hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
α波による注意制御機構の経頭蓋磁気刺激を用いた検証

感覚器官から外部情報を受け取って意識的経験を生じさせるまでに注意による情報選択が行われていることは多くの研究で示唆されている。多くの研究は、アルファ振動に反映された抑制機能が情報選択に関与していることを示唆している。しかし、これまでの研究は網膜質状態経路を通る視覚入力に対する神経応答を観察していたため、視床レベルまたは新皮質レベルでの選択を区別できなかった。本研究では、注意課題中に大脳皮質を直接刺激することによって、皮質興奮性および指向性を持った領野間結合がαパワーの強度に応じて動的に変化することを見出した。感覚器官から外部情報を受け取って意識的経験を生じさせるまでに注意による情報選択が行われている。情報選択がどう実現されているかについてα波パワーの抑制機能が関わっていることが多くの研究で示唆されている。本研究の目的は注意誘発性のα波の調節度合いに応じて刺激に対する皮質反応性や領野間結合強度が変化することを直接的に示すことである。そのために注意課題中に経頭蓋磁気刺激(TMS)と脳波(EEG)を計測し、刺激誘発性の活動伝播を時空間的にトレースする。注意課題は手がかり刺激(矢印)を先行して呈示し、被験者の注意を右または左視野に誘導するポズナーパラダイムを用いた。また注意を誘導した視野に反応を要求する標的刺激(±2度傾いた縦縞)が呈示される試行とされない試行をランダムに繰り返し、後者の試行においてのみ右または左半球の初期視覚野にTMSを印加した。TMSを印加する半球内での注意によるα波パワーの増減を調べるため、手がかり刺激と磁気刺激間の脳波データ対してFFTを行い注意誘発性のα波パワー変調求めた。α波パワーに応じた刺激の効果を調べるため、ウェーブレット変換から位相情報を取り出し位相リセット、領野間の位相同期を調べた。その結果、注意によってα波パワーが減少した半球では位相リセットが起こりやすく、異なる領野間の位相同期が増大していることが分かった。この結果は注意を向けている半球でαパワーを減少させることで、入力に対する位相リセットが起こりやすくなり局所的な皮質反応性の増大をもたらしていることを示唆している。また局所的な位相リセットの高まりが領野間の位相同期の増大をもたらしていると考えられる。情報選択がどう実現されているかについて脳波のα波パワーに反映される抑制機能が関与していることが多くの研究で示唆されている。つまり非注意視覚野に現れるα波は不必要な情報を抑制するように、皮質反応性を低下させている。しかしながらこれまでの研究は注意課題中に視覚刺激を与え、それに対する視覚野の反応を示していているため、視覚野に到達する以前の視床などで抑制された結果と区別することができない。そのため、本研究では注意課題中に脳波を計測し、同時に経頭蓋磁気刺激(TMS)を使用して視覚外部入力を受け取る脳領域を直接刺激した。α波パワーの高い半球に比べて、α波パワーの低い半球ではTMSによる誘発電位が有意に増加した。さらに、α波パワーが低い半球では高周波数(β/γ波)の振幅がα波の位相によって変調されていることが分かった。脳波で見られる高周波成分は局所の神経発火を反映していると言われており、α波はその発火タイミングを調節している可能性が示唆される。このように活動のタイミングが他の脳領域と揃うことによって領野間の結合が強まる可能性がある。実際にα波パワーの低い半球と他の脳領域はα波の位相同期が高まっていることが分かった。さらに注意障害を持つ半側空間無視患者を対象とした安静時脳波解析を進めている。患者群のなかでも重症度に応じで半球間のα波周波数の差が大きくなることが分かった。健常者の解析をさらに進め、新たな結果を追加できた。患者脳波データの解析を開始したが、発症からの継時的なデータ測定には至らなかった。つまり非注意視野に対応する視覚野で増大するα波は不必要な情報を抑制するように、皮質反応性を低下させている。しかしながら、これまでの研究は注意課題中の視覚刺激への視覚野の反応を示しているため、視覚野に到達する以前の視床などで抑制された結果と区別することができない。そのため本研究では注意課題中に経頭蓋磁気刺激(TMS)を使用して視覚野を直接刺激し、その脳波反応を計測した。α波パワーの高い半球に比べ、パワーの低い半球に刺激を行った場合、刺激誘発電位が有意に増大した。さらに、α波パワーの低い半球と他の脳領域の位相同期が高まった。つまり領野間の同期を高めることで情報伝達を有意にしている可能性が示唆される。さらに注意障害の一つである半側空間無視を伴った脳卒中患者を対象とした安静時脳波解析を進めている。患者群の中でも重症度に応じて半球間のα波周波数の差が大きくなることが分かった。また、縦断的に計測されたデータから、病態指標が回復している患者ほど、左右差の改善も見られた。健常者被験者の結果をまとめ、論文の作成に取り掛かった。患者脳波データの解析を進めているが、継時的なデータ測定の進捗が遅かった。

感覚器官から外部情報を受け取って意識的経験を生じさせるまでに注意による情報選択が行われていることは多くの研究で示唆されている。情報選択がどう実現されているかについて脳波のα波パワーに反映される抑制機能が関与していることが多くの研究で示唆されている。つまり非注意視野に対応する視覚野で増大するα波は不必要な情報を抑制するように、皮質反応性を低下させている。しかしながら、これまでの研究は注意課題中の視覚刺激への視覚野の反応を示しているため、視覚野に到達する以前の視床などで抑制された結果と区別することができない。さらに注意は局所的な皮質の反応性を変調しているだけでなく、領野間の結合強度を変調していることがよく知られている。しかしながらこれまでは方法では結合の指向性を直接的に調べられていなかった。本研究ではTMS摂動を局所で与え、その効果がどのように他の領域に伝播するのか、またα波パワー依存的にどのように変動するのかを調べた。注意課題中にα波パワーが高くなった半球に経頭蓋磁気刺激(TMS)を行った場合、α波パワーが低くなった半球への刺激に比べて、刺激誘発電位が有意に増大した。また、α波パワーが低い半球へのTMS摂動によって、他の脳領域が強く影響を受けたが、α波パワーが高い半球への摂動は伝播しなかった。この結果は注意によって変調されるα波は視床レベルでの機能抑制だけでなく、皮質反応性及び領野間結合の動的変調を反映していることを示唆している。多くの研究は、アルファ振動に反映された抑制機能が情報選択に関与していることを示唆している。しかし、これまでの研究は網膜質状態経路を通る視覚入力に対する神経応答を観察していたため、視床レベルまたは新皮質レベルでの選択を区別できなかった。本研究では、注意課題中に大脳皮質を直接刺激することによって、皮質興奮性および指向性を持った領野間結合がαパワーの強度に応じて動的に変化することを見出した。TMS-EEGの実験手法とアーチファクト除去法を確立し、α波パワーに応じた皮質反応性と領野間結合に関する解析は概ね完了したため。患者脳波データのさらなる解析を進め、α波と半側空間無視の関係を明らかにする。健常者データの論文を投稿する。患者脳波データの解析を進めると同時に継時的データの取得も継続する。認知科学今回確立した手法や知見から、脳卒中患者における活動伝播とリハビリによる可塑的変化について検証する。脳卒中などによって片半球の機能を局所的に失った結果、どの領野間のネットワークが同時に損なわれているかなどを検証する。さらにリハビリテーションによる機能回復はその要因について不明な点が多く、同じ訓練を行っても効果に個人差が大きい。リハビリの効果は発症からの経過時間で大きく異なるため、ネットワークの再編成が行われると思われる時期から経時的にTMS-EEGの同時計測を行う。具体的にはリハビリ前とリハビリ中を次の3つの期間に分ける:急性期(発症直後数週間)、回復期(数週間数ヶ月)、維持期(数ヶ月6ヶ月目以降)。TMSは閉眼時における損傷領域および反対側半球の非損傷領域へ行う。
全身麻酔における意識消失メカニズムの電気生理学的研究

吸入麻酔薬による視床部LD部位神経細胞のGABA性抑制電流の変化に及ぼす麻酔拮抗薬の効果を調べた。実験方法:ラット(17-20days)を用いの脳スライスを作成、環流式のチャンバーに移した後、混合ガス(O_2(95%),CO_2(5%))バブリングしたIan Solutionを環流しながら、顕微鏡下にガラス電極で視床のLD GABA神経細胞をパッチした。ホールセルの状態にした後、吸入麻酔薬(Habthan(0.5%))を含む混合ガスでバブリングした細胞外液(CNQX, AP-5, Strychnine, DMSOを含むIan Solution)を環流しながら、GABA性抑制性電流を記録した。ハロセン、セボフルレンによる変化が安定した後、麻酔拮作用のあるミリスチン酸とドキサプラム灌硫させ、影響を観察した。結果:0.5%ハロセンにより増強したGABA電流を麻酔拮抗薬ミリスチン酸は減少させる傾向を示した。0.5%ハロセンにより延長したGABA電流の時定数τはミリスチン酸による影響を受けなかった。0.5%セボフルレンにより増強したGABA電流を麻酔拮抗薬ドキサプラムは減少させる傾向を示した。0.5%セボフルレンにより延長したGABA電流の時定数τはドキサプラムによる影響を受けなかった。考察:ミリスチン酸、ドキサプラムによる麻酔拮抗作用は麻酔薬で増強したGABA電流の抑制による可能性がある。全身麻酔の作用機序は未だ確定していないが、シナプス伝達、特にGABA系抑制性シナプス達に及ぼす作用が注目されている。静脈麻酔薬、ガス麻酔薬、揮発性麻酔約にわたる広範な麻酔薬によりIPSP/IPSC振幅の変化や持続・減衰(decay)の延長が報告されている。本年度の成果としてはラット視床スライスを用い、自発性IPS/IPSCを記録した。ハロセン麻酔下にラットを断頭し、リンゲル液中に固定し、肉眼的に視床周辺部のブロックを切り出した。スライサーに固定し、200-300μのスライス標本を作成した後、35°Cで1時間インキュベートした。静脈麻酔薬、ガス麻酔薬、揮発性麻酔薬にわたる広範な麻酔薬によりIPSP/IPSC振幅の変化や持続・減衰(decay)の延長が報告されている。本年度の成果としては、昨年に引き続きラット視床スライスを用い、自発性IPSP/IPSCを記録した。またそれに対するハロセンの作用を検討した。さらに2%ハロセンを適用しその効果を調べた。上記の実験をそのまま継続中である。
軸流ターボ機械の不安定領域の新しい流れ解析

軸流羽根車は低流領域で失速し、揚程特性に右上がり部を生じるために作動不安定に陥る。失速開始点の予測と失速流れが誘起する非定常流れの特性の把握は設計上不可欠であるが、経験則に依存しているのが現状である。本研究では、低圧軸流送風機の失速セルのある流れを直接数値シミュレーションによって再現し、その流れと機構を解明した。計算機性能の制約の下で数個の羽根間流路にわたる失速セルをとらえるため・単段で静翼を持たないものとして、実験結果のある2種類の羽根車に対して複数流路の流れ計算を実施した。実験的に旋回失速が観察される場合でも、アスペクト比の小さな羽根枚数の少ない羽根車では安定なセルを伴う数値解は必ずしも得られなかった。他方の条件では安定なセルを持つ流れが得られ、三次元的に実現されたのは世界で始めてである。格子解像度の不足により実験との定量的な一致は十分ではないが、定性的な流れの機構は正しく捉えられていると考えられる。失速セルの本質は竜巻状の渦で,複数の翼間流路から羽根車上流に向かって延びている。その回転は羽根の持つ循環流れと反対方向で、羽根車に対して相対的に運動し、セルの伝播が起きる。この伝播は従来考えられているように、セルが障害物として働くためでなく、渦が流れに乗って運ばれるためである。したがって、セルの移動速度、つまり、羽根車に対する非定常流体力の周期は算定の基礎を変えなければならない。セルのある流れは渦管であるセルが誘起する流れとしてすべて説明することが出来る。失速開始点の予測と失速流れが誘起する非定常流れの特性の把握は設計上不可欠であるが、これまでは経験に基づく知見を整理して利用している。失速開始点の予測は、精度はなお不足するものの、数値解析を利用する方法が開発されつつある。一方、失速流れの特性については、羽根車上、下流での位相固定平均流れを実験的に測定する研究が進展しているものの、その流れの機構を知るに足る詳細な計測は不可能で、データは皆無である。このため、数値解析による解が期待されているが、これまでのところ信頼性のある結果は得られていない。これは、失速域が固定せず旋回するため、非定常流れを扱わなければならないこと、流路形状が複雑で数値精度を上げにくいことのほかに、流れが高レイノルズ数流れで、強い乱流であることにある。このため、旋回失速流れがシミュレートされた例はない。本研究ではこの困難な問題に取り組み、初めて安定な旋回失速流れを得ることができた。計算機能力はすべての渦を解像するには容量・速度とも不足するので、数値粘性を含まざるを得ないが、時間平均の流速分布は実験と満足に一致し、定量的な精度は十分とは言えないが、流れの機構を知る目的には十分な精度を有している。二つの羽根車について解析を行ったが、低アスペクト比羽根車では旋回失速が生じなかった。旋回失速の発生が羽根車形状によって左右されることは実験的に断片的に知られているが、初めて確認された。失速域が旋回しなくとも特性曲線には変化がなく、実機の失速で区別はできない。本研究の結果は旋回失速についてのこれまでのこのような基本的な理解を修正するものである。数値計算結果から得られる流れのさまざまな解析を進めている。低圧軸流送風機の失速セルのある流れをDNSによって作り、その流れと機構を解明した。現在の電子計算機は目的の流れを作るには計算速度、記憶容量ともになお、不足しており、限定的な計算条件でシミュレーションを進めた。すなわち、羽根車は単段で静翼を持たない。また、セルは数個の羽根車流路にわたるのでセルが余裕を持って存在しうる程度に多くの流路の計算が必要である。

実験結果のある2種類の羽根車について計算したが、アスペクト比の小さな羽根枚数の少ない羽根車では安定なセルを伴う流れは得られなかった。実験的に旋回失速が観察される場合でも必ずしも安定な失速セルは生じない。もう一つの羽根車では安定なセルを持つ流れが得られたが、三次元流れでは世界で始めてである。解像度が尚不足するので、定量的には信頼性は確かめられないが定性的な流れの機構は正しく捉えられていると考えられる。失速セルの本質は竜巻状の渦で、複数の翼間流路から羽根車上流に向かって延びている。その回転は羽根の持つ循環流れと反対方向で、羽根車に対して相対的に運動し、セルの伝播が起きる。この伝播は従来考えられているように、セルが障害物として働くためでなく、渦が流れに乗って運ばれるためである。したがって、セルの移動速度、つまり、羽根車に対する非定常流体力の周期は算定の基礎を変えなければならない。セルのある流れは渦管であるセルが誘起する流れとしてすべて説明することが出来る。
遷移金属パイロクロア弗化物におけるスピンフラストレーションの系統的研究

遷移金属および非磁性イオンとしてカドミウムまたは水銀を含むパイロクロアのフッ化物に関して、磁気的な特性の研究を行った。いずれの物質も、100K程度の反強磁性相互作用をもつが、10K程度まで磁気秩序を示さず、スピンフラストレーションが大きく働いている。また、その多くにおいて磁場誘起相転移を観測し、反強磁性的に結合しているパイロクロア格子において磁場誘起転移が普遍的に存在することが明らかになった。当該年度には、カドミウム系のパイロクロア弗化物の合成条件を確立し、その基本的な物性の測定を行った。それにより、スピンフラストレーションの効果の検証を行い、また一部の物質については磁気転移を発見した。まず、純良な試料の作成を目指して合成条件を調べた結果、カドミウムイオンが遷移金属イオンサイトの一部を置換していることが判明した。この事実に基づいて、様々な組成の試料の合成を行い、遷移元素の種類によって多少異なるものの、最低でも10%程度置換が起こることが明らかになった。そのさまざまな置換量の物質の基本的な物性の測定によって、置換量が少ない試料では、10K程度以下で磁気秩序が形成されるが、置換量の増加に伴って磁気秩序の形成が抑制されることが分かった。そして、低温での磁気エントロピーの放出の仕方が、置換量に伴って変化することを明らかにした。また、最も置換量の少ない試料に関して、強磁場下での磁化測定を行い、鉄の化合物において、磁気転移を発見した。この磁気転移は、クロムスピネルで見られる磁化プラトー相への転移の振る舞いと酷似しており、同様の現象が起きていると予想される。当該年度には、水銀系のパイロクロア弗化物の合成条件を確立し、二つのコバルトの化合物について強磁場下で磁気転移を発見した。水銀系パイロクロア弗化物には、フッ素以外の陰イオンとしては酸素と硫黄の化合物があり、遷移金属としてはコバルトとニッケルの化合物に関して主に研究を行った。これらの化合物は、いずれもキュリーワイス温度が負で大きさは100K以上であるが、10K程度の低温において磁気秩序を示し、スピンフラストレーションの影響が強いことが明らかになった。さらに、コバルトについては酸素と硫黄の化合物はともに、強磁場下で磁気転移を示すことを発見した。これらの磁気転移は、磁化の値が全磁化の半分のところで起こっており、クロムスビネルで見られた磁化プラトー相への転移と関連すると考えられる。しかし、ニッケル系に関しては、反強磁性相互作用が強いため、磁化が半分未満のところまでしか測定できず、同様な磁気転移の有無に関しては検証できなかった。昨年度に発見したように、カドミウム系の鉄のパイロクロア弗化物力桐様の磁気転移を示すととを考え合わせると、クロム、鉄、コバルトのパイロクロア格子において磁気転移が観測されたことになる。本研究によって、半磁化プラトーは、磁性イオンの種類によらず、パイロクロア反強磁性体に一般的に現れる現象であることが示された。
高分子基複合材料の衝撃負荷下における層間せん断特性及び層間破壊じん性評価法の確立

本研究では、ホプキンソン棒法を使用して、複合材の衝撃層間せん断特性(層間せん断強度,破壊ひずみ,吸収エネルギ)及びモードII衝撃層間破壊じん性(衝撃荷重下でのき裂による層間強度低下に対する抵抗の程度)を評価する。また、衝撃試験の時と同じ形状をもつ試験片を使用して、市販の万能試験機により静的試験を行なう。以上の結果から、層間せん断特性と層間破壊じん性に及ぼす負荷速度の影響を明らかにすることで、様々な衝撃負荷に対する複合材構造物の安全設計に対する有用な設計指針を与えることが期待される。
肢芽の位置価に対応した細胞接着の分子機構に関する研究

肢芽での位置価は進行帯細胞のホメオボックス遺伝子の発現パターンとして表され、これに基づいて分岐分節した軟骨パターンが作られると考えられる。このホメオボックス遺伝子と軟骨パターンの間に介在する因子として細胞接着分子が予想された。本研究で、我々はニワトリ肢芽の部域特異的あるいは発生段階特異的な接着性の差を、培養した間充織細胞の選別実験によって見いだした。さらにこの細胞選別は間充織凝集以前に起こり、培養基質との接着とは独立であることを示した。さらに位置価の異なる細胞群同士を並置した場合は、境界線上の細胞は軟骨分化をせずに繊維性結合組織に分化し、細胞表面分子の違いが、軟骨の分岐分節に作用することを示唆した。この細胞選別に関連した細胞表面の接着分子を明らかにするために、遺伝子からのアプローチと抗原タンパクからのアプローチを行った。RT-PCRによって肢芽で発現しているカドヘリン遺伝子をスクリーニングした結果、12種のカドヘリンスーパーファミリーを含む遺伝子を得た。肢芽での発現を調べると、N-カドヘリンは発生後期の肢芽先端部に発現がみられ、選別との関係が示唆された。またL-CAMはAERで特異的に強い発現がみられた。また新規なカドヘリンとしてプロトカドヘリン2が得られた。これはヒトのプロトカドヘリンPcdh2に対応し、発現は肢芽発生初期には肢芽先端部、後期には肢芽前端部で強く細胞選別との関係が示唆された。抗原タンパクからのアプローチとして、細胞選別を阻害するモノクローナル抗体の単離を行った。培養したstage25肢芽進行帯細胞を抗原として、モノクローナル抗体を作成した結果、stage25肢芽の間充織で強く発現し、stage20進行帯細胞とstage25進行帯細胞の選別を阻害する抗体が1クローン得られた。今後、これらの分子の解析を進めることによって、四肢のパターン形成の分子機構の研究のみならず、間充織細胞の位置依存的な接着機構の解析が大きく進ものと思われる。四肢のパターン形成は中胚葉性の細胞集団のどの部分が軟骨に分化し、どの部分が繊維性結合組織に分化するかによって決まる。これが決められてゆく領域が進行帯で、この領域の細胞は、発生段階、位置に応じて分化方向を決める値、位置価を次々に指定されると考えられてきた。位置価の実体は不明であったが、ホメオボックス遺伝子群、特にHoxA,HoxDの発現状態が位置価と密接に関係するものと考えられている。しかしながらこれらの遺伝子の産物は細胞核内で働く転写制御因子であり、実際に肢芽内で起こっている調節等の細胞間相互作用から考えると、細胞表面の分子が位置価に関連して変わっており、これがホメオボックス遺伝子の制御の下にあると考えたほうが理解し易い。我々は鶏胚肢芽の異なった発生段階の進行帯細胞間の単層培養下での選別を見いだした。更に基部側の細胞についても選別現象を見いだし、若い進行帯の細胞は発生の進んだ肢芽の基部の細胞と選別されないことから、これらの細胞の表面分子が位置価に対応する可能性を示した。本年度は以下のことを明らかにした。1.この選別は基質との接着を介さない寒天上の培養でも細胞塊内で起こるので、細胞間物質によらず、細胞接着分子によることを明らかにした。

2.この選別はカルシウム依存であるが、これは基質との作用によるもので、上記の細胞間の作用のみで起こる選別はカルシウム非依存性であることを見いだした。3.繊維芽細胞増殖因子は選別を促進することを見いだした。4.肢芽のRNAからカドヘリンの共通配列を用いてPCR法で得た産物の塩基配列を調べ、プロトカドヘリンをひとつ得た。肢芽内でのRNAの分布を現在調べている。肢芽のパターン形成時の位置価に対応した肢芽中胚葉細胞の培養下での選別の機構を解析している。昨年度まで、2種類の細胞の片方を染色する方法を用いていたが、今回、PKH-26とPKH-2の2種類の蛍光色素を用いて、無染色を含めて3種類の細胞の混合培養を行い、3種類の細胞それぞれで、選別を行っている事を明らかにした。また異なった色素で細胞を区別した結果、stage25の細胞の方がstage20の細胞より集合性が高く、選別への寄与が高い事がわかった。また培養基質と肢芽細胞との作用を排除するため、agar上での培養を行い、stage25肢芽の前端部、後端部の細胞間でカルシウム依存性の選別を見いだした。これらの細胞については、同程度の集合性が認められた。これらの選別を行っている分子を明らかにするため、肢芽でのカドヘリン遺伝子の発現をPCR法で調べた。その結果、新規のプロトカドヘリン遺伝子2種を見いだした。これらのプロトカドヘリン及び既知のカドヘリン遺伝子の発現をwhole mount in situ hybridizationで調べた結果、基部-先端部軸方向、および前後軸方向について発現パターンの差異がみられ、これらの接着分子が選別に関与している可能性が強く示唆された。またL-CAM(E-カドヘリン)遺伝子の発現は、表皮部全体ではなく、AERに局在しており、AERのマーカーとして使用できる事が示された。1)RT-PCR法により肢芽で発現しているカドヘリン遺伝子をスクリーニングした。その結果、既知のカドヘリンの遺伝子以外にプロトカドヘリンを含む12種のカドヘリンスーパーファミリーの遺伝子を得た。これらの発現を調べると、N-カドヘリンは発生後期の肢芽先端部に発現がみられ、選別との関係が示唆された。L-CAMはAERで特異的に強い発現がみられた。またプロトカドヘリン2はヒトのプロトカドヘリンPcdh2に対応する配列をもち、発現は肢芽発生初期には肢芽先端部、後期には肢芽前端部で強く、細胞選別との関係が示唆された。2)18時間培養したstage25肢芽進行帯細胞を抗原として得たひとつのモノクローナル抗体は、stage20よりstage25肢芽の間充織を強く認識し、stage20進行帯細胞とstage25進行帯細胞の選別を阻害した。肢芽では軟骨形成とともに発現は消えたが、脊索、体節等にも強い発現が見られた。培養された肢芽細胞上では、抗体は細胞表面に結合していることが観察された。対応する抗原は発生段階に依存した細胞表面の差に対応した接着分子のひとつと考えられる。3)stage20の進行帯細胞とstage25の進行帯細胞を混合すると独自のクラスターを作り、その中でそれぞれ軟骨分化し、クラスターの境界面では軟骨分化をしない。この性質とin vivoでの軟骨の分岐分節パターンとの関係を明らかにするため、stage20の進行帯細胞群とstage25の進行帯細胞群を15ミクロン離して並置培養する方法を考案した。
新規遺伝子増幅法による簡便・迅速な疥癬診断法の臨床応用と薬剤耐性虫の同定

疥癬は、その診断の難しさや感染力の強さから、最前線の皮膚科医にとって、常に忘れてならない皮膚疾患となっている。本研究の目的は、簡便・迅速で多くの検体を処理できる画期的な検査法の臨床応用である。1)ヒゼンダニ特異的プライマーの作成、DNAとLoop-Mediated Isothermal Amplification(LAMP)法の条件の設定。2)検体の採取:虫体、虫卵、排泄物などの検体から、PCRとLAPM法で増幅を行った。3)患者での応用:鏡検とLAMP法で検討した。4)病棟での検査:疥癬の流行があった病棟で、体幹に散発する掻痒の強い小丘疹を有する患者から検体を採取し、検討した。本研究の目的は、簡便・迅速で多くの検体を処理できる画期的な検査法の臨床応用、ならびに今後問題となる薬剤耐性虫の同定である1)ヒゼンダニ特異的プライマーの作成、DNAとLoop-Mediated Isothermal Amplification(LAMP)法の条件の設定:我々はすでにヒゼンダニDNA塩基配列からPCRを行いある程度プライマーに適したDNA配列を決定していたので、その部位を基本としてLAMP法に適した種々のプライマーを作成し、得られたPCR産物をクローニングしてシークエンスを行いDNAの配列を確認、種々の温度にて反応を検討した。2)適切な検体の採取法:虫体、虫卵、排泄物などの検体から、PCRとLAPM法で増幅をおこなった。また、どの程度で陽性になるか、寝具などのゴミから検査を行うことも検討した。3)患者での実際の応用:実際に疥癬が流行している施設において、倫理委員会での同意を得て、鏡検とLAMP法の感度や特異度の相違を検討した。また、実際に検体採取から診断までの時間を測定した。さらに、鏡検で虫体が消失後もLAMP法が陽性になるか検討した。4)通常の病棟での検査:疥癬の流行があった病棟で、倫理委員会での同意のもと、臨床症状を有する患者・医師・看護師から検体を採取し、検討した。また疥癬の集団発生のおこっていない老人を主体とする病院やベットを共用する人工透析病院で体幹に散発する掻痒の強い小丘疹を有する患者で鏡検を行い、潜在する患者がどのくらいいるのか調査した。本研究の目的は、簡便・迅速で多くの検体を処理できる画期的な検査法の臨床応用、ならびに今後問題となる薬剤耐性虫の同定である。1)ヒゼンダニ特異的プライマーの作成、DNAとLAMP法の条件の設定:我々はすでにヒゼンダニDNA塩基配列からPCRを行いある程度プライマーに適したDNA配列を決定しているので、その部位を基本としてLAMP法に適した種々のプライマーを作成し、得られたPCR産物をクローニングしてシークエンスを行いDNAの配列を確認、また、種々の温度反応を検討した。2)適切な検体の採取:虫体、虫卵、排泄物などの検体から、PCRとLAPM法で増幅をおこなう。増幅産物をゲルに流して確認した。さらにサイバーグリーンや比色で定量する。また、どの程度で陽性になるか、最小量も決定し、寝具などのゴミから検査を行うことも検討した。LAMP法のトリックは、通常のPCRで使用するプライマー1に加え、DNA増幅で末端まで伸びたDNA鎖を継続して新しい鎖の増幅を可能にするプライマー2、3を使用する点にある。従って通常のプライマー2本と反応継続用プライマーが2本で、計4本必要になるが、反応の特異性が上がり、94°CでのDNAの変性も必要がない。また増幅されるDNAは鎖のように長くなるが、増幅反応は迅速になる。従来の疥癬の診断に用いるPCR法は、3段階の温度で、3時間かかることと比較すると、画期的な進歩である。ヒゼンダニDNAを効率よく増幅できるプライマーを決定し、LAMP法も、アトピー性皮膚炎での単純へルぺスウイルスの診断に応用し非常に有用であった患者での実際の応用:実際に疥癬が流行している施設において、倫理委員会での同意を取る。実際に疥癬の流行している病棟で、鏡検とLAMP法の感度や特異度の相違を決定する。また、実際に検体採取から診断までの時間などを測定する。さらに、虫体が消失してから、どのくらいLAMP法が陽性になるかも検討する。

通常の病棟での検査:対象とする、疥癬の流行がよくみられる施設の、倫理委員会での同意を取る。疥癬の集団発生のおこっていない老人を主体とする病棟で、すべての患者や患者の寝具から検体を採取する。LAMP法を行い、潜在する患者がどのくらいいるのかも調査してみる。イベルメクチン耐性ヒゼンダニの同定:対象とする、疥癬のよく流行がみられる施設の倫理委員会での同意を取る。疥癬が集団発生している病棟を、定期的にスクリーニングすることで、イベルメクチンの効果がない患者、イベルメクチンが長期に投与されている患者、再発を繰り返す患者などに注意して、LAMP法で調査する。それらから得られたヒゼンダニを国立感染症研究所などに相談し、イベルメクチン耐性の有無を依頼する。研究費の多くは、消耗品の購入や実験補助への人件費に使用される。遺伝子工学用酵素類・キットの項目には、PCRやLAMP法などのによる遺伝子増幅用のキットが含まれる。また、本研究では、数多くのプライマーの作成が必要となる。その他、ガラス・プラスチック器具と一般試薬も、今回の研究費には必須である。
制御信号系列によって多機能性を実現する分子計算システムの理論とその設計基盤の構築

本研究は,従来のDNAコンピュータがベースとしているDNA配列に情報処理機能をプログラミングするというアプローチから転換して,光照射や温度変化のような環境因子の変化系列(制御信号系列と呼ぶことにする)に個々の情報処理機能をプログラミングことにより,外部からの信号で多機能性を実現する汎用的なDNAコンピュータを設計する枠組みを提案することを目的とする.この目的の達成のため,外部信号によって制御される分子コンピュータの計算理論と,そこで得られる指針に基づいた設計基盤を構築する.これにより,DNAコンピュータの設計に新たな潮流を生み出す.本研究は,従来のDNAコンピュータがベースとしているDNA配列に情報処理機能をプログラミングするというアプローチから転換して,光照射や温度変化のような環境因子の変化系列(制御信号系列と呼ぶことにする)に個々の情報処理機能をプログラミングことにより,外部からの信号で多機能性を実現する汎用的なDNAコンピュータを設計する枠組みを提案することを目的とする.この目的の達成のため,外部信号によって制御される分子コンピュータの計算理論と,そこで得られる指針に基づいた設計基盤を構築する.これにより,DNAコンピュータの設計に新たな潮流を生み出す.
繊維状接着構造形成におけるビネキシンファミリータンパク質の機能解析

これまでに、接着斑に局在すると考えられていたアダプター型の接着領域裏打ちタンパク質であるビネキシンが特定の条件下で繊維状接着構造に局在することを見出している。そこで、接着斑と繊維状接着構造形成の決定にアダプター型の接着領域裏打ちタンパク質がどのように関与しているのかを検討している。平成23年度は昨年度に作製したビネキシンとCAPの両方の遺伝子を破壊したダブルノックアウト細胞を用いて、さらにArgBP2の発現も抑制した細胞を作製するために、ArgBPに対するshRNAプラスミドの作製を行った。また、市販されている抗ArgBP2抗体はいずれも正しくArgBP2を認識できなかったため、平成23年度は抗ArgBP2抗体の作製に取り組んだ。作製した抗ArgBP2抗体はタグ付きのArgBP2を細胞に導入することで、正しくArgBP2を認識していることを確認した。これにより、ビネキシンファミリータンパク質を解析するための実験系を構築することに成功した。また、昨年までにビネキシン結合性アダプタータンパク質Dlg5は、TGF-βシグナル経路のうちTGF-β受容体からSmad2/3ではなくp38、JNKへのシグナルを抑制することで細胞の上皮間葉転換を抑制していることを明らかにしてきた。Dlg5の発現を抑制したところE-cadherinの転写調節因子であるSnailの発現量が増加することが分かった。このことから、Dlg5の発現抑制はJNK、p38を活性化し、Snailの発現量を調節することでE-cadherinの発現量を制御している可能性が考えられる。さらにJNK、p38の上流にあるTGF-β受容体の阻害剤で細胞を処理したところ、Dlg5の発現抑制によって誘導される上皮間葉転換が抑えられた。このことから、Dlg5の発現抑制による上皮間葉転換はTGF-β受容体を介したものであることが明らかになった。また293T細胞を用いた共免疫沈降を行ったところ、Dlg5はTGF-βI型受容体と結合することが分かった。以上のことから、Dlg5はTGF-βI型受容体と結合することでTGF-βシグナルを抑え、上皮間葉転換を抑制している可能性が考えられる。ビネキシンはビネキシンファミリーを形成し、類縁のタンパク質としてCAPとArgBP2が存在する。平成21年度はビネキシンファミリー間での機能の違いを明らかにするために、ビネキシンファミリータンパク質のクローニングを行った。その結果、新規バリアントを含む2種類のCAPとArgBP2のクローニングに成功した。これらのビネキシンファミリータンパク質を線維芽細胞に発現させ、免疫染色でその局在を確認したところ、ビネキシンは接着斑に、CAPは接着斑及び繊維状接着構造に、ArgBP2はアクチンストレス繊維上に主に局在していることが分かった。また、ブタ近位尿細管由来のLLc-PK1細胞をTGF-βで処理するとフィブロネクチンとSMAの発現量上昇と、E-cadherinの発現量低下がみられ、上皮間葉転換が引き起こされることを見出した。この時ビネキシンとビネキシン結合タンパク質Dlg5の発現量も低下することも見出した。そこで平成21年度はDlg5が関与する上皮間葉転換の制御メカニズムについても解析を進めた。その結果Dlg5がTGF-β受容体からJNKへのシグナルを抑制することで、E-cadherinやフィプロネクチン、.SMAの発現量を調節し、上皮間葉転換を抑制する働きを持っていることを明らかにした。平成22年度はビネキシンが接着斑形成に与える影響を検討するために、ビネキシンノックアウト細胞と、ビネキシンノックアウト細胞にビネキシンを再発現させたビネキシン誘導細胞を用いて、接着斑の数と大きさを比較した。その結果、ビネキシン誘導細胞ではビネキシンノックアウト細胞と比較して、接着斑の数が増加していることが分かった。また、ビネキシン結合性アダプタータンパク質Dlg5はTGF-β受容体からp38、JNKへのシグナルを抑制することで細胞の上皮間葉転換を抑制していることを明らかにしてきた。TGF-β経路は細胞骨格の形成やコラーゲン繊維の形成を促進すると考えられているシグナル経路である。TGF-βシグナル経路はTGF-β受容体の局在によってシグナルの流れ方が異なることが報告されていることから、平成22年度はDlg5がTGF-β受容体の細胞内局在に与える影響について検討した。その結果、ビネキシン結合性タンパク質Dlg5の発現を抑制しても、TGF-β受容体の細胞膜表面と細胞質内の局在比に大きな影響を与えないことが分かった。また、Dlg5の発現を抑制してもTGF-β受容体のラフト、ノンラフトへの局在に大きな影響を与えないことが分かった。

このことから、Dlg5はTGF-β受容体の細胞内局在を制御するのではなくTGF-β受容体の発現量などを調節することで、TGF-βシグナルを制御している可能性が考えられる。これまでに、接着斑に局在すると考えられていたアダプター型の接着領域裏打ちタンパク質であるビネキシンが特定の条件下で繊維状接着構造に局在することを見出している。そこで、接着斑と繊維状接着構造形成の決定にアダプター型の接着領域裏打ちタンパク質がどのように関与しているのかを検討している。平成23年度は昨年度に作製したビネキシンとCAPの両方の遺伝子を破壊したダブルノックアウト細胞を用いて、さらにArgBP2の発現も抑制した細胞を作製するために、ArgBPに対するshRNAプラスミドの作製を行った。また、市販されている抗ArgBP2抗体はいずれも正しくArgBP2を認識できなかったため、平成23年度は抗ArgBP2抗体の作製に取り組んだ。作製した抗ArgBP2抗体はタグ付きのArgBP2を細胞に導入することで、正しくArgBP2を認識していることを確認した。これにより、ビネキシンファミリータンパク質を解析するための実験系を構築することに成功した。また、昨年までにビネキシン結合性アダプタータンパク質Dlg5は、TGF-βシグナル経路のうちTGF-β受容体からSmad2/3ではなくp38、JNKへのシグナルを抑制することで細胞の上皮間葉転換を抑制していることを明らかにしてきた。Dlg5の発現を抑制したところE-cadherinの転写調節因子であるSnailの発現量が増加することが分かった。このことから、Dlg5の発現抑制はJNK、p38を活性化し、Snailの発現量を調節することでE-cadherinの発現量を制御している可能性が考えられる。さらにJNK、p38の上流にあるTGF-β受容体の阻害剤で細胞を処理したところ、Dlg5の発現抑制によって誘導される上皮間葉転換が抑えられた。このことから、Dlg5の発現抑制による上皮間葉転換はTGF-β受容体を介したものであることが明らかになった。また293T細胞を用いた共免疫沈降を行ったところ、Dlg5はTGF-βI型受容体と結合することが分かった。以上のことから、Dlg5はTGF-βI型受容体と結合することでTGF-βシグナルを抑え、上皮間葉転換を抑制している可能性が考えられる。
DNA付加体1分子による遺伝子変異解析系の構築と閾値の存在の検証

低用量暴露の影響を解析するために,低用量域へ外挿する用量依存的な相関性を調べる古くからの手法に関して,我々は限界があると考えている。そこで,我々は低用量暴露のモデルとして,ヒトリンパ芽球細胞株TSCER122(TK6由来)のチミジンキナーゼ遺伝子のエキソン5内にDNA付加体1分子を導入し,簡易に遺伝子変異誘発頻度を解析できる実験系を確立した。その結果,付加体が1分子でもDNA上に形成すれば遺伝子変異が起きることを明らかにした。これは遺伝毒性発がん物質には閾値が無いという従来からのリスク評価法をサポートしている。しかしながら,この実験系は,DNA修復機能が正しく働いていないなどの不明な点が多く,データの蓄積がさらに必要である。すなわち,閾値の存在を確認するには, DNA修復遺伝子を改変させた細胞株を用いて,付加体1分子が起こす遺伝子変異誘発機構をさらに研究する必要がある。本研究の目的は,DNA付加体1分子で起こるチミジンキナーゼ(TK)遺伝子変異を簡易に検出できる復帰突然変異解析系を構築することである。そして,遺伝毒性発癌物質の低用量域における閾値の形成機構を最終的に明らかにすることを目標とする。本解析系においてターゲティングベクターを細胞に形質転換する際に,その導入効率が毎回異なる可能性がある問題に関して,緑色蛍光タンパク質の発現ベクターを導入し,蛍光を発する細胞をカウントすることにより形質転換ごとの違いを補正できることを確認した。次に,一塩基置換でTK遺伝子が変異する既知の自然突然変異スペクトラムデータをもとに,エキソン5内の2カ所の塩基部位(a)(b)について,それぞれ陽性および陰性を示すコントロールターゲティングベクターを作製し,どちらの部位がよりTK遺伝子が変異しやすいかを比較した。その結果,塩基部位(a)および(b)の各陽性ベクター導入時のTK遺伝子変異頻度は,陰性ベクターのそれよりも7倍および15倍それぞれ高かった。よって,塩基部位(b)の方がTK遺伝子を変異させるのに適していることが分かった。次年度は,その部位にDNA付加体を1分子含むターゲティングベクターを導入させ,ターゲティングミュータジェネシスによる復帰突然変異解析系を確立する予定である。研究代表者は,DNA付加体8-オキソグアニン1分子をヒトTK6細胞のチミジンキナーゼ(TK)遺伝子のイントロン4に部位特異的にインテグレートさせることに成功し,Targeted Mutagenesisという新しい手法を確立した。そのゲノム上の8-オキソグアニンの運命を定量的に解析し,突然変異を起こしやすい部位とそうでない部位の存在を確認した。予備実験として,さらにエキソン5内にもそれを導入したが,類似の結果が出始めている。そこでエキソン内で突然変異を起こしやすい塩基部位を見つけ出し,わずかDNA付加体1分子で起こるTK遺伝子変異の解析系を構築することを目的とし,最終的には,遺伝毒性発癌物質の低用量域における閾値の有無の検証および形成機構を明らかにすることを目標とする。これまでに,8-オキソグアニンだけでなく,1,N6-エセノアデニンDNA付加体もTK遺伝子のイントロン4とエキソン5の特定部位に導入して解析した。8-オキソグアニンを導入した解析結果と比較したところ,やはり1,N6-エセノアデニンについても,突然変異を起こしやすい部位とそうでない部位の存在を確認することができた。しかしながら,8-オキソグアニンおよび1,N6-エセノアデニンDNA付加体は,TK6細胞内ではミューテーション頻度がわずか数十%程度であり,前述の新しい現象の証明としては未だ不足していると考えられる。よって,次年度はさらなる再現性の確認と本現象の信憑性について調べる予定である。化学物質や放射線の低用量(低線量)域における微弱な影響シグナルは,他の要因による影響に埋没し区別できないこと,そして測定系の検出限界以下の場合がよくあること等から,我々は低濃度から用量依存的に暴露させるこれまでの実験手法に限界があると考え,DNA損傷1分子をゲノムに導入することで低用量暴露を模擬する実験系を確立した。それは,ヒトリンパ芽球細胞TK6由来のTSCER122細胞株のチミジンキナーゼ遺伝子内にDNA付加体1分子を導入し,その部位周辺で起こる突然変異誘発頻度とスペクトラムを詳細に解析することができる。これまでにチミジンキナーゼ遺伝子のイントロン4およびエキソン5のある塩基部位に,8-オキソ-7,8-ジヒドロ-2'-デオキシグアノシン(8-OxodG),1,N6-エセノ-

2'-デオキシアデノシン(εdA),そして2'-デオキシキサントシン(dX)付加体を導入し解析した結果,わずか1分子であっても,それらの付加体は主に一塩基変異(8-OxodGはG:C→T:A(5.6%),εdAはA:T→G:C(7.6%),dXはG:C→A:T(20.5%))を誘発することが分かった。これは,極めて低い用量であっても,付加体がDNA上に形成すれば突然変異を誘発すること(そして発がんに至る可能性を持つ)を示しており,遺伝毒性発がん物質には閾値が無いという従来からのリスク評価法をサポートしている。しかしながら,ここで使用された実験系は,DNA修復機能が正しく働いていないなど,本知見に関してはまだまだデータの蓄積が必要である。すなわち,閾値の存在(付加体が100%修復されなければならない)を確認するためには,関連するDNA修復遺伝子を改変させたTSCER122細胞株を用いて,付加体1分子が起こす遺伝子変異誘発機構を詳細に研究する必要がある。当初の研究計画通りに進行できているため。24年度が最終年度であるため、記入しない。突然変異を起こしやすい部位とそうでない部位の存在を再度確認するために,8-オキソグアニンおよび1,N6-エセノアデニンよりも高いミューテーション頻度を示すDNA付加体を探さなくてはならない。しかしながら,市販で利用できるDNA付加体が限られている中,それを探しだし,それを含むDNAオリゴマーの合成を行うことが困難な点であると言える。第一候補としては,キサンチンDM付加体である。これは8-オキソグアニンよりも高頻度にミューテーションを誘発させるDNA付加体であり,研究代表者は以前にキサンチンを含むDNAオリゴマーを合成した経験があるため実施できると考えている。
ヒト味覚受容体遺伝子の遺伝的多型による味覚感受性の個人差及び味覚障害の解析

味覚の感受性はヒトにより大きな個人差がある。どの様なメカニズムで、個人個人において味覚の感受性に、差が生じるかは未だ不明な点が多い。我々は、味覚受容体遺伝子の塩基配列の解析結果から、4種類の苦味受容体遺伝子においてそれぞれアミノ酸配列に変異を伴う遺伝的多型が存在することを発見した。このことは味覚受容体蛋白の構造が個人によって異なることを意味していると同時に、個人の味覚受容体のアミノ酸配列が異なるのが原因で味を呈する物質に対する感受性や選択性が個人で異なる可能性を示唆している。この遺伝的多型が存在する4種類の苦味受容体の機能を調べるため、まず最初にガストデューシンとGα16のキメラGタンパク質を作成し、カルシウムイメージング法を用いてそれぞれの苦味受容体cDNAをHEK細胞に強制発現し検討し、特定のリガンドを検索した。この結果、サリシンに応答を示すhT2R16の機能解析に成功した。今回の我々の遺伝子の解析で、hT2R16はcoding SNPを有し、172番目のアミノ酸残基が、アスパラギンとリジンのものが存在することが分かつたので、この両者のhT2R16cDNAをHEK細胞に強制発現させて、リガンドの応答性を詳しく検索した。hT2R16の172番目のアミノ酸残基がリジンのものとアスパラギンのものとでは、サリシンに対する応答性にはほとんど差は見られなかった。またhT2Rl6のcodingSNPを有する被検者の苦味物質に対する感受性を調べたが、このSNPに関しても大きな差は認められなかった。今後このシステムを使って我々が確認したcSNPを有するhT2R4やhT2R5についても同様の方法で解析し、味覚受容体遺伝子と味覚感受性の個人差との関係を明らかにしていく。我々は以前にヒト味覚受容体をコードしている遺伝子の中で3種類の遺伝子群hT2R3、hT2R4、hT2R5にアミノ酸変異を伴う遺伝子多型が存在することを示したが、さらにヒト味覚受容体遺伝子hT2R16にも多様性が存在することを明らかにした。この味覚受容体遺伝子hT2R16はそのままでは機能解析を行うことが大変困難だった。その解決法として、ウシの視覚受容体(オプシン)のN末端のアミノ酸をhT2R16のN末端に付加し(ウシオプシンのN末端は細胞膜への強力な移行シグナルを含むため)、味蕾特異的なG蛋白のgustducin(hT2R16と共役するG蛋白)とGα15/16(PI turnoverセカンドメッセンジャー系にシグナルを伝達)のキメラG蛋白を発現させたHEK培養細胞に、その改変型hT2R16を強制発現させ、細胞内カルシウムイメージング法を用いて機能解析を行うことに成功した。その結果、ヒトhT2R16はアミノ酸変異を伴う多様性を持ちながらもサリシンに全てタイプが応答した。サリシンは鎮痛、解熱作用を有する薬草の成分で苦味を呈する物質である。また、味覚受容体遺伝子が味蕾特異的なG蛋白のgustducinと共役する際にどの部位が結合部位となるかを明らかにするために、G16とgustducinのキメラG蛋白を作成し、カルシウムイメージング法を用いてgustducinの構造の中でも味覚受容体遺伝子との結合に重要な部位を絞り込んだ。その結果、gustducinのC末端に味覚受容体と共役するための必修な部位が見つかった。ヒトの苦味受容体であるT2Rファミリーの遺伝子を解析し、多様なcoding single-nucleotide polymorphysms(cSNPs)が存在することを明らかにした。例えばhT2R4は4カ所のアミノ酸残基において変異(F7S, T74M, V96F, S171N)があることが分かった。

味覚受容体遺伝子のこの様なDNAレベルでの個人差が、生理学的に知られているヒトでの味覚の個人差と、どの様な相関関係にあるのかは、興味深いところであるが、実際にT2R遺伝子の機能を解析するには困難な点が多く、約40種類有るT2R遺伝子ファミリーの中でもリガンドが同定されているものはわずかなクローンにしかすぎない。そこで、我々はT2R味覚受容体の機能をより詳しく解析するために、T2Rがどの様な種類のG蛋白と共役可能か、またG蛋白のどの部位がT2R受容体と結合するのに必要かを、キメラG蛋白を作成し解析した。gustducinとGα16によるキメラG蛋白を作成し、mT2R5やhT2R16苦味受容体と共役させることによりカルシウムイメージングにより機能解析を行ったところ、T2R苦味受容体との共役にはgustducinのβ6sheets、α5helix、extreme C terminusが必須で有ることを明らかにした。また、未来に発現しているG蛋白の中でも、gustducin、Gαi2とcone-transducin(Gαt2)がT2Rと共役できることが分かった。我々はヒト苦味受容体であるT2R遺伝子ファミリーに多様なcoding single-nucleotide polymorphysms (cSNPs)が存在することを明らかにした。苦味受容体遺伝子にはこの様なDNAレベルでの多様な個人差が存在するが、実際にヒトの味覚に対する感受性の個人差と、これらのT2R遺伝子の変異との間の相関関係を明らかにしていくためには、約40種類存在するT2R遺伝子ファミリーのリガンドを同定することが急務である。しかし、G蛋白共役型味覚受容体は、G蛋白やセカンドメッセンジャー等との適切な共役が難しく、培養細胞発現系を用いたin vitroでの受容体の機能解析は多くの研究グループが取り組んでいるにもかかわらず長年困難を要してきた。そこで、我々はまず、T2R受容体がどの様な種類のG蛋白と共役可能かをキメラG蛋白を用いて解析した。キメラG蛋白はPCR法を用いて様々なG蛋白間での組み換え蛋白を作成した。苦味受容体としてはmT2R5とhT2R16を用いて、それぞれのリガンドであるサイクロヘキサミドとサリシンに対する応答性を解析したところ、gustducin、transducin、Gαi2などのG蛋白と少なくともmT2R5とhT2R16は共役可能であることがわかった。また、G蛋白のC末端のβ6シート、α5ヘリックス、extreme C terminusが苦味受容体とG蛋白との共役に重要な部位であることがわかった。ヒトの味覚には大きな個人差が存在するが、どの様なメカニズムで、個人個人において味覚の感受性に、差が生じるかは未だ不明な点が多い。我々は、味覚受容体遺伝子の塩基配列の解析結果から、4種類の苦味受容体遺伝子においてそれぞれアミノ酸配列に変異を伴う遺伝的多型が存在することを発見した。このことは味覚受容体蛋白の構造が個人によって異なることを意味していると同時に、個人の味覚受容体のアミノ酸配列が異なるのが原因で味を呈する物質に対する感受性や選択性が個人で異なる可能性を示唆している。この遺伝的多型が存在する4種類の苦味受容体の機能を調べるため、まず最初にガストデューシンとGα16のキメラGタンパク質を作成し、カルシウムイメージング法を用いてそれぞれの苦味受容体cDNAをHEK細胞に強制発現し検討し、特定のリガンドを検索した。
ハイウエイ系ノンポイント汚濁負荷の流出挙動に関する調査研究

調査汚濁物流出の実態調査結果から以下の知見を得た。1.降雨時流出負荷量が年間総流出負荷量に占める比率は22.463.4%と大きく、しかもその75.792.3%が49月の半年間に集中している。両河川とも、1回の降雨量が100mm以上となる大降雨において、生起確率が低いにも関わらず、年間流出負荷量の19.852.3%が流出しており、汚濁物流出の集中性が示された。他方、T-N, T-Pは、同10mm未満の小降雨についても年間流出負荷量の13.326.5%が流出しており、比較的頻繁に起こるこうした小さな降雨においても一定の流出負荷量があることが示さた。次いで、調査結果を用いて流出汚濁負荷量を巨視的に促えるモデルを構築し、これを用いた都市域中小河川および琵琶湖集水域を対象としたシュミレーション解析を行うことにより、以下の知見を得た。3.都市域中小河川では、流域からの総流出負荷量に占める市街地ノンポイント負荷量の比率が、下水道整備の進捗に伴いT-Nで10%程度,T-Pで2050%にまで増加し得る。4.琵琶湖集水域の下水道整備により、市街地ノンポイントソースからの流入負荷量が顕在化し、下水道整備が完了後の市街地ノンポイントソースの比率は、年間流入負荷量にしてT-Nが0.8%,T-Pが3.1%程度となる。今後さらに、ハイウエイ排水口からの流出水の直接測定やマクロモデルを用いた多様な時間スケールの解析を実施することにより、具体的な施設計画に反映させうる知見が得られるものと思われる。