hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
次世代プラズマＭＩＧハイブリッド溶接の知的自動制御に関する基礎研究

プラズマ溶接の品質はキーホールの状態にも依存する。基礎実験を行い、最適な溶接電流波形と溶融状態のモニタリング方法について検討を行った。その結果、パルス電流を用いることにより、裏ビードおよびキーホールを明確に観察できることを明らかにし、この電流によるキーホールの安定化について検討した。さらに、電流を30Aにさげ、低電流期間を2msに下げることにより、プラズマ溶接におけるアークの影響を少なくできた。これによりCCDカメラによりキーホールの直接観察ができるようになった。また、プラズマ溶接はトーチ構造を考えると、電極はトーチのチップ内にあるために、肉眼による直視ができない。このため溶接線にトーチ内の電極中心を合わせることが困難である。そこで、溶融池画像を処理することにより、溶接線の自動検出を行った。これにより、溶接線倣いを自動化できた。各電極の極性と極間距離が溶滴移行およびキーホール形成に与える影響が予想していたよりも大きかったため、溶接状態を推定するのに時間がかかった。また、この基礎実験において、プラズマノズルの損傷などが生じ、この対策にも時間が割かれた。MATLABを用いてdsPICの制御を試みたが、実行速度が遅くなるので、この手法を断念してC言語で直接プログラムを作成した。この作成にも時間がかかった。従来の溶接電源と異なり、プラズマ溶接用電源は予想以上に、電気雑音が強かった。このため、従来と同じように電源制御のためにパソコンを接続したとき、パソコンが正常に動作せずに電源制御ができなかった。この対策のために、電気雑音に強い新たなシステムを考案した。このシステム構築に時間がかかった。また、GMA電源も同時に使用するので、その電源に対する電気雑音の影響を検討する必要があった。1.溶融池前方形状からのプラズマ電極の高さ、溶接線倣いはほぼ完了したので、溶接時のキーホールを溶接面の表面から観察し、その大きさを計測する。2.キーホールの大きさの制御方法について検討する。3.電磁力の影響を明らかにするために、アーク形状を仮定し、Maxwellの電磁方程式に基づいた数値シミュレーションを行う。4.アーク長を制御して、MIG溶接の溶着量を増加させる方法を検討する。プラズマ電源、GMA電源の両方ともコンピュータ制御できるようになったので、2電源での溶接を行う。同じ極性の電源を用いるため、それぞれのトーチからのアーク放電したとき、その電流方向は同じである。互いのアーク電流により電磁力が干渉力として働き、プラズマアークおよび溶滴移行に影響を与える可能性がある。そこで、現象を高速度ビデオカメラで撮影して、電磁力の干渉について、解析し電源を制御する。高能率を達成し、アルゴンシールド下での溶滴移行を実現する。さらに、現象を制御するための制御器について検討し、シミュレーションを行いながら、制御器の有用性についても検討する予定である。
秘密鍵情報を含む平文を暗号化可能な完全準同型暗号の実現

本年度は鍵依存平文安全性(KDM安全性)を満たす準同型暗号の実現に向け以下の研究を行った.KDM安全な準同型暗号の実現に向け,まず準同型性を考えずない通常の公開鍵暗号においてKDM安全性を満たす方式の構成可能性を検討した.具体的には,選択暗号文攻撃に対する鍵依存平文安全性(KDM-CCA安全性)を満たす公開鍵暗号を射影的ハッシュ関数に基づいて構成する手法を示した.本研究で提案する手法を用いて,decisional diffie-hellman(DDH)仮定,quadratic residuosity(QR)仮定,及びdecisional composite residuosity(DCR)仮定に基づく具体的な公開鍵暗号方式を得ることができる.それらの具体的方式は線形関数に関するKDM-CCA安全性を満たしており,Applebaum(ECROCRYPT 2011)により提案されたKDM-CCA安全性を強化する手法を適用可能である.そのため,提案手法とApplebaumにより提案された手法を組み合わせることにより,任意の多項式時間計算可能回路に関するKDM-CCA安全性を満たす公開鍵暗号方式を構成することができる.これらの方式は,標準モデルにおいて,非対話型ゼロ知識証明及び双線形写像を用いずに同安全性を満たす初めての方式である.この結果について,国際会議ASIACRYPT2018において論文発表を行った.平成30年度が最終年度であるため、記入しない。平成30年度が最終年度であるため、記入しない。本年度は鍵依存平文安全性(KDM安全性)を満たす準同型暗号の実現に向け研究を行った.最近の研究によりKDM安全な暗号技術,及び準同型暗号の両者の構成において,識別不可能性難読化(IO)が構成要素として非常に有用であることが示された.そのため,KDM安全な準同型暗号を実現する要素技術としてIOは有力な候補であると推察される.しかし,IOの構成可能性についてはまだ課題が多く,特に実用に耐える効率の構成は実現されていない.そこで本年度はIOの実現に向け,IO及びIOを構成する上で重要な要素技術である関数型暗号について以下の二つの研究を行った.まず一つ目の研究として秘密鍵関数型暗号(SKFE)において安全に発行可能なユーザ鍵を増やす方法を提案した.具体的には,ユーザ鍵を一つだけ発行できるSKFEを用いて,ユーザ鍵を無制限に発行可能なSKFEを構成する方法を提案した.既存の結果により,ユーザ鍵を無制限に発行可能なSKFE及び公開鍵暗号を組み合わせることによりIOが構成可能であることが知られている.この結果と本結果を組み合わせることにより,ユーザ鍵を一つだけ発行可能なSKFE及び公開鍵暗号を用いてIOが構成可能であることが分かる.言い換えると我々の結果は,IOを実現する上で必要なSKFEに対する要求を緩和している.また二つ目の結果として,従来に比べ簡素にまた効率的にSKFE及び公開鍵暗号からIOを構成する方法を提案した.また提案構成は従来の構成に比べ大幅に安全性の損失を軽減している.この事実により,提案構成を用いて具体的にIOを構成する際のシステムパラメータのサイズは従来の構成を用いる場合よりも非常に小さくて良く,この観点からも提案方式は従来の構成を効率化していると言える.この結果については論文をCryptology ePrint Archiveにて公開した.本年度は来年度以降に行う暗号方式の構成において有用と考えられる要素技術である識別不可能性難読化の調査及び設計を試みた.その結果,識別不可能性難読化の研究において重要と考えられるいくつかの結果を得ることができ,またそれらの結果を論文にまとめ国際学会に投稿中である.これは当初考えていたよりも大きく進展している.本年度は鍵依存平文安全性(KDM安全性)を満たす準同型暗号の実現に向け研究を行った.KDM安全な準同型暗号の実現に向け,まず通常の公開鍵暗号により近い発展的暗号技術においてKDM安全性を満たすものの構成可能性を検討した.具体的にはIDベース暗号と呼ばれる技術を対象に検証を行った.IDベース暗号は,ユーザのID等,任意の文字列を公開鍵のように使用できる公開鍵暗号技術である.本研究ではKDM安全性を満たすIDベース暗号を実際に構成した.提案構成は適応的ID攻撃に対する安全性という強い安全性を有する.また提案構成の安全性は,安全性ゲームにおいて攻撃者に許すクエリの回数に一切の制限を設けることなく証明可能である.上述の安全性を満たすIDベース暗号は提案構成が初めてである.この結果について,国内学会SCIS2018において発表を行った.また国際学会PKC2018においても論文発表を行った.また,最近の研究によりKDM安全な暗号技術,及び準同型暗号の両者の構成において,関数型暗号が構成要素として非常に有用であることが示された.そのため,KDM安全な準同型暗号を実現する要素技術として関数型暗号は有力な候補であると推察される.しかし,関数型暗号の構成可能性についてはまだ多くの課題があるため,本年度は関数型暗号の実現に向けても研究を行った.具体的には,従来に比べ簡素にまた効率的に関数型暗号を構成する方法を提案した.また提案構成は従来の構成に比べ大幅に安全性の損失を軽減している.この事実により,提案構成を用いて具体的に関数型暗号を構成する際のシステムパラメータのサイズは従来の構成を用いる場合よりも非常に小さくて良く,この観点からも提案方式は従来の構成を効率化していると言える.この結果についても国際学会PKC2018にて論文発表を行った.本年度は鍵依存平文安全性を満たす高機能暗号技術を構成することに成功した.

また準同型暗号の構成に有用と考えられる関数型暗号に関する研究も行い一定の成果を得ることができた.これらの研究において得た知見は本研究の目的である鍵依存平文安全性を満たす準同型暗号の実現に向け非常に有用であると考えられる.本年度は鍵依存平文安全性(KDM安全性)を満たす準同型暗号の実現に向け以下の研究を行った.KDM安全な準同型暗号の実現に向け,まず準同型性を考えずない通常の公開鍵暗号においてKDM安全性を満たす方式の構成可能性を検討した.具体的には,選択暗号文攻撃に対する鍵依存平文安全性(KDM-CCA安全性)を満たす公開鍵暗号を射影的ハッシュ関数に基づいて構成する手法を示した.本研究で提案する手法を用いて,decisional diffie-hellman(DDH)仮定,quadratic residuosity(QR)仮定,及びdecisional composite residuosity(DCR)仮定に基づく具体的な公開鍵暗号方式を得ることができる.それらの具体的方式は線形関数に関するKDM-CCA安全性を満たしており,Applebaum(ECROCRYPT 2011)により提案されたKDM-CCA安全性を強化する手法を適用可能である.そのため,提案手法とApplebaumにより提案された手法を組み合わせることにより,任意の多項式時間計算可能回路に関するKDM-CCA安全性を満たす公開鍵暗号方式を構成することができる.これらの方式は,標準モデルにおいて,非対話型ゼロ知識証明及び双線形写像を用いずに同安全性を満たす初めての方式である.この結果について,国際会議ASIACRYPT2018において論文発表を行った.上述のように今年度は,KDM安全な準同型暗号の構成において有用と考えられる識別不可能性難読化について研究を行い,結果としていくつかの知見を得ることができた.次年度はこれらの知見を活かし,KDM安全な準同型暗号の構成を試みるつもりである.上述の通り今年度は鍵依存平文安全性を満たす準同型暗号を構成する上で有用な知見を多く得ることができた.特に同安全性を満たすIDベース暗号の設計方針は非常に参考になると考えられる.次年度はこれらの知見を活かし鍵依存平文安全性を満たす準同型暗号の構成を試みる.平成30年度が最終年度であるため、記入しない。平成30年度が最終年度であるため、記入しない。
ハイパフォーマンス簡易分析システムの開発と応用

環境水中の微量な金属イオンを迅速、簡便、高感度に化学分析できるハイパフォーマンス簡易分析システムを開発した。環境水に溶存する金属イオンを分離・濃縮できるキレート樹脂の新規合成と、それらの金属イオンに対する吸着性能を解明しながら、キレート樹脂を測定前処理剤として活用することによって、前処理プロセスを自動化したシステムと検出器をカップリングした迅速、簡便、高感度なハイパフォーマンス簡易分析システムを開発した。環境水中に存在する微量元素の動態を解明することは,環境の保全や生体の安全を確保するために極めて重要な課題である.環境や生体に悪影響を与える有害元素は,海水や河川水などの環境水中にpptppbレベと比較的低濃度で存在するにもかかわらず,環境や生体を脅かすには十分な量である.そのような極微量元素(特に有害金属イオン)の環境水中濃度を正確に把握するために,精度,感度,確度のよい測定方法を確立しなければならない.具体的には次の項目を達成した.(1)機能性分離・濃縮剤の開発:環境水中には高感度測定を妨害する高濃度なマトリックス成分と,測定目的の微量元素が共存しているため,測定前に高濃度なマトリックス成分を効率よく分離し,測定目的の元素を濃縮する必要がある.水溶液内の金属イオンの捕集に有効な親水性の高い有樹天然材料であるキトサン基剤に,キレート官能基としてアミノ基とカルボキシル基を有するアミノ酸を導入した分離・濃縮剤の新規合成に成功した.(2)分離・濃縮性能にかかわる吸着メカニズムの解明:測定目的の金属イオンを選択的に捕集することの可能な高機能な分離・濃縮剤を開発するために,キレート官能基近傍の立体障害が吸着性能に与える影響について詳細に検討し,分離・濃縮性能にかかわる吸着メカニズムを解明した.(3)簡易分析システムの試作:高濃度マトリックス成分の分離と,極微量金属イオンの濃縮およびその高感度測定を実現するために,ハイパフォーマンス簡易分析システムの試作を行い,その性能評価を実施した.環境水中のppbレベルの微量元素を測定するには十分な精度,感度,確度を有した簡易分析システム試作機の開発に成功した.本研究は環境水中の微量な物質、特に有害金属イオンの定量を主体とした環境動態解析を遂行するための迅速、簡便、高感度な分析手法の構築を目指して、水溶液内の微量な金属イオンを分離・濃縮することのできるキレート樹脂を創製し、ハイパフォーマンスな簡易分析システムを開発した。キレート樹脂の金属イオン吸着に関するメカニズムについて、その化学構造を制御し合成したキレート樹脂の金属イオンに対する吸着性能と吸着メカニズムを検討、評価した。特定の金属イオンと錯形成可能なキレート試薬をキレート樹脂基材に結合することにより、その金属イオンに対する吸着選択性や吸着容量を改善することも可能であった。キレート樹脂基材へのキレート官能基の導入やそのキレート試薬の適切な選択・活用によりある程度自在にキレート樹脂の吸着性能をコントロールすることが可能であった。さらに分析前処理のオンライン化・簡易化を目指してスイッチングバルブやセレクションバルブ、シリンジポンプ等から構成される前処理システムを構築し、ハイパフォーマンスな簡易分析システムの開発に成功した。金属イオンを測定する際には目的の金属イオンを捕集・濃縮することのできるキレート樹脂を充填したミニカラムを本システムに組み合わせることによって、水試料中のマトリックスを分離し特定の金属イオンを濃縮した後、高感度に定量することができる。本研究は水試料中の微量な金属イオンの濃縮と高濃度なマトリックス成分の分離の分析前処理の過程をオンラインで実施し、金属イオンを高感度に定量することのできるハイパフォーマンスな簡易分析手法を確立した。
流体力学的手法を用いた混雑危険度の定量的評価手法の開発と応用

本研究では、帰省ラッシュ時における高速道路などで発生する自動車の渋滞や、通勤ラッシュ時の駅や、災害が発生したときの建物からの避難時に発生する歩行者の渋滞に着目した。渋滞は車もしくは人が多く存在するときに必然的にと言っていいほど発生するものだが、その渋滞がどれくらい多くの台数、もしくは人数のときに、どのような場所で発生し、またどのような条件で渋滞が解消されるのかに焦点をあて研究を行った。本研究では、シミュレーション手法を用いて2種類の空間内における渋滞の性質について分析を行った。1つ目は一方通行の通路における歩行者のシミュレーションを行った。先行研究として、中国の祭りの際の一歩通行の通路での歩行者の挙動に関する実験結果が報告されている。その実験では、通路内の壁側に渋滞が発生するという現象が観測された。この観測結果を再現するために、1つ目で使用したセルオートマトン手法を改良することで、通路内の歩行者の挙動を定量的かつ定性的に再現を行うことができた。この成果を査読付き国際ジャーナルであるphysicaAに投稿し、出版された。また、2つ目として高層ビルや地下街、もしくは幹線道路のようなネットワーク状に広がる空間内における渋滞の挙動について分析を行った。この分析では、直線状の道を仮想空間内でネットワーク状に接続し、ネットワーク内の交通流を扱う先行研究の研究手法をもとに渋滞のダイナミクスを分析した。この手法によって、ネットワーク空間内において、ある道に渋滞を意図的に発生させ、その渋滞がどのように広がるのか、もしくは渋滞が解消されるのかをシミュレーションによって確かめた。また、渋滞が解消される場合の条件を理論的に導出し、シミュレーション結果との一致を確認した。この成果を査読付国際学会であるICORESにて発表を行った。29年度が最終年度であるため、記入しない。この研究計画の最終目標は「道に存在する歩行者の流れを制御し、その制御手法を建物レベルに拡大し渋滞の発生を極力抑え、緊急事態発生時に迅速かつ安全な避難手法を実現させる」というものだった。申請者は研究実績の概要に示したように「歩行者の通路のダイナミクス」と「ネットワーク空間上の自動車や歩行者のダイナミクス」に焦点をあて研究を行った。後者の研究は前者の研究を行っていたときに渋滞のダイナミクスを考えた際、どのようになるかを考え後者の研究も進展させることに興味が出たという経緯がある。前者の研究に関しては、既に流れを制御できる手法を流体力学に基づいた理論を導出し、理論値と実験結果のデータを比較したものを論文にし投稿したが結果はリジェクトだった。今後は却下された理由に基づいて研究を進める予定である。

また、2つ目として高層ビルや地下街、もしくは幹線道路のようなネットワーク状に広がる空間内における渋滞の挙動について分析を行った。この分析では、直線状の道を仮想空間内でネットワーク状に接続し、ネットワーク内の交通流を扱う先行研究の研究手法をもとに渋滞のダイナミクスを分析した。この手法によって、ネットワーク空間内において、ある道に渋滞を意図的に発生させ、その渋滞がどのように広がるのか、もしくは渋滞が解消されるのかをシミュレーションによって確かめた。また、渋滞が解消される場合の条件を理論的に導出し、シミュレーション結果との一致を確認した。この成果を査読付国際学会であるICORESにて発表を行った。不採択であった歩行者流に関する論文の研究を進める。また、この研究で議論した理論に基づき、緊急時の建物からの迅速かつ安全な避難を達成できるような評価手法を開発し、その結果を論文にする予定である。また、ネットワーク上の自動車や歩行者のダイナミクスに関する研究は国際会議で発表した内容をさらにブラッシュアップさせ論文として投稿する予定である。また、このネットワーク状の渋滞のダイナミクスの分析結果をもとに、渋滞の挙動を予測し、渋滞を回避して目的地に向かうことを考慮できるような最短経路アルゴリズムを開発した。この結果についても分析を進め今後論文として国際ジャーナルに投稿予定である。29年度が最終年度であるため、記入しない。
ＡＳＤ者が視覚的に空気を読むスキルを習得するためのプログラムの開発

3人の人が会話をしている場面の静止画を1.5秒間観察する条件では、TD者は3人の人物全員の顔を固視したが、ASD者は中央の人物の顔だけを固視した。3人の中で誰が中心話者かを3択ボタンで答える条件では、ASD者の方がTD者よりも反応時間が長いものの、ASD者もTD者同様、3人全員の顔を固視した。以上より、ASD者には社会的場面において参加者全員を自発的に見渡すスキルを習得するための支援が必要であると考えられた。自閉症スペクトラム障害(ASD)者には、社会的対人関係やコミュニケーションの質的障害がみられ、「空気が読めない人」と揶揄されることもある。「空気が読めない」ことの中には集団が共有している話題の焦点を探査することの困難も含まれると考える。本研究では、複数の他者の視線に対する注意の配分、複数の他者視線の焦点位置(人に焦点を合わせる場合と物に焦点を合わせる場合)の探査という2つの観点から、ASD者が話題の焦点位置を探査する際の問題を、アイ・トラッキングと選択肢課題の方法を用いて実験的に明らかにする。さらに、本人のアイ・トラッキング画像と健常な模範画像とを比較可能な形でフィードバックしながら教示する方法で、話題の焦点位置を探査するスキルを習得できるようにするための訓練プログラムを開発する。研究目的の達成のために、定型発達(TD)成人40名、ASD成人40名に、アイ・トラッキング装置を搭載したディスプレイの上に提示された各種の対人的相互作用の場面の画像を数秒間観察し、選択肢課題にボタンスイッチで回答してもらう。課題は、画像内の「3名の人の中で今話をしている人を当てる」「2名の人が一緒に見ている物を当てる」などとする。測定データは、被験者の注視の軌跡、反応の正誤、反応時間とする。その後、ASD者に対して自身の注視の軌跡とTD者の典型的な注視の軌跡をフィードバックし、複数の他者の視線に対する注意の配分、複数の他者視線の焦点位置(人に焦点を合わせる場合と物に焦点を合わせる場合)の推定スキルの訓練を行う。当該年度は、実験設備の構築・調整と課題画像の作成、および関連する課題画像を用いた予備実験を行った。ASD者は対人場面において他者の視線を観察しないことから、それを手がかりとして活用することなく、結果的に他者の感情や意図を読み取ることに失敗すると考えられている。本研究では、そのようなASD者の特徴が、複数の他者が存在する場面で、その時々の中心人物が誰かを推定するスキルにも影響を及ぼしているのではないかと考えた。そこで、コース立方体テストのIQが100以上で絵画語彙年齢が12歳以上の8名のASD者と同数の生活年齢12歳のTD者を対象として、まず3名の人が会話をしている場面の静止画9種類を1.5秒間提示し、それを観察する間の被験者の固視位置を測定した(観察条件)。次に、同じ9種類の静止画を提示し、3人の中で今誰が話しているかを3択ボタンによって答えてもらった(課題条件)。その結果、観察条件では、TD者がほぼ3名の人物全員の顔を固視するのに対して、ASD者はほとんど中央の人物の顔だけを固視した。一方、課題条件では、ASD者の方がTD者よりも反応時間が多少長いものの、ASD者もTD者と同様、3名全員の顔を固視した。また平均正答率にも差はなかった。以上のことから、ASD者は認知的課題の解決を前提として課せられれば、複数の他者の顔を固視してその中の中心人物(話し手)の探査をすることが可能であるが、単に自発的観察に委ねられるだけの状況では、ASD者は複数の他者の顔を念のために万遍なく固視して中心人物を探査しておくことは少なく、それをTD者は日常的に柔軟に行っていることが示唆された。本研究の結果を活用し、社会的場面に身を置く際にときどき場面全体を見渡す習慣をASD者が身に付けることを支援するプログラムを検討する。臨床発達心理学実験設備の構築・調整と課題画像の作成、および関連する課題画像を用いた予備実験が終了し、予定の実験を開始している状況であるから。複数の他者の視線に対する注意の配分、複数の他者視線の焦点位置(人に焦点を合わせる場合と物に焦点を合わせる場合)の推定能力を明らかにする実験、それに関するスキルの訓練、データ解析を行い、「ASD者が視覚的に空気を読むスキルを習得するためのプログラム」を作成する。
月地球回転力学進化の縞状堆積物からの解読

本研究の目的は地球環境の変動リズムを記録している海底縞状堆積物から、その変動の周期を読みだし、40億年にわたる月-地球回転力学系の進化を明らかにすることである。そのために、適切な試料の確保・成形、縞を計測するための分析機器の開発および解析手法の開発を行った。1.試料として、38億年前のBIFおよびチャート(グリーンランド・イスア)、33億年前のBIFおよびチャート(西オーストラリア・ピルバラ)、25億年前のBIF(西オーストラリア、ハマ-スレ-)、19億年前のストロマトライト(カナダ・グレートスレーブ)、6億年前の縞状泥質石灰岩(カナダ・ニューファンドランド)などを確保した。これらの試料を40cm×20cm×3cmのプレートに加工し、表面を研磨した。2.このプレート表面に対して以下のような機器を応用・開発し、新しい画像分析手法を開発した。(1)CCDカメラによるデジタルカラー画像計測。(2)蛍光X線スキャナによる元素組成の画像計測。(3)イメージングプレートを用いた放射能の画像計測。3.さらにこれらの計測によって得られた縞縞画像データを解析するアルゴリズムを開発した。これは以下の手順で行われる。(1)試料の縞状構造はしばしば堆積過程や続成作用、変形などにより乱されている。画像強度データを乱された縞に沿って平均する画像処理(SSSN)を行い、層準に沿った空間系列データを得る。(2)空間系列データを堆積速度モデルを仮定して時系列データに変換する。このデータに対して時系列解析(存否法を応用)を行い、周波数スペクトルを得る。(3)これらの周波数をLODをパラメータにした潮汐およびミランコビッチサイクルの理論周波数と対比して縞の同定と堆積パラメータの決定を行い、さらに当時のLODを得る。これらの画像計測および画像解析手法の開発によって、はじめて縞状堆積物の定量的な時系列解析ができるようになり、太古代からのLODの変化を読み取ることが可能となった。本研究の目的は地球環境の変動リズムを記録している海底縞状堆積物から、その変動の周期を読みだし、40億年にわたる地球回転力学系の進化の歴史を明らかにすることである。本年度はそのための試料の確保と基礎的な記載を行う装置の開発を行い、それを用いた分析を開始した。試料については33億年前の縞状鉄鉱床およびチャート、25億年前の縞状鉄鉱床、19億年前のストロマトライトなどの大型試料を確保した。これを切断・研磨して基礎的記載に供した。基礎的記載の中でもその基本となる可視光画像を取り込むスキャナを開発した。これは100cm×50cmの範囲にわたって動くスキャナのヘッドに高精度なCCDカメラを搭載し、R,G,Bのデジタル画像が計測できるものである。これによって試料の色や形を定量的に測定でき、縞状構造の空間系列データを高速度・高精度で取得できるようになった。同時に紫外蛍光画像計測を試み、これが有用な記載項目であることがわかった。これは有機物や重金属の濃集イベントをきわめて効率よく検出、測定することができる。また、イメージングプレートによる試料の放射能画像測定を試み、十分に使える手法であることを明らかにした。蛍光X線スキャナにらる化学組成画像の取得を試み、広いサイプル表面に対して化学組成画像を得ることができるようになった。さらに同じ試料に対するこれらの画像データ相互の相関を分析し、縞状構造から堆積過程の変動をよみとる手法の開発を開始した。本研究の目的は地球環境の変動リズムを記録している海底縞状堆積物から、その変動の周期を読みだし、40億年にわたる月-

地球回転力学系の進化を明らかにすることである。そのために、適切な試料の確保・成形、縞を計測するための分析機器の開発および解析手法の開発を行った。1.試料として、38億年前のBIFおよびチャート(グリーンランド・イスア)、33億年前のBIFおよびチャート(西オーストラリア・ピルバラ)、25億年前のBIF(西オーストラリア・ハマ-スレ-)、19億年前のストロマトライト(カナダ・グレートスレーブ)、6億年前の縞状泥質石灰岩(カナダ・ニューファンドライド)などを確保した。これらの試料を40cm×20cm×3cmのプレートに加工し、表面を研磨した。2.このプレート表面に対して以下のような機器を応用・開発し、新しい画像分析手法を開発した。(1)CCDカメラによるデジタルカラー画像計測。(2)蛍光X線スキャナによる元素組成の画像計測。(3)イメージングプレートを用いた放射能の画像計測。3.さらにこれらの計測によって得られた縞縞画像データを解析するアルゴリズムを開発した。これは以下の手順で行われる。(1)試料の縞状構造はしばしば堆積過程や続成作用、変形などにより乱されている。画像強度データを乱された縞に沿って平均する画像処理(SSSN)を行い、層準に沿った空間系列データを得る。(2)空間系列データを堆積速度モデルを仮定して時系列データに変換する。このデータに対して置き系列解析(存否法を応用)を行い、周波数スペクトルを得る。(3)これらの周波数をLODをパラメータにした潮汐およびミランコピッチサイクルの理論周波数と対比して縞の同定の堆積パラメータの決定を行い、さらに当時のLODを得る。これらの画像計測および画像解析手法の開発によって、はじめて縞状堆積物の定量的な時系列解析ができるようになり、太古代からのLODの変化を読み取ることが可能となった。
多面的アプローチによる膀胱癌のGCプライマリレジスタンスを予測するマーカーの開発

(GC)療法が1stライン治療であるが、GCに対するプライマリーレジスタンスの症例や治療後に再発をきたす症例も少なからず存在する。本研究では従来のRNAシーケンスやマイクロRNAの発現プロファイルに基づく解析に加えて、メタボロミクス解析や新しいゲノム編集技術であるCRISPRライブラリーを膀胱癌細胞に導入して解析する。このように多くのデータベースから多面的アプローチを行い、核心的なGCに対するプライマリーレジスタンスを予測する有効な腫瘍マーカーを見つける提案である。
骨固定源を応用した成長期における新規顎矯正歯科治療法の開発

近年、上下顎骨にミニプレートを埋入し、ミニプレート間で顎間牽引を行うBone-anchored maxillary protraction (BAMP)と呼ばれる新たな成長期顎矯正歯科治療が報告され、国外において臨床報告が散見されている。しかし、形態学的・組織学的観点から作用機序や治療効果に関する詳細な検討を行った報告はない。本研究では、BAMPの動物実験モデルを構築し、効果を形態学的・組織学的観点から検証した。その結果、BAMPのヒトを対象とした過去の報告と同様の効果を認め、BAMPの臨床的有用性を支持する結果が得られた。1.目的:近年、成長期に上下顎骨へミニプレートを埋入し、顎間牽引を行う顎矯正治療法Bone anchored maxillary protraction(BAMP)の臨床報告がなされているが、その効果に関する動物実験的検証はなされていない。そこで、BAMPの動物実験モデルを構築し、顎顔面形態の変化について解析を行った。2.資料および方法:100日齢(Day -20)の雄性ビーグル幼犬6匹を用い、上顎両側後臼歯部と下顎両側前臼歯部にミニプレートを埋入した。120日齢(Day 0)から180日齢(Day 60)まで顎間牽引を行い(牽引群;n=3)、牽引しなかった対照群(n=3)と比較した。また、頭部X線規格写真を経時的に撮影して資料として用いた。解析はフランクフルト(FH)平面を基準平面として距離計測と角度計測を行った。距離計測は各計測点をFH平面上へ投影して行い、In(Inion)とN(Nasion)の投影距離を基準とし、それに対するInとPr(Prosthion)またはId(Infradentale)の投影距離の百分率をそれぞれ上下顎骨の前後的評価項目(In-Pr%、In-Id%)とした。角度計測にはFH平面と上下顎第一切歯歯軸とのなす角(U1-FH、FMIA)を用いた。統計学的解析にはMann-Whitney U-testを用いて、両群間を比較した。3.結果、考察:60Dayで、距離計測にてIn-Pr%は牽引群で有意に大きかったが、In-Id%は有意差を認めなかった。また、角度計測では牽引群においてU1-FH、FMIAはともに有意に小さかった。以上の結果より、BAMPにより上顎骨の前方成長促進および上下顎切歯の歯性補償が生じたと考えられ、BAMPの動物実験モデルにて上顎骨の前方成長に対する促進効果を認め、BAMPの臨床的有用性を支持する結果が得られた。【目的】近年、成長期に上下顎骨へミニプレートを埋入し、顎間牽引を行う顎矯正治療法Bone anchored maxillary protraction(BAMP)の臨床報告がされているが、その効果に関する動物実験モデルを用いた基礎的研究は行われていない。そこで、BAMPの動物実験モデルを構築し、顎顔面形態の変化および組織学的変化について解析を行った。【資料および方法】100日齢(Day -20)の雄性ビーグル幼犬10匹を用い、上顎両側後臼歯部と下顎両側前臼歯部にミニプレートを埋入した。120日齢(Day 0)から180日齢(Day 60)まで顎間牽引を行った群を牽引群(n=5)、牽引しなかった群を対照群(n=5)とした。両群ともに骨形成マーカーとしてカルセインとテトラサイクリンの二重蛍光染色を行った。また、実験期間中、頭部X線規格写真を経時的に撮影し、形態学的検討を行った。180日齢(Day 60)にて両群ともに屠殺し、上顎頬骨縫合部の非脱灰組織標本を作製した。標本はVillanueva bone染色後、メチルメタクリレート包埋を行った。薄切研磨した標本の蛍光組織像を撮影し、骨形態計測による組織学的検討を行った。統計学的解析にはMann-Whitney U-testを用いた。【結果および考察】形態学的検討において上顎骨の前後的評価項目(In-Pr%)の距離計測は牽引群で有意に大きかった(P<0.05)。組織学的検討から牽引群では骨量(BV/TV,%)が有意に小さく、また骨形成速度(MAR,μm/day)が有意に大きかった(P<0.05)。以上より、牽引群において上顎骨の前方成長促進および上顎頬骨縫合部の開大と同部位における骨形成の促進を認めた。【結論】BAMPの動物実験モデルにおいて上顎骨の前方成長に対する促進効果を認め、BAMPの臨床的有用性を支持する結果が得られた。26年度が最終年度であるため、記入しない。医歯薬学26年度が最終年度であるため、記入しない。動物実験施設の工事改修に伴い、実験の進捗がやや遅れている。

まず、平成25年度の実験計画のうち、年度内に遂行できなかった解析を行う。また、平成25年度に確立した動物実験モデル系を用いて、引き続きミニプレートの埋入部位をII級治療へ応用し、下顎骨の前方成長促進を想定した部位に変更し、その後、同様に牽引群・対照群の2群を設けてミニプレート間での牽引の効果について比較検討を行う。その後、牽引方向・牽引期間・牽引力・保定期間やその有無などの条件設定を工夫変更し、BAMPにおいて治療効果に影響を与える因子についての詳細な検討を行う。また、並行して同分野において検討しているOnplantを用い、OnplantをBAMPに応用するための予備実験を行う。具体的には、100日齢のビーグル犬を用い、Onplantの上下顎骨への埋入や加重付加実験を行い、評価検討を行う。その後、本実験として平成25年度と同様の方法にてOnplantを埋入し、牽引群・対照群の2群を設けて牽引の効果についてミニプレートを用いた群と比較検討を行う。
非肝臓細胞におけるHCV持続感染機構の解析

C型肝炎ウイルス(HCV)の主要標的臓器は肝臓であるが、肝臓以外の組織にも病変を引き起こすことが臨床的に報告されている。また最近我々は、HCVの増殖に必須な肝臓特異的なマイクロRNAであるmiRー122が発現していない非肝臓細胞においても、HCVは低レベルながら複製可能であり、その過程で5'非翻訳領域に適応変異が導入され、miR-122非依存性を獲得することをin vitroの実験で明らかにした。さらに、患者サンプルの非肝臓細胞からも同様の変異型ウイルスゲノムが有意に検出されたことから、非肝臓細胞がHCVゲノムのリザーバーとなる可能性を提示した。そこで本研究では、非肝臓細胞でのHCVの持続感染に関わる宿主因子や変異ウイルスの出現メカニズムを検討し、肝外病変の発症やウイルス排除後の再燃を制御する有効な治療法の開発に繋げることを目的とした。本年度は、非肝臓細胞でHCVが持続感染する過程で、miR-122以外のマイクロRNAがHCV-RNAの複製亢進に寄与している可能性について検討した。まずmiR-122をベースとした様々な変異体を用いて、HCV-RNA複製亢進に重要なマイクロRNAの領域およびモチーフ配列を検索した。すると、ウイルスゲノムへの結合領域がmiR-122と異なっていても複製亢進が可能なマイクロRNAのモチーフ配列が存在した。in silicoスクリーニングによりそれらのモチーフを保有するマイクロRNAを探索し検討したところ、miR-122型、non-miR-122型の結合様式でHCV-RNA複製を亢進しうるマイクロRNAを新たに計9つ同定した。また、得られた候補マイクロRNAのヒト正常組織中における発現量を定量したところ、肝外組織での発現が認められたため、それらは生体内でもHCVゲノム複製をサポートしている可能性が示唆された。以下の2点において大きな進展があったため。miR-122以外にHCV-RNA複製亢進能のあるマイクロRNAを探索するために、miR-122をベースに様々な変異マイクロRNAを作製してmiR-122欠損細胞で発現させ、複製亢進に重要な領域を同定した。すると、miR-122のように、シード領域の37番目に存在するGAGUGモチーフを介して2分子がHCVゲノムと相互作用するものと、GAGUGモチーフを持たないが、miR-122とは異なる部位で1分子が相互作用するnon-miR-122型のマイクロRNAにも複製亢進能があることを認めた。得られたモチーフ配列を元にin silicoスクリーニングを行ったところ、7種類のmiR-122型(miR-504-3p, miR-574-5p、miR-1236-5pなど)と、2種類のnon-miR-122型(miR-25-5p、miR-4730)の結合様式を呈するマイクロRNAにHCVゲノム複製亢進効果が認められた。特に後者はこれまでに報告がない、たった1分子の結合で効果を発揮することができる新規結合様式である。これは他のウイルスでは見られない、HCV特異的なマイクロRNAによるウイルス増殖亢進効果のメカニズムについてさらなる知見を得る手がかりになると期待される。・マイクロRNAの枯渇による宿主遺伝子発現への影響通常のマイクロRNAの機能は宿主遺伝子発現を抑制することであるが、HCVの複製にマイクロRNAが利用されることで本来の発現制御が行えなくなる。今回得られたmiR-574-5pやmiR-25-5pなどはがん関連遺伝子の制御に関与することが報告されていることから、非肝臓組織におけるHCVの持続感染による宿主側遺伝子発現への影響が、肝外病変発症のきっかけとなる可能性も示唆された。現在考えられているHCVの感染環におけるmiR-122の役割は、その結合によりHCVのIRES構造を翻訳開始複合体が形成しやすくなる活性型へと変化させることだと報告されている。そこでRNAの三次元構造およびRNA-タンパク質相互作用のモデリングを専門とする国内および海外の研究者との共同研究により、今回得られた様々なmiRNAがAgo2を介してHCV-RNAの5'領域と相互作用することで活性型IRES構造を取りうるのか否かを検証する予定である。また、今回得られた候補マイクロRNAはそれぞれ亢進効果の程度が異なるため、それが配列依存的な相互作用の強さによるものなのか否かもこの3Dモデリングから明らかにできると期待される。以上を今年度中にまとめて論文投稿予定である。さらに非肝臓組織のようなmiR-122非発現細胞でのHCV持続感染で導入される適応変異G28AはmiR-122存在下では導入されないため、その変異導入に非肝臓マイクロRNAが関与するのか否か、また関わる宿主因子の同定を通してその導入メカニズムについても知見を得る。

そこで本研究では、非肝臓細胞でのHCVの持続感染に関わる宿主因子や変異ウイルスの出現メカニズムを検討し、肝外病変の発症やウイルス排除後の再燃を制御する有効な治療法の開発に繋げることを目的とした。本年度は、非肝臓細胞でHCVが持続感染する過程で、miR-122以外のマイクロRNAがHCV-RNAの複製亢進に寄与している可能性について検討した。まずmiR-122をベースとした様々な変異体を用いて、HCV-RNA複製亢進に重要なマイクロRNAの領域およびモチーフ配列を検索した。すると、ウイルスゲノムへの結合領域がmiR-122と異なっていても複製亢進が可能なマイクロRNAのモチーフ配列が存在した。in silicoスクリーニングによりそれらのモチーフを保有するマイクロRNAを探索し検討したところ、miR-122型、non-miR-122型の結合様式でHCV-RNA複製を亢進しうるマイクロRNAを新たに計9つ同定した。また、得られた候補マイクロRNAのヒト正常組織中における発現量を定量したところ、肝外組織での発現が認められたため、それらは生体内でもHCVゲノム複製をサポートしている可能性が示唆された。以下の2点において大きな進展があったため。miR-122以外にHCV-RNA複製亢進能のあるマイクロRNAを探索するために、miR-122をベースに様々な変異マイクロRNAを作製してmiR-122欠損細胞で発現させ、複製亢進に重要な領域を同定した。すると、miR-122のように、シード領域の37番目に存在するGAGUGモチーフを介して2分子がHCVゲノムと相互作用するものと、GAGUGモチーフを持たないが、miR-122とは異なる部位で1分子が相互作用するnon-miR-122型のマイクロRNAにも複製亢進能があることを認めた。得られたモチーフ配列を元にin silicoスクリーニングを行ったところ、7種類のmiR-122型(miR-504-3p, miR-574-5p、miR-1236-5pなど)と、2種類のnon-miR-122型(miR-25-5p、miR-4730)の結合様式を呈するマイクロRNAにHCVゲノム複製亢進効果が認められた。特に後者はこれまでに報告がない、たった1分子の結合で効果を発揮することができる新規結合様式である。これは他のウイルスでは見られない、HCV特異的なマイクロRNAによるウイルス増殖亢進効果のメカニズムについてさらなる知見を得る手がかりになると期待される。・マイクロRNAの枯渇による宿主遺伝子発現への影響通常のマイクロRNAの機能は宿主遺伝子発現を抑制することであるが、HCVの複製にマイクロRNAが利用されることで本来の発現制御が行えなくなる。今回得られたmiR-574-5pやmiR-25-5pなどはがん関連遺伝子の制御に関与することが報告されていることから、非肝臓組織におけるHCVの持続感染による宿主側遺伝子発現への影響が、肝外病変発症のきっかけとなる可能性も示唆された。現在考えられているHCVの感染環におけるmiR-122の役割は、その結合によりHCVのIRES構造を翻訳開始複合体が形成しやすくなる活性型へと変化させることだと報告されている。
異種材料コンタクト界面の電子状態に関する理論的研究

1.表面上やバルク中などでエレクトロマイグレーションを起こすAl原子核を波束に置き換えたシミュレーションを行い、運動エネルギー密度・張力密度・有効電荷を新しく定義することにより、局所的に生じるストレスを考察した。有効電荷に関しては、外部電場による直接的な力に起因するものと、電子と原子核の衝突による運動量の変化に起因するものに分けることによって局所的な電荷密度分布を明らかにした。2.GaN結晶の(0001)表面および(000-1)表面に加え、(1-100)表面および(11-20)表面についてもGa原子・N原子が吸着するプロセスを第一原理計算により検討した。吸着サイトや吸着原子の表面からの距離等に著しい面方位依存性が示され、Ga吸着では(0001)表面、N吸着では(000-1)表面で原子の化学ポテンシャルが最も低く、結晶が成長しやすいことが明らかになった。また、結晶成長のドライヴィングフォースの描像を量子エネルギー密度により示した。3.SiO_2の薄膜モデルや結晶構造について、外部電場存在下において酸化膜内に取り込まれた層間水素原子が電子状態に与える影響をバンド構造計算や量子エネルギー密度により解析した。層間水素原子の存在はバンド構造に大きく影響し、これが絶縁破壊の一因になっていることが示された。また、外部電場存在下における層間水素原子のダイナミクスについても検討した。4.ZrO_2およびHfO_2の結晶構造について、外部電場存在下における電子状態と、第一原理計算により得られた波動関数から導出される誘電物性について議論した。本課題で開発した外部電場下の電子状態を求める計算手法や量子エネルギー密度による解析により結晶内における分極の様子や微視的な電子ストレスの描像が明らかになった。さらに、摂動論により格子振動も考慮した誘電率の計算手法を開発した。1.いくつかの面方位について、TiN表面にF原子が配位するプロセスに関して第一原理計算を用いて検討した。各TiN表面においてF原子が表面に近づくにつれ大きく安定化し、TiN(111)表面についてはF原子が配位しているTi原子に2つ目のF原子が容易に配位することが示された。F原子吸着の電子過程を領域密度汎関数理論の応用計算により議論した結果、フッ素配位数が2の場合においても、フッ素配位のドライヴィングフォースが電子集積に基づく領域電子エネルギーの安定化によるものであることが実証された。2.GaN結晶の(0001)表面および(000-1)表面について、Ga原子・N原子が吸着するプロセスを第一原理計算を用いて検討した。各表面の第2層原子が吸着界面に及ぼす影響の相違により、吸着サイトや吸着原子の表面からの距離等に著しい面方位依存性が示され、原子の化学ポテンシャルは(0001)表面のほうが(000-1)表面よりも低く、結晶が成長しやすいことが明らかになった。また、領域密度汎関数理論の応用計算により結晶成長のドライヴィングフォースが電子集積に基づく領域電子エネルギーの安定化によるものであることを実証した。3.Si(100)-1×1ダイハイドライド表面およびSi(100)-2×1モノハイドライド表面について、フッ素原子によるエッチング反応を第一原理計算を用いて検討した。フッ素原子のシリコン表面内部への侵入については1×1、2×1両表面ともに発熱的に進行し、その安定化エネルギーは両表面ともに水素終端Si(111)面と比較して著しく大きいことが示された。フッ素とシリコン表面間での相互作用やシリコン格子の結合の変化は領域密度汎関数理論に基づく運動エネルギー密度により系統的に理解できることを明らかにした。

1.表面上やバルク中などでエレクトロマイグレーションを起こすAl原子核を波束に置き換えたシミュレーションを行い、運動エネルギー密度・張力密度・有効電荷を新しく定義することにより、局所的に生じるストレスを考察した。有効電荷に関しては、外部電場による直接的な力に起因するものと、電子と原子核の衝突による運動量の変化に起因するものに分けることによって局所的な電荷密度分布を明らかにした。2.GaN結晶の(0001)表面および(000-1)表面に加え、(1-100)表面および(11-20)表面についてもGa原子・N原子が吸着するプロセスを第一原理計算により検討した。吸着サイトや吸着原子の表面からの距離等に著しい面方位依存性が示され、Ga吸着では(0001)表面、N吸着では(000-1)表面で原子の化学ポテンシャルが最も低く、結晶が成長しやすいことが明らかになった。また、結晶成長のドライヴィングフォースの描像を量子エネルギー密度により示した。3.SiO_2の薄膜モデルや結晶構造について、外部電場存在下において酸化膜内に取り込まれた層間水素原子が電子状態に与える影響をバンド構造計算や量子エネルギー密度により解析した。層間水素原子の存在はバンド構造に大きく影響し、これが絶縁破壊の一因になっていることが示された。また、外部電場存在下における層間水素原子のダイナミクスについても検討した。4.ZrO_2およびHfO_2の結晶構造について、外部電場存在下における電子状態と、第一原理計算により得られた波動関数から導出される誘電物性について議論した。本課題で開発した外部電場下の電子状態を求める計算手法や量子エネルギー密度による解析により結晶内における分極の様子や微視的な電子ストレスの描像が明らかになった。さらに、摂動論により格子振動も考慮した誘電率の計算手法を開発した。
自然免疫に関わる受容体タンパク質CD14と膜とリガンドとの相互作用解析

GPIアンカー型CD14の試料調製が難航したため計画を変更し、シンプルなタンパク質を用いて擬似的なGPIアンカー型タンパク質を調整し、脂質二重膜に再構成し、高分解能な固体NMR測定を行う手法を構築した。自然界には、CD14としてGPIアンカー結合型のCD14と、GPIアンカーが結合していない水溶性のCD14が存在する。我々のターゲットとしているのは、GPIアンカー結合型のCD14であるが、これを直接発現、精製するのは非常に困難である。そこで、水溶性のCD14を発現、精製し、これにGPIアンカーを後ほど結合することを計画している。また、CD14は糖タンパク質であり、糖鎖がないと会合体を形成してしまうことがこれまでに報告されている。会合体を形成しないためにも、糖鎖を付加した状態での発現が可能な酵母の系で水溶性CD14を発現させ、これを精製し、CD14の膜外部分の調整方法を確立することを試みた。(1)非標識CD14の発現と精製ピキア株を用いて調整したコンピテントセルに、ピキアを宿主とするプラスミドpHIL-S1にCD14のDNAを組み込んだものを混ぜてエレクトロポレーション法により形質転換した。エレクトロポレーションの効率が多少悪そうではあったが、何度か形質転換をやり、出てきたコロニーで発現チェックを行った。この中から、1番発現量の多い株を選択した。この株をグリセロールストックとして保存したが、ここから立ち上げなおすとうまく発現しない事があった。(2)非標識CD14の精製培養後の培地の上清を用いて、ニッケルカラムでヒスタグ精製を行い、SDSページで確認した結果、精製前には沢山あったバンドが2本になり、この方法で粗精製が出来ることを確認した。また、精製されて残っているものがCD14であることを、ウエスタンブロッティングで確認した。我々は、GPIアンカー結合型受容体タンパク質CD14と脂質二重膜との相互作用を固体NMRを用いて解析することを目指しているが、GPIアンカー結合型のCD14を直接発現、精製するのは非常に困難である。そこで、試料調製として水溶性のCD14を発現、精製し、これにGPIアンカーを後ほど結合することを計画している。昨年度までに、CD14の発現の検討は完了している。CD14の精製の手順としては1)His-tag精製、2)His-tag部分を切断、3)陰イオン交換クロマトグラフィー、4)糖鎖の切断、5)ゲルろ過を計画しているが、今年度はhis-tag精製に使うresinの再検討から行った。1、非標識CD14の精製His-tag精製に使用するresinを、ニッケルをキレートしたものからコバルトをキレートしたresinに変更することにより、精製の効率が向上した。また、his-tag精製後はhis-tagは必要がないので、酵素により切断し、さらに陰イオン交換クロマトグラフィーにより不要となった酵素やhis-tag部分とCD14を分離した。その後に、CD14の会合を防ぐように糖鎖の根元から3糖を残し、タンパク質のシグナル観測の邪魔になる糖鎖の切断を試みた。3糖を残した切断が可能な酵素であるα-mannosidaseを用いて切断を行った。酵素の切断後にゲルろ過精製をしたところ、ゲルろ過のピークが大きな分子量を示し、CD14が会合していることがわかった。2、GPIアンカーミミックの合成水溶性CD14に後ほど結合させてGPIアンカー型のタンパク質にするため、GPIアンカーミミックを合成した。その結果、固体NMRでの測定に必要な量のGPIアンカーミミックが合成できた。これをDMPCの脂質二重膜に再構成させたところ、GPIミミックが存在していてもミセル化を起こすことなく綺麗なリポソームを形成したので、この合成品を使って目的とするサンプル調整が出来ることが確認できた。自然免疫反応の初期過程でLPSが検知されるGPIアンカー結合型受容体蛋白質CD14と脂質二重膜とLPSとの3者の相互作用を固体NMRを用いて解析することを目指したが、精製の段階で糖鎖の切断による会合を防ぐことが難しいと判断し、CD14よりも簡単なモデル系でGPIアンカー型蛋白質の調整と膜への再構成を検討することに計画を変更した。モデル蛋白質としては、化学シフト値や3次元構造が既知のGB1を選んだ。GB1のC末端をアンカーと共有結合するように発現ベクターを構築し、この蛋白質の発現、精製を行った。さらに、これを合成した新規GPIアンカー模倣分子と反応させ、GPIアンカー型GB1のみをHPLCにより精製した。さらに、多重層リポソーム(MLV)、バイセル、一重層リポソーム(LUV)のそれぞれの膜系にアンカー型GB1を挿入した。MLV膜への挿入は蛋白部分とアンカーを先に化学的に連結させてから膜へ再構成させる方法を用いた。バイセルとLUV膜に対しては、アンカーを含んだ膜をあらかじめ作成した後、膜中のアンカーと蛋白部分を連結させた。これらの1次元と2次元の固体NMRスペクトルを測定し、分解能の高い固体NMRシグナルを観測した。

得られたNMRスペクトルは、バイセル膜中では非常に高分解能なものが得られ、MLV膜中では双極子相互作用による分子内の相互作用が観測出来ることが分かった。このように、シンプルな蛋白質を用いて擬似的なGPIアンカー型蛋白質を調整し脂質二重膜に再構成し、固体NMR測定を行う手法を構築することに成功した。CD14は糖鎖が付加しているため、NMRでそのままシグナルを測定すると、糖鎖のシグナルがバックグラウンドにでて、タンパクの糖鎖以外のピークの観測の妨げになってしまう。これを回避するために、糖鎖の根元の3糖を残して、残りの糖鎖部分は全て切断しようと試みているが、糖鎖の切断を行うとCD14が会合してしまい、精製が困難になってしまうため。24年度が最終年度であるため、記入しない。CD14へのGPIアンカーミミックの結合と膜への再構成を行き成り行う前に段階を踏んで、簡単なモデル系で検討する方が確実であると思われる。CD14の代わりに、NMRでもモデルタンパクとしてよく用いられていて、化学シフト値や3次元構造が既知のGB1をモデルタンパクとして、GPIアンカーミミックとの結合と膜への再構成方法の検討、さらに、GPIアンカーにより膜に再構成されたGB1の固体NMRでの測定方法の検討を先に行った方が成功への近道になると思われる。そこで、先にこのモデル蛋白を用いて、想定している実験がうまく働くか、方法論の確立を行いたい。その後に、再度CD14を用いて、GPIアンカー型CD14の模倣分子を脂質二重膜に再構成して、CD14と膜とリガンドとの相互作用解析を行うことを目指すつもりである。