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第2種超伝導磁束量子ダイナミクスの計算機シミュレーション研究

弾性系が駆動力を受け、ランダムポテンシャルにピン止めされた静止状態から動的状態へ転移する現象は物性物理の重要なパラダイムの一つである。臨界駆動力近傍では、多数粒子系に良く見られる協力現象が顔を出す。また、低駆動力ではグラス的特徴が顕著になり、運動方式に強い非線形現象が現れる。最近、汎関数繰り込み群の発展によって、これらのダイナミクス現象の理論的理解はかなり進んだ。しかし、その予言の多くは実験検証を得ていない。一方、磁束運動に関するAnderson-Kim理論は、多くの実験観測を良く再現できるが、現象論的な側面が強い。我々は欠陥を含む超伝導体に於ける磁束量子系の電流駆動ダイナミクスの計算機シミュレーションを行った。その結果、ゼロ温度depin転移のスケーリング振る舞いを解明し、ゼロ温度depin転移の臨界駆動力、臨界指数を高い精度で評価できた。また、スケーリング曲線から、ランダムピン止め力が強い場合はAnderson-Kim理論を導出しました。一方で、ランダムネスが弱く、熱平衡状態がブラッグ・グラスになっている場合のダイナミクスはアレニウス則に従わないことも判明した。現在これらの結果を纏めた論文がPRLに掲載された。最近の実験結果が我々の理論予言を確認した。最近、我々は以上の成果を発展させ、小さい駆動力下のクリープ運動則を解明した。特に個々の点ピン止めセンターの強さとクリープエネルギーバリアの発散指数の関係について新しい結果が得られ、この分野で続いてきた議論に結論を与えるものと期待される。論文は投稿準備中である。ゼロ温度では臨界駆動力が存在し、速度が連続的にゼロから立ち上がり、depin転移が観測される。有限温度では熱励起によって系がエネルギーバリアを超えて運動できるので、明確なdepin転移が存在しない。我々は有限温度において系の運動速度の温度と駆動力依存性にスケーリング則を見出した。この性質を利用して、ゼロ温度depin転移の臨界駆動力、臨界指数、及び温度依存性を記述する臨界指数を高い精度で評価できた。現在これらの結果を纏めた論文が投稿中である。

その結果、ゼロ温度depin転移のスケーリング振る舞いを解明し、ゼロ温度depin転移の臨界駆動力、臨界指数を高い精度で評価できた。また、スケーリング曲線から、ランダムピン止め力が強い場合はAnderson-Kim理論を導出しました。一方で、ランダムネスが弱く、熱平衡状態がブラッグ・グラスになっている場合のダイナミクスはアレニウス則に従わないことも判明した。現在これらの結果を纏めた論文がPRLに掲載された。最近の実験結果が我々の理論予言を確認した。最近、我々は以上の成果を発展させ、小さい駆動力下のクリープ運動則を解明した。特に個々の点ピン止めセンターの強さとクリープエネルギーバリアの発散指数の関係について新しい結果が得られ、この分野で続いてきた議論に結論を与えるものと期待される。論文は投稿準備中である。
視覚障害者の聴覚錯誤のメカニズムに関する研究

視覚障害者が外出時など単独歩行する際、様々な音の情報を認知して歩行している。しかし、突発的な騒音が発生した場合、方向感覚を錯誤が生じて、方向感を無くさせることが懸念されている。本研究では、視覚障害者の安全な歩行環境のために、聴覚錯誤のメカニズムを明らかにすることを目的として研究を行ってきた。研究の最終的な成果としては、聴覚錯誤をより明確に解明することを目的として実施した方向定位への反射壁面の影響に関する基礎的検討から、壁面の位置や音源の種類によっては聴覚錯誤が顕著に表れることが明らかとなった。また、長時間の聴取した場合、疲労度からも聴覚錯誤が多く発生する可能性があることが分かった。本研究は、視覚障害者が歩行中に突発的な騒音等が発生した場合に聴覚錯誤が起きることが以前の筆者の研究で明らかとなっており、様々な音環境の変化によってどのような条件で錯誤が起きるのかを明らかにすること、また、音以外の原因に関しても、どのような条件で方向の錯誤が発生しているかについて、聴覚錯誤のメカニズムを明確にすることを目的として研究を進めている。本年度は聴覚錯誤研究に関して、福祉先進国である北欧のデンマーク及びスウェーデンでは視覚障害者福祉に関して、特に音に関する訓練に関してどのような施策があるのか実際に現地を訪ねて調査を行った。特に、デンマークでは視覚障害者への生活訓練として音に関するプログラムがあることもデンマーク国立の視覚障害者訓練施設における調査で明らかになった。聴感実験に関しては、本年度は残響時間の短い空間を使用して聴感実験を繰り返し行った。実験空間としては、本学の既存の設備である簡易型無響室(無響空間)を使用した。無響室内に8chのスピーカーを被験者の周りを囲むように円状に設置し、中心に被験者に座ってもらう形で聴感実験を行った。音源には1,000kHzの単音を使用した。スピーカーから被験者までの距離は1.9mである。被験者30名を対象として、8chの各スピーカーから音をランダムに発生させて、発生したスピーカーの位置を示してもらう手法で実験を行った。被験者の正面からみて真横(左右)のスピーカーに関する正答率は約80%であるのに対して、正面や真後ろに存在するスピーカーの方向に関する正答率は50%程度であり、正面や真後ろに関する聴覚錯誤が明らかとなった。この実験結果より、無響空間における聴覚錯誤が明確になった。固定音源に関する聴感実験により聴覚錯誤が明らかになったことを踏まえて、今後は移動音源による聴感実験を進め、聴覚錯誤のメカニズム解明に向けて研究を進めていく。本年度は、実験室における聴感実験を主に実施した。無響室内に8chのスピーカーを被験者の周りを取り囲むように円状に設置し、中心に被験者が座ってもらう形で聴感実験を行った。スピーカーから音源のスピーカーの距離を約1.9mとして、8chの各スピーカーより、音をランダムに発生させて、発生した音源の方向を手で示してもらう手法で実施した。本年度は、昨年度行った実験における1,000Hzの音源を利用した聴感実験と、人間にとって最も感度が良いとされる4,000Hzの音源、更に全周波数帯域が発生するホワイトノイズを音源として、18歳22歳までの晴眼者30名(男15名、女15名)を対象として実験を行った。実験全体の結果としては、ホワイトノイズを音源としたときの各方向における正答率は90%程度であるのに対して、昨年度同様、1,000Hz音源のときには正面に関しては40%程度の正答率であった。また、4,000Hz音源の際にも正面、真後ろの際には4060%の正答率と低い結果となっていた。更に、男女別に分析してみると、4,000Hz音源の際に、正面に関する正答率は男性が平均約70%の正答率であるのに対して、女性は約50%と男女間にも正答率の差があることが分かった。このメカニズムについても次年度に詳細を調査する必要があり、聴覚錯誤の更なるメカニズム解明に向けて研究を進めていく。また、本研究は視覚障害者の安全単独歩行の実現も目的の一つであることから、歩行訓練等の整備も含めた研究調査が必要不可欠であることが、研究を進めていく上で明らかとなった。このことから、聴覚サイン等についても国内外の事例について、国内の研究者を中心に協力を得ながら調査を進めてきた。

本研究は、視覚障害者が歩行中に突発的な騒音等が発生した場合に聴覚錯誤が起きることが以前の筆者の研究で明らかとなっており、様々な音環境の変化によってどのような条件で錯誤が起きるのかを明らかにすること、また、音以外の原因に関しても、どのような条件で方向の錯誤が発生しているかについて、聴覚錯誤のメカニズムを明確にすることを目的として研究を進めている。本年度は、聴覚錯誤の実態について確認するために、視覚障害者から聴覚錯誤や、それらに関して、これまでに発生した歩行中の事故などに関するヒアリング調査、固定音源による聴感実験(予備実験)を進めてきた。ヒアリング調査の結果、視覚障害者からは聴覚錯誤とは断定できないまでも、駅のホームで方向を見失ってしまったことや、風雨などの影響により方向が分からなくなったことなど、聴覚錯誤に繋がるような事象の経験が少なくともあることが確認できた。歩行中に様々なものに衝突するなどの歩行事故については、筆者が以前に行った調査でも明らかとなっているが、電柱や標識に衝突した経験や駅のホームからの転落事故など、今回の調査でも同じようなケースが確認できた。固定音源による聴感実験については、整備できつつあるデジタルミキサー等を組み合わせて、8chのスピーカーから音がランダムに発生する音響システムを構築し、晴眼者の被験者に対して、被験者の周りを円状に8個のスピーカーで囲み、スピーカーからランダムに音を発生させてどの位置から音が発生したかを示してもらったところ、実際には音が発生している場所とは全く逆の方向を示した被験者が数件確認できた。今回は予備的な実験だったため、来年度は改めて実験場等の再考も含めて再度実験を実施していくこととする。研究の最終年度となる当年度は、視覚障害者による聴覚錯誤に関する聴感実験を中心に行った。実験空間としては、昨年度と同様、本学の既存の設備である簡易無響室(無響空間)を使用した。無響室内に8chのスピーカーを被験者の周りを取り囲むように円状に設置し、音源の中心に被験者に座ってもらい実験を行った。スピーカーから音源のスピーカーの距離を約1.9mとして、8chの各スピーカーより、音をランダムに発生させて、発生した音源の方向を手で示してもらう手法で実施した。本年度は簡易無響室における聴感実験について、聴覚錯誤をより明確に解明することを目的として、方向定位への反射壁面の影響に関する基礎的検討を実施した。実験室内に音が反射するような仮設の壁面を設置し、壁面の位置も可変させて評価してもらう実験を行った。被験者から見て前後左右4つの壁面に12パターン(例えば前面のみ、前面及び右側面、前面及び後面、壁面無しなど)の壁面をつくり出し、反射による聴覚錯誤の影響について調べた。音源は昨年度と同様の1,000Hzの正弦波、ホワイトノイズ、そして人の声として女性アナウンス音の3種を使用した。実験には4名の視覚障害者の被験者に協力してもらった。4名とも身体障害者1級を所持している。被験者の内訳は4060代の男性1名、女性3名である。実験の条件としては、上記のように壁面位置の可変の他、頭部を固定(動かさない)した条件とどこから音が聞こえているかを自由に頭を動かして良いという条件の2パターンに分けて行った。実験の結果、ホワイトノイズと女性アナウンスを音源に使用した際にはほぼ100%に近い確率で方向定位ができていた。しかし、1,000Hzの音源の際には全ての被験者が方向を誤って示しており、反射壁面の影響に関しても聴覚錯誤が十分に考えられることが明らかとなった。社会福祉学本研究の目的は、様々な音環境の変化によってどのような条件で錯誤が起きるのかを明らかにすること等、聴覚錯誤のメカニズムを明確にすることである。
新規ヘリセン型ホスフィンの開発と不斉触媒反応への応用

本研究課題では、螺旋π共役構造を有するヘリセンの分子構造に着目し、ジヒドロヘリセン型L1及びヘリセン型L2のホスフィン配位子の合成と不斉触媒反応への応用研究を行った。具体的には、Pd触媒による不斉鈴木-宮浦カップリング(SMC)反応および不斉アリル位置換(AAS)反応に適用への適用を検討した。その結果、不斉SMC反応ではL2を、AAS反応ではL1を用いた場合に、高収率、高エナンチオ選択的に反応が進行することを見出した。本結果は、過去に報告されている類似反応に比べて、収率、立体選択性共に著しく優れている。本研究は、我々が独自に開発した内部置換型ヘリセン類の構築技術を利用し、新たに設計・合成したヘリセン型ホスフィン配位子を不斉触媒反応へと展開することで、ヘリセンの潜在的有用性を明らかにするものである。計画している具体的な研究項目は1螺旋構造内部ホスフィノ基を有するヘリセン型ホスフィン配位子の創製とその光学分割法の確立、2不斉触媒反応の探索とその不斉誘起機構解明の2点である。既に合成に成功している2種のホスフィン配位子(ジヒドロ[5]ヘリセン型ホスフィン配位子:L1, [5]ヘリセン型ホスフィン配位子:L2)がPd触媒不斉鈴木-宮浦カップリング反応に対して高い活性を示し、特にL2を用いた場合、軸不斉ビアリール体を高収率・高エナンチオ選択的に与えることを見出している。本年度は、これら配位子の適用範囲の拡大を目的としてPd触媒による各種不斉アリル位置換(AAS)反応を検討した。1,3-ジフェニル酢酸アリルとマロン酸ジメチルとのAAS反応にL1及びL2を用いたところ共に定量的に所望の生成物が得られ、特にL1を用いた場合には、高エナンチオ選択的に反応が進行することを見出した。本手法は、インドール類やアルコールなどの求核剤に対しても適用可能であった。特にインドール類を求核剤とした場合には、過去に報告されている反応例に比べて、収率、立体選択性共に著しく優れていることを明らかとした。更に、これら不斉配位子の高い立体識別機構をDFT計算により解析し、その機能性を提唱した。H28年度は、項目1を中心として研究を行うことを計画していた。即ち、新規π拡張型ホスフィン配位子の合成と、光学活性なヘリセン型ホスフィン配位子を得る新たな手法を開発することである。様々な酵素を用いてヘリセンの速度論的光学分割法を実施したが、予備検討の段階で見出した条件よりも良好な条件を見出すことができなかった。本条件を検討するのに予想以上に時間を費やしたため、π拡張型ホスフィン配位子の合成はH29年度に実施する事とした。一方、同時進行で実施していた項目2に関して、ヘリセン型ホスフィン配位子がPd触媒不斉アリル位置換反応に極めて優れた配位子として機能することを見出すことに成功した。以上、H28年度に計画以上に項目2の研究を進めることはできたが、項目1に関しては計画通りに進めることはできなかった。本研究は、我々が開発した内部置換型ヘリセン類の構築技術を基盤し、新たに設計・合成したヘリセン型ホスフィン配位子を各種不斉触媒に展開することで、ヘリセンの潜在的有用性を明らかにするものである。計画している具体的な研究項目は1螺旋構造内部ホスフィノ基を有するヘリセン型ホスフィン配位子の創製とその光学分割法の確立、2不斉触媒反応とその不斉誘起機構解明の2点である。昨年度までに、リン原子上にフェニル基を有する2種のホスフィン配位子(ジヒドロ[5]ヘリセン型ホスフィン配位子:L1、[5]ヘリセン型ホスフィン配位子:L2)をPd触媒不斉鈴木-宮浦カップリング(SMC)反応及びPd触媒不斉アリル位置換反応に適用し、何れの場合も所望の生成物を高収率且つ高エナンチオ選択的を与えることを見出した。本年度は、ヘリセン型ホスフィン配位子の置換基効果を検証するため、リン原子上にイソプロピル基を有するジヒドロ[5]ヘリセン型配位子L3を合成した。なお、L3の光学活性体は、そのホスフィンオキシド体に対するTADDOL誘導体を用いた分別結晶化によって達成した。この際、その共結晶体のX線結晶構造解析にも成功し、不斉識別機構も明らかにした。次いで、L3を不斉SMC反応に適用した結果、興味深いことに(M)-L1と同方向の螺旋不斉を有する(M)-L3を用いた場合、生成物のエナンチオ選択性が逆転する現象を見出した。一方、螺旋軸に対して垂直方向にπ共役系を拡張した配位子L4の前駆体であるホスフィンオキシド体までの合成とそのX線結晶構造解析にも成功した。

現在までの進捗状況に示したように、実施項目2においてヘリセン型ホスフィン配位子がPd触媒不斉アリル位置換反応に極めて優れた配位子として機能することを見出すことに成功している。また、ヘリセン螺旋空間内でのリン-Pd-アレーン相互作用が、触媒活性と立体選択性に関与していることがX線結晶構造解析や計算化学により明らかになりつつある。このことから、次年度は、リン-金属-アレーン相互作用を活用した触媒システムの開発(不斉触媒反応の探索)と、更なる高エナンチオ選択性の発現を目指し、螺旋反応場を拡張したπ拡張型ホスフィン配位子の合成を実施する。医歯薬学H28年度に、合成化合物のスペクトル解析を行う予定であったが、対象化合物の合成が遅延したため、未使用額が生じた。合成化合物のスペクトル解析を次年度に行うこととし、未使用額(6,789円)はその経費に充てることとしたい。
ヌードマウスに腫瘍形成能を示すC型肝炎ウイルスNS3領域蛋白はヒトでも機能的か

われわれは、C型肝炎ウイルス(HCV)蛋白NS3がマウス細胞NIH3T3の形質転換を惹起し、腫瘍形成能を発現する作用を示すことを見いだした(J Virol,69:3893,1995)。したがって、HCVの肝発癌機構は、肝細胞へのHCV-NS3導入によって惹起される肝細胞の形質転換に起因する可能性が考えられる。本研究は、このNS3作用が宿主蛋白と如何なる相互関係を有するのかの性状を解析して、腫瘍形成能を発現するHCV-NS3蛋白の肝発癌機構に及ぼす臨床的意義を明らかにすることを目的とし、以下の成果を得た。まず、NS3結合蛋白の有無を検索する目的で、酵母を用いた2-ハイブリッド法を施行し、複数の核内蛋白を検出した。このうちSm-D1を同定し、本蛋白はin vitro/in vivoともにNS3と結合することを見いだした。さらに、新たなNS3結合蛋白SRCAPを同定した。この蛋白は、CBPと相互作用して転写活性化に関与する。これら2つのNS3結合核蛋白をそれぞれヒト肝細胞由来のHepG2細胞株あるいはKN73細胞株へ遺伝子導入し、蛋白発現が如何なる変動を受けるかをルシフェラーゼ発現量で検討した。その結果、ルシフェラーゼ活性はSRCAP発現ベクターとの共導入では増加するが、NS3蛋白を共発現させると活性が著明に低下することを見いだした。次に、2つのNS3結合蛋白がNS3蛋白の細胞内局在にいかなる影響を与えるかを特異抗体を用いたウエスタンブロット法および間接蛍光抗体法を用いて検討した。その結果、本来は細胞内のcytoplasmに局在するNS3蛋白が、細胞内へのSm-D1あるいはSRCAPとの共導入によって明らかに細胞内移動が生じ、核内にも多量のNS3蛋白が確認できるように変化することを見いだした。以上の成績は、HCV蛋白NS3は宿主蛋白と結合し、核内で宿主蛋白機能に影響を与えることを強く示唆するものである。NS3による腫瘍形成能の生物学的機構は今後の重要な研究課題である。これまでわれわれは、C型肝炎ウイルス(HCV)持続感染者の肝細胞癌化プロセスにはHCV蛋白NS3が関与すること、このNS3作用には宿主蛋白が大きな役割を有することを報告してきた。本研究は、さらなるNS3結合宿主蛋白の検出、これら蛋白間の相互作用の性状分析、および、これら蛋白と腫瘍形成能との関連性の解明を目的とし、本年度は以下の成果を得た。まず、酵母を用いた2-ハイブリッド法によりNS3結合蛋白の検出を行い、従来まで獲得したNS3結合蛋白SmD1に加え、新たなNS3結合蛋白SRCAPを同定した。このSRCAPは、CBPと相互作用して転写活性化に関与する蛋白である。次に、転写レベルへの影響をみるために、p21プロモーター下流にルシフェラーゼ遺伝子を有する発現ベクターを構築し、それらをヒト肝細胞由来株のHepG2およびKN73細胞株へ遺伝子導入した。その結果、ルシフェラーゼ発現量(活性)はSRCAP発現ベクターとの共導入では増加するが、HCV蛋白NS3蛋白を共発現させると活性が著明に低下することを見いだした。SRCAP発現ベクターとNS3蛋白発現ベクターとをKN73細胞に遺伝子導入し、共発現させてNS3の細胞内局在を検討すると、局在に変化が生じて、より多くのNS3蛋白が核に存在することを発見した。

しかし、この核移行の効果は、先に報告したNS3結合蛋白SmD1による核移行効果よりも小さかった。この成績は、HCV蛋白NS3は宿主蛋白SmD1と結合し、その存在の場を核に移行させること、さらに、核内でSRCAPの機能に影響を与えることを強く示唆するものである。HCV蛋白NS3は、P21プロモーター活性に対して抑制的に作用する。以上より、NS3による細胞周期への影響、すなわち細胞分裂促進作用が大いに示唆されるところであり、この作用の結果として腫瘍形成能が発現する可能性が推定された。われわれは、C型肝炎ウイルス(HCV)持続感染者の肝細胞癌化プロセスにはHCV蛋白NS3が関与すること、このNS3作用には宿主蛋白が大きな役割を有する可能性を報告してきた。本研究の初年度(平成14年度)には、酵母を用いたtwo hybrid法を用いてNS3結合蛋白の性状の分析を行い、宿主の核蛋白Sm-D1に加えて新たにSRCAPがNS3結合蛋白であることを同定した。今年度は、これら核蛋白のSm-D1およびSRCAPが、HCV蛋白NS3の細胞内局在にいかなる影響を与えるかを検討した。細胞はヒト肝細胞由来のHepG2およびKN73細胞株を使用し、また発現蛋白の検出には、特異抗体を用いたウエスタンブロット法および間接蛍光抗体法を用いた。まず、通常状態における細胞内Sm-D1の局在を確認する目的で、FLAG添加Sm-D1発現ベクターであるpcDNA/FLAG/Sm-D1と、その突然変異体ベクターのpcDNA/FLAG/SmD438を作成して各々免疫染色を行い、Sm-D1蛋白は核内に局在するが、変異蛋白の染色は核内と核外ともに認められることを確認した。一方、N末端含有NS3発現ベクターの細胞導入では、既報のとおりNS3蛋白は細胞内cytoplasm(以下、核外)に局在することも確認した。そこで、この核外に局在するNS3蛋白が、Sm-D1あるいはSRCAPとの共発現によってどのような変化を受けるのかを検討した。その結果、Sm-D1とNS3の共発現では、明らかにNS3蛋白の細胞内移動が生じて、核内にも多量のNS3蛋白が確認できるように変化することを見いだした。同様の核移行現象はSRCAPとNS3との共発現でも観察されたが、その程度はSm-D1より弱かった。以上の成績は、HCV蛋白NS3は宿主蛋白と結合し、その存在の場を核に移行させること、さらに、核内で宿主蛋白機能に影響を与えることを強く示唆するものである。NS3による細胞分裂促進作用と腫瘍形成能発現への細胞生物学的機構は今後の研究課題である。
結晶型アレイを用いたアレイ信号処理の基礎的研究

本研究の目的は、センサ配置の対称性を利用した新しいアレイ信号処理の枠組みの基礎を確立することである。得られた研究成果は以下のようにまとめられる。1)本技術が適用可能なアレイ配置をほぼ全て明らかにした。2)拡散雑音に頑健な複数音源定位手法:CRYSTAL-MUSIC法を定式化した。3)残響が存在する場合にも適用可能な、拡散性雑音抑圧のための多チャンネルフィルタ設計法を確立した。4)雑音環境下でのインパルス応答のブラインド推定法を考案し、基礎的な有効性を確認した。5)対称性の概念を一般化し、雑音抑圧フィルタの設計法を任意配置に適用可能な手法に拡張した。本研究の目的は、センサを結晶のように対称性よく配置することにより、従来困難であった拡散性雑音の抑圧や拡散性雑音下ての定位を可能にする新しいアレイ信号処理の枠組みを確立することである。特に2年の研究期間の間に、理論面を整備、拡充し、実環境への適用範囲の拡大を行うことを目指している。昨年度は、以下のような実績を得た。1)等方性雑音直交化を実現する結晶型アレイ配置を群論的に検討し、群論から導出される必要条件を3次元の点群に全てに対してチェックすることにより、雑音共分散行列のブラインド無相関化を行うセンサ配置として、これまで得られていた、正多角形、正多角柱(ねじれ含む)、等面四面体(長方形含む)、直方体、正多面体の他の、新たな配置を発見した。2)対称性の概念を一般化し、任意のセンサ対の間のクロススペクトルの性質に着目することで、クロススペクトル虚部法という、任意配置に適用可能な新しい雑音抑圧法の枠組みを確立した。これにより、雑音抑圧の適用範囲が大きく広がった。3)複数音源定位手法として有名なMUSIC法を拡張し、拡散雑音下での高精度な複数音源定位を行うための手法:CRYSTAL-MUSIC法を定式化した。具体的には共分散行列の低ランク性の仮定に基づき、行列補完という数学的な技術と拡散雑音共分散行列のブラインド無相関モデルを組み合わせた手法を定式化し、基礎実験によりその有効性を確認した。このうち1)は2010年度発表予定、2)は国際会議発表済み、3)は国際会議投稿済みで2010年度発表予定である。本研究の目的は、センサを結晶のように対称性よく配置することにより、従来困難であった拡散性雑音の抑圧や拡散性雑音下での定位を可能にする新しいアレイ信号処理の枠組みを確立することである。平成22年度は、以下のような実績を得た。1)結晶型マイクロフォンアレイを用いた拡散性雑音抑圧のための多チャンネルウィーナーフィルタ設計法を、室内などの残響が存在する場合にも適用可能に拡張した。具体的には、残響の影響により直接音モデルからずれるステアリングベクトルを、観測信号のみからブラインド推定する手法を確立した。2)前年度に引き続き、複数音源定位手法として有名なMUSIC法を拡張し、拡散雑音下での高精度な複数音源定位を行うための手法:CRYSTAL-MUSIC法の定式化をすすめた。具体的には共分散行列の低ランク性の仮定に基づき、行列補完という数学的な技術と拡散雑音共分散行列のブラインド無相関モデルを組み合わせた手法を定式化し、実験によりその有効性を確認した。3)実環境での高精度な残響除去法確立のために、結晶型マイクロフォンを用いて、音源から各マイクロフォンまでの室内インパルス応答を、雑音環境下で推定する手法を考案し、基礎実験により有効性を確認した。このうち1)はIEEE Trans.に採録決定、2)は国際会議発表済み、3)は卒業論文として研究を行い、次年度以降、学会発表予定である。
中国南部地域のムスリム宗族に関する総合的調査と比較研究

中国南方の複数の地域においてムスリム宗族を調査し、現地と中国、台湾、香港、アメリカの図書館、資料館で多くのムスリム宗族の族譜、なかにかつて外部に知られなかった族譜と失う直前の族譜も含まれる)を入手し、それに基づいて研究を行い、研究結果として三冊の研究報告書、一冊の学術書、複数の学術論文を発表し、本来祖先崇拝に否定的であるイスラームの信仰者たちは、中国においてムスリム宗族を結成した原因と意義を究明した。またこの研究を通じて、二回の学術シンポジウムを開催し、中国、台湾、香港の学者との研究ネットワークを形成した。2012年9月から、代表者、分担者、現地研究協力者が中国広西チワン族自治区、江西省、江蘇省、福建省、浙江省、雲南省において、左蠡馬氏宗族(江西省都昌県)、白氏宗族(広西桂林と臨桂県)、馬氏宗族(広西桂林市)、馬氏宗族(臨桂県崑岡公支族)傅氏宗族(広西臨桂県懐徳堂支族)、以氏宗族(広西臨桂県)、楊氏宗族(江蘇省高郵市菱塘郷)、郭氏宗族(福建省恵安県百崎郷)などの回族宗族について現地調査を行い、多くの族譜を収集した。中に未公刊のものも多く、学術的な価値が非常に高いものが含まれている。現在、その一部はすでに調査研究資料集1、中国江西省九江市都昌県『馬氏宗譜・巻首』として刊行された。なお、資料集IIである『柱林回族宗族族譜資料集』は現在編集中である。これらの調査資料に基いて、研究代表者と分担者が研究活動を行った。以上の調査と研究を通じて、研究グループはムスリムの中国化のプロセスにおいて「宗族化」が大きな役割を果たしたという初歩的結論を得た。調査研究活動から日にちがそれほど立っていないためその研究結果はまだ活字になっていないが、王栂「伝統とは何カー桂林白氏族譜から見た中国ムスリム宗族の再建」(滋賀県立大学国際コミュニケーション学科とケンブリッジ大学モンゴル中央アジア研究所(MIASU,University of Cambhdge)が共同主催の国際シンポジュム「中国の政治改革と少数民族の権利-いわゆる"第二次民族政策"をめぐって-」、2012年12月8日)など、複数の学界で発表しはじめている。また比較の視点から、雲南麗江ナシ族の家譜内容と保存状況についても調査し、ムスリム宗族の族譜との異同及びその原因についても調査した。王ムスリム社会の宗族化と科挙試験への参加との関係、科挙試験への参加と漢化との関係について広西チューワン族自治区と雲南省でフールドワーク調査を実施、潘宏立は宗族組織の構成の実態、族譜の再編、共有財産の再形成、祠堂の再建及び祖先祭祀儀礼、族長および長老組織、宗族の教育などについて福建省と広東省でフールドワーク調査を実施、王維は宗族と関わる人生儀礼、年中行事、宗教信仰について北京でフールドワーク調査を実施、山田勅之は族譜の編集プロセス、族譜編集の原則、祖先に関する伝承の生成、さらにナシ族の文化同化と比較し多民族文化社会形成と宗族との関係いついて雲南省でフールドワーク調査を実施;雲南大学、厦門大学、陝西師範大学、浙江大学、中央民族大学、北京国家図書館などにおいて資料の調査と収集を行い、中国の複数の学者と意見や研究成果を交換し、いままで未刊行の回族『族譜』を発見し、その他にまた多くの資料を入手した。今までの調査と研究成果に基いて、次のような著作物を出版した。王柯、『調査研究資料集II、桂林回族宗族資料』(112頁、2013年8月)を編集;潘宏立(共編)『現代アジアにおける華僑・華人ネットワークの新展開』、風響社、2014年2月;王維「再創成された地域ブランドと観光資源ー春節祭を事例として」『香川大学経済論叢』第86巻2号、査読無、101-157頁、2013年;石原享一「逡巡する中国の新改革ー富強と効率と公正のトリレンマ」『東亜』2014年1月号、2029頁(依頼原稿)以上の研究、特にいままで研究者にほとんど注目されなかった、独自に発見した回族の族譜など貴重な第一次史料に基いて、回族にとっての「宗族」の意義、その特徴、中国社会との関係などをほぼ把握した。王柯は香港中文大学、台湾国家図書館、中央研究院の民族研究所、歴史言語研究所などにてムスリム社会の宗族化と科挙試験への参加との関係、科挙試験への参加と漢化との関係について調査を実施、山田勅之は8月と12月に二回にわたって雲南省麗江にて東巴文化研究院と麗江博物院にてナシ族の家譜について調査した。王維は福建省の陳鎮鎮回族村と百崎回族郷白奇村にてムスリム宗族の祭祀と音楽活動に焦点を当てて、二つの側面から現地調査を行った。1、福建省にある伝統的音楽ー南音、特に南音組織ー南音社についての調査。2,白奇回族鄕のムスリム宗族郭姓の宗廟における春の祖先祭祀ー「春祭」についての調査。潘宏立は福建省において族譜の再編、族長および長老組織についてフールドワーク調査を実施した。

8月に札幌北海商科大学にてワークショップを開き、王柯は「周縁と中心ー中国イスラム宗族研究の手がかりとして」と題する報告を発表し、研究者分担者全員がこれについて討議し、ムスリム宗族研究の方法論問題について話し合いをした。11月に中国から学者を招聘し、神戸大学にて国際シンポジウム「中国南部地域のムスリム宗族の成立と発展」を開き、王柯が「中国南方ムスリムの宗族形成と科挙参加ー百寿堂『沙氏族譜』を例に」、山田勅之が「木氏族譜はどうしてできたのかー中国ムスリムとの比較」、海外研究協力者方素梅(中国社会科学院民族学与人類学研究所)は「宗族、宗教と郷村社会治理ー広西桂林市草坪回族鄕潜経村の考察」、研究協力者馬京(雲南大学)は「雲南回族宗族の形成と族譜作成」を発表した。研究成果の一部は、次の著作に反映した。1,王柯、『中国、従天下到民族国家』(中国、天下から民族国家へ)、台湾政治大学出版社、2014年6月、総293頁。2,王維『華僑的社会空間与文化符号』(『華僑の社会空間と文化記号』、中国中山大学出版社、2014年8月、総376頁。王柯は香港中文大学図書館、国家図書館、国史館、中央研究院傅斯年図書館、民族研究所図書館、台湾大学と国立政治大学図書館など(以上は台湾)にて資料調査を行い、愛群道モスク、林士德イスラーム・センタ(以上は香港)、中華民国イスラーム協会、台北モスク、ムスリム墓地にてフィールドワークを行った。王維は福建恵安にて郭氏宗族を調査し、藩宏立は福建にて丁氏宗族の分枝を調査し、山田勅之は雲南省シャングリラにて木氏一族に関する契約文書を調査した。以上の調査と研究に基づき、王維は「記憶・構築された『回』の時空間」『第12回海港都市国際シンポジウム:学際的フィールドとしての海港都市ー理論と方法をめぐってー』(16.2、長崎大学)、山田勅之は「ナシ族歴史史料概述ーチベット語、モンゴル語、満洲語を中心に」(東京外大AA研、15.12)を報告し、石原享一は福建泉州の丁氏宗族におけるフィールドワークで『丁氏回族宗譜』にある【東塘墳の小作人徐福の取り調べ調書】を日本語に翻訳し、土地制度の分析を行った。11月に神戸大学国際文化学研究科に国際学術シンポジウム「中国南方ムスリム宗族の社会学的特徴と意義」を開き、北京大學教授馬戎(社会学)、南京大學教授範可(人類学)、台灣政治大學張中復(ムスリム研究)等を招へいし、「宗族の記憶と「官」の語りー中国南方ムスリムの宗族化と公共性」(王柯)、「福建陳だい丁氏宗族再建の人類学的意義」(範)、「中国南方の回族と北方回族社会の異同」(馬)など7つの報告が発表された。研究成果として、王柯は「伝統」はどこまで遡れるものかー中国南方の「回族」社会におけるイスラームへの「回帰」(千葉商科大学経済研究所紀要View & Vision 41、16.4、24-29頁)を刊行し、香港中文大学出版社から出る予定の『消えた「国民」--中国における周辺民族集団の国家認識と民族認識』(仮題)の原稿を提出済みである。文書の研究はおおむね順調に進んでいるが、しかし現地社会に関する調査と現地で新たな文書の発見などにおいて遅れている。その理由は2015年度に入ってから、多くの日本人または日本において研究に従事する中国人学者が中国現地で拘束された事態は多発している。そのため、中国の少数民族社会、とくに中国のイスラーム社会を対象とする本研究にとって、現地調査を慎重に進めざるを得なくなっている。代表者はアメリカ合衆国ソルトレークにあるFamily Search International, Family History Libraryにて、『懐寧馬氏宗譜』(15巻)、『江蘇如皐沙氏世系略述』、『江蘇吉安麻氏親親余亊』、『江蘇江陰曁陽沙氏宗譜』(22巻)、『浙江穆氏後穆宗譜』、『江西会昌湘南馬氏家乗』(5巻)、『江西余干王馬二宗譜』、『広東廉使家風
In vitro RNAi再構成系の構築

In vitroにおけるRNAi再構成を目指し、この経路およびこれに酷似するmiRNA経路において必要な因子の同定、および分子機能解析を進めた。ショウジョウバエmiRNA経路においてDicer1、AGO1、GW182が必須因子であることは明らかになっているものの、分子間の作用・機序ついての知見は乏しい。そこでmiRNA機構の中心作動複合体「miRISC」およびmiRISC前駆体「miRLC」の同定及び機能解析を進めた。これまでにAGO1相互作用因子として、GW182およびLoqsを同定している。抗GW182および抗Loqsモノクローナル抗体を作製し、これらの抗体を用いた生化学的実験から、細胞内において少なくとも二種類のAGO1複合体が存在することを明らかにした。つまり、Dcr1/Loqs/AGO1複合体(IP-Loqs)とAGO1/GW182複合体(IP-GW)である。またGW182はmiRNAの成熟には関与しないことを示した。本年度では、これら複合体の機能解析を行った。AGO1免疫沈降物(IP-AGO1)及びIP-GWは、内在の成熟したmiRNAを含んでいたが、IP-Loqsには成熟型miRNAが含まれておらず、その前駆体のpre-miRNAや二本鎖のmiRNAが含まれていた。このことは、IP-Loqsに成熟miRNAを含むAGO1が含まれていないことを示す。また、Dcr1/Loqs/AGO1複合体(IP-Loqs)の機能的性質の解析により、「IP-Loqsは、miRNAを成熟化させ、miRNAをAGO1に導入する」機能を持つことが明らかになった。さらに、Dcr1/Loqs/AGO1複合体からのAGO1の解離は成熟miRNAのAGO1への導入により誘導されることを明らかにした。これらのことから、Dcr1/Loqs/AGO1複合体はpre-miRNAの成熟化に必須な複合体「miRLC」であり、AGO1/GW182複合体は標的RNAの切断や翻訳抑制に必須な複合体「miRISC」であると考えた。このようにmiRLC及びmiRISCの精製に成功した。ショウジョウバエArgonaute蛋白質ファミリーには、ArgonauteサブファミリーであるAGO1,AGO2とPiwiサブファミリーであるPiwi, Aubergine(Aub)とAGO3が存在する。これらの機能的比較を行い、in vitro RNAi再構成系の構築に応用する。まず、既知RNAi因子のリコンビナント作製を進行させ、これらを用い、効率的なRNAiの再構築を進行させている。次に、Piwiに結合する低分子RNAを同定した。これらは、トランスポゾン領域やヘテロクロマチン領域などを由来としたrasiRNAであった。Piwiは、生殖細胞特異的に発現する核蛋白質である。また、in vitroにおいてrasiRNAに完全相補する標的RNAは、rasiRNA依存的にリコンビナントPiwiによって切断されることを示した。これらの結果から、PiwiがrasiRNA依存的に標的RNAを切断することにより、生殖細胞における核内のRNAサイレンシングに機能していると結論づけた。さらに、AubとAGO3に結合する低分子RNAを同定した。Aubは、主にレトロトランスポゾンのantisense由来のrasiRNAが結合していたのに対し、AGO3はsense由来のものと相互作用していた。Aubに相互作用するrasiRNAの5'末端はウラシルであり、AGO3のrasiRNAの5'末端から10番目は、アデニンであった。AGO3とAubに相互作用するrasiRNAの比較により、それぞれのはじめの10塩基が相補することを見いだした。AubとAGO3は、in vitroにおいて、標的RNAの切断活性(slicer活性)を示す。これらの結果から、rasiRNA前駆体の5'末端の決定は、相補する対合鎖のrasiRNAとそれと結合するAGO3もしくはAubのslicer活性によって引き起こされると結論づけた。RNAサイレンシング機構とは、小分子RNAをガイド分子として配列依存的に標的遺伝子の発現抑制を行う機構の総称である。これには、RNA干渉(RNAi)やmiRNAによる翻訳抑制機構(miRNA機構)、piRNAによるレトロトランスポゾンの発現抑制などが含まれる。これらは非常に似通った分子経路をもつ。次にmiRNA機構の分子経路の解明を進めた。miRNA機構は、以下の分子経路により導かれる。まず、miRNA遺伝子転写産物が切断され、pre-miRNAとして細胞質に輸送される。pre-miRNAは、Dicer1-Loqs複合体により二本鎖miRNAに切断される。このうち、片方鎖のガイド分子となるmiRNAが、中核因子AG01に取り込まれる。miRNA-AG01複合体により、標的mRNAの翻訳が阻害される。この経路の各段階における分子の入れ替えを明らかにした。これまでにAG01相互作用因子として、GW182を同定している。GW182欠失S2培養細胞では、miRNAの成熟に欠損がないことから、GW182はmiRNAの成熟には関与しないと示唆される。またGW182抗体を用いた実験において、AG01は共沈するがDicer1やLoqsは共沈しない。一方でDicer1やLoqsの抗体を用いた実験では、AG01は共沈するがGW182は共沈しない。

これらより、Dicer1-Loqs-AG01複合体とAG01-GW182複合体は異なった複合体であることを明らかにした。現在、AG01結合因子置換のトリガーについて解析している。RNAi機構においても中核因子AG02結合蛋白質を同定しており、似通った機能を持つことが予想される。In vitroにおけるRNAi再構成を目指し、この経路およびこれに酷似するmiRNA経路において必要な因子の同定、および分子機能解析を進めた。ショウジョウバエmiRNA経路においてDicer1、AGO1、GW182が必須因子であることは明らかになっているものの、分子間の作用・機序ついての知見は乏しい。そこでmiRNA機構の中心作動複合体「miRISC」およびmiRISC前駆体「miRLC」の同定及び機能解析を進めた。これまでにAGO1相互作用因子として、GW182およびLoqsを同定している。抗GW182および抗Loqsモノクローナル抗体を作製し、これらの抗体を用いた生化学的実験から、細胞内において少なくとも二種類のAGO1複合体が存在することを明らかにした。つまり、Dcr1/Loqs/AGO1複合体(IP-Loqs)とAGO1/GW182複合体(IP-GW)である。またGW182はmiRNAの成熟には関与しないことを示した。本年度では、これら複合体の機能解析を行った。AGO1免疫沈降物(IP-AGO1)及びIP-GWは、内在の成熟したmiRNAを含んでいたが、IP-Loqsには成熟型miRNAが含まれておらず、その前駆体のpre-miRNAや二本鎖のmiRNAが含まれていた。このことは、IP-Loqsに成熟miRNAを含むAGO1が含まれていないことを示す。また、Dcr1/Loqs/AGO1複合体(IP-Loqs)の機能的性質の解析により、「IP-Loqsは、miRNAを成熟化させ、miRNAをAGO1に導入する」機能を持つことが明らかになった。さらに、Dcr1/Loqs/AGO1複合体からのAGO1の解離は成熟miRNAのAGO1への導入により誘導されることを明らかにした。これらのことから、Dcr1/Loqs/AGO1複合体はpre-miRNAの成熟化に必須な複合体「miRLC」であり、AGO1/GW182複合体は標的RNAの切断や翻訳抑制に必須な複合体「miRISC」であると考えた。このようにmiRLC及びmiRISCの精製に成功した。
非肝臓細胞で複製可能なC型肝炎ウイルスの作製と増殖機構の解析

肝臓特異的なmiR-122はHCVの肝臓指向性を決定する因子の一つであるが、本研究において、非肝臓組織のようなmiR-122非存在下でも、miR-122による翻訳・複製亢進作用を必要とせずに効率よく複製できるHCVの適応変異体を得た。さらに、ウイルスゲノムRNAに存在するmiR-122結合部位周辺への変異導入が、miR-122非依存的なウイルス増殖に重要であることが明らかとなり、同様の変異ウイルスがHCV感染患者の非肝臓細胞内でも出現し、HCV感染患者で高率に誘発される肝外病変の原因となりうることが示された。C型肝炎ウイルス(HCV)の主要標的臓器は肝臓であるが、肝臓以外の組織にも病変を引き起こすことが臨床的に報告され、HCVが非肝臓細胞でも増殖できる可能性が示唆されている。HCVの増殖には肝臓特異的に発現しているmiR-122が重要であるが、最近当研究室では、遺伝子型2aのJFH-1株を用いてmiR-122非依存的に非肝臓組織で増殖可能なHCV変異株を樹立した。そこで、本研究ではHCV変異株の非肝臓細胞での複製・増殖に必須な適応変異を同定し、変異型ウイルスの非肝臓系細胞での増殖機構を明らかにすること、そして非肝臓系細胞からのHCVの感染性粒子産生の可能性を検証することを目的とした。まず、miR-122欠損細胞を用いて独立した継代により得られた複数のHCV変異株の配列解析を行ったところ、5'末端の非翻訳領域(5'UTR)に存在する、28番目のグアニンからアデニンへの適応変異(G28A)が共通して有意に認められた。miR-122はHCV-RNAの5'UTRに2ヶ所結合し、その翻訳や複製を亢進するが、G28A変異はその結合領域の近傍に存在した。この変異を導入したウイルスは高い翻訳活性を示し、miR-122非依存的に効率良くHCVーRNAの複製複合体を形成できることが明らかとなった。一方、この変異はmiR-122存在下では導入されず、野生型に比べて増えにくい性状を示した。さらに、28番目の塩基が元々アデニンである遺伝子型1bを用いて、miR-122欠損細胞に適応した変異ウイルスを得たところ、5'UTRにおいてmiR-122非依存性を付与できる変異の導入は認められなかった。1.HCV変異株における適応変異の同定と野生株との性状比較次世代シークエンサーを用いてウイルスゲノム上の適応変異を探索したところ、G28A変異が有意に検出された。逆遺伝学的な手法を用いて作製したG28Aウイルスは、miR-122欠損細胞内で野生株に比べ効率良く増殖可能であった。そのメカニズムとしては、変異導入によってHCV-RNAの翻訳活性が上昇することでウイルスの複製複合体形成が促進されることが示唆された。以上から、G28A変異がmiR-122非依存性獲得に必須であることが明らかとなった。2.遺伝子型1bを用いた、他の遺伝子型における適応変異の検討遺伝子型2aでは28番目の塩基はグアニンだが、他の遺伝子型では元々アデニンであることが多い。そこで、日本の患者数で7割を占める遺伝子型1bに属するCon1株を用いて、導入される適応変異を解析した。5'UTRおよび構造タンパク質領域はCon1株で、非構造タンパク質領域はJFH-1株由来であるキメラウイルスを作製し、miR-122欠損細胞で継代することで変異ウイルスを得た。すると5'UTRにおいてmiR-122結合領域近傍には変異が認められなかったものの、一塩基変異が認められた。しかし逆遺伝学的手法により、miR-122非依存的な翻訳活性の上昇には関与しないことが明らかになった。遺伝子型2aの場合とは異なり、このキメラウイルスではウイルスRNA全域に複数の適応変異が認められたため、HCVがmiR-122非依存性を獲得するのには5'UTRへの変異導入が必ずしも必要ではないことが明らかとなった。HCVの増殖には肝臓特異的に発現しているmiR-122が重要であるが、最近当研究室では、miR-122欠損細胞で遺伝子型2aのJFH-1株を継代することで、miR-122非依存的に非肝臓組織で増殖可能なHCV変異株(HCV122KO)を樹立した。そこで、本研究ではHCV変異株の非肝臓細胞での複製・増殖に必須な適応変異を同定し、非肝臓系細胞での増殖機構を明らかにすることを目的とした。まず、HCV122KOの配列解析により、5'末端の非翻訳領域(5'UTR)への適応変異G28Aが有意に認められた。miR-122はHCV-RNAの5'UTRに2ヶ所結合し、その翻訳や複製を亢進するが、G28A変異はその結合領域の近傍に存在する。

さらに、G28Aに相当する29番目の塩基が元々アデニンである遺伝子型1bを用いて同様に変異ウイルスを得たところ、C30U変異が認められたことから、miR-122結合領域近傍への変異導入がmiR-122非依存性獲得に寄与している可能性が高い。また遺伝子型2aのHCV患者の臨床検体から、肝外病変が発症した症例を含む、約4割の非肝臓細胞由来サンプルからG28A変異が有意に検出された。以上の成績から、非肝臓組織における持続感染によりmiR-122非依存的に増殖可能なHCV変異株が出現しうること、そしてその肝外病変発症との関連性が示唆された。肝臓特異的なmiR-122はHCVの肝臓指向性を決定する因子の一つであるが、本研究において、非肝臓組織のようなmiR-122非存在下でも、miR-122による翻訳・複製亢進作用を必要とせずに効率よく複製できるHCVの適応変異体を得た。さらに、ウイルスゲノムRNAに存在するmiR-122結合部位周辺への変異導入が、miR-122非依存的なウイルス増殖に重要であることが明らかとなり、同様の変異ウイルスがHCV感染患者の非肝臓細胞内でも出現し、HCV感染患者で高率に誘発される肝外病変の原因となりうることが示された。1.臨床検体を用いた検討;広島大学との共同研究で、遺伝子型2aのHCV患者の血液由来のサンプルが解析可能となっている。血液から血清と末梢血単核球(PBMC)を分離し、血清中のウイルスを肝臓由来、PBMC中のウイルスRNAを非肝臓細胞内というmiRー122非存在環境下で持続的に複製したものとして、G28A変異が導入されているか否かを解析する。また臨床検体からG28A変異が導入されたウイルスRNAが得られた場合、可能であれば肝外病変との関連性を検討する。2.非肝臓細胞におけるHCV粒子産生の可能性の検討;以前我々は、アポリポタンパク質の両親媒性αヘリックス領域が、HCVの粒子産生に重要であることを報告した(Fukuhara and Wada et al., 2014, PLoS Pathog.)。そこで、肝臓以外の組織で発現が認められる他の分泌タンパク質が粒子産生に寄与しうるか否かを検討する。3.他のマイクロRNAの関与の検討;肝臓細胞で発現しているマイクロRNAの7割はmiR-122であるが、それ以外に他のマイクロRNAも発現している。配列の異なる遺伝子型1bでは5'UTRに変異が導入されなかったため、miR-122非存在下での遺伝子型2aにおけるG28A変異の導入およびウイルス増殖効率の上昇に、miRー122以外のマイクロRNAが関わっている可能性がある。そこで、HCV-RNAの翻訳・複製を亢進しうる他のマイクロRNAを探索する。また、得られた結果を取りまとめ、成果の発表を行う。肝炎ウイルス学
IP_3誘導Ca^<2+>放出チャネルの構造・機能機関

1.IP_3受容体のIP_3結合領域を大腸菌で発現させて、そのIP_3リガンド結合活性に関してアミノ酸レベルで解析した。N末端側の225578アミノ酸はIP_3結合の「コア領域」を形成し、この中でArg-265、LYs-508、Arg-511は必須の塩基性アミノ酸であることが解った。一方、N末端から224アミノ酸まではIP_3結合にむしろ阻害的に働くことを明らかにした。バキュロウイルスベクター/昆虫細胞系で、機能的なIP_3結合活性を持つヒトIP_3受容体を大量に発現させることに成功した。発現したIP_3受容体のIP_3結合親和性はCa^<2+>の影響を受け、タイプ1IP_3受容体とタイプ3IP_3受容体では全く逆のCa^<2+>濃度依存性を示した。タイプ1は、10nM以下の低濃度のCa^<2+>で高親和性で、Ca^<2+>濃度が高くなるにつれ徐々にIP_3結合活性が低下し、数μMで低親和性に至る、EC_<50>が100nMCa^<2+>のシグモイドカーブを示した。逆に、タイプ3は、100nM付近からそれ以下のCa^<2+>では低親和性で、Ca^<2+>濃度が高くなるに従いIP_3結合活性が上昇し、1μMCa^<2+>以上になると高親和性に達する、EC_<50>が872nMCa^<2+>のシグモイドカーブを示した。いずれのタイプのCa^<2+>依存性の親和性変化は可逆的であった。いくつかの系で、IP_3結合が低親和性の時にIP_3感受性Ca^<2+>チャネル活性が観察され、高親和性に変換するとチャネル活性がなくなることが報告されている。従って、細胞内のCa^<2+>濃度とIP_3濃度の両方がタイプ特異的なIP_3誘導Ca^<2+>放出を巧妙に制御することが予想される。IP_3受容体の膜貫通領域を含むC末端部分とGreen Fluorescent Protein(GFP)とを融合したタンパク質をアフリカツメガエル卵母細胞で発現させた。共焦点レーザー蛍光顕微鏡で観察すると、発現タンパク質は網目状に分布する細胞内膜(小胞体など)に存在し、核膜外膜にも多く存在した。これらは何れもCa^<2+>ストア膜であることからIP_3受容体本来の局在部位に合致する。また、クロスリンク実験で発現タンパク質が四量体を形成することが解った。以上のことから、IP_3受容体の四量体形成とCa^<2+>ストア膜への局在にはチャネル領域を含むC末端部分が重要であることが明らかとなった。
GPIb自動結合/非結合型Von Willebrand因子ノックインマウスの作成

初期の血栓形成においてはGPIbとVWFとの相互作用が重要であり、三次元構造を保持した状態でのGPIbαとVWFの結合形式を検討することが必要である。我々はGPIbαのN末端フラグメントのC末端にFLAG-tagを付け、これをHEK293T細胞で発現/回収、これを抗FLAG抗体で固層化した後ラベルしたVWFとの結合性を評価した。さらにマウスVWFゲノム遺伝子のA1ドメインを含む断片を単離、K599がノックインされたマウスの作成を行った。2 VWF-GPIba複合体の立体構造に当てはめた結果VWF Lys599の側鎖がGPIbaに向かって深く埋没していることが明らかになり、本研究においてノックイン作成をすすめてきたLys599の意義が明らかになった。3 129SVJマウスのゲノムライブラリー(STRATAGENE社製)からすでに明らかになっているマウスVWFのexon28(A1 domainをふくむ)のシークエンスをkeyにマウスVWFゲノム遺伝子のA1ドメインを含む断片を単離、得られたマウスVWF geneをもとにloxP配列によって囲まれたネオマイシン耐性遺伝子(MC1-neo)とジフテリア毒素Aフラグメント遺伝子(PGK-DTA)によるポジティブ・ネガティブセレクション用のターゲティングベクターを作成し、あわせてVWF当該領域(Al domainに含まれる)に対してsite-directed mutagenesisを行ってK599Aのmutationを導入した。これをエレクトロポレーションによりES細胞(D3細胞)に導入、G-418により選択培養し、PCRおよびサザン解析して相同組換え体の単離・同定を行っている。得られたクローンはC57BL/6Jマウスより採取した胚盤胞に注入し、仮親の子宮に移植、生まれたキメラマウスをICRマウスと交配し、変異アレルの伝搬を調べてヘテロマウスを抽出する。これをCre-recombinaseを発現するCAG Cre mouseと交配させ、Cre-recombinaseによりloxP配列で挟まれたNeoR遺伝子がexcisionされたものをPCRによって選別した初期の血栓形成においてはGPIbとVWFとの相互作用が重要であり、三次元構造を保持した状態でのGPIbαとVWFの結合形式を検討することが必要である。これをCre-recombinaseを発現するCAG Cre mouseと交配させ、Cre-recombinaseによりloxP配列で挟まれたNeoR遺伝子がexcisionされたものをPCRによって選別した冠動脈、脳血管を問わずあらゆるタイプの血管に発生する血栓症においては、血小板のGPIbα鎖のvon willebrand因子(以下VWF)へめ粘着がその起点と考えられる。しかしながらこれまで喧伝されているようにVWFが実際の血栓症発症において実際どの程度の役割を果たすのかは全く分かっていない。本研究では主にGPIb結合部位Lys599をアラニンに置換したマウスVWFを表現形として持つノックインマウスを作成、血栓症におけるVWFの真の役割を明らかにしようとするものである。VWFのGPIb結合部位にmutationを持つヒト疾患は知られていないので結合能欠如マウスが呈する表現型はヒト疾患からは予測できない。表現型解析によりGPIb結合部位としてのLys599の重要性を確認できると共に、血栓誘発により、血栓症発症におけるVWFの役割を明らかにすることができる。平成14年度:相同組換え体の単離・同定とノックインマウスの作製129SVJマウスのゲノムライブラリー(STRATAGENE杜製)からすでに明らかになっているマウスVWFのexon28(A1 domainをふくむ)のシークエンスをkeyにマウスVWFゲノム遺伝子のAlドメインを含む断片を単離、得られたマウスVWF geneをもとに1oxP配列によって囲まれたネオマイシン耐性遺伝子(MC1-neo)とジフテリア毒素A