hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
若年者の性腺被ばくに由来する妊孕性の異常の解析と予防法の開発

28年度では、性腺未成熟な生後4週齢の雄マウスを使用し、1.5-4.5Gyの全身照射を実施して照射8週間後に正常雌マウスと10日間の同居を実施し、雌マウスに対する受胎能力(妊孕性)について検討した。すなわち、照射雄マウスと正常雌マウスの交尾により、照射による妊孕性(妊娠率、産仔数、妊娠日数)の影響について検討した。妊娠率は非照射雄マウスに対して照射マウスで70-80%と低下した。産仔数では非照射雄マウスで平均12.5匹の出産数であり、3.0-4.5Gy照射で平均8.6匹の出産数であった。妊娠日数は各群とも22-23日で変化は認められなかった。4週齢雄マウスの正常雌マウスに対する妊孕性に対する障害は4.5Gyの全身照射マウスで明らかに発現した。29-30年度では、4.5Gy全身照射雄マウス(4週齢)に対して当研究室にて放射線防護効果が研究されている培養担子菌抽出物質(以下:菌抽出物)を含む飼料を給餌して妊孕性の向上効果を検討した。照射8週後(12週齢)で正常雌と同居させた結果、照射単独群(非投与)に対して菌抽出物投与雌マウス群では、妊娠率および新生仔育成率(生存新生仔/子宮の着床痕数)の上昇が認められた。また、性成熟に達している8週齢の雄マウスに4.5Gy全身照射を実施し、照射8週後に正常雌と同居させた結果、照射マウスの妊娠率は100%であり、産仔数も非照射正常マウスと同等の出産数であった。また、8週齢で照射後に菌抽出物添加飼料を給餌した雄マウスでは、同居雌マウスの産仔数が照射単独マウスに対して有意な増加が認められた。これらの結果は、生後4週齢の性腺未成熟マウスの被ばくが、性成熟に達した8週齢マウスの被ばくより、強い影響(放射線障害)を受ける可能性を示唆している。また、照射マウスのリンパ球や精巣の組織に対しても菌抽出物投与により障害が改善された。本研究は、若年者の被ばくに注目し、特に性腺の未成熟時における低線量放射線被ばくが若年者の性成熟過程、もしくは成長後の妊孕性・出産および新生児の発育成長におよぼす影響について基礎的な解析を実施する目的で計画した。ヒトに対する放射線被ばくの影響は、我が国に投下された原爆被害者の疫学調査や放射線生物学の研究により得られた多くの科学的知見の集積から検討され、線量限度が健康管理に用いられている。ICRPでは妊娠初期の放射線被ばくによって影響をおよぼす最低線量(しきい線量)は0.1Gyであり、生殖腺に対する確定的影響のしきい線量(ICRPPubl.60)は、男子の永久不妊で3.56.0Gy、女子では0.651.5Gyとしている。小児がんの放射線治療で生殖組織(正常組織)が最も被ばくする疾患は血液がんであり、骨髄移植の前処置として全身照射が実施され、総線量が12Gyを超える照射が骨髄移植の前処置として実施されている。しかし、最近ではミニ移植の概念から高齢者のみならず、小児においても免疫抑制と晩期の放射線障害の軽減を目的とした低線量(総線量24Gy)照射が実施されている。この骨髄移植前処置としての放射線照射総線量24Gyは、男子の一時不妊(0.1Gy以上)から永久不妊(3.56.0Gy)を発症する線量である。本研究では、未成熟マウスの低線量放射線被ばくによる性腺に対する障害について、特に雄マウスの精子造成、妊孕性および出産後の新生児の発育に対する異常の発生について基礎的な研究を実施し、さらに当研究室にて放射線防護作用が研究されている「培養担子菌抽出物質」が抗酸化剤として放射線障害を防御および修復する可能性を検討する。28年度(初年度)では、動物種間では放射線の感受性が異なり、全身照射による致死線量(LD50/30)では、マウスはヒトの23倍ほど放射線に抵抗性である。本年度では、性腺未成熟雄マウスの生殖腺に対する線量を検討する予備実験から実施した。被ばく雄マウスに対する妊孕性の実験は、いくつかの予備試験を実施して以下の方法で行なわれた。性腺未成熟として生後4週齢の雄マウスを使用し、1.5Gy、3.0Gyおよび4.5Gyの全身照射を実施して照射8週間後に正常雌マウスと10日間の同居を実施した。同居終了後に雌雄を分離して雌マウスの妊娠率、産仔数、妊娠日数について検討した。妊娠率は非照射マウスの100%に対して1.54.5Gyでは7080%と低下し、産仔数では非照射マウス1匹で平均12.5匹の出産数であり、3.0および4.5Gyでは、平均78匹の出産数であった。また、妊娠日数は各群とも23日で変化は認められなかった。雄マウスの妊孕性に対する照射の影響は4.5Gyで明らかに発現した。この結果より、「培養担子菌抽出免疫賦活物質」を1.5%配合した飼料を雄マウス給餌(1.5%ABM飼料)して4.5Gy被ばく雄マウスの妊孕性に対する障害の軽減効果について検討した。1.5%ABM飼料を給餌した雄マウスでは、同居雌マウスの妊娠率、産仔数および新生仔育成率に被ばく障害軽減効果が認められた。

低線量放射線被ばくが若年者の性成熟過程、もしくは成長後の妊孕性・出産および新生児の発育成長におよぼす影響について基礎的な解析を実施する目的で計画した。ヒトに対する放射線被ばくの影響は、我が国に投下された原爆被害者の疫学調査や放射線生物学の研究により得られた多くの科学的知見の集積から検討され、線量限度が健康管理に用いられている。ICRPでは妊娠初期の放射線被ばくによって影響をおよぼす最低線量(しきい線量)は0.1Gyであり、生殖腺に対する確定的影響のしきい線量(ICRP Publ.60)は男子の永久不妊で3.5-6.0Gy、女子では0.65-1.5Gyとしている。小児がんの放射線治療で生殖組織(正常組織)が最も被ばくする疾患は血液がんであり、骨髄移植の前処置として全身照射が実施され、総線量が12Gyを超える照射が骨髄移植の前処置として実施されている。最近ではミニ移植の概念から小児においても免疫抑制と晩期の放射線障害の軽減を目的とした低線量(総線量2-4Gy)照射が実施されている。この骨髄移植前処置としての放射線照射総線量2-4Gyは、男子の一時不妊(0.1Gy以上)から永久不妊(3.5-6.0Gy)を発症する線量である。本研究では、未成熟マウスの低線量放射線被ばくによる性腺に対する障害について、特に雄マウスの精子造成、妊孕性および出産後の新生児の発育に対する異常の発生について基礎的な研究を実施し、さらに当研究室にて放射線防護作用が研究されている「培養担子菌抽出物質」が抗酸化剤として放射線障害を防御および修復する可能性を検討した。これまでに照射時に性成熟に達した8週齢の雄マウスに対して性腺未成熟4週齢マウスで放射線障害が強く発現され、「培養担子菌抽出物質」添加飼料の給餌により障害の軽減が認められた。平成28年度では、性腺未成熟雄マウスの生殖腺に対する線量を検討する予備実験から実施した。性腺未成熟として生後4週齢の雄マウスを使用し、1.5-4.5Gyの全身照射を実施して照射8週間後に正常雌マウスと10日間の同居を実施して雌マウスの妊娠率、産仔数、妊娠日数について検討した。妊娠率は非照射マウスの100%に対して1.5-4.5Gyでは70-80%と低下し、産仔数では非照射マウス1匹で平均12.5匹の出産数であり、3.0および4.5Gyでは、平均8.6匹の出産数であった。妊娠日数は各群とも22-23日で変化は認められなかった。4週齢雄マウスの正常雌マウスに対する妊孕性に対する障害は4.5Gyの全身照射マウスで明らかに発現した。平成29年度は、4週齢の雄マウスに対する4.5Gy全身照射による妊孕性の変化を当研究室にて放射線防護効果が研究されている培養担子菌抽出物質(以下:菌抽出物)を含む飼料を給餌して検討した。4.5Gy照射8週後(12週齢)で正常雌と同居させた結果、照射単独群(非投与)に対して菌抽出物投与雌マウス群では妊娠率および新生仔育成率(生存新生仔/子宮の着床痕数)の上昇が認められた。性成熟した8週齢の雄マウスに4.5Gy全身照射を実施し、照射8週後に正常雌と同居させた結果、照射マウスの妊娠率は100%であり、産仔数は14-15匹で非照射正常マウスと同等の出産数であった。また、照射後菌抽出物添加飼料を給餌した雄マウスでは、同居雌マウスの産仔数が照射単独マウスに対して有意な増加傾向が認められた。これらの結果は、生後4週齢の性腺未成熟マウスの被ばくが、性成熟に達した8週齢マウスの被ばくより、強い影響(放射線障害)を受ける可能性を示唆している。28年度では、性腺未成熟な生後4週齢の雄マウスを使用し、1.5-4.5Gyの全身照射を実施して照射8週間後に正常雌マウスと10日間の同居を実施し、雌マウスに対する受胎能力(妊孕性)について検討した。すなわち、照射雄マウスと正常雌マウスの交尾により、照射による妊孕性(妊娠率、産仔数、妊娠日数)の影響について検討した。
教育現場で使用できる雪の顕微鏡観察と人工雪生成実験

雪の結晶は自然の美の象徴であるにも拘わらず、これまで教科書に登場することはほとんどなかった。その大きな理由の一つは、北海道や標高の高い場所は別として、降った雪がすぐ融けてしまい、観察の対象になり得なかったことである。本研究では、ドライアイスや、氷と塩を用い、顕微鏡下の必要な部分のみ冷却し、雪を冷凍保存して観察する方法(部分冷却法)を開発し、比較的気温の高い北陸地方でも十分自然雪の観察ができることを実証した。この自然雪の観察を総合学習のテーマとして取り上げる場合、どのような展開が可能か、その参考になると思われる実践的研究を行った。また、これまで、人工雪生成実験は結晶学、あるいは気象学の対象として、殆ど専門家のみによって行われていた。本研究では、氷と塩を用いて得られる低温が人工雪生成に適した温度であることに注目し、カップラーメンの容器や、魔法瓶など、身の回りの身近な道具を用いて人工雪生成実験を行い、非常に対称性のよい人工雪が比較的簡単にできることを明らかにした。この実験の中で、結晶の核生成に、静電気が大きな役割を果たす事もわかった。本研究のもう一つの目的は、この人工雪生成実験を、我が国や外国の教育現場に普及させることであった。そのために、福井市内の中学校理科の選択授業を利用して、出張実験を行った。また、大学の公開講座を利用して一般の人々にも実験を公開し、地元のテレビや新聞でその内容が詳しく報道された。さらに、14年10月には、インドネシア大学、及び全北大学(韓国)を訪問し、人工雪実験について講演および実践指導を行った。前回使用した人工雪生成装置はスチロール容器とプラスチック容器を組み合わせて作った。しかし、この方法では周囲からの輻射熱を十分遮断できない。今回は魔法瓶を用い、その中に寒剤を入れ、その上に、帯電したプラスチックの板などを置いて結晶生成する方法を確立した。この方法で、実際熱帯地方でも人工雪が生成できることを、インドネシア国で実験し確認した。しかし、空調の完備した室内で、かつ室内の湿度を抑えて実験しなければならない。本年度研究の最大の成果は、これまで紙やプラスチックの板などの表面にしか人工雪ができなかったものを、細い毛の上にまで人工雪が出来るよう発展させたことである。方法は、魔法瓶中の寒剤の上に、底を黒く塗った小さなプラスチックシャーレを置き、そのシャーレの中に、帯電させたタンポポの綿毛を置き、毛を-12°Cから-15°C程度に冷却したところで、上部に水分を適当に含ませたティッシュペーパーを置き、水蒸気を上部より少しずつ供給する。水蒸気を送り始めてから、約数分でタンポポの綿毛に立体的、かつ非常に対照的な人工雪ができる。タンポポの綿毛の一本を70倍程度の顕微鏡で観察すると、毛の所々に鋭い尖ったトゲがあることが分かった。帯電した電荷がこの尖ったトゲに集まり、それが結晶成長の核になっていることも明らかにした。この成果をすぐ、日本雪氷学会誌に投稿し、15年1月号に掲載された。タンポポ以外の植物の細い毛を用いた実験も行なっているが、毛の特徴によってできる結晶に幾分傾向の差が認められる。しかし、結晶形の差は主に、温度と水蒸気の量に依存している。この研究によって初めて、極めて自然の雪に近い人工雪が簡単な装置を使ってできるようになった。14年度の研究において、身近にある物を用いて比較的簡単に人工雪ができることを示したが、日本の夏や、熱帯地方のような、高温・多湿の条件下での人工雪生成はなお困難であった。今年度はこの点を改良するために、20l程度のポリ容器の中にシリカゲルを入れ簡易ドライボックスとして用い、その中に寒剤を入れた魔法瓶を置き、魔法瓶内の空気を乾燥した空気と置換する方法を採用した。

この結果、気温28°C、湿度70%のような高温・多湿の室内でも人工雪ができることがわかった。また、冷蔵庫内に魔法瓶を置き、冷蔵庫内の乾燥した空気を利用する方法も開発した。今年度のもう一つの成果は、いままでの人工雪実験には、観察物体と顕微鏡対物レンズの先端との距離(作動距離)が長い実体顕微鏡が不可欠であったが、通常の生物顕微鏡を用いても人工雪観察ができるよう装置を工夫したことである。これは、2段構成のスチロール容器を用いて人工雪生成を行い、人工雪ができたのち、上部のスチロールを下部の寒剤の中に沈めていく方法で可能にした。これによって実体顕微鏡を持たない開発途上国でも人工雪の実験ができるようになった。今回の研究の結果、結晶の対称性や大きさにおいて、自然の雪と殆ど変わらない人工雪が、教育現場で比較的簡単にできるようになった。これらの成果は15年、12月、福井大学で開催された、応用物理学会、物理教育分科会シンポジユウムにおいて実演発表した。
神経芽腫担癌状態下の骨格筋、腎臓におけるグルタミン動態

1.本研究は、担癌状態のマウスを用いて骨格筋および腎臓での悪性腫瘍の増殖過程におけるグルタミンに対する影響を研究した。モデルとしてA/Jマウス神経芽腫C-1300を用いて作製した担癌状態のマウスを用いて実験を行った。2.方法として、無処置のマウス及び腫瘍細胞を移植した移植後7日目、14日目、21日目のマウスを用い、それぞれの血中のアミノ酸濃度(グルタミン濃度)を調べた。さらに大腿四頭筋、腎臓のグルタミンシンセターゼ活性およびグルタミン濃度も測定した。また腫瘍を切除し腫瘍の重量を測定し、それぞれのデータを比較検討した。3.結果は、まだ実験途中でありグルタミンシンセターゼ活性も不安定なためデータを検討中である。4.本研究の意義としては神経芽腫の担癌状態でのグルタミン代謝を解明することにより、小児の難治性悪性固形腫瘍である神経芽腫の治療中における至適栄養環境を究明することにある。5.今後はさらに神経芽腫の担癌状態のマウスモデルを用い、神経芽腫の生化学的特徴を研究していく方針である。
代数曲線の退化族の局所符号数とモノドロミーに関する研究

まず半安定還元に伴う(古田型の)局所符号数の変動項を明示表示するという目標については,Atiyah-Singerの同変符号数定理を応用して達せられた。答は,valency, screw number等のNielsen-松本-Montesinosによるモノドロミー情報からDedekind和を用いて書き下せる。具体的には,京大数理研講究録No.1345中の筆者の解説記事pp.203-237中に示してある。吉川謙一氏の定義した井草保型形式を経由する局所符号数を,古田幹雄氏のワク組みで理解することもほぼ可能になり主な論点は上の解説記事にも入れた。ただケーラー計量のとり方にもっと精密に議論すべき点があることを吉川氏に指摘されたので,その方面はまだ考察中である。また吉川氏の局所符号数の半安定還元に伴う変動項も,正則Lefsthetz不動点公式(Atiyah-Botl-Singer-Segal)を応用することにより可能になり,研究集会「Hodge理論・退化・複素曲面の代数幾何とトポロジー」で発表した。以上の成果を論文にまとめるための準備を,現在進めている。大域的な曲面上の曲線束に対し,符号数の局所集中性を問う"枠組み"はいくつか知られているが、このうち古田幹雄氏が2000年に与えた局所符号数の定義が,我々の代数幾何的な動機とも良くマッチすることが,当該研究期間中にしだいに明らかになってきた。その要因は曲線束の持つ"特殊性"が考察すべきファイバー芽の境界となるS^1上のリーマン面束の相対接束のフレーミングを規定することから来ている。また,もとのファイバー芽とそれの半安定環元したファイバー芽の(古田の意味での)局所符号数の比較も,境界付多様体に対するAntiyah-Patodi-Singer式の同変数定理を応用することにより、位相モノドロミーを規定する松本-Mantesionsの不変量に関するデデキント和を用いて記述できる事も明らかになった。そこで現在,「T.Ashikaga, Defect of Furuta's local signature of pencils of curves(仮題)」というタイトルで,これらの研究成果を論文にまとめつつある。現在まだ未完成であるが,鋭意感性に向けて努力したい。しかしこの方面の研究はまだまだ未開拓な面が多く,代数幾何やトポロジーなど複数の領域の境界にあって魅力を保ち続けているので,さらなる研究を継続していきたい。まず半安定環元に伴う(古田型の)局所符号数の変動項を明示的に表すという目標について,Atiyah-Singerの同変符号数定理を応用して達せられた。答は,Valency, screw number等のNielsen-松本-Montesinosによるモノドロミー情報からDedekind和を用いて書き下すことができる。その公式の形は,京大数理研講究録No.1345中の筆者の解説記事pp.203237中に書き下してある。また,吉川謙一氏の定義した井草保型形式を経由する局所符号数を,古田幹雄氏のワク組みで理解することもほぼ可能になりその論点は上の解説記事にも入れた。また吉川氏の局所符号数の半安定環元に伴う変動項も,正則Lefschetz不動点定理(Atiyah-Bott-Singer-Segal)を応用することにより可能になり,そのことを16年3月の研究集会「Hodge理論・退化・複素曲面の代数幾何とトポロジー」の講演の中で発表した。以上の成果を論文にまとめるべく,現在準備を進めている。
プラスミドとファージキメラによる複製開始蛋白質の機能解析

2、更にP1 RepAはin vivoの系でRts1 oriからの複製を開始させ得た(oriの活性化)が、その効率は極めて低かった。(2)の知見を基に、P1 RepAの一部をRts1 RepAの対応する領域と置換し、Rts1 ori活性化の効率が増加する領域を同定することを試みた。その結果、次のことが明らかになった。4、Rts1 RepAの中央部(145-176AA)をP1 RepAに置換挿入したところRts1 oriを強く活性化した。6、以上より、Rts1 RepAとP1 RepA分子上には、それぞれのoriを特異的に活性化するドメイン(145-176AA)があること、そしてその領域はin vitro ori結合に関与するドメイン(113-144AA)に隣接はしているが、明らかにそれとは区別できる領域であることを明らかにした。プラスミドRts1の複製開始蛋白質RepA(288アミノ酸残基)の持つ2つの機能、すなわち複製開始点oriに結合してDNA複製を開始させるポジティブな働きと、開始した複製反応を制御するネガティブな働きがRepA分子上どこに局在するかを解明する目的で本研究を行った。そのため、Rts1-RepA分子と相同性が高く、しかし特異性の異なるP1ファージの複製開始蛋白質RepA(286アミノ酸残基)との間で一連のキメラ蛋白質RepALXnを作成し、機能を解析した。研究結果2、P1-oriに対するin vitro結合能:LX_<12>_<15>が結合し、LX_<17>は結合しなかった。3、P1-oriに対するin vivo活性化:LX_2,_3のみがP1-oriからの複製開始能を示した。2、3は、Rts1-RepAをN末端側、P1-RepAをC末端側をするキメラ蛋白質RepAXnに対応する成績であり、Rts1-RepAのN末端側113129aa部位にRts1-ori結合能、これに177206aa部位が加わることによりRts1-oriが活性化されるとのすでに得られた知見を強く支持する。4、Rts1-oriに対するin vitro結合能:LXnの全てが結合した。P1-RepAwtがRts1-oriに結合できることから、このことは当然の帰結と考えられる。なおRts1-RepAwtはP1-oriに結合できない。5、RepALX_<15>について:Rts1-oriに強く結合し、且つRts1-oriを強く活性化した。興味あるキメラRepAである。6、複製開始を制御する機能については現在実験中である。プラスミドRts1とファージP1の複製開始蛋白質(共にRepAと名付けられている)は、各々の複製開始点oriに特異的に結合することにより、DNA複製が開始される。Rts1 RepA蛋白(288アミノ酸残基)の機能的ドメインを明らかにするために、P1 RepA蛋白(286aa)との間でキメラ蛋白質を作成し、機能解析を行った。昨年度報告した、N末端側がP1 RepA由来、C末端側がRts1 RepA由来のP/Rタイプキメラのほか、今年度はP1 RepA中央部を、これに対応するRts1 RepAに置換したP/R/Pタイプキメラを作成し、Rts1 oriに対するin vitro結合能、in vivo活性化能のみでなく、P1 oriに対する機能も詳細に調べた。これに加え、Rts1 ori,P1 oriを構成する主要部分(direct repeats)から最も重要と推定される各々19bpのオリゴヌクレオチドを合成し、それに対するin vitro結合能も調べた。研究結果1)P1 RepAのP1 ori DNA結合には113-144aa領域が重要である。この領域は、Rts1 RepAのRts1 oriに対する結合に必要な領域(113-129aa)と重複する。2)P1 RepAのP1 ori活性化に必要な領域は、上記DNA結合ドメインに加え、145-176aaと206-256aaの両領域を必要とする。145-176aa領域は、Rts1 RepAのRts1 oriに対するori活性化ドメインと一致することがP/R/PタイプキメラRepAの解析により確認された。(3)Rts1 RepA,P1 RepAはそれぞれ19merの合成oriに特異的に強く結合した。しかしori活性化能を持たないキメラRepAのいくつかも合成oriへの結合能を示した。

このことはori DNAへの特異的な結合能とori活性化能は必ずしも一致しないことを示唆する。プラスミドRts1の複製開始蛋白質RepA(288アミノ酸残基)と大腸菌ファージP1の複製開始蛋白質RepA(286AA)は、それぞれの複製開始領域oriに結合することによりDNA複製を開始させる。今年度本研究において、RepA(Rts1,P1)とori(Rts1,P1)のin vitro、in vivoの相互作用を解析することにより、次のような実験成果が得られた。2、更にP1 RepAはin vivoの系でRts1 oriからの複製を開始させ得た(oriの活性化)が、その効率は極めて低かった。(2)の知見を基に、P1 RepAの一部をRts1 RepAの対応する領域と置換し、Rts1 ori活性化の効率が増加する領域を同定することを試みた。その結果、次のことが明らかになった。4、Rts1 RepAの中央部(145-176AA)をP1 RepAに置換挿入したところRts1 oriを強く活性化した。6、以上より、Rts1 RepAとP1 RepA分子上には、それぞれのoriを特異的に活性化するドメイン(145-176AA)があること、そしてその領域はin vitro ori結合に関与するドメイン(113-144AA)に隣接しているが、明らかにそれとは区別できる領域であることを明らかにした。
サブナノ細孔場内分子クラスター濃縮系化学

疎水性ナノ空間中での水分子クラスターの構造0.7から1.3nm細孔径のスリット型カーボンナノ空間中の水分子集団構造のx線回折を143Kから303Kの温度範囲で測定し、電子動径分布関数解析するとナノ空間中の水分子集団とバルクの水とが、0.3・0.5nmの近距離構造に大きな差異を持つことが見い出された。疎水性ナノ空間中では、水分子は細孔壁に吸着されというよりは、互いにクラスターを形成しながら、規則構造形成を進めていると言える。143Kでは、バルクの氷のような動径分布構造をとるが、分布のピーク位置は303Kのものと変わらなかった。このミクロ孔内の水の構造を明かにするために、回折シミュレーションを実施した。これによると、細孔内の水の構造は氷I_h構造とは異なることが明らかになった。CC1_4のナノ空間中でのプラスチック結晶構造形成0.6から1.8nmの範囲で細孔径の異なるスリットグラファイト細孔中に303KでCC1_4が吸着する様子を、モンテカルログランドカノニカル法で検討すると、細孔径が1.0nmの時のみ、動径分布曲線が他のものと違っている。この動径分布は文献で低温のバルク相で認められるプラスチック結晶構造とほぼ一致する。更に、この構造は実験的にもx線回折から見い出した。
自己免疫疾患と不妊症に関する分子解剖学ー発症と精子発生チェックポイントとの関連ー

MRL/MpJマウスは自己免疫疾患および精子発生異常モデルとして知られる。本研究では、このマウスを用いて血液精巣関門(BTB)のチェックポイント機能を解析した。Claudin3はBTB通過時の精母細胞に局在し、発現を抑制するとBTB通過が抑制された。精巣内卵細胞の責任因子は第1染色体に座位し、自己免疫疾患との関係が疑われる。ビタミンA欠乏実験によって、BTBは精細胞の分化調節を担う構造と考えられた。熱ショックによるBTB破綻耐性因子および石灰沈着緩解因子が第1ならびに第11染色体上にあることを示した。とくに、MRL型1番染色体テロメア領域は重要で、今後は候補遺伝子の同定が急がれる。精子発生チェックポイントは細胞品質管理機構である。MRLマウスは自己免疫疾患および精子減少症モデルとして知られる。本研究の目的は、精子発生チェックポイントと自己免疫疾患発症の関連について明らかにすることである。今年度は、候補アリルをMRL型に維持したまま、バックグラウンドをC57BL/6に置換したコンジェニックマウスを作出した。すなわち、MRLマウス第1および第2染色体上にある精母細胞アポトーシスを表現型とする遺伝子座を持つコンジェニックマウス(B6.MRLc1、B6.MRLc2)、および精巣内卵細胞を表現型とする遺伝子座を持つコンソミックマウス(B6.MRLcY)を作出し、それらの自己免疫疾患発症を観察した。その結果、B6.MRLc1コンジェニックマウスで膜性増殖性糸球体腎炎の像を呈し、メサンギウム増殖、糸球体基底膜の肥厚・免疫複合体沈着、足細胞傷害、糸球体スリット膜関連分子の発現低下ならびに炎症メディエーターの発現増強等を示したことから、自己免疫性糸球体腎炎の発症が確認された。さらに本マウスの膵臓でCD3陽性T細胞およびB220陽性B細胞の浸潤が有意に高く、一部に腺房細胞の破壊像が観察された。しかし、本マウスは高い血中抗DNA抗体価を示すが、血中リパーゼおよびアミラーゼの活性とは十分な相関が得られなかった。MRLマウス同様に、B6.MRLcYマウスは精巣内卵細胞を有することから生殖細胞分化に異常のあることが確認された。さらに、精巣内卵細胞の出現を決める因子は9番染色体上にもあることが推測された。高温曝露によって実験的不妊症を誘発したMRLおよびB6の精巣では、重度の精細管腔内石灰沈着が出現したが、B6.MRLc1の精巣では石灰沈着の発生が抑制されていた。研究を続行するうち、昨年度に完成したコンジェニックマウス(B6.MRLc1)において、自己免疫疾患が精子発生だけではなく全身性に発症していることを発見した。そこで、自己免疫疾患と不妊症発症とが間接的に関連している可能性を探るため、膵臓に着目して研究を続けた。今年度は、精子発生チェックポイントに異常を示すB6.MRLc1ならびに各種近交系マウスを用いて、自己免疫性慢性膵炎の発症を検討した。マウス膵臓には単核細胞浸潤像が認められ、細胞浸潤の出現頻度と面積の組織計測値はいずれもA/J、AKR/N、B6、MRL、B6.MRLc1で高く、DBA/1J、DBA/2では中程度で、BALB/c、C3H/Heでは細胞浸潤が稀であった。さらに各系統の両計測値は雌で雄よりも高値を示した。B6、MRL、B6.MRLc1を精査したところ、浸潤細胞は導管と血管周囲に認められ、MRLとB6.MRLc1では腺房細胞間への浸潤像も観察された。浸潤細胞は主にT細胞とB細胞で、一部細胞増殖マーカーPCNAに陽性を示した。細胞浸潤の出現頻度と面積は6ヵ月齢以降加齢性に増加・拡大傾向にあり、MRLとB6.MRLc1の浸潤面積はB6よりも有意に大きかった。B6.MRLc1の血中dsDNA抗体とLIPの濃度はB6よりも有意に高値だった。加齢性に出現するマウス膵臓への細胞浸潤は遺伝学的背景に左右され、特にMRL型1番染色体テロメア領域はB6の自己抗体濃度を高めると共に、膵臓への細胞浸潤様式を変化させ、浸潤巣の拡大や膵機能悪化といったMRL様の病態を導くと考えられた。

平成26年度は、各種コンジェニックマウスを加えた多方面から、自己免疫疾患と不妊症に関する解析を、精巣ならびに卵巣を用いて行った。精巣においては、血液精巣関門(BTB)の構成蛋白の動態と精子形成細胞分化との関係を解析し、BTB機能の一端を解明した。すなわち、密着結合蛋白であるClaudin3がBTB通過に重要な役割を果たすことが明らかとなった。次に、ビタミンA欠乏食給餌マウスを用いて不妊症モデルを作出し、BTB形成と精子形成細胞分化の関連を解析した。その結果、Second wave以降の両者に遅延が見られた。このことから、BTBは持続的な精子形成を維持する為に必須の構造であり、その破綻は雄性不妊症の一因となることが明らかとなった。そこで、不妊症モデルとして、各種マウス精巣に熱ショックを与え、精子形成過程の変化を観察した。その結果、自己免疫疾患マウスでは熱ショック耐性の傾向が認められたが、石灰沈着傾向が正常マウスと同様に観察された。一方、コンジェニックマウスでは驚くことに石灰沈着が観察されなかった。現在、自己免疫疾患因子ー熱ショック耐性因子ー石灰沈着誘導因子の因果関係を追跡中である。さらに、自己免疫疾患モデルマウスであるMRL/MpJの新生子卵巣に出現する肥満細胞が不妊症に関連する可能性を検討した。その結果、肥満細胞は生後0日で卵巣表面上皮直下のnestに局在することがわかった。nestの中で、肥満細胞は不良卵細胞を選択的に排除し、かつ良質な卵細胞の卵胞形成を早めていることが明らかとなった。これらの所見は、肥満細胞を介した免疫機構と生殖機構の新たな機能的関連を示す。26年度が最終年度であるため、記入しない。獣医解剖学26年度が最終年度であるため、記入しない。自己免疫疾患の発症と不妊症の発症とが同一系統のコンジェニックマウスで確認されたことは、今年度の目的を十分に達成できたと評価した。精子減少症の原因遺伝子座を固定したコンジェニックマウスを作出し、自己免疫性腎臓病に引き続き慢性膵炎の発症が確認されたことは、今年度の目的を達成できたと評価した。各血液精巣関門因子を蛋白レベルで検出すると共に、電子顕微鏡による形態観察を行う。引き続きコンジェニックマウス作出および解析を行う。メチル化酵素に対する抗体およびプローブを用いて生殖細胞の分化過程を解析し、自己免疫疾患との関連性を検討する。雄の不妊症は、精巣における血液精巣関門(BTB)の異常と密接に関連することから、BTB機能の解明を目指す。そのためにBTB構成蛋白の局在ならびにビタミンA欠乏による不妊症モデルの解析を行う。新たに発見された高温曝露精巣の石灰沈着現象がB.MRLc1マウスでは出現しなかった。これをマイクロアレイ等の分子生物学的に解析するための予算を翌年度予算と併せて使用する計画である。また、精巣内卵細胞出現を決定する9番染色体コンジェニックマウスの作出を、資金を要するスピードコンジェニック法で実施する計画である。平成25年度では、補助金は計画通り支出したが、助成基金助成金に関しては372,658円を平成26年度に繰り越した。うち約29万円は、大学の会計システムが新規導入されたことに伴い自動的に事務処置遅延が生じたもので、平成26年度のシステム上に計上されている。約8万円は、最終年度である平成26年度に研究用抗体1点を新たに購入する目的で残した。
血管内皮PDK1の糖代謝及び膵β細胞に及ぼす病態生理学的役割の解明

VEPDK1KOマウスでは12週齢において腹腔内ぶどう糖負荷試験を施行すると、コントロールと比較し、血糖値には違いがないが、インスリン値は低値であった。また、経口ぶどう糖負荷試験を施行すると、15分値で有意にVEPDK1KOマウスは耐糖能が増悪しており、インスリン値も低値であった。これらの結果からインクレチンホルモンの感受性に違いがあると仮定して、Ex-4を前投与した後に腹腔内ぶどう糖負荷試験を施行したところ、VEPDK1KOマウスの耐糖能は有意に増悪していた。さらにEx-4を添加したGSISではインスリン分泌の差はより顕著となった。血圧には変化がないものの、Microsphere実験で特に膵島における血流低下がKOマウスで顕著であった。膵島内CD31陽性面積は有意にKOマウスで低下していた。Pimonidazole染色ではpimonidazole陽性β細胞は有意にKOマウスで増加していた。実際にTUNEL染色、Ki67染色の結果、KOマウスでは有意にapoptosisが増加し、増殖は低下していた。単離膵島のmRNAを評価したところ、虚血にかかわるhif1αをめとするその下流遺伝子は、vegfaを含め有意に上昇していた。さらに興味深いことにIns1,Ins2, MafA, PDX-1, GLP1-receptorなど膵β細胞機能において重要な遺伝子発現がKOマウスで有意に低下していた。ER stressに関するapoptotic geneであるtrb3,ddit3,atf3は有意にKOマウスで発現が増加していた。また、炎症性サイトカインであるiL-1β、TNF-αなども増加していた。これらの結果から、血管内皮PDK1は膵臓・膵β細胞の血流を保持することで、ER stress,炎症性サイトカインなどからβ細胞を保護することで、膵β細胞量、機能を維持していることが判明したVEPDK1KOマウスでは12週齢において腹腔内ぶどう糖負荷試験を施行すると、コントロールと比較し、血糖値には違いがないが、インスリン値は低値であった。膵臓の血流を評価したところ、血圧には変化がないものの、KOマウスで有意に血流は低下しており、膵島内CD31陽性面積は有意にKOマウスで低下していた。Pimonidazole染色ではpimonidazole陽性β細胞の割合は有意にKOマウスで増加していた。TUNEL染色、Ki67染色の結果、KOマウスでは有意にapoptosisが増加し、増殖は低下していた。単離膵島のmRNAを評価したところ、虚血にかかわるhif1αを始めとするその下流遺伝子は、vegfaを含め有意に上昇していた。これらの結果から、血管内皮PDK1は膵臓・膵β細胞の血流を保持することで、ER stress,炎症性サイトカインなどからβ細胞を保護することで、膵β細胞量、機能を維持していることが判明したH29年に計画していたdb/dbバックグラウンドを有する血管内皮特異的PDK1欠損マウスは、生まれる確率からも研究時間が掛かっている。こちらは想定内として研究計画を立案しており、H30年に施行予定であった、血管内皮PDK1が膵β細胞に及ぼす影響について同時に研究を行うことで、成果が出ている。

ER stressに関するapoptotic geneであるtrb3,ddit3,atf3は有意にKOマウスで発現が増加していた。また、炎症性サイトカインであるiL-1β、TNF-αなども増加していた。これらの結果から、血管内皮PDK1は膵臓・膵β細胞の血流を保持することで、ER stress,炎症性サイトカインなどからβ細胞を保護することで、膵β細胞量、機能を維持していることが判明した現在順調に経過している血管内皮PDK1の膵β細胞に及ぼす影響の解明を優先的に行っていく。さらに、db/dbバックグラウンドの血管内皮特異的PDK1欠損マウスについては、出生確率が低いものの、生まれてきた個体について当初の予定通りの解析を行っていく。
点過程データに対する汎用で強力な解析手法の開発とモデルライブラリーの構築

神経細胞網の発火,心拍,降雨,地震,金融商品の取引発生,店への客の来店など,さまざまな点過程データに共通に適用可能なデータオリエンテッドなモデル構築手法を開発するとともに,ひとつのモデルライブラリーとして蓄積した.また,適切なデータ取得に必要な実験計画,データ解析をトータルにサポートするソフトウエア環境の構築,時系列モデルとの関連性の研究も並行して進めた.本研究は,現象と数理モデルを結びつける道筋を明らかにし,その道筋つまりメタデータを蓄積し,支援環境として実現する一般的な研究計画の一環であり,特に点過程データに焦点を絞ったものである.ライブラリーは,クラスタリングのある点過程に対する汎用なモデル,隠れマルコフ点過程モデル,隠れ準マルコフ点過程モデル,混合点過程モデル,多変量点過程モデル,ゼロにリセットされたのち単調に増加する強度関数モデル,モデルそれぞれに関する最尤解探索離散化アルゴリズムなどからなり,その適用事例は,神経細胞の膜電位,心拍,降雨,地震発生,美容院来店,金融商品取引発生など多岐に渡る.また,モデル構築を容易にするための統合環境も構築した。本環境はDandDに基づくものであり,Textile Plotをはじめとするさまざまなデータヴィジュアリゼーション手法の充実が一つの特徴である.神経細胞網の発火,心拍,降雨,地震,金融商品の取引発生,店への客の来店など,さまざまな点過程データに共通に適用可能なデータオリエンテッドなモデル構築手法を開発するとともに,ひとつのモデルライブラリーとして蓄積した.また,適切なデータ取得に必要な実験計画,データ解析をトータルにサポートするソフトウエア環境の構築,時系列モデルとの関連性の研究も並行して進めた.本研究は,現象と数理モデルを結びつける道筋を明らかにし,その道筋つまりメタデータを蓄積し,支援環境として実現する一般的な研究計画の一環であり,特に点過程データに焦点を絞ったものである.ライブラリーは,クラスタリングのある点過程に対する汎用なモデル,隠れマルコフ点過程モデル,隠れ準マルコフ点過程モデル,混合点過程モデル,多変量点過程モデル,ゼロにリセットされたのち単調に増加する強度関数モデル,モデルそれぞれに関する最尤解探索離散化アルゴリズムなどからなり,その適用事例は,神経細胞の膜電位,心拍,降雨,地震発生,美容院来店,金融商品取引発生など多岐に渡る.また,モデル構築を容易にするための統合環境も構築した。本環境はDandDに基づくものであり,Textile Plotをはじめとするさまざまなデータヴィジュアリゼーション手法の充実が一つの特徴である.神経細胞の発火,心拍,降雨,地震,金融商品の取引発生など,さまざまな点過程現象に対して共通に適用可能なデータオリエンテッドなモデル構築手法とその結果であるモデルを一つのライブラリーとして蓄積するという本研究の目的に沿って,初年度である本年は,神経細胞の発火と金融商品の取引発生に的を絞って研究を進めた.神経細胞の発火に関しては,本理工学部の岡浩太郎助教授の研究室と共同で,ミミズの神経細胞の発火データからそれら神経細胞の接続パターンを推定するという問題に対して,どのような点過程モデルが構築可能であるかという観点から探索的な研究を開始した.しかしこのように互いに一定のラグをもって接続している系の場合,これまで統計学で典型的に用いられてきた多変量点過程では説明しきれない部分が多く,実験やその測定の仕方を含め,データそのものに戻ってモデルを構築しなおす必要に迫られ,現在精力的に取り組んでいる最中である.一方,金融商品とくに外国為替の取引発生に関しては,最尤法によってクラスタを見つけだすアルゴリズムを開発したことにより,各クラスタ内では強度が一定のポアッソン過程として十分モデル化可能であることを確認できた.しかしクラスタ間隔自体はランダムなポアッソン過程としてモデル化するには無理があり,よく用いられるランダムな点を中心とするポアッソン現象としてのクラスタ点過程をそのまま適用することは適切でないことが判明した.その理由としては,金融商品の取引という現象そのものの特性と,時間という方向性の明確な場合の点クラスタという違いが大きい.なお,各クラスタ内での値の分布は,背後にブラウン運動を想定したときの,ポアッソン過程に従ってランダムなサンプリングを行ったときの分布である両側指数分布によく適合することが確かめられた.また,ブラウン運動の標準偏差とポアッソン過程の強度の間には一定の関数関係があることも発見した.本研究の主題である,さまざまな点過程データに共通して適用可能なモデル構築手法開発のため,以下のようなデータに関して研究をすすめた.1.ミミズの神経細胞発火を蛍光染色により観測したデータと筋電位時系列観測データからの神経細胞ネットワーク同定を目的としてモデル構築をおこなった.具体的にはネットワークを構成する点過程が直接観測できないという状況でのいわば,隠れ点過程モデルを構築した.筋電位時系列との関係をつける部分は現在さらに研究を進めている.2.美容院の各顧客の来店日データに関する点過程を構築した.この場合の強度関数は,通常と違い,来店と同時にゼロに戻り,その後単調に増加する関数を考える必要があり,その共変量としては,年齢,自宅までの距離,割引券の配布,季節要因などさまざまな要因が考えられたが,結果的に有意であったのは,担当者の違いであることが判明した.これは,適切な点過程モデル構築の有効性をしめしている.3.瞬時ドル為替レートに対するマーク付点過程モデルの有効性をさらに検証するため,瞬時ユーロ為替レートに対しても同様のモデル当てはめをおこなったけっか,ほぼ同様のモデルが当てはまることが判明した.為替レート以外の金融商品に関しても現在検証中である.過去2年間の研究成果にもとづき,次の課題を中心に継続的に研究を行った.

1.ミミズの神経細胞の膜電位データの解析とモデル化岡研究室で0.05ms単位で40sに渡って観測された一つの神経細胞の膜電位時系列は多数の発火クラスターをなしている.これをモデル化するにはタイムスケールごとに別のモデルを構築する必要があり,数ミリセカンドのスケールでは,有名なモデルであるHodgkin-Huxleyモデルのパラメータが発火のピークで変化すると仮定することでモデル化でき,発火開始時点に関してはクラスターごとに,ガンマ関数でモデル化した強度関数をもつ点過程モデルで十分よく表現できることがわかった.さらに,クラスターごとに基準電位の緩やかな変化(トレンド)を考える必要があり,このトレンドは,強度関数の変化に対して遅れをもっているので,この間の関係についてさらに研究をすすめている.2.ポアッソン点過程のパラメータ推定生起時間に下限があり,その下限からの増分を考えればポアッソン点過程でモデル化できることが多い.このようなときは,待ち時間で考えれば,一定時間シフトした指数分布を基に尤度を考えることになるが,このシフトを単なる連続なパラメータとみなして,最尤解を求めようとしてもうまく求まらないことが多い,これは,このパラメータに関する尤度の変化が極めて微妙であるからである.このような場合,このパラメータを離散化することで,各離散値に対する最尤解を求め,それらを比較する方法で満足な解が得られることを発見した.すでにソフトウエアとして実装したが,その真の原因とよりよい解決策については研究を継続中である.これまで3年間の研究成果を統合することによって、点過程データに対する汎用な解析手法を確立し、モデル化への道筋を明らかにした。その汎用な解析手法の一つがTextile Plotであり、多次元の値をとる点過程データに関してもこのTextile Plotにより、その確率的な挙動、特に強度の変化と値の変化の関係を的確に把握することができることが明らかとなった。本年度は特にこのTextile Plotの理論的な裏付けとソフトウエアの開発を精力的に行ったことにより、マーク付き点過程モデル構築の基盤はより確固なものとなった。そこで、前年度まで研究対象としてきた、TOPIXをはじめとするマーケットインデックス、為替レート、地震の位置やマグニチュード、神経細胞の膜電位の変化など具体的なデータをもう一度このTextile Plotを通じて見直すことにより、あらたなモデル化の方向性があきらかとなり、さらに研究を進めることができた。隠れマルコフ点過程モデル、隠れ準マルコフ点過程モデル、クラスタリングのある点過程、確率的ニューロネットワークによる点過程モデルなどがその例である。また、点過程データのもつ限られた情報を有効に活用して安定したモデルの同定に至るためには、効率的な最尤解探索アルゴリズムが必須となるが、パラメータの離散化によりそれを達成するアイディアの実装にも取り組み、ある程度の成果を得ることができた。さらに、理論面では、多変量点過程の基礎となるMultiplicative Correlationの特徴づけに取り組み、さまざまな興味深い結果を得ることができた。
ホルモンによる性転換技法の有効性と安全性に関する研究

(1)魚類の性は、基本的には遺伝支配を受けて決定されるが、幼弱期に外因性のステロイドの影響を受けると性転換をおこす。本研究においては、性転換をおこさせるステロイド投与時期、投与量、作用機序、魚への毒性、食用としての安全性を2か年にわたって検討した。その結果、形態学的性分化臨界期において投与することが有効であること、投与量は極めて微量でよいことが判明した。また、雌性発生魚に対して投与した結果から、遺伝的配偶子は退行変性を示し、残存の生殖原細胞から新たに配偶子形成がおきることが判明した。(2)食用としての安全性を検討するため、放射能でラベルしたエストラジオール17βおよびメチルテストステロンを投与し、吸収、蓄積、排泄の状況を解析した。その結果、吸収量は2週間ほどで平衡状態に達すること、排泄は肝臓から胆のうを経て腸管内へ行なわれること、生物学的半減期は1.53時間と短かいことが判明した。したがって、幼弱期に投与したステロイドが公用サイズの大きさにまで残存することはなく、食用とした場合の安全性には問題ないと結論された。著者らはこれまでに魚類仔稚期に性ステロイドを投与することによって表現型性を制御できることを示してきたが,それらステロイドの魚体内残留性ひいては食品としての安全性については未検討であった.そこで,ステロイド投与による性転換技法を確立させ,かつその安全性について検討を加えた.その結果,コイ,アユ,ニジマス,テラピア,ペヘレイなど,性によって商品価値の異なる魚種における性の形態学的臨界期を明らかにし,その時期に性ステロイドを投与することによって性比を変化させることが判明した.また,ニジマスにおいて雌化を図るために投与するエストラジオール17βの生体内運命を明らかにするため,^3Hで放射化したエストラジオールを経口投与し,蓄積,分布,排泄および代謝について検討した.その結果,吸収されたエストラジオールは主として胆のう,肝臓,腎臓に分布し,いずれにおいても投与16日以降は平衡に達することが判明した.排泄状況について検討したところ,胆のうにおける生物学的半減期は1.52時間,肝臓で2.53時間とかなり速かであった.したがって,仔稚魚に本ステロイドを投与して性転換を図った場合,投与中止とともに体内から速やかに消失するまで,食用サイズに達した段階での残留性は全く心配ないと結論された.現在,雄性化ステロイドの残留性について検討中であるが,合成ステロイドを使用するため,検出技術に慎重な配慮を必要としている.この点は次年度において解明されるところとなろう.(1)魚類の稚仔期に性ステロイドを経口的もしくは経皮的に摂取させると遺伝的が転換し、性比を変更させ得ることが、ニジマスの他コイ、アユ、テラピア、ペヘレイで判明した。昭和63年度においては、これら前年に得られた結果を確認するとともに、性転換の過程を精査した。特に、そのために雌性発生魚を雄化させる過程を検討し、生殖原細胞が一旦退化の後、残存生殖原細胞から雄性配偶子が生じることが結論された。(2)ニジマス稚魚へ、性転換をおこさせ得る量の性ステロイド2種(エストテジオール17β、メチルテストステロン)を経口摂取させ、吸収、蓄積、排泄の状態をラジオ・アイソトープを用いて検討した。その結果、投与後2週間ほどで吸収量は平衡となること、生物学的半減期は1.53時間と短かいこと、腹肝循環系によって排泄されることなどが判明した。排泄時間が短かいことから、幼若期に使用したステロイドが食用サイズにまで残存している可能性は極めて低く、したがって食品衛生状は問題ないものと結論された。
体外受精による効率的子牛生産システムの開発に関する研究

卵胞内未熟卵子を利用して、体外受精に基づく大量の牛胚を生産・利用できるシステムを確立し、効率の高い子牛生産に結びつけることを目的として研究を進め、主に以下のことを明らかにした:1)上皮成長因子(EGF)は、卵丘付着未熟卵子の核成熟のみならず、細胞質成熟をも促進し、それにより体外受精後の胚の胚盤胞への発生率が高められる:2)体外成熟卵子の限定培地における体外受精において、グルコースの存否にかかわりなく、力フェインとヘパリンの両者の存在下で最も高い侵入率(73-83%)が得られ、侵入卵の9-21%が胚盤胞にまで発育しうる:3)牛成長ホルモン(bGH)およびインシュリン用成長因子(IGF-I)による卵丘付着未熟卵子の核成熟および細胞質成熟の促進作用は卵丘細胞を通して発現され、さらにbGHの促進作用は、卵丘細胞からのIGF-Iの生産と分泌が刺激されることによって発現される間接的なものである:4)内卵胞膜細胞は卵丘付着未熟卵子の成熟分裂の再開を抑制するが、卵核胞の核相を同期化し、共培養から内卵胞膜細胞を除去すると成熟分裂が再開される:5)排卵や受精などの種々の生殖現象に対して生理的な役割を果たしているプラズミノゲンアクチベーター(PA)に関して、EGF(30ng/ml)の存在下で培養された卵丘付着未熟卵子においてウロキナーゼ型PA(uPA)、組織型PAおよびtPA抑制因子が検出された。一方、卵子自体では、卵丘細胞の共存下においてuPAのみが生産され、EGFはuPAの生産を促進する: 6)その他、実験動物における受精卵子のガラス化凍結と核移植に関する研究、さらに単為活性豚卵子の発生培養に関する研究において、牛胚に適用されうる幾つかの知見を得ている。さらに、体内における卵胞の発育に対するオキシトシンの役割の一部も明らかにし、体外における卵子の成熟条件を考える上で有用な知見を得た。個々の関連技術について下記のような基礎研究を重点的に行った。1.上皮成長因子(EGF)、牛成長ホルモン(bGH)およびインシュリン用成長因子(IGF-I)が牛未熟卵子の体外成熟におよぼす影響:種々の濃度(0-50ng/ml)のEGFを含む血清不含培地で未熟卵子を24時間培養した結果、成熟率は30ng/mlの濃度で最も高かった(88%)。また、体外受精後の精子侵入率、侵入卵子のその後の発生率はいずれも、10あるいは30ng/mlの濃度で高い傾向が見られた。一方、bGHおよびIGF-Iでは10-100ng/mlの範囲の濃度において、成熟率は高かったが、精子侵入率には、これらの因子の存否および濃度による差は認められなかった。2.限定培地におけるカフェイン(C)、ヘパリン(H)およびグルコース(G)の存否が牛体外成熟卵子の体外受精におよぼす影響:精子侵入はCとHの両者あるいはいずれか一方が存在している時にのみ観察された。しかし、Gの存否にかかわらず、CとHの両者の存在下で最も高い侵入率(73-83%)が得られ、侵入卵の9-21%が胚盤胞にまで発育した。

3.単為活性豚卵子の発生培養に関する研究:牛胚のモデルとして、体外成熟後に電気刺激により活性化させた豚卵子の体外発生におよぼす幾つかの要因について調べた結果、浸透圧が重要な要因の一つであることが明らかとなった。すなわち、初期桑実胚を分岐点として、前半には高浸透圧、後半には逆に低浸透圧の条件が必須である。現在、この条件の適合性について、牛胚を用いて調べている。4.その他、実験動物における受精卵子のガラス化凍結に関する研究および核移植に関する研究において、牛胚に適用されうる幾つかの知見を得ている。さらに、体内における卵胞の発育に対するオキシトシンの役割の一部も明らかにし、体外における卵子の成熟条件を考える上で有用な知見を得た。未熟卵子の体外成熟条件ならびに体外受精の条件に関する検討を継続して行い、以下のような最終成績を得ている。1.0-50ng/mlの上皮成長因子(EGF)を添加した血清無添加培地を用いて、卵丘付着卵子(COCs)24時間培養した結果、第二成熟分裂中期(M-II)にまで成熟した卵子の割合は、30ng/mlの濃度のEGFで最も高かった(88%)。体外受精後の精子侵入率は、EGFの無添加(78%)よりも添加(97-100%)した条件下で成熟した卵子において高かったが、EGFの濃度間での差は認められなかった。しかし、受精卵子の前核形成率は、いずれの濃度のEGFを添加しても促進されなかった。発生培養の結果、授精後144時間の桑実胚への発生はいずれの濃度のEGFによっても促進されなかったが、192時間で胚盤胞に発生した胚の割合は、EGFの添加によりその濃度にかかわらず高くなった。これらの結果から、EGFはCOCsにおける未熟牛卵子の核成熟にもならず、細胞質成熟をも促進することが明らかとなった。2.前年度において、牛成長ホルモン(bGH)およびインシュリン用成長因子(IGF-I)はいずれもCOCsにおける牛未熟卵子の核成熟および細胞質成熟を促進することを見いだしたが、この促進作用は卵丘細胞を通して発現されること、さらにbGHの促進作用は、卵丘細胞からのIGF-Iの生産と分泌を刺激することによって発現される間接的なものであることを明らかにした。3.排卵や受精など、種々の生殖現象に対して生理的な役割を果たしていることが知られているプラズミノゲンアクチベータ-(PA)に関して、PAは成熟培養中の牛卵子および卵丘細胞の両者から生産されるが、PAの型による生産形態が異なることを明らかにした。前年度から継続して未熟卵子の体外成熟条件ならびに体外受精の条件に関する検討を行うとともに、体外成熟卵子の凍結条件の検討をも行い以下のような最終成績を得ている。1.卵子卵丘細胞複合体(COCs)を種々の成熟抑制因子および卵胞細胞の共存下で培養した結果、種々のcAMP類は卵子の成熟分裂の再開を抑制しなかった。しかし、シクロヘキサミドの存在下では、成熟分裂の再開は抑制されたが、卵核胞(GV)の核相の変化は認められなかった。一方、内卵胞膜細胞(THC)との共培養下では成熟分裂の再開が抑制されるとともに、GVの核相がGV崩壊直前の核相に同期化された。共培養からTHCを除去すると、成熱分裂の再開が観察されたので、THCとの共培養により、牛未熟卵子の細胞質成熟が改善される可能性が示唆された。2.牛COCsを上皮成長因子(EGF; 30 ng/ml)を含む培地で24時間培養した結果、3つのブラズミノゲン・アクチベーター(PA)依存性バンド、すなわちウロキナーゼ型PA(uPA)、組織型PA(tPA)、tPA抑制因子(tPA-PAI)が検出された。一方、卵子自体では、卵丘細胞の共存下においてuPAのみが生産され、EGFはuPAの生産を促進することが示唆された。