hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
顎運動機能測定を応用した咬合高径決定法の研究

しかし、シーネ除去直後では、測定開始直後に不安定な大きな動きを示す者もみられた。発音位と発音空隙を応用する方法では、usi、usu、putuを素早く5回発音させた。このいずれの発音においても、顆頭の運動量は下顎安静位法のそれにより大きくなる傾向を示し、その変位量は垂直方向で最大1mm以上に達する者が2名みられた。顆頭変位の様相は、左右で差の発現する変位であった。この測定においてもシーネの着脱の影響はわずかであった。嚥下を応用する方法では、軽く咬合させた状態より嚥下させその時の顆頭位を測定した場合、嚥下による方法は下顎安静位法に次いで顆頭の変位は小さくなった。またシーネを除去することにより、変位中間層で垂直的、前後的にわずかに大きく変位する傾向にある。
RNAの起源と進化

当研究班では,RNAワールドの概念に基づき,RNAの起源と進化に焦点をあてて,RNA機能構造の成立機構を明らかにすることを目的とした.そのため,(1)RNAワールドにおいて機能していたと考えられるRNAに関して,現存するリボザイムの構造と反応機構の解明,ならびに,新しい機能を付与したRNAのSELEX法による創出,の二つの視点から研究を試みるとともに,(2)RNAワールド成立後に,特にタンパク質生合成に関わるRNAおよびタンパク質が,構造と機能を進化させてきたプロセスをたどることにより,RNAワールドにおける実体に迫ることを試みた.その成果は,(1)RNasePの構成成分であるM1RNAをもとに,新規の自己切断RNAを構築することによって,リボザイム機能の詳細を明らかにした.RNAワールドにおいて重要な反応と想定されるライゲーション反応が,RNAのみで自発的に行われることを発見した.SELEX法により,様々な機能性RNA分子を創出することに成功し,それらがRNAワールドにおいて果たしていたと考えられる役割について議論することができた.(2)tRNAのアイデンティティー決定機構を,大腸菌,酵母などの生物種について生化学的な手法と遺伝学的な手法を組み合わせることにより,ほぼ完全に解明した.アミノアシルtRNA合成酵素については,ヒトの遺伝子の大半をクローニングすることに成功した.そして,古細菌,真核生物,真正細菌の酵素の系統関係に基づいて,起源を明らかにした.生物種間などでの水平伝搬が起こったことが示唆された.以上により,tRNAとアミノアシルtRNA合成酵素の進化過程を知ることができた.他方,古細菌tRNAに広く存在するアーケオシンという修飾ヌクレオシドが,真正細菌や真核生物において別の機能を担うキューオシンと同様の塩基交換反応によって生合成されるということを明らかにした.当研究班では,RNAワールドの概念に基づき,RNAの起源と進化に焦点をあてて,RNA機能構造の成立機構を明らかにすることを目的とした.そのため,(1)RNAワールドにおいて機能していたと考えられるRNAに関して,現存するリボザイムの構造と反応機構の解明,ならびに,新しい機能を付与したRNAのSELEX法による創出,の二つの視点から研究を試みるとともに,(2)RNAワールド成立後に,特にタンパク質生合成に関わるRNAおよびタンパク質が,構造と機能を進化させてきたプロセスをたどることにより,RNAワールドにおける実体に迫ることを試みた.その成果は,(1)RNasePの構成成分であるM1RNAをもとに,新規の自己切断RNAを構築することによって,リボザイム機能の詳細を明らかにした.RNAワールドにおいて重要な反応と想定されるライゲーション反応が,RNAのみで自発的に行われることを発見した.SELEX法により,様々な機能性RNA分子を創出することに成功し,それらがRNAワールドにおいて果たしていたと考えられる役割について議論することができた.(2)tRNAのアイデンティティー決定機構を,大腸菌,酵母などの生物種について生化学的な手法と遺伝学的な手法を組み合わせることにより,ほぼ完全に解明した.アミノアシルtRNA合成酵素については,ヒトの遺伝子の大半をクローニングすることに成功した.そして,古細菌,真核生物,真正細菌の酵素の系統関係に基づいて,起源を明らかにした.生物種間などでの水平伝搬が起こったことが示唆された.以上により,tRNAとアミノアシルtRNA合成酵素の進化過程を知ることができた.他方,古細菌tRNAに広く存在するアーケオシンという修飾ヌクレオシドが,真正細菌や真核生物において別の機能を担うキューオシンと同様の塩基交換反応によって生合成されるということを明らかにした.岡田は、レトロポゾンを用いてサケ科サケ属の6種の系統関係を確定することに成功した。この系統関係は統計的な誤差のない確実な系統関係であると考えられる。リジンtRNAを起源とする5種の異なったレトロポゾンを、アライメントしたところ、それぞれのレトロポゾンは、系統的に離れた動物由来であるにもかかわらず、tRNA非相同領域において良く保存された配列が発見された。さらにこの配列と相補的な配列が、リジンtRNAをプライマーとする幾つかのレトロウイルスのU5領域に見い出された。以上の事実から、tRNAを起源とするレトロポゾンは、レトロウイルスから逆転写の際に生ずるstrong stop DNAが起源であるというモデルを提出する。坂本は、大腸菌温度感受性の相補性試験によりリランダムの塩基置換を導入したtRNAのidentityの解析法の確立を目指している。dnaY変異株では高温でアルギニンtRNAがほとんど存在せず、AGAコドンの翻訳が阻害されるために、高温での増殖阻害が起こることが明らかになった。宮田は、アミノアシルtRNA合成酵素のクラスI,クラスIIのグループについては、およそ60残基からなる保存領域のアライメントに基づいて、aaRSの分子系統樹を推定し、それらの分岐パターンについての予備的結果を得た。菊池は大腸菌RNasePの触媒サブユニットであるM1RNAの遺伝系とその基質となるtRNAの前駆体の遺伝子とを連結し、ひと続きのRNAとして転写されるようなプラスミドを構築し、転写産物の反応について検討したところ、M1RNA-PretRNAの場合には、正常な位置で切断が起こり、この自己切断は低濃度のマグネシウムイオン存在以下でも起こることが明らかになった。さらにこの配列と相補的な配列が、リジンtRNAをプライマーとするいくつかのレトロウィルスからU5領域に見い出された。

以上の事実から、tRNAを起源とするレトロポゾンはレトロウィルスから逆転写の際に生ずるstrong stop DNAが起源であるというモデルを提出する。(以上岡田)/大腸菌tRNA^<Arg>遺伝子に変異を持つargU10温度感受性変異株は、野性型tRNA^<Arg>の導入により相補される。tRNA^<Arg>遺伝子にランダムに塩基置換を導入し、ArgRSの大量発現下でのみ相補活性を示すものを選択した結果、A14,G18がアルギニン受容活性に必須であることが明らかになった。(以上坂本)/アミノアシルtRNA合成酵素(aaRS)は遺伝暗号系の起源と進化を解明する上で重要な情報を提供するものと期待される。最近、我々はアライメント可能な領域をさらに拡張することを試みた。その結果、以下のことが明らかになった。クラスIのaaRSにおいて、2つのモチーフHIGHとKMSKSの間に新しいモチーフ、hydrophobic-X-D-X4-Rが見つかった。さらに、クラスIIについても、モチーフ1とモチーフ2の間にGX3-5Y/FX4Y/F及びY/L XhydrophobicXPという強く保存されたモチーフを見いだした。従来、クラスIIに属するGlyRSとAlaRSにはモチーフ1とモチーフ2の存在が知られていなかったが、今回それらのモチーフが見つかった。ValRS,IleRS,LeuRS,MetRS,CysRSの系統樹に関してはしっかり結果が得られたので、今後この系統樹をもとに、アミノ酸の認識がどのように進化したかを調べていく予定である。(以上宮田)/植物のレポーター遺伝子としてよく使われているβ-Glucuronidase(GUS)mRNAに対するヘアピンリボザイムを三種類設計した。三種ともGUSmRNAを切断できたが、特に長い基質結合部位をもつHG10LとHG10L2は非常に効率よく切断した。(以上菊池)古細菌ハロバクテリウムから、tRNAのG15位にグアニンを挿入できるtRNAグアニントランスグリコシラーゼを発見した。これは、同位置に存在する微量塩基成分であるアーケオシンがやはり大腸菌のQの場合と同じように塩基の交換反応によって生成するということを強く示唆している。本酵素の基質特異性を検討したところ、グアニン以外にpreQ0を挿入することが出来るが、preQ1は挿入することが出来ないということが明かになった。(以上岡田)大腸菌argU温度感受性変異株に対する相補性を指標にしたアッセイ系を構築し、tRNAのコア領域の特定の三次構造塩基対がin vivoでのアルギニン受容活性に必須であることを明かにした。(以上坂本)117種類の異なる蛋白質を使って、三つの超生物界の系統関係を再検討した。その結果、転写・翻訳・DNA合成系に関与する遺伝子では、古細胞一真核
核準位密度における殻構造及び集団運動の効果の微視的理論による解明

殻模型モンテカルロ法を用いて微視的立場から核準位密度の記述を進め,偶々核と同一の枠組みにより希土類領域の奇中性子核の形状変化と準位密度を再現した他,模型空間を拡張してNi領域の核準位密度のパリティー依存性を再現することにも成功した。これらの成果を基に,有限温度平均場近似の結果との比較も援用して,振動及び回転による集団運動の効果,さらに粒子数保存則の影響を調べ新しい知見を得た。他方,半微視的有効相互作用を用いた自己無撞着平均場計算により,マジック・ナンバーに代表される殻構造変化の全体像を,実験値とほぼ矛盾なく明らかにした。1.自己無撞着平均場計算に基づき,特に球形核における対相関の強さを用いて,核図表のほぼ全体にわたってmagic numberの分布を調べた.テンソル力等を含んだ適切な有効相互作用を用いることにより,今までに知られている実験データとほぼ矛盾のない結果を得た他,実験データの乏しい中質量核以上の不安定核領域でのmagic numberの予言も行った.この結果は今後の殻模型計算で模型空間を定めるための基礎としても有用である.2.殻模型モンテカルロ法により,Nd-Sm領域の球形核・変形核・遷移核にわたる一連の奇中性子核の状態密度を計算し,偶々核と同様に,中性子数の変化に伴う形状相転移の様子まで含め実験データをよく再現することを示した.3.従来の殻模型モンテカルロ計算では状態密度を計算するのが通常であったが,量子数射影を用いて,殻模型モンテカルロ法による準位密度の直接計算法を開発した.この方法ではよい精度で磁気量子数に関する縮退が除去され,実験データとの直接的な比較が行える.実際にFe-Ni領域核及び希土類のDy162に応用し,実験値とのよい一致を確認した.4.共鳴一粒子軌道が関わる相互作用行列要素の計算法を調べ,Pade近似による外挿の有効性を示唆する結果を得た.今後特にCa領域での殻模型モンテカルロ計算への応用を見込んでいる.1.実験データを援用して殻模型モンテカルロ法の結果から基底状態エネルギーを引き出す方法を開発し,Nd-Sm領域核に応用することにより,この領域の球形核・変形核・遷移核にわたる一連の奇中性子核の状態密度を,偶中性子核と同じHamiltonianを用いて再現することに成功した.2. Ni領域において,十分広い模型空間に対して実験データをよく再現しかつ殻模型モンテカルロ計算に適した有効相互作用パラメータを見出し,この領域の準位密度研究の準備を整えた.3.有限温度BCS理論と粒子数射影を組み合わせてNd-Sm領域の偶々核に応用し,振動状態による核準位密度のcollectiveenhancement factorの温度依存性を調べた.その結果,従来振動状態の影響は低温で速やかに消えると考えられてきたが,この理解は通常平均場近似に合わせて導入される粒子数非保存に強く依拠したもので,粒子数保存の成り立つ実際の系では,振動状態の影響がより高温まで残ると考えるべきことを示唆する結果を得た.4. Pb核のisotope shiftに対する3体LS力の効果を調べ,20年来の問題であったPb核のisotope shiftのkinkが,中性子軌道の縮退を無理に仮定することなしに3体LS力により説明できることを示した.これにより,原子核の殻構造に本質的な役割を果たしているスピン・軌道ポテンシャルにおいて,3体力の影響が重要であることが明らかになった.1. Ni同位体核に対し従来より広い模型空間を採用して殻模型モンテカルロ計算を実行し,微視的立場から状態密度の実験dataの再現に成功した.Z=N=20を跨ぐ励起がparity依存性に寄与することを確認した.2.殻模型モンテカルロ法による,角運動量に関する縮退を除いた核準位密度の直接計算法を提案した.これにより,核準位密度の計算結果をより高いエネルギーまで直接に実験データと比較することが可能となる.実際にこの方法をFe領域核及び162Dyに応用して実験値とのよい一致を確認した.3.同一の模型空間とHamiltonianを用いて,殻模型モンテカルロ法により求めた厳密解と有限温度平均場理論の結果を比較し,平均場理論に基づく取扱いの改良法を提案すると共に,希土類核を例としてエネルギー期待値,エントロピー,準位密度についてその精度と限界を明らかにした.4.有限温度BCS理論に粒子数射影を組み合わせて,振動状態による核準位密度のcollectiveenhancement factorを調べた.Nd-Sm領域の偶々核に対する数値計算により,通常のBCS理論では低温で消失する振動状態の影響が,粒子数保存のため高温まで残ることを示唆する結果を得た.5. Pb核のisotope shiftにおけるkink問題をほぼ説明する3核子間LS力により,40年以上にわたる難問であった40Caと48Caの荷電半径がほぼ等しいという実験dataが説明できること,またSnのisotope shiftもよく再現することを示し,同時に132SnにおいてPbの場合と同様のkinkを予言した.これにより,原子核の殻構造に本質的な役割を果たしているスピン・軌道ポテンシャルに対する3核子間力の影響が重要であることが一層明確になった.132Snにおけるkinkの実験的検証が待たれる.殻模型モンテカルロ法を用いて微視的立場から核準位密度の記述を進め,偶々核と同一の枠組みにより希土類領域の奇中性子核の形状変化と準位密度を再現した他,模型空間を拡張してNi領域の核準位密度のパリティー依存性を再現することにも成功した。

これらの成果を基に,有限温度平均場近似の結果との比較も援用して,振動及び回転による集団運動の効果,さらに粒子数保存則の影響を調べ新しい知見を得た。他方,半微視的有効相互作用を用いた自己無撞着平均場計算により,マジック・ナンバーに代表される殻構造変化の全体像を,実験値とほぼ矛盾なく明らかにした。次の2点について,非常に重要な結果を得た.まず,核準位密度における集団運動の影響について,従来の理解を覆すことを意味する結果を得た(研究実績の概要3.).今後,より精確な数値計算を行う.また,3体LS力が原子核の殻構造に重要な寄与をもたらすことを明らかにし,Pb核のisotope shift問題をほぼ解決した(研究実績の概要4.).この知見は本課題の遂行にも重要な意味を持つ.これらは当初の研究計画を上回る成果である.また,Ni領域核の準位密度計算は海外の研究協力者との適切な役割分担が奏功して目処が立っており,Zr領域の計算準備も進行中である.Ca領域の計算が遅れ気味であるが,総合的に見て,平成25年度の若干の遅れを取り戻し,順調に研究が進んでいると言える.理論核物理次のような内容の研究を完成させ,その成果を発表する.・Ni, Ca, Zr領域核の,殻模型モンテカルロ法による準位密度の計算.・粒子数射影を用いた,振動運動が核準位密度にもたらす影響の研究.・3体力起源のスピン・軌道ポテンシャルの影響を調べ,原子核の殻構造のより精確な理解を図る.Ni核での核準位密度のパリティー依存性に関する計算が完了しておらず,またCa領域核の予備計算もまだ不十分であるため,上記の評価とした.その主因は,希土類領域の奇中性子核の計算を前倒ししたこと(研究実績の概要2.),及び準位密度直接計算法の開発を優先したこと(研究実績の概要3.)である.これらが重要であると共に今後の研究推進に資するところが大きいことが分かったためで,長期的に見れば決してマイナスではないと考えている.
カテコラミンを介した細菌と宿主との対話：心身相関の新しいパラダイムの創出

宿主と細菌との界を超えた相互作用(情報交換)が注目を集めている。本研究では、腸管管腔内のカテコラミン(CA)やセロトニン(5-HT)に着目し、その制御機構について検討した。脳室内corticotrophinreleasing factorの投与によって腸管管腔内のCAが一過性に上昇した。腸管管腔内には生理活性を有する遊離型の5-HTが存在しているが、無菌マウスではその多くがグルクロン酸抱合されていた。糞便内から回収された腸内細菌はCAを含有していた。以上の結果は、腸管内腔にはCAや5-HTなどのモノアミンが存在しており、様々なストレス関連の病態を修飾している可能性を示唆するものである。近年、宿主と細菌の相互作用、いわゆる“インターキングダム・シグナリング(Inter-kingdom signaling)"への関心が高まっている。なかでも宿主由来のストレス関連ホルモンであるカテコラミンが細菌側の特異的レセプターに作用し、細菌の増殖能や病原性を高める可能性があるという知見は、注目の的である。我々のグループは、腸管管腔内にドーパミン、ノルエピネフリンが存在することを世界で初めて証明し(Asano Y et al. Am J Physiol Gastrointest Liver Physiol. 303(11):G1288-95, 2012)、腸管を舞台としたインターキングダムシグナリングが現実に起こりうる可能性を示した。本研究では、腸管におけるカテコラミンを介した宿主と腸内細菌との相互作用に焦点を当て、ストレスによる易感染性の病態機序を解明し、その動物モデルを確立することを目的としている。平成26年度においては、腸管管腔内を還流する腸管ループモデルを用いて、脳室内corticotrophin releasing hormone投与後の腸管管腔内ノルエピネフリン濃度を計時的に測定した。また腸管神経叢から管腔内への遊離の可能性を検証するために、カテコラミンの小胞体への取り込みを阻害するreserpinとカテコラミン性神経を破壊する6-hydroxydopamineを前処置することによって腸管管腔内カテコラミンが低下するか否かについて検討を進めた。なかでも宿主由来のストレス関連ホルモンであるカテコラミンが細菌側の特異的レセプターに作用し、細菌の増殖能や病原性を高め、逆に細菌由来のカテコラミン様物質が宿主細胞に作用するという知見は世界中の研究者に大きな衝撃をあたえた。本研究では、腸管におけるカテコラミンを介した宿主と腸内細菌との相互作用に焦点を当て、その詳細を解明することを目的としている。平成27年度は腸管管腔内におけるセロトニンに注目し、腸内細菌との関連について検討した。その結果、腸内細菌はEnterochromaffin細胞からのセロトニン遊離を惹起し、腸管管腔内のセロトニン濃度を上昇させることがわかった。また生理活性を有する管腔内セロトニンの一部はグルクロン酸包合されたセロトニンの脱包合によって生成されることが明らかとなった。平成26年度においては、腸管管腔内CA遊離の調節機構の解明とストレス惹起性内因性感染モデルの確立を目的に種々の実験を行い、興味深い結果を得た。内科学一般(含心身医学)本年度は、以下の課題3,4について解析を加えていく。課題3.ストレス惹起性内因性感染モデルの作製:カテコラミン高感受性大腸菌株およびBW25113株のみで構成された単一細菌マウスを作成し、拘束ストレス負荷に対する腸管炎症およびバクテリアル・トランスロケーションの程度を評価する。対照群には、その変異株であるJW2994のみで構成された単一細菌マウスを用いる。課題4.全身への影響は?:上記モデルマウスを用いて、ストレス負荷後の行動(自発運動や摂食行動の評価ーいわゆるsickness behaviorの有無、程度)を観察する。またストレス負荷、直後、12時間後、24時間後に末梢血を採取し、CRPなどの急性炎症反応を調べる。
融合型ドナーを用いた有機分子性超伝導体の構築

本研究では、テトラチアフルバレン類縁体をユニットとして含む種々の新規な融合型ドナーを合成し、それらを用いた分子性錯体の構造と物性を解明することにより、二次元有機分子性金属および有機超伝導体の設計指針を確立することを目的としている。本研究により得られた成果は以下のとおりである。(1)二分子のジセレナジチアフルバレンをユニットとして含む融合型ドナー、ST-TTPの合成に成功し、これが対アニオンの形状に関係なく4.2Kまで金属的なカチオンラジカル塩を与えることを見いだした。それらのうち、AsF_6塩のX線構造解析を行ったところ、二次元的なβ型と呼ばれるドナー分子配列をとることが明かとなった。(2)π電子骨格中に酸素原子を含む非対称融合型ドナー、PDT-TTPを用いたカチオンラジカル塩の作製について検討したところ、そのエチレンジチオ誘導体、ET-PDTが多くの種類の単結晶を与えることを見い出した。それらの電気伝導性について検討したところ、すべて4.2Kまで金属的な温度依存性を示すことが明かとなった。それらのうち、PF_6塩のX線構造解析を行ったところ、二次元的なβ型ドナー分子配列をとることを見い出した。構造解析の結果を基にバンド計算を行ったところ、ドナー骨格が非対称性であるためスタック内の重なりが小さく、結晶構造的には二次元的であるにもかかわらず電子構造的には一次元性が強いことが明かとなった。これらの結果をまとめた論文については投稿準備中である。
微動測定による熊本平野の地下水資源調査

標準的な沖積平野(八代平野など)は洪積世の砂礫層とこれを覆う沖積層からなっていて,この両者の間にS波速度や密度の違いがあるので,帯水層である砂礫層の深度を推定するのは比較的容易である。これに対して,熊本平野では沖積層の下部に複数の帯水層が存在する。それらは洪積世の地層で,上部から順に,砂礫層,火砕流堆積物(ASOー4,ASOー3など),多孔質の砥川溶岩である。このような熊本平野において短周期(固有振動数1Hz)振動計と長周期(固有振動数0.2Hz)振動計を用いて微動の測定を行い,前者で1Hz以上の卓越周波数がある場合,後者では1Hz以下の場合について解析した。地層の種類やN値を記載したボ-リング柱状図があり,すでに地下構造が明らかになっている18箇所を選んで検討の対象とした。N値から推定されるS波速度と微動計測から得られる卓越周波数から計算される深度は,ほとんどの場合,最上部の洪積層までの深度に対応した。このことは熊本平野の帯水層である複数の洪積層の間のS波速度や密度の違いが小さく,沖積層と最上部の洪積層との間のコントラストの方が大きいことを意味している。本研究の結果から,概査の一つである微動計測は洪積層の深度を推定するのには有用であるが,速度と密度に大きな違いがない地層構造を解明するための主役とはなり得ないことが明らかとなった。
親電子性シクロペンテンジオンの生体エネルギ-感応性と抗がん活性

申請者は、細胞の“ある特定の状態"のみを認識して活性を発現する阻害剤を見いだすことができるならば、薬物の作用の特異性を高めることができるので、副作用が低く、かつ有効性の高い抗がん剤の開発に有用であると考え、エネルギ-状態に応じて膜の性質が大きく変わる細胞内小器官ミトコンドリアに注目し、本申請研究を行った.得られた成果を以下に示す.1.正常細胞のミトコンドリアにおけるエネルギ-転換機構の解析ならびにその阻害剤の作用解析を行った.2.がん細胞由来のミトコンドリアの単離方法の開発を行い、腹水がん細胞AH130から、高い機能を保持したミトコンドリアの単離を行うことに成功した.3.ミトコンドリアのエネルギ-状態を測定する指標として最も有効であるとされている膜電位の測定に関し、従来の電極より、より小型で、かつ感度の高い電極の開発に成功した。この電極や酸素電極などを用いた解析の結果、エネルギ-転換を阻害しうる化合物の発見、その作用機構の解析を行った.更に本電極を用いて、シクロペンテンジオン誘導体の正常細胞、がん細胞由来ミトコンドリアに対する作用をリン酸透過系の機能を中心に調べた.4.3の結果、がん細胞のリン酸透過担体の方がシクロペンテンジオンに対する感受性が高いことが明らかになった.更に、シクロペンテンジオン誘導体ま、がん細胞由来のミトコンドリアにおいては、膜電位形成速度を遅延させる作用があることを見いだした.5.また、上述のがん細胞株AH130では、II型のヘキソキナ-ゼの転写が特異的に著しく亢進していることを見いだし、このこともがん細胞のエネルギ-代謝を特徴付けるよい指標になることを明らかにした.申請者は、細胞の“ある特定の状態"のみを認識して活性を発現する阻害剤を見いだすことができるならば、薬物の作用の特異性を高めることができるので、副作用が低く、かつ有効性の高い抗がん剤の開発に有用であると考え、エネルギ-状態に応じて膜の性質が大きく変わる細胞内小器官ミトコンドリアに注目し、本申請研究を行った.得られた成果を以下に示す.1.正常細胞のミトコンドリアにおけるエネルギ-転換機構の解析ならびにその阻害剤の作用解析を行った.2.がん細胞由来のミトコンドリアの単離方法の開発を行い、腹水がん細胞AH130から、高い機能を保持したミトコンドリアの単離を行うことに成功した.3.ミトコンドリアのエネルギ-状態を測定する指標として最も有効であるとされている膜電位の測定に関し、従来の電極より、より小型で、かつ感度の高い電極の開発に成功した。この電極や酸素電極などを用いた解析の結果、エネルギ-転換を阻害しうる化合物の発見、その作用機構の解析を行った.更に本電極を用いて、シクロペンテンジオン誘導体の正常細胞、がん細胞由来ミトコンドリアに対する作用をリン酸透過系の機能を中心に調べた.4.3の結果、がん細胞のリン酸透過担体の方がシクロペンテンジオンに対する感受性が高いことが明らかになった.更に、シクロペンテンジオン誘導体ま、がん細胞由来のミトコンドリアにおいては、膜電位形成速度を遅延させる作用があることを見いだした.5.また、上述のがん細胞株AH130では、II型のヘキソキナ-ゼの転写が特異的に著しく亢進していることを見いだし、このこともがん細胞のエネルギ-代謝を特徴付けるよい指標になることを明らかにした.申請者らの研究は、細胞内エネルギ-獲得器官であるミトコンドリアに作用することによって殺細胞効果を示す化合物のうち、がん細胞選択性を有する化合物を同定することにより、新たな抗がん剤を見い出すことを目的としている.申請者らが合成し、その作用の解析を進めている化合物のひとつであるKIHー203は、ミトコンドリアにおけるエネルギ-転換反応を非常に低濃度(25nmols/mg protein)で阻害し、その阻害機構はミトコンドリアのリン酸輸送担体の特異的阻害によるものであった.そこで、ミトコンドリアのリン酸透過担体の機能を解析する目的で、リン酸依存性の脱共役剤であるCd^<2+>の作用を検討した結果、Cd^<2+>の脱共役活性はリン酸のミトコンドリア内への取り込みを伴うものであることが判明した.さらに、このリン酸依存性の脱共役は、ヌクレオチド透過担体のコンホメ-ション変化によって調節されていることが明かになった.以上の実験結果から、ミトコンドリアに作用する抗がん剤の開発に、これらの溶質輸送担体の機能解析が重要であることを結論した.一方、がん細胞に特異性を有するかどうかを解析する目的では、がん細胞ミトコンドリアの機能を解析しなければいけない.現在までのところ、がん細胞から機能を保持したミトコンドリアを簡便かつ収率よく単離する方法は開発されていなかったので、まず、この方法を開発することにした.その結果、窒素キャビテ-ション法によって細胞を破壊、遠心分画することによって、高活性を保持したミトコンドリアの調製を簡便に行い得ることが明らかになった.このようにして調製されたがん細胞由来のミトコンドリアおよび正常細胞ミトコンドリアに対するKIHー203の作用を比較したところ、正常細胞では、HIHー203はリン酸透過担体に特異性を示したのに対し、がん細胞ではむしろ電子伝達系に特異的に阻害活性を示し、がん細胞に特異性をもたせることも可能であることが明らかにされた.

申請者は、細胞の"ある特定の状態"のみを認識して活性を発現する阻害剤を見いだすことができるならば、薬物の作用の特異性を高めることができるので、副作用が低く、かつ有効性の高い抗がん剤の開発に有用であると考え、エネルギ-状態に応じて膜の性質が大きく変わる細胞内小器官ミトコンドリアに注目し、本申請研究を行った.得られた成果を以下に示す.1.正常細胞のミトコンドリアにおけるエネルギ-転換機構の解析ならびにその阻害剤の作用解析を行った.2.がん細胞由来のミトコンドリアの単離方法の開発を行い、腹水がん細胞AH130から、高い機能を保持したミトコンドリアの単離を行うことに成功した.3.ミトコンドリアのエネルギ-状態を測定する指標として最も有効であるとされている膜電位の測定に関し、従来の電極より、より小型で、かつ感度の高い電極の開発に成功した.この電極や酸素電極などを用いた解析の結果、エネルギ-転換を阻害しうる化合物の発見、その作用機構の解析を行った.更に本電極を用いて、シクロペンテンジオン誘導体の正常細胞、がん細胞由来ミトコンドリアに対する作用をリン酸透過系の機能を中心に調べた.4.3の結果、がん細胞のリン酸透過担体の方がシクロペンテンジオンに対する感受性が高いことが明らかになった.更に、シクロペンテンジオン誘導体は、がん細胞由来のミトコンドリアにおいては、膜電位形成速度を遅延させる作用があることを見いだした.5.また、上述のがん細胞株AH130では、II型のヘキソキナ-ゼの転写が特異的に著しく亢進していることを見いだし、このこともがん細胞のエネルギ-代謝を特徴付けるよい指標になることを明らかにした.
ボルネオ熱帯林における伐採インパクトの違いが細根現存量の回復に及ぼす影響

マレーシアなどの木材生産林の一部では、過去の無秩序な伐採により森林を荒廃させた反省から、持続可能な森林管理の実践的手法として低インパクト伐採が行われている。この方法は年間収穫量を従来の数十パーセント以下に抑えるほか、残存木の損傷や地表撹乱にも配慮している。低インパクト伐採の効果については、これまで森林地上部を中心に研究されてきた。しかし、伐採インパクトの違いが、森林地下部の現存量回復にどのような影響を及ぼすかという問題は、未解明なまま残されている。ボルネオ熱帯林における伐採インパクトの違いが細根現存量の回復時間に及ぼす影響とその要因を明らかにするため、マレーシア・サバ州のMaliau Basin森林保護区の原生林と、その周辺地域で過去に伐採が行われた森林を対象に、調査区設定のための候補地選定と樹木のサイズ計測を行った。混交フタバガキ林の原生林に設置した既存の調査プロットで毎木調査を実施したところ、原生林に特徴的なL字型のサイズ分布となっていた。また、胸高直径5 cm以上の個体を対象とした胸高断面積合計は48.8 m2/ha、地上部現存量は484.6 Mg/haと推定された。保護区周辺部の伐採が行われた森林では、地元の森林事務所スタッフらの情報提供により、2015年に低インパクト伐採が行われた場所と、2010年に従来型伐採が行われた場所を候補地として選定した。現地の状況を確認したところ、低インパクト伐採の森林は、場所によって状況が異なるものの原生林の樹種組成がある程度保たれているようであった。従来型伐採の森林では、多くの個体につる植物が繁茂し、個体を覆っているため、生育が阻害されている場所が目立った。以上のように、原生林、従来型伐採、低インパクト伐採の森林間比較を行うための基盤整備を進めた。現地関係機関の協力の下、伐採履歴情報の収集にあたり、従来型伐採および低インパクト伐採の調査地を選定することができた。原生林については地上部を中心とした森林構造に関する調査を実施した。現地における課題遂行上の基盤整備としては概ね計画どおり進めることができたと考えている。引き続き設置した調査プロットにおいて地上部の森林構造や地表面の撹乱に関する調査を進めるとともに、地下部細根の現存量把握を行う。また、細根生産量測定についての予備調査を行う。これらの調査結果にもとづき、伐採インパクトの異なる森林における地上部森林構造や地下部細根現存量の違いを明らかにする。現地スタッフの協力により調査地の選定作業を効率的に進めたことから、渡航回数が想定よりも少なくなり旅費支出が抑えられた。本年度は予備調査が中心であったが、次年度は細根現存量等の把握のための現地調査を予定しており、支出が増えることが見込まれるため、未使用分を次年度へ繰り越すこととした。
移行期経済における農業をとりまく環境変化に関する研究

本研究は、市場経済体制への移行の目的で導入されてきた価格・貿易政策、財政政策民営化政策等と農業生産者保護政策が、市場経済への移行期にある東欧の国々の農業部門に対して環境面でどういう影響を与えているのかを検証し、持続可能な農業発展を図るという視点より環境への外部効果を内部化するための制度を考察し、広く移行期にある経済における環境政策面での政府の役割を明確化することを研究目的とした。この研究により、以下のことが達成された。1)急速に変容を遂げる移行期経済における経済改革と環境変化に関係する最近の内外の研究成果について再サーベイがおこなわれ、ハンガリー科学アカデミー土壌研究所のライカイ博士と共著でレビュー論文が作成された。そこでは、これまでのアプローチの特徴や限界、実際に存在するデータを使った分析の可能性について考察がなされている。2)またハンガリー農業省がまとめてきた集計された農業生産データを、1965年分から1995年分まで入手し、データベース化した。さらに、農業関連の環境指標として、水質変化に関するデータも入手し、データベース化した。そしてこれらを使い分析がなされ、結果の一部は、環境経済・政策学会の全国大会で発表された。新しい経済環境が窒素肥料使用の低下をもたらし、それが地下水汚染の軽減をもたらしていることが、モデルを使い明示化された。3)上の分析により明示化された環境への外部効果と現実に存在する経済・環境政策との乖離につき細部にわたり問題検討が行われており、持続可能な農業発展を図るために必要な制度・政策について論文の形にまとめられている。そこでは持続可能な農業発展にする環境に負荷をかけないような農業生産形態を確立するためには、経済的インセンティブを与えるような制度の導入が求められていることが考察されている。現時点までに、平成7年度の作業の進展状況は以下の通りである。1)移行期経済における経済改革と環境経済学における最近の内外の研究成果についてサーベイをおこなった。政治上の混乱は続くが、経済政策面では堅実な財政・金融政策を導入している移行経済において、経済発展の回復が見られていることが確認できた。さらに環境面では資源利用の効率性が高まったことと、農業分野においても改善がはかられていることが確認できた。また環境計量モデルの構築に関するレビューがおこなわれた。2)ワルシャワ経済大学のコバルスキー助教授を通してポーランド農業省農業食料経済研究所が収集した農家サーベイデータを1988年分から1994年分まで入手した。3)農家の種類別、地域別にデータを入力し、データベースをつくる作業が現在おこなわれている。4)京都大学に客員教授として滞在しているトムチャック教授(ワルシャワ経済大学)に対するヒアリングをもとに計量分析モデルがつくられ、分析がすすんでいる。作業がまだ進展している段階であるので、最終的な結論は出せないが、以下の評価が可能である。1)各種の経済改革とその効果に関しては、経済的な評価が可能なレベルまで研究が進んでいる。環境経済学の理論を使った環境影響評価手法の当研究に対する応用可能性は、データ及び費用の制約があることより限定されたものとなりそうである。2)農業をとりまく広範な環境関連基礎データが順調に収集されている。ことに農家レベルにおけるデータは貴重であり、独自性のある研究結果が導入できそうである。3)教育、生産構造、市場へのアクセス等が肥料、農薬の使用量に及ぼす影響について統計分析が進んでいることより政策的含意のある研究結果が導入できそうである。

本研究は、市場経済体制への移行の目的で導入されてきた価格・貿易政策、財政政策、民営化政策等と農業生産者保護政策が、市場経済への移行期にある東欧の国々の農業部門に対して環境面でどういう影響を与えているのかを検証し、持続可能な農業発展を図るという視点より環境への外部効果を内部化するための制度を考察し、広く移行期にある経済における環境政策面での政府の役割を明確化することを研究目的とした。本年度の研究においては、以下のことが達成された。1)急速に変容を遂げる移行期経済における経済改革と環境変化に関係する最近の内外の研究成果について再サーベイがおこなわれ、ハンガリー科学アカデミー土壌研究所のライカイ博士と共著でレビュー論文が作成された。そこでは、これまでのアプローチの特徴や限界、実際に存在するデータを使った分析の可能性について考察がなされている。2)またハンガリー農業省がまとめてきた集計された農業生産データを、1965年分から1995年分まで入手し、データベース化した。さらに、農業関連の環境指標として、水質変化に関するデータも入手し、データベース化した。そしてこれらを使い分析がなされ、結果の一部は、環境経済・政策学会の全国大会で発表された。新しい経済環境が窒素肥料使用の低下をもたらし、それが地下水汚染の軽減をもたらしていることが、モデルを使い明示化された。3)上の分析により明示化された環境への外部効果と現実に存在する経済・環境政策との乖離につき細部にわたり問題検討が行われており、持続可能な農業発展を図るために必要な制度・政策について論文の形にまとめられている。そこでは持続可能な農業発展にする環境に負荷をかけないような農業生産形態を確立するためには、経済的インセンティブを与えるような制度の導入が求められていることが考察されている。
ハミルトン力学系を用いたタンパク貭機能発現のモデル作成と動力学的特徴付け

筋肉を構成する基本的な運動タンパク質(分子モーター)を念頭に置き、二種類のタンパク質が相互作用によって自律的に運動する様子を数理モデルで表した。今年度は特に、このモデルの解析を元に、タンパク質が生体内のような大きく揺らぐ環境の下でも頑強に機能を実現する仕組みを、ダイナミクスの立場から堤案することを目指した。実際、タンパク質はいつでも画一的な機能発現をするのではなく、状況に応じて機能発現の度合いを調節しているように見受けられる。このような柔軟な機能発現がタンパク質分子自身によって自己制御される様子は、身近なマクロ機械の動作原理とは大きく異なっているだろう。本研究で用いたモデルは、入力されるエネルギー量や環境の温度変化、与えられる負荷量に対し、柔軟に対応することが可能である。このモデルの解析から得られた柔軟な機能発現を実現する機構は以下のようであった。発現過程を開始するために分子の一部に外部からエネルギーを与えると、エネルギーが他の部分に移っていく過程において、段階に応じて相互作用の変化が促されていることがわかる。これは、システムのダイナミクスによる自律的制御の結果可能になっており、この自律的制御により、エネルギーの無駄な散逸が抑制され、入力エネルギーが確実で効率的に機能に変換されている。特にダイナミクスの中のカオス性の制御は、有効な仕事(機能)の取り出しと発現過程のルース性に重要な位置を占めることが示唆されている。この研究結果は現在投稿準備中である。筋肉細胞中の運動タンパク質を参照し、ハミルトン力学系を用いたモデルの構築を行なった。モデルの一部に、インプットとして化学反応由来と設定したエネルギーを注入したところ、アウトプットとして仕事(方向性運動)を取り出すことに成功した。仕事の抽出は幅広い温度下で機能し、他のパラメータ変化に関しても特異的でないことから、作成したモデルによる機能発現は非常に頑強なダイナミクスになっていることがわかった。また、インプットエネルギーの量に比して仕事量が増加することから、このモデルが見せる機能は、与えられるエネルギーが不確定であっても、それを無駄にすることなく効率的に利用できる良い性質のものであることもわかった。さらに、機能発現に際しては、非平衡状態でないと実現確率が非常に低いようなある定型のダイナミクスを示すことが、発現過程のダイナミクスの細かい特徴抽出により把握された。一方で、このモデルが見せる頑強さは、ダイナミクスの持つカオス性と密接に関係していることが示唆され、このカオス性と上記の定型ダイナミクスとの関係が頑強な機能発現を実現しているようである。この点の解明を来年度の課題とする。
絶滅危惧種ツキノワグマはなぜ人里へ出没するのか?-生理学的なアプロ-チからの出没要因の解明-

本研究は絶滅の危機にあるツキノワグマ個体群(以下クマ)個体群を対象に,行動追跡,生理的状態,食物資源量,土地利用の変遷に関するデータを収集,GIS上に統合し,出没要因の解明と出没危機管理体制を構築することにある。本年度は,8頭のクマにGPSテレメトリーを装着・追跡した。これまで装着した個体も合わせ,合計17頭のデータを取得した。その結果,人里付近に出没する個体と非出没個体では,行動特性が異なることが明らかとなった。出没個体のうち,オスの最外郭行動圏は,55.6±55 km^2と広域で個体差が著しく,複数の集落周辺で活動が認められた。出没時の追い払いによって,行動が修正できたケースと,修正できず兵庫県の基準に基づき,捕殺に至った個体もいた。メスでは,30.2±38 km^2と狭く,恒常的に利用するエリアは極めて狭かった。また,特定の場所に固執する行動を示し,追い払いによる行動修正も困難であった。さらに,非出没個体の行動を明らかにするため分布中心部で捕獲したところ,メスのみが捕獲された。非出没個体のメスは,出没個体のメスより,さらに行動圏が狭く,集落へ近づくことが極めで少なかった。以上より,出没個体と非出没個体の存在が確認され,出没個体は,堅果類の豊凶に関わらず,集落周環境を利用していた。出没、非出没個体の行動圏と1900年代,1950年代の植生図をオーバーレイすると行動辺圏内の約20%が荒地であり・クマが行動可能な森林環境は増加していると判断された。死亡個体の分析からは,成獣に骨の異常が複数確認され異常割合は,骨そしょう症33%,過形成59%,骨盤奇形7%,脛骨左右非対称7%と極めて高く,遺伝的劣化の影響が示唆された。これらの情報を地図化し,クマの出没頻度の高い地域,遺伝的劣化が示唆され保全上の対策が必要な地域など保護管理に必要な情報を地図化し,保全対策・出没対策マップを作製した。本研究は、ツキノワグマの出没要因を解明するため、行動追跡、生理モニタリング、食物資源調査、生息環境の変化に関する調査を行い、GIS上で解析を行うものである。本年はクマの出没が極端に少なく、発信機が装着できた個体は1個体であった。そのため、毎年行う食物資源調査と過去に発信機を装着した個体の追跡のほか、GIS上での解析に必要となる植生図の情報整備を集中的に行った。したがって実施した内容のうち、発信機装着や遠隔ダウンロード等の現地調査の回数が予定より大幅に減り、GIS整備委託費、被害調査委託費などに多くの費用を要した。GIS整備については、クマの生息環境の変遷がクマの行動に及ぼした影響を推定するため、1900年、1950年の古地図から植生図をデジタル化した。食物資源の調査では、兵庫県内を4×5kmのメッシュに区切り、各メッシュ内のブナ、ミズナラ、コナラの堅果類豊凶調査を行った。その結果、クマの主要な生息地である高標高のブナ・コナラの豊凶指数が著しく高く、2005年は豊作年であったことが明らかとなった。行動追跡からは、2004年に集落周辺で被害を及ぼした個体がブナ帯や高標高地域のみで行動していることが明らかとなり、豊作地域との行動範囲の一致が見られた。集落での被害も著しく少なかった。このように一度集落に被害を及ぼした個体でも、豊作年には集落へ出没しないことを確認、今後のクマ対策に重要な知見を与える情報が得られた。また、GIS装着個体については、放獣から7日後にデータの遠隔ダウンロードを試み成功した。測位試行回数は189回、うち成功数147回、有効測位回数は46回(約24%)であった。有効測位回数としては低い割合であったが、地上波と比べると格段に効率が良い。以上から、兵庫県の環境においてもGPSテレメトリーの測位やダウンロードに支障がないことが確認できた。本年度はクマの大量出没があり、52頭のクマを捕獲・学習放獣を実施した。そのうち、9頭についてGPS内臓発信機の装着に成功、7頭については、行動追跡を行い、遠隔ダウンロードにも成功した。前年度からの追跡個体を含め、8頭の詳細な行動追跡のデータが蓄積できた。2頭については、発信機の不具合により行動追跡が行えていない。行動追跡を行った7頭のうち2頭については、学習の効果が認められない行動が再三繰り返されたため、兵庫県の保護管理計画の基準に基づき、追跡途中ではあったが捕殺に至った。捕殺された個体については、詳細な解剖を実施し、齢査定や栄養診断を行った。このように昨年来から予測されたように本年度は、クマの行動追跡に多くの費やし、のべ1876回の有効測位回数を得ることができ、これまで追跡が困難であったツキノワグマの長期的な行動追跡に成功した。さらに、これらの情報と昨年度に収集整備した古地図データとのオーバーレイを実施した。

その結果、クマが現在行動域として利用している二次林の多くは、50年から100年前には、荒地・草地であり、薪炭林としての人による利用が顕著で当時はクマが活動できる植生ではないことが明らかとなった。その後集落周辺にあった薪炭林はエネルギー革命とともに活用されなくなり、この50年間の間に放置されたまま広葉樹の二次林へと変化し、ツキノワグマが自由に活動し、集落周辺まで容易にアクセスできる状況を生み出していたことなど、集落環境を取り巻く社会的な変化がクマの行動にも大きく影響していたことが推測された。今後は、得られた位置情報から、冬眠穴の環境調査、昨秋執着が著しかった集落環境の調査、さらにこれまで解剖調査を行った30個体の分析を行い、GIS上での解析を行っていく。本研究は絶滅の危機にあるツキノワグマ個体群(以下クマ)個体群を対象に,行動追跡,生理的状態,食物資源量,土地利用の変遷に関するデータを収集,GIS上に統合し,出没要因の解明と出没危機管理体制を構築することにある。本年度は,8頭のクマにGPSテレメトリーを装着・追跡した。これまで装着した個体も合わせ,合計17頭のデータを取得した。その結果,人里付近に出没する個体と非出没個体では,行動特性が異なることが明らかとなった。出没個体のうち,オスの最外郭行動圏は,55.6±55 km^2と広域で個体差が著しく,複数の集落周辺で活動が認められた。出没時の追い払いによって,行動が修正できたケースと,修正できず兵庫県の基準に基づき,捕殺に至った個体もいた。メスでは,30.2±38 km^2と狭く,恒常的に利用するエリアは極めて狭かった。また,特定の場所に固執する行動を示し,追い払いによる行動修正も困難であった。さらに,非出没個体の行動を明らかにするため分布中心部で捕獲したところ,メスのみが捕獲された。非出没個体のメスは,出没個体のメスより,さらに行動圏が狭く,集落へ近づくことが極めで少なかった。以上より,出没個体と非出没個体の存在が確認され,出没個体は,堅果類の豊凶に関わらず,集落周環境を利用していた。出没、非出没個体の行動圏と1900年代,1950年代の植生図をオーバーレイすると行動辺圏内の約20%が荒地であり・クマが行動可能な森林環境は増加していると判断された。死亡個体の分析からは,成獣に骨の異常が複数確認され異常割合は,骨そしょう症33%,過形成59%,骨盤奇形7%,脛骨左右非対称7%と極めて高く,遺伝的劣化の影響が示唆された。これらの情報を地図化し,クマの出没頻度の高い地域,遺伝的劣化が示唆され保全上の対策が必要な地域など保護管理に必要な情報を地図化し,保全対策・出没対策マップを作製した。
塩ストレス下でのアイスプラントのCAM型光合成関連遺伝子の発現調節機構

アイスプラントは500mMNaClを含む水耕液(海水の塩分濃度に匹敵)でも生育可能な耐塩性に優れた植物である。その耐塩性メカニズムの一つとして塩ストレスによって光合成型がC_3型からCAM型へシフトすることがあげられる。本研究ではCAM型光合成における鍵酵素の一つであるNADP-リンゴ酸酵素(NADP-ME)に着目し,塩ストレス下での発現調節機構を明らかにする目的で行った。「材料及び方法」アイスプラントは水耕栽培し,水耕液のNaCl濃度を400mMに高めることによってCAM型光合成を発現された。抗NADP-ME抗体は,CAM型アスカプラントより精製したNADP-MEを使って作製した。「結果及び考察」1.塩ストレスによって葉身のNADP-ME活性は約12倍に増加した。2.C_3及びCAM型アイスプラントの葉身よりNADP-MEを抽出し,デイビス法に従って電気泳動したところC_3型とCAM型とでNADP-MEの移動度が異なっていた。3.C_3型のNADP-MEのペプチドマップは一致し,二つのNADP-MEの一次構造は類似していることが分かった。4.しかし,抗NADP-ME抗体を使った免疫沈降反応及びELISAからC_3型とCAM型のNADP-MEで抗原性が異なることが示された。5.NADP-MEcDNA断片をプローブとしたノーザンブロットハイブリダイゼーションでは,塩ストレスによってNADP-MEのmRNAの増加が認められた。6.以上の結果から,アイスプラントのNADP-MEはC_3型とCAM型のものが存在は,塩ストレスによってC_3型のNADP-MEは消失し,CAM型のNADP-MEが発現され,その発現はmRNAのレベルで調節されていることが明らかとなった。
クリニカル モレキュラ スキャナによる組織オルガネラ蛋白質の系統的解析法

ポストゲノムの時代に入り,組織或いは細胞に発現する蛋白質のゲノム機能解析は一段と加速した。二次元電気泳動法(2D SDS-PAGE)は発現蛋白質の分離同定に有用な機器であるが,同時に特異的な疾患のマーカー蛋白質の診断ツールとしても使用し得る。しかしながら、全組織分析は,低コピー率の蛋白質の検出を不可能とする。従って、免疫沈降,アフィニティークロマトグラフィー,オルガネラ分画等の前処理を必要とする。我々の研究目的は,細胞及び組織のオルガネ分画物の蛋白質プロファイルを、医学領城におけるクリニカルモレキュラスキャナとして1D/2D SDS-PAGEを使用する事にある。第一に、我々はNycodenz溶液の凍結融解で密度勾配を作成し、ラット肝臓のワンステップ-オルガネラ分画法を開発した。40mlの遠心管に20%Nycodenz液を入れ-20°Cのフリーザーで一夜凍結し,室温に数時間放置後、密度勾扉を作成した(1.0068-1.3523)。ラット肝臓の核及び細胞質除去後のホモジナイズ液をNycodenz勾配液に層積し,遠心,オルガネラを分画した。分画後の1D SDS-PAGEで蛋白質のプロファイルを観察し,各オルガネラのマーカー蛋白質をウエスタンブロットで確認した。オルガネラの主画分については2D SDS-PAGEで蛋白質プロファイルを得た。電気泳動-質量分析法による蛋白質の同定は、プロテオーム解析において有効な手法である。蛋白質のシステイン残基は,ゲル内消化に先立ち還元アルキル化処理を必須とする。我々は電気泳動中にアクリルアミドを添加するアルキル化-システインプロピオンアミド(PAMcys)法を開発した。その結果,システイン及び総トリプシンペプチドの回収率上昇によりデーターベースサーチ精度が上がった。正常と老化マウス肝臓の発現蛋白質をオルガネラ分画と1D/2D SDS-PAGEとのシークエンシャル法で、比較を開始した。従来とは異なる概念を用い密度勾配を作成し、オルガネラ分画法を確立した。密度勾配のメヂユムとして造影剤に用いられるNycodenz(NycomedPharmaAS)を使用した。本剤は細胞毒性がなく、Ficollのように膜を通過する性質がなく、酵素の活性を阻害しない利点があり、分画後直ちにマーカー酵素の測定が可能であった。また、本剤は遠心分離による自動密度勾配作成能が利点とされているが、遠心には長時間を要し、十分な勾配形成が出来なかった。我々はNycodenz溶液の凍結融解による完全な密度勾配作成法を開発した。遠心チューブ内にNycodenz溶液を入れ、-20°Cに一夜放置後、室温で自然解凍させる事により、十分な密度勾配を形成させた。用いるチューブのサイズ、Nycodenzの濃度により、異なった密度勾配が作成され、目的とするオルガネラに応じて自由に勾配を選択できる事を明らかにした。10、20,30%Nycodenz液で密度勾配作成後、ラット肝臓のホモジネイトを試料として、超遠心分離し、フラクショネーターで分画した。各チューブの密度を測定後、一部を1次元SDS-PAGEで蛋白質分離を試みた。蛋白質パターンは密度変化に相関しており、蛋白質パターンから密度が推測出来た。また、2種の酵素活性測定及び4種の抗体によるオルガネラの同定を試みたが、後者ではオルガネラの広がりや、重なりを容易に判定出来た。

リソゾームとミトコンドリアは分離が難しく、今後、遠心管サイズおよびNycodenz濃度の検討を必要とした。しかしながら、本法において両者の分画はわずかにずれており、両者の重なりが少ない部分の分画物を二次元電気泳動で比較したところ、夫々に特異的な蛋白質スポットが確認された。One Step分画ですべてのオルガネラに存在する蛋白質を俯瞰できるNycodenzによる密度勾配分画法はプロテオーム解析の前処理法として、欠くべからざるものであることが明確になった。平成12年度,Nycodenzを凍結融解することで密度勾配を作成し、ラット肝臓オルガネラの分画法を確立した。二次元電気泳動における蛋白質分析は蛋白質分布が俯瞰できる利点があるが、蛋白質間の結合が強い場合、一次元等電点電気泳動のストリップ内に結合した状態でとどまり、二次元ゲル内への展開に問題が残る。その現象が一個体内での再現性と個体差間の差異の判断を困難にしている場合がある。そこで、本年度は、老化によるマウス肝臓蛋白質変化を観察すべく、正常マウスと老化マウス間の蛋白質の変化を解析し、システム確立の検討を進めた。成熟マウスBalbC♂、5週齢(20g-肝臓1.37g)に対し、老化マウス同、月齢10ヶ月(33g-肝臓1.89g)をモデルとし、オルガネラ分画後の主分画物を、再現性の高い一次元SDS-ポリアクリルアミドゲル電気泳動で比較した。その結果、ミトコンドリアでは、全83バンドのうち、老化で50%以上減少する蛋白質は12バンド、3倍以上増加するバンドは2バンドであった。老化で検出されない3バンドのうちIntOD値が1以上の存在量を示すものは1バンドであり、逆に、老化のみで観察されたバンドは6、そのうちIntOD値が1以上を示すものは2バンドであった。他のオルガネラに対しても同様に解析し、オルガネラ全般の老化における蛋白質変化を観察した。上記、変化の大きいゲルバンドを切り取り、目下ペプチドマッピングで蛋白質同定を実施している。最終的には、二次元電気泳動法を併用し、蛋白質の一次元/二次元電気泳動挙動から蛋白質間の結合解析を含む,蛋白質の分布状況を俯瞰し解析する。蛋白質同定におけるゲル内蛋白質の還元アルキル化は、すでに多くの報告はあるが,いずれも問題を抱えており、我々は電気泳動を用いた利点として、積極的にアクリルアミドを用いて電気泳動中にアルキル化する、簡便で高効率の方法を検討し報告した。