hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
大量DNAシーケンシングと生命システム比較解明への応用

線虫C.elegansのcDNA解析を徹底的に進めた。V-capping法により作成した発生時期ごとの完全長cDNAライブラリ約15万クローンのEST解析を行い、新たに4909のcDNA種を得た。whole mount in-situ hybridization法による発現解析を継続し、11,309種について発現画像を取得した。これらの結果はNEXTDBに統合し、WormBaseともリンクした。さらに次世代DNAシーケンサで全トランスクリプトーム解析を行い、NEXTDBに統合した。発現制御領域の体系的同定、発現制御ネットワークの解析では、腸系譜の時期特異的なモチーフの同定とシス因子の同定、温度感受神経AFDでの発現を制御する調節配列と制御遺伝子を同定した。翻訳制御・局在化のメカニズムの解明の研究では、pos-1 mRNA局在化のシス配列とトランス因子を同定した。mex-3 mRNA局在化でもシス配列を同定した。モデル化に向けた胚の細胞配置データ取得を進めた。近縁線虫D.cronutusのゲノム/cDNA解析をサンガー法と次世代シーケンサのハイブリッド法で進めた。1)線虫発現データベースNEXTDBの拡張線虫C.elegansについてEST配列・分類、ゲノムとのアラインメントによる遺伝子構造、whole mount in situ法による発現パターン解析(詳細なアノテーション付け)、発現パターンに基づくRNAi解析、などのNEXTDBの内容拡張をおこない、公開した。<http://nematode.lab.nig.ac.jp>これをもとにして、様々な遺伝子の機能研究や共同研究を遂行した。2)初期胚の力学計算機モデル構築及び細胞形状モデルの半自動生成システム開発C.elegans初期胚での細胞運命決定には細胞配置に基づく細胞間相互作用が極めて重要である。われわれは細胞配置を再現するシミュレータを構築し,26細胞期までのシミュレーションを行い検証した。また、細胞膜を蛍光染色して共焦点顕微鏡で観察した時系列3次元画像をもとに、半自動的に細胞モデルを構築するシステムの開発を進めた。24200細胞期の85時点における画像データに適用し、大部分でほぼ正しい形状モデルを構築できた。3)近縁線虫の研究発生過程の多様性および可塑性の遺伝基盤を解析するため、原腸陥入までの細胞配置がC.elegansとは異なる近縁の線虫Diploscapter coronatusについてESTおよびゲノム解析を行った。EST解析の結果、約1万のクラスターに分類され、うち5,800種にC.elegansのホモログが見出された。EST解析を補完するために低カバー率の全ゲノムショットガンシーケンスをおこない、C.elegansゲノムと比較した結果、新たに4,000のC.elegans遺伝子ホモログが見つかった。これらすべての結果はNEXTDB上に統合され、相互参照可能とした。1)線虫発現データベースNEXTDBの拡張:昨年度に引き続き、EST配列・分類、ゲノムとのアラインメントによるゲノム構造、whole mount in situハイブリダイゼーションによる発現パターン解析(詳細なアノテーション付け)、発現パターンに基づくRNAi解析、などの結果をNEXTDBで統合、公開した。WormBaseとも直接リンクする方向で作業を開始した。URLはhttp://nematode.lab.nig.ac.jpである。これらをもとにして、様々な遺伝子の機能研究や共同研究を遂行した。2)母性遺伝子pos-1 mRNAの局在機構:pos-1はNEXTDBプロジェクトの中で2細胞期にかけてmRNAが後極に局在する遺伝子として見つかった一つであり、生殖系列の創始細胞の運命確立に関与している。今回、パーティクルガンによる外来遺伝子を効率よく母性発現させる条件を見出し、これにより、pos-1 mRNAの3'UTRの後ろ半分に局在活性が存在すること、近縁線虫のC.briggsaeのpos-1 mRNAの3'UTRでも代替が効き、この部分には進化的に保存された30塩基の配列があることを見出し、局在シグナルの可能性を示した。3)新しいモチーフ探索アルゴリズムの開発:NEXTDBから発現パターンが共通する遺伝子群については、主として5'上流領域に何らかのモチープ配列の存在が期待される。このためには初期の検索対象として5'上流の少なくとも1000塩基、できればより長いものが望まれるが、探索空間が激増するために困難であった。このために我々は、対象配列を「圧縮」する方法を開発した。この結果、10-20%の圧縮率で、対象配列が2000塩基になっても十分モチーフ検出可能であることを示した。

4)近縁線虫の研究:近縁の線虫Diploscapter coronatusは発生過程の解析の結果、原腸陥入までの卵割およびその配置がC.elegansとは異なる。昨年に引き続きESTおよびゲノム解析を行った。低カバー率の全ゲノムショットガンシーケンスをおこなった結果、scaffold数:30,336、総延長66Mbpを得た。ここから4,647のC.elegans遺伝子ホモログが見つかった。これらすべての結果はNEXTDB上に統合され、相互参照可能とした。1)NEXTDBの拡張:引き続きEST/ゲノムとwhole mount in situハイブリダイゼーションによる発現パターン解析(詳細なアノテーション付け)、発現パターンに基づくRNAi解析、などの結果をNEXTDB<http://nematode.lab.nig.ac.jp>で統合、公開を行い、これらをもとにして様々な共同研究を遂行した。Solexaシーケンサによる全トランスクリプトーム解析もおこなった。2)母性mRNAの局在機構:母性遺伝子pos-1mRNAの第一卵割時の後極への局在化に必要なシス配列の解析のために、VENUS::pos-1配列融合遺伝子の形質転換体を作成し、VENUSプローブを用いたin situ hybridizationで融合mRNAの分布を調べた。pos-13'UTRが局在化に必要十分な活性を持つことを明らかにし、必須領域を近縁種間でも保存されている58塩基の配列にまで絞りこんだ。3)新しいモチーフ探索アルゴリズムの開発:陽性を残しつつ探索する領域を狭めるアルゴリズム「filtering step」を開発し、ベンチマークテストではモチーフを想定以上の長い数Kb領域から見つけ出すことに成功した。さらにこのアルゴリズムは複数のモチーフを同時に検出できることが分かり、実験的検証を行った。4)温度感受神経AFDでの発現制御調節配列の系統的解析:グアニリル環状化酵素gcy-8について、AFD特異的な発現を誘導するには50bpの調節配列で十分であることを示し、二つの転写調節遺伝ttx-1、ceh-14の両方が、gcy-8を含むAFD特異的な発現に重要な役割を持つことを強く示唆した。5)線虫胚発生における細胞形状モデルの半自動生成システムの開発:細胞膜に局在するGFP融合遺伝子を発現する線虫株の画像データを多光子共焦点顕微鏡を用いて取得し、このシステムを適用して形状モデルを構築した。細胞間接触状況を体系的に明らかにし、細胞運命誘導との関係を探った。1)線虫C.elegansトランスクリプトームの徹底解析: NEXTDB〈http://nematode.lab.nig.ac.jp〉の高度化を進めた。
劇症型心筋炎の画期的診断法・治療法の開発

劇症型心筋炎を呈する自己免疫性心筋炎の平均生存期間は4-12カ月であり、極めて予後不良である。生存率改善のためには、早期診断による早期治療の開始や新たな治療法の確立が期待される。本事業では、心筋炎部位での血管透過性が亢進し、ナノサイズ粒子が心臓に集積することを見出した。次に、免疫抑制剤FK506単独と比較して、リポソーム化したFK506は、劇症型心筋炎ラットモデルにおいて、心機能低下を著明に抑制することに成功した。リポソーム化免疫抑制剤は劇症型心筋炎に対する有効な治療法になることが期待できる。劇症型心筋炎を呈する巨細胞性心筋炎の平均生存期間は4-12カ月であり、極めて予後不良である。生存率改善のためには、早期診断による早期治療の開始が必要である。しかし、現状では、臨床症状、身体的所見、血液生化学検査、胸部レントゲン、心電図、心エコー図などの非特異的所見による総合的診断が行われており、心筋炎特異的診断方法は存在しない。心内膜心筋生検もサンプリング・エラーが大きいため信頼性がない。実地臨床現場では、劇症型心筋炎の診断や治療に対する"unmet needs"が存在する。本事業では、心臓超音波検査を用いて、静脈内薬剤投与により、劇症型心筋炎の診断をベッドサイドでおこなう技術を開発した。本診断法は、劇症型心筋炎に特異的な病態を利用したものであり、心筋炎に対する初の特異的診断法につながる。同時に、劇症型心筋炎に対する新規治療方法の開発をおこなった。免疫抑制剤の劇症型心筋炎に対する効果は一定ではないが、根治療法が存在しない現状では,難治症例での使用は是認されているのが現状である。申請者らは、免疫抑制剤を用いたドラッグデリバリーシステムを新たに開発することにより、ミオシン感作により作製した劇症型心筋炎ラットモデルにおける左室拡張末期圧上昇を抑制するなどの効果を見出し、心筋炎に伴う心機能低下を抑制することに成功した。アカデミアにおいてGMP基準に対応した免疫抑制剤を作製し、早期探索的試験実施に向けて基礎実験成果を得た。(601文字)
骨基質蛋白質Dmp1の力学的負荷に関する機能解析

Dentin matrix protein 1は、骨細胞特異的な骨基質蛋白質で、我々のこれまでの研究から、力学的負荷が減少したラットでは、血清Dmp1値が有意に低下することを明らかにしており、骨細胞は生体に加えられた力学的負荷に反応してDmp1の発現を調節することで、Dmp1を介して骨組織の恒常性を維持する機能を担っているのではないかと考えている。本研究では、Dmp1発現欠損骨芽細胞株を用いて、Dmp1発現の有無により力学的負荷に対する反応の変化を検討するとともに、実験動物を利用し、力学的負荷に対して骨細胞がDmp1を介して骨組織の恒常性維持に果たしている機能を明らかにしたいと考えている。
細胞内カルシウム放出の制御を介したシナプス伝達修飾機構の解明

これまで機能がほとんど解明されていないカルシウム動態調節分子の役割を明らかにすることを試みた。この分子のシナプス部位特異的遺伝子改変マウスを作製し機能解析を行った。海馬スライス標本を用いた電気生理学的解析においては、シナプス後部特異的な分子A欠損マウスでは長期増強が有意に減弱し、シナプス前終末特異的分子A欠損マウスでは、低頻度持続刺激によるシナプス応答が増大することを見出した。行動実験においては、分子B欠損マウスにおいて、異常がある可能性を見出した。本研究計画では、これまで中枢神経系での機能がほとんど解明されていないカルシウム動態調節分子の役割を明らかにすることを試みた。この機能分子のシナプス前終末、および、シナプス後細胞それぞれでのシナプス伝達とその長期増強(LTP)や長期抑圧(LTD)などの可塑性における役割と、この分子により調節される細胞内カルシウム動態のシナプス伝達および高次脳機能における役割を明らかにするために、この機能分子のシナプス部位特異的遺伝子改変マウスを作製し、その機能を電気生理学的、生化学的、および、行動学的解析により、分子、細胞、ネットワークおよび個体レベルで明らかにした。まず、平成27年度は、海馬部位特異的にこの分子が欠損する変異マウスの作製を行い、その作出に成功した。これらの変異マウスを用いて、海馬における役割を明らかにするために、海馬スライス標本を用いた電気生理学的解析、および、個体マウスを用いた行動学的解析を行った。電気生理学的解析においては、海馬特異的コンディショナルノックアウトマウスから定法に従って海馬スライス標本を作製し、細胞外電位記録法により興奮性シナプス応答を記録した。通常のシナプス応答には、大きな異常はみられなかったが、短期的、および、長期的シナプス可塑性の一部に異常がある可能性が示唆されるデータを得た。また、行動バッテリーテストを行い、いくつかの項目で個体レベルにおける行動異常を見出した。平成28年度は、これらの結果を確定するとともに、より詳細な解析を進めて、論文を発表する予定である。予定していたコンディショナル遺伝子改変マウスの作出に成功し、機能解析もかなり進んでいるため、当初予定していた研究成果を十分に得ることができた。さらに、次年度のための準備も順調に進んでおり、全体としておおむね順調に進展していると判断している。平成27年度には、海馬部位特異的にこの分子が欠損する変異マウスの作製を行い、その作出に成功したため、平成28年度はこの変異マウスを用いた機能解析を進めた。海馬における当該分子の役割を明らかにするために、海馬スライス標本を用いた電気生理学的解析、および、個体マウスを用いた行動学的解析を行った。電気生理学的解析においては、海馬特異的コンディショナルノックアウトマウスから定法に従って海馬スライス標本を作製し、海馬CA1領域において細胞外電位記録法により興奮性シナプス応答を記録した。通常のシナプス応答には明らかな異常はみられなかったが、シナプス前性およびシナプス後性のいずれの可塑性においても異常を見出すことができ、この分子によるカルシウム動態調節によりシナプス可塑性が制御されることが明らかとなった。個体レベルでの行動実験においても異常がある可能性を見出しており、これらの成果をまとめて、近いうちに論文として成果を発表する予定である。当初の計画通り、作出したコンディショナル遺伝子改変マウスの機能解析を進め、シナプス伝達やその可塑性における表現型をさらに詳しく解析するとともに、カルシウム動態調節による高次脳機能の制御機構を明らかにする。さらに、生化学的な解析も進め、対象分子の下流での生化学的な調節機構を明らかにすることも試みる。神経科学実験計画が予想よりも効率的に進展したため、本年度は実験補助を雇用する必要もなく、物品費にも余裕が出たことから、次年度使用額が生じた。また、研究内容を公表する段階にはまだないため、この課題に関する学会発表などを行わなかったことから、旅費も生じなかった。次年度は、機能解析により多くの物品費を使用し、さらに大きく研究を発展させる。それに伴って、実験補助も必要になると思われるので、補助者の雇用にも予算を使用する予定である。論文も発表できるものと思われるので、この課題に関する学会発表も行うことになるため、そのための旅費も使用する予定である。
内軟骨性骨化におけるレチノイドシグナルによるCbfa1とIHHの発現制御機構

本研究は、レチノイドシグナルがCbfa1とIndian hedgehog (IHH)の発現を制御することにより、内軟骨性骨化を制御するという仮説を証明することを目的としている。本研究により以下のような結果が得られた。1.レチノイド感受性エレメントにβガラクトシダーゼを接続したレポーター遺伝子を導入したF9細胞を用いて、レチノイドシグナルの活性を検討したところ、軟骨肥大層に近接する軟骨膜において、強いレチノイドシグナル活性が検出され、他の部分の軟骨膜および軟骨組織においては活性が弱かった。2.発生軟骨組織にレチノイドを添加したビーズを移植すると、Cbfa1の発現が誘導され、レチノイド拮抗物質を添加したベーズを移植すると軟骨細胞の肥大化が抑制された。3.軟骨細胞培養系において、レチノイドはcbfa1の発現を亢進させた。逆に、レチノイド拮抗物質はcbfa1の発現を抑制した。4.軟骨細胞培養系において、レチノイドシグナルにより、誘導される、軟骨細胞終末分化促進作用はCbaf1の機能阻害により完全に抑制された。一方、Cbfa1による終末分化促進作用はレチノイドシグナルを阻害しても、抑制されなかった。5.未熟軟骨細胞におけるIHHの発現はレチノイドにより促進されたが、成熟軟骨細胞においては、逆に阻害された。以上の結果より、レチノイドシグナルはcbfa1の発現を誘導することにより、軟骨細胞の肥大化を促進すること、また、レチノイドシグナルは、肥大細胞において、IHHの発現を抑制し、IHHによる軟骨細胞の肥大化抑制作用を解除していることが示唆された。本研究により、内軟骨性骨化の制御において、レチノイドシグナルは重要な役割を果たしていることが強く示唆された。本研究では、レチノイドシグナルがCbfa1の発現を促進する一方、Ihhの発現を制御することにより、内軟骨性骨化を制御しているという仮説を実証することを目的としている。本年度は以下のような結果を得た。1.レチノイド感受性エレメントにβガラクトシダーゼを接続した遺伝子を組み込んだF9細胞に、軟骨組織の抽出液を添加し、βガラクトシダーゼ活性を測定した結果、レチノイド活性は肥大細胞層に近接する軟骨膜に強く検出され、他の軟骨組織においては活性が弱かった。2.軟骨組織発生初期(鶏胚5.5日齢)の肢芽の軟骨形成部にレチノイン酸を含有するビーズを移植すると、Cbfa1の発現が誘導された。また、レチノイド拮抗物質を含有させたビーズの移植近傍では軟骨細胞の肥大化マーカーの遺伝子発現が強力に抑制された。3.レチノイドシグナルにより誘導される、軟骨細胞の終末分化促進作用はCbfa1の機能の阻害により完全に抑制された。一方、レチノイドシグナルを阻害しても、Cbfa1による終末分化促進作用は阻害されなかった。4.レチノイド添加による軟骨細胞におけるIhhの発現の変化を検索したところ、未熟軟骨細胞においてはレチノイドはIhhの発現を促進するが、成熟軟骨細胞においては逆に阻害することが判明した。以上の結果より、レチノイドシグナルはCbfa1の発現を誘導することにより、軟骨細胞の肥大化を促進すること、および肥大化期の軟骨細胞におけるIhhの発現を制御していることが考えられ、内軟骨性骨化の制御におけるレチノイドシグナルの重要性が強く示唆された。本研究は、レチノイドシグナルがCbfa1とIndian hedgehog(IHH)の発現を制御することにより、内軟骨性骨化を制御するという仮説を証明することを目的としている。

2.発生軟骨組織にレチノイドを添加したピーズを移植すると、Cbfa1の発現が誘導され、レチノイド拮抗物質を添加したベーズを移植すると軟骨細胞の肥大化が抑制された。3.軟骨細胞培養系において、レチノイドはcbfa1の発現を亢進させた。逆に、レチノイド拮抗物質はcbfa1の発現を抑制した。4.軟骨細胞培養系において、レチノイドシグナルにより、誘導される、軟骨細胞終末分化促進作用はCbaf1の機能阻害により完全に抑制された。一方、Cbfa1による終末分化促進作用はレチノイドシグナルを阻害しても、抑制されなかった。5.未熟軟骨細胞におけるIHHの発現はレチノイドにより促進されたが、成熟軟骨細胞においては、逆に阻害された。以上の結果より、レチノイドシグナルはcbfa1の発現を誘導することにより、軟骨細胞の肥大化を促進すること、また、レチノイドシグナルは、肥大細胞において、IHHの発現を抑制し、IHHによる軟骨細胞の肥大化抑制作用を解除していることが示唆された。本研究により、内軟骨性骨化の制御において、レチノイドシグナルは重要な役割を果たしていることが強く示唆された。
被虐待児の脳におけるDNAメチル化とその神経発達への影響に関する検討

本研究の目的は、虐待というストレスが加わった子どもの脳で、脳神経細胞におけるDNAメチル化の検索を行うことである。海馬のパラフィン包埋切片からレーザーマイクロダイセクションシステムを利用して、神経細胞層を特異的に切り出し、そこからDNAを抽出し、バイサルファイト処理後に、NR3C1遺伝子プロモーター1Fを標的にPCRを行い、クローニング後に塩基配列調べメチル化の検索を行った。虐待例1例と内因性急死例2例の脳について調べた。虐待例ではメチル化部位の増加や転写因子NGFI-Aの認識配列のメチル化等が認められた。従って、虐待では海馬の神経細胞のメチル化が亢進することが示唆された。ストレス状況下において、視床下部ー下垂体ー副腎システムが恒常性維持のために重要である。この経路に関わるコルチコトロピン放出ホルモン(CRH)の増加はこの経路に悪影響を及ぼし、精神的な問題を惹起する。その遺伝子発現はストレス下で一過性に増強され、その後に抑制を受けるが、その抑制に視床下部室傍核の神経細胞のGlucocorticoid receptorが関わっている。自殺者脳を用いた研究では、子供時代に虐待を受けたヒトではそのGlucocorticoid receptor (NR3C1)遺伝子プロモーターにメチル化の増加が観察されている。以上より、虐待を受けたヒトではGlucocorticoidによる抑制が効かず、CRHが増加した状態が続き、ストレスに対する抵抗性の低下や精神的な問題を生じやすくなるのではないかと推論されている。そこで、虐待死亡事件例の解剖時に保存された脳からDNAを抽出し、DNAメチル化の検索を行う計画である。平成25年度には、コントロールの脳から作製されたパラフィン包埋切片からQIAamp DNA FFPE Tissue Kit (QIAGEN社)を用いてDNA抽出を行い、良好なDNA抽出を実現するために、試薬量、組織面積やプレパラート数の条件検討を行い、条件設定を行えた。次に、EpiTect Bisulfite Kit (QIAGEN社)を用いてDNAのバイサルファイト処理を行い、良好なバイサルファイト変換を実現するために、試薬量、DNA量の条件検討を行い、条件設定を行えた。一方、細胞の種類によってDNAメチル化が変化することから、細胞収集の選択性を高め、異種類の細胞を排除した形でDNA抽出を実現するために、ZEISS社製PALMレーザーマイクロダイセクションシステムを利用した細胞収集とDNA抽出、バイサルファイト処理を行うための予備実験を行った。結果は、海馬で24アリルを調べたところ、左海馬では12アリル中の5アリル、右海馬では12アリル中の7アリルにメチル化が認められた。ほとんどのメチル化部位は転写因子NGFI-Aの認識配列に位置し、2箇所以上のメチル化を有するアリルが5アリルあった。平成27年度は、虐待死亡例及び同年齢の内因性急死例の解剖時に保存された脳から、大脳皮質、海馬、扁桃体、小脳等についてパラフィン包埋切片を作製した。左右海馬からZEISS社製PALMレーザーマイクロダイセクションシステムを利用して、神経細胞層を特異的に切り出し、そこからQIAamp DNA FFPE Tissue Kit(QIAGEN社)を用いてDNAを抽出し、そのDNAにEpiTect Bisulfite Kit(QIAGEN社)を用いてバイサルファイト処理を施し、プロモーター1Fを標的にPCRを行い、PCR産物をクローニングベクターpUC118に組み込み、各クローンの塩基配列を調べることでメチル化の検索を行った。結果は、虐待例の海馬で24アリルを調べたところ、左海馬では12アリル中の5アリル、右海馬では12アリル中の7アリルにメチル化が認められた。一方、内因性急死2例を調べた。一例では左海馬8アリル中の2アリル、右海馬11アリル中の1アリルにメチル化が認められた。調べた範囲で2箇所以上のメチル化を有するアリルは無かった。他方、左海馬16アリル中の全アリルにメチル化が認められたが、そのメチル化部位は一箇所であり、その他にメチル化をもつアリルは3アリルであった。調べた範囲で、全アリルで見つかったメチル化を除くと、2箇所以上のメチル化を有するアリルは無かった。但し、内因性急死例のメチル化部位は転写因子NGFI-Aの認識配列に位置していなかった。以上から、非虐待例に比較して虐待例では海馬のDNAメチル化が増加しており、特に転写因子NGFI-Aの認識配列にメチル化が存在することが特異的であった。

脳から作製されたパラフィン包埋切片からQIAamp DNA FFPE Tissue Kit (QIAGEN社)を用いてDNA抽出を行い、良好なDNA抽出を実現するために、試薬量、組織面積やプレパラート数の条件検討を行い、条件設定を行えた。次に、EpiTect Bisulfite Kit (QIAGEN社)を用いてDNAのバイサルファイト処理を行い、良好なバイサルファイト変換を実現するために、試薬量、DNA量の条件検討を行い、条件設定を行えた。一方、細胞の種類によってDNAメチル化が変化することから、細胞収集の選択性を高め、異種類の細胞を排除した形でDNA抽出を実現するために、ZEISS社製PALMレーザーマイクロダイセクションシステムを利用した細胞収集とDNA抽出を実行した。以上から、メチル化検出のための一連の作業工程を確立し、虐待脳の試料を用いて、メチル化の検索を行った。法医学平成27年度は、コントロールの脳から作製されたパラフィン包埋切片からDNA抽出を行い、メチル化の程度を調べる計画である。前頭回、海馬、扁桃体、小脳等のメチル化を調べる予定である。研究の進行が遅れているが、細胞の種類によってDNAメチル化が変化することから、異種類の細胞を排除し、細胞収集の選択性を高めるために、ZEISS社製PALMレーザーマイクロダイセクションシステムを利用することを加えたため、細胞収集とDNA抽出、バイサルファイト処理を行うための予備実験を行っており、レーザーマイクロダイセクション装置の使用方法、微量なサンプルの取扱いに関する手技等の習熟に時間を要したことが挙げられる。細胞の種類によってDNAメチル化が変化することから、異なる種類の細胞を排除し、細胞収集の選択性を高めるために、医学系研究科共同利用機器部門に導入されたZEISS社製PALMレーザーマイクロダイセクションシステムを利用することとした。HE染色標本だけでなく、免疫組織染色標本からも細胞収集が可能であることから、特定の抗原が発現している細胞を選択的に収集し、DNA抽出、バイサルファイト処理を行い、DNAメチル化を検索する予定である。レーザーマイクロダイセクションの利用により、神経細胞、神経膠細胞、脳室上衣細胞、血管内皮細胞等の区別を厳密に行い、脳の部位と細胞特異的なDNAメチル化の検索が可能となり、より厳密なDNAメチル化の評価が可能となると思われる。今後はレーザーマイクロダイセクションの利用を加味したDNAメチル化の検索を行うこととする。
糸球体高血圧による糸球体の障害機構とその抑制についての検討

腎疾患の進展・増悪の指標となる,種々のサイトカイン,ケモカイン,成長因子のうちFGF, TGF-β,オステオポンチン,MCP-1, scavenger receptor-1, RANTESを選び,各因子のmRNAの発現が5/6腎摘ラットまたは肥満ラットの腎切片または単離糸球休でどのように変化しているのか,in situ hybridizationなどにより検討する準備を進めてきた。各因子のcDNA配列から特有な塩基配列を持つ部位を選び,cDNAのクローニングを行い,発現を調べた。特に有意に増加を認めたのはTGF-βであり,その他でははっきりとした差が認められなかった。今回の検討では、この差が何を示しているのかはっきりさせることはできなかったが、コラーゲンの発現や、種々の細胞間のクロストークに関与している可能性が示唆された。2.カルシウム動員抑制による障害抑制効果の検討準備カルシウムの細胞内動員経路としてL型カルシウムチヤンネルおよびstretch-activated calcium channel (S-Aチャンネル)を介していることが考えられ,L型カルシウムチャンネルインヒビターであるnifedipineおよびS-Aチヤンネルのインヒビターであるgadolinium (Gd)の投与を検討したが,gadoliniumを腎不全ラットに投与した報告はなく,基礎的検討として正常ラットにGdClを投与し,副作用の発現が生じるかどうかを検討した。3.ラット血管平滑筋細胞の機械的収縮/伸展による細胞骨格形成とpaxillinチロシンリン酸化経路についての検討血流増加または血圧上昇による血管のリモデリングにつき検討した。ラット大動脈より平滑筋細胞を単離し,伸展刺激を加えた場合,平滑筋細胞の接着斑に局在するP125^<FAK>やその基質である細胞骨格蛋白であるpaxillinのリン酸化が生じるかどうか,ウェスタンブロット法により検討し,さらにこのリン酸化機構と細胞骨格の関係について検討した。機械的伸展により,P125^<FAK>やpaxillinのリン酸化が生じ,細胞骨格の変化も認められた。腎疾患の進展・増悪の指標となる,種々のサイトカイン,ケモカイン,成長因子のうちFGF,TGF-β,オステオポンチン,MCP-1,scavenger receptor-1,RANTESを選び,各因子のmRNAの発現が5/6腎摘ラットまたは肥満ラットの腎切片または単離糸球体でどのように変化しているのか,in situ hybridizationなどにより検討する準備を進めてきた。各因子のcDNA配列から特有な塩基配列を持つ部位を選び,約600bpのDNA配列をもつcDNAのクローニングを行っている。ラット線維芽細胞,メサンギウム細胞などよりRNAを抽出し,RT-PCR法により各因子のcDNAを増幅させた。出来上がったcDNAをTAクローニング法によりPCRII-TOPOプラスミドDNAにサブクローニングし,ブラスミドを大腸菌にトランスフェクションさせ増幅を行っている。また腎糸球体内の組織変化との関係についても検討するため,ラミニン-β1,I型コラーゲン,MMP-2のcDNAについてもクローニングを行っている。cDNA作成後,in situ hybridizationを開始する予定である。2.カルシウム動員抑制による障害抑制効果の検討準備カルシウムの細胞内動員経路としてL型カルシウムチャンネルおよびstretch-activated calcium channel(S-Aチャンネル)を介していることが考えられ,L型カルシウムチャンネルインヒビターであるnifedipineおよびS-Aチャンネルのインヒビターであるgadolinium(Gd)の投与を検討しているが,gadoliniumを腎不全ラットに投与した報告はない。そのため,基礎的検討として正常ラットにGdClを投与し,副作用の発現が生じるかどうかの検討を行っている。
景観基本法の提言にかかる研究

「景観基本法の提言」に関して、研究を集約して以下の11の提言にまとめた。1.風景基本法(仮称)を制定し、国と地方公共団体の責務を明らかにする2.法定の風景基本計画づくりを風景基本法の中で規定する3.電線の地中化や屋外広告物規制など、新しい風景づくりへと法の対象を拡大する4.「風景の保全と創造」を建築基準法や都市計画法など、既存の建設関連法規の目的の中へ加える5.建設関連法規の記述において、規制はナショナル・ミニマムであることを明記し、そのような運用に移行する6.特別用途地区などの新たに改正されてきた既存制度を積極的に活用する7.風景向上施策を戦略的に進めるための重点地区を指定する8.各地で制定されてきている景観条例に対して、風景基本法において根拠を与える9.デザイン審査制度を導入する10.デザイン・ガイドラインを作成する11.都市景観規制およびデザイン規制に関する専門職能を確立するなお、この提言を含む研究成果の全体について、『日本の風景計画』と題して、学芸出版社より平成15年6月頃に出版予定である。以上の具体的提案をまとめると、第一に風景基本法制定の提言、第二に既存制度を改善することによる統合的風景行政の推進、第三に風景の質の向上のための具体的な諸施策の提言、の3つに大別できる。特に風景基本法の制定に関しては、先進諸国の風景法制を概観し、わが国の風土にあった法制度の提言を行う工夫をしている。この主張は国の施策にも取り入れられる可能性が高く、今後さらに詳細な法制度上の検討を重ねる必要がある。同時に、風景関連の規制の具体的なあり方について、実務面にまで踏み込んだ施策の提言を今後行っていく必要がある。本年度の研究実績は大きく二つに分けることができる。ひとつは、これまでに既に完了している欧米諸国での現地調査を踏まえて、詳細な文献調査を追加し、各国の都市計画体系における風景計画や景観規制の位置づけを行うということである。前年度までの成果の精緻化である。もうひとつは景観基本法(仮称)をわが国へ適用するための道筋を具体的に示すために、わが国での先進的な事例にあたってきた。前者については、既に決まっている担当者によって行われている。イギリス中井検裕(東工大)・山崎正史(立命館大)フランス西村幸夫(東大)・和田幸信(足利工業大)イタリア宮脇勝(千葉大)オーストリア・ドイツ三島伸雄(佐賀大)アメリカ岡崎篤行(都立大)カナダ岡崎篤行(都立大)後者については、先進事例のまちで実際に取り組んでいる方をお招きし議論を行っている。具体的には遠野市から現地で活躍されている建築家をお招きしどのような景観向上の取り組みが為されているのかを伺ったり、あるいは倉敷市でヒアリングを行った研究会のメンバーや金沢市を地元とするメンバーからの報告を行った。そして、各国との比較やわが国の歴史を振り返りながら、わが国に風景計画や景観規制を位置づけるための道筋を議論している。議論の過程では法律を専門とするメンバーによる法律的な障害やありうべき法的枠組みに関する意見を参考にしている。今後は、こうした議論を組み上げていく作業を行っていく。1.日本の風景計画の発展過程:都市計画における景観・風景の位置づけとその変遷。そもそも「風景」や「都市美」といった概念が都市計画の中でどのように生まれてきたか、その後どのような変遷をたどったかを概観する。2.各種制度と風景計画:規制と固定資産税の軽減措置を関連づける政策や市民参加と助成措置を結びつける施策など各種のインセンティブを風景計画の中で援用する方策について考察した。さらに街なみ環境整備事業の例を中心に、事業による風景の誘導について、その実態と可能性を論じ、さらに事業一般が風景づくりに果たす役割について考察した。

3.風景計画と計画主体:伝統的建造物群保存地区や登録建造物制度、重要文化財制度等を題材に、国の役割と地方自治体の役割を論じた。さらに風景計画における合意形成の特質を制度の導入前後、制度運用の段階別に分けて考察した。デュー・プロセス及ぴ目標景観像を確立することが肝要であると主張した。風景計画が有する市民参画の幅広い可能性を論じる。4.風景計画とその法的根拠:『都市の風景計画』における海外の事例などをもとに、風景計画の規制がどのような法的根拠を有するのかを国際的に比較する。あわせて日本における計画規制の特色を論じる。さらに現段階における基本的人権としての環境権・景観権の可能性について触れる。また、自治体が制定している景観条例の概要と類型別の特色を述べ、風景づくりにおけるこれら自主条例の可能性と問題点を論じた。5.都市政策の中の風景計画:今日における総合的な都市政策に関する国際的な比較を通して、日本における風景計画の占めるべき位置を考察した。以下、実際例を、都道府県の景観条例、屋外広告物の規制、総合性を持った風景計画事例を調査した。すなわち、横浜市、京都市、金沢市である。次いで歴史的都市の風景計画松本市、飛騨古川、倉敷市、臼杵市の現地調査を実施した。さらに一般市街地の風景計画として、一般市街地での風景計画の可能性について論じた。最後のこれからの風景計画に向けての考察は、平成14年度の課題である。「景観基本法の提言」に関して、研究を集約して以下の11の提言にまとめた。1.風景基本法(仮称)を制定し、国と地方公共団体の責務を明らかにする2.法定の風景基本計画づくりを風景基本法の中で規定する3.電線の地中化や屋外広告物規制など、新しい風景づくりへと法の対象を拡大する4.「風景の保全と創造」を建築基準法や都市計画法など、既存の建設関連法規の目的の中へ加える5.建設関連法規の記述において、規制はナショナル・ミニマムであることを明記し、そのような運用に移行する6.特別用途地区などの新たに政正されてきた既存制度を積極的に活用する7.風景向上施策を戦略的に進めるための重点地区を指定する8.各地で制定されてきている景観条例に対して、風景基本法において根拠を与える9.デザイン審査制度を導入する10.デザイン・ガイドラインを作成する11.都市景観規制およびデザイン規制に関する専門職能を確立するなお、この提言を含む研究成果の全体について、『日本の風景計画』と題して、学芸出版社より平成15年6月頃に出版予定である。
多地域での遺跡探査を可能とする衛星データの応用に関する研究

衛星リモートセンシングデータを考古学調査の領域に応用し、世界各地に存在する多種多様な未発見遺跡の検出に利用可能なグローバルスタンダード技術を改良する。現時点における研究の最重要課題は、国や地域が異なる遺跡を対象に調査事例を積み重ね、その有効性を事例ごとに明らかにしながら実用ツールとしての技術的体系を確立することである。
腎機能低下に伴うMg代謝異常の骨由来リン利尿因子と抗加齢蛋白に対する効果の検討

透析導入時尿毒症状態にある1231例の患者において、高Mg血症は高頻度に認められ、副甲状腺ホルモン(PTH)と血清Mg濃度が独立した関連因子であることを報告した。高リン負荷ラット大動脈血管組織培養において血管石灰化部位をFTIRおよびSEM-EDXを用いた成分分析を行い、その主成分がリン酸カルシウムであることを明らかにした。Ca負荷により血管石灰化が増強し、Pit-1の発現が増加すること、さらに高リン負荷血管石灰化がMg添加により抑制されることを明らかにした。また、TRPM7の阻害作用のある2-APBを添加することで、効果が減弱し、Pit-1の発現量が減少することを明らかにした。本研究は、腎機能低下に伴うマグネシウム(Mg)代謝異常と新規骨由来リン利尿因子(FGF-23)および抗加齢蛋白(Klotho)との関連の機序解明し、血管保護と抗加齢の手段の研究の方向性を示すことを目標とする研究である。腎機能低下に伴うMgトランスポーターの変化に関しての研究をまず行うこととした。基礎研究として慢性腎不全モデルとして5/6腎摘ラットを作成した。そのうえで、腎機能に伴うTRPM6/7の発現の検討を行った。腎以外には腸管等のサンプリングも行った。5/6腎摘ラット群ではではコントロール群に比べて、TRPM7のmRNA発現は亢進していた。TRPM6の発現は変化が認められなかった。western blotting法を用いた蛋白定量を試み、現在入手できうるTRPM抗体にて行ったが、非特異的なバンドが多数認められ、現段階では蛋白発現量を測定することは不可能であった。慢性的な腎機能低下に伴うMgトランスポーターの変化に関してはTRPM7>6で発現が亢進する可能性があると考えられた。臨床的検討としては、ヒト腎生検組織における検討に先立って、透析導入時の尿毒症患者1231例の血清Mgと副甲状腺ホルモン(PTH)との関連を検討した。その中で、iPTHが血清Mg濃度との有意な関連を示すことを証明でき、論文化、投稿を行っているところである。血清MgがiPTHの有意な関連因子であることで、MgとCKD-MBD関連の機序解明の1つであることがわかった。基礎研究ラット血管培養モデルを用い、高リン培養液にて血管石灰化が促進されるモデルを用い、SEM/EDXを用いることで、血管石灰化部分の成分分析を行った。それらの研究は論文掲載予定である。さらにマグネシウムが高リン負荷による血管石灰化を抑制するのか、その抑制効果は、マグネシウム濃度に依存するのかを検討した。血管組織の高リン負荷による血管石灰化は、マグネシウムの添加によって明らかに抑制されることがわかった。SEM/EDXによる分析の結果、高リン負荷による石灰化部にリン酸、カルシウム、マグネシウムの分布が一致しており、マグネシウムによって石灰化が抑制された血管では、これらの分布が認められなかった。本研究は現在論文執筆中である。臨床研究2006年1月から2011年12月までに透析が開始されたCKD患者2441名中、除外項目に該当しない1231名を対象とし、尿毒症状態にある透析開始直前の血清Mgと血清PTH濃度およびその他の臨床的バラメーターおよび薬剤との関連を検討した。透析直前の尿毒症患者では血清Mg濃度は上昇する傾向がある。血清Mg濃度はiPTH濃度と有意な関連性が認められ、PTH調整に関連する他の因子とは独立してその関連性が認められた。このことは、Mgが尿毒症状態でPTHを調整する因子の一つである可能性を示唆していると考えられる。基礎研究では、ラット血管組織培養モデルを用い、高リン培養液にて血管石灰化が誘導される実験系を用い、SEM/EDXを用いる事で、血管石灰化部位の成分分析を行い、誘導される血管石灰化主成分はリン酸カルシウムである事がわかり、論文発表を行った。さらにカルシウム添加による血管石灰化への影響を検討するため、同様のラット血管組織培養モデルを用い、高リン培養条件下でのみカルシウム添加による血管石灰化のさらなる促進が認められた。その機序としてリントランスポーターであるPit-1の遺伝子発現及び蛋白発現が増強する事を見いだし、Pit-1阻害作用のあるPFAにより、血管中膜石灰化はほぼ完全に抑制された。この事から、カルシウム負荷はリン酸トランスポーターであるPit-1を介して血管石灰化を促進する事がわかった。カルシウムアンタゴニストであるマグネシウム負荷による血管石灰化への影響を同様のラット血管培養モデルを用いて行った。その結果、マグネシウム負荷により血管石灰化は明らかに抑制される事がわかり、その際はPit-1の遺伝子発現および蛋白発現は抑制されていた。2-APBによるTRPM7阻害により、マグネシウムの血管石灰化抑制効果は部分的に消失した。以上の事から、マグネシウムによる血管石灰化抑制の機序としてTRPM7を介する機序以外に、少なくとも一部はPit-1が関与している可能性が示唆された。

Ca負荷により血管石灰化が増強し、Pit-1の発現が増加すること、さらに高リン負荷血管石灰化がMg添加により抑制されることを明らかにした。また、TRPM7の阻害作用のある2-APBを添加することで、効果が減弱し、Pit-1の発現量が減少することを明らかにした。臨床研究に関してはマグネシウムとPTHというCKD-MBDの分野で新たな役割が注目されるマグネシウムという因子に関して解析、発表をおこなった。基礎研究では、マグネシウムが高リン負荷による血管石灰化を抑制するのか、その抑制効果は、マグネシウム濃度に依存するのかを検討し、血管組織培養モデルにおいても、高リン負荷による血管石灰化は、マグネシウムの添加によって抑制されることが明らかになり、その中で、SEM/EDXによる画像的な分析も行った点では、順調に経過していると考えられるが、血管培養モデルを用いて次のステップとしてのカルシウム濃度とリン濃度の変化によるカルシウムーリン積による血管石灰化の程度を確認し、それに対するマグネシウムによる石灰化抑制効果を明らかにし、(カルシウム×リン)÷マグネシウムの関係の検討が、行えておらず、その他にも高リン負荷+FGF23添加による血管石灰化をマグネシウムによって抑制できるのかを明らかにし、その際のERK1/2シグナル経路の活性化の有無を検討する課題も残っており、基礎研究においての課題がおくれているのが要因と考えられる。慢性腎臓病カルシウム濃度とリン濃度の変化によるカルシウムーリン積による血管石灰化の程度を確認し、それに対するマグネシウムによる石灰化抑制効果を明らかにし、(カルシウム×リン)÷マグネシウムの関係を検討を今年度中に行っていく。また、骨由来リン利尿因子(FGF23)と関係として血管培養モデルを用い、高リン負荷+FGF23添加による血管石灰化の促進をマグネシウムによって抑制できるのかを明らかにする予定である。また、今年度は現在までの実験をまとめて、成果として論文掲載を行っていく予定である。慢性腎不全モデルとしての5/6腎摘を用いる検討において、各種サンプリングは既に終えている。しかしながら、TRPMの遺伝子発現に関しては、測定を終えているが、TRPM蛋白発現に関して、western blottingでは市販されている抗体を用い検討したが、特異的なTRPMのバンドの発現が確認できず、現在入手可能な抗体を用いて検討したが、非特異的なバンド発現が多数認められ、測定に時間を要した。TRPM6および7の腎機能低下における発現に関して、mRNA発現の相違(TRPM6<7)が認められ、急性腎機能低下やさらなる腎機能低下によるmRNA発現量の相違点を今後検討する必要がある。また抗加齢蛋白(Klotho)および骨由来リン利尿因子(FGF-23)との関連を探るべく、尿細管上皮細胞培養を用いた検討も今後行う予定である。必要な試薬や抗体を測定直前に購入するものとして購入する必要があったため、次年度使用額が生じた。次年度使用額を合わせて、試薬および抗体購入費として使用する予定である。
4次元CTを用いた肩関節の動作解析

近年、4次元computed tomography (4D-CT)により3次元骨表面情報を16cm2の撮影範囲において1周0.25秒で撮像することが可能となり、この結果3D骨モデルの連続撮影が可能となった。この4D-CTの手法を用いた関節の動作解析の有用性が散見されようになっており、肩甲上腕関節を含め多くの関節は広い可動性を持ち、靭帯・腱などの軟部組織の機能により複雑な動作となるため、3次元による動作解析が好ましいことから、我々は4D-CTが肩甲上腕関節を含む関節の動作解析に有用であると考えた。本研究では肩甲上腕関節の動きを4D-CTを用いて視覚化し関節動作解析法のシステムを構築すること、およびこのシステムを用いて投球障害や腱板断裂といったこれまで病態把握が困難であった障害の動作解析からその病態を解明することを目的とした。さらに、得られたCT画像より関節軟骨下骨骨密度を計測するCTOAM法により長期応力分布を推測し本動作解析結果の妥当性についても検討する。本研究ではこれまでに、高性能CT装置を用いることで3D骨モデルの連続撮影が可能となった。また、画像情報を3次元的に処理するための解析プログラムが共同研究者の協力により開発され、肩甲上腕関節の動きを4D-CTを用いて視覚化し関節動作解析法のシステムを構築することが可能となった。本システムを用いることでこれまで解析が困難であった、肩甲上腕関節運動に伴う上腕骨頭の軌跡を計測し、これまで解析が困難であった投球動作が肩甲上腕関節に与える影響を明らかにした。本研究の結果は国内学会および国際学会にて報告され、学会誌に一部発表内容を投稿し掲載に至っている。本研究ではこれまでに、高性能CT装置を用いることで、理論上妊婦にも許容される程度の低被爆量による撮影が可能となり、肩関節の場合においても高性能CT装置を用いることで3次元骨表面情報を16cm2の撮影範囲において1周0.25秒で撮像することが可能となり、3D骨モデルの連続撮影が可能となった。また、画像情報を3次元的に処理するためには膨大な情報量の解析が必要であったが、共同研究者の協力により解析プログラムが開発され、肩甲上腕関節の動きを4D-CTを用いて視覚化し関節動作解析法のシステムを構築することが可能となった。さらに、本システムを用いることでこれまで解析が困難であった、肩甲上腕関節運動に伴う上腕骨頭の軌跡を計測することが可能とりなった。本システムを用いたところ、上腕骨頭の軌跡を計測することで投球側および非投球側における上腕頭の変位量を求めることが可能となり、これまで解析が困難であった投球動作が肩甲上腕関節に与える影響を明らかにした。本研究の結果は2018年11月に日本臨床バイオメカ学会におけるシンポジウムにおいて報告を行い、さらに同学会誌に一部発表内容を投稿し掲載に至っている。また、現在、投球障害や腱板断裂といったこれまで病態把握が困難であった障害の動作解析からその病態を解明することを目的として、これらの病態を有する対象者の解析を進めている。これまでの研究より、4D-CTを用いた関節動作解析法のシステムを構築し肩甲上腕関節の動作解析が可能となった。そこで本システムを用いて投球障害といったこれまで病態把握が困難であった障害や、腱板断裂といった障害の病態など、それぞれの障害における肩甲上腕関節の動作解析を行うことで、それぞれの病態を解明することが可能と考えられる。また、過去の報告から、関節内動作解析と関節内応力分布解析が可能と考えており、4D-CTで得られたデータは、関節内応力分布解析にも使用が可能であり、一度の検査により全く別の観点から関節動作解析を検討できる。これにより被爆の点からも医療経済的にも十分臨床応用が可能な検査となりうると考えられる。

本研究の結果は国内学会および国際学会にて報告され、学会誌に一部発表内容を投稿し掲載に至っている。本研究ではこれまでに、高性能CT装置を用いることで、理論上妊婦にも許容される程度の低被爆量による撮影が可能となり、肩関節の場合においても高性能CT装置を用いることで3次元骨表面情報を16cm2の撮影範囲において1周0.25秒で撮像することが可能となり、3D骨モデルの連続撮影が可能となった。また、画像情報を3次元的に処理するためには膨大な情報量の解析が必要であったが、共同研究者の協力により解析プログラムが開発され、肩甲上腕関節の動きを4D-CTを用いて視覚化し関節動作解析法のシステムを構築することが可能となった。さらに、本システムを用いることでこれまで解析が困難であった、肩甲上腕関節運動に伴う上腕骨頭の軌跡を計測することが可能とりなった。本システムを用いたところ、上腕骨頭の軌跡を計測することで投球側および非投球側における上腕頭の変位量を求めることが可能となり、これまで解析が困難であった投球動作が肩甲上腕関節に与える影響を明らかにした。本研究の結果は2018年11月に日本臨床バイオメカ学会におけるシンポジウムにおいて報告を行い、さらに同学会誌に一部発表内容を投稿し掲載に至っている。また、現在、投球障害や腱板断裂といったこれまで病態把握が困難であった障害の動作解析からその病態を解明することを目的として、これらの病態を有する対象者の解析を進めている。これまでの研究より、4D-CTを用いた関節動作解析法のシステムを構築し肩甲上腕関節の動作解析が可能となった。そこで本システムを用いて投球障害といったこれまで病態把握が困難であった障害や、腱板断裂といった障害の病態など、それぞれの障害における肩甲上腕関節の動作解析を行うことで、それぞれの病態を解明することが可能と考えられる。また、過去の報告から、関節内動作解析と関節内応力分布解析が可能と考えており、4D-CTで得られたデータは、関節内応力分布解析にも使用が可能であり、一度の検査により全く別の観点から関節動作解析を検討できる。これにより被爆の点からも医療経済的にも十分臨床応用が可能な検査となりうると考えられる。さらに、得られたCT画像より関節軟骨下骨骨密度を計測するCTOAM法により長期応力分布を推測し本動作解析結果の妥当性についても検討する。既存の物品を使用したため新たな購入が少なかった。追加購入に使用するため次年度に繰越する。学会や論文などの費用として使用する。
生体内微小pH変化を認識する樹木状多分岐高分子の創製と医薬キャリアーへの応用

生体内恒常性の乱れは、種々の疾病を誘発する。恒常性の乱れた部位を特異的に認識した上で、治療効果のある薬物を送り込むことが望まれる。血流フリーラジカル発生に伴う組織微小循環や好気性エネルギー代謝の影響により、局所pHの低下が認められる。そこで、pH応答性セグメントを有する樹木状多分岐高分子医薬キャリアーの設計、及び、その内包医薬、スーパーオキシドラジカルを不均化するスーパーオキシドジスムーターゼ(SOD)モデル化合物、の合成を行った。前年度合成した医薬キャリアー前駆体であるアミノ化ポリ(L-ヒスチジン)への糖鎖修飾、すなわち、マルトペンタオースの導入を行った。^1H NMRによるキャラクタリゼーションの結果、アミノ基導入率は約14%と見積もられたが、この導入率においては、ポリ-L-ヒスチジン固有の物性を維持していた。つまり、生理pH7付近においては、脱プロトン化したイミダゾール基を有するため非水溶性を示し、pH6付近においては、プロトン化により水溶性を獲得した。ところが、糖鎖導入により、キャリアーの生理pHでの水溶性が向上した。生理pHにおいては、脱プロトン化したポリ-L-ヒスチジンがミクロな疎水環境を形成していることが示唆された。また、前年度合成したSODモデル化合物、糖クラスターを有するマンガン(Mn)ポルフィリン錯体、の糖鎖認識性を検討した。レクチン固定化カラムを用いた特異的糖鎖結合実験を行った結果、糖鎖を有さないMn錯体の低結合性(約10%)に対し、糖鎖修飾した錯体は約60%の結合性を示した。従って、得られたpH応答性医薬キャリアーと糖鎖認識性を有するMnポルフィリンSODモデル医薬とを軸配位させた超分子を得ることにより、恒常性を乱す原因物質自体、及び、その産生場所の二重ターゲティングが期待される。故に、治療工学へ新たな展開を導くものと考えられる。血流フリーラジカル発生に伴う組織微小循環や好気性エネルギー代謝の影響により、局所pHが低下するため、スーパーオキシドラジカル(O_2・^-)の高効率な消去系の確立を試みた。そこで、O_2・^-を過酸化水素(H_2O_2)と酸素(O_2)に不均化するスーパーオキシドジスムターゼ(SOD)活性を有する金属ポルフィリンを核とした、樹木状多分岐高分子の設計を行った。金属ポルフィリンのSOD活性発現に重要な役割を演じている4つのカチオン性ピリジル基を保存しつつ、高分子側鎖を樹状成長させることが容易な脂肪族第一級アミノ基のワンステップ導入を行った。つまり、2-ブロモエチルアミンを用い、5,10,15,20-テトラキス(4'-ピリジル)ポルフィリンのピリジル基の4級化に成功した。4分岐の脂肪族第一級アミノ基が得られたので、O_2・^-過剰発生臓器に対する標的指向性を有する糖鎖を、(最)外殻アミノ基へ還元アミノ化により導入した。最後に中心金属にマンガン(Mn)を導入し、糖クラスターを有するカチオン性Mnポルフィリン錯体を合成した。得られたポルフィリン錯体は水溶性を有しており、凍結乾燥により回収した。そのSOD活性はストップトフロー分光蛍光光度計を用い評価した。ポルフィリン低濃度域(0-1[μM])においてO_2・^-不均化反応速度定数(Kcat)を算出すると、10^7[M^<-1>S^<-1>]オーダーの有意な値が得られた。並行して、O_2・^-を誘因としないpH変化を認識するセグメントの導入を考慮し、イミダゾール基を有するポリ(L-ヒスチジン)に着目した。上述の系に準じ、イミダゾール基への2-ブロモエチルアミンの導入に成功した。その結果、pH応答性部位のイミダゾール基と化学修飾部位のアミノ基が共存する医薬キャリアー前駆体が得られた。

レクチン固定化カラムを用いた特異的糖鎖結合実験を行った結果、糖鎖を有さないMn錯体の低結合性(約10%)に対し、糖鎖修飾した錯体は約60%の結合性を示した。従って、得られたpH応答性医薬キャリアーと糖鎖認識性を有するMnポルフィリンSODモデル医薬とを軸配位させた超分子を得ることにより、恒常性を乱す原因物質自体、及び、その産生場所の二重ターゲティングが期待される。故に、治療工学へ新たな展開を導くものと考えられる。