hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
記憶成績低下メカニズムの脳磁場計測による探究

2年目には、記銘の終盤のα波律動変調は記憶と直接関係なく、記銘の前半から中盤にかけてのα波律動の増大が記憶の指標となることが明らかになった。α波律動が増大する脳部位は後頭部の視覚野であり、α波律動の増大は、記憶に関係のない視覚入力の能動的抑制を反映することが示唆された。以上の結果は20歳代前半の若年被験者群で得られた結果である。最終年度(3年目)は、2年目に引き続き60歳代の高齢者群で同様の計測と解析を行った。その結果、高齢者では記憶成績は若年者に比べて有意に低下するものの、初頭性・新近性効果は生じ、行動上の結果は従来の心理学の知見によく一致していた。しかし、α波律動の結果は若年者と全く異なり、記銘中のα増大が見られなかった。このことは、若年群と高齢者群では行動実験の結果は類似するものの、脳内処理過程は大きく異なることを示唆した。以上の結果から、特に記銘中盤のα波律動振幅が記憶能力の指標となり、記憶障害の鑑別に有用であることが示唆された。今後は軽度認知症検査法の結果も援用し、記憶の処理過程の詳細を明らかにしていく計画である。加齢による記憶能力低下のメカニズムを探るため、記憶中に脳から出る微弱な磁場(脳磁場)を計測し、20歳代前半の若年者群と60歳代の高齢者群で比較した。記憶対象を順番に視覚呈示すると、若年者群ではα帯域(8-13 Hz)の脳律動が記憶中に増加していくのに対し、高齢者群では逆に減少することがわかった。脳磁場分布から脳内の活動部位を逆算すると、若年者で見られたα波律動の増大は、記憶に関係のない視覚入力の抑制により生じているらしいことが分かった。以上の結果は、記憶に関係のない視覚入力の抑制が働きにくくなることが加齢による記憶能力低下の一因となることを示唆した。加齢の影響の検証はまだ完了していないが、記憶障害の鑑別法の見通しを得ているので、ほぼ予定通りに進捗していると判断する。生体医工学高齢者群は当初2群(40歳代と60歳代)で計測する予定であったが、働き盛りの40歳代を被験者として募集することは非常に困難であることがわかったので、まずは定年後の60歳代を対象として結果をまとめ、20歳代との群間比較を行うものとする。研究の主体は引き続き脳磁計とする。まだ高齢者群の計測を継続しているので、予算を多めに繰り越した。世界的なヘリウム資源の不足により平成27年度は脳磁計の使用料が高額となる可能性がある。研究の推進に支障をきたさないよう、繰越金を有効活用する。明治大学の小野研究室との共同研究や、フィンランドのアアルト大学とのディスカッションも引き続き継続する。想起時のみならず記銘時にも研究対象を広げ、記銘時と想起時におけるα波律動の関与を共通した手法で解析できたことは想定以上の成果であった。国外の研究機関への短期滞在では、予算上の制約もあって本研究テーマを直接扱うことはできなかったが、本テーマに関しても先方の研究者と議論し、多くの示唆を受けたことがこの成果につながった。本研究に特に関連の深いオリジナルの学会発表が3件あるほか、国際学会の招待講演(海外、1回)と学会以外の解説講演(国内、2回)で本研究を紹介し、研究成果の発信にも努力した。その結果、今後の展開に有用な共同研究も開始できた。以上、本研究は当初の計画以上に進展したものと考える。高齢者群の計測がまだ途上であり、次年度にも脳磁計を使用した研究を継続する必要がある。脳磁計は液体ヘリウムを冷媒として使用するが、世界的なヘリウム資源の不足により脳磁計の使用料が大幅に増額される事態も考えられる。この状況に鑑み、次年度の研究に支障をきたさないよう当該年度は多めに繰り越しを行ったため。
特異点をもつ曲線と曲面の幾何学

特異点をもつ曲線と曲面の幾何学について,研究を行い,以下のような成果をおさめた.曲面あるいは超曲面にもっとも頻繁に現れるA型の特異点の判定法を与え,これを変曲点の研究に応用した.またこの特異点の判定条件に立脚し,曲面から多様体の概念が生まれたように,外の空間を払拭して,内的に波面を記述する概念として連接接束の概念を樹立し,多くの応用を与えた.一方,この研究に関連し,3次元時空の極大曲面,3次元ド・ジッター空間の平均曲率1の曲面について,特異点を許すが,ある種の完備性をもつ興味深い曲面の例を数多く構成した.また研究分担者と協力し,国内外で関連する研究者等との研究交流を図る研究集会をいくつか開催した本研究は,特異点自体に曲率を導入し,微分幾何的な対象として研究することを最終的な目標としている.具体的には以下の3つのテーマについて研究を行う.(1)特異点を対象とする微分幾何学の構築(2)定曲率空間における波面の特異点と位相に関する研究,およびその関連分野への応用(3)Euclid空間および双曲型空間における完備かつ有界な極小曲面の研究.特異点をもつ曲線と曲面の幾何学について,研究を行い,以下のような成果をおさめた.曲面あるいは超曲面にもっとも頻繁に現れるA型の特異点の判定法を与え,これを変曲点の研究に応用した.またこの特異点の判定条件に立脚し,曲面から多様体の概念が生まれたように,外の空間を払拭して,内的に波面を記述する概念として連接接束の概念を樹立し,多くの応用を与えた.一方,この研究に関連し,3次元時空の極大曲面,3次元ド・ジッター空間の平均曲率1の曲面について,特異点を許すが,ある種の完備性をもつ興味深い曲面の例を数多く構成した.また研究分担者と協力し,国内外で関連する研究者等との研究交流を図る研究集会をいくつか開催した特異点をもつ曲線と曲面の幾何学について,本年度は以下の成果を得た.(1)大阪大学理学研究科修士学生の黒野君との共同研究で,3次元Euclid空間の平坦なメビウスの帯で,中心線が測地線に保ったまま(あるいは,中心線が曲率線であることを保ったまま),任意のイソトピー型を実現できることを示した.(2)分担者の山田,ラスマン,藤森そして研究協力者のYang氏とde Sitter空間における平均曲率1の曲面の研究を行い,曲面が,ある種の完備性をもつ場合にOsserman型の不等式が成り立ち,等号条件はエンドが自己交叉しないことと同値であることを示した.これらの研究の推進・発展のため分担者の山田,間下,橋本等はそれぞれ,9月,11月,3月に研究集会を開催し,この研究テーマに関連する研究者同士の研究連絡や研究交流を行った.また研究代表者は5月にドイツのOberwolfach数学研究所において,Dorfmeister氏,Abresch氏等と-緒に曲面と可積分系に関する国際研究会を主催し,本研究テーマに関する研究交流を行った.特異点をもつ曲線と曲面の幾何学について,本年度は以下の成果を得た.(1)分担者の山田氏と連携研究者の佐治氏と,前年度に与えたA_K型の特異点の判定条件の応用として,超曲面のA_K型の変曲点と同じ型の特異点との間の双対性に関する研究を行ない,その応用として,3次元Euclid空間内にはめ込まれた超曲面の2次の変曲点に関するBleekerとWilsonの結果を,射影空間における同種の公式に一般化した.(2)分担者の山田氏,グラナダ大学のMartin氏と共同で,前年度に与えた単連結かつ虚部も同時に有界な極小曲面を摂動して,2次元複素線形空間に完備かつ有界な任意種数の1次元複素部分多様体の構成および,3次元時空に弱完備かつ有界な任意種数の極大曲面が存在することを示した.(3)研究代表者は5月に,ケルン大学を訪問し,Thorbergsson氏と,平面曲線の2次以上の代数曲線による近似によって生ずる高次の頂点の個数の下からの評価に関する新手法について研究討論を行った.(4)これらの研究の推進・発展のため研究代表者は分担者の山田,間下,橋本等適宜連携して,9月,11月,3月に研究集会を開催し,この研究テーマに関する研究者同士の研究連絡や研究交流を行った.特異点をもつ曲線と曲面の幾何学について,本年度は以下の成果を得た.1.外相者の山田氏と連携研究者の佐治氏と,波面の内的か定式化を与え,さらにその定曲率空間への超曲面としての実現定理を与えた.また前年度に与えた「特異点と変曲点」の間の双対性を,内的に再定式化し,閉曲面としての波面に合計4個のガウス・ホンネ型の定理の存在を示した.これらの公式は特異点をもたない閉曲面に対しても新しい結果をもたらす.例えば,曲面のガウス曲率が負の部分部分のオイラー数や全曲率を,その曲面のガウス写像の特異点に関する幾何学的な不変量を用いて表すことが可能となった.2.連携研究者の國分氏および分担者の山田氏と共に,3次元時空の極大曲面および3次元ド・ジッター空間の平均曲率1の曲面に,ある種の特異点を許したとき,向き付け可能性,完備性,弱2完備性について相互の関係を明らかにした.

特に3次元球面において,平坦で弱完備なはめ込みで完備でない例を発見し特異点がなくても完備性と弱完備性の間には差異があることが判明した.3.連携研究者の藤森氏,ラスマン氏,高麗大学のYang氏,および分担者の山田氏と共に上述の3次元時空の極大曲面の完備性と弱完備性に関連する研究として,完備かつ充分遠方で自己交叉をもたない種数1の新しい極大曲面と,円錐的特異点とカスプ片を同事に保有する完備な極大曲面の初めての例の構成を行った.3.これらの研究の推進,発展のため研究代表者は,分担者の山田氏,間下氏,橋本氏等と適宜連携し,9月,11月,3月に研究集会を開催し,この研究テーマに関連する研究者同士の研究交流を行った.
全身性エリテマトーデスにおけるB細胞活性化機構の解析と制御方法の開発

1.全身性エリテマトーデス(SLE)や関節リウマチ(RA)では血中BAFFレベルの増加が報告されているが,末梢血単核細胞でのBAFF遺伝子発現は健常者とSLE症例との間に有意の差は認められなかった.2.BAFFに対する3種類のレセプター,すなわちBCMA, TACIおよびBAFF-R遺伝子の発現はSLE末梢血単核細胞において大部分の症例で亢進していた.これらのうち,BAFF-R遺伝子発現の亢進が抗DNA自己抗体産生に関与しているようであった.3.BAFF, TACIおよびBCMAに対するモノクローナル抗体を作製する計画であったが,使用可能な抗体作製には未だ成功していない.4.TACI遺伝子発現の解折中に遺伝子発現変異体をクローニングした.この変異体は細胞外ドメインをコードするエクソンの選択的スプライシング(エクソンスキッピング)によるものと考えられた.このスプライシング変異体がコードするアミノ酸は,全長サイズの遺伝子と比較して,46個のアミノ酸の欠失とアミノ酸1個の置換が細胞外領域で推測されるが,膜貫通領域や細胞内領域には異常がないと考えられる.この変異体蛋白の発現や機能については現在,解折中である.1.全身性エリテマトーデス(SLE)や関節リウマチ(RA)では血中BAFFレベルの増加が報告されているが,末梢血単核細胞でのBAFF遺伝子発現は健常者とSLE症例との間に有意の差は認められなかった.2.BAFFに対する3種類のレセプター,すなわちBCMA, TACIおよびBAFF-R遺伝子の発現はSLE末梢血単核細胞において大部分の症例で亢進していた.これらのうち,BAFF-R遺伝子発現の亢進が抗DNA自己抗体産生に関与しているようであった.3.BAFF, TACIおよびBCMAに対するモノクローナル抗体を作製する計画であったが,使用可能な抗体作製には未だ成功していない.4.TACI遺伝子発現の解折中に遺伝子発現変異体をクローニングした.この変異体は細胞外ドメインをコードするエクソンの選択的スプライシング(エクソンスキッピング)によるものと考えられた.このスプライシング変異体がコードするアミノ酸は,全長サイズの遺伝子と比較して,46個のアミノ酸の欠失とアミノ酸1個の置換が細胞外領域で推測されるが,膜貫通領域や細胞内領域には異常がないと考えられる.この変異体蛋白の発現や機能については現在,解折中である.平成13年度の研究計画を実行し,以下の研究成果を得た.1. SLEにおけるBAFF/TACI/BCMAシステムの発現解析健常者及び未治療SLE症例各8名の末梢血単核細胞において,新しいTNFファミリーに属するBAFFとそのレセプターであるTACIとBCMA,及び計画実行中に発見されたBAFF-Rも加えて遺伝子発現をRT-PCR法にて解析した.それぞれの遺伝子が直線的に増幅されるサイクル等のPCR条件を設定し,サンプル中のRNA量はそれぞれのGAPDH発現量にて補正した.その結果,健常者とSLE症例両群間においてBAFF,TACI,BCMAの遺伝子発現に有意差は認められなかったが,意外にもBAFF-RのみがSLEで有意に遺伝子発現が低下していた(ρ=0.021).TACIとBCMAはB細胞のみならずT細胞にも発現されるが,BAFF-RはB細胞のみに発現されることから,この結果がSLEにおけるB細胞分画の変動を反映している可能性もある.しかし,B細胞に特異的に発現するCD19を同様に検索しても両群間に有意差がないことから,単なるB細胞の比率を反映しているとは考えられない.SLEではT細胞のみならずB細胞も多クローン性に活性化されて自己抗体産生に寄与しており,BAFF-R遺伝子発現の低下はそれを示唆する新たなマーカーの一つになりうると考えられる.2. BAFFファミリー蛋白分子に対するモノクローナル抗体の作製遺伝子発現の差が認められたBAFF-Rの蛋白レベルの解析のために,遺伝子組換え融合蛋白BAFF-R-Igを作製してマウスに免疫した.しかし,この様な方法では現在まで特異的抗体が得られていないため,研究方法の一部を変更して次年度も実施する.平成14年度の研究計画を実行し,以下の研究成果を得た.昨年度より継続して,健常者及び未治療SLE症例の末梢血単核細胞におけるBAFFとそのレセプターであるTACI, BCMA及びBAFF-Rの遺伝子発現解析を行った所,TACI遺伝子において期待されるPCR産物以外に,予想外のPCR産物(T8)が明確に認められた.シーケンスの結果,後者はTACI遺伝子の変異体であり,細胞外ドメインをコードする138塩基が欠損していた.恐らくエクソンスキッピングによる選択的スプライシングにより生じた変異体と考えられた.T8がコードするアミノ酸は21番目のPheからTrpへの置換とそれに引き続く46アミノ酸の欠失が推定された.これら以外の細胞外ドメイン,膜貫通領域及び細胞内ドメインは保存されていることから,何らかのシグナル伝達に関与していると予想された.SLE患者にT8遺伝子発現増強例がみられたが,その意義については蛋白発現や機能解析など今後に残された課題である.培養細胞株HL60にBAFF遺伝子及び蛋白発現が認められたため,HL60を免疫原として抗BAFFモノクローナル抗体の作製を試みた.組換え

BAFF-Flag蛋白を抗原とするELISAで陽性となる複塾のクローンが得られたが,これらの組合せによるサンドイッチELISAシステムの確立には至っていない.しかし,これらクローンにはBAFF/BAFF-R相互作用を阻害する活性を有する可能性があり,B細胞制御への生物製剤開発の突破口となるものである.
嵩高いカチオン性金属錯体により安定化されたフラ-ライド単結晶の育成と物性

本年度はフラーレンアニオンラジカル分子と嵩高いカチオン性金属錯体との組み合わせにより新たな分子性伝導体系の構築をもくろんだ。O_h型の金属錯体ではファンデアワールス結合を上回る最密充填構造を有する安定な結晶構造を想定し、カチオン性金属錯体として[Ru(NH_3)_6]^<3+>や[Co(NH_3)_6]^<3+>などの対称性の高い分子を対カチオンとして、これらとフラーレン分子とのイオン結合的な新和性を駆動力とした安定な結晶構造の構築をめざした。拡散法によるヘキサアンミン錯体とC_<60>との反応によって黒色単結晶性物質が得られたが、伝導性は見いだされずESRの信号も観測されなかったことから電荷移動をともなわない付加体であることが判明した。また、申請者らの開発したアルカリ金属・アルカリ土類金属の有機ホウ酸塩をドープ金属源とする液相均一系での金属フラ-ライド単結晶育成法において電解結晶成長法や拡散結晶成長法により比較的良質の単結晶が得られており、NaBPh_4を出発物質とするナトリウム系については、電気伝導性を有する良質の単結晶Na_XC_<60>(THF)_yが得られている。この系においては溶媒として使用したTHFが配位的にナトリウムに結合して嵩高いカチオンとなってC_<60>アニオンラジカルを安定化するものと予測される。本年度はさらに、よりイオン半径の小さいリチウムをアルカリ金属源としたリチウム系結晶Li_xC_<60>(THF)_yの高い電気伝導性を期待して単結晶育成を行った。その結果、Na系と同様な伝導性結晶が得られた。室温での伝導度はおよそ30Scm^<-1>であり、150K近傍まではほとんど伝導度の温度依存性がないものの、この温度付近で激しく絶縁化することが見いだされた。その他、白金やパラジウムのベンゾニトリル錯体との反応およびルシゲニンやクリスタルバイオレットなどの嵩高い有機カチオンとの反応、さらに嵩高いカルコゲン分子を骨格に含む有機ドナー分子との反応を試みた。
新規治療の開発を目指したBach1の筋損傷抑制効果の解明

平成29年度は野生型およびBach1ノックアウトマウスを用いて筋損傷への影響を解析したところ,Bach1ノックアウトマウスの筋は野生型マウスの筋と比較して,損傷後の再生能が低下していることが判明したため,平成30年度はBach1が筋細胞分化に及ぼす影響を検討するためにin vitroの実験を行った.1.増殖期にあるC2C12筋芽細胞のBach1をノックダウンさせると,筋芽細胞の増殖抑制が見られた.2.分化期にあるC2C12筋芽細胞では,Bach1のmRNA量および蛋白量が分化とともに増加した.3.Bach1をノックダウンしたC2C12細胞を分化誘導すると,コントロールに比べて筋管形成が抑制された.また,MHCのmRNAの発現量も低下した.また,筋分化決定因子の発現では分化早期のMyogeninやMyoDの発現低下がみられた.以上より,Bach1は筋芽細胞の早期筋分化に作用することが考えられた.次にBach1の直接転写抑制因子であるHO1遺伝子(Hmox1)の発現制御について検討した.1.Bach1ノックダウンC2C12細胞は分化全過程においてHmox1の発現が増加した.2.WTの筋損傷後3日目の筋組織再生早期においてHmox1の発現が増加するが,Bach1ノックアウトマウスでは筋損傷後3日目のHmax1の発現を有意に増加させた.以上より,Bach1はHO1遺伝子の転写抑制を介して,筋細胞分化に関与することが考えられた.さらに筋の増殖,分化制御におけるBach1の機能を検討するため,分化開始後のBach1ノックダウンC2C12細胞およびコントロール細胞でDNAマイクロアレイによる網羅的解析を行った.Bach1ノックダウンによってMyod1,Myogの発現は有意に低下し,Myostatinの発現が最も上昇していた.Bach1ノックダウンにより筋細胞の増殖・分化が抑制されることがin vivoおよびin vitroで判明し,その経路もHO1遺伝子を介する可能性があることが示された.また,マイクロアレイ法によりBach1ノックダウンにより関連する遺伝子が同定された.平成31年度はHO1阻害薬を投与することでBach1強制発現を模倣し,筋細胞の増殖や分化に与える影響を評価する.具体的にはin vitroで分化開始後のC2C12細胞にHO1阻害薬を添加し,C2C12細胞の変化を観察する.in vivoにおいてはマウスに筋損傷作成後にHO1阻害薬を投与し,筋再生への影響を検討する.また,DNAマイクロアレイ法により発現に変化を生じた遺伝子を解析し,筋細胞増殖・分化因子としてのBach1との関連を検討する.具体的にはBach1ノックダウンにより筋形成抑制因子であるMyostatinの発現が最も上昇していたため,Myostatinによる筋分化抑制経路に対するBach1の影響をin vivo, in vitroで検討する.平成29年度は野生型およびBach1ノックアウト(Bach1-KO)マウスを用いて筋損傷への影響を解析した.2.野生型マウスにおいて,カルジオトキシンを用いた筋毒損傷モデルを製作し,損傷後の変化を経時的に観察した.損傷後3日目に筋線維の多くがいびつとなり,その数も減少した.損傷後7日目には新たに中心核を有する筋線維が出現し,損傷した筋線維はほとんど取り除かれ、新たに形成された筋線維に入れ替わった.損傷後21日目にはその筋線維は損傷前より腫大した.この経過をBach1-KOマウスと比較した所,損傷3日目では大差は見られないものの、損傷後7および21日目の筋線維の面積はBach1-KOマウスで小さかった.これらの結果からBach1-KOマウスの筋は野生型マウスと比較し、損傷後の筋再生能が低下していることが判明した.3.野生型マウスの筋損傷前後における筋でのBach1のmRNAおよびタンパク質発現量の変化を調べた.前脛骨筋におけるBach1のmRNA量は非損傷筋に比較し,損傷後に次第に低下したが,Bach1タンパク質は,非損傷筋では殆ど見られないのに対し,損傷後3日目に急激に増加し,損傷後7日目にその発現量は減少した.このことから,Bach1は筋再生の早期において重要な役割を担っていることが推測された.in vivoの解析により,Bach1-KOマウスの筋は野生型マウスの筋と比較し、損傷後の再生能が低下していることが判明した.この結果は仮説と正反対の結果であるが,Bach1は筋再生の早期において重要な役割を担っていることが確認できたため,このBach1が筋細胞分化にどのような影響をもたらすのか,当初の計画通り,in vitroで確認する.平成29年度は野生型およびBach1ノックアウトマウスを用いて筋損傷への影響を解析したところ,Bach1ノックアウトマウスの筋は野生型マウスの筋と比較して,損傷後の再生能が低下していることが判明したため,平成30年度はBach1が筋細胞分化に及ぼす影響を検討するためにin vitroの実験を行った.1.増殖期にあるC2C12筋芽細胞のBach1をノックダウンさせると,筋芽細胞の増殖抑制が見られた.2.分化期にあるC2C12筋芽細胞では,Bach1のmRNA量および蛋白量が分化とともに増加した.3.Bach1をノックダウンしたC2C12細胞を分化誘導すると,コントロールに比べて筋管形成が抑制された.また,MHCのmRNAの発現量も低下した.

また,筋分化決定因子の発現では分化早期のMyogeninやMyoDの発現低下がみられた.以上より,Bach1は筋芽細胞の早期筋分化に作用することが考えられた.次にBach1の直接転写抑制因子であるHO1遺伝子(Hmox1)の発現制御について検討した.1.Bach1ノックダウンC2C12細胞は分化全過程においてHmox1の発現が増加した.2.WTの筋損傷後3日目の筋組織再生早期においてHmox1の発現が増加するが,Bach1ノックアウトマウスでは筋損傷後3日目のHmax1の発現を有意に増加させた.以上より,Bach1はHO1遺伝子の転写抑制を介して,筋細胞分化に関与することが考えられた.さらに筋の増殖,分化制御におけるBach1の機能を検討するため,分化開始後のBach1ノックダウンC2C12細胞およびコントロール細胞でDNAマイクロアレイによる網羅的解析を行った.Bach1ノックダウンによってMyod1,Myogの発現は有意に低下し,Myostatinの発現が最も上昇していた.Bach1ノックダウンにより筋細胞の増殖・分化が抑制されることがin vivoおよびin vitroで判明し,その経路もHO1遺伝子を介する可能性があることが示された.また,マイクロアレイ法によりBach1ノックダウンにより関連する遺伝子が同定された.平成30年度はBach1が筋芽細胞の分化に及ぼす影響をin vitroの実験により確認する.すなわち,マウスの筋芽細胞株であるC2C12細胞を用いて分化誘導を行う.これらに随時,Bach1のノックダウンを行い,細胞分化への影響を評価する.具体的にはsiRNAを用いBach1のノックダウンを行った後にC2C12細胞を増殖させ,分化を誘導し,誘導後2,4,6日目で分化における酸化ストレスの評価を行う.ウェスタン・ブロット法やRT-qPCR法でHO-1,筋分化マーカーであるpax7,myoD,myoG,MRF4,MyHCを測定し,また酸化ストレスマーカーであるカルボニル化蛋白を測定,、筋分化や酸化ストレスの変化を評価する.また、H2O2を加えた酸化ストレス下にも分化誘導を行った上で同様に評価し,酸化ストレス増強下の筋芽細胞におけるBach1の働きを評価する.また,プラセミドを用いHO-1過剰発現を行った後にC2C12細胞を増殖・分化させ,筋分化や酸化ストレスを評価する。さらに,H2O2を加え、酸化ストレス増強下の筋芽細胞におけるHO-1の働きを評価する.平成31年度はHO1阻害薬を投与することでBach1強制発現を模倣し,筋細胞の増殖や分化に与える影響を評価する.具体的にはin vitroで分化開始後のC2C12細胞にHO1阻害薬を添加し,C2C12細胞の変化を観察する.in vivoにおいてはマウスに筋損傷作成後にHO1阻害薬を投与し,筋再生への影響を検討する.また,DNAマイクロアレイ法により発現に変化を生じた遺伝子を解析し,筋細胞増殖・分化因子としてのBach1との関連を検討する.
汎関数繰り込み群法を用いたQCD相図の研究

汎関数繰り込み群方程式は演算子形式や経路積分形式と同様に場の量子論の定式化の方法であり、QCDの有効模型に応用することで、中間子のゆらぎをきちんと取り入れた計算が可能となる。平成24年度は主にQCD臨界点近傍の密度ゆらぎの効果について研究を行った。QCD臨界点は有限密度、有限温度中に現れ2次相転移をする点であり、して様々な先行研究の結果に現れている。高エネルギー重イオン衝突実験での探索も行われており、QCD臨界点の性質の理論的予測が必要となっている。QCD臨界点近傍ではカイラル対称性のオーダーパラメータのゆらぎに加えてバリオン数の密度ゆらぎも増大することが知られている。そこで、これまでの多くの研究で用いられてきたカイラル対称性のオーダーパラメータだけで構成された有効模型に新たにバリオン数密度に対応する自由度を加え、QCD臨界点近傍での有効模型を構成した。この有効模型を用いてカイラル対称性のオーダーパラメータとバリオン数密度の2変数の有効ポテンシャルについて汎関数くりこみくりこみ群方程式を構成し、増大するそれらのモードのゆらぎを取り込んだ。くりこみ群方程式を数値的に解くことでQCD臨界点のまわりの物理量が特異的な振る舞いを起こす臨界領域の性質について調べた。数値計算の結果、臨界領域はカイラル対称性のオーダーパラメータとバリオン数密度の間の結合の強さに非常に敏感であり、結合が強ければ従来知られていた結果よりも臨界領域が大きく成り得ることが分かった。この結果はQCD臨界点周辺の理論的解析にはバリオン数密度の自由度を加えることが不可欠であることを示しており、バリオン数密度とカイラル対称性のオーダーパラメータの間の結合の強さをより微視的な理論を用いて見積もることの重要性をも示唆している。3年間の研究で汎関数くりこみ群方程式の適用可能な模型及び物理量の範囲を広げることができ、研究が順調に進展したと判断できる。しかしながら量子色力学への応用には及ばなかったために(2)の評価が妥当である。平成24年度までの研究で、汎関数くりこみ群を用いて実時間2点関数の運動量依存性まで含めた計算を可能にすることができた。この方法を用いることで有限温度密度中での中間子などの性質の変化を2点関数から研究することが可能となっている。今後はQCDの相構造だけでなく、各相中や相転移点近傍でのダイナミカルに生成されるモードの性質についても研究の対象としていく予定である。強い力を記述するQCDの有限温度、有限クォーク密度中での性質は実験、理論両面で研究の対象となっている。格子QCDを用いた第一原理計算は存在するが技術的困難のために有限密度への拡張が難しく、有限密度に対してはQCDの有効模型を用いた研究が有効な方法である。本研究も汎関数繰り込み群方程式をQCDの有効模型に対して適用するものである。今年度はゼロ温度の場合の汎関数繰り込み群方程式と摂動的くりこみ群のε展開の関係について研究を行った。軸性量子異常の効果が大きい場合の有限温度QCDの有効模型であるO(N)線形シグマ模型と小さい場合のU(2)×U(2)線形シグマ模型それぞれ対して汎関数くりこみ群を適用し有効ポテンシャルに対する汎関数偏微分方程式を導いた。U(2)×U(2)線形シグマ模型はゆらぎによる一次相転移が起こることが知られている。この方程式をオーダーパラメータに対してテイラー展開することでポテンシャルを決めるパラメーターに対する微分方程式を導出し、これらがすでに知られているε展開と同等であり、それぞれの模型に特徴的なフローの様子を再現することを確認した。さらに、ポテンシャルに対する偏微分方程式とパラメーターに対する常微分方程式のそれぞれ数値的に積分することで相転移の次数がパラメーターのフローとどのような関係があるのかを明らかにした。これらの研究によりくりこみ群のフローと相転移の次数の関係が、とくにゆらぎの効果による一次相転移の場合に、明らかになり相転移に対する基礎的な理解が進んだ。平成23年度はドイツ連邦共和国のダルムシュタット工科大学に半年間滞在し、Jochen Wambach教授らと有限アイソスピン化学ポテンシャルの系へのくりこみ群法の応用に関する共同研究を行った。アイソスピン化学ポテンシャルが有限の状況は中性子星内部などの天体現象で実現していると考えられている。その様な系を記述するためには有効ポテンシャルをシグマの一変数関数からシグマと荷電パイオンの二変数関数へ一般化することが必要であった。共同研究ではアップクォークとダウンクォークの密度が異なる場合に対してクォークメソン模型を拡張することでくりこみ群方程式を導いた。共同研究では主に以下に上げる三つのことが明らかになった。1)メソンの質量の定義を新たに2点関数の極で行うことでゼロ温度の場合の臨界化学ポテンシャルとパイオンの質量の関係を再現した。2)クォークメソン模型を有限アイソスピン化学ポテンシャルに拡張したモデルは2カラーQCDの有効模型であるクオークメソンダイクオーク模型とそれぞれの自由度た対して一対一の対応があることがわかった。現在QCD自身の解析で2カラーQCDとの対応が盛んに議論されており、当研究は有効模型においてそれが実現した例である。3)3次元(温度、バリオン化学ポテンシャル、アイソスピン化学ポテンシャル)の空間においてQCD相図を特定した。

メソンのゆらぎを無視する平均場近似を行った場合と揺らぎを取り入れた場合についてそれぞれ相構造を計算し、その結果、メソンのゆらぎの効果は平均場近似の結果から大きな変化を起こさないことを示した。汎関数繰り込み群方程式は演算子形式や経路積分形式と同様に場の量子論の定式化の方法であり、QCDの有効模型に応用することで、中間子のゆらぎをきちんと取り入れた計算が可能となる。平成24年度は主にQCD臨界点近傍の密度ゆらぎの効果について研究を行った。QCD臨界点は有限密度、有限温度中に現れ2次相転移をする点であり、して様々な先行研究の結果に現れている。高エネルギー重イオン衝突実験での探索も行われており、QCD臨界点の性質の理論的予測が必要となっている。QCD臨界点近傍ではカイラル対称性のオーダーパラメータのゆらぎに加えてバリオン数の密度ゆらぎも増大することが知られている。そこで、これまでの多くの研究で用いられてきたカイラル対称性のオーダーパラメータだけで構成された有効模型に新たにバリオン数密度に対応する自由度を加え、QCD臨界点近傍での有効模型を構成した。この有効模型を用いてカイラル対称性のオーダーパラメータとバリオン数密度の2変数の有効ポテンシャルについて汎関数くりこみくりこみ群方程式を構成し、増大するそれらのモードのゆらぎを取り込んだ。くりこみ群方程式を数値的に解くことでQCD臨界点のまわりの物理量が特異的な振る舞いを起こす臨界領域の性質について調べた。数値計算の結果、臨界領域はカイラル対称性のオーダーパラメータとバリオン数密度の間の結合の強さに非常に敏感であり、結合が強ければ従来知られていた結果よりも臨界領域が大きく成り得ることが分かった。この結果はQCD臨界点周辺の理論的解析にはバリオン数密度の自由度を加えることが不可欠であることを示しており、バリオン数密度とカイラル対称性のオーダーパラメータの間の結合の強さをより微視的な理論を用いて見積もることの重要性をも示唆している。「研究の目的」2年目に当たる23年度は汎関数くりこみ群の方法をQCDの有効模型の有限温度の性質を調べることとなっていたが、実際にアイソスピン化学ポテンシャルが有限の物理系を含めて解析を行い結果を得た。よって順調に進展していると言えるが年度内に論文の出版までに至らなかったため(2)の評価となる。3年間の研究で汎関数くりこみ群方程式の適用可能な模型及び物理量の範囲を広げることができ、研究が順調に進展したと判断できる。しかしながら量子色力学への応用には及ばなかったために(2)の評価が妥当である。平成24年度は用いていた有効模型を更に拡張し、ベクターメソンの相互作用をも含めた解析をおこなう。ベクターメソンの自由度を含めた場合オーダーパラメータが2つの場合のくりこみ群方程式を構成し解く必要があるが、23年度にすでに荷電パイオンのオーダーパラメータが存在する場合のくりこみ群を完成させており、これらの応用でベクターメソンの揺らぎも含めて議論できる見込みである。平成24年度までの研究で、汎関数くりこみ群を用いて実時間2点関数の運動量依存性まで含めた計算を可能にすることができた。
雄性ラットにおける、GnRHニューロンに対するGABA性神経入力の生後変化

雄性ラットにおけるGnRHニューロンとGABAニューロンの生後変化に関する免疫組織学的検討を行った。その結果、GnRHニューロン数の成熟過程における変化は認められなかったが、OVLT外側領域でのGAD67陽性細胞数は16日齢では比較的少なく、25日齢では16日齢の2.7倍、30日齢では4.8倍、10週齢では5.7倍に増加することが判明した。またDBB領域でも同様に16日齢では少なく、25日齢では16日齢の1.8倍、30日齢では2.2倍、10週齢では2.8倍に増加することが確認された。一方、大脳皮質では以上のような明確な発達変化は認められず、16日齢から10週齢群まで定常的にGAD67陽性細胞が観察された。Cingulate CortexにおけるGAD67陽性細胞数を定量したところ有意な変動は認められなかった。GABA_A受容体はα、β、γ、δサブユニットが様々なパターンで組み合わされた5量体により形成されているが、特にαとβサブユニットはリガンド結合に中心的な役割を担っていると考えられている。そこで次に、GABAニューロンのGnRHニューロンに対する神経連絡を証明し、GnRHニューロンに発現するGABA_A受容体の成熟変化をサブユニットレベルで検討するために、まずGABA_A受容体α1サブユニットやβ2/3サブユニットとGnRHの二重免疫染色を行い、これらのサブユニット陽性のGnRHニューロン数の成熟変化について検討を行った。16日齢群では約20%のGnRHニューロンがα1サブユニット陽性、4060%のGnRHニューロンがβ2/3サブユニット陽性に過ぎないのに対し、10週齢群では約40%のGnRHニューロンがα1サブユニット陽性、8090%のGnRHニューロンがβ2/3サブユニット陽性であった。以上より、成熟に伴うGABA_A受容体を発現するGnRHニューロン数の増加が示唆された。我々は、雄性ラットにおけるGABAニューロンによるGnRHニューロンへの神経入力が、18日から29日齢の未成熟期に形成される可能性を示してきた。本実験ではまず、GnRHとGABA合成酵素の一つであるGAD67に対する抗体を使って、雄性ラットにおけるGABAニューロンの生後変化に関する免疫組織学的検討を行った。その結果、GnRHニューロン数の成熟過程における変化は認められなかったが、OVLT外側領域でのGAD67陽性細胞数は16日齢では比較的少なく、25日齢では16日齢の4.6倍、30日齢では6.4倍、10週齢では7.4倍に増加して行くことを見い出した。GABA_A受容体はα、β、γ、δサブユニットが様々なパターンで組み合わされた5量体により形成されており、ラット脳における各サブユニットの構成比率は個体の発達と成長に伴って変化することが知られている。そこで次に、GABAニューロンのGnRHニューロンに対する神経連絡を証明し、GnRHニューロンに発現するGABA_A受容体の成熟変化をサブユニットレベルで検討するために、まずGABA_A受容体β2/3サブユニットとGnRHの二重免疫染色を行い、これらのサブユニット陽性のGnRHニューロン数の成熟変化について検討を行った。16日齢群、10週齢群を用意して検討した結果、両群で多くのGnRHニューロンがβ2/3サブユニット陽性であったが、β2/3サブユニット陽性のGnRHニューロン数は、16日齢の未成熟群と比べ、成熟群では有意に増加した。また、胎生期のolfactory placodeのGnRHニューロンについても同様の二重染色を行ったところ、β2/3陽性GnRHニューロンはほとんど認められなかった。また、α1サブユニットとGnRHの二重免疫組織についても現在検討中である。16日齢群では約20%のGnRHニューロンがα

1サブユニット陽性、4060%のGnRHニューロンがβ2/3サブユニット陽性に過ぎないのに対し、10週齢群では約40%のGnRHニューロンがα1サブユニット陽性、8090%のGnRHニューロンがβ2/3サブユニット陽性であった。以上より、成熟に伴うGABA_A受容体を発現するGnRHニューロン数の増加が示唆された。
生体物質およびその関連物質を用いた発光ダイオードの作成、物性測定

電界発光測定がこれまでほとんど行われていない生体関連物質を対象として、電界発光測定(および関連した研究)を行った。その結果、スピンクロスオーバー錯体に混入したクロロフィルa(チュ-インガム等に入っている植物由来の生体関連物質)の示す電界発光が、スピンクロスオーバー転移に伴って消失-出現する、新規なスイッチング現象を見出した。また極低温・強磁場中の有機薄膜デバイスの光電流測定に初めて成功し、新規な磁場効果を発見した。(1)heminを用いて作成した発光デバイスは電圧印加時に発光スペクトルの変化が起こることを以前の研究で見出している。[実績報告書業績2]昨年度の研究の結果、この電圧誘起相転移に伴って、ポルフィリン分子の配向が、無配向から基盤に分子面に垂直になるように変化していることがわかった。この結果は、現在論文投稿を目指して、データのとりまとめを行っている。(2)cytchrome cを用いて作成した、発光デバイスが幅の広い発光を示すことを以前報告したが、この発光は注入されたキャリアの電極での発光であることを明らかにした。(3)ポルフィリン錯体の電界発光測定生体物質に類似の構造を有するM(TPP)[M=Cu,Zn]を用いた単層型電界発光素子(/ITO/M(TTP)/Al/)を作成し、実験をおこなった。この素子では、M(TPP)とITOが接触する側で、オーミック接合ができている。その結果、Zn(TPP)を用いた素子で、電圧により発光スペクトルの形状が変わる現象を見出した。この現象は、電荷注入により生じる励起子が低電界では二重項であったのが、高電界では一重項となることを示唆していると考えられる。電界発光における励起子生成過程は、未だに不明の点も多く、本物質の研究を通して、この過程を明らかにしたいと考えている。(4)極低温、強磁場中の光起電力測定有機薄膜デバイスの一種である、ポリマー太陽電池を作成し、光変調に対する光電流応答を調べたところ、温度依存性、磁場依存性に著しい変化を見出した。さらに光電流応答の磁場効果は、変調周波数が高いほど大きいことがわかった。ちなみに極低温で、ポリマー太陽電池の電流電圧特性の実験を行ったのは本研究がはじめてである。光起電力は、電界発光のちょうど逆の現象であり、生体物質を用いて類似の実験を行うことを現在計画中である。(1)分子配同と電流た竃圧特性の同時測定電流一電圧特性と,吸収スペクトルの偏光度を同時に測定するシステムを開発した。分子に由来する特定の吸収バンドは分子配向と密接な関連があるので,このシステムを用いることにより,電流一電圧特性の異常が分子配向の変化によるかそれとも別の要因に由来するかを実験的に明らかにすることができる。このシステムを用いて以下の実験を行った。(a)heminの電圧誘起転移においては,分子配向の変化が関連していることを昨年の研究で明らかにしたが,この配向変化が電流一電圧特性の異常と密接に関連していることを,同時測定により明らかにした(b)導電性高分子P3HTの電流-電圧特性においては,規則的なヒステレシスループが観測されるが,このヒステレシスループは分子配向の変化によることを明らかにした。(2)スピン転移と電界発光の相関の研究heminの電圧誘起発光スペクトル変化は,高スピン-低スピン転移に伴って電界発光の様子が変化することを示唆している。そこで,スピンクロスオーバー転移を起こす試料中に発光分子であるクロロフィルを閉じ込めて,電界発光測定を行ったところ,スピンクロスオーバー転移に伴う電界発光の消失を観測することに成功した。また,この研究に基づいた特許申請を行った。(3)強磁場中の光電流測定強磁場中で光電流測定を行い,磁場が光電流に大きな影響を与えることを見出した。(4)CELIV法による移動度測定CEILN法は,薄膜試料で移動度を測定できる手法として注目されている。極低温で,この実験が可能な測定システムを立ち上げて,実験を行った。(5)輸送方程式の数値計算薄膜デバイスの電気物性を定量的に解析してゆくためには,非線形の連立微分方程式である,半導体の輸送方程式を数値計算により解く必要がある。そこで,このような計算ができるプログラムを作成した。本研究課題においては、生体関連物質を用いた電界発光の実験を行い、また有機薄膜デバイスを用いた種々の物性研究を行った。最終年度においては、特にデータのとりまとめを中心にした。一連の研究と平行して、伝導性フタロシアニン塩に関する論文をPRB誌に発表した。また共同研究者の松田真生氏は、2月1日付けで熊本大学に転出した。(1)分子配向と電流一電圧特性の同時測定電流一電圧特性と、吸収スペクトルの偏光度を同時に測定するシステムを開発した。分子に由来する特定の吸収バンドは分子配向・と密接な関連があるので、このシステムを用いることにより、電流一電圧特性の異常が分子配向の変化によるかそれとも別の要因に由来するかを実験的に明らかにすることができる。

このシステムを用いて(a)heminの電圧誘起転移および(b)導電性高分子P3HTの電流一電圧特性における、規則的なヒステレシスループの起源を明らかにした。またこの研究成果のとりまとめを行いChem.Lett.およびThin Solid Filmで公表した。(2)スピン転移と電界発光の相関の研究スピンクロスオーバー転移を起こす試料中に発光分子であるクロロフィルを閉じ込めて、電界発光測定を行ったところ、スピンクロスオーバー転移に伴う電界発光の消失を観測することに成功した。また、この研究に基づいた特許申請を行うとともに、Chem.Lett.誌および化学工業誌に成果をまとめた。(3)強磁場中のCELIV測定強磁場中で光電流測定を行なった結果、磁場が光電流に大きな影響を与えることはこれまでの実験で見出していたが、CELIV法の実験を行った結果、トラップからの電子の脱出rateが磁場中で低くなることに起因するという結果を得た。成果の一部はThin Solid Film誌で印刷中である。
蛋白質生合成系の有機化学的拡張と合成生命体の創成

蛋白質生合成系を構成する分子群、すなわちアミノ酸、核酸、酵素などを有機化学的に拡張し、人工機能を持つ蛋白質を作製する。さらにこの拡張生合成系を生きた細胞に導入し、人工機能を発現する「合成生命体」を作成することが、本研究の目的である。平成19年度は以下の研究を行った。(1)大腸菌中で直交するtRNAとそれにアミノ酸を結合する酵素ARSとの対を用いて、いくつかの非天然アミノ酸をtRNAに結合させ、それらを大腸菌細胞外生合成系で発現させた。また、細胞外でアミノアシル化したtRNAを改変EF-Tuを介して哺乳類細胞(CHO)に導入し、細胞内で蛋白質が合成できることを確認した。さらに、あるtRNAに相補的な配列をもつペプチド核酸に非天然アミノ酸を結合させ、それを当該tRNAを発現させているCHO細胞に導入すると、細胞中で非天然アミノ酸が導入された蛋白質の発現が、極微量ではあるが、観測された。一方、リボソームを使用せずに蛋白質に非天然アミノ酸を導入する新方法として、酵素L/F-transferaseを使う方法が提案された。とくにこれを変異ARSとともに使うことにより、1段階、10-20分程度で蛋白質のN末端に非天然アミノ酸を導入できることが示された。非天然アミノ酸の蛋白質やペプチドへの導入技術は、蛍光標識蛋白質ライブラリーやペプチドライブラリー作製に使用できる。そのさきがけとして、合成ペプチドライブラリーを作製し、種々の蛍光性非天然アミノ酸を導入することによるがん細胞特異的結合ペプチドの探索を行った。現在までの準備的な結果では特異的ペプチドへの道筋が確認できている。非天然アミノ酸を蛋白質に導入する第1段階は,アミノ酸のtRNAへの担持(アミノアシル化)である。15年度はこの段階について集中的に研究し,以下の成果を得た。(1)アミノ酸活性エステルとtRNAとをミセル水溶液で混合することにより,50%以上の収率でアミノアシル化が起こることを確認した。また反応位置についても80%程度が本来の3'末端に反応していることが確認された。(2)アミノ酸活性エステルとペプチド核酸とを適当な長さのスペーサーを介して結合した分子(アミノアシルPNA)を作成した。これをtRNAと混合すると,tRNAの3'位置に特異的にアミノアシル化が起こることを確認した。またこの方法では種々のtRNA混合物中で特定のtRNAだけにアミノアシル化を起こすことが確認された。この方法を応用し,大腸菌細胞外生合成系中にアミノアシルPNA/tRNAの対を導入することによって,生合成系中で直接アミノアシル化を起こさせることが可能であることを見出した。したがって,合成生命体にはアミノアシルPNAの細胞内導入の段階だけを残すことになり,その実現可能性が具体的なものになった。上のアミノアシル化においてtRNA識別分子としてはNielsenらの開発したペプチド核酸(PNA)を用いた。しかしPNAは水溶性に問題があり,その細胞内導入効率は高くない。そこで新たに水溶性に優れたペプチド核酸としてピロリジン環を含むオキシペプチド核酸(POPNA)を開発し,それとDNAやRNAとの相補対形成の安定性を調べた。非天然アミノ酸として種々の蛍光性アミノ酸を開発した。とくに青色レーザーで励起可能な蛍光性アミノ酸としてアクリドニルアラニンが見出された。実際このアミノ酸を導入した蛋白質により,nMレベルの抗原やリガンドを蛍光で検出できることが示された。(1)ミセルを介したtRNA非特異的アミノアシル化:単離したtRNAを非天然アミノ酸で簡便にアミノアシル化する方法として、ミセル中でtRNAと活性化アミノ酸を混合した。それだけではほとんど反応しなかったが、これに超音波照射することにより、70%の収率でアミノアシル化が起こることがわかった。

またアミノアシル化は約70%の選択率でtRNAの2'あるいは3'末端OH基に起こっていることがわかった。これはいままで報告されている中でもっとも簡便なアミノアシル化方法である。(2)直交化tRNAの発見:非天然アミノ酸のキャリアーとしてのtRNAは、系中のアミノアシル化酵素を介した天然のアミノ酸によるアミノアシル化を受けてはならないが、いったん非酵素的にアミノアシル化されると効率よくリボソームにアミノ酸を受け渡すことが必要である。この直交化条件を満たすtRNAを種々のtRNAをもとに探索した結果、ウシミトコンドリア由来のものなどが見出された。(3)翻訳伸張因子(EF-Tu)と非天然アミノ酸担持tRNAとの結合:アミノアシル化tRNAをリボソームに送り込む酵素であるEF-Tuが、種々の非天然アミノ酸を担持したtRNAにも有効であるかどうかを確認した。その結果、かなり大きなアミノ酸を担持したtRNAであってもEF-Tuと結合することが明らかになった。(4)新規蛍光性非天然アミノ酸の作成:非天然変異蛋白質のもっとも重要な用途である蛍光基導入のためのアミノ酸を新規に設計し合成した。それらは細胞固有の蛍光がすくない480nmのレーザー光で励起可能であり、500nm以上の蛍光を高い量子収率で発することが分かった。(5)細胞導入可能な新規ペプチド核酸の合成:細胞に容易に導入できるように水溶性を高めた新規ペプチド核酸を設計し合成した。1.PNAをtRNA識別分子とする非酵素的アミノアシル化:tRNAの3`末端付近に相補的なPNAがtRNAと特異的に結合することを利用し、それに活性エステル結合を介してアミノ酸を結合することによって、非酵素的にアミノアシル化を行った。この方法はすでに1昨年度に報告しているが、今回はより大きな蛍光基としてBODIPYFL基をもつアミノ酸について、アミノアシル化を行った。種々の条件を最適化した結果、収率は10%程度と低いもののアミノアシル化が起こることが確認された。2.新規蛍光性アミノ酸の合成:昨年度から蛋白質に高効率で導入され、かつ側鎖が比較的小さな蛍光性アミノ酸の開発を行っている。本年度はアミノ酸のα炭素と蛍光基の間にエーテル結合を導入したものを作製した。この型のものは側鎖が柔軟なコンホメーションをとることが予想され、リボソームに取り込まれやすいと予想される。また水溶性にも富むので細胞導入も期待であきる。3.αシヌクレインへのニトロチロシンの導入:非天然アミノ酸導入変異法の応用として、パーキンソン病の原因と言われるαシヌクレインのニトロ化に伴う会合体形成について検討した。まず大腸菌無細胞蛋白質合成系でαシヌクレインを発現する系を作製した。つぎにそのなかのいくつかのチロシン残基をニトロチロシンに置換したものを作製した。これらについて、その会合性を比較したところ、133位にニトロチロシンを導入した変異体が4量体を形成することが予備的な結果として得られた。4.新規ペプチド核酸の合成と細胞導入:細胞に容易に導入できるようにカチオン基を導入した新規ペプチド核酸を設計し合成した。それらは哺乳類細胞の一種であるCHO細胞にそのまま導入できることが明らかになった。1.PNAをtRNA識別分子とする非酵素的アミノアシル化:PNAを介したtRNA
手術浸襲時におけるヒトリンパ球接着分子発現の動態と免疫応答の検討

生体の免疫応答は、損傷された組織が放出するインターロイキン8、ロイコトルエンを初めとする遊走因子により、リンパ球、好中球が損傷部位の毛細血管に停滞し、そこで血管内皮との接着し、血管外に脱出することにより開始される。この血管内皮との接着の段階には、細胞膜上に発現している多くの接着分子が関与していることが知られている。外科的手術は、多くの組織損傷を伴い、これにより生体は免疫応答を開始している。手術侵襲を受けている生体において、この免疫応答におけるリンパ球、好中球に発現しているLFA-1、CD35、CR3接着分子の役割を解析するために、リンパ球、好中球に発現している接着分子の発現の動態の変化を細胞学的、遺伝子発現のレベルから解析した。開腹手術を受けている生体より採取したリンパ球、好中球を用いて、モノクロール抗体を用いたフローサイトメーターにより膜抗原の発現を解析し、また、リンパ球よりメッセンジャーRNAを抽出し、遺伝子発現をPCR法ならびにRNA定性定量を用いて接着分子の遺伝子発現を解析した。リンパ球、好中球共に、LFA-1分子の細胞膜上の発現、mRNAの発現共に、腹腔内操作の開始から、1時間後に、発現の低下を認め、6時間目まで、低下を認めた。このことから、LFA-1分子の変動は、手術操作により臓器、腹膜に対する操作が炎症を惹起したことと関係があると考えられる。しかしながら、LFA-1分子を除く、CD35、CR3の接着分子の発現には、分子の膜上の発現、遺伝子発現に有意な変化を認めることができなかった。腹部手術及び、脳外科手術において、手術侵襲下ヒトリンパ球を採取し、細胞膜上に発現している接着分子(LFA-1、CD35、CR3、p150,95)の動態をモノクローナル抗体を用いてフローサイトメーターにて測定した。CD35、CR3、p150,95においては、細胞表面に発現している接着分子の変化を認めることはできなかった。しかしながら、LFA-1は、腹部手術においては手術開始早期(約1時間)よりLFA-1を発現しているリンパ球の低下を認めた。一方、脳外科手術においては、LFA-1の発現に有為な変化を認めることはできなかった。これらのことは、腹部手術においては腹膜等に存在するマクロファージが開腹手術により刺激を受けて炎症を引き起こし、ケモタクテック因子を放出することによりリンパ球を炎症部位に誘因している可能性を示唆していると考えられる。また我々は、スーパーオキシドジスムターゼ、グルタチオン還元酵素、カタラーゼ、チオレドキシンの活性酸素消去系蛋白の遺伝子発現を、ヒトT細胞リンホ-マ由来細胞株Jurkat細胞及び正常ヒトリンパ球をin vitroにて細胞に過酸化水素等の酸化剤を加えたメディアムにて一定時間培養した後、メッセンジャーRNAを抽出し、ノーザンブロッティング法にて解析した。このin vitroにおける遺伝子発現の解析の結果はチオレドキシン遺伝子が酸化的刺激に対し新しい遺伝子発現の機構にて遺伝子を発現、誘導していることが示唆された。

開腹手術を受けている生体より採取したリンパ球、好中球を用いて、モノクローナル抗体を用いたフローサイトメーターにより膜抗原の発現を解析し、また、リンパ球よりメッセンジャーRNAを抽出し、遺伝子発現をPCR法ならびにRNA定性定量を用いて接着分子の遺伝子発現を解析した。リンパ球、好中球共に、LFA-1分子の細胞膜上の発現、mRNAの発現共に、腹腔内操作の開始から、1時間後に、発現の低下を認め、6時間目まで、低下を認めた。このことから、LFA-1分子の変動は、手術操作により臓器、腹膜に対する操作が炎症を惹起したことと関係があると考えられる。しかしながら、LFA-1分子を除く、CD35、CR3の接着分子の発現には、分子の膜上の発現、遺伝子発現に有意な変化を認めることができなかった。