hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
広範な脊椎動物に共通の新規フェロモン受容体の解析

我々は広範な脊椎動物ゲノム中に存在するフェロモン受容体候補遺伝子(ancV1R)を発見した。本研究では、脊椎動物の生殖行動におけるancV1Rの機能やフェロモン受容システムの進化的起源を明らかにするために、哺乳類や両生類、原始的な魚類の嗅(鋤鼻)上皮におけるancV1Rの発現場所を調べると共に、広範な脊椎動物ゲノム中におけるancV1Rの偽遺伝子化パターンを解析した。その結果、ancV1R mRNAが鋤鼻器官の全体に発現していること、ancV1Rの偽遺伝子化が鋤鼻器の退化と相関していることが明らかとなった。また、培養細胞を用いた発現実験系の構築や、ノックアウトマウス作製に成功した。本研究の目的は、我々が新規に発見したほぼ全ての脊椎動物ゲノム中に共通に存在する唯一のフェロモン受容体遺伝子(ancV1Rと名付けた)の生理機能を明らかにし、魚から哺乳類まで共通の生殖認知システムの存在をつきとめることである。現在までにancV1Rは広範な脊椎動物のゲノム中に存在することは分かっていたが、その鋤鼻器における発現は実験的に示されていなかった。そこで今回は、古代魚からポリプテルス、両生類からネッタイツメガエル、そして哺乳類からはマウス、ヤギを選別し、嗅覚・鋤鼻器官におけるancV1RのmRNAの発現の有無を、RT PCRもしくはin situハイブリダイゼーションにより検証した。その結果、マウス・ヤギにおいてin situハイブリダイゼーションによって鋤鼻上皮全体に渡るancV1Rの発現が観察され、このグループにおいてancV1Rがフェロモン受容に重要な役割を果たしていることが示唆された。またポリプテルス、ネッタイツメガエルにおいてはRT PCRレベルでのancV1Rの発現は確認されたが、in situハイブリダイゼーションでは明瞭なシグナルが観察されなかった。ancV1Rはフェロモンを受容する神経細胞全体に弱く発現する傾向にあると予想され、in situハイブリダイゼーションによる発現の検出が難しいことが分かった。また、哺乳類のいくつかの種(類人猿、コウモリ類、鯨類)においてはancV1Rが偽遺伝子化しており、これは鋤鼻器官の退化パターンと強く相関しており、このことからもancV1Rがフェロモン受容と強く関わっていることが示唆された。昨年度までにancV1R遺伝子の発現がマウスとヤギの鋤鼻上皮におけるin situハイブリダイゼーションによって確認されてきたが、おもに古代魚や両生類での遺伝子発現は確認できていなかった。今年度は、両生類であるネッタイツメガエルの幼生(オタマジャクシ)の嗅上皮におけるancV1Rの発現をRT-PCRとin situハイブリダイゼーションによって確認した。また、古代魚であるポリプテルスに関してはRT-PCRによって遺伝子発現を確認した。さらに、哺乳類においては原始的な霊長類であるマーモセットにおいてin situハイブリダイゼーションによる発現確認に成功した。また遺伝子データベースの検索をおこなったところ、こう取る霊長類、鯨類、コウモリ類だけでなく、ラッコ、海牛類、鳥類、ワニ類、カメ類においてancV1R遺伝子が偽遺伝子化していることが明らかとなった。上記のグループは鋤鼻器官が退化していることが知られており、ancV1Rの偽遺伝子化と鋤鼻器官の退化に強い相関関係があることが分かった。これはancV1Rがフェロモン受容の中心的な役割を果たしていることを示唆する興味深いデータである。我々が新規に発見したほぼ全ての脊椎動物ゲノム中に共通に存在する唯一のフェロモン受容体遺伝子(ancV1Rと名付けた)の生理機能を明らかにし、魚から哺乳類まで共通の生殖認知システムの存在をつきとめることを目的として研究を進めている。これまでにancV1R遺伝子の発現がマウス、ヤギ、マーモセットに加えてネッタイツメガエルの鋤鼻上皮におけるin situハイブリダイゼーションによって確認されてきた。また、古代魚であるポリプテルスに関してはRT-PCRによって遺伝子発現を確認されていた。また遺伝子データベースの検索により鋤鼻器官の退化している霊長類、鯨類、コウモリ類だけでなく、ラッコ、海牛類、鳥類、ワニ類、カメ類においてancV1R遺伝子が偽遺伝子化していおり、ancV1Rの偽遺伝子化と鋤鼻器官の退化に強い相関関係があることが示唆されていた。本年度はCRISPR/Cas9システムを利用したancV1Rノックアウトマウスを作出することに成功し、現在ではancV1R遺伝子が欠失した系統を複数維持している。ancV1Rの欠失個体が作出されたことで、その機能解析が飛躍的進むことが期待される。

また、培養細胞を用いた発現実験系の構築や、ノックアウトマウス作製に成功した。これまでに遺伝子発現が確認できていなかったポリプテルスや両生類においてもancV1Rの発現が確認できたのは大きな進展であった。また、ゲノムデータベースの検索でも、ancV1Rの偽遺伝子化と、鋤鼻器官の退化に相関関係が観察され、これはancV1Rの進化的な役割を考察する上で重要であった。これらの発見があったことから、研究はおおむね順調に進展していると考えている。進化生物学Crispr/Cas9システムを用いたancV1Rノックアウトマウスを作製して、その系統を維持していく予定であったが、コンストラクトをインジェクションした個体についてgenotypingしてみたところ、遺伝子が破壊された個体を得ることができていない。今後は、ノックアウトマウスの作製に力を入れることと、ポリプテルスやスポッテットガー、ハイギョなど現生の古代魚におけるancV1R遺伝子の発現の検出に力を入れていきたいと考えている。ancV1R遺伝子が広範な脊椎動物のゲノム中に存在することのみしか明らかになっていなかったが、2013年度中の実験によってancV1Rが鋤鼻・嗅覚器官で発現していることを明らかにすることができた。また、ゲノムデータベースのより詳細な検索により鋤鼻器官の退化した種においてのみancV1Rの偽遺伝子化が確認されたことも大きな成果であると考えている。以上、研究は予定通りに進行していると考えてよい。平成26年度において計画していたノックアウトマウスの作製がうまくいかなかったため、そのノックアウトマウス系統の維持に関わる予算を残余させることとなった。ポリプテルスやネッタイツメガエルにおいてはin situハイブリダイゼーションによるシグナルが確認できず、さらにはRT PCRにおいてもその発現がポジティブコントロール(OMP)と比較して明らかに少ないことが分かった。我々はこの理由として、実験に使用したポリプテルスやネッタイツメガエルが生殖段階に入っていなかった可能性があると考えている。つまり生殖のタイミングと同調して嗅神経におけるancV1Rの発現が上がる可能性があると予想している。その可能性を検証するために、今年度においてはポリプテルス、ネッタイツメガエルに生殖腺刺激ホルモンを注射することで、人工的に交配のタイミングを誘導し、それから嗅上皮におけるancV1Rの発現をin situハイブリダイゼーションもしくはRT PCRで調べたいと考えている。また、鋤鼻神経細胞にて発現が知られている遺伝子(例えばTRPC2)の偽遺伝子化のパターンとancV1Rの偽遺伝子化のパターンを比較し、それらの整合性を調べる。最終的にはancV1Rの機能を明らかにする目的でCrispr/Cas9システムを用いたancV1Rノックアウトマウスの作成を視野に入れて実験を進める。これらは平成27年度においてノックアウトマウスの作製が成功した際に合わせて使用する予定である。それ以外は、ancV1Rの培養細胞中における発現をおこない、その生理機能の解析に関わる研究に用いる予定である。実験計画にあるノックアウトマウスの作製に着手しようとしていたが、その部分の実験が遅れているため、その研究にかかる予算を翌年度予算とした。
地域共生社会の実現に向けた多文化共生介護実践論の構築

本研究の目的は、介護実践のグローバル化に視座をおいた新たな介護実践論を構築することである。本研究では、介護をする側と介護をされる側が多様な文化に属するなかで実践される介護実践を「多文化共生介護」と定義付け、多文化共生の視座のもと介護が実践されている諸外国の実践事例から日本の介護実践への汎用を目指した新たな介護実践理論を生成するという方法で研究に取り組む。研究成果として、わが国において多文化共生に根差した介護を実践・実現するための「多文化共生介護」の実践概念を理論化し実践理論を検証的に検討することで、介護の現場に依拠した、かつ新たな介護概念である多文化共生介護実践理論の構築を目指す。
決定論的ドーピング法による量子物性制御

本研究では、10nm以下の領域へのドーピングを実現し、次世代デバイスに適応可能な決定論的ドーピング法の確立を第1の目的とし、単一ドーパントシリコンデバイス、単一シリコン-空孔ダイヤモンドデバイスをはじめとする量子デバイスの物性制御を第2の目的とした。具体的には、110nm以下の領域への単一ドーパントドーピングプロセスモジュールの開発に成功し、2単一ドーパントシリコンデバイス量子輸送、及び3単一ドーパントシリコンー空孔ダイヤモンド量子発光の観測と制御に成功した。将来のCMOSテクノロジーの延伸に資する決定論的ドーピング法の確立、及びその量子物性制御を実現したことは大きな成果である。本研究では、10nm以下の領域へのドーピングを実現し、次世代デバイスに適応可能な決定論的ドーピング法の確立を第1の目的とし、単一ドーパントシリコンデバイス、単一シリコン-空孔ダイヤモンドデバイスをはじめとする量子デバイスの物性制御を第2の目的としている。単一ドーパントの3次元規則配列が最終目標である。具体的には、研究実施期間内に3つの研究項目1「10nm以下の領域への単一ドーパントドーピングプロセスモジュールの開発」、2「単一ドーパントシリコンデバイス量子輸送」、3「単一ドーパントシリコンー空孔ダイヤモンド量子発光」に取り組む。H25年度は以下の研究項目に取り組んだ。研究項目1「10nm以下の領域への単一ドーパントドーピングプロセスモジュールの開発」・10nm以下の領域への単一ドーパントのドーピングを可能とするために、電子線リソグラフィによってチャネル領域に10nm以下の単一孔を有するレジスト形成を試みた(早稲田大学との共同)。・3次元アトムプローブ法によってドーパントの注入分布を評価するためのスキームを構築した(早稲田大学、および東北大学との共同)。H26年度は、以下の研究項目に取り組んだ。研究項目1「10nm以下の領域への単一ドーパントドーピングプロセスモジュールの開発」:単一イオン注入装置の照準精度の向上のために、有機レジストナノホールマスクを介して単一イオンを注入するための条件出しを行い、位置合わせ精度と直径ともに20 nm以下にできる条件を見出した。3次元アトムプローブで注入イオンの基板内分布を測定できる手ごたえを得た。研究項目2「単一ドーパントシリコンデバイス量子輸送」:単一イオン注入装置を用いて、Erを打ち込むための新液体金属イオン源AuSiErの開発に成功した。Siデバイス中にErとOを共注入することが可能となり、シリコンフォトニクスの応用が可能となった。また、1 umのチャネル長を持つチャネルに10 nmピッチでGeイオンを注入したところ、Geバンドの電子輸送を室温でも観測できることを見出した。研究項目3「単一ドーパントシリコンー空孔ダイヤモンド量子発光」:単一イオン注入装置を用いて、単結晶ダイヤモンド薄膜にSi原子を打ち込み、Siと空孔からなるSiVセンタを作製し、ドースと生成収率との関係を明らかにした。1スポットあたり20個のSi原子を打ち込むと、生成収率15%で負に帯電したSiVセンタが生成されること、形成したスポットの中に単一のSiV-センタも存在すること、単一SiV-センタが単一光子源として機能すること、長時間の熱処理より輝度が十分に高くなることを見出した。本研究では、10nm以下の領域へのドーピングを実現し、次世代デバイスに適応可能な決定論的ドーピング法の確立を第1の目的とし、単一ドーパントデバイスの量子物性制御を第2の目的としている。H27年度は、以下の研究項目に取り組んだ。研究項目1「10nm以下の領域への単一ドーパントドーピングプロセスモジュールの開発」:10nm領域への単一ドーパント導入プロセスを開発し、注入された単一ドーパントを可視化するために、3次元アトムプローブによる評価を行った。測定の針試料作製方法や測定条件の検討を行い、局所的に注入されたイオンの検出に初めて成功した。シミュレーションによる結果と比較し、イオン注入分布が正しく検出されたことを確認した。研究項目2「単一ドーパントシリコンデバイス量子輸送」:単一ドーパントが作る量子準位に基づくSi中の量子的電子輸送特性解析のため、チャネル中に比較的深い不純物準位を形成するGeを注入し、低温から室温までの電気伝導特性評価を行った。注入されたGeによる複合欠陥が再現され、チャネル中に1次元的にGeを配置することで不純物バンドが形成し、チャネル長100 nmでは室温下で不純物バンドを介した電子輸送を観測した。研究項目3「単一ドーパントシリコンー空孔ダイヤモンド量子発光」:電子線リソグラフィを用いて、ダイヤモンド上のレジストマスクに直径約10 nmのナノホール配列形成に成功した。マスクを介して低エネルギー窒素イオン注入を行うことによって、NVーセンタの位置と個数をおおよそ制御して作製可能となった。表面バックグラウンドは低く、作製したNVーの電荷が安定であることを確認した。コヒーレンス時間は3.1 μsであり、光検出磁気共鳴による評価では、1スポットに3個のNVーセンタが形成されたことを確認した。

単一イオン注入を用いた決定論的ドーピング法によって、個数と位置が制御されたドーパント原子がシリコン、及びダイヤモンドに導入され、たまたま発現するのではなく、量子物性制御が可能となり、電子デバイス、量子情報への応用展開が可能となったため。本研究では、10nm以下の領域へのドーピングを実現し、次世代デバイスに適応可能な決定論的ドーピング法の確立を第1の目的とし、単一ドーパントデバイスの量子物性制御を第2の目的としている。単一ドーパントの3次元規則配列が最終目標である。H28年度は、以下の研究項目に取り組んだ。研究項目1「10nm以下の領域への単一ドーパントドーピングプロセスモジュールの開発」:Si中に局所的に注入されたイオンの分布についてアトムプローブで実験的に評価をした。アトムプローブでの3次元再構成を丁寧に行い、信頼あるイオンの分布を得た。その分布の深さ方向および面内方向の広がりについて、シュミレーション結果との比較を行い、ほぼコンシステントであり、イオン注入の空間精度の確認をし、決定論的ドーピング法の信頼性を高めた。研究項目2「単一ドーパントシリコンデバイス量子輸送」:単一ドーパントが作る量子準位に基づくSi中の量子的電子輸送特性解析のため、チャネル中にErイオンとOイオンを同時に注入し、光励起電流特性を計測した。Er準位を介して光が吸収され、光励起電流としてチャネルを流れたことを初めて確認した。研究項目3「単一ドーパントシリコンー空孔ダイヤモンド量子発光」:電子線リソグラフィを用いて、ダイヤモンド上のレジストマスクに直径約10 nmのナノホール配列を形成し、マスクを介して低エネルギー窒素イオン注入を行い、水素原子核スピン検出が可能か検証した。共焦点レーザー走査型蛍光顕微鏡(CFM)を用いて、NVーセンターの特性を評価したところ、水素の核スピンに由来するピークの観測に成功した。本研究では、10nm以下の領域へのドーピングを実現し、次世代デバイスに適応可能な決定論的ドーピング法の確立を第1の目的とし、単一ドーパントシリコンデバイス、単一シリコン-空孔ダイヤモンドデバイスをはじめとする量子デバイスの物性制御を第2の目的とした。具体的には、110nm以下の領域への単一ドーパントドーピングプロセスモジュールの開発に成功し、2単一ドーパントシリコンデバイス量子輸送、及び3単一ドーパントシリコンー空孔ダイヤモンド量子発光の観測と制御に成功した。将来のCMOSテクノロジーの延伸に資する決定論的ドーピング法の確立、及びその量子物性制御を実現したことは大きな成果である。研究項目2「単一ドーパントシリコンデバイス量子輸送」について、Si基板にErを打ち込むための新しい液体金属イオン源AuSiErの開発に成功した。単一イオン注入法のシリコンフォトニクスへの応用を広げる成果である。研究項目1「10nm以下の領域への単一ドーパントドーピングプロセスモジュールの開発」イオン注入されている領域をアトムプローブ測定用針状試料の針先先端に持ってくる作業がネックとなっている。
Salmonella choleraesuisの感染に及ぼす毒カプラスミドの影響

1.Salmonella choleraesuisの毒カプラスミド、PKDSC50のマウス病原性への影響:毒カプラスミドpKDSC50保有株(親株及び再導入株)とpKDSC50脱落株を各々ICRマウスに腹腔接種し、病原性を病理学的に比較した。pKDSC50保有株ではマウスは菌血症を示し臓器から投与菌が回収された。腹水、腸間膜、各臓器にも明らかな病変がみられ、それらは接種後14日まで持続した。一方pKDSC50脱落株では菌血症は起こらず、腹水、腸間膜、臓器での病変も軽度で且つ一過性であった。2.pKDSC50のS.choleraesuis細胞表層物質への影響:pKDSC50保有株と脱落株のリポ多糖、外膜蛋白質、及びりん脂質を化学的、生化学的手法を用いて比較分析した。その結果有意な差異は認められず、pKDSC50によるこれらの表層成分の量的変動はないことが確認された。3.トランスポゾン挿入変異法によるpKDSC50上の菌血症惹起能領域の決定:病理学的所見に基づき菌血症惹起能試験法を確立し、この方法によりトランスポゾンTn1挿入変異株100株のマウス菌血症惹起能試験を行った。得られた惹起能陰性株のプラスミドを脱落株に形質転換し、再度試験したところ、最終的に9株の惹起能陰性株が得られた。それらのTn1挿入部位はプラスミド上の6.2kbの領域に局在していた。この領域をマウス菌血症惹起能領域(mba領域)と名づけた。4.mba領域の分子遺伝学的解析:mba領域を大腸菌にクロ-ニングし、大腸菌ミニセル法及びlacプロモ-タ-による高発現系によりこの領域にコ-ドされている蛋白質を同定した。その結果29K、70K、32K、32Kの4種の蛋白質が検出された。mba領域の全塩基配列を決定したところ上記の蛋白質に相当する4つのOpen readingframtが見出された。S.typhimuriumの毒カプラスミド上にも同様の蛋白質がコ-ドされていることが最近知られてきたので、これらの蛋白質はサルモネラに共通の病原性に関与する蛋白質であると考えられる。1.Salmonella choleraesuis毒力プラスミドのマウス感染病理に及ぼす影響:S.choleraesuis親株、毒力プラスミド(50kbプラスミド)脱落株、および50kbプラスミド再導入株を各々亜致死量マウス腹腔に投与し、14日間の病理学的変化を経時的に観察した。親株と再導入株では菌投与後3日目から菌血症が引きおこされ、心血から投与菌が回収された。菌血症は14日間持続した。一方プラスミド脱落株では菌血症は認められなかった。病理組織所見においてもプラスミド保有株と脱落株では明らかな相違が見られた。

特に腸間膜貼りつけ標本において見られる肉芽腫性病巣形成や血管炎がプラスミド保有株では強度認められたのに対し、脱落株ではこれらの病変が軽度でかつ一過性であった。2.菌血症惹起能試験の開発:病理学的所見に基づき、50kbプラスミドによって引きおこされる菌血症の試験方法を開発した。即ち亜致死量の菌をマウス腹腔に投与し、3日後に心血を採取し、血中の投与菌の有無を調べた。これにより菌血症惹起能を迅速かつ簡便に判定できるようになり、以下の遺伝学的解析が可能になった。3.50kbプラスミド上のマウス菌血症惹起能領域の特定;50kbプラスミドへのトランスポソンTn1による挿入変異株を100株分離しこれらの株のマウスに対する菌血症惹起能を調べた。その結果、19株の菌血症惹起能陰性株が得られた。これら陰性株の50kb〓Tn1プラスミドを脱落株に再導入して再度菌血症惹起能を調べたところ、9株が陰性であった。従ってこれら9株は50kbプラスミド上の菌血症惹起能領域にTn1が挿入した変異株であると考えられた。これらのプラスミド上のTn1挿入部位を調べたところ、すべて制限酵素地図上のSalIとHindIIIの切断部位に挟まれた約4.7kbの領域に局在していた。従ってこの領域をマウス菌血症惹起能領域と決定した。1.S.choleraesuis 50kbプラスミドpKDSC50のマウス病原性への影響の病理学的研究:pKDSC50保有株(親株、再導入株)をICRマウスに復腔接種したところ、接種後1日目から復水中の好中球やマクロファ-ジが活性化し、これが14日目まで持続した。また腸間膜、卵管間膜、膵蔵、腸間膜リンパ節、脾臓及び肝臓において14日間にわたり病変が観察された。一方pKDSC50脱落株接種マウスでは感染初期に好中球反応、腹膜表層の病変が見られたものの、病変はpKDSC50保有株に比べて軽度且つ一過性であった。以上によりpKDSC50のマウス病原性への影響はLD_<50>,血流、臓器中の菌の有無のみならず他の病理所見においても顕著に見られることが示された。2.pKDSC50のS.choleraesuis細胞表層仏質への影響:pKDSC50保有株と脱落株について細菌細胞表層成分であるリポ多糖、外膜蛋白質、リン脂質を化学分析、電気泳動、薄層クロマト等の手法を用いて比較分析した。その結果、有意な差異は認められず、pKDSC50は主要表層成分に対して量的変化を与えないということが明らかになった。3.pKBSC50上の菌血症惹起能領域の分子遺伝学的解析:前年度のトランスポゾンによる挿入不活化実験によりpKDSC50上の6.2kbの領域が菌血症惹起能に関与する領域であることが明らかとなったので、この領域をmba領域と名づけ大腸菌にクロ-ニングした。大腸菌ミニセル法及びlacプロモ-タ-による高発現系によりmba領域にコ-ドされている蛋白質の同定したところ、29k、70k,32k,32k,の4種の蛋白質が検出された。この領域の塩基配列を決定したところ、各々の蛋白質に対応するOpen reading frameが見出された。他の研究グル-プによりS.typhimnriumのビルレンスプラスミドにも同様の蛋白質をコ-ドした遺伝子が見つかっているので、これらの蛋白質がサルモネラの病原性発現に重要な役割をはたしているものと考えられる。
凝固・線溶系における二機能性阻害剤のデザイン

1.二機能性トロンビン阻害剤の抗血栓作用の検討及び多機能性トロンビン阻害剤のデザイン:ラット微小血管にHe-Neレーザーを照射し、血管内に血栓を形成する系で、二機能性トロンビン阻害剤はヒルジン、ヒルログより強力な抗血栓作用を示し、アルガトロバンとほぼ同等の抗血栓作用を示した。そこで、in vivoでより効力を示す二機能性阻害剤を得るために、阻害剤を血栓が形成されている場に特異的に集める目的で(targeting)、Arg-Gly-Asp(RGD)モチーフを二機能性阻害剤の架橋部分に導入した。2.二機能性プラスミン阻害剤のデザイン:3.血漿カリクレイン阻害剤のデザイン:血漿カリクレインを特異的に阻害するPKSI-527の阻害効果、特異性を向上させるために、各部分をそのアナログで置換し、どのような構造が阻害活性を示すうえで必要なのか検討した。その結果、阻害活性はほぼ同等で、特異性に優れた化合物を見い出した。血漿カリクレインは活性中心に加え、天然基質の一つであるキニンノーゲンと結合する部位を持っており、ここで得られた活性中心阻害シークエンスと結合部位阻害シークエンスを組み合わせれば、機能性阻害剤に展開することが可能である。◆二機能性トロンビン阻害剤のラットにおける抗血栓作用の検討及び多機能性トロンビン阻害剤のデザイン:山本らはラット微小血管にヘリウム・ネオンレーザーを照射し、血管内に血栓を形成する系を確立しており、この方法を用いて津田が既に開発した2種の二機能性トロンビン阻害剤の抗血栓作用を検討し、in vivoでの評価を行った。この系で二機能性トロンビン阻害剤はヒルジン、ヒルログより強力な抗血栓作用を示し、二機能性トロンビン阻害剤の有用性が明らかとなった。in vitroのアッセイ系における結果より、in vivoの系において二機能性トロンビン阻害剤はアルガトロバンより強く、持続して血栓形成を抑制すると期待されたが、抗血栓作用、持続時間ともアルガトロバンとほぼ同等であった。in vivoにおいてより効力を示し、副作用が少ない二機能性(多機能性)阻害剤を得るために阻害剤を血栓が形成されている場に特異的に集める(targeting)機能を阻害剤に付加するデザインが必要であると考えられる。活性化された血小板の膜上に存在する受容体はArg-Gly-Asp(RGD)配列を有するリガンド蛋白を認識することが知られているので、RGDモチーフを二機能性阻害剤に導入する試みを行っている。◆二機能性プラスミン阻害剤のデザイン:◆多機能性トロンビン阻害剤のデザイン:阻害剤を血栓が形成されている場に特異的に集める(targeting)機能を二機能性阻害剤に付加する試みを行った。活性化された血小板の膜上に存在する受容体はArg-Gly-Asp(RGD)配列を有するリガンド蛋白を認識することが知られているので、RGDモチーフを二機能性阻害剤の架橋部分に導入した。ペプチドのフィブリン分解活性阻害作用とアミド加水分解活性阻害作用を検討したところ、10^<-7>10^<-5>Mでトロンビン活性を50%阻害した。この結果より、RGDモチーフは活性中心阻害シークエンスとある程度の距離をもつことが必要であり、また架橋部分は十分溶媒側に露出していることが必要であることが明らかになった。◆二機能性プラスミン阻害剤のデザイン:◆血漿カリクレイン阻害剤のデザイン:血漿カリクレインを特異的に阻害するPKSI-527の阻害効果、特異性を向上させるために、各部分をそのアナログで置換し、どのような構造が阻害活性を示すうえで必要なのか検討した。その結果、阻害活性はほぼ同等で、待異性に優れた化合物を見い出した。血漿カリクレインは活性中心部位に加え、キニンと結合する部位を持っており、ここで得られた活性中心阻害シークエンスは二機能性阻害剤に展開することが可能である。
心臓ＭＲＩによるミトコンドリア心筋症の病態解明

我々は従来の心臓MRIの方法に加えて心筋MRスペクトロスコピー(MRS)を実施することにより,ミトコンドリア心筋症の心筋代謝の評価を試みた.心筋MRSの至適撮影条件は,息止め・心電図同期で収縮末期に心室中隔に関心領域を設定し撮影することであった.心臓MRIが実施できたミトコンドリア心筋症3例のうち,全例で心周囲脂肪が少なく左室駆出率は正常であった.左室肥大と線維化病変がそれぞれ1例でのみ認められた.心筋MRSは1例が不成功であり2例が心筋内脂肪蓄積の増加を示さなかった.この3例の約2年間の心血管予後は良好であったが,左室線維化病変が認められた1例は神経症状の増悪により入退院を繰り返した.1)心筋MRスペクトロスコピー(MRS)の至適撮像条件の検討本研究は,ミトコンドリア心筋症の病態を心臓MRIによって解明することをである.心臓MRIを用いた評価法の1つであるMRSについて,ひきつづき至適撮像条件を検討した.皮下や右室前面の脂肪組織の信号をRFパルスにより抑制することにより,ノイズの少ない心筋のスペクトルが得られた.2)ミトコンドリア心筋症患者における検討当院で加療されているミトコンドリア心筋症9例を抽出し,このうちの3例に対して心臓MRIを実施した.シネ画像で1例に左室肥大が認められ全例に左室収縮能障害は認められなかった.また,全例で心周囲脂肪は少なく心筋の脂肪変性は認められなかった.遅延造影画像では1例に右室境界部に島状の高信号領域が認められた.MRSでは1例で心筋スペクトルが検出できず,2例で心筋内脂肪蓄積の増加は認められなかった.さらに,ミトコンドリア心筋症を合併している可能性が高い左室肥大患者43例に対して心臓MRIを実施した.MRSで検出される心筋内脂肪蓄積は糖尿病合併例で有意に増加しており,また,BMIと相関関係が認められた.以上,本研究で得られた知見は,別紙のように様々な機会で論文発表と学会発表を行った.1)心筋MRスペクトロスコピー(MRS)の至適撮影条件の検討本研究は,ミトコンドリア心筋症の病態を心臓MRIによって解明することである.心臓MRIを用いた評価法の1つであるMRSについて,ひきつづき至適撮影条件を検討した.これまで我々が用いていた息止め・心電図同期を用いた心筋MRSでは約20秒以内に撮影を終わらせる必要があるため,積算回数は10-12回に制限されスペクトルの検出感度が不良であった.今回,我々は,呼吸と心電図を同期させた心筋MRSを導入した.積算回数を36回に増加させることができた.健常者での検討では,息止め・心電図同期の心筋MRSに比べて心筋内脂肪のスペクトルが有意に高かった.2)心臓MRIによる検討当院で加療されているミトコンドリア心筋症9例を抽出し,このうちの3例に対して心臓MRIを実施した.シネ画像で1例に左室肥大が認められ全例に左室収縮能障害は認められなかった.また,全例で心周囲脂肪は少なく心筋の脂肪変性は認められなかった.遅延造影画像では1例に右室境界部に島状の高信号領域が認められた.MRSでは1例で心筋スペクトルが検出できず,2例で心筋内脂肪蓄積の増加は認められなかった.さらに,ミトコンドリア心筋症を合併している可能性が高い肥大型心筋症患者22例に対して心臓MRIを実施した.MRSで検出される心筋内脂肪蓄積は左室心筋重量と負の相関関係,左室駆出率と正の相関関係を示した.また,乳酸は検出されなかった.これらの症例は後日の精査によりミトコンドリア心筋症が否定された.3)予後評価心臓MRIが実施されたミトコンドリア心筋症3例の約2年間の心血管予後は良好であった.しかしながら,遅延造影が認められた1例は神経症状の増悪により入退院を繰り返した.我々は従来の心臓MRIの方法に加えて心筋MRスペクトロスコピー(MRS)を実施することにより,ミトコンドリア心筋症の心筋代謝の評価を試みた.心筋MRSの至適撮影条件は,息止め・心電図同期で収縮末期に心室中隔に関心領域を設定し撮影することであった.心臓MRIが実施できたミトコンドリア心筋症3例のうち,全例で心周囲脂肪が少なく左室駆出率は正常であった.左室肥大と線維化病変がそれぞれ1例でのみ認められた.心筋MRSは1例が不成功であり2例が心筋内脂肪蓄積の増加を示さなかった.この3例の約2年間の心血管予後は良好であったが,左室線維化病変が認められた1例は神経症状の増悪により入退院を繰り返した.1)心筋MRスペクトロスコピー(MRS)の至適撮像条件の検討本研究は,ミトコンドリア心筋症の病態を心臓MRIによって解明することをである.心臓MRIを用いた評価法の1つであるMRSについて,心筋内脂肪または乳酸計測における至適撮像条件の検討を行った.

なお,実用性を考慮し心臓MRIを1時間以内に終了させるため,MRSは息止め・心電図同期で撮像することとした.MRSに大きく影響を与えると考えられる関心領域の位置と大きさ,サンプリング回数,TE値,およびTrigger delayについて検討した.結果,関心領域の位置心室中隔基部,大きさ20 ×20 ×10 mm,サンプリング回数12,TE 30(脂肪測定)または135(乳酸検出),およびTrigger delay約300 ms(収縮末期)が最適とされたが,測定困難な症例があり,さらなる検討が必要であると考えられた.2)ミトコンドリア心筋症患者における検討当院で加療されているミトコンドリア心筋症9例を抽出し,このうちの1例に対して心臓MRIを実施した.シネ画像で軽度の左室肥大を認め左室駆出率は正常であったが拡張能は低下していた.また,心周囲脂肪や心筋の脂肪変性は認められなかった.遅延造影画像では右室境界部に島状の高信号領域が認められた.MRSでは心筋内脂肪蓄積や乳酸は検出されなかった.さらに,ミトコンドリア心筋症を合併している可能性が高い左室肥大を伴う糖尿病患者5例に対して心臓MRIを実施した.MRSで検出される心筋内脂肪蓄積は,糖尿病を合併しない心疾患患者に比して多い傾向が認められた.また,このうちの1例で乳酸が検出された.今後,さらに,症例数を増やし,心臓MRI所見と臨床背景とを比較し予後調査を行う予定である.ミトコンドリア心筋症を評価するための評価法の1つである心筋MRスペクトロスコピー(MRS)について,至適撮像条件がこれまでの研究により明らかになりつつある.そして,我々はこのMRSを含めた心臓MRIをミトコンドリア心筋症3例に行った.本研究で得られた知見は,別紙のように様々な機会で論文発表と学会発表を行った.なお,ミトコンドリア心筋症について,シネ画像や遅延造影画像等の従来法による評価はいくつかの論文が近年報告されるようになったが,MRSによる評価は我々以外には未だ報告されていない.稀な疾患であるミトコンドリア心筋症患者の抽出に時間を要し心臓MRIが実施できた症例が少ない.心臓MRIが実施できていないミトコンドリア心筋症患者8例に対しても早急に心臓MRIを実施する.また,ミトコンドリア心筋症の可能性が高い左室肥大を合併した糖尿病患者に対しても積極的に心臓MRIで評価していく.心筋MRスペクトロスコピー(MRS)の精度向上のため,息止めではなく呼吸同期での撮像が出来るようソフトを改良する.次に,ミトコンドリア心筋症が希少疾患であるため症例数が少なく,県内の関連病院から紹介していただけるよう,再度通知する.最後に,最初の症例から3年が経過しており予後の評価を行う.ミトコンドリア心筋症は稀な疾患であり患者の抽出に時間を要している.この問題については,関連病院から難聴,筋力低下および左室肥大のいずれかを伴う糖尿病患者を当院へ紹介するシステムを構築することにより対処する予定である.心臓MRIの実施に伴う経費,解析・統計処理に要するソフトウェア費や人件費,論文や学会発表に要する費用に用います.本研究の目的は心臓MRIによってミトコンドリア心筋症の病態を解明することをである.心臓MRIを用いた評価法の1つとしてMRSを用いて心筋内脂肪や乳酸を計測することを試みているが一部の症例では計測できない.至適撮像条件のさらなる改善や,ソフトウェアのバージョンアップなどに研究費を使用する予定である..
敗血症時の脊髄における急性炎症変化とその臨床的意義

マウスにLPS腹腔内投与を行い、脊髄を摘出し、炎症性サイトカイン(IL-1b, IL-6, TNF-αなど)の誘導をリアルタイムPCR法やイムノブロット法、ELISAを使用して検討した。LPS投与後に炎症性サイトカイン(IL-1b, IL-6, TNF-α)はすべて上昇し、また免疫組織染色の結果からIBA-1陽性細胞の著明な増加を認めた。以上からLPS全身投与後に脊髄内のマイクログリアが活性化し、これら炎症性サイトカインを誘導することが示唆された。一方、HE染色で検討した範囲においては、脊髄内に炎症細胞が浸潤している像は確認できず、脊髄に発生する炎症のすくなくとも急性期においてはマイクログリアが主体となるものと思われた。一方で、マイクログリア活性を抑制するとされているミノサイクリンを投与したが、脊髄への炎症性サイトカイン誘導は有意には抑制されなかった。これは仮説の誤りというよりは薬理的作用(ミノサイクリンの作用が弱い、もしくは特異的ではない)に原因があるものと考えている。脊髄の組織学的検討では、炎症細胞浸潤の所見は全くないにもかかわらず、脊髄全体に著明な炎症と浮腫を認め、神経細胞にも疎血性変化を認めている。運動障害の原因としては、脊髄以外にも脳自体や筋肉、末梢神経があり、行動学的検討では、脊髄の関与をどこまで明らかにできるかは未知であり、この点が今後の課題であると考えている。脊髄の電気生理学的検討や神経モニタリングの応用を検討中である。免疫組織学的検討では、神経細胞マーカーであるNeuNの著明な減少を認めたが、ウェスタンブロットでは、NeuNタンパク量には有意な変動は認めなかった。これは敗血症性の病態によってNeuNタンパクの抗原性が変化したためではないかと考えている。敗血症時の脊髄に発生する炎症像を明らかにすることができた。最終的には機能評価(マウス運動機能や脊髄標本における電気生理学的検討)を行う予定である。敗血症の際に、脊髄にサイトカインをはじめとする炎症性メディエーターがどのように誘導されるかを分子生物学的に解析する。またこれらの炎症反応が脊髄に生じうる形態変化を評価することを目的とし、敗血症モデルマウス(LPS腹腔内投与マウス、および盲腸結紮モデル)を作製した。いずれのモデルにおいても敗血症誘導後速やかに脊髄組織全長にわたって炎症性サイトカイン(IL-1β、IL-6、TNF-α)の転写レベルでの高度の誘導が確認できた。また組織像においては。注目すべきことに、炎症性サイトカインの誘導はあるものの、炎症性細胞の浸潤は全く認められず、一方で、組織の著明な浮腫像、そして神経細胞死が認められた。これらの所見から炎症性サイトカインはもともと中枢神経にあった細胞とくにミクログリアが誘導している可能性が示唆され、同細胞の抑制薬であるミノマイシンを投与したところ、炎症性サイトカイン誘導は有意に減少した。また同細胞の特異抗体であるIba-1で免疫組織染色を行ったところ、敗血症モデルマウスでは有意に脊髄にIba-1シグナルの増強を認めたことから、敗血症時には、脊髄内のミクログリアが活性化し、これにより脊髄内に炎症が惹起されることを示した。今後はこれら誘導された炎症がどのように脊髄機能に影響するかを検討する予定である。一方盲腸結紮モデルでは炎症性サイトカイン誘導は確認できたものの、致死率が高いことから、より長期間の観察には不向きであった。モデルの確立と評価については順調に施行できた。
生理機能診断に資する超偏極希ガスの生体磁気共鳴計測法の開発と応用

連続フロー型超偏極キセノン製造装置を開発し、キセノン磁気共鳴信号の2万倍向上を達成した。さらに、超偏極希ガスMRIを用いて、肺機能である換気・拡散・灌流を画像診断しつつ、脳内キセノン緩和速度から脳機能を同時計測する手法を開発し、慢性閉塞性肺疾患(COPD)モデルマウスに適用して肺・脳機能連関を調べた。その結果、病態が惹起する局所肺機能変化とともに脳内キセノン緩和速度が上昇し、肺機能低下と負の相関があることを確認した。本研究では感度不足という生体磁気共鳴(MRI/MRS)計測に固有の問題を乗り越えるべく連続フロー型超偏極キセノン製造装置を開発し、その応用を試みた。その際、低圧条件下で、即ち0.15気圧で超偏極操作を行うことにより、通常の偏極率(信号強度増強率)よりも4倍程度も向上するとの世界的にも類を見ない知見を得ることができた。この偏極率向上がキセノンと混合する窒素ガスのバッファー効果によってもたらされることを明らかとするとともに、MRIマグネット内に設置したマウスに超偏極キセノンを吸入させ条件を最適化することにより、キセノン/窒素ガス混合比が70:30の場合に最も生体磁気共鳴信号が効率的に増強されることを見出した。この時の、生体磁気共鳴信号の増強率は約10%、即ち1万倍であった。本研究では、偏極率向上を模索するとともに、MRI撮像手法についても詳細に検討を加えた。超偏極磁化についてはRFパルスによる脱偏極、即ち信号強度の減少という固有の問題が生じるが、これに対して高速撮像法の1種であるbSSFP(balanced Steady State Free Precession)法が有効であることを見出し、従来では不可能であったマウス肺MRI画像取得を実に0.05秒/枚という時間分解能で取得することが可能となった。これにより、呼気位相と吸気位相とを分離して撮像することができるので、にれらの画像をもとに換気率(1回の呼吸でどの程度肺中のガスが入れ替わるかを示す指標)、ガス拡散(ガスが肺胞中と血液中とでどの程度入れ替わるかを示す指標)、および灌流(血流速度)を評価できる手法を開発した。また、この時肺から脳へと移行したキセノンの信号観測も同時に行い、キセノンの脳内動態から脳血流量と緩和時間を評価するための手法の開発も併せて行った。本手法を肺気腫モデルマウスに適用し結果から、新たな生理機能診断法を提案するに至り、その適否の確認を継続して行う予定である。本研究では感度不足という生体磁気共鳴(MRI/MRS)計測に固有の問題を乗り越えるべく連続フロー型超偏極キセノン製造装置を開発し、研究初年度において生体磁気共鳴信号の約10%増強、即ち1万倍の感度向上を達成した。本年度は、この飛躍的に感度向上した偏極希ガスの生体MRI計測条件を最適化することにより、マウス肺のシネMRI画像を実に0.05秒/枚という高時間分解能で取得することを可能とした。これにより呼気位相と吸気位相とを分離撮像できるので、これらの画像をもとに呼吸機能パラメータである、換気率(1回の呼吸でどの程度肺中のガスが入れ替わるかを示す指標)、ガス拡散(ガスが肺胞中と血液中とでどの程度入れ替わるかを示す指標)、および灌流(血流速度)を画像診断する手法を開発した。本手法をエラスターゼ誘発肺気腫モデルマウスに適用して、病態が惹起する呼吸機能変化を局所定量評価することができ、この変化が病理診断結果と相関することを確認した。本年度は、肺診断手法開発と並行して肺から脳へ移行したキセノン脳内動態から緩和時間を測定するための手法の開発も併せて行った。本測定手法は、肺におけるキセノンの取り込み一洗い出し動態、即ち入力関数の測定を不要とする全く新しい手法であり、これにより肺病態モデルマウスの脳機能変化を簡便に健常マウスと比較することができた。その結果、肺気腫モデルマウスにおいてキセノン脳内緩和時間が約20%まで低下することを確認した。この低下が酸素摂取率低下、即ち脳神経活動の低下に起因するかどうかの確認実験を継続して行う予定である。さらに、2年目では超偏極希ガスの生体MRI計測条件を最適化することにより、マウス肺のシネMRI画像を実に0.05秒1枚という高時間分解能で取得することを可能とし、呼気位相と吸気位相画像をもとに呼吸機能パラメータである、換気率(1回の呼吸でどの程度肺中のガスが入れ替わるかを示す指標)、ガス拡散(ガスが肺胞中と血液中とでどの程度入れ替わるかを示す指標)、および灌流(血流速度)を画像診断する手法を開発した。

本手法をタバコ煙薬液ならびにエラスターゼ誘発慢性閉塞性肺疾患(COPD)モデルマウスに適用して、病態が惹起する呼吸機能変化を局所定量評価することができ、この変化が病理診断結果と相関することを確認した。最終年度である本年度は、生体磁気共鳴信号の2万倍の感度向上を成功し、これをもとにしてCOPDモデルマウスについて肺機能に加えて脳内キセノン緩和速度から脳機能を同時計測し、この2つの機能の間の連関を調べた。その結果、脳内キセノン緩和速度が最大で約2倍程度まで上昇し、この上昇の度合いは肺機能低下と負の相関があることを確認した。このことは、COPD患者において健常の10%程度の血流量増加が観測されるとの報告を支持するが、併せて脳内におけるキセノンの緩和速度も大幅に上昇しているとの新たな知見をもたらし、この上昇が酸素摂取率低下即ち脳神経活動の低下の定量指標となる可能性が示唆された。COPDは精神疾患発症も伴う全身性の疾患であり、肺・脳機能連関についての意義を解明する必要がある。
アルギン酸‐硫酸Ｃａ三次元架橋構造をベースとするリン酸Ｃａ徐放型骨再建材料の創製

我々は、硫酸カルシウム由来のCa2+を介したアルギン酸との架橋構造内に、高い骨形成能を有するリン酸カルシウム(β-TCP)を効率よく取り込むための最適な作成条件を設定し、より高い効率性と再現性を得るための手技的検討を行った。その結果作成された柔軟な賦形性を有する複合体について、材料学的評価、生体親和性、細胞接着性等のデータを加え、将来的に骨欠損の大きさ、形状に左右されることなく応用可能な生体内吸収性骨再建材料の開発を目指す。本研究は、高い骨形成能を有するリン酸カルシウムを、硫酸カルシウム由来のCa2+を介してアルギン酸と架橋構造を形成することで、柔軟な賦形性を有し、骨欠損の大きさ、形状に左右されることなく応用可能な生体内吸収性骨再建材料を開発することを目的とした。申請者はこれまで、複合体作成過程において、アルギン酸濃度や精製過程における遠心分離の回転速度を変化が、1)リン酸カルシウムの取り込み効率、2)Scaffoldとして求められる気孔径や架橋形態、3)骨再建材料として求められる機械的強度、賦型性、形態保持性に影響を及ぼすことを報告している。将来的なin vivoでの埋入試験を見据え、最も効率よくβ-TCPが取り込まれる条件がアルギン酸ナトリウム粉末1.0wt%の条件下であることを特定し研究を進めた。しかしながら、FTIRおよびXRDによる解析により、作業工程のわずかな違いにより、作製される複合体の性状が異なり再現性に乏しい。In vivoでの実験を見据え、実験の再現性を高めるため、繰り返しの実験を進めた。その結果、ある程度の再現性の向上を得られたが、安定した材料の供給までには至っていない。また、高濃度のリン酸カルシウムは細胞毒性が指摘されており、骨芽細胞に対する細胞毒性を制御する濃度を探索し更なる改良を模索するために、細胞のアポトーシスのメカニズムについて基礎的な実験も行った。さらに、バイオリアクターを用いた細胞培養実験を行うことで、動的条件下での細胞分化、増殖の基礎的データを採取した。これらをさらに進めていくことで、より優れた骨形成能を有する骨再建材料の開発が期待できる。本研究は、高い骨形成能を有するリン酸Caであるβ-TCPと多糖類のアルギン酸Naを、硫酸Ca由来のCa2+を介して架橋化し、新規骨再生材料を開発することを目的とした。本材料の最大の特色は、動物性由来の材料を一切含まず、安全性、生体親和性が極めて高いことである。また、柔軟な賦形性、生体内吸収性を有し、骨欠損の大きさ、形状に左右されない。申請者は、Ca2+過飽和な硫酸Ca溶液に、β-TCP(0.5wt%)を加え、さらに過去のデータからアルギン酸Na粉末(0.251.5wt%)を加えて複合体ゲルを作成し、凍結乾燥後にFTIRおよびXRDで解析を行った。その結果、アルギン酸Na粉末濃度1.0wt付近にβ-TCPが最も効率よく取り込まれるピークを示した。しかし、さらに研究を進めた結果、再現性に乏しく、改めて条件設定の見直しが必要となった。アルギン酸Na溶解時にゲル状の核が初期形成されると、β-TCPの取り込みの効率が悪くなる傾向が認められ、核化には1)湿度、2)アルギン酸溶解速度(回転速度)の関与が考えられた。研究を進めた結果、硫酸Ca溶液に適切な1水流速度と2渦径(容器依存)を与え、アルギン酸を一定量少量ずつ加えることで、核化を防ぐことに成功した。実験室内における湿度の変化は結果に影響がなかった。再現性が向上し、結果は我々のの報告と同様に、アルギン酸Na粉末濃度1.0wt%付近にピークを認めた。申請者はこれまで、複合体作成精製過程における遠心分離の回転速度が、1)細胞の接着や増殖、リン酸カルシウム放出の為にScaffoldとして求められる気孔径や架橋形態、2)骨再建材料として求められる機械的強度、賦型性、形態保持性の双方の要件に影響を及ぼすことも報告している。このことを踏まえ、本条件下にて遠心分離の回転速度を変化させ、より優れた骨再生能を有する材料の開発を進めていく。本研究は、将来的な臨床応用を見据え、マウスによる動物実験を予定している。動物倫理の観点からも、本材料の生体親和性や細胞毒性に関して、まだまだin vitroレベルでの基礎的データを積み上げる必要がある。また、そのような部分も含め、本材料の生成過程において、高い再現性は必須であり、そのための実験に、多くの時間を費やすことになった結果、進捗状況は当初の予定より遅れてしまっている。本年度は、本材料製作の再現性の部分において多くの時間を費やした。再現性のある材料の開発が確立されたことで、今後は細胞実験などを通じて、細胞毒性、接着性、生体親和性を、RT-PCR法にて骨基質由来タンパク質のmRNA発現を指標とし、骨形成能を評価する。について評価していく予定である。

また、併せて、複合体をSBFに浸漬し、上澄みからβ-TCPに特有なピークを観察することで、本材料のβ-TCP徐放能を評価する。材料学的評価として、本条件下にて遠心分離の回転速度を変化させ、気孔率および気孔径をより優れた骨形成能を有する条件に設定する。これらの基礎的データを積み重ね、安全性が確認されたうえで、本年度中にはマウスによる動物実験を開始する予定である。引き続き、基礎的データの収集のため、材料及び試薬を購入する。また、実験手技等をフィードバックし、再現性を図るため、記録媒体の購入を検討する。材料学的評価において、気孔径や気孔率の評価のための外部委託を行い、また細胞実験のための培養実験用細胞および器具を購入する。年度内のマウスによるin vivoの実験を予定し、マウス60匹およびその飼育費に予算を充てる予定である。また、本研究に関連がある学会発表の調査および本研究成果の発表の旅費を予定している。
がん幹細胞を標的とした新規脳転移予防法・治療法の開発

本研究では脳転移に必要な遺伝子やがん幹細胞マーカーの発現と、実験系でがん幹細胞の脳転移能を検証することでがんの脳転移メカニズムを明らかにすることである。2017年度に転移性脳腫瘍の動物モデルの確立のため、既に確立されている方法の検証としてマウスへ腫瘍細胞の心腔内接種を行なった。血液循環により脳実質への転移が起こり、転移性脳腫瘍が形成されることを確認した。2018年度は同様の方法を用いて、免疫不全マウスにヒト悪性腫瘍細胞株を、心腔内接種によって転移性脳腫瘍モデルを作成し解析をするために、脳への親和性が高い細胞株としてまずは乳癌細胞株MDA-MB-231を用いて実験を行うべく準備を進めた。また既に当研究グループが確立している手法で、脳室内投与によって髄膜播種モデルの作成、解析も同時に行うこととした。生着の確認及び生着した腫瘍細胞をFACSにより回収し遺伝子発現を解析するためMDA-MB-231に標識としてLuc及びGFPを導入すべく、SBI社のLentivector Expression Systemsを用いた。良好に導入されたが、promoterの発現強度の問題でGFPのみ良好に発現し、Lucが発現されなかった。同社の別のvectorを用いて再度導入を試みている。標識が導入された細胞株が得られた後、上記の方法で腫瘍生着を行い、生着した腫瘍細胞を転移巣・血中・髄液中からFACSにより回収し、RNA抽出を行う。RNA sequenceにより幹細胞マーカーを含め網羅的に解析を実施することにより、転移や播種に関わる遺伝子発現の変化について検討する。標識としてLuc及びGFPの導入をSBI社のLentivector Expression Systemsを用いて試みたが、導入した細胞のpromoterの発現強度の問題で、良好な標識の発現が得られなかったため、別のpromoterを含有したvectorを再度導入している。また転移性脳腫瘍の手術摘出標本についても、幹細胞マーカーの発現について解析を行う予定であったが、標本の質の問題や原発巣のばらつきによって解析に必要な十分な症例数が確保できない可能性があり、現在実施可能な解析について検討中である。免疫不全マウスへのヒト悪性腫瘍細胞株の心腔内接種・脳室内接種により、転移性脳腫瘍モデル・髄膜播種モデルを作成し、生着した細胞をFACSにより回収し、RNA sequenceやRT-qPCRによる解析により幹細胞マーカーを含む遺伝子発現変化について検討を行う。転移性脳腫瘍の手術摘出標本への検討は、動物実験の解析により得られる予定の遺伝子発現変化の結果を踏まえて、解析対象を絞り、免疫染色やRT-qPCRにより実施していく。転移性脳腫瘍の動物モデルの確立のため、まずは同種移植モデルとしてC57BL/6マウスに脳実質に生着するマウス脳腫瘍グリオーマ細胞株GL261の心腔内投与を行い、血液循環により脳実質への転移が起こるかを検討した。左室への1 ×10^5個の腫瘍細胞の投与により、接種から45日程で神経症状が出現し、脳切片では転移性脳腫瘍が確認された。同様の手技を用いて、免疫不全マウスにヒト悪性腫瘍細胞株を心腔内投与によって、転移性脳腫瘍を作成するために、脳への親和性が高い細胞株としてMDA-MB-231を用いて実験を行う予定である。転移性脳腫瘍の手術摘出標本における幹細胞マーカー(CD44、CD133、CD166:ALCAM)の存在頻度と局在の評価のため、腫瘍試料の当該研究への使用について、当院倫理委員会への申請を行った。転移性脳腫瘍の動物モデルではIn Vivo Imaging System (IVIS)を用いて腫瘍の生着の確認、評価を行う予定であるため、ルシフェラーゼ(Luc)の遺伝子導入をヒト悪性腫瘍細胞株(A549、SK-BR3)に試みたが、導入が困難であり、時間を要した。そのため、脳への親和性が高く、既にLucが導入されている細胞株MDA-MB-231-Lucを細胞バンクより購入し、今後の実験系に用いることとした。

標識が導入された細胞株が得られた後、上記の方法で腫瘍生着を行い、生着した腫瘍細胞を転移巣・血中・髄液中からFACSにより回収し、RNA抽出を行う。RNA sequenceにより幹細胞マーカーを含め網羅的に解析を実施することにより、転移や播種に関わる遺伝子発現の変化について検討する。標識としてLuc及びGFPの導入をSBI社のLentivector Expression Systemsを用いて試みたが、導入した細胞のpromoterの発現強度の問題で、良好な標識の発現が得られなかったため、別のpromoterを含有したvectorを再度導入している。また転移性脳腫瘍の手術摘出標本についても、幹細胞マーカーの発現について解析を行う予定であったが、標本の質の問題や原発巣のばらつきによって解析に必要な十分な症例数が確保できない可能性があり、現在実施可能な解析について検討中である。やや遅れて進捗はしているが、研究遂行において問題となる予期しない事象は発生していないため、予定通り研究計画に沿って進めていく。免疫不全マウスへのヒト悪性腫瘍細胞株の心腔内投与により、転移性脳腫瘍モデルを作成し、生着した細胞での遺伝子発現変化、幹細胞マーカーの変化をFACSやRT-qPCR、RNA sequenceにより解析する。転移性脳腫瘍の手術摘出標本の使用について、当院倫理委員会の承認が得られたため、免疫組織染色及びRT-qPCRにより評価を行っていく。免疫不全マウスへのヒト悪性腫瘍細胞株の心腔内接種・脳室内接種により、転移性脳腫瘍モデル・髄膜播種モデルを作成し、生着した細胞をFACSにより回収し、RNA sequenceやRT-qPCRによる解析により幹細胞マーカーを含む遺伝子発現変化について検討を行う。転移性脳腫瘍の手術摘出標本への検討は、動物実験の解析により得られる予定の遺伝子発現変化の結果を踏まえて、解析対象を絞り、免疫染色やRT-qPCRにより実施していく。研究計画が予定よりも遅れて進捗しているため、購入予定であった試薬や動物について、購入を行わなかったことによる。これらは次年度に持ち越し、使用する予定である。研究計画が予定よりも遅れ、一部実施困難な解析が存在するため、購入予定であった試薬や動物について、購入を行わなかったことによる。これらは次年度に持ち越し、2019年度に継続実施予定の研究のために使用する。