hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
S1Pシグナルを介したエキソソーム放出の分子機構の解析

本研究はスフィンゴシン1リン酸(S1P)シグナルによる多小胞エンドソーム(MVE)へのターゲット機構を解明し、更に病気との関連からパーキンソン病の病態にS1Pシグナルが関与しているかを分子生物学的手法を用いて明らかにすることを目的とした。初年度においてはS1Pシグナルによるエキソソーム系MVEへの積荷ソーティングの分子メカニズムの解明、並びにパーキンソン病の病態にS1Pシグナルが関与しているかを実験的に証明することを目指した。その結果、S1Pシグナルには受容体を介する経路と受容体を介さない経路が存在するが、受容体のブロッカーを用いた実験結果からS1Pシグナルによるエキソソーム系MVEへの積荷ソーティングはS1P1受容体を介することが明らかとなった。更に、S1P1受容体からの刺激にはβアレスチンを介する経路、GiαサブユニットやGβγサブユニットを介する経路に別れて行くが、阻害剤を用いた実験結果から、GβγサブユニットがMVE周囲のアクチン重合を引き起こし積荷ソーティングを調節していることを証明し、これらの結果をJ. Biol. Chem. (2018) 293, 245-253に報告した。また、パーキンソン病とS1Pシグナルに関しては、同疾患の原因タンパク質であるαシヌクレインを細胞に添加することによりS1P1受容体が細胞膜の脂質ラフトから駆逐されGiたんぱく質と脱連関(アンカップリング)が引き起こり、S1P1受容体のGiタンパク質シグナルが阻害されることが示された。これらの結果をJ. Biol. Chem. (2018) 293, 8208-8216に報告した。MVEはリソゾームと融合して内容物を加水分解しそれぞれの構成成分を再利用する系と、細胞膜と融合し内部の小顆粒をエキソソームとして放出する系の二つが存在する。酵母のような下等な真核生物ではMVEは全て液胞(リソゾームのオルトログ)と融合するが、ヒトのように進化した脊椎動物では細胞は常にエキソソームを血中に放出し細胞間情報伝達の重要な手段として活用することが知られる。リソゾームと融合するMVEへの積荷ソーティングに関しては、モノユビキチン化された細胞質たんぱく質をESCRT系タンパク質複合体がMVEに取り込むことが酵母の系を用いて詳細に解析されている。しかしながら、エキソソーム系MVEへの積荷ソーティング機構に関してはこれまで不明であった。今回の我々の研究では、エキソソソーム系MVEの膜に存在するS1P1受容体が同オルガネラ近傍で産生されたS1Pにより持続的に活性化されることによって、絶えずS1P1受容体に連関(カップル)したGiタンパク質が活性化を受け、アクチン重合を促していることを証明した。これらのメカニズムはS1Pシグナルに於いて受容体を獲得したのは進化の過程で脊索動物以降であることと考え合わせると進化論的に大変興味深い結果と思われる。また、病気とS1Pシグナルとの観点で、パーキンソン病の原因タンパク質αシヌクレインが細胞膜上に存在するS1P1受容体を脂質ラフト画分から駆逐し、S1P1受容体とGiタンパク質の脱連関(アンカップリング)を引き起こすことを見出した。今後この現象をMVEの膜に存在するS1P1受容体で確認することにより、細胞外αシヌクレインがエキソソソーム系MVEへの積荷(内因性αシヌクレイン)ソーティングを抑制し、細胞内でのαシヌクレインの凝集(レビー小体)を引き起こす機序が説明できる可能性がある。平成30年度の研究により、エキソソーム系MVE上でのS1Pが受容体を介してGiタンパク質を活性化し、その結果Gβγサブユニットが低分子量型Gタンパク質CDC42およびRac1を活性化し、アクチン重合を引き起こすことが明らかとなった。実際、アクチン重合をサイトカラシンBを用いて阻害すると、エキソソーム系MVEへの積荷ソーティングは完全に抑制された。これらは当初は想定しなかった結果であり、満足のいく進展であるものの、当初課題として挙げていた後期エンドソーム・MVEで特異的にS1Pシグナルが「オン」になっている分子メカニズムを明らかにすることは出来なかった。MVE上でのS1Pシグナルを決定する分子はS1P産生酵素スフィンゴシン・キナーゼ2(SphK2)であるが、SphK2のMVEへのターゲット機構は未だに解明できていない。解決を困難にしている原因は初期エンドソームから後期エンドソームへの成熟過程でエンドソーム膜を構成する脂質やタンパク質の組成が大きく変化し、それらの分子の中からSphK2のターゲティングを決定する分子の同定には至っていない。今後の研究では低分子量型Gタンパク質Rabとホスホイノシタイドに焦点を当て、SphK2及びこれの結合タンパク質RPK118との結合を調べる方針である。また、αシヌクレインによるS1P1受容体とGiタンパク質との脱連関に関しては細胞膜のガングリオシドとαシヌクレインとの結合が重要であることが平成30年度の研究から明らかになった。今後更にガングリオシドの分子種を決定し、αシヌクレインとS1P1受容体との機能連関の分子メカニズムを明らかにしていきたい。本研究はスフィンゴシン1リン酸(S1P)

シグナルによる多小胞エンドソーム(MVE)へのターゲット機構を解明し、更に病気との関連からパーキンソン病の病態にS1Pシグナルが関与しているかを分子生物学的手法を用いて明らかにすることを目的とした。初年度においてはS1Pシグナルによるエキソソーム系MVEへの積荷ソーティングの分子メカニズムの解明、並びにパーキンソン病の病態にS1Pシグナルが関与しているかを実験的に証明することを目指した。その結果、S1Pシグナルには受容体を介する経路と受容体を介さない経路が存在するが、受容体のブロッカーを用いた実験結果からS1Pシグナルによるエキソソーム系MVEへの積荷ソーティングはS1P1受容体を介することが明らかとなった。更に、S1P1受容体からの刺激にはβアレスチンを介する経路、GiαサブユニットやGβγサブユニットを介する経路に別れて行くが、阻害剤を用いた実験結果から、GβγサブユニットがMVE周囲のアクチン重合を引き起こし積荷ソーティングを調節していることを証明し、これらの結果をJ. Biol. Chem. (2018) 293, 245-253に報告した。また、パーキンソン病とS1Pシグナルに関しては、同疾患の原因タンパク質であるαシヌクレインを細胞に添加することによりS1P1受容体が細胞膜の脂質ラフトから駆逐されGiたんぱく質と脱連関(アンカップリング)が引き起こり、S1P1受容体のGiタンパク質シグナルが阻害されることが示された。これらの結果をJ. Biol. Chem. (2018) 293, 8208-8216に報告した。MVEはリソゾームと融合して内容物を加水分解しそれぞれの構成成分を再利用する系と、細胞膜と融合し内部の小顆粒をエキソソームとして放出する系の二つが存在する。酵母のような下等な真核生物ではMVEは全て液胞(リソゾームのオルトログ)と融合するが、ヒトのように進化した脊椎動物では細胞は常にエキソソームを血中に放出し細胞間情報伝達の重要な手段として活用することが知られる。リソゾームと融合するMVEへの積荷ソーティングに関しては、モノユビキチン化された細胞質たんぱく質をESCRT系タンパク質複合体がMVEに取り込むことが酵母の系を用いて詳細に解析されている。しかしながら、エキソソーム系MVEへの積荷ソーティング機構に関してはこれまで不明であった。今回の我々の研究では、エキソソソーム系MVEの膜に存在するS1P1受容体が同オルガネラ近傍で産生されたS1Pにより持続的に活性化されることによって、絶えずS1P1受容体に連関(カップル)したGiタンパク質が活性化を受け、アクチン重合を促していることを証明した。これらのメカニズムはS1Pシグナルに於いて受容体を獲得したのは進化の過程で脊索動物以降であることと考え合わせると進化論的に大変興味深い結果と思われる。また、病気とS1Pシグナルとの観点で、パーキンソン病の原因タンパク質αシヌクレインが細胞膜上に存在するS1P1受容体を脂質ラフト画分から駆逐し、S1P1受容体とGiタンパク質の脱連関(アンカップリング)を引き起こすことを見出した。今後この現象をMVEの膜に存在するS1P1受容体で確認することにより、細胞外αシヌクレインがエキソソソーム系MVEへの積荷(内因性αシヌクレイン)ソーティングを抑制し、細胞内でのαシヌクレインの凝集(レビー小体)を引き起こす機序が説明できる可能性がある。平成30年度の研究により、エキソソーム系MVE上でのS1Pが受容体を介してGiタンパク質を活性化し、その結果Gβγサブユニットが低分子量型Gタンパク質CDC42およびRac1を活性化し、アクチン重合を引き起こすことが明らかとなった。実際、アクチン重合をサイトカラシンBを用いて阻害すると、エキソソーム系MVEへの積荷ソーティングは完全に抑制された。
核内高次構造を介する転写制御機構解明に向けた人工染色体操作技術の活用

核の高次構造の体系的解析を進めるための新たな技術としてゲノムを自由に扱い生細胞内での挙動を可視化するゲノム操作技術を開発した。これはBACでのゲノム改変技術、さらにBACを搭載できるベクターである人工染色体の操作技術を利用する技術である。本研究では、HACに搭載したヒトHoxB遺伝子クラスターを例として以下の三点について明らかし、本技術が核内高次構造を介する転写制御機構解明に有用であることを示すことを目指した。1.核内高次構造を介した転写調節の可視化、2.その制御に必要なゲノム領域の同定、3.その写制御を行う候補タンパク質の同定と生細胞での動態観察。初年度は目的とするHoxB遺伝子クラスターを含むBACを取得し人工染色体ベクターに搭載する上で必要なLoxP+選択マーカー遺伝子をタグするゲノム改変を試みたところ、この改変のための宿主大腸菌内ではHox遺伝子クラスターを含むBACは不安定でゲノムの再編成がおきてしまい、これを回避することは困難であった。そこで本年度(二年目)方針を変え、HoxB遺伝子クラスターのマップされるヒト当該染色体(17番染色体)をマウスES細胞に導入することにした。この方法を確立し、実際にこの染色体が移入されたマウスES細胞は多数取得でき、これらのクローンは神経分化誘導も可能であった。しかしどのクローンも肝心のHoxB遺伝子クラスター座の構造が異常であった。マウスA9細胞中に保持している導入元のHoxB遺伝子クラスターの構造は正常であったので、マウスES細胞特有の現象であると考えられるが、巨大な単位で繰り返し構造を持つ外来遺伝子は大腸菌内でもマウスES細胞内でも保持できなかったことになる。内在のものとの区別が付かなくなること、また細かな改変が難しいという欠点があるが、マウスES細胞中の内在性遺伝子について解析することが現時点では可能な方法である。我々は、核の高次構造の体系的解析を進めるための新たな技術としてゲノムを自由に扱い生細胞内での挙動を可視化するゲノム操作技術を開発した。本研究では、HACに搭載したヒトHoxB遺伝子クラスターを例として以下の三点について明らかにし、本技術が核内高次構造を介する転写制御機構解明に有用であることを示す。1.核内高次構造を介した転写調節の可視化、2.核内高次構造を介する転写制御に必要なゲノム領域の同定、3.核内高次構造を介する転写制御を行う候補タンパク質の同定と生細胞での動態観察を目指した。今年度は目的とするHoxB遺伝子クラスターを含むBACを取得した。人工染色体ベクターに搭載する上で必要なLoxP+選択マーカー遺伝子をタグするゲノム改変を試みたところ、この改変のための宿主大腸菌内ではHox遺伝子クラスターを含むBACは不安定でゲノムの再編成がおきてしまい、これを回避することは困難であった。そこで方針を変え、HoxB遺伝子クラスターのマップされるヒト当該染色体を導入することにした。マウスES細胞についてHoxBの核内高次構造変化を伴う発現誘導を観察するため、神経分化誘導したところたしかに分化誘導はおこるものの、その同調性に問題があることが判明した。そこでマウスES細胞が偶発的な分化状態にあるときには死滅するような(未分化マーカーが発現しているときのみ生存できるような)選択マーカー遺伝子を挿入したマウスES細胞を選択している。

このようなマウスES細胞が取得できしだい、ヒト当該染色体を移入し、神経分化誘導に伴う変化を確認し、発現に重要であると推測される部位を改変したものについても同様の解析を行うこととする。核の高次構造の体系的解析を進めるための新たな技術としてゲノムを自由に扱い生細胞内での挙動を可視化するゲノム操作技術を開発した。これはBACでのゲノム改変技術、さらにBACを搭載できるベクターである人工染色体の操作技術を利用する技術である。本研究では、HACに搭載したヒトHoxB遺伝子クラスターを例として以下の三点について明らかし、本技術が核内高次構造を介する転写制御機構解明に有用であることを示すことを目指した。1.核内高次構造を介した転写調節の可視化、2.その制御に必要なゲノム領域の同定、3.その写制御を行う候補タンパク質の同定と生細胞での動態観察。初年度は目的とするHoxB遺伝子クラスターを含むBACを取得し人工染色体ベクターに搭載する上で必要なLoxP+選択マーカー遺伝子をタグするゲノム改変を試みたところ、この改変のための宿主大腸菌内ではHox遺伝子クラスターを含むBACは不安定でゲノムの再編成がおきてしまい、これを回避することは困難であった。そこで本年度(二年目)方針を変え、HoxB遺伝子クラスターのマップされるヒト当該染色体(17番染色体)をマウスES細胞に導入することにした。この方法を確立し、実際にこの染色体が移入されたマウスES細胞は多数取得でき、これらのクローンは神経分化誘導も可能であった。しかしどのクローンも肝心のHoxB遺伝子クラスター座の構造が異常であった。マウスA9細胞中に保持している導入元のHoxB遺伝子クラスターの構造は正常であったので、マウスES細胞特有の現象であると考えられるが、巨大な単位で繰り返し構造を持つ外来遺伝子は大腸菌内でもマウスES細胞内でも保持できなかったことになる。内在のものとの区別が付かなくなること、また細かな改変が難しいという欠点があるが、マウスES細胞中の内在性遺伝子について解析することが現時点では可能な方法である。
ヒトT細胞白血病ウイルスI型PX遺伝子産物のリン酸化の部位決定と機能に及ぼす影響

リン酸化部位決定と機能に及ぼす影響に関して以下の研究を行なった。(1)HTLV-I感染細胞株であるMT-2を用いて、培地に^<32>Pオルソリン酸を加えて代謝標識を行なった後p40^<tax>を免疫沈降法により回収した。この沈降物を010ユニットのトリプシンで限定分解し、SDSポリアクリルアミド電気泳動で分離した結果、約15kdの分解産物に標識が移行していたことからp40^<tax>分子上の限られた領域でリン酸化を受けていることが示唆された。今後は(3)で述べるモノクロ-ナル抗体を利用して標識されたプロテア-ゼ分解産物の同定を進める計画である。(2)HTLV-Iのプロモ-タ-の下流にクロラムフェニコ-ルアセチルトランスフェラ-ゼ遺伝子を接続したプラスミドを作製し、p40^<tax>を発現している細胞株HOS/PLにトランスフェクションすることによりトランスアクチベ-ション活性を測定できるようにした。この系にp40^<tax>のリン酸化を阻害する薬剤K252aを020μMの範囲で添加した結果、トランスアクチベ-ションは0.2μM以上のK252aにより阻害されることが明らかとなり、p40^<tax>の機能発現にリン酸化が重要であることが強く示唆された。(3)大腸菌で生産された組換えp40^<tax>でBALBICマウスを免疫しモノクロ-ナル抗体4種を得た。一方、p40^<tax>の部分欠失変異型を大腸菌で発現させ、これを抗原として各モノクロ-ナル抗体のエピト-プマッピングを行なった。現在p40^<tax>のN末端側およびC末端側を特異的に認識する抗体が同定されたので(1)で述べたペプチドマッピングに利用可能となった。今後はこれらの部分欠失変異型を哺乳類細胞で発現可能なベクタ-に導入し、トランスアクチベ-ション活性の有無を検討し、最終的にはどの特定のセリン残基のリン酸化がどのようにp40^<tax>の機能に影響するかを明らかにする予定である。リン酸化部位決定と機能に及ぼす影響に関して以下の研究を行った。(1)HTLVーI感染細胞株であるMTー2を用いて,培地に32Pーオルソリン酸を加えて代謝標識を行った後p40^<tax>を免疫沈降法により回収した。この沈降物を010ユニットのトリプシンで限定分解し,SDSポリアクリルアミド電気泳動で分離した結果,約15kdの分解産物に標識が移行したことからp40^<tax>分子上の比較的限られた領域でリン酸化を受けていることが示唆された。(2)HTLVーIのプロモ-タ-の下流にクロラムフェニコ-ルアセチルトランスフェラ-ゼ遺伝子を接続したプラスミドを作製し,p40^<tax>を発現している細胞株HOS/PLにトランスフェクションすることによりトランスアクチベ-ション活性を測定できるようにした。この系にp40^<tax>のリン酸化を阻害する薬剤K252aを020μMの範囲で添加した結果,トランスアクチベ-ションは0.2μM以上のK252aにより阻害されることが明らかとなり,p40^<tax>の機能発現にリン酸化が重要であることが強く示唆された。(3)大腸菌で生産された組換えp40^<tax>でBALB/Cマウスを免疫しモノクロ-ナル抗体4種を得た。一方,p40^<tax>の部分欠失変異型を大腸菌で発現させ,これを抗原として各モノクロ-ナル抗体のエピト-プマッピングを行った。今後はこれらの部分欠失変異型を哺乳類細胞で発現可能なベクタ-に導入し,トランスアクチベ-ション活性の有無を検討し,最終的には特定のセリン残基のリン酸化がどのようにp40^<tax>の機能に影響するかを明らかにする予定である。

この系にp40^<tax>のリン酸化を阻害する薬剤K252aを020μMの範囲で添加した結果、トランスアクチベ-ションは0.2μM以上のK252aにより阻害されることが明らかとなり、p40^<tax>の機能発現にリン酸化が重要であることが強く示唆された。(3)大腸菌で生産された組換えp40^<tax>でBALBICマウスを免疫しモノクロ-ナル抗体4種を得た。一方、p40^<tax>の部分欠失変異型を大腸菌で発現させ、これを抗原として各モノクロ-ナル抗体のエピト-プマッピングを行なった。現在p40^<tax>のN末端側およびC末端側を特異的に認識する抗体が同定されたので(1)で述べたペプチドマッピングに利用可能となった。今後はこれらの部分欠失変異型を哺乳類細胞で発現可能なベクタ-に導入し、トランスアクチベ-ション活性の有無を検討し、最終的にはどの特定のセリン残基のリン酸化がどのようにp40^<tax>の機能に影響するかを明らかにする予定である。
絶対定量的質量分析法を用いたアミロイド前駆蛋白質の同定

アミロイドーシスには約30種類の前駆タンパク質が報告されており、これらがアミロイドーシスの原因と考えられる。免疫組織化学的にアミロイド前駆蛋白質を同定することが一般的であるが、偽陽性や偽陰性により判断が難しいことがしばしば経験される。今回、12種類に特異的なペプチド配列を選択し、同位体標識ペプチドを合成した。アミロイドーシス剖検症例30例の心臓およびその他の臓器のアミロイド沈着部を回収し、濃度の判明している同位体標識ペプチドを用いて濃度を測定した。アミロイド前駆蛋白質のうち11種類の蛋白質の定量結果が得られた。AA、ATTRアミロイドーシス症例では各々原因となるアミロイド前駆蛋白質が多く検出されており、本手法によるアミロイド前駆蛋白質の同定が容易であった。一方でAL-kappa、AL-lambdaに関しては、原因となる軽鎖の検出量が十分ではなかった。この原因として、軽鎖には定常域と可変域とが存在し、可変域は個人差があって定量に用いることができないため、定常域から同位体ペプチドを選択したが、実際には可変域が主に沈着する症例も少なからず報告されており、軽鎖沈着に関しては本手法の改善が必要と考えられた。一方で、原因と考えられるアミロイド前駆蛋白質と共沈着していると考えられる蛋白質との相関について検討したところ、AAアミロイドーシスにおいてはAAと一部のApolipoproteinが正の相関を示していた。今後は原因蛋白質と共沈着蛋白質との相関や意義などについて詳しく検討していく予定である。順調に解析が進み予定よりも先の検討まで進めている。原因と考えられるアミロイド前駆蛋白質と共沈着していると考えられる蛋白質との量に相関がみられたため、共沈着蛋白質がアミロイドの沈着する機序にどうかかわっているのか、検討していく。本研究は,質量分析法を用いてアミロイドの前駆蛋白質を定量的に測定し,複数の前駆蛋白を有するアミロイドーシス症例を見出すものである.まず,当院で経験したアミロイド症例をランダムに定性的に質量分析し,定量に適したペプチド断片の選び出しを行った.各アミロイド原因蛋白質において,データベース(UniProt)に登録されている変異部位を確認し,この部位を極力避けるように,また,質量分析器で検出されやすい部位を選び,ひな型となるペプチド断片を決定した.同定に使用するペプチド断片は各アミロイド原因蛋白質について複数(4個以上)のペプチド断片を定量に使用する.さらに,これらのペプチド断片の同位体ペプチドを合成した.次に1999年から2016年に行われた剖検症例のうち,アミロイドーシス症例,30症例の病理組織学的評価を行い,アミロイドの沈着部位と沈着の程度についてまとめ,免疫組織化学的検討を行った.免疫組織化学的検討については,まだ,すべて終了していないが,通常の病理診断業務に用いていない抗体も新たに購入し条件検討を行った.さらに,各症例に沈着するアミロイドをレーザーマイクロダイセクションを用いて回収し,トリプシン消化後,質量分析器にて先に合成した同位体ペプチドを用いた定量を行っている.現在はこの定量結果を待ち,データ解析を行う予定であり,免疫組織学的検討の結果と合わせて評価していく予定である.また,イメージング質量分析法の条件検討も開始している.研究が遅延する事象が生じなかったため.アミロイドーシスには約30種類の前駆タンパク質が報告されており、これらがアミロイドーシスの原因と考えられる。剖検30症例のアミロイド前駆蛋白質について,免疫組織化学的検討に加えて,質量分析法を用いた結果を加えて,評価していく.また,イメージング質量分析法を行うための条件検討を開始する予定である.原因と考えられるアミロイド前駆蛋白質と共沈着していると考えられる蛋白質との量に相関がみられたため、共沈着蛋白質がアミロイドの沈着する機序にどうかかわっているのか、検討していく。計画していた国際学会への参加を見送ったため。
真核生物のヘム依存性転写因子の研究

真核細胞のモデル生物である出芽酵母には環境の酸素濃度の変化に共役して呼吸系および酸素代謝系酵素群の生合成量が変動する、という適応現象がある。これらの遺伝子発現を制御するHAP1遺伝子産物は、細胞内ヘム濃度に依存し活性化する転写因子である。本研究ではHAP1蛋白質におけるヘムの結合様式とエンハンサー結合能の制御機構の理解をめざし本蛋白質の発現系の構築をおこなった。まず、DNA結合領域とヘム結合領域をふくむN末端側446個までのポリペプチドをコードする遺伝子を6xHisタグに融合させ大腸菌で発現させたところほとんどが不溶性であり、可溶性画分には分解産物があることが判明した。また、シャペロニン、チオレドキシンとの共発現でも可溶性画分での発現効率は向上しなかった。チオレドキシンなどとの融合蛋白質を作製してもやはり不溶性となった。本蛋白質の不溶性は異種蛋白質との融合の長さに起因すると考えられる。そこで43残基からなる短いカルモジュリン結合ペプチドをC末端に融合し、完全長の蛋白質を特異的に検出できる組換えプラスミドを用いてプロテアーゼを欠損した大腸菌内で発現させる系を構築した。その結果、遺伝子発現を誘導し1時間後から可溶性画分に完全長のHAPl蛋白質の生成が確認された。今後は陽イオン交換カラム、アフィニティーカラムを用い精製条件の検索をおこなう。さらに、精製標品とヘムの結合を分光学的測定によって明らかにし、エンハンサーとの結合能との相関を解析する。
多チャンネル時代における個別視聴化の進行と家庭の教育力に関する研究

この研究をしている間にメディアリテラシーという言葉が日常用語になり、多くの著書が出版されるようになった。国語の教科書には「ニュース番組を作ろう」という単元が入った。テレビを見たり作ったりする力を学校でつけようという動きが広まったといえる。暴力や性描写に対する放送局の自主規制も始まり、番組内容を青少年に配慮する「青少年の時間帯」が設けられた。テレビを見る力は自然に身につくものではなく、家庭や学校といった社会の中で教えられていることがわかってきたためといえる。多メディア・多チャンネルの進行は個別視聴化を促進する。社会は今のうちに対策を立てておかなければならない。<視聴実態の解明>今回の研究の中で、若者のザッピングといわれるテレビ視聴の実態を明らかにした。若者は1時間に16回以上チャンネルを替えてテレビを見ていた。<放送局の対策の功果について>メディアリテラシー教材や番組が開発された。メディアリテラシー教育番組には、NHKのものも民間放送連盟のものも教育効果があることを児童を対象にした実験によって示した。また、「青少年の時間帯」の番組は、性描写や暴力が少ないこと、さらに夜9時以後も暴力描写が減少していることを示した。<学校や家庭と放送局が協力して視聴能力を高める試み>NHK福井放送局と協力して児童・生徒の作品を放送する試みを実施し、4年間継続している。また、PTAが学校を撮影してケーブルテレビで放送する試みを紹介した。学会においてシンポジウムやワークショップを開催し、研究者が「テレビと子ども」やメディアリアリテラシーへ関心を高める役割を果たしてきた。以上の成果は、著書3冊にまとめられている。学校の教師や放送局と協力して作った著作である。特に「子どもの発達とテレビ」(村野井均著、かもがわ出版)は、2002年度の日本図書館協会選定図書、全国学校図書館協議会選定図書に選ばれた。今後はメディアリテラシーを具体化し、カリキュラム開発や教材開発、実験授業とその効果測定をする必要がある。リモコンによるTVチャンネルのひんぱんな切りかえをザッピングという。テレビ番組は、視聴者のザッピングに対して細切れにしたり、つながりをわかりにくくしてチャンネルを替えさせないようにしている。ザッピングの実態が不明なためである。今年度は、テレビのリモートコントローラーから出る赤外線を受信し、時間とチャンネルを記録する機械(ザッピングカウンター)を試作した。また、計測データを表計算ソフトへ移しかえるソフトを制作した。次年度にザッピングの実態把握をおこなう。リモコンによるTVチャンネルのひんぱんな切り替えをザッピングという。視聴者のザッピングに対して、番組制作者は、番組を細切れにしたり、つながりをわかりにくくしたりしてチャンネルを替えさせないようにしている。あるいは、他のチャンネルからザッピングしてくる視聴者を捕まえるために、画面を光らせたり、画面に動きをつけている。また、番組開始を54分開始と、少し早める「8時またぎ」は、8時にかぎらず行われるようになった。これらの対策はテレビ画面を落ち着きのないもの、刺激の強いものにしている。これらは、どの国でも起きているのではなく、日本でのみ生じている現象である。ザッピングの実態が不明なためといえる。昨年の研究では、ザッピングを機械計測するための装置「ザッピングカウンター」を1台、開発した。テレビを操作するリモートコントローラーからでる赤外線を感知する受光部と、チャンネル、開始時間、チャンネル切り替え時間を記録する記録部からなる装置である。テレビの側に設置できるように、高さ15cm、横4cm、奥行き20cmと小型化した。

地上波ならびにケーブルテレビに対応して、30チャンネル、データ8000件記録できる装置である。今年度は、1、ザッピングカウンターを5台製作し、家庭で試用してみた。2、CS放送に対応できるように300チャンネルまで測定できるシステムとその試作機を製作した。1、家庭での試用について6ヶ所の家庭で1週間試用してみた。すると家庭用蛍光灯のon,offあるいは夕日の影響を受け、データにエラーがでることがわかった。データの信頼性は低かったが、テレビ番組自体がストーリー性のあるドラマ主体になったためか、ザッピングの回数は、先行研究(村野井、1998)の3分40秒に1回に比べ、10分に1回と減っていた。2、300チャンネル対応についてCS放送に対応するためにプログラムを書き換え、内臓チップも変更した。それによりザッピングカウンター改良型を製作することはできた。しかし、家庭で試用することを考えた場合、家庭の人にチャンネルをすべてザッピングカウンターに覚えこませてもらうのは、かなり困難といえる。何らかの対策が必要である。昨年まではザッピングデータを収集した。今年度は、家庭の教育力について調べるため以下のことをした。1.学校がテレビ番組を作り、地域の放送局と協力して放送する。保護者に見てもらい、学校への信頼を回復することを試みた。同様にPTAが学校を取材し放送したり、幼稚園がCATVで家庭向けに放送する試みを行った。2.メディアリテラリー教育がどの程度、効果があるのか南条町立南条小学校で測定し、効果を確かめた。これまでの成果は、「学校で拓くメディアリテラシー」(日本文教出版)にまとめた。多チャンネル化が進む中、視聴者の視聴能力をどう高めるべきか多角的に研究した。<テレビ視聴の現状分析>視聴者の変化:ザッピングや2チャンネル同時視聴などの視聴行動が変化していることを示した。また、コンピューターグラフィクスによる混乱・誤解も児童、高齢者で生じている。番組編成の変化:ザッピング対策として、8時またぎ、コーナーの短時間化、細切れ化が進んでいる。また、画面に動きをつけるなど見にくく、理解しにくくなっていることを明らかにした。<対策>メディアリテラシー番組の効果測定:放送局が積極的にメディアリテラシーに取り組んでいる。民間放送連盟およびNHKが制作した番組を児童に視聴させ、教育効果があることを示した。メディアリテラシー教材の制作:学校で制作したメディアリテラシー教材は、生徒の実態に応じて制作されており役に立つ。福井県丸岡中学校の教材「メディアタイム」を指導書、生徒用ワークシート、指導ビデオにまとめ、郵政省に提出した。
高密度DNA マイクロアレイを用いた精神疾患のホモ接合マッピング

いとこ婚の両親をもつ統合失調患者10家系11名を対象に高密度DNAマイクロアレイを用い、LOH解析後、有意なホモ接合領域を同定した。また、罹患者間9名(兄弟発症例を除く)のうち4症例以上の重複領域を検索したところ4、5、11、12、19、20番染色体の一部に重複領域あることがわかった。これらの染色体に含まれる14領域には84個の遺伝子が含まれ、中には既に統合失調症との関連が指摘されている遺伝子が含まれていた。代表的な精神疾患である統合失調症の遺伝研究においては、複数の研究間で再現性が乏しいのが現状である。このような現状を打破するために、本研究では従来とは明確に異なる手法、すなわち、この1、2年の間に急激に実用化の時代に入った高密度DNAマイクロアレイを用い、いとこ婚を両親にもつ家系において、極めて解析度の高いパラメトリック連鎖解析法であるホモ接合マッピングによって疾患感受性遺伝子を検索することを目的としている。対象は、DSM-VI-TRおよびICD-10の診断基準に基づき厳密に診断され、さらに両親がいとこ婚であることが確認された患者である。長崎大学医学部附属病院精神神経科および関連病院に入院または通院中の統合失調症患者から現在までに12検体の集積を行った。インフォームドコンセントを得られた患者から約10mlの採血を行い、フェノール法でDNAを抽出した。高密度DNAマイクロアレイはAffymetrix社のGeneChip Human Mapping 50K Array XbaIを使用した。DNAは制限酵素XbaIで切断した後、アンカーを付加しPCRで増幅してラベリングした後、アレイDNAとの16時間のハイブリダイゼーションを行った。アレイを洗浄した後、Affymetrix GeneChip^[○!R]Scannerでデータを読み取った。現在までに、12検体に対して解析を施行した。その結果、複数の症例に共通するホモ接合となっている領域(同祖性領域)を同定した。これらの領域は、従来の連鎖解析において、統合失調症の遺伝子座として既に報告されたものや、今回の解析で新たに同定した未報告の領域も含んでいる。これらの領域が多型である可能性を十分吟味のうえ、同祖性領域を決定する。今後は、引き続き症例の集積を図るとともに、同祖性領域が特定されたら、精神薬理学的見地から候補遺伝子の検索を積極的に行う予定としている。現在までに10家系11名の集積を行った。高密度DNAマイクロアレイはAffymetrix社Wide Human SNP Assay5.0によるGenotypingを行い、Partek社Genome SuiteVer6.3によるLOH解析を行った。前後するSNPの連続性及び対象集団における各SNPのヘテロ接合度を考慮したhidden Markov modelのアルゴリズムを用いた解析を用いて有意なホモ接合領域を同定した。次に罹患者群と健常者群(非血族婚)間でホモ接合領域の長さ及び個数の比較を行ったところ、罹患者群においてより長いものをみとめ、その個数は少ない傾向にあった。また、ホモ接合領域長の閾値を設定した上で罹患者間9名(兄弟発症例を除く)のうち4症例以上の重複領域を検索したところ4、5、11、12、19、20番染色体の一部に重複領域あることがわかった。これらの染色体に含まれる14領域には84個の遺伝子のなかには既に統合失調症との関連が指摘されている遺伝子も含まれていた。今後は遺伝子座より確定された候補遺伝子に関し精神薬理学的見地からシーケンスベースの変異解析を行う。
ガスフローレーザークリーニングによる高価基板の再生利用

本研究の目的は,我々の研究室において大量消費している高価サファイア基板の再利用と関連技術への応用である.研究背景として,窒化ガリウムに代わる有望な化合物半導体材料である安価で安全な酸化亜鉛を主材料としたナノ構造体による白色LEDの研究開発を行っており,その酸化亜鉛ナノ構造体は主にサファイア基板上に作製している.用いている単結晶サファイア基板は,近年量産化技術の確立により価格が下がってきているが,機械的強度があるため加工費がかかり,現在も1枚当たり数千円での納入となっている.しかし,良質な酸化亜鉛ナノ構造体を得るためには、数多くの作製条件での試作を必要とし,それに伴い大量のサファイア基板を消費している現状がある.また,近年の研究費削減による購入枚数の制限や資源の有効利用という観点からも再利用は非常に有意義であり,不可欠であると考えている.今回の試みにより年間数十万円程度の経費削減に繋がり,また,この技術を用いた他材料への応用や他技術へ応用についても発展していくと考えており,関連研究を行っている.本年度は,下記について試みた.1.自作したガスフロー装置にてAirブローしながらのクリーニングを試みたが現時点では有用性が確認出来ていない.今後,ブロー圧力等条件を振っての実験を行いたいと考えている.また,真空時におけるクリーニングについても試みたが,現有の真空容器及びロータリーポンプの仕様等制限により数Pa程度での条件でしか行えず,有用性が確認出来なかった.2.ネオンガスの入手に目途が付いて来たので,当該残ガスを用いた予備実験を再開し,レーザー照射フルエンス等最適条件を探っているところである.3.より酸化亜鉛が吸収すると思われる波長351nmで発振するXeFエキシマレーザーの有用性について確認する予定である.本研究の目的は,我々の研究室において大量消費している高価サファイア基板の再利用と関連技術への応用である.研究背景として,窒化ガリウムに代わる有望な化合物半導体材料である安価で安全な酸化亜鉛を主材料としたナノ構造体による白色LEDの研究開発を行っており,その酸化亜鉛ナノ構造体は主にサファイア基板上に作製している.用いている単結晶サファイア基板は,近年量産化技術の確立により価格が下がってきているが,機械的強度があるため加工費がかかり,現在も1枚当たり数千円での納入となっている.しかし,良質な酸化亜鉛ナノ構造体を得るためには、数多くの作製条件での試作を必要とし,それに伴い大量のサファイア基板を消費している現状がある.また,近年の研究費削減による購入枚数の制限や資源の有効利用という観点からも再利用は非常に有意義であり,不可欠であると考えている.今回の試みにより年間数十万円程度の経費削減に繋がり,また,この技術を用いた他材料への応用や他技術へ応用についても発展していくと考えており,関連研究を行っている.本年度は,下記について試みた.1.自作したガスフロー装置にてAirブローしながらのクリーニングを試みたが現時点では有用性が確認出来ていない.今後,ブロー圧力等条件を振っての実験を行いたいと考えている.また,真空時におけるクリーニングについても試みたが,現有の真空容器及びロータリーポンプの仕様等制限により数Pa程度での条件でしか行えず,有用性が確認出来なかった.2.ネオンガスの入手に目途が付いて来たので,当該残ガスを用いた予備実験を再開し,レーザー照射フルエンス等最適条件を探っているところである.3.より酸化亜鉛が吸収すると思われる波長351nmで発振するXeFエキシマレーザーの有用性について確認する予定である.
下部尿路閉塞に伴う過活動膀胱の発生に関する検討・部分的尿道閉塞ラットの基礎的研究

1.部分的尿道閉塞ラットにおける下部尿路機能の評価部分的尿道閉塞ラットでは、(1)膀胱重量の増加、(2)自然排尿観察における1回排尿量の減少、(3)膀胱内圧測定における膀胱容量の増大、排尿閾値圧の上昇、最大排尿圧の上昇、排尿筋過活動が観察され、下部尿路閉塞に伴う過活動膀胱のモデルとして適切であることが示された。2.C線維の脱感作が部分的尿道閉塞後の下部尿路機能の変化に与える効果カプサイシン及びレジニフェラトキシンはバニロイド受容体刺激薬で、長期間にわたってC線維を脱感作する。カプサイシンあるいはレジニフェラトキシンの全身投与によりあらかじめC線維を脱感作した後に部分的尿道閉塞を作成したラットでは、脱感作していない閉塞ラットと比べて、膀胱容量と排尿閾値圧の増大を認めたが、排尿効率、最大排尿圧、排尿筋過活動には有意な変化がみられなかった。この結果より、C線維は部分的尿道閉塞後の排尿求心路の機能的変化に関与しているが、尿道閉塞後の排尿遠心路の変化や排尿筋過活動の出現には必須ではないと考えられた。3.グルタミン酸受容体拮抗薬の慢性投与の効果NMDA型グルタミン酸受容体拮抗薬(MK-801)を反復投与された部分的尿道閉塞ラットでは、MH-801非投与の閉塞ラットと比べて、膀胱重量の増加、排尿効率、最大排尿圧、排尿筋過活動には変化がみられなかったが、膀胱容量は有意に増加した。このMK-801の効果は偽手術ラット(非閉塞ラット)ではみられず、尿道閉塞モデルではNMDA受容体が関与した排尿求心路のneuroplasticityが起こると考えられた。4.尿道閉塞後の排尿筋過活動に対するα1D受容体遮断薬の効果尿道閉塞後の排尿筋過活動はα1D受容体に選択的に作用する薬剤により抑制された。従って下部尿路閉塞に伴う排尿筋過活動の発生にはα1D受容体の機能的亢進が関与することが示唆された。2.グルタミン酸受容体拮抗薬の慢性投与の効果NMDA型グルタミン酸受容体拮抗薬(MK-801)を反復投与された部分的尿道閉塞ラットでは、MK-801非投与の閉塞ラットと比べて、膀胱重量の増加、排尿効率、最大排尿圧、排尿筋過活動には変化がみられなかったが、膀胱容量は有意に増加した。

3.C線維の脱感作が部分的尿道閉塞後の下部尿路機能の変化に与える効果カプサイシンあるいはレジニフェラトキシンの全身投与によりあらかじめC線維を脱感作した後に部分的尿道閉塞を作成したラットでは、脱感作していな閉塞ラットと比べて.膀胱容量と排尿閾値圧の増大を認めたが、排尿効率、最大排尿圧、排尿筋過活動には有意な変化がみられなかった。この結果より、C線維は部分的尿道閉塞後の排尿求心路の機能的変化に関与してしいるが、排尿筋過活動の出現には必須ではないと考えられた。1.部分的尿道閉塞後の下部尿路機能変化に対するC線維の脱感作の効果カプサイシン及びレジニフェラトキシンはバニロイド受容体刺激薬で、全身投与により長期間にわたってC線維を脱感作する。カプサイシンあるいはレジニフェラトキシンの全身投与によりあらかじめC線維を脱感作した後に部分的尿道閉塞を作成したラットでは、脱感作していない閉塞ラットと比べて、膀胱容量と排尿閾値圧の増大を認めたが、排尿効率、最大排尿圧、排尿筋過活動には有意な変化がみられなかった。この結果より、C線維は部分的尿道閉塞後の排尿求心路の機能的変化に関与しているが、尿道閉塞後の排尿遠心路の変化や排尿筋過活動の出現には必須ではないと考えられた。2.グルタミン酸受容体拮抗薬の反復投与の効果尿道閉塞作成直前からNMDA型グルタミン酸受容体拮抗薬(MK-801)を反復投与された部分的尿道閉塞ラットでは、MK-801非投与の閉塞ラットと比べて、膀胱重量の増加、排尿効率、最大排尿圧、排尿筋過活動には変化がみられなかったが、膀胱容量は有意に増加し、1回排尿量も有意に増加した。このMK-801の効果は偽手術ラット(非閉塞ラット)ではみられず、尿道閉塞モデルではNMDA受容体が関与した排尿求心路のneuroplasticityが起こると考えられた。3.尿道閉塞後の排尿筋過活動に対するα_<1D>受容体遮断薬の効果尿道閉塞後の排尿筋過活動はα_<1D>受容体に選択的に作用する薬剤の仙髄クモ膜下投与および骨盤内の動脈内投与により抑制された。従って下部尿路閉塞に伴う排尿筋過活動の発生には、仙髄レベルおよび末梢レベルのα_<1D>受容体の機能的亢進が関与することが示唆された。
消化器内科的アプローチによる咀嚼筋障害の根本療法の開発

健康な男性患者に対して、咀嚼が消化管ホルモンの血中濃度や胃の活動(胃排出能、胃電図)、自律神経機能に与える影響を調べることとした。消化管ホルモンの項目はグルコース、インスリン、ガストリン、グレリン、CCK, GLPー1とした。5時間かけてデータの採取を経時的に行い、採決済シリンジは各ホルモンに応じて処理を行い、実験終了後にすべての資料はサンプルボックスに入れて保管し、データ解析を行った。4人の被験者に対して、咀嚼ありなしの条件で、これらの実験を行ったが血中ホルモン濃度に有意な差は認められなかった。今後、被験者を増やすと同時に咀嚼筋障害を持つ患者に対しても調べる予定である。本研究の目的は、健康な成人男性と咀嚼筋障害を有する男性患者を対象に両群の上部消化管症状や機能の違いを解明し、咀嚼筋障害の症状と上部消化管の症状や機能に相関があるのかを検証することである。まず、本年度は咀嚼が消化管機能に及ぼす影響を特に上部消化管症状について検討した。咬合接触が少なく、弱い咬合力を示すことから咀嚼機能が低下している開咬患者は上部消化管症状が多いことが予想されるため、開咬患者の上部消化管症状、咬合力、咬合接触面積および唾液流出率を調べ、正常咬合者と比較した。対象は、鹿児島大学歯学部附属病院矯正歯科を受診した開咬を呈する不正咬合患者16名(開咬群:女性、平均年齢25.2±6.9歳)、個性正常咬合の者15名(対照群:女性、平均年齢24.7±1.9歳)である。QUESTとFSSGの2種類の質問紙を用いてGERD症状を調べ、咬合力、咬合接触面積と安静時の唾液流出率の測定を行ったところ、開咬群では、対照群に比べ、QUESTおよびFSSGの値は有意に高かった。FSSGにおいてGERD陽性と診断される8点以上のスコアを認めた者の割合も開咬群の方が有意に高かった。また、開咬群の方が咬合力や咬合接触面積は有意に小さく、唾液流出率は有意に低かった。以上から、咀嚼機能が低下した者では上部消化管疾患が多くなる可能性が示唆された。咀嚼機能の改善によりそれらの上部消化器症状が改善したとの報告があることから、開咬患者のような不正咬合患者でも矯正治療で咀嚼機能を改善することにより、上部消化管症状が改善する可能性が考えられた。現在、上部消化管機能について詳しく調べるために13C呼気試験、胃電図、咀嚼筋活動、血糖値、血中ホルモン濃度を調べるために実験設備や測定機器の導入や手技の準備を行っている。本研究の目的は、健康な成人男性と咀嚼障害を有する男性患者を対象に咀嚼筋障害の症状と上部消化管の症状や機能に相関があるのかを検証することである。その際、消化管ホルモンの血中濃度測定には長時間の経時的採血が必須となるが、ヒトにおいて消化管ホルモンの血中濃度を評価する非侵襲的手法は未だ確立されていないため、通常の穿刺による採血を高頻度に行うことは被験者に与える苦痛が極めて大きい。そこで、本年度は低侵襲で安定した経時的採血の解析手法について検討した。健康な成人男性を対象とし経時的採血は刺入時の疼痛による影響を排除するために上腕部に刺入した静脈留置針を用いて行った。術者は被験者に留置針と接続した延長カテーテルからシリンジを用いてサンプルを採取した。採血間隔は1530分とし、採血時以外はカテーテルに生理食塩水を30ml/hで注入した。2回目以降のサンプル採取時には、直前にカテーテル内の生理食塩水をシリンジで除去し、その後サンプル採取を行う必要があるが、閉塞防止用の生理食塩水が計測値に与える影響を検討するため、生理食塩水の除去量を2ml6ml間で変えたときの血液成分の変化を血糖値を代用指標として測定した。血糖値を指標とした測定値への影響については、除去する生理食塩水の量が2mlの場合は6mlと比べ5%以上低い値を記録したが、3mlでは6mlとの差は5%以内で、4mlでは4%以内、5mlでは2%以内であった。また、測定値のバラつきについては、2mlがもっとも大きく、3ml以上では除去量が大きくなるに従ってバラつきが小さくなる傾向が認められた。実験中の痛みについては、採血中であっても痛みや不快感を訴えるものはほとんど認められなかった。今後は本方法を用いた静脈血の経時的採血と13C呼気試験法や胃電図、心電図の測定を行い、咀嚼が胃の機能に与える影響を多面的に評価する予定である。本研究の目的は、健康な成人男性と咀嚼障害を有する男性患者を対象に咀嚼筋障害の症状と上部消化管の症状や機能における相関の有無を検証することである。上部消化管の運動機能には自律神経(神経性調節)だけでなく消化管ホルモン(体液性調節)も影響を与える。体液性調節について評価する際、様々な消化管ホルモンの血中濃度の経時的変化を調べる必要がある。

その測定には、長時間の経時的採血が必須となるが、ヒトにおいて消化管ホルモンの血中濃度を評価する非侵襲的手法は未だ確立されていないため、通常の穿刺による採血を高頻度に行うことは被験者に与える侵襲が極めて大きく現実的ではない。本年度は点滴などで使用する留置針を用いて多頻度採血を行い血中ホルモン濃度の経時的変化を評価する手法について検討を行った。その結果、採血後にカテーテル内を生食で満たすことでカテーテルの閉塞は回避され、また、カテーテル内容量の約2倍に相当する4mlの生食と血液を除去した後に血液サンプルを採取することで、バラつきの少ない安定した測定を行えることが確認できた。また、痛みや不快感に関しても、留置針の刺入時にのみ僅かに生じるものの、その後は採血操作時にも痛みや不快感を訴える被験者はほぼおらず、被験者に与える痛みや不快感が自律神経活動に影響を与え得る観点からも本手法は好ましいと考えられた。これらの手法を用いて、今後は健康な成人男性と咀嚼筋障害を有する男性患者に対して、消化管ホルモンの血中動態変化とともに、胃電図および13c呼気試験法を用いて上部消化管の運動機能を調べる予定である。咀嚼筋活動、13C呼気試験法および胃電図の測定は我々の先行研究により手技が確立しているが、低侵襲で安定した長時間の経時的採血、および採取した血液の消化管ホルモンの血中濃度の測定方法の確立に時間がかかってしまったためである。また、研究代表者が客員研究員になり非常勤になったため、研究を行う時間が昨年度よりも少なくなったことも考えられる。本研究の目的は対症療法が行われている咀嚼筋障害の根本療法に繋がる効果的な方法を開発することである。胃食道逆流症患者に咀嚼筋障害が多いことも最近報告されていることから咀嚼筋障害は上部消化管疾患と関連があるのではないかという着想に至った。そこでまず、健康な成人男性と咀嚼障害を有する男性患者を対象に咀嚼筋障害の症状と上部消化管の症状や機能における相関の有無を検証することとした。上部消化管の運動機能には自律神経だけでなく消化管ホルモンも影響を与える。消化管ホルモンについて評価する際、様々な消化管ホルモンの血中濃度の経時的変化を調べる必要がある。その測定には長時間の採血が必要だがヒトにおいて消化管ホルモンの血中濃度を評価する非侵襲的手法が確立されていないため、点滴などで使用する留置針を用いて多頻度採血を行い、血中ホルモン濃度の経時的変化を評価する手法を検討した。その結果、採血後にカテーテル内を生理食塩水で満たすことでカテーテルの塞栓は回避されて、カテーテル内容量の約2倍に相当する4mlの生理食塩水と血液を除去した後に血液サンプルを採取することで、バラつきの少ない安定した測定を行えることが確認できた。これらの手法を用いて、健康な男性患者に対して、咀嚼が消化管ホルモンの血中濃度や胃の活動(胃排出能、胃電図)、自律神経機能に与える影響を調べることとした。消化管ホルモンの項目はインスリン、ガストリン、グレリン、CCK,GLPー1とした。5時間かけてデータの採取を経時的に行い、採血済シリンジは各ホルモンに応じて処理を行い、実験終了後に全ての資料はサンプルボックスにいれて-80°Cで保管し、データ解析を行った。4人の被験者に対して咀嚼ありなしの条件で、これらの実験を行ったが血中ホルモン濃度に有意な差は認められなかった。今後、被験者数を増やすと同時に咀嚼筋障害を持つ患者に対しても調べる予定である。健康な男性患者に対して、咀嚼が消化管ホルモンの血中濃度や胃の活動(胃排出能、胃電図)、自律神経機能に与える影響を調べることとした。消化管ホルモンの項目はグルコース、インスリン、ガストリン、グレリン、CCK, GLPー1とした。5時間かけてデータの採取を経時的に行い、採決済シリンジは各ホルモンに応じて処理を行い、実験終了後にすべての資料はサンプルボックスに入れて保管し、データ解析を行った。4人の被験者に対して、咀嚼ありなしの条件で、これらの実験を行ったが血中ホルモン濃度に有意な差は認められなかった。
ＳＬＥ発症をもたらす枢軸的異常シグナル経路の解明

研究成果の概要(和文):我々は全身性エリテマトーデス(SLE)モデル(NZB x NZW) F1マウスにおいて、末梢性免疫寛容の遺伝的欠損が、親系NZB系マウスの第1染色体上の抑制性Fc受容体Fcgr2b遺伝子と、これに密接に連鎖するSLAM遺伝子群のepistaticな相互作用によって規定されていることを明らかにした。これらのNZB系由来の多型遺伝子群は、双方の親系由来の主要組織適合遺伝子複合体(MHC) class II遺伝子とともに、このマウスの獲得免疫系における自己寛容破綻・自己反応性クローン選択、さらには自己抗体の親和性成熟を規定していると考えられる。全身性エリテマトーデス(SLE)では免疫系の自己寛容が破綻し、抗体の親和性成熟をもたらす機序が自己抗体産生において作動する。さらにSLEでは、自己反応性の免疫細胞クローンの異常に帰せられるべき自己抗体産生が、広汎なCD4陽性T細胞レパートリーの自発的活性化と機能異常を背景として起こることが特徴である。申請者はマウスSLEモデルにおいて、B細胞系の寛容破綻とCD4陽性T細胞のポリクローナルな異常が、それぞれFcgr2b遺伝子とMHC class II遺伝子を中核とする異なる多遺伝子支配下にあり、その相互作用がSLE発症をもたらす枢軸的異常シグナル経路を規定している可能性があることを報告した。本研究では免疫系のシグナル伝達に関する先験的情報と、自己免疫応答を基礎づけるcomponent phenotypeを対象とする量的遺伝学の方法により、これらの多遺伝子相互作用がもたらす枢軸的異常シグナル経路の本質を分子論的に明らかにする。平成24年度は、正常マウスで見られる免疫寛容誘導現象、ポリエチレングリコール(PEG)修飾卵白アルブミン(PEG-OVA)による卵白アルブミンに特異的な免疫寛容誘導が全身性自己免疫疾患モデルであるNZB系マウスにおいてみられないこと、正常マウスにおいてはこの免疫寛容誘導能が抑制性Fc受容体であるFcgr2bの発現に依存した現象であること、さらにFcgr2b遺伝子欠損が免疫寛容誘導能の遺伝的欠如として表現されるためには、Fcgr2b遺伝子に密接に連鎖するSLAM遺伝子族の多型が自己免疫疾患感受性を担う系統に由来していることが必要であることを明らかにした。平成25年度は、これらの研究結果を通じて明らかにされた免疫寛容の遺伝的欠損を基礎づけるcomponent phenotypeに着目し、SLE発症を規程する異常シグナル経路の本質を明らかにする。申請者はSLEモデル(NZB x NZW)F1マウスにおいて、B細胞系の寛容破綻とCD4陽性T細胞のポリクローナルな異常がそれぞれ、抑制性Fc受容体であるFcgr2b遺伝子を中核とする遺伝子群と、主要組織適合遺伝子複合体(MHC) class II遺伝子を中核とする遺伝子群の、異なるふたつの多遺伝支配によって規定され、さらにこのふたつの相互作用によって、SLE発症をもたらす枢軸的異常シグナル経路が規定されている可能性があることを明らかにした。本研究ではこれらの研究成果に基づき、自己免疫応答を基礎づけるcomponent phenotypeに着目した量的遺伝学の方法を用い、SLE発症を規定する枢軸的異常シグナル経路の本質を明らかにする。平成25年度は、(NZB x NZW)F1系マウスについて、未だ自己免疫病態が現れる前の2か月齢と、SLE病態を示している8か月齢の雌マウスの脾臓細胞を対象とし、DNAアレイを用いて網羅的遺伝子発現解析を実施した。その結果、このマウスの加齢に伴う重篤なSLE病態の出現に伴い、多数の遺伝子発現に異常が観察された。リンパ球の機能に係わる遺伝子発現については、Fcgr4, Try5, Sycn,等の遺伝子の転写について4倍以上の増加、Trat1, Dapl等の遺伝子について、約1/4以下への減少が認められた。さらに(NZB x NZW)F1マウスを双方の親系マウスに交配して退交配マウスを得てこれらの候補遺伝子の転写産物をRT-PCRによって測定するとともに、各マウス個体のゲノムDNAのマイクロサテライトDNA多形を遺伝子マーカーとして着目し、各候補遺伝子の転写がどのような遺伝支配を受けているかを検証中である。これらの実験データと、免疫系のシグナル伝達に関する先験的情報とを総合し、SLE発症を規定する枢軸的異常シグナル経路の本質を分子論的に明らかにする作業を現在継続している。申請者はマウスSLEモデルにおいて、B細胞系の寛容破綻とCD4陽性