hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
ヒトiPS細胞を用いたムコ多糖症におけるワクチンの免疫誘導効果の解析

Toll様受容体(TLR)を介した自然免疫応答を解析した結果、健常者由来のiPS細胞から分化した樹状細胞との比較では、zymosanとMALP2によるサイトカイン産生が健常者と比較してムコ多糖患者では低いことが示された。また、対照となる健常者の新生児期と成人期の自然免疫応答の差異について解析を進めたところ、新生児におけるTLRを介した自然免疫応答の未熟性は免疫細胞やTLRによって異なり、zymosanがTLR2を介して新生児に成人と同等の免疫応答を惹起できることがわかった。今後、同症小児患者に対するワクチン開発においては、zymosanをアジュバントに用いた開発が有用と考えられる。ワクチン接種による獲得免疫を誘導する上で、免疫誘導の出発地点となるのは自然免疫であり、樹状細胞などの抗原提示細胞に発現するToll-like receptor(TLR)である。本研究ではムコ多糖症患者の自然免疫応答を明らかにすることが目標の一つであるが、対照となる健常人の自然免疫応答についても不明な点が多い。具体的には、(1)ムコ多糖症患者の自然免疫応答を評価する上で基準値となる健常人の免疫応答に年齢に伴う変化、(2)10種類におよぶ多様なヒトTLRに応じた免疫応答の差、が不明であり本研究を円滑に推進していく上で重要なこれらの問題点を明らかにすることとした。実際には、新生児期の免疫を反映する臍帯血中の免疫担当細胞と健常成人の末梢血液中の免疫担当細胞(単球、樹状細胞、単球由来樹状細胞)を各種TLR作動薬で刺激し、それらの免疫担当細胞から産生される炎症性サイトカインを測定した。初年度は、ムコ多糖症患者から疾患特異的iPS細胞を樹立し、樹状細胞(DC)へ分化誘導することに成功した。DCの自然免疫応答を解析するためにTLRを介した炎症性サイトカインの産生を測定した結果、健常者由来のiPS細胞から分化したDCとの比較では、zymosanとMALPによるサイトカイン産生が健常者と比較してムコ多糖患者では低い事が示された。翌年度は、対照となる健常者の新生児期と成人期の自然免疫応答の差異について解析を進め、新生児におけるTLRを介した自然免疫応答の未熟性は免疫担当細胞やTLRによって異なり、zymosanがTLR2を介して新生児に成人と同等の免疫応答を惹起できる事を明らかにした。最終年度は、zymosanのワクチンアジュバントとしての有用性をさらに検討した。ZymosanはTLR2/TLR6ヘテロ二量体のリガンドとされているが、MALP2もTLR2/TLR6ヘテロ二量体であることから、zymosanとMALP2の間で自然免疫応答の活性化に差がないかどうかを評価した。その結果、単球とDCに関しては、zymosanとMALP2の間にサイトカイン産生の差は認めず、単球由来DCへのMALP2刺激によるサイトカイン産生に関しては、IL-8,IL-6,TNF-αは臍帯血群が成人血群よりも有意に高値であった。以上のことから、TLR2/TLR6ヘテロ二量体に対するリガンドであるZymosanとMALP2のサイトカインプロファイルは免疫担当細胞間で差がみられ、今後ムコ多糖症の小児患者に対するワクチンのアジュバントを開発していくためには、TLR2/TLR6ヘテロ二量体のリガンドが一様に候補となるわけではなく,Zymosanが活性化する経路に焦点をおいたアジュバント開発が必要であると考えられた。ムコ多糖症の疾患特異的iPS細胞から分化させたDCに関しては、培養条件によってプロファイルが一定しないという問題がみられたため、今後は安定した培養条件下で分化したDCを用いてzymosanを含めたTLRリガンドの反応性を検証していく。自然免疫を評価する上で要となるToll様受容体(TLR)の刺激による免疫応答について、本研究の比較対照となる健常者の年齢に伴う変化、TLRの種類や免疫担当細胞の種類による差異について明らかにすることができ、論文化することができた。小児では年齢に伴う変化を加味する事は重要であり、今後の研究の基盤となるデータを蓄積する事ができた点で意義が大きい。粘膜免疫学今後は前年度に作成したムコ多糖症特異的iPS細胞から分化させた樹状細胞を用いて、本年度の研究で用いた各種TLR作動薬;LPS (TLR4リガンド), Pam3CSK4 (TLR1/2リガンド), flagellin (TLR5リガンド), zymosan (TLR2リガンド), poly(I:C) (TLR3リガンド), imiquimod (TLR7リガンド),ならびにCpG (TLR9リガンド)を反応させ、炎症性サイトカイン(IL-8, IL-6, TNF)の産生濃度を測定する。

また、各免疫担当細胞のTLRの免疫応答は年齢によっても異なることが本年度の研究でも明らかとなったことから、分化させた細胞の培養条件・培養日数・成熟度などが免疫応答にも大きく作用すると考えられる。今後は、分化させた樹状細胞の生育条件を様々に変化させ、TLR刺激による自然免疫応答を解析していく。ムコ多糖症患者由来のiPS細胞から安定して樹状細胞を樹立できる事が確認できた。また、病原微生物に特異的な防御免疫を誘導する為には自然免疫応答を効果的に惹起する必要があり、Toll-like receptorを介した免疫応答の理解が重要である。したがって、ムコ多糖症患者のワクチンの有効性を確認する目的で、樹状細胞の自然免疫応答を検索することとし、その基盤となる成果を得る事ができたので、本年度の目標は達成できた。本年度計画していた研究の一部を次年度に実施する事から、その研究に要する次年度使用額が生じた樹状細胞の自然免疫応答をサイトカイン産生だけでなく、mRNAの発現や表面分子マーカーの発現の差異についても注目して解析する。さらに、酵素補充による樹状細胞の自然免疫応答の変化についても同様の手法を用いて解析を進める。免疫担当細胞のTLRを刺激した後の表面分子マーカーの発現の検索を行う。本年度で使用しきれず、かつ次年度で継続的に研究を行うために次年度への使用をお願い致します。樹状細胞の自然免疫応答をサイトカイン産生だけでなく、mRNAの発現や表面分子マーカーの発現の差異についても注目して解析する。
グラフェンナノフレークの開殻性と非線形光学特性についての理論研究

近年、単層グラファイトであるグラフェンが将来のエレクトロニクス、スピントロニクス、フォトニクスにおける基礎物質として期待され、化学物理を問わず数多くの研究が進められている。特に有限サイズのグラフェンナノフレーク(GNF)が見せる開殻性は、その特異な物性の起源として大きな注目を集めている。一方、近年我々は新規な高効率非線形光学(NLO)物質として開殻分子系に着目し、特に中間的な開殻性を有する分子系が、閉殻系に基づく従来の物質に比べて非常に大きな三次MO物性を示すことを理論的に予測し、また実験的にも証明した。そこで我々は新規開殻NLO分子系としてGNFに着目し研究を進めてきた。これまでの研究では、主に単分子における構造荊性相関について着目したものがほとんどだったが、近年、開殻分子系がラジカルサイトを介して共有結合的な強い分子間相互作用示すことが理論・実験の両面から示されている。これは単体では有限系である開殻分子が、クラスターや固体結晶中では大規模なマルチラジカル構造を有する可能性を示唆している。そこで本年度は最も単純な一次元開殻分子集合体のモデルとして、三角形GNFモノラジカル分子を用いて、そのπ-π積層構造を持つ一次元分子集合体をモデルとし、分子間相互作用に基づく開殻性およびNLO物性の制御可能性について検討した。その結果、系の開殼性は分子間距離に依存して幅広い変化を示し、また、中間的な開殻性を示す領域ではNLO物性が顕著に増大するという、従来の開殻NLO分子系と同様の特徴が見られた。本研究結果から、開殻GNF系における分子間相互作用に基づく新たな開殻性の制御指針および、開殻GNF分子集合体に基づく新たな高効率NLO材料の設計指針の基礎が得られた。(抄録なし)近年、単層グラファイトであるグラフェンが将来のエレクトロニクス、スピントロニクス、フォトニクスにおける基礎物質として期待され、化学物理を問わず数多くの研究が進められている。一方、近年我々は新規な高効率非線形光学(NLO)物質として開殻分子系に着目し、特に中間的な開殻性を有する分子系が、閉殻系に基づく従来の物質に比べて非常に大きな三次NLO物性を示すことを理論的に予測し、また実験的にも証明した。そこで我々は新規開殻NLO分子系としてGNFに着目し、これまで研究を進めてきた。本年度は三角形GNFを構成単位とした一次元連結分子系における開殻性および三次NLO物性の微視的起源である第二超分極率γについて量子化学計算に基づき調査した。その結果、系はユニット接続方式のわずかな違いによって非常に多様なマルチラジカル性を発現し、複雑な構造依存性を持つことが判明した。それに応じて系のγ値もまた大きく変化する事が示された。また、六角形GNFにおいて分子内の欠損(アンチドット)構造が系の開殻性およびγ値に与える影響についても検討した。その結果アンチドットサイズの増大によって系の開殻性は交互に減少増大し、非単調な変化を示すことが判明した。それに伴いγ値にも変化が見られた。いずれの系においても、過去の開殻NLO分子系に対する研究同様、中間的な開殻性を示す分子でγが顕著に増大するという特徴を示した。以上の研究結果から、開殻GNFに基づく新たなNLO物質の設計および物性制御指針が得られた。また最近我々は、中間ジラジカル分子において外部電場の印加やドナー・アクセプター置換基の導入が非常に大きな第二超分極率γ(三次NLO物性の微視的起源)の増大を引き起こすことを理論的に予測した。そこで本研究では四角形GNFを対象とし、これらに対する置換基効果を量子化学計算により検討し、ジラジカル因子および三次NLO物性との相関について調査した。その結果、GNFにおいても中間開殻性を持つ系で置換基導入によりγ値が著しく増大することが判明した。また、無置換系からのγの増大率が置換基導入部位に対して顕著に依存することが分かったが、比較対象として閉殻GNFについて検討したところ同様の置換部位依存性は一切見られず、開殻GNF特有の現象であることが示された。この特異なγ増大率の構造依存性は、開殻性の空間的寄与を表す奇電子密度分布に基づいて説明できることが判明した。

一方、近年我々は新規な高効率非線形光学(NLO)物質として開殻分子系に着目し、特に中間的な開殻性を有する分子系が、閉殻系に基づく従来の物質に比べて非常に大きな三次MO物性を示すことを理論的に予測し、また実験的にも証明した。そこで我々は新規開殻NLO分子系としてGNFに着目し研究を進めてきた。これまでの研究では、主に単分子における構造荊性相関について着目したものがほとんどだったが、近年、開殻分子系がラジカルサイトを介して共有結合的な強い分子間相互作用示すことが理論・実験の両面から示されている。これは単体では有限系である開殻分子が、クラスターや固体結晶中では大規模なマルチラジカル構造を有する可能性を示唆している。そこで本年度は最も単純な一次元開殻分子集合体のモデルとして、三角形GNFモノラジカル分子を用いて、そのπ-π積層構造を持つ一次元分子集合体をモデルとし、分子間相互作用に基づく開殻性およびNLO物性の制御可能性について検討した。その結果、系の開殼性は分子間距離に依存して幅広い変化を示し、また、中間的な開殻性を示す領域ではNLO物性が顕著に増大するという、従来の開殻NLO分子系と同様の特徴が見られた。本研究結果から、開殻GNF系における分子間相互作用に基づく新たな開殻性の制御指針および、開殻GNF分子集合体に基づく新たな高効率NLO材料の設計指針の基礎が得られた。本年度は、当初一年目の研究計画として予定していた、三角形ユニットからなる一次元連結GNFにおける開殻性と三次NLO物性の解明だけでなく、二年目の研究計画であったアンチドット構造がGNFの物性に与える影響についても既に研究結果が得られている。それらの成果は国内外の学会にて発表すると共に、国際的に著名な学術雑誌に論文を投稿した。本年度は当初計画していた、開殻GNFへのドナー・アクセプター基の導入による非対称化効果の検討に着手し、開殻GNFの新規な分子構造依存性を見出すとともに、その機構の理論的な解明にも成功した。これらの研究成果は国内外の主要な学会にて発表すると共に、国際的に著名な学術雑誌に論文を投稿した。これまで主に対称型のものに限ってきた計算対象を非対称型GNFへと拡張し、ジグザグ端部分へのドナー(D)/アクセプター(A)置換基の導入による、系の非対称化効果について検討する。一般に非対称分子系では、対称分子系とは異なるエネルギー準位間の遷移過程が許容されるため、これに由来するY値の変化が期待される。また、単純な置換基効果だけでなく、異なる部位にDA基を持つ分子同士で比較を行うことで置換部位依存性についても検討すると共に、その起源を開殻電子の空間分布との関係に基づき解析する。これまでの研究では主に、単一のGNF分子における開殻性およびNLO物性の幾何構造依存性に着目してきたが、今後はさらに分子間相互作用の効果についても検討する。最も単純な開殻GNFの1つであるphenaleny1を用い、この二量体をモデル系として分子間距離に応じた開殻性の変化を解析し、それに伴う三次NLO物性への影響について調査する。またさらに系を四量体へと拡張し、マルチラジカル化の効果についても検討する。(抄録なし)
農業土木設計における景観評価システムモデルに関する研究

圃場整備や農業水利など広域を対象とする農業土木においては、域の景観と深くかかわる事業を行なっているが、一般土木事業と同様景観に関する評価手法については末だ模索の域を出ていない。事業の計画設計における景観評価のシステムモデルとして、どのような手順で景観を考慮した事業計画を立てるべきかを考察してきた。事業前後の景観の変化をとらえる方法としてパソコンを用いる方法,大型計算機を用いる方法,イメージスキャナやビデオコーダを用いる方法及びそれらの応用包法について検討した。また景観評価のシステムとしては事業計画段階を中心にどのような理念の下にどのような方法で評価検討を行なうべきかについて考察を加えた。パソコンを利用した方法としては等高線表示による三次元的表示法を作成し、デジタイザによる作業能率の高いデータ入力処理法を検討した。メッシュ法による地形の表示についてもデータの読み取りが煩雑な点に難点があるが、等高線データからの自動計算処理をパソコン上で行なった。農地造成地区で造成前後の地形変化をこの方法で比較した。大型電算機による表示法としてはIGLによる地形の立体表示,道路河川等のはめ込み操作,像の回転,視点位置の移動による全体像の変化等の検討を行なった。また、現況データの入力法としてイメージスキャナ及びカメラインターフェースによる写真入力処理法及びビデオカメラによる映像とパソコン上に表示した新設構造物画像との合成評価法についても検討した。現在急速な進展がみられる画像処理技術を景観の評価と修景作業にどのように応用していくかについても検討しておく必要があり、精巧な画像モデルが要望される一方で、景観への意識が十分でなく、経費的な制約も大きい状況の下での作業モデルについて、事業実施,計画設計,さらに地域総合計画の三段階に分けて考察を行なった。
マウス神経冠細胞移動パターンの3次元画像解析-細胞外基質分子の役割

1.一つの硬節中にマウス胴部神経冠細胞の移動様式が異なる3つの領域が存在し、それぞれの領域の大きさは、神経冠細胞の移動期を通じて規則的に変化する事が判明した。2.神経冠細胞の移動期においてコンドロイチン硫酸プロテオグリカンの硬節内分布は規則的変化を示し、この変化は神経冠細胞の移動様式の変化と密接に関連していた。3.硫酸化プロテオグリカン合成阻害剤(β-D-xyloside,sodium chlorate)で処理されたマウス胎児において、正常胎児で観察された様な胴部神経冠細胞の移動様式は完全に消失していた。この結果は、コンドロイチン硫酸プロテオグリカンの硬節内分布の規則性をもった時間的・空間的変化が、マウス胴部神経冠細胞の移動様式形成に重要であることを示す。4.テネイシンノックアウトマウス胎児における神経冠細胞の移動は、正常胎児と変わらなかった。この結果は、マウス神経冠細胞の移動様式形成にテネイシンの直接関与は少ない事を示す。5.前・中脳領域におけるマウス頭部神経冠細胞の移動が解析された。その結果、5体節期にはすでにこれらの領域において神経冠細胞の出現が見られ、12体節期には顔面・下顎部の間充織に広く分布することが判明した。さらに、多くの中脳神経冠細胞は、特定の領域すなわち中・後脳境界付近の間充織を移動することが判明した。本年度は、マウス胴部(前肢芽・後肢芽部域)神経冠細胞の移動パターンの3次元画像解析を行ったばかりでなく移動パターン形成における細胞外基質分子の役割を多重免疫染色法により解析した。その結果、以下の事が判明した。(1)マウス胴部神経冠細胞は、鳥類等でも報告されている通り、それぞれの硬節の前部に偏った移動経路を通り腹部方向に移動した。しかし、3次元画像解析法による詳細な解析の結果、硬節前部においても移動様式の異なる領域が存在する事が判明した。その結果、一つの硬節中に移動様式の異なる3つの領域が存在した。(2)硬節中に観察される移動様式の異なる領域のそれぞれの大きさは、神経冠細胞の移動期を通じて規則的に変化する事が判明した。移動様式の異なる領域の存在及びそれらの大きさの規則的変化が、マウス個体内での神経冠派生分化細胞種の規則正しい空間的配置を構築する上にきわめて重要である事が示唆された。(3)(1)、(2)に述べたマウス胴部神経冠細胞の移動パターン形成にコンドロイチン硫酸が重要な役割を果たす事が判明した。神経冠細胞の移動期においてコンドロイリン硫酸の硬節内分布は規則的変化を示し、この変化は神経冠細胞の移動パターンに密接に関連していた。すなわちコンドロイチン硫酸は、神経冠細胞の移動経路を制限する事によって、その移動パターン形成に寄与する事が示唆された。(4)従来の研究において、神経冠細胞移動におけるテネイシンの役割については明確な見解が得られていなかった。テネイシンノックアウトマウスを用いた本研究の結果は、マウス胴部神経冠細胞の移動パターン形成におけるこの細胞外基質分子の直接関与は少ない事を示した。しかし、テネイシンの発現時期および発現部位の特異性から、テネイシンが移動経路の閉鎖を調節する可能性が示唆された。本年度は、以下の研究を行った。(1)前年度の研究において示唆されたマウス胴部神経冠細胞の移動様式形成におけるコンドロイチン硫酸プロテオグリカンの重要性を立証するために、硫酸化プロテオグリカン合成阻害剤(β-D-xyloside,sodium chlorate)で処理されたマウス胎児における胴部神経冠細胞の移動様式を3次元画像解析により詳細に検討した。その結果処理胎児においては、正常胎児で観察された様な移動様式は完全に消失していた。さらに、移動様式の規則的経時変化も観察されなかった。以上の結果は、コンドロイチン硫酸プロテオグリカンの硬節内分布の規則性をもった時間的・空間的変化が、マウス胴部神経冠細胞の移動様式形成に重要であることを示す。

(2)マウス頭部神経冠細胞の移動様式が、胴部の場合と同様な手法を用いて解析された。本研究では、比較的知見の少ない前・中脳領域における神経冠細胞の移動に注目した。その結果、5体節期にはすでにこれらの領域において神経冠細胞の出現が見られ、12体節期には顔面・下顎部の間充織に広く分布することが判明した。さらに中枢神経冠細胞の移動に関して興味ある知見が得られた。すなわち多くの中脳神経冠細胞は、中・後脳境界付近の間充織を移動し、三叉神経形成領域および上・下顎弓に分布した。中・後脳境界領域が、FGF-8の特異的発現等において示唆されるように、特殊な領域であること考慮すれば、この観察の意味する事柄について今後十分に検討する必要があると考えられる。
宿主個体群遺伝構造に応じた新興病原ウイルスの進化プロセスの解明

2004年に同一株が琵琶湖へと人為導入されたコイヘルペスウイルス(CyHV3)をモデルとし、宿主コイの個体群遺伝構造の違いに応じた病原体の進化プロセスの評価を試みた。CyHV3への抵抗性は、日本在来系統のコイで低くユーラシア大陸産の外来系統で高いことが知られる。そこで宿主個体群遺伝構造の指標として、環境DNA分析により在来/外来遺伝子型頻度を定量的に解析したところ、琵琶湖の地域間で差異が検出された。CyHV3の4つの病原性遺伝子については、CyHV3導入後数年内は地域間での変異は検出されなかった。導入10年後以降については、1つの遺伝子のみ解析した結果、地域間での遺伝変異は見られなかった。近年世界的に問題となっている野生生物新興感染症は、人為拡散によって同一の病原体が複数の宿主個体群に同時に導入される。そこで本研究では、宿主個体群間の遺伝的構造の違いに応じた病原体の進化プロセスを、コイを宿主とする新興病原体コイヘルペスウイルスをモデルとし、定性的かつ定量的に評価することを目的とした。2016年度は、宿主個体群の遺伝的構造を、環境DNA(水などの環境媒体に含まれる、そこに生息する生物由来のDNA)分析を用いて評価する手法の開発を行った。日本には、コイヘルペスウイルス抵抗性の低い日本在来系統のコイと、抵抗性の高いユーラシア大陸産の外来系統のコイが生息している。そこで、宿主個体群の遺伝的構造を評価するマーカーとして、在来遺伝子型と外来遺伝子型を判別する核DNA上の一塩基多型(SNP)遺伝子座を選定し、環境水より抽出した環境DNA試料を用いて、在来/外来遺伝子型頻度を定量するための手法の検討と開発を行った。従来の環境DNA分析は、環境水中に存在する希薄なDNAを検出するため、1細胞あたりのコピー数が多いミトコンドリアDNAをターゲットとしてきた。しかし、本研究では、1細胞あたり1コピーしか存在しない核遺伝子を検出する必要があったため、まず、環境水から高濃度の環境DNAを得るためのろ過濃縮法を確立した。さらに、SNPを特異的に検出するDNA-RNA-DNAプローブを用いたリアルタイムPCRにより、在来/外来遺伝子型頻度を定量的に解析する手法を確立した。環境DNAを用い、宿主個体群の遺伝的構造を迅速かつ簡便に推定する手法をほぼ確立した。また、コイヘルペスウイルス試料は既に得られているため、今後ウイルスの遺伝変異の解析を速やかに開始することができる。近年世界的に問題となっている野生生物新興感染症は、人為拡散によって同一病原体が複数の宿主個体群に同時に導入される。そこで本研究では、宿主個体群間の遺伝的構造の違いに応じた病原体の進化プロセスを、2003年に日本に導入された、コイを宿主とするコイヘルペスウイルス(CyHV3)をモデルとし評価することを目的とした。CyHV3への抵抗性は、日本在来系統のコイで低く、ユーラシア大陸産の外来系統では高いため、宿主個体群の遺伝的構造の評価には、在来/外来遺伝子型を区別するマーカーを用いた。2016年度は、環境DNA(水に含まれる生物由来のDNA)を用いて宿主個体群遺伝構造を推定する手法の開発を行った。在来/外来遺伝子型を判別する核DNA上の一塩基多型(SNP)遺伝子座を選定し、SNPを特異的に識別するDNA-RNA-DNAプローブを用いたリアルタイムPCRにより、環境水より抽出した環境DNA中の在来/外来遺伝子型頻度を定量的に解析する手法を確立した。2017年度は、宿主個体群遺伝構造解析のための環境DNA手法の野外への適用を進めるとともに、CyHV3の遺伝解析を行った。宿主遺伝構造解析においては、環境DNA手法により水域間で遺伝構造の差異を検出することに成功し、本手法の野外における有効性が示された。CyHV3の遺伝解析においては、CyHV3導入から数年内は、対象とした遺伝子については水域間で変異は見られなかった。導入10年後以降においては、環境水から十分量のCyHV3を回収することが困難であったため、一つの遺伝子のみ解析した結果、水域間での遺伝変異は見られなかった。研究期間中に宿主個体群遺伝構造に応じたウイルス進化の差異を評価することはできなかったが、環境DNA手法を用いた宿主遺伝構造解析の有効性が示されたことは重要な成果となった。今後、宿主-病原体相互作用を解析する上で、宿主個体群遺伝構造解析を迅速に実施する方法として、環境DNA手法の活用が期待される。2016年度の研究により、宿主個体群の遺伝的構造を推定する環境DNA手法をほぼ確立した。既に得られているコイヘルペスウイルス試料を用い、ウイルスの遺伝変異の解析を進めることにより、本研究の目標である、宿主個体群遺伝構造に応じた病原ウイルスの進化プロセスの評価を実現することができると考えられる。

生態学次年度に使用が見込まれる研究費を確保するため、当該年度に予定していた遺伝子解析の外注を次年度に一括して行うことにより、外注費の抑制を行った。また、学会出張や調査出張の日程を短縮することにより、旅費の抑制を行った。以上の理由により次年度使用額が生じた。次年度に必要となる消耗品費や遺伝子解析の外注費として適切に使用する。
ヒト人工染色体を用いた薬物膜透過に伴う薬物代謝予測可能な新規動態モデル開発

本研究では、消化管における薬物代謝と薬物吸収を同時に評価可能なモデルを作製することを目的とした。方法は、我々の研究室が開発した人工染色体に目的遺伝子を搭載し、それを消化管細胞Caco-2細胞へと移入することを目指した。今回の開発では、CYP過剰発現Caco-2作製のための人工染色体を構築した。さらに構築した人工染色体は別のヒト由来細胞(HT1080細胞)に移入することが可能であることを示した。さらにこの人工染色体はHT1080細胞内にて導入遺伝子を保持し、タンパク発現を有すること示した。今後、本研究にて開発した人工染色体をCaco-2細胞に移入することで、本目的を達成できることが考えられる。昨年度までにCaco-2細胞へ導入する人工染色体を搭載したCHOドナー細胞の作成に成功した。本ベクターコンストラクトはCAGをプロモーターとして、その下流にCYP遺伝子(CYP2C9、CYP2C19、CYP2D6、CYP3A4)または還元酵素(POR)を搭載したものを1ユニットとし、それらユニットを直鎖状に連結した。さらに、各ユニット間にインスレーター配列HS4を搭載し、隣り合う遺伝子発現干渉を防ぐことを可能にした。ドナー細胞におけるその搭載遺伝子局在について検証すると、人工染色体上に1コピー導入されていることが認められた。また遺伝子発現量をreal-time PCRで測定すると、搭載した全ての遺伝子が発現していることを確認した。これらのことから本研究目的を達成可能なドナー細胞が得られた。前年度までに薬物代謝酵素(CYP2C9, CYP2C19, CYP2D6, CYP3A4)および還元酵素PORを搭載した人工染色体保持CHO細胞を作製した。本年度はこの人工染色体を別細胞へと移入したときに、その細胞内において人工染色体が正常に機能することを確認した。本研究にて用いた人工染色体移入のためのホスト細胞は代表者が所属する研究室において、その実績があるHT1080細胞株を用いた。導入の方法は、前年度作製したドナーCHO細胞に麻疹ウイルスエンヴェロープを一過性に発現させた後に、微小核融合法を用いてHT1080細胞と人工染色体含有微小核を融合させた。その後、人工染色体保持HT1080細胞を取得することを目的として、予め人工染色体に搭載しているネオマイシン耐性遺伝子を利用しG418にて選択培養を行った。最終的に3株のG418耐性クローンを取得した。その後、取得したG418耐性クローンの中で増殖が速い1クローンについてFISH解析を行ったところHT1080細胞のホスト染色体の他に、目的遺伝子を搭載した人工染色体を示すシグナルが認められた。加えて、CYP2C9, CYP2C19, CYP2D6, CYP3A4およびPORの遺伝子発現量をreal-time PCRにて解析を行ったところ、トランフェクション前に発現が認められなかったCYP2C9, CYP2C19, CYP2D6, CYP3A4およびPORの発現が有意に高くなることが認められた。また免疫染色にて解析するとすべての細胞にて一様に発現することが認められた。これらの結果から本課題にて開発した人工染色体は別細胞へと移入した際に機能することを示した。昨年度までに、当初の予定通りにCaco-2細胞へ人工染色体を導入するドナー細胞の作製に成功した。当該研究における進捗は、概ね順調である。27年度が最終年度であるため、記入しない。薬物動態学本年度は、以下について行う。1)遺伝子搭載人工染色体ベクターのCaco-2細胞への移入。CHO細胞から目的遺伝子搭載人工染色体を微小核細胞融合法により、Caco-2細胞に導入し、目的の人工染色体が導入されたクローンをPCR法、FISH法により選別する。3)人工染色体導入腸管モデルの形態及び機能解析。1細胞形態学的解析、2細胞膜透過性の評価、3薬物の細胞膜透過性の確認、4タイトジャンクションのporeの半径及び間隙率の算出、5透過係数(Papp値)及び吸収率(Fa)の解析4)初回通過効果予測モデル解析と評価。経口投与後の薬物に対する初回通過効果におけるMDR1/P-gp及びCYP3Aの寄与について、Quinidineをモデル薬物として検討する。また、小腸抽出率がTestosteroneの小腸代謝固有クリアランスと相関するか解析する。
看護者のリフレクション能力を開発するためのプログラム構築に関する基礎的研究

本研究では、看護者のリフレクション能力を開発するためのプログラム構築を目的に、省察的対話を展開するセッションとして、9名の看護師を対象に1回/月、約4か月間の継続的なインタビューを、のべ41回実施した。結果、看護師が、一連のセッションを通して気がかりへの取り組み方が変化する過程が見出された。その変化の過程は【省察的対話での気づき】と【実践の場での省察的対話を意識した試み】を繰り返しながら深化していた。さらに参加者への思考の影響として、【継続的省察的対話と実践の繰り返しによる気づき】が特徴づけられた。本セッションの体験がリフレクション能力の獲得に有用であることが示唆された。本研究は、看護者のリフレクション能力を開発するためのプログラムを構築することを目的とし、本年度は以下2点に取り組んだ。1.文献検討国内外の文献を収集し、反省的実践の定義、リフレクションの促進に影響する要因などについて、研究者間で検討を行った。また、リフレクションを教育実践に活用しているワークショップに参加し、実践的観点での情報収集を行った。2.看護師を対象とした継続的インタビュー調査反省的対話の特徴や対話を促進・阻害する要因などについて明らかにするとともに、継続的なインタビューが看護師のリフレクションの深化や実践にどのように影響しているかを見出すことを目的とした。調査は日本赤十字看護大学研究倫理審査委員会の承認を得て実施した。2010年8月2011年2月までに、研究に同意した一般病棟に勤務する5年目以上の看護師8名を対象に、気がかりとなった状況を手がかりとして、12回/月、36ヶ月の継続したインタビューを実施した。うち、4名の研究参加者に対しては、前回のインタビューの影響を意識するようなインタビューを行い、残りの4名については、前回のインタビューを意識させないようなインタビューを行った。インタビュー内容は逐語録にし、MGTA法によりリフレクションにかかわるような思考の特徴、リフレクションのプロセスの特徴について分析を重ねている。次年度は参加者数を6名程度増やすと共に、継続的インタビューを応用したグループセッションを実施し、グループインタビューを行うことで、リフレクションの様相の変化とその進展に影響した要因を明らかにする。また、中間報告として、得られた知見を学会で発表する予定である。本研究は、看護者のリフレクション能力を開発するためのプログラムを構築することを目的とし、本年度は以下3点に取り組んだ。2.看護師を対象とした継続的インタビュー調査反省的対話の特徴や対話を促進・阻害する要因などについて明らかにするとともに、継続的なインタビューが看護師のリフレクションの深化や実践にどのように影響しているかを見出すことを目的として、昨年度に引き続き、インタビュー調査を実施した。平成23年10月から、研究に同意した一般病棟に勤務する5年目以上の看護師4名を対象に、気がかりとなった状況を手がかりとして、1回/月、35ヶ月の継続したインタビューを継続している。インタビュー内容は逐語録にし、M-GTA法によりリフレクションにかかわるような思考の特徴、リフレクションのプロセスの特徴について分析を行っている。3.研究成果の中間報告平成22年度に実施した看護師4名への継続的インタビューの分析結果を、リフレクションに関わる思考のプロセスの特徴としてまとめ、第31回日本看護科学学会学術集会にて発表した。今後は、現在の調査結果ともあわせて分析を重ね、さらにファシリテーターの役割についても抽出し、プログラムの構築の基礎的資料を明示する予定である。本研究は、看護者のリフレクション能力を開発するためのプログラムを構築することをめざし、本年度は以下の課題に取り組んだ。1.継続的インタビューの実施と分析:看護師を対象とした34か月の継続的な面接に対する参加者を追加募集し、合計9名の参加者に各46回(のべ41回)のインタビューを実施した。継続的な面接は同一の研究者と参加者が1対1の関係を維持するように設定し、参加者の気がかりとなった事象を基軸にし、気がかりとなった状況、その時の参加者の思考や感情、行動などを振り返るような形で実施した。2回目以降は気がかりとなった事象への取り組みなどについても確認するようにした。この面接を継続的省察的対話が展開できるセッションとして位置付けた。ここでの参加者の思考の特徴や変化についてMGTA法で分析を行った。また、参加者自身がセッションによって影響を受けたと語っていることについて解釈し、意味内容の類似性を検討しカテゴリー化した。

3.プログラム構築への展開:継続的なインタビューを受けたことで参加者の気づきや変化がどのように起こるのか、リフレクションのプロセスはどのように進むのか、それらをファシリテートするものは何かについて、さらに分析を進め、研究成果を論文としてまとめ公表する予定である。本研究の目的である反省的対話を中心としたプログラムの構築に向けて、文献検討、継続的インタビューによる反省的対話を通したリフレクションの進展状況の記述、その成果の中間報告を行っており、おおむね順調に進展しているものと評価できる。24年度が最終年度であるため、記入しない。平成24年度は、全事例のインタビューデータについてMGTA法により、「状況や周囲の人々との反省的対話によるリフレクションの進展」「状況や周囲の人々との反省的対話による看護実践状況の変化」という観点から分析を行い、得られた知見を論文としてまとめる予定である。また、インタビューの影響やファシリテーターの役割という点から分析することにより、プログラム構築の基礎的資料として、学会にて発表する予定である。
大規模コホートによる認知症の環境リスク要因および遺伝要因との相互作用の解明

本研究は分子疫学コホート研究(村上コホート研究、対象地域:村上市、関川村、粟島浦村)の枠組みにおいて、体質を考慮した日本人の認知症の変容可能な要因を解明するコホート研究であり、認知症の一次予防におけるポピュレーションアプローチ及びハイリスクアプローチに資することを目的とする。調査は、医療機関での認知症診断(診療情報調査)及び要介護情報に基づく新規認知症(要介護認知症)をエンドポイントとして収集している。1認知症の環境リスク要因および遺伝要因を検討するために、ベースライン調査における、基本属性、生活習慣要因のデータや、バイオマーカーが既存情報として利用可能であり、現時点で収集された新規症例について中間解析を行った。2また、ベースライン保存血液検体のあるサブグループにおいて認知症の強力な感受性遺伝子であるアポリポプロテインE遺伝子の遺伝子多型を解析することにより、nested case-control studyの手法を用いて環境要因と遺伝要因との相互作用を検討する。現時点で収集された症例群と対照群の検体について遺伝子解析を進めた。医療機関と自治体の協力を得て、順調に新規症例のデータ収集を進めており、DNA抽出および遺伝子解析も症例収集に伴い実施しているため。これまでと同様に、医療機関での認知症診断(診療情報調査)及び要介護情報に基づく新規認知症(要介護認知症)の登録を進める。収集された症例の検体および対照群の遺伝子解析を引き続き行う。これらの認知症登録の情報と、既に得られている対象者の基礎情報等を活用し、認知症発症リスクに関する要因を分析し論文化を進める。今年度は認知機能検査データのある一部対象者について追跡認知機能検査を行い、前述の既存情報を用いて認知機能低下に関する要因も分析する。高齢社会における認知症患者の増加は著しい。認知症は、個人や家族、周囲の人々のQOL低下を招き、経済的負担も極めて大きい。またそれは社会全体にも影響を与えるため、公衆衛生対策上の最優先課題の一つである。本研究では、大規模分子疫学コホート研究の枠組みにおいて、診療情報調査による認知症の新規発症をエンドポイントとして把握し、詳細な環境・生活習慣情報を用いた認知症の環境リスク要因を特定する。さらに保存血液検体のあるサブグループにおいて認知症の強力な感受性遺伝子であるアポリポプロテインE遺伝子の遺伝子多型を解析することにより、環境要因と遺伝要因との相互作用を解明する。本研究は体質を考慮した日本人の認知症の変容可能な要因を解明するコホート研究であり、認知症の一次予防におけるポピュレーションアプローチ及びハイリスクアプローチに資することを目的とする。認知症の新規発症は、対象及び近隣地域の医療機関に協力が得られているため、登録作業を進めている。新規症例については、連携研究者の補助にて遺伝子解析を開始した。同時に、対象地域の自治体の協力を得て、要介護情報(要介護認知症の登録)を収集している。医療機関と自治体の協力を得て、順調に新規症例のデータ収集を進めているため。初年度同様に医療機関と自治体から情報収集し、認知症新規発症登録を進める。順次遺伝子解析を進行させる。既に得られている対象者の基礎情報等を活用し、認知症発症リスクに関する中間分析を進める。理由:データ整理、DNA抽出や遺伝子解析にかかる人件費が当初予定より少なくなったため。使用計画:初年度の実績をふまえて、DNA抽出や遺伝子解析に関するプロトコールを確立し、それにかかる費用に充当する予定である。使用計画:実績をふまえ、DNA抽出や遺伝子解析に関するプロトコールを確立し、それにかかる費用に充当する(平成30年度内に、施設内で遺伝子解析等システムが確立されたので、それに準じて解析予定検体数を算出する)。また、今年度は対象者への認知機能調査を実施するため、調査費用にあてる。
法医学分野におけるヒロトニン遺伝子を用いたイヌの個体識別法の確立

犯罪現場から採取された試料がヒト由来であることの証明やヒト以外の動物種であることを特定する科学的作業は,法医学上しばしば要求される。昨今のペットブームや犯罪の多様性を受け,犯罪現場から採取されるヒト以外の動物由来試料は増加しており,それらの試料から動物種の特定のみならず,動物の個体識別が可能になれば飼い主の特定につながるなど,その検査結果は犯罪捜査に大きく寄与するものと期待されている。近年盛んに研究されている性格遺伝子は,そのDNA多型が動物の性格や行動などと深く関与するものと考えられており,中でもセロトニン遺伝子(5-HTR1B遺伝子)はイヌの攻撃性に関与するものとして注目されている性格遺伝子の一つで,6つの一塩基多型が存在することが報告されている。本研究ではこの多型に注目し,一塩基多型を検出する6種類のプライマーを設計し,簡便な多型検出法を検討した。その結果,本研究で用いた8品種を含む108個体のイヌから6ヵ所の一塩基多型が検出された。得られた多型のパターンから,品種を問わずイヌの個体識別は可能であった。また,本研究で用いた方法は,鋳型DNA量が1ngから多型検出が可能であった。既に報告のある品種と今回用いたボーダーコリー種(74個体)の多型の分布を比較したところ,品種によって多型の分布に偏りがあることが伺われ,本方法により品種の推定も可能と考えられた。また,この方法をヒト,ネコ,オオカミのDNAに用いたところ,オオカミのみ多型が検出された。したがって,本方法はイヌあるいはイヌに近いとされる動物種に特異性があるものと示唆された。以上の結果から,本方法はイヌの塩基配列を比較することなく,目的の多型のみを簡便に検出することが可能であり,その多型はイヌの個体識別に有用で,実務に利用できる方法であると考えられた。
母乳分泌量維持要因の探索的研究～ＮＩＣＵ入院中の母親の肯定的体験～

本研究の目的は,母乳分泌量が維持されている母親の,出産直後からの搾乳体験を明らかにし,搾乳への思いと実態を明らかにすることである.その結果,早産児を持つ母親の搾乳体験は【精一杯の産後】から始まり,入院中から【目覚ましをかけて搾乳】となり退院後【搾乳の困難にぶつかる】体験をしていた.搾乳の困難は,【家族の助け】を借りて乗り越えNICU面会などポジティブ体験を【搾乳へのモチベーション】として活用し,産後1か月までに【自分のライフスタイルに合わせた搾乳】となっていった.退院後早期に本人の生活に合わせた搾乳の見直しの提案をする機会が必要である.本研究の目的は,NICUに入院した新生児を持つ母親が母乳分泌量の維持の体験を明らかにすることである.本年度は母親が周囲の人々(家族や看護者)からの支持された体験を明らかにすることとした.研究対象者は,妊娠2332週未満で単胎を出産し,児がNICU入院中である基礎疾患のない初産婦で,産後1か月健診時に直接授乳を開始しておらず,母乳分泌量が500ml/日以上維持されている母親4名である.分析の結果,5つのカテゴリー,8つのサブカテゴリーに分けられた.以下,カテゴリーは【】,サブカテゴリーは〈〉で表す.NICU入院児を持つ母親は,初回面会時,最初のイメージよりも,姿,形,大きさが良い状態であったことで〈最初の安堵感〉を得ていた.また,児の動きや表情を見ることで〈児に出会えた嬉しさ〉を感じ【最初の肯定的な気持ち】を抱いていた.その後,面会を通して発見する〈目に見える児の成長〉や,〈面会中の児との水入らずの時間〉から母親は【自分の子どもとしての実感】を得ていた.よって,面会時に看護者は母親との関わりの中で母親の思いを傾聴し,傍に寄り添い受容することが重要である.その体験を通じで母親は,児の順調な成長を願い,児を〈大きくしないとだめという気持ち〉が強くなり,直接授乳ができない自分の立場から〈自分にできることは母乳を届けること〉という【母乳をあげたい】思いにつながっていた.それらの気持ちには,傍に寄り添い,最も身近な理解者である【夫からの支え】が大きく関係していた.夫は最も身近な支援者で良好な夫婦関係が母親の精神的安定に繋がると考えられる.よって,看護師には夫婦の関係性をアセスメントし,夫を巻き込んだ関わりが重要である.さらに,〈面会時間外の児の様子を聞く〉,〈母乳分泌をほめられる〉という看護者との関わりを通して,母親は【看護者からのサポート】を肯定的な体験としてとらえていた.本研究の目的は,NICU入院時を持つ母親の搾乳体験を記述的に明らかにすることである.本研究の結果を3点にまとめ報告する.まず「早産児の母親の搾乳体験」である.分析の結果【精一杯の産後】から始まり【目覚ましをかけての搾乳】となり退院後【搾乳困難にぶつかる】経験をしていた.この困難を乗り切るには【家族の助け】や,子どもへのポジティブな思いが【搾乳へのポジティブな思い】へと繋がり,産後1カ月までに【自分のライフスタイルに合わせた搾乳】を確立していた.出産直後の不安定な時期への看護介入が必要であり,母親が自分の出産体験を受け入れ,子どもを受容することが重要である.看護者は母親の身体・精神的健康度を把握し母親に寄り添い,搾乳の介助・支援をし【自分のライフスタイルに合わせた搾乳】を母親ができるよう児への面会時などに気軽に相談できる場所の提供が必要である.2点目は「母親の出産体験」についてである.NICU入院児の母親は,お産を「突然のこと」と捉え「家族や子どもとの関係について」の記述がなく,出産した児を家族の一員として捉えにくいことが特徴的であった.そのため,家族を含めて児との関係性を育むことが,出産体験の肯定的な受け止めを支援することで,母親は肯定的な体験をし,搾乳へ前向きになれると考える.3点目として「子どもとの面会」である.初回面会までに抱く【子どもに会うことで不安が和らぐことを期待】する感情や【意識的に不安を押し込める】感情があり,それは初回面会時の【子どもに生きて会えた喜び】へ繋がり,これらの感情が高まることで母児の愛着形成が促進されると考える.また,【他者から認められることで気持ちが和らぐ】体験,【同胞の存在に安心】することも大切であり,家族が母親と前向きに関わることができるよう家族への心のケア,母親を特別扱いしない,頑張りを認める声掛けを心がけた支援が必要である.本研究の目的は,母乳分泌量が維持されている母親の,出産直後からの搾乳体験を明らかにし,搾乳への思いと実態を明らかにすることである.その結果,早産児を持つ母親の搾乳体験は【精一杯の産後】から始まり,入院中から【目覚ましをかけて搾乳】となり退院後【搾乳の困難にぶつかる】体験をしていた.搾乳の困難は,【家族の助け】を借りて乗り越えNICU面会などポジティブ体験を【搾乳へのモチベーション】として活用し,産後1か月までに【自分のライフスタイルに合わせた搾乳】となっていった.退院後早期に本人の生活に合わせた搾乳の見直しの提案をする機会が必要である.本研究の目的は、NICUに入院した新生児を持つ母親が母乳分泌量の維持の体験を明らかにすることである。

平成23年度は、予備調査を終了し本調査を開始、母親の搾乳への思いを中心に分析し、母親の搾乳体験を明らかにした。対象者は、妊娠23週から妊娠34週未満で出産した初産婦9名で,産後1か月の時点で児がNICU入院中であり、母乳分泌量が500ml/日以上の母親である。平均年齢は28歳であった。本研究は、東北大学大学院医学系研究科倫理委員会の承認を得て実施した【承認番号2011-169】。分析の結果、【いたみの体験】、【いわれるがままの搾乳】、【搾乳の困難にぶつかる】、【家族の助け】、【ポジティブな思い】、【自分のライフスタイルに合わせた搾乳】の6つのカテゴリーが抽出された。母親が搾乳を続ける体験は【いたみの体験】から始まり、その痛みの時期には積極的に搾乳しようとはせずに看護者から【いわれるがままの搾乳】をしていた。退院後、母親は頑張って搾乳を続けようとするが【搾乳の困難にぶつかる】体験をしていた。困難にぶつかった母親は【家族の助け】と【ポジティブな思い】を体験することで【自分のスタイルに合わせた搾乳】の確立を経験していた。その中の【ポジティブな思い】は母親が<児の成長を実感する>ことを通じて、NICU退院後の子どもとの生活を思い描き<ハッピーエンドへの期待>を持つことができていた。また、母親は早期から<搾乳することでの母親体験>をしており、夜間搾乳が段々と出来なくなることもポジティブに捕らえ<赤ちゃんが休ませてくれている>と母親は語っていた。看護者からの3時間毎の搾乳提案は、母親の精神的・身体的負担になる可能性があり、本人の生活に合わせた搾乳の見直しの提案をする機会が必要である。また、家族に対して、搾乳時の支援を提示し、家族を巻き込んだ支援を実施することが急務である。本年度は,母乳分泌量が維持される要因のうちの,母親が周囲の人々(家族や看護者)からの支持された体験を明らかにすることに主眼を置いて研究を進めて行った。研究対象者が4名と少なくなってしまった。その原因として2点あげたい。1点目として,早産と低出生体重児の増加が見られていたが,3236週前後の早産児が多く対象となる2332週の早産児の母親症例は減少していた.それに伴い,研究同意が得られた母親たちも減少し,研究対象者を集めることが大変だった.2点目として,研究依頼施設での入院制限があったことが挙げられる.6か月間のNICU入院制限があり,対象要件である妊娠2332週未満の早産児は半数近くが中核病院へ搬送となってしまった.そのために重症者の中から症例を選ばなくてはならず減少せざる負えなかった。しかし,4例でも12回の面接ができ、データとしては本人に再確認が取れたものとなった.対象者数は少なかったが,分析に時間がかけられてよかったと思う.その他に昨年度から継続してい進めている母乳分泌の維持要因に関しては,おおむね順調に進行していて,本年度はさらに12名追加インタビューができ,再分析中である.本年度の予定としては、1)インタビューガイドの作成、2)本学倫理委員会への申請、3)研究施設への協力依頼、4)予備調査、5)本調査であった。順番に達成度を報告する。まず、1)インタビューガイドの作成に関しては、新生児看護学会・日本母性衛生学会学術集会へ参加し情報収集、意見交換を経て修正を加えて完成させた。次に2)東北大学大学院医学系研究科倫理委員会への申請を平成23年7月に行い、倫理委員会の承認を得た【承認番号2011-169】。倫理委員会承認後、3)研究施設への協力依頼を開始し、研究施設より研究協力の承諾を得て、調査を開始した。
がんの化学予防に有用な天然化合物に関する基礎的研究

発がんにはイニシエーションとプロモーションの過程のあることが明らかにされており、これらの過程をそれぞれ防止するものを検索する必要があるが、本研究においては、特にプロモーション過程の抑制について重点を置いて検討した。天然化合物を種々スクリーニングしたところ、発がんプロモーターの作用を抑制するものが、多数見い出された。それらの化合物のうち、いくつかのものについては、皮膚二段階発がんを抑制することを実証できた。特に、グリチルレチン酸、デヒドロエピアンドロステロン(DHEA)などは、抗プロモーション作用が強力であったので、本年度はこれらについてさらに検討を加えた。まず、グリチルレチン酸の配糖体であるグリチルリチンについて調べたところ、肝臓発がんのプロモーション過程を抑制することを見い出した。次にDHEAについて、多段階のプロモーション過程のうち、どのステップを抑制することによって発がんの抑制をするのかについて検討した。はじめに、プロモーションの第一段階のみにDHEA処理を行なった場合、発がんを抑制しうるかどうかの検討を試みた。その結果、DHEAは、第一段階のプロモーション過程を抑制する効力を持っていることが証明されたと同時に、それのみでも十分強い発がん抑制の達成されることが明らかとなった。これに続いて、第二段階以後のプロモーション過程に対するDHEAの効果を検討中である。次に、種々の抗プロモーターの作用機序を解析したが、それぞれの作用点に統一性がみられず、確定的な結論を出せるようになるまでには、今後さらに広い範囲にわたる検討が必要である。ただ、【Ca^(2+)】の関与する系が重要であることは確実であり、すでにいくつかの抗プロモーターは、【Ca^(2+)】-カルモジュリン系の阻害を介して作用を発現しているものと考えられる結果が得られているので、今後重点点に検討すべきところであると考えられる。
原始的な花粉媒介システムにおける花および果実の香り成分とその生態学

アテモヤとチェリモヤの花の香気成分をGC/MSで分析し,また半導体センサで花香量の経時変化を測定した.チェリモヤの♀花と♂花いずれでも香りの主要な成分は各種カルボン酸エステルであったが,構成比は雌雄で異なっていた.また,アテモヤでもほぼ同様であった.これらは通常は果実の香りに多く、チェリモヤ等の花は化学的に果実に擬態して果実食性の昆虫を誘引していると考えられた。花香の量には一つの花につき通常2回、ピークが存在した.このように花香の量を経時的に変化させることで昆虫を効率よく利用できると考えられた。ハナバチが花粉媒介しない原始的な植物のうち、バンレイシ科の果樹の花粉媒介のメカニズムの解明の一環として、花香の化学分析を通じて花と昆虫との相互作用を解明することを大きな目標としている。とくに、花が香りに関して自らの果実に擬態して果実食性の甲虫を誘引し、花粉媒介に役立てている証拠、そして花の開花ステージの進行に応じて花香が変化し、虫の行動を制御している証拠を化学的につかむことが本研究の目的である。3年計画の初年度である今年は、主に果樹チェリモヤの花の香りをサンプリングし、これをGCおよびGC/MSにより分析した。得られた花香成分のほとんどはエステル類であると推定された。雌性先熟である本種の花は、♀ステージの時に甲虫類をにおいで誘引し、約24時間後の♂ステージの時には脱出させることで花粉媒介を成立させると考えられる。♀ステージの花(以下♀花、♂も同様)からの花香の経時的なサンプリングの結果、♀花は他の花が♂となる夕方頃に花香成分の放出量を大きく増加させていた。これにより、♂花から脱出した直後の甲虫を効率よく誘引できると見られる。♀花の花香と♂花の花香の構成成分は似通っていたが、♀花にしか見られない成分が存在するほか、それらの構成比も異なっているように考えられたので、主成分分析に掛けたところ、第1主成分と第2主成分からなる平面上で、♀花のグループと♂花のグループを完全に分離することが出来た。したがって、甲虫はこの違いに基づいて訪花と脱出を行っているものと示唆された。本研究で得られた花香成分を他の果樹の花、さらには果実と比較した結果、エステルに富むという特性は通常の果樹の花には見られず、むしろ多くの果実に近いものであり、主成分分析でもそのようなグルーピングが出来た。ただし、必ずしも自らの果実に近いとは結論できなかった。ハナバチの働かない有用植物チェリモヤ・アテモヤについて、進化の歴史を理解し、その生産性の向上に資するために、24時間の雌性先熟を示すこれらの花香成分を、ガスクロマトグラフィーなどを用いて解明するためにサンプリングした。GCでは、前年に明らかになったと同様、様々なエステルが存在すると考えられたが、今年度サンプリングした花香のGC-MSデータの解析はまだ完了しておらず、来年度に行う予定である。GCからは各成分のピークの高さ、エリアの広さが経時的に変化していることが示唆された。一方、本補助金で購入した半導体式の匂い成分のセンサーを用いて、花香成分の経時的な変化を定量的に解析したところ、チェリモヤでは♀ステージと♂ステージそれぞれの夕方から数時間の時間帯に明瞭なピークが認められた。これら植物の花香成分の経時的な変化の定量化に成功したのは全く新しい知見である。全植物を見渡してもこれまでに得られた定量的変化のデータは極めて少なく、重要である。アテモヤでもピークは2つあったが、♀の夕方と、その次の日の朝方に認められた。これはおそらく測定したのがすでに夏で、高温障害により♂ステージになるのが異常に早くなったからではないかと考えている。この点については今後さらに究明したい。訪花者群集の側からもこれら植物の花香による花粉媒介者の誘引の特徴をより深く解明するために、石垣島のアテモヤ園で訪花者および果実食性昆虫群集の比較を行った。花と果実いずれからも主に採取されたのはケシキスイ科の甲虫であり、この点花香を果実の匂いに似せているという仮説は支持されたが、群集の組成は両者で異なり、果実食性甲虫の中で、匂いの好みや体サイズなどが花の形質に適合するもののみが訪花しているのではないかと考えられる。