hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
タンパク質分解系による複製のライセンシング確立の制御機構

細胞周期において、次のサイクルでの染色体複製の準備が、M期終期においてなされる。我々は、M期中期においてCdt1はリン酸化され安定に存在することを見出した。リン酸化解析により、Cdt1とサイクリンA-CDKの結合に関わるCy領域近傍にM期に高度にリン酸化が検出された。これまでPlk1とCDK1-サイクリンBがリン酸化に関わる結果を得ており、これらのリン酸化がCRL1-Skp2ユビキチンリガーゼの認識をブロックすることによりCdt1安定化に寄与すると捉え分子機構の解析を進めた。1.M期においてCdt1がCRL4-Skp2による分解から保護されていることを確認するため、同様にCRL1-Skp2により分解されるp27を融合したCdt1-p27を安定に発現する細胞を作成し、M期での安定性を調べた。Cdt1-p27は、M期で分解され、またMG132で抑制されたので、CRL1-Skp2はM期でも活性があるが、Cdt1は、CRL1-Skp2による分解から保護されていることを確認した。2.Plk1とCDK1-サイクリンBの阻害剤を用いて、これらのキナーゼを抑制しM期からG1期にリリースしてMCMタンパク質のクロマチン結合を指標にライセンス化を調べたところ、両キナーゼを抑制するとライセンス化が抑制される結果を得た。3.Plk1が結合するCdt1の領域を、欠失変異体を作成し調べた所、N末端150アミノ酸領域に強い結合が見られた。この領域に存在するCy領域近傍のリン酸化部位(73,78,79,82,93)の変異体を作成し、精製Plk1およびCDK1-サイクリンBキナーゼを用いてin vitroでアッセイした。これら5カ所すべてに変異をいれると、Plk1、CDK1-サイクリンB両方によるリン酸化が低下した。アミノ酸配列による考察と2変異および3変異体を用いた結果より、Plk1は主に73と93、CDK1-サイクリンBは79,82,93をリン酸化すると考えられた。以上より、Plk1およびCDK1-サイクリンBがCdt1をリン酸化することによりM期に分解から保護しており、M期終了時に確実に複製のライセンス化を行なうことにより、遺伝情報の維持に寄与すると考えられる。細胞周期において、次のサイクルでの染色体の複製の準備が、M期終期においてなされる。ライセンス化因子Cdt1はS期からG2期においては、再複製の抑制のため分解されるが、M期中期においてCdt1はリン酸化され安定に存在することを見出した。リン酸化解析により、Cdt1とサイクリンA-CDKの結合に関わるCy領域近傍にM期に高度にリン酸化される部位を見つけており、このリン酸化が安定化に関与していると捉え研究を行った。Cy領域の近傍に検出されたリン酸化部位78S,79S,82Tをアラニン(A)に変異させたCdt1(78A79A82A)-3FLAGを安定に発現する株を作成し、M期で機能するキナーゼであるPlk1, Aurora A, AuroraBをノックダウンしたところPlk1をノックダウンした場合に、Cdt1 (78A79A82A)-3FLAGが不安定になることを確かめた。また、Cdt1のN末100アミノ酸を含む領域Cdt1(1-101)(78A79A82A)を発現する細胞株でもPlk1ノックダウンにより顕著に不安定化が見られた。Skp2を同時にノックダウンすると安定性の回復が見られた。79Sと82TはそれぞれSP,TP配列になっておりM-CDKによるリン酸化と考えられるので、M-CDKとPlk1によるCdt1のリン酸化がM期における安定化に関与する可能性が高い。In vitroキナーゼアッセイによりサイクリンB-Cdk1によるCdt1のリン酸化を確認した。また、免疫沈降法によりPlk1がCdt1と結合することも確認したので、Plk1によるリン酸化アッセイを行なう予定である。

3.Plk1が結合するCdt1の領域を、欠失変異体を作成し調べた所、N末端150アミノ酸領域に強い結合が見られた。この領域に存在するCy領域近傍のリン酸化部位(73,78,79,82,93)の変異体を作成し、精製Plk1およびCDK1-サイクリンBキナーゼを用いてin vitroでアッセイした。これら5カ所すべてに変異をいれると、Plk1、CDK1-サイクリンB両方によるリン酸化が低下した。アミノ酸配列による考察と2変異および3変異体を用いた結果より、Plk1は主に73と93、CDK1-サイクリンBは79,82,93をリン酸化すると考えられた。以上より、Plk1およびCDK1-サイクリンBがCdt1をリン酸化することによりM期に分解から保護しており、M期終了時に確実に複製のライセンス化を行なうことにより、遺伝情報の維持に寄与すると考えられる。
動的画像解析法による流動粒子数測定法の開発

2次元流れ場に対する動的画像解析法は近年長足の進歩をとげており,ビデオ撮影した1画面当り通常数百個の粒子の速度ベクトルをほぼリアルタイムで測定可能なレベルまで達しているが,従来速度ベクトルを求めることに主眼がおかれ,粒子数を数えるようにはなっていない.しかしプログラムを少し改良するだけでこのことは達成可能である.昨年度はこの方法を用いて2次元形状のロートから空気中へ連続的に落下するポリスチレン粒子の数を測定し,±5%の誤差範囲で測定可能な方法の開発に成功した.しかしこの方法では粒子数が多くて互いに重なっている場合の粒子数の測定は不可能である.そこで,今年度の当初の予定である3次元測定法の開発に先立ち,著者らの以前の研究成果を参考にして,大小様々な粒子が複雑に重なりながら流れている場合を対象として,粒子の大きさを判別し,それらの頻度分布を求めることの可能なソフトの開発を行った.今後,引続き3次元流路における移動粒子数測定法の確立を目指す.具体的には直径の異なるいくつかのロートから落下するポリスチレン粒子を2台のビデオカメラで撮影し,3次元動的画像解析プログラムを改良したプログラムによって解析し,落下粒子数を求める.2次元流れ場に対する動的画像解析法は近年長足の進歩をとげており,ビデオ撮影した1画面当り通常数百個の粒子の速度ベクトルをほぼリアルタイムで測定可能なレベルまで達しているが,従来速度ベクトルを求めることに主眼がおかれ,粒子数を数えるようにはなっていない.しかしプログラムを少し改良するだけでこのことは達成可能であると考え,研究を開始した.本年度は2次元流れ場の代表例として,ロート状の出口から空気中へ連続的に自由落下するポリスチレン粒子の数を測定するための実験装置の製作と調整を行い,落下粒子数の測定ならびにデータ整理に着手し,同時に粒子数計測用プログラムの開発と改良に取り組んでいる.現在のところ,落下粒子数が少なく粒子の重なりがほとんど無い場合については,±5%の精度で単位時間あたりに落下する粒子数を数えることができるようになっている.この成果は既にISIJ International誌へ投稿しており,掲載可の通知を得ている.なお,精度を±1%にまで向上させるとともに,重なり粒子が多い場合にも適用できるプログラムを開発するために鋭意努力中である.さらに,水中に設置したロート状の出口から水中へ連続的に落下するポリスチレン粒子の数を測定するための実験装置の製作と調整を行っている.2次元流れ場に対する動的画像解析法は近年長足の進歩をとげており,ビデオ撮影した1画面当り通常数百個の粒子の速度ベクトルをほぼリアルタイムで測定可能なレベルまで達しているが,従来速度ベクトルを求めることに主眼がおかれ,粒子数を数えるようにはなっていない.しかしプログラムを少し改良するだけでこのことは達成可能である.昨年度はこの方法を用いて2次元形状のロートから空気中へ連続的に落下するポリスチレン粒子の数を測定し,±5%の誤差範囲で測定可能な方法の開発に成功した.しかしこの方法では粒子数が多くて互いに重なっている場合の粒子数の測定は不可能である.そこで,今年度の当初の予定である3次元測定法の開発に先立ち,著者らの以前の研究成果を参考にして,大小様々な粒子が複雑に重なりながら流れている場合を対象として,粒子の大きさを判別し,それらの頻度分布を求めることの可能なソフトの開発を行った.今後,引続き3次元流路における移動粒子数測定法の確立を目指す.具体的には直径の異なるいくつかのロートから落下するポリスチレン粒子を2台のビデオカメラで撮影し,3次元動的画像解析プログラムを改良したプログラムによって解析し,落下粒子数を求める.
前立腺癌定位放射線治療におけるスペーサーを用いた線量増加と臓器移動抑制効果の検証

前立腺癌における体幹部定位放射線治療(stereotactic body radiotherapy: SBRT)は、高度画像誘導技術を用いることにより、1回線量を増加させ治療期間の短縮を可能にした高精度放射線治療である。本研究では、SBRTに直腸と前立腺の間に挿入し直腸の高線量被ばくを低減させるハイドロゲルスペーサーを併用することにより、有害事象を増やすことなく線量増加が可能であるか、治療時に問題となる臓器移動を抑制することができるかを明らかにすることを目的としている。本年度は、SBRTにおけるハイドロゲルスペーサーの有効性と安全性を明らかにするために行った第2相臨床研究の登録治療を完了した。主要評価項目である急性期消化管有害事象と線量分布の改善の結果についてまとめ解析を行い、国内学会で発表し国際学会(アメリカ放射線腫瘍学会)に抄録を提出中で、現在論文執筆を行っている。また関連する研究として、3次元原体照射(3D-CRT)におけるハイドロゲルスペーサーの有効性に関する研究を行い、国内学会で発表を行った。2019年4月に国際学会(ヨーロッパ放射線腫瘍学会)でも発表予定である。晩期有害事象の評価のため、今後フォローアップを継続していく。上記結果をふまえて、前立腺癌SBRTの線量増加試験のプロトコールを作成し、今後倫理委員会に提出する予定である。ハイドロゲルスペーサーの臓器移動抑制効果に関しては、現在ハイドロゲルスペーサーを挿入して治療した治療中cone beam CT (CBCT)画像を収集中である。第2相試験の結果解析後に、線量増加試験のプロトコール作成を予定していたため、年度内に倫理委員会提出することを目標にしていたが、作成に時間を要し次年度の提出となった。ただおおむね予定通りの進捗状況であり、次年度には線量増加試験を開始したいと考えている。2019年度に線量増加試験のプロトコールを倫理委員会に提出し承認を得て、実際の研究開始を目標としている。ハイドロゲルスペーサー挿入治療手技には販売会社からトレーニングを受けライセンスを得る必要があるが、現在2名ライセンス取得者がいるのに加えて、さらにもう1名ライセンスを取得する予定である。臓器抑制効果の検証も、線量増加試験と同時平行で行い、解析を進めていく。予定していた学会発表、論文投稿、倫理申請が次年度になったため、そのための費用を次年度に繰り越すこととなった。学会発表参加費用、論文投稿に必要な経費(英文校正代・投稿料)、倫理申請費用を次年度に使用する。
スピン輸送現象を利用した反強磁性体磁化の検出と制御

反強磁性体は、磁気モーメントが互いに打ち消し合うように配列し全体として自発磁化をもたない磁性体であり、共鳴周波数がテラヘルツ領域にあることや、漏れ磁場が無いなどの特徴を持つ。現在、それらの特徴を利用したテラヘルツ発振素子や磁場に対して強固な磁気メモリが提案され、反強磁性薄膜に関する研究が盛んに行われている。そこで反強磁性体を素子応用するにあたり、反強磁性体の磁気相転移温度をはじめとする物性を検出することが重要である。本研究では磁性体の磁化配向に応じて、隣接した非磁性重金属層の抵抗値が変化するスピンホール磁気抵抗効果(SMR)に着目し、磁気相転移温度を290 Kにもつ反強磁性体CoOを用い、SMRの温度依存性を調査した。実験では、Pt4 nm/CoO10 nm/Pt4 nm//MgO(001)薄膜をマグネトロンスパッタ法により成膜し、フォトリソグラフィ法により細線幅5 um、細線長さ25 umのホールクロス構造に加工した。薄膜面内方向に24 Tの磁場を印加して回転させ、電流と磁場との相対角度がαのときにおける縦抵抗値と横抵抗値を測定した。試料温度はCoOの磁気相転移温度290 Kを跨ぐ240 320 Kで変化させた。その結果、縦磁気抵抗値はcos2αにしたがって変化する一方で、横磁気抵抗値は-sin2αにしたがう変化を示した。得られた抵抗変化比を試料温度に対してプロットした結果、およそ磁気相転移温度のときに抵抗変化比が極小を示した。これは、反強磁性由来のSMRと常磁性由来のSMRによる抵抗変化が互いに打ち消したためと解釈できる。したがって磁気相転移温度をSMRを介して電気的に検出することに成功した。また、放射光施設にて、XMLD-PEEMによるバルクNiOの磁気イメージングを行った。その結果、NiOの磁区がパルス磁場に応答して変化している様子を観測することに成功した。研究費を申請する際に計画した反強磁性体磁化の電気的な書き込みと読み出しは昨年度に既に成功しており、本年度では、更に反強磁性体の磁気的相互作用に着目した電気測定を行った。その結果、試料温度が磁気転移温度で磁気抵抗変化比が最小を示すという期待通りの実験結果を得ることに成功した。これは、反強磁性体を用いたメモリにおいて、試料温度が磁気転移温度にまで加熱されると得られる抵抗値のスイッチングの大きさが小さくなることを示す。また、反強磁性体の磁場に対する磁化応答の様子を磁気イメージングにも成功した。この知見は、反強磁性体磁化の電気的な書き込みにも応用できるものである。まず、XMLD-PEEMイメージングで得られたNiOの磁区を解析し、静的な磁化状態や、磁場応答の機構を解明する。それと並行して、反強磁性体磁化のスピントルク制御の実験について、SMRを介して得られる抵抗変化比が試料温度の上昇とともに大きくなる問題に取り組み、その結果をまとめて論文化する。反強磁性体は、スピンが反平行に並び、ネール温度以下でも合成された磁気モーメントはゼロであるため、漏れ磁場が無いなどの特徴を持つ。そのため超高密度の磁気メモリを実現する可能性を秘めている。一方で反強磁性体の磁化配向(ネールベクトル)の電気的な検出や操作はこれまで困難と考えられてきた。そこで、磁気メモリへの応用に向けてネールベクトルを電気的に検出し操作する必要がある。まず、ネールベクトルの電気的な検出を試みた。一般に、強磁性体においては印加電流と磁化の相対角度によって抵抗値が変化する異方性磁気抵抗効果が存在するため、抵抗値から磁化方向を検出できる。反強磁性体においてもこれを観測するためには、ネールベクトルを操作する必要がある。反強磁性体に十分に大きな磁場Hを印加すると、ネールベクトルは磁場に対して垂直方向に配向する。実際に、Hを回転させながら反強磁性金属IrMnを含む多層膜の細線に電流を印加して抵抗値を測定した。その結果、Hに対してネールベクトルが垂直方向に配向していることを示唆した抵抗変化を得た。以上より、ネールベクトルを電気的に検出することに成功した。次に、ネールベクトルを電気的に操作することを試みた。ここで、スピン角運動量の流れであるスピン流に着目した。スピン流はPtのようなスピン軌道相互作用の大きな物質に電流を流すとスピンホール効果により生成される。そのスピン流を反強磁性酸化物CoOに注入することで、ネールベクトルを操作できると期待される。実験では、Pt (4 nm) / CoO (10 nm) / Pt (4 nm)を十字型の素子に加工したあと、書込み電流を流してスピン流をCoOに注入し、読取り電流を流して電気抵抗を測定した。その結果、書込み電流の方向に応じて抵抗値が切り替わったことから、CoOのネールベクトルを操作することに成功した。本研究課題の目標は、反強磁性体のネールベクトルを電気的に検出し操作したうえで、メモリとしての動作を検証することである。申請した研究計画では1年目でネールベクトルの方向を電気的に検出するとした。上述したように、実際にはネールベクトルの電気的な検出に加えて反強磁性CoOを用いた磁気メモリの連続的な読み書きまで達成したため、当初の計画以上に研究が進展したと判断した。

反強磁性体は、磁気モーメントが互いに打ち消し合うように配列し全体として自発磁化をもたない磁性体であり、共鳴周波数がテラヘルツ領域にあることや、漏れ磁場が無いなどの特徴を持つ。現在、それらの特徴を利用したテラヘルツ発振素子や磁場に対して強固な磁気メモリが提案され、反強磁性薄膜に関する研究が盛んに行われている。そこで反強磁性体を素子応用するにあたり、反強磁性体の磁気相転移温度をはじめとする物性を検出することが重要である。本研究では磁性体の磁化配向に応じて、隣接した非磁性重金属層の抵抗値が変化するスピンホール磁気抵抗効果(SMR)に着目し、磁気相転移温度を290 Kにもつ反強磁性体CoOを用い、SMRの温度依存性を調査した。実験では、Pt4 nm/CoO10 nm/Pt4 nm//MgO(001)薄膜をマグネトロンスパッタ法により成膜し、フォトリソグラフィ法により細線幅5 um、細線長さ25 umのホールクロス構造に加工した。薄膜面内方向に24 Tの磁場を印加して回転させ、電流と磁場との相対角度がαのときにおける縦抵抗値と横抵抗値を測定した。試料温度はCoOの磁気相転移温度290 Kを跨ぐ240 320 Kで変化させた。その結果、縦磁気抵抗値はcos2αにしたがって変化する一方で、横磁気抵抗値は-sin2αにしたがう変化を示した。得られた抵抗変化比を試料温度に対してプロットした結果、およそ磁気相転移温度のときに抵抗変化比が極小を示した。これは、反強磁性由来のSMRと常磁性由来のSMRによる抵抗変化が互いに打ち消したためと解釈できる。したがって磁気相転移温度をSMRを介して電気的に検出することに成功した。また、放射光施設にて、XMLD-PEEMによるバルクNiOの磁気イメージングを行った。その結果、NiOの磁区がパルス磁場に応答して変化している様子を観測することに成功した。研究費を申請する際に計画した反強磁性体磁化の電気的な書き込みと読み出しは昨年度に既に成功しており、本年度では、更に反強磁性体の磁気的相互作用に着目した電気測定を行った。その結果、試料温度が磁気転移温度で磁気抵抗変化比が最小を示すという期待通りの実験結果を得ることに成功した。これは、反強磁性体を用いたメモリにおいて、試料温度が磁気転移温度にまで加熱されると得られる抵抗値のスイッチングの大きさが小さくなることを示す。また、反強磁性体の磁場に対する磁化応答の様子を磁気イメージングにも成功した。この知見は、反強磁性体磁化の電気的な書き込みにも応用できるものである。次年度は、スピン流で反強磁性体のネールベクトルを操作したことを多面的に検証する。一つ目は、SPring-8にてX線磁気直線二色性と光電子顕微鏡による反強磁性体の磁気イメージング手法を利用する。これによって、電流印加で磁区が変化する様子の観測を試みる。二つ目は、強磁場を印加してネールベクトルを操作したときの磁気抵抗効果を測定し、スピン流による抵抗変化との定量的な比較検討を行う。三つ目は、スイッチング実験の温度依存性を測定し、反強磁性体が常磁性となる温度領域でメモリ特性が失われるかどうか検証する。まず、XMLD-PEEMイメージングで得られたNiOの磁区を解析し、静的な磁化状態や、磁場応答の機構を解明する。それと並行して、反強磁性体磁化のスピントルク制御の実験について、SMRを介して得られる抵抗変化比が試料温度の上昇とともに大きくなる問題に取り組み、その結果をまとめて論文化する。
PCB分解土壌細菌の総合理解と微生物機能高度利用のための技術開発

PCB分解細菌Acidovorax sp.KKS102株を解析するのにあたりqTnSeq法を開発した。この過程において汎用の逆転写酵素が強いtailing活性を有していること、またこの活性を増強する促進化合物を発見した。またあらかじめ形成させた3'突出に対して一本鎖DNAを高効率で取り込ませる方法を開発した。様々な特質を備えたTnカセットをデザイン、人工合成しこのTnカセットを使用しておよそ6万クローンよりなるTn変異株ライブラリーを作製し、構築したqTnSeq法にて十分な効率で解析可能であることを示した。他方、本株のカタボライト調節およびICE転移について、基礎学問的に重要な知見を得た。qTnSeq法に用いるトランスポゾンカセットをデザインし作製した。カセットとしてはカセット外側に向かうプロモーターを配置したものと、外側に向かう転写が起きないように転写ターミネーターを配置したもの、の2種類を作製した。次いで、カセット上の薬剤耐性遺伝子について各種耐性遺伝子に置換した複数種類のカセットを作製した。このうち1つをPCB分解菌Acidovorax sp. KKS102株由来のICE接合伝達頻度が向上したSA17株に適用しておよそ60,000クローンよりなるライブラリーを作製した。ライブラリーの解析方法については、当初断片化したゲノムDNA断片を平滑化処理後、Taqポリメラーゼを利用して3'端にAを1つ突出させ、3'をT突出させたアダプターDNAを連結させることを考えていたが、十分な効率が得られずにいたところ、汎用の逆転写酵素が強い3'突出末端形成能力を有していることを示唆する結果を得た。qTSS法については、RNAの5'端にアダプターDNAをライゲースによって連結することを考えていたが、これについても反応効率が十分でなくqTSS法を構築するには何らかの別の方法を採用する必要があることが示唆された。これについてある酵素がRNAの5'端に高い効率でアダプターDNAを連結可能であることが示唆され、さらなる条件検討により新しい実験系として確立できることが期待される。精製したBphPのC末端ドメインがATPとインキュベートすることでリン酸化されること、またこのリン酸基が精製したBphQに受け渡されることが確認された。またアセチルリン酸とBphQをインキュベートするとBphQがアセチル化されることを示唆するデータを得た。qTnSeqについては当初考えていた方法では十分な効率で断片化したDNAとアダプターDNAを連結することはできなかった。効率良く連結可能な方法としてある別の酵素が有する活性を利用することが有用であることを見いだしており、これを利用することで今後研究が加速すると期待される。BphPの自己リン酸化とBphQへのリン酸基受け渡しを検出するのに成功したこと、BphQがアセチルリン酸によってアセチル化することを見いだしたことと合わせて、計画は概ね順調に進行していると考えている。qTnSeq法を実施するにあたり、断片化したゲノムDNAに効率良くアダプターDNAを付加する方法が必要であった。この目的に、マウス白血病ウィルス由来の逆転写酵素が有用であることを見出した。従来、二本鎖DNAの3'末端に突出塩基を付加する酵素としてTaqポリメラーゼやターミナルデオキシヌクレオチジルトランスフェラーゼ(TdT)が用いられてきたが前者については1塩基のAのみを付加することが可能であり、後者については30から60の塩基を付加してしまい付加する数を制御することが困難であった。本研究課題の遂行により、マウス白血病ウィルス由来の逆転写酵素が強いtailing活性を有しておりA、C、G、Tを高い効率で付加できることを見出した。またさらに、酵素活性について至適条件を探索し、4 mM程度の濃度の二価マンガンが活性を上昇させること、またC、G、T付加についてこれを特異的に増強する化合物をそれぞれ発見した。新たに見出された当該酵素活性を利用して、PCB分解細菌であるKKS102株のトランスポゾン変異株ライブラリーの解析を行い、およそ6万箇所のトランスポゾン挿入部位を同定した。これによりKKS102株の生育必須遺伝子が明らかとなった。またPCB分解遺伝子群を乗せたICEにより、KKS102株ゲノム全体が受容菌株へと転移することを支持する結果を得た。一方qTSS解析において、mRNAの5'端を定量的にかつなるべく高い効率で検出できるようにするため、RNAの5'に対するアダプター連結法についてモデル実験系を構築し、反応条件についての一定の知見を得た。よく用いられている逆転写酵素が強いtailing活性を有していることを、本研究課題の遂行中に偶然見出した。本研究の遂行のみならず、新規知見として非常に重要であると考え、逆転写酵素の特性について様々な観点から解析を行うこととした。そのため当初計画していた研究計画について一時的に遅れが生じたが、以後その遅れを取り戻しており、概ね順調であると考えている。定量的にTn変異株ライブラリーを解析可能なqTnSeq法の確立を行った。qTnSeq法では、Tn変異株ライブラリーDNAを断片化後、ランダムな配列よりなる識別タグ配列を連結した後にPCR増幅してからNGSで解析し、Tnカセット挿入部位を定量的に明らかにする。平滑DNA末端の3'端に対してマロニーマウス白血病ウィルス由来の逆転写酵素により形成させた突出末端に、突出塩基と相補的な塩基を3'端部分に有する一本鎖DNA(GAO; guide adaptor oligonucleotide)を作用させると、当該逆転写酵素の活性により、GAOの相補鎖が合成され、伴ってGAOが3'端へと連結される。

この反応(CIS反応と命名)は非常に効率良く進行し、識別タグを含むアダプターを連結する上で理想的な方法である。実際にqTnSeq法を行うにあたり、超音波で剪断処理して得られたDNAの末端は、各社が販売している末端修復キットではほとんど修復されていないことを示す結果を得た。これについて修復方法を検討したところ、およそ70%程度の効率でCIS反応が起こる修復条件を見いだした。実際にKKS102株由来のTn変異株ライブラリーの解析を行ったところ、96万Tnカセット含有DNA分子を検出することができた。これは用いたDNAの量から計算して35%の検出効率と計算され、従来に無い高い効率で定量的にTnカセットを同定することができた。他方、カタボライト調節機構についてBphQのK108がアセチル化されることを示すデータをMALDI-TOFMSによる解析により得た。また、アセチルCoAがアセチル基供与体となることを示唆するデータを得た。またICEについて、そのoriT部位に関する知見を得た。PCB分解細菌Acidovorax sp.KKS102株を解析するのにあたりqTnSeq法を開発した。この過程において汎用の逆転写酵素が強いtailing活性を有していること、またこの活性を増強する促進化合物を発見した。またあらかじめ形成させた3'突出に対して一本鎖DNAを高効率で取り込ませる方法を開発した。様々な特質を備えたTnカセットをデザイン、人工合成しこのTnカセットを使用しておよそ6万クローンよりなるTn変異株ライブラリーを作製し、構築したqTnSeq法にて十分な効率で解析可能であることを示した。他方、本株のカタボライト調節およびICE転移について、基礎学問的に重要な知見を得た。qTnSeq法についてこれまでに見いだした新規活性についてさらなる検討を行うことで、高効率アダプター連結手法を構築する。またqTSS法についても、目的に適していると考えられる酵素活性について詳細に検討することで、RNA 5'端の定量的検出方法として確立する。トランスポゾン変異株ライブラリーを解析するための手法的な課題は既に解決されており、今後数回の実施により改善点の洗い出しと手法の改善を行いqTnSeq法として確立する。またqTSS解析については、構築したモデル実験系を用いてアダプター連結の最適条件を見出し、またこれに基づいて実際の解析を行い、KKS102株の転写開始点を網羅的に決定するとともにカタボライト調節される遺伝子を同定する。BphPQによるカタボライト調節機構について、BphPおよびBphQアセチル化がカタボライト調節の根幹をなすとの仮説についてin vitrotranscriptionを用いた実験系などにより検証する。29年度が最終年度であるため、記入しない。分子生物学29年度が最終年度であるため、記入しない。
遺伝子改変マウスを用いるプロスタグランジン生合成系酵素の生理的機能に関する研究

心血管系の恒常性維持のために重要な血管作動因子であるプロスタグランジン(PG)の詳細な作用機序は未だに不明な点が多い。本研究ではプロスタサイクリン(PGI)の生理的役割を明らかにするためにPGI合成酵素欠損マウスを個体レベルで解析した。PGI合成欠損マウスはトロンボキサン(TX)やPGEなど他のプロスタノイド産生量の増加をもたらし、心血管系の機能に問接的な影響を及ぼす可能性を考慮し、TX合成欠損マウス、PGE合成酵素トランスジェニックマウスの作成、PGI合成酵素欠損マウス解析を行った。その結果、(1)PGI合成酵素(PGIS)欠損マウスの腎臓で動脈の肥厚が認められ、ジーンチップを用いて解析した結果多くの炎症性発現遺伝子の発現を認めた。(2)モノクロタリン投与肺高血圧モデルラットに、HVJリポゾーム法を用いてPGI合成酵素を発現したところ、肺高血圧の改善と生存率のが上昇した。(3)前年度PGIS欠損マウスで、血管平滑筋の増殖が認められたので、培養細胞を用いてPGISの過剰発現を行った結果、血管平滑筋や血管内皮細胞を含む多くの細胞で、PPAR応答配列を含んだレポータ遺伝子の活性化とともにアポトーシスの誘導が認められた。このアポトーシスの誘導は、ドミナントネガティブ型PPARδの共発現によって完全に抑制された。さらに、細胞外からPGIアナログ・イロプロストで刺激した場合、細胞内cAMP濃度の上昇とともに細胞内PGI-PPARδ依存型アポトーシスの抑制が認められた。cAMPアナログdbcAMPで処理したところ、濃度依存的な細胞内PGI-PPARδ依存型アポトーシスの抑制が認められた。一方、cAMPアンタゴニストであるRp-cAMPで処理したところ、細胞内PGI-PPARδ依存型アポトーシスの促進が認められた。(4)PGISは1型より2型シクロオキシゲナーゼからの基質PGH_2を受けやすいことが判明した。心血管系の恒常性維持のために重要な心血管作動因子であるプロスタグランジン(PG)の詳細な作用機序は未だ明らかではない。本研究ではプロスタサイクリン(PGI)合成酵素の遺伝子欠損マウスを解析し、個体レベルでこの点を解明するPGI合成酵素欠損は、トロンボキサン(TX)やPGEなど他のプロスタノイドの産生量に変動をもたらし心血管系にさらなる影響を及ぼす可能性が考えられることから、TX合成酵素欠損やPGI、TX,PGE合成酵素の過剰発現マウスを作成し解析を行う。本年度は、(1)PGI合成酵素欠損マウスを解析した結果、腎臓に形態変化を伴う異常を生じ、腎動脈の血管壁に動脈硬化様病変が認めた。加齢に伴い血圧の上昇が認められ、6ヶ月齢の欠損マウス胸部大動脈において有意な中膜平滑筋層の肥厚が観察された。(2)PGI合成酵素の発現調節機構を明らかにするため、マウスPGI合成酵素遺伝子プロモーター領域の解析を行い、Sp1配列が重要であることを見出した。(3)モノクロタリン肺高血圧ラットに、HVJリポゾーム法でヒトPGI酵素発現ベクターを投与した結果、肺動脈の肥厚が抑制され肺高血圧の改善が認められた。(4)TX合成酵素欠損マウスの作成がほぼ終了し、現在微生物クリーニングを行っている。妊娠、出産、発育は正常である。血小板凝集能を持つTXA_2欠損により、野生型と比較して約2.5倍の止血時間遅延が認められた。

(5)PGI合成酵素、膜結合型PGE酵素過剰発現マウスの作成を行い系統の確立に向けた努力を行った。心血管系の恒常性維持のために重要な血管作動因子であるプロスタグランジン(PG)の詳細な作用機序の機序は未だに不明な点が多い。本研究ではプロスタサイクリン(PGI)合成酵素欠損マウスを解析し、個体レベルで解析する。PGI合成欠損マウスはトロンボキサン(TX)やPGEなど他のプロスタノイド産生量の増加をもたらし、心血管系の機能に間接的な影響を及ぼすことが考えられることから、PGI、TX、PGE合成欠損マウスの作成・解析を行った。本年度は、(1)PGI合成酵素(PGIS)欠損マウスの腎臓で変動する発現遺伝子の解析を、ジーンチップを用いて解析した結果多くの炎症性発現遺伝子が発現を認めた。(2)モノクロタリン投与肺高血圧モデルラットに、肝臓でHVJリポゾーム法を用いてPGI合成酵素を発現したところ、肺胞内腔投与とほぼ類似の結果が得られた。(3)前年度PGIS欠損マウスで、血管平滑筋の増殖が認められたので、培養細胞を用いてPGISの過剰発現を行った結果、血管平滑筋や血管内皮細胞を含む多くの細胞で、PPAR応答配列を含んだレポータ遺伝子の活性化とともにアポトーシスの誘導が認められた。このアポトーシスの誘導は、ドミナントネガティブ型PPARδの共発現によって完全に抑制された。また、不活性型PGI発現ベクターをHEK-293細胞に導入した場合、レポータ遺伝子の活性化もアポトーシスも誘導されなかった。さらに、細胞外からPGIアナログ・イロプロストで刺激した場合、細胞内cAMP濃度の上昇とともに細胞内PGI-PPARδ依存型アポトーシスの抑制が認められた。cAMPアナログdbcAMPで処理したところ、濃度依存的な細胞内PGI-PPARδ依存型アポトーシスの抑制が認められた。一方、cAMPアンタゴニストであるRp-cAMPで処理したところ、細胞内PGI-PPARδ依存型アポトーシスの促進が認められた。すなわち、細胞外PGI刺激は、細胞内cAMP濃度の上昇させる結果、細胞内PGI-PPARδシグナル伝達経路を介するアポトーシスの誘導が抑制されることを見出した。PGISは1型より2型シクロオキシゲナーゼからの基質PGH_2を受けやすいことが判明した。
尿中キラルアミノ酸メタボローム解析を利用する鋭敏な非侵襲診断法の開発

本研究では、尿試料におけるタンパク質構成アミノ酸のD体及びL体含量を網羅的に個別解析可能な専用装置の開発を達成した。また、質量分析計を検出器として導入し、尿由来の夾雑成分の影響をほとんど受けずに尿中キラルアミノ酸含量解析が可能な高性能分析装置を構築した。開発した装置を用いて、ヒトおよびマウス尿試料において様々なD-アミノ酸の存在を明らかにした。虚血再灌流腎障害モデルマウスにおける尿中キラルアミノ酸メタボロミクスを行い、D-アスパラギン、D-セリン、D-アラニン、D-プロリン等8種のキラルアミノ酸が腎障害マーカーとなり得る可能性を示した。平成26年度は、応募者らがこれまでに開発した二次元HPLC分析装置を基盤として、D体とL体を区別する尿中キラルアミノ酸メタボローム解析の専用装置開発を行った。一次元目の逆相分離においては、九州大学薬学部(浜瀬健司)および研究協力企業(株)資生堂と共同開発したモノリス型キャピラリーカラムを用い、タンパク質構成全アミノ酸20種にイソロイシンとスレオニンのアロ体を加えたアミノ酸22種の相互分離並びに尿中夾雑成分との分離条件を検討した。その結果、移動相としてトリフルオロ酢酸を含むアセトニトリル、テトラヒドロフランおよび水の混合液を用いることで、10時間以内で相互分離を達成した。二次元目の光学分割については、分析対象のキラルアミノ酸21種について微量成分であるD体がL体よりも先に溶出し良好な光学分割が得られ、かつ尿中で大きな夾雑成分が存在しないキラルカラムが不可欠である。そこで、市販のパークル型およびキナ皮アルカロイド誘導体型キラル固定相、九州大学薬学部および(株)資生堂と共同開発した新規キラル固定相を用いて、キラルカラムのスクリーニングを行った。その結果、共同開発した新規キラル固定相、Sumichiral OA-2500S、OA-3200S、OA-4700SRカラムにおいて、多くのキラルアミノ酸が良好に光学分割され、D体がL体よりも先に溶出した。そこで、ヒト尿試料を用いて尿由来の夾雑成分と分離するため、光学分割における移動相条件の検証・最適化を行った結果、共同開発した新規キラル固定相とOA-3200Sカラムの2種を使用することにより、尿中キラルアミノ酸の良好な分離が達成された。また、本分析システムを用いてヒト尿中D-セリン、D-アルギニン、D-アラニン、D-アスパラギン、D-グルタミン酸の良好な分離が可能であり、尿中キラルアミノ酸メタボローム解析装置の構築が達成された。平成27年度は、D体とL体を区別する尿中キラルアミノ酸二次元HPLC分析装置を完成させるため、タンパク質構成全アミノ酸20種にイソロイシンとスレオニンのアロ体を加えた22種のアミノ酸について、光学分割における移動相中酸濃度およびメタノールとアセトニトリルの組成比を精査し、哺乳類尿試料を用いて尿由来の夾雑成分と分析対象キラルアミノ酸を分離可能な移動相条件を確立した。また、尿試料では血液や組織試料とは異なる夾雑成分が多数存在するため、キラルアミノ酸のピーク同定および定量値確認には、より選択性の高い分析システムが不可欠である。そこで、質量分析計におけるNBD-アミノ酸の検出条件を最適化し、研究協力企業の株式会社資生堂と質量分析計を検出器として使用する高選択的多次元HPLCシステムを構築した。その結果、ヒト尿中ではD-アラニン、D-アルギニン、D-アスパラギン、D-アスパラギン酸、D-グルタミン酸およびD-セリンが高濃度に存在することを多次元HPLC-MSシステムにおいても確認した。また、上記以外にも多くのタンパク質構成アミノ酸のD体がヒト尿中に存在することを明らかにした。マウス尿試料においてもD-セリン、D-アラニン、D-プロリン、D-アルギニン、D-リジン、D-フェニルアラニン、D-バリンが存在することを示し、開発したHPLCシステムにより哺乳類尿試料中キラルアミノ酸の網羅的含量解析が可能であることを実証した。また、疾患モデルとして虚血性急性腎障害モデルマウス尿試料におけるキラルアミノ酸の含量解析を行った。その結果、コントロール群と比較して虚血再灌流後8時間では尿中D-アスパラギン、D-セリン、D-アラニンおよびD-プロリンのD体の割合(%D=D/(D+L)*100)が劇的に減少することを明らかにし、4種のD-アミノ酸が腎障害のマーカーになり得ることを示した。平成27年度は、ヒト尿試料を用いて尿由来の夾雑成分と分離するための逆相分離および光学分割における移動相条件の検証・最適化の検討を行い、尿中キラルアミノ酸メタボローム解析装置を完成させ、尿中キラルアミノ酸メタボロミクスによる新規診断指標の探索を進める計画だった。本年度は、光学分割における移動相条件の精査を進めると共に、質量分析計を検出器として用いる高選択的多次元HPLCシステムを構築し、尿中キラルアミノ酸のピーク同定・含量解析を可能にした。また、虚血性腎障害モデルマウス尿試料におけるキラルアミノ酸メタボロミクスを進め、尿中キラルアミノ酸が診断指標となり得ることを示しており、当初の計画通りにおおむね順調に進展していると考える。平成28年度は、D体とL体を区別する尿中キラルアミノ酸二次元HPLC分析装置の連続安定稼働および高性能化を実現するため、研究協力者の九州大学薬学部の浜瀬健司および協力企業の株式会社資生堂と高い分離能を有する逆相カラムおよび光学分割カラムの開発と尿中における高性能メタボロミクス分析法の開発を行った。

一次元目の逆相カラムにはカラム長1メートル以上のモノリス型オクタデシルシリカカラムを使用し、分離条件の最適化により再現性および分離能の向上を達成した。二次元目には高分解能光学分割カラムを搭載し、移動相条件やカラム洗浄条件の最適化を行った。その結果、タンパク質構成アミノ酸とアロイソロイシン、アロスレオニンを加えた21種のアミノ酸について1本のキラルカラムによる光学分割を達成し、連続安定稼働可能な実用機の開発に成功した。尿中に多く認められるD-アスパラギン、D-セリン、D-アラニンおよびD-プロリンの由来解析を行うため、無菌マウス尿中含量解析を実施した。その結果、D-アラニンは尿中含量が激減し主に腸内細菌由来であることが示され、D-アスパラギンおよびD-セリンは一部が腸内細菌に由来していることが明らかとなった。D-プロリン含量は無菌マウスにおいてほとんど変化が認められず、腸内細菌に由来しないことが示された。また、虚血再灌流腎障害マウスにおけるキラルアミノ酸メタボロミクスを進めた。その結果、コントロール群と比較して虚血再灌流4時間、8時間、20時間、40時間後における尿中アスパラギン、セリン、アラニンおよびプロリンのD体の割合(%D=D/(D+L)*100)が有意に減少することが明らかとなった。また尿中アルギニン、バリン、フェニルアラニンおよびリジンの%Dの減少も認められ、これら8種のキラルアミノ酸が腎障害マーカーとなり得る可能性を示した。本研究では、尿試料におけるタンパク質構成アミノ酸のD体及びL体含量を網羅的に個別解析可能な専用装置の開発を達成した。また、質量分析計を検出器として導入し、尿由来の夾雑成分の影響をほとんど受けずに尿中キラルアミノ酸含量解析が可能な高性能分析装置を構築した。開発した装置を用いて、ヒトおよびマウス尿試料において様々なD-アミノ酸の存在を明らかにした。虚血再灌流腎障害モデルマウスにおける尿中キラルアミノ酸メタボロミクスを行い、D-アスパラギン、D-セリン、D-アラニン、D-プロリン等8種のキラルアミノ酸が腎障害マーカーとなり得る可能性を示した。平成26年度は、応募者らがこれまでに開発した二次元HPLC分析装置を基盤として、D-アミノ酸とL-アミノ酸を区別する尿中キラルアミノ酸メタボローム解析の専用装置を開発するため、カラムや移動相条件の精査を行う計画だった。本年度では、一次元目の逆相分離条件の確立、二次元目の光学分割カラムの選定、移動相条件の確立に成功しており、当初の計画どおり、尿中キラルアミノ酸メタボローム解析装置の構築を達成した。また、平成27年度実施計画であった、「ヒト尿試料を用いて尿由来の夾雑成分と分離するための逆相分離および光学分割における移動相条件の検証・最適化の検討」についても平成26年度中に進行しており、当初の計画以上に進展していると考える。平成28年度は、尿中キラルアミノ酸メタボローム解析装置を用いて、腎泌尿器疾患、肝疾患、精神・神経疾患、循環器系疾患等におけるヒト臨床検体やモデル動物尿中キラルアミノ酸メタボロミクスを進め、新規診断指標・バイオマーカーの探索・確立を行う。また、九州大学薬学部(浜瀬健司)および研究協力企業(株)資生堂とHPLC部品の開発・改良、逆相カラムおよび高性能キラルカラムの開発を引き続き行い、分析装置の連続安定稼働・高性能化実現のための検討を進める予定である。
矯正学的歯の移動が大脳皮質の体性感覚誘導磁場に与える影響に関する研究

歯科矯正治療おいて、歯の移動の際に疼痛が生じるが、この痛みの性質やメカニズムについては未だ不明な点が多い。本研究では、矯正学的歯の移動に伴う痛みを、脳磁図を用いた体性感覚誘導磁場測定により客観的に評価することを目的とした。研究の結果、一部の被験者において矯正学的歯の移動前よりも移動から24時間後の方が刺激の大脳皮質への伝達速度が短い傾向が示唆された。また、上下顎第一大臼歯歯根膜刺激時の感覚を比較したところ、下顎の方が、上顎よりも刺激の伝達速度が速く、信号強度が大きいことが明らかとなった。以上から、下顎第一大臼歯歯根膜感覚は、口腔機能において、より重要な役割を担う可能性が示唆された。歯の移動に伴う痛みあるいは不快感は矯正治療における重大な副作用の一つであり、これから治療を受けようとする患者にとって大きな関心事でもある。そのため、この痛みの性質やメカニズムを明らかにすることは歯科矯正学において重要な課題であるが、従来の研究では主観的評価による手法が主に用いられており、未だその特徴が十分に解明されているとは言い難い。そこで本研究では、非侵襲的な脳機能イメージング法である脳磁図(MEG)とMRIを用いて、歯の移動に伴う痛みを脳の体性感覚野の反応として定量的、客観的に捉えることを目的とした。当該年度は、歯に一定の間隔で打撃を与えるための歯根膜刺激装置製作を行った。本研究では大脳皮質錐体細胞の細胞内電流により生じる磁場を記録するため、磁場を乱すような金属をシールドルーム内で使用することができない。そのため、3Dプリンターで形成した樹脂を組み立て、圧縮空気の力で作動し歯に刺激を与えることのできる装置を製作した。しかしながら、この装置は安定した力を一定の間隔で供給することができなかったため、現在、装置の改良を進めている。また同時に、リニアアクチュエーターをシールドルーム外に設置し、精密機械によって安定した力を一定の間隔で与える装置も製作している。こちらはリニアアクチュエーターの制御プログラミングを行うところまで完了した。当該年度は、まず始めに、MEG装置内で使用できる機械的刺激装置を作製し、その安全性と有効性を確認した後に被験者を募集し、第一段階として、矯正力を負荷していない成人ボランティアの歯に機械的刺激を加え、MEGによりSEFを記録する予定であった。しかし、刺激の圧と間隔を一定するためには精密機械によるシステム制御、磁場を乱さない材料の選択と機構が必要となり、これらの製作に多くの時間を費やしたため、そこまで至っていない。当該年度は昨年度に続き、歯に一定の間隔で打撃を与えるための歯根膜刺激装置製作を行った。そのため、シールドルーム外にリニアアクチュエーターを、シールドルーム内には非磁性体のアルミニウムを用いた刺激装置を設置し、精密機械によって安定した力を一定の間隔で与える装置の製作を試みた。しかしながら、刺激装置から生じる微細な振動によりノイズが生じ、刺激装置として用いることができないと判断したため、機械的刺激装置製作を断念した。代わりに、手動により歯に機械的刺激を加える装置を製作し、実験者が直接被験者の歯根膜刺激を行うことでSEFの測定を行った。当該年度は被験者を募集してSEF測定を行い、データ解析を行うことを目標としていた。これまで、歯科矯正治療を経験したことのないボランティアを19名集め、手動の歯根膜刺激装置を用いてSEF測定を行なった。現在、データ解析を行なっており、すでにある程度の結果を得ている。最終年度には、ボランティア被験者に対し、右側上下第一大臼歯近遠心にセパレーションエラスティックを挿入し、エラスティック挿入前・挿入直後・挿入から24hr後・撤去直後に申請者らが製作した歯根膜機械刺激装置を用いて機械刺激を付与した後、SEF(Somatosensory Evoked magnetic Field:体性感覚誘導磁場)計測を行ない、主観的評価とともにデータの解析を行った。上記を含め、補助事業期間全体を通じて実施した研究の成果として、まずは先端部に赤色光を発する光ファイバーが装着され、対象物に接触すると光が遮断されるように設計された歯根膜機械刺激装置の製作を行った。

その後、同装置を利用し、歯根膜の機械的刺激によるSEFの特徴を明らかにした。上述の通り、本研究において、歯の移動に伴う痛みを脳の体性感覚野の反応として定量的、客観的に捉えることを可能とする評価系を構築することができた。歯科矯正治療おいて、歯の移動の際に疼痛が生じるが、この痛みの性質やメカニズムについては未だ不明な点が多い。本研究では、矯正学的歯の移動に伴う痛みを、脳磁図を用いた体性感覚誘導磁場測定により客観的に評価することを目的とした。研究の結果、一部の被験者において矯正学的歯の移動前よりも移動から24時間後の方が刺激の大脳皮質への伝達速度が短い傾向が示唆された。また、上下顎第一大臼歯歯根膜刺激時の感覚を比較したところ、下顎の方が、上顎よりも刺激の伝達速度が速く、信号強度が大きいことが明らかとなった。以上から、下顎第一大臼歯歯根膜感覚は、口腔機能において、より重要な役割を担う可能性が示唆された。これまで製作を続けてきた歯根膜刺激装置を早急に完成させ、シールドルーム内で試運転し、磁場への影響がないこと、被験者に対する安全性を確認する。測定条件が整い次第、今年度中に健常ボランティアを募り、実際に矯正学的移動を行った歯の歯根膜刺激に対する脳磁図の測定を行う予定である。ボランティアを用いて集めたデータの解析を引き続き進め、次年度には学会発表や論文作成、投稿を行う予定である。歯科矯正学当該年度は、まず始めに、MEG装置内で使用できる機械的刺激装置を作製し、その安全性と有効性を確認した後に被験者を募集し、第一段階として、矯正力を負荷していない成人ボランティアの歯に機械的刺激を加え、MEGによりSEFを記録する予定であった。しかし、機械的刺激装置の製作に多くの時間を費やしたため、そこまで至っていない。その結果、人件費・謝金の支出がほとんどなく、次年度使用額が生じたものである。当該年度は、歯根膜刺激装置の製作、ボランティアのSEF測定、データ解析を行った。歯根膜刺激は精密機器によって行うことが困難であると判断し、途中で手動による装置に変更したため、必要な経費が減少した。またデータ解析においては、すでに別の研究で購入した解析ソフトが本研究室にあるため、経費がかからなかった。その結果として、次年度使用額が生じた。機械的刺激装置はまだ完成していないため、装置材料購入のために繰り越した研究費の一部を充当する予定である。その後、成人ボランティアを対象とした実験を開始し、当該年度に人件費・謝金として計上しながら使用しなかった研究費を使用していく。次年度に学会発表や論文作成費用として計上しながら使用しなかった研究費を使用していく。
BMP-2と骨髄未分化幹細胞移植法を用いた広範囲顎顔面骨欠損修復への試み

骨再生医療は顎顔面領域の外科手術後の機能回復において重要な研究課題の一つである。申請者らは、これまで一貫して骨再生医療の臨床応用化を目的として、骨膜・骨髄などから採取した骨形成細胞移植や骨形成因子IGFsやBMP-2を応用した骨再生研究を行い、これらの有効性を報告し、臨床応用化を推進してきた。そして、これらの再生医療により形成された骨が複雑な構造を持つ顎顔面領域で長期的な三次元形態を維持するためには、骨形成の初期段階での微小血管網の構築が不可欠である事を示唆してきた。この研究では、申請者らが使用してきた骨欠損モデルを用いて骨髄移植が、微小血管網の誘導・構築が形成骨の長期形態安定にどのように影響を与えるのかをマイクロCTと組織形態学手法を用いて行った。Bone Morphogenic Protein(=BMP-2)は、骨を形成する骨芽細胞の増殖・分化を調整するTGFスーパーファミリーに属するタンパクである。この研究では、BMP-2と骨髄に含まれる多分化間葉系細胞を用いた顎顔面骨再生医療の新規開発を目的として、その基礎的研究を本年度に行った。実験計画に基づき、ラット頭蓋骨に人工的骨欠損を直径7mmで脳硬膜に達する深さで作成した。(Shirasu, Ueno, et.al.Acta Histochemica. 2009)この欠損部に大腿骨から骨髄を採取し移植を行った。移植後に7,14,21日後に組織を摘出し、組織学的観察を行い骨の形成過程を確認した。その結果、移植後7日目には、骨欠損部において細胞の活発な増殖が観察された。またそれらの細胞は骨形成マーカーRunx2を発現した。移植後21日目には骨欠損部の中心に骨新生が観察された。一方、非移植群では、移植後7日目には、活発な細胞増殖は観察されず、21日目には骨欠損断端部にわずかな新生骨が観察されたのみであった。これらの結果は、1)ラット頭蓋骨モデルが骨形成能を評価するために適切なモデルであること、2)骨髄細胞が骨欠損部において活発な骨形成能を持つ再生組織であることを証明できた。また、平行してBMP-2を投与した骨欠損部における骨形成過程が予備的に観察され、次年度の研究のための準備がなされた。またこうした研究成果を国際学会European Academy of Osseointegrationモナコ2009年9月、Academy of Osseointegartionオーランド2010年3月4-8において発表した。顎顔面骨欠損への治療法として成長因子BMP-2と骨髄細胞を用い、骨欠損部周辺の未分化間葉系細胞を増殖・分化させることで骨採取を行う事なく骨の修復を可能とする新規再生医療の実用化を目的として研究を行った。本年度は、1)ラット頭蓋骨に人工的に作成した骨欠損における自家骨髄細胞移植による骨形成。2)ヒト顎骨においてBMP-2を使用して修復された新生骨の組織学的、三次元微細構造X線学的評価を行い、BMP-2、骨髄細胞を用いた再生療法の有効性をそれぞれ検証した。ラット頭蓋骨においては、頸骨から採取した自家骨髄からは移植後7日目から細胞増殖が観察され、これらは移植後14日目からオステオポンチン(=OPN)陽性骨芽細胞様細胞への分化が観察された。また骨髄細胞は移植後21日目から活発な骨形成を示し、移植後35日目には、これらの新生骨が連続し、新生骨梁を形成していく様子がマイクロCTを用いた三次元微細構造学的観察から確認された。このことから、移植骨髄は骨欠損部において高い骨形成能を持つ事が証明された。またこの中で血管形成能を評価するためにCD34陽性細胞発現の観察を行ったところ、BMPを投与しない群に比較して、投与群では、有意にCD34陽性細胞の増殖が観察された。これらの細胞の増殖・分化の様相がBMPを用いて骨修復を行ったヒト再生骨でも観察されるか否かの検証を重ねて行った。ヒト歯槽骨から採取した直径4mmの骨を三次元微細構造学的に観察し、正常骨に近い骨梁構造を確認した。また組織学的にはBMP新生骨周囲に活発な血管新生が観察され、新生骨形成への血管新生の関与が示唆された。顎顔面骨の広範囲骨欠損の組織再生医療においては、骨髄などから分離培養された骨形成細胞や骨膜移植などから骨が誘導されることはすでに多くの研究者が明らかにしてきた。しかしながら、誘導された新生骨の顎顔面骨への形態的適合性や形成後の過剰な骨吸収の抑制には欠損部への緻密な血管誘導が不可欠であることをいままでの課題研究で明らかにしてきた。

骨髄は骨形成細胞のみならず豊富な血管内皮細胞形成細胞を含み血管再生医療には心臓血管外科領域ですでに実用化が試みられている。しかしながら顎顔面骨再生領域においては骨形成過程における血管新生に関する研究は少ない。この研究課題では成長因子BMP-2を使用した骨形成過程において血管内皮細胞を含む骨髄を移植することで形成される骨量がどのように変化するのかを検証するために骨髄を移植しない群との比較を免疫組織学的研究とマイクロCTを用いた新生骨の骨梁解析法による骨梁比較を行い、血管誘導の新生骨形成における有効性を検証した。ラットの頭蓋骨に形成された直径10mmの脳硬膜まで貫通する骨欠損を作成した。ラットをBMP群(B群)、骨髄移植群(M群)、BMP+骨髄移植群(BM群)、非移植群(コントロール群)の4群に分類し移植後7日目、21日目、35日目、60日目に組織を摘出し観察した。B群では移植後7、21日目に骨芽細胞マーカー陽性の骨形成細胞が欠損部中心と周辺部に観察された。21日目には血管内皮細胞発現マーカーCD34陽性細胞が形成骨周囲と骨髄に観察された。35日目には欠損中心部と周辺部に新生骨が観察され始めた。M群では移植後7日目には活発な細胞増殖が観察され骨欠損断端では破骨細胞が観察された。60日目の骨形成量はBM群が最も多く、次いでB群、M群であった。この結果から血管内皮細胞の形成が骨形成の維持に有効な可能性が示唆された。