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高齢一卵性双生児における咬合・咀嚼が生活習慣病，認知機能，遺伝子修飾に及ぼす影響

高齢の一卵性双生児(MZ)間と二卵性双生児(DZ)間との類似度を比較することによって,遺伝因子ならびに環境因子による影響を統計学的に検討した.その結果,唾液分泌,咀嚼能率に関しては遺伝による影響が認められたが,歯周病や残存歯数に関しては環境因子の影響が大きいことが示された.口腔機能と全身疾患の関係について,さらに,年齢,性別,喫煙を調整した上でも歯の数と動脈硬化との間に有意な関連が認められた.口の健康に関連する歯の数や咀嚼機能、歯の形態について遺伝または環境の影響をどの程度受けているかを調べた。歯列形態は遺伝の影響、歯の数や歯周病は環境の影響を強く受ける一方、咬合力や咀嚼能率,唾液分泌などの機能は遺伝にも環境にも影響を受けていることがわかった。このことは歯科医、患者共に治療の限界を知り、予防する上で重要であると考えられる。近年、口の健康と動脈硬化の関連が指摘されているが、遺伝の影響を考慮した研究はみられない。遺伝因子を考慮し、これらの関係を調べたところ、歯数と動脈硬化のとの関係には遺伝因子が関与していること、また遺伝因子を取り除いた上でも両者の関連性が認められた。これより、歯の数は動脈硬化に影響を与える環境要因として重要であることが示唆された。人間のあらゆる行動や意思決定、ある疾病への罹患には少なからず遺伝が関与していると考えられている。さらに、遺伝統計学の分野においては、その遺伝の寄与は年齢とともに増す傾向にあることが知られている。今回我々の集めた一卵性の双子サンプルにおいては、高齢になるほど双子間で口腔の状態が大きく異なるペアの占める割合が多くなることがわかった。これより口腔の状態に対しては高齢になるほど環境因子がより強く影響を与えることが示唆された。口腔の健康を維持するためには大きく影響を与えている環境因子を取り除き、予防に力を注ぐ必要がある。高齢の一卵性双生児(MZ)間と二卵性双生児(DZ)間との類似度を比較することによって,遺伝因子ならびに環境因子による影響を統計学的に検討した.その結果,唾液分泌,咀嚼能率に関しては遺伝による影響が認められたが,歯周病や残存歯数に関しては環境因子の影響が大きいことが示された.口腔機能と全身疾患の関係について,さらに,年齢,性別,喫煙を調整した上でも歯の数と動脈硬化との間に有意な関連が認められた.対象:大阪大学ツインリサーチセンターにおいて検診を受けた高齢双生児57組(MZ: 46組、DZ: 11組)、平均年齢69.4±12.2歳を対象とした。方法:各被験者に対し、診察・検査を行い、残存歯数(1)、齲蝕経験歯率(2)、唾液中潜血(3)、咀嚼能率(4)、上下顎骨の大きさ(5)を調べた。1残存歯数は上下顎骨における全残存歯数とした。2齲蝕経験歯率は、齲蝕未処置歯(D)と処置歯(F)の合計の全被検歯数に占める割合とした。3唾液中潜血はペリオスクリーン(サンスター社)を用いて、含嗽後の排出唾液中の潜血反応より判定した。4咀嚼能率は検査用グミゼリー(アズワン社)を30回咀嚼後の咬断片の粉砕度とした。5上下歯列の大きさは、歯列模型の左右第一小臼歯頬側咬頭頂間距離を測定し、歯列弓幅径とした。それぞれの項目において双子間における級内相関係数の検定、共分散構造分析を用いた単変量遺伝解析を行った。結果:平均残存歯数は、20.0±9.7本であった。級内相関係数については、上顎歯列弓幅径はMZ: 0.95、DZ: 0.87、下顎はMZ: 0.84、DZ: 0.63、咀嚼能率はMZ: 0.72、DZ: 0.53、齲蝕経験歯率はMZ: 0.47、DZ: -0.33となり、単変量遺伝解析においていずれもAE(A:相加的遺伝要因、E:非共有環境要因)モデルが採択された。これに対して、残存歯数の級内相関係数はMZ: 0.64、DZ: 0.78、唾液潜血はMZ: 0.40、DZ: 0.60となり、いずれもCE(C:共有環境要因)モデルが採択された。被験者も順調に集まり,検査も問題なく,他分野との連携も良好である.これまで通り進め,被験者数を増やし,分析と総合評価を行う.これまで通り進め,被験者数を増やし,分析と総合評価を行うために経費が必要である.
インプリンティング疾患発症機序の解明

ヒトインプリンティング疾患発症機序や臨床像の解明の解明を目指して研究を実施した。その結果、第14染色体父性ダイソミーupd(14)patおよび類縁疾患では、(1)発症原因の解明とそれに基づく遺伝的診断法の確立、(2)高齢出産と父性ダイソミー発症リスクの評価、(3)個体および胎盤インプリンティングセンターと主要表現型発症責任遺伝子の同定、(4)母性発現遺伝子RTL1asによるRTL1発現抑制の同定、(5)胎盤組織所見の解明、(6)画像診断基準の作成などが、(1)発症原因の解明とそれに基づく遺伝的診断法の確立、(2)高齢出産と母性ダイソミー発症リスクの評価、(3)生殖補助医療とPrader-Willi症候群発症リスクの評価などが、(1)発症原因の解明とそれに基づく遺伝的診断法の確立、(2)詳細な遺伝子型-表現型解析などがなされた。さらに、全染色体母性ダイソミーキメラおよび全染色体父性ダイソミーモザイクが同定された。これらの成果は、ヒトインプリンティング疾患研究の進展に大きく貢献するものである。本年度における主たる成果は以下の通りである。●第14染色体インプリンティングドメインの発現調節機構の解明:われわれは、第14染色体父性・母性ダイソミー様表現型を呈する患者の解析を介して、この領域からIG-DMRおよびMEG3-DMRという2つの親由来特異的メチル化を受けるDMR(メチル化可変領域)を同定していた。本年度、IG-DMRあるいはMEG3-DMRのみを欠失する患者を見出し、その詳細な解析を行った。その結果、下記のことが判明した。(1)IG-DMRは、配偶子形成過程においてメチル化パターンが決定されるprimary DMRであり、個体と胎盤の両者においてDMRとしてふるまう。(2)MEG3-DMRは、受精後の発生過程においてメチル化パターンが決定されるsecondaly DMRであり、個体ではDMRとしてふるまうが、胎盤では親由来にかかわらず比較的低メチル化状態にある。(3)IG-DMRは、直接的に胎盤における全てのインプリンティング遺伝子の発現制御を担う。(4)MEG3-DMRは、直接的に個体における全てのインプリンティング遺伝子の発現制御を担う。(5)IG-DMRは、MEG3-DMRのメチル化パターンを決定することで、間接的に個体におけるインプリンティング遺伝子の発現制御を担う。これは、primary DMRとsecondaly DMRの機能分担と相互作用を示す世界で初めてのデータであり、インプリンティング遺伝子の発現調節機構の解明に大きく貢献すると考えられる。●全染色体母性および父性片親性ダイソミーモザイク・キメラ患者の同定:全染色体母性および父性片親性ダイソミー患者は、インプリンティング遺伝子発現異常のために致死的であるが、両親由来ゲノム陽性細胞が共存するときには生存しうる。われわれは、世界で初めてとなる全染色体母性片親性ダイソミー細胞と両親由来ゲノム陽性の45,X細胞を有する患者、および、世界で6例のとなる全染色体父性片親性ダイソミー細胞と正常細胞を有する患者を同定し、その発症機序および表現型決定因子を明確とした。この2例を用いた網羅的インプリンティング遺伝子やDMR同定を進めている。●高齢出産と片親性ダイソミー発症:高齢出産は、第一減数分裂時の不分離(M1)によるダイソミー卵子とトリソミー卵子形成のリスク因子であり、TR/GCによる母性ダイソミー発症リスクとなりうる。われわれは、まずPrader-Willi症候群138例において、欠失を99例、TR/GC[M1]を19例、TR/GC[M2]を9例、MR/PEを3例、エピ変異を2例において同定し(残る6例ではFISHのみ行い、欠失は認められなかった)、母親の出産年齢が、TR/GC[M1]群で、欠失患者群(およびその他の群)に比し、有意に上昇していることを見出した(P=1.0×10^<-7>)。これは世界で初めて、高齢出産が、主にTRを介する母性ダイソミーの発症リスクであることを世界で初めて示すデータである。

●シルバーラッセル症候群発症機序の解析:本症候群患者150例を集積し、既知の第7染色体母性ダイソミーやH19-DMRのエピ変異解析を終了した。そして、原因不明の訳100例においてアレイCGHや次世代シークエンサーを用いた網羅的ゲノム・エピゲノム配列解析を開始した。●その他:新規インプリンティング領域の同定、種々のインプリンティング疾患患者における網羅的DMR解析を開始した。本年度における主たる成果は以下の通りである。(1)第14染色体父性ダイソミー(upd(14)pat)表現型を招く遺伝的機序:upd(14)pat表現型陽性例における胎盤の発現解析やメチル化解析により、世界で初めて、母性発現遺伝子RTL1asにコードされるmicroRNAがRTL1の発現抑制機能を有することを証明し、さらに、免疫染色や電顕解析により、upd(14)pat表現型陽性例の胎盤においてRTL1, DLK1の発現が確かに増加していること、upd(14)pat表現型陽性例の胎盤過形成が主にRTL1発現養成のpericyteの腫大によることを明らかとした。(2)Prader-Willi症候群発症における生殖補助医療のリスク評価:Prader-Willi症候群138例において生殖補助医療の有無と遺伝的発症原因を明確とし、生殖補助技術に直接的に関わる因子(排卵誘発や体外培養など)と生殖補助医療受けた背景となる交絡因子(高齢出産や不体質など)の影響を検討した。その結果、生殖補助医療出生児に高頻度にみられるダイソミーは高齢出産によりほぼ説明されるが、生殖補助医療出生児がプラダーウイリ症候群患者集団において一般集団よりも高いことから、生殖補助技術に直接的に関わる因子の影響も否定できないことが判明した。(3)シルバーラッセル症候群発症機序の解析:本症候群患者138例の解析を行い、H19-DMRのエピ変異を43例(グループ1)、第7染色体母性ダイソミー(upd(7)mat)を9例(グループ2)同定した。さらに、(a)グループ1が、グループ2に比し、より小さな生下時身長・体重、より大きな頭囲、より高頻度の左右非対称を有すること、(b)グループ1の患者の35.7%で複数DMRのエピ変異が存在すること、(c)グループ1の身長・体重はIGF2の発現量で規定されることを見出した。われわれは、第14染色体インプリンティング領域において、IG-DMR(メチル化可変領域)およびMEG3-DMRが各々胎盤および個体のインプリンティングセンターとして機能すること、また、IG-DMRが個体においてMEG3-DMRのメチル化パターンを決定すること世界で初めて報告した。これは、いままでのすべてのインプリンティング領域において知られていなかった新知見である。また、高齢出産が、主にTRを介する母性ダイソミーの発症リスクであること、シルバーラッセル症候群150例以上を集積し発症原因を明確にしていることなど、多くの新しい知見を報告している。さらに、新規インプリンティング領域の同定、次世代シークエンサーを用いた網羅的ゲノム・エピゲノム配列解析を開始している。現在、エピ変異発症機序の解明に取り組んでおり、最終年度にこれを明らかとしたい。24年度が最終年度であるため、記入しない。
microRNAをターゲットとした神経幹細胞移植による脳梗塞再生治療の開発

脳梗塞に対する幹細胞移植治療は新規治療法として期待を集めているが、移植細胞の生着率の低さ、特定の細胞への分化制御、および周囲とのネットワーク形成など、効率的な治療に向けての課題は多い。一方、遺伝子発現を調節するmicroRNA(miRNA)は近年様々な疾患での関与が注目され、また生体内への投与が比較的安全なことから、これをターゲットとした創薬が注目されつつある。miRNAは神経幹細胞の増殖や分化の制御のみならず神経ネットワークの構築にも関わっていることが示され、移植後神経幹細胞においてもこれらの制御の鍵を握ると考えられる。本研究では、脳虚血後移植神経幹細胞におけるmiRNAの役割を解明し、幹細胞移植治療の臨床応用へ向けmiRNAをターゲットとした新たな治療法の開発を目指す。本年度は、主にin vitroでの実験を行い、生後1日マウスを用いて、subventricular zoneより神経幹細胞を摘出分離した。第5継代以降の培養神経幹細胞に対し、非致死的な低酸素刺激による神経保護効果を解析するため、低酸素低グルコース条件(OGD)を負荷する実験を行っている。培養幹細胞を用いたmiRNAの解析が遅れているためOGD負荷による虚血環境の作成を確立し、第5継代以降の培養神経幹細胞を用いて、その環境下でのmiRNAの発現変化を解析する。一方、遺伝子発現を調節するmicro RNA(miRNA)は近年様々な疾患での関与が注目され、また生体内への投与が比較的安全なことから、これをターゲットとした創薬が注目されつつある。本年度は、in vitroでの実験を行い、生後1日マウスを用いて、subventricular zoneより神経幹細胞を摘出分離した。第5継代の培養神経幹細胞を用いて、miRNA発現を解析し、細胞増殖に関わるmiRNAを検討している。神経幹細胞の培養と、その培養幹細胞を用いたmiRNAの解析が遅れているため脳梗塞に対する幹細胞移植治療は新規治療法として期待を集めているが、移植細胞の生着率の低さ、特定の細胞への分化制御、および周囲とのネットワーク形成など、効率的な治療に向けての課題は多い。第5継代以降の培養神経幹細胞に対し、低酸素低グルコース条件(OGD)を負荷する実験を行い、擬似虚血性傷害および耐性獲得現象におけるmiRNAの発現変化を細胞レベルで検討している。培養幹細胞を用いたmiRNAの解析が遅れているため安定した神経幹細胞の培養を確立し、その培養幹細胞を用いて、細胞増殖に関わるmiRNAを特定する。その後、虚血環境下での神経幹細胞におけるmiRNAの発現変化を解析する。安定した神経幹細胞の培養を確立し、その培養幹細胞を用いて、虚血環境下での神経幹細胞におけるmiRNAの発現変化を解析する。OGD負荷による虚血環境の作成を確立し、第5継代以降の培養神経幹細胞を用いて、その環境下でのmiRNAの発現変化を解析する。培養幹細胞を用いたmiRNAの解析が遅れているため、動物実験などが遅れ、この分の購入管理費が未使用金となった。理由)神経幹細胞を用いたmiRNAの解析が遅れているため、動物実験が遅れ、この分の購入管理費が未使用金となった。

使用計画)本年度の未使用金を含め、次年度の研究費は、動物購入管理費、miRNA解析用物品購入費などに使用する予定である。理由)OGD負荷による虚血環境の作成の確立が遅れており、神経幹細胞を用いたmiRNAの解析および動物実験が遅れ、この分の購入管理費が未使用金となった。本年度の未使用金を含め、次年度の研究費は、動物購入管理費、miRNA解析用物品購入費などに使用する予定である。
胃壁細胞の分泌細管小胞融合・伸展の分子機構

モルモット単離胃壁細胞を、位相差顕微鏡下に同定し、バッチクランプ全細胞記録法および位相感受性検出法を適用し、壁細胞膜容量の測定を行った。その結果、壁細胞はヒスタミン刺激に対しては膜容量増加という反応を示し、この反応はピリラミンでは抑制させなかったがシメチジンにより抑制された。この事からこの反応はH_2受容体を介する反応である事が明らかとなった。一方カルバコ-ル刺激では膜容量増加は見られず、膜透過性の亢進が見られるのみであった。次に膜容量増加に至る細胞内伝達機構について検討を加えた。H_2受容体刺激により細胞内CAMPが増加する事より、abcーAMPにより壁細胞を刺激したところ、ヒスタミン刺激と同様の反応が見られた。さらにBAPTAをピプット電極から注入しと細胞内Ca^<2+>イオンを強くキレ-トして、ヒスタミン刺激を行い膜容量変化を測定したところ、膜容量増加は見られなかった。しかし細胞内Ca^<2+>イオンを弱キレ-トした場合にはヒスタミン刺激によって膜容量増加が見られた。この事より膜容量増加には最低限の細胞内Ca^<2+>イオン濃度が必要である事が明らかとなった。次にCキナ-ゼの活性化物質であるOAG、抑制物質であるポリミキシンB存在下でヒスタミン刺激による膜容量増加を検討したが、これらの薬剤は増加反応に対して何らの作用も示さなかった。次にAキナ-ゼの関与を確かめるため、Aキナ-ゼGキナ-ゼに対し抑制作用を持つHー8、Gキナ-ゼに対しより強い抑制作用を持つHー9を作用させて膜容量変化を検討した。その結果ヒスタミンによる膜容量増加はHー8では抑制されたが、Hー9では抑制を受けなかった。従ってヒスタミンによる胃壁細胞膜容量増加Aキナ-ゼを活性化する事により引き起こされる事が明らかとなった。
内分泌かく乱物質の新規G蛋白質連関型神経ステロイド受容体への作用機構の解明

肥満細胞の株化細胞であるRBL-2H3細胞を用い、刺激に応じて放出されるβ-ヘキソサミニダーゼの活性を測定し脱顆粒応答を評価した結果、デヒドロエピアンドロステロン硫酸抱合体(DHEAS)及びプレグネノロン硫酸抱合体(PREGS)による脱顆粒応答が観察されるが、この応答が、ホスホリパーゼC(PLC)阻害剤により阻害された。更に、Fura-2を用いた測定でDHEAS添加により細胞内カルシウムの持続的な上昇を確認した。このカルシウム上昇はG蛋白質Gqのアンチセンスオリゴヌクレオチド処置、PLC阻害剤処置では阻害されたが、百目咳毒素やチロシンキナーゼ阻害剤処置では影響を受けなかった。このことから、Gq-PLCを介する細胞内カルシウム動員系が働いていることが示唆された。細胞外カルシウムを除去するとカルシウム上昇の持続相が消失し一過性のカルシウム上昇のみが観察されたことから、細胞内カルシウム貯蔵部位からのカルシウム動員後に細胞外からカルシウム流入が起き、持続相を形成していると考えられた。次に、内分泌かく乱物質類について脱顆粒応答に対する効果を検討した。ビスフェノールA、ノニフェノール、オクチルフェノール、DDE、ジブチルフタル酸、ジエチルヘキシルフタル酸等が、DHEAS脱顆粒作用に拮抗作用を示した。内分泌かく乱物質のin vivoでの作用を評価する目的で、エバンスブルー静脈注射による血管透過性亢進を検討したところ、DHEASによる亢進作用とビスフェノールAによる抑制作用が観察された。細胞膜受容体の同定のためにFITC標識-BSA-PROGによる細胞標識を行ったところ、特異的に細胞膜が標識され、未標識PROG、DHEAS、ノニフェノールにより結合が阻害されたことから、これらの神経ステロイドや内分泌かく乱物質の共通の結合部位が存在することが確認された。これまでマウスに対する末梢性疼痛試験法を用いた実験より、神経ステロイドであるデヒドロエピアンドロステロン硫酸抱合体(DHEAS)及びプレグネノロン硫酸抱合体(PREGS)足蹠皮下投与による応答を観察したところ、それぞれ0.1amol及び1amolの低用量から侵害応答が観測され、その応答はプロゲステロン(PROG)により拮抗された。この低用量での侵害応答は百日咳毒素非感受性で、ホスホリパーゼC阻害剤、あるいはヒスタミン拮抗薬のジフェンヒドラミン(DPH)足蹠皮下投与により抑制され、肥満細胞からのヒスタミン遊離を介した応答であることが示唆された。一方、DPH存在下においても、1pmol以上のDHEASにより侵害応答が観察された。この応答は、PROGにより拮抗され、また百日咳毒素感受性であった。以上の結果から、神経ステロイドは二種類の受容体を介して知覚神経興奮を引き起こすことが示唆された。次ぎに、神経ステロイドが直接肥満細胞を活性化し脱顆粒を引き起こすかどうかを検討した。肥満細胞の株化細胞であるRBL-2H3細胞を用い、刺激に応じて放出されるβ-ヘキソサミニダーゼの活性を測定し脱顆粒応答を評価した。神経ステロイドは、末梢性疼痛試験法で用いたPREGS、DHEAS、そしてPROGについて検討した。その結果、PREGSとDHEASによる濃度依存的なβ-ヘキソサミニダーゼの遊離が認められた。一方、PROG単独ではβ-ヘキソサミニダーゼの遊離は引き起こさなかったが、PREGSおよびDHEASの作用に対して拮抗した。神経ステロイドが肥満細胞を活性化し、脱顆粒を引き起こすという今回の結果は、in vivoで見られた神経ステロイドによる侵害応答の分子機構を証明するものである。

神経ステロイドによる肥満細胞の脱顆粒応答の詳細な分子機構については、細胞内カルシウム測定を含めた様々な観点から解析中である。肥満細胞の株化細胞であるRBL-2H3細胞を用い、刺激に応じて放出されるβ-ヘキソサミニダーゼの活性を測定し脱顆粒応答を評価した結果、デヒドロエピアンドロステロン硫酸抱合体(DHEAS)及びプレグネノロン硫酸抱合体(PREGS)による脱顆粒応答が観察されるが、この応答が、ホスホリパーゼC(PLC)阻害剤により阻害された。更に、Fura-2を用いた測定でDHEAS添加により細胞内カルシウムの持続的な上昇を確認した。このカルシウム上昇はG蛋白質Gqのアンチセンスオリゴヌクレオチド処置、PLC阻害剤処置では阻害されたが、百日咳毒素やチロシンキナーゼ阻害剤処置では影響を受けなかった。このことから、Gq-PLCを介する細胞内カルシウム動員系が働いていることが示唆された。細胞外カルシウムを除去するとカルシウム上昇の持続相が消失し一過性のカルシウム上昇のみが観察されたことから、細胞内カルシウム貯蔵部位からのカルシウム動員後に細胞外からカルシウム流入が起き、持続相を形成していると考えられた。次に、内分泌かく乱物質類について脱顆粒応答に対する効果を検討した。ビスフェノールA、ノニフェノール、オクチルフェノール、DDE、ジブチルフタル酸、ジエチルヘキシルフタル酸等が、DHEAS脱顆粒作用に拮抗作用を示した。内分泌かく乱物質のin vivoでの作用を評価する目的で、エバンスブルー静脈注射による血管透過性亢進を検討したところ、DHEASによる亢進作用とビスフェノールAによる抑制作用が観察された。細胞膜受容体の同定のためにFITC標識-BSA-PROGによる細胞標識を行ったところ、特異的に細胞膜が標識され、未標識PROG、DHEAS、ノニフェノールにより結合が阻害されたことから、これらの神経ステロイドや内分泌かく乱物質の共通の結合部位が存在することが確認された。
イオンチャネルとその活性調節物質による超分子形成

ブロモユ-ジストミンD(BED)誘導体を多数合成し、そのカルシウム遊離活性、[^3H]リアノジン並びに[^3H]MBED結合に対する影響を検討した。BED誘導体の多くは骨格筋筋小胞体からカルシウムを遊離させ、その活性とカルシウム遊離チャンネル開口の指標である[^3H]リアノジン結合活性との間によい相関があった。非常に興味深い事に、BED誘導体の1つである4,6-ジブロモ-3-ヒドロキシカルバゾール(DBHC)が筋小胞体からのカルシウム遊離を顕著に阻害した。このこととDBHCが[^3H]MBED結合を拮抗的に阻害することを考えあわせると、DBHCはカルシウム遊離チャンネル上のカフェイン結合部位に結合してカルシウム遊離を阻害すると推定される。従ってDBHCは既知のカルシウム遊離チャンネル阻害剤のプロカイン等とは全く異なる作用機構を持つ阻害剤であるといえる。以上より、カルシウム遊離チャンネルはこれらBED誘導体の構造上の微妙な違いを識別し、自身のコンフォメーションを変化させ、リガンドであるBED誘導体との結合による超分子形成を通じてチャンネル活性を変化させることが明らかとなった。[^3H]MBED結合を指標にして平滑筋、脳の各組織のMBED結合蛋白質の精製を行った。各組織のミクロソームを可溶化し、蔗糖密度勾配遠心で分画すると、[^3H]MBEDの結合とリアノジンチャンネルの存在を示す[^3H]リアノジンの結合活性とが見られたが、その分布は互いに異なっていた。このことから、MBEDによって活性化される新しいチャンネルあるいはMBEDを結合する未知のカルシウム遊離調節因子の存在が明らかとなった。MBED結合蛋白質の精製に成功すると、直接それらとMBEDとの超分子形成のメカニズムを解析する道が拓かれ、カルシウム遊離チャンネルの機能発現におけるカフェインとの超分子形成の詳細が明らかになると期待される。
中期キェルケゴールの愛の思想――「愛はすべてを希望する」というテーゼを中心に

キェルケゴールは一般的には「実存主義」「絶望」「単独者」といった概念と一体となって理解されている。確かに彼の思想において、苦悩や殉教といった神的な側面が強調されることが多いのは事実だが、愛や希望といった人間的な側面も存在する。こうした人間的な側面は、彼の元婚約者レギーネ・オルセンと密接に結びついている。キェルケゴールの愛の思想は、神的な側面と人間的な側面を揺れ動きながら、ロマン主義から影響を受けつつ、レギーネとの関係性によって誕生し彼女との和解の挫折とともに消失していく。本研究は、この過程を日記・著作等の分析から明らかにし、キェルケゴールに対する新しい視点を提示することを目指している。
高性能ULSIのための歪みGeチャネルの形成と物性評価

本研究では、Si-On-Insulator上にSiGeをエピタキシャル成長させて酸化濃縮する手法により歪みSiGe-On-Insulator(SGOI)を形成すると共に、Ge基板上に高誘電率ゲート絶縁膜(High-k膜)を形成する手法を構築した。得られた成果は次の通りである。高品質SGOI形成にはGe濃度50%が最適で、歪み率と正孔チャネル移動度はそれぞれ1. 7%と570 cm^2/V・sである。Ge基板上へHigh-k膜を形成し、酸化膜換算膜厚(EOT) 1. 0 nm、界面準位密度9×10^<11> cm^<-2> eV^<-1>、同一EOTのSiO_2と比べて4桁のゲートリーク電流低減を達成した。Ge基板上にn-およびp-MOSFETを試作し、電子移動度1097 cm^2/V・s、正孔移動度376 cm^2/V・sの性能を得た。これはSiと比べて約1. 5倍の高移動化を意味する。本研究では、SOI上にSiGeをエピタキシャル成長させて局所的に酸化する手法により歪みSiGe-On-Insulator(SGOI)を形成すると共に、SGOIとの良質な界面特性を有する高誘電率ゲート(High-k)絶縁膜の形成技術を確立し、界面特性の良いSGOI-MOS構造の実現を目指している。H21年度は、(1)絶縁膜/Ge構造形成、(2)SGOI層の欠陥制御の研究を実施し、以下の成果を得ている。(1) Ge-MOS構造として、Ge表面をSiO_2/GeO_2の2層膜でパッシベーションする手法を検討した。GeO_2及びSiO_2膜の役割はそれぞれGe表面のダングリングボンド終端化及びGeO_2中への不純物(水や炭化水素)混入防止にある。この2層パッシベーション膜を大気暴露無しで形成する手法を開発した。この新規な界面層形成手法を用いれば、低い界面準位密度(4×10^<11>cm^<-2>eV^<-1>)のMOS構造が実現できる。更に、2層パッシベーションとHigh-k膜形成技術を組合せれば、酸化膜換算膜厚(EOT)で1.4nm、同一EOTのSiO_2と較べて3桁のゲートリーク電流低減ができる。この独自技術は良質なGe-MOS界面構造形成のための手法として有用であることを実証した。(2) SGOI形成時に発生する積層欠陥に起因する深いアクセプタを低減するため、フォーミングガスアニール(FGA)とAl堆積後アニール(Al-PDA)を検討した。その結果、低Ge濃度領域ではFGAとAl-PDAは共に有効に機能するが、高Ge濃度領域では、FGAは機能しないのに対して、Al-PDAは有効との知見を得た。SGOI中の欠陥を低減する重要なプロセス指針である。更に、Alの代わりにAl_2O_3を用いることにより、欠陥低減効果とAl/SGOI界面反応の防止ができるプロセス技術を確立した。本研究では、SOI上にSiGeをエピタキシャル成長させて酸化する手法により歪みSiGe-On-Insulator(SGOI)を形成すると共に、Ge基板との良質な界面特性を有する高誘電率ゲート(High-k)絶縁膜の形成技術を確立することを目指している。H22年度は、(1)SGOI層の歪み制御、(2)絶縁膜/Ge構造形成、(3)Ge-MOSFETによる性能検証、の研究を実施し、以下の成果を得ている。(1)SGOI層への歪み導入のため、初期SiGe膜厚の異なる基板をGe濃度50%まで濃縮し、歪み率(ε_c)と正孔移動度(μ_h)を調べた。その結果、SiGe膜厚が薄い程高いμ_hを示し、これは高い圧縮歪みと高い結晶性が起因していることを明らかにした。最適SiGe膜厚で濃縮したSGOIでμ_h=570cm^2/V_<-s>を示した。これは、Siのμ_hと比べて約3倍の高移動度化を意味する。(2)Ge-MOS構造として、Ge表面をSiO_2/GeO_2の2層膜でパッシベーションする手法を確立した。この新しい界面層形成手法を用いれば、低い界面準位密度(4×10^<11>cm^<-2>eV^<-1>)のMOS構造が実現できる。

更に、2層パッシベーションとHigh-k膜形成技術を組合せて、酸化膜換算膜厚で1.5nm、界面準位密度6×10^<11>cm^<-2>eV^<-1>、同一EOTのSiO_2と比べて4桁のゲートリーク電流低減ができた。(3)上述の界面層形成技術と新たに確立したpn接合形成技術とを組み合わせて、n-およびp-MOSFETを試作した。その結果、電子移動度1097cm^2/V・s、正孔移動度376cm^2/V・sの性能が得られた。これは、Siと比べて約1.51.6倍の高移動化を意味する。本研究では、SOI上にSiGeをエピタキシャル成長させて酸化する手法により歪みSiGe-On-Insulator (SGOI)を形成すると共に、Ge基板との良質な界面特性を有する高誘電率ゲート(High-k)絶縁膜の形成技術を確立することを目指した。H23年度は、(1)SGoI層の歪み制御、(2)高誘電率絶縁膜/Ge構造形成、(3)Ge-MOSFETによる性能検証、の研究を実施し、以下の成果を得た。(1)SGOI層への歪み導入のため、初期SiGe膜厚の異なる基板を濃縮し、歪み率(εc)と正孔移動度(μh)を調べた。その結果、歪みはGe濃度50%付近まで単調に増加するが、50%以上では歪み緩和が起こることが分かった。一方、μhのGe濃度依存性は、Ge濃度50%以上でほぼ一定値(μh=570cm^2/V・s)に保たれた。これは、Geの高濃度化による移動度向上、歪み効果の低減による移動度劣化が共存した結果と解釈される。従って、高品質SGOI形成にはGe濃度50%が最適で、その場合のεcとμhはそれぞれ1.7%と570cm^2/V・sである。(3)Ge上にHfおよびTiNをスパッタ堆積することにより正孔および電子に対して低障壁なコンタクト形成技術を確立した。この技術を用いて、ショットキーソース・ドレイン構造のpおよびn-MOSFETを試作した結果、電子移動度220cm^2/V・s、正孔移動度340cm^2/V・sの性能が得られた。
記憶情報処理における海馬ゲーティング機構の役割解明

自由行動中のラットに行動課題が与えられると、情報環境やその場の物理的状況の変化に応じてこれらの各種の記憶モード間の切り替えが行われ、異なる種類の学習が実行されると考えられる。共同実験者の佐治は、視床下部上乳頭核から海馬歯状回への入力系が、海馬内での情報伝搬の流れのスイッチングを行うゲーティング機構を形成していることを見出した。この入力系の一時遮断により、行動様式切り替えと脳波θ波出現が阻害されるか否かの検討を本研究の目的とした。平成15年度には、自由行動中のラット海馬より安定した脳波導出法を開発し、ラット海馬より導出した脳波と同時録画した行動を同時記録するシステムを作成した。これにより、海馬脳波との行動と相関を観察することが可能となった。また、飼育環境と脳波の関連の検討し、1ヶ月の飼育期間では単一飼育と2匹飼育環境下での脳波に大差は認めらなかった。さらに、海馬シータ波出現を示標とし、各種行動を分類した。平成16年度には、音刺激、餌、Wheelの回転を関連付けて学習させ、音刺激により注意が餌に向いたとき(探索行動の出現)の海馬θ波出現を指標とし、行動切り替えと脳波との関係について、正常時と上乳頭核一時遮断時の相違を比較・検討するべく研究を進めてきた。オープンフィールド内に配置したWheelの回転を計測し、回転課題を達成した後に音刺激を与え、指定時間内に餌エリアに移動した場合にのみ報酬を与えるという行動パラダイムを考案した。これら一連の計測・制御を行うためにコンピュータを用いたシステムも構築した。これまでに音刺激とエサと関連づけられた音刺激を与えると、海馬脳波にθ波に加えて高い周波数成分の増加が観察された。この周波数変化が、上乳頭核の一時的な遮断で影響を受けるか否かの結論はまだ得ていないが、影響を受けるという仮説を立て、今後も研究を進める予定である。目的自由行動中のラットに行動課題が与えられると、情報環境やその場の物理的状況の変化に応じてこれらの各種の記憶モード間の切り替えが行われ、異なる種類の学習が実行されると考えられる。共同実験者の佐治は、視床下部上乳頭核(SuM)から海馬歯状回(DG)への入力系が、海馬内での情報伝搬の流れのスイッチングを行うゲーティング機構を形成していることを見出した。行動様式切り替えと脳波θ波出現を伴うこの行動パラダイムの実行がSuMからDGへの入力系の一時遮断により阻害されるか否かの検討を、本研究の目的とした。平成15年度の結果1.自由行動中のラット海馬よりテレメーターを用いての安定した脳波導出法の開発は、ほぼ安定した自由行動中の脳波導出が可能となり、送信機装着部位と薬物注入部位の位置関係も決定した。2.ラット海馬より導出した脳波の自動解析法の開発は、購入した脳波解析システムに、ビデオ録画できるオプション(ソフトウエア)が発売され、追加購入し、同時に脳波と行動との相関を観察することが可能となった。3.ラットの飼育環境と脳波の関連の検討については、30日以内の実験期間では、単一飼育と複数(2匹)飼育環境下での脳波に大差は認めらなかった。このために複数飼育とし、測定を行っている。4.行動パラダイムの考案については現在進行中である。音刺激、餌、Wheelの回転を関連付けて学習させ、音刺激により注意が餌に向いたとき(探索行動の出現)の海馬θ波出現を指標とし、行動切り替えと脳波との関係について、正常時とSuM一時遮断時の相違を明らかにする。平成16年度の予定平成15年度には、測定条件をほぼ決定できた。今後行動パラダイムの考案を進め、行動切り替えと脳波との関係について明らかにする予定である。

これまでに音刺激とエサと関連づけられた音刺激を与えると、海馬脳波にθ波に加えて高い周波数成分の増加が観察された。この周波数変化が、上乳頭核の一時的な遮断で影響を受けるか否かの結論はまだ得ていないが、影響を受けるという仮説を立て、今後も研究を進める予定である。
マイクロRNAを新規分子指標に用いた新しい神経・高次脳機能解析

近年、ゲノム上に数百千近く存在するタンパク質をコードしないマイクロRNA遺伝子とその機能が注目されている。このマイクロRNAが関わる遺伝子発現調節は、RNAi(RNA interfbrence)マシーンが関与する新規の翻訳抑制機構であり、しかも、一種類のマクロRNAが複数のターゲット遺伝子の発現を制御するまったく新しい遺伝子発現調節機構を担っている。本研究は、このマイクロRNAを新規分子指標に用いた、まったく新しい観点からの高次脳機能解析を行う。本年度は、昨年度に引続き研究代表者らが開発したDNAチップ(Genopal-MICM)を用いてマウスP19細胞の神経細胞分化過程におけるマイクロRNAの発現プロファイルを解析した。そして、神経細胞分化過程におけるマイクロRNAとそのターゲット遺伝子の関連を解析した。その結果、let-7マイクロRMが神経分化過程で顕著に増加し、そのターゲット遺伝子であるHmga2遺伝子の発現が、let-7マイクロRNAの増加に伴って翻訳レベルで抑制されていることを見出した。Hmga2タンパク質が細胞の更新に関わると考えられていることから、Hmga2タンパク質のlet-7マイクロRNAによる発現抑制が神経細胞分化に伴う細胞分裂停止と形態変化に関与している可能性が考えられる。マイクロRNAライブ・アッセイ用レポータープラスミド・ライブラリーの作製に関しては、約120個のマイクロRNAをターゲットとするそれぞれのクローンの構築を完成させることができた。近年注目されている研究分野にタンパク質をコードしない機能性RNAの研究がある。特に、ゲノム上に数百千近く存在すると言われているマイクロRNA遺伝子そしてその機能解析に大きな注目が集まっている。このマイクロRNA分子が関わる遺伝子発現調節は、RNAi(RNA interference)マシーンが関与する新規の翻訳抑制機構であり、しかも、一種類のマクロRNAが複数のターゲット遺伝子の発現を制御する、まったく新しい遺伝子発現調節機構を担っている。本研究は、このマイクロRNAを新規分子指標に用いた、まったく新しい観点からの高次脳機能解析を実施する。本年度は、複雑な組織構造を持つ脳組織の各サブドメイン(大脳皮質、小脳、海馬、間脳、橋、延髄、脊髄)とマウスP19細胞を用いた神経細胞への分化過程におけるマイクロRNAの発現プロファイル解析を、研究代表者らが既に開発したDNAチップ(Genopal-MICM)を用いて行なった。その結果、各脳組織サブドメインでは、発現するマイクロRNAの種類に大きな差は見られなかったが、それらの発現量についてはサブドメイン間で有意な差が観察された。また、P19細胞の神経細胞系への分化過程では、マイクロRNAの発現が質的にも量的にも大きく変化することを観察した。これらの結果は、マイクロRNAが複雑な脳機能や神経細胞分化に関与している可能性を示唆している。なお、これらの研究成果は既に国際誌に掲載した。マイクロRNAライブ・アッセイ用レポータープラスミド・ライブラリーの作製については、現在進行中である。
X線散乱トポグラフ法による金属人工格子の構造評価に関する研究

本研究の目的は、X線散乱トポグラフ法を用いて、金属人工格子の構造不均一性を評価する方法を確立し、これを実際の金属多層膜の構造評価に応用することであり、以下のような成果を得た。(1)X線散乱トポグラフ撮影装置の開発:細束X線ビ-ムを金属人工格子表面に斜めに入射し、試料を走査しながら、散乱X線デ-タを自動的に収集する装置ならびにそのデ-タを解析・表示するソフトウェアを開発した。種々の検討の結果、多層構造の積層状態を反映する中角度域の散乱角に位置敏感検出器(PSPC)を設定して測定するのが最適であることを見いたした。また、主ピ-クの強度・半値幅だけではなく、サテライト・ピ-クの位置・強度も同時に測定できるように検出器を設定することが重要であることを見い出した。(2)Co/PdおよびCo/Au多層膜の構造評価:上記装置を用いて、実際の膜構造の評価を行なった。従来からX線回折による膜構造の評価は行なわれているが、それらは膜面の広い面積にわたる平均構造を調べるものであった。ここで開発した方法では、膜面内の構造不均一を画像として表示するものであり、不均一性を一目で見ることができる。その結果、高周波スパッタリング膜の構造が中央部から周辺部へと連続的に変化する様子が初めて明らかになった。この不均一性は、主として製造方法に依るものであるが、アニ-リングの効果も認められる等、多層膜の作製上重要な知見が得られた。今後、この方法を用いることによって、垂直磁気異方性の発現が膜構造とどのような関係にあるかを明らかにし、その発現機構の解明に役立てめ予定である。
ガ類の炭化水素型性フェロモン生合成器官の探索

本課題は、「部位」と「関わる酵素(遺伝子)」が現時点で共に不明なガ類の炭化水素型性フェロモンの生合成器官の実体を解明することを目指している。これまでに、アメリカシロヒトリの腹部トータルRNAの大規模シークエンスと、続くRT-PCRによる組織発現解析より炭化水素性フェロモン生合成に関する候補となるHc_Cyp4G77を見出し、同遺伝子が真皮細胞で特異的に発現する事がin situハイブリダイゼーションにより実証された。次に、この目的遺伝子を昆虫細胞で発現させ酵素機能を解析した。まず、長鎖脂肪酸を基質として試験したが、該当する炭化水素は検出されなかった。次に長鎖脂肪族アルデヒドの炭化水素を基質として試験を行なった結果、炭化水素への変換を認めたが変換効率が最大で数パーセントと低かった。この結果より、炭化水素型性フェロモンは多くの昆虫のクチクラ炭化水素の形成と同様に、脂肪酸から中間体アルデヒドを経由する二段階反応であると思われた。この仮説の確度を上げるためにHc_cyp4g77遺伝子の二本鎖RNAをオフターゲットを留意して遺伝子内の3か所でデザインし(dsRNA1-3)、二本鎖GFP処理区を陰性対照区としてRNAi法による機能解析を行なった。この結果として、dsRNA1処理区では主成分のフェロモン量が対照区と比べ19.2%まで低下した。dsRNA2とdsRNA3処理区では、対照区と比べてフェロモン量に有意差が無かったが昆虫細胞発現試験の結果と合わせて、アメリカシロヒトリの炭化水素型性フェロモンは真皮細胞においてHc_CYP4G77により、脂肪族アルデヒドより炭化水素に変換され生合成されることが示唆された。化学的に性質の異なる脂肪族型と炭化水素型の二型を示すガ類の性フェロモンについて、炭化水素型性フェロモン生合成器官の実体が不明なため、炭化水素型性フェロモンを分泌するヒトリガ科のアメリカシロヒトリとキマエホソバを用いて当該器官の探索を開始した。まず、両種を頭部、胸部、腹部、フェロモン腺、及び血液の5試験区に分割し、それぞれのヘキサン抽出物中に含まれるガ類フェロモン関連炭化水素を質量分析により調査した。その結果、両種において頭部を除く全ての試験区からフェロモン関連炭化水素が検出され、血中の運搬タンパク質リポフォリンを介して予想以上に全身に分布していることが示唆された。並行して、昆虫で体表炭化水素の形成に関与することが明らかとされているエノサイトの類似器官を「気管との癒着」及び「大きさ」という二つの解剖学的所見に基づき探索した。両種のメス成虫腹部を解剖し高解像度実体顕微鏡下で観察した結果、両種の気管にブドウの房状に付着した半透明の白色器官の存在を認めた。続いて、当該器官の核、及び脂質染色し暗視野顕微鏡下の観察により、この器官が脂肪細胞塊であることを確認した。一方で、アメリカシロヒトリのフェロモン腺と表皮クチクラ由来のRNAを大規模シークエンスし、その結果の比較解析から、ショウジョウバエの体表炭化水素を生合成する脱カルボニル酵素のホモログ遺伝子がアメリカシロヒトリのメスの表皮クチクラで特異的に高発現していることが分かり、この遺伝子を仮にHc77CYP4Gと名付けた。Hc77CYP4Gの部分配列をプローブとし、in situハイブリダイゼーションを行なった結果、腹部矢状面の切片から気管に付着したブドウの房状組織ではなく、その基底部のソケット細胞、或いは上皮細胞と思われる箇所にシグナルを認めた。化学分析の結果、当初の予想に反し、フェロモン関連炭化水素が頭部を除く全ての試験区から検出された。とりわけ胸部クチクラから検出された性フェロモン前駆体量は他試験区と比べて差が無く検出された。これは、腹部で生合成された性フェロモン前駆体炭化水素が選択的に腹部末端のフェロモン腺へ輸送されていないことを示唆しており、当初予定していたフェロモン前駆体量を手がかりに組織や器官を絞り込んでいくことが難しくなった。更に現在までに、炭化水素型性フェロモンの前々躯体であると考えられている食物由来の遊離脂肪酸を、脂肪酸分析により虫体広範にわたり探索したが検出されていない。このことから、組織を標識した前々躯体脂肪酸と培養し変化を追跡することも難しくなった。しかし、本研究目的はガの炭化水素型性フェロモンの生合成の場を明らかとすることにある。この期間ではエノサイトと思われる脂肪細胞の集合器官を、これまでに報告の無かったガ類成虫で発見したこと、遊離脂肪酸ではないが脂肪族CoAを基質に炭化水素へ変換する脱カルボニル酵素遺伝子の配列情報を得ていることから、研究は概ね順調に進展していると判断する。ガ類には炭化水素型性フェロモンを分泌する種の他に、脂肪族型性フェロモンを用いる種も存在し、それらの種の代表としてアワノメイガ、アズキノメイガ(共にツトガ科)カイコガ(カイコガ科)、ヨトウガ(ヤガ科)の各成虫を用いて、エノサイト類似器官である気管に癒着した半透明の脂肪塊を探索した。その結果、カイコガを除くすべての種の雌雄成虫から、当該器官を発見した。この種間の保存性から、第33回国際化学生態学/第9回アジア太平洋化学生態学合同会議におけるセッション「Pheromone communication」で口頭発表し、エノサイトという言葉の定義を再考した。更に、アメリカシロヒトリより単離したHcCYP4G_77

遺伝子の機能解析を開始した。まず、この遺伝子がメスの表皮で特異的に発現していることをRT-PCRとin situハイブリダイゼーションから結論付けた。目的遺伝子をバキュロウイルスゲノムに組み込み、昆虫細胞に感染させ目的タンパク質を発現させた。タンパク質の発現を確認後、予め合成した長鎖脂肪酸と長鎖アルデヒドを培地へ添加し細胞画分の抽出物を質量分析しHcCYP4G_77の触媒能を評価した。この結果、本遺伝子の基質が必須脂肪酸ではなく、必須脂肪酸由来のアルデヒドであり脱カルボニルを経て性フェロモン前駆体を生合成した。この結果を踏まえて、RNAシークエンス結果を再解析しHcCYP4G_77と同じく表皮クチクラで特異的に発現する還元酵素を2コピー発見した。これらの遺伝子をそれぞれHcFAR_163、HcFAR_174とし、機能解析のためにクローニングを行なった。感染時間など発現系の諸条件の検討や基質の精製などに時間を要したが、現在は解決した。ガ類の炭化水素型性フェロモンの生合成反応は見かけ上脱炭酸反応と考えらえていたが、本課題の成果により、実際は食草中の必須脂肪酸の還元・脱カルボニル反応の組み合わせである可能性が高まり、当該遺伝子機能を慎重に吟味している。本課題は、「部位」と「関わる酵素(遺伝子)」が現時点で共に不明なガ類の炭化水素型性フェロモンの生合成器官の実体を解明することを目指している。これまでに、アメリカシロヒトリの腹部トータルRNAの大規模シークエンスと、続くRT-PCRによる組織発現解析より炭化水素性フェロモン生合成に関する候補となるHc_Cyp4G77を見出し、同遺伝子が真皮細胞で特異的に発現する事がin situハイブリダイゼーションにより実証された。次に、この目的遺伝子を昆虫細胞で発現させ酵素機能を解析した。まず、長鎖脂肪酸を基質として試験したが、該当する炭化水素は検出されなかった。次に長鎖脂肪族アルデヒドの炭化水素を基質として試験を行なった結果、炭化水素への変換を認めたが変換効率が最大で数パーセントと低かった。この結果より、炭化水素型性フェロモンは多くの昆虫のクチクラ炭化水素の形成と同様に、脂肪酸から中間体アルデヒドを経由する二段階反応であると思われた。この仮説の確度を上げるためにHc_cyp4g77遺伝子の二本鎖RNAをオフターゲットを留意して遺伝子内の3か所でデザインし(dsRNA1-3)、二本鎖GFP処理区を陰性対照区としてRNAi法による機能解析を行なった。この結果として、dsRNA1処理区では主成分のフェロモン量が対照区と比べ19.2%まで低下した。dsRNA2とdsRNA3処理区では、対照区と比べてフェロモン量に有意差が無かったが昆虫細胞発現試験の結果と合わせて、アメリカシロヒトリの炭化水素型性フェロモンは真皮細胞においてHc_CYP4G77により、脂肪族アルデヒドより炭化水素に変換され生合成されることが示唆された。本研究の目的がガの炭化水素型性フェロモンの生合成の場を特定することであるため、今後は配列情報を獲得しているHc77CYP4Gの機能解析を優先的に行なう。また、質量分析より胸部からフェロモン炭化水素が発見されたことを踏まえて、in situハイブリダイゼーションによる胸部における遺伝子発現の確認も行なう。ガには炭化水素型性フェロモンのみならず、アワノメイガ類、カイコガなどの脂肪族型性フェロモンを分泌する種も多くいる。
ペクチン修飾システムの解析による根冠最外層脱離機構と根冠最外層分化機構の解明

本年度は昨年度発見したシロイヌナズナの根冠ムシレージについてその発生機構を詳細に解析した。まず、Propidiumu Iodideを用いて根冠ムシレージを染色することで、根冠ムシレージが蓄積するタイミングを明らかにした。また、透過型電子顕微鏡による詳細な観察により、根冠ムシレージが細胞膜と細胞壁の間に存在していることを明らかにした。さらに、根冠ムシレージの周囲に他の細胞では観察できない非常に大きな小胞が存在していることを発見した。これらの小胞によって根冠ムシレージが輸送されているのではないかと考えられた。また、ムシレージが蓄積しているc6細胞の周辺細胞に注目して観察したところ、6細胞やその次のc7細胞の基部側の細胞壁だけ薄くなっている様子が観察された。また、c6細胞とc7細胞の間では細胞壁が乖離しており、その間にムシレージが存在していたことから、薄くなった細胞壁を通ってムシレージが細胞壁の外へと出ているのではないかと考えられた。また、根冠のTerminal differentiationを制御していると報告されているBEARSKIN1(BRN1), BEARSKIN2(BRN2)がムシレージを制御しているのではないかと考え、解析を行った。まず、brn1 brn2二重変異体の根端をPI染色した結果、c6細胞に根冠ムシレージは観察されなかった。次に、根端に墨汁をかけると根やムシレージの領域には墨汁が入って行けないことを利用し、放出されたムシレージの量を定量した。その結果、brn1 brn2二重変異体では野生型と比べて有意にムシレージの放出量が少ないことが分かった。また、brn1 brn2二重変異体では野生型で見られた小胞が非常に小さいことが分かった。以上の結果から、BRN1とBRN2は冗長的にperiplasmic mucilageの蓄積を制御しているのではないかと考えられた。平成30年度が最終年度であるため、記入しない。植物の根端は静止中心を中心に様々な幹細胞が存在しており、絶えず細胞分裂と細胞伸長を繰り返している。その結果、植物の根は伸長することができる。しかし、根端分裂組織より先端に存在する根冠は一定のサイズを保ったままである。これは根冠細胞が最外層に達すると脱離することによって調整されているということが知られているが、根冠最外層細胞の脱離機構や、脱離することの必要性については不明な点が多い。筆者はこれまでに報告された組織特異的な公開マイクロアレイデータから根冠特異的に発現する遺伝子のリストを作成し、その中から脱離に機能すると思われる因子の解析を行った。中でも、細胞の接着や脱離に重要であることが知られている細胞壁の主要成分の一つであるペクチンの修飾酵素PME11に注目して解析を行った。筆者はPME11を欠損した変異体pme11を作出し、根冠最外層細胞の脱離が野生型と比べて正常に行われないことを観察した。また、植物の根冠細胞は脱離した後も一定時間生存し根圏の微生物との相互作用などを行うことが知られている。つまり、根冠細胞は最外層や脱離した後では遺伝子発現が劇的に変動していると考えられる。PME11のプロモーター下でGFPを発現させ、発現パターンを確認した所、根冠最外層のみで特異的に発現していることが明らかとなった。このことを利用し、根冠最外層細胞を単離しトランスクリプトーム解析を行うことで根冠最外層細胞の脱離機構や分化過程の謎に迫ることができると考えている。まず、PME11とGFPの融合タンパク質を発現する植物体を作出するためのコンストラクトを作製した。さらに、PME11の酵素活性測定を目的とした形質転換体の作出が現在進行中である。さらに、pme11変異体の表現型がPME11の欠損に由来することを確認するために、PME11遺伝子をpme11変異体に戻した相補株を作出中である。また、アリル変異体を獲得するためにCRISPR/Cas9法による遺伝子破壊株の作出を進行中である。さらに、電子顕微鏡を用いた根端組織の細胞壁の観察を行う予定であり、現在条件検討を重ねている。さらに、去年発表された論文ではペクチンの分解酵素であるポリガラクツロナーゼ(RCPG)が根冠最外層特異的に発現し、さらに欠損変異体では根冠最外層の脱離に異常があると発表された。現在、PME11とRCPGの二重変異体を作成中であり、両者の関係を明らかにしたいと考えている。また、根冠細胞の最外層に置ける分化機構の解明のために、根冠最外層特異的なPME11のプロモーターを利用したトランスクリプトーム解析を予定している。そのための植物体として、二つ用意している。一つはPME11のプロモーター下でH2B-GFPを発現する植物体で、FACSを用いて光る細胞だけを集めることで根冠最外層細胞だけを集めることができる。もう一つはBREAK-lineというシステムを用いることで、特定のプロモーター下の核のみを無傷で単離することができる。このシステムをPME11プロモーター用に改変した植物体を作出した。現在、以上の二つの方法の長所、短所を検討している。

まず、Propidiumu Iodideを用いて根冠ムシレージを染色することで、根冠ムシレージが蓄積するタイミングを明らかにした。また、透過型電子顕微鏡による詳細な観察により、根冠ムシレージが細胞膜と細胞壁の間に存在していることを明らかにした。さらに、根冠ムシレージの周囲に他の細胞では観察できない非常に大きな小胞が存在していることを発見した。これらの小胞によって根冠ムシレージが輸送されているのではないかと考えられた。また、ムシレージが蓄積しているc6細胞の周辺細胞に注目して観察したところ、6細胞やその次のc7細胞の基部側の細胞壁だけ薄くなっている様子が観察された。また、c6細胞とc7細胞の間では細胞壁が乖離しており、その間にムシレージが存在していたことから、薄くなった細胞壁を通ってムシレージが細胞壁の外へと出ているのではないかと考えられた。また、根冠のTerminal differentiationを制御していると報告されているBEARSKIN1(BRN1), BEARSKIN2(BRN2)がムシレージを制御しているのではないかと考え、解析を行った。まず、brn1 brn2二重変異体の根端をPI染色した結果、c6細胞に根冠ムシレージは観察されなかった。次に、根端に墨汁をかけると根やムシレージの領域には墨汁が入って行けないことを利用し、放出されたムシレージの量を定量した。その結果、brn1 brn2二重変異体では野生型と比べて有意にムシレージの放出量が少ないことが分かった。また、brn1 brn2二重変異体では野生型で見られた小胞が非常に小さいことが分かった。以上の結果から、BRN1とBRN2は冗長的にperiplasmic mucilageの蓄積を制御しているのではないかと考えられた。これまでの研究により、細胞の脱離には様々な細胞壁成分の変動が重要であることがわかっている。これまでにペクチンの修飾因子であるPME11とその分解酵素であるポリガラクツロナーゼ(RCPG)、セルロースの分解酵素であるCEL5が根冠最外層の脱離に関わっていることが明らかとなっている。これらの因子が協調的に働いて脱離が起こっていると考えると、これらの因子の多重変異体を作り、解析することで脱離機構のさらなる解明、そして脱離することの意義についても明らかにできると考えている。平成30年度が最終年度であるため、記入しない。