hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
インスリン産生細胞の自己複製におけるReg蛋白質とその受容体の関与

本研究の目的はインスリン産生細胞の再生増殖因子Regファミリーに共通の受容体を欠失したマウスを作製し、インスリン産生細胞の発生、分化、自己複製による形態、機能の維持、再生における役割を明らがにすることである。平成18-19年度の研究により以下の成果が得られた。1)ES細胞での相同組み換えを利用し、Reg受容体遺伝子の翻訳開始コドンを有するエクソンの両側に1oxP配列を挿入したノックインマウスを作製した。このマウスを、受精卵でCre recombinaseを発現するトランスジェニックマウスと交配し、Reg受容体遺伝子を全身でヘテロに欠損するマウス(ヘテロ欠損マウス)を得た2)ペテロ欠損マウスは正常に生まれ、体重の増加、随時血糖値、主要臓器の形態は野生型マウスと差がなく、耐糖能も正常だった。3)ヘテロ欠損マウス同士を交配しホモ欠損マウスを作製したところ、ホモ欠損マウスは胎齢8.59.5日で致死になることが明らかとなった。4)711週齢のマウスの膵臓を70%切除し、切除後2日-8週の残存膵のインスリン陽性細胞のBrdU取り込み、PCNA陽性率を検討した。ヘテロ欠損マウスのBrdU取り込みは術後2日-8週の全期間にわたり野生型マウスに比し有意に低下していた。またPCNA陽性細胞率も術後2日-8週で野生型に比し有意に低下していた。膵β細胞の再生にはβ細胞の自己複製と非β細胞からのneogenesisがあるが、70%膵切除モデルではβ細胞の自己複製が中心であることが報告されている。70%膵切除モデルでReg受容体ヘテロ欠損マウスのβ細胞複製が野生型マウスより有意に低下していることから、Reg受容体がβ細胞の自己複製に重要であることがin vivoで示された。またReg受容体遺伝子ホモ欠損マウスが胎生致死であることから、Reg受容体を介するシグナルが正常の発生、分化、臓器形成においても重要な働きをしていることが示唆された。本研究の目的はインスリン産生細胞の再生増殖因子であるRegファミリーに共通のReg受容体(RegR)をインスリン産生細胞特異的に欠失したマウスを作製し、インスリン産生細胞の発生・分化、自己複製による形態・機能の維持、再生における役割を明らかにすることである。平成18年度の研究では1)遺伝子の翻訳開始コドンをコードするエキソンを挟むようにloxP配列を挿入したノックアウトベクターをES細胞に導入し、染色体上の遺伝子が相同組換えによりベクターと入れ換わった変異ES細胞株をSouthern blot法を用いて同定・分離した。このES細胞を用いて凝集法によりES細胞と宿主胚由来の細胞とで構成されるキメラマウスを作製した。キメラマウスを野生型マウスと交配して得られた仔マウスのgenomic DNAをPCR及びSouthern blot法により解析して、RegR遺伝子の一方の対立遺伝子にloxP配列を有するヘテロ変異マウスを得た。2)申請者らは胎生初期にCreレコンビナーゼを発現するマウスを作製している。このマウスと1)で得られたRegR遺伝子の一方の対立遺伝子に10XP配列を有する変異マウスを交配することにより、RegR遺伝子の一方の対立遺伝子を全身で欠失したマウスを作製した。また申請者らはインスリン産生細胞で特異的にCreレコンビナーゼを発現するマウスを作製している。このマウスとRegR遺伝子全身ヘテロ欠失マウスおよび1)で得られたRegR遺伝子の一方の対立

遺伝子に10XP配列を有する変異マウスを交配していくことにより、RegR遺伝子の一方の対立遺伝子を全身でヘテロに欠失し、もう一方の対立遺伝子に1oxP配列が挿入された変異遺伝子を持ち、インスリン産生細胞でCreレコンビナーゼを発現するマウスを得た。このマウスのインスリン産生細胞ではRegRが欠失することになる。RegRの欠失は免疫組織染色や単離インスリン産生細胞のSouthernblot、RT-PCR解析により確認した。本研究の目的はインスリン産生細胞の再生増殖因子Regファミリーに共通の受容体を欠失した々ウスを作製し、インスリン産生細胞の発生・分化、自己複製による形態・機能の維持、再生における役割を明らかにすることである。平成18年度の研究ではES細胞での相同組み換えを利用し、Reg受容体遺伝子の翻訳開始コドンを有するエクソンの両側にloxP配列を挿入したノックインマウスを作製した。このマウスを、受精卵でCre recombinaseを発現するトランスジェニックマウスと交配し、Reg受容体遺伝子を全身でヘテロに欠損するマウス(ヘテロ欠損マウス)を得た1)ヘテロ欠損マウスは正常に生まれ、体重の増加、随時血糖値、主要臓器の形態は野生型マウスと差がなく、耐糖能も正常だった。2)ヘテロ欠損マウス同士を交配しホモ欠損マウスを作製したところ、ホモ欠損マウスは胎齢8.59.5日で致死になることが明らかとなった。3)7-11週齢のマウスの膵臓を70%切除し、切除後2日8週の残存膵のインスリン陽性細胞のBrdU取り込み、PCNA陽性率を検討した。ヘテロ欠損マウスのBrdU取り込みは術後2日8週の全期間にわたり野生型マウスに比し63-80%に有意に低下していた。またPCNA陽性細胞率も術後2日8週で野生型の5274%と有意に低下していた。膵β細胞の再生にはβ細胞の自己複製と非β細胞からのneogenesisがあるが、70%膵切除モデルではβ細胞の自己複製が中心であることが報告されている。70%膵切除モデルでReg受容体ヘテロ欠損マウスのβ細胞複製が野生型マウスより有意に低下していることから、Reg受容体がβ細胞の自己複製に重要であることがin vivoで示された。またReg受容体遺伝子ホモ欠損マウスが胎生致死であることから、Reg受容体を介するシグナルが正常の発生・分化、臓器形成においても重要な働きをしていることが示唆された。
味蕾の甘味情報伝達系におけるアディポネクチンの機能解明

本研究では、味蕾におけるアディポネクチン受容体(AdipoR1)の発現の検索および、栄養状態による本受容体の発現調節に関して研究を行った。マウス有郭乳頭におけるAdipoR1の局在を蛍光抗体法により調べた。その結果、AdipoR1は味蕾の味毛、味蕾基底部の細胞およびその周囲の細胞に局在が認められた。次に絶食条件下の有郭乳頭でのAdipoR1の発現量変化をリアルタイムPCR法にて調べた。その結果、給餌条件下と比較し1.4倍の発現量の増加が認められた。絶食時には視床下部のAdipoR1の発現量も増加することから、味蕾においても中枢神経系と同様な、AdipoR1の発現調節機構の存在が推定された。中枢においてアディポネクチンはレプチンと協調して摂食を調節していると考えられている。一方、味蕾においてはレプチンがレプチン受容体を介して甘味応答を調節していることが明らかになっている。しかしながら、アディポネクチンおよびアディポネクチン受容体(AdipoR1,AdipoR2)の味蕾での機能は明らかになっていない。本研究ではアディポネクチン受容体の味蕾での機能解明を目的として行った。昨年度までの研究で、AdipoR1が味蕾の味毛および味蕾の基底部近傍の細胞において発現していることを明らかにしている。そこで、本年度の研究ではマウス味蕾の基底部近傍にあるAdipoR1発現細胞が、味蕾のどの細胞型に属しているかを蛍光2重染色法により調べた。味蕾基底部各細胞型のマーカータンパク質として、GLAST(グルタミン酸トランスポーター; I型細胞マーカー)、PLCβ2(ホスホリパーゼCβ2 ; II型細胞マーカー)、AADC(セロトニン合成酵素; III型細胞マーカー)およびShh(ソニックヘッジホッグ;基底細胞マーカー)を使用した。その結果、味蕾基底部近傍のAdipoR1発現細胞において、Shhが発現していることが明らかになった。一方、I型、II型、III型の細胞マーカータンパク質との共発現は認められなかった。味蕾基底部のShh発現細胞は、味蕾細胞の分化に関わっている。一方、アディポネクチンは、細胞増殖や分化においても機能していることが明らかになっている。従って、AdipoR1およびShh共発現細胞において、アディポネクチンはAdipoR1を介して細胞増殖や分化に関与している可能性が推測された。そこで、本研究では味蕾でのアディポネクチン受容体の機能解明を目的として、AdipoR1およびAdipoR2のマウス味蕾での発現様式を調べた。RT-PCR法によりマウス有郭乳頭におけるAdipoR1およびAdipoR2の発現を調べた所、両者が発現していることが明らかになった。次に、マウス有郭乳頭および葉状乳頭から全蛋白質の抽出を行い、Western blotting法により両受容体蛋白質の発現を調べた結果、AdipoR1蛋白質の発現が認められた。そこで有郭乳頭におけるAdipoR1の局在を蛍光抗体法により調べた。アディポネクチンは、グルコースの恒常性維持および脂質代謝において重要な役割をはたしている。アディポネクチンは絶食時にはその血中濃度は高く、再摂食時には低下する。中枢神経系においては、絶食時にアディポネクチン受容体AdipoR1の発現量が増加し、摂食後減少する。絶食時にはアディポネクチンは中枢神経系に作用し、レプチンとは逆の摂食促進に働いている。しかしながら、味蕾でのAdipoR1の機能は明らかになっていない。そこで本研究では、絶食時における味蕾におけるアディポネクチン受容体の発現量の変化をリアルタイムPCR法にて調べた。さらに味覚感受性は摂食状態により変化することから、絶食条件による甘味、苦味、酸味およびうま味の味覚受容体の発現量の変化に関しても調べた。絶食条件下の有郭乳頭において、AdipoR1の発現量が給餌条件下と比較して1.4倍に増加することが明らかになった。この結果より、味蕾においても中枢神経系と同様な、絶食時におけるAdipoR1の発現調節機構の存在が推定された。

さらに絶食条件下の各種の味覚受容体において、酸味受容体PKD2L1よりも、甘味・うま味受容体T1R1, T1R2, T1R3の発現量が特に増加することが明らかになった。一方、苦味受容体Tas2r138の関しては、絶食条件下でもその発現量は変化しないことが明らかになった。このように絶食条件下において、特にT1Rファミリーの発現量の増加が認められたが、肥満ラットの味蕾においては、T1R3の発現量の低下が報告されている。これらのことから、肥満や痩身など、栄養状態により味蕾でのT1R3の発現量が調節を受けている可能性が推察された。口腔組織学本研究では味蕾でのアディポネクチン受容体の機能解明を目的として行っている。本年度はAdipoR1のマウス味蕾での発現様式を調べた。その結果、マウス有郭乳頭において味蕾基底部近傍のAdipoR1発現細胞において、Shhが発現していることが明らかになった。一方、I型、II型、III型の細胞マーカータンパク質との共発現は認められなかった。味蕾基底部のShh発現細胞は、味蕾細胞の分化に関わっている。一方、アディポネクチンは、細胞増殖や分化においても機能していることが明らかになっている。従って、AdipoR1およびShh共発現細胞において、アディポネクチンはAdipoR1を介して細胞増殖や分化に関与している可能性が推測された。これらの研究の結果、マウス味蕾でのAdipoR1発現様式が明らかになったことから、おおむね順調に進展していると考えられた。本研究では味蕾でのアディポネクチン受容体の機能解明を目的として行っている。その第一段階として、本年度はAdipoR1およびAdipoR2のマウス味蕾での発現様式を調べた。その結果、マウス有郭乳頭においてAdipoR1およびAdipoR2が発現していることをRT-PCR法により明らかにした。さらに、蛋白質レベルではAdipoR1のみがマウス有郭乳頭で発現していることをWestern blotting法により明らかにしている。そこで有郭乳頭におけるAdipoR1の局在を蛍光抗体法により調べた。その結果、AdipoR1は味蕾の味毛、味蕾基底部の細胞およびその周囲の細胞での局在を明らかにしている。これらの研究の結果、マウス味蕾での発現様式が明らかになったことから、本年度の研究目的はおおむね達成できたと考えられた。味蕾におけるアディポネクチンおよびAdipoR1の機能解析を以下の内容で行う。(1)味蕾でのAdipoR1発現量が、摂食状態に応じて制御されているかを調べる。(2)味覚感受性は摂食状態により変化することから、絶食条件による甘味、苦味、酸味およびうま味の味覚受容体の発現量の変化に関しても調べた。(3)肥満マウスへのアディポネクチン投与による甘味感受性への影響を調べる。(2)肥満マウスへのアディポネクチン投与による甘味感受性への影響を調べる。(3)初代味蕾培養細胞を用いて、甘味情報伝達系およびアディポネクチンとの関係を調べる。(4)初代味蕾培養細胞を用いて、甘味情報伝達系およびAdipoR1との関係を調べる。
動脈硬化改善に対する運動効果の個人差を規定する新規遺伝子の探索

加齢により、動脈硬化度(動脈スティフネス)は増大し、高血圧や心血管疾患発症のリスクを増加させる。一方、継続的な運動には、加齢による動脈スティフネスの増大を改善させる効果があるが、その効果には個人差が認められる。この個人差が生じる原因には遺伝的な背景が考えられるが、どのような遺伝子の多様性が関与しているかは不明である。心房性ナトリウム利尿ペプチド(ANP)は、血管拡張作用や動脈硬化抑制作用を有することから、動脈スティフネスに影響を及ぼす可能性が考えられる。本年度は、動脈スティフネスにおける運動効果の個人差にANP遺伝子の多様性が影響すると仮説を立て、中高齢者の習慣的な運動による動脈スティフネスの改善効果とANPの遺伝子多型との関連を検討した。健康な中高齢者291名の1日の平均身体活動量の中央値を基準として、対象を活動群と非活動群とに分けた。ANP遺伝子多型は664G/A(Val/Met)、2238T/C、1837G/A,708C/TをTaqman法にて判定した。動脈スティフネスの指標である上腕-足首間脈波伝播速度(baPW)は、活動群で有意に低値を示した。すなわち、活動群では動脈スティフネスが低下していることが示された。ANPの664G/A遺伝子多型において、GG型のbaPWおよび血中AN膿度は活動群と非活動群との間に有意な差が認められたが、GA+AA型では差が認められなかった。ANPの2238T/C、1837G/A,708C/T遺伝子多型は、活動群と非活動群のbaPWVに影響しなかった。以上より、ANP遺伝子多型664G/Aは、習慣的な運動による動脈スティフネスの改善効果の個人差に関連している可能性が考えられた。エストロゲンは血管内皮機能の改善、血管平滑筋の増殖抑制、血中脂質プロファイルの改善などを介して、加齢による動脈硬化の進行を抑制する作用を有する。これらのエストロゲンの作用はエストロゲン受容体を介して発揮される。エストロゲン受容体遺伝子多型は、心血管疾患リスクなどと関連があることが報告されているが、動脈スティフネスとの関連については不明である。今年度は、エストロゲン受容体α遺伝子多型が中高齢者の動脈スティフネスに及ぼす影響を検討した。中高齢男女185名(男性/女性=66/119,64±6歳)を対象とした(女性は全員が閉経後女性)。エストロゲン受容体α遺伝子多型は、-401T/C(intronl)および30T/C(exonl)をTaqMan-PCR法にて解析し、いずれもTT型、TC型およびCC型に分類した。動脈スティフネスは上腕-足首間の脈波伝播速度(brachial-ankle pulse wave velocity : baPWV)にて評価した。収縮期血圧および拡張期血圧は女性で男性よりも低値であったが、心拍数は女性が高値を示した。各性別において、エストロゲン受容体α遺伝子多型間で年齢、血圧、および心拍数に差は認められなかった。-401T/C多型において、女性のbaPWVはTT型よりCC型で有意に低値であったが、男性の-401T/C多型はbaPWVに影響しなかった。30T/C多型についても、女性のbaPWVはTT型よりCC型で有意に低値であったが、男性では差が認められなかった。これらの結果から、エストロゲン受容体α遺伝子多型は閉経後女性の動脈スティフネスに影響する可能性が示唆された。エストロゲンは血管内皮機能の改善や血管平滑筋の増殖抑制などを介して、加齢による動脈硬化(動脈スティフネス)の進行を抑制する。昨年度は、エストロゲン受容体遺伝子多型と動脈スティフネスの関係を検討し、エストロゲン受容体α遺伝子多型は閉経後女性の動脈スティフネスに影響する可能性を示唆した。今年度は、身体活動水準と動脈スティフネスとの関係にエストロゲン受容体α遺伝子多型が及ぼす影響について検討した。閉経後女性195名(62±6歳)を対象とした。エストロゲン受容体α遺伝子多型は-401T/CをTaqMan-PCR法にて解析した。動脈スティフネスは、上腕-足首間の脈波伝播速度(baPWV)にて評価した。加速度付き歩数計により、1日あたりの運動量を算出し、その中央値を基準にして、活動群と非活動群に分けて、解析を行った。年齢と平均血圧を共変量として、baPWVを比較すると、活動群のbaPWVは非活動群よりも低値であった。また、TC+CC型の遺伝子型を有する者のbaPWVは、TT型の遺伝子型を有する者よりも低値であった。すなわち、活動群で動脈スティフネスが低く、またTC+CC型の遺伝子型の者は動脈スティフネスが低いことが示された。身体活動水準とエストロゲン受容体α遺伝子多型により、4群(TT-活動群、TT-非活動群、TC+CC-活動群、TC+CC-非活動群)に分けて検討すると、TC+CC-活動群のbaPWVは、他の3群より低値(動脈スティフネスが低い)であった。他の3群間には差はなかった。

すなわち、TC+CC型は動脈スティフネスに対する運動効果が期待できるが、TT型は運動効果が得られ難い可能性が示唆された。これらの結果から、エストロゲン受容体α遺伝子多型は、身体活動水準と動脈スティフネスの関係に影響することが示された。加齢により、動脈硬化度(動脈スティフネス)は増大し、高血圧や心血管疾患発症のリスクを増加させる。一方、継続的な運動には、加齢による動脈スティフネスの増大を改善させる効果があるが、その効果には個人差が認められる。この個人差が生じる原因には遺伝的な背景が考えられるが、どのような遺伝子の多様性が関与しているかは不明である。心房性ナトリウム利尿ペプチド(ANP)は、血管拡張作用や動脈硬化抑制作用を有することから、動脈スティフネスに影響を及ぼす可能性が考えられる。本年度は、動脈スティフネスにおける運動効果の個人差にANP遺伝子の多様性が影響すると仮説を立て、中高齢者の習慣的な運動による動脈スティフネスの改善効果とANPの遺伝子多型との関連を検討した。健康な中高齢者291名の1日の平均身体活動量の中央値を基準として、対象を活動群と非活動群とに分けた。ANP遺伝子多型は664G/A(Val/Met)、2238T/C、1837G/A,708C/TをTaqman法にて判定した。動脈スティフネスの指標である上腕-足首間脈波伝播速度(baPW)は、活動群で有意に低値を示した。すなわち、活動群では動脈スティフネスが低下していることが示された。ANPの664G/A遺伝子多型において、GG型のbaPWおよび血中AN膿度は活動群と非活動群との間に有意な差が認められたが、GA+AA型では差が認められなかった。ANPの2238T/C、1837G/A,708C/T遺伝子多型は、活動群と非活動群のbaPWVに影響しなかった。以上より、ANP遺伝子多型664G/Aは、習慣的な運動による動脈スティフネスの改善効果の個人差に関連している可能性が考えられた。
赤道域中層大気力学の日・豪・インドネシア共同研究

本研究では、赤道域でも特に対流活動が盛んなインドネシア域における中層大気の力学をレーダーやラジオゾンデを用いた観測を通じて解明することを目標とした。まず、当センターがジャカルタ(ジャワ島)に設置した流星レーダーおよびポンティアナ(カリマンタン島)に設置した中波(MF)レーダーを連続運転し、中間圏界面付近の風速などを測定することによりこの領域での大気波動の強度変動や運動量輸送の解析を行った。またポンティアナにおいてラジオゾンデ観測を集中的に行い、対流圏から下部成層圏に至る波動の励起源近傍での特性を解析した。この結果、短周期・小スケールの擾乱成分の強度が1年や半年などの特徴的な周期で変動していることを示し、これと水蒸気量や平均東西風速などの背景場パラメータとの間に明確な相関があることが明らかになった。更に、これらインドネシア域で取得したデータをこれまでの赤道域のレーダー観測網での観測から得られたデータにより構築されたデータベースに組み込み、また数値モデルや衛星観測結果も援用しながら、赤道波や大気潮汐、あるいは赤道域特有の大気大循環のグローバルな空間構造を推定した。この結果、潮汐波赤道非対称モードの低緯度域での微細構造や中間圏半年周期振動(MSAO)の経度依存性などが明らかになった。この他、ラジオゾンデデー夕による運動量フラックス推定法の開発・検証やインターネットによるインドネシアからのデータ転送ルートの開拓などを行った。地球環境変化を解明する上で積雲活動が活発な西太平洋赤道域の大気の運動を解明することが重要であるが、本研究では赤道域中層大気でのレーダー・ラジオゾンデのネットワーク観測で赤道中層大気の大気循環、運動量輪送を明らかにすることを目的とした。その為、まずインドネシア域で当センターが行っているジャカルタ(ジャワ島)およびポンティアナ(カリマンタン島)での流星レーダーおよび中波(MF)レーダー観測について欠測を生じないように長期の連続観測を行った。また、ラジオゾンデとレーダーによる地上から中層大気全域にいたる大気波動の観測について解析を行い、ケルビン波や重力波などの大気波動と赤道域特有の大気大循環すなわち、準2年周期振動・半年周期変動との相関などを見出した。また、ラジオゾンデ観測による湿度・風速データを用いることで運動量フラックスを測定する方法をレーダー観測データとの比較検討から開発・検証した。また、インドネシアのレーダー観測データを始め、太平洋クリスマス島のMFレーダー観測データ、ハワイのMFレーダー観測データ、その他日・豪の観測データを集積してデータベースを構築した。とくにインドネシアからのデータは通信環境が劣悪であったが、インターネットをもちいたデータ転送のルートを開拓した。これらにより、赤道中層大気の多点観測のデータを解析して、赤道域の重力波、大気潮汐波、2日周期波、ケルビン波、6.5日波などの大気波動の振る舞いとグローバル構造を明らかにした。赤道域大気の運動は地球規模の大気大循環を正確に理解する為にもこれまで以上の精度で理解される必要がある。本研究では、日・豪がこれまで中緯度域で培ってきたレーダー・ラジオゾンデなどによる大気観測技術をインドネシア域へ展開することにより、赤道大気の運動を継続的に観測してその特性を明らかにした。平成10年度には9年度に引続きジャカルタ(ジャワ島)での流星レーダー観測やポンティアナ(カリマンタン島)での中波(MF)レーダー観測を継続し、これまでに蓄積された観測結果と結合することにより長期間のデータベースを構築した。さらにポンティアナにおいてはGPS技術を応用したラジオゾンデを集中的に放球し、下層から中層大気の運動を観測した。これらの方法で取得したデータを高度・周波数帯毎に解析し、各種大気波動のパラメータや活動度の季節・年々変動等を明らかにした。特に中間圏界面付近の超高速ケルビン波(周期3日前後)に関しては、その強度が約半年の周期で変動しており、この高度の背景東西風に特徴的に見られる半年周期振動との関連が予想された。また、クリスマス島・ハワイなどに設置されている中層大気観測レーダーのネットワークを利用して低緯度域のケルビン波や大気潮汐波の緯度構造を解明した。特に潮汐波に関してはこれまで不十分だった低緯度域における観測と各種モデルとの比較において貴重な結果を提供している。
帯電エアロゾルを用いた高結晶性微粒子の多次元集積と評価

ナノ粒子合成技術と高い選択性をもつ粒子集積化技術を用いて、気相プロセスに液相法の利点を組み込んだ「複合型ナノ材料プロセッシング」を開発した。静電気力を用いて、気中におけるナノ粒子の輸送と基板上のナノ粒子群の構造を制御し、高感度の環境センサ素子を構成するナノ粒子構造体における最適な幾何学的構造モデルを試みた。材料とする懸濁液を用い、その後のプロセスを気相において行う輸送制御技術を開発した。構造体の形成技術として、安定した懸濁液の調整とエアロゾル化技術、静電気力を用いた気中での粒子の輸送・制御技術、基板の帯電パターニングによる粒子集積制御技術を開発し、一連の技術の高度化を行った。本研究は、気相法によるナノ粒子合成技術と高い選択性をもつ液相粒子集積化技術を用いて、気相プロセスに液相法の利点を組み込んだ「複合型ナノ材料プロセッシング」を新規に開発している。外力(電界など)を用いて、気中におけるナノ粒子の輸送と基板(金属・ガラス・有機物等)上のナノ粒子群の構造を制御する。粒子構造体の形成に向け、新たに開発されたナノ粒子を材料とする懸濁液を用い、気相において行う新規の輸送制御技術を開発している。安定した懸濁液の調整を行って、懸濁液における粒子集積技術の開発をしながら、懸濁液のエアロゾル化技術(気中での粒子の輸送)と、目的の基板での粒子集積制御技術を開発し、一連の技術の高度化と最適化を行っている。ナノ粒子の液相合成技術には電気化学的な手法を取り入れ、モデル材料としてシリカ系粒子を用いた。比較のために従来の液相合成法で粒子の合成も行い、粒子径が数10 nmの銀粒子の合成が確認できており、合成法に工夫を加えることで液中における銀粒子の帯電状態(ゼータ電位基準)がプラス帯電またはマイナス帯電で制御できることがわかった。一方、懸濁液の気中への分散(エアロゾル化)とその後の基板への集積させるが、懸濁液に対して電界を印加し、気中において帯電粒子を浮遊させて、目的の基板に集積させる方法を開発した。目的の基板の材質としてガラスや金属の他に有機物(プラスチック等)も用いており、全ての基板に粒子が集積できることを確認した。さらに学内で実施されている「植物への粒子沈着」プロジェクトからヒントを得て、植物の葉を有機基板とみなし、粒子を葉表面に集積させる実験も行っている。基板上に集積した粒子の個数濃度等を評価するためには主に光学特性を用いた。本研究は、機能性粒子状素子を創製することを目標にしている。液相法でナノ粒子・微粒子を合成し、気相に浮遊させながら、高い選択性をもつ粒子集積化技術を開発した。(1)出発原料のナノ粒子を合成し、原料の粒子を主に液体(水など)中サンプルに分散させた。分散方法を検討した結果、数時間以内に気相分散を実施する場合は、液体への粒子分散は超音波力を用いることができることを確認した。懸濁液の気中分散と粒子構造体の形成のために、静電気型エアロゾル化装置を製作し、気中に浮遊した粒子の粒子径分布をリアルタイムで計測をした。その結果、数十nmまたは数百nm(100, 200 nm前後)のピークを持つ粒子の調製が可能であることがわかった。(2)粒子の集積を行う前に、基板に対する事前の化学処理の影響の有無を調べた。化学処理を施した場合、表面が高い親水性になり、その表面電位が高い値を示す。電子顕微鏡(減圧型分析装置)および蛍光エックス線分法(常圧型分析装置)により、親水性の高い表面にはより多くの(正電荷)帯電粒子が沈着されたことを確認できた。基板上の親水性のパターンがより微細に形成できれば、より細かいパターンの粒子配列の可能性が高い。(3)基板に集積した2次元と3次元の銀(Ag)粒子構造体の形成において、表面増強ラマン散乱法(SERS法)に基づいた高感度分子センサの作製も試みた。(4)気中に浮遊する粒子の輸送を予測する数値(熱流体)シミュレーションを行い、空間の電界分布を解析した。本研究の成果は、東京農工大学で実施した「植物への粒子曝露研究における粒子曝露装置の設計・作製にも大いに役に立つものであった。本研究は、気相法による高結晶ナノ粒子合成技術と高い選択性をもつ粒子集積化技術を用いて、「複合型ナノ材料プロセッシング」を開発し、高性能な粒子状素子を創製することを目的とする。(1)ナノ粒子の合成と液中分散:出発粒子として高結晶ナノ粒子を合成した。原料粒子を主に水中に分散させるが、その分散方法も検討した。(2)懸濁液の気中分散と粒子構造体の形成:エアロゾル化装置を設計・製作した。

ある程度分散性が保持できる粒子分散液を発生器により気中に分散させて、懸濁液のエアロゾルを形成する。これまで開発した静電型技術を用いて、供給流量や液体の物性または印加電圧を変化させることで、エアロゾル液滴の表面の帯電量を変化させることによって、液滴に大きな帯電量を待たせ、液滴が破裂する。ナノ粒子が孤立した一次粒子状態または複数のナノ粒子の集合体の状態の形成が制御できた。(3)帯電粒子の輸送を予測する数値シミュレーション:気中に浮遊するミクロン液滴と粒子の輸送、空間の電界分布を数値計算により解析した。さらに、粒子の集合状態と帯電量および輸送速度との関係を予測し、任意の空間におけるナノ粒子の個数濃度の変化を求めた。少なくとも異なる二種類の粒子集合体に関してシミュレーションを行った。シミュレーションの結果に従って、実際の粒子発生ノズルと集積させる基板との距離または基板の大きさを調整した。(4)ナノ粒子構造体の形成に向け、高結晶ナノ粒子のエアロゾル化を行う輸送制御技術を開発した。構造体の形成技術として、エアロゾル化技術と外力を用いた気中での粒子の輸送・制御技術、基板の帯電パターニングによる粒子集積制御技術を開発し、一連の技術の高度化と最適化を行った。これら技術により形成した、2次元と3次元の粒子構造体を用いて、高感度の環境センサを作製した。発表論文を基準にすると予想していた達成度へのスピードがやや低いが、順調に研究が進展している。基板上ナノ粒子を分析する手法は多く存在しているが、局部的な分析する装置がほとんどである。それらを使う場合、mmオーダーの基板上のナノ粒子の個数濃度を把握するために時間がかかってしまう。そこで本年度ではナノ粒子をより効率よく分析できる手法を新たに開発しながら、本研究の目的である粒子の集積技術を進めている。本研究は、気相法による高結晶ナノ粒子合成技術と高い選択性をもつ粒子集積化技術を用いて、「複合型ナノ材料プロセッシング」を開発し、高性能な粒子状素子を創製することを目的とする。平成23年度には、下記の(1)(2)(3)を予定していたが、(1)ナノ粒子の合成と液中分散(2)懸濁液の気中分散と粒子構造体の形成:(3)帯電粒子の輸送を予測する数値シミュレーション:平成23年度中には、高結晶ナノ粒子のエアロゾル化を行う輸送制御技術の開発も行い、これら技術により形成した、2次元と3次元の粒子構造体を用いて、高感度の環境センサの作製まで行えた。基板上ナノ粒子の分析手法のほとんどは局部(ミクロメーターオーダー)に限定されており、ミリメーターオーダーの基板におけるナノ粒子の個数濃度を把握するために時間がかかってしまう。ここでナノ粒子をより効率よく分析できる手法を新たに開発し、本研究の目的である粒子の集積技術の開発を進めている。本研究は、気相法による高結晶・高純度ナノ粒子合成技術と高い選択性をもつ粒子集積化技術を用いて、気相プロセスに液相法の利点を組み込んだ「複合型ナノ材料プロセッシング」を新規に開発し、数十数百nmオーダーの高性能な粒子状光学素子を創製することを目的とした基盤研究である。この目的のため、外力を用いて、気中におけるナノ粒子の輸送と基板上のナノ粒子群の構造を制御し、高感度の環境センサ素子と発光体素子を構成するナノ粒子構造体における最適な幾何学的構造モデル(粒子サイズと集合状態等)を探る。
顧客関係管理における成功要因の未探求の国際・国内差の解明

本研究では、顧客関係管理の成功要因における国際・国内差を解明した。消費者データの分析結果として、消費者行動は、個人主義及び不確実性回避、男性らしさ、長期志向といった文化的次元、そして消費者の金銭的状況及び年齢、性別から影響を受けることを見出した。これにより、消費者行動における国際差、及び地方・移民という所属による国内差を解説した。また、法人顧客データの分析結果として、新商品開発プロセスの成功要因は、権力差及び長期志向により異なることを明らかにした。本研究の結果をもとに、企業は顧客関係管理の戦略を局地的な消費者ニーズに適応させ、長期的収益性をより高めることができると思われる。顧客関係管理における成功要因の国際・国内差を解明するために、消費者を対象にするアンケート調査を設計した。内容は、品質属性、価格、カスタマーサービス、顧客価値創造、ブランド特性、スイッチングコスト、顧客ロイヤルティ、そして顧客の性格と文化性向であり、特にブランド特性及び、顧客の感情に訴える価値創造に関する調査内容は新規性が高い。アンケートの内容を携帯電話及び洋服といった二つの製品に適用し、まず日本で調査を行った。収集した実証データで質問項目の信頼性と妥当性を証明できたため、調査範囲を外国に広げることにした。新興国を代表するエクアドル及びスリランカで携帯電話と洋服を対象に、そして日本以外の先進国を代表する米国で携帯電話を対象にアンケート調査を行った。さらに、ドイツと米国で今後の共同研究を準備した。次に、法人顧客を対象に類似のアンケート調査を設計し、東南アジア諸国を中心に繊維産業においてのデータを収集した。発表した論文で、不確実性回避は国家文化の特性のみならず、個人の文化性向としても消費者の認知プロセスに影響を与え、製品に対する顧客評価を厳しくする仕組みを解明した。具体的には、不確実性回避が顧客満足度に負の影響を与えるが、その影響メカニズムは直接に働かず、知覚品質及び知覚価値、企業イメージに仲介される。その影響は製品の方がサービスよりも顕著に強く、年齢や性別の影響力を上回る。別の論文では、中国経済の重要性をきっかけに、日本に住んでいる中国人と日本人の消費者行動を比較した。日本人は企業イメージと品質上のリスクを重視する一方で、中国人は知覚価値及び金銭的なリスク、品質に対する期待度、製品の有用性を重視する傾向、そしてその差の文化的な背景を解明した。他の論文では、感情的な製品価値は再購買と肯定的な口コミを促す一方で、理性的な製品価値は否定的な口コミを防止するという結果を得た。顧客関係管理における成功要因の国際・国内差を解明するために、昨年度に設計した、消費者を対象にするアンケート調査および法人顧客を対象にするアンケート調査を両方拡張した。消費者を対象にするアンケートの内容は、品質属性、価格、カスタマーサービス、顧客価値創造、ブランド特性、スイッチングコスト、顧客ロイヤルティ、そして顧客の性格と文化性向である。一方、法人顧客を対象にするアンケートの内容は、顧客価値創造、新商品開発戦略、組織文化、営業利益である。消費者を対象にするアンケートについては、昨年度その内容を携帯電話及び洋服といった二つの製品に適用し調査を行ったが、今年度は、携帯電話に関する調査の範囲を海外に拡張し、米国、フランス、ボリビアで調査を行った。さらに、アンケートの内容を腕時計といった製品に適用し、それで日本及び米国、エクアドル、スリランカで調査を行った。法人顧客を対象にするアンケートについては、日本及びドイツ、スイス、オーストリア、東欧、中国、スリランカで調査を実施した。発表した論文では、男女別による消費者行動を分析した。製品の購入にあたっては、女性は企業イメージを重視する一方で、男性は顧客満足度、知覚価値、人間関係によるスイッチングコストを重視する。男性らしい文化と女性らしい文化という国家差は、男女別による個人差と同じ傾向を示すことを見つけた。また、別の論文では、日本と中国における消費者行動を比較した。文化的かつ経済的な差の結果として、日本の消費者は知覚品質を重視する一方で、中国の消費者は知覚価値、企業イメージ、品質への購入前の期待を重視し、製品を評価している。別の論文では、消費者行動における、中国の地方における文化的かつ経済的な国内差を分析した。地方が発展するほど、知覚品質と企業のイメージの重要性が高まり、品質への購入前の期待の重要性が下がる等の結果を得た。顧客関係管理における成功要因の国際・国内差を解明するために、昨年度までに設計した、消費者を対象にするアンケート調査および法人顧客を対象とするアンケート調査の両方を拡張した。消費者を対象とするアンケートの内容は、品質属性、価格、カスタマーサービス、顧客価値創造、ブランド特性、スイッチングコスト、顧客ロイヤルティ、そして顧客の性格と文化的性向である。一方、法人顧客を対象とするアンケートの内容は、顧客価値創造、新商品開発戦略、組織文化、営業利益である。消費者を対象とするアンケートについては、昨年度まではその内容を携帯電話及び洋服、腕時計といった三つの製品に適用し調査を行ったが、今年度は、調査の範囲を拡張した。

携帯電話のアンケート調査をフランス及びボリビア、日本で継続し、洋服のアンケート調査を日本で継続し、そして腕時計のアンケート調査を日本及び米国で継続し、また新たにフランスで行った。さらに、サービスに関する情報を得るために、アンケートの内容をファストフード店に適用し、それについて日本及び米国、スリランカで調査を行った。法人顧客を対象とするアンケートについては、米国で調査を実施した。発表した論文では、知覚品質が顧客ロイヤルティに与える影響が、顧客満足のみならず製品連想にも媒介され、そしてそれが理性的かつ感情的なプロセスであり、理想と感情が共作用することを見出した。それぞれのプロセスは、消費者の経験の範囲及び、購入からの時間、製品の価格、ブランド経験、国家文化により異なる。別の論文では、製品の放射能汚染リスクへの消費者態度が、人口属性及び国家文化、個人的文化性向による変化するパターンを分析した。また、別の論文では、高品質の新商品開発を目指す企業内のプロセスが国家文化に依存するパターンを解説した。さらに、別の論文では、顧客価値創造の国際差を見極めた。26年度が最終年度であるため、記入しない。マーケティング、品質管理26年度が最終年度であるため、記入しない。共同研究者の都合が非常に良かったため、アンケート調査の範囲は当初の計画よりも速く広がった。ボリビアの代わりにエクアドルとスリランカといった二つの新興国で膨大なデータを収集し、さらに消費者を対象にしたアンケート調査のみならず法人顧客を対象にしたアンケート調査も行った。共同研究者の協力が快く得られたため、アンケート調査の範囲を当初の計画よりも速く広げることができた。法人顧客を対象にするアンケートについては、タイにおけるデータ収集を準備するための交渉に、予定したよりも時間がかかったため、タイのデータはまだ収集していないが、その代わりに当初予定しなかったオーストリアと東欧からデータを収集した。消費者を対象にするアンケートについては、予測した進捗を超えており、さらにフランスで膨大な調査を行った。平成24年度に開始した、消費者を対象にしたアンケート調査及び法人顧客を対象にしたアンケート調査の範囲を他国や他業種に拡張する計画がある。具体的には、ドイツ及び米国、スイス、タイで調査を行い、スリランカとエクアドルの調査を他業種で行う予定である。次に、収集したデータを分析し、研究成果を論文と国際学会で報告する計画をしている。平成25年度に開始した、消費者を対象にしたアンケート調査及び法人顧客を対象にしたアンケート調査の範囲を広げ、他国に拡張する計画がある。具体的には、日本、米国、ドイツ、中国、フランスで調査を継続しデータ数を増やし、またタイから新たな調査を行う予定である。
マクロファージピノサイトーシスを標的とした新規動脈硬化治療戦略の構築

昨年度までにカルパインファミリーの非プロテアーゼ型アイソフォームであるカルパイン-6がエクソン接合部複合体構成分子CWC22と分子間相互作用し、結果としてマクロファージ飲作用を介したnative LDL取込みを促進し、動脈硬化症を増悪化させることを明らかとした。また、関連疾患として食餌誘発性の肥満症の解析を行い、カルパイン-6の欠損にともない体重の減少と、脂肪間質マクロファージにおいてカルパイン-6に依存したいくつかの興味深いmRNAスプライシングを検出した。本年度はCWC22欠損マウス(ヘテロ欠損型)とLDLR欠損マウスを交配して得られた2重欠損マウスとLDLR欠損マウスに高脂肪食を負荷し、大動脈における動脈硬化病変を解析した。Oil-red-O染色により動脈硬化病変のサイズを検討したところ、CWC22の欠損にともない動脈硬化病変の促進が認められた。カルパイン-6はCWC22の活性を阻害し、カルパイン-6欠損は動脈硬化症を改善することから、上記CWC22欠損マウス(2重欠損マウス)の表現型は妥当であると考えられる。一方、血漿中の脂質異常症ならびに炎症マーカーの発現に影響は認められなかった。CWC22のがヘテロ欠損型であるために表現型が弱い可能性が示唆される。ホモ型CWC22欠損マウスは胎生致死であることから、現在はコンディショナルなCWC22欠損マウス(CWC22 floxマウス)を作製中であり、LysM-creマウス等と交配することで実験に供する予定である。また、関連疾患としてCWC22ヘテロ欠損マウスで食餌誘発性の肥満症を惹起したところ、CWC22のヘテロ欠損で体重の増加が認められた。これもカルパイン-6とは逆の表現型で、動脈硬化同様妥当であると評価された。CRISPR/Cas9システムを用いたゲノム編集によりCwc22の第2エクソン以降を欠損させたCwc22欠損マウスの作出を行った。2度のインジェクションで変異マウスは得られなかったが、gRNAの配列を変更して再度インジェクションを行ったところ9ラインのファウンダーが得られた。これまでの検討で、カルパインー6が炎症性マクロファージにおいてCWC22の核移行を制限し、これがRac1を含む一部遺伝子のmRNAスプライシング効率の低下に繋がることが明らかとなっている。本研究において、カルパインー6野生型ならびに欠損マウス動脈硬化病変マクロファージにおいてCWC22の発現分布を検討したところ、野生型で同分子はほとんど核局在が認められなかったが、欠損型では多くが核内に移行していた。動脈硬化病変におけるRac1のスプライシング効率を検討したところ、カルパインー6の欠損により同スプライシング効率の増加が認められた。骨髄移植実験により、スプライシング効率は骨髄細胞のみに依存することが明らかとなった。また、カルパインー6の欠損によりRac1タンパク質発現は増加した。免疫組織化学法においても、カルパインー6欠損に伴う動脈硬化病変マクロファージにおけるRac1タンパク質発現の増加が認められた。ヒト剖検サンプルを用いてカルパイン-6およびCWC22の発現を免疫組織化学的に検討した。高度に進展したヒト動脈硬化病変においてはカルパイン-6が泡沫化マクロファージに局在し、CWC22の核移行が低下する傾向が認められた。CWC22欠損マウスのファウンダー作出に成功し、動脈硬化症におけるCWC22の機能解析についても進展が認められたため。本年度は、特にマクロファージが生体内でどのようにして飲作用活性を獲得するか検討した。動脈硬化症モデルマウスの循環血中の単球を蛍光ビーズでラベルし、3日後に動脈硬化プラークに動員された蛍光ビーズ陽性細胞を組織化学的に検出したところ、多くの陽性細胞はカルパイン-6陰性であった。プラーク内部の泡沫化マクロファージが顕著にカルパイン-6を発現することから、単球が動脈硬化病変に動員された後にカルパイン-6が発現誘導され、これがマクロファージの飲作用活性獲得に寄与すると考えられる。実際カルパイン-6の欠損により動脈硬化病変マクロファージの飲作用活性は消失した。In vitroの検討では、TNF-a刺激により単離骨髄由来マクロファージにおけるカルパイン-6依存的な飲作用獲得が再現された。したがって、マクロファージは動脈硬化プラーク内部の局所環境に依存して飲作用活性を獲得すると考えられる。また、動脈硬化病変における酸化ストレス、死細胞コアの容量を検討したが、カルパイン-6野生型と欠損マウスで明らかな違いは認められなかった。CWC22欠損マウスの解析も続行している。同マウスは胎生致死であったため、いずれの時期に致死に至るのか胎児を摘出して検討している。胎児におけるCWC22の発現はE11.5を境に低下する傾向がある。そこでE11.5の時点でマウスの解析を行った。これまで22匹の胎児を検討したがホモ接合型の欠損マウスは得られていない。CWC22欠損マウスが胎生致死の表現型を呈したため。昨年度までにカルパインファミリーの非プロテアーゼ型アイソフォームであるカルパイン-6がエクソン接合部複合体構成分子

CWC22と分子間相互作用し、結果としてマクロファージ飲作用を介したnative LDL取込みを促進し、動脈硬化症を増悪化させることを明らかとし、Journal of Clinical Investigation誌に報告した。本年度はCWC22欠損マウスの解析を続行している。同マウスは胎生致死であったため、いずれの時期に致死に至るのか胎児を摘出して検討した。E9.5の時点で欠損マウスは得られておらず、CWC22は極めて早期の段階で個体発生に関与しているものと考えられる。CWC22ヘテロ欠損マウスに高脂肪食を負荷したところ、野生型マウスと比べて体重の増加、脂肪量の増加が認められ、インスリン抵抗性の低下が認められたことから、ヘテロ欠損マウスにおいても生体機能に著しい影響を及ぼすと考えられた。CWC22ヘテロ欠損マウスにおいて動脈硬化症の表現型を検討する目的で、同マウスとLDL受容体欠損マウスの2重欠損マウスを作出し、現在高脂肪食の負荷を行なっている。同時に次世代シーケンスを用いて、カルパイン-6欠損によるスプライスバリアントの発現変動について検討を行い、同分子の下流に複数種の脂質代謝関連分子のスプライスバリアントの存在を検出した。また、骨髄系細胞に特異的なスプライシング制御因子自身のバリアントも複数種検出された。パスウェイ解析の結果、脂質代謝経路の変化が検出された。CWC22欠損マウスが胎生致死であり、実験計画を変更した。昨年度までにカルパインファミリーの非プロテアーゼ型アイソフォームであるカルパイン-6がエクソン接合部複合体構成分子CWC22と分子間相互作用し、結果としてマクロファージ飲作用を介したnative LDL取込みを促進し、動脈硬化症を増悪化させることを明らかとした。また、関連疾患として食餌誘発性の肥満症の解析を行い、カルパイン-6の欠損にともない体重の減少と、脂肪間質マクロファージにおいてカルパイン-6に依存したいくつかの興味深いmRNAスプライシングを検出した。本年度はCWC22欠損マウス(ヘテロ欠損型)とLDLR欠損マウスを交配して得られた2重欠損マウスとLDLR欠損マウスに高脂肪食を負荷し、大動脈における動脈硬化病変を解析した。Oil-red-O染色により動脈硬化病変のサイズを検討したところ、CWC22の欠損にともない動脈硬化病変の促進が認められた。カルパイン-6はCWC22の活性を阻害し、カルパイン-6欠損は動脈硬化症を改善することから、上記CWC22欠損マウス(2重欠損マウス)の表現型は妥当であると考えられる。一方、血漿中の脂質異常症ならびに炎症マーカーの発現に影響は認められなかった。CWC22のがヘテロ欠損型であるために表現型が弱い可能性が示唆される。ホモ型CWC22欠損マウスは胎生致死であることから、現在はコンディショナルなCWC22欠損マウス(CWC22 floxマウス)を作製中であり、LysM-creマウス等と交配することで実験に供する予定である。また、関連疾患としてCWC22ヘテロ欠損マウスで食餌誘発性の肥満症を惹起したところ、CWC22のヘテロ欠損で体重の増加が認められた。これもカルパイン-6とは逆の表現型で、動脈硬化同様妥当であると評価された。昨年度までに作出したCwc22欠損マウスの表現型解析を行う。
養殖魚類キチン分解酵素の生体内における役割

魚類の中ではキチン分解活性の高いマダイを材料として、その胃のキチナーゼの酵素反応機構を調べた。最適pHは基質にグリコールキチンおよびN-アセチルキトオリゴ糖(GlcNAc_5)を角いた場合、前者ではpH2.5およびpH9.0であったが、後者ではpH2.5およびpH5.0と異なった。本酵素は長鎖の糖をよく分解し、2糖および3糖は分解しなかった。アロサミジンで阻害されること、反応生成物がβアノマー型であることなどからマダイ胃キチナーゼはファミリー18の糖質分解酵素と考えられる。次いで、マダイ胃キチナーゼのcDNA配列の解析を行った。本酵素をコードするcDNAは1,428塩基であり、これから予測されるタンパク質のアミノ酸残基は476残基であった。得られた配列から相同性検索をした結果、ヒトおよびマウスの酸性キチナーゼ、ニワトリ胃および肝臓のキチン結合タンパクと高い相同性がみられた。また、マダイ胃キチナーゼのmRNAを用い、ノザン解析ならびにRT-PCR法によってマダイ成魚における各組織の発現状況を調べたところ、胃の他に肝臓、幽門垂および腸に発現がみられた。さらに、マダイの発生に伴うキチナーゼの発現動態を免疫組織化学法によって調べた。孵化後2日目までは免疫陽性反応は観察されなかったが、孵化後3日目には腸に、24日目には胃が分化した個体は胃に、未分化の個体は腸に、46日目には胃のみに観察された。これらのことから、消化器系の発達に伴い孵化後20日目前後にキチナーゼの発現器官が腸から胃に移行したと考えられる。以上の結果から、消化管に発現するキチナーゼはキチン質を含む餌料の消化の役割を果たすと考えられるが、肝臓のキチナーゼの役割については今後、検討の必要がある。(1)種苗生産したマダイ仔魚に10%キチン添加飼料を与え、飼育実験を行った結果、添加区は無添加区に比べ有意に成長が良かった。(2)マダイ成魚の組織別キチン分解酵素活性を測定したところ、エンド型キチン分解酵素(キチナーゼ)は胃に、またエキソ型キチン分解酵素(β-N-アセチルヘキソサミニダーゼ)は幽門垂と腸に特に強い活性を示した。(3)マダイ2年魚の胃よりキチナーゼを精製・単離した。本酵素はSDS-PAGEで単一のバンドを示し、分子量は44、000、等電点は8.3、最適pHは5.5であった。(4)単離したマダイ胃キチナーゼに対する抗体をウサギを用いて作製した。(5)マダイ、クロダイおよびブリの各組識の抽出液をSDS-PAGE後、ウェスタンブロッティングに付し酵素免疫測定法によってキチナーゼの生体内での局在を調べたところ、マダイおよびクロダイでは胃、脾臓、腎臓に検出されたが、幽門垂および腸には検出されなかった。ブリでは胃に僅かに検出されたのみであった。(6)マダイの発生に伴うキチナーゼの出現動態を免疫組織化学法によって調べた。孵化後2日目から60日目まで定期的に仔・稚魚を採取し、ブアン液で固定しパラプラスト切片を作製した。免疫陽性反応は孵化後3日目から腸に観察された。孵化後3から24日目までは消化管の胃はまだ未分化であった。孵化後46日目には免疫陽性反応は胃に観察され、腸にはみられなくなった。このことは消化器系の発達に伴い、消化酵素としてのキチナーゼの作用器官が変化したと考えられる。

以上の結果から、消化管に発現するキチナーゼはキチン質を含む餌料の消化の役割を果たすと考えられるが、肝臓のキチナーゼの役割については今後、検討の必要がある。魚類キチン分解酵素の生体内での役割をしらべるため代表的養殖魚であるマダイの胃からキチナーゼを精製・単離した。まず、本酵素の抗体を作製し免疫組織化学法によつ発生段階での発現状況を調べた。種苗生産したマダイを孵化後2日目から60日目まで定期的に採取し、ブアン液で固定し組織切片を作製した。各成長段階の切片にヘマトキシリン・エオシン染色を施し、消化器系の発達過程を調べたところ、胃および腸の分化は艀化後20日前後から始まった。マダイ抗体に対する免疫陽性反応は孵化後3日目から腸に、19-24日目は腸および胃の両方に、さらに27日目以降は胃のみに観察された。これらのことは孵化後20日前後に消化器系の基礎構造が確立されたためキチナーゼを発現する器官が腸から胃へと移動したと考えられる。さらに、魚類キチナーゼの魚種別、組織別および成長段階での発現を調べるため、マダイキチナーゼ遺伝子のクローニングと構造解析を行った。単離した酵素をプロテインシークエンサーによってN-末端アミノ酸配列14残基(YILSXYFTNWGQYRP)を同定した。また、CNBr分解法により、内部アミノ酸配列の部(NYWKSNGAPA)を同定し、NCBIで本酵素と相同性を持つタンパク質を検索したところ、複数の動物酸性キチナーゼおよびキチン結合タンパク質と非常に高い相同性を持つことがわかった。これらの保存領域からプライマーを作製し、マダイキチナーゼをコードするcDNAのクローニングをRT-PCR法およびRACE法によって行った。決定したcDNA配列をアミノ酸配列に変換した結果、476残基のアミノ酸をコードしていることがわかった。この演繹アミノ酸配列はFamily18キチナーゼに保存されている領域region1,2が存在し、哺乳類酸性キチナーゼのAMCaseやCBPb04と良く似ていた。現在、マダイキチナーゼ遺伝子の定量的発現解析を組織別および発生段階で試みている。