hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
成長因子による骨組織再生に関する研究

骨組織再建の方法として、近年注目されている仮骨延長術を用いて指骨の先天異常を治療した。治療対象となった疾患は、母指多指症術後の変形と頭蓋骨縫合早期癒合症侯群の一つであるアペール症候群の2つのグループである。2グループとも同様に、骨切り術を行い1日に1mmづつ延長すると共に角度の修正も行った。延長した部分に骨が形成されるのを待ってから装具を取り外したが、2つのグループ間で、骨形成の速度に違いがあった。骨形成の速度を定量的に表す目的で、ヒーリング・インデックス(1cmの新生骨を形成するのに要した日数:日/cm)という指標を使ったが、アペール症候群においては37.2日/cm、母指多指症後の変形においては64.3日/cmであった。この比較検討により、母指多指症患者に比較しアペール症候群患者においては、仮骨延長部の骨形成が早いことが示された。アペール症候群では、以前より、線維芽細胞増殖因子受容体2(FGFR2)遺伝子の変異がほぼ全例に認められることが欧米で示されており、また東洋人アペール症候群患者においても同様の変異が、検討例全例でみられたことを本研究代表者が報告している。このFGFR2の生物学的効果は広範囲にわたっており、未だ詳細に確認されていないが、骨形成に対しては強く関与していると考えられている。今回、アペール症侯群において仮骨延長部の骨形成が促進されていることが示唆されたため、アペール症侯群で変異を示すFGFR2遺伝子は、骨形成を促進させる役割を果たしていることが推測された。また,骨芽細胞の培養による検討により,FGFR2遺伝子においてアペール型の変異(Ser252Trp)を持つ骨芽細胞は,変異を持たない骨芽細胞に比較し,OsteopontinやOsteocalcinが強く発現していること,培養液中のアルカリフォスファターゼ活性が高いことが判明した。このことから,アペール型変異を持つ骨芽細胞は,骨への分化能が亢進していることが予測された。このin vitroの結果は,以前に,実際の臨床例で得られた結果と一致した。治療対象となった疾患は、母指多指症術後の変形と頭蓋骨縫合早期癒合症候群の一つであるアペール症候群の2つのグループである。骨形成の速度を定量的に表す自的で、ヒーリング・インデックス(1cmの新生骨を形成するのに要した日数:日/cm)という指標を使ったが、アペール症候群においては37.2日/cm、母指多指症後の変形においては64.3日/cmであった。今回、アペール症候群において仮骨延長部の骨形成が促進されていることが示唆されたため、アペール症候群で変異を示すFGFR2遺伝子は、骨形成を促進させる役割を果たしていることが推測された。

また,骨芽細胞の培養による検討により,FGFR2遺伝子においてアペール型の変異(Ser252Trp)を持つ骨芽細胞は,変異を持たない骨芽細胞に比較し,OsteopontinやOsteocalcinが強く発現していること,培養液中のアルカリフォスファターゼ活性が高いことが判明した。このことから,アペール型変異を持つ骨芽細胞は,骨への分化能が亢進していることが予測された。このin vitroの結果は,以前に,実際の臨床例で得られた結果と一致した。
共生概念を基にした自然保護教育の体系化に関する基礎研究

本研究は、環境教育の中で自然保護教育を位置づけ、自然保護教育の体系化を図るための基礎研究を目的に、次のことを課題にして行われた。1.子ども・生徒の意識調査を行う。小学生から中学生・高校生にかけて自然保護の意識がどのように形成されるかを調査し、自然保護意識の発達の筋道を解明する。2.自然保護を含む環境教育に関する教材を収集し、データ・ベース化を行う。3.自然保護に関する教材を開発する。シミュレーション行動を行わせる等コンピュータ利用を試みる。4.自然保護教材が意識形成やその行動化にどのように関連し、また、障害があるかを検討する。5.以上のことを踏まえ、環境教育の構造の中に自然保護教育を位置づけながら、その体系化を試みる。1について小学生の意識調査を行った。その結果、第一に環境問題意識には構造的なものがみられること、第二に開発よりも保護意識の方が強いこと、それにはいくつかの立場が分かれること等を明らかにした。2については資料の収集を行った。3の自然保護教育の実践について、交感的自然認識の必要のもと、ネイチャーゲームの活動を試みた。5については環境教育とは何かということを究めようとした。その概念が確定しないでは先に進むことはできないと考えた。したがって、本研究の成果としていえることはまだまだ自然保護教育の体系化を試みるまでに至っていないということである。この点で本テーマの研究の入口に入ったところであるといわざるをえない。今後に継続していくことを総括として述べておきたい。本研究の目的は、環境教育の中で自然保護教育を位置づけ、自然保護教育の体系化を図るための基礎研究を行うものである。第一に、子ども・生徒の意識調査を行う。第二に、自然保護を含む環境教育に関する教材を収集し、データ・ベース化を行う。第三に、自然保護に関する教材を開発する。第四に、自然保護教材が意識形成やその行動化にどのように関連し、また障害があるかを検討する。第五に、以上のことを踏まえ、環境教育の構造の中に自然保護教育を位置づけながら、その体系化を試みる。さらに、自然保護教育のカリキュラム試案を作成する。本年度は研究目的の第一,第二を主として行う。まず、意識調査については、自然保護意識の構造を仮定し、調査項目を作成する。調査を行い、認識発達の筋道を解明する。これについては1.環境問題意識の程度2.共生概念の発達3.保護の立場か開発の立場かの価値選択、からなる問題群を作成し、調査を実施し、現在分析中である。第二に、データ・ベース化について、現在資料を収集中である。また英国STSの教材を入手し、現在分析中である。第三にコンピュータ利用について、バランスオブプラネットを購入し、授業への導入を検討している。第四に、環境教育の理論研究を継続している。月例会を持ち、環境教育の理論、実践について分担し、報告検討を重ねてきた。以上が、本年行ってきた研究であるが、十分成果を上げているといえよう。調査結果は学会発表を計画しているところである。STSの教材分析についても発表を重ねている。本研究の目的は,環境教育の中で自然保護教育を位置づけ,自然保護教育の体系化を図るための基礎研究を行うものである。第一に,子ども・生徒の意識調査を行う。小学生から中学生・高校生にかけて自然保護の意識がどのように形成されるかを調査し,自然保護意識の発達の筋道を解明する。第二に、自然保護を含む環境教育に関する教材を収集し,データ・ベース化を行う。第三に,自然保護に関する教材を開発する。第四に,自然保護教材が意識形成やその行動化にどのように関連し,また障害があるかを検討する。

第五に,以上のことを踏え,環境教育の構造の中に自然保護教育を位置づけながら,その体系化を試みる。さらに,自然保護教育のカリキュラム試案を作成する。本年度は研究目的の第一の分析と整理・発表にほとんどの時間を費やした。子どもの環境問題意識がどのようになっているかを明らかにすることを狙って平成5年3月阪神地域の小学5年生536人に調査を行った。第一部は,環境問題用語の認知、第二部では,子どもの「環境問題」意識の内容、第三部では,子どもの自然保護意識といった3部についてのものである。結果は、第一部では、子どもの環境問題用語の認知にはグループ化の可能なものとそうでないものがあるということを,第二部では,子どもの「環境問題」意識には感情移入ないしスローガン的傾向が強いことを,第三部では開発か保護かでは自然保護の意識の方が高いことを,その保護意識にも多様な考えがあることを捉えることができた。これらを踏え,現在第三の研究目的である教材開発を検討しているところである。その他第三の研究目的である環境教育に関する教材収集も日本環境協会の協力を得て本年度順調に進んだ。本年度はつぎのことを研究課題とした。1.国内外の環境教育を総括し、その中の自然保護教育の扱いについて総括する。これについて研究を進めた。2.環境論理について教材化を行い、授業実践し、それが子どもの環境問題意識にどのように影響するかを調査する。これについて素案を作成しつつあるが、授業化までにいたっていない。3.自然保護教育を共生概念に基づいていかに体系化できるかを総括する。これについて研究を始めたが、共生概念の解明に時間を取りすぎ、自然保護教育の体系化を試みるまでに至らなかった。最後に3年間の研究の総括として、環境教育の理論化を中心にした最終報告書を作成した。報告書は論文5編、47ページからなる冊子とした。
ＭＲＳＡ菌血症に対する抗ＭＲＳＡ薬の妥当性について

研究目的MRSA(メチシリン耐性黄色ブドウ球菌)菌血症治療において、ガイドラインでは代替薬とされている抗MRSA薬テイコプラニン(TEIC)が実際には第1選択として用いられている場合も少なくない。抗菌薬感受性指標のCLSI基準においてTEICの最小阻止濃度(MIC)4および8はMRSAに対して感受性ありと評価される一方で、他の基準EUCASTでは感受性なしとされており、実際の感受性および治療効果は不明確である。そこで本研究ではMRSA菌血症に対するTEICの治療効果をTEICのMIC2以下群および4以上群で比較検討した。研究方法北海道大学病院において、2008年4月から2014年12月までにMRSA菌血症を発症し、その治療目的にTEICを第1選択として用いられた症例を対象とし、MIC2以下群(16例)および4以上群(4例; MIC4, 8それぞれ2例)における治療効果を後ろ向きに比較検討した。評価項目は1)菌血症発症から60日以内の死亡、2)TEIC投与期間における菌の持続、3)TEIC投与終了後30日以内の菌の再発とし、1)から3)のいずれかひとつを満たす場合、治療失敗とした。研究成果MIC2以下群および4以上群における死亡例はそれぞれ2/16(12.5%)、3/4(75%)(p<0.05)、菌の持続は1/7(14.3%)、3/4(75%)、菌の再発は1/4(25%)、1/1(100%)、治療失敗は4/16(25%)、4/4(100%)(p<0.05)であった。有効群および無効群におけるMIC4以上の割合は、各群それぞれ0/12(0%)、4/8(50%)であった。本成果からMRSA菌血症治療においてTEIC MICが4以上であった場合、CLSI基準により感受性ありとされていても、治療効果が低いため他の抗MRSA薬への変更を推奨することが妥当であると考えられる。
住まい・まちづくり学習から始める持続可能な社会づくりの実践的プログラム開発

持続可能な社会づくりには、人々の生活基盤である住生活が安定的に営まれることが必須である。即ち、住まいやまちといった生活空間を工夫しながら「使い続ける」、良き住生活の様式を「伝え続ける」、地域や生活を担う人々と「関わり続ける」ことである。本研究では子どもの住教育認識調査結果を基にしながら、地域の行事や伝統行事によって育まれるもの(伝え関わり続ける)、伝建群における住教育(使い関わり続ける)、学校エコ改修と環境教育(使い続ける)を事例研究として積み上げ、実践的なプログラムとして提示した。研究の初年度にあたり、研究分担者の役割を明確にすること、持続可能な社会づくりを具体化するための「継承」「再生」に関わる学校・家庭・地域での取り組み等についてプレ調査等を実施しながら、議論した。(1)家庭における住文化継承の実態把握のためのプレ調査を行い、特に保護者の住生活体験と児童の生活実態の関係性を把握する手がかりを模索した。(2)歴史系博物館における住教育の試みのための居住文化体験プログラムを作成した。(3)地域の気候・風土を考慮した住まいとして歴史的住居(重文)の紙模型を作成し、教育プログラムの試案を作成した。(4)伝統的建造物群保存地区における住教育の試案として、紙模型を使った教育プログラムを作成し、地域の建築士会等の連携による授業実践を試みた。(5)高校家庭科における住居領域の学習実態調査を行った。学習指導要領の改訂に伴う教科書改訂が順次行われることを前提に住教育内容の変化を把握する基礎調査とした。これらを元に議論を深め、「継承」「再生」のための教育プログラム開発へ向けての次年度以降の研究作業についても見通しを確認した。持続可能な社会づくりには、生活基盤である住宅・住生活が安定的に営まれることが必須である。それは東日本大震災での被災・復旧・復興を見ても明らかである。本研究では主として子どもを対象に、住まい・まちづくり学習による持続可能な社会づくりのための実践的プログラムの開発を試みるものである。昨年度は研究期間の中間期であり、各研究者のテーマに沿って、調査や資料収集を積極的に行った。(1)重要伝統的建造物群保存地区の竹富島、また青森県黒石市などで、ペーパークラフトを活用した住まい・まちづくり学習の実践を行い、子どもや教師の学習成果に対する意見を収集した。(2)新学習指導要領に基づく小学校家庭科、中学校家庭科の教科書分析を行った。(3)祭礼住文化のもたらす住まいやまちづくりへの効用を、事例的に検討した。(4)生徒の住教育に対する考え方(住教育観)を検討するため、2つの高校の1年生を対象に、アンケート調査を行った。(5)これらの結果を持ち寄り全員で検討会を行い、最終年度へ向けての方向性を議論した。その結果、住まい・まちづくり学習に関する実践的プログラムの開発と同時に、住教育支援のプラットフォームづくりの試行も行うこととした。(6)中間期の成果発表として、日本建築学会2011年大会(於;早稲田大学)の「オーガナイズドセッション:住まい・まちづくり学習」において、研究代表者を含め4名が発表し、住教育関連研究者との情報交換を行った。研究の最終年度に当たって、これまでの「持続可能な社会づくりのための学習」のあり方を全員で議論・整理するとともに、各人の分担研究の遂行と全体のまとめを行った。具体的には以下である。1子どものための住まい・まちづくり学習の基本基礎を探るため、その意識調査を実施し共同でまとめた。2地域の伝統行事や祭礼による地域文化の継承が子どもの住まい・まちづくり参加に果たす役割を検証した。3伝統的建造物群保存地区における子どものためのペーパークラフトづくり(授業実践を含む)を通した住まい学習の実践と評価を行った。4学校校舎のエコ改修をきっかけに、学校・地域による環境教育の進展と地域再生への波及効果を実証した。これらを報告書としてまとめ、学校関係者、関連研究者、調査等協力者らに配布した。報告書(全80頁)の目次は以下である。はじめに、第1章高校生の家事・地域参加からみた住まい・まちづくり学習に対する意識、第2章地域の行事を通して考える文化継承に果たす学校・家庭・まちづくりの役割、第3章地域の伝統行事を伝え続けるための体験学習プログラムの実践と評価第4章伝建地区の民家ペーパークラフトを活用した住まい・まち学習の実践第5章学校校舎エコ改修を契機とした環境教育の地域展開第6章小活いずれも地域での実践或いは学校での授業実践を軸に「使い続ける」「伝え続ける」「関わり続ける」ことの具体的実践的研究となり、そのまま活用できる実践的ミニプログラムとした。付随的であるが、関連の木造の学校校舎の保存改修が、学会等の高い評価を受けたことも記したい。研究代表者の「高校生の住教育観」アンケート調査を含め、各分担研究者の担当テーマも着実に実施されている。24年度が最終年度であるため、記入しない。最終年度は、まとめとしての議論が欠かせない。

実践的プログラムの作成に関する試案の検討と議論、また住まい・まちづくり学習支援のプラットフォームづくりのための試行など、全員での議論するために、必ず複数回の研究会をもつ。まとめとして、家庭科教員向けの報告書を作成し、関心を持つ教員に配布する。24年度が最終年度であるため、記入しない。
新製品開発に貢献する研究開発組織改革の効果測定

産前産後休暇及び育児休業取得に伴い、研究期間を当該年度1年間中断した。2017年12月14日から2018年8月31日までが研究中断期間であり、2019年4月1日に研究を再開した。2018年度は研究中断期間中であったため、予定していた質問票調査やインタビュー調査が実施できていない。予定していた先行研究調査や特許情報のデータセットの作成に着手できており、その部分については予定通り進行している。予定通り、企業の従業員に対するインタビュー調査と質問票調査を実施する。質問票調査実施前に数人の調査対象者に対するインタビュー調査を行い、その調査結果をもとに質問票調査の設計と検討を行う。質問票調査の実施には、企業の協力者と協働し、配布と回収の方法について検討する。また、特許情報のデータセットの更新を予定通り実施する。当初の分析目的に沿ったデータセットの作成・整理・加工を行い、分析を行う。解析の段階で明確な結果が得られない場合は、異なる解析法を用いる、仮説を立てなおす等の対処を行い再検証する。本研究では、研究所集約を行う予定の調査対象の企業において、研究開発部門に所属する研究員を対象に質問票調査を行い、統計解析を行う予定である。当該年度では、調査対象となる企業を訪問し、研究所集約前に、インタビュー調査を行った。調査対象は、研究開発部門のコミュニケーション促進政策を企画する担当者および研究員であり、企業内の部門が異なる研究員同士のコミュニケーションの現状や、企業のコミュニケーション促進のための政策、研究員の研究環境、および研究所集約の現状等に関する情報を収集した。質問票調査実施前にインタビュー調査を行うことで得られた情報は、調査対象の企業の現状把握および、質問票作成に生かした。また、研究所集約の事前に研究員に配布するための質問票を作成し、企業の担当者と協働して精査及び確認を行った。質問内容は研究者の研究活動や行動特性、部署内外の同僚や上司・企業内外の研究者や顧客とのコミュニケーション、研究上の行動や性格の特性、異分野に対する関心や理解、研究の創造性や分野横断性、新製品開拓に対する意欲、職務満足等に関するものである。今後、これらの変数が研究所集約後にいかに変化するかを検証し、研究開発部門への大部屋制の導入効果を明らかにする。質問票作成までは研究計画通りに進行することができたが、質問票調査の実施が、調査対象の事情により遅延している。今後計画が遅延することが予想されるが、研究計画全体の期間内での遂行には問題はないと思われる。今後は、研究計画通りに質問票調査、特許データ収集、データの結合と解析を実施する予定である。遅延している質問票調査は、企業の担当者を通じて調査対象の実施可能な時期を見計らい、調査対象の事情を鑑みながら、適切なタイミングで実施する。当該年度で質問票調査の実施が遅延したため、調査協力者に対する謝金の支払いが未実施である。次年度で調査を実施する予定である。産前産後の休暇及び育児休業の取得に伴い、2017年12月14日から2018年8月31まで研究を中断し、2019年4月1日に研究を再開したため、2018年度の支出実績はなかった。2018年度に実施予定であった研究内容を2019年度に実施する。詳細としては、質問票調査の実施、回収及び回答謝礼金、質問票調査のデータ入力および整理に係る人件費、英文校正費用等が主な用途である。
GPIアンカー生合成変異トリパノソーマにおけるGPIアンカー型蛋白質の分解機構

プロサイクリック型トリパノソーマよりGPIの生合成に関与する遺伝子の一つであるGPI10をノックアウトするとGPIの生合成はその遺伝子が関与しているステップで停止し、そのため通常原虫表面に大量に発現されるGPIアンカー型タンパク質であるプロサイクリンは細胞表面から全く検出できなくなっていた。そこでノックアウトトリパノソーマにおけるパルス・チェイス実験を行うと、原虫表面に発現されなかったプロサイクリンは非常に短時間のうちに原虫内で分解され、その後分解を受けながら細胞外へと分泌されていることが明らかとなった。続いてこの分解がGPIアンカー生合成能欠失トリパノソーマにおいて共通の現象であることを確認するため、GPIアンカー生合成経路の最終ステップ、即ちアンカーをタンパク質に結合させるステップに働いている酵素であるトランスアミダーゼのサブユニットの1つであるGPI8をクローニングし、更にその遺伝子をノックアウトしたプロサイクリック型トリパノソーマを作製した。このノックアウト変異株では完成型のGPIは合成されていたが原虫表面のプロサイクリンの発現は消失していた。またGPI8ノックアウト変異株はGPI10ノックアウト変異株と同様に、付着細胞用の表面処理をした培養器具の内壁に強く密着し細長く伸びた形態を示し、増殖が著しく阻害されたが、GPI10の変異株と異なり死滅することはなかった。また、無処理の培養器具内での増殖もGPI10の変異株と、その変異をプラスミドにより相補したクローンの中間的な形質を示し、GPI8のノックアウト変異株はGPI10ノックアウト変異株と比較してマイルドな表現型を示すことが明らかとなった。本研究は、申請者らがTrypanosoma bruceiにおいて始めてクローニングに成功したGPIアンカー生合成に関与する遺伝子をノックアウトしたプロサイクリック型トリパノソーマで、表面コートタンパク質であるPARP(プロサイクリン)の挙動を調べるというものである。プロサイクリック型トリパノソーマよりGPIの生合成に関与する遺伝子をノックアウトするとGPIの生合成はその遺伝子が関与しているステップで停止しており、そのため通常原虫表面に大量に発現されているプロサイクリンは全く検出出来なくなっていた。続いてこの分解がGPIアンカー生合成能欠失トリパノソーマにおいて共通の現象であることを確認するため、GPIアンカー生合成経路の最終ステップ、即ちアンカーをタンパク質に結合させるステップに働いている酵素であるトランスアミダーゼのサブユニットの1つをクローニングし、更にその遺伝子をノックアウトしたプロサイクリック型トリパノソーマを作製した。現在このノックアウト変異株におけるプロサイクリンの細胞内での挙動を検討中である。
シェーグレン症候群の酸化ストレス制御による口腔乾燥症状緩和に向けて

慢性炎症性の自己免疫疾患のひとつシェーグレン症候群は、主として唾液腺と涙腺が障害されるため口腔乾燥と乾燥眼をきたす。本研究では、唾液腺における酸化ストレスの制御機構を明らかにするため、酸化ストレスの影響をヒト顎下腺由来A-253細胞を用いて解析した。ヒト全ゲノム発現解析の結果から、A-253細胞でH2O2存在下では炎症性サイトカインの発現が亢進していた。一方で、抗炎症性サイトカインであるIL-11も誘導されていた。これは、標的組織自体が局所の炎症を制御する機能を有することを示唆している。またIL-11は補充療法の候補分子だと考えられる。さらに、ヒト唾液腺から可溶性IL-17受容体(IL-17RA)の同定に成功した。IL-17はシェーグレン症候群、慢性関節リウマチおよび炎症性大腸炎クローン病などの炎症性疾患において重要な分子とみなされており、可溶性IL-17RAは内因性のIL-17阻害物質となり得る。近年、糖尿病や動脈硬化症など、慢性炎症による酸化ストレスと疾病との関連が注目されている。口腔乾燥症の原因となるシェーグレン症候群も慢性炎症を呈する自己免疫疾患のひとつである。そこで、シェーグレン症候群の病態の解明とその知見に基づく治療に役立てることを目的とし、唾液腺への酸化ストレスの影響を解析した。まず、ヒト顎下腺由来細胞株A-253細胞の酸化ストレスに対する抵抗性を検討した。細胞培養液に酸化ストレス源としてH_2O_2を添加し、濃度、添加時間を変えて、A-253細胞への影響を観察した。シェーグレン症候群では、主として唾液腺と涙腺が障害される。しかし、報告されている他の組織由来細胞株と比較して、唾液腺由来A-253細胞が特に酸化ストレス感受性が高いことを示すような結果は得られなかった。次に、酸化ストレスによる生理的影響を調べるために、A-253細胞の分泌能を検討した。A-253細胞はイソプロテレノール等の分泌刺激により、細胞質のCa2+濃度が上昇することが報告されている。イソプロテレノール刺激後の培養上清の解析から、数種類のタンパクが分泌されていることを確認できた。これらは酸化ストレスの分泌機能への影響を解析する指標となり得る。また、シェーグレン症候群などの自己免疫疾患患者の多くが、コイルドコイル構造をもつゴルジ体タンパクに対する自己抗体を保有している。そのような特徴をもつゴルジ体タンパクの機能解析を行ったところ、新生タンパクの糖鎖修飾に必須であることがわかった。正常な糖鎖修飾ができない場合、糖タンパクが重要な役割をもつ細胞接着などに重大な影響を及ぼすと考えられる。シェーグレン症候群は、口腔乾燥とドライアイを主症状とする自己免疫疾患である。その標的組織である唾液腺と涙腺は慢性的な炎症状態にあり、酸化ストレスの影響を受けていると考えられる。そこで、酸化ストレスが唾液腺細胞に与える影響を検討するため、酸化ストレスによるタンパク質発現の変化をマイクロアレイで解析した。解析には、モデル細胞として、唾液腺(顎下腺導管部由来)細胞株A-253を、酸化ストレス源としてH_2O_2を用いた。また、(1)定常状態、2つの酸化ストレス条件(2)酸化ストレス抵抗性を示す条件(生存率・増殖能は正常)(3)細胞増殖が抑制される条件、の3条件下で比較した。H_2O_2処理細胞では(2)(3)どちらの条件でも、抗酸化ストレス分子やDNA損傷に対応する分子の発現上昇と共に、炎症性サイトカイン発現量の著しい上昇が観察された。また、(2)の条件下では、炎症性サイトカインの発現上昇に関わるNFkBパスウェイを促進する分子と抑制する分子の両方の発現量が増加していた。その均衡がどちらに傾くかが問題となると考えられる。さらに、(3)条件ではアポトーシス関連分子の発現が上昇していた。シェーグレン症候群患者唾液腺組織では、導管部周辺にリンパ球の浸潤が観察されている。今回の結果から、導管部細胞による炎症性サイトカインの分泌がその理由のひとつであり、酸化ストレス下ではそれが増強される状態が持続していることが推測された。シェーグレン症候群患者唾液中には、炎症性サイトカインが健常者より有為に多く含まれていることが知られている。また、唾液腺組織へのリンパ球浸潤が観察されることから、炎症性サイトカインは同症候群の進行および症状と密接な関連があると考えられる。

今年度はこの点に着目して、酸化ストレス条件下で分泌される炎症性サイトカインによって唾液腺が受ける影響をヒト顎下腺由来A-253細胞を用いて解析し、その影響を緩和する分子を探索した。マイクロアレイを用いた解析から、酸化ストレス条件下で炎症性サイトカインIL-17の受容体であるIL-17RAの発現量が増加していることが観察された。シェーグレン症候群患者の組織染色からIL-17受容体が健常者より増加していることが報告されており、酸化ストレスの影響が考えられる。シェーグレン症候群患者の唾液中IL-17含量も増加していることから、その作用の増強が推測される。また、A-253細胞にIL-17を作用させるとIL-6やCXCL-1等の分泌量増加が観察されたことから、唾液腺組織内で炎症の連鎖がおこっていることが示唆された。サイトカイン受容体の中には内因性の阻害分子として可溶型受容体を発現しているものがあり、IL-17RAと複合体を形成して働くIL-17RCおよびIL-17RB受容体の可溶型が産生されることが知られているが、IL-17RAについては不明であった。そこでIL-17RAについて探索したところ、選択的スプライシングによって産生される可溶化型IL-17RA受容体の存在を明らかにすることができた。ヒトでは可溶化型IL-17RAは唾液腺を含む広範な組織で発現していることが確認された。内因性の抗炎症分子としての機能が期待される。平成23年度は、前年度の研究成果から設定した実験条件に基づいた網羅的解析をすることができた。24年度が最終年度であるため、記入しない。今後は、前年度までの網羅的解析で得られた結果について、個別に詳細な検証を行う。また、本研究課題は、酸化ストレス条件下での解析を目的とするものであるが、定常状態での働きが明らかでない因子の関与が多大である可能性も考えられる。その場合は、その因子の定常状態の機能、特徴についても実験を行い、結果を比較するよう対応する。
ペプチドを基本骨格とした新規遺伝子治療ベクターの創成

遺伝子治療は,先天的な遺伝子疾患にとどまらず,癌やエイズなど後天的疾患に対する画期的な治療法として期待されている。現在の遺伝子治療では,ウイルスの生活環を利用した,ウイルスベクターが主に使用されている。しかし,生体に対する安全性の問題,ベクター作製が複雑であるなどの問題が指摘されている。そこで,本研究では,安全かつ合成が比較的簡便なオリゴペプチドを基本骨格とした,完全合成型遺伝子治療ベクターの創成を目的として,DNA結合性オリゴペプチドを合成し,遺伝子治療用ベクターとしての機能を検討した。昨年度までに我々は,DNA結合性ペプチドの候補として,ロイシンジッパー型のDNA結合因子である,Fos-Jun複合体のDNA結合領域に着目し,DNA結合性オリゴペプチド(以下,F/J-P)を合成し,そのDNA結合性およびヌクレアーゼからの保護作用,更に細胞内への導入を試みた。その結果,F/J-PはDNAと結合し,ヌクレアーゼからの保護作用を示した。加えて,F/J-PとGFP遺伝子の複合体を細胞内に導入したところ,GFP遺伝子の発現が認められた。本年度は,DNA結合能の更なる向上を目的として,F/J-Pを構成するアミノ酸残基を改変し,ペプチド分子がα-ヘリックス構造をとるように再設計を行い(以下,NK-2M3),そのDNA結合能およびヌクレアーゼからの保護作用の検討,細胞毒性の検討を行った。NK-2M3のCDスペクトルを測定した結果,50%メタノール溶媒中でのα-ヘリックス形成率は約50%であった。更に,PBS中におけるCDスペクトルを測定したところ,約20%のα-ヘリックス形成率を示した。PBS中で,温度条件の変化によるα-ヘリックス形成率の変化を検討したところ,興味深いことに,0°Cで約40%のα-ヘリックス形成率を示し,NK-2M3は,F/J-Pと比較してα-ヘリックスを形成しやすい事が示された。さらに,in vitroにおいて,F/J-Pと同程度のDNA結合能とヌクレアーゼからの保護作用を示し,加えて,顕著な細胞毒性は認められなかった。1)DNA結合領域の設計と結合能の評価2)ぺプチド/DNA複合体のヌクレアーゼ耐性能の評価In vitroにおいて、F/J-PとpGFPの複合体を種々の分子数比で混合して形成させ、DNase Iを作用させた。アガロース電気泳動後、閉環状pGFPのバンド強度を測定し、ヌクレアーゼ耐性を示す分子数比を調査した。その結果、pGFPとF/J-Pの分子数比が1:1000までの範囲で、有為に、DNase Iからの保護作用を示した。3)培養細胞への導入細胞内に導入したF/J-PとDNAの複合体が、細胞内で安定に保持され、遺伝子発現を行うかどうかの検討を行った。先ず、上記2)で明らかにした、DNase Iからの保護作用を示す分子数比(pGFP:F/J-P=1:1000)で複合体を形成させた。その後、リン酸カルシウム法を用いて、NIH-3T3細胞に対して遺伝子導入を行った。GFP遺伝子の発現効率を測定した結果、F/J-PとpGFPの複合体、pGFP単独の場合共に、発現効率は約30%であった。この結果から、F/J-Pは細胞内において、リン酸カルシウム法と同程度のDNAに対する保護作用を示し、また、遺伝子発現の阻害は示さなかった。
高知県産ショウガの腸管免疫機能活性化に関する基礎的研究

ショウガによる腸管免疫機能の活性化に関して、動物の腸管を用いた検討を行った。BALB/cマウスへ1%ショウガ粉末を2週間経口投与後、小腸からパイエル板を摘出し細胞懸濁液を作製し初代培養した後、培養上清中の免疫グロブリンA(IgA)濃度を測定した。また、摘出したパイエル板免疫担当細胞の定量的解析を行った。その結果、ショウガ摂取によりパイエル板におけるIgAの産生・分泌能は亢進し、CD4/CD8比は上昇していたことから、ショウガ摂取により腸管免疫機能が活性化することが示唆された。ショウガの腸管免疫機能活性化に関して、本年度は主に培養細胞を用いた検討を行った。まず、リポ多糖(LPS)で炎症を誘発したマウスマクロファージ由来RAW264.7細胞に対してショウガ抽出エキスを添加し、炎症マーカーの一つである一酸化窒素の産生抑制効果とその作用機序について検討を行った。その結果、ショウガ抽出エキスの添加により一酸化窒素の産生は抑制され、主要な炎症誘導因子であるNuclear Factor-kappa B(NF-κB)の核への濃縮は抑制され、これらの現象には転写因子の一つであるCyclic AMP Response Element Binding protein(CREB)の発現上昇が関与することを見出した。次に、マウスパイエル板の初代培養細胞を用いた検討を行った。パイエル板は腸の中でも小腸下部に特に多く存在し、腸管免疫において中心的な役割を担うことが知られている。BALB/cマウスからパイエル板を摘出し、免疫担当細胞を単離した後、96well dishに細胞を播種した。培地は10%FBS入りRPMI1640を使用した。培養3日後および7日後に培養上清を回収し、上清中の免疫グロブリンA(IgA)濃度をELISA法により測定した。IgAは腸管免疫において中心的な役割を果たす分子であり、腸管に入ってくる様々な病原体を排除し、腸管粘膜における感染防御に大きく貢献することが知られている。ショウガ抽出エキスの添加により培養上清中のIgA濃度は上昇する傾向がみられ、ショウガによる腸管免疫機能活性化が示唆された。培養細胞を用いた実験において、当初予定していなかった抗炎症作用についての検討を追加して行った。そのため、当初予定していたマウスへのショウガ投与実験が遅れている。ショウガによる腸管免疫機能の活性化に関して、本年度は動物の腸管を用いた検討を行った。10週齢BALB/c雌マウスへ1%ショウガ粉末を2週間経口投与後、小腸からパイエル板を摘出し細胞懸濁液を作製した。その後、パイエル板免疫細胞の細胞表面マーカーに対する免疫染色を行い、フローサイトメトリーにより免疫担当細胞の定量的解析を行った。また、パイエル板免疫細胞の細胞懸濁液を96well plateに播種し7日間初代培養した後、培養上清中の免疫グロブリンA(IgA)濃度をELISA法により測定した。その結果、ショウガ摂取によりパイエル板Bリンパ球中のIgA陽性細胞数の割合は上昇し、培養上清中のIgA濃度はショウガ摂取マウスにおいて上昇する傾向がみられた。また、ショウガ摂取によりパイエル板リンパ球におけるCD4陽性細胞数の割合は上昇し、CD8陽性細胞数の割合は不変であったため、CD4/CD8比は上昇した。パイエル板リンパ球におけるナチュラルキラー細胞数の割合は不変であった。パイエル板は腸管免疫において中心的な役割を果たす組織であり、そこで産生・分泌されるIgAは粘膜免疫を司る主要な分子である。一方、CD4/CD8比も免疫機能の指標の一つであり、CD4/CD8比の低下は免疫機能の低下と関連していると考えられている。今回、ショウガ摂取によりパイエル板におけるIgAの産生・分泌能は亢進し、CD4/CD8比は上昇していたことから、ショウガ摂取により腸管免疫機能が活性化することが示唆された。今後早急にマウスへのショウガ投与実験を行っていく。また、マウスについては正常マウスのみならず、糖尿病モデルマウス等の病態モデルマウスについても検討し、ショウガによる免疫機能活性化をより効果的に評価できる系の構築を目指す。臨床薬理学、食品機能学当初予定していた動物実験が遅れているために、余剰金が発生した。引き続き、培養細胞実験および動物実験に必要な試薬・消耗品、さらには論文投稿等に使用していく計画である。今後特に、動物実験によるメカニズムの解明に力を注いでいく予定である。
通信プロトコルにおける障害からのリアルタイム回復技術に関する研究

(1)リスポンシブプロトコル検証技術:プロセス間の同期のずれにより異常状態に陥ってもリアルタイムに正常状態に回復する機能を備えている通信プロトコルをリスポンシブプロトコルと呼ぶ。通信プロトコルがこのような機能を備えているか否かを判定するため、任意の異常状態に陥っても有限時間内に正常状態に回復するか否か、更に正常状態に回復するまでの時間を計算してそれがあらかじめ決められている時間より短いか否かを検証する方法を考案した。この方法に基づいた検証システムを試作して、システムを用いて双方向ハンドシェイクプロトコルなどを検証し、所期の機能が実現されていることを確認した。(2)リスポンシブプロトコル設計技術:リスポンシブプロトコルを設計するための2つのアプローチについて検討した。まず、リスポンシブプロトコルの機能を備えているか否かを検証し、備えていなければプロトコルを修正するという、検証と修正を反復する方法を考案した。この方法は回復機能とリアルタイム機能を独立して設計できるタイプのプロトコルに有効であることを例示した。次に、任意の通信プロトコルにリスポンシブ機能としてチェックポイント/ロールバック機能を付加する統一的設計法を考案した。この方法をISDN網間プロトコルであるISUPの主要部分に適用してその有効性を確認した。(3)リニアアレイシステム再構成技術:線上に位置する複数のプロセッサを接続したリニアアレイシステムで通信システムを構成した場合の信頼性と性能のトレードオフについて考察した。各プロセッサに対して予備のプロセッサを用意する方法と全てのプロセッサを相互に接続する方法に比べて、各プロセッサを隣接する定数個のプロセッサに接続し故障時にシステムを再構成する方法が、信頼性と性能の観点からみて評価が高いことを示した。
いつ肌色が変わったのか：量的形質遺伝子多座位同時進化モデルによる考察

ヒトの皮膚色は、環境に適応すべく進化した最も多様な形質の一つである。出アフリカ以降、東アジア人の皮膚色は明るく変化したが、メラネシア人はアフリカ人と同程度の暗い皮膚色を保っている。両者の祖先は34万年前に分岐しており、わずか数万年間でこれほどの違いを生んだ進化過程についてはよくわかっていない。本研究では、タイ人とメラネシア人を対象に、皮膚色関連多型を調べ、アリル頻度分布の相違を指標として皮膚色が変化した過程について考察した。ヒトの皮膚色は、環境に適応(紫外線からの防御とビタミンD合成を両立)すべく進化した最も多様な形質の一つである。メラニン色素の合成量は多数の遺伝子に支配されており、皮膚色は量的形質といえる。これまでに皮膚色との関連が確認されている多型では、皮膚色を明るくするのは全て派生アリルであり、メラニン合成関連遺伝子では常に機能低下型変異が起こっていると考えられる。したがって、明るい皮膚色と関連する機能低下型変異が固定しまうと、その集団は暗い皮膚色に戻ることはできなくなる。アジア人とメラネシア人とは遺伝的には近縁であるが、前者の皮膚色は明るく、後者はアフリカ人と同程度に暗い。両者の祖先は34万年前に分岐しており、わずか数万年間でこれほどの皮膚色の違いを生んだ進化機構についてはよくわかっていない。申請者は、これまで、アジア・オセアニア地域でのヒトの移住とその過程で作用した最近の正の自然選択について人類遺伝学的研究を行ってきた。これらの研究成果を踏まえ、「アジア・メラネシア集団でみられる多様な皮膚色の進化」を解明すべく、本研究を着想するに至った。タイ人集団を対象に、これまでに報告のあった皮膚色関連多型について調べた。年齢と性別を調整した重回帰分析により、各非同義多型と3種類のskin reflectance値(上腕内側、額、額から上腕内側を引いたtanning ability)との関連を調べた。次に、派生アリル1コピー当りの独立な効果を推定すべく、独立な関連多型の全てを独立変数とし、性別と年齢で調整した重回帰分析を行い、各多型の偏回帰係数を求めた。メラネシア集団についても、それらの多型の解析を行った。タイ人集団を対象にした関連解析、およびメラネシア集団の多型解析が完了したため。特に、(1)皮膚色は一度明るくなりメラネシアで再び暗くなったのか、(2)暗い皮膚色のまま東南アジアまで到達し、その後、アジアで明るくなったのかは謎である。本研究では、関連解析(皮膚色関連変異の網羅的同定)と集団遺伝学的解析(量的形質進化モデルの構築)を併用することで、アジア・オセアニア地域の皮膚色変化の歴史に迫ることを目的とした。タイ国タック県在住タイ人213名を対象に、分光反射率測定器を用いた皮膚色測定(上腕内側および額のskin reflectance値測定)を行った。皮膚色関連候補多型として95個を調べ、年齢と性別を調整した重回帰分析により、各多型と3種類のskin reflectance値(上腕内側、額、額から上腕内側を引いたtanning ability)との関連を調べた。本研究では、派生アリルコピー数(0, 1, or 2)を各多型の値とした。次に、各種skin reflectance値を従属変数とし、調べた全多型の全てを独立変数とし、性別(女性は0 or男性は1)と年齢で調整した重回帰分析を行い、各多型の偏回帰係数を求めた。もっとも強い関連を示したのはDEF8遺伝子上にあるSNP(rs8049897)であった。また、ATRN遺伝子とMYO5A遺伝子上のSNPも関連していた。自然選択の検出各メラニン合成関連遺伝子に作用する自然選択を検出すべく、集団毎にMcDonald-Kreitman検定(2x2の分割表を用いたFisherの正確確率検定)を行う。次に、アフリカ集団とメラネシア集団では、メラニン合成関連遺伝子に強い純化選択が働いていることを確かめる。派生アリルはほぼ全てが機能低下型変異と考えられるため、暗い皮膚色をもつこれらの集団は、他の集団よりも非同義多型の派生アリルの個数は少なく、その頻度は低いと予想される。これを適当な統計検定を用いて検証する。ヒト進化遺伝学エクソーム解析を次年度に行うこととしたため。エクソーム解析の消耗品費として使用する。
芳香環の還元的破壊に基づく有機合成

頑丈で安定なヘテロ芳香環を還元的に破壊・開裂する新手法を開発し、芳香環の骨格そのものを改変する斬新な有機合成手法を創出する。具体的には、「高反応性求核剤の付加」や「金属リチウムからの電子移動」を鍵素反応として、「ヘテロ芳香環内への原子挿入」や「ヘテロ芳香環内原子の置換」を達成する。これらの革新的手法に基づき、窒素、ケイ素、ホウ素、リンなどを環内鍵元素とする未知の機能を秘めた新規エキゾチックヘテロ芳香族分子群を続々と生み出す。こうして、化学・医農薬・エレクトロニクス産業にまで波及する新しい芳香族化学を切り拓く。具体的には、「高反応性求核剤の付加」や「金属リチウムからの電子移動」を鍵素反応として、「ヘテロ芳香環内への原子挿入」や「ヘテロ芳香環内原子の置換」を実現する。ヘテロ芳香環の開裂と再構築による革新的手法に基づき、窒素、ケイ素、ホウ素、リンなどを環内鍵元素とする未知の機能を秘めた様々な新規エキゾチックヘテロ芳香族分子群の創製が期待できる。創製される化合物は化学・医農薬・エレクトロニクス産業にまで普及し、新しい芳香族化学が切り拓かれると期待できる。
統計解析に基づく英語形容詞の認知言語学的研究

本研究課題においては、英語形容詞の意味と構文との関係について、認知言語学の知見を背景としながら、大規模な共時的・通事的なコーパス・データの解析に基づく量的言語学の厳密な検証と実証の手法を用いることによる分析を展開した。調査に用いられた共時的データはICE-GBから得られたものであり、一方、通時的データはCLMETやDCPSEなどのコーパスから得られた。限定構文と叙述構文について形容詞の分布を詳細に分析することによって、英語形容詞がどのように二構文間で使用されているのか、また形容詞とそれが生じる構文とが歴史的にはどのように発展してきたのかが包括的に明らかになった。一般的に、形容詞とは、モノの属性を表す語類である。形容詞が述べる対象は幅広く、認知主体である言語使用者が認知する世界の事象・状況だけでなく、事態・状況についての認知主体の態度や評価も含まれる。認知言語学は、言語使用者の外部世界に対する主体的な解釈や意味づけを重視するアプローチを採用しており、形容詞の研究にとっても有用な枠組みを提供する。本研究の目的は、最新の認知言語学の知見に基づいて、「英語形容詞の意味と構文との関係」を精査することである。なお、今日、言語学では量的アプローチの価値がますます高まっており、認知言語学理論とコーパス・データに基づく実証的研究の融合の可能性については特に強い主張がなされている。本研究は、共時的・通事的なコーパス・データとその統計解析に基づく研究を行う。当該年度前半は、前年度の流れに基づき、共時的なコーパス・データを以下の手順に従って調査した。1. British component of the International Corpus of English(ICE-GB)を用いて、「限定形容詞」と「叙述形容詞」を抽出した。2. 1で得た「標本」について、共起語や意味や生起する構文等に関する情報をコーディングした。3. 2のデータベースについて、多変量解析などを用いて定量的な分析を行った。4.調査結果を発表した。当該年度後半では、通事的なコーパス・データについて、形容詞の意味変化と構文との関係を、以下の手順に従って調査した。1. The Corpus of Late Modern English Texts(CLMET)を用いて、「限定形容詞」と「叙述形容詞」を抽出した。本研究の目的は、「英語形容詞の意味と構文との関係」について、「最新の認知言語学の知見」と、大規模な共時的・通事的なコーパス・データの解析に基づく「量的言語学の厳密な検証と実証の手法」を用いることによって、体系的で包括的な研究を行うことであった。形容詞とは、話者が世界や状況を描写する際に用いる言語カテゴリであり、その使用には、話者自身の状況への態度や評価が含まれるものであり、言語研究にとって興味深いカテゴリである。本研究をスタートさせてから、最終年度に至るまで、実際に多くのコーパスデータの解析を行うことを通して、形容詞の分布や研究対象となる構文の各々の特徴(例:共起する語句のタイプ、機能の違い、構文間の関係)について、これまで不明であった多くの点が明らかになり、形容詞の意味と構文との関係が明らかになった。研究成果の一部は、国内及び海外の学会において研究発表を行っている(例えば、英語コーパス学会、日本認知言語学会、英国認知言語学会などでの発表を行った)。本研究はそれ自体が形容詞研究の分野にとって貢献を果たすものであることは言うまでもなく、言語研究の分野一般にとっても有用なデータや分析法を提供する役割を果たすものであると考えられる。なお、研究実施計画によると、最終年度には、英語と諸言語の比較研究を実施することを予定していたが、残念ながら、英語形容詞の調査自体でかなりの時間が要求されたため、結果的には類型論的研究はほとんどなされなかったことが心残りである。形容詞は、話者が世界や状況を描写する際に用いる言語カテゴリであり、使用には話者自身の状況への態度や評価が含まれる。認知言語学は、話者の外部世界に対する主体的な解釈や意味づけ、又カテゴリ化等の一般的な認知能力を基盤として、規則よりも「使用」、そして使用に伴うスキーマの抽出を重視する「非還元主義的」で「ボトムアップ的」なアプローチを展開しており(山梨2000)、形容詞研究にとっても有用な枠組みを提供する。本研究の目的は、最新の認知言語学の知見に基づき、「英語形容詞の意味と構文との関係」を調査することである。なお、言語学では量的アプローチの価値が高まっており、特に最近では、認知言語学理論とコーパス・データに基づく実証的研究の融合の重要性が主張されている(Gries & Stefanowitsch 2006)。

本研究は、共時的・通事的なコーパス・データとその統計解析に基づく研究を行う。当該年度は、「研究実施計画」に基づき、共時的コーパス・データについての基礎調査と分析の方針決定を目指して、次の手順で研究を行った。1、British National Corpus(以下、BNC)とBritish component of the International Corpus of English(以下、ICE-GB)に含まれる形容詞の中で、調査対象とする「形容詞リスト」を作成する。2、リスト中の形容詞の事例をBNCとICE-GBから入手する。3、「標本」について、共起語や意味や生起する構文等に関する情報をコーディングする。4、調査結果について、多変量解析(例:回帰分析、主成分分析、クラスター分析)などを行う。5、解析結果を検討する。認知言語学の構文文法、特にラディカル構文文法(Croft 2001)の視点からデータを検証する。6、調査結果を成果報告する。本研究は、現在までのところ、おおむね順調に進んでいると言える。ただし、当該年度前半では、コーパスから得られる大量のデータを客観性を保ちながらも、正確に処理する方法についての検討を幾度も迫られたため、当該年度後半で行った通事的研究に至るまで、若干の時間が必要であった。ただし、研究方針が固まってからは、現在の研究はおおむね順調に進展しており、共時的コーパス・データと同様、通事的コーパス・データについても、英語形容詞の構文における分布を明示的に表示できるようになった。主な研究成果は、2012年7月にイギリスで開催された第4回イギリス認知言語学会(4th UK Cog nitive Linguistics Conference)で発表した。そこでは、大量の英語形容詞について、限定構文と2つの叙述構文における分布を構文文法の観点から説明し、テキストマイニングの手法に基づきながら、Collostructional analysisやクラスター分析を用いて、それぞれの構文を特徴づけた。本研究は、現在おおむね順調に進んでいると言えるが、研究が軌道に乗るまでに幾つかの問題を経験した。まず、当該年度の目的は、共時的コーパス・データの標本についてコーディングを行い、それを統計解析するというものであったが、そもそもデータのサンプリングの方法に関する問題や、共起語や意味や生起する構文等に関する情報のコーディングの方法について、どのように客観性を保ちつつも、コーパスから得られる大量のデータを処理することができるのかについて、多くの事前調査や試行錯誤が求められた。結果としては、構文と語との共起性の強さの測り方については、Collostrutional analysisを採用しながら、意味分類についてはWordNetを使う形となったが、特に意味分類についてはデータの量が多いために苦労した。さらに、当該年度では、テキストマイニングの手法を取り入れることを決定したが、これに至るまでにも幾つかの試行錯誤が行われた。
低線量・低線量率の放射線治療効果向上を目的とした新規放射線増感剤の開発

放射線併用治療の効果向上と適応拡大を目的とした放射線増感剤開発のため、がん細胞に高発現するとがん細胞の生存や転移に寄与することが知られているトランスグルタミナーゼ2(TG2)の放射線抵抗性とその作用機序解析を目標に研究を行った。TG2の高発現は放射線照射後の細胞生存率を高めるが、その作用発現にTGase活性やGTPase活性の欠損に影響しない。しかしながら、放射線耐性細胞に対するTG2-C277Sの発現は、放射線照射後の細胞死を増加させた。また細胞膜結合型TG2の発現は、血清飢餓条件下における細胞死に強い抵抗性を示したが、放射線照射誘導性の細胞死は抑制することができないことが明らかとなった。放射線併用治療の適応拡大、特に低線量・低線量率での放射線治療効果向上を目的とし、放射線照射によるDNA損傷非依存的な細胞死を誘導する新規の手法の開発を目指し研究を進めている。この目的を達するために、トランスグルタミナーゼ2(TG2)を標的とした放射線増感剤の開発を行っている。本年度は、放射線照射による細胞死に対するTG2機能解析のために、DNA修復能の高い放射線耐性がん細胞とその親株である肝がん細胞であるHepG2にTG2変異体(W241A, C277S, Y516F, R580A)を強制発現させた細胞株の樹立を行い、放射線照射による細胞死に対する影響を調査した。HepG2にTG2を過剰発現させると血清飢餓状態による細胞死に対してだけではなく、放射線に対しても抵抗性を示すようになったが、TG2-C277S発現HepG2(HepG2-TG2-C277S)では、血清飢餓状態の細胞死には抵抗を示したが、放射線照射によるアポトーシスは増加することが確認された。同様にTG2-C277Sの過剰発現は、放射線耐性がん細胞においても細胞死の増加を誘導し、放射線感受性が増加していることが明らかとなった。TG2による放射線抵抗性の作用機序解明のために作成した細胞膜局在型TG2発現HepG2は、血清飢餓状態における細胞死に高い抵抗性を示したが、放射線誘導性細胞死に対しては全く抵抗性を示さなかった。これらの結果は、TG2をターゲットとした放射線増感剤の可能性を示しているが、その作用機序は今後も引き続き解析する必要がある。細胞膜局在型TG2に放射線誘導性細胞死への耐性能を期待していたが、全くその作用がないことが明らかになった。しかしながら、TGase活性が放射線誘導性細胞死抑制に寄与することが示唆されたため、今後はこの点について詳細に解析を続けていく。放射線併用治療の適応拡大を目的とし、Transglutaminase 2(TG2)を標的とした放射線増感剤の開発を目指し研究を行なった。本年度は、前年度に作成したTG2変異体発現HepG2細胞を用いて解析を行った。TG2のTGase活性欠損またはGTPase活性欠損変異体発現細胞を用いて放射線感受性を調べたところ、すべての変異体発現細胞において放射線抵抗性を示し放射線照射後でも高い細胞生存率を示した。しかしながら、TG2-C277S発現細胞では放射線照射後の24時間後のアポトーシスの増加も認められた。また、TG2発現細胞では、放射線照射後のDNA障害の指標のγH2AXの発現の上昇が抑制されたが、TG2によるこの放射線抵抗性にこれらの活性は直接的に寄与しないことが示唆された。また、TG2発現細胞はDoxorubicinには耐性を示したが、Cisplatinに対する感受性は増大した。前年度作成した血清飢餓に耐性を示し、放射線照射には耐性を示さない細胞膜結合型TG2発現細胞用いた解析では、このTG2は細胞膜に局在し核に存在せず、放射線照射による細胞死抑制には、TG2の核局在が必要なことが推察された。抗がん剤耐性試験において、細胞膜結合型TG2発現細胞は、感受性に変化は現れなかった。また、放射線耐性細胞にTG2を過剰発現させても、それ以上の放射線抵抗性は得られなかったが、TG2-C277S発現放射線耐性細胞では、放射線照射後の細胞生存率が著しく低下した。さらに放射線耐性細胞に細胞膜結合型TG2を過剰発現させた細胞や神経細胞におけるTG2過剰発現細胞の作成し解析なども行った。本研究において、TG2による放射線耐性の作用機序の一部が明らかになったが、詳細は不明のままであるため今後も解析を続けていく必要がある。今後は、予定通り、神経細胞における細胞膜局在型を含むTG2変異体の発現が及ぼす放射線感受性への影響及びアルツハイマー病、パーキンソン病を含む神経変性疾患への影響を調べるため、TG2変異体発現神経細胞の作成及び機能評価を行っていく。細胞生物学TG2発現細胞における薬剤線抵抗性の解析についての実験に関して一部順序を変えて行ったため。TG2発現細胞における薬剤線抵抗性の細胞内シグナル解析について、ウェスタンブロット法を中心に行う。