hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
窒化ガリウムナノ細線を用いた化学センサとその集積化センサチップへの展開

本研究では、環境にやさしく化学的に安定な表面をもつAlGaN/GaNウエハ上に、将来オンチップ集積により、ユビキタス・センサ・ネットワークに組み込み可能な集積化センサを実現するための要素技術を基礎的な立場から検討し、次の成果を得た:(1)半導体界面のモデルを概観し、AlGaN/GaNのショットキ障壁について、フェルミ準位ピンニング、障壁高、逆方向リーク電流についての問題点を指摘した。さらに電流輸送機構を、代表者らのTSBモデルで説明し、逆方向リーク電流が、酸素ゲッタリング・プロセスで大幅に減少できることを示した。(2)HEMT用AlGaN/GaNウエハ上に、触媒金属Pdを障壁とし、酸素ゲッタリング・プロセルスを施したショットキ障壁型水素ガスセンサを製作し、それが空気中・室温でかってない高感度を実現することを示した。(3)この水素ガスセンサのセンシング機構は、Pd表面で発生した原子状水素がショットキ界面で界面ダイポールを形成し、障壁高を減少させることにあり、その応答が表面反応律速であることを示した。さらにセンシングの定常および過渡応答動作を記述する数式を確立した。(4)本水素センサが高温で感度が向上することを示すとともに、他の化合物半導体と比較し、AlGaN/GaNセンサの優位性を示した。(5)水素センサの示す遅い過渡応答が、表面準位を介した電子のホッピング分散性伝導によることを示し、AlGaN/GaN高移動度トランジスタの電流コラプスの新モデルを提案した。(6)電解液ゲート型AlGaN/GaNトランジスタを用いたpHセンサを試作し、その閾値シフトがNernstの式で与えられる理想特性に近いことを示した。さらに、バイオセンサ応用への問題点を指摘した。(7)ナノ細線ネットワーク形ヘキサゴナルBDD情報処理回路方式を用いたセンサのオンチップ集積化に向け、集積化基本構造、基本センサ・ブリッジ、センサ・アレイの構成法、AlGaN/GaNナノ細線ネットワークのMBE選択成長法、オンチップアンテナとRFフロント・エンドの集積方式を提案・実証した。本研究では、独自の表面・界面制御技術とナノテクノロジーを、環境にやさしく表面が化学的に安定なGaN系材料に適用し、高感度・高機能・超微細の化学センサを、AlGaN/GaNナノ細線上に実現し、これをヘキサゴナル2分決定グラフ(BDD)回路と組み合わせ、超低消費電力集積化センサチップを実現する基礎研究を行っている。本年度は、その要となるセンサヘッドの研究開発に主眼をおき研究を推進し、次の成果を得た。(1)AlGaN/GaNウエハ上に、Pdショットキ電極をもつ水素ガスセンサを試作して、真空中および大気中で、水素照射下の定常電流-電圧特性・容量特性とオン・オフ過渡応答特性を明らかにした。ことに、AlGaN表面層にAl膜を用いた酸素ゲッタリングを加えると、電流による水素検出感度が5桁向上する有望な結果を得た。(2)水素センサの詳細な実験データを解析し、センシング機構が原子状水素によるショットキ界面ダイポールの形成にあることを確立し、酸素ゲッタリングの効果や電流輸送機構の定量的解明に成功し、センサ設計理論を構築した。(3)溶液センサとして、オープンゲート構造のAlGaN/GaNヘテロ接合トランジスタを用いたpHセンシングに成功した。結果は、ネルンストの理論式にほぼ従う理想的特性に近い。固体のショットキ障壁で生じるフェルミ準位ピンニングが、溶液-

半導体の擬似ショットキ障壁では存在しないのは、極めて興味深く、今後の発展が期待できる。pHセンサはバイオセンサの基礎となるので、この結果は極めて有望である。(4)ナノ細線にセンサヘッドを形成し、ヘキサゴナルBDD回路に接続する方法として、ブリッジ方式を考案し、細線の形成しやすいインジウムリンを用いて、その有効性を実証した。センサ情報を適切に処理しディジタル出力をうるアナログ・ディジタル混在型センサ情報処理回路については、シリコンCMOS集積回路設計の経験を活かし、それを基盤としてAlGaN/GaNヘテロ接合トランジスタBDD回路系を構築することの検討を開始した。本研究では、高感度・高機能・超微細の化学センサを、独自の表面制御により、AlGaN/GaNナノ細線上に実現し、ヘキサゴナル2分決定グラフ(BDD)回路方式と組み合わせて、オンチップ集積により、超低消費電力集積化センサチップを実現する基礎研究を行う。本年度は次の(1)-(4)の成果を得るとともに、予想していなかった重要なポイント(2),(3)を発見し、その解明のため、研究期間をさらに6ヶ月繰り越し延長することとした。(1)酸素ゲッタリングを施したAlGaN/GaNウェハ上に、Pdショットキ電極をもつ水素ガスセンサのセンシング機構として、原子状水素によるショットキ界面ダイポールの形成によるショットキ障壁の現象を昨年度提案したが、詳細な検討で、I-V特性から求められる障壁高変化と、C-V特性から求められる障壁高変化が一致しないことを見出した。そして、この理論上の矛盾点を、独自のTSB(thin surface barrier)モデルで説明することに成功した。(2)実用的には、高温下での水素検知が実用上極めて重要となる。この点に関して、通常材料では、高温で、ショットキ障壁のリーク電流の増加により、検知特性が悪化するのに対し、本Pd/AlGaN/GaN水素ガスセンサでは、逆に検知特性が向上するという有望な結果を得た。この機構の解明と性能最適化には、さらなる検討が必要である。(3)水素センサにおいてバイアス条件により、動作理論からは説明できない非常に遅い過渡応答不安定性を見出した。これは、水素センサのみならず、AlGaN/GaN溶液センサの信頼性にかかわる重要なものである。これは窒化ガリウム電子デバイスの「電流コラプス」に関連している可能性が示され、さらに詳細な検討が必須である。(4)ナノ細線センサヘッドをブリッジ方式で、AlGaN/GaNヘテロ接合トランジスタBDD回路へ接続したアナログ・ディジタル混在型センサ情報処理回路について、その実現可能性を確認した。
肝臓の領域特異的分化を制御する転写調節因子の同定と機能解析

本年度は昨年度おこなったdegenerate RT-PCRによって同定された遺伝子群のうち、Id関連遺伝子のひとつであるId3に着目しその機能解析を行った。我々は本遺伝子の肝発生における機能を明らかにする目的で、肝発生過程におけるその詳細な発現パターンを解析した。Id3は肝原基が形成された直後である発生段階14において肝原基全体で発現していた。しかし、近位遠位軸にそった形態学的特徴が顕著になる発生段階20では、腸管に関して近位側の総胆管内胚葉におけるその発現は消失する一方で、遠位側の肝臓本体における発現は継続していた。すなわち、肝-胆管系において、Id3は遠位特異的に発現する。次にそのmRNA量の経時的な変化を3日-14日胚肝臓において計測したところ、3日目と6日目に発現のピークがあり、6日以降からは急速に減少することが明らかになった。この結果はId3が肝臓発生の異なった二つの発生段階において機能している可能性を示唆する。次にId3の機能を明らかにするために、Id3に対するsiRNAを作成し、肝内胚葉に導入した際の効果を調べた。Id3特異的siRNAの導入により肝臓が縮小した。一方、器官培養系を用いてId3過剰発現の効果を検討したところ、肝臓内胚葉の増殖が促進された。さらにin ovoにおいて肝臓内胚葉特異的にId3 cDNAを恒常的に発現したところ、ニワトリ肝臓の分化マーカーであるalbuminの発現が抑制された。以上の結果はId3が肝-胆管系における遠位側、すなわち肝臓内胚葉の領域特異的増殖の促進因子であることを強く示唆している。また今回の結果はId3が肝発生分化状態の維持に関与している可能性を示唆する。これまでの経過より、類似した特定の転写制御因子のサブファミリーが、器官発生の領域特異性の決定に関与していることが明らかにされている。私は肝臓系内胚葉においてもなんらかの転写調節因子群が肝臓内胚葉における領域特異的分化を制御していると予想した。そこで、以下の手順で肝臓発生に関わる新規転写制御因子を同定する。ホメオボックス遺伝子などの転写遺伝子群に注目し、それらの保存領域に対するdegeneratedオリゴヌクレオチド対を合成する。次に本オリゴヌクレオチド対を用いてニワトリ胚肝臓由来のcDNAよりRT-PCRを行い、特定の転写調節因子ファミリーの保存領域を増幅しT-ベクターに組み込み、ブラスミドを精製しその塩基配列を決定する。いくつかの新規ホメオボックス遺伝子断片が同定されている。(2)発現パターン解析による候補遺伝子の絞り込みこのホメオボックス遺伝子断片をプローブとし、whole mount in situハイブリダイゼーションを行い、その発現パターンを指標に領域特異的に発現する遺伝子断片を同定する。少なくとも初期肝臓原基で発現する2種類の新規ホメオボックス遺伝子断片を単離された。そのうちのclone #1は発生段階23の肝臓において領域特異的発現パターンを示した。このことは本遺伝子が肝臓の発生過程において領域特異的分化に関与している可能性を示唆する。IdはDrosophila emc(extramacrochaetae)の関連遺伝子であり、他のbHLH型転写活性化因子と結合することで細胞分化を抑制すること、または細胞周期調節因子と結合することで細胞増殖を促進することがこれまでに報告されている。またsiRNAの導入によって特定の分化マーカーの発現が低下した。この結果はId3が肝発生初期の分化状態の維持に関与している可能性を示唆する。

しかし、近位遠位軸にそった形態学的特徴が顕著になる発生段階20では、腸管に関して近位側の総胆管内胚葉におけるその発現は消失する一方で、遠位側の肝臓本体における発現は継続していた。すなわち、肝-胆管系において、Id3は遠位特異的に発現する。次にそのmRNA量の経時的な変化を3日-14日胚肝臓において計測したところ、3日目と6日目に発現のピークがあり、6日以降からは急速に減少することが明らかになった。この結果はId3が肝臓発生の異なった二つの発生段階において機能している可能性を示唆する。次にId3の機能を明らかにするために、Id3に対するsiRNAを作成し、肝内胚葉に導入した際の効果を調べた。Id3特異的siRNAの導入により肝臓が縮小した。一方、器官培養系を用いてId3過剰発現の効果を検討したところ、肝臓内胚葉の増殖が促進された。さらにin ovoにおいて肝臓内胚葉特異的にId3 cDNAを恒常的に発現したところ、ニワトリ肝臓の分化マーカーであるalbuminの発現が抑制された。以上の結果はId3が肝-胆管系における遠位側、すなわち肝臓内胚葉の領域特異的増殖の促進因子であることを強く示唆している。また今回の結果はId3が肝発生分化状態の維持に関与している可能性を示唆する。
ストレスに対する細胞応答

1)ストレス負荷による胃粘膜損傷はよく知られている事象であるが、長期SSRI投与によるストレス耐性形成により胃粘膜損傷が部分的に阻止できることを報告した。2)ストレス負荷による海馬領域でのアポトーシス信号の亢進と、オートファジー信号には変化のないことを報告し、さらに電気けいれん療法によって海馬領域でのオートファジー信号は亢進するものの、アポトーシス信号には変化のないことを報告した。3)ストレス負荷を伴う自衛隊訓練においては、BDNFとVEGFの血中濃度は有意に低下することを報告した。4)良環境飼育によって、海馬領域でのオートファジー信号が増強されることを報告した。ストレスによるラット脳内海馬領域でのアポトーシス信号の亢進、抗うつ効果を有する電気けいれん処置による同領域でのオートファジー信号の亢進を確認し、海外雑誌へ報告した。オートファジーはリソゾームによって細胞内の陳旧化した構造を分解し、神経可塑性に寄与しているのではないかとする作業仮説のもと研究を進めている。また実地研究として自衛隊レンジャー訓練中の血中BDNF(brain derived neurotrophic factor)およびVEGF(vascular endothelial growth factor)の低下を観察し、海外雑誌へ報告した。従来的には運動によってあるいは睡眠時間の低下によって血中BDNFの低下することが報告されていたが、ストレスによる同血中濃度への関与がもっとも強いことが示された。今後の展開としては内因的精神刺激療法を研究の中心に据える予定である。内的精神刺激療法(Endogenous psychostimulation therapy)とはここでは以下のように考える。電気けいれん療法、磁気刺激療法、実験動物での良環境飼育、もっと広げれば精神療法、認知療法を含む薬を使わない精神科治療は、生体外部から化学物質を注入されることはないものの、生体内部での生物学的反応を引き起こし、うつ病、ストレス性疾患からの回復過程を援助する。機能蛋白を含む多くの内因生体物質が、脳内でいわば薬となって作用していると考える。特定の作用機序をもつ向精神薬を対象とするより、本質的な発見をするために重要である。精神薬理学は偶々発見された効用を研究し、類似物質を作ることで歩んできた。ストレス負荷時、抗うつ薬投与時の中枢神経系機能蛋白の発現動態を観察中である。アポトーシス、オートファジーは細胞死を制御するが、初期段階では小胞体が不全蛋白を除去し蛋白発現にブレーキを掛け(アポトーシス)、ライソソームが老朽化した細胞内器官、耐用の過ぎたタンパク質を取り込んで新陳代謝に寄与する。この両面の性質を持った過程を観察することに一年を費やした。1)電気痙攣療法によって脳内海馬のオートファジー過程が活性化すること、2)ストレス負荷によって脳内海馬のアポトーシス過程が活性化することが確認できた。英文論文を準備すると共に、平成25年開催の国際生物学的精神医学会での発表を予定している。ウエスタンブロットを多用して、解析を施行しているが一年で技術は著しい向上を見ている。電気けいれん療法では1)脳内神経伝達物質受容体の数の制御、2)神経栄養因子発現亢進、3)神経新生活発化が知られていたが、あらたにオートファジ経路の活性化(おそらくその後の可塑性過程の活発化)の知見が得られたことになる。2)の発見に過去に関与しており、うつ病の病態機構の解明にさらにアプローチすることを継続する予定である。近年、神経細胞の活動によりオートファジー過程が活発化し、これが神経可塑性に影響を与えていることが報告されだしており、ここに関連する新知見であろうと推測している。この研究結果により、抗うつ薬の長期投与により脳内にストレス耐性の性質が付与されることが明らかとなった。これを形成する脳内機構として、今回の研究対象となるオートファジーを注目するに至った。本来的には、SSRIはセロトニン再取り込み阻害から血小板の凝固能を下げるため、出血傾向が増強され胃粘膜損傷傾向を急性投与では惹起する物質である。また胃領域のセロトニン受容体刺激は胃酸分泌を亢進し、やはりSSRIの急性投与はい粘膜損傷傾向をここからも惹起する。しかしながら、中枢神経系からのストレス耐性形成により、胃粘膜保護作用が観察されたとする報告である。

この集団ではBDNFの濃度を高めることが知られている運動量増加や、間欠的飢餓が発生しているが、ストレスによる影響が強いことが示唆された。4)良環境飼育によって、海馬領域でのオートファジー信号が増強されることを報告し、抗うつ効果とオートファジー系の関連について考察した。精神医学数本の査読を有する海外紙へ投稿し受理されたことで、今後の展開がさらに期待できる状況にある。新規発見があり、論文発表の可能性が極めて高い状況にある。電気けいれん以外に、電磁気刺激、良好環境、抗うつ薬長期投与によるアートファジー信号の推移を観察する。オートファジー、アポトーシスの神経脆弱性、ストレス耐性形成への関与をさらに追求してゆく。少額差額が出現した。入札により単価が定まるため回避が難しい。少額差額については回避が難しいが、なるべく有効使用を心がける。試薬を中心に幅広く消耗品を購入し、データ作成のための研究に邁進する予定である。
関節拘縮による関節軟骨変性メカニズムの解明およびリハビリテーションの効果

不動化したラットの関節軟骨において軟骨層の菲薄化、軟骨基質の低下を明らかにし、TUNNEL陽性の軟骨細胞が増加傾向にあること、ならびに軟骨基質の分解酵素であるマトリックスメタロプロテアーゼ(MMP)の発現が増強していることを証明した。さらに、軟骨基質への血管増生とともに、VEGFの発現増強、Chondromodulin-1の発現低下を見出した。そして、固定中に持続的他動運動を実施することによって、関節軟骨層の菲薄化、軟骨基質の低下に関連するこれらの変化を抑制した。ラットの足関節の不動化による関節軟骨の変化を明らかにし、その変化の発現に関与する因子について免疫組織学的に検討した。8週齢のWistar系雄ラットの両足関節を最大底屈位の状態でギブス固定後、麻酔下で足関節を摘出。足関節の関軟骨の形態学的変化をヘマトキシリン・エオジン染色ならびに、サフラニン-O染色、トルイジンブルー染色で観察した。さらに、血管増生に関与するHIF-1α、VEGF、血管増生を阻止するchondromodulin-1、軟骨組織中の細胞外マトリックスの分解酵素であるMMP-3、MMP-13の発現を免疫組織染色によって検討した。その結果、固定群においては関節軟骨層が菲薄化しており、サフラニン-O染色、トルイジンブルー染色の染色性が低下しており、基質であるプロテオグリカンが減少していることが推測された。そして、軟骨細胞の肥大化と配列の乱れも認められた。しかし、コラーゲンIならびにコラーゲンIIの発現に有意な差を見い出すことはできなかった。固定群の軟骨細胞外のマトリックスでは、MMP-3やMMP-9、MMP-13の発現が充進しており、固定による軟骨層の菲薄化、プロテオグリカンの減少にこれらの蛋白分解酵素が関与していることが示唆された。また、軟骨下骨層から血管様構造をしたものが侵入していた。軟骨層は通常無血管野であるが、固定群においてHIF-1αおよびVEGFの発現が増加していた。これらの血管増生因子の発現は軟骨細胞や血管様構造付近において多く認められた。一方、固定群では、関節軟骨、特にその深層において軟骨層への血流を阻害するChondromodulin-1の発現が低下しており、軟骨層への血管様構造の侵入に関与しているものと考えられた。昨年度の本研究において、不動化したラットの関節軟骨において軟骨層の菲薄化、軟骨基質の低下を明らかにし、軟骨基質の分解酵素であるマトリックスメタロプロテアーゼの発現が増強していることを証明した。本年度は不動化による関節軟骨組織内の軟骨細胞の減少に着目して、軟骨細胞におけるアポトーシスの関与、ならびにアポトーシスに関連する細胞内シグナル伝達経路について検討した。8週齢のWistar系雄ラットの両足関節を最大底屈位の状態でギブス固定後、麻酔下で足関節を摘出した。摘出した足関節の軟骨細胞のアポトーシスの発現について、TUNNEL染色によって検討した。固定群では、コントロール群と比較して脛骨側の関節軟骨においてTUNNEL陽性の細胞が増加傾向にあった。そこで、アポトーシスに関連するFas、caspase-3、Bcl-2、Baxなどの発現について免疫組織学的に検討したが、固定による有意な発現増強は認められなかった。次に、不動化した関節軟骨組織においてNF-kBの発現を免疫組織化学的に検討した。固定群ではNF-kBの発現ならびにその上流であるAktの発現が増強していた。NF-kBは一般的にアポトーシスを抑制する転写因子として知られているが、一部の細胞においては逆にアポトーシスに対して促進的に働くことが報告されている。一方、AP-1の発現は固定によって増強されなかった。NF-kBは軟骨基質の分解酵素であるマトリックスメタロプロテアーゼの活性化に関与する因子でもあり、不動化による関節軟骨の変性において重要な因子であることが示唆された。本研究において、不動化したラットの関節軟骨において軟骨層の菲薄化、軟骨基質の低下を明らかにし、軟骨基質の分解酵素であるマトリックスメタロプロテアーゼの発現が増強していることを証明した。そして、軟骨細胞におけるアポトーシスの関与、ならびにアポトーシスに関連する細胞内シグナル伝達経路について着目し、固定した関鰍骨においてTUNNEL陽性の軟骨細胞が増加傾向にあること、、NF-kBの発現ならびにその上流であるAktの発現が増強していることを明らかにしてきた。本年度は、不動化による関節軟骨の菲薄化、軟骨基質の低下を抑制するために、固定中に週5回、毎日30分ずつ、持続的他動運動(CPM)を実施した。1)軟骨層の菲薄化ならびに軟骨基質の低下ならびにMMP-3,-9,-13の発現はCPMによって抑制された。2)軟骨細胞のアポトーシスも、CPMによって抑制傾向にあった。3)関節を固定すると軟骨下骨層から軟骨層へ血管様構造が発現し、骨化を進めることを明らかにした。

その際、関節軟骨への血管新生を惹起する増殖因子であるVEGFの発現が増強し、逆に血管新生を抑制するChondromodulin-Iの発現が低下することを明らかにし、さらに、CPMによって改善することを証明した。以上より、不動化によってもたらされた関節軟骨層の菲薄化、軟骨基質の低下は、MMP発現抑制とともにCPMによって改善された。また、CPMは軟骨細胞のアポトーシスに対して改善傾向を認めた。さらに、不動化による軟骨組織の血管新生を伴う骨化も、VEGFの発現増強、Chondromodulin-1の発現低下の改善を介して抑制することが示唆された。
結核菌のニューキノロン耐性に係る遺伝子変異の解析及び結晶構造解析

キノロン系抗菌薬は結核症の治療に有用であり、その標的部位はDNAジャイレースである。近年、キノロン系抗菌薬に耐性を示す結核菌の出現が問題となっており、DNAジャイレースの変異が耐性菌出現の要因となっている。DNAジャイレースの変異と耐性獲得機構の詳細な関連性を明らかにするためには、DNAジャイレースの立体構造情報が必要不可欠である。それで本研究では、結核菌由来DNAジャイレース上のアミノ酸置換とキノロン耐性との関係を明らかにすることで結核菌由来DNAジャイレースの立体構造を決定するとともに詳細な構造と機能の相関を明らかにすることを目的とした。本研究では、ニューキノロン耐性結核菌の遺伝子変異検出を基盤とした迅速なニューキノロン感受性試験を可能とするために、ニューキノロンのターゲットである結核菌のDNAジャイレース上のアミノ酸置換とニューキノロン耐性との関係を明らかにする事と結核菌由来DNAジャイレースの立体構造解析から、新規抗結核薬の開発につながる新規キノロン誘導体のデザインを最終的な目標としている。平成25年度は以下の2つの研究を行った。1)組換えDNAジャイレース遺伝子のクローニングおよび大量発現と精製。実験用株である結核菌H37Rv株とキノロン耐性株である結核菌osaka株から、DNAジャイレースであるGyrAのN末端部分(502アミノ酸残基分)をコードする遺伝子をそれぞれPCR反応によって増幅させた後、発現用ベクターに挿入したプラスミドを構築した。作製したプラスミドをそれぞれ発現用の大腸菌に導入して発現系を構築し、IPTG誘導による目的蛋白質の過剰発現が確認された株について大量培養を行った。菌体を集菌し、超音波破砕装置を用いて細胞内画分を抽出した。FPLCを用いて2種類のカラム操作により、SDS-PAGE上でほぼ目的タンパク質のみが検出される状態になるまで、H37Rv株由来GyrA(N末)とosaka株由来GyrA(N末)の精製を行った。2)組換えDNAジャイレースの結晶化。上記1)で得られた精製H37Rv株由来GyrA(N末)とosaka株由来GyrA(N末)について、市販の結晶化スクリーニングキットを用いて結晶化条件のスクリーニングを行った。その結果、H37Rv株由来GyrA(N末)およびosaka株由来GyrA(N末)のそれぞれについて、X線測定が可能な結晶を作製することができた。本研究では、ニューキノロン耐性結核菌の遺伝子変異検出を基盤とした迅速なニューキノロン感受性試験を可能とするために、ニューキノロンのターケットである結核菌のDNAジャイレース上のアミノ酸置換とニューキノロン耐性との関係を明らかにすることで結核菌由来DNAジャイレースの立体構造解析から、新規抗結核薬の開発につながる新規キノロン誘導体のデザインを最終的な目標としている。平成26年度は以下の3つの研究を行った。1)野生型組換えDNAジャイレースの酵素活性:25年度より得られた野生型(H37Rv, Osaka株)の組み替えDNAジャイレースを用いて酵素活性の条件を検討させた。DNAジャイレース活性にはRelaxed plasmid DNA及びSupercoiled plasmid DNAが必要であり、それぞれのプラスミドを用いたSupercoiling assay及びCleavage assayを行った。その結果、この組み替えDNAジャイレースはDNAジャイレース活性を持つことをin vitroで確認した。2)変異型組み替えDNAジャイレース遺伝子のクローニング及び発現と精製:平成25年度より得られた野生型の組み替えDNAジャイレース(H37Rv, Osaka株)の遺伝子を元にし、site-direct mutagenesis方法を用いて遺伝子変異を作成し、発現と精製を行った。3)組み替えDNAジャイレースの結晶化:平成25年度より得られた野生型組み替えDNAジャイレースの結晶化のスクリーニングを行い,いくつかの結晶が得られてこの結晶を用いて高エネルギー加速器研究機構においてX線回折データの収集を行った。本研究では、キノロン耐性結核菌の遺伝子変異検出を基盤とした迅速なニューキノロン感受性試験を可能とするために、キノロンのターケットである結核菌のDNAジャイレース上のアミノ酸置換とキノロン耐性との関係を明らかにすることで結核菌由来DNAジャイレースの立体構造解析から、新規抗結核薬の開発につながる新規キノロン誘導体のデザインを最終的な目標としている。平成27年度は以下の2つの研究を行った。1)北京株の変異株由来結核菌DNAジャイレースの酵素活性:26年度より得られた変異型(H37Rv標準株と北京株)の組換えDNAジャイレースを用いて酵素学的諸性質を決定することとともに、キノロン耐性獲得機構との関連について解析を行った。その結果、変異型DNAジャイレースは活性を持つことを確認した。さらにキノロンを加えた阻害実験を行った結果、キノロン耐性決定領域(QRDR)外側に存在している2つのアミノ酸残基(74番と95番目のアミノ酸残基)がキノロン耐性獲得に重要な役割を果たしていることを明らかにした。2)北京株由来結核菌DNAジャイレースの結晶化:26年度より得られた野性型DNAジャイレース(H37Rv標準株及び北京株)の結晶を用いて高エネルギー加速器研究機構においてX線回折データの収集を行った。回折データから結晶学的諸性質と統計値を求めた結果得られた結晶は立体構造の決定に適していることが示された。そこで、すでに報告されている結核菌標準株(H37Rv株)由来GyrA(N末部分)を用いて、分子置換法による北京株由来GyrA(N末部分)の立体構造決定を行った。

CCP4プログラム、並びにPHENIXプログラムを用いてモデルの構築と精密化を行い、最終的に2.1&#197;の分解能で北京株由来GyrA(N末部分)の立体構造を決定した。決定した北京株由来GyrA(N末部分)の立体構造をH37Rv株由来GyrA(N末部分)の立体構造と比較すると、N末端部分の構造が異なっていることを明らかにした。キノロン系抗菌薬は結核症の治療に有用であり、その標的部位はDNAジャイレースである。近年、キノロン系抗菌薬に耐性を示す結核菌の出現が問題となっており、DNAジャイレースの変異が耐性菌出現の要因となっている。DNAジャイレースの変異と耐性獲得機構の詳細な関連性を明らかにするためには、DNAジャイレースの立体構造情報が必要不可欠である。それで本研究では、結核菌由来DNAジャイレース上のアミノ酸置換とキノロン耐性との関係を明らかにすることで結核菌由来DNAジャイレースの立体構造を決定するとともに詳細な構造と機能の相関を明らかにすることを目的とした。1)野生型及び変異型の各タンパク質については活性を十分調べる濃度まで精製できた。2)組み替えDNAジャイレースの結晶化:平成26年度に得られた結核菌北京型(osaka株)由来DNAジャイレースA (GyrA)のN末部分(502残基分)結晶を用いて高エネルギー加速器研究機構においてX線回折データの収集を行った。回折データから結晶学的諸性質と統計値を求めた結果、得られた結晶は立体構造の決定に適していることが示された。そこで、すでに報告されている結核菌基準株(H37Rv株)由来GyrA (N末部分)の構造情報を用いて、分子置換法によるosaka株由来GyrA (N末部分)の立体構造決定を行った。最終的にosaka株由来GyrA (N末部分)の立体構造を決定した。細菌学、薬剤耐性結核学平成27年度は以下の2つの研究を進める。1)野生型及び変異型組み替えDNAジャイレースの酵素活性及び阻害実験:平成25年度と26年度より得られたそれぞれの組み替えDNAジャイレースを用いて酵素活性及びキノロンに対する阻害実験を行う。それで野生型と変異型の活性及びどんなメカニズムで阻害が出来るかを明らかにする。2) DNAジャイレースとニューキノロン剤との共結晶化:平成26年度で得られた結晶の条件を用いてosaka株由来DNAジャイレースとニューキノロン剤との共結晶ができる条件を検討させる。各タンパク質の野生型DNAジャイレースの結晶化ができ、DNAジャイレースとニューキノロン剤の共結晶の条件を検討している。平成27年度はDNAジャイレース活性及びキノロンが入った阻害実験を行う予定である。このDNAジャイレースの活性及び阻害実験に必要な試薬(Relaxed DNA, supercoiled DNA,キノロン剤など)が高いことで平成26年度の研究費から少し残した。平成26年度は以下に示す2つの研究を進める。
薬理学的安定化による脳動脈瘤破裂予防の研究

本研究は、腹部大動脈瘤においてその進展を妨げる肥満細胞の抑制が脳動脈瘤の破裂を予防するかを検証し、薬物による新しい脳動脈瘤の破裂予防法の開発を目指すものである。ラット腹部大動脈モデルにおいて、腹部大動脈瘤径の増大を抑制した、肥満細胞のケミカルメディエーター遊離抑制作用薬が、我々の脳動脈瘤マウスモデルにおいても同様に作用し、脳動脈瘤の破裂を予防するかを調べたところ、肥満細胞の抑制が、マウス脳動脈瘤モデルにおいても脳動脈瘤の破裂を抑制した。本研究結果は将来ヒトの脳動脈瘤破裂予防研究に応用できる可能性がある事を示唆するものである。脳動脈瘤を薬理学的に安定化させ、破裂を予防する為には、脳動脈瘤が自然経過で高率に破裂する動物モデルを用いる必要がある。そのため、本研究では代表者が米国留学中にその作成法を学んだ、UCSFの橋本らが開発した脳動脈瘤モデルを用いる事とした。代表者の所属する浜松医大の研究グループには、マウスの麻酔器具、モニター、手術器具、組織学的解析器具等は充実しているが、マウスの脳内にエラスターゼを微量注入する為の脳固定器とインジェクター等を新規に購入する必要があった。器械のセッティング、研究環境の整備等を行った上でマウス脳動脈瘤モデルの作成を行ったが、高率に脳動脈瘤が破裂するモデルを、再現性をもって作成するのには1年の月日を要した。2014年4月1日現在、モデルの作成は可能となり、薬剤を用いた本実験に移る直前まで準備が進んでいる。浜松医大での研究と並行して、UCSF橋本研究室との共同研究も進めている。マスト細胞の脳動脈瘤破裂における役割を探索する為に、マスト細胞欠損マウスに脳動脈瘤を誘導した。マスト細胞の欠損は脳動脈瘤の発生率に影響を及ぼさなかったが、破裂率を優位に減少させた。マスト細胞の顆粒内に含まれるキマーゼは、脱顆粒に伴い細胞外に放出され、MMPを活性化させることが知られている。脳動脈瘤におけるMMPの活性をin-situ zymographyを用いて測ったところ、マスト細胞欠損マウスにおいてはMMPの活性が低いという結果を得て、2013年10月米国麻酔科学会で発表した。Roles of Mast Cells in the Rupture of Intracranial Aneurysms.本研究は、腹部大動脈瘤においてその進展を妨げる肥満細胞の抑制が脳動脈瘤の破裂を予防するかを検証し、薬物による新しい脳動脈瘤の破裂予防法の開発を目指すものである。昨年度までに、研究器械の購入や習熟を行い、実実験に入る環境整備を整える事が出来た。本年度は、ラット腹部大動脈モデルにおいて、腹部大動脈瘤径の増大を抑制した、肥満細胞のケミカルメディエーター遊離抑制作用薬が、我々の脳動脈瘤マウスモデルにおいても同様に作用し、脳動脈瘤の破裂を予防するかを調べたところ、1)肥満細胞からのケミカルメディエーター阻害作用を持つトラニラストが脳動脈瘤の破裂率を下げた。2)同効薬であるDSCG(クロモリンナトリウム)も脳動脈瘤の破裂率を下げた。3)肥満細胞欠損マウスにおいてはワイルドタイプに比べ脳動脈瘤の破裂率が低い。との結果を得る事が出来た。一連の研究結果は肥満細胞の抑制が、マウス脳動脈瘤モデルにおいても脳動脈瘤の破裂を抑制する事を示し、ヒトの脳動脈瘤破裂予防研究に応用できる可能性がある事を示唆するものである。また、実験の精度を高めるために、マウス脳動脈瘤及びくも膜下出血の画像診断を実用化する研究を行った。マウスの脳動脈瘤は、その小ささゆえに、現在まで画像診断は困難とされてきたが、造影剤を注入し、マウスの脳血管系を描出した他者の先行研究がある。しかし、脳動脈瘤の発生・増大やくも膜下出血を経時的に評価する為には非侵襲的な画像診断法の開発が望まれる。我々の研究グループは、3テスラの臨床用MRIに小型サドルコイルを用い、撮像法を工夫する事で、MRAにて脳動脈瘤を、MRIT2強調画像でくも膜下出血を非侵襲的に描出する事に成功した。これは世界初の研究結果であるために、World Congress of Stroke 2014にて発表し、現在論文執筆中である。周術期管理医学器械のセッティング、研究環境の整備等を行った上でマウス脳動脈瘤モデルの作成を行ったが、高率に脳動脈瘤が破裂するモデルを、再現性をもって作成するのには1年の月日を要した。計画書通りにトラニラストを使う本実験まで進めなかった事は残念だが、モデルさえ出来上がれば、本実験はすぐに行える所まできているため、「やや遅れている」という評価とした今後、計画通りの薬剤を用いた実験を速やかに行っていく予定である。2013年度は、高い再現性を持ったモデルを効率的に作成するのに時間をとられ、トラニラストを用いた本実験に進めませんでした。
非線形予測子パラメータ族によるカオス時系列の非定常解析

決定論的カオスが,実在系に偏在する現象として認知されるに伴い,カオス時系列を解析するための新しい信号処理技術の開発が急ピッチで進んでいる。これまでに,様々のカオス時系列解析手法が開発され,その有効性が確認されてきたが,従来型のカオス時系列解析は,データの「定常性」を仮定した手法に基づいているため,実在系から計測されるカオス時系列の定常性を検定する手法を確立することが急務となっている。このようなカオス時系列の非定常性の問題に関して,昨年度は,「非線形予測子パラメータ族によるカオス時系列の非定常性解析手法」を開発した。今年度は,本開発手法を実在系のデータに応用し,以下のような研究成果を得た。1)「非線形予測子パラメータ族によるカオス時系列の非定常性解析手法」を病理音声信号に応用し,非定常信号から定常な病理音声信号を自動抽出し,非線形性の強さを計ることによって,病理音声の自動検出システムの開発を行なった。フンボルト大学・理論生物グループに短期滞在して共同研究を行い,病理音声解析の専門家の意見を取り入れることによって,実用性の高いシステムを構築した。2)乳幼児の心電位(ECG)信号の非定常非線形解析を行い,心拍異常がリミットサイクル的発振現象によって起こることを確認した。ポツダム大学・非線形力学グループに短期滞在し,共同研究の形式で研究を進めた。決定論的カオスが,実在系に偏在する現象として認知されるに伴い,カオス時系列を解析するための新しい信号処理技術の開発が急ピッチで進んでいる.これまでに,様々のカオス時系列解析手法が開発され,その有効性が確認されてきたが,従来型のカオス時系列解析は,「定常性」を仮定した時系列データに基づいて現象の定量化を試みるものが主流であった.しかし,現実に観測される実データに対しては,定常性の成立が必ずしも仮定できない状況がしばしば生じ,カオス時系列の解析結果が信頼性を著しく欠く場合が多く存在した.このため,実在系から計測されるカオス時系列の定常性を検定する手法を確立することが急務となっている.このようなカオス時系列の非定常性の問題に関して,今年度は,以下のような研究成果を得た.1.スイッチ点検出アルゴリズムの開発非定常カオス時系列は,計測中に分岐係数が複数の値の間をスイッチし,システムの質的状態が揺らぐシステムから生成される.このような非定常カオス時系列の背後に存在する分岐係数値を逆推定し,分岐係数値の変化するスイッチ点を検出するアルゴリズムを「非線形予測子パラメータ族の特異値解析手法」に基づいて開発した.比較的低次元のローレンツ方程式から高次元のマッケイグラス方程式まで,さまざまなカオス力学系を対象として,三点以上の分岐係数値の間をスイッチする非定常時系列に対して,スイッチ点を自動検出するアルゴリズムを開発した.2.レーザーデータへの応用1で開発したアルゴリズムをレーザーデータヘ適用し,実在系における有効性を確認した.決定論的カオスが,実在系に偏在する現象として認知されるに伴い,カオス時系列を解析するための新しい信号処理技術の開発が急ピッチで進んでいる。
政治経済的地域統合

A02班「政治経済的地域統合」では、国際社会における政治的、経済的地域統合体を単なる国家間の集合体とみずに、国際機関や市民社会、超国家的ネットワークなどの上位システムを含むグローバル社会における動向と国家主体内の多様な価値観から成るサブシステムとの相互作用の中で隆盛もしくは減退するものととらえ、その全体像を解明することを目的としている。1990年代後半より地域統合の動きは経済面でのグローバル化により相互依存関係の深化の象徴として顕著となったが、2010年代後半にはその反動としての「自国中心主義」の隆盛による地域統合体の「分断」的状況が欧州連合(EU)、東南アジア諸国連合(ASEAN)、アジア太平洋経済協力(APEC)を母体とした環太平洋パートナーシップ協定(TPP)において観察されている。さらに湾岸協力理事会(GCC)、アフリカ連合(AU)などの地域統合体も耳目を集めており、これらの地域統合を分析対象とし、その実態を把握するための統一的な分析枠組みの構築を目指している。具体的には、地域統合の突発的かつ階層縦断的な「分断」事由を「カタストロフィ理論」により類型化し、たとえば(1)権利主張の高まりによる分断(ASEAN、TPPなどに該当するという仮説)、(2)資源豊富国が他国から権利主張を受けた場合の分断(中東において該当するという仮説)、(3)資源非保有・貧困国が他国から権利主張を受けた場合の分断(中東において該当するという仮説)、(4)関係性を反転させることによる分断(EUが該当するという仮説)、などのように「地域統合分断」の仮設を提示した。すでにいくつかの個別研究に学理が反映されているが、今後はさらに地域統合の分断および促進についての学理を具体的な事例に即して検証し、新学術領域としての研究を推進していく予定である。主な研究活動の進捗状況としては、2018年9月には計画研究全体のセミナーを開催し、学理に基づいた地域統合の事例について分担者の皆様よりお話しいただいた。2018年12月にはセルビアにおける領域全体の国際シンポジウムにおいて計画研究A02のパネルセッションを設けていただき、地域統合の関係性をめぐる「学理」の試論として、政治経済的な「コスト」(地域統合内に共通の法規制に一律に従うことに関わる負担など)および「ベネフィット」(規模の経済性、対外的交渉力の増大など)が各階層間において許容しうる限度を超えた場合に、突発的に地域統合が分断されうる状況を提示した。また国家間関係が分断される原因および結果としての移民問題および南シナ海問題といったによるASEANの分断傾向など具体的な事例を学理(試論)に即して論じた。これらをふまえて、地域統合を巡る学理(試論)は領域全体のオンラインペーパーに提示した。今後は研究成果の叢書としての取りまとめに尽力していく予定である。また個別の研究では、2019年2月には宇都宮大学において国際シンポジウムを開催し、ジャコモ・ルキアーニ氏(ジュネーヴ国際開発高等研究所教授)より資源を巡るグローバルな情勢に関する研究報告を行っていただき、地域統合の分断・促進要因の考察を深めた。別の研究としては、ASEANを「分断」させる要因の1つともいえる「ロヒンギャ」と呼ばれる民族(もしくは難民)の問題に関するキンニュン・ミャンマー元首相の著作を、学理を含む解題付きで日本語にて刊行した。試論として提示した学理が地域統合の様々な地域および局面に適用可能であるかどうかの検証を個別研究で積み重ねていく。その際、新学術領域の研究たるべく、地域統合の分断を巡る仮説を定性的かつ定量的な手法で検証していく計画である。研究成果は叢書の一部としての刊行を見すえており、テーマ設定を具体的に列挙すると、次の通りである。「政治経済的地域統合の学理:カタストロフィ理論とソシオン理論の接合として」、「アジア太平洋における重層的な地域経済統合」、「事実上の地域統合としての物品貿易と模造品貿易」、「東南アジア諸国連合(ASEAN)の地域統合と南シナ海問題」、「ASEANの縮図としての多民族国家ミャンマーの統合と開発」、「中東地域における政治経済的な非統合の現状:主体の多義性を中心に」、「資源を紐帯とした地域統合の可能性:中東の事例を中心に」、「アフリカにおける地域統合:アフリカ大陸自由貿易協定の可能性」、「欧州連合(EU)を巡る地域統合の諸課題:中心ー周辺の関係から」、「日中韓の経済連携の可能性」、「朝鮮半島における地域統合(南北統一)の可能性」、「中国の地域統合戦略としての一帯一路」、「地域的統合についての多次元的理論ー幸福研究に基づく心理的関係性と地理的階層性の動態的分析」、「企業の異質性と地域統合:東アジアにおける海外進出企業の実態分析」、「地域統合を巡るテキスト解析:関係性の可視化と定量化を中心に」。いずれのトピックにおいても、「多義的な主体」(文脈により違った意味合いの主体と捉えられる存在)が地域統合という関係性を維持することと分断させる(離脱する)ことの政治・経済・心理的なコストおよび便益の比較考量により地域統合の離合集散が決定されている様相を具体的に描き出すことを目指していく。政治経済的地域統合のマクロ的な現状形成の要因として、さらに下部階層のメソ・ミクロ的主体間(例えば企業間、政治的集団間、民族間)の関係性に着目することで、統合の阻害要因を詳細に分析した。年度前半には地域統合の阻害要因と関係性に関する個別論文執筆を共同で開始し、これを受けて、11月には東南アジア諸国連合(ASEAN)の関係性分断の要因分析を主題に国際シンポジウムを開催し、所得格差、政治信条の違いおよび国内の諸民族間の差異性が政治経済的地域統合の分断要因となっている点を検証した。

同シンポジウムでは、ASEAN開発のための国際機関代表、日本における政治難民第1号の方および在日ミャンマー人・留学生らを招聘し、シンポジウムでの登壇およびセミナー開催を行った。これらの成果を年度末に研究図書として刊行した。またASEANの一国・ミャンマーに注目し、同国の軍政時代に民主化を画策しアウンサンスーチー氏と対話の窓口を務めたキンニュン元首相と首都ヤンゴンにて面談を行い、ミャンマーの「民主化ロードマップ」およびいわゆる「ロヒンギャ問題」(ミャンマー国内の「難民」もしくは認定されていない「少数民族」の扱いを巡る課題)について聴取を行い、関係性の考察を開始した。さらに、いわゆる「ポピュリズム」の世界規模での台頭について研究メンバーが研究書籍を刊行し、「グローバル関係性」構築のための重要な研究努力を行った。アジア太平洋地域(南シナ海の国境問題を含む)およびアフリカ地域における地域統合・開発を巡る関係性に関するセミナーも開催し、来年度に刊行予定の階層的関係性を重視した研究のための準備を行った。またAPEC、日本ASEANセンター、東アジア・ASEAN経済研究センターなどの国際機関、および日本の外務省、経済産業研究所等からの共同研究依頼を受けて、企業レベルの関係性に関する統計分析を行った。政治経済的地域統合の阻害要因と促進要因を新たな概念構築と事例分析の双方により進めている。概念的な面においては、「関係性」と階層構造の「メタ理論」について考察している。階層構造とは、いくつかの層が入れ子となった構造を意味し、個人→家計→民族や地方自治体→国家→国家統合体→政治経済的地域統合体といった各層の主体間および内部における相互作用を意識的にとらえて地球全域を考察の対象として分析中である。地域統合を巡る議論には、所得、民族、宗教などの諸側面において階層的な主体間の関係性が「慣性力」として存在するが、ある層での主体間の「粘着力」が低くなると、上位の層における社会的「乱流」状態に至り、それが移民や難民、テロや経済危機といった形で表現される状況に至る、ととらえることができる。社会的な「慣性力」と「粘着力」とは深く関係している点を注視して考察を行っている。「一国第一主義」という「慣性力」が国家を構成する業界・市民団体や企業同士のつながり、すなわぎ「粘着力」の弱いところで分断されてしまう状況は、たとえば米国のトランプ政権と環太平洋パートナーシップ協定(TPP)の成否、および国内の所得格差是正を巡る論戦のありようについての考察にそのまま援用可能と思われる。今後はさらに地域統合をめぐる「ミクロ」「メソ」「マクロ」の「階層性」を考慮した主体間の「関係性」について、ASEANを巡る地域統合(ミャンマーにおける国家統合の動向を含む)や日中韓の東アジアにおける地域統合の可能性(朝鮮半島の統一問題も含む)などを事例に、さらに具体的な研究をしている。分析手法的には、質的差異を伴った主体間の関係性を分析するための新たな統計手法である「マルチレベル分析」、および質的な解析として、経済・社会体制(冷戦下の東西対立を含む)に関する言説分析のためのソフトを活用し、関係性のマッピングを試みている。
インフルエンザウイルス・肺炎球菌重複感染マウスにおけるマクロライド系抗菌薬の効果

インフルエンザウイルス感染後の二次性細菌性肺炎はインフルエンザウイルス感染症の最も重要な合併症の一つである。また、マクロライド系抗菌薬(MCLs)は、抗菌活性以外にも免疫調節機能、抗ウイルス作用などを持つことについて注目されている。今回、インフルエンザウイルス感染後に肺炎球菌を感染させた二次性肺炎マウスモデルを用いてMCLsの二次性細菌性肺炎の重症化における抑制効果を検討した。MCLsはTh1サイトカインであるIL-12、IFN-γを誘導させ、肺炎球菌の気道定着因子であるPAFレセプターの発現を抑制させることにより、生存期間を延長させる効果を持つと考えられた。我々にとって最も身近な感染症の一つとして、インフルエンザ感染症が挙げられるが、インフルエンザウイルス感染後の二次性細菌性肺炎はインフルエンザウイルス感染症の最も重要な合併症の一つである。また、マクロライド系抗菌薬(MCLs)の薬理作用として、抗菌活性以外にも直接的な抗インフルエンザ作用などをもつことも報告されているが、我々はインフルエンザウイルス感染後に肺炎球菌を感染させる二次性重症肺炎マウスモデルを作成し、そのモデルを用いてMCLsの二次性細菌性肺炎の重症化における抑制効果を検討している。また、以上の研究内容を、平成25年1月12日に博多にて開催された第12回肺分子病態研究会にて発表した。もっとも代表的な感染症の一つとして、インフルエンザウイルス感染症が挙げられるが、インフルエンザウイルス感染後の二次性細菌性肺炎はインフルエンザウイルス感染症の最も重要な合併症の一つである。また、マクロライド系抗菌薬(MCLs)の薬理作用として、抗菌活性以外にも直接的な抗インフルエンザ作用などをもつことも報告されているが、我々はインフルエンザウイルス感染後に肺炎球菌を感染させる二次性重症肺炎マウスモデルを作成し、そのモデルを用いてMCLsの二次性細菌性肺炎の重症化における抑制効果を検討した。SPF雄性6週齢CBA/JNマウスにDay0にインフルエンザウイルス、Day4に肺炎球菌を重複感染させた二次性肺炎モデルを作成。このモデルに対してクラリスロマイシン(CAM)を10日間(Day-7Day3)連日経口投与したところ、CAMは二次性肺炎モデルにおいて、生存期間の延長及び体重減少を遅らせる効果が認められた。その機序を調べるために、Day6における肺ホモジネートのサイトカイン濃度を測定したところ、Th1サイトカインであるIL-12、IFN-γを増加させる傾向が認められた。また、肺炎球菌の気道への定着因子であるPAFレセプターにも着目し、Day4におけるPAFレセプターのmRNA発現をリアルタイムPCR法を用いて測定したところ、CAMはPAFレセプター発現を抑制させる傾向が認められた。これらの結果から、インフルエンザウイルス感染後の二次性細菌性肺炎モデルにおいて、CAMはIL-12、IFN-γを誘導し、PAFレセプター発現を抑制することにより、重症化を抑制すると考えられた。現在はより臨床的なモデルとしてCOPDマウスモデルを作成し、上記と同様の研究を行っている。【(1)インフルエンザウイルス・肺炎球菌重複感染マウスモデル作成】SPF雄性6週齢CBA/Jマウスにインフルエンザウイルス(A/PR8/34)を経鼻感染させ、その4日(96時間)後に肺炎球菌を経鼻感染させ、インフルエンザウイルス・肺炎球菌重複感染マウスモデル(以下、重複感染マウスモデル)を作成した。今年度はインフルエンザウイルス(A/PR8/34)とペニシリン感受性肺炎球菌の重複感染マウスモデルを完成し、単独感染群より生存率が低下することを確認した。【(2)重複感染マウスモデルにおけるMCLsの効果検討】インフルエンザウイルス感染1週間前より、マクロライド系抗菌薬であるクラリスロマイシン(CAM)の投与を開始し、肺炎球菌感染24時間前(肺炎球菌への直接的な抗菌作用は関与しない)までの計10日間投与し、CAM投与群と非投与群とを比較検討した。[(2)-1]生存率及び体重減少率:同感染モデルをCAM投与群と非投与群に分け、生存率及び体重減少率を検討したところ、CAM投与群で生存率が高く、体重減少率も有意に改善した。[(2)-2]インフルエンザ感染6日後(肺炎球菌感染2日後)の病理および気管支肺胞洗浄液の解析:インフルエンザウイルス感染6日後(肺炎球菌感染2日後)に重複感染マウスを屠殺し、肺組織をHE染色し、肺炎の重症度を評価した。また、肺炎球菌接着因子として報告されているPAFレセプターはインフエンザ感染後に増加し、免疫組織化学染色による肺組織のPAFレセプターの発現に関しても、その分布とMCLsの効果についても検討した。HE染色では、重複感染群において高度の炎症細胞浸潤が認められたが、MCLsの効果はHE染色上は有意ではなかった。

しかし、PAFレセプターの発現に関しては、重複感染モデルにおいて、CAM投与群は同発現が低下していたことが判明した。我々は重複感染モデルマウスに対して14員環MCLs・クラリスロマイシン(CAM)を投与した群と非CAM投与群で生存率および体重変化について検討し、CAM投与により有意に生存率改善、体重減少抑制を認めていた。また、その後の検討で重複感染マウスの感染6日後のホモジネート肺の上清を用いて、サイトカイン(TNF-α、IL-1β、-2、-4、-5、-6、-10、-12、IFN-γ、MIP-2、GM-CSF)を測定したところ、Th1系サイトカインであるIL-12、IFN-γにおいてCAM投与群において上昇する傾向が認められた。CAMによりIL-12を誘導することによってインフルエンザ肺炎の重症化を抑制することが出来たとの報告もあり、重複感染マウスにおいても同様の機序が関係した可能性が示唆された。現在では、その機序の一つとして、PAFレセプター(血小板活性化因子レセプター)に着目し、リアルタイムPCR法などを用いてCAMの作用機序の解明に努めている。(理由)インフルエンザウイルス・肺炎球菌の重複感染マウスモデルの作成と、同モデルにおけるMCLsの生存率、体重減少率改善効果を確認できた。そのMCLsが有する重症化抑制作用機序に関して、肺組織におけるHE染色およびPAFレセプターの免疫組織化学染色を行い、肺炎球菌接着因子であるPAFレセプターへのMCLsの効果について注目し、次年度はさらに詳細な検討を行う予定としている。当初の計画に沿って、おおむね順調に進展していると考えている。平成23年度にはインフルエンザおよび肺炎球菌の重複感染マウスモデルに対してマクロライド系抗菌薬を投与し、生存期間の延長効果および体重減少率の抑制効果を認めた。また、肺ホモジネートにおける各種サイトカインの測定を行った。平成24年度にはインフルエンザ感染後のPAFレセプター発現に対するマクロライド系抗菌薬の効果について、リアルタイムPCR法を用いて検討を行った。ここまでの研究内容を平成25年5月に学会にて発表予定であるが、マウスを用いたデータでは有意差を認めないものもあったため、追加実験としてA549細胞を用いて感染実験を行い、PAFレセプターの発現についてマクロライド系抗菌薬の効果も含めて検討することとした。(今後の推進方策)平成23年度の検討結果から、インフルエンザウイルスおよび肺炎球菌の重複感染マウスモデルにおいて、MCLsの重症抑制効果が示唆された。また、PAFレセプターに対するMCLsの効果は、MCLsの重症抑制効果のひとつの機序としてさらなる検討が必要であり、インフルエンザウイルス感染後の経時的な評価などを追加検討していく予定である。さらに、MCLsの抗炎症作用に着目し、ホモジネート肺におけるサイトカインやケモカインについてELISA法やLuminex法を用いて検討する予定である。ウイルス、細胞、マウス、研究用試薬などの追加購入が必要となり、未使用額はその経費に充てることとする。