hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
配線損傷の高精度予測に立脚した電子デバイス長寿命化のための回路設計指針の新規策定

これら一連の関連性から配線構造・形状に関する長寿命化の設計指針を獲得することができた。平成18年度は次に示す3項目の研究を実施し,保護膜の材料・厚さの観点から指針の策定を図った。1.配線材料と保護膜材料・厚さの組み合わせ配線の損傷予測配線材料としてのAlとTiNにおけるエレクトロマイグレーション(EM)損傷の検討を行ったところ,TiNの配線はAl配線に対して極めてEM損傷が生じにくいことがわかった。そこで本項目では,TiN層を下層に有するAl積層配線を対象とし,かつビア接続を模擬した構造の配線を扱うこととした。さらに,配線の表面をTEOSとポリイミドの保護膜材料の各々で被覆した配線構造を想定した。既に得られているEM特性定数を用いて,EM損傷に対するしきい電流密度の数値シミュレーション予測を実施することにより,Al/TiN積層配線に対する保護膜材料の組み合わせ毎に,寿命と密接に関連したしきい電流密度の評価を行った。一方,想定した配線構造の試験片を作製し,加速通電実験を実施した。実験後の観察より,通電によるEM損傷を確認することができた。現在,導入した損傷の定量化に基づいて各組み合わせのEM特性定数の導出を図っている。2.実験による予測結果の検証研究項目1で想定した組み合わせ配線の作製を行い,通電実験を実施した。ビア接続を模擬した配線構造を対象としたため,通電実験によるEM損傷しきい電流密度の評価を図った。通電が長時間に亘るため現在も実験を継続中である。3.組合せ配線構造体の機械的特性評価研究項目1で作製した組み合わせ配線を対象に,微小表面材料特性評価装置を用いたナノ・インデンテーション試験を実施した。これによりTEOSとポリイミドの保護膜各々で表面近傍の弾性率の評価を行い,TEOSの弾性率はポリイミドに比較して4.5倍ほど大きいことがわかった。また,押し込み量の大きな試験を実施することにより,保護膜-配線間の付着強度について検討を行った。本年度は最終年度であり,次の4項目の研究を実施し,目的の達成を図った。1.配線材料と保護膜材料・厚さの組み合わせ配線の損傷予測A1積層配線に対しTEOSとポリイミドの保護膜材料を組み合わせた配線を想定し,数値シミュレーションによるEM寿命予測を行った。同じ保護膜厚さに対してポリイミド保護膜配線の方が長寿命となる結果を得た。また保護膜厚さの違いによるしきい電流密度の変化についても検討した。保護膜材料,厚さの異なる配線の損傷予測を初めて実施した。2.実験による予測結果の検証加速通電実験を実施し,専用に作製した試験片でのEM損傷の発生を確認できた。発生時間の長期化と発生確率が低いことから,予測結果の十分な検証に至らなかった。3.組合せ配線構造体の機械的特性評価A1配線に対しTEOS,ポリイミド,さらにSiNを保護膜とした組み合わせ配線を作製し,ナノ押し込み試験を実施した。弾性率はSiN,TEOS,かなり離れてポリイミドの順に小さくなった。
疾病増悪因子の直接分解を基盤とする治療戦略

ホルモン療法耐性乳がんは、未だ当該所望化合物の創製や治療戦略が確立されていない。そこで、この疾患に関与する増悪因子の直接分解を基盤とする医薬リードの創製を目的とし、これを達成すべく、平成30年度は研究計画の第一段階であるタンパク質分解誘導剤の創製および、第二段階の生物活性評価を遂行した。具体的には、乳がんに関与することが報告されている、核内受容体のエストロゲン受容体(ER)およびエピジェネティクスを制御するBET(bromodomain and extra-terminal)ファミリータンパク質であるBRD4を標的として選定し、それらタンパク質の分解を誘導する化合物を創製することを目指した。続いて、生物活性評価系の新規構築およびその系を用いた活性評価を行った。その結果、下記の成果を上げた。(1) ERリガンドをデザイン・合成した。その際、ステロイドの代替骨格として当研究代表者等が報告しているdiphenylmethane骨格を母骨格とした。(2) (1)で合成した化合物のER転写活性、ER結合試験を行い、さらに、ヒト乳がん細胞であるMCF細胞を用いた内在性ERの分解誘導活性を評価した。また、計算化学により得られた情報に基づく構造展開を行うことで、構造活性相関に関しても一定の解答を得ている。(3)当研究代表者の発見したN6-benzoyladenine骨格を有するBRD4阻害剤を基盤に、BRD4分解誘導剤をデザイン、合成した。(4) (3)で合成した化合物について、BRD4結合試験および、白血病細胞であるHL-60細胞を用いた内在性BRD4の分解誘導活性を評価した。構造展開を行い、構造活性相関を解析中である。(5)スクリーニングの効率化を図る目的で、ER-lucを安定発現した細胞株の樹立および、定量的かつハイスループットなER分解誘導活性評価系の構築を進行中である。乳がんの増悪因子として報告されている、核内受容体であるエストロゲン受容体(ER)およびエピジェネティクス制御因子であるBRD4を標的タンパク質として選定し、それらのリガンド合成に成功した。また、計算化学により得られた情報等に基づく構造展開研究および構造活性相関解析により、タンパク質分解誘導剤に関する重要な情報も得ることができた。さらに、スクリーニングの効率化を図る目的で構築中の、定量的かつはいスループットなタンパク質分解誘導活性の評価系は、従来のWestern blottingの代替検出法になり得ることが期待される。以上より、当初の予定通りに研究課題を進展させることができていると考えている。本年度の研究で蓄積したデータを十分に踏まえた上で、次年度は、引き続き第一段階のタンパク分解誘導剤の創製、および第二段階の合成化合物の生物活性評価と応用展開研究、第三段階の作用機序解析を並行して遂行する。具体的には、得られた構造活性相関の情報を基に、選択的ERダウンレギュレーター(SERD)およびBRD4分解誘導剤(BRD4 SNIPER)等を創製する。これにより、現在欠如しているこれら分解誘導剤の医薬化学的・生化学的情報を付与する。さらに、研究の進捗を観ながら、各現象に関与する作用機序を解析する。具体的には、ユビキチンプロテアソーム系(UPS)等への関与や三者複合体(BRD4と、BRD4分解誘導剤と、ユビキチンE3リガーゼ)の形成を検討する。本研究計画は、当研究代表者らの発見した生物活性を有するリガンドの構造活性相関を基に、タンパク質の寿命を制御する化合物の創製を図るといううものであるので、それらを十分に生かして順調に進められると考えているが、仮に計画している標的タンパク質に対する分解誘導剤が創製できない場合は、適宜軌道修正する。具体的には、生体内機能の縮重性に着目し、標的を関連因子に随時シフトさせる。例えば、UPSを誘導するE3リガーゼをIAPからセレブロンへシフトすることを考えている。本研究の目的は、新たな治療戦略としての疾病増悪因子の直接分解であるため、この軌道修正も意義のある展開になると考える。以上一連の研究により、従来のホルモン療法では明確な治療効果が期待できず、当該所望化合物の創製・治療戦略は確立していないホルモン療法耐性乳がんなどの治療戦略を提案することを目指す。

(3)当研究代表者の発見したN6-benzoyladenine骨格を有するBRD4阻害剤を基盤に、BRD4分解誘導剤をデザイン、合成した。(4) (3)で合成した化合物について、BRD4結合試験および、白血病細胞であるHL-60細胞を用いた内在性BRD4の分解誘導活性を評価した。構造展開を行い、構造活性相関を解析中である。(5)スクリーニングの効率化を図る目的で、ER-lucを安定発現した細胞株の樹立および、定量的かつハイスループットなER分解誘導活性評価系の構築を進行中である。乳がんの増悪因子として報告されている、核内受容体であるエストロゲン受容体(ER)およびエピジェネティクス制御因子であるBRD4を標的タンパク質として選定し、それらのリガンド合成に成功した。また、計算化学により得られた情報等に基づく構造展開研究および構造活性相関解析により、タンパク質分解誘導剤に関する重要な情報も得ることができた。さらに、スクリーニングの効率化を図る目的で構築中の、定量的かつはいスループットなタンパク質分解誘導活性の評価系は、従来のWestern blottingの代替検出法になり得ることが期待される。以上より、当初の予定通りに研究課題を進展させることができていると考えている。本年度の研究で蓄積したデータを十分に踏まえた上で、次年度は、引き続き第一段階のタンパク分解誘導剤の創製、および第二段階の合成化合物の生物活性評価と応用展開研究、第三段階の作用機序解析を並行して遂行する。具体的には、得られた構造活性相関の情報を基に、選択的ERダウンレギュレーター(SERD)およびBRD4分解誘導剤(BRD4 SNIPER)等を創製する。これにより、現在欠如しているこれら分解誘導剤の医薬化学的・生化学的情報を付与する。さらに、研究の進捗を観ながら、各現象に関与する作用機序を解析する。具体的には、ユビキチンプロテアソーム系(UPS)等への関与や三者複合体(BRD4と、BRD4分解誘導剤と、ユビキチンE3リガーゼ)の形成を検討する。本研究計画は、当研究代表者らの発見した生物活性を有するリガンドの構造活性相関を基に、タンパク質の寿命を制御する化合物の創製を図るといううものであるので、それらを十分に生かして順調に進められると考えているが、仮に計画している標的タンパク質に対する分解誘導剤が創製できない場合は、適宜軌道修正する。具体的には、生体内機能の縮重性に着目し、標的を関連因子に随時シフトさせる。例えば、UPSを誘導するE3リガーゼをIAPからセレブロンへシフトすることを考えている。本研究の目的は、新たな治療戦略としての疾病増悪因子の直接分解であるため、この軌道修正も意義のある展開になると考える。以上一連の研究により、従来のホルモン療法では明確な治療効果が期待できず、当該所望化合物の創製・治療戦略は確立していないホルモン療法耐性乳がんなどの治療戦略を提案することを目指す。
新奇Ｇサイクルの起動制御に関わる構造生物学的解析

本新学術領域研究では、新奇低分子量G蛋白質群の中で、従来の刺激依存性GDP-GTP交換によるコンホメーション転換には依らないGTP結合待機型G蛋白質及び既知のGドメインに加えて別の機能領域も有するユニークな構造のマルチ・ドメイン型G蛋白質について、生化学、分子生物学、細胞生物学的な研究を進め、解析が可能となったG蛋白質とそれらの複合体については構造生物学的な評価と考察も加えた。1.Di-Rasは、従来型Rasメンバー(H、K-Rasなど)とは異なり、その大部分がSmgGDSとヘテロ二量体を形成して細胞質に存在し、SmGDSとの結合によってDi-Rasのグアニンヌクレオチド結合能が低下することを見出したが、さらに細胞膜に存在するDi-Rasについても生化学性状解析を進め、その一部が他のタンパク質と複合体を形成していることを見出した。2.リソソームに局在するArl8は、その多くがGTP結合型(活性化型)として細胞膜に結合しており、界面活性剤によって生体組織から可溶化したGTP-Arl8は、そのN末端の疎水的性状から多くのタンパク質に非特異的に結合してしまうため、精製に困難を極めていた。しかし、GTPを解離させてGDP結合型へと転換して細胞膜から遊離させる方法を考案し、カラムクロマトグラフィーによる精製と可能とした。また、この精製法は、他の多くのGTP結合型G蛋白質にも有用であると考えられた。3.ヘテロ二量体G蛋白質のRagについては、ヒトRagA/Bオルソログである線虫RAGA-1の恒常活性化体を神経前駆細胞に隣接する表皮で過剰発現すると、mTORC1活性依存的に神経前駆細胞を活性化させること、さらに、神経前駆細胞の活性化において、インスリン経路の構成遺伝子であるptenやfoxoが、線虫Ragと遺伝学的相互作用を示すことを見出した。26年度が最終年度であるため、記入しない。本新学術領域研究では、既知タイプとは異なる新奇低分子量G蛋白質群、すなわち、従来の刺激依存性GDP-GTP交換によるコンホメーション転換には依らないGTP結合待機型G蛋白質(RasファミリーのDi-Ras、Arfファミリーに属するArl8など)及び既知のGドメインに加えて別の機能領域も有するユニークな構造のマルチ・ドメイン型G蛋白質(栄養感知からmTORへのシグナル伝達に介在するヘテロ二量体G蛋白質のRagなど)について、生化学、分子生物学、細胞生物学的な解析を進め、評価が可能となったG蛋白質複合体については構造学的な考察及び解析も加えた。1.H-、K-Rasなどの代表的なRasとは異なり、Di-Rasはその大部分がSmgGDSとヘテロ二量体を形成して細胞質の可溶性画分に存在した。SmgGDSはRhoAのグアニンヌクレオチド交換を促進する活性を有し、RhoAの活性化因子の一つと考えられている。そこで、SmgGDSがグアニンヌクレオチド結合状態に与える影響を検討した結果、RhoAに対する作用とは全く対照的に、SmGDSとの結合によってDi-Rasのグアニンヌクレオチド結合能が低下することを見出した。2.リソソームに局在するARL8が、GTP結合型(活性化型)において、HOPS複合体の構成因子VPS41と結合することを見出し、VPS41がARL8のエフェクターである可能性が示唆された。3.線虫のRag二量体をコードするraga-1及びragc-1両遺伝子の欠失変異体を用いた解析から、G蛋白質Ragが食餌中の必須アミノ酸に応答した神経前駆細胞の活性化に介在することを見出した。さらに、大腸菌の共発現系を用いて、点変異の導入等による組み換えヘテロ二量体(RagA-RagC)の精製系を構築し、ヘテロ二量体中の個々のRagGサイクルに関わる動態評価を可能とした。

3.ヘテロ二量体G蛋白質のRagについては、ヒトRagA/Bオルソログである線虫RAGA-1の恒常活性化体を神経前駆細胞に隣接する表皮で過剰発現すると、mTORC1活性依存的に神経前駆細胞を活性化させること、さらに、神経前駆細胞の活性化において、インスリン経路の構成遺伝子であるptenやfoxoが、線虫Ragと遺伝学的相互作用を示すことを見出した。26年度が最終年度であるため、記入しない。G蛋白質複合体の高次構造決定に関わる研究の進展は、引き続く重要な課題であるが、本研究で対象とした新奇の低分子量G蛋白質群のいくつかについて、それらの新しい機能を見出した点は大きな進展である。特に、Di-Rasのユニークな生化学的性状解析の結果は、これまで単純化して考えられてきたRasファミリーのGサイクルを再考する上で、意義深い研究成果と考えられる。また、Ragヘテロ二量体G蛋白質中の個々のRag-Gサイクルをモニター可能な評価系を構築したので、Gサイクルの存在様式が生理機能の発揮において果たす役割の解明に向けて貢献すると期待している。低分子量G蛋白質Di-RasがSmgGDSとヘテロ二量体を形成し、GTP/GDPとの結合親和性を低下させて細胞質画分に存在することは、ユニークな生化学的性状である。この特性を可能とする構造生物学的解析が、引き続く重要な課題の一つであり、構造生物学者との共同研究によって、その原子レベルでの解明を推進する。さらに、Di-RasはSmgGDSが解離することによってGTPの結合した活性型となり、細胞膜で機能するものと考えられるので、複合体の形成・解離を指標に、このGサイクルを始動させる新たな因子群の同定も進める。他方、リソソームと後期エンドソーム、ファゴソームとの融合過程に関与するArfファミリーG蛋白質ARL8のエフェクターとして、HOPS複合体の構成因子であるVPS41を見出したので、その複合体の構造生物学的な解析にも着手する。
認知症に対する反復経頭蓋磁気刺激とコンピュータ認知リハビリテーションの併用効果

超高齢社会において、認知症進行予防は喫緊の課題となっています。本研究では反復経頭蓋磁気刺激(rTMS)とコンピュータを用いた認知訓練課題による認知リハビリテーション(CACR)による認知機能改善効果を検証してゆきます。また治療前後における大脳皮質内抑制機能の変化について、非侵襲的な方法で評価を行う予定です。こうした評価がより身近に実用的になれば、認知症治療段階における脳の機能的な変化を定量的に評価することが可能になるため、治療効果を計るためのバイオマーカーとしての活用も期待されます。本研究の結果によって、認知症に対する新たな非薬物治療開発につながることが期待されます。
数理ファイナンスのための統計理論と時系列分析による検証

1.金融および経済時系列の分析手法として、共和分モデルにおける短期ならびに長期のグレンジャーの因果関係の検定方法を開発した。2.大規模な共和分モデルにおける予測方法を開発した。本研究では主成分を取り出すことにより、大規模な共和分過程での予測が可能となった。実験および25企業の株価予測によって、その効果が確認されている。3.金融時系列を含む経済時系列の、従属性の強さの変化に関する問題を考察し、ラグランジュ乗数検定を提案、その統計的性質を調べた。またこの手法を用いて、円/ドル為替レートの従属性の強さの変化を調べた。4.従来の理想的であるが制約的な完全市場の概念に代わるEmbedded complete marketという概念を提案し、それに基づいてオプション価格の新しい計算方法を導いた。5.天候デリバティブの価格決定問題について研究を行った。具体的には、東京と名古屋の気温データに基づく天候デリバティブのための気温モデルの構築を行った。6.シミュレーション手法を使った2通りの計量経済学モデル分析法を議論した。一つはベイズ的マルコフ連鎖モンテカルロ法(MCMC)法、もう一つは非ベイズ的ブートストラップ法である。7.高頻度の為替レート・データを用いて、経済指標発表の効果を分析した。この研究では,さらに発表の効果をベースラインとサプライズの部分に分解して分析を行った。8.フラクショナル・ブラウン運動の2次汎関数に関する分布の導出を議論した。厳密な結果は未解決であるが、積分ブラウン運動の場合の分布からの類推を与えた。同時に、モーメントに関する単純な結果の予想を与えた。9.非定常あるいは長期記憶的な時系列モデルのパラメータ推定を、既存の方法である時間領域および周波数領域で考察後、ウェーブレットの方法による推定結果と比較した。本研究は3年間の研究計画の1年目であり、次の知見や結果を得た。1バリアー・オプションを使った権利行使価格問題に対して、境界を時間の平方根の関数とした上で、権利行使価格を求めるために、漸近展開による計算式を導出した。2金融時系列を含む経済時系列の構造変化の問題を、季節性をもつようなデータも考慮して、検定の観点から議論して、最適な検定方式を提案して、その統計的性質を調べた。3グレンジャー因果性のワルド検定は、共和分している場合には、統計量の分布が真の構造に依存して決まり、しかも、標準的な分布に従わないので、有意点を決めることが困難である。そこで、このような欠点を克服して、背後にある真の構造とは無関係に通常の分布を使うことができるような検定を考案し、シミュレーション実験により検出力などを調べた。4通常の因果性のほかに、長期グレンジャー因果性を考察し、その検定問題を議論した。その際、ワルド検定統計量は、共和分関係がある場合には、共分散行列のランクが落ちて逆行列が定義できないという問題が生じる。そこで、実際にランク落ちしているかどうかを検定する方法を提案して、性質を調べた。また、因果性の検定として、一般化逆行列を用いた方法も考察した。5金融時系列が長期記憶性をもつかどうかの検定問題を、フラクショナルARIMAモデルを使い、階差のパラメータdに関する検定問題として定式化して考察した。さらに、パラメータdの推定をウェーブレットの方法を使い、最小2乗法および最尤推定法により実行して、シミュレーション実験により、従来から提案されている周波数領域における推定法と比較した。1非定常VARモデルにおけるGrangerの因果関係の検定問題について、Short-runの場合とLong-runの場合についてまとめた。ともにWald検定統計量の退化の問題を、Kurozumi(2002)のランク検定の方法を有効に用いて、一般化逆行列の方法により克服した点に特徴がある。

2 Duffie and Singleton(1999)の方法を使って、流動性に基づくスプレッドを説明するモデルをきちんと導出した。実証面では、昨年来研究代表者と大学院生で格付別の社債のイールドカーブの推定を行った。3裁定価格理論(APT)におけるリスク・プレミアを時系列的に変動するモデルに再構成し、それをベイズ的に推定するプロジェクトを研究した。この予備段階としてベイズ的推定のMCMC手法に関するノートも書いた。4確定的トレンドを伴うモデルにおいて、共和分行列の部分行列の階数に関するカイ2乗検定、および、共和分行列の識別に関する検定を導出した。非定常回帰モデルにおける構造変化点の一致推定量の収束速度を導出した。5ウェーブレット変換の帯域特性により、従来の時間領域あるいは周波数領域における方法が計算上の困難さや精度の点で問題がある点を克服できる場合の研究を行った。また、単位根問題や共和分分析に対しても、ウェーブレットの方法を使って、長期記憶時系列まで拡張した状況で、適用する方法を議論した。1大規模な共和分モデルにおける予測方法を開発した。従来のVEC(vector error correction)モデルに基づく予測は、小規模の確率過程(10変数以下)に対してしか適用可能でなかったが、本研究では主成分を取り出すことにより、大規模な共和分過程での予測を可能とした。実験および25企業の株価予測によって、その効果が確認されている。2天候デリバティブの価格決定問題について研究を行った。具体的には、東京と名古屋の気温データに基づく天候デリバティブのための気温モデルの構築を行った。3シミュレーション手法を使った2通りの計量経済学的分析を行ってきた。一つはベイズ的マルコフ連鎖モンテカルロ法(MCMC)、もう一つは非ベイズ的ブートストラップ法である。4金融資産の価格変動リスクを計量する尺度として広く用いられているバリュー・アット・リスク(VaR)の推定方法について比較を行った。5フラクショナル・ブラウン運動の2次汎関数に関する分布の導出を議論した。厳密な方法は解決であるが、積分ブラウン運動の場合の分布からの類推を与えた。同時に、モーメントに関する単純な結果の予想を与えた。6非定常あるいは長期記憶的な時系列モデルのパラメータ推定を、既存の方法である時間領域および周波数領域で考察後、ウェーブレットの方法による推定結果と比較した。その結果、非定常な場合には、ウェーブレットの方法は、既存の方法よりも精度のよい結果を与えることが見出された。両者の違いは、非定常性の程度が強くなるにつれて、さらに顕著となる。
P53-1-;カスパーゼ3-1-マウスを用いたアポトーシス・細胞周期の解析

1,p53-/-カスパーゼ3-/-マウスの性状P53+/-;カスパーゼ3+/-マウスの雌雄の交配を行ないp53-/-;カスパ一ゼ3-/-マウスの獲得を試みた。この結果得られた個体の遺伝型はおよそメンデル則に従っていた。現在まで得られたp53-/-;カスパーゼ3-/-マウスは全例が母乳を飲む事が出来ず生後1日前後で死亡した。現在p53-/-;カスパーゼ3-/-マウスの新生児期での死亡の原因を組織病理学的に検討しているところである。2,p53-/-;カスパーゼ3+/-マウスの性状p53-/-マウスが目然発癌により比較的早く死亡することが知られているが、P53-/-;カスパーゼ3+/-マウスでも自然発癌が認められ、その多くが生後4カ月後に死亡した。P53-/-マウスとP53-/-;カスパーゼ3+/-マウスの寿命の差を見極めるため昭和大学SPF動物飼育施設にて、観察を継続している。3,p53+/-;カズパーゼ3-/-マウスの性状P53+/-;カスパーゼ3-/-マウスは新生児期に死亡するものと生き残るものとに分かれた。新生児期で死亡したものはP53-/-;カスパーゼ3-/-マウスと同様に母乳を飲めていなかった。生き残りp53+/-;カスパーゼ3-/-マウスはカスパーゼ3-/-マウスの表現型に類似し成長遅延、回転運動を主とする行動異常を示した。4,p53-/-;カスパーゼ3-/-胎児由来線維芽細胞を用いた解析p53、カスパーゼ3両者の細胞の増殖への作用を調べる為、胎生14日目の胎児から調製した線維芽細胞を用いてその増殖能を調べた。野生型(p53+/+;カスパーゼ+/+)細胞に比べ、増殖速度が速くまた接触阻止能も劣っていることが認められた。また各種抗癌剤処理による影響を調べた。現在までのところ各種薬剤への感受性においてp53-/-細胞との違いは認められていない。
遺伝子導入を用いたin vivo不整脈モデルの開発

平成10年度はラット心筋梗塞モデルを作製しHVJウィルスを用いた遺伝子導入法の作製ならびにイオンチャネルの制御機構を解析した。実験計画本年度はHVJ-リポソーム法を用いてGreen Fluorescent Protein(GFP)の発現ベクターを遺伝子導入し、蛍光活性をレーザー共焦点顕微鏡にて解析した。2)ラット慢性心筋梗塞モデルを用い非梗塞部心筋における膜電位依存性Kチャネルの発現量を検討した。結果1) GFP発現ベクターを遺伝子導入することにより心筋細胞内に遺伝子導入することが可能であることが組織レベルで明らかとなった。2)心房、心室で各KvlmRNAの存在を認めた。Kv1.2は心室ではsham群とMI群で有意な変化を認めなかったが、心房ではMI群で減少した。Kv1.4は心房、心室でham群とMI群で有意な変化を認めなかった。一方、Kv1.5は心房ではsham群とMI群で有意な変化を認めなかったが、心室ではMI群で著明に減少した。さらにアンギオテンシン変換酵素阻害薬を投与し心筋リモデリングを退縮させることによりKv1.2とKv1.5の発現量の変化は抑制された。まとめGFP発現ベクターを遺伝子導入することにより心筋細胞内への遺伝子導入が可能である事が組織レベルで明らかとなった。また心房と心室ではKv1.2とKv1.5の発現制御が異なっており、これらのチャネル発現量の変化は心筋梗塞後リモデリングに伴う電気生埋学的変化に関与している可能性が示唆された。平成8年度はHVJウィルスを用いた遺伝子導入法を作製することを目的とし、以下の実験を行った。実験計画1)リポゾーム膜の作製ロータリーエバポレーターを用いてリン脂質、コレステロール等によりリポソーム膜を作製する。調製したHVJウィルス蛋白およびコントロール遺伝子としてまずルシフェラーゼ遺伝子とを混合しミセルを形成させる。2)心臓への遺伝子導入SDラットを麻酔下にて開胸し拍動心へシリンジを用いて直接心筋へHVJ-リポゾームを注入する。一旦閉胸し48時間から72時間後に心臓を取り出し、コントロール遺伝子としてまずルシフェラーゼ遺伝子を導入し、ルシフェラーゼ活性を測定することにより心筋遺伝子導入の有無を検討する。結果われわれはHVJ-リポゾームの作製に成功し、心筋に著明なルシフェラーゼ活性を認めた。まとめルシフェラーゼ遺伝子は心筋細胞に発現されており、生体内心臓遺伝子導入が可能であることが明らかとなった。現在、生体臓器への遺伝子導入に用いられるベクターはHVJ-ルポゾーム以外に、(1)レトロウイルスベクター、(2)アデノウイルスベクター、(3)リポソームなどがある。(1)は分裂する細胞にはよくDNAを導入可能であるが分裂しない心筋細胞でのDNAの発現は困難である。また発癌の危険性もある。(2)は分裂しない心筋細胞へもDNAを導入・発現できるがその遺伝子導入効率は低い。また細胞障害性を有することも問題となる。(3)は心筋細胞への遺伝子導入効率は非常に低い。これらの遺伝子導入法に比べHVJ-リポソーム法は心筋細胞には細胞障害性が低く高効率な遺伝子導入法であると考えられる。今後、我々はこの方法を用いて生体内の心臓の生理機能を分子レベルで解析していきたい。平成9年度はラット心筋梗塞モデルを作製し心筋肥大、イオンチャネルの制御機構を解析し、さらにHVJウィルスを用いて外来遺伝子を導入する事を目的とし、以下の実験を行った。【実験計画】1)ラット心筋梗塞モデルの作製ラットの左冠動脈近位部を結紮し、慢性心筋梗塞モデルを作製する。4週間後に心臓を取りだし、イオンチャネルの発現様式を検討する。さらに電気刺激を行うことにより心室性不整脈を誘発し不整脈基質の有無を解析する。2)心臓への遺伝子導入特定の遺伝子を実際に心筋細胞内に導入する事で不整脈の誘発性ならびに心筋肥大に対する影響を解析する。【結果】心筋梗塞後リモデリングの過程で非心筋梗塞部位は著明な心肥大を呈し、また特定のイオンチャネルの発現が変化することが明らかとなった。さらに電気刺激では心室細動が誘発され不整脈基質の存在が示唆された。我々はさらに外来遺伝子を心筋細胞内に導入する事によりこれらの病態に対す影響を解析する予定である。【まとめ】昨年は、ルシフェラーゼ遺伝子を用いては心筋細胞に高効率で外来遺伝子を導入することが可能であることがわかった。本年度はラット心筋梗塞を用いた不整脈解析の疾患モデルを作製し、心筋リモデリングの過程を病理学的および生化学的に解析した。今後はこのモデルを用いて、心筋細胞に外来遺伝子を導入する事により心肥大、不整脈発生の分子機構を解析する予定である。

Kv1.2は心室ではsham群とMI群で有意な変化を認めなかったが、心房ではMI群で減少した。Kv1.4は心房、心室でham群とMI群で有意な変化を認めなかった。一方、Kv1.5は心房ではsham群とMI群で有意な変化を認めなかったが、心室ではMI群で著明に減少した。さらにアンギオテンシン変換酵素阻害薬を投与し心筋リモデリングを退縮させることによりKv1.2とKv1.5の発現量の変化は抑制された。まとめGFP発現ベクターを遺伝子導入することにより心筋細胞内への遺伝子導入が可能である事が組織レベルで明らかとなった。また心房と心室ではKv1.2とKv1.5の発現制御が異なっており、これらのチャネル発現量の変化は心筋梗塞後リモデリングに伴う電気生埋学的変化に関与している可能性が示唆された。
微小重力による脳循環動態変化と対応策

宇宙開発が進む現在、長期宇宙滞在が人体の健康に及ぼす影響を調べることが急務となってきた。宇宙飛行士は、飛行中に宇宙酔い、頭痛、記憶の低下などを訴えたり、地球帰還後に起立性低血圧を経験することが多く、これらの症状の一部は脳血流あるいは頭蓋内圧の変化に起因すると考えられる。本研究はヒトおよび実験動物を対象として脳循環動態に及ぼす模擬微小重力の影響を調べ、その対応策を検討することを目的として行った。1.頭蓋内圧測定装置の開発: 1994年以来、Ames研究所のグループと共同研究を行い、超音波を用いた新しい非侵襲的頭蓋内圧測定法の開発を進めてきた。本法の原理は頭蓋内圧上昇により生じる頭蓋骨間距離の増加を精密に測定する。今回の研究では、死体の側脳室に生理食塩水を注入し、この時の頭蓋内圧を硬膜下に挿入したカテーテルにより直接測定するとともに、超音波法を用いて頭蓋骨間距離を計測した。その結果、両者の間には一次の比例関係が認められた。2.体位変換時における脳組織の酸素飽和度およびヘモグロビン量の変化:立位から背臥位に体位を変換すると、直後に脳組織の酸素飽和度は9.4%、ヘモグロビン量は4.9%増加した。3.頭蓋内圧と脳血流量の同時測定:ヘッドダウンテイルト負荷直後の頭蓋内圧上昇は、ラットでは約2mmHgであるのに対し、ウサギでは12mmHgの上昇が認められた。ウサギ脳血流量は、HDT負荷2時間までは有意な変化を示さなかった。4.眼内圧と眼血流量の同時測定:実験はウサギを用いて行い、ヘッドダウンテイルト負荷直後に眼内圧は上昇したが、その変化分は2mmHg程度であった。眼血流量は、ヘッドダウンテイルトにより約10%増加した。動物モデルの開発は始めたばかりで、まだ確立されていない。今後さらに研究を進めて、長時間ヘッドダウンテイルト負荷した際の各パラメータの変化を経時的に観察していきたい。1.頭蓋内圧測定装置の開発:河合は1994年以来、Ames研究所のグループと共同研究を行い、超音波を用いた新しい非侵襲的頭蓋内圧測定法の開発を進めてきた。その結果、両者の間には一次の比例関係た認められた。2.体位変換時における脳組織の酸素飽和度およびヘモグロビン量の変化:近赤外線を利用してヒト脳組織の酸素飽和度ならびにヘモグロビン量(局所の血液量に相当する)を測定した。立体から骨臥位に体位を変換すると、直後に脳組織の酸素飽和度は9.4%、ヘモグロビン量は4.9%増加した。これらの変化は、体位の元の立体に戻すと速やかに消失した。以上の結果より、被験者を臥位あるいはヘッドダウンテイルト位にすると、直後には脳血流量が一過性に増加することが確認された。3.頭蓋内圧と脳血流量の同時測定:ヘッダダウンテイルト負荷を行うと、頭蓋内圧は急激な上昇を示した後、基線に向かってやや下がってプラトーに達した。ヘッドダウンテイトルト負荷直後の頭蓋内圧上昇は、ラットでは約2mmHgであるのに対し、ウサギでは12mmHgの上昇が認められた。

ウサギ脳血流量は、HDT負荷2時間までは有意な変化を示さなかった。4.眼内圧と眼血流量の同時測定:ヘッドダウンテイルト負荷直後に眼内圧は約2mmHg上昇した。眼血流量は、ヘッドダウンテイルトトにより約10%増加した。動物モデルの開発は始めたばかりで、また確立されていない。今後さらに研究を進めて、長時間ヘッドダウンテイルト負荷した際の各パラメータの変化を経時的に観察していきたい。
イネにおけるセロトニン蓄積の抑制機構の解明：アブラムシによる抵抗性の抑制と利用

オカボノアカアブラムシ(以下アブラムシ)がイネ根に寄生すると誘導抵抗性として褐変が生じる。ところが褐変物質の前駆体であるセロトニンの蓄積が不自然に遅延し、アブラムシの寄生後24日間は低い濃度にとどまる。低濃度のセロトニンがアブラムシの生育を促進することを確認したことから、アブラムシはイネの防御反応を抑制することで抵抗性を弱めるばかりか、さらにこの抵抗性物質を逆手にとり自身の増殖に積極的に利用している可能性が示唆された。本研究ではこのアブラムシによるイネの誘導抵抗性を制御する機構を分子生物学的・生物有機化学的に解明することを目的とした。アブラムシがイネ根に寄生した際の植物における遺伝子発現動態と、サリチル酸(SA)やアブシジン酸処理したイネ根での遺伝子発現動態を比較調査した結果、処理4日後ではアブラムシを寄生させたイネ根の遺伝子変動とSA処理した根の遺伝子は類似することが判明し、SA処理はアブラムシ寄生による褐変を増大させることも解明できた。既にアブラムシ寄生後期(7日目以降)にSA蓄積量が増大することが判明していることから、アブラムシ寄生における褐変に係る遺伝子を除くためにSA処理とアブラムシ寄生を比較した。その結果、1.8倍以上の発現変動が観察された遺伝子は13存在した。処理7日後でも同様の傾向が確認されたが、処理4日後と7日後では特異的に発現する遺伝子はすべて異なっていた。そこで処理4日後に特異に発現した遺伝子の機能と発現様式からOrnithine decarboxylase(OD)が特異的に発現しているものと考えられた。この遺伝子は寄生前期(1-5日後)には対照区よりも発現量が多く、その後(7-10日後)は同程度に戻ることが判明した。ODは生体アミンの生合成に関わる遺伝子であることから、イネの誘導抵抗性の抑制はアミン類によって制御されていることが予想された。平成30年度が最終年度であるため、記入しない。本研究ではこのアブラムシによるイネの誘導抵抗性を抑制する機構を分子生物学的・生物有機化学的に解明することを目的とした。H27年度はアブラムシがイネ根に寄生した際の、植物における代謝産物動態の分析を行うとともに、植物ホルモンや遺伝子の発現動態の網羅的な解析の準備を行った。イネ根における代謝産物のCE-TOFMSによる詳細な分析結果から、セロトニンの蓄積がアブラムシの寄生後24日間は低い濃度にとどまることが再確認され、前述の現象はイネ根の抵抗性をアブラムシが恒常的に抑制することでイネ根の栄養状態を改善する適応戦略であることが判明した。さらにこの期間、アミノ酸の蓄積量は大きくは変動しないことからアブラムシはイネの代謝経路を選択的に抑制する能力をもつことが新たに判明した。またマイクロアレイによる遺伝子発現の網羅的解析のための抽出・精製・分析技術の最適化を行うとともに、植物ホルモン類のLC-MSMS(MRM)による一斉分析条件の最適化を行った。マイクロアレイによる遺伝子発現の網羅的な解析を行うためにイネ根からのtotal-RNAの抽出・精製方法の諸条件の検討を行い、イネ根約20 mgから、濃度65 ng/uL以上、純度RIN値8.5以上のtotal-RNAを18 uL調整するスキームの確立を行った。即ち、イネ根約20 mgを破砕機(2200 rpm)とキット(RNeasy Plant Mini Kit)を用いて抽出し、RNase free-DNaseでDNAを分解した後、定法により精製するスキームを開発した。さらに得られたtotal-RNAをバイオアナラオザーを用いて純度の検討を行うとRIN値9.0前後の純度であったことから、このtotal-RNAとキット(Affymetrix)を用いてcRNAを経てss-cDNAを合成し、短断片化した後にDNAマイクロアレイ(Affymetrix Rice(Jp) Gene Array 1.1 ST Strip)にハイブリダイゼーションさせ、マイクロアレイスキャナで読み取ることで遺伝子発現の網羅的な解析を行えることを確認した。これらの技術を用いて今後、経時的なイネ根における遺伝子発現解析を行うことが可能となった。また、植物の代謝産物の網羅的な解析は既にCE-TOFMSによる分析技術が確立しているものの、病害抵抗性に関与する植物ホルモン分析の分析方法は未確立であった。そこでサリチル酸グルコシド(SAG)を合成するとともに、3種の植物ホルモン(サリチル酸(SA)、SAG、アブシジン酸(ABA))のLC-MSMS(MRM)での分析条件の検討を行い最適化に至っている。このことから今後イネ根におけるホルモン変動の経時的な解析が可能となった。以上のことから本研究は概ね順調に進展していると考えられる。

ところが褐変物質の前駆体であるセロトニンの蓄積が不自然に遅延し、アブラムシの寄生後24日間は低い濃度にとどまる。低濃度のセロトニンがアブラムシの生育を促進することを確認したことから、アブラムシはイネの防御反応を抑制することで抵抗性を弱めるばかりか、さらにこの抵抗性物質を逆手にとり自身の増殖に積極的に利用している可能性が示唆された。本研究ではこのアブラムシによるイネの誘導抵抗性を制御する機構を分子生物学的・生物有機化学的に解明することを目的とした。H28年度はアブラムシがイネ根に寄生した際の、植物における植物ホルモンや代謝産物動態の分析を行うとともに、マイクロアレイによる遺伝子発現動態の網羅的な測定を行った。イネ根における代謝産物のメタボローム解析の詳細な解析結果から、セロトニンの蓄積量が低いアブラムシの寄生後24日目の期間は、セロトニンの前駆体であるトリプトファンをはじめ殆どのアミノ酸が一時的に増加・蓄積していることが判明した。これらのアミノ酸の減少とともにセロトニンの蓄積が増大することから、イネの根では寄生初期にはアミノ酸類の普遍的な生合成活性化が生じた後、生合成経路の活性化がトリプトファン-セロトニン生合成に集中することが判明した。このことからイネ根の生合成活性化には量的制御と質的制御が複雑にかかわりあうことが判明した。イネ根約15-20 mgから破砕機(2200 rpm)とキット(RNeasy Plant Mini Kit)を用いてtotal-RNAの抽出・精製し、バイオアナラオザーを用いて純度の検討を行った。RIN値8.5以上のtotal-RNAを対象にキット(Affymetrix)を用いてcRNAを経てss-cDNAを合成し、短断片化した後にDNAマイクロアレイ(Affymetrix Rice(Jp) Gene Array 1.1 ST Strip)にハイブリダイゼーションさせ、マイクロアレイスキャナで読み取ることで遺伝子発現の網羅的な解析を達した。寄生から2週間にわたる経時的な調査が終了したことによりオミックス解析の実施が可能となった。また、病害抵抗性に関与する植物ホルモンのうちサリチル酸(SA)、サリチル酸グルコシド(SAG)、アブシジン酸(ABA)分析の分析方法は確立していたがインドール酢酸(IAA)およびジャスモン酸(JA)、ジャスモン酸イソロイシン(JA-Ile)の分析条件は未明であったためLC-MSMS(MRM)でのこれらの分析条件の検討を行い最適化に至った。このことから今後イネ根におけるホルモン変動の経時的な解析が可能となった。以上のことから本研究は概ね順調に進展していると考えられる。オカボノアカアブラムシ(以下アブラムシ)がイネ根に寄生すると誘導抵抗性として褐変が生じる。
ナノ構造制御による多環縮合系パイ共役の高密度化と高電子伝導性材料への展開

電解重合により生成する導電性高分子は多環縮合系パイ共役構造をとることが期待される。その配列が線形にかつ高密度化した場合に予想されるような優れた物性の実現に近づけるために(i)電解重合に用いる電極材料の品質向上(ii)電解重合に用いる単量体の構造についての検討(iii)電解重合生成物の構造と形態の評価の検討を行った。多環縮合系パイ共役構造が線形に超高密度化した高電子伝導性材料を実現するための基礎的な検討として、電解重合を適用する場合に重要な因子の一つとなるモノマーの選択として前年度に引き続いていくつかの基礎的な検討を行い、電解重合可能な二つのアミノ基を有する芳香族化合物である2,3-ジアノトルエン、2,3-ジアミノフェノール、2,3-ジアミノニトロベンゼンに着目し、電気化学的な特性評価と電気化学重合挙動および重合生成物の酸化還元特性評価を行った。強酸性水溶液中でグラッシーカーボン電極を作用電極としてこれらの芳香族ジアミン類の重合を行った場合、生成物であるポリマーは比較的単純な酸化還元挙動を示した。これは単結晶電極を用いれば配向性が期待できることを示唆している。これらの化学修飾電極は酸性水溶液中で溶存酸素を触媒酸化することが明らかとなったため、いずれも分子構造として環が閉じたフェナジン部位を有することが分かった。微細形態を評価するためには走査型トンネル顕微鏡の観察が不可欠であり、その整備を継続しているが現有装置のトンネル電流アンプの感度が大気中で吸着有機分子を観察するためには不足していることが判明した。多環縮合系パイ共役構造が線形に超高密度化した高電子伝導性材料を実現するための基礎的な検討として、前年度までに行った電解重合を適用する場合に重要な因子の一つとなるモノマーの選択やグラッシーカーボン電極での酸化還元特性評価に引き続いて、いくつかの検討を行った。特に単結晶面を有する蒸着金薄膜電極を作用電極とした電解重合とその生成物の電気化学的特性評価および走査トンネル顕微鏡を用いた形態観察を行った。また、電解重合生成物の電気特性測定と構造に関する知見を得るためにX線光電子分光測定を行った。走査トンネル顕微鏡の電流電圧変換アンプの選択とノイズ対策を行うことで、トンネル電流レンジを昨年度と比較して1/30程度まで下げることに成功した。真空蒸着で作製した金薄膜を電気炉によりアニール処理を行い、表面の平滑性が大幅に向上することを走査トンネル顕微鏡観察により確認したのち、電解重合用作用電極に供した。オルトフェニレンジアミンをモノマーとした場合、サイクリックボルタンメトリーによる酸化還元特性評価ではグラッシーカーボン電極で電解重合を行った場合と異なり、遅い掃引速度まで良好な酸化還元応答を示し、その酸素還元反応に対する触媒応答は電流密度で比較した場合、大幅な増加が見られた。X線光電子分光測定からは単結晶電極を用いることで電解重合生成物での-C-N-C-結合の割合が増加し、電解重合生成物であるポリマーは、より閉環状態に近い構造を取ることが裏付けられた。多環縮合系パイ共役構造が線形に超高密度化した高電子伝導性材料を実現するための基礎的な検討として、電解重合を適用する場合にはモノマーの選択が重要な因子の一つである。いくつかの基礎的な検討の結果、電解重合可能な二つのアミノ基を有する芳香族化合物である2,3-ジアノフェナジンに着目し、電気化学的な特性評価と電気化学重合挙動および重合生成物の酸化還元特性評価を行った。強酸性水溶液中で2,3-ジアノフェナジンの重合を行った場合、生成物であるポリマーは複雑な酸化還元挙動を示し、一見して解析が難しく、配向性などは期待できない。一方で、有機酸を添加したアセトニトリル中で2,3-ジアノフェナジンの電解重合を行った場合の生成物は、酸性水溶液中で電解重合を行った場合と全く異なり、吸着種に特有で比較的シンプルな酸化還元応答を示すことを見いだした。この場合、酸性水溶液中でのサイクリックボルタモグラムはピーク電位のpH依存性からは分岐した構造が予想される結果となったが、より重合条件を検討することで分子の配列配向が向上することが期待できる。微細形態を評価するためには走査型トンネル顕微鏡の観察が不可欠であり、その整備を継続している。また、導入した基板加熱ユニットを組み込んだ真空蒸着装置でAu(111)薄膜を作製し作用電極とすることで、より配向性を持たせた2,3-ジアノフェナジンの電解重合条件の検討を継続して行っている。特に単結晶面を有する蒸着金薄膜電極を作用電極とした電解重合とその生成物の電気化学的特性評価、走査トンネル顕微鏡(STM)および原子間力顕微鏡(AFM)を用いた形態観察を試みた。

また、電解重合生成物の電気特性測定と構造に関する知見を得るためにX線光電子分光測定を行った。STMの電流電圧変換アンプの選択とノイズ対策を行うことで、トンネル電流レンジを昨年度と比較して1/30程度まで下げることに成功し、更に分解能を向上させる目的で探針をチューニングフォークに置換えてAFMによる観察に供した。真空蒸着で作製した金薄膜を電気炉によりアニール処理を行い、表面の平滑性が大幅に向上することをSTM/AFMにより確認したのち、電解重合用作用電極として用いた。オルトフェニレンジアミン以外の芳香族ジアミン類をモノマーとした場合でも、サイクリックボルタンメトリーによる酸化還元特性評価で良好な酸化還元応答を示し、その酸素還元反応に対する触媒応答は電流密度で比較した場合、増加が見られた。X線光電子分光測定からは単結晶電極を用いることで電解重合生成物での-C-N-C-結合の割合が増加し、電解重合生成物であるポリマーは、より閉環状態に近い構造を取ることが裏付けられた。化学多環縮合系パイ共役構造が線形に超高密度化した高電子伝導性材料を実現するために電解重合法を適用する場合に選択するモノマーとして、電解重合可能な二つのアミノ基を有する芳香族化合物として新たに2,3-ジアノトルエン、2,3-ジアミノフェノール、2,3-ジアミノニトロベンゼンの酸化還元特性を検討した。これらの分子は酸性水溶液中で電解重合することおよびそれらの重合生成物は溶存酸素を触媒酸化することが明らかとなり、重合生成物の分子構造としていずれも分子構造として環が閉じたフェナジン部位を有することが分かった。これら分子の電解重合用作用電極をグラッシーカーボンから前年度に導入した基板加熱ユニットを装備した真空蒸着装置で作製したAu(111)基板に変更して、走査プローブ顕微鏡による構造観察を行う準備を進めている。多環縮合系パイ共役構造が線形に超高密度化した高電子伝導性材料を実現するために電解重合法に原子レベルで平滑面を有する金薄膜単結晶電極を適用し、物性を電気化学測定と電気測定、形態を走査プローブ顕微鏡とX線光電子分光法に評価を行った。電解重合を行う場合に選択するモノマーとして、電解重合可能な二つのアミノ基を有する芳香族化合物として新たに2,3-ジアノトルエン、2,3-ジアミノフェノール、2,3-ジアミノニトロベンゼンの酸化還元特性を検討した。走査プローブ顕微鏡測定として、STMのトンネル電流アンプの選択やノイズ対策を施し、電解重合生成物の大気中での観測を行った。金薄膜電極で電解重合を行ったオルトフェニレンジアミンは酸素還元反応に対する触媒作用に大幅な向上が見られ、X線光電子分光法から、より環が閉じた構造を取っていることが明らかとなった。多環縮合系パイ共役構造が線形に超高密度化した高電子伝導性材料を実現するために電解重合法を適用する場合モノマーの選択が重要である。いくつかの化合物を候補として検討を開始した結果、2,3-ジアノフェナジンの酸化還元特性について、従来報告されているものとは異なる興味深い挙動を示すことを見いだし、平成24年3月の電気化学会第79回大会において発表を行った(論文投稿中)。重合に関与していないアミノ基の評価のためのプローブ分子として検討しているフェロセンカルボン酸の電極反応についても検討開始した。有機化合物の電極表面での配列配向を検討する際電極表面の平滑さは極めて重要な因子である。
ミクログリア由来のプラスミン生成系の神経系における意義について

本研究の目的は、ミクログリアのプラスミン生成系プロテアーゼの(1)ニューロンに対する作用メカニズム、(2)生体内における産生、(3)産生調節について解析を行うことであった。この2年間にわたり検討した結果、以下の諸点が明らかとなった。(1)ラット胎仔脳由来のニューロンを用いてプラスミノーゲン(PGn)の作用とイノシトール3リン酸(IP3)または蛋白リン酸化との連動性を検討し、PGnの添加により、ニューロンのIP3が一過性に増加することを明らかにした。また、ニューロンのある蛋白(>100kDa)がチロシンのリン酸化を受ける結果も得たが、その量は微量であり基質蛋白の同定まで進展するのは困難と思われた。(2)ラットの顔面神経を切断する系を用いた結果、活性化ミクログリアにプラスミノーゲンアクチベータ-(PA)が一過性に誘導されることが明らかとなった。このPAは、阻害剤に対する感受性や分子量からウロキナーゼ型のPAであることが判明した。またPGnも顔面神経の切断によりアクソトミ-側の神経核に増加する結果が得られたが、PGn抗体が免疫組織化学には不適のため、細胞種は明らかではない。(3)これまで種々の既知因子を用いて、PGnおよびPAの産生を促進する因子を探索してきたが、ニューロントロフィンにその作用の強いことを示した。NGF、BDNF、NT-3、NT-4/5はほぼ同等の活性を示し、50ng/mlの濃度で約4-6倍の増加をもたらした。ミクログリアがニューロントロフィンの特異性レセプターを発現している可能性をRT-PCRにより検討したところ、高親和性レセプターであるtrkA、trkB、trkCの他、低親和性レセプターであるp75がmRNAレベルで発現されていることが示された。さらに免疫細胞化学的方法、ウエスタンブロット法によって、蛋白質としても存在することも明らかとなった。本年度は、インビトロで明らかになったミクログリアのプラスミノーゲンアクチベータ-(PA)およびプラスミノーゲン(PGn)の産生調節因子の探索とそれらのインビボにおける産生について検討することを目標とした。ミクログリアのPAおよびPGn産生に及ぼす因子を既知のサイトカインや成長因子の添加により検討した結果、PA産生を促進する因子としてNGFやIL-1が、逆に抑制的な因子としてTGFβが明らかとなった。またPGnの産生はNGFおよびIL-2.IL-5により顕著に促進され、TGFβにより抑制された。これらの因子によるPAおよびPGn産生の変動は従来知られておらず、インビボにおける調節因子を想定する上に興味深い結果であった。インビボにおけるPAおよびPGnの産生を検討する系としてラットの顔面神経切断の系を用いた。組織切片のザイモグラフィを行った結果、顔面神経切断後3-5日にかけて最大活性を示すように一過性に神経切断側の顔面神経核にPA活性が検出された。その性質についてtPAおよびuPAの阻害剤を用いて検討した結果、神経核に誘導されるPA活性はuPAであることが強く示唆された。さらにtPAとuPAを区別する大きな特徴である分子量を調べたところ、顔面神経核に誘導されるPAは48kDaを示し、明らかにuPA型であることが認められた顔面神経核におけるuPAの産生細胞は予備的な免疫組織学的検討などからミクログリアと考えられている。

一方、PGnの変動をウエスタンブロット法により検討した結果、PAと同様に神経切断後3-5日目にピークを示すように神経核に増加した。インビボにおける産生細胞を同定するために5種のPGn抗体を作製し免疫組織化学を行ったが、現在のところミクログリアらしい形態を示す細胞が染色されるものの明瞭な結果が得られていない。PAおよびPGnの免疫組織化学は今後も検討を続ける予定である。本年度の目標として(1)ミクログリア由来プラスミノーゲン(PGn)およびプラスミノーゲンアクチベータ-(PA)の産生調節因子を既知物質から探索する。(2)ミクログリア由来PGnおよびPAの産生調節をニューロンとの細胞間相互作用から検討する。(3)ミクログリアによるPGnおよびPAの生体内における産生を検討する。の3点をあげ、検討した結果、以下の諸点が明らかとなった。(1)昨年度、種々の成長因子やサイトカインのなかでPGnおよびPAの産生を促進する因子としてNGFを明らかにしたが、新たにBDNF,NT-3,NT-4/5などのニューロトロフィンも同様の作用をもつことを示した。4種のニューロトロフィンはほぼ同等の活性を示し、50-100ng/mlの濃度で約4-6倍の増加をもたらした。ミクログリアがニューロトロフィンの特異的レセプターを発現している可能性が推測されたため、その存在をmRNAおよび蛋白レベルで検討したところ、高親和性レセプターであるtrkA、trkB、trkCの他、低親和性レセプターであるp75が発現されていることが示された、(2)培養ニューロンとミクログリアをコカルチャーする方法を用いてミクログリア由来PAの産生を検討したところ、ニューロンの存在によりミクログリアによるPAの産生は約10倍増加した。ニューロンの培養上清をミクログリアに添加することによっても同様の結果が得られることから、ニューロンはミクログリア活性化を引き起こす可溶性因子を産生するものと推測された。(3)昨年に引き続き、顔面神経のアクソトミ-の系を用いて、活性化ミクログリアがPGnまたはPAの産生をおこなうかどうか免疫細胞を化学的に検討したが、作製抗体および市販抗体ともに明瞭な結果を与えなかった。現在、RT-PCR法を用いて検討している。