hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
エキソソーム表面のヒアルロニダーゼに着目した膀胱癌浸潤・転移機序の解明

13種の尿路上皮癌細胞株、KK47、RT-4、YTS-1から、超遠心により比較的大量にエキソソームを調製する方法を確立した。調製されたエキソソームの粒度・粒径を、ナノ粒子マルチアナライザーqNanoを使用して測定した。また、ウェスタン・ブロッティングによって、エキソソーム・マーカーであるCD9、TSG10の発現を検出した。上記2つのデータから確かにエキソソームの調製ができたことを確認した。さらに、蛍光色素PKH67を用いてエキソソームを蛍光標識し、細胞内とインキュベートした際に細胞内に取り込まれる過程を追跡する方法を確立した。2尿路上皮癌細胞株YTS-1を用いて、この浸潤突起形成に必須のタンパク質であるコータクチン(Cortactin)の発現を、shRNAにより抑制したCortactin KD YTS-1株を樹立した。本研究計画4つのうち、1の計画を完遂し、さらに、Cortactin KD YTS-1細胞を樹立した。ここまでの結果で、2で掲げたエキソソームが癌細胞の浸潤・転移に果たす役割を検討する実験の準備が整った。以下の研究を行った。1尿路上皮癌細胞株からエキソソームを分離し蛍光標識する。3種の尿路上皮癌細胞株、KK47、RT-4、YTS-1から、超遠心により比較的大量にエキソソームを調製する方法を確立した。2エキソソームが浸潤・転移に果たす役割について検討する。癌細胞が浸潤・転移するためには、浸潤突起と呼ばれる膜突起の形成が必須である。尿路上皮癌細胞株YTS-1を用いて、この浸潤突起形成に必須のタンパク質であるコータクチン(Cortactin)の発現を、shRNAにより抑制したCortactin KD YTS-1株を樹立した。Cortactin KD YTS-1からのエキソソームの回収は、対照の細胞に比べて著しく低かった。このことは、エキソソームの分泌には、Cortactinによって形成される浸潤突起の形成が必須であることを示唆する。本研究計画14のうち、1の計画を完遂し、さらに、Cortactin KD YTS-1細胞を樹立した。このことから、本研究計画は、現在のところおおむね順調に進捗していると評価できる。今後の予定は以下である。まずエキソソームが浸潤・転移に果たす役割について検討する。続いて、臨床検体におけるエキソソームの検出、TMEM2の発現と予後の関係についての検証を行う。その後、臨床検体を用いたエキソソーム測定法の確立および表面マーカーと予後との関係についての検証を行う。
白血球細胞間相互作用を調節する血漿タンパク複合体のプロテオミクス解析と標的分子

生体防御反応は、白血球を中心とする細胞間相互作用によって営まれ、それら細胞の活性化は液性因子ならびに接着分子を介して制御されている。液性因子としてすでに多くのサイトカイン、ケモカイン分子が同定されているものの、敗血症に代表されるSIRSあるいはCARS病態形成に関与するような血中因子の解析は殆ど進んでいない。このような背景に立って本研究では、以下の諸点について明らかにした。1)現在我が国の敗血症治療には、血中LPSの除去を目的としてポリミキシンB結合カラム(PMX)への直接血液還流法が用いられている。本研究では、LPSの吸着除去に加え、液性タンパク因子の除去仮説の下に、網羅的、系統的な吸着タンパクプロファイリングとそれらの白血球細胞機能に対する効果の評価をおこなった。2)群特異的リガンド(ポリミキシンB)でアフィニティ精製された血漿蛋白複合体プロテオミクスの解析により、S100A8,S100A12などのEFハンドカルシウム結合タンパクと、MIFならびにHMGB1を同定した。精製されたS100A12を用いてIL-18による刺激・非刺激時の単球/マクロファージ上のICAM-1、B7.1、B7.2、CD40、CD29、CD62L、CD31などの接着分子群の発現に対する効果を明らかにした。同様に、HMGB1の作用特性について解析した。3)同定された因子の中で、HMGB1はエンドトキシン血症の致死応答に関与するメディエターと考えられている。組み換え体ヒトHMGB1タンパクを大腸菌に発現させることに成功した。大量精製法を目下検討しているが、この標品を得て敗血症における役割の研究に発展させる計画である。白血球細胞間相互作用、特に単球-リンパ球間相互作用における接着分子の機能の重要性について明らかにした。つまり、LPSやInterleukin-18でヒト末梢血単核球(PBMC)を刺激すると、単球細胞表面上にIntercellular adhesion molecule-1,B7,CD40分子の発現が増加する。PBMCにおけるIL-12やIFN-gammaの産生は、これらの接着分子とリンパ球上の対分子との相互作用によって惹起されることを示した。さらに、内因性オータコイドであるヒスタミンやロスタグランジン類は、単球上接着分子の発現調節を介してサイトカイン産生を調節することをあきらかにした。以上の結果は、炎症・免疫応答の調節における接着機能分子群の機能制御の重要性を示唆するものである。一方、Sepsis患者さんに使用された治療カラムから細胞成分の回収を試み、これに成功した。細胞成分のインキュベーション上清から、主要な蛋白質をSDS-PAGEで確認し、各蛋白質を精製後プロテインシークエンサーにかけることによって、N末端アミノ酸配列を読み取った。得られたアミノ酸配列情報と、SDS-PAGE上の見かけの分子量から、4種類の蛋白質が同定された。各蛋白質の精製標本を用いて、単球上接着分子の発現に対する効果を種々の条件下に検討したところ、非常に興味深い活性が検出された。さらに、特定の蛋白質に対する抗体を作成し、免疫沈降を行うことによって、この蛋白質と複合体を形成する可能性のある蛋白質群の検索を進めている。

1)現在我が国の敗血症治療には、血中LPSの除去を目的としてポリミキシンB結合カラム(PMX)への直接血液還流法が用いられている。本研究では、LPSの吸着除去に加え、液性タンパク因子の除去仮説の下に、網羅的、系統的な吸着タンパクプロファイリングとそれらの白血球細胞機能に対する効果の評価をおこなった。2)群特異的リガンド(ポリミキシンB)でアフィニティ精製された血漿蛋白複合体プロテオミクスの解析により、S100A8,S100A12などのEFハンドカルシウム結合タンパクと、MIFならびにHMGB1を同定した。精製されたS100A12を用いてIL-18による刺激・非刺激時の単球/マクロファージ上のICAM-1、B7.1、B7.2、CD40、CD29、CD62L、CD31などの接着分子群の発現に対する効果を明らかにした。同様に、HMGB1の作用特性について解析した。3)同定された因子の中で、HMGB1はエンドトキシン血症の致死応答に関与するメディエターと考えられている。組み換え体ヒトHMGB1タンパクを大腸菌に発現させることに成功した。大量精製法を目下検討しているが、この標品を得て敗血症における役割の研究に発展させる計画である。
自然堆積地盤の遅れ長期圧密沈下のメカニズム解明と予測・対策工システムの開発

(1)道路用盛土載荷地盤の長期大沈下挙動に対する各種対策工の検討長期大沈下挙動が起きている神田地区と伊勢地区を対象に、室内試験結果と各種現場データをもとにSYSカムクレイモデルに基づく水土連成有限変形計算により長期大沈下を再現し、種々の解析条件を想定する事で、長期大沈下挙動を引き起こすような地盤に対する沈下軽減の対策工を検討した。長期大沈下が起こるか否かには閾値となる荷重が存在し、軽量盛土材等による盛土荷重の軽減は長期大沈下の防止に有効であることを数値計算により明らかにした。これは上越地区等のEPS置換効果と整合する。また、SD(サンドドレーン)打設による粘土層の透水性の改善により、大沈下の防止はできないが、早期に沈下を収束させる事により、供用後の残留沈下の低減に効果があることを数値計算により示した。神田地区では実際に、無処理部に比べてSD打設部で顕著な残留沈下の低減効果が認められている。一方、緩速施工やサーチャージなどの時間効果のみでは、排水距離が長く構造が卓越した粘土層に対する、圧密促進や残留沈下の低減は期待できないことも示した。(2)長期広域地盤沈下の蓄積データ収集と数値計算によるメカニズムの解明旧日本道路公団による軟弱粘土地盤上への高速道路用盛土の施工実績をもとに、長期・大沈下を引き起こす粘土の室内試験結果に見られる共通点を整理し、この種の粘土の判定法を提案した。長期大沈下の原因となる粘土は圧縮指数比と鋭敏比が大きく、これはSYSカムクレイモデルに基づくと構造が高位で構造劣化が速い粘土として説明できる。また、不撹乱試料の標準圧密試験結果から原位置初期状態の推定を行い、長期・大沈下を数値計算で再現する際の初期地盤性状の確定法を提案した。1.現地採取土試料の力学特性の把握(室内実験と数値計算)と材料定数・地盤状態量の同定方法の検討長期継続沈下が起こっている常磐自動車道盛土地盤から採取した不撹乱試料(高位な構造の粘土),ならびにそれを十分に練り返した試料(低位な構造の粘土)を用いて,室内試験(三軸圧縮試験,一次元圧密試験)を実施し,材料定数と構造・過圧密の初期値を算定した.また常磐粘土と同様の地層構造および沈下挙動を示す地盤(伊勢粘土地盤)についても同様の検討を行った.2.側方変位制御(K_0条件下)・圧密試験による遅れ継続沈下挙動のメカニズムの解明三軸供試体の側方変位をゼロに保ったまま(K_0条件下)で,定率ひずみ圧密試験が可能な,試験機を作製し,いろいろなキャリブレーションを行った.本試験機を用いて,常磐粘土・伊勢粘土についてK_0定率ひずみ圧密試験を実施したが,今のところ顕著な,塑性圧縮を伴う軟化挙動は観察されていない.3.一次元/多次元の水土連成解析による遅れ継続沈下挙動のメカニズムの解明(数値計算)1.で得られた材料定数を用いて,構造・過圧密・異方性の初期状態,発展則を想定し,常磐自動車道の複雑な粘土層・砂層の層序を考慮しながら地盤をモデル化して水土連成計算を行い,地盤の長期沈下挙動のメカニズム,すなわち塑性圧縮を伴う軟化が時間とともに地盤域を伝播することを突き止めた.また,パイルド・ラフト基礎をはじめ沈下抑止工法をいくつか提案し,計算により改良効果を調べた.さらに,伊勢粘士においても同様の検討を行った.平成17年度の研究実績として、主に次の2点が明らかとなった。(1)道路用盛土載荷地盤の長期大沈下挙動に対する各種対策工の検討

長期大沈下挙動が起きている神田地区と伊勢地区を対象に、室内試験結果と各種現場データをもとにSYSカムクレイモデルに基づく水土連成有限変形計算により長期大沈下を再現し、種々の解析条件を想定する事で、長期大沈下挙動を引き起こすような地盤に対する沈下軽減の対策工を検討した。長期大沈下が起こるか否かには閾値となる荷重が存在し、軽量盛土材等による盛土荷重の軽減は長期大沈下の防止に有効であることを数値計算により明らかにした。これは上越地区等のEPS置換効果と整合する。また、SD(サンドドレーン)打設による粘土層の透水性の改善により、大沈下の防止はできないが、早期に沈下を収束させる事により、供用後の残留沈下の低減に効果があることを数値計算により示した。神田地区では実際に、無処理部に比べてSD打設部で顕著な残留沈下の低減効果が認められている。一方、緩速施工やサーチャージなどの時間効果のみでは、排水距離が長く構造が卓越した粘土層に対する、圧密促進や残留沈下の低減は期待できないことも示した。(2)長期広域地盤沈下の蓄積データ収集と数値計算によるメカニズムの解明旧日本道路公団による軟弱粘土地盤上への高速道路用盛土の施工実績をもとに、長期・大沈下を引き起こす粘土の室内試験結果に見られる共通点を整理し、この種の粘土の判定法を提案した。長期大沈下の原因となる粘土は圧縮指数比と鋭敏比が大きく、これはSYSカムクレイモデルに基づくと構造が高位で構造劣化が速い粘土として説明できる。また、不撹乱試料の標準圧密試験結果から原位置初期状態の推定を行い、長期・大沈下を数値計算で再現する際の初期地盤性状の確定法を提案した。
摩擦ゼロの炭素系超潤滑物質の解明

これまで知られていなかった超潤滑(超低摩擦)状態が、特徴的な条件・環境のもとで、観測されつつある。これらの摩擦、潤滑の素過程には、原子間結合の破断・生成が寄与するナノニュートンのオーダーから水素結合等が寄与するピコニュートンオーダーの力が関わっている。特に我々によって発見されたフラーレン分子をグラファイトに内包する炭素系超潤滑物質においては、従来の摩擦力測定装置の測定限界をこえるピコニュートンの力が働いている。まさに、これはブラウン運動の領域の熱揺らぎ力に匹敵する。したがって、超潤滑機構の詳細は、ピコニュートンの測定精度をもつ摩擦実験によって明らかになることが期待される。本研究では炭素系超潤滑物質の超潤滑機構を高精度の摩擦力測定により次に示す2点から系統的に調べた。(1)荷重に対する摩擦力の測定と解析。(2)速度に対する摩擦力の測定と解析。まず、荷重が100nN以下のとき、摩擦力は実験誤差内でほぼゼロを示す。荷重が100nNまで増加すると、摩擦力像に明確なC_<60>の稠密構造を反映した周期像が現れると同時に有限な摩擦力が出現する。この結果は、荷重の増加によって、グラファイト表面による圧縮で内在するC_<60>分子の動作が凍結されるかC_<60>分子とグラフェン間の化学結合の形成が起こることを示唆している。すなわち、このことは、C_<60>分子の回転や揺らぎの流動性が固体潤滑における超低摩擦発現に極めて重要であることを意味している。さらに、摩擦力が走査方向依存性を示さなかったことより、C_<60>単分子層の多層効果が現れている。走査速度が数10μm/secまでは、摩擦力においては変化がなかったため、この速度内では、超低摩擦が維持されていることを示唆している。18年度は、我々によって発見された炭素系超潤滑物質の構造の解明及びピコニュートンの測定精度をもっ摩擦力測定装置とそれを用いた摩擦力測定法の開発を行った。(1)炭素系超潤滑物質の微細構造の解明(1)高分解能ラマンスペクトロスコピーによると、グラファイト層間に入っているC60単層膜からのラマンスペクトルは、層間に入っていないC60分子からのスペクトルに比べ明らかに異なる位置にピークをもつ。このことによってグラファイト層間にC60単層膜が存在するときのラマンスペクトルスコピーによる同定法が確立された。しかしながら、X線回折法によると、本試料はグラファイト層間にC60単層膜が多数存在することを示す強いピークをもたない。このことは、現在の作成法では、グラファイト内にC60分子が容易に拡散できるグラファイト層間(1.3nm以上)の割合が少なくC60単層膜がグラファイト層間に効率よく封入されていないことを示す。このため、新規の方法でのグラファイトの膨張化が次年度の研究課題になっている。(2)ピコニュートンの測定精度をもつ摩擦力測定装置の開発

TR-modeとともに、新たにLateral Bending-Mode(LB-mode)が、ピコニュートンの測定精度をもつ摩擦力測定のために開発された。どちらも従来の測定法よりも検出感度が優れていることがわかった。特に、LB-modeは検出感度においても極端に優れた感度を示すことがわかった。さらにTR-mode、LB-modeで測定したデータからの摩擦力の導出法が検討された。これまで知られていなかった超潤滑(超低摩擦)状態が,特徴的な条件、環境のもとで,観測されつつある。これらの摩擦,潤滑の素過程には,原子間結合の破断、生成が寄与するナノニュートンのオーダーから水素結合等が寄与するピコニュートンオーダーの力が関わっている。特に我々によって発見されたフラーレン分子をグラファイトに内包する炭素系超潤滑物質においては,従来の摩擦力測定装置の測定限界をこえるピコニュートンのカが働いている。まさに,これはブラウン運動の領域の熱揺らぎ力に匹敵する。したがって,超潤滑機構の詳細は,ピコニュートンの測定精度をもつ摩擦実験によって明らかになることが期待される。19年度は,炭素系超潤滑物質の超潤滑機構を高精度の摩擦力測定により次に示す2点から系統的に調べた。(1)荷重に対する摩擦力の測定と解析。(2)速度に対する摩擦力の測定と解析。まず,荷重が100nN以下のとき,摩擦力は実験誤差内でほぼゼロを示す。荷重が100nNまで増加すると,摩擦力像に明確なC_<60>の稠密構造を反映した周期像が現れると同時に有限な摩擦力が出現する。この結果は,荷重の増加によって,グラファイト表面による圧縮で内在するC_<60>分子の動作が凍結されるかC_<60>分子とグラフェン間の化学結合の形成が起こることを示唆している。すなわち,このことは,C_<60>分子の回転や揺らぎの流動性が固体潤滑における超低摩擦発現に極めて重要であることを意味している。さらに,摩擦力が走査方向依存性を示さなかったことより,C_<60>単分子層の多層効果が現れている。走査速度が数10μm/secまでは,摩擦力においては変化がなかったため,この速度内では,超低摩擦が維持されていることを示唆している。
哺乳類フェロモンによる生理機能および行動の制御法開発

動物におけるフェロモンの作用は強力で、受け取った個体の脳機能に大きな影響を与え行動や生理状態を変える。しかし哺乳類のフェロモンについては未だに多くの謎が残されている。本研究では、ヤギの雄効果フェロモンの主要成分が4-ethyloctanalであること、ラットの警報フェロモンが4-methylpentanalとhexanalという2種の混合物であり、それぞれの成分が鋤鼻系と主嗅覚系を経由して受容されることを明らかにした。本年度は、雄効果フェロモンの受容機構および中枢作用機構に関して特筆すべき進展を見ることができた。まずフェロモンの作用点である視床下部GnRHパルスジェネレーターの主要な構成神経がキスペプチンニューロンであることが示されていたが、実際にキスペプチンニューロンのクラスターから多ニューロン発射活動(MUA)を連続記録することによってS/N比にすぐれた明瞭なパルス活動が記録されるようになり、フェロモン生物検定の精度が大きく向上した。MUA記録をしながらフェロモン(候補分子または活性画分)を嗅覚系に提示すると、わずか1秒という短時間提示であってもキスペプチンニューロンの神経活動は即時に上昇を示し、フェロモン刺激が一定の閾値をこえるとクラスターが一斉に神経興奮を起こしてキスペプチンニューロンのボレー(volley;一斉発火)が誘導され、最終的に正中隆起からのGnRHデカペプチドの神経内分泌すなわちGnRHパルスを引き起こす、という雄効果フェロモンの作用機序の重要な一端が明らかになった。フェロモンがパルスジェネレーターを活性化するメカニズムに関しては、キスペプチンニューロン細胞内に共存するダイノルフィンやニューロキニンBの役割が前年度までの研究で推測されていたが、本年度に組織学的手法を用いてその仮説を証明することができた(J.NeuroscienceやJ.Neuroendocrinologyに公表)。一方、情動系のフェロモンに関しては、齧歯類において警報フェロモンとは逆の効果を持つ安寧フェロモンの存在が示唆されているが、今回、安寧フェロモンが主嗅覚系で受容されたのち嗅覚前野を経由して扁桃体に伝達される神経回路と、効果発揮に必要なタイムウィンドウが明らかとなった。これらの発見によりフェロモンが情動中枢に作用して恐怖反応を制御するメカニズムを解明する上で重要な手がかりが得られた。雄効果フェロモンの産生母地である雄ヤギ頭部皮膚から放出される揮発性低分子化合物を、Tenaxカラム粉末を収納した特製のキャップを新規に作製することで効率よく回収できた。脱着した揮発成分をガスクロマトグラフィーを用いて分画し活性画分を絞り込んだ。この活性画分を構成する18成分を同定し、入手できないものはすべて合成した上で画分中の量や蒸気圧といった特性に準じて再構成し、合成フェロモンカクテルとして以後の実験に用いた。個々の成分について詳細に検討したところ、陽性反応率および所要時間のいずれの指標においても、4-ethyl****<註>のみが単独で、ポジティブコントロールである雄の被毛あるいは18成分カクテルとほぼ同等のフェロモン活性を示すことが明らかとなり、フェロモン候補の最有力物質として同定された。<註:物質名は未発表のため伏せる>情動系フェロモンに関しては、警報フェロモンが単独個体だけでなく個体間の相互作用に与える影響を調べるため、ラットの性行動に与える影響について検討を行った。警報フェロモンの提示により、雄ラットでは射精に必要なマウント数の増加など性行動の変化が認められた一方で、雌では影響が観察されず、警報フェロモンの性行動に対する影響は雄に特異的な抑制であることが示された。また警報フェロモンの中枢作用に関しては視床下部室傍核を中心とする脳内オピオイド系とCRH系が重要であることが明らかとなり、鋤鼻器と行動的・神経内分泌的反応を司る神経部位とをつなぐ神経回路としては分界条床核や脳幹の巨細胞性傍核などの中枢神経部位が深く関与していることが示された。さらにラット警報フェロモンは自己暴露によっても不安を亢進する効果がみられるなど、今後の研究展開にとって有用な情報が得られた。これらの発見は、情動系フェロモンの作用機序を解明する上で重要な手がかりとなることが期待される。本研究では、二種類のプライマーフェロモン分子(反芻家畜の雄効果フェロモンとげっ歯類の警報フェロモン)の単離精製・構造決定と合成を端緒として、フェロモンの産生・分泌機構、フェロモンの受容機構、フェロモンによる脳機能の修飾メカニズムについて解析を行い、哺乳類におけるフェロモンを介した化学的情報通信システムの全容解明と応用技術開発の基盤形成を目的に研究を行った。本研究期間では、いずれのフェロモンに関しても、その同定についてメジャージャーナルに投稿すべく、追加実験を行った。雄効果フェロモンに関しては、これまで脳内神経活動のみを指標として同定作業を行ってきたがフェロモン候補18成分が黄体形成ホルモンに与える影響について検討した。

その結果、黄体形成ホルモンが脳内神経活動に追随して分泌されていることが明らかとなり、全ての成果をまとめてCurr Biol (2014 Mar 17 ; 24(6) : 681-6. doi:10.1016/j.cub.2014.01.073)に公表した。警報フェロモンに関しては、受容機構を解析する目的で、4-メチルペンタナールとヘキサナールを同時もしくは個々に嗅がせることで鋤鼻神経細胞の活性化について検討した。その結果、4-メチルペンタナールが鋤鼻系のV1R受容体を介して、ヘキサナールが主嗅覚系を介して受容されるというように、2種類の物質がそれぞれの嗅覚系によって受容されることが明らかとなり、全ての成果をまとめてProc Natl Acad Sci USA (2014 Dec 30 ; 111(52) : 18751-6. doi:10.1073/pnas.1414710112)に公表した。反芻動物の雄効果フェロモンについては、これまでにフェロモンリガンド分子として最有力候補であることを見出した4-ethyl****(MW156)に加えて、4-ethyl****acidや6-ethyl****<註>にも弱い活性が保持されていることが分かった。これまでの成果を勘案すると、雄ヤギが特異的に産生するエチル基側鎖のある分子量150ー200程度のアルデヒド、アルコール、ケトン、カルボン酸といった物質群が、雄効果フェロモン成分として重要であることが明らかとなった。また作用点が視床下部弓状核に存在するキスペプチン・GnRHニューロンの構造ユニットであることを明らかにした。雄効果フェロモンの受容体については、c-FosとV1Rのdouble in situ hybridizationの系を確立した。神経活性の指標であるc-FosのシグナルとV1Rグループに属するフェロモン受容体遺伝子5種のプローブを混合したものに対するシグナルの両方が実際に重なって検出される細胞を嗅上皮の嗅覚細胞に見出すことができた。ラットの警報フェロモンについては、収集効率の高いフェロモン捕集装置を開発し、大量のフェロモン物質を分析した結果、hexa***(MW100)と4-methyl****(MW100)<註>からなるフェロモン候補物質の組み合わせにフェロモン活性の存在が推測された。これらの物質を化学合成し、生理学的濃度にまで希釈したその混合液について聴覚性驚愕反射を指標として生物検定を行った結果、活性が確認され、警報フェロモンの主要成分と同定された。さらに、この人工フェロモンは、嗅覚受容した個体の防御行動や危険評価行動といった不安関連行動を増加させ、また反応には鋤鼻器の存在が必要であることなど、天然フェロモンと極めて類似した性状を持つことが明らかになった。<註:物質名は未発表のため伏せる>農学本研究では、二種類のプライマーフェロモン分子(反芻動物の雄効果フェロモンとげっ歯類の情動系フェロモン)の単離精製・構造決定と合成を端緒として、フェロモンの産生・分泌機構、フェロモンの受容機構、フェロモンによる脳機能の修飾メカニズムについて解析を行い、哺乳類におけるフェロモンを介した化学的情報通信システムの全容解明と応用技術開発の基盤形成を目的に掲げた。雌の生殖内分泌系を強く刺激して雄効果をもたらす反芻動物の雄効果フェロモンについては、フェロモン効果をもたらす活性画分の絞り込みに成功した。
CD30-NF-kBシグナル伝達系によるHodgkinリンパ腫分子病態の解析

CD30はTNFレセプターファミリーに属する分子でHodgkin and Reed-Sternberg(H-RS)細胞表面に過剰発現しH-RS細胞のマーカーとして注目されてきた。ここ数年、分子レベルでのHodgkinリンパ腫に対する理解が進み、H-RS細胞が胚中心B細胞に由来する腫瘍成分であること、転写因子NF-kBやIL-13の恒常的誘導が共通の分子基盤であることが報告されている。本研究は14年度にCD30とNF-kBというH-RS細胞に特徴的分子がCD30過剰発現-NF-kBの恒常的活性化というループを介してHodgkinリンパ腫の病態に本質的に関わっている事を示すと同時にCD30自己活性化の下流でNF-kB恒常的活性化に関わるシグナル伝達分子群の分子機構をsignalosome形成という新しい概念により示した。15年度は、CD30過剰発現の分子機構を、CD30プロモーターの転写制御の観点から明らかにすることを目標とした。我々はCD30プロモーターを制御する分子としてJunBを同定した。すなわちJunBはH-RS細胞に恒常的に誘導されCD30過剰発現に関わる分子の一つであることが明かとなった。このことは、これまでほとんど解明されていないH-RS細胞でのCD30過剰発現に関わる分子を始めて具体的に同定すると同時に、JunBの発現機構の解明は胚中心B細胞がH-RS細胞にトランスフォームする際の分子機構の理解を確実に一歩進めるものと考えられる。Hodgkinリンパ腫(HL)は欧米ではごく一般的な悪性腫瘍であり、わが国でも頻度は少ないものの悪性リンパ腫の10-20%を占める。しかしHLは他の悪性腫瘍と比較すると非常に際立った特徴を有する。すなわち腫瘍細胞であるHodgkin、Reed-Sternberg(H-RS)細胞は実は全体の1-2%以下を占めるにず腫瘍のほとんどは炎症性性浸潤細胞からなる。CD30はTNFレセプターファミリーに属する分子でH-RS細胞表面に過剰発現しH-RS細胞のマーカーとして注目されてきた。数年分子レベルでのHLに対する理解が進み、H-RS細胞が胚中心B細胞に由来する腫瘍成分であること、転写因子NF-κBやIL-13の恒常的誘導が共通の分子基盤であることが示された。本研究はCD30とNF-κBというH-RS細胞に特徴的分子群がCD30過剰発現-NF-κBの恒常的活性化というオートクラインループを介してHLの病態に本質的に関わっている事を示すと同時にCD30自己活性化の下流でNF-κB恒常的活性化に関わるシグナル伝達分子群の分子機構をsignalosome形式という新しい概念により説明するものである。通常CD30シグナルはCD30リガンドがCD30と結合することにより伝達しNF-κBの活性化を誘導するが、本研究でCD30は過剰発現状態では自己凝集により自己活性化されNF-κBの活性化を誘導することが明らかとなった。さらにH-RS細胞におけるNF-κBの構成的な活性化がCD30の過剰発現状態-自己凝集によるオートクライン機構によることを示した。またこのCD30-NF-κBの構成的な活性化機構がH-RS細胞の増殖やHLに特徴的であるIL-13の産生に関わることが示された。H-RS細胞におけるCD30とNF-κBの間に位置するシグナル伝達分子群:TRAF, NIK, IKKの検討によりH-RS細胞ではCD30過剰発現による自己凝集によりCD30機能ドメインにTRAFを動員、活性化したTRAFは下流のシグナル伝達分子群とともに凝集体:signalosomeを形成、NF-κBの構成的活性を誘導していると考えられた。次年度はCD30過剰発現機構の解明を目指している。これらを通して通して胚中心B細胞がH-RS細胞にトランスフォームしHLを発症して特徴的病態を形成する過程における分子基盤への理解が深まると考えられる。胚中心

B細胞がH-RS細胞へトランスフォームする過程でCD30の過剰発現が誘導されるが、15年度は、その分子機構を、CD30染色体遺伝子プロモーターの転写制御の観点から明らかにすることを目標とした。これを通して、現在ほとんど解明が進んでいない胚中心B細胞がH-RS細胞にトランスフォームする際の分子機構、すなわちHodgkinリンパ腫発症機構を理解するための鍵が得られると考えられた。CD30プロモーターの転写活性はコアプロモーター内にあるSp1サイトが誘導的に、さらにマイクロサテライト領域がCCAT配列の長さに比例して抑制的に働くことが報告された。マイクロサテライト領域の長さは多様であり、その短縮による抑制解除がCD30過剰発現の原因である可能性が想定されていた。しかしながらCD30を過剰発現しているH-RS細胞株では、マイクロサテライト領域を調べてみるとその短縮は認められず、にもかかわらず抑制解除が認められた。このことは抑制解除がマイクロサテライトの短縮という構造変化によるのではなく、転写因子レベルで誘導されていることを示唆した。これに関与する転写因子の一つとして、我々はJunBを同定した。すなわちJunBはH-RS細胞に恒常的に誘導され、CD30過剰発現に関わる分子の一つであることが明かとなった。このことは、これまでほとんど解明されていないH-RS細胞でのCD30過剰発現に関わる分子を始めて具体的に同定すると同時に、JunBの発現機構の解明は胚中心B細胞がH-RS細胞にトランスフォームする際の分子機構の理解を確実に一歩進めるものと考えられる。
波浪中を航行する船の運動モデルに関する逐次データ同化

本研究では、波浪中の船体運動として、強非線形現象であるパラメトリック横揺れに着目した。パラメトリック横揺れ現象に関して、規則波中および不規則波中の問題を取り扱った。これまでは実験を行うことによって推定されていた運動方程式(モデル)中の係数が逐次データ同化で推定できることを確認した。これは、自由航走模型実験や実船が航走している際の動揺データをモデルに同化することによって、パラメトリック横揺れの発生の有無が判断できることを意味しており、船舶安全運航確保に多大な貢献ができる。規則波中におけるパラメトリック横揺れ予測モデルの計算コードを粒子フィルタによる逐次データ同化が行なえるように拡張した。さらに、パラメータ同定のための方法として、超多粒子を用いる方法および自己組織型モデルを用いる方法に関してパラメータ同定の精度および計算時間などの検討を行った。超多粒子を用いる方法では膨大な計算時間が係るものの概ね良い同定結果が得られることが確認できた。一方、自己組織型モデルを用いる方法では、パラメータの初期値分布の与え方に工夫が必要であることが確認できた。この問題を解決するための方法としては、Nelder-Mead法の利用が有効であることが確認できた。模型船実験による検証を行なうために、水槽内における位置および船速が計測できる自走可能なコンテナ船の模型船を製作した。この模型船を使用した自由航走実験を行なうことにより、船の運動データが計測でき、逐次データ同化で使用する観測データが取得できる。また、製作した模型船は船体に作用する流体力ベースでの比較を行なうための実験も実施できるようになっており、流体力の推定に関してもデータ同化の実施が可能である。なお、制作した模型船は実船が就航しており、実船データを用いた検証が行なえる。パラメトリック横揺れ予測モデルと時系列モデルの関係を導出し、時系列解析に基づく大振幅横揺れの発生可能性の有無の判定法について示した。この方法は漁船などの横揺れデータを用いて検証した。その結果、この方法を実船の横揺れデータ解析法として用いることにより、船の安全運航支援の一助とできることが確認できた。本研究の目的は、まず逐次データ同化の方法を用いて波浪中を航行する船の運動モデルに関するヴァリデーションならびにパラメータ推定を行い、現在使用している波浪中における船体運動の予測モデルの改良を行うことである。具体的な方法および着目する項目は次の通りである。1)逐次データ同化の方法:粒子フィルタ(北川のモンテカルロ・フィルタ)2)波浪中における船の運動モデル:向い波中におけるパラメトリック横揺れ予測モデル3)パラメータ推定:モデルで経験的に与えている項(特に減衰力係数)および不規則な波強制力項。次に実船動揺データのみを用いた実海域でのパラメトリック横揺れ予測システムの開発を試みる。このような目的のもと、平成26年度は先ず一自由度パラメトリック横揺れ予測数学モデルのヴァリデーション方法について検討した。逐次データ同化で使用する北川のモンテカルロフィルタはモデルのデータへの当てはまりの良さを表す尤度が自動的に考慮でき、したがってモデルの良さを尤度を用いて客観的に評価する赤池情報量規準(AIC)に基づき、現象をより良く説明できるモデルを選択することが可能になる。これに関して、数値実験に基づく検討を行った。その結果、提案する方法は数値データを生成したモデルを正しく選択することができ、さらにパラメータ水しての精度も格段に良いことが確認できた。また、三自由度パラメトリック横揺れ予測数学モデルに関して、最もリーズナブルなモデルの構築を行なった。平成27年度は、このモデルを逐次データ同化用の計算コードに拡張し、種々の検討を行なう予定である。次に、模型実験を実施し、パラメトリック予測数学モデルの検証で必要となるデータの取得を行なった。また、横揺れパラメータの一種である減衰力係数を推定するための新しい方法およびパラメトリック横揺れ発生予測のための新しい時系列解析法を確立できた。本研究の目的は、まず逐次データ同化の方法を用いて波浪中を航行する船の運動モデルに関するヴァリデ-ションならびにパラメータ推定を行い、現在使用している波浪中における船体運動の予測モデルの改良を行うことである。1)逐次データ同化の方法:粒子フィルタ(北川のモンテカルロ・フィルタ)2)波浪中における船の運動モデル:向い波中におけるパラメトリック横揺れ予測モデル3)パラメータ推定:モデルで経験的に与えている項(特に、減衰力係数)および不規則な波強制力。次に、実船動揺(横揺れ)データのみを用いた実海域でのパラメトリック予測システムの開発を試みることである。このような目的のもと、平成27年度は、平成26年度に開発した規則波中における一自由度モデルに関する逐次データ同化の計算コードを、規則波中における三自由度モデルに拡張した上で平成26年度と同様な検討を行った。数値実験および模型実験に基づく検証の結果、モデル・ヴァリデーションおよびパラメータ推定ともに上手く実現できことが明らかにできた。また、不規則波中における一自由度モデルに関する逐次データ同化の計算コードを開発した。さらに、実船横揺れデータのみを用いた実海域でのパラメトリック予測に関しては、これまでの方法とは異なり、確率分布の時間発展を予測する方法を新たに提案した。模型実験のデータに基づいてその有効性を検証した結果、提案した方法がパラメトリック横揺れの予測に関して有効であることが確認できた。規則波中におけるパラメトリック横揺れ数学モデルのモデル・ヴァリデーションおよびパラメータ推定に関する方法論を確立することができた。

また、不規則中におけるパラメトリック横揺れ数学モデルに関する逐次データ同化のための計算コードの開発が実現できた。さらに、実船横揺れデータのみを用いた実海域でのパラメトリック予測に関しては、これまでの方法とは異なり、確率分布の時間発展を予測する方法を新たに提案できた。本研究の目的は、まず逐次データ同化の方法を用いて波浪中を航行する船の運動モデルに関するヴァリデーションならびにパラメータ推定を行い、現在使用している波浪中における船体運動の予測モデルの改良を行うこと、さらにその応用として実海域における実船横揺れデータのみを用いた安全運航支援のためのパラメトリック横揺れ予測システムの開発を行うことである。具体的な方法および着目する項目は次の通りである。1)逐次データ同化の方法:粒子フィルタ(北川のモンテカルロ・フィルタ)2)波浪中における船の運動モデル:向い波中におけるパラメトリック横揺れ予測モデル3)パラメータ推定:モデルで経験的に与えている項(特に、減衰力係数)および不規則な波強制力このような目的のもと、平成28年度は、不規則波中における一自由度モデルを用いて逐次データ同化を行った。当初の予定では三自由度モデルで検証する予定であったが、パラメトリック横揺れにおける連成項からの寄与は不規則な波強制力に吸収されることが明らかとなったため、一自由度モデルを用いた。数値実験および模型実験に基づく検証の結果、不規則波中においても、定係数パラメータならびに不規則に変動するパラメータの推定が上手く実現できることが明らかにできた。さらに、実船横揺れデータのみを用いたパラメトリック横揺れ予測に関しては、昨年度に開発した確率分布の時間発展を予測する方法に加えて、時系列そのものを予測する方法を新たに開発した。模型実験のデータに基づく検証の結果、提案するパラメトリック横揺れ予測の方法は有効であることが確認できた。本研究では、波浪中の船体運動として、強非線形現象であるパラメトリック横揺れに着目した。パラメトリック横揺れ現象に関して、規則波中および不規則波中の問題を取り扱った。これまでは実験を行うことによって推定されていた運動方程式(モデル)中の係数が逐次データ同化で推定できることを確認した。これは、自由航走模型実験や実船が航走している際の動揺データをモデルに同化することによって、パラメトリック横揺れの発生の有無が判断できることを意味しており、船舶安全運航確保に多大な貢献ができる。これまでの研究で、逐次データ同化における種々の知見を得ることが出来ている。特に、パラメータ推定の部分に関しては、最適化(マルコフ連鎖モンテカルロ法、粒子群最適化)のルーチンを一部組み込む方法あるいは分布の収束を加速させるための方法(パーティクルラーニング)などを上手く活用することにより、パラメータ推定の精度が向上することを確認した。また、計算コードの高速化に係るOpenMPやMPIによる計算コードの並列化技法の習得が出来た。
外洋域における粒子フラツクス-気候及び生物生産性変遷の動向

当研究室では、生物生産性の高いことが知られている北太平洋亜寒帯海域でのオパール粒子フラックスについて研究を行った。特に、季節環境指標、湧昇流指標、及び生産性指標のトレーサー種について、またメソスケールでのフラックスの類似性について次ページの出版物中で著述したような知見が得られた。北太平洋東部亜寒帯でのフラックスとあわせて、中部亜寒帯でのフラックス計測も行なってきた。すなわち、アリュウシャン列島南部の海域におけるセディメント.トラップ設置点SA(Subarctic Pacific)及び、ベーリング海での設置点AB(Aleutian Basin)での継続計測である。これは、当研究室のティームと北海道大学水産学部.米田義昭教授の率いるティームを中心とした国際共同研究である。全粒子フラックスにあわせて、生物起源の粒子フラックスの研究が現在進んでいる。また、熱帯モンスーン気候にともなうアラビア海の粒子フラックスに関しても研究を開始したところである。この海域では、レディオラリアをはじめ)、その他の生物起源の粒子に関しても解析が現在進行中である。モンスーン湧昇流と全粒子フラックスそしてレディオラリアのフラックスが密接な関係にあることが分かった。このアラビア海でのフラックスの研究は、ドイツのハンブルグ大学のVenu Ittekkot教授を中心とする国際共同研究の一貫であり、当研究室では生物起源の粒子について担当している。GOFSU.S.A.の大規模なティームもアラビア海に遠征が決まった現在、我が研究室でも今後おおいなる貢献をしたいと考えている。以上、生物源粒子フラックスの海洋環境トレーサーとしての概念を、北太平洋亜寒帯およびアラビア海からの例をいくつか用いて簡単に述べた。今後も我々のティームの総力をあげて粒子フラックスの研究に努力したい。
球体マルチロータヘリコプタのバイラテラル遠隔操作

プロペラ推進システムのバイラテラル制御に関して以下の知見が得られた:1)プロペラ推進システムの動力学は、地面からの距離に大きく依存するため、地面効果のモデルを用いたゲインスケジューリング制御器が有効である。2)プロペラ推進力の大きさの制御にはプロペラ角速度のフィードバック制御が有効である。3)プロペラ推進力の方向の制御には、プロペラ回転軸のティルト角のフィードバック制御が有効である。球体のプロテクトフレームで覆ったマルチロータヘリコプタをバイラテラル制御(人が操作するマニピュレータの変位に比例した速度でヘリコプタが飛び、ヘリコプタが物と接触すると、その接触力を手元で知覚できる遠隔操作)するために、課題ACに取り組んでいる。本年度は課題Aに取り組んだ。【課題A:2次元空間上で任意の推力を発揮できる2自由度マルチロータヘリコプタの開発】1つ目に、2次元空間においてXZ軸方向に任意の推力を発揮できるマルチロータヘリコプタを開発した。機体にはZ軸方向を向いた2枚のロータを搭載した。推力の大きさは、それぞれのロータの回転速度の2乗の和に比例する。一方で、機体の重心周りの回転モーメントはそれぞれのロータの回転速度の2乗の差に比例する。回転モーメントによって機体の姿勢を制御することで、XZ平面上の任意の方向に推力を出すことができる。ロータが発生する推力は回転速度の2乗に比例する。そのため、右側のロータの回転速度が、左側のロータの回転速度より大きいと、ヘリコプタの重心周りに反時計回りの回転モーメントが発生し、姿勢が変化する。ヘリコプタの発生する推力(プロテクトフレームが発生する推力)は、2つのロータが発生する推力と重力の合成になるため、姿勢が左に傾いている時には、左方向に推力が発生する。2つ目に、開発時に機体が不安定化し暴走する危険を回避しつつ、機体の速度・姿勢・推力を正確に評価するために、機体の運動を2次元空間上に拘束しつつ、その位置・姿勢を計測する3自由度アームを製作した。3自由度アームの先端に機体を取り付けた状態で性能を評価した。研究成果を、国際会議2件(内、招待講演1件)で発信するなど、計画は予定通り進んでいる。本年度は課題Bと課題Cに取り組んだ。【課題B:3次元空間上で任意の推力を発揮できる4自由度球体マルチロータヘリコプタの開発】3次元空間においてXYZ軸方向に任意の推力を発揮できるマルチロータヘリコプタを開発中である。機体にはZ軸方向を向いた4枚のロータを搭載する。機体の速度・姿勢・接触力は、加速度センサ、変位センサ、力センサなどで計測する。【課題C:多自由度マニピュレータによる球体マルチロータヘリコプタのバイラテラル制御】研究代表者が現有するマニピュレータをマスタロボット、課題Aで開発したヘリコプタをスレーブロボットに用いたバイラテラル制御系を構築した。動作としては、マスタロボットを人が操作すると、スレーブロボットがマスタロボットに位置追従する。また、スレーブロボットが未知物体と接触すると、その時の接触力と同じ力をマスタロボットが発生し、操作者が接触物体の硬さを知覚できる。一般的に、ヘリコプタのロータが発生する揚力はロータ角速度の2乗に比例するとされている。研究者代表者らは実験の過程で、ロータ揚力とロータ角速度を結びつける比例定数がロータと接触物体の距離の関数になっていることに気がついた。そこで、対物距離を引数としたゲインスケジューリング制御器を設計したところ、制御性能に明確な改善が見られた。研究成果を、国際会議2件、国内会議2件で発信するなど、計画はほぼ予定通り進んでいる。球体のプロテクトフレームで覆ったマルチロータヘリコプタをバイラテラル制御(人が操作するマニピュレータの変位に比例した速度でヘリコプタが飛び、ヘリコプタが物と接触すると、その接触力を手元で知覚できる遠隔操作)の研究について以下の進捗があった。1) 3次元空間においてXYZ軸方向に任意の推力を発揮できるマルチロータヘリコプタを開発し、力制御の実験を行った。機体にはZ軸方向を向いた4枚のロータ、力センサが取り付けてある。推進力の大きさの制御に、プロペラ角速度のフィードバック制御が有効であることが分かった。プロペラ角速度を計測しない従来のフィードフォワード制御に比べ、プロペラ回転軸周りの負荷トルクに対する外乱抑圧特性が高いためと考えられる。2) 2次元空間においてXZ軸方向に任意の推力を発揮できるティルトロータヘリコプタを開発し、接触力制御の実験を行った。機体にはZ軸方向を向いた2枚のロータ、片方のロータのティルト角を制御するサーボモータ、力センサが取り付けてある。推進力方向の制御に、プロペラ回転軸のティルト角の制御が有効であることが分かった。ヘリコプタ全体の姿勢を変化させることで推進力方向を制御する従来手法に比べ、推進力方向の制御に必要なモーメントが少ないためと考えられる。

2)プロペラ推進力の大きさの制御にはプロペラ角速度のフィードバック制御が有効である。3)プロペラ推進力の方向の制御には、プロペラ回転軸のティルト角のフィードバック制御が有効である。昨年度の課題Aの成果を踏まえ、今年度は下記の課題Bに取り組む。【課題B:3次元空間上で任意の推力を発揮できる4自由度球体マルチロータヘリコプタの開発】1つ目に、3次元空間においてXYZ軸方向に任意の推力を発揮できるマルチロータヘリコプタを開発する。機体にはZ軸方向を向いた4枚のロータを搭載する。推力の大きさは、4枚のロータの回転速度の2乗の和により制御する。一方で推力の向きは機体の姿勢によって決まる。また、機体のピッチ角とヨー角は4枚のロータの回転速度の2乗の差によって制御する。機体の速度・姿勢・推力は、課題Aと同様に加速度センサ、ジャイロセンサ、力センサなどで計測する。2つ目に、機体の不安定化による暴走の危険を回避しつつ、機体の速度・姿勢・推力を正確に計測するために、機体の可動域を3次元空間上に拘束しつつ、その位置・姿勢を計測できる6自由度アームを製作する。6自由度アームの先端に機体を取り付けた状態で性能を評価する。27年度と28年度の成果を踏まえつつ、引き続き課題Bと課題Cに取り組む。【課題B:3次元空間上で任意の推力を発揮できる4自由度球体マルチロータヘリコプタの開発】昨年度に引き続き、3次元空間においてXYZ軸方向に任意の推力を発揮できるマルチロータヘリコプタを開発する。【課題C:多自由度マニピュレータによる球体マルチロータヘリコプタのバイラテラル制御】研究代表者が現有する多自由度マニピュレータをマスタロボット、課題Bで開発したマルチロータヘリコプタをスレーブロボットに用いたバイラテラル制御系を構築する。モーションコントロール
皮下注射に代わるインスリンの眼粘膜投与法の確立を目的とした基礎的研究

眼粘膜に投与された薬物は、角膜、結膜などの眼周辺組織に吸収されて、局所や全身に移行し薬理作用を発揮する。したがって、眼粘膜に投与されたインスリン等のペプチド医薬品の眼粘膜透過性は、吸収速度や吸収量を抑制するための極めて重要な要因となる。一般に、水溶性で分子量の大きいペプチド医薬品の眼粘膜透過性は、低いことが知られている。本研究では、ペプチド医薬品のモデルとして、分子量が3509400の6種の水溶性薬物を用い、in vitroで眼粘膜透過性の検討を行い、以下の知見を得た。1水溶性薬物は、角膜透過性が極めて低く、眼内への移行は少いことが示された。角膜の上皮細胞層を取り除くことにより、水溶性薬物の角膜透過性が顕著に増大したことから、上皮細胞層が、主な透過障壁であることが示された。また、角膜に比べて結膜は、水溶性薬物に対して高い膜透過性を示した。2拡散モデルに基づいた解析を行った結果、薬物透過定数の分子量依存性は、結膜では拡散パラメータに起因し、角膜では、拡散パラメータと分配パラメータの両方に起因することが明らかとなった。3吸収促進剤を併用することにより、水溶性薬物の眼粘膜透過性を顕著に改善できることが認められた。これらの結果から、インスリンの眼粘膜投与により、血糖低下作用を発現できる可能性が示唆された。皮下注射に代わるインスリンの新しい投与方法が確立されれば、糖尿病患者の生涯にわたる注射に伴う身体的、精神的苦痛がなくなり、Quality of Lifeの向上に貢献できるものと信じている。
新しい胎児性血管内皮細胞由来の細胞外基質蛋白Dellの血管新生に及ぼす作用の検討

新しい胎児性細胞外基質蛋白であるDel1のトランスジェニックマウス作製は、当初予定していたβアクチンプロモーター(全身性に発現)ではその発現が弱いことが判明し、方針を変更。全身への発現から血管内皮特異的な発現(特に胎生期)にすることにし、プロモーターをTie-2の第一イントロンを含んだものに変更した。またDel1の発現部位を正確に同定するために、β-galactosidase遺伝子を挿入したコンストラクトを再度作製。受精卵への打ち込みを行い、ファウンダーを得た。現在1ラインが確立し、ほか数ラインを確立中であるが、確立された1ラインでは、そのホモ接合体もlethalではなかった。現在フェノタイプについて検索中である。Del1ノックアウトマウスに関しては、米国スタンフォード大学循環器内科T.Quertermousラボとの共同研究により、ようやくキメラが生まれた。その後、ホモ接合体を得るためにキメラ同士を掛け合わせ、生まれてきたマウスをテイルブロットでホモとへテロの割合を調べてみると、ホモの割合がその予想される値より極端に少ない。よって、ホモはどうやら基本的にはembryonic lethalと思われるが、中には正常に近く生まれてくるものもあり、その結果はまだ混沌としている。そこで、胎生期の血管新生に異常が認められないかどうかを、ヘテロ同士を掛け合わせ、胎生約9.5日前後でsacrificeして胎児を取り出し、その胎児を詳細に検討するという手法で、現在調査中である。Dell(Developmental endothelial locus 1)ノックアウトマウスの作成については、転写開始部位のATGを含みシグナルペプチドの全長をコードしているエクソンをターゲットにして、ノックアウトコンストラクトを作成、ES細胞へ導入し、相同変異体の選択、同定を行なった。1000個を超えるESコロニーの検索を行なったがなかなか相同変異体が見つからずに、結局コンストラクトの3末端を少し長くして再度ES細胞へ導入し、ようやく相同変異体のコロニーを複数個見出した。これらを偽妊娠マウスから採取した初期胚に注入、仮親の子宮に戻してキメラを作成している。Del1過剰発現トランスジェニックマウスに関しては、血管内皮細胞特異的に強力に発現させる手段として、エンドセリン-1のプロモーターよりもむしろTie-2のプロモーターの方が発現が強いことが判明し、Tie-2のプロモーターとDel1遺伝子をつないだコンストラクトを作成し、そちらを使って現在マウスの作成中である。また、胎児以外の組織でのDel1蛋白の発現を調べるため、腫瘍組織の免疫組織染色を行なった。その結果、皮膚癌の一種である基底膜腫において、大量にDel1が腫瘍細胞から発現されていることが判明した。また、その他の癌においても腫瘍間質の微小血管に添ってDel1の発現が認められた。腫瘍組織における血管新生において、Del1が何らかの作用を及ぼしていることが考えられる。また、つい最近我々の共同研究ラボであるStanford大学のQuertermousラボにてDel1がウサギの下肢虚血モデルにおいてその発現が亢進していること、Del1蛋白の投与にて新生血管が増えることが報告された。