hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
トロンビンレセプター特異的33kDaリン酸化酵素の構造・活性相関の解析

同じ7回膜貫通構造を持つβアドレナリンレセプターはG protein-coupled receptor kinase 2 (GRK2)やGRK3によりリン酸化される。そこで、33kDaリン酸化酵素がGRK2やGRK3と関係があるか否かを調べるために、トロンビン活性化ヒト血小板抽出液からDEAE-Sepharose, Heparin-Sepharoseを用いて、この酵素を粗精製した。GRK2やGRK3に対する抗体を用いたWestern blotting法で粗精製した33kDaリン酸化酵素との反応性を検討したところ、この酵素はこれらの抗体と反応しなかった。また、同じ7回膜貫通構造を持つβアドレナリンレセプターやPAR4の細胞内ドメインはリン酸化しないことから、33kDaリン酸化酵素はPAR1に特異的な細胞内ドメインリン酸化酵素と考えられた。また、この33kDaリン酸化酵素の活性化過程では細胞内Ca^<2+>濃度の上昇が必須であるが、阻害剤を用いた実験よりμ-calpainがこの33kDaリン酸化酵素の活性化に関与していることが明らかになった。トロンビンレセプターは3種類(PAR1、PAR3、PAR4)存在するが、ヒト血小板ではPAR1とPAR4が発現し、PAR1が主要なトロンビンレセプターとして働いている。PAR1は7回膜貫通構造をもつG蛋白共役型受容体の一つで、トロンビン刺激により活性化され、産生されたIP_3が細胞内Ca^<2+>を上昇させる。これに伴い、PAR1のC末側の細胞内ドメインがリン酸化される。我々は、血小板におけるPAR1の細胞内ドメインを特異的にリン酸化する酵素を調べるために、PAR1の細胞内ドメインを大腸菌にグルタチオンSトランスフェラーゼ(GST)との融合蛋白として発現させた。この融合蛋白をゲル内リン酸化法のin vitroの基質として用いたところ、血小板内にトロンビン刺激により新たに活性化される33kDaリン酸化酵素が検出された。同じ7回膜貫通構造を持つβアドレナリンレセプターはG protein-coupled receptor kinase 2(GRK2)やGRK3によりリン酸化される。
伝統楽器を使ったふしづくりによる音楽科の授業開発-箏の効果的な活用を通して-

1研究目的:本研究の目的は,児童の音楽科の本質に関わる資質・能力を育むために,箏を使ったふしづくりによる授業を行うことを通して,箏の有効な活用方法を示し,音楽科の授業開発を行うことであった。2研究方法:次のような方法で研究を行った1本研究における授業構成と,児童の姿による評価を行うためのルーブリックを作成する。2作成したルーブリックをもとに,授業実践を行い,児童の音楽科の本質に根差した資質・能力と,音楽的能力を図るための質問紙調査を授業前後に実施する。3質問紙調査によって得られた結果を,量的に検証するとともに,授業の中で見られた児童の姿を,ビデオ観察により質的に検証し,それぞれの結果を統合する。3研究成果:箏をふしづくりで活用する際の有効な点は, 1弦を弾くと音が鳴ること, 2箏柱を動かせば自由に音階を変化させることができることである。それらの箏の性質は,児童が即興的且つ自由自在にふしを創っていくことを容易なものとし,児童の創作意欲が持続した要因であった。また,本研究の授業実践では,箏の学習を通して「なりたい自分」を一人ひとり考え,「なりたい自分」を具体化するために,題材を通してめざす姿を3段階のルーブリックにして提示することで,どのような姿が望ましいのかを価値づけ,子どもたちが「なりたい自分」とめざす姿とを反映させてフィードバックしてきた。このことを通して,箏の知識・技能習得のみならず,教科の中で育むことのできる資質・能力の要素を,児童の姿から表出していくことができた。
足場材料の多孔質構造の制御

撥水性表面に固着させた氷微粒子とフリーの氷微粒子を鋳型として用い、開いた表面空孔と連通する内部空孔を有するPLGA-コラーゲン多孔質足場材料を開発した。本多孔質材料にウシ関節軟骨細胞を播種したところ、細胞は開いた表面孔を通じて内部空孔に侵入し、多孔質足場材料全体に均一に分布して増殖した。細胞は丸い形態を有し、軟骨細胞特異的な遺伝子を発現して豊富な軟骨細胞外マトリックスを産生し、均一な軟骨様組織を再生することができた。以上の結果から、開発した多孔質足場材料は均一な軟骨組織の再生に有効であることが示された。本研究では、氷の微粒子を結晶核として氷の結晶成長を制御し、形成した氷晶のネットワークを空孔のテンプレートとして用いることにより、連通性に富んだ空孔構造を有するコラーゲン多孔質足場材料の開発を目的とする。平成27年度は、型板表面に付着させた氷微粒子とフリーの氷微粒子を用い、表面の開いた空孔構造と連通する内部空孔構造を有するコラーゲン多孔質材料を作製した。1冷却したポリマー撥水性フィルム被覆銅板に純水を微量液体ディスペンサーで滴下し、粒径400 μm程度の氷微粒子を撥水性フィルム表面に形成させた。2純水を液体窒素中に噴霧し、フリーの氷微粒子を作製した。この氷微粒子をー15°Cの低温チャンバーに移し、目開きが425と500 μmの篩で直径425500 μmのフリーの氷微粒子を得た。3コラーゲンを水/エタノール/酢酸の混合溶媒に溶解させた。4[手順1]で作製した表面固定化氷微粒子及び[手順2]で作製したフリーの氷微粒子をー5°Cの低温チャンバーに移し、氷微粒子の温度を調整した。5[手順4]で温度調整したフリーな氷微粒子と[手順3]で作製したコラーゲン溶液をかき混ぜ、この混合物を表面固定化氷微粒子の撥水性フィルム被覆銅板2枚ではさみ、コラーゲン溶液を凍結させた。6この凍結物を凍結乾燥より行い空孔を形成させ、化学架橋により、コラーゲン多孔質材料を作製した。作製したコラーゲン多孔質材料の表面及び断面を走査電子顕微鏡で観察したところ、多孔質材料の外表面に多数の大きな空孔が観察され、これらは内部の空孔と連通していることが分かった。また、断面像から、多孔質材料の内部には氷微粒子を反映した大きさの空孔が密に存在し、互いに連通していることが分かった。さらに、力学試験より、氷微粒子で作製したコラーゲン多孔質材料は、高い力学強度を有することが分かった。平成27年度は、まず氷微粒子及び氷晶からなるテンプレートを用いて、開口した表面孔と連通性に優れた内部空孔を持つ多孔質足場材料の作製条件を確立した。次に、本方法で作製したコラーゲン多孔質足場材料の空孔構造、力学特性を評価した。以上のように、当初の計画通りに研究成果を上げることができたと評価している。本研究では、氷の微粒子を結晶核として氷の結晶成長を制御し、形成させた氷晶のネットワークを空孔のテンプレートとして用いることにより、生体組織をより効率よく再生できる、連通性に富んだ空孔構造を有するコラーゲン多孔質足場材料の開発を目的とする。平成28年度は、昨年度に検討した多孔質構造を制御する最適な条件で、開いた表面空孔構造と連通する内部空孔構造を有するコラーゲン多孔質材料を作製した。作製時に、フリーの氷微粒子とコラーゲン水溶液の混合物の中央部にPLGAニットメッシュを挟んだものを凍結することにあり、多孔質構造を制御したPLGAーコラーゲン複合多孔質材料を得た。本複合多孔質材料は高い引張強度を有し、表面空孔は開いて材料内部の空孔は連通していることが電子顕微鏡観察より分かった。本複合多孔質材料を用いてウシ関節軟骨細胞を培養し、多孔質材料における軟骨細胞の分布を調べた。その結果、軟骨細胞は開いた表面孔を通じて多孔質材料の内部空孔に侵入し、三次元的に均一に分布していることが分かった。さらに、培養した細胞/多孔質材料の構造体をヌードマウスの背中皮下に8週間埋植したところ、光沢のある軟骨組織が再生された。組織染色及びII型コラーゲンの免疫染色により、再生組織における軟骨細胞及び軟骨細胞外マトリックスの分布は均一であった。再生された組織に含まれるDNA及びグリコサミノグリカンの含量は移植前と比較して有意に増加した。また、軟骨細胞のマーカー遺伝子であるII型コラーゲンとアグリカンの遺伝子発現レベルをリアルタイム定量PCR法で解析した結果、II型コラーゲンとアグリカンがよく発現していることが分かった。以上の結果より、本複合多孔質材料は均一な軟骨様の組織の再生に有効であることが示された。

以上の結果から、開発した多孔質足場材料は均一な軟骨組織の再生に有効であることが示された。今後も当初の計画通りに研究を進める。すなわち作製した多孔質足場材料を用いて軟骨細胞を培養し、細胞の三次元的な分布、および大きな軟骨組織の再生効果を調べ、足場材料の多孔質構造による軟骨組織再生への影響を明らかにする。生体材料
超高解像度観測と数値モデルを組み合わせた沿岸域における栄養塩動態の解明

潮汐フロント域における超高解像度観測:伊予灘佐田岬周辺の潮汐フロント域において、海洋表層の成層強度が異なる初夏と盛夏の大潮・小潮時に現場観測を実施した。今年度は、潮汐フロントの詳細な3次元分布を捉えるために、昨年度までの中央観測ラインに加えて、南北2本の観測ラインを追加した。約1.55.0km間隔で高応答性センサー(硝酸計、浅海用乱流計、多項目センサー群[水温、塩分、濁度、PAR、DO、Chl.a濃度]、船底超音波多層流向流速計)を用いて観測した。また、センサーの校正のために、随時海水を採取して持ち帰り実験室にてChl.a濃度および硝酸塩濃度を高精度に分析した。さらに、低次生態系の群集構造把握のために、海水をサイズ分画濾過し植物のサイズ組成を分析した。瀬戸内海における超高解像度数値モデルの開発:本研究の数値モデルは、物理モデルと生態系モデルから構成されるが、今年度は、複雑な低次栄養段階生態系と栄養塩動態を再現できる生態系モデルの改良を実施し、西部瀬戸内海の代表的な4つの灘において現実的な栄養塩と植物・動物プランクトンの季節変化を再現した。佐田岬における高頻度時系列観測の実施:三崎漁協と共同で佐田岬に時系列モニタリングステーションを設け、水温・塩分・Chl.a濃度・濁度を20分間隔で、栄養塩濃度を1日間隔で観測した。また、約1月半毎に現地に赴き、センサー類の保守作業を実施した。また、三崎漁協の西濱らにより毎日採水・濾過処理・冷凍保存された栄養塩分析用海水サンプルを、実験室にて栄養塩自動分析機を用いて高精度に分析した。ひまわり8号による高頻度時系列データの解析:静止軌道衛星ひまわり8号による1時間毎の海表面水温データを用いて、水平的な水温勾配の分布から潮汐フロントの水平分布を抽出すると共に、それらの短時間での水平的な移動について解析した。高機動観測船と高応答性センサー群を用いたこれまでに類を見ない超高解像度の現場観測は、技術的な面でハードルが高かったが、これまでの2年間にかなりの部分を成功させることができたため。また、佐田岬における高頻度時系列観測についても、センサー類のメンテナンスを高頻度に実施することにより、生物付着によるデータクオリティの低下を最小限に抑えることができたため。その他に、当初予定していなかった静止軌道衛星の高頻度海表面水温データの解析から、潮汐フロントの水平的な分布や短時間での移動を捉えることに成功したため。衛星観測から明らかとなった短時間での潮汐フロントの移動の影響を調べるために、昨年度の3本の観測ラインによる観測に加えて、定点における高頻度の時系列観測を実施する。また、これまでに開発してきた超高解像度海洋物理モデルに生態系モデルを結合し、観測で得られた混合・栄養塩供給過程に関する知見と生態系データをモデルに導入し、現実に即した形で物理場・生態系構造・栄養塩循環を再現することをめざす。佐田岬ステーションにおいては、継続して高頻度時系列定点観測を実施する。潮汐フロント域での超高解像度観測の合間における時間変化の補完、突発的な気象擾乱などによる特異な変動イベントについてのデータ解析、水温・塩分センサーおよびChl.a・濁度センサーの保守と栄養塩分析を行う。伊予灘潮汐フロント域における超高解像度観測の実施:伊予灘佐田岬周辺の潮汐フロント域において、海洋表層の成層強度が異なる初夏と盛夏に、大潮・小潮の潮汐強度変化による影響を除去するために2週間にわたる現場観測を2回実施した。具体的には、全長約40kmの観測ラインを約0.9から1.5km間隔で高応答性センサー(硝酸計、浅海用乱流計、多項目センサー群[水温、塩分、濁度、光合成有効放射(PAR)、溶存酸素(DO)濃度、植物色素(Chl.a)濃度]、船底超音波多層流向流速計)を用いて観測した。瀬戸内海における超高解像度数値モデルの開発:本研究の数値モデルは、物理モデルと生態系モデルから構成されるが、今年度は、POM(Princeton Ocean Model)を瀬戸内海および九州・四国南岸に適応したモデルを元に、ネスティング手法により伊予灘の潮汐フロント域を超高解像度化したモデルの開発に着手した。また、約1月半毎に現地に赴き、センサー類(水温・塩分計、Chl.a・濁度計)の保守作業(データ回収・電池交換・生物付着の除去・再設置)を実施した。高機動観測船と高応答性センサー群を用いたこれまでに類を見ない超高解像度の現場観測は、技術的な面でハードルが高かったが、初年度にかなりの部分を成功させることができたため。

また、佐田岬における高頻度時系列観測についても、センサー類のメンテナンスを高頻度に実施することにより、生物付着によるデータクオリティの低下を最小限に抑えることができたため。潮汐フロント域における超高解像度観測:伊予灘佐田岬周辺の潮汐フロント域において、海洋表層の成層強度が異なる初夏と盛夏の大潮・小潮時に現場観測を実施した。今年度は、潮汐フロントの詳細な3次元分布を捉えるために、昨年度までの中央観測ラインに加えて、南北2本の観測ラインを追加した。約1.55.0km間隔で高応答性センサー(硝酸計、浅海用乱流計、多項目センサー群[水温、塩分、濁度、PAR、DO、Chl.a濃度]、船底超音波多層流向流速計)を用いて観測した。また、センサーの校正のために、随時海水を採取して持ち帰り実験室にてChl.a濃度および硝酸塩濃度を高精度に分析した。さらに、低次生態系の群集構造把握のために、海水をサイズ分画濾過し植物のサイズ組成を分析した。瀬戸内海における超高解像度数値モデルの開発:本研究の数値モデルは、物理モデルと生態系モデルから構成されるが、今年度は、複雑な低次栄養段階生態系と栄養塩動態を再現できる生態系モデルの改良を実施し、西部瀬戸内海の代表的な4つの灘において現実的な栄養塩と植物・動物プランクトンの季節変化を再現した。佐田岬における高頻度時系列観測の実施:三崎漁協と共同で佐田岬に時系列モニタリングステーションを設け、水温・塩分・Chl.a濃度・濁度を20分間隔で、栄養塩濃度を1日間隔で観測した。また、約1月半毎に現地に赴き、センサー類の保守作業を実施した。また、三崎漁協の西濱らにより毎日採水・濾過処理・冷凍保存された栄養塩分析用海水サンプルを、実験室にて栄養塩自動分析機を用いて高精度に分析した。ひまわり8号による高頻度時系列データの解析:静止軌道衛星ひまわり8号による1時間毎の海表面水温データを用いて、水平的な水温勾配の分布から潮汐フロントの水平分布を抽出すると共に、それらの短時間での水平的な移動について解析した。高機動観測船と高応答性センサー群を用いたこれまでに類を見ない超高解像度の現場観測は、技術的な面でハードルが高かったが、これまでの2年間にかなりの部分を成功させることができたため。その他に、当初予定していなかった静止軌道衛星の高頻度海表面水温データの解析から、潮汐フロントの水平的な分布や短時間での移動を捉えることに成功したため。次年度は、伊予灘潮汐フロント域においては、昨年度に実施した東西方向の超高解像度観測を発展させ、南北方向にジグザグな観測ラインを設けることにより、潮汐フロントの詳細な3次元分布を捉えることを目指す。また、初年度に開発に着手した超高解像度海洋物理モデルに生態系モデルを結合し、観測で得られた混合・栄養塩供給過程に関する知見と生態系データをモデルに導入し、現実に即した形で物理場・生態系構造・栄養塩循環を再現することをめざす。佐田岬ステーションにおいては、継続して高頻度時系列定点観測を実施する。潮汐フロント域での超高解像度観測の合間における時間変化の補完、突発的な気象擾乱などによる特異な変動イベントについてのデータ解析、水温・塩分センサーおよびChl.a・濁度センサーの保守と栄養塩分析を行う。衛星観測から明らかとなった短時間での潮汐フロントの移動の影響を調べるために、昨年度の3本の観測ラインによる観測に加えて、定点における高頻度の時系列観測を実施する。
多重極限における強相関ボーズ流体の量子相転移

ナノ構造体を用いて次元制御した強相関ヘリウム4ボーズ量子流体を実現し、多重極限下の超流動、量子相転移などの新規物性を開拓した。本研究により、主に次の結果が得られた。1回転下2次元超流動の高周波実験を実施し、有為な回転効果が認められなかった。これは低周波の先行研究と相反している。2ナノ多孔体MCM-48中の3次元接続を持つヘリウム4薄膜の研究から、その新規な相図を明らかにした。31次元細孔長がFSM -16よりも数十倍長い多孔体HMM-1中の1次元強相関ボーズ流体の実験を実施し、1次元ナノチューブ超流動の「有限長理論」の妥当性を示した。本研究はナノ構造体を用いて次元制御した強相関ヘリウム(ボーズ)量子流体を実現し量子相転移を含めた新規物性を開拓することにある。ゼロ回転下において1次元強相関ボーズ流体研究のためナノ多孔体HMM-1を使い、1次元強相関ボーズ流体の機械的応答研究(ねじれ振り子測定)を実施した。HMM-1は孔径3.1nm、長さ10μmと従来研究されてきたFSM-16(細孔長さ300nm)に比べて細孔長が30倍程度長いという特徴を持つ。本測定では過去の我々の研究で観測された1次元超流動クロスオーバー温度は明確には観測されなかったが、クロスオーバー温度が低温側にシフトしたと解釈できるため、有限長理論をサポートする結果となった。加えて3次元接続を持つナノ多孔体HMM-2(接続周期5.5nm、細孔直径2.7nm)中に吸着したヘリウム3薄膜の比熱実験を実施した。細孔壁面に垂直向きの励起エネルギーよりも十分低温において、約1.5Rの一定な比熱が観測された。これは壁面に沿った運動の自由度しかもたない薄膜(壁面に垂直な運動は基底状態にある)でありながら、3次元接続性のために3次元ボルツマンガス状態が実現していることを示唆している。さらに上記研究と平行して回転希釈冷凍機を利用した実験準備を実施した。回転実験では回転の遠心力に耐えるだけのリジッドで対称性の良いデザインにする必要があり、また回転冷凍機の中心へ設置する必要がある。これらを考慮し回転実験のための無酸素銅QCM実験セルを新たに設計・作製した。常温において回転希釈冷凍機に設置後、回転状況下で動作テストを実施し良好な動作結果を得た。加えて極低温において予備実験を実施し、約1回転/秒の回転下において金基盤上ヘリウム4薄膜の超流動転移の観測に成功した。本研究はナノ構造体を用いて次元制御した強相関ヘリウム量子流体を実現し、さらに回転という新しいパラメータを加えることで多重極限下の超流動、量子相転移など新規物性を開拓することにある。今年度は、細孔直径2.2nmのFSM-16(細孔長300nm)中のヘリウム4ナノチューブ(1次元強相関ボーズ流体)についてねじれ振り子測定を実施し、超流動シフトとエネルギー散逸を高精度で測定した。一次元超流動オンセットとそれに伴う散逸ピークを検証した結果、有効長理論で説明されることを確認した。加えて3次元接続を持つナノ多孔体MCM-48(接続周期3.7nm、細孔直径3.3nm)中に吸着したヘリウム4薄膜の比熱実験とねじれ振り子測定を実施した。2種類の異なる比熱ピークの解析から温度-吸着量相図を明らかにし、2次元相および3次元相領域を確定した。過去に実施したHMM-2(接続間隔5.5nm、細孔直径2.7nm)のデータと比較して3次元相の領域が高温側まで広がっており、より3次元性が強いことが解った。またねじれ振り子で観測された超流動転移は、比熱のフォノン解析より3次元超流動転移であることが解った。さらに回転希釈冷凍機を用いたQCM実験により、高周波及びより低温領域(1K以下)における金基板上ヘリウム4薄膜超流動転移の研究を実施した。測定周波数20MHzの実験では、回転下(4rad/sec)での超流動密度の温度変化は、ゼロ回転下での実験結果と誤差内で一致した。一方で、エネルギー散逸については回転効果が示唆されるデータを得た。エネルギー散逸ピーク温度を回転速度に対してプロットすると、測定データのばらつきの範囲内で回転速度に比例して低温側へのシフトを示唆する結果を得た。また、ピーク温度より高温側のエネルギー散逸データが3mKほど低温側にシフトした。本年度も前年度に引き続きナノ構造体によって次元制御した強相関ボーズ流体に対しての研究を実施した。ゼロ回転下における研究では、主に、11次元強相関ヘリウムボーズ流体の機械的応答、23次元接続したヘリウム4薄膜の3次元超流動転移、に関して新しい知見を得た。また回転下における研究では、前年度得た予備的研究の成果をもとに回転希釈冷凍機を利用した回転下における2次元超流動の研究を実施し、回転効果を示唆するデータを得ている。以上より、研究計画はおおむね順調に進展している。本研究はナノ構造体を用いて次元制御した強相関ヘリウム量子流体を実現し、多重極限下の超流動、量子相転移など新規物性を開拓することにある。28年度は以下の研究を実施した。

11次元における超流動の理論の一つである「有限長理論」の妥当性を議論するため、1次元細孔長がFSMよりも数十倍長い多孔体HMM-1(細孔長1020μm、孔径3.1nm)に形成したヘリウム4ナノチューブ(1次元強相関ボーズ流体)についてねじれ振り子測定を実施した。孔径が大きいにもかかわらず、表面積で規格化した周波数シフト量は孔径2.2nmのFSMよりも更に小さく、エネルギー散逸も観測されなかった。クロスオーバー温度は測定範囲よりも低温であると思われ、有限長理論で理解される。23次元接続を持つナノ多孔体MCM-48(接続周期3.7nm、細孔直径3.3nm)中に吸着したヘリウム4薄膜の比熱実験を実施した。3次元相転移を示す温度領域はHMM-2の場合は換算温度t<0.15であるが、MCM-48の方がより高温まであり、比熱ピークも3倍以上大きく観測された。これはMCM-48の3次元周期が短いため、3次元性が強く発現したことを示唆する。3回転希釈冷凍機を用いたQCM実験により、高周波及びより低温領域(1K以下)における金基板上ヘリウム4薄膜超流動転移の研究を実施した。測定周波数20MHz、100MHzの実験では、回転下(4rad/sec)での超流動密度の温度変化は、ゼロ回転下での実験結果と誤差内で一致した。さらに試験的に25倍高調波を使い500MHzのQCM実験を実施し、世界で初めてマイクロ波帯における超流動薄膜の振動応答測定に成功した。また、バルクヘリウム4のQCM回転実験を実施し、回転による異常な振動子応答を観測した。ナノ構造体を用いて次元制御した強相関ヘリウム4ボーズ量子流体を実現し、多重極限下の超流動、量子相転移などの新規物性を開拓した。本研究により、主に次の結果が得られた。1回転下2次元超流動の高周波実験を実施し、有為な回転効果が認められなかった。これは低周波の先行研究と相反している。2ナノ多孔体MCM-48中の3次元接続を持つヘリウム4薄膜の研究から、その新規な相図を明らかにした。31次元細孔長がFSM -16よりも数十倍長い多孔体HMM-1中の1次元強相関ボーズ流体の実験を実施し、1次元ナノチューブ超流動の「有限長理論」の妥当性を示した。次元制御した強相関ボーズ流体実現のためのナノ構造体を選定し本研究をスタートした。ゼロ回転下において11次元強相関ヘリウムボーズ流体の機械的応答研究、23次元接続を持つナノ多孔体中ヘリウム3薄膜のボルツマンガス状態の実現、の2つの成果を得た。さらに回転下実験のための新しい技術革新を行い、予備実験でヘリウム4薄膜の超流動転移の観測に成功した。次年度も引き続きナノ構造体によって次元制御した強相関ヘリウム4ボーズ流体に対して、多重極限下において各種測定(ねじれ振り子、QCM、比熱)を実施する。ゼロ回転下における1次元および3次元ナノ構造体中のヘリウム4の研究では、1次元強相関ヘリウムボーズ流体の実現と1次元超流動オンセットの観測や3次元接続したヘリウム4薄膜の3次元超流動転移が観測されている。これらの新奇な超流動についてさらなる知見を得るために、ナノ構造体のパラメータ(細孔直径、接続間隔)を変化させた実験を実施する。回転希釈冷凍機を用いた回転下の2次元ヘリウム4超流動の実験では、測定周波数20MHzで回転効果が観測された。しかしながら測定精度に問題があり、さらに詳しく検証するため、測定精度(振幅、温度)を向上する必要がある。また、この回転効果は過去に他グループが実施したマイラー上のねじれ振り子測定と比較して劇的な結果の差も見られており、測定周波数依存している可能性が示唆される。
分配的正義の理論的・実証的研究-不平等指標と不公平感をもとにして-

1.階級構造の公正性にかんする理論的研究本研究は、階級・階層という領域に注目し、そこにおける財の分配の公正性を理論的、実証的に探究するものである。これまでの階級・階層研究では、階級・階層構造の公正性を判断する基準として、「機会の平等」に関心が集中していた。一方で、「地位の不平等」、すなわち地位とライフチャンスに影響する資源との不平等な結びつきが公正であるかを問う試みがなされてこなかった。ライフチャンスに差異をもたらすものとして階級を定義する階級論、およびマルクス主義階級論に注目し、そこで地位の不平等の公正性を判断するいかなる正義が存在したかを確認した。個々人の平等と自由の尊重という理念に照らし合わせて、「機会の平等」規範の有効性と限界を示し、主としてマルクス主義階級論に拠りながら、「地位の不平等」の公正性を判断する妥当な基準を導出し、その正当化を試みた。以下の2、3では、現実の資源分配が、資源の公正性を判断する基準といかに乖離しているかを明らかにした。2。仕事の自律性からみた雇用関係の変化階級・階層地位に結びつく資源のひとつとして、仕事の自律性に注目し、その変化を分析した。被雇用者がどれほど仕事の自律性を持っているかによって、被雇用者がいかに管理されているかが、被雇用者間で仕事の自律性がいかに規定されているかによって、被雇用者間の雇用主への有利性の不平等がわかる。1979年「仕事と人間調査」と20012年「情報化社会に関する全国調査」を用いて分析した結果、被雇用者の仕事の自律性が低下し、また、職業に結びつく解雇のリスクと専門性の違いによって仕事の自律性が差異化されるようになったことがわかった。3。所得分配の公平性の研究所得分配の公平、不公平性を判断する「技能にもとづく所得分配」というひとつの基準を提案し、男女有職者を対象にした全国調査データ(2004年「情報化社会に関する全国調査」)の分析から、技能を介さない、いかなる不公平な所得格差が存在しているのかを明らかにした。1.分配的正義の理論的研究a.多くの文献を読むことで、公正という観点から、いかなる社会的・経済的資源によって個々人の立場を捉えればよいかを探究した。その結果、資源が「いかに分配されるか」という、資源配分の手続きに関わる観点に加えて、資源が「どのように分配されているか」という、資源配分の様態に関わる観点の重要性を明らかになった。資源配分の手続きに関わる観点は、資源配分の様態に関わる論点と密接に関連しながら存在している。これらを峻別した上て統合する必要性を明らかにした。b.上記の点はより一般的、抽象的な探究である。当研究は一方で、分配的正義の研究を、階級・階層という具体的事象からはじめ、それから個々人の生活全般領域へ対象を拡大することを目指すものである。よってまず、階級・階層と深いかかわりのある、労働や仕事といった領域において、公正という観点から、個々人の状況を捉える上で、いかなる資源に注目すれはよいかを探究した。その結果、これまで注目されてきた所得や威信、学歴水凖という資源に加えて、仕事の遂行形態をより直接的に表す「職業上の自己指令性」という概念に注目するに至った。この概念に注目することは、ある階級・階層に占める個々人の生活状税を、従来の地位指標より実態的に把握することを可能とする。この概念の有用性の検討を行った。2.分配的正義の実証的研究上記1-bで注目するに至った「職業上の自己指令性」が、日本社会において、実際にいかに分布しているかを探究した。特に、従来の地位指標とどのように結びついて分布しているかに焦点を当てた。その結果、「職業上の自己指令性」は地位指標としても妥当性を持つ指標であり、総合的な不平等指標を作成する一つの中心的要素となりうることが判明した。1.階級・階層構造と分配的正義の理論的研究階級・階層の存在は、いかなる規範によって正当化されてきたかを、文献を精読することによって考察した。階級・階層研究では、親と子の地位が無相関である状態を指す「機会の平等」規範がさまざまな論者によって表明、支持されていること、それが社会的目的からの正当化、個人的立場からの正当化という2つの立場から論じられていることがわかった。そして、「機会の平等」を正当化しうる立場は個人的立場からしかありえないこと、「機会の平等」規範が、それが意味するとされてきた平等主義、職業選択の自由という価値を適切にあらわしているかどうかを検討した。「機会の平等」規範は、親と子の地位の関連を、不公正なものとして糾弾し続けるものとして機能し、それは、親の地位から自由に達成した地位による報酬の不平等までをも正当化しない。階級・階層地位に結びつく報酬の不平等が公正な分配状態であるかどうかを評価するためには、「機会の平等」規範以上のものが必要であることがわかった。2.仕事の自律性からみた雇用関係の変化階級・階層地位に結びつく資源のひとつとして、仕事の自律性に注目し、その変化を分析した。

従来の階級・階層図式は、もっぱら被雇用者間の不平等に焦点を当てており、被雇用者が管理される存在であり、その力関係が変化しうるものであるとは考えられてこなかった。1979年「仕事と人間調査」と20012年「情報化社会に関する全国調査」を用いて分析した結果、被雇用者の仕事の自律性が低下し、また、職業に結びつく解雇のリスクと専門性の違いによって仕事の自律性が新たに差異化されるようになったことがわかった。1.階級構造の公正性にかんする理論的研究本研究は、階級・階層という領域に注目し、そこにおける財の分配の公正性を理論的、実証的に探究するものである。これまでの階級・階層研究では、階級・階層構造の公正性を判断する基準として、「機会の平等」に関心が集中していた。一方で、「地位の不平等」、すなわち地位とライフチャンスに影響する資源との不平等な結びつきが公正であるかを問う試みがなされてこなかった。ライフチャンスに差異をもたらすものとして階級を定義する階級論、およびマルクス主義階級論に注目し、そこで地位の不平等の公正性を判断するいかなる正義が存在したかを確認した。個々人の平等と自由の尊重という理念に照らし合わせて、「機会の平等」規範の有効性と限界を示し、主としてマルクス主義階級論に拠りながら、「地位の不平等」の公正性を判断する妥当な基準を導出し、その正当化を試みた。以下の2、3では、現実の資源分配が、資源の公正性を判断する基準といかに乖離しているかを明らかにした。2。仕事の自律性からみた雇用関係の変化階級・階層地位に結びつく資源のひとつとして、仕事の自律性に注目し、その変化を分析した。被雇用者がどれほど仕事の自律性を持っているかによって、被雇用者がいかに管理されているかが、被雇用者間で仕事の自律性がいかに規定されているかによって、被雇用者間の雇用主への有利性の不平等がわかる。1979年「仕事と人間調査」と20012年「情報化社会に関する全国調査」を用いて分析した結果、被雇用者の仕事の自律性が低下し、また、職業に結びつく解雇のリスクと専門性の違いによって仕事の自律性が差異化されるようになったことがわかった。3。所得分配の公平性の研究所得分配の公平、不公平性を判断する「技能にもとづく所得分配」というひとつの基準を提案し、男女有職者を対象にした全国調査データ(2004年「情報化社会に関する全国調査」)の分析から、技能を介さない、いかなる不公平な所得格差が存在しているのかを明らかにした。
組織Ｑ－ＦＩＳＨ法による膵β細胞の同定と糖尿病におけるβ細胞のテロメア短縮の証明

2型糖尿病ではβ細胞が減少し膵島の機能を低下させる。テロメアは癌や老化に関連する疾患と深く関係することから、糖尿病では選択的にβ細胞のテロメア短縮が加速していると予想した。糖尿病例と非糖尿病例の剖検膵組織パラフィン切片にFISHを施行し、膵各細胞群のテロメア長を計測し、比較した。また、膵島α・β細胞についてはFISHにグルカゴンおよびインスリンの免疫蛍光法を重ねて鑑別した。テロメア長は神経細胞で最も長く、上皮では導管が外分泌腺、膵島細胞より長かった。対照群に比し糖尿病例ではテロメアが短縮し、特にβ細胞において著明であった。従って2型糖尿病の発症にテロメアが関与している可能性が示唆された。生活習慣病の1つである2型糖尿病では、β細胞がアポトーシスにより減少し、膵島機能を低下させている。テロメアは加齢と共に短縮し、癌や種々の老化に関連する疾患と深く関係していることから、β細胞の減少には、選択的にβ細胞の過度のテロメア短縮が起きていると予想した。これを証明するために、平成24年度は23年度までの検体に加え、さらに目標症例数までの検体入手・収集、それに引き続き組織の検定を行ない、症例を選択し解析対象が50例以上となるようにした。検体は順次組織FISH法を施行し、膵組織の各構成細胞群別のテロメア長測定、および免疫蛍光法とQ-FISH法を重ねる方法によるα細胞とβ細胞のテロメア長測定を継続して行なった。膵α細胞、β細胞のテロメア長測定は、各構成細胞群別の検討よりも撮像、合計解析細胞数が少なくて済むため進行が早く、膵組織の各構成細胞群別のテロメア長測定よりも先に進めることとした。当該年度終了時点で、症例の収集および組織学的検定の結果は対照群、糖尿病症例群でともに51例となった。膵組織の各構成細胞群別のテロメアは、対照群と糖尿病症例群ともに約45例ずつの解析を終了し、現時点で糖尿病症例群におけるテロメアの短縮傾向が見られた。一方、膵α細胞、β細胞のテロメア長測定については、当該年度終了時点で、51例全例の解析を終了し、糖尿病症例群では対照群に比較してβ細胞のテロメアに対し有意な短縮が認められたが、α細胞では有意差が見られない。テロメアは加齢とともに短縮し、癌や種々の老化に関連する疾患と深く関係していることから、β細胞の減少には選択的にβ細胞のテロメア短縮が過度に起きていると予想した。これを証明するために、対象として2型糖尿病例47例、対照群高齢者51例、青壮年31例、乳幼児22例の剖検例膵組織パラフィン標本を用いてQ-FISH法を行ない、膵各細胞群(外分泌細胞、膵島α細胞、膵島β細胞、導管、間質線維芽細胞、神経細胞)ごとにオリジナルテロメア長解析ソフトTissue Telo ver.3.1を用いて解析を行なった。なお、膵島α・β細胞は免疫蛍光法によりグルカゴンとインスリンの染色を行なってからFISHを施行した。その結果、糖尿病群では対照群に比しβ細胞およびα細胞のテロメア長はいずれも,短かった。また、β細胞のテロメアはHbA1cの値に負の相関を示した。また、各細胞群においては、神経細胞を除いては導管が最も長く、外分泌腺、膵島の順に長い傾向が見られた。年齢により、乳児から壮年層までの非糖尿病群の解析も行なうと、年齢により各細胞群のテロメアは短縮し、有意な回帰直線が引かれた。線維芽細胞のみ年齢によるテロメア短縮ははっきりしなかった。また、糖尿病群ではこれらの細胞群別テロメア長についても対照群よりも短かった。以上の結果から、2型糖尿病では膵島β細胞およびα細胞のテロメアが短縮しており、β細胞の短縮が著明であったことから2型糖尿病の発症にテロメアが関わっていると考えられた。また各組織のテロメアが短縮しており、これらは年余に渡る高血糖状態による糖毒性などによる短縮の可能性が考えられた。テロメアは加齢と共に短縮し、癌や種々の老化に関連する疾患と深く関係していることから、β細胞の減少には、選択的にβ細胞のテロメア短縮が過度に起きていると予想した。これを証明するために、平成23年度は検体の入手・収集、それに引き続き組織の検定を行ない、症例を選択した。

組織FISH法によるテロメア長測定のコントロールとなるセルブロックの作製も併せて行なった。順次組織FISH法を施行し、膵組織の各構成細胞群別のテロメア測定を行なった。Q-FISH法に免疫蛍光法を重ねて行なうことによる膵α細胞、β細胞のテロメア長測定は、膵組織の各構成細胞群別のテロメア長測定終了症例から順次行なうこととした。当該年度終了時点で、症例の収集および組織学的検定は目標50例のうち対照群約40例、糖尿病症例群で約30例終了した。膵組織の各構成細胞群別のテロメアは、対照群と糖尿病症例群ともに約20例ずつの解析を終了し、糖尿病症例群におけるテロメアの短縮傾向が見られたが、統計学的有意差は認められなかった。一方、膵α細胞、β細胞のテロメア長測定については、Q-FISH法に二重の免疫蛍光法を行ないα細胞とβ細胞のテロメアを10例ずつ検討した時点で評価を行なったところ、免疫蛍光法を行なわなかった場合の結果と症例間の相対的関係が一致せず、α細胞とβ細胞の免疫蛍光法を個別に行なって解析することとした。当該年度終了時点で、β細胞のテロメア解析を対照群約15例、糖尿病症例群約10例の解析を終了し、糖尿病症例群では対照群に比較してβ細胞のテロメアに短縮傾向が認められている。解析ソフトTissue Teloをパソコンの最新OSへの切換えに伴い対応できるようアップデートを行なった。研究計画3年のうち2年を終了した時点で、テロメア長解析のために必要な目標症例の症例収集が終わり、約9割の症例において膵組織の各構成細胞群別テロメア長解析が終了していること。また、膵α細胞、β細胞のテロメア長については、当初の計画を変更し、膵α細胞とβ細胞の2つの免疫蛍光法を個別に標本を作製、解析を行なったにも関わらず、全症例の解析を終了できていることから、研究計画の3年以内には目標症例数の解析を完了し、論文作成まで行なうことが十分に可能と考えられるため。研究計画3年のうち1年を終了した時点で、テロメア長解析のために必要な目標症例の2/3は症例収集が終わり、1/3以上の症例において膵組織の各構成細胞群別テロメア長解析が終了していること。また、膵α細胞、β細胞のテロメア長については、当初の計画では二重の免疫蛍光法を重ねた標本で解析を行なう予定であったが、途中経過でデータの評価を行ない、膵α細胞とβ細胞の2つの免疫蛍光法を個別に標本を作製、解析を行なわなくてはならないという計画変更を余儀なくされた。しかし、それでも順調に症例の解析を継続できていることから、研究計画の3年以内には目標症例数の解析を行なうことは十分に可能と考えられるため。膵組織の各構成細胞別の解析を継続して行なう。α細胞およびβ細胞の解析を完了したことから、その解析結果について学会発表(日本病理学会、日本糖尿病学会)および英語論文発表を行なう予定である。また、膵組織の各構成細胞別の解析は完了次第、順次学会発表および英文論文の作成に入る予定である。次年度も引き続き対照群および糖尿病症例群の症例の収集を目標数に達するまで行なう。標本の組織学的検定は順次行なう。組織学的検討により選択した症例について膵組織の各構成細胞別の解析を継続して行なう。免疫蛍光法を用いた実験についても、現在計測中のβ細胞を継続して解析し、これに引き続き順次α細胞についても解析を行なう予定である。また、膵組織の各構成細胞別の解析は次年度に大半が終了すると考えられることから、順次学会発表および英文論文の作成に入る予定である。
神経細胞運命決定の核内過程

この基盤研究の目的は2種の光受容ニューロン間の遺伝的スイッチである核内リセプターSeven-upの作用機構を解明することであった.(1)遺伝的スクリーンによるニューロンの運命決定に関与する新規遺伝子の検索Seven-upの複眼内異所的発現症状を優性に抑制する系統を検索し,21個の突然変異系統を単離した.このうちいくつかはras活性上昇とよく似た症状を示し,rasの抑制因子をコードすることが示唆された.(2)sprouty遺伝子の同定と解析(1)で行った遺伝的スクリーンから,rasシグナル新規の新規抑制因子をコードするsprouty遺伝子を同定した.複眼発生過程では,Sproutyはレンズ予定細胞で細胞自立的にニューロン分化を抑制するほか,予定ニューロン細胞ではEGFアンタゴニストArgosの発現を抑制することにより,神経誘導を制御している.sprouty遺伝子の転写はSeven-upによって抑制されているため,Sproutyの発見により,Seven-upがrasシグナル抑制因子のカスケードを介してニューロンの種類と数を調節する分子機構が明らかになった.Seven-upのリガンド結合領域の転写調節活性を生体内で可視化する方法を開発した.その結果,Seven-upリガンド結合領域は転写抑制活性を有し,その活性は空間的・時間的に調節されていないことが判明した.Two-hybrid法を用いてSeven-upリガンド結合領域に結合する蛋白質を検索し,基本転写因子TFIIHのp52サブユニットを同定した.この結合の生体内での意義を探るため,Seven-upリガンド結合領域の過剰発現を行ったところ,発生過程の様々な細胞運命に変化することを見いだした.これは,TFHIIHのSeven-upリガンド結合領域との結合点が他の転写因子によっても共有されていることを示唆する.ニューロンによる特異的シナプス形成・軸索誘導といった現象の理解には、神経系の発生過程に於けるニューロンの多様性生成の分子機構の解明が必要である。我々はショウジョウバエの神経系発生過程で特定のニューロン前駆細胞でのみ発現する新しい核内リセプターSeven-upを同定し、Seven-upが複眼において2種類の光受容ニューロン間の遺伝的スイッチとして働くことを明らかにしてきた。Seven-upは進化的に極めてよく保存された蛋白であり、ショウジョウバエとヒトのホモログとの間には、DNA結合領域、リガンド結合領域いずれも93%以上の高い相同性が見られる。しかし、Seven-upのリガンド結合領域のみを酵母GAL4のDNA結合領域と結合した融合蛋白(G74S1蛋白と呼ぶ)も、完全長のSeven-up蛋白同様に、各種ニューロンの運命を変える活性があることが判明した。従って、強制発現されたSeven-upのリガンド結合領域は、多種のニューロンの運命決定に関与している別の蛋白(蛋白Xと呼ぶ)を吸収する事によりその効果を発揮している、という可能性が強い。Seven-upのリガンド結合領域の構造-機能関係を明らかにするため、G74S1蛋白の機能を失活させる点突然変異を検索した。得られた10個のミスセンス変異の内、3個はSeven-upのリガンド結合領域内の変異であり、内2個はリガンド結合領域の構造維持に重要な働きをしていると想像されるアミノ酸残基の変異であった。しかし意外にも、残りの7個はGAL4のDNA結合領域の変異であることが判明した。このことは、G74S1蛋白の効果発揮のためにはこの蛋白がDNA結合能をもつことが必要であることを示しており、蛋白XとSeven-upの相互作用がクロマチン上で起こることを示唆している。この基盤研究の目的は2種の光受容ニューロン間の遺伝的スイッチである核内リセプターSeven-upの作用機構を解明することであった.(1)遺伝的スクリーンによるニューロンの運命決定に関与する新規遺伝子の検索Seven-upの複眼内異所的発現症状を優性に抑制する系統を検索し,21個の突然変異系統を単離した.このうちいくつかはras活性上昇とよく似た症状を示し,rasの抑制因子をコードすることが示唆された.(2)sprouty遺伝子の同定と解析(1)で行った遺伝的スクリーンから,rasシグナル新規の新規抑制因子をコードするsprouty遺伝子を同定した.複眼発生過程では,Sproutyはレンズ予定細胞で細胞自立的にニューロン分化を抑制するほか,予定ニューロン細胞ではEGFアンタゴニストArgosの発現を抑制することにより,神経誘導を制御している.sprouty遺伝子の転写はSeven-upによって抑制されているため,Sproutyの発見により,Seven-upがrasシグナル抑制因子のカスケードを介してニューロンの種類と数を調節する分子機構が明らかになった.Seven-upのリガンド結合領域の転写調節活性を生体内で可視化する方法を開発した.その結果,Seven-upリガンド結合領域は転写抑制活性を有し,その活性は空間的・時間的に調節されていないことが判明した.Two-hybrid法を用いてSeven-upリガンド結合領域に結合する蛋白質を検索し,基本転写因子TFIIHのp52サブユニットを同定した.この結合の生体内での意義を探るため,Seven-upリガンド結合領域の過剰発現を行ったところ,発生過程の様々な細胞運命に変化することを見いだした.これは,TFHIIHのSeven-upリガンド結合領域との結合点が他の転写因子によっても共有されていることを示唆する.核内リセプターは細胞外シグナルを直接核に伝える転写因子であり、DNA結合領域とリガンド結合領域(LBD)を有している。

無脊椎動物においても様々な核内リセプターが同定されているが、中でもSEVEN-UP/COUP TFは進化的に極めてよく保存されている。ショウジョウバエseven-up遺伝子は複眼形成中,2種のニューロン間の遺伝的スイッチとして働く。SEVEN-UPのLBDの強制発現は種々の神経細胞の細胞運命を変換させる。このことはSEVEN-UP LBDが他の蛋白(蛋白Xと呼ぶ)をtitrateしたために生ずると考えられる。我々は、蛋白Xは多くの細胞種においてそれぞれの細胞運命決定に関与しており、SEVEN-UP或いは他の転写因子と結合してその標的遺伝子の転写調節に寄与する非常に重要な分子であるというモデルを立て、その検証に努めている。本研究では、SEVEN-UPLBDと結合する蛋白を同定する目的で、酵母Two-hybridスクリーンを行った。得られた遺伝子の塩基配列を決定した結果、205Dクローンは基本転写因子TFIIHの56kDサブユニットであること、401CクローンはPolycombグループに属する二つの蛋白、polyhomeoticとsex comb on middle legと相同性を持つ領域を含むことが判明した。TFIIHは細胞周期と転写をリンクする働きを有することが知られており、発生における細胞運命決定に特殊な機能を持っている可能性もある。Polycombグループ蛋白は、クロマチン構造の変化を介して遺伝子発現を制御するため、401C遺伝子産物はSEVEN-UPによる転写調節を媒介していることも考えられる。これらの遺伝子の遺伝解析を行う目的で、突然変異系統の検索を行い、それぞれの遺伝子近傍にトランスポゾンが挿入された系統を同定した。現在、これらの系統を利用して、機能欠損型アリルの作成を行っている。ショウジョウバエSeven-upは核内孤児レセプターのひとつであり,個眼の光受容ニューロンのうち特定の細胞でのみ発現してその細胞運命の決定に機能する.このことからSeven-upはリガンド非依存的に機能することが示唆される.一方,seven-up発現細胞以外の細胞でSeven-upのリガンド結合領域のみを異所的に強制発現させると,それらの細胞は細胞種によって異なる細胞運命へと転換した.このことから我々はSeven-upのリガンド結合領域は他の蛋白質の活性に関わっており,強制発現症状はSeven-upリガンド結合領域がこの蛋白質を吸着,阻害することで生じたと考え,リガンド結合領域と結合する蛋白質の探索を行った.酵母2ハイブリッド法によるスクリーニングの結果,TFIIHサブユニットのひとつとPolyhomeotic類似の蛋白相互作用ドメインを持つ蛋白を同定した.現在,これらの遺伝子の機能欠失系統及び機能亢進系統を作成し,seven-upとの遺伝学的相互作用について解析すると共に,両者の結合を生化学的手法を用いて確認している.ショウジョウバエ核内レセプターSeven-upは個眼の光受容ニューロンのニューロン種を決定する遺伝的スイッチとして機能する.
TP53は条件付きがん遺伝子なのか？

がん関連遺伝子TP53は最も研究されているがん抑制遺伝子の一つで、様々ながん種でTP53遺伝子変異が観察されている。TP53遺伝子変異によって、p53蛋白はがん化を抑制する機能を失うが、近年、変異型p53蛋白の中に腫瘍細胞の細胞増殖を促進する「機能獲得型p53変異体」が存在することが報告された。本研究の目的は、TP53遺伝子変異がんモデルの高異型度漿液性癌を研究対象として、TP53遺伝子がヒト生体内で「条件付き」がん遺伝子として実際に機能しているかどうかを検証し、機能獲得型p53の意義を解明することである。当初の計画通り、卵巣・卵管・腹膜原発の高異型度漿液性癌に対し、TP53遺伝子解析を行った。遺伝子変異が集中しているTP53遺伝子のエクソン4からエクソン8までをダイレクトシークエンス法で解析したところ、p53免疫染色でびまん性陽性パターンとなった高異型度漿液性癌の大部分で、TP53遺伝子のDNA結合領域にミスセンス変異が確認された。その一方、びまん性陰性パターンとなった高異型度漿液性癌は、TP53遺伝子の欠失を伴う傾向がみられた。これらの結果より、p53の異常発現パターンはTP53遺伝子のDNA結合領域の塩基配列変化と強く関連していることが確認できた。予定通り、高異型度漿液性癌のTP53遺伝子解析が概ね終了したため、TP53遺伝子変異パターンの機能的意義について解析する。機能獲得型TP53遺伝子変異の有無で高異型度漿液性癌を2群に分けて、臨床疫学的特徴、組織学的特徴、免疫組織化学的特徴を比較検討し、機能獲得型TP53遺伝子変異が腫瘍細胞に与える影響を明らかにする。
中性子回折による水和構造理解と新規FPPS阻害剤の開発

ファルネシル二リン酸合成酵素(FPPS)とリセドロネート(RIS)複合体の中性子結晶構造解析を行い、FPPSに結合した状態でのRISのプロトン化および水和状態を決定した。構造解析の結果、RISのリン酸基は完全に脱プロトン化しており、FPPSに結合した状態ではそのpKaが異常に低下していることがわかった。また、リガンド結合に伴う余分な負電荷はE93やD264のプロトン化によって相殺されていることが示唆された。中性子結晶構造解析によって得られた情報はFPPS阻害薬の発展に役に立つだろう。本課題はファルネシル二リン酸合成酵素(FPPS)を阻害する非ビスホスホネート系化合物を論理的に開発することを目的としている。初年度は論理的創薬に必要な、水素原子を含む“完全な"立体構造を明らかにするべく、FPPS-リセドロネート複合体の大型結晶作成と中性子回折データ収集を行った。8ヶ月に及ぶマクロシーディング法によって約3.5 mm3の結晶が得られ、これらの結晶をドイツ・ミュンヘン工科大学の研究用原子炉FRMIIに建設されたタンパク質単結晶用中性子ビームラインBIODIFFで回折測定を行った。2.4 Å分解能までのブラッグ反射を用いて積分強度計算・スケーリングを行い、Rmerge、完全性がそれぞれ10.7、98.4%と良好なデータが得られた。ここまでの研究成果をまとめて、研究論文をActa Crystallographica Section Fに投稿して受理された。さらに、より精度の高い水素原子位置情報を得るために相補的なデータとなるX線回折データを高エネルギー加速器研究機構・PF-ARのビームラインNW12Aで収集した。現在、これらの回折データを用いて構造解析を行っている。それために必要な水素原子を含む“完全な"立体構造を明らかにするべく、FPPS-リセドロネート(RIS)複合体の中性子結晶構造解析を行っている。まず、前年度にドイツの中性子ビームラインFRMIIで収集したFPPS-リセドロネート複合体の中性子結晶構造をジョイント精密化を行い、精度の高いモデルを構築することができた(R=18.6%, Rfree=22.9%)。さらに、基質であるイソペンテニル二リン酸(IPP)を加えたFPPS-RIS-IPP三者複合体結晶の中性子結晶構造解析を大強度陽子加速器施設のBL-03、iBIXで中性子回折データ収集を行った。データ処理をおこない、2.4Åまでのデータを用いてジョイント精密化した結果、Rfactor,Rfreeがそれぞれ26, 28.7%となった。これらの構造から、RISのピリジン環はプロトン化された状態でFPPSに結合することがわかった。このプロトン化は近傍のT201、K200、Q240、D244、水分子を含む水素結合ネットワークの形成に必須であり、RISの安定な結合に寄与していることがわかった。また、周囲のグルタミン酸のプロトン化状態がリガンド結合に伴って変化することを明らかにし、RISやIPPのリン酸基のプロトン化状態を決定することができた。本課題では、ファルネシル二リン酸合成酵素(FPPS)を阻害する非ビスホスホネート薬剤の開発を目的として、FPPSの中性子結晶構造解析を行ってきた。昨年度までに、大型結晶作成、中性子ビームライン(FRM、iBIX)を利用した回折データ収集、構造解析を済ませた。最終年度は、ビスホスホネートのプロトン化状態を吟味するところから始めた。驚いたことに、ビスホスホネートの二つのリン酸基は完全に脱プロトン化しており、FPPS結合ポケット内ではそれらのpKaが大幅に低下していることがわかった。ビスホスホネートのリン酸基はFPPS非結合状態では12個プロトン化されていると考えられるため、FPPSは脱プトロン化されたビスホスホネートを選択しているか、結合する間に脱プロトン化されていることが示唆される。この結果は、ビスホスホネートのリン酸基が水素結合のアクセプターとして機能していることを示しており、FPPS薬剤の設計において、水素結合アクセプターとなる置換基の導入が有効であることを示唆している。さらに、アミドプロトンの重水素交換率からリガンド結合に伴う立体構造変化に重要と示唆される領域や、E93とD264がリガンド結合に伴う電荷のバランスを調整していることがわかった。これらの研究成果を学術雑誌に投稿し、掲載された(Journal of Medicinal Chemistry、Acta Crystallographica Section F)。本課題を達成するために必要な中性子結晶構造データが順調に得られているため、進捗は概ね順調である。医歯薬学リガンド結合に伴うプロトン化状態の変化やFPPSに結合したRISのプロトン化状態など、阻害剤の結合と阻害能力の関係を深く考察する。

また、中性子構造を用いてファーマコフォアモデルを構築し、コンピューターを用いた仮想化合物ライブラリのスクリーニングを行う。当初の計画では、初年度中に大型結晶化・中性子テスト測定まで行う予定であったが、期待していた以上に用意した結晶の回折能が高く回折データ収集まで完遂できたため。中性子回折データ収集が期待していた以上のデータが得られたため、結晶化条件を最適化する必要がなくなった。研究は順調に進んでいる。引き続き構造解析を行い、薬剤の結合に重要な水分子やアミノ酸側鎖のプロトン化状態を決定する。その後、研究実施計画通りにイン・シリコ創薬研究を行う。化合物の探索の幅を広げるために使用する予定である。次年度使用額は1000円以下であり、研究遂行自体に問題は無く、今後の研究計画に変更は無い。次年度研究遂行に必要で、少額の消耗品購入に充てる。