hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
甲状腺がんの発症分子機構の解明と分子標的治療の臨床応用

この研究を展開し、この研究期間中に、BRAF遺伝子変異と甲状腺癌の組織型および病期との間の関連性について臨床データを基に検討した。BRAF遺伝子変異解析をおこなうことで診断及び予後予測に応用できるか評価した。その結果BRAF変異は、臨床病期と相関が見られ報告した。さらに、BRAF遺伝子変異の結果、細胞内MAPK経路が活性化された甲状腺腫瘍に対して分子標的治療として、BRAF変異がある腫瘍では、NF-kBの活性化がみられることより、甲状腺未分化癌に対するNF-kB阻害剤の効果をin vitroとin vivoで調べたところ有意な増殖抑制がみられ分子標的治療薬としての臨床使用が期待された。さらに新規NF-kB阻害剤である低分子量のDHMEQを用いて甲状腺がんに対する効果を調べたところ、単独あるいは放射線と組み合わせることにより効果がみられ今後臨床応用されることが期待された。また、すでに乳がんでは治療薬として使用されているタキソールの効果も甲状腺癌で調べた結果、少量で長時間の投与によりより強いアポトーシス効果が見られることがわかった。チェルノブイリの原発事故より20年が経過し、事故後5年で急増した小児甲状腺がんは、すでに発症年齢のピークが思春期から若年成人に移っている。しかし、依然として甲状腺がんの発症は増加している。比較的予後良好な経過をとる甲状腺がんの特徴ゆえに、2005年のIAEAの調査では、甲状腺がんで死亡した患者数は、現在までに10名と少ない。しかし遠隔転移を特徴とする小児甲状腺がんでは、将来的に再発する可能性が高く、通常の外科手術が適用にならない再発後の治療法が問題となる。そこで我々は、遺伝子発現プロフィールを用いて、悪性度、転移の有無を調べる方法を開発するための基礎研究をすすめる(Cancer Letter)とともに、悪性度の高い未分化甲状腺がんに対して放射線とc-ABL阻害薬を併用することでがん細胞の老化様の細胞増殖停止を誘発することを明らかにした(Thyroid, Radiation Research)。さらにin vitroで有意な甲状腺がん細胞死誘導作用をもつNF-kB阻害薬であるDHMEQが、in vivoでも有効なことを示すために、現在、甲状腺がん発症のモデルマウスであるBRAF発現トランスジェニックマウスおよびRet/PTC発現トランスジェニックマウスを用いてDHMEQの効果を判定する研究を実施中である。DHMEQの甲状腺がんに対する治療に関する特許はすでに取得しておりさらに実用化できるように基礎研究を進めてゆく。また、甲状腺がんの治療標的となる可能性を有するがん幹細胞の研究も同時に進めており、甲状腺がん細胞株でいわゆる幹細胞のマーカーとみなされているSP分画の細胞を確認できている。今後、これらの幹細胞の性状についてさらに検討を加える予定である。
生活支援・就労支援型中間支援組織における学習の構造と機能に関する実証的研究

本研究では、地域のくらしを支援する新たな中間支援組織・施設や諸主体間の連携の枠組みについて、国内事例及び海外事例として農村コミュニティの支援を展開する英国のRural Community Councilなどの調査を実施した。そこでは、地域課題の解決や事業活動への住民参加など学習の自由が多様な形で実現されていた。同時にまた、社会教育ガバナンスの変容という実態があることや他方で今後の自治体社会教育の新たな展開可能性の萌芽が指摘できる。本研究の初年度(19年度)として、国内及び海外事例について訪問調査を中心に展開した。海外事例については、英国のRCC(Rural Commullity Council)について取り上げた。州単位にあるRCCは、特に農村コミュニティを支援対象とし、就労、教育、福祉等、住民生活にかかわる広範な課題について、多様なセクター、機関等とのパートナーシップを形成しながら支援事業を展開する中間支援組織である。RCCは、日本国内における生活支援・就労支援型中間支援組織を検討する上での仮説的位置づけとして、平成19年度の調査としてそのマネジメント、事業内容、パートナーシップ形成等について整理し、研究成果(学会発表及び学会投稿論文)として取り上げている。RCCの事業についてはまた、近年の中心的課題である英国のパリッシュにおける計画=Parish Planの策定支援について着目した。そのプロセスは単なる地域計画づくりに止まるのではなく、地域民主主義の再構築を含んだ住民自治への学習プロセスと捉えることができる。この点については、20年度の追調査を経て研究成果にまとめる予定である。こうしたRCCの調査を踏まえ、国内調査ではNPO等の民間によるコミュニティ支援や住民自治の促進と同時に、行政による支援事業についても調査を進め研究成果(出版図書)にまとめている。市町村合併後の自治と協働を推進する目的から、人材育成事業や地域担当職員制度などを展開する自治体を取り上げている。こうした支援機能の民間による展開や、従来の社会教育行政、施設との機能の重なりなど引き続き検討を進める予定である。平成20年度の本研究では、当初の目的である国内外の中間支援組織並びに社会教育施設の新たな機能分析のため事例調査を中心に進めてきている。国内については、若者の就業体験を通した地域活性化をコーディネートするNPOの事例(那覇市)、また従来から縦割りの関係となっていた地域福祉団体、社会教育関係団体そしてNPOなどを支援事業を通じて結ぼうとする市民活動支援センターの事例(多賀城市)など、新たな中間支援施設機能に着目し調査を実施した。事例からは、当該地域における住民活動、地域産業・文化等の蓄積を生かしながら、地域課題の解決へと向かうための相互のコミュニケーション機会の創出、情報発信と共有による信頼関係の醸成を意図した多様な事業活動の展開がみられた。他方で、こうした中間支援組織の事業活動及び組織運営への参加など、住民の学習の自由をどのように実現していくのかが課題と捉えられた。国外については、前年度末に実施した英国南西部のRCC(Rural Community Council)に関する調査結果の分析を進めた。具体的には、英国全土に展開している地域計画=パリッシュ・プラン(PP)策定への支援プロセスに焦点を当て、人材養成を含むコミュニティ支援プログラムを中心としたRCCの事業内容、あるいは他セクターとのパートナーシップ構造の分析などを進めた。RCCの支援によるPPの策定過程を通して、(1)特に英国の地域コミュニティであるパリッシュをめぐってはパリッシュ・カウンシルによる代表制民主主義から参加型民主主義へという地域民主主義の再構築が図られていること、(2)パリッシュと政府関係機関、企業、NPO等のパートナーシップ形成が促進されていることなどを指摘した。なお、こうしたRCCの支援活動が創り出す住民の学習については、第55回日本社会教育学会研究大会自由報告において発表の機会を得ている。平成21年度の本研究では、当初の目的である国内外の中間支援組織・施設並びに社会教育施設の新たな機能分析のため事例調査を継続させ、特に国内調査のフォローを中心に進めている。地域自治組織など地域課題の解決に取り組む主体の支援を目的として事業活動を展開する社会福祉協議会(三重県伊賀市)、あるいはこうした社会福祉協議会と行政との連携によって地域コミュニティによる課題解決を総合的に支援しようとする事例(宮崎県都城市)などが注目された。また前年度の継続調査として若者の就業体験を通した地域活性化をコーディネートするNPOの事例(那覇市)、地域福祉団体、社会教育関係団体そしてNPOなどを支援事業を通じて結びつけようとする市民活動支援センターの事例(多賀城市)など、新たな中間支援施設機能に着目した調査を実施した。さらに、行政による支援方策として行政区や小学校区単位で行政職員を配置する地域担当職員制度の実態とその課題なども調査の過程で明らかとなってきた。これについては、特に山形県内の全市町村における導入状況、並びに導入自治体における現状と課題を中心に論文「地域コミュニティ支援をめぐる構造と課題(1)」(研究成果欄に記載)として整理している。また本研究の成果全体については22年度発行の2冊の図書(共著)として刊行予定である。一連の調査研究から、(1)地域のくらしを支援する新たな中間支援組織・施設や諸主体間の連携の枠組みの登場によって、各地では従来からある社会教育施設の捉え直しが多様な形で行われていること。

(2)これらの中間支援組織の事業活動及び組織運営への参加など、住民の学習の自由をどのように実現していくのかが課題である。こうした社会教育ガバナンスの変容をめぐる実態と課題、あるいは今後の自治体社会教育の展開可能性を明らかにしていくことが新たな研究課題として指摘できる。
アリル特異的DNAメチル化解析による炎症性腸疾患感受性遺伝子の機能解析

我々は炎症性腸疾患疾患感受性領域に存在するゲノム変異が近傍のDNAメチレーション変化を引き起こし、遺伝子発現に影響を与え、疾患発症を引き起こしていると予想している。そこで200の疾患感受性領域を中心にアリル特異的にDNAメチレーションの変化が認められるか、T cellから精製したゲノムDNAを検体とし、ジャポニカアレイを用いて解析した。その結果、インプリンティング領域を除いた218ケ所のSNP周囲にアリル特異的メチル化を確認し、そのうちの2ケ所が炎症性腸疾患感受性領域に存在していた。またそのうちの1ケ所でアリル間で発現差を認めた。これらの結果は前述の仮説の傍証となるものであった。炎症性腸疾患はその発症に遺伝要因と環境因子が関与する多因子疾患である。その遺伝因子を同定するため本申請者を含む多数の施設からゲノムワイド関連解析(GWAS)が報告され、既にゲノムの163領域に疾患感受性領域が同定されている。しかし相関を示すゲノム変異のほとんどはタンパクをコードしていない領域に存在し、疾患を発症させるメカニズムが未解明のままであり、感受性遺伝子の確定もできていない。本申請者らは疾患感受性領域に存在するゲノム変異が近傍のエピゲノム変化を引き起こし、遺伝子発現に影響を与え、疾患発症を引き起こすと考えた。そこで、1163疾患感受性領域を中心にゲノム変異特異的(アリル特異的)にエピゲノム変化(主にDNAメチレーション)が認められるかどうか、2ゲノム変異特異的(アリル特異的)に近傍遺伝子発現変化を認めるかどうか、3ゲノム変異特異的エピゲノム変化が発現に影響を与えるかプロモーターアッセイにて確認することを目的とした。遺伝子解析を含む研究に同意を文書で取得した活動期クローン病12例、活動期潰瘍性大腸炎5例から細胞を採取し、さらに詳細に分画した(CD4 memory Tcell, CD4 naive T cell, monocyte/macrophage,およびLPMCから調製したmyeloid and plasmacytoid dendritic cell).その後、DNA,RNAを調製し保存した。そのサンプルを用いて、現在アリル特異的メチル化部位を検索中である.炎症性腸疾患はその発症に遺伝要因と環境要因が関与する多因子疾患である。その遺伝因子を同定するために本申請者を含む多数の施設からゲノムワイド関連解析が報告され、既にゲノムの163領域に疾患感受性領域が同定されている。本申請者らは疾患感受性領域に存在するゲノム変異が近傍のエピゲノム変化を引き起こし、遺伝子発現に影響を与え疾患発症を引き起こすと考えた。そこで1163疾患感受性領域を中心にゲノム変異特異的(アリル特異的)にエピゲノム変化(主にDNAメチレーション)が認められるかどうか、2ゲノム変異特異的(アリル特異的)に近傍遺伝子発現変化を認めるかどうか、3ゲノム変異特異的エピゲノム変化が発現に影響を与えるかプロモーターアッセイにて確認することを目的とした。遺伝子解析を含む研究に同意を文書で取得した活動期クローン病12例、活動期潰瘍性大腸炎5例からLPMCを分取しさらにCD4 memory T cellまで分画後に、RNA, DNAを精製した。また制限酵素消化後に、各種SNP arrayにて取得したデータからアリル特異的メチル化部位を抽出する作業を行っている。研究の進展は、予定通りである。炎症性腸疾患はその発症に遺伝要因と環境要因が関与する多因子疾患である。その遺伝因子を同定するために本申請者を含む多数の施設からゲノムワイド関連解析が報告され、既にゲノムの200領域に疾患感受性領域が同定されている。そこで200疾患感受性領域を中心にゲノム変異特異的(アリル特異的)にエピゲノム変化(主にDNAメチレーション)が認められるかどうか、2ゲノム変異特異的(アリル特異的)に近傍遺伝子発現変化を認めるかどうか、活動期クローン病10例、活動期潰瘍性大腸炎5例からLPMCを分取し、さらにCD4 memory T cellまで分画後にRNA, DNAを精製し検討した。アリル特異的メチル化の同定は、メチル化感受性制限酵素とジャポニカアレイを用いてヘテロ接合のSNPを利用して同定した。最終的に223個のSNP近傍にあるアリル特異的メチル化を同定した。既知のimprinting領域を除外すると、218領域が残り、現在同定されている200のIBD疾患感受性SNPの周辺にあたるものはrs36221701(平均RAS 0.14)、rs1130368(平均RAS 0.23)の2か所であった。発現の情報を合わせて解析をし、成果発表をする予定である。

またそのうちの1ケ所でアリル間で発現差を認めた。これらの結果は前述の仮説の傍証となるものであった。研究の進展は、予定通りである.特に推進方策に変更はない。消化器病学特に推進方策に変更はない.予定物品費の購入が次年度にわずかにずれただけであり、研究の進行は予定通りである。予定消耗品の購入が次年度にわずかにずれただけであり、研究の進行は予定通りである.次年度へ持ち越された予算を含め、予定通り使用する予定である。次年度から持ち越された予算を含めて、予定通り使用する計画である.
線虫の神経可塑性におけるRas-MAPK経路及びインシュリン経路の機能の解明

1)我々は以前にRas-MAPK経路が線虫C.エレガンスの嗅覚神経で働き、効率のよい匂い応答に必要であることを報告した(Hirotsu et al. 2000)。本研究では、Ras-MAPK経路が嗅覚順応にも関わっていることを見出し、機能解析を行った。この嗅覚順応は早期嗅覚順応と名付けた現象で、この順応が感覚神経のみでなく、AIYと呼ばれる介在神経の機能に依存して起こることを見出した。AIYは嗅覚神経AWA, AWCを含む複数の感覚神経から入力を受ける介在神経である。Ras-MAPK経路のいくつかの変異体が、早期嗅覚順応に欠損を示した。さらに、細胞特異的遺伝子発現実験により、Rasをコードするlet-60遺伝子をAIY神経で発現させると嗅覚順応の欠損がもとにもどること、すなわちRasがAIY介在神経で働くことを明らかにした。匂い刺激により、嗅覚神経及び介在神経AIYでMAPキナーゼが活性化されることが抗体染色で確認された。2)また、化学走性の連合学習のアッセイ系も構築している。線虫は通常NaClを好むが、餌の非存在下でNaClを一定時間経験すると、NaClを忌避するようになる。インスリンINS-1、インスリン受容体、およびその下流で機能することの知られているPI3キナーゼ、PDKキナーゼ、Aktキナーゼそれぞれの変異体でこの行動可塑性が失われていた。細胞特異的発現実験により、INS-1は介在神経AIAで、PI3キナーゼはNaClを受容するASE神経で働いていることがわかった。すなわち、感覚神経からシナプス入力を受けるAIA介在神経がINS-1を介して感覚神経に逆行性に働きかけることにより、行動を変化させる。ASE感覚神経は左右対称に一対存在するが、PI3キナーゼは右のASE神経でだけ働いていた。我々は線虫C.エレガンスの新しいタイプの嗅覚順応、早期順応の現象を見出している。早期順応は、線虫に5分間の匂い刺激を与えた後にその匂いへの化学走性行動を測定すると、無処理の場合に比べて顕著に化学走性が低下するという現象である。すでに、この順応には嗅覚神経のみならず、嗅覚神経から入力を受ける介在神経、AIY神経が重要な働きをすること、さらに、AIYでのRas-MAPキナーゼ経路の働きが早期順応に必須であることを明らかにしている。本年度の研究では、早期順応におけるグルタミン酸受容体の働きについて検討した。AMPA型グルタミン酸受容体の線虫ホモログGLR-1の変異体では、早期順応に欠損が見られた。さらに、GLR-1::GFP融合蛋白質をAIY神経に発現させ、その後シナプス部位における局在を調べたところ、Rasの機能欠損変異体では、GLR-1::GFPのドットの数が減少していた。一方、Rasの機能昂進型変異体では各ドットのサイズが小さくなっていた。これらの観察は、Ras、そしておそらくMAPキナーゼの下流でGLR-1グルタミン酸受容体の局在が制御されていることを示唆している。さらに、線虫に匂い刺激を与えてGLR-1::GFPの局在を観察したところ、5分間の匂い刺激の受容により、GLR-1::GFPのドットのサイズが小さくなることが観察された。この局在変化の意味するところは不明であるが、後シナプスの機能部位にGLR-1受容体が集合するという可能性を考えている。

匂い刺激によりRas経路を介してこのようなGLR-1の局在変化が起こり、これにより嗅覚神経からAIYへのシナプス伝達が増強され、活性化されたAIY介在神経が化学走性を抑えるというモデルが想定される。1)我々は以前にRas-MAPK経路が線虫C.エレガンスの嗅覚神経で働き、効率のよい匂い応答に必要であることを報告した(Hirotsu et al.2000)。本研究では、Ras-MAPK経路が嗅覚順応にも関わっていることを見出し、機能解析を行った。この嗅覚順応は早期嗅覚順応と名付けた現象で、この順応が感覚神経のみでなく、AIYと呼ばれる介在神経の機能に依存して起こることを見出した。AIYは嗅覚神経AWA,AWCを含む複数の感覚神経から入力を受ける介在神経である。Ras-MAPK経路のいくつかの変異体が、早期嗅覚順応に欠損を示した。さらに、細胞特異的遺伝子発現実験により、Rasをコードするlet-60遺伝子をAIY神経で発現させると嗅覚順応の欠損がもとにもどること、すなわちRasがAIY介在神経で働くことを明らかにした。匂い刺激により、嗅覚神経及び介在神経AIYでMAPキナーゼが活性化されることが抗体染色で確認された。2)また、化学走性の連合学習のアッセイ系も構築している。線虫は通常NaClを好むが、餌の非存在下でNaClを一定時間経験すると、NaClを忌避するようになる。インスリンINS-1、インスリン受容体、およびその下流で機能することの知られているPI3キナーゼ、PDKキナーゼ、Aktキナーゼそれぞれの変異体でこの行動可塑性が失われていた。細胞特異的発現実験により、INS-1は介在神経AIAで、PI3キナーゼはNaClを受容するASE神経で働いていることがわかった。すなわち、感覚神経からシナプス入力を受けるAIA介在神経がINS-1を介して感覚神経に逆行性に働きかけることにより、行動を変化させる。ASE感覚神経は左右対称に一対存在するが、PI3キナーゼは右のASE神経でだけ働いていた。
口腔細菌に起因する炎症性腸炎悪化に対する小児歯科領域からの予防システムの構築

う蝕(むし歯)の原因細菌であるStreptococcus mutansは,血液中に侵入し病原性を呈することがあることで知られている.本研究では,マウス腸炎モデルを用いてS. mutansによる炎症性腸疾患の悪化のメカニズムを検討した.その結果, S. mutansを取り込んだ肝臓実質細胞は,IFN-γを産生しαAGPおよびアミロイドA1といったタンパクにより炎症反応を増幅させることで免疫機構の不均衡が生じ,腸炎の悪化につながる可能性が示唆された.またマウス腸炎の悪化が抗IFN-γ中和抗体により緩和されることが示された.う蝕(むし歯)の原因細菌であるStreptococcus mutansは,血液中に侵入し病原性を呈することがあることで知られている.本研究では,マウス腸炎モデルを用いてS. mutansによる炎症性腸疾患の悪化のメカニズムを検討した.その結果, S. mutansを取り込んだ肝臓実質細胞は,IFN-γを産生しαAGPおよびアミロイドA1といったタンパクにより炎症反応を増幅させることで免疫機構の不均衡が生じ,腸炎の悪化につながる可能性が示唆された.またマウス腸炎の悪化が抗IFN-γ中和抗体により緩和されることが示された.う蝕の主要な病原性細菌であるStreptococcus mutansは、感染性心内膜炎の起炎菌としても知られている。近年、口腔細菌と様々な全身疾患との関連が指摘されているが、消化器疾患に対する影響に関連するものはほとんどない。炎症性腸疾患は、主として消化管に原因不明の炎症をおこす慢性かつ難治性の腸疾患の総称である。これまでの研究は主に腸管粘膜側からの細菌を主体としており、口腔細菌との関連の検討は行われてこなかった。最近になって、S. mutans菌株による炎症性腸炎の発症・悪化における影響とそのメカニズムの一端を明らかにした。今年度は、各種の口腔レンサ球菌株を用いて、潰瘍性大腸炎のモデルとして一般的に用いられているマウス腸炎モデルにおける病原性を検討した。その結果、S. mutans以外にもある種のS. sanguinis株によっても腸炎悪化が認められることが示された。これまでの研究結果よりIFN-γが腸炎悪化に関連していることが示唆されたため、本研究においても検討したところ、肝臓における著明な発現が認められた。さらに、IFN-γの中和抗体を事前に投与しておくと、腸炎悪化が抑制されることが明らかになった。これらのことから、ある種の口腔レンサ球菌は腸炎悪化と関連することが示された。昨年度までの研究により,デキストラン硫酸ナトリウム(Dextran Sulfate Sodium; DSS)を用いたマウス腸炎モデルにおいて,抜歯後菌血症患者の血液より分離されたStreptococcus mutansの血液中への投与によって腸炎悪化が誘発され,菌を感染させずDSSのみ摂取させたマウスと比較して,生存率を有意に減少させることを明らかにした.そのメカニズムとしてS. mutansは一旦肝臓に取り込まれた後,炎症性サイトカインであるインターフェロンγ(IFN-γ)と関与することが考えられたため,今年度は,このS. mutansによる腸炎悪化におけるIFN-γの役割を追究した.まず,肝臓培養細胞にS. mutansを感染させた時のIFN-γのmRNAの発現について検討したところ,発現の亢進が認められた.また,マウス腸炎モデルにS. mutansを感染させた時の,肝臓組織におけるIFN-γのmRNAの発現について検討したところ,同様に発現の亢進が認められた.その時のマウスの肝臓組織および腸組織に対して免疫染色を施したところ,菌を感染させずDSSのみ摂取させた群と比較してIFN-γの産生が亢進していた.さらに,菌を感染させる24時間前に抗IFN- γ中和抗体を腹腔内より投与した時のマウスの病体の変化を検討したところ,抗IFN-γ中和抗体を投与した群では,S. mutans感染群と比較して有意な腸炎の悪化の緩和および有意な生存率の上昇が認められた.以上の結果より, S. mutansを取り込んだ肝臓実質細胞は,IFN-γを産生することで免疫機構の不均衡が生じ,腸炎の悪化につながる可能性が示唆された.また,マウス腸炎の悪化が抗IFN-γ中和抗体により緩和されることが示された.患者の口腔細菌叢の分析は未だ開始できていないが、それ以外は申請時に立てた計画通りに進んでいるため。25年度が最終年度であるため、記入しない。1.腸炎モデルを用いた各種口腔レンサ球菌株における病原性の解析潰瘍性大腸炎のモデルとして一般的に用いられているデキストラン硫酸ナトリウムを用いたマウス腸炎モデルにおける各種口腔レンサ球菌株における病原性を検討する。2.腸炎悪化に関連するサイトカインの検討IFN-γ以外にも一般的に腸炎の悪化に関与するとされているサイトカイン(TNF-α,IL-1β,IL-6,IL-17など)についても検討する。また、マウス腸炎モデル上で病原性が高いと考えられる株や低いと考えられる株を感染させ、標的臓器を摘出して各サイトカインのmRNAの発現量をリアルタイムPCRを用いて定量し、その変化を分析する.3.小児・思春期患者の口腔細菌叢についての分析小児・思春期患者における口腔細菌叢の分析を継続し、in vitro系や動物実験で病原性が高いと考えられた株と同タイプの株の存在頻度を検討する。

4.高リスク細菌の保有者を簡易同定するシステムを構築腸炎の悪化を誘発する高リスク細菌株の特定ができれば,ヒトの唾液サンプルよりこの高リスク細菌株の保有を簡易同定するシステムの構築を目指す.現在,腸炎を悪化させるタイプのS. mutans菌株の検出法について検討を進めている段階であるが, S. sanguinisなど新たに病原性が高いことが判明した菌種および菌株についても,その検出法の構築を順次開始する.25年度が最終年度であるため、記入しない。
グアニリンとその受容体を発現するマクロファージによる脂肪蓄積抑制機構の解明

これまでに申請者は、高脂肪食を摂取しても肥満にならない肥満抵抗性ラットを解析し、内臓脂肪組織のマクロファージにおいて、生理活性ペプチド;グアニリン(Gn)と、その受容体であるグアニリル酸シクラーゼC(GC-C)が高発現していることを見出し、Gn/GC-Cをマクロファージ特異的に高発現させたダブルトランスジェニックラットも肥満抵抗性であることを明らかにした。本研究では、マクロファージのGn/GC-C発現調節機構を明らかにし、Gn/GC-C発現マクロファージから産生・分泌され、脂肪蓄積を抑制させる新規液性因子を探索することで、肥満治療の創薬シーズにつながる候補分子を同定する。
糸球体上皮細胞障害におけるmiR-143の役割の解明

まず、TGF-beta1を作用させた培養糸球体上皮細胞において、コントロールの細胞と比べ、miR-143の発現が有意にに上昇することをmicroarrayとRT-PCRでで確認した。次に、レンチウイルスベクターを用いてmiR-143を高発現させた培養糸球体上皮細胞を用いて、以下のようにmiR-143の機能解析を行った。Smadのレポーターアッセイでは、コントロールの細胞と比べ、miR-143を高発現させた細胞でSmadの活性が上昇することが示された。また、ウエスタンブロットとRT-PCRによるWT1の発現解析により、miR-143を高発現させた培養糸球体上皮細胞ではWT1の発現が低いことが示された。これらは正常糸球体上皮細胞にTGF-beta1を作用させた時と同様の形質の変化であった。以上より、糸球体上皮細胞において、miR-143はTGF-beta1により発現が増強し、発現増強したmiR-143はTGF-beta1の作用を増強させWT1の低下を惹起させることにより、糸球体上皮細胞障害障害を引き起こすと考えられた。今後は、miR-143をノックダウンした糸球体細胞を用いて、TGF-beta1による細胞の形質変化が抑えられるかどうか解析する予定である。また、miR-143とクラスターを形成し、同様に発現制御されていると考えられているmiR-145について、TGF-beta1により発現が増強するかどうかを調べる予定である。更に、TGF-beta1トランスジェニックマウスの腎組織を用いてmiR-143の局在や発現上昇を確認したいと考えている。miR-143がTGF-betaの作用を仲介しているかどうかについては、miR-143をノックダウンした糸球体上皮細胞でTGF-beta1の作用が減弱することを示す必要があるが、それが行えていない。また、生体においてmiR-143が腎疾患に関与しているかどうかを調べるために、最低限、マウスの腎疾患モデルでmiR-143の発現が増強することを確認する必要があると思われるが、今のところ行えていない。レンチウイルスベクターを用いて糸球体上皮細胞のmiR-143をノックダウンし、その細胞にTGF-beta1を作用させて、TGF-beta1による細胞の表現型の変化が解除されるかどうかを調べる。また、miR-143とクラスターを形成し、miR-143と同じように発現が制御されているmiR-145について、TGF-beta1によって発現が増強するかどうかをRT-PCRをにより調べる。さらに、可能であればTGF-beta1トランスジェニックマウスの腎組織を入手して、RT-PCRまたはin situ hybridizationによりmiR-143の局在と発現増強を確認する。我々はこれまでに、TGF-betaを作用させた培養糸球体上皮細胞でmiR-143の発現が上昇すること、および、通常の培養糸球体上皮細胞ではTGF-betaを作用させた際に認められるWT1の低下が、miR-143を強発現させた培養糸球体上皮細胞ではTGF-betaを作用させない状態でもみられることを確認した。以上の結果と、WT, miR-143それぞれの塩基配列からWT1がmiR-143の直接のターゲットである可能性が低いことから、miR-143が未知のターゲット遺伝子の発現低下を介してTGF-betaシグナルを増幅していると考えた。そこで、以下の方法でそのターゲット遺伝子の同定を試みた。1)ウェブツールを用いてmiR-143のターゲットとなり得る遺伝子群を調べ、そのなかでTGF-betaシグナルを抑制する可能性があるもの候補として選択。2) miR-143を強発現させた培養糸球体上皮細胞を用い、ウエスタンブロット法でこれら候補の遺伝子の蛋白発現を解析し、コントロールに比べmiR-143を強発現させた細胞で蛋白発現が低下したものを選ぶ。3)選択した遺伝子について、3'UTRレポーターベクターを用いてレポーターアッセイを行い、miR-143を導入した細胞でコントロールに比しレポーター活性が低下したものをターゲット遺伝子とする。これまでのところ、上記2)の段階で、複数の遺伝子についてウエスタンブロットで解析を行ったが、残念ながら蛋白発現が低下したものはみつかっていない。TGF-betaのシグナルを抑制することが知られており、かつその配列からmiR-143のターゲット遺伝子となる可能性のある分子の中で、miR-143の強発現させることで発現が低下するものを培養糸球体上皮細胞を用いて探索しているが、現時点で同定されていない。我々は、TGF-beta1による糸球体上皮細胞障害に関与するmicroRNAを同定するため、TGF-beta1を作用させた培養糸球体上皮細胞を用いてmiicroRNA microarray解析を行い、TGF-betaにより発現量が有意に変化したmicroRNAのうち、最も変化量が多く、発現が亢進したmiR-143に着目し、解析をすすめた。まず、TGF-betaでmiR-143の発現が上昇することを定量的RT-PCRで確認した。次に、miR-143高発現の機能意義を調べるため、レンチウイルスベクターを用いて培養糸球体上皮細胞にmiR-143を高発現させ、表現型を解析した。その結果、miR-143を高発現させた培養糸球体上皮細胞では、コントロールと比べてWT1の発現が低く、また、type Iコラーゲンの発現が高いことが分かった。

TGF-beta1は糸球体上皮細胞のWT1発現を低下させ、また、type Iコラーゲンの発現を上昇させることが知られていることから、miR-143はTGF-betaの作用を増強する可能性が考えられた。また、Smadのレポーターアッセイを行ったところ、miR-143を高発現した糸球体上皮細胞ではSmadの活性が上昇することが分かった。このことから、miR-143はSmadの活性を上昇させることでTGF-betaの作用を増強させることが示唆された。microRNAは、ターゲットの遺伝子の翻訳を抑制することでその作用を発揮することが知られているが、多数存在するターゲットの候補の中で、どの分子がmiR-143で実際にターゲットとなって発現が低下し、それによって、TGF-betaのシグナルを増強するかは現時点では分かっていない。培養糸球体上皮細胞において、TGF-betaによりmiR-143の発現が亢進すること、miR-143がTGF-betaによるWT1の発現低下やtype Iコラーゲンの発現増強作用を増幅することを示した。また、miR-143がSmadシグナルを増強することによりTGF-betaの作用を増強することを示した。しかし、その作用が、miR-143のどのターゲット分子の発現抑制を介しているかが解明されていない。まず、TGF-beta1を作用させた培養糸球体上皮細胞において、コントロールの細胞と比べ、miR-143の発現が有意にに上昇することをmicroarrayとRT-PCRでで確認した。次に、レンチウイルスベクターを用いてmiR-143を高発現させた培養糸球体上皮細胞を用いて、以下のようにmiR-143の機能解析を行った。Smadのレポーターアッセイでは、コントロールの細胞と比べ、miR-143を高発現させた細胞でSmadの活性が上昇することが示された。また、ウエスタンブロットとRT-PCRによるWT1の発現解析により、miR-143を高発現させた培養糸球体上皮細胞ではWT1の発現が低いことが示された。これらは正常糸球体上皮細胞にTGF-beta1を作用させた時と同様の形質の変化であった。以上より、糸球体上皮細胞において、miR-143はTGF-beta1により発現が増強し、発現増強したmiR-143はTGF-beta1の作用を増強させWT1の低下を惹起させることにより、糸球体上皮細胞障害障害を引き起こすと考えられた。今後は、miR-143をノックダウンした糸球体細胞を用いて、TGF-beta1による細胞の形質変化が抑えられるかどうか解析する予定である。また、miR-143とクラスターを形成し、同様に発現制御されていると考えられているmiR-145について、TGF-beta1により発現が増強するかどうかを調べる予定である。更に、TGF-beta1トランスジェニックマウスの腎組織を用いてmiR-143の局在や発現上昇を確認したいと考えている。miR-143がTGF-betaの作用を仲介しているかどうかについては、miR-143をノックダウンした糸球体上皮細胞でTGF-beta1の作用が減弱することを示す必要があるが、それが行えていない。
顔年齢が衝動性や抑制判断に及ぼす影響.子供の顔は衝動性を抑制させるのか?-

本研究は,子どもの顔の認知が成人の行動に影響するかどうかを検討するため,実験社会心理学的アプローチ,認知心理学的アプローチ,発達心理学的アプローチにより実験を行った.その結果,子どもの顔は危険行動を抑制すること,自意識が高い成人や親子間関係が不安定な成人ほど子どもの顔に対する反応が遅いこと,葛藤を伴う顔判断は,両側前頭前野が関係している可能性が示唆された.また,月経周期における排卵期の成人女性は,子どもの顔より成人男性に対して反応しやすいことが示された.これらのことから,子どもの顔の認知は成人の行動に影響することがわかった.本研究は,子どもの顔の認知が成人の行動に影響するかどうかを検討するため,実験社会心理学的アプローチ,認知心理学的アプローチ,発達心理学的アプローチにより実験を行った.その結果,子どもの顔は危険行動を抑制すること,自意識が高い成人や親子間関係が不安定な成人ほど子どもの顔に対する反応が遅いこと,葛藤を伴う顔判断は,両側前頭前野が関係している可能性が示唆された.また,月経周期における排卵期の成人女性は,子どもの顔より成人男性に対して反応しやすいことが示された.これらのことから,子どもの顔の認知は成人の行動に影響することがわかった.平成21年度は、購入した光イメージング脳機能測定装置を用いて、葛藤課題における異なる年齢の顔刺激(幼児・成人の顔)を提示することにより、顔の年齢が課題に及ぼす影響について検討した。実験参加者に課した課題は、他者の顔に対して魅力的かどうかという客観的魅力判断課題と、自分より魅力的かという自己関連魅力判断課題であった。子どもの顔に対しても、単に可愛いかどうかという客観的魅力判断と、可愛さを基準にして自分の子供にしたいかどうかという自己関連魅力判断を課した。実験で用いた自分より美人かどうかというような優劣をつける判断は、表面的には出しにくい判断で一種の葛藤課題であるといえる。このようなネガティブな感情判断を抑制する場合、両側前頭前野が活性化することが報告されている(Hooker et al., 2010)ことから、本実験では、両判断に関する反応時間と脳血流の変化の2指標を用いて測定した。その結果、自己関連魅力判断は、客観的魅力判断に比べ判断しにくいことから、認知的葛藤が生じやすいと考えられ、感情抑制の先行研究と同様に両側前頭前野が関係する可能性が示唆された。本研究の結果は、顔に対するネガティブな判断をした際には、葛藤が生じそれが行動抑制につながる可能性があることを示唆している。近年、児童虐待の発生件数が多くなっているが、虐待する側の行動特性について、認知的側面からはあまり研究されていない。本研究の意義は、子供を含む顔の認知と衝動性特性、および前頭葉機能課題に関する研究結果より、虐待する側の行動特性の基礎データを得られることにある。平成22年度は、メンタライジングという観点から幼児の顔の表情に対する視線方向の効果について検討した。例えば、泣いている幼児の顔に成人女性が視線を向けていない状況を見たとき、この女性は、幼児に無関心かもしれないと解釈することができる。「メンタライジング」の発達は、発達初期に形成される母子関係と関係があり、その後の人間関係全般に強く影響を及ぼすことが示唆されている。例えば幼児期に安定した愛着を形成していた青年は不安定愛着型の青年よりも,対人関係や感情制御能力が高かったことが報告されている。本実験では、成人女性の視線が幼児の顔(笑顔・泣き顔)を向いている状況、向いていない状況という仮想母子相互作用状況場面下で、実験参加者の親子関係の安定度の違いが視線方向判断にどう影響するのかを検討した。実験では、コンピュータ画面の中央に、正面向きの成人女性の顔を提示し、その後、視線のみ左右いずれかの方向を向いた画像を提示した。同時に両側のいずれかに幼児の顔を提示した。実験参加者の課題は、成人女性の視線方向を判断することである。実験参加者には、前もって親子関係尺度を課しており、親子関係の信頼度の高低で、視線判断時の反応時間に違いが見られるかどうかを検討した。その結果、視線方向判断は、実験参加者の親子関係の安定度によって違いがみられた。親子関係の安定度が低い場合、視線の方向だけではなく、幼児の表情も加味した全体的な状況で判断する傾向があり、特にネガティブな状況下で何らかの心的葛藤により判断が遅れることが示唆された。愛着を含めた親子関係とその後の対人関係能力に関しては、発達という観点から論じられることが多いが、本研究の意義は、親子関係の安定度が視線方向判断という認知的側面にも影響することを示した点で評価されると考えられる。本研究の意義は、子どもの顔の認知と月経周期、母性に関する研究結果より、虐待する側の行動特性の基礎データを得られることにある。平成23年度は,Gaze Cuingパラダイムを用いて,幼児の顔および成人男性の顔に対する注意抑制について検討した。実験1では,母性の観点から検討した.実験1では、成人女性の視線が幼児の顔(笑顔・泣き顔)を向いている状況、向いていない状況という仮想母子相互作用状況場面下で、実験参加者の親子関係の安定度の違いが視線方向判断にどう影響するのかを検討した。実験参加者には、前もって親子関係尺度を課していた.その結果、視線方向判断は、実験参加者の親子関係の安定度によって違いがみられた。

親子関係の安定度が低い場合、視線の方向だけではなく、幼児の表情も加味した全体的な状況で判断する傾向があり、特にネガティブな状況下で何らかの心的葛藤により判断が遅れることが示唆された。実験2では,月経周期の観点から実験を行った.女性の場合、妊娠可能性が高い時期にはより「男性的な顔」を好むようになること,さらに、女性は男性に比べると子どもの顔に敏感なことが報告されており、配偶者として男性の顔を認知するだけではなく、子孫としての子どもの顔に特異的な反応をすることが示唆されている.実験2では、視線の向いている場所にターゲットである子どもの顔が提示されたときに,妊娠可能性が高い実験参加者は視線判断が早くなるかどうか,また妨害刺激(男性顔)が視線判断に影響するのかどうかも検討した.その結果,妊娠可能性高群は,低群に比べて妨害刺激(男性顔)が提示されると,妊娠可能性高群の視線判断は低群に比べて影響されることがわかった.これらのことから,顔の認知は実験参加者の母性や月経周期の影響を受けることが示唆された.
砂地盤の液状化が杭の地震時水平抵抗に及ぼす影響

砂地盤の液状化過程における杭構造物地盤系の挙動を明らかにするため、大型せん断上槽を用いて、杭構造物地盤系の振動実験を行なった。地盤の密度、杭構造物系の固有周期、杭径、杭の曲げ剛性等を変化させて行なった実験結果を比較検討して得られた、杭・構造物系の挙動は以下の通りである。液状化の進行に伴って、地表面の加速度応答倍率のピ-クが最大となる周波数が低くなり、同時じ応答倍率も低くなり、これに伴って、剛性の低い杭の加速度応答倍率も同様に変化する。しかし、剛性の高い杭では、液状化後は地盤より高い固有周波数で振動している。このことは、杭頭変位に、剛性の低い杭では液状化前後とも地盤変位にほぼ等しいが、剛性の高い杭では、液状化後急激に小さくなっていることに対応している。また、地表面付近に非液状化層がある場合、杭頭変位はつねに地盤変位と一致するため、全層の地盤が液状化する場合により杭に不利な強制変形が与えられる可能性があることが分った。この結果杭頭に発生する曲げモ-メントは、杭頭に発生した加速度よりも地盤変形と良い相関関係のあることが明かとなった。次に、液状化過程における杭の水平地盤反力係数のモデル化を行ない、さらにこのモデルを組入れた有効応力法による杭構造物・地盤系の応答解析を行なって、上記実験結果と比較することにより、解析モデルの妥当性と作成した解析法の有効性を検討した。解析によって求められた、杭頭変位曲げモ-メントと加速度等の時刻歴は、剛性の高い杭、低い杭とも、実験結果と良く対応していた。また解析結果の、液状化前後の杭頭加速度のフ-リエスペクトル変化の傾向及びその卓越周期の変化等も、実験と良く対応していた。以上の一致から、開発した解析モデルと解析手法の有効性が示された。液状化過程における杭構造物地盤系の動的挙動を把握する目的で,大型せん断土槽中に杭ー構造物ー地盤系模型を作成し,水平振動実験を行なった.その際,杭の曲げ剛性,杭径,入力波,地盤密度,液状化層厚を変化させてその動的挙動に与える影響を調べた.地表面の振動台に対する加速度応答倍率のピークは,液状化と伴に10Hz付近から1Hzへと移行し,その倍率を低下させている.これに対応して,剛性の低い杭では,杭頭加速度応答倍率は地表面と同様に変化している.一方,剛性の高い杭は液状化後,この杭ー構造物系の空中での固有振動数で振動し地盤と独立した挙動をしている.この結果,加振中の地表面変位と杭頭変位は,杭剛性の低い場合,液状化全過程で一致しているのに対し,高い場合,液状化の進行に伴って杭頭変位が小さくなっている.これらの結果は,液状化した地盤と杭構造物系の相互作用として説明できる.地表面付近に地盤反力が低下しない非液状化層がある場合,杭頭変位は地表面変位とほぼ一致した.このことは,非液状化層が液状化層の上にあって大きな変位をする場合非液状化層により杭が強制変形させられる可能性を示している.振動実験で生じた杭頭曲げモーメントの最大値と,その時刻付近で杭頭に発生した最大加速度を慣性力として杭頭に加えた時に生じる曲げモーメントの関係は,特に剛性の高い杭で前者の方が大きく,両者に良い相関が認められない.しかし,各振動実験の地表面最大変位だけ杭頭を空中で静的に変位させた時に生じる曲げモーメントと振動実験で生じた曲げモーモントの最大値は良く一致している.

このことは,地盤の変形を予測することが液状化層を貫く杭の設計において重要であることを示している.液状化過程における杭構造物地盤系の挙動を明らかにするため、大型せん断土槽を用いて、杭構造物地盤系の振動実験を行った。この際、地盤の密度、杭構造物系の固有周期、杭径、杭の曲げ鋼性等を変数とした。実験結果に認められた、杭・構造物系の挙動は以下の通りである。液状化の進行に伴って、地表面の加速度応答倍率のピークは、10H_2から1H_2へと変化し、これに伴って、鋼性の低い杭の加速度応答倍率も低周波数へ移行している。しかし、鋼性の高い杭では、液状化後地盤より高い固有振動数で振動している。この結果、杭頭変位は、鋼性の低い杭では液状化前後とも地盤変位にほぼ等しいが、鋼性の高い杭では、液状化後急激に小さくなっている。また、地表面付近に非液状化層がある場合、杭頭変位はつねに地盤変位と一致するため、全層の地盤が液状化する場合より杭に不利な強制変形が与えられる可能性がある。実験結果を説明するため、液状化過程における杭の水平地盤反力係数のモデル化を行った。骨格曲線はROモデルで与え、有効応力の低下は初期鋼性を低下することにより再現した。上記、杭の水平地盤反力係数モデルを組込んだ杭地盤構造物系の応答解析プログラムを作成し、上記実験結果と比較することにより、解析モデルの妥当性を検討した。解析上の各質点等を実験の測定点と一致させ、さらに地盤変位を解析モデルに強制変位として与えることにより、不確定要因を減少させ、解析と実験の比較を容易にさせた。解析によって求められた、杭頭変位と加速度の時刻歴は、鋼性の高い杭、低い杭とも、実験結果と良く対応していた。また、液状化前後の杭頭加速度のフーリエスペクトルの変化についても、解析結果は実験と良く対応していた。以上の一致から、開発した解析法の有効性が検証された。砂地盤の液状化過程における杭構造物地盤系の挙動を明らかにするため、大型せん断土槽を用いて、杭構造物地盤系の振動実験を行なった。地盤の密度、杭構造物系の固有周期、杭径、杭の曲げ剛性等を変化させて行なった実験結果を比較検討して得られた、杭・構造物系の挙動は以下の通りである。液状化の進行に伴って、地表面の加速度応答倍率のピ-クが最大となる周波数が低くなり、同時に応答倍率も低くなり、これに伴って、剛性の低い杭の加速度応答倍率も同様に変化する。しかし、剛性の高い杭では、液状化後は地盤より高い固有周波数で振動している。このことは、杭頭変位は、剛性の低い杭では液状化前後とも地盤変位にほぼ等しいが、剛性の高い杭では、液状化後急激に小さくなっていることに対応している。また、地表面付近に非液状化層がある場合、杭頭変位はつねに地盤変位と一致するため、全層の地盤が液状化する場合より杭に不利な強制変形が与えられる可能性があることが分った。この結果杭頭に発生する曲げモ-メントは、杭頭に発生した加速度よりも地盤変形と良い相関関係のあることが明らかとなった。次に、液状化過程における杭の水平地盤反力係数のモデル化を行ない、さらにこのモデルを組入れた有効応力法による杭構造物・地盤系の応答解析を行なって、上記実験結果と比較することにより、解析モデルの妥当性と作成した解析法の有効性を検討した。解析によって求められた、杭頭変位曲げモ-メントと加速度等の時刻歴は、剛性の高い杭、低い杭とも、実験結果と良く対応していた。また解析結果の、液状化前後の杭頭加速度のフ-リエスペクトル変化の傾向及びその卓越周期の変化等も、実験と良く対応していた。
分子シャペロンのX線結晶構造解析

分子シャペロンは,ほどけたポリペプチドのフォールディングを助け,タンパク質としての機能を与える.あるいは逆に,固くまとまってしまったポリペプチドを一度ほどくことによって再利用したり,脂質膜で隔てられた領域の間を効率的に輸送したりすることを可能にしている.このようなポリペプチドの動的な構造変化に応じて,分子シャペロン自身も構造を変化させる.本研究では,シャペロン分子全体の結晶構造を決定し,ATP加水分解に伴う構造変化とシャペロン機構についての構造基盤を確立することを目的とした.リボソームで合成されたばかりのポリペプチド鎖のフォールディングを助けるDnaK・DnaJ・DafA複合体,および,小胞輸送の最終段階で膜小胞と標的膜との融合で働くNSFを解析対象として研究を開始した.DnaK・DnaJ・DafA複合体については4.4Å分解能の回折データセットを収集したが構造決定までには至らなかった.DnaJ単体についても3.2Å分解能の回折データセットを収集したが,回折の異方性が高く構造を決定することができなかった.酵母のNSFであるSec18Pについては,10種類の発現コンストラクトについて様々なアデニンヌクレオチド存在下での結晶化スクリーニングを行なったが結晶は得られなかった.一方,ATPに依存した膜透過を行なう膜透過装置複合体SecDFおよびSecYEについて,京大ウイルス研の伊藤維昭教授との共同研究を行なって来た.好熱菌由来のSecDFおよびSecYEについて,分解能3.7Åおよび3.2ÅのMAD回折データセットを収集した.SecYEの構造は,Fabフラグメントとの複合体の状態で3.14Å分解能で決定した(R_<free>=0.32).機能上重要であると示されている領域の電子密度も比較的明瞭であり,膜透過メカニズムがより詳細に明らかになるものと考えている.分子シャペロンの作動機構を解明する上で,反応に伴う構造変化の一コマ一コマにあたる立体構造を決定することは重要である.GroEL・GroES複合体などのいくつかの巨大なシャペロン分子では,分子全体の結晶構造が決定されている一方で,未だにドメイン構造のみが知られており,ドメインどうしの相対的な配置,さらには,ATPの加水分解によって生じるダイナミックなドメインの再配置を知る上で重要な全体構造が決定されていないシャペロンがいくつかある.本研究では,そういったシャペロンのうち,リボソームで合成されたばかりのポリペプチド鎖のフォールディングを助けるDnaK・DnaJ・DafA複合体,および,小胞輸送の最終段階で膜小胞と標的膜との融合で働くNSF(N-ethylmaleimide sensitive factor)について,シャペロン分子全体の結晶構造を決定し,それぞれについて,ATP加水分解に伴う構造変化とシャペロン機構についての構造基盤を確立する.今年度は,高度好熱菌Thermus thermophilus由来のDnaK・DnaJ・DafA複合体およびDnaJの結晶学的解析および酵母のNSFであるSec18pの結晶化条件の探索を行なった.DnaK・DnaJ・DafA複合体の結晶は,空間群、P3_121(あるいはP3_221)に属し,格子定数は,a=b=215Å,c=149Åであった.分解能4.4Åまでの回折データをSPring8 BL41XUにて収集した.多波長異常分散法(MAD法)による位相決定のために,セレノメチオニンを導入したタンパク質の結晶を得て,6Å分解能の回折データを収集したが,位相を決定するには至らなかった.今後は,重原子同型置換法による位相決定も並行して試み,4Å分解能での構造決定を試みる.DnaJの結晶は,空間群P3_121(あるいはP3_221)に属し,格子定数は,a=b=69Å,c=277Åであった.分解能3.2Åまでの回折データをSPring8 BL41XUにて収集した.DnaJにっいても,セレノメチオニンを導入したタンパク質の結晶をつかって,MAD法による位相決定を試みている.Sec18pについては,N末あるいはC末を削った変異体をつかって,さまざまなヌクレオチド結合型での結晶化を試みたが,結晶を得るには至らなかった.分子シャペロンは,ほどけたポリペプチドのフォールディングを助け,タンパク質としての機能を与える.あるいは逆に,固くまとまってしまったポリペプチドを一度ほどくことによって再利用したり,脂質膜で隔てられた領域の間を効率的に輸送したりすることを可能にしている.このようなポリペプチドの動的な構造変化に応じて,分子シャペロン自身も構造を変化させる.本研究では,シャペロン分子全体の結晶構造を決定し,ATP加水分解に伴う構造変化とシャペロン機構についての構造基盤を確立することを目的とした.リボソームで合成されたばかりのポリペプチド鎖のフォールディングを助けるDnaK・DnaJ・DafA複合体,および,小胞輸送の最終段階で膜小胞と標的膜との融合で働くNSFを解析対象として研究を開始した.DnaK・DnaJ・DafA複合体については4.4Å分解能の回折データセットを収集したが構造決定までには至らなかった.DnaJ単体についても3.2Å分解能の回折データセットを収集したが,回折の異方性が高く構造を決定することができなかった.酵母のNSFであるSec18Pについては,10種類の発現コンストラクトについて様々なアデニンヌクレオチド存在下での結晶化スクリーニングを行なったが結晶は得られなかった.

一方,ATPに依存した膜透過を行なう膜透過装置複合体SecDFおよびSecYEについて,京大ウイルス研の伊藤維昭教授との共同研究を行なって来た.好熱菌由来のSecDFおよびSecYEについて,分解能3.7Åおよび3.2ÅのMAD回折データセットを収集した.SecYEの構造は,Fabフラグメントとの複合体の状態で3.14Å分解能で決定した(R_<free>=0.32).機能上重要であると示されている領域の電子密度も比較的明瞭であり,膜透過メカニズムがより詳細に明らかになるものと考えている.