hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
延髄腹側表層神経組織の呼吸リズム発生・制御にはたす役割

呼吸に関する化学感受性機構の少なくとも一部は延髄腹側表層に存在するとされている。本研究ではこの延髄腹側表層の神経組織が、呼吸リズムの発生・制御にどのような役割を演じるかを検討した。麻酔ラットの延髄腹側表層に存在するNucl parapyramidalis superficialis部を両側性に冷却し、横隔神経と舌咽神経(茎突咽頭筋枝)の吸息性活動に及ぼす影響を解析した。舌咽神経の吸息性活動は横隔神経活動に比べて、種々の呼吸抑制因子によって抑制されにくく呼吸中枢活動を知るための重要な指標である。舌咽神経(茎突咽頭筋枝)の運動ニューロン分布部位についても神経組織学的に検索した。また、この実験の基本条件としての麻酔下動物の生体内酸素状態管理に必要な測定技術および評価法を開発した。延髄腹側表層に26-24°Cに冷却すると、横隔神経活動は低下消失したが、舌咽神経の吸息性活動は残存した。20-22°Cに冷却すると舌咽神経活動も消失し、呼吸リズム発生は停止したと判断された。冷却からの回復時には、先ず、舌咽神経に吸息性活動が出現し、横隔神経活動の回復は遅延した。これらは迷走神経切断・人工呼吸下に得られたが、迷走神経を切断せずに人工呼吸した場合にも全く同様の結果が得られた。また、肺の進展による吸息抑制反射効果も横隔神経より舌咽神経で弱いことも判明した。以上より、呼吸リズムの発生に延髄腹側表層からのdrivesが不可欠であると考えられる。このdrivesが延髄腹側表層の化学感受性組織のみに由来するか、あるいは化学感受性とは関連しないものかについてはさらに検討する必要がある。また、横隔神経活動の停止が必ずしも延髄内における呼吸リズム発生の停止を意味しないことも判明した。従来より、上気道筋支配の脳神経運動ニューロンの呼吸性活動は麻酔などの呼吸抑制因子によって抑制されやすいことが報告されてきた。しかし、舌咽神経茎突咽頭筋枝の運動ニューロンについては、このニューロン自体の特性、または、呼吸リズム形成機構との神経回路が特異な性質をもつと考えられ、呼吸中枢活動を現す重要なニューロン群と考えられ、今後舌咽神経茎突咽頭筋枝の運動ニューロンの形態的・機能的特性を検討しなければならない。延髄腹側表層には呼吸に関する化学感受性領野が存在し、同野CO_2/H^+による刺激は呼吸を促進すると考えられている。さらに同野は呼吸リズム発生にも重要な役割を演じると推測されている。しかし、延髄腹側表層の神経組織学的構造の詳細や呼吸リズム発生機構との関連は不明である。本研究では麻酔ラットを用いて延髄腹側表層神経組織の呼吸リズム発生機序への関与について以下の知見が得られた。1呼吸中枢におけるリズムの発生状況を観察・記録するためには、従来から用いられている横隔神経(Phr)の吸息性発射活動よりも各種呼吸抑制因子に対して抵抗性のある舌咽神経(茎突咽頭筋枝、IXsty)の吸息性活動を指標にすべきことを明らかにした。

2錐体路外縁の延髄腹側表層に存在するNucl.parapyramid.superf.(Fukudaら1993)を両側性に局所冷却すると(28-25°C)、先ず、Phrの吸息性活動が停止するが、IXstyには小さな吸息性活動が残存する。これも20-24°Cで停止し、完全な呼吸リズムの停止に至る。回復時には、先ずIXstyにのみ小さな吸息性活動が現われる。ついで吸息性活動の後半部分の活動が著しく増加するとPhrにも吸息性活動が出現する。すなわち、延髄の呼吸リズム形成機構においては、IXstyにのみ現われるようなわずかな吸息性活動が先ず発生し、これが引き金となってPhrとIXstyに同期した吸息性活動が発生すると考えられる。両過程が発生するためには延髄腹側表層からの緊張性信号が必要であると推測された。3茎突咽頭節にHRPあるいはCholera toxinを局注し運動ニューロンの延髄内分布を検索したところ、IXstyの運動ニューロンは顔面神経核の背側、疑核の頭側に吻尾側方向に細長く分布していた。これらの運動ニューロンは解剖学的・機能的に呼吸リズム形成機構に近接して存在すると考えられた。平成5年度に引き続き麻酔ラット延髄腹側表層の局所冷却による呼吸リズ変化を観察した。とくに舌咽神経(茎突咽頭筋枝)と横隔神経の吸息性活動の変化を比較検討した。また、茎突咽頭筋にhorseradish peroxidase(HRP)またはcholera-toxin-Bsubunit-HRPを局所注入した後、24-26時間生存させ、逆行性にこれらの物質を細胞体まで取り込ませた。その後運動ニューロンの延髄内における局在部位を神経組織学的に検索した。さらに、両側迷走神経をintactのまま人工呼吸し、肺伸展による呼吸抑制の様相についても観察した。これらから以下の知見を得た。延髄腹側表層の冷却(26-20°C)による吸息性活動の抑制は舌咽神経よりも横隔神経に顕著であり、横隔神経発射が停止して(26-24°C)も舌咽神経には吸息性活動が残存した。舌咽神経の活動は20-22°Cで停止した。さらに、冷却からの回復時には、まず舌咽神経の吸息性活動が現れ、横隔神経発射の回復は遅延した。舌咽神経茎突咽頭筋の運動ニューロンは疑核の最頭側、顔面神経核の後内側に吻尾側方向に細長く分布していた。この分布域は呼吸リズム形成ニューロン群が存在すると想定されているBotzinger complexまたはpre-Botzinger comlexに近接している。一個体の平均ニューロン数は32個であった。樹状突起の多くは延髄腹側方向に認められた。肺伸展による呼吸抑制(Hering-Breuerの吸息抑制反射)時にも舌咽神経活動は横隔神経活動より抑制されにくかった。すなわち、気道内圧上昇による肺伸展によって横隔神経発射が停止してもなお舌咽神経には吸息性活動が残存した。したがって、肺伸展によるslowly adapting stretch receptor刺激の吸息抑制効果に対しても、舌咽神経の運動ニューロンは抑制されにくいことが判明した。以上より、舌咽神経茎突咽頭筋の吸息性運動ニューロン活動は種々の呼吸抑制因子によって制されにくく、中枢における呼吸リズム形成機序を解析する上で重要な指標であると考えられた。また、呼吸リズムが形成されるためには延髄腹側表層組織からのdrivesが不可欠と判断された。
細胞の極性を制御するリン酸化シグナルの解明

極性の獲得とその維持はそれに基づく生体の生理機能維持のために重要であり、Par遺伝子群を代表とする多数の極性制御因子の研究が進んでいる。本研究では、極性因子下流のシグナル伝達経路に多数存在するプロテインキナーゼの基質探索とその生理機能の解明を行った。独自に開発したキナーゼ特異的基質の探索法により多数の極性関連キナーゼの基質候補を得た。また、得られた基質のリン酸化について極性形成過程における時間空間的なプロファイリング、機能抑制型もしくはリン酸化部位の変異体等を用いた生理機能の解析を行い、神経軸索決定機構、細胞移動制御機構における極性関連キナーゼとその基質の役割を明らかにした。3.新規基質の細胞内におけるリン酸化プロファイリング(担当:貝淵、渡辺、天野、西岡):KISS法で得られた基質候補について、リン酸化抗体精製および感度の確認を行った。また、生体試料より対象となる蛋白質を免疫沈降し、質量分析にてリン酸化ペプチドを解析する系を立ちあげ、この系によりリン酸化がモニターできることを確認した。4.新規基質の生理機能・制御機構の解析(担当:貝淵、渡辺、天野、西岡):得られた基質候補についてパスウェイ解析を行い、微小管形成に関与する可能性の高い基質候補のリン酸化部位の変異遺伝子や変異蛋白質を作製した。(3)新規基質の細胞内におけるリン酸化プロファイリング(担当:貝淵、天野、西岡、黒田、中牟田): KISS法及びPIKISS法で得られた極性関連分子のリン酸化抗体に関しては、Kif2A Ser135、Ser135/137抗体を新たに精製し、Tiam1 Ser29のモルモット由来抗体を新たに作成した。これらKif2ASer135、Ser135/137、Tiam1 Ser29、CLASP2 Ser940を用いて細胞極性化時のリン酸化のモニタリングを行った。(4)新規基質の生理機能・制御機構の解析(担当:貝淵、天野、黒田、中牟田):極性関連基質候補Tiam1、CLASP、KIF2a等についてはリン酸化部位の変異遺伝子や変異蛋白質を作製し、上述したリン酸化抗体と併用して細胞内局在の顕微観察及び機能解析を行った。(3)新規基質の細胞内におけるリン酸化プロファイリング(担当:貝淵、天野、西岡、黒田、中牟田、船橋):作成したKISS法及びPIKISS法で同定した極性関連分子のリン酸化部位特異的な抗リン酸化抗体Tiam1 pS29、Kif2a pS135を用いたモニタリングによりこれらリン酸化の細胞極性制御機構を解析した。(4)新規基質の生理機能・制御機構の解析(担当:貝淵、天野、西岡、黒田、中牟田、船橋):極性関連分子Tiam1、Kif2a等について、上記抗リン酸化抗体や導入した変異遺伝子の解析等により、細胞内機能解析を行いこれら分子のリン酸化による細胞極性制御機構を明らかにした。(3)新規基質の細胞内におけるリン酸化プロファイリング(担当:貝淵、天野、西岡、黒田、中牟田): KISS法及びPIKISS法で得られた極性関連分子のリン酸化抗体に関しては、作成、精製した抗体の感度・特異性はその後の研究用の使用に耐えるものであることの確認ができ、抗体を使用した研究も順調に進行している。(4)新規基質の生理機能・制御機構の解析(担当:貝淵、天野、西岡、黒田、中牟田):極性関連基質の変異蛋白質の発現・精製は順調であり、上述したリン酸化抗体を併用した機能解析実験も順調に進行している。27年度が最終年度であるため、記入しない。生物学(1)Kinase-interacting substratescreening (KISS)法によるキナーゼ基質のスクリーニング:当研究室で開発したアフィニティカラム上のキナーゼ基質複合体を基質リン酸化反応後、LC-MS/MSにより多数の基質とそのリン酸化サイトを決定する方法(KISS法)によるPAK1等の極性関連キナーゼのスクリーニングを行う。aPKC、MARK1等の得られた基質候補数が少ないものについて、キナーゼタンパク質や反応条件の改変により更なる基質候補分子の同定を行う。(3)新規基質の細胞内におけるリン酸化プロファイリング:昨年度までの基質スクリーニングで得られた基質候補について、免疫沈降後のリン酸化ペプチドの質量分析によりリン酸化の変動をモニターする。同時に生理的に重要と予想される蛋白質のリン酸化部位についてリン酸化抗体作製に着手する。(4)新規基質の生理機能・制御機構の解析:基質候補について、in silicoにてパスウェイ解析を行い、シグナルネットワーク内の役割を検討する。また、リン酸化部位の変異遺伝子や変異蛋白質を作製し、細胞内局在の顕微観察及び機能解析を行う。細胞において基質蛋白質の機能抑制、変異型遺伝子による機能回復実験を行うことで、極性形成過程におけるリン酸化シグナルの生理的意義を調べる。(1)Kinase-interacting substrate

screening (KISS)法によるキナーゼ基質のスクリーニング:極性関連キナーゼRho-kinase, aPKC, PAK, Cdk5のリコンビナントタンパク質精製およびKISS法による基質の網羅的スクリーニングは順調に進捗しており、Rho-kinase, aPKC, PAK7, Cdk5についてそれぞれ113、15、78、190の基質候補を得ている。(2)Phosphatase Inhibitor and Kinase Inhibitor Substrate Screening (PIKISS)法によるキナーゼ基質のスクリーニング:PIKISS法のためのリン酸化酵素阻害剤の処理条件の最適化はaPKC、GSK3betaについては完了し、サンプル数を増やしてリン酸化基質のデータを増加していく段階に達している。そのほかの極性関連キナーゼの阻害剤について細胞処理の最適化を行っている。(3)新規基質の細胞内におけるリン酸化プロファイリング:KISS法及びPIKISS法で得られた極性関連分子についてリン酸化抗体を作成し、Tiam1 Ser29、CLASP2 Ser940の抗体を精製した。また、KIF2aリン酸化抗体を作成中である。KIF2aについては蛋白質を免疫沈降し、質量分析にてリン酸化ペプチドを解析する系を立ちあげ、この系によるリン酸化モニターを行っている。(4)新規基質の生理機能・制御機構の解析:得られた極性関連基質候補Tiam1、CLASP、KIF2a等についてはリン酸化部位の変異遺伝子や変異蛋白質を作製した。27年度が最終年度であるため、記入しない。(1)Kinase-interacting substratescreening (KISS)法によるキナーゼ基質のスクリーニング:KISS法によりスクリーニングを行う極性関連キナーゼをさらに増やし、LKB、MARK等についての網羅的スクリーニングを行う。また、aPKCのようにスクリーニングの結果得られた基質候補の数が少ないキナーゼについては、キナーゼの基質選択性、分子構造を考慮したリコンビナントタンパク質の改変等により基質候補分子の更なる同定を行っていく。(3)新規基質の細胞内におけるリン酸化プロファイリング:Tiam1、CLASP、KIF2a以外のKISS法及びPIKISS法で得られた極性関連分子についてもリン酸化抗体を作成を行っていく。抗体の作成のためのリン酸化部位の選別と抗体作成期間中の研究に質量分析によるリン酸化モニターを利用することで研究の効率化、高速化をはかる。(4)新規基質の生理機能・制御機構の解析:得られた基質候補については順次in silicoにてパスウェイ解析を行い、キナーゼとその基質がどのようなシグナルネットワークに帰属するか検討する。また、Tiam1、CLASP、KIF2aについて作成したリン酸化部位の変異遺伝子や変異蛋白質、リン酸化抗体をもちいて、細胞内局在の顕微観察及び機能解析を行う。細胞において基質蛋白質の機能抑制を行い、野生型リン酸化部位の変異型遺伝子による機能回復実験を行うことで、極性形成過程におけるリン酸化シグナルの生理的意義を調べる。
改変の詩学と政治学-ハーディ後期小説に施された改稿の分析

家庭向けの雑誌で一旦脱色されたエロスは大抵の場合、版本において復元されたというのが研究者に広く流布するトマス・ハーディの改変の文法だが、本研究ではこの文法を吟味・検討し、それが必ずしもすべての小説にあてはまるわけではないことを論証した。具体的に分析の俎上に載せたのは、後期の小説『カースタブリッジの町長』(The Mayor of Casterbridge)の原稿を始めとする未定稿-初出、初版、第2版、1895年版-および最終稿(1912年版)で、これらのすべてのヴァージョンを比較・検討することで、この小説を律するのが広く流布する改変の文法ではないこと、むしろ独自の改変の文法があることを明らかにした。またハーディ書誌学にあって改変は専ら通時的観点から論じられる傾向にあり、共時的観点から論の俎上に載ることがほとんどなかった。改変の相互連関や相互反照といったテクスト読解にとって興味深いと思われる点は不問に付され、そのためハーディ研究において書誌学的成果はほとんどテクスト分析に活かされてこなかったと言える。本研究では、『カースタブリッジの町長』および『ダーバヴィル家のテス』(Tess of the d'Urbervilles)に施された改変を共時的観点から分析し、最終的には、改変によって生じたテクストの亀裂や空白、あるいは撞着する語りに焦点を当てながら、二作を読み直した。そうすることで、新たな分析アプローチの提示をも試みた。なお『ダーバヴィル家のテス』を分析する際に取り上げたのは、原稿、初出、初版、第5版、1895年版、1900年版、1912年版である。トマス・ハーディは家庭向けの雑誌では性的な表現や挿話を削除・修正したが、版本ではそのほとんどを原稿どおりに復元したというのが、研究者の間に広く流布するハーディの改変の政治学である。本研究では、その改変の政治学がハーディ小説のすべてを統べるわけではなく、それから逸脱したハーディ小説があることを論証するのを最終目的としている。その目的を達成するべく、本年度では『カスタブリッジの町長』を分析の俎上に載せることとした。本年度ではまず、この小説の原稿をマイクロフィルムのかたちで入手し、およそ500葉のうちの300葉を解読した。改稿の相互連関や相互反照といったテクスト読解にとって興味深いと思われる点は不問に附され、そのためハーディ研究において書誌学的成果はほとんどテクスト分析に活かされてこなかったと言える。本研究では、『カスタブリッジの町長』に施された改変を共時的観点から分析し、改稿によって生じたテクストの亀裂や空白、あるいは撞着する語りに焦点を当てながら、この小説を読み直すことも目標としている。今年度はその手始めとして、『カスタブリッジの町長』に施された改稿(一部ではあるが)の意味効果を分析し、研究成果を論文「父娘の絆-『カスタブリッジの町長』のテクストを読む」として纏めた。本研究では、そうした改変の政治学がハーディ小説の全てを統べるわけではなく、独自の改変の文法を持つ小説--『カスタブリッジの町長』--があることを論証するのを最終目的としている。本年度はまず昨年度同様、この小説の草稿解読に専念し、草稿解読を終えることが出来た。来年度は、初出誌から最終稿へ至る活字テクストの分析に移行するため、現在はヴァリアントを収集している。

またハーディ研究において改変は専ら通時的観点から論じられる傾向にあり、共時的観点から論の俎上に載せられることがほとんどなかった。改稿の相互連関や相互反照といったテクスト読解にとって興味深いと思われる点は不問に附され、そのためハーディ研究において書誌学的成果はほとんどテクスト分析に活かされてこなかったと言える。本研究では『町長』に施された改変を共時的観点から分析し、改稿によって生じたテクストの亀裂や空白、あるいは撞着する語りに焦点を当てながら読み返すことも目標としている。そこで現在は、改変によって生じた意味効果に注目しながら、『町長』論を執筆している。また『町長』固有の改変の詩学を明確にするため、本年度はハーディの他の後期小説も分析することとした。取り上げたのは『ダーバヴィル家のテス』で、この小説の改変およびその意味効果に注目しながら『テス』を読み返すという作業を行った。なお研究成果は「改変の剰余価値をめぐって」と題した論文として纏め、日本ハーディ協会大会シンポジウム「再び『テス』の再読」(2006年10月28日,於大阪学院大学)において発表した。トマス・ハーディは家庭向けの雑誌では性的な表現や挿話を削除・修正したが、版本ではそのほとんどを原稿どおりに復元したというのが、研究者の間に広く流布するハーディの改変の政治学である。本研究では、そうした改変の政治学がハーディの小説全てを統べるわけではなく、独自の改変の文法を持つ小説--『カスタブリッジの町長』--があることを論証するのを最終目的としている。本年度は、この小説の活字テクストの校合分析に専念し、すべての異同をコンピュタ化・データ化した。現在は、この小説に固有の改変の文法を析出している。改変の相互連関や相互反照といったテクスト読解にとって興味深いと思われる点は不問に付され、そのためハーディ研究において書誌学的成果はほとんどテクスト分析に活かされてこなかったと言える。本研究では『町長』に施された改変を共時的観点から分析し、改変によって生じたテクストの亀裂や空白、あるいは撞着する語りに焦点を当てながら読み返すことも目標としている。改変によって生じた意味効果に注目しながら、現在、『町長』論を執筆している。また『町長』に固有の改変の詩学を明確にするため、本年度はハーディの他の小説も分析することとした。取り上げたのは『狂乱の群れをはなれて』で、この小説の改変およびその意味効果に注目しながら『狂乱』を読み返すという作業を行った。なお研究成果は「『狂乱の群れをはなれて』--『コーンヒル』誌の検閲に抗して」と題した論文として纏めた(日本トマス・ハーディ協会編『トマス・ハーディ全貌』、音羽書房鶴見書店、2007)。
文文法と談話解釈の接点としての文主題の形式意味論的研究

本研究は、日本語や英語における主題標示の比較を通じて(1)主題はどのように標示されるのか、(2)主題の標示は文脈にどのような変化をもたらすのか、という2つの問題に通言語学的な観点から取り組むものである。従来の分析における記述的一般化の多くは、文脈から切り離された文の容認可能性に基づくものであり言語事実を正確には反映していない。質疑応答など言語的・非言語的文脈を付加した例文の解釈をもとに主題の解釈とその言語的具現化を考察した結果、次のような提案がなされた。1.「主題」と「対比」は独立した2つの解釈である。2.主題の「は」は命題外の文内演算子と結合し発話行為のレベルにおける代替値間の対立を表す。対比の「は」は命題の内部に現れ命題の表す事実レベルでの対立を表す。3.「主題」の解釈には文法関係や統語位置など文文法による制約が大きく、純粋に意味論的な定義は不可能である.「対比」の解釈は基本的に強勢や文脈など文文法外の要因に支配される。4.主題は必ずしも定名詞句である必要はないが特定の指示対象の存在は前提とする。対比には、このような制限はない。5.英語のBアクセントは、「対比」を表す.したがって、Bアクセントの観察に基づいたBuring(1995)やRoberts(1996)などによる「対照的主題」の形式語用論的分析を、そのまま「主題」の意味論として採用することはできない。英語やドイツ語には、明示的な主題の表現形式は存在しない。6.主題には先行文脈との調和を示すだけでなく、後続する文脈の展開を方向付ける働きもある。個々の文脈における主題解釈の可能性を説明するには、文法の各部門の相互作用と言語形式の競合を扱う必要がある。包括的な理論を構築するためには最適化理論のような枠組が必要となる。本研究は、日本語や英語の典型的な主題表示の形式のもつ意味論・語用論を考察し、両者の比較を通じて(1)主題はどのように標示されるのか、(2)主題の標示は文脈にどのような変化をもたらすのか、という2つの問題に通言語学的な観点から取り組むものである.本年度は、日本語の「は」表す「主題」と「対比」を中心に分析をすすめ、その意味論を「構造化された意味(structured meanings)」の枠組みにより特徴づけた.その過程でえられた知見には次のようなものがある.1.「は」の表す「主題」と「対比」は独立した2つの解釈であり、一方から他方を派生させたり両者を段階的範疇と仮定するような分析には問題がある.「は」の解釈には「主題」、「対比」、「主題+対比」の3通りの可能性があり、「主題」の解釈には文法関係や統語位置など文文法による制約が大きい.一方、「対比」の解釈は基本的に強勢や文脈など外的な要因を必要とするが、「主題」の解釈が不可能な場合にはグライスの法則に基づき文脈の修復が試みられる.2.従来の分析における記述的一般化の多くは、文脈から切り離された文の容認可能性に基づくものであり言語事実を正確には反映していない.質疑応答など言語的・非言語的文脈を付加した例文の解釈をもとに「は」の解釈とその言語的具現化を考察した結果、(1)主題の「は」は命題外の文内演算子と結合し発話行為のレベルにおける代替値間の対立を表す、(2)対比の「は」は命題の内部に現れ命題を表す事実レベルでの対立を表すという分析が得られた.3.英語のBアクセントは、本研究でいうところの「対比」または「主題+対比」を表す.したがって、英語のBアクセントの意味論をそのまま日本語の「主題」の分析にあてはめることはできない.英語における「主題」の解釈は通常、特定の環境における規定値として得られるものと考えられるが、その詳細については分からないことも多く、その理解には通言語的な分析を通じた主題の意味論の構築が必要とされる.本研究は、日本語や英語における主題標示の比較を通じて(1)主題はどのように標示されるのか、(2)主題の標示は文脈にどのような変化をもたらすのか、という2つの問題に通言語学的な観点から取り組むものである。

英語やドイツ語には、明示的な主題の表現形式は存在しない。6.主題には先行文脈との調和を示すだけでなく、後続する文脈の展開を方向付ける働きもある。個々の文脈における主題解釈の可能性を説明するには、文法の各部門の相互作用と言語形式の競合を扱う必要がある。包括的な理論を構築するためには最適化理論のような枠組が必要となる。
マトリックス単離法による立体選択的光酸化反応の機構の解明と応用

1.トランス-2-ブテンと二酸化窒素を15Kでアルゴンマトリックス単離して、アルゴンイオンレ-ザ-励起の色素レ-ザ-の光を照射したところ、未知の反応中間体であるトランス-ブチルニトリトラジカルの赤外吸収スペクトルを測定することができた。最終生成物としては、トランス-ブテンオキシドが生成することがわかった。2.シス-2-ブテンについて同様の実験を行なったところ、未知の反応中間体であるシス-ブチルニトリトラジカルの赤外吸収スペクトルを測定することができた。最終生成物としては、メチル基が移動してできる2-メチルプロパナ-ルが生成することがわかった。トランス-2-ブテンとの比較から、可視光によって電子励起された二酸化窒素の酸化反応は、完全に立体選択的であることがわかった。また、マトリックス単離試料の温度をあげたり、あるいは、二酸化窒素の量を増やすと、回転異性化が誘起されて、最終生成物はすべてトランス-ブテンオキシドになることがわかった。3.エチレンについて同様の実験を行なったところ、未知の反応中間体であるエチルニトリトラジカルの赤外吸収スペクトルを測定することができた。最終生成物としては、エチレンオキシドとアセトアルデヒドが生成した。両者の生成比は照射光の波長に強く依存し、エネルギ-の高いほどエチレンオキシドが生成しやすいことがわかった。1,2-重水素化エチレンについて同様の実験を行なったところ、トランス形の重水素置換体からはトランス形のエチルニトリトラジカルが、シス形の重水素置換体からはシス形のエチルニトリトラジカルが生成し、2-ブテンと同様に、立体選択的な光酸化反応であることがわかった。また、エチルニトリトラジカルの前駆体として、オキシランビラジカルを仮定して反応機構の解明を試み、実験事実と矛盾しないことがわかった。
アクティブ・ラーニングによる人物画指導に関する研究

本研究は国内外の人物画の画像収集を通して、絵画の様式毎に構図、背景、光源、衣装、小道具などについて調査を行い、1「三原色と白だけをまぜて、自分の色をつくる」、2「描きはじめの一点から、となりへとなりへと描きひろげていく」、3「構図は描いたあとで、考える」の3つを描くときの約束とするキミ子方式を基にして、新学習指導要領に準拠した小学校「図画工作」、及び中学校「美術」の教科書に見られる人物画に関連する題材に対し、主体的・対話的で深い学び(アクティブ・ラーニング)の観点から新たな指導法を開発しようとするものである。
過酸化水素の色素の退色におよぼすポルフィリン誘導体の効果

〈研究の目的〉繊維や河川の汚れ除去に漂白剤の役割は重要である。しかし近年、塩素系漂白剤がダイオキシン生成の一因となることが指摘され、環境保全の面から酸素系漂白剤の利用が注目されている。本研究は繊維や環境にやさしい酸素系漂白剤の有効利用のために、できるだけマイルドな条件で活性化できる諸種のポルフィリンの金属錯体を合成し、触媒として使用することを試みた。〈実験方法〉過酸化系漂白剤には過酸化水素を、触媒にはポリエチレングリコールと結合したマンガンポルフィリン誘導体を、被漂白物質にはC.L.Acid Orange 7とBC-1(紅茶汚染布)を用いた。分光光度計(島津製作所UV-160)を用い、色素の吸光度変化から擬一次速度定数(K_<obs>)を算出し、色素溶液の退色速度について検討した。また、分光式色差計(日本電色工業SE-2000型)を用い、汚染布の反射率の変化から漂白率を算出し、汚染布の漂白効果について検討した。〈結果〉pH8.0という温和な条件で漂白を行った結果、過酸化水素のみではほとんどC.I.Acid Orange 7の退色が見られなかったが、ポリエチレングリコールと結合したマンガンポルフィリン誘導体存在下では色素の退色が促進された。ポルフィリンの骨格をフッ素化したマンガンポルフィリン誘導体よりも塩素化したマンガンポルフィリン誘導体のほうが大きな効果が認められた。また、ポリエチレングリコールと結合したマンガンポルフィリン誘導体を触媒とした過酸化水素による漂白が酵素類似の反応として取り扱えることがわかった。さらに、汚染布での漂白効果においては、本条件下では顕著な差が認めらなかった。
環状磁場閉じ込めプラズマ発生装置を用いた高効率プラズマエッチングプロセシング

現在、エッチングプロセシングにおいては、現在半導体の高集積化のために、サブミクロンオーダーの加工技術の確立が求められている。本研究では、環状磁場閉じ込めプラズマ発生装置(トカマク装置)で生成されたプラズマ中における、エッチングプロセシングの基礎的過程を明らかにすることを目的とする。具体的には、閉じ込め磁場がエッチングパターンに与える影響を明らかにするために、閉じ込め磁場中のイオンの軌道の解析を行い、イオンの基板への入射角度分布に関する計算を行った。その結果、磁力線が基板に斜めに入射する場合においても、イオンは基板前面に形成される静電シース中で基板に垂直方向に加速を受けるために、イオンの基板への入射角は磁力線が基板面となす角に比べて、より垂直方向に入射されることがわかった。現在実験において得られたエッチングパターンと計算結果との比較・検討を行っている。本研究ではさらに、高密度トカマク放電を中性ビーム源として用いたエッチングプロセシングについても検討を行った。プラズマ中にバイアス可能な金属板(タングステン及びチタン)とそれに対向させてシリコン基板を設置する。プラズマイオンは金属前面のシース電圧で加速されて金属板に流入し、中性化して反射する。今回、ACATコードを用いて、この反射中性ビームのエネルギー分布及び放出角度分布の解析を行った。その結果、プラズマイオン(フッ素イオン)がタングステン板に入射した場合、入射エネルギーの大部分を持って反射し、放出角度分布はほぼコサイン分布に従うことが分かった。現在、本手法を用いたエッチングに関する実験を行っている。
セクシュアリティ、ジェンダー、アイデンティティの構築資源としての日本語研究

第一に、スパムメール、親密な関係を扱った小説、日常会話を分析し、「女ことば」や「男ことば」が、異性愛規範に沿ったセクシュアル・アイデンティティ構築に利用されていることを明らかにした。第二に、マスコミの多様なセクシュアル・アイデンティティ遂行とことばの実践を考察し、その歴史的な変動を明らかにした。第三に『ことばとセクシュアリティ』(邦訳)を出版した。第四に、多くの国際学会でこれらの研究成果を発表した。中村は、従来のことばとジェンダー研究で見過ごされがちであった男性性の構築にかかわる研究を行った。ひとつは、明治の近代化において創生された「国語」概念が、実は否定項として作り出された「女学生ことば」などとの関係において男性化された概念であったことを主張した。もうひとつは、スポーツ新聞が「物語化」と「お笑い化」という独特の文体を用いて、「男同士の絆」に特徴付けられた世界を作り出していることを指摘した。佐藤は、言語使用の背後に人がどのような規範意識を持っているのかを探ることを中心に研究を行った。ひとつは、親が子どもに話しかけるときに使用する自称詞の選択と母親役割意識、父親役割意識そして子どもの性別の相関関係を明らかにした。もうひとつは、指導者の立場にたつ女性による談話の分析を通じて、女性たちが依拠している規範の実態をあぶりだすことを試みた。マリィは、クィア理論と言語研究の可能性を探ることを中心に研究を行った。ひとつは、インタビューにおける協力者の位置取りについてのクィア理論を配慮した分析であった、もうひとつは、近年マスコミに登場するオネエタレントの言語資料の収集と記録であった。中村は、大きく二つの領域にかかわる研究を行った。ひとつは、メタ言説が話し手の創造的な言語実践を価値付ける働きである。新聞、国語教科書、恋愛シュミレーションゲームなどのメタ言説が、少女が用いる男性形人称詞に特定の価値づけを与えていることを示した。もうひとつは、異性愛を表現する言語資源として「女/男ことば」がどのように用いられているのか示した。迷惑メールの分析は、「女/男ことば」がジェンダーだけでなくセクシュアリティの言語資源としても利用されていることを示した。ひとつは、若い女性の日常会話に見られる談話構造と彼女たちが日常を暮らす社会に流布する規範意識の関連性を探ること、もうひとつは、若い男性の日常会話の背後にある規範意識が彼らの言語行動にどのように反映するのかを特定する試みを行った。マリィは、近年マスコミに登場するおネエタレントの言語資料(放送メディア・インタネットメディアやほかの活字メディア)を質的ソフト等で分析できる形式に変換し、分析過程を開始した。「おネエ言葉」をキーワードに放送メディアにおけるジェンダーおよびセクシュアリティとことばの分析をし、近年の放送言語に進出したことばを特定することを試みた。中村は、二つの領域にかかわる研究を行った。ひとつは、日本人が女ことばに対して抱いている感情的価値は歴史的過程に基づいていることを論じた。第二次大戦中に天皇制国家の伝統として称賛された女ことばは、天皇制が象徴に変質した米軍の占領下においても残ったために、日本の伝統という肯定的な価値を与えられたことを指摘した。もうひとつは、日本語の女ことばの歴史的言説分析を、言語とジェンダー研究の中に位置づけて、その理論的重要性を論じた。佐藤は、人が持っている規範意識と言語行動の関係性を明らかにすることを中心に研究を行った。まず、若い男性の日常会話に注目し、男らしさの規範意識がこの数十年間変化していないことを確認した。さらに、男らしさを表明するひとつの手段として若い男性がどのように会話の主導権を握るのか、その言語的方略をいくつか指摘した。規範意識という目に見えない価値も、具体的な会話場面の中で日々再生産されていることが明らかになった。マリイ(研究分担者の変更(辞退):平成23年1月31日補助事業者変更承認)は、近年マスコミに登場しているおネエタヒントが用いる言葉づかいの資料を、放送メディア、インターネットメディアや活字メディアなどから収集し、それらを質的ソラト等を用いて分析した。その結果、性的マイナリティのような特定のコミュニティで使用されていた言葉づかいがマスコミというより広いコミュニティへと進出する際には、いおば「超越」するそのことばが新たな働きを担うことが確認できた。言葉づかいの機能は、使用領域を越境することにより変化することが明らかになった。
ポジトロニウム・レーザー冷却のための陽電子蓄積法の開発

本実験は、ポジトロニウムのレーザー冷却を実現するために、直流陽電子ビームを蓄積し、パルス化する装置を開発することを目的としている。ペニング・トラップと呼ばれる磁場と電気ポテンシャルを用いた蓄積法を利用し、陽電子を閉じ込めるが、入射した陽電子が再び逃げ出さないようにトラップ内部で陽電子の運動エネルギーを失わせる必要がある。この実験ではトラップの磁場と垂直方向に磁場をかけ、陽電子の運動量ベクトルの方向を変え、実効的な運動エネルギーを失わせることによって、これを実現している。トラップ内部に蓄積された陽電子は出口側の電気ポテンシャルをパルスの印加によって短時間引き下げることにより、パルス・ビームとして取り出してやることができる。実験では立ち下がり時間500ピコ秒の高速パルス発生装置を用いる。電子銃からの電子ビームを用いた予備的実験では、パルス幅100ナノ秒の電子ビームを蓄積装置を働かせない時に比べて270倍の強度で取り出すことに成功した。陽電子ビームを用いた実験では、蓄積効果とパルス強度増大が確認されたが、電子ビームほどの大幅な増大は得られていない。これは、陽電子ビームが10mm程度のビーム・サイズを持つ事、エネルギーが10eV程度広がっている事による。高強度のパルス陽電子ビームを取り出すためには、小ビーム径で単色性の良い、高品質な陽電子ビームを作ることが必要条件となる。以上の実験結果は、日本物理学会での講演の他、Applied Surface Science誌に掲載された論文に掲載されている。本研究では、パルス化陽電子ビームを生成するための、陽電子蓄積の新手法を開発している。これは、最終的にはポジトロニウムのレーザー冷却を目的としたものであり、陽電子の直流ビームを磁場中で一度蓄積し、パルス状電場によって引き出すことにより、周期25Hz、パルス幅10ナノ秒以下、陽電子1個以上/パルスの陽電子パルスを作り出すことを目標としている。この陽電子パルスを金属ターゲットに照射することにより、パルス幅10ナノ秒のポジトロニウムを生成することができ、冷却用レーザーと同期させることが可能となる。蓄積装置は、ビーム軸方向に逃げようとする陽電子を電場のポテンシャル障壁で閉じこめ、ビーム軸と垂直方向に逃げようとする陽電子を磁場で押さえ込むという、ペニング・トラップを基礎として、入口付近にトラップ磁場と垂直な磁場をかけて陽電子の運動量方向を回転させることにより、進行方向運動量を減少させ、結果的に陽電子が入口の電場ポテンシャル障壁を再通過しないようにして蓄積を行う。平成10年度には、装置を実際に組み立てて、陽電子ビームの代わりに電子銃からの電子ビームを用いて、蓄積効果の実証を行った。結果として、蓄積装置を用いない時に比べて、パルスあたり12倍の電子数を観測し、蓄積型パルス化装置の有効性が確認された。この結果は平成11年3月末に広島大学で開かれる日本物理学会で発表される。数値的には毎秒10^5個の直流陽電子ビームに適用すると、25Hz周期の10nsec幅パルスあたり陽電子0.012個に相当する。これでは目標値にくらべ、まだ不十分なので、来年度には電磁場の配置を改良して、さらに効率の高いシステムを制作し、実際に陽電子のパルスを行う予定である。
DNA複製機構の解明に向けた関連酵素Dna蛋白質の結晶構造解析

本研究において、大腸菌由来のDnaB-DnaC蛋白質のドメイン複合体結晶を得ることに成功した。さらにX線構造解析を行い、その楕造を明らかにした。また構造から活性に重要な残基が示峻された。DnaBのC末ドメインがDnaCのN末ドメインと結合している構造が解明され、これは本研究が初となる構造であった。この結果からDnaBが、どのようにDnaCと結合しているかが分子レベルで解明された。そこからDNA複製においてDnaBとDnaCがどのように機能しているかの知見が更に深まった。また、DnaB-DnaC蛋白質のドメイン構造は、活性体である6量体構造を保持しておらず、今回構造解析に使用したドメイン以外の部分において、6量体形成を促していることが明らかになった。しかし、今回の構造で解かれたDnaBのC末ドメインは他種由来のDnaBのC末ドメインと構造が類似していることから、DnaBのC末ドメインにおいては、今回の構造が実際の活性体でも保時される構造であると考えられた。また、本研究で解かれた結晶構造は大腸菌由来のヘリカーゼでは初の結晶構造であった。今までの機能解析の多くが大腸菌由来のヘリカーゼを用いて行われていたが、構造が未知であった。本研究でその結晶構造が解析されたことで、過去の機能解析についても構造的知見と照らし合わせることができると期待される。論文の掲載は無いものの、すでにDnaBのC末ドメインとDnaCのN末ドメインとの複合体結晶構造を決定している。更には結晶構造に基づいた変異体解析も行っており、近日中には論文を投稿するに至れる。大腸菌由来のDnaタンパク質群とAquifex aeolicus由来Dnaタンパク質群それぞれについて結晶化条件の最善化と構造解析を目的とし、研究を進めた。【大腸菌由来Dnaタンパク質群の構造解析】既存の結晶化条件の更なる最適化やシーディング、脱水といった処理を行うことにより、分解能の向上に成功した。そのデータを使って構造解析も進めており、すでにほぼ完了している。他種由来のDnaタンパク質との比較により、重要なアミノ酸残基が具体的に特定されており、論文執筆にむけた変異体解析を進めている。新しく得られたデータによりDnaBのC末端とDnaCのN末端の相互作用に関する特定の側鎖による影響が新たな知見として得られ、現在は更なる知見を得るために構造解析の精密化を進めている。DnaBとDnaGcの結晶について結晶化条件の最適化を行ったが、未だX線構造解析に適した結晶は得られていない。その他タンパク質群の組み合わせでも様々な結晶化条件を試みたが今のところ良質な結晶は得られておらず、今後はタンパク質群の中で一番良質と思われる結晶が得られているDnaBとDnaGcの複合体に重点を置いて更なる結晶化条件の模索、最適化を行う。また、他の組み合わせにおいても、現在までに使ってきた結晶化条件とは全く異なる新しい条件を今後も試していき、結晶化を成功させるべく、実験を進めていく予定をしている。更には現在までに分子の大きさが同程度のため判別しにくいとされていたDnaBとDnaGの組み合わせに関しても判別法が確立されたので、それらの組み合わせでの結晶化も実験を行っていく予定である。
新規エストロジェン分解細菌を活用したエストロジェンの活性汚泥処理能力の向上化

本研究の最終目標は、下水処理工程においてエストロジェン除去率を向上させることである。各種エストロジェンやその抱合体といった物質間の物質転換、および分解経路を調べ、それぞれの分解を担う細菌についての情報を得、各種エストロジェンの活性汚泥中における生分解特性を把握することが目的である。今年度は以下の検討を行った。1)単離された分解細菌によるエストロジェン分解特性の解析と分解中間産物の同定分離菌株3菌株の休止菌体を用いて、エストラジオールおよびエストロンを分解させ、分解中間産物の分析をガスクロマトグラフ質量分析計を用いておこなった。その結果、6-keto-E2,4-OH-E2および4-OH-E1の3物質が中間産物として標準物質を用いて同定され、さらに多くの物質がマススペクトルパターンから推定された。これらの産物より、エストロゲン分解経路としてこれまでに報告のあるA環からの酸化開裂(メタ開裂)が示されただけでなく、B環への酸化(飽和環の酸化)を示唆する産物を同定することに初めて成功した。これまでに活性汚泥での分解でD環への酸化も報告されており、エストロジェンの酸化分解経路の多様性を示す結果となった。2)分解細菌の系統学的多様性について保有する3菌株が属するSphingomonas属およびRhodococcus属の細菌あわせて23種の標準菌株を菌株保存施設より購入し、エストロジェン分解能を評価した。その結果、両属とも一部の標準菌株にエストロジェン分解能があることが確認された。その分布はエストロジェン分解菌として分離された菌株との類縁性にも関係がある可能性が示された。1)単離された分解細菌によるエストロジェン分解能力の測定各単離株によるエストラジオール(E2),およびエストロン(E1)の分解能力を調べた。全単離菌株7株について、E1,E2ともに初期濃度200mg/Lを120時間程度でほぼ完全に分解できることがわかった。分解を経時的に測定したところ、すべての菌株において分解速度に大きな違いは見られず、どれも一様に一次反応的な分解を示した。また、すべての単離菌株において、分解に伴って菌体の増殖が見られたことから、これらの菌株はE1,E2を用いて増殖できることが改めて確認された。2)分解細菌の系統分類単離菌株の16S rDNA塩基配列の解読を行い、系統解析を行った。また、グラム染色やオキシダーゼ試験などの各種形態学的・生理学的試験を行い、これらの情報をあわせて、細菌の分類を行った。その結果、菌株は3つのグループに分けられることがわかった。うち2つはグラム陰性のSphingomonas spp.に分類され、1つはグラム陽性のRhodococcus spp.に分類されることがわかった。2種のSphingomonasspp.は16S rDNA塩基配列も異なり、また生理学的試験の結果も異なることから、異なる種であることは確認された。これら3つのグループ内では、16SrDNA塩基配列はほぼ100%の相同性を持っており、分離された7菌株は分類学的には3種であることが判明した。
カルシウム依存的な発現制御系を介した神経細胞活性化と活性化薬剤の検索

代表者らは、主にラット大脳皮質初代神経細胞培養系において、脳由来神経栄養因子(BDNF)やPACAPなどの一連の分泌性蛋白質をコードする遺伝子群の発現が、細胞内カルシウム(Ca^<2+>)流入で活性化されることを報告してきた。本研究の推進によって、以下に示す成果を得た。1.BDNF遺伝子プロモーターI (BDNF-PI)のCa^<2+>シグナルによる活性化には、転写調節因子CREBばかりでなくUpstream stimulatory factor 1/2(USF1/2)も関わっていること、及び、PACAP遺伝子プロモーター活性化に一つだけのCREがピンポイン,トに効いていることが明らかとなった。また、BDNF遺伝子プロモーターがCa^<2+>シグナルに感受性が高く、この分子機構の解析を行っている。2.新たなCa^<2+>シグナル応答遺伝子として、Vasoactive intenstinal peptide (VIP)遺伝子を同定した。同じファミリーのsecretin, glucagon遺伝子は応答性を示さなかった。3.異常伸長ポリグルタミンを含む蛋白質を核内に強制発現させると、BDNF-PI,-PIII, c-fos, PACAPプロモーター活性化が、ポリグルタミン鎖長依存的に抑制された。したがって、この発現制御系が障害されることで、神経変性疾患発症の可能性が考えられた。現在、多検体ルミノメーターでDNAトランスフェクション解析系の条件検討の進行中である。1.カルシウムシグル応答遺伝子の検索BDNF遺伝子プロモーターIのCa^<2+>シグナルによる活性化には、上流-80付近に存在するCRE, USF-1, -2結合サイトが大きく関わり、実際に転写制御因子CREB, USF-1, -2の関わりが明らかとなった。また、PACAP遺伝子プロモーターでは、上流-200付近のCREを含む領域がCa^<2+>応答に関わっていることが明らかとなった。以上の結果から、このCa^<2+>シグナル依存的な発現制御系を活性化する薬剤のスクリーニング系の設定が可能となった。本年度は以下に示す成果を得た。1.BDNF遺伝子プロモーターI(BDNF-PI)のCa^<2+>シグナルによる活性化には、転写調節因子CREBばかりでなくUpstream stimulatory factor 1/2(USF1/2)も関わっていること、及び、PACAP遺伝子プロモーター活性化に一つだけのCREがピンポイントに効いていることが明らかとなった。2.新たなCa^<2+>シグナル応答遺伝子として、Vasoactive intenstinal peptide(VIP)遺伝子を同定した。
ＪＡＫｓ　ＳＴＡＴｓを標的とした新たなＲＡ治療法の開発

関節リウマチ(RA)滑膜線維芽細胞を、IL-6系サイトカインであるオンコスタチンM(OSM)で刺激し細胞内シグナル伝達を検討した。その結果、OSMの刺激により、RA滑膜細胞のJAK1、2、3の活性化が確認された。この実験系を用い、現在、RAの治療薬として臨床導入が検討されているJAK阻害剤CP690,550とINCB028560の作用を検討した所、両薬剤とも、JAK1、2、3の活性化を阻害するPan JAK阻害薬であり、下流のSTATsの活性化を阻害し、免疫、炎症に関わる遺伝子発現を阻害することが判った。一方JAK3選択的阻害剤であるPF98650はJAK2/STAT3の炎症シグナルには影響せず、STAT3で誘導される炎症分子の遺伝子発現誘導は阻害しないことを明らかにした。Janus Kinase 3(JAK3)阻害薬は、リンパ球のサイトカインのシグナル伝達を抑制する新規免疫抑制薬として開発された。現在、JAK阻害薬であるCP690, 550(トファシチニブ)は関節リウマチ(RA)に対する治療薬として米国食品医薬品局(FDA)において承認されている。RAに対してすぐれた治療効果が認められるが、血球減少、帯状疱疹を含めたウイルス感染などの副作用に注意が必要である。CP690,550は当初、JAK3選択的阻害薬として開発されたが、JAK1、JAK2に対する阻害作用も有していることが明らかになっている。RA滑膜細胞を用いた検討においても、CP690,550が、JAK3に加え、JAK2/STAT3の炎症シグナルの経路を阻害し、抗炎症にはたらくことが示唆された。また選択的JAK1、2阻害薬もRAに対して奏功することが示唆されており、JAK阻害薬によるRAの治療効果が、JAK3選択的な阻害によるものか、今後の検討が必要である。JAK阻害剤の関節リウマチ(RA)の治療の有用性を明らかにする目的で、RA由来の炎症滑膜細胞を用いその抗炎症効果を検討した。RA滑膜細胞をIL-6あるいはIL-6系サイトカインであるオンコスタチンMで刺激すると、JAKs/STATs分子が活性化(リン酸化)され、急性期蛋白である血清アミロイドA蛋白(SAA)の遺伝子発現が誘導された。JAK3阻害剤であるトファシチニブ、JAK1,2阻害剤であるバリシチニブは、このIL-6系サイトカインで誘導されるJAKs/STATsの活性化を阻害し、SAA遺伝子発現を抑制することを明らかにした(発表論文1)。またトファシチニブ、バリシチニブは、JAK1,2,3の活性化を阻害することより、Pan-JAK阻害剤であることが示唆された。これらのin vitroでのJAK阻害剤の抗炎症効果を臨床的に検証する目的で、トファシチニブで治療を行ったRA患者の血清を解析した。トファシチニブ投与前、および投与4週後の血清を用いSAAおよびIL-6を測定した所、トファシチニブはSAA、IL-6の濃度を低下させることを明らかにした(発表論文2)。以上の結果より、JAK阻害剤は、RA患者の血清IL-6を低下させることが、抗炎症に働くことを明らかにした。(1)RAの滑膜細胞に対するJAK阻害剤の作用RA患者滑膜より分離した滑膜細胞を用いJAK阻害剤の作用を検討した。RA滑膜細胞をIL-6系サイトカインであるオンコスタチンMで刺激すると、JAK1、2、3、STAT1、3、5のリン酸化およびIL-6の産生が誘導された。JAK阻害剤であるCP690, 550は、オンコスタチンM刺激で誘導されるJAK1、2、3/STAT1、3、5のリン酸を阻害し、IL-6産生をほぼ完全に抑制した。CP690, 550は、Pan JAK阻害剤としてRA滑膜細胞に作用しIL-6系シグナルを阻害することで、抗リウマチ作用を示すことが示唆された。(2)JAK阻害剤のT細胞に対する作用健常人末梢血CD4+ T細胞を分離し、抗CD3抗体で刺激し、各種サイトカインの産生を測定した。CP690,550は、抗CD3抗体刺激でCD4陽性T細胞誘導されるSATA1、3、4、5、6のリン酸化を阻害し、IL-2以外のIL-4、IL-17A、IL-22、IFN-γの産生を抑制した。CP690,550はIL-2産生以降のシグナル伝達を阻害すること、Th1、Th2、Th17サイトカインを抑制することが判った。目的:関節リウマチ(RA)に対するJAK/STATシグナルを阻害する分子標的療法の有用性に関してRA患者より分離した滑膜細胞を用い解析を行った。研究方法:インフォームドコンセントの得られたRA患者より人工関節置換術の際、採取された関節滑膜より樹立した滑膜細胞を用いて検討を行った。これらRA滑膜細胞を炎症性サイトカインであるオンコスタチンM(OSM)、IL-6(可溶性IL-6R存在下)で刺激した。シグナル伝達は、サイトカイン刺激後、滑膜細胞を溶解し、その溶解物を、抗リン酸化JAK1,2,3,およびSTAT1,3,5抗体を用いたイムノブロットで解析した。SAA1,2のmRNAの発現は、RT-PCRで検討した。

研究結果:RA滑膜細胞をOSMで刺激すると、JAK1、2、3のリン酸化、およびその下流のSTAT1、3、5のリン酸化が確認された。トファシチニブ(0.5μM)で前処置すると、OSMによるJAK1,2,3およびSTAT1,3,5のリン酸化は阻害された。以上の結果によりトファシチニブは当初考えられていたJAK3選択的阻害剤ではなくJAK1,2も阻害することが判った。さらにトファシチニブはこのIL-6による炎症シグナルに影響するか、RA滑膜細胞を用い検討した。RA滑膜細胞をIL-6で刺激を行うと、JAK2、STAT3のリン酸化が誘導され、SAA1,2のmRNA発現が誘導された。このIL-6刺激によるJAK2/STAT3のSAA1,2のmRNA発現をトファシチニブは抑制した。結論:低分子化合物であるトファシチニブは、JAK3のみならずJAK2を阻害することで、その下流のSTAT3を介した炎症シグナルをブロックし、抗炎症に働くことが示唆された。臨床免疫、リウマチ学低分子化合物を用いたJAK阻害が、関節リウマチ滑膜細胞のIL-6系サイトカインで誘導されるシグナル伝達をブロックし、様々な炎症メディエータの産生を抑制し、抗炎症に働くことを明らかにした。これらの研究成果は、Journal of Rheumatology, Arthritis Research and Therapyなどのリウマチに関する国際ジャーナルに原著論文として発表することができた。JAK阻害剤の抗リウマチ作用について、RA滑膜細胞、T細胞を用い明らかにすることができた。今後、siRNAを用い、より選択的に各JAKキナーゼの阻害を試み、RAの炎症病態にどのJAKキナーゼ、STAT分子が必須であるか明らかにしていく。これらの結果をもとに、関節リウマチ(RA)などの慢性炎症性疾患の炎症制御に必要なシグナル伝達の阻害、標的となるシグナル分子を同定し、JAKs/STATs分子を標的とした新しい炎症制御法を開発する。関節リウマチ患者由来の生体試料を用いJAK/STATシグナル伝達ブロックが、抗炎症につながることをIn vitroの実験系で明らかにした。今後は、これら研究結果が、実際の臨床現場で確認できるか明らかにする。すでにJAK阻害剤は、抗リウマチ剤として日本で承認された。JAK阻害剤の投与をうけている患者の血清を用い、JAK阻害剤が各種炎症性サイトカインにどのように影響するか明らかにする。JAK阻害剤のRA滑膜細胞、T細胞に対する免疫抑制作用を明らかにすることができた。今後、RAの炎症病態の中心であるIL-6、TNF-αなどのシグナル伝達にどのように作用するか検討する。siRNAを用いるJAKs、STATs分子の選択的阻害の炎症制御に必要なシグナル分子を同定する。siRNA作成、核酸導入に関する試験、シグナル伝達解析に必要な抗体等の試験の購入に用いる。研究成果が予想より早く得られ、これら結果の論文化にエフォートを追加したため、研究費の残額が生じた。今後、in vitroの実験で得られた知見が、in vivoの生体の現象を反映しているか、臨床検体を用い検証する。具体的には、JAK阻害剤投与前後での血清サイトカインの変化をELISA、ELIS potで測定し、JAK阻害剤の抗リウマチ効果と血清炎症性サイトカインとの関係を明らかにする。トファシチニブ投与前後で、RA患者血清を用い、ELISA法で、IL-6、SAA測定しその変化を明らかにする。さらにELISpotを用い炎症性サイトカインを包括的に測定し、トシリズマブで治療前後で、変動するサイトカインを明らかにする。