hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
ガングリオシドの構造と免疫源性の系統的再検討

ガングリオシド抗原が細胞膜上でどのように認識されるかを特異的な認識方法としてもっとも基礎的な抗原と抗体との反応性を解析した。抗体として今回作製したウシ白血病腫瘍細胞由来ガングリオシドGD3を抗原とした、ガングリオシドGD3を特異的に認識するモノクロ-ナル抗体と、Nアセチル型のGM3と反応することが報告されているM2590抗体を対象とした。特異性は、種々の糖脂質を組み込んだリポソ-ムによるliposome immunelysis assayをもちいた。GD3に対するここで作製したいずれの抗体もGD3(NeuAcーNeuac)およびGD3(NeuAcーNeuGc)と反応し、GD3(NeuGcーNeuAc)ならびにGD3(NeuGcーNeuGc)とは反応しなかった。またシアル酸間の結合がα2ー9の合成GD3ともまったく反応しなかった。これらの結果から、得られたモノクロ-ナル抗体は、GD3分子と特異的に反応し、ガングリオシドGD3のNeuAcα2ー8Siaα2ー3Galβ1ー4G1cーのエピト-プを認識しているものと思われる。シアル酸間の結合も厳密に区別されている。GM3と反応するM2590については、疎水性の残基を変更した類縁体をもちいて疎水性基の構造と抗原性の関連を調べた。その結果(1)疎水性のが鎖1本のものは反応しない(2)疎水性の鎖が2本のものは反応する。また必ずしもスフィンゴシン構造をとらなくてもよい。(3)ヒドロキシ脂肪酸をもつものはエピト-プ濃度が低くてもよく反応する。(4)脂肪酸鎖はC14>C18>C24の順に反応が弱くなる。これらの結果はリポソ-ムの脂質二重層において、モノクロ-ナル抗体との抗原エピト-プの形成にGM3分子の疎水性残基の構造が強く影響を与えることを示唆している。
近現代モンゴルにおける遊牧の変容

私はモンゴル人たちの遊牧とその変化を研究した。彼らの遊牧は、モンゴル国では今も維持されているが、内モンゴルでは20世紀中頃までに大半が定着牧畜と農牧に変わった。だがこの状態は、1980年代以後に市場経済になった後、大きく変化した。すなわち内モンゴルでは牧畜が畜産に転換させられ、モンゴル国では畜産の要素をもつ集約化牧畜が試みられ始めている。私はこれらのことを指摘し、またその変化がもつ歴史的意味についても考察した。今年度はモンゴル国の牧畜書、民族学・考古学に関する文献・資料を検討するとともに、夏季にモンゴル国に出かけて同国の遊牧状況の観察を行うとともに、遊牧の変容との関連で考察する必要のある同国におけるモンゴル人の行なった農耕に関する資料をウランバートルの歴史民族博物館及び考古博物館、オヴス県オラーンゴム及びボルガン県ハルポハの博物館において調査し、関連資料を博物館の許可を得て撮影した。また同国関係の地方誌や遊牧関係・農耕関係の文献や手稿本を、現物またはコピーによってかなり収集した。内モンゴルに関しては、満鉄産業部の科爾沁左翼中旗に対する1937年頃の調査報告のうち第一区、第五区、第六区の部分を整理・分析し、その上でそれらの地区に該当する中国内モンゴル東部に位置する同旗の最東部及び北部の該当する地域に出かけて、その中にあるいくつかの集落を訪れ、現状を観察し聞き取り調査を行った。また同旗の主都である保康及び同旗が所属する通遼市にある大学図書館等において関連資料を収集し複写した。モンゴル国と内モンゴルでの調査には、研究協力者である永井匠を同行し、両国の研究者等の協力も得た。また日本国内にある関連統計資料も追加収集をした。以上の調査等によって収集した資料も使って、目下定着牧畜の半農半牧と純農耕への転換過程の双方について分析を行っているところであるが、この二つの問題は密接に絡まっているために、どちらかを優先させることは困難であると、現在考えている。今年度は、社会主義体制のもとで改変される前の主にモンゴル国の遊牧と農業に関する文献・資料を検討した。特にモンゴル国の各地の民族(主要構成民族のハルハ=モンゴル族と東部・西部に多いモンゴル系トルコ系の諸少数民族)ごとの遊牧と農業の違いを調べるために、19世紀末20世紀初の時期の、換言すれば社会主義体制確立以前の時代の、モンゴル国の遊牧や農業について民族別に記されている『モンゴル国民族学1-3』(本書はモンゴル人民共和国時代に同国の研究者が実地調査による資料や文献を参照してまとめられた)の関連箇所を読み検討した。これらは難解であるから、モンゴル人の協力も得て詳細に検討した。12月にはモンゴル国で同国科学アカデミー歴史研究所蔵の現地調査の報告書(未刊行報告書)の一部を複写し、また同国の遊牧・農業に関する手稿本・刊行文献を入手し、農業に関する若干の聞き取りを行った。なお内モンゴル自治区主都のフフホトでも若干の聞き取りを行った。現代モンゴル国の遊牧については、主として20世紀前半以来の統計集を集めて精査し、それらの統計集の問題点に留意しつつ分析して、社会主義的統制がゆるんで牧民が生産意欲を高めて家畜が急増した第二次大戦直前の一時期の家畜頭数が、同国の草原の家畜牧養力の上限に案外近かったこと、1990年代の体制変革後家畜が急増した状態は、モンゴル国の草原の家畜牧養力を越えるために遊牧環境に大きな打撃を与えるおそれがあることを述べ、またモンゴル国における遊牧の大きな問題は、それが肥大化したウランバートルなどの都市の住民に乳製品を供給することが困難であることなどにあることを指摘した論考を発表した。09年8月1日10日に、内モンゴルの赤峰市に出かけてヘシクテン旗では最近のウマ飼育の問題および1995年に調査した牧民3家族の現状を聞き取りし、アルホルチン旗ではこれまで繰り返し調査してきたバヤンウンドル=ソムの牧民の現状および彼らのかつての遊牧について聞き取りした。博物館で関連資料も調査した。また9月8日13日にモンゴル国ウランバートルに出かけ、『モンゴル人民共和国の民族学(モンゴル文)』13(19世紀末20世紀初めのモンゴル国の民族学)の各巻における牧畜の項の意味のはっきりしない箇所やわからない箇所を牧民にたずね、かつウランバートル近郊で現代的な集約型牧畜を営む牧民を訪れ調査をした。歴史民族博物館で牧畜・農耕関係展示物の再調査も行い、科学アカデミー歴史研究所蔵の諸民族の民族学関係実態調査報告書を調査・収集した。以上の調査において注目すべき点を一つ挙げると、ヘシクテン旗で旗の指導者がウマ飼養の必要性を否定する見解を示し、牧民との軋轢が生じていることを知ったことである。近年オートバイ等の車の普及によって乗用や荷物運搬への大型家畜の利用価値が低下して来ているが、内モンゴルではそれに加えて牧民家族への牧地の分配の結果

各牧民家族が牧地を柵で囲い、その結果として足の速いウマやラクダの放牧が困難となって来ているが、騎馬遊牧民であることを誇りとしていたモンゴル民族の間に、ついにウマ飼養を否定する見解が打ち出され事態が生じるに至ったことは、内モンゴルの牧畜の将来を考える上で示唆的であると考えられる。以上のほか、モンゴル国と内モンゴルの両地域のモンゴル族の遊牧経済について、現地調査から得た資料と文献を分析し、かつての遊牧経済の状態から社会主義時代の協同組合方式による牧畜経済を経て最近の状態に至るまでの変化の流れを考察して発表した。
インドール酢酸(IAA)複合体の生合成・分解を化学的にノッアウトする

本研究は、オーキシン(インドール酢酸、IAA)のホメオスタシスに重要な役割を果たしていると思われる、インドール酢酸-アミノ酸複合体(IAA-aa)の合成酵素および加水分解酵素の特異的阻害剤を設計・合成し、遺伝子ノックアウトの代わりに、阻害剤によって化学的に酵素活性をノックアウトするような化合物を開発することを目的としたものである。オーキシン早期誘導遺伝子のGH3ファミリーの一群が、IAA-aa合成酵素ではないかとの予測をふまえ、その推定反応機構にもとづき、IAAのアデニル化中間体のアナログとして、IAAのスルファモイルアデノシン誘導体(IAA-SA)を合成した。さらに、天然および人工オーキシンであるフェニル酢酸、ナフタレン-1-酢酸、2,4-DそれぞれのSA誘導体(PA-SA,NAA-SA,2,4-D-SA)を合成した。得られた化合物は、大腸菌で発現させたGH3-5およびGH3-6に対する阻害活性を測定した。その結果、いずれの化合物も、GH3-5およびGH3-6を両方とも阻害する強い活性を示し、特に、PA-SAはIC_<50>値にして3μM以下の強い阻害活性を示した。これら一連のSA誘導体を培地に溶かし、シロイヌナズナの幼植物体を培養したところ、2,4-D-SAが1μMの低濃度で、根の著しい形態変化を引き起こすことがわかった。これは、IAA過剰時に見られる異常発根(adventitious rooting)に酷似しており、化合物が植物体に取り込まれ、GH-3を阻害することによってオーキシンのホメオスタシスに影響を与えている可能性が強く示唆された。一方、IAA-aa加水分解酵素についての知見はきわめて乏しいが、IAA-aa添加によってIAA過剰症が出ない変異体の解析から、IAR3,ILR1,ILL2などの遺伝子が見いだされ、それが金属プロテアーゼの一種であるとの知見をもとに、アミノ酸部分の構造の異なるIAAホスフィン酸誘導体5種類を合成した。ホスフィン酸誘導体は、濃度依存的にILR1を阻害することが判明し、合成した化合物が、少なくとも、IAA-aa加水分解酵素の障害剤として機能することが確かめられた。以上のように、酵素の推定反応機構を唯一の手がかりに、反応機構依存的に設計したオーキシンのSA誘導体および、IAAホスフィン酸誘導体が、予想通り、IAA-aa合成酵素および加水分解酵素の阻害剤として機能し、特に、SA誘導体はin vivoでも活性を示す、化学ノックアウト剤として有望な化合物であることがわかった。
電極材料の緩和解析

リチウム挿入あるいは脱離後の開回路状態において、経時的に電極材料の解析を行うことにより、速度論的過程から熱力学的平衡に至る材料の状態変化を明らかにすることができることを、申請者は世界に先駆け発見し、この解析を「緩和解析」と名付けた。緩和解析は電極材料の動的状態変化を明らかにすることができる画期的手法であり、電極材料の研究に重要な知見を与える。緩和解析を多くの電極材料に適用した結果、電極材料は、リチウムの拡散に関し、ダイナミックにその状態を変化させていることが明らかになった。電極材料において、リチウム挿入あるいは脱離後の開回路状態において、経時的に材料の解析を行うことにより、速度論的過程から熱力学的平衡に至る材料の状態変化を明らかにすることができることを、申請者は世界に先駆け発見し、この解析を「緩和解析」と名付けた。緩和解析は電極材料の動的状態変化を明らかにすることができる画期的手法であり、電極材料の研究に重要な知見を与えるものと考えられる。緩和解析を多くの電極材料に適用した。γ-Fe2O3では、速度論的にはリチウムは8aサイトを優先し、平衡論的に安定なサイトは16cであることが明らかになった。第1原理計算を用いたシミュレーションでもこれを支持し、J-PARCで中性子回折を測定し、リチウムのサイト占有率についても解析した。LiFePO4において、リチウム挿入停止後に、LiFePO4相のモル分率が減少した。リチウム挿入時には、リチウムの拡散を促進するために、欠陥を持つLiFePO4が多く生成するが、挿入停止後にそれが欠陥のないLiFePO4とFePO4に変化するためと考えられる。LiMn2O4やLiCoO2では、リチウム挿入後の緩和時間にLi-rich相の割合は増加し、Li-lean相の割合は減少した。リチウム挿入時には拡散に有利なLi-lean相の構造が優先的に保持され、挿入後の緩和において熱力学的に安定なLi-rich相が増加したと考えられる。LiNiO2ではLi-richとLi-lean相の2相が共存し,高Li領域では欠損の多いLi-lean相が拡散に有利で充放電中に多く生成し、低Li領域では格子の大きなLi-rich相が拡散に有利であることを見いだした。グラファイトでは充電時には欠損を含むステージ1が多く形成し、緩和過程で欠損の少ないステージ1とステージ2に分離することがわかった。γ-Fe2O3において、速度論的にはリチウムは8aサイト(酸素4配位)を優先し、平衡論的に安定なサイトは16c(酸素6配位)であることが明らかになった。第1原理計算を用いたシミュレーションにより、8aサイトの方が16cサイトよりも安定であることが示された。J-PARCにおいて中性子回折を測定し、リチウムのサイト占有率について解析した。LiMn2O4において、リチウム挿入後の緩和時間にLi-rich相の割合は増加し、Li-lean相の割合は減少した。リチウム挿入時にリチウムを含みながらも拡散に有利なLi-lean相の構造が優先的に保持され、これがリチウム挿入後の緩和時間に伴って熱力学的に安定なLi-rich相が増加したと考えられる。LiCoO2において、Li脱離停止後に、Li-lean相が減少した。Liの拡散を促進するため、Liを含みながらもLi-lean相の構造が優先的に保持され、Li脱離停止後、この相がLi-rich相と過剰のLiを含まないLi-lean相に分かれたと考えられる。本課題は、平成24年度、25年度の2ヶ年にわたるものである。

平成24年度において、1種々の酸化物系リチウムイオン2次電池電極材料について充放電(リチウム挿入脱離)を行うこと、2充放電停止後、直ちに回路を遮断し、開回路にしたときに起こる局部電池反応を避けるため、速やかにセルを解体して電極材を取り出し、Ar雰囲気下でX線回折測定を行うこと、3種々の緩和時間における精密なX線回折パターンを得、リートベルト法による結晶構造解析を行こと、4またXAFS測定装置を用いて種々の緩和時間におけるX線吸収スペクトルを測定し、各元素周囲の局所構造解析、原子価分析を行うこと、5更にはJ-PARCでの中性子回折の解析結果を総合し、それぞれの電極材料の緩和過程の挙動を、結晶学的に明らかにすること、6第一原理コンピュータシミュレーションを行い、理論的裏付けを行こと、7以上の結果をもとに、速度論的状態と平衡論的状態の関連について明らかにすること、以上を計画していた。平成24年度においては既に、γ-Fe2O3、LiMn2O4、LiCoO2、LiFePO4、Li4/3Ti5/3O4、LiNi1/3Mn1/3Co1/3O2、α-Fe2O3について、リチウム挿入脱離、X線回折測定、リートベルト解析を行い、緩和過程の挙動を結晶学的に明らかにしている。さらに、速度論的状態と平衡論的状態の関連について考察している。更にγ-Fe2O3については、第一原理コンピュータシミュレーションを行い、リチウム安定サイトを理論的にもとめ、実験との一致を見ている。またJ-PARCでの中性子回折の測定並びにXAFS測定を実施し、解析を行っている。これらの研究結果は、既に、5編の査読つき論文、1編の解説、2回の招待講演を含む21回の講演で発表している。平成24年度において、当初の計画通りに研究を進めることができた。前年度に引き続き、種々の電極材料について、X線リートベルト解析、X線吸収解析を駆使して、緩和解析を行う。中性子回折により、リチウムの挙動を詳しく解析する。電極材料の速度論的状態と平衡論的状態の関連について明らかにする。1.前年度に引き続き、種々のリチウムイオン二次電池電極材料を用いて、リチウム電池セルを組み、充放電を行う。酸化物系電極材料に留まらず、グラファイト等、電極材料の範囲を広げる。2.緩和過程におけるX線回折測定を行い、リートベルト法による結晶構造解析を行う。測定結果を解析し電極材料の緩和過程の挙動を明らかにする。X線回折測定に留まらず、XAFS測定による各元素周囲の局所構造解析・原子価分析、可視・紫外あるいは赤外分光等による解析等、種々の測定を駆使して緩和現象を解析する。3.中性子回折を測定し、緩和過程におけるリチウムの挙動を詳しく解析する。緩和解析に適した粉末中性子回折リートベルト構造解析プログラムを開発する。4.リチウム挿入脱離過程並びに速度、挿入脱離量等を種々変化させて、緩和解析を行い、緩和過程の挙動をより精密に解明する。以上の速度論的状態と平衡論的状態の関連について明らかにする。次年度の研究費の使用計画を下記に示す。試薬、金属メッシュ、ガラス器具等、物品費:600,000円、研究成果報告のための国内外の旅費:700,000円(うち国内旅費200,000円、海外旅費500,000円)研究成果報告のための学会参加費等その他:100,000円
C型肝炎ウイルスによる自然(Innate)免疫応答への干渉メカニズム解析

C型肝炎ウイルス(HCV) NS5Bは,TLR3, TRIF, IRF-3を介してIFNβを活性化した.一方,NS3, NS4A, NS4B, NS5Aがこの誘導を抑制した.その機序として,NS3がTBK1と結合することによりTBK1に結合するIRF3の量が減少し,IRF3活性化およびIFNβプロモーター活性化を抑制することを明らかにした.これらがHCV持続感染成立に寄与している可能性がある.RNAiは生体の抗ウイルスシステムの一つであるが,HCVコアがRNAiを抑制していた.コアはDicerと結合し,その機能を阻害していた.Dicer発現によりHCV増殖は抑制されたが,コア添加により回復した.これらがHCV持続感染成立に寄与している可能性がある.p53ノックダウン細胞では,HCV増殖効率が高かった.p53ノックダウン細胞では,IFNのHCV増殖抑制効果が減弱していた.p53ノックダウン細胞では,ISREの活性化,IFN誘導遺伝子の発現が減弱していた.p53はIRF9と直接結合していた.p53はHCVに対する自然免疫機構において重要な役割を担っていた.HCV増殖に対するIFN誘導遺伝子PKR, MxA, OAS-1の働きを検討した.PKRノックダウン細胞においては,HCV増殖が増加していた.また,PKRノックダウンにもかかわらず,IFNにより抗HCV増殖抑制効果が得られた.PKRは,自然免疫によるHCV増殖抑制に重要だが,IFN治療では必須の分子ではない.MxAノックダウン細胞においては,HCV増殖が増加していた.また,MxAノックダウン細胞では,IFNの抗HCV効果が減弱していた.MxAは,HCV増殖抑制において重要な役割を担っていた.OAS-1をHCV感染増殖細胞に強制発現したところ,HCV増殖は減弱した.OAS-1はHCV増殖抑制に重要な役割を担っていた.C型肝炎ウイルス(HCV) NS5Bは,TLR3, TRIF, IRF-3を介してIFNβを活性化した.一方,NS3, NS4A, NS4B, NS5Aがこの誘導を抑制した.その機序として,NS3がTBK1と結合することによりTBK1に結合するIRF3の量が減少し,IRF3活性化およびIFNβプロモーター活性化を抑制することを明らかにした.これらがHCV持続感染成立に寄与している可能性がある.RNAiは生体の抗ウイルスシステムの一つであるが,HCVコアがRNAiを抑制していた.コアはDicerと結合し,その機能を阻害していた.Dicer発現によりHCV増殖は抑制されたが,コア添加により回復した.これらがHCV持続感染成立に寄与している可能性がある.p53ノックダウン細胞では,HCV増殖効率が高かった.p53ノックダウン細胞では,IFNのHCV増殖抑制効果が減弱していた.p53ノックダウン細胞では,ISREの活性化,IFN誘導遺伝子の発現が減弱していた.p53はIRF9と直接結合していた.p53はHCVに対する自然免疫機構において重要な役割を担っていた.HCV増殖に対するIFN誘導遺伝子PKR, MxA, OAS-1の働きを検討した.PKRノックダウン細胞においては,HCV増殖が増加していた.また,PKRノックダウンにもかかわらず,IFNにより抗HCV増殖抑制効果が得られた.PKRは,自然免疫によるHCV増殖抑制に重要だが,IFN治療では必須の分子ではない.MxAノックダウン細胞においては,HCV増殖が増加していた.また,MxAノックダウン細胞では,IFNの抗HCV効果が減弱していた.MxAは,HCV増殖抑制において重要な役割を担っていた.OAS-1をHCV感染増殖細胞に強制発現したところ,HCV増殖は減弱した.OAS-1はHCV増殖抑制に重要な役割を担っていた.HCVの持続感染のメカニズムを明らかにする目的で、HCV蛋白と自然免疫機構のシグナル分子との相互作用についての検討を加えた。HCVの各蛋白のうちNS3がTLR3刺激で惹起されるIFN-beta promoterの活性化を抑制した。NS3はTBK1と結合した。NS3存在下ではTBK1に結合するIRF3の量が減少しており、これがIRF3の活性化の抑制およびIFN-beta promoterの活性化能の抑制につながることが示唆された。NS3蛋白は内因性IFNの誘導を抑制し、これがHCVの持続感染を可能にするメカニズムの一因であると考えられた。RNA干渉(RNAi)は二本鎖RNAによってその配列特異的にmRNAが分解され,その結果遺伝子の発現が抑制される現象である.RNAiは生体の防疫システムの一つであること明らかになっている.そこで,われわれは,HCVとRNAiとの関連につき検討した.コア蛋白がRNAiを抑制していた。コア蛋白はDicerと結合した.Dicerの発現によりHCV repliconの増殖は抑制されたが,コア蛋白を加えることにより回復した.コア蛋白は生体の抗ウイルスシステムの一つであるRNAiを抑制することにより,HCVの持続感染に寄与している可能性が示唆された.PKRは,インターフェロンに誘導される遺伝子で,ウイルス増殖を抑制する.そこで,C型肝炎ウイルス増殖に対するPKRの働きを検討した,PKRノックダウン細胞とコントロール細胞でのC型肝炎ウイルスレプリコン増殖を比較したところ,PKRノックダウン細胞において,レプリコン増殖がコントロール細胞の約3倍に上がっていた.

また,PKRノックダウン細胞では,インターフェロンの抗レプリコン活性がコントロール細胞に比し減弱していた.PKRは,C型肝炎ウイルス増殖抑制において重要な役割を担うことが示された.次に,全長C型肝炎ウイルス感染増殖システムを確立し,これを用いて癌抑制遺伝子p53のC型肝炎ウイルス感染・増殖に及ぼす影響を検討した.p53をノックダウンしたHuh7では,全長C型肝炎ウイルスゲノムおよびレプリコンともにコントロール細胞に比べて増殖効率が高かった.p53のC型肝炎ウイルス増殖抑制作用はN端のtransactivationドメインを介していた.p53がC型肝炎ウイルスに対する宿主の自然免疫機構において重要な役割を果たしていることが示された.PKR,MxA,OAS-1は,インターフェロンに誘導される遺伝子で,ウイルス増殖を抑制する機能があると考えられている。そこで,C型肝炎ウイルス増殖に対するこれらインターフェロン誘導遺伝子の働きを検討した。まず,PKRノックダウン細胞を樹立し,C型肝炎ウイルス(HCV)増殖につき検討したところ,PKRノックダウン細胞においては,HCV増殖がコントロール細胞に比し増加していた。また,PKRノックダウン細胞では,低濃度インターフェロンの抗HCV効果がコントロール細胞に比し減弱していたが,インターフェロン治療を行っているC型慢性肝炎患者での血中に相当するインターフェロン濃度では,PKRがノックダウンされているにもかかわらず,良好な抗HCV増殖抑制効果が得られた。PKRは,自然免疫におけるC型肝炎ウイルス増殖抑制において重要な役割を担うが,インターフェロン治療において必須の分子ではないことが示された。次に,MxAノックダウン細胞を樹立し,HCV増殖につき検討したところ,MxAノックダウン細胞においては,HCV増殖がコントロール細胞に比し増加していた。また,MxAの強制発現によりHCV増殖は減弱した。さらにMxAノックダウン細胞では,インターフェロンの抗HCV効果がコントロール細胞に比し減弱していた。MxAは,HCV増殖抑制において重要な役割を担うことが明らかになった。次に,OAS-1をHCV感染増殖細胞に強制発現したところ,HCV増殖は減弱した。OAS-1はHCV増殖抑制に置いて重要な役割を担うことが明らかになった。また,アミノ酸置換を引き起こすような一塩基多型を有するOAS-1は,HCV増殖抑制効果が低く,このような患者では病態が進行しやすいことを明らかにした。
Mtus1遺伝子による 心肥大抑制機構の解明とその臨床応用

1.Mtus1バリアントの発現制御解析Mtus1の3つのバリアント(Mtus1A, B, C)は、5 prime側が特異的な配列を持ち、3 prime側は一部配列が共通していることから、バリアントの発現は異なる転写因子により制御されていると考えられた。そこで、心肥大に関与する転写因子として知られているc-Myc, GATA4, TBP, MEF2をアデノウイルスベクターにより、仔ラット心筋細胞に強制発現させた。その結果、c-Mycの強制発現によりMtus1Aの発現増加がみられ、c-MycがMtus1Aの転写因子として働いていることがわかった。しかし、Mtus1B, Mtus1Cの発現に変化は見れなかった。2.ヒト心筋症サンプルを用いたMtus1A蛋白の発現解析予備実験として、我々が既に作成しているMtus1バリアントを特異的に検出する抗体を用い、仔ラット心筋細胞でタンパク発現解析を行った。バリアントをそれぞれアデノウイルスベクターで強制発現させたところ、Mtus1Aはミトコンドリア、Mtus1Bは核膜、Mtus1Cは微小管と、局在が異なることを明らかにした。心肥大モデルマウスを用いた組織学的検討では、心筋においてMtus1Aが増加していることがわかった。我々は、拡張型心筋症患者よりバチスタ手術の際に取り出された心臓から、cDNAを取り出し保管している。このサンプルは、個人情報保護法改訂前に取得され、すでに匿名化され個人を特定できないものである。このサンプルを用いて、RT-PCRにてMtus1Aの発現を調べたところ、正常心と比較し、Mtus1Aは多いもので1.8倍に増加していたが、減少しているサンプルもあった。Mtus1Aの発現解析や機能解析には、臨床背景や心機能の評価を合わせて考えることが重要であることがわかり、ヒトサンプルを用いた実験を行うため、研究計画書を作成している。Mtus1バリアントの発現制御解析では、Mtus1Aの発現はc-Mycが転写因子として働いていることを明らかにした。直接制御していることを明らかにするため、さらなる検討が必要と考えられるが、ターゲットを絞ることができ、進捗はおおむね順調である。ヒト心筋症を用いたMtus1Aの発現解析では、Mtus1バリアントの細胞内局在を明らかにし、心肥大モデルマウスにてMtus1Aが心筋組織において有意に増加していることを明らかにした。この発現は、血管平滑筋、内膜、線維巣では見られず心筋特異的なものであった。また、拡張型心筋症のサンプルを用いた遺伝子発現の解析も行った。これらの予備実験より、ヒトサンプルの解析に繋がる知見が得られた。拡張型心筋症および肥大型心筋症のサンプルを用いた免疫染色や変異解析を行うため、研究計画書を作成中であり、次年度に実施予定であり、進捗はおおむね順調である。ダイレクトシークエンス法にて遺伝子解析を行うため、プライマーの作成を完了した。転写因子の解析では、Mtus1のプロモーター領域のメチル化解析やクロマチン免疫沈降アッセイにより、c-MycがMtus1の転写因子として働くことを明らかにする。ヒトサンプルを用いた解析は、研究計画書を作成後、倫理委員会に申請し、承認された後に開始する。具体的には、心筋生検や剖検が行われた拡張型心筋症患者、肥大型心筋症患者を病理のデータベースより抽出する。その後、患者背景や心機能などに関する臨床情報を取得し、心筋組織でのMtus1A発現との相関を検討する。また、同じ患者から取得した血液サンプルよりDNAを抽出し、今回作成したプライマーを使用し、遺伝子変異解析を行う予定である。

Mtus1バリアントの発現制御解析では、Mtus1Aの発現はc-Mycが転写因子として働いていることを明らかにした。直接制御していることを明らかにするため、さらなる検討が必要と考えられるが、ターゲットを絞ることができ、進捗はおおむね順調である。ヒト心筋症を用いたMtus1Aの発現解析では、Mtus1バリアントの細胞内局在を明らかにし、心肥大モデルマウスにてMtus1Aが心筋組織において有意に増加していることを明らかにした。この発現は、血管平滑筋、内膜、線維巣では見られず心筋特異的なものであった。また、拡張型心筋症のサンプルを用いた遺伝子発現の解析も行った。これらの予備実験より、ヒトサンプルの解析に繋がる知見が得られた。拡張型心筋症および肥大型心筋症のサンプルを用いた免疫染色や変異解析を行うため、研究計画書を作成中であり、次年度に実施予定であり、進捗はおおむね順調である。ダイレクトシークエンス法にて遺伝子解析を行うため、プライマーの作成を完了した。転写因子の解析では、Mtus1のプロモーター領域のメチル化解析やクロマチン免疫沈降アッセイにより、c-MycがMtus1の転写因子として働くことを明らかにする。ヒトサンプルを用いた解析は、研究計画書を作成後、倫理委員会に申請し、承認された後に開始する。具体的には、心筋生検や剖検が行われた拡張型心筋症患者、肥大型心筋症患者を病理のデータベースより抽出する。その後、患者背景や心機能などに関する臨床情報を取得し、心筋組織でのMtus1A発現との相関を検討する。また、同じ患者から取得した血液サンプルよりDNAを抽出し、今回作成したプライマーを使用し、遺伝子変異解析を行う予定である。今年度、転写因子同定のために行う予定であったクロマチン免疫沈降アッセイが施行できなかった。次年度に解析を行うため、残余金額を使用予定である。
歯の移動時における歯根吸収の抑制のための遺伝子導入の検討

実験的歯の移動における,破歯細胞の発現様相ならびに増殖,分化,抑制に関与する因子を詳細に検討した.6週齢の雄性ICRマウスを用い,バルビツレートによる腹腔内麻酔の後,切歯に0.012inchのNickel-Titaniumの矯正用ワイヤーを光重合レジンにて固定し,上顎右側第一臼歯を口蓋側に移動させた.歯の移動開始から,2,6,12時間,1,2,3,5,7,14,28日後に,4%パラホルムアルデヒドで灌流固定し,エチレンジアミン4酢酸で脱灰した.アルコール脱水したものをパラフィン包埋後し,ミクロトームにて5μmの矢状断および水平断薄切切片を作成した.脱パラフィン後,酒石酸抵抗性酸性ホスファターゼ(TRAP)染色にて赤紫色に染まる多核細胞を破骨細胞とし,発現様相を経時的に観察した.Connective Tissue Growth Factor(CTGF), Cbfal, Osteopontin(OPN), Osteocalcin(OSC),Collagen type IのRNAプローブを用いてin situ hybridyzation法を行い,mRNAの発現部位を光学顕微鏡にて検鏡し,それぞれの経時的変化を検討した.プローブはdig-UTPでラベリングし,ハイブリダイゼーション後の反応物の可視化はNTP/BCIPにて行った.同様の因子に対して,ABC法による免疫組織化学染色を行い,各因子のタンパク発現と局在を検索した.これらの結果から,本実験系においては破歯細胞が歯の移動から5日及び7日で,圧迫側及び牽引側の両方において,最も多く観察されることが明らかとなった.また破歯細胞の増殖,分化,抑制にOPN及びCTGFが関与している可能性が示唆された.そこで,β-galactosidase遺伝子[LacZ]とOPN及びCTGFの遺伝子を組み込んだplasmid DNAとHMG-1, HVJ-liposomeを混合し複合体を作成し,これをシリンジにより上顎第一臼歯の歯周組織に直接投与し遺伝子導入した後,上記の方法で上顎第一臼歯を移動させることとした.さらに遺伝子導入後に,マウスをパラホルムアルデヒドで灌流固定し,上顎骨を摘出後,薄切切片を作成し,遺伝子の発現様相を検討することにより,導入の試適条件の検索を進めた.実験的歯の移動における,破歯細胞の発現様相ならびに増殖,分化,抑制に関与する因子を詳細に検討した.6週齢の雄性ICRマウスを用い,バルビツレートによる腹腔内麻酔の後,切歯に0.012inchのNickel-Titaniumの矯正用ワイヤーを光重合レジンにて固定し,上顎右側第一臼歯を口蓋側に移動させた.歯の移動開始から,2,6,12時間,1,2,3,5,7,14,28日後に,4%パラホルムアルデヒドで灌流固定し,エチレンジアミン4酢酸で脱灰した.アルコール脱水したものをパラフィン包埋後し,ミクロトームにて5μmの矢状断および水平断薄切切片を作成した.脱パラフィン後,酒石酸抵抗性酸性ホスファターゼ(TRAP)染色にて赤紫色に染まる多核細胞を破骨細胞とし,発現様相を経時的に観察した.Connective Tissue Growth Factor(CTGF), Cbfal, Osteopontin(OPN), Osteocalcin(OSC),Collagen type IのRNAプローブを用いてin situ hybridyzation法を行い,mRNAの発現部位を光学顕微鏡にて検鏡し,それぞれの経時的変化を検討した.プローブはdig-UTPでラベリングし,ハイブリダイゼーション後の反応物の可視化はNTP/BCIPにて行った.同様の因子に対して,ABC法による免疫組織化学染色を行い,各因子のタンパク発現と局在を検索した.これらの結果から,本実験系においては破歯細胞が歯の移動から5日及び7日で,圧迫側及び牽引側の両方において,最も多く観察されることが明らかとなった.また破歯細胞の増殖,分化,抑制にOPN及びCTGFが関与している可能性が示唆された.そこで,β-galactosidase遺伝子[LacZ]とOPN及びCTGFの遺伝子を組み込んだplasmid DNAとHMG-1, HVJ-liposomeを混合し複合体を作成し,これをシリンジにより上顎第一臼歯の歯周組織に直接投与し遺伝子導入した後,上記の方法で上顎第一臼歯を移動させることとした.さらに遺伝子導入後に,マウスをパラホルムアルデヒドで灌流固定し,上顎骨を摘出後,薄切切片を作成し,遺伝子の発現様相を検討することにより,導入の試適条件の検索を進めた.歯根吸収は破歯細胞が,セメント質及び象牙質を吸収することにより起こる現象である.そこで,実験的歯の移動における破歯細胞の発現様相ならびに増殖,分化,抑制に関与する因子について検討した.6週齢の雄性ICRマウスを用い,バルビツレートによる腹腔内麻酔の後,切歯に0.012inchのNickel-Titaniumの矯正用ワイヤーを光重合レジンにて固定し,上顎右側第一臼歯を口蓋側に移動させた.歯の移動開始から,2,6,12時間,1,2,3,5,7,14,28日後に,4%パラホルムアルデヒドで灌流固定し,エチレンジアミン4酢酸で脱灰した.アルコール脱水したものをパラフィン包埋後し,ミクロトームにて5μmの矢状断および水平断薄切切片を作成した.脱パラフィン後,Hematoxilin-Eosin(H-E)

染色,酒石酸抵抗性酸性ホスファターゼ(TRAP)染色を用いて,破歯細胞の発現様相を経時的に観察した.Connective Tissue Growth Factor(CTGF), Cbfa1,Osteopontin(OPN), Osteocalcin(OSC), Collagen type IのRNAプローブを用いてin situ hybridyzation法を行い,mRNAの発現部位を光学顕微鏡にて検鏡し,それぞれの経時的変化を検討した.プローブはdig-UTPでラベリングし,ハイブリダイゼーション後の反応物の可視化はNTP/BCIPにて行った.同様の因子に対して,ABC法による免疫組織化学染色を行い,各因子のタンパク発現と局在を検索した.これらの結果から,本実験系においては破歯細胞が歯の移動から5日及び7日で,もっとも多く観察されることが明らかとなった.また破歯細胞の増殖,分化,抑制にOPN及びCTGFが関与している可能性が示唆された.前年度に引き続き実験的歯の移動における,破歯細胞の発現様相ならびに増殖,分化,抑制に関与する因子を詳細に検討した.6週齢の雄性ICRマウスを用い,バルビツレートによる腹腔内麻酔の後,切歯に0.012inchのNickel-Titaniumの矯正用ワイヤーを光重合レジンにて固定し,上顎右側第一臼歯を口蓋側に移動させた.歯の移動開始から,2,6,12時間,1,2,3,5,7,14,28日後に,4%パラホルムアルデヒドで灌流固定し,エチレンジアミン4酢酸で脱灰した.アルコール脱水したものをパラフィン包埋後し,ミクロトームにて5μmの矢状断および水平断薄切切片を作成した.脱パラフィン後,酒石酸抵抗性酸性ホスファターゼ(TRAP)染色にて赤紫色に染まる多核細胞を破骨細胞とし,発現様相を経時的に観察した.Connective Tissue Growth Factor(CTGF), Cbfal, Osteopontin(OPN), Osteocalcin(OSC), Collagen type IのRNAプローブを用いてin situ hybridization法を行い,mRNAの発現部位を光学顕微鏡にて検鏡し,それぞれの経時的変化を検討した.プローブはdig-UTPでラベリングし,ハイブリダイゼーション後の反応物の可視化はNTP/BCIPにて行った.同様の因子に対して,ABC法による免疫組織化学染色を行い,各因子のタンパク発現と局在を検索した.これらの結果から,本実験系においては破歯細胞が歯の移動から5日及び7日で,圧迫側及び牽引側の両方において,最も多く観察されることが明らかとなった.また破歯細胞の増殖,分化,抑制にOPN及びCTGFが関与している可能性が示唆された.そこで,β-galactosidase遺伝子[LacZ]とOPN及びCTGFの遺伝子を組み込んだplasmid DNAとHMG-1,HVJ-liposomeを混合し複合体を作成し,これをシリンジにより上顎第一臼歯の歯周組織に直接投与し遺伝子導入した後,上記の方法で上顎第一臼歯を移動させることとした.さらに遺伝子導入後に,マウスをパラホルムアルデヒドで灌流固定し,上顎骨を摘出後,薄切切片を作成し,遺伝子の発現様相を検討することにより,導入の試適条件の検索を進める.
高分子会合体「混合ミセル」の混和性とダイナミックス

本研究は、両親媒性高分子が選択溶媒中で形成する会合体ミセルの多様性における「混合効果」・「多成分性」に注目し、混合ミセルの形成と秩序構造を解明しようとしたものである。種々の疎水性修飾したポリエチレングリコール水溶液を用い、光散乱・X線散乱・粘弾性などにより調べた。研究成果の内容は(A)希薄溶液中の混合ミセル、(B)混合ミセルが形成するリオトロピック液晶、(C)複数の会合性部分を有する両親媒性物質におけるゲル化と混合ミセル、に分けられる。得られた主な結果は次の通りである。(A)では、(1)単独では球状ミセルを形成するゲスト物質を紐状ミセル希薄溶液に添加すると、紐状ミセルの長さは急激に減少し、ゲスト物質10mol%程度において転移的に球状ミセルに変化する。(2)この現象は、ゲスト物質のミセル両末端への局在化を伴っていると考えられる、このことは自己無撞着(SCF)計算によるシミュレーションによっても支持される。(B)では、(3)等方相-液晶相転移は、力学的にゾル-ゲル転移として明確に観測される。(4)ヘキサゴナル液晶相を示す溶液に、単独で球状ミセルを形成する両親媒性物質を添加してもヘキサゴナル液晶相は比較的安定に保持される。(5)これに対し、立方晶相を示す溶液に、単独でヘキサゴナル液晶相を形成する両親媒性物質を添加すると立方晶相は容易に不安定となり崩壊する。(6)液晶相での会合体の会合数と充填密度の組成依存性を評価し、SCF計算によるシミュレーションの結果も用いて議論した。(7)(A)(B)いずれにおいても異なる疎水性部分のコアでの混和性は良い。(C)では、(8)ジブロック型両親媒性物質の形成するヘキサゴナル液晶相へ添加されたトリブロック型両親媒性物質はブリッジ・ループを形成して一定程度混和する。両親媒性高分子あるいはブロック共重合体は選択溶媒中で会合体ミセルを形成する。本研究では同一化学種で構成組成が異なるジブロック共重合体混合系の会合体ミセル形成挙動を解明することを目的とする。初年度である本年度は、(1)コロナ鎖(非会合ブロック鎖)の長さが異なる混合系、(2)コア鎖(会合ブロック鎖)の長さが異なる混合系のそれぞれの希薄溶液におけるミセル形成挙動、に加えミセル濃厚溶液系での(3)中間相形成についての予備的実験を行った。(1)についてはポリエチレングリコールモノドデシルエーテル混合(C12E8/C12E25)水溶液中でのミセル構造の組成依存性を調べた。(C12Enのnはエチレングリコール単位の数)その結果、C12E8にC12E25を加えていくと、会合数とミセルサイズは急激に減少した後、緩やかに減少してC12E25単独の値に達する。この結果は、加えたC12E25が、紐状ミセルを形成しているC12E8のミセル末端に混入・会合することによりミセル長を短くし、ついには均一に混合して球状ミセルへと変化させることを示唆している。(2)についてはポリスチレン(PS)/ポリエチレングリコール(PEG)ブロック共重合体をPEGへの選択溶媒中で混合ミセル形成させた。ミセルを形成しているコアPS鎖の長い共重合体溶液へ、単独ではミセルを形成しないPS鎖の短い共重合体成分を混合することにより非球状ミセル粒径は一旦増大した後、転移的に球状ミセルへ変化して粒径を減少させることが分かった。

(3)では、純C12E25濃厚水溶液の秩序相についてその立方格子間隔の濃度依存性をx-線小角散乱で調べ、濃度増加に伴い格子定数はほぼ一定のまま会合数が増加することを明かにした。両親媒性高分子あるいはブロック共重合体は選択溶媒中で会合体ミセルを形成する。本研究では同一化学種で構成組成が異なるジブロック共重合体混合系の会合体ミセル形成挙動を解明することを目的とする。本年度は、(1)コロナ鎖(非会合ブロック鎖)の長さが異なる混合系、(2)コア鎖(会合ブロック鎖)の長さが異なる混合系のそれぞれの希薄溶液におけるミセル形成挙動、に加えミセル濃厚溶液系での(3)中間相の相図と秩序構造について研究を行った。(1)(2)についてはポリエチレングリコールモノドデシルエーテル混合[(1):C18E8/C18E25,(2):C18E8/C12E8]水溶液中でのミセル構造の組成依存性を調べた。(C12Enのnはエチレングリコール単位の数)その結果、C12E8にC18E25あるいはC12E8を加えていくと、(1)、(2)いずれの場合も会合数とミセルサイズは急激に減少した後、30wt%付近で転移的に減少、その後は緩やかに減少する。この結果は、加えたC18E25,C12E8が、紐状ミセルを形成しているC18E8のミセル末端に混入・会合することによりミセル長を短くし、30wt%付近で転移的に球状ミセルへと変化させることを示している。一方、ポリスチレン/ポリエチレングリコールブロック共重合体についてもシクロヘキサノール中で混合ミセル形成させ、会合数・サイズの混合組成による特異な変化を明らかにした。(3)では、C12E8/C12E25混合濃厚水溶液について主にx-線小角散乱により相挙動と秩序構造のC12E25の混合組成(f)依存性を調べた。C12E8-rich領域(f=0-0.4)で円柱六方晶相、C12E25-rich領域(f=0.8-1.0)で体心立方晶相を示し、中間組成領域では無秩序相、2相共存相である。秩序相でのミセル間距離、会合数の組成変化を明らかにした。本年度の研究では同一化学種だけではなく異種化学種も含め構成組成が異なるジブロック共重合体混合系の会合体ミセル形成挙動を明らかにした。研究は(1)コア鎖(会合ブロック鎖)の化学種が異なりコロナ鎖(非会合ブロック鎖)の長さ異なる混合系のそれぞれの希薄水溶液におけるミセル形成挙動、に加えミセル濃厚溶液系での(2)コロナ鎖(非会合ブロック鎖)の長さが異なる混合系(3)コア鎖の化学種とコロナ鎖の長さが異なる混合系、についての中間相の相図と秩序構造の三つに分けられる。(1)については親水部分(コロナ)としてポリエチレングリコールを、疎水部分としてそれぞれ飽和アルキル鎖、不飽和アルキル鎖、フェニル基を含むアルキル鎖、によって構成された両親媒性物質2成分混合物の水溶液中でのミセル構造の組成依存性を調べた。その結果、異なる化学種でもコアの混和性はあり、混合ミセルを形成する。紐状ミセルから球状ミセルへの組成変化による変化は、いずれも球状ミセル成分組成の小さいところで急激に起こることが明らかとなった。(2)(3)では(1)と同様の種々の混合系について、円柱六方晶相あるいは立方晶相をそれぞれ形成する溶液に対する他成分添加の効果の観点から調べた。その結果、ミセル形成と同様、疎水性会合部の混和性は良好で混合会合体を形成して秩序構造を示す。
酸性オリゴ糖とのハイブリッド化による乳タンパク質の低アレルゲン化

牛乳の主要な乳清タンパク質であるβ-ラクトグロブリン(β-LG)は良質な食品タンパク質であるが、強力なアレルゲンであるという大きな問題点がある。そこで、本研究では、β-LGのアレルゲン性の低減化、機能特性のさらなる増強といった、多岐にわたる機能改変を同時の達成することを目的として、可食性を維持した状態で、酸性オリゴ糖とのハイブリッド化を行った。酸性オリゴ糖としては、アルギン酸由来のオリゴ塘(ALGO、平均重合度4)を用いた。β-LGとALGOを、重量比1:1で混合の後、50°C、湘対湿度79%の条件で24時間メイラード反応させ、分子量22,000、β-LG : ALGO=1:6の組成のハイブリッド分子を得た。等電点電気泳動の結果、等電点は酸性側へシフト(pI<4.6)していた。また、ハイブリッドを還元カルボキシメチル化し、トリプシン分解の後、逆相HPLCで糖鎖結合ペプチドを分取し、シークエンシングを行い、糖鎖結合部位を^<60>Lys、^<77>Lys、^<100>Lys、^<138>Lys、^<141>Lysと決定できた。さらに、自然蛍光の測定、CDスペクトルの測定、モノクローナル抗体を用いたELISAによる構造解析の結果、ハイブリッドはβ-LGのネイティブ構造をほぼ維持していることが明らかとなった。ハイブリッド化による機能改変として、熱安定性の向上、乳化性の改善、抗β-LG抗体産生性の低下を効果的に達成することができた。さらに、ピンペプチドを用いたELISAならびにT細胞増殖試験を行った結果、ハイブリッド化により、B細胞エピトープならびにT細胞エピトープの分布が大きく変動しない状態で、特にC末端側において免疫応答性が低下したことを明らかにした。ALGOとのハイブリッド化によるβ-LGの免疫原性低下のメカニズムとして、糖鎖によるエピトープの遮蔽が重要であると考えられた。本研究では、牛乳アレルギーの主要なアレルゲンであるβ-ラクトグロブリン(β-LG)と酸性オリゴ糖をハイブリッド化し、β-LGの有用機能である疎水性物質結合能を維持した状態で、アレルゲン性を低減化するとともに、同時にβ-LGの有する優れた機能特性(乳化性、気泡性、ゲル化性)をさらに増強するような多面的な機能改変を達成することを目的としている。今年度は、酸性オリゴ糖として、アルギン酸由来のオリゴ糖(ALGO、平均重合度4)を用いた。β-LGとALGOを、混合比を重量比1:1、50°C、RH79%、24hの条件でメイラード反応させ、ハイブリッドを得た。ハイブリッドの分子量は22,000、組成比はモル比でβ-LG:ALGO=1:6であり、等電点は酸性側へシフト(pI<4.6)していた。自然蛍光測定、CD測定、モノクローナル抗体を用いた競合法ELISAにより構造解析を行った結果、ハイブリッドはβ-LGのネイティブ構造をほぼ維持していた。また、示差走査熱量測定の結果、ハイブリッド化による熱安定性の著しい向上が明らかとなった。乳化性については、濁度法により評価した結果、β-LGの乳化性が低下する酸性領域及び塩存在下で改善することができた。ハイブリッド化による免疫原性の変化については、3系統の近交系マウス(BALB/c、C3H/He、C57BL/6)を免疫して得られた抗血清を用い、非競合法ELISAにより解析を行った。

その結果、全系統のマウスにおいて、β-LGの免疫原性を低下させることができた。また、ピンペプチド法により、B細胞エピトープの変化について解析を行った結果、全系統のマウスにおいて、特にC末端側のエピトープの免疫原性を著しく低下させることができた。本研究では、牛乳アレルギーの強力なアレルゲンであるβ-ラクトグロブリン(β-LG)と酸性オリゴ糖を、可食性を維持した状態でハイブリッド化し、β-LGの有用機能である疎水性物質結合能の維持、β-LGの有する優れた機能特性のさらなる増強、アレルゲン性の低減化といった、多岐にわたる機能改変を同時に達成することを目的としている。ハイブリッド化に用いる酸性オリゴ糖としては、アルギン酸由来のオリゴ糖(ALGO、平均重合度4)を用いた。β-LGとALGOを、重量比1:1で混合の後、50°C、相対湿度79%の条件で24時間メイラード反応させ、分子量22, 000、β-LG: ALGO=1: 6の組成のハイブリッド分子を得た。等電点電気泳動の結果、等電点は酸性側ヘシフト(pI<4.6)していた。また、ハイブリッドを還元カルボキシメチル化の後、トリプシン分解の後、逆相HPLCで糖鎖結合ペプチドを分取し、シークエンシングを行い、糖鎖結合部位を^<60>Lys、^<77>Lys、^<100>Lys、^<138>Lys、^<141>Lysと決定することができた。さらに、自然蛍光の測定、CDスペクトルの測定、モノクローナル抗体を用いたELISAによる構造解析の結果、ハイブリッドはβ-LGのネイティブ構造をほぼ維持していることが明らかとなった。ハイブリッド化による機能改変として、熱安定性の向上、乳化性の改善、抗β-LG抗体産生性の低下を達成することができた。さらに、ピンペプチドを用いたT細胞増殖試験を行った結果、ハイブリッド化により、T細胞エピトープの分布が大きく変動しない状態で、特にC末端側において低下したことを明らかにすることができた。ALGOとのハイブリッド化により、β-LGの免疫原性を効果的に低下させるごとができ、そのメカニズムとして、糖鎖によるエピトープの遮蔽が重要であることを明らかにすることができた。
分子内捕捉を利用したホスファ-Cope転位の機構解明

1.分子内捕捉が期待できる3ー(2ーヒドロキシメチルフェニル)ー3ーホスファ-1,5ーヘキサジエン=3ーオキシド(1a)およびその5ーメチル体(1b)は以下の経路で合成した。エチル=(アリルおよびメタリル)ビニルホスフィナ-ト(2a,b)を合成し、塩化チオニルでクロロ化後、臭化2ーテトラヒドロピラニロキシメチルフェニルマグネシウムとテトラヒドロフラン中反応させ、脱保護し、1a,bを44および65%得た。まず、1aをoージクロロベンゼン中Ar雰囲気下加熱したところ、分子内捕捉ホスファ-Cope転位生成物3ー(5ーペンテニル)ー1,3ージヒドロ-2,3ーベンゾオキサホスホ-ル=3ーオキシド(3a)と1aのアリル基の二重結合がシフトした化合物(4a)が61および14%の収率で得られた。1bを用いると定量的に3bが得られたので、以後の検討は1bで行った。ヘキサノ-ル中でも分子内捕捉生成物のみが得られた。2.溶媒効果を調べるために内部標準としてトリフェニルホスフィンオキシドを用い、各溶媒中GLCで1bの消失速度を求めた。反応は1bに対して1次であった。溶媒としては極性の異なるoージクロロベンゼン、ヘキサノ-ル、ニトロベンゼンを選び各温度での速度定数を求め、活性化パラメ-タを算出した。△G^≠はそれぞれ33.1,33.2および32.9kcal mol^<ー1>であり測定誤差内で一致したことより遷移状態はほとんど無極性であること、△H^≠,△S^≠もCope転位であるとして報告されている例と同様な傾向であることから本反応も協奏的機構で進行していると結論された。3.他の例として、2a,bを同様にクロロ化後、1,3ープロパンジオ-ルと反応させ、3ー(3ーヒドキシプロポキシ)ー3ーホスファ-1,5ーヘキサジエン(5a,b)を合成した。5a,bも同様な反応をし、分子内捕捉生成物を与えることが分かった。
安定有機ラジカルを用いた分子性強磁性体の開発に関する研究

我々の研究グループは、完全に有機物よりなる強磁性体を開発し続けているが、我々の提唱しているσ電子系を通した磁気的相互作用のメカニズムの妥当性を明らかにするために、いくつかの試料について、完全重水素置換体の磁性や、極低温μSRのよる磁性の次元性などを明らかにした。また、TEMPOラジカル置換基を持たせたフラーレンC_<60>分子のTDAE錯体を合成し、その磁性を調べた。今年度新たに分子設計、合成検討された化合物類は、π電子共役系で安定化されたラジカル、例えば、芳香族環を有するニトロキシドラジカル等である。これらはπ共役系同士が空間的に接近することで相互作用が増大する可能性がある。実際ビスビフェニリルニトロキシドやベンズイミダゾールオキシルオキシド誘導体で本研究室で開発されたものの中で最高のワイス定数をもつものを見出した。5,6-ジヒドロフェナントリジノキシル誘導体では、分子間の強・反強磁性的相互作用を結晶構造解析に基づいて解析した。電導性と磁性の共存する系は現在大変興味が持たれており、合成強磁性金属は新たなターゲットである。有機電導性錯体を与えやすいTCNQ類を用いた銅錯体は電導性の面では半導体であったが、磁性の面では10Kの強磁性相転移が見出された。またBEDT-TTFを用いた錯体で、アニオンに有機ラジカルアニオンを用いたものを合成した。ラジカル部位が電解条件で損なわれるなどの問題点を明らかにした。別のアプローチとして、スピン源として遷移金属イオンを用い芳香族環としてピリミジンで架橋配位させ、d軌道上のスピンを平行にすることを行っている。ピリミジンを架橋配位子とするハロゲン化コバルト錯体についても強磁性相転移が見られた。