hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
牛属のプリオン遺伝子に関する分子遺伝学的研究

現在までに、ウシ・プリオン遺伝子(PRNP)中には多数の多型が存在することが知られている。最近、Sander et al.(2004)はドイツのウシにおいてBSEの感受性とPRNPの推定上のプロモーターに見られる23bpの挿入/欠失(indel)多型の頻度分布との間に有意な関連を報告した。そこで本研究では、23bpのindel多型について、アジア在来牛5集団324頭、ミタン(Bosfrontalis)4頭において対立遺伝子の頻度分布を調査し、Sander et al.(2004)のデータと比較した。得られた結果を以下に述べる。1)23bpのindel領域は、調査したすべての集団で多型的であった。また、ミタンを除くすべての集団で、23bpのindelをもたない対立遺伝子(-)の頻度が23bpのindelをもつ対立遺伝子(+)の頻度よりも高かった。2)ベトナム北部在来牛およびミタンの対立遺伝子の頻度分布はSander et al.(2004)の報告したBSE罹患牛のそれと有意な差が認められた。3)モンゴル、ベトナム南部ならびにミャンマー在来牛の対立遺伝子の頻度分布はBSE罹患牛のそれと似ていた。さらに、ベトナム南部およびミャンマー在来牛の対立遺伝子の頻度分布は、正常牛のそれと有意に異なっていた。プリオン遺伝子(PRNP)は、牛海綿状脳症(BSE)やスクレイピーなどのプリオン病に関わる遺伝子である。ヒトやヒツジでは、PRNPの遺伝変異が潜伏期の長さや発病の有無に影響することが知られているが、ウシPRNPの遺伝変異とプリオン病との関連性はほとんど示されていない。ところが、Sanderら(2004)は、ウシPRNPのプロモーター領域に23-bpのindel(挿入もしくは欠失)を発見し、その多型がドイツのウシ集団においてBSEの感受性と有意に関連することを報告した。そこで、本年度は23-bpのindelをアジア在来牛6集団340頭、和牛4品種211頭、近縁種であるミタン4頭において解析し、対立遺伝子の保有状況を調査した。ミタンを除くすべての集団で、23-bpのindelをもつ対立遺伝子(+)の頻度がもたない遺伝子(-)の頻度よりも低かった(Table1)。この傾向は、Sanderら(2004)やSeaburyら(2004)と一致した。解析した座位は、アジア在来牛6集団のうち口之島野生化牛を除く5集団、和牛4品種のうち日本短各種を除く3品種で多型的であった。また、ハーディーワインベルグ平衡から有意にずれた集団は見当たらなかった。ミタンにおいては、indelをもつ対立遺伝子(+)の頻度が高い傾向を示し、興味深い結果が得られた。近年、ウシPRNPのプロモーター領域には、12bpと23bpの挿入/欠失(indel)の多型が存在することが明らかとなった(Hills et al.,2001;Sander et al.,2004)。これらのうち23bpのindel多型がドイツのウシ集団においてBSEの感受性と有意に関連することが報告され、BSE抵抗性牛の確立に可能性が示された。その後、Sander et al.(2005)はこの領域に転写制御因子であるRP58(repressor protein of 58kDa)の結合配列が存在することを明らかにし、この領域と12bpのそこで、本研究は23bpのindelについて、和牛4品種とわが県で維持されている在来牛である口之島野生化牛において解析し、遺伝子頻度および遺伝子型頻度を解明した。さらには既報のBSE罹患牛のデータと比較検討した。得られた結果は以下のとおりである。1)23bpのindel領域は、黒毛和種、褐毛和種、無角和種で多型的であった。他方、日本短角種と口之島野生化牛で、23bpのindelをもたない対立遺伝子(-)のみ観察された。すべての集団で(-)の頻度が23bpのindelをもつ対立

遺伝子(+)の頻度よりも高かった。2)鹿児島県の黒毛和種における対立遺伝子の頻度分布はBSE罹患牛のそれと似ていた。3)今回得られたデータと12bpのindelのデータとを統合した結果、褐毛和種の遺伝子型構成が他の和牛や既報のものとは異なっていた。
土壌-微生物-根複合系を介した作物の有機態窒素吸収メカニズム

1.前年度に引き続き、植物の有機態窒素吸収における菌根菌共生の効果について検討するとともに、有機態窒素のひとつアミノ酸の直接吸収メカニズムを明らかにするため、同位体標識アミノ酸を用いた直接吸収量の定量と、アミノ酸トランスポーターの探索を行った。2.ソルガム、パールミレット、イネの幼苗を、窒素源として有機態窒素(米ぬか・稲わら)を含む培土に移植し、アーバスキュラー菌根菌の胞子を接種した。いずれの植物も、有機態窒素の施用によって窒素吸収量がわずかながら増加したが、菌根菌接種による違いはほとんど見られず、有機態窒素吸収におけるアーバスキュラー菌根菌の関与は少ないことが明らかとなった。3.有機態窒素施用でもっとも良い生育を示したソルガムについて、有機態窒素の直接吸収能力を検討した。窒素源の異なる無菌的条件下で栽培したソルガムでは、無機態窒素である硝酸を与えた場合に比べて、アミノ酸のグリシンを施用すると窒素含有率が有意に増加し、グルタミン施用ではさらに増加した。このことから、ソルガムのアミノ酸吸収能力は非常に高く、窒素源として効率的に利用されている可能性が示唆された。4.さらに、窒素と炭素の同位体元素で二重標識されたグリシンを与え、植物体中に存在する標識グリシンをGC-MSで同定・定量した。その結果、グリシンを窒素源として生育させたソルガムでは標識グリシンの吸収速度が非常に高いことが分かった。すなわち、生育期間中の窒素形態によってアミノ酸吸収能力の発現に違いが現れることが明らかとなった。5.ソルガムのアミノ酸吸収におけるトランスポーターの関与を証明するため、ソルガム根のmRNAからcDNAを合成し、シロイヌナズナの遺伝子情報を参考にPCRを行った。その結果、ソルガム根にはシロイヌナズナおよびイネのアミノ酸トランスポーターと相同性の高い遺伝子領域が存在し、これがアミノ酸の輸送体として働いている可能性が考えられた。1.植物の有機態窒素吸収能力を無機態窒素(硝酸、アンモニウム)と区別して比較するため、土壌微生物による有機態窒素の無機化が起こらない無菌条件下で、栽培試験を行った。2.ソルガム、パールミレット、イネの無菌苗を、窒素源として無機イオン(硝酸アンモニウム)、アミノ酸(グリシン)、ペプチド(グルタチオン)、タンパク質(牛血清アルブミン)を含む無菌栽培用ポットに移植し、84-91日間栽培した。3.供試した3植物種いずれも、窒素吸収量は硝酸アンモニウム区で最も高く、続いてグリシン、グルタチオン、牛血清アルブミンの順に低くなった。とくにグリシン区の窒素吸収量は硝酸アンモニウム区と同じくらい高く、今回用いた植物種はグリシンを窒素源として有効に利用できることが明らかとなった。一方、牛血清アルブミン区の窒素吸収量は非常に低く、ソルガムとイネでは無窒素区をやや上回ったものの、パールミレットでは逆に低下した。4.培地溶液中の窒素形態を分析した結果、栽培前に比べて減少した全窒素量が、植物の窒素吸収量とほぼ対応していたことから、溶液中に遊離していた窒素が吸収されていたと考えられた。5.培地溶液中のペプチダーゼ活性はいずれの植物でも低く、少なくともグルタチオン区で植物が吸収した窒素は、グルタチオンの直接吸収によるものであることが示唆された。6.以上の結果から、本研究で供試したイネ科3作物いずれにおいても、有機態窒素吸収量はアミノ酸>ペプチド>タンパク質の順に低下し、高分子化合物になるほど吸収されにくいことが明らかとなった。さらに、ソルガムとイネでは、タンパク質(牛血清アルブミン)をわずかながらも窒素源として吸収していたのに対し、パールミレットではほとんど利用できないという、有機態窒素吸収能力における植物間差が明らかになった。植物根が、共生糸状菌であるアーバスキュラー菌根菌を介して有機態窒素を吸収する際、菌糸内におけるリン(ポリリン酸)と共役したアミノ酸輸送システムが関与することが考えられる。そこで今年度は、菌糸中のポリリン酸と窒素の同時分析により、両者の共役輸送の可能性について検討した。ポットにオートクレープ滅菌した川砂を充填し、ナイロンメッシュ(37μm格子)で2区画に仕切った。一方の区画にアーバスキュラー菌根菌胞子を接種し、ミヤコグサを8週間栽培した。栽培期間中は、低リン濃度の培養液を23日おきに潅水した。もう一方の区画から外生菌糸を回収し、ポリリン酸含有率を、ポリリン酸キナーゼ反応にもとつくATP生産量に換算して測定した。また、菌糸を酸分解し、窒素および各種元素の含有率を測定した。菌糸回収量は1ポットにつき15-20mgであり、ポリリン酸や各種元素の分析が可能な量であった。培地に用いた川砂が,菌糸に付着して元素分析結果に影響をおよぼすことが懸念されたが、川砂の主な元素がAlやFeであるのに対して、菌糸はN, K, Mgをもっとも多く蓄積したなど、異なる傾向を示したため、菌糸の分析値における川砂の影響は小さいものと考えられた。しかし、培地の影響を極力低減するため、各種元素含有率の低い石英砂を用いることを検討している。今年度はさらに、有機態窒素の直接吸収が、植物の窒素代謝におよぼす影響について検討した。無菌的に有機態窒素を与えて栽培したソルガムの根抽出物を、GC-MSにより一斉分析した結果、66化合物が同定された。ピーク面積値にもとづく主成分分析を行ったところ、与えた窒素形態による代謝産物組成の違いが見られた。

すなわち、吸収した有機態窒素が、無機態窒素とは異なる代謝経路を通じて同化されている可能性が示唆された。1.前年度に引き続き、植物の有機態窒素吸収における菌根菌共生の効果について検討するとともに、有機態窒素のひとつアミノ酸の直接吸収メカニズムを明らかにするため、同位体標識アミノ酸を用いた直接吸収量の定量と、アミノ酸トランスポーターの探索を行った。2.ソルガム、パールミレット、イネの幼苗を、窒素源として有機態窒素(米ぬか・稲わら)を含む培土に移植し、アーバスキュラー菌根菌の胞子を接種した。いずれの植物も、有機態窒素の施用によって窒素吸収量がわずかながら増加したが、菌根菌接種による違いはほとんど見られず、有機態窒素吸収におけるアーバスキュラー菌根菌の関与は少ないことが明らかとなった。3.有機態窒素施用でもっとも良い生育を示したソルガムについて、有機態窒素の直接吸収能力を検討した。窒素源の異なる無菌的条件下で栽培したソルガムでは、無機態窒素である硝酸を与えた場合に比べて、アミノ酸のグリシンを施用すると窒素含有率が有意に増加し、グルタミン施用ではさらに増加した。このことから、ソルガムのアミノ酸吸収能力は非常に高く、窒素源として効率的に利用されている可能性が示唆された。4.さらに、窒素と炭素の同位体元素で二重標識されたグリシンを与え、植物体中に存在する標識グリシンをGC-MSで同定・定量した。その結果、グリシンを窒素源として生育させたソルガムでは標識グリシンの吸収速度が非常に高いことが分かった。すなわち、生育期間中の窒素形態によってアミノ酸吸収能力の発現に違いが現れることが明らかとなった。5.ソルガムのアミノ酸吸収におけるトランスポーターの関与を証明するため、ソルガム根のmRNAからcDNAを合成し、シロイヌナズナの遺伝子情報を参考にPCRを行った。その結果、ソルガム根にはシロイヌナズナおよびイネのアミノ酸トランスポーターと相同性の高い遺伝子領域が存在し、これがアミノ酸の輸送体として働いている可能性が考えられた。
微細密集コア光ファイバ構造の波長分散特性の研究

近年、光の経路のコアを複数設けて伝送容量増大を目指す多重コア光ファイバが実現されている。このような構造において、コア寸法とコア間の間隔を光の波長程度に小さくした「微細径密集コア光ファイバ構造」を本計画では取り上げる。寸法が光の波長程度となる光学素子は、大寸法の素子には見られない特異な特性を持つことが知られており、多重コア構造においても構造の微細化により、特異な光波伝搬特性を持つ可能性を秘めている。そこで本計画では、円周状に対称配置された多数の微細径コアを持つ光ファイバ構造の伝搬特性を精密に解析し、この構造が有する、通常の光ファイバでは実現困難な有用な特性の可能性を追求することを目的とする。
親密な対人関係における自己とwell-beingのモデル化

Bauer et al.(2008)の研究に基づき,親密な対人関係の観点から,自己の成長に対する動機づけとwell-beingとの関連を検討した。欧米の研究では,個人がいかに認知的に複雑な見方をしようとするのかという認知的な成熟へ向けた動機づけと,自分自身の内在的な豊かさ(自己成長や対人関係の向上)を志向する動機づけがそれぞれ個人の成熟やwell-beingといった適応に重要であることが示唆されていた。これらの動機付けはすべて個人内の成長を重視したものである。本研究では日本の集団主義的な文化的背景を考慮し,このような動機づけが個人内のみの観点に完結するのではなく,社会貢献や対人関係全体を考慮するという集団としての成長の視点が重要となることを検討した。これまでの自伝的物語から,個人の成熟やwell-beingにとって重要となる視点を抽出し,成長に対する動機づけの尺度が開発された(Bauer et al.,2008)。本研究ではそれを邦訳し,日本版の尺度を開発した。さらに,この尺度とwell-beingとの関連を検討した結果,日本人の成長の動づけは,個人の内面を深めるという個人内の視点のみではなく,社会貢献に対する動機づけと,親密な関係をよりよくするという動機づけがあることが示された。さらに,社会貢献に対する動機づけは,個人のwell-beingにとってもっとも大きな影響力があることが示された。以上の結果から,日本の文化的背景においては,個人が個人としてのみ成長しようとする動機づけだけではなく,社会全体に貢献しようとする動機づけ,あるいは親密な関係を向上しようとする動機づけが,結果的に個人のwell-beingにとって重要となることが示唆された。Bauer, et. al. (2005)の研究に基づき,日本の文化的背景を考慮した上で親密な対人関係の観点から,自伝的物語とwell-beingとの関連を検討した。well-beingは,理性的成熟を反映するeudaimonismと,快楽の達成を反映するhedonismの2側面から検討した。大学生43名,看護学校生33名を対象に,人生で最高・最悪・転換期となった出来事の物語と,情動知能(eudaimonism;内山ら,2001)と関係満足度(hedonism;Rucbult, et. al.,1998)を測定した。出来事に対して複雑に吟味する解釈(統合的主題)が情動知能と関係満足度を高めることが示された。しかし,Bauer, et. al.(2005)で指摘されていた内在的な価値観は明確な結果が示されなかった。あいまいなコミュニケーションという文化的特徴から,自己や他者などについて複雑に捉える統合的主題の方が,関係満足度に重要である可能性が考えられた。年長者を対象に知見の一般性を確認し, eudaimonismがhedonismの関連についても社会的スキルの観点から検討した。また,出来事をポジティブに解釈する"昇華"や,そのような変化が自己または他者についてなのかについても,well-beingとの関連を検討した。中高年62名(平均年齢48.56歳,SD=8.49)を対象に調査を実施した。その結果,統合的主題が,自己概念をポジティブに昇華し情動知能を高め,内在的主題が精神的健康を促進していた。情動知能は社会的スキルを通じて親密な関係の満足度を高めており,eudaimonismとhedonismの関連が示された。従来検討されていなかった,これらの関連が実証的に明らかとなり,年長者においても出来事の解釈がwell-beingに影響することが示された。
生殖腺で特異的に発現するGSE遺伝子の機能解析

GSE(gonad-specific expression gene)遺伝子はZGA期に発現が変化する、精巣および卵巣で特異的に発現する新規遺伝子である。これまでの研究からGSEは、(1)ノーザンブロット解析より生殖腺以外の体細胞系列組織では発現しないこと、(2)精巣ではパキテン期の精母細胞が出現する生後14日目からGSEは発現し始めること、(3)減数分裂期にある精母細胞が存在する分娩時から発現し始めることが示され、生殖細胞の減数分裂に何らかの役割を果たしていることが示唆された(Zhang et al.,2002)。そこで、本研究はGSEが初期発生胚ならびに生殖腺で果たす役割を明らかにすることを目的として、相互作用するタンパク質の検索およびRNAi(RNA-mediated interference)をもちいた遺伝子ノックダウンにより卵巣・精巣における機能解析を行う。1)マウス卵巣cDNAライブラリーによるTwo-hybrid systemを用いたマウスGSEと相互作用を示すタンパク質の探索・lacZ遺伝子を制御しているLexAオペレターに結合領域を持つpGildalexA vectorにGSEi遺伝子を組み込んだベクターを構築した。・現在、leucineを欠損した培地で酵母を培養することでGSEと相互作用を持つタンパク質を発現している酵母コロニーのスクリーニングを行っている。2)RNAi(pDECAP)ベクターにGSEcDNAを組み込んだ発現ベクターの構築・鋳型となるプラスミドのinverted repeat配列部位のDNA複製時に鋳型が十字構造(cruciform)をとることで、この部分のdelitionが起こり大腸菌内での複製がうまくいかないことが予測される。このため、宿主となる大腸菌とその培養条件の検討している。
認知主体における「こころ」「信念体系」「行為」の相互連関に関する総合的研究

前年度からの継続で、認知科学の成果が提供するさまざまな問題に対して、哲学的考察を加えるという研究のスタイルを維持しつつ、さらに、前年度(平成3年度)の具体的成果を意識しつつ、最終年度は以下のような成果がえられた。1「信ずること」をめぐって、「知ること」あるいは思弁理性がどのように実践理性にかかわるのか、あるいはみずから退いて実践理性に道を譲るのか、これに関してカントの『純枠理性批判』の堅実な解読を行った、2人間に行為には、複数で行う行為だけではなく、ただひとりで行う行為であっても、一般に共同行為であるという性格が備っているということ、さらにそうした共同行為の基礎をなしているのが、われわれがコミュニケーションに与る存在であるということに他ならないということが確認された、3哲学の伝統上しばしば問題にされる<quod sit〉(何であるか?)という問いをめぐって、通常いわれるように、「一と多」、「普遍対個物」という枠組みがまずあって、その上で問われていると理解すべきではなく、この問いそのものを日常的な対話文脈において理解すべきであるという見解が可能であるということ、4「知る」と「なす」の関係をめぐって、古来から論じられてきたテクネー・アナロジーの問題を取り上げ、従来理解されてきたように、テクネーとはたんなる技術知ではなく、テクネーを有するものの信念を構造化し、行為するもののあり方を規定していくような、認織と行為の構造そのものであるということが確認された、等である。認知科学の発展にともない、「こころ」「信念体系」「行為」などの概念に関する哲学的な再検討が必要とされているが、哲学史あるいは哲学史あるいは哲学の伝統を踏まえつつ、認知科学の基礎論の整備に貢献することを目的として、本研究は発足した。平成3年度の成果としては、まず1.たとえば言語使用といった行為を遂行する場面で、知覚における信念に比せられる信念が存在し、そうした信念に基づいて言語が使用され、さらに「表象」に関してもそうした信念に基づいて形成されるということ2.信念を願望とともに行為を説明するものとして行為に相関的に捉らえる観点の下で、命題と文の区別と類比的に、信念内容(命題)と信念状態が区別されなければならず、行為と連関するのは、むしろ信念状態の方であるということ3.行為の社会哲学的・倫理的再検討の結果としては、行為の倫理的正当化の際に、現実的には伝統的な平等原理が有効でない場合があり、われわれが持っている生活全般に関わる信念体系を適切に反映させる手続きを経ることによって、はじめて説得力を持ちうるということ4.知覚に代表される表象作用が、認識主観の「構成」という操作によって形成されるのではなく、身体を持ってわれわれが存在するという事実と不即不離のかたちで形成されるということ、等が確認された。1「信ずること」をめぐって、「知ること」あるいは思弁理性がどのように実践理性にかかわるのか、あるいはみずから退いて実践理性に道を譲るのか、これに関してカントの『純枠理性批判』の堅実な解読を行った、2人間の行為には、複数で行う行為だけではなく、ただひとりで行う行為であっても、一般に共同行為であるという性格が備っているということ、さらにそうした共同行為に基礎をなしているのが、われわれがコミュニケーションに与る存在であるということに他ならないということが確認された、3哲学の伝統上しばしば問題にされる〈quod sit〉(何であるか?)という問いをめぐって、通常いわれるように、「一と多」、「普遍対個物」という枠組みがまずあって、その上で問われていると理解すべきではなく、この問いそのものを日常的な対話文脈において理解すべきであるという見解が可能であるということ、4「知る」と「なす」の関係をめぐって、古来から論じられてきたテクネー・アナロジーの問題を取り上げ、従来理解されてきたように、テクネーとはたんなる技術知ではなく、テクネーを有するものの信念を構造化し、行為するもののあり方を規定していくような、認識と行為の構造そのものであるということが確認された、等である。
分化転換を支えるエピジェネティクスの全ゲノム包括的解析

一般的に終末分化した細胞は他の細胞種に変化しないと考えられているが、限られた細胞種で分化転換と呼ばれる現象が起こる。ニワトリ胚網膜色素上皮細胞(RPE)は、脱分化を経てレンズ細胞へと分化転換する。本研究では、RPEの脱分化におけるエピジェネティクスをゲノム包括的に解析した。その結果、脱分化の過程で1)転写に関わるヒストンH3K4me3が極めてダイナミックに変化すること、2)各エピジェネティクス修飾の増減は非選択的というより、遺伝子選択的に行われること、そして3)各修飾の変化は連関していることが明らかになった。iPS因子の遺伝子導入や卵母細胞への核移植で体細胞核はリプログラミングされる。これらの人為的リプログラミングに対して、分化転換という生命現象としての体細胞核リプログラミングが存在する。分化転換の研究は主に両生類イモリの組織再生を対象に研究されてきたが、イモリのゲノム配列が未解読であるため、ゲノム包括的なエピジェネティクス解析が不可能であった。ニワトリ胚網膜色素上皮細胞(RPE cell)はレンズへと分化転換すること、そして、ニワトリのゲノム配列は解読されていることに着目し、本研究では、レンズ分化転換を支えるエピジェネティクスをゲノム包括的に解析する。本年度、ニワトリ胚培養系を導入した。摘出条件の検討を行い、8日令のニワトリ胚からRPE cellを単離、培養することが出来るようになった。以後、この培養系を利用して分化転換におけるエピジェネティクスを解析する。一般的に終末分化した細胞は他の細胞種に変化しないと考えられているが、限られた細胞種で脱分化・分化転換と呼ばれる現象が起こる。例えば、ニワトリ胚網膜色素上皮細胞(RPE)は、脱分化を経てレンズ細胞へと分化転換する。iPSや卵母細胞への核移植は人為的に誘導される体細胞核リプログラミングであるが、脱分化・分化転換は生命現象としてのリプログラミングと言える。このユニークな細胞制御を支えるエピジェネティクスを知る目的で、RPEの脱分化・分化転換におけるエピジェネティクスをゲノム包括的に解析した。8日令のニワトリ胚からRPEを単離した。そしてRPEをフェニルチオウレアとヒアルロニダーゼ存在下で培養し脱分化細胞を誘導した。RPEと脱分化細胞の核分画に対してChIP-seqを行い、脱分化過程におけるエピジェネティクス制御を解析した。転写活性化に関与するHistone H3K4me3が脱分化の過程でダイナミックに変化していることが明らかになった。脱分化過程でH3K4me3が消失する領域(TFEC)や増加する領域(glioma pathogenesis-related protein1)が認められた。また、H3K4me3の減少がヘテロクロマチン形成に関わるH3K27me3の増加と連関する領域(SOCS2, negatively regulate cytokine receptor signaling)、さらにH3K4me3の減少がH3K9me3の増加と連関する領域(IRF5)が認められた。逆にH3K4me3の増加がそれぞれH3K27me3やH3K9me3の減少と相関する領域も認められた。以上から脱分化の過程で1) H3K4me3がダイナミックに変化すること、2)各エピジェネティクス修飾のリクルートは非選択的というより、むしろ選択的に行われること、そして3)各修飾の変化は連関していることが示唆された。これまで両生類を対象に研究してきたが、本研究で初めてニワトリ胚を実験に用いた。そのため、培養系の導入に時間がかかってしまった。RPEcell単離手技の上達やトリプシン処理等の条件の最適化を行い、最終的に実験系を構築できた。今後は、この系を利用して研究が進展すると思われる。再生・発生構築された培養系を利用して、1) RPE cell、2)脱分化細胞、3)レンズ細胞を分取する。これらの細胞種に対して、ChIP seqを行い、分化転換過程におけるエピジェネティック制御をゲノムワイドに明らかにする。さらに、レンズ分化転換能を持つステージと消失するステージのRPEcellのエピジェネティクスをChIP seqにより比較し、分化転換能を担保するエピジェネティクスを明らかにする。ニワトリ胚培養系の構築に時間が取られ、ChIP seq解析を行うことが出来なかった。そのため、ChIP seq用の予算を使うことが出来なかった。初年度に計画していたChIP seq解析は、次年度に行う。初年度に使用できなかったChIP seq用予算は、次年度のChIP seq解析に使用する。
ビタミンB_1強化発酵食品開発のための有用酵母の構築

平成16年度に引き続いてthi81変異株に酵母ゲノムライブラリーを導入し、thi81変異の機能相補スクリーニングによりTHI81遺伝子を単離することを試みたが、現在までのところ成功していない。また、酵母1遺伝子破壊株ライブラリーキットを用いて、B_1生合成に関与するホスファターゼ遺伝子の同定を試みるためスクリーニングを行った。ホスファターゼ活性を持つ可能性の高い塩基配列である遺伝子を破壊した株28株について、それぞれの細胞から抽出した粗抽出液を用いてB_<1->1リン酸(TMP)ホスファターゼ活性を測定するとともに、B_1添加無添加液体培地における生育の違いを親株と比較した。しかし、明確にTMPホスファターゼ活性が低下している破壊株も、B_1要求性を示す破壊株も見出すことはできなかった。これと平行して、B_1代謝に関与する遺伝子の発現を正に調節する2つの遺伝子、THI2、THI3がコードするたんぱく質の機能について検討した(Molecular Microbiology 58(2) pp467-479)。DNAマイクロアレイ解析の結果、B_1欠乏によりTHI遺伝子群の発現は10倍から90倍に増加し、THI2、THI3の発現もそれぞれ17倍、3倍に増加していた。B_1添加培地から無添加培地に移すと2つの遺伝子ともプロモーター活性は同じくB_1遺伝子群の1つであるPHO3と同様に上昇した。THI3を破壊するとTHI3プロモーター活性の働きも低下し、THI3たんぱく質は自身の遺伝子発現を調節していることが明らかとなった。thi81変異株に酵母ゲノムライブラリーを導入し、thi81変異の機能相補スクリーニングによりTHI81遺伝子の単離を試みた。thi81変異の指標として、分泌酵素であるチアミン抑制型酸性ホヌファターゼ(PHO3、チアミン調節系で発現調節を受ける)の活性を利用し、ビタミンB_1(B_1)添加寒天培地で生育したコロニーを酸性ホスファターゼ活性試薬で染色したところ、野性株と同様に酵素が発現されないで白いままになる株は現在までのところ得られていない。H17年度も継続してTHI81遺伝子の単離を行う予定である。これと平行して、同じくB_1生合成に関与することが以前より示唆されていた、相同性の高い2つの遺伝子、THI20、THI21がコードするたんばく質の機能について明らかにした(Curr. Genet. 47 pp156-162)。この結果、Thi20p、Thi21pにはともにB_1の構成単位の1つであるHMP(ヒドロキシメチルピリミジン)からHMP-2リン酸(HMP-PP)を生合成する2つの連続する反応を触媒する酵素活性(HMP kinaseとHMP-P kinase)があることが明らかになった。この2つの酵素反応は1つの活性部位で連続して行われる。しかし、Thi21pの触媒活性はThi20pに比べて著しく小さく、酵母での生理的な機能は主にThi20pが担っているものと考えられる。また、大腸菌と同様に、酵母でもHMPからHMP-1リン酸(HMP-P)への反応はB_1生合成のde novoの経路には含まれていない可能性が示唆された。
組織細胞によるヒトノロウイルス培養への挑戦

本プロジェクトでは、組織細胞での培養方法が確立していないヒトノロウイルスについて、組織細胞へのノロウイルスの感染確立を可能とする知見を得ることを試みた。ウイルス粒子の細胞への侵入及び脱殻過程を蛍光顕微鏡で観察する目的で、緑色蛍光タンパク質が付加したノロウイルス様中空粒子を合成することに成功したが、組織細胞への感染操作において観察に足る十分な蛍光量が確保できないことが明らかとなった。そこで、組織細胞へのノロウイルス感染が生じた際の細胞応答に着目し、ウイルス感染を迅速に検出可能な遺伝子マーカーの探索を試みた。テストウイルスとしてはポリオウイルスを用い、INT407細胞へ感染後、12時間後に総RNAを抽出し、DNAマイクロアレイを用いたトランスクリプトーム解析を行った。その結果、高い変動値を示す遺伝子としてカリウムイオンの恒常性に関わるKCNJ4が見出された。この結果は、ポリオウイルスが細胞に感染した際、細胞応答の1つとして細胞内小器官内のカリウムイオン濃度の調整が行われたことを示している。さらに、このKCNJ4遺伝子はウイルス感染以外の影響、例えば重金属の存在等によっては発現量が変動しないことも確かめられた。本研究により、ノロウイルスの細胞感染を迅速に検出するために必要な遺伝子マーカーが同定されたことから、組織細胞によるノロウイルス培養実現に向けて非常に貴重な知見が得られたと言える。研究初年度に準備した緑色蛍光タンパク質付加ノロウイルス様中空粒子を用いて,ノロウイルス培養細胞の探索を行った。組織細胞としてはヒト腸管由来のINT407細胞を採用し、緑色蛍光タンパク質付加ノロウイルス様中空粒子を滴下して蛍光顕微鏡で観察した。その結果、中空粒子の観察に足る十分な蛍光量が確保できないことが明らかとなった。その結果、発現量が上昇した遺伝子数は49,下降した遺伝子数は66であった。中でも特に高い変動値を示した遺伝子は,ケモカイン,ケモカインレセプター,そしてイオンチャネルに関わるグループに大別された。最も高い変動値を示したKCNJ4はカリウムイオンチャネルの調節に関わる遺伝子であり,カリウムの恒常性を保つ働きがあるイオンチャネルである。ポリオウイルス1型感染後のKCNJ4の発現解析を行ったところ、感染後6時間以内において発現量が顕著に上昇し、濃度の低い条件においても極めて高い変動値を示したことから、この遺伝子が低濃度のウイルス感染に対して敏感に反応することが示唆された。以上の結果は、KCNJ4がウイルスの細胞感染を検出する遺伝子マーカーとして活用可能であることを示している。培養不可能なノロウイルスの代替試験ウイルス粒子として,バキュロウイルス-昆虫細胞発現系により蛍光タンパク質付加ノロウイルス様中空粒子の新規合成を行った。はじめに,ノロウイルスGII/4の翻訳領域ORF3の5'末端に緑色蛍光タンパク質遺伝子(GFP)を付加した遺伝子を作成し,翻訳領域ORF2と共に昆虫細胞sf-9またはHigh Fiveに感染させることでウイルス様粒子を合成した。その後,遠心分離により昆虫細胞を除去し,26,000×g,4°Cでの超遠心分離により残存するバキュロウイルスを除去した。次に,スクロースクッション法による濃縮を行ったあと塩化セシウム密度勾配遠心法(0.37 g CsCl2/cm3,220,000×g, 40 hour, 4 °C)により精製した。さらに,ノロウイルス抗体をリガンドとしたアフィニティクロマトグラフィを行うことでウイルス様中空粒子外部にある緑色蛍光タンパク質を除去した。精製後のウイルス様粒子に対し透過型電子顕微鏡での観察および蛍光強度の測定を行った。

昆虫細胞High Fiveを使用し,モルモット抗体を用いたアフィニティクロマトグラフィを行った試料の顕微鏡観察においてノロウイルス様中空粒子が観察された。またこの試料からは弱いながらも緑色蛍光も観測できたことから,緑色蛍光タンパク質が付加したノロウイルス様中空粒子の合成に成功したことが確認された。一方昆虫細胞sf-9を使用した系では,本来のウイルス様中空粒子より小さいT=1粒子が多く観察されたことから,ノロウイルス様中空粒子の合成には適していないことが明らかとなった。初年度の目標である緑色蛍光タンパク質付加ノロウイルス様中空粒子の合成に成功しており,順調に進展しているといえる。研究初年度に準備した緑色蛍光タンパク質付加ノロウイルス様中空粒子を用いて,ノロウイルス培養細胞の探索を行う。まず回転培養器から分化細胞を取り出し,24穴プレート内に接種する.24穴プレート内で分化誘導ホルモン物質を添加されて培養した細胞は,そのまま24穴プレート内でGFP-NoVLP添加実験に使用する.GFP-NoVLPを投入し,37 ̊C,5%CO2条件下で静置培養を行う.GFP-NoVLP接種後12時間,2時間ごとに蛍光顕微鏡で細胞を観察し,GFP-NoVLPの挙動を観察する.本研究で用いる3種類の細胞すべての関して同様の研究を行い,ノロウイルス感受性細胞及び培養条件の検索を行う.平成23年度に使用予定であった研究費に残額が生じたが,当初の想定より物品購入にかかる費用および実験補助のための謝金が安く抑えられたためであり,共に平成24年度の研究を加速させるために使用する。
運動学習に伴うラット脳マクロ構造変化の生物学的基盤の解明

様々な技能や知識を新しく学習、獲得することは脳の重要な役割の一つであり、そのため脳には、技能や知識を獲得すべく変化する働き、すなわち「神経可塑性」が備わっている。そして、学習に伴い、組織学的手法による細胞レベルでの変化やMRIによる脳構造変化が生じることが明らかにされているが、脳マクロ構造と細胞レベルでの変化を同時に評価した報告はほとんどなく、脳マクロ構造変化の生物学的基盤は不明である。本研究では、ラットを対象に、オペラントレバー引き運動課題を学習させ、MRIを用いることで学習により可塑的変化が生じている領域を明らかにし、それら領域において組織学手法を用いることで、脳構造変化の生物学的背景を明らかにする。本研究ではまず、げっ歯類用オペラントレバー引き学習パラダイムを用いて、音刺激とレバー引きの連合学習によりどの領域に体積変化が生じるかを特定した。20匹の雄性ロングエバンスラットを対象に実験を行った。Kimuraらが開発したげっ歯類用オペラントレバー引き学習装置を用いて、音刺激とレバー引きの連合学習を3日間訓練した(3hours/day)。その日の最大の音刺激に対するレバー引き率(Maximum correct response rate: MCRR)を学習の程度を示す指標とした。また3日間の学習前後のMRIを撮像し、テンプレートへの標準化等の前処理を行った後、学習に伴い脳体積変化が生じている部位を特定した。3日間の訓練により、すべてのラットは最大OCRRが85%以上を示しており音刺激に対するレバー引き運動学習が成立したと考えられる。また3日間の学習により小脳において有意な体積変化が確認された。当該領域での、学習に伴い変化する細胞を特定するため、蛍光染色による定量評価を行うための基盤整備を行った。今後コントロール群と学習群においてどのような違いがあるかを検討する必要がある。そして、技能や知識の獲得により小動物の脳においてシナプス形成、軸索発芽、髄鞘高密度化等細胞レベルで変化を生じることが組織学的手法により明らかになってきた。一方、近年のMRイメージング技術の進歩により、人の脳において灰白質の容積・白質の繊維方向などマクロレベルで脳構造に変化が生じるということが、我々の研究も含め報告されている。このように学習に伴う、組織学的手法による細胞レベルでの変化、およびMRIによる脳構造変化が、小動物や人の脳を対象にした研究で報告されているが、脳マクロ構造と細胞レベルでの変化を同時に評価した報告はほとんどない。そこで本年度はまずIsomuraらが開発したげっ歯類の学習パラダイムを用いて、運動学習に随伴する脳灰白質変化を調べることを目的とした。学習群17匹において、オペラント反応正解率は、9.7%(学習1日目)、54%(学習2日目)、85%(学習3日目)と増加した。また内7匹でMRIによる学習前後の脳体積変化を調べたところ、統計的な有意差は認められなかったものの、視床、小脳の灰白質において学習後に体積が増加傾向にあった。統計的に意味のある領域を調べるため、更にMRI実験を続けていくと同時に、今後の組織学的手法による細胞レベルでの評価の対象領域を絞り細胞変化と脳構造変化の関連を調査する。本年度の主目的であるラット学習率評価および灰白質・白質体積評価を行う実験系を確立した。また学習に伴うオペラント反応正解率の経時変化および学習前後の灰白質、白質体積変化を明らかにした。来年度は、統計的に必要な匹数までMRI実験を行うとともに組織学的手法による細胞評価に取り組む予定である。以上、本研究はおおむね順調に進展している。様々な知識を新しく学習、獲得することは脳の主要な役割であり、そのために脳には神経可塑性が備わっている。そして、技能や知識の獲得により小動物の脳においてシナプス形成や軸索発芽等細胞レベルで変化を生じることが組織学的な手法により明らかになってきた。一方、MRイメージング技術の進歩によりヒトの脳において、学習に随伴し灰白質の容積が増加するというマクロレベルな変化も生じることが報告されている。本研究では、このマクロな脳構造変化とミクロな細胞変化の連関について調査することを目的とした。40匹のラットを対象とし、20匹のラットは学習群として3日間オペラント条件下でレバー引きを学習をさせた。また学習前後のMRIT2強調画像を撮像した。残り20匹においては、学習させず学習群と同時期にMRIを撮像した。学習群において、学習成績は、53±39%(1日目)、74±34%(2日目)98±5.6%(3日目)と増加した。またラットの学習前後のMRIデータより小脳における灰白質体積の増加が確認され(P<0.001)、小脳においてなんらかの細胞変化が起こっていると予想された。MRIの撤去ならびに研究代表者の異動により、実験、解析の遂行に遅れが出ている。様々な知識を新しく学習、獲得することは基本的な脳の役割であり、そのために脳には神経可塑性が備わっている。そして技能や知識の獲得により小動物の脳においてシナプス形成や軸索発芽等細胞レベルで変化がが生じることが組織学的研究により明らかになっている。一方、MRI、PET等のイメージング技術の進歩によりヒトの脳において学習に随伴し灰白質の容積が増加する等のマクロレベルでの変化も報告されている。

本研究では、このマクロレベルな変化とミクロな変化の連関について調査することを目的とした。40匹のラットを対象とし、20匹のラットは学習群とし3日間の巧緻レバー引き運動を学習させた。残り20匹は学習をさせずコントロール群とした。両群においてMRI、PETの撮像を行い(PETに関しては両群、10匹)学習による変化部位を特定した。学習成績(音刺激に対するレバー引き運動率)は、53±39%(学習1日目)から98±5.6%(学習3日目)と増加した。MRIによるマクロレベルの変化として小脳における灰白質体積の増加が見られた。PETによる変化として、小脳、側坐核、一次運動野、視床、前辺縁皮質のグルコース代謝量の変化が見られた。これら領域においてなんらかの細胞レベルの変化が起きていると予想された。また学習群ラットの側坐核に、可逆性神経阻害剤であるムシモールを投与したところ、巧緻運動を行わなくなったことから、巧緻運動において側坐核からの信号が運動を行うきっかけとなることが示唆された。MRIの撤去ならびに研究代表者の異動により実験、解析の遂行に遅れが出ている。様々な技能や知識を新しく学習、獲得することは脳の重要な役割の一つであり、そのため脳には、技能や知識を獲得すべく変化する働き、すなわち「神経可塑性」が備わっている。そして、学習に伴い、組織学的手法による細胞レベルでの変化やMRIによる脳構造変化が生じることが明らかにされているが、脳マクロ構造と細胞レベルでの変化を同時に評価した報告はほとんどなく、脳マクロ構造変化の生物学的基盤は不明である。本研究では、ラットを対象に、オペラントレバー引き運動課題を学習させ、MRIを用いることで学習により可塑的変化が生じている領域を明らかにし、それら領域において組織学手法を用いることで、脳構造変化の生物学的背景を明らかにする。本研究ではまず、げっ歯類用オペラントレバー引き学習パラダイムを用いて、音刺激とレバー引きの連合学習によりどの領域に体積変化が生じるかを特定した。20匹の雄性ロングエバンスラットを対象に実験を行った。Kimuraらが開発したげっ歯類用オペラントレバー引き学習装置を用いて、音刺激とレバー引きの連合学習を3日間訓練した(3hours/day)。その日の最大の音刺激に対するレバー引き率(Maximum correct response rate: MCRR)を学習の程度を示す指標とした。また3日間の学習前後のMRIを撮像し、テンプレートへの標準化等の前処理を行った後、学習に伴い脳体積変化が生じている部位を特定した。3日間の訓練により、すべてのラットは最大OCRRが85%以上を示しており音刺激に対するレバー引き運動学習が成立したと考えられる。また3日間の学習により小脳において有意な体積変化が確認された。当該領域での、学習に伴い変化する細胞を特定するため、蛍光染色による定量評価を行うための基盤整備を行った。今後コントロール群と学習群においてどのような違いがあるかを検討する必要がある。使用実績のある既存のツールを活用することによって、研究を推進する。具体的には、SPMソフトウェアにより学習前後での灰白質、白質体積変化を統計的に明らかにする。
動物細胞における複数人工遺伝子回路の組み合わせのシステム理論の確立と実践

本研究では、動物細胞における複数人工遺伝子回路の組み合わせの手法を用いて、数理モデルに基づいた細胞種の多様化比率が制御可能な人工遺伝子回路を作製することを第一の目標とした。この実現のため、CRISPR-dCas9から構成される人工転写調節系を用いた遺伝子回路の設計と、これに必要な部品の作製を行った。先行研究や我々の研究成果から、CRISPR-dCas9から構成される人工転写調節系を用いた人工遺伝子回路は超高感度性を有することがわかった。人工遺伝子回路の超高感度性とは、入力の変化に対する出力の変化が増幅されるような応答のことである。超高感度性は、遺伝子回路同士の連結や複雑な回路を組み立てる際に重要になってくる性質である。本来、CRISPR-dCas9などの人工転写調節系は、超高感度性に必要な協同性が高くないという問題があるが、分子滴定という考え方を用いることで、超高感度性を持たせることができることがわかった。分子滴定反応では、転写因子とDNA、転写因子と結合する阻害因子が用いられる。本研究では、遺伝子回路に分子滴定反応を実装するため、anti-CRISPRタンパク質を阻害因子として用いた。代表的なanti-CRISPRタンパク質であるAcrIIAは、CRISPR-dCas9系の転写因子であるdCas9-gRNAに強く結合し、DNAへの結合能を失わせる。本研究では、実験的にAcrIIAがdCas9-gRNAのDNAへの結合を阻害することを確認した。ただし、AcrIIAに温度依存性があるという問題がわかった。また、阻害効果を得るために、dCas9-gRNAに対して、多量のAcrIIAが必要であるという点も、超高感度性の実現を難しくしていることがわかった。これらの結果から、超高感度性を利用した人工遺伝子回路を実装するためには、AcrIIAの特性を改変する必要があることが示唆された。本研究では、相互抑制系など、パラメタに微小な差異を持った種々の人工遺伝子回路を数理モデルに基づいて動物細胞内に組み合わせるためのシステム論を確立する。合成生物学では、生物実験結果とモデルの差異に基づいて、次サイクルの生物実験のためのDNA配列を設計し、モデルを改良するというアプローチが取られている。こうしたアプローチを用いて大腸菌を始めとした微生物ではすでに多くの成果が得られており方法論もある程度確立されているが、動物細胞では実験系の複雑さからまだ難しいというのが現状である。そこで、本研究では、この方法論を動物細胞へと拡張する。その結果として、動物細胞を活用する合成生物学でこれまで不可能であった、細胞の多様化比率における数理モデルと実際の細胞の挙動との対応の精緻化を達成する。平成27年度は、相互抑制ネットワークを持つ人工遺伝子回路および大量発現回路を組み合わせて動物細胞の人工染色体に組み込み、細胞の多様化を達成させるための基本的な人工遺伝子回路を作成する予定であったが、先行研究で作製された相互抑制ネットワークを持つ人工遺伝子回路に不備が見つかったため、この回路の設計変更を行うことにした。我々の細胞実験と解析により、使用されている人工転写抑制因子の協同性が低いために、この人工遺伝子回路が設計通りの双安定性を示さないことがわかった。この結果から、転写抑制因子の協同性を高めることで双安定性が生じることが示唆されたため、転写抑制因子が結合するプロモータ配列の数を増加させるという設計変更を行った。先行研究で作製された相互抑制ネットワークを持つ人工遺伝子回路において、転写抑制因子の協同性が低いことにより設計通りの双安定性を持たないことがわかり、回路の設計を変更する必要が生じたため。平成28年度は、相互抑制ネットワークを持つ人工遺伝子回路にロバストな双安定性を持たせるため、転写抑制因子の協同性を高めるという設計変更を行う計画であった。先行研究で作製された相互抑制ネットワークを持つ人工遺伝子回路は、TALエフェクターを用いた人工転写抑制因子の組み合わせによる構造をもっている。この転写抑制因子の協同性を高めるために転写抑制因子が結合するDNA配列の数を増加させるという設計変更をしたが、実装が困難であることが予想された。そこで、TALエフェクターと同様に人工転写因子として用いられるCRIPSR-dCas9などを用いた人工遺伝子回路の設計変更を行った。また細胞実験と並行して、幹細胞の分化の事例を参考に数理モデルの改良も行った。相互抑制ネットワークを持つ人工遺伝子回路にロバストな双安定性を実現させるために、さらなる設計変更が必要になったため。

こうしたアプローチを用いて大腸菌を始めとした微生物ではすでに多くの成果が得られており方法論もある程度確立されているが、動物細胞では実験系の複雑さからまだ難しいというのが現状である。そこで、本研究では、この方法論を動物細胞へと拡張する。その結果として、動物細胞を活用する合成生物学でこれまで不可能であった、細胞の多様化比率における数理モデルと実際の細胞の挙動との対応の精緻化を達成する。平成29年度は、これまで使用していたTALエフェクターではなく、dCas9から構成される人工転写調節タンパク質を用いるための設計変更を行った。ロバストな双安定性を持つ相互抑制ネットワークを人工遺伝子回路によって作製するためには、協同性の高い転写タンパク質を用いることがこれまでの一般的な考えであった。これは転写タンパク質の協同性によって入力に対する出力応答の非線形性を高めるためであるが、分子滴定という考え方を用いることで協同性が高くない人工転写タンパク質でも、高い非線形性を持たせることができることがわかった。そこで、dCas9から構成される人工転写調節タンパク質を用いて、分子滴定により非線形性を持つ人工遺伝子回路の設計を行った。dCas9から構成される人工転写調節タンパク質を用いることで、双安定性を持つ相互抑制ネットワークに必要となる非線形な応答が起きることを数理的には示すことができたが、人工遺伝子回路の実装には至らなかったため。本研究では、動物細胞における複数人工遺伝子回路の組み合わせの手法を用いて、数理モデルに基づいた細胞種の多様化比率が制御可能な人工遺伝子回路を作製することを第一の目標とした。この実現のため、CRISPR-dCas9から構成される人工転写調節系を用いた遺伝子回路の設計と、これに必要な部品の作製を行った。先行研究や我々の研究成果から、CRISPR-dCas9から構成される人工転写調節系を用いた人工遺伝子回路は超高感度性を有することがわかった。人工遺伝子回路の超高感度性とは、入力の変化に対する出力の変化が増幅されるような応答のことである。超高感度性は、遺伝子回路同士の連結や複雑な回路を組み立てる際に重要になってくる性質である。本来、CRISPR-dCas9などの人工転写調節系は、超高感度性に必要な協同性が高くないという問題があるが、分子滴定という考え方を用いることで、超高感度性を持たせることができることがわかった。分子滴定反応では、転写因子とDNA、転写因子と結合する阻害因子が用いられる。本研究では、遺伝子回路に分子滴定反応を実装するため、anti-CRISPRタンパク質を阻害因子として用いた。代表的なanti-CRISPRタンパク質であるAcrIIAは、CRISPR-dCas9系の転写因子であるdCas9-gRNAに強く結合し、DNAへの結合能を失わせる。本研究では、実験的にAcrIIAがdCas9-gRNAのDNAへの結合を阻害することを確認した。ただし、AcrIIAに温度依存性があるという問題がわかった。
腫瘍の免疫逃避機構の解明と癌免疫療法への応用

癌免疫療法を確立するためには、癌の免疫逃避機構を克服することが重要な課題である。がん患者の癌病巣近くには、制御性Tリンパ球が集積しCTLの誘導を抑制していた。癌細胞のHLA class I欠失も免疫逃避の一つであるが、欠失したHLAの再構築によりCTLが誘導可能となり、CTLが認識する腫瘍抗原を同定した。免疫抑制状態にある全ての担癌患者から癌特異的CTLを誘導することは困難であり、これを克服するため腫瘍抗原特異的CTL cloneからT細胞受容体遺伝子を単離し、増殖させたγδT細胞に遺伝子移入することにより、in vitroおよびin vivoで腫瘍特異的な抗腫瘍効果を有するエフェクターを作成しえた。これまでに肺癌細胞株を樹立し、リンパ球と混合培養することにより自己肺癌特異的CTLを誘導・解析してきた。しかし、全ての症例においてCTLの誘導が可能ではなく、CTL活性化に免疫学的な抑制機構が考えられている。腫瘍細胞のHLA発現異常や制御性Tリンパ球の免疫応答抑制が、腫瘍の逃避機構の重要なメカニズムと考えられる。腫瘍細胞のHLA発現異常に関しては、β2ミクログロブリン遺伝子異常のためにHLAを発現欠失した肺癌C831Lに、正常なβ2ミクログロブリン遺伝子の移入によりHLAの発現を回復させることができた。さらに、HLA発現を回復させた肺癌細胞株C831Lを用いて、自己リンパ球よりCTLクローンを樹立し、現在cDNA発現クローング法により、腫瘍抗原遺伝子の同定を行っている。また、2003年から2004年に当科で手術した肺癌患者84例における所属リンパ節リンパ球および末梢血リンパ球のCD4+CD25+Foxp3+細胞(制御性Tリンパ球)の発現を細胞内FACSにて解析したところ、肺癌患者における制御性Tリンパ球は、末梢血リンパ球では2.8%であったのに対し、所属リンパ節リンパ球では4.4%と有意に高い頻度で認め、腫瘍浸潤リンパ球では10.4%とさらに高い頻度で存在していた。以上のように制御性Tリンパ球は所属リンパ節リンパ球や腫瘍浸潤リンパ球に多く存在し、腫瘍近傍におけるCTL誘導を抑制することで、抗腫瘍免疫の抑制に関与していることが考えられた。腫瘍のHLA発現の回復および制御性Tリンパ球の除去は、CTLの誘導効率を上げることが示され、これらのことは今後の免疫療法の確立にとって、重要な知見と考えられる。癌の免疫逃避の解明は、癌免疫療法の構築に重要な課題であり、H21年度の研究計画1)-3)に対して以下の結果を得た。1)HLA発現異常を有する肺癌細胞を認識するCTLの解析2)腫瘍の増殖や進展に関わる新たな腫瘍抗原の同定肺多形癌の原発巣(G603L)と転移巣(G603L-AD)から樹立した腫瘍細胞株に対し、反応性の違うCTL cloneの認識機構の解析を進めるために、細胞数に限りのあるCTL cloneからTCR遺伝子(Va34,Vb5.1)をクローニングし、PMXレトロウイルスベクターに組み込んだ。G603LよりcDNA libraryを作成し、cDNA発現クローニング法によるスクリーニングを準備している。3)同定した抗原の治療応用に向けた検討免疫抑制状態にある全ての担癌患者から自己癌特異的CTLを誘導・大量培養することは困難であり、これを克服するために新たな抗腫瘍エフェクター細胞の作成を行った。腫瘍抗原特異的CTL cloneからT細胞受容体遺伝子を単離し、増殖させたγδT細胞に遺伝子移入することにより、in vitroおよびin vivoでの抗原特異的な抗腫瘍効果が得られた。
ヘルスケア関連ビッグデータ解析による口腔保健・歯科医療の健康増進効果の検証

本研究では、保健・医療の様々なヘルスケア関連ビッグデータを活用した研究を行う。協会けんぽ加入事業所の従業員を対象に、口腔保健教育により歯科受診勧奨を行う介入を行い、口腔健康状態の維持や改善による全身の健康状態さらには医療費への影響について検証する。また、後期高齢者の歯科・医科の健診データおよび医療費のビッグデータを解析することにより、高齢期まで健康な口腔を維持することによる全身の健康増進効果を検証する。さらに、全国規模の歯科患者調査により得られたビッグデータの分析を行い、歯科医療が口腔および全身の健康増進に果たす効果を検証する。