hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
FEN1欠損マウスの自己免疫疾患

FEN1トランスジェニックマウスにおいて各種の検討を行ったが、自己免疫疾患が発現しているかどうかについて確認することができなかった。代わりに自己免疫疾患のマウスであるIQIマウスにおいて唾液腺(顎下腺、舌下腺)のリンパ球浸潤を確認した。しかしながらこれらの唾液腺の微細な変化に関してMRイメージング(拡散強調撮像)にて、正常マウスとの間に有意な差を確認することは困難であった。本年度は、FEN1トランスジェニックマウス唾液腺での自己免疫疾患発症を解析するに先立ち、シェーグレン症候群モデルマウスとされているIQIマウスを使って唾液腺病変の発症の過程をMRイメージングと病理学的手法を用いて解析した。IQIマウスは、生後6月齢を過ぎるころからリンパ球の浸潤が認められるようになるとされるので、5月齢以降ほぼ2ヶ月毎に23匹のIQIマウス並びにコントロールマウスをと殺し舌下腺および顎下腺を摘出した後MRイメージングを使って拡散強調撮像を行い、拡散強調係数(apparent diffusion coefficient,ADC)を求め、さらに固定して病理組織切片を作製し顕微鏡下で観察した。その結果月齢が進むにつれ、IQIマウスの顎下腺ではコントロールと比べて有為にADC値が低下していった。また8月齢を過ぎるころから腺内導管周囲にリンパ球の集族が認められるようになった。現在10月齢の解析を進めているが、これまでのところ腺房の破壊はそれ程進行しておらず、今後病変の進行伴ってADC値がどのように推移していくか解析を続ける予定である。一方、顎下腺に比べると舌下腺では、病変の進行が遅く、ADC値の変化も顎下腺ほど著しくはない。舌下腺についても今後さらに解析を続けていく予定である。次年度以降、IQIマウスの解析に併せて、FEN1トランスジェニックマウスでも同様の解析を行うことを予定している。20年度に引き続いて21年度もIQIマウスとFEN1トランスジェニックマウスの唾液腺における免疫応答の異常との程度を解析した。したがって本年度は、前年におけるMRイメージングを使った解析に加えて、IQIマウスおよびFEN1トランスジェニックマウスの唾液腺におけるERストレスを解析し、その結果を唾液腺の病理組織学的所見と対比させることで、IQIマウス、FEN1トランスジェニックマウス唾液腺における自己免疫疾患の発現メカニズムの解明を進めている。病理組織学的には、IQIマウスでは、4ヶ月齢を過ぎるころからリンパ球の浸潤が認められはじめるが、13ヶ月齢を過ぎても顎下腺、舌下腺ともに経時的な増加傾向は顕著でなかった。現在経時的にIQIマウスより切除した顎下腺ならびに舌下腺を使って(1)Westen blot解析、(2)免疫組織学的解析によりERストレス関連蛋白である(a)XBP-1,mRNAのスプライシング、(b)PERKのリン酸化、(c)elF2αのリン酸化、(d)BiP蛋白質の発現、(e)SEC6i蛋白の発現、(f)IRE1のリン酸化、および(g)CHOP蛋白の発現について解析を進めている。本年度は、自己免疫疾患のモデルマウスとしてIQIマウスを用いた。生体内での唾液腺(舌下腺と顎下腺)の微細変化とらえることを目的MRによる解析を行った。MRの撮像法は、細胞内に自由水の変化に敏感で早期の炎症変化をとられることに優れた撮像法である拡散強調撮像を用いた。また撮像後はIQIマウスの唾液腺を摘出し、各月齢ごとに病理組織像を正常マウスと比較検討した。IQIマウスの唾液腺は、同じ月齢の正常マウスと比較して、唾液腺の腺細胞周囲に多数のリンパ球浸潤を認めた。ただ実質組織の破壊像はみられなかった。生きたIQIマウスと正常マウスにおいて、MRを用いて唾液腺の拡散強調撮像を行った。みかけの拡散強調係数(ADC)においてIQIマウスと正常マウスとを比較した結果、有為差を認めず、唾液腺に顕著な炎症の存在は指摘できなかった。T24培養細胞においてFEN1をsiRNAで発現抑制した場合これらの細胞は老化を示す形態学的特徴を有していた。炎症をともなったT24細胞においては、テロメアに結合しているFEN1が消失し、これに合わせてH2AXのリン酸ならびにそれに伴ってDNA損傷修復反応が惹起されていることを確認した。またマウス個体においてFEN1の活性を抑えることで一部の臓器での老化が進むことを確かめている。これらのことから推察して、シェーグレン症候群等の自己免疫疾患においては、通常よりも老化が進んだ状態になっていると考えられる。
トライボロジ問題の破壊力学的研究

本総合研究では特に圧延プロセス,軸受,歯車,レールなど従来からよく知られているが近年特に負荷条件の苛酷化と信頼性向上への期待のため表面損傷問題が再びクローズアップされてきたマクロトライボロジー問題,コンピュータ用ハードディスクとヘッドの摺動に代表される電子機器のマイクロトライボロジー問題,さらにセラミックスなど新材料のトライボロジー問題を大学と企業の研究者が協力して破壊力学的観点から解決を試みることを目的とした.研究期間内に得られた研究実績(研究論文の分類と数)は次のようにまとめられる.(1)2物体の弾塑性接触の解析法の提案:研究論文:5件(2)繰返し移動荷重を受ける接触表面の弾塑性解析法の提案:研究論文:4件(3)混合モードき裂抵抗値測定とその機構の解明:研究論文:3件(4)き裂が存在する表面の破壊力学的解析:研究論文:11件(5)表面の残留応力・微小表面き裂の挙動と表面損傷の関連の解明:研究論文:6件(6)接触荷重を受ける表面層の損傷形態の調査:研究論文:10件(7)マイクロトライボロジーの測定法の確立と解析法の開発:研究論文:5件(8)新素材の摩擦,摩耗特性,圧力,温度分布の測定と表面損傷形態の破壊力学的研究:研究論文:14件なお,ここにあげた研究論文の具体的な内容は,研究成果報告書に全て記載されているので,参照されたい.本総合研究では特に圧延プロセス,軸受,歯車,レールなど従来からよく知られているが近年特に負荷条件の苛酷化と信頼性向上への期待のため表面損傷問題が再びクローズアップされてきたマクロトライボロジー問題,コンピュータ用ハードディスクとヘッドの摺動に代表される電子機器のマイクロトライボロジー問題,さらにセラミックスなど新材料のトライボロジー問題を大学と企業の研究者が協力して破壊力学的観点から解決を試みることを目的とした.研究期間内に得られた研究実績(研究論文の分類と数)は次のようにまとめられる.(1)2物体の弾塑性接触の解析法の提案:研究論文:5件(2)繰返し移動荷重を受ける接触表面の弾塑性解析法の提案:研究論文:4件(3)混合モードき裂抵抗値測定とその機構の解明:研究論文:3件(4)き裂が存在する表面の破壊力学的解析:研究論文:11件(5)表面の残留応力・微小表面き裂の挙動と表面損傷の関連の解明:研究論文:6件(6)接触荷重を受ける表面層の損傷形態の調査:研究論文:10件(7)マイクロトライボロジーの測定法の確立と解析法の開発:研究論文:5件(8)新素材の摩擦,摩耗特性,圧力,温度分布の測定と表面損傷形態の破壊力学的研究:研究論文:14件なお,ここにあげた研究論文の具体的な内容は,研究成果報告書に全て記載されているので,参照されたい.本年度の研究成果は,次のようにまとめられる.(1)繰り返し移動荷重を受ける接触表面の弾塑性解析とき裂が存在する表面の破壊力学的解析に関する研究.(a)ヘルツ接触論の拡張による二層弾性体の接触問題に対する近似解法の提案.(b)フレッティング疲労き裂の破壊力学的解析と疲労寿命評価.(2)マイクロトライボロジの測定法と解析法に関する研究.(a)磁気ディスクのトライボロジシミュレ-タの開発.磁気ディスクのヘッド・スライダとディスクの界面における粘着力,接触応力,衝突力の計算を目的に開発し,その有用性を確認した.(b)磁気ディスクのヘッドしゅう動による表面形状と摩擦力の変化の観察と測定.ヘッドのしゅう動によるディスクの平滑化や,しゅう動特性安定化の条件の実験的検討を行った.(3)混合モ-ドき裂進展抵抗に関する研究.金属およびセラミックスの転がり疲労のフラクトグラフィと疲労き裂のモ-ド||進展機構の解明を試みた.破面フラクトグラフにより転がり疲労の過程や機構を明らかにし,材料のモ-ド||進展抵抗値を求める実験について検討を行った.(4)接触荷重を受ける表面層の損傷評価に関する研究.(a)セラミックスの転がり疲労損傷評価に関して,超音波顕微鏡や表面弾性波を用いた疲労損傷評価の実験的研究を行った.(b)熱延ワ-クロ-ルのスポ-リングのケ-ススタディとスポ-リングの発生機構について破壊力学的解析を行った.さらに,耐スポ-リング性の評価法についても検討を行った.本年度の研究成果は次のようにまとめられる。(1)き裂が存在する表面層の弾塑性解析に関する研究(a)摩擦を考慮した円環状剛体パンチによる半無限体の弾性接触問題や2層半無限弾性体の軸対称接触問題の解析法を提案した。(b)摩擦を有するパンチ端から発生したき裂の応力拡大係数の解析法を提案した。(2)表面の残留応力,微小表面き裂の挙動と表面損傷の関連の解明に関する研究(a)圧延ロールの表面損傷(熱衝撃クラック現象)に関する基礎研究を行った。(b)転がりすべり疲労き裂発生・進展挙動の連続観察を実施した。(c)製鉄設備のトライボロジ問題と対応技術の討論を行った。(3)マイクロトライボロジの測定法の確立と解析法の開発に関する研究(a)自動車エンジンの電装・補機用軸受にみられるミクロ組織の変化と脆性剥離の原因究明を行った。(b)ハードディスク装置におけるトライボロジ問題の分類・整理を行い今後の研究課題について検討した。(4)新材料のトライボロジ問題における損傷形態調査と金属材料との比較に関する研究(a)新材料への応用例として人工関節用超高分子量ポリエチレンの変形挙動の解析法を提案した。

本年度の研究成果は次のようにまとめられる.(1)2物体の弾塑性接触解析:摩擦を考慮した円環状剛体パンチによる半無限体の弾性接触問題の解析法を提案した.(2)繰返し移動荷重を受ける接触表面の弾塑性解析:繰返し応力負荷や熱負荷により圧延ロール表面層に発生する応力.ひずみを計算する熱弾塑性数数値解析モデルを提案した.(3)き裂が存在する表面の破壊力学的解析:a.接触条件下の応力解析,応力特異場の解析,破壊力学解析に基づいてフレッティング疲労過程のシミュレーションを行った.b.圧延中のロールの表面き裂の応力拡大係数解析法を提案し,解析結果を実機のき裂進展挙動に適用した.c.表面き裂を有する半無限体表面が摩擦熱を伴う転がりすべり接触を受ける場合の破壊力学的解析法を提案した.d.摩擦を有するパンチ〓から発生したき裂の応力拡大係数の解析法を提案した.(4)混合モードき裂進展抵抗値測定とその機構の解明:a.転がり疲労の機構とモードII疲労き裂進展に関する検討を行った.b.新しいモードII疲労き裂進展試験法を提案した.(5)表面の残留応力,微小表面き裂の挙動と表面損傷の関連の解明:a.鉄鋼材料疲労き裂進展下限界値に及ぼすき裂長さと結晶粒径の影響を予測できるモデルを提案した.b.切欠き付き円筒試験片を用いた転がりすべり疲労き裂発生,進展挙動の連続観察により,WAYの油圧作用によるき裂進展の検討を行った.(6)接触荷重を受ける表面層の損傷形態の調査:a.圧延ロールの転がり疲労強度の改善法やスポーリング事故の解析に関して検討した.b.転がり軸受の長寿命化達成のための材料組織や熱処理の条件について検討し,超清浄軸受鋼を開発した.(7)マイクロトライボロジの測定法の確立と解析法の開発:a.磁気ディスクのしゅう動部表面の摩耗の様子をAFMにより観察し,しゅう動部凸部の高さと摩擦力との相関関係を明らかにした.(8)新素材の摩擦摩耗特製の測定と表面損傷形態の破壊力学的研究:a.レーザーラックル法による新しい摩耗評価法を提案した.b.赤外線サーモグラフィよる滑り接触面温度分布の可視化技術を確立した.c.被覆膜内の〓応力や音速変化を利用したTiC被覆鋼の転がり疲労損傷評価法を〓した.
二つのデータセットの接合を伴う回帰モデルの推定及び推論

ミクロ実証分析においてモデル推定に必要な変数が単一のデータセットに揃っていない場合、二つのデータセットを組み合わせて当該モデルを推定する必要が生じる。Hirukawa and Prokhorov (2018, "HP18")では二つのデータセットを最近傍法により接合した上で一致性を確保するバイアス修正推定法を提案した。本研究では、HP18で得た知見を基に、1最近傍法によらない2標本回帰推定、2データ接合の際の次元縮小、3分析対象とするモデルの拡張、など2標本推定問題の多方面にわたる深化・発展に取り組む。同時に、標準的な統計パッケージ上でコマンドを開発し、実務家への浸透・利便も図る。
脳機能等の非対称性に着目したパニック症の病態研究

1不安症(特にパニック症)の発症前後の不安感受性についての検討:青年期を中心する健常者とパニック症患者について、NEO-PI-R, TCI,の下位項目やSTAI(特性・状態不安)の各質問項目の関する因子分析や主成分分析を行い、不安症と健常者の不安特性に関する比較を行った。その結果、パニック症で特有の不安傾向が見いだされ、パニック症に広場恐怖を伴いやすく、社会的活動の制限を示唆する可能性が認められた。2脳内ネットワーク障害についての検討: 3.0テスラMRI装置によるdiffusiontensor imaging : DTI(拡散テンソル画像)を用いて疾患群と健常者群の比較検討を行った。疾患群において脳内ネットワーク障害に影響を与える因子を検討した。その結果、合併症を有するパニック症患者のFA(Fractional anisotropy)値は、合併症を有しないパニック症患者のFA値と比べて、左視放射・左運動前野において、有意に低いことが見いだされた。3FreeSurferを用いた脳皮質構造の検討:3T MRI装置を用いて、パニック症患者と健常対照被験者のMRIT1画像を得てFreeSurferを用いて脳皮質構造の比較検討を行った。その結果、パニック症患者の上前頭回において健常者に比べて、脳容積の増加が見られた。またパニック症患者群において、側頭葉における皮質厚が男性では年齢と正の相関がみられるが、女性では負の相関がみられた。4遺伝的因子の関与についての検討:脳内ネットワーク障害(拡散テンソル画像)とFreeSufer脳構造解析に関して代表的な遺伝子多型(COMT Val158Met多型やBDNFval66met多型、シグマ1受容体関連遺伝子、セロトニントランスポーター遺伝子多型)で検討した。サンプリングが順調に推移しており、健常者で約570例、パニック障害において630例に達している。その各々について不安感受性に関する心理検査や遺伝子解析によるデータの蓄積を行っている。また約40例についてはMRIテンソル画像解析、FreeSurfer解析と遺伝子解析の双方を施行している。拡散テンソル解析、および構造画像解析としてFreeSurferによる解析を継続的に行う。本研究においてはパニック症の脳機能の非対称性に着目し、局所的な連関の障害とともに脳構造に疾患が与える影響を仮定し、遺伝的因子を含めて検討する。1発症前の不安感受性についての検討:青年期を対象に、発症以前の状況、広場恐怖の有無などを把握すべく、不安感受性に関する項目に関する質問紙を用いた心理検査(NEO-PI-R, TCI, STAI, GHQ12)によって行った。2不安に関する因子特性についての検討:健常者とパニック症者を対象に不安の状況について、NEO-PI-R, TCI, STAIおよびGHQ12の結果について因子分析や主成分分析を行い、不安症と健常者の不安特性に関する比較を行った。3発症に係る脳内ネットワーク障害(微細な脳構造異常)・脳機能の変化についての検討: 3.0テスラMRI装置によるdiffusiontensor imaging : DTI(拡散テンソル画像)を用いて患者群と健常者群のサンプリングを継続的に行った。前頭葉の入出力系である前視床放線、鉤状束および下前頭後頭束、前帯状束や後帯状束を関心領域、脳梁膨大部を対照領域として拡散テンソル画像の解析を行い脳内ネットワーク障害(拡散テンソル画像)や前頭葉機能異常(NIRS研究)に影響を与える因子を探索した。4遺伝的因子の関与についての検討:パニック症の発症に関わると想定される脳内ネットワーク障害(拡散テンソル画像)について代表的な遺伝子多型(COMT Val158Met多型やBDNFval66met多型、シグマ1受容体関連遺伝子、セロトニントランスポーター遺伝子で検討した。特にライフイベントの有無やパニック発作・初発時の症状とセロトニントランスポーター遺伝子多型の関連など発症時の症状と遺伝子多型との関連を調べた。サンプリングが順調に推移しており、健常者で約550例、パニック障害において620例に達している。また約40例についてはMRIテンソル画像解析と遺伝子解析の双方を施行している。1不安症(特にパニック症)の発症前の不安感受性についての検討:青年期を対象に、発症以前の状況、広場恐怖の有無などを把握すべく、不安感受性に関する項目に関する質問紙を用いた心理検査(NEO-PI-R, TCI, STAI, GHQ12)によって行った。2不安に関する因子特性についての検討:健常者とパニック症者を対象に不安の状況について、NEO-PI-R, TCI, STAI(特性・状態不安)の結果について因子分析や主成分分析を行い、不安症と健常者の不安特性に関する比較を行った。4遺伝的因子の関与についての検討:パニック症の発症に関わると想定される脳内ネットワーク障害(拡散テンソル画像)について代表的な遺伝子多型(COMT Val158Met多型やBDNFval66met

多型、シグマ1受容体関連遺伝子、セロトニントランスポーター遺伝子多型)で検討した。特に合併症の有無とセロトニントランスポーター遺伝子多型の関連を調べた。サンプリングが順調に推移しており、健常者で約560例、パニック障害において630例に達している。その各々について不安感受性に関する心理検査や遺伝子解析によるデータの蓄積を行っている。また約40例についてはMRIテンソル画像解析と遺伝子解析の双方を施行している。1不安症(特にパニック症)の発症前後の不安感受性についての検討:青年期を中心する健常者とパニック症患者について、NEO-PI-R, TCI,の下位項目やSTAI(特性・状態不安)の各質問項目の関する因子分析や主成分分析を行い、不安症と健常者の不安特性に関する比較を行った。その結果、パニック症で特有の不安傾向が見いだされ、パニック症に広場恐怖を伴いやすく、社会的活動の制限を示唆する可能性が認められた。2脳内ネットワーク障害についての検討: 3.0テスラMRI装置によるdiffusiontensor imaging : DTI(拡散テンソル画像)を用いて疾患群と健常者群の比較検討を行った。疾患群において脳内ネットワーク障害に影響を与える因子を検討した。その結果、合併症を有するパニック症患者のFA(Fractional anisotropy)値は、合併症を有しないパニック症患者のFA値と比べて、左視放射・左運動前野において、有意に低いことが見いだされた。3FreeSurferを用いた脳皮質構造の検討:3T MRI装置を用いて、パニック症患者と健常対照被験者のMRIT1画像を得てFreeSurferを用いて脳皮質構造の比較検討を行った。その結果、パニック症患者の上前頭回において健常者に比べて、脳容積の増加が見られた。またパニック症患者群において、側頭葉における皮質厚が男性では年齢と正の相関がみられるが、女性では負の相関がみられた。4遺伝的因子の関与についての検討:脳内ネットワーク障害(拡散テンソル画像)とFreeSufer脳構造解析に関して代表的な遺伝子多型(COMT Val158Met多型やBDNFval66met多型、シグマ1受容体関連遺伝子、セロトニントランスポーター遺伝子多型)で検討した。サンプリングが順調に推移しており、健常者で約570例、パニック障害において630例に達している。また約40例についてはMRIテンソル画像解析、FreeSurfer解析と遺伝子解析の双方を施行している。
クラック先端のプロセスゾーンの長さを推定する手法の研究

申請者はフラクチャープロセスゾーン(以降、プロセスゾーンと呼ぶ)を有する破壊力学モデルに対する解析関数を基にして、「変位測定によってプロセスゾーンの長さbを最も効率的に推定するには、供試体の如何なる点の変位を計測するのが望ましいか」という問題を解析的見地から考察した。以下に解析手法の手順および解析結果から得られた結論を列記する。1.y軸上に長さ2aのクラックを有するモデルを例に採り、プロセスゾーンの長さbの変化に敏感でかつ計測しやすい点の変位を選ぶため、bに対する変位の変化率、すなわちx軸方向変位uあるいはy方向変位vをプロセスゾーン長さbで一回微分した|∂u/∂b|(あるいは|∂v/∂b|)の値を求めるための解析関数を複素応力関数から誘導した。ただし導いた関数は煩雑であり列記することを割愛する。2.導いた解析関数をプログラム化して解曲面を視覚的に分かり易く表示するために、32ビット・パーソナルコンピュータ(PC9821/Na7/Hc7,NEC製)を用いて描画した。3.プロセスゾーンbの推定曲線の結果を比較検討するために、カラープリンター(BJC-6801,Cannon製)を設置して描画した結果を出力した。4.これらの結果から次のような結論が得られた。(1)変化をプロセスゾーン長さbで一回微分した曲面を描いて検討した結果、クラック開口部中央点からx軸方向に少し離れた点で計測してもプロセスゾーンの長さを推定することが可能であることが判明した。(2)本研究で検討したプロセスゾーン計測位置に関する考察は、既に多くの実験で計測されている位置であって自明な結論であるが、理論的な裏付けを行い従来の計測位置が正しいことを証明した成果は大きい。
出雲地方における城下町及び町場の形成とその変容過程に関する研究

本研究は、地方の城下町とその周辺の町場の形成とその変容過程に関する都市形成史的な研究である。具体的には、山陰地方でも歴史的景観を留めている城下町松江と、その周辺部に形成された町場のうち宍道・安来・平田・今市など松江藩の中でも重要視されていた町場を取り上げた。研究の第一目的は、城下町とその周辺都の町場について、街区構造・住居集合の構成要素を、近世土地資料の解読・分析作業と歴史的街区の観察調査によって明らかにしようとすることであった。本年度は、城下町松江を中心に調査研究したが、武家屋敷と町人町に分けて街区の基本構成とその特性を明らかにした。基礎資料としては、広島大学附属図書館に所蔵されている『中国五県土地祖税資料文庫』に含まれている「松江城下武家屋敷明細帳」(貞享頃明治初期の武家の変動、資料16点)と「沽券大帳」(明治6年の屋敷帳、松江市街7小区の内小区欠)を用いたが、武家屋敷では地区を限定(城東・城西地区)して、元禄年間の屋敷構成を復元し、当時の武家屋敷の動態(変動)を明らかにし、町人町については、末次・白潟「両町」の街区構成を「沽券大帳」を解読しながら、地価構造や職能分布を中心に分析してみた。こうした歴史的街区構成の基礎的研究は、城下町や町場が持つ近世的な都市構造の相互関係を浮き彫りにし、地域的な住居集合特性を一層鮮明にすることとなった。また、ない得た研究成果は、必要に応じて関係市町の教育委員会や図書館等にも報告しているが、復元的資科は歴史講座等の基本資料ともなり活用されている。城下町松江の近世的都市構造の解析作業を進めているが、武家屋敷については近世資料「武家屋敷明細帳」の解読によって、この資料の全容を明らかにしながら.松江城周辺の武家屋敷の構成とその変容過程についての考察を行っている。松江城の東側に位置する内山下については「松江藩給帳」と照合しながら.その変容過程を明らかにしたが.現在,資料の整理を進めながら調査範囲を拡張している。また.松江市街地の明治初期の都市構造を記す資料に「沽券帳」(明治6年)があるが、この資料の大要については以前報告し、近世城下町松江が近代化を迎える中で、その変容過程を知り得る貴重な資料であることを明らかにしたが.市街地中心部にある町人町末次について、現在屋敷地ごとに「沽券帳」に記載されている地価等を照合し.近代初期の町人町末次の都市構造を浮き彫りにしようとしているところであるが、この研究成果は今秋に報告するべく、準備を進めている。なお、周辺部の町場については.近世資料(地銭帳等)によって.その概要を明らかにし.当時の町場=在町の街区構成を復元的に考察している。その中でも、代表的な町場の一つ今市(出雲市)については、町並みの復元とともに.町家の実測調査を地元の建築家の協力を得て行っている。また.代表的な町場の一つ平田(平田市)については、現存する三冊の「地銭帳」(正保4、明歴3.延宝9)によって、17世紀後半の町並みの変容過程を「正保ー延宝年間における在町平田(本町)の変容」と題して.この3月の建築学会中国支部研究報告会で発表したところである。
現実環境とのインタラクション機能を持つ共有仮想環境システムの研究

当研究では、利用者の現実世界と仮想世界との間の情報の媒体として、非接触型ICカードを利用している。平成13年度はICカードの情報記録フォーマットの策定や、そのフォーマットに従って記録された個人属性を読み取って、仮想環境での展示解説を変更するするシステムを作成した。平成14年度はシステムに、仮想環境中のどの展示を見たかをカードに記録する拡張を行った。これにより、現実環境での行動を仮想環境へ通知するのに加え、仮想環境から現実環境への情報の通知が可能となり、より密接な連携が可能となった。実装されたシステムは、博物館内に設置して、利用者が自由に利用できるキオスク端末として構成した。館内には多数のキオスク端末が設置されているが、どの端末を利用する場合でも、利用者は個人属性が記録されたICカードを読み込ませることで、展示解説の個人化が可能となっている。仮想環境システムも、そのようなキオスク端末の一種として設置され、ICカードから読み取った個人属性に応じて仮想環境での解説を変更したり、逆に、仮想環境で見た展示の履歴をICカードに書き戻すことで、現実世界でのキオスク端末で、これまでに見た展示や、逆に見逃している展示の一覧を作成したり、その履歴をデータベースに登録することで、あとで展示解説のブックマークとして利用できるようになっている。当初の計画では、現実環境と仮想環境のインタラクションのためにビデオキャブチヤを使う予定であったが、研究を実際に行うにあたり、ネットワーク通信機能を持った非接触ICカードが利用できることになった。そこで、このICカードを現実環境と仮想環境の間を結ぶ情報の媒体としてを用いることにした。本研究では、現実環境として特に博物館という場を想定している。そこで、まずICカードやサーバに、どのような情報を記録すべきかを決めるため、博物館の展示、および評価に必要な情報の整理を行った。その上で、ICカードへの情報記録フォーマットを決定した。ICカードに記録した情報はさまざまであるが、例えば以下のような情報がある。1.利用者の属性大人/子供、説明のレベル、興味を持っている分野、などの情報である。これらの情報をICカードを用いて現実環境から仮想環境へ持ち込むことで、展示を利用者に合わせて変化させ、より分かりやすい展示を行うことが可能となった。2.展示を見た履歴利用者が、現実環境および仮想環境での展示のうち、どの展示を見たかの履歴である。これを利用することで、次にどこを見ればよいかという、ナビゲーションが可能となった。また、利用者が展示を見て回った経路情報としても利用でき、上記の利用者の属性とあわせることで、博物館の展示評価にも役立てることが出来た。非接触ICカードを用いた展示システムは、東京大学総合研究博物館で2002年1月から2月にかけて行われた"デジタルミュージアム3"などの実際の展示会で運用され、現実環境と仮想環境を結び付けたシステムが、博物館での新たな展示手法として有効であることが確認できた。
ドラッグデリバリーシステムを応用した徐放化局所麻酔薬の作成と慢性疼痛治療への応用

ポリ乳酸とリドカインを用いて長時間放出型の局所麻酔薬を作成した。さらにラットを用いて術後痛モデルを作成し、坐骨神経周囲にその徐放薬を投与した。徐放薬は2日間で半分程度を放出し、1週間程度放出し続けるシートが作成できた。行動実験(von Freytest)と脊髄L4/5のc-fosレベルで長時間作用を確認し、さらに神経や筋肉の毒性を病理学的に検討したが問題なかった。さらなる応用ができるように、粒子化を試みている。1.【薬剤作成】長期徐放型局所麻酔薬の作成を、京都大学再生医科学研究所生体材料学の教室の協力を得て行った。ポリ乳酸もしくはポリ乳酸とポリグリコール酸の重合体とリドカインを用いて、顆粒状徐放薬とシート状徐放薬を作成した。さらに、現在ヒトに用いることのできる徐放薬作成を検討中である。3.【行動実験】作成した徐放薬を用いて行動実験を行った。250gラットを用い、左後肢に切開を加える術後痛モデルを作成し、坐骨神経周囲へ徐放薬剤の投与を行った。痛みの評価は、機械刺激で行った。コントロール群(未治療群)との比較で、痛み閾値を低下させないことを確認し、さらに徐放されていないリドカインそのものとの比較でも徐放薬としての利点を示すことができた(5、10、24、48、72時間)。4.【脊髄免疫染色】ラットの潅流固定を行い、脊髄後角スライスを作成し、痛みのマーカーとして利用されるc-fosを用い免疫染色を行った。リドカイン徐放薬投与群では、コントロール群、リドカインそのもの群に比べて有意にc-fos陽性細胞数が少ないことを確認した。5.【安全性の確認】徐放薬投与後のラット血中濃度測定を行った。徐放薬投与群では、2, 5, 10時間後の血中濃度は測定範囲外であった。(全身への影響はないかあっても軽微)6.【今後】ヒトに用いることのできるポリマーを購入して、ヒトボランティアに対してもリドカイン徐放薬を安全に使用できるように確認したい。さらに、別の薬剤を用いた徐放薬作りにも着手したい。昨年までに、ポリ乳酸・ポリグリコール酸を用いた30%リドカイン徐放シートの作成に成功し、それを用いてラット行動実験、脊髄免疫染色により、in vivoにおいてもその作用時間の延長を確認できた。今年度は、その作成した薬剤の安全性について主に調べた。全身への影響を調べるために、2、5、10h後のタイムポイントにおけるラットのリドカイン血中濃度を測定した。30%リドカイン20mg徐放薬投与では、2時間後にわずかに測定できたラットが1匹/6のみいたが、それ以外のタイムポイントでは測定限界以下であった。同量のリドカインそのものを投与したものと比較しても明らかに低く、動物内においても徐放になっていることも示すことができた。さらに、運動麻痺の程度についても調べたが、リドカインそのものを投与したものに比べて明らかに麻痺は少なかった。さらに、徐放薬投与部位周囲の炎症反応について、組織学的に調査した。投与部位周囲の坐骨神経、筋肉を一塊に取り出し、H-E染色で、炎症細胞の浸潤や神経細胞や筋細胞の形態学的変化を病理医により点数化した。結果、徐放薬投与群では、坐骨神経や筋肉への影響は投与部位に非常に近い場所にあっても軽微であった。以上の実験結果より、リドカイン徐放シートは生体内においても安全に使用できると思われた。一方で、今回作成した徐放薬では、非常に分子量が大きいため生体内での分解に時間がかかり臨床応用という意味ではやや実用性にかける問題点も発生した。これを解決するべく、分子量の小さいポリマーを用いたり、粒子化することを念頭にさらに新たな徐放薬作成も開始している。今後は、別の薬剤を用いての徐放薬作成、鎮痛治療を行っていく予定である。数年前よりポリ乳酸とリドカインを用いて、局所麻酔薬徐放の研究を進めている。シート状のリドカイン徐放薬に関しては、ラットの術後痛モデルを用いて、投与周囲の筋肉障害や神経障害を起こすことなく、安全かつ長時間の鎮痛効果を示すことができた。その結果を、アメリカ麻酔学会機関誌であるAnesthesiology誌に投稿し、2010年に掲載された。一方で今回作成したものは、シート状のものであったため、今年度はリドカイン徐放粒子の作成のために時間を費やした。粒子化することができれば、さらに利用できる範囲は広がり臨床応用へ一歩近づくことが考えられた。更には、薬剤による特性による相違がある可能性を考え、リドカイン以外の局所麻酔薬における徐放薬作成にも着手した。粒子化は以前にも行ったが、やはり初期の大きな放出の制御がうまくいかず、徐放薬の濃度や徐放手法に工夫が必要であると思われる。

現在はポリ乳酸やポリグリコール酸を用いて作成しているが、ポリエチレングリコールやゼラチンハイドロゲルを使うなどの別の手法が必要になってくる可能性が高い。さらなる研究余地がある。リドカイン以外の局所麻酔薬に関しても問題点は同様である。粒子化の試みの一方で、作成したリドカイン徐放シートの実用化に向けた製品作りも並行して行っている。カテーテル類をコーティングしたりすることで、体に入る部分での痛みを軽減させることが狙いである。以上の内容を2010年6月に日本麻酔科学会で発表し、優秀演題賞に選ばれた。目指すところは臨床応用であるので、来年度以降もさらなる研究を進めていく必要があると思われる。
知覚意識の時間ダイナミクスを支える神経機構

前年度には、複数の実験固体で、行動課題の習得に成功し、同一の視覚刺激を反復的に見落とす現象を、実験の俎上で、安定的に観察できた。見落としが生じる要因は、視覚刺激の物理的強度や呈示間隔の時間的近接性などによる外的要因と、観察者自身の注意資源の剥奪や記憶容量の制限といった内的要因に大別することができる。これら二つの要因は、正常脳において、眼前の情報をかき消す状況を同じく作り出すが、得られる主観経験は全く異なることが、近年、指摘されている。しかし、その神経メカニズムの詳細は不明であった。両者の相違相関から、知覚意識と脳の時間的関係性を明らかにするために、本年度は、一端である外的要因を対象に、神経生理実験を行った。時間発展が追いやすく、本研究であつかう現象とも関わりの深い、大脳皮質の階層性をターゲットに、多数のニューロン活動を記録した。輝度操作により標的刺激の物理的強度を低下させた場合には、標的刺激に対する初期視覚野の早期応答が減弱した。一方、標的と妨害刺激との時間的近接性を操作した場合には、妨害刺激の応答が減弱するとともに、先行標的の応答パターンへ同化してゆくことがわかった。前者の状況は、刺激が呈示されていない場合と実質的に同じ状態となっていくが、後者の状況は、標的刺激の応答パターンを保存したまま、わずか数十ミリ秒の間に知覚内容の上書きが完遂されていることを示唆している。次年度は、階層間連絡に着目し、より下流との関係を探るとともに、要因間比較を行っていく。神経生理データの一部を収集できた。引き続き、神経生理実験を行い、要因間比較を行う。ここ十数年の間に、知覚意識に関する神経科学実験は、多数繰り返されてきたが、現象記述の域にとどまり、体系的理解は進んでいない。その一因に、特定の現象の神経動態から、知覚意識の共通性を追い求め、個別の現象毎に生じる“気づきの失敗"の原因究明が遅れていることが挙げられる。本研究では、マカクサルを対象に、正常脳において、本来見えるべきものを容易に見落とす現象を複数、実験の俎上で再現し、現象間の共通性と個別性から気づきの失敗を生む神経メカニズムを明らかにする。正常脳における盲目現象を究明することにより、知覚意識の成立過程とその移り変わりを実現する神経メカニズムを具現化する。初年度は、主に、実験環境のセットアップと、行動データの収集に充てた。実験固体に、視覚特徴の弁別判断と、視覚刺激の存在検出を、バー判定で報告させ、両者の干渉効果を測定した。二つの課題を系列的に行う状況下では、ターゲットの呈示時間差に依存して、見落とし率が増減することが確認できた。また、単独の課題でも、ターゲットに付随する妨害刺激の呈示時間差を操作すると、同様に見落とし率を変調できた。これらの結果は、学習効果によって消失せず、長期間、反復的に観察できた。したがって、各種神経科学実験に耐えうる頑健性を担保できた。次年度の神経生理実験へ向け、ノイズ除去を含め神経活動を安定して記録できる環境整備にも同時に着手し、円滑に移行できる状況にある。複数の実験個体で、行動成績を定量的に評価できた。また、神経生理実験へ向けたセットアップも順調に進行している。サルが課題遂行中に、多数の神経活動を記録し、神経相関を明らかにする。初年度は、実験環境のセットアップと動物のトレーニングに時間を要したため。当初の計画通り、神経生理実験を行うための物品費に充てる。納期の関係で、次年度使用額が生じた。大半は、次年度4月に、当初予定していた物品購入に充てたため、研究遂行上、大きな支障はない。
新しい超二次構造,ポリプロリン・β-ターン・ヘリックス構造:合成と構造

タコ・ロドプシン,シナプトラィンシ,シネクシン,RNAポリメラーゼII,グリアヂン,ホルダイン,グルテニン等に存在する繰り返しアミノ酸配列に対して提案したポリプロリン・β-ターン・ヘリックス構造を新しい超二次構造として確立するため,平成2年度および3年度において行った研究をさらに詳しくすすめた。(1)ロドプシンは網膜の子細胞に存在する色素タンパク質で,イオンポンプの働きをもっているといわれている。タコ・ロドプシンC末満に存在する繰り返しアミノ酸配列(Tyr・Pro・Pro・Gln・Gly)n (n=8)(最近,イカ・ロドプシンにも同じ繰り返しアミノ酸配列が存在することが明らかにされている)を化学合成した試料をもちいて,種々の2次元NMR測定を行った。n=2の試料の測定は,すでに行っているが本年度はN=4についても行い,n=2に非常に似たスペクトルを観測した。そこで,分子モデリングによりNMRの結果にもとづいて得たn=2の可能な立体構造を,n=4の場合にのばしてそれをn=4の初期構造とてい得た。次に,このn=4の初期構造のエネルギー極小化および分子動力学計算をおこなった。二つの可能な初期構造にうち,一つの構造は,300Kの分子動力学計算(プログラムAmber)を1 psec後においても,グリシン残基の内部回転角は余り変化せずかなり安定な構造であることが示唆され,また,Gly・Tyrである種のターン構造をとることが見いだされた。(2)小麦の貯蔵タンパク質であるグルテニン高分子量(HMW)サブユニットのX線小角散乱の濃度依存性の詳しい実験を行った。その結果,0.1M酢酸溶液における微小角領域(分子全体の慣性半径が測定できるギニエ領域)の散乱強度は,濃度2.0mg/1を越えると著しく減少した。このような強度の減少は,分子間の干渉効果として知られている。ド・ジャンは高分子溶液のダインミックな振舞いを理解するために,希薄溶液とは体質的に異なる′′準希薄溶液′′を考えている。準希薄溶液は,分子同志が互いに接触し始める濃度であり,濃厚溶液と同様に分子間干渉効果を起こすと考えられる。準希薄溶液の性質を示し始める濃度は,分子の大きさと形に強く依存し,球状分子やランダムコイルに比べ棒状分子のそれはかなり低い濃度である。したがって,比較的低いタンパク質濃度であらわれた強い分子間干渉効果は,分子全体の慣性半径および断面の慣性半径の結果を併せて,グルテニンHMWサブユニットは棒状分子として存在することが強く示唆された。(3)小麦の貯蔵タンパク質は溶液解度の程度に従いプロラミン(α/β,γ,w-グリアジン)とグルテニンに分類される。オオムギおよびライムギ,トウモロコンのプロラミンは,それぞれホルダイン,セカリン,ゼインと呼ばれている。これらの貯蔵タンパク質の一次構造は,PheおよびPro,Glnが高い現れる繰り返しアミノ酸配列部分を含んでいる。すでに述べた様に,われわれはホルダインおよびグリアジン,グルテニンの繰り返しアミノ酸配列に対しポリプロリン・β-ターン・ヘリックス構造を提案しているが,コンピュータグラフィックスを用いた分子モデリングおよびエネルギー計算により,次のタンパク質に存在する繰り返しアミノ酸配列の立体構造予測も行った。γ-グリアジンに存在する繰り返しアミノ酸配列(Pro・Gln・Gln・Pro・Phe・Gln・Gln)n(n=16)およびゼイン/グルテリン-2に存在する縦列反復配列(Leu・Pro・Pro・Pro・Val・His)n(n=8)が,やはりポリプロリン・β-ターン・ヘリックスあるいはそれと密接に関連したらせん構造をとりえることが明らかとなった。このようにポリプロリン・β-ターン・ヘリックスをとると思われる縦列反復配列は,他のタンパク質にも見いだされいてる。以上の立体構造予測研究および二次元核磁気共鳴,X線小角散乱の実験研究は,確かにポリプロリン・β-ターン・ヘリックスという超二次構造が存在し,しかも一つの基本的な構造であることが強く示唆される。

(2)小麦の貯蔵タンパク質であるグルテニン高分子量(HMW)サブユニットのX線小角散乱の濃度依存性の詳しい実験を行った。その結果,0.1M酢酸溶液における微小角領域(分子全体の慣性半径が測定できるギニエ領域)の散乱強度は,濃度2.0mg/1を越えると著しく減少した。このような強度の減少は,分子間の干渉効果として知られている。ド・ジャンは高分子溶液のダインミックな振舞いを理解するために,希薄溶液とは体質的に異なる′′準希薄溶液′′を考えている。準希薄溶液は,分子同志が互いに接触し始める濃度であり,濃厚溶液と同様に分子間干渉効果を起こすと考えられる。準希薄溶液の性質を示し始める濃度は,分子の大きさと形に強く依存し,球状分子やランダムコイルに比べ棒状分子のそれはかなり低い濃度である。したがって,比較的低いタンパク質濃度であらわれた強い分子間干渉効果は,分子全体の慣性半径および断面の慣性半径の結果を併せて,グルテニンHMWサブユニットは棒状分子として存在することが強く示唆された。(3)小麦の貯蔵タンパク質は溶液解度の程度に従いプロラミン(α/β,γ,w-グリアジン)とグルテニンに分類される。オオムギおよびライムギ,トウモロコンのプロラミンは,それぞれホルダイン,セカリン,ゼインと呼ばれている。これらの貯蔵タンパク質の一次構造は,PheおよびPro,Glnが高い現れる繰り返しアミノ酸配列部分を含んでいる。すでに述べた様に,われわれはホルダインおよびグリアジン,グルテニンの繰り返しアミノ酸配列に対しポリプロリン・β-ターン・ヘリックス構造を提案しているが,コンピュータグラフィックスを用いた分子モデリングおよびエネルギー計算により,次のタンパク質に存在する繰り返しアミノ酸配列の立体構造予測も行った。γ-グリアジンに存在する繰り返しアミノ酸配列(Pro・Gln・Gln・Pro・Phe・Gln・Gln)n(n=16)およびゼイン/グルテリン-2に存在する縦列反復配列(Leu・Pro・Pro・Pro・Val・His)n(n=8)が,やはりポリプロリン・β-ターン・ヘリックスあるいはそれと密接に関連したらせん構造をとりえることが明らかとなった。このようにポリプロリン・β-ターン・ヘリックスをとると思われる縦列反復配列は,他のタンパク質にも見いだされいてる。以上の立体構造予測研究および二次元核磁気共鳴,X線小角散乱の実験研究は,確かにポリプロリン・β-ターン・ヘリックスという超二次構造が存在し,しかも一つの基本的な構造であることが強く示唆される。タコ・ロドプシン、シナプトフィシン、シネクシン、RNAポリメラ-ゼII、ホルダイン、グルテンに存在する数残基が連続して繰り返しアミノ酸配列(縦列反復配列)の立体構造を、コンピュ-タ-・グラフィックスを利用した分子モデリング法により予測し、一連のらせん構造(ポリプロリン、βータ-ン・ヘリックス構造)を提案した。さらに、これら以外のタンパク質に存在する縦列反復配列も、ポリプロリン・βータ-ン・ヘリクッス構造で合理的にモデリングできることを明らかにした。
強磁性微粒子/高分子溶液分散系の磁場中における粒子分散構造とその動的粘弾性特性

強磁性微粒子を高分子溶液中に分散させた磁性塗料に対して、磁場を印加した際の粒子配向挙動及び粒子分散状態をin situ評価することを目的として動的粘弾性測定を行った。スリットせん断型レオメーターに磁場印加装置を組み込み、印加磁場強度H=01.0kGにおいて磁性塗料の動的粘弾性測定を行った結果、Hの増加に伴い貯蔵弾性率G'が顕著に増加する現象が観察された。また、磁場印加角度依存性が確認され、スリットに対して垂直に磁場を印加した場合、最も大きなG'が得られた。これらの現象は、磁性粒子の磁化容易軸が磁場印加方向と平行になるように配向し、さらに粒子が連結して鎖状クラスター構造を形成した結果と判断した。一方、塗料中における磁性粒子体積分率を増加させると、G'は増加するが、磁場印加前のG'_0との相対弾性率G'/G'_0は低下する傾向を示し、高体積分率では磁場印加効果が小さくなった。高粒子体積分率では、1)隣接する粒子間で互いに配向を妨げ合う、2)粒子分散性の低下により粒子凝集体が形成される、などの理由により磁場応答性が低下したと考えられ、磁性粒子分散状態の差異が粒子配向挙動に影響を及ぼすことが確認された。磁場印加により形成される鎖状クラスター構造を直接評価するために、磁場を印加した磁性塗料を液体窒素を用いて急速凍結・固化させ、その表面状態をクライオSEMによって観察した。一次粒子の配向を確認することはできなかったが、レオロジー測定においてG'/G'_0が高い値を示した低粒子体積分率の塗料において、太さ13μmの鎖状クラスターの存在が観察された。しかし、粒子体積分率の増加とともに鎖状配向構造は不明瞭になり、このことはG'/G'_0が低下したことと一致した。以上のことから、磁性塗料に磁場を印加した際の粒子配向挙動については、本手法による検討が有効であることが確認された。本研究では、高分子溶液中に強磁性微粒子を分散させた磁性塗料に対し、磁場を印加した際に観察されるレオロジー挙動の変化から、塗料内粒子配向挙動を明らかにすることを目的とし、また、その際の磁性粒子配向構造を確認するため、磁場中において塗料を急速凍結させてクライオSEMによる直接観察を試みた。以下に得られた知見を示す。1.レオメーターにスリットせん断治具及び磁場印加装置を装着し、磁場中における磁性塗料の動的粘弾性特性を測定した。磁場を印加すると、貯蔵弾性率(G')が急激に増加すると共に、損失正接は減少し、また磁場強度の増加に伴いその傾向はより顕著になった。これは磁性粒子の配向を反映した結果てあり、本手法により、塗料内粒子配向挙動評価が可能であると考えられる。2.磁場印加角度を変化させたところ、スリット表面に対し垂直に磁場を印加した場合、最も大きなG'が得られた。粒子配向方向は磁場印加方向と平行であり、またこれらが連結することにより鎖状クラスターを形成していると判断した。3.磁場応答性の良否を、磁場印加時のG'を無磁場の際のG'で除した相対貯蔵弾性率により評価した。相対貯蔵弾性率は、粒子分散性が良好な場合大きな値を示し、磁場による配向が生じ易いことが確認された。粒子配向性向上には、塗料中での粒子高分散化が必要不可欠である。4.数種の強磁性微粒子を用いて比較検討したところ、飽和磁化及び軸比が大きなメタル鉄微粒子を用いた塗料において、最も大きな磁場印加効果が得られた。5.クライオSEMにより粒子配向構造の観察を試みたが、現在の塗料組成では溶媒融点と鏡筒内温度が近く凍結が不完全であり、観察中にガスが発生するため観察できていない.今後、融点のより高い溶媒を用いたモデル塗料での観察や、観察条件を変えて粒子配向構造の観察を試みる予定である。

一次粒子の配向を確認することはできなかったが、レオロジー測定においてG'/G'_0が高い値を示した低粒子体積分率の塗料において、太さ13μmの鎖状クラスターの存在が観察された。しかし、粒子体積分率の増加とともに鎖状配向構造は不明瞭になり、このことはG'/G'_0が低下したことと一致した。以上のことから、磁性塗料に磁場を印加した際の粒子配向挙動については、本手法による検討が有効であることが確認された。
生体内での細胞挙動を可視化する分子プローブ

本研究では,海洋生物である橈脚類(ガウシア・プリンセプス)由来のルシフェラーゼを出発物質として,超高輝度の変異体を論理的に開発した.ガウシアルシフェラーゼの酵素活性中心を推定し,部位特異的アミノ酸変異導入を行った.開発した変異体の中には,オリジナルのガウシアルシフェラーゼに比べて,10倍程度高輝度化した変異体や,スペクトルが33nm長波長化した変異体が含まれ,これらはバイオアッセイにおいて非常に有用なツールを提供する.この変異体の有用性は,BALB/cヌードマウスにおいて,当該ルシフェラーゼ変異体を発現するマウスB16メラノーマ細胞の肺への変異を高感度に可視化できたことでも明らかである.ガン研究や幹細胞研究,再生医学研究の急速な進展を受けて,ガン細胞や幹細胞,幹細胞から分化した細胞などの様々な細胞種が生体の中でどのよう振る舞うのか,すなわち生体における各細胞種の時空間動態の解析に多くの研究者の興味が集まっている.本研究では,生体内での細胞動態を可視化する新しい分子プローブを開発する.この分子プローブは,蛍光プローブが抱える自家蛍光のような問題に無縁であり,生体深部での細胞追跡(cell tracking)を可能にすることが求められる.本研究で開発するのは,このような生体イメージングを実現する極めて高性能の生物発光プローブである.平成24年度は前年度より遂行してきた生物発光タンパク質(ルシフェラーゼ)の活性中心近傍を狙ったアミノ酸変異導入をさらに大規模に行った.この変異導入と大腸菌コロニーを用いたハイスループットスクリーングのサイクルを繰り返し行うことにより,ルシフェラーゼを飛躍的に分子進化させ,極めて輝度の高いルシフェラーゼ変異体を取得することができた.さらにこの高輝度変異体をガン細胞に導入し,既存のルシフェラーゼよりも極めて高い感度で,当該ガン細胞のマウス生体内での転移を可視化することができることを示した.本研究では,海洋生物である橈脚類(ガウシア・プリンセプス)由来のルシフェラーゼを出発物質として,超高輝度の変異体を論理的に開発した.ガウシアルシフェラーゼの酵素活性中心を推定し,部位特異的アミノ酸変異導入を行った.開発した変異体の中には,オリジナルのガウシアルシフェラーゼに比べて,10倍程度高輝度化した変異体や,スペクトルが33nm長波長化した変異体が含まれ,これらはバイオアッセイにおいて非常に有用なツールを提供する.この変異体の有用性は,BALB/cヌードマウスにおいて,当該ルシフェラーゼ変異体を発現するマウスB16メラノーマ細胞の肺への変異を高感度に可視化できたことでも明らかである.ガン研究や幹細胞研究,再生医学研究の急速な進展を受けて,ガン細胞や幹細胞,幹細胞から分化した細胞などの様々な細胞種が生体の中でどのよう振る舞うのか,すなわち生体における各細胞種の時空間動態の解析に多くの研究者の興味が集まっている.本研究では,生体内での細胞動態を可視化する新しい分子プローブを開発する.申請者が本研究で目指すのは,生体内での細胞の場所についての空間情報を与えたり,細胞分化や特定の遺伝子発現が起こってからどの程度時間が経過したのかについて情報を与える分子プローブの設計とその開発である.さらにこの分子プローブは,蛍光プローブが抱える自家蛍光のような問題に無縁であり,生体深部での細胞追跡(cell tracking)を可能にすることが求められる.本研究では,この新しい分子プローブを設計・開発し,これを用いて,細胞の分化が生体のどこで起こっているのか,分化した細胞はどのように生体内で振る舞うのか,あるいは特定の遺伝子発現が生体内のどこで起こっているのか,その遺伝子発現を起こした細胞は生体内でどのような挙動を示すのか等,新しい細胞追跡を実現する.平成23年度はルシフェラーゼにアミノ酸変異を導入し,その輝度を大幅に向上させることを目的に研究を遂行した.まずルシフェラーゼの活性中心近傍を狙った部位特異的なセミランダム変異導入,およびルシフェラーゼ全体にアミノ酸置換を施すためのランダム変異導入を行う.変異を施したルシフェラーゼのcDNAを大腸菌に導入し,寒天プレート上でコロニーを形成させる.多数のコロニーの発光を同時にCCDカメラで観察し,高輝度のルシフェラーゼを発現するコロニーを単離する.この変異導入とコロニースクリーングのサイクルを繰り返してルシフェラーゼを飛躍的に分子進化させ,高輝度変異体を効率良く取得しつつある.平成23年度はルシフェラーゼの輝度を大幅に向上させることを目的に研究を遂行した.ルシフェラーゼの活性中心近傍を狙った部位特異的なアミノ酸変異導入と高輝度変異体のクリーングの結果,現在までに高輝度変異体を効率良く取得しつつある.従って,おおむね順調に研究は伸展していると判断できる.平成23年度までに開発してきた変異体に対して.更にアミノ酸変異を導入する.特に,ルシフェラーゼの活性中心近傍を狙った部位特異的なセミランダム変異導入,およびルシフェラーゼ全体にアミノ酸置換を施すためのランダム変異導入を行う.この変異導入とコロニースクリーングのサイクルを繰り返してルシフェラーゼを飛躍的に分子進化させ,高輝度変異体を取得する.開発したルシフェラーゼの高輝度変異体を用いて生物発光プローブを開発し,生体での細胞イメージングに応用する.物品費1,300,000円旅費300,000円間接経費450,000円