hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
老年期食生活における食物繊維の役割-老齢ラットにおける遺伝子発現変化を指標として

老年期の食物繊維の生理的な役割を検討するために40週令ラットに食物繊維としてセルロースを10%、2%添加した飼料を作り約1週間飼育し、血中の内分泌物質、肝臓のDNAマイクロアレイによる遺伝子発現の変化、腸内細菌叢の変化を検討した。その結果、内分泌物質のPAI-1(plasminogen activator inhibitor-1)に有意差が見られた他、肝臓では脂質代謝系の遺伝子の発現が亢進し、腸内細菌叢もそれぞれ各群がクラスターを形成した。これらの事から食物繊維量の変化で腸内細菌叢の変化を起こし、その変化が腸内から吸収される栄養素に変化を与え、食物が最初に通過する肝臓での遺伝子発現を変化させ、さらに血中の内分泌成分の変化をもたらせた事が示唆された。老年期食生活の問題点として、食物繊維の摂取が少ないことがあげられる。そこで、本実験では、老齢ラットを用いて遺伝子発現を指標として健康に影響を及ぼすような遺伝子発現があるか検討することにした。まず予備実験として老齢ラットは37週令のオスラットを用いて、食物繊維20%の群と2%の群をもちいて、1週間飼育した。その間、食物繊維の量に左右される糞の形状を観察した。食物繊維の多い群では大きく白い形状の糞を1匹あたり1日30-40ほど排泄したのに対し、2%の群では黒色の糞を3-4つほど排泄しただけであった。そこで、腸内細菌叢に変化がないか、細菌のリボゾームRNAの中の16SRNAの配列で特定の領域をプライマーの末端に蛍光ラベルしたものでPCR法により増幅し、その産物についてHhaI, HspIおのおので制限酵素処理をし、Applied Biosystems社のPrism3100で断片長を計測した。その結果を和光市にある理化学研究所バイオリソースセンターで開発したソフトで解析し、細菌の種類を同定した。その結果、食物繊維を多く与えた群では腸内細菌叢が種類が少なく、どのラットも同様な種類であったが、食物繊維の少ない群では腸内細菌の種類も多く、ラットの個体差があるという結果であつた。この結果をもとに21年度は本実験を行う。食物繊維は第六の栄養素と言われ最近注目されてきているが、主に栄養素を吸着させて腸からの吸収を遅らせる効果が機能と考えられている。しかし、腸内細菌の中には食物繊維を栄養源として生育する菌もあり、それらの代謝産物や食物の分解物が吸収されて肝臓で代謝されるにあたり、遺伝子の発現調節を行っているのではないかということから、動物実験を行って肝臓のDNAマイクロアレイを行うことを考えた。機能が低下した老齢期での食物繊維の効果を調べるために老齢ラットをモデル動物とした。ラットは40週令の雄のラットを用い食物繊維10%の群と2%の群で飼育し、ネンブタール麻酔で頸動脈より失血死させ、その後肝臓を取り出し、サンプルとした。サンプルはまずtotal RNAを抽出後、それからcDNAを合成し、さらにcRNAを合成後断片化してマイクロアレイのチップにハイブリダイズさせた。そののちAffymetrix社のGene Chip Fluidic Station 450で染色、洗浄後、Affymetrix社のGene Array Scanner3000でスキャンしてソフトウェアのGCOSでマイクロアレイのデーターを得た。それを基に統計解析言語「R」を用いて解析し、正規化はFactor Analysis for Robust Microarray Summarization (FARMS)で行った。二群間比較はRank Product法で行った。また、False Discoveryrate (FDR)を考慮して理論上False positiveが1つ未満になるような遺伝子リストを抽出し、それをDAVIDのウェブツールを用いてどのような遺伝子が有意に集まっているかgene enrichment analysisを行ったところ、10%食物繊維群では脂肪酸のβ酸化、コレステロール合成、抗アポトーシスに関する遺伝子の割合が高まっていた。老年期の食生活を考える上で食物繊維の果たす役割を生理学的に解明しようと考え、19年度から3年間かけて研究を行ってきた。初年度は食物繊維がもつ腸内細菌叢の変化を検討し、生化学的な検証が得られたので、その翌年には肝臓の遺伝子の発現変化をDNAマイクロアレイによる網羅的な解析を行なった。最終年度の21年度は内分泌に関する検討を行った。40週令の雄ラット14匹を二群に分け、2%食物繊維、10%食物繊維で1週間飼育した。ネンブタール麻酔をかけ頸動脈から採血した血液は一晩4°Cで静置後、遠心分離して上清を血清とした。

測定した内分泌物質はACE,ACTH,C3aアディポネクチン,アンジオテンシン,コーチソール,ガラニン,成長ホルモン,GF-1インスリン,レプチン,LH,PAI-1,プロゲステロン,プロラクチン、セクレチン,テストステロン、無機質としてCa,Mg,血糖値、脂質として、コレステロール、中性脂肪ともカイロミクロン,VLDL,LDL、HDLであった。その結果、血糖値については10%群の血糖が低い結果になり、従来言われている食物繊維が物理的に糖を吸着する事により、血糖の上昇を遅らせるという事が裏づけられた。また、過剰な食物繊維量により、無機質の吸収阻害が起こるということが報告されているが、10%食物繊維群の血清のCa,Mgの濃度の値は2%食物繊維群との変化が見られず、今回の実験計画の食物繊維量が過剰すぎる量ではない事が証明された。脂質では10%食物繊維群でコレステロールの値が全体的に低い値である事が認められたが有意差は得られなかった。内分泌では特にPAI-1 (plasminogen activator inhibitor 1)に有意差が見られた。PAI-1は脂肪組織から分泌され、悪玉として認識されているが、アディポネクチンに比べ研究が盛んに行なわれていない。PAI-1は平常値の4-5倍になると心筋梗塞などの危険が高まると言われている。今回10%食物繊維群は2%食物繊維群に比べいわゆる疾病を起こすような高い値ではなく1.16倍という低値であったが、0.01%の危険率で有意差が認められ、食物繊維の摂取量と血中PAI-1濃度に相関関係があると考えられた。このことからさらに食物繊維とPAI-1についての因果関係についてin vivo、in vitro両方からの詳細な研究がされる必要があると考えられる。
膜タンパク質チャンネル／金属錯体ナノ孔複合システムを用いた一分子計測

ナノポア計測では、脂質二分子膜中に形成したチャネル膜タンパク質を通過する分子を電気的に計測する。しかしこれまで主に直径1.4 nmの細孔を有するヘモリシンという膜チャネルが用いられてきたが、これを用いたナノポア計測では、チャネルサイズより小さい分子の検出に課題があった。そこで本研究では構造を自由に設計できる配位高分子をヘモリシンと複合化することで、サイズ制御可能なナノポア計測を提案する。本研究の結果、1)水溶液中で構造が安定なRhMOPの合成、2)RhMOPとヘモリシンの複合化、に成功した。現在のところ、この複合化を確率的に行っているので、今後複合化の能動的制御を目指す。ナノポアセンシングは、脂質二分子膜中にナノ孔を形成する膜タンパク質を再構成し、その上下に配置した電極によりナノ孔を流れるイオンをイオン電流として計測、またナノ孔を通過する分子を一分子レベルで計測する方法である。これまでは主に、直径1.4 nmのチャネルを有するヘモリシンという膜タンパク質が用いられていたが、様々な標的分子の検出を考えた場合、目的とする分子サイズと膜タンパク質のチャネルサイズが合わないことが大きな問題であった。そこで本研究では合成的手法によりナノ孔を作製し、へモリシンチャネルと複合化させることにより汎用性のあるナノポアセンシング法を提案する。本実験を効率的に行うためには、プラットフォームとなる脂質二分子膜の安定形成が不可欠であるので、まずはじめにマイクロ微細加工技術を利用し、再現性よく安定した脂質膜の形成法を確立した。安定な脂質膜プラットフォームを用い、配位性高分子であるMOFの1ユニット構造を切り出したMOP分子を新たに合成し、種々の実験条件を検討した結果ヘモリシンとの複合化に成功した。本研究の目的は、人工脂質膜に再構成させた膜タンパク質のイオンチャンネルに金属錯体ナノ孔を導入し、ナノレベルで生体材料と人工材料とを複合化した高精度一分子認識システムの構築を目指すことにある。今年度はかご状金属錯体を合成し、脂質膜との複合化に取り組んだ。中心金属としてRh、架橋配位子としてBDC(1,3-benzenedicarboxylate)を用いおよそ0.6 nmの細孔を有す金属錯体[Rh24(m-BDC)24] (RhMOP-OH)の合成に成功し、水溶液中で安定なナノ孔構造を保持できることを確認している。またこの錯体の配位子部分にアルキル鎖を修飾することにより、脂質溶液へ溶解可能になり、アルキルRhMOPを含有した脂質溶液で平面脂質二分子膜の作製を試みた。従来の人工平面膜形成法では、作製した平面膜が不安定で再現性が低く、熟練した技術が必要であることからその利用は研究室レベルに限定されていた。このような膜を再現性良く形成する方法が望まれているが、再現性・安定性の向上を目指した工学的な研究は少ない。そこで本研究では「液滴接触法」による脂質二分子膜形成を行った。この方法では、まず有機溶媒中に脂質分子を溶かし、そこに水滴を導入する。脂質分子は親水基と疎水基からなるため、水と有機溶媒との界面には脂質の単分子膜が形成される。こうした液滴を2つ用意し、双方をマイクロ流体デバイス内で接触させることで、脂質二分子膜を簡便に再構成した。この方法での膜形成は再現性が約90%に向上させることができた。アルキルRhMOPを含有した脂質溶液で液滴接触法を行い、チャネル電流計測を行ったところ、MOPチャネル一分子に起因するイオン電流が観察された。引き続き本方法を用いて、MOPチャネルの物性評価を行う。現在ターゲットとなるかご状金属錯体分子の合成、および脂質膜への埋め込みに成功している。現在このかご状分子の一分子のチャネルを流れるイオン電流の計測にも成功しつつあり、本研究は研究計画に沿って順調に進捗していると言える。かご状金属錯体一分子を流れるイオン電流を観測することにより、その物理化学的な状態を明らかにしていく。物品として試薬消耗品、および実態顕微鏡の購入を予定している。旅費として、国際学会、国内学会発表の他、連携研究者との共同実験のために使用する予定である。その他、論文英文校閲費用、論文投稿費用、謝金等使用する予定である。
発がんにおける内在的突然変異誘導因子AIDと外的発がん因子の相互作用

発がんにおける突然変異の原因として外的な化学的・物理的要因が従来重視されてきたが、これらが生体で実際にがんに導く突然変異を誘発しているのか、最近の報告からは疑問視されている。逆に内在的な突然変異因子と外的因子の相互作用が注目を浴びはじめてきた。その内的因子のひとつであるAIDのトランスジェニックマウスではTリンパ腫と肺がんが生じるが、それらのため早期に死亡し、他の組織での発がんが検討できない。この問題を解決するため、AIDの発現を時間空間的に制御可能なトランスジェニックモデルを作成した。Creリコンビナーゼの働きによりAID発現のスイッチが恒久的に入るコンディショナルトランスジェニックマウス(AID cTg)を作成した。(1)AID cTgとBリンパ球特異的にCreを発現するCD19-Creマウスとを交配させた結果、生まれたマウスにおいてはBリンパ球でのみAIDが構成的に過剰発現していた。そのようなマウス12匹を20カ月にわたって観察したが、Bリンパ球腫瘍の発症は認められなかった。Tリンパ球と異なり、Bリンパ球ではAIDの活性が何らかの機構により抑制されている可能性が示唆された。(2)全身でモザイク的にCreを発現するTNAP-Creマウスと交配することにより種々の組織で中程度のAIDの過剰発現をみるマウスを作成した。このマウスを60週間観察すると肺や肝臓などで腫瘍の発生を認める個体が観察された。この結果はAIDにより肺とリンパ球の腫瘍のみならず、肝臓など他臓器の腫瘍も誘発されることを示している。(I)発がんにおける突然変異の原因として外的な化学的・物理的要因が従来重視されてきたが、これらが生体で実際にがんに導く突然変異を誘発しているのか、最近の報告からは疑問視されている。Creリコンビナーゼの働きによりAID発現のスイッチが恒久的に入るトランスジェニックマウスを作成した。これとBリンパ球、神経、精巣のそれぞれに特異的なCreの発現を示す3系統のトランスジェンニックマウスと交配することにより、該当臓器におけるAIDの過剰発現をみるマウス系統を樹立した。これらのマウスのAID発現臓器にがんが生じるかどうか観察を開始した。また、タモキシフェンによりAIDの活性を制御しうるAID-ER-GFPトランスジェニックマウスを得た。(II)AIDの作用機序に関する研究から、AIDによるクラススイッチ組換え誘導にはウラシルDNAグリコシラーゼの酵素活性は不要であることを示し、AIDの基質がDNAであるとする仮説と矛盾する結果を得た。(1)AID cTgとBリンパ球

特異的にCreを発現するCD19-Creマウスとを交配させた結果、生まれたマウスにおいてはBリンパ球でのみAIDが構成的に過剰発現していたが、そのようなマウス12匹を20カ月にわたって観察したが、Bリンパ球腫瘍の発症は認められなかった。Tリンパ球と異なり、Bリンパ球ではAIDの活性が何らかの機構により抑制されている可能性が示唆された。(2)全身でモザイク的にCreを発現するTNAP-Creマウスと交配することにより種々の組織で中程度のAIDの過剰発現をみるマウスを作成した。このマウスを60週間観察すると肺や肝臓などで腫瘍の発生を認める個体が観察された。今後、匹数を増やして観察を継続することにより、AIDがどのような臓器にがんを生じせしめうるのか、どのような遺伝子に変異を誘導するのかについて解析を進めてゆく。
要介護高齢者および健常高齢者に装着された義歯に付着したマイクロバイオームの検討

本研究の目的は、要介護者と健常高齢者それぞれの義歯表面に付着した口腔マイクロバイオームの組成を明らかにし、義歯の清掃状態の違いによる影響を検討することである。方法として、自立高齢者および要介護高齢者それぞれの上顎総義歯から試料を採取し、義歯の清掃状態を調べるとともに16s rRNAシークエンサーを用いて義歯表面のマイクロバイオームを解析する。真菌についてはITS領域を増幅して解析を行う。唾液や舌苔のマイクロバイオームとの違いを対象者内で検討するとともに、義歯床用材料、対象者の環境(要介護状態など)、義歯清掃状態による違いについて被験者間の比較検討を行っていく。
再灌流障害における責任冠動脈粥腫性状および微小循環障害の関与と至適治療戦略の開発

1.正常冠動脈症例を用いてhMR測定の妥当性、有用性を確認した結果、hMRの測定値は、これまでの検討において冠微小循環を引き起こすと考えられている左室壁肥厚の程度と極めて良好に相関する事が確認された。2.IVUS/OCTを用いてAMI症例の責任病変プラークを観察した結果、RIの原因と考えられている末梢塞栓物質の脂質成分、壊死成分を大量に含む不安定プラークが、ST上昇型心筋梗塞で高頻度に観察され、RIのメカニズムが不安定プラーク内容物の末梢塞栓である事を突き止めた。3,pPCI施行時、血栓吸引療法併用した群では造影上の再灌流障害の発生頻度が低く、pPCI終了時のhMRが低値である事が確認された。1.対象患者(急性心筋梗塞を発症し当科緊急入院し、心臓カテーテル検査において血管造影上の責任冠動脈病変が同定され、同部位に対する直接的冠動脈インターベンション(PPCI)を施行する患者のうち、本研究参加への同意が得られた患者)の登録を行った。4.コアラボでの定量的IVUS画像解析を施行した。5.確認造影時におけるMVD再評価を上記登録患者のうち確認造影施行患者において施行した。6.経時的心エコーによる心機能評価を上記登録患者のうち確認造影施行患者において施行した。2.PPCI施行時における血管内超音波(IVUS)および光干渉断層法(OCT)による冠動脈プラーク組織性状評価法の施行を行った。この結果をもとに、急性冠症候群の中でもST上昇型心筋梗塞患者の責任冠動脈プラークに脂質成分など不安定プラーク要素が多いこと(Tak交付申請書に記載した「研究の目的」「研究計画」の則り、平成26年度は、1.対象患者の登録;2.PPCI施行時におけるIVUSおよびOCTによる冠動脈プラーク組織性状評価法の施行;3.PPCI施行時におけるMVD評価:ComboWireデータに基づくHMR算出を施行;4.コアラボでの定量的IVUS画像解析を施行;5.確認造影時におけるMVD再評価を上記登録患者のうち確認造影施行患者において施行;6.経時的心エコーによる心機能評価を上記登録患者のうち確認造影施行患者において施行、に関しては予定どおり施行することができた。また、上記達成項目をクリアーすることができた研究成果については、上記実績概要の通り、国際ジャーナルに報告した。従って、本研究の達成状況はおおむね研究計画書通り進行していると思われる。本研究を通して、まず、冠微小血管抵抗:hMRが、冠微小循環障害の評価に耐えうるかの検証研究を行った。結果、hMRが、従来指標の冠血流予備能:CFRや冠血流予備量比:FFRに比し、より鋭敏に冠微小循環障害を評価しうる事、また、プラーク不安定性が増した場合にhMRの上昇を来しやすい事が明らかになった。さらに、左室肥大の程度に相関してhMRの増加がみられること、また全身性の内皮機能障害および微小循環障害指標と考えられる推定糸球体濾過量と有意に負の相関を認めることが明らかになった。また治療介入としては、不安定プラークが検出された際、フィルトラップなどのデバイスを事前使用することで、この再灌流障害に伴うnoreflow/slow flowを低減させうることも明らかになった。冠動脈インターベンションの前治療として、当科が有効性をすでに発表しているニコランジルやプラークの安定化を促進させる脂質低下療法を先行させることで、これらの再灌流障害を低減させるメカニズムは、やはり責任病変プラークの安定化が主要な要因であることが推察された。またこの研究の過程で、左室肥大を呈する心筋症においても、この冠微小循環障害が存在し、心機能低下の要因となり得る事も判明し、心不全パンデミックが喫緊の課題であるが、心不全対策の切り札として、今後の研究課題が浮かび上がってきた。本研究データをもとに、今後更なる冠微小循環研究の発展が大きく期待される。交付申請書に記載した「研究の目的」「研究計画」の則り、平成26年度は、1.対象患者の登録;2.PPCI施行時におけるIVUSおよびOCTによる冠動脈プラーク組織性状評価法の施行;3.PPCI施行時におけるMVD評価:ComboWireデータに基づくHMR算出を施行;4.コアラボでの定量的IVUS画像解析を施行;5.確認造影時におけるMVD再評価を上記登録患者のうち確認造影施行患者において施行;

6.経時的心エコーによる心機能評価を上記登録患者のうち確認造影施行患者において施行、に関しては予定どおり施行することができた。また、上記達成項目をクリアーすることができた研究成果については、上記実績概要の通り、国際ジャーナルに報告した。従って、本研究の達成状況はおおむね研究計画書通り進行していると思われる。当初の研究計画書の則り、平成27年度以降も予定通りの計画遂行が可能と思われる。具体的には、1.RI発生の原因となりうるプラーク内容物末梢塞栓の予防的治療戦略開発現段階で、RI発生を軽減させうるPPCIにおける治療手技は確立していないため、本研究では、RIによるMVD発生予防目的の至適治療戦略開発に向け、血栓・末梢塞栓物質捕捉カテーテルであるFILTRAP&#174;(上図)によるPPCI前治療の有用性評価を行う。具体的には、PPCIを施行する急性心筋梗塞患者のうち、本研究参加に同意を得た患者において、1従来治療である現行ガイドラインに則った一般的PPCI治療手技群と2FILTRAP&#174;前治療追加群、に無作為割り付けし、責任冠動脈プラーク評価ならびにMVD、心機能評価を両群で行うことで、FILTRAP&#174;によるPPCI前治療のRI発生予防効果を検討し、その長期的な有用性評価についても経時的心エコー評価にて行う。2.フォローアップ症例におけるMVD改善・増悪の予後規定因子の探索これまで、MVD改善に有用性が証明された薬理学的介入手法としては、ニコランジル(シグマート&#174;)が挙げられ我々は報告しているが(Izumiya, et al. Atherosclerosis 2011)、そのほか急性心筋梗塞患者におけるMVDの増悪、改善の予後規定因子は明らかになっていないため、本研究では、確認造影時のMVD再評価データを用いて、PPCI施行時のMVDデータと比較し、各々の臨床背景因子や処方薬、PPCI治療手技などを従属因子とし単変量・多変量解析を行うことで、急性心筋梗塞患者におけるMVD改善・増悪の予後規定因子の探索を行う。本解析で、急性心筋梗塞患者におけるMVD改善・増悪の予後規定因子が明らかになれば、急性心筋梗塞患者に対する至適治療戦略の開発に資する重要な臨床データが得られると期待される。医歯薬学当初の研究計画書の則り、平成27年度以降も予定通りの計画遂行が可能と思われる。具体的には、1.RI発生の原因となりうるプラーク内容物末梢塞栓の予防的治療戦略開発現段階で、RI発生を軽減させうるPPCIにおける治療手技は確立していないため、本研究では、RIによるMVD発生予防目的の至適治療戦略開発に向け、血栓・末梢塞栓物質捕捉カテーテルであるFILTRAPによるPPCI前治療の有用性評価を行う。具体的には、PPCIを施行する急性心筋梗塞患者のうち、本研究参加に同意を得た患者において、1従来治療である現行ガイドラインに則った一般的PPCI治療手技群と2FILTRAP前治療追加群、に無作為割り付けし、責任冠動脈プラーク評価ならびにMVD、心機能評価を両群で行うことで、FILTRAPによるPPCI前治療のRI発生予防効果を検討し、その長期的な有用性評価についても経時的心エコー評価にて行う。2.フォローアップ症例におけるMVD改善・増悪の予後規定因子の探索
ミクロ空間領域における強磁界分布の3次元画像計測

最近、ミクロンオーダーの微小領域に集中している空間漏れ磁界分布の3次元計測手法の開発が、応用磁気分野で強く望まれている。本報告書は、電子線トモグラフィ手法による空間漏れ磁界分布の3次元画像化・計測手法の開発を目的として、2年間にわたり研究してきた成果をまとめたものである。報告書は6章からなっており、初期の研究目的を十分達成できたことを結論付けている。以下に、各章の内容を簡単にまとめておく。第2章では、筆者らが新たに提案したART法に基づく非線形再構成法の原理および再構成アルゴリズムについて述べた。第3章では、今回設計・試作した電子線トモグラフィのための計測装置の概略について述べた。この計測装置によってサブミクロンの空間分解能、数ガウスの磁界分解能で空間漏れ磁界分布が計測可能である。第4章では、磁界分布が厳密に計算できる一巻コイル(ワンターンコイル)をモデルに選び、今回提案した非線形再構成アルゴリズムを用いてコンピュータによる再構成シミュレーションを行った結果について述べ、さらに厳密解との比較検討から、約10%の精度で、空間漏れ磁界分布を再構成できることを明らかにしている。第5章では、今回試作した計測装置を用いて、実際にワンターンコイルの作る磁界分布の再構成実験を行った結果について述べ、数値計算による厳密解との比較検討から、コンピュータシミュレーションで予測されていた再構成精度で対象磁界分布を3次元的に再構成できることを実験的に明らかにした。また、実際のダブルギャップ形消去ヘッドについての再構成実験結果、及び有限要素法による2次元磁界分布解析結果について述べ、両者はよく対応していることを示した。第6章では、本研究で得られた主な成果、知見をまとめると共に、今後の果題などについて述べた。本年度の研究実施計画は, 1.電子線逆行問題手法による微小領域強磁界分布の再構成アルゴリズムの開発, 2.電子ビーム偏向観測システムの設計および画像化・計測システムの構成,そして3.微小領域強磁界分布計測の基礎実験,の3項目からなっていたが,各項目ともほぼ当初の計画通りに実施することができた.これらの成果の一部をすでに,昭和62年度の電子情報通信学会信越支部大会および秋期応用物理学会学術講演会で口頭発表している.つぎに,各項目毎に,その研究経過および成果などをまとめておく.1.に関しては,電子ビームの磁界偏向投影データから次に述べる手順で磁界分布を再構成するアルゴリズムを新に開発した.ステップ(1)磁界中の電子軌道は2次曲線で近似できると仮定し,磁界偏向投影データから近軸軌道方程式を用いて直線光軸軌道に沿っての磁界分布を計算する.これを全方位について行ない磁界分布の初期値を求める.ステップ(2)これらの初期値をもとに空間的な可変重み付けを取り入れた反復法を用いて最終的な3次元磁界分布を推定する.磁場分布が既知の解析モデルを用いてコンピュータ・シミュレーションを行った結果,本アルゴリズムによって3次元磁場分布が精度よく再構成できることを確認できた.2.および3.に関しては,市販の走査型電子顕微鏡に試料微動装置および電子線の偏向量計測装置を組み込んで計測システムを実際に構築し, 3次元計測の基礎となる諸特性を計測した結果,所期の計画通りミクロン・オーダの精度で磁界分布が計測可能なことが確かめられた.現在,磁界分布が既知の試料を用いて,その磁界分布の3次元再構成実験の準備を進めている.本研究は微小空間に集中している強磁界分布の、電子線逆行問題手法による、3次元画像化、計測法の開発を目的としており、今年度は、1)磁界分布の3次元再構成・計測実験、2)本手法の評価、などを予定していた。

1)、2)とも年限内に終了し、電子線逆行問題手法(電子線トモグラフィ)による3次元磁界分布計測手法の実用化へのメドをつけることができた。以下に、これらについて簡単にまとめておく。ART(Arithmetic Reconstruction Techninque)法と呼ばれている反復再構成手法を基にした電子線トモグラフィのための非線形構成手法を新たに提案し、コンピュータシミュレーションにより、その再構成精度のチェックを行うと共に、実際に計測装置を組立て、実際の磁気ヘッドのギャップ近傍の磁界分布を3次元的に再構成した。その結果1)磁界分布が厳密に計算できる一巻コイル(ワンターンコイル)をモデルに選び、今回提案した非線形再構成アルゴリズムを用いてコンピュータによる再構成シミュレーションを行った結果、厳密解との比較検討から、本再構成アルゴリズムによって、約10%の誤差で元の磁界分布を逆推定、3次元再構成可能なこと。2)今回試作した計測装置を用いて実際にワンターンコイルの作る磁界分布を再構成し、得られた実験結果と厳密解とを比較した結果、コンピュータシミュレーションで予測された精度で対象磁界分布を3次元的に再構成できること。3)実際のダブルギャップ形消去ヘッド(ギャップ幅:70μm,100μm)について再構成実験を行った結果、再構成した磁界分布の形状は有限要素法による2次元磁界分布解析の結果とよく対応していること。などを明らかにすることができた。なお、再構成の際の、磁界の空間分解能はサブミクロン、磁界分解能は数ガウスが得られている。
温暖化環境での落葉広葉樹の光合成特性と食害抵抗性に関する予測研究

進行する温暖化環境では食葉性昆虫の活動期間が延長され、食害が増えるのであろうか?一般に、高CO_2環境で生育した葉のC/Nは大きくなる。このためタンパク源としての葉の質が低下し食害が増える可能性がある。高CO_2環境では一時的に光合成速度は上昇し、C/Nの大きな葉が生産される。そこで、増加したC/NのうちCの増加を防御物質の変化と考えて、総フェノールと消化不良物質として知られる縮合タンニンの定量を行った。すると遷移後期樹種であるミズナラと日本列島の冷温帯を広く覆うブナでは、高CO_2では総フェノールのみ増加し、縮合タンニン量は変化しなかった。これに対して、シラカンバとカラマツでは、総フェノール量と縮合タンニン量の両方が増加した。とりわけ高肥料条件でのシラカンバの増加量が大きかった。従来、マイマイガの幼虫を利用した生物検定が用いられ、ミズナラの葉を混入した資料での成長が悪いことが判明した。しかし、この虫は普段、ミズナラも食害するので、なんらかの防御物質を持っている可能性がある。相対的な樹種比較を行なうためには、広食性で実験材料を食害しない生物検定の材料を多量に必要とする。現在、この生物検定の材料を選定中である。共同研究を予定している森林総合研究所の人工気象室を使用し、主要広葉樹を温暖化環境(高CO_2、4°C上昇時の気温)で栽培して葉の光合成能力を測定した。この測定には本研究で申請する高精度光合成蒸散測定装置(LI-6400)を用いる。また、現有の変調型葉緑素蛍光測定装置を利用して、葉の活性を推定する。この測定と並行して、マイマイガなど雑食性の幼虫を利用し、食害試験を実施予定であったが、材料の入手ができず、葉の切除試験にとどまった。残存葉に対し、これらの測定後、葉の化学成分の変化を現有の高速液体クロマトグラフィーなどで分析し、防御物質の推定と定量を行っている。温暖化環境で予想される葉の形態変化や水利用効率の変化を、現有のレーザー顕微鏡と木部圧測定装置で測定する。これにより、特に温暖化環境で予想される水利用効率の変化を定量的に解明できる基礎を模索中である。また、育種目標を掲げるべく、基礎情報の文献整理を実施した。
運動トレーニングによるヒト遺伝子の傷害とその予防法の運動栄養学的研究

運動が、遺伝子を傷害する可能性について、1)ミトコンドリアDNAの変異出現頻度、2)DNA傷害の代謝マーカーから検討した。核蛋白質の保護がないミトコンドリア遺伝子はストレスにより傷害を受けやすいことが知られており、その変異は運動に伴う代謝昂進時の酸化ストレスによっても生じる可能性が考えられていた。本研究では、27名の長距離競技選手と30名の対象群のミトコンドリアDNAのDループ領域の塩基配列をdirect sequence法で解析した。1122塩基からなるDループ領域をAndersonらにより報告されている欧米人の標準配列(Nature 290 : 457-470, 1981)と比較すると競技者では13.2±3.2、対照群では13.8±3.3の違いが認められた。更に、今回の全被検者において最も多く認められた配列を標準として比較した場合にも競技者では9.3±4.8、対照群では9.9±4.4の違いが認めれ、両群間には有意な差は認められなかった。デオキシ・グアノシンは酸化的ストレスにより傷害されるとその修復過程において8-ハイドロキシ・デオキシ・グアノシン(8-OH-dG)となり尿中に排泄される。本研究においてはレジスタンス運動初心者が高強度運動を行った際の血中8-OH-dG濃度および尿中8-OH-dG排泄量を測定し、運動がヒト遺伝子の傷害を引き起こしているか否かを検討した。健康な男性非鍛錬者10名がレジスタンス運動(マシーンを用いる8種目のウエイトトレーニング運動で最大挙上重量)を行った前後の血中および尿中8-OH-dGには統計学的に有意な変化は認められなかった。有酸素エネルギー代謝の中心となるミトコンドリアは、核DNAとは別に16,569塩基からなるミトコンドリアDNA(mtDNA)を有する。活性酸素生産の場に近い位置にあることや、核のDNAのように蛋白で保護されてはいないなどの特徴からmtDNAは変異をうけて傷害されやすいDNAであると考えられている。本年度は、日本人学生32名の白血球mtDNAのD-loop全領域の塩基配列を決定し、一流長距離ランナーのと一般学生の比較を行った。Andersonらによって報告されているヒトmtDNAを標準配列とし、これと比較して異なる塩基配列は、D-loop全領域において1.05±0.07%(12.2±0.2bp/1,122bp)であり、比較的多数の個人差が確認された。また、mtDNA複製を担う2つのプロモーター領域の塩基配列は高度に保存されていたが、その間の領域(385bp)にはより多くの個人差が認められ、これを含まない領域(737bp)に比べて有意に高い値が得られた(それぞれ0.93±0.07%、1.28±0.07%、p<0.01)。また、標準配列と異なる塩基の数は長距離ランナーと一般学生との間に差は認められなかったが、出現頻度が長距離ランナー(17.6%)と一般学生(53.3%)との間で異なる多型が見い出された。これらの結果は当初の危惧「トレーニングによる酸化ストレスが遺伝子の傷害を引き起こしている可能性」を支持しないものであるが、平成12年度には更にDNAの傷害に特異的な代謝マーカーの測定を行いこの点について更に確かめる予定である。トレーニングによる酸化ストレスが遺伝子の傷害をひき起こしている可能性を確かめるため、1)ミトコンドリア遺伝子の変異出現率を一般健常人と長距離走競技者との間で比較した。2)DNAダメージの指標である8-oxoguanineを指標として検討した。1)新たに健常人15人、長距離走競技者15名から末梢血を採取し、白血球ミトコンドリアDNAを抽出氏、D-ループ領域の全塩基配列を読み取り比較した。標準のミトコンドリアDNA D-ループの塩基配列との違いは両グループにおいて同程度であり、長距離走トレーニングによる酸化ストレスが最もダメージを受けやすい遺伝子の一つであるミトコンドリアDNAの変異をもたらしている可能性は認められなかった。2)健常人が激しいウエイトトレーニングを行った際のDNAダメージをその指標である8-oxoguanineの血中濃度および尿中排泄量の変動から検討した。何れの指標においても一回の激運動が健常人のDNAダメージを増大することを示す結果は得られなかった。これらの結果はいずれも運動がヒトの遺伝子傷害増大をひき起こす可能性を否定しているが、遺伝子傷害の修復機構が低下していると考えられる高齢者の運動あるいは喫煙と運動との組み合わせなどの状況についての検討を待って結論すべき問題と考えられる。

デオキシ・グアノシンは酸化的ストレスにより傷害されるとその修復過程において8-ハイドロキシ・デオキシ・グアノシン(8-OH-dG)となり尿中に排泄される。本研究においてはレジスタンス運動初心者が高強度運動を行った際の血中8-OH-dG濃度および尿中8-OH-dG排泄量を測定し、運動がヒト遺伝子の傷害を引き起こしているか否かを検討した。健康な男性非鍛錬者10名がレジスタンス運動(マシーンを用いる8種目のウエイトトレーニング運動で最大挙上重量)を行った前後の血中および尿中8-OH-dGには統計学的に有意な変化は認められなかった。
非翻訳リピート伸長による脊髄小脳失調症の病態解明と治療開発

平成28年度はSCA8、SCA36における伸長非翻訳マイクロサテライト・リピート領域のクローニングおよびコンストラクト作成を試みた。SCA8においては120回まで伸長したCTG・CAGリピート領域を、SCA36においては75回まで伸長したGGCCTGリピート領域をクローニングし、RANTを生じた場合にはHisやmycといったエピトープタグ付きの蛋白として発現するコンストラクトを作成した。SCA8におけるCTG・CAGリピート伸長変異およびSCA36におけるGGCCTGリピート伸長変異を導入した発現コンストラクトを作成し、RNA foci形成やrepeat-associated non-ATG translationを介した伸長リピート由来のホモポリマータンパクを発現する培養細胞モデルを作成できているため。非翻訳領域に存在するマイクロサテライト・リピート伸長を原因とする遺伝性脊髄小脳変性症であるSCA8、SCA36の根本的治療法開発へ向け、前年度までに作成した、各々の伸長リピート変異を導入した培養細胞モデルを用いて分子病態解析を行った。これらの伸長リピートを導入した培養細胞モデルでは、非伸長リピートを導入したコントロール培養細胞に比べて高度の細胞死が誘導された。平成28年度までに作成したSCA8、SCA36の伸長リピート変異を導入した培養細胞モデルを用いて候補治療の検討を行い、それらの効果について結果を得ることができているため。上記のSCA8およびSCA36培養細胞モデルに対して、既存化合物・薬物の中から候補となり得るものを用いて治療効果を検討する。病的表現型として形成されたRNA fociとrepeat-associated non-ATG translation由来蛋白を定量的に評価することにより、これらの形成が抑性された場合には、当該の化合物・薬物はSCA8/SCA36に対する候補治療薬になり得ると想定することができる。培養細胞モデル作成のためにクローニングを行った、SCA8、SCA36の伸長リピート変異を利用したマウスモデル作成に着手する。また、平成29年度に結果が得られた候補治療に関して、臨床的有用性が期待できるかどうか、さらに検討を進める。
３者同時交渉がもたらす２者関係の変化：カラスの同盟形成とストレス緩衝機能の検討

本研究は,カラスのオス間に形成される同盟のストレス緩衝機能とその形成要因を,生理信号のレベルで明らかにすることを目指す。社会性動物の同盟の機能には,「相手の存在が個体のストレス応答を低減させる」というストレス緩衝機能が提唱されているものの未検証である。ストレスを生理信号のレベルで測定評価するため,本研究ではストレスホルモン濃度および心拍の計測系を導入する。同盟という概念に,その形成要因と機能について生理レベルからの説明を与える。これによって,生理学的基盤の解明が進んでいる母子関係などの他の社会関係との比較ができ,個体間の宥和や協力との共通基盤,および,系統発生を超えた独立進化の理解を図る。
サル連合野ニューロン相互の情報統合と時間特性の研究

大脳皮質のニューロンでは数千のシナプスへの入力信号の統合の結果が、次のニューロンへの信号伝達(スパイク発生)を決定する。このとき発生するシナプス電位は通常数十ミリ秒で減衰する。従って、シナプスでの統合が効率良く生じるためには、発生した電位変化が比較的短い時間間隔で起こる必要がある。1個の神経細胞が短時間に数発から十数発のスパイクを発生するバースト発射は、上記のようなシナプス電位の時間的加重に伴い、ターゲット細胞に大きなインパクトを与えることが知られている。一方、バースト発射の高次脳機能のおける役割はあまり注目されてこなかった。そこで、今年度は、前頭連合野(帯状回前部および前頭連合野外側部)のニューロンでバースト発射を示すものについてその特徴を解析した。バースト発射のパターンはニューロン毎に異なっており、いくつかのタイプに分類することができた。(1)FSニューロン(Fast Spiking Neuron):1つのバースト内のスパイク数が多く、バースト中のスパイク間隔、スパイク・サイズの減少がわずかである。(2)IBニューロン(Intrinsic Bursting Neuron):3-6発程度の比較的少ないスパイク数のバーストで、バーストの1発目に比べ2発目、3発目とスパイク・サイズの減少とスパイク間隔の延長が見られる。(3)FRBニューロン(FastRythmic Bursting Neuron):バーストのスパイク数は3-6で、スパイク間隔はFSニューロンのように比較的短く、バースト中、スパイク・サイズ、スパイク間隔はあまり変化しない。また、バーストが一定の時間間隔で繰り返し発生する傾向にある。これらのニューロンのうちのいくつかは学習課題の中で学習課題の特定のイベントに対応してバースト発射を示した。一連の解析の結果、バースト発射の特徴を用いて、高次脳機能を担う大脳皮質内回路の解析が可能なことが明らかになった。
ヴァレール・ノヴァリナの俳優術におけるアール・ブリュットの受容と展開

本研究の目的は、ヴァレール・ノヴァリナの演劇理論と言語創造においてアール・ブリュット理論がどのように受容されるのか、そして、テクストに摂取されたアール・ブリュット理論が俳優術においてどのような展開をみせるのかを考察することである。研究実施計画では、文献資料の読解を中心に行う予定であったが、申請時から研究開始までの半年間で理論的考察がある程度進展し、また、当初予期していなかった国際シンポジウムでの発表および仏人演出家の来日という貴重な機会が重なったことから、現地調査に重心を移すことにした。フランスでは、ノヴァリナへの聞き取り調査を通して、創作方法やキリスト教信仰そしてアール・ブリュットの創唱者であるデュビュッフェとの交友関係について、書籍化されていない貴重な話を聞くことができた。俳優4名への聞き取り調査では、俳優の演技方法は多種多様であるものの数種類に分けられること、そしてそのいずれの場合もアール・ブリュットとの接続を見出せることが明らかになった。日本では、ノヴァリナに大きな影響を与えた演出家ビュシュヴァルトの来日を機に、講演の通訳、聞き取り調査、演技と仏語のワークショップを行い、文献からは見えてこない豊かな知見を得ることができた。なかでも、ワークショップにおいて仏語未習者が言葉の音と戯れながら意味を発見してゆくプロセスを直接観察できたことにより、教育という広い視野でアール・ブリュットをとらえ直すという新しい視点が得られた。また、社会福祉施設での観察調査では、アール・ブリュットの創造活動におけるファシリテーターの役割の重要性が確認できた。現地調査と並行して進めているノヴァリナの理論書の翻訳については、その成果の一部をもとに国際シンポジウムで口頭発表を行い、各言語の背景にある文明を視野に入れて翻訳する必要性を具体的に示した。これは次年度刊行の論文集に掲載される予定である。本年度はノヴァリナのアール・ブリュット受容に関する研究の基礎を固めるため、文献読解、現地調査、翻訳の三つを並行して行う予定であったが、「研究実績の概要」欄に記したように、アール・ブリュットの文献調査及びノヴァリナの理論書の分析については、申請から研究開始までの間に一定の成果をあげることができた(国内学会での口頭発表後、論文を発表)。また、研究計画を立てる段階では予期していなかった国際シンポジウムでの発表などが入ったこともあり、現地調査と翻訳の二つを研究の主軸に据えた。現地調査については、予定どおり、渡仏してノヴァリナと俳優への聞き取り調査を実施した。加えて日本では、演出家のワークショップ及び社会福祉施設での観察調査も行うことができた。これら現地調査を通してアール・ブリュットの理論を批判的に検討することができ、問題の焦点が教育と身体のあり方に絞られてきた。他方、ノヴァリナの理論書の翻訳は、予想外の発表が入ったため、予定より遅れているが、下訳は終わり推敲段階に入った。来年度刊行の予定である。今年度明らかになった成果をもとに現地調査と理論的考察を進め、研究の一層の深化を図りたい。具体的には、渡仏して知的障害者の職業俳優からなる〈蜂鳥劇団〉を訪問し、ノヴァリナのテクストの演技法や劇団運営について調査する。日本では、翻訳と並行して、デュビュッフェ全集および雑誌『アール・ブリュット』を精査し、ノヴァリナの劇および理論との比較検討を行う。また、最終年度に予定しているノヴァリナの招待公演の準備を進める。

また、研究計画を立てる段階では予期していなかった国際シンポジウムでの発表などが入ったこともあり、現地調査と翻訳の二つを研究の主軸に据えた。現地調査については、予定どおり、渡仏してノヴァリナと俳優への聞き取り調査を実施した。加えて日本では、演出家のワークショップ及び社会福祉施設での観察調査も行うことができた。これら現地調査を通してアール・ブリュットの理論を批判的に検討することができ、問題の焦点が教育と身体のあり方に絞られてきた。他方、ノヴァリナの理論書の翻訳は、予想外の発表が入ったため、予定より遅れているが、下訳は終わり推敲段階に入った。来年度刊行の予定である。今年度明らかになった成果をもとに現地調査と理論的考察を進め、研究の一層の深化を図りたい。具体的には、渡仏して知的障害者の職業俳優からなる〈蜂鳥劇団〉を訪問し、ノヴァリナのテクストの演技法や劇団運営について調査する。日本では、翻訳と並行して、デュビュッフェ全集および雑誌『アール・ブリュット』を精査し、ノヴァリナの劇および理論との比較検討を行う。また、最終年度に予定しているノヴァリナの招待公演の準備を進める。研究費を効率的に使用したため小額の残額が生じた。次年度の物品費として使用する。
閉塞性唾液腺炎(唾石症モデル)におけるアポトーシス誘導機序の解析

昨年はヒトに発症した閉塞的唾液腺炎(唾石症)に対して、T1強調spin echo、脂肪抑制T2強調fast spin echo、short inversion time inversion recoveryといった従来のMR法にて、唾石症の病態について検討を行ったが、本年度は現存する最高速のMRI技術であるエコープラナーイメージング(Echo Planar Imaging;EPI)を用いて、拡散強調撮像を行い、水分子の拡散という新しい面から、唾石症を含めた様々な唾液腺の病態の検討をおこなった。また唾液腺疾患患者のみでなく、健常ボランティアを用いて正常耳下腺、顎下腺各腺体部の、みかけの拡散係数(apparent diffusion coefficien;ADC)の正常値をもとめた。結果は以下のとおり。1.健常者では耳下腺のADCは顎下腺のADCより高かった。2.シェーグレン症候群患者の耳下腺のADCは病期で異なっており、健常者のADCと差がないものとそれより高いものがあった。3.唾石症の患者では罹患側顎下腺のADCは健常側より高い場合と差がない場合があった。4.急性耳下腺炎の患者では罹患側耳下腺のADCは健常側より著名に高くなっていた。以上のようにEPIを用いた拡散強調撮像を行うと、ADCを求めることで唾液腺の病態を定量的に評価することが可能であることがわかった。また今回行ったシングルショットのEPIでは、-回の撮像時間は160秒と非常に高速でmotion artifactにも強いという利点を備えている。今後、拡散強調撮像を用い、定量的に病態、進行状態の把握を行うだけでなく、各唾液腺疾患の特徴を捉え、鑑別診断への応用の可能性についても検討を行いたいと考える。これらの結果は第40回日本歯科放射線学会総会、岐阜、平成12年にて口演した。今後研究をすすめ、論文にまとめる予定である。本年度は、ヒトに発症した唾石症において、その画像診断学的変化と病理学的変化との相関について検討を加えた。対象は16名の顎下腺唾石症患者。画像診断としてMRI,CTおよび唾液腺造影を行った。MRについてはT1-weighted imageおよびfat-suppressed T2-weighted imageおよびshort inversion time-inversion recovery法を用いて撮像した。MR造影剤についてはこれを用いなかった。以上の画像所見を臨床症状並びに手術により得られた摘出標本の病理所見と比較検討した。結果は以下の通り。1)顎下腺唾石症はMRIにより、3つの型(TypeIIII)に分類することができた。2)TypeIは、何らかの臨床症状とMRI上での以上所見があるもので、病理組織学的には強い炎症所見を呈するもの9名(56%)。3)TypeIIは、臨床症状は無いものの、MRIでは以上所見が認められるもので、病理組織学的には脂肪の広範な沈着が特徴的である4名(25%)。4)TypeIIIは、臨床症状も、MRIの以上所見も認められないものである3名(19%)。CT像もこれらMRI像と非常によく相関していた。さらにCTは唾石の存在部位その個数を知るのにMRIより有効であり、唾石の存在部位と臨床症状との間にも相関があり、それが上記の3つの型となって、分類できる要因になっていると思われた。これらの結果より、MRIは顎下腺の唾石症の病態をよく反映することが認められた。これらの結果は、第38回歯科放射線学会総会軽井沢平成10年にて口演し、またAJNR20:1737-1743,1999に掲載された。結果は以下のとおり。
相補性問題に対する主双対内点法を用いた実用的な解法についての研究

本研究の目的は、主双対内点法を応用し、非線形相補性問題に対する実用的な解法を示すことで、最適化問題を確実に速く解くこと可能にすることであった。相補性問題とは、ある写像F:R^n→R^nが与えられているとき、y=F(x),(x,y)【greater than or equal】0かつx_iy_i=0(i=1,2,...,n)であるような2n次元の点(x,y)を求める問題である。上記の目的のもとに主双対内点法の枠組を用いるという前提で研究を行ない、以下のような知見を得た。(1)非線形計画法の分野での古典的な理論を用いて、大域的収束性を保証するためのアルゴリズムの条件を示し、具体的なアルゴリズムの例を提示した。(2)主双対内点法の枠組においてその計算複雑度を左右する写像Fの要因を発見し、過去に提示されたいくつかの因子との関連性を明確にした。この結果、非線形相補性問題に対する新たな解法の理論と応用の可能性が得られた。しかし、解法の実用性に関する検証は残念ながら行なうことができなかった。また、上記(2)に関しては、関連性がまだ不明な因子が残されている。これらは今後の課題であり、継続して研究を行なう予定である。(尚、本研究の代表者久野章子は筆名吉瀬章子(YOSHISE Akiko)を用いている。)本研究の目的は、主双対内点法を応用し、非線形相補性問題に対する実用的な解法を示すことで、最適化問題を確実に速く解くこと可能にすることであった。)
マウスES細胞の神経分化抵抗性に関与する新規遺伝子の機能解析

申請者は、変異に伴いマウスES細胞の分化に異常をきたす機能未知のzincfinger protein(Zfp)遺伝子を同定し、その機能解析を進めている。平成30年度は、本Zfp遺伝子の「培養細胞レベルでの分子メカニズムの解明」と「マウス胎児個体での機能解析」を目指して、前者ではChIP-seq、RNA-seq、質量分析を予定、後者ではホモ変異マウスの全身および脳の表現型解析を行うことを計画していた。前者の「培養細胞レベルでの分子メカニズムの解明」については、ChIP-seq以外は全て予定通り進行し、現在、情報学的解析を進めている最中である。質量分析の結果では、NuRD複合体を形成する分子群との相互作用が認められた。NuRD複合体はES細胞の分化の際に重要な機能を果たす分子であることが知られており、この複合体とZfp遺伝子が相互作用するのであれば、神経分化時における未知の分子メカニズムが同定されたことになる。また、RNA-seqでは、Zfp遺伝子と共に発現量が変動する遺伝子群を解析したところ、大脳の発生に必要なことが知られている遺伝子や、神経疾患の原因遺伝子の可能性が示唆されている遺伝子などが同定された。ChIP-seqに関しては、当初はFlag tagでChIP-seqを行う予定にしていたが、より適切なtagへの変更などを行っていたため、予定より少々遅れて進行しているが、順調に前進している。後者の「マウス胎児個体での機能解析」については、18.5日胚のホモ変異マウスの全身(脳、心臓、肺、肝臓、脾臓、胸腺、腎臓、腸管)と胎盤の組織染色を行い、生まれた直後(1日以内)に死亡する原因を探索することを試みたが、野生型マウスと比較して特に変化が見られず、残念ながら死因を特定するには至らなかった。脳の組織染色を行った結果、大脳の6層構造に異常が見られた。平成30年度は、新規zinc finger protein(Zfp)遺伝子の「培養細胞レベルでの分子メカニズムの解明」と「マウス胎児個体での機能解析」を目指して、前者ではChIP-seq、RNA-seq、質量分析を予定、後者ではホモ変異マウスの全身および脳の表現型解析を行うことを計画していた。前者の項目の一つであるChIP-seqが未だ解析できていない段階であるが、その他は予定通り進行しており、ChIP-seq解析も適切なtagの検討などを行い、試行錯誤しながらも順調なペースで前進しているため、「おおむね順調に進展している」とした。まず、質量分析で得られた結果(NuRD複合体とZfp遺伝子が相互作用すること)を共免疫沈降などで実験的に検証していく。相互作用が認められたら、NuRD複合体を形成する分子のノックアウト株を作製し、Zfp遺伝子のノックアウト株の表現型と比較する。RNA-seq解析で得られた、Zfp遺伝子と共に発現量が変動する遺伝子群については、これらがZfp遺伝子と同じパスウェイに存在するか否かを検証するために、こちらについてもノックアウト株を作製し、Zfp遺伝子のノックアウト株の表現型と比較する。ChIP-seqに関しては、CRISPR/Cas9を用いてZfp遺伝子座へtagをノックインし、ChIPの条件検討を早期に行い、ChIP-seq解析を行う。また、科研申請書の当初の計画では、ヒトにおけるZfp遺伝子の機能解析を行うことを目的として、平成31年度より、ヒトiPS細胞でのZfp遺伝子のノックアウト株の作製を開始する予定にしていた。こちらについても予定通り開始する予定である。

平成30年度は、新規zinc finger protein(Zfp)遺伝子の「培養細胞レベルでの分子メカニズムの解明」と「マウス胎児個体での機能解析」を目指して、前者ではChIP-seq、RNA-seq、質量分析を予定、後者ではホモ変異マウスの全身および脳の表現型解析を行うことを計画していた。前者の項目の一つであるChIP-seqが未だ解析できていない段階であるが、その他は予定通り進行しており、ChIP-seq解析も適切なtagの検討などを行い、試行錯誤しながらも順調なペースで前進しているため、「おおむね順調に進展している」とした。まず、質量分析で得られた結果(NuRD複合体とZfp遺伝子が相互作用すること)を共免疫沈降などで実験的に検証していく。相互作用が認められたら、NuRD複合体を形成する分子のノックアウト株を作製し、Zfp遺伝子のノックアウト株の表現型と比較する。RNA-seq解析で得られた、Zfp遺伝子と共に発現量が変動する遺伝子群については、これらがZfp遺伝子と同じパスウェイに存在するか否かを検証するために、こちらについてもノックアウト株を作製し、Zfp遺伝子のノックアウト株の表現型と比較する。ChIP-seqに関しては、CRISPR/Cas9を用いてZfp遺伝子座へtagをノックインし、ChIPの条件検討を早期に行い、ChIP-seq解析を行う。また、科研申請書の当初の計画では、ヒトにおけるZfp遺伝子の機能解析を行うことを目的として、平成31年度より、ヒトiPS細胞でのZfp遺伝子のノックアウト株の作製を開始する予定にしていた。こちらについても予定通り開始する予定である。ChIP-seq解析を行うにあたり、Zfp遺伝子に付加するtag配列を検討した。その過程において、当初予定していたtagと異なる配列を付加することになり、ChIP-seq実験が次年度に持ち越された。