hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
抗腫瘍性を有する微生物酵素の構造機能解析と次世代型抗腫瘍性酵素開発への応用

抗腫瘍性酵素L-メチオニンγ-リアーゼは,現在すでに抗がん酵素として研究開発が進んでおり,実用性があるとされている。次世代型抗腫瘍性酵素として開発するに当たり,本酵素の詳細な構造的情報及びその機能の解明が望まれている。本酵素の立体構造を1.8Åの分解能で精密に解析し,特にこれまでに不明であったN末端領域部分の明瞭な空間的情報を提供することが可能となった。このことは,高機能化抗腫瘍性酵素創製のための大きな一助となると期待される。これらの知見から,本酵素の活性中心に補酵素ピリドキサール5'-リン酸(PLP)を中心とした水素結合ネットワークの存在が明らかになり,特にCys116残基は生理的基質であるL-メチオニンを基質とした場合のα,γ脱離反応に重要で,基質認識に大きく関与していることを見出した。また,この過程で得られたC116H変異酵素は,基質特異性が大きく変化し,β脱離活性を大幅に向上させ,His残基が反応に関わっているのではないかということを新規に見出した。ところで,本酵素を抗がん剤として血中投与するにあたり,プロテアーゼ等によるストレスを受けることで失活することが考えられており,より安定な抗がん酵素開発に向け,低純度における本酵素がCys49-Phe50間で特異的に切断されることを見出した。今後,本酵素の抗原性の低下を目指したポリエチレングリコール修飾が期待される。最後に,近年行われた放線菌Streptomyces avermitilisのゲノム解析によりL-メチオニンγ-リアーゼの遺伝子が同定された。この遺伝子配列を元に,一次構造解析を行うと共に,遺伝子クローニング及び発現,精製,速度論解析等を行うことで,放線菌属でL-メチオニンγ-リアーゼ活性を有することを世界で初めて見出した。抗腫瘍性酵素L-メチオニンγ-リアーゼ及びL-レリジンα-オキシダーゼの構造機能解析及び遺伝子クローニング、抗腫瘍効果の検討を行った。近年,Pseudomonas putida由来L-メチオニンγ-リアーゼの立体構造が1.8Åの解像度で完全に解析され、多くの知見を得ることが可能となった。とりわけ、活性中心に存在するシステイン残基に着目し、部位特異的変異導入法を用いて組換え型変異酵素を作製したところ、顕著な活性の低下が認められたことから、本残基が触媒回転に必須であることが示唆された。また、本残基を含む水素結合ネットワークも確認され、その重要性が示唆された。Trichoderma viride由来L-リジンα-オキシダーゼの遺伝子と思われるcDNAを逆転写により獲得し、それより推定されるアミノ酸配列と周知のTrichodermaharzianum由来のL-アミノ酸オキシダーゼのそれとの相同性があることが確認された。本遺伝子を発現ベクターヘクローニングし、本酵素の発現を試みたが活性を検出できなかった。T.virideのゲノム上の本遺伝子周辺領域において、上流に数アミノ酸残基がさらに存在する可能性を示唆する配列を確認した。これは先の本酵素におけるN末解析の結果と符合するものであった。また、この推定配列中にFAD結合に関与すると思われる残基も含まれており、今回組換え型酵素での活性を検出できなかった原因の一つと考えられ、さらなる上流域を含む遺伝子のクローニングが当面の目標である。組換え型酵素L-メチオニンγ-リアーゼとT.virideから精製したL-リジンα-オキシダーゼの抗腫瘍効果をin vitroで検討したところ、両者ともに高い抗腫瘍効果が認められ、正常細胞に対する顕著な毒性は認められなかった。

抗腫瘍性酵素L-メチオニンγ-リアーゼ及びL-リジンα-オキシダーゼの構造機能解析及び遺伝子クローニングの検討を行った。Pseudomonas putida由来のL-メチオニンγ-リアーゼは,これまでに活性中心形成に関わるN末端部分が未解明であったが,本研究で1.8Aの分解能で完全に解明され,より詳細な知見が得られるようになった。とりわけ,補酵素ピリドキサール5'-リン酸(PLP)を中心に重要な水素結合ネットワークの存在が明らかになった。中でも活性中心に存在するCys116残基について着目し,部位特異的変異導入法を駆使し詳細に検討し,この残基がL-メチオニンを基質とした場合のα,γ脱離反応に重要で,基質認識に大きく関与していることを見出した。また,この過程で得られたC116H変異酵素は,基質特異性が大きく変化し,β脱離活性を大幅に向上させたことから,His残基が反応に関わっている可能性を新規に見出した。このことは,本酵素を抗がん剤として使用するだけでなく,動脈硬化や肥満などへの新たな応用が望める可能性を示唆している。さらに,本酵素を抗がん剤として血中投与するにあたり,プロテアーゼ等によるストレスを受けることで失活することが考えられる。低純度で保存した場合に,本酵素がCys49-Phe50間で特異的に切断されることを見出した。この領域を改変することによりプロテアーゼ耐性な酵素が取得できるものと思われる。一方,糸状菌Trichoderma viride由来のL-リジンα-オキシダーゼは,必須アミノ酸であるL-リジンを酸化的且つ特異的に分解し,さらに過酸化水素を生成することで抗がん活性を示すことが分かっており,次世代型抗腫瘍性酵素としての応用が期待されている。工業的生産系の確立を目指し,mRNAから5'-RACE法などを駆使してcDNAを作製し,目的の遺伝子を発現用ベクターヘクローニングすることに成功した。
人工多能性幹細胞を用いたもやもや病の病因病態解析と治療法の開発

もやもや病で亡くなった患者さんの病変部の血管を免疫組織化学染色を用いて詳細に検討した。その結果、もやもや病の患者さんでは、動脈の内腔を覆っている血管内皮細胞の表面の基質(マトリックス)が正常と異なっており、基質を構成するコンドロイチン硫酸、ヒアルロン酸が平常に比し減少していることが分かった。そのため、もやもや病では血流ストレスによる内皮細胞の損傷を受けやすく、損傷部位から血管壁内へ細胞が浸潤し、そこでヒアルロン酸が過剰に産生されることにより血管内腔の狭窄をきたすことが推察される。我々は、もやもや病患者剖検例の検討から、ヒアルロン酸の内膜への蓄積が狭窄の原因であると推測した。今回、2名の小児のもやもや病患者の皮膚線維芽細胞よりiPS細胞を樹立した。患者iPS細胞(A182, A205)と正常対照人より樹立したiPS細胞(N1)を平滑筋用培地SMCMで10日間培養し分化誘導。その後、抗SMA抗体陽性細胞をMACSを用いて分離し、それぞれの平滑筋細胞株を樹立した(SM182, SM205, SMN1。さらに、ヒト脳血管平滑筋細胞株(BVSMC)も対照として使用した。それぞれの平滑筋細胞株におけるヒアルロン酸合成酵素の発現について検討した。刺激は、IL-1beta;と低周波超音波刺激(LIPUS)を用いた。LIPUSは血流による血管壁への物理的ストレスのモデルとして行った。それぞれの平滑筋細胞株におけるヒアルロン酸合成酵素(HAS2,HAS3)のmRNAの発現について、TaqMan定量PCRにて検討した。正常細胞と患者細胞株の間で明らかな発現の違いはみられなかった。HAS3はIL-1や超音波刺激で発現が亢進する傾向がみられた。今後、血管内皮細胞へ分化させた場合のヒアルロン酸合成酵素の発現の違いについて検討していく予定である。我々は最近、もやもや病剖検例の病変血管の免疫組織化学的検討を行い、患者血管では血管壁にHAS2を高発現した骨髄由来の血管内皮細胞前駆細胞が浸潤しており、肥厚した内膜にヒアルロン酸が蓄積していることを発見した。また、患者血管では内皮細胞表面のマトリックスを形成するコンドロイチン硫酸、ヒアルロン酸の発現が低下しており、その結果、血流によるshearstressに対する脆弱性をきたしている可能性が示唆された。その後、患者iPS細胞を血管内皮細胞へ分化誘導を行い、現在分化の確認作業を行っている。小児神経学iPS細胞の維持培養のに手間取ったことと、平滑筋への分化後のヒアルロン酸発現の結果が予想と異なっていたため計画の変更が必要となったため血管内皮細胞へ分化させた場合のヒアルロン酸合成酵素の発現の違いについて検討していく予定である。差が出なかった場合は、アレイCGHでの比較も検討している。使用額に端数が生じたため次年度の研究費の一部として使用する
広島の復興における米国・諸外国の関わり：その歴史学的考察と我が国と原子力について

平成26年度は、いくつかの主たる研究群において大規模な予備的研究を行い、日本各地の平和運動家と医者へのインタビューなどの一次資料調査を実施した。また、トラウマの影響を過去に受けたり、現在も受けているコミュニティに住むヒバクシャなどの応用研究に着手した。また、国際学会での研究発表、論文審査付のジャーナルへの論文掲載やメディアから当研究に関して多くのインタビューを受けるなどした。1、口述歴史聞き取り調査:広島、長崎、名古屋、京都のヒバクシャの心理的なトラウマを調査した医者へのインタビューを実施。また、様々な団体が運営する平和運動と医学に関する資料館において、資料調査を行った。広島の医療関係団体および平和団体の協力のもとに調査活動を行うとともに、各地でヒバクシャから聞き取り調査を行った。2、資料収集:広島平和記念資料館、国会図書館、長崎の証言者の会、広島大学、名古屋大学にて原子力および心理学の研究に関する資料を収集した。3、日本の医学史研究者、特に軍事に関連する医学と心理的トラウマの専門家から平成26年度に受けた協力の成果として、トラウマと原子力、また、戦争とトラウマに関するワークショップを平成27年の夏、京都大学で開催する。4、いくつかの国際会議において研究成果を発表、ジャーナルへも関連論文を掲載し、複数の国々のメディアから、当研究に関する多くのインタビューを受けた。26年度が最終年度であるため、記入しない。
仮想現実感技術を用いたボールの到達地点予測に関する時空間認知スキルの解析

平成15年度に実施した二次元画像による時空間認知スキル評価のための実験から,興味深い現象が観察された。すなわち,自由落下物体の位置予測課題において,判断した位置は,実際の位置よりも過少評価し(実際の位置より手前に判断する),自由落下運動においても実際の速度より遅い落下速度で物体運動をイメージ(このイメージした速度を予測速度とした)し,位置予測するという予測速度低下現象が観察された。平成16年度は、この現象の原因を解明するために、原因仮説を設定し,その仮説検証を行った。第1実験では,(1)自由落下による加速運動の影響。(2)落下運動が遮蔽されるまでの時間が短い,または速度が速すぎる。の2点仮説を設定した。これらを検証するのために,物体運動速度を等速3m/s(遮蔽時における自由落下の速度は3m/sであったため),等速1m/s,自由落下の3条件に設定し実験を行った。この結果,自由落下と等速3m/sの条件では,ほぼ同様な位置を判断し,予測速度は実速度の1/6程度であった。また,等速1m/sの条件においても,予測速度は実速度の1/4程度で,実速度よりはるかに遅いものであった。したがって,これらの予測速度低下現象は,物体運動の加速や速度の影響によるものではないことが明らかとなった。さらに,第2実験では,(1)自由落下運動がイメージできない。(2)板に隠れる瞬間が板への衝突印象を与える。の2点の仮設を設定した。物体が,遮蔽板(板の変色によって視覚刺激も提示する)の前面を落下する実験(落下の様子が十分に観察可能)において,板の変色時の位置を判断する課題や衝突印象を排除するため,遮蔽板を延長し,遮蔽板の途中でボールが消失するように設定した課題を行った。しかし,この2つの条件も原因とはならないことが判明した。一方,自由落下が見えているにもかかわらず,板が変色した時の実際の位置より上方(運動方向と反対側)に判断するという,位置認知エラー現象が観察された。この原因については,解明には至らなかった。平成14年度は、2次元画像による時空間認知スキル実験のうち、時間認知の部分についての実験を行った。22インチの大画面ディスプレイとコンピュータシステムを構築し、このシステムにおける時間認知スキル評価のタスクを検討した。このタスクを検討するにあたり、現実空間においていくつかの予備実験を実施し、その結果から本実験用タスクを決定した。2.本実験用VR画(VRプログラムのと実験タスク本実験用のタスクは、Open GLにより作成した。時間的認知スキルを評価するために次のようなタスクで実験を行った。VR環境内の実験室で、2.5m離れた所で、卓球ボールが打上げられ自由落下する。ボールの直前には、板(高さ110cm)を設置し、その後ろをボールが落下するため板に隠れたボールの落下運動は見えなくなる。板に隠れた後、板全体が変色した時(タイミングは実験者が変えることができる)のボールの位置を被験者に回答させた。3.VR画像によるタスクの妥当性の検証現実環境において卓球ボールを打上げ、板の後ろに隠れた後、板が変色する実験装置を作成し、VR画像と同様の実験タスクを実施した。VRにおける実験が現実環境の実験と同様の傾向が得られたことにより、VRによる実験の妥当性が確かめられた。したがって今後のVRによる実験によって現実環境実験の代用が可能であると考えられる。4.実験データの解析時間認知に関する実験データの解析は、現在、細部を検証するための実験を行っており、その実験データと合わせて解析し、結果をまとめることになっている。平成15年度は、2次元画像による時空間認知スキル評価のための実験を行った.その解析結果から,自由落下物体の位置予測に関して,興味深い現象が観察された.平成14年度の研究では,仮想環境における物体運動を再現した実験から,現実環境における同じタスクの実験と同様の結果が得られた.このことから,仮想環境において再現した実験が,現実環境実験を反映することの妥当性が確認された.本年度は,コンピュータによって作られた仮想環境を利用して,打上げられたボールが自由落下する運動を再現し,実験を行った.実験には,12名の健康な男子大学生(19-21歳)が,被験者として参加した.被験者には,矯正視力0.8以上,色盲など視覚障害がないことと実験参加への同意を確認した.実験タスクは,物体の自由落下運動の途中,遮蔽板で物体運動を遮蔽し,その後視覚刺激を提示した時の物体位置を回答させる予測課題であった.このタスクは,運動物体までの距離を2.5mに設定して実施した.さらに,眼球運動との関係を検討するために,物体までの距離が,3.5m,4.5mの距離条件においても,同じタスクを実施した.また,自由落下という加速運動だけでなく,一定速度の等速運動による物体運動をコンピュータにより再現し,遮蔽後の位置予測課題も行った.実験から,落下物体の位置予測では,実際よりも位置を過少評価する結果が得られた.データ解析から,実際の速度よりも遅い落下速度で位置予測するという,予測速度低下現象が観察された.さらに実験から,この現象は,追跡眼球運動の角速度特性や物体運動における加速や等速などの物体運動様式との関連性がないことが明らかとなった.この現象の原因解明については,さらなる実験と検討を必要とし,今後の課題となった.平成15年度に実施した二次元画像による時空間認知スキル評価のための実験から,興味深い現象が観察された。

すなわち,自由落下物体の位置予測課題において,判断した位置は,実際の位置よりも過少評価し(実際の位置より手前に判断する),自由落下運動においても実際の速度より遅い落下速度で物体運動をイメージ(このイメージした速度を予測速度とした)し,位置予測するという予測速度低下現象が観察された。平成16年度は、この現象の原因を解明するために、原因仮説を設定し,その仮説検証を行った。第1実験では,(1)自由落下による加速運動の影響。(2)落下運動が遮蔽されるまでの時間が短い,または速度が速すぎる。の2点仮説を設定した。これらを検証するのために,物体運動速度を等速3m/s(遮蔽時における自由落下の速度は3m/sであったため),等速1m/s,自由落下の3条件に設定し実験を行った。この結果,自由落下と等速3m/sの条件では,ほぼ同様な位置を判断し,予測速度は実速度の1/6程度であった。また,等速1m/sの条件においても,予測速度は実速度の1/4程度で,実速度よりはるかに遅いものであった。したがって,これらの予測速度低下現象は,物体運動の加速や速度の影響によるものではないことが明らかとなった。さらに,第2実験では,(1)自由落下運動がイメージできない。(2)板に隠れる瞬間が板への衝突印象を与える。の2点の仮設を設定した。物体が,遮蔽板(板の変色によって視覚刺激も提示する)の前面を落下する実験(落下の様子が十分に観察可能)において,板の変色時の位置を判断する課題や衝突印象を排除するため,遮蔽板を延長し,遮蔽板の途中でボールが消失するように設定した課題を行った。しかし,この2つの条件も原因とはならないことが判明した。一方,自由落下が見えているにもかかわらず,板が変色した時の実際の位置より上方(運動方向と反対側)に判断するという,位置認知エラー現象が観察された。この原因については,解明には至らなかった。
新規miRNA阻害ベクターライブラリーを用いたがん細胞増悪化関連miRNAの探索

我々が開発したmiRNAを阻害するDecoy RNA, TuD(Tough Decoy) RNAの発現ベクターを改良し、これを用いて癌性質に関わるmiRNAを探索することが本研究の目的であった。本研究において実際に我々はTuD RNA発現ベクターを改良することができた。この改良型TuD RNAを発現するユニットを搭載したレンチウイルスベクターが、導入された培養細胞内において100日以上の長期に渡り、miRNA阻害効果を維持することができることを示した。さらにこのベクターを用いることにより、癌細胞において上皮一間充織転換を誘導することができた。これにより改良型TuD RNA発現ベクターが、癌細胞におけるmiRNAの機能を解析する上で有用なツールであることを実証した。microRNA(miRNA)の中にはtumor suppressorとして機能するものがあり、それらは発がんやがんの進展に伴って発現が低下することが報告されている。申請者はこれまでに独自の二次構造を持つDecoy RNA(TuD RNAと名付けた)を細胞内で発現させ、標的とするmiRNAを特異的に高効率、長期間阻害する手法を開発してきた。本研究では、この手法の改良を進めるとともに、本手法を用いてがん細胞の増殖能や転移能といった性質に深く関わるmiRNAを同定し、その機能を解明することを目的とする。TuD RNAの改良を目指し、その二次構造や配列、発現に用いるプロモーターについて検討した。従来法ではmU6プロモーターを用いるが、h7SKプロモーターを用いることにより、標的miRNAの阻害効果が大きく上昇することを見出した。次に改良した阻害法を用いてがん細胞の増悪化を誘導できるかどうかを検討した。がん細胞のEMTを抑制するmiRNAとして報告されているmiR-200familyに対するTuD RNAを発現するレンチウイルスベクターを大腸がん上皮細胞であるHCT-116細胞に導入し、TuD-miR200安定発現細胞を作製した。この細胞の上皮、間葉細胞のマーカー遺伝子であるE-cadherin、Vimentinのタンパク質量を測定したところ、レンチウイルスベクター導入から7日目にはE-cadherinの減少が見られ、11日目にはE-cadherinの大幅な減少、Vimentinの発現増強が観察された。さらにこの細胞の形態は、レンチウイルスベクター導入から11日目には元の敷石状の形態からスピンドル様の形態へと変化していた。さらに培養を続けたところ、この効果は100日以上持続することが確認された。以上より改良阻害法は高いmiRNA阻害効果を持続的に発揮し、EMTをも誘導し得ることが示された。申請者はこれまでに独自の二次構造を持つDecoy RNA(Tu DRNAと名付けた)を細胞内で発現させ、標的とするmiRNAを特異的に高効率、長期間阻害する手法を開発してきた。前年度においてmiR-200 familyに対する、改良型TuDRNAを発現するレンチウイルスベクターを大腸がん上皮細胞であるHCT-116細胞に導入し、TuD-miR200安定発現細胞を作製した。この細胞について形態や遺伝子マーカーを解析したところ上皮-間充織転換(EMT)が誘導されていた。そこで本年度においては、このTuD-miR200安定発現細胞について細胞増殖能および軟寒天中でのコロニー形成能を解析した。この細胞がEMTを起こしていることから、増殖能や足場非依存性といった点において増悪化しているものと思われたが、細胞増殖速度は低下しており、また軟寒天中でのコロニー形成能も低下していた。さらに文献情報を基に20種程度のmiRNAを選定し、これらに対するTuDRNA発現ベクターをそれぞれ作製した。現在これらのベクターを各種癌細胞に導入し、細胞増殖等への影響について解析を進めている。
大学看護学教育における情報リテラシー教育方法の開発と評価

本研究では、基礎看護学教育の課外プログラムによる、(1)基礎的な情報リテラシーの反復体験による習得、(2)基礎看護学の補完的・発展的学習支援、(3)グループ活動やWeb上での交流による意思決定・問題解決能力や人間関係スキルの育成、の3点を目指した。平成17年度は、前年度に続き「排泄の援助」に絞って課外プログラムの運用を行い、前述の(1)(3)に沿ってプログラム内容・方法を評価した。単元の特性(援助に迅速さが要求されること、心理的配慮と確実な技術が不可欠であること)に対して、学習を情意領域・認知領域からも深めることを狙った。プログラムはA.個人作業課題(A1.実習体験レポート(Word)、A2.グループ発表成果について意見交換(Web上の電子掲示板))とB.グループ作業課題(B1.全員の体験レポートのまとめ(Word)、B2.アンケート結果のまとめ(WordとExcel)、B3.調べ学習の結果レポート(Word))で構成した。ほとんどの学生はパソコンを持っていたが、課題作業の観察から、所有パソコンで利用可能な記憶メディアの違いなどによってグループ作業が能率的に進まないこと、全員の情報リテラシー向上につながりにくいことがわかった。(1)の情報活用能力育成のためには個人作業が有効である。(2)では、アンケートから自分たちの生活における排泄を見つめ直すこと、アンケート結果や実習で体験した排泄ケアについて電子掲示板で意見交換することが、これまでにはなかった学習成果として学生・教員から評価された。しかし、アンケート、電子掲示板利用とも1回のみの体験となったため、(3)で成果を期待できなかった。電子掲示板利用は学生への負担感も少なかったためさらに活用できる可能性がある。プログラム運用・管理にあたっては情報セキュリティ対策に時間・金のコストがかかるため、利用手段を限定して高頻度で活用するのが妥当と思われた。本研究では、大学看護学教育において学生が情報リテラシーを習得し、情報機器やソフトを活用するための教育プログラムを開発する。看護師・保健師養成統合カリキュラムでは、国家試験受験資格取得のための必要科目・単位数が非常に多く、情報教育を授業科目にし難い。そこで課外学習プログラムの開発を目指し、平成15年度は以下の3つの内容で研究をすすめた。1.学習環境の整備現在は固定式デスクトップPCが並ぶ構造のPCルームのみであり、グループ作業がしづらく、PC動作も悪い。そこでWindowsXP搭載ノートPCを7台購入し、看護実習室に配置した。作業に合わせて場所を移動できるよう、可動式PC台やLAN環境も整備した。プログラム提示や作業中の情報交換、学習結果発表の専用Webサイトも構築中である。大学全体での情報セキュリティ管理下で問題なく利用できるよう、定期的な点検の体制作りや管理マニュアル作成、利用マニュアル作成も行った。2.情報教育としての学習内容と評価方法の検討ワープロや表計算、プレゼンテーションのソフトの反復利用で情報活用能力および情報モラルを習得させる。これらは看護実践で活用しうるが学生への事前調査では利用経験が十分でなかった。既存の情報リテラシー調査票などを用いて、学習プログラム実施前後での変化を評価し、かつプロセスをポートフォリオ評価する。3.基礎看護学教育としての学習内容と評価方法の検討授業前後に提示した項目の下調べをさせ、それに関する学生の実態や考えを調査させて結果をWeb上で発表させる。これに対し学生同士での意見交換、教員からのコメントを行う。学習効果の評価は、知識を問う筆記テストの実施、強制連結法による思考力チェックなどを行う。2年目の平成16年度は、学内研究倫理審査結果を待ち、1年生を対象とした課外学習プログラムを実行し学習効果等の結果を収集する。本研究では、基礎看護学教育の課外プログラム(Webページを利用した学習支援)による、(1)基礎的な情報リテラシーの反復体験による習得、(2)基礎看護学の補完的・発展的学習支援、(3)グループ活動やWeb上での交流による意思決定・問題解決能力や人間関係スキルの育成、の3点を目指している。平成15年度はプログラムの骨格を形作るための基礎研究を行い、平成16年度は、具体的なプログラム内容・方法の計画を検討した。基礎看護学の科目担当教員と相談を重ね、「排泄の援助」の課外学習に設定することにした。排泄の援助のもつ特性(援助に迅速さが要求されること、心理的配慮と確実な技術が不可欠であること)に対して、学習を単なる知識・技術としてだけでなく情意領域・認知領域からも深めるには課外学習が有効と考えられたためである。まず基礎看護学およびコンピュータリテラシーの学習としての課題内容、グループ作業の体験としての課題内容が、合目的であり教員・学生双方にとって無理がないこと、課題の教示方法・内容が適切であること、質問紙等の調査内容と調査方法が適切であること、Webサイトがスムーズに運用されることを確認するため、平成16年5月7月にプレテストを実施した。プログラム内容は、これまでと同様の事前課題に加える形で、グループ作業とWord、Excelによるレポート作成、およびWeb上で発表されるそのレポートに対しての電子掲示板での全員での意見交換という2つの事後課題とした。学生・教員双方から「排流の援助」でのプログラム実施が有意義であったと評価が得られた。さらに学部教員全体での検討会で内容・方法への意見をもらい、学生・教員双方の負担度も考慮してプログラム内容・方法の精錬をすすめた。これに基づき、平成17年度にプログラムを本格運用する予定である。

本研究では、基礎看護学教育の課外プログラムによる、(1)基礎的な情報リテラシーの反復体験による習得、(2)基礎看護学の補完的・発展的学習支援、(3)グループ活動やWeb上での交流による意思決定・問題解決能力や人間関係スキルの育成、の3点を目指した。平成17年度は、前年度に続き「排泄の援助」に絞って課外プログラムの運用を行い、前述の(1)(3)に沿ってプログラム内容・方法を評価した。単元の特性(援助に迅速さが要求されること、心理的配慮と確実な技術が不可欠であること)に対して、学習を情意領域・認知領域からも深めることを狙った。プログラムはA.個人作業課題(A1.実習体験レポート(Word)、A2.グループ発表成果について意見交換(Web上の電子掲示板))とB.グループ作業課題(B1.全員の体験レポートのまとめ(Word)、B2.アンケート結果のまとめ(WordとExcel)、B3.調べ学習の結果レポート(Word))で構成した。ほとんどの学生はパソコンを持っていたが、課題作業の観察から、所有パソコンで利用可能な記憶メディアの違いなどによってグループ作業が能率的に進まないこと、全員の情報リテラシー向上につながりにくいことがわかった。(1)の情報活用能力育成のためには個人作業が有効である。(2)では、アンケートから自分たちの生活における排泄を見つめ直すこと、アンケート結果や実習で体験した排泄ケアについて電子掲示板で意見交換することが、これまでにはなかった学習成果として学生・教員から評価された。しかし、アンケート、電子掲示板利用とも1回のみの体験となったため、(3)で成果を期待できなかった。電子掲示板利用は学生への負担感も少なかったためさらに活用できる可能性がある。プログラム運用・管理にあたっては情報セキュリティ対策に時間・金のコストがかかるため、利用手段を限定して高頻度で活用するのが妥当と思われた。
年金財政と高齢者の労働供給

本年度の研究実績は、次の要素からなっている。第1に、1994年の年金改革による財政収支及び世代別分配効果分析をさらに精緻化し、改善した。年金改革で行われた国民年金保険料の前倒し、スライド制の採用、部分年金の採用等は、当初において全て財政収支改善の効果を持つ。しかし保険料の前倒しは、2020年以降収入減の要因になる。このためもし94年改革で保険料の前倒しのみが行われていたならば、2025年には年金基金の残高は負になってしまうことが判明した。次に、物価スライド制は、全期間を通じて基金の収支改善効果をもたらす。しかし、保険料の前倒しとスライド制だけでは、2035年に基金が底を突いてしまう。部分年金は、スライド制と相まって強力な財政収支改善効果をもたらし、最終的には全期間に渡って年金改革の財政収支改善効果をもたらすことがわかった。第2に、この改革の一つの柱である部分年金は。60才から65才までの年齢層の労働供給促進効果を持つ。その効果の度合いに応じて年金収支がいかに改善するかを測定した。第3に、年金の物価スライド制は、消費税の財政改善効果を打ち消す効果を持っている。これがどれだけ打ち消すかを分析した。従来分析されてきた定常経済モデルでは、物価スライド制は、消費税の財政収支改善効果をあまり大きく打ち消さないが、高齢化過程ではこれが大きな効果を持つことことを示した。1994年度の後半に年金改革が行われた。本年度の主要な成果は、この新しい制度を取り入れたプロトタイプ重複世代モデルを作成し、種々のシュミレーションを行ったことである。この年金改正では、60才から65才までの人々の年金支給方法に大きな改革が行われた。それに伴う財政収支の影響の分析が研究の主眼であった。また、この改訂に伴い過去には公表されていなかった世代別加入率に関するデータが公表され、さらに新しい人口推計のため、それらのデータを組み込んだモデルを作った。このモデルでわかったことは、次のとおりであった。第1に、世代間の純受給率が改正前より大幅に均等化したことである。これは、主としてネットスライド制の採用による。第2に、年金基金が高齢化のピーク時においても底を突かず、かなりな余裕が発生することがわかった。第3に,GDPの2.8%を年金のための超過負担を続ければ、一度も年金基金残留の減少を経験することなく、高齢化時代を乗り切れることも判明した。このモデルでは、まだ労働供給が内生化されていない。これを行うことが来年度の目標である。そのための準備として、木村は女性の退職行動データを収集し、供給関数の分析を行った。本年度の労働供給内生モデルにこれを結びつける予定である。1994年に年金改革が行われた。これは、「部分年金」と呼ばれており、この年齢の人々の労働供給を促進する効果を持っている。本研究では、この改革に伴う財政収支の影響の分析を行った。この改訂に伴い過去には公表されていなかった世代別加入率に関するデータが公表され、さらに新しい人口推計も行われた。それらのデータを組み込んだモデル重層世代モデルを作成した。このモデルを用いてわかったことは、次のとおりである。第3に、GDPの2.8%を年金のための超過負担を続ければ、一度も年金基金残高の減少を経験することなく、高齢化時代を乗り切れることも判明した。第4に、部分年金の労働供給増大効果を考慮に入れた年金財政の収支共に改善効果を測定した。
ウシ顆粒層細胞の分化に伴うPGF2αレセプター発現調節機構の解明

排卵直前の卵胞を構成する顆粒層細胞においてPGF2αが合成分泌されることが明らかとなり、PGF2αが卵巣内局所調節因子として作用することが示唆されている。しかし、その生理作用は多くの研究が行われているにもかかわらず、ほとんど解明されていない。PGF2αは細胞膜上の特異的なレセプターを介して作用することから、レセプターの発現とその調節機構の解明はPGF2αの生理的役割を明らかにする上で重要な意義があると考えられる。そこで、本研究ではウシ顆粒層細胞のPGF2αレセプター発現について遺伝子レベルでの検討を試みた。1,ウシ成熟卵胞あるいは小卵胞より採取した顆粒層細胞のPGF2αレセプターmRNA(PGFRmRNA)発現量について検討した。すなわち、採取した細胞を10%ウシ胎児血清を含むDMEM/F-12で培養した(37.5C,5%CO2in air)後、Guanidine thiocyanate法に従って総RNAを抽出してNorthen blotを行い、PGFRmRNAの検出を行った。その結果、熟成細胞より採取された顆粒層細胞においては、PGFRmRNAが検出されたが、小卵胞に由来する顆粒層細胞では認められなかった。2,小卵胞に由来する顆粒層細胞の分化あるいは黄体化過程におけるPGF2αレセプター調節機構を検討しうる実験系の確立を目的として、培養期間の延長に伴う培養顆粒層細胞のステロイド合成能の変化、形態的変化を検討した。その結果、顆粒層細胞を10%子牛血清を含むDMEM/F-12でInsulinとForskolin存在下において、216時間培養することにより機能的にも形態的にも大型黄体細胞に類似した細胞に分化することが明らかになった。本研究の成果は、日本繁殖生物学会の機関誌であるJournal of Reproduction and Developmentに掲載された。以上の結果から、顆粒層細胞の分化に伴いそのPGFRmRNA発現が誘起されることが明らかにとなった。また、PGFRmRNA発現調節機構の解明に有用な顆粒層細胞の黄体化を誘起しうる培養系が確立された。
胸腺における多量体免疫グロブリンレセプターの機能解析

当教室で樹立したマウス多量体免疫グロブリンレセプター(mpIgR)cDNA transfectant LmSC細胞を,抗mpIgR抗体により染色しより発現の強いsubclone LmSC5を樹立した。同細胞とparental cellであるL細胞を、それぞれ3x10^5個の割合で10cm培養皿に撒き18時間培養後、C3H/HeJマウスの胸腺細胞を調整し、1x10^7個の割合で加え共培養した。培養5日目に浮遊細胞を回収し、細胞表面マーカーについてFACScanにて検索した。いずれの培養系においても、Thy-1陽性細胞が95%,B220陽性細胞が5%という割合で存在しており、大きな差は認められなかった。しかし、CD5陽性細胞に関しては、transfectantとの共培養で約10%と、L細胞との共培養よりも(2%)わずかに多かった。今後さらに検索を続け、この現象の再現性について確認するとともに、その他の細胞表面マーカーについても検索する。
4-space内の曲面のState-Sum Invariantについて

4次元空間内に埋め込まれた曲面を3次元空間に射影すると一般には交わりを持つ曲面が得られる。その交わりの3重点について調べた。3重点についての研究で、向き付け不可能な曲面に対しては最小な3重点の数が決まるものが多く知られている。また3重点の最小数が1個である曲面は存在しないことが知られている。これらは佐藤進氏の研究による。また任意の自然数に対してその数を越えるような最小な3重点をもつ結び目曲面は鎌田氏によって構成された。しかし、よく知られている向き付け可能な曲面に対してでも、最小な3重点の数がいくつなのかはあまりよく知られていない。今回の研究で得られた主な結果は「三葉結び目の2-ツイストスパン結び目曲面について、その最小3重点数は4個であり、三葉結び目の3-ツイストスパン結び目曲面について、その最小3重点数は6個である」ことである。最初の定理は最近発見されたstate-sum invariantを用いて証明した。示す方法は3重点の数が3個以下ならばstate-sum invariantの値はある特定の値、整数しかとらない事を示した。三葉結び目の2-ツイストスパン結び目曲面のstate-sum invariantは整数でない値をとり、3重点の数が4個以上であることを示した。また佐藤進氏により、実際4個の3重点を持つ形で描けることがわかり、最小な3重点の数が4個あることが分かった。2番目の定理は最初に使ったquandleを取り替えて、S_4と呼ばれるものに限ったとき、state-sum invariantの値を調べた。この不変量が整数でない値をとり得るためには最低3重点が何個必要かどうかを調べる方程式を立てて、その計算を計算機で行うプログラムを作った。その結果、三葉結び目の3-ツイストスパン結び目曲面は最低3重点が6個は必要であることが示せた。曲面結び目については具体例が結び目に比べ少ない。そこで、4次元空間に埋め込まれた曲面を研究する一つの方法、平面に上のグラフある条件を満たすもの(chartと呼ばれているもの)を使って曲面結び目について調べた。鎌田氏により3-chartは次数が6の頂点がないものにC-move同値であることが示された。4-chartで次数が4の頂点を高々1つしか持たない場合は永瀬氏と広田氏によって同様の結果が得られている。この研究で、4-chartで次数が1のもの頂点が6個のとき次数が6の頂点がないものにC-move同値であることも示した。この条件をもつchartに対応する曲面は球面に対応する。次数が6の頂点は結び目曲面には3重点に対応する。その交わりで紙がちょうど3枚交わっている点、3重点の最少の数をある結び目曲面に対して決定した。

3重点についての研究で、向き付け不可能な曲面に対しては最小な3重点の数が決まるものが多く知られている。また3重点の最小数が1個である曲面は存在しないことが知られている。これらは佐藤進氏の研究による。また任意の自然数に対してその数を越えるような最小な3重点をもつ結び目曲面は鎌田氏によって構成された。しかし、よく知られている向き付け可能な曲面に対してでも、最小な3重点の数がいくつなのかはあまりよく知られていない。今回は3重点をもつ結び目曲面の内もっとも簡単と思われている、三葉結び目の2-ツイストスパン結び目曲面について、その最小3重点数は4個であることを決定した。使った手法としては最近発見されたState-sum不変量を用いる。State-sum不変量はquandleから決まる不変量である。このquandleを特にAlexander quandleとしたとき、古典的な不変量Alexander多項式の値が消えていたらこのState-sum不変量が消えている事を以前示した。逆にState-sum不変量が消えていなければ複雑な絡み方をして、3重点の数も多いだろうと考えられた。そこで、3重点の数が3個以下ならばState-sum不変量の値はある特定の値、整数しかとらない事を示し、三葉結び目の2-ツイストスパン結び目曲面は整数でない値をとり、3重点の数が4個以上であることを示した。また佐藤進氏により、実際4個の3重点を持つ形で描けることがわかり、最小な3重点の数が4個あることが分かった。他にもいろいろな最小な3重点の数が4個である向き付け可能な曲面を構成した。4次元空間内に埋め込まれた曲面を3次元空間に射影すると一般には交わりを持つ曲面が得られる。その交わりで紙がちょうど3枚交わっている点、3重点の最少の数について研究している。3重点について今まで知られていた事は3重点の最小数が1個である曲面は存在しないこと(これは佐藤進氏の研究による)や、任意の自然数に対してその数を越えるような最小な3重点をもつ結び目曲面は鎌田氏によって構成された。去年は3重点をもつ結び目曲面の内もっとも簡単と思われている、三葉結び目の2-ツイストスパン結び目曲面について、その最小3重点数は4個であることを決定した。これを示すために最近発見されたState-sum不変量を用いた。使ったquandleは位数が3のdihedralquandleを用いた。示す方法は3重点の数が3個以下ならばstate-sum不変量の値はある特定の値、整数しかとらない事を示し、三葉結び目の2-ツイストスパン結び目曲面は整数でない値をとり、3重点の数が4個以上であることを示した。今回は3以上の奇数nに対して、位数がnのdihedral
素形材プロセスを経ない高強度・高延性電解析出バルクナノ結晶Al合金の創製

ジメチルスルホン浴を用いた電解析出法による、高強度・高延性バルクナノ結晶アルミニウム合金の作製を目的として行った。最初に、脆化元素である硫黄・塩素の除去プロセスを構築した。次に、第一原理計算により、結晶粒微細化および固溶強化元素としてCu、Fe、Mn、Zrを選択した。この中で、Cu、Mn、Zr添加合金においてバルク体が作製可能であった。引張試験の結果、Al-Zr合金は156 MPaの引張強度、20%の延性を示した。この降伏強度と伸びは、非熱処理型商用Al合金の強度ー延性バランスにおける最高値と同等であり、商用Al合金と同等の強度・延性バランスに優れる電析Al合金の作製に成功した。ジメチルスルホン浴を用いた電解析出法による、高強度・高延性バルクナノ結晶アルミニウム合金の作製を目的として研究を行っている。具体的には、脆化元素である硫黄、塩素除去プロセスと、Mnなどの大きなミスフィットひずみを有する元素を過飽和に固溶させた過飽和固溶体合金作製プロセスを同時に実現する新たなプロセスを構築する。平成28年度は「脆化元素を含まない合金作製プロセス構築」と「過飽和固溶体作製のためのプロセス最適化」をそれぞれ実施した。「脆化元素を含まない合金作製プロセス構築」では、3種類の添加剤との組合せによる脆化元素共析濃度の関係を実験的に明らかにした。いずれの条件下においても、溶質元素濃度が増加しても脆化元素である硫黄・塩素濃度が0.15 at.%以下になることが明らかになった。すなわち、溶質元素を添加した3元系合金においても、脆化元素除去のための添加剤により、延性発現可能な硫黄・塩素濃度が0.15 at.%以下の材料を作製可能であることが明らかになった。「過飽和固溶体作製のためのプロセス最適化」では、固溶量が多くなるプロセスが見つかりつつある。しかしながら、溶質元素の増加に伴い、表面の平滑性が失われる場合が多く、過飽和固溶体の作製が困難であった。そこで、添加によっても表面平滑性を失わない元素の探索を行った。その結果、Zrは過飽和に添加が可能であることが明らかになった。また、連携研究者の上杉が実施する、「第一原理計算による相互作用エネルギー算出の結果、表面平滑性と相関のあるパラメータについても見つかりつつある。今後は、その物理的意味について検討し、合金設計指針を明確にする予定である。平成28年度は「脆化元素を含まない合金作製プロセス構築」と「過飽和固溶体作製のためのプロセス最適化」の実施を予定していた。「脆化元素を含まない合金作製プロセス構築」では溶質元素を添加した3元系合金においても、脆化元素除去のための添加剤により、延性発現可能な硫黄・塩素濃度が0.15 at.%以下の材料を作製可能であることが明らかになり、目標を達成した。「過飽和固溶体作製のためのプロセス最適化」では、溶質元素の増加に伴い表面の平滑性が失われるという問題が生じ、当初予定していたMnの過飽和添加が困難となったが、新たに添加によっても表面平滑性を失わない元素を明らかにするとともに、「第一原理計算による相互作用エネルギー算出の結果、表面平滑性と相関のあるパラメータについても見つかりつつあり、おおむね目標を達成している。最初に、合金化による脆化元素である硫黄・塩素除去プロセスの構築を行った。様々な合金元素を含む電析アルミニウム合金を作製した結果、合金元素種によって試料中の硫黄・塩素濃度が変化することが明らかになった。その中でAl-Ga合金において、30%以上の延性を示す電析純Alと同程度の硫黄・塩素濃度を達成した。このAl-Ga合金は塑性変形能を示すものの、その伸びは3%程度であった。これは、Ga自体も粒界脆化元素であることに起因する。そこで、硫黄・塩素濃度が電析純Alと同程度となる最小のGa濃度を明らかにし、これをベースの合金とした。次に、合金化による固溶強化、結晶粒微細化を検討した。添加元素として、Mn、Fe、Zr、Cuを選択した。全ての合金のXRDパターンにおいて、Alのfccピークのみが見られ、析出物に起因するピークは見られなかった。電析浴中に新たに金属塩を添加することによって、硫黄・塩素量が増大することはなかった。いずれの試料においても、電析純Alと比較して、結晶粒径の微細化と硬度上昇が確認できた。また、曲げによる塑性変形が確認できた。そこで、バルク試料を作製し、引張試験を行った。引張試験の結果、Al-Cu、Al-Mn合金は350MPaを越える高強度を示したが、弾性変形領域で破断した。この理由として、表面形態に起因する粗大な欠陥が破断の起点となったことが考えられる。一方、Al-Zr合金は156 MPaの引張強度、20%の延性を示した。この合金の降伏強度と伸びは、非熱処理型商用Al合金の強度ー延性バランスにおける最高値と同等であり、これらの結果から、合金元素を多く含む商用Al合金と同等の強度・延性バランスに優れる電析Al合金の作製に成功した。

最初に、脆化元素である硫黄・塩素の除去プロセスを構築した。次に、第一原理計算により、結晶粒微細化および固溶強化元素としてCu、Fe、Mn、Zrを選択した。この中で、Cu、Mn、Zr添加合金においてバルク体が作製可能であった。引張試験の結果、Al-Zr合金は156 MPaの引張強度、20%の延性を示した。この降伏強度と伸びは、非熱処理型商用Al合金の強度ー延性バランスにおける最高値と同等であり、商用Al合金と同等の強度・延性バランスに優れる電析Al合金の作製に成功した。平成29年度は平成28年度の研究によって得られた知見をもとに、脆化元素を含まない過飽和固溶体合金の作製を行う。これまでに、延性を発現するための脆化元素除去、表面平滑性の維持については指針が得られている。また、過飽和に固溶可能であることも確認できている。平成29年度の課題は、固溶強化および結晶粒微細化に有効な元素であり、かつ表面平滑性を維持できる元素を新たに探索することである。第一原理計算によって得られた表面平滑性と相関のあるパラメータを参考に、新たな添加元素について検討する。これにより、素形材プロセスを経ない高強度・高延性電解析出バルクナノ結晶Al合金の創製を実現する。材料プロセス
色素細胞活性化におけるＶａｒｐの機能解析

メラニンは、有害な紫外線から細胞を守るために必要だが、一方でしみやそばかすの原因ともなり、皮膚に沈着するメラニン量を適切に制御することは生活の品質向上に不可欠である。メラニンは色素細胞のメラノソームと呼ばれるオルガネラ(脂質でできた袋)で合成・貯蔵され、このメラノソームが隣接する皮膚の細胞や毛母細胞に受け渡されることで、皮膚や髪が黒くなる。本研究では、Varpと呼ばれる分子が低分子量Gタンパク質の1つであるRab21を活性化し、色素細胞の突起形成を促すことで、メラノソームが受け渡しやすくなることを発見した。小胞輸送制御因子であるVarpについて、色素細胞におけるデンドライト伸長機構とメラニン合成酵素輸送機構に焦点を当て、その機能を解明することで、色素細胞の活性化機構の理解を目指している。本年度は、Varpにより活性化されるRab21について、デンドライト伸長における機能解析をより進め、メラニン合成酵素輸送機構との類似性と相違性について検討を行った。1.色素細胞のフォルスコリン刺激によるデンドライト伸長機構をまず解析した。(1)このデンドライト伸長活性にはフォルスコリンによるPKA活性化が関与すること、(2)そしてフォルスコリン刺激によりRab21が活性化されることが、Rab21エフェクターを用いたプルダウン実験により明らかになった。2.つぎに、Varpによって活性化されるRab21と、Varpに結合するRab32/Rab38について、それぞれの機能を解析した。(1) Rab21の機能を欠損した色素細胞では、フォルスコリン刺激によるデンドライト伸長が抑制されるのに対し、Rab32/Rab38の機能を欠損した色素細胞では、デンドライト伸長に異常は全く認められなかった。(2)一方で、VarpとRab32/Rab38による複合体はメラニン合成酵素輸送において重要な役割を果たすことがすでに明らかになっている。つまり、Rab32/Rab38の機能を欠損した色素細胞ではTyrp1などのメラニン合成酵素が消失するわけだが、Rab21の機能を欠損した色素細胞ではメラニン合成酵素の輸送に影響は認められなかった。(3)さらに、Rab21とRab32/Rab38の細胞内局在を検討したところ、それぞれが異なる小胞上に存在することが明らかになった。これらの結果、VarpによるRab21の活性化とVarp-Rab32/38による複合体形成が、それぞれ色素細胞のデンドライト伸長とメラニン合成酵素輸送という異なるステップを制御することが明らかになった。低分子量Gタンパク質Rabは真核生物に普遍的に保存された膜輸送(メンブレントラフィック)の制御因子であ。GEFにより活性化されたRabタンパク質は、エフェクター分子と相互作用することにより膜輸送を制御している。本研究では、メラニン合成酵素の膜輸送を正しく制御することで知られるRab32/Rab38とVarp(我々が新規に同定したRab32/Rab38エフェクター分子)にまず着目し、メラノソーム形成・成熟に関する詳細なメカニズム解明を第一の目的とした。Rab32/Rab38-Varp複合体のいずれかのコンポーネントを1つでも欠損させると、すでに明らかにしていたTyrp1輸送だけでなく、TyrosinaseやDCTといった三つすべてのメラニン合成酵素輸送に異常を来した。次にVarpの別の機能、すなわちRab21活性化能の色素細胞における生理機能の解明を第二の目的とした。すでにVarp欠損色素細胞において、フォルスコリン刺激によるデンドライト伸長が抑制されること、一方でVarpやRab21を過剰に発現させると、色素細胞のデンドライト伸長が亢進することを見出していた。そこで本年では、Rab21とVarpのヒエラルキーを明らかにすることを目的とした。活性化型Rab21をVarp欠損色素細胞に発現させたところ、デンドライトの伸長がレスキューされることを見出した。さらに、VarpのRab21活性化ドメインに点変異を導入した変異型VarpをVarp欠損色素細胞に発現させたところ、デンドライト伸長をレスキューできなかった。これらの結果は、VarpによるRab21の活性化が色素細胞のデンドライト伸長に必要であることが強く示唆するものである。GST-Rab21あるいはGST-Rab32といった組み換えタンパク質を調製し、Rab21、Rab32にそれぞれ特異的な抗体を作成した。これらの抗体を用いて、色素細胞のホモジネートからRab32陽性膜画分あるいはRab21陽性膜画分を精製したところ、Rab32陽性画分からはチロシナーゼやTyrp1などのメラニン合成酵素が、またRab21陽性画分からはEEA1などのエンドソームに局在するタンパク質が検出された。さらに、VarpはRab32陽性画分、Rab21陽性画分双方に存在することが見出された。

また、VarpにはRab21を活性化するVPS9ドメイン、Rab32/38のエフェクタードメインとして機能するANKR1のほかにも、SNARE分子の1つであるVAMP7が結合するVID(VAMP7-interaction domain)が存在し、VAMP7がVarpとともにメラニン合成酵素陽性Rab32/38小胞ならびにEEA1陽性Rab21小胞の双方に存在することを確認した。さらに興味深いことに、VAMP7を欠損した色素細胞ではVarp欠損色素細胞と同様、チロシナーゼ・Tyrp1といったメラニン合成酵素の輸送障害ならびに樹状突起伸長が抑制されることを見出した。細胞生物学Rab21の活性化能を欠失したVarp変異体を用いた解析から、VarpによるRab21の活性化が色素細胞のデンドライト伸長に必須であることを前年度に明らかにしていた。本年度は、デンドライト伸長においてPKA経路が関わり、そしてRab21が活性化されるなど、デンドライト伸長に関わる分子機構の一端を明らかにした。すでに、VarpとRab32/Rab38からなる複合体が、メラニン合成酵素の輸送過程に必須であることが明らかになっているが、興味深いことに、この複合体が色素細胞のデンドライト伸長には関与しないことを明らかにした。一方で、VarpによるRab21の活性化がデンドライト伸長を制御するものの、メラニン合成酵素の輸送過程には関与しないことを明らかにした。そして、Rab21とRab32/Rab38がそれぞれ異なる細胞内局在を示すことも明らかにした。このように、細胞内局在の異なるRab21とRab32/Rab38が機能的にも使い分けられていることが明らかになり、当初の予定通りの成果を出すことができていると考えられる。Varp欠損色素細胞においてTyrp1輸送に異常を認めることはすでに見出していたが、さらにTyrosinaseやDCTといった他のメラニン合成酵素の正しい膜輸送にもVarpが必要であるとの新しい知見が得られた。また、Varpのデンドライト伸長における生理機能については、当初の予定通りに進展している。Varp欠損色素細胞に活性化型Rab21を発現させたときに、Varp欠損によるデンドライト伸長の抑制がレスキューされたこと、そして、VarpのRab21活性化能欠損変異体を用いた解析から、VarpによるRab21の活性化が確かに色素細胞のデンドライト伸長に必須であることを明らかにすることができており、研究目的は順調に達成している。Rab21とRab32/Rab38といった異なるRabアイソフォームが、それぞれ色素細胞のデンドライト伸長とメラニン合成酵素輸送という異なるステップを制御する知見を確固たるものにするため、より様々な角度から検証する。Rab21を活性化できないVarp変異体はデンドライト伸長を促進しないことは分かっているが、この変異体がメラニン合成酵素輸送を制御できるのかどうかを解析する。一方で、Rab32/Rab38と結合できないVarp変異体はメラニン合成酵素輸送を促進しないことは分かっているが、この変異体がデンドライト伸長を制御できるのかどうかを解析する。これらの解析から得られる知見は、VarpによるRab21とRab32/Rab38の使い分けの分子機構解明につながるものと期待される。