hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
中国語声調の言語学的・音響学的データを踏まえたインタネット利用の指導システム

平成17年度(第1年度)に試作した中国語四声の聴取の指導システムについて,平成18年度(第2年度)には,「中国語四声弁別のためのCAIによる自習システム」として,レンタルサーバに保存してインタネットを通して,早稲田大学の中国語教育の教員を介して,学習の初期段階の学生に公開して,試用実験を行った.その自習過程の解析にもとづいて,声調の音響的特徴の詳しい解説を追加,ピッチパタンと合わせて音声波形の図形を表示,ピッチパタンの表示を音階尺度に変更,声調の聴きやすさによって単語を再配列,2声と3声に集中した単語表を追加などの修正を加えた.平成19年度(最終年度)には,試用実験での問題点についてこれらの修正を加えたシステムで,さらに広い範囲へ公開して試用実験を継続したが,その過程で,とくに以下の項目を取り上げた.1)単語の提示の前に注意を集中できるように1秒間の無音区間を挿入した.2)自習の所要時間を短縮するためのアルゴリズムとして,回答の正誤の履歴に応じた最適な難しさの次の単語表を自動的に選択して提示する.また,予習のあとで誤答の単語だけ練習できるアルゴリズムも有効に組み合わせることができた.3)教場での教師の発声による直接の指導とCAIシステムによる自習が,同等な結果が得られることも実験的に確かめた.平成17年度(第1年度)に試作した中国語四声の聴取の指導システムについて,平成18年度(第2年度)には,「中国語四声弁別のためのCAIによる自習システム」として,レンタルサーバに保存してインタネットを通して,早稲田大学の中国語教育の教員を介して,学習の初期段階の学生に公開して,試用実験を行った.その自習過程の解析にもとづいて,声調の音響的特徴の詳しい解説を追加,ピッチパタンと合わせて音声波形の図形を表示,ピッチパタンの表示を音階尺度に変更,声調の聴きやすさによって単語を再配列,2声と3声に集中した単語表を追加などの修正を加えた.平成19年度(最終年度)には,試用実験での問題点についてこれらの修正を加えたシステムで,さらに広い範囲へ公開して試用実験を継続したが,その過程で,とくに以下の項目を取り上げた.1)単語の提示の前に注意を集中できるように1秒間の無音区間を挿入した.2)自習の所要時間を短縮するためのアルゴリズムとして,回答の正誤の履歴に応じた最適な難しさの次の単語表を自動的に選択して提示する.また,予習のあとで誤答の単語だけ練習できるアルゴリズムも有効に組み合わせることができた.3)教場での教師の発声による直接の指導とCAIシステムによる自習が,同等な結果が得られることも実験的に確かめた.本研究は、中国語の声調の言語学的なデータと、それらの聴取や発声の音響学的なデータを踏まえて、標準中国語の四声のうちで日本人学生の初級者にむずかしい2声と3声の弁別に絞って、音声指導の効率のよい方法を開発することを目的としている。聴取の指導には、合成音声による中間的な声調の音声サンプルや、声の高さの変化(ピッチパタン)の視覚表示を活用し、CAIのアルゴリズムを導入する。発声の指導では、音声の基本周波数を抽出し求めた各話者の声域に応じて、声調のピッチパタンの許容範囲を指定する。さらに、このような指導システムを、インタネットを通した自習システムへ試験的に移行して、必要とする学生が夫々の学習段階に応じて、個別に活用できるようにして、指導の効果を確かめる。平成17年度(第1年度)の研究実績は、以下の通りである。1.国語声調の基礎データの解析1-1.言語学的なデータの整理:四声の出現頻度と遷移確率について収集してきたデータを、この音声指導システムの設計に役立つように整理した。1-2.音響学的なデータの整理:実音声と合成音声の聴取実験による四声の弁別の特性のデータや、喉頭の上昇下降や喉頭筋の筋電図の観測データを整理した。1-3.日本人学生の声調の学習経過の解析:とくに2声と3声の弁別について、従来の指導法による日本人学生の声調学習の経過を記録して、聴取と発声の誤りの性質を詳細に解析した。2.聴取の指導システムの試作2-1.音声刺激の録音編集:最適な単語表を多数から選択できるように、2音節語10表(15単語/表)を女声と男声で正確な発声を録音して、音声サンプルを編集した。2-2.声の高さの視覚表示:音声サンプルのピッチパタンを抽出する専用プログラムを使って、必要に応じて画面に表示して弁別を補助するための図形を作成した。本研究は、中国語の声調の言語学的なデータと、それらの聴取や発声の音響学的なデータを踏まえて、標準中国語の四声のうちで日本人学生の初級者にむずかしい2声と3声の弁別に絞って、音声指導の効率のよい方法を開発することを目的としている。発声の指導では、音声の基本周波数を抽出して求めた各話者の声域に応じて、声調のピッチパタンの許容範囲を指定する。

平成18年度(第2年度)の研究実績は、以下の通りである。1.平成17年度(第1年度)に試作した中国語四声の聴取の指導システムについて,試用実験をするに先立って,次のような修正を加えた。1)声調の音響的特徴の詳しい解説を追加,2)ピッチパタンと合わせて音声波形の図形を表示,3)ピッチパタンの表示を音階尺度に変更,4)声調の聴きやすさによって単語を再配列,5)2声と3声に集中した単語表を追加。2.「中国語四声弁別のためのCAIによる自習システム」として,レンタルサーバに保存してインタネットを通して開けるようにした。そして,早稲田大学の中国語教育の教員を介して,学習の初期段階の学生に公開した。3.約200件の試用状況の記録を解析した結果にもとづいて,単語の提示の前に注意を集中できるように1秒間の無音区間を挿入したり,自習の所要時間を短縮するためのアルゴリズムを修正したりするなど,次年度のさらに広い範囲への公開に向けて準備をした。平成19年度(最終年度)には、このシステムをさらに広い範囲へ公開して試用実験を継続したが、その過程で、とくに以下の項目を取り上げた.1.単語の提示の前に注意を集中できるように1秒間の無音区間を挿入したことが、このような自習システムが使われる環境で、どのように有効に働くかを、単語表の最初の問の誤答率などから調べた結果、最適と思われる0.5秒に変更した.2.自習の所要時間を短縮するためのアルゴリズムとして,回答の正誤の履歴に応じた最適な難しさの次の単語表を自動的に選択して提示する方法について、(1)まず女声,次に男声、(2)音節の子音と母音の構成によるやさしい単語が多い4表から難しい単語が多い4表へ、(3)1声と4声だけの単語が全部正解なら2声と3声を含む単語だけの表へ、(4)表の単語が全部正解なら対応する男声の表の次の表へ.男声では次の次の表へ進むプログラムに改造して、有効であることを確かめた.また、予習のあとで誤答の単語だけ練習できるアルゴリズムも有効に組み合わせることができた.3.教場での教師の発声による直接の指導とCAIシステムによる自習が、同等な結果が得られることも実験的に確かめた.
脳梗塞に対する細胞治療が幹細胞ニッチにおよぼす影響の検討

本研究は、新生血管を含む幹細胞ニッチに焦点を当て、傷害誘導性神経幹細胞に関する知見の収集を行うことを目的とする。その結果、リンパ球等の炎症細胞が神経再生を左右することが明らかになった(J Neurosci Res 2010)。また、内皮細胞増殖抑制因子やアンギオテンシンが内皮細胞増殖を抑制して神経幹細胞増殖・分化を抑制すること、骨髄単核球がFGF, EGF, IGF, PDGFの産生を亢進させ幹細胞維持に関わることなどを明らかにした。さらに、骨髄単核球の投与により、大脳皮質血流が有意に増加し、脳機能改善に貢献することも判明した(Stem Cells 2010)。また、Pericyteが神経幹細胞の起源であり(Stem Cell Dev2011)、活性化リンパ球が神経幹細胞の細胞死を招くこと(Cell Death Differ 2011)から、脳梗塞後の血管内皮細胞の維持が内因性神経再生を介した神経機能改善に関与することを示した。我々はすでに血管血球系幹細胞の投与が脳梗塞後の神経再生を介して神経機能を改善し((J Clin Invest, 2004)、またその再生神経が大脳皮質に由来する障害誘導性神経幹細胞であること(Eur J Neurosci, 2009)、さらに血管内皮細胞が幹細胞ニッチとしてこの神経幹細胞の生存を左右することを見出している(Stem cells, 2009)。本研究においては、内因性神経幹細胞の生着・成熟に必要な微小環境に関して、新生血管網を含む幹細胞ニッチに焦点を当て、神経幹細胞の機能のための必要十分条件に関する知見の収集を行うことを目的としている。その結果、脳梗塞後の脳内サイトカインは脳梗塞後の炎症を反映するものの、リンパ球をはじめとする炎症細胞が神経再生を左右することが明らかになった(J Neurosci Res, in press)。さらに、骨髄幹細胞投与は虚血性脳障害の有効な治療手段であると提唱されているが、本年度では骨髄幹細胞投与の治療効果が幹細胞ニッチを介しているかどうかを検証する目的で、血管血球系幹細胞を多く含む骨髄単核球をマウス脳梗塞モデルに投与し、幹細胞ニッチ(血管内皮細胞)動態および障害誘導性神経幹細胞発現に及ぼす影響をin vivo, in vitroで検討した。その結果、梗塞作成2日後に投与した骨髄単核球は、大脳皮質の梗塞領域と周辺領域に局在し、この領域では血管内皮細胞の増殖がみられ、多くの神経幹細胞は血管内皮細胞に接して存在することが観察された。これらのことから神経幹細胞の生存維持には血管内皮細胞の存在が影響しているが、骨髄単核球はこの血管内皮細胞の増殖に関与することで神経再生を制御していると考えられた。本研究により、骨髄単核球の治療効果のメカニズムが明らかにされたことより、本治療法の臨床応用への妥当性・有用性が証明されたものと考えられる。本年度は、傷害誘導性幹細胞を用いて骨髄単核球と血管内皮細胞、神経幹細胞間の分子機構を明らかにするとともに、脳生理学的指標に及ぼす効果も検討した。その結果、in vivo神経再生評価系を用いた解析では、内皮細胞増殖抑制因子やアンギオテンシンが内皮細胞増殖を抑制して内因性神経幹細胞増殖・分化を抑制すること、in vitro神経再生評価系を用いた解析では、骨髄単核球が血管内皮細胞由来のFGF, EGF, IGF, PDGFの産生を亢進させ幹細胞維持の制御に関わることなどを明らかにした。さらに、骨髄単核球の投与により、脳梗塞作成後の大脳皮質血流が有意に増加し、脳機能改善に貢献することも判明した(Stem Cells, 2010)。

以上のことから、骨髄単核球を脳梗塞後に投与すると、脳梗塞部位の血管内皮細胞の増殖・活性化を介して内因性神経再生が亢進し、結果として神経機能が改善することが示唆された。今後は、いかなる神経機能が改善し、その基盤となる神経回路回復およびその機序を明らかにする必要があると思われる。我々はすでに血管血球系幹細胞の投与が脳梗塞後の神経再生を介して神経機能を改善し((J Clin Invest 2004)、またその再生神経が大脳皮質に由来する障害誘導性神経幹細胞であること(Eur J Neurosci 2009)、さらに血管内皮細胞が幹細胞ニッチとしてこの神経幹細胞の生存を左右することを見出している(Stem cells,2009)。本研究においては、内因性神経幹細胞の生着・成熟に必要な微小環境に関して、新生血管網を含む幹細胞ニッチに焦点を当て、神経幹細胞の機能のための必要十分条件に関する知見の収集を行うことを目的としている。本年度は、傷害誘導性幹細胞を用いて骨髄単核球と血管内皮細胞、神経幹細胞間の分子機構を明らかにするとともに、脳生理学的指標に及ぼす効果も検討した。その結果、in vivo神経再生評価系を用いた解析では、内皮細胞増殖抑制因子やアンギオテンシンが内皮細胞増殖を抑制して内因性神経幹細胞増殖・分化を抑制すること、in vitro神経再生評価系を用いた解析では、骨髄単核球が血管内皮細胞由来のFGF,EGF,IGF,PDGFの産生を亢進させ幹細胞維持の制御に関わることなどを明らかにした。さらに、骨髄単核球の投与により、脳梗塞作成後の大脳皮質血流が有意に増加し、脳機能改善に貢献することも判明した(Stem Cells 2010)。さらにPericyteが神経幹細胞の起源であることを見出し(Stem Cell Dev 2011)、血管内皮細胞障害にともない脳梗塞領域に浸潤する活性化リンパ球が内皮細胞と接する神経幹細胞の細胞死を招くこと(Cell Death Differ 2011)から、脳梗塞部位の血管内皮細胞の増殖・活性化が内因性神経再生を亢進させ、結果として脳梗塞後の神経機能が改善することが示唆された。
拮抗する自然選択による集団内の遺伝的多様性維持：一見不適応な花形態は何を物語るか

(1)開花株ロゼットの頻度調査二年生一回繁殖型の植物(二年生草本)では、一年目に根茎葉の栄養器官(ロゼット)を形成して越冬し、二年目に開花結実し枯死する。これまでの研究で、キク科シオン属の二年生草本とされているヤマジノギクAster hispidus種群のヤマジノギク、ツツザキヤマジノギク、ヤナギノギクと、近縁種カワラノギクA. kantoensisにおいて、ロゼットをもつ開花個体(以下、開花株ロゼット)の存在を明らかにしてきた。20162018年に上記分類群の計9集団において開花株ロゼットの集団内頻度を調査した結果、ロゼットを持つ開花株の割合に0%25%の間で集団間変異が見出され、草原環境で低く、河原や蛇紋岩地において高い傾向がみられた。また、生活史の中にこの多回繁殖を考慮した推移行列モデルを作成し、解析的にパラメーターの感度分析を行ったところ、開花株が開花株ロゼットを介して翌年も繁殖する確率の変化は、開花株の種子を介してロゼットになる確率の変化よりも集団の増殖率に対して大きな影響を及ぼすことがわかった。(2)ツツザキヤマジノギク集団および三重ヤマジノギク集団の遺伝的関係を明らかにするためのRAD-seq解析ヤマジノギク種群および近縁種の計35集団、101個体のSNPデータを取得した。この解析を進めている。ツツザキヤマジノギク集団および三重ヤマジノギク集団の遺伝的関係の解明をする予定であった。SNPデータを取得することはできたものの、データ解析が遅れているため。また、花形態差に対応する発現差を示す遺伝子座の特定のためのRNA-seq解析を行えなかったため。令和元年度は、ツツザキヤマジノギク集団および三重ヤマジノギク集団の遺伝的関係を明らかにするためのデータ解析を引き続き行う。また、花形態差に対応する発現差を示す遺伝子座の特定のためにRNA-seq解析を行う予定である。本研究では、集団内に一見不適応な花形態変異が存在するツツザキヤマジノギク(以後、ツツザキ)(キク科植物)を対象に、集団遺伝学的解析および花形態変異と相関する適応形質の探索を行うことで、ツツザキ集団内の花形態変異がどのような自然選択によって維持されているかを明らかにし、自然選択による集団内の遺伝的多様性維持メカニズムの包括的理解に向けた新たな視点を提示することを目的とする。ツツザキ集団と同様の花形態変異を持つヤマジノギク集団を三重県にて確認している。両集団は約200km隔離されているが、同様の環境に生育するという共通点がある。ツツザキ集団および三重ヤマジノギク集団にみられる花形態変異は一回起源なのか、または、各集団で独立起源(平行進化)なのかを明らかにすることは、花形態の適応を考える上で興味深く、本研究において重要である。平成27年度は、ツツザキ集団・三重ヤマジノギク集団の遺伝的関係を解析するためにすでに採集していた三重ヤマジノギク集団の葉サンプルのDNA抽出を行った。平成27年度の長期にわたる体調不良により、研究を計画通りに進めることが出来なかったため。平成28年度は、ツツザキ集団内の花形態変異を可能にする新規適応形質の探索を野外観察にて行った。ツツザキを含むヤマジノギク種群Aster hispidusは二年生草本とされているが、河原に生育するツツザキヤマジノギクにロゼットを持つ開花個体が観察され多数回繁殖の可能性が考えられた。そのため、新規適応形質として、開花個体におけるロゼット形成に着目した。当該年度は、シオン属の二年生草本とされる複数種・変種において、ロゼットをもつ開花個体がどの程度みられるか、さらに、ロゼットを持つことと生育環境との相関の有無を検証することを目的とした。ヤマジノギク種群内のヤマジノギク(草地・河原)、ツツザキヤマジノギク(河原)、ヤナギノギク(蛇紋岩地)と近縁種カワラノギクA. kantoensis(河原)を生育地で調査した結果、両種共にロゼットをもつ開花個体が見いだされ、その割合は、河原・蛇紋岩地に生育する集団の方が草地に生育する集団よりも有意に高いことが示された。河原や蛇紋岩地は環境撹乱の度合いが草地よりも大きく、花茎の損傷等により当年の開花・結実が妨げられやすいと考えられる。このことから、開花個体が予めロゼットに投資しておくことは、撹乱環境下での適応的なリスク分散戦略であると解釈できる。ツツザキにおいて開花個体のロゼット形成が花形態変異と相関する形質とは示されなかったものの、それ自身が適応形質であると考えられる。

両集団は約200km隔離されているが、同様の環境に生育するという共通点があり、本研究において重要である。平成28年度は、ツツザキ集団および三重ヤマジノギク集団にみられる花形態変異は一回起源なのか、または、各集団で独立起源(平行進化)なのかを明らかにすることを目的とし、ツツザキ集団および三重ヤマジノギク集団の遺伝的関係を明らかにする予定であった。しかしながら、近畿以東におけるヤマジノギクは減少傾向にあり解析に十分なサンプルを収集することができず、解析を行うことができなかったため。(1)平成28年度から継続して行っている開花株ロゼットの追跡調査二年生一回繁殖型の植物(二年生草本)では、一年目に根茎葉の栄養器官(ロゼット)を形成して越冬し、二年目に開花結実し枯死する。平成28年度の研究で、キク科シオン属の二年生草本とされているヤマジノギクAster hispidus種群のヤマジノギク(生育環境:草地・河原)、ツツザキヤマジノギク(河原)、ヤナギノギク(蛇紋岩地)と近縁種カワラノギクA. kantoensis(河原)に、ロゼットをもつ開花個体(以下、開花株ロゼット)を見出した。その割合は、河原・蛇紋岩地に生育する集団の方が草地に生育する集団よりも有意に高く、撹乱地適応としての機能が予測された。平成29年度の研究では、開花株ロゼットが複数回繁殖を可能にするかどうかを検証することを目的とした追跡調査を河川環境に生育するカワラノギク・ツツザキヤマジノギクを対象に行った。2016年秋の開花期から追跡を行った結果、カワラノギクは48%、ツツザキヤマジノギクは31%が翌春まで生存した。さらにカワラノギクにおいては、2017年の晩秋に(1)結実、(2)結実+ロゼット再形成、(3)ロゼットのままの3パターンを示した。これらの結果から、開花株ロゼットを介して複数回繁殖が実際に行われていることが明らかになった。(2)ツツザキヤマジノギク集団および三重ヤマジノギク集団の遺伝的関係を明らかにするための分布調査・サンプリングヤマジノギク種群および近縁種の分布情報の収集・サンプリングを行った。計28集団のサンプルを収集することができた。また、分布情報の収集・サンプリングの過程で、ヤマジノギクは近畿以東で個体数の減少傾向にあることが考えられた。ツツザキヤマジノギク集団および三重ヤマジノギク集団の遺伝的関係の解明をする予定であった。サンプル収集等は行うことが出来たが、解析まで行うことができなかったため。(1)開花株ロゼットの頻度調査二年生一回繁殖型の植物(二年生草本)では、一年目に根茎葉の栄養器官(ロゼット)を形成して越冬し、二年目に開花結実し枯死する。これまでの研究で、キク科シオン属の二年生草本とされているヤマジノギクAster hispidus種群のヤマジノギク、ツツザキヤマジノギク、ヤナギノギクと、近縁種カワラノギクA. kantoensisにおいて、ロゼットをもつ開花個体(以下、開花株ロゼット)の存在を明らかにしてきた。20162018年に上記分類群の計9集団において開花株ロゼットの集団内頻度を調査した結果、ロゼットを持つ開花株の割合に0%25%の間で集団間変異が見出され、草原環境で低く、河原や蛇紋岩地において高い傾向がみられた。また、生活史の中にこの多回繁殖を考慮した推移行列モデルを作成し、解析的にパラメーターの感度分析を行ったところ、開花株が開花株ロゼットを介して翌年も繁殖する確率の変化は、開花株の種子を介してロゼットになる確率の変化よりも集団の増殖率に対して大きな影響を及ぼすことがわかった。(2)ツツザキヤマジノギク集団および三重ヤマジノギク集団の遺伝的関係を明らかにするためのRAD-seq解析ヤマジノギク種群および近縁種の計35集団、101個体のSNPデータを取得した。この解析を進めている。
質量顕微鏡法による精神神経疾患脳における脂質‐炎症相互連関の解明

精神神経疾患の発症・増悪の分子メカニズムを、脳内メタボロームと炎症応答が与える影響の面から解明することを目的とし、統合失調症とアルツハイマー病を主な対象として研究を進めた。統合失調症プロジェクトについてはこれまでに引き続き、作用機序が不明である抗精神病薬の作用メカニズムを明らかにする視点で研究を進めた。超解像イメージング技術を用いることで、標的候補分子の細胞内局在に対して抗精神病薬が与える影響を評価した。マウス神経細胞の初代培養系を用いて、樹状突起のスパイン形成への影響を評価した。さらにマウスに薬剤を投与し、in vivoでの脳内におけるスパインへの影響も評価した。今年度AMED-CREST研究開発の一環として導入されたイオンサイクロトロン-フーリエ変換型質量分析機を使用し、これまで得られていた結果を更に高い精度で得ることに成功した。これらの結果をもとに論文を執筆し、現在国際科学誌へ投稿中である。さらに本論文で新たに示した質量顕微鏡法の変法については、浜松医科大学を通じて特許を出願した。また福島県立医大との共同研究ある統合失調症患者死後脳のリピドミクス解析、ならびに熊本大学との共同研究による死後脳プロテオミクス解析については、投稿した論文がともに科学誌に受理された。アルツハイマー病プロジェクトについては、p47タンパク質の機能解明を中心に進めた。In vivoでの機能評価のためCRISPR-Cas9システムを用いたノックアウトマウスの作製を進めた。受精卵へのマイクロインジェクションの実験系立ち上げは時間的に難しいため外部受託サービスを利用したが、技術的な問題から遺伝子が破壊されたマウスが得られなかった。現在開発している技術でこの問題は打開できると考えられるので、神経変性疾患の理解につながる知見として、将来的に何らかの形で発表することを目指す。28年度が最終年度であるため、記入しない。精神神経疾患の発症・増悪の分子メカニズムを、脳内メタボロームと炎症応答が与える影響の面から解明することを目的とし、統合失調症とアルツハイマー病を対象として研究を開始した。統合失調症については作用機序が不明である治療薬の作用メカニズムを明らかにする視点で研究を進めた。質量顕微鏡法の新たな応用手法により、治療薬と高い親和性をもつ分子群をマウス脳内から新たに同定した。予備実験から研究開始当初に想定していたものとは別の、より神経機能への直接的影響が強いと思われる分子種であるため、現在はこちらに焦点を当てている。同定分子種のマウス脳内分布のイメージングも成功し、統合失調症の病態に重要とされる大脳皮質に注目して、治療薬投与による変化を現在解析中である。アルツハイマー病については、p47タンパク質の機能解明を中心に進めている。細胞内膜輸送との関係性を明らかにするためp47結合タンパク質の探索を行い、同定した候補分子との細胞内結合を免疫沈降法や蛍光染色により確認した。一方でSTING凝集体を除去する機構については、これまでのデータと他のグループの最新報告を併せて考えるとユビキチンシステムが主であると思われ、p47ノックダウン細胞でオートファゴソーム形成が亢進する現象は、おそらく小胞体ストレスの亢進による二次的現象と考えている。神経系での機能を評価するためにCRISPR-Cas9システムを用いたノックアウトマウスの作製を進めた。準備として過去に電気生理学実験に用いられていた機器をマイクロインジェクション用に確保した。また生理学研究所のトレーニングコースに参加し、実際の操作技術について学んだ。浜松医大内の承認手続きも完了したので、今年度は実際に作製を開始する予定である。初年度に引き続き、精神神経疾患の発症・増悪の分子メカニズムを脳内メタボロームと炎症応答が与える影響の面から解明することを目的とし、統合失調症とアルツハイマー病を主な対象として研究を進めている。統合失調症について、作用機序が不明である抗精神病薬の作用メカニズムを明らかにする視点で研究を進めた。初年度に質量顕微鏡法で同定した薬剤結合分子について、リポソーム結合アッセイ、表面プラズモン共鳴解析、等温滴定カロリーメトリーによる親和性試験を行ない、既存の手法による親和性の評価を行なった。さらに岡崎分子研の加藤教授らの協力によりNMRによっても結合が確認されつつある。神経系における結合分子の機能の観点からシナプス可塑性への影響が予想されたため、イメージングを中心とした細胞生物学的な実験を進めている。マウスの海馬神経の初代培養系を立ち上げ、遺伝子導入や高解像度イメージングも可能になった。RNA干渉を用いてp47をノックダウンすると自然免疫応答時の小胞体ストレスが増加する可能性があるため、CRISPR-Cas9システムを用いたノックアウトマウスの作製を進めた。昨年度から準備を進めた機器を用いてC57BL/6Jマウスの受精卵にマイクロインジェクションを試みるつもりであったが、過排卵操作が上手くいかないために断念した。代替手段としてin vivoでゲノム編集可能なCas9ノックインマウスを入手し繁殖中である。統合失調症プロジェクトにおいては、初年度に同定した薬理標的候補分子について、複数の分子間相互作用実験で一定の親和性が評価できている。これまで知られている機能のうち神経系、特に統合失調症患者で異常が知られるものに焦点を当て、シナプス可塑性への影響が明らかになりつつある。当該研究に必要な神経初代培養実験を立ち上げ、順調に軌道に乗っている。

一方で、共同研究において統合失調症患者死後脳のリピドミクス解析およびプロテオミクス解析が完了し、論文を作成ならびに投稿中である。さらにトランスクリプトーム解析を加えるために、岡崎基生研において次世代シーケンサーを用いたRNA-seq解析を開始した。以上のことから本プロジェクトは順調に進んでいる。一方でアルツハイマー病プロジェクトについては、培養細胞でのゲノム編集実験が当初想定していたよりも難航したこと、前述の統合失調症プロジェクトを重点的に進めたことから、あまり進展していない。ゲノム編集による遺伝子改変マウス作製実験も進んでいないため、Cas9ノックインマウスの使用や外部の受託サービスを利用するなどの代替案を検討中である。よって研究プロジェクト全体としては「概ね順調」が妥当と考える。精神神経疾患の発症・増悪の分子メカニズムを、脳内メタボロームと炎症応答が与える影響の面から解明することを目的とし、統合失調症とアルツハイマー病を主な対象として研究を進めた。統合失調症プロジェクトについてはこれまでに引き続き、作用機序が不明である抗精神病薬の作用メカニズムを明らかにする視点で研究を進めた。超解像イメージング技術を用いることで、標的候補分子の細胞内局在に対して抗精神病薬が与える影響を評価した。マウス神経細胞の初代培養系を用いて、樹状突起のスパイン形成への影響を評価した。さらにマウスに薬剤を投与し、in vivoでの脳内におけるスパインへの影響も評価した。今年度AMED-CREST研究開発の一環として導入されたイオンサイクロトロン-フーリエ変換型質量分析機を使用し、これまで得られていた結果を更に高い精度で得ることに成功した。これらの結果をもとに論文を執筆し、現在国際科学誌へ投稿中である。さらに本論文で新たに示した質量顕微鏡法の変法については、浜松医科大学を通じて特許を出願した。また福島県立医大との共同研究ある統合失調症患者死後脳のリピドミクス解析、ならびに熊本大学との共同研究による死後脳プロテオミクス解析については、投稿した論文がともに科学誌に受理された。アルツハイマー病プロジェクトについては、p47タンパク質の機能解明を中心に進めた。In vivoでの機能評価のためCRISPR-Cas9システムを用いたノックアウトマウスの作製を進めた。受精卵へのマイクロインジェクションの実験系立ち上げは時間的に難しいため外部受託サービスを利用したが、技術的な問題から遺伝子が破壊されたマウスが得られなかった。現在開発している技術でこの問題は打開できると考えられるので、神経変性疾患の理解につながる知見として、将来的に何らかの形で発表することを目指す。統合失調症プロジェクトについては、解析条件の改善と得られたデータの精査により、予備検討時点とは別の向精神薬標的候補を同定した。神経系でこれまで知られている機能や共同研究で得られつつある知見と併せても興味深い結果であり、既存治療薬の新規作用メカニズムの提唱と今後の治療薬開発につながることが期待できる。
細胞の代謝及び細胞膜の物理特性を基園にした農産物の鮮度低下メカニズムの解明

葉菜類の品質は流通段階における水分損失によって大きく低下する。この水分損失には細胞膜の特性が深く関わっていると考えられるので、オオムギ子葉のプロトプラストを作製して細胞膜の力学的物性を測定し、かつ、細胞の劣化と細胞内水の物理的状態との相互間系を明らかにするためにオオムギ子葉内水のスピン-格子緩和時間T1、スピン-スピン緩和時間T2の測定を行った。オオムギはいずれも播種後12日目のものを用いた。プロトプラストの密度を1.0×10^6/mlに調整し、0.5Mから0.1Mまでのマンニトール溶液200μ1に4μ1ずつ滴下し40分以上静置した。浸透圧平衡に達したプロトプラスト懸濁液を2μ1ずつ採取し、顕微鏡観察による細胞膜の破壊の有無により生死を判別した。切断後56時間を経過した子葉から作製したプロトプラストは切断直後のものに比べて高い浸透圧のマンニトール溶液中で、すなわち細胞内外の小さい浸透圧差で破壊された。これは子葉の切断とその後の時間経過により、細胞膜の物性が変化し、破壊強度が低下したこと、あるいは細胞膜の劣化により細胞の浸透圧調節機能が低下したことによると考えられる。またプロトプラストは0.90MPaから0.50Mpaにかけてマンニトール溶液の浸透圧が低くなるにつれて生存率が急激に減少することが確認された。一方、緩和時間については、時間経過と共にT1、T2が長くなる傾向を示した。これは子葉を切断したことによる物理的ストレスから子葉細胞の劣化が進み、細胞内の水の状態が変化したことを示している。以上により、オオムギ子葉細胞の劣化が細胞膜の破壊強度及び細胞内水の緩和時間に影響を与えることが示された。
北方寒冷地域における織布技術と布の機能

本研究では日本とロシアの博物館に収蔵されているシベリア、極東ロシアの先住諸民族と日本の先住民族アイヌの織機と布製品を調査し、北方寒冷地域における織布技術の分布と布の機能を明らかにしようとした。その成果として、以下の2つの結論を得ることができた。第1には、北方寒冷地域における独自の織布技術と布の分布が、当初の予想に比べてはるかに北に広がり、種類も豊富だったことである。第2には、アイヌの事例が他の北方諸民族と比べると特異で、近代化の波に洗われたのにもかかわらず、独自の織布技術と布を現代まで継承してきた点である。それはそれらが民族アイデンティティと結びついていたからではないかと考えられる。○平成26年4月10日第1回の全体会議を開催し、連携研究者全員に本プロジェクトの目的と意義と本年度の計画を説明した。○6月23日30日研究代表者(佐々木)、連携研究者(吉本)がロシア、サンクトペテルブルクにあるロシア民族学博物館と人類学民族学博物館において、ブリヤート、ハンティ、タタール、アイヌの織機と自然繊維の織物、木綿製の衣服の調査を行った。○7月13日17日研究代表者(佐々木)、連携研究者(吉本、日高)が札幌、静内、千歳の博物館でアイヌの古い衣服と出土した擦文文化期の繊維断片に関する調査を行った。○7月29日8月1日連携研究者(吉本、日高、齋藤)が旭川、釧路、札幌の博物館でアイヌの古い衣装の調査を行った。○8月3日17日研究代表者(佐々木)がロシア連邦ブリヤート共和国において、ブリヤートと古儀式派の織機と織物の調査を行った。○9月17日23日連携研究者(齋藤)が阿寒でアットゥシと織機、テタラペの調査を行った。○10月14日第2回目の全体会議を開催し、平成26年度前半の活動を報告した。○11月15日18日研究代表者(佐々木)、連携研究者(吉本、日高)が函館、札幌、釧路の博物館においてアイヌの古い衣装とオホーツク文化期の繊維断片に関する調査を行った。○平成27年1月19日21日連携研究者(吉本)が札幌、白老でアイヌの古い衣装に関する調査を行った。○2月23日第3回全体会議を行い、今年度の調査報告を行った。以上の調査と研究会の実施により、まず、アイヌの衣装について、ロシアの博物館が所蔵するものと釧路の博物館が所蔵するものとが同じ北海道虻田町近辺で作られたものであることが判明した。擦文文化期の道東の布の断片の調査から、擦文文化期末には現在よりも高度な織布技術があったこと、オホーツク文化期の千島列島出土の布の断片から、アイヌ以外の北方民族でも織布技術を持っていたことが判明した。平成27年度は、ロシアではサンクトペテルブルクにある2つの博物館とウラジオストークの博物館、国内では北海道と東京の博物館を中心に調査を行った。具体的には、まずロシアでは平成27年8月30日から9月3日の日程で、ロシア科学アカデミーピョートル大帝記念人類学民族学博物館とロシア民族学博物館で、西シベリアのハンティの伝統的な織物と衣装、北海道と樺太のアイヌの織物と衣装の熟覧とデジタル顕微鏡を用いた素材分析を行った。ウラジオストークでは沿海州立郷土博物館でアイヌのイラクサ製の「テタラペ」と呼ばれる衣装を3点熟覧した。北海道では、白老町のアイヌ民族博物館(4月20日、21日)、旭川市の旭川市博物館(4月22日)、苫小牧市の市立美術博物館(4月23日)、札幌の北海道大学北方生物圏フィールド科学センター植物園博物館(7月15日17日)、道立北海道博物館(7月18日、19日)とその他10月から11月にかけて浦河、様似、伊達紋別などで調査を実施した。東京では東京国立博物館(7月28日、29日)、早稲田大学會津八一記念館(7月30日)で調査した。国内の博物館では主にアイヌの木綿衣(ルウンペ、カパラミプ)と刀掛け帯(エムシアツ)を中心に熟覧と顕微鏡による素材分析を行った。熟覧した資料の数は、集計が終わっていないので正確な数字はまだないが、200点を超える。その結果、アイヌやハンティなどの北方諸民族に見られる靭皮繊維、草皮繊維などの伝統的な繊維による糸づくりの変遷、絹、木綿、羊毛などの輸入繊維製品の使用状況の変遷過程をある程度復元することができるようになった。ことにアイヌの衣文化に関しては、従来考えられてきた以上に高級な素材をふんだんに使っていることがわかるとともに、時代が下るに連れて素材の質が低下していくことも判明した。デジタル顕微鏡による観察の対象とした衣類の点数を昨年度の倍以上に増やしたことから、多様な種類の繊維を観察することができ、各繊維の持つ細かな特徴を把握することができるようになった。そのために、使われている布素材の同定がたやすくなり、また精度も上がった。例えば、肉眼あるいは手触りでは区別が難しい絹とレーヨン(人絹)の区別も顕微鏡による繊維の細かい観察により、より明確につけらるようになった。その結果、その衣装が製作された年代をより狭い範囲に限定できるようになった。アイヌ、ハンティをはじめ北方民族の博物館資料には製作年代が不明の資料が多いが、レーヨンが使われていたとすると20世紀以降の製作であることが明白になる。昨年度に比べて調査した博物館の数、地域も広がり、比較対象とすべきものの点数が増えたことから、量的な分析も可能になってきた。

そのために、時代差、地域差を量的に表すことが可能になった。例えば、サンクトペテルブルクの人類学民族学博物館所蔵のアイヌの木綿衣(ルウンペ)は製作年代を比較的狭い範囲に限定できる数少ない資料だが、それと類似の素材、文様、スタイルを持つが木綿衣が国内の博物館でも複数見つかっており、それらを比較することで、ルウンペの相対的な年代とその変遷を復元できるようになった。平成28年度は、北海道では函館市北方民族資料館、小樽市総合博物館、旭川市博物館、標津町歴史民俗資料館、平取町立アイヌ文化博物館、アイヌ民族博物館、苫小牧市美術博物館、北海道大学植物園博物館、釧路市立博物館、北海道立北方民族博物館、網走市立郷土博物館、上ノ国町勝山館調査整備センターなど、本州では青森市教育委員会文化財収蔵庫、日本民藝館、国立民族学博物館、天理大学天理参考館などでアイヌ衣類の調査を行った。また、海外ではロシア連邦ウラジオストーク市のロシア科学アカデミー極東支部極東諸民族歴史学考古学民族学研究所と連邦極東大学考古学研究室において沿海地方の遺跡から出土した繊維遺物の調査を、また同国カムチャツカ州ペトロパヴロフスク・カムチャツキー市のカムチャツカ総合博物館にてカムチャツカ半島北部の遺跡から出土した繊維遺物や布断片の調査を行った。国内調査では、アイヌの衣類に使用された素材の多様性が明らかになるとともに、一つの衣装に靱皮繊維、木綿、絹、化学繊維など様々な素材が使われていて、従来の樹皮衣、木綿衣などといった素材による区分では説明できないものが少なからずあることがわかった。例えばオヒョウの樹皮繊維とイラクサの草皮繊維を同時に使用した交織織物、地布と装飾布に木綿やレーヨンを使った衣装、あるいは絹の小袖をアイヌ風に仕立て直した衣装などが見られた。海外調査では、従来織布文化の存在が知られていなかった北方の古い遺跡から「もじり」技術で作成された織物が発掘されていたことが判明した。それらは材質、年代などを詳しく分析する必要がある。本年度はこれらの調査と並行して、アイヌ民族出身の織布技術伝承者にオヒョウとシナノキの繊維の実験的な織物を作成してもらった。また、これまでの調査で蓄積されたアイヌをはじめとする北方諸民族の製糸技術、織布技術、衣類に関する情報をデータベースにまとめた。本研究では日本とロシアの博物館に収蔵されているシベリア、極東ロシアの先住諸民族と日本の先住民族アイヌの織機と布製品を調査し、北方寒冷地域における織布技術の分布と布の機能を明らかにしようとした。その成果として、以下の2つの結論を得ることができた。第1には、北方寒冷地域における独自の織布技術と布の分布が、当初の予想に比べてはるかに北に広がり、種類も豊富だったことである。第2には、アイヌの事例が他の北方諸民族と比べると特異で、近代化の波に洗われたのにもかかわらず、独自の織布技術と布を現代まで継承してきた点である。それはそれらが民族アイデンティティと結びついていたからではないかと考えられる。アイヌの伝統衣装に関してはロシアの博物館と北海道の博物館での調査によって、予想以上の発見があった。擦文文化期、オホーツク文化期などの先史時代の布の断片の調査からも予想以上の成果があった。しかし、シベリア地域の織機と織布の調査については十分な時間を取ることができず、概観したのにとどまったために、予想通りの成果しか上げられなかった。まず、平成27年度に全てを熟覧することができなかった博物館での調査を継続したい。
反跳粒子3D計測による高感度速中性子イメージング法の開発

マイクロピクセルガスチェンバー(μ-PIC)を用いた速中性子到来方向測定装置を開発した。μ-PICはプリント基板の微細加工技術を用いたマイクロパターンガス検出器である。この装置は、100mm角μ-PICを用いたタイムプロジェクションチェンバーからなり、速中性子により反跳された陽子を3次元計測することで、雑音となるガンマ線を排除しながら中性子の入射方向を測定できる。我々は、Cf-252中性子線源を用いた原理実証に成功した。我々の開発した手法は、ホームランドセキュリティにおけるHe-3代替検出器として有効である。本研究の目的は、マイクロパターンガス検出器のひとつであるマイクロピクセルチェンバー(μ-PIC)を用いた中性子検出器を製作し、モンテカルロシミュレーションによる最適化により、高感度中性子イメージング法を開発することである。今年度は、プロトタイプ検出器を製作し、中性子の入射方向を決定するガス増幅部の設計及び製作を行なった。ガス増幅部及び検出器の改良作業は埃の無い場所で行なう必要があるため、簡易のクリーンブースを購入し、開発作業環境を整えた。また、FPGAエンコーダーボード(座標演算装置)を購入し、荷電粒子の位置情報、時間情報を計算できる読み出し環境を整えた。現在、GEANT4を用いて検出器の性能評価に必要なモンテカルロシミュレーションのプログラムを製作している。今後はガンマ線(Co-60)及び中性子線源(Cf-252)を用いて検出器の動作確認を行ない、ガス増幅部及び検出器部(μ-PIC)の高電圧設定値の最適化を行なう。本研究の目的は、マイクロパターンガス検出器のひとつであるマイクロピクセルチェンバー(μ・PIC)を用いた中性子イメージング装置を製作し、ガンマ線中性子線弁別能力に優れた高感度中性子イメージング法を開発することである。装置内に入射した速中性子は、ガス中の水素原子と弾性散乱を起こし、反跳陽子が生成される。その飛跡を位置分解能に優れたμPIC検出器で3次元計測し、速中性子の入射方向を捉える。速中性子イメージング法が確立すれば、核物質(プルトニウム)の探知、中性子を用いた地雷探査、医療分野(ホウ素中性子捕捉療法)等での応用が期待できる。これまで、科学警察研究所においてプロトタイプ装置を製作し、中性子線源(カリフォルニウム252)を用いた原理実証を行ない、反跳陽子の飛跡をとらえることに成功している。また、中性子の検出効率が悪いため、これまでターゲットとして使用していたAr/CH_4混合ガスをAr/C_2H_6混合ガスに変更することを検討している。さらに、ガス圧を大気圧(1気圧)から下げることで、反跳陽子の飛跡が伸びるため、中性子の角度分解能向上が見込める。検出効率も考慮しながら、速中性子イメージングに最適なガスの条件を決定したい。本研究の目的は、マイクロパターンガス検出器のひとつであるマイクロピクセルチェンバー(μ-PIC)を用いた速中性子イメージング装置を製作し、ガンマ線中性子線弁別能力に優れた高感度中性子イメージング法を開発することである。これまで、科学警察研究所において速中性子イメージング装置のプロトタイプ機を製作した。中性子線源(カリフォルニウム252)を用いた原理実証を行ない、反跳陽子の飛跡を3次元でとらえることに成功した。また、飛跡の単位長さあたりのエネルギー損失分布(ブラッグ曲線)を各イベントごとに計測し、その曲線の傾きから中性子の入射方向を推定できることが実証された。これらの成果は、国際会議や国内学会で発表した。現在、中性子到来方向決定精度や検出効率等の性能評価を行なっている。今後は、装置に搭載する全方位可視光カメラ映像と中性子到来方向確率分布とを重ね合わせて表示することで、核物質探査を目的としたシステムの製作に取り組む。
プロスタシンによるNaチャネル活性化の分子生物学的機構と高血圧治療への応用

プロスタシンの病態生理学的意義の解明1)ヒトプロスタシンのアミノ酸配列をもとに抗ペプチド抗体を作製した。この抗体はヒトプロスタシンを特異的に認識し、ウエスタンブロットでのヒトプロスタシンの検出を可能にした。この抗体を用いたウエスタンブロットによりヒトプロスタシンが尿中に排泄されることを確認した。2)原発性アルドステロン症は副腎皮質の腺腫からアルドステロンが過剰に分泌され、アルドステロンが上皮性ナトリウムチャネル(ENaC)を活性化することにより高血圧を引き起こす疾患と考えられている。私たちはこの病態にナトリウムチャネル活性化因子であるプロスタシンが関与していると考え、原発性アルドステロン症患者の術前・術後の尿サンプルを集め、ウエスタンブロットにより半定量的にプロスタシンの尿中排泄量を検討した。その結果、原発性アルドステロン患者の尿中には健常者に比して数倍以上のプロスタシンが排泄されていて、腺腫摘出術後にプロスタシンの排泄量が減少することを見出した。私たちはすでにin vitroでプロスタシンがENaCを活性化することを証明しているので、今回の知見はプロスタシンがin vivoでENaCの活性化および高血圧の発症に関与しうる可能性を示唆するものと考えた。今後、さらにプロスタシンの生体内での意義を検討し、新しい高血圧治療への応用を検討したい。1.プロスタシンによるENaC活性化機構の解明(1) Invitro transcriptionにより合成したENaCのα、β、γサブユニットそれぞれのcRNAを単独またはプロスタシンのcRNAと共に実体顕微鏡下でアフリカツメガエルの卵母細胞にmicroinjectionし、2448時間後にその細胞膜分画をショ糖密度勾配法により精製した。得られた細胞膜蛋白質を可溶化してSDS-PAGEを行い、ENaCのそれぞれのサブユニットに対する抗体を用いてウエスタンブロットを行った。αおよびβサブユニットに対する抗体を用いたウエスタンブロットではサイズに変化はなかったが、γサブユニットに対する抗体ではプロスタシンの共発現により85kDaのバンドが70kDaにシフトしていることが判明した。(2) (1)の知見にもとづき、プロスタシンがγサブユニットのN末端から約15kDaのところを切断すると仮定した。γサブユニットのそれに対応する場所としてRKRR(a.a.135-138)という配列を切断部位と想定し、site-directed mutagenesisによりRKRRをAAAAに変異させたmutantγサブユニットを作成した。アフリカツメガエルの卵母細胞にmutant ENaCのcRNAとプロスタシンのcRNAをmicroinjectionし、2448時間後に、アミロライド感受性Na電流を双電極膜電位固定法を用いて測定した。膜電位を-100mVに保持して、5μMのアミロライドによって阻害される電流を測定したところ、AAAAmutantではプロスタシンの共発現によるENaCの活性化が阻害されていることが判明した。この実験からプロスタシンによるENaCの活性化にはγサブユニットが必要であり、さらに、RKRR配列が活性化のために必要な部位であることが証明された。
ラフ集合理論による組織文化コンピテンシーの発見とその応用

平成14年度は、以下の3つの成果を得た。まず、13年度の成果から、分析対象を次の3つに絞り込んだ。それらは、(1)郊外大型店内の各店舗、中心街にある百貨店内の各店舗、及び(3)アーケード街の各店舗である。さらに、各カテゴリー内の企業を優良店舗と斜陽店舗に区分する。この計6区分を対象に、アンケート調査項目の絞り込みを行った。アメリカや日本の5つの企業とのインタビュー調査や現地調査及びコンピテンシー関連の文献の整理を通して、多数存在するコンピテンシー測定尺度の中から、質問表調査の際に用いるアンケート項目を絞り込み、プレアンケート調査の準備を行った。次に、プレアンケート調査のため、2社にアンケート調査を行った。そこで発見したことは、ラフ集合理論で、これまでの統計学で把握することが難しかった、組織の中で働く人たちの感情や感性などの言葉の中に潜む法則や関連を測定し分析しようと試み、これまで以上に言葉の中に込めたほんの少しのニュアンスの差を測定しようと試みたが、ラフ集合理論の対象となるデータの集め方の問題やラフ集合理論だけでは捕らえきれないデータをどのように処理するかという問題点を発見した。現在、ラフ集合理論を発展・応用させた理論に関する文献調査・レビュー中である。この問題をカバーできれば、当初の目的を達成できると考えている。最後に、アメリカと日本で現在共同調査を行っている企業の中の1社が、個人のコンピテンシーによる業績測定・評価を導入し始め、その導入過程に参与し収集したデータから、このような業績測定・評価がもたらす組織文化への影響を分析し、組織文化コンピテンシーを発見することで、表現は難しいが、集合体の代表としてのコンピテンシーとその集合体のコアコンピテンシーとのつながりを探求できる可能性を見出した。平成13年度は、以下の3つの成果を得た。まず、ラフ集合理論の基本文献を整理し次のことを発見した。これまでの統計学で把握することが難しかった、組織の中で働く人たちの感情や感性などの言葉の中に潜む法則や関連を測定し分析できる可能性を見出した。したがって、質間表調査などで、これまで以上に言葉の中に込めたほんの少しのニュアンスの差を測定できる可能性が拡がった。次に、分析対象を特定化した。アメリカと日本で現在共同調査を行っている5杜とのインタビュー調査や研究対象地域の現地調査から、分析対象を次の3つに絞ることにした。(1)郊外大型店内の各店舗、(2)中心街にある百貨店内の各店舖、(3)アーケード街の各店舖である。この分析対象に特定化した理由は、3つあり、まず、各カテゴリーに属する各店舗が感じる組織文化をまとめてそのカテゴリーのコンピテンシーを測定する狙いがあること、次に、それによりカテゴリー間のコンピテンシーの違いを把握すること、そして最後に、各カテゴリー間の優良・斜陽店舗の組織文化を比較しその違いをもたらすコンピテンシーを発見することである。最後に、アンケート調査項目の絞り込みである。上記の5つの企業とのインタビュー調査や現地調査及ぴコンピテンシー関連の文献の整理から、多数存在するコンピテンシー測定尺度の中から、質問表調査の際に用いるアンケート項目を絞り込んでいる。これは現在も進行中であり、研究の進展によっては若干増減する可能性はある。
動脈管血管トーヌスにおける一酸化窒素の役割とその制御

本研究の最終目的は、動脈管における一酸化窒素(NO)産生の制御因子を探り、動脈管の開存・閉鎖のコントロールを容易にすることにより、動脈管開存症を発症する未熟児や動脈管依存性心疾患をもつ新生児の生命予後を改善することにあった。1研究課題1について仮説「胎児期の高濃度の血中estrogenはNOを介して胎児の動脈管を開存させる機転に寄与している。また生後動脈管が閉鎖する機転にもそのestrogenの供給が絶たれたことが関与している」に対し、in vivoとin vitroの実験を施行した。まず、estrogen receptor blockerのtamoxifenとICI 182780、cyclooxygenase inhibitorのindomethacin、NOS inhibitorのL-NAMEを妊娠ラットに皮下投与し、その後胎仔を摘出・瞬間凍結したのち組織切片を作成し、切片上の肺動脈と動脈管の血管径を比較し動脈管収縮の有無を調べた。indomethacin、L-NAMEは予想通り動脈管を収縮させたが、estrogen receptor blockerであるtamoxifenとICI 182780は有意な収縮をさせなかった。また、In vitroの実験で上記の薬剤を用いてラット胎仔の動脈管の等尺性張力の測定を試みたが、有用な情報を得ることができなかった。(結論)ラット動脈管においてestrogenを介したNOの作用を証明することはできなかった。2研究課題2について仮説「未熟児において、indomethacinに反応する動脈管と反応しない動脈管では、ecNOS geneのpolymorphismのパターンに差がある」に対し、正常新生児と動脈管開存を発症した未熟児におけるecNOS gene Exon 7のpolymorphism、894 G/T; Glu296Aspの同定を行った。PCRで増幅後direct sequenceによって解析したが、症例数が不足しているためか、両群間に同遺伝子のpolymorphismのパターンに有意差は認められていない。(結論)症例数を増やすと有意差が認められる可能性があると考え、今後も検討を続ける。3その他国外研究協力者のR.I.Clyman教授(アメリカ合衆国)と協力し、NOの役割の検討に、やはり動脈管を拡張するプロスタグランディンEとそのリセプターサブタイプ(EP2,EP3,EP4)の役割に関する検討も加えて、後述の研究発表を行った。【研究課題1】仮説「胎児期の高濃度の血中estrogenは一酸化窒素(NO)を介して胎児の動脈管を開存させる機転に寄与している。また生後動脈管が閉鎖する機転にもそのestrogenの供給が絶たれたことが関与している」に対し、14年度はestrogen receptor blockerのtamoxifenとICI 182780、cyclooxygenase inhibitorのindomethacin、NOS inhibitorのL-NAMEを妊娠ラットに皮下投与した。その後胎仔を摘出・瞬間凍結したのち組織切片を作成し、切片上の肺動脈と動脈管の血管径を比較し動脈管収縮の有無を調べた。(結果)このin vivoの実験において、indomethacin、L-NAMEは予想通り動脈管を収縮させたが、estrogen receptor blockerであるtamoxifenとICI 182780は有意な収縮をさせなかった。(結論)この実験系では動脈管に対するestrogenの作用は証明されなかった。

(今後の方針)in vivoの追加実験として投与方法の変更を試みる。また、in vitroの実験系を完成させる。具体的にはラット胎仔の動脈管を摘出、灌流漕に浴し薬理学的な処置を加えながら等尺性張力を測定する。さまざまな酸素分圧下でestrogen投与時の張力を測定するとともに、in vivoの実験と同様にtamoxifen、ICI 182780、indomethacinやL-NAME投与との関係を調べる。【研究課題2】仮説「未熟児において、indomethacinに反応する動脈管と反応しない動脈管では、ecNOS geneのpolymorphismのパターンに差がある」に対し、ヒトにおけるecNOS geneのpolymorphismの同定を試験的に開始した。15年度は実際に未熟児出身患者の血液の解析を行い、動脈管開存の合併の有無との関係を検討する。【研究課題1】仮説「胎児期の高濃度の血中estrogenは一酸化窒素(NO)を介して胎児の動脈管を開存させる機転に寄与している。また生後動脈管が閉鎖する機転にもそのestrogenの供給が絶たれたことが関与している」に対し、estrogen receptor blockerのtamoxifenとICI 182780、cyclooxygenase inhibitorのindomethacin、NOS inhibitorのL-NAMEを妊娠ラットに皮下投与した。その後胎仔を摘出・瞬間凍結したのち組織切片を作成し、切片上の肺動脈と動脈管の血管径を比較し動脈管収縮の有無を調べた。(結果)このin vivoの実験において、indomethacin、L-NAMEは予想通り動脈管を収縮させたが、estrogen receptor blockerであるtamoxifenとICI 182780は有意な収縮をさせなかった。(結論)昨年度に引き続きin vivoの追加実験として投与方法の変更を試みたが、この実験系では動脈管に対するestrogenの作用はやはり証明されなかった。(今後の方針)in vitroの実験系において、ラット胎仔の動脈管を摘出、灌流漕に浴し薬理学的な処置を加えながら等尺性張力を測定する。【研究課題2】仮説