hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
高効率で簡易な遺伝子ターゲッティング技術の開発

本研究の最終目標は、ニワトリBリンパ細胞株(DT40)特異的な相同DNA組換え因子を見つけ、標的組換え効率を、現在の手法より1,000倍上昇させることである。CRISPR/Cas9が開発されたが、初代培養細胞やヒトES(iPS)細胞では、CRISPR/Cas9を使ってもゲノム編集(例、特定の点変異のノックイン)は非常に困難である。我々は、目標達成のために、相同組換え因子をDT40から精製する手法を確立した。(1)BRCA1複合体を作る分子を精製BRCA1は、停止した複製フォークや2重鎖DNA切断に集合して、シャペロンとして、相同DNA組換えを促進する。2重鎖切断をおこす抗がん治療薬(カンプトテシンおよびエトポシド)で細胞を処理前後に、BRCA1複合体を精製し、複合体の構成因子を質量分析にて同定した。既知の構成因子は、すべて同定できた。その中には、Abraxa, BRCA1, BRCC36, CtIP, Merit40, Rad51, RAP80が含まれる。したがって、BRCA1複合体精製⇒質量分析の実験手法は、最適化できた。カンプトテシンによる2重鎖切断(エトポシドによる2重鎖切断ではなく)は相同組換えによって修復される。よって、カンプトテシン処後の場合の複合体のみに含まれる分子には、新規の相同組換え因子が含まれている可能性がある。そのような分子が、複数個同定でき、その中にはプロテオソーム構成因子があった。(2)MRE11複合体を作る分子を精製H25年に実施していない。既知の複合体構成因子(DNA2ヌクレアーゼ)の機能解析を実施した。iPONDとは、複製フォークに存在する分子を濃縮精製する手法である。DNA複製を抑制する2mMHydroxyurea処理条件下に細胞を培養し、iPONDを野生型細胞とRNF8-/-細胞を比較しながら実施した。野生型細胞のみに濃縮されたタンパク分子は、ATRX, FANCD2-I, NCAPD2, NUSAP1があった。これらの分子は、RNF8ユビキチン化酵素によって制御されながら、停止した複製フォークの崩壊を防止している可能性がある。本研究の最終目標は、ニワトリBリンパ細胞特異的な相同DNA組換え因子を見つけ、高等真核細胞で標的組換え効率を、現在の手法より1,000倍上昇させることである。既にCRISPR手法が開発され、現在の手法より3桁標的組換え効率が上がり、ヒト細胞や受精卵(マウス、魚等)において遺伝子破壊や遺伝子改変(例、特定の点変異のノックイン)が可能になった。しかし、初代培養細胞やiPS細胞では、CRISPRを使っても遺伝子改変はできない。本研究は、CRISPR手法と併用し、その標的組換え効率をさらに1,000倍上げることにある。可能になれば、体細胞の遺伝子治療に応用できる。本研究助成が始まる2012年以前に、DT40細胞のトランスクリプトームを調べ、そしてDT40細胞においてSILAC (Stable Isotope Labeling with Amino acids in Cell culture)をタンパク質量分析に応用する実験手法を確立した。2012年以降に実施した実験は、相同組換えタンパクの精製法の開発である。相同組換えは100種類以上のタンパクが関与する複雑な生化学反応であり、相同組換えタンパクを一網打尽に精製する手法はない。精製には、(i)既知の相同組換え因子と結合、(ii)相同組換えを誘導する条件で複製フォーク近くに存在、の2つの原理で可能である。(i)については、既知の相同組換え因子としてBRCA1を選び、そのタンパクと結合することが知られているタンパクが全種類いっしょに精製されてくることを確認した。(ii)についてはiPONDと呼ばれる手法をDT40に応用できた。相同組換えを誘導する条件の代表は、抗がん治療薬(例、PARP阻害薬)の添加であるが、その条件ではiPONDを実施できていない。分子生物学(1)「平成25年度の研究実施計画」の中の「(1-1) BRCA1複合体を作る分子を精製する方法を最適化」は、完成した。具体的には、2重鎖切断をおこす抗がん治療薬(カンプトテシンおよびエトポシド)で細胞を処理前後に、BRCA1複合体を精製し、複合体の構成因子を質量分析にて同定した。その結果、既知の構成因子(Abraxa, BRCA1, BRCC36, CtIP, Merit40, Rad51, RAP80)がすべて同定できた。(2)「平成25年度の研究実施計画」の中の「(1-2) MRE11複合体を作る分子を精製する方法を最適化」は未だ開始できていない。以上まとめると、当初計画した2つの実験:(i)抗体を使ったタンパク複合体精製とその質量分析。(ii)

iPONDによってタンパクを精製し、それを質量分析する。は、それぞれの実験条件を最適化できた。よって「おおむね順調に進展している」と結論する。CRISPRやTALENの出現により様々な生物(病原微生物、植物、魚類、家畜など)において遺伝子破壊ができるようになった。しかし、相同組換えによる遺伝子改変、例えば、塩基配列に特定の点変異を相同組換えによって挿入することは、現在のところ困難である。この困難を乗越える方策の1つが、ニワトリDT40細胞の相同組換えの分子機構を解明することである。なぜならば、DT40細胞は、いかなる動物細胞に比べて、その相同組換え効率が3桁以上高いからである。この高い原因は未解明である。本研究課題の最終目標は、この未解明な分子機構を解明することである。H25年度の研究によって、DT40細胞の相同組換えに関与する分子を、抗体およびiPOND法によって精製→質量分析による同定ができるようになった。しかし、質量分析によってたくさんの種類の分子が同定されてくるので、次に、たくさんの種類の分子のうちのどれが重要かを絞り込む作業が必要である。この絞り込みには、以下のように優先順位をつける:(1)カンプトテシン処理前に精製されるタンパク分子より、カンプトテシン処理後に精製度が増加するタンパクを優先(2)野生型DT40と相同組換えの効率よく開始できないミュータントDT40細胞を比べる。カンプトテシン処理後において、ミュータントにおいて精製されるタンパク分子より、野生型においてその精製度が増加するタンパクを優先以上の2つのカテゴリーを満足するタンパク分子が相同組換えに関与しているか否かを調べる。タンパク分子がDT40にのみ発現していれば、最優先で解析する。DT40のmRNA deep sequencingが実施済みである。解析手法は、そのタンパク分子をコードする遺伝子をDT40細胞で遺伝子破壊することによる。当初平成25年度に予定していた「MRE11複合体を作る分子を精製する方法を最適化」が、実験計画の変更で、まだ開始できていないため。カンプトテシン処理前に精製されるBRCA1複合体に関して、野生型DT40と相同組換えの効率よく開始できないミュータントDT40細胞を比べる。相同組換えの効率よく開始できないミュータントとして、CtIP遺伝子破壊株を選ぶ。CtIPは、BRCA1複合体に含まれ、相同組換えの開始に必須である。抗がん治療薬、カンプトテシンか、同様の損傷を作るPARP阻害剤を使って、それらの薬剤の処理前後で精製されるBRCA1複合体の構成因子を定量解析する。この実験によりDT40細胞特異的に機能している相同組換え因子の候補を絞り込む。
無機系産業廃棄物を利用したリサイクル型ポーラスコンクリートの開発・研究

本研究は、それ自体が環境共生型材料として利用されつつあるポーラスコンクリートに、産業廃棄物を大量活用することを目的としており、この2年間の研究で、その製造技術の確立と普及を目指すものである。本研究の最大の特色は、以下の2点である。・産業廃棄物を利用した化学的に安定なリサイクル型ポーラスコンクリートを新たに提案・実用すること。・現在では埋立てし処分されている無機系産業廃棄物を大量に再利用できること。2年間の研究の実績は、おおよそ以下のようにまとめられる。(1)ポーラスコンクリートと再生骨材に関する文献調査(谷川・畑中・湯浅)(2)無機系廃棄物のコンクリート用結合材としての利用の検討(湯浅・畑中)(3)再生骨材のポーラスコンクリート用骨材としての利用の検討(月岡・畑中・湯浅)(4)ポーラスコンクリートの破壊メカニズムと力学特性の分析(畑中・湯浅)(5)軽量骨材ポーラスコンクリートの開発(石黒)以上の研究成果の一部は既に論文として発表している。また、その他も含め,全ての項目について研究論文として公表しつつある。(1)産業廃棄物を利用した化学的に安定なリサイクル型ポーラスコンクリートを新たに提案・実用すること。(2)現在では埋立てし処分されている無機系産業廃棄物を大量に再利用できること。研究初年度の実績は、おおよそ以下のようにまとめられる。また、その他の研究も順調に進んでおり、研究終了時(平成13年3月)には、全ての項目について研究論文として公表する予定である。研究2年度(最終年度)は,研究初年度の成果をさらに発展させたものであり,その実績は、研究初年度と同様,おおよそ以下のようにまとめられる。
前頭連合野における認知マップの多重性と可塑性

本研究の目的は,前頭連合野における認知機能-とくに選択的注意とワーキングメモリーの脳内再現様式(マップ)とその可塑的変化を明らかにすることにある。この問題にアプローチするため,2頭のサルに,眼球運動性の遅延反応課題(oculomotor delayed-response,ODR)と視覚探索課題(oculomotor visual search,OVS)を訓練した。ODR課題では,サルは数秒の遅延期の前に提示された視覚手掛り刺激の位置に向かって記憶誘導性サツケードを行うことが要求されるため,視空間性のワーキングメモリを調べるのに適当である。一方のOVS課題では,一つのターゲット刺激とその周りに妨害刺激(distracters)が配列した刺激配列が提示され,サルは妨害物の中からターゲットを選び出し,その方向に向かってサッケードすることが要求された。このOVS課題では,妨害物の中からターゲットを選び出す過程としての選択的注意が必要である。サルがこれらの課題を遂行している間に前頭連合野の局所に微量のムシモール(5μg/ミリ(リットル),μ(リットル))を注入して局所的に機能脱落を起こし,課題遂行への効果を調べた。その結果,1)ODRとOVS課題がムシモール注入によって障害されること;2)障害された手掛り・ターゲット位置と注入部位の間にはトポグラフィカルな関係があること,そして3)OVSの障害を引き起こす注入部位は,ODRの障害と関係する部位よりもやや尾側に分布していたが,重複があること,がわかった。これらの結果は,前頭連合野においてメモリマップと注意マップが重複して(多重して)再現されていることを示唆する。さらに,ODR課題を2年間訓練したサルに,OVS課題を訓練して同様の実験を行った結果,注意マップがメモリマップの周囲に排他的に再現されているというデータを得た。このことは,既に認知マップがある場合,そのマップを避ける形で(排他的に)別の認知マップが形成されることを示唆する。すなわち,前頭連合野の認知マップは,経験に応じてダイナミックに再現される可能性がある。今後はこの問題をさらに調べてゆく予定である。本研究の目的は、前頭連合野における認知機能ーとくに選択的注意とワーキングメモリーの脳内再現様式(マップ)とその可塑的変化を明らかにすることにある。遅延期に方向選択的な活動を示した162のニューロンのうち,87(54%)はODRとODVSの両方で遅延期活動を示した("Delay-neuron").このニューロン群は一般的なメモリシステムを担うと考えられる.一方,残りの75(46%)は,ODVSのみで遅延期活動を示した("Search-delay neuron").これらは「選択的注意と結びついたメモリシステム」を特異的に再現すると考えられる.さらに,これらのニューロン群での遅延期活動の時間経過は類似していたが,その皮質内分布ははっきりと異なっていた.すなわち,Search-delay neuronsは,Delay neuronsよりも,より尾側の領域(46野尾側と8A野)にまとまってみつかった.これらデータから,前頭連合野において「選択的注意用メモリシステム」と「一般的メモリシステム」が並列的に多重したマップを形成していることが示唆される.本研究の目的は,前頭連合野における認知機能-とくに選択的注意とワーキングメモリーの脳内再現様式(マップ)とその可塑的変化を明らかにすることにある。
ASD（自閉症スペクトラム障害）の病理学知見を用いた哲学的構想力概念の再構築

本研究は、近年自然科学分野において研究が進み、社会的にも関心が高まるASD(自閉症スペクトラム障害)の病理学が急速に明らかにしつつある人間の知覚、想像力、記憶についての知見を、伝統的な哲学研究における概念や理論と突き合わせることで、学際的な相互作用による新しい総合人間科学分野形成のための基盤構築を目指すものである。特にASDが示す知覚、記憶、想像力の特異性と社会的コミュニケーション能力の障害特性に注目し、その知見の上に、古典哲学および現代思想分野における「構想力」概念を軸とした人間精神についての理論的把握の再構成を体系的に行なうことを目的とする。
腸管寄生原虫類の網羅的検出法の開発と遺伝子情報リファレンスの構築

最新のDNAバーコーディング構想を臨床検査に導入して、全ての腸管寄生原虫を特異的かつ網羅的に検出・同定するという新しい検査法の確立を目指し、ヒトに感染し得る6種のEntamoeba属(E.histolytica、E.dispar、E.coli、E.hartmanni、E.polecki、E.moshkovskii)を同定する新規PCR法を確立した。さらに、その有効性を確認すると同時に途上国におけるアメーバ属感染状況の解明を目的に、Entamoeba属の遺伝子型解析を実施した。具体的には、Entamoeba属を網羅的に検出するPCR(網羅的PCR)と種特異的PCRの組み合わせによるnestedおよびsemi-nested PCR法を用い、インドネシアにおいて採取した459検体の糞便サンプルに本法を適用し、糞便から直接抽出したDNAをテンプレートに、Entamoeba属の検出および種同定を実施した。網羅的PCRでは79検体(17.2%)が陽性を示し、その内、E.dispar6検体(1.3%)、E.coli 62検体(13.1%)、E.hartmanni 38検体(7.6%)、E.polecki 2検体(0.4%)が種同定PCRにより同定された。また、22検体(4.8%)は混合感染だった。以上の結果から、まん延地域では複数の種による重複感染が日常的に起こっており、PCRを用いた検出と分子疫学的解析を実施するには、本法で使用したような各々の種を特異的に検出可能なプライマーが必要であり、有効であることが判明した。したがって、網羅的PCRと特異的PCRを組み合わせた分子系統樹におけるクラスターごとの検出は、DNAバーコーディングを原虫同定に適応していく上で現実的に可能なアプローチであり、今後、その適応範囲を広げていくことが比較的容易と考えられた。
大腸癌におけるE型Cadherinの発現性についての免疫組織学的研究

癌の浸潤、転移において重要な役割を占めるといわれる細胞間接着因子E-Cadherin(以下E-CD)の発現性からみた、ヒト大腸癌の生物学的悪性度、ならびに転移の早期予知に関する研究を施行した。対象は平成6年度に手術が施行された大腸癌45例で、手術後20%ホルマリン固定標本におけるE-CDの発現性を検討した。また、45例中、新鮮手術摘出標本が作成できた25例に対しても同様にE-CDの発現性を検討した。1次抗体としては、宝社製抗ヒトE型カドヘリンモノクローナル抗体を用いた。また、染色法は酵素抗体法(ABC法)にて免疫組織学染色を行った。結果としては、今回の研究においては、固定標本、新鮮手術摘出標本いずれにおいても、組織型、壁深達度、脈管侵襲、浸潤形式、リンパ節転移、肝転移などの病理組織学的因子おいて、その程度や有無による腫瘍内のE-CDの発現性に関しては、有意差は認められず、研究当初予想していた、肝転移例、リンパ節転移陽性例、腹膜播種陽性例、組織型の分化度の低い症例、脈管侵襲陽性例などの、高度進行癌症例ほどE-CDの発現性が減弱するということが、大腸癌の浸潤、転移を予知させる生物学的悪性度の一つの指標になる可能性があるという結果は得られなかった。しかしながら、壁深達度が高度な症例、および肝転移症例では、有意差は認めないものの、E-CDの発現性が減弱する傾向が認められ、今後、さらなる症例の蓄積、研究が必要と考えられた。尚、研究開始時は約100例のヒト大腸癌を研究対象としていたが、研究開始時からの約50例に関しては、研究評価の対象とできるような十分な染色結果が得られず、対象からの脱落症例となった。
HCN4イオンチャネルを指標とした心筋純化法の開発と心疾患への再生医療

心臓は、洞結節ペースメーカ細胞や刺激伝導系細胞などの特殊心筋と、心房筋や心室筋など作業心筋など、各種のサブタイプ心筋から構成されている。近年、再生医療、創薬においてヒトES/iPS細胞に由来する心筋細胞の有用性が広く認められている。しかし、これらの多能性幹細胞からの分化誘導心筋には、各種サブタイプ心筋が混在している。本研究では、これらの混在した心筋細胞集団の中から、それぞれのサブタイプ心筋を純化できる実験系の確立と、純化した各種心筋の解析、およびその再生医療あるいは創薬への応用を目標とした。ヒト多能性幹細胞から心筋細胞を分化誘導した場合には、ペースメーカ細胞や刺激伝導系細胞などの特殊心筋と、実際に収縮する心房筋、心室筋の作業心筋とが、混合した状態で得られる。しかし、特殊心筋の異常は、不整脈、作業心筋の障害は、心不全と異なった病態を示す。このように、それぞれの病気の再生医療には、それぞれの障害に対応した心筋細胞を用いることが望ましいであろう。本研究では、特殊心筋マーカーであるHCN4イオンチャネルの発現を指標とすることによって、混在した心筋分化誘導系から、特殊心筋と固有心筋とを選別採取することを試みる。本年度は、ヒトES細胞の改変を行い、2つの細胞株を樹立した。ひとつは、ペースメーカ細胞を含む特殊心筋の可視化を可能とするHCN4遺伝子座への青色蛍光タンパク質(CFP)のノックイン株、もうひとつは、心室筋細胞の可視化を目的としたMlc2v遺伝子座への赤色蛍光タンパク質(mcherry)ノックイン株である。HCN4遺伝子を発現する細胞の可視化のためには、HCN4遺伝子を含んだBACベクターを用いて、ヒトES細胞の改変を行った。また、Mlc2v発現細胞の可視化のためには、ゲノム編集技術を用いCrisper/CAS9法で、mCherryのノックイン株を作製した。現在、このES細胞株から心筋を分化誘導し、CFPおよびmCherry陽性細胞を選別採取し、その特性を解析中である。予備的な結果ではあるが、HCN4陽性細胞が、生体の洞結節ペースメーカ細胞と同等の特性を持っていることを明らかにすることができている(ISSCR発表予定)。心臓病は、洞結節ペースメーカ細胞・刺激伝導系細胞(特殊心筋)あるいは心房・心室筋細胞(作業心筋)といった障害部位の解剖学的差異により、不整脈や心不全といった異なった臨床症状を呈する。また、心筋細胞は、ほとんど再生しないため、治療にはヒト多能性幹細胞から作製した心筋細胞を用いる再生医療が有望である。しかし、ヒト多能性幹細胞から心筋細胞を分化誘導した場合には、特殊心筋と作業心筋とが、混合した状態で得られる。本研究では、ヒト多能性幹細胞からペースメーカ細胞と心室筋細胞とを選別分取できる実験系の構築と、各種心筋細胞特性解析およびその臨床応用の可能性を探ることが目標である。昨年度作製に成功した二重改変ヒトES細胞株(#2-6、#3-8)を用いて、1HCN4イオンチャネルを指標にペースメーカ細胞を、2MLC2vミオシン軽鎖を指標に心室筋細胞を、同時に選別分取することに成功した(ISSCR2015、第80回日本循環器学会)。具体的には、HCN4発現ペースメーカ細胞をCFP(青色蛍光タンパク質)、MLC2v発現心室筋細胞をmCherry(赤色蛍光タンパク質)によって、同時に可視化し、それぞれをセルソーターによって選別分取した。これら二重改変細胞株から選別分取したGFP(HCN4)陽性細胞とmCherry(MLC2v)陽性細胞は、それぞれ、ペースメーカ様細胞と心室筋様細胞の電気生理学的特性を示した。さらに、分化誘導後、2ヶ月のGFP陽性細胞を選別採取し、各種薬剤に対する応答性を検討したところ、など各種イオンチャネルブロッカーに対する生理的濃度での反応性を確認することができた。これらの結果は、ペースメーカ細胞と心室筋細胞を選別採取できる実験系の確立に成功し、選別採取したペースメーカ細胞を用いて、薬剤に対する安全性試験あるいは薬剤スクリーニングが可能であることを示している。本年度の計画は、(1)HCN4陽性細胞とMLC2v陽性細胞の選別分取による純化、(2)基本的な特性解析、(3)各種チャネルブロッカーに対する薬剤応答性の解明、(4)疾患モデル動物への移植実験であった。我々は、まず、作製した二重改変ヒトES細胞株(#2-6、#3-8)から、純化したHCN4陽性細胞とMLC2v陽性細胞の大量調整に成功した。続いて、純化した細胞を用いて、ホールセルパッチクランプ法によって電気生理学的解析を行い、HCN4陽性細胞がペースメーカ細胞、MLC2v陽性細胞が心室筋細胞としての特性を示すことを明らかにした。さらに、選別分取したHCN4陽性細胞について、各種チャネルブロッカーに対する薬剤応答性が生理的濃度で認められた。このように、ヒトES細胞に由来するペースメーカ細胞と心室筋細胞を選別分取することに成功し、薬剤の安全性薬理試験、スクリーニングなど将来の医学応用の可能性を示すことができた。しかし、当初予定していた遺伝子発現プロファイル、再生医療のためのモデル動物への移植実験は行えなかった。一方、当初予測していなかったに二重陽性細胞が存在することが判明した。さらに、将来の医療応用を鑑みた場合、ヒトiPS細胞に由来する細胞の方が、応用可能性が広がると考えられる。

そこで、ヒトiPS細胞を用いた可視化-選別採取法を新たに開発することとし、HCN4-GFP(緑色蛍光タンパク質)-BACベクターの遺伝子導入による新規ヒトiPS細胞株の樹立に成功した。このように、本年度、ペースメーカ細胞の選別分取に成功したこと、一部ではあるが、それらの特性解析、薬剤応答性を明らかにすることができ、また新たな細胞株の樹立にも成功していることなど、研究は、おおむね順調に進行したと考えている。ヒトiPS/ES細胞を用いた心筋分化誘導系では、各種サブタイプ心筋が混在している。本年度は、これらの混在した心筋細胞集団の中から、それぞれのサブタイプ心筋を純化できる実験系の確立と、純化した各種心筋の解析、およびその再生医療あるいは創薬への応用を目標とした。具体的には、洞結節ペースメーカ細胞はHCN4イオンチャネルを、そして心室筋細胞はMLC2vミオシン軽鎖を指標に、選択的に分取・純化できるヒトiPS/ES細胞の樹立を試みた。そのために、(1)BACベクターを用いたセミノックイン法によって、HCN4発現を緑色蛍光タンパク質(GFP)で、(2)CRISPR/Cas9によるゲノム編集法によって、MLC2v発現を赤色蛍光タンパク質(mCherry)で、可視化できる二重改変ヒトiPS/ES細胞株の樹立に成功した。心筋を分化誘導後、FCMで解析すると、GFP陽性細胞が分化誘導後10日前後で、それより遅れ約1ヵ月後にGFP/mCherry二重陽性細胞が、続いてmCherry陽性細胞が観察されることが分かった。これら3種の細胞をセルソーターで分画したところ、予測どおり、GFP陽性細胞は、HCN4を特異的に発現し洞結節ペースメーカ型の電気生理学的特性を、mCherry陽性細胞は、MLC2v陽性の心室筋の特性を示した。また、将来の創薬への応用を目指し、純化したHCN4陽性細胞を用いて、各種イオンチャネルブロッカーに対する応答性を市販心筋細胞と比較検討した。その結果、薬剤として使用される生理学的濃度での反応性を確認することができた。このように、ヒトiPS/ES細胞の心筋分化誘導系から、生体の洞結節ペースメーカおよび心室筋細胞と同等のサブタイプ心筋を選別採取できる実験系の確立に成功した。これらの細胞解析は、途上であるが、創薬への展開などに有望であると考えている。心臓は、洞結節ペースメーカ細胞や刺激伝導系細胞などの特殊心筋と、心房筋や心室筋など作業心筋など、各種のサブタイプ心筋から構成されている。近年、再生医療、創薬においてヒトES/iPS細胞に由来する心筋細胞の有用性が広く認められている。しかし、これらの多能性幹細胞からの分化誘導心筋には、各種サブタイプ心筋が混在している。本研究では、これらの混在した心筋細胞集団の中から、それぞれのサブタイプ心筋を純化できる実験系の確立と、純化した各種心筋の解析、およびその再生医療あるいは創薬への応用を目標とした。当初の予定では、まずHCN4遺伝子座に単純ヘルペスウイルスのチミジンキナーゼ遺伝子(HSV-TK)を導入したヒトES細胞株を樹立する。続いて、心筋へ分化誘導後、HCN4発現細胞で、HSV-TKによる選択的な細胞死を引き起こすことによって、ペースメーカ細胞などの特殊心筋を除き、心室筋などの固有心筋を分取する計画であった。
超音波診断装置を用いた気泡の画像化によるワイヤレス圧力センサシステムの基礎的研究

本研究では圧力に応じて変化する気泡の固有振動数を超音波診断装置により計測することで環境の圧力を見積もる手法を提案し、提案システムの圧力計測原理となる気泡の固有振動数の圧力依存性の計測を行った。まず、気泡の圧力に対する固有振動数の変化がどの程度となるかを理論的に見積もった。その後、超音波造影剤を気泡として使用し、圧力の変化を、超音波診断装置におけるパルス波ドップラのドップラシフトとして計測できる可能性を確認した。本研究では、母胎内という外から直接触れることのできない環境にいる胎児の生体情報計測に向け、超音波診断装置を用いた気泡の撮像によるワイヤレス圧力計測システムを提案し、提案システムの実現可能性を評価することを目的とし研究を行っている。超音波診断装置を利用することで、圧力計測部に電源が不要となるうえ、センサの形状を確認しながら情報伝達が可能となるため、情報伝達の確実性が向上する。本年度は、超音波診断装置による圧力計測原理確認のため、超音波診断装置・テフロンチューブ・シリンジ・圧力計からなる実験系を構築した。撮像対象となる気泡として、市販の超音波造影剤を用いた。テフロンチューブ内を超音波造影剤の懸濁液で満たし、超音波診断装置によりテフロンチューブの画像を取得した。このとき、水をシリンジにより出し入れすることで、テフロンチューブ内の圧力を大気圧に対し、陽圧・陰圧に調整することが可能である。超音波診断装置はテフロンチューブとの位置関係が変わらないよう冶具を用いて固定した。超音波診断装置により撮像したBモード画像を解析したところ、超音波造影剤の造影効果を確認するには至らなかった。また、圧力を印加したのち、カラーフローモード画像を解析したところ、色の変化は見られなかった。これらの要因として、超音波強度が強すぎたこと、印加する圧力の変化量が小さく周波数シフトが小さかったこと、があげられる。次年度以降、速やかにこれらの課題に対処し、計測原理確認を行った後、圧力計測部の設計・試作を行う予定である。超音波診断装置によるテフロンチューブ内の超音波造影剤の撮像がうまくいかず、原理確認に手間取っているため。本年度は昨年度に引き続き超音波造影剤(気泡)の圧力に対する応答の評価を行った。昨年度問題となっていたチューブ内の超音波造影剤の撮像がうまく行かないという課題を解決するため実験系の見直しを行い、超音波造影剤に対してゲージ圧で-1515 kPaの圧力を印加可能な実験系を構築した。実験系には超音波診断用ゲルパッドを用いた超音波撮像用チャンバを設け、チャンバ内に超音波造影剤を含む生理食塩水を導入し、チャンバに接続したシリンジにより圧力の印加を行うことができる。超音波診断装置により撮像したチャンバ内のBモード画像を解析したところ、超音波造影剤の造影効果を確認した。しかし、超音波造影剤に圧力を印加したのち、カラーフローモード画像を解析したところ色の変化は見られなかった。この要因解明にむけて、次年度は印加する圧力に対する気泡の共振周波数の変化を改めて理論的に見直す。理論的考察により超音波診断装置の撮像条件を詳細に検討したのち、計測原理確認を行う。その後、デバイス化に向けて圧力計測部の設計・試作を行う予定である。実験系を見直し、超音波造影剤への圧力の印加が可能な実験系を構築したものの、超音波診断装置による撮像条件の条件だしがうまく行っていないため。本年度は超音波診断装置の撮像条件を検討するため、超音波造影剤(気泡)の振動に関する理論的な考察を行った。超音波造影剤(気泡)が弾性領域での振動を行っていると仮定した際の圧力変化に対する共振周波数の変化量と超音波診断装置における流速計測時のドップラシフト量を比較したところ、同程度のオーダの値が得られる見込みがあることを確認した。実験系に関しては、シリンジポンプを用いた圧力印加機能の向上、被圧力印加モデルの改善を行った。また、撮像用の超音波診断装置として性能の異なる2種類の装置を用いた評価を行ったものの、いずれの装置を用いた場合も圧力印加による画像の変化は見られなかった。研究期間全体として、試作実験系での圧力計測に適した超音波診断装置の撮像条件の抽出はできなかったものの、今後も継続して研究を行うための超音波診断装置と被圧力印加モデルおよび圧力印加装置で構成される実験系を構築できた。今後は撮像時の信号処理用フィルタの変更、超音波プローブの送信周波数の変更等を行い、圧力計測用の撮像条件の抽出を行う。

本研究では圧力に応じて変化する気泡の固有振動数を超音波診断装置により計測することで環境の圧力を見積もる手法を提案し、提案システムの圧力計測原理となる気泡の固有振動数の圧力依存性の計測を行った。まず、気泡の圧力に対する固有振動数の変化がどの程度となるかを理論的に見積もった。その後、超音波造影剤を気泡として使用し、圧力の変化を、超音波診断装置におけるパルス波ドップラのドップラシフトとして計測できる可能性を確認した。超音波造影剤の撮像がうまくいっていない要因として、造影剤にあたる超音波強度が強すぎたということが考えられる。今後は、超音波診断装置のプローブと計測部の間での超音波の減衰量・プローブと計測部間距離・角度を調整できるよう実験系の改善を行い、引き続き原理確認を行う。このとき、まずは当初の予定より大きな圧力変化を加え、原理確認を行う。原理確認ができ次第、圧力計測部の設計・試作を行う。超音波診断装置の撮像条件を詳細に検討するため、理論的な考察を行ったうえで引き続き原理確認を行う。原理確認ができ次第、デバイス化に向けて圧力計測部の設計・試作を行う。医用システム学会発表を予定していたが思ったような成果が出ず発表するに至らなかったため。学会発表を予定していたが思ったような成果が出ず発表するに至らなかったため。当初の計画通り、旅費として使用する予定である。成果発表のための旅費での使用に加え、理論的検討を行うためのソフトウェアライセンス費用として使用する予定である。
殉教の位置づけから見た初期キリスト教会の内政・外交研究

前年度までの研究状況を受け、ローマ皇帝デキウスによる、帝国の安寧を祈願するよう命令した供儀執行命令布告と、それに対するキリスト教会をつぶさに見ることを第一の研究とした。司教らを頂点とする教会指導者たちは、帝国・各属州当局による供儀執行命令にも屈せずに拷問・追放・財産没収等を耐えた教徒らを告白者、さらには殉教者として称揚した。しかしながら、彼らの存在が各地の教会でさらなる分裂をもたらした。この研究では、これらの分裂状況を解消するために司教キプリアヌスが行った教会統治と政治交渉の過程を明らかにすべく、キプリアヌスらの書簡、彼が招集した教会会議の決議録等を分析し、分離派を議決の場から排除し、司教権を確立していくキプリアヌスの活動を再構成した。この研究成果は「カルタゴ司教キプリアヌスと3世紀中葉北アフリカにおける教会会議」と題し、『歴史学研究』第937巻に掲載した。また、初期キリスト教史料における殉教者の位置づけを巡って、4世紀に教会史家カエサレアのエウセビオスが執筆した『古の殉教集成』を検討した。この史料はすでに散逸しているが、諸史料の断片的引用をもとに、その構成について一部再構成を試み、そこからエウセビオスが殉教者・告白者に与えた定義と位置づけを考察した。エウセビオスは殉教者と告白者に厳密なランク付けを行い、殉教者のみ個人名を記録し、告白者はその人数を記すに留めた。この研究は初期キリスト教における殉教者記録の法則を明らかにするものである。この研究は“Martyrs and Confessors of Lugdunum: A Validation of Eusebius's Documentation"のタイトルでScrinium: Journal of Patrology and Critical Hagiography, vol. 11(1)に論文掲載した。27年度が最終年度であるため、記入しない。本研究では、初期キリスト教教会記録における、生ける殉教者に関する抑制的叙述が、教会内の制度的権力の頂点たる司教と、迫害に際してイレギュラーに発生する非制度的・カリスマ的権威たる殉教者との政治的闘争を反映していることを明らかにすることを課題の一つとしている。そのため本年度は可能な限り殉教者文書や教会暦史料などの一時文献、研究文献の収集に努め、またパソコンを購入して電子データ化された史料類に対応する予定であった。また、重要史料に関しては翻訳を行い、研究成果の学会報告、学術雑誌投稿を目指した。本研究は、初期キリスト教会における殉教者ならびにかれらに次ぐ存在とみなされた告白者に関する位置づけを検証することを通じて、ローマ帝政期における初期教会の内政と外交を解明しようとするものである。今年度、本研究は昨年度からの研究の進展を受け、ローマ皇帝デキウス(位249ー251)が行った対キリスト教徒政策がどのように施行されたかを検証した。彼が250年に発布した、全帝国市民に対し、帝国の安寧を祈り神々に供儀をささげよとの布告とそれに対する各属州の行政現場での実施、ならびにこの布告に対するキリスト教徒の反応が考察の対象である。主な検証の対象となったのは、供儀執行者に発行された証明書パピルスである。本研究はこのパピルス史料全46葉を近代の校訂に基づき全訳し、そこから読み取れる供儀ならびに証明書執行の手続きを考察した。複数のパピルスには同一家族内の個人名がまとめて記載されており、そこから、証明書パピルスは、個々人が携帯するのではなく、一家に一枚保管されるために発行されたと考えられる。このことから、デキウスの対キリスト教徒政策とは、個々のキリスト教徒を探索し炙り出す踏絵のようなものではなかったことが浮かび上がる。こうした皇帝政府の方針は、当時の状況を証言する教会史史料、殉教伝史料とも整合する。この研究は第64回日本西洋史学会大会(立教大学、2014年6月)にてポスター報告され、大会参加者の投票により優秀ポスター賞に選ばれた。この受賞を記念して2014年11月に立教大学にて開催された公開講演会で同研究に関する講演を行い、研究成果の社会還元を行った。

エウセビオスは殉教者と告白者に厳密なランク付けを行い、殉教者のみ個人名を記録し、告白者はその人数を記すに留めた。この研究は初期キリスト教における殉教者記録の法則を明らかにするものである。この研究は“Martyrs and Confessors of Lugdunum: A Validation of Eusebius's Documentation"のタイトルでScrinium: Journal of Patrology and Critical Hagiography, vol. 11(1)に論文掲載した。研究課題を達成していくことと同時に、学会報告で成果を報告し、研究内容の妥当性を確認しながら作業することができたが、伝統ある日本西洋史学会大会にて報告に対し受賞できたことは、研究が計画以上に進展していたことを示すと考える。27年度が最終年度であるため、記入しない。本研究は古代ローマ帝国におけるキリスト教会の内政・外交を殉教をキーワードに探ろうとするものである。これまでの研究の進展を受け、当初の計画に加え、ローマ帝国がキリスト教化していくと言われる古代末期、特にコンスタンティヌス朝期以降やポスト・ローマ期なども視野に入れることが可能となることが明らかになってきた。国家によるキリスト教徒の信仰問題を対象とした刑事裁判が存在しなくなる時代、すなわち殉教が発生し得ない時代になっても、殉教者という象徴的な存在は、キリスト教会において内外との交渉を行う際に有効であった。こうした点を念頭におき、今後研究を進めていきたい。本年度は予定していた史料収集・分析ならびに国内外での学会報告を経て、本研究の妥当性の確認と研究内容上の計画の微修正を行うことができたため、おおむね順調に進展した。今後、2014年5月31日には日本西洋史学会大会にてポスター報告を行い、三世紀のキリスト教迫害の実情とそれに際した教会メンバーの行動様式を分析することで、当時の教会内外に対しておこなわれた内政・外交の検証をさらに進める予定である。また、研究成果の公表も随時試みていく。
骨基質タンパクの破骨細胞形成に与える影響について

破骨細胞形成に及ぼす骨基質(骨粉)の影響について、ラット長管骨から単離した骨髄細胞を使って検討した。全骨髄細胞を48穴プラスチックマイクロプレート中で4日間培養すると、破骨細胞のマーカー酵素であるTRAP陽性の多核細胞が形成された。さらに培養開始2日後より[^3H]-プロリンで標識した骨粉(100μg/cm^2:20-53μm)を添加すると、多核細胞の形成が50%促進した。この時の培養液中の放射活性が約30倍増加していたことから、TRAP陽性の多核細胞は破骨細胞であると考えられた。この結果から、骨基質中に破骨細胞形成促進因子が存在することが示唆された。次に骨粉添加が、破骨細胞内での情報伝達系(特にチロシンのリン酸化)におよぼす影響について検討した。2週間低カルシュウム食で飼育したニワトリ長管骨より、Hiuraらの方法に従い単球を単離し、6穴プラスチックプレート中で培養を開始した。4日後、骨粉(20-53μm)を添加しCell Lysateを通法に従い作製した。チロシンのリン酸化についてウエスタンブロット法により解析すると、骨粉添加群において明らかに促進された200kDa,130kDa,および85kDaのバンドが検出された。さらにリン酸化は、骨粉添加10分後に最大を示した。そこで、骨粉添加によりリン酸化されたタンパク質が、テンシン、FAK、コルタクチンである可能性について、免疫沈降法とウエスタンブロット法を用いて検討した。集められたテンシンとFAKには、チロシンのリン酸化は検出されなかったが、免疫沈降しなかったサンプルにおいて、200kDaと130kDaにリン酸化のシグナルが検出された。しかし、免疫沈降法により集められたコルタクチンはリン酸化していたことから、骨基質添加によって起こる破骨細胞の形態変化(波状縁形成)に、コルタクチンのチロシンリン酸化は関与しているが、テンシンとFAKは係わっていないことが示唆された。また、骨基質中に多数含まれる骨細胞のカルシウムに対する応答とメカニズムについて調べたところ、細胞外液のカルシウム濃度に依存して細胞内カルシウムの上昇がみられた。さらに、この現象はカルシウム感受性レセプターによることが示唆された。破骨細胞の分化および機能に対する、骨基質の影響について検討したところ次のような結果が得られた。5-フルオロウラシル処理マウス脾細胞からの破骨細胞形成系において、骨基質に芽球細胞維持能力は認められなかったが、分化促進効果を認められた。またその効果は、1α,25-(OH)_2D_3あるいは間質細胞の共存により増幅された。さらに、骨基質のEDTA抽出群中にもこのような破骨細胞形成促進効果がみられたため、現在この物質について単離精製中である。さらに、骨吸収中の破骨細胞には波状縁がみられ、その形成にはシ-リングゾーンにおける骨基質タンパクの認識、およびシグナル伝達(特にpp60c-srcのチロシンリン酸化)にともなう細胞骨格の変化が必要であると考えられている。そこで我々は、骨基質あるいは抽出物の破骨細胞におけるシグナル伝達系にもたらす効果を検討する測定系の開発を試みた。まず、破骨細胞におけるテンシンとコルタクチンの発現、局在、およびチロシンリン酸化について調べた。テンシンとコルタクチンは、新しく発見された細胞膜裏打ちタンパク質で、細胞-基質間接着部に存在し、pp60c-srcの基質であり、アクチンの縮重合に関係している。テンシンおよびコルタクチンは、破骨細胞のシ-リングゾーンに認められたが、前破骨細胞中には認められなかった。すでに知られているポドゾーム形成タンパク質であるビンキュリンとの関係について調べたところ、テンシンはビンキュリンと同じ部位に、コルタクチンはその中に観察された。次に、骨基質添加による両タンパク質のリン酸化について検討した。骨基質の添加により、両タンパク質のチロシンリン酸化が促進されており、骨基質中に破骨細胞の細胞骨格に変化をもたらすシグナル伝達系を活性化する物質が含まれていることが示唆された。

そこで、骨粉添加によりリン酸化されたタンパク質が、テンシン、FAK、コルタクチンである可能性について、免疫沈降法とウエスタンブロット法を用いて検討した。集められたテンシンとFAKには、チロシンのリン酸化は検出されなかったが、免疫沈降しなかったサンプルにおいて、200kDaと130kDaにリン酸化のシグナルが検出された。しかし、免疫沈降法により集められたコルタクチンはリン酸化していたことから、骨基質添加によって起こる破骨細胞の形態変化(波状縁形成)に、コルタクチンのチロシンリン酸化は関与しているが、テンシンとFAKは係わっていないことが示唆された。また、骨基質中に多数含まれる骨細胞のカルシウムに対する応答とメカニズムについて調べたところ、細胞外液のカルシウム濃度に依存して細胞内カルシウムの上昇がみられた。さらに、この現象はカルシウム感受性レセプターによることが示唆された。破骨細胞形成に及ぼす骨基質(骨粉)の影響について、ラット長管骨から単離した骨髄細胞を使って検討した。全骨髄細胞を48穴プラスチックマイクロプレート中で4日間培養すると、破骨細胞のマーカー酵素であるTRAP陽性の多核細胞が形成された。さらに培養開始2日後より[^3H]-プロリンで標識した骨粉(100μg/cm^2:20-53μm)を添加すると、多核細胞の形成が50%促進した。この時の培養液中の放射活性が約30倍増加していたことから、TRAP陽性の多核細胞は破骨細胞であると考えられた。この結果から、骨基質中に破骨細胞形成促進因子が存在することが示唆された。次に骨粉添加が、破骨細胞内での情報伝達系(特にチロシンのリン酸化)におよぼす影響について検討した。2週間低カルシュウム食で飼育したニワトリ長管骨より、Hiuraらの方法に従い単球を単離し,6穴プラスチックプレート中で培養を開始した。4日後、骨粉(20-53μm)を添加しCell Lysateを通法に従い作製した。チロシンのリン酸化についてウエスタンブロット法により解析すると、骨粉添加群において明らかに促進された200kDa,130kDa,および85kDaのバンドが検出された。さらにリン酸化は、骨粉添加10分後コルタクチンである可能性について、免疫沈降法とウエスタンブロット法を用いて検討した。しかし、免疫沈降法により集められたコルタクチンはリン酸化していたことから、骨基質添加によって起こる破骨細胞の形態変化(波状縁形成)に、コルタクチンのチロシンリン酸化は関与しているが、テンシンとFAKは関わっていないことが示唆された。
生体内観察システムによる心血管疾患における白血球遊走過程の解明

昨年度までに血管内膜の炎症反応を観察するカフ傷害モデル、高脂血症モデルであるアポE欠損マウスにおけるリアルタイム観察の実験系を確立し、すでに確立済であるワイヤー傷害モデルと合わせて様々な動物モデルでの観察が行えるようになった。これらのモデルを用いて様々な血管炎症反応モデルにおける細胞接着現象の生体内観察が可能とあった。さらに、本年より新しい動物モデルとして、血管周囲脂肪組織に着目し、血管周囲に他動物由来の脂肪組織を移植するモデルを考案し、観察・病態メカニズムの検討を進めた。まず、移植する脂肪組織によってそれらの作用に差があり、皮下脂肪よりも内臓脂肪でその作用は強く、高脂肪食負荷動物由来の脂肪組織を移植するとその作用はより強くなった。また移植した脂肪組織および移植された動物の血清のELISA解析を行った結果、炎症性サイトカインであるIL-6および炎症性ケモカインであるMCP-1とMIP-1βの関与が示唆された。さらに脂肪組織中へ浸潤している細胞種の同定を試みたところ、M1マクロファージ、活性化単球および成熟樹状細胞の浸潤を認めた。またそれらは皮下脂肪に比べ内臓脂肪で顕著であり、高脂肪食負荷によって増加した。脂肪移植後の顆粒球および単球上の接着分子であるCD11bの発現が増加しており、観察前に抗CD11b抗体を静注する事によって血管への細胞接着数が有意に抑制された事から、脂肪移植後の細胞接着にCD11bが重要であることが示唆された。一方で機械的傷害後の細胞接着に重要な役割を果たす酸化ストレスに関しては増強が見られず、別のメカニズムが存在する可能性があり、観察・病態メカニズムの検討をさらに進める事で、メタボリックシンドロームにおける脂肪組織の役割をより明らかにする事が出来ると考えられる。これまでの研究でワイヤー傷害後の白血球遊走過程の可視化と、酸化ストレスの重要性を明らかにしていたが、実際の生体において重要な役割を果たす血管内皮との関連性や高脂血症などの病態における観察については行っていなかった。そこで昨年度の研究では、ワイヤー傷害に代わる観察可能な新たな傷害モデルを作成し、接着現象の再現性の確認および基礎的な病態メカニズムの解明を目的とした。まず血管内皮を温存した機械的傷害であるカフ傷害モデル、および高脂血症モデルであるアポE欠損マウスについてリアルタイム観察を確立し、目的に応じて動物モデルを選択できるようになったが、それぞれに長所・短所があり、さらに新しい動物モデルの作成を試みた。そこで、近年炎症との関連が指摘されている血管周囲脂肪組織に着目し、血管周囲に他動物由来の脂肪組織を移植するモデルを考案した。このモデルは血管周囲脂肪組織と血管炎症の関連性のみならず、肥満によって腹部大動脈周囲に内臓脂肪が蓄積するメタボリックシンドロームの様な病態を仮定しており、ワイヤー傷害モデルにおいて問題となっていた血管内皮の存在、カフ傷害における観察期間の制限、アポE欠損マウスにおける実験計画の組みにくさといった短所を全て解決出来る動物モデルとして、本研究における動物モデルの中心と位置付け、観察・病態メカニズムの検討を進めている。これまでに時間依存的に白血球の接着が増加する事、移植する脂肪組織によってそれらの作用に差がある事を明らかにしており、さらに血清ELISA解析などによるサイトカインやケモカインの同定、免疫ブロット等による細胞内シグナル伝達や酸化ストレス分子の解析をする事で、メタボリックシンドロームにおける脂肪組織の役割を明らかにする事が出来ると考えられる。
超小角X線散乱法による高分子粒子系における相互作用と相転移の解析

低イオン強度下において水分散液中で形成されるコロイド結晶構造とその変化を超小角X線および中性子散乱法(USAXS,USANS)により詳細に調査し、コロイド粒子間相互作用の本質について厳密な考察を行った。超小角散乱曲線にブラックピークとして現れる粒子間距離の塩濃度依存性を系統的に調査したところ、塩濃度の現象にともないいったん増加し極大に達した後、減少する傾向を発見した。この実験事実は、従来の古典的および新規なコロイド間相互作用に関する理論では説明できない新たな発見である。この現象は、大きさ、荷電状態の異なる他のラテックス粒子に関しても確認され、普遍的現象であることが確認された。ブラッグピークの高さや形状をLindemann則やParacrystal理論により定量的に解析したところ、粒子間距離の極大は、固液相転移点に対応し、それより高塩濃度側で液体構造、低濃度側で固体様結晶構造となることが判明した。この相転移については、USANSによる温度変化実験によっても確認された。今回に発見の中でも特に固体結晶状態での挙動、すなわち塩濃度減少に伴う粒子間距離の減少は従来の概念では説明できない、興味深い点である。このことは、少なくとも、従来考慮されていなかった新たな因子が、コロイド結晶形成に重要な役割を果たしていることを意味している。我々はこの新たな因子の可能性として(1)多体効果、および(2)カウンターイオンの速い運動性の寄与、を提唱した。(2)のカウンターイオンの効果に関しては別途動的光散乱実験によりその重要性が証明された。さらに、大小、大きさの異なる二種類のラテックス粒子を混合した系についてUSANS実験を行ったところ、小さな粒子のみが結晶構造を形成するという、興味ある結果が得られた。このようなコロイド合金構造の解明もコロイド粒子間相互作用の解明において重要な意義を持っている。低イオン強度下の分散液中でコロイド粒子がいわゆる「コロイド結晶」を形成することが知られているが、その構造性に関する知見は顕微鏡法や反射スペクトル法など限られた手法によるセルガラス壁面近傍の、しかも二次元情報に限られていた。そのため、構造形式のdriving forceと考えられる静電的相互作用の本質に関する議論、考察は、きわめて限られたものであった。本研究では、われわれが試作に成功した超小角X散乱装置(USAXS)を用いて、分散液内部におけるコロイド結晶の三次元構造に関する情報を得ることにより、コロイド間相互作用と構造の変化の詳細を調査することを試みた。3カ年調査の初年度である本年は、コロイド結晶構造のイオン強度(添加塩濃度)依存性を詳細に調査した。その結果、USAXS曲線よりコロイド結晶は面心立方格子系であることが判明し、ピーク位置より計算した粒子間距離は、塩濃度増加にともない一旦増加したあと減少する傾向が観察された。従来の顕微鏡法による実験結果では単調減少する傾向が報告されており、またコロイド間相互作用の新旧理論であるDLVOおよび曽我見-伊勢の理論でも単調減少が示唆されており、USAXS法によってのみ可能であった全く新規な情報であり、従来のコロイド科学の常識を覆えすものである。同様の測定を種々の異なる電荷数、粒径を有するラテックス粒子に関して行ったところ、いずれの場合も粒子関距離の極大はκa(κ^<-1>:デバイ長、a:粒子半径)が約1.3のところに出現することが判明した。したがって、観察された減少は普遍的なものであることが確認された。また、散乱曲線のパラクリスタル理論による解析により、上述の粒子間距離の極大は構造性の見地からは固体状構造-液体状構造の転移に対応することが判明した。ポリスチレンラテックスなどの表面に電荷を有するコロイド粒子は、分散液中で粒子間の静電的相互作用により粒子が規則正しく配列するコロイド結晶を形成する。このコロイド結晶の構造性を超小角X線散乱測定により、調査したところ、その粒子間距離はイオン強度の低下とともに一旦増加した後減少に転じることが確認された。これは新旧コロイド理論のいずれにも反する新たな発見である。様々な粒径、電荷密度を有するラテックス粒子に関して系統的に検討したところ、この現象の普遍性が確認できた。また、コロイド結晶構造の詳細な解析により、この現象はコロイド結晶構造の固液相転移であることが判明した。コロイド理論の基礎によれば、イオン強度の変化と温度変化は対等に扱えるため、上記結論が正しければ、分散液の温度変化によっても同様の現象が観測されるはずである。この見地に立ち、超小角散乱装置に温度制御セルを組み込んだ。+200-190の範囲で厳密に温度制御可能であることを確認し、測定を行った。

ブラッグピークの高さや形状をLindemann則やParacrystal理論により定量的に解析したところ、粒子間距離の極大は、固液相転移点に対応し、それより高塩濃度側で液体構造、低濃度側で固体様結晶構造となることが判明した。この相転移については、USANSによる温度変化実験によっても確認された。今回に発見の中でも特に固体結晶状態での挙動、すなわち塩濃度減少に伴う粒子間距離の減少は従来の概念では説明できない、興味深い点である。このことは、少なくとも、従来考慮されていなかった新たな因子が、コロイド結晶形成に重要な役割を果たしていることを意味している。我々はこの新たな因子の可能性として(1)多体効果、および(2)カウンターイオンの速い運動性の寄与、を提唱した。(2)のカウンターイオンの効果に関しては別途動的光散乱実験によりその重要性が証明された。さらに、大小、大きさの異なる二種類のラテックス粒子を混合した系についてUSANS実験を行ったところ、小さな粒子のみが結晶構造を形成するという、興味ある結果が得られた。このようなコロイド合金構造の解明もコロイド粒子間相互作用の解明において重要な意義を持っている。
単一細胞PCR法によるATL及びHAM患者組識からのHTLV-I検出

我々の開発した単一細胞PCR法を使用し、パラフィン包埋したATL患者のリンパ節及び胃,HAM患者の脊髄標本中の各種細胞におけるHTLV-I感染の有無を検索し以下の結果を得た。〔ATL〕通常のPCR法ではリンパ節,胃ともにHTLV-Itax遺伝子を検出できたので,単一PCR法を適用する前段階として50-100個の細胞をマイクロマニピュレーターで集めPCR法を行った。リンパ節:濾胞芽中心の細胞では1/12,T細胞領域では2/12,リンパ洞細胞では0/2にtax遺伝子を検出した。胃:リンパ装置芽中心では1/20,平滑筋では0/24,胃粘膜上皮では0/2にtax遺伝子を検出した。以上芽中心及びT領域の細胞に低頻度でHTLV-I感染細胞が存在することがわかったが,未だ検索例が少く,さらに検索を進める必要がある。〔HAM〕3症例のHAM脊髄標本のうち1例で,通常のPCR法によりHTLV-Iゲノム(tax,pol)を検出できたので,この症例を使用し55cycleの単一細胞PCR法でtax遺伝子を検索し次のような結果を得た。perivascular cuffingを示すリンパ球7/15,神経細胞2/7,corpora amylacea2/5,アストロサイト0/5上衣細胞1/2に陽性シグナルを得た。corpora amylaceaに陽性シグナルを得たことは予期しない結果であったが,HTLV-I感染細胞の変性核を含んでいた可能性もある。神経細胞,上衣細胞に陽性シグナルを得たことも重要な新知見であるが,artifactの可能性を除外すると共にさらに検索例を増やして検討する必要がある。なお,reverse transcriptase PCR法による検索は本年度中には行うことができなかった。