hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
両生類の系統についての内分泌学的アプロ-チ

両生類を中心として、脳下垂体のペプチドホルモンを純化し、その抗体を作製し、また受容体との結合性を調べ、両生類の系統学的特徴をこれまでと違った立場から明らかにしようとした。その成果を述べる。1)生殖腺刺激ホルモン(GTH)の純化と、その抗体の種特異性:ヒキガルの脳下垂体から濾胞刺激ホルモン(FSH)と黄体形成ホルモン(LH)を純化し、それらの抗体を作製した。交差反応実験からヒキガエルに免疫学的に似てはいるが明らかに異なるFSHとLHの分子が存在すること、これらの分子は両生類のうちヒキガエルとオオヒキガエルとでは似ているが、ヒキガエルとウシガエルとではかなり異なり、鳥類や哺乳類とはもっと異なることが分った。2)GTH受容体のFSH/LH特異性:ウシガエル精巣のGTH受容体には、FSHの作用を伝えるものと、LHの作用を伝えるものの2種類があっても、それらのホルモン結合部位はFSHとLHを区別出来ないことが明らかとなった。すなわち、ウシガエルではホルモン分子は完全に二つに分化していても、その受容体の分子のほうはまだ完全には分化していないことが、明らかにされた。このために、一方のホルモンが他方のホルモンの競合阻害をおこす可能性が考えられるが、これもFSHはLHの結合に正の共同作用を示すことが明かとなり、少なくとも、FSHはLHの競合阻害物とはなりにくくする機構があることが分かった。3)ウシガエルのプロラクチンに対する抗血清はヒキガエルのプロラクチンとは交差反応を示すが、哺乳類のものとは交差しないことが明かにされた。4)以上及び他の研究から、有尾両生類やアフリカツメガエルの類は高等な脊椎動物の祖先に比較的近いが、RanaやBufoのような無尾両生類はかなり特異的に分化したグル-プではないかと結論された。その成果を述べる。1.ウシガエルの生殖腺刺激ホルモンは高等な脊椎動物のホルモンと同じように、瀘胞刺激ホルモン(FSH)と黄体形成ホルモン(LH)の2種があるが、高等な脊動物と異なって、ウシガエルでは、FSHとLHは共通な受容体に結合すること、言いかえれば、ウシガエルには1種類の生殖腺刺激ホルモン受容体しかないことが分った。2.ヒキガエルのFSHとLHも純化することができたので、その受容体を調べたところ、これも1種類であることが分った。3.上の結果から両生類では、生殖腺刺激ホルモンは2種類に分化していても、その受容体は分化せず1種類のままである可能性が示された。4.ヒキガエルのFSHやLHに対する抗体そっくり、ウシガエルのFSHやLHに対する交又性を調べたところ、弱い交又が認められた。鳥類、哺乳類、魚類の生殖腺刺激ホルモンは全く交又を示さなかった。5.ヒキガエルの生殖腺刺激ホルモン受容体に対して、ウシガエルの生殖腺刺激ホルモンはかなり高い親和性を示すが、哺乳類や鳥類、魚類の生殖腺刺激ホルモンはほとんど親和性を示さなかった。6.哺乳類のFSHはヒキガエルやウシガエルの生殖腺刺激ホルモン受容体に全く結合しないといってよいが、アフリカツメガエルや数種の有尾両生類の受容体には極めて良く結合する。この結果から、アフリカツメガエルはウシガエルはヒキガエルよりも有尾両生類に似ていると結論された。7.ウシガエルのプロラクチンに対する抗体はヒキガエルのプロラクチンに対しても交又反応を示し、ヒキガエルのプロラクチンに対する抗体もウシガエルのプロラクチンに交又反応を示すことが明らかとなった。明らかにされた重要な事実をあげよう。

一つは両生類では哺乳類や鳥類と同じように生殖刺激ホルモンの分子は瀘胞刺激ホルモンに黄体形成ホルモンの2種に分化していても哺乳類、鳥類とは異なって、これらのホルモンの受容体のホルモン結合部位は未分化で、両ホルモンを区別できないことである。すなわち両生類では進化の過程でこれらのホルモン分子の分化は完全におこっていても、受容体分子の分化は不完全であり、少くともこの場合、受容体分子の分化はホルモン分子の分化よりおくれて生じるといえよう。さらに、生殖腺刺激ホルモンと受容体との結合性からみると、ウシガエルやヒキガエルはアフリカツメガエルとは縁が遠く、アフリカツメガエルは有尾両生類に近いこと、また、有尾両生類とアフリカツメガエルは魚類よりも哺乳類や鳥類に似ていることなどが明らかとなった。生殖腺刺激ホルモンの化学構造、プロラクチンの化学構造、プロラクチンのcDNAの構造からみると、両生類は魚類よりも、哺乳類に近いと結論された。しかし、両生類にはそれ独特の特徴、たとえば生殖腺刺激ホルモンが肝臓に作用してアデニルシクラ-ゼを活性化し、何らかの生理作用を果していること、また、精巣の生殖腺刺激ホルモン結合部位には、二種のホルモンを区別する性質はないが、一方が他方の競合阻害をおこさないようにする特別な機構が受容体に存在することも判明した。以上、両生類と哺乳類・鳥類とのへだたりは魚類とのへだたりほど大きくないこと、両生類の中でも、アフリカツメガエルの類は他の無尾類よりも有尾類に近いこと、両生類にはいくつかの独特な特徴があることなどが結論された。
ミトコンドリアの選択的分解に必要な新規因子の網羅的探索と機能解析

ミトコンドリアは細胞の発電所として、生命機能に必須の役割を果たしている細胞小器官である。最近、ミトコンドリアを丸ごと除去する仕組み「マイトファジー」が、ミトコンドリアの品質管理にとって重要であると提唱されてきたが、その分子機構は殆どわかっていなかった。本研究では出芽酵母を用い、選択的ミトコンドリア分解を解析可能な現象として捉えるとともに、マイトファジーに関与する因子を網羅的に同定することに成功した。【平成20年度】ミトコンドリア・オートファジーを欠損した遺伝子破壊株の探索と表現型解析1.ミトコンドリアGFPマーカーを発した遺伝子破壊株の作製ミトコンドリア・オートファジー(マイトファジー)を蛍光顕微鏡で可視化するため、ミトコンドリア・マトリックス局在シグナル配列付きGFP(mito-GFP)をコードしたプラスミドで細胞を形質転換し、約5150株のミトコンドリア可視化株コレクションを作製した。2.蛍光顕微鏡を用いた網羅的1次スクリーニング上記コレクションを、グリセロールを含む非発酵性の96ウェル選択液体培地に殖菌後、培養し、蛍光顕微鏡での観察を行った。液胞への取り込み後、ミトコンドリアの膜構造と多くのタンパク質は消化されるが、分解されにくいGFPは液胞に残る。mito-GFPで可視化されたミトコンドリアに加えて、球状のGFPシグナルを持つものをネガティブ、持たないものをポジティブとし、1次スクリーリングを行った結果、53株のマイトファジー欠損変異株を単離した。そのうち、顕著な表現型を示すもので未解析の遺伝子をMTV1(M__-itochondria T__-ransport to V__-acuoles)と命名し、機能解析を現在行っている。【平成21年度】ミトコンドリア・オートファジー変異株の2次スクリーニングと表現型解析1.2次スクリーニング蛍光顕微鏡による網羅的1次スクリーニングで単離されたミトコンドリア・オートファジー変異株について、栄養飢餓誘導型の非選択的オートファジーやCvt経路(液胞酵素の生合成に働く選択的オートファジー)が正常に働いているかどうかを、酵素学的アッセイとウェスタンブロットの手法を用いて調べた。現在までに、4種類の変異株において、栄養飢餓誘導型オートファジーおよびCvt経路が正常に起こっていることを示すデータが得られている。2.表現型解析上記2次スクリーニングの結果、ミトコンドリア・オートファジーに特異的な異常が認められた変異株について、ミトコンドリア分解を調べるため、ウェスタンブロットと蛍光顕微鏡観察を行った。その結果、ミトコンドリア分解が顕著に低下していることを明らかにした。これらの変異株でミトコンドリアや液胞の形態に異常は認められなかったことからも、変異株が欠失しているタンパク質がミトコンドリア分解に直接関与する可能性が考えられる。【平成22年度】新規ミトコンドリア・オートファジー関連タンパク質の機能解析前年度までの研究で、蛍光顕微鏡による網羅的1次スクリーニングで単離されたミトコンドリア・オートファジー変異株について、栄養飢餓誘導型の非選択的オートファジーやCvt経路(液胞酵素の生合成に働く選択的オートファジー)が正常に働いているかどうかを、酵素学的アッセイ、ウェスタンブロット、電子顕微鏡解析、光学顕微鏡観察の手法を用いて調べた。また、ミトコンドリア・オートファジーに特異的な異常が認められた変異株について、ミトコンドリア分解を定性的かつ定量的に調べるため、ウェスタンブロット、蛍光顕微鏡観察、電子顕微鏡解析を行った。その結果、エンドソーム・リソソーム系の膜輸送、タンパク質のアセチル化、脂質合成、タンパク質の新現合成の標的化に関与するタンパク質の欠損でミトコンドリア分解が顕著に低下することを確認した。またこれら因子の欠失変異細胞において、ミトコンドリア・オートファジーの選択性を規定する鍵タンパク質Atg32の発現は正常であることがわかった。興味深いことに、これら新規ミトコンドリア分解関連因子は、その多くが酵母からヒトまで保存されている。これらの知見は、選択的ミトコンドリア分解が細胞内の様々なプロセスと密接に結びついて起こること、その仕組みは共通のメカニズムで制御されていることを示唆するものである。今後の詳細な解析により、ミトコンドリア・オートファジーの分子機構の全貌に迫ることができると期待される。
チンパンジーとヒトのＦＯＸＰ２転写因子の脳内標的の異同の解析

FOXP2遺伝子は転写因子をコードしており、その機能は言語に関わる非常に興味深い遺伝子である。FOXP2の標的遺伝子を単離するため、FOXP2 transgene細胞を作成しマイクロアレイ法で検出した。この網羅的スクリーニングにより、多数抽出された。今回は、2way ANOVA解析により、ヒトFOXP2で2個、FOXP2 isoformで31個、chimp FOXP2で6個の遺伝子が変化したところまで、候補を絞った。次に神経芽細胞腫由来Tg FOXP2の細胞を作製し、再現性を解析した。両者の細胞で発現促進された遺伝子群が数個が認められ、グリア細胞由来やマトリックス形成に関するものであった。FOXP2は言語関連遺伝子として注目を浴びており、その変異は特異的言語障害を起こす。転写因子であるFOXP2のターゲットを同定することは、言語障害の診断ばかりでなく、ヒトの言語の進化を考察するうえで非常に有用である。そこで我々は、ヒト、チンパンジー、ヒトisoform特異的FOXP2遺伝子のTET ON/OFFプロモーター下流に挿入されたtransgeneをFlip in recombinazeで、Hek293由来細胞株に導入した。これらの操作は、すべての生物学的backgroundを同一にし、それぞれのtransgeneをONにした場合に、変化をきたす遺伝子群をスクリーニングするためである。Affymetrics社製GeneChip Human Gene 1.0 ST Arrayに4種のtransgeneのON/OFF 3サンプルづつハイブリし、変化のある遺伝子群を選出した。次にneuronとgliaに分化能のある、GOTO細胞にヒト、チンパンジー、ヒトisoform特異的FOXP2遺伝子の発現ベクターを安定的にゲノムに挿入した。これらの細胞群は、ランダムなゲノム領域に挿入されているが、multipleなコロニーを拾い上げ、そのRNAを抽出しマイクロアレイでスクリーニングにおいて変化のあった遺伝子群が、GOTO細胞で挿入されたFOXP2遺伝子の発現で同様の動きが認められるかreal time PCRで確認した。その結果、マイクロアレイのスクリーニングとGOTO細胞で同じ発現する遺伝子もあれば、反対の発現を示す遺伝子もあった。言語関連遺伝子は、転写因子であり、ヒト言語の進化に関わってきたと推測されている。この転写因子の標的遺伝子を見つけ出し、言語がどのような分子生物学的機序で、発達してきたかのヒントを得るのが目的である。Hek293細胞にヒト、チンパンジー、ヒトisoform FOXP2遺伝子の過剰発現させ、動きが見られた遺伝子群をマイクロアレイで網羅的に解析した。動きのあった遺伝子を、ひとつひとつデーターベースから、言語への関与を推測した。さらに再現性を見るために、他の細胞を用いて遺伝子発現の変化を確認する解析を引き続き行った。最終年度にかけて、再びヒト、チンパンジー、ヒトisoform FOXP2遺伝子のG418耐性遺伝子を含む過剰発現ベクターを作製し、神経芽細胞由来細胞株にG418培養液下、染色体に安定的に挿入された細胞を回収し、real time PCRでアレイで得られたーゲットとなる遺伝子群のFOXP2による動きを解析した。外部からのFOXP2の導入により、GABA遺伝子群の一部は、FOXP2により抑制される傾向があった。グリア細胞で発現する遺伝子が上昇が認められた。Isoform FOXP2遺伝子が、もっとも大きく遺伝子の変化を認めた。これらの変化した遺伝子群から、共通のカスケードを見出すことを、行っている。また、FOXP2タンパクは齧歯類からチンパンジーまで1つのアミノ酸の変化しか伴わない、高度に保存されたタンパクである。ヒトに進化した段階で2つのアミノ酸変化をきたしており、転写因子であるFOXP2のターゲットを同定することは、言語障害の診断ばかりでなく、ヒトの言語の進化を考察するうえで非常に有用である。Human Gene 1.0 ST Arrayに4種のtransgeneのON/OFF 3サンプルづつハイブリし、変化のある遺伝子群を選出した。結果的にTet OFFでもtransgeneからリークしており、必ずしもOFFとONの状態ではないことが明らかになた。したがって単純な2群間の分散分析では本当の変化した遺伝子がスクリーニングできないことが明らかになった。また、スクリーニングで使用する統計学的手法により選び出される遺伝子群が大きく違っていた。どの統計学的手法で選び出すべきかを検討した。

また、volcano法でOFFとONのグループに差が大きかった遺伝子群30個を選び出し蛍光LUXプライマーを用いてreal time PCRで再現性を確認した。使用したHek293細胞はヒト胎児腎細胞が由来であるが、神経で特異的に多く発現している遺伝子も今回のスクリーニングで陽性に出ており、神経特異的遺伝子に絞って再解析中である。マイクロアレイのスクリーニングと、GOTO細胞におけるFOXP2遺伝子発現による影響を受けた遺伝子群は、当然完全に一致するわけではない。その遺伝子発現の違いや機能を一つ一つ吟味しており、相当の時間がかかっている。得られたヒト・チンパンジー・ヒトisoform特異的FOXP2とnegative controlのCAT遺伝子のON/OFFで1サンプルあたn=3アレイ解析を行った。そのため8種類24サンプルのアレイ結果を得ているが、そのグループで有意差を示す遺伝子の選出法に難儀している。TET OFFといえどもtransgeneから目的の遺伝子がリークして発現しており、またnegative controlからもendogenousなFOXP2の発現が見られる。このような状態を考慮して、2群間の分散分析では挿入した遺伝子特異的に変化した量的違いをとらえにくい。多変量解析なども試みたが、選出されてきた遺伝子群はリアルタイムPCRの再現性確認では有意に差がでない遺伝子が多い。多量なデーターから本当の変化を検出するのに時間を要した。TET ON/OFFプロモーター下流に挿入されたtransgeneをFlip in recombinazeで、Hek293由来細胞株に導入した厳格にback groundをそろえた細胞から得られたRNAの変化した群を、今回おこなったGOTO細胞に挿入されたtransgeneされたFOXP2遺伝子により、どう変化するか、real time PCRでさらに多くの遺伝子群を比較する。両者で同様の変化を認めれば、確実にまた神経においても影響を受けていることになり、FOXP2転写因子カスケードに存在する遺伝子といえる。また、データーベースから、それぞれの変化した遺伝子の機能を推測し、言語関連に必要な遺伝子群の機能を推測する。マイクロアレイスクリーニング結果に対する多グループ間の比較における効率的な解析方法を探索するために、さまざまな手法を試みる。現在のところ、他群のなかでTet ON negative controlとの各ヒト、チンパンジー、または、ヒトisoform Tet ONの2群間での分散分析で有意差のあった遺伝子群のなかで、発現量の倍率が大きく変わった遺伝子群を拾い上げ、その遺伝子のOFF群や、他transgene群での動きを視覚的にみるのが最も再現性が高い。
家族性高脂血症モデル動物にみる動脈硬化発生機序と発症予防・進展抑制に関する研究

我々は粥状動脈硬化初期巣の中心病巣をなしているマクロファ-ジ(Mφ)由来の泡沫化機構、および泡沫化に関与するatherogenicリポ蛋白の解析を行ってきた。従来より、研究を進めてきている過程で、LDLが酸化を受けることにより変性修飾を受けた酸化LDLがMφを泡沫化することをin vitroで確認した。次に、抗酸化剤であるプロブコ-ルを遺伝的に粥状動脈硬化を起こしてくるWHHLウサギに投与し続けたところ、その病変の進展を完全に抑制する事実を発見した。このことは、in vitroにおいても酸化LDLが存在するという一つの証拠になるわけである。この様なことから、生体内に存在しうる酸化LDLのMφへの取り込み機序、およびプロブコ-ルの抗動脈硬化性がどのレベルで行われるかにつき検討した。酸化LDLはMφに存在する酸化LDLに特異的な受容体を介して取り込まれることが明らかになった。プロブコ-ルはこの過程を阻害しないが、プロブコ-ル食を摂取した家兎から得たLDLの酸化は、ほぼ完全に阻害することがわかった。このことがプロブコ-ルの作用機序として最も重要であることが明らかになった。Mφや内皮細胞は種々の生理活性物質を分泌し、動脈硬化の進展、あるいは抑制に働きうるわけであるが、その中で動脈硬化に関係深い、IL-1、MDGF、アラキドン酸代謝産物の合成分泌にプロブコ-ルが関与するか否か検討したところ、現時点では、その硬化が認められなかった。次に、in vivoで酸化LDLの候補となり得るタバコ煙修飾LDLを我々は提唱してきたが、この反応には、活性酵素が関与しており、従って、SODで産生が阻害される。このLDLもまた酸化LDL受容体で代謝されることが明らかになった。今後、今回の研究から明らかになった、酸化LDL受容体の単離、その構造決定を行い、動脈硬化形成の分子レベルでの研究を進展して行きたい。我々は遺伝的に高コレステロール血症及び動脈硬化症を発症するWHHLウサギに抗酸化剤プロブコールを投与することにより動脈硬化症の発生を予防することに成功した。プロブコールの抗動脈硬化作用につき詳細な分子機構の解明を試みた結果以下のことが明らかになった。(結果)プロブコールを投与したWHHLウサギより得たLDL(PーLDL)及び普通食を食べさせたWHHLウサギの血漿より得たLDL(CーLDL)の酸化修飾を検討したところ、0.5μMの銅イオンの存在でCーLDLは容易に酸化を受けたが、PーLDLは酸化修飾を受けず、過酸化脂質定量の指標であるチオバルビツール酸反応物(TBARS)の上昇及びMφの泡沫化が起こらなかった。また、プロブコールがMφの泡沫化を直接抑制するのかどうかを明らかにするためプロブコールを加えた培地でMφと種々のリポ蛋白を共に培養してみたが、βVLDLや酸化LDL、アセチルLDLによるMφの泡沫化はプロブコールの追加による影響を受けなかった。またMφの細胞膜に対する影響を調べるためにプロブコールを食べさせたマウスやWHHLウサギより腹腔Mφを得てリポ蛋白による泡沫化を調べたところ、上記リポ蛋白による泡沫化は抑制されなかった。さらに、プロブコールを取り込ませたMφを用いて同様の実験を行ったが、やはり泡沫化の抑制はみられなかった。

以上の結果よりプロブコールはMφのリポ蛋白取り込みや泡沫細胞形成には影響を与えず、LDLの酸化修飾を抑制する効果によりinvivoでWHHLウサギの動脈硬化巣形成を抑制することが明らかになった。Mφが泡沫化にともない産生する化学物質に付いては、我々はすでに酸化LDLがMφのプロスタグランディンE2、ロイコトリエンC4の産生を促す事実を報告しているが、さらに予備実験で酸化LDLがMφのインターロイキン1の産生を促すことを確認した。今後プロブコールによる産生抑制作用を調べていく予定である。(Mφ=マクロファージ)我々は粥状動脈化初期巣の中心病巣をなしているマクロファ-ジ(MΦ)由来の泡沫細胞の泡沫化機構、および泡沫化に関与するaterogenicリポ蛋白の解析を行ってきた。従来より、研究を進めてきている過程で、LDLが酸化を受けることにより変性修飾を受けた酸化LDLがMΦを泡沫化することをin vitroで確認した。次に、抗酸化剤であるプロブコ-ルを遺伝的に粥状動脈硬化を起こしてくるWHHLウサギに投与し続けたところ、その病変の進展を完全に抑制する事実を発見した。このことは、in vivoにおいても酸化LDLが存在するという一つの証拠となるわけである。この様なことから、生体内に存在しうる酸化LDLのMΦへの取り組み機序、およびプロブコ-ルの抗動脈硬化性がどのレベルで行われるかにつき検討した。酸化LDLはMΦに存在する酸化LDLに特異的な受容体を介して取り込まれることが明らかになった。プロブコ-ルはこの過程を阻害しないが、プロブコ-ル食を摂取した家兎から得たLDLの酸化は、ほぼ完全に阻害することがわかった。このことがプロブコ-ルの作用機序として最も重要であることが明らかになった。MΦや内皮細胞は種々の生理活性物質を分泌し、動脈硬化の進展、あるいは抑制に働きうるわけであるが、その中で動脈硬化に関係深い、IL-1、MDGF、アラキドン酸代謝物産の合成分泌にプロブコ-ルが関与するか否か検討したところ、現時点では、その効果が認められなかった。次に、in vivoで酸化LDLの候補となり得るタバコ煙修飾LDLを我々は提唱してきたが、この反応には、活性酸素が関与しており、従ってSODで産生が阻害される。このLDLもまた酸化LDL受容体で代謝されることが明らかになった。今後、今回の研究から明らかになった、酸化LDL受容体の単離、その構造決定を行い、動脈効果形成の分子レベルでの研究を進展して行きたい。
細胞センサーとしてのGタンパク質共役受容体

ムスカリン性アセチルコリン受容体M2サブタイプ変異体の結晶化・高次構造の解明を主目的とした。約8Aの回折点を示す結晶が再現的に得られる条件を見いだしたが、原子構造の解明には至らなかった。副次的課題として、ムスカリン受容体の細胞内第3ループがフレキシブルな構造を取ること、ムスカリンM4受容体の細胞内移行には2つ以上の機構が併存すること、ムスカリン受容体のリサイクリングに関わるモチーフの同定、などの結果を得た。ムスカリン性アセチルコリン受容体M2サブタイプの変異体(糖鎖非結合型で、細胞内第3ループ中央部分を除去したもの)をバキュロウイルス・Sf9細胞発現系、リガンドアフィニティークロマトグラフィー(Aminobeztropine-agarose)系で比較的大量に調製・精製し、その結晶化を試みている。特定研究経費で購入したX線解析装置(Micro Max 007/AXIS IV-GUIW/S(リガク))での検討を平成16年1月から開始した。10A程度の回折点を示す結晶は再現的に得られるが、より高分解能の回折点を示す結晶は得られていない。界面活性剤の選択、沈殿剤の選択などの条件検討を行っている。Gタンパク質共役受容体のカルボキシ末端とGタンパク質αサブユニットのN末端を結合させた受容体・Gα融合タンパク質を作成し、受容体とGタンパク質の相互作用を検討した。リガンド無添加あるいはアンタゴニスト添加、部分アゴニスト添加、フルアゴニスト添加で、この順にGタンパク質のGDPへの親和性が低下した。それぞれのリガンドの奏効性(Efficacy)は、GDPへの親和性を変化させる程度で決定されると考えられる。アゴニスト添加によるGDP親和性の低下にはMg^<2+>イオンの共存が必要であった。受容体・Gα融合タンパク質はリガンド検索にも応用可能である。ヒトゲノム配列から見いだした新規のGタンパク質共役受容体とGタンパク質αサブユニットとの融合タンパク質を調製し、リガンド検索を行った。いくつかの代理アゴニスト(surrogate agonists)を見いだした。培養細胞に発現させたムスカリン受容体をアゴニストに曝しておくと、受容体のエンドサトーシス(細胞内移行)が起こる。このアゴニスト依存性細胞内移行の特性はサブタイプ間で異なる。サブタイプ特異性に関与する部位を同定する試みを行っている。ムスカリンM_2受容体変異体の結晶化の試みを継続している。X線回折装置の日常的な使用により、結晶を再現的に生成できるようになった。しかし、回折点の分解能は10A程度にとどまっている。M_2,M_4受容体を、HEK293細胞に発現させ、アゴニスト依存性細胞内移行とアゴニスト除去による細胞表面へのリサイクリングを調べた。M_4受容体はリサイクリングしたがM_2受容体はしなかった。M_2とM_4のキメラ受容体を用いた実験で、リサイクリングの有無は細胞内第3ループによって決まることが分かった。ヒト、アフリカツメガエル、ニワトリ、何れのM_4受容体でもリサイクリングが観察された。共通領域を殆ど覆う種類の変異体を調べたが、どの変異体もリサイクリング能を示した。「リサイクリングを可能にする部位が複数ある可能性」、「M_4受容体にリサイクリングを可能にする配列があるのではなくM_2受容体にリサイクリングを阻害する配列がある可能性」などが考えられる。M_1受容体の細胞内第3ループ(アミノ酸残基数156)を大腸菌に発現させ、円偏向2色性(CD)の測定を行った。予想に反し、第3ループはランダムコイルであることが示唆された。各種GPCRとGタンパク質αサブユニットとの融合タンパク質(受容体・Gα)をバキュロウイルス・Sf9細胞系で発現させ、その膜標品を用いて、受容体とGαとの相互作法を調べた。この系を用いて、脳抽出液中のペプチド(ノシセプチン)を検出できることを示した。一方、受容体・Gα_<16>融合タンパク質を培養細胞に発現させると、Ca^<2+>濃度の上昇を指標としてアゴニストを鋭敏に検知できる。受容体・Gα融合タンパク質は化学センサーとして有効と考えられる。ムスカリンM_2受容体の結晶化の試みを継続している。阪大月原教授・菅氏の協力でアニーリングを試みた。結晶の質が向上する傾向が見られたが、構造解析へ進むには至っていない。ムスカリン受容体は細胞内第3ループ(i3)が長い(160-240残基)。他の多くのGPCRのi3は短く、M_2-i3の根元以外の大部分を削除してもアセチルコリン結合能やGタンパク質活性化能は変わらない。M_2-i3は独立したサブドメインで、一定の構造を取る可能性が考えられた。M_2-i3を大腸菌で発現させ円2色性を測定したところ、予想に反して2次構造は認められなかった。

阪大白川教授・立石氏の協力で1次元NMRを測定したところ、rigidな構造を作らないことが判明した。さらに、野生型M_2受容体とi3を欠損させたM_2受容体を発現・精製しその円2色性の差を調べると、i3が2次構造を作らないことが示された。これらの結果より、M_2受容体の長いi3はフレキシブルな構造として存在すると推測した。M_4受容体i3の色々な部分を切除した変異体は、同じような発現レベルで、同様なリガンド結合活性を示した。この結果は、長いi3がrigidな構造を取らないというM_2受容体の結果と符合する。M_4変異体のダイナミン依存性細胞内移行は、i3の削除部分に依存して、影響を受けない場合と約1/2に減少する場合がある。予想に反してi3の根元以外の殆どを削除した変異体でも野生型の半分程度のダイナミン依存性細胞内移行が観察された。ダイナミン依存性細胞内移行に関わる部位がi3以外にも存在する可能性を示している。細胞内移行したM_4受容体は、アゴニストを除くと細胞表面に復帰する(リサイクリング)。リサイクリングはi3の存在に依存していた。i3を部分切除したM_4受容体のリサイクリングを調べ、リサイクリングに必要な部位の同定を試みている。ムスカリン受容体M2サブタイプの変異体(糖鎖を結合せず、細胞内第3ループの大部分を削除したもの)を主な対象として、大量発現・精製系を確立し(10-15mg/month)、結晶化の試みを行った。回折点を与える結晶は再現的に得られるが、分解能は10A程度以上に上がらなかった。大阪大学安達宏昭博士や科学技術振興機構岩田想博士との共同研究を行い、これらの研究室でも同じ条件でムスカリン受容体の結晶化は再現された。しかし分解能の顕著な向上は見られていない。ムスカリンM4受容第3ループを部分的に削除した変異体を作成し、ダイナミン依存性細胞内移行とアゴニスト除去後の細胞表面へのリサイクリングを調べた。ダイナミン依存性細胞内移行は、i3の削除部分に依存して、影響を受けない場合と約1/2に減少する場合がある。また、予想に反してi3の根元以外の殆どを削除した変異体でもダイナミン依存性細胞内移行が観察された。これらの結果はダイナミン依存性細胞内移行に関わる部位が複数あることを示している。一方、M4受容体のリサイクリングは、i3内の特定の配列の削除によって消失した。この約20残基の部位を、i3を除去したムスカリンM2受容体に付加すると、アゴニスト依存性細胞内移行とリサイクリングが見られるようになった。この部位がリサイクリングに必須と考えられる。この部位に結合する成分の同定を試みている。受容体・Gα融合タンパク質は化学センサーとして有効であると同時に、オーファン受容体のリガンド検索にも利用可能である。この方法で同定した5-oxo-eicosaenoic acid(5-oxo-ETE)の受容体hGPCR48が、実際5-oxo-ETEへ向けての顆粒球の走化性に関与していることが、hGPCR48に対する抗体を用いて明らかになった。ムスカリン受容体M2サブタイプ変異体(糖鎖を結合せず、細胞内第3ループの大部分を削除したもの)の結晶は再現的に得られるが、X線回折の分解能は9A程度にとどまっている。結晶の質を改善する試みを継続的に行っている。
放射光を用いたラウエトポグラフ法によるリゾチーム結晶の格子欠陥の解析

生体高分子結晶の格子欠陥の情報を得るためにはX線トポグラフ法が最適である。放射光を用いたラウエ法は短時間に多数の回折スポットの情報が同時に得られるため最強力な方法である。しかし放射線損傷を避ける有効な方法が見出せず,実用化しなかった。本研究で水フィルターの利用で損傷を減少し,初めて結晶内部の情報が連続してX線トポグラフ法で得られることができた。その結果,成長時あるいは結晶のハンドリング中に入った格子欠陥を放射線損傷により生じた欠陥と識別できるようになり,格子欠陥と成長条件の関連の系統的な研究が可能になった。実験はPFのBL-15Bで行った。水フィルターは5mm厚,アグファD2,D4フィルムを使用,3060秒露出で,数枚のラウエ写真が連続撮影可能であることを見出した。本研究では成長条件を変えて作製した斜方晶,正方晶の卵白リゾチーム単結晶を試料とした。7年度の2回のマシンタイムですでに1)成長が遅い場合の方が良い結晶が得られる2)正方晶の方が良い結晶が成長する,3)容器に接した部分は歪みやすい,4)モザイク構造に基ずく結晶全体に均一に分布する格子歪が存在する,5)螺旋転位と同種の格子欠陥が存在することである。などの結果が得られた。これらの結果は7年秋,日本物理学会,生体高分子結晶成長国際会議(広島)で発表,さらに8年春の日本物理学会でも報告される。
新世代ナノ集積回路のための多重複合型製造後調整の理論と設計

集積回路の製造ばらつきによる動作タイミング誤りや動作速度劣化の問題に対処するための,製造後個別チップに対するフリップフロップへのクロック到着時刻調整と基盤バイアス電圧調整による信号伝搬遅延量調整を連携させた多種複合的動作調整を提案し,チップ個別のポテンシャルを最大限引き出すための検査・調整量決定アルゴリズム,製造後調整にて達成される最大性能を最大化するための回路設計最適化手法などの関連諸技術を開発し,製造ばらつきの下での製造歩留まり向上を達成した.本研究課題は,集積回路の製造ばらつきによる動作タイミング誤りの問題に対して,製造後の個別チップに対するフリップフロップ(FF)へのクロック到着時刻調整(以下CST)と基盤バイアス電圧調整による信号伝搬遅延量調整(以下BBT)を連携させた多種複合的動作調整(以下PMT)により,ばらつきを克服して性能向上を実現する技術の確立を目的としたものである.平成26年度の主な成果は以下の2点に要約される.1.製造後の個別チップに対する信号伝搬遅延情報が全て入手でき,かつBBTによる電圧調整とCSTによるスキュー調整が連続値的に行われるとの理想的な状況を仮定し,BBTによる信号経路毎の最大,最小信号伝搬遅延量の調整とCSTによるFFへのクロック到着時刻調整とを同時に設計する手法を開発した.問題の定式化には,各FFを頂点とし,FF対間での正しい動作タイミングを規定するセットアップ条件,ホールド条件に対応して辺を設けた有向グラフ(スキュー制約グラフ)を使う.BBTによる信号伝搬遅延量の調整がグラフの辺重みの変化として現れることと,CSTのためのスキュー調整量がスキュー制約グラフ上での最大パス長計算に帰着されることに注目し,スキュー制約グラフが正サイクルを持たないことを制約条件とする基盤バイアス電圧調整最適化問題として捉え,発見的解法を導いている.2.実際のPMT適用に当たっては,BBTやCSTによる調整量は離散的であり,かつまた製造後の個別チップに対する完全な情報を持つことは非常に難しい.実用的調整量決定手法開発の第一段階として,CSTのみに注目し,個別チップに対して遅延テスト結果をスキュー調整量修正にフィードバックする方式のスキュー調整アルゴリズムを開発した.本研究課題は,集積回路の製造ばらつきによる動作タイミング誤りの問題に対して,製造後の個別チップに対するフリップフロップへのクロック到着時刻調整(CST)と基盤バイアス電圧調整による信号伝搬遅延量調整(BBT)を連携させた多種複合的動作調整(PMT)により,ばらつきを克服して性能向上を実現する技術の確立を目的としたものである.平成26年度にて成されたPMTに関する基本的な方式やクロック到着時刻調整量・基盤バイアス電圧調整量の基本的最適化手法の確立を受け,平成27年度においては以下を達成した.1.データパス回路を対象にしたBBT,CST同時最適化手法の確立集積回路の中のデータパス部(特定アプリケーション向けアクセラレータなどを含む)は数値的・論理的計算を実行する回路であり,その機能的重要性や高い動作速度要求などから,当初よりPMTの最も重要な適用先として想定していたものである.データパス部は元々,ALU,レジスタ,マルチプレクサなど,構成要素のコンポーネント化ができており,こうしたコンポーネントを単位としてBBT調整を行うことは,速度性能面での効果は元より,回路構造やレイアウトへの負担も小さい.この年度では,コンポーネント単位でのBBT調整とレジスタ,マルチプレクサへの制御信号に対するCST調整を組み合わせたPMTを対象として,調整量最適化手法を開発し,シミュレーションを通して性能向上を検証した.2.データパス回路を対象としてCSTのための回路最適化製造後調整にて達成される最終的な性能歩留りは,BBT調整量・CST調整量の最適化だけでなく,回路の構造やアプリケーション実行における演算のスケジュールが大きな影響を与える.この年度ではCST調整を主な対象として,製造後のCST調整を考慮した(製造後CST調整にて達成される性能歩留りの最大化を目的とした)回路・演算スケジュール最適化手法を開発した.当初の計画の概要では,平成26年度において多種複合的動作調整の基本的方式とBBT,CST同時最適化手法の開発,平成27年度以降において,製造後調整が最も有効に機能するための回路本体の最適化手法の開発,実際の製造後チップに対して製造後調整を適用するための情報収集から調整量決定アルゴリズムの開発を予定していた.これに対して;1.多種複合的動作調整の基本的方式(平成26年度予定)とBBT,CST調整量同時最適化の基本手法の開発(平成26年度予定)は平成26年度にて終えている.2.製造後調整が最も有効に機能するための回路本体の最適化手法(平成27・28年度予定)について,平成27年度において製造後CSTを考慮した回路構造・演算スケジュール最適化手法を開発し,平成28年度において更に製造後BBTを考慮した回路構造・演算スケジュール最適化手法を開発する予定である.3.実際の製造後チップに対する調整量決定アルゴリズムの開発(平成27・28年度予定)については,一部既に平成26年度から着手し,調整後の動的変動に対するタイミングマージンまでも考慮した現実的CST調整量の決定アルゴリズムを開発しており,平成27年度においては,製造ばらつきと製造後調整を模擬する計算機シミュレーションを行って,手法の有効性を検証している.平成28年度においては,これを更に発展させ,製造後BBT・CST同時調整アルゴリズムを開発する予定である.以上の通り,当初の想定通りに研究が進んでいる.本研究課題は,集積回路の製造ばらつきによる動作タイミング誤りの問題に対して,製造後の個別チップに対するフリップフロップへのクロック到着時刻調整(CST)と基盤

バイアス電圧調整による信号伝搬遅延量調整(BBT)を連携させた多種複合的動作調整(PMT)により,ばらつきを克服して性能向上を実現する技術の確立を目的としたものであり,以下の成果を挙げている.1.PMTを構成するCSTとBBTそれぞれに関する回路技術的方式とクロック到着時刻調整量・基盤バイアス電圧調整量の最適化手法の確立を行い,さらにデジタル集積回路における計算処理の中核となるデータパス回路を対象にしたBBT・CST同時最適化手法の確立した.この手法は,回路構造とBBTに依存した信号遅延量が決めるスキュー制約グラフにおけるクリティカルサイクルがCSTによって達成される性能限界を決める点に注目し,常にクリティカルサイクルを緩和するBBTを繰り返すことで,高性能化のためのクロック到着時刻調整量・基盤バイアス電圧調整量同時最適化を達成するものである.2.PMTを製造後の個別チップへ適用するためのテストと調整量決定手法を開発した.実際の集積回路では製造ばらつきだけでなく,動作環境や電源雑音等により動作時ばらつきが存在し,それらに対処するためのタイミング・マージン付き調整量決定法を開発している.3.PMT適用を前提として,適用後の回路性能を最大化する全く新しい回路設計問題に取り組み,データパス回路の高位合成の枠組みと連動した最適化手法を開発し,計算機シミュレーションにより回路性能の向上を確認している.当初の計画の概要では,平成26年度において多種複合的動作調整の基本的方式とBBT,CST同時最適化手法の開発,平成27年度において実際の製造後チップに対して製造後調整を適用するための情報収集から調整量決定アルゴリズムの開発,平成28年度において製造後調整が最も有効に機能するための回路本体の設計最適化手法の開発を行う予定であった.これに対して,1.多種複合的動作調整の基本的方式(平成26年度予定)とBBT,CST調整量同時最適化の基本手法の開発(平成26年度予定)を平成26年度にて終えている.2.実際の製造後チップに対する調整量決定アルゴリズムの開発(平成27・28年度予定)については,一部平成26年度から先行着手し,調整後の動的変動に対するタイミングマージンまでも考慮した現実的CST調整量の決定アルゴリズムを開発しており,平成27年度においては,製造ばらつきと製造後調整を模擬する計算機シミュレーションを行って,手法の有効性を検証している.平成28年度においては,これを更に発展させ,製造後BBT・CST同時調整アルゴリズムを開発した.3.製造後調整が最も有効に機能するための回路本体の最適化手法(平成27・28年度予定)について,平成27年度においてデータパス回路を対象とした製造後MSTを考慮した回路構造・演算スケジュール最適化手法を開発し,平成28年度において更に,レジスタ・クラスタリング手法,最適解を保証するための混合整数線形計画法(MILP)による解法を開発している.以上の通り,おおよそ当初の計画通りに研究が進んでいる.
概日時計の細胞内振動ならびに細胞間同調を担うリン酸シグナリング

約1日周期の生体リズムが安定に保たれるためには、ひとつひとつの細胞が持つリズムが同調することが重要である。これまでに、細胞間のリズム同調に関わるリン酸化シグナル因子をマルチPK抗体を用いて探索したところ、細胞膜上のラフトにおいて夜(ZT16)に存在量が上昇し、非ラフト膜においては昼(ZT4)に存在量が上昇する48 kDaおよび58 kDaのSre/Thrキナーゼを見出した。これらのキナーゼは細胞間のシグナル伝達において時刻依存的な制御を担うと考えられた。そこで当該年度においては、ラフトにおいて存在量が日内変動するキナーゼを同定し、機日時計におけるラフトの重要性について追及した。まず、これらのキナーゼを同定するため、昼(ZT4)および夜(ZT16)の時刻に摘出したマウス脳からラフト画分を調製した。このラフト画分をMALDI-TOF MSにより解析したところ、48 kDaのキナーゼとしてキナーゼXを同定した。キナーゼXの細胞膜上における動態をキナーゼX特異的な抗体を用いて解析したところ、細胞膜上のラフトにおけるキナーゼXの存在量は夜(ZT16)に上昇し、非ラフト膜においては昼(ZT4)に上昇していた。ラフトと非ラフト膜におけるキナーゼXの存在量が逆位相の日周変動を示すことから、キナーゼXは一日の中でラフトと非ラフト膜の間を移行し得ると考えられる。次に、マウスの時計中枢である視床下部の視交叉上核(SCN)におけるラフトの重要性を明らかにするために、PER2::LucマウスのSCNスライスを培養して発光リズムを測定し、ラフト破壊薬であるmethyl-β-cyclodextrin(MβCD)の効果を調べた。その結果、マウスSCNスライスの発光リズムはMβCD処理により短周期化した。以上の結果から、細胞膜上のラフトを介したシグナル伝達機構が概日時計の周期を制御する可能性が考えられた。本研究では、細胞『内』および細胞『間』のリズム調節において重要な役割を果たすキナーゼシグナルネットワークを明らかにするため、交付申請書の研究実施計画に沿って研究を遂行した。細胞『内』において概日リズムの制御に関わるプロテインキナーゼを探索するため、一日の様々な時刻に摘出したマウス脳をDignam法により細胞質と核に分画し、各画分に存在するプロテインキナーゼをマルチPK抗体(プロテインキナーゼを網羅的に検出できる抗体)を用いて解析した。その結果、各画分に多数のキナーゼが検出され、このうち大部分のキナーゼの発現量に有意な変動は認められなかった。しかし細胞質と核画分においては、48kDaおよび58kDaのキナーゼの発現量が昼に高く夜に低いという日内変動を示した。この結果は、一部のキナーゼの発現量が概日時計によって制御されることを示唆する。次に、細胞『間』において概日リズムの同調に関与するキナーゼを探索するため、ショ糖密度勾配遠心法によって細胞膜画分からラフトおよび非ラフト膜を調製し、マルチPK抗体を用いて各画分を解析した。その結果、細胞膜における48kDaおよび58kDaのキナーゼの存在量に有意な変動は見られなかったが、これらキナーゼの存在量はラフトにおいて夜(ZT20)に上昇し、非ラフト膜においては昼(ZT4)に上昇することを見出した。これらの結果は、細胞膜上の48kDaおよび58kDaのキナーゼが夜間にラフトに移行する可能性を示す。今後は、これらのキナーゼがラフトへ局在することの意義の解明を目指す。
冗長数系に基づく計算機回路の高速化に関する研究

本研究では冗長数系システムの実用化を目指して、これまでに提案した、複数の冗長数オペランドを同時に加算することのできる多重加算器と、冗長2進数を純2進数に復号するデコーダ回路、以上2つの回路について、ニューロンMOSFET (νMOS)の効果的な適用法を提案し、高速化・低消費電力化・小型化をはかることを目的としている。本年度の成果は以下の通りである。1.冗長2進数4重加算回路の回路設計とシミュレーション考案済みの4重加算アルゴリズムに対して、νMOSを適用して回路設計を行った。これについて、昨年度得た予備データの値を元に計算機シミュレーションを行い、従来のCMOSによる多重加算器との比較を行った。その結果、例えば語長16ビットでは、CMOS回路に比べ47%の高速化と、42%のトランジスタ数の削減を実現した。2.リコンフィギャラブル多重加算についての着想と回路設計昨年度の6重加算、および今年度の4重加算のアルゴリズムと回路の研究を通じて、リコンフィギャラブル冗長数多重加算回路の着想を新たに得た。これは、用途に応じてオペランド数を動的に切替える冗長数多重加算器であり、最小限の素子数で動的に要求仕様を満たすシステムとして有効なものである。回路実現にはνMOSの持つ柔軟性を応用している。これについて回路設計と計算機シミュレーションを行い、正しく動作することを確認し、本着想の有効性をまず明らかにした。今後は回路の最適化と遅延時間の測定などを行っていく予定である。3.デコーダ回路の計算機シミュレーション等デコーダ回路については、高基数化を押し進める過程で、必要な予備シミュレーションがさらに必要であることが判明したので、これらを慎重に検討した。また昨年度報告の、パストランジスタロジックの併用による低消費電力化についても調査を行った。その結果ほぼ満足のいくデータが収集でき、デコーダに対しての適用を今後引続き検討していく。本研究では冗長数系システムの実用化を目指して、これまでに提案した、複数の冗長数オペランドを同時に加算することのできる多重加算器と、冗長2進数を純2進数に復号するデコーダ回路、以上2つの回路について、ニューロンMOSFETの効果的な適用法を提案し、高速化・低消費電力化・小型化をはかることを目的としている。1.回路シミュレーションの準備本研究費で購入したPC-ワークステーションと回路シミュレータを用いて、ニューロンMOS-FET回路について予備シミュレーションを行い、現有の0.5μmプロセスパラメータにおける最適な素子サイズなどの条件テータを収集した。2.冗長2進数6重加算回路の回路設計考案済みの6重加算アルゴリズムに対して、ニューロンMOSFETを適用して回路設計を行った。これについて、1.の結果を元にシミュレーションを行い、従来の冗長2進数2重加算回路により6重加算を行った場合との比較を行ない、従来より少素子になることを確認した。さらに2値CMOS加算器とも比較し提案手法の方が高速であることを確認した。3.低消費電力化についての着想2.の研究過程で、パスナランジスタロジックを併用することにより低消費電力化がはかれるとの着想を得たので、これについては現在回路設計を行っており、16年度にシミュレーションを行う予定である。4.冗長2進数4重加算回路の回路設計考案済みの冗長2進数4重加算アルゴリズムについても、2.と同様に回路設計を行いシミュレーンョンを行った。この成果は16年度に発表予定である。5.デコーダ回路の回路設計デコーダ回路のハードウェア・アルゴリズムを、ニューロンMOSFETを用いて設計した。その際ニューロンMOSFETは高基数冗長数に対しても効果的であることがわかったので、さらに16年度にシミュレーションを進める予定である。

また昨年度報告の、パストランジスタロジックの併用による低消費電力化についても調査を行った。その結果ほぼ満足のいくデータが収集でき、デコーダに対しての適用を今後引続き検討していく。
がん抑制遺伝子p53による細胞死誘導機構の解明とがん治療への応用

DNA損傷によって惹起される細胞死(アポトーシス)では、がん抑制遺伝子であるp53がその中心的な働きを担っており、中でもSer46のリン酸化はアポトーシス誘導に必須と考えられている、我々は世界に先駆けてSer46キナーゼとしてDYRK2を同定することに成功した、しかしその細胞内制御は多くが不明であった。そこでDYRK2の機能解析を進めたところ、DYRK2はATMによって制御されていることが判明した。具体的には、DNA損傷に伴ってATMはDYRK2のThr33とSer369をリン酸化し、DYRK2を活性化するだけでなく、DYRK2の核内での安定化にも寄与していることが明らかになった。さらにDYRK2は核内にも存在するが、MDM2によって恒常的にユビキチン化され分解されていること、DNA損傷後ATMによるThr33のリン酸化によってMDM2がDYRK2から解離し分解が抑制されることを見いだした、そしてこの制御がDNA損傷におけるp53依存性アポトーシス誘導に本質的なステップであることが示された、以上の結果から、DYRK2は細胞質だけでなく核にも存在しているが、核内DYRK2はMDM2によって恒常的に分解されており、DNA損傷によってATMによるリン酸化を受け核内で安定化し活性化され、p53をリン酸化しアポトーシスを誘導するというモデルを提唱した。今後は、根本的な課題として、p53のSer46がリン酸化されるとどのようにアポトーシスを誘導するのかについて、その詳細なメカニズムの解明に軸足を移す予定である。癌抑制遺伝子p53は細胞周期の制御や、アポトーシス誘導に重要な役割を果しているが、その生理機能と調節機構の詳細ははっきりしない。特に、p53転写活性の調節についての情報は極めて少ないのが実状である。我々は、Ras responsive element binding protein 1(RREB1)と呼ばれる機能未知の転写因子がp53の発現を転写レベルで制御していることを見いだした。まずp53のプロモーターを用いたレポーターアッセイの解析から、RREB1がp53のプロモーター領域のうちCPEと呼ばれる配列を介して、p53の転写活性を促進することを明らかにした。またクロマチン免疫沈降法を用いた解析から、DNA損傷によりRREB1はp53のプロモーターにリクルートされp53のプロモーター活性を誘導するが、RREB1の発現抑制によりp53のプロモーター活性が顕著に抑制されることが明らかとなった。その結果、p53のmRNAと蛋白質レベルの発現も明らかに減少した。それに伴って、p53によって制御を受けている下流遺伝子の発現もその多くが低下した。さらにRREB1のsiRNAを用いることで、DNA損傷によるp53依存性アポトーシス誘導が著しく低下した。これらの結果から、RREB1はp53の転写制御を介して、DNA損傷によるアポトーシスを誘導することが明らかになった。今後は、RREB1がどのような機序でDNA損傷に応答して転写活性を上げるのかについて解明していきたい。
1本鎖核酸の細胞内への取り込みメカニズムの解明

核酸医薬候補の1つである1本鎖RNA及び人工核酸は細胞内に導入する際にリポフェクション試薬等のキャリアを必要としないという特徴(gymnosisとも呼ばれている)を持つ事が知られている。本研究の目的は、gymnosisの解明を行うことである。本研究によって、HeLa細胞においてSIDT2ノックダウン条件下では1本鎖核酸の細胞内への取り込みが減少し、またアンチセンス効果が弱まることが明らかになった。SIDT2高発現条件下では1本鎖核酸細胞内への取り込みが上昇することが分かったが、変異型SIDT2では観察出来なかった。よって、SIDT2は1本鎖核酸の細胞内への取り込みに関与することが示唆された。現在、我が国のみならず世界各国では核酸医薬の開発が盛んである。核酸医薬は低分子化合物の様に高いコストパフォーマンスを持ち、抗体医薬の様に高い特異性を持つという、2つの利点を併せ持った医薬品として知られている。その核酸医薬候補の1つである、1本鎖RNA及び人工核酸は細胞内に導入する際にリポフェクション試薬等のキャリアを必要としないというすぐれた特徴を持つ事が知られている。しかし、今日に至るまでその詳細な細胞内導入メカニズム(gymnosisメカニズム)はあまりよく知られていない。本研究の目的は、リポフェクション試薬を使用しない1本鎖RNA及び人工核酸の細胞内導入機構の解明を行うことである。平成27年度は研究実施計画に記載してある(1)SIDT1,2の細胞外からの1本鎖RNAの取り込み能力の検討、(2.a)内在性SIDT1,2ノックダウンにおける条件での解析に関する研究を実施した。(1)の研究によって、SIDT2を組み込んだpCI-neoプラスミドをトランスフェクションし、SIDT2を高発現させたHeLa細胞には、pCI-neoプラスミドの空ベクターをトランスフェクションした細胞と比較して、多くのリポフェクション試薬を使用しない蛍光標識1本鎖2′-O-メチル化RNAが取り込まれたことが明らかになった。また(2.a)の研究によって、内在性SIDT2をノックダウンさせたHeLa細胞においては、蛍光標識1本鎖2′-O-メチル化RNAの細胞内への取り込みが減少することも判明した。平成27年度は研究実施計画に記載した(1)と(2.a)の研究を実行した。(1) SIDT1,2の細胞外からの1本鎖RNAの取り込み能力の検討については、おおむね順調に進行している。平成27年度の研究によって、SIDT2を組み込んだpCI-neoプラスミドをトランスフェクションし、SIDT2を高発現させたHeLa細胞には、pCI-neoプラスミドの空ベクターをトランスフェクションした細胞と比較して、多くのリポフェクション試薬を使用しない蛍光標識1本鎖2′-O-メチル化RNAが取り込まれるということが明らかになった。(2.a)内在性SIDT1,2ノックダウンにおける条件での解析についても、おおむね順調に進んでいる。平成27年度の研究によって、siRNAをトランスフェクションすることによって内在性SIDT2をノックダウンさせたHeLa細胞においては、ネガティブコントロールsiRNAをトランスフェクションしたHeLa細胞と比較して、蛍光標識1本鎖2′-O-メチル化RNAの細胞内への取り込みが減少することも判明した。平成28年度は研究実施計画に記載してある(2 a,b)内在性SIDT1,2ノックダウン及びノックアウトにおける条件での解析に関する研究、(3)SIDT1,2遺伝子の細胞内局在解析に関する実験を実施した。(2 a,b)では、2つの違う配列のsiRNAによって、内在性SIDT2をノックダウンさせたHeLa細胞においては、miRNA-16を標的にしたアンチセンスオリゴのアンチセンス効果が弱まることが確認された。また(3)に関しては、HeLa細胞においてSIDT2は大部分がリソソームの膜上に発現しており、一部分が細胞膜上にも発現していることを見出した。今年度と前年度の研究の結果から、SIDT2は1本鎖RNA及び人工核酸の細胞内への取り込みに関与していることが示唆された。

よって、SIDT2は1本鎖核酸の細胞内への取り込みに関与することが示唆された。研究の最終年度における平成28年度の研究においては、研究実施計画に記述した(2)SIDT1,2がgymnosisメカニズムにおける核酸トランスポーターそのものであるか否かの検討に関する解析を引き続き行っていく。そして、(3)SIDT1,2の細胞内局在解析に関する研究を行っていく予定である。そして、平成28年度中に本研究に関係する論文を執筆し、投稿することも目標としている。分子生物学3月納品の物品があり、この物品の業者への代金支払いは4月となる。よって、次年度使用額が生じている。今回生じた次年度使用額分は今回の報告書には当てはまっていないので、次回の報告書に記載する。