hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
蛋白質マイクロチューブを用いた大腸菌トラップの創製

蛋白質マイクロチューブの一次元内孔空間に微生物を効率よく取り込ませることに成功した。具体的には、多孔性ポリカーボネイト膜を用いた独自の鋳型内交互積層法によりヒト血清アルブミンからなる中空シリンダー構造のマイクロチューブ(外径1.0μm)を合成し、それが大腸菌(E. coli K12株)を捕捉できる“大腸菌トラップ"となることを明らかにした。病原性大腸菌の駆除にも応用できると期待される。近年、蛋白質からなるバイオナノマテリアルの開発に注目が集まっている。研究代表者は、独自の鋳型内交互積層法により中空シリンダー構造の蛋白質ナノチューブを合成し、その内孔空間を利用した様々な機能発現に成功している。本研究では、これまでの知見を大きく発展させ微生物の捕捉に挑戦する。具体的には、大腸菌を効率よくトラップできる蛋白質マイクロチューブの開発を目指す。所望の蛋白質中空シリンダーを合成し、効率的な大腸菌捕捉能、殺菌能を実証する。病原性大腸菌の駆除に応用できると考えられ、人類の健康・福祉に与える波及効果と意義はきわめて大きい。1蛋白質マイクロチューブの精密合成と微細構造解析多孔性ポリカーボネイト(PC)膜(孔径1.0μm)を鋳型とした交互積層法により、蛋白質マイクロチューブを合成した。まず、ポリ-L-アルギニン(PLA)水溶液をPC膜に通過させ正電荷層を作成、続いてヒト血清アルブミン(HSA)水溶液を通過させ負電荷層を形成した。これらの操作を計9回繰り返し、得られた複合膜をDMF溶液に浸漬すると、テンプレートが溶解し蛋白質マイクロチューブ[(PLA/HSA)9]が得られた。中空管の外径/内径/管壁厚/長さを走査電子顕微鏡(FE-SEM)、透過電子顕微鏡(TEM)観察により測定。単離したマイクロチューブを水中へ戻すと管壁が膨潤することがわかった。2大腸菌捕捉能の評価大腸菌(EK1 E. coli K12株、外径約425nm)分散液に蛋白質マイクロチューブを加え、静置後、LB agarプレート上に播種・培養し、経時的にコロニー形成数を観測した。マイクロチューブと30分以上混合すると、コロニーは1つも形成しないことがわかった。また、大腸菌とマイクロチューブをそれぞれ蛍光色素で染色し、大腸菌がマイクロチューブに捕捉される様子を共焦点レーザー顕微鏡測定から観測した。詳細な条件検討から、捕捉率との相関を解明。最終的には捕捉率100%を達成した。本研究ではこれまでの知見を大きく発展させ、微生物の捕捉に挑戦した。具体的には、大腸菌を効率よくトラップできる蛋白質マイクロチューブの開発を目指した。2年間の研究期間内に所望の蛋白質中空シリンダーを合成し、効率的な大腸菌捕捉能、殺菌能を実証することができた。1蛋白質マイクロチューブの精密合成と微細構造解析:多孔質ポリカーボネイト(PC)膜を鋳型とした交互積層法により、蛋白質マイクロチューブを合成した。中空管の構造を各種電子顕微鏡観察により測定。2大腸菌捕捉能の評価:大腸菌(E.coli K12株)分散液に蛋白質マイクロチューブを加え、LB agarプレートに播種・培養すると、コロニーは1つも形成されない。チューブ内孔に大腸菌が100%捕捉されていることがわかった。3銀ナノ粒子含有蛋白質マイクロチューブの合成(最終年度成果):銀ナノ粒子(AgNP)を階層成分として含むマイクロチューブを調製した。AgNPは負電荷層として使用したが、AgNP溶液のみでは形態安定性の高いチューブが得られなかったので、ヒト血清アルブミン(HSA)とAgNPの混合溶液を用いてマイクロチューブを作成した。構造を電子顕微鏡観察により測定。得られた銀ナノ粒子含有蛋白質マイクロチューブは、さらに高い大腸菌殺菌能を有すると期待される。得られた成果をまとめ、大腸菌を効率よく捕集できる蛋白質マイクロチューブすなわち“極微小サイズの生物トラップ"の合成法、構造、有効性に関する知見を得た。本成果は、病原性大腸菌の駆除に応用できると考えられ、人類の健康・福祉に与える波及効果と意義はきわめて大きい。計画に従い実験を遂行し、本研究の目標を達成することができた。当初は、大腸菌と相互作用する糖蛋白質の導入と殺菌するための銀ナノ粒子の導入が必要不可欠と考えていたが、いずれも持たないマイクロチューブでも、100%の捕捉と殺菌が達成できた。本成果は、イギリス化学会誌Chem. Commun.に掲載されたばかりでなく、その表紙を飾るとともに、イギリス化学会ニュースChemistry Worldで紹介された。さらに、日本経済新聞(2014.10.22)にも掲載された。生命分子化学銀ナノ粒子含有蛋白質

マイクロチューブの合成と大腸菌殺菌能の評価前年度に確立した鋳型内交互積層法により、銀ナノ粒子(AgNP)を階層成分として含むマイクロチューブを調製する。銀ナノ粒子の導入により、さらに効率の高い殺菌効果が期待できる。AgNPは負電荷層(2,4,6,8層目)として使用するが、AgNP溶液のみでは形態安定性の高いチューブが得られない可能性もある。その場合、HSAとAgNPの混合溶液を用いて蛋白質マイクロチューブを作成する。内径/外径/管壁厚/長さをFE-SEM、TEM観察により測定。得られた銀ナノ粒子含有蛋白質マイクロチューブの大腸菌捕捉能と殺菌能を評価する。2年間に得られた成果をまとめ、微生物(大腸菌)を効率よく捕集できる蛋白質マイクロチューブすなわち“極微小サイズの生物トラップ"の合成法、構造、有効性を総括する。次年度使用額は小額(7,588円)であり、2014年度の予算執行は、計画通りに実施できたと判断している。上記の通り、次年度使用額は小額であるため、消耗品(試薬)に充当する。
各種光源の光照射器の特性が光重合レジンの重合性と色調安定性に及ぼす影響

昨年度の実験結果から、光源の異なる光照射器による重合性の違いが光重合レジンの重合性および色調安定性に及ぼす影響が示唆された。この結果を基にBis-GMA、TEGDMAの組成比を変えたモノマーに屈折率の異なるフィラーを加えてコンポジット化し、各光照射器の特性と光重合レジンの成分がその重合性と光透過性に及ぼす影響についてさらに実験を行った。1.試作光重合モノマーの屈折率Bis-GMA、TEGDMAの配合比を変えた3種の試作モノマーと2種のフィラーの組み合わせで計6種の試作レジンを作成した。重合前後の試作モノマーとフィラーの屈折率との差の変化を測定して、重合性および色調安定性の比較試料とした。2.試作光重合レジンの重合性プラズマ照射器、LED照射器、ハロゲン照射器にて重合した試作レジンの硬化深さを調べた。いずれの照射器においても、フィラーとモノマーの屈折率の差が小さい方が大きな値を示した。また硬化深さは照射時間の延長と共に大きくなっていた。3.試作光重合レジンの色調安定性ISO4049にしたがって、各光照射器で重合した光重合レジンについて耐光試験を行い、耐光試験を行わない試料をコントロールとして色差ΔE*abを分光計測色計にて測定した。ΔE*abはLED照射器で重合した試作レジンが最も大きい値を示した。以上の結果により、光照射器の光源にかかわらず、光重合レジンのマトリックスとフィラーの屈折率の差がその重合性に影響を及ぼしていた。また、昨年度の実験こおいで光強度の最も低かったLED照射器は硬化深さ、色調安定性ともに他の光源の照射器よりも劣る結果となり、光強度が光重合レジンの重合性および色調安定性にも影響を及ぼしていることが示された。プラズマ照射器およびLED照射器の特性を捉え、ハロゲン光照射器との比較を行うと共に各種光照射器の特性がシェードと組成の異なる光重合レジンの重合性および色調安定性に及ぼす影響を調べた。1.光強度の測定3機種の中でプラズマ照射器が最も光強度が高く、ハロゲン照射器の約2倍、LED照射器との比較では約10倍もの光強度を示していた。2.光重合レジンの重合性市販光重合レジンの硬化深さを3種のシェードを使って測定し、その重合性を調べるために深さ方向にヌープ硬さを測定した。照射時間はプラズマ照射器では3秒および9秒、LED照射器とハロゲン照射器については20秒および60秒について測定を行った。硬化深さは各照射器共に照射時間の延長と共に大きくなっていた。色調別ではA3、B3、C3の順で硬化深さは大きかった。ヌープ硬さにおいても光照射量の多いプラズマ照射器が同様の結果を示した。また、ハイブリッド型に比べ、超微粒子フィラー型の光重合レジンは各光照射器で硬化深さおよびヌープ硬さ共に低い値を示した。3.光重合レジンの色調安定性ISO4049にしたがって各光照射器で重合した光重合レジンについて耐光試験を行ない、耐光試験を行わない試料をコントロールとして色差ΔE*abを分光測色計を用いて測定した。ΔE*abは各照射器共に照射時間を延長した試料の方が値が小さく、また、光照射器のロッドの中心部と辺縁部の比較では光強度の強い中心部の方が値が小さく色調安定性に優れていた。以上の結果により、光照射器による重合性の違いが光重合レジンの重合性および色調安定性に影響を及ぼしていることが示唆された。今後、試作レジンを作製し、重合性に影響を及ぼす原因の一つであるフィラーとマトリックスレジンの屈折率の差と各光照射器の特性との関係についても引き続き実験を行う。

また、昨年度の実験こおいで光強度の最も低かったLED照射器は硬化深さ、色調安定性ともに他の光源の照射器よりも劣る結果となり、光強度が光重合レジンの重合性および色調安定性にも影響を及ぼしていることが示された。
統合失調症患者における感覚ゲーティング異常の詳細検討-脳磁図研究-

現段階では正常対照者28名および統合失調症患者2名の脳磁図測定が終了している。うち正常者15名の計測データについて予備的な解析を行った。【結果】以下は正常対照者15名におけるm50振幅の平均測定値である。音声刺激については左半球・第一音では36±18fT/cm、第二音では28±20fT/cm、右半球・第一音では40±37fT/cm、第二音では36±38fT/cmであった。クリック音刺激については左半球・第一音では17±5fT/cm、第二音では14±5fT/cm、右半球・第一音では19±8fT/cm、第二音では19±7fT/cmであった。反復測定分散分析により、有意な聴覚刺激の種類および聴覚刺激の順番の主効果を認め、この結果よりm50振幅が聴覚刺激の種類と左右の半球に関わらず、第1音に対して第2音では有意に減弱することが認められた。【考察】我々は先行研究として脳磁図を用いて正常者における2連発音声刺激を提示した際のm50振幅の減弱を検討しているが(Hirano Y., etal. Psychiatry Res, 2008)、今回と同様の結果を得ている。また脳磁図を用いた正常者における2連発クリック声刺激を提示した際のm50振幅の減弱については、我々の知る限りではあまりこれまでに検討されていないが、Weilandら(Weiland B.J., et al. Neuroimage, 2008)は脳内電流源を推定した上で、正常者において2連発クリック声刺激を提示した際にm50振幅が減弱することを示しており、今回の結果を支持するものと考えられる。今後は本研究の第一の目的である、ニューラルオシレーションとp50抑制との関連さらには、これらを指標とした統合失調症での感覚ゲーティング異常の検討を進めていくことが重要である。
レーザー支持誘導結合プラズマの高エンタルピー風洞への応用と性能評価

レーザー駆動誘導加熱プラズマ風洞の基礎試験本実験では2kW級連続発振二酸化炭素レーザー及び1.5kW級高周波電源を使用した.まず,石英管内でプラズマを生成・維させ可視化試験を行った.石英管は直径14mmと25mmの管を半二重管構造として使用し,小径管によりガス流速を上げ大径小径管出口にLSPを生成・維持する.このLSPに対し大径管外側から周波数13.56MHzの高周波を印可させ誘導加熱を行った.結果,アルゴンガス1.8g/s,入力レーザーパワー800WのLSPに対し,整合器により反射を最小化することで最大で正味1kWの加熱に成功した.次にプラズマの温度分布を評価するため発光分光を行った.まず最も高温になると予想される焦点付近のフトル分布を集光系により取得し,ボルツマンプロットを適用することで温度を推定した.ここで本プラズマは2気圧程度であるた所熱平衡が成り立つと見なした.次にCCDカメラにバンドパスフィルタを装着することでArl852nmライン強度の空間分布を取得ボルツマンプロットで得られた結果及びラレンツの式を用いて温度分布を求めた.その結果,中心で鋭いピークを持つLSPの半向温度分布が誘導加熱の結合により平坦化していることが確認できた最後に実際の風洞を想定し,セラミック材を用いたスロート直径2mm,ノズル出口10mmのコンバージェント/ダイバージェントルを作成し,スロート部生成したLSPに対しノズル外部から高周波を印可することで誘導加熱を行った.作動条件はアルゴンガ1.8g/s,800WのLSPに対し高周波を0から1kWまで変化させプレナム圧を測定し,ソニックフロー法を用いてエネルギー変換効率求めた.その結果,誘導加熱のエネルギー変換効率は高周波電力と共に増加し,最大で14%に達することがわかった.本年度の研究成果は以下の通りである.1.レーザー加熱風洞の基礎実験本研究室が所持している2kW級炭酸ガスレーザーを用いて高エンタルピー気流を生成し,その作動特性及び気流特性を検証した.本研究ではアルゴン・酸素を作動ガスとして実験を行った.その結果,気流はレーザー強度の振動に起因して300500Hzで振動することがわかった.この振動周波数はスロート部の形状等に依存するものであり今後の研究課題である.またレーザー吸収分光法により気流の比エンタルピー,酸素解離度を計測し,本風洞によりほぼ完全解離した原子状酸素気流を生成することが可能であることがわかった.2.アーク風洞,誘導加熱風洞診断2006年度10月11月に渡り2ヶ月間、シュツットガルト大学航空宇宙システム研究所(ドイツ)に本研究室で開発したレーザー吸収分光システム(LAS)を持ち込み,アーク風洞,誘導加熱風洞気流診断を行った.(1)アーク風洞気流診断本研究は現地にて急遽決まった共同研究であり高エンタルピー気流と磁場の相互作用を解明するものである.まず,アルゴン一様流の並進温度,数密度の空間分布を測定し,次に熱流束プローブ及び永久磁石を埋め込んだプローブを気流中に投入しプローブ周囲の並進温度,数密度分布を測定した.これにより磁場の影響を実験的に評価した.本研究成果は共同研究者(Andreas Knapp)による数値計算結果と比較・検証する予定である.(2)誘導加熱風洞気流診断空気流,酸素流,窒素流の気流診断を行った.過去の研究では酸素流にしかLASを適用できなかったが,今回は空気流における酸素原子の吸収信号を検出することができた.これより空気流の比エンタルピーを推定した.一方,窒素流における窒素原子の吸収信号は検出できなかったため,今後,感度を向上させるためさらなる改良を施す必要がある.本年度の研究成果は以下の通りである1.高圧下での作動限界の取得本研究室が所持している2kW級炭酸ガスレーザーを用いてレーザー維持プラズマ(Laser Sustained Plasma)の生成実験を行った.まず,LSPのメリットの一つである高圧下での作動特性を検証した.レーザーパワー800W,スロート径1mmのプラズマ生成装置を用いてアルゴンを作動ガスとし,流量をパラメータとすることでプレナム圧を変化させた.その結果,0.1MPa1MPaでのLSP維持に成功した.現状の上限は流量制御計及びZnSe窓の強度であるため,さらに高圧下でのLSPの維持も可能であると考えられる.2.気流診断作動ガスとしてアルゴン・酸素を用いて本風洞の原子状酸素源としての可能性を検証した.気流診断法としてレーザー吸収分光法を使用し,気流の流速,並進温度を計測し,ノズル膨張での等エントロピー流れ,凍結流れを仮定することでLSP維持部での全温を推定した.また,LSPは高圧下であるため熱化学平衡を仮定することで酸素解離度を計算した.その結果,本風洞により生成される気流は中心から直径10mm程度にわたり完全解離しており,流速3000m/s,酸素原子流束2.2×10^<21>atom/cm^2であることがわかり原子状酸素源としての有用性を実証した.3.高感度レーザー分光法の開発ICOS(lntegrated Cavity Output Spectroscopy)を用いた高感度レーザー吸収分光法を開発した.マイクロ波放電管を用いた感度向上試験の結果,従来のシングルパスレーザー吸収分光法に比べ感度が約600倍向上したことがわかった.

作動ガスとしてアルゴン・酸素を用いて本風洞の原子状酸素源としての可能性を検証した.気流診断法としてレーザー吸収分光法を使用し,気流の流速,並進温度を計測し,ノズル膨張での等エントロピー流れ,凍結流れを仮定することでLSP維持部での全温を推定した.また,LSPは高圧下であるため熱化学平衡を仮定することで酸素解離度を計算した.その結果,本風洞により生成される気流は中心から直径10mm程度にわたり完全解離しており,流速3000m/s,酸素原子流束2.2×10^<21>atom/cm^2であることがわかり原子状酸素源としての有用性を実証した.3.高感度レーザー分光法の開発ICOS(lntegrated Cavity Output Spectroscopy)を用いた高感度レーザー吸収分光法を開発した.マイクロ波放電管を用いた感度向上試験の結果,従来のシングルパスレーザー吸収分光法に比べ感度が約600倍向上したことがわかった.レーザー駆動誘導加熱プラズマ風洞の基礎試験本実験では2kW級連続発振二酸化炭素レーザー及び1.5kW級高周波電源を使用した.まず,石英管内でプラズマを生成・維させ可視化試験を行った.石英管は直径14mmと25mmの管を半二重管構造として使用し,小径管によりガス流速を上げ大径小径管出口にLSPを生成・維持する.このLSPに対し大径管外側から周波数13.56MHzの高周波を印可させ誘導加熱を行った.結果,アルゴンガス1.8g/s,入力レーザーパワー800WのLSPに対し,整合器により反射を最小化することで最大で正味1kWの加熱に成功した.次にプラズマの温度分布を評価するため発光分光を行った.まず最も高温になると予想される焦点付近のフトル分布を集光系により取得し,ボルツマンプロットを適用することで温度を推定した.ここで本プラズマは2気圧程度であるた所熱平衡が成り立つと見なした.次にCCDカメラにバンドパスフィルタを装着することでArl852nmライン強度の空間分布を取得ボルツマンプロットで得られた結果及びラレンツの式を用いて温度分布を求めた.その結果,中心で鋭いピークを持つLSPの半向温度分布が誘導加熱の結合により平坦化していることが確認できた最後に実際の風洞を想定し,セラミック材を用いたスロート直径2mm,ノズル出口10mmのコンバージェント/ダイバージェントルを作成し,スロート部生成したLSPに対しノズル外部から高周波を印可することで誘導加熱を行った.作動条件はアルゴンガ1.8g/s,800WのLSPに対し高周波を0から1kWまで変化させプレナム圧を測定し,ソニックフロー法を用いてエネルギー変換効率求めた.その結果,誘導加熱のエネルギー変換効率は高周波電力と共に増加し,最大で14%に達することがわかった.
ミオシン頭部SH2周辺の構造変化検出のための特異的蛍光標識法

ミオシン頭部(S-1)の重鎖には8個のCys残基が存在する。このうちCys-707(SH1)とCys-697(SH2)はATP結合部位とアクチン結合部位のそれぞれで起きると立体構造変化の信号を互いに相手側に伝えるための"通信回路"の役を担うと考えられている。SH1とSH2はさまざまな化学修飾試薬に対して他のCys残基よりも高い反応性をもつ。さらにSH1はSH2よりも反応性が高いので、IAEDANSのような蛍光試薬でSH1だけを標識できる。このためIAEDANSは、SH1だけを選択的に蛍光標識できる有用な試薬として20年以上もミオシンモーター機能の研究に使われ続けている。これに対して、SH2だけを選択的に標識できる蛍光試薬は現在でもまだ見つかっていなかった。これまでに使われたミオシンのSH基の蛍光標識試のほとんどは、反応基としてIAAかマレイミドをもつ。しかしIAAをもつ試薬はSH1とは反応するけれど、SH2とは反応しない。一方申請者がこれまでやってきた予備実験の結果から、マレイミドをもつ試薬はSH2と反応するが、同時にSH1とも反応するので目的には不適であることが明らかになっている。そこで本研究計画では、IAAとマレイミド以外の反応基をもつ蛍光標識試薬に的を絞ることにした。使用された試薬は、反応基としてそれぞれビニルスルホン(VS)、アクリロイル基(AC)、アジリジン(AZ)、エポキシド(EP)、ブロモメチル基(BM)をもつ十数種の蛍光試薬である。
血清カルシウム降下因子Caldecrinを用いた骨粗鬆症の遺伝子治療の開発

カルデクリンは膵臓から精製、クローニングした新規血清カルシウム降下因子である。本因子はプロテアーゼ活性を持つが血清カルシウム降下と相関しないこと、血清カルシウム降下作用は骨吸収抑制作用によること、成熟ウサギ破骨細胞による骨吸収を抑制することを明らかにして来た。本研究では、まずマウス破骨細胞形成系を用いカルデクリンの抑制作用を検討した。カルデクリンは、破骨細胞分化因子(RANKL/ODF)によりマウス骨髄細胞から誘導される破骨細胞形成をプロテアーゼ活性に関係なく容量依存性に抑制した。破骨細胞分化のマスター遺伝子であるNFATc1遺伝子の発現はRANKL刺激により経時的に増加するが、カルデクリンはこの誘導を抑制したことから、カルデクリンは破骨細胞分化の初期の段階で抑制することを示唆した。次にマウス卵巣摘出(OVX)による骨粗鬆症モデルを用いてカルデクリンの遺伝子発現の効果を検討した。カルデクリン遺伝子はHVJエンベロープに封入し大腿二頭筋に注入した。2週間後のカルデクリン発現OVXマウスの血清カルシウムとコラーゲンC-ペプチド濃度は対照ベクター投与OVXマウスに比べ低下していた。OVX対照ベクター発現マウスの大腿骨骨端の非脱灰組織像は骨稜構造を顕著に消失していたが、OVXカルデクリン発現マウスでは骨稜構造が偽処置マウスの組織像に回復していた。以上の骨粗鬆症モデルマウスを用いた結果から、カルデクリンを筋肉内で遺伝子発現を行なうことにより骨粗鬆症の遺伝子治療を行なえる可能性を示唆した。カルデクリンは我々により膵臓から精製、クローニングした新規血清カルシウム降下因子であり、急性膵炎に伴う低カルシウム血症の惹起因子と考えられている。我々は本因子がプロテアーゼ構造とプロテアーゼ活性を持つこと、一方、血清カルシウム降下活性はプロテアーゼ活性と相関しないこと、血清カルシウム降下作用は骨吸収抑制作用によることを明らかにしてきた。骨吸収抑制作用には、従来検定に用いた成熟ウサギ破骨細胞による吸収窩形成系における抑制効果を用いていたが、新たにマウス破骨細胞形成系を用いカルデクリンの抑制作用を検討した。その結果、カルデクリンは、マクロファージーコロニー刺激因子と破骨細胞誘導因子(RANKL)存在下でマウス骨髄細胞から誘導される多核で酒石酸抵抗性酸ホスファターゼ(TRAP)活性を持つ破骨細胞の形成を容量依存性に抑制した。また、プロテアーゼ活性欠失のミュータントカルデクリンも同様に抑制した。また、カルデクリンの破骨細胞形成に対する抑制効果は、カルデクリンフラグメントを用いても再現された。このことより、カルデクリンのマウス破骨細胞形成系に対するカルデクリンの抑制効果はカルデクリンのプロテアーゼ活性に依存しないことを明らかにした。また、カルデクリンの抑制効果はRANKL非依存性でありた。カルデクリンは膵臓より精製クローニングした血清カルシウム降下因子であり、急性膵炎の惹起因子と考えられる。本因子はプロテアーゼ活性を持つが、血清カルシウム降下活性はプロテアーゼ活性と無関係であることを明らかにしている。また、本因子の血清カルシウム降下作用は成熟破骨細胞による骨吸収の抑制活性によることを明らかにしている。そこで、マウス骨髄細胞からの破骨細胞誘導系を用いてRANKLによる破骨細胞誘導に対するカルデクリンの抑制効果を検討すると、カルデクリンは濃度依存的に破骨細胞の誘導を抑制した。このことは、カルデクリンは成熟破骨細胞の活性抑制のみならず破骨細胞誘導においても抑制効果があることを示し、長期間の骨代謝異常症である骨粗鬆症の治療に適用できることを示している。そこで、卵巣摘出骨粗鬆症モデルマウスを用いてカルデクリンの腹腔内連日投与における骨粗鬆症治療を行なった。その結果、カルデクリンは血清カルシウムの低下とともに骨吸収のマーカーである血清コラーゲンペプチドを低下させた。

このことから、カルデクリンの腹腔内連日投与により卵巣摘出による骨吸収促進を抑制したことを明らかにした。さらに、カルデクリン遺伝子を卵巣摘出マウスの筋肉細胞内で2週間発現させた。カルデクリン遺伝子は投与後2週間にわたり発現が維持されていたが、血清カルシウムは低下の傾向は見られるものの有意な低下はなかった。組織学的検索では、卵巣摘出群の大腿骨の骨稜構造は正常対照群に比べ著しい減少が見られたが、卵巣摘出カルデクリン遺伝子発現群では骨稜構造が回復する傾向が見られた。以上の結果は、骨粗鬆症をカルデクリンの遺伝子治療で行なえる可能性を示唆した。
cross-ply構造を利用した高密着力を有する炭素系硬質薄膜被覆部材の創製

本研究では,近年注目されている炭素系硬質薄膜(CTF)を3次元的cross-ply構造に成膜することにより,従来のCTF被覆部材よりも高い密着性,耐久性を発揮する炭素系硬質薄膜被覆部材の創製を目指した.cross-ply構造1層のみ成膜した試験片の微視的観察から,提案した3次元cross-ply構造成膜が可能であることを確認し,さらに,3層cross-ply試験片は従来のCTF被覆部材に比べ,3倍程度高い耐久性を示すことが確認されたことから,実機への応用が期待される.本研究では,近年注目されている炭素系硬質薄膜(CTF)を3次元的cross-ply構造に成膜することにより,従来のCTF被覆部材よりも高い密着性,耐久性を発揮する炭素系硬質薄膜被覆部材の創製を目指した.cross-ply構造1層のみ成膜した試験片の微視的観察から,提案した3次元cross-ply構造成膜が可能であることを確認し,さらに,3層cross-ply試験片は従来のCTF被覆部材に比べ,3倍程度高い耐久性を示すことが確認されたことから,実機への応用が期待される.本年度は,炭素系硬質薄膜の一つであるDLC薄膜に注目し,1層のみのcross-ply構造成膜を行い,実用に近い繰返し負荷に対しても高い密着力を有するcross-ply積層構造を有する炭素系硬質薄膜被覆部材の創製を更に進める目的で以下の通り実施した.1.基材として一般的な構造用炭素鋼SCM440を選定し,板状試験片へと機械加工を行った.さらに炭素系硬質薄膜成膜に適した表面粗さまで機械的研磨を行った.2.次にアルミナメッシュを用い,タングステンを添加した比較的軟質なDLC層をcross-ply構造に厚さ0.5μm成膜し,その後,タングステンを添加しない比較的硬質なDLC層を1.0μm成膜することにより,1層のみのcross-ply構造を有する被覆試験片を作成した.なお,成膜には一般的な炭素系硬質薄膜成膜手法の一つであるUBMS装置を用いた.また比較のため,タングステンを添加した比較的軟質なDLC層のみ,またタングステンを添加しない比較的硬質なDLC層のみの試験片も合わせて作成した.3.作成した1層のみのcross-ply構造を有する被覆試験片の断面を走査型電子顕微鏡により観察することにより,被膜性状を確認した.その結果,本研究で提案した1層のみのcross-ply構造を有するDLC被膜には,被膜の割れや,基材界面での割れは確認されず,極めて良好な被膜が形成されていることを確認した.これにより,次年度において目標とするcross-ply積層構造への応用が十分可能であると考えられる.昨年度までの実験的検討により,1層のみ(厚さ1.5μm)のcross-ply構造成膜が可能であることを確かめたため,今年度はこれを複数回積層することが可能であるか,またこれにより,本研究の目的とする従来の成膜に比べ著しく高い密着力を有する炭素系硬質薄膜被覆部材の創製が可能であるかを実験的に検討する目的で以下の通り実施した.1.昨年度同様,基材(SCM440)を板状試験片に機械加工し,成膜に適した表面粗さまで機械的研磨を行った.2.次に昨年度成膜可能であることを確かめた厚さ1.5μmのcross-ply構造を3層,および6層積層することにより,3層cross-ply積層,および6層cross-ply積層した2種類の炭素系硬質薄膜被覆試験片を作成した.なお,昨年度同様,比較的軟質なDLC層にはタングステンを添加し,成膜には一般的な炭素系硬質薄膜成膜手法の一つであるUBMS装置を用いた.3.作成した2種類のcross-ply構造を有する被覆試験片の断面を走査型電子顕微鏡SEMにより詳細に観察することにより,被膜性状を確認した.その結果,3層cross-ply積層被膜には被膜の割れや,基材界面での割れは確認されなかったものの,6層cross-ply積層被膜には,局所的に界面剥離が確認された.これは,被膜厚さの増加に伴い被膜の内部応力が増大したことに起因するものであると考えられる.4.上述した2種類のcross-ply構造を有する被覆試験片に対し,繰返し負荷を与えることにより,その耐久性,密着性を検討した.その結果,従来の硬質薄膜被覆部材に比べ,その耐久性が向上していることが確認された.来年度以降,その耐久性向上メカニズム,またさらに高い耐久性向上のための被膜構造の検討を行う.炭素系硬質薄膜技術(Carbon Thin Film : CTF)は地球環境問題へ大きく貢献が期待される成膜技術であるが,常にその「密着性」が懸念されている.そこで本研究では,比較的軟質なCTF層(中間層)と,比較的硬質なCTF層をcross-ply構造を利用し3次元的に成膜することにより,従来のCTF被覆部材よりも高い密着性,耐久性を発揮する炭素系硬質薄膜被覆部材の創製を目指した.まず,cross-ply構造1層のみ成膜した試験片作成を試み,その様相を微視的観察することにより,提案した3次元cross-ply構造成膜が可能であることを確認した.

次に,上述したcross-ply層を3層,および6層積層した2種類のCTF被覆試験片を作製し,繰返し負荷を与えることによりその耐久性を評価した結果,3層cross-ply試験片は,従来のCTF被覆部材に比べ,3倍程度高い耐久性を示すことが確認された.しかしながら,6層cross-ply試験片の耐久性は,従来のCTF被覆部材に比べ低いものとなった.この要因について,詳細なその場微視的観察を行った結果,3層cross-ply試験片は,繰返し負荷に対して,微視的剥離が発生しにくいことが明らかとなり,また6層cross-ply試験片は,被膜厚さの増大に伴う内部応力が増大したことにより,比較的早期に界面剥離が生じていることが明らかとなった.以上の実験的検討より,本研究で提案した3次元cross-ply構造を有するCTF被覆部材は,従来の被覆部材に比べ,極めて高い耐久性を示すことから,実機への応用が期待される成膜技術であるといえる.しかしながら,より高い耐久性を発現するためには,CTF被膜の厚膜化は必須課題であり,本研究においては良好な結果を発現することができなかった6層cross-ply試験片の実現が今後の課題であるといえる.おおむね申請書に記載した研究目的通りに進んでいるが,今年度実験を予定していた被膜ミクロ観察について,一定の観察結果を得られていないため.この点についてはすでに観察手法等の再検討が終わっており,来年度早い段階にて達成できる遅れであり,問題となる遅れとは考えていない.24年度が最終年度であるため、記入しない。申請書に記載した通り,今後は本研究で提案した成膜手法が,一般の成膜手法に比べ優位な要因を実験的に明らかにしていく.また得られた実験的知見を基に,積層方法を再検討し,より高い耐久性・密着性を有する硬質薄膜成膜手法の確立を目指す.24年度が最終年度であるため、記入しない。
末梢組織における異物排出トランスポータ機能のイメージング

Multidrug resistance-associated protein 1 (MRP1)は生体内に広く分布し、細胞内に侵入する有害な異物を排除している一方で、その過剰発現は薬剤耐性に深く関与し、また、一部の疾患ではMRP1の発現量が変化している。本研究では、プリン骨格を有する11C標識プローブを用いて末梢組織におけるMRP1機能のイメージングの可能性を検討した。その結果、本プローブは肺組織においてP糖タンパク質や乳癌耐性タンパク質には認識されず、MRP1特異的に排出されたことから、肺のMRP1機能の非侵襲的測定が可能であることが示唆された。異物排出トランスポータ(MRP1)は生体内に広く分布し、細胞内に侵入する有害な異物を排除している。一方で、MRP1の過剰発現は薬剤耐性に関与し、一部の疾患ではその発現量が変化していることが認められている。従って、MRP1機能のインビボイメージングは薬物治療の改善や病態解明に貢献できることが期待される。しかしながら、末梢組織でのMRP1に特異的なイメージングプローブは開発されていない。前年度、候補プローブの6-bromo-7-[11C]methylpurine ([11C]1)は投与後、肺に移行し、速やかにMRP1の基質に変換されることが確認され、水溶性の基質を効率よく肺組織内に送達することに成功した。本年度は、ポジトロン断層撮像法を用いて、[11C]1についてMRP1機能のイメージングの可能性を検証した。野生型マウスでは、肺組織内で変換されたMRP1の基質は排出速度0.1 min-1で速やかに肺から洗い出されたのに対して、Mrp1欠損マウスでは基質の洗い出しが著しく遅延した(排出速度:0.006 min-1)。また、排出トランスポータのP糖タンパク質と乳癌耐性タンパク質の双方が欠損したマウスの肺における[11C]1の動態は野生型マウスと同様であった。これらの結果から、[11C]1はMRP1に対する特異性が高いことが示唆された。さらに、[11C]1の動態に対するMRP1阻害剤(MK571)の影響を検証した結果、MK571を前投与したマウスでは肺/血液比は対照群と比べて有意に高かく、また投与量依存的に排出速度の低下が認められた。以上、[11C]1を用いることで特異的に肺組織のMRP1機能をイメージングすることが可能であると考えられる。この成果はAmerican Journal of Respiratory Cell and Molecular Biology誌に掲載予定である。Multidrugresistance-associated protein 1 (MRP1)は生体内に広く分布し、細胞内に侵入する有害な異物を排除している一方で、その過剰発現は薬剤耐性に深く関与し、また、一部の疾患ではMRP1の発現量が変化している。研究代表者は、最近、異物排出トランスポータ(MRP1)の機能評価のため、PETプローブの6-bromo-7-[11C]methylpurine ([11C]1)およびmetabolite extrusion methodと呼ばれる測定法を開発し、脳内のMRP1のイメージングに成功した。本研究では、[11C]1について末梢組織(特に肺組織)でのMRP1機能のイメージングの可能性を検討した。本測定法により肺のMRP1をイメージングするには、[11C]1は1)肺組織への高い取り込み、2)水溶性基質であるグルタチオン(GSH)抱合体への速やかな変換という条件を満たすことが必要である。まず、マウスの肺ホモジネート中において[11C]1とGSHとの反応速度を調べた。その結果、1.6/min/g/mLと非常に速く、インビボでの肺においても[11C]1は速やかにGSH抱合体に変換されることが示唆された。次に、[11C]1および[35S]GSH抱合体の肺への移行性と滞留性を検討した。[11C]1をマウスに静脈内投与したところ、投与後1分で肺に高い取り込みが認められ、その後、肺の放射能は急速に減少した。一方、GSH抱合体の1分における肺/血液比は[11C]1に比べ低値を示し、抱合体の単純拡散による透過性は低いと考えられた。また、Mrp1欠損マウスでは[11C]1は肺に取り込まれた後、緩やかに減少し、投与60分後の肺/血液比は野生型マウスに比べ、有意に高かった。さらに、Mrp1欠損マウスにおける肺の化学形を分析したところ、未変化体の[11C]1は消失し、放射能の大分部がGSH抱合体であることが確認された。以上、本年度の研究により、[11C]1は肺への高い取り込みおよび基質への速やかな変換という条件を満たし、肺組織におけるMRP1機能のイメージングの可能性が示唆された。PETプローブ6-bromo-7-[11C]methylpurine ([11C]1)について肺組織における異物排出トランスポータMRP

1機能のイメージングの可能性を検討した。本年度の研究では、マウス肺ホモジネート中において[11C]1はグルタチオン(GSH)と速やかにかつ特異的に反応することが判明し、反応性の改善といった候補プローブの最適化を行うことなく、インビボでの検討に移ることができた。また、[11C]1は静脈内投与後、肺に移行し、インビボでも速やかにGSH抱合反応を受けることが確認され、水溶性のGSH抱合体を効率よく肺組織内に送達することに成功した。さらに、Mrp1欠損マウスを用いた検討より、生成したGSH抱合体の肺組織から血液中への排出にはMrp1が関与していることが確認された。このように、[11C]1はプローブの基本的条件(高い肺への取り込みと基質への速やかな変換)を満たし、MRP1機能のイメージングの可能性が示唆されたことから、本研究はおおむね順調に進展していると考えられる。現在まで、本研究はおおむね計画通りに進み、6-bromo-7-[11C]methylpurine ([11C]1)は肺のMRP1イメージングプローブとしての基本的な条件を満たした。よって、今後は、[11C]1の動態に対するMK571あるいはプロベネシドといったMRP1阻害剤の影響を検討し、[11C]1の応答性を確認する。また、他の排出トランスポータ遺伝子欠損マウスを用い、その選択性を調べる。これらの結果が良好な場合は、肺のMRP1の発現が変化した病態モデル動物を用いて、[11C]1の応答性を調べることを予定している。最近の研究から、慢性閉塞性肺疾患患者の気管支生検におけるMRP1の発現が健常者と比べ低いことや、インビトロにおいてタバコ煙抽出物がMRP1の活性に影響を及ぼすことが示唆されており、喫煙曝露やリポポリサッカライド投与により作製した慢性閉塞性肺疾患モデル動物を用いて、その評価を行う。さらに、肺組織に加えて、腫瘍におけるMRP1機能イメージングの可能性を検討することも予定している。具体的には、MRP1高発現の薬剤耐性およびMRP1低発現の非薬剤耐性のマウス腫瘍モデルを作製し、このモデルマウスにおいて[11C]1の動態や排出速度の変化を比較検証し、MRP1イメージングプローブとしての可能性を探る。本プローブが不適切な性質を有する場合にはその原因を検討し、候補プローブを再設計・合成し最適化を行い、研究を進めていく。本研究で用いる非標識/標識化合物を合成するための試薬や溶媒、分離・精製のための分取用高速液体クロマトグラフ(HPLC)カラム、また化学形の同定のための薄層シリカゲルクロマトグラフおよび分析用HPLCカラム、放射能測定のためのプラスチックチューブを購入する(350,000円)。インビボ実験に関しては、実験動物、遺伝子組み換え動物、さらに腫瘍モデル作製のための細胞培養用試薬・器具を購入する(450,000円)。また、研究成果を学会にて報告するための旅費(400,000円)および参加費(100,000円)、誌上発表するための経費として外国語論文校閲費等に使用する(100,000円)。合計:1,400,000円(物品費:800,000円、学会旅費:400,000円、学会参加費:100,000円、論文校閲費:100,000円)
ロープテザーに対する宇宙エレベータークライマーの姿勢制御

ロープ型クライマーの姿勢制御に関して複数CMG機構やスパイラル推進機構、オムニホイールを用いた機構などについて理論的および実験的に検討を行ってきている。オムニホイールを用いた機構については、市販のオムニホイールで基本的な装置を作って検討を行った。その結果、複数のオムニホイールで検討を行ったが、いずれもオムニホイールの表面の凸凹がロープに食い込んでオムニホイールが破損してしまった。通常のオムニホイールはローブテザー昇降に適した形状をしておらず、適した形状のオムニホイールが必要と考えられるため、検討を行っているが難航している。複数CMG機構は構想通り製作して実験を行い、一つのCMGを用いた場合よりも長い時間の飽和抑制が可能であることを確かめたが、長時間になるとやはり飽和は避けられなかった。また構造が複雑で重量が大きくなってしまい、過負荷状態になってしまうなどの問題点も見られた。このためより単純な構造で軽量のリアクションホイールを用いた機構に切り替えて検討を行っている。リアクションホイールを用いた場合も飽和の問題は生じる可能性はあるが、リアクションホイール機構はCMG機構よりもフライホイールの回転速度が遅いため、対応しやすいと考えている。スパイラル推進機構も構想通り製作して実験を行い、基本的な特性は想定した通りの結果が出ている。しかし、ロープテザーに沿うローラの脱輪を防ぐためローラを3輪にしているため、取り付けの際に装置のゆがみなどで少しでも位置がずれるとローラが接触してしまう問題点が見られた。このためローラを2輪にして、脱輪を防ぐために脱輪防止板を考案して検討を行っている。以上のように当初計画した機構や方式は、ある程度は想定した結果が得られているが、いずれもいくつかの問題点が明らかになり、別の機構や方式に切り替えて検討を行っている。オムニホイールは市販品に適したものがなかなか見つからず、オーダーメイドで製作を頼むと多額の費用が発生する。自作をするのも難しい状況であり難航している。複数CMG機構も飽和するまでの時間は伸ばせたものの,飽和は避けられなかった。また構造が複雑で重量が大きくなる問題も見られた。このため,リアクションホイールを用いた機構に切り替えて検討を行っている。スパイラル推進機構も最初に製作した3輪ローラの機構は、装置のゆがみなどでローラが接触してしまう問題点が見られたので、脱輪防止板を新たに考案し、これを用いた2輪ローラの装置を検討している。このように最初に構想した機構や方式が、いろいろと問題が生じ、別の機構や方式を検討する必要が生じているため。オムニホイールは適したものを入手するめどが立たないため、このめどが立つまで一時保留にする予定である。複数CMG機構はリアクションホイールを用いた機構に切り替えて、基本的な装置を製作し、制御などを検討する予定である。リアクションホイールを用いた機構も飽和が起きる可能性はあるが、CMG機構に比べてフライホイールの回転速度が遅いため、対応はやりやすいと考えている。スパイラル推進機構は、脱輪防止板を新たに考案し、これを用いた2輪ローラの装置を製作して、姿勢制御の効果について検討する予定である。

このように最初に構想した機構や方式が、いろいろと問題が生じ、別の機構や方式を検討する必要が生じているため。オムニホイールは適したものを入手するめどが立たないため、このめどが立つまで一時保留にする予定である。複数CMG機構はリアクションホイールを用いた機構に切り替えて、基本的な装置を製作し、制御などを検討する予定である。リアクションホイールを用いた機構も飽和が起きる可能性はあるが、CMG機構に比べてフライホイールの回転速度が遅いため、対応はやりやすいと考えている。スパイラル推進機構は、脱輪防止板を新たに考案し、これを用いた2輪ローラの装置を製作して、姿勢制御の効果について検討する予定である。次年度使用額が生じた理由はロープ型クライマーの姿勢制御に関して、当初計画した機構や方式はいずれも問題点が明らかになり、別の機構や方式に切り替えて検討を行うことになったため、それらの対応に時間を費やしてしまい、予定していた機材を購入する段階まで至らなかったためである。今後は、予定していた性能を満たすリアクションホイール機構を用いたクライマーやスパイラル推進機構を用いたクライマーが製作できれば、3次元測域センサや画像装置など想定した応用に必要な機材を購入する予定である。
ヒマ〓果上に形成される集光組織の解明に関する研究

1.研究目的油料作物のヒマには〓果上に刺のあるものと無いものとがあり,一般に有刺種は無刺種に比較して含油量がやや多いことが筆者らの調査で明らかになった.この場合〓果上の刺がこれに関与している可能性があるため,刺の先端部に形成される瓜状の組織の吸収波長を調査した結果400nmの波長を吸収していることが明らかとなった.ヒマの油脂生成は光の強度に著しく影響を受け易いため,この組織と油脂生成との関係を明らかにしようとした.2.実験材料および方法ヒマ(中国系統小粒種)を本学実験圃場の播種し,花房の開花後20日目よりこの刺を根元より切除して成熟させた.さらにこの切除した花房に寒冷紗を被覆して遮光した区も設けた.一方無処理の対照区も設置してこれと比較した.3.結果および考察ヒマ種子の100粒重は対照区が26.15gに対し,刺切除露光区は25.48g,刺切除被覆区は25.02gさらに無切除被覆区は25.23gで物質生産が抑制されたことが明らかとなった.しかもこれには5%水準で有意差が認められた.次に油脂の含油量についてみると,対照区が70.85%(種皮は含まず)に対し,刺切除露光区が69.20%,刺切除被覆区69.05%で無切除被覆区は66.13%を示した.この4処理区を比較すると,刺の有無により油脂の生成に差があることが明らかとなり,この場合も5%水準で有意差が認められた.油脂中の遊離脂肪酸含量を示す酸価を調査した結果,対照区が1.00に対し刺切除露光区1.22,刺切除被覆区は1.27,無切除被覆区は1.49で酸価に関しては有意差が認められなかった.今後は〓壁の解剖学的研究を推進する予定である.1.研究目的油料作物のヒマには〓果上に刺のあるものと無いものとがあり,一般に有刺種は無刺種に比較して含油量がやや多いことが筆者らの調査で明らかになった.この場合〓果上の刺がこれに関与している可能性があるため,刺の先端部に形成される瓜状の組織の吸収波長を調査した結果400nmの波長を吸収していることが明らかとなった.ヒマの油脂生成は光の強度に著しく影響を受け易いため,この組織と油脂生成との関係を明らかにしようとした.2.実験材料および方法ヒマ(中国系統小粒種)を本学実験圃場の播種し,花房の開花後20日目よりこの刺を根元より切除して成熟させた.さらにこの切除した花房に寒冷紗を被覆して遮光した区も設けた.一方無処理の対照区も設置してこれと比較した.3.結果および考察ヒマ種子の100粒重は対照区が26.15gに対し,刺切除露光区は25.48g,刺切除被覆区は25.02gさらに無切除被覆区は25.23gで物質生産が抑制されたことが明らかとなった.しかもこれには5%水準で有意差が認められた.次に油脂の含油量についてみると,対照区が70.85%(種皮は含まず)に対し,刺切除露光区が69.20%,刺切除被覆区69.05%で無切除被覆区は66.13%を示した.この4処理区を比較すると,刺の有無により油脂の生成に差があることが明らかとなり,この場合も5%水準で有意差が認められた.油脂中の遊離脂肪酸含量を示す酸価を調査した結果,対照区が1.00に対し刺切除露光区1.22,刺切除被覆区は1.27,無切除被覆区は1.49で酸価に関しては有意差が認められなかった.今後は〓壁の解剖学的研究を推進する予定である.
歯髄誘導因子の同定および微小環境再構築による歯髄再生

歯髄再生に効果がある化学的微小環境を検討した結果、以下の結論を得た。塩酸、グアニジン塩酸、EDTAにて段階的に処理後にEDTA処理をすることで歯髄再生能、血管新生能および象牙芽細胞数が著しく減少したことから、歯髄再生に関与する化学的微小環境はEDTA抽出液に含まれることが示唆された。歯髄幹細胞培養上清にて歯髄組織再生、血管新生、歯髄マーカーの発現を認めたことから、歯髄幹細胞培養上清内には歯髄再生に関与する化学的微小環境が含まれることが示唆された。EDTA抽出液だけでは歯髄は再生しなかったが、EDTA抽出液と歯髄幹細胞培養上清の両方を付着させることで、歯髄再生能を向上させることが示唆された。本研究は象牙質再生誘導因子を特定し、その応用により歯髄再生に必要な歯根の微小環境を再現することで歯髄再生の適応症を広げることを目的とする。本年度は各種処理を行った歯根を異所性移植し、その再生能を比較することでどの処理区分に再生誘導因子が含まれているか検討した。まず歯根を1.塩酸処理、2.グアニジン塩酸処理、3.EDTA処理を行った。それぞれを異所性に移植し、その歯髄再生量、血管誘導能、象牙質誘導能を免疫組織染色あるいはin situ hybridyzationにて比較した。その結果、3の処理を行うことにより歯髄再生能は極端に減少した。次いで、1.2.3.それぞれをオートクレーブによる失活歯根に凍結乾燥にて再付着させた。同様にそれぞれをそれぞれを異所性に移植し、その歯髄再生量、血管誘導能、象牙質誘導能を免疫組織染色あるいはin situ hybridyzationにて比較した。その結果、歯髄再生量および象牙質誘導能がEDTA抽出区分の再付着により回復していた。よって上記結果から、EDTA抽出区分に象牙質誘導因子が含まれていると推定できた。初年度の計画として挙げた異所性移植とその解析は順調に終了している。塩酸・グアニジン塩酸処理した歯根を用い異所性移植を行った場合、歯髄再生量に著変はなかったが、EDTA処理した歯根を用い異所性移植を行った場合には歯髄再生量・血管新生能・象牙質再生能が有意に減少した。またそれらの因子をオートクレーブ処理により失活させた歯根に再付着させた場合に歯髄再生量が回復した。またその原因として、血管新生能の著変はなく象牙質再生能のみ改善したことからEDTA画分には象牙質形成に関与する因子が含まれていることが考えられる。さらにEDTA抽出区分を濃縮し、歯髄幹細胞に作用させると、象牙質誘導能が促進されることも明らかとした。本実験において塩酸、グアニジン塩酸、EDTAの順に段階的に歯根の処理を行った結果、EDTA処理後に、歯髄再生能、血管新生能、および象牙芽細胞数が未処理歯根と比べて有意に減少した。また歯髄マーカーの発現を比較すると、EDTA処理歯根において、未処理、塩酸処理およびグアニジン塩酸処理歯根と比較してほとんどその発現が無くなり、歯根膜マーカーの発現が有意に高くなった。これらの結果から、EDTA処理により歯髄再生に必要な化学的微小環境を構成する因子が抽出されていることが示唆された。グアニジン塩酸およびEDTA処理によって、象牙質内より抽出可能な因子として、ほとんどの非コラーゲンタンパクが含まれていると報告されている。そこで非コラーゲンタンパクの混合物であるEDTA抽出液をオートクレーブ処理による不活性化歯に再付着させて、歯髄再生に関与する微小環境の再構成について検討したところ、EDTA抽出液の再付着のみでは歯髄は再生しなかった。EDTAは非コラーゲンタンパクを中心に抽出するため、歯髄再生に関与する因子が不足し、歯髄再生が誘導されなかったと考えた。そこで、接着能、増殖能、細胞遊走促進効果、血管形成促進能、象牙芽細胞分化能に効果がある因子を含む上清を不活性化歯根に付着させたところ、歯髄の再生が観察された。さらに、EDTA抽出液と上清を混和し付着させることで、上清単独を付着させたときより、歯髄再生能および根管壁の象牙芽細胞数が有意に増加した。一方、EDTA抽出液と上清の両方を付着させても血管新生量に関しては上清のみと比較して有意差は無かった。マウス筋芽細胞(C2C12)に対し、抽出液、歯髄幹細胞

培養上清5&#181;g/mlを単独または混合して添加し、遊走促進能、付着促進能、増殖促進能、血管新生能、象牙質・歯根膜誘導促進能を比較する。遊走促進能:TAXIScan-FLを用いた解析を行う。付着促進能:スライスしたブタ歯上に細胞を播種し、24時間後付着細胞をカウントする。増殖促進能:Tetra Color ONEを添加し2、12、24時間後に吸光度450nmにて測定する。血管新生能:アスコルビン酸、ヒドロコルチゾン、ヘパリンを添加してDMEM、2%FBS下にて21日間培養する。培養後、VE-cadherinにて免疫染色を行う。象牙質誘導能:アリザリン染色により解析する。また、スライスしたブタ歯上に細胞を播種し、21日後、共焦点レーザー顕微鏡にて形態を観察する。1)イオン交換クロマトグラフィーを用いて抽出液をフラクションに分ける。2)各フラクションをブタ歯根に再付着させ、異所性移植を用いて、再生能を比較する。さらに、上記と同様の添加実験を各フラクションを用いて行う。4)再生能の高いフラクションを質量分析し、蛋白質同定する。5)リコンビナント蛋白質を作製し、異所性歯根移植により、再生能を歯髄幹細胞移植の場合と比較する。また上記と同様の添加実験を、リコンビナント蛋白を用いて行う。再生歯学