hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
金融政策正常化を規定する社会経済的要因を考慮したマクロ経済分析：理論・実証・歴史

各自が、担当する研究テーマに即した論文を執筆中であり、学会での発表や論文の投稿へ進みつつあるので、順調だと判断している。春に上智大学で研究会を開催して、研究チーム内部の各研究者の研究経過を確認するとともに、東京財団の加藤創太研究員の報告を基にして、民主主義と経済政策に関する政治経済的な議論を行った。社会経済的要因の一面として、政治経済的要因の重要性が確認された。夏には、Ken Kuttner教授(Williams College)の来日を受けて、国際研究ワークショップを開催した。本研究チーム外からの研究者の参加も得て、金融政策に関わる諸研究報告を行い討議した。また、本研究プロジェクトの方向性についても、時間をかけて丁寧に意見交換することができた。秋から冬にかけては、地主を中心としてアメリカの金融政策についての歴史的な分析を行って、日本金融学会などで発表した。重要な知見として「標準的な」金融政策運営枠組みが、かなり頻繁に変更されてきたことが見出された。この標準的な金融政策運営枠組が変遷してきたことへの、所得分配や人口構成および政党支持率など社会経済的要因の影響を検討しつつある。冬には、竹田と地主がアトランタで開催されたアメリカ経済学会に参加した。竹田が金融政策正常化に関わる研究報告をするとともに、金融政策に関わる諸研究の進行状況を調べるとともに、本研究プロジェクトの方向性を再確認した。3回の研究集会と歴史的研究の進展を通じて、マクロ経済分析で捨象されがちな社会経済的要因の重要性を再確認することができた。当科研研究チームのメンバーは、得られた諸コメントを活用して、それぞれの研究を深めて、学会発表と論文投稿を積極的に進めつつある。春・夏・冬と3回の研究集会および歴史的研究の進展を通じて、各メンバーがそれぞれの研究を深めつつある。社会経済的要因の重要な側面に対して、政治経済的な分析が不可欠であり、その代表的な研究者である加藤創太氏との議論を通じて、金融政策の専門家揃いの本研究チームメンバーの知見も広げることができた。Kenneth Kuttner教授が来日したこともあって、個別の研究内容や本研究プロジェクトの研究方向性についても、多くのアドバイスをうけることができた。各メンバーが、こうした知見を基にして、学会発表を重ねて、積極的に研究論文を投稿しいるので、「おおむね順調である」と評価した。春に労働市場の賃金構造に関する研究会を上智大学で開催して、川口大司教授(東京大学)の報告を基に、人口構造などの賃金への影響に関する問題を議論した。インフレーションに関する社会経済要因の重要性が強く認識された。この認識に基づいて、インフレ期待のデータの規模を縮小することとして、日経センターの作成しているエコノミスト・フォーキャストに変更した。日本の低インフレ下でのインフレ期待形成に焦点を当てることとして、当該データで十分であると判断された(同データを用いた分析を新たに購入したワークステーションで実施しており、予備的な検討の結果は、地主が2019年4月に東京大学ー日本銀行共催のコンファレンスでパネリストとして発言するために用いた)。夏に日本銀行の金融政策の長期的な変遷を、鎮目雅人教授(慶応大学)の報告を基にして、神戸大学で検討した。
スピンカイラリティーによる磁気光学効果

本研究は、相互作用の競合(フラストレーション)によって生まれた非共面な磁気状態において、電子がスピンカイラリティーに由来する非自明な位相(ベリー位相)を感じたことにより生じた"異常な"異常ホール効果やその高周波版である磁気光学効果の研究を目的としている。本年度では、まず昨年度に引き続きスピンカイラリティー誘起の異常ホール効果が現れる(Nd,Ca)2(Mo,Nb)2O7の磁気光学効果の研究を行い、磁場方向依存性の詳しい測定を行うとともに理論計算との詳細な比較検討した。その結果、ベリー位相由来の異常ホール伝導度スペクトルはバンド交差点をまたぐ励起に鋭い共鳴を起こすということ最終的に確認することが出来、その結果をPhysical ReviewLetters誌に投稿、掲載した。同時に関連する研究を幅広く展開し、同じくモリブデン酸化物では、高圧下で局在スピン間の反強磁性相互作用と伝導電子を介した強磁性的相互作用が競合し、散乱が非常に大きい異常な常磁性金属状態が現れることを明らかにした。また、遍歴電子系MnSiの高圧下では縮退したヘリカル磁性状態の干渉によって一様スピンカイラリティーを有する磁性状態であるスカーミオン格子があらわれることが指摘されているが、そこでのスピンカイラリティーに由来する異常ホール効果を観測することに成功した。さらには、2次元ヘリカル磁性体のBa2CuGe2O7においては、その結晶格子が空間反転対称性を破れていることを利用して、電場によってヘリカル磁気構造の方向が制御できることを明らかにした。フラストレーション系においては、相互作用のせめぎ合いの結果、スピンカイラリティーが有限の非共面な磁気構造がしばしば生じる。そのような系では、電子はスピンカイラリティーに比例する仮想的な磁場を感じる。近年、このスピンカイラリティーが作る仮想磁場による異常な異常ホール効果が注目を集めている。本研究ではスピンカイラリティーを示す物質を開拓し、ホール効果の高周波版である磁気光学効果においてスピンカイラリティー誘起の影響を調べることを目的とする。本年度は、スピンカイラリティー誘起の異常ホール効果を示す(Nd, Ca)2(Mo, Nb)2O7における磁気光学効果の測定を行った。Nd2Mo2O7においては、縦の光学伝導度、カー回転角、カー楕円率スペクトルより得られたホール伝導度スペクトルに中赤外領域(0.3eV)にブロードなバンドを観測した。Nb置換するとそのバンドが徐々に高エネルギーにシフトしていき、Ca置換すると低エネルギーにシフトする様子が観測された。そのシフトエネルギーは、Nb置換は電子ドープ、Ca置換はホールドープしていると仮定した場合のバンド計算から期待される化学ポテンシャルのシフトと一致している。このような観測結果は、バンド交差点をもつバンド電子系におけるホール伝導度スペクトルの理論的計算と一致しており、スピンカイラリティー誘起ホール伝導の特徴であるバンド交差点遷移近傍の大きな増大が有限エネルギーで観測されたものであることを示唆している。
甲状腺濾胞癌の発生と進行に関与する免疫的癌微小環境特性の同定

我々はこれまでに、一枚のホルマリン固定パラフィン包埋切片から12種類のエピトープを免疫組織化学で解析できるmultiplex immunohistochemistry (IHC)ならびにその画像定量化技術image cytometryを初めて開発し、3枚の切片から定量化可能な14種類の免疫細胞の組成や性質を統計解析することで、癌の亜分類や予後と相関する腫瘍の免疫的性質を報告してきた。本研究では、この手法を用いて、甲状腺濾胞癌の発生・進行に関わりうる免疫的機序を組織内免疫細胞分布を調べることで解析し、甲状腺濾胞癌の早期診断や発癌機序の解明に寄与する組織バイオマーカーの確立を目的とする。
転写因子ATF1による熱ショック応答の制御機構の解明

熱ストレス時におけるHSF1の活性化機構を明らかにするために、HSF1に結合するタンパク質を解析し、その構成タンパク質の1つである転写因子ATF1について解析を行った。マウス胎児線維芽細胞(MEF)を用いて、ATF1ファミリー群の中でATF1とCREMのノックダウンが、熱ストレスによるHSP70誘導の減弱、及び回復過程の遷延を導くことを明らかにした。さらにATF1はBRG1やp300/CBPを呼び込むために必要であることも分かった。研究代表者らはHSF1による転写調節機構を明らかにするために、HSF1相互作用タンパク質の解析を行った。30のタンパク質を同定し、その中で、まずHSF1-RPA(DNA複製-修復因子)が、非ストレス条件下でヌクオソームを形成するDNAへの結合に必要であることを報告した(Fujimoto et al, Mol. Cell 2012)。一方、熱ストレス条件でのHSF1複合体については未解明であった。本研究で、世界ではじめて、HSF1による転写誘導に、別の転写因子ATF1が極めて重要な役割を担っていることを明らかにした(未発表)。まず、マウス胎児線維芽細胞(MEF)を用いて、ATF1ファミリー群(ATF1、CREB、CREM)の中でATF1とCREMのノックダウンが、熱ストレスによるHSP70誘導の減弱、及び回復過程の遷延を導くことを明らかにした。両遺伝子のノックダウンは同程度の効果であったので、以降の実験はATF1に焦点を絞った。次に、ATF1は、熱ストレスの際にHSF1に依存してHSP70プロモーターへリクルートされること、そのリクルートにはATF1のDNA活性を必要としないことを明らかにした。さらに、ATF1はBRG1やp300/CBPを呼び込むために必要であった。つまり、ATF1は転写仲介因子群のTethering Factorとして働くことが明らかとなった。これらの結論は、HSF1を介する転写調節機構において新しい分子機構を示している。同時に、HSF1転写複合体が、クロマチン修飾やHSF1自身の化学修飾をどのように書き換えて調節するのか、さらにATF1がDNA障害ストレスによって制御されるがHSF1-ATF1複合体の生理的意義はなにかなど、解明すべき疑問は多く残された。まず、『HSF1による転写の促進因子』として同定した転写因子ATF1が、どのように熱ショックタンパク質群の発現を制御するのかを明らかにする。1. HSF1を介するHSPの発現とATF1の関連を明らかにする。様々な細胞での、熱ショック応答におけるATF1の効果を明らかにする。2. HSF1とATF1の結合部位を同定する。互いにどの領域で結合し、リン酸化修飾が結合に与える影響を明らかにする。3. HSPプロモーターでのHSF1-ATF1協調制御の分子機構を解明する。HSF1にATF1が結合することでHSP70プロモーター上でどのようなクロマチン修飾やその構造変化が導かれるかを明らかにする。4. ATF1欠損細胞を用いた機能解析および個体レベルでのATF1欠損の影響を調べる。さらに、HSF1-ATF1を介するタンパク質ホメオスタシスへの関与を明らかにする。ポリグルタミン病の細胞ならびにマウスモデルを用いてATF1の効果を調べる1については、様々なマウス由来の細胞を用い、ATF1 family分子が熱依存的なHSP70の発現に関与することを明らかにした。またヒト由来の細胞を用いても同様の結果が示され、種を超えてATF1 family分子の重要性が明らかとなった。2に関しては、HSF1のDNA binding domainとATF1のKID領域を介して、両者が直接的に結合することを明らかにした。今後は、HSP70の発現に両者の結合がどの程度かかわるかを明らかにする。3に関しては、ATF1は熱依存的にHSP70プロモーター上へリクルートされることが明らかとなりそのリクルートはHSF1依存的であることが分かった。一方、ATF1は、HSP70の発現だけでなく、後期における減弱にも関与することが明らかとなり、今後はこの生物学的意義を検討していく。研究計画でに示した事柄は、おおむね順調に解析を行っている。また、計画当初に比べ、DNAマイクロアレイ解析を容易に行える環境が整い、さらに計画以上の解析をおこなえている。また、当初予想していたATF1の役割とは異なる新しい役割が明らかなり、最終年度では、この新規のATF1の役割を含め解析を行っていく。我々がHSF1の結合タンパク質として同定したATF1は、熱刺激によるHSP70の発現を調節することを明らかにした。一方、ATF1がどのようにHSP70の転写を促進するのか未解明の部分が存在し、その分子メカニズムを明らかとする。また、ATF1は、熱刺激後期のHSP70の発現の減弱にも関与することを明らかとしており、その生物学的意義についても明らかとする。

HSF1-ATF1が関与するHSP70を含む多くの遺伝子を網羅的に解析するために、DNAマイクロアレイ解析を行った。その発現パターンの解析、およびプロモーター部位での解析にtaqポリメラーゼおよびChIP assay kitの購入を中心に、測定用の抗体も購入し執行する。また、ATF1が呼び込む転写活性化及び抑制因子の同定のために、同因子に対する数種の抗体、taqポリメラーゼおよびChIP assay kitを購入し解析を行う予定である。
博物館・大学の学習資源を活用した地域の環境課題のカリキュラム化に関する実践的研究

1.研究代表者、研究分担者、地域の博物館等職員から構成する研究協議会を設置した。博物館・大学に蓄積されている環境学習に関する学習資源(情報・機器)と地域の環境課題について検討を行い、カリキュラムの研究開発、実践方法、評価について協議した。2.環境学習カリキュラムの実施モデル地域において、地域の博物館等職員と学校教員が協力しワーキンググループを設け、継続的に環境学習カリキュラムの開発・運営を行った。3.研究代表者・研究分担者は、博物館・大学のもつ学習資源(研究や教育普及活動の蓄積・情報・機材)を検討し、「総合的な学習の時間」で活用可能な環境学習カリキュラム(教材・プログラム)を開発した。児童・生徒の環境観を形成する環境学習カリキュラムとして研究代表者・研究分担者の専門領域から水、土壌、地形、気象、地質、植物・動物、民俗、美術を取り上げ、組み合わせることで地域の環境を総合的に理解できるカリキュラムの開発に努めた。4.研究代表者、研究分担者は博物館等を中心に5地域の学芸員・研究者・教育者等と共に学習方法を学校の「総合的な学習」等で試行を重ねることにより実践的に研究開発し、地域の環境を学ぶ教材、教具などを成果物として制作した。研究開発に当たっては、(1)主に環境の調査、資料整理と考察、成果の発表方法、(2)ワークショップの中で参加者が共有する方法、(3)多機関の継続的な連携・プログラム開発などに焦点をあてて開発した。研究開発に当たっては、(1)主に環境の調査、資料整理と考察、成果の発表方法、(2)IT技術を使った成果の情報公開、(3)ワークショップの中で参加者が共有する方法などに焦点をあてて開発した。

研究開発に当たっては、(1)主に環境の調査、資料整理と考察、成果の発表方法、(2)ワークショップの中で参加者が共有する方法、(3)多機関の継続的な連携・プログラム開発などに焦点をあてて開発した。
医療情報システム利用時の個人認証方式の検討

1、各種学会発表などによる本方式の評論学会などを通して、「質問に対する解答を利用した認証方式」を発表することにより、様々な立場の人間の意見を収集できた。得られた評価としては、理論的にユニークでありさらなる発展を求めるとの肯定的意見を多く得られたが、解答の信頼性(2にて調査)および認証時間(3にて実施)などの問題点の指摘もあった。2、質問および解答の経時的信頼性の調査本研究では、認証方式として、人間(利用者)の経験および嗜好などの記憶を利用した方式としているが、利用者が問題(質問と解答)を登録した時点より日数を経過することによる記憶の喪失および意識の変化などにより認証が正確に実施されるかを調査する為に利用者に経時的な信頼性(解答の正誤)の調査を実施した。調査期間として、特定質問を1月毎、3月毎、6月毎および12月毎にて調査を行ったが、何れの期間においても誤答はなかった。また、この調査は長期間の検証が必要な為、来年度以降も継続して実施する予定である。3、プログラムの改良学会発表などから得られた意見をもとにプログラムの改良を実施した。特に、認証に要する時間が長くなる欠点を指摘された意見が多かったため時間短縮の改良を実施した。この改良作業は継続中である。4、今後の予定認証方式などのセキュリティ分野研究では、長期間の利用によりはじめて安全性が確認されることとなるので、今後も本研究を継続して実施することによりさらなる安全性の向上をめざす予定である。また、利用者として患者を対象とした場合の特定利用者に限定した場合の研究として行きたい。1、従来の利用者認証方式の検証および本研究との理論的比較パスワード方式などの安全性、利便性などを検証する為に、複数コンピュータにより仮医療情報システムを構築し、そのシステムにて実際に運用を実施(Computer Assisted Radlologyにて報告)し、その結果得られた問題点と本研究方式とを比較し、本研究方式の仕様を設計した。2、利用者認証にしよう予定の質問および回答の作成当初は全ての質問および解答を可変性の無い不変的な質問とする予定であったが、質問を不変的なものに限定するとプライバシー領域に深く踏み込むことになり利用者の賛同が困難と予想される為、質問範囲を個人の嗜好などのような変化する可能性のある問題も含めて作成を実施した。(質問および解答の作成は継続して実施している3、本研究方式のプログラム1、にて本研究方式の仕様および設計の概要が決まったので、それに基づきプログラム作成を開始した。なお、プログラム作成は1、での検討の結果、システムの規模、運用形態により利便性などが変化する可能性を得た為に、3種類の方式を仮プログラムとして作成し、それらを1、と同様に仮運用して得られた結果を基に最適なプログラムの作成を実施する予定である。(現在は仮プログラム作成を終了し、3方式の比較検討中である)4、2、にて作成した質問および解答の信頼性などの確認2、にて記述した本方式にて利用予定の質問および解答は経時的な理由などにより変化する可能性が生ずる。そこで、質問内容の信頼性を経時的にどの程度保てるかの検証を開始した。5、その他本研究にて作成するシステムが広範囲にて利用可能となる為に、日本および世界の医療情報分野の情報および今後進展するであろう方向性の情報を収集し、1、にて決定した、仕様および設計の修正を随時実施した。
極低温、超高純度パラ水素量子固体を用いた化学反応の新展開

1.極低温、超高分解ESRスペクトル超高純度パラ水素は核スピンがなく、ESRスペクトルの線幅の原因となる磁気的相互作用がないので、ESR吸収線が鋭くなり高分解能ESR測定が出来ることを筆者が初めて提案した。超高純度パラ水素固体中において、C_2H_5ラジカルのESRスペクトルは23本の線スペクトノレから成っている。スペクトルの温度依存性を調べた結果、CH_3基の内部回転のエネルギー障壁は5.3Kであることを明らかにした。今後、超高純度パラ水素固体を用いた超高分解ESR測定法により、極低温で存在するラジカルの精密な構造解析が可能となった。2.相互作用のない媒体中の化学反応化学反応においてエネルギーの散逸効果が反応を制御することがある。これまでの研究はいずれも古典的過程に対するものであり、トンネル反応については研究例がない。また、この効果は主に気体でみられた。超高純度パラ水素は固体でありながら、反応物との相互作用が非常に小さく、相互作用からみると真空のような物体である。筆者は極低温超高純度パラ水素固体中で、H原子のトンネル再結合反応や電子バブルのトンネル中和反応に対して、エネルギーの散逸効果が顕著に現れることを初めて発見した。超高純度パラ水素固体中において、C_2H_5ラジカルのESRスペクトルは23本の線スペクトルから成っている。2.相互作用のない媒体中の化学反応真空中でH原子同志は再結合反応をしない。しかし、H_2分子等を存在させると、これらがエネルギー散逸の媒体となるのでH原子は再結合してH_2分子になる。この考えに基づけば固体H_2中では水素分子が多量に存在するので、H原子は容易に再結合してH_2になると予想される。しかし超高純度p-H_2中にH原子を生成すると、H原子同志はトンネル拡散により遭遇しても再結合しないことを発見した。固体p-H_2はH原子との相互作用がなく、再結合反応で生じるエネルギーの散逸媒体になり得ないためである。実際、スピン-格子緩和時間は超高純度パラ水素固体中では非常に長くなることからもわかる。このように超高純度パラ水素固体は、相互作用の面からみると真空のような不思議な物体であると言える。超高純度パラ水素固体を用いることにより、固相反応の新しい側面を切り開くことが出来ると思われる。
ショウジョウバエの器官アイデンティティーを決定するプログラムの網羅的解析

器官のアイデンティティーがどのようにして決定されるのかという問題は、発生プログラムの基本をなす重要な問題である。これまで、ショウジョウバエの主要な成虫器官である、複眼、触角、翅、肢の全てにおいて、これらの形成をより上位で支配している遺伝子の発現を、Notchシグナリングを中心とした機構が共通に制御していることを明らかにした。そして、この共通機構からどの器官の誘導がなされるのかは、この機構と共に働く遺伝子の発現状況により決定されることを明らかにした。本研究では、ショウジョウバエを用いて、この共通機構から器官特異性が決定されるまでに必要な遺伝子発現のカスケードと、それらの遺伝子間のクロストークを明らかにすることを目的とした。そのために、酵母の転写因子GAL4のターゲット配列UASをランダムに導入したショウジョウバエ系統(遺伝子サーチシステム)を用いて、複眼原基でGAL4を発現させ、活性化型Notchレセプターと同時に発現させたときに、複眼から翅、触角あるいは肢へと器官変換を誘導できる、UASの下流に存在する遺伝子を同定することにした。現在までおよそ350系統のスクリーニングを終了しているが、すでに複眼が翅に変換する系統(GS1068)と複眼が触角に変換する系統(GS1129)を見出している。それぞれの系統においてゲノム上でのUAS挿入位置はすでに明らかとなっており、現在それらの遺伝子の同定を進めている。これまでに、GS1068はNotchシグナルと共に働きAntennapedia(Antp)の異所的な発現を誘導し、そのAntpが再びNotchシグナルと共に働き、翅の形成を支配するvestigialの発現を誘導し、複眼から翅への転換を誘導することを明らかにした。
神経膠腫における免疫逃避機序と遺伝子変異・予後との関係の解明

悪性神経膠腫の腫瘍微小環境におけるチェックポイント分子の発現、浸潤リンパ球、マクロファージの役割を解析することを目的に本研究を開始した。これらの結果を定量評価するために免疫染色画像を取り込み画像ソフトを用いて解析を行ったところ再現性をもった解析が困難であった。そこで別の画像解析ソフトを用いて定量化を行う方針とし、いくつかの画像解析ソフトを検討しデモを行ったところPatholoscope(三谷商事)が本解析に適していると判断し購入手続きを行っているところである。今後は条件設定を行い、上記の免疫染色の結果を定量化し、1PD-L1分子の評価に適した抗体の選定し陽性判定基準の確立し、2PD-L1発現・浸潤リンパ球・マクロファージと悪性神経膠腫の病理学的・遺伝学的・臨床的特徴の検討を行う方針としている。この1と2に加え、以前に行った14種類の悪性神経膠腫細胞株におけるフローサイトメーターを用いたチェックポイント分子の網羅的解析結果を含めて論文作成を行う方針とする。600枚の免疫染色画像を取り込む作業および画像ソフトを用いて解析を行う作業に時間を費やした。さらに免疫染色の陽性陰性の判断がスライドごとにバラついており再現性を持った定量化ができないことが判明し、別の解析ソフトを用いることに方向転換したため達成度が遅れている。悪性神経膠腫は最も頻度の高い悪性脳腫瘍であり、特に膠芽腫は現在の標準治療である放射線治療併用テモゾロミド療法を行っても生存期間中央値は1.5-2年と極めて予後不良な疾患である。悪性神経膠腫においてPD-L1 (programmed cell death ligand -1)の発現等を介した免疫逃避機序が存在し、現在の抗癌剤に対する治療抵抗性の原因となっている可能性が考えられる。本研究では悪性神経膠腫組織中に発現するチェックポイント分子の発現、浸潤リンパ球、患者血液中の免疫担当細胞を解析し、悪性神経膠腫の遺伝子異常や治療効果・予後との関係を明らかにし、治療効果を予測する因子の同定や新たな治療開発を目指している。初年度は悪性神経膠腫における免疫逃避機序の探索を目的として、悪性神経膠腫100例の組織マイクロアレイを用いて、PD-L1、CD4, CD8,制御性T細胞(regulatory T cell: Treg)のマーカーであるFOXP3、抑制マクロファージのマーカーであるCD68およびCD204の免疫組織化学的検討を行った。その結果、悪性神経膠腫100例中、PD-L1陽性21例(21%)、CD4陽性62例(62%)、CD8陽性63例(63%)、FOXP3陽性34例(34%)、CD68陽性93例(93%)、CD204強陽性33例(33%)であった。PD-L1発現はCD4陽性、CD8陽性、FOXP3陽性、CD204陽性と有意に相関し、膠芽腫67例においてPD-L1陽性例は陰性例より有意に生存期間が延長していた。これらの結果からはPD-L1発現は内在性の免疫応答に対応した腫瘍の抵抗機序の表れと考えられ、チェックポイント阻害剤を用いることによりPD-L1発現例に対しては抗腫瘍免疫が賦活化され治療効果が得られる可能性が考えられた。悪性神経膠腫の組織マイクロアレイを用いたPD-L1発現と免疫担当細胞の浸潤の検討により、腫瘍局所における免疫反応とPD-L1発現の関連が示唆される結果が得られた。一方で、非小細胞肺癌を対象とした4つの抗PD-L1抗体(22C3, 28-8, P142, P263)を比較した報告(Hirsch et al. 2017)がなされたことから今回用いた抗PD-L1抗体:E1L3Nの再評価が必要と判断し、今後の研究に用いる抗PD-L1抗体の選定と陽性判断基準を設定する必要があるためやや遅れていると判断している。悪性神経膠腫においてPD-L1 (programmed cell death ligand -1)の発現等を介した免疫逃避機序が抗癌剤に対する治療抵抗性の原因となっている可能性を考え、悪性神経膠腫組織中に発現するチェックポイント分子の発現、浸潤リンパ球、マクロファージの役割を解析することを目的に本研究を開始した。これまでに行ってきたことは以下の3つである。114種類の悪性神経膠腫細胞株をフローサイトメーターを用いて網羅的に解析し、PD-L1が全ての細胞株に発現していることを確認した。2悪性神経膠腫100例の組織マイクロアレイを用いて、PD-L1、CD4, CD8,制御性T細胞のマーカーであるFOXP3、抑制マクロファージのマーカーであるCD68およびCD204の免疫組織化学的検討を行った。PD-L1発現はCD4陽性、CD8陽性、FOXP3陽性、CD204陽性と有意に相関し、膠芽腫67例においてPD-L1陽性例は陰性例より有意に生存期間が延長しており、腫瘍局所における免疫反応とPD-L1発現の関連が考えられた。

3抗PD-L1抗体としてE1L3Nを用いて上記の実験を行ったが、肺癌領域で抗PD-L1抗体として、22C3, 28-8, SP142, SP263が治療薬に応じて用いられることから、E1L3Nと3種類の抗PD-L1抗体(22C3, 28-8, SP142)との染色性の比較を行った。その結果、それぞれの抗体により染色性の違いがあるものの病理学的にはPD-L1陽性・陰性の判定には大きく影響しないものと考えられた。上記3における4種類の抗PD-L1抗体(E1L3N, 22C3, 28-8, SP142)のなかから適切な抗PD-L1抗体を選定し陽性判定基準の確立するところは今後研究を進める上で重要になることから慎重に検討している。このため達成度がやや遅れていると判断している。悪性神経膠腫の腫瘍微小環境におけるチェックポイント分子の発現、浸潤リンパ球、マクロファージの役割を解析することを目的に本研究を開始した。これらの結果を定量評価するために免疫染色画像を取り込み画像ソフトを用いて解析を行ったところ再現性をもった解析が困難であった。そこで別の画像解析ソフトを用いて定量化を行う方針とし、いくつかの画像解析ソフトを検討しデモを行ったところPatholoscope(三谷商事)が本解析に適していると判断し購入手続きを行っているところである。今後は条件設定を行い、上記の免疫染色の結果を定量化し、1PD-L1分子の評価に適した抗体の選定し陽性判定基準の確立し、2PD-L1発現・浸潤リンパ球・マクロファージと悪性神経膠腫の病理学的・遺伝学的・臨床的特徴の検討を行う方針としている。この1と2に加え、以前に行った14種類の悪性神経膠腫細胞株におけるフローサイトメーターを用いたチェックポイント分子の網羅的解析結果を含めて論文作成を行う方針とする。600枚の免疫染色画像を取り込む作業および画像ソフトを用いて解析を行う作業に時間を費やした。さらに免疫染色の陽性陰性の判断がスライドごとにバラついており再現性を持った定量化ができないことが判明し、別の解析ソフトを用いることに方向転換したため達成度が遅れている。抗PD-L1抗体として我々は当院で過去にvalidationされ論文化に用いられた抗PD-L1抗体: E1L3Nを用いて上記の実験を行ったが、肺癌領域では抗PD-L1抗体は、22C3, 28-8, SP142, SP263が治療薬に応じて用いられることから、他癌腫との比較可能性を考慮して我々の用いたE1L3Nよりも、上記の4抗体(22C3, 28-8, SP142, SP263)を用いた研究を行う方がよいと考えた。従って今回我々の用いた同じ組織マイクロアレイを用いて、3種類の抗PD-L1抗体(22C3, 28-8, SP142)での免疫染色を行い、E1L3Nとの染色性の比較を行った。今後は4種類の抗体による染色性を定量化し悪性神経膠腫における適切な抗PD-L1抗体を選定し陽性判定基準を確立することを予定している。さらに均一な治療を行った膠芽腫におけるPD-L1発現と免疫担当細胞の浸潤を検討し、予後との関係を検討すること、グレードIIおよびIII神経膠腫におけるIDH1/2遺伝子変異有無と免疫逃避機序との関係を検討することを予定している。現在膠芽腫においてMGMT(O-6-methylguanine DNA methyltransferase)プロモーター領域のメチル化別に抗PD-1抗体薬(Nivolumab)を用いた臨床試験が行われていることから、MGMTプロモーター領域のメチル化別に免疫逃避機序の解明を予定している。
3次元濾過理論に基づく泥しょう鋳込み成形の有限要素解析

本研究の主な成果は以下の通りである。1.既往の近代濾過理論を一般座標系に拡張することにより,3次元鋳込み成形の基礎支配方程式系を与えた。これは,液流速qと粒子移動速度rを含む濾液流動基礎式,qとrの発散を空隙率の時間微分と関連づける連続式,および液圧p_Lと圧縮圧力p_Sの関係から成る。qとrの方向が-∇p_L=∇p_Sの方向と一致すると仮定し,また,圧縮透過特性を利用すると,基礎支配方程式系を2個の偏微分方程式に帰着させ得る。これらの式を,空間的にはGalerkin有限要素法で,時間的には有限差分法で離散化し,各時間毎に得られたマトリックス方程式をGauss消去法によって解いた。着肉表面および液フロントの計算では,主曲率の影響を考慮した。円筒石こう型による鋳込み成形の解析結果は,ここで提案する解析手法により3次元着肉成長は勿論,空隙率,圧力,流速等の内部状態の時間発展やスラリー濃度の影響なども推定できることが示された。2.濾材抵抗を比較的大きく設定して定圧濾過実験を1回だけ実施し,その初期段階の濾液流出量経時変化(Vvs.θ)を用いて,逆推算により圧縮透過特性を決定する簡便な方法を提案した。本手法は,近代濾過理論とSimplex法とを用いて,(Vvs.θ)関係の推定値と実測値の偏差を最小化するよう,圧縮透過特性と濾材抵抗特性を規定する計10個のパラメータを求めるものである。カオリンスラリー系への適用例により,本手法が圧縮透過特性の高精度かつ迅速なる決定法であることを実証した。1.〓過実験の実施と解析:試作した小型濾過実験装置にて定圧濾過を行い,濾液量の経時変化を電子天秤(購入)により電気信号に変換し,それを一旦ファイルに落とした後,ワークステーション(購入)に取り込んで後述する解析を実施した。朝鮮カオリンと水の混合物をボールミルに仕込み2日間の連続運転によりスラリー調成を行い,定圧濾過実験,及び,別に実施した圧縮透過実験と遠心沈降・重力沈降実験に供した。2.圧縮透過特性の迅速決定プログラムの開発:圧縮透過特性を規定する7個のパラメータと濾材抵抗を規定する2個のパラメータとの計9個のパラメータを任意に設定すると,近代濾過理論に基づき濾液流出量の経時変化を推定できる。濾過現象を規定するのは圧力差(p-p_m)であり,その値が急激に増加する定圧濾過の初期段階に注目すると,そのケーク特性は変圧濾過のそれと同等であり十分な情報量を含んでいる。以上の事実に基づき,本研究では,1回の定圧濾過実験の初期段階の濾液流出量変化に注目し,目的関数(すなわち濾液流出量変化の推定結果と実測結果との偏差)を最小化するよう9個のパラメータ探索を行った。つまり,圧縮透過特性の逆推算問題を最小値探索問題に帰着させ,探索法としてSimplex法を用いるプログラム開発を行った。また,本プログラムの検証のため,上記定圧濾過実験に基づき圧縮透過特性の迅速決定を行い,別に実施した圧縮透過実験及び遠心沈降・重力沈降から得られた圧縮特性等と良好に一致することを確認した。なお,この成果は第5回日韓分離技術シンポジウム(韓国ソウル;1999.8.20-21)にて発表予定であり,論文原稿を既に送付した。3. 3次元鋳込成形プログラムの開発:着肉層の圧縮性を考慮した有限要素解析の定式化を終了し,既に完成している非圧縮性着肉層の場合の解析プログラムの修正に着手した。1.圧縮透過特性の迅速決定法の開発:圧縮透過特性は7個の実験定数で規定され,濾材抵抗を規定する1個の定数との計8個の定数を任意に設定すると,近代濾過理論に基づき濾液流出量の経時変化を予測できる。

意図的に大きくした濾材抵抗にて定圧濾過を行うとその初期段階の濾過特性は変圧濾過のそれと同等な情報を含む。従って,定圧濾過実験の初期段階の濾液流出量変化データだけに基づき,その理論値と実測値との偏差を最小化するよう8個の実験定数を探索すると,圧縮透過特性を簡便迅速に決定することができる。本研究ではSimplex法による探索法を提案した。従来の実験法では長い日数(20日30日)を要したが,本方法によれば,高々23時間にて圧縮透過特性の迅速決定が可能となった。2.3次元鋳込成形の解析手法の開発:先ず,セラミックス焼成用または化学用容器として重要な矩形体を想定し,鋳込成形時の非圧縮性ケークの成長を2次元的に有限要素法を用いて予測した。次に,円筒型における鋳込成形について,濾過理論に基づき圧縮性ケークの3次元成長挙動を有限要素法により予測する手法を提示した。この場合,最終的に解くべき方程式系は圧縮圧力に関する非定常の偏微分方程式および粒子移動速度に関係する変数に関する偏微分方程式とからなり,空間的には有限要素法で,時間的には有限差分法でそれぞれ離散化すると時間発展的に解くこととなる。なお,数値解析においては,無限小時間ということはありえないため,有限の時間刻み△tにて,有限の厚さだけ曲面を成長させる必要がある。このとき,△t時間後に成長させるべき着肉厚さはケーク曲面の曲率に依存することを明らかにし,2つの主曲率を考慮に入れる着肉計算式の導出を行った。
がん患者のギアチェンジを支える援助モデルの開発

ギアチェンジを"抗がん治療をしている患者が、治療の目的を治癒以外の方向に転換していくこと"と捉え、医療者のがん患者のギアチェンジに対する認識、ギアチェンジを支える援助内容と援助を提供する上での阻害要因を明らかにした。看護師はがん患者のギアチェンジに対して課題、意義、実現するための看護の役割を捉える一方、心的負担を認識しつつ援助を行っていた。終末期がん医療は不確かで、ギアチェンジを支える援助に確信が持ちにくいという特徴が示された。医師や看護師ががん患者のギアチェンジを支える援助についてどのように理解しているのか、また、がん患者のギアチェンジを支える上での阻害要因や促進要因を明らかにしていくために、次の2段階のプロセスを実施した。第1段階:半構成的インタビューガイドの作成文献レビューを通して、研究者間でギアチェンジを「がん患者が治癒を目的とした積極的治療が望めなくなり、避けられない死に向き合い、自分らしい生き方を選択できるようにするために、積極的治療をあきらめて、緩和ケアへと方向を変更すること」と定義し、本研究のインタビューガイドを作成した。医療者を対象とした半構成的面接法で活用するインタビューガイドの項目は、(1)ギアチェンジに関する考え方(患者や家族にとっての意義(意味)、医療者にとって患者がギアチェンジすることの意味)、(2)患者に沿ったギアチェンジができた事例と支援できたと考える理由、(3)上手くできたと思われることに関係する要因、(4)患者に沿ったギアチェンジへの支援ができなかった事例と支援ができなかったと考える理由、(5)ギアチェンジへの支援をしていくために実践していること、(6)ギアチェンジをしていくために重要であると考えていること、(7)ギアチェンジをしていくための課題である。第2段階:データ収集と掘り起こし上記のインタビューガイドを用いて、K県およびO県の病院、緩和ケア病棟、訪問看護ステーションに所属する医師10名(緩和ケア病棟医師、一般病院医師)および看護者20名(病院看護師、がん看護専門看護師、訪問看護師、緩和ケア病棟看護師)を対象として面接を行った。現在、研究協力者に面接内容の掘り起こしを依頼し、逐語録の作成を行っており、分析を進めつつある。<研究目的>がん患者が積極的な治療をあきらめ、避けられない死に向き合い自分らしい生き方をしていけるように、医師や看護師ががん患者のギアチェンジを支える援助についてどのように理解しているのか、また、がん患者のギアチェンジを支える援助を提供していく上での阻害要因や促進要因を明らかにしていくために、次の研究計画を実施した。<データの掘り起こしとデータ分析>昨年度から引き続き、データの掘り起こしと分析を進めている。分析は途中段階であるが、現時点で阻害要因として、医療従事者側の要因(患者のアセスメントカの問題、情報提供の時期の問題、コミュニケーション能力の問題等)家族側の要因(患者との認識のずれ等、患者との予後に関する情報共有上の問題等)、患者側の要因(意思決定上の問題、準備性の問題等)、施設側の要因(入院期間の短縮化の問題、受け入れ施設側の問題等、連携上の問題等)などが浮かび上がってきている。促進要因としては、患者との継続的なコミュニケーション、タイムリーな患者の意思確認、患者の意思を尊重する、患者や家族への情緒的サポート、転院先(緩和ケア病棟、訪問看護ステーション)の情報の提供などが浮かび上がってきている。さらに分析を進め、カテゴリー化していく予定である。本年度は、面接データ分析し、結果より看護師のがん患者のギアチェンジについての捉え・援助内容・阻害要因から成る“がん患者のギアチェンジを支える看護援助モデル"を開発した。<結果>1.看護者のギアチェンジについての捉えとして11カテゴリーが抽出され、これらは【ギアチェンジの迷い】【ギアチェンジの現実課題】【ギアチェンジの成果】【ギアチェンジにおける看護の役割】の局面から援助モデルに示唆を与える。2.ギアチェンジを支える援助として、[意図的に医師に関わり援助に巻き込む][ICにおける看護師の役割を果たす][治療開始時から経過を見通しながら継続的に関わる][治療が限界にきていることへの情動を受け止める][患者・家族が納得して方向転換ができるよう環境を整える][症状緩和をはかり好機を捉えてタイミングよく介入する]など、13カテゴリーが抽出され援助モデルの中心となる。3.ギアチェンジを支える援助の阻害要因として、[患者家族が緩和ケアへの移行を受け入れられない][症状や病気の進行が速く患者・家族が考えるゆとりがない][医療者と患者・家族の関係性が上手くとれていない][医療者の意向・考え方で進めている]患者にタイミングよく関われていない][医師のギアチェンジへの知識・技術が不足している][看護師の知識・技術が不足している][看護師・医師がギアチェンジの難局に向き合えない]など10カテゴリーが抽出され、これらの阻害要因への取り組みが今後の重要課題となる。
高速・高精度のディジタル電圧・電流検出器の開発

本研究では,電流測定範囲±50AT,帯域幅DC1MHz,分解能12bit,サンプリングレート8MS/s,スリューレート25AT/musのディジタル電流検出器を開発した。その結果,ディジタル電流検出器は故障時の急激な電流変化に対しても,1mus程度の遅れで検出可能であることを実験により確認した。本研究では,さらに以下の点を明らかにした。1)ディジタル電流検出器に用いているA/D変換器の分解能とクロック周波数を大きくすることで,スリューレート特性を改善できる。2)A/D変換器としては,最近低価格化の著しいフラッシュ形(8bit,20MS/s)のものが十分使用可能である。3)電圧・電流変換器はその周波数帯域(100kHz)以上では電圧源として働くので,測定電流の100kHz以上の高周波成分はAC-CTの変圧器作用により二次巻線に流れる。4)この二次巻線に流れる高周波電流成分のみを抽出し,ディジタル積分器にフィードバックする新しいループを追加することで,ディジタル電流検出器の高周波検出特性を100kHz以上に改善できる。このディジタル電流検出器の原理を適用して,ディジタル電圧検出器を試作し,電流検出器の場合と同様の良好な検出特性が得られることを実験により確認した。また,ディジタル電圧・電流検出器で使用する演算増幅器,A/D変換器,D/A変換器などの構成要素に必要な性能を,応答性に着目して理論解析した。
貝殻集積層のタホノミー:掛川、唐浜、宮崎層群を例として

本研究は貝殻集積層を多量に有し、それらから多くの進化古生物学的研究材料を提供してきた西南日本太平洋側に分布する掛川層群(静岡県)、唐浜層群(高知県)、宮崎層群(宮崎県)を研究対象とした。唐浜層群では、Phanerolepida pseudotransenna(巻貝)の産状記載を行い、その分類を明らかにした。また、掛川層群大日層の外浜堆積物と推定される層準に挟在し、HCS層に整合に覆われる貝殻集積層のブロックサンプリングを行い、層準ごとの貝殻の種構成、貝殻の大きさの変化、および貝殻の配列傾向を調べた結果、以下の点が明かとなった。1.この貝殻集積層には浅海の砂底、砂泥底、岩礁に生息する種が混在して産し、また、特に内湾度の高い種が産出しないので、外洋に面した浅海に生息する種から成る混合群集である。2.貝殻の配列を計測した結果、貝殻には配列傾向が存在し、また貝殻集積層の上部と下部では、配列傾向が異なることがわかった。3.流水下における貝殻配列の従来の研究結果と比較したが、これらを元に解釈すると多くの矛盾が生じることから、従来行われてきた実験や観察とは異なった流速や堆積様式を仮定する必要があることがわかった。4.この貝殻集積層の貝殻の配列は、ほぼ北西から南東に流れる、秒速1mを超えるような貝殻を多量に含んだ密度流が極めて短時間に堆積したと仮定すると合理的に説明ができる。5.貝殻集積層を形成した密度流は、ストームピーク時における引き波と地衡流との複合流が引き起こしたと考えられる。本年度は以下の2点を明らかにすることができた。1.宮崎県の平田川流域岩瀬橋付近の鮮新統高鍋層の貝殻集積層を調査した。露頭上の貝殻の分布状態を詳細に記載し,一部の貝殻については殻の方位の測定を行った。その結果,この貝殻集積層は異なった二つのステ-ジに棲息していた群集から構成されている事が明かとなった。すなわち,殻の方位がランダムで,バッチ状に密集し,異地性の産状を示すCucullaea,Anadara,Paphiaなどの二枚貝類が最初の群集を構成し,棲息時の状態を保って,散在的に産するEufistulana,Barneaなどが二番目の群集を構成する。筒状の殻を持つEufistulanaは最初のステ-ジのCucullaeaの殻を穿孔している。恐らく,最初のステ-ジの貝殻はスト-ムのラグ堆積物で,スト-ムの結果変化した底質に二番目の群集が住み着いたと考えられる。2.静岡県の掛川地域の鮮新統大日層の貝殻集積層のブロックサンプリングを行い,貝殻集積層の内部構造を明らかにした。サンプリングしたブロックを研究室で処理し,ブロックに含まれる全ての貝殻の大きさ,方位,種名を記載した。貝殻集積層内の二枚貝と巻貝の配列は,それらの流体力学的挙動を考慮すると,この集積層が振動流で形成されたことを示した。この成果は,世界で初めて貝殻集積層の内部構造から集積層の起源を説明したものである。本研究は貝殼集積層を多量に有し,それらから多くの進化古生物学的研究材料を提供してきた西南日本太平洋側に分布する掛川層群(静岡県),唐浜層群(高知県),宮崎層群(宮崎県)を研究対象とした.唐浜層群では,Phanerolepida pseudotransenna(巻貝)の産状記載を行い,その分類を明らかにした.また,掛川層群大日層の外浜堆積物と推定される層準に挟在し,HCS層に整合に覆われる貝殼集積層のブロックサンプリングを行い,層準ごとの貝殼の種構成,貝殼大きさの変化,および貝殼の配列傾向を調べた結果,以下の点が明らかとなった.

1.この貝殼集積層には浅海の砂底,砂泥底,岩礁に生息する種が混在して産し,また,特に内湾度の高い種が産出しないので,外洋に面した浅海に生息する種から成る混合群集である.2.貝殼の配列を計測した結果,貝殼には配列傾向が存在し,また貝殼集積層の上部と下部では,配列傾向が異なることがわかった.3.流水下における貝殼配列の従来の研究結果と比較したが,これらを元に解釈すると多くの矛盾が生じることから,従来行われてきた実験や観察とは異なった流速や堆積様式を仮定する必要があることがわかった。4.この貝殼集積層の貝殼の配列は、ほぼ北西から南東に流れる,秒速1mを超えるような貝殼を多量に含んだ密度流が極めて短時間に堆積したと仮定すると合理的に説明ができる.5.貝殼集積層を形成した密度流は,ストームピーク時における引き波と地衡流との複合流が引き起こしたと考えられる.
倍数性・ダウン症モデル解析に基づく加齢疾患の発症原理解明と創薬応用

新規ダウン症モデルマウス樹立に向けて、目的3'側へのloxP挿入した組み換えESが完成し、個体化し、ES単離も行った。更に5'側の相同アレルにLoxPを挿入を追加した組み換えES細胞を得た段階である。またダウン症因子ー1 (DSCR-1)の欠損マウスとApoE欠損マウスとの掛け合わせ実験を行い、DSCR-1欠損の影響が大血管内皮と末梢循環内皮とで大きく異なること、例えば高脂肪食負荷にて生じる動脈硬化プラーク形成度合いがDSCR-1欠損だと減弱する一方、ApoE単独欠損マウスに比べDSCR-1とのダブル欠損マウスでは更なる病的高コレステロール血症を呈し、その結果、末梢での脂肪腫や角膜混濁にまで至ることを見出した。この角膜血管新生の中心的役割を担うSDF-1-CXCR4シグナル軸について解明し、論文のrevise ssubmissionを行った段階である。一方、DSCR-1の血管内皮特異的安定発現マウスも樹立した。これは、ヘテロTgマウスだけがviableで、ホモTgマウスでは血管リモデリングが始める時点で血管成熟が生じずに胎生致死になることが判明している。このヘテロTgマウスではダウン症同様、NFATの機能低下から胎仔の発育遅延にも繋がる結果となり、更に本マウスで血管分岐の異常や血管恒常性の低下が顕著に認められることから、NFAT/DSCR-1シグナルの血管分岐・血管リモデリング機能への根本的な原理解明に繋がる可能性が示唆されている。更に、共同研究者からダウン症iPS細胞の供与を受け、安定的に培養出来ている段階である。Hi-C解析に向けてまずダウン症ESの培養を開始出来ていること。ダウン症モデルマウス樹立に向けては、現段階では全5ステップの内、3ステップ目に入っていること。ダウン症の複合疾病を考える上で、研究代表者での血管機能解析に加え、共同研究者の血液研究、神経研究との融合を考慮しているが、更に、行動実験薬理、骨粗鬆症、筋肉活性、不妊を専門とする研究者とダウン症モデルマウス解析を軸とした共同研究が進むことを計画しており、順調に進めば大きな相乗効果が期待される。新規ダウン症モデルマウス樹立においては、目的ES細胞からの個体化が成功すると、ダウン症にて重要視されてきた遺伝子セットを全てトリソミー化したモデルマウスが日本初で出来るので、迅速に出来るよう、ここに集中できる研究員の雇用経費を一部、本科研費で扱う予定である。DSCR-1の血管機能解析について、とくに動脈硬化との関連性は早期論文化を図るとともに、新たに見出したNFATと血管分岐、発芽などの原理解明に繋がる実験データを積み重ねて、新たな血管分岐の概念が生み出されるよう、研究推進を図る。ダウン症iPSでのHi-C解析では、東大先端研での先行技術を学び、今年度中に一回Hi-seqで実験できるよう、共同研究者との話し合いを進め、先ずはHi-C解析条件が固定化できることを目指す予定である。

DSCR-1の血管機能解析について、とくに動脈硬化との関連性は早期論文化を図るとともに、新たに見出したNFATと血管分岐、発芽などの原理解明に繋がる実験データを積み重ねて、新たな血管分岐の概念が生み出されるよう、研究推進を図る。ダウン症iPSでのHi-C解析では、東大先端研での先行技術を学び、今年度中に一回Hi-seqで実験できるよう、共同研究者との話し合いを進め、先ずはHi-C解析条件が固定化できることを目指す予定である。新規ダウン症モデルマウス作製のためのES細胞を樹立し、その6クローンをinjectionしたが、結果としてどれもキメラマウスへの供与率が10%未満とかなり低く、モデルマウスの作製において、再度ES構築のステップから開始する必要が生じた。そこで、このマウス化にむけたES再調整におけるスタッフの雇用費の一部を今年度に移行させた。更にダウン症由来iPS細胞の獲得に倫理手続きを含めて時間が要し、今年度からiPS細胞の培養とHi-C解析を始める予定となったので、その解析費用を今年度に移行させた。
生殖細胞に対する光細胞操作を駆使した重複受精機構の解析

被子植物の重複受精では,2つの精細胞がそれぞれ異なる受精相手,すなわち卵細胞および中央細胞と受精する。正常な種子の発達には両方の受精が達成されることが必須であるが,2つの精細胞を異なる受精相手へと正確に分配する機構など,重複受精の詳細な仕組みは未だ明らかになっていない。そこで本研究では,モデル植物シロイヌナズナを材料に,花粉管と胚珠組織を用いたsemi-in vivo重複受精系による重複受精のライブイメージング解析と顕微細胞操作を駆使して,2つの精細胞の受精相手が決定されるための雌雄配偶子間コミュニケーションの実体を解明することを目指した。まず,二光子レーザー顕微鏡のフェムト秒パルスレーザーを用いることで,胚珠内の卵細胞または中央細胞の核にレーザーを特異的に照射し,ダメージを与えることに成功した。卵細胞核を破壊した胚珠内における2つの精細胞の挙動をsemi-in vivo重複受精系により観察したところ,残された中央細胞が2つのうち1つの精細胞のみと受精する「多精拒否機構」を有する可能性が示唆された。さらに,精細胞の数が増えたときの雌雄配偶子間コミュニケーションを解析するために,1本の花粉管内に複数ペアの精細胞をもつtetraspore変異体のノックアウト変異体をCRISPR/Cas9システムにより作出した。この変異体を用い,胚珠内に放出された4つの精細胞の挙動をライブイメージングにより初めて捉えることに成功し,4つの精細胞のうち2つだけがそれぞれ卵細胞および中央細胞と受精することを見出した。これにより,2つの雌性配偶子が1つの精細胞とだけ受精する多精拒否機構を有することで,重複受精が成立していることが示唆された。今後,作出した変異体を用い,より多くの精細胞が放出された際にも1対1での受精が維持されるのかどうかなど,重複受精における多精拒否機構の重要性を明らかにしたい。27年度が最終年度であるため、記入しない。本研究では、シロイヌナズナを用い、重複受精時に2つの精細胞がそれぞれ卵細胞および中央細胞と正確に受精するための仕組みを解明することを目的とした。これまでに、二光子レーザー顕微鏡のフェムト秒パルスレーザーを用いて胚珠内の卵細胞を特異的に破壊し、胚珠内に放出された2つの精細胞の挙動を共焦点レーザー顕微鏡によりライブイメージングする系を立ち上げた。それに加え、卵細胞に比べてサイズの大きい中央細胞についても、レーザー強度や照射回数を検討することにより、破壊することに成功した。同時に、胚珠内の細胞の細胞膜が標識されたマーカーラインを用いることで、卵細胞および中央細胞を破壊した際の他の細胞の膜の状態を詳細に観察することが可能となった。これにより、卵細胞を破壊した胚珠内において、中央細胞は2つのうち1つの精細胞のみと受精する「多精拒否機構」をもっていることが示唆された。さらに、細胞機能を破壊する別の手法として、翻訳阻害を引き起こすジフテリア毒素の時空間特異的な発現による遺伝学的な細胞破壊のためのコンストラクトの作製を進めた。また、受精できない精細胞を生じるためヘテロ接合でしか維持することのできないgcs1変異体に関して、熱ショックによりホモ接合体を誘導するコンストラクトの作製を行い、熱ショックの条件を検討することによりホモ接合変異体を作出することに成功した。この成果により、すべての花粉がgcs1の遺伝子型・表現型を示す株を得ることができ、これまでには比較することのできなかった、受精直前の精細胞の放出という現象に伴う胚珠内での変化を解析することが初めて可能となった。さらに、今回確立したホモ接合体の誘導系を、精細胞の分化および受精能の獲得に関与する精細胞特異的な転写因子DUO1の変異体に応用する準備を進めた。本研究では,シロイヌナズナを用い,重複受精において2つの精細胞の受精相手を決定するための雌雄配偶子間コミュニケーションを明らかにすることを目的とした。これまでに,胚珠内の卵細胞または中央細胞に対し特異的にフェムト秒パルスレーザーを照射し,胚珠内に放出された2つの精細胞の挙動をライブイメージングする系を確立した。雌性配偶子の細胞膜が標識された株を用い,細胞核へのレーザー照射により,卵細胞においては膜が変形し破壊される様子が観察された。一方,中央細胞においては膜に影響はなく細胞の形が残っているものの,ダメージを与えられることが分かった。卵細胞を破壊した胚珠において,中央細胞は2つのうち1つの精細胞のみと受精する多精拒否機構を持っていることが示唆された。中央細胞にダメージを与えた胚珠では,ほとんどの場合,2つの精細胞がそれぞれ卵細胞および中央細胞に分配される様子が観察された。この結果から,中央細胞ではレーザー照射前に準備されているタンパク質を用い重複受精が成立している可能性が考えられた。そこで,より早期にタンパク質合成を阻害する目的で,DEX誘導的にジフテリア毒素を発現させるコンストラクトの作製および植物体への形質転換を行った。重複受精時の膜融合に欠損のある精細胞を生じるgcs1変異体(Mori et al., 2006)はヘテロ接合体でしか維持することができないため,これまでは半数含まれる野生型精細胞を含む花粉により,表現型を解析することが困難であった。本研究では,gcs1ホモ接合変異体を熱誘導的に作出することに成功した。さらに,作出したgcs