hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
反応中間体を動的に制御する触媒的分子間連続反応の開発と生理活性物質合成への展開

不飽和カルボニル化合物への共役付加反応を基盤に新たなタイプの連続反応の開発研究を行った。即ち、ごく単純なアクリル酸エステルやアミドから分子間連続反応を利用して簡便に生理活性物質の核となる多置換縮合環の製造法を検討した。反応中間体の寿命およびコンフォメーションを考慮することで、立体選択的な環構築反応をいくつか開発した。さらに、今年度は生理活性物質の全合成研究を中心に以下の検討を行った。(1)ルイス酸を触媒に多様なシクロブタン化合物を極めて簡便に製造する技術を確立した。また、不斉補助基を効果的に活用することで光学活性シクロブタン化合物を効率的に合成することに成功した。また、さらに付加価値の高い連続反応として3段階以上の反応が進行する多連続反応を検討した。その結果、ジエンと2分子の不飽和エステルが一挙に縮環する多成分反応を開発した。本法を用い、抗癌剤として期待できるセスキテルペンの超短行程合成を達成した。(2)シリル系ルイス酸-アミン混合反応剤を用いて、置換ピペリドンを迅速に合成する技術を開発した。本法を用い生理活性アルカロイド、タカモニンの形式的全合成法を達成した。また、臨床で使用される抗うつ剤の短段階合成法を確立した。本研究の過程で、従来まで困難とされていたハイドロアミデーション反応の触媒反応化にも成果を挙げた。(3)ラジカル転位反応を含む新たな連続反応を開発し、効率的かつ立体選択的なアザスピロ環物質の合成法をあみだした。この反応を環境低負荷型間接電解に応用した。本法を用いて、脳梗塞治療薬に期待されるハリクロリン類の重要中間体の合成に成功した。当初の目的に従い、共役付加反応を基盤に新たなタイプの分子間連続反応の開発研究を行った。第一に分子間マイケル・アルドール(2+2)連続反応による多環性シクロブタン化合物の立体選択合成、第二に分子間アザ・ダブル・マイケル反応による多置換ピペリドン化合物の合成法を確立した。(1)アルミニウム系ルイス酸を触媒に多様なシクロブタン化合物を極めて簡便に製造する技術を検討した。本法では、従来まで短行程合成が困難であった化合物も単行程で作りうることを実証した。次に、不斉合成を目指して、不斉補助基を用いる間接不斉合成ならびに不斉触媒による直接不斉合成を検討した。前者では完全な立体制御下で光学活性シクロブタンの合成に成功した。後者は検討中である。また、β-ラクタム類を作るべく検討を行ったが、目的の反応は進行しないことが明らかとなった。本法で製造できる化合物群は中枢作用を示す薬剤の基本原料となりうることから、今後の展開が期待できる。実際に、インドールアルカロイドであるデプランシェインの合成法が確立できた。また、現在臨床に用いられる抗うつ剤の短段階合成法も開発した。現在は実用的な大量合成法の実現を目指している。また、さらに付加価値の高い連続反応として3段階以上の反応が進行する多連続反応の検討が進みつつある。医薬化学的に興味のもたれるセスキテルペノイドの超短行程合成を検討中である。
転写因子NF-κB制御による関節リウマチ滑膜炎の新規治療法確立に関する研究

本研究は原因不明の慢性炎症性疾患である関節リウマチの滑膜炎の新規治療法として転写因子NF-κBの抑制分子であるIκBβ2を内因性に制御することにより確立しようとするものであり、平成17年度から平成18年度の2年間で計画され、1)NF-κBとIκBファミリーの活性化と発現の検討。2)NF-κB活性化におけるIκBβ2の役割の検討。3)各疾患におけるIκBファミリーの細胞内安定性の検討。4)Iκβ2 mRNAにおけるRNA結合蛋白の同定と機能解析、について検討した。その結果、正常および変形性関節症滑膜細胞に比して関節リウマチ滑膜細胞で非刺激下においてNF-κBが活性化されていた。IκBα/IκBβ1/IκBβ2の発現は、IκBαおよびIκBβ1は発現に差を認めなかったが、IκBβ2は有意に低下していた。また、IκBβ2発現プラスミドを使用した強制発現実験では、ゲルシフト法による蛋白・DNA結合活性において非刺激下およびTNF-α存在下で活性型NF-κBは有意に低下していた。また正常、変形性関節症、関節リウマチから採取した滑膜細胞へキメラプラスミドを導入し、半減期を測定したところ、正常や変形性関節症滑膜細胞に比較して、関節リウマチ滑膜細胞で有意に短縮していた。従って、関節リウマチ滑膜細胞におけるIκBβ2蛋白の低下は、関節リウマチ滑膜細胞におけるIκBβ2 mRNAの半減期の低下によることが明らかになった。一方、IκBβ2 mRNA発現量を規定していると考えられる3'非翻訳領域を用いたRNA結合蛋白同定と機能解析について現在検討中であるが、正常あるいは変形性関節症滑膜細胞に比較して、関節リウマチ滑膜細胞では幾つかのRNA結合蛋白が減少あるいは欠損している可能性を示すデータが得られている。これらRNA結合蛋白の機能障害が容易にNF-κBを活性化させ滑膜炎を増幅させていることが示唆された。本研究は原因不明の慢性炎症性疾患である関節リウマチの滑膜炎の新規治療法として転写因子NF-κBの抑制分子であるIκBβ2を内因性に制御することにより確立しようとするものであり、平成17年度から平成18年度の2年間で計画されている。本年度は、初年度にあたり、1)NF-κBとIκBファミリーの活性化と発現の検討。4)IκBβ2 mRNAにおけるRNA結合蛋白の同定。についての4項目について検討した。その結果、滑膜炎の増悪や滑膜細胞増殖に強く関与していることが知られているNF-κBは、健常者および変形性関節症滑膜細胞に比して関節リウマチ滑膜細胞で非刺激下においても活性化されていた。IκBα/IκBβ1/IκBβ2の発現については、ノーザンブロット法とウエスタンブロット法を用いたmRNAおよび蛋白レベルでの検討から、IκBαおよびIκBβ1は発現に差を認めなかったが、IκBβ2は有意に低下していた。従って、滑膜炎の増悪には、IκBβ2発現コントロール下での活性型NF-κBの存在が重要である可能性が明らかになった。

さらに、並行して、IκBβ2の細胞内安定性を検討したところ、関節リウマチ滑膜細胞で有意に低下し、その作用はIκBβ2 mRNA発現量と比例していた。従って、IκBβ2発現低下作用はmRNAレベルで作用していることが明らかになった。現在、IκBβ2 mRNA安定性に関与している因子について検討中であり、同時にIκBβ2 mRNAの3'非翻訳領域の解析を進めている。本研究は原因不明の慢性炎症性疾患である関節リウマチの滑膜炎の新規治療法として転写因子NF-κBの抑制分子であるIκBβ2を内因性に制御することにより確立しようとするものであり、平成17年度から平成18年度の2年間で計画されている。本年度は、2年目にあたり、初年度で検討した1)NF-κBとIκBファミリーの活性化と発現の検討。2)NF-κB活性化におけるIκBβ2の役割の検討。3)各疾患におけるIκBファミリーの細胞内安定性の検討。4)IκBβ2mRNAにおけるRNA結合蛋白の同定と機能解析、について、さらに詳細に解析した。その結果、関節リウマチ患者滑膜細胞で低下していたIκBβ2の発現低下はmRNAレベルで調節されており、その作用は転写後のmRNAの安定性に依存していることが明らかになった。すなわち、IκBβ1とIκBβ2の3'非翻訳領域とルシフェラーゼ遺伝子を融合させたキメラプラスミドを作成し滑膜細胞に導入し、それぞれのmRNAの半減期を測定したところ、IκBβ2の3'非翻訳領域を用いたルシフェラーゼmRNAが有意に延長していた。そこで、次に、正常、変形性関節症、関節リウマチから採取した滑膜細胞ヘキメラプラスミドを導入し、半減期を測定したところ、正常や変形性関節症滑膜細胞に比較して、関節リウマチ滑膜細胞で有意に短縮していた。従って、関節リウマチ滑膜細胞におけるIκBβ2蛋白の低下は、関節リウマチ滑膜細胞におけるIκBβ2mRNAの半減期の低下によることが明らかになった。一方、IκBβ2mRNA発現量を規定していると考えられる3'非翻訳領域を用いたRNA結合蛋白同定と機能解析について現在検討中であるが、正常あるいは変形性関節症滑膜細胞に比較して、関節リウマチ滑膜細胞では幾つかのRNA結合蛋白が減少あるいは欠損している可能性を示すデータが得られている。これらRNA結合蛋白の機能障害が容易にNF-κBを活性化させ滑膜炎を増幅させていることが示唆された。
摂食調節に機能する新規ペプチドの探索と機能解析

ペプチドーム・ペプチドミクスを活用したペプチドの網羅的解析を行えば、前駆体蛋白由来のペプチドフラグメントが多数同定でき、その前駆体蛋白の遺伝情報や新たに同定したペプチドフラグメントのアミノ酸配列から生理活性を有するペプチドが推定可能であると考えられた。実際にこの方法を培養細胞株に適用した結果、約200個のペプチドフラグメントが同定された。その中から摂食・エネルギー代謝に重要と推定されるペプチドを合成し、ラット脳室内に投与してその生物活性を評価した。ラット脳室内投与後の摂餌量を測定し、用量依存的に摂食を増やす新規生理活性ペプチドを同定した。同定したペプチドのアミノ酸配列に基づき、ラット組織よりペプチドをコードするcDNA配列を決定し、ペプチド前駆体構造を明らかにした。その結果、新規ペプチドフラグメントの前駆蛋白のノックアウトマウスにて著しいやせ、自発運動増加を示し、肥満モデルマウスとの交配で肥満を改善させ、インスリン感受性を増す既知遺伝子のペプチド断片であることを見いだした。脳内神経核のmRNA発現量について定量PCRを行った結果、摂食・エネルギー代謝調節に重要な視床下部・延髄の神経核に発現し、絶食でその遺伝子発現量が変動することを認めた。家兎に免疫して新規ペプチドの特異的抗体を作製し、高感度RIA系を開発した。この定量系を用いて新規生理活性ペプチドの脳内免疫活性を検討した結果、視床下部弓状核など摂食調節に重要な神経核に免疫活性を認めた。特に視床下部弓状核において、強力な摂食亢進ペプチドであるニューロペプチドYと共存することを見いだした。網羅的ペプチド解析の結果、新規摂食調節ペプチドの同定に成功した。グレリンは、成長ホルモン分泌促進、摂食亢進や体重増加、消化管調節やエネルギー代謝調節に機能する。グレリンは、摂食抑制に機能する脂肪細胞から産生されるレプチンと機能的に拮抗し、迷走神経求心路を介して末梢の空腹情報や成長ホルモン分泌に関する情報を視床下部に伝達する。一方、腸管で産生される消化管ペプチドコレシストキニン(CCK)は、グレリン同様、迷走神経求心路を介して満腹情報を伝達する。これら迷走神経を介したエネルギー調節は、迷走神経の神経節で合成される受容体の輸送や生合成の変化によって複雑に調節されている。今回私たちは、消化管ペプチドペプチドYY(PYY)の摂食抑制作用が迷走神経の神経節で合成されたY2受容体を介して、迷走神経求心路により満腹情報を伝達していることを明らかにした。迷走神経は末梢のエネルギー情報を中枢に伝える重要な経路であり、加齢にともなう自律神経系のトーヌスの変化が、満腹情報や空腹情報の伝達に障害し、中年期以降に生じる肥満やソマトポーズの要因になっていることが示唆された。また新たに、オーファン受容体であったGPR7とGPR8のリガンドとして、ニューロペプチドW(NPW)を視床下部から単離した。NPWは、ラットの暗期摂食と絶食後の再摂食を抑制し、体温の上昇、エネルギー代謝の亢進を引き起こす。加えて透過性ポンプによるNPWの慢性投与を受けたラットはやせを呈する。NPWの作用を中和する、抗NPW抗体の投与によって摂食が亢進する。さらにNPWはラット胃にも産生細胞を有し、その多くはガストリン細胞と共存していた。これらのことからNPWは中枢においてカタボリックに機能するとともに、末梢においても胃酸分泌調節に関与している可能性がある。本研究は、消化管ペプチドによる摂食調節機序の障害が、肥満の原因の一つであり、生活習慣病の発症に深く関与している可能性を示唆した。
エイズウイルスによる細胞傷害性に関与する細胞因子の同定

1、Fas依存性アポトーシスに関与する細胞因子の同定:Fas依存性アポトーシスがエイズウイルスによる細胞傷害性に関与するすることが示唆されている。そこで、さまざまなT細胞株について、このアポトーシスに対する感受性を検討した。HTLV-I(human T-cell leukemia virus type I)に感染した細胞株が特異的に抵抗性を示した。アポトーシス抵抗性は2つのメカニズムによることが示唆された。1つはウイルス蛋白のTax,もう1つは細胞因子FAP-1(Fas-associated phosphatase)の発現であった。Fas依存性アポトーシスに感受性を示すT細胞株にTaxを発現させることによって、抵抗性が誘導され、Taxによるアポトーシス抑制作用が証明された。Taxは転写活性化因子であり、転写活性化能を失った変異体では抵抗性誘導活性が失われることから、Tax依存性に発現される細胞因子の関与が推定された。一方、FAP-1はFasに直接結合することさらにFas依存性のアポトーシスを抑制することがすでに知られている。FAP-1とTaxの発現(RNA)には相関が見られず、これらは独立して機能していた。2、エイズウイルスによる、Fasリガンド発現誘導機構の解析:Fasリガンドのプロモーター領域を含むゲノムDNAを遺伝子クローニングし、その配列を決定した。Fasリガンドのプロモーター活性を測定するために、プロモーター領域をリポータープラスミド(ルシフェラーゼ発現ベクター)の上流に組み込んだ。このプラスミドをT細胞株に一過性に導入したところ、転写活性が検出された。このプラスミドを用いて、エイズウイルスによる、Fasリガンドの発現誘導機構の解析を進めている。
骨肉腫細胞に対するHSP90阻害剤とドキソルビシン併用による抗腫瘍効果の増強

近年、分子シャペロンの一種であるHeat shock protein 90(HSP90)が癌関連蛋白の構造を安定化させる機能があるためHSP90の阻害は重要な治療標的として注目されている。我々は骨肉腫細胞株の遺伝子発現を網羅的に解析したところ、HSP90のクライアント蛋白の一種であるMETの発現が共通に上昇していることを突き止めた。そこで本研究において我々は、骨肉腫細胞に対しHSP90 inhibitorである17-DMAGを投与することでMETのシグナル活性の変化および抗腫瘍効果についての検証を行った。本研究ではADMと17-DMAGの併用効果を検証しHSP90iを臨床応用するための基礎研究を行っている。ADMは肉腫に対する標準治療薬であり、17-DMAGはADM耐性細胞に対し化学療法抵抗性を減弱させる可能性が高いことから、両者の併用は骨肉腫に対して理想的である。骨肉腫細胞に対する17-DMAGとADMの併用効果について検証する。この結果から、ADM耐性の細胞ではP-glycoprotein(Pgp)による薬剤排出機構のため、このICD現象が減弱していると予想されるが、HSP90iを投与することでPgp発現を減弱させADM本来の抗癌作用を増強させると共に、より効果的にICDをも惹起できる可能性がある。すでに我々は、ADMが骨肉腫細胞株に対しImmunological Cell Death (ICD)を引き起こし、抗腫瘍効果を発揮していることを示した。さらに昨年度までの実験では、1) 17-DMAG投与によりc-MetとPDGFRの発現が有意に低下した。2)骨肉腫細胞株にADMを投与するとICDが惹起され抗腫瘍免疫が活性化した。これらの結果に基づき、HSP90iのマルチキナーゼ阻害効果に加え、ADMとの併用による抗腫瘍免疫活性の上昇効果についても解析中である。上記の研究成果をもとに、本研究おいて、骨肉腫細胞に対する17-DMAGとADMの併用効果については抗腫瘍効果は見込めそうである。現在その有効性を示す根拠となる基礎実験を行っている。具体的には抗腫瘍効果を最大化できるメカニズムの解明とHSPiを臨床応用するための基礎となる研究を行っている。1)骨肉腫細胞において、17-DMAGがc-MetとPDGFRのチロシンキナーゼ活性と下流のpathwayのリン酸やシグナル伝達機能を阻害できることを検証している。2)c-Metが抑制されることにより、ADM耐性の原因であるP-glycoprotein (Pgp)の発現が抑制できるか確認する。3)17-DMAGによりMDSCおよびTregの集簇が減弱し、抗腫瘍免疫が活性化するか検討する。Heat shock protein 90(HSP90)はチロシンキナーゼ活性を持つ分子シャペロンの一種であり、細胞内の様々な蛋白質の輸送・活性化に関わっている。悪性腫瘍においてはHSP90により様々な制御機構が破綻状態になっていることが知られているため、マルチキナーゼ阻害剤であるHSP90 inhibitor(HSP90i)が新たな抗癌剤として注目されている。正常細胞と比較して腫瘍細胞内のHSP90の活性は高いためHSP90iは選択性にも優れているが、単剤としての開発しかされておらず未だ十分な効果が発揮されていない。より高い効果を得るためには他剤との併用が必要と考えられる。しかし、臨床応用を考えた場合、数多く存在する抗癌剤の中でも、標準治療薬でありかつHSP90iとの相乗効果ができる薬剤との併用が鍵となる。本研究において我々は、骨肉腫細胞に対する17-DMAGとADMの併用効果について検証する。さらに、腫瘍微小環境内では抗腫瘍免疫を担うCD8(+)Tリンパ球の機能を阻害するMyeloid Derived Suppressor Cell (MDSC), regulatory T cell (Treg)が集簇することで抗腫瘍免疫を抑制しているが、過去の報告からHSP90iはMDSC, Tregの集簇を抑制できることも判明している(Rao, et al; Cancer Res 72(13):3196-206,2012)。我々は骨肉腫に対しても同様の作用があると考え、この効果についても実証する。骨肉腫における標準化学療法薬剤であるADMの効果を最大化するため、17-DMAGとの併用効果について検証する。さらにADM投与によって免疫活性が低下する可能性も考慮し17-DMAGとADMの投与タイミングについても検討する。

17-DMAG投与により、腫瘍内の免疫抑制機能を有するTreg, MDSCが低下し、さらにCD8(+)T細胞、CD4(+)T細胞、が増加することをa)腫瘍の蛍光免染、b)腫瘍内リンパ球のFACS解析により評価する。以上の実験から、骨肉腫細胞に対してHPS90iがもつキナーゼ活性阻害作用、ADMの効果の増強作用、ICD増強作用、さらには免疫抑制因子の抑制による腫瘍免疫増強作用が示されると予想している。骨軟部腫瘍申請時には使用予定の抗体では予備実験に多くの試薬を使用しなければ有用なデータとして活用できないと考えていたが、MTTアッセイやTUNELアッセイで至適使用濃度と作用時間が早期に判明したことが理由であると考えられる。また動物実験に関しても同様で、報告できるデータが早期に取得できたため予備実験が予想よりも軽減できたことが要因であると考えられる。今後はMDSCやRegulatory T cellの解析における抗体など試薬が多必要となるためそちらに重点を置く。とくにFlow cytometryによるソーティングには実験手技の訓練を含めて蛍光標識抗体が必要となるためそちらに使用していきたい。
モンテ・カルロ法を使ったQCDでのクォーク閉じ込め機構の研究

モンテ・カルロ法では、1992年度は1)モノポールによる閉じ込めがわかっているcompact U(1)と比較をしつつ調べた。その結果、abelian projectionした後のSU(2)effective actionはcompact U(1)のような簡単な形ではないこと、2)SU(2)でクォーク場の入ったQCDでの計算も実行した。その結果、monopole currentの時間-空間成分の差が、クォーク場のないときと同様にたいへん良い閉じ込め-非閉じ込めの秩序パラメーターであることがわかった。クォーク場の存在しているfull QCDでは始めての信頼できる閉じ込めの秩序パラメーターの発見である。1993年度は1)abelian Wilson loopがphotonからの寄与の部分とmonopoleからの寄与の部分の積に書けることを見出し、SU(2)gauge theoryでそれぞれからstatic potentialを計算した。その結果、monopoleの寄与からstring tensionが再現され、クーロン項はphotonから得られることがわかった。2)温度ゼロのSU(2)gauge theoryでmonopoleのeffective actionを求め、真空中ではlong distanceでmonopole loopのentropyはenergyを上まわり、monopole condensationが起こっていることが明かにされた。3)SU(2),SU(3)pure gauge theoryで、abelianのWilson loopを外場として入れた、QCDの真空を調べた。monopole currentのrotationとabelianの電場を測定し、Dual Ginzburg-Landau方程式にあてはめることにより、その中のパラメーターである、penetration lengthとcoherence lengthを求めた。その結果、SU(2),SU(3)ともに、超伝導の言葉でいうと、type1とtype2の境界あたりであることがわかった。QCD赤外有効理論の立場では、バリオンのスピンと速度に依存したポテンシャルの計算を行った。大変に複雑な系なので、最も単純な正三角形の場合のみを行ったが、メソンの場合と良くにた振る舞いがわかった。QCDにおけるクォーク閉じ込めの機構の解明はハドロン物理学の研究にとってもっとも重要なテーマである。我々はこれまで、SU(3)のトーラス群U(1)×U(1)のみを残すゲージ固定(abelian projectionと呼ぶ)をすると生じるU(1)×U(1)磁極子(モノポール)が凝縮をおこしてカラー荷電粒子(クォーク、グルオン)を閉じ込めるという考えでモンテ・カルロ法を用いた計算機実験および赤外有効理論の方法によって調べてきた。これまで、予想を支持する有望な結果を得てきたが、今年度の研究の結果でさらに主として以下のようなことが明らかになった。1.モンテ・カルロ法では、アーベリアンのモノポールがクォークの閉じ込め機構を本質的に担っていることの直接的証拠を得ることを目的に、モノポールによる閉じ込めがわかっているcompact U(1)と比較をしつつ調べた。その結果、abelian projectionした後のSU(2)effective actionはcompact U(1)のような簡単な形ではないこと、連続理論でのモノポール分離と同様にモノポールを含む部分を分離すると、その部分がstring tensionを再現することをみつけ、モノポールのみで閉じ込めが理解できるのではという一つの証拠を得た。2.SU(2)でクォーク場の入ったQCDでの計算も実行した。クオーク場の存在しているfull QCDでは始めて信頼できる閉じ込めの秩序パラメーターの発見である。

3.昨年9月から2カ月間学術振興会の費用で同様の研究を行っているアムステルダム大学のJ.Smit教授のところに滞在し研究交流するとともに、以上の結果を「Lattice'92」国際集会で発表した。鈴木が"monopoles and confinement"というタイトルで招待講演をし、世界の関連グループの研究をレビューし、学生二人が上記の結果を発表した。またまた帰途モスクワによってITEPに滞在しPolikarpovたちと研究交流をしてきた。4.本年1月に京都大学基礎物理学研究所で研究会「カラーの閉じ込め機構」を鈴木が主催し、それに松原、学生が参加をして、研究発表と交流をした。1993年度のモンテ・カルロ法を用いた長時間計算機実験での成果は次の通りであった。monopoleのstring tensionへの寄与を詳細に調べ、予想どおりmonopoleのみで再現される事が解った。さらに、monopoleのeffective actionを求めることに成功し、compact U(1)と同様の議論で、モノポール凝縮とそれによるクォーク閉じ込めを示す結果を得た。またQCDのデュアルな真空を、外場をいれたときの系の反応から調べた。1)abelian Wilson loopがphotonからの寄与の部分とmonopoleからの寄与の部分の積に書けることを見出し、SU(2)gauge theoryでそれぞれからstatic potentialを計算した。その結果、monopoleの寄与からstring tensionが再現され、クーロン項はphotonから得られることがわかった。2)温度ゼロのSU(2)gauge theoryでmonopoleのeffective actionを求め、真空中ではlong distanceでmonopole loopのentropyはenergyを上まわり、monopole condensationが起こっていることが明かにされた。3)SU(2),SU(3)pure gauge theoryで、abelianのWilson loopを外場として入れた、QCDの真空を調べた。monopole currentのrotationとabelianの電場を測定し、Dual Ginzburg-Landau方程式にあてはめることにより、その中のパラメーターである、penetration lengthとcoherence lengthを求めた。
成長因子を用いた関節軟骨修復に関する研究

ウサギ膝関節の顆間部に直径4mmの軟骨欠損を作成し、これを骨軟骨欠損のモデルとし、ゼラチン粒子にbFGFを吸着させたものをヒアルロン酸スポンジに含浸させて骨関節欠損に充填した。術後4週、12週、25週、50週にて経時的に屠殺し、肉眼的、組織学的検討を行った。得られた組織は、肉眼的に観察した後、固定、脱灰し、骨軟骨欠損の中央部分を6μmの切片とした。この切片はトルイジンブルー染色、ヘマトキシリンエオジン染色、抗type2 collagen抗体免疫染色を行った。肉眼的には4週、12週では骨軟骨欠損はまだ軟骨様組織では十分には充填されていなかった。25週、50週ではbFGF使用群では組織が十分充填されていた。また周囲との境界も不鮮明で、硝子軟骨様の組織が形成されていた。その他の群では、25週、50週では周囲との境界が鮮明な線維性組織で充填されていた。組織学的観察では4週、12週では、それぞれの群で明確な差異は認められなかった。また再生した軟骨様組織のトルイジンブルー、抗type2 collagen抗体での染色性は低かった.25週、50週においてヒアルロン酸スポンジ+bFGF使用群ではトルイジンブルーでの染色性の高い、抗type2 collagen抗体陽性の軟骨様組織で修復されていた。IGFについても、上記の実験と同様に、直径3mmの骨軟骨欠損を作成し.、IGFをコラーゲンスポンジに含浸させて骨関節欠損に充填した。対照としてコラーゲンスポンジのみを骨関節欠損に充填した。3週、6週の観察では両者の間に有意差は認められなかった。先ず、最初に関節軟骨欠損の修復におけるIGF-Iの役割を明らかにするため、家兎の膝関節を用いて研究を行った。家兎の大腿骨顆間部に作成した直径3mm径の骨軟骨欠損に対してIGF-Iを含浸したcollagen sponge(IGF-I:100μg、10μg)を充填した。対照としては反対側大腿骨顆間部に同じく3mm径の骨軟骨欠損を作製し、同量のcollagen spongeのみを充填した。術後3,6週にて経時的に屠殺し、肉眼的、組織学的検討を行った。肉眼的観察では、IGF-I投与群と対照群の間では明白な差は認められず、3週において、欠損部の一部に赤色調の陥凹部が認められるが、6週になると殆ど全体が均一な白色調を呈し周囲正常関節面とほぼ同じ高さまで、修復組織で被覆されていた。組織学的観察では、3週、6週においてIGF-Iの量による差異は認められなかった。Wakitaniらのhistological grading scaleによる修復組織の評価では、6週においてIGF投与群3.9,対照群5.7であったが、有意差はなかった。軟骨欠損の大きさが3mmの欠損では差がでないので、今後より大きな5mmの欠損で比較と、IGF-Iの至適用量とcarrierのさらなる検討必要と考えられた。次に、ヒアルロン酸のスポンジをcarrierとし、成長因子としてb-FGFを用いて同様の実験を行った。軟骨欠損の大きさは、4mmとしb-FGFはそれぞれ100μg、1μg、10μgをゼラチンに含浸させヒアルロン酸のスポンジ内にしみこませた。4,8週で屠殺し、組織学的に検討を行った。4週の時点では、ヒアルロン酸のスポンジ単独使用による効果は認められず、b-FGFの100μg、1μg投与において軟骨修復が増長される傾向を認めているが、引き続き実験を継続中である。

関節軟骨欠損の修復について、家兎の膝関節をモデルとしてヒアルロン酸スポンジをcarierとし、bFGFを局所に徐放したもので関節軟骨の修復を観察した。まず家兎の大腿骨顆間部に直径4mm径の骨軟骨欠損を作成し、これに対してbFGF1μgを含浸したヒアルロン酸スポンジを充填した。ヒアルロン酸スポンジはラットの皮下で1週間で溶解するものを用いた。bFGFはゼラチンの粒子を作成し、これにbFGFを吸着させ、ゼラチンの生体内での分解によってbFGFを約2週間局所に徐放させた。対照としては直径4mm径の骨軟骨欠損のみのコントロール群」、直径4mm径の骨軟骨欠損にヒアルロン酸スポンジを充填したヒアルロン酸スポンジ群を用いた。術後4週、12週、25週、50週にて経時的に屠殺し、肉眼的、組織学的検討を行った。肉眼的には4週、12週では骨軟骨欠損は組織で十分には充填されていなかった。25週、50週ではbFGF使用群では組織が十分充填されていた。組織学的観察では4週、12週ではヒアルロン酸スポンジの溶解性が早く、組織の骨軟骨欠損部への充填が不十分であり、それぞれの群で明確な差異は認められなかったが、25週、50週においてヒアルロン酸スポンジ+bFGF使用群では抗type2 collagen抗体陽性の軟骨様組織で修復されており、軟骨の再生が促進される傾向がみられた。一方ヒアルロン酸スポンジ使用群とコントロール群では骨軟骨欠損部の組織の充填がヒアルロン酸スポンジ群で優れていた。術後4週、12週での軟骨再生が不十分であると考えており、今後さらにヒアルロン酸スポンジの溶解性を調節して適当な生体内での溶解性を検討する。また他の成長因子の除放を行って関節軟骨の再生を観察する予定である。
遺伝性ライソゾーム病における変異遺伝子発現機序の解析

本年度は、beta-ガラクトシダーゼ活性発現の制御に関与する蛋白質の遺伝子変異による病気(ガラクトシアリドーシス)の病態解析を行った。この蛋白質は、仮に保護蛋白質と呼ばれているが、ライソゾームに存在するbeta-ガラクトシダーゼ並びにシアリダーゼの活性発現に関与し、同時にそれ自体、カルボキシペプチダーゼ、デアミダーゼ、エステラーゼなどの酵素活性をもつ。これまでに6種の異なった変異遺伝子が同定された。エキソン7のスプライスドナー部位の1塩基置換による変異SpDEx7は、日本人の遅発症例に存在し、特に成人例はすべてこの変異のホモ接合体であることが明らかになった。この変異によりスプライシングの異常をおこした蛋白質は、全く機能を失うが、変異が存在するにもかかわらず正常のスプライシングにより機能をもつ蛋白質も10%程度合成され、それが病気の軽症化につながることが分かった。他の4つの1塩基置換(Q49R、W65R、S90L、Y395C)は全く機能を消失した蛋白質を発現し、重症例に検出された。白人の遅発軽症例で発見された変異Y249Nは、検出し得る量の前駆体並びに成熟体蛋白質を発現していた。この結果により、変異の質と発現蛋白質の量、そしてガラクトシアリドーシス症例の重症度との間に密接な関係のあるとの結論を得た。
菌根共生系におけるリン酸の長距離輸送メカニズム

アーバスキュラー菌根菌におけるリン酸輸送メカニズムを明らかにするために、リン酸輸送に関与するポリリン酸合成活性の酵素学的特性と菌根特異的なボスファターゼ遺伝子の発現解析を行った。1.ポリリン酸合成活性の特性解析外生菌糸からポリリン酸合成活性を有する画分を調製し、この活性の酵素学的特性を調べた。マリーゴールドを宿主として培養した菌根菌の外生菌糸1,000-1,500mgを収穫後、直ちに氷冷した乳鉢上で磨砕し、Percoll連続密度勾配遠心により分画した。比重1.06-1.09gmL^<-1>の画分には、最も高いポリリン酸合成活性が認められたが、液胞型および原形質膜型H^+-ATPaseの活性は検出されなかったことから、液胞や原形質膜にポリリン酸合成活性が存在する可能性は少ないと考えられた。また、ミトコンドリアの混入が予想された。電子顕微鏡観察もこれらのことを裏付けていた。液胞型および原形質膜型H^+-ATPaseの阻害剤、およびプロトノフォアは、ポリリン酸合成活性に影響を及ぼさなかったことから、プロトン勾配が本活性の駆動力とはなっおらず、ATPが直接の基質となりポリリン酸が合成されると結論された。2.共生特異的酸性ホスファターゼの全長cDNA塩基配列の決定および遺伝子発現解析共生特異的酸性ホスファターゼのN末端アミノ酸配列15残基を基にPCRプライマーを設計し、3′/5′RACE法によりcDNA(TPAP1)の全長塩基配列を決定した。TPAP1は,1,8kbpからなり,N末端部分に34残基のシグナルペプチドを含む466残基のアミノ酸をコードしていた。RT-PCRとそれに続くサザンハイブリダイゼーションにより、菌根形成によるTPAP1mRNA発現量の変化を調べた。TPAP1の発現量は菌根形成により310倍に増加した。また、TPAP1のC末端に対する抗体を用いたWestern blottingにより、TPAP1の定量を行ったところ、酵素活性の上昇と共にタンパク量も増加していたことから、本酵素の活性は遺伝子発現のレベルで制御されていることが示唆された。アーバスキュラー菌根菌におけるリン酸輸送メカニズムを明らかにするために、リン酸輸送に関与するオルガネラの単離・特性解析とリン酸輸送速度の解析を行った。1.オルガネラ単離・特性解析菌糸内では土壌から吸収したリン酸からポリリン酸を合成し、オルガネラ(未知)中に蓄積していると考えられる。そこで、大量に集めた外生(根外)菌糸からポリリン酸を多く含む細胞器官の分画を試みた。マリーゴールドを宿主として培養した菌根菌の外生菌糸500-1,000mgを収穫後、直ちに氷冷した乳鉢上で磨砕し、Percoll連続密度勾配遠心により分画した。比重1.06-1.10g mL^<-1>の画分には、ポリリン酸が多く含まれ、分画前と比べで約10倍に濃縮(タンパク質含量あたり)された。この画分にATPを加えて、30°Cで30分インキュベートしたところ、ポリリン酸合成活性が検出された。

この合成活性の駆動力について、液胞型H^+-ATPaseとの共役の有無を確かめるために、液胞型H^+-ATPaseの阻害剤であるBaffiromycin A_1を反応液に添加したところ、ポリリン酸合成活性の低下は認められなかったことから、本菌におけるポリリン酸の合成は、ATPを直接の基質として行われていると推測された。今後は、分画されたオルガネラの純度をについて、マーカー酵素や電子顕微鏡などにより検走する予定である。2.リン酸輸送速度解析菌糸中をポリリン酸が移動する速度を測定する実験系を確立し、温度、pH、無機養分などの環境因子が、リン酸輸送速度に及ぼす影響を明らかにすることが目的である。今年度はこれまでの速度推定に用いていたモデルに誤りが見つかったため、モデルの修正を行った。また、より精細な時間設定で測走を行い、ポリリン酸が菌糸中を1cm進むのに要する時間を5-5.5時間(1.8-2.0mm h^<-1>)と推定することができた。アーバスキュラー菌根菌におけるリン酸輸送メカニズムを明らかにするために、リン酸輸送に関与するポリリン酸合成活性の酵素学的特性とリン酸輸送速度の解析を行った。1.ポリリン酸合成活性の特性解析菌糸内では土壌から吸収したリン酸からポリリン酸を合成し、オルガネラ(未知)中に蓄積していると考えられる。本年度は、大量に集めた外生(根外)菌糸からポリリン酸合成活性を有する画分の純度を検討すると共に、この活性の酵素学的特性を調べた。マリーゴールドを宿主として培養した菌根菌の外生菌糸1,000-1,500mgを収穫後、直ちに氷冷した乳鉢上で磨砕し、Percoll連続密度勾配遠心により分画した。比重1.06-1.09gmL^<-1>の画分には、最も高いポリリン酸合成活性が認められたが、液胞型および原形質膜型H^+-ATPaseの活性は検出されなかったことから、液胞や原形質膜にポリリン酸合成活性が存在する可能性は少ないと考えられた。また、若干のチトクロームオキシダーゼ活性が認められたことから、ミトコンドリアの混入が予想された。電子顕微鏡観察もこれらのことを裏付けていた。液胞型および原形質膜型H^+-ATPaseの阻害剤、およびプロトノフォアは、ポリリン酸合成活性に影響を及ぼさなかったことから、プロトン勾配が本活性の駆動力とはなっておらず、ATPが直接の基質となりポリリン酸が合成されると結論された。今年度はポリリン酸と共に全リンおよびオルトリン酸を同時に測定し、i)取り込まれたリン酸はオルトリン酸として一時的に蓄えられることなく、直ちにポリリン酸合成に使われること、ii)菌根菌は一時的に全リンの80-90%に達するほど多量のポリリン酸を蓄積する潜在力を有していることなどを明らかにした。
マイクロ波加熱酸素プラズマによる塩廃棄物の直接ガラス固化

本研究では、プラズマによって塩化物を酸化物に転換し、同時にプラズマの熱で加熱溶融したガラスに直接溶解させる試験的研究を行った。平成9年度は、今まで得られた知見を元に、実用化を見据えたプロセス評価の課題と問題点の抽出、実験環境の整備を行った。平成10年度は、9年度で整備された実験環境の元で以下の実験デー夕の取得とプロセス評価に重点を置いて以下の手順で実験・解析を行った。(1)実現可能な系に近いホウ珪酸ガラス中への溶解挙動を中心に実験を行った。アルカリ金属塩(塩化ナトリウム、塩化セシウム)、アルカリ土類金属塩(塩化ストロンチウム)を、各々酸素プラズマで酸素化し、直接溶融ガラスへ溶解させた。気相温度、液相温度、ガラス材組成、(二酸化珪素、ほう酸他)、供給試料量を変化し、溶融基礎特性を調べた。尚、ガラス材に溶解した金属元素の定量分析は、ガラス試料をふっ酸に溶解した後、その水溶液をプラズマICP法、イオンクロマトグラフによって分析を行った。(2)揮発・蒸発し易いセシウムなどの移行挙動を、安全性の観点から調べ、その対策について検討した。(3)ワークステーションにより実システムに近い系の熱力学的平衡計算を行い、実際のプロセスについて化学工学的考察を行い、プロセス評価を行った。その結果、研究で提案した、直接固化法は科学的に可能であり、また技術的にも可能性を有するなどの見通しを得ることに成功した。プラズマによって塩化物を酸化物に転換し、同時にプラズマの熱で加熱溶融したガラスに直接溶解させることを目的に、小型のプラズマガラス溶融炉を作成し、その特性を調べ、それを用いて以下の実験を行い、それぞれ成果を得ることができた。(1)種々の金属塩化物単体をガラス原料と混合し、製作した小型ガラス溶融炉でガラス固化実験を行い、残存率などの各金属元素の溶融特性を明らかにした。(2)種々の金属塩化物の混合物をガラス原料と混合し、同様のガラス固化実験を行い、核金属元素の残存率などの溶融特性を調べ、単体の残存率と比較し、混合物の溶融挙動は単体のデータから推測しうることを明らかにした。(3)生成ガラス固化体を、XRDによってその特性を分析し、短時間のプラズマ処理によって完全なアモルファスが生成していることを明らかにした。(4)生成ガラス中の塩素の除去率をイオンクロマトグラフにより測定し、短時間の照射で塩素がほぼ完全に除去できることを明らかにした。(5)システムの熱力学的辺平行計算ができるようデータ、ソフトを整備し計算可能であることを確かめた。今後は、(1)気化した気相酸化物が直接溶融ガラス中に溶解する移動速度と移動量などの科学工学的特性、(2)その他の金属塩化物との混合が酸化・溶解に及ぼす特性、(3)システムの熱力学的平衡特性を明らかにしていく計画である。本研究では、プラズマによって塩化物を酸化物に転換し、同時にプラズマの熱で加熱溶融したガラスに直接溶解させる研究を行った。平成10年度は、9年度で整備された実験環境の元で以下の実験データの取得とプロセス評価に重点を置いて以下の手順で実験・解析を行った。気相温度、液相温度、ガラス材組成(二酸化珪素、ほう酸他)、供給試料量を変化し、溶融基礎特性を調べた。(3)ワークステーションにより、実システムに近い系の熱力学的平衡計算を行い、実際のプロセスについて化学工学的考察を行い、プロセス評価を行った。
培養骨膜細胞による歯槽骨再生ＰｈａｓｅII臨床試験と将来の無血清化への基礎的検討

【培養自家骨膜による歯槽骨増生の臨床試験】研究期間中に23症例に培養自家骨膜施用による歯槽骨増生を行った。移植材の生着は良好であり、全例でインプラント埋入に十分な骨再生がえられた。3D-CT精密画像解析では骨形成と骨吸収の協調的な促進が確認され、細胞投与の効果の機序が提示された。【無血清培地を用いた培養法による骨形成能の向上、製造の簡素化】幹細胞無血清培地を用いた4週間の培養により、高い骨形成能を有する均質な培養骨膜細胞が製造できた。この培養法による培養骨膜細胞は骨芽細胞マーカーを強く発現し、高い骨形成能を示した。これらの結果は本研究課題の目的を達成している。【培養自家骨膜併用による歯槽骨造成の臨床試験】平成24年度中、臨床試験では8名に歯槽骨上および上顎洞底に自家骨30-50%の割合で培養骨膜とPRPを混合した移植材を移植した。移植材の移植床骨上への生着は全般に良好であった。現在までに移植後の骨造成の状態を臨床的、画像所見および組織生検で確認しえた症例において、全例でインプラント埋入を行うに十分な骨再生がみられている。細胞移植に明らかに関連したと考えられる異常経過、有害事象は観察されなかった。【無血清培地を用いた新たな培養プロトコールによる安全性と培養操作の簡素化と低侵襲化】ボランティアから提供を受けた顎骨骨膜を用いて、無血清培地(STKシリーズ培地)を用いた条件検討を開始した。これまでにヒト血清を0.5%まで減量して、おおよそ4週間の培養期間で直径3cmの培養骨膜シートが安定して得られている。コントロールの従来培養法に比べて、無血清培地培養法(STK1+STK3併用)では、アルカリフォスファターゼ染色で培養骨膜シートの広範囲で酵素活性を示し、アリザリンレッド染色でも広範囲に染色が観察された。これは、骨膜を増殖し、かつ分化を誘導して、骨形成能の優れた細胞を比較して短期間で製造できる低侵襲な方法を確立できる可能性が示された。マウス皮下への培養骨膜移植実験では、無血清培地培養法(STK1+STK3併用)では骨形成の活性が従来法に比べて高いことが示唆された。【培養自家骨膜併用による歯槽骨造成の臨床試験】平成25年度中では6名、研究期間全体で23症例に培養自家骨膜による歯槽骨および上顎洞底に培養骨膜と自家骨40-25%とPRPを混合した移植材を移植した。移植材の生着は良好であり、現在までに移植後の骨造成の状態をCT画像解析で確認をすすめた。全例でインプラント埋入に十分な骨再生がえられた。異常経過、有害事象は観察されなかった。3D-CT精密画像解析では1年経過後に骨形成と骨吸収の協調的な促進が確認され、細胞投与の効果が提示された。Bone 2012に端緒的な報告を行い、さらに詳細の内容について現在投稿の準備を進めている。目的とする培養骨膜施用の効果の証明とメカニズムの提示が達成された。【無血清培地を用いた新たな培養プロトコールによる安全性と培養操作の簡素化と低侵襲化】ヒト顎骨骨膜を用いて、無血清培地(STK1と3)にヒト血清を0.5%加えた条件で4週間の培養期間で直径3cmの培養骨膜シートが安定して得られることを見出した。従来培養法に比べ、無血清培地培養法(STK1+STK3)は、アルカリフォスファターゼ染色、オステオポンチンなどの骨芽細胞マーカーの発現が顕著で、アリザリンレッド染色でも広範囲に染色が観察された。マウス皮下への移植実験では、無血清培地培養法では骨形成の活性が従来法に比べて高いことが示唆された。これは、骨膜細胞を効率よく増幅し増殖し、かつ均一な分化を誘導して、骨形成能の優れた細胞を短期間で製造できる方法を確立できる可能性が示された。この結果はJ Tissue Eng 2013に報告済みである。目的とする培養の効率化と安全性の確保に多くの前進が得られた。【培養自家骨膜併用による歯槽骨造成の臨床試験】平成23年度中、臨床試験では13名に歯槽骨上および上顎洞底に自家骨40-50%の割合で培養骨膜とPRPを混合した移植材を移植した。

現在までに移植後の骨造成の状態を臨床的、画像所見および組織生検で確認しえた症例において、全例でインプラント埋入を行うに十分な骨再生がみられている。ただし2例において、創治癒に部分的な問題を生じ、移植材の一部排出を生じた。しかしながら、これらは培養骨膜細胞が原因ではなく、術式による通常の骨移植においてみられる異常経過であると考えている。そのほかで明らかに直接原因となる有害事象では観察されなかった。【無血清培地を用いた新たな培養プロトコールによる安全性と培養操作の簡素化と低侵襲化】ボランティアから提供を受けた顎骨骨膜を用いて、無血清培地を用いた条件検討を開始した。これまでにヒト血清を0.5%まで減量して、おおよそ4週間の培養期間で直径3cmの培養骨膜シートが安定して得られている。コントロールの従来培養法に比べて、試行した無血清培地培養法では、アルカリフォスファターゼ染食で培養骨膜シートの広範囲で酵素活性を示し、アリザリンレッド染色でも広範囲に染色が観察された。これは、骨膜を増殖し、かつ分化を誘導して、骨形成能の優れた細胞を比較して短期間で製作できる低侵襲な方法を確立できる可能性が示された。今後、これらのデータについて追加的な検証を進めるとともに、培養技術のさらなる最適化を実施する。初年度の研究目標としての臨床試験はおおむね10名を対象に行われており、その臨床的な経過について、順調に経過観察を行っている。この内容については国際誌における出版を完了した。培養条件の無血清化にかかわる基礎実験については、昨年度に引き続き順調なデータの集積が行われて、良好な骨分化傾向を示し、かつ短期間の培養で発育の良好な培養条件として、国際誌への出版の準備を進めている。臨床試験の結果ならびに基礎研究の結果について2012年6月(2題)および2013年3月(1題)の日本再生医療学会ならびに2012年9月の日本口腔インプラント学会においてその成果を発表した。培養条件の無血清化にかかわる基礎実験については、研究環境が年度後半に整い、培養条件の最適化の試みを進めてきた。年度末の段階で良好な骨分化傾向を示し、かつ短期間の培養で発育の良好な培養条件が整いつつある。これらの結果を踏まえて、細胞の発育状況について各種のマーカーと検出手段を用いた分析を開始した。2012年では臨床試験の結果について日本再生医療学会ならびに日本口腔インプラント学会、培養条件の最適化に関する基礎的検討では日本口腔科学会ならびに日本再生医療学会で発表の準備を進めている。研究結果の公表に関しても、前年度までの実績を学術誌に投稿と受理まで完了することができた。実施計画に掲げたことの内容通りに進行する予定である。1臨床試験は継続して行う。培養条件や観察は従来通りの方法を継続し、正確な臨床情報を記録する。2学術誌にこれまでの研究成果を投稿する。2製造された細胞のゲノム異常について受託解析によって分析する。(1)臨床試験は継続して行う。(2)無血清化の条件設定を前年度までに完了しつつあるので、この内容を各種分析で精査するとともに、必要に応じて修正を行う。(3)学会においてこれまでの研究成果を公表する。(4)学術誌にこれまでの研究成果を投稿する。これにかかわる消耗品を支出する。2作製された細胞のゲノム異常について受託解析にかかる費用を支出する。
超低誘電率シリカ膜の気相堆積

テトライシシアネートシラン(TICS)とトリメチルアミンで堆積できるOHフリーの低温CVDSiO2膜にビスジメチルアミノジフェニルシランを用いて含有させたフェニル基を熱脱離させて形成するポーラスシリカ膜について熱脱離温度の再検討を行い450°Cで処理することで、空孔率の値が約40%と向上し屈折率と一致する結果が得られた。TICS流量を変えることで誘電率2.5が得られた。また、最適化した条件の試料の熱脱離前後で光電子分光スペクトルにどのような変化が見られるかを測定し、熱脱離前には287eV付近のフェニル基に起因するピークが見られたが熱脱離後ではほとんどされなくなっていることやTICS流量を増やすことで膜中に含まれるフェニル基の量が増していることも確認された。耐プラズマ性、高熱伝導性を有するメチレン基含有シリカ膜へ含有されるメチレン基の量を向上させるためにビストリエトキシシリルメタンBTMとヒストリエトキシシリルエタンBTEを原料としてゾルゲル法でメチレン基を膜中に含むSOGを合成することに成功した。この膜ではk=2.6がえられた。さらに低誘電率化を実現するため沸点の低い材料を膜中に含ませ、ポーラス化する事を検討した。その結果、多孔質バルクの作製において実績のあるメチルペンタジオールMPDとBTEの組み合わせで均一な膜が得られた。FTIR測定により、450°Cの真空アニールでMPDが完全に脱離できることを確認した。この結果は、X線光電子分光法、オージェ電子分光の結果とも一致した。また、450°C真空アニール後の電気的特性の測定より比誘電率が1.9であることと10^<14>Ωcmの抵抗率を示すことを確認した。膜密度が下がっていることはX線反射率測定やGIXA法により確認した。理論的に結合が強いCF構造を膜中に取り込むことも検討し初期的結果を得た。耐プラズマ性、高熱伝導性を有するメチレン基含有シリカ膜へ含有されるメチレン基の量を向上させるためにゾルゲル法を用いて予めメチレン基を膜中に含むSOGを合成することに成功した。熱脱離種の選択としてヨウ素、ジメチルスルホキシド、プロピレングリコールプロピルエーテル(PPG)等を検討して、ヨウ素では電気適特性が悪く使用できないことがわかった。ジメチルスホキシドは今回合成したSOG中への含有量があがらず、空孔率が向上しないことがわかった。最終的にはPPGが最も良いことがわかった。テトライシシアネートシランとトリメチルアミンで堆積できるOHフリーの低温CVDSiO2膜にビスジメチルアミノジフェニルシランを用いて含有させたフェニル基を熱脱離させて形成するポーラスシリカ膜について熱脱離温度の再検討を行い450°Cで処理することで、C-V測定と素子完成後のアニールを繰り返して、アニール温度400°Cでえられた比誘電率のk=2.8の値と矛盾していた空孔率の値が約40%と向上し理論的に予測される値となった。最適化した条件の試料の熱脱離前後で光電子分光スペクトルにどのような変化が見られるかを測定した。測定に当たり、試料表面を中性化するために用いられるフラッドガンの照射条件を行った。

通常用いられる自然界に存在する炭素ピークによるチャージアップ補正を用いることが出来ないため、酸素のピークをもとにシフト量を評価し、この値をシリコン及び炭素に適用して予測される値が問題ないことを確かめた。熱脱離前には287eV付近のフェニル基に起因するピークが見られたが熱脱離後ではほとんど確認されなくなっている。TICS流量を増やすことで膜中に含まれるフェニル基の量が増していることも確認された。比誘電率を効率的に下げるために、SOG法を用いて有機基含有ポーラスシリカ膜を作製する方法について検討した。出発原料として、ピスジトリエトキシシリルメタン[BTM]とビストリエトキシシルエタン[BTE]とし、これから合成した膜にいかにポアを形成するかを検討し、その結果、合成したSOGと反応しないこと、高い沸点を有することの2点から絞込み、超臨界乾燥で実績のあるジメチルスルホキシド[DMSO]と多孔質バルクの作製において実績のあるメチルペンタジオール[MPD]を候補とした。BTMとの組み合わせでは均一な膜が得られず、、BTEとMPDのときのみ均一な膜が得られた。FTIR測定により、初期の膜中にMPDが含まれており、450°Cの真空アニールによりMPDが完全に脱離できることを確認した。この結果は、X線光電子分光法により膜中に含まれるCとSiの比が同アニールで1まで下がり、化学量論的組成比になることが確認された。この結果はオージェ電子分光の結果とも一致した。また、450°C真空アニール後の電気的特性の測定より比誘電率が1.9であることと10^<14>Ωcmの抵抗率を示すことを確認した。X線反射率測定をもちい、その臨界角の温度依存性から膜密度が真空アニールにより低下し、450°C後には1.3以下まで下がることを確認した。さらにGIXA法により膜構造を求めたところ、表面に薄いCの酸化した層を仮定することにより理論曲線と測定結果が良く一致することを確かめた。さらに、熱的およぴプラズマ耐性のあるCF結合を含む膜についても検討しビストリクロロシリルアセチレンをもちいて初期的知見を得た。