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網膜ジストロフィーの成因に関する基礎的および臨床的研究

網膜ジストロフィーの成因を解明するために基礎的および臨床的研究を多角的に進めた.1.基礎的研究視細胞膜表面または視細胞間質の複合糖質と網膜ジストロフィー成因との関連生を検討する方向でいくつかの基礎的研究を進めた.(1)ピーナツレクチン(PNA)がサルの網膜視細胞のうち錐体視細胞の細胞膜表面および周囲間質に結合し,杆体視細胞にはほとんど結合しないことをフェリチン標識PNAを用いて電子顕微鏡的レベルで検討した.視細胞と網膜色素上皮細胞におけるPNA認識複合糖質の局在をはじめて明らかにすることができた. (2)サル網膜中心窩の錐体視細胞は周辺部錐体細胞と同じようにPNAを結合する所見がみられた.この現象は, PNAを認識する複合糖質が杆体視細胞との間の隔壁としての役割をもつこと示唆する.(3)実験的にサル,ラットの網膜下腔に微量のレクチンを注入して,網膜に発生する変化を経時的に観察した.急性炎症が特定のレクチンで起こり,ついで広範な網膜変性が生じることが明らかになった.興味ある所見は,レクチンの種類によって変性部位に差異が認められることであった.(4)抗糖脂質抗体を用いて網膜における糖脂質の局在を検討した.(5)牛眼においては糖転移酵素は眼球諸組織で神経網膜および網膜色素上皮に最も顕著な活性を示した.網膜中心部と周辺部とで糖転移酵素活性に有意の差異が認められた.2.臨床的研究(1)網膜色素変性症患者についてリンパ球のさまざまな糖転移酵素活性を調べると,活性低下がしばしば認められた.(2)錐体ジストロフィー患者の末梢血において免疫生化学的検索を進めた.(3)レーベル先天盲の家族例を報告した.網膜ジストロフィーの成因を解明するために基礎的および臨床的研究を多角的に進めた.1.基礎的研究視細胞膜表面または視細胞間質の複合糖質と網膜ジストロフィー成因との関連生を検討する方向でいくつかの基礎的研究を進めた.(1)ピーナツレクチン(PNA)がサルの網膜視細胞のうち錐体視細胞の細胞膜表面および周囲間質に結合し,杆体視細胞にはほとんど結合しないことをフェリチン標識PNAを用いて電子顕微鏡的レベルで検討した.視細胞と網膜色素上皮細胞におけるPNA認識複合糖質の局在をはじめて明らかにすることができた. (2)サル網膜中心窩の錐体視細胞は周辺部錐体細胞と同じようにPNAを結合する所見がみられた.この現象は, PNAを認識する複合糖質が杆体視細胞との間の隔壁としての役割をもつこと示唆する.(3)実験的にサル,ラットの網膜下腔に微量のレクチンを注入して,網膜に発生する変化を経時的に観察した.急性炎症が特定のレクチンで起こり,ついで広範な網膜変性が生じることが明らかになった.興味ある所見は,レクチンの種類によって変性部位に差異が認められることであった.(4)抗糖脂質抗体を用いて網膜における糖脂質の局在を検討した.(5)牛眼においては糖転移酵素は眼球諸組織で神経網膜および網膜色素上皮に最も顕著な活性を示した.網膜中心部と周辺部とで糖転移酵素活性に有意の差異が認められた.2.臨床的研究(1)網膜色素変性症患者についてリンパ球のさまざまな糖転移酵素活性を調べると,活性低下がしばしば認められた.(2)錐体ジストロフィー患者の末梢血において免疫生化学的検索を進めた.(3)レーベル先天盲の家族例を報告した.複合糖質が網膜変性の成因にどの程度に関連するかを求める実験をさまざまな角度から行ない、以下に記する研究成果をあげることができた。1.基礎的成果として、ピーナツレクチンの網膜視細胞への結合性をサル網膜について調べ、それが中心窩錐体視細胞にも結合することを明らかにした。この事実は、網膜変性として錐体視細胞が選択的もしくは優位に障害される臨床疾患の病態理解のための有用な基礎的知見と思われる。2.シアル酸含有複合糖質の網膜における生合成について調べた。前駆物質として、放射標識アセチルマンノサミンをサル硝子体に注入し、経時的に眼球を摘出して光顕および電顕オートラヂオグラムを作成した。注入4時間後から視細胞内節や網膜色素上皮に標識物質の局在が証明された。過去の成績から、シアル酸の合成を示すとみなされるので、シアル酸含有複合糖質がこれらの組織に豊富に存在することが示唆される。3.さまざまなレクチンをラット網膜下腔に微量注入すると網膜変性が発生することを明らかにした。WGAレクチンは視細胞を含む網膜外層に主として変性を生じるのに対して、RCAレクチンは網膜全層におよぶ変性を生じることが判明した。この所見は複合糖質を介した変性と解釈されるから、網膜変性における細胞膜表面複合糖質の重要性が示唆される。この方法は、網膜変性の実験モデルを提供すると思われる。4.視細胞変性マウス網膜についてシアリルトランスフェラーゼ活性を測定すると、顕著な変動を示唆する所見を得た。5.網膜色素変性症患者の末梢リンパ球におけるシアリルトランスフェラーゼ活性を測定した。正常者と比較して、有為に活性の低下がみられた。この所見の解釈については今後の検討課題である。
機能性物質の階層的制御による光応答システムの設計に関する研究

4.5世代カルボキシレート末端または4世代アミン末端ポリアミドアミンデンドリマーで被覆した酸化チタン微粒子は、冷却した四塩化チタンをデンドリマーの冷水溶液に撹拌しながら注入して調製した(チタンイオンとデンドリマー末端基の数比は1:1)。未反応物質を除去するために透析処理を行った後に溶液の紫外-可視及び赤外吸収スペクトルを測定して、酸化チタン微粒子へのデンドリマーの結合を確認した。微粒子の大きさは透過型電子顕微鏡の観察により決定した。デンドリマーの種類と溶液のpHに依存するが,平均直径8から15nmの球形微粒子が観察された。デンドリマーで被覆した微粒子は水に十分に分散したが、非被覆微粒子は凝集して沈殿した。ゲスト分子2,4-dichlorophenoxyacetic acidの光分解を行うことによってこの微粒子-デンドリマーハイブリッドの光触媒作用を検討した。ハイブリッドとゲスト分子との混合水溶液に320nm以下の紫外線を照射し、照射開始後の時間変化に伴う蛍光スペクトル(励起波長254nm)の変化を測定した。ゲスト分子の357nmと398nmの蛍光バンドが検出されるが,そのうちの357nmの蛍光バンド強度が光照射と共に減少した。このバンド強度から算出したゲスト分子の濃度を照射時間の関数として図示し、デンドリマー被覆および非被覆酸化チタン微粒子間で比較したところ、デンドリマー被覆酸化チタン微粒子のほうが反応率は高かった。いずれの系においても、反応は初期(20分以内)の速い反応とその後の緩やかな反応の二段階で発生した。まとめると、デンドリマーを保護剤として用いることによって水分散性の高い酸化チタン微粒子を生成することに成功した。このデンドリマー被覆微粒子は2,4-dichlorophenoxyacetic acidの光分解触媒として作用することが分かった。反応率はデンドリマー非被覆微粒子よりも高かった。
ウナギの筋肉の性能が浸透圧ストレスによって変化する分子機構の解明

ウナギを淡水,50%人工海水および100%人工海水で飼育し,普通筋および血合筋における速筋型および遅筋型ミオシン重鎖遺伝子の発現比を解析した.その結果,50%人工海水で飼育した場合には,普通筋における速筋型ミオシン重鎖遺伝子の発現が抑制された.100%人工海水で飼育した場合には,より速筋型ミオシン重鎖遺伝子の発現が抑制され,相対的に遅筋型ミオシン重鎖遺伝子の発現量が増加することで,普通筋が浸透圧ストレスによって遅筋化することが示唆された.昨年度までの研究によって、ウナギが浸透圧ストレスを受けることによって、筋肉におけるミオシン・アイソフォームの発現パターンが変化することがわかった。そこで今年度は、速筋型ミオシン重鎖遺伝子と遅筋型ミオシン重鎖遺伝子の発現レベルと飼育水中の塩濃度の関係を詳細に調べた。また速筋型及び遅筋型ミオシン重鎖をそれぞれ特異的に認識する抗体の作製した。ウナギを淡水、50%海水および100%海水で一定期間飼育した。飼育後、普通筋および血合筋を採取した。淡水、50%および100%海水飼育ウナギの普通筋における速筋型および遅筋型ミオシン重鎖遺伝子発現量をリアルタイムPCR法により定量した。血合筋についても同様の解析を行った。さらに普通筋および血合筋筋原線維に対して、抗速筋型あるいは遅筋型ミオシン重鎖抗体を用いたウェスタンブロッティングを行った。普通筋における速筋型ミオシン重鎖遺伝子の発現量が、50%および100%海水で飼育した個体(海水飼育個体)では、平均で淡水飼育個体のそれぞれ4.2倍および1.7倍の値を示した。遅筋型ミオシン重鎖の発現量は、海水飼育個体では、平均で淡水飼育個体のそれぞれ6.6倍および44.9倍の値を示した。一方、血合筋における速筋型ミオシン重鎖の発現量は、海水飼育個体では、平均で淡水飼育個体のそれぞれ125分の1および500分の1の値を示し、遅筋型ミオシン重鎖の発現量は海水飼育個体では、平均で淡水飼育個体のそれぞれ10000分の1、1000分の1の値を示した。以上のことから、ウナギ筋肉では浸透圧ストレスによってミオシン重鎖アイソフォームの発現量が変化することが分かった。ウェスタンブロッティングの結果、ウナギ普通筋ではほぼ速筋型ミオシン重鎖しか存在しなかったものの、ウナギ血合筋には速筋型および遅筋型ミオシン重鎖の両方が存在することが分かった。ウナギを淡水,50%人工海水および100%人工海水で飼育し,普通筋および血合筋における速筋型および遅筋型ミオシン重鎖遺伝子の発現比を解析した.その結果,50%人工海水で飼育した場合には,普通筋における速筋型ミオシン重鎖遺伝子の発現が抑制された.100%人工海水で飼育した場合には,より速筋型ミオシン重鎖遺伝子の発現が抑制され,相対的に遅筋型ミオシン重鎖遺伝子の発現量が増加することで,普通筋が浸透圧ストレスによって遅筋化することが示唆された.ウナギは浸透圧ストレスをうけると筋肉のタイプを速筋型から遅筋型に変換させている可能性が考えられているが、その分子メカニズムは分かっていない。そこで本研究では、筋収縮タンパク質であるミオシンに着目し、速筋型ミオシンアイソフォームと遅筋型ミオシンアイソフォームの発現パターンが、浸透圧ストレスによってどのように変化するのかを調べることを目的とした。まず本年度は、ミオシンアイソフォームの発現パターンをタンパク質レベルで明らかにするために、ウナギ筋原線維を電気泳動に供し、ミオシンアイソフォームの発現パターンを調べた。淡水、50%海水および100%海水で飼育したウナギから筋肉を採取し、普通筋と血合筋に分け、それぞれから筋原線維を抽出した。筋原線維をSDSポリアクリルアミドゲル電気泳動に供した。泳動パターンから主たる筋原線維タンパク質が確認されたものの、ミオシンアイソフォームを分離するには至らなかった。次に筋原線維を二次元電気泳動に供した。市販のゲルストリップを用いて一次元目の等電点電気泳動を行い、続いて二次元目のSDS-PAGEを行ったが、一次元目で筋原線維タンパク質がうまく分離されなかった。そこで、一次元目にアガロースゲルを用いて同様に二次元電気泳動を行ったところ、筋原線維タンパク質がうまく分離され、複数のミオシンアイソフォームを確認することができた。現在のところ、十分なデータは得られていないが、各試験区のウナギ筋肉について解析を続けている。本年度の研究成果によって、浸透圧ストレスによるミオシンアイソフォームの発現パターンの変化を遺伝子レベルだけでなく、タンパク質レベルでも解析することが可能となり、より詳細にウナギ筋肉タイプの変換メカニズムを解析できるようになった。浸透圧ストレスによるミオシンアイソフォームの発現パターンの変化をタンパク質レベルで解析することを目指し、電気泳動法を用いることによって速筋型および遅筋型ミオシンアイソフォームの分離を試みたが、電気泳動の条件設定に時間を要した。最終的には本年度内に最適条件の設定に成功したものの、当初の計画からは遅れる結果となった。本年度確立した電気泳動によるミオシンアイソフォームの発現パターン解析法を用いて、各試験区すなわち淡水、50%海水および100%海水で飼育したウナギの筋肉における、速筋型および遅筋型ミオシンアイソフォームの発現パターンを解析する。また、遺伝子レベルでのミオシンアイソフォーム発現パターンと、タンパク質レベルでの発現パターンを比較解析するために、ミオシンアイソフォーム遺伝子の発現パターンを解析する。

さらに、速筋型および遅筋型ミオシンアイソフォームをそれぞれ認識する抗体を作製し、免疫組織化学の手法を用いて、ウナギ筋肉におけるミオシンアイソフォームの分布を解析する。これら実験から得られた結果をもとに、ウナギが浸透圧ストレスによってどのように筋肉の性能を変化させているのかを分子レベルで考察する。速筋型および遅筋型ミオシンアイソフォームをそれぞれ特異的に認識する抗体を作製するための経費が必要となる。試薬類などの消耗品を購入する経費が必要となる。研究遂行のための情報収集や、他研究者との研究打合せ、学会での研究発表のための旅費が必要となる。
グルタミン酸虚血下分節注入モデルによるRiluzoleの評価-Amyotrophic lateral sclerosis(ALS)にたいする薬理学的脊髄保護の開発-

近年、脊髄を含む中枢神経系の興奮性神経伝達物質であるグルタミン酸のneurotoxicityと,ALSの病態発生との関係が報告されている。Amyotrophic lateral sclerosis (ALS)は,進行性の神経変性疾患であり,脊髄のmotor neuronの変性をきたす致死的な疾患であるが,有効な治療法は確立されていない。glutamate neurotoxicityを減弱する薬物であるriluzoleは,臨床治験ではじめて進行を遅らせる効果が報告された唯一の薬剤であるが、in vivoでは特異性の高い実験動物モデルが乏しく、その有効性や作用機序を解明することが困難であった。グルタミン酸虚血下分節注入モデルで,riluzoleおよびAMPA/kainate受容体の選択的阻害薬、2,3-dihydroxy-6-nitro-7-sulfamoyl-benzo(f)-quinoxaline(NBQX)との併用効果をin vivoで評価した。実験動物は3.5-4.0kgのNew Zealand white rabbitを使用した。A群(n=7)では,術前10日間,riluzole 100mg/kg/dayを経口投与した.B群(n=7)はcontrolとして通常の水,食餌を与えた.New Zealand white rabbitを開腹し、腹部大動脈を腎静脈の直下およびbifurcation直上で剥離した。カテーテルを右大腿動脈から腹部大動脈にむけ挿入、その先端はbifurcationから5mm上の位置に固定した。50mMのグルタミン酸溶液を2ml/minの注入速度でカテーテルから注入した。同時に腹部大動脈を左腎静脈直下で遮断、カテーテルをbifurcationで外側から締め、血流を遮断した。5分後、血流を再開、同時に注入も停止した。C群(n=8)とD群(n=8)は,術前10日間,riluzole 100mg/kg/dayを水に混ぜ投与した.E群(n=8)はcontrol群として,通常の水,食餌を術前与えた.C群は、溶解液のみ分節注射したのち、50mMのグルタミン酸溶液を2ml/minの速度で5分間注入しつつ血流を遮断した。D群およびE群は4mg/kgのNBQXを分節注射したのち、同様に実験を進めた.神経学的所見をTarlovのmodified scoreに従い、手術後、12、24、48時間後、評価した。A群のTarlov scoreは、3.7±1.6,B群は0.8±0.6とA群でB群より有意に良好な回復を示した(p<0.05)。C群は3.2±0.6,D群は4.1±0.5、E群は2.3±0.7とD群でC群,E群より有意に良好な回復を示した(p<0.05)。病理組織学的検索では、C群,E群では、灰白質とくにventral hornの神経細胞の脱落が著明であったが、D群では軽度のeosinophilic changeのみで、灰白質は保護されていた。Riluzoleは、グルタミン酸虚血下分節注入モデルでAMPA/kainate受容体阻害薬であるNBQXとの併用効果をin vivoで示した。今後さらに検討することで新しい治療プロトコールの開発が期待できる.近年、脊髄を含む中枢神経系の興奮性神経伝達物質であるグルタミン酸のneurotoxicityと,ALSの病態発生との関係が報告されている。D群およびE群は4mg/kgのNBQXを分節注射したのち、同様に実験を進めた.

神経学的所見をTarlovのmodified scoreに従い、手術後、12、24、48時間後、評価した。A群のTarlov scoreは、3.7±1.6,B群は0.8±0.6とA群でB群より有意に良好な回復を示した(p<0.05)。C群は3.2±0.6,D群は4.1±0.5、E群は2.3±0.7とD群でC群,E群より有意に良好な回復を示した(p<0.05)。病理組織学的検索では、C群,E群では、灰白質とくにventral hornの神経細胞の脱落が著明であったが、D群では軽度のeosinophilic changeのみで、灰白質は保護されていた。Riluzoleは、グルタミン酸虚血下分節注入モデルでAMPA/kainate受容体阻害薬であるNBQXとの併用効果をin vivoで示した。今後さらに検討することで新しい治療プロトコールの開発が期待できる.【本年度の研究結果】近年、脊髄を含む中枢神経系の興奮性神経伝達物質であるグルタミン酸のneurotoxicityと,ALSの病態発生との関係が報告されている。特に,glutamate neurotoxicityを減弱する薬物であるriluzoleは,臨床治験ではじめて進行を遅らせる効果が報告された唯一の薬剤である.本研究ではグルタミン酸虚血下分節注入モデルを用いて,riluzoleの脊髄保護作用をin vivoで評価することを目的とする。実験動物としては,New Zealand white rabbitを用い,A群,B群の2群に分けた.A群(n=7)では,術前10日間,riluzole 100mg/kg/dayを水に混ぜ投与した.B群(n=7)はcontrol群として,通常の水,食餌を術前与えた.動物を全麻、自発呼吸下にて、正中切開で開腹し、腹部大動脈を腎静脈の直下およびbifurcation直上で剥離した。ヘパリンを静注、カテーテルを右大腿動脈から腹部大動脈にむけ挿入、その先端はbifurcationから5mm上の位置に固定した。30mMのグルタミン酸溶液を2ml/minの注入速度でカテーテルから注入し、同時に腹部大動脈を左腎静脈直下で遮断、カテーテルをbifurcationで外側から締め、血流を遮断した。5分後、血流を再開、同時に注入も停止した。注入用のカテーテルを抜去し、腹壁を2層に閉じた。神経学的所見をTarlovのmodified scoreに従い、手術後、12、24、48時間後の各時点において、評価した。A群では,Tarlov scoreは、3.7±1.6,B群は0.8±0.6とA群でB群より有意に良好な回復を示した(p<0.05)。病理組織学的検索では、B群の脊髄標本では、灰白質とくにventral hornの神経細胞の脱落が著明であったが、A群では軽度のeosinophilic changeのみで、灰白質は保護されていた。Riluzoleは、グルタミン酸虚血下分節注入モデルで脊髄保護作用をin vivoで示した。【本年度の研究結果】Amyotrophic lateral sclemsis(ALS)は,進行性の神経変性疾患であり,脊髄のmotor neuronの変性をきたす致死的な疾患であるが,有効な治療法は確立されていない。
認知及び記憶に及ぼすカテゴリの効果

認知及び記憶は互いに独立した別個の機能ではなく,相互に密接な関連をもっている.図形,言語のいずれにおいても,どのように所与情報を認知するかということが,次の保持行動に大きな影響を及ぼす.本研究は認知と記憶を一連の情報処理過程においてとらえなおし,その相互関連性を総合的に検討したものである.61年度は非言語情報について検討し,幾何図形の要素である特徴について考察した.4特徴3数値より成る図形群を視覚提示し,注目すべき特徴を指定した実験群とこのような指示のない統制群における保持を比較し,図形の認知及び保持が特徴のような複数のサブグループによって分析可能であることを示した.次に特定の特徴に注目させ,認知を変えることによって生じる保持の変化を測定し,図形の複雑性もしくは認知及び保持に際しての困難度は特徴の種類数に主として影響されることを示した.これらの結果は,図形情報が特徴に基づいて複数に区分されて,認知され保持されることを示す.62年度は言語情報について検討し,語彙の認知と保持に及ぼす自然カテゴリとカテゴリ内での名詞の典型度について考察した.自然カテゴリの特性を検討するため8種のカテゴリに各々属すると考えられる名詞を自由想起させた.次にこれらのカテゴリの名詞約30種に対してカテゴリ内での典型度を7段階に評定させ,各カテゴリの大きさ,名詞の典型度について両者を比較検討した.これらの結果に基づいて,典型度,属するカテゴリの種類数,各名詞とそのカテゴリ名との意味関係を変化させた名詞群のリストを作成し,再生及び再認法によって保持を測定した.その結果,提示される名詞が属するカテゴリ数の増大につれて保持が減少することを示し,カテゴリによる語彙の構造化が保持の向上に寄与することを示した.認知及び記憶は互いに独立した別個の機能ではなく,相互に密接な関連をもっている.図形,言語のいずれにおいても,どのように所与情報を認知するかということが,次の保持行動に大きな影響を及ぼす.本研究は認知と記憶を一連の情報処理過程においてとらえなおし,その相互関連性を総合的に検討したものである.61年度は非言語情報について検討し,幾何図形の要素である特徴について考察した.4特徴3数値より成る図形群を視覚提示し,注目すべき特徴を指定した実験群とこのような指示のない統制群における保持を比較し,図形の認知及び保持が特徴のような複数のサブグループによって分析可能であることを示した.次に特定の特徴に注目させ,認知を変えることによって生じる保持の変化を測定し,図形の複雑性もしくは認知及び保持に際しての困難度は特徴の種類数に主として影響されることを示した.これらの結果は,図形情報が特徴に基づいて複数に区分されて,認知され保持されることを示す.62年度は言語情報について検討し,語彙の認知と保持に及ぼす自然カテゴリとカテゴリ内での名詞の典型度について考察した.自然カテゴリの特性を検討するため8種のカテゴリに各々属すると考えられる名詞を自由想起させた.次にこれらのカテゴリの名詞約30種に対してカテゴリ内での典型度を7段階に評定させ,各カテゴリの大きさ,名詞の典型度について両者を比較検討した.これらの結果に基づいて,典型度,属するカテゴリの種類数,各名詞とそのカテゴリ名との意味関係を変化させた名詞群のリストを作成し,再生及び再認法によって保持を測定した.その結果,提示される名詞が属するカテゴリ数の増大につれて保持が減少することを示し,カテゴリによる語彙の構造化が保持の向上に寄与することを示した.本年度は非言語情報の認知及び記憶をとりあげ、幾何図形を形成する要素となる特徴(feature)の認知と保持に及ぼす影響及び認知と保持の相互関連性について検討した。実験【I】に於いては、Bruneri(1956)を参考にして長方形の枠の数、枠内の記号の数、種類、色を特徴群とした4特徴各3数値(velue)より成る図形群を作成した。プロジェクションタキストスコープを用いて刺激を視覚提示し、注目すべき特徴を指示した実験群とこの様な指示のない統制群における保持を測定し比較検討した結果、図形の認知及び保持が特徴のような複数のサブグループによって分析可能であることを示した。次に特定の特徴に注目させ認知を変えることによって生じる保持の変化を測定し、枠に注目させると全体の保持は減少し記号の数に注目させると全体の保持が向上するという様に特徴の種類によって認知の変化が保持に及ぼす影響が異なることを明らかにした。これらの結果は図形情報が特徴に基づいて複数に区分されて認知され、保持される可能性を示唆している。実験【II】に於いてはこのような保持の容量が(1)1特徴内で保持し得る数値の限界(2)複数の特徴毎の数値を合計した限界(3)特徴の種類数の限界という3種の内のいずれによって規定されるかを明らかにする為Newmann(1977)を参考にして長方形内の横線の数と棒の長さを特徴群とした2特徴各6数値の図形群を作成しその保持を測定した。その結果図形全体の保持は実験【I】よりも実験【II】が優位であった。特徴内の数値の合計が同一であっても特徴の種類数の小さい実験【II】の方が再生が容易であるという結果は、幾何図形の複雑性もしくは認知及び保持に際しての困難度が、数値の種類数よりもむしろサブグループとなり得る特徴の種類数によって影響される可能性を示唆しているということが出来る。
大腸菌プリンヌクレオチド生合成系制御蛋白質PurRの構造と機能

本研究は大腸菌プリンヌクレオチド生合成系の制御因子であるDNA結合蛋白質PurRの構造と機能の関係を明らかにすることを目的としている。PurR蛋白質の効率の良い大量発現系を作成するための前段階として、本年度もPurR蛋白質をコ-ドするpurR遺伝子の発現制御機構の解析を行った。昨年度は、種々のDNA断片を用いたゲル・シフト・アッセイおよび変異型Pur boxを用いたpurR遺伝子の発現の解析を行い、PurR蛋白質の2つのPur boxへの結合は、親和性の差はあるものの非協同的であることと、2つのPur boxは発現抑制効果の点ではほぼ同程度であり、効果的な抑制のためには両方とも必要であることが明らかとなった。また、変異型Pur boxとPurR蛋白質の結合の解析から、Pur boxのどの塩基がPurR蛋白質との相互作用に重要な役割を果たしているかについて示唆を得ることができた。本年度はこれをさらに進め、purR遺伝子の自己制御が転写の開始の段階に働いているのか、それとも転写の伸長の段階に働いているのかを明らかにするために、転写産物の詳細な解析を行った。その結果、過剰のアデニンが存在する培地中で培養した菌より抽出したRNAは、アデニンが存在しない培地で培養した菌より抽出したRNAと比較してPur boxのところで転写がポ-ズしている転写産物をより多く含んでいることがわかった。このことは、制御が転写の伸長を阻害することによってなされていることを示唆する。今後は、2つのPur boxを壊したpurRを大量発現系につないで効率よくPurR蛋白質を発現させ、精製を行ってゆきたい。
非線形微分方程式の解の漸近挙動の研究

幾何学,物理学に現れる非線形問題の解明に不可欠である非線形微分方程式の解の漸近挙動に関する問題について,従来の微分方程式論に実関数論,力学系理論を加えた方法による研究を行い,非線形楕円型,放物型微分方程式に対して多くの研究成果を得た.本研究の成果には微分幾何学,トポロジー,数理生態学,最適化理論において重要な結果が含まれている幾何学,物理学に現れる非線形問題の解明に不可欠である非線形微分方程式の解の漸近挙動に関する問題について,従来の微分方程式論に実関数論,力学系理論を加えた方法による研究を行い,非線形楕円型,放物型微分方程式に対して多くの研究成果を得た.本研究の成果には微分幾何学,トポロジー,数理生態学,最適化理論において重要な結果が含まれているp-調和写像の解析的性質についての研究を行った.n次元Riemann多様体Mから別のRiemann多様体Nへのp-調和写像の列はp-energyが一様有界でもコンパクトになるとは限らないことが知られているが,pがn未満の自然数の場合にはコンパクト性が成り立たない場合に障害として現れるdefect measureと呼ばれるRadon測度を(n-p)次元のHausdorff測度とrectifiable集合を用いて具体的に記述できることを示した.さらにその応用としてp-調和写像に対するコンパクト性定理を示した.数理生態学のパターン形成モデルの1つとして有名なGierer-Meinhart系で特に弱い飽和効果を取り入れたモデルにおいて,空間多次元軸対称領域上で多重ピークをもつ定常解の構成を行った.ラグランジュはめ込みのフレアー理論を研究した.具体的には、シンプレクティック多様体Mの中の,横断的な自己交差をもつラグランジュはめ込みに対して,境界付きリーマン面からMへの安定写像で,境界値がラグランジュはめ込みに含まれるようなもののモジュライ空間を調べ,そこからA無限大代数を構成した.カオス的な振る舞いをする力学系の(規格化した)再帰時間の極限分布を調べ,力学系の性質と再帰時間(極限)分布の形がどのように関連しているかを研究した.特に,有限不変測度を持たないような例に対し,再帰時間の規格化の方法を工夫し,極限分布の形とカオスの程度との関係の解析を行った.1.p-調和写像の解析的性質についての研究を行った.n次元Riemann多様体Mから別のRiemann多様体Nへのp-調和写像の列はp-energyが一様有界でもコンパクトになるとは限らないことが知られているが,pがn未満の自然数の場合にはコンパクト性が成り立たない場合に障害として現れるdefectmeasureと呼ばれるRadon測度を(n - p)次元のHausdorff測度とrectifiable集合を用いて具体的に記述できることを示した.さらにその応用としてp-調和写像に対するコンパクト性定理を示した.コンパクト性定理と密接な関係をもつLiouville型定理をp-調和写像に対して証明した.2.数理生態学におけるパターン形成モデルとして有名なGierer-Meinhardt系で,特に弱い意味での飽和効果が考慮された反応拡散方程式系において,軸対称領域上で,いくつも指定した有限個の点に凝縮した形状をもつ定常解の構成に成功した.3.Dirichlet境界条件下で,拡散効果を持ったロジスチックモデルにおける漁獲最適戦略問題を提唱し,対応する数理モデルにおける最適戦略解の存在,定性的および定量的性質の研究を行った.この問題は,ある制限された条件を満たす捕獲戦略のうち,魚の定常パターンが持つエネルギーを最小にするような捕獲戦略は何か?を問うもので,漁獲量を最大にする戦略等とは異なり,魚(あるいは魚の環境)にとって最もよい捕獲戦略を考える問題ともいえる.
内視鏡手術におけるスコピストの手技評価とトレーニングシステム開発に関する研究

内視鏡手術におけるスコピストの技量を評価するシステムを構築した.開発したシステムの妥当性を評価するために学会場で被験者を募り,乳児サイズのドライボックスを用いて,被験者にスコープでドライボックス内に配置されたマーカーを捕捉したり,ボックス側面のラインを追跡したりするタスクを課し,スコピストとしての手技を評価した.本システムは研修医と非研修医の間にスコピストとしての技術の差を見出すことができた.また,マーカー捕捉というシンプルなタスクにおいても技術の差があるとわかった.実験終了後に行ったアンケートでは,スコピストの手技評価として,また,トレーニングとして有用な可能性があると評価された.内視鏡手術では奥行情報が欠如し,触覚を用いることができないため,モニタに映し出される視覚情報は極めて重要である.内視鏡手術の術者には高度な技術が必要とされ,ドライボックス,バーチャルリアリティ(VR)シミュレータ,動物を用いたハンズオンコースなど,術者用の様々な手技評価手法やトレーニングが開発されてきた.しかし,術中に術者の目として重要な役割を果たすスコピストに関する研究は少なく,スコピストのトレーニング方法は確立されていない.VRシミュレータの中には,スコピスト訓練用のプログラムが搭載されているものもあるが,日常臨床においては,多くの場合,練習する機会を与えられることもなく,突然に若手医師にスコピストの役割が巡ってきて,手術中に厳しい指導を受けながらその技術を身に付けていくのが現状である.そこで本研究の目的は,医工連携により,スコピストの技量を定量的に評価するシステムを構築し,スコピストとして必要な技術を習得するためのトレーニングシステムを開発し,最終的には,術者とスコピストがチームとしてトレーニングをすることが可能なシステムを構築することである.平成27年度は,小児用の小さなドライボックスを作成し,スコープにセンサを取り付けてスコープ先端の速度(加速度)を測定しつつ,スコープが取得した画像をリアルタイムに処理する技術を用いて,スコピストの手技評価が可能なシステムを構築した.さらに,ドライボックス内に配置されたマーカーやラインを指定された順番に描出していくというタスクを考案した.平成27年度は,ドライボックスやスコープにセンサを取り付け,スコープが取得した画像をリアルタイムに処理する技術を用いて,スコピストの手技評価が可能なシステムを構築することと,スコピストのためのトレーニングタスクを考案して妥当性を評価することを計画した.前述の如く,実験は概ね予定通り遂行された.本研究の目的は,スコピストの技量を定量的に評価するシステムを構築し,スコピストとして必要な技術を習得するためのトレーニングシステムを開発することである.平成28年度は,前年度に作成したシステムを用いて,スコピストの手技評価実験を行った.乳児サイズのドライボックス上面中央から30°斜視鏡を挿入し,乳児骨盤内手術を模した下記タスクを設定した.1左右ワーキングポート挿入部に配置したマーカーを捕捉して静止.2底面上の正面およびその左右に配置されたマーカーを補足して静止.3左側面,正面,右側面上の水平線を,水平を保ちながら描出・移動する.学会に出展して被験者を募り,タスク終了後にアンケート調査を行った.また,手技時間を計測した.被験者52人中,初期研修医5名が含まれていた.ボックスのサイズ,スコープ挿入位置,タスク設定が臨床と似ているかというアンケート結果(5点満点)は,それぞれ4.0, 3.9, 3.6であった.本システムがスコピストの手技評価として,初心者のトレーニングとして,被験者自身のトレーニングとして有用かという質問の結果は,4.1, 4.3, 4.2点であった.全タスク遂行時間は研修医群(508秒)が非研修医群(269秒)よりも長く(p = 0.04),マーカー捕捉タスク合計時間(1,2の合計)は研修医群(244秒)が非研修医群(124秒)よりも長かったが(p = 0.04),3のライン描出タスク遂行時間に両群間で有意差を認めなかった.アンケート結果からは,本システムはスコピストの手技評価及びトレーニングに有用な可能性があり,ボックスサイズは臨床と類似していたが,スコープ挿入位置とタスク設定に改善の余地があった.タスク遂行時間は研修医において長く,研修医と非研修医の間にスコピストとしての技術の差があった.マーカー捕捉はライン描出よりも難しかった.平成28年度は,昨年度開発したシステムおよびタスクが,スコピストの手技評価に妥当なものであるかどうかを評価した上で,スコピストのトレーニングツールとして有用かどうかを評価する実験も行う予定であったが,妥当性評価実験において改善の余地があることが判明し,有用性評価実験には進めなかった.本研究の目的は,スコピストの技量を定量的に評価するシステムを構築し,スコピストとして必要な技術を習得するためのトレーニングシステムを開発することである.

平成28年度は,前年度に作成した乳児サイズのドライボックスを用い,被験者にスコープでドライボックス内に配置されたマーカーを捕捉したり,ボックス側面のラインを追跡したりするタスクを課し,スコピストとしての手技を評価するシステムを考案した.また,本システムの妥当性を評価するために学会場へ出展して被験者を募り,データを収集・解析した.今年度は,平成28年度に行ったスコピスト手技評価システムの妥当性実験で明らかになった改善点を修正したあと再度妥当性評価実験を行い,また,考案したタスクがスコピストのトレーニングとして有用かどうかを評価する実験も行う予定でいた.しかし,前年度の実験結果はワーキングスペースが小さな小児外科特有のものであるのか,成人外科においても同等の結果が得られるのかを先に検証すべきであると考えを改め,計画の変更を行ったことから,システムの変更を行うにとどまった.3年間の研究期間を通じて,我々の作成したシステムは研修医と非研修医の間にスコピストとしての技術の差を見出すことができることがわかった.また,マーカー捕捉というシンプルなタスクにおいても技術の差が出るということがわかった.さらに実験終了後に被験者に対して行ったアンケートでは,スコピストの手技評価として,また,トレーニングとして有用な可能性があると評価された.内視鏡手術におけるスコピストの技量を評価するシステムを構築した.開発したシステムの妥当性を評価するために学会場で被験者を募り,乳児サイズのドライボックスを用いて,被験者にスコープでドライボックス内に配置されたマーカーを捕捉したり,ボックス側面のラインを追跡したりするタスクを課し,スコピストとしての手技を評価した.本システムは研修医と非研修医の間にスコピストとしての技術の差を見出すことができた.また,マーカー捕捉というシンプルなタスクにおいても技術の差があるとわかった.実験終了後に行ったアンケートでは,スコピストの手技評価として,また,トレーニングとして有用な可能性があると評価された.今年度は,まず,構築したスコピスト手技評価システムの妥当性を評価するために,医師や研修医,医学生を対象としてタスクを行ってもらい,データを蓄積して解析する.将来的には,被験者に対して自身の手技レベルをフィードバックすることができるようなシステムの完成を目指す.また,考案したタスクがトレーニングとして有用かどうかを評価する実験も行いたい.今年度は,まず,平成28年度に行ったスコピスト手技評価システムの妥当性実験で明らかとなった改善点を修正し,再度妥当性評価実験を行う.また,考案したタスクがトレーニングとして有用かどうかを評価する実験も行いたい.小児内視鏡手術既存の物品をできる限り使用し,物品を新規購入する際にも徹底的に市場調査を行って同等の製品の中で安価なものを選択するというコスト削減により,システム開発費を低額に抑えることができたため.妥当性評価実験を行った学会会場が近隣であったため,実験器具の運搬費や交通費が当初予測よりも安価で済んだこと,また,学会側の配慮により出展費用が予測よりも安価で済んだ.また,有用性評価実験に進めなかったことから,費用がかさまなかったために次年度使用額が生じた.システムの改良,および,実験遂行費(会場費,物品運搬費など)に充てる予定.主にシステムの改良費に充てる予定.また,最終年度であることから,成果発表用に用いる予定.
日韓文化の比較-国宝臼杵石仏の真名野長者伝説と韓国国宝弥勒寺址石塔の末多王伝説-

本研究は、日本の国宝臼杵石仏の真名野長者伝説と韓国の国宝弥勒寺址石塔の末多王伝説との歴史的比較研究を具体的に試みたものでる。研究結果をまとめれば次のようである。(1)韓国の「末多王伝説」と日本の「真名野長者伝説」を総合的に検討し、「真名野長者伝説」に比べ、「末多王伝説」はその主人公の王権神話を志向したため、主人公末多王の神秘的出生が強調されており、日本の場合、三輪明神が登場しており、この物語と深く関わった三輪(大神)氏が重要な存在として浮上してきた。(2)韓国の「末多王伝説」の主人公「薯童」は、なぜ「真名野長者伝説」のように炭焼きを職業とせず、「薯童」となっているのかを検討してみた。大分県宇佐などでは炭をイモジと言い、「イモヅル」とか「金ヅル」という言葉は、鉱山師が使う隠語であったことから考えると、韓国の薯童も単なる薯掘の童ではなく、炭を焼いて鉄を製錬する鋳物師・鍛冶族であったことを明らかにした。(3)「末多王伝説」の主人公・末多王は、『日本書紀』によれば、筑紫国(九州)から朝鮮半島に渡って百済王になったと記されている。末多王は百済の東城王のことであり、彼の異称は「牟大」などと表れており、任那系統の牟氏族である可能性を提示した。九州には今でも牟田の地名がたくさん残っているように、当時、九州は牟氏族の本拠地であり、真名は実在した人物で『日本書紀』の武烈天皇五年条に見える「麻那王」と同一人物であり、その「麻那王」は東城王の息子であり、政権争いに敗れ、大分に移り住み、それによって真名野長者伝説の原型も一緒に運ばれたことを究明した。最後に本研究がきっかけとなり、大分県豊後大野市と韓国全羅北道益山市が2005年8月に友好交流協定を結んだ。韓国からの研究者・祭りへの相互訪問、研究会組織、伝説に因んだ商品開発など、日韓交流のブームがまきおこっていることはこの研究の重要性と意義が証明されたことであろう。本研究は、日本大分県の国宝臼杵石仏と蓮城寺(内山観音)の「真名野長者伝説」と韓国国宝弥勒寺址石塔の「末多王伝説」の歴史的比較研究を行なうことに目的がある。今回の研究では、大分県臼杵市・三重町と韓国現地を訪問して資料調査などを行ない、その伝説の背景にある歴史的背景を探ることによって伝説・物語の成立過程、文化交流の歴史を展望することができた。『日本書記』によれば、「末多王伝説」の主人公である百済国の末多王は、九州(筑紫国)出身で百済国に渡り、王様になった人物であることが考えられる。特に今回の研究、現地調査を通して次のような成果が得られた。(1)韓国の研究者は従来、「末多王伝説」の主人公である「薯童」について、「薯を掘る童子」と解釈してきた。

しかし、日本の「真名野長者伝説」の資料、伝承地を調査・検討した結果、「薯童」は単なる薯を掘る童ではなく、砂鉄・黄金を掘り出し、炭を焼いて鉄を製錬する鋳物師・鍛冶族で、その財力などをもとに百済の王様(末多王)になったことが考えられる。(2)韓国の「末多王伝説」の内容は日本の「真名野長者伝説」にきわめて類似しているが、「真名野長者伝説」では主人公の名が炭焼き小五郎であり、炭焼きは鋳物が主業で、炭焼きは副業である点、「イモヅル」とか「金ヅル」という言葉は鉱山師が使いはじめたこと、大分県宇佐地方では炭をイモジというところから考えると、韓国の薯童も、単なる「薯を掘る童子」ではなく、「炭焼きの童子」、または「鋳物師」か「鍛冶屋」とみるのが妥当である。また、現地調査などを通じて、両国の伝説が歴史的にも文化的にも深く関わりがあることも確認できた。今後の課題としては、真名氏族と末多王との関わりなどを探ることによって伝説・物語の成立過程を明らかにし、真名野長者伝説を通して古代においての九州と韓国の文化交流の歴史を究明したい。またその研究成果を地域に還元したい。本研究は、日本大分県の国宝臼杵石仏と蓮城寺(内山観音)の「真名野長者伝説」と、これと極めて類似している韓国国宝弥勒寺址石塔の「末多王伝説(薯童伝説)」の歴史的比較研究を行なうことに目的があった。今回の研究、現地調査を通して次のような成果が得られた。(1)『三国遺事』の「武王物語」として記されている武王は実は武王ではなく、百済国の第二十四代の「東城王(末多王)」である可能性が高い。武王の幼名は、「薯童(まと)」である。『日本書紀』によれば、百済国の「東城王」を「末多王(またおう)」としているが、この「末多(また)」は「薯童(まと)」の音に通じる。「東城王」について、『三国史記』には「牟大」、『南史』『南斉書』『梁書』の「百済伝」には「牟都」の子、または孫として「牟大」が見える。『日本書紀』に「任那王、己能末多干岐(このまたかんき)が来朝した」という記録が見え、この任那の「己能末多干岐(このまたかんき)」は、百済の「末多王」と同系列の名前と見ることもできる。したがって、東城王は任那(伽耶)と同系統の百済王と見ることができる。(2)『新撰姓氏録』に、「三間名公、彌麻奈国主牟留知王之後也」とあって、三間名公は牟氏族であり、崇神天皇は「御間城(那)」と関わる人物なので牟氏族である可能性がある。「三間名」の異称は、「御間名」「彌麻奈」「美麻奈」「彌麻那」となっており、「真名野長者物語」の「真名」、『日本書紀』の「麻那」は任那と同族である牟氏であることが考えられる。(3)大分県の国宝臼杵石仏と蓮城寺(内山観音)の「真名野長者伝説」の主人公である「真名」は実在した可能性がきわめて高い。真名野長者の「真名」は当て字で、『日本書紀』に見える、「麻那王」と同一人物・氏族で百済の東城王の息子と考えられる。「真名」(麻那)という氏族は祖先が九州出身で、おそらく製鉄集団であると思われるが、この真名王族が政権争いによって大分県に移動し、それによって真名王族の神話とも言える「真名野長者物語」も一緒に運ばれたのではないかと思われる。最後に本研究がきっかけとなり、大分県豊後大野市と韓国益山市が2005年8月に友好交流協定を結んだ。韓国からの研究者・祭りへの相互訪問、研究会組織、伝説に因んだ商品開発など、日韓交流のブームがまきおこっている。
Ｉｎ　ｓｉｔｕ計測による脂質、膜受容体の活性化機構の解明

構造生物学、分子生物学本研究ではin-cell NMRやin-cell ESRなどの磁気共鳴の手法を中心に細胞内や細胞表層で形成される過渡的なたんぱく質複合体のその場(in situ)観察・解析のための手法の開発と細胞機能の解析を目的とする。解析対象として、1)脂肪酸シャペロン(FABP)による細胞質におけるlipokineの認識と転写因子への伝達、2)自然免疫応答を担うToll様受容体(TLR)がアダプター分子と形成するシグナル開始複合体、3)リガンド結合に誘起される代謝型グルタミン酸受容体(mGluR)の2量体構造の動的変換、などの3つの系を取り上げる事とした。平成21年度後半においては、1)に関してはFABP4のアポ体、及び脂肪酸結合状態における主鎖15N各緩和時間測定を行い、運動性をモデルフリーn手法で解析した。またFABP4のCell Penetrating PeptideによるヒトHeLa細胞への導入を検討した。またさいぼうないしぐなるでんttにおいてうFABP4の下流に位置する可能性がある、ペルオキシソーム増殖剤活性化受容体(PPAR・: peroxisome proliferator-activated receptors gamma)を取り上げた。これは2型糖尿病、動脈硬化や肥満といった生活習慣病の装薬標的蛋白質として注目されているが、SUMO化による活性調整が報告されている。その分子機構を明らかにすべく、PPAR・-りがんど結合ドメインを大腸菌内SUMO化系を試みたが、SUMO化PPAR・の試料は得られなかった。この原因として、PPAR・-LBDのSUMO化サイトが構造上埋没した位置にあることが挙げられる。今後はSUMO化E3として機能すると提案されている、PIAS1を使ったin vitro SUMO化による試料調製を森川グループにて進める予定である。我々はこれまでに、細胞内にある状態での、タンパク質のNMRスペクトルやESRスペクトルを取得し解析する手法を開発してきた。また、この「In-cell NMR/ESR法」によって細胞内タンパク質の分子間相互作用、プロセッシング、運動性・安定性が原子レベルで解析可能であることを示してきた。本研究ではこれら手法を中心として、細胞内や細胞表層で形成される過渡的なたんぱく質複合体のその場(in situ)観察・解析のための手法を開発する。本年度は、フッ素^<19>FのNMRを用いたHeLa細胞でのIn-cell NMRの開発を重点的に行なった。我々は、これまで、^1H-^<15>NHMQC法を用いてIn-cell NMRを行なっていたが、二次元測定のため測定に時間がかかるという難点があった。^<19>Fによる部分標識を行なうことにより、一次元測定でもNMRシグナルを分離でき、そのため、測定時間の短縮が可能となる。まず、モデルタンパク質として、FKBP12を用い、そのフェニルアラニン(Phe)残基をp-フルオロフェニルアラニン(^<19>F-Phe)としたタンパク質を調製した。これを我々が開発したTAT-Ubタグを用いてHeLa細胞内に導入し、細胞を回収後、NMR測定を行なった。FKBP12には合計五つの^<19>F-Pheがあるが、当該In-cell ^<19>F NMRスペクトル中に、これら五つのNMRシグナルを観測することができた。本手法により測定時間および細胞の量が、ともに従来の半分以下でも十分に解析可能なスペクトルを得ることができた。さらに、FKBP12と相互作用するとされる免疫抑制剤FK506およびラパマイシンとの相互作用を細胞内で検出することに成功した。【脂質シャペロンFABP4の細胞内構造と相互作用の解析】FABP4をAlexa488で蛍光標識し、膜透過性TAT配列を用いてHeLa細胞内に導入できるかどうかを検討した結果、良好に導入できることを確認した。続いて、15N標識したFABP4にジスルフィド結合を介してTATペプチドを繋ぎ、これをHeLa細胞内に導入して、FABP4のin-cell NMRスペクトルを取得することに成功した。【Toll様受容体のシグナル伝達の制御】MyD88-TIRドメインを細胞導入するために、TAT-Ub-MyD88-TIRというコンストラクトを作成し、蛋白質の発現・精製を行った。得られた試料を293T細胞に導入し、TLR4依存的なNF-κBの活性化をアッセイしたところ、MyD88-TIRによるドミナントネガティブ効果に起因すると思われるNF-κB活性化の抑制が見られた。しかし、TAT-Ubのみを導入した場合でもある程度の抑制効果が見られた。これは、ユビキチン部位(Ub)の機能に拠る可能性があると思われたため、Ub部分に変異を入れ、その機能を抑えたコンストラクトを作成した。このUb変異体を使用することによりTAT-Ub部位によるNF-κB活性化の抑制は見られなくなった。【IL-18による受容体活性化機構の解明】IL-18を重水素化し、これとIL-18受容体との複合体を調製した。TROSY測定によって、受容体の結合界面を同定することに成功した。【19Fを使ったin-cell NMR】19F-標識したFKBP12を使ってin-cell 19F-NMRを試み、1H-15N HMQCよりも短時間・少量の細胞でも良好なスペクトルを得ることに成功した。また、FK506との相互作用をHeLa細胞内で検出することに成功した。

脂肪酸シャペロン・FABP4の脂肪酸輸送機構の解明を目指してダイナミクスと機能の関連を解析した。FABP4を15N標識し、NMR緩和時間測定(T1T2({1H}ー15Nへテロ核NOE)を行い、モデルフリー解析により回転相関時間と化学交換寄与及びオーダーパラメータを求めた。主鎖15核のT1/T2の値から、FABP4のヘリックス-ループ-ヘリックス領域(HLH領域)が基質非結合状態においてマイクロ秒秒時間スケールでゆらいでいることが示唆された。一方、基質であるANSを結合させると、HLH領域のRexが顕著に抑制され、新たにRexを有するようになる残基が多く存在することがわかった。さらに、FABP4 3-fluorotyrosineで標識したもののNOESY測定を行った結果、Tyr19の位置に挿入された19F間は二状態あり、その間に交換ピークが観測された。これは、HLH領域の構造のゆらぎによるものと考えられた。また、in-cell NMRスペクトルから、FABP4はHeLa細胞内ではアポ体であることが示唆された。Toll様受容体(TLR)の細胞内シグナルに関しては、リニア型ユビキチン鎖のin vitroでの物性解析を行った。熱変性実験の結果、モノユビキチンとユビキチン鎖では、熱安定性が異なることが分かった。すなわち、ユビキチン鎖の鎖長が長くなるに従って、変性温度が低下した。また、水溶液を攪拌し、剪断力を与えると、ユビキチン鎖が容易に沈殿し、繊維化することを見出した。一方で、モノユビキチンを同様の条件で攪拌してもこのような繊維化は起こらなかった。現在、細胞内環境下でも試験管内で見られたようなユビキチン鎖の繊維化が起こるのかどうかを検証している。本研究ではin-cell NMRを用いて、細胞内で形成される蛋白質複合体の構造や運動性・安定性をその場(in situ)観察・計測する手法の開発を目指した。・脂肪酸シャペロン蛋白質FABP4の解析リガンド結合により活性化された蛋白質はしばしば過渡的で不安定なためin vitroでの解析が困難であるので、細胞内等、in situで蛋白質の構造を観察する必要がある。モデル系として、FABP(Fatty Acid Binding Protein)4を用い、in-cell NMRによる細胞内での動的状態の解析を行うための準備として、まずin vitroで解析した。FABP4は細胞内における脂肪酸輸送に関与する蛋白質で、遊離脂肪酸や類縁体と結合し細胞内の特定部位に移動する。試験管内でのNMR緩和時間測定から、基質非結合状態でFABP4のhelix-loop-helix (HLH)領域がミリ秒の時間スケールで複数の立体構造間で有意に揺らいでいること、更にモデル基質であるANS(1,8-anilinonaphthalene sulfonate)の結合によりこの揺らぎが抑制されることがわかった。またANS結合によってHLHとは異なる部位で運動性の上昇が見られた。この構造揺らぎは、核内移行に際し、或いは移行後の他分子との相互作用を促進するものである可能性がある。より簡便・高感度なin-