hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
コーポレート・ガバナンス、会計監査、利益の質の関連性に関する実証的研究

追加分析からは,第一に、ガバナンスの独立性の水準と監査報酬が正の関連性があること、第二に、所有構造の違いはガバナンス構造および監査報酬と関連性があることを示唆させる証拠が発見された。本研究の特徴は、これまでわが国では制度、実務上は重要性が指摘されながらも、学術的な解明が十分に行われておらずミッシングリンクであったコーポレート・ガバナンス、監査報酬、利益管理の関連性について理論的、実証的な解明を行ない、新たな知見を提供している点である。第一に、わが国でも外国人投資家や機関投資家を背景としてガバナンスの独立性が強化されているとともに独立性の高いガバナンスと外部監査は相互に関連性をもつ、第二に、独立性の高いガバナンスと十分な監査報酬には経営者の利益管理を抑制するという仮説と一貫する証拠が観察された。また第三に、社外取締役と社外監査役、独立取締役(監査役)と関係取締役(監査役)の役割に相違があること、第四に、これらガバナンス構造と所有構造との関連性には一定の類型的特徴があることを明らかにした点は、今後の関連分野の研究に対する貢献となる。
植物二次代謝産物の分子多様性を創出するIII型ポリケタイド合成酵素の構造機能解析

薬用植物キダチアロエ(Aloe arborescens)より、オクタケタイド及びペンタケタイドの骨格を構築する2種の新規III型ポリケタイド合成酵素(PKS)のクローニングと機能解析に成功した。アミノ酸レベルで互いに90%の相同性を示すオクタケタイド合成酵素(OKS)とペンタケタイドクロモン合成酵素(PCS)は、8分子あるいは5分子のマロニルCoAを基質として、SEK4b及び5,7-dihydroxy-2-methylchromoneをそれぞれ主生成物とする。活性部位キャビティを構成するThr197が、OKSではGlyに、一方、PCSにおいてはMetに特徴的に置換されていることに着目し、このアミノ酸残基に部位特異的変異を導入することにより、酵素機能に及ぼす効果を検討した。まず、ペンタケタイドを生成するPCSについて、Met197をOKSと同じくGlyで置換したところ、このM197G点変異酵素がSEK4bを生成することを見出した。即ち、驚くべきことに、単一アミノ酸残基の置換によって、PCSからOKSへの酵素機能の変換がなされたことになる。一方、逆に、OKSにG197M点変異を導入した場合、オクタケタイド生成能が完全に消失して、代わりに新規ペンタケタイド2,7-dihydroxy-5-methylchromoneが生成した。また、G197Tではヘキサケタイド6-(2,4-dihydroxy-6-methylphenyl)-4-hydroxy-2-pyroneの生成が、さらに、G197Aではヘプタケタイドaloesoneの生成が認められた。この結果、活性部位キャビティを構成する単一アミノ酸残基の置換によって、しかもその側鎖の立体的な大きさに単純に依存して、マロニルCoA縮合数と生成物特異性が決定されることが明らかになった。薬用植物ダイオウとアロエは、クロモンやナフタレン誘導体をはじめアントラキノンなどを豊富に含む薬用植物であり、従って植物に普遍的に存在するカルコン合成酵素以外にも、複数のポリケタイド合成酵素の存在が予想される。そこでカルコン合成酵素との配列相同性に基づくPCR、及び、cDNAライブラリーのスクリーニングにより、これら生合成酵素遺伝子のクローニングに着手し、これまでにカルコン合成酵素とは50%程度の配列相同性しか示さない複数の新規クローンを得ることに成功した。組み換え酵素を大腸菌に異種発現し、その機能解析を行うことにより、このうち2つは、5分子あるいは7分子のマロニルCoAから、それぞれペンタケタイドとヘキサケタイドの骨格を構築する新規III型ポリケタイド合成酵素であることを明らかにした。また、部位特異的変異酵素を作成し、その活性を検討することにより、酵素活性の発現に重要な役割を演ずるアミノ酸残基を特定した。さらに、酵素の立体構造の解明をめざし、結晶化にも着手した。一方、今回新たに長鎖脂肪酸COAエステルをカルコン合成酵素に作用させ、基質特異性を検討したところ、C_<14>脂肪酸エステルから2分子のマロニルCoAを縮合したトリケタイドラクトンの生成などが認められ、ウルシオール(C_<16>脂肪酸エステルに由来)を初めとする植物二次代謝産物の生合成においても、III型ポリケタイド合成酵素が関与する可能性が示された。を考える上で興味深い知見を得られつつある。薬用植物キダチアロエ(Aloe arborescens)より得た、オクタケタイド及びペンタケタイドの骨格を構築する新規III型ポリケタイド合成酵素(PKS)におけるポリケタイド鎖長制御機構を解明した。

活性部位キャビティを構成するThr197が、OKSではGlyに、一方、PCSにおいてはMetに特徴的に置換されていることに着目し、このアミノ酸残基に部位特異的変異を導入することにより、酵素機能に及ぼす効果を検討した。まず、ペンタケタイドを生成するPCSについて、Met197をOKSと同じくGlyで置換したところ、このM197G点変異酵素がSEK4bを生成することを見出した。即ち、驚くべきことに、単一アミノ酸残基の置換によって、PCSからOKSへの酵素機能の変換がなされたことになる。一方、逆に、OKSにG197M点変異を導入した場合、オクタケタイド生成能が完全に消失して、代わりに新規ペンタケタイド2,7-dihydroxy-5-methylchromoneが生成した。また、G197Tではヘキサケタイド6-(2,4-dihydroxy-6-methylphenyl)-4-hydroxy-2-pyroneの生成が、さらに、G197Aではヘプタケタイドaloesoneの生成が認められた。この結果、活性部位キャビティを構成する単一アミノ酸残基の置換によって、しかもその側鎖の立体的な大きさに単純に依存して、マロニルCoA縮合数と生成物特異性が決定されることが明らかになった。
ハロゲン原子の特性に着目した繊維状タウタンパク質選択的PETプローブの開発

操作性に優れた凝集タウ選択的PET薬剤の創製を目的として、PBB3の共役ジエン構造にクロロアルケンを導入したクロロアルケン型誘導体ITY11-397の開発研究を行なった。その結果、2-クロロ-5-シアノピリジンから8工程で所望のITY11-397を合成に成功した。ITY11-397の光安定性を評価したところ、対応する水素体と比較して6倍以上光安定性が向上することを明らかにした.加えて, ITY11-397は蛍光試験によって2N3R型Tauに対して高選択的に結合することを見出した。これらの成果は,共役ポリエン構造を含む機能性分子の開発研の進展に資するものである。本研究課題では、タウタンパク質の凝集体に結合するPET薬剤: PBB3の共役ジエン構造にクロロアルケンを導入したPBB3誘導体(Cl-PBB3)の開発研究を行うことにより、可視光や酸化反応に安定な凝集タウ選択的PETプローブを目指す研究課題である。平成29年度は、計算化学的手法によって構造最適化を行い、PBB3の共役ジエン構造における塩素原子の導入位置を精査した結果、3位に塩素原子を導入したCl3-PBB3がHOMO-LUMO間のエネルギー差が大きいことを明らかにした。そこで、まずモデル基質として、PBB3の部分構造であるベンゾチアゾール骨格を含む共役ジエン化合物を合成し、オレフィン上の置換基導入に伴う光安定性を精査した。その結果、塩素原子を導入することで、紫外光350 nmに対する安定性が約6倍向上することを見出した。さらに、過酸化物を用いた酸化反応に対する化学的安定性についても検討した結果、塩素置換体は水素置換体に比べ、安定性が約10倍向上することを見出した。また、モデル基質だけでなく、PB3誘導体も合成し、同様に評価したところ、紫外光や酸化反応に対して大幅に安定性が向上することが明らかとなった。なお、本年度の研究遂行を通じて明らかになった問題として、含塩素共役ジエン化合物のベンゾチアゾール骨格におけるメトキシ基からヒドロキシ基への脱保護反応が予想に反して著しく遅いことが明らかとなってきた。そこで、現在フェノール性水酸基の保護基の再検討ならびにPET薬剤へと実用化するための新規合成経路について検討を加えている。クロロアルケン骨格を導入した共役ジエン化合物の合成を行い、紫外光や酸化反応に対する安定性を評価することで、クロロアルケンを含む共役ジエン化合物が高い化学的安定性を有することを明らかにした。また、メチル置換体ならびにフッ素置換体を用いて同様に評価した結果、塩素原子導入に伴う化学的安定性の向上は、非局在化したπ電子系の高い平面性を崩す効果(分子をねじる)に加え、高い電気陰性度に起因する電子的効果に由来するものであることを明らかにした。化合物合成が予定より順調に進んだこと、本研究課題で提案したハロゲン原子による効果が期待通り得られたことから、研究はほぼ順調に進展していると判断している。本研究課題では、ハロアルケン骨格をアルケン等価体として利用することで、可視光や酸化反応に安定な操作性に優れた凝集タウ選択的PETプローブの創製を目的とする。平成29年度は、タウタンパク質の凝集体に結合するPET薬剤: PBB3の共役ジエン構造にクロロアルケンを導入したPBB3誘導体の有用性について検討した。共役ジエン構造における置換基効果:平成28年度までの検討において、PBB3の共役ジエン構造に塩素原子を導入することで、紫外光や酸化反応に対して大幅に化学的安定性が向上することを見出していた。この結果を踏まえ、フッ素原子やメチル基など種々の置換基を有する誘導体を合成し、塩素原子の置換基効果の優位性について検討した。その結果、塩素原子導入に伴う化学的安定性の向上は、電子的効果に加え、立体的効果によるものであることが明らかになった。タウタンパク質に対する結合能の評価:βシート構造を形成するタウタンパク質の微小管結合領域中の6残基ペプチド(VQIVYK)およびアミロイドβの7残基ペプチド(KLVFFAE)を用いて、新たに見出したPBB3誘導体ITY11-397の凝集ペプチドに対する結合能および凝集Tau/ Aβへの結合選択性を蛍光試験によって検討した。その結果、ITY11-397はAβフラグメントペプチドに比べ、Tauフラグメントペプチドに対する蛍光強度の増大が大きいことから、Tau選択的結合能を有していることが明らかになった。同様にして、42残基のアミノ酸からなるAβ42および2N3R型Tauを用いて検討したところ、ITY11-397はタンパク質レベルにおいてもTau選択的に結合することが明らかになった。これらの結果は、凝集タウ選択的PETプローブの開発研究において重要な基礎的知見を与えるものである。

本研究課題で提案したハロアルケン骨格を、ペプチド結合等価体ではなく、アルケン等価体として利用するアイディアは一応の成功を納めていると判断している。しかしながら、最終工程における脱保護の反応効率の向上や、合成した化合物のタンパク質レベルでの実用性を明らかにすることが必要である。そこで、今後の検討課題として次の点を推進する予定である。PET薬剤への応用を指向したCl3-PBB3の実践的合成法の開発タウモデルペプチドならびにタウタンパク質における有用性の検証これらを通じて、Cl3-PBB3の有用性、実用性、汎用性を明らかにすることで、真に実用的な可視光や酸化反応に安定な凝集タウ選択的PETプローブの開発を行う予定である。創薬化学、有機合成化学、ペプチド化学
中国における胃がんの血清疫学的研究

1.一般住民における各種血清指標の分布の検討瀋陽市内の供血センターに、20歳代から50歳代までの供血者のうち、各年代男女各50検体計400検体のパイロット血清の供与を依頼した。50歳代の供血者が少ないため、一部瀋陽市内医療施設の外来患者の血清を加え、最終的に380検体の血清を収集した。これらについて、ペプシノーゲンIおよびII値をダイナボット社製RIAキットにより、H.pylori抗体をバイオメリカ社製ELISAキットにより、β-カロテンをHPLC法により測定した。現在までに20歳代40歳代の3年齢階級の分析を完了した(β-カロテンについては全例を完了)。それらの測定結果の概要について述べる。(1)ペプシノーゲン値:ペプシノーゲンI値の平均は男58.5±24.6mg/dl、女38.4±14.8mg/dlであり、宮城県の同年代の値(男47.3±17.5mg/dl、女44.7±17.6mg/dl)に比して男で高値、女で低値であった。ペプシノーゲンII値は男13.1±7.7mg/dl、女8.9±5.1mg/dl)で宮城県の値(男13.9±8.4mg/dl、女12.9±10.6mg/dl)に比べると女で低い傾向が見られた。ペプシノーゲンIおよびII値から診断される慢性萎縮性胃炎の有病率は、男5.2%(7/134)、女10.3%(15/146)で、宮城県の有病率(男30.0%、女26.7%)より有意に低かった。(2)H.pylori抗体:陽性率は男40.3%(54/134)、女39.0%(57/146)であり、宮城県の陽性率(男50.8%、女35.0%)に比べて男で低い傾向が見られた。(3)慢性萎縮性胃炎とH.pylori感染の関連性:慢性萎縮性胃炎有病者のH.pylori抗体陽性者率は85.7%(6/7)であるのに対し、慢性萎縮性胃炎のない者の陽性率は37.8%(48/127)であり、H.pylori感染のオッズ比は9.9と計算された。これは宮城県で行なった研究のリスク(オッズ比12.6)と同程度であった。(4)β-カロテン値:男20.3±20.8μg/dl、女32.7±28.7μg/dlで、女性に有意に(p<0.01)高値であった。宮城県の4044歳のβ-カロテン値は男18.2±25.1μg/dl、女38.3±34.2μg/dlであり、β-カロテン値に関しては、日中の差が著明ではなかった。2.胃がんのケース・コントロール研究遼寧省腫瘤病院およびその関連病院に入院した胃がん患者をケース、同時期に入院した他疾患(がん、消化器疾患を除く)の患者をコントロールとしたケース・コントロール研究を行なった。これらに対し、医師によるライフスタイルに関するインタビュー調査および血清採取を行なった。現在までに、ケース50例、コントロール150例が集積されている。集積されたデータをもとにロジスティックモデルにより解析した結果について概説する。(1)胃がんのリスクを有意に上げている要因:胃がんの家族歴(オッズ比34)、精神的なショック(オッズ比5.0)、せっかちな性格(オッズ比4.6)、不愉快なことをがまんする(オッズ比6.3)、くよくよしやすい(オッズ比2.5)、夕食を満腹になるまで食べる(オッズ比2.3)、暴飲暴食をする(オッズ比6.0)、塩辛いものが好き(オッズ比2.0)、現在喫煙(オッズ比3.7)。(2)胃がんのリスクを有意に下げている要因:生きがいがある(オッズ比0.3)、規則正しい食事(オッズ比0.3)、コウリャンの摂取(オッズ比0.2)、豚肉以外の肉類の摂取(オッズ比0.3)、卵の摂取(オッズ比0.4)、豆類の摂取(オッズ比0.2)、緑色野菜の摂取(オッズ比0.1)、その他の野菜の摂取(オッズ比0.1)、果物類の摂取(オッズ比0.4)、植物性油脂の摂取(オッズ比0.2)。血清指標(ペプシノーゲン、H.pylori抗体、β-カロテン)は、ケースの目標数(200)に達成した時点で一括測定することにするため、今回は分析していない。

現在までに20歳代40歳代の3年齢階級の分析を完了した(β-カロテンについては全例を完了)。それらの測定結果の概要について述べる。(1)ペプシノーゲン値:ペプシノーゲンI値の平均は男58.5±24.6mg/dl、女38.4±14.8mg/dlであり、宮城県の同年代の値(男47.3±17.5mg/dl、女44.7±17.6mg/dl)に比して男で高値、女で低値であった。ペプシノーゲンII値は男13.1±7.7mg/dl、女8.9±5.1mg/dl)で宮城県の値(男13.9±8.4mg/dl、女12.9±10.6mg/dl)に比べると女で低い傾向が見られた。ペプシノーゲンIおよびII値から診断される慢性萎縮性胃炎の有病率は、男5.2%(7/134)、女10.3%(15/146)で、宮城県の有病率(男30.0%、女26.7%)より有意に低かった。(2)H.pylori抗体:陽性率は男40.3%(54/134)、女39.0%(57/146)であり、宮城県の陽性率(男50.8%、女35.0%)に比べて男で低い傾向が見られた。(3)慢性萎縮性胃炎とH.pylori感染の関連性:慢性萎縮性胃炎有病者のH.pylori抗体陽性者率は85.7%(6/7)であるのに対し、慢性萎縮性胃炎のない者の陽性率は37.8%(48/127)であり、H.pylori感染のオッズ比は9.9と計算された。これは宮城県で行なった研究のリスク(オッズ比12.6)と同程度であった。(4)β-カロテン値:男20.3±20.8μg/dl、女32.7±28.7μg/dlで、女性に有意に(p<0.01)高値であった。宮城県の4044歳のβ-カロテン値は男18.2±25.1μg/dl、女38.3±34.2μg/dlであり、β-カロテン値に関しては、日中の差が著明ではなかった。2.胃がんのケース・コントロール研究遼寧省腫瘤病院およびその関連病院に入院した胃がん患者をケース、同時期に入院した他疾患(がん、消化器疾患を除く)の患者をコントロールとしたケース・コントロール研究を行なった。これらに対し、医師によるライフスタイルに関するインタビュー調査および血清採取を行なった。現在までに、ケース50例、コントロール150例が集積されている。集積されたデータをもとにロジスティックモデルにより解析した結果について概説する。(1)胃がんのリスクを有意に上げている要因:胃がんの家族歴(オッズ比34)、精神的なショック(オッズ比5.0)、せっかちな性格(オッズ比4.6)、不愉快なことをがまんする(オッズ比6.3)、くよくよしやすい(オッズ比2.5)、夕食を満腹になるまで食べる(オッズ比2.3)、暴飲暴食をする(オッズ比6.0)、塩辛いものが好き(オッズ比2.0)、現在喫煙(オッズ比3.7)。(2)胃がんのリスクを有意に下げている要因:生きがいがある(オッズ比0.3)、規則正しい食事(オッズ比0.3)、コウリャンの摂取(オッズ比0.2)、豚肉以外の肉類の摂取(オッズ比0.3)、卵の摂取(オッズ比0.4)、豆類の摂取(オッズ比0.2)、緑色野菜の摂取(オッズ比0.1)、その他の野菜の摂取(オッズ比0.1)、果物類の摂取(オッズ比0.4)、植物性油脂の摂取(オッズ比0.2)。血清指標(ペプシノーゲン、H.pylori抗体、β-カロテン)は、ケースの目標数(200)に達成した時点で一括測定することにするため、今回は分析していない。
ヒト消化器癌モノクローナル抗体結合制癌剤による標的化学療法の研究

モノクローナル抗体の導入により,単一抗原にのみ選択的に反応する特異性の高い抗体が無尽蔵に得られるようになり,医学,生物学は大きな進歩をとげつつある.本研究ではこのモノクローナル抗体を,消化器癌の診断と治療に応用するための基礎的ならびに臨床的検討を行った.その結果,胃癌の中でも診断が最も困難で予後の悪いスキルス胃癌のモノクローナル抗体と,大腸癌に特異性の高い新しいモノクローナル抗体を作製することができた.スキルス胃癌のモノクローナル抗体は,摘出胃癌組織と酵素抗体法(ABC法)で高い反応性を示し,とくにスキルス胃癌に対して100%に反応した.次に,このモノクローナル抗体をスキルス胃癌の組織診断とくに手術中の迅速診断への応用を試みた. 15分で鏡検できる新しい迅速酵素抗体染色法を開発した結果,術中に速やかにスキルス胃癌の組織診断が可能となり,切除断端の術中診断や転移の有無の組織診断も容易となった.大腸癌のモノクローナル抗体と抗癌剤とを化学的に結合させた複合体を作製し,基礎的に検討したところ,癌細胞に極めて選択毒性が高くこの複合体は,これまでにない癌選択性の高いTargeting療法として有望であることが明かとなった.そこで,この複合体を大腸癌患者に対して臨床的に初めて応用した.複合体は大腸癌に特異的に集積し,しかも癌細胞質の中まで取込まれることが明らかとなった.また,複合体投与により肝転移の縮小や症状の寛解例も認められたが,重篤な副作用は全くなかった.これらの結果から,モノクローナル抗体をcarrierとした新しいTargeting療法あるいはミサイル療法の可能性が臨床的にも示された.これまでモノクローナル抗体単独を臨床的に応用した報告は欧米にあったが,ミサイル療法の報告はこれが最初でありCancer 61:881-888, 1988に掲載された.モノクローナル抗体の導入により,単一抗原にのみ選択的に反応する特異性の高い抗体が無尽蔵に得られるようになり,医学,生物学は大きな進歩をとげつつある.本研究ではこのモノクローナル抗体を,消化器癌の診断と治療に応用するための基礎的ならびに臨床的検討を行った.その結果,胃癌の中でも診断が最も困難で予後の悪いスキルス胃癌のモノクローナル抗体と,大腸癌に特異性の高い新しいモノクローナル抗体を作製することができた.スキルス胃癌のモノクローナル抗体は,摘出胃癌組織と酵素抗体法(ABC法)で高い反応性を示し,とくにスキルス胃癌に対して100%に反応した.次に,このモノクローナル抗体をスキルス胃癌の組織診断とくに手術中の迅速診断への応用を試みた. 15分で鏡検できる新しい迅速酵素抗体染色法を開発した結果,術中に速やかにスキルス胃癌の組織診断が可能となり,切除断端の術中診断や転移の有無の組織診断も容易となった.大腸癌のモノクローナル抗体と抗癌剤とを化学的に結合させた複合体を作製し,基礎的に検討したところ,癌細胞に極めて選択毒性が高くこの複合体は,これまでにない癌選択性の高いTargeting療法として有望であることが明かとなった.そこで,この複合体を大腸癌患者に対して臨床的に初めて応用した.複合体は大腸癌に特異的に集積し,しかも癌細胞質の中まで取込まれることが明らかとなった.また,複合体投与により肝転移の縮小や症状の寛解例も認められたが,重篤な副作用は全くなかった.これらの結果から,モノクローナル抗体をcarrierとした新しいTargeting療法あるいはミサイル療法の可能性が臨床的にも示された.これまでモノクローナル抗体単独を臨床的に応用した報告は欧米にあったが,ミサイル療法の報告はこれが最初でありCancer 61:881-888, 1988に掲載された.(1)抗大腸癌モノクローナル抗体(A7)と抗癌剤ネオカルチノスタチン(NCS)との結合体の臨床投与例は40例に達した。重篤な副作用は一例も無く、本剤型が安全に使用可能であることが明らかになった。また、その治療効果について検討してみると、肝転移巣に対する投与例の中に有効例が認められた。すなわちA7-NCS投与6例中3例(50%)でX線CT像上、腫瘍径の縮少などの効果が得られた。(2)大腸癌病巣の支配動脈よりA7-NCSを投与し、その到達性について検討した。A7は抗原性の低下のためA7-NCSにすると染色性はA7単独に比較して不良であった。しかし、NCSを酵素抗体法で検索したところ、多量のNCSが大腸癌細胞の内に証明された。これはA7とNCSを結合することにより、NCSが大腸癌組織に選択的に到達し、しかも細胞質内にとりこまれることを証明したものであり、モノクローナル抗体結合制癌剤によるミサイル癌化学療法の可能性を示したものと考えられる。(3)ヒトスキルス胃癌に対するモノクローナル抗体を開発し、その特性について検討した。スキレス胃癌をヌードマウスに移植し、ヨードラベルした抗ヒトスキルス胃癌モノクローナル抗体S74を投与したところ、抗体は選択的に移殖スキルス胃癌に集積した。前述の大腸癌に対するモノクローナル抗体A7と同様に、抗癌剤のキャリアーとして使用できる可能性がある。またS202抗体は酵素抗体法でスキルス胃癌を特異的に染色したので、これを臨床に応用した。
サブミリ波帯超伝導ミキサーの基礎に関する研究

(1)ジョセフソン・ミキサーのシミュレーションシミュレーションの第一段階として、電磁波照射により誘起されるシャピロ・ステップの振る舞い、とくに、ミキサー動作のため解明が必要な応答の不安定性(カオス)の発生条件を明らかにすることを目的とした。すでに、微視的理論にもとづくシミュレーションプログラムは完成しており、シャピロ・ステップに関する予備的計算もできていたが、カオスの発生に関しては、十分系統的には調べられていなかったので、大幅な追加計算とデータ処理プログラムを作成して、カオスの発生条件等を統計的に明らかにした。結果として、エネルギーギャップ周波数以下では、高品質トンネル接合における極めて小さいリーク電流は、カオス発生を誘起しやすく、ミキサー応用上好ましくないことが判明した。エネルギーギャップ由波数以上では、ミキサー応用に希望的結果が得られた。今後は、カオス発生抑制のため、シャント抵抗を通入した場合について調べる。予備的調査では、これはカオス抑制に効果的であることが分かっている。(2)磁性バリアトンネル接合の製作磁性バリア、CrOx、をトンネルバリアとする、Nbトンネル接合の製作を目指しているが、まだ非線形性の強いよい接合は製作できない。低電圧でのスパっタを実現するため、より強磁場のスパッタ用マグネットを製作したが、実験回数が少ないので、製作条件の解明を今後行う。また、重子ビーム蒸着用チャンバーを改造し、真空度改善と、磁性酸化物のレーザアブレーションを可能とした。この装置による素子製作も今後行う。
制癌剤の生体内局在の研究(効果増強と耐性の克服)

抗アドリアマイシン抗体はアドリアマイシン(ADM)とウシ血清Albとを水溶性カルボディミドによって結合させた後コンプリート・アジュバンドと混合させウサギ皮下に投与して作製した.この抗体は感作時に用いたADM抗原によって吸収することが出来ADMに対する特異抗体であると考えられる.制癌剤の薬効作用を腫瘍の形態学的変化とADMの腫瘍内の局在の経時的変化を免疫酵素抗体法を用いて観察した.実験のための腫瘍系としてADMに感受性の弱い系としてSC115腫瘍,感受性の強い系としてCa755腫瘍系を用いた. SC115腫瘍に対するADMの効果は投与後3時間で細胞膜に染色性を認めた.しかし細胞質,核には3日後でも染色性を認めなかった.Ca755腫瘍に対するADMの効果は投与後24時間で細胞内,核に強い染色性を認めた.組織学的にはSpindleshape細胞の増加が認められた. 2日後,組織学的には殆んどの腫瘍細胞は壊死に陥っていた.壊死部にはADMの局在は観察されなかった.以上のように投与されたADMの細胞内の局在を組織学的な構造を保ったまゝinviroでの変化として観察しうることは,制癌在の効果の解析に非常に有用である.従来の制癌剤の選択は培養細胞を用いたinvitroですなわち,手術の数時間後の細胞を用いたものであった.しかしわれわれの実験では,手術の数時間前に投与された制癌剤の局在を解析することによって,より効果的な化学療法が可能となり,適確な制癌在の選択が出来る.抗アドリアマイシン抗体はアドリアマイシン(ADM)とウシ血清Albとを水溶性カルボディミドによって結合させた後コンプリート・アジュバンドと混合させウサギ皮下に投与して作製した.この抗体は感作時に用いたADM抗原によって吸収することが出来ADMに対する特異抗体であると考えられる.制癌剤の薬効作用を腫瘍の形態学的変化とADMの腫瘍内の局在の経時的変化を免疫酵素抗体法を用いて観察した.実験のための腫瘍系としてADMに感受性の弱い系としてSC115腫瘍,感受性の強い系としてCa755腫瘍系を用いた. SC115腫瘍に対するADMの効果は投与後3時間で細胞膜に染色性を認めた.しかし細胞質,核には3日後でも染色性を認めなかった.Ca755腫瘍に対するADMの効果は投与後24時間で細胞内,核に強い染色性を認めた.組織学的にはSpindleshape細胞の増加が認められた. 2日後,組織学的には殆んどの腫瘍細胞は壊死に陥っていた.壊死部にはADMの局在は観察されなかった.以上のように投与されたADMの細胞内の局在を組織学的な構造を保ったまゝinviroでの変化として観察しうることは,制癌在の効果の解析に非常に有用である.従来の制癌剤の選択は培養細胞を用いたinvitroですなわち,手術の数時間後の細胞を用いたものであった.しかしわれわれの実験では,手術の数時間前に投与された制癌剤の局在を解析することによって,より効果的な化学療法が可能となり,適確な制癌在の選択が出来る.
フェムト秒レーザーによるタンパク質結晶成長モードの時空間制御

“フェムト秒レーザー照射による結晶表面への渦巻き成長誘起"現象について、原理解明を行った。対象とする物質に応じて、レーザー照射条件の最適値(特に照射パルス数)があり、照射パルス数が少ない場合には渦巻き成長が誘起されず、逆に多すぎる場合には渦巻き成長誘起とともに多結晶化が起こることが分かった。X線トポグラフィ観察により、レーザー集光位置かららせん転位が発生し、これを中心にうずまき成長丘ができることが示された。本手法で育成した結晶は単結晶性を維持し高品質であり、さらに内包する不純物量が少ないことが分かった。結果として本手法は、成長促進に加え、高品質化を促す可能性が示された。有効なドラッグデザインのためにはタンパク質分子の立体構造の解明が必須であるが、それを実現させるには構造解析に足る高品質なタンパク質結晶が必要である。申請者らは、フェムト秒レーザーをタンパク質結晶の表面に直接照射することで、結晶の成長機構を高品質化に有利とされている「渦巻き成長機構」へ転換できる技術を高度化し、高品質かつ大型なタンパク質結晶の育成技術の開発を目的とする。本技術は申請者らによって世界で初めて見出されたものである。これまでに開発してきたフェムト秒レーザーによる結晶核発生技術と組み合わせることで、タンパク質の核発生から成長までをレーザーで一貫制御することを目指して研究を行った。平成27年度は特に、鶏卵白リゾチームの正方晶結晶表面に渦巻き成長丘を誘起可能なレーザー照射条件および溶液の過飽和条件(σ:濃度に対応)に関して成果を得た。現時点で最適なレーザー照射方法は、集光点をある程度走査する集光走査という方法である。また、渦巻き成長の誘起にはレーザー照射総パルス数が重要であり、今回検証したσ=2.8程度の過飽和条件において、照射総パルス数が4000パルス程度の走査が結晶表面に単独の渦巻き成長丘を発生するのに最適であることが分かった。一方、パルス数が少なすぎると渦巻き成長は発生せず、照射総パルス数が大きすぎる(例えば20000パルス)と、結晶表面に多数の微結晶が晶出し、結晶が多結晶化してしまうことも明らかになった。鶏卵白リゾチーム(HEWL)をモデル物質として用い、正方晶結晶の{110}面に渦巻き成長を誘起可能なレーザー照射条件および溶液の過飽和度条件を検討した。結晶へのレーザー照射方法としていくつかの照射方法(結晶表面への直接集光、集光点の走査、レーザーによって生じたキャビテーションバブルを衝突させるなど)を試みた。その結果、レーザーを結晶表面近傍に、集光走査する方法が最も渦巻き成長誘起に適していることが分かってきた。また、レーザーを集光走査する際のパワーおよびパルス繰り返し周波数を最適化する必要性も明らかになった。パルス数が少なすぎると渦巻き成長は発生せず、照射総パルス数が大きすぎる(例えば20000パルス)と、結晶表面に多数の微結晶が晶出し、結晶が多結晶化してしまう。今回、σ=2.8程度の過飽和条件において、照射総パルス数が4000パルス程度の走査により、結晶表面に単独の渦巻き成長丘を発生可能であることが明らかになった。また、この適切な照射総パルス数は、溶液の過飽和度に依存してシフトすることも明らかになった。これらは当初の計画どおりの進行であり、よって評価を2とする。平成28年度には、本技術で渦巻き成長した結晶について欠陥のキャラクタリゼーションを行った。また、タンパク質構造解析にとって最重要である、X線構造解析分解能への影響も評価した。結晶の欠陥評価は、実験室内の結晶表面観察装置とKEKなどの放射光施設を併用して行った。はじめに、結晶の大部分を渦巻き成長機構で成長させた結晶を作成した。この結晶の表面をごく微小量溶かすことで、結晶内部に取り込まれている不純物の密度や、結晶欠陥の密度を見積もった。その結果、渦巻き成長で成長した結晶は、劇的に不純物の取り込み量が低減していることが明らかになった。次に、同様にして得た結晶をKEKにおいてX線トポグラフィ観察し、結晶内部の欠陥の同定を行った。その結果、フェムト秒レーザー照射を施した場所から、らせん転位と呼ばれる欠陥が発生していることを確認した。このらせん転位の直上に、実際にうずまき成長が形成されていた。同様にして得た結晶をSPring8にて評価したところ、フェムト秒レーザーを照射したにも関わらず結晶品質は良好であり、単結晶性を保存しながら成長を続けていることが明らかになった。また、他タンパク質への技術適用という課題においては、インシュリン結晶について実験を行い、同様に意図した場所に渦巻き成長丘を発生させることに成功している。平成2728年度に予定していたフェムト秒レーザー照射による渦巻き成長誘起条件の探索が順調に終了しており、結晶成長のかなり早い段階で渦巻き成長を誘起することに成功している。これにより、結晶全体の80%近くの体積が、渦巻き成長機構で成長した結晶を作ることができた。これらの結晶を用いることで、渦巻き成長誘起結晶の品質評価(平成2728年度予定)を進めることができた。SPring8およびKEKという2つの放射光施設にて結晶の評価を行ったところ、SPring8では、結晶そのものに直接レーザー照射を施しているにも関わらず単結晶性が維持され、その品質は良好であるという重要な結果が得られている。また、KEKにおいてはフェムト秒レーザーにより、結晶内部へのらせん転位の意図的導入が実現できると示した。

顕微鏡観察の結果と照らし合わせることで、このらせん転位上に渦巻き成長丘が発生していることも明らかになっている。結晶表面の微小量エッチングにより、渦巻き成長をした場合、従来多く見られる二次元核発生で成長した結晶と比べて飛躍的に不純物の取り込み量が低減していることが示されている。平成2829年度に予定していた他タンパク質への技術適用という課題においては、インシュリン結晶について実験を行い、同様に意図した場所に渦巻き成長丘を発生させることに成功した。これにより、技術の汎用性を示すことができた。上記理由より、研究は計画以上に進展していると評価する。平成28年度までに、本課題で目標としていた渦巻き成長誘起技術の確立、他サンプル(ウシ脾臓由来インシュリン)への技術適用、本技術で得られた単結晶の評価まで一連を完了することができた。また、その成果についても平成28年度中に報告することができ、Nature Photonics誌に掲載されるに至った。そのため平成29年度には、本技術を幅広い材料に展開するために、有機低分子アスピリンなどを新たなモデル物質として取り扱う挑戦を行った。また、鶏卵白リゾチームに関しても、別の結晶面に対して技術適用を行う検討を行った。鶏卵白リゾチームについては、これまでに正方晶{110}面へのレーザー照射を行っていた。今回、鶏卵白リゾチーム正方晶{101}面へのレーザー照射を試みた。この面は通常二次元核形成が支配的に進む面であったが、{110}面と同様に渦巻き成長を誘起することに成功した。この時の成長丘は、{110}面に照射した時に比べて同心円状に近い形状になることが分かった。有機低分子のアスピリン結晶については、本研究室のフェムト秒レーザーで核形成を誘起できる条件が明確になった。この条件に基づき、単結晶をレーザー照射可能なサイズまで育成できる条件も明確化した。このようにして得られたアスピリン単結晶にレーザー照射を行ったところ、リゾチームと同様の条件では結晶が破砕された。アスピリン結晶は板状の結晶のため、レーザーの強度のさらなる微調整が必要であった。その後の検討で、アスピリン単結晶を破壊しないレーザー強度が分かった。“フェムト秒レーザー照射による結晶表面への渦巻き成長誘起"現象について、原理解明を行った。対象とする物質に応じて、レーザー照射条件の最適値(特に照射パルス数)があり、照射パルス数が少ない場合には渦巻き成長が誘起されず、逆に多すぎる場合には渦巻き成長誘起とともに多結晶化が起こることが分かった。X線トポグラフィ観察により、レーザー集光位置かららせん転位が発生し、これを中心にうずまき成長丘ができることが示された。本手法で育成した結晶は単結晶性を維持し高品質であり、さらに内包する不純物量が少ないことが分かった。結果として本手法は、成長促進に加え、高品質化を促す可能性が示された。平成28年度には、本技術で渦巻き成長した結晶について欠陥のキャラクタリゼーションを行う。また、タンパク質構造解析にとって最重要である、X線構造解析分解能への影響も評価する。結晶の欠陥評価は、実験室内の結晶表面観察装置とKEKなどの放射光施設を併用して行う。
美術批評から見たフランス象徴主義の言説の場の再編成

2018年10月に行われた日本フランス語フランス文学会2018年度秋季大会・ワークショップ「近代フランス美術と文学ーその照応と対立のダイナミズム」において、「ペンで描かれた「象徴主義」ーアルベール・オーリエの美術批評から」と題した発表を行った。本研究課題の要点となる、世紀末美術と象徴主義文学の言説の関係についての考察である。オーリエの批評におけるボードレールからの引用を新たに指摘したうえで、2019年3月に論文を発表した。また、2018年9月に行われた「マラルメ・シンポジウム2018」において、「マラルメの詩の「縁語」についてー≪A la nue accablante tu密雲の低く圧しかぶさるあたりに...≫を中心に」という発表を行った。マラルメの難解といわれる詩を、和歌の技法である「縁語」という概念を援用して分析する試みであり、象徴主義詩読解に新たな視点を提示した。2019年3月に論文を発表した。さらに、2018年12月に「ミシェル・ウエルベックとユイスマンスー『服従』における《女性嫌悪》をめぐって」と題する論文を発表した。イスラーム教の表象をめぐって論議を呼んだ『服従』の主人公が、ユイスマンスの研究者であることをきっかけに、両作家を女性嫌悪と食卓というテーマから論じたものであり、世紀末文学解釈の刷新を目指した。これ以外にも、哲学者カンタン・メイヤスーのマラルメ論(「『賽の一振り』あるいは仮定の唯物論的神格化」)を翻訳し、昨年度発表した後期マラルメ論を論文とした(「詩句の危機から再構成の詩学へーマラルメ『ディヴァガシオン』と『賽の一振り』を結ぶもの」)。2018年12月には、岩手大学国際シンポジウム「証言の時代とそれ以前」にて、「「無常」から「非情」へーカタストロフィーを語る堀田善衞」と題した発表を行い、戦後日本文学をフランスに紹介する試みを行い、論文として発表した。論文という形にはまだ至っていないが、アルベール・オーリエの美術批評など、世紀末美術についての言説の読解を進め、また2015年8月の海外出張によって資料探索を行って、2018年度までの研究課題の基盤を作った。ベルトラン・マルシャル『サロメ』の翻訳も始まり(大鐘敦子との共訳、水声社から出版予定)、言語表象と芸術表象の交差する神話的形象についての第一線の研究を日本に紹介する作業も進めている。また昨年度までの研究課題「マラルメと象徴主義を中心とする無意識の詩学の生成とその展開」の延長線上として、世紀末の女性作家ラシルドの読解・翻訳を進め、『自然を逸した者たち』の抄訳と「アンティノウスの死」の全訳を、『古典BL小説集』(笠間千浪編、平凡社ライブラリー)に発表した(2015年5月)。さらに、女性の身体表象をテーマとした「身体の「自律」から「関係」の身体へーアニエス・ヴァルダ『歌う女、歌わない女』をめぐって」を研究発表し、『〈68年〉の性ー社会の変容と「わたし」の身体』(小松原由理編著、青弓社)に同名論文を寄稿した(2016年2月)。分析対象は20世紀であるが、女性の身体的「自由」や裸体表象といったテーマは、世紀末美術の枠組みの研究から出発したものである。最後に、神奈川大学非文字資料研究センターから『18世紀ヨーロッパ生活絵引』(鳥越輝昭、ステファン・ブッヘンベルゲルと共著)を刊行し(2015年12月)、「『パリは移動祝祭日』ー18世紀パリの民衆的祝祭空間を中心にー」を公開研究会(2016年3月)にて発表した。本発表は『非文字資料研究』13号に論文として掲載される(2016年10月発行予定)。これも時代は異なるものの、都市生活の視点から視覚資料を分析したものであり、ローデンバックの『死都ブリュージュ』やヴェラーレン『触手ある都市』など、世紀末文学の都市表象を考える視点にもなった。本研究の中心となる論文は年度中に公開することはできなかったが、資料の読解は進んでおり、2016年度に公刊する予定である。また研究に付随する著書・論文等は順調に出版されている。2016年8月の海外出張によって資料探索を行い、とりわけ批評言説を通じたナビ派と象徴主義の関係について考察を深めた。また、日本フランス語フランス文学会2016年度秋季大会において、「文学集団の詩学」というワークショップを組織した。世紀末文学を専門とする3人の研究者の発表をコーディネートするとともに、「マラルメと師弟のまじわり」という発表を行い、2017年3月に同名論文を発表した。言説を集団の中で流通させることで、文学者・芸術家が商品化の時代をどのように生きのびるのか、という視点を提出できたと考える。また、311などの災害や相次ぐ「テロ」の時代にあって、カタストロフィー後の都市を歴史的に考える論集、『破壊のあとの都市空間ーポスト・カタストロフィーの記憶』を2017年3月に出版した。全体の編集とインタビュー、全体の理論的枠組みとなる前書き・序論の執筆に携わるとともに、1871年のコミューン後のパリの荒廃について論じた(「パリは燃えているか?ーパリ・コミューンの廃墟をめぐって」)。文学者の言説だけでなく芸術家によるコミューン表象に注目して、19世紀後半フランスの文化的状況を分析するという点で、本研究課題との関わりも大きい業績である。

最後に、神奈川大学非文字資料研究センターにおいて「『パリは移動祝祭日』ー18世紀パリの民衆的祝祭空間を中心にー」を査読論文として掲載するとともに、二つの国際シンポジウムで「『18世紀ヨーロッパ生活絵引』から見る都市の祝祭空間」(浙江工商大学共催)、「写真のポスト・トゥルース性ー非文字資料としてのパリ・コミューン表象」(台湾大学共催)を発表した。都市や写真といった近代の重要なモチーフを、フランス研究の外部にいる研究者に向けて伝えることで、フランス固有の枠組みを相対化し、今後、世紀末表象をより大きな視点から考察するきっかけとなった。本研究の中心となる論文を1本公開したが、美術批評とのリンクを十分には示せなかった。しかし、資料の読解は進んでおり、研究に付随する著書・論文等は順調に出版されている。2017年7月に行われた第11回表象文化論学会において、「青猫・以後」と郷愁ー「のすたるぢや」の歴史性」と題した発表を行った。萩原朔太郎におけるボードレールやフランス象徴詩の遺産を、挿絵といった視覚表象などの関係から考察するという点で、本研究課題と深い関係をもつものである。「政治の美学化」に関するコメントを踏まえて同年12月に論文を発表した。また、神戸大学で2017年12月に行われた、マラルメ・シンポジウム2017において、「詩句の危機から再構成の詩学へー『ディヴァガシオン』と『賽の一振り』を結ぶもの」と題した発表を行った。『賽の一振り』という図形詩の歴史的作品を、デカダンスの風潮や同時代の自由詩論議という文脈、そして視覚性の観点から再検討する試みであった。この発表の内容も論文という形で、2018年9月に『人文研究』195号において発表される予定である。また『賽の一振り』についての特異な分析で知られる、カンタン・メイヤスーの論文の翻訳が、2018年6月に青土社から出版される予定である。この『賽の一振り』研究を含む19世紀末視覚文化・思想研究については、2017年9月の海外出張によって資料探索を行い、とりわけ美術批評家アルベルト・オーリエについての研究を深めることができた。オーリエについての論文も近日中に発表する予定である。最後に、『神奈川大学評論』の第88号に、「ジャンヌ・ダルクからジュピターへー戦後フランスの男性権力表象」と題した論考を発表した。女性表象ではなく男性表象というまだあまり分析されていない主題をめぐって、トランプ大統領就任などアクチュアルな問題と接続させることで、フランスにおける表象研究を一般の読者に紹介するとともに、ミソジニー(女性嫌悪)表象と男性支配的な言説が流通していた19世紀末の文学場・芸術場を考察するための事例研究となった。本研究の中心となるマラルメの図形詩についての発表を一つ行ったが、美術批評とのリンクよりも同時代の詩論や思想との関連を強調した。世紀末の美術批評をめぐる一次資料・研究資料の読解は着実に進んでいると思われるが、研究全体の核となるような論文をなるべく早く発表して、次なる研究プロジェクトにつなげたい。2018年10月に行われた日本フランス語フランス文学会2018年度秋季大会・ワークショップ「近代フランス美術と文学ーその照応と対立のダイナミズム」において、「ペンで描かれた「象徴主義」ーアルベール・オーリエの美術批評から」と題した発表を行った。本研究課題の要点となる、世紀末美術と象徴主義文学の言説の関係についての考察である。オーリエの批評におけるボードレールからの引用を新たに指摘したうえで、2019年3月に論文を発表した。
代数仕様を用いた要求モデルの自動検査に関する研究

「利用者の誤使用も製造者の責任」、といわれ、どのような機能を提供すべきかを決める作業が大きな課題になっている。この問題に対して、開発の初期段階で作成する要求モデルの検査を行う方法がある。本研究課題では、Event-Bと呼ぶ手法で作成した要求モデルの正しさを自動検証する技術の研究を行った。考案した抽象化に基づく自動検査は、従来の検査方法と補完的な役割を果たす。正しさを検査する基準として新しい視点を導入できたといえる。本研究課題ではEvent-Bを用いて表現した要求モデルの自動検査に関する研究を実施した。Event-Bは20年以上の実績があるBメソッドを改良して開発上流工程のモデル記述を表現するために、並行性ならびに非決定性を明確に導入した。表現力が向上した反面、Bメソッドの検証法では、妥当性、安全性、進行性などの確認が難しくなった。本研究課題では抽象化支援モデル検査をEvent-Bに適用する方法を研究した。Event-Bに関する技術文書は欧州の研究プロジェクトRODINから公開されている。公開資料を調査し、掲載されている小規模例題を対象として、考案した方式の事例実験を代数仕様言語Maudeによって実施した。その結果、C言語やJavaによるプログラムのモデル検査で成功した述語抽象の方法をEvent-Bの体系の中で整理、実現できることがわかった。特に、ランキング抽象と呼ぶ方法を適用することで、安全性の確認だけではなく、妥当性の確認や進行性の確認も行うことができた。一方、ランキング抽象で必須となるランキング関数を発見することは難しいこと、より複雑なEvent-B記述(集合記法を用いた仕様)では述語抽象の方法だけではモデル検査の問題に帰着できないこと、などがわかった。上記の事例研究によって得た知見を欧州のBメソッドに関わる研究コミュニティが主催する国際ワークショップIM_FMTで発表した。Bメソッドの研究コミュニティは長い歴史を持つが初めての日本からの発表である。Event-Bは欧州の研究資金(FP7)で継続的に研究が続けられており、Bメソッドが実用的な成果を持つことから、その動向に注目が集まっている。本研究課題を国際交流のきっかけとすることを計画している。本研究課題では、Event-Bを用いて表現した要求モデルの自動検査に関する研究を実施した。初年度に得た知見をもとに、自動検査対象となるイベント記述の範囲を広げた。特に、when形式に加えて、any-where形式を取り扱う方式を考察した。方式のポイントは本質的に無限のデータ空間を表現するany-where形式を有限スコープに制限することである。これは一般に有界モデル検査や述語論理を対象とする有界探索による解析と同様な考え方にたつ。与えられたany-where形式の記述から、等価変換を行って、有界化しやすい形式に変換し、その後、有界化ならびに述語抽象の方法を組み合わせる。簡単な例題を対象として方式を確認した。また、Event-Bを用いた要求モデル作成の知見を得ること、ならびに自動検査の研究を進めるための具体的な事例を作成すること、という目的から、中規模事例を作成した。組込みソフトウェアの要求モデルで重要な多重割り込みシステムの例題を取り扱った。これは、複数の形式手法を比較検討するベンチマーク問題として考案したものである。本中規模事例の作成過程で、リファインメントがモデリングに与える影響についても知見を得ることができた。なお、産業界でもEvent-Bへの関心が高まってきている。本研究で得られた知見がアウトリーチ活動に役立つ。自動検査に関わる学術研究と並行してEvent-B適用ノウハウの蓄積が重要になってきている。本研究課題ではEvent-Bを用いて表現した要求モデルの自動検査方式に関する研究と、Event-Bを用いた要求のモデリング法に関する研究を中心に行った。前年度までの成果をもとに、Event-Bの最も一般的なイベント記述の方法であるany-where形式について述語抽象の方法を定式化した。さらに、Event-BのツールRODINを用いて上記の方法で必要となる抽象化計算を行う枠組みを考案した。抽象化した表現がProBでも解析可能であることを確認することで、抽象化のよる方法とProBが採用している有界化による方法の関係を考察した。モデリング法としては、イベント抽出、集合に基づく情報構造の整理、リファインメント手順の計画、の3つの点が難しく、一般のソフトウェア技術者が使用する阻害要因になっている。そこで、オブジェクト指向方法論をベースに、リファインメント計画シートと命名した新しい形式を提案し、これを用いたモデリング法を、産業界の技術者向けにまとめた。また、最近、オープンなシステムの要求モデル作成の難しさが指摘されていることから、利用者の振る舞いが関わるオープンなシステムを対象としてのモデリング事例を作成し、代数仕様の方法が自動解析に効果があることを示した。本研究課題では、当初計画の通り、Event-Bに対する抽象化検証の方法を導入することが可能であることを示すことができた。また、研究の過程で、オープンなシステムの要求モデル作成へのEvent-
Cdk5による脳の形成・発達に関与する蛋白質リン酸化の同定とその機能解明

目的と方法:Cdk5は神経細胞特異的セリン・スレオニン(Ser/Thr)キナーゼで、Cdk5欠損マウスでは、脳の皮質形成の異常があり、脳形成に重要な基質のリン酸化が起こらない事が原因であると推定される。我々は、リン酸化特異的抗体と2次元電気泳動を組み合わせた方法により、Cdk5欠損マウス脳でリン酸化の低下している蛋白質をスクリーニングし、同定された蛋白質でのリン酸化の機能的意義を検討した。既知の基質であるDab1についても、Cdk5によるリン酸化の意義を検討した。結果:このスクリーニングにより、CRMP2が新たに基質として同定された。横浜市大薬理学教室との共同研究により、Cdk5のリン酸化部位はSer522と同定され、このリン酸化が、Ser509のGSK3βによるリン酸化に必須であり、Cdk5→GSK3βによるsequentialなCRMP2のリン酸化により、CRMP2とチュブリンとの結合能が低下し、Cdk5欠損マウス脳においては両者の結合が亢進している事が明らかとなった。さらに、このリン酸化がAlzheimer病患者脳特異的な3F4モノクローナル抗体の抗原性の出現に関与することを明らかにした。また、脳形成関連蛋白質でCdk5の基質として同定された蛋白質Dab1ついて検討した。Dab1は、脳の皮質形成に異常をきたすリーラーマウスで欠損しているリーリンのシグナルを伝える細胞内アダプター蛋白質である。我々はin vitroの実験から、Dab1のC末の8ヶ所のSer/ThrをCdk5がリン酸化する事を明らかにした。Dab1は、リーリン刺激によりチロシンリン酸化を起こすが、このチロシンリン酸化が、Cdk5のSer/Thrリン酸化により、抑制されている事を見出した。この事は、Cdk5がリーリンシグナルを調整しているものと考えられた。Cdk5-/-を用いた脳内基質検索により同定された基質のリン酸化の機能的意義についての検討目的と方法:Cdk5は神経細胞特異的に活性化されているセリン・スレオニンキナーゼで、Cdk5欠損マウスでは、脳の皮質形成の異常があり、その脳内の基質がリン酸化されない事で異常が起きている事が推定される。我々は、リン酸化特異的抗体と、2次元電気泳動を組み合わせた方法により、Cdk5欠損マウス脳でリン酸化の低下している蛋白質として、Pak1とCRMP-2を同定した(発表準備中)。また、Cdk5によるリン酸化部位も同定されている。これらの蛋白のCdk5によるリン酸化の生体での意義を明らかにするため、マウス個体へのCdk5リン酸化サイトを置換した変異体蛋白質の強制発現を試みる事で、その生体でのリン酸化の意義を検討した。それぞれのCdk5によるリン酸化部位をAlaに置換した変異体を作成し、胎児脳にin uteroelectroporation法にて遺伝子導入し、神経細胞の移動、樹状突起や軸索の極性、ガイダンスなどに着目して効果を判定した。結果:まず、Cdk5-dominat negative(D144N)プラスミドを、In utero electroporatiop法にて胎児脳に遺伝子導入すると、神経細胞の移動が強く障害される事が確認された。同様にPak1T212A、CRMP-2S522Aを導入したが、明らかな神経細胞の移動の障害は起らなかった。また、CAGプロモーターを用いた実験でも、同様であった。Pak1はPak2,3が、CRMP-2はCRMP-1が機能を代償する可能性が考えられた。