hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
匂い感性の予測：脳活動―自律神経活動―感性指標のモデル化と人工官能検査法の提案

本研究では,匂い刺激に対して主観評価アンケートから得られる感性指標が予測可能な人工官能検査アルゴリズムの構築を目指して,脳科学分野において発展した脳活動の非侵襲計測技術(fMRI)や心理学的実験手法に,これまで応募者が構築した各種嗅覚系モデルと生体信号計測評価技術を駆使して,以下4項目を達成目標とする.1)匂い刺激に対する自律神経活動と感性指標の関係を明らかにする.2)匂い刺激が誘起する脳活動と感性指標の関係を明らかにする.3)脳活動ー自律神経活動ー感性指標の関係を説明可能な数理モデルを構築する.4)匂いの感性指標予測アルゴリズムを開発する本年度は,1脳活動から匂い感覚の予測を試みる(目標4)とともに,2前年度に引き続き匂い提示実験による感性指標と自律神経活動の解析を行った(目標1・3).1単分子の匂いが誘起する嗅球の活動から匂い感覚データベース[Dravnieks, 1985]に収録された146種類の主観評価指標の予測を行った.まず,嗅球表面の活動パターンベクトルを構成する各要素と各主観評価指標との相関を求め,有意な相関が存在する要素を抽出した.そして,サポートベクトル回帰を用いて抽出した要素ベクトルを主観評価指標空間に写像する関数を求め,Leave-one-out交差検証を用いて主観評価指標の予測精度を評価した.その結果,近年報告された分子記述子を用いる手法[Keller et al. Science, 2017]と同等の精度が得られた.以上より,脳活動から匂い感覚を予測可能であることが分かった.2昨年度構築した匂い提示装置を用いて,匂い刺激に対する主観評価を計測するとともに末梢血管剛性・粘性と心拍変動指標を求めた.末梢血管剛性と粘性のそれぞれについて低周波成分と高周波成分の最大値と最小値を抽出し,主観評価指標との関係を解析した結果,中程度の相関が認められた.研究実績の概要で述べたように,自律神経活動計測により,末梢血管剛性と粘性を用いて匂いの主観評価を予測できることを示した.また,単分子の匂いが誘起する嗅球の活動から匂い感覚データベース[Dravnieks, 1985]に収録された146種類の主観評価指標の予測にある程度成功した.当初,平成30年度に予定していた脳活動と自律神経活動の同時計測には至らなかったが,自律神経活動と脳活動の応答から感性予測可能な数理モデルを構築するという課題は最終年度に行う予定である.以上のように計画全体としては予定通りに進展している.最終年度は,fMRI内における匂い刺激実験プロトコルを策定し,脳活動と自律神経活動の同時計測を行い,脳活動と自律神経活動,そして感性指標の関係を多変量解析により明らかにするとともに,感性指標や自律神経活動に影響を及ぼす脳機能部位を特定する.また,これまでの解析より自律神経活動と感性指標の間に非線形性が認められるため,統計構造を内包したニューラルネットLog-linearized Gaussian Mixture Network (LLGMN)を用いて自律神経活動から感性指標の予測可能性について検討する.そして,これまでの研究成果をまとめ,国際会議や学術論文にて報告する予定である.本研究では,匂い刺激に対して主観評価アンケートから得られる感性指標が予測可能な人工官能検査アルゴリズムの構築を目指して,脳科学分野において発展した脳活動の非侵襲計測技術(fMRI)や心理学的実験手法に,これまで応募者が構築した各種嗅覚系モデルと生体信号計測評価技術を駆使して,次の4項目を達成目標とする.1)匂い刺激に対する自律神経活動と感性指標の関係を明らかにする.2)匂い刺激が誘起する脳活動と感性指標の関係を明らかにする.3)脳活動ー自律神経活動ー感性指標の関係を説明可能な数理モデルを構築する.4)匂いの感性指標予測アルゴリズムを開発する本年度は,当初の予定通り,各種計測機器を制作・購入して実験条件と実験環境の整備を進め,自律神経活動と感性指標の関係を明らかにするとともに,脳活動計測に向けた予備実験を行った(目的1,2に対応).まず,文献[Lundstrom et al. 2011]に基づいてコンピュータ制御可能な匂い暴露装置を製作した.本装置は匂いカプセル中を通る空気を電磁弁の開閉によって制御している.電子制御により匂いをパルス状に被験者に提示することで被験者の順応を防ぎ,匂い射出口を鼻先に入れてキャリアガスを噴射し続けることで残り香の影響を防ぐ.本装置を用いて,被験者に数種類の匂い(T&Tオルファクトメータ,第一薬品産業(株))を提示し,心電と呼吸,血圧,ならびに,指尖容積脈波を計測するとともに,匂いに対する主観評価データを採取した.そして,自律神経活動から得られた指標と感性指標の間の関係について検討し,血管剛性と感性指標の第一主成分の間に中程度の相関があることを発見した(国際会議発表).平成29年度は次の項目を実施することを予定していた.1)匂い暴露装置の製作,2)匂い刺激実験,3)脳活動計測予備実験研究実績の概要に述べた通り,1項については文献[Lundstrom et al. 2011]に基づいてコンピュータ制御可能な匂い暴露装置を製作した.2項については,被験者に数種類の匂いを提示し,心電と呼吸,血圧,ならびに,指尖容積脈波を計測した.そして,末梢の自律神経応答の指標である血管剛性を推定し,匂いに対する主観評価データと比較した.本成果は国際会議において発表する予定である.また,3項については匂い暴露装置の一部を改修し,暴露装置本体から伸展するガスチューブを導波管からシールドルーム内に入れて被験者の鼻先まで届くように延長し,被験者に匂いが提示できることを確認した.以上のように当初の予定通りの進展があったため.

本研究では,匂い刺激に対して主観評価アンケートから得られる感性指標が予測可能な人工官能検査アルゴリズムの構築を目指して,脳科学分野において発展した脳活動の非侵襲計測技術(fMRI)や心理学的実験手法に,これまで応募者が構築した各種嗅覚系モデルと生体信号計測評価技術を駆使して,以下4項目を達成目標とする.1)匂い刺激に対する自律神経活動と感性指標の関係を明らかにする.2)匂い刺激が誘起する脳活動と感性指標の関係を明らかにする.3)脳活動ー自律神経活動ー感性指標の関係を説明可能な数理モデルを構築する.4)匂いの感性指標予測アルゴリズムを開発する本年度は,1脳活動から匂い感覚の予測を試みる(目標4)とともに,2前年度に引き続き匂い提示実験による感性指標と自律神経活動の解析を行った(目標1・3).1単分子の匂いが誘起する嗅球の活動から匂い感覚データベース[Dravnieks, 1985]に収録された146種類の主観評価指標の予測を行った.まず,嗅球表面の活動パターンベクトルを構成する各要素と各主観評価指標との相関を求め,有意な相関が存在する要素を抽出した.そして,サポートベクトル回帰を用いて抽出した要素ベクトルを主観評価指標空間に写像する関数を求め,Leave-one-out交差検証を用いて主観評価指標の予測精度を評価した.その結果,近年報告された分子記述子を用いる手法[Keller et al. Science, 2017]と同等の精度が得られた.以上より,脳活動から匂い感覚を予測可能であることが分かった.2昨年度構築した匂い提示装置を用いて,匂い刺激に対する主観評価を計測するとともに末梢血管剛性・粘性と心拍変動指標を求めた.末梢血管剛性と粘性のそれぞれについて低周波成分と高周波成分の最大値と最小値を抽出し,主観評価指標との関係を解析した結果,中程度の相関が認められた.研究実績の概要で述べたように,自律神経活動計測により,末梢血管剛性と粘性を用いて匂いの主観評価を予測できることを示した.また,単分子の匂いが誘起する嗅球の活動から匂い感覚データベース[Dravnieks, 1985]に収録された146種類の主観評価指標の予測にある程度成功した.当初,平成30年度に予定していた脳活動と自律神経活動の同時計測には至らなかったが,自律神経活動と脳活動の応答から感性予測可能な数理モデルを構築するという課題は最終年度に行う予定である.以上のように計画全体としては予定通りに進展している.平成30年度以降はfMRIによる脳活動と自律神経活動を同時計測し,感性指標との対応を明らかにするとともに,これを説明可能な数理モデルを構築する.このモデルと応募者が開発した糸球体層の活動パターン予測モデル[Soh et al. 2011, Soh et al. 2016]を統合し,匂い分子のグラフ構造を入力とし,脳活動と自律神経活動の応答をシミュレート可能な感性予測モデルの構築を行う.
リケッチア感染症のTh2免疫系の抑制機序に関する研究

申請者らは前年度同様に十分なインフォームド・コンセントを行い研究の同意を得た日本紅斑熱罹患患者からの急性期、回復期の血清を計10検体収集した。そして、血清中のTh2系サイトカインを測定し好酸球が消失する研究を継続した。Th2系サイトカインのうちIL-4,IL-5,IL-9,IL-13,IL-33を測定した。またこれらの10検体すべてにおいて好酸球が01%内であることを確認した。今回測定した5種類のサイトカイン全てにおいて健常人コントロールを差がないという結果であった。IL-5,IL-13,IL-33のいずれかのカスケードが阻害されているという仮説をもっていたが新たなTh2系サイトカインが関与していた可能性も考慮にいれつつ、再度測定しなおす、また今回使用したabcam社ではなく他社性のELISAキッドでの施行をおこなう必要があった。基礎疾患としてアトピー性皮膚炎や喘息、悪性リンパ腫等の疾患等をもてば、好酸球数は罹患前より上昇していることが多く、日本紅斑熱を罹患した場合、好酸球数の影響は未知であるが、論文等において過去の報告は認めなかった。また論文等において調査したが、基礎疾患にこれらの疾患にすでに罹患していた場合、おそらく日本紅斑熱罹患時においても好酸球の減少は起こるであろうと推測した。今回の対象患者10名は基礎疾患としてアトピー性皮膚炎や喘息、悪性リンパ腫等の疾患等は認めなかった。10名の対象患者の既往歴や薬剤内服歴は今回のサイトカインの測定結果に影響を与えていなかったと判断した。測定予定対象患者の数には達したが、測定したサイトカインであるIL-4,IL-5,IL-9,IL-13,IL-33は健常人コントロールと差を認めなかった。ゆえにどのTh2系カスケードが好酸球の減少に影響を与えていたか特定できていない。IL-5,IL-13,IL-33のいずれかのカスケードが阻害されているという仮説をもっていたが新たなTh2系サイトカインが関与していた可能性も考慮にいれつつ、再度測定しなおす。また今回使用したabcam社ではなく他社性のELISAキッドでの施行をおこなう。IL-6,10なども測定する。申請者らは先ず十分なインフォームド・コンセントを行い研究の同意を得た日本紅斑熱罹患感染患者の急性期と回復期の血清中のTH2系サイトカインであるIL-33, IL-5, IL-13の濃度をELISA法にて測定し、好酸球が消失する機序を解明する計画を立てた。まず本年度は日本紅斑熱罹患患者の血清を集めること、および学会や文献等で情報を収集することに終始した。現在7検体の急性期及び回復期の血清が集まり、それらの対象患者の同意を得た。また日本紅斑熱罹患対象患者の好酸球数は急性期はO%1%未満であること。回復期には数%に回復していたことを全例で確認できた。また、測定予定のサイトカインのうちIL-4、5を測定した。結果として、IL-4,5とも測定感度以下であり、また正常人コントロールとも差がなかったため、いまのところ関与の可能性は低いと思われる。しかし、実際、日本紅斑熱罹患患者は好酸球が消失しており、IL-33, IL-5, IL-13のいずれかのカスケードを阻害しているのかの基礎研究となる。この結果と、日本紅斑熱罹患患者の各種サイトカインの値を比較検討し、ダニ刺傷時の日本紅斑熱罹患予防法の確立、また新たな日本紅斑熱罹患時の治療法に応用に結びつける。また、本研究において対象患者におけるアトピー性皮膚炎や喘息、悪性リンパ腫等、好酸球の増多、減少にかかわる基礎疾患の調査ならびに各種内服薬における人体へのTh2型免疫反応におけるサイトカインの影響につき、論文等の文献にて調査中である。当初10名程度を予定していたが対象患者数におおむね達しつつある。急性期と回復期の血清中のTH2系サイトカインであるIL-33, IL-5, IL-13等の濃度をELISA法にて測定するが、測定予定のサイトカインのうちIL-4、5を測定した。

また論文等において調査したが、基礎疾患にこれらの疾患にすでに罹患していた場合、おそらく日本紅斑熱罹患時においても好酸球の減少は起こるであろうと推測した。今回の対象患者10名は基礎疾患としてアトピー性皮膚炎や喘息、悪性リンパ腫等の疾患等は認めなかった。10名の対象患者の既往歴や薬剤内服歴は今回のサイトカインの測定結果に影響を与えていなかったと判断した。測定予定対象患者の数には達したが、測定したサイトカインであるIL-4,IL-5,IL-9,IL-13,IL-33は健常人コントロールと差を認めなかった。ゆえにどのTh2系カスケードが好酸球の減少に影響を与えていたか特定できていない。Rickettsia japonicaを細胞膜、細胞小器官膜、核の3つの成分に分離し、それぞれの成分を培養血管内皮細胞と共培養する予定だが、Rickettisia japonicaの分離は細胞内寄生菌であり、サイズ的にも分離は難しいと現時点では判断している。ゆえにマクロファージにRickettsia japonicaは取り込まれるため、マクロファージを分離し、また破砕し血管内皮細胞と共培養する予定である。各成分の刺激により、産生されたサイトカインをELISA法で測定し評価すが、Rickettsia japonicaのどの部分であったかはDNAを抽出し、Rickettsia japonicaの各種、細胞膜、細胞小器官膜、核の特異プライマーで増幅し確認する。IL-5,IL-13,IL-33のいずれかのカスケードが阻害されているという仮説をもっていたが新たなTh2系サイトカインが関与していた可能性も考慮にいれつつ、再度測定しなおす。また今回使用したabcam社ではなく他社性のELISAキッドでの施行をおこなう。IL-6,10なども測定する。消耗品費として本研究は血清からの各種サイトカインをELISA法にて測定する。既存の各種サイトカインに対するELISA kitが主な消耗品であった。また、情報を収集するため国内旅行費、ならびに外国旅費で研究における学会出席において発生する旅費を必要とした。次年度も引き続き、ELISA kitが主な消耗品で、ならびに解析にかかる費用が必要となる。また人件費・謝金:翻訳、校閲に係る謝金、得られた成果を国外の一流雑誌に投稿するための出版費等を計上した。前年度に施行した各種サイトカインの測定結果が健常人と比較して差が出なかった。ゆえに好酸球産生を阻害しているサイトカインカスケードの絞り込みができず、カスケード内に影響を与える各種サイトカインの測定を行えなかった。またサイトカインカスケードが絞り込みができていないため、マクロファージと血管内皮細胞を共培養し、その上清に対するサイトカインの種類の測定も絞り込めていない。ゆえに今回使用したabcam社ではなく他社性のELISAキッドでの施行をおこなう。Rickettsia japonicaはマクロファージに取り込まれるため、マクロファージを分離または破砕し、血管内皮細胞と共培養する。上清よりサイトカインを測定し比較検討する。
リソゾーム病の遺伝子異常、酵素蛋白異常と表現型に関する研究

I、β-ヘキソースアミニダーゼ、αサブユニットの遺伝子異常:(1)1993年に、日本人のTay-Sachs病患者の変異対立遺伝子の約8割を占める共通の変異(Japanese major mutation)を見つけ、さらにこれが日本の本州を中心に高頻度に認められることをも明らかにした。他方、沖縄県の患者で本土と異なる変異を見つけたことから、沖縄県における前述のmajor mutationの頻度を本土と比較した。本土では、約150人に1人がmajor mutationの保因者であったが、沖縄県では、200人を検索したが保因者は見つからず、現在まだ進行中ではあるが、頻度は本土より低いものと推測される。(2)COS細胞において、major mutationを持つ異常αサブユニットと正常βサブユニットとを同時発現させ、異常αサブユニットと正常βサブユニットとが結合する状態をウエスタンブロット法により検討したところ、major mutationを持つ異常αサブユニットは、正常βサブユニットと結合できないことが明らかにされた。II、β-ヘキソースアミニダーゼ、βサブユニットの遺伝子異常:βサブユニット異常症の頻度は、日本人においてはαサブユニット異常症に比べてはるかに少ない。遺伝子変異についても、αサブユニットに比べて、世界的にも報告は少ない。日本人では、若年型のSandhoff病で2つ、乳児型で1つ報告されている。申請者は、乳児型の4症例について、2つの変異を明らかにした。うちの1つは、若年型で報告されたものと同じ遺伝子変異であった。これらの症例は、若年型、乳児型ともにホモ接合体であった。これらが同じ遺伝子型を有しているにもかかわらず、異なる臨床症状を呈している理由について、さらに検討をすすめている。1 β-ヘキソースアミニダーゼ、αサブユニット遺伝子について、沖縄県のTay-Sachs病の一症例で本土と異なる新しい変異(Arg170→Trp)を明らかにした。患者は、ホモ接合体であった。厚生省の先天性代謝異常症スクリーニングのデータによると、沖縄県では、フェニールケトン尿症をはじめ、患者頻度が本土と異なっていることが知られている。Tay-Sachs病においても同様のことが推測されるので、日本の本州を中心に高頻度に認められているmajor mutationと、このArg170→Trpについて、沖縄県の一般人口集団における遺伝子頻度を検索中である。2異常αサブユニットが正常βサブユニットと結合する状態は、αサブユニットの変異の場所によって異なることが考えられる。前述のmajpr mutation(IVS5,-1G→T)では、エクソン6が欠失した安定なmRNAが作られ、アミノ酸配列では、32個のアミノ酸が欠落するがフレームシフトはおこさない。これのホモ接合体患者の酵素学的検索で、この変異αサブユニットは安定でβサブユニットと二量体を作ることが推測された。Major mutationの変異を持つαサブユニットcDNAを、正常のβサブユニットのcDNAと同時にCOS細胞で発現させ、ヘキソースアミニダーゼA(αβ)およびB(ββ)のおのおのに対する抗体をそれぞれ用いて、ウェスタンブロッティングと、発現蛋白を抗体精製して分析することにより検討したところ、このことを支持する結果を得た。3 βヘキソースアミニーダーゼ、βサブユニットの遺伝子異常症(Sandhoff病)について、日本人の乳児型患者3症例を解析して遺伝子変異を明らかにした。1例は、ミスセンス変異(Pro405→Leu)で2例は、イントロン10内の点変異(-17A→G)により起こったスプライシング変異であり、3例ともホモ接合体であった。I、β-ヘキソースアミニダーゼ、αサブユニットの遺伝子異常:(1)1993年に、日本人のTay-Sachs病患者の変異対立遺伝子の約8割を占める共通の変異(major mutation)を見つけ、さらにこれが日本の本州を中心に高頻度に認められることも明らかにした。

他方、沖縄県の患者で本土と異なる変異を見つけたことから、沖縄県における前述のmajor mutationの頻度を本土と比較した。本土では、約150人に1人がmajor mutationの保因者であったが、沖縄県では、200人を検索したが保因者は見つからず、現在まだ進行中ではあるが、頻度は本土より低いものと推測される。(2)COS細胞において、major mutationを持つ異常αサブユニットと正常βサブユニットとを同時発現させ、異常αサブユニットと正常βサブユニットとが結合する状態をウエスタンブロット法により検討したところ、major mutationを持つ異常αサブユニットは、正常βサブユニットと結合できないことが明らかにされた。II、β-ヘキソースアミニダーゼ、αサブユニットの遺伝子異常:βサブユニット異常症の頻度は、日本人においてはαサブユニット異常症に比べてはるかに少ない。遺伝子変異についても、αサブユニットに比べて、世界的にも報告は少ない。日本人では、若年型のSandhoff病で2つ、乳児型で1つ報告されている。申請者は、乳児型の4症例について、2つの変異を明らかにした。うちの1つは、若年型で報告されたものと同じ遺伝子変異であった。これらの症例は、若年型、乳児型ともにホモ接合体であった。これらが同じ遺伝子型を有しているにもかかわらず、異なる臨床症状を呈している理由について、さらに検討をすすめている。
フーグスティン塩基対形成型DNA蛍光プローブに基づく点突然変異遺伝子分析法の開発

水素結合型レセプターとして二つの芳香環を持つナフチリジン,キノリン誘導体を合成し,各レセプター分子添加前後におけるDNA二重鎖の融解温度(Tm)を測定した。その結果,Tmの著しい増加が観測されることから,レセプター分子が脱塩基部位中において核酸塩基を認識し得ることが示唆された。さらに興味深いことは,Gと相補的な3点の水素結合部位を持つナフチリジン誘導体が,CやTのピリミジン塩基に対して高い選択性を示す点である。このようなバルク溶液系とは異なる反応性は,本系における核酸認識が水素結合形成と脱塩基部位の空間的な規制による協同的な効果により達成されているためで,特に同空間の上下に位置する核酸塩基とのスタッキング相互作用が大きな役割を果たしていると考察している。CDスペクトル測定およびMacroModelを用いた分子力場計算の結果も上記考察を支持するものであった。また、ナフチリジン誘導体を用いることで、C特異的な蛍光検出を達成した。以上のように本研究では,DNA脱塩基部位(AP site)を利用することにより、水素結合型レセプターによる点突然変異蛍光検出法の開発に成功した。本研究で提案する脱塩基型合成DNAを用いる核酸塩基認識法は,脱塩基部位やレセプター分子を適切に設計・合成することで種々の塩基配列に適用可能であり,簡易且つ迅速な遺伝子診断法としての展開が期待できる。レセプター分子の基本骨格として,シトシンと同様の水素結合能を有する2-amino-7-methylnaphtyridineを採用し,これにフーグスティン型の水素結合部位としてアミノ基及びチオ尿素基を導入したプローブ群を合成した。グアノシン誘導体添加により,各プローブのアミド部位のプロトンに低磁場シフトが見られることから,水素結合形成に基づく錯形成が示唆された。得られた化学シフト値の変化から,1:1錯形成定数を算出したところ,シトシンと同様の水素結合能を有するNPMeで14M^<-1>であったのに対し,アミノ基を導入したNPPAでは45M^<-1>,チオ尿素基を導入したNPTUでは120M^<-1>となることが分かった。以上の結果は,NPPA及びNPTUがフーグスティン型の水素結合形成によりグアノシン誘導体を補足していることを強く示唆している。グアノシンに対して最も高い錯形成能を示したNPTUの塩基認識選択性について評価したところ,他の塩基誘導体添加では,^1H NMRスペクトル変化が全く観測されないことから,NPTUがグアノシンに対して高い選択性を有することが分かった。以上,本研究では,ワトソン-クリック型及びフーグスティン型の塩基対形成部位を併せ持つプローブが,グアノシンに対する錯形成能・選択性向上に有用であることを明らかにした。今後,SNPs検出用蛍光プローブとしての詳細な機能評価を行う予定である。
地球深部条件におけるマグマの分光学

スプリング8の放射光X線を用いて、高温度高圧力条件でマントル鉱物と水を共存させて、水の中に溶け込むケイ酸塩の性質を調べた。温度1000°Cでは3.3GPaよりも低い圧力で、Mg2SiO4フォルステライトが成長し、それより高圧ではエンスタタイトしか確認されなかった。このことは低圧では、水に溶け込むケイ酸塩成分のMg/Siが1よりも小さく、高圧になると1よりも大きくなりうることを示している。従来の急冷実験結果と合わせて考えると次のようなことがわかる。(1)3GPa付近でシリカに富む水から、マグネシウムに富む水に急に変化するかも知れない。このことは、水の中に溶け込むシリ水の中に溶け込むケイ酸塩の構造が変化するためか、H2Oそのものの構造が変化するからかもしれない。(2)圧力上昇にともない水に溶け込むケイ酸塩の化学組成がマグネシウムに富むようになることは、マントル鉱物と水の間の濡れ角にも影響を与えるはずだ。フォルステライトと水の間の濡れ角が1ム5GPaの範囲で、圧力とともに低下するのは、水に溶け込むケイ酸塩の溶解度が上がっていくため、あるいは、同時にMg/Si比が近付いていくため、と解釈できる。後者の影響が無視できないことはザクロ石(1Mg/Si)と水の間の濡れ角に表れている。濡れ角と水に溶け込むケイ酸塩の組成を同時に測定する実験がなされるべきである。(3)3GPaム10GPaでエンスタタイトとフォルステライトと共存する水に溶け込むケイ酸塩のMg/Siモル比と同じ温度圧力条件で生成された水を含むKLB-1かんらん岩の部分融解液のそれと似たような傾向を示す。このことは、上部マントルのどこかで(それが決定できるとうれしいが)水にとむマグマとケイ酸塩にとむ水は、互いに溶け合い、一相になっている可能性を示している。スプリング8のBL04B2ビームラインにおいて、0.5GPaから5GPa、800°Cから1000°Cの圧力温度範囲において、バセット型外熱式ダイアモンドアンビルセル(Bassett et al.,1993,Rev. Sci. Inst.)を用いて一連のX線回折実験を行った。実験には次の3つの物質と脱イオン水の混合物を使用した:MgSiO3結晶,Mg2siO4結晶,とMgSiO3組成のガラス。各温度、圧力条件に保ち、直径40ミクロンないし100ミクロンに絞ったX線を3分間試料に照射し、イメージングプレートに記録した。温度はクロメルアルメル熱電対を用いてモニターし制御した。熱電対はNaNO3,CsCl,とNaClの大気圧での融解温度を用いて校正した。試料内の温度勾配は数°C以内であると考えている。高温度高圧力条件におけるH2Oフルイドと共存する結晶を同定することでH2Oフルイド中のシリケイト成分のMg/Siの比を推定した。0.5GPaないし1GPaの低圧範囲でエンスタタイトーH2O系では、エンスタタイトの他にフォルステライトが観察された。このことは、この圧力範囲ではエンスタタイトとフォルステライトと共存するH20フルイドの組成はエンスタイトよりもシリカに富んでいることを示す。また、1GPaなしい5GPaの圧力範囲では、エンスタタイトもフォルステライトも調和的にH20フルイドに溶け込んでいる。このことは、同条件ではH2OフルイドのMg/Siは1と2の間にあることを示している。本実験結果はこれまでの急冷回収実験の結果と調和的である。今後も、本実験で示したその場観察方法で地球マントル内のH2Oフルイドの化学的な性質を理解していきたい。(3)3GPaム10GPaでエンスタタイトとフォルステライトと共存する水に溶け込む

ケイ酸塩のMg/Siモル比と同じ温度圧力条件で生成された水を含むKLB-1かんらん岩の部分融解液のそれと似たような傾向を示す。このことは、上部マントルのどこかで(それが決定できるとうれしいが)水にとむマグマとケイ酸塩にとむ水は、互いに溶け合い、一相になっている可能性を示している。
頭頚部扁平上皮癌に対するマトリックスメタロプロテアーゼ阻害剤の抗腫瘍効果

本研究はMMP阻害剤投与による腫瘍増殖抑制効果(腫瘍径、腫瘍重量、転移数)、Apoptosisへの影響を検索し、腫瘍細胞に抗CD34,Ki67抗体による免疫組織化学染色を行い、腫瘍増殖能、血管新生に対する抑制効果を検索した。また、CDDP,5-FU、TXTとの併用による相乗効果を検討した。また、放射線照射にともなう腫瘍増殖抑制効果も検討した。MMP阻害剤における頭頚部扁平上皮癌に対する抗腫瘍効果、他の抗癌剤併用による相乗効果を検討する。頭頚部扁平上皮癌において、MMPの発現と転移、予後との関係を示した論文は希少であり、また、MMP阻害剤と他の抗癌剤を併用した報告は皆無である。他の抗癌剤併用により副作用を軽減し、効果を高める治療法を検討するのが、本研究の最も大きな特色である。また、実際、臨床の現場にて、どのようにMMP阻害剤を使用すれば最も効果的か検索した。抗癌剤の投与にも様々な経路、方法がある。高齢化を迎える現在、患者のQOLを考慮し、外来経口維持化学療法として本剤を用いて、また他の抗癌剤や、治療法と併用することにより、副作用を軽減し、より高い効果が得られると期待される。具体的な臨床での投与方法についても検討した。研究を遂行するにあたり、横浜市立大学医学部耳鼻咽喉科学教室研究室を中心に実験を施行した。当研究室は、今までも、佃守教授を中心に頭頸部腫瘍の化学療法、遺伝子治療等、に関する研究を幅広く行っている。また、病理学第二教室に病理学的検索を施行する際に御指導していただき、また、神奈川県立がんセンター研究科、神奈川歯科大学生化学教室にも具体的な実験の技術指導をして頂いた。頭頚部扁平上皮癌樹立細胞におけるMMP-1,2,9,13等の発現を検索し、MMP阻害剤投与によるMMPの抑制効果、腫瘍増殖能への影響等を検索し、他剤との併用による相乗効果を検討した。ザイモグラフィー、ELISA法、PCR法により頭頚部扁平上皮癌樹立細胞におけるMMPの発現を検索し、MMP阻害剤投与による培養細胞上清中のMMPの抑制効果、腫瘍増殖能、Cell Cycle、への影響を検索し、double chamber invasion assey systemによる浸潤能を測定した。CDDP,5-FL,ドセタキセルとの併用による相乗効果を検討し、さらに放射線治療を加えることにより、より強い腫瘍増殖抑制効果が得られ、論文として発表した。また、頭頚部扁平上皮癌移植ヌードマウスを用いて、MMP阻害剤投与による腫瘍増殖抑制効果(腫瘍径、腫瘍重量、転移数)、Apoptosisへの影響を検索を現在施行中である。腫瘍細胞に抗CD34,Ki67抗体による免疫組織化学染色を行い、腫瘍増殖能、血管新生に対する抑制効果を検索している。また、手術摘出標本におけるMMPの発現と転移、予後との関係を検索する。研究を遂行するにあたり、横浜市立大学医学部耳鼻咽喉科学教室研究室を中心に実験を施行している。また、病理学第二教室に病理学的検索を施行する際に御指導していただいている。また、神奈川県立がんセンター研究科にも具体的な実験の技術指導をして頂いている。
盲導犬ロボットの開発

盲導犬ロボット「瞳」を開発した。1.ロボットの機構:「瞳」は高さ1050mm、幅540mm、奥行き840mmで、車体はスズキ(株)の電動車椅子で、センサーとしてビデオカメラとその回転台、ソナー、光ジャイロスコープを有し、コンピュータとして画像処理用68040シングルボードコンピュータ、走行制御用V25シングルボードコンピュータを有し、バッテリーで走行する自律移動ロボットである。後部に盲人とのコミュニケーション用にハンドルを設けている。平地の連続走行時間は2時間である。2.道路走行:画像処理で道路の白線や点字ブロックの位置と方位を70100msでサンプリングし、走行制御するシステムを開発し、歩道や一車線道路を30cm/sで走行する実験に成功した。3.車両検出:リアルタイムで道路上の車両の位置と速度を検出する画像処理法を考案し計算機システム上に実現した。検出時間は距離によって異なり1070msである。道路のシーンをビデオに撮って実験した。検出成功率は晴天で9297%曇天で98%で、失敗は蔭を車両と誤認したのが殆どで、車両を見逃した率は1%以下である。4.歩行者検出:リアルタイムで道路上の歩行者を検出する画像処理法「リズムモデル」を考案し、並列画像処理システム上に実現した。7686%の確率で歩行者を自転車や犬などの移動体と区路できた。このシステムは電源容量が大きいため、ロボットに搭載していない。5.歩行ガイドのための地図データベースについては開発中でロボットに搭載するには至らなかった。実用性と互換性を考慮し、ゼンリン(株)の住宅地図をベースにシステムを開発中である。1.複雑な走行環境のリアルタイム画像処理の研究大学の構内道路のような白線がない道路で、移動のガイドとなるサインパタ-ンを検出する方法を開発した。この方法はハフ変換によるサインパタ-ン抽出と色彩によるサインパタ-ンの両側の領域の認識からなり、ハフ変換の速度を上げるためにcoarce to fineの2段階法を適用した。また、複数の矩形上のウィンドウでサインパタ-ンを抽出することにより、曲がった道路や直角に折り曲がる道路でサインパタ-ンを抽出することが出来るようになった。晴の日に道路に自動車が駐車していると、ロボットの眼は自動車と自動車がつくる蔭を区別することができず、自動車を回避する経路を計画できないことがある。本研究は、TV画面のアスファルト道路の日向領域と蔭領域の明度と色彩を太陽光と青空の反射光の色温度、およびTV画面における日向領域と蔭領域の面積の比から予測する式を統計的手法で見いだした。1シ-ンの画像処理に要する時間は0.6秒である。2.歩行者に適応する走行制御の研究盲導犬ロボットの走行制御システムを開発した。ロボットの後部に手すりがあり、視覚障害者はそれにつかまって歩くことにより、姿勢を安定に保つことができる。また。手すりには歩行速度を検出するテ-プ状スイッチがあり、ロボットは視覚障害者の歩行に適応した速度で移動する。従来の推測航法では、排水を目的とする路面の横断方向の傾斜のため、走行につれて路肩の方に曲がって行く。本ロボットはこれを防ぐためジャイロスコ-プでロボットヨ-角を測り方位を修正し、PID制御でなめらかな軌跡を描くように制御した。その結果、路面に5度程度の横方向傾斜がある場合でも、10m走行して20cmの横ズレしかおこさないようになった。本年度は研究計画の2年目に当り交叉点の認識、移動体の検出、ロボットと盲人の行動協調の基礎研究を行った。1.交叉点の認識:盲導犬ロボッドは交通規則を守らなければならない。交叉点を渡るときは横断歩道マークの上を走行しなければならない。

リアルタイムで横断歩道を検出するアルゴリズムを考案し、4個のDSPを有する並列画像処理システム上に実現した。1画面の処理時間は66msで実用的であることがわかった。2.移動体の検出:道路で事故に合わないためには、道路を走る自動車や歩行者を検出し、その距離と移動速度をリアルタイムで検出しなければならない。従来の3次元形状モデルは処理時間がかゝり過ぎて実用的ではない。そこで自動車や歩行者を特定できる単純な特徴すなわちサインパターンを利用することにした。自動車のサインパターンは自動車の真下の蔭で、それは道路の汚れやしみよりも暗く蔭をリアルタイムで検出することで距離と速度が推定できる。歩行者のサインパターンは足のリズムである。歩行のリズムは、季節・天候、朝夕の時刻によって変らず、歩行者とロボット間の距離にも依存しない。また歩行者の服装にも影響されない。歩行者の脚部のリズムをリアルタイムで検出するアルゴリズムを考案し、並列画像処理システムで実現した。8秒程度の時間で歩行者の認識ができた。3.ロボットと盲人の行動協調:ロボットの背面に取手をつけ、盲人が軽く手を触れて歩くことによって、盲人の歩行速度を検出しロボットの走行を協調させる研究を行った。適応機能を持ったファジィ制御が有効であることがわかった。盲導犬ロボット「瞳」を開発した。1.「瞳」は高さ1050mm、幅540mm、奥行き840mmで、車体はスズキ(株)の電動車椅子で、センサーとしてビデオカメラとその回転台、ソナー、光ジャイロスコープを有し、コンピュータとして画像処理用68040シングルボードコンピュータ、走行制御用V25シングルボードコンピュータを有し、バッテリーで走行する自律移動ロボットである。後部に盲人とのコミュニケーション用にハンドルを設けている。平地における連続走行時間は2時間である。2.画像処理で道路の白線や点字ブロックの位置と方位を70100msでサンプリングし、それに基づいて走行制御するシステムを開発し、歩道や一車線道路を30cm/sで走行する実験に成功した。3.2個のソナーを対にして壁やフェンスの距離と方位を検出し、それに沿って走行し障害物の前で停止するシステムを開発した。屋外環境におけるソナーの測距範囲は3mで測距角度は±10度である。20cm/sでブロック塀に沿う走行に成功した。4.画像処理で道路上の車両を検出し、その位置と速度をリアルタイムで検出するシステムを開発した。検出時間は距離によって異なり1070msである。道路のシーンをビデオに撮って実験した。検出成功率は晴天で9297%、曇天で98%で、失敗は蔭を車両と誤認したのが殆どで、車両を見逃した率は1%以下である。5.歩行ガイドのための地図データベースについては開発中でロボットに搭載するには至らなかった。実用性と互換性を考慮し、ゼンリン(株)の住宅地図をべースにシステムを開発中である。
高次元宇宙モデルにおける揺らぎの進化と観測的検証の可能性

宇宙の加速膨張の起源は未解明の謎であるが、それを余剰次元模型の枠組みで重力の法則を変更することにより説明しようという試みがある(DGP模型)。私は、DGP模型の4次元有効理論に動機づけられた、非線形微分相互作用項を持つようなスカラー・テンソル理論の研究をおこなった。この種の模型はガリレオン模型と呼ばれ、スカラー的な重力の自由度が宇宙を加速膨張させる源になる一方、太陽系などの小スケールでは物質との相互作用が実効的に弱くなるという機構を有しており、実験・観測からの制限を逃れることができるという点で非常に興味深い。私は、密度揺らぎの進化が一般相対論にもとづいた標準的な宇宙模型とガリレオン模型とでは異なる点に着目し、模型の観測的検証につなげることを目的として、ガリレオン模型における宇宙論的摂動論の定式化をおこなった。加速膨張背宇宙を実現させる様々な模型を観測的に区別するために有効なツールのひとつとして、マイクロ波背景放射の積分ザックス・ウォルフェ効果が知られているが、私は、積分ザックス・ウォルフェ効果と銀河分布の相関を実際に計算することで、標準的な宇宙模型では正の相関が見られるのに対しガリレオン模型では負の相関が見られることを示し、そのような観測によりガリレオン模型が検証可能であることを主張した。ここでの摂動論の定式化はかなりの程度一般的になされたため、今後、既存の観測データを利用しながら、模型に具体的な制限をつけていく研究に適用していくことができる。超弦理論の示唆する高次元宇宙モデル(ブレーンワールド)が、重力と宇宙論についてどのような予言を与えるかを調べ、そのようなモデルの実験的・観測的検証の可能性を議論するのが、本研究の目的である。本年度は、6次元のフラックスコンパクト化モデルと呼ばれる、磁束(フラックス)による余剰次元の安定化機構を特徴とするブレーンモデルを精査した。まず、6次元のアインシュタイン-マクスウェル理論に基づいた比較的単純なトイモデルに着目し、ブレーン上の低エネルギーでの重力を記述する有効理論を、微分展開(長波長展開)を用いて導いた。その結果、微分展開の最低次で、ブレーン上の重力は4次元の一般相対論で記述されることが明らかになった。このようにして導いた有効理論は、重力の非線形効果が効く領域でも妥当なものであるため、この結果は、低エネルギーのブレーン上で通常の宇宙論が再現されることを意味する。同様の手法を、素粒子理論により深い関係のある6次元の超重力理論に基づいたモデルにも適用した。この場合には、有効理論にスカラー場(モジュライ場)が現れるが、ブレーンに有限の大きさを持たせることでそのモジュライを固定することが可能であり、結果として、有効理論は再び4次元の一般相対論になることがわかった。また、この超重力理論に基づいたブレーンモデルにおいて、厳密な宇宙論解を系統的に求める手法を考案し、実際に、網羅的に厳密解を提示した。以上の研究により、6次元のブレーンモデルにおける宇宙論を議論するうえで基礎となる事柄が明らかになったと言える。この他にも、加速器実験でブラックホールが生成される可能性を念頭に置いて、自己重力を持ったブレーンに6次元の回転ブラックホールが局在している場合に、ホーキング輻射によるエネルギーと角運動量の放射率が、ブレーンの自己重力を無視した場合とどのように変わるのかを解析した。複数の観測から、現在の宇宙が加速膨張していることがほぼ明らかになっているが、その起源は宇宙論の最大の謎と言える。本年度は、宇宙論的長距離で重力を修正することによって加速膨張の起源を説明できる可能性に着目した研究をおこなった。そのような理論の中でも「f(R)重力」と呼ばれる比較的シンプルな修正重力理論モデルは、近年非常に盛んに研究されている。宇宙論的観測や太陽系の重力実験等と無矛盾なf(R)重力理論の範疇で相対論的星の解を数値的・解析的に精査し、そのような理論においては中性子星が存在できないという深刻な問題があることを指摘した。さらに、この問題の解決法として提案された、高次曲率項を加えるという素朴な手法では、実際には問題を解決することが非常に困難であることを示した。これらの研究により、従来は綻びがないと考えられていた修正重力理論に重大な欠陥があることが明らかになった。また、余剰次元を利用して長距離で重力を変更するモデルを提案し、弱重力場の性質を解析した結果、短距離では正しくニュートン重力が再現されることが分かった。その際、弱い重力場に対しても非線形効果が重要なはたらきをすることも示した。上記以外では、宇宙論的摂動論に関するいくつかの研究をおこなった。具体的には、2次の宇宙論的摂動による銀河磁場の起源の説明、および、p-formを用いたインフレーションモデルにおける重力波のふるまいの研究である。

私は、密度揺らぎの進化が一般相対論にもとづいた標準的な宇宙模型とガリレオン模型とでは異なる点に着目し、模型の観測的検証につなげることを目的として、ガリレオン模型における宇宙論的摂動論の定式化をおこなった。加速膨張背宇宙を実現させる様々な模型を観測的に区別するために有効なツールのひとつとして、マイクロ波背景放射の積分ザックス・ウォルフェ効果が知られているが、私は、積分ザックス・ウォルフェ効果と銀河分布の相関を実際に計算することで、標準的な宇宙模型では正の相関が見られるのに対しガリレオン模型では負の相関が見られることを示し、そのような観測によりガリレオン模型が検証可能であることを主張した。ここでの摂動論の定式化はかなりの程度一般的になされたため、今後、既存の観測データを利用しながら、模型に具体的な制限をつけていく研究に適用していくことができる。
NMR法による触媒抗体の構造特性の解析と触媒能の改変

アミノ酸配列の相同性は高いが,エステル加水分解活性の異なる2種類の触媒抗体6D9,および9C10について安定同位体標識Fabを調製しNMR解析を行った.新規に開発したNMR測定法により,基質およびTSA結合における,ヒスチジン側鎖のプロトン解離状態,および互変異性体の決定などを行ったところ,His27d(L)がTSA結合時にTSAのリン酸エステルの酸素原子との間に水素結合を形成していることが明らかとなった.さらに,基質およびTSAに存在する2つの芳香環について,高活性6D9抗体は両芳香環の相対位置を厳密に認識するが,低活性の9C10抗体は一方の芳香環の認識が甘いことが判明した.一方,触媒抗体7C8は,単なる四面体型中間体の安定化以外の因子が重要であることが指摘されている.今回中性酸性領域における反応速度のpH依存性を調べたところ,pH4.5付近に変曲点が存在した.また,7C8結合時における,エステル中心の炭素の化学シフトのpH依存性を調べたところ,pKaが4.6を有する解離性アミノ酸残基が反応部位に影響を与えていることが明らかとなった.7C8の安定同位体標識を行いpH滴定実験などにより,相当する7C8の解離性アミノ酸残基を調べたところ,His92(L)のpKaが5以下であり,触媒反応速度に影響を与えるアミノ酸残基であることが判明した.現在His92(L)の関与する反応機構を明らかにするため,低温での反応中間体検出実験を進行中である.これまでに得られた構造生物学的知見をもとに,反応機構の異なる高活性触媒抗体6D9,7C8の触媒能のさらなる向上,および両者の特長を生かした,ハイブリッド触媒抗体の作製を目指し,大腸菌によるFv発現系の構築を計画した.現在6D9-Fvについては可溶画分における発現が可能となり,精製条件の検討を行った結果,純度の高いFvを得ることが可能となった.アミノ酸配列の相同性は高いが,エステル加水分解活性の異なる2種類の触媒抗体6D9,および9C10について安定同位体標識Fabを調製しNMR解析を行った.新規に開発したNMR測定法により,基質およびTSA結合における,ヒスチジン側鎖のプロトン解離状態,および互変異性体の決定などを行ったところ,His27d(L)がTSA結合時にTSAのリン酸エステルの酸素原子との間に水素結合を形成していることが明らかとなった.さらに,基質およびTSAに存在する2つの芳香環について,高活性6D9抗体は両芳香環の相対位置を厳密に認識するが,低活性の9C10抗体は一方の芳香環の認識が甘いことが判明した.一方,触媒抗体7C8は,単なる四面体型中間体の安定化以外の因子が重要であることが指摘されている.今回中性酸性領域における反応速度のpH依存性を調べたところ,pH4.5付近に変曲点が存在した.また,7C8結合時における,エステル中心の炭素の化学シフトのpH依存性を調べたところ,pKaが4.6を有する解離性アミノ酸残基が反応部位に影響を与えていることが明らかとなった.7C8の安定同位体標識を行いpH滴定実験などにより,相当する7C8の解離性アミノ酸残基を調べたところ,His92(L)のpKaが5以下であり,触媒反応速度に影響を与えるアミノ酸残基であることが判明した.現在His92(L)の関与する反応機構を明らかにするため,低温での反応中間体検出実験を進行中である.これまでに得られた構造生物学的知見をもとに,反応機構の異なる高活性触媒抗体6D9,7C8の触媒能のさらなる向上,および両者の特長を生かした,ハイブリッド触媒抗体の作製を目指し,大腸菌によるFv発現系の構築を計画した.現在6D9-Fvについては可溶画分における発現が可能となり,精製条件の検討を行った結果,純度の高いFvを得ることが可能となった.エステル加水分解活性の異なる2種類の触媒抗体6D9,および9C10を研究対象とし,それらの安定同位体標識Fabを調製しNMR解析を行った.両抗体は反応速度解析の結果から,基質と遷移状態アナログ(TSA)に対する親和力の差が触媒活性を生み出す機構であることがわかっている.部位特異変異実験からは、6D9の触媒活性発現にはHis27d(L)が主要な役割を果たしていることが知られている.そこで本年度はこのHis27d(L)に着目した解析を行った.主鎖アミド窒素を^<15>N標識したFabを大量調製し,^1H-^<15>Nシフト相関スペクトルを測定した.NMRシグナルの帰属は^<13>C標識アミノ酸による二重標識法により行った.得られた帰属をもとに、基質,TSA添加に伴う化学シフト変化を解析したところ,6D9、9C10両抗体ともV_H,V_Lの界面を中心とした領域で,リガンド(基質・TSA)を認識していることが明らかとなった.次にヒスチジン残基の基質,およびTSA結合に伴うpKa値の変化をpH滴定実験から明らかにした.その結果、6D9のHis27d(L)は,TSA存在下でのみ低pH側に大きくpKa値がシフトする(pKa<4.3)ことが判明した.

これは,His27d(L)がTSA結合時に何らかの相互作用を形成したことを示唆する.さらに,ヒスチジン側鎖イミダゾール水素のNMRシグナルを解析したところ,His27d(L)とTSAのリン酸エステルの酸素原子との間に水素結合が形成されていることが明らかとなった.6D9と基質との結合,および9C10における基質・TSA結合の際は,水素結合の形成は観測されなかった.したがって,6D9では,基質とTSAのエステル部分の化学構造の識別にHis27d(L)が,水素結合を通して主要な役割を果たしていると考えた.6D9-TSA複合体におけるHis27d(L)の水素結合様式をさらに詳細に調べるために,NMRによるヒスチジン側鎖のプロトン解離状態,および互変異性体の新規決定法を開発した.その結果,His27d(L)はdeprotonation型でN3互変体の状態でTSAのリン酸基の酸素原子と水素結合していることが明らかとなった.このような詳細な水素結合様式の決定は触媒活性発現機構の理解に必須なものであり,合理的な活性向上を目指すために重要な情報になると考えられる.触媒抗体7C8は,単なる四面体型中間体の安定化以外の因子が重要であることが指摘されている.今回,中性酸性領域における反応速度のpH依存性を調べたところ,pH4.5付近に変曲点があることが明らかとなった.そこで,7C8の触媒反応進行要因を探るため,NMRにより7C8の反応部位のミクロ環境の解析を行った.エステル中心の炭素を^<13>Cで標識した反応基質を作成し,7C8結合時における^<13>C化学シフトのpH滴定実験を行った.その結果,pKaが4.6を有する解離性アミノ酸残基が,反応部位に影響を与えていることが明らかとなった.一方,各種アミノ酸選択的安定同位体(^<15>N,^<13>C)標識7C8アナログを用いた解析により,pKaが45を有するアミノ酸はHis92(L)であると考えられた.これらの事実は,抗体7C8による触媒反応がTyr95(H)とHis92(L)の解離性アミノ酸残基の相乗的な作用により推進されている事を意味する.現在,これらのアミノ酸残基が関与した反応機構を明らかにするため,反応中間体のリアルタイム検出を行っている.さらに昨年度までに研究が進んでいる,触媒抗体6D9,および本年度研究を行った触媒抗体7C8の触媒機能の改変,および両者の特長を生かしたハイブリッド型触媒抗体の作成を目指し,大腸菌によるFv発現系の構築を行った.通常,単鎖Fvの安定性が悪いことを考慮し,可変領域ドメインV_H,V_Lを遺伝子上にタンデムに載せ,それぞれ独立にペリプラズムに発現するように計画した.現在,6D9-Fvについては可溶画分における発現を確認した.
歯根膜幹細胞に対する新規骨形成剤ペプチドの効果

組織再生に関与するのは幹細胞である。歯周組織、とくに歯根膜にも幹細胞の存在が言われている。今回、歯根膜幹細胞を抽出し、新規骨形成剤である合成ペプチドを培養歯根膜幹細胞に添加して、その細胞の機能変化と遺伝子発現を検討した。その結果、細胞増殖能および石灰化物の形成が増加し、骨芽細胞マーカー発現が増強した。また、leucine-rich repeat-containing protein (LRR)の遺伝子発現が最も顕著であったので、合成ペプチドは歯根膜幹細胞を骨芽細胞へ分化させる可能能を持っていることが示唆される。歯根膜幹細胞は、歯列矯正のため便宜抜去された歯あるいは抜去された埋伏智歯の歯根膜から分離した。抜去歯をPBS(Phosphate Buffered Saline)で洗浄し、次いでD-MEM(Dulbecco's Modified Eagle Medium)で洗浄して外科用メスで歯根中央部表面から歯根膜組織を剥離し採取した。採取した歯根膜組織を1平方ミリメートルの大きさに細切し、その組織片を3 mg/mL type Icollagenaseおよび4 mg/mL dispaseのタンパク分解酵素で37°C、1時間作用させた。その後、10%ウシ胎児血清含有のD-MEMを加えて反応を停止しピペッティングを行い、細胞懸濁液を作製した。細胞懸濁液を70 μm径の篩のCell Strainerに通し、single cellの状態にし、1,000 rpmで5分、遠心分離して上清を捨て培地を加えて懸濁しT-75フラスコに播種した。その510日後にコロニーを形成している細胞を継代し(P0とする)、継代P3あるいはP4を用いて歯根膜幹細胞の同定を行った。同定には間葉系細胞マーカー(Vimentin)および間葉系幹細胞マーカー(STRO-1、SSEA-4)を用いて免疫染色によって実施した。得られた歯根膜幹細胞に新規骨形成剤ペプチドを作用させ3日および7日後に細胞を回収して市販キットによってRNAを抽出しNano DropでRNAの純度を確認し、現在、メインの研究については遺伝子解析中であり、遺伝子解析はまだ十分でない状況であるが、再生に関わるサブの研究については炎症性サイトカインによって歯根膜幹細胞が影響を受けることを明らかにした。各臓器組織には幹細胞が存在し、その細胞によって臓器組織は維持されている。歯根膜組織にも幹細胞の存在が明らかにされ、歯根膜の維持に関与しているといわれている。歯周組織再生の鍵を握る歯根膜幹細胞を抽出し、それに対する新規骨形成剤ペプチドの作用を明らかにし、新たな骨形成に関わる因子を見出すことを目的とする。健全なヒトから、歯並びの矯正を行う際に歯の移動スペースを確保するために便宜的に抜去した歯、あるいは水平に埋伏している智歯が将来、一部萌出して歯肉の炎症がもとで開口障害を起こさないように予防的処置のため抜去した歯を、医の倫理委員会の承認を得て、用いた。歯に付着している歯根膜組織を外科用メスで剥離し、細胞をばらばらにするために酵素で処理して細胞の懸濁液を調製し、セルストレイナーと呼ばれる篩いにかけて一個一個の細胞に分けた。幹細胞かどうかは近年よく用いられている幹細胞マーカー(STRO-1)を用いる方法を採用して確認した。この歯根膜幹細胞の継代35代の培養細胞に新規合成ペプチドを添加して培養した。硬組織形成能の確認は、骨芽細胞分化の特徴を示すアルカリホスファターゼ(ALP)活性、オステオカルシン産生、オステオネクチンmRNA発現、カルシウム沈着を測定することによって行った。その結果、細胞増殖は培養期間のすべてに亘って有意に増加し、多量の石灰化粒状物がみられた。また、ALP活性、オステオネクチン遺伝子発現、およびオステオカルシン産生は対照群に比較して有意に増強した。以上のように歯根膜幹細胞に新規合成ペプチドを添加して培養すると、骨芽細胞としてのマーカーの発現が増強し、骨芽細胞へと分化したことを認めたことから、新規合成ペプチドは歯周組織の再生にとって重要な役割を担うことが示唆される。歯の矯正のため便宜抜去された歯、あるいは抜去された埋伏智歯の歯根膜から分離した歯根膜幹細胞(PDLSCs)は間葉系マーカー(Vimentin)および間葉系幹細胞マーカー(STRO-1、SSEA-4)を用いて免疫組織化学的に間葉系幹細胞であることを確認した。PDLSCsは1通常の培地で培養したもの、2骨芽細胞用培地で培養したもの、および3骨芽細胞用培地で培養のものに我々が開発したWYQNMIRのアミノ酸シークエンスからなる新規合成ペプチドを添加したものの3種類について網羅的遺伝子解析であるマイクロアレイ解析を行った。1および2をコントロールとして3との比較を行った。その結果、Leucine-rich repeat-containing protein (LRR)の遺伝子発現が1と比較して35倍増強していた。LRR遺伝子は骨芽細胞に強く発現する遺伝子であるので、新規合成ペプチドは、PDLSCsを骨芽細胞へ分化させる機能を有している可能性が示唆された。しかし、試料によっては増強が顕著でないものもあった。