hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
口腔悪性腫瘍治療効果の向上を目的にしたＢａｘ　ｍＲＮＡ遺伝子治療の開発

われわれは口腔悪性腫瘍を対象に新たな方法としてBax mRNA lipofection法を用いた遺伝子治療の研究を行っている(Baxは腫瘍抑制因子として機能し、mRNAはplasmidよりも効率的に遺伝子導入される)。本研究ではヒト下顎骨肉腫(HOSM-1細胞)に対して、liposomeを用いてBax mRNAをヌードマウス移植腫瘍へ投与し、抗腫瘍効果について検討した。H27年度にはHOSM-1細胞を移植したヌードマウスにLiposome-RFP mRNAを静脈内投与し、IVS Imaging Systemを用いて移植腫瘍および全身への遺伝子発現を確認する予定であったが、傾向強度が弱く評価が困難であったため、H28年度に発光遺伝子であるルシフェラーゼ(Luc2)を用いて同様の測定を行う予定であった。Luc2遺伝子をpcDNA3.1(+) plasmidに挿入し、luc2 plasmidを作成後、kitを用いてluc2 mRNAを作成した。導入ベクターはCationic Liposomeを用いてDOPEとDOTAPによりロータリーエバポレーターを用いて作成した。予備実験としてIn vitroにてHOSM-1細胞へのluc2 mRNAの導入を行い、発現を確認したところ、Liposome-Luc2 plasmid群では62%で発現していたのに対し、Liposome-Luc2 mRNA導入群では約92%の細胞に発現しており、従来のplasmidに比較し、mRNAを用いることで導入効率が上昇することを確認した。In Vivoにおいても検討する予定であったが、医局員の急な退職により、臨床業務が多忙となったため、研究計画が遅延した。予定していたRFP mRNAの投与によるIVIS Imaging Systemでのヌードマウスでの全身への発現は蛍光強度が弱く測定困難であった。医局員の急な退職により、臨床業務が多忙となったため、大幅に実験計画が遅延した。In vitroにてHOSM-1細胞へのluc2 mRNAの導入を行い、発現を確認したところ、Liposome-Luc2 plasmid群では62.2%で発現していたのに対し、Liposome-Luc2 mRNA導入群では約93.0%の細胞に発現しており、従来のplasmidに比較し、mRNAを用いることで導入効率が約1.5倍に上昇した。腫瘍増殖抑制効果については、Bax mRNAを同様に作成し、ヌードマウスの背部皮下に腫瘍細胞を移植,腫瘍径5mmとなった時点をDay0として,Liposome-Bax mRNAもしくはBax plasmidの投与を開始した.投与方法は静脈内注射によりBax mRNA、Bax plasmidともに50μgを投与した。腫瘍増殖抑制効果はDay20に腫瘍体積を測定し、対象群と比較した。腫瘍体積はLiposomeのみを投与した対象群と比較し、Bax plasmid群が47.2%であったのに対し,Bax mRNA群は23.3%であり、Bax mRNA投与によりPlasmid投与よりも高い腫瘍増殖抑制効果が得られた。Luc2遺伝子から同様にLuc2 mRNAを作製して、IVIS Imaging Systemを用いてHOSM-1移植腫瘍及びマウス全身への遺伝子発現の分布を経時的に測定し、腫瘍への発現の高い投与量、発現時間を参考にLiposome-Bax mRNAを投与し抗腫瘍効果について検討する。口腔外科学実験計画が予定より遅れており、ヌードマウスや試薬の購入を見送ったため実験計画が大幅に遅れており、ヌードマウスや試薬の購入を見送ったためルシフェラーゼをIVISImaging Systemで測定するのに必要な試薬(ViviRen等)およびヌードマウスを購入する予定である
磁束格子デザインによる中性子ビーム新集光法の開拓

中性子は物質透過能力等の優れた特長を持つ解析プローブである。しかし、ビーム強度は大強度施設といえども絶対的に不足しており、中性子の適用範囲に限界を与えている。これは中性子の幅広い利用を促進する上で克服すべき重要な課題である。この克服には優れた中性子光学技術が不可欠となる。我々は多極磁場(六極磁場等)が中性子の高精度かつ高効率な制御に極めて有効であることをこれまでの研究で見出した。そこで本研究では、超伝導体内に多極磁場による磁束格子を作り、中性子をこの格子で回折させることで、中性子ビームを強い集光力で集光する新手法を世界に先駆けて開拓することを目指している。前年度までに中性子ビームを集光するのに最適な磁束格子を超伝導体内に作る磁石と超伝導体のデザインを行い、超伝導体部分にニオブ単結晶(形状:円柱、直径12mmφ、方位:(100)、(110)、(111)//円柱軸)を磁石部分にフェライト磁石(形状:角形、断面:5mm×5mm)を使用した原理実証機を製作したが、この原理実証機を4Tesla横磁場マグネット内に設置するための試料ロッドの製作を行った。そして、J-PARCの物質・生命科学実験施設(MLF)の中性子小角・広角散乱装置(TAIKAN)を利用して、原理実証機の集光性能の基礎データを白色パルス中性子について測定し、解析を進めている。J-PARCの物質・生命科学実験施設(MLF)の中性子小角・広角散乱装置(TAIKAN)を利用して、原理実証機の集光性能の基礎データを白色パルス中性子について測定することができた。J-PARCの物質・生命科学実験施設(MLF)の中性子小角・広角散乱装置(TAIKAN)を利用して、原理実証機の集光性能の超伝導体結晶方位依存性を評価する。さらに集光性能の向上のために超伝導体部分に育成したニオブ3スズ単結晶(形状:円柱、直径:3mmφ、長さ:2mm、方位:(111))を磁石部分にネオジム磁石を使用し、ニオブ3スズ単結晶の六極磁場内の位置も変えることのできる試験機を製作し、集光性能を評価する。

J-PARCの物質・生命科学実験施設(MLF)の中性子小角・広角散乱装置(TAIKAN)を利用して、原理実証機の集光性能の超伝導体結晶方位依存性を評価する。さらに集光性能の向上のために超伝導体部分に育成したニオブ3スズ単結晶(形状:円柱、直径:3mmφ、長さ:2mm、方位:(111))を磁石部分にネオジム磁石を使用し、ニオブ3スズ単結晶の六極磁場内の位置も変えることのできる試験機を製作し、集光性能を評価する。
太陽光を利用してH2OとCO2から合成ガスを生成する人工光合成型光電極系の創出

Cu0.8Ag0.2GaS2光カソードをAgおよびZnSで共修飾することで,H2OおよびCO2の還元活性が飛躍的に向上することを見いだした.また,金属硫化物光触媒粒子と電極基板との間を導電性有機ポリマーでネッキングすることは,金属硫化物光カソードの電極性能の向上に効果的であった.本研究で開発した金属硫化物光カソードをCoO修飾BiVO4光アノードと組み合わせることで,疑似太陽光照射下での水中におけるH2OとCO2の還元による合成ガス生成に活性な人工光合成型光電極システムを開発することに成功した.本研究は,太陽エネルギーを利用してH2OおよびCO2から合成ガス(H2およびCOの混合ガス)を生成するための人工光合成型光電極系の創出を目的としている.本年度は,合成ガス生成に有効な光カソード材料の探索および高性能化を目的とした研究を行い,以下の成果が得られた.(1)合成ガス生成に有効な可視光応答性金属硫化物光カソードの探索さまざまな組成からなる金属硫化物光触媒粉末を導電性ガラス基板上に塗布することで作成した光カソードの中で,Cu1-xAgxGaS2光カソードが,CO2を飽和させたKHCO3水溶液中において,安定なカソード光電流を与えた.気相成分を分析した結果,観測された光電流に見合った量のH2Oの還元生成物であるH2およびCO2の還元生成物であるCOが得られた.13CO2を用いた同位体実験によって,CO2が還元されることでCOが生成している科学的根拠を得た.このように,Cu1-xAgxGaS2光カソードがH2OおよびCO2からの合成ガス生成に有効であることを見いだした.Cu1-xAgxGaS2光カソードの合成ガス生成活性が,その表面をZnSおよびAgで共修飾することによって,飛躍的に向上することを見いだした.一方,ポリピロールなどの導電性有機ポリマーでネッキングすることによって,CuGaS2光カソードの合成ガス生成活性が向上することを見いだした.これら光カソードは,疑似太陽光照射下においてもH2OおよびCO2を還元することによって合成ガスを生成した.以上のように,光電気化学的にH2OおよびCO2を還元することによって合成ガスを生成することができる可視光応答性金属硫化物光カソードを見いだした.さらに,その合成ガス生成活性の向上に有効な表面修飾およびネッキング法を開発することに成功した.平成28年度の目標であった(1)合成ガス生成に活性な可視光応答性金属硫化物光カソードの探索および(2)表面修飾による光カソードの高性能化を達成した.さらに,平成29年度の目標の一部であったポリピロールなどの導電性有機ポリマーによるネッキングが,金属硫化物光カソードの性能向上に有効であることを実証した.以上のことより,当初の計画に沿って進捗していると言えるため,おおむね順調に進展していると判断した.研究実施期間の最終年度である本年度では,昨年度に得られた成果を発展させるために「種々の金属硫化物光カソードに対する有機導電性ポリマーのネッキング効果」および本研究の最終目標である「疑似太陽光照射下における合成ガス生成に活性な人工光合成型光電極系の構築」に注力し,以下のような成果が得られた.(1)Cu,Ag,GaおよびInからなる種々の金属硫化物光カソードがH2OおよびCO2の還元による合成ガス生成に活性であることを見いだした.さらに,それらの活性は,ポリピロールなどの有機導電性ポリマーでネッキングすることによって向上した.この成果によって,有機導電性ポリマーによるネッキングが高い汎用性を有する金属硫化物光カソードの高活性化手法であることが示された.(2)H2OおよびCO2の還元による合成ガス生成に活性なAgおよびZnSで共修飾した金属硫化物光カソードと水の酸化に活性な酸化コバルト修飾バナジン酸ビスマス光アノードを組み合わせた光電気化学セルを作成した.この光電気化学セルは,両極間に外部バイアスを印加しない条件においても,疑似太陽光照射下における合成ガス生成に活性であった.さらに,水の酸化生成物である酸素が得られたことから,本反応において水が電子源として消費されていることがわかった.このように,常温・常圧の温和な条件において,太陽光エネルギーを利用してH2OおよびCO2から合成ガスを生成するポテンシャルを有する新規な人工光合成型光電極系を開発することに成功した.Cu0.8Ag0.2GaS2光カソードをAgおよびZnSで共修飾することで,H2OおよびCO2の還元活性が飛躍的に向上することを見いだした.また,金属硫化物光触媒粒子と電極基板との間を導電性有機ポリマーでネッキングすることは,金属硫化物光カソードの電極性能の向上に効果的であった.本研究で開発した金属硫化物光カソードをCoO修飾BiVO4光アノードと組み合わせることで,疑似太陽光照射下での水中におけるH2OとCO2の還元による合成ガス生成に活性な人工光合成型光電極システムを開発することに成功した.本研究で開発した合成ガス生成に有効な金属硫化物光カソードを水の酸化反応に有効な可視光応答性光アノードと組み合わせることで,本研究の最終目標である水を電子源とした合成ガス生成に活性な新規光電極システムを構築する.水の酸化生成物である酸素の定量実験を行うことで,水を電子源として合成ガスが生成している科学的根拠を得る.また,本研究で発見した金属硫化物光カソードの高性能化に有効な導電性有機ポリマーによるネッキング効果の詳細なメカニズムを調査する.光触媒
エラジタンニンのアレルギー抑制効果の解明と食品への利用

接触過敏症(CHS)は,アレルギー性接触皮膚炎のモデル動物実験系としてよく用いられる。本研究では,CHS動物実験系を用いてエラジタンニンを多く含むザクロポリフェノール濃縮物(PPC)のアレルギー抑制効果を検討した。研究の結果,食品として摂取可能なポリフェノール量に相当するマウスの摂取量で,CHS抑制効果が示された。そのメカニズムとして好中球を動員するCXCL2とマクロファージを動員するCCL12の発現抑制が考えられた。さらに,PPCと大豆イソフラボンの相乗効果によるCHS抑制効果が示唆された。本研究は、ザクロ果汁からエラジタンニンを主成分とするポリフェノール濃縮物(以下、PPC)を調製し、アレルギー抑制効果の解明と食品への利用を目的として研究を進めている。平成25年度は、接触性過敏症(CHS)モデル動物実験系を用いたPPCの抗アレルギー作用について検討した。実験の結果、PPC投与群でアレルギーに関与するIgG1の産生抑制効果とCHS抑制効果が観察された。次に、全身の免疫系に関わっている臓器である脾臓から免疫細胞を取り出し、CD4陽性T細胞について解析をおこなった。その結果、PPC投与群で抗炎症性サイトカインであるIL-10産生細胞とTh1細胞であるIFN-gamma産生細胞の増加が示された。PPCには、Th1/Th2バランスのTh1への調整作用とIL-10産生細胞を増加させる作用があり、CHSとIgG1産生を抑制したことが考えられた。さらに、この実験で使用したMF飼料には大豆イソフラボンが51.2mg(飼料100g中)含まれていた。大豆イソフラボンもポリフェノールの一つであり、抗アレルギー作用や抗炎症作用が報告されていることから、MF飼料にもCHS抑制作用がある可能性を考えた。そこで、MF飼料と大豆を原料にしていないF2PLD1飼料で比較実験をおこなった。その結果、MF飼料にCHS抑制効果があること、アレルギー性炎症部位である耳介組織への好中球の浸潤が抑制されること、が示された。現在、そのメカニズムについて検討を進めている。本研究では、ザクロ果汁からエラジタンニンを主成分とするポリフェノール濃縮物(PPC)を調製し、接触過敏症(CHS)モデルマウスを用いてアレルギー抑制効果の解明と食品への利用を目的として研究を進めている。平成26年度は、1.ヒトでザクロジュース200mLに相当する0.01%PPCでのCHS抑制効果、2.遺伝子発現解析によるPPCのCHS抑制効果の機序の解明、3.大豆と大豆イソフラボン(SI)のCHS抑制効果とその機序にの解明について検討した。CHS抑制効果は、CHS反応による耳介の腫れと耳介組織に浸潤した炎症細胞の状態により評価をおこなった。耳介の遺伝子発現解析については、DNAマイクロアレイとリアルタイムPCRを用いておこなった。検討の結果、1.CHS抑制効果が0.01%PPC摂取群で示された。2.PPCのCHS抑制効果の機序として、好中球の耳介への浸潤に関与しているCxcl2とCxcl3の発現が耳介で抑制されることが示された。3.今回新たに0.1%SI摂取群でCHS抑制効果が示された。遺伝子発現解析結果から、大豆摂取群で好酸球を活性化するCcl24とTh2を活性化するCcl17の遺伝子発現が耳介で抑制されることが示された。今回の研究から、1.ヒトが1日にザクロジュース200mLを摂取することでアレルギー性接触皮膚炎(ACD)の改善効果が期待できること、2.その理由として、PPCの摂取は好中球の耳介への浸潤を抑制することが考えられること、3.大豆と大豆イソフラボンにもACDの改善効果が期待できること、その理由として好酸球とTh2の活性化が抑制されることが示唆された。平成27年度は、1)PPCのCHS抑制効果における機序の解明、2)SIのCHS抑制効果における機序の解明、3)PPCとSIの相乗効果によるCHS抑制効果とその機序の解明について検討を行った。1)PPCのCHS抑制効果における機序の解明:CHS惹起部位である耳介を試料として抗体アレイを用いて、25種類のケモカインの発現について検討をおこなった。その結果、好中球を動員するCXCL2とCXCL5,単球/マクロファージを動員するCCL12の発現抑制が示された。さらに、ELISAを用いてCXCL2とCCL12の定量を行って発現抑制を確かめた。2)SIのCHS抑制効果の機序解明:CHS惹起部位である耳介を試料として抗体アレイを用いて、40種類のサイトカインの発現について検討をおこなった。その結果、好中球を動員するCXCL1,単球/マクロファージを動員するCCL2,炎症性サイトカインであるIL-1betaの発現抑制が示された。3)PPCとSIの混合液摂取のCHS抑制効果を、耳介の腫れと耳介組織に浸潤した炎症細胞の数による評価から示した。CHS惹起部位である耳介を試料として抗体アレイを用いて、40種類のサイトカインの発現について検討をおこなった。その結果、PPCとSIの混合液摂取群において、好中球を動員するCXCL2、単球/マクロファージを動員するCCL12、T細胞の活性化を誘導するCXCL10の発現抑制が示された。

今回の研究から、1)PPCの摂取によりCXCL2とCCL12の発現抑制されることからCHSが抑制されること、2)SIの摂取によりCXCL1とIL-1betaの発現抑制されることからCHSが抑制されること、3) PPCとSIの相乗効果により、CXCL10の発現抑制効果が高くなることが示された。接触過敏症(CHS)は,アレルギー性接触皮膚炎のモデル動物実験系としてよく用いられる。本研究では,CHS動物実験系を用いてエラジタンニンを多く含むザクロポリフェノール濃縮物(PPC)のアレルギー抑制効果を検討した。研究の結果,食品として摂取可能なポリフェノール量に相当するマウスの摂取量で,CHS抑制効果が示された。そのメカニズムとして好中球を動員するCXCL2とマクロファージを動員するCCL12の発現抑制が考えられた。さらに,PPCと大豆イソフラボンの相乗効果によるCHS抑制効果が示唆された。前年度の検討で、ザクロポリフェノール濃縮物(PPC)のCHS抑制効果を示すことができた。しかし、その際検討したPPC投与量は、ヒトで1日あたりザクロジュース16Lに相当し、日常の食生活で利用できる量ではない問題があった。今回の検討で、「ザクロジュースコップ1杯に含まれるポリフェノールに相当する量」でCHS抑制効果を示すことができた。そのため、本研究課題の最大の目的である「食品への利用」を考えることができる成果が得られた。さらに、遺伝子発現解析を進めた結果、PPCと大豆のCHS抑制機序に大きな進展がみられた。食生活学26年度の研究成果から、ザクロポリフェノール濃縮物(PPC)には、好中球の耳介組織への浸潤に関与するケモカインを抑制する効果があることが示された。さらに、その詳細を検討するため、ヒトの皮膚角質細胞由来であるHaCat細胞株を用いて調べる。エラジタンニンは、エラグ酸に分解されて、さらに腸内細菌によって主にウロニチンAに代謝されてから体内に吸収される。また、マウスで好中球を動員するケモカインとしてCxcl2とCxcl3の遺伝子発現抑制効果が示されたが、ヒトではその代表はIL-8であり,マウスにそのケモカインはない。そこで,IL-8を指標としてCHS抑制効果をエラグ酸とウロニチンAで検討する。さらに、栄養バランスの関係から、食品はいろいろなものを食べることがよいとされる。大豆は、日本人の食生活には欠かせない。研究の結果から、PPCと大豆の両方にCHS抑制効果があり、遺伝子発現解析の結果からそれらの抑制機序は異なることが示された。そのため、CHSモデル動物実験系を用いてPPCと大豆との相乗効果を調べる。平成25年度は、接触性過敏症(CHS)モデル動物実験系を用いたPPCの抗アレルギー作用とそのメカニズムの解明を目標とした。その結果、PPCのCHS抑制効果を示すことができ、そのメカニズムにおいても成果をあげるごとができた。ところが、PPCのCHS抑制効果についてのメカニズム解明は不十分であること、飼料中の大豆イソフラボンにもCHS抑制効果があるといった予想外の結果が得られた。従って、研究を進めることはできたが、さらに研究を進めなければならない課題が増えたと強く感じる理由から、自己評価をおこなった。研究計画に沿って研究をおこなった結果、生じた未使用額は33,888円であった。この未使用額は、次年度に使用する方が有効に利用できると判断した。
新規膀胱癌マーカー蛋白質ペリプラキンの尿細胞診への応用と膀胱癌における機能解析

我々は、プロテオミクス解析によって膀胱癌組織で発現が消失する新規マーカー蛋白質ペリプラキン(PPL)を発見した。尿中剥離細胞でPPL発現を免疫組織化学的に検討した。尿中PPL発現は癌患者群でコントロール群と比べて有意に低下した。また、癌陽性で細胞診が陰性であった31例中23例(74.2%)でPPL陽性率が異常値を示した。このことから、PPLの免疫染色と従来の尿細胞診と併用することにより、診断精度を向上させる可能性がある。高分子量プロテオーム解析により、新規膀胱癌マーカー蛋白質としてPeriplakin(以下PPL)を発見した。PPLは細胞間接着に関与しているといわれている。細胞膜の裏打ち蛋白質と言われ、食道癌においては癌が進行するにつれて、発現が低下することが報告されている。今回、上部尿路上皮癌におけるPPLの発現につき、免疫組織化学的検討を行った。また、マーカーとして臨床的に有用であるかを尿中剥離細胞でのPPLの発現頻度を免疫染色にて検討した。組織における検討では、PPLの発現は、癌では消失し、正常の尿路上皮では発現を認めた。PPLの発現の有無と組織学的悪性度、深達度、臨床病期では明らかな関連は認めなかった。尿中移行上皮細胞でのPPL発現は、癌患者群でコントロール群と比べて低下した。ROC曲線よりPPL陽性率のcut off値を66%とすると感度74.4%、特異度69.7%であった。また、癌があるにもかかわらず細胞診が陰性であった31例中23例(74.2%)でPPL陽性率が異常値を示した。尿中移行上皮細胞でのPPL発現は、従来の尿細胞診診断と併用して同じ尿のプレパラートで免疫染色を行うことにより尿細胞診の強力な補助診断が可能となり、尿細胞診検査の正診率を飛躍的に向上させることが期待される。また、PPLが正常膀胱粘膜構造を保ち、膀胱癌の浸潤、進行や転移を抑えている可能性がある。そこでPPLの膀胱癌の浸潤、進行への関与を解析することは、癌の進展機序の解明だけではなく癌治療への応用という点からも大変意義深いと思われる。我々は、膀胱癌細胞株を用い、PPLを遺伝子導入あるいは発現抑制し、増殖抑制・浸潤抑制について今後検討する予定である。我々は、高分子量のプロテオミクス解析によって膀胱癌組織で発現が消失する新規膀胱癌マーカー蛋白質ペリプラキン(PPL)を発見した。本研究では尿中剥離細胞でPPL発現を免疫組織化学的に検討することにより、より精度の高い膀胱癌の非侵襲的検査法を確立することを第一の目的とした。これまでに、尿中剥離細胞の免疫染色による解析から、癌患者群ではPPL発現が低下することを明らかとし、尿細胞診と併用することにより診断精度を向上させる可能性があること示した。これまで尿中剥離細胞でのPPL発現を解析してきたが、尿中で測定することが可能となれば、さらに簡便な膀胱癌の診断法を確立できると考えられたため、尿中でのPPL発現をWestern Blot法にて解析した。膀胱癌患者群6例、コントロール群3例の尿を用いて検討したところ、期待される分子量にPPLは検出されなかったが、分子量の小さいタンパク質が癌患者群で5例、コントロール群で1例に検出され、癌で発現が増加することが明らかとなった。PPLは新たな尿中マーカーとなると考えられ、尿中PPL測定は、より簡便な膀胱癌診断法となる可能性が示唆された。
幼若永久歯の根尖閉鎮機構-基質小胞性石灰化について-

1996年に日本小児歯科学会が発表した「小児の歯の外傷の実態調査」において幼若永久歯の外傷の頻度の高さが改めて浮き彫りになった、外傷により歯髄処置を必要とする幼若永久歯の症例は、多い。しかし完全抜髄および感染根管処置後の失活歯に対する根管充填処置後(Apexification)に伴う根尖閉鎖には、その由来の細胞や石灰化機構に不明な部分が多い。また添加された硬組織の不十分な石灰化が指摘されている。今回、我々は歯根の形成に関与する象牙芽細胞の基質小胞性石灰化に焦点を置いた。実験材料は、胎生8ヶ月のウシの歯胚を使用し、象牙芽細胞および象牙前質を分離し、Aliの方法に従い、コラゲナーゼ処理後、分画遠心により基質小胞画分を調製した。得られた基質小胞画分を蔗糖密度勾配遠心法により分画後、Alkline phosphtase(ALP), Protease, Lactate dehydrogenase(LDH)を指標酵素として検索を行い、以下の結果を得た。2.基質小胞中のProteaseは、Zn^<2+>,Fe^<2+>,Co^<2+>を必要とするMetalloproteaseであった。3.現在、基質小胞中のmetrallloprotraseを精製中で、今後DNAsequenceを同定する予定である。4.セメント芽細胞層についても同様に検索中である。1996年に日本小児歯科学会が報告した「小児の歯の外傷の実態調査」において幼若永久歯の外傷の頻度の高さが浮き彫りになった。外傷により歯髄処置を必要とする幼若永久歯の症例は、多い。しかし完全抜髄および感染根管処置後の失活歯に対する根管充填処置(Apexification)に伴う根尖閉鎖には、その由来の細胞や石灰化機構に不明な部分が多い。また添加された硬組織の不十分な石灰化が、指摘されている。平成12年度は歯根の形成に関与する象牙芽細胞の基質小胞性石灰化に焦点を置いた。基質小胞は、軟骨や歯などの硬組織石灰化部位の細胞外基質中に存在する小胞であり、初期石灰化に重要な役割を演じるとされている。実験にはウシ歯胚を使用し、象牙芽細胞層を分離後、Aliの方法に従い、コラゲナーゼ処理後、分画遠心により基質小胞画分を調製した。得られた基質小胞画分を蔗糖密度勾配遠心法により分画後、Alkaline phosphatase,Protease,Lacatate dehydrogenaseを指標酵素として検索した。その結果、前記の3種類の酵素を含む基質小胞の外に、Alkaline phosphatase,Lactate dehydrogenaseを含むが、metallo proteaseを含まない基質小胞様小胞が存在することを明らかにした。また基質小胞中のproteaseは、metalloproteaseであることを明らかにした。現在、このmetalloproteaseの特性について検索中である。近年、日本小児歯科学会が報告した「小児の歯の外傷の実態調査」において改めて、幼若永久歯の外傷の頻度の高さが浮き彫りになった。外傷に伴い、歯内療法を必要とする症例も多い。その際に最も問題になるのは、歯根形成である。そこで歯根形成に最も関与する象牙質の石灰化(特に基質小胞性石灰化)について検索した。胎生期のウシの歯胚を使用し、象牙芽細胞および象牙前質より、基質小胞を分離し、以下の結果を得た。2.基質小胞中のProteaseは、Zn^<2+>,Fe^<2+>,Co^<2+>を必要とするmetalloproteaseであった。3.象牙芽細胞層から細胞培養を行い、metalloproteaseに対する抗体とプロテインAゴールドを用いる免疫組織化学的手法により、両小胞を検索中である。
インターネット上の組織の相対的なトラフィック量推定に関する研究

本研究課題では,インターネット上のノード(組織や個人)の生成するトラフィック量がどのような分布で特徴付けられるかを,複数のインターネットトラフィックデータから解析した.その結果,ノードのトラフィックは既存の指数分布モデルとは異なり,裾の広い対数正規分布でモデル化する必要があることが明らかになった.また,そのような分布が,トラフィック量の指数的増加により説明可能であることを明らかにした.本研究課題では,インターネット上のノード(組織や個人)の生成するトラフィック量がどのような分布で特徴付けられるかを,複数のインターネットトラフィックデータから解析した.その結果,ノードのトラフィックは既存の指数分布モデルとは異なり,裾の広い対数正規分布でモデル化する必要があることが明らかになった.また,そのような分布が,トラフィック量の指数的増加により説明可能であることを明らかにした.本研究では,インターネット上の組織(AS(Autonomous System)やドメインレベル)で生成されるトラフィック量を,複数の指標を用いて相対的に推定する方法を確立することを目標としている.これにより,これまで大規模ネッワークシミュレーションでは考慮されていなかったトラフィック量の空間統計モデルを,より実態に即したものとして提案できる.この結果は全てのネットワークシミュレーション研究に,より正確な共通的モデルを提供するものであり,該当研究分野にインパクトを与えるものである.本年度は,SINETトラフィックデータを利用して,組織ごとのトラフィック分布を解析した.基となるデータは,SNMPを用いて収集したノードのインターフェイスバイトカウンタである.解析の結果,組織単位のトラフィックは直感的な正規分布にしたがうのではなく,より裾の長い分布を持つ対数正規分布にしたがうことがわかった.また,裾の長い分布の一つであるべき分布に対するフィッティングが適切でないことを示した.同様に観測される分布ならびにトラフィック成長率を再現するモデルとして,multiplicative modelが適切なモデルの1つであることをシミュレーションより明らかにした.この結果,一定の年率増加するトラフィック成長が止まった後に,定量増加傾向に転じたとしても,トラフィックの分布にはほとんど影響を及ぼさないことが示された:本研究では,インターネット上の組織(AS(Autonomous System)やドメインレベル)で生成されるトラフィック量を,複数の指標を用いて相対的に推定する方法を確立することを目標としている.これにより,これまで大規模ネッワークシミュレーションでは考慮されていなかったトラフィック量の空間統計モデルを,より実態に即したものとして提案できる.この結果は全てのネットワークシミュレーション研究に,より正確な共通的モデルを提供するものであり,該当研究分野にインパクトを与えるものである.本年度は, SINETトラフィックデータを利用して,組織ごとのトラフィック分布を解析した.基となるデータは, SNMPを用いて収集したノードのインターフェイスバイトカウンタである.解析の結果,組織単位のトラフィックは直感的な正規分布にしたがうのではなく,より裾の長い分布を持つ対数正規分布にしたがうことがわかった.また,裾の長い分布の一つであるべき分布に対するフィッティングが適切でないことを示した.また,商用ISPのブロードバンドカスタマのトラフィック入出力トラフィックデータを使用して,ノードとして見た場合の,組織のトラフィックと個人のトラフィックの統計的性質を解析した.その結果,個人のトラフィックでは,同様にトラフィック分布は対数正規分布に従うものの,通常のユーザならびにヘビーユーザの2種類のユーザタイプがそれぞれ異なる平均・分散を持つ対数正規分布で特徴付けられることが明らかとなった.
ホヤゲノムにコードされる小分子RNAの包括的探索

近年、miRNA等の小分子RNAが、広い範囲の生命現象に重要な役割を果たしていることが明らかになってきた。そこで本研究では、脊椎動物のモデル生物(ホヤ)の転写制御に関するこれまでの研究経験をいかして、理論と実験を組み合わせ、ホヤゲノムにコードされた小分子RNAを包括的に検出し、その特徴付けを行った。その結果、新しいmiRNA遺伝子候補群を信頼度付きで得たほか、いくつか興味深い発現パターンを示すものについては、ヒトなどとの対応遺伝子との進化的保存性と多様性を明らかにした。本課題の申請時に計画していた内容に近い研究が海外で発衰されたこともあり、当初の方針を変更して、とりあえず他の生物種で組織特異的発現をすることが知られているmicroRNAのホヤにおけるホモログをゲノムから探索し、その機能解析を行うことどした。まず、脊椎動物で筋肉特異的であるmiR-1/miR-133がホヤゲノム中、シングルコピーであること、脊椎動物と類似のクラスター構造をもち、脊椎動物と同様にmib(mindbomb)遺伝子のイントロンに存在することをみいだした。また、ナメクジウオでも、やはりmibのイントロンに存在することが明らかになった。miR-1とmiR-133の発現プロファイルについて、5'EsTのマッピング、insitttハイブリダイゼーション、ノザン解析を行い、miR-1とmiR-133は主に成体の筋肉組織(心筋、体壁筋)で発現が顕著であること、両者の発現パターンに明瞭な違いがあり、それぞれ異なる発現制御を受けている可能性があることが示された。次に、神経系で特異的に発現するmiRの候補として、ゼブラフィッシュおよび哺乳類の発現データをもとに、12の遺伝子を選び、ホヤゲノム中の探索、カタユウレイボヤとユウレイボヤの種間比較を行った。ホヤに存在することが濃厚となったlet-7、miR-7、miR-8、miR-34、miR-124、miR-125、miR-153、miR-183について、LNAプローブを設計し、insituハイブリダイゼーションとノザン解析を行った。in situハイブリダイゼーションの結果、miR-124が尾芽胚期から中枢神経系(脳・運動神経節)特異的に発現することが明らかになった。この他、小分子RNAの生合成等に関わる遺伝子の解析も進行中である。近年、miRNAなどの小分子RNA(ncRNA)が、さまぎまなメカニズムで広い範囲の細胞機能や発生過程に重要な役割を果たしていることが明らかになってきている。また、それら小分子RNAの生合成や機能発現にはDicer, Drosha, Piwi/Argonauteなどの遺伝子ファミリーも種を超えて関わっていることが明らかにされつつある。そこで本研究では、これまで我々が行ってきた脊椎動物のモデル生物(ホヤ)の転写制御領域に関する研究経験をいかして、理論と実験を組み合わせて、ホヤゲノムにコードされた小分子RNAの機能解明を目指している。また、ゼブラフィッシュとの進化的保存性を調べることで、脊椎動物の研究へも新しい角度からの貢献を目指している。今年度の成果としては、まずゼブラフィッシュなどの脊椎動物の筋肉細胞発生に重要な役割を果たすことが知られている2種類のmiRNA(miR-1,miR-133)のホヤホモログについて、その転写調節領域を単離し、蛍光レポーターを用いて、幼生筋特異的な発現を得ることに成功した。現在、詳細な転写制御配列の解析と、Kaedeレポーターを用いた発現細胞の追跡を行っている。また、上述のDicerなどの小分子RNAの生合成などに関わる遺伝子群の解析も行った。ホヤゲノムにはDicer, Droshaはそれぞれ一遺伝子しかコードされていない。Argonauteも一遺伝子だが、piwiは2個のファミリーメンバーが存在する。これらの遺伝子はホヤの発生において非常に早い段階で発現していることを確認した。特にpiwiの二つの相同遺伝子のうちの一つの転写調節領域を単離し、蛍光レポーターによってその発現パターンを再現することに成功したので、今後、より詳細に発現細胞の追跡と、転写制御領域の解析を行う。最後に、次世代シークエンサーを用いた、組織特異的・発生時期特異的サンプルの網羅的なトランスクリプトームデータが得られており、現在その解析と整備を進めている。近年、miRNAなどの小分子RNA(ncRNA)が、さまざまなメカニズムで広い範囲の細胞機能や発生過程に重要な役割を果たしていることが明らかになってきている。また、それら小分子RNAの生合成や機能発現にはDicer,Drosha,Piwi/Argonauteなどの遺伝子ファミリーも種を超えて関わっていることが明らかにされつつある。そこで本研究では、これまで我々が行ってきた脊椎動物のモデル生物(ホヤ)の転写制御領域に関する研究経験を活かし、理論と実験を組み合わせて、ホヤゲノムにコードされた小分子RNAの機能解明を行った。また、脊椎動物の研究へも新しい角度からの貢献を目指して、メダカなどの魚類との進化的保存性を調べた。

今年度は総仕上げとして、ホヤゲノムにおける未発見のmiRNAを調べるために、まず現在入手できた(一部は投稿中)4つのmiRNA予測結果とmiRBaseのアノテーションを比較し、相互の予測結果の重なりの傾向を調べた。これによって、miRBaseに未登録のmiRNA候補をスコア付けしてリストアップし、可能性の高そうなものの妥当性を現在検討中である。たとえば次世代シークエンサーを用いていくつかの組織で網羅的なTSS-seq解析を行った結果とも比較している。次に、前年度に続いて、ゼブラフィッシュなどの脊椎動物の筋肉細胞発生に重要な役割を果たすことが知られているmiRNAのホヤホモログについて、その転写調節領域を解析した。これらの筋肉特異的miRNAについては、メダカホモログが胚発生において果たす役割も解析して、その進化的意義を考察した。最後に、小分子RNAの生合成などに関わる遺伝子群の解析として、今年度はPiwiの機能を解析したところ、従来他の生物で知られている生殖細胞だけでなく、ホヤにおける神経系における新たな活性を発見した。
混相流体の特性を含む大気境界層パラメタリゼーションの開発

気候変動に伴い台風の強大化が予測される中,それに伴う豪雨,高潮,強風による甚大な被害が予測される.そこで,台風の発達に関わる大気と海面間の運動量・熱交換の物理過程を解明し,台風へのそれぞれの影響を評価し,再現性を向上する.野外観測では,船舶レーダやパーティクルカウンタを用いて,降雨や砕波飛沫,海面波を面的に捉え,台風など暴風状態での境界層に存在する乱流構造を解明し,運動量輸送量を推定する.また,暴風雨下での運動量・熱交換を解析的に議論可能なモデルを構築する.解析的に得られた運動量・熱交換係数を数値気象モデルに組み込み,台風の風速や中心気圧,降雨量の変化を定量的に評価する.気候変動に伴い台風の強大化が予測される中,それに伴う豪雨,高潮,強風による甚大な被害が予測される.そこで,台風の発達に関わる大気と海面間の運動量・熱交換の物理過程を解明し,台風へのそれぞれの影響を評価し,再現性を向上する.野外観測では,船舶レーダやパーティクルカウンタを用いて,降雨や砕波飛沫,海面波を面的に捉え,台風など暴風状態での境界層に存在する乱流構造を解明し,運動量輸送量を推定する.また,暴風雨下での運動量・熱交換を解析的に議論可能なモデルを構築する.解析的に得られた運動量・熱交換係数を数値気象モデルに組み込み,台風の風速や中心気圧,降雨量の変化を定量的に評価する.
１４－３－３ファミリータンパク質が制御する癌細胞の悪性化メカニズムの全容解明

癌の悪性化に働くFBI1/Akirin2により下方制御される遺伝子として、BCAMとSPARCを同定し、癌抑制遺伝子として機能することを明らかにした。これらの結果より、FBI1/Akirin2は、癌抑制遺伝子の転写を抑制させることで、癌の悪性化に関与するというユニークな制御を行っていることが明らかとなった。さらに、マウスLLC1細胞においても、FBI1/Akirin2は、肺転移の促進など癌の悪性化に働くことから、普遍的な癌遺伝子である可能性が示唆された。14-3-3βとその結合因子FBI1/Akirin2複合体は、核内で転写抑制複合体を形成し、MAPキナーゼフォスファターゼであるMKP-1の発現を抑制し、Ras/Raf/ERKシグナル伝達経路を活性化させ、造腫瘍能と転移能を促進することを明らかにしてきた。平成24年度は、マイクロアレイ解析で同定したFBI1/Akirin2発現抑制細胞株で発現上昇した遺伝子SPARCの機能解析を行った。(1) SPARCが癌の悪性化にどのように働くか解析するため、ラット肝癌K2細胞を用いSPARC安定発現株と発現抑制株を樹立した。SPARC安定発現株と発現抑制株ともに、足場依存的増殖能はコントロール細胞株と変わらなかった。しかし、足場非依存的増殖能はSPARC安定発現株で有意にコロニー形成が抑制された。この結果より、ラット肝癌でSPARCは癌抑制タンパク質として機能していることが示唆された。(2) SPARC遺伝子の転写制御に、14-3-3β・FBI1/Akirin2複合体が影響を及ぼすか検討した。SPARCプロモーターを取得し、ルシフェラーゼ活性を調べたところ、FBI1/Akirin2の量依存的にSPARCプロモーター活性の抑制が確認された。さらに、FBI1/Akirin2が、B-CAMプロモーター上に結合することをクロマチン免疫沈降法により明らかにした。以上の結果より、14-3-3β・FBI1/Akirin2複合体は、癌抑制タンパク質SPARCの発現を抑制することで、腫瘍形成能と転移能を獲得すること明らかとした。さらに、本研究課題においてFBI1/Akirin2複合体の下流遺伝子をマイクロアレイ解析で探索し、FBI1/Akirin2発現抑制細胞株で発現亢進するSPARCとBCAMが、癌抑制因子として機能していることを明らかにし、その転写活性はFBI1/Akirin2により負に制御されていることを明らかとした。平成25年度は、これらの結果はラット肝癌由来K2細胞で明らかとされたが、様々な癌細胞においてもFBI1/Akirin2が癌の悪性化に寄与するかを明らかにするために、Lewis肺癌細胞株であるLLC1細胞を用いて、FBI1/Akirin2の機能を解析した。(1) LLC1細胞を用いFBI1/Akirin2発現抑制細胞株を樹立した。FBI1/Akirin2発現抑制LLC1細胞株は、足場非依存的増職能が抑制され、リン酸化ERKの抑制が示された。これらの、結果よりLLC1細胞においてもFBI1/Akirin2は、腫瘍促進能を有することが示された。(2) LLC1細胞は、肺への高い転移能を示すことが知られていることから、FBI1/Akirin2発現抑制LLC1細胞株の転移能の影響を検討した。その結果、FBI1/Akirin2発現抑制LLC1細胞株は、造腫瘍能の抑制および肺への転移能が抑制された。以上の結果より、14-3-3β・FBI1/Akirin2複合体は、ラット肝癌K2細胞のみではなく、様々な癌細胞において腫瘍形成能と転移能の獲得に関与していることを明らかとした。(1) 14-3-3β・FBI1/Akirin2複合体の標的因子を探索するため、FBI1/Akirin2発現抑制細胞で発現上昇する因子をマイクロアレイ解析で探索し、標的遺伝子の1つとして、B-CAMを単離した。(2) B-CAMが癌の悪性化にどのように働くか解析するため、B-CAM安定発現株を樹立した。B-CAM安定発現株は、足場非依存的増殖や運動能など癌の悪性化に寄与する性質が抑制されていることを明らかにした。

さらに、NOD/SCIDマウスへの移植実験により、造腫瘍能の抑制も確認された。これらの結果より、B-CAMは癌抑制タンパク質として機能していることが示唆された。(3) B-CAM遺伝子の転写制御に、14-3-3β・FBI1/Akirin2複合体が影響を及ぼすか検討した。B-CAMプロモーターを取得し、ルシフェラーゼ活性を調べたところ、FBI1/Akirin2の量依存的にB-CAMプロモーター活性の抑制が確認された。さらに、FBI1/Akirin2が、B-CAMプロモーター上に結合することをクロマチン免疫沈降法により明らかにした。以上の結果より、14-3-3β・FBI1/Akirin2複合体は、癌抑制タンパク質B-CAMの発現を抑制することで、腫瘍形成能と転移能を獲得すること明らかとした。FBI1/Akirin2の標的遺伝子であるSPARCの機能解析を通じて、14-3-3β・FBI1/Akirin2複合体による癌転移亢進メカニズムの一端を解明した。平成23年度は実施予定であったセルソーターを用いたSP解析による細胞分取が装置の技術的問題で実行できなかったが、平成24年度はSP解析の条件検討に成功した。さらには、FBI1発現抑制株を用いEMT関連遺伝子の発現変化も検討し、FBI1はEMT誘導に関与する事が明らかとなり、FBI1/ Akirin2が転移に関与する可能性が示唆された。FBI1/Akirin2の標的遺伝子であるB-CAMの機能解析を通じて、14-3-3β・FBI1/Akirin2複合体による癌転移亢進メカニズムの一端を解明した。平成23年度に実施予定であったセルソーターを用いたSP解析による細胞分取が装置の技術的問題で実行できなかった。SP解析の条件検討が整ったので、癌幹細胞の発生機序に14-3-3β・FBI1/Akirin2複合体が関与するか、癌幹細胞と非癌細胞をSP解析により分取し、EMT誘導実験および実験動物への移植により造腫瘍能を解析する。さらには、FBI1発現抑制株でABCトランスポーターの1つであるABCG2の発現抑制が認められたことから、抗癌剤排出に関与することが報告されているABCトランスポーター遺伝子(10種類)の発現を調べ、FBI1が発現制御しているABCトランスポーターを特定する。また、FBI1はコファクターとして転写制御因子複合体で働いているので、その全容解明のためFBI1に結合する因子の同定を試みたい。癌幹細胞の発生機序に14-3-3β・FBI1/Akirin2複合体が関与するか、癌幹細胞と非癌細胞をSP解析により分取し、EMT誘導実験および実験動物への移植により造腫瘍能を解析する計画であるが、技術的問題によりセルソーターを用いたSP分画の分取に至っていない。細胞分離用磁気ビーズを用いた分取を検討する予定である。B-CAM以外のFBI1/Akirin2標的遺伝子の機能解析も継続して行う予定である。次年度は、細胞培養関係の消耗品、EMTの誘導とその解析に使用するEMT誘導増殖因子、間葉系細胞関連抗体とマトリゲルチャンバーおよび免疫染色、ウェスタンブロットに使用する抗体と試薬購入費が必要となる。また、研究成果を癌専門誌への掲載のため、研究成果発表費が必要となる。
産褥早期におけるインファントマッサージの生理学的検証を用いた母子相互作用の検討

インファントマッサージの効果は、児への効果とあわせ母親の安心やリラックスをもたらすとの先行研究があり、母子愛着形成を促進する働きがある。本研究は産褥早期におけるインファントマッサージが、母親の持つ不安へどのように影響をもたらすのかを明らかにする目的で実施した。測定用具は、心理尺度としてState-Trait Anxiety Inventory(STAI)Form-Y(高橋ら)を用いインファントマッサージ実施前後の比較を行った。また生理学的指標として母親の心電図R-R間隔を測定し心電図R-R間隔変動係数(CV_<R-R>)を求め、インファントマッサージ実施前の安静時とマッサージ実施中との変化を検討した。また、インファントマッサージ実施後の母親の感想をインタビューした。調査は初産婦を対象に、産後2日目より連続4日間インファントマッサージを実施し、実施1日目ならびに4日目に測定を行った。結果は、STAIの変化ではState、Traitともインファントマッサージ後に低下する傾向を示した。心拍変動は、安静時よりインファントマッサージ実施中の方がR-R間隔が短く、CV_<R-R>が高い傾向を示した。インファントマッサージ実施後の母親の感想はマッサージを行うことへの緊張感を示すものは少なく、マッサージを通して子どもの様子や変化を感じているものが多くみられた。これらの結果から、産褥早期のインファントマッサージ実施は心理的指標においては母親の不安が低下する傾向を認めた。CV_<R-R>はインファントマッサージ中の方が高い傾向を示し、副交感神経機能優位な状態反応を示さない可能性が示唆された。本年度は研究を実施するにあたり、以下2点の事項を検討した。(1)インファントマッサージ導入のリスク文献上、タッチケアを実施する前後において、児のバイタルサインの変化を認めないという報告があるが、同時に児の体調によってはストレス徴候を示す新生児もあるとも述べられており、インファントマッサージ導入時の児の変化には留意が必要であると考えられた。本研究で導入予定のマッサージ方法は、児のサインを読み取りながら実施することがマニュアルにあげられているため、実施者である母親と、新生児のストレス徴候を事前に確認することで児へのストレスは回避でき、研究実施に大きな問題にはならない。しかし、この方法における新生児への影響については科学的に検証されておらず、研究に際しては細心の注意を払い実施する必要があると考え、当大学看護学部倫理委員会のみでなく、研究予定である施設の倫理委員会において、重ねて審査を受ける必要性が高いと考え、現在申請準備中である。(2)計測器具の妥当性使用予定の計測機器を用いた女性における実験は先行研究で行われているが、産褥期の女性においても同様に計測可能であるかは不明であり、倫理委員会の承認を得た上で予備研究を実施していく。
不均一収縮を呈する心筋においてグルコース値の上昇が不整脈の発生に果たす役割の解明

グルコース値の上昇がカルシウム・カルモデュリン依存性プロテインキナーゼII(CaMKII)をO-結合型グリコシル化し、このグリコシル化によるCaMKIIの活性化が不整脈を増加させるという仮説が提唱されている。そこで以下の測定を行った。(1)グルコース値の150から400 mg/dLへの上昇は、ラット多細胞心室筋においてカルシウム波伝播速度を増加させ(n=9, p<0.05)、400から150 mg/dLへの減少は伝播速度を低下させた(n=9, p<0.05)。CaMKIIの阻害薬であるKN-93存在下での400 mg/dLへのグルコース値の上昇は、カルシウム波伝播速度を増加させなかった(n=9)。イソプロテレノール存在下で、グルコース値の150から400 mg/dLへの上昇は、電気刺激後の不整脈を増加させた(n=8, p<0.05)。CaMKIIの阻害薬であるKN-93(n=7)とautocamtide-2 related inhibitorypeptide (n=6)存在下、フルクトース6リン酸からグルコサミン6リン酸への変換酵素を阻害するジアゾ5オキソLノルロイシン(n=7)存在下では、グルコース値の400 mg/dLへの上昇は電気刺激後の不整脈を増加させなかった。(2)グルコース値の上昇による浸透圧の上昇が催不整脈性の亢進に関与するのかどうかを検証するために、グルコース値150mg/dlにL-グルコース250mg/dLを加えた。L-グルコースを用いたグルコース値の上昇は電気刺激後の不整脈を増加させなかった(n=6)。(3)CaMKII活性の測定はSignaTECT CaM KII Assay System(Promega)を用いて行った。グルコース値の150から400 mg/dLへ上昇はCaMKII活性を増加させた(n=5, p<0.05)。心疾患を有していない糖尿病患者において、血糖値の上昇は動悸などの自覚症状を引き起こすことはない。そのため、グルコース値の上昇が、正常心筋と不均一収縮を呈するような病的心筋に与える影響の相違点をまず初めに明らかにした。1)ラット多細胞心室筋(トラベクラ)を摘出し、2秒間隔電気刺激、細胞外カルシウム濃度0.7mMの低カルシウム負荷状態において、グルコース値を150から400mg/dlへと上昇させ、張力・細胞内カルシウムを記録し、グルコース値の上昇が正常心筋に与える影響を検証した。グルコース値の上昇は、電気刺激による発生張力と細胞内カルシウムを変化させなかった。2)糖尿病患者に認められる病的心筋の実験モデルとして研究代表者らが確立した不均一収縮心筋を用いた。0.4秒間隔電気刺激、細胞外カルシウム濃度2mMの高カルシウム負荷状態において、グルコース値を150から400mg/dlへと上昇させ、細胞内カルシウム動態の変化を記録した。グルコース値の上昇は、カルシウム波伝播速度と後収縮の大きさを増加させた。β刺激薬である200mMイソプロテレノールを加え、高カルシウム負荷状態において不整脈を誘発し、グルコース値の上昇による不整脈の誘発性を記録した。グルコース値の上昇は電気刺激によって誘発される不整脈を増加させた。以上より、グルコース値の上昇は、細胞内カルシウム負荷のある状態においてのみ、カルシウム波を促進し、催不整脈性を亢進させることが明らかになった。科研費内定の決定が10月と遅く、実験の開始が遅れたため。ストレプトゾトシンを腹腔内注射し、8週間後に血糖値が300mg/dlを超えたラットを糖尿病ラット、生理食塩水を腹腔内注射したラットを対照ラットとして実験を行った。ストレプトゾトシンを腹腔内注射したラットの血糖値は平均573mg/dlと上昇していた。(1)グルコース値上昇による発生張力の変化の検証糖尿病ラットにおいては対照ラットと比べて、発生張力と最大細胞内カルシウム値が有意に低下した。対照ラットでは、低カルシウム負荷状態においてグルコース150と400mg/dlで発生張力と細胞内カルシウムは変化せず、カルシウム波伝播速度と催不整脈性にも変化を認めなかった。一方、高カルシウム負荷状態においてはグルコース150に比べて400mg/dlでは発生張力が低下したのに対し、細胞内カルシウムは変化しなかった。このことはグルコースの上昇により収縮蛋白のカルシウム感受性が低下したことを示唆した。更に、グルコースの上昇により、カルシウム波伝播速度が亢進し、不整脈が増加した。これに対し、糖尿病ラットでは、低カルシウム負荷と高カルシウム負荷状態のどちらにおいても、グルコース値400mg/dlで収縮蛋白に対するカルシウム感受性は変化せず、カルシウム波伝播速度と催不整脈性にも変化を認めなかった。(2)不整脈性の発生機序の解明グルコース値の変化によるCaMKII活性の影響を糖尿病ラットと対照ラットで記録し、催不整脈性への影響を解明した。対照ラットにおいてはグルコース値400mg/dlで不整脈が誘発された。CaMKII阻害薬であるKN93などの投与によって、この催不整脈性の亢進は抑制された。対照ラットと糖尿病ラットにおける多細胞心室筋(トラベクラ)を用いた研究が予定通りに進んでいる。