hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
放線菌が生産する生物活性物質のユニークな構造の形成に関与する酵素・遺伝子の解析

多種多様な生物活性物質を生産する放線菌においてユニークな構造を有する化合物の生合成遺伝子は未だに解明されていないものも多く、その生合成機構を解明することは、学術的、応用的な面からも興味深いものがある。そこで、その生合成に関与する遺伝子を取得し、ユニークな構造を形成するための生合成遺伝子・酵素の解析を行なった。放線菌Streptomyces sp. 2238-SVT4が生産するhatomarubigin ADは、アングサイクリン抗生物質に属しており、このうちhatomarubigin Dは2分子のhatomarubigin Cがメチレンを介して結合したユニークな構造を有している。アングサイクリン生合成に特徴的なアロマターゼおよびサイクラーゼ遺伝子の周辺領域35kbpの塩基配列を決定したところ、30kbpにわたるアングサイクリン生合成遺伝子クラスター(hrbクラスター)が見出された。そこで、本遺伝子クラスターがhatomarubigin生合成遺伝子であるかどうかを検討した。hrbクラスターは30個のORFからなるが、アングサイクリンの生合成に必須な遺伝子は、前半の25個のORFに含まれていた。そこで、hrbR1hrbXの25遺伝子をStreptomyces lividansTK23株で発現させて、代謝産物をHPLC分析したところ、hatomarubigin A、B、Cの生産が確認され、hrbわクラスターがhatomarubigin生合成遺伝子であることが明らかになった。また、HrbYの組換え酵素を用いた反応によりhatomarubigin Cからhatomarubigin Dへの変換が確認されたことから、hatomarubigin Dの生合成におけるメチレン架橋には、HrbYが関与することが明らかとなった。
グリア細胞における化学伝達物質およびそのレセプターの制御機構の解明

脳が機械的損傷やウイルス感染などを受けると活性化アストロサイトが出現するが、その活性化機構や機能的な役割はまだよく分かっていない。昨年度までの報告で、我々が作成した、SNAP-25変異マウスの脳で、生後10週齢頃から抗GFAP抗体で強染色される活性化アストロサイトが、大脳皮質や海馬を中心に出現することを見いだした。本年度はSNAP-25変異マウスの脳で見られる活性化アストロサイトの性質を明らかにするため、様々な抗体を用いて免疫組繊化学解析を行った。イムノプロット解析から変異マウスの脳ではBDNF発現も上昇することが明らかとなったため、抗BDNF抗体を用いて免疫組繊化学解析を行ったところ、活性化アストロサイトに強い陽性反応を見いだした。さらに様々な抗体を用いて網羅的染色を行った結果、GDNFやSynaptogyrinに対しても陽性反応を示すことが明らかとなった。興味深いことにBDNF陽性の活性化アストロサイトは海馬や大脳皮質に存在しているのに対し、Synaptogyrin陽性細胞は海馬に、GDNF陽性細胞は海馬歯状回に限定して見いだされた。これらの結果からアストロサイトには、活性化の度合いや機能の違いによる多様性が存在することが考えられた。さらに活性化アストロサイトからの神経栄養因子の分泌機構を明らかにするため、ラット由来のグリオーマ細胞にBDNFを発現させたところ、細胞内顆粒に貯蔵され、Ca2+依存的な機構で放出されることが明らかとなった。グリア細胞が活動依存的にグルタミン酸を放出し、神経回路の制御に関わっていることが明らかにされつつあるがその詳しい機構は明らかではない。この問題を明らかにするため本年度は次のような実験をおこなった。単層培養したラットアストロサイトをCa^<2+>イオノフォア処理するとグルタミン酸およびアスパラギン酸放出が大きく促進された。外液中にはアラニン、グリシン、バリンなども検出されたが、その量はイオノマイシン処理で変動していなかった。グルタミン酸の放出速度はイオノマイシン処理後徐々に増加し、処理後10分でほぼ最大に達した。細胞のホモジネートをイムノブロット解析した結果、アストロサイトからのグルタミン酸放出には神経細胞と一部共通のタンパク質を用いているが、異なるタンパク質も関与していることが示唆された。C6B、354A、RN-2、G-26、T98Gなどのグリア細胞株のグルタミン酸放出能の有無を調べたところ、いずれの細胞も、イオノマイシン刺激でグルタミン酸を放出する機能を保持していることが明らかとなった。グリア細胞のグルタミン酸含有小胞の単離法を確立するため、抗VAMP-2抗体を架橋した磁気ピーズを用いて、ラット脳からVAMP-2含有小胞を精製し、TOF-MS解析によって構成タンパク質を同定することが可能となった。グリア細胞膜上に、グルタミン酸放出に関わる特定の部位が存在するか否かを明らかにするため、細胞膜の構造を2次元的に解析する方法の確立を試みた。その結果カバーグラス上に単層培養したPC12細胞を超音波処理することにより、カバーグラス上に細胞膜のみを残した細胞膜シートを再現良く作成することが可能となった。SNAREタンパク質を介した開口放出は、生理活性物質の放出や、細胞膜へのレセプターの組込などに重要な役割を果たしている。これらの機能の発現がグリア細胞でどの様に制御されているかを明らかにするため、生後2日のラット脳より調製し培養下においたアストログリア細胞を用いて解析を行った。イムノブロット解析によってSNAREタンパク質としてVAMP-2、-3、-4、SNAP-23、Syntaxin2、3、6、13、16などの発現が確認されたが、小胞性グルタミン酸トランスポーターは検出できなかった。神経のシナプスのアクティブゾーンに存在するタンパク質では、BassoonやPiccoloは確認去らなかったが、CAST抗体と反応するタンパク質の発現が確認できた。イオノマイシンを作用させると顕著なグルタミン酸遊離が認められたが、この遊離はBAPTA-AMによって抑制されなかった。一方、ヒト成長ホルモンを発現させると、細胞内に顆粒状構造に蓄積され、イオノマイシンやATP刺激で放出が引き起こされた。この放出はBAPTA-AMや破傷風毒素によって抑制されたことから、SNARE依存的な開口放出によると考えられた。グルタミン酸レセプターとしてはGluR1とGluR2の発現が確認できたが、修飾糖鎖の殆どは高マンノース型であり、大部分は細胞内膜系に留まっていると推察された。以上のことから培養したアストロ細胞には開口放出装置やレセプターの組込装置が存在するが、現在の培養条件化では未成熟な状態で留まっていると考えられた。昨年度我々は培養したラット脳のアストログリア細胞にヒト成長ホルモンを一過的に発現させると細胞内に顆粒状構造に蓄積され、イオノマイシンやATP刺激を加えるとCa^<2+>およびSNARE依存的な機構で開口放出されることを報告した。本年度はグリア細胞からの開口放出がタンパク質リン酸化によって制御されるかを明らかにするためPKCの作用を検討した。アストログリア細胞を1μMのphorbol-12-myristate-13-acetate(PMA)で15分間前処理をするとATP誘発性のヒト成長ホルモン放出が顕著に抑制された。

この抑制はPKCの特異的阻害剤であるbisindolylmaleimide I(BIS,5μM)で解除されることからPKC依存的なリン酸化を介したものであると考えられた。培養したアストログリア細胞をPMAで処理した後イムノブロット解析を行うと、SNAP-23のバンドの移動度が部分的に遅くなり、この変化はBISを加えると見られなくなった。以上の結果からアストログリア細胞では神経細胞とは大きく異なり、PKCによって開口放出が抑制的に制御されており、その制御にSNAP-23のリン酸化が関与している可能性が考えられた。SNAP-23のリン酸化の役割を明らかにしていくため、ラット骨格筋のcDNAライブラリーからSNAP-23遺伝子をクローニングした。その結果、従来知られていなかった新しいスプライシングバリアントが存在する可能性を明らかにした。SNAKEタンパク質の一種であるSNAP-25は、神経のシナプスでの神経伝達物質放出や内分泌細胞からのホルモン分泌に必須の役割をはたしている。SNAP-25はPKCによってSer^<187>がリン酸化を受けるが、このリン酸化の役割を明らかにするためS187Aという1アミノ酸変異によるノックインマウスを作成したところ、顕著な情動異常やストレス脆弱性を示すことが明らかとなった。ストレスやストレスホルモンであるグルココルチコイドは脳のアストログリアに大きな作用を及ぼすことが知られているので、ホモ変異体の脳を抗GFAP抗体を用いて免疫染色したところ、海馬や大脳皮質を含む広い範囲で活性化アストロサイトが出現していることが明らかとなった。活性化アストロサイトの出現には部域差が見られ、小脳では認められなかった。アストロサイトの活性化は海馬のイムノブロット解析でも確認され、生後10週までに活性化が起こっていることも明らかとなった。それに対してミクログリアの活性化はより遅い時期にほぼ海馬に限局して起こっていた。この様なグリア細胞の異常活性化が、ホモ変異体で見られるさまざまな情動異常にどのような関連を持っているかを明らかにすることで、情動行動におけるグリア細胞の役割が明らかになると考えられた。PKCによるグリア細胞からの伝達物質放出制御機構を明らかにするため、株化されたラットアストログリオーマ細胞であるC6細胞を用いて解析を行った。C6細胞にヒト成長ホルモンを一過的に発現させると、細胞室内の小胞状の構造に蓄積され、イオノマイシンやセロトニン刺激で細胞外液に放出された。C6細胞をPKCの活性化薬であるPMAで前処理すると、成長ホルモン放出は抑制され、この抑制はPKC阻害剤で回復した。以上の結果はC6細胞においても、グリア細胞からの開口放出がPKCによって抑制的に制御されていることが明らかとなった。脳が機械的損傷やウイルス感染などを受けると活性化アストロサイトが出現するが、その活性化機構や機能的な役割はまだよく分かっていない。昨年度までの報告で、我々が作成した、SNAP-25変異マウスの脳で、生後10週齢頃から抗GFAP抗体で強染色される活性化アストロサイトが、大脳皮質や海馬を中心に出現することを見いだした。本年度はSNAP-25変異マウスの脳で見られる活性化アストロサイトの性質を明らかにするため、様々な抗体を用いて免疫組繊化学解析を行った。
特異超函数を核とした積分作用素とその応用

1.群の作用で不変な超関数の決定問題:本年度の研究のなかで、本研究者は超局所解析の方法によって具体的にこれらを決定する問題に対して一定の進歩をさせた。すなわち、具体的応用に関して重要とおもわれる(既約でない)正則概均質ベクトル空間に対して、その存在する相対不変超関数を実際に決定して見せた。この研究はこれからも継続される。一方で、「可換放物型」の概均質ベクトル空間の不変超函数の決定についての論文を刊行した。2.概均質ベクトル空間への応用:不変超関数を決定するだけでは応用と結び付かない。そのひとつの応用として、概均質ベクトル空間に付随するゼ-タ関数の特殊値および留数の計算がある。これについては、例外群E_7に付随するゼ-タ関数についての研究が進行中である。計算結果は来年度中に発表予定である。3.特異超函数への応用:積分核作用素としての特異超函数の研究は実例の計算が進行中である。特殊な超函数どうしは掛算が可能であることは確かめられたが、積分核作用素と掛算作用素との間の交換関係を決定することができない。4.REGULAR HOLONOMIC MICROFUNCTIONの実表象理論:将来的に発展するであろうという見込みで取り組んでいる研究としては、超局所解析を算術化することを目指したREGULAR HOLONOMIC MICROFUNCTIONの実表象理論の建設がある。この理論の基礎に、実表象の定義の確立があるがこれについては基礎的な部分をまとめている段階である。5.コンピュ-タの利用:これは、従来から問題になっている純粋数学における計算機の利用の一環である。数式処理システム「REDUCE3.3」を有効に活用することによって、概均質ベクトル空間のゼ-タ関数の関数等式にかんするプログラムをいくつか書くことができた。この研究はこれからもより高度な数式処理システムを使うことを目指して続けられる。
識別の根拠が提示できる高信頼メラノーマ自動識別システムの構築

メラノーマの自動診断ならびに、診断根拠の客観的な提示を実現することを主目的に、3年間研究に取り組んだ。我々はメラノーマ診断の臨床で用いられるABCDルールおよび7-point checklistの全項目について、皮膚科医と同等の推定精度を得るモデルを実現した。また近年の深層学習技術を応用し、学習時間を大幅に削減しつつ熟練と皮膚科医と同等以上の識別精度を実現した。診断が難しく早期発見が極めて重要なメラノーマの自動診断技術開発に関して、その信頼性を高めるべく、診断の根拠が提示できるシステムの開発に向けた研究を実施してきた。目標実現をより確実なものにするため、当初の計画していた(1),(2)に加え、近年提案されてきた深層学習に基づく(3)を加え、大きく分けて以下の3つの内容について研究を実施した。(1)臨床で用いられる診断指標を目的変数とした回帰モデルの作成:臨床現場で用いられるABCDルールや7-point checklistと呼ばれる計15の診断指標となる数値を画像から推定した。230枚の皮膚ダーモスコピー(皮膚科専用の診断用ルーペ)画像に対して、5人の皮膚科医が診断を行った結果を元に回帰モデルを構築した結果、各診断項目について統計的に皮膚科と同等の推定が行えた。(2)RandomForest(RF)を用いた決定木の構築:識別モデルが木構造となり結論への根拠が直観的に把握できるRFを用いたメラノーマ識別器を構築した。従来の最良手法に匹敵する性能(8割後半)を実現したが、診断根拠の可読性向上のためにTreeの段数を制約した場合では識別精度は8割弱にとどまった。今後の改善が望まれる。機械学習分野で近年高い注目を集めているCNNをメラノーマ識別に応用した。CNNは学習画像の中から識別のために必要な効果的な画像特徴を自動的に抽出し、識別に利用できるため、これまのパターン認識技術で必須であり困難であった腫瘍領域の抽出などの前処理を省略することができる。CNNの学習方法を独自に改良する手法を用いることで、前述の前処理や、特徴設計、抽出といった手法をすべて不要とした上で、従来の最前手法と同等の識別能(8割後半)を達成した。今後、メラノーマ識別の根拠にむけ、獲得された局所特徴の解析を行う。メラノーマの自動診断の際に、利用者に対して理解しやすい形で診断の根拠を提示することで、システムに対する信頼性を向上させることを目的に、高い識別能と、識別の過程の見通しができるRandom Forest識別器を基礎要素に用いた識別システムを構築し改良を続けてきた。高い識別能と、得られる識別の根拠の可読性の両立のため、Random Forestにおいて識別に必要な特徴量を自動選択できる仕組みを開発した。その結果、利用者に理解しやすい腫瘍の色情報のみを用いた識別ルールを提示しながら、およそ8割の精度でメラノーマと母斑の識別を実現した。識別率を追い求める研究は多くあるが、こうした根拠を提示する研究は見当たらず新規性が高い。可読性の高い実用的な識別ルールの提示に重きを置くため、識別能だけを比較すれば既存の最先端の成果に一歩譲るものの、皮膚科医に匹敵する精度を実現することができた。これらの成果は、難易度の高い画像認識の国際会議および、国内の学会で発表を行った。一方、当初の研究テーマとは離れるが、近年機械学習、パターン認識の分野で大きな技術革新を実現しているdeep learning (深層学習)技術のメラノーマ識別問題への応用も始めた。今年度は、深層畳込みニューラルネットワーク(以下CNN)を適用し、これまで培った知見と融合することで、これまで困難であった腫瘍領域抽出を不要としながらも、従来の最先端に匹敵するメラノーマ識別精度を実現した。今後この技術を利用しつつ、本採択課題のメインテーマである診断根拠の提示に結び付けていきたい。当初目標としてきた内容について、研究2年目の現段階においてメラノーマの識別精度の数値目標についてはほぼ達成でき、識別の根拠の提示についても、「if腫瘍辺縁の輝度のばらつきが35.5以下and if腫瘍内部の色が・・・then良性の傾向が強い」のように、if-then形式で識別結果に至る結果を、利用者に比較的わかりやすい腫瘍の色情報のみを用いて、かつifの段数を少なく限定したうえで、提示することができた。上記のように利用できる特徴量を色のみに限定し、かつif節で表される条件の数を制限した状態で、高い識別精度を実現するために、Random Forest識別器における、効果的な特徴量の選択手法を開発できたことは、このテーマの成果だけではなく、他のすべてのパターン認識問題に対して適用できる手法と考えている。一方、これまでの研究成果から前処理として腫瘍画像の色補正処理を加えることで識別精度の向上が期待できないかと、いろいろと検討してきたが、こちらについては現時点でいい結果が得られなかった。また、近年極めて優れた学習アルゴリズムとして注目されているdeep learningの枠組みをもちいた研究も開始した。以上のことから、進捗状況は当初計画したのとほぼ同程度の進捗状況で進んでいると考えている。メラノーマの診断にはdermoscopy (専用のスコープ)が用いられ、診断指標であるABCDルールおよび、7-point check listが使われている。診断は、各項目のスコアの合計値を元に行われる。我々はこれまでの知見からdermoscopy画像から効果的な画像特徴量を計算し、上記評価基準を構成する15項目の全てに対し、皮膚科医と統計的に有意差のない推定するモデルを実現した。

また得られた各スコアに基づき求められた診断結果も、熟練皮膚科医と同等の精度を得ることができ、当初の本申請課題の目標を技術的に達成できた。研究により、人間に理解しやすい上記のような診断指標を数値化した上で識別を行う手法は、直接識別結果のみを推定する従来の機械学習手法により精度が劣ることも確認した。これは人間の「理解しやすさ」に重点をおいた診断指標の限界と考えられる。これらの成果について現在論文執筆中である。また近年、deep learning(深層学習)技術により、様々なタスクで既存の画像認識技術では実現が難しかった高精度での自動識別が可能になってきている。我々は研究のさらなる発展のため、上記で得られた知見を反映させメラノーマの細胞学的特徴を利用した前処理法を開発した。これによりdeep learningにおける大きな課題である長い学習時間を1/9以下にしつつ、従来の最先端結果と同等のメラノーマ識別精度を得た。さらに現在、deep learningにおける転移学習(他の目的で学習された大規模ネットワークを別の用途に応用する)を用いることで、皮膚腫瘍のさらなる高い識別精度ならびに、わかりやすく信頼性の高い診断根拠の提示を目指した研究を進めており、結果を将来公表予定である。メラノーマの自動診断ならびに、診断根拠の客観的な提示を実現することを主目的に、3年間研究に取り組んだ。我々はメラノーマ診断の臨床で用いられるABCDルールおよび7-point checklistの全項目について、皮膚科医と同等の推定精度を得るモデルを実現した。また近年の深層学習技術を応用し、学習時間を大幅に削減しつつ熟練と皮膚科医と同等以上の識別精度を実現した。これまでの研究の下地の上に1年間の研究を実施することで、上記の(1)-(3)はいずれも数値上、目標値、あるいはそれに準ずる結果を実現することができた。一方で、構築するシステムは実用性、信頼性確保のため、より多くのデータに基づきロバストで普遍的なものでなければならない。そのため各項目に対する自己評価の達成度は、(1)80%、(2)60%、(3)50%としたい。上記(1)では熟練皮膚科医と同等の診断指標の推定が実現でき、実施した手法の有効性が裏付けられたが、モデル構築の元となる教師データを得られた症例数が230にとどまった。これは教師データ作成にかかるコストが極めて高い(1症例ごとに複数の熟練皮膚科に大変手間のかかる仕事を依頼する必要があり、時間的負担が大きい)ためである。今後、時間をかけて解析できるデータ数を増加させ、より信頼性の高いモデルを構築する必要がある。RFを用いた(2)についても、識別の根拠の提示を実現しているが、より可読性の高い根拠の提示には、より状況を説明できる高い普遍性を持つ説明変量(画像特徴)が必要であり、今後模索していく必要がある。現在、色補正技術との組み合わせで、少ない段数で明確な識別ルールの開示に向けて研究を続けている。
水星ナトリウム大気の研究

2006年6月から7月にかけてアメリカ合衆国ハワイ州ハレアカラ山頂においてナトリウム大気光観測を行った。本観測では世界で初めてファブリペロー干渉計を用いて水星ナトリウム大気発光を捉えることができた。従来の分光器を用いた観測と異なり、ファブリペロー干渉計を使用することで広い観測視野が得られた。ナトリウム大気の広域分は複数の画像の合成によって得られており、観測時間の制限から分布の一部しか捉えられていなかったが、本観測により広域分布が抜け落ちなく捉えられた。水星ナトリウム大気は太陽輻射圧を受け反太陽方向に引き延ばされた尾状の形(ナトリウム尾)を成しているということは既に予想されていたが、これまでに行われた観測で得られたデータでは明らかにはなっていなかった。太陽放射圧は水星の公転軌道上の位置によって異なるため本観測ではそれが最大になる時期に観測を行い、尾状のナトリウム大気の観測に成功した。この結果から光電離の時定数が見積もられ過去の研究による予想値と誤差の範囲内で一致するということが分かった。昨年12月に岡山天体物理観測所で行った日中の水星ナトリウム大気光観測結果の解析を行った。過去の観測結果から水星大気密度の時間変動は太陽風フラックスの時間変動に伴いスパッタリングによって地表から放出される量が変動することが原因であると推測されていたが、本研究では2005年12月の観測結果とACE衛星によって観測された太陽風フラックスの変動を比較し本観測期間中においては太陽風スパッタリングによる放出は主な過程ではなく、太陽紫外線による光脱離の方が主な放出過程である、という結論を得た。本年度前期は周回衛星から水星大気光の撮像を行う観測器用のファブリペロー干渉計(Fabry-Perot Interferometer:以下FPI)の開発を行った。FPIは狭帯域干渉フィルタと2枚の透過型反射鏡を平行に並べたエタロンを用いて分光観測を行う装置である。従来のFPIは温度変化に対して大きく透過波長が変わるため、通常は温度を1°C程度以下の精度で固定して使用される。しかし、水星周回衛星に搭載した場合±30°C程度の温度変化が予想され、これに対して透過波長が変わらないようにする必要がある。本年度は2枚の別個の鏡を用いるエタロンと平面ガラスの両面に反射膜を蒸着したソリッドエタロンの性能比較を行った。結論として、温度ドリフトを抑えた干渉フィルタを使い、2枚の鏡を用いたエタロンを2組搭載し片方を±10°C程度の精度で温度調節することで、温度による透過波長の変化の無いファブリペロー干渉計を用いるのが最良の方法であるという結果を得た。2004年12月に水星周回衛星BepiColomboMMO搭載用大気光カメラにファブリペロー干渉計の採用が決定されている。本年度後期は2005年3月のハワイ・ハレアカラ観測所における水星ナトリウム大気光の地上観測に向けて準備を行った。水星は太陽に近いため低高度での観測となり、地球大気の状態によって像のボケが大きくなる。そのため地球大気が安定している観測場所を選ぶ必要がある。水星は明るいため可搬型望遠鏡を用い、分光するためにファブリペロー干渉計を用いて観測を行った。本観測では世界で初めて水星ナトリウムの尾状構造を1枚の画像に捉えることに成功した。本年度前期は2005年12月に岡山天体物理観測所にて共同研究課題として採択された、日中の水星大気観測を行なうための準備として、5月に東北大学惑星圏飯舘観測所で日中に水星の観測を行い、晴天であれば日中でも空の背景光差し引きすることで水星ナトリウム大気発光の輝線が捉えられることを確認した。また8月には岡山天体物理観測所にて試験観測を行い、水星を導入、追尾することが可能であることが確認できた。これら準備の段階で追尾用の望遠鏡駆動ソフトの改良や、ガイド系に赤色フィルタを用いることで青空の光をなるべく落とすという工夫が有効であることも確認できた。12月の本観測では4時間にわたる追尾を行ない、4時間の間に密度が7パーセント増減しているという結果が得られた。(この結果については現在解析途中である。)2006年1月には周回衛星から水星大気光の撮像を行う観測器用のファブリペロー干渉計(Fabry-Perot Interferometer:以下FPI)の熱真空試験を行なった。しかし、水星周回衛星に搭載した場合20±40°C程度の温度変化が予想され、これに対して透過波長が変わらないようにする必要がある。本年度は、温度調節機構を取り付けた2組のエタロンで構成されるタンデムエタロンを試作し熱真空試験を行なった。その結果、-20°C、+60°Cの環境においてもヒータが動作すること、冷却後常温に戻した際に分光特性が変化しないことが確認できた。しかし、-20°C、+60°Cでは装置関数が広がるという結果も得られている。来年度はこの対策として形状の再設計を行なう予定である。

従来の分光器を用いた観測と異なり、ファブリペロー干渉計を使用することで広い観測視野が得られた。ナトリウム大気の広域分は複数の画像の合成によって得られており、観測時間の制限から分布の一部しか捉えられていなかったが、本観測により広域分布が抜け落ちなく捉えられた。水星ナトリウム大気は太陽輻射圧を受け反太陽方向に引き延ばされた尾状の形(ナトリウム尾)を成しているということは既に予想されていたが、これまでに行われた観測で得られたデータでは明らかにはなっていなかった。太陽放射圧は水星の公転軌道上の位置によって異なるため本観測ではそれが最大になる時期に観測を行い、尾状のナトリウム大気の観測に成功した。この結果から光電離の時定数が見積もられ過去の研究による予想値と誤差の範囲内で一致するということが分かった。昨年12月に岡山天体物理観測所で行った日中の水星ナトリウム大気光観測結果の解析を行った。過去の観測結果から水星大気密度の時間変動は太陽風フラックスの時間変動に伴いスパッタリングによって地表から放出される量が変動することが原因であると推測されていたが、本研究では2005年12月の観測結果とACE衛星によって観測された太陽風フラックスの変動を比較し本観測期間中においては太陽風スパッタリングによる放出は主な過程ではなく、太陽紫外線による光脱離の方が主な放出過程である、という結論を得た。
ポルフィリンとヘテロール双方の特性をあわせ持つ新規ポルフィリノイドの創製

π共役分子はπ電子系による多様な性質を発現しうるため、近年ますます注目を集めている。その中でもポルフィリンとヘテロールは、どちらも機能性材料の開発において中心的な骨格として注目されているが、これらを組み合わせた系を構築する、という研究はほとんど検討されてこなかった。そこで本研究では、ポルフィリンとヘテロールを組み合わせ、双方の物性をあわせ持つ化合物の創製とその物性の解明を目的とし、検討を行った。まず、スズ置換ホスホールとハロゲン化ポルフィリンとのクロスカップリング反応により、ホスホール架橋ポルフィリンダイマーの合成に成功した。これは、ポルフィリン周辺部にホスホールが連結された、世界で初めての化合物である。このホスホール架橋ポルフィリンダイマーは、チオフェンやベンゼンで架橋した化合物よりも大きな吸収スペクトル変化を与え、ホスホールを介した効果的なポルフィリン同士の相互作用を示した。加えて、ホスホールに由来した電子受容性の向上も見られ、ポルフィリンとホスホールの両方の特徴を有していると言える。また、縮環ホスホール誘導体の合成検討を進めていくなかで、チオフェン縮環ベンゾジホスホールの合成に成功した。このチオフェン縮環ベンゾジホスホールは、クロスカップリング反応により様々な置換基を導入することができ、置換基によって様々な性質を示すことを明らかにした。近赤外領域における強い発光や、大きな二光子吸収断面積、さらには良好な電子移動度を示唆する結果が得られるなど、多方面での応用が期待できる分子であることを見出している。当初計画していた、ホスホール連結ポルフィリンダイマーの合成に成功した。研究着手時点では反応がうまく進行しなかったが、スズ置換ホスホールを用いたクロスカップリング反応による合成スキームを確立することで、目的としていた分子を得ることができた。また、新規縮環ホスホール誘導体の合成検討を進めていたところ、チオフェン縮環ベンゾジホスホールの合成に成功し、適切な置換基の導入によって様々な機能の発現が可能であることを見出した。この分子はポルフィリノイドではないが、多方面での応用が期待できる分子であることから、興味深い骨格として利用可能であると考えている。したがって、本研究はおおむね順調に進展している。本研究で合成に成功した、ホスホール連結ポルフィリンダイマーを用いた金属錯体の合成検討を行う。また、ホスホール縮環ポルフィリンダイマーの合成法改良の実現に向けてさらに検討を進める。加えて、本研究で見つかったチオフェン縮環ベンゾジホスホールを用いた、近赤外発光色素や電子輸送材料としての応用展開を目指し、分子設計と合成・機能発現を狙い検討を進める予定である。当初の計画では、合成が比較的難しく、合成ルートの検討や反応条件のスクリーニングが必要と予想していたが、実際に目的としていた分子の合成に成功したため、物品費に余裕ができたことが理由として挙げられる。本年度でも進める予定である化合物の合成や合成法の改良を行うための物品費、また各種測定のための消耗品の費用として使用する予定である。
トランスオミクス解析による低酸素応答のシステム的理解

地球上のほとんどの生命システムにとって分子酸素に対する細胞応答は重要な環境適応の一つであり、酸素濃度変化を検知し発現する遺伝子セットを量的・質的に変化させる。脊椎動物細胞における低酸素応答はPHD-HIF経路が最もよく知られているが、これ以外の経路の存在も示唆されている。さらに、細胞の状態に応じて酸素応答が異なることも知られており、低酸素応答システムの全貌は未だ不明である。本課題は、われわれが最近開発したiMPAQT法を中心とする定量トランスオミクスプラットフォームを用いて、いくつかのモデル細胞(正常、がん、老化など)における低酸素応答を、タンパク質発現量、水酸化、さらには代謝物の変動として包括的に計測し、それらの多階層データを統合的に解釈することで、既存の分子機構に依らない新たな生体酸素応答の実体解明を試みる。まず、正常線維芽細胞を用いて、通常の増殖期、がん、老化、および休止期の4つのモデル状態を確立し、これを対象に絶対定量プロテオーム解析法であるiMPAQT法を用いて多数の代謝酵素の発現量の低酸素応答を時系列データで取得することに成功した。タンパク質の水酸化部位同定に関しては生理的なプロリン水酸化と実験過程で生じるメチオニンやトリプトファンなどの酸化を区別することが困難であることが判明し、これを解消するための技術開発を行った。さらに、プロリン水酸化酵素に対する結合タンパク質の同定を免疫沈降-MSおよび近位ビオチン化標識法をもちいて実施し、既存の基質であるHIF-1 alphaと共に多数の結合タンパク質の同定に成功した。平成30年度が最終年度であるため、記入しない。脊椎動物細胞における低酸素応答はPHD-HIF-1経路が最もよく知られているが、これ以外の経路の存在も示唆されている。本課題は、われわれが最近開発したiMPAQT法を中心とする定量トランスオミクスプラットフォームを用いて、いくつかのモデル細胞(正常、がん、老化など)における低酸素応答を、タンパク質発現量、水酸化、さらには代謝物の変動として包括的に計測し、それらの多階層データを統合的に解釈することで、既存の分子機構に依らない新たな低酸素応答システムの発見を目指す。平成29年度は正常線維芽細胞を用いて、通常の増殖期、がん、老化、および休止期の4つのモデル状態を確立した。また、絶対定量プロテオーム解析法であるiMPAQT法を用いて多数の代謝酵素の発現量の低酸素応答を時系列データで取得することに成功した。このように当初の研究計画は概ね順調に進んでいるが、タンパク質の水酸化部位同定に関しては生理的なプロリン水酸化と実験過程で生じるメチオニンやトリプトファンなどの酸化を区別することが困難であることが判明し、その解決のための技術開発等を実施したが、解決に至らず、次年度もさらなる検討が必要となった。以下のように3つの計画のうち1)および2)は順調に進んでいるが、3)に関しては技術的問題点が明らかとなり対応をおこなっている。1)ヒト正常線維芽細胞から4状態モデル細胞の樹立:ヒト正常線維芽細胞株であるTIG-3を用いて、i)増殖期、ii)静止期、iii)がん化、iv)老化、の4状態を樹立した。具体的には、TIG-3にがん遺伝子〔SV40 T抗原とc-Mycなど〕を導入することでがん化細胞、がん遺伝子〔H-Ras(G12V)のみを導入して老化細胞、低血清と接触阻止を組み合わせることで休止期状態を作り出すことができた。2)iMPAQT法を用いた低酸素応答の定量プロテオーム解析:iMPAQT法は多数のタンパク質の絶対量を同時に測定する新技術である。主要な代謝酵素を対象に、低酸素暴露をがんモデル細胞に施し低酸素暴露への時系列データを取得した。3)水酸化ペプチドの低酸素応答計測:既知の水酸化ペプチドの同定は可能であった。しかしながら、新規に同定された水酸化ペプチドに関しては、その後のバイオインフォマティスク等を用いたデータ精査の結果、多くの場合はプロリンやリジンの水酸化を特定できていない可能性が明らかとなった。これは、メチオニンやトリプトファンに酸素付加が化学的に生じるためであり、これらをコントロールする手法の開発もいくつか試みた現時点では成功に至っていない。

まず、正常線維芽細胞を用いて、通常の増殖期、がん、老化、および休止期の4つのモデル状態を確立し、これを対象に絶対定量プロテオーム解析法であるiMPAQT法を用いて多数の代謝酵素の発現量の低酸素応答を時系列データで取得することに成功した。タンパク質の水酸化部位同定に関しては生理的なプロリン水酸化と実験過程で生じるメチオニンやトリプトファンなどの酸化を区別することが困難であることが判明し、これを解消するための技術開発を行った。さらに、プロリン水酸化酵素に対する結合タンパク質の同定を免疫沈降-MSおよび近位ビオチン化標識法をもちいて実施し、既存の基質であるHIF-1 alphaと共に多数の結合タンパク質の同定に成功した。今後は、より幅広い機能を持つタンパク質(シグナル伝達や転写関連タンパク質)などの計測も実施する。現行のiMPAQT法でも任意のタンパク質の計測は可能であるが、効率良い実施のためには安定同位体標識された評品ペプチドが必要である。そこで、iMPAQTデータベースに格納されている情報から、真に有効なペプチドだけを連結した人工組み換えタンパク質をデザインし、これを独自に作製したリジンおよびアルギニン要求大腸菌にて合成させることで、高ラベル効率の安定同位体標識タンパク質を得ることを試みる。これらの手法が確立できた時点で、老化や休止期の状態に対して低酸素応答を計測する。さらに、細胞内代謝物量をメタボローム解析によって計測する。メタボローム解析はイオンクロマトグラフィーMSや逆相クロマトグラフィーなどを駆使して、幅広い代謝物の変動を計測する。さらに、同モデル細胞に対して次世代シークエンサーを用いたトランスクリプトーム解析を実施する。上記計測により得られた大規模定量情報を統合し、低酸素応答に関わる新規分子ネットワークをあぶり出す。具体的には、公共データベースに蓄積されてた膨大なタンパク質情報(パスウェイや局在など)に基づき本研究で得られたデータを統合し、既知情報と取得データとの相互関連を探索する。また、水酸化部位の同定が困難な場合は、相互作用を元にPHD等の基質を探索する方向に切り替えることも検討する。現在、近位ビオチン標識法やクロスリンク法による相互作用解析法を比較検討中であり、これらの手法によって新規水酸化基質が見つかれば、大目標である低酸素応答分子ネットワーク拡張が期待される。同定された低酸素応答分子ネットワークに対して、ネットワークのハブとなっている分子を推定し人為的にかく乱(ノックダウンなど)することで、低酸素応答における当該ネットワークの重要性を評価する。平成30年度が最終年度であるため、記入しない。
近代日本における議会政治と天皇

本研究は、近代日本において議会政治が定着する過程を、統治機構としての天皇と議会の関係に注目して、明らかにすることを目的とする。そのために、以下の観点から分析を進める。(1)衆議院・貴族院の二院制を採る議会と、「第三院」として作動する枢密院や天皇との関係は、どのように変遷したのか。緊急勅令・緊急財政処分などの運用過程から考察する。(2)憲法に規定された権限を議会がどのように定着させたのか。天皇・内閣・議会の関係、天皇と議会との間の儀礼などとあわせて考察する。(3)議会の持つ国家・国民の代表性・象徴性が、天皇(君主)のそれとどのような関係にあったのか。御料地問題および国民の請願から考察する。
難治性神経芽腫治療に直結する代謝拮抗剤の利用法とその作用メカニズムの解明

小児がんの一種である神経芽腫ではMYCファミリーに属するMYCN遺伝子の増幅が予後不良と強く相関する。この難治性神経芽腫に対する治療法の開発を目指して新しい治療標的分子の探索を行った結果、核酸代謝拮抗剤の有効性が明らかとなった。本研究では核酸代謝拮抗剤による新しい難治性神経芽腫の治療コンセプトを実証する。また、MYCN増幅型細胞に特異的な作用メカニズムを理解することにより、薬効を更に増強するための鍵となる分子を同定する。
磁気励振攪拌フィンを利用した高速・高性能振動型ミキサーの開発

各種物質生産における攪拌・混合工程の効率化をはかるため,磁気反発力により浮上した攪拌フィンの非線形共振を利用した振動型ミキサーの開発を行った.磁気浮上攪拌フィンは円筒状攪拌槽内において振動し,効率的に攪拌・混合操作を行う.攪拌フィンの励振方法として,攪拌フィン内に固定された永久磁石に対し,攪拌槽外部から作用する周期変動する磁気力を利用するため,攪拌槽内を周囲環境から完全に遮断できる.このため,従来の振動型混合装置で問題となっていた混合液への外部からの不純物の混入を防止できる.試作機を設計・製作し,実験と数値解析を通して,本研究で開発した振動型ミキサーの有効性を確認した.本研究で開発する振動型ミキサーは,磁気反発力により浮上した攪拌フィンを円筒状攪拌槽内において高振動数域で振動させ,各種物質の攪拌・混合工程の劇的な効率化をはかるものである.本研究の特徴は,機械系では避けられるべき共振現象を積極的に利用することである.さらに本研究で開発するミキサーは,攪拌フィンの駆動機構として,攪拌フィンに固定された磁石に作用する周期変動磁気力を利用する.本ミキサーにおいては,攪拌槽内の攪拌フィン駆動用の機械的部材が必要なく,攪拌槽内を周囲環境から完全に遮断できる.このため,従来の混合装置で深刻な問題となっていた混合液への外部からの不純物の混入や各種駆動用の各種機械部品に発生するカビの問題なども解決できる.平成25年度の研究では,攪拌槽部と攪拌フィンの大幅な改良を行い,3個の攪拌ユニットを直列に結合した構造に改造を行った.また,磁気浮上フィンに作用する加振力の増大をはかるため,新たな加振機構を採用した.この加振機構では,強力なネオジム磁石を組み込んだ円盤を回転させ,この磁石の運動により磁気浮上フィンに固定した永久磁石に対し磁気を発生させる.昨年度までの加振方法に比較して,より強力な周期的加振力を発生させることが可能となった.振動試験を実施し,攪拌フィンの振動振幅を増加でき,この加振方式の有効性を確認した.また,上記のような加振用磁石の機械的運動を利用した攪拌フィンの加振方法の他に,電磁力を利用した振動型ミキサーについても設計を行った.さらに,液中で振動するフィンまわりの複雑な流体運動の数値シミュレーションを行うため,粒子法(SPH法)の計算理論に基づいた数値計算プログラムの開発を行った(開発中の段階).このプログラムの利用により,本研究で用いる振動フィンまわりの液体に運動を解析し,複雑な攪拌・混合メカニズムを明らかにすることが可能となる.各種物質生産における攪拌・混合工程の効率化をはかるため,磁気反発力により浮上した攪拌フィンの非線形共振を利用した振動型ミキサーの開発を行った.磁気浮上攪拌フィンは円筒状攪拌槽内において振動し,効率的に攪拌・混合操作を行う.攪拌フィンの励振方法として,攪拌フィン内に固定された永久磁石に対し,攪拌槽外部から作用する周期変動する磁気力を利用するため,攪拌槽内を周囲環境から完全に遮断できる.このため,従来の振動型混合装置で問題となっていた混合液への外部からの不純物の混入を防止できる.試作機を設計・製作し,実験と数値解析を通して,本研究で開発した振動型ミキサーの有効性を確認した.本研究で開発する振動型ミキサーは,液中で磁気反発力により浮上した攪拌フィンを円筒状攪拌槽内において高振動数域で共振させ,各種物質の攪拌・混合工程の劇的な効率化をはかるものである.本研究の特徴の一つとして機械系では避けられるべき共振現象を積極的に利用することがあげられる.本研究では,攪拌フィンの駆動機構として,攪拌フィン部磁石に作用する周期変動磁気力を利用する.本ミキサーにおいては,攪拌槽内の攪拌フィン駆動用の機械的部材が必要なく,攪拌槽内を周囲環境から完全に遮断できる.このため従来の混合装置で深刻な問題となっていた混合液への外部からの不純物の混入や各種駆動用の各種機械部品に発生するカビの問題なども解決できる.本年度の研究では,現在使用されている機械駆動方式の振動型ミキサーで実績のある運転周波数(フィンの振動周波数)15Hz以上で攪拌フィンの非線形共振を発生させることを目的として,上記の振動型ミキサーの構造,攪拌フィンの駆動機構など詳細な検討を行い試作機の設計を行った.また,試作機を実際に製作し基礎実験を行った.その結果,攪拌槽を液体で満たした状態で十分に高い振動数で攪拌フィンを共振させることができた.また.磁化反発力に対する近似式の作成,攪拌フィンの運動の解析のための数学モデルの構築などを行い,攪拌フィンの運動解析のための基礎理論を確立した.次に,攪拌槽外部に設置したコイルに流す交流電流の周期的変動を利用した攪拌フィン電磁的加振方式を採用した振動型ミキサーの開発についても検討を行った.さらに,液中で振動するフィンまわりの複雑な流体運動の数値シミュレーションを行うため,粒子法の一種であるSPH法の計算理論に基づいた数値計算プログラムの製作を行った.このプログラムの利用により,本研究で用いる振動型ミキサーによる攪拌メカニズムを明らかにすることが今後可能となる.本研究で開発する振動型ミキサーは,磁気反発力により浮上した攪拌フィンを円筒状攪拌槽内において振動させ,各種物質の攪拌・混合工程の効率化をはかるものである.本研究で開発するミキサーは,攪拌フィンの励振として,攪拌フィンに固定された磁石に作用する周期変動磁気力を利用するものである.

このため,本ミキサーにおいては,攪拌槽内の攪拌フィンを駆動するための機械的部材が必要なく,攪拌槽内を周囲環境から完全に遮断できる.このため,従来の混合装置で深刻な問題となっていた混合液への外部からの不純物の混入の問題なども解決できる.また,機械系では避けるべき共振現象を攪拌フィンの運動に積極的に利用することも特徴の一つである.本研究では,攪拌フィンの駆動方式として,1)攪拌槽外部に設置した永久磁石を内蔵した円板の回転運動を利用したもの,2)攪拌槽外部に設置したコイルで発生する交流磁場を利用したものの2方式の加振機構を開発した.1)の方式では,非常に強い磁気反発力を発生でき,励振振動数の調整を円板駆動用モータの運転振動数の変更のみで行えるといいシンプルな構造である.両方式とも,十分な混合に利用できる振動数と振幅で攪拌フィンの共振を発生でき,本混合装置の実用化につながる多くの技術的成果を得ることができた.また,液中で振動するフィンまわりの複雑な流体運動を解明するため,粒子法(SPH法)の計算理論に基づいた流体解析プログラムを開発した.種々の物理モデルで計算を実行し,解析プログラムの有効性を確認した.このプログラムの利用により,振動フィンまわりの液体運動を解析でき,複雑な攪拌・混合メカニズムを明らかにすることが可能となった.さらに攪拌フィンの加振装置で発生する有害振動を除去する振動低減装置や固液(粉と液体)混合操作に対して本ミキサーを利用する際に必要となる高精度連続式粉体供給装置についても開発を行った.機械工学,機械力学,振動工学1.前年度の研究で試作したミキサーは,攪拌フィン3枚を有する攪拌槽を1ユニットとしたものである.平成25年度は,これを3ユニット直列に連結したミキサーに改良し,実際に製作した.2.3ユニット直列結合型の振動型ミキサーにおいては,流体抵抗が増大するため,攪拌槽内の磁気浮上フィンへ作用する外部加振力の増加が必要不可欠である.このため,本年度は,より強力な反発力を発生させるため,ネオジム磁石を組み込んだ円盤を回転させて,周期的な磁気反発力を攪拌フィンに作用させる加振方式を採用した.昨年度の外部永久磁石の往復運動を利用した加振方式に比較して,より強力な周期的加振を発生させることが可能となった.3.上記加振方式を利用した3ユニット直列結合した振動型ミキサーの攪拌フィンの振動実験を実施した.液中(水)における攪拌フィンの共振振動数を20Hz以上とすることができた.しかし,フィンの振動振幅は,目標値を実現することはできなかったため,さらに加振方式の改良が必要である.4.加振用磁石の機械的運動を利用した攪拌フィンの加振方法のほかに,電磁力による加振方法を利用した振動型ミキサーの開発を行った.このミキサーは,攪拌槽外部に設置したコイルに流す交流電流の周期的変動を利用し,そのコイルに発生する電磁力の周期変動を利用して加振を行うものである.平成25年度は,攪拌フィンなどの運動部及び攪拌槽などの振動型ミキサーの設計を行い,具体的に試作機の完成まで行った.5.本ミキサーの攪拌槽内での攪拌フィンの周辺流体の運動の解析を実施するため,粒子法(SPH法)による流体運動解析プログラムの開発が継続中である.いくつかの簡単な計算モデルにおける流体運動に対し,差分法や有限要素法による解析結果と照合などを終え,開発プログラムの有効性を確認している.
マイクロＲＮＡ／エクソソームの非標識検出による簡易型がん診断デバイスの開発

microRNA、特に体内を循環している分泌型miRNAはエクソソームに内包されており、複数のmiRNAファミリーががん遺伝子を標的として作用していることが注目されている。で細胞間情報伝達機構に関与していることが知られている。現状の抗体を主とした免疫染色およびイムノアッセイによる解析は、煩雑で多段階のプロセスを要する古典的な生物学的手法に依存しており、高品質、経済的ながん診断プラットフォームを構築することが求められている。本研究では電気化学的な検出法に基づいたがんを迅速に検査するためのがん細胞/エクソソーム検出、またmicroRNA解析を目指した核酸の増幅と検出を同一に行うデバイス開発に取り組んだ。乳がん検出を目的とした小型・可搬型デバイスの作製を目指し、エクソソームのシアル酸発現量および等温核酸増幅技術に着目し、ターゲットを非標識に検出する新たな検出技術を確立した。当該年度4月以降はスイス連邦工科大学ローザンヌ校(EPFL)に場所を移し、国際共同研究を推進しながら本研究を展開した。得られた研究成果について積極的に学会発表を行っており、国内にとどまらず国際的にも本研究をアピールし、海外の研究者と広く意見交換を行った。将来的には、リアルサンプルであるヒト体液試料を用いた評価を目指し、エクソソームおよびmiRNAを検出するマイクロ流体デバイスをデザインすることに繋げていくため、マスクアナライザー、スピンコーター、ベーキング装置等を用いて、最適化した電極薄膜を搭載する診断チップを試作する。がんの早期発見に繋がる健診・検査受診率を向上させるため、また術後の予後管理を定量的に行い再発などの病状を的確に判断するためには、患者に負担や時間をかけることなく身近の診療所や在宅で、高精度・高感度にがんマーカーを検出できる本研究のような小型で簡易なバイオセンサの開発が有効であると考える。翌年度、交付申請を辞退するため、記入しない。エクソソームとは細胞外に放出される200 nm程度の大きさを持つ脂質二重膜からなる小胞で細胞間情報伝達機構に関与していることが知られている。microRNA (miRNA)は18-25塩基ほどの長さを持ち、特に体内を循環している分泌型miRNAはエクソソームに内包されており、複数のmiRNAファミリーががん遺伝子を標的として作用していることが注目されている。現状の抗体を主とした免疫染色およびイムノアッセイによる解析は、煩雑で多段階のプロセスを要する古典的な生物学的手法に依存しており、高品質、経済的な未来型医療をより身近な場所で提供できるとは言い難く、新たながん診断プラットフォームを構築することが求められている。本研究では、電界効果トランジスタ(Field Effect Transistor: FET)の動作原理に基づくバイオトランジスタを用いて、がんを迅速に検査するためのがん細胞検出、またmicroRNA解析を目指した核酸の増幅と検出を同一に行うデバイス開発に取り組んだ。FET計測は半導体微細加工技術によるセンサのデザインが容易であるという利点を有する。FETに基づく電位計測原理は、薄いゲート絶縁膜上に、あるいはエクステンドゲート表面に捕捉された標的分子の荷電または誘電率変化を固ー液界面電位変化として直接検出するものであるため、精密な表面設計が重要である。そのため、目的の生体分子を捕捉する機能性センサ表面の構築を目的とした。将検出原理を明らかにするために正常な乳腺細胞と乳がん細胞の比較計測を行うセンサ表面の構築を目的として電位計測を行った。特に核酸の増幅と検出を同時に行うデバイスの開発も目標として取り組んでおり、電位測定における最適条件を整えつつ、モデルサンプルを用いて電位計測を行った。核酸を定量的に検出する一般的な技術としてリアルタイムPCRが有用なツールとして用いられているが、PCRは正確な温度制御装置や蛍光ラベリングによる光学的検出装置が必要であり小型化に不利である近年ではサーマルサイクラーを必要としない等温核酸増幅法が盛んに研究されている。半導体は微細加工術を用いることで高スループットな計測を実現する一方で、温度変化により電気特性が著しく変化する性質を持っているため、測定中に生じる電位不安定性、ノイズの低減が課題とされている。そこで、電位安定性向上およびデバイスの小型化・低コスト化を目指し、等温核酸増幅反応と電気化学計測を組み合わせた、定量核酸検出デバイスの開発を試みた。等温核酸増幅法にはPrimer-generation rolling circle amplification (PG-RCA)を利用した。核酸増幅反応のリアルタイム検出を実現するため、増幅反応産物として放出されるプロトンを指標とした電位計測を試みた。プロトン感応材料としてはイリジウムオキサイドを選択し、熱酸化法により作製し、参照電極と一体化した微小電極システムを構築した。そのpH感度を評価したところNernstの式から導かれる室温での理論値が-59.2 mV/pHに近い値が得られ、pH感度の良いシステムの構築を実現した。target DNAの濃度を0 (Negative control), 10 pM, 100 pM, 1 nMと設定しPG-RCAの電位計測を行った結果、target DNA濃度に依存して電位の振る舞いに大きな違いがみられた。通常PCR法が1時間以上の反応時間を要するのに対し、本方式を用いた場合開始から数10分後には定量解析を実現できる可能性を見出した。

現状の抗体を主とした免疫染色およびイムノアッセイによる解析は、煩雑で多段階のプロセスを要する古典的な生物学的手法に依存しており、高品質、経済的ながん診断プラットフォームを構築することが求められている。本研究では電気化学的な検出法に基づいたがんを迅速に検査するためのがん細胞/エクソソーム検出、またmicroRNA解析を目指した核酸の増幅と検出を同一に行うデバイス開発に取り組んだ。乳がん検出を目的とした小型・可搬型デバイスの作製を目指し、エクソソームのシアル酸発現量および等温核酸増幅技術に着目し、ターゲットを非標識に検出する新たな検出技術を確立した。当該年度4月以降はスイス連邦工科大学ローザンヌ校(EPFL)に場所を移し、国際共同研究を推進しながら本研究を展開した。得られた研究成果について積極的に学会発表を行っており、国内にとどまらず国際的にも本研究をアピールし、海外の研究者と広く意見交換を行った。将来的には、リアルサンプルであるヒト体液試料を用いた評価を目指し、エクソソームおよびmiRNAを検出するマイクロ流体デバイスをデザインすることに繋げていくため、マスクアナライザー、スピンコーター、ベーキング装置等を用いて、最適化した電極薄膜を搭載する診断チップを試作する。がんの早期発見に繋がる健診・検査受診率を向上させるため、また術後の予後管理を定量的に行い再発などの病状を的確に判断するためには、患者に負担や時間をかけることなく身近の診療所や在宅で、高精度・高感度にがんマーカーを検出できる本研究のような小型で簡易なバイオセンサの開発が有効であると考える。今年度はがん検出を行う小型デバイスの作製を目指し、核酸の等温増幅技術に着目してターゲットを非標識に検出する新たな検出技術を確立した。並エクソソームのシアル酸発現量の違いに基づくがん診断デバイスの開発と組み合わせ、ヒト血液試料といったリアルサンプルへの展開を見据えて、開発したセンサを搭載したフローシステムでの評価を行う。電極表面でのターゲット認識能や電極の感度を評価するため、ポンプや電磁弁を用いた制御されたフローシステムの下で電極性能の検討を行いサンプル量の低減を試みる他、リアルサンプルとしてヒト血液試料を用いた評価を目指し、エクソソームおよびmiRNAを検出するマイクロ流体デバイスをデザインする。マスクアナライザー、スピンコーター、ベーキング装置等を用いて、最適化した電極薄膜を搭載する診断チップを試作する。翌年度、交付申請を辞退するため、記入しない。