hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
歯周病原細フソバクテリウム属由来リピドAの化学構造と宿主細胞活性化機構

本研究は,健常者の歯肉溝や歯周病患者の病巣局所より高頻度に検出されるグラム陰性紡錘状細菌であるFusobacterium nucleatum細胞壁外膜に存在するリピドAを分離・精製し,その化学構造および宿主(細胞)に対する作用機構について明らかにしようとするものである.本年度は以下の結果が得られた.1.F.nucleatum subsp.nucleatum ATCC 25586^Tを,ヘミンおよびメナジオンを添加したGAM培地を用いて大量培養し,遠心操作により菌体を得た.2.同菌体を凍結乾燥後,温水・フェノール法によりリボ多糖(LPS)画分を粗抽出し,タンパク分解酵素や核酸分解酵素にて処理した.3.同LPS画分を酢酸により加水分解し,その活性中心であるリピドA画分を切出し後,疎水性相互作用,イオン交換およびゲル濾過などの各種クロマトグラフィーを用いて単離・精製した.4.リピドAの化学構造をMSスペクトラムにより解析した結果,リピドAの分子量は1949.2と1978.3が2:1の割合で存在していることが明らかとなった.分子量1949.2のメインピークをMS-MSスペクトラムにより解析した結果,1位,4'位にリン酸基をもつβ(1-6)グルコサミンジサッカリド骨格の2,3位に炭素数14の3-ヒドロキシルアシル基,2',3'位に炭素数14と16のアシルオキシアシル基を含む6本鎖の直鎖脂肪酸をもっリピドAであることが明らかとなった.他方,分子量19783のリピドAは,炭素数14の脂肪酸のいずれかが炭素数16に置換したものと推測される.現在,得られたLPS/リピドAの内毒素活性および宿主細胞活性化機構について検討を進めている.本研究は,健常者の歯肉溝や歯周病患者の病巣局所より高頻度に検出されるグラム陰性紡錘状細菌であるFusobacterium nucleatum細胞壁外膜に存在するリピドAを分離・精製し,その化学構造および宿主(細胞)に対する作用機構について明らかにしようとするものである.本年度は以下の結果が得られた.1.F.nucleatum subsp.nucleatum ATCC 25586^Tを,ヘミンおよびメナジオンを添加したGAM培地を用いて大量培養し,遠心操作により菌体を得た.2.同菌体を凍結乾燥後,温水・フェノール法によりリボ多糖(LPS)画分を粗抽出し,タンパク分解酵素や核酸分解酵素にて処理した.3.同LPS画分を酢酸により加水分解し,その活性中心であるリピドA画分を切出し後,疎水性相互作用,イオン交換およびゲル濾過などの各種クロマトグラフィーを用いて単離・精製した.4.リピドAの化学構造をMSスペクトラムにより解析した結果,リピドAの分子量は1949.2と1978.3が2:1の割合で存在していることが明らかとなった.分子量1949.2のメインピークをMS-MSスペクトラムにより解析した結果,1位,4'位にリン酸基をもつβ(1-6)グルコサミンジサッカリド骨格の2,3位に炭素数14の3-ヒドロキシルアシル基,2',3'位に炭素数14と16のアシルオキシアシル基を含む6本鎖の直鎖脂肪酸をもっリピドAであることが明らかとなった.他方,分子量19783のリピドAは,炭素数14の脂肪酸のいずれかが炭素数16に置換したものと推測される.現在,得られたLPS/リピドAの内毒素活性および宿主細胞活性化機構について検討を進めている.
化合物半導体多結晶薄膜太陽電池における結晶粒界の不活性化に関する研究

多結晶CdS/cdTe太陽電池について、接合の基礎特性を明らかにすると共に,性能向上に向けて接合の水素アニール処理を行った。得られた成果は次の通りである。(1)数mm角の小面積ダイオードの接合特性は,室温での飽和電流密度が10^<-11>A/cm^2オーダー,容量特性から求めた空乏層付近の不純物濃度が10^<14>cm^<-3>のオーダーデあり,不純物濃度はほぼ満足できる値であるものの,飽和電流密度が同程度の禁止帯幅をもつGaAsダイオードと比較して2桁ほど高い値であることがわかった。(2)接合内の再結合中心について解析したところ,活性化エネルギー0.4eV付近に存在しており,飽和電流密度を減少させるにはこの中心を不活性化することが必要である。この原因を明らかにするためDLTS測定を行い,深い不純物レベルとして価電子帯から0.55eVという値を得たが,この信号には少数キャリア注入が原因と見られる逆方向のピークとの重なりがあり,正確に合離できなかった。今後ピーク分離を行いオリジンを解明していく必要がある。(3)cds/cdTe接合の各接合作製段階での水素アニールを試みたところ,Cds膜抵抗が大きく減少し,直列抵抗損失を大きく減少させることができたことに加え,空乏層付近の不純物濃度も合わせて減少していることがわかった。このことは空乏層が広がることに対応し,多結晶太陽電池のようにキャリア拡散長の短い材料では,光電流の増加にも寄与していることがわかった。(4)多結晶材料の特性が太陽電池出力に与える影響を調べるため,温度および入射光強度に対するI・V特性の変化を調べたところ,光電流が温度上昇とともに減少するという,単結晶とは反対の傾向がみられた。原因として不純物レベルの活性化とともに空乏層幅が変化する事が上られる。
赤外波長域カルコゲナイド光ファイバーを用いた非侵襲的血糖計測システムの開発

中赤外波長域については,吸光スペクトル測定には,フーリエ変換赤外分光光度計を用い,入射光をカルコゲナイド光ファイバーに導き,先端部に組み込まれたカルコゲナイドATRプリズムと試料表面の薄層間で減衰全反射を行わせ,反射光を水銀-カドミウム-テルル半導体検出器にて検出した。まず,本法をブドウ糖水溶液(ブドウ糖濃度:501000mg/dl)へ適用,ブドウ糖固有の吸光ピークを波数1033及び1080cm^<-1>に認め,波数1080cm^<-1>の吸光強度がブドウ糖濃度定量化のパラメータとして最適であることを確認した。次に,カルコゲナイドATRプリズムを口唇粘膜へ一定圧で接着,口唇粘膜組織の吸光スペクトルを解析した結果,ブドウ糖水溶液と同様,ブドウ糖固有の吸光スペクトルを認めた。さらに,静脈内ブドウ糖パルス状負荷時の口唇粘膜組織の吸光強度は,4分の時間遅れで血糖値の変動によく追随することを認め,口唇粘膜組織の吸光強度の変化が組織内ブドウ糖濃度の変化を反映していることを確認した。現在,糖尿病患者における血糖日内変動の計測を試みており,波数1080cm^<-1>の吸光強度と血糖値の間に相関係数r=0.92と高い正の相関を認め,本システムが非侵襲的血糖計測システムとして有用であることが示された。また,近赤外波長域においては,石英光ファイバーを用いた透過光及び拡散反射光での計測を行い,吸光スペクトルはインジウム-アンチモン半導体検出器にて検出した。まず,本法をブドウ糖水溶液へ適用した結果,850011000cm^<-1>に,ブドウ糖濃度依存性に吸光スペクトルが変化する領域を認め,この領域を用いて検量線の作成を試みた。さらに,耳朶や指頭部にて透過光及び拡散反射光の吸光スペクトルの測定可能なプローブを作製した。本プローブを用いて得られた吸光スペクトルを多変量解析することにより,血糖値との間に相関係数r=0.76と高い正の相関を認め,本法の有用性を確認した。現在,糖尿病患者における血糖日内変動の計測を試みている。

また,近赤外波長域においては,石英光ファイバーを用いた透過光及び拡散反射光での計測を行い,吸光スペクトルはインジウム-アンチモン半導体検出器にて検出した。まず,本法をブドウ糖水溶液へ適用した結果,850011000cm^<-1>に,ブドウ糖濃度依存性に吸光スペクトルが変化する領域を認め,この領域を用いて検量線の作成を試みた。さらに,耳朶や指頭部にて透過光及び拡散反射光の吸光スペクトルの測定可能なプローブを作製した。今後,本プローブを用いて得られた吸光スペクトルを多変量解析し,生体応用時の計測アルゴリズムの確立を試みる。中赤外波長域については,吸光スペクトル測定には,フーリエ変換赤外分光光度計を用い,入射光をカルコゲナイド光ファイバーに導き,先端部に組み込まれたカルコゲナイドATRプリズムと試料表面の薄層間で減衰全反射を行わせ,反射光を水銀-カドミウム-テルル半導体検出器にて検出した。まず,本法をブドウ糖水溶液(ブドウ糖濃度:501000mg/dl)へ適用,ブドウ糖固有の吸光ピークを波数1033及び1080cm^<-1>に認め,波数1080cm^<-1>の吸光強度がブドウ糖濃度定量化のパラメータとして最適であることを確認した。次に,カルコゲナイドATRプリズムを口唇粘膜へ一定圧で接着,口唇粘膜組織の吸光スペクトルを解析した結果,ブドウ糖水溶液と同様,ブドウ糖固有の吸光スペクトルを認めた。さらに,静脈内ブドウ糖パルス状負荷時の口唇粘膜組織の吸光強度は,4分の時間遅れで血糖値の変動によく追随することを認め,口唇粘膜組織の吸光強度の変化が組織内ブドウ糖濃度の変化を反映していることを確認した。現在,糖尿病患者における血糖日内変動の計測を試みており,波数1080cm^<-1>の吸光強度と血糖値の間に相関係数r=0.92と高い正の相関を認め,本システムが非侵襲的血糖計測システムとして有用であることが示された。本プローブを用いて得られた吸光スペクトルを多変量解析することにより,血糖値との間に相関係数r=0.76と高い正の相関を認め,本法の有用性を確認した。
マウス生殖細胞におけるナノス2結合タンパク質の同定と機能解析

本研究においては、マウス生殖細胞の雄性化に必須な機能を持つRNA結合タンパク質NANOS2の生化学的・細胞生物学的解析を行うことによってその細胞内局在、結合するタンパク質やRNAを明らかにした。以上の知見をもとにしてNanos2の機能モデルを提唱すると共に、生殖細胞の雄性化を制御する分子機構についてその一端を明らかにした。マウス生殖細胞の雄性分化は、RNA結合蛋白質であるNanos2によって制御されている。しかしながら、その分子的基盤については未だに不明である。本研究においては、Nanos2の結合蛋白質を網羅的に同定すると同時に、同定した蛋白質の機能を解析することによって、Nanos2との結合の生理的意義を明らかにすることを目指している。そうすることによって、生殖細胞の雄性分化を制御する分子ネットワークの全体像を明らかに出来ると期待している。以上の目的のために、Nanos2蛋白質を生体組織から効率的に単離するための遺伝子改変マウスを考案して提唱した。Nanos2を効率よく単離したいが、マウスのライフサイクルには約9週間もの時間がかかるというジレンマがあるものの、平成20年度において作製に成功し、現在、その数を増やしている。また、Nanos2結合蛋白質の候補であるD1BwgO121eについて培養細胞を用いて解析したところ、確かにNanos2結合蛋白質であることを確認できた。また、それ以外に、D1BwgO212eは単独でDeadenylation complexと結合することを発見したことから、D1BwgO212eをDeadenylation complexの新規な構成因子として同定することが出来た。今後は、D1BwgO212eがDeadenylation complexの活性などの生理的機能に関与する可能性について検討する予定である。Nanos2もD1BwgO212eもRNA制御に関わることが深く示唆されていることから、生殖細胞の雄性分化には未だに明らかになっていないRNAの制御システムが存在する可能性がある。平成21年度の解析において、そういった制御メカニズムが明らかになることを期待している。マウスの生殖細胞は胚体外で少数の細胞集団として形成される。その後、増殖しながら移動し、将来の生殖巣へと到達する。移動期の生殖細胞は卵母細胞にも精母細胞にも分化する能力を持つが、生殖巣に到達すると体細胞側の性に従って分化を開始する。すなわち、雌においては減数分裂を開始するのに対して、雄においては細胞周期が停止する。Nanos2は生殖巣に到達した雄性生殖細胞に特異的に発現するRNA結合蛋白質であり、生殖細胞の性分化を制御する。すなわち、Nanos2が発現することによって生殖細胞中の雌のプログラムが抑制され、一方で雄のプログラムが働いて生殖細胞が雄性化する。そこで、その分子機構を明らかにするために、まず、Nanos2の細胞内局在を解析したところ、Processing body(P-body)と呼ばれるRNAを分解する細胞内小器官に局在していることが明らかになった。また、Nanos2に結合する因子を免疫沈降と質量分析法によって解析したところDeadenylation complexが同定された。このことから、Nanos2は特定のmRNA上にDeadenylation complexをリクルートすることでそのRNAの分解を促進し、そうすることで生殖細胞の雌性化を抑制することが強く示唆された。しかしながら、Nanos2自体はRNAと非特異的に結合するために、mRNA結合特異性を決定するメカニズムは未だに不明である。そこで、雄の生殖巣抽出液を用いて、免疫沈降と質量分析法によるNanos2結合蛋白質の同定をさらに詳細に行った。その結果、21個のRNA依存的、14個のRNA非依存的なNanos2結合蛋白質を新たに同定することに成功した。この中にNanos2の結合特異性を決定する因子が存在する可能性が高く、生殖細胞の雌雄分化のメカニズムを解明する上で重要な知見を得られると考えている。
神経芽腫の早期診断と病態解明に関するニューロペプチドY測定の意義

神経芽細胞腫(本症)患児の血漿NPY濃度について測定法を改革し、尿中NPY濃度を測定するとともに免疫組織化学染色によりNPYとKi-67の染色を行い比較検討を行った。対象は85年以後の本症群63例と他疾患群64例の計127例である。1)本症の血漿NPY濃度は他疾患群に比し有意に高値を示し、本症診断の鋭敏性は86%、特異性は82%であった。本症血漿NPY濃度は年齢とともに増加し4歳以上では10,000pg/ml前後の値を示すが他疾患群は対照的に年齢とともに低下し成人値の150pg/mlに近づく。1歳未満、1歳、2歳4歳、4歳以上に分類すると本症群は他疾患群に比し有意に高値を示す。病期IV群22例の血漿NPY濃度はI,II,IVS群30例に比し有意に高値を示したが、病期IV群4歳以上群7例のみが4歳未満までの群に比し高値を示し予後も不良であった。本症ではマス陰性後発症群、病期進行群、LDH高値群、NSE高値群、島田分類UH群、N-myc増幅群などの予後不良群で有意に高い血漿NPY濃度を示した。血漿NPY濃度は血清LDH、Ferritin、NSEとは相関は認めなかった。腫瘍死群は腫瘍(-)長期生存群に比し有意に高値を示した。2)本症尿中NPY濃度は血漿NPY濃度と軽度の相関が認められたが病期、年齢、原発部位、マススクリーニング発見の有無などとの関係は認められず、他疾患群の尿中NPY濃度との有意差もなく、さらに工夫を要する。3)神経芽腫37例の組織標本Ki-67染色性は(-)21例、(+)5例、(2+)5例、(3+)6例で、(2+)、(3+)群では瀰慢性と局所性に染色される例があり、NPY陽性領域細胞群とKi-67陽性細胞群と明瞭に分画される群は予後良好で、分画不明瞭群は予後不良であった。これまで神経芽細胞腫(本症)患児の血漿NPY濃度について測定しNPYが本症の診断と予後判定に有効である事を報告した。今回さらに測定法を改革し腫瘍組織内NPY濃度、尿中NPY濃度を測定するとともに免疫組織化学染色によりNPYの染色を行い各種因子との比較検討を行ったのでこれまでの実績について報告する。1)NPYの発現に関する免疫組織化学的検討:神経芽腫32例の組織標本について検討した。高分化系の腫瘍細胞が染色され低分化系腫瘍細胞は染色性が低かった。組織分類との比較では神経節腫は1例のみで陽性(+)、神経節芽腫5例のうち(+)1例、(++)1例、(+++)3例であった。神経芽腫26例のうち花冠細線維型13例では(-)2例、(+)3例、(++)5例、(+++)3例であった。円形細胞型13例では(-)3例、(+)4例、(++)4例、(+++)2例であった。

血漿NPY濃度と染色性の検討では、両者に相関は認められなかった。腫瘍組織内NPY濃度と染色性の検討では3例で測定された組織内NPY濃度と染色性には相関傾向がみられ、(+++)組織で高い腫瘍中NPY濃度(6.76μg/g)が認められた。年齢、原発部位、病期、N-myc増幅、予後と染色性には相関が認められなかった。2)尿中NPY濃度の測定:本症10例について尿中NPY濃度を測定し血漿NPY濃度と比較した。10例の尿中NPY濃度は11.4166.92pg/mlで平均値72.6pg/mlであった。血漿NPY濃度との相関関係は8例において認められたが、他の2例では全く逆相関の関係にあり、クロマトグラフィーを用いたNPY分解産物の測定が必要であると考えている。以上の結果から、予後不良の低分化系腫瘍では組織内で生産されたNPYは容易に血中、尿中に分泌されるものと思われる。これまで神経芽細胞腫(本症)患児の血漿NPY濃度について測定しNPYが本症の診断と予後判定に有効である事を報告した。今回さらに測定法を改革し、尿中NPY濃度を測定するとともに免疫組織化学染色によりNPYとKi-67の染色を行い比較検討を行ったのでこれまでの実績について報告する。1)神経芽腫75例の血漿NPY濃度は2738.2pg/ml、他疾患63例(ウイルムス腫瘍8例、肝悪性腫瘍4例、軟部肉腫11例、胚細胞腫瘍10例、PNET2例、神経節腫6例、他の両性腫瘍7例、良性疾患15例)では421.6pg/mlであり有意に神経芽腫で高値を示した。神経芽腫ではマス陰性後発症群、病期進行群、LDH高値群、NSE高値群、島田分類unfavorable histology群、N-myc増幅群などの予後不良群で有意に高い血漿NPY濃度を示した。2)NPYとKi-67の発現に関する免疫組織化学的検討:神経芽腫37例の組織標本Ki-67染色性は(-)21例、(+)5例、(2+)5例、(3+)6例で、(2+)、(3+)群では瀰慢性と局所性に染色される例があり、NPY陽性領域細胞群とKi-67陽性細胞群と明瞭に分画される群は予後良好で、分画不明瞭群は予後不良であった。3)尿中NPY濃度の測定:本症17例について尿中NPY濃度を測定し血漿NPY濃度と比較した。17例の尿中NPY濃度は11.4844.6pg/mlで平均値122.8pg/mlであった。血漿NPY濃度との相関関係は認められず、クロマトグラフィーを用いたNPY分解産物の測定が必要であると考えている。神経芽細胞腫(本症)患児の血漿NPY濃度について測定法を改革し、尿中NPY濃度を測定するとともに免疫組織化学染色によりNPYとKi-67の染色を行い比較検討を行った。対象は85年以後の本症群63例と他疾患群64例の計127例である。1)本症の血漿NPY濃度は他疾患群に比し有意に高値を示し、本症診断の鋭敏性は86%、特異性は82%であった。本症血漿NPY濃度は年齢とともに増加し4歳以上では10,000pg/ml前後の値を示すが他疾患群は対照的に年齢とともに低下し成人値の150pg/mlに近づく。1歳未満、1歳、2歳4歳、4歳以上に分類すると本症群は他疾患群に比し有意に高値を示す。病期IV群22例の血漿NPY濃度はI,II,IVS群30例に比し有意に高値を示したが、病期IV群4歳以上群7例のみが4歳未満までの群に比し高値を示し予後も不良であった。本症ではマス陰性後発症群、病期進行群、LDH高値群、NSE高値群、島田分類UH群、N-myc増幅群などの予後不良群で有意に高い血漿NPY濃度を示した。血漿NPY濃度は血清LDH,Ferritin、NSEとは相関は認めなかった。腫瘍死群は腫瘍(-)長期生存群に比し有意に高値を示した。2)本症尿中NPY濃度は血漿NPY濃度と軽度の相関が認められたが病期、年齢、原発部位、マススクリーニング発見の有無などとの関係は認められず、他疾患群の尿中NPY濃度との有意差もなく、さらに工夫を要する。3)神経芽腫37例の組織
時計遺伝子クラスターkaiABCのサーカディアン発現の制御

藍色細菌の生物時計遺伝子KaiABCと時計タンパク質KaiA, KaiB, KaiCを中心にして生物時計を解析し、以下の結果を得た。1.KaiCはATPやGTPと結合し、ATP存在下で自己リン酸化する。これらの活性は時計の発振機能に不可欠である。2.KaiCと結合して時計の発振を増強する因子SasAの同定4.KaiC上の2つのKaiA結合ドメインの同定5.藍色細菌のプロモータートラツプ法の開発6.PexはkaiA遺伝子の転写を抑制する負の因子であることの証明(論文準備中)6に関しては論文準備中であるが、他は論文として発表した。酵母のTwo-hybrid系を利用して、KaiCタンパク質と相互作用するタンパク質として、バクテリアの2成分系のsensory kainaseの一種であるSasAタンパク質を同定した。SasAはKaiBとアミノ酸配列で弱い類似性があり、これがKaiCとの結合能に関係している可能性がある。酵母Two-hybrid系で検討したところ、KaiBと類似性のあるN末側97残基のSasA断片はKaiCと結合するが、KaiBとは結合しなかった。試験管内タンパク質間結合能測定では、SasAはKaiCだけではなくて、SasA自体にも結合するが、KaiAやKaiBには結合しなかった。KaiCはdomain Iとdomain IIとよりなる重複構造をとっている。SasAはdomain IにもIIにも結合した。しかもN末側97残基のSasA断片でも同様の結合をした。sasA遺伝子を破壊すると、高光強度条件では、KaiA、KaiBC遺伝子の発現レベルは著しく減少し、リズムもほとんど分からなくなった。psbAI遺伝子の発現レベルも減少し、リズムの振幅も小さくなって急速に減衰した。いっぽう低光強度条件では、kaiA、kaiBC、psbAI遺伝子の発現リズムは振幅が小さくなり、周期も3時間ほど短くなった。とりわけkaiBC遺伝子の発現レベルは著しく減少した。野生型ではkaiA、kaiBCmRNAのレベルは共にサーカディアンリズムを示すが、sasA破壊体では、はっきりしたリズムは認められなかった。KaiBとKaiCタンパク質のレベルはsasA破壊体では著しく低下し、KaiAレベルもいくぶん低下していた。一方、kaiABC遺伝子を破壊しても、sasAタンパク質レベルはほとんど影響されなかった。sasA遺伝子はkaiABC遺伝子に依存してサーカディアン発現する。sasA遺伝子を過剰発現すると、kaiA、kaiBC遺伝子の発現は著しく低下し、見掛け上リズムは消失した。sasAを一過性に過剰発現させたところ、時計の位相に対応して、位相の前進と後退を起こした。恒明条件下では、sasAの破壊は細胞の増殖に影響しなかったが、明暗サイクル条件下では、細胞の増殖が著しく阻害された。なお、この成果は論文にとりまとめて現在Cellに投稿中である。1)既に昨年度の研究成果報告書で報告したように、酵母のTwo-hybrid系を利用して、KaiCタンパク質と相互作用するタンパク質SasAを同定した。SasAはバクテリアの2成分系のsensory kainaseの一種でKaiBとアミノ酸配列で弱い類似性がある。細胞内でSasAはKaiCとタンパク質複合体を形成しており、時計の本体の一部あるいは時計のフィードバック発現系に関与していると推定される。SasAそのものは時計の発振そのものには不可欠ではないが、kai遺伝子の発現レベルを上げることにより、時計の発振を強める働きをしていると考えられる。また、明暗サイクルに適応して増殖するためには、sasAの存在が不可欠である。なお、この成果はCell,2000に掲載された。2)藍色細菌Synechocistis sp.PCC6803のゲノムには植物の青色光受容体クリプトクローム(cry)関連の遺伝子が2つ存在する。生物時計の光受容体との関連で、cry関連遺伝子とそのタンパク質産物を解析した。2つのうちどちらの遺伝子を破壊してもほとんど生育には影響が認められなかったが、UVを照射すると一つの遺伝子の破壊体でのみ生存率が低下した。この結果はphotolyaseである可能性を示唆している。また、この遺伝子はphotolyase欠損の大腸菌を相補することができた。さらに、大腸菌で大量発現させて精製したタンパク質は試験管内でphotolyase活性を示した。活性の有無、分子系統樹解析などから、cry関連の遺伝子のうち一つはphotolyaseであることが証明され、もう一つは積極的なデーターはないもののクリプトクロームであると推定される。遺伝子を破壊しても今のところ何の影響も認められなかったので、まだ藍色細菌ではクリプトクロームが関与する生理現象は見つかっていない。単独の遺伝子破壊では、生物時計への影響も認められなかった。

3)Synechococus sp PCC7942において、KaiAタンパク質はkaiA遺伝子の転写を抑制する負の因子であることを証明した。また、P_<kaiA>プロモーターの特定の塩基配列(シスエレメント)に間接的に作用することを明らかにした。この研究成果はEMBO.J.に投稿中である。藍色細菌の生物時計遺伝子kaiABCと時計タンパク質KaiA,KaiB,KaiCを中心にして生物時計を解析し、以下の結果を得た。1.KaiCはATPやGTPと結合し、ATP存在下で自己リン酸化する。これらの活性は時計の発振機能に不可欠である。2.KaiCと結合して時計の発振を増強する因子SasAの同定4.KaiC上の2つのKaiA結合ドメインの同定5.藍色細菌のプロモータートラップ法の開発6.PexはkaiA遺伝子の転写を抑制する負の因子であることの証明(論文準備中)6に関しては論文準備中であるが、他は論文として発表した。
新規巨大タンパク質ミステリンによる血管・神経形成の制御

日本人に多い脳血管疾患、モヤモヤ病の感受性因子として同定された新規巨大タンパク質ミステリンは、ユビキチンリガーゼ活性とATPアーゼ活性を持つ。しかし、ミステリンの細胞内における機能と血管組織における機能の詳細、また、疾患原因変異がミステリンの機能にどのような影響をおよぼし、どのような機序で疾患が引き起こされるのか、いずれも現在まで全く不明である。ミステリンのATPアーゼドメイン周辺の構造予測から、ミステリンはAAA+型ATPアーゼである可能性が示唆された。全長ミステリンの精製標品を用いた検討や生化学的検討から、ミステリンは細胞内でリング状の多量体を形成し、ATPの結合・加水分解サイクルを通じて集合と解離を繰り返していることが示唆された。AAA+型ATPアーゼ一般の性質として、エネルギーの消費と共役した物理的な作用があるが、ミステリンは結合・解離サイクルを含むエネルギー依存的構造変化を通じて、細胞内の物理的過程に寄与する可能性が強く示唆された。このような特異かつ明瞭な活性はミステリンの機能を考える上で本質的なものと思われるが、これがどのように血管・神経の構造と機能につながるのか、解析を継続している。またミステリンと結合するタンパク質の探索からは、ミステリンの細胞内機能を示唆する基質・共役因子候補を複数同定した。このうちの幾つかについては、細胞内でミステリンとの物理的・機能的相互作用を確認しており、ミステリンの生理機能の解明のため、解析を継続している。24年度が最終年度であるため、記入しない。ミステリンの細胞内、生体内機能を探る目的で、MSを用いて細胞内でミステリンと結合する因子の網羅的解析を行ったところ、幾つかの結合因子を得た。このうち過去に神経発生に関与することが報告されている脱ユビキチン化酵素にフォーカスをしぼった解析を行った。ミステリンはユビキチン化酵素であることから、ユビキチン化酵素と脱ユビキチン化酵素が拮抗的、あるいは共役的にはたらくことが示唆されたが、実際、細胞内でこの両者は結合し、さらにユビキチン化反応に関してこの両者が機能的に相関することも明らかとなった。次に問題となるのは、血管・神経形成におけるこの両者の役割であり、現在、これを解析するために血管内皮の初代培養細胞と個体における血管・神経形成の両方の系において、ミステリンと脱ユビキチン化酵素の発現を制御する系を構築している。また、ミステリンの細胞内機能にとって重要なことの1つに、ミステリンのAAA+ATPアーゼ活性の問題があるが、最近、我々はミステリンの精製に成功し、この精製標品を用いて電子顕微鏡観察を行ったところ、ミステリンが複合体リング状構造をとっていることを見出した。このようなリング構造形成はAAA+タンパク質ファミリーに共通の性質と考えられ、またATPアーゼ活性との関連が示唆されたため、ミステリンのATP加水分解活性に変化のある各種変異体を作成し、構造解析を行った。この結果、ミステリンの複合体形成能とATPアーゼ活性の間に強い相関があることが示唆された。ミステリンが複合体を形成し、AAA+ATPアーゼ型分子エンジンとして、どのように細胞内ではたらき、血管・神経形成を制御するのか、引き続き解析を行う。血管と神経の相互作用というチャレンジングな課題において、血管に関与するミステリンと神経に関与する脱ユビキチン化酵素の機能相関を見出し、神経・血管相互作用をこれらの分子から切り拓いて行く足掛かりができた。2年目には雑誌での公表を目指したい。ミステリンと脱ユビキチン化酵素の機能相関、血管・神経における役割の解析を進めるとともに、そのような機能にミステリンの複合体形成と構造変化がどのように寄与するのか、分子・細胞・個体のレベルで解析を進めて行く,
合金固液相変化を解析する指向性エネルギー堆積法シミュレータの開発

金属材料の3次元造形に適した指向性エネルギー堆積法(DED: Direct Energy Deposition)の時間領域シミュレータを開発するにあたり,本研究では熱伝導,レーザー,キャリアガス,固液相変化といったDEDプロセスに含まれる物理現象を解析するアルゴリズムを個々に作成し,これらのモジュールを統合する.開発したDED時間領域シミュレータを用いて,造形物内部の空孔や残留応力の発生メカニズムを明らかにし,造形物の形状精度向上も評価に含め造形条件の最適化を行う.本年度の成果としては,熱伝導モジュールとレーザーモジュールの開発に注力し,両者を統合した加工点温度予測アルゴリズムを構築した.DEDにおける造形精度低下の主要因として,加工点の溶融金属の表面張力が過加熱によって低下すること挙げられる.開発した加工点温度予測アルゴリズムは造形条件から造形物内部の温度分布を時間領域で解析できる.本研究ではこれを逆算的に利用することで,加工点の温度を一定に保つレーザー出力計算法を提案した.算出したレーザー出力をDED造形に利用した結果,高層造形時の過加熱の抑制に成功し,造形物の形状誤差が大幅に低減することが実験的に明らかとなった.また,造形条件ごとの空孔発生率の評価実験は完了しており,高レーザー出力,少材料粉末供給といった加工点温度を安定して高められる造形条件が空孔の発生を抑制できることを示している.これらの研究成果をもとに,3回の国際会議発表と4回の国内会議発表を行い,国際誌への論文投稿を行っている.現在,粒子法に基づく流体解析法の開発に着手し,温度に応じた粘性,表面張力特性を粒子に与えることで溶融金属の流動解析法の確立を目指している.今後の予定としては,溶融金属の流動解析を開発した加工点温度予測アルゴリズムに統合し,造形物内部の空孔発生メカニズムを理論的に明らかにする.翌年度、交付申請を辞退するため、記入しない。翌年度、交付申請を辞退するため、記入しない。
ハイブリッドな平和構築論の新展開

ハイブリッド平和構築論が提起された背景には、従来の平和構築の在り方(経済改革の導入や選挙を通した現地社会への介入など)への批判が平和構築の実践評価にもとづく問題意識であることから、現実の社会で伝統的に治安の維持やコミュニティ内の問題解決に重要な役割を果たしてきた非政府アクターが、どのように統治機構や権力関係に組み込まれており、支援(外部介入)によってどう変化しているのか実態を定性的に分析するものである。
耐熱性白色腐朽菌ラッカーゼの高発現システムを組み入れた木材のエタノールへの変換

木材からエタノールを生産するプロセスにおいては、発酵阻害物質の生成を抑えるとともに、生成した発酵阻害物質を分解・除去することが重要となる。本研究では、発酵阻害物質の分解・除去法としてラッカーゼに注目して研究を行った。また、発酵阻害物質の生成を抑えるエタノール生産プロセスとして白色腐朽菌前処理とエタノリシスを組み合わせたプロセスを検討した。ラッカーゼは、メディエーター存在下でリグニンを強力に分解するが、反応中に生成する有機ラジカルによる攻撃を受け失活する。このため、耐熱性と有機ラジカルに対する安定性の両者を併せ持つ酵素の探索が求められてきた。本研究では、42°Cで生育する耐熱性白色腐朽菌Trametes versicolor RC3株のラッカーゼに注目し、その機能を発酵阻害の軽減に利用するための研究を行った。即ち、RC3株ラッカーゼを精製し、5-HMF、レブリン酸、バニリンなどの発酵阻害物質分解能を分析するとともに、ラッカーゼの主要アイソザイムをコードする遺伝子(cDNA)をクローニングし、単離した遺伝子をヒラタケをホストとして高発現させた。また、ラッカーゼの機能を最大限に引き出すラッカーゼ・メディエーター反応の活性化法を見出すとともに、白色腐朽菌とエタノリシス前処理により分離された成分のエタノールへの高効率変換法を開発した。遺伝子を取得したRC3株のラッカーゼは、これまでに報告されているT.versicolorのラッカーゼ(LAC4)と81%のアミノ酸配列の相同性をもつ新規な酵素であり、比較対象として使用した既存の担子菌ラッカーゼと比較し発酵阻害物質除去反応に対する酵素の安定性に優れていた。既存酵素とRC3株ラッカーゼの安定性の違いは、多種の発酵阻害物質を多量に含むエタノリシス可溶性画分と反応させた時に明確に示された。この安定性が、RC3株ラッカーゼの発酵阻害物質除去能力の主要な要因であると結論した。リグニン分解性担子菌Coriolus versicolor RC3株は、酸性ラッカーゼアイソザイムと中性ラッカーゼアイソザイムを生産する。このうち、酸性アイソザイムを発現する培養条件は確立されていたが、耐熱性が高い中性アイソザイムを発現する培養条件は未解明であった。このため、ラッカーゼ中性アイソザイムを発現する培養条件を探索し、フスマと各種無機塩を含む酵素生産最適培地を決定した。この培養条件で生産した培養液から、中性アイソザイムを新規に精製し、N末端のアミノ酸配列を決定した。また、耐熱性など酵素学的諸性質を明らかにした。その結果、本アイソザイムは、これまでに報告されているラッカーゼとは異なる新規な酵素であることが明らかとなった。このN末端アミノ酸配列をもとに縮重プライマーを設計し、現在、遺伝子クローニング実験を進めている。次に、スギ材チップを用いて白色腐朽菌を培養し、耐圧ガラス製加圧反応装置で、内部温度を制御しながら所定の時間エタノリシスし、パルプ画分と可溶性画分に分離した。パルプ画分については、セルラーゼ/ヘミセルラーゼで糖化後、組換バクテリアでエタノールに変換した。可溶性画分については、メディエーターとRC3ラッカーゼ、キシラナーゼ/セルラーゼを混合し、45-50°Cで24-48時間分解した。培養物のフェノール類をGC-MSで分析し、ラッカーゼによるバニリンなどの発酵阻害物質の分解を明らかにした。これらの実験により、ラッカーゼ活性と発酵阻害物の分解、エタノール生成率に対する影響を評価した。木材の酵素糖化・発酵にはリグニンによるセルロースの被覆を破壊する前処理が必要である。

熱化学的前処理では、発酵阻害物質が生成するため、これらを除去する操作が必要となる。これまでの研究で、Trametes versicolor RC3株のラッカーゼ画分でエタノリシス可溶性画分を処理すると市販の担子菌由来のラッカーゼで処理した場合に比べ、Pichia stipitisによる発酵効率が約2.5倍上昇することが示された。本研究では担子菌RC3株が生産するラッカーゼによる発酵阻害物質の除去メカニズムを明らかにする目的で、ラッカーゼアイソザイムの単離とクローニングを行い、担子菌Pleurotus ostreatusを用いた異種発現を行うと共に、RC3株ラッカーゼを用いて発酵阻害物質を処理した。初めにRC3株の生産するpI8.35のラッカーゼアイソザイムを精製し、N末のアミノ酸配列を決定した。この配列をもとにして、CODEHOP法によりプライマーを作製した。さらに既報の担子菌ラッカーゼに高度に保存されている領域に対応するCODEHOPプライマーを作製し、これらを組み合わせてPCRを行った。さらに、インバースPCR法により周辺領域を増幅し、全長DNAのクローン化、および塩基配列決定を行った。推定アミノ酸配列をホモロジー解析したところ、pI8.35のアイソザイムとは異なるN末端配列を持ち、既報のT.versicolorのLAC4と81%の相同性を持つ新規なラッカーゼをコードしていることが明らかとなった。そこで、この遺伝子にコードされているアイソザイムについてP.ostreatusをホストとして異種発現を行った。分析により今回クローニングしたRC3株由来の酸性ラッカーゼがP.ostreatusにおいて異種発現していることが示された。また、RC3株ラッカーゼを部分精製し、エタノリシス可溶性画分を処理したところ、市販ラッカーゼやアルカリ性アイソザイムの活性が消失したのに対し、酸性アイソザイムのみ活性を保持していることが示された。この安定性が発酵阻害物質除去効果に影響していると推察した。
透析アミロイド症におけるβ_2ーミクログロブリンとそのフラグメントの役割について

透析アミロイド症のアミロイド構成蛋白はβ_2ーミクログロブリン(β_2ーM)であり、血中のβ_2ーMはその前駆物質と考えられる。しかし、β_2ーMがいかなる機序にてアミロイド沈着におこすのかは明かでない。本研究では、β_2ーMとそのフラグメントのアミロイド化の役割について以下の成績を得た。(1)透析アミロイドとして特異な尿路アミロイド結石の生化学的分析をつづけ、N末端intactβ_2ーM、N末端7、20残基よりのlysin末端で切断された2つのフラグメントならびに38残基よりの新たなフラグメントをそれぞれ同定した。このことは、それ以後の2つの疎水部分(60番目、80番目近くの部分)がよりアミロイド形成に重要であることと考えられる。(2)β_2ーMのフラグメントのうち、N末端部分とC末端部分に対する抗体を家兎にて作成することができた。N末端に対する抗体はintactβ_2ーMに反応せず特異抗体であることを^<125>Iーβ_2ーMを用いたRIAにて確認した。しかし、本抗体を用いた免疫組織化学的検討からは、ほとんどの透析アミロイド組織に陽性を示し、N末端部分のβ_2ーMのアミロイド化への役割については、なお検討をつづける予定である。(3)血中のβ_2ーMがアミロイド化する機序を知る目的で、Na^<131>Iを純化したβ_2ーMにアイソト-プ標識し、in vivoにて血中減衰曲線をみたところ2コンパ-トメントプ-ルに近似することを確認した。また、経時的な全身スキャニングにより、静脈内注射後、48時間後から168時間後にわたりアミロイド沈着部位に特異的なアイソト-プの集積を認めた。このことは、血中のβ_2ーMがアミロイド組織に取り込まれたことを示唆するものであり、血中のβ_2ーMを除去する透析治療法がアミロイド症に対し有用であることを支持する成績と考えられる。血中のβ_2ーMがアミロイド形成を起こす最も重要な因子については現在なお不明であり、今後さらにこの面の研究を行って行かなければならない。
脱チロシンリン酸化酵素の関わる恐怖情動記憶消去の分子神経機構

恐怖記憶の消去機構の破綻は情動障害の一因となることから、消去のメカニズムの解明が望まれているが、その分子神経機構はほとんど不明である。私はこれまでの研究から恐怖記憶の消去に積極的に働く脱リン酸化酵素の存在を予測し、本研究にて検討を行った。脱チロシンリン酸化酵素SHP1/SHP2の活性阻害剤を海馬に注入して記憶の形成および消去への影響を検討したところ、恐怖記憶の消去は抑制されるが、形成への影響はないことがわかった。生物が感じる恐怖は、生まれながらにある対象に対して感じる先天的なものと、後天的に獲得されるものとに分類される。Freezingはマウスの恐怖情動を測定する行動指標の一つであり、マウスは先天後天に関わらず恐怖を感じるとFreezingを示す。私は平成22年度の研究から、先天および後天的なFreezingは一見同一の行動に見えながら、その行動および生理学的な性質は全く異なるものであることを明らかにした。これまでに、マウスにとっての天敵であるキツネ由来のトリメチルチアゾリン(TMT)という匂い分子は、ただそれを嗅がせるだけでマウスの先天的な恐怖反応を誘導することが報告されてきた。しかしFreezingを指標とした場合TMTの効果は程度の低いものであり、そのため恐怖条件付けにより誘導された後天的Freezingとの比較が困難であった。そこで私は、強力な先天的Freezingを誘導する匂い分子の探索を行い、TMTの約10倍もの強度のFreezingを誘導する匂い分子を同定した(Odor F)。そこで、Odor Fに対する先天的なFreezingと恐怖条件付けによる後天的Freezingとの比較を行ったところ、1)後天的Freezingは時間経過に伴い消去されるが、先天的Freezingはむしろ増強されていくこと、2)後天的Freezingは体表面及び深部体温、心拍数の低下を伴うが、後天的Freezingはそれらの変化を伴わないことを明らかにした。さらに現在までに、それぞれのFreezingの発現が別個の神経回路により制御されることを示す予備的な結果を得ている。生物が感じる恐怖は、生得的にある対象に対して感じる先天的なものと、後天的に獲得されるものとに分類される。後天的な恐怖については恐怖条件付け課題を用いた様々な報告があり、Freezing行動の発現、心拍数と深体部温度の上昇、及び末梢血管の縮小などの特徴をもつ逃走・闘争反応が生じることが分かっている。しかし先天的な恐怖反応に伴う行動、及び生理学的特徴についてはほとんどわかっていない。マウスにとっての天敵であるキツネ由来のトリメチルチアゾリン(TMT)という匂い分子は、ただそれを嗅がせるだけで先天的な恐怖反応を誘導することが報告されてきた。しかしTMTにより誘導されるFreezing行動は非常に程度が低いことから、先天的恐怖はFreezingの発現を伴うのか否か不明であった。そこで我々は、TMTをリード化合物として様々な匂い分子を探索し、後天的恐怖が誘発するFreezingに匹敵する強度のFreezingを誘導する匂い分子を同定した(Odor F)。さらにOdor Fに対する先天的Freezingと、それに伴う生理指標の変化を観察したところ、1)先天的Freezingは後天的Freezingとは異なり消去されないこと、2)先天的Freezingは体表面温度、深部体温、末梢血流量の減少、及び心拍数の低下を伴うことから、後天的恐怖反応とは全く異なる特徴を持つことがわかった。さらに、先天及び後天的Freezingの発現に伴い活性化する脳の領域を、活性化神経細胞特異的に発現する分子を用いて全脳領域を対象としたin situ hybridizationにより探索したところ、先天的恐怖は、後天的恐怖により活性化する扁桃体中心核-中脳水道周囲灰白質システムに加えて背側線条体や中隔核を含む広範囲な脳領域により制御されることが明らかになった。以上の結果から、先天的恐怖と後天的恐怖はFreezingという共通の行動を示すにも関わらず、それに伴う生理指標は全く異なる動態を示すこと、さらにそれぞれの恐怖は異なる神経回路により制御される可能性を示した。
T細胞増殖分化のための胸腺微細環境の構造解析

ヒトTリンパ球の初期発生と分化のメカニズムを考察する目的で未熟リンパ性白血病細胞に発現されるCommon ALL抗原の生化学的性状を解析し、またリンパ球前駆細胞の抗原受容体遺伝子の構造を解析した。更にヒト胸腺上皮細胞の単離に成功し、膜抗原や、産生されるリンフォカインについても検討した。これらの研究によってTリンパ球発生分化のメカニズムを明らかにできるもの期待した。Common ALL抗原はBリンパ球や一部のTリンパ球、線維芽細胞や腎上皮細胞などにも発現がみられる分子量100kdの糖たん白である。我々はこの抗原を分離し、各組織においてたん白レベルで共通性がみられること、結合しているシアル酸の構造に多様性のみられることを明らかにした。未熟B細胞の中でもCommon ALL抗原を発現するものは従来既にIgH遺伝子の再構成がみられるとされている。我々は未熟Bリンパ球と考えられるものの中にIgH遺伝子胎児型のもの、DQ_<52>ーJ結合型のもの、より上流のDとJの結合したものを見出し、夫々がB前駆細胞の分化段階を反映するものと推察した。この推察はその後F.Altらによってマウスの実験で支持された。Tリンパ球の分化においては胸腺上皮細胞との反応が極めて重要である。我々はヒト胎児胸腺より被膜下上皮細胞を単離し、これをSV400ri^-遺伝子により不死化した。さらにこれをクローン化することにより、被膜下上皮細胞がMーCSFを産生することを明らかにした。これは胸腺内におけるマクロファージやDendritic cellの分化に重要な役割を果していると考えられる。更にこの上皮細胞にはLFA3抗原が発現されており、Tリンパ球のCD_2抗原と強く結合することも明らかにできた。これらの研究を通して、Tリンパ球の発生分化のメカニズムを更に一層明らかにできるものと期待している。Tリンパ球の増殖分化のための場としての胸腺の役割を解析するために混合型胸腺腫で免疫源としてヒト胸腺と反応するモノクロナル抗体3D8,及び1H10を作製した.3D8は正常胸腺組織での免疫染色の結果,皮膜下上皮細胞,及び髄質細胞と反応した.一方1H10は胸腺皮質上皮細胞とのみ反応した.また胸腺腫で増殖する細胞は3D8, 1H10及び抗ケラチン抗体等を組合せ用いることにより単一の抗原形質を示さず,その形質は多彩であるこが明らかとなった.ヒト胸腺上皮細胞の単離は技術的に極めて困難であり,我々の報告したSM株の他に十分Characteriqeされたものはみられない.このような現状にかんがみ我々はVトロウイルスベクターにSV40largeT抗原を連結し, largeT遺伝子をレトロウイルスの形でとりこませる系を考えた.現在この遺伝子構造の作製に成功し,レトロウイルス産生能について検索中である.Tリンパ球の発生,分化に関する研修においてTリンパ球同定のためのマーカーの開発が重要な課題である.リンパ球の初期分化の研究においては特に細胞質内に発現されるT細胞特異抗原の同定が重要な手段となると考え, T細胞抗原受容体とTリンパ球膜表面において複合体として発現されるCD3抗原の細胞質内発現の特異性について検討を加えた.正常胸腺内未熟Tリンパ球, T細胞性白血病, mixedlineageLeukeiuiaなどにおける研究の結果,細胞質内CD3抗原の発現やT細胞系列の細胞において特異的であることを発表した.本年度我々はTリンパ球初期分化における分子機構の解明に向けてT細胞抗原受容体(TCR)遺伝子、イムノグロブリン重鎖遺伝子の遺伝子再構成、Topその発現について分子生物学的、細胞生物学的研究を行った。

Tリンパ球においてイムノグロブリン重鎖遺伝子の再構成が2030%の頻度で観察されている。我々はこの内容について更に詳しく解析する目的で5′JH領域の遺伝子解析を行った。当初5′JH領域プローブによって再構成のパターンを示したものを8例発見し、これらについてその再構成を確認する目的で、BglIIプローブによる検索を加えた。その結果8例中5例は胎児型を示し、他の3例のみが遺伝子再構成を示した。BglIプローブにより胎児型を示した5例のJH領域の遺伝子構造を更に詳しく解析するためにMspI消化したDNAをBglII/BawHIの5′プローブにより解析した所これらの5例の全てにおいてMspIによって挟まれる領域の遺伝子多型(RFLP)を発見した。この結果8例中5例はJH領域の遺伝子再構成を示さず、RFLPがその再構成様のパターンに影響を及ぼしていることが明らかになった。このようなことから考えるとTリンパ球のlineage fidelityは当初考えられていた程低くないことが予想された。また一方再構成を示した3例はいずれもDQ52-Jの再度構成であり、遺伝子再構成としては不完全なものであることが明らかになった。T細胞株の一つであるJMはイムノプロブリンJ領域の異常な再構成を示すことを明らかにした。現在この異常が発生していると考えられる5′JH領域DQ52近傍の遺伝子クローニングを行っている。
筋強直性ジストロフィーのCTGリピートが多因子細胞内システムに及ぼす影響の追究

筋強直性ジストロフィー(DM)の遺伝子変異は3'側非翻訳領域にあり、通常の優性遺伝病に対する概念では説明できない。我々は、伸長したCTGリピートがmRNAレベルで新たな機能を獲得し、DM発症につながる可能性について追究しており、ゲノム資源を有効利用することでDMの分子機構に迫ることを目的としている。発症機構のひとつに、細胞内にはCTGリピート(RNAではCUGリピート)に結合する蛋白質(CUG binding protein,CUG-BP)が存在しており、これが伸長したCUGリピートに結合することで、細胞内システムの異常が起こる可能性がある。我々が酵母Three hybridsystemを用いた研究では、確かにCUG-BPはCUGトリプレット・リピートに結合することが示された。しかし、CUG-BPの結合能はCUGリピートよりもUG二塩基繰り返し配列に対する方が高いという結果も同時に得られた。データベース検索の結果では、TG二塩基配列はゲノム中に非常に多く存在しているが、それに比べ、長いCTG配列を持つ遺伝子はそれほど多くないようである。よってこの結果はCUG-BPの信憑性を疑うものというよりは、通常はUGリピートを持つ種々の遺伝子に作用しているCUG-BPが、DM患者においては長いCUG配列にも結合することで、細胞内の供給バランスが崩れることを示唆する可能性を持つ。また、CUG-BP以外にCUGトリプレット・リピートに結合する他の蛋白質(EXP)の存在も報告されている。現在では、CUG-BPと共に、EXPでも同様なThree hybrid解析を行い、両者の生理機能追究を同時に進めている。
小学生を対象とした身近な自然からESDに広がる学習カリキュラムの開発

素材の精選と集約研究題目である「小学生を対象とした身近な自然からESDに広がる学習カリキュラムの開発」の「身近な自然」について、1)理科の授業で扱うことができるもの、2)自然環境としての学習ができること、3)他の教科、総合的な学習への広がりが可能であることとの観点から、素材を限定するための探求と検討の結果、「米」「米粉」に着眼することとした。特に米粉については、米の消費量が落ち込む一方、パン食は増加している事実があり、「米粉」を使った食パン作りの活動から総合的な学習への発展が期待できる。「米粉」を中核に据えた教材の開発文部科学省が無償配布した「わたしたちの健康」や「食生活を考える」等の冊子の中で「米」に対する「食育」への期待や「米粉パン」への関心の高さが読み取れた。しかし、うるち米100%の「米粉」の流通量は少なく、コストも高い。さらに、「米粉」を対象にした教材開発や先行実践もほとんど無いことが明らかになったので、「米粉食パン」の教材開発を行った。材料の調達方法、作り方、理科や社会等の教科と関連する学習内容を明らかにした。同時に、実際に試作を繰り返した「米粉食パン」に対する子どもや大人の感想によって、教材としての確信を得るに至った。「食教育」と「ESD」のクロスカリキュラムの構想現在、文部科学省と農林水産省との連携により「食教育」が推進されている。その中で、「パン作り」という楽しい学習活動に着想を得て、学校給食で食べる「小麦食パン」と「米粉食パン」との食べ比べを通して考える「食教育」と「ESD」とのクロスカリキュラムの可能性を検討した。小規模な試行であるが、「小麦食パン」と「米粉食パン」の食べ比べを核とする学習の有効性の示唆によりカリキュラム構想が得られたことは、本研究の大きな成果である。
胎児行動の評価と未熟児行動との比較に関する研究

本研究では、(1)胎児の基本的行動特性、(2)母体外からの言語音、音、光、触刺激等への反応性、(3)同一の在胎週齢にある未熟児の行動特性との比較検討、を行なうための基礎的研究として、胎児と未熟児の行動比較を可能にする行動計測方法の開発と、それによる、胎児の呼吸様運動期の体動(体幹の粗大な動き)パターンの解析を行なった。在胎週齢28週付近の胎児3名を対象として、児が呼吸様運動期の状態にある時に、横隔膜に直交する断面の動きを超音波診断装置により観察/ビデオ記録し、これを独自に開発したスリットスキャナー型の画像処理装置によりパターン解析した。スリットスキャナー型の行動解析システムは、臨床現場で使用されている超音波診断装置の映像解析方式に類似した方式で画像処理する動画解析システムであり、リズミカルな横隔膜運動を波形データとして抽出することができた。一方、以上の胎児行動データを、未熟児行動のデータと比較するために、同様の在胎週齢にあり、保育器内部で仰臥して集中治療を受けている未熟児を対象に、その胸部の垂直方向の動きを同一のスリットスキャナー型画像処理システムにより解析した。この結果、胎児の呼吸様運動時の横隔膜の動きと、保育期内部で集中治療を受ける未熟児の胸部の動きは、部分的にではあるが、類似したパターンが含まれることが明らかとなった。このことは、未成熟な状態で肺呼吸を開始した未熟児の成長・発達のプロセスを特徴づけるものであり、無呼吸発作などの問題を考える上に重要な知見となるものと考えられる。