hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
海外拠点における製品開発：開発機能の形成とボトルネックの所在

本研究の目的は、製品開発機能のグローバル化プロセスおよび、そのプロセスにおけるボトルネックを探ることであった。研究方法としては、主に日系・韓国系多国籍企業を対象にインタビュー調査を通じてデーターを収集し、事例分析を行った。研究結果を一言でいうと、主要海外市場への対応のため製品開発機能をグローバル化させていくには、本社と海外拠点の間に効果的な知識連携体制を構築することが重要である。例えば、本研究の事例分析では、本社で現地化製品開発を行ってみる経験が本社と海外拠点とのよりスムーズな連携を可能にすること、また海外エンジニアの本社逆駐在を通じて長期的な知識疎通が促進できることを指摘している。本研究は、多国籍企業の海外拠点における製品開発機能の形成プロセスを整理した上で、その過程における促進要因と阻害要因を解明することを主要目的としている。このような研究目的のために、本年度に行った研究内容とその実績は以下のように整理することができる。第一に、主な事例研究の対象としているデンソーのインド拠点におけるインタビュー調査を数回にわたって行った。Denso India International(Technical Center), Denso Subros Thermal Engineering Centerなどでのヒアリングを通じて、現地拠点において製品開発・設計機能が形成されていくプロセスを観察してきた。現地エンジニアの育成が製品開発のグローバル化の中で果たす役割について、Kim(2013)にまとめて公表している。第二に、製品開発をグローバル化していくために、本社組織はどのように変わるべきか、何を変えるべきかを、デンソー本社におけるインタビュー調査を通じて調べてきた。主に2009年から3年間実際されたDP-EM(Denso Project for Emerging Market)を中心にした調査から、本社組織の体制が整えられてない状況で現地開発を進めることには様々な問題があることが分かった。この内容については、2013年4月の国際ビジネス学会関東部会において報告を行っている。第三に、市場(顧客)が伸びる際に、外資系企業の現地拠点が開発機能を持つことがどのような競争上の意義を持つのかという観点から、韓国自動車市場における日系サプライヤーの調査を行った。その結果、2000年代にかけて現代自動車が急成長する中で、現地開発機能を有する日経サプライヤーは顧客の成長を自分のものにすることができたことが分かった。この調査については、補足調査を行ったうえで論文化する計画だ。平成25年度には、前年度の研究実施の結果からより焦点を絞ったうえで、特に製品開発をグローバル化させていくうえで本社組織の変化の必要性と、本社と現地開発拠点の間をつなげる逆駐在(impatriation)制度の有効性を中心的に検討した。主な研究内容とその実績は以下の3点に整理することができる。第一に、製品開発機能を現地化していくプロセスにおいて、本社に蓄積されてきた技術的知識と海外拠点における市場知識とを効果的につなげていくことの重要性に注目し、まずは、本社組織の変化が必要であることを事例分析から検討した。24年度の調査成果を整理し、2013年6月にパリーで開かれたGERPISAという国際会議で報告を行った。文書としても書き上げ、博士論文の第6章に掲載しているし、今後学術誌への投稿も予定している。第二に、本社と現地拠点間の知識をつなげるリエゾンとして逆駐在員の役割に注目し、日本人駐在員ではなく、外国人エンジニアの本社駐在を通じて両方をつなげることがなぜ効果的であるかについて分析した。その調査結果については、2013年5月のABAS Conferenceで報告を行い、逆駐在と関連したレビュー論文をABASに投稿・掲載した。なお、博士論文の第7章として掲載した。第三に、既存の研究成果に加え、平成24年度と平成25年度の研究実施内容をもとに、博士論文を作成・提出し、現在最終審査中である。博士論文においては、製品開発機能のグローバル化にかかわる諸課題や、グローバル製品開発のマネジメントの上生じうるボトルネックの所在および対応について論じている。2012年度には、日本国内、韓国、インドにおける現地調査を活発に行い、最大限生のデーターを収集することが最大の目標であった。幸い、企業の方々のご協力が得られ、科研費と時間と体力が許す限りの現地調査を行ってきたと思う。そこで、実際に製品開発機能の現地化がどのように行われているか、何か課題であり、どのような対応が求められるかなど、現場における生のデーターを色々収集することができた。若干の補足調査は必要であるが、今まで集めたデーターをきちんと分析し、まとめていくことで本研究プロジェクトの目標は達成できることと考えている。25年度が最終年度であるため、記入しない。昨年度、科研費を活用しインド、韓国、日本などで様々な実態調査を行うことができた。本年度には、昨年度の調査をまとめつつ、必要に応じて追加調査を行いたい。また、研究会、学会などで研究報告を行い、多様な視点を持った研究者のコメントを受けることによって、研究成果をまとめ上げ、論文として完成させていきたい。

現在における具体的な計画は以下の通りである。まず、追加調査については、主に企業の日本本社における国内調査が中心となる。昨年度は海外拠点における開発機能形成の実態調査を主に行ったので、本年度はそれを裏付ける本社側のデーターをインタビュー調査などを通じて収集していきたい。主に、名古屋、大阪、首都圏、古川への出張を予定している。次に、研究会及び学会での報告については、現在のところ以下の4件が予定されている。14月27日早稲田大学で開催される「国際ビジネス学会関東部会」における研究報告、25月17日東京大学で開催されるABAS Conferenceにおける研究報告、36月1214日フランスのパリで開催される「GERPISA: International Colloquium 2013]における研究報告、49月26日28日アメリカのデトロイトで開催される「Global Supply Chain Management Conference」である。その他も、積極的に研究会・学会で研究報告を行いながら、同研究の先行研究者などから様々な刺激およびコメントを取り入れ、研究を発展させていきたい。それによって、より完成度の高い論文として社会に一つの知識を提供できるようにしていきたい。25年度が最終年度であるため、記入しない。
植物におけるエピジェネティックな遺伝子発現制御を利用した新規機能性成分の分析系

植物成分の持つ未知の機能を探索する観点から、エピジェネティックな機構による転写不活性化を受けている状態にあるレポーター遺伝子を持つ形質転換植物を利用して、物質の持つDNAメチル化の抑制効果および転写不活性化状態を解除する効果を検出する系を開発した。この系を利用することで、イソフラボンの一種であるゲニステインが、植物細胞でこの活性を持つ植物由来の物質として初めて同定された。植物成分の新規機能性成分を同定することを目的とし、エピジェネティックな機構による転写不活性化を受けている状態にあるレポーター遺伝子を持つ形質転換植物を利用して、その不活性化状態を解除する効果を持つ植物成分のスクリーニング系の開発を行った。それは、以下の二つの段階を含む方法による。1)低分子二本鎖RNAの持つ機能を利用して、植物に導入されているレポーター遺伝子の転写制御を行うプロモーター配列中のシトシンメチル化を誘導し、レポーター遺伝子を転写不活性化状態にする。2)自殖により得た次世代の植物に対して、シトシンメチル化を抑制する効果を持つ物質を与えた場合に起きるレポーター遺伝子発現の復帰を指標にして、物質をスクリーニングする系を確立する。この方法を確立するための第一段階として、新規なRNAウイルスのベクターのクローニングサイトにCaMV35Sプロモーターの配列を挿入し、その核酸を持つウイルスを、CaMV35Sプロモーターの制御下で転写されるGFP遺伝子をゲノムに組み込んであるNicotiana benthamiana植物体に対して接種した。これにより、このプロモーターのメチル化およびGFP遺伝子の転写不活性化が誘導された。また、次世代の植物においてもシトシンのメチル化および転写不活性化の状態が維持されていることを確認した。1植物体を多数育成し、スクリーニングに使用する自殖種子を得た。この種子を無菌培地に播種し、植物体を育成した。その際、培地中に5-azacytidine、および、trichostatin Aを正の対照として加え、植物体においてメチル化抑制およびGFP遺伝子の転写抑制解除が起きることを確認した。エピジェネティックな機構による転写不活性化を受けている状態にあるレポーター遺伝子を持つ形質転換植物を利用して、その不活性化状態を解除する効果を持つ植物成分のスクリーニング系を開発することを目的として以下の実験を行った。RNA機能を利用したDNAのメチル化を介して転写が不活性化された状態にあるCaMV 35Sプロモーターの下流にGFP遺伝子が連結したDNAコンストラクトをゲノムに組み込んであるNicotiana benthamiana植物体の種子を無菌培地に播種し、植物体を育成した。これまでの研究で、培地中に5-azacytidine、および、trichostatin Aを正の対照として加えると、植物体においてメチル化抑制およびGFP蛍光の復帰が起きることを見出していた。本年度は、第一に、これらの薬剤処理によりGFP蛍光の復帰が転写抑制の解除によることを、GFP遺伝子に関する定量RT-PCRにより確認した。つづいて、この不活性化状態からのGFP遺伝子の発現の復帰が、CaMV 35Sプロモーターのエピジェネティックな変化によるものであることを確認する目的で、bisulfite sequencing法によりメチル化状態を解析した。その結果、GEP遺伝子の再活性化に伴い、顕著なメチル化状態の低下が検出され、プロモーターのメチル化が転写抑制とその解除に密接に関与していることが示唆された。また、植物体の育成が著しく異常とはならない範囲内で転写抑制の解除効果をもたらす培地中の物質の濃度範囲を明らかにした。本年度はさらに、植物組織の抽出物を対象として、シトシンのメチル化抑制効果を持つ物質を探索した。その結果、ダイズ種子に多く含まれるイソフラボンの一種がこの効果を持つことを明らかにした。植物成分の持つ未知の機能を探索する観点から、エピジェネティックな機構による転写不活性化を受けている状態にあるレポーター遺伝子を持つ形質転換植物を利用して、その不活性化状態を解除する効果を持つ植物成分のスクリーニング系を開発することを目的として研究を行った。これまでの研究過程において、RNA機能を利用したDNAのメチル化を介して転写が不活性化された状態にあるCaMV 35Sプロモーターに制御されたGFP遺伝子を持つNicotiana benthamiana植物体を作出した。この植物体由来の種子を、既知のメチル化抑制効果を持つ物質を添加した培地に播種して植物体を育成し、レポーター遺伝子の転写抑制状態の解除を指標として、DNAのメチル化抑制効果を検出する系を確立した。また、ダイズ種子に多く含まれるイソフラボンの一種、ゲニステインがこの効果を持つことを見出した。今年度は、より再現性の高いアッセイ系を確立するため、自然に起きたエピジェネティックな変化により、より安定に転写不活性化された、CaMV 35Sプロモーターに制御される外来のカルコン合成酵素遺伝子を持つペチュニアを用いて、同様の実験を行った。その結果、上記のGFP遺伝子を用いた時と同様に、メチル化抑制効果を持つと想定される物質の作用により、外来遺伝子のmRNA量の増加ならびにプロモーターのメチル化頻度の低下が検出された。これらの効果は、既知のメチル化抑制物質に加え、上記の系で新たにその効果を見出したゲニステインに関しても検出された。

以上の研究により、転写が不活性化された状態にある外来遺伝子を持つ植物を利用して、物質の持つDNAのメチル化抑制効果を検出する二つの系を開発するとともに、植物においてその活性を持つ新規の物質を同定した。植物が産生する物質の中に、植物の細胞においてエピジェネティックな変化により転写抑制を起こしている遺伝子の再活性化を誘導する物質が存在するか否かは研究を行ってみるまでは未知であった。本研究では想定していたよりも早期にそうした活性を持つ物質を見出すことに成功し、当初の計画以上の進展が見られた。24年度が最終年度であるため、記入しない。同定された物質の効果が植物ゲノムに導入したレポーター遺伝子にのみ作用するのか、あるいは、植物の内在性遺伝子に対しても作用するものであるのかが興味深い問題であり、この点を明らかにすることで、本研究を飛躍させることができるものと考えている。
内向き整流Kチャネルの電位およびKイオン依存性開閉機構

内向き整流Kチャネルの活性化は細胞外Kイオンに依存すると考えられている。また、膜二回貫通型Kチャネル結晶のX線解析により、selectivity filterの入口付近にKイオンが結合していることがわかっている。細胞外にK結合部位があり、Kが結合することによりチャネルが活性化するという仮説を立て、この部位を同定するため、内向き整流Kチャネル(Kir2.1)の細胞外ループの酸性アミノ酸残基を中性化した.変異体遺伝子(D112N、D114N、E125Q、D152N、E153Q及びD112N/D114N)を導入した培養細胞(COS-1細胞、HEK-293細胞)では内向き整流K電流を記録できたが、D152N/E153Qを導入した細胞では記録できなかった。E153Q1個とD152N/E153Q変異体遺伝子3個を直列に連結した遺伝子(E153Q-(D152N/E153Q)3)を導入すると、内向き整流Kチャネル電流を記録できるようになった。D152N-(D152N/E153Q)3を導入した細胞では内向き整流K電流を記録できなかったが、(D152N)2-(D152N/E153Q)2を導入した細胞では、電流値は小さいが記録できた。したがってD152、E153の陰性電荷が細胞外Kイオンの結合とチャネルの活性化に関与していること、D152の場合は1つでよいが、E153の場合は2つ以上必要であることがわかった。また、野生型及び内向き整流性が弱いD172N/E224Sを導入した細胞でoutside-out法で電流記録を行うと、細胞外Kイオンがなくても外向き電流を記録することができた。細胞内から流出するKが細胞外結合部位に結合し、チャネルを活性化できると考えた。細胞外Kイオンを除くと、内向き整流Kチャネルを内向きに流れる電流だけでなく、外向き電流も流れなくなる。これは、内向き整流Kチャネルが細胞外Kイオン、あるいはRb、Csイオンにより活性化されるためと考えられている。また、単一チャネルコンダクタンスは細胞内K濃度より細胞外K濃度に強く依存する。細胞外Kイオンがチャネルを活性化するとともに、コンダクタンスを増加させる機序を解明する第一段階として、細胞外Kイオンが結合する可能性がある内向き整流Kチャネル(Kir2.1)蛋白のM1とH5、H5とM2の連結部の酸性アミノ酸残基を中性化した。D114N、E125Q,D152N,E153Q変異体遺伝子を導入したCOS1細胞、HEK293細胞では、内向き整流K電流が記録できたが、D112Nを導入した細胞では、記録できなかったので、D112がKイオン結合部位であると考えた。内向き整流Kチャネルは4つのサブユニットにより構成される。野生型(WT)遺伝子1個と変異体遺伝子3個を直列に連結した遺伝子(WT-(D112N)3)を導入すると、内向き整流を示す全細胞電流が記録できるようになったが、電流値はWTに比べ小さい。WTのサブユニットを1つ増やしたWT2-(D112N)2では、WTとほとんど変わらない内向き整流電流が記録できた。WT-(D112N)3により発現したチャネルの単一チャネルコンダクタンスはWTやWT2-(D112N)

2より小さい傾向があるが、全細胞電流の違いを説明できるほどの差ではなかった。細胞外Kイオンを除くと、内向き整流Kチャネルを内向きに流れる電流だけでなく、外向き電流も流れなくなる。これは、内向き整流Kチャネルが細胞外Kイオン、あるいはRb、Csイオンにより活性化されるためと考えられている。また、単一チャネルコンダクタンスは細胞内K濃度より細胞外K濃度に強く依存する。細胞外Kイオンがチャネルを活性化するとともに、コンダクタンスを増加させる機序を解明するため、細胞外Kイオンが結合する可能性がある内向き整流Kチャネル(Kir2.1)蛋白のM1とH5、H5とM2の連結部の酸性アミノ酸残基を中性化した。変異体遺伝子(D112N、D114N、E125Q、D152N、E153Q)を培養細胞(COS1細胞、HEK293細胞)に導入し、パッチクランプ法によりチャネル活性の有無を検討した。変異体から発現したチャネルはいずれも機能しており、内向き整流K電流が記録できた。ついで近接する酸性アミノ酸残基を中性化したdouble mutants (D112N/D114N、D152N/E153Q)を作成した。D112N/D114Nにより内向き整流Kチャネルは発現したが、コンダクタンスは野生型(WT)より有意に小さかった。またD152NIE153Qを導入した細胞からは内向き整流K電流を記録できなかった。野生型遺伝子1個と変異体遺伝子3個を直列に連結した遺伝子(WT-(D152N/E153Q3)を導入すると、内向きKチャネル電流が記録できるようになった。単一チャネルコンダクタンスは野生型と大差なかった。D152、E153が細胞外Kイオンの結合とチャネルの活性化に関与していること、1つのサブユニットのこの部位にKが結合すればチャネルが活性化することが示唆された。膜二回貫通型Kチャネル結晶のX線解析により、selectivity filterの入口付近にKイオンが結合していることがわかっている。この部位を同定するため、内向き整流Kチャネル(Kir2.1)の細胞外ループ(M1とH5、H5とM2の連結部)の酸性アミノ酸残基を中性化した。変異体遺伝子(D112N、D114N、E125Q、D152N、E153QおよびD112N/D114N)を導入した培養細胞(COS1細胞、HEK293細胞)では内向き整流K電流を記録できたが、D152N/E153Qを導入した細胞では内向き整流K電流を記録できなかった。野生型(WT)遺伝子あるいはE153Q1個と、D152N/E153Q変異体遺伝子3個を直列に連結した遺伝子(WT-(D152N/E153Q)3、E153Q-(D152N/E153Q)3)を導入すると、内向き整流Kチャネル電流を記録できるようになったが、D152N-(D152N/E153Q)3を導入した細胞では内向き整流K電流を記録できなかった。したがってD152、E153の陰性電荷が細胞外Kイオンの結合とチャネルの活性化に関与していること、D152の場合は陰性電荷1つでよいが、E153の場合は2つ以上の陰性電荷が必要であることが示唆された。またWTおよび内向き整流性が弱いD172N/E224S変異体遺伝子を導入した細胞でoutside-out法で電流記録を行うと、細胞外Kイオンがなくても外向き電流を記録することができた。細胞内から流出するKイオンが細胞外結合部位に結合し、チャネルを開状態に保つと推測した。
分子三脚を起点とする表面逐次カップリング反応による機能性単分子膜の創製

アダマンタン骨格をコアにもつ剛直な分子三脚がAu基板表面に強固に3点吸着して自己組織化単分子膜を形成することを利用して、これを起点とするクロスカップリング反応により単分子膜上での分子伸長を検討した。伸張した分子の末端にフェロセン又はTEMPOラジカルを結合し、電気化学測定により反応収率を評価した。基板上での薗頭カップリングによるフェロセンを結合は1段階では収率80%、2段階の分子伸張の総合収率では30%に達することが示された。本研究では、アダマンタン骨格をコアにもつ分子三脚がAu基板表面に吸着して形成される自己組織化単分子膜(SAM)を起点とした、基板上での連続クロスカップリング反応による分子伸長を検討している。平成25年度の結果は以下の通りである。1.単分子膜上での薗頭カップリング昨年度作製した、上部にp-ヨードフェニル基を持つアダマンタン分子三脚のSAMに対し、基板上でエチニルフェロセンの薗頭カップリングを行った。反応後の基板を作用電極とするサイクリックボルタンメトリーにより表面に結合したフェロセンを定量した結果、収率が77%であることが示された。同様の反応を溶液中の従来法で行った場合の収率が80%であることから、SAM上の薗頭カップリングが溶液中と同等の収率で進行することが確認できた。2.単分子膜上での逐次薗頭カップリングによる分子伸長昨年度作製した、上部にエチニル基を持つアダマンタン分子三脚のSAMに対し、1-ヨード-4-(フェロセニルエチニル)ベンゼンの薗頭カップリングを行った。これにより、Au基板上のp-ヨードフェニル置換分子三脚のSAMに対して、1)トリメチルシリルアセチレンの結合、2)トリメチルシリル基の除去、3)1-ヨード-4-(フェロセニルエチニル)ベンゼンの結合、を連続して行ったことになる。上記と同様に、基板に結合したフェロセンを電気化学的に定量したところ、3段階反応の総合収率は約30%であることが示された。本研究では、アダマンタン骨格をコアにもつ分子三脚がAu基板表面に強固に3点吸着して自己組織化単分子膜を形成することを利用して、これを起点とする単分子膜上での逐次カップリング反応により分子を段階的に伸長する。平成24年度はこの目的で研究を進め、以下の成果を得た。1.分子伸長の起点形成分子伸長の起点として、アダマンタン骨格の3個の橋頭位にCH2SH基を持つ三脚形分子の上部にp-ヨードフェニル基を持つトリチオール(分子三脚)を合成し、その単分子膜をAu基板上に作製した。続いてこの単分子膜を形成した基板上での薗頭カップリング反応によりTMS保護基を持つアセチレンを連結し、さらに脱保護を行うことによりp-エチニルフェニル基を垂直上方に向けた単分子膜を形成した。2.単分子膜の表面密度解析上記の分子変換の各段階において、電気化学的手段により表面分子密度を測定した。具体的には、単分子膜を形成したAu基板を作用電極とするサイクリックボルタンメトリーを行い、負電位で吸着分子が還元的脱離を受ける際の電気量から三脚分子の密度を決定した。その結果、いずれの段階でも三脚分子は高密度で凝集した単分子膜を形成しており、表面分子変換により脱着を起こしていないことが明らかとなった。本研究課題では、アダマンタン骨格をコアにもつ分子三脚がAu基板表面に吸着して形成される自己組織化単分子膜(SAM)を起点として、基板上での連続クロスカップリング反応により分子の伸長を検討して来た。平成26年度の結果は以下の通りである。1.SAM上での逐次薗頭カップリング反応の収率向上の検討これまでの反応検討ではSAM上での連続カップリングの収率が良好でなかったが、その原因として、触媒活性種の溶解度が低いことが考えられた。SAM上での合成では反応基質分子が基板に固定されているため、触媒が溶解して基板表面に到達することが重要であり、この条件の改善が期待できる溶媒としてイオン液体2-ブチル-3-メチルイミダゾリウムビス(トリフルオロメチルスルホニル)イミドを用いてSAM上のヨードフェニル基末端に対するエチニルフェロセンの薗頭カップリングを行った。しかし、得られたSAMのサイクリックボルタンメトリーにより求めた反応収率は59%であり、これまでのトリメチルアミン溶媒中での反応(77%)以上の収率には至らなかった。2.単分子膜上での薗頭カップリングによる安定ラジカルTEMPOのSAMの作製上部にp-ヨードフェニル基を持つアダマンタン分子三脚のSAMに対し、エチニル基をもつTEMPOを薗頭カップリングで結合した。結合したTEMPOをサイクリックボルタンメトリーで定量することにより、エチニルフェロセンとのカップリング反応と同様に良好な収率で反応したことが確認された。

一般にTEMPOはSH基により還元されてしまうため、SAM作製前に溶液中で同じ分子を合成することは不可能であり、このタイプのSAMを作製するために本課題で開発したSAM上での薗頭反応が有用であることが示された。物理有機化学当初計画した通りアダマンタン分子三脚上での薗頭カップリング反応で分子を連結し、その収率を電気化学的に求めることが出来た。フェロセンを結合してそれを元に反応収率を求める方法は、今後様々なタイプの基板上分子伸長反応の効率を評価するのに有効と思われる。SAM上での1段階カップリングでは溶液反応と同様の収率が得られたのに対し、薗頭カップリングを2回実施後には収率が大きく低下したため、これを改善することが今後の課題である。当初計画した分子伸長の起点形成については、単分子膜上の各三脚分子にp-エチニルフェニル基を結合できたため、目的を達成した。さらに、得られた単分子膜の吸着分子密度の評価まで完了した。一方、この単分子膜へのフェロセン結合の計画については予備実験が完了し条件の詳細検討ができる段階に達したが、最適反応条件の探索はなお進行中である。反応収率が低下したのは、触媒活性種の溶解度が低いことによる可能性がある。SAM上での合成では反応基質分子が基板に固定されているため、触媒が溶解して基板表面に到達することが重要となる。この条件を満たす溶媒として各種イオン液体が有効と期待されるため、今後これを検討し表面反応収率の改善を図る基板表面上での反応は、通常の溶液中での合成とは異なった反応条件を必要とする場合が多い。特に、クロスカップリング反応のように重金属触媒を用いる場合は、触媒活性種が可溶であるかどうかが鍵となる。これは、反応基質分子が基板に固定されているため、基質と触媒活性種が接触するには後者が溶解していることが必要なためである。現在、一般によく用いられているテトラヒドロフランやトリエチルアミンを溶媒に用いているが、触媒活性種の溶解度が低い可能性がある。今後最適な溶媒を探索して表面反応収率の改善を図る。該当なし
神経幹細胞の運命決定の分子機構解明

神経幹細胞は、胎生期に全ての神経細胞・グリア細胞を産み出すのみならず、成体脳でも一生に亘って新生神経細胞を産生し、脳の構築・機能維持に極めて重要な役割を果たす。神経幹細胞の形成や維持、分化開始を決定する因子として、エピゲノム修飾が注目を集めている。研究代表者はこれまでに、神経幹細胞の未分化性維持に関わるエピゲノム因子としてBre1aを同定し、機能解析を行ってきた。Bre1aが、多くのゲノム修飾因子の発現を制御しているという新たな知見を得たことから、本研究を計画した。Bre1aを中心に、様々なエピゲノム修飾因子が織りなすネットワークを解析することで、神経幹細胞の運命決定のメカニズムを明らかにし、多様な神経細胞・グリア細胞からなる脳が構築される根本原理を明らかにすることを目的とする。当初の計画通り、Bre1aノックアウトマウスから野生型・ヘテロ・ホモの遺伝子型をもつES細胞株を3ライン以上樹立した。さらに、CRISPR/Cas9法を用いて、誘導型Creリコンビナーゼの発現によってBre1をノックアウトし、同時にテトラサイクリン誘導によりBre1発現量を制御できるES細胞を作製し、Bre1aノックアウトによる性質の変化を詳細に解析している。また、Bre1aが触媒するモノユビキチン化ヒストンH2Bに対してChIP-seqの条件検討を行い、最適条件を確立して野生型およびBre1aノックアウトES細胞の全ゲノムにおけるモノユビキチン化ヒストンH2B分布のデータを獲得している。従って、本研究課題は概ね順調に進展している。これまでに樹立した複数のBre1aノックアウトES細胞および、CRISPR/Cas9のゲノム編集技術とテトラサイクリン誘導システムを用いて作製した、Bre1aコンディッショナルノックアウト/過剰発現ES細胞を用いて、ChIP-seqおよびRNA-seq法によりBre1aが制御するエピゲノム修飾と、それによる遺伝子発現プロファイルを網羅的に解析する。モノユビキチン化ヒストンH2Bのみならず、ヒストンH3やDNAメチル化に対する影響も含めて調べていく予定である。一方、早期胚で多能性を有する内部細胞塊の細胞が運命決定していく分子メカニズムに、Bre1aがどのように関与しているのかを解明するため、内部細胞塊から3胚葉へと分化していくときに発現調節される遺伝子を、RNA-seq法などによって明らかにする。ES細胞で解明されたエピゲノム修飾と遺伝子発現変化との関係が、早期胚においても成立しているかどうかを解明する予定である。平成28年度には、Bre1aノックアウトマウスの胚盤胞から、各遺伝子型3ライン以上のES細胞を作製した。これらのBre1a-/-, Bre1a+/-, Bre1a+/+ ES細胞を用いて、RNA-seq法により遺伝子発現プロファイルを網羅的に解析するとともに。定量RT-PCR法によってその結果を検証した。これまでに、胎生早期に働いている遺伝子群の発現プロファイルを獲得するとともに、樹立した複数のBre1aノックアウトES細胞の解析から、ES細胞の継代を重ねるに従ってBre1aの発現が徐々に高まることが判明した。平行して、Bre1aが媒介するヒストンH2Bのモノユビキチン化に対してChIP-seq法を適用することにより、ゲノム上でモノユビキチン化ヒストンH2Bが集積している領域の分布の解析を進めている。当初の計画通り、Bre1aノックアウトマウスから野生型・ヘテロ・ホモの遺伝子型をもつES細胞株を3ライン以上樹立し、性質を詳細に解析している。また、Bre1aが触媒するモノユビキチン化ヒストンH2Bに対してChIP-seqの条件検討を行い、最適条件を確立するとともに野生型ES細胞の全ゲノムにおけるモノユビキチン化ヒストンH2B分布のデータを獲得し始めている。

当初の計画通り、Bre1aノックアウトマウスから野生型・ヘテロ・ホモの遺伝子型をもつES細胞株を3ライン以上樹立した。さらに、CRISPR/Cas9法を用いて、誘導型Creリコンビナーゼの発現によってBre1をノックアウトし、同時にテトラサイクリン誘導によりBre1発現量を制御できるES細胞を作製し、Bre1aノックアウトによる性質の変化を詳細に解析している。また、Bre1aが触媒するモノユビキチン化ヒストンH2Bに対してChIP-seqの条件検討を行い、最適条件を確立して野生型およびBre1aノックアウトES細胞の全ゲノムにおけるモノユビキチン化ヒストンH2B分布のデータを獲得している。従って、本研究課題は概ね順調に進展している。上記のように、これまでに樹立した複数のBre1aノックアウトES細胞では、ES細胞の継代を重ねるとともにBre1aの発現が徐々に高まることが判明した。これは、Bre1a遺伝子のノックアウトが、レトロウイルスを用いたトラップカセットによるため、継代したES細胞ではBre1a遺伝子発現がリークによって回復すると考えられた。そこで平成29年度には、CRISPR/Cas9のゲノム編集技術を用い、Cre-loxPシステムでBre1aノックアウトを誘導できるES細胞を作製する。同時に、テトラサイクリンシステムを用いたBre1aの過剰発現系も構築する。これらのBre1aコンディッショナルノックアウト/過剰発現ES細胞を用いて、RNA-seq法により遺伝子発現プロファイルを網羅的に解析する。一方、早期胚で多能性を有する内部細胞塊の細胞が運命決定していく分子メカニズムに、Bre1aがどのように関与しているのかを解明するため、内部細胞塊から3胚葉へと分化していくときに発現調節される因子に注目し、それらの発現調節がBre1aノックアウトによってどのように異常になっているのかを明らかにしていく。これまでに樹立した複数のBre1aノックアウトES細胞および、CRISPR/Cas9のゲノム編集技術とテトラサイクリン誘導システムを用いて作製した、Bre1aコンディッショナルノックアウト/過剰発現ES細胞を用いて、ChIP-seqおよびRNA-seq法によりBre1aが制御するエピゲノム修飾と、それによる遺伝子発現プロファイルを網羅的に解析する。モノユビキチン化ヒストンH2Bのみならず、ヒストンH3やDNAメチル化に対する影響も含めて調べていく予定である。一方、早期胚で多能性を有する内部細胞塊の細胞が運命決定していく分子メカニズムに、Bre1aがどのように関与しているのかを解明するため、内部細胞塊から3胚葉へと分化していくときに発現調節される遺伝子を、RNA-seq法などによって明らかにする。ES細胞で解明されたエピゲノム修飾と遺伝子発現変化との関係が、早期胚においても成立しているかどうかを解明する予定である。
培養系及び担癌動物系でのTransforming Growth Factorーβ(TGFーβ)による白血病細胞増殖抑制効果の検討と臨床応用

【研究の意義】Transforming Growth Factorーβ(TGFーβ)の持つ生理活性の多様性が注目されている.TGFーβのもつ正常造血細胞の増殖に対する抑制性因子としての役割を明らかにしつつ,造血器腫瘍に対する抗腫瘍効果を検討し,臨床応用への可能性を探る.【TGFーβの造血幹細胞,支持細胞に対する作用の検討】TGFーβ1は,種々の造血因子存在下でのマウス造血前駆細胞のコロニ-形成,液体培養系での増殖を濃度依存性に抑制した.これらの反応は,TGFーβ1に対する特異的レセプタ-(Type I receptor)を介して行なわれることが明らかになった.in vivoでの造血を最もよく反映できる長期骨髄培養系では,形成される間質系造血支持細胞と,造血幹細胞から構成される造血の場(Cobblestone Islands)の形成を,TGFーβ1は強く抑制した.TGFーβ1は未熟造血幹細胞に作用し,負の増殖制御因子として重要な役割を持つことが明らかになった.【TGFーβの白血病細胞に対する増殖抑制効果の検討】当研究者らが樹立した単球性白血病細胞株JOSKーIの増殖をTGFーβ1は濃度依存性に抑制した.細胞回転の検討から,TGFーβ1は細胞周期のG1/S期をブロックすることにより細胞増殖を抑制するものと推定された.またTGFーβ1により癌原遺伝子CーMYC発現量の抑制も観察された.現在TGFーβ1の作用とRB遺伝子等の癌抑制性遺伝子発現との関連について検索をすすめている.【白血病担癌動物系の確立】従来ヒト白血病細胞担癌動物の確立は困難とされてきた.JOSKーI細胞をBalb/cあるいはKSNヌ-ドマウスに皮下接種もしくは腹腔内注入し,腫瘤形成型および腹水貯留型ヒト白血病細胞担癌動物の作製,安定した継代移植に成功した.現在in vivoでのTGFーβ1の白血病細胞増殖に対する作用を,種々の実験モデルを用いて探索中である.【研究の意義】Transforming Growth Factorーβ(TGFーβ)の持つ生理活性の多様性が注目されている.TGFーβのもつ正常造血細胞の増殖に対する抑制性因子としての役割を明らかにしつつ,造血器腫瘍に対する抗腫瘍効果を検討し,臨床応用への可能性を探る.【TGFーβの造血幹細胞,支持細胞に対する作用の検討】TGFーβ1は,種々の造血因子存在下でのマウス造血前駆細胞のコロニ-形成,液体培養系での増殖を濃度依存性に抑制した.これらの反応は,TGFーβ1に対する特異的レセプタ-(Type I receptor)を介して行なわれることが明らかになった.in vivoでの造血を最もよく反映できる長期骨髄培養系では,形成される間質系造血支持細胞と,造血幹細胞から構成される造血の場(Cobblestone Islands)の形成を,TGFーβ1は強く抑制した.TGFーβ1は未熟造血幹細胞に作用し,負の増殖制御因子として重要な役割を持つことが明らかになった.【TGFーβの白血病細胞に対する増殖抑制効果の検討】当研究者らが樹立した単球性白血病細胞株JOSKーIの増殖をTGFーβ1は濃度依存性に抑制した.細胞回転の検討から,TGFーβ1は細胞周期のG1/S期をブロックすることにより細胞増殖を抑制するものと推定された.またTGFーβ1により癌原遺伝子CーMYC発現量の抑制も観察された.現在TGFーβ1の作用とRB遺伝子等の癌抑制性遺伝子発現との関連について検索をすすめている.【白血病担癌動物系の確立】従来ヒト白血病細胞担癌動物の確立は困難とされてきた.JOSKーI細胞をBalb/cあるいはKSNヌ-ドマウスに皮下接種もしくは腹腔内注入し,腫瘤形成型および腹水貯留型ヒト白血病細胞担癌動物の作製,安定した継代移植に成功した.現在in vivoでのTGFーβ1の白血病細胞増殖に対する作用を,種々の実験モデルを用いて探索中である.
落葉性木本植物のリン酸分配・転流機構の解析

落葉木本植物ポプラにおけるリンの転流と冬期の貯蔵を明らかにするために、実験室内でリンの回収・貯蔵を模倣した短期-落葉開芽系を用いて、放射性同位体リンを用いたオートラジオグラフィーを行なった。前年度に明らかになった落葉時の葉から幹へのリンの回収に加え、落葉後の個体では幹と根に非常に強くリンが集積されることを明らかにした。また、短期落葉-開芽系においてミクロオートラジオグラフィーにより明らかになった、幹の師部の柔細胞、木部の放射柔細胞・髄冠細胞へのリンの貯蔵が、細胞内において野外と同様に行なわれているかを確認するために、幹の電子顕微鏡観察を行なった。野外のポプラにおいて明らかになったリンの貯蔵構造であるグロボイド様構造が実験室内のポプラの幹においても多数観察された。樹木におけるリンの転流については、葉や枝におけるリンの測定等の研究は行われてきたが、その分子メカニズムについての報告は少ない。これまで、樹木におけるリン酸トランスポーターの解析は、主に葉において行なわれており、秋の葉における発現の上昇から葉からのリンの回収に関わると考えられるリン酸トランスポーターが報告されてきた。本研究ではリンの貯蔵組織である枝に着目し、年間を通した野外ポプラのRNAseq解析から示唆されていたリン酸トランスポーターの季節的変動の詳細を明らかにするため、qPCRによるPHT1メンバーの発現解析を行なった。その結果、枝において成長期特異的な高発現を示し、季節的なリンの転流への関与が示唆されるPHT1メンバーを特定した。28年度が最終年度であるため、記入しない。落葉木本植物ポプラにおけるリンの貯蔵を担う組織を同定するために、野外ポプラの冬の当年枝を用いて、電子顕微鏡観察とSTEM-EDXを用いて細胞内構造の元素分析を行なった。師部・木部の柔細胞のタンパク質貯蔵液胞内に高電子密度のグロボイド様構造が観察された。元素分析を行なったところ、グロボイド様構造にはリンが強く検出されたことから、冬期のリンは師部・木部の柔細胞において貯蔵されると考えられる。葉から回収されたリンが幹のどの組織・細胞に転流されるのかを明らかにするために、実験室内の落葉-開芽系で培養したポプラを用いて、放射性同位体リンを用いたミクロオートラジオグラフィーとリアルタイムイメージングを行なった。成長期であるstage1の個体では放射性同位体のリンが葉から上部や下部の幹へと移行し、時間とともに若い葉や茎頂へ集積していく様子が観察された。一方で、葉の老化時にあたるstage3の個体では、リンは下部の幹へのみ移行してく様子が観察された。組織レベルでは、葉に与えたリンが、成長期には幹の主に師部に検出され、葉の老化時には幹の木部の放射組織や髄周辺の柔細胞においても強くリンが検出された。このことから、葉の老化時には、葉から回収されたリンが木部の放射組織や髄周辺の柔細胞へと転流され、蓄積されることが明らかになった。野外と実験室内ポプラの葉と枝を用いてRNA-seqによる季節的な遺伝子の発現変動を解析した。Bark Storage Proteinなど先行研究と同様の発現変動を示す遺伝子や、秋に高発現し、葉のリンの回収時にDNAやリン脂質の分解に関わると思われる遺伝子が検出された。一方で、リン酸トランスポーターのホモログについては発現量が低く検出が困難であった。落葉木本植物の一年を通した転流と貯蔵を明らかにするために、27年度の研究において、ポプラにおけるリンの貯蔵を担う化合物と組織、細胞内の貯蔵形態を明らかにした。また、確立した実験室内落葉-開芽系においてオートラジオグラフィーとリアルタイムラジオアイソトープイメージングを行い、葉から転流されるリンの器官・組織レベルでの転流の方向性が、季節ごとに切り替わることを明らかにした。以上の二点から、落葉木本植物ポプラにおける一年を通したリン動態の概略をつかむことができたので、それぞれの成果を論文にまとめる準備を進めている。現在はこれらの季節的な貯蔵と転流を調節する分子機構を明らかにするために、現在は葉と幹の一年を通したRNA-seqを進めている。初年度のRNA-seqの結果では発現の低い遺伝子については年変動を追うことができなかったので、今年度は実験系の再検討を行ないリン転流・貯蔵の調節や輸送の方向性の切り替わりに関わる要因の解明を目指す。

これまで、樹木におけるリン酸トランスポーターの解析は、主に葉において行なわれており、秋の葉における発現の上昇から葉からのリンの回収に関わると考えられるリン酸トランスポーターが報告されてきた。本研究ではリンの貯蔵組織である枝に着目し、年間を通した野外ポプラのRNAseq解析から示唆されていたリン酸トランスポーターの季節的変動の詳細を明らかにするため、qPCRによるPHT1メンバーの発現解析を行なった。その結果、枝において成長期特異的な高発現を示し、季節的なリンの転流への関与が示唆されるPHT1メンバーを特定した。今後は野外・実験室内におけるポプラの葉と枝のRNA-seqの追試実験を行なうとともに、27年度において、発現量が低く検出が難しかったリン酸輸送体やIP6合成関連遺伝子についてはリアルタイムPCRなどで、発現の季節変化を追跡する。また、リン酸輸送体のシンク・ソース組織ごとの発現量の比較を行ない、成長期と秋の老化時でそれぞれの組織において発現しているリン酸輸送体の特定を行なう。これらにより、オートラジオグラフィーで明らかになった季節的な転流経路の変化がどのよな分子メカニズムで調節されているのかを明らかにする。また、実験室内系におけるリンの季節的な転流と蓄積について、オートラジオグラフィーの追試実験、貯蔵組織の電子顕微鏡観察と元素分析、葉から回収され冬期に幹に蓄積されている放射性同位体リンの化合物の同定などを行ない、投稿論文にまとめる。28年度が最終年度であるため、記入しない。
骨吸収抑制と抗炎症作用を併せもつビスホスホネートの作用機序の検討と臨床応用

ビスホスホネート(BP)は強力な骨吸収抑制作用を有する薬物であり、現在、骨粗鬆症や悪性腫瘍による高カルシウム血症などの骨吸収有意な疾患に臨床で使用されている。これまでに、側鎖にメチルチオフェニルチオ基をもつTRK-530はin vitroにおいてプロスタグランジンE2の産生抑制や抗酸化作用の抗炎症作用と骨吸収抑制作用併せ持つBPであることを報告してきた。今回、ラットの第一臼歯にリガーチャーバンドを巻き、実験的歯周炎モデルを作成しin vivoにおけるTRK-530の有効性について検討した。リガーチャーを巻いた第一、第二臼歯間の歯槽骨の骨密度(BMD)はTRK-530の全身投与において濃度依存的に減少を抑制した。組織学的に非投与群では歯槽骨の吸収を活発に行っている破骨細胞を認め、歯槽骨が吸収されている像を呈していたが、TRK-530投与群では歯槽骨の吸収が抑制され、破骨細胞は多数存在するが、骨表面から離れている破骨細胞も多数認めた。また、TRK-530投与群では歯槽骨の吸収抑制の結果、歯根膜の破壊が少なかった。また、局所投与においてもTRK-530は歯槽骨のBMDの減少を抑制した。組織学的には歯槽骨に認められる破骨細胞は非投与群では多数の破骨細胞を認めたが、TRK-530投与群ではその破骨細胞数は減少していた。これらの結果から、TRK-530は歯周疾患における炎症性の歯槽骨吸収を抑制できる可能性があり、その投与方法は全身および局所投与ともに有効であると思われた。TRK-530には骨吸収抑制作用と抗炎症作用を併せ持つBPであると報告してきたことあわせると、TRK-530は歯周疾患に有効な薬物である可能性が考えられた。ビスホスホネート(BP)は強力な骨吸収抑制作用を有する薬物であり、現在、悪性腫瘍で惹起される高カルシウム血症や骨粗鬆症に使用されている。BPの側鎖によって骨吸収抑制作用は異なることが報告され、チオメチルフェニルチオ基を持つBPは骨吸収抑制と抗炎症作用、特にPGE2の産生抑制することを確認している。今回、このBPの歯周疾患への応用を考え、マウス頭蓋冠器官培養を用いて検討した。側鎖にチオメチルフェニルチオ基をもつBPはマウス頭蓋冠器官培養において以下の結果を得た。1)LPS刺激によるNOの産生を減少した。2)LPS刺激によるTNF-alphaの産生を減少した。チオメチルチオ基のNO産生抑制を調べるため、無細胞系の実験を行い以下の結果を得た。1)キサンチン-キサンチンオキシターゼ系で発生させた活性酸素を濃度依存的に減少した。2)NOドナーを用いて産生させたNOは減少しなかった。これらの結果からチオメチルフェニルチオ基を持つBPは活性酸素をスカベンジするという抗酸化作用を持ち、この作用によってNOの産生を抑制した可能性が考えられた。また、LPS刺激によるTNF-alphaの産生抑制したことから、歯周疾患の重要因子の一つであるTNF-alphaを抑えられ、また以前にPGE2の産生抑制の結果を得ていることを合わせると歯周疾患治療薬として応用できると思われた。しかし、NOとTNF-alphaの関連性は今のところ不明である。NOとTNF-alphaとの関連性を今後検討し、さらにラット歯周炎モデルを作成し、このBPを全身または局所投与を行い、歯周炎への効果を調べる予定である。
単結晶シリコンの超精密加工における延性・ぜい性遷移点の究明

本研究では、硬脆材料の加工を行った時に発生するクラック、特に試料表面と内部に発生したクラックの関係に着目し、シリコンウェハ(100)面と光学ガラス(BK7)に微細切込みの単粒研削を行い、試料表面および内部に発生したクラックを観察することにより延性・ぜい性遷移点すなわち、延性モードからぜい性モードに変わる切込みの解明を行った。試験には、本研究室にで製作された超精密旋盤を使用し、研削速度を変えることにより延性モード加工の速度依存性を検討した。工具にはビッカース圧子を用いた。加工表面の評価には、表面クラックの観察に加え、斜め研磨法により内部クラックを測定した。シリコンウェハ(100)面について、すべての研削速度、結晶方向、工具形状において全体的に見ると表面クラックは切込み50100nm、内部クラックは切込み550nmより発生する結果となり、内部クラックが表面クランクに先行して発生することが明らかとなった。研削速度依存性については顕著な傾向が見られないが、結晶方位依存性についてはその存在が認められた。光学ガラスについては、表面クラックは切込み180700nm、内部クラックは常に切込み数nmより発生し、すべての試験条件において内部クラックが表面クラックに先行して発生することが明らかとなった。両被削材を通し、内部クラックが表面クラックに先行して発生することから、硬脆材料の延性モード加工の評価方法には内部クランクの評価が必要であり、特に仕上げ加工では必須であることが示された。この視点から、これらの硬脆材料の延性モード領域は非常に狭い領域であることが明らかとなり、この領域の把握のため、より加工条件を吟味する必要のある結果となった。半導体デバイスに多用されている単結晶シリコンを対象とした超精密加工における加工精度及び加工能率の改善を最終目標として、現有の微細加工用の走査型プローブ顕微鏡(SPM)システムを用いて数nm数十nmの切込みで微細加工し、同時に加工面形態を分析することによって、延性モードの加工メカニズムを解明するとともに、これと並行して現有の超精密切削加工試験機に観察用SPMシステムを組込み、数十nm数百nmの切込みで単結晶ダイヤモンド工具による加工を行い、延性・ぜい性遷移点を把握する。本年度は、SPMこよる微細加工試験を単結晶シリコン(100面)に適応し、線状及び面状の加工試験を行い、走査幅、走査送り幅、探針荷重などの加工条件と加工量及び加工面形態の関係を調べている。また、主軸にエアベアリングを用いた現有の超精密切削加工試験機(最大主軸回転数10000rpm、送り速度5010000μm/s、切込み精度1020nm)に対して、弾性ヒンジ・圧電素子からなる切込み機構に微小切込み制御と同時に工具-工作物間の相対振動除去の制御を行うためのデュアルサーボを組み込み、微小切込みの分解能及び安定性を改善した。さらに、現有の観察用SPMシステムを組込み、オンマシンで加工面及び工具先端のSPM観察ができる構造とし、同様に単結晶シリコン(100面)のダイヤモンド工具による超精密加工に関して予備試験を行った。本研究では、硬脆材科の加工を行った時に発生するクラック、特に試料表面と内部に発生したクラックの関係に着目し、シリコンウェハ(100)面と光学ガラス(BK7)に微細切込みの単粒研削を行い、試料表面および内部に発生したクラックを観察することにより延性・ぜい性遷移点すなわち、延性モードからぜい性モードに変わる切込みの解明を行った。試験には、本研究室にて製作された超精密旋盤を使用し、研削速度を変えることにより延性モード加工の速度依存性を検討した。

加工面の評価には、表面クラックの観察に加え、斜め研磨法により内部クラックを測定した。シリコンウェハ(100)面について、すべての研削速度、結晶方向、工具形状において全体的に見ると表面クラックは切込み50100nm、内部クラックは切込み550nmより発生する結果となり、内部クラックが表面クラックに先行して発生することが明らかとなった。研削速度依存性については顕著な傾向が見られないが、結晶方位依存性についてはその存在が認められた。光学ガラスについては、表面クラックは切込み180700nm、内部クラックは常に切込み数nmより発生し、すべての試験条件において内部クラックが表面クラックに先行して発生することが明らかとなった。両被削材を通し、内部クラックが表面クラックに先行して発生することから、硬脆材料の延性モード加工の評価方法には内部クラックの評価が必要であり、特に仕上げ加工では必須であることが示された。この視点から、これらの硬脆材料の延性モード領域は非常に狭い領域であることが明らかとなり、この領域の把握のため、より加工条件を吟味する必要のある結果となった。
レジオネラ属菌の細胞内侵入機序と細胞内増殖様式の多様性の比較生物学的研究

1.ヒトに病原性があると報告されているレジオネラ属菌20菌種のマウスマクロファージ(Mφ)内増殖が、マウスMφの自然抵抗性を支配する2つの遺伝子Lgn1とBcgの支配をうけるかどうか検討した。その結果、(1)調べた20菌種のうちマウスMφ内での菌の増殖がLgn1に支配される菌種はL.pneumophilaとL.jordanisの2菌種のみであり、レジオネラ属の中ではむしろ例外的と考えられた。(3)マウスMφ内で増殖できない菌種のうち、L.wadsworthiiとL.lansingensisはモルモットのMφ内では増殖できた。このことは本菌種のMφ内増殖についてマウスとモルモットの間に種差があることを示し、この種差を決定する遺伝支配の研究を今後展開する必要があると考えられた。2.L.dumoffiiはヒトに重篤な肺炎をおこす菌種であるが、申請者らは本菌がVero細胞に非常に効率よく侵入することを見出していた。今回新たに以下の結果を得た。(1)その侵入がモノダンシルカダベリンで阻害されることからrecepteor-mediated endocytosisによること。(2)ヒト肺胞上皮由来培養細胞A549にも侵入すること。(3)モルモット気管内生菌感染実験により肺胞上皮に侵入して増殖していることが電顕で確かめられた。(4)ヒトの肺炎死亡例剖検肺の組織標本の免疫染色によってもヒト肺胞上皮内で増殖することが観察された。これらの結果はレジオネラ属の中には肺胞上皮細胞に侵入し増殖して肺胞上皮を破壊し、肺炎を重篤にするという病態形成機序があることを示している。
世界海洋観測システムに関連する海洋科学長期計画の立案

世界海洋観測システム(GOOS)は、地球上の生命を形成し、維持、発展させてきた地球の3/4を占める海洋を深く理解し、これを保全するとともに有効に活用し将来の人類の繁栄をはかることが主要な目的であり、次の5つの主要な課題、1)気候変動、2)海況サービス、3)沿岸域管理、4)海洋の保全、5)海洋生物資源、によって構成される。GOOSには加えて研究、サービス、予測の3側面がある。こうした国際的な要請に応えるために、日本学術会議海洋科学研究連絡委員会のGOOS小委員会との連係のもとで、OOSDP(海洋観測システム開発パネル)の最終レポートを参考にして我が国の長期的プランを策定する会合をもった。1)気候変動、2)海況サービスについては研究代表者が中心となり札幌において3日間にわたり関連研究者および現業官庁の代表者による研究討論および我が国の長期的プランに関する報告書の原案作成を行った。3)沿岸域管理、4)海洋の保全については研究分担者の柳が中心となり、松山で同様の研究会を持ち原案をとりまとめた。5)海洋生物資源については杉本が中心となり関連研究者および現業官庁の代表者をあつめ函館において研究会を催し、原案をとりまとめた。また関連研究者は随時意見交換のために相互の訪問を行い意見の調整をはかった。この方式は当初予定したものと若干違っているが、多忙な構成メンバーの限られた時間をより効率よく活用するうえで効果的であった。こうしてつくられた最終案は現在、研究代表者がとりまとめ報告書として編集中である。完成までにまだ若干の日数を要するが、学会時などに広く配布し、より広範な意見をもとめて長期的に改訂してゆくための土台とする予定である。また国際会議等で資料としても役立つように英語版も用意する準備を進めている。