hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
生理活性物質を識別するセンサー開発とその応用

本研究では、カフェインと活性酸素種(ヒドロキシルラジカルやスーパーオキシドアニオン)を識別するセンサーを開発した。とくに、市販の酸素電極を活性酸素種の検出に使用したことが特徴である。また、薬物が細胞膜に開けた孔のサイズや光照射したポルフィリンの細菌膜に対する作用などをセンサーを利用して検討した。本年度は、カフェインセンサーの開発と酸素電極を利用するヒドロキシルラジカル定量法の開発を中心に研究を進めた。私達は過去に報告されたカフェインセンサーが、カフェインのイオン形(カフェイニウムイオン)のpK_aが0.60.7付近であるにもかかわらず、中性付近のpHでも安定した電位応答を示す点に大きな疑問を抱き、本研究を開始した。一般に、無機イオンからの妨害が少ない優れた有機アンモニウムイオンセンサーを作製するためには、脂溶性の高いイオン交換体(テトラキス[3,5-ビス(2-メトキシヘキサフルオロー2-プロピル)フェニル]ホウ酸ナトリウム)と誘電率の高い膜溶媒との組み合わせがよいことが知られている。様々な膜溶媒を検討した結果、カフェインセンサーの場合でも誘電率の高い膜溶媒(2-フルオロー2'-ニトロジフェニルエーテル)の使用がよいことが明らかにされた。今回開発したセンサーを用いて、pH効果を詳細に検討した結果、中性付近ではカフェイニウムイオンに対する応答は認められず、酸性領域でカフェイニウムイオンのpK_aに近くなるほど強く応答することが明らかにされた。一方、酸素電極法によるヒドロキシルラジカルの定量は、マンニトールなどのヒドロキシルラジカルスカベンジャー存在下で酸素消費速度を測定することを原理としている。例えば、マンニトールの場合では、生成したマンニトールラジカルが酸素分子と反応して溶存酸素が減少する。様々なスカベンジャーを用いて酸素消費速度を比較検討した結果、従来法であるニトロソジメチルアニリン法(吸光度法)とよい相関性がみられた。その他、センサーを用いた応用研究として、細菌をポルフィリン存在下で光照射したときに引き起こされる細胞膜電位の低下、呼吸阻害および膜損傷の検討、細胞膜に開けられたチャンネルサイズの定量法の開発なども行っており、現在さらに詳細な検討を進めている。本年度得られた研究成果は以下の通りである。1.酸素電極を用いたスーパーオキシドアニオン(O_2^-)測定法を開発し,O_2^-消去剤の活性評価に応用した。本法は、鉄(III)-ニトリロ三酢酸錯体(Fe(III)NTA)と過酸化水素(H_2O_2)との反応により生成したO_2^-が、Fe(III)MAと反応して酸素に変化するため,O_2^-生成量と酸素発生量が対応することを利用している。アミノ酸などの抗酸化剤のO_2^-消去活性を酸素電極法により検討した結果、吸光度法(ニトロブルーテトラゾリウム法)の結果とよい相関関係が得られ,本法がO_2^-消去剤の活性評価に応用できることが示された。2.ポルフィリン類による細菌の光不活性化機構を解明するために、細菌細胞質膜に対する作用をセンサーを用いて系統的に検討した。その結果、抗菌作用の強さと膜電位低下との相関性が見出され、抗菌作用の強いボルフィリンは細菌の細胞質膜電位の低下を引き起こすことが示された。さらに、呼吸阻害と膜透過性変化を測定したところ、呼吸阻害が大きく引き起こされていることが見出された。この事実は、ポルフィリンによる光不活性化は、呼吸阻害による膜電位低下が引き金になっていることを強く示唆した。一方、水溶液中でのボルフィリンの存在状態を検討したところ、適度な凝集状態をもつポルフィリンに強い抗菌作用が見られる傾向があることが示された。ポルフィリンなどの光増感剤を使用した細菌の光不活性化は、感染症などの治療にも応用されていることから、本研究で行われた細菌細胞質膜に対する一連の作用の検討は今後の光増感剤の開発に新たな指針を与えるものと思われる。3.その他、酸素電極を用いたヒドロキシルラジカル(HO・)の定量、ポリエン抗生物質が細胞膜に開けたチャンネルサイズの定量などの研究成果が国際雑誌に掲載された。1.昨年度の実績報告書に記載した「酸素電極を用いたスーパーオキシドアニオン(O_2-)の定量法」について、さらに抗酸化剤(アミノ酸や糖など)の検討例数を増やし、従来法である吸光度法(ニトロブルーテトラゾリウム法)と比較検討した結果,本法がO_2-消去剤の活性評価に有効であることを明らかにした。2.昨年度に引き続き、ポルフィリン類による細菌の光不活性化機構を解明するために、細菌細胞質膜に対する作用をセンサーを用いて系統的に検討した。本年度は、特にポルフィリンの電荷の違いに着目して研究を進めた。その結果、強い抗菌作用を示すカチオン性ポルフィリンは細菌の細胞質膜電位の低下を引き起こすことを見出した。さらに、カチオン性ポルフィリンは呼吸阻害と膜透過性変化を大きく引き起こすことを明らかにした。これらの事実は、カチオン性ポルフィリンによる光不活性化は、呼吸阻害と膜透過性変化による膜電位低下が引き金になっていることを強く示唆した。

一方、抗菌作用の弱いアニオン性ポルフィリンでは細胞質膜に対する作用は弱いことも明らかにした。3.さらにグラム陰性菌の外膜透過性を亢進させる物質を探索することを目的として、アミジノ基を2コ有する両親媒性物質の大腸菌外膜に対する作用を系統的に検討した。その結果、2コのアミジノ基に加えて分子内に比較的大きな脂溶性部分をもっ薬物には外膜の透過性亢進作用があることを明らかにした。4.その他、胃粘膜培養細胞膜障害に対する熱ショックタンパク質の効果をカリウムイオンセンサーを用いて検討した。
農地制度及び農業構造の国際比較研究

農地制度及び農業構造の国際比較研究を通して日本農業の零細性が歴史と風土に規定されていることを実証的に解明した。すなわち、世界農業のタイプを新大陸型、旧大陸型に分け、さらに旧大陸型をヨーロッパ型と東アジア型に分ける。このタイプごとに農業経営規模はひと桁ずつ異なるが、そうした規模格差をもたらす歴史的条件や、気候等風土条件に根差した農業技術体系(農法)の違いを実証的に解明した。(1)イギリスの法体系は慣習法(Common Law)と成文法(Statute Law)の両体系で構成される。歴史的には慣習法が先行するなかで、中世以降は成文法に基づく法体系が確立されてきた。土地法の分野ではそれほど単純な経過をたどったわけではなく、17世紀末の清教徒革命を経て成文法体系が形成された一方で、王権が復権する過程で慣習法に基づく裁判制度が成立し、両者の並立がしばらく継続し、近代に至り裁判制度としての統一が果たされた。イギリス土地法の基本的特徴をみると、法律体系について(農地制度を含めて)、単純化がよいと言うべきではないかもしれない。わが国の農地制度は農地法を基礎としつつ、農用地利用増進法(現在は農業経営基盤強化促進法)によって農地に関わる権利の移動規制を行ってきた。さらに農業振興地域の整備に関する法律によって土地利用の区域規制(ゾーニング)と農地の農外転用規制を都市計画法とともに実施してきた。筆者はこれを農地法制の「複々線的規制」として批判してきた。しかし、農地法制が歴史的事情の影響を強く受け、またその変更が漸進的に行うべきものであれば、一概に単純化がよいとする必要はないかもしれない。(2)EnglandとWalesの伝統的土地所有パターンは、地主と小作農、または自作農であった。1970年代にはシティによる所有の比重が増大して企業経営による農業が拡大し、経営者による短期的利益の追求が、大農場において実施される懸念がでてきた。一部の土地所有者は税金の関係から農場を保有し、マネージャーの助けを得て経営した。多くの農業者は借地と自作地の両方を保有し、総所得の増大と規模の経済の利益を得るために農場規模の拡大を図った。1983年にはEnglandとWalesの経営の5分の1、面積の3分の1が自小作農によって占められ、とくにEngland東部で大規模農場の増加がみられた。世界の農業のタイプを3タイプ(類型)に分けて構造問題を考察することがかのうであり、有効である。こうしたタイプ分け(類型区分)の基準は二つである。一つは歴史であり、東アジアやヨーロッパでは「歴史」があり、農業及び農村は長い時間の中で形作られてきた。ところが、アメリカやオーストラリアのような新大陸は別で、ヨーロッパからの移民(植民)が、「誰もいない(と見なされた)」土地を、多くは政府の後押しで囲い込み、当時及び将来の必要性の見通しに基づき広大な土地を囲い込んで「大農場」を形成した。その結果が新大陸型農業の「大規模性」をもたらした。これは、旧大陸では望めない歴史である。これが第一の類型化(新大陸型農業と旧大陸型農業の区分)基準である。第二の基準は、自然、とくに気象条件である。ヨーロッパの経営規模が東アジアより大きいのは、ヨーロッパ農業の土地生産力がアジアより劣っていたからである。例えば、1819世紀ヨーロッパでは播種量の5倍程度の収量があればよいとされていたのに対し、日本の江戸時代の中田(中程度の水田)では40倍程度であった。このような生産力の違いは、経営規模の違いをもたらす。家族を養い、年貢ないし租税を支払い生計を維持するためには、ヨーロッパでは日本よりも大きな面積の農地を必要とする。さらに、日本のようなアジアモンスーンでは、夏の高温多雨のゆえに植物の生長力は大きく、作物よりも成長の早い雑草との闘いに勝利しなければ収穫は望めない。除草剤もなく機械による除草も望めない時代では、人力による雑草駆除しか途はない。したがって大規模化すれば除草は追いつかず、かえって収穫が減ることにもつながりかねない。およそこういった事情により、ヨーロッパと東アジアの農業規模の格差が成立する。こうした規模格差がそのまま近代に持ち越され、構造の違いとなった。世界の農業のタイプを3タイプ(類型)に分けて構造問題を考察することが可能かつ有効である。こうしたタイプ分け(類型区分)ゐ基準は二つである。ところが、アメリカやオーストラリアのような新大陸は異なる事情にあり、ヨーロッパからの移民(植民)が、「誰もいない(と見なされた)」土地を、多くは政府の後押しで囲い込み、当時及び将来の必要性の見通しに基づき広大な土地を囲い込んで「大農場」を形成した。

ヨーロッパの経営規模が東アジアより大きいのは、ヨーロッパ農業の土地生産力がアジアより劣っていたからである。例えば、1819世紀ヨーロッパでは播種量の5倍程度の収量があればよいとされていたのに対し、日本の江戸時代の中田(中程度の水田)では40倍程度であった。このような生産力の違いは、経営規模の違いをもたらす。家族を養い、年貢ないし租税を支払い生計を維持するためには、ヨーロッパでは日本よりも大きな面積の農地を必要とする。さらに、日本のようなアジアモンスーンでは、夏の高温多雨のゆえに植物の生長力は大きく、作物よりも成長の早い雑草との闘いに勝利しなければ収穫は望めない。除草剤もなく機械による除草も望めない時代では、人力による雑草駆除しか途はない。したがって大規模化すれば除草は追いつかず、かえって収穫が減ることにもつながりかねない。およそこういった事情により、ヨーロッパと東アジアの農業規模の格差が成立する。こうした規模格差がそのまま近代に持ち越され、構造の違いとなった。23年度は以上のようなことを明らかにするため、アメリカ合衆国カリフォルニア州の調査を行った。なお、当初計画では23年度は中国を調査する計画であったが、諸般の都合により中国調査は最終年度の24年度に実施することとした。農地制度及び農業構造の比較研究を実施した。本研究では農業構造の違い、例えばなぜ日本の農業経営は零細規模であるのかなど、を経営規模格差をもたらす歴史的条件や気候等風土条件に根差した農業技術体系(農法)の違いに着眼してその形成過程とメカニズムを解明しようとするものである。すなわち、理論的には世界農業を3つのタイプに分けたうえで(世界農業類型論)、その起源と類型成立の要因を明らかにしようとするものである。具体的には、西欧諸国からの植民によって成立したアメリカ、オーストラリアなどの新大陸型農業、西欧や東アジア諸国における歴史的に徐々に形成されてきた旧大陸型農業という類型をまず立てる。新大陸型農業は先住民を排除しつつ新たな土地所有と農業・農場制度を確立していった大規模農業を特徴としている。すなわち固有の歴史的条件によって生み出されたある意味では極めて特殊なタイプの農業である。それにもかかわらず、現代における国際農産物市場をリードする農業構造を有している。これに対し旧大陸型農業は歴史的に徐々に形成されざるを得ないがゆえに飛躍的な構造変動によって一挙に大規模化することは極めて困難である。したがって新大陸型農業と旧大陸型農業においては競争力に格差が存在する。さらに旧大陸型農業においてもヨーロッパ型と東アジア型という農業類型の違いをみることができる。この違いは主として気候・風土条件差に基づく農業生産力の違いに起因している。すなわち、2世紀以前においては、ヨーロッパでは播種量の5倍の収穫しか望めないのに対し、東アジアではモンスーン気候の夏季の高温多雨条件によって播種量の4050倍の収穫が期待されたのである。この結果、家族を養い、貢租を納めるに必要な土地面積がヨーロッパと東アジアでは異なることとなり、現在の規模格差が成立したと考えられる。本研究はそのメカニズムを解明するためのものである。
「青色効果」の検証：青色環境は認知，心理，行動にどのような影響を与えるのか？

本研究では,色彩環境,特に青色環境が人の認知的機能や心理的反応,行動などへ影響を与えるのか否かを検証した。実験1では先行研究における認知課題成績を再検討したが,文字判断課題となぞなぞ課題での反応時間が赤色条件で短い傾向を示した。実験2では,系列位置学習を用いて記憶成績への色彩の影響を調べたが,色彩条件による成績の有意差は現れなかった。実験3では白色と青み,赤みのかかった照明光を用いて,ストループ課題と内田クレペリン検査を行った。しかし,照明条件による成績の一貫した違いは示されなかった。これらの実験結果は,巷で語られている「青色効果」を疑問視させるものである。世間では,近年,青色灯の設置が増え,青色が競技や学習成績のパフォーマンスを高めるとの言説がしばしば聞かれる.しかし,青色という色彩が人間の行動に与える効果を明確に示した報告はない.このため本研究では,主に,青色照明および青色を用いた環境が,他の色彩環境かと比べて人の心理や行動に特別な効果を持つか否かを比較検討することを目的としている。H26年度は,まず,色彩が人の心理的行動に異なる影響を示すことを報告した先行研究の一つであるMehta & Zhu (2009)の研究の追試を行なった。《方法》【装置・色彩環境・刺激】暗幕で区切られた実験室内にマルチカラーLEDシーリングライト(TOSHIBA, LEDH82718X-LC)によって室内照明を施した。照明には3つの色彩条件を用いた。机上での照度は赤色61 Lx,x-.52,y=.32,青色44 Lx, x=.90,y=.13,そして白色20 Lx, x=.28, y=.32であった。心理行動成績を調べるための課題/問題はPC(SOTEC, )上のソフトウエアE-prime2.0によって制御され,CRTモニター(DELL, )に呈示された。【手続き】参加者は実験室内でモニターの80cm前に楽な姿勢で座った。参加者は呈示される課題に対して,求められたテンキーを押すか解答用紙にペンで解答した。課題には1.記憶課題,2.文字判断課題,3.気分評価課題,4.想像課題,5.熟慮性-衝動性尺度課題(質問紙尺度)を実施した。【参加者】正常色覚を持つ60名の学生が参加した。20人ずつ照明3条件に無作為に振り分けられた。《結果》文字判断課題において,赤色条件の判断反応時間が青色条件より短い傾向が見られた。また想像課題において赤色条件での反応時間は白色条件よりも有意に早かった。しかし,その他の課題における成績に有意差は見られなかった。先行研究(Mehta & Zhu, 2009)や我々が行った先の予備的研究では、記憶への「赤色効果」を得ている。しかしまた、受験生あるいは受験産業の間では「青ペンを使うと記憶力が良くなる」(すなわち青色効果)の言説が広まっているという。このため、2年目にあたる本年度(H27年度)は、心理的指標に関しては、記憶課題に焦点を絞り多様な色彩要因を変化させて記憶課題成績への色彩効果を吟味した。色彩が記憶成績に与える影響を評価するために、記憶材料としては無意味綴り単語を使用し、15単語を順次PCモニターに呈示してそれらを記銘するように求めた。実験1では白色画面上に黒色文字を呈示する条件と、赤色文字、青色文字によって表示する条件をテストした。実験2では黒色文字単語を白色背景画面に呈示した。そして、赤色背景画面、青色背景画面にそれぞれ呈示する条件も行った。さらに実験3では、単語を白色背景に黒色文字で呈示し、参加者は黒色、赤色、または青色のボールペンでその都度単語を手元の用紙に書き写した。そして、各実験では各条件における全単語の呈示が終了した後に、記銘単語の再生を求めた。その結果、全実験を通して、記憶成績における色彩条件の効果は観察されなかった。一方、記憶課題や計算課題といった認知課題を実施し、その前後に脈拍数と血圧値を計測したところ、計測値は多くの場合、課題実施前に比べて実施後に低下したが、課題の色彩背景について課題成績および生理指標の計測値を比較したが、それらの間にほとんど有意な違いは一部を除いてほとんど見られなかった。近年,日本各地で青色灯の設置が進み,競技場などでは青色に着色されたトラックの設置など広がっている。これは世間で「青色には自殺や犯罪の抑制効果がある」「青色は集中力を高めたり、パフォーマンスを高める働きがある」という俗説(青色効果と呼ぶ)が広がっているためであると考えられる。しかし、青色環境や青色照明が人間の行動に与える効果を明確に示した報告はない.このため本研究では,青色刺激/青色環境において行動が変化するのか、するならばどのように変化するのか、そしてそれは青色刺激/青色環境が我々の心理的過程にどのような効果を与えるためかを明らかにしたいと考えて本研究を開始した。この問題に応えるためには、まず、青色といった色彩が行動または心理・認知過程のどのような側面に影響を与えうるのかを明らかにする必要がある。このため、心理行動指標や生理的指標を測定して,「青色効果」の有無を検証することが第一段階の課題である。そして、このような効果が「有る」場合には続いてそのメカニズムを考えることが第二段階となるであろう。

この疑問に対してこれまで我々は一連の実験を行ってきたが、これまでに行った認知的機能課題のうち、連想課題といった思考課題において得られたデータを詳細に分析した結果、青色環境では創造性評価の高い反応が得られていたことがわかった。このためそのデータを国際学会において発表した(ECVP, 2015)。しかし、他の認知的課題の結果を総合的に見る限り、その効果の有無を明確に答えるまでに至っていないのが現在までの研究状況である。実験の結果から言えることは、この色彩効果、特に「青色効果」は明確に存在するとは言えない。しかしまた全く否定する結果でもなく、僅かにそのような効果が見られる条件もある。つまり、その存在は極めて特殊な条件、あるいは繊細な状況で現れるのではないかと考えられる。本研究では,青色照明あるいは青色の環境が,他の色彩環境下と比べて人の心理や行動に特別な効果を持つか否かを比較検討することを目的とし,研究期間内に大きく分けて3つの実験を行った。実験1では3色の室内照明光(白色,赤色,青色)の下において,人の認知的課題成績に差異が生じるかを検証した。認知課題には,1.記憶課題,2.文字判断課題,3.気分評価課題,4.なぞなぞ課題,5.衝動性質問紙尺度が用いられた。その結果,文字判断課題において赤色条件では青色条件よりも反応時間が有意に短い傾向が示された。しかし,他の課題において照明条件間での明確な有意差や有意傾向は示されなかった。実験2では,色彩が認知処理に何らかの効果を与えるのかを詳細に検討するために,語彙の系列学習課題を用いて記憶成績が調べられた。実験は,1)記名語の文字色,2)背景色,を白,赤,青とした場合,3)刺激語とその呈示背景はモノクロだが,記名語を黒色,赤色,青色のボールペンで書いた場合,の3条件で行われた。その結果,何れの呈示記名条件でも全体として色彩条件間での成績の違いは観察されなかった。しかし,試行の後半もしくは終了直前において色彩刺激条件による成績の違いが見られた。今後,この現象について,より詳細な検討が必要である。実験3では,色彩環境による認知的処理および行動特性の変化を調べるために,認知心理的課題の実施とともに生理指標の計測を行った。その結果,認知課題や行動特性課題の成績のみならず,心拍数,血圧,唾液アミラーゼといった生理指標についても色彩条件間での明確な差は観察されなかった。本研究では,いずれの実験においても,色彩,特に青色が人間の認知行動に変化を及ぼす効果(青色効果)を明確に見出すことはできなかった。本研究では,色彩環境,特に青色環境が人の認知的機能や心理的反応,行動などへ影響を与えるのか否かを検証した。実験1では先行研究における認知課題成績を再検討したが,文字判断課題となぞなぞ課題での反応時間が赤色条件で短い傾向を示した。実験2では,系列位置学習を用いて記憶成績への色彩の影響を調べたが,色彩条件による成績の有意差は現れなかった。実験3では白色と青み,赤みのかかった照明光を用いて,ストループ課題と内田クレペリン検査を行った。しかし,照明条件による成績の一貫した違いは示されなかった。これらの実験結果は,巷で語られている「青色効果」を疑問視させるものである。本研究において検証を目指している問題(「青色効果」)に関して,先行研究の報告結果は分かれており,また実験状況も様々である。
ナノカーボン電界エミッタを用いた小型高性能電子顕微鏡およびＸ線顕微鏡の開発

独自に設計作製した電子源室および集束系を既製の卓上SEMの鏡筒に組込み,単一のカーボンナノチューブ(CNT)を電界放出エミッタとする小型SEMシステムを構築した。引出電極とButlerレンズは,近軸軌道計算および実軌道計算に基づいて設計した。電子源室を10-7 Paオーダーの真空まで排気することにより安定した電子ビームが得られ,分解能30 nmのSEM像の観察に成功した。さらに,小型SEMの試料室に金属ターゲット,Be窓を取り付けることにより,X線顕微鏡として用いることにより,電子の加速電圧17kV,ビーム電流8.5nAにおいて,140μm幅のSDメモリの配線の撮影に成功した。1本の単一カーボンナノチューブ(CNT)を電子源とする小型走査電子顕微鏡(小型SEM)の開発のために,本年度は,以下の研究を実施した。1.CNT電子源の近軸軌道計算および実軌道計算:CNT電子源の電子引出・集束系を構成する電子レンズはサプレッサ(ウェーネルト電極に相当)、引出電極、バトラーレンズとした。CNTエミッタの形状は直径20nm、長さ1μm、先端形状を半球としてモデル化した。サプレッサ、引出電極、バトラー第1陽極および第2陽極の開口半径および電極間距離、ならびに印加電圧を変化させて、倍率、像面位置、球面収差係数、色収差係数、クロスオーバーのサイズ、電子光学輝度の計算を行った。これにより以下の設計指針を得た。引出電極の開口半径aの電子光学輝度への影響は比較的少ない。しかし、CNTエミッタの放出電流量には大きく影響を及ぼすため、a=1mm程度が良い。引出電極とバトラー第1陽極の間の距離bは小さいほど良いが、電極間の耐圧などを考慮すると、b=1mm程度が良い。また、軸上位置z=33mm付近にクロスオーバーを形成させる動作モード(印加電圧の組合せ)は、複数存在するが、引出電極とバトラー第1陽極間(距離b=1mm)の耐圧などを考慮すると、引出電極1kV、バトラー第1陽極0.65kV、バトラー第2陽極17kVの条件で動作させることが望ましい。2.CNT電子銃部の設計と作製:上記の軌道計算の結果に基づき,レンズ系を設計・製作した。また,CNT電子源の機械的軸調整を可能とする機構を設計した。3.CNT電子源搭載用の小型SEM鏡体の改造と電子銃部の真空排気系の強化:CNT電子銃の搭載に適して接続部を有する小型SEM鏡体を設計し,特殊仕様の小型SEMとして購入した。また、CNT電子源の安定動作のために,電子銃部を鏡筒とは別系統で真空排気する真空排気系を設計・製作した。1本の単一カーボンナノチューブ(CNT)を電子源とする小型走査電子顕微鏡(小型SEM)の開発およびX線顕微鏡への応用を目指して,本年度は,以下の研究を実施した。1.前年度に設計・製作した電子線照射系の小型卓上SEMの鏡筒部への組込み:電子銃部,鏡筒および試料室をターボ分子ポンプ2台によって真空排気することにより,電子銃部を10-7Paオーダーの真空に維持できることを確認した。電子線の高い安定性を確保するため,電子源室は超高真空の環境を必要とする。そのため,軸調整用の可動部分にはOリングは用いず,ベローズを使った可動機構を採用した。また,外部コイルによる電子線の軸調整機構も付加した。2.電極構造の変更および真空排気系の除振対策:当初の実験装置の設計段階では想定できなかった電子銃内での放電,および真空排気ポンプの機械的振動の侵入による装置本体の振動が起こったため,電子銃電源の修理,放電防止のための内部電極構造の変更,および振動抑止構造の追加することにより,これらの問題を解決した。3.単一CNT電子エミッタの作製:マイクロマニピュレータを装備した他のSEMを用いて、電子ビーム誘起堆積法により1本のCNTをW針先端に固定し、CNTエミッタを作製した。電子放出前に,CNT表面を清浄にするためのフラッシング機能も付加した。4.電子ビームの生成:CNT電子エミッタから放出された電子を引出電極、バトラー第1および第2電極、コンデンサー絞り、対物レンズを通過させ、試料に照射することに成功した。当初の設計段階では想定できなかった電子銃内での放電,および真空排気ポンプの機械的振動の装置本体への振動の侵入が起き,電子ビームを安定にターゲットに照射することが出来ないことが判明したため,電子銃電源の修理,放電防止のための内部電極構造の変更,および振動抑止構造の追加が必要となり,これらの改良に5ヶ月要した。単一カーボンナノチューブ(CNT)を電子源とする小型走査電子顕微鏡(小型SEM)の開発およびX線顕微鏡への応用を目指して,本年度は,以下の研究を実施した。1.CNT-FE電子源搭載の小型SEMシステムの構築:独自に作成した電子源室および集束系を既製の小型卓上SEMの鏡筒に組込み,CNTをFEエミッタとする小型SEMシステムを構築した。走査コイル,対物レンズ,試料室および検出系は既製の小型卓上SEMのものを使用した。本装置は電子源室を超高真空仕様としてあることを特徴とする。2.単一CNTをエミッタとしたSEM像撮影:エミッタを装着後,電子源室は10-7 Paオーダーの真空まで排気した。引出電極、バトラー第1電極および第2電極に印加できる電圧はそれぞれ0から3.0 kV、0から1.5 kV、0から17 kVである。

エミッタと試料の位置、電極に印加する電圧を調整することでFE-SEM像を観察し、空間分解能を測定した。Cuメッシュを試料に用いて,撮影されたSEM像から空間分解能として約30 nm程度を得た。3.小型SEMの試料室の改造:試料室に金属ターゲット,X線取出窓を取り付け,X線像撮影のためのCCDカメラを設置した。4.単一CNTエミッタを用いたX線像の撮影:上記の小型SEMで生成した電子ビームをCuターゲットに照射することにより,X線を発生し,SDメモリカードを試料として,フォトカウンティング型X線CCDカメラにより,そのX線像を撮影した。電子の加速電圧17kV,ビーム電流8.5nAにおいて,CCDカメラの1ピクセル当り50カウントを得るのに露出時間1000秒を要したが,140μm幅の配線を撮影することができた。独自に設計作製した電子源室および集束系を既製の卓上SEMの鏡筒に組込み,単一のカーボンナノチューブ(CNT)を電界放出エミッタとする小型SEMシステムを構築した。引出電極とButlerレンズは,近軸軌道計算および実軌道計算に基づいて設計した。電子源室を10-7 Paオーダーの真空まで排気することにより安定した電子ビームが得られ,分解能30 nmのSEM像の観察に成功した。さらに,小型SEMの試料室に金属ターゲット,Be窓を取り付けることにより,X線顕微鏡として用いることにより,電子の加速電圧17kV,ビーム電流8.5nAにおいて,140μm幅のSDメモリの配線の撮影に成功した。内部電極構造の改良,および振動抑止構造の追加が完了したので,当初の目標を目指して,来年度はSEM分解能と電子ビーム径の評価,X線顕微鏡像の撮影に向けて,研究を加速させる。27年度が最終年度であるため、記入しない。結晶物理学当初計画に挙げた、CNT電子源搭載用の小型SEM鏡体の改造および電子引出電極および集束レンズの設計を遂行できた。作製した実験装置に当初の設計段階では想定できなかった問題が判明したため,その改善と設計変更に時間を要したため,当初の計画を遅らせた。これらの問題は解決されたので,次年度に使用する計画である。当初計画に沿って、CNT電子源用引出電極・集束レンズ系を小型SEMに組み込め、実際に電子ビームを出し、電子光学的特性の評価を行う。次年度への繰越額1,485,344円は次年度の物品費として使用する予定。備品として購入した小型走査電子顕微鏡およびターボ分子ポンプの価格が年度当初の予定価格よりも安く納品されたため。繰越額1,485,344円は次年度の物品費にあてる。
マイクロメカトロニクス・システムにおける3次元マイクロ構造製作プロセスの研究

平成10年度の研究計画に基づき、日本、米国、フランス、ドイツの複数の研究者がお互いに訪問しあい、平成9年度で得られた交流成果の上に、3次元マイクロ構造製作プロセス、ナノ領域における3次元マイクロ構造の検討、応用システムの検討の3分野を中心に更にマイクロメカトロニクスに関する深い議論、活発な意見交換、共同研究を行なった。特に、今年度においては、マイクロメカトロニクスがナノ領域まで研究領域を広げる道筋を体系的に検討するという新しい進展を示すことができた。これは日・仏の本研究の分担者らが中心となリナノに関する国際ワークショップを開催し集中的に討論した成果である。この成果を受けて、ナノ領域の新しい研究分野が生まれつつある。本研究の研究成果は著名な国際会議、ワークショップ等において数多く発表されており、国際的に高い評価を受けており、マイクロメカトロニクス及び新しい研究分野であるナノテクノロジーに大きなインパクトを与えている。平成9年度、10年度の本研究成果は現在、世界中で注目を集めつつあるナノ・ピコテクノロジーに対して多大な貢献を与え、今後この分野での我が国の優位性を得るための基礎的な成果となっている。今後の展開としては、マイクロ領域からナノ領域への研究課題の移行を念頭に置いた、組織的な研究が望まれる。米国では、既にそのような動きが出ており、我が国においても現在の優位性を保つためにもナノに特化したプロジェクトが必要である。平成9年度の研究計画に基づき、日本、米国、フランス、ドイツの複数の研究者がお互いに訪問しあい、3次元マイクロ構造の選定、製作プロセスの検討及び応用システムの検討に関して活発な意見交換と実システムに於けるシミュレーション等の共同研究を行った。なお、これらの研究成果は国際会議、ワークショップ、等において発表される高い評価を得ている。特にマイクロ領域で重要な役割を果たすナノレベルのマニピュレーションという新しい研究課題を抽出し、本研究計画の枠組みの中で日・仏共同研究の一つとして確立する事ができた。これは、本研究のみならずマイクロ・メカトロニクス全般に渡って大きなインパクトを与えつつあり、真に国際共同研究として、更なる伸展が期待される。これは日・仏の本研究の分担者らが中心となりナノに関する国際ワークショップを開催し集中的に討論した成果である。
カルモジュリン-カルモジュリン結合蛋白質相互作用の動的過程の解析

一般細胞において外界からの信号はカルシウムイオン濃度の増加として細胞内に伝わる。細胞内のカルシウムイオン濃度は元々非常に低いので、上昇したとしても【10^(-5)】M程度にしかならない。このように低い濃度でもカルシウムイオンを強く結合し、それによっておこった構造変化によって種々の酵素の活性を調節する蛋白質がカルモジュリンである。カルモジュリンは分子量17000の小さな蛋白質であるが多種の蛋白質と相互作用する。カルモジュリン上の相互作用部位は相手によって異なるのか、それとも同一部位がすべての蛋白質と相互作用するのかという点と、その相互作用の速さが細胞内での生理的諸反応の速度にみあうだけ速いかという点を明らかにすることが我々の研究の目的である。方法としては化学試薬による架橋反応を用いた。カルモジュリンは牛の脳より調製し、カルモジュリン結合蛋白質としてはニワトリ砂のうより調製したミオシン軽鎖キナーゼを用いた。まず、サクシニミジル-2-(m-アジド-O-ニトロベンズアミド)エチル-1,3′-ジチオプロピオネイトでカルモジュリンのリジン残基を修飾し、ストップトフロー装置によってミオシン軽鎖キナーゼと混合した後、時間をずらして閃光を当てそれによって起った架橋量から両者の複合体形成速度を測定した。その結果、混合後100ミリ秒ですべてのカルモジュリンはミオシン軽鎖キナーゼと複合体をつくることが分り、細胞の生理的な応答に十分なほど速いことが明らかになった。カルモジュリンとカルモジュリン結合蛋白質との相互作用部位については、蛋白質同志が接触しているところでのみ架橋反応を起す水溶性カルボジイミドを用いて調べた。カルモジュリンとミオシン軽鎖キナーゼはこの試薬によって架橋されることが分ったので、その部位をペプチドマップ法によって調べている。
脳虚血耐性現象の遺伝子発現からのアプローチ

神経細胞における虚血耐性現象の解明のために,まず砂ネズミを用いて再現性の高い虚血耐性モデルの作成を試みた.特に短時間の虚血を加える場合,側副血行路の発達の程度により頚動脈閉塞時間は必ずしも負荷の強さを反映しない.そこで,古くからenergy failureの指標とされてきた脱分極の持続時間を虚血負荷の指標として用いた.その結果,脱分極持続時間6.5分以上の虚血負荷で海馬CAl神経細胞に完全な細胞死が生じるが,2日前に脱分極持続時間2.53.5分の虚血負荷を加えておくと,6.58.5分の脱分極持続時間を加えてもCAl神経細胞はほぼ100%助かることが確認された.この耐性効果はCAlに完全な細胞死を引き起こす脱分極持続時間を10分以上,すなわち2倍近くに延長させる程の強い効果で,虚血耐性現象は少なくとも10日間は持続した.つまり,砂ネズミにおいてDC potential計測下に脱分極持続時間が2.53.5分になる虚血負荷を加えることで,極めて再現性の高いmaximumな耐性効果を持つ虚血耐性モデルを確立することができた.次に,同モデルの海馬CAl神経細胞における虚血耐性現象の獲得に関与する遺伝子を明らかにする目的で,Heat shock proteinに代表されるHSP72と転写因子を発現するimmediate early geneのうちc-fos,junB,junD,c-junについて,それらの発現の脱分極持続時間の閾値を測定し,虚血耐性効果を誘導する脱分極持続時間と比較検討した.その結果,虚血後1時間で,HSP72は脱分極持続時間3.5分以上でようやく発現し,脱分極持続時間の延長とともに増強し5分以上でplateauに達したのに対して,c-fos,junB,junD,c-jun全て,虚血耐性効果が現れ始める脱分極持続時間1.5分から同じく発現し,peakになる脱分極持続時間はIEGの種類によりやや異なったものの,耐性効果がmaximumとなる2.53.5分で強い発現が観察された.以上より,当初虚血耐性現象の獲得に深く関係すると考えられたHSPのうち少なくともHSP72は虚血耐性現象の発現に必ずしも必要でないが,FosやJun familyの転写因子は標的遺伝子そのものは明らかではないが虚血耐性現象の発現に深く関わっている可能性が強く示唆された.今後は,本モデルのような再現性の高いモデルを用いたin vivoからのapproachに加え,細胞単位でのin vitroからのapproachも必要であるとともに,神経細胞以外にastrocyteやmicrogliaなどのglia細胞の虚血耐性現象における役割にも着目する必要がある.神経細胞における虚血耐性現象の解明のために,まず砂ネズミを用いて再現性の高い虚血耐性モデルの作成を試みた.特に短時間の虚血を加える場合,側副血行路の発達の程度により頚動脈閉塞時間は必ずしも負荷の強さを反映しない.そこで,古くからenergy failureの指標とされてきた脱分極の持続時間を虚血負荷の指標として用いた.その結果,脱分極持続時間6.5分以上の虚血負荷で海馬CAl神経細胞に完全な細胞死が生じるが,2日前に脱分極持続時間2.53.5分の虚血負荷を加えておくと,6.58.5分の脱分極持続時間を加えてもCAl神経細胞はほぼ100%助かることが確認された.この耐性効果はCAlに完全な細胞死を引き起こす脱分極持続時間を10分以上,すなわち2倍近くに延長させる程の強い効果で,虚血耐性現象は少なくとも10日間は持続した.つまり,砂ネズミにおいてDC potential計測下に脱分極持続時間が2.53.5分になる虚血負荷を加えることで,極めて再現性の高いmaximumな耐性効果を持つ虚血耐性モデルを確立することができた.次に,同モデルの海馬CAl神経細胞における虚血耐性現象の獲得に関与する遺伝子を明らかにする目的で,Heat shock proteinに代表されるHSP72と転写因子を発現するimmediate early geneのうちc-fos,junB,junD,c-junについて,それらの発現の脱分極持続時間の閾値を測定し,虚血耐性効果を誘導する脱分極持続時間と比較検討した.その結果,虚血後1時間で,HSP72は脱分極持続時間3.5分以上でようやく発現し,脱分極持続時間の延長とともに増強し5分以上でplateauに達したのに対して,c-fos,junB,junD,c-jun全て,虚血耐性効果が現れ始める脱分極持続時間1.5分から同じく発現し,peakになる脱分極持続時間はIEGの種類によりやや異なったものの,耐性効果がmaximumとなる2.53.5分で強い発現が観察された.以上より,当初虚血耐性現象の獲得に深く関係すると考えられたHSPのうち少なくともHSP72は虚血耐性現象の発現に必ずしも必要でないが,FosやJun familyの転写因子は標的遺伝子そのものは明らかではないが虚血耐性現象の発現に深く関わっている可能性が強く示唆された.今後は,本モデルのような再現性の高いモデルを用いたin vivoからのapproachに加え,細胞単位でのin vitroからのapproachも必要であるとともに,神経細胞以外にastrocyteやmicrogliaなどのglia細胞の虚血耐性現象における役割にも着目する必要がある.実験脳における虚血耐性現象の解明のために,まず再現性の高い虚血耐性モデルの作成の確立を試みた。短時間の虚血負荷の場合,頚動脈の閉塞時間を虚血負荷の指標とすると動物間のバラツキが大きいため,客観的指標として脱分極の持続時間を用いた。

1.砂ネズミ(n=22)において両側海馬のDC potentialを計測しながら様々な時間の両側頚動脈閉塞を行い,1週間後の海馬CAIの神経細胞死の状態を評価した。その結果,CA1神経細胞障害を引き起こす脱分極持続時間の閾値は46.5分で,6.5分以上ではCA1神経細胞の完全な障害が観察された。2.砂ネズミ(n=47)にDC potential計測下にCA1細胞障害をきたさない範囲の短時間の虚血を加え(1回目の虚血),その2日後同じくDC potential計測下に脱分極持続時間が6.58.5分の虚血(1の結果よりCA1神経細胞に完全な障害を生ずるに十分な虚血)を加え,1週間後の海馬CA1の神経細胞死の状態を評価した。その結果,1回目の虚血の脱分極持続時間が1.5分以上でCA1神経細胞の温存が見られ,その耐性効果は脱分極持続時間が2.53.5分でmaximumであった。しかし,4分以上になると耐性効果の消失が観察されはじめた。3.2の結果より,1回目の虚血として,DC potential計測下に脱分極持続時間が2.53.5分になるような虚血を加えれば,再現性の極めて高い虚血耐性モデルを砂ネズミにおいて作成できることが明らかになった。今後は虚血耐性と遺伝子発現の関係を見るために,同じくDC potential計測下に虚血モデルを作成し,様々な遺伝子発現の脱分極持続時間の閾値を測定し,虚血耐性効果を誘導する脱分極持続時間と比較検討する予定である。DC potentialを計測することで再現性の高い砂ネズミの虚血耐性モデルを作成することができたので,遺伝子発現との関連を見る前に本モデルに於ける耐性現象の性質を明らかにすることを目的に,耐性現象の強度,前負荷とtest負荷と間隔と耐性現象獲得との関連について検討した.1.砂ネズミ(n=18)において,前負荷(耐性効果がmaximumとなる脱分極持続時間2.53.5分の虚血)の2日後に脱分極持続時間が6分以上の腫々の時間の虚血を加え,1週間後の海馬CA1の神経細胞死の状態を評価した.前虚血負荷がない場合のCA1神経細胞障害を引き起こす脱分極持続時間の閾値46.5分が,前負荷を行った場合10分以上と約2倍に延長した.2.前負荷(脱分極持続時間が13.5分)とtest負荷(脱分極持続時間が6.58.5分の虚血:正常状態でCA1神経細胞に完全な障害を生ずる十分な虚血)の間隔を6時間(n=15),1日(n=19),4日(n=19),10日(n=11)と変え,各群において1週間後の海馬CA1の神経細胞死の状態を評価し虚血耐性効果を比較した.前負荷後6時間では脱分極持続時間が2.5分以下とやや軽度の前負荷で中程度(温存CA1神経細胞からみると約半数)の耐性効果が観察された.1日以降でmaximumの耐性効果がみられ少なくても10日後まではその効果は持続していた.3.以上,前負荷後6時間ですでに耐性現象が獲得され,その効果は1日にほぼmaximumとなり,少なくとも10日以上持続することが明らかとなった.その耐性効果はtest負荷の脱分極持続時間を2倍に延長させるほどの強い効果であった.
化学トレーサーによる深層循環の解析

本年度は、白鳳丸KHー89ー2次世界周航航海において世界の主要な海盆から新たに放射性核種、微量元素、およびフレオンなどの試料の採取を行なったが、主として前年度までに得られた試料の分析とその結果のとりまとめに重点を置いて研究を行った。先ずKHー87ー2次白鳳丸航海で見つかった表層から1000m深にかけての異常に大きな^<210>Pbに対する^<210>Poの不足量は、北赤道海流が黒潮となる海洋循環過程で大気由来の^<210>Pbが集積する効果を導入することによって初めて説明しうることをモデルから明らかにした。さらに北西太平洋におけるこれまでのU/Th系列核種の分析結果を詳細にレヴューレ、拡散・混合のトレーサーとしてのRa同位体、^<222>Rn、^<227>Acなどの有用性とともに、スキャベンジングのトレーサーとしてのTh同位体、^<231>Pa、^<210>Pbなどについても現状を分析し今後の課題をまとめた。またKHー88ー3次航海で得られた試料の分析もほぼ完了し、太平洋における^<228>Ra/^<226>Ra比の表面海水中の分布を図にすることができた。これは沿岸域から外洋への物質の輸送経路を示す最もよい指標となり得る。PuとAmについては、分析手法の改良に努力が払われ、また広範囲な海域でのデータが着実に集められている。タンデトロンを用いる^<14>Cの分析は順調に行われているが、本年度はとくに海水からCO_2を直接抽出する装置を作成し、分析の利便性を増すことができた。微量金属については、これまで数多くのデータが得られているが、それらの抱括的にまとめて公表する段階にきている。酸素酸に関しては、生物活動との関連において新しい知見が得られた。フレオンについては分析法の習得も終り、多くのデータを集積しつつある。これらの結果の多くは、今後の1・2年の間に学術誌に公表される予定である。
４者複合体の構造解析によるｔｒａｎｓｓｕｌｆｕｒｓｏｍｅのｔＲＮＡ変換機構の解明

古細菌におけるCys-tRNA(Cys)の生合成は,2つの酵素,SepRSとSepCysSが,それぞれ触媒する2段階の反応から成り立っている.申請者らは,この反応を推進するためには,第3のタンパク質SepCysEがSepRSとSepCysSをつないで3者複合体(transsulfursome)を形成することが必須であることを明らかにした.本研究では,そのtranssulfursomeとtRNAから成る4者複合体の構造解析により,transsulfursomeが2つのリンカーを利用して動的なtRNAをプロセスする分子機構を明らかにする.そのために,H29年度に引き続き,H30年度に下記のように研究を進めた.H30年度に,transsulfursomeとtRNAの結合実験で確認しながら,各反応段階を反映するtranssulfursomeとtRNAの変異体作製を続き,精製できた第1段階反応状態を反映するtranssulfursome変異体SepRS-SepCysE(H)とtRNA複合体を結晶化し,初期結晶を得た.現在に,その結晶の条件最適化を行っている.また,transsulfursome-tRNA複合体のクライオ電子顕微鏡の測定について,当学科に既存の共用透過型電子顕微鏡(Hitachi社製H7650)を用いて,硝酸ウランを用いたネガティブ染色法によりtranssulfursome-tRNA複合体の確認を行ったところで,tRNA結合状態のtranssulfursomeが単体より,まっすぐのような形が多かったということが分かった.さらに,放射光施設PFにて,凍結条件のスクリーニングを実施した.その結果,transsulfursome-tRNA複合体が沈殿しやすい,クライオ電子顕微鏡の測定に適切なグリッドの作製が困難であることが分かった.平成30年では,各反応段階を反映できるtranssulfursomeとtRNA複合体を得るために,SepRS,SepCysS,SepCysE,tRNAの変異を作製し,目的に応じるtranssulfursomeとtRNAの複合体を得ることができた.そのうち,SepRS-SepCysE(H)とtRNA複合体の初期結晶を得た.また,ネガティブ染色法によりtranssulfursome-tRNA複合体の確認を行ったところで,tRNA結合状態のtranssulfursomeが単体より,まっすぐのようなI形が多かったということが分かった.さらに,クライオEMの条件のスクリーニングも始め,クライオ電子顕微鏡の測定に適切なグリッドの作製が困難であることが分かり,次に進める計画を立てることができた.以上の結果から、本研究はおおむねに順調に進展しているといえる.これまでの実験結果から、分かった問題を解決しながら,申請当初に計画した実験を実施する.1.各反応段階を反映する変異体の作製:結晶構造解析とCryo-EMの構造解析を行うために,これまでに得られた実験結果に応じて,大量調製法の条件を最適化しながら,各サンプル(transsulfursome,tRNA,およびそれらの変異体)を調製する.3.電顕を用いた各反応状態のtranssulfursome-tRNA複合体の構造解析:平成30年に実施した電顕実験から,ネガティブ染色法により得られたtranssulfursome-tRNA複合体のパーテクルが単独のtranssulfursomeより,I型が多いであることを観察できたので,ネガティブ染色法を用いた単粒子解析法もtranssulfursome-tRNA複合体の構造に適用出来る.よって,今後,Cryo-EMの測定を行うと共に,ネガティブ染色法の解析も進める.また,Cryo-EMの測定はサンプルの安定性を考え,主に国内の電顕施設(大阪大学蛋白質研究所や、放射光施設PF、沖縄科学技術大学院大学など)を利用する.4.transsulfursomeの動的なtRNAプロセスのメカニズムの検証:各反応状態を示すtranssulfursome-tRNA複合体構造が得られたら,単体と複合体の構造比較を行い,transsulfursomeによって行われる二段階反応における動的なtRNAプロセスを考察する.また,立体構造情報に基づいて活性に密接に関与すると考えられるアミノ酸残基に変異を導入し, tRNAの認識と酵素間の受け渡し機構を明らかにする.古細菌におけるCys-tRNA(Cys)の生合成は,2つの酵素,SepRSとSepCysSが,それぞれ触媒する2段階の反応から成り立っている.申請者らは,この反応を推進するためには,第3のタンパク質SepCysEがSepRSとSepCysSをつないで3者複合体(transsulfursome)を形成することが必須であることを明らかにした.本研究では,そのtranssulfursomeとtRNAから成る4者複合体の構造解析により,transsulfursomeが2つのリンカーを利用して動的なtRNAをプロセスする分子機構を明らかにする.そのために,H29年度に引き続き,H30年度に下記のように研究を進めた.H30年度に,transsulfursomeとtRNAの結合実験で確認しながら,各反応段階を反映するtranssulfursomeとtRNAの変異体作製を続き,精製できた第1段階反応状態を反映するtranssulfursome変異体SepRS-SepCysE(H)とtRNA複合体を結晶化し,初期結晶を得た.現在に,その結晶の条件最適化を行っている.また,transsulfursome-tRNA複合体のクライオ電子顕微鏡の測定について,当学科に既存の共用透過型電子顕微鏡(Hitachi社製H7650)を用いて,硝酸ウランを用いたネガティブ染色法によりtranssulfursome-tRNA複合体の確認を行ったところで,tRNA結合状態のtranssulfursomeが単体より,まっすぐのような形が多かったということが分かった.さらに,放射光施設PFにて,凍結条件のスクリーニングを実施した.

その結果,transsulfursome-tRNA複合体が沈殿しやすい,クライオ電子顕微鏡の測定に適切なグリッドの作製が困難であることが分かった.平成30年では,各反応段階を反映できるtranssulfursomeとtRNA複合体を得るために,SepRS,SepCysS,SepCysE,tRNAの変異を作製し,目的に応じるtranssulfursomeとtRNAの複合体を得ることができた.そのうち,SepRS-SepCysE(H)とtRNA複合体の初期結晶を得た.また,ネガティブ染色法によりtranssulfursome-tRNA複合体の確認を行ったところで,tRNA結合状態のtranssulfursomeが単体より,まっすぐのようなI形が多かったということが分かった.さらに,クライオEMの条件のスクリーニングも始め,クライオ電子顕微鏡の測定に適切なグリッドの作製が困難であることが分かり,次に進める計画を立てることができた.以上の結果から、本研究はおおむねに順調に進展しているといえる.古細菌におけるCys-tRNA(Cys)の生合成は,2つの酵素,SepRSとSepCysSが,それぞれ触媒する2段階の反応から成り立っている.申請者らは,この反応を推進するためには,第3のタンパク質SepCysEがSepRSとSepCysSをつないで3者複合体(transsulfursome)を形成することが必須であることを明らかにした.本研究では,そのtranssulfursomeとtRNAから成る4者複合体の構造解析により,transsulfursomeが2つのリンカーを利用して動的なtRNAをプロセスする分子機構を明らかにする.そのために,H29年度には,まず,各反応段階を反映するtranssulfursomeとtRNAの変異体作製,および得られた成果をまとめて投稿することに集中した.その結果,論文をNature Communicationに掲載することができた.変異体の作製について,SepCysEのlinker1とlinker2を短くした変異体以外に,当初の計画により最も安定な,RNAと結合できないSepCysSの変異体を見つけて,作製し,tRNAがSepRSのみ結合する第1段階反応状態でのtranssulfursome-tRNA複合体調製を試みた.また,第2段階反応状態でのtranssulfursome-tRNA複合体調製を作製するため,SepRS変異体の調製の問題、およびSepCysEとの結合への影響を考え,アンチコドンを認識するSepRSの残基変異の変わりに,tRNAの変異体を作ることにした.調製できた各種のtranssulfursome-tRNAの変異体を用いて,放射光施設PFにて, SEC-SAXS測定した結果,二つの段階の反応状態を反映するtranssulfursometとtRNAの回折曲線の予想している違いが見られなく,今回構築した第1段階反応状態でのtranssulfursomet-tRNA