hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
励起分子ダイナミック

重点領域研究「励起分子ダイナミックス」の発足にあたり、研究計画を十分に討議し確立することが本総合研究の目的である。研究会を下記の通り開催し、昭和62年度科学研究費補助金公募要領の領域6の記載内容を討議し、さらに慎重な検討の結果に基づいて総括班および計画研究の計画調書を提出した。会議の議事は別紙の通りである。1.第一回研究会、総括班が会合し、重点領域研究の計画研究として、(1)励起分子の生成と構造、(2)励起分子およびイオンの反応素過程、(3)分子の光励起ダイナミックス、(4)弱い分子間錯体の生成とダイナミックス、(5)凝集系中での活成分子の構造とダイナミックス、を研究課題とすることを決定した。次に各課題別に計画研究班の構成、班員の研究分担課題の内容と研究計画、予想される主要な設備備品とその使用計画、各課題内、課題間および計画研究参加者以外の研究者との研究交流の計画について詳細に検討した。2.第二回研究会、本総合研究の参加者全員が会合し、各自の分担課題につき研究目的と意義、研究計画と方法、予想される問題点と解決方法などを長時間にわたって討議した。そのあと総括班の会合を開き、計画研究の細部にわたる検討と調整を行うとともに、励起分子ダイナミックスの分野に関する調査研究を計画研究と併行して行い、その成果を公表する計画についても検討を行った。上記のほかに、総括班の代表者と班員の一部が数回にわたって合議し、本重点領域研究の進め方につき討議を重ねた。以上の研究会の議事要旨と班員の研究論文リストを参考資料として提出する。参考資料1:総合研究(B)「励起分子ダイナミックス」研究会議事録要旨参考資料2:班員の研究報告書重点領域研究「励起分子ダイナミックス」の発足にあたり、研究計画を十分に討議し確立することが本総合研究の目的である。参考資料1:総合研究(B)「励起分子ダイナミックス」研究会議事録要旨参考資料2:班員の研究報告書
軟骨代謝を標的にした新たな変形性関節症の治療法の開発

関節炎発症の主要な役割を果たすIL-1βは,関節軟骨細胞の基質分解を強力に促進することが知られている。一方レチノイドは軟骨細胞に作用して種々の最終分化マーカーや基質分解酵素の発現を誘導することが知られている。そこでin vivo, in vitro関節炎モデルを用いてレチノイドレセプターアンタゴニストのIL-1βによる軟骨基質分解作用に対する影響を調べた。その指標として,異常な分化マーカーやタンパク分解酵素の発現上昇の変化を組織化学的,生化学的,分子生物学的手法を用いて検討した。マウス膝関節器官培養系,マウス軟骨細胞に10ng/mlのIL-1βで刺激し,2,4,6日目に膝関節軟骨,マウス軟骨細胞の変性をin vivo, in vitroで組織学的に生化学的,分子生物学的手法を用いて検索した。関節軟骨破壊に主要な役割を担うマトリックスメタロプロテアーゼであるMMP-3,-9,-13の発現はIL-1βによりマウス膝関節器官培養系,マウス軟骨細胞共に上昇することが,免疫染色,ウエスタンブロット法により明らかとなった。IL-1βでマウス膝関節軟骨,マウス軟骨細胞を処理すると,in vivo, in vitro共にアルシアンブルー染色が減少し,軟骨基質分解が促進されていることが確認できた。さらに10ng/mlのIL-1βで48時間刺激したマウス膝関節器官培養系に10^<-7>Mレチノイドレセプターアンタゴニスト(Ro)を添加後,2日,4日目に組織学的に比較検討を行うと,IL-1βで誘導された軟骨破壊が減少していることが明らかとなった。同様に,マウス軟骨細胞においてもIL-1βによって促進される軟骨基質が10_<-7>MRoで抑制されることがアルシアンブルー染色で明らかとなった。さらにIL-1βで誘導されたMMP-3,-9,-13発現は10^<-7>MRoにより発現減少することが免疫組織学的にもまた,ウエスタンブロット法においても明らかとなった。従来の変形性関節症におけるIL-1βレセプター抗体など炎症性サイトカインを標的にした治療に対し,レチノイドレセプターアンタゴニストは変形性関節症における病的な軟骨細胞のプロテアーゼによる関節破壊に対して有効な治療法となると予想された。変形性関節症は現代社会の高齢化により先進国ではその有病性の高さが注目されている。しかしながら現在変形性関節症の治療は主に対症療法が行われており、根本的治療法は今だ開発されていない。志茂らはマウス軟骨細胞関節炎モデルでレチノイドレセプターアンタゴニストが変形性関節炎の新たな治療法になることを見つけたので報告する。関節軟骨の変性、破壊には軟骨細胞分化マーカーの異常発現や基質分解の異常な亢進が引き起こされる。そこで志茂らは変形性関節症において、もしレチノイドが用いているようなシグナルの異常な経路があるならば、そのシグナルをレチノイドレセプターアンタゴニストを用いて軟骨変性が抑えられるのではないかと考えた。In vitro関節軟骨モデルとしてATDC5細胞を用い、ITSで刺激後10日目でアグリカン、II型コラーゲン発現が確認でき、以下の実験をこの条件で行った。軟骨細胞をIL-1βで刺激すると軟骨基質の構成成分アグリカン、II型コラーゲンmRNAレベルは減少し、軟骨基質分解酵素であるマトリックスメタロプロテアーゼ(MMP-3,9,13)mRNAは上昇することが明らかとなった。軟骨細胞をIL-1βで刺激すると同時にアンタゴニストで処理すると濃度依存的にMMP-3,9,13mRNA発現は低下し、軟骨基質の破壊が抑制されていることが明らかとなった。アルシャンブルー染色においてもIL-1βで誘導された軟骨基質の分解はアンタゴニストによってレスキューされていることが明らかとなった。以上の結果からレチノイドレセプターアンタゴニストは変形性関節症におけるプロテアーゼによる関節破壊に対して有効な治療法となると予想される。さらに10ng/mlのIL-1βで48時間刺激したマウス膝

関節器官培養系に10^<-7>Mレチノイドレセプターアンタゴニスト(Ro)を添加後,2日,4日目に組織学的に比較検討を行うと,IL-1βで誘導された軟骨破壊が減少していることが明らかとなった。同様に,マウス軟骨細胞においてもIL-1βによって促進される軟骨基質が10_<-7>MRoで抑制されることがアルシアンブルー染色で明らかとなった。さらにIL-1βで誘導されたMMP-3,-9,-13発現は10^<-7>MRoにより発現減少することが免疫組織学的にもまた,ウエスタンブロット法においても明らかとなった。従来の変形性関節症におけるIL-1βレセプター抗体など炎症性サイトカインを標的にした治療に対し,レチノイドレセプターアンタゴニストは変形性関節症における病的な軟骨細胞のプロテアーゼによる関節破壊に対して有効な治療法となると予想された。
新しい性染色体特異多型マーカーの発見と法医学,人類遺伝学への応用

・X染色体多型マーカー当教室で発見報告したDXS10011について,サンプル数を増やして集団遺伝学的検索を実施し,遺伝子頻度などのより信頼性の高いデータを公表した。また,その中で見つかった3種の新規な変異型について,塩基配列などの詳細を報告した。・Y染色体多型マーカー2001年に引き続きDYS443,DYS444,DYS445の3種の新規のSTR多型マーカーを発見報告した。これらのDYS441,DYS442,DYS443,DYS444,DYS445のY染色体上の新規多型性STR5種を,同時に検出するためのMultiplex PCR法を確立した。また,血痕や精液斑などの法医学的資料からの個人識別に,この方法が十分応用可能であることを確認した。当教室で発見したYfm1が,種々の実験結果からY染色体長腕に局在する多型性のあるマルチコピーマーカーであることを報告した。[材料と方法]Y染色体長腕centromere近傍のcosmid libraryを徳島大学中堀教授より供与を受けた。四塩基繰り返し配列DNAは20塩基長のものを合成して用いた。Probeの標識にはAmershamの3'末端ラベル&増幅キットを用い,FluorImagerで検出した。制限酵素断片からの繰り返し配列を含む断片の選択にはbiotin-avidin-磁気ビーズ法を用いた。選択した断片はTA cloningの後,PE310又は島津DSQ2000Lにより塩基配列を決定した。[結果と考察]合成四塩基繰り返し配列DNAを数種混合したものをprobeとし,224個のcosmid cloneとcolony hybridzationをおこなって,18個の陽性cloneを得た。全ての陽性cloneよりcosmid DNAを調整し,dot hybridization法で特異性を調べたところ,TCTG又はTATGの配列が含まれていた。これらのDNAを制限酵素により断片化し,adapterを両端に結合させてPCR増幅したDNAから,繰り返し配列を含む断片を磁気ビーズ法で選択した。更にこれからsubcloningして得られた12kbの繰り返し配列を含むclone DNAの塩基配列を決定した。得られた配列について,DNA Databasesの検索をした結果,1個はY染色体上の配列(GenBank)とほぼ一致し,1個は未知の配列であった。各塩基配列から,繰り返し配列を含む部分のPCR増幅用のprimersを合成し,20名の男性のゲノムDNAで多型を調査したところ,1個は多型を示した。また,いずれも数名の女性ゲノムDNAでは対象部位を増幅することができなかった。以上,今回使ったcosmid libraryから,少なくとも1個の男性に特異的なDNA多型部位を発見することができた。前年度に発見したヒトY染色体DNA多型マーカーをYfm1と命名し、ゲノムDNAを鋳型にして合成したPCRプライマーによって増幅される部位が、Yq11.21-q11.23であることをFISHにより確認した。ヒト女性のDNAでは検出されず、男性に特異的であること、150名の血縁関係のない男性の集団遺伝学的調査から少なくとも7アレルと1から13サブアレルより構成される多型が認められることを確認した。また、20組の父子間で、アレルおよびサブアレルを含めてYfm1型が完全に一致していることを見出した。一方、HumanSTS、UT413(DYS384)と過去に報告されていた多型部位が、X染色体DNA多型マーカーであることを我々は一昨年来報告しており、DXS10011としてGDB(Genome Data Base)に登録し、X q27-q28に局在することを報告した。DXS10011型は従来から平板ポリアクリルアミドゲル電気泳動後に蛍光染色して検出していたが、6FAMで標識した合成プライマーを用いてゲノムDNAをPCR増幅し、キャピラリー電気泳動法で分離検出することにより、より簡便で迅速かつ高感度にDXS10011型を判定できる方法を開発し、DNA多型(vol.IX)に掲載予定である。1.前年度に発見した多型マーカーYfm1について,ヒトY染色体のゲノム構造との関連を調べ,ゲノムDNAを鋳型にして合成したPCRプライマーが,男性に特異的であること,男性に多型が認められることを更に調査するとともに,独立の200名の男性から得られたゲノムDNAを用いて,各対立遺伝子頻度を調査し,利用可能な新しい多型マーカーとして確立した(松木)。

4.一昨年に報告したDXS10011の日本人データーベース構築に際して,繰り返し配列部位の近傍に一塩基付加された変異型が約1600染色体に3個確認された(松木)。
多彩な生物活性を有する肝細胞増殖因子のホメオスタシスに基づいた臓器特異的送達

肝細胞増殖因子(HGF)は、各種上皮細胞に対して、極めて顕著な増殖促進作用を有することから、肝障害、腎障害などの障害臓器の修復を目的とした、医薬品としての開発が期待されている。しかしながら、そのレセプターの発現が多臓器にわたることから、生物活性が予期しない臓器においても発揮される危険性がある。そこでHGFの体内動態機構を、特に各臓器における抽出効率(一回の通過でどの程度が臓器細胞に結合し取り込まれるか)に焦点をあて、検討を行った。正常ラットにHGFを定速静注し、定常状態下での循環血、肝静脈、腎静脈、左心房中濃度をELISAにて測定したところ、肝臓、腎、肺の抽出率はそれぞれ50-60%、<10%、<10%であることが明かとなった。各種障害モデルラットを用いた解析からも肝抽出率はせいぜい60%程度であることが示唆された。この結果は、HGFを循環血中に投与した場合、いずれの臓器においても半分ないしそれ以上が臓器通過後、再度循環血中に帰還することを意味する。また、内因性のHGFは、不活性型(一本鎖)として生合成され、障害臓器において活性化され二本鎖の活性型HGFとなることから、臓器内毛細血管スペースを一つのコンパートメントと考えた場合には、活性化されたHGFの少なくとも半分以上は循環血中に放出されることを示唆する。一般に内因性HGFは障害臓器特異的に修復効果を発揮すると考えられ、従って何らかのメカニズムによって活性化を受けたHGFがそのまま障害臓器に留まる機構が働いている可能性がある。そこでより障害臓器特異性を発揮させる目的で、HGFの前駆体である一本鎖HGFを遺伝子組み換えにより合成し、その生物活性ならびに臓器移行性について検討を試みた。一本鎖HGFは成熟HGF(二本鎖)に比べ障害臓器特異的な生物活性が比較的強く認められた。そこで本年度はHGFの体内動態機構を、特に各臓器における抽出効率(一回の通過でどの程度が臓器細胞に結合し取り込まれるか)に焦点をあて、検討を行った。正常ラットにHGFを定速静注し、定常状態下での循環血、肝静脈、腎静脈左心房中濃度をELISAにて測定したところ、肝臓、腎、肺の抽出率はそれぞれ50-60%、<10%、<10%であることが明かとなった。来年度はこのメカニズムの解析を行いたいと考えている。

活性型HGFを腎障害マウスに投与すると腎臓ばかりでなく肝臓でも増殖促進が見られた一方、不活性型を投与すると障害臓器特異性が観察されたことから、来年度はこのアプローチをDDSに応用し、障害臓器特異性を持たせた製剤設計を行いたいと考えている。肝細胞増殖因子(HGF)は、肝障害、腎障害などの障害臓器の修復を目的とした、医薬品としての開発が期待されている。しかしながら、その血中安定性が低いこと、レセプターの発現が多臓器にわたることから生物活性が標的臓器以外においても発揮される危険性があり副作用の問題があること、が問題となっている。前年度の研究からHGFの体内動態機構、特に障害臓器と非障害臓器における挙動の違いが明らかとなり、肝臓、腎臓、肺のいずれの臓器障害においても障害臓器特異的な移行はさほど認められないことが明らかとなった。そこでより障害臓器特異性を発揮させる目的で、HGFの前駆体である一本鎖HGFを遺伝子組み換えにより合成し、その生物活性ならびに臓器移行性について検討を試みた。一本鎖HGFは成熟HGF(二本鎖)に比べ障害臓器特異的な生物活性が比較的強く認められたものの、遺伝子組み換えによって生成される蛋白量が十分でなかったため、それ以上の検討が困難となった。そこで同様な体内動態学的問題点を持つサイトカインであり、その反面遺伝子組み換えによる蛋白質の合成が比較的容易な上皮成長因子(EGF)に切り替え、さらに検討を加えたところ、EGFの体内動態特性を変化させるための新たな知見(細胞にエンドサイトーシスされた後のレセプターからの解離を制御することによってEGFを再び細胞表面に戻す方法)が得られた。この方法に従うことにより、サイトカインの血中での安定性を高めることにつながる可能性が示唆されたものの、障害臓器特異性の問題は今後のさらなる検討が必要であると考える。
多極着磁法による新しい極短周期アンジュレータ開発と加速器におけるその光源性能評価

比較的低エネルギーの加速器でも、高エネルギーの放射光を生成するために、極短周期アンジュレータを開発した。そのために板状磁石(100mm長2mm厚)を効率的に着磁(周期長4mm)する方式を確立した。この着磁法をさらに発展させ、磁石長長尺化のために磁石板を適切に連結する方式を確立した。上記磁石を装着した極短周期アンジュレータの光源性能評価試験を東北大学電子光理学研究センターのS-band線形加速器に於いて行い、青色のアンジュレータ放射の生成を確認することができた。さらに、狭小ギャップの極短周期アンジュレータに適合する蓄積リング設計について検討を進め、新型小型光源として提案することに成功した。アンジュレータは光源加速器において周回中の電子に周期磁場を印加することで周期運動を行わせ,干渉効果によって放射の単色度と輝度および空間指向性を著しく高める装置である。比較的低エネルギーの加速器でも、高いエネルギーの放射光(基本波で10keV以上)を生成するために、極短周期アンジュレータの開発を行った。このために我々は多極着磁法を応用して、パルス電磁石によって発生させた極短周期磁場を希土類元素永久磁石材料(NdFeB系)に直接“転写"する方法を開発した。目標周期長を4mmとし、長さ100mm×厚さ2mm×幅20mmの板状の磁石素材を効率的に着磁する方式を確立した(平成24-25年度挑戦的萌芽研究:JSPS科研費24651107)。着磁した2枚の板状磁石を互いに対向させて、その隙間(磁石ギャップ)の中心軸上に極短周期アンジュレータ磁場を生成することができる。平成26年度は、上述の磁気回路着磁法をさらに発展させた。着磁強度の向上が磁場強度を向上させ、さらに磁性材の着磁飽和が強度および周期精度を向上させるので、高い着磁強度の得られる着磁器の開発が非常に重要である。このために着磁ヘッドの改良を行い、磁石板両面からの着磁を可能にした。さらにアンジュレータ磁石長尺化のための磁石板連結法の開発・アンジュレータ端部磁場の補正方法の開発に着手した。本研究では複数施設での光源評価のため数種類の周期長(2, 4, 6mm等)に対応可能な試験機を開発する。平成26年度はそのための準備として、磁場測定用テストベンチを設計・製作してギャップ駆動機構の開発を行った。極短周期アンジュレータに要求される1micron以上の高精度ギャップ制御を実現することができた。また、既存の光源加速器における光源性能評価試験を行うために、試験に最適な環境を持つSPring-8での光源性能試験の実現性について検討した。目標周期長を4mmとし、長さ100mm×厚さ2mm×幅20mmの板状磁石素材の効率的着磁方式を確立した(平成24-25年度挑戦的萌芽研究:JSPS科研費24651107)。平成27年度は26年度に引き続き、極短周期アンジュレータ磁気回路着磁法をさらに発展させた。このために磁石板上下両面から着磁できる着磁器を開発し、高強度かつバラツキの少ない高精度磁場の達成および磁場周期長精度の向上を追求した。26年度に一部進展した磁石長長尺化のための磁石板連結法を発展させ確立を目指した。これまでの周期長4mmを目標にした開発に加え、26年度開発した周期長6mmの着磁法を改良した。更に短周期を目指した周期長2mmの着磁法の開発に着手した。また、26年度行った高精度ギャップ駆動機構開発の成果を応用して、光源性能評価試験のための極短周期アンジュレータ駆動架台の設計・製作も行った。これまでのSPring-8およびKEK-cERLでの性能評価試験実施のための検討に加えて、平成27年度は、あいちシンクロトロン光センターにおける性能評価試験実施可能性の検討を開始した。上記に関する成果をまとめて学会発表を行った。比較的低いエネルギーの加速器においても、高いエネルギーの放射光(基本波で10keV以上)を生成することを目的として,極短周期アンジュレータの開発を行っている。このために、我々は多極着磁法を応用した方法の開発を行ってきた。この方法では、パルス電磁石によって発生させた極短周期磁場を板状の希土類元素永久磁石材料(NdFeB系)に直接“転写"する。平成27年度は、(1)着磁法の改善による着磁強度・精度の更なる向上、(2)光源性能評価試験のための極短周期アンジュレータ駆動架台の設計・製作、(3)光源性能試験実現性の検討、の3項目を主な目標として研究を行った。

項目(1)では、着磁強度・精度を向上させるために、着磁を磁石板の上下両面から行える様に着磁器の改造を行った。あわせて磁石板を連結して着磁する方法を確立することで、磁石板連結部の磁場性能を著しく向上させることができた。この成果によって、アンジュレータ磁場の長尺化に見通しをつけることができた。周期長については、これまでの4mmに加え、26年度に開発した周期長6mmの着磁法の改良を行うとともに、更に短周期を目指した周期長2mmの着磁法の開発に着手した。項目(2)では、光源性能評価試験のための極短周期アンジュレータ駆動架台の設計・製作を行うことができた。また、項目(3)では、既存の光源加速器における光源性能評価試験を行うために、試験に最適なビーム診断用環境を有するSPring-8施設の状況をより深く調査し、光源性能評価試験のための詳細な検討を行った。上述の成果により,本研究は現在までおおむね順調に進展していると判断する。アンジュレータは光源加速器において周回中の電子に周期磁場を印加することで周期運動を行わせ,干渉効果によって放射の単色度と輝度および空間指向性を著しく高める装置である。比較的低エネルギーの加速器でも、高いエネルギーの放射光(基本波で10keV以上)を生成するために、極短周期アンジュレータの開発を行った。このために我々は多極着磁法を応用して、パルス電磁石によって発生させた極短周期磁場を希土類元素永久磁石材料(NdFeB系)に直接“転写"する方法を開発した。目標周期長を4mmとし、長さ100mm×厚さ2mm×幅20mmの板状磁石素材の効率的着磁方式を確立した(平成24-25年度挑戦的萌芽研究:JSPS科研費24651107)。着磁した2枚の板状磁石を互いに対向させて、その隙間(磁石ギャップ)の中心軸上に極短周期アンジュレータ磁場を生成することができる。平成28年度は、磁気回路着磁法をさらに発展させた。このために磁場強度/精度の向上・磁場周期精度の向上を更に追求した。磁石長長尺化のための磁石板連結方式をほぼ確立することができた。より広い磁石ギャップを実現できる点で光源加速器における性能試験の際に有用になる周期長6mmについては、新しい専用着磁器を製作し着磁方法の最適化を行っている。昨年度、極短周期アンジュレータのための高精度ギャップ駆動機構を開発し完成できたことは本研究の大きな成果の一つである。今年度はこの成果を応用して、これまでのSPring-8およびKEK-cERLに加えて、あいちシンクロトロン光センターにおける極短周期アンジュレータの光源性能評価試験実施の条件をより深く調査し、詳細な検討と試験実施の準備を行った。更に、狭小ギャップの極短周期アンジュレータに適合する蓄積リングの設計・検討を開始した。上記に関する成果をまとめて学会発表を行った。比較的低いエネルギーの加速器においても、高いエネルギーの放射光(基本波で10keV以上)を生成することを目的として,極短周期アンジュレータの開発を行っている。このために、我々は多極着磁法を応用した方法の開発を行ってきた。この方法では、パルス電磁石によって発生させた極短周期磁場を板状の希土類元素永久磁石材料(NdFeB系)に直接“転写"する。
力学に関する学習者の理解の実態

本研究では,力学領域のフォーマル理論の学習に決定的な影響を及ぼすとされるインフォーマル理論の実態解明を試みた。具体的には,子ども達が日常的に観察可能な多様な状況を取り上げ,彼らがそれらの状況をいかに分節化して捉えているのかを個別面接法を用いて明らかにした。調査では,当該分野の先駆的研究者であるオグボーン(Ogborn,J.)らの知見を参照しつつ,身の回りで観察されうる物体の運動を描画で表現した17枚のカードを作成して利用した。面接では,被験者2名を一組として,両者による相互対話を奨励しつつ,17枚のカードの類似性を判断させ,それらを任意の数のグループに分類するよう求めた。調査の結果,子ども達が物体の運動を分節化して捉える際に用いる基準として,「支える有無」,「運動原因の違い」,「運動の種類の違い」などが利用されていることが明らかにされた。これらの結果は,オグボーンらによって提出されている常識的運動理論の存在を強力に支持するものであると言える。しかしながら,その一方で,彼の理論では説明のつかない結果も得られている。例えば,「運動体の種類の違い(例えば,運動体が生物が無生物か)」は,物体の運動を分節化して捉える際の基準として頻繁に用いられることが明らかにされた。したがって,今後の課題は,「運動体の種類の違い」を視野に入れながら常識的運動理論を再構築することである。
ブラインシュリンプのノ-プリウス幼生からのトレハラ-ゼとセロビア-ゼの同時調製

1.トレハラ-ゼの精製.ノ-プリウス幼生のホモジネ-トよりポストミトコンドリア画分を得,これをアセトン処理,DEAEーSepharose CLー6Bクロマトグラフィ-,ConAーSepharose 4Bクロマトグラフィ-した後,Polyー(A)ーSepharose 4Bクロマトグラフィ-を新たに導入した。低イオン強度で酵素を吸着させ,100mMイミダゾ-ル-塩酸にて溶出した。活性画分をTSKG3000SWで3回ゲルろ過HPLCI酵素を精製した。Poly(A)Sepharose 4Bカラムは,従来クロマトフォ-カシングしていたステップに代り導入されたものである。これにより純品の酵素が,安定的に得られた。2.セロビア-ゼの精製.ConAーSepharoseクロマトグラフィ-まではトレハラ-ゼと同一条件で行い,この後クロマトフォ-カシングし,次にTSKG3000SWにて3回ゲルろ過HPLCを行うことにより,安定で多量の酵素が手に入った。3.トレハラ-ゼの性状分析:粗標品によって得ていたデ-タを純品にてやり直す予定である(純品が得られたのは2月末であった)。4.セロビア-ゼの性状分析:新たに(1)熱安定性の解析,(2)セロオリゴ糖に対する基質特異性のチェック,(3)イミダゾ-ルが阻害効果を持つことの確認,(4)アミノ酸組成分析,(5)N末端アミノ酸がブロックされていた。(6)アシルアミノ酸遊離酵素処理とアミノ酸配列分析により,N末端より二番目のアミノ酸がセリン,三番目がグリシンと推定した。詳しいことは分析中である。5.両酵素に対する抗体の作製は,mg以上の純品が必要なので現在準備中である。6.抗体を用いて,ブラインシュリンプの発生過程における酵素の発現の推移や幼生内酵素分布の検索を今後行いたい。7.得られた純品の酵素の部分アミノ酸配列の決定を行い,CDNAのクロ-ニングをめざしたい。(平成3年度の科研費に申請中)1.トレハラ-ゼの精製.ノ-プリウス幼生のホモジネ-トよりポストミトコンドリア画分を得,これをアセトン処理,DEAEーSepharose CLー6Bクロマトグラフィ-,ConAーSepharose 4Bクロマトグラフィ-した後,Polyー(A)ーSepharose 4Bクロマトグラフィ-を新たに導入した。(平成3年度の科研費に申請中)
本邦で見出された新規多剤耐性変異N348IのHIV逆転写酵素に及ぼす影響に関する研究

HIV逆転写酵素(RT)の多剤耐性変異N348Iは取り込まれた核酸系RT阻害剤を除去し、他の変異と組み合わせでさらなる高度耐性をもたらす。非核酸系RT阻害剤に対しては、酵素への結合能低下が耐性機序であった。さらに新たな耐性変異K70QやA376Sを同定した。新規RT阻害剤がこれらのウイルスを阻害できることを見出した。本研究は、臨床サンプル解析、新規変異の獲得状況、耐性メカニズム解析、有用な薬剤の同定から、難治性HIV感染症のさらなる治療効果の増強に役立つと思われる。一方で他のグループからconnection subdomainの他の変異が多剤耐性に関与しているのではないかという報告が相次ぎ、研究代表者はN348Iと比較するために独自に本邦で薬剤治療歴のないHIV感染患者からsubtype Bを101株、non-B subtypeを16株分離し、connection subdomainにおける変異の導入程度を検討した。これまでの他のグループからの報告ではG312QやG335Dが関連するように報告されていたが、我々の解析では未治療者からもそのような変異を有するHIVが分離されること、特にG335Dはnon-B subtype HIVでは約70%程度に見られることから、薬剤によって誘導されたというよりはもともとのsubtype特異的なpolymorphismであると考えられた。さらに感染性分子クローンを用いた解析でN348I以外は多剤耐性を示さないことが分かり、おもに非核酸系逆転写酵素阻害剤であるネビラピンに対して耐性を未すことを明らかとした。現在本邦ではネビラピンではなくエファビレンツが主に使われているため、connection subdomainの変異としてはN348I以外はあまり留意する必要がないと考えられる。本研究はHIV-1逆転写酵素(RT)の酵素活性に直接関与していないと考えられてきたconnection subdomainに位置する新規多剤耐性変異N348Iの意義を解明し、今後の治療成績の向上を目的としている。平成22年度はN348Iが他の耐性変異とどのような相互作用をするのかを解析した。N348Iは一度取り込まれた核酸系RT阻害剤を切り出してDNA合成を再開する機序(excision)によって耐性を獲得することから、この機序と相反する変異であるM184V等を導入し、その影響を検討した。この相反する変異は耐性度を低下させることを確認した。さらに逆転写酵素の生化学的な解析のために発現ベクターを構築、大腸菌でRTを作製、精製した。RTは2つのsubunit p66とp51からなるheterodimerであることから、N348Iをp66のみ、p51のみ、そして両方に導入した酵素を使って検討した。その結果、p66またはp51どちらにおいても非核酸系RT阻害剤であるnevirapin(NVP)に対する耐性を獲得した。p66におけるN348IはRNase H活性には影響を及ぼさなかった。また、N348Iが導入されたRTはDNA合成能が低下したおり、これがウイルス複製能の低下の原因だと推測された。NVPに対する耐性はN348Iが導入されたことによるNVPの結合力の低下であることを明らかとした。本年度の結果から、N348Iは作用機序の異なる2つのRT阻害剤に対し、核酸系では阻害剤のexcision、非核酸系では結合能の低下という2つの耐性機序を併せもつ変異であることを明らかとした。このことは今後N348Iのgenotype assayによる検出が感染患者における治療効果判定や薬剤選択において重要であることを意味する。本研究では平成21年度から23年度にかけて、HIV逆転写酵素における非核酸・核酸系逆転写酵素阻害剤という異なる作用機序を有する薬剤に対して多剤交差耐性を示す耐性変異N3481について解析した。このN3481はこれまで耐性変異解析に含まれていなかった領域である。この部位を申請時から症例数を増やして解析することによってN3481稀な変異ではないことが明らかとなった。またN3481だけでなく、A376Sなど他の変異も同様に耐性を付与することを見出した。N3481の耐性機序は一度取り込まれた核酸系逆転写酵素阻害剤のexcisionであり、T215Yに代表されるthymidine associated mutationsと組み合わせることでさらなる高度耐性がもたらされる。一方、米国ミズーリ大学との共同研究によって非核酸系逆転写酵素阻害剤に対してはそれらの酵素への結合能が低下することが耐性機序であることを見出している。これらの実験はリコンビナント逆転写酵素を用いたアッセイで明らかとした。上記の解析に併せて新たな耐性変異K70Qも同定することができた。この耐性変異はQ151Mという高度多剤耐性変異に加わることで、Q151Mを阻害できるtenofovirに対しても耐性を示してしまう。

そのため、この変異が出現した場合、核酸系としてはlamivudineまたは非核酸系逆転写酵素阻害剤を用いることが望ましいと考えられる。一方で、研究代表者がこれまで開発してきた新規逆転写酵素阻害剤は、これらのウイルスに対しても非常に強い感受性を有していたこどを明らかとしたことから、今後の治療法の改善に役立たせることができると思われる。この一連の研究では、臨床サンプルを解析し、新たな耐性変異の獲得状況を調べるとともに、その耐性メカニズムを解析、有用な薬剤の探索を行った。この成果は難治性疾患であるHIV感染症のさらなる治療効果の増強に役立つと思われる。
ミクログリアを介した自閉症病態発現機序の解明と治療標的の探索

自閉症スペクトラムは、他者とのコミュニケーション能力や社会性などが障害される発達障害の一種である。近年自閉症患者脳でミクログリアの異常や炎症関連因子などの発現増強が報告され、自閉症の発症や病態発現におけるミクログリアの関与が指摘されている。本研究では、ヒトと同じ霊長類であるマーモセットを用いて自閉症モデルを作製し、ミクログリアを介した自閉症病態発現機序の解明と、ミクログリアを標的とした自閉症新規治療法の開発を目的に研究を行った。抗てんかん薬であるバルプロ酸をある時期に妊婦が服用すると、生まれてきた子の自閉症発症リスクが高まるという臨床報告から、げっ歯類ではバルプロ酸暴露による自閉症モデルを用いた研究が多く行われている。我々は胎生60日目の雌マーモセットにバルプロ酸を経口投与し、生まれてきた仔が複数の自閉症様行動異常を示すことを確認している。また、このモデルマーモセットではニューロンのシナプス密度増加、刈り込み異常が認められることを示している。このモデルマーモセットから複数の大脳皮質領域を採取し、各発達段階における遺伝子発現変化をDNAマイクロアレイにより網羅的に解析し、正常発達マーモセットと比較した。また、固定脳切片を用いてミクログリアの形態や数の変化を解析し、自閉症モデルマーモセットと正常発達マーモセットで比較した。自閉症モデルマーモセットのミクログリアは密度の低下、突起の繊細化などの異常形態を示すことが明らかになった。さらに、ミクログリア機能関連分子の発現を比較解析し、自閉症モデルマーモセットのミクログリアは機能異常を有している可能性を示した。以上の結果より、自閉症モデルマーモセットではミクログリアがその形態や機能に異常をきたし、その結果として適切なシナプス刈り込みができなくなっている可能性が示された。近年自閉症患者脳でミクログリアの異常や炎症関連因子などの発現増強が報告され、自閉症の発症や病態発現におけるミクログリアの関与が示唆されている。本研究では、ヒトと同じ霊長類であるマーモセットを用いて自閉症モデルを作製し、ミクログリアを介した自閉症病態発現機序を解明することにより、ミクログリアを標的とした自閉症病態を改善する新規治療法の開発を目指す。抗てんかん薬であるバルプロ酸をある時期に妊婦が服用すると、生まれてきた子の自閉症発症リスクが高まるという臨床報告から、げっ歯類ではバルプロ酸暴露動物の仔を自閉症モデルとして用いた研究が多く行われている。我々は胎生60日目の雌マーモセットにバルプロ酸を200 mg/kgで経口投与し、生まれてきた仔が複数の自閉症様行動異常を示すことを確認している。平成29年度は、このように作製した自閉症モデルマーモセットから複数の大脳皮質領域を採取し、生後直後、2、3、6ヶ月齢、成体の各発達段階における遺伝子発現変化をDNAマイクロアレイにより網羅的に解析し、正常発達マーモセットと比較した。また、固定脳切片を用いた解析も並行して実施した。ミクログリアは神経障害をいち早く感知して活性化し、障害部位への遊走、死細胞の貪食、炎症性サイトカインの産生など様々な作用を発揮し、種々の神経疾患に関与することが知られている。そこでまず、自閉症モデルマーモセット脳におけるミクログリアの数や形態の変化を解析した。さらに、ミクログリア機能関連分子に対する抗体を用いて、自閉症モデルマーモセットと正常発達マーモセットにおける発現変化を検討した。自閉症などの精神疾患患者の脳内においてミクログリアや炎症関連因子の異常が報告され、精神疾患におけるミクログリアの関与が着目されている。また、ミクログリアはその突起をシナプスと直接接触させシナプス刈り込みに関与することが報告されている。自閉症スペクトラム障害ではシナプス形成に比べて刈り込みが少ないことが示されており、シナプス形成異常にミクログリアが関わっている可能性が考えられる。我々が作製したバルプロ酸暴露自閉症モデルマーモセットにおいて、スパインの形成と刈り込みに異常が認められることが明らかとなった。そこで、自閉症脳におけるミクログリアの関与を明らかにするため、バルプロ酸暴露自閉症モデルマーモセット脳におけるミクログリアの数や形態の変化を、ミクログリアを認識する抗Iba1抗体を用いた免疫組織染色により解析した。種々の神経疾患ではミクログリアは活性化ミクログリアに変化することが知られているため、同様の挙動の変化を予想していた。しかしながら、予想に反してミクログリアの数は自閉症モデルで顕著な増加を認めず、また形態も活性化型とは異なる形態を示していた。従って、自閉症モデルマーモセット脳におけるミクログリアの数や形態の変化を詳細に把握することを優先したため、当初予定していた自閉症病態関連遺伝子の探索が遅れた。

また、このモデルマーモセットではニューロンのシナプス密度増加、刈り込み異常が認められることを示している。このモデルマーモセットから複数の大脳皮質領域を採取し、各発達段階における遺伝子発現変化をDNAマイクロアレイにより網羅的に解析し、正常発達マーモセットと比較した。また、固定脳切片を用いてミクログリアの形態や数の変化を解析し、自閉症モデルマーモセットと正常発達マーモセットで比較した。自閉症モデルマーモセットのミクログリアは密度の低下、突起の繊細化などの異常形態を示すことが明らかになった。さらに、ミクログリア機能関連分子の発現を比較解析し、自閉症モデルマーモセットのミクログリアは機能異常を有している可能性を示した。以上の結果より、自閉症モデルマーモセットではミクログリアがその形態や機能に異常をきたし、その結果として適切なシナプス刈り込みができなくなっている可能性が示された。ミクログリアは神経変性疾患や虚血などの種々の神経疾患において、神経障害を感知すると形態を変化させ、活性化ミクログリアになることが知られている。バルプロ酸暴露自閉症モデルマーモセット脳において、ミクログリアはこれまでに知られている活性化型を示さず、特徴的な形態を示すことが明らかになった。現在その詳細な形態解析を行っており、正常発達マーモセットや他の神経疾患で認められる活性化型とどのように異なるのかを示す。平成29年度にすでに着手している、各発達段階ごとの大脳皮質領域を用いた網羅的遺伝子発現については、現在結果を解析中であり、今後その中から自閉症病態関連遺伝子を探索する。自閉症モデルマーモセット脳において観察されたミクログリアの異常形態は、ヒト自閉症患者脳や加齢脳におけるミクログリア形態と類似しており、ミクログリアの機能異常が示唆されるため、機能関連分子の発現変化などの検討も引き続き進める予定である。自閉症モデルマーモセット脳内におけるミクログリアの数及び形態を解析したところ、予想と異なり特徴的な形態を示すことが明らかになったため、平成29年度は形態の詳細な解析を優先させた。形態解析は、マーモセット固定脳に対してミクログリアを認識する抗Iba1抗体を用いた免疫組織染色を実施した後、ニューロルシダという形態解析システムを使用したが、これらは当研究室に既存のシステムであるため、追加の経費は不要であった。従って、自閉症病態関連遺伝子の発現変化の検討が当初の予定よりも遅れ、平成30年度に実施する予定であるため、それに使用する新しい抗体の入手などに経費をあてる予定である。
分子集合体を利用したタンパク質を基礎とするナノ粒子製造プロセス構築

本研究の自的は、両親媒性分子を基幹として形成された分子集合体を利用してナノメーターレベルのタンパク質微粒子の生成を試み、その制御因子を実験的に検討することである。また、得られたタンパク質ナノ粒子の構造・物性を評価するとともにそれらの生成に最適な操作条件を実験的に検討することにより、分子集合体を用いたタンパク質ナノ粒子の工業的製造プロセスの確立を目指すことである。平成17年度では、本系における微粒子形成反応を進めるにあたり、その基礎となる初期条件の探索を目的として(1)分子集合体へのタンパク質の最大可溶化量、さらに(2)可溶化されたタンパク質の立体構造について検討した。まず、モデルタンパク質としてリゾチーム、牛血清アルブミン(BSA)、リパーゼを用いて各タンパク質の最大可溶化量を決定した。得られた最大可溶化量はタンパク質種によって異なることが明らかとなり、微粒子形成反応におけるタンパク質仕込み可溶化量に関する重要な知見が得られた。また、分子集合体の形成条件(有機相水分量、有機溶媒、助剤アルコール)がタンパク質の立体構造に及ぼす影響について調べたところ、特にリパーゼに関して有機相水分量並びに助剤アルコールがその構造に大きく影響することが明らかとなった。また、分子集合体サイズの測定から、これらの因子によって集合体サイズも大きく変化していることが明らかとなった。なお、これらの成果はThe International Conference on Biopartioning and Purification(要旨集ISBN No.:90-809691-2-5)において公表した。
アデノウイルス一過性発現ベクターによるサイトカインと情報伝達分子の作用機構の研究

本研究では当初の計画の通りアデノウイルスベクター(AdV)を用いて以下の検討を行なった。(1)各種サイトカイン発現アデノウイルスベクターの作製とin vitroおよびin vitro感染実験CAGプロモーターの支配下に各種サイトカイン(hGM-CSF,mGM-CSF,mIL-2,mIL-4,mIFN-gなど)を発現するベクターを作製した。COS細胞など細胞株における発現パターンを検討し,MOI依存的一過性発現パターンを認めた。また,マウスに静脈注射後,第3-7日目をピークに肝臓>脾臓>その他の臓器の発現を認めた。(2)各種サイトカインレセプター発現ベクターの作製と遺伝子発現効率の検討ヒトGM-CSFレセプターaおよびb鎖,b鎖の変異分子などの発現AdVを作製した。これらのベクターは付着性細胞に高レベルに外来性レセプター分子を発現したが,Tリンパ球など非付着性細胞に対しては低レベルの発現しか認められなかった。(3)各種サイトカインレセプター発現ベクターの作製とシグナル伝達の検討上記のヒトGM-CSFレセプター発現ベクターをNIH3T3細胞に感染させ,サイトカイン応答性の獲得を3H-thymidine取り込みやc-fos-luciferase assayにより検討したところ,ヒトGM-CSF依存性に一部反応性が認められる傾向があったが,感染による細胞変性などばらつきが大きかった.(4)AdVによる免疫反応の惹起と疾患治療モデルの作製AdVのin vivo投与により,高濃度ではdose-dependentに早期死亡した。また,数種のサイトカイン発現ベクターにより数日後の死亡を認め,現在,臓器変化,抗ウイルス免疫反応の強度などを検討している。また,以上の結果をもとに造血幹細胞や腫瘍細胞の増殖・分化を外来性レセプター発現ベクターにより制御するシステムの研究を続行している。平成6年度の研究計画として提出した諸点につき以下の検討を行なった。(1)LacZ遺伝子を発現する組換えアデノウイルス(Ad)を各種細胞株およびprimary骨髄細胞に感染させ,遺伝子発現を比濁法,フローサイトメトリーおよび細胞化学的方法により検討した。本ベクターによる遺伝子導入効率は高率であり,ウイルス力価,宿主細胞接着分子受容体,プロモーター活性依存的に遺伝子を発現すること,細胞周期非依存性であること,感染後3-5日目をピークとする一過性発現であることが明らかになった。また,従来遺伝子導入困難であったヒトprimary骨髄細胞への効率良い遺伝子導入が可能であることを認めた。(2)ヒトGM-CSFなどの遺伝子を発現する組換えAdを作製し,HeLa細胞への感染上清中のサイトカイン活性をMTT法にて確認した。(3)マウスに上記のLacZ遺伝子発現Adを静注感染させ,肝・脾・腎・肺におけるβ-galactosidase発現を組織化学的に検出した。さらに,マウスGM-CSF発現Adを静注感染させ,7日-14日後に骨髄および脾臓の骨髄細胞および骨髄巨核球系細胞などの増殖を認めた。また,同ベクター感染骨髄細胞のサイトカイン無添加条件下におけるメチルセルロース・コロニー形成を認めた。以上の結果は,本ベクターによる遺伝子導入がin vitroおよびin vivoの両者において有効であり,感染条件を調節することにより外来性遺伝子の発現量を制御できることを示した。現在,サイトカイン分子およびシグナル伝達分子の遺伝子を発現するベクターを作製中である。平成6年度までにアデノウイルスベクター(AdV)の各種細胞への感染効率とそれに影響する因子の解析,さらに,サイトカイン遺伝子発現ベクターによる造血刺激などin vivo生物学的活性の検討を行なってきた。これらのデータをふまえ、平成7年度には、以下の検討を行った。(1)AdVの各種細胞系への感染・遺伝子発想効率の検討

T細胞などvitronectinreceptor低発現細胞への感染効率を検討したが,各種のリンパ球刺激条件下でも遺伝子発現細胞比率は数%にしか上昇しなかった。さらに,サイトカイン・レセプター発現ベクターをCOS細胞に感染させ,FCM解析により,発現がMOI依存性,かつ,heterogenousであることを明らかにした。また,COS細胞を用いて,AdVによるサイトカイン発現量り時間経過を検討した。これらの結果は,AdVをex vivoで感染させた腫瘍細胞のin vivo移植による遺伝子治療の基礎データになると考えられる。(2)各種サイトカイン発現ベクターの作製とin vivo感染実験各種のサイトカイン(mIL-2,mIL-4,mIFN-γなど)発現ベクターを作製し,マウスへのin vivo注射によるサイトカイン血中濃度の時間経過と生物学的作用の検討を開始している。(3)各種サイトカインセレプター発現ベクターの作製とシグナル伝達の検討さらに,ヒトGM-CSFレセプターαおよびβ鎖およびその変異遺伝子発現ベクターなどを作製し,現在,NIH3T3細胞におけるサイトカイン応答性の獲得(1uciferase assay)を検討している。以上,本年度は各種ベクターを構築し,大量に精製ウイルスを作製したこと,また,in vivoおよびprimary細胞への感染実験を発展させた。最終年度である平成8年度には,これらのin vivo実験による結論を得る予定である。本研究では当初の計画の通りアデノウイルスベクター(AdV)を用いて以下の検討を行なった。(1)各種サイトカイン発現アデノウイルスベクターの作製とin vitroおよびin vitro感染実験CAGプロモーターの支配下に各種サイトカイン(hGM-CSF,mGM-CSF,mIL-2,mIL-4,mIFN-gなど)を発現するベクターを作製した。COS細胞など細胞株における発現パターンを検討し,MOI依存的一過性発現パターンを認めた。また,マウスに静脈注射後,第3-7日目をピークに肝臓>脾臓>その他の臓器の発現を認めた。(2)各種サイトカインレセプター発現ベクターの作製と遺伝子発現効率の検討ヒトGM-CSFレセプターaおよびb鎖,b鎖の変異分子などの発現AdVを作製した。これらのベクターは付着性細胞に高レベルに外来性レセプター分子を発現したが,Tリンパ球など非付着性細胞に対しては低レベルの発現しか認められなかった。(3)各種サイトカインレセプター発現ベクターの作製とシグナル伝達の検討上記のヒト
レプチン抵抗性を改善する食品因子の探索とその抗肥満効果の検証

本研究の目的は、レプチン抵抗性を改善する食品因子を探索・同定し、その抗肥満効果を培養神経細胞および動物個体レベルで実証することである。また、分子レベルでそのメカニズムを解明することで科学的根拠に基づいた高機能性食品創製のための基盤的知見の集積を目指している。平成29年度までに、PTP1B活性を阻害する食品素材のスクリーニングを実施し、アブラナ野菜に含まれるisothiocyanate (ITC)が、PTP1Bのシステインチオール基を修飾することで、活性を阻害することを見出した。また、ITCの一種であるphenethyl isothiocyanate (PEITC)が濃度依存的に培養神経細胞内のPTP1Bを阻害し、Ob-Rb、JAK2およびSTAT3のリン酸化を誘導してレプチンシグナルをリガンド非依存的に活性することを見出した。そこで平成30年度は、当初の計画通りに動物レベルでPEITCがレプチンシグナルを活性化して摂食抑制作用を示すかどうかを検証した。C57BL/6JマウスにPEITCを経口投与し、視床下部中のレプチンシグナルを解析したところOb-Rb、JAK2、およびSTAT3のリン酸化が認められた。また、PEITCが、投与14時間後まで摂食を抑制することを見出した。本研究によって、PEITCの摂取がレプチンシグナルを活性化することで摂食を抑制し、抗肥満効果を発揮する可能性が示唆された。平成28年度は、レプチンシグナルの解析を行うにあたり、ヒト神経芽細胞腫SH-SY5Y細胞にretinoic acid (RA)を処理し、レプチン応答細胞への分化条件を検討した。その結果、100 nMのRAを5日または6日間処理した細胞において、レプチン受容体(Ob-Rb)、およびその下流のシグナル因子であるJAK2とSTAT3の発現上昇が観察され、神経様細胞への分化が確認された。そこで、SH-SY5Y神経様細胞にレプチンを処理し、レプチン作動性を評価した。ウェスタンブロッティングによる解析の結果、レプチン処理によってOb-Rb、JAK2およびSTAT3の顕著なリン酸化が認められた。また、定量逆転写PCRにより、レプチンシグナルによって発現が制御されているPOMCのmRNAレベルの有意な増加と、NPYとAgRPの有意な低下が確認された。さらに、PTP1B阻害剤であるオルトバナジン(V)酸ナトリウムがレプチンシグナルに及ぼす影響を検討し、レプチン非存在下においてレプチンシグナルの活性化を誘導することを明らかにした。現在は、当初の計画通りにPTP1B活性を阻害する食品素材および成分の培養神経様細胞に対するレプチン抵抗性改善作用の評価を実施している。平成28年度に計画していた研究項目(1)レプチン抵抗性モデル細胞の確立を達成し、平成28年度から29年度にかけて実施を計画していた項目(2)PTP1Bを阻害してレプチン抵抗性を改善する食品因子の探索と機構解析を実行中のため。平成29年度は、PTP1B活性を阻害する食品素材のスクリーニングを実施し、阻害活性の認められた食品素材の抽出物をSH-SY5Y神経細胞に処理し、レプチンシグナルに与える効果を検証した。その結果、アブラナ野菜に含まれるisothiocyanate(ITC)が、PTP1Bのシステインチオール基を修飾することで、活性を阻害することを見出した。そこでITCの一種であるphenethylisothiocyanate(PEITC)が、レプチンシグナル増強作用を示すかどうかを検証したところ、PEITCは濃度依存的に細胞内PTP1Bを阻害し、Ob-Rb、JAK2およびSTAT3のリン酸化を誘導してレプチンシグナルをリガンド非依存的に活性することを見出した。STAT3は活性化すると核内へと移行し、摂食関連遺伝子の発現を調節する転写因子として機能する。そこで、PEITC処理した神経様細胞におけるSTAT3の局在を蛍光免疫染色法および細胞分画法によって解析した結果、PEITC濃度依存的なSTAT3の核内集積が観察された。さらに、STAT3に転写制御されている神経ペプチドのmRNAをqRT-PCR解析によって評価した。その結果、PEITC処理によってPOMCのmRNAレベルの有意な増加およびNPYとAgRPの有意な低下が認められた。平成30年度は、当初の計画通りに動物レベルにおけるレプチン抵抗性改善作用の評価を実施する。平成29年度に計画していた研究項目(1)レプチン抵抗性モデル細胞の確立を達成し、平成28年度から29年度にかけて実施を計画していた項目(2)PTP1Bを阻害してレプチン抵抗性を改善する食品因子の探索と機構解析を実行中のため。

平成29年度までに、PTP1B活性を阻害する食品素材のスクリーニングを実施し、アブラナ野菜に含まれるisothiocyanate (ITC)が、PTP1Bのシステインチオール基を修飾することで、活性を阻害することを見出した。また、ITCの一種であるphenethyl isothiocyanate (PEITC)が濃度依存的に培養神経細胞内のPTP1Bを阻害し、Ob-Rb、JAK2およびSTAT3のリン酸化を誘導してレプチンシグナルをリガンド非依存的に活性することを見出した。そこで平成30年度は、当初の計画通りに動物レベルでPEITCがレプチンシグナルを活性化して摂食抑制作用を示すかどうかを検証した。C57BL/6JマウスにPEITCを経口投与し、視床下部中のレプチンシグナルを解析したところOb-Rb、JAK2、およびSTAT3のリン酸化が認められた。また、PEITCが、投与14時間後まで摂食を抑制することを見出した。本研究によって、PEITCの摂取がレプチンシグナルを活性化することで摂食を抑制し、抗肥満効果を発揮する可能性が示唆された。平成28年度から29年度にかけて実施を計画していた項目(2)PTP1Bを阻害してレプチン抵抗性を改善する食品因子の探索と機構解析を継続する。また、PTP1B阻害効果の高い食品因子を選抜し、研究項目(3)培養神経細胞を用いた食品因子のレプチン抵抗性改善作用の評価を実施する。平成30年度に実施を計画していた項目(4)肥満モデルマウスを用いた食品因子の抗肥満効果の検証を実施する。同定した食品因子(PEITC)を添加した高脂肪食をマウスに摂食させ、その抗肥満効果を実証する予定である。当初予定していた高脂肪食負荷マウスを使用した高肥満効果の他に、肥満自然発症モデルKK-Ayマウス等を使用した検討も行う予定である。