hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
血漿中イソプレノイド高感度定量の開発と新規抗がん剤ターゲットとしての有用性

イソプレノイド化合物のファルネシルピロリン酸(FPP)は、細胞増殖に関与し新しい抗がん剤のターゲットとして注目されている。そこで、LC-MS/MSおよびヘッドスペースGC-FIDを用いた高感度定量法を開発し、細胞培養系によるイソプレノイドの代謝に関係する化合物の作用評価に応用した。また、ヒト血漿中の濃度測定を行い、健常人とがん患者の濃度を比較した。確立した本定量法は、化合物のビスホスホネート薬およびザラゴジン酸、ポリフェノール化合物のヘスペレチンおよびナリンゲニンの機能評価に有用であった。また、肺がん患者の血漿中FPP濃度が健常人より低値であることを認め、がんとの関連性が示唆された。イソプレノイドは細胞増殖に関係するタンパク質の修飾に関与しており、新しい抗がん剤のターゲットとして注目されている。ところが、これらイソプレノイドは血漿中にごく微量しか存在せず、血漿中濃度は殆ど明らかにされていない。本研究では、高感度測定が可能なLC-MS/MS法を用いて、これまでに明らかにされていなかった血漿中イソプレノイド濃度を明らかにし、がんバイオマーカーとしての可能性を探る。さらに、培養細胞系を用いて抗がん剤の評価に応用し、新規抗がん剤のターゲットとして提案するものである。本年度は、昨年度に開発したヘッドスペースGC法を用いるDMAPP定量法を細胞培養系に応用した。ヒト肝がん由来HepG2細胞にFPP合成酵素阻害薬であるビスホスホネート薬を添加すると、濃度依存的にDMAPPの蓄積を確認することができ、パミドロネート、リセドロネートの順となり、エチドロネートおよびクロドロネートは検出限界以下であった。この結果は、昨年度のLC-MS/MS法を用いたIPPおよびDMAPP混合物の測定結果とほぼ同様であった。また、イソプレノイド化合物に作用する物質として、コレステロール合成阻害作用をもつクロロゲン酸を評価したところ、FPPおよびGGPPの増加は認められなかったが、スクワレン合成阻害作用のあるザラコジン酸では、濃度依存的にFPPおよびGGPPの増加が認められた。さらに、LC-MS/MS法を用いてヒト血漿中イソプレノイド化合物の定量法に応用したところ、IPPおよびDMAPP混合物、GPPおよびGGPPは検出限界以下であったが、FPPは定量可能であり、その血中濃度が約0.5 ng/mLであることが判明した。ところが、これらイソプレノイドは血漿中にごく微量しか存在せず、MS測定で妨害となるリン脂質と同じリン酸基を持つため、血漿への応用は難しく、血漿中濃度は殆ど明らかにされていない。本研究では、固相抽出法でリン脂質のみを除去することで高感度測定可能なLC-MS/MS法を血液検体へ応用し、これまでに明らかにされていなかった血漿中イソプレノイド濃度を明らかにし、がんバイオマーカーとしての可能性を探る。本年度は、IPP、DMAPP、FPP、GPPおよびGGPPの5成分の定量法を検討した。LC-MS/MSを用いることで、IPPとDMAPPの混合物、FPP、GPPおよびGGPPが定量できた。分離できないIPPおよびDMAPPについては、ヘッドスペースGC法を用いてDMAPPのみを酸加水分解し、生成したイソプレンを定量することでDMAPPを定量した。また、LC-MS/MS法においてリン酸基を特異的に認識する固相抽出カラム(HybridSPE-Phospholipid)を用いてリン酸基を持つイソプレノイドおよび血漿中マトリックスであるリン脂質をトラップさせ、溶出液にアンモニア水を用いることで極性の高いIPPおよびDMAPPのみを溶出させる前処理法を検討した。この前処理法を用いて細胞培養系に応用し、ヒト肝がん由来HepG2細胞にFPP合成酵素阻害薬であるビスホスホネート薬を添加すると、濃度依存的にIPPおよびDMAPPの蓄積を確認することができた。さらにFPP合成酵素阻害作用の強さについても評価でき、パミドロネート、リセドロネート、クロドロネート、エチドロネートの順であった。イソプレノイド化合物は細胞増殖に関与することから、がんの診断における指標として注目されてきている。本研究課題は、これまでに明らかにされていなかった血漿中イソプレノイド濃度を明らかにし、肺がんバイオマーカーとしての可能性を検討するとともに、培養細胞系を用いてイソプレノイド化合物に作用する物質を探索し、新規抗がん剤のターゲットとしてのイソプレノイドの有用性を提案するものである。まず、LC-MS/MS法を用いてヒト血漿中イソプレノイド化合物の定量法を確立し応用したところ、血漿中イソプレノイド化合物の中でもファルネシルピロリン酸(FPP)のみが定量でき、その安定性を調べたところ、ー80°Cの保存においては採血後334日まで安定に測定可能であった。さらに、健常人とがん患者の血漿中FPP濃度を比べたところ、健常人は0.386 ng/mL、がん患者は0.297 ng/mLとなり、健常人に比べてがん患者は若干低い傾向であった。今後、検体数をさらに増やすことで、血漿中イソプレノイド化合物のがんマーカーとしての有用性が明らかになると思われる。また、イソプレノイド化合物の生合成系に作用する物質を探索する研究の一環として、コレステロール合成阻害作用をもつ茶

由来のポリフェノールであるエピカテキンガレート(ECG)をヒト肝がん由来HepG2細胞の細胞培養系を用いて評価した。その結果、ECGの添加によって、IPPおよびDMAPPの減少傾向を得ているが、検体数を増やしてさらなる検討が必要である。新しい抗ガン剤のターゲットとして、細胞増殖に関与するイソプレノイド化合物の生合成阻害が注目されているが、血漿中ファルネシルピロリン酸(FPP)濃度はほとんど報告されておらず、ガンとの関連性を明らかにすることを目的としている。本年度は、前年度に確立したFPPのLC-MS/MS定量法を用いて、健常人および肺ガン患者の血漿中FPP濃度を定量し、その濃度を比較検討した。健常人の血漿中FPP濃度は、0.424+0.11 ng/mL (n=7)と得られ、肺ガン患者の血漿中FPP濃度は、約0.273+0.137 ng/mL (n=106)と、健常人よりも低値を示した。今後、さらに健常人の検体数を増やして確認する必要はあるが、FPP定量とがんとの関連性が示唆された。また、イソプレノイド化合物の生合成系に作用する物質を探索する研究については、昨年と同様にヒト肝がん由来HepG2細胞を用いて評価した。結果として、柑橘由来のポリフェノールであるナリンゲニンの添加によって、FPPおよびゲラニルゲラニルピロリン酸(GGPP)が減少し、また、同じ柑橘由来のヘスペレチンの添加によって、FPPが減少した。これらについても測定試料数を増やして明らかにする必要があるが、イソプレノイド化合物に対する柑橘由来のポリフェノールの新しい作用が推察された。イソプレノイド化合物のファルネシルピロリン酸(FPP)は、細胞増殖に関与し新しい抗がん剤のターゲットとして注目されている。そこで、LC-MS/MSおよびヘッドスペースGC-FIDを用いた高感度定量法を開発し、細胞培養系によるイソプレノイドの代謝に関係する化合物の作用評価に応用した。また、ヒト血漿中の濃度測定を行い、健常人とがん患者の濃度を比較した。確立した本定量法は、化合物のビスホスホネート薬およびザラゴジン酸、ポリフェノール化合物のヘスペレチンおよびナリンゲニンの機能評価に有用であった。また、肺がん患者の血漿中FPP濃度が健常人より低値であることを認め、がんとの関連性が示唆された。昨年7月28日より産休、育休明けで復職したが、子供がまだ4か月であり、保育園に入園できず、時間短縮労働で勤務していたため。臨床分析化学本年度は、5月1日よりフルタイムで勤務するため、時間を十分に取って研究を進めていく予定である。継続して健常人の検体を追加測定することで、年齢差、性差を比較し基準値を求めるとともに、さらに肺がん患者の検体を増やし、血漿中イソプレノイド化合物の定量を行い、健常人と比較してがんバイオマーカーとしての有用性を検討する。また、培養細胞を用いた評価系への応用も継続し、LC-MS/MS法を用いて評価物質であるコレステロール合成阻害作用を持つポリフェノール(特に代表的な茶由来カテキン、エピガロカテキン、柑橘由来のヘスペレチン、大豆由来のダイゼインなど)について、細胞内外においてそれぞれの阻害作用を検討する。
食生活における脂質・炭水化物の種類と量は大豆の脂質代謝改善作用に影響するか？

大豆粉を摂取したラットのうち、スクロース主体の食餌では肝臓の中性脂肪濃度の低下が認められたが、スターチ主体、脂肪主体の食餌ではそのような傾向は見られず、食餌炭水化物の種類や脂質の量は大豆の脂質代謝改善作用に影響することが示唆された。煎り大豆、大豆飲料、蒸し大豆を添加した飼料を用いた試験では、高スターチ、高スクロース、高脂肪食ともに、蒸し大豆を摂取した群で肝臓での胆汁酸合成酵素mRNA発現量上昇や糞便中への胆汁酸排出量の増加が認められた一方、煎り大豆ではこのような作用は小さいことが示された。従来型日本食モデル(高スターチ・低脂肪食)および現代食モデル(高スクロース食、高脂肪食)をベースにした食餌条件で、大豆粉の脂質代謝改善作用の違いを、ラットを用いて観察した。食餌群は、大豆成分を含まない高スターチ・低脂肪食を対照とし、大豆食は、1高スターチ・低脂肪食、2高スクロース・低脂肪食、3高脂肪食の3種類として、3週間自由摂食させた。いずれの食餌群でも、大豆を摂取することにより盲腸内のpH値が有意に低下し、腸内環境が向上していると考えられた。高スターチ・低脂肪食で大豆を摂取した群では、対照食群と比べ、肝臓脂肪酸合成系酵素活性の抑制と糞中への総脂質排出量の増加、血中コレステロール濃度の低下が有意に認められた。一方、高スクロース大豆食群では、対照食群と比べ、血中コレステロール濃度の低下と糞中への総脂質排出量の増加は見られたが、肝臓脂肪酸合成系の酵素活性は抑制されなかった。高脂肪大豆食群では、他群と比べて、摂取エネルギー量と白色脂肪組織重量、血中遊離脂肪酸濃度、肝臓中性脂肪・コレステロール濃度、糞中総脂質排出量が増加し、肝臓脂肪酸合成系酵素活性が大きく低下した。しかし、高スクロース食と高脂肪食では、脂質代謝パラメータの変化が大豆摂取による影響なのか、ベース食自体の特性であるかの区別ができなかった。したがって、高スターチ、高スクロース、高脂肪食それぞれに大豆添加食と大豆を添加しない対照食を設定し、新たに6群の動物試験を実施した。その結果、血中総コレステロールとリン脂質濃度は、高スターチ、高スクロース食で大豆摂取によって低下傾向がみられたが、高脂肪食では大豆食での低下は小さく、ベースの食餌が大豆の脂質代謝調節作用に影響を示すことが示唆された。次年度も引き続き、本実験結果の解析を継続する。前年度に続き、主要エネルギー源をコーンスターチ(高スターチ食)、ショ糖(高スクロース食)、あるいはパーム油(高脂肪食)とした大豆粉添加または無添加の食餌を調製し、大豆食と食餌エネルギー源組成の組み合わせがラットの脂質代謝調節作用に及ぼす影響を検討した。血中総コレステロール濃度は、どの食餌でも大豆添加食群で有意な低下が見られた。一方、血中中性脂肪濃度は高スターチ食で大豆摂取により低下傾向を示したが、高スクロースや高脂肪食ではその低下が見られなかった。また、大豆摂取による肝臓の中性脂肪濃度低下は、高スクロース食でのみ傾向がみられた。したがって大豆の脂質濃度低下作用は、食餌主要エネルギー源組成の影響を受けることが明らかとなった。肝臓の脂質代謝系では、大豆摂取により脂質合成系が強く抑制されたが、基礎的な脂質合成活性が低い高脂肪食ではその抑制作用が相対的に小さかった。このことは、高脂肪食で大豆摂取による生体内の脂質濃度低下作用が小さくなった一因であると考えられた。また、肝臓で発現する脂質輸送系レセプターやリパーゼも主要エネルギー源の組成の影響を受け、大豆が有する調節作用が変化した可能性も示唆された。続いて、高スターチ食の条件で、大豆を丸ごと使用して製造した3種類の食品(煎り大豆、大豆飲料、蒸し大豆)はそれぞれ脂質代謝作用にどのような影響を与えるかを検討した。栄養分析の結果、試験に供した大豆食品の栄養組成はほぼ同等であったが、食品中のタンパク質の分解度に少しずつ違いが見られた。血清中の中性脂肪濃度は、大豆飲料食群で対照食、煎り大豆食群よりも有意に低下し、蒸し大豆はその中間程度の低下度を示した。一方、肝臓での脂肪酸合成系酵素の活性は、大豆食はいずれも同程度有意に低下させた。今後、さらにデータ分析を進め、大豆食品別の脂質代謝への影響の解明を目指す。計画通りの動物試験およびデータ解析を実施している。当初はトータルで3回の動物試験を予定していたが、研究を効率的に推進し得られたデータを精査した結果、これまでに4回の動物試験を実施することができた。次年度に残り1回を実施する。これまでに得られた試料の分析およびデータ解析を引き続き実施し、研究期間内の完了を目指す。前年度の高スターチ食条件に続き、高スクロース食、高脂肪食条件において、3種類の大豆食品(煎り大豆、大豆飲料、蒸し大豆;栄養成分の組成はほぼ同等)がそれぞれ脂質代謝にどのような影響を与えるか、ラットを用いた食餌試験で比較した。加工過程が異なる大豆食品間で違いが見られたパラメーターのひとつは糞便中の総脂質量であった。その量は煎り大豆≦蒸し大豆≦大豆飲料であり、高スターチ食では各大豆食品間に有意差が見られた一方、高スクロース食では食品間の差が小さくなっていた。乾燥糞便重量は大豆飲料と比べて煎り大豆で有意に多く、蒸し大豆と大豆飲料の間には有意差がなかった。

これらの違いは、食品に含まれる食物繊維量等の成分に起きた調理加工による変化が影響している可能性がある。肝臓での胆汁酸合成の律速酵素であるCyp7a1のmRNA発現量は、高スターチ、高スクロース食では大豆食品摂取による有意な影響は示されなかったが、高脂肪食条件下では大豆飲料、蒸し大豆摂取群で有意に増加した。このCyp7a1のmRNA発現量は、糞便中への胆汁酸排出量の変化との相関が認められた。さらに、肝細胞から胆汁へのコレステロール排出に関与すると考えられている肝臓のAbcg5とAbcg8のmRNA発現量は、大豆食品摂取により増加し、血清コレステロール濃度と逆の相関を示した。肝臓でのコレステロール濃度には大豆食品摂取の影響がなく、コレステロール合成酵素のmRNA発現量は血清コレステロール濃度との相関がなかったことから、これらの大豆食品摂取による血中コレステロール濃度減少には胆汁を介したコレステロール排出促進が関与していると考えられた。一方、肝臓での脂肪酸合成系酵素の活性およびmRNA発現量はいずれも大豆食品により有意に低下したが、大豆食品間の差、食餌条件の違いによる応答の変化は認められなかった。大豆粉を摂取したラットのうち、スクロース主体の食餌では肝臓の中性脂肪濃度の低下が認められたが、スターチ主体、脂肪主体の食餌ではそのような傾向は見られず、食餌炭水化物の種類や脂質の量は大豆の脂質代謝改善作用に影響することが示唆された。煎り大豆、大豆飲料、蒸し大豆を添加した飼料を用いた試験では、高スターチ、高スクロース、高脂肪食ともに、蒸し大豆を摂取した群で肝臓での胆汁酸合成酵素mRNA発現量上昇や糞便中への胆汁酸排出量の増加が認められた一方、煎り大豆ではこのような作用は小さいことが示された。当初計画通りの動物試験およびデータ測定を実施している。これまでに得られた結果から、高スターチ食だけでなく、高スクロース、高脂肪食にも大豆を添加しない対照群を設定することで、大豆の脂質代謝改善作用が期待できる食餌条件をより正確に解析できると考えられたため、新たに設計した動物試験を追加した。追加の試験は、研究計画自体に影響しない見込みである。これまでに高スターチおよび高スクロース食における大豆食品摂取の影響を調べるための動物試験を実施し、試料を得た。これらの試料の解析を進めるとともに、高脂肪食に大豆食品を添加した食餌で動物試験を実施する。これらの研究により、同じ大豆を原料として製造した大豆食品は、調理加工の影響により食品機能性に違いが見られるのか、脂質代謝への作用を指標に比較する。どの大豆食品が脂質代謝の改善に有効であるか、主な食餌エネルギー源である炭水化物や脂質の種類や量との組み合わせ効果がどのように影響するかを解明する。食品栄養化学高スターチ、高スクロース、高脂肪食の対照食と、それぞれに大豆を添加した時の影響を比較して、食餌によって基礎的なエネルギー代謝が異なる状態で、大豆の脂質代謝調節作用がどのように異なるかを解析し、作用メカニズムを解明する。これまでの研究で使用した大豆粉に加え、各種大豆食品はその調理加工により栄養成分の組成や物性の変化が生じるため、栄養的な機能性がそれぞれ異なると考えられる。今後、どの大豆食品が脂質代謝の改善に有効であるか、主な食餌エネルギー源である炭水化物や脂質の種類や量との組み合わせ効果がどのように影響するかを解明する。提出した研究計画に沿って効率的に研究費を執行し、かつ、これまでに得られた研究結果を精査した結果、追加の試験を加えた方がより適切な考察ができると考えた。
癒着性イレウスの腹腔鏡下治療に関する臨床的ならびに実験的研究

本研究の目的は、癒着性イレウスに対する腹腔鏡下癒着剥離述の手技を確立することにある。手技上の問題点として、(1)腸管把持鉗子による腸管の圧挫裂創、(2)癒着剥離中の腸管損傷、の各合併がある。問題点の(1)を解決するために、従来の腸管把持鉗子に独自に改良を加え、腸管把持力を調整する手元のハンドル圧を一定圧以上に上がらないよう工夫した腸管把持鉗子を考案した。これによって腸管壁の圧挫や過牽引を防止することが可能になった。問題点の(2)の解決は、腹腔鏡下癒着剥離術の手技を確立するうえで最も重要であり、臨床成績からその解決方法を検討した。これまでに、癒着性イレウス17例に腹腔鏡下癒着剥離術を試みた。このうち、腸管把持鉗子を用いることなく、腹腔鏡で観察しながら電気メスまたはハサミで癒着剥離手技を完了できた症例は6例である。一方、腸管把持鉗子で腸管を牽引しながら電気メスまたはハサミで癒着剥離を試みた11例中、4例(36.4%)に剥離操作中に腸管穿孔を起こした。穿孔例は、いずれも剥離完了後、小開腹による穿孔部修復術を要した。術後の経過は17例全例とも良好で、これまでにイレウス再発はない。以上の臨床成績から、癒着剥離操作中に腸管穿孔を起こす原因は、腸管把持鉗子の使用にある可能性が高く、腸管穿孔は数cmの小開腹で対処することにより、良好な手術成績が得られる、との結論を得た。従って、牽引腸管に対する電気メスやハサミによる影響を実験で測定することは、腹腔鏡下癒着剥離術の手技を確立するために意義が少ないと判断し、実験計画を中止した。また、オリンパス社が現在開発中の外径3mmの針状腹腔鏡を癒着剥離術に使用した経験から、針城腹腔鏡を用いた腹腔鏡下癒着剥離術は、標準型腹腔鏡を用いた場合より手技が極めて容易で低侵襲であり、安全性の向上に有用と考えられた。これまでに腹腔鏡下癒着剥離術を試みた癒着性イレウス症例は15例である。このうち癒着剥離に成功した症例が12例、術中に腸管を損傷した小開腹に移行した症例が3例である。腸管損傷をおこした理由は、不適当な腸管把持鉗子による腸管把持操作によると考えられた。術後経過は15例全例とも順調で、特に腹腔鏡下癒着剥離に成功した12例はすべて術後24時間以内に排ガスがみられ、創痛もなし、創感染や呼吸循環系の合併症もなかった。更に、術後1ケ月めに腹腔鏡で腹腔内を観察した2例は再癒着を全く認めなかった。以上の臨床経験から、従来の腸管把持鉗子に改良を加え、把持力を調整する手元のハンドル圧を一定圧以上に上がらないよう工夫した改良型把持鉗子を考案し使用しているが、腸管壁の圧挫や過牽引を防ぐのに役立っている。

癒着性イレウスに対する腹腔鏡下癒着剥離術は、極めて合理的な治療手技であるが、腹壁への広汎な癒着がある場合など極力細径の腹腔鏡でのアプローチが有利であり、我々は主にオリンパス社製針状腹腔鏡を用いてきた。最近、急性腹症を簡便に診断・治療することを目的に新たに3mmの針状腹腔鏡が開発されたことから、本機種を使用しているが、極めて効果的である。現時点で、新針状腹腔鏡と改良型腸管把持鉗子を用いた腹腔鏡下癒着剥離術は、標準型腹腔鏡を用いた場合より手技が極めて容易で低侵襲であり、安全性の向上に有効と考えられた。本研究の目的は、癒着性イレウスに対する腹腔鏡下癒着剥離術の手技を確立することにある。手技上の問題点として、(1)腸管把持鉗子による腸管の圧挫裂創、(2)癒着剥離中の腸管損傷、の各合併がある。問題点の(1)を解決するために、従来の腸管把持鉗子に独自に改良を加え、腸管把持力を調整する手元のハンドル圧を一定圧以上に上がらないよう工夫した腸管把持鉗子を考案した。これによって腸管壁の圧挫や過牽引を防止することが可能になった。問題点の(2)の解決は、腹腔鏡下癒着剥離術の手技を確立するうえで最も重要であり、臨床成績からその解決方法を検討した。これまでに、癒着性イレウス17例に腹腔鏡下癒着剥離術を試みた。このうち、腸管把持鉗子を用いることなく、腹腔鏡で観察しながら電気メスまたはハサミで癒着剥離手技を完了できた症例は6例である。一方、腸管把持鉗子で腸管を牽引しながら電気メスまたはハサミで癒着剥離を試みた11例中、5例(45.5%)に剥離操作中に腸管穿孔を起こした。穿孔例は、いずれも剥離完了後、小開腹による穿孔部修復術を要した。術後の経過は17例全例とも良好で、これまでにイレウス再発はない。以上の臨床成績から、癒着剥離操作中に腸管穿孔を起こす原因は、腸管把持鉗子の使用にある可能性が高く、腸管穿孔は数cmの小開腹で対処することにより、良好な手術成績が得られる、との結論を得た。従って、牽引腸管に対する電気メスやハサミによる影響を実験で測定することは、腹腔鏡下癒着剥離術の手技を確立するために意義が少ないと判断し、実験計画を中止した。また、オリンパス社が現在開発中の外径3mmの針状腹腔鏡を癒着剥離術に使用した経験から、針状腹腔鏡を用いた腹腔鏡下癒着剥離術は、標準型腹腔鏡を用いた場合より手技が極めて容易で低浸襲であり、安全性の向上に有用と考えられた。
網羅的DNA-蛋白相互作用データに基づく染色体のモデル表現

本申請ではDNA結合タンパクについて出芽酵母の六番染色体(280kb)についてDNAチップを用い、結合プロファイル情報を得、因子間の相互作用情報を結合プロファイルに基づき抽出、分類、比較可能なソフトの構築を行えるシステム作りを目指した。データのプレゼンテーションソフトについては開発を終了し公開した。さらにこれを原型として発展させ出芽酵母、分裂酵母、ヒトの全ゲノムについても解析可能なソフトを構築しつつある。公開したものについては、同じプラットホームを有する研究者との間で共有できるシステムとなっており、また、システムを利用した論文(共同研究であるかないかにかかわらず)の発表も開始された。このことは我々が構築した解析プロトコルが世界的スタンダードになりつつあることを意味している(Methods in Enzymology,2006)。比較、分類ソフトについてはプロトタイプ版が完成し、プロファイルの類似性から、1)コヒーシンの制御因子の同定(Nature,2006)、3)コヒーシンローダーを新規修復因子として同定、4)コヒーシンの染色体への接着が複製に伴うこと、5)SMCファミリーに属する修復因子が染色体の長さに依存した局在パターンを示すこと、等コヒーシン蛋白を中心とした染色体諸機能の連携、そのダイナミクス、について次々と新たな発見を行うことができた。これらの中の発表済みの結果は、前年度までの分を含め、最終的に生データまで参照可能な形式でデータベースとして公開する準備を現在進めている所である。染色体代謝過程を明らかにするためには一本の染色体のレベルで詳細に染色体の動態を解析できるシステムを構築しなくてはならないと考え、出芽酵母第六染色体に解析対象を絞込み、280kbの六番染色体全体を約13000個の25塩基長の単鎖DNAで余すところなくカバーするカスタムDNAチップを作成した。このDNAチップを用い、いくつかのタンパクの染色体上での結合領域についてChIP-chip法(Chromatin Immuno-precipitationにより得られたDNAをDNAchip上で検出する方法)により解析を行ったところ、解像度300塩基対でタンパクの結合プロファイルを解析可能であることが明らかとなった。同時に我々は複製領域をBrdUでラベルし、抗BrdU抗体で免疫沈降することで、チップ上で複製領域を検出することにも成功した。この方法により、現在までに100を越えるタンパクの染色体上での配置について、細胞周期G1、S、G2、それぞれの時期について解析した。解析のアルゴリズムも完成し、現在、これらのタンパクの配置の相関について、解析を進めた。その結果、染色体接着因子の結合位置と転写ユニットの配置、ピストン修飾レベル間で強い相関が見られたので、鋭意、染色体上に種々の変異を導入することにより解析を進めているところである。また、この方法により、MRC1(Mitotic Replication Checkpoint)、及びTOF1(Topoisomerasel Interachng Factor)という二つのチェックポイント因子の機能について、新しい知見が得られた。新たに、分裂酵母染色体についてもChIP-chip法により染色体上のタンパクの配置を解析可能なシステムを構築した。約10個の蛋白について、ChIP-chip法によるDNAChipのハイブリダイゼーションデータから、分裂酵母染色体の二番、三番についてタンパクの配置を網羅的に同定可能なシステムを構築した。このシステムを用い、分裂酵母染色体の複製プロアイルをBrdUの取り込みと、3種類の複製タンパクの動態変化により明らかにした(阪大、升方らとの共同研究)。また、姉妹染色体分体間の接着を確立するタンパク、染色体凝集タンパクの系統的な配置解析を行った。解析結果からは、巨大な分裂酵母染色体に於いては、出芽酵母染色体で見られたような複製の時間的制御がむしろ失われており、多数の複製開始点が短時間で複製を終了させるために配置されているというレプリコン構成の実態が明らかとなった。分裂酵母染色体はゲノムの複雑さからみても(配列のエントロピーが小さい)、出芽酵母に比べより複雑であり、データ処理においても、繰り返し配列によるノイズシグナルが検出され、その評価が問題となった。

今回のシステムでは、これらノイズを生み出すプローブ配列について特定し、計算から除外することで対処したが、重複度(繰り返しの数)も計算に含め、配列毎により柔軟に対応することも考慮に入れ、さらにシステムの開発を進めている。こういった分裂酵母特有の問題に対処することで、より複雑な高等真核生物のアレイデータ解析に向けたシステム作りを推進出来るはずである。本申請ではDNA結合タンパクについて出芽酵母の六番染色体(280kb)についてDNAチップを用い、結合プロファイル情報を得、因子間の相互作用情報を結合プロファイルに基づき抽出、分類、比較可能なソフトの構築を行えるシステム作りを目指した。データのプレゼンテーションソフトについては開発を終了し公開した。さらにこれを原型として発展させ出芽酵母、分裂酵母、ヒトの全ゲノムについても解析可能なソフトを構築しつつある。公開したものについては、同じプラットホームを有する研究者との間で共有できるシステムとなっており、また、システムを利用した論文(共同研究であるかないかにかかわらず)の発表も開始された。このことは我々が構築した解析プロトコルが世界的スタンダードになりつつあることを意味している(Methods in Enzymology, 2006)。比較、分類ソフトについてはプロトタイプ版が完成し、プロファイルの類似性から、1)コヒーシンの制御因子の同定(Nature, 2006)、3)コヒーシンローダーを新規修復因子として同定、4)コヒーシンの染色体への接着が複製に伴うこと、5)SMCファミリーに属する修復因子が染色体の長さに依存した局在パターンを示すこと、等コヒーシン蛋白を中心とした染色体諸機能の連携、そのダイナミクス、について次々と新たな発見を行うことができた。これらの中の発表済みの結果は、前年度までの分を含め、最終的に生データまで参照可能な形式でデータベースとして公開する準備を現在進めている所である。
栄養教諭導入による学校給食を活用した食育展開のありかたに関する研究

本研究は、過去10年間にさかのぼって学校給食献立の内容の変化を時系列的に比較することで、栄養教諭制度の導入や学校給食法の改正によって学校給食がどのように変化したのか、そして給食がどのように食育展開に活用されてきたのかについて明らかにしようとしている。また、給食を食育の時間として活用するためには栄養教諭と学校教諭との連携をとることが必要であることから、栄養教諭と学校教諭の給食時間の食育等に関するアンケート調査を実施し、食育実施にかかる学校現場での食育の連携の実態を把握する。申請者らは、全国7県(鹿児島、広島、香川、滋賀、岐阜、富山、福島)の栄養教諭からなる研究チームを構築し、各県の研究チームが、各々の県の過去10年間のうち、主に平成17年、21年、26年の3年間の給食献立内容についてのデータベースを作成し、献立内容の変化について統計学的手法を用いて解析を行ってきた。その結果、主食+主菜+副菜が明確な献立が増加したこと、野菜の提供も増加していること、和洋中の献立の区別が明確になったこと、献立中の食塩量は減少し、和食より洋食の方が食塩量が多いことなどを明らかにしてきた。一方、給食施設の設備が献立内容に影響を与えており、設備などの環境要因が献立作成に影響を与えていることも明らかにした。給食を活用した食指導状況をみると、食育の観点(6つの食の指導目標)の中で、「食事の重要性」の観点をもたせた献立が増加していた。これらのことから、この10年間の学校給食では、献立種別が明確で主食+主菜+副菜のそろったバランスの良い給食が提供されるようになり、栄養教諭は食育の指導目標と関連させた給食献立を作成し、給食指導を行っていたことが明らかになった。また、栄養教諭及び教職員に対しての学校給食の食育に関するアンケート調査を行い、現在解析を進めている。本研究は、栄養教諭制度の導入や学校給食法の改正によって学校給食がどのように変化したのか、過去10年間にさかのぼって、学校給食献立の内容の変化を時系列的に比較し、栄養教諭導入により学校における給食がどのように食育展開に活用されてきたのかについて明らかにしようとしている。平成28年度は、全国8県(岐阜県、滋賀県、香川県、石川県、富山県、鹿児島県、広島県、福島県)における平成17,21,26年度の1年間の給食献立について、データベースの作成を行った。我々が先行研究において作成したデータベースでは、各年のうち6月と11月の2か月間の献立について入力を行ったが、本研究から1年間の献立についても入力することとし、本年度は各県におけるデータベース作成を中心に行った。各県において作成されたデータベースを元に、各県ごとに栄養教諭を中心とした献立研究チームにおいて、県ごとの10年間における学校給食の変遷について解析を行い、第63回日本栄養改善学会において、その成果(11件)を発表した。栄養教諭が導入される以前の平成17年度の献立と導入されて10年を経過した平成26年度の献立を比較すると、いずれの県においても、ごはんを中心とした和食の献立が増加し、また主食・主菜・副菜・汁物といったバランスのとれた食事の構成をした献立の出現率が増加していた。また、食育推進基本計画で目標に設定されている学校給食での地場産物の活用においても、すべての県において地場産物の利用率が増加したことが明らかとなった。平成28年度中に全国版としての統合データベースを作成することとしていたが、全国統一データベースの完成に至らなかった。その理由として、先行研究においては平成17、21、26年度の各年のうち6月と11月の2か月間をデータベースの入力期間として設定し、これまで解析を実施してきたが、試行的に1年間のデータを入力し献立内容について解析した結果、季節間による変動が示唆されたため、1年を通した献立データ入力の必要性が明らかになり、各年8か月分の追加の献立入力作業を行い、その入力に時間を要したことがある。また、より全国網羅的なデータとするため調査地域を広げる必要性も考えられたことから、新たな地域のフィールドを構築し、研究フィールドとしての範囲を広げることによってより広範な範囲での献立の内容について検討を行えることが可能となったが、本研究の独創的な点である各県の栄養教諭を中心とした研究班を構築し、研究班メンバー(各県1020名)が自らの献立の評価を行うという仕組み上、そのフィールドの構築及び研究実施までの準備として、新たな研究班メンバーの研修等に時間を要したため、各地域での進捗状況がばらついたこと等から、本研究全体としての進捗状況にやや遅れが生じたと考える。本研究は、栄養教諭制度の導入や学校給食法の改正によって学校給食がどのように変化したのかを明らかにするために、過去10年間にさかのぼって学校給食献立の内容の変化を時系列的に比較し、また、栄養教諭導入により学校における給食がどのように食育展開に活用されてきたのかについても明らかにしようとしている。平成29年度は、全国7県(岐阜県、滋賀県、香川県、富山県、鹿児島県、広島県、福島県)において、平成17,21,26年度の1年間の給食献立について、データベースの作成を行った。我々が先行研究において作成したデータベースは、各年のうち6月と11月の献立についてのみ入力を行っていたが、本研究から1年間の献立について入力することとし、本年度は各県におけるデータベース作成を中心に行った。

各県において作成されたデータベースを元に、各県ごとに栄養教諭を中心とした献立研究チームが、10年間における学校給食の変遷について統計学的手法を用いて解析を行った。昨年度までに、10年間で給食に和食が増え、主食・主菜・副菜が明確な献立増えていたことを明らかにしてきたが、本年度は、この10年間で給食に野菜の摂取量が増えたこと、給食施設の設備が献立内容に影響を与えていること、献立に含まれる食塩量は和食のほうが洋食献立より少ないことを新たに明らかにした。これらの成果を、第64回日本栄養改善学会において、発表(8件)するとともに、栄養教諭食育研究会誌に論文(8件)を発表した。また、栄養教諭及び教職員に対する食育アンケートを作成し、アンケート調査を全国の各地区において開始した。平成17、21、26年度の各年のうち、給食献立の各1年間の入力を完了した。今年度は1年間のデータを用いて各研究ブロックにおいて解析を行い、その成果を学会で発表するとともに、研究会誌に論文として発表した。また、給食の献立作成や給食を用いての食育展開の実態を調査するために、栄養教諭及び学校栄養職員を対象として各県において学校給食献立作成と食育に関するアンケート調査を実施した。また、連携を図るために、学校教諭を対象として、学校教諭の食育に対する意識や態度、給食時における食指導や、栄養教諭との連携の取り方についてのアンケート調査も開始した。本研究は、過去10年間にさかのぼって学校給食献立の内容の変化を時系列的に比較することで、栄養教諭制度の導入や学校給食法の改正によって学校給食がどのように変化したのか、そして給食がどのように食育展開に活用されてきたのかについて明らかにしようとしている。また、給食を食育の時間として活用するためには栄養教諭と学校教諭との連携をとることが必要であることから、栄養教諭と学校教諭の給食時間の食育等に関するアンケート調査を実施し、食育実施にかかる学校現場での食育の連携の実態を把握する。申請者らは、全国7県(鹿児島、広島、香川、滋賀、岐阜、富山、福島)の栄養教諭からなる研究チームを構築し、各県の研究チームが、各々の県の過去10年間のうち、主に平成17年、21年、26年の3年間の給食献立内容についてのデータベースを作成し、献立内容の変化について統計学的手法を用いて解析を行ってきた。その結果、主食+主菜+副菜が明確な献立が増加したこと、野菜の提供も増加していること、和洋中の献立の区別が明確になったこと、献立中の食塩量は減少し、和食より洋食の方が食塩量が多いことなどを明らかにしてきた。一方、給食施設の設備が献立内容に影響を与えており、設備などの環境要因が献立作成に影響を与えていることも明らかにした。給食を活用した食指導状況をみると、食育の観点(6つの食の指導目標)の中で、「食事の重要性」の観点をもたせた献立が増加していた。これらのことから、この10年間の学校給食では、献立種別が明確で主食+主菜+副菜のそろったバランスの良い給食が提供されるようになり、栄養教諭は食育の指導目標と関連させた給食献立を作成し、給食指導を行っていたことが明らかになった。また、栄養教諭及び教職員に対しての学校給食の食育に関するアンケート調査を行い、現在解析を進めている。これまで全国8県の栄養教諭からなる研究チームを構築してきたが、全国の献立として考える際、必ずしも全国地域として完全に網羅されていないことから、関東圏及び中国地方でのフィールドの設定と研究班の構築を行い、より網羅的な献立データベースの構築を推進する予定である。
ICPCを用いたプライマリ・ケア領域の症状分析－根拠に基づく地域医療教育に向けて

本研究は、外来患者における受診理由と症状を分析することを目的としている。症状は、国際プライマリ・ケア分類(International Classification of Primary Care; ICPC)を用いて標準化した。平成27年度は、自治医科大学附属病院総合診療部門の診療録の記載を調査した。調査項目は、受診日、年齢、性別、症状、診療医師の特性である。診療録は、SOAP形式、詳細表記形式(主訴、現病歴、家族歴、既往歴等)の2種類からなり、それぞれのS(Subjective)、主訴、現病歴から症状を抽出した。診療録に記載のある症状を、自動抽出システムを用いて抽出した。平成2830年度は、山口県立医療センター救急外来の診療録の記載を調査した。平成28年4月1日平成29年3月31日の1年間に救急外来を受診した16歳以上の12,349件の診療録を対象とした。診療録は#SOAP形式であり、#、S、O(Objective)、A(Assessment)から106,082症状を抽出した。各症状に対してICPCの要素1(愁訴と症状)のコードを付与した。臓器系17分類において頻度の多い順にD(消化器)、S(皮膚)、A(全身と不特定の問題)、N(神経)、R(呼吸器)であった。また、コードにおいて頻度の多い順にA03(発熱)、D10(嘔吐)、N01(頭痛)、N07(痙攣/発作)、S06(限局性の発疹)、S07(全身性の発疹)であった。研究の成果を平成30年10月にソウル(韓国)で開催されたWONCA world conference(世界家庭医療機構世界大会)にて発表した。本研究は、へき地診療所、小規模病院、大規模病院における受診理由の一般化可能性の検証、救急外来における受診理由と在宅診療における往診理由の抽出、各診療形態における現病歴を含めた症状を分析することを目的としている。これらの症状は、国際プライマリ・ケア分類(International Classification of Primary Care; ICPC)を用いて標準化し、地域医療教育の資源として役立つ形に整理し、発信する予定である。まず平成27年度は、自治医科大学附属病院総合診療部門の診療録の記載を主に調査した。診療録は、SOAP形式、詳細表記形式(主訴、現病歴、家族歴、既往歴等)の2種類からなり、それぞれのS(Subject)、主訴、現病歴から症状を抽出した。対象は、平成25年4月1日平成26年3月31日までの期間に受診した16歳以上の初診患者1937例である。すべての症状を、開発中の自動抽出システムを用いて抽出し、ICPCコード化した。うち100例は、抽出システムの精度評価に用いるゴールドスタンダードを作成するために、2名の臨床医が手作業で症状を抽出し、ICPCコード化した。診療録の形式や診療医師の特性によって、扱われる症状が異なるか検証中である。更に、山口県立医療センター(外来診療)および郡上市地域医療センター(外来診療)の診療録調査の準備を進めた。自治医科大学附属病院総合診療内科を受診した初診患者の診療録調査は、滞りなく進捗した。さらに、地域の医療機関における調査の準備を整えることができた。平成28年度は、より大規模に診療録情報を解析するため、山口県立医療センター救急外来、茨城県立中部病院救急外来、佐賀県立医療センター好生館救急外来、郡上市地域医療センター外来の診療録調査の準備を進めた。対象期間は、平成28年4月1日平成29年3月31日の期間に救急外来を受診した16歳以上の患者約30000例である。患者リスト(受診日、性別、年齢、受診科)等はすでに整理され、症状データの抽出も可能となった。自動コーディングシステムを用いて症状を抽出し、解析する予定である。多施設共同研究のため、各医療機関で採用している電子カルテによって、診療情報の保存形態が異なるため、データ抽出法の確認と確立に時間を要した。本研究は、救急外来における受診理由と在宅診療における往診理由の抽出、各診療形態における現病歴を含めた症状を分析することを目的としている。症状は、国際プライマリ・ケア分類(International Classification of Primary Care; ICPC)を用いて標準化し、地域医療教育の資源として役立つ形に整理し、発信する予定である。

調査項目は、受診日、年齢、性別、症状、診療医師の特性である。診療録は、SOAP形式、詳細表記形式(主訴、現病歴、家族歴、既往歴等)の2種類からなり、それぞれのS(Subject)、主訴、現病歴から症状を抽出した。平成25年4月1日平成26年3月31日までの期間に受診した16歳以上の初診患者1937例を対象とした。診療録に記載のある症状を、開発中の自動抽出システムを用いて抽出し、ICPCコード化した。平成28年度は、より大規模に診療録情報を解析するため、複数の協力医療機関における調査の準備を進めた。平成29年度は、山口県立医療センター救急外来の診療録を調査した。平成28年4月1日平成29年3月31日の期間に救急外来を受診した16歳以上の13107件の記録を調査し、重複の受診を除いた10142件を解析した。診療録は#SOAP形式であり、#、S、O、Aから症状を抽出し、ICPCコード化した。平成30年度は、佐賀県立医療センター好生館救急外来および、複数の在宅クリニックの診療記録を解析する予定である。多施設共同研究のため、協力医療機関において倫理申請手続きおよび電子カルテからのデータ抽出に想定以上の時間を要した。本研究は、外来患者における受診理由と症状を分析することを目的としている。症状は、国際プライマリ・ケア分類(International Classification of Primary Care; ICPC)を用いて標準化した。平成27年度は、自治医科大学附属病院総合診療部門の診療録の記載を調査した。診療録は、SOAP形式、詳細表記形式(主訴、現病歴、家族歴、既往歴等)の2種類からなり、それぞれのS(Subjective)、主訴、現病歴から症状を抽出した。診療録に記載のある症状を、自動抽出システムを用いて抽出した。平成2830年度は、山口県立医療センター救急外来の診療録の記載を調査した。平成28年4月1日平成29年3月31日の1年間に救急外来を受診した16歳以上の12,349件の診療録を対象とした。診療録は#SOAP形式であり、#、S、O(Objective)、A(Assessment)から106,082症状を抽出した。各症状に対してICPCの要素1(愁訴と症状)のコードを付与した。臓器系17分類において頻度の多い順にD(消化器)、S(皮膚)、A(全身と不特定の問題)、N(神経)、R(呼吸器)であった。また、コードにおいて頻度の多い順にA03(発熱)、D10(嘔吐)、N01(頭痛)、N07(痙攣/発作)、S06(限局性の発疹)、S07(全身性の発疹)であった。研究の成果を平成30年10月にソウル(韓国)で開催されたWONCA world conference(世界家庭医療機構世界大会)にて発表した。次年度は、地域の医療機関における外来診療の診療録調査を開始する。
マウスES細胞の胚様体形成に及ぼす物理化学的因子の解明

ES細胞は再生医療の素材として期待されており、その増殖及び分化を制御する技術の確立が求められている。本研究では、マウスES細胞の増殖及び分化に深く関わると考えられる物理化学的因子に注目し、培養容器の性状や形状あるいは培養中の酸素濃度が、細胞増殖及び胚様体(EB)形成にどのように影響するのかを検討した。2-Methacryloyloxyethyl Phosphorylcholine(MPC)で表面を処理したU底96-well plateに、ES細胞1000個を播種してEB形成培養を5日間行った。その結果、ほぼ100%の形成効率でEBが形成された。これは、従来法である懸滴培養法に比べて優れていた。また、操作も簡便であった。培養容器に細胞が付着しないことが、EB形成には重要であることがわかった。また、容器底の形状は、フラットであるよりも、U形やV形の方が好ましくかった。形成されたEBは、様々な細胞系列に分化させることが可能であった。例えば、EBを接着培養すると、その全てに心筋の拍動が観察された。これにより、新規なEB形成培養法が確立された。ES細胞は、2040%-pO_2下において良好に増殖したが、5%-pO_2下では増殖が顕i箸に抑制された。細胞当たりのAP活性は、酸素分圧が高いほど維持されており、酸素が不足すると細胞増殖が低下し、分化が進む傾向があることが示唆された。いずれの酸素分圧下でもEB形成がみられたが、5%-pO_2で形成されたEBは小さく、構成細胞数も少なかった。これに対し、40%-pO_2下で形成したEBは、細胞密度が最も高くなった。心筋の発生は、酸素分圧が高い方が観察されやすく、拍動も強く現れた。EB形成と接着培養を5%-pO_2下で行ったものは、拍動の出現数が少なかった。試験管内で胚性幹細胞(ES細胞)の分化を誘導する場合、まず浮遊培養系にて胚様体(Embryoid body ; EB)と呼ばれる球状の細胞凝集塊を形成させた後、このEBを接着培養系に移し、ここでさらなる分化誘導を行うのが一般的である。現在、EB形成には懸滴培養法(Hanging drop method ; HD法)という手法が主に用いられているが、HD法は操作が煩雑で熟練を要するため、EBの形成率が低く、形成されるEBの質も一定でないなどの問題がある。本研究では、簡単な操作で質的に均一なEBを効率的に形成する方法について検討を行った。培養基材の材質及び基材表面の処理法が異なる4種類のU底96we11プレート(ポリスチレン製;PS、ポリプロピレン製;PP、細胞外マトリックス処理:ECM、2-Methacryloyloxyethyl Phosphorylcholine処理;MPC)の各wellに、ES細胞懸濁液200mlを播種してEB形成培養を5日間行った。その結果、PSおよびPP製のプレートではEBの形成はみられなかったが、ECMおよびMPC処理プレートにおいてはEBが形成された。その形成効率はほぼ100%であり、HD法におけるEB形成率60%に比べ優れていた。ECMおよびMPC処理プレートで形成されたEBを接着培養して心筋へ分化させたところ、接着培養開始から5日目までにほぼ100%のEBにおいて心筋の拍動が観察された。

このことから、両プレートで形成されたEBが、質的にも十分なものであることが確認された。ES細胞は再生医療の素材として期待されており、その増殖及び分化を制御する技術の確立が求められている。本年度は、マウスES細胞の増殖及び分化に深く関わると考えられる酸素に注目し、細胞増殖、胚様体(EB)形成、分化誘導に対する酸素の影響を検討した。マウスES細胞(129SV)をインキュベータ内の酸素分圧(pO_2)を5、20、40%に変化させて培養した。培養は、白血病阻害因子(UF)存在下及び非存在下で行い、それぞれの細胞数の計測及び細胞未分化性の指標としてアルカリフォスファターゼ(AP)活性の測定を行った。また、種々の酸素分圧下でEB形成を行い、EB形態及びEBを構成する細胞数を計測した。さらなる分化誘導のためEBの接着培養を行い、心筋細胞等の発生を確認した。ES細胞は、2040%-pO_2下において良好に増殖したが、5%-pO_2下では増殖が悪く、特に、LIF非存在下では、5%-pO_2下での増殖抑制が顕著であった。細胞当たりのAP活性は、酸素分圧が高いほど維持されており、酸素が不足すると細胞増殖が低下し、分化が進む傾向があることが示唆された。いずれの酸素分圧下でもEB形成がみられたが、5%-pO_2で形成されたEBは小さく、構成細胞数も少なかった。細胞同士の接着も弱く、培養5日目になるとEBが崩れはじめた。これに対し、40%-pO_2下で形成したEBは、細胞接着が強く、細胞密度が最も高くなった。このため、40%-pO_2下で形成したEBは、接着培養に移しても細胞の拡がりが遅く、E8の3次元構造の一部が最後まで残存した。心筋の発生は、酸素分圧が高い方が観察されやすく、拍動も強く現れた。EB形成と接着培養を5%-pO_2下で行ったものは、拍動の出現数が少なかった。
不規則表面による電磁波の散乱-相反定理と後方強調散乱-

確率汎関数法を用いて2次元不規則表面による電磁波散乱波動場を不規則表面の汎関数としてWiener-Ito展開の形で表現し、不規則境界条件を解いてWiener核An,n=0,1,2,・・・を求め、これらから各種の散乱統計量を計算した。具体的には1.2次元不規則表面による電磁波散乱問題を1次元並びに2次元ノイマン、ディリクレ不規則表面によるスカラー波の散乱問題の定式化の結果を踏まえ、TE平面波とTM平面波入射の場合のWiener-Ito展開形を示した。2.次に不規則面の境界条件を解いて、近似精度を上げたWiener核An,n=0,1,2を示した。3.以上の結果を用いて、コヒーレント散乱振幅、インコヒーレント散乱角度分布などの各種の散乱統計量を数値的に計算した。この結果、2次元ノイマン不規則表面においては電磁波の場合でもいわゆる後方強調散乱が現れることを理論と数値計算を用いたインコヒーレント散乱角度分布の両方で示した。更に、これが数学的には2次のWiener核A_2からの寄与であり、物理的には2つの"着物を着た"2重散乱過程の干渉による強調がノイマン表面の異常散乱を中間状態として生じたものであることを明らかにした。
体液循環ｍｉＲＮＡ輸送機構を用いたがん特異的新規ＤＤＳの開発

エクソソームによるDDSの取り込み効率を評価する評価系の構築ためにエクソソームを高分泌する細胞系のスクリーニングをおこないマクロファージでの分泌能が高いことを明らかにした。これらの細胞を用いてエクソソームマーカーであるCD63にGFPを融合したCD63-GFPレンチウイルスを作成しCD63-GFPを発現した細胞を樹立しGFPラベルされたCD63を含むエクソソームが分泌されていることを確認した。CD63-GFPを含むエクソソームを培養細胞から精製して、他の細部に添加したところ高効率にGFPが伝播さえることを確認できたことから、エクソソームはDDSとして用いられる可能性が示唆された。分泌型miRNA輸送体として細胞外小胞であるエクソソームを用いるために、細胞外小胞(EV)を高分泌する細胞系のスクリーニングを実施した。線維芽細胞、上皮系細胞、がん細胞、マイクロファージなどを用いて培養上清に存在するEVの量をナノパーティクル計測器qNANOを用いて、粒子径分布、細胞あたりのEV分泌量を計測したところ、マイクロファージが他の細胞に比較して高分泌していることを見いだした。マイクロファージや線維芽細胞から回収したEVを可視化するためにエクソソームマーカーの一つであるCD63にGFPを融合したCD63ーGFPベクターを細胞内に導入して、CD63陽性のEVがGFPにより可視化できる系を構築した。これらの細胞の培養上清から回収し、乳癌細胞、膵がん細胞に添加したところ高効率に標的細胞にGFPが検出された。また、in vivoの実験では、ルシフェラーゼ遺伝子を高発現した乳癌高転移がん細胞を膵臓に移植し、膵臓に腫瘍を形成して膵臓でのルシフェラーゼの蛍光を確認した。このマウスに、リポソームに封入したルシフェラーゼに対するsiRNAを腹腔内に投与し、膵臓がんでのルシフェラーゼ遺伝子の発現をRT-PCRにより確認した。その結果、マウス腹腔内にルシフェラーゼに対するsiRNAを導入して、ルシフェラーゼに対するsiRNAを腹腔内に投与したマウスの膵臓においてルシフェラーゼの発現の減弱が確認された。また、腹腔内マクロファーを活性化させるためにグリセロールを同時と投与すると、その効果が促進された。以上の結果らか、in vivoにおいて、細胞外小胞をにDDSを応用した核酸医薬のデリバリーにマクロファージ誘導性のエクソソームDDSが有望である可能性が示唆された。平成24年度の計画であった、1分泌型miRNA輸送体およびmiRNAの可視化によるDDS評価系の構築、2分泌型miRNAを高分泌する細胞培養系の構築、および3がん組織特異的DDSの構築について研究を実施した。その結果、1分泌型miRNA輸送体およびmiRNAの可視化によるDDS評価系の構築については、miRNAのダイレクトの可視化は、マイクロRNAをCy3でレベルしたものでモニターできることを明らかにできた。2分泌型miRNAを高分泌する細胞培養系の構築については、我々は、MASPINおよびCHMP4Cの高発現によりエクソソームの分泌を3倍にあげることができることを明らかにした。この結果を基に、特定のマイクロRNAをレンチウイルスを用いたpre-microRNAの強制発現により、目的microRNAを多く含むエクソソームを分泌する細胞培養系の構築ができた。また、用いる細胞によりエクソソーム分泌効率が大きく関わることも明らかにできた。3がん組織特異的DDSの構築については、エクソソーム分泌に用いる細胞の種類に大きく左右されることが明らかになった。マウスを用いたルシフェラーゼsiRNAを用いて、in vivoでのエクソソーム分泌システムを構築し、ルシフェラーゼsiRNAを含むエクソソームが膵臓がんに導入できる知見を得ることに成功した。1分泌型miRNA輸送体およびmiRNAの可視化によるDDS評価系の構築については、miRNAのダイレクトの可視化は、マイクロRNAをCy3でレベルしたものでモニターできることを明らかにできており、当初の目的を達成できたが、今後は感度の向上をどうするかが課題である。2分泌型miRNAを高分泌する細胞培養系の構築については、MASPINおよびCHMP4Cの高発現によりエクソソームの分泌を3倍にあげることができることを明らかにし、特定のマイクロRNA含むエクソソームの産生系の構築に成功しており、予定通り進んでいる。3がん組織特異的DDSの構築については、マウスを用いたルシフェラーゼsiRNAを用いて、新規のin vivoでのエクソソーム分泌システムを構築した。この方法は、効率を挙げる課題があるもののある一定の効率でsiRNAを膵臓がん組織に導入できる知見を得ており、概ね順調に推移している。4がん組織特異的DDSの構築(2)・がん細胞特異性が見いだせない場合は、がん細胞特異的膜タンパク質を分泌型miRNAを高分泌する細胞培養系に発現させることで、がん細胞特異性を持たせる。