hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
平均声道モデルに基づく声質の多様性の身体的基盤に関する研究

本研究では,話者の声質の多様性を生み出す身体的な基盤について,生体観測技術と数値音響解析技術を用いて検討を行い,以下の成果を得た.(1)発話運動の形態と動態を3次元MRI同期撮像法により計測し,対応する音声と組み合わせ,データベースを構築した.(2)このデータベースに基づいて発話器官のモデルを開発した.(3)声質への寄与が大きい鼻腔・副鼻腔の音響特性を解析した.(4)プロの物真似タレントの物真似発話時,および声優の発話時の声道形状を観測し,声質の多様性を生み出す原理を調査した.(5)磁気センサシステムのセンサを改良し発話への影響を軽減するセンサを開発した.このセンサは市販されている.本年度は,(1) 3次元MRIによる母音発話時の声道形状の計測,(2)音声における鼻腔音響特性の影響の調査,(3) 3次元MRIによる鼻腔形状の計測を行った.(1)では,まず発話時の声道形状計測に適したMRI撮像法の検討を行い,発声同期撮像法(被験者に母音を繰り返し発話させ,発話中のみ撮像することによって高品質のMRIデータを得る方法)を中心にデータ収集を行うこととした.ただし,MRI装置内で安定した発話を継続的に行うことができない被験者のことを想定し,MRIデータの画質は劣るものの極めて短時間で3次元撮像を行うことができる撮像法を併用することとした.以上2つの撮像法を用いて,女性6名,男性5名の日本語5母音発話時の3次元声道形状を計測し,これに対応する音声を収録した.音声の収録は,MRI装置の磁気の影響を受けない光マイクロフォンを利用した.得られたデータのうち,女性のデータは,音声からの声道長逆推定法のパラメータ調整に利用され,高精度の逆推定が可能なことを示すことができた.この成果は2014年度の国際会議にて発表される予定である.(2)では,音声のうち口腔を経由して口唇部から放射される成分と鼻腔を経由して鼻孔から放射される成分を分離して収録できる装置を入手し,男女約20名を対象とした計測を行った.従来の音声学の考え方では,鼻音やその前後でのみ鼻孔からの放射があると考えられてきたが,本研究では鼻音やその前後に限らず鼻孔からの放射があることを明らかにした.さらに,その成分は音声の個人性知覚(話者の識別)に有効な音響的特徴が多く含まれていることを示した.これらの成果は3月に国内で発表し,さらに2014年度に国際会議にて発表される予定である.(3)に関しては,分解能の高いMRI撮像法により複雑な鼻腔形状が計測できる目途をつけることができた.本年度は以下の成果が得られた.1.磁気センサシステムによる調音運動計測手法の確立:磁気センサシステム(NDI社Wave)のセンサが発話に及ぼす影響を軽減するため,純正品のワイヤを細く,柔軟性のあるものに交換した.その影響を評価する実験を実施し,有効性を確認した.また,口蓋形状を含む歯型とセンサを埋め込んだバイトプレートを用いて,再現性のある手法で調音空間を正確に計測する手法を開発した.これらの成果に関して日本音響学会研究発表会などで発表を行った.2015年度にはこの手法の講習会が開催されるほか,学会誌に解説記事が掲載される予定である.このように,本研究課題において開発された手法が,関連領域の研究にも利用される段階まで進んでいる.2.物真似発話時の調音運動観測:プロの物真似タレントを対象にしてMRIにより物真似発話時の調音運動の観測を行った.物真似タレントは,1名の発話器官で複数の話者の声質を生成できるという意味で音声の個人性にとって貴重な研究対象といえる.MRIデータを分析した結果,通常の発話の範囲を超えた喉頭位置の制御および舌形状の複雑な制御によって多様な声質を作り出していることが明らかになった.3.鼻腔音響特性のシミュレーションおよび計測:3次元CTデータから詳細な鼻腔形状を抽出し,時間領域差分法によるシミュレーションを試み,実行可能であるを確認した.また,外部音響励振法の装置を製作し,鼻腔音響特性を簡便に計測できることを確認した.その他,鼻腔音響特性の個人性知覚への影響,音声からの声道長の逆推定,声道音響特性の3次元シミュレーションと1次元シミュレーションの比較について国際会議にて成果発表を行った.(1)発話器官のモデリング:正中面の発話器官の形状から,その外側の形状を推定する手法を開発した.主成分分析を利用して,発話器官の形状を表すパラメーターの数を削減した上で,線形モデルによって正中面の形状から外側の形状を推定するものである.これにより,2次元のデータを収集するだけで,3次元の発話運動データを構築することができ,大幅な効率化が期待できる.(2)磁気センサシステムによる発話運動計測:磁気センサシステムにより発話運動の計測を行った.このシステムは,舌,口唇,顎などに小型のセンサを貼り付け,磁気を利用してその運動を計測するものである.昨年度はこのシステムのセンサの改良を行い,センサ装着による発話への影響を軽減させることに成功している.口蓋の3次元形状を計測して発話運動データと統合する手法を開発し,これを用いることによって,口蓋形状と舌運動の関係を示した.(3)鼻腔音響特性のシミュレーション:コーンビームCTデータから抽出した詳細な3次元鼻腔形状に基づいて鼻腔や副鼻腔の音響特性を計算した.CTデータからの鼻腔形状の抽出にあたっては,機械学習を利用して,再現性を向上させる手法を考案した.

シミュレーションは時間領域差分法(FDTD法)により実行した.この研究により,鼻腔や副鼻腔による音声スペクトルへの影響を調べる手法を確立できたので,今後対象者を増やして研究を進める.(4)音声の個人性の知覚要因:公開されている研究用音声データベース(ATR音声データベース)内の文音声を対象にして,聴取実験により,話者間の知覚的類似度を計測した.関東出身の男女各20名の音声を対象にして,のべ100名を超える被験者がその類似度を評価した.話者間の類似度を行列状に示した結果が得られ,学会誌等で公開した.今後,音声の個人性知覚に関する研究をするにあたっての重要な基礎データになると考えている.当初予定していたMRI-音声データベースの構築が遅れている.MRIデータを計測予定の機関に,来年度新たに高性能なMRI装置が導入される予定となったことから,その装置で撮像した方がより高品質なデータが得られると考えられたため,計測を延期しているものである.その他,代表者,分担者の体調不良の問題もあり,やや遅れた状態になっている.本研究は,音声-MRI(磁気共鳴画像法)データベースに基づき平均声道モデルを構築し,声質の多様性が発話器官のいかなる形態的特徴を反映したものかを明らかにすることを目的としている.4年目の2016年度は以下の成果が得られた.(1)鼻腔・副鼻腔の音響的特性の調査:2015年度より,音声の個人性への寄与が大きい部位として,鼻腔・副鼻腔に着目し,その音響特性の詳細な分析を行っている.コーンビームX線CTデータから鼻腔および副鼻腔領域を抽出し,その音響特性を時間領域差分法(FDTD法)に基づき解析した.一方で,3Dプリンタを用いて鼻腔・副鼻腔の実体模型を製作し,その音響特性を計測した.その結果,これらの結果がほぼ一致し,これらの手法が信頼性の高いものであることを示した.また,個々の副鼻腔の音響特性も調査し,従来の定説と異なる音響的役割を持つことを示した.なお,この調査は昭和大学との共同で実施した.(2)外鼻の音響的特性の調査:外鼻(顔から突き出したいわゆる鼻の部分)はサルには見られないヒトの形態的特徴である.この音響的役割を調査するため,FDTD法により,外鼻を除去した状態の音響特性を解析した.その結果,外鼻は2kHz付近の音響特性に影響を及ぼすことを明らかにした.(3)音声-MRIデータベースの構築:5名の男女を対象にして,連続発話時のMRI動画および音声データを収集した.MRI動画は複数断面を同期させたデータであり,この種類のデータを音声研究に応用した例はない.(4)声優のMRI観測:声優が多彩な声質を生み出すメカニズムを明らかにするため,3名の声優(女性)の発話時のMRI計測を行い,声質と声道形状の関係を調査した.その結果,喉頭の高さの変化およびそれに起因する声道形状の変形,鼻咽腔連結の程度に顕著な差異が現れることが明らかになった.鼻腔・副鼻腔の音響分析や声優のMRI観測が進むなど成果が出ているものの遅れが生じている.研究分担者1名が産前産後休業,育児休業のため本研究プロジェクトを離脱したことなどの影響である.特に,時間を要する音声-MRIデータベースのデータ収集,整備が遅れている.最終年度は以下の研究を行った.(1)発話器官モデルの検討:
自然の歴史化-環境芸術におけるnarrativeなもの-

境芸術は自然環境を主題にして成立してきた。しかしそこで扱われるのは、西洋哲学の伝統的な自然観ではもはや捉えきれない複雑な現代の自然環境である。未曾有の速度と規模で現在も進行している環境の悪化が示すことは、自然がもはや調和と秩序の中で循環する存在ではなく、死すべき運命の中に歴史を持つ人間と同じように、不可逆的な時間のうちに歴史を有する存在だということである。本研究は、英国の環境芸術の中に表現された現代の自然環境の考察を通じて、自然の歴史化と環境芸術におけるnarrativeなものを明らかにした。本研究では、英米の環境芸術について美学的に分析し記述し、とくにそれちが扱う風景の物語性と自然環境の歴史性を明らかにすることで、環境芸術の論理的基盤となる、現代の自然環境を捉えるための新しい環境美学を構築することを目的とする。従来の哲学の文脈で捉えられてきた「循環し永遠の生命を持つ自然」ではなく、自然環境の急速な悪化に伴い「死すべき存在」として捉えられなければならない自然の現在を、環境芸術を手がかりに美学的に考察する。平成22年度は、自然環境との関わりを最重要課題としている英国各地にある最新の環境芸術作品の実地野外調査を行った。調査にあたって、環境芸術研究の現状を最新の文献資料によって把握し、国内での予備調査の後に野外調査を実行した。環境芸術作品の調査を行った場所は、トネリコのドーム、ウッドゥン・ボールダー(北ウエールズ、グイネズ州)、ヨークシャー・スカルプチャー・パーク(イングランド、ヨークシャー州)、シープフォールズ・プロジェクト(スコットランド、ダンフリーズシャー州、イングランド、カンブリア州、同、ヨークシャー州、全46点)であり、平成22年9月7同9月24日にかけて実施した。作品の映像資料はデジタル・カメラにより記録収集し、これら英国の環境芸術作品の野外実地調査によって収集された資料をもとに、自然環境との関わりに重点を置いた環境芸術の個別の実証研究を行った。この成果は「自然の歴史化と環境芸術の物語性(1)-デイヴィッド・ナッシュ《木製の丸石》をめぐる考察-」『GEIBUN 005富山大学芸術文化学部紀要第5巻』(pp.106-112)に発表した。本研究では、英米の環境芸術について美学的に分析し記述し、とくにそれらが扱う風景の物語性と自然環境の歴史性を明らかにすることで、環境芸術の論理的基盤となる、現代の自然環境を捉えるための新しい環境美学を構築することを目的とする。平成23年度は、自然環境との関わりを最重要課題としている英国各地にある最新の環境芸術作品の実地野外調査を行った。環境芸術作品の調査を行った場所は、トネリコ・ドーム、ウッドゥン・ボールダー(北ウエールズ、グイネズ州)、ヨークシャー・スカルプチャー・パーク(イングランド、ヨークシャー州)、シープフォールズ・プロジェクト(スコットランド、ダンフリーズシャー州、イングランド、カンブリア州、同、ヨークシャー州、全46点)ならびにクレラー・ミュラー美術館(オランダ、オッテルロー)、ハンブルク美術館(ドイツ、ハンブルク)であり、平成23年8月10日9月2日にかけて実施した作品の映像資料はデジタル・カメラにより記録収集し、これら英国の環境芸術作品の野外実地調査によって収集された資料をもとに、自然環境との関わりに重点を置いた環境芸術の個別の実証研究を行った。この成果は平成24年3月16日に「自然の歴史化-環境芸術におけるnarrativeなもの-」という題で、東洋大学国際哲学研究センターで講演した。本研究では、英国の環境芸術について美学的に分析し記述し、とくにそれらが扱う風景の物語性と自然環境の歴史性を明らかにすることで、環境芸術の倫理的基盤となる、現代の自然環境を捉えるための新しい環境美学を構築することを目的とする。そのため従来の哲学の文脈で捉えられてきた、調和と秩序の中で循環する存在ではなく、死すべき運命の中に歴史を持つ人間と同じように、不可逆的な時間のうちに歴史を有する存在としての自然の現在を、環境芸術を手がかりにした美学的な考察を行った。最終年度に当たる本年度は、昨年度に引き続き、自然環境との関わりを最重要課題としている英国の最新の環境芸術作品の野外実地調査を行った。調査に当たって環境芸術研究の現状を最新の文献資料によって把握したのちに野外実地調査を実行した。

調査の実施場所は、ロンドン南西部にある英国王立植物園であるが、これは、研究対象である英国の環境芸術家、ディヴィッド・ナッシュが、植物園の敷地全体を使った大規模な環境芸術作品のインスタレーションを行ったためで、会期途中の展示替えを含めてすべての作品が調査できるように、夏期に集中して10日間の調査を行った。デジタル・カメラによってこれらの環境芸術作品を記録し、資料収集を行った。この野外実地調査によって得られた資料をもとに、環境芸術の個別の実証研究を行い、これを理論的に支える環境美学研究によって得られた成果を、「自然の歴史化と環境芸術の物語性ーデイヴィッド・ナッシュの《トネリコのドーム》と《木製の丸石》をめぐる考察ー」という題で美学会で発表した。ほかにも、「自然の歴史化ー英国の環境芸術におけるnarrativeなものー」(『国際哲学研究』第二号pp.113-125)および、「自然の歴史化と環境芸術の物語性(2)」(『GEIBUN007富山大学芸術文化学部紀要』pp.94-105)も本研究による成果である。英国各地にある最新の環境芸術作品の実地野外調査が順調に行われることによって、環境芸術の個別の実証研究が進んでいるので、その美学的な分析および記述を基に現代の自然環境を捉える環境美学の考察が可能になったと考えられるため。24年度が最終年度であるため、記入しない。今後は、3年間にわたる詳細な実地野外調査および分析による英国の環境芸術の実証研究とそれを支える環境美学の理論研究によって得られた研究成果を報告書にまとめる。
き裂の伝播挙動を支配する法則の解明(正弦波状き裂、らせん状き裂を例として)

本研究では、破壊現象を材料の切断・割断加工に応用するために、き裂の伝播径路を自由にコントロールできるよう、「き裂の伝播径路を支配する法則」を解明することを最終目的としている。今回はこの研究の一環として、古くから知られた、(I)一様に熱したガラス平板(円管)を冷水中に徐々に沈下させる際に生ずる正弦波状き裂(らせん状き裂)、(II)ガス輸送管が破壊する際に観察される正弦波状き裂に着目し、その伝播挙動を調べ、メカニズムを考究することを目的として実験および理論解析を行った。その結果、(I)については、沈下速度および加熱温度が大きい程正弦波状き裂の波長が短くなる等の知見を得た。また、熱応力解析の結果、き裂は水面下では水面に対して垂直に伝播しようとするが、水面よりも上では水面に平行な方向に曲がろうとする傾向があることが判明した。なお、今回使用したガラス円管は靭性が高く、らせん状き裂を発生させるには至らなかった。次に、(II)については、水槽中でガラス円管を水圧による内圧により破壊させる実験を行い、以下の知見を得た。1.ガラス円管でも正弦波状き裂が発生するのでその発生メカニズムには塑性変形は関与していない。2.き裂伝播速度が概ね100m/s以下のときのみ正弦波状き裂が発生し、200m/sを超える高速伝播の際は正弦波状に伝播しない。このことは正弦波状き裂の発生メカニズムには動的効果が関与していないことを物語る。3.試験片寸法、き裂伝播開始時の水圧等の値に関わらず、正弦波状き裂の波長、振幅はそれぞれ円管直径の約4倍、4割となっている。4.モードIII型せん断荷重によりき裂の伝播方向が円管の軸方向から傾く。また、連続分布転位法による弾性解析の結果、5.正弦波状き裂の発生要因として、き裂の干渉効果や多軸応力効果が重要であることが示唆された。本研究では、破壊現象を材料の切断・割断加工に応用するために、き裂の伝播径路を自由にコントロールできるよう、「き裂の伝播挙動を支配する法則」を解明することを最終目的としている。今回はこの研究の一環として、古くから知られた、(1)一様に熱したガラス平板を冷水中に徐々に沈下させる際に生ずる規則正しい正弦波状き裂、(2)ガス輸送管が破壊する際にしばしば生ずる正弦波状き裂、さらに、(3)一様に熱したガラス円管を冷水中にその軸方向に徐々に沈下させる際に生ずるらせん状き裂に着目し、その伝播挙動のメカニズムを考究することを目的とする。まず、(1)、(3)に関しては、ガラス板/円管を電気炉中で100300°C程度まで一様に熱した後に、冷水中に一定速度(速度は可変)で沈下させる装置を作製し、予備的な実験を行った。その結果、ガラスの加熱温度が200°C程度で沈下速度が非常に遅い場合に正弦波状き裂やらせん状き裂が発生することが多いことが判明した。

さらに、ガラス円管でらせん状き裂が発生するのは、その上部に耐熱樹脂栓を装着して冷水中に沈下させた場合に限られ、上部を開口した状態で冷水中に沈下させてもガラス平板の場合と同様な正弦波状き裂しか発生しないことが判明した。今後は、正弦波状き裂の波長・振幅・間隔・位相差、らせん状き裂のピッチ等と実験条件の関係を定量的に調べ、その発生メカニズムを解明する予定である。さらに、(2)に関しては、ガラス円管に水圧による内圧を作用させて破壊させる装置を製作し、数多くの実験を行った。さらに、今回購入したハイスピードカメラシステムを用いてき裂の伝播過程を撮影したところ、き裂速度が100m/s程度以下の場合のみに規則正しい正弦波状のき裂が発生し、き裂速度が大きい場合は不規則なき裂しか生じないことが判明した。このことは、従来から言われている「内圧によって円管に発生する正弦波状き裂は動的な影響によるものである」ということを否定するものである。今後は適切なモデル化によりこのような正弦波状き裂の伝播の数値シミュレーションを試みる予定である。本研究では、破壊現象を材料の切断・割断加工に応用するために、き裂の伝播径路を自由にコントロールできるよう、「き裂の伝播挙動を支配する法則」を解明することを最終目的としている。今回はこの研究の一環として、古くから知られた、(1)一様に熱したガラス平板を冷水中に徐々に沈下させる際に生ずる規則正しい正弦波状き裂、(2)ガス輸送管が破壊する際にしばしば生ずる正弦波状き裂、さらに、(3)一様に熱したガラス円管を冷水中にその軸方向に徐々に沈下させる際に生ずるらせん状き裂に着目し、その伝播挙動のメカニズムを考究することを目的とする。今年度は、(1)に関して、昨年度完成した実験装置を用い、加熱温度、沈下速度、ガラス平板の厚さ・サイズ等をいろいろと変化させて体系的実験を行った。その結果、沈下速度が大きいほど正弦波状き裂の波長が長くなること、加熱温度が小さいほど正弦波状き裂の波長が短くなること等の知見が得られた。また、き裂の存在を考えない熱応力解析を行った結果、水面下ではき裂が水面に対して垂直に伝播しようとすること、水面上ではき裂は水面に平行な方向に曲がろうとする傾向があることがわかり、正弦波状き裂発生のメカニズムがある程度明確になったが、来年度はき裂の存在をも考慮したより精確なき裂伝播のシュミレーションを試みる予定である。また、(2)に関しては、ガラス円管の径・肉厚、破壊時の水圧をいろいろと変えて体系的実験を行い、生ずる正弦波状き裂の波長、振幅がそれぞれ円管の外径の約4倍、0.4倍になっていることを見出した。さらに、正弦波状き裂の弾性解析を連続分布転位法により行い、エネルギ解放率を計算した。その結果、複数のき裂の干渉効果や多軸応力効果により正弦波状き裂が発生するのではないかと思われるが、これについてはより詳細な計算が必要である。今年度は(1)に関して平成14年度に購入したハイスピードカメラシステムを用い、生ずる正弦波状き裂の伝播速度を測定したところ、正弦波状き裂の節(き裂が水面にほぼ平行に伝播している部分)付近では伝播速度が比較的大きく、その後き裂の進展が一旦停まった後に、腹(き裂が水面にほぼ垂直に伝播している部分)付近では沈下速度とほぼ同じ速度で進むことが判明した。
サイトカインの細胞内情報伝達とTecチロシンキナーゼ

Tecキナーゼが具体的にどのような生理活性を担っているかを明らかにする目的で、Tecあるいは他の非受容体型チロシンキナーゼ発現プラスミドをマウスIL-3依存性細胞株BA/F3細胞に電気穿孔法にて導入した。またその際、レポータープラスミドとしてc-fos promoter/luciferaseを同時に導入し、各キナーゼによるプロモーター活性可を検討した。その結果Tecが非常に強くc-fos転写を誘導することが判った。さらに不活型Tecキナーゼを導入した場合は、サイトカインによるc-fos活性化をdominant negativeに抑制することも判りTecがサイトカインシグナルの中でc-fos転写調節を担っていることが明らかになった。次にTecの下流分子を同定する目的で、Tecのキナーゼドメインを"bait"としてyeast two hybridscreeningを行った結果、7種類のTec-Interacting Proteins(TIPs)が同定された。そのうちTIP-1はGrb10/GrbIRと呼ばれるアダプター分子であった。我々はGrb10/GrbIRがTecと細胞内で構成的に会合することを確認しただけでなく、TecによってGrb10/GrbIRが極めて強くチロシンリン酸化されることを明らかにした。さらにBA/F3細胞にGrb10/GrbIRを導入することでサイトカインによるc-fos活性化は抑制されることも明らかになった。したがってTecは細胞内でc-fos活性化機構をONにするだけでなくnegative feedback loopもスタートさせることが示された。
肥満の食リズム異常に関わる摂食促進ホルモン・グレリンの役割

本研究は摂食促進ホルモンのグレリンについて,高脂肪食により生じる食行動異常と肥満制御のメカニズムを明らかにすることを目的とし,高脂肪食下のエネルギー代謝障害におけるグレリンの関与,肥満制御機構に関わるグレリン・摂食リズムの役割,および肥満者の食行動異常と自律神経活動を解析した。本研究により,高脂肪食負荷によりグレリン日内リズムの位相にズレが生じ,明期における摂餌量増加の一因である可能性が示唆され,高脂肪食にて生じる食リズム異常には,末梢時計遺伝子の日内リズム異常も関与していることが明らかとなった。また,肥満者において夜間の副交感神経活動が減弱し,QOLの低下をきたしている可能性が示唆された。本研究は、摂食促進ホルモンのグレリンについて、高脂肪食により生じる食行動異常と肥満制御のメカニズムを明らかにすることを目的とし、平成25年度は「高脂肪食下のエネルギー代謝障害におけるグレリンの関与」について以下の研究を実施した。1脂肪食にて生じるグレリン動態の解析:1)経日的変動;野生型(WT)マウスを用い高脂肪食(60 kcal% fat)を4、8、12週間給餌後のグレリン動態は、高脂肪食の長期給餌に伴い低くなり、普通食給餌群と比べ有意に低値であった。2)日内変動;WTマウスの普通食給餌(CD)群と高脂肪食給餌(HFD)群(8週間給餌)の7時、13時、19時、25時におけるグレリン動態を比較検討した結果、CD群においては25時に有意に高くなり、7時に有意に低値となる日内リズムが存在し、一方、HFD群では13時に有意に高くなり25時に有意に低くなるCD群とは異なる日内リズムが存在し、高脂肪食給餌により摂食リズムに異常が生じることが示唆された。2高脂肪食による肥満・摂食・エネルギー代謝リズムの解析:WTおよびグレリンKOマウス(KOマウス)の高脂肪食を12週間給餌後の体重増加は、KOマウスの方が少ない傾向にあり、エネルギー代謝は逆に増加していた。また、KOマウスでは自発活動量や体内エネルギー代謝の日内リズムの恒常性に異常が認められた。3高脂肪食によるグレリン摂食・エネルギー代謝リズム調節の解析: 8週間高脂肪食給餌後のWTおよびKOマウスについて、迷走神経胃枝切除後のWTマウス,グレリンantagonist投与後のWTマウスでは体重増加が抑制され、一方、グレリンagonist投与後のKOマウスではWTマウスと同様の体重増加が認められた。以上の結果より、高脂肪食にて生じる食リズムの異常に、グレリンが関与している可能性が示唆された。平成26年度は「肥満制御機構に関わるグレリン・摂食リズムの役割」について以下の研究を実施した。1高脂肪食による肥満モデルマウスの摂食抑制関連ペプチドおよび末梢時計遺伝子発現の日内変動:野生型(WT)マウスの普通食給餌(CD)群と高脂肪食給餌(HFD;60 kcal% fat)群(8週間給餌)の7時、13時、19時、25時における視交叉上核のニューロメジンUとS(摂食抑制因子・概日リズム因子)および胃内のPer2、BMAL1、CLOCKなどの時計遺伝子発現を比較検討した。視交叉上核のニューロメジンUとSの発現は、HFD群では暗期に有意に高くなり明期に有意に低くなるCD群とは異なる日内リズムが存在した。さらに、胃内の時計遺伝子発現の日内リズムは、Per2においてのみCD群とHFD群とでは異なるパターンが存在した。高脂肪食給餌により摂食抑制関連因子においても日内リズムに異常が生じ、一部の末梢時計遺伝子発現の日内リズムも異常をきたしていることが明らかとなった。2高脂肪食負荷マウスにおけるグレリン末梢投与後の摂餌行動:WTマウスのCD群とHFD群(12週間給餌)にグレリンアゴニスト(GHRP-6)を明期(9時30分、15時30分)および暗期(21時30分、3時30分)に腹腔内投与し、摂餌行動(摂餌量、活動量)を比較検討した。グレリンアゴニストを投与すると、CD群では何れの時刻においても摂餌行動が認められたが、HFD群では明期に投与すると摂餌行動が認められたが、暗期における時刻に投与しても、摂餌行動は発現しなかった。以上の結果より、高脂肪食にて生じる食リズム異常には、摂食促進作用を有すグレリン以外の摂食抑制因子や末梢時計遺伝子の日内リズム異常も関与し、また肥満モデルではグレリン末梢投与による摂餌行動に異常が生じ、摂餌リズム異常との関連を示唆する結果であると考える。平成27年度は「肥満者における食行動やグレリン分泌異常の有無、生活習慣介入による効果」について以下の研究を実施した。1)対象:肥満または肥満歴を有する入院患者18名(Ob群;男6名・女12名(糖尿病))および当院で交代勤務に従事する看護師13名(SW群)を対象とした(年齢:50.6±14.0歳, BMI:31.3±8.0kg/m2)。SW群のうち肥満(SW-Ob群)が4名(年齢:42.8±3.6歳, BMI:30.1±1.9kg/m2 )、非肥満(SW-N群)が9名(年齢: 36.4±8.8歳, BMI:22.5±1.4kg/m2)であった。

2)方法:自律神経活動の評価はActiHR4を24時間装着し、心拍周期変動の周波数成分のHF成分(副交感神経活動)とLF成分(交感・副交感神経両者の活動)を抽出し、HF成分を副交感神経活動、LF/HF比を交感神経活動の指標とした。24時間を6時間毎に分け、深夜(0時6時)と昼(12時18時)のHF成分、LF/HF比を比較した。3)結果:LF/HF比についてはOb群(深夜2.47±1.07,昼5.62±2.04)で、深夜に比較して昼が有意に上昇し、SW-Ob群、SW-C群でも深夜に比較して昼において有意な上昇を認めた。一方、HFはOb群(深夜617.6±833.4ms2,昼411.1±675.4ms2)では健常者でみられる夜間の上昇がみられず、SW-Ob群でも深夜と昼に有意差が認められなかったのに対し、SW-N群(深夜645.9±340.9ms2,昼213.1±132.0ms2)では深夜が昼に比べ有意な上昇を認めたが、健常者と比較すると深夜のHFが減弱していた。以上の結果より、肥満およびShift workerと深夜の副交感神経活動に関係性が示唆され、副交感神経活動に影響を与える因子を特定することが肥満の予防や改善に寄与する可能性が考えられた。本研究は摂食促進ホルモンのグレリンについて,高脂肪食により生じる食行動異常と肥満制御のメカニズムを明らかにすることを目的とし,高脂肪食下のエネルギー代謝障害におけるグレリンの関与,肥満制御機構に関わるグレリン・摂食リズムの役割,および肥満者の食行動異常と自律神経活動を解析した。本研究により,高脂肪食負荷によりグレリン日内リズムの位相にズレが生じ,明期における摂餌量増加の一因である可能性が示唆され,高脂肪食にて生じる食リズム異常には,末梢時計遺伝子の日内リズム異常も関与していることが明らかとなった。また,肥満者において夜間の副交感神経活動が減弱し,QOLの低下をきたしている可能性が示唆された。平成26年度予定していた野生型(WT)マウスおよびグレリンKOマウスを用いた「摂餌制限/自発運動による肥満制御に関わるグレリン・摂食リズムの役割」について、1食餌制限によるグレリン動態および基礎代謝の解析、2食餌制限+自発運動時のグレリン動態および基礎代謝の解析などに必要な動物実験をほぼ終了し、現在解析中である。さらに、グレリンアゴニスト投与実験から新たな知見も得ることができ、当初の予定に入れていなかった摂食抑制因子や時計遺伝子制御における日内リズム解析も進み、今後は、視床下部室傍核oxytocin→延髄の孤束核プロオピオメラノコルチン(POMC)ニューロンを介する摂食抑制機序も研究視野に入れて本研究を発展させる。内分泌学・実験動物学平成25および26年度の研究結果より、高脂肪食給餌により摂食リズムに異常をきたし、摂食促進ホルモン・グレリン動態が普通食給餌マウスに比べ日内リズムパターンにズレが生じていることや、視交叉上核の摂食抑制因子や胃内の末梢時計遺伝子の一部においても日内リズム異常を来していることが明らかとなった。さらに、グレリン末梢投与による摂食促進効果は、肥満モデル動物では明期と暗期により異なり、グレリン日内リズムやGHS-Rの異常が生じ、摂餌リズム異常との関連が示唆された。これらの高脂肪食給餌による肥満におけるグレリンの摂食活動メカニズムの解析結果を踏まえ、グレリンの関与が最も強く認められた摂食リズムや肥満制御機構において、グレリンKOマウスを用いグレリンのagonist, antagonistなどによる介入を行い、摂食活動への影響およびその他のパラメーターの変動を検討し、食リズム異常へのグレリン治療の可能性を探索する。平成25年度(初年度)予定していた野生型(WT)
ワイヤレス電力伝送を利用したがん温熱治療用コイルで磁界分布を多様に制御する方法

磁界共鳴式ワイヤレス電力伝送は励磁側と誘導側の2つの共振回路を持つことで効率の良い電力伝送を行う方式である。昨年の研究で、磁界共鳴式ワイヤレス電力伝送方式を用いることでコイル間に効率的に強力な磁界を発生させることを確認できた。また電界の影響を非常に少なくすることも確認できた。次に磁界により体内にはうず電流が流れ発熱現象を起こす問題があり、とても無視できないものである。発熱は磁束密度の2乗、周波数に比例して発熱量が決まるが、渦電流は磁束密度の2乗、周波数の2乗に比例して発熱量が決まる。このためあまり高い周波数を用いることができない問題がある。これまでの研究で用いられている磁性発熱体では、100kHz程度が限界と思われている。当研究では患部以外の部分の磁界強度を下げることで、渦電流を50%以下に減らすことに成功した。ただし磁束密度の分布は実際の人体の大きさを想定した磁界発生装置を制作し確認したが、人体内部の渦電流については非常に単純な人体モデルによるシミュレーションにより確認したものである。結果的に磁界強度を25%上げることか、周波数を25%上げることが可能になった。治療には非常に有効だと思われる。実現方法であるが、2つの共振回路の共振周波数を±8%程度の差を設けることで励磁側コイルと誘導側コイルの電流が2倍以上の差を発生させることである。注目すべきは、励磁側より、誘導側(電源の付いていないコイル)に2倍以上3倍近くの電流を流すことが可能になったと言うことである。(5ターンQ=500以上400A120kHz)磁界共鳴式ワイヤレス電力伝送は励磁側と誘導側の2つの共振回路を持つことで効率の良い電力伝送を行う方式である。(5ターンQ=500以上400A120kHz)
神経細胞の移動と配置情報受容の同時可視化

本研究は、新規プローブを開発し、'いつ'、'どこで'神経細胞がリーリンシグナルを受容しているのかを明らかにすることが目的です。私は、Dab1がリン酸化されるとSH2ドメインと結合することを利用して、CFPとYFPを近接させ、紫色(440nm)の光で励起したときに、水色(480nm)の蛍光が黄色(530nm)へ変化するプローブを作製し、7%程度のレシオの変化率を達成しました。大脳皮質の層構造形成過程における神経細胞の移動および配置に関わる分子基盤は徐々に明らかにされつつあります。しかしながら、それらの分子が'いつ''どこで'機能するのかというような時空間的制御機構については未だ何もわかっておらず、この分野の理解が進まないことの理由の一つとなっています。そこで私は新奇蛍光プローブを開発することにより、層構造形成シグナルと神経細胞の移動を脳スライス上で同時に可視化し、いつどこでそのシグナルが活性化し、神経細胞が配置情報を受容しているのかを明らかにすることを目的に本研究を進めました。神経細胞が配置情報を受容する様子を可視化するために、大脳皮質層構造形成シグナルの一つであるリーリンシグナルを可視化するプローブを開発することにしました。このプローブはシアン(CFP)および黄色(YFP)蛍光タンパク質を用いたFRET型プローブであり、Dablのリン酸化を検出するものです。このプローブはDablがリン酸化されるとSH2ドメインと結合することを利用して、CFPとYFPを近接させ、紫色(440nm)の光で励起したときに、水色(480nm)の蛍光から黄色(530nm)へ蛍光が変化することを検出することにより、リーリンシグナルのオン・オフを可視化します。DablとSrcおよびFynのSH2ドメインをCFP、YFPに結合させたコンストラクトを作成し、培養細胞に導入しました。そこに非特異的リン酸化を引き起こすオルソバナジン酸ナトリウムを添加したところわずかながらDablのリン酸化に反応するプローブを獲得しました。今後はこのプローブのdynamic rangeを広げて、脳スライスへの適用を試みる予定です。リーリンはアポリポタンパク質E受容体(ApoER2)や超低比重リポタンパク質受容体(VLDLR)に結合し、神経細胞内にシグナルを伝え、神経細胞の移動や配置を制御しています。しかしながら、リーリンは髄膜側の辺縁帯にあるカハール・レチウス細胞で発現しており、神経細胞が産まれる脳室側から離れた場所にあるリーリンをどうやって神経細胞が認識し、移動に利用しているのかはわかっていません。本研究は、新規プローブを開発し、'いつ'、'どこで'リーリンシグナルを受容しているのかを明らかにすることを目的にしております.新規プローブを開発するために、リーリンシグナルを受容するとリン酸化を受けるDab1に着目しました。Dab1がリン酸化されるとSH2ドメインと結合することを利用して、CFPとYFPを近接させ、紫色(440nm)の光で励起したときに、水色(480nm)の蛍光から黄色(530nm)へ蛍光が変化することを検出することでDab1のリン酸化を可視化し、リーリンシグナルが入力されているのか否かを理解します。このCFP、YFP、Dab1、SH2ドメインを連結したDNAコンストラクトを培養細胞に導入し、非特異的リン酸化を引き起こすオルソバナジン酸ナトリウムを添加したところ、わずかながらDab1のリン酸化に反応するプローブを獲得しました。より大きなダイナミックレンジを獲得するために、以下の改良を行いました。(1)結合部位(リンカー部分)の長さを長くする、短くする、アミノ酸の組成を変更する。(2)使うSH2ドメイン(FynやSrcなど)を変更する。(3)Dab1やSH2ドメインのつなぐ順序を変更する。(4)円順列変異型の蛍光タンベク質を用いる。(5)蛍光タンパク質をGFPやmCherryに変更する。以上の改良により、レシオの変化率が1.2倍程度のプローブを作製することに成功しました。
セントロメア不活性化の抑制機構の解明

分裂酵母を用いて、細胞分裂の際に重要な染色体の正確な分離を担う構造であるセントロメアが、どのようにして機能を失わず維持されるかの分子機構の解明を試みた。2本の染色体を人為的により簡単で効率よく一本につなぎ合わせる実験系を構築し、その株を用いて、染色体が融合した際に生存率が上昇する遺伝子破壊株8株をスクリーニングした。これらの遺伝子の破壊により、セントロメアがより不活性化しやすくなっていることが示唆される。これらはヒストン修飾等に関わる遺伝子であり、特定のヒストンの修飾がセントロメアの不活性化を抑えていることが予想される。本申請研究はモデル生物である分裂酵母を用いて実験を計画し、研究目的の「セントロメア不活性化の抑制機構の解明」に焦点を絞って解析を行っている。方法としてダイセントリック染色体が形成された際にセントロメアの不活性化が促進される変異体をスクリーニングし、その変異した原因遺伝子を同定することで、セントロメア不活性化抑制機構に関わる因子が同定可能であると考えた。本研究ではセントロメア不活性化の調節制御機構に関わる因子の解明を試みる目的で、主に遺伝子を破壊しても細胞が生存可能な非必須遺伝子を中心に解析を計画した。この実験計画を遂行するため、平成24年度は申請者開発のダイセントリック誘導株を改変することで、本研究のスクリーニングに使用可能な分裂酵母株を作製した。そこで、平成25年度は、より効率的に研究を遂行するために、Bioneer社の分裂酵母非必須遺伝子破壊ライブラリー株を使って遺伝子スクリーニングを行った。このスクリーニングのために、遺伝子破壊ライブラリー株とダイセントリック染色体誘導株を掛け合わせ、遺伝子破壊を持つダイセントリック染色体誘導株を作製した。そして、これらの株において、組換え酵素の発現によって2本の染色体の末端融合を起こさせ、ダイセントリック染色体を誘導した。染色体融合の起こった株はマーカー遺伝子を発現するので、このダイセントリック染色体を形成した細胞のみが生育可能な寒天プレート上で、その生存割合を調べた。このスクリーニングによって、8株のダイセントリック細胞の生存率が上昇する株と、9株の生存率が減少する株が得られた。これらの株において破壊されている遺伝子は、それぞれセントロメアを活性化と不活性化へ調節している可能性がある。平成26年度に予定している、これら遺伝子機能の解析により、不明な部分の多いセントロメアの調節機構の遺伝学的な解明が期待される。本申請研究ではモデル生物である分裂酵母を用いて実験を計画し、研究目的の「セントロメア不活性化の抑制機構の解明」に焦点を絞って解析を行っています。方法としてダイセントリック染色体が形成された際にセントロメアの不活性化が促進される変異体をスクリーニングし、その変異した原因遺伝子を同定することで、セントロメア不活性化抑制機構に関わる因子が同定可能であると考えました。本研究ではセントロメア不活性化の調節制御機構に関わる因子の解明を試みる目的で、主に遺伝子を破壊しても細胞が生存可能な非必須遺伝子を中心に解析を計画しました。この実験計画を遂行するために、平成24年度は申請者開発のダイセントリック作成用株の改変とその株を用いた非必須遺伝子破壊株ライブラリーの作成を実施する予定でした。しかし、非必須遺伝子破壊株ライブラリーの作成に使用する、申請者開発のダイセントリック作成用株において、後の解析をよりスムーズにより確実に遂行するにあたり、想定していた以上の改変を行わなければいけないことが判明しました。その株の問題点の一つは、部位特異的酵素Creの発現、抑制の調節が不完全であったことでした。このため破壊株ライブラリー作成時にすでに酵素が発現し、細胞の死やダイセントリック染色体誘導時の野生株と変異株の間で生育の違いが見分けにくく解析にあまり適していませんでした。そこで、発現調節のプロモーター配列の改変や、Cre/loxPの部位特異的組換え酵素も、より調節のしやすいシステムに変換しました。この株の大幅な改変と条件検討によって、より扱いやすく、より制御の効くダイセントリック染色体作成が可能な実験株が構築できました。この改変作業に時間がかかったため、研究計画に予定していたライブラリー作成までは達成できませんでした。しかし、今回作成した新たな株により、より効率な今後の研究遂行が可能になりました。本申請研究はモデル生物である分裂酵母を用いて「セントロメア不活性化の抑制機構の解明」に焦点を絞って解析を行った。方法として一つの染色体上に2つのセントロメアが存在するダイセントリック染色体が形成された際に、セントロメアの不活性化が促進される変異体のスクリーニングを試みた。その変異した原因遺伝子を同定することで、セントロメア不活性化抑制機構に関わる因子が同定できると考えた。前年度までに申請者開発のダイセントリック誘導株を改変することで、本研究のスクリーニングに使用可能な分裂酵母株を作製した。

そして、分裂酵母非必須遺伝子破壊ライブラリーを使ってダイセントリック染色体誘導株による遺伝子スクリーニングを行い、8株のダイセントリック細胞の生存率が上昇する株と、9株の生存率が減少する株を得た。平成26年度は、前年度までに選別できたダイセントリック染色体が形成された際に生存率が上昇する変異株において、さらに詳細な解析により5株を選別した。そして、それらのダイセントリック染色体生存株で、染色体やセントロメアのどのような変化が細胞の生存に寄与するのか解析を行った。パルスフィールドゲル電気泳動法を用いた染色体の核型変化を基に解析を行った結果、セントロメアのエピジェネティックな不活性化により、機能的セントロメアが一つになり、染色体が安定化した細胞の割合が最も多いことが分かった。よって、これらの遺伝子破壊株においてセントロメアは不活性化しやすくなっていることが示唆される。これらの遺伝子はヒストンの修飾に関連するタンパク質をコードしていることから、ヒストンの修飾が不活性化抑制機構に関与している可能性が考えられる。より詳細なヒストン修飾とクロマチン構造の変化等の解析を進め、不活性化抑制の機構をまとめる予定である。分子生物学平成24年度は、分裂酵母において申請者が確立していた染色体融合のためのシステムを、本申請研究に適するよう大幅に改良したため、その作成や条件検討に申請書の計画以上に時間を要した。しかしながら、出来上がった株は、遺伝子発現制御のためのプロモーターや部位特異的組換え酵素、選択マーカー遺伝子の改変により、元の株と比べダイセントリック染色体の形成のための組み換えの制御がより正確で容易に行える、利用価値および汎用性の高い株となった。またさらに、申請書に示していた遺伝子挿入によるランダム変異を用いた変異株ライブラリーの作成を、Bioneer社の遺伝子破壊株ライブラリーの使用に変えることによって、遺伝子破壊および破壊された遺伝子の同定のステップが省略できより迅速な研究遂行が可能になった。加えて、クロマチン関連の変異株に重点を置いた解析を行うことで、平成25年度はダイセントリック染色体の生存に影響する遺伝子破壊株のスクリーニングを行う事が出来た。故に、研究計画に予定していた平成25年度の目標は達成でき、平成24年度の遅れは取り戻せた。これにより、平成26年度は今回スクリーニングされたセントロメア活性の調節制御機構に関わると考えられる候補遺伝子についての解析が可能となり、本研究目的が達成できると考えている。研究実績概要に述べたように、ダイセントリック染色体作成のための菌株の大幅な改変を行う必要が生じたため、その作成および条件検討に計画以上に時間を要しました。そのため、平成24年度予定していたダイセントリック染色体が誘導できる株におけるライブラリーの作成までは到達できませんでした。しかしながら、今回作成した株は、遺伝子発現制御のためのプロモーターや部位特異的酵素、選択マーカー遺伝子を改変する事で、元の株と比べダイセントリック染色体の形成のための組み換えの制御がより正確に行えることから、今後の研究遂行の上で様々な利点を持つ利用価値および汎用性の高い株であることが分かりました。
窒素栄養とオートレギュレーションによる根粒形成の制御機構

ミヤコグサの根粒過剰着生変異体よりポジショナルクローニングで特定したKLAVIER (KLV)はLRR型のレセプター様キナーゼをコードしており、根粒のシステミックな抑制のみならず、メリステムの維持や維管束の連続性、花成の促進、茎の伸長など多面的な機能を有する。KLVのin situ hybridizationによる発現解析から茎頂分裂組織や葉原基で若干高い発現が観察されたが、それは細胞質にとんだ細胞が多い組織でしばしば観察されたことから今後さらに検討する必要がある。一方、klvやharl変異体の硝酸耐性制御部位を特定するために、接ぎ木実験を行った。しかし充分な数の個体を得ることができず定量的なデータを出すには至っていない。現在継続中である。klv変異体に黒インクをすわせ根からシュートへの移動を調べたところ、特に野生型と差が検出されなかった。このことから、少なくとも維管束の異常が根からシュートへの物質輸送を阻害しているのではないことが明らかとなった。イオンビーム照射より単離した新規根粒過剰着生変異体tmlは、ポジショナルクローニングにより原因遺伝子領域に少なくとも200kb以上の欠失を生じていることが明らかとなった。harl tml2重変異体からの解析から、tmlはharlと遺伝学的に同一経路で働くことが明らかとなった。さらに接ぎ木実験によりtmlはklvやharlと異なり根制御であることが判明した。マメ科植物の根粒形成は、充分な窒素栄養を含む土壌では抑制される。また、植物の根に根粒菌が感染すると、根とシュート間の遠距離シグナル伝達により過剰な根粒形成を抑制するオートレギュレーション機構が発動することが知られている。オートレギュレーションによる根粒形成の抑制が破綻した根粒過剰着生変異体は、高濃度硝酸塩処理下でも根粒を形成することから、窒素感受性と根粒菌感染に対する応答機構の間にクロストークが存在すると予想される。我々は、マメ科モデル植物ミヤコグサ(Lotus japonicus)を用いた根粒形成に関する共生変異体の網羅的なスクリーニングから、オートレギュレーションと硝酸塩による根粒抑制の両方に異常のある根粒過剰着生変異体har1やkalvier(klv)を単離している。klvとhar1のダブルミュータントを作成したところ、その表現型は、根粒数、シュートの生育や形態においてklvと同様であった。このことから根粒数の制御においては、KLVとHAR1が同一系路上で機能していることが示唆された。また、klvでは葉の維管束の連続性が失われ、vascular island等が観察されていたが、茎でも観察を行なった結果、klvの茎では野生型にみられるような維管束が環状に並んだ構造が崩れている様子などが観察された。klvのポジショナルクローニングにより候補遺伝子を特定した。klv変異体への形質転換を行ったところ、klvの根粒過剰着生、花成遅延、葉脈の浮上、茎の二叉分枝などの表現型が相補され、KLV遺伝子がこれらすべての形質に関わっていることを明らかにした。また、イオンビーム照射によるスクリーニングにおいて単離された716-1及び1836-1変異体の表現型解析を行なったところ、根粒過剰着生変異体としては初めて、硝酸塩による根粒形成の阻害が野生型と同様に起こる可能性が示された。現在継続中である。
腎臓で作動する組織レニン・アンジオテンシン系の血圧調節、腎組織障害における意義

1.尿細管特異的Agt遺伝子不活化マウスの作製と解析Agt遺伝子に変異アレル(Agt-loxP)を導入したマウスと、近位尿細管にCreを発現するKAP-Creマウスを交配して尿細管特異的Agt不活化マウスを作製した。肝Agt mRNA発現は対照マウスと同等であったが腎での発現は著明に減弱しており、腎特異的な遺伝子不活化が確認された。血中Agt濃度、血圧、腎組織は対照マウスと同等であった。遺伝的背景が均一なマウスを用いて塩分制限食下における尿量、尿Na排泄を検討した。尿細管特異的Agt不活化マウスにおいても対照マウスと同様に尿量減少、尿Na排泄低下を認めた。2.尿細管特異的AT1遺伝子不活化マウスの作製と解析AT1遺伝子に変異アレル(AT1-loxP)が導入されたマウスと、KAP-Creマウスを交配して尿細管特異的AT1遺伝子不活化マウスを作製した。不活化の確認が十分でないが、塩分制限下における尿量、尿中Na排泄を検討したところ、対照群と同等の尿量低下、尿中Na排泄低下を認めた。3.肝特異的Agt遺伝子不活化マウスの作製と解析当初の期待に反して腎におけるAgt不活化マウスでは塩分制限下での塩分・水分の保持能力は十分に保たれており、血中Agt濃度の重要性が示唆された。そこで、肝特異的なAgt遺伝子不活化マウスを作製し塩分制限を行った。そのマウスの血中Agt濃度は感度以下となり、低血圧、多尿を呈した。塩分制限下でも多尿傾向が持続し、尿中Na/K比が対照群と比較して高値であり、水分・塩分の保持能力が劣っていることが示された。腎組織学的検討では、傍糸球体装置の過形成、輸入細動脈壁の肥厚などAgt欠損マウスの所見と質的に一致していた。以上の結果から、水分・塩分の保持には肝由来のAgtがより重要であり、腎由来のAgtの役割は限定的であることが示唆された。1.尿細管特異的アンジオテンシノーゲン遺伝子不活化マウスの作製アンジオテンシノーゲン遺伝子(Agt)のエクソン2を挟むようにloxP配列を挿入した変異アレル(Agt-loxP)を持つマウスを戻し交配により、純系のC57BLの遺伝的背景にした。同様に、近位尿細管直部にCre酵素を発現するKAP-Creマウスに関してもC57BL純系を作成した。現在、純系のAgt-loxPマウスと、純系のKAP-Creマウスを交配して、尿細管特異的Agt不活化純系マウスを作製中である。2.尿細管特異的Agt不活化マウスの表現型解析同胞間交配を繰り返してほぼ均一な遺伝的背景を有する雄マウスを用いて、表現型の解析を行った。Agt-loxPアレルをホモに持つマウスで、KAP-Creを有するマウスと、KAP-Creを有さないマウスを比較した。ノーザンブロッティングにより腎臓、肝臓におけるAgtのmRNA発現を検討した。

肝臓でのAgt mRNA発現はKAP-Creの有無による影響を受けなかったが、腎臓での発現はKAP-Creを有するマウスで著明に減弱していた。血中のアンジオテンシノーゲン濃度、血圧、腎組織学的検索では、両マウス間で差を認めなかった。3.塩分制限下における水分・塩分保持能力の検討塩分制限下では、尿量が低下し、尿中ナトリウム排泄量も低下する。上記のマウスを用いた検討では、腎臓特異的にAgtが不活化されたマウスであっても十分な塩分保持能力を有していた。4.尿細管特異的にAgtr1遺伝子が不活化されたマウスの作製および解析Agtr1-loxPマウスについても戻し交配によりC57BLの遺伝的背景とした。尿細管におけるAgtr1の不活化を免疫組織学手法により確認することを試みたが、困難を極めている。不活化の評価が不十分だが、塩分制限に対する反応は正常マウスと同様であった。1.尿細管特異的アンジオテンシノーゲン(Agt)遺伝子不活化マウスの解析尿細管特異的にAgt遺伝子を不活化したマウスを、遺伝的背景を均一にし、塩分制限食下における尿量、尿中Na排泄を検討した。以前の遺伝的背景が不均一な予備実験と同様、尿細管におけるAgt不活化マウスにおいても、対照マウスと同様に尿量の減少および尿中Na排泄の低下を認めた。また、腎臓の組織学的検討では、明らかな異常を指摘し得なかった。2.尿細管特異的AT1遺伝子不活化マウスの解析同様に、遺伝的背景を均一にしたマウスを用いて、塩分制限下における尿量、尿中Na排泄などを検討した。以前の予備実験と同様、尿細管特異的AT1遺伝子不活化マウスにおいても対照群と同等の尿量の低下、尿中Na排泄の低下を認めた。血圧、体重減少も同等であった。3.肝臓特異的Agt遺伝子不活化マウスの作製と解析当初の期待に反して腎臓におけるAgt不活化マウスでは塩分制限下における塩分・水分の保持能力は十分に保たれていた。すなわち血中Agtの濃度がより重要であることが示唆されたため、この点をより明確にする目的で、肝臓特異的なAgt遺伝子不活化マウスを作製し、塩分制限を行った。そのマウスは血中Agtの濃度は感度以下となり、低血圧、多尿を呈した。塩分制限下でも多尿傾向が持続し、尿中Na/K比が対照群と比較して高値であり、水分・塩分の保持能力が劣っていることが示された。また、腎臓の組織学的検討では、傍糸球体装置の過形成、輸入細動脈壁の肥厚などがみられ、これはAgt欠損マウスで見られた所見と比較して軽度であるが、質的には一致していた。以上の結果から、水分・塩分の保持には肝臓由来のAgtがより重要であり、腎臓由来のAgtの役割は限定的であることが示唆された。