは、皮膜内部にフッ素化カーボンが存在しているために、その部分で強度が落ちるためであると考えられる。
分子間相互作用による光学分割能の評価手法の開発

結晶構造未知の包接化合物のS体、R体のエナンチオマー過剰率(ee)を予測する手法の確立に向けて以下の研究を行った。(1)eeが未知のゲストの位格構造の予測包接構造の予測を可能とするため、胆汁酸ステロイド-光学活性アルコール包接結晶を用いてホスト分子によるケスト分子のキラル認識機構を詳細に解析した。その結果、従来の三点モデルによる認識では結晶形成時に十分なキラル認識がされず、2-t-ブチルブタノールおける不斉炭素部位の水素原子など、4点目が認識されることで初めて高いeeが得られることがわかった。このことから、ゲスト分子の構造から包接結晶が光学分割能の高い構造をとるか否かを予測でぎざことがわかった。(2)ホストーケスト相互作用の解析と光学分割能の予測分子力場計算を用いた構造最適化計算の精度を向上させるため、有機結晶に対する精度が高いと言われているWilliamsのパラメータを導入したが、期待どおりの結果が得られなかった。力場計算では水素結合の方向性を正確に評価できないためと考えられる。そこで、電荷の空間分布から静電エネルギーを評価できる密度汎関数計算(DFT計算LPW91」)を試みた。コール酸アミド-2-ブタノールを用いた計算の結果、実際の結晶構造にかなり近い構造が得られた。S体、R体め構造か最適化し、abinitio分子軌道計算(MP2/6-31G*レベル)で分子間相互作用を計算したところ、S体が0.72kcal/mol安定という結果で得られた。(3)eeの予測精度の検証上記の結果は力場計算による最適化で得られた2.26kcal/molという値よりも実際(0.2kcal/mol)に近く、DFT計算による構造最適化の妥当性が示された。以上のことから、計算科学的手法により包接結晶の光学分割能を予測するために必要な手順が明らかとなり、目標をほぼ達成することができた。今年度は、結晶構造が決定された包接化合物を用いて光学分割能の評価手法の開発を行うため、以下の研究を行った:(1)胆汁酸ステロイド包接結晶のエナンチオマー過剰率の解析:結晶解析済みの胆汁酸ステロイド-脂肪族アルコール包接化合物23種類のエナンチオマー過剰率(ee)を実験的に求めた。また、3-エピコール酸-2-ヘキサノール等の新規包接化合物を合成し、結晶構造解析とeeの解析を行った。この中から以降の検討に適切な結晶解析精度とeeを示す系として、コール酸アミド-2-ブタノール(以下CAM-BuOHと略)系、コール酸アミド-2-ペンタノール(CAM-PeOH)系を選択した。(2)ホスト-ゲスト相互作用の解析:CAM-BuOH系において(3)で述べる方法で構造を最適化し、S体、R体のゲスト-ホスト間の相互作用をMP2/6-31G*レベルで計算したところ、S体がR体よりも1.6Kcal/mol安定であった。また、CA-PeOH系においてS体の構造をR体の結晶構造を基に作成し同様の計算を行ったところ、R体がS体よりも2.6Kcal/mol安定であった。いずれの系においても安定な異性体は実験と同じであった。(3)分子間相互作用とエナンチオマー過剰率の相関の解明:(2)で計算したエネルギー差とボルツマン分布の式からeeを計算したところ、CAM-BuOH系では87%、CAM-PeOH系では97%という値が得られ、実測値(17%および30%)とは一致しなかった。この理由としては、構造最適化に用いた既存の力場パラメータの精度が不十分であるため、拘束条件の選択方法によって水素結合部位の構造などが大きく変動することなどが考えられる。現在利用可能な力場パラメータを使用する場合は、結晶構造をもとに(1)格子定数、(2)ホスト分子の骨格、(3)ゲスト分子の水酸基を固定し、ホスト分子のsp3炭素に結合する水素とゲスト分子骨格を最適化するのが最善であることがわかった。19年度は、力場パラメータの改善などにより計算精度を向上させ、構造未知の包接化合物の光学分割能の予測を行う。

S体、R体め構造か最適化し、abinitio分子軌道計算(MP2/6-31G*レベル)で分子間相互作用を計算したところ、S体が0.72kcal/mol安定という結果で得られた。(3)eeの予測精度の検証上記の結果は力場計算による最適化で得られた2.26kcal/molという値よりも実際(0.2kcal/mol)に近く、DFT計算による構造最適化の妥当性が示された。以上のことから、計算科学的手法により包接結晶の光学分割能を予測するために必要な手順が明らかとなり、目標をほぼ達成することができた。
ファンコニ貧血経路の真のターゲットは内因性ホルマリンによる蛋白質ゲノム架橋か?

ファンコニ貧血(FA)はまれな小児の遺伝性疾患で、臨床的には進行性の骨髄不全、高発がん性(白血病、扁平上皮がん)、骨格異常が特徴的である。患者由来の細胞はシスプラチンやマイトマイシンCなどのDNAクロスリンク薬剤に極度に感受性である。現在、13の原因遺伝子/相補群(FANCA、B、C等)が知られており、その産物はFA経路と呼ばれる共通の生化学経路で機能するものと考えられる。しかし、FA経路が実際に細胞内でどのようなDNAダメージを修復しているのかは、現在全く不明である。最近、正常細胞の代謝産物であり、血液中にも含まれているフォルムアルデヒドに対して、FA分子の欠損細胞(BRCA2/FANCD1と、FANCD2の欠損細胞)が特に高いフォルムアルデヒド感受性を示す事が報告された。本研究は、フォルムアルデヒドに対するFA分子の応答を解析し、メダカのFAモデルの作成を通じて、フォルムアルデヒドとFAとの関係を調べようとした。1.メダカのFAモデルの作成のため、変異メダカライブラリーをいくつかの方法でスクリーニングを施行したが、残念ながら機能のロスが期待できる変異を同定できなかった。2.フォルムアルデヒドのクエンチャー薬剤二種類添加のFA分子変異株の増殖への効果を調べた。FANCD2、FANCJ、FANCD1(=BRCA2)のいずれの細胞においても増殖スピードが加速されたが、一方野生型においてはその効果は全く見られなかった。FA経路分子がフォルムアルデヒドによるDNA損傷の除去に関与することが推定された。今後より詳細な解析が必要と思われる。本研究では、フォルムアルデヒドに対するFA分子の応答を解析し、メダカのFAモデルの作成を通じて、フォルムアルデヒドとFAとの関係を調べる。1. DT40細胞においてフォルムアルデヒド添加によるFANCD2モノユビキチン化を解析した。100μM1時間処理にて、D2はモノユビキチン化されたが、その至適濃度は狭く、25μMと250μMではほとんど変化が検出できなかった。また同濃度で、Chk1のリン酸化も検出された。2.メダカのFAモデルの作成のため、京都大学医学部放射線遺伝学の谷口准教授と共同で、メダカBRCA2遺伝子の変異を彼らの作成した変異メダカライブラリーでスクリーニングした。I2164T, F2110L, N2192S,V2132E, S2181P,などのミスセンス変異が同定されたが、V2132E以外は保存されたアミノ酸残基への変異ではなく、V2132EもこれによってBRCA2の機能にどのくらいのインパクトがあるか不明である。さらに次年度でスクリーニングを再度試みることとする。本研究は、フォルムアルデヒドに対するFA分子の応答を解析し、メダカのFAモデルの作成を通じて、フォルムアルデヒドとFAとの関係を調べようとするものである。メダカのFAモデルの作成のため、京都大学医学部放射線遺伝学の谷口准教授と共同で、メダカBRCA2遺伝子の変異を彼らの作成した変異メダカライブラリーでスクリーニングを施行しているが、昨年度においてはいくつかの機能低下が明らかではないミスセンス変異を同定してのみであった。本年度は、方法を変更し、谷口准教授、遺伝研との共同で次世代シーケンサーによって変異.同定をこころみたが、またしても適切な変異を同定できなかった。

最近、正常細胞の代謝産物であり、血液中にも含まれているフォルムアルデヒドに対して、FA分子の欠損細胞(BRCA2/FANCD1と、FANCD2の欠損細胞)が特に高いフォルムアルデヒド感受性を示す事が報告された。本研究は、フォルムアルデヒドに対するFA分子の応答を解析し、メダカのFAモデルの作成を通じて、フォルムアルデヒドとFAとの関係を調べようとした。1.メダカのFAモデルの作成のため、変異メダカライブラリーをいくつかの方法でスクリーニングを施行したが、残念ながら機能のロスが期待できる変異を同定できなかった。2.フォルムアルデヒドのクエンチャー薬剤二種類添加のFA分子変異株の増殖への効果を調べた。FANCD2、FANCJ、FANCD1(=BRCA2)のいずれの細胞においても増殖スピードが加速されたが、一方野生型においてはその効果は全く見られなかった。FA経路分子がフォルムアルデヒドによるDNA損傷の除去に関与することが推定された。今後より詳細な解析が必要と思われる。
人工軟化象牙質の作成と再硬化に関する研究

本研究の目的は,自然う蝕に出来るだけ類似した人工軟化象牙質を作成し,この軟化象牙質を再石灰化/再硬化させる方法を確立することであるが、今回以下のことが明かとなった。1.人工軟化象牙質の作成〓ヒト抜去歯歯頚部に数種類の酸を作用させて脱灰した後,縦断切片を作成して硬さを測定し,硬さ-深さ曲線によって比較検討したところ,フォトクリアフィルライナーボンドシステム附属の歯面処理剤CA-AGENT(KURARAY)を72時間作用させた場合,軟化深度は約500mumで,硬さ-深さ曲線上表層では,下に凸,深部では上に凸のシグモイドカーブを描き,最も自然う蝕に近い軟化パターンを示すことが分かった。2.人工軟化象牙質の再硬化〓上記の方法で作成した人工軟化象牙質に,再硬化が期待される数種のタンニンフッ化物含有セメントを貼布し,4週後に被験歯を取り出して硬さを測定したところ,HY-C CEMENT(SHOFU)を貼付した被験歯において著明な再硬化が認められた。この被験歯を厚さ約100mumの研磨切片として顕微X線写真を撮影したところ,再硬化が認められた部位に一致してX線不透過性の亢進した層と,その直下に逆にX線透過性のやや強い一層とが認められた。3.再硬化象牙質のう蝕抵抗性〓次にこの被験歯をCA-AGENTで再度脱灰し,HY-C CEMENTで処理して再硬化した軟化象牙質の耐酸性について調べたところ,対象群と比較して,深部への軟化の進行が明らかに抑制されており,顕微X線写真上でも明瞭なX線不透過帯が認められた。以上,HY-C CEMENTを軟化象牙質に貼付することにより,表層に著名な再硬化が認められると同時に,耐酸性の強い一層が形成され,さらに酸の侵襲が持続した場合でも,より深部への軟化が抑制されることが,硬さ測定及び顕微X線写真の結果から示唆され、臨床応用においてもその有用性が期待される。
X線銀河団のX線輝線分布と銀河形成との関連

銀河団は宇宙初期の密度揺らぎから形成されたと考えられている。銀河団に分布する銀河間ガスのメタルの量は、銀河団における銀河形成過程や銀河からのメタルを含んだガスの放出そして多数の銀河の銀河団への集合過程を反映していると考えられる。銀河団は宇宙の中で最も大きなビリアル平衡にあり、高温な銀河間ガスから放出されるX線の観測によって銀河団の質量分布、メタルの量や分布が明らかにされている。この研究の目的は、原始銀河からのエネルギー放出が銀河団の銀河間ガスのメタル分布に与える影響を明らかにし銀河団における銀河形成の影響を明らかにすることである。我々は以下のようなモデルを仮定した。(1)原始銀河はz=3での密度揺らぎのピークで形成される。(2)原始銀河からメタルとエネルギーが放出される。その値をパラメーターとした。この結果、以下のことが明らかになった。(1)原始銀河からエネルギーが放出されない場合、メタルと水素の比は銀河団中心ほど増大する分布となる。(2)原始銀河からエネルギーが放出される量に応じて、メタルと水素の比は一様に近づく。観測されているメタルの量と分布と我々の結果を比較すると銀河形成時に放出された超新星爆発のエネルギーの数%程度がメタルとともに放出されたと考えられ、これは従来の銀河からのメタル放出機構と矛盾しない結果である。結果の一部は論文として投稿した。
大型建築屋根上積雪分布の現地実測・風洞実験・数値解析法の開発

本研究は、ISOで国際標準化を試みている建築物設計用積雪荷重の算定に当たって、屋根形状や寸法に対応した積雪分布性状を考慮する設計法が要求されている。しかし、屋根上積雪分布に関する実測資料が少なく、その測定も極めて困難なために、屋根上積雪深の実測資料の収集と模型雪風洞実験等による推定法の確立が急務の課題であり、これを解決するための研究計画を策定するために、以下の3課題について企画調査研究を行った。(1)実建物の屋根上積雪深分布実測に関する調査:屋根上での直接的な積雪実測調査を回避する方法として、航空写真測量技術の応用がある。しかし、変形を伴う建物の測量精度向上、連続的で広域測定用に人工衛生写真情報の利用、斜面移動や滑落挙動の測定用のビデオカメラの利用、屋根上積雪の深さ-重量関係解明用の重量実測の自動化などの技術的開発事項を指摘し、これらの技術を用いた実構造物での実測を組織的に計画することの必要性を明確にした。(2)模型建物の降雪風洞実験に関する調査:模型雪を用いた縮小建物模型の風洞実験による積雪分布の推定法はあるが、寸法効果や模型雪の選定法など、その手法は確立されていない。世界各地に各種の規模・方式の積雪シミュレーション風洞実験設備があるので、これらを利用して標準模型建物でのキャリブレーションおよび充分な実測資料を有する実建物の模型による比較検証を組織的に行うことが重要であり、日本・カナダ・米国・フランス等が協力した共同研究の可能性と実施方法を現地調査により提案した。(3)積雪分布数値シミュレーションに関する調査:降水量と気象データによる積雪重量の推定法など各種の数値解析による重量としての推定法を充実させること、有限要素法等を用いた平面分布の数値解析法の精度向上を上述の実測資料や風洞実験結果を用いて実施すること、このためにも国内外の共同研究の一環として位置づけることを提案した。
胆石症におけるコレステロールおよび胆汁酸生合成の調節機構に関する研究

私共はコレステロール胆石症患者肝におけるコレステロールおよび胆汁酸生合成の調節機構について明らかにするため、cytosolic proteinとくにnonspecific lipid transfer protein(NLTP)の、胆汁酸生合成過程の律速酵素である7αー水酸化酵素活性に対する影響について検討した。胆石症患者8例から手術中の生検により得た肝組織を用いて、型の如く、ミクロソーム分画とcytosol分画を得た。患者肝において7αー水酸化酵素活性は平均3.8pmol/min/mg蛋白であり、正常肝の平均6.1pmol/min/mg蛋白に比して、低下してることが明らかとなった。一方、7αー水酸化酵素活性に対するcytosol分画添加の影響を検討したが、正常肝よりのミクロソームに正常肝よりのcytosol分画を添加すると、100μg蛋白の添加で活性は約1.2倍に、900μgの添加で約1.5倍に増加した。このことから、cytosol分画には7αー水酸化酵素活性を増加させるcytosolic proteinが存在することがヒト肝において、初めて示された。さらに、胆石症患者からの肝ミクロソームを用いた7αー水酸化酵素活性測定系において、それぞれのcytosol分画を100μg添加すると、平均約1.4倍に活性が増加したが、正常肝からのcytosol分画を100μg添加した場合には1.2倍の活性上昇にとどまった。このことから、胆石症患者肝のcytosol分画には7αー水酸化酵素を活性化するcytosolic proteinがより多量に存在することが推定された。イムノブロッティング法を用いて、私共が開発したNLTP定量法により、患者肝と正常肝のNLTPを測定したところ、胆石症のcytosol分画において、約1.5倍の増加を見い出した。これらの実験事実から、胆石症患者肝におけるコレステロール7αー水酸化酵素の低下を代償する一つのメカニズムとして、nonspecific lipid transfer protein量が増加している可能性が示された。
α-Cre相補とフレームオーバーラップ発現法の開発

B型肝炎ウイルス(HBV)ゲノムを可視化する目的で、PreS蛋白領域をCre遺伝子の前半部分(α-Cre)または後半部分(β-Cre)に置き換えたHBVゲノムを作製した。分断Creのサイズは本来のCreの半分であり、両者を同時発現するとCre活性を生ずる。この分断Creを、HBVのPol遺伝子のフレームを温存しながらゲノムサイズをあまり大きくせずに置換した。作製されたHBVゲノムは分断Creを発現し、他方の分断Creをゲノムの外から供給するとCre活性を示し、GFPの発現をオンにした。ここで開発されたHBVゲノムは抗HBV薬剤の蛍光スクリーニングに道を開くと考えられる。B型肝炎ウイルス(HBV)ゲノムの複製量を反映してGFP蛍光を発する細胞培養系が構築できれば、その複製を特異的に阻止する薬剤を極めて効率的に同定することができる。この蛍光発光を用いる方法は簡便かつ定量的であり、現在行われているHBV薬剤のスクリーニングより優れていると考えられる。しかし(1)HBVゲノムには外来配列を組み込める場所がない(2)厳密なサイズ制限がある、という二つの極めて難しい問題がある。HBVゲノムではpreS蛋白をコードするDNA領域は1塩基ずれたオーバーラップフレームで、複製に必要な逆転写酵素polのスペーサードメインをコードしている。このpreS蛋白がコードされている領域で、preSの代わりにα-Creまたはβ-Creという外来蛋白を、polのフレームを温存しながら発現させる塩基配列DNAを用いる。このようにすれば外来遺伝子であるα-Creあるいはβ-Creを特定に場所に組み込むのではなくpol遺伝子と完全にオーバーラップさせる事により回避することができると考えられる。(2)のサイズ制限についてはGFP遺伝子を間接的に制御発現させるCre遺伝子をその前半部分(α-Cre)と後半部分(β-Cre)に分ける事により(half-Cre)、組み込むサイズを約半分にすることで解決できると思われる。このα-Cre発現HBVゲノムが複製すると、産生されたα-CreはHBV外部からtransfectionあるいはウイルスベクターで供給されるβ-Creと会合するだけでCre活性を示し(α相補)、その外部上のGFP発現をONにすることができる。またこの組み合わせを逆にすることも考えられる。平成26年度はこのようなhalf-Creを持つHBVゲノムを複数作製し、その効果の検討を開始した。本研究は当初の挑戦的計画をほぼ達成することができた。B型肝炎ウイルス(HBV)ゲノムは約3kbと小さく、また全ての遺伝子フレームがオーバーラップしているため本来はGFPやCre遺伝子を組み込むことはできない。しかしCre遺伝子を前半部分(α-Cre:0.5kb)と後半部分(β-Cre: 0.4kb)に分断し、両者を同時発現させるとCre活性を生ずる。またHBVのPreS1プロモーターから発現するPreS蛋白の領域(0.3kb)はP遺伝子とは異なるフレームを用いて発現しているが、HBVゲノム複製には不要である。本研究ではまず、このPreS蛋白のアミノ酸配を分断Creのアミノ酸配列に置き換えながらP遺伝子フレームを温存し、PreS1プロモーターから分断Creを発現するHBVゲノムを設計・構築した。そして他方の分断Creを外から過剰発現させることによりCre活性が得られるか検討した。その結果、作製した分断Creが確かにCre活性を生ずること、その活性によりGFP遺伝子の発現がonとなり、肝由来HuH細胞がGFPにより明瞭に蛍光を発することをトランスフェクションにより確認した。またHBVゲノム上のPreS1プロモーターからβ-Creを発現させた場合の方が、α-Creを発現させた場合よりも高い蛍光が得られることを見出した。HBVゲノム複製量を可視化測定できる方法が本研究により確立されたことにより、HBVゲノムの複製を阻止する薬剤の効率的スクリーニングに道が開かれたと考える。α-Cre発現HBVゲノムが複製すると、産生されたα-Creは外部のβ-Creと会合してCre活性を示し、外部のGFP発現をONにすることができると考えられる。しかしたとえフレームをオーバーラップさせてサイズの問題を解決してもpolのスペーサードメインのアミノ酸配列は大きく変わってしまうため、half-Creは複数設計しその中で効果の高いものを同定する必要がある。しかも当然のことであるがα-Creとβ-Creを会合させるα-相補で得られるCre活性は本来のCre活性よりも低いため、コドンをヒト型化することにより、その実質活性を高める必要がある。これらの条件全てを満たす設計は非常に難しく、1種類では目的通り進むとは限らないので、これらを複数作製してから比較実験を行う必要がある。平成26年度はこのようにして設計された多種類のhalf-Creを合成し、polのフレームを温存したHBVゲノム上でpolのスペーサードメインと効率よく置き換えることのできるカセットゲノムを多数作製した。transfectionによりゲノム複製可能なhalf-Cre HBVゲノムを選び出す作業を行っている。

ウイルス学平成27年度にはこのように多数作製されたhalf-Cre発現HBVが実際に同時transfectionあるいは同時感染したもう一方のhalf-CreおよびCreによりGFP発現をONにすることを確認し、作製した多数のHBVゲノムについて、有効な薬剤のスクリーニングに使用できるHBVゲノムの構築をtransfectionおよびウイルスベクターを用いて選び出す。その上で既存の抗HBV薬剤を陽性コントロールとして、最初の目的である蛍光強度を用いた抗HBV薬剤伸のクリーニングに有用であるかの結論を出す予定である。
芳香族並びに脂肪族炭素-水素結合の活性化に基づくホウ素基およびケイ素基導入反応

入手容易で安価な芳香族並びに脂肪族化合物の炭素-水素結合活性化を機軸とするジボロンやヒドロボランあるいはジシランやヒドロシランによる直接的なホウ素化反応およびケイ素化反応が、イリジウムなどの適当な遷移金属錯体を触媒として用いることにより進行することを明らかにした。これらの反応は、有機合成中間体、生理活性物質あるいは機能性分子として注目されている有機ホウ素およびケイ素化合物の経済的で環境調和型かつ効率的な合成法である。芳香族炭素-水素結合の活性化に基づくホウ素化反応1.反応条件とホウ素化剤量論量のアレーンおよびヘテロアレーンのビス(ピナコラート)ジボロンおよびピナコールボランによる芳香族炭素-水素結合の直接ホウ素化反応が、[Ir(OMe)(COD)]_2および4,4'-ジ-tert-ブチル-2,2'-ビピリジンとから調製した触媒の存在下ヘキサン溶媒中室温で進行し、対応するアリール型ホウ素化合物を収率良く与えることを見いだした。2.反応の一般性と選択性本ホウ素化は官能基共存性に優れており、エステル、シアノおよびハロゲンなどを有するアレーンおよびヘテロアレーンも利用可能である。アレーンの反応における位置選択性は置換基の立体障害による影響を大きく受け、置換基のオルト位での反応は極端に遅い。このことを利用することで、1,3-二置換型および置換基が同一の1,2-二置換型アレーンで単一の異性体が得られる。五員環ヘテロアレーンの反応は、環内ヘテロ原子の電子的影響により活性化されたα位炭素-水素結合で選択的に進行する。3.反応機構[IrCl(COE)_2]_2、4,4'-ジ-tert-ブチル-2,2'-ビピリジンおよびビス(ピナコラート)ジボロンの混合物をメシチレン中50°Cで攪拌した後に再結晶を行ったところ、トリス(ボリル)イリジウム(III)錯体が得られた。この錯体を過剰のベンゼンと反応させたところ、室温数分で完結したフェニルボランが得られた。以上の結果より、本反応の触媒活性腫はトリス(ボリス)イリジウム(III)錯体であり、この錯体への芳香族炭素-水素結合の酸化的付加およびアリール型ホウ素化号物の還元的脱離を経由してホウ素化が進行する。4.有機合成への有効利用本ホウ素化で得られたアリール型ホウ素化合物は単離・精製することなく、パラジウム触媒を用いたハロゲン化アリールとの鈴木・宮浦カップリングに利用可能であり、ワンポットで簡便に非対称ビアリールが得られる。芳香族炭素-水素結合の活性化に基づくケイ素化反応1.反応条件とケイ素化剤アラーン類の1,2-ジ-sec-ブチルー1,1,2,2-テトラフルオロジシランによる直接ケイ素化反応が、[Ir(OMeCOD)]_2および2,9-ジイソプロピル-1,10-フェナントロリンとから調製した触媒の存在下オクタン溶媒中120°Cで進行し、対応するアリール型ケイ素化合物が収率良く得られることを見いだした。また、ヘテロアレーン類の1,2-ジーterトブチル-1,1,2,2-テトラフルオロジシランによる直接ケイ素化反応が、[Ir(OMe)(COD)]_2および2-ter-ブチルー1,10-フェナントロリンとから調製した触媒の存在下オクタン溶媒中120°Cで進行し、対応するヘテロアリール型ケイ素化合物が収率良く得られることを見いだした。2.反応の一般性と選択性本ケイ素化反応は官能基共存性にも優れており、エステル、アルコキシおよびハロゲンなどを有するアレーンおよびヘテロアレーンも利用可能である。アレーンの反応における位置選択性は置換基の立体障害による影響を大きく受け、置換基のオルト立での反応は極端に遅い。五員環ヘテロアレーンの反応は、環内ヘテロ原子の電子的影響により活性化されたα位炭素-水素結合で選択的に進行する3.有機合成への有効利用本ケイ素化で得られたアリール型ケイ素化合物は、有機合成上有用なアリール化剤である。例えば、パラジウム触媒を用いるハロゲン化アリールとのクロスカップリングに利用することにより、対応する非対称ビアリールが収率良く得れる。また、ロジウム触媒を用いるα,β-不飽和ケトンへの1,4-付加に利用することにより、対応するβ-アリールケトンが収率良く得られる。ビニル位炭素-水素結合の活性化に基づくホウ素化反応1.反応条件とホウ素化剤環状ビニルエーテル類のビス(ピナコラート)

ジボロンおよびピナコールボランによるビニル位炭素-水素結合の活性化を伴う直接ホウ素化反応が、[Ir(OMe)(COD)]2および4,4'-ジ-tert-ブチル-2,2'-ビピリジンとから調整した触媒の存在下オクタン中120°Cで進行し、対応するビニル型ホウ素化合物を収率良く与えることを見出した。2.反応の一般性と選択性基質としては1,4-ジオキセン、ジヒドロピランやジヒドロフラン類が利用可能である。単純なジヒドロピランやジヒドロフラン類の反応ではα/βの選択性は低いが、γ位に置換基を導入することで高いα選択性が実現できた。また芳香族炭素-水素結合を有する基質でもビニル位でのホウ素化が高い選択性で進行する。3.有機合成への有効利用グルカール類のα位選択的ビニル位C-Hホウ素化に続くハロゲン化アリールとのクロスカップリングによる生理活性物質であるC-アリールグルカール類のワンポット合成を実現した。ベンジル位炭素-水素結合の活性化に基づくホウ素化反応アルキルアレーン類のビス(ピナコラート)ジボロンおよびピナコールボランよるベンジル位炭素-水素結合の活性化を伴う直接ホウ素化が、Pd/C触媒の存在下100°Cで進行し、対応するベンジル型ホウ素化合物を収率良く与えることを見出した。安息香酸エステル類のビス(ピナコラート)ジボロンによるホウ素化反応が、[Ir(OMe)(COD)]_2とトリス[3,5-ビス(トリフルオロメチル)フェニル]ホスフィンを組み合わせた触媒を用いることにより80°Cでオルト位選択的に進行することを見出した。本反応では配位子の選択がきわめて重要であり、dtbpyを用いた場合は上述したようにオルト位ホウ素化体は全く得られない。おそらくdtbpyの二つの窒素が強固に配位しているために基質のカルボニル酸素が配位できないためと考えられる。そこで、単座型配位子としてピリジン、トリフェニルホスフィン、およびトリフェニルアルシンを用いて検討を行ったところ、トリフェニルホスフィンで中程度のオルト選択性が認められた。続いてトリアリールホスフィンの電子的性質について検討したところ、電子供与性のものでは選択性が下がったが、電子求引性のものでは高い選択性が認められた。本反応では、ジボロンの二つのホウ素基のうち一つだけが利用可能であった。基質として、安息香酸エステルの2位、3位および4位にそれぞれ電子供与基あるいは電子求引基が置換しているものでも、対応する6位ホウ素化体が得られた。3位に置換基を有する基質では2位および6位で反応する可能性があるが、2位は置換基の立体障害のためにホウ素化は6位でのみ進行した。一般にブロモアレーン類は遷移金属に対して高い反応性を示すことが知られているが、芳香環上に臭素を有する基質でも反応はオルト位C-H結合で選択的に進行した。
戦後日本の経済外交の再検討――高碕達之助文書を中心に

本研究は「高碕達之助文書(東洋食品研究所蔵)」の整理・分析を通じて、1950年代における日本の経済外交の展開を再検討した。具体的には高碕達之助が戦後に関与した各種事業を通じて(1)外資導入、(2)アジア外交、(3)地域性、の三つの観点から日本の経済外交を捉え直すことを目指した。本研究の成果としては、第一に、満洲の製鉄技術を日印鉄鋼共同開発事業の実態を明らかにし、第二に日中民間貿易の展開とLT貿易の前史にあたる時代を分析した。そして、雑誌記事を中心に関西財界と経済外交との関わりについて解明した。以上の分析を通じて、「過渡期」と評される1950年代における日本の経済外交を民間の立場から明らかにした本研究の第一年度は以下の二点を中心に調査分析を進めた。第一に高碕文書の整理を行い、文書目録の作成とデジタル化を進めることで効率的な分析を可能にする。第二にアメリカなどで関連資料の収拾を行う。第一としては、史料を管理する公益財団法人東洋食品研究所(兵庫県川西市)において、高碕文書の整理と並行して調査分析を実施した。また研究所の許可を得た上で文書の一部を、香川大学井上研究室において、文書目録の作成とデジタル化を実施した。第二としては米国国立公文書館で1950年代の日米関係に関する史料収集を実施した。史料調査と並行して整理済の高碕文書の読み込みを進め、2014年3月に「高碕達之助と日印製鐵交渉」と題する研究報告を行い(「日本と東アジアの未来を考える委員会」2014年3月22日)、今後の研究方向に対して隣接分野の研究者から貴重なコメントを得た。第二年度(平成26年度)は、第一に、前年度に継続して、高碕文書の整理・分析並びに関係者へのヒアリングを行った。第二に、経済外交研究の前提として、前年度に引き続き復興期から1950年代前半にかけての日本経済史に関する先行研究や関連官庁の文書を読み込んだ。具体的には経済安定本部(経済審議庁)の文書を収録した史料集『経済安定本部戦後経済政策資料』及び『戦後経済計画資料』の収集・読み込みを継続した。また雑誌記事を中心に目録を作成した。第三に、高碕文書の調査と継続して、近年利用可能となった経済外交に関わる私文書の調査を行った。第四に、海外での史料調査を実施しインドのニューデリーにおいてインド国立公文書館並びにネルー図書館での関連文書ならびに書籍の収集を行った。本年度はとりわけ1950年代の日印製鐵交渉の分析に重点を置いた。海外での収集文書、高碕文書に加えて鉄鋼業界の関連雑誌記事、高碕の構想が政府側にいかに認識され、どのような形で民間構想が政府と交錯したのかを検証した。日印製鐵交渉は世界銀行の外資導入をめぐる最初の事例であり、関西の製鐵業界も関与した案件であった。本稿は、インド鉄鋼業の育成と日本鉄鋼業の発展の両立を目指した高碕構想の内容を解明し、鉄鋼業という視角から戦前から戦後へ、そして満洲からインドへと連なる高碕達之助のアジア経済開発構想の軌跡を明らかにすることで、講和直後における日本の経済外交の特質を解明した。また東洋食品工業短期大学において高碕達之助没後50年記念シンポジウムを開催するにあたってモデレータを努め、高碕研究の第一線の研究者によるパネルディスカッションを実施した。前年度に継続して、高碕文書の整理・分析並びに関係者へのヒアリングを行った。文書の調査と継続して、経済史関連の研究の読み込みを基礎に、近年利用可能となった経済外交に関わる文書・雑誌類の調査を行った。具体的には国立国会図書館デジタルコレクションで公開が進んでいる1950年代から1960年代にかけての雑誌記事の収集を進めた。前年度に引き続いて高碕の構想が政府側にいかに認識され、どのような形で民間構想が政府と交錯したのかを検証した。また高碕に関連して2016年2月に「戦後の日中貿易」と題するシンポジウム報告を実施した。高碕達之助を中心とする日中民間貿易の展開についての報告を行なった。おおむね順調に進展している。中華人民共和国での史料調査については外交部當案館が事実上の閉鎖状態が続いているので調査は延期としている。ただし、LT貿易など日中貿易に関わる部分は日本側の私文書収集によって補うことが可能と考えている。第四年度としては、これまでの調査結果の中で見落としていた箇所を中心に追加調査を行なった。まず高碕の事業の起源にあたる東洋製罐の戦前事業に着目し、東洋食品研究所において戦前の台湾の鳳梨事業に関する史料収集を実施した。また戦後の日中民間貿易の理解を深めるべくLT貿易事務所関係者へのインタビューを実施した。またカーター大統領図書館でTrilatral Commissionファイルを調査し、高碕の米中仲介工作の背景であった民主党の対中外交に関する史料を調査した。その結果高碕の戦後アジア外交の展開の起源ともいえる戦前の缶詰事業から戦後の外交への連続性への手がかりを見出すことができた。本年度は戦後を対象とした高碕達之助の人物評伝の執筆を進め、これまで収集した資料を基礎に戦後の電源開発総裁時代の借款問題について、国会図書館のデジタル雑誌記事及び電源開発(株)の社史を中心に執筆を行なった。またナセルとの交友に基づいたエジプトのアスワンダム開発計画についても調査を進めた。

研究成果としては、またLT貿易研究として富山県南砺市で「松村謙三と日中関係」と題する講演を行ない、松村と高碕の関係性について明らかにした。インドでの史料調査を基にした論文「高碕達之助と日印鉄鋼交渉」を執筆しており2017年度中に京都大学学術出版会から刊行される論文集に所収予定である。また東洋製罐の社史編纂プロジェクトとして戦前事業並びに戦後の人物小伝を執筆した。同社史も2017年内に刊行予定である。高碕の戦後の事業については電発、日中民間貿易、日ソ漁業、日印製鉄など個別的研究を重ねた結果全体像が見えつつある。一方、高碕文書の整理については戦後部分については目録化が完成しているが、戦前部分については分量が膨大であるため未だ完了していない。そのため研究計画を一年延長している。高碕の戦前事業の全体像の解明にはさらに一年を要すると考えられる。研究最終年度の本年は、これまでの調査結果の集大成として、主に研究業績を発表することを重視した。第一に兵庫県川西氏の東洋食品研究所にある「高碕達之助文書」の戦前事業編文書の整理を完了した。最終的に分量はアーカイバルボックス35箱(1666点)からなる。内容としては、1920年代後半から1940年代前半までの業務文書が中心であり、戦前の東洋製罐の事業展開を理解するためには不可欠の史料である。同文書に関しては目録を作成しており、東洋食品工業短期大学図書館において公開予定である。これをもって東洋食品研究所蔵の高碕達之助文書の整理は全て完了した。第二に、日印製鉄事業に関する研究成果を公表した。高碕文書の史料に加えてインド側資料も部分的に参照しつつ、鉄鋼業という観点から、満洲からインドへと連なる高碕達之助のアジア経済開発構想の軌跡を明らかにした。これを通じて、民間主導で進められた講和直後の経済外交の実態を明らかにすることに成功した。第三に、高碕達之助研究の到達点を示す業績として『東洋製罐グループ100年史』(東洋製罐グループホールディングス株式会社、2017年)が刊行された。本プロジェクトに当初から申請者は関わり、戦前の東洋製罐に関する事業部分(研究所の戦前事業関係文書を活用した)並びに高碕達之助人物史の執筆を行なった。このプロジェクトを通じて関係資料の追加収集を実施し、日中民間貿易交渉、日印製鉄交渉、日ソ漁業交渉や同時に高碕達之助における戦後事業と政治との関わりを明確にした。本研究は「高碕達之助文書(東洋食品研究所蔵)」の整理・分析を通じて、1950年代における日本の経済外交の展開を再検討した。具体的には高碕達之助が戦後に関与した各種事業を通じて(1)外資導入、(2)アジア外交、(3)地域性、の三つの観点から日本の経済外交を捉え直すことを目指した。本研究の成果としては、第一に、満洲の製鉄技術を日印鉄鋼共同開発事業の実態を明らかにし、第二に日中民間貿易の展開とLT貿易の前史にあたる時代を分析した。そして、雑誌記事を中心に関西財界と経済外交との関わりについて解明した。以上の分析を通じて、「過渡期」と評される1950年代における日本の経済外交を民間の立場から明らかにした高碕文書の整理については計画通りに進展し目録作成も順調である。さらにインドでの史料調査を実施したことで日印製鐵交渉の経緯を明らかにすることが可能となった。世界銀行アーカイブの史料調査については、日程の都合から第二年度は実施できなかったが第三年度での実施を予定している。
フィブロネクチン、ビトロネクチンの構造と細胞接着機能及び病態

ビトロネクチンは1983年に発見された血漿糖タンパク質で、新しい血液凝固・線溶調節因子である。本研究によって得られた新たな知見、成果は以下の通りである。1.ヒト血漿中のビトロネクチンを免疫学的手法により定量する方法を確立し、1)肝疾患患者では血漿中のビトロネクチン濃度が大きく低下していること、2)75Kと65Kの存在比はヒトにより異なり、75Kの多いI型、75Kと65Kが同量のII型、75Kの少ないIII型、の3つのビトロネクチン血液型に分類されること、3)ビトロネクチン血液型は、疾患とは関係ないこと、などの知見を得た。2.新しく開発したビトロネクチン精製法をヒト以外の動物であるウシ、ウマ、ニワトリ、ブタ、ウサギに適用し、ほとんど同じ精製度のビトロネクチンを容易に得ることができた。ヒト、ウシ以外からビトロネクチンを精製したのは世界初である。3.ヒト血漿ビトロネクチンに対するマウスモノクローナル抗体を調製した。結局4つのハイブリドーマが確立し、抗体としてM1、M2、M4、M5、が得られた。この4種の抗体を用いて、ビトロネクチンの細胞伸展活性とコラーゲン結合活性の阻害を調べ、ビトロネクチンのコラーゲン結合ドメインがビトロネクチン分子のN末端半分側に存在する知見を得た。4.ビトロネクチンをギ酸処理し、得られた断片をアフィニティカラム、イオン交換カラム、ゲルろ過カラムにより、コラーゲン結合ドメインと推定される断片を精製することができた。このような多くの研究の成果が得られ、当初計画以上の大きな進歩が見られた。ビトロネクチンは, 1983年にRuoslahtiにより発見・命名された動物血奨中の細胞接着性糖タンパク質である.ヒト血奨中に,約0.2mg/mlの濃度で存在し,肝臓で合成・分泌される.分子量75,000(以下75kDと略)の単量体であるが,生体内で既に一部は65kDに分断されている.私たちは,この糖タンパク質ビトロネクチンの生化学的な性状をより深く解明することを目的にビトロネクチンの分子量75kDと65kDの測定とビトロネクチン精製法の研究を行なった.ビトロネクチンは,新鮮な血奨中で既に,分子量75kDのポリペプチドと,それが一部断片化した65kDのものの混合物として存在する.しかし, 75kDと65kDの機能の差や, 75kDから65kDへの断片化の過程,断片化の生理的意味などは全く不明である.一方,たまたま入手したヒト血奨中の75kDと65kDの存在比が血奨によって異なることから, 75kDと65kDの存在量を決定している因子を探索する計画を立てた. 75kDと65kDの比を, 200余名のヒト血奨・血清について測定した.まず,一検体0.1μlの血奨・血清で測定可能な方法を開発した.驚くべきことに, 75kDと65kDの存在比は, 65kDの多い人,中程度の人,少ない人の3つのグループに,はっきりわかれる.この3つのグループが,ヒトのどのような因子と対応しているのか,今のところ,全くわからない.しかし,同時に測定したビトロネクチンの血奨中濃度は,肝疾患患者では有意に低い値を示し,大変興味深い.また,ビトロネクチンの新しい精製法の開発を試み,ヘパリン固定化カラムを使用する画期的な精製法を確立することができた.この方法により従来法の450倍の効率を達成できた.

通常, 100mlのヒト血清より, 1530%の回収率で, 36mgのビトロネクチンが23日で精製できる.ビトロネクチンは1983年に発見された血漿糖タンパク質で、新しい血液凝固・線溶調節因子である。ビトロネクチンは、トロンビン・抗トロンビンIII複合体に結合するばかりでなく、血小板や線維芽細胞に作用して、それらの細胞外マトリックスへの接着を促進し、生体内では、多彩で巧妙な働きをしていると思われる。しかし、今まで、ビトロネクチンの精製が困難であったために、ビトロネクチン分子の構造と機能の解明は十分ではなかった。本研究によって得られた新たな知見、成果は以下の通りである。1.ヒト血漿からビトロネクチンを精製する方法の主要な点は、本研究代表者により概ね確立していたが、その後新たに出現した操作上の問題点を改善し、完成度の高いビトロネクチンの精製法を確立した。2.上記の精製法をヒト以外の動物であるウシ、ウマ、ニワトリ、ブタ、ウサギに適用し、ほとんど同じ精製度のビトロネクチンを容易に得ることができた。ヒト、ウシ以外からビトロネクチンを精製したのは世界初である。3.ヒト血漿ビトロネクチンに対するマウスモノクローナル抗体を調整した。結局4つのハイブリドーマが確立し、抗体としてM1、M2、M4、M5が得られた。この4種の抗体を用いて、ビトロネクチンの細胞伸展活性とコラーゲン結合活性の阻害を調べ、ビトロネクチンのコラーゲン結合ドメインがビトロネクチン分子のN末端半分側に存在する知見を得た。4.ビトロネクチンをギ酸処理し、得られた断片をアフィニティカラム、イオン交換カラム、ゲルろ過カラムにより、コラーゲン結合ドメインと推定される断片を精製することができた。このような多くの研究成果が得られ、当初計画以上の大きな進歩が見られた。