hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
自動血球分析装置による破砕赤血球定量の有用性

1.自動血球分析装置XE-2100による破砕赤血球比率定量の性能評価1)同時再現性3検体10回連続測定による同時再現性を検討した結果,CV22.29%(mean0.25%),CV11.68%(mean1.44%),CV4.49%(mean10.63%)と低値域でややばらつきがみられた。2)目視法との相関患者検体45検体について目視法とXE-2100による相関を検討した結果,回帰式y=1.47x+1.21,相関係数r=0.581であった。目視法とXE-2100のデータが乖離した症例について,MCV(平均赤血球容積),RDW(赤血球分布幅)との関連を検討したが,一定の傾向はみられなかった。3)採血後の経時変化3検体について室温保存と4°C保存で経時的に測定し,検体保存によるデータの変動を検討した。採血直後から48時間後まで,いずれの条件でも大きな変動はみられなかった。4)基準範囲の設定健常人およびスクリーニング検査で異常がみられない外来患者より,破砕赤血球比率の基準範囲を求めた。ノンパラメトリック法で求めた基準範囲はXE-2100で0.0050.785(n=64),目視法で0.0140.686(n=33)となった。2.赤血球破砕症候群での検討同種骨髄移植後に赤血球破砕症候群を発症した2症例について破砕赤血球比率を経時的に測定し,臨床経過との関係について検討した。破砕赤血球比率はLDH,間接ビリルビン,網状赤血球数の変動とほぼ一致した動きを示し,溶血性貧血の進行を反映しているものと考えられた。以上の結果より,XE-2100による破砕赤血球比率定量は,一部で目視法と乖離した結果を示す場合もみられたが,個々の症例での変動はよく一致しており,赤血球破砕症候群などの症例における経過観察においては大変有用であると思われた。
リアルタイム菌体pH測定法の開発とSha輸送系によるpH環境調節機構の解明

本研究は、pH感受性GFP変異体をpHプローブとして用いて、動的変化や局所的変化を含めた菌体内pHに関する詳細な情報を得ることを目的としている。本年度は、Bacillus属細菌におけるpH測定系の確立と、大腸菌の膜近傍pHの測定を行った。枯草菌や好アルカリ性菌などのBacillus属細菌における本pHプローブの発現量は大腸菌に比べて低く、そのままでは精度の良い測定が困難であるため、プロモーター改変等による発現量の上昇を試みた。枯草菌において構成的に高発現するS10プロモーターと統計学的に最適と予想されるリボソーム結合部位をpHプローブ遺伝子の上流に付加し、多コピーベクターpGETS103上で発現させた。その結果、Pspacプロモーターを用いた従来の場合と比べて数倍の蛍光強度の上昇が認められた。今後この系を用いて、大腸菌と枯草菌のpH恒常性を比較検討することが可能である。膜近傍pHの測定を目的として、大腸菌由来の様々な膜蛋白質とpHプローブとの融合蛋白質の発現を試みた。二次構造予測プログラムから膜貫通領域と予想される部分を抽出し、PHプローブのN末端側に融合・発現させた。その結果、浸透圧センサー蛋白質EnvZのN末側領域240アミノ酸残基を付加した場合に有意な蛍光強度が観察された。またpHプローブが膜画分に局在することを、ウェスタン解析により確認した。この系を用いて大腸菌の細胞質と膜近傍のpH恒常性を比較したところ、膜近傍pHは細胞質pHよりもややアルカリである傾向が認められた。本研究により、従来の方法では不可能であった菌体内pHの動的変化や局所的変化を調べることが可能になった。今後は、高い菌体濃度による蛍光の内部遮蔽効果など細菌特有の問題を解決しつつ、より良い系を確立していくことが課題である。本研究は、pH応答性GFP変異体をpHプローブとして利用して菌体内pHの動的変化を調べ、Sha輸送系の機能と関連づけることが目的である。本年度は、pHプローブの構築とpHキャリブレーションを行い、大腸菌の菌体内pHの挙動について検討した。まずpH応答性を持たないYFP変異体(Venus)に変異を導入し、Venus^*を得た。これにpH非応答性のGFPuvを連結して、pH-Venusを構築した。pH-VenusはGFPuv由来(390nm)とVenus^*由来(495nm)の2っの励起波長を持ち、その520nm蛍光強度比(R_<495/390>)は酸性側で低く、アルカリ側で高くなる傾向を示す。pH-Venus蛋白質をGST融合蛋白質として発現させ、グルタチオンセファロースカラムによりアフイニティー精製した。精製pH-Venus蛋白質を用いてpHキャリブレーションを行い、pH応答性を確認した。次に、pH-VenusをIPTG存在下で安定に発現するPspacプロモーター下流に連結して大腸菌細胞内で発現させ、菌体内pHの時間変化を追跡した。CSM培地で培養したときの大腸菌の菌体内pHは、対数増殖期ではややアルカリ(pH8)であり、定常期に入るとpH7.5まで酸性化が見られた。この間、外部pH変化は0.2以下と小さいものであった。またLB培地では、培養の進行に伴い外部pH変化が大きくアルカリ化するのに対し、菌体内pHは比較的安定している傾向が認められた。以上の結果から、菌体内pHは、「外部pH変化より小さく中性付近で安定している」という従来の考えに反して予想以上に動的に変化しており、またその挙動は培地条件により異なることが明らかとなった。今後は、pHプローブに適切なアンカー部位を付加することにより局所的pHを測定し、また別の細菌での挙動を調べて比較を行う予定である。

本研究により、従来の方法では不可能であった菌体内pHの動的変化や局所的変化を調べることが可能になった。今後は、高い菌体濃度による蛍光の内部遮蔽効果など細菌特有の問題を解決しつつ、より良い系を確立していくことが課題である。
エレクトロポレーション法による時間・空間特異的な遺伝子発現制御系の確立

初期胚の血管系は血流の有無に関わらず、段階的に形成されていく。このメカニズムの解明には、血管形成に係る特定遺伝子の発現を時間空間的に制御できる手法が必要である。本研究では、デュアルパルスエレクトロポレーション(DP)と導入遺伝子の特性に注目し、系の樹立を試みた。試行錯誤の結果、全身性にGal4蛋白質を発現させたTg(bactin2:GFF)を用意し、任意の領域にUAS:EGFP pAのベクターを注入、DPにより遺伝子導入する系を構築した。この系では、遺伝子を注入した任意の領域でEGFPの発現が確認され、発現誘導が証明された。今後は細部の改善を加え、より高精度な時間空間特異性の実現を図る。脳血管系がいかなる過程をへて形成されるか、我々は小型魚類のゼブラフィッシュを用いてその初期過程の全容をタイムラプス法を用いて詳細に解析した。その結果、眼胞嘴側に動脈性の、眼胞と耳胞の間の神経管の外側領域に静脈性の血管床がまず形成されて、そこからの血管新生によって脳血管系が構築される過程を明らかにした。しかしながら、この過程が個体内においてどのような分子機構により制御されているのか、いまだ不明のままである。この状態を打破するためには、時間・空間特異的に個体内で遺伝子を操作する方法の開発が必須である。そこで本研究では、発生過程にあるゼブラフィッシュ胚に微量インジェクションした核酸を、エレクトロポレーション法を用いて細胞内へ取り込ませることで遺伝子発現を制御する実験系の確立に挑戦する。本方法を確立することで個体自体を実験の場とし、形態形成に関与する新たな分子機構を明らかにすることを目指す。27年度には、まずはエレクトロポレーターを購入し、遺伝子導入実験が可能な環境のセットアップを行い、全身性に遺伝子発現するbactin遺伝子のプロモーターに緑色蛍光蛋白質(EGFP)をつなげたplasimidを作成した。そしてこのplasmidを用いて、エレクトロポレーション法による効率的な遺伝子導入条件を探索した。遺伝子導入の成否は、発現したEGFPの蛍光で判断した。当初は、アガロースに包埋した胚は、マイナス極のタングステン電極をインジェクション用のガラス針の中に差し入れ、プラス極の電極はサンプルを包埋したゲルの下層にシート状に設置する方法で、遺伝子導入を試みたが、ある程度の太さにガラス管の先端を削らないと十分な電流が流れないことが判明した。そこで、従来通りの白金電極を用いた方法で、条件検討を試みた。使用する胚が生存可能な電圧の上限を探索し、その後実際にplasimid DNAのインジェクションを行ったあとに電圧負荷をかけて導入を試みた。しかしながら27年度中に、遺伝子導入を成功することはできず、次年度以降に更なる条件検討を進めていく必要がある。脳血管系がいかにして形成されるか、我々はゼブラフィッシュを用いてその初期過程の全容をタイムラプス法を用いて詳細に解析した。そこで本研究では、発生過程にあるゼブラフィッシュ胚に微量インジェクションした核酸を、エレクトロポレーション法を用いて細胞内へ取り込ませることで遺伝子発現を制御する実験系を確立し、個体自体を実験の場とすることを目指した。2015年度には、遺伝子導入を成功させることができなかったため、2016年度には、GAL4-USAシステムを導入し、新たな実験系の樹立を試みた。すなわち、全身性にあらかじめGFFタンパク質を発現する遺伝子組換え体Tg(bactin:GFF)を新規で作成し、この組換え体に対してUSA:EGFP vectorをエレクトロポレーションにより導入することを試みた。結果、vectorをインジェクションした領域でのみエレクトロポレーションしたタイミングでEGFPの発現を誘導することができ、時間空間的に制御した遺伝子導入系の樹立に成功した。本方法では、GFFの発現組織を組み換え体により制御することで組織特異性を得ることが可能となるが、今後の課題としては、高効率で導入可能なvectorのサイズに制限がある点(5kbp以内)が挙げられる。またより局所性を高めるため使用する電極に今後更なる検討と改善を加えていく。28年度は、継続して効率的に遺伝子導入可能な条件検討をまずは進めていく。必要に応じて、アフリカツメガエルやニワトリ胚子、マウス胚子での遺伝子導入実績をもつ研究室と共同で進めていく。導入条件を確立でき次第、血管系、神経組織、網膜組織、神経堤細胞特異的に血管系の動静脈分化や形態形成への関与が報告されている遺伝子をそれぞれ導入し、異所的な強制発現による影響を評価する。

また並行して血管系・神経組織・神経堤細胞・網膜組織での特異的な遺伝子発現を制御するDNAコンストラクトをそれぞれ作製する。P2A配列を介することで上流の蛍光タンパクと下流の機能遺伝子を同時に発現させる系を確立する。遺伝子導入に成功した胚は、その後の血管系の動静脈分化や形態形成への影響を評価する。特に本研究では、その観察対象領域として、9-15体節期に認められる最初の動脈性血管床、静脈性血管床の発生分化、そこからの血管新生による脳底動脈輪の形成に注目して、遺伝子操作による影響を共焦点レーザー顕微鏡により観察する。解剖学一般(含組織学・発生学)計画に遅延が生じたため、残額が10万円程発生した。上記のごとく繰越金額は10万円程であり、28年度の予算と合わせて使用する。28年度の研究費は遺伝子破壊体作成のために科研費使用のルールを厳守して使用していく。
海の深層冷熱を利用する取排水のない発電所の冷却水システムに関する研究

本研究では、冷却水を海の深層の低温領域と発電所の復水器の間でクローズドで循環させ、取排水をともなわずに深層の冷熱をタービン発電の蒸気冷却に用いるシステムを提案し、その成立性に関する研究を実施した。10万kW級の汽力発電所に適用した場合のケーススタディの結果、冷却水への抵抗低減剤の添加や、適切な要目計画によって電力の利得が2.5%程度まで得られることが示され、また、海底配管敷設方法や深層熱交換器の概略イメージの明確化、深層への入熱を利用した湧昇による海域肥沃化の可能性評価を行うことができた。本研究では、蒸気タービン発電の冷却用水を、海の深層の低温領域と発電所の復水器の間で循環させる、取排水をともなわない発電所冷却水システムを提案している。温排水による沿岸域生態系への影響を回避できることに加え、取排水路の生物付着やクラゲ侵入対策が不要になること、冷却水温度の夏場の上昇が抑制されること等が効果として見込まれる。本年度の主な成果は以下の通りであり、システム成立性の確度が向上した。1.発電端出力10万kW級の汽力発電所を対象に、従来の取排水方式に替えて海洋深層冷熱利用方式を用いた場合のシステム設計を行い発電効率への影響を検討した。海洋深層の低温を利用するとタービンの発電出力が向上するが、長距離の海底配管内で生じる摩擦損失によってポンプ消費動力がその効果の一部を減殺する。従来の取水量に相当する循環流量と海底配管の管径を適切に選ぶことが重要であることが示された。また今回の検討範囲では従来型に比べて3%程度までの利得が得られると評価された。2.表層より栄養が豊富な深層海水中での、周囲より表面温度の高い人工構造物への生物付着あるいは化学的成分の付着について、東京都大島の深層水取水設備を用いて実験的研究を行った。光を遮断し深層水をかけ流した環境下では温度によらず特に付着物は認められなかった(実験期間2ヶ月)。今後、実験条件を変えて追試を行う予定である。3.深層域での熱交換によって生じる高温・低密度水の挙動シミュレーションを行うための数値モデルを作成した。今後、海底熱交換器周辺への熱の広がり方の推定や、湧昇流による新漁場造成の可能性の検討を行うのに資する。本研究では、発電所構内の復水器と深度数百メートルの海洋深層との間を循環型の大径配管で結び、深層の冷熱を用いて復水器での蒸気冷却を行うことによって、温排水がなく、発電効率が年間を通じて安定化・向上する新形式の冷却水システムを提案している。その技術的・経済的成立性を明らかにするために、本年度は総合評価に必要な手法の構築・データの取得を行った。主な成果は以下のとおりである。1.管内摩擦損失計測用温度制御型回流実験装置(測定区画の長さ2.8m・内径50mmまたは100mm、最大流速3m/秒(内径100mmの場合)、設定温度;室温70°C)を製作し、冷却用水への抵抗低減剤添加による管摩擦損失低減効果と温度影響・抵抗低減剤の種類や濃度影響を実験的に評価した。2.一般に光が届かずかつ低温の海洋深層では生物活動が希薄で生物付着などは少ないと考えられているが、そこへ熱が持ち込まれた場合の知見は乏しい。そこで研究代表者らの所属機関が伊豆大島に保有する深層水取水設備を利用して定期的に実際の深層水を入手し、暗室内で低温に制御した深層水中にチタン細管を配して高温水を30日間連続して流し、管表面の付着物の観察・分析、伝熱性能変化の計測などを行った。40°C以上の高温部では海洋性バクテリアによるバイオフィルムが付着・成長し伝熱性能が低下したが、本システムで想定している程度の温度範囲ではほとんど変化が無いことが薙認された。3.深層へ熱入力があった場合の物理-生態系結合モデルを構築し、仮想的な海域における栄養塩動態のシミュレーションを行うことにより、深層での熱交換による湧昇を利用した海域肥沃化効果の試計算を行った。本研究では、発電所構内の復水器と深度数百メートルの海洋深層との間を閉鎖式循環型の大径配管で結び、深層の冷熱を用いて復水器での蒸気冷却を行うことによって、温排水がなく、発電効率が年間を通じて安定化・向上する新形式の冷却水システムを提案している。平成24年度は研究計画の最終年度にあたり、当初予定どおり、新システムの総合評価を行った。1.海底に設置することになる熱交換装置の熱交換性能評価法を開発し、陸上から送られてくる温度の高い冷却用水が深層で所要の低温まで冷やされるために必要な装置の基本計画を行った。熱交換性能と装置の規模がトレードオフになるが、海洋での設置工事が不可能なほどの規模は不要であることが示された。

2.海底の熱交換装置の性能、冷却用水への界面活性剤添加による管内摩擦抵抗低減の効果など、これまで本研究で得られた評価成果をおりこんで、システムの性能面の総合評価を行った。最適な配管直径や流量を選定すると、従来の冷却水システムに比べて2%強の発電効率向上が見込まれる。3.長い配管の敷設工事を短縮して工事の安全性・経済性を高めるために、全長一括敷設方式を提案し、敷設時のパイプの挙動および強度のシミュレーション計算手法を開発して地形に応じて適切な敷設方法の指針を得た。本方式は、撤去時の工事の時間短縮にも有効になる可能性が示唆された。4.昨年度に引き続き、地形を考慮した海流・潮流のシミュレーションと深層の熱交換で生じた低密度水の挙動のシミュレーションを行い、生態系モデルを付加して、栄養塩を豊富に含む深層水が温められ表層へ輸送されることによる海域の一次生産力向上等について評価した。循環型冷却水システムの冷却用水への抵抗低減剤添加による効果が定量的に評価可能になり、深層の低温利用による発電効率向上が管内摩擦損失や熱交換器内の損失を上回ることをケーススタディ計算で確認した。また海底に設置する熱交換器への付着物(ファウリング)についてはバクテリアによるバイオフィルム付着の可能性が実験的に確認されたが、想定温度内ではほとんど影響がないと判断された。さらに、深層への熱入力にともなう周囲の流場変化予測と湧昇に伴う栄養塩の挙動検討を行うための数値モデルを構築し、入熱の有効利用による肥沃化効果検討の準備ができた。以上、研究計画に沿ってほぼ順調に成果が上がっている。24年度が最終年度であるため、記入しない。平成24年度は研究計画の最終年度にあたる。当初予定どおり、新システムのプロトモデルを構築し性能面・経済面での総合評価を行う。具体的には、まず海底設置型熱交換装置の性能評価手法の開発を行い、所要の性能を発揮するための基本計画を行う。またこれまでに得られた知見や開発された手法を用いて海底配管の基本計画を行う。これらによって新形式冷却水システムを採用した場合のプロトモデルを構築し、全体としての効率向上・費用を評価する。また深層への熱入力を有効利用した肥沃化効果の可能性を提示する。
腎がん治療薬パゾパニブの肝毒性メカニズムの解明と薬物動態・薬理遺伝学的解析

パゾパニブは経口の分子標的抗がん薬であり、国内では腎がんの治療薬として承認されている。パゾパニブは、既存薬のスニチニブよりも骨髄抑制や消化器症状がなく、今後の進行腎がんのキードラックとして位置付けられている。しかし、一部の患者では肝不全により死亡に至った例が報告され、その危険因子の解明が喫緊の課題である。今回、パゾパニブを投与された腎がん患者における血中濃度測定および遺伝子多型解析は順調に集積されている(11名、採血70ポイント)。しかし、予定症例数(50名、300ポイント)には達しておらず、現在、肝毒性の要因をPK/PD/PG解析するためのデータ整理を行っているところである。今回は、パゾパニブを投与された透析患者で重篤な肝機能障害を来した症例を経験し、パゾパニブの透析による蓄積性を検討したので報告する。1)肝不全を来した透析患者においてパゾパニブの血中濃度を解析した症例1)70才男性。転移性の腎がんで、透析を施行中。スニチニブ等で前治療をしていたが、肺転移巣の増大のためパゾパニブが400mg/日で開始となった。開始3日後にGrade3の肝機能障害が発現した。休薬10日後に、200mgを隔日投与で再開され、再開7日後のトラフ濃度(透析前)は2,900ng/mLと低値であったため(有効域は15,000ng/mL以上)、200mg/日へ増量となった。パゾパニブ開始34日目(非透析日)および35日目(透析日)にパゾパニブの血中濃度を継時的に採血し、トラフ濃度、最高血中濃度およびAUC_<0-24>値は透析日と非透析日で差はなかった。投与開始60日目に、G1の肝機能障害を発現したためパゾパニブは中止となった。本症例において、パゾパニブの薬物動態は透析の影響を受けないことがはじめて示された。
急性期疼痛時の脊髄におけるｎNOSとCOX-2の関連性

神経障害性疼痛は、末梢の神経損傷や機能異常が起こってから一定の期間を経て形成されることが分かっているが、超急性期にどのような変化が生じるのか未解明な点が多い。申請者は先行研究で、末梢の虚血性変化に対して、その直後より脊髄で一酸化窒素が形成され、神経活動増強に関連することを発見した。今回、その早期の変化が疼痛形成へと流れる機序の一端を解明し、将来的な神経障害性疼痛の治療につながることを期待して、本研究を遂行していく予定である。
4Dライブセルイメージングデータ内の非常に多数の細胞の自動追跡手法の開発

本研究で4Dライブセルイメージングデータ内の非常に多数の細胞を自動追跡するための基盤技術の開発を目指した.細胞動画像の典型的な特徴のひとつとして,多数の細胞が密に存在し視覚的に類似している.標準的な追跡手法を利用した場合,本来追跡すべき細胞を別の細胞と誤認し追跡に失敗する.この問題に対し,細胞の運動は近隣の細胞の位置や運動に依存するという空間的依存性に着目し,追跡のための補助的な情報としてこれを利用することで追跡精度の向上を目指した.課題研究を順調に遂行することができ,高速かつ高精度で細胞の追跡を行うことのできるソフトウェアの開発に成功した.楕円形状の複数対象物体の同時追跡手法の開発線虫の神経細胞の活性に関する動画像データからの神経細胞の追跡を平成27年度の課題とした.対象となる動画像は奥行きのある3次元動画像であるため,試作段階のソフトウェアのさらなる拡張が必要であった.以下の順で研究を進めた.(1) 3次元動画像への対応.まず試作済みの2次元動画像用ソフトウェアを3次元動画像へ対応させた.これは現在解析対象としている神経細胞の動画像が3次元であるためである.しかしながら,解析対象とする線虫の動画像に限らず例えばThe Cell: An Image Libraryに登録されている多くの動画像が3次元であり,汎用性という意味でも意義のある拡張である.拡張に必要な作業は単に対象物の座標を2次元から3次元に変更するのであり,比較的単純な作業であった.(2)対象物の出現・消滅への対応.現在対象としている動画像では神経細胞の活性の増加・減少に応じて追跡対象の出現・消滅が起こるため,出現・消滅への対応が必要不可欠である.標準的な粒子フィルタでは消滅中に対象物が予測不可能な動作をした場合,それ以降の追跡に失敗することが多い.消滅中の対象物の位置予測に使う情報が,対象物の最後に出現した位置のみになるからである.本研究では,複数物体の共変動という性質に着目し物体追跡に他の対象物の相対位置を考慮に入れる拡張を行ったところ,消滅中も高い精度での物体追跡を行うことができた.細胞追跡アルゴリズム「空間粒子フィルタ」の提案細胞画像中の多数の細胞を高精度で同時追跡するために粒子フィルタの改良手法を提案した.その際,類似手法であるマルコフ確率場を利用した粒子フィルタ(MRF-PF)のサンプリングの課題を克服するために,効率のよいサンプリング手法を開発する必要があった.以下がそのアイデアである.標準的な粒子フィルタにおけるサンプリングの非効率さは,時間情報からの細胞位置予測の難しさに由来する.この非効率性を克服するためのアイデアが細胞運動の空間的依存性(共変動性)を提案分布の設計に組み込むことであった.もし現在と1つ前の観測時点における標的細胞の周辺に存在する細胞の位置が既知であり,細胞運動が空間的に強く依存しているのであれば,標的細胞の位置はその空間的依存性から効率的に予測することができる.そこで,粒子フィルタにおける時間情報からの提案分布の代わりに,空間情報に基づいて標的細胞の位置を予測する提案分布を設計した.本研究で4Dライブセルイメージングデータ内の非常に多数の細胞を自動追跡するための基盤技術の開発を行った.細胞動画像の典型的な特徴のひとつとして,多数の細胞が密に存在し視覚的に類似していることが挙げられる.このような動画像に対し標準的な追跡手法である粒子フィルタを利用した場合,本来追跡すべき細胞を別の細胞と誤認し追跡に容易に失敗してしまう.この問題に対し,細胞の運動は近隣の細胞の位置や運動に依存するという空間的依存性に着目し,追跡のための補助的な情報としてこれを利用することで追跡精度の大幅な向上を達成した.前年度は楕円形状の複数物体の同時追跡手法の開発を行った.ほぼ研究計画通りの進捗があった.具体的には以下を行った.(1)追跡ソフトウェアの3次元動画像への対応:試作済みの2次元動画像用ソフトウェアを3次元動画像に対応させた.これは今回主な解析対象であったデータが3次元動画像だったためである.(2)対象物の出現・消滅への対応:今回主な解析対象とした動画像では追跡対象である神経細胞の出現・消滅が起こる.本研究で複数物体の移動量の相関に着目し,物体追跡に他の対象物の相対位置を考慮に入れる拡張をおこなった所,消滅中も高い精度で追跡を行うことができた.前年度の経過を踏まえ今年度も計画通り以下の進捗があった.(1)自由形状対象物への応用:追跡対象物を自由形状物体に拡張した.これは場当たり的な探索に対する正解判定を改良するという方針で開発を行った.その結果,自由形状物体であってもまずまずの精度での追跡を実現した.(2)対象物の経時的な形状変化への対応:(1)の開発後,追跡対象物の形状変化への対応を行った.細胞分裂時の紡錘体や組織内を移動する細胞である遊走細胞は,時間の経過とともにその形状が変化する.このような場合であっても,まずまずの追跡精度を達成するソフトウェアの開発に成功した.平成28年度には,より汎用的な追跡手法の開発を目的として形状変化を考慮した自由形状対象物の追跡手法の開発を行った.具体的には以下について研究を行った.(1)自由形状対象物への応用:追跡対象物を自由形状物体に拡張した.ここでの自由形状物とは例えば神経細胞に対応する星型の形状のように,球や楕円体などの単純な形状をとらない対象物である.

これは場当たり的な探索に対する正解判定を改良するという方針で開発を行った.より具体的には,初期フレームの対象物の画像領域そのものを正解判定に使うという方法である.(2)対象物の経時的な形状変化への対応:(1)の開発後,追跡対象物の形状変化への対応を行った.細胞分裂時の紡錘体や組織内を移動する細胞である遊走細胞は,時間の経過とともにその形状が変化する.この場合に,追跡の良さの判定素材として追跡対象物の静止画像(テンプレート)を利用する標準的な手法を採用すると,形状変化に対応できないため,追跡精度が著しく低下する.この問題に対処するために,テンプレートを経時的に変化させる方法を導入した.より具体的には現在時刻からある程度以前の時間までの追跡対象に対応する部分画像の移動平均により判定素材を更新させる方法を実装した.本研究で,4Dライブセルイメージングデータ内の非常に多数の細胞を自動追跡するための基盤技術の開発を目指した.細胞動画像の典型的な特徴のひとつとして,多数の細胞が密に存在し視覚的に類似していることが挙げられる.このような動画像に対し標準的な追跡手法である粒子フィルタを利用した場合,本来追跡すべき細胞を別の細胞と誤認し追跡に容易に失敗する.この問題に対し,細胞の運動は近隣の細胞の位置や運動に依存するという空間的依存性に着目し,追跡のための補助的な情報としてこれを利用することで追跡精度の向上を目指した.本研究の意義は,追跡結果をもとに細胞運動の定量化を計算機で自動化することができ,提案手法を前提とした医学生物学の研究が期待できる点にある.例えば,線虫の個々の神経細胞の活性強度を蛍光タンパク質を利用することで視覚化することができるが,本手法が実現すれば,非常に多数の神経細胞の刺激に対する活性を経時的に定量化することができ,嗅覚などのさまざまな刺激をどのような神経活動ネットワークを利用して処理しているかという研究に応用可能である.課題研究を順調に遂行することができ,2年目終了までに高速かつ高精度で細胞の追跡を行うことのできるソフトウェアの開発に成功した.また,開発したソフトウェアを代表者のウェブサイトで配布した.最終年度である3年目には,研究結果をまとめた論文がIEEEの専門誌に掲載されることが決定した.本研究で4Dライブセルイメージングデータ内の非常に多数の細胞を自動追跡するための基盤技術の開発を目指した.細胞動画像の典型的な特徴のひとつとして,多数の細胞が密に存在し視覚的に類似している.標準的な追跡手法を利用した場合,本来追跡すべき細胞を別の細胞と誤認し追跡に失敗する.この問題に対し,細胞の運動は近隣の細胞の位置や運動に依存するという空間的依存性に着目し,追跡のための補助的な情報としてこれを利用することで追跡精度の向上を目指した.課題研究を順調に遂行することができ,高速かつ高精度で細胞の追跡を行うことのできるソフトウェアの開発に成功した.平成28年度には,より汎用的な追跡手法の開発を目的として形状変化を考慮した自由形状対象物の追跡手法の開発を行う.発生段階での細胞分裂動画像における染色体の追跡や複数の遊走細胞の追跡など様々な動画像への応用を予定している.(1)自由形状対象物への対応:まず追跡対象物を自由形状物に拡張する.
血管新生による脳血管障害および血管性痴呆の予防法・治療法の開発

アテローマ血栓性梗塞など虚血性脳血管障害による脳梗塞の進行さらには血管性痴呆は頻度も多く大変大きな問題となっている。私達が開発したRDP(deversed durapexia)は効果的に脳硬膜の血管から虚血脳へ豊富な神聖血管を誘導しうる方法であり臨床例を重ねその効果を確認している。しかしながらさらに効率良く、より確実な血管新生療法とするために昨年に続いて血管新生機序の解明と治療法の開発を目的として研究を行った。前年度までに虚血血巣の辺縁部すなわちpenumbraの状態にある部分で血管増殖因子VEGF,bFGF,TGF-βが増加していることを経時的に観察し、また同部を中心に血管密度が増加していることもあきらかにした。今年度は増殖因子陽性細胞の単位面積当たりの数を数え、部位(大脳皮質、大脳基底殻、梗塞部)別に経時的にその変化を明らかにした。また血管密度についても局在毎にNIH imageを用いて計測し経時的に観察した。増殖因子ではVEGFが虚血7日後には最も増加し、他の2つも1日後から増加し30日後まで維持していた。血管密度は7日後には明らかでなかった30日後には増加していた。同じ虚血モデルを作成し、さらに脳の虚血部を被う硬膜に線状切開をおいた。21日の脳と硬膜の関係を保ったままの観察では、硬膜血管から虚血脳組織に多数の血管が新生してきているのが認められた。虚血巣へ周囲脳組織からの血管新生、増加も認められたが、硬膜血管からの新生の方が著明であった。さらに同じ虚血モデル(硬膜の切開を伴った)の硬膜切開部に増殖因子VEGF,bFGFを同時に投与し、14日後に組織を検討したところさらに血管新生は強く認められた。現在血管新生療法として硬膜血管からの新生血管を得るRDP(reversed durapexia)を臨床例で行っているが、今回得られた結果はそれをさらに効率のよい方法に発展させ得ることを示唆していると考える。これらの成果の一部は昭和大学共同研究発表会で報告し、11th International Vascular Biology Meetingで発表する。またこの成果を含めて「血管新生研究の新展開」(医薬ジャーナル社)に「血管新生療法:脳血管」として掲載された。動脈硬化性変化、モヤモヤ病など虚血性脳血管障害による脳梗塞さらには血管性痴呆は大変大きな問題であり、その対応策の開発が望まれる。私たちは侵襲が少なく、効果的に脳硬膜の血管から虚血脳へ豊富な新生血管を誘導しうる間接的血行再建術RDPを開発し、臨床例を重ねその血管新生に関係しうる関係因子の検討を行うとともに、その血管新生機序の解明とより効果的な治療法開発を目指して実験的研究を行ってきた。動物実験では(実験1)ラットの中大脳動脈閉塞モデルを作成し、梗塞巣およびその周辺での増殖因子(VEGF,bFGF,TGF)および血管数を3時間後から1ヵ月後まで経時的に観察した。

増殖因子は免疫組織学的手法を用い、因子によって担細胞は異なるが、ともに梗塞巣辺縁部では3日目から出現し、1週間で最高になり、1ヵ月後にはより限極して認められた。血管の多寡は免疫染色した組織像を写真にとり画像解析装置を用い部位毎に測定した。1ヵ月後には梗塞辺縁部の外側に血管増殖を認め、大脳皮質より大脳基底核でより顕著であった。さらに(実験2)では、同じ虚血モデルを用い、虚血部を覆う脳硬膜を露出し、ここに硬膜切開を作りRDPのモデルとした。経時的に血管新生の有無、程度を観察し、硬膜側から虚血脳への新生血管の増殖を認めた。さらに増殖因子をフイブリン糊に混入し硬膜切開創部に塗布し、血管新生の増強効果の有無の検討を進めている。これらの結果は第1回日本細胞生物学会、11th Intenational Vascular Biology Meetingなどで報告してきた。単行本“血管新生のメカニズムと疾患"の“血管新生と治療:脳血管"を分担し執筆を進めているところである。前年度までに脳虚血巣の辺縁部すなわちpenumbraの状態にある部分で血管増殖因子VEGF,bFGF,TGF-βが増加していることを経時的に観察し,また同部を中心に血管密度が増加していることもあきらかにした.今年度は増殖因子陽性細胞の単位面積当たりの数を数え,部位(大脳皮質,大脳基底殻,梗塞部)別に経時的にその変化を明らかにした.また血管密度についても局在毎にNIH imageを用いて用いて計測し経時的に観察した.増殖因子ではVEGFが虚血7日後に最も増加し,他の2つも1日後から増加し30日後まで維持していた.血管密度は7日後には明らかではなかったが30日後には増加していた.同じ虚血モデルを作成し,さらに脳の虚血部を被う硬膜に線状切開をおいた.21日後の脳と硬膜の関係を保ったままの観察では,硬膜血管から虚血組織に多数の血管が新生してきているのが認められた.虚血巣へ周囲脳組織からの血管新生,増加も認められたが,硬膜血管からの新生の方が著明であった.さらに同じ虚血モデル(硬膜の切開を伴った)の硬膜切開部に増殖因子VEGE,bFGFを同時に投与し,14日後に組織を検討したところさらに血管新生は強く認められた.現在血管新生療法として硬膜血管からの新生血管を得るRDP(reversed durapexia)を臨床例で行っているが,今回得られた結果はそれをさらに効率のよい方法に発展させ得ることを示唆していると考える.
高等植物における小胞体分子シャペロンの発現制御機構の解析

1, BiPプロモーターの解析アラビドプシスBiP遺伝子プロモーター(約1.5kb)にβ-グルクロニダーゼ(GUS)遺伝子を連結したキメラ遺伝子を用いトランスジェニックアラビドプシスを作製した。トランスジェニック植物においてGUS活性はツニカマイシンにより顕著に誘導された。TATAボックスから62bp上流までプロモーターを欠失させても誘導性が見られたことから、UPRに必要なシスエレメントはこの62bpの領域に存在すると考えられたが、この領域には酵母あるいは哺乳類で同定されているシスエレメントと相同の配列は見られず植物特有のシスエレメントの存在が示唆される。この領域に関してさらに詳細な解析をすすめる。2, Irelホモログの単離イネおよびアラビドプシスからIrelのホモログと考えられるcDNAを単離した。酵母あるいは哺乳類のIrelpと同様タンパク質の中央付近に膜貫通領域が存在し、C末端側のキナーゼドメイン、RNaseドメインは高度に保存されているが、N末端側のセンサー機能を持つと考えられる領域の相同性は低い。イネホモログにGFPを連結しタマネギ表皮細胞でのトランジエントな発現により細胞内局在性を調べたところ、小胞体あるいは核膜近辺に局在することが示唆された。続いてイネホモログをアラビドプシスで過剰発現させ、UPRに与える影響を調べている。3,突然変異体の探索1)で作製したトランスジェニックアラビドプシスの種子をEMSにより変異処理した。M2植物をツニカマイシンに対するGUS活性の誘導性を指標にスクリーニングし、ツニカマイシンによりGUS活性が誘導されない変異体、あるいはツニカマイシン処理をしなくても高いGUS活性を示す変異体を得た。BiPの発現を調べることで、実際にUPRのシグナル伝達系に変異がある個体を選び、特徴付けをおこなうとともに原因遺伝子の単離を目指す。
環境志向型光学活性ハイブリッド錯体の多機能発現メカニズムの解明と応用

この3年間において,新規なハイブリッド錯体の立体選択的または用いる化合物により様々な生成比で光学活性な多核錯体を合成する方法を見出すことができた。さらに,配位子の置換基を変えることで容易に多核錯体の構造を変化させることも可能なことが明らかにでき,環境応答性金属錯体におけるキラル選択性に及ぼす付加的な要因に関する知見を得ることができた。本研究内容は交付期間後も引き続き検討し,光学活性を有する環境応答性多核金属錯体の開発を目指し,このシステムを用いた機能発現を拡大していきたいと考えている。今回のテーマは,光学活性を有する環境応答性金属錯体の開発を目指し,キラル反転反応を特定の部位に,いかに効率よく誘起するかについて,分子レベルで設計,合成するとともに,そのシステムを用いた機能発現に焦点をあてる。本研究では,組織化反応を行う上で有用となる16族元素として硫黄および酸素原子を含む二あるいは三座配位が可能な配位子を用い,単核錯体を原料とした異種の金属あるいは金属錯体との間で形成される多核錯体の立体選択的合成を試みる。昨年度からの継続として,配位子としては光学活性な錯体を合成できること及び溶液中で分子内あるいは分子間の水素結合が形成可能なメルカプト酢酸,メルカプトプロピオン酸に加えて,Lーシステインメチルエステル(L-cysMe)やLーシステインエチルエステル(L-cysEt)を用いた。昨年に引き続き,L-cysEt単核錯体と種々のコバルト(III)錯体との反応を行ったところ,様々な生成比で光学活性な三核錯体を合成できることがわかった。さらに今回は,メルカプト酢酸,メルカプトプロピオン酸を用いた錯体の光学分割を行うことにより,光学活性な単核錯体を合成するとともに,立体特異的な集積型多核錯体の合成法に関する新規実験を行った。単離した単核錯体は,可視ー紫外吸収・赤外吸収・NMRスペクトルおよび元素分析等に基づいて構造決定を行ったのちに,それらのCDスペクトルを測定することにより,立体化学的,分光化学的性質を明らかにした。メルカプトプロピオン酸錯体では,4つの異性体(ΔR,ΔS,ΛR,ΛS)を分離することができ,スペクトルを比較したところ,これまでに報告されているチオラト錯体やアミノ酸錯体と同程度のCD強度を示したのに対して,加成性に基づいて計算した隣接効果の示すCD強度が顕著に大きくなるという興味深い結果が得られた。最終年度である今回は,これまでの脂肪族チオラト配位子を用いた単核コバルト(III)錯体の合成及びそれらを前駆体とした多核錯体の合成による立体特異的な集積型多核錯体の合成に関する知見との比較を目的とする検討を行った。具体的には,ピリミジンチオレート誘導体を用いた単核コバルト(III)錯体の合成およびそれらを前駆体としたコバルトー銀混合多核錯体の合成を行い,立体選択性に及ぼすチオラト配位子の影響について置換基の違いをもとに比較,考察した。ピリミジン環上の置換基をメチル,アミノ,ヒドロキシ基の組み合わせにより変化させた配位子を用いることで,2つの置換基の空間的な配置が異なる2つの結合異性体のうち一方のみを選択的に合成することに成功し,それらの構造を単結晶X線構造解析により明らかにした。この選択性の発現は,カルボニル酸素原子とエチレンジアミンのアミンプロトンの間に水素結合が形成されることで安定性が増したことなどに起因していると考えられた。また,pHをコントロールすることで,ピリミジン窒素上でのプロトンの脱着が起こり, pH 38の水溶液中で容易に相互変換(異性化)することも明らかにした。引き続き,銀イオンとの多核化反応を行ったところ,配位様式の異なる3核,4核錯体が生成することもわかった。この3年間において,新規なハイブリッド錯体を立体選択的に合成または用いる化合物により様々な生成比で光学活性な多核錯体を合成する方法を見出すことができた。さらに,配位子の置換基を変えることで容易に多核構造を変化させることが可能なことも明らかにし,環境応答性金属錯体におけるキラル選択性に及ぼす付加的な要因に関する知見を得ることができた。本研究内容は交付期間後も引き続き検討し,光学活性を有する環境応答性金属錯体の開発を目指し,このシステムを用いた機能発現を拡大していきたいと考えている。今回のテーマは,光学活性を有する環境応答性金属錯体の開発を目指し,酸化還元能を特定の部位に,いかに効率よくキラル反転反応を誘起するかについて,分子レベルで設計,合成するとともに,そのシステムを用いた機能発現に焦点をあてる。本研究では,組織化反応を行う上で有用となる16族元素として硫黄および酸素原子を含む二あるいは三座配位が可能な配位子を用い,単核錯体を原料とした異種の金属あるいは金属錯体との間で形成される多核錯体の立体選択的合成を試みることとした。

研究初年度として,配位子としては光学活性な錯体を合成できること及び溶液中で分子内あるいは分子間の水素結合が形成可能なメルカプト酢酸,メルカプトプロピオン酸に加えて,Lーシステイン,および,Lーシステインメチルエステル(L-cysMe),Lーシステインエチルエステル(L-cysEt)を用いた。錯体の合成は,反応物質およびpHや温度等の反応条件を詳細に検討し,立体特異的な集積型多核錯体の合成法についての検討を行った。単離した化合物は,NMRスペクトルおよび元素分析等に基づいて構造決定を行った。さらに,それらの可視ー紫外吸収・赤外吸収スペクトルやマススペクトル等を測定することにより,立体化学的,電気化学的,分光化学的性質について検討した。次に,得られた単核錯体と銀あるいはコバルトイオンまたはコバルト(III)錯体を反応させることによって、五核あるいは三核錯体を合成した。UV-Vis吸収,CDスペクトルのデータから,これらの多核化反応は,用いるイオンや錯体の種類によって単核ユニットの絶対配置がΔΔまたはΛΛの多核錯体を形成することがわかった。興味深いことに,L-cysEt錯体と,L-cysMe錯体とでは,生成物のCDスペクトルが対掌的になっており,絶対配置が異なっていると考えられた。研究二年目として,新規なハイブリッド錯体の立体選択的または用いる化合物により様々な生成比で光学活性な三核錯体を合成する方法を見出すことができた。キラリティの判定をより簡便にできる二核錯体の生成が困難であったことから,当初の計画を変更したが,その代わりに立体特異的な集積型多核錯体の合成法についての適用範囲を大幅に拡張することが可能となった。研究内容の一部は,日本化学会の春季年会や錯体化学会討論会等で発表するとともに,アジア化学会議でも発表する予定であることから概ね順調に進んでいると判断できる。さらに,光学活性なチオカルボキシラト錯体の特異なCD挙動を見出すことができたことから,最終年度には新たなキラリティ増殖反応へと発展することができると考えている。研究初年度として,新規なハイブリッド錯体の立体選択的に合成する方法を見出すことができた。反応物質およびpHや温度等の反応条件を詳細に検討し,立体特異的な集積型多核錯体の合成法についての有用な知見を得ることができ,日本化学会の春季年会や西日本大会等で発表した。単離した化合物は,NMRスペクトルおよび可視ー紫外吸収・赤外吸収スペクトルやマススペクトルに基づいて構造決定を行い,これまでのデータと比較することにより不斉制御反応に関して新たな知見を得ることができた。次年度には,この五核あるいは三核錯体でみられた特異的な不斉誘導反応について,キラリティの判定をより簡潔にできる二核錯体を用いて詳細な検討を行っていく。多核錯体形成時における電子移動と立体特異性との関連について明らかにすることを目的として,種々の反応場における立体特異的な合成を検討し,合成法を確立する。前年度の研究成果をもとに,反応場が立体選択性に及ぼす影響に注目しながら,キセノン光源を使用した光誘起不斉反応について検討し,不斉反転がどのような波長領域で起こるかについても検討することで,キラル反転メカニズムの解明の手がかりを得る。さらに,グラフト重合により導入したエポキシ基にLーシステインを付加した光学活性な多核錯体の各種物性を明らかにするとともに,抗菌・防かび性能についても評価する。
蛋白質等のヘテロ高分子の設計問題に関する理論的研究

タンパク質などのヘテロ高分子モデルにおける、折り畳み問題と、それとは逆に、ある蛋白質の機能に対応する立体構造へと安定に折り畳むアミノ酸配列を探す設計問題(=逆折り畳み問題)に関する研究を行った。ヘテロ高分子の設計問題は、新薬開発、分子機械開発、機能性材料開発など巨大な応用分野に関わる重要な問題であるが、これまでは、経験論的な方法でしか扱われて来なかった。蛋白質における相同配列の存在からも明らかなように、ある立体構造へと折り畳む配列は一つとは限らず、一般に逆折り畳み問題は複数の解を持つ(解がない場合もある)。解の個数は、設計の容易さに関係するので、デザイナビリティと呼ばれている。それは、ランダムな配列から正しい配列への進化的な到達のし易さでもあり、蛋白質の進化的安定性にも関係する。折り畳み問題と同様に、逆折り畳み問題も、モノマー数が増大すると可能な配列の数が爆発してしまい、単純なしらみづぶしで解を得ることは不可能になる。これがこれまで設計問題を原理的に扱う方法の研究がほとんど行われて来なかった理由である。本課題においては、逆折り畳み問題を効率的に解く全く新しいアルゴリズムを開発し、これが従来のシミュレーテッドアニーリングと同等かそれ以上の効率を示すことを検証した。蛋白質の天然構造の進化に関しては、遺伝アルゴリズムのような進化アルゴリズムの効率が解の多様性の維持に関係していることから、一般的な進化ダイナミクスを表現する方程式(Replicator方程式系)における種の多様性維持のメカニズムについて新しい知見を得、理論生態学、集団遺伝学との関連を明らかにした。タンパク質などのへテロ高分子モデルにおける、折り畳み問題と、それとは逆に、ある蛋白質の機能に対応する立体構造へと安定に折り畳むアミノ酸配列を探す「設計問題(=逆折り畳み問題)」に関する研究を行った。それは、ランダムな配列から正しい配列への進化的な到達のし易さでもあり、蛋白質の「進化的安定性」にも関係する。蛋白質の天然構造の進化に関しては、遺伝アルゴリズムのような進化アルゴリズムの効率が解の多様性の維持に関係していることから、一般的な進化ダイナミクスを表現する方程式(Replicator方程式系)における種の多様性の増大・維持のメカニズムについて新しい知見を得た。
C型肝炎ウイルスの遺伝子変異とその臨床応用

本邦ではHCVは1920年代に感染拡大が始まったと推定し、その社会的要因として1921年から地域限定で開始された日本住血吸虫症に対する駆虫剤の経静脈投与の可能性を報告し検討してきた。一方、世界において日本のHCV関連肝細胞癌(HCC)の頻度は極端に高く、その原因の一つとして感染時期の違いを考え、米国(1a)、日本(1b)、スペイン(1b)、旧ソ連(3a)、エジプト(4a)、南アフリカ(5a)、香港(6a)におけるHCV populationの推移を比較した。結果、大きく3つのグループに分かれ、グループI(日本;1920年より拡散)、グループII(ヨーロッパ、エジプト;1940年)、グループIII(米国、旧ソ連、南アフリカ、香港;1960年)に分類された。この拡散時期の違いは、HCV抗体陽性率とHCC死亡率の相関パターンに関連しており、HCV拡散時期を推定することで将来のHCC死亡率の予測も可能と考えられる。この研究成果はGastroenterology 2006に掲載された。また、C型慢性肝炎に対するRibavirin単独療法が施行された症例のシリーズ検体を用いて、in vivoにおけるRibavirinのRNA mutagenとしての作用及びその遺伝子変異パターンを検討した。Ribavirin単独投与により、in vivoにおいてヌクレオチドアナログとして作用するだけでなくRNA Mutagenとしても作用する可能性が示唆され、昨年度日本肝臓学会総会にて発表を行った。こうしたウイルス遺伝子変異は、HCVに対する主要な治療法であるIFN+Ribavirin併用療法における治療効果にも影響を及ぼす可能性が考えられ検討したが、IFNとの併用ではRibavirinのRNA Mutagenとしての作用や治療効果への影響は明らかにできなかった。これらの結果は学会及び論文にても発表を行った。本邦における肝癌死亡率に地域差があることは周知の事実だが、最近厚生労働省から発表された1975年当時の肝癌の地域分布をみると、過去に日本住血吸虫症(日住症)の蔓延が報告されている九州、広島及び東日本では唯一山梨付近に肝癌蔓延地域が存在した。これらの地域における過去の社会的背景としては、1921年以降の日住症に対する駆虫剤の静注使用が特記すべき点であり、こうした過去における背景とHCV感染との関与を明らかにするために、山梨・広島・福岡のHCV感染患者を対象として、日住症既往感染の有無でHCVの拡散時期に差があるか否かについて、年齢性別をマッチさせたcase-control studyを行った。分子進化学的手法により、日住症群のHCV拡散はコントロール群のHCV単独感染群より約20年早期に拡散し始めたと推定された。このことは、過去の日住症蔓延地域では日住症に対する治療がHCV拡散の最初のリスクファクターの一つと考えられ、こうした地域によるHCV拡散時期の違いが現在のC型肝癌の発生率の地域差を反映しているのではないかと推定された(文献)。Ribavirin単独投与により、in vivoにおいてヌクレオチドアナログとして作用するだけでなく、RNA Mutagenとしても作用する可能性が示唆され学会発表を行った(平成16年日本肝臓学会総会発表)。こうしたウイルス遺伝子変異は、IFN+Ribavirin併用療法における治療効果に影響を及ぼす可能性が考えられ、現在IFN+Ribavirin併用例における遺伝子変異パターンを検討している。
内皮型NO合成酵素遺伝子-786C変異に結合する新規リプレッサーのクローニング

一酸化窒素(NO)は、動脈硬化はじめ様々な心血管病との関連が示唆されている。我々と熊本大学循環器内科の泰江等は共同で、内皮型NO合成酵素(eNOS)遺伝子の5'転写調節領域に3つの点突然変異とエクソン7にmissense mutation(Glu298Asp)を発見し、これらの遺伝子変異が冠攣縮性狭心症と有意に相関していることを報告してきた。さらに、リポータージーンアッセイの結果、5'転写調節領域の3つの点突然変異はeNOS遺伝子の転写を低下させており、eNOS遺伝子が冠攣縮性狭心症の原因遺伝子である可能性が示唆された。さらに最近の予備研究から3つの点突然変異の中では-786C変異が転写活性の低下に寄与しており、同部位にリプレッサーが結合している可能性を示唆する実験結果が得られ、このリプレッサーは新規の蛋白質の精製を試みた。ヒト臍帯静脈内皮細胞の核蛋白質を約200μg用い、目的の蛋白質は、DEAEセファロースに吸着し、NaCl濃度0.5Mで活性は溶出された。-786Cを中心にした30bpのオリゴDNAを用いてアフィニティービーズを用いて精製し、SDS-PAGEで展開すると約70KDの位置に銀染で染色されるバンドが確認された。アミノ酸の一次構造を決定するためには、更に大量の核蛋白質が出発材料として必要であるため、Hela細胞にも同一の蛋白質が大量に存在していることから、Hela細胞の核蛋白質を出発材料として同様の精製ステップを経て目的の蛋白質の精製に成功した。アミノ酸配列を決定したところそれはDNAの修復に関与していることが知られているreplication protein Aと同一蛋白質であった。今後はこの蛋白質の機能解析を行う予定である。
機能的磁気共鳴画像法による多重言語皮質表象の研究

本研究は申請者がカリフォルニア大学在任18年間の実績をもとに、長年の間緊密な共同研究体制係を維持して来たカリフォルニア大学認知神経学の教授陣とハーバード大学磁気共鳴センターの教授陣との間で国際学術共同研究を確立、推進することを目的として行われた。言語機能の解析とその皮質表象の局在解明は米国研究者にとっても最重要課題のひとつであり、多重言語を用いた研究には近似言語以外の言語を母国語とする国との協力が必須である。特に、同一の超高磁場磁気共鳴装置を有する本邦と米国の代表的な機関の共同研究は世界的立場から見ても重要な課題であった。初年度は超高磁場装置を用いた機能的磁気共鳴画像(fMRI)の設定と装置の標準化を行うことに主眼が置かれた。この作業はハーバード大学磁気共鳴センターの教授陣との共同研究が主体となった。続いて、超高磁場装置の特性を生かしたfMRIの課題設定の検討を行い、カリフォルニア大学認知科学の教授陣が参加することとなった。この共同研究体制は現在でも継続しており、平成11年度および12年度の国際学術研究助成が内定している。本共同研究が齎した具体的成果としては、まず、読字に関する「英語型」と「日本語型」の発見が上げられる。「黙読」における文字のsymbolic decoding過程を対象とした研究の結果、「読む」行為における脳機能分布は民族学的backgroundに依存せず、最初に学習された言語に依存することが判明した。同時に、「英語型」と「日本語型」とに優位の差があることが証明された。第二言語の読字機能は第一言語のそれの延長上にあり、英語を母国語として学習したヒトはethnical backgroundに関係なく英語も日本語も「英語型」で読み、日本語を母国語として学習したヒトは日本語も英語もともに「日本語型」で読むことが証明された。続いて行われた賦活部位の詳細解析から、漢字に代表されるsemantic symbolのdecodingを必要とする言語では左半球のsuperior temporal sulcusの後部が特異的に使われること、alphabetに代表されるsyllableによるsymbolic combinationを必要とする言語では両側のlingual gyrusが特異的に用いられることを見出した。すべての言語に共通なsymbolic decoding部位は左半球のfusiform gyrusであることも判明している。これらの知見は日米の最先端研究者の緻密な協力なしでは到底為し得なかった成果である。本研究により言語機能の詳細解明にとって国際学術共同研究が如何に重要な役割を果たすかが実証されたと言える。本研究はカリフォルニア大学在任18年間の実績をもとに、長年の間緊密な共同研究体制係を維持して来たカリフォルニア大学認知神経学の教授陣とハーバード大学磁気共鳴センターの教授陣との間で国際学術共同研究を確立、推進することを目的としている。言語機能の解析とその皮質表像の局在解明は米国研究者にとっても最重要課題のひとつであり、多重言語を用いた研究には近似言語以外の言語を母国語とする国との協力が必須である。