hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
スプライシング関連遺伝子異常による骨髄異形成症候群の分子病態の解明

骨髄異形成症候群においてRNAスプライシングに関わる遺伝子群に高頻度かつ特徴的な変異が認められるが、MDS発症における分子病態は不明である。そこで、本研究では、本遺伝子異常のモデルマウスの作成ならびに造血系への影響を解析した。Sf3b1ヘテロ欠失マウスおよびSrsf2変異マウスを用いた造血系の解析では、造血幹細胞数が減少し、造血再構築能が低下していること、さらにはSrsf2変異マウスにおいて特徴的なRNAスプライシング変化が観察された。骨髄異形成症候群(MDS)においてRNAスプライシングに関わる遺伝子群に高頻度かつ特徴的に後天的な変異が生じていることが明らかとなったが、その分子メカニズムは不明である。細胞株を用いた変異遺伝子の導入実験やウィルスベクターを用いたマウス造血幹細胞への遺伝子導入ならびに、同細胞を用いた骨髄移植実験においては、変異体発現細胞の細胞増殖等における生物学的な優位性は確認されず、また貧血などMI)S様の所見も観察されない。そこで、本研究では内因性の発現制御による生理的な発現量で評価を行うために、U2AF1、5F3B1、SRSF2においては変異体のコンディショナル・ノックインマウス、不活化変異が大半を占めるIRSR2についてはコンディショナル・ノックアウトマウスの作成を行った。今年度はCre-loxPシステムを用いたターゲティングベクターを作成し、ES細胞に遺伝子導入し、キメラマウスを経て、目的のマウスを取得した。今後、造血幹細胞レベルで組織特異的にCreを発現させるVav1-Creマウスとの交配を進め、来年度中には、同マウスを用いた解析研究を始動できる予定である。前述のマウスの作成を進める一方で、レトロウィルスベクターを用いた遺伝子導入系による骨髄移植実験によるhms病態の再現を試みた。これまでの検討では、変異U2AF1および変異SRSF2を単独で過剰発現させても、MDS病態につながる生物学的効果は確認されといないため、変異と共存する異常との複合的な効果をTET2欠失マウス由来の造血幹細胞および加齢マウス由来の造血幹細胞を用いて移植実験を行い、現在、キメリズムや血算などの経過を観察中である。細胞株を用いた変異遺伝子の導入実験やウィルスベクターを用いたマウス造血幹細胞への遺伝子導入ならびに、同細胞を用いた骨髄移植実験においては、変異体発現細胞の細胞増殖等における生物学的な優位性は確認されず、また貧血などMDS様の所見も観察されない。そこで、本研究では内因性の発現制御による生理的な発現量で評価を行うために、U2AF1、SF3B1、SRSF2においてはCre-loxPシステムによる変異体のコンディショナル・ノックイン(cKI)マウス、不活化変異が大半を占めるZRSR2についてはコンディショナル・ノックアウトマウスの作成を行った。U2AF1およびSRSF2-cKIマウスについては、Mx-Creマウスとの交配を行い、pIpC投与により、造血細胞特異的に変異アレルが設計通りに発現することが確認をされた。MDSで変異が認められるスプライシング分子は遺伝情報の翻訳過程において重要な機能を担う分子群であるが、造血における機能は明らかではないため、遺伝子変異が最も多く認められるSF3B1を欠失させたマウスの造血系の解析を行った。SF3B1をホモ欠失させた個体は胎生致死であるが、ヘテロ欠失マウスは軽度の骨格異常のみにて生まれる。ヘテロ欠失マウスの末梢血所見においては野生型マウスと差が認められなかったが、骨髄中の造血幹細胞分画は減少し、競合移植実験から野生型マウス由来の造血幹細胞に比し、造血再構築能が低下していることから、造血幹細胞において重要な役割を担っていることが明らかとなった。ただし、SF3B1変異に特徴的な環状鉄芽球をはじめとするMDS様の病態は観察されず、変異アレル特有の効果が必要であると考えられた。骨髄異形成症候群(MDS)においてSF3B1やSRSF2などのスプライシング関連遺伝子の変異は、高頻度かつ特徴的に観察をされ、MDSの病態形成に大きく寄与していると示唆されるが、その機序は明らかとされていない。そこで、分子病態を明らかとする目的に、本研究で作成したモデルマウスの解析を行った。本研究では、前年度までにSrsf2変異体のコンディショナルノックイン(cKI)マウス、U2af1変異体のcKIマウス、Zrsr2コンディショナルノックアウトマウスを作成したが、バッククロスが進んでいるSrsf2-P95HcKIマウスを用いた造血系の解析ならびにRNA解析を重点的に進めた。P95H変異はSRSF2変異の中で最も高頻度に、特にCMML例に多く認められる。

造血細胞に特異的に発現するvav1-Creアレルを持つ遺伝子改変マウスと交配をさせ、造血細胞特異的にSRSF2変異体を発現させたマウスを用いることで、野生型アレルとほぼ近似した変異アレル発現量となる、MDS患者で観察される遺伝子異常を再現した。末梢血には有意な所見は観察されなかったが、骨髄中の造血幹細胞数が、同腹の野生型マウスと比し少なく、本観察結果は非競合移植実験においても再現された。野生型マウスとの競合移植実験では、変異体マウス由来のキメリズムは低く、先に行ったレトロウィルスベクターを用いた強制発現実験と類似した観察結果であった。すなわち、SRSF2変異による造血系への影響は認められたが、クローン性増殖に代表されるMDS病態への寄与は本マウスにても再現されていない。一方で、幹細胞を含む造血前駆細胞由来のRNAのシーケンス解析では、exon usageに特徴的な変化が認められ、我々が行ったSRSF2変異陽性MDS例のRNAシーケンス解析においても同様に観察され、SRSF2変異により生じたスプライシング変化であると考えられた。26年度が最終年度であるため、記入しない。血液腫瘍学・分子遺伝学26年度が最終年度であるため、記入しない。本研究計画の遂行上、最も重要な変異体ノックイン・マウスは完成間近であり、平成25年度より、マウスの解析を進める。平成25年度までに、計画していたマウスの作成がほぼ終了し、U2AF1およびSRSF2-変異体ノックイン・マウスにおいては、計画通りに変異アレルが誘導的かつ組織特異的に発現することが確認された。後天的な1アミノ酸置換変異に基づく疾患に対する、遺伝学的に正確に再現された動物モデルであると考えられる。残るSF3B1ノックインおよびZRSR2ノックアウト・マウスについても、個体数が確保でき次第、確認を進める。確認が終了しているマウスについては、平成26年度内に詳細な解析が行える状況となっており、ほぼ予定通りに進展していると考える。また、本研究事業において重要な位置づけにあるRNAシーケンス解析についても、スプライシング変化を同定・比較するための独自のパイプラインの構築も進んでいる。現在、作成中のRNAスプライシング変異のコンディショナル・ノックインおよびノックアウトマウスを用いて、造血幹細胞レベルで誘導的に変異アリルを発現させ、造血系に及ぼす効果を解析し、本変異のMDS発症に関わる分子メカニズムを明らかとする。現在、観察中の移植マウスについても、引き続き、解析を行う。完成したマウス系統については、計画通りのアレル組み換えが生じるかを確認の上、C57BL/6マウスとのバッククロスを進め、より正確な解析が可能な個体作出を目指す。十分なバッククロスを行うためには、非常に長い時間を要するため、体外授精(IVF)とマイクロサテライトマーカーを用いた評価を組み合わせて行い、期間の短縮を目指すことで、H26年度内に長期的な観察以外の予定されている研究計画が実施可能である。また、バッククロスに必要な個体数を確保の上で、随時MxCreもしくはVav1-Creマウスと交配させ、バッククロスと並行して予備検討を早期に開始する。
ケニア海岸地方のスピリチュアリティおよび宗教性に関する人類学的国際学術研究

本研究課題は東アフリカの宗教性およびスピリチュアリティを中心的なテーマとして、1日本、ケニア、英国の研究者(人類学、宗教学、哲学、映像・写真作家等)との国際共同研究を推進すること、2上記1のプロジェクトに若手研究者の育成を組み込むこと、3上記1と2の成果を国内外で発表することを主たる目的としていた。13についてほぼ期待通りの成果を得られることができたし、最大の成果は東アフリカ研究を媒介として日本、ケニア、英国の国際共同研究の連携を強化することができ、研究拠点を形成してゆくためのユニークな学術ネットワークを構築することができた点にある。本研究は申請額よりも低予算配分だったため、当初は3つのプロジェクトを予定していたが、研究連携者等との打合せを踏まえ「言語と宗教」以外の2つのプロジェクトを優先することになった。また、平成23年度は予算配分が12月になされたため、時期的な問題から当初予定していた代表者によるケニア現地調査やアフリカ人類学セミナーを実施できなかったが、ケニア人研究者を招聘するなど可能な範囲でカヤ・プロジェクトと国際学術研究(若手研究者支援を含む)の推進を行った。以下に研究実績を簡潔かつ具体的に報告する。1.カヤ・プロジェクト:ケニア海岸地方に点在する世界遺産「聖なるカヤの森」を中心に、平成23年度はカヤを管理するミジケンダに帰属する研究者(G.クンバータ氏)を招聰し、ケニア人研究者との学術交流の基盤を確立した。また、氏は代表者(慶田)との共同研究テーマの設定を行い、さらには国内の研究連携者(浜本)や研究協力者(東アフリカ研究者4人)との研究連携を深めた。2.国際学術研究:まず、若手研究者の国際学術研究を支援した。久我(熊大)は英国とカナダでケニア海岸地方に関する資料収集と研究ネットーワーク構築を行い、中原(九大)はケニアで、香室(熊大)はナミビアで、久下(熊大)はルワンダで現地調査を行った。慶田は英国オックスフォード大学社会文化人類学研究所との連携(D.ゲルナー教授)を再確認し、D.パーキン(オールソウルズ・カレッジ名誉教授)と協力し、国際学会での発表(2013年)、日本でのセミナー開催(2013年)、ケニアでの現地共同調査(2014,2015年)などの具体的な研究計画を話し合い、継続的に研究推進することになった。3.その他:2012年度から国内で行うアフリカ人類学セミナーに参加予定の研究連携者・協力者(浜本、岡崎、田川、梅屋、上田冨士子など)と打合せをし、「妖術・邪術・呪術」をテーマとした研究会を開催することになった。H25年度の交付申請書の「研究目的」および「研究実施計画」に照らし、当該年度に実施した研究成果について述べる。1)H25年度は、当初の予定通りH25年8月5日10日に英国マンチェスター大学で開催された第17回国際人類民族科学連合(IUAES)での研究パネルG20: Trust in Super-Diversityを慶田勝彦(研究代表者)、岡崎彰(連携研究者)、D.パーキン(海外研究協力者)を代表として組織した。H25年8月6日に上記3名の他、梅屋潔(神戸大学)、小川さやか(立命館大学)、吉田優貴(明治学院大学)、橋本栄莉(一橋大学)、田口陽子(京都大学・JSPS研究員)、A.サントス(オックスフォード大学)、N.ベックマン(ローハンプトン大学)、J.チェスワース(オックスフォード大学)、I.バーヤ(オックスフォード大学)の9名を加えた12名で研究発表を行い、その後、パネル原稿の論集化や研究協力体制のあり方について議論すると同時に各自がIUAESの参加者と新たなネットワークを構築した。英国滞在中、慶田は岡崎、秋月(研究協力者)とともにR.ワーブナー教授(マンチェスター大学)との研究連携を深め、IUAES研究大会終了後はD.パーキン教授、D.ゲルナー教授(オックスフォード大学)、R.リトルウッド教授(UCL)から本研究プロジェクトに関して貴重な助言を得た。2)ケニア海岸地方の調査に関しては、若手研究者の岡本(九大)と秋月(熊大・研究員)を研究協力者として、それぞれクワレ地区とモンバサに派遣した。また、慶田は別のプロジェクト資金でカヤを訪問すると同時にケニアのキリフィに位置するプワニ大学との研究連携を新たに確立することができた。また、慶田はカヤ・プロジェクトとの関係で2013年5月には国立民族博物館で開催された文化遺産をめぐる国際シンポジウム(英語)で発表した。H24年度の交付申請書の「研究目的」および「研究実施計画」に照らし、当該年度に実施した研究成果について述べる。1)H24年度の前期(9月まで)は、H25年8月5日10日に英国マンチェスター大学で開催される第17回国際人類民族科学連合(IUAES)での研究パネル組織(組織者は本科研の代表者慶田と連携者岡崎、海外研究協力者のD.パーキン)を進め、その過程でケニアおよび東アフリカにおけるスピリチュアリティと宗教性についての情報交換や議論を行った。最終的に日本から7名(熊本大、一橋大、神戸大、国立民族学博物館)、英国(オックスフォード大学)から5名の東アフリカ研究者がパネルで発表することになった。パネル名はTrust in Super-Diversityで一般発表の部でエントリー(G20)が確定している。IUAESでのパネル組織は本科研の目的のひとつである人類学的国際学術研究にとって重要な位置にあり、具体的な成果のひとつとなるが、本年度はその準備を予定通りに進めることができた。

2)ケニア海岸地方の調査に関しては、研究連携者の浜本が中心に実施した。特に浜本と同じ地域を調査する岡本(九大)を研究協力者として長期現地調査に派遣し、浜本と慶田が調査研究の助言にあたった。浜本はこれまでの調査データを駆使して、ケニア海岸地方の妖術に関する報告書(現在、出版申請中)を作成した。慶田は若手研究者の香室(熊大)を比較研究のためナミビアに派遣し、研究指導を行った。また、橋本(一橋大)を比較研究のためにスーダンに派遣したが、本研究指導は岡崎が担当した。岡崎自身もH25年度のIUAESでの発表のため、スーダンとガーナで調査研究に従事した。久我もケニアでの長期調査を継続し(別資金)、その研究指導を慶田が担当した。平成26年度は計画の一部を変更したが、ケニアとの国際共同研究体制をより充実させた点が最も大きな成果であり、また、これまで支援してきた若手研究者たちが個々に成果を出してきている点も成果のひとつである。第一に、代表者の慶田はケニアでの現地調査(カヤ・プロジェクト)を行うと同時に、ケニア海岸地方キリフィにあるプワニ大学人文社会学部・大学院と慶田が属する熊本大学文学部および社会文化科学研究科との間で正式な学術間交流協定を締結し、中長期的な共同研究拠点を確立した。第二に、この共同研究拠点化と連動して、海外連携研究者のシモーネ・グラッシ(映像作家)と協力し、東アフリカ・映像人類学研究センター(仮)の設置を日本、イタリア、ケニアの間で進めてゆく計画に着手した。現地調査においてはマリンディ文化協会(MADCA)と連携し、カヤをめぐる現地の動向についての聞き取り調査を継続し、それ以前の調査については2014年4月にナイル・エチオピア学会で発表した。第三に、アフリカ人類学セミナーの一環として平成26年度は東アフリカの宗教性とスピリチュアリティに関する理論研究成果(エヴァンズ=プリチャードを焦点化)を特集化するための研究会等を開催した。この成果(論文)を『文化人類学』に投稿し(企画者は佐々木重洋、投稿者には若手研究協力者の橋本、代表者の慶田が参加)、すべての論文の採択、掲載(2015年秋)が決定した。研究連携者の岡崎も予定通りに国際学会での発表を行い、また、海外研究連携者のシモーネもマリンディ文化協会センターおよび英国東アフリカ研究所で開催されたセミナーで研究成果の一部(映画上映含む)を発表した。本年度はケニアとの連携および国内での研究成果発表作業を中心にしたため、予定していた英国研究者との共同研究を推進することができなかったが、2015年度中には彼らとの研究成果を可視的にする予定である。平成27年度は本研究課題の最終年度にあたり研究の総括を含んでいるが、本年度の交付申請書で列挙していた計画の研究実績の概要を以下に述べる。1)平成27年度はプワニ大学と熊本大学の研究者双方が本務校での業務との折り合いがつかず、国際共同研究会等を開催することはできなかったが、プワニ大学を始め、BIEA(英国東アフリカ研究所:ナイロビ)、オックスフォード大学等との研究連携は継続している。2)平成24年度のIUAESでのパネル発表論集刊行は出版社等の事情で遅れていたが、D.Parkin(オックスフォード大学)との打合せを通じて、平成28年度に日本文化人類学会の英文雑誌(JRCA)に投稿することになった。
電磁加熱による機能材料プロセシングに関する研究

大阪大学接合科学研究所とオーストラリアのウォロンゴン大学との大学間協力研究として以下の目的を設定し、大出力マイクロ波やプラズマあるいはイオンを利用した新しい電磁加熱プロセスに関する研究を平成7年度から2年間にわたって遂行してきた。1.従来より優れた性能を持つニューセラミックスならびに、これらの複合化・傾斜構造化による新しい機能性材料の創製を目指す。2.電磁場や荷電粒子とこれらの材料の相互作用を微視的立場から解明し、従来の熱的なプロセスとの比較を行う。3.さらに、これらの機能材の接合研究により新しいプロセスとしての完成をめざす。4.以上の研究内容を共同に持ち寄り討議するため、平成7年度ならびに平成8年度の両年度に、日本・オーストラリア間の国際共同シンポジウムにおいて、研究成果について学術討論を行うと共に、新しい材料合成・加工科学の開拓に貢献し、国際協力の実を上げる。本研究で得られた成果を以下にまとめる。まず、上記の1のテーマについて、高融点で且つ仕事函数が低く、さらに酸素あるいは塩素などの反応性ガスを含む雰囲気における耐消耗性に優れたプラズマ用新電極材料としてTaCおよびHfCに注目し、アルゴン高周波プラズマによる燒結と得られた燒結体の電極特性を調べた。その結果、TaCは燒結時間を十分長くとれば燒結助材の添加無しでも、90%以上の相対密度が得られ、また塩素を含むアークプラズマ雰囲気中で安定した電極特性を示した。一方、HfCは金属Hf粉を30%添加することによって、燒結密度の大幅な上昇が認められ、また得られた燒結体より作製した電極は空気プラズマ中で、従来電極より優れた特性を示した。次いで、2番目の目的のうち電磁波と材料との相互作用については、電磁波中でのセラミックス焼結特性を従来の熱的プロセスとの比較ならびにセラミックスの放射する赤外線スペクトルに重点をおいて研究を遂行した。周波数28GHzのミリ波帯電磁波を用いて、窒化珪素ならびにジルコニアの焼結実験を行い、従来の電気炉よりも低温かつ短時間の内に緻密化が進行し、著しい粒成長を伴うことなく緻密な焼結体を作製することが可能であることを明らかにした。特に、窒化珪素の焼結においては、焼結過程における窒素雰囲気の圧力が焼結特性に与える影響を明らかにすると共に、曲げ強度として1GPaを越える実用近い特性の焼結体が作製可能であることを示した。また、高強度の電磁場中で加熱されたセラミックス試料から放射される赤外線スペクトルの計測により試料の温度ならびにその誘電特性を予測する手法の開発を行い、従来の2色放射温度計等に比べ温度計測の精度が向上することを示すと共に、焼結過程での電磁波の吸収特性の予測にも有効であることが示された。さらに、荷電粒子との相互作用に関して、特に(Ti、Al)N系窒化物セラミックスの合成について研究を行い、イオン照射による熱的に非平衡な反応場が相構造および微視的構造に及ぼす効果を明らかにした。3.の機能材の接合研究に関する基本的な問題として、異種材料薄膜を基材に形成する際における剥離のメカニズムを力学的に解明することをテーマとして着目し、ひずみエネルギー開放率に基づいて残留応力と座屈を考慮した有限要素法を開発した。さらに、4番目の目的として、以上の研究内容を共同に持ち寄り討議するため、平成7年度ならびに平成8年度の両年度に、日本・オーストラリア間の国際共同シンポジウムを開催し、研究成果の発表ならびに上記の電磁プロセスに関する国際的な学術討論ならびに情報交換を行った。本研究計画の初年度においては、平成8年3月にオーストラリア・ウォロンゴン大学にて国際共同シンポジウムを開催し、日本側・オーストラリア側双方から計13件の成果報告を行った。さらに、2ヶ年の共同研究全体のまとめと国際的学術討論を目的として、平成9年2月3日から2日間にわたって大阪大学接合科学研究所において国際共同シンポジウムを開催した。このシンポジウムでは、日本およびオーストラリアのみならず、米国、ロシア、ドイツから招へいした著名な研究者を加え、100名あまりの参加者により上記の電磁プロセスについて、22件の研究発表と共に活発な学術討論を行った。

一方、HfCは金属Hf粉を30%添加することによって、燒結密度の大幅な上昇が認められ、また得られた燒結体より作製した電極は空気プラズマ中で、従来電極より優れた特性を示した。次いで、2番目の目的のうち電磁波と材料との相互作用については、電磁波中でのセラミックス焼結特性を従来の熱的プロセスとの比較ならびにセラミックスの放射する赤外線スペクトルに重点をおいて研究を遂行した。周波数28GHzのミリ波帯電磁波を用いて、窒化珪素ならびにジルコニアの焼結実験を行い、従来の電気炉よりも低温かつ短時間の内に緻密化が進行し、著しい粒成長を伴うことなく緻密な焼結体を作製することが可能であることを明らかにした。特に、窒化珪素の焼結においては、焼結過程における窒素雰囲気の圧力が焼結特性に与える影響を明らかにすると共に、曲げ強度として1GPaを越える実用近い特性の焼結体が作製可能であることを示した。また、高強度の電磁場中で加熱されたセラミックス試料から放射される赤外線スペクトルの計測により試料の温度ならびにその誘電特性を予測する手法の開発を行い、従来の2色放射温度計等に比べ温度計測の精度が向上することを示すと共に、焼結過程での電磁波の吸収特性の予測にも有効であることが示された。さらに、荷電粒子との相互作用に関して、特に(Ti、Al)N系窒化物セラミックスの合成について研究を行い、イオン照射による熱的に非平衡な反応場が相構造および微視的構造に及ぼす効果を明らかにした。3.の機能材の接合研究に関する基本的な問題として、異種材料薄膜を基材に形成する際における剥離のメカニズムを力学的に解明することをテーマとして着目し、ひずみエネルギー開放率に基づいて残留応力と座屈を考慮した有限要素法を開発した。さらに、4番目の目的として、以上の研究内容を共同に持ち寄り討議するため、平成7年度ならびに平成8年度の両年度に、日本・オーストラリア間の国際共同シンポジウムを開催し、研究成果の発表ならびに上記の電磁プロセスに関する国際的な学術討論ならびに情報交換を行った。本研究計画の初年度においては、平成8年3月にオーストラリア・ウォロンゴン大学にて国際共同シンポジウムを開催し、日本側・オーストラリア側双方から計13件の成果報告を行った。さらに、2ヶ年の共同研究全体のまとめと国際的学術討論を目的として、平成9年2月3日から2日間にわたって大阪大学接合科学研究所において国際共同シンポジウムを開催した。このシンポジウムでは、日本およびオーストラリアのみならず、米国、ロシア、ドイツから招へいした著名な研究者を加え、100名あまりの参加者により上記の電磁プロセスについて、22件の研究発表と共に活発な学術討論を行った。全体としては、当初計画した研究目的ならびに研究計画・方法に対しほぼ8割程度が達成されており、順調に研究計画を遂行しているものと考えている。日本側ならびにオーストラリア側において実施した研究により得られた成果を以下にまとめる。1.プラズマ加熱とマイクロ波による直接吸収を併用した複合加熱接合法を開発し、窒化珪素焼結体とステンレス鋼の接合における有効性が確かめられた。2.炭化珪素を用いたマイクロ波
脂質2分子膜相分離構造の側方圧依存性とラフト形成機構の解明

ソフトマターとしての細胞膜は、環境に応じた様々な形状や、融合・分裂等の膜変形、膜面上でのドメイン構造形成などの多様な現象を生じる。我々は、細胞膜の物性および組織化メカニズムを理解するため、脂質膜ベシクルを用いた膜構造ダイナミクスの実験的研究を行った。結果、液滴法による非対称2層膜ベシクルの構築、および相分離ドメイン構造の観察に成功した。細胞膜モデルとして幅広く利用されている巨大ベシクルは、その多くが水和法により作製され、対称な二層膜構造をとっている。これに対し、実際の細胞膜は内外層で異なった脂質組成をもち、二層膜の非対称性を再現したベシクルの構築はこれまで困難であった。我々は、液滴法による非対称巨大ベシクルの構築およびキャラクタリゼーションを行った。液滴法とは、脂質でおおわれた油中液滴を油水界面単分子膜を介して水相に移行させて、非対称2層膜を形成させる方法である。溶液の比重を調整することで、数μmから数十μmの細胞サイズの非対称ベシクルを選択的に得ることに成功した。そして、外膜に単一脂質、内膜に多成分脂質を使用した非対称ベシクルを構築し、蛍光顕微鏡観察より内膜のみに相分離ドメイン構造の形成を確認した。さらに、片方の単層膜の脂質組成を変化させることで、もう片方の単層膜上ドメイン構造が影響を受けることを発見した。対称分布膜では内外層の組成が等しいためドメイン構造は内層と外層でカップルして安定に存在していたが、内外層の異なる組成で形成されたドメインは2分子膜内での相互作用により不安定化することが分かった。ソフトマターとしての生体膜は、環境に応じた様々な形状や、融合・分裂等の膜変形、膜面上でのドメイン構造形成などの多様な現象を生じる。我々は、生体モデル膜として多成分ベシクルを用いて、膜構造ダイナミクスの実験的研究を行った。細胞が物質を取り込む過程(エンドサイトーシス)は、脂質膜の内包変形および内包された小胞の分裂からなる動的な膜構造変化であり、この膜内包機構のひとつとして膜面内に存在するミクロドメイン構造(脂質ラフト)が近年注目されている。このドメイン構造は脂質多成分系における膜面内相分離構造体であると考えられ、巨大ベシクルによるモデル研究が進められてきている。我々は、ドメインを持つ脂質多成分巨大ベシクル系において、外部刺激(浸透圧および界面活性剤)による応答を蛍光顕微鏡でリアルタイム観察した。結果、ベシクル上のドメインが内側に向かって自発的に出芽するプロセスを見いだした。この内包過程はドメインサイズに依存し、「ドメイン陥入による内包(simple budding)」と「ドメイン境界からの連続的小胞放出(wavy budding)」の2つのパターンに分けられた。また、wavy buddingにより形成された膜小胞は単分散のサイズ分布を示した。これは、サイズのそろった小胞を生み出す力学的性質を脂質膜自体が備えている事を示唆する。膜面の弾性エネルギーと相境界エネルギーを考慮に入れた自由エネルギーを用いて、ドメイン内包のメカニズムを説明した。
植物生産物の植物病原菌制御に対する応用

ミカン科及びセンダン科には強力な苦味物質であるリモノイドが含まれている。これらのリモノイドは幅広い生理活性を示し、昆虫の摂食阻害ならびに動物や人間に対する医薬品的効果、抗かび、殺菌剤、抗ウイルス活性などとして種々の生長抑制作用等を持っている。アフリカの西海岸の熱帯雨林に分布するアフリカンマホガニー(Khaya ivorensis A.)の各部位からリモノイドを単離し、それらの化学構造を決定するため、つぎのような継続実験を行い、生理活性を研究した。採集した樹皮をジエチルエーテルで抽出したのち、シリカゲルを充填したオープンカラムで分画した。カラムから塩化メチレンとアセトンの濃度勾配法により活性物質を溶出した。HPLCと組み合わせて精製し、アンゴレンセイト、D環が開環したリモノイド、メキシカノイドの10個のリモノイドを単離した。リモノイドの構造は^1Hと^<13>C-NMRを用いて解析した。次に単離したリモノイドについて抗かびや抗菌活性を数種の食品を介した病原菌や植物病原菌を用いて研究した結果、methyl angolensateと1,3,7-trideacetylkhivorinが最も強い抗カビ活性を示した。さらに、日本に自生しているサルトリイバラの葉を山から採集し、メタノールで抽出したのち、濃縮し、シリカゲルクロマトグラフィーによって抗菌物質を精製したが、生理活性が低かったため、伝統的な薬として用いられていたMagnolia grandifloraから抗菌物質を抽出して、結晶化した。葉と樹皮から塩化メチレンとメタノールで抽出してシリカゲルで精製したものはparthenolide, costunolide,1,10-epoxyparthenolideの3種のセスキテルペンラクトンであり、そのうちparthenolideが最も強い抗菌活性(MIC25mg/l)を示した。これらは纏めて国際誌に投稿している。
mos癌遺伝子による癌化における細胞同期調節因子及び核内癌遺伝子産物の活性制御

1.Mosによる細胞がん化におけるMAPキナーゼの関与:Mosによる細胞がん化経路におけるMAPK活性化の意義について検討するため、MAPKKの一部子種であるMEK1のcDNAをクロン化すると共に、優勢不能型および優勢活性型MEK1を発現させるためのベクターを作製した。これらとMosとをNIH3T3細胞において共発現させることにより、優勢不能型MEK1がMosによるトランスフォーメーションを完全に抑制できることを明らかにした。一方、これとは対照的に、野生型MEK1の共発現によって、Mosのトランスフォーム能が顕著に高まることも示した。また、優性活性型MEK1はそれだけでトランスフォーム能を持ち、生じたフォーカスの形態的な特徴はMos単独によって生じたものと区別できないほど良く似ていた。以上の結果を総合することにより、MosによるNIH3T3細胞のがん化には、MEK1/MAPキナーゼカスケードの活性化が必須にして充分であることを初めて明らかにした。その一方で、RafやRasによるがん化には、複数の(MEK1/MAPKおよびそれ以外の)シグナル伝達経路が存在している事を示す結果を得た。2.Mosによる核内原がん遺伝子産物の修飾、活性調節作用の解析:Mosとc-Fosの共発現における相乗的ながん化能増強の原因として、Mosのキナーゼ活性に依存して、c-Fosの蓄積量およびリン酸化が著しく増加していることを見いだした。次いで、Mosの存在下で起きるc-FosのC末端領域での特異的なリン酸化によって、c-Fosが代謝的な安定化を受けることを明らかにした。したがってMosは、本来きわめて半減期の短い転写調節因子であるc-Fosの機能を、リン酸化を通じた安定化によって制御できることが示された。
内因性ウワバイン様物質の簡便な測定法の開発

^<32>Piによる(Na^++K^+)-ATPaseのウワバイン感受性リン酸化反応を利用し,ウワバイン様物質を再現性良く簡便に測定する方法を開始することを目的とし,本研究を行い次の成績を得た.1)α(+).αアイソザイムの^<32>Piによるリン酸化の性質について検討し,ウワバイン非存在下でのリン酸化能が低いこと,低濃度(10^<-8>M)のウワバインでリン酸化が促進されることから,本測定系にはα(+)アイソザイムが適していることを明らかにした.2)α(+)の^<32>Piによるリン酸化がK+により抑制されたので,本測定系のサンプル前処理において,リン酸に加えK^+の除去が必要となった.3)サンプルの前処理として, C_<18>-SepPaKカートリッジ,ゲルマンイオン交換フィルターの使用が有効であることが判明した.4)α(+).αアイソザイムが,コンホメーション変化の点で異なっていることを明らかにした.5)ラット血しょう中のウワバイン様物質の精製をHPLCで試みたが,成功しなかった.この原因として,その阻害物質の量が正常ラットにおいては低いということが考えられた.6)循環器系に障害をもつ病態動物モデルとしてビタミンB_1欠乏ラットを用い,血しょう中阻害物質の量的変動を検討したが,変化は認められなかった.以上,本測定で内因性ウワペイン様物質を測定することが可能となったが,本測定法には〔^3H〕ウワバイン結合実験や(Na^++K^+)-ATPase活性の阻害による従来の測定法と比べそれ程簡便さは認められなかった.しかしながら,従来の方法で得た因子の性質をより詳細に検討する場合,本測定法は大変重要なものであると考えられる.^<32>Piによる(Na^++K^+)-ATPaseのウワバイン感受性リン酸化反応を利用し,ウワバイン様物質を再現性良く簡便に測定する方法を開始することを目的とし,本研究を行い次の成績を得た.1)α(+).αアイソザイムの^<32>Piによるリン酸化の性質について検討し,ウワバイン非存在下でのリン酸化能が低いこと,低濃度(10^<-8>M)のウワバインでリン酸化が促進されることから,本測定系にはα(+)アイソザイムが適していることを明らかにした.2)α(+)の^<32>Piによるリン酸化がK+により抑制されたので,本測定系のサンプル前処理において,リン酸に加えK^+の除去が必要となった.3)サンプルの前処理として, C_<18>-SepPaKカートリッジ,ゲルマンイオン交換フィルターの使用が有効であることが判明した.4)α(+).αアイソザイムが,コンホメーション変化の点で異なっていることを明らかにした.5)ラット血しょう中のウワバイン様物質の精製をHPLCで試みたが,成功しなかった.この原因として,その阻害物質の量が正常ラットにおいては低いということが考えられた.6)循環器系に障害をもつ病態動物モデルとしてビタミンB_1欠乏ラットを用い,血しょう中阻害物質の量的変動を検討したが,変化は認められなかった.以上,本測定で内因性ウワペイン様物質を測定することが可能となったが,本測定法には〔^3H〕ウワバイン結合実験や(Na^++K^+)-ATPase活性の阻害による従来の測定法と比べそれ程簡便さは認められなかった.しかしながら,従来の方法で得た因子の性質をより詳細に検討する場合,本測定法は大変重要なものであると考えられる.細胞膜酵素である(【Na^+】+【K^+】)-ATPaseは、強心配糖体であるウワバインの薬理学的受容体と言われており、また細胞膜には特異的なウワバイン結合部位が存在している。このことは、エンドルフィン類の発見から見て、生体内におけるウワバイン様物質の存在を示唆し、近年いくつかの因子が報告されている。これらの内因性ウワバイン様物質に対する研究は、(【Na^+】+【K^+】)-ATPaseの活性調節機構を追求する上で重要であり、また高血圧との関連から考えて、臨床的立場からも注目されている。本研究は、ATPaseの逆反応を用いて、この物質の簡便な測定法を開発しようとするもので、現在までに(【Na^+】+【K^+】)-ATPaseの【^(32)Pi】によるリン酸化反応の基礎的性質を明らかにした。酵素標品としてはラット延髄(α(+)型),小脳(α(+)とα型),ラット,ウサギ,モルモット腎臓(α型)より部分精製したものを用いた。【^(32)Pi】によるリン酸化には、α(+),α型ともに【Mg^(++)】を必要とした。α(+)型の場合α型と異なり、【Mg^(++)】単独ではリン酸化はほとんど見られなかった。【Mg^(++)】存在下において、両型ともにウワバインによりリン酸化が促進されたが、その感受性は異なっていた。すなわちα(+)型の場合【10^(-8)】M以上で、α型の場合【10^(-5)】M以上の濃度で促進効果が見られた。また、これらの効果は【K^+】により選択的に阻害されたが、その阻害作用はα型の方が大きかった。

以上の成績から、内因性ウワバイン様物質の測定には、α(+)型酵素の方が適していると考えられた。一方、正常ラット血液中の内因性ウワバイン様物質に関しては、血しょうを熱処理し遠心後に得られる上清分画に〔【^3H】〕ウワバイン結合を阻害する物質が存在していることを認め、この分画が本阻害物質の精製のための出発物質となることを明らかにした。現在、試料から無機リン,【K^+】を除く前処理法について、また〔【^3H】〕ウワバイン結合の阻害度で本因子活性を測定することでラット血しょうからの本物質の精製について検討中である。
HIV-1感染症におけるA3Gのアセチル化とVif/HDAC3複合体の役割

APOBEC3Gのアセチル化をp300過剰発現およびHDAC阻害剤投与時に抗アセチルリシン抗体を用いてウエスタンブロット法で確認した。p300過剰発現の有無でサンプルを作成し免疫沈降したAPOBEC3Gを質量分析により解析し、既報のVif感受性に関わるリシン残基を含む5カ所のアセチル化リシン部位を同定した。該当リシンのアルギニン変異体を作成し機能解析を行い、C末端のアルギニン変異体で蛋白安定性、Vif抵抗性に影響が見られた。二重蛍光レポーターHIV(Duo Fluo HIV)を用いてJurkat T細胞および初代培養活性化T細胞を用いてGFPおよびmKO2陽性のウイルス産生性感染細胞とmKO2単独陽性の潜伏感染細胞を単離した。Alu-PCR法により潜伏感染細胞とウイルス産生性感染細胞で同程度のウイルスゲノム挿入を確認した。次にqPCR法でウイルスRNAを検討し、ウイルス産生細胞でのみウイルスRNAの検出を確認した。ウイルス産生性感染細胞、潜伏感染細胞および非感染細胞の各分画での遺伝子発現をCAGE法により解析した。各分画7500万CAGEタグの解析結果から非感染細胞や潜伏感染細胞と比較してウイルス産生性感染細胞では2000程度の遺伝子に発現の変化が見られた。潜伏感染細胞と非感染細胞が非常に似ていたが、その中で潜伏感染細胞で特異的に発現が低下する33遺伝子を同定した。潜伏感染細胞のみで特異的に発現が増加する遺伝子はなかった。本研究の目的はHIV-1 Vif/HDAC3複合体がどのようにHIV-1の病態に影響しているかを明らかにし、その臨床的意義および新規治療法の理論的背景を提供するため、下記の3項目を中心として研究を進めている。1. A3GおよびHIV-1 Vifのアセチル化とその機能への影響2. HIV-1 Vif/HDAC3複合体によるタンパク質脱アセチル化の網羅的解析3. HIV-1 Vif/HDAC3複合体による転写制御の網羅的解析およびHIV-1潜伏感染への影響このうち1.に関して、VifとHDAC3の機能解析を行いHDAC3によるVifの安定化に関し学会報告した。1.に関して、VifとHDAC3の機能解析を行いHDAC3によるVifの安定化に関し学会報告した。2.、3.に関しては網羅的解析に向けて実験系の再確認が進んでいる。p300過剰発現の有無でサンプルを作成し免疫沈降したAPOBEC3Gを質量分析により解析し、既報のVif感受性に関わるリシン残基を含む5カ所のアセチル化部位を検出した。p300の過剰発現をしない条件でもアセチル化が検出された。該当のリシンのアルギニン変異体を作成し機能解析を行っている。潜伏感染モデルの作成のため二重蛍光レポーターHIV(Duo Fluo HIV)を用いてJurkat T細胞および初代培養活性化T細胞を用いて感染実験の条件設定を行った。GFPおよびmKO2陽性のウイルス産生性感染細胞とmKO2単独陽性の潜伏感染細胞を検出し、それぞれソーティングを行い遺伝子発現解析を予定している。APOBEC3Gのアセチル化部位を検出でき、機能解析を行っている。Duo Fluo HIVの感染実験の条件検討がすみ、遺伝子発現解析を行う予定である。次年度はA3Gのアセチル化修飾部位の質量解析および組換えウイルスと初代培養末梢血T細胞を用いた潜伏感染細胞モデルの構築および網羅的解析の準備を行う。アルギニン変異体の機能解析と、潜伏感染細胞の遺伝子発現解析を行う。網羅的解析を次年度に予定したため。不足分を別資金より充当したため残額が発生しました。研究項目2.の質量解析に使用する。
調和解析とその応用

調和解析の問題は、平行移動不変作用素の問題に帰着されることが多い。それを扱う効果的な実解析的理論として、特異積分の理論があるが、近年その理論の範疇に収まらない作用素が注目されている.そこでは掛谷の極大関数は補助関数として重要な役割を果たすのであるが、精密な評価が得られていない。猪狩は特殊な基を持つ掛谷の極大関数に対し完全な評価を与えた。それは、動径関数に対して精密な評価を与えJ.Bourgainなどの結果の一部をも与える。新井は、境界のすべての点で楕円性が退化するような楕円型偏微分作用素を調和解析の視点から研究した。シュタイン多様体の強擬凸領域やデータ構造を持つ多様体、有限型領域等の境界で退化する楕円型偏微分作用素に関する調和解析の理論の基礎をつくり、論文を準備中である。また、多変数正則関数の各点ファトウ問題解決への十分可能性のある糸口を見出した。ナヴィエ・ストークス方程式の解の一意性は古くから研究されているが,未解決の重要問題である。増田は、一意性について、実解析的な,まったく新しい方法を導入して,従来のとは異なる手法で、この問題の解決の糸口をみつけた。この結果は、イタリアのヴェローナで開催した国際会議で報告された。また、2次元複素空間形内の実2次元定曲率極小曲面の分類に関する予想を剱持勝衛氏との共同研究で解決した。斎藤は非可換調和解析の研究を続けた。Ara,Goldstein等によって示されたRickart C*-環のσ-正規性について新しい初等的証明を与えることによってC*-環の単調完備性の研究にとって重要な道具を開発した。また、C*-環の研究でσ-正規性、完全加法的量子測度について新しい知見を得た。猪狩は,特殊な基底に対して定義される掛谷の極大関数にたいして,予想される評価が成り立つ事を示した.この結果は,動径関数に対する従来知られている結果を包含する.また,d(>3)次元以上の場合は,一般の基底に対する掛谷関数のT. Wolffの評価と併せると,d-ルベ-グ空間において現在知られている最もよい評価を与える.将来これをもとに最終的な評価とともにリ-ス.ボッホナ-作用素をモデルとするある種の振動積分の評価を試みたい.新井は,多様体の境界で退化する楕円型偏微分方程式の調和解析の研究に成果をあげた.モレ-空間の実解析的研究を行い,準楕円型擬微分方程式やデ-・バ-方程式の解の評価にたいする新しい評価を得た.立沢は,ウイルソン基底や局所三角基底,あるいはガボ-斜交系を用いて,大域的擬微分作用素の特異値の評価の研究を行った.その結果,擬微分作用素がSchatten-von Neumannクラスに属するための新しい条件を得た.増田は,ロトカ・ヴォルテラ型の反応拡散系を研究し時間増大時における解の大域的挙動,極限集合などを定めることに成功した.高木は,半線形楕円型境界値問題の解の研究をおこなった.特に,活性因子-抑制因子型の反応拡散方程式系に対し定常解について新しい知見をえた.斉藤は,C^*環に関するAra-Goldsteinの結果「Rickart C^*環は正則である」を,C^*環の基本的性質のみを用いて初等的に証明することに成功した,従来の証明は深い解析と複雑な経緯を経て証明されていた.掛谷の極大関数は,る種の振動積分の評価,多変数フーリエ解析との関連で興味をもたれている.しかし3次元以上の場合は,予想される評価問題は解決していな.

猪狩は,特殊な基底に対して定義される掛谷の極大関数に対して,予想される評価が成り立つ事を示した.この結果は,動径関数に対する従来知られている結果を包含する.今後は基底の一般化を試みること,およびフーリエ解析への応用を考えたい.新井は,抽象的な等質空間上にハ-ル基底のアナロジーを考え,その調和解析への応用を研究した.これはウェーブレットが構成できないような多様体や複雑な集合上によい基底を構成し,応用をするための基礎的研究である.またブラックホールに関連した非線形双曲型方程式の研究をおこなった.沢は,ガボ-斜交系を用いて,擬微分作用素の解析を行った.特に表象がどのような条件を満たすとき作用素がシャッテンクラスに属するのかを調べた.また,作用素の固有関数の評価を与えた.堀畑は,調和写像に付随する熱方程式の存在,部分的正則性,特異点の大きさに関する研究をした.そして特異点の大きさ,位置とエネルギーの関係について一定の成果を得た.増田は,非線系放物型偏微分方程式の研究において,古典的な滑らかさをもたない(弱)解に対して比較定理,最大値の原理を示すのに成功した.斎藤は,作用素環は,非可換測度空間とみるときどのような構造をしているのか,関数解析、およびフーリエ解析の道具をもちいて研究した.その結果つぎの結果を得た:ノイマン環に対して,その上の完全加法的測度がすべて有界であるための必要十分条件は,そのイマン還が有限次元の直和因子をもたないことである.掛谷の極大関数の精密な評価は,ある種の振動積分の評価.多変数フーリエ解析において重要な役割をはたす.しかし3次元以上の場合は,予想される評価問題は解決していない.猪狩は,特殊な基底に対して定義される掛谷の極大関数に対して,予想される評価が成り立つ事を示した.この結果は,いくつかの知られている評価を与えることがわかってきたが,最終的な評価を得るための手がかりをあたえるものと考え,研究を進めている.新井は,境界のすべての点で楕円性が退化するような楕円型偏微分作用素を調和の視点から研究した.シュタイン多様体の強擬凸領域やテーター構造を持つ多様体,有限型領域等の境界で退化する楕円型偏微分作用素に関する調和解析の理論の基礎をつくり,現在その論文を準備中である.また,特異楕円型偏微分作用素の調和解析を拡散過程をい使って研究したその結果,多変正則関数の各点ファトウ問題解決への十分可能性のある糸口を見出した.立択は,ウイルソン基底及びガボーフレームを用いて,擬微分作用素の解析を行った.つまり,ウイルソン基底を固有関数の代用として,作用素の性質を調べることを行なった.これによって,従来のものとは異なる,作用素の表象のある値を用いた固有値の漸近評価が得られ,さらに固有値の個数の漸近評価を与えることができた.堀畑は,ある函数のクラスに於いて与えられたディリクレ積分の最小化函数でない調和写像を見つけることが目標とし,調和写像に付随した熱方程式系について,弱解の存在,正則性,部分的正則性,解の時間的挙動を研究した.時間を差分化する方法によって,弱解の性質について一定の結果をえた.増田は剱持との共同研究によって,極小曲面にかんするある常微分方程式系の解の性質を詳しくしらべ,最終的に,そのシステムのすべての場合に,非自明な共通解の非存在を証明した.その結果を利用し,複素2次元複素空間形内の一定ガウス曲率を持つ極小曲面を分類に成功した.
高均一大口径ECRプラズマリアクターの開発研究

大口径ウェハを高速に処理可能なプラズマプロセス用リアクターの実現を目指して、マルチアニュラー(MA)アンテナを採用した電子サイクロトロン共鳴(ECR)プラズマリアクターを試作した。MAアンテナは、多重の円環状スリットから、同軸管で給電されるマイクロ波を放射し、スリット出口付近に設置した永久磁石列により作られたリングカスプ磁場のECR層でプラズマを生成する。この磁場構造は、プラズマを円周方向にドリフトさせるのでプラズマの均一性が向上する。また、各スリット内ではプラズマの生成が抑止されているため、マイクロ波はスリット出口から先のプラズマ中を強磁場側から弱磁場側へと伝搬し、R波の励起によって高密度プラズマが生成される。試作リアクターにより、ガス圧力5×10^<-4>Torrにおいて、直径30cm、密度2×10^<11>cm^<-3>のプラズマが生成された。MAアンテナのスリット数を変化させて密度、電子温度の均一性を調べた結果、最外周の1列を用いた場合が最良であり、密度8-10×10^<10>cm^<-3>のプラズマの均一度は、直径30cmで±10%であった。拡散方程式の数値計算により、MAアンテナのスリット数と密度の均一性との関係を吟味した結果、スリットがむしろ管壁近くにある方が均一性を得られやすいことが示され、実験結果と良く対応した。さらに、数値計算結果にもとずき、管壁近傍に2つの円環状スリットを持ち、それぞれからの放射マイクロ波電力を独立に変化可能なA(adjustable)MAアンテナを試作した。これは、2つのマイクロ波源から、2重同軸管によって2つの円環状スリットに独立に給電されるものである。このAMAアンテナを用い、2つのマイクロ波源の電力を加減することにより、密度のさらなる上昇、および均一性の向上が可能となった。10インチ以上の直径に渡って均一かつ高密度で、しかも電子エネルギー可変のプラズマを発生可能な新しいECRプラズマリアクターの開発研究を行っている。1.2次元ECRプラズマシミュレーションコードにより、マルチリングカスプ表面磁場のもとでのECRプラズマ生成を計算し、高密度プラズマ生成のために必要なマイクロ波モード整形器の寸法を決定した。また、TE_<11>モードだけでなくTM_<01>モードもプラズマ生成に大きく寄与することが分かった。2.2台の1.3kWマグネトロンを方向性結分器を用いて互いに弱く結合させると引き込みを起こし、抵抗負荷に対して安定な同相あるいは逆相発振をさせ得ることを確認した。3.直径35cmの多重円筒型モード整形器とマルチリングカスプ表面磁場を組み合わせたマイクロ波アンテナを試作した。入射電力約500Wにて、アンテナの近傍で密度3×10^<11>cm^<-3>、7cmの位置で0.6×10^<11>cm^<-3>の直径40cmのプラズマ生成に成功した。プラズマの均一度は直径28cmに渡って3%以内であった。4.マグネトロン電源にパルス変調を加えて生成プラズマに過渡的な高電子エネルギー状態を作り出すことにより、シラン、メタン等の材料ガスのプラズマ中での解離速度およびシリコン基板上への堆積速度が増大することが実証された。来年度は、生成プラズマの可視光トモグラフィ計測を行い、2次元分布を求め、シミュレーションと比較する。また、リアクター内に直径10インチの基板を設置し、膜を堆積させ、基板各部の堆積速度をレーザー干渉計によりin-situ計測する。また堆積後、基板各部の膜厚、膜質を計測し、成膜の均一度を評価する。

大口径ウェハを高速に処理可能なプラズマプロセス用リアクターの実現を目指して、マルチアニュラー(MA)アンテナを採用した電子サイクロトロン共鳴(ECR)プラズマリアクターを試作した。MAアンテナは、多重の円環状スリットから、同軸管で給電されるマイクロ波を放射し、スリット出口付近に設置した永久磁石列により作られたリングカスプ磁場のECR層でプラズマを生成する。この磁場構造は、プラズマを円周方向にドリフトさせるのでプラズマの均一性が向上する。また、各スリット内ではプラズマの生成が抑止されているため、マイクロ波はスリット出口から先のプラズマ中を強磁場側から弱磁場側へと伝搬し、R波の励起によって高密度プラズマが生成される。試作リアクターにより、ガス圧力5×10^<-4>Torrにおいて、直径30cm、密度2×10^<11>cm^<-3>のプラズマが生成された。MAアンテナのスリット数を変化させて密度、電子温度の均一性を調べた結果、最外周の1列を用いた場合が最良であり、密度8×10^<10>cm^<-3>のプラズマの均一度は、直径30cmで±10%であった。拡散方程式の数値計算により、MAアンテナのスリット数と密度の均一性との関係を吟味した結果、スリットがむしろ管壁近くにある方が均一性を得られやすいことが示され、実験結果と良く対応した。さらに、数値計算結果にもとずき、管壁近傍に2つの円環状スリットを持ち、それぞれからの放射マイクロ波電力を独立に変化可能なA(adjustable)MAアンテナを試作した。これは、2つのマイクロ波源から、2重同軸管によって2つの円環状スリットに独立に給電されるものである。このAMAアンテナを用い、2つのマイクロ波源の電力を加減することにより、密度のさらなる上昇、および均一性の向上が可能となった。
遺伝子の一塩基変異を見分けるDNAコンジュゲートデバイスの開発

現在の遺伝子診断法の多くは相補的な二重らせん形成に立脚している。しかしながら、DNAの二重らせんは、その一部の塩基対が不整合であってもある程度は形成されてしまうため、長い遺伝子配列における一塩基の違いを単純な原理で見分けることは困難である。本研究ではこれまでに、ポリ(N-イソポロピルアクリルアミド)(PNIPAAm)-DNA複合体の相転移によって自発的に形成するポリマーミセルの自己凝集反応を活用して、サンプルDNAの末端に存在する一塩基変異を目視検出することに成功している。本年度は、今後の実用化のために検出限界を向上させることを目指して、ポリマーミセルの構造最適化に取り組んだ。サンプルDNAの必要量を下げるためには、ポリマーミセルの表面上に固定されたプローブDNAの絶対量を減らすことが最も直接的な解決策である。そこで、PNIPAAm-DNA複合体におけるDNAの共重合比を従来の0.3mol%から低下させるために、この複合体にPNIPAAmを混合して見かけの共重合比を1/10の0.03mol%にまで下げた。その結果、ポリマーミセルの平均粒径が、従来の49nmから210nmへと4倍以上に大きくなることが分かった。これは凝集による濁度上昇がより容易に起こることを意味している。実際、ポリマーミセルを形成させるために使用する全ポリマー量を従来の0.1mg/mLから1/2の0.05mg/mLにまで下げても、濁度上昇を日視で検出できることが明らかになった。場上の方法を組み合わせることにより、検出限界を1/20にまで下げることに成功した。これは、検出に必要なサンプルDNAの濃度が、2.56μMから0.13μMにまで低減されたことに相当しており、細胞から抽出した遺伝子をPCRによって増幅・調製したサンプルに対しても充分に適用可能であることが実証された。DNAのコンジュゲートは熱応答性高分子であるpoly (N-isopropylacrylamide) (PNIPAAm)とDNA(9量体)から構築した。導入するオリゴヌクレオチドは、ターゲットのガン遺伝子(c-K-rasのコドン10から12の範囲の9量体)に対して相補的な配列を用いた。このコンジュゲートを水中で相転移させると、PNIPAAmの疎水核表面に一本鎖DNAを担持した平均粒径46nmのコロイド粒子が自発的に形成した。このコロイド粒子の分散液にターゲットのガン遺伝子を加えると、急激に粒子が凝集して系が白濁するのに対し、その塩基変異体を加えた場合には溶液は透明なままであった。上述の凝集現象を、長鎖サンプルDNAに拡張した二重鎖形成方式を検討した。サンプルにコロイド粒子上に担持された9量体DNAに対して、相補的あるいは一塩基変異を含む24量体DNAを用いた場合、サンプルDNAがコロイド粒子上のDNAと二重鎖を形成しても15塩基の一本鎖部分が残るため、粒子の凝集は見られなかった。しかし、この一本鎖部分と相補的な補助DNAをさらに追加すると、NaCl濃度が500mM以上で粒子の凝集による系の白濁が観察された。これに対し、補助DNA存在下、検出部位を一塩基置換した変異型サンプルDNAを添加した場合では、同じ塩濃度条件でナノ粒子の凝集は全く見られなかった。以上の方法により、ナノ粒子に担持させたDNAよりも長い鎖長のサンプルの一塩基変異を検出することに成功した。