hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
算数・数学の学習を支える言語的・非言語的表象の発達

『診断学的暗算の実践体系』は,昭和11年にモナスから出版された.戦前の尋常科6学年での暗算教育について,非常に綿密な研究と実践が記されている. Webcat Plusで大学図書館でのこの書籍の所蔵状況を調べてみたところ,わずか6大学で所蔵されているにすぎなかった.この著作をこのまま埋もれさせておくのは非常に残念なので,中島による暗算教育体系と,現在の暗算教育への利用を研究することにした.最初に,この著作全体を概観し,中島による暗算の教育と研究がどのようなものであったかを把握した.標準テストによる教育診断や,反応時間などを指標とした心理学実験に基づく暗算課題の難易評価といった,さまざまな特徴が明らかになった.この研究成果を日本数学協会の年次大会で報告した.この年次大会では中国での暗算教育の報告が2件なされ,今後中島の暗算教育との比較検討を行うことになった.この著作を,筆者が作成している「電子アーカイブ」に収録することにした.ページをスキャンした画像ファイルでなく,テキスト形式で公開を行っている.現在,第1章のテキスト化が完了している.数式を含んだ著作であるため,ウェブページで数式を表示するためにMathMLを採用した.日本ではMathMLの利用法はまだあまり知られていないため,これを解説した論文を日本数学協会論文集に発表した.あわせて,ウェブページ作成のためのテンプレー卜を用意し,ウェブで公開した.
直線収束ビーム超音波顕微鏡による光ファイバ・プリフォームの弾性特性評価

本研究は、直線集束ビーム(LFB)超音波顕微鏡による光ファイバ・プリフォームの弾性特性評価法の確立を目指したものである。気相軸付け(VAD)法により純粋な石英ガラスロッド、及び単一ドーパントを添加した石英ガラスロッドを作製した。ドーパントとしては、F,GeO_2,P_2O_5、及びB_2O_3を取り上げ、不純物濃度の異なる複数のガラスロッドを作製した。各ロッドから厚さ4mm程度の円盤を切り出し、両面を光学研磨し試料とした。Fをドープした試料に対して、まず、LFB超音波顕微鏡による漏洩弾性表面波(LSAW)速度の測定、およびEPMA法による元素分析を行い、F濃度およびプリフォームの製造過程において残留する塩素濃度と音響特性の関係を明らかにした。Fおよび塩素濃度に対するLSAW速度の変化率は、それぞれ-115.6(m/s)/wt%、および-47.4(m/s)/wt%であった。LSAW速度の測定分解能を0.3m/s(0.01%)とすると、F濃度および塩素濃度の変化に対する感度は、それぞれ2.6×10^<-3>wt%および6.3×10^<-3>wt%となる。次に、光導波路部のコア部が純粋石英で、クラッド部および構造的クラッド部にFがドープされたプリフォーム試料に対して、径方向におけるLSAW速度の分布を測定した。元素濃度分布の分析結果から見積もったLSAW速度の分布と比較したところ、そのプロファイルがよく一致し、不純物濃度の分布をLSAW速度の変化として敏感に捉えられることを明らかにした。本手法が光ファイバープリフォーム及びその作製プロセス評価において極めて有用であることが示された。また、GeO_2,P_2O_5,B_2O_3試料の切り出しにおいて、クラックが生じやすいことから、これらの試料には内部残留応力が存在すると考えられる。今後、これらの試料に対しても音響特性の測定を行い、元素濃度分布と比較することにより、内部残留応力の評価も可能であると考える。光ファイバ・プリフォームには、光ファイバの屈折率プロファイルや熱膨張率を制御するために、各種の不純物が添加されており、径方向の化学組成比が異なる。このため、プリフォームの製造およびファイバ線引きの過程において内部残留応力が生じる。本研究は、LFB超音波顕微鏡による光ファイバ・プリフォームの弾性特性、特に内部残留応力を定量的に評価する方法の開発を目指すものである。本年度は、試料の作製および光学特性の評価を行った。以下に実施内容を示す。気相軸付け(VAD)法により長さ100mm、直径20mm程度の純粋な石英ガラスロッド、及び単一ドーパントを添加した石英ガラスロッドを作製した。ドーパントとしては、GeO_2、P_2O_5、及びB_2O_3を取り上げ、不純物濃度の異なる複数のガラスロッドを作製した。音響特性と比較するための基礎データとして、プリフォームアナライザにより屈折率分布の測定を行った。これより、作製した試料は径方向に均一にドーパントが添加されておらず、中心部の濃度が高く、外周部にいくに従い濃度が低下していることが分かった。屈折率の測定後、各ロッドから厚さ4mm程度の円盤を切り出し、両面を光学研磨し音響特性測定用の試料を作製した。試料の切り出しにおいてクラックが生じやすいことから、本試料には、内部残留応力が存在すると考えられる。今後、作製した試料に対して音響特性の測定及び元素分析を行い、音響特性と各ドーパント濃度の関係を調べ、内部残留応力の評価法について検討を進める予定である。
１８世紀ハンガリー王国におけるツィガーニ

本研究は18世紀のハンガリー王国において「周囲からツィガーニと呼ばれた人々」(以下、ツィガーニ)が取り結びえた社会的諸関係の解明を企図し、とりわけ市場町ミシュコルツにおけるこの人々の状況を地域定的文脈や、より広範な社会的・政治的情勢と関連付けて検討することを課題としている。本年度は、博士論文執筆に必要な史料・文献の入手を目的とするハンガリーへの調査渡航(2016年1月27日2月15日)を除けば、前年度までに入手した史料・文献の内容整理、その中で明らかとなった知見の公表に努めた。結果、研究報告2本と図書1点の成果を得た。研究報告では、まず日本西洋史学会大会(2015年5月17日)にて、18世紀半ばのミシュコルツにおけるツィガーニ集団の指導者、頭領の機能とその変化を、1767年の頭領の法的廃止という王国規模の政策の影響なども考慮しつつ、検討した。また、東欧史研究会・ハプスブルク研究会合同報告会(2015年10月18日)では、18世紀初頭のミシュコルツにおけるツィガーニ、とりわけ鍛冶師の経済活動を、地域の経済的状況やギルドなどその他の経済活動主体との関係の中で検討した。さらに、次年度にはジプシー/ロマ研究会(2016年4月16日)にて、ミシュコルツにおけるツィガーニによる「犯罪行為」について、18世紀ハンガリー王国で実施されたツィガーニに対する「同化」の試みと関連付けて検討する予定である。図書については、ハプスブルク家とブルボン家の宮廷を比較検討したJ.ダインダム『ウィーンとヴェルサイユ』の翻訳に参加し、18世紀当時ハプスブルク家領に属したハンガリー王国を、より広い枠組みから捉え直す重要性を再認識した。目標としていた年度中の博士論文完成には至らなかったが、以上の研究報告、調査などによって、本博士論文は完成に向けて大きく前進し、2016年度中に提出できる見込みである。それと合わせて、以上の研究報告を今後、論文の形で公表することを目指したい。27年度が最終年度であるため、記入しない。本研究は18世紀のハンガリー王国において「周囲からツィガーニと呼ばれた人々」(以下、ツィガーニ)が取り結びえた社会的諸関係の解明を目的とし、18世紀前半から末にかけて作成された地域レベル(特に市場町ミシュコルツ)の史料を検討することでその課題に取り組むものである。なお、ツィガーニはハンガリー語で「ジプシー」を意味し、それはロマ民族への蔑称の一つと見なされる傾向があるが、本研究は、史料中でそのように表現された人々そのものを対象とするため、18世紀に限ってはその表現を用いる。平成26年度の前半には、史料・文献調査をハンガリーのミシュコルツ、ブダペシュトにて実施し、18世紀史関連文献や当時のツィガーニに関する行政文書、裁判関連文書、統計調査資料などを収集した。また、現地の研究者数名と意見交換を行い、その際の勧めもあり、調査成果の一部をハンガリーで論文化した。帰国後は史料の情報整理を進め、加えて調査成果の一部を用いた研究報告を日本ロマ学研究会、ならびにジプシー研究会にて行った。以上の成果のうち、ミシュコルツ大学の紀要に発表した論文では、18世紀後半にボルショド県ミシュコルツ郡で作成された統計的史料『ツィガーニ帳簿』を用い、同地域におけるツィガーニの定住・非定住の度合やその変動、ツィガーニによる移動の特徴などを検討した。研究報告については、ともに、ロマ/「ジプシー」を研究する歴史学以外の研究者が中心となる集会で行われたため、その内容も、ロマ自身が描くロマの歴史に内在する民族主義的バイアスの指摘や、ロマ/「ジプシー」研究に対して歴史学、中でも近世史研究が持ちうる意義(近代的ロマ/「ジプシー」認識の相対化)の説明など、他の専門分野と議論を深めるための準備作業という性格が強いものとなった。出席者からは歴史的視点で見ることの重要性を改めて認識したとの感想を受け取るなど、概ね好評を得られた。

さらに、次年度にはジプシー/ロマ研究会(2016年4月16日)にて、ミシュコルツにおけるツィガーニによる「犯罪行為」について、18世紀ハンガリー王国で実施されたツィガーニに対する「同化」の試みと関連付けて検討する予定である。図書については、ハプスブルク家とブルボン家の宮廷を比較検討したJ.ダインダム『ウィーンとヴェルサイユ』の翻訳に参加し、18世紀当時ハプスブルク家領に属したハンガリー王国を、より広い枠組みから捉え直す重要性を再認識した。目標としていた年度中の博士論文完成には至らなかったが、以上の研究報告、調査などによって、本博士論文は完成に向けて大きく前進し、2016年度中に提出できる見込みである。それと合わせて、以上の研究報告を今後、論文の形で公表することを目指したい。当初予定していた史料の収集が概ね完了し、それらを基に研究報告、博士論文やその他の学術論文の執筆が可能な状況を構築することができたためである。確かに、当初予定していた個別テーマ(18世紀のツィガーニの頭領の機能、18世紀ハンガリー社会におけるツィガーニの「犯罪」行為、市場町におけるツィガーニの経済的機能、など)については、いずれも年度中に論文投稿や研究者集会での研究報告を行うことがかなわなかった。しかし、これらのテーマについては着実に発表の準備を進めている。また、関連する別のテーマ(ツィガーニの領域的流動性)を扱った論文をハンガリーにて発表できたこと、ロマ/「ジプシー」をめぐる学際的な研究者集会で2度、ロマ/「ジプシー」の歴史を研究する意義に関する報告を行ったことなどを考慮すると、本研究は平成26年度において一定程度進展を見せたと言える。27年度が最終年度であるため、記入しない。平成26年度の反省点として、歴史学分野の研究者集会にて研究成果を発表することが叶わなかったことが挙げられる。それを踏まえて、次年度は、年度中の博士論文の提出を最重要課題としつつ、歴史学系の学会・研究会での報告、学術誌への論文投稿をより積極的に行っていきたい。手始めに、2015年5月16、17日に富山大学で開催される第65回日本西洋史学会大会にて「18世紀ハンガリー社会におけるツィガーニの頭領の機能ー市場町ミシュコルツの事例を中心にー」という題目で自由論題報告を行う予定である。また同様の内容を扱った論文の投稿も現在準備中である。史料・文献調査に関しては、博士論文の執筆や、その内容の一部を学術雑誌に投稿するにあたり、手元の資料のみでは立論が十分にできなかった場合に、それを補足可能な資料を入手するために、今年度も適切な時期に行う予定である。少なくとも、博士論文提出以降(2016年1月3月)に、ハンガリーへの数週間の渡航を一度予定している。
地球環境衛星データシステムの構築とその利用

宇宙からの地球観測情報は、地球環境の変動の機構を解明するために不可欠のものとなっている。衛星からの観測データの学術的な利用は,特定研究(1)「宇宙からのリモートセンシングデータの高次利用」(昭和60年度-62年度)において,衛星データは何に利用可能であるかを明らかにするための「衛星データ利用可能性の検証」に研究の主眼が置かれた。各専門分野毎に衛星データの検証および衛星データの処理方法が確立された。引続き,重点領域研究「衛星による地球環境の解明」(平成元年度-3年度)では,気圏,水圏,地圏の相互作用としての地球現象を解明するためにグローバルな視点で理学,工学,農学等の学際的研究が発足した。「グローバルな衛星観測とその解析」にもとづいた地球現象の変動に関する知見が蓄積された。重点領域研究「衛星による地球環境の解明」終了後に,我国における衛星を利用して宇宙から観測されるデータを用いて,グローバルな地球環境の種々の変動を学術的な見地から解明するための研究を,世界の研究を凌駕する様に,更に発展される必要がある。本研究は,そのための方策を検討し,次の重点領域研究としての研究を推進するための組織と研究計画を具体的に提案することを目的としている。衛星観測データの地球環境の研究へ利用することは,大学における十分な基礎研究に基いて初めて可能となる。更に,地球をシステムとして捉え,学術的に解明することは,先端科学技術国として我国に期待されている学術的貢献を果たすことができ,大きな効果が期待されるので,「衛星計測による大陸規模の水・熱エネルギーフローの解明」を立案し,平成7年度発足の重点領域研究として申請した。又,ネットワークに基づく衛星データセンター構想を提案した。
光電流増倍現象を利用した電流注入制御型有機トランジスター

本研究の目的は、有機半導体薄膜デバイスにおいて観測される光電流増倍現象(光電流量子収率が100%を越える現象)のメカニズムを応用することにより、全く新しい動作原理に基づく有機トランジスターデバイスを開発することにある。この光電流増倍現象は、光生成したホールが有機/金属界面に蓄積することで高電界を形成し、その結果大量のトンネル電子注入が引き起こされ光電流が大幅に増幅される現象である。ここで、この光生成ホールに相当する電荷を有機薄膜中に挿入した第3の電極から供給することができれば、わずかな電流を大量の電流に増幅するトランジスターデバイスとして動作することが期待できる。申請者らは昨年度、光電流増倍を示す有機半導体であるペリレン顔料の蒸着膜中に100mmピッチのストライプ状アルミ電極を挿入した3端子デバイスで、最大25倍程度の電流増幅効果を観測し、全く新しい電荷注入制御型有機トランジスターの動作原理実験に成功した。本年度は、素子中を流れる電流成分の解析を行った結果、観測される入力・出力電流には目的とする増幅とは関係のない漏れ電流成分が多く含まれており、素子性能の向上のためにはこれを抑制することが最も重要であることを見いだした。実際、得られた設計指針に基づいてベース電極下に絶縁層を設けた素子を作製することで、電流増幅率を70倍程度にまで向上させることができた。さらにこの設計指針を推し進めて、リソグラフィーによってストライプ状の絶縁層の上にベース電極を精密にパターニングした基板を用いて素子を作製した結果、漏れ電流をほぼ抑制することができ、最高1000倍以上の電流増幅率を達成することができた。この光電流増倍現象は、光生成したホールが有機/金属界面に蓄積することで大量のトンネル電子注入が引き起こされ、その結果として光電流が大幅に増幅される現象である。ここで、この光生成ホールに相当する電荷を有機薄膜中に挿入した第3の電極から供給することができれぱ、わずかな電流を大量の電流に増幅するトランジスターデバイスとして動作することが期待できる。申請者らは、光電流増倍を示す有機半導体であるペリレン顔料の蒸着膜中に、100μmピッチのストライプ状アルミ電極を挿入した3端子デバイスを作成し、べース電流変化に対するコレクター電流の変化量を測定した。その結果、最大で25倍程度の電流増幅率を得ることができ、トランジスターとしての動作を確認することに成功した。このような電流増幅が、光電流増倍現象を示す材料でしか観測されないことから、トランジスター作用は上記の電荷注入メカニズムによって起こっていると考えられる。また、本デバイスのもう一つの特徴である光電流増倍特性(フォト・トランジスター特性)を、べース電極の電圧によって変調することを試みた。その結果、吸収フォトン数に対する光電流キャリア数の比率である光電流増倍率を、5Vのべース電圧印加によって24000倍から28000倍に変調することができた。
修学指導支援システムのＷｅｂユーザインタフェース動的生成機能の開発

本研究では,情報検索システムが扱う情報の仕様や抽出・可視化のニーズの変化に柔軟に対応し,システム側の改修を要しない自由度の高い検索インタフェースを実現した。データ間の関係やデータ形式,データごとの利用要件などをXML形式で記述されたメタデータで管理し,それに基づいてインタフェースを動的に生成する機構を開発した。この機構により,検索者は自由に条件項目を指定することができる(検索の自由度)。また,システム開発者は,XMLメタデータを編集するだけで自由にシステムのインタフェースをデザインできる(修正の自由度)。開発した機構を複数の検索システムに適用してその有用性を確認した。修学指導支援システムで利用される学生の修学データを効率的に管理・利用するためのWeb検索インタフェースの動的生成機能について,昨年度の成果をさらに発展させる研究を進めた。具体的には,修学指導支援システム以外にも本手法が利用できることを念頭にプロトタイプで用いたXMLメタデータの仕様を見直し,汎用化を進めた。さらに,新たな仕様に併せ,動的生成の機構についても改良を進めた。改良後の新たな機構について,標準な会計データベースのサンプルなどを用いて動作を確認した。この新たな改良版については、成果をまとめ学会において1件の発表を行った。さらに,改良版のインタフェース動的生成機能を,従来の修学指導支援システムに適応させるとともに,新たな応用先として,廃棄物処分場の埋立ガスデータを可視化するソフトウェアに注目し,その検索インタフェースとして適応させる作業を進めた。本作業は現在も継続中である。昨年度までの成果であるプロトタイプ版では,修学指導支援システムで用いられる成績や教育カリキュラムなどの修学に関するデータベースに特化していたが,今回の汎用化により,他の様々なデータの検索インタフェースとして利用可能となった。また,動的生成のための処理時間も,それを用いない一般のインタフェースの表示処理とさほど変わらない時間で体感的にはほぼ同等の成果が得られた。本研究の成果はWebユーザインタフェースを持つ多くのアプリケーションで応用可能な技術であり,高い汎用性を有する。修学指導支援システムで利用される学生の修学データを効率的に管理・利用するためのWeb検索インタフェースの動的生成機能について,前年度までに開発済みのプロトタイプをベースにさらに改良を進めた。そして,動的生成機能で利用されるXMLメタデータの仕様設計を行った。具体的には,検索条件として入力フォーム上で指定できる学生データの項目を洗い出し,それぞれについて条件の入力方法と選択制約などを記述するためのメタデータの仕様を設計した。さらに,入力フォームで選択された入力条件,出力項目の選択内容に基づいて学生データベースから情報を取得するための問合せ(SQL)を自動生成するためのメタデータの仕様を設計した。次に,インタフェース上で選択可能な組み合わせや入力可能なデータの範囲など,入力データの制約,制限,有効数値等について検討し,データポリシーを設定した。これらと並行して,メタデータを簡単に作成するための作成支援エディタの開発を進めた。既存のメタデータを読み込んで編集できるだけでなく,学生データベースの構成を自動的に取得し,それをメタデータのテンプレートとして利用できる機能を実装した。これらの研究成果をまとめ,学会において4件の発表を行った。従来技術では,データの追加や変更,システム側インタフェースデザインの変更のたびにシステムそのものの大幅な改修が必要となっていた。これに対して本研究で実現した機能は,データの構成や利用法をXML形式のメタデータとして管理し,それに基づいて検索インタフェースを動的に生成する。さらに入力内容に応じてデータベースへの問合せや出力形式を自動的に生成する。この機能により多様な修学データに柔軟に対応可能なシステムが実現された。修学指導支援システムで利用される学生の修学データを効率的に管理・利用するためのWeb検索インタフェースの動的生成機能について,昨年度までの成果を改めて自己評価し,修学指導支援システム以外の検索インタフェースとしても広く活用することを念頭に置いた汎用化に取り組んだ。具体的には,インタフェースの動的生成に利用されるXMLメタデータの仕様の見直しを進めるとともに,検索結果の出力方法として,従来までの表形式での出力の他に,検索者の選択により,グラフ形式での出力等,用途に応じた情報を得られる工夫を新たに盛り込んだ。さらに,改良版のインタフェース動的生成機能の新たな応用先として,廃棄物処分場の埋立ガスデータを可視化するソフトウェアに注目し,その検索インタフェースとして適応させる作業を進めた。これまでの成果では,修学指導支援システムで用いられる成績や教育カリキュラムなどの修学に関するデータベースに特化していたが,今回の汎用化により,他の様々なデータの検索インタフェースとして利用可能となった。

教育工学修学指導支援システムで利用される学生の修学データを効率的に管理・利用するためのWeb検索インタフェースの動的生成機能については,当初年度内に予定していた開発作業を予定通りに進めることができた。具体的には,XMLメタデータの仕様の見直しと,新たな仕様に対応したインタフェース動的生成の機構の改良が完了した。さらに,他の情報検索システムのインタフェースとして広く応用するための汎用化についても改良を進め,順調に作業を進めている。一方で,XMLメタデータを簡単に作成・編集するためのグラフィカルインタフェースを有する専用エディタの開発については,XMLメタデータの仕様そのものを見直したため,作業が中断され,当初予定していた計画が進まない結果となった。汎用化されたインタフェースを広く利用してもらうためには,XMLメタデータそのものの作成にかかる時間の短縮は必要不可欠な課題であるが,メタデータ自体はエディタを用いずとも作成することは可能である。以上より,達成度としてはおおむね順調に進展していると評価する。修学指導支援システムで利用される学生の修学データを効率的に管理・利用するためのWeb検索インタフェースの動的生成機能については,当初年度内に予定していた開発作業を予定通りに進めることができた。プロトタイプを拡張子,新たな入力インタフェースに対応させることに成功した。一方で,動的生成機能で利用されるXMLメタデータの仕様設計と,XMLメタデータを簡単に作成・編集するためのグラフィカルインタフェースを有する専用エディタの開発については,仕様設計に予定以上に時間を要したため,エディタの開発が当初予定よりも大幅に遅れてしまう結果となった。メタデータを簡単に作成するためのエディタは完成に至らぬ結果となったが,メタデータ自体はエディタを用いずとも作成することは可能である。メタデータの仕様設計は年度内に終わらせることができたため,修学指導支援システムそのものは予定した機能拡張まで終わらせることができた。今後は,汎用化された新たなWeb検索インタフェース動的生成機構について,具体的なWeb検索システムに適用することで,導入にかかるコストや,利用に際しての処理時間や適応度など,その性能の評価を進める予定である。その上で,ユーザに使いやすいインタフェースを提供するために,HTML5などWebのこれからの標準となる新たな技術に対応させるとともにOSやブラウザごとの差を無くすような細かな仕様の見直しを行い,実運用環境として再構築する。
GM-CSF産生Th細胞の分子制御メカニズム解明への挑戦

本研究では、活性化Th細胞のGM-CSF産生制御に関わる特異的な表面分子としてTNFRSF18を同定した。TNFRSF18シグナル経路の活性化により、生体内エフェクター/メモリーTh細胞からのGM-CSF産生が増強され、このシグナルカスケードがGM-CSF産生制御に関わる鍵となる分子機構であることを見いだした。また、TNFRSF18シグナルは炎症組織Th細胞からのGM-CSF産生を増強し実験的自己免疫性脳脊髄炎発症に関わることを見いだした。従って、これらの分子機構を治療標的にした免疫制御法開発に向けて有用な知見がえられた。GM-CSF(Granulocyte Macrophage colony-stimulating factor)は古くから造血因子として知られているサイトカインの一つであるが、近年GM-CSF産生Tヘルパー(Th)細胞が関節リウマチや多発性硬化症の動物モデルにおいて病因惹起性のThサブセットであることが明らかになってきた。本研究では、活性化Th細胞のGM-CSF産生制御に関わる分子基盤の包括的な理解と分子標的の臨床応用を視野に入れた研究を展開している。本年度、GM-CSF産生Th細胞の分化を誘導する特異的副刺激シグナル(Tnfrsf18)を同定した。TCR刺激との組合わせにより、細胞内染色によってGM-CSFのみならずIL-3の発現上昇を見いだした。これまで提唱されているTh1、Th2、Th17サブセットとはエフェクターサイトカインの発現パターンが異なっており、サイトカイン産生パターンから特に骨髄系細胞の分化・成熟化を誘導するユニークなThサブセットであると考えられる。また、試験管内におけるTh17誘導条件においてTnfrsf18刺激によるGM-CSF発現上昇が強く抑制されることから、従来考えられてきたTh17細胞が産生するGM-CSF発現機構とは異なった制御機構が存在することが示唆された。また、生体内からエフェクター/メモリーTh細胞を純化してTnfrsf18による再刺激を行ったところ、TNF、IL-17産生能に変化は見られなかったが、GM-CSF産生を有意に上昇させた。これらナイーブTh細胞と分化後エフェクターTh細胞に対する特異的効果は、GM-CSF特異的な免疫制御法開発に向けた有用な知見である。本年度、Tnfsf18欠損抗原提示細胞を用いて活性化Th細胞のGM-CSF産生能を試験管内試験で測定した。Tnfrsf18を抗体刺激した時と同様に、Tnfsf18欠損抗原提示細胞との共培養条件下ではTh細胞からのGM-CSF産生能が有意に減少していた。また、Tnfsf18を高発現する細胞として腹腔B1細胞を同定した。次に、Th細胞を試験管内で抗Tnfrsf18抗体及びTnfsf18欠損抗原提示細胞を用いて刺激後、Tnfr18依存性の遺伝子発現変化を解析した。現在までに、Tnfsfシグナル経路に依存した分子候補として72遺伝子を同定した。本研究課題では、活性化Th細胞のGM-CSF産生制御に関わる分子基盤の包括的な理解と分子標的の確立を目的とする。本年度の成果、即ち、GM-CSF産生制御に関わる上流遺伝子候補の同定は、GM-CSF産生Th細胞が関与する様々な自己免疫疾患の治療標的分子につながる可能性があり、順調に研究が進んでいるGM-CSF(Granulocyte Macrophage colony-stimulating factor)は古くから造血因子として知られているサイトカインの一つであるが、近年GM-CSF産生Tヘルパー(Th)細胞が関節リウマチや多発性硬化症の動物モデルにおいて病因惹起性のThサブセットであることが明らかになってきた。本年度、Tnfsfシグナル経路に依存して上昇する分子を定量的PCR法を用いて検証し、今後の研究展開に必要な候補分子として絞り込みを行った。また、生体内におけるTnfsf18シグナルの意義を調べるため、野生型とTnfsf18欠損マウスを用いて自己免疫病モデルを誘導し病態と炎症組織に浸潤した細胞機能について解析をおこなった。自己免疫性関節炎および実験的脳脊髄炎を誘導したところ、自己免疫性関節炎では有意な差が見いだせなかったが、Tnfsf18欠損マウスにおいて実験的脳脊髄炎の有意な重症度の低下が観察された。臨床的な表現型と一致して、組織に浸潤しているエフェクター細胞のGM-CSF産生能を含む機能低下も確認できた。従って、Tnfsf18シグナルはエフェクターTヘルパー細胞の機能を特異的に修飾し、自己免疫病の病態に重要な役割を果たすことを明らかにした。TNFRSF18シグナル経路の活性化により、生体内エフェクター/メモリーTh細胞からのGM-

CSF産生が増強され、このシグナルカスケードがGM-CSF産生制御に関わる鍵となる分子機構であることを見いだした。また、TNFRSF18シグナルは炎症組織Th細胞からのGM-CSF産生を増強し実験的自己免疫性脳脊髄炎発症に関わることを見いだした。従って、これらの分子機構を治療標的にした免疫制御法開発に向けて有用な知見がえられた。本研究課題では、活性化Th細胞のGM-CSF産生制御に関わる分子基盤の包括的な理解と分子標的の確立を目的とする。本年度の成果、即ち、Tnfrsf18刺激による新規のGM-CSF産生制御機構の同定は、研究の目的であるGM-CSF産生Th細胞のエフェクターサイトカイン制御法開発の鍵となる可能性があり、GM-CSF産生Th細胞が関与する様々な自己免疫疾患の治療標的分子につながる可能性がある。本研究課題では、引き続き、GM-CSF産生制御に関わる分子基盤を明らかにするために、分子生物学的、構造学的、免疫学的手法を用いて詳細な検討を行っていく。次年度、Tnfrsf18シグナル経路依存性の分子として同定した72遺伝子候補の検証を行うとともに、Tnfrsf18欠損マウスを用いて、生体内におけるTnfsf18のGM-CSF産生制御に関わる重要性と自己免疫疾患モデルを用いた評価を進める。免疫学本研究課題では、引き続き、GM-CSF産生制御に関わる分子基盤を明らかにするために、分子生物学的、構造学的、免疫学的手法を用いて詳細な検討を行っていく。次年度、Tnfrsf18シグナルとGM-CSF産生を橋渡しするアダプター分子や転写因子の検索を行い、より特異的なGM-CSF制御法開発に向けた分子メカニズム解明を目指す。また、Tnfrsf18欠損マウスを用いて、生体におけるGM-CSF産生Th細胞に対する影響を確認する。所属研究施設移動のため、当該研究課題に必要なマウスの移動に時間がかかり、予定していた遺伝子改変マウスを用いた実験を次年度に延期したため。本年度に計画している実験準備は整っており、主に物品費・消耗品として使用予定である。
完全無蛋白初代培養によるニワトリ胚間充織細胞の増殖調節因子群の解析

(1)強膜線維芽細胞が分泌するオートクライン因子群のうち、熱感受性ヘパリン結合性のSAF-llaは分子量約16KDaでBALB/c3T3細胞をよく増殖させ、FGF familyと考えられる。SAF-lおよびSAF-llbは独立の因子でその本体はいまだ不明である。この細胞はトランスフェリンをオートクライン産生しておらず、トランスフェリン以外の鉄導入機構を備えている可能性がある。(2)強膜繊維芽細胞は、軟寒天中で分化軟骨クローンに分化する周軟骨性前軟骨細胞である。bFGFはこの軟骨分化を抑制しつつ、強い増殖促進活性を示す。bFGFは分化軟骨細胞に対しても、同様に巨大化細胞への分化を抑制しつつ強い増殖促進活性を示す。このbFGF依存性の増殖促進を、TGF-βは、前軟骨細胞では阻害し分化軟骨細胞では増強する。なお、単層培養の培養上清中にはELISAで検出可能なTGF-β様分子が存在する。(3)培養上清中に、bFGFに類似して軟骨分化抑制下に顕著な細胞増殖の持続を導く画分が存在し、SAF-llaである可能性がある。これは胚の前軟骨細胞から直接分離されたオートクライン因子であり、肢芽の進行帯で機能している因子との関連が強く期待される。(4)レチノイン酸は、細胞密度が低いと増殖阻害的に、高いと促進的に働く。この働きはオートクライン増殖因子の産生能の変動を介して行われているらしい。これらのオートクライン因子群は、自細胞腫(前分化細胞)と他細胞腫(既分化細胞)増殖に対して多様な調節を行う組織環境を提供できることが判る。位置情報を含む環境条件に対応してこのような因子の相互作用がプログラムされ、軟骨形態形成が起こると想定することができる。1.本補助金によって購入した遠心濃縮機を利用することにより、これまでの限外濾過法と異なる、より効率的で精度の高い増殖因子の精製法を確立した。これによって、(1)熱耐性増殖因子が分離され、SAFーIと同様に31KDa付近に活性があることが確認された。この分子の単離とアミノ酸配列の決定を急ぐ予定である。(2)ヘパリン結合性で熱感受性の増殖因子SAFーIIaは、ニワトリ胚強膜線維芽細胞だけでなく、マウスBalb/c 3T3 A31細胞の増殖も顕著に促進するが、ヘパリン添加の影響を受けないなど、既知のFGFファミリ-の増殖因子とは性質がやや異なっていた。このほかに未知の熱感受性で酸耐性の増殖因子が検出された。2.あらたに無蛋白培養下でオ-トクライン増殖することが明らかになったニワトリ胚の胸軟骨膜細胞の無蛋白培養上清から増殖因子を分離したところ、各画分の活性分布パタ-ンは、既報のSAFーI、SAFーIIa、SAFーIIbのそれと基本的に一致し、胸軟骨膜細胞だけでなく強膜線維芽細胞に対しても同様の増殖因子活性を持つことが確認された。我々の解析しているオ-トクライン増殖因子群が、前軟骨細胞個有のものらしいことが判った。3.強膜線維芽細胞を無蛋白培養下でレチノイン酸処理すると、一過性にDNA合成活性の阻害が認められた後、かえって細胞増殖を促進することが判った。このとき培養上清中に熱耐性の増殖因子が増えており、レチノイン酸がこの細胞におけるオ-トクライン増殖因子の産生パタ-ンを制御していることが判った。最近1年間、原因不明の『コンフルエント後の細胞死』にみまわれ、培養上清の収集が意にまかせなくなった。

胚組織細胞を無タンパク下に初代培養すること自体、元来チャレンジングな試みであり、改めてこの予期せぬ事態を克服するための努力を重ねた。その結果、次のような事実が判明した。1.アスコルビン酸リン酸を無タンパク培養液に添加することにより、この細胞死は起こらなくなり、コンフルエント後も培養上清の採取が再び可能となった。2.このとき、細胞の形態は独特の偏平化を示しており、また、培養上清に含まれる細胞増殖促進活性画分の組成も、アスコルビン酸不添加の場合と明らかに異なっていた。3.我々がすでに報告したSAF-11a、SAF-11bとは異なる4種の熱感受性の増殖促進活性画分が得られており、この中には分化軟骨細胞に対してのみ増殖促進活性を示すものが含まれ、実際に軟骨分化途上の胚組織内で働くオートクライン因子の可能性がある。4.これらの増殖促進活性画分のどれも、単独ではアスコルビン不添加下での細胞死を救うことはできなかっただけでなく、これらのうちの一つはむしろ細胞死を促進する働きがあった。以上の結果は、ニワトリ胚の間充織細胞が無タンパク培養液の初代培養下で増殖し、維持され、分化調節をうけるためには、予期以上の多種類の増殖調節、分化調節因子の関与によって支えられていることを物語っている。このこと自体、重要な発見であるが、同時に、これらは当然、環境の変化に対応してデリケートな変動(シフト)を行っているはずで、今後の解析には相当の工夫が必要であることを示している。一方、SAF-IIbは、最適濃度の10倍に濃度を上げると、そのオートクライン増殖促進活性が消え、またヘパリンには弱く結合するのみで、BALB/c3T3細胞に対しても活性を示さず、なお本体不明である。レチノイン酸は、細胞数、3×10^4細胞/15-mm dishのまきこみ細胞密度を臨界密度とし、これよりも細胞密度が小さい時には細胞増殖を抑制し、これよりも細胞密度が大きい時には細胞増殖を促進することが判った。この二相性の効果は、恐らくオートクライン増殖因子の産生を介して働いていると考えられた。強膜線維芽細胞は、bFGFを添加して軟寒天培養すると、軟骨の分化形質を発現することなく増殖し、巨大な線維芽細胞コロニーを形成するが、TGF-βはこの増殖促進を濃度依存的に阻害することが判った。一方、この細胞から分化した分化軟骨細胞では、TGF-βは、このbFGF依存性の増殖促進を逆に濃度依存的に促進した。さらに、強膜線維芽細胞はTGF-β様の分子をオートクライン分泌していることがELISA法によって示された。すなわち、この細胞の分泌するオートクライン因子群はその増殖促進活性を正または負に、相互に干渉しあうことが判明した。以上の結果から、前軟骨細胞である強膜線維芽細胞が無蛋白条件下に産生するオートクライン因子群にはユニークなものが含まれることが推定され、その抽出精製と共に、その作用様式を解明することは、軟骨の形態形成を支配している液性因子を解明する上で重要な知見をもたらすと期待された。
家族性進行性核上性麻痺における遺伝子解析研究に基づいた進行性核上性麻痺の病態解析

進行性核上性麻痺(PSP)は孤発性疾患であるが、まれに家系内に複数の発症者をみた家系も報告されている。われわれは、認知症とパーキンソン症状を主な症状とし臨床的に進行性核上性麻痺と診断し、病理学的に海馬、淡蒼球、視床下核、黒質の神経変性を伴い、3リピートと4リピートのタウ蛋白の蓄積を伴う家族性神経変性疾患があることを見出した。この家族歴のある患者を対象に過去にPSPの原因遺伝子として報告されている遺伝子やパーキンソン病や認知症の原因遺伝子などを含む50遺伝子を候補遺伝子として解析したが、それらの遺伝子には原因となる変異を認めなかった。そこでさらに、全エクソーム解析および連鎖解析を実施し、bassoon(BSN)遺伝子に発症者特異的にミスセンス変異が存在することを見出した。bassoon蛋白は神経終末アクティブゾーンに存在する巨大蛋白質である。さらに孤発PSP患者41名を対象に解析したところ、4名の患者において3種類のミスセンス変異が認められた。これらの遺伝子変化は健常者データベースには記載が無いか、あっても0.5%以下のまれな変化であった。次いで、遺伝子変化を導入した変異型ラットBSN遺伝子と野生型ラットBSN遺伝子を導入したHEK293T細胞でタウ蛋白を比較検討すると、遺伝子変化を導入した細胞で不溶性のタウ蛋白が多く存在することが見出され、この遺伝子変化により不溶性のタウ蛋白が蓄積することが確認された。この結果を踏まえて、現在この遺伝子変化のPSP病態への関与について共同研究が進捗中である。北海道大学で実施された先行研究の結果を示す。家族歴のある患者を対象に過去に進行性核上性麻痺の原因遺伝子として報告されている遺伝子やパーキンソン病や認知症の原因遺伝子などを含む50遺伝子を候補遺伝子として解析したが、それらの遺伝子には原因となる変異を認めなかった。進行性核上性麻痺と臨床診断された孤発例患者41名を対象に解析したところ、4名の患者において3種類のミスセンス変異が認められた。次いで、遺伝子変化を導入した変異型ラットBSN遺伝子と野生型ラットBSN遺伝子を導入したHEK293T細胞でタウ蛋白を比較検討すると、遺伝子変化を導入した細胞で不溶性のタウ蛋白が多く存在することが確認された。家族例の病理学的所見では、障害部位は進行性核上性麻痺に類似するが3+4リピートタウが蓄積しtufted astrocyteが認められてないことから、進行性核上性麻痺とは異なるタウオパチーと考えられるが、臨床的に孤発性進行性核上性と診断された患者の約10%にBSN遺伝子変化を伴っていたことから、JALPAC(Japaneseパーキンソン病およびその類縁疾患であるパーキンソン症候群は発症頻度の多い神経疾患であり、パーキンソン病のみでも人口10万人あたり100150人程度発症する。加齢が発症の危険因子であることも知られており、高齢化社会を迎えて、今後患者数はますます増加することが予想される。パーキンソン病以外のパーキンソン症候群においては、その病態機序は未解明な部分が多く、根治療法も見出されていない。パーキンソン症候群のなかで、進行性核上性麻痺は体幹部に強いパーキンソニズム、認知機能障害、垂直方向性の核上性眼球運動障害を主徴とする疾患であり、パーキンソニズムを呈する神経変性疾患のなかでは、パーキンソン病、多系統萎縮症に次いで頻度の高い疾患である。進行性核上性麻痺は前頭葉機能の低下も伴うことから、前頭側頭葉変性症の範疇にも分類されており、認知機能障害の観点からも病態解明が望まれる疾患である。通常は孤発性に発症する疾患であるが、われわれは最近、世界的にみても過去にわずかしか報告のない、家族性に発症する進行性核上性麻痺類似の神経変性疾患家系を経験した。まずはこの家系を対象に、神経病理学的解析と遺伝学的解析を行った。その結果、次世代シークエンサーを用いたエクソーム解析によって、1つの候補遺伝子を見出した。病理学的解析では、淡蒼球、視床下核、黒質の神経変性を伴い、3リピートと4リピートのタウ蛋白の蓄積を伴う新しい神経変性疾患である可能性を見出した。また孤発性進行性核上性麻痺の一部にもこの遺伝子変異が関与する可能性も見出した。これらの知見について報告すべく、現在英文誌に投稿中である。同時に見出した候補遺伝子の翻訳タンパクがバイオマーカーになり得る可能性を考慮し、血漿と髄液を用いELISA測定を試行中である。研究成果に基づき、論文作成および投稿まで進捗している。ついで、新たな家系の調査や孤発性疾患との関与、バイオマーカー探索を継続する予定である。

この家族歴のある患者を対象に過去にPSPの原因遺伝子として報告されている遺伝子やパーキンソン病や認知症の原因遺伝子などを含む50遺伝子を候補遺伝子として解析したが、それらの遺伝子には原因となる変異を認めなかった。そこでさらに、全エクソーム解析および連鎖解析を実施し、bassoon(BSN)遺伝子に発症者特異的にミスセンス変異が存在することを見出した。bassoon蛋白は神経終末アクティブゾーンに存在する巨大蛋白質である。さらに孤発PSP患者41名を対象に解析したところ、4名の患者において3種類のミスセンス変異が認められた。これらの遺伝子変化は健常者データベースには記載が無いか、あっても0.5%以下のまれな変化であった。次いで、遺伝子変化を導入した変異型ラットBSN遺伝子と野生型ラットBSN遺伝子を導入したHEK293T細胞でタウ蛋白を比較検討すると、遺伝子変化を導入した細胞で不溶性のタウ蛋白が多く存在することが見出され、この遺伝子変化により不溶性のタウ蛋白が蓄積することが確認された。この結果を踏まえて、現在この遺伝子変化のPSP病態への関与について共同研究が進捗中である。北海道大学で実施された先行研究の結果を示す。家族歴のある患者を対象に過去に進行性核上性麻痺の原因遺伝子として報告されている遺伝子やパーキンソン病や認知症の原因遺伝子などを含む50遺伝子を候補遺伝子として解析したが、それらの遺伝子には原因となる変異を認めなかった。進行性核上性麻痺と臨床診断された孤発例患者41名を対象に解析したところ、4名の患者において3種類のミスセンス変異が認められた。次いで、遺伝子変化を導入した変異型ラットBSN遺伝子と野生型ラットBSN遺伝子を導入したHEK293T細胞でタウ蛋白を比較検討すると、遺伝子変化を導入した細胞で不溶性のタウ蛋白が多く存在することが確認された。進行性核上性麻痺(PSP)は孤発性疾患であるが、まれに家系内に複数の発症者をみた家系も報告されている。われわれは、認知症とパーキンソン症状を主な症状とし臨床的に進行性核上性麻痺と診断し、病理学的に海馬、淡蒼球、視床下核、黒質の神経変性を伴い、3リピートと4リピートのタウ蛋白の蓄積を伴う家族性神経変性疾患があることを見出した。
選択的波長を利用した光線療法の開発とその作用機序の解析

従来のPUVA療法やUVB(Broad-band UVB)とは違い、選択的な波長を用いることで、安全性と有効性を高め難治性皮膚疾患に応用することが大きな目標である。紫外線領域のみならず可視光線領域を含め、波長ごとの光生物学的作用を検討する必要がある。これまで、UVA1によって生じる病因となるT細胞アポトーシスの検討を行ってきた。UVA1療法で皮膚の真皮に浸潤する活性化T細胞(アトピー性皮膚炎)、すなわち病因となる細胞が、アポトーシスを起こして除かれ病変が良くなることをこれまでに明らかにしている。また、悪性T細胞は、正常T細胞に比べ、明らかにUVA1に対して感受性が高くアポトーシスを起こしやすいことを明らかにしている。これはUVA1照射によって選択的に悪性T細胞にアポトーシスを起こすことを示唆した。UVAの領域におけるアポトーシスを波長ごとに詳細に解析した。さらに、制御性T細胞の誘導について、UVA1光源を用い検討を行った。UVAの領域におけるアポトーシスは、短い波長が最も強く誘導される以外、360-380nm付近で、第2のピークがあることが明らかとなった。また、制御性T細胞に関しては、CD4+CD25+Foxp3+T細胞は明らかに誘導されるものの、免疫寛容は誘導されず、照射量や繰り返し照射、さらには照射のタイミングなどをさらに検討して、最終的な結論を導き出したい。新たな紫外線療法として、340-400nmの波長を用いるUVA-1療法が開発された。ソラレンを用いないため、高出力のメチルハロゲンランプが光源として用いられる。名古屋市立大学大学院医学研究科加齢・環境皮膚科学では、これまで約10年にわたり、UVA1領域の研究をすすめてきた。アトピー性皮膚炎においてUVA-1照射が真皮に浸潤したCD4陽性T細胞にアポトーシスを起こすことにより、浸潤T細胞が消失し治癒することを明らかにした。このアポトーシスの機序明らかにするため、皮疹からCD4陽性T細胞をクローン化しin vitroでUVA-1照射したところ、同様にアポトーシスが起こり、それはFAS-FASLの系、一重項酸素産生を介すことを明らかとなり、一方、UVA-1では線維芽細胞、角化細胞ともT細胞に比ベアポトーシスは起こり難いことが明らかとなり、むしろ角化細胞ではsFASLが産生され、それによってT細胞がアポトーシスを起こすこと、paracrineの機序が示唆された。活性化もしくは悪性化したT細胞は、正常(活性化していない)T細胞に比べると感受性が高いことも明らかとなり、皮膚T細胞リンパ腫、アトピー性皮膚炎のなどのT細胞が病因と考えられる皮膚疾患に対してUVA-1が有効であることが作用機序から明らかとなった。340-400nmのすべての波長が、これらのアポトーシスの誘導や治療に必要か明らかではない。ナローバンドUVBと同様に、UVA領域でも、治療上有益な波長を探すことは可能か、モノクロメーターを用いて、波長ごとのアポトーシス誘導に関して今回研究を進めた。まだ、現在追試中であるが、UVA領域での波長ごとのアポトーシス誘導に対して、抗酸化剤・OGG1リポゾームの添加、D20存在下での照射を行い、各波長におけるアポトーシス誘導のメカニズムの解析を行った。新たな紫外線療法として,340-400nmの波長を用いるUVA-1療法が開発された。ソラレンを用いないため,高出力のメチルハロゲンランプが光源として用いられる.名古屋市立大学大学院医学研究科加齢・環境皮膚科学では,これまで約10年にわたり,UVA1領域め研究をすすめてきた。アトピー性皮膚炎においてUVA-1照射が真皮に浸潤したCD4陽性T細胞にアポトーシスを起こすことにより,浸潤T細胞が消失し治癒することを明らかにした。このアポトーシスの機序明らかにするため,皮疹からCD4陽性T細胞をクローン化し.

in vitroでUVA-1照射したところ,同様にアポトーシスが起こり,それはFAS-FASLの系,一重項酸素産生を介すことを明らかとなり,一方,UVA-1では線維芽細胞,角化細胞ともT細胞に比ベアポトーシスは起こり難いことが明らかとなり,むしろ角化細胞ではsFASLが産生され,それによってT細胞がアポトーシスを起こすこと,paracrineの機序が示唆された。活性化もしくは悪性化したT細胞は,正常(活性化していない)T細胞に比べると感受性が高いことも明らかとなり,皮膚T細胞リンパ腫,アトピー性皮膚炎のなどのT細胞が病因と考えられる皮膚疾患に対してUVA-1が有効であることが作用機序から明らかとなった。340-400nmのすべての波長が,これらのアポトーシスの誘導や治療に必要か明らかではない。ナローバンドUVBと同様に,UVA領域でも,治療上有益な波長を探すことは可能か,モノクロメーターを用いて,波長ごとのアポトーシス誘導に関して今回研究を進めた。まだ,現在追試中であるが,UVA領域での波長ことのアポトーシス誘導に対して,抗酸化剤・OGG1リポゾームの添加,D20存在下での照射を行い,各波長におけるアポトーシス誘導のメカニズムの解析を行った。従来のPUVA療法やUVB(Broad-band UVB)とは違い、選択的な波長を用いることで、安全性と有効性を高め難治性皮膚疾患に応用することが大きな目標である。紫外線領域のみならず可視光線領域を含め、波長ごとの光生物学的作用を検討する必要がある。これまで、UVA1によって生じる病因となるT細胞アポトーシスの検討を行ってきた。UVA1療法で皮膚の真皮に浸潤する活性化T細胞(アトピー性皮膚炎)、すなわち病因となる細胞が、アポトーシスを起こして除かれ病変が良くなることをこれまでに明らかにしている。また、悪性T細胞は、正常T細胞に比べ、明らかにUVA1に対して感受性が高くアポトーシスを起こしやすいことが明らかにしている。これはUVA1照射によって選択的に悪性T細胞にアポトーシスを起こすことを示唆した。UVAの領域におけるアポトーシスを波長ごとに詳細に解析した。さらに、制御性T細胞の誘導について、UVA1光源を用い検討を行った。UVAの領域におけるアポトーシスは、短い波長が最も強く誘導される以外、360-380nm付近で、第2のピークがあることが明らかとなった。また、制御性T細胞に関しては、CD4+CD25+Foxp3+T細胞は明らかに誘導されるものの、免疫寛容は誘導されず、照射量や繰り返し照射、さらには照射のタイミングなどをさらに検討して、最終的な結論を導き出したい。
高等植物におけるペプチド性細胞増殖因子受容体の解析

多細胞生物においては,個体の恒常性を維持するために個々の細胞間のコミュニケーションが重要な役割を担っている.申請者らが1996年に発見したPSKは,オートクリン型の細胞間情報伝達因子として,植物細胞の分化全能性の制御に関与していることが推定されている.本研究では,PSKの個体レベルでの役割を解明することを最終目的として,PSK受容体のクローニングを目指した.PSK受容体を多量に発現していることが明らかとなっているニンジン培養細胞株を用いて,受容体の可溶化条件を検討した結果,一般的な界面活性剤であるTX-100により効率よく可溶化されることが明らかとなった.次に,効率よく受容体分子を精製するためにアフィニティーカラムの調製を試みた結果,[Lys^5]PSKの側鎖アミノ基にスペーサーを介してセファロースに固定化したカラムが,受容体に対する高い親和性を示すことが明らかとなった.このカラムを用いて4.8gのニンジン膜画分から受容体を精製した結果,SDS-PAGE上で120および150kDの位置にPSK特異的な結合活性を示すタンパク質が得られた.得られたタンパク質の内部アミノ酸配列の解析結果に基づき設計したプライマーを用いて,PCR法による受容体cDNAのクローニングを行なった結果,これらのタンパク質はロイシンリッチリピート型受容体キナーゼの一種であることが明らかとなった.このタンパク質を過剰発現させた細胞では,PSK結合活性の顕著な増加とPSKに対する応答性の向上が確認されたことから,真のPSK受容体であると結論づけられた.多細胞生物においては,個体の恒常性を維持するために個々の細胞間のコミュニケーションが重要な役割を担っている.申請者らが発見したPSKも,オートクリン型の増殖因子として,細胞培養時だけでなく植物体内においても一定量の発現が検出されており,細胞増殖の制御に関与していることが明らかとなりつつある.本研究では,まず,PSK受容体を多量に発現していることが明らかとなっているニンジン培善細胞株を用いて,受容体の可溶化条件を検討した結果,一般的な界面活性剤であるTX-100により効率よく可溶化されることが明らかとなった.次に,効率よく受容体分子を精製するためにアフィニテイーカラムの調製を試みた結果,I[Lys5]PSKの側鎖アミノ基にスペーサーを介してセファロ一スに固定化したカラムが,受容体に対する高い親和性を示すことか明らかとなった.このカラムを用いて4.8gのニンジン膜画分から受容体を精製した結果,SDS-PAGE上で120および150kDの位置にPSK特異的な結合活性を示すタンパク質が得られた.得られたタンパク質の内部アミノ酸配列の解析結果に基づき設計したプライマーを用いて,PCR法による受容体cDNAのクローニングを行なった結果.これらのタンパク質は受容体型キナーゼの一種であることか明らかとなった.現在,これらのタンパク質をニンジン細胞で過剰発現させ,得られた細胞膜画分のPSK結合活性の変化を検討している.多細胞生物においては,個体の恒常性を維持するために個々の細胞間のコミュニケーションが重要な役割を担っている.申請者らが1996年に発見したPSKは,オートクリン型の細胞間情報伝達因子として,植物細胞の分化全能性の制御に関与していることが推定されている.本研究では,PSKの個体レベルでの役割を解明することを最終目的として,PSK受容体のクローニングを目指した.PSK受容体を多量に発現していることが明らかとなっているニンジン培養細胞株を用いて,受容体の可溶化条件を検討した結果,一般的な界面活性剤であるTX-100により効率よく可溶化されることが明らかとなった.次に,効率よく受容体分子を精製するためにアフィニティーカラムの調製を試みた結果,[Lys^5]PSKの側鎖アミノ基にスペーサーを介してセファロースに固定化したカラムが,受容体に対する高い親和性を示すことが明らかとなった.このカラムを用いて4.8gのニンジン膜画分から受容体を精製した結果,SDS-PAGE上で120および150kDの位置にPSK特異的な結合活性を示すタンパク質が得られた.得られたタンパク質の内部アミノ酸配列の解析結果に基づき設計したプライマーを用いて,PCR法による受容体cDNAのクローニングを行なった結果,これらのタンパク質はロイシンリッチリピート型受容体キナーゼの一種であることが明らかとなった.このタンパク質を過剰発現させた細胞では,PSK結合活性の顕著な増加とPSKに対する応答性の向上が確認されたことから,真のPSK受容体であると結論づけられた.