hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
小中学校教員の指導観ギャップに着目した生徒指導マニュアルの作成と小中連携への効果

<研究の目的>本研究では小中学校教員の指導観についてのギャップを洗い出し,それを活用した生徒指導マニュアルを作成することで教育効果を上げることを目的としている。<研究の方法>以下の項目で小中学校管理職・教員にアンケート調査し,キーワードを抽出,コーディング分析して小中教職員の指導観ギャップを明らかにする。さらにその指導観ギャップを生かしたマニュアルを作成し関係者に配付し,指導の効果を上げる。・7月8月にかけて,中学校に勤務していて,その後管理職として小学校に勤務後46年を経過した教頭先生に,小中学校の指導観で大きく違いを感じるところを質問紙で調査した。全般的な視点と生徒指導の視点で,感じるところを忌憚なく記述していただいた<研究成果>記述してもらった内容を短文に区切り,コーディングを意識してエクセルの表に整理し,共通のキーワードをカウントした。全般的な視点では,「小中の組織の違い」生徒指導の視点では「対応の順序」として中学校は各教員⇒学年部・生徒指導担当⇒管理職,小学校は学級担任⇒管理職となっている点に大きな違いがあることが分かった。そうなる理由は「教科担任制と学級担任制の違い」「クラブ指導・給食指導の有無」などの制度上のものと,対象としての「子どもの発達段階による違い」によると考えられた。今後,この結果をふまえて効果的な資料(リーフレット)を作成する予定である。※参考資料;文部科学省「生徒指導提要」<研究の目的>本研究では小中学校教員の指導観についてのギャップを洗い出し,それを活用した生徒指導マニュアルを作成することで教育効果を上げることを目的としている。※参考資料;文部科学省「生徒指導提要」
量子論理回路の最適化に関する研究

量子コンピュータの物理的実現には、多くの困難が存在する。例えば、量子もつれ合いを保つことができる時間が短いことや、複雑な量子操作を行なうことが難しいこと等が挙げられる。これらの問題の解決において、量子回路のサイズは非常に重要である。本研究では、量子回路サイズの新たな評価方法について検討する。特に、C-NOTゲートに着目し、量子回路計算量とC-NOTゲート数の関係について、幾つかの定理を示した。現在、量子コンピュータの物理的実現について盛んに研究が行われているが、その実現には多くの困難が伴う。そのうちの一つとして、量子コンピュータは量子重ね合わせ状態という量子力学的にデリケートな状態を取ることが挙げられる。そのため、サイズの大きな量子コンピュータの複雑な量子重ね合わせ状態を長時間維持することは非常に困難となるそれに加えて、量子コンピュータは扱えるビット数が大きくなるほど実現が困難となる。すなわち、同じアルゴリズムを実行する場合、量子コンピュータにおいては、特に、時間計算量および領域計算量を縮小することが本質的に重要な問題となる。そこで、本研究では、量子回路のゲート数とビット数の関係についても考察した。具体的には、あるアルゴリズムを実行する量子回路に対して、それに補助量子ビットを付加し、回路を再構成することで、ゲートの総数をさらに縮小できるかどうかを検証した。我々は古典コンピュータを用いてアルゴリズムを実行するときに、計算時間の短縮のために、計算の途中で、その計算結果の一部をメモリの別の場所に一時的に保管することをよく行う。量子コンピュータの回路設計においても、補助量子ビットはそのようなワークビットとしてたびたび用いられるが、そこで使われる補助量子ビットは厳密に定義されているわけではない。本研究では、どのような種類の補助量子ビットにゲート数縮小の効果があるのかを検証するために、補助量子ビットの分類と定式化を行った。近年,NMRやイオントラップ,単一光子,量子ドットなどを用いて量子回路を物理的に実現し,量子計算機を構築しようという研究が盛んに行なわれている.なかでも,NMR(Nuclear Magnetic Resonance,核磁気共鳴)を用いた量子計算は,近い将来に実現可能であると考えられている.NMR法は,分子を構成する原子一つ一つを区別して見ることを可能にする方法で,現在,有機化合物の分子構造解析の分野で威力を発揮している.しかし,このようなNMR装置を用いて行NMR量子計算は,通常の量子計算とは若干異なり,Bulk量子計算と呼ばれる枠組みであるため,NMR量子計算の理論的基礎を与えるための研究も行われている.また,先行研究では,NMR量子計算が通常の量子計算よりも効率的である可能性が(計算モデルを用いずに)定性的に指摘されている.しかし,このような議論は,明確な計算モデル上で行わなければならない.なぜなら,例えば,NMR量子計算機が,出力値に対する無限の測定精度を持つと仮定すると,論理式の充足可能性判定問題(SAT)が多項式時間で解けるという非現実的な結果が導き出されてしまうからである.実際のNMR装置には,測定精度に関する厳しい制約があるため,NMR量子計算のアルゴリズムの効率について理論的に考察する際には,このような測定精度を十分考慮に入れる必要がある.そこで,今年度の本研究では,このようなNMR量子計算の枠組みを反映させたBulk量子計算モデルを提案し,その性質について考察した.具体的には,出力値の測定精度について厳密な制約を設けても,Bulk量子計算モデル上では,Groverのアルゴリズムの効率が改善できることを示した.この研究成果を応用すれば,将来的に,NMR量子計算を実行する素子数の少ない量子回路の設計も可能になるものと期待される.本研究の目的は,量子論理回路の量子ビット数と回路の段数をうまくバランスさせて削減し,最適な量子論理回路を自動設計するための基礎理論,および,その応用プログラムを開発することである.具体的には,(a)一般のブール関数を計算する量子論理回路の段数やサイズを最小化するための基本原理を確立し,(b)置換や乗算といった個別のブール演算を行う量子回路のサイズや段数の上界や下界の評価を行い,最適な量子論理回路の構造に関する知見を確立する.さらに,(c)それらの知見を応用して,与えられたブール関数を計算する最適な量子論理回路を自動生成するためのコンピュータ・プログラムを開発する.本年度は,特に,以下の研究を行った.我々はすでに,量子論理回路の深さ最小化問題を明確に定式化し,補助量子ビットを用いずに最適な量子論理回路を構成する方法と,その深さ最小化についての研究を行った.任意の積項を排他的論理和で結合したAND-EXOR論理式をESOP (Exclucive-or Sum Of Product)と呼び,また,論理関数fをESOPで表現したときに積項数が最小になるESOPを論理関数fの最小ESOPと呼ぶが,具体的には,論理関数fの最小ESOPが,f-C-NOT回路と呼ばれる形式のfを計算する回路の,深さ最小の量子論理回路を与えることを示した.しかし,この研究では,補助量子ビットを一切用いずに回路が構成されている.一方,補助量子ビットを用いることで,回路をさらに最小化しようとする試みもある.そこで,これら2つの手法を融合したヒューリスティックな最適化手法の開発を行った.また,置換や乗算のような,量子コンピュータを構成する際に,必須となるであろう基本演算について,最適な量子論理回路を設計した.すでに,我々は,任意の置換を定数深さで行える量子論理回路の設計について検討を始めてきており,ある程度の結果を得ている.

そこで,本年度は,その研究成果を応用して,量子乗算回路のさらなる小型化や,パーマネントなどの他の計算を行う量子回路の設計についても研究を進めた.量子計算機の物理的実装の実現には,多くの困難が存在する.例えば,量子もつれ合いを保つことができる時間が短いことや,複雑な量子操作を行なうことは難しい等である.これらの問題の解決のためにも,量子回路サイズは重要である.本研究では,量子回路サイズの優れた評価方法について検討する.特に,C-NOTゲートに着目し,量子回路計算量とC-NOTゲート数の関係について,幾つかの定理を示していく.現在、量子コンピュータの物理的実現について盛んに研究が行われているが、その実現には多くの困難が伴う.そのうちの一つとして、量子コンピュータは量子重ね合わせ状態という量子力学的にデリケートな状態をとる、ということが挙げられる。そのためサイズの大きい量子コンピュータの複雑な量子重ね合わせ状態を長時間維持することは非常に困難となるそれに加えて,量子コンピュータは扱えるビット数が大きくなるほど実現が困難であることが知られている.すなわち,同じアルゴリズムを実行する場合,量子コンピュータにおいては特に,時間計算量および領域計算量を縮小することが本質的に重要な問題となる.そこで、本研究では,量子回路のゲート数とビット数の関係についても考察する.具体的には,あるアルゴリズムを実行する量子回路に対して,それに補助量子ビットを付加し,回路を再構成することで,ゲートの総数をさらに縮小できるかどうかを検証する.我々は古典コンピュータを用いてアルゴリズムを実行するときに,計算時間の短縮のために計算の途中で,その計算結果の一部をメモリの別の場所に一時的に保管することをよく行う.量子コンピュータの回路設計においても,補助量子ビットはそのようなワークビットとしてたびたび用いられるが,そこで使われる補助量子ビットは厳密に定義されているわけではない.本研究ではどのような種類の補助量子ビットにゲート数縮小の効果があるのかを検証するために,補助量子ビットの分類,定式化を目指す.量子コンピュータの物理的実現には、多くの困難が存在する。例えば、量子もつれ合いを保つことができる時間が短いことや、複雑な量子操作を行なうことが難しいこと等が挙げられる。これらの問題の解決において、量子回路のサイズは非常に重要である。本研究では、量子回路サイズの新たな評価方法について検討する。特に、C-NOTゲートに着目し、量子回路計算量とC-NOTゲート数の関係について、幾つかの定理を示した。現在、量子コンピュータの物理的実現について盛んに研究が行われているが、その実現には多くの困難が伴う。そのうちの一つとして、量子コンピュータは量子重ね合わせ状態という量子力学的にデリケートな状態を取ることが挙げられる。そのため、サイズの大きな量子コンピュータの複雑な量子重ね合わせ状態を長時間維持することは非常に困難となるそれに加えて、量子コンピュータは扱えるビット数が大きくなるほど実現が困難となる。すなわち、同じアルゴリズムを実行する場合、量子コンピュータにおいては、特に、時間計算量および領域計算量を縮小することが本質的に重要な問題となる。
強相関分子性導体の階層的電荷・スピン・格子ダイナミクスの研究

本研究では,強相関電子系分子性導体に特徴的な電荷-スピン-格子自由度の複合的結合による“やわらかい強相関電子・格子系"で実現する新しい非線形電子誘電物性の創出,解明を目指した実験研究を行った.その結果,電子が配列秩序化した電荷秩序絶縁体状態(電荷固体),融解・液体化した良電気伝導状態(電荷液体)に加えて,電子が極めて遅い時間スケールのダイナミクスを有し,不均質に凍結した新しい電子状態(電荷ガラス)を,電荷秩序絶縁体転移(電子固体-液体転移)の近傍に発見した.平成25年度は,以下の項目について各分担者とともに本課題を実施し,各項目に示す結果・成果が得られた.[1]分子ダイマー系分子性導体の単結晶育成,周辺物質探索において新たなダイマーモット絶縁体・電荷秩序絶縁体物質(BPDT-TTF)2X系の合成に成功し,ダイマーモット状態と電荷秩序状態の相関を研究する対象物質を得ることができた.(分担者米山,橋本)[2]電荷秩序系有機物質(BEDT-TTF)2CsZn(SCN)4の電荷ガラス状態における特異な赤外光学応答の観測から,特有の電荷秩序パターンを有するガラス状態のコレクティブモーションを示唆する結果が得られた.このモードが現れるエネルギーは,他の電荷ダイナミクスが不安定・不均質なふるまいを示す物質群に共通にみられるため,ダイマーモット系に特有の電荷ガラスダイナミクスが存在することを示している.(分担者橋本)[3]1次元的な構造を有する(TTM-TTP)X系において,特徴的なTTM-TTP分子のフラグメント構造に起因する分子内電荷不均化による誘電異常を発見した.この誘電異常は分子内電荷自由度がスピン,格子の自由度と結合した結果生じる大きな分子内電荷ゆらぎの発達を起源とするものであることが分かった.(分担者井口)[4]複合的な電荷ー格子ースピン自由度の結合を非弾性中性子散乱により明らかにするために,電荷秩序系(BEDT-TTF)2CsZn(SCN)の試料準備,試料ホルダーの整備を行った.(分担者河村,松浦)また,1個の単結晶での中性子回折実験を海外熱中性子炉の利用により高精度に行うために海外研究機関との調整,試料準備を行い次年度に4軸回折実験を行う目途をつけることができた.これらの成果のうち[2]は論文で,他は口頭発表などで成果発表を行った.平成26年度は,以下の項目について各分担者とともに本課題を実施し,各項目に示す結果・成果が得られた.1.分子ダイマー系分子性導体の単結晶育成,周辺物質探索においてH25年度に見出した新たなダイマーモット絶縁体・電荷秩序絶縁体物質(BPDT-TTF)2X系の赤外分光,電気抵抗,磁化測定を行い,ダイマーモット状態と電荷秩序状態が競合する状態の特異性を明らかにした.(分担者米山,橋本)2. 1次元ダイマーモット絶縁体に高圧力を印加することでモット絶縁体状態から電荷秩序状態への変遷過程をダイアモンドアンビルセルを利用した放射光赤外分光実験により明らかにし,超伝導発現と電荷ゆらぎの相関に関する知見を得た.(分担者橋本)3. 1次元的な構造を有する(TTM-TTP)X系において,特徴的なTTM-TTP分子のフラグメント構造に起因する分子内電荷不均化による誘電異常を発見した.この誘電異常は分子内電荷自由度がスピン,格子の自由度と結合した結果生じる大きな分子内電荷ゆらぎの発達を起源とするものであることが分かった.(分担者井口)4.複合的な電荷ー格子ースピン自由度の結合を非弾性中性子散乱により明らかにするために,ダイマーモット絶縁体k-(BEDT-TTF)2Cu[N(CN)2]Clの中性子実験をフランスグルノーブルの大型中性子施設で行った.(分担者河村,松浦)これらの成果のうち[2]は論文投稿中,[3]は論文発表として,他は口頭発表などで成果発表を行った.本年度の主要な成果としては,圧力下超伝導を示す最も典型的な準2次元分子性ダイマーモット絶縁体β'-(BEDT-TTF)2ICl2における圧力印加下での光学伝導度測定による電子状態変化の知見から,超伝導発現近傍では電荷揺らぎがスピンゆらぎに加えて重要であることを示したことである.具体的には,ダイヤモンドアンビルセルを用いた10GPaまでの高圧力中での遠赤外-赤外領域の光学伝導度測定を大型放射光施設SPring-8の赤外物性ビームラインBL43IRで行い,圧力変化に対するハバード・ダイマーバンド間遷移による電子励起状態の変化を観測し電子相図に表すことで圧力印加が単にバンド幅の拡張のみではなくクーロン相互作用の変化も同時にもたらし,特に相対的なクーロン相互作用増強による電荷秩序とそのゆらぎがこの物質の圧力中超伝導発現と強い相関があることを明らかにした.また,電荷秩序絶縁体状態を示すθ-(BEDT-TTF)2TlZn(SCN)4において,金属絶縁体転移の近傍において抵抗の長時間緩和現象が出現し電荷がガラス的に凍結することが明らかになった.この長時間緩和過程において金属領域と絶縁体領域がマクロスコピックなスケールで共存・相分離していることが明らかになった.

このような電荷ゆらぎと動的な分子格子状態との結合を探るためにβ'-(BEDT-TTF)2ICl2およびκ-(BEDT-TTF)2Cu[N(CN)2]Clの非弾性中性子散乱実験をJ-PARCのアマテラスおよびフランスグルノーブルのILLビームラインで行った.特定フォノンモードのソフトニング現象は見出されていないが,光学伝導度での電荷ギャップの成長や反強磁性転移温度などに符合するフォノン強度の変化の観測に成功した.現在のところ,特徴的な電荷秩序状態を示す分子性導体において,低周波数誘電率,赤外光学伝導度測定またその空間マッピング測定などの実施により電荷ダイナミクスの時間的,空間的な出現についての知見が得られており,他の磁気的測定などとの相関から電荷-スピンの協力的振舞いについては実験的な理解が進んでいる.一方で,格子,フォノンとの相関については,中性子実験の制約から若干進展が遅れているが予備的データは揃い,その検証を行っている.これらのデータの解釈には理論的サポートが不可欠であるため理論家との情報交換を進めている.このような状況から本研究はおおむね順調に進展していると判断される.本年度の主要な成果としては,電荷秩序絶縁体状態を示すθ-(BEDT-TTF)2TlZn(SCN)4において,金属ー電荷秩序絶縁体転移の近傍において電気抵抗の長時間緩和現象を見出し,電荷が急冷下の準安定状態においてガラス的に凍結することを明らかにした.加えてこの電荷ガラス状態についてエックス線散乱解析,比熱,電気抵抗ノイズ,赤外反射分光などの多様な時間スケールを有するプローブによる実験観測を行い,電荷ガラス形成と結晶化過程の電荷ダイナミクスに関しての知見を得ることができた.この電荷ガラス状態については,理論考察から電子間クーロン相互作用による幾何学的なフラストレーションを起源とするものであり強相関電子系の特徴が表れた電荷のガラス化,また結晶絶縁体化過程を明らかにしたものとしての意義がある.このようなクーロン相互作用が働いている電荷自由度と電子スピンや分子格子との結合について探るために,β'-(BEDT-TTF)2ICl2およびκ-(BEDT-TTF)2Cu[N(CN)2]Clの中性子散乱実験をJ-PARCおよびドイツガーヒングのFRM-IIにおいて行った.この2つの反強磁性ダイマーモット絶縁体状態を基底状態とする電荷移動錯体は,長距離秩序化前の低温で低周波数誘電率の異常として観測される電荷ゆらぎを示す.この電荷またスピンゆらぎと結合した格子系に特徴的なフォノンモードの検出とソフトニング現象の観測を試みた.その結果,電荷ギャップの成長や反強磁性転移温度などに符合する特定フォノンの強度の変化が観測された.このような変化は電荷-スピン-格子が協力的に結合して物性変化をもたらし,それぞれのゆらぎは複合していることを表していることを示唆している.現在詳細なデータ解析を進めている.本研究では,強相関電子系分子性導体に特徴的な電荷-スピン-格子自由度の複合的結合による“やわらかい強相関電子・格子系"で実現する新しい非線形電子誘電物性の創出,解明を目指した実験研究を行った.
農産施設内の空中浮遊菌の殺菌に関する研究

本研究は、農産施設内の空中浮遊菌の調査および殺菌を目的としたものである。はじめに、農産施設空間内の浮遊微粒子の粒子数や空中浮遊菌濃度を計測し評価した。次に、電気集じん装置は、種々の湿度の条件下で空中の微生物を集菌できることを示した。また光触媒溶液は、紫外線(UV-A)照射下で溶液内の生菌数を検出限界値以下まで減少できることを明らかとした。本研究では、上記した集菌・殺菌法を実際の農産施設内に応用することで、施設内の空中浮遊菌の集菌・殺菌を可能とした。平成25年度は、青果物貯蔵施設内の空中浮遊菌をエアサンプラーで収集し、得られた菌(カビ)を継代培養し、菌株の28S rRNA(カビ)遺伝子配列を増幅させ、direct sequencingにより塩基配列を決定後、同定した。その結果、リンゴ貯蔵庫内のカビのフローラはPenicillium rugulosum, Penicillium sp., Cladosporium cladosporioides, Fusarium sp.がメインであった。リンゴ貯蔵において問題となるパツリンを産生するP. expansumは検出されなかったが、本実験で同定された菌株はカビ毒を生産するものもあり、また喘息などのアレルギーあるいは真菌症の原因となる菌株もある。併せて、浮遊真菌濃度は屋内環境としては高く、公衆衛生学的観点から農産施設内の空中浮遊菌の殺菌(捕集)の必要性が示された。更に平成25年度は、静電気力により気体中の浮遊粒子を捕集する電気集じん法に着目した。本研究では、電気集じん装置を作製し、空気と混合したドライイースト粉末(Saccharomyces cerevisia)を空中浮遊菌のモデル材料として用い、種々の相対湿度条件下での装置の微生物捕集能力を測定した。併せて、放電極への印加電圧極性を変化させた場合の微生物捕集能力も測定した。その結果、電気集じん装置は、高湿度および低湿度環境の両方において空気中の微生物を捕集できた。印加電圧極性については、正極性高電圧より負極性高電圧のほうが微生物の捕集に適することが示された。以上、本研究では空中浮遊菌の殺菌(捕集)法に関して、昨年度開発した水中殺菌装置(浮遊菌を混入した空気を水中にて光触媒とUVライトで殺菌)に加えて新たな手法(電気集じん法)を得た。得られた知見は、農産施設内の空中浮遊菌の殺菌に資する知見を与えるものである。平成24年度は、実際の青果物貯蔵施設を用い、収穫前から貯蔵にかけて施設空間内の浮遊微粒子の粒径分布や粒子数、および空中浮遊菌濃度の定点観測を行った。その結果、浮遊微粒子の粒径分布は、エアロゾルの粒径分布を表す際に一般的に用いられているJunge則で良く近似できた。また、粒径10ミクロン未満の浮遊粒子量について公衆衛生学的観点からリスク評価したところ、問題となる課題は見つからなかった。また、浮遊微粒子数の季節変動は小さいことが示された。一方、浮遊微生物(真菌)濃度は、季節変動が認められ、農産物の収穫期は微生物数が多く、真冬(施設周辺は根雪)では少ない傾向を示した。得られた真菌濃度をリスク評価した結果、欧州の屋内真菌濃度の規格の範囲内であったが、農産物収穫期の施設空間内の真菌数の増加については留意する必要があることが示された。更に、本年度は実験室レベルでの水中殺菌装置(密閉空間内で浮遊菌を混入した空気を、光触媒を入れた水中にてトラップしUVライト殺菌するための予備試験装置)を作成し、Escherichia coliおよびBacillus subtilisを供試菌として、その殺菌基礎特性を評価した。その結果、供試菌は処理時間とともに指数関数的に殺菌された。また、水中殺菌後も生存した供試菌は、コントロール区(殺菌処理をしていない区)と比べ、コロニー形成速度が遅く、損傷菌を多く含むことが示された。この損傷菌に対して修正ゴンペルツ式を用いてコロニー形成速度とコロニー出現数との関係を近似したところ、測定値を良く表現できた。以上、本研究は青果物貯蔵施設内の空中浮遊微粒子や空中浮遊菌濃度の季節変動の一例を示すことができ、またその空中浮遊菌の殺菌法についても検討・測定したもので、実際の農産施設内の空中浮遊菌の殺菌に資するデータを与えるものである。平成26年度は、農産施設内の空中浮遊菌の殺菌に、本研究で開発したラボスケールの電気集じん技術および水中殺菌技術(浮遊菌混入空気を水中にトラップさせ光触媒とUVライトで殺菌)が適応できるか、実機試験を行った。具体的には、電気集じん装置、水中殺菌装置および空気吸引装置を農産施設内にタンデム配置し、それをバイオエアロゾルリッチな環境下で稼働させ、電気集じんによる粒子捕集率や空中浮遊菌捕集率、併せて水中殺菌処理による殺菌効率を計測した。

その結果、電気集じん処理は流入空気内のほとんどの浮遊粒子を除去でき、空中浮遊菌も大きく減少させた。また光触媒を用いた水中殺菌処理は、流入空気内の浮遊菌濃度を検出限界値以下まで殺菌した。併せて平成26年度は、紫外線照射(UVC)とカビ胞子の不活性化との関係を測定・検討した。Aspergillusnigar胞子を用い、その不活性化に要する積算紫外線照射量の水分活性依存性を測定するとともに、胞子が接種されたリンゴをモデル農産物として、その病斑形成を抑制する紫外線照射エネルギを計測した。その結果、カビ胞子の不活性化に要する紫外線照射エネルギは水分活性に影響されないこと、また1平方cmあたり1.62 Jの紫外線を照射すればリンゴ表面のカビ胞子由来の病斑形成を完全に抑制できることが明らかとなった。すなわち、農産施設内の農産物表面を極めて短い時間紫外線照射すれば、農産物のカビ腐敗・汚染を水分活性の高低に関わらず抑制でき、よって農産物由来の空中浮遊菌の発生・増加を防止できることを示した。以上、本研究では農産施設内の浮遊菌の濃度と公衆衛生学的評価を行うとともに、バイオエアロゾルリッチな施設内空気の殺菌を目的として新たに電気集じん技術や水中殺菌技術を開発した。これら殺菌技術は、今後ポストハーベスト空間での実用化が大いに期待できる。ポストハーベスト工学本研究は最終的に、1「農産施設内の空中浮遊菌濃度の調査および同定とリスク評価」と、2「電気集じん技術・水中殺菌技術を併用した空中浮遊菌の殺菌」、3「現場に適応可能な空中浮遊菌の殺菌技術の提案と、リスク評価から農産施設内における食品の安全性向上や労働環境改善に資する情報の提案」を行うことを目標としている。研究実績の概要に記したように、本研究は現時点で、上述した目標に向かって大きく前進していると判断する。青果物貯蔵施設内の空中浮遊粒子や空中浮遊菌濃度の季節変動が明らかとなり、また水中殺菌技術を用いた農産施設内における空中浮遊菌の殺菌に関しても、基礎データの修得が終わり、実際の農産施設内での測定についての実験を計画中である。また、字数の関係で割愛したが、青果物貯蔵施設内の風向・風速分布予測も、ある程度予測可能な状況にあり、食品の安全性向上や労働環境改善にも資する情報が得られた。来年度は、電気集じん技術・水中殺菌技術を用いて、農産施設内の空中浮遊菌の殺菌について試みる。また、新しい殺菌手法として紫外線殺菌によるカビ胞子の殺菌特性について測定するとともに、紫外線殺菌による農産物市場病の抑制効果についても検討する予定である。以上、得られた結果を取りまとめ、空中浮遊菌の効率的な殺菌技術や農産施設の空間内の新たな衛生管理手法を提案し、学会等で発表を行う。貯蔵施設内の空中浮遊菌(カビ)濃度の属種を把握するとともに、そのフローラの変遷を把握することにより、食品安全・公衆衛生の観点から、より精度の高いリスク評価を行うことができる。よって今後は集菌された真菌(カビ)についてその同定を試みる予定である。また電気集じん装置を用い、供試菌を浮遊させ電気集じん処理後の菌数を評価することにより、農産施設内における空中浮遊菌の殺菌に資する基礎的知見を収集を試みる。このことより、電気集じん技術と24年度に基礎的知見が得られた水中殺菌技術を併用させ、農産施設内でも実現可能となる空中浮遊菌の殺菌法に関して、スケールアップをかんがみた開発研究を推進させる。該当なし
脳波(Fmθ波)バイオフィードバックによる集中力トレーニング法の開発

本研究は、Fmθ波を利用してバイオフィードバックトレーニングを行い、集中力向上のためのトレーニングの開発が可能であるかどうかを検討することを目的とした。また、Fmθ波の他に、SPN(stimulus-preceding negativity)と呼ばれる緩電位成分も同時に測定し、緩電位成分と集中力との関係も合わせて検討した。用いた課題は時間評価課題であり、被験者の前1.5mに置かれたLED指定された秒数が経過したと思ったならば右手人差し指でボタンを押すように指示した。ボタン押しから3秒後にフィードバック情報を与えた。Fmθ波の出現しやすい状況を作るため、試行は、36試行×2セットを1ブロックとし、10分の休憩をはさんで合計4ブロック行った。その結果、11名の被験者のうち、4名からFmθ波と思われる成分が観察できた。しかしながら、フィードバックによるFmθ波の増大やパフォーマンスの改善は見られなかった。緩電位成分であるSPNを観察したところ、全ての被験者に置いてフィードバック刺激前に顕著なSPNが観察された。またSPNは、エラーの次の試行や報酬が与えられる試行においては、SPNの値が有意に増大した。エラーの次の試行や報酬が与えられる試行は、被験者の集中力画像出していると考えられ、Fmθ波よりもSPNを用いたバイオフィードバックシステムの構築の有効性が指摘された。脳波の中でも前頭部より導出されるFmθ波を利用して集中力トレーニング法の開発をこころみた。本年度に関しては、Fmθ波導出のための基本的な研究を行うために、どのようなときにFmθ波が測定できるか、について主に調べた。被験者は、成人男性12名を用いた。全員Edinbergの聞き手テストでは、右利きと評価された。各被験者とも、頭部の外傷、手術とうの経験はなく健常者であった。脳波測定脳波、国際式10-20法に従い、F3,F4,C3,C4,P3,P4の6カ所に装着した。用いた電極は、Ag-AgCl電極であり、電極の抵抗が3キロオーム以下になるように装着した。用いた実験課題は、時間評価課題を用いた。時間評価課題では、光刺激の後に一定時間(6、8、10秒のいずれか)が経過したと思ったならば右手人差し指でボタンを押すよう被験者に求められた。ボタン押しの後、3秒後に時間評価についてのフィードバック情報を与えた。この試行を72試行を2回、合計140試行行った。脳波は、視察的にFmθ波の出現を観察するとともに、加算平均を行い、フィードバック刺激に対する刺激先行陰性電位(SPN)を測定し、被験者の課題に対する集中度の指標とした。その結果、12名のうち典型的なFmθ波が観察された被験者は、4名であった。また、それらの被験者は、比較的SPNの振幅が大きくなる傾向にあったが、有意な差は示さなかった。以上のことより、Fmθ波は、これまでの研究通り個人差による影響が大きいことが示された。今後は、典型的なFmθ波のみに対象を絞る以外に、前頭部より導出したθ帯域の脳波を単純にFmθ彼とするなどの定義を用い、よりバイオフィードバックに用いやすい条件を設定するなどの必要性が示唆された。
化石系芳香族炭素資源からヘテロ原子を含む特異な構造を有する新規芳香族化合物の合成

【1!_】.ベンゾシクロプロペンから13段階で橋かけ〔9〕チアアヌレンを合成した。【^1H】-,【^(13)C】-NMR,UVスペクトルの温度変化より、この化合物は主として三環性のプロペラン型として存在するが、30°Cでは16%アヌレン型として存在し、後者は芳香族性をもつことが示された。【2!_】.ベンゾシクロプロペンよりシクロヘプタトリエン骨格をもついくつかのクラウン型化合物(【A!】)を合成し、金属イオン取込み能を測定したが、【Ag^+】を取込むものの、相当するベンゾ体よりも取込み能が低下していることがわかった。さらに、【A!】からトロピリウムイオンを含むクラウン型化合物を合成することができた。【3!_】.かさ高いArLi (Ar=2,4,6-トリ-t-ブチルフェニル)とチオギ酸O-エチルから安定なチオベンズアルデヒドが合成でき、200°Cでの加熱、光照射により定量的にベンゾチアン誘導体に環化した。【Me_2】CCNとの反応でも同じ環化体が得られたが、t-【C_4】【H_9】とはスピン捕捉体も得られることがわかり、スピン捕捉剤となる可能性が示された。【4!_】.ArLiから合成される立体保護による安定化されたジホスフェン(【B!】)(Ar-P=P-Ar′)は硫黄との反応により、すいた方のリン原子が硫化され、得られた硫化物は光または熱により定量的に三員環化合物チアジホスフィランを与えた。【B!】(Ar′=メシチル)は(THF)M【(CO)_5】〔M=Cr,【M_o】,W〕とはメシチル側のP上にM【(CO)_5】が配位した錯体を与えた。ArP(Li)Si-【Me_2】-t-Bu(【C!】)とベンズアルデヒドの反応で安定なE-ArP=CHPhが合成できたが、光照射によりZ-体と光平衡になり、この両異性体は容易に分離できることがわかった。両異性体は、それぞれP上でのM【(CO)_5】配位錯体を与え、E-体の硫化では、P-スルフィドを経由して、硫黄が2原子関与した三員環化合物チアホスフィランスルフィドを与えることがわかった。しかし、【C!】はベンゾフェノンとは予想される化合物Ar-P=C【Ph_2】を与えなかった。
LDA+U法などLDAを越える方法を用いた遷移金属酸化物の研究

遷移金属酸化物などいわゆる強相関電子系では、密度汎関数を超えた電子間相互作用の取り扱いが必要である。本研究では(1)LDA+U法による取り扱い、(2)GW近似による取り扱い、を行った。また(3)動的平均場近似による予備的な計算、を試みた。さらに、大きな系において密度汎関数理論の枠内で第一原理分子動力学を実行するために、オーダーN法のアルゴリズムを開発した。一方,Ni, Feなどのバンドの交換分裂はLDAの結果からほとんど変化しない。これは、交換分裂には梯子ダイアグラムの寄与が必要だが、他は電子正孔の対生成消滅ダイアグラムからの寄与で大きな改善が得られるためである。一方、MnO, NiOについては無摂動状態の波動関数をよりよいものにする必要が示された。現在検討中である。(3)オーダーN法については、絶縁体のワニエ関数を反復的に構成し、これをもとにMauri, Galli等と同じアルゴリズムで分子動力学を実行した。ワニエ関数から、変分および摂動により波動関数を構成するため計算負荷が少なく、現在100万原子の系で計算が可能になっている。Si(100)面の亀裂伝播を実行し、亀裂により発生した面に非対称ダイマーが構成されるプロセスを見出した。現在検討中である。今年度の重点的な研究は以下のとおりである。(1)Nd{1-x}Sr{x}MnO{3} (x1/2)近傍ではCE-type反強磁性絶縁体、A-type反強磁性金属、強磁性金属といった様々な軌道およびスピン秩序を示す。これをLDA+U法により調べた。実験的に見い出された結晶構造を仮定しいくつかの磁気構造を調べたが、いずれも実験的に見い出された磁気構造および金属・非金属状態が基底状態であることを確認した。その結果にもとずいて結晶のa,b,c軸長比と秩序構造の関連を議論した。(2)La{7/8}Sr{1/8}MnO{3}の強磁性絶縁相をLDA+U法に基づき議論した。その結果、この物質が強磁性絶縁性(エネルギーギャップはほとんどゼロ)を示すことを確認した。さらに長距離の軌道整列とホールが面内にストライプ構造をとることを見い出した。この物質の強磁性はMnのe_g軌道が縮退していることが本質的であるし、またそのために2次元的な異方性がある。(3)現実的な物質に対して、動的平均場近似により電荷密度の揺らぎを取り込むことを検討した。遷移金属酸化物などいわゆる強相関電子系といわれる物質系では、密度汎関数理論を超えた取り扱いが要求される。本年は(1)LDA+U法による取り扱い、(2)GW近似による取り扱い、(3)動的平均場近似と密度汎関数理論の結合、の3つを行った。La_<7/8>Sr_<1/8>MnO_3においては、2a×b×cの超格子単位胞が形成され、そこに正孔が導入されたことによる特徴的な電荷整列、軌道整列を見出した。正孔は1つのac面上でa方向に広がるストライプを形成している。YNiO_3ではNi^<2+>,Ni^<4+>の電荷秩序があらわれる。これはYの大きな原子半径が原因である。一方、NdNiO_3ではNi^<3+>となり電荷秩序、軌道秩序はない。また軌道秩序がないことから磁気整列のタイプも決めることができる。(2)ではGW近似のプログラムを整備し、応用範囲の拡大を目指している。(3)では、強相関系における金属-絶縁体転移を、物質に即して定量的に議論することを目的とし、その準備をすすめた。密度汎関数理論における局所密度近似(LDA)を越える方法として、LDA+U法およびGW近似についてプログラムコードを完成した。またLDAの枠内で大きな系を対象として第一原分子動力学およびそのオーダーNアルゴリズムを構成した。以下具体的な研究対象とした系を箇条書きにする。LDA+U法:種々の遷移金属酸化物系の軌道・スピン・電荷秩序を調べた。(1)Mn

ペロブスカイト系Nd_<1-x> Sr_x MnO_3における軌道およびスピン秩序(2)Mnペロブスカイト系La_<7/8> Sr_1 1/8MnO_3における軌道秩序とホールストライプ秩序(3)Niペロブスカイト系NaNiOおよびYNiOにおけるスピンおよび電荷秩序GW法GW法:GW法の計算効率を向上させる種々の方法を開発し、以下の物質系に応用した。MnO, NiOなど反強磁性遷移金属酸化物において従来からGW近似が良い結果を与えないといわれているが、その原因を明らかにした。(1)Siなど半導体(3)MgO, CaOなどの酸化物絶縁体よびTiO, VOなどの酸化物金属第一原理分子動力学法:(1)NaSnの金属-半導体転移とイオンダイナミックス(2)Si中の転移と塑性オーダーN法:オーダーN法の新しいアルゴリズムを構成した。(1)半導体中のワニエ状態とオーダーNアルゴリズム(2)Siにおける亀裂伝播
シリコン表面の原子レベルでの平坦化に関する電気化学的手法を用いた研究

化学的脱酸素剤である亜硫酸塩を低濃度添加した水にSi(111)面を浸し、表面原子構造への影響を調べた。その結果、室温の溶液においてSi (111)面が極めて容易に平坦化することを見出した。例えば、室温の0.05M亜硫酸アンモニウム水溶液で20分間処理を行った後のSi(111)表面は原子レベルで平坦化され、MIII観察により明瞭なテラスとステップ構造が見られた。水によるSi(111)の溶解あるいは表面平坦化は従来ほとんど知られていなかった現象である。そこで、その詳細を調べるために室温の0.05M亜硫酸アンモニウム水溶液中でのSi (111)面のAFM測定を行い、溶解過程のその場観察に初めて成功した。また、その観測結果から、溶解はおもにステップエッジ部分から進行すること、また、室温におけるステップの後退速度が約8nm/minであることを見出した。フッ化アンモニウム水溶液はSl(111)面の平坦化のみならず、シリコンの処理行程において頻繁に用いられる。水溶液中において、溶存酸素が平坦化に大きな影響を及ぼすことが見出されたことから、フッ化アンモニウム水溶液中の溶存酸素がSi(111)面の平坦化に及ぼす効果を調べた。その結果、亜硫酸アンモニウムを添加して溶存酸素を除去した系では、溶存酸素を含む溶液と比べて平坦化に要する時間が著しく短縮されることがわかった。また、現れるステップの形状にも溶存酸素が影響を与えることを見出した。これらの影響は、溶存酸素が主にSi(111)面のステップ部分に吸着してその部分での溶解を阻害するために起こると考えられる。電気化学測定からもこのことをを支持する結果が得られた。1.水によるシリコン(111)面の原子レベルでの平坦化完全に酸素を除いた純水によって、シリコン(111)面が原子レベルで平坦化されることは従来より知られていた。しかし、酸素の完全な除去は容易ではなく、この方法のデバイス作製への応用や、表面観察の研究に応用することに限界があった。我々は、水中の酸素を除くために、脱酸素剤として亜硫酸塩を用いることを検討した。その結果、亜硫酸塩の存在は表面平坦化に悪影響を与えずに、有効に溶存酸素を除去することができ、極めて簡便に表面平坦化が達成できることを見出した。Si表面の原子レベルでの平坦化過程を直接観測するために、亜硫酸イオンを添加した溶液中での原子間力顕微鏡測定を試み、水中における原子レベルで平坦化されたSi(111)面およびステップの後退過程を初めて観測することに成功した。2・シリコン(111)面の平坦化過程の電気化学的追跡フッ化物イオン(一部はフッ化水素としてして存在)を含む水溶液中では、純水中と比べて極めて速い速度で、n型シリコン(111)面の平坦化が進行する。この過程をn型シリコン電極の電気化学特性から検討した。0.0V(Ag/AgCl)の電位より正の電位で定常的なアノード電流を生じるが、この電流はシリコンの溶解、および平坦化と密接に結びついていると考えられる。この電流値を種々の条件下で測定すると、溶液中に酸素が存在すると電流値が低下することが見出された。このことから、溶液中の酸素はシリコンを酸化することによって平坦化過程を阻害するのではなく、フッ化物(フッ酸)さらには水による平坦化そのものを阻害する作用を持っていることが示唆された。
多巣性ニューロパチーの伝導ブロックと抗GM1抗体の生理作用に関する研究

多巣性運動ニューロパチー(Multifocal Motor Neuropathy ; MMN)は、筋萎縮性側索硬化症(ALS)と類似した筋萎縮と筋線維束攣縮を示す疾患であるが、大量ガンマグロブリン静注法で治療が可能であり、その診断には伝導ブロックの証明が重要である。MMNでは運動神経に較べて知覚神経はブロックを受けにくいことが知られている。その病理像として局所性の脱髄が示されているが、なぜ伝導ブロックが運動神経に選択的におこるかについては明らかになっていない。従来伝導ブロックは脱髄による髄鞘の破壊による活動電流の散逸が原因と考えられてきた。我々は、研究分担者のHugh Bostock教授とともにヒト末梢神経の軸索機能の非侵襲的な検査法を開発し(業績2、3)、軸索のイオンチャネルや興奮性の異常によっても伝導ブロックが生ずることを明らかにした。とくにMMNにおいて著明な筋疲労現象がおこることを見出し、その機序がNa-Kポンプの活性化による軸索膜の過分極であることをはじめてあきらかにした(業績4)。これは末梢神経疾患で筋疲労がおきることを示した最初の研究となった。また、この膜の過分極がMMNの病巣周辺部で持続的に存在することを示し、1.MMNでは病巣の中心部で膜の脱分極性伝導ブロックが存在する、2.この脱分極と過分極の境界部位で筋線維束攣縮が生じうる、3.知覚神経線維では、Na-Kポンプ活性が元来高いため、この脱分極性伝導ブロックをおこしにくいことが推測された(業績5、6)。この一連の研究によりMMNの病態生理がほぼ完全に明らかにされた。また、抗GM1抗体の関与は本病態を来たすためには必ずしも必須ではないことが示唆された。多巣性運動ニューロパチー(MMN)は筋萎縮性側索硬化症(ALS)に似た筋萎縮を示しながら、大量ガンマグロブリン静注療法で治療が可能な病態でその特徴として電気生理学的に伝導ブロックをともない、しばしば、神経軸索に存在するガングリオシドであるGM1にたいする抗体の上昇を伴う。本年度は多巣性運動ニューロパチー患者において筋疲労現象が少なからずみられること、またそれが起こる機序が頻度依存性伝導ブロックであることを世界ではじめてヒトで証明した(業績3)。また、坑GM1抗体の作用機序の解明のための方法論の確立として、閾値電気緊張法(TE法)の動物モデルを開発した(業績1)。これにより、坑体などの液性因子が末梢神経軸索イオンチャネルにどのような生理学的な作用を及ぼすかが解明可能になった。臨床的な業績として、伝導ブロックを示さないが、坑ガングリオシド抗体の上昇を伴い大量ガンマグロブリン静注療法で治療が可能な病態(chronic motor axonal neuropathy;CMAN)を報告した。これは従来筋萎縮症として治療はされなかった例であり、今後同様の患者を治療していくうえで重要な報告といえる。とくに、従来平山病として、免疫学的な治療法をうける機会がなかったような例でも大量ガンマグロブリン静注療法で治療出来た例があり、いわゆる「平山病」のなかにも、治療可能な例があると考えられる。また、平山病で特徴的な寒冷麻痺は、CMANにおいて脱分極性の伝導ブロックを想定すると説明がつくことも判明した。多巣性運動ニューロパチー(Multifocal Motor Neuropathy ; MMN)は、筋萎縮性側索硬化症(ALS)と類似した筋萎縮と節線維束攣縮を示す疾患であるが、大量ガンマグロブリン静注法で治療が可能であり、その診断には伝導ブロックの証明が重要である。

その病理像として局所性の脱髄が示されているが、なぜ伝導ブロックが運動神経に選択的におこるかについては明らかになっていない。従来伝導ブロックは脱髄による髄鞘の破壊による活動電流の散逸が原因と考えられてきた。我々は、研究分担者のHugh Bostock教授とともにヒト末梢神経の軸索機能の非侵襲的な検査法を開発し(業績2、3)、軸索のイオンチャネルや興奮性の異常によっても伝導ブロックが生ずることを明らかにした。とくにMMNにおいて著明な筋疲労現象がおこることを見い出し、その機序がNa-Kポンプの活性化による軸索膜の過分極であることをはじめてあきらかにした(業績4)。これは末梢神経疾患で筋疲労がおきることを示した最初の研究となった。また、この膜の過分極がMMNの病巣周辺部で持続的に存在することを示し、1.MMNでは病巣の中心部で膜の脱分極性伝導ブロックが存在する、2.この脱分極と過分極の境界部位で筋線維束攣縮が生じうる、3.知覚神経線維では、Na-Kポンプ活性が元来高いため、この脱分極性伝導ブロックをおこしにくいことが推測された(業績5、6)。この一連の研究によりMMNの病態生理がほぼ完全に明らかにされた。また、抗GM1抗体の関与は本病態を来たすためには必ずしも必須ではないことが示唆された。
Ｓ－ニトロシル化の可視化を目指した蛍光タンパク質の改変

一酸化窒素(Nitric Oxide:NO)が生理活性を示すための機序であるS-ニトロシル化修飾(SNO化)が生じる経過を解析可能にすることを目的として,SNO化修飾に反応して蛍光強度が増強する緑色蛍光蛋白質(GFP)の改変をおこなった.野生型GFPにSNO化修飾を受けるシステインを導入し,さらにアミノ酸置換を無作為に行なったクローンを多数作成したところ,SNO化処理に伴い蛍光強度が迅速に変化する変異体が得られた.遺伝子配列の解析から,感受性はSH基のpKa変化よりも立体構造に依存している事が示唆され,SNO化修飾の生成・特異性を規定する機序に新たな視点を与えることにもなった.一酸化窒素(Nitric Oxide : NO)が生理活性を示す機序であるS-ニトロシル化反応(SNO化)が細胞内で生じる過程を,時空間的に解析可能とするリアルタイムイメージング手法を開発することを目的として,SNO化に反応して蛍光強度が変化する緑色蛍光蛋白質(GFP)の開発をおこなった.SNO化修飾はシステインSH基に対して起きるタンパク質の翻訳後修飾であるが,対象となるシステイン周囲を取り囲むアミノ酸によりSNO化モチーフが形成されることが特異的なSNO化をもたらす重要な因子であると考えられてきた.そこで,まずGFPのアミノ酸222番近傍にSNO化モチーフを形成する様にアミノ酸変異を導入し,SNO化に伴う蛍光強度の変化を検討した.SNO化処理に対する反応は認められたが,蛍光強度の変化としてとらえられる程度は小さく,効率的なSNO化測定を行なうためには不十分であった.平成25年度は継続して,GFPの205番にシステインを導入し,立体構造上近傍に位置する部位にランダム変異を導入し得られたクローンをSNO化処理に対する蛍光強度変化を指標としてスクリーニングを行ない,前年度得られたクローンも含めアミノ酸変異の場所とSNO感受性の増大をタンパク質立体構造上での位置関係を考慮して検討をおこなった.この結果,システイン近傍のアミノ酸に変異が導入されSNO感受性が亢進する場合よりも,Cys205からやや離れた部位に変異が導入された結果,GFPのバレル構造にゆがみが生じSNO感受性が大きく変化した場合が多く認められた.すなわち,Cys205近傍の構造的な変化がSNO化修飾反応に対する反応性を強く規定することが示唆された.これらの結果より,従来考えられてきたシステインpKaを変化させるアミノ酸モチーフ以上にシステイン周囲の構造的な要因が強く働くことが明らかになり,SNO化修飾が特異的に生じる機序に新たな視点が与えられ,シグナル伝達におけるSNO化修飾の生理的重要性を示す事にもつながった.一酸化窒素(Nitric Oxide:NO)が生理活性を示すための機序であるS-ニトロシル化修飾(SNO化)が生じる経過を解析可能にすることを目的として,SNO化修飾に反応して蛍光強度が増強する緑色蛍光蛋白質(GFP)の改変をおこなった.野生型GFPにSNO化修飾を受けるシステインを導入し,さらにアミノ酸置換を無作為に行なったクローンを多数作成したところ,SNO化処理に伴い蛍光強度が迅速に変化する変異体が得られた.遺伝子配列の解析から,感受性はSH基のpKa変化よりも立体構造に依存している事が示唆され,SNO化修飾の生成・特異性を規定する機序に新たな視点を与えることにもなった.一酸化窒素(Nitric Oxide : NO)が生理活性を示す機序であるS-ニトロシル化反応(SNO化)が細胞内で生じる過程を,時空間的に解析可能とするリアルタイムイメージング手法を開発することを目的として,研究を開始した.具体的には,SNO化に反応して蛍光強度が変化する緑色蛍光蛋白質(GFP)を開発することを目標としている.まず,野生型では蛍光を示さないGFPのアミノ酸222番近傍にSNO化モチーフを導入することにより,SNO化により蛍光を発する様になるか検討をおこなった.理論的に考えられた3通りのSNO化モチーフを作製しSNO化感受性について検討をおこなった.反応性を示すものの,その程度は小さく,効率的なSNO化測定を行なうためにはいずれも不十分であることがわかった.次に,SNO化モチーフのうちシステインのみを導入したプラスミドに対して,導入範囲を限ってランダム変異導入によりアミノ酸置換を行なった.このプラスミドをもちいて大腸菌を形質転換し,蛍光強度の低いものを中心に約10,000個のコロニーを選択し,96-wellプレートに整理した.SNO化処理を施した際の蛍光強度の増大を指標にして,感受性を示すものを選択した.さらに,それぞれのサンプルをクローン化したのち,SNO感受性を示すクローンからプラスミドを抽出し,GFPの遺伝子配列を解析し導入された遺伝子変異の確認を行なった.この結果,30種類程度のSNO感受性を引き起こす遺伝子変異パターンが得られ,パターン間での変異の重複やSNO化に対する感受性の強弱により,どのアミノ酸置換がSNO化感受性を規定するのに重要であるかを,アミノ酸配列並びに結晶構造データを用いた立体構造上の位置情報をもとにして,詳細な解析を実施しているところである.平成24年度は,以下の2つのテーマを予定していた.1:変異体の作成とタンパク質発現,2:クローンの選別とSNO特異性スクリーニング1,2ともに計画通りに実施することができた.

2は平板寒天プレート上で大腸菌が発する蛍光強度を目視しながら作業を実施できる様にするという新たな作業技術開発を必要としたが,ほぼ問題なく装置の開発と作製を行なうことができた.1では,理論的に設計したSNOモチーフを導入した変異体を作製し,大腸菌内部で発現させた後,SNOに対する反応性を蛍光強度の変化から検討した.これらのクローンは,SNO化試薬による蛍光強度変化をしめすものの,その感受性はあまり高くなく,実用的なものではなかった.2では,SNO化部位近傍に対してのみランダム変異導入法を用いて遺伝子変異を導入し,大腸菌へ導入・発現させた.これらのクローンを平板寒天培地上で選択することを試みたが,蛍光強度の変化を経時的に定量的に測定することが難しく,実現することは出来なかった.そのため,一旦平板寒天培地から自家蛍光が弱い菌株を選択的に採取し,96ウェルプレートを用いて整理した.採取した株総数は約1万個であった.96ウェルプレート上に整理された株各々に対してSNO化試薬を添加し,反応性に蛍光強度が増大するものを選別した.100個程度の株がSNO処理により蛍光強度が増大した.これらの株を改めてクローン化したのち,再度SNO処理により蛍光強度が増大することを確認したものについて,プラスミドDNAを抽出・精製し,DNAシークエンスを確認した.これらのクローンから得られた遺伝子配列を蛍光強度の増大幅と比較整理し,SNO感受性GFPを作製するための至適アミノ酸配列を現在検討中である.以上の成果は,ほぼ計画した通りであるため,おおむね順調に進展していると判断される.平成25年度は,「より高感度・高特異性を有するSNO感受性GFPの至適化」を目標に研究を実施する.前年のスクリーニング結果から,SNO感受性を示すアミノ酸配列パターンを見いだし,それらの共通項や立体構造上の位置関係を検討することから,よりSNO特異性・感受性の高いGFP変異体を生み出せないか検討する.すなわち,高感度(SNO化処理に伴う蛍光強度変化が大きい),高特異性(SNO化処理にのみ特異的に反応する)を有するアミノ酸配列を推測し,その変異を実際に導入したGFPを作製・発現させる.SNO感受性・特異性を詳細に検討する他,培養系動物細胞(血管内皮細胞など)に導入し,内因性・外因性のNO供給を変化させることにより生じるSNO化修飾の変動を,蛍光顕微鏡下などにおいて観察出来るかについても検討する.平成24年度は,制度改正により共用設備としての備品購入が可能になったため,蛍光プレートリーダーの購入費用が申請時の予算額よりも少なくなった.また,蛍光マイクロプレート(400円/枚)も洗浄方法を工夫することにより繰り返し使用することができる様になったため,消耗品費についても予算額を下回る支出となった.平成25年度予算は,高感度・高特異性を実現するための遺伝子変異を作製するためのプライマーの作製費用や変異導入のための試薬,SNO感受性評価のためのプラスチックプレートなどの消耗品の購入や,変異導入の確認のためDNAシークエンスを受託解析を利用して行なうための費用を計上した.平成24年度で残額が生じたため,本研究課題をさらに発展させるために,SNO化感受性GFPを動物由来の細胞で発現させ検討をおこなうことを追加で計画した.そのための動物飼育・細胞培養などにかかる費用も計上した.成果発表を薬理学会(平成26年3月)等にて行なうことも予定しており,学会参加費用ならびに論文作製費用も計上した.