hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
次世代橋梁維持管理のためのクラウドソーシングの創出

本研究では、Web技術やセキュリティなど情報通信技術を利用して、次世代橋梁維持管理のための「データ・情報・知」を流通させるプロトタイプシステムの構築を行った。さらに、蓄積されたデータ・情報の活用に関する研究として、橋梁点検にて蓄積されたひび割れ撮影画像データの活用を目的とした、デジタル画像から、ひび割れのみを抽出するためのソフトウェア開発の核となる画像処理アルゴリズムに関する知識の抽出手法に関する研究を行った。本研究では、次世代橋梁維持管理のための「知の流通基盤」を構築する。具体的には、Web(World Wide Web)技術やセキュリティなど情報通信技術を駆使した「共創の場」をインターネット上に構築し、道路交通網の持続的な発展を支える産官学民からなる集合知(Wisdom of Crowds)を創りだすクラウドソーシング(Crowdsourcing)の実現を目指す。ここで、集合知とは、多数の個人(組織)が参加することによって形成される知識を意味する。また、クラウドソーシングとは、個々人(組織)が有するデータや経験を、インターネット上で流通させ、多数の人々からの新たなデータ・情報・知を調達、集約、さらに共創することである。平成23年度は、本研究の土台となる技術を構築し、コミュニティ形成プロトタイプシステムを開発した。平成24年度は、プロトタイプを発展させるとともに、点検データ取得の効率化やシステムの公開環境を構築した。具体的には、以下の内容を実施した。1.情報基盤の開発:平成24年度は、前年度に開発したデータベースシステムの洗練を進めるとともに、点検データを効率的に収集および蓄積できる手法およびソフトウェアを研究・開発した。2.情報流通基盤の開発:データベースに蓄積されたデータ・情報・知識を、インターネット上で流通させるための基盤となるサーバシステムおよび情報ネットワークのプロトタイプを構築し、サーバおよびネットワークの脆弱性テストを実施した。平成23年度および平成24年度の研究成果により、維持管理に関するデータ・情報を蓄積し、流通させるシステム開発は完成したことから、平成25年度は、特に、蓄積されたデータ・情報の活用に関する研究を大きく2つ実施した。1つは、橋梁点検にて蓄積されたひび割れ撮影画像データを活用し、デジタル画像から、ひび割れのみを抽出するためのソフトウェア開発の核となる画像処理アルゴリズム最適化に関する知識を抽出する研究を行った。2つ目は、研究対象範囲を橋梁維持管理から他の施設維持管理へ拡張し、トンネル照明設備の点検結果を蓄積したデータベースからの照明設備の健全度予測に関する研究を行った。1.情報基盤の開発:本研究者が開発した山口県橋梁維持管理データベースを情報基盤とし、データベース内のデータを積極的に活用する機能として、データをグラフ化し電子地図へ視覚的に表示できる機能を開発した。2.情報流通基盤の開発:Web上でのコンテンツの分類・検索、さらに交換など、データの流通性能を高めるために、データ入力・出力・送信形式の標準化を検討した。次年度に、開発システムへ実装する予定である。3.コミュニティ形成プロトタイプシステムの開発:組織内外の多くの人々が、データ・情報交換、さらにはコミュニケーションを行うためのプラットフォームのプロトタイプを構築した。具体的には、情報基盤となる山口県橋梁維持管理データベース、コミュニケーションを支援するWeb2.0技術の代表であるSNS(Social Networking Service)機能、および電子地図(Google map)を組み合わせ、コミュニティ形成プロトタイプシステムを開発した。平成24年度は、平成23年度の研究成果をもとに、実施計画の内容をおおむね実施できた。特に、点検結果のデータの入力を効率化するための手法およびソフトウェアの開発は、研究開始当初では、研究範囲に含めていなかったが、本研究をさらに進める上で重要となることから、新たに研究範囲として含め実施した。平成23年度に予定した研究実施計画の内容をおおむね実施できた。

特に、コミュニケーションを行うためのプラットフォームのプロトタイプを構築し、コミュニティ形成プロトタイプシステムを開発したことは、予定よりも、やや進んだ計画の実施となった。研究最終年となる平成25年度は、平成23年度および平成24年度に得られた成果をもとにして、実際に構築したシステムを道路交通網管理機関の実務者へ利用して頂きながら洗練する。具体的には、構築されたシステム内のデータや機能を利用した劣化予測モデルの検討を実務者とともに行い、データ蓄積の効率化、データ流通性能、また情報セキュリティ性能の観点からシステム設計や実装された機能を検証する。平成23年度に得られた結果を基にして、システムを洗練する。具体的には、以下の内容を実施し、セキュリティを十分に考慮した、電子地図上でコミュニティを実現できるシステムの開発を行う。1.情報流通基盤の開発:本システムは、情報資産(データや情報)を扱うことから、情報システムとしてのセキュリティリスク(情報漏洩や外部からの攻撃など)への配慮が必須である。本研究では、これらリスクや対策法をまとめ、実際にセキュア情報システム(ハード(ネットワークを含む)・ソフトウェア)を構築する。2.コミュニティ形成システム:平成23年度に開発したコミュニティ形成プロトタイプシステムをさらに発展させ、電子地図上で、橋梁のデータを見ながら、会話や議論、情報提供を円滑に進める場を構築する。また、データの提供や議論への参加を促すためのインセンティブ機能についても検討を行う。平成25年度は、研究最終年となることから、平成23年度および平成24年度に開発したプロトタイプシステムの検証用PCを購入し、システムの評価を行いながら、改良を進める。また、これらの成果を、学会等で発表する。平成24年度からはセキュアな情報システムプラットフォーム構築も研究対象となることから、平成23年度に開発したシステムのインターネット上での公開を想定した環境を構築し、各機能の洗練またセキュリティを高める。このための実験ネットワーク構築用の通信機器およびセキュリティ検証用クライアントPCを購入し、システムの研究・開発および検証を進める。
マクロファージによる一酸化窒素産生増強を指標とする抗腫瘍性植物成分の探索

マイクロファージの産生する一酸化窒素(NO)は、外来微生物や癌細胞を障害するなどの生体防御の役割を担う一方で、肝炎やリウマチなどの炎症を悪化させる。したがって、マイクロファージのNO産生量を増強させる物質は抗腫瘍薬としての可能性が、NO産生量を抑制する物質は抗炎症薬としての可能性が考えられる。今回、数種の植物について、マウス復腔マクロファージのNO産生に影響を及びぼす成分の検索を行い、次のような結果を得た。1)メグスリノキ(Acer nikoense)のメタノールエキスを分画したAcOEt可溶画分はマイクロファージのNO産生を抑制し、その活性本体は(+)-rhododendrolであった。一方、n-BuOH可溶画分はNO産生を増強し、その活性本体は高極性のポリフェノール類と推定された。また、n-BuOH可溶画分から得られたepi-rhododendrinはNO産生を抑制した。2)クガイソウ(Veronicastrum sibiricum L)のメタノールエキスはマクロファージのNO産生を強く増強し、この活性はAcOEt可溶画分に移行した。AcOEt可溶画分からはNO産生増強効果を有するpicroside Iを単離、同定するとともに、活性をもたない新規成分である6-(3,4-dimethoxycinnamoyl) ajugolを単離した。n-BuOH可溶画分はNO産生を抑制した。3)コウモリカズラ(Menispermum dauricum)およびオオヅラフジ(Sinomenium acutum)のメタノールエキスはマクロファージのNO産生を抑制し、それぞれの活性成分としてdauricineおよびsinomenineが単離された。4)日本冬虫夏草の一種、ハナサナギタケ(Isaria japonica)の培養液は、免疫作用を増強するとともに、抗癌剤、5-FUの副作用である免疫機能低下を抑制した。1)マウス腹腔マクロファージ(MΦ)は、エンドトキシン(lipopolysaccharide: LSP)の刺激により一酸化窒素(NO)を産生するが、この産生量を増強させる薬物は、がん細胞の増殖を抑制することが明らかにされている。そこで、肝炎やリウマチのように免疫反応が深く関与している炎症疾性患の治療に民間で使われてきた薬用植物の中からクガイソウ(Veronicastrum sibiricum)、メグスリノキ(Acer nikoense)、カガミグサ(Ampelopsis japonica)およびヤブガラシ(Cayratia japonica)を取り上げ、それらのメタノールエキスについてMΦのNO産生に対する影響を調べた。その結果、メグスリノキのメタノールエキスに有意なNO産生増殖効果が認められ、各種クロマトグラフィーによる分離操作を行った結果、NO産生増強効果を示す物質はロドデンドロールであることが明らかになった。2)抗腫瘍活性が報告されている日本冬虫夏草、ハナサナギタケ(Isaria japonika)培養液の免疫増強作用を、ひ臓の抗体産生細胞数を調べるPFC法により検討した。その結果、本培養液には免疫増強作用があるとともに、抗癌剤、5-FUの副作用である免疫機能低下を抑制する作用があることが明らかになった。NO合成酵素に対する阻害物質の探索研究の一環として、有毒担子菌、ドクササコのアミノ酸成分の検索を行った。その結果、バリノピン、エピロイシノピン、イソロイシノピン、フェニルアラニノピンの4種のオパイン型新規アミノ酸を単離した。これらアミノ酸のNO合成酵素に対する作用については、今後の検討課題である。

マクロファージの産生する一酸化窒素(NO)は、外来微生物や癌細胞を障害するなどの生体防御の役割を担う一方で、肝炎やリウマチなどの炎症を悪化させる。したがって、マクロファージのNOの産生量を増強させる物質は抗腫瘍薬としての可能性があり、NO産生量を抑制する物質は抗炎症薬としての可能性が考えられる。今回、数種の植物について、マウス腹腔マクロファージのNO産生に影響を及ぼす成分の検索を行い、以下のような結果を得た。1)メグスリノキ(Acer nikoense)のメタノールエキスを分画したAcOEt可溶画分はマクロファージのNO産生を抑制し、その活性本体は(+)-rhododendrolであった。一方、n-BuOH可溶画分はNO産生を増強し、その活性本体は高極性のポリフェノール類と推定された。また、n-BuOH可溶画分から得られたepi-rhododendrinはNO産生を抑制した。2)クガイソウ(Veronicastrum sibiricum L)のメタノールエキスはマクロファージのNO産生を強く増強し、この活性はAcOEt可溶画分に移行した。AcOEt可溶画分からはNO産生増強効果を有するpicroside Iを単離した。また、本画分からは活性を示さなかったが新規成分である6-(3, 4-dimethoxycinnamoyl)ajugolを単離した。n-BuOH可溶画分はNO産生を抑制した。3)コウモリカズラ(Menispermum dauricum)およびオオツヅラフジ(Sinomenium acutum)のメタノールエキスにマクロファージのNO産生抑制作用が認められ、dauricineおよびsinomenineがそれぞれの活性成分であることが明らかになった。
宿主自然免疫応答に作用するプリオンの感染メカニズムの解明

本研究では、宿主の自然免疫機構に着目し、プリオン感染との関係について検討した。結果としてIRF3の下流に位置するI型IFNの機構がプリオン感染に重要な役割を果たしていることやIRF3の転写因子Oct-1の発現がプリオン感染によって制御されていることを明らかにした。本研究により、自然免疫機構をターゲットにしたプリオン病の予防・治療薬の開発が進むと考えられる。平成25年度では、平成24年度から継続したプリオン感染によるIRF3抑制機構の解明について検討を行った。レポーターアッセイにより、500bp以下のよりコアな領域(転写開始部位の上流119bp内)にマウスIRF3のプロモーター領域を同定した。この領域における特有の転写因子Oct-1についてプリオン感染時の影響についても検討した。Oct-1は、プリオン感染に影響を示す可能性を示唆した。この結果は、プリオン感染によるIRF3の発現抑制がOct-1に制御されているためでプリオン感染によってOct-1が抑制されている可能性を示唆するものである。次に、平成24年度にプリオン感染モデルでの自然免疫関連候補因子の挙動変化を検討したが、今年度ではIRF3の下流に位置する自然免疫関連候補因子をそれぞれ単独でプリオン持続関連細胞に導入した後の異常型プリオン蛋白質の発現を検討したところ、著名な変化は観察されなく、さらに複数の組み合わせを用いてプリオン感染細胞に導入後の検討を行ったが、同様の結果であった。しかしながら、興味深いことに、他の方法を使用した新規合成される異常型プリオン蛋白質に対する影響について検討したところ、一部のinterferon stimulated genes(ISGs)の因子については、抑制効果があることが確認された。さらに、上流に位置するI型インターフェロンとプリオン感染との関与を検討するため、IFNAR1遺伝子欠損マウスにプリオン感染させ、生存期間等を検討中である。本実験によって得られた新たな知見は、これまでにプリオン感染において関与を示唆する報告は無く、ISGsがプリオン感染に影響することが確認されたことより、その上流に位置するI型インターフェロンの発現およびその機能について今後詳細に検討していく予定である。平成24年度では、プリオン感染によるIRF3抑制機構の解明およびプリオン感染におけるIRF3を介するシグナルカスケード中の重要な因子を特定することより、1)プリオン感染によるIRF3抑制機構を解明について検討を行った。まず始めに、異常型PrPは核内にも存在するということから、我々はIRF3の転写に着目して検討を行った。レポーターアッセイにより、マウスIRF3のプロモーター領域を転写開始部位の上流500bp内においてコア領域を同定した。この領域における特有の転写因子の重要性についてクロマチン免疫沈降法等により確認し、プリオン感染時の影響、プロモーター領域に関わる転写因子とのさらなる因果関係についてもゲルシフトアッセイ(EMSA)法などを用いて検討する予定である。一方、翻訳に関わる宿主の因子との関係についても検討する予定である。次に、2)自然免疫関連候補因子とプリオン感染との関係性について検討を行った。in vitroの系におけるプリオン感染モデルでの自然免疫関連候補因子の挙動について検討するために、非感染培養細胞にプリオンを感染させ、候補因子の発現を経時的にリアルタイムPCR、ウエスタンブロット法にて確認し、因子の選定について検討を行った。結果、複数のIRF3を介したシグナルカスケードの下流に位置するinterferon stimulated genes(ISGs)の重要性を確認した。さらに、この候補因子のプリオン感染への影響について検討し、異常型PrPの発現を抑制する候補因子の絞り込みの実験を行った。本実験によって得られた新たな知見は、これまでにプリオン感染において関与を示唆する報告は無く、全く新しいものである。今後、それらの候補因子の重要性について深く検討していく予定である。平成26年度では、本研究課題にて継続して検討したプリオン感染によるIRF3の抑制機構について詳細に検討を行い、以下の結果を得た。1)レポーターアッセイによりマウスIRF3遺伝子の転写開始地点から上流-119bpに位置するプロモーター領域に結合すると推定された転写因子E2F1やAML1では無く、Oct-1が特異的に転写活性を示すこと2)プリオン持続感染細胞におけるIRF3遺伝子発現の減少と共にそのプロモーター活性が低下していたこと3)異常型プリオン蛋白を減少させる薬剤pentosan polysulfateやCongo-red処置により減少していたプロモーター活性が回復したこと4)クロマチン免疫沈降アッセイによりOct-1が特異的にプロモーター領域と結合していること5)プリオン感染マウスの脳においてOct-1の発現が有意に減少していたことである。つまり、我々は、プリオン感染によるIRF3の低下の要因の一つにOct-1の減少に伴う結果であることを明らかにした。次に、自然免疫関連因子とプリオン感染との関係性について検討を行った。

さらにin vivoの系におけるプリオン感染モデルマウスを用いても同様の検討を行った。結果、IRF3を介したシグナルカスケードの下流に位置する複数のinterferon stimulated genesの重要性を確認した。本実験によって得られた新たな知見は、これまでのプリオン研究において全く新しい知見と考えられる。ウイルス学、免疫学、分子生物学交付申請書に記載している平成25年度の項目に沿った実験内容から、結果を得ており、予定通り実験が進行しているため。交付申請書に記載している平成24年度の項目に沿った実験内容から、結果を得ており、尚且つ新規候補因子の選定にまで実験が進行しているため。現在のところ、おおむね順調に進展しているため、交付申請書に従って実験内容を検討していく予定である。現在のところ、おおむね順調に進展しているため、交付申請書に従って実験内容を検討していく予定であるため、次年度の使用額が必要となる。多量の細胞培養用製品が必要となるため、主にこれらの研究用途に重点を置いて使用する予定である。平成24年度に残した検討課題であるプロモーター領域とプリオン感染との関与についてこの領域における特有の転写因子の重要性についてクロマチン免疫沈降法等により確認し、プリオン感染時の影響、プロモーター領域に関わる転写因子とのさらなる因果関係についてもゲルシフトアッセイ(EMSA)法などを用いて検討する予定である。また、自然免疫関連候補因子とプリオン感染との関係性についてをin vitroやin vivoのプリオン感染実験手法を用いて自然免疫関連候補因子の遺伝子操作によるプリオン感染の成立を随時行うと同時に、平成25年度では、1)遺伝子改変マウスを用いた自然免疫関連因子とプリオン感染と関係性、2)異常型PrP以外の病原体関連因子の探索についてバイオアッセイなどのin vivoおよびin vitroの系にて検討する予定である。
骨コラーゲン成分を利用した骨・バイオセラミックスのレーザ接合に関する基礎研究

レーザ光を用いたバイオセラミックス(G-HAp)と生体骨組織の接合技術を示し、実用化の可能性を探り、次の成果が得られた。接合部およびG-HApの強度向上による適用範囲の拡大を図り、ウシ骨試料にG-HAp試験片(板厚1mm)を多点接合し、せん断接合強度が21N以上になる方法を考案した。より厚いG-HApに対して、接合部のみを接合可能な板厚に成形するなど、接合可能な試験片形状を示した。ほとんどの生体骨は楕円断面をしていることから、G-HApのペーストを利用した。骨との接合強度が最大となるG-HApペーストの成形方法、製造方法、成分比を検討した。研究の目的は、レーザを用いたバイオセラミックスと生体骨組織の接合技術を提案し、実用化の可能性を探ることである。レーザ照射しても熱衝撃で割れないバイオセラミックスをすでに開発しており、同材を用いることで骨との接合が可能となる。骨界面接合力や初期固定強度・剛性等の力学的性質、生体組織との適合性やレーザ生成物の毒性、等のパラメータを調査し、最適なレーザ加工条件と材料製造条件を明らかにする。本年度は、以下の実績が得られた。1)接合強度向上のための多点接合構造の開発:ウシ骨試料にG-HAp試験片(板厚1mm)を多点接合し、せん断接合強度が21N(目標値)以上になる方法を検討した。レーザ出力とレーザ光誘導孔径の影響や接合熱影響部の最小化も確認した。本実験にはファイバーレーザ(2kW発信器搭載二次元レーザ加工機:北海道工業試験場所有)を使用した。2)より厚いるG-HAp接合を可能とする継手形状の開発:重ね継手で良好な接合の実績は厚さ1mmのG-HApである。より厚い1.5mmの板厚G-HApについて、レーザ出力を300Wにすると、骨試験片と接合が可能なことを確認した。またレーザ光誘導光の大きさや形状の検討を実施した。3)任意の骨形状に対応させる継手形状・接合方法の開発:ほとんどの生体骨は楕円断面をしていることから、表面曲率の任意形状に対応させるための継手形状・接合方法を確認した。4)接合強度が最大となるG-HApの開発:骨との接合強度が最大となるG-HApの成形方法、製造方法、成分比を検討した。ガラス含有率と接合強度を調査し、ガラス含有率が20%のとき最大となることを確認した。またガラス含有率と接合組織構造の影響を確認した。G-HApの焼結温度が1140°Cのとき強度が最大となった。体内で骨組織と強固な結合が要求される人工関節やインプラントには、生体適合性や骨癒合性の高いバイオセラミックスが利用されている。本研究では、レーザ光を用いたバイオセラミックスと生体骨組織の接合技術を提案し、実用化の可能性を探ることにある。本研究期間内に以下のことを明らかにした。1)接合部およびG-HApの強度向上による適用範囲拡大:ウシ骨試料にG-HAp試験片(板厚1mm)を多点接合し、せん断接合強度が21N(目標値)以上になる方法を検討した。重ね継手で良好な接合の実績は厚さ1mmのG-HApであるが、より厚いG-HApに対して、接合部のみを接合可能な板厚に成形するなど、接合可能な試験片形状を考案した。ほとんどの生体骨は楕円断面をしていることから、表面曲率の任意形状に対応させるための継手形状・接合方法を開発した。これにはG-HApのペーストを利用した。メッシュ状の金属体(チタンやステンレスなど)に対してG-HApを溶射した複合材料や機械的締結構造の金属体とG-HApとを接合した複合材料の可能性を探った。2)接合品質に関する不安定要因の究明:レーザ加工パラメータと接合品質の関係を明らかにした。接合品質に影響する要因特性図を作成し、各種要因と加工条件裕度を明確にした。接合部の上面外観写真と接合部強度および接合部断面との関係を関連付け、評価基準を作成した。3)レーザ照射生成物の骨細胞影響の確認:骨コラーゲンとG-HApによる発泡生成物の毒性試験を行った。これは通常の骨細胞培養実験環境下で実施した。発泡生成物には数マイクロ程度の気孔が含まれるので、それが細胞増殖のスカフォールドになる可能性がある。これは今後の課題である。当初の予定通り、接合基礎実験は進展している。骨界面接合力や初期固定強度・剛性等の評価手法を整理するとともに、接合の特性を注意深く整理している。

セラミックスについては、焼結したプレートを用いてその強度が上昇するレーザ照射条件が整理できた。バイオメカニクス1)接合品質に関する不安定要因の究明:レーザ加工パラメータと接合品質の関係を調査するため、接合品質に影響する要因特性図を作成し、各種要因と加工条件裕度を明確にする。また、接合部の上面外観写真と接合部強度および接合部断面との関係を関連付け、評価基準を作成する。2)Intact骨試験片とG-HApへのレーザ接合適応および安全性評価:レーザ照射生成物の骨細胞影響の確認のため、骨コラーゲンとG-HApによる発泡生成物の毒性試験を行う。これは通常の骨細胞培養実験環境下で実施する。また、発泡生成物には数マイクロ程度の気孔が含まれるので、それが細胞増殖のスカフォールドになる可能性がある。これを検証する。また、実験動物のintactな骨試験片とG-HApの接合状態を検証する。実験動物から採取したintactな骨試験片とG-HApをレーザ接合し、接合状態および接合強度を確認する。接合強度目標を21N/1試験片以上とする。4)G-HApペースト接合:G-HApの原材料をジェラチンとのコラーゲンとでペースト状にした材料を作り、その骨との接合性について検討し、最大接合強度が得られる条件を整理する。5)動物実験によるinvivoレーザ接合と安全性評価:ウサギによる実験動物を行なうための実験系を開発する。消耗品等について、当初計画より効率的実験に心がけた結果、143,155円の差額が生じた。来年度は、消耗品に充当する。
Aβ-ABAD相互作用によるミトコンドリア機能破綻と神経毒性発現の分子機序

代表者の所属する研究グループでは,これまでに,Alzheimer病(AD)の重要な発症因子の一つと考えられているアミロイドβペプチド(Aβ)と,その結合タンパク質としての性質が見いだされたAβ結合アルコール脱水素酵素(ABAD)の相互作用によりミトコンドリア機能障害,神経細胞のアポトーシス,ならびにそれに関連した記憶障害と脳海馬領域での神経変性が引き起こされることを変異型アミロイド前駆タンパク質(mAPP)およびABADの遺伝子を二重導入したマウスを用いて明らかとした(Science, 2004; FASEB J., 2005).これらの結果を踏まえて,本申請課題では,Aβ-ABAD相互作用によるミトコンドリア機能破綻と神経毒性発現の分子機序をミトコンドリアタンパク質ならびに遺伝子の質的・量的変化の解析を通して解明することを目的として実験計画を立案した.一方,研究計画の立案以降,上記の知見を学会にて発表した際にAβがABADと相互作用するために必要なミトコンドリアへの到達経路に関して質問を受け,Aβ-ABAD相互作用によるミトコンドリア機能破綻を議論するうえで避けては通れぬ非常に重要な課題であると認識した.そこで,計画を若干変更し,ミトコンドリアでのAβ-ABAD相互作用に関連する細胞内Aβ輸送経路を重点的に解析した.培養神経細胞の培地にAβを添加すると,Aβがミトコンドリア内へ移行することを免疫染色により確認した.神経細胞におけるAβ取込みは,糖化最終産物受容体(RAGE)抗体の共存により抑制され,RAGE遺伝子欠損マウス由来細胞では消失していた.これらの結果より,Aβの神経細胞膜の透過にRAGEが関与することを明らかとした.また,Aβ処置が,RAGEを介してp38 MAPKを活性化すること,RAGEがAβの輸送担体として機能することを見いだした.すなわち今回の知見は,Aβ-ABAD相互作用によるミトコンドリア機能破綻において重要な鍵を握る細胞外Aβの神経細胞内移行機序を明らかとしたものであり,AD発症機序の解明において極めて有益な知見であると評価される.代表者の所属する研究グループでは,これまでに,Alzheimer病(AD)の重要な発症因子の一つと考えられているアミロイドβペプチド(Aβ)と,その結合タンパク質としての性質が見いだされたAβ結合アルコール脱水素酵素(ABAD)の相互作用によりミトコンドリア機能障害,神経細胞のアポトーシス,ならびにそれに関連した記憶障害と脳海馬領域での神経変性が引き起こされることを変異型アミロイド前駆タンパク質(mAPP)およびABADの遺伝子を二重導入したマウスを用いて明らかとした(Science, 2004; FASEB J., 2005).これらの結果を踏まえて,本申請課題では,Aβ-ABAD相互作用によるミトコンドリア機能破綻と神経毒性発現の分子機序をミトコンドリアタンパク質ならびに遺伝子の質的・量的変化の解析を通して解明することを目的として実験計画を立案した.一方,研究計画の立案以降,上記の知見を学会にて発表した際にAβがABADと相互作用するために必要なミトコンドリアへの到達経路に関して質問を受け,Aβ-ABAD相互作用によるミトコンドリア機能破綻を議論するうえで避けては通れぬ非常に重要な課題であると認識した.そこで,計画を若干変更し,ミトコンドリアでのAβ-ABAD相互作用に関連する細胞内Aβ輸送経路を重点的に解析した.培養神経細胞の培地にAβを添加すると,Aβがミトコンドリア内へ移行することを免疫染色により確認した.神経細胞におけるAβ取込みは,糖化最終産物受容体(RAGE)抗体の共存により抑制され,RAGE遺伝子欠損マウス由来細胞では消失していた.これらの結果より,Aβの神経細胞膜の透過にRAGEが関与することを明らかとした.また,Aβ処置が,RAGEを介してp38 MAPKを活性化すること,RAGEがAβの輸送担体として機能することを見いだした.すなわち今回の知見は,Aβ-ABAD相互作用によるミトコンドリア機能破綻において重要な鍵を握る細胞外Aβの神経細胞内移行機序を明らかとしたものであり,AD発症機序の解明において極めて有益な知見であると評価される.代表者の所属する研究グループでは、これまでに、Alzheimer病の重要な発症因子の一つと考えられているアミロイドβペプチド(Aβ)と、その結合タンパク質としての性質が見いだされた17β-水酸化ステロイド脱水素酵素(HSD,現在当グループではAβ結合アルコール脱水素酵素(ABAD)と表記)の相互作用によりミトコンドリア機能障害とそれに関連した記憶障害と脳海馬領域での神経変性が引き起こされることを変異型アミロイド前駆タンパク質(mAPP)および(ABAD)の遣伝子を二重導入したマウスを用いて明らかとした(Science 2004)。また、この遣伝子二重導入マウス由来の培養神経細胞を用いて、ミトコンドリア機能の低下が呼吸鎖複合体IVの活性低下と密接に関連しており、ATP産生の低下、活性酸素産生の増加、ミトコンドリアからのシトクロムc遊離およびカスパーゼ3活性増加といった一連のアポトーシスシグナルの活性化をもたらすことを明らかとした(FASEBJ.,2005)。さらに、AβとABADの相互作用を阻害するペプチドがこれらの障害を抑制することを示した。これらの結果を踏まえて、本申請課題では、Aβ-ABAD相互作用によるミトコンドリア機能破綻と神経毒性発現の分子機序をミトコンドリアタンパク質ならびに遺伝子の質的・量的変化の解析を通して解明することを目的として実験計画を立案した。

一方、研究計画の立案以降、上記の知見を学会にて発表した際にAβがABADと相互作用するために必要なミトコンドリアへの到達経路に関して質問を受け、Aβ-ABAD相互作用によるミトコンドリア機能破綻を議論するうえで避けては通れぬ非常に重要な課題であると認識した。そこで、平成18年度は計画を若干変更し、ミトコンドリアでのAβ-ABAD相互作用に関連する細胞内Aβ輸送経路を重点的に解析した。培養神経細胞の培地にAβを添加すると、Aβが細胞内へ移行することを免疫染色ならびにELISA法により確認した。神経細胞におけるAβ取込みは、糖化最終産物受容体(RAGE)をsiRNAでノックダウンさせた細胞あるいはRAGE抗体の共存によって抑制された。これらの結果より、Aβの神経細胞膜の透過にRAGEが関与することを明らかとした。また、培養神経細胞の培地へのAβ添加実験において、細胞内に取り込まれたAβがミトコンドリアに蓄積していること、このAβのミトコンドリア移行が透過性遷移孔(PTP)阻害薬により抑制されることをELISA法により明らかとした。Aβを処置していない細胞ではPTP形成を反映するシトクロムc遊離が見られないことを合わせて考えると、今回の知見は、Aβが神経細胞のPTP形成を誘導するとともに、そのPTPを介してミトコンドリア内に到達することを示唆するものと評価される。代表者の所属する研究グループでは,これまでに,Alzheimer病(AD)の重要な発症因子の一つと考えられているアミロイドβペプチド(Aβ)と,その結合タンパク質としての性質が見いだされた17β-水酸化ステロイド脱水素酵素(HSD,現在当グループではAβ結合アルコール脱水素酵素[ABAD]と表記)の相互作用によりミトコンドリア機能障害とそれに関連した記憶障害と脳海馬領域での神経変性が引き起こされることを変異型アミロイド前駆タンパク質(mAPP)およびABADの遺伝子を二重導入したマウスを用いて明らかとした(Science 2004)。また,この遺伝子二重導入マウス由来の培養神経細胞を用いて,ミトコンドリア機能の低下が神経細胞のアポトーシスシグナルの活性化をもたらすことを明らかとした(FASEBJ。,2005)。これらの結果を踏まえて,本申請課題では,Aβ-ABAD相互作用によるミトコンドリア機能破綻と神経毒性発現の分子機序をミトコンドリアタンパク質ならびに遺伝子の質的、量的変化の解析を通して解明することを目的として実験計画を立案した。一方,研究計画の立案以降,上記の知見を学会にて発表した際にAβがABADと相互作用するために必要なミトコンドリアへの到達経路に関して質問を受け,Aβ-ABAD相互作用によるミトコンドリア機能破綻を議論するうえで避けては通れぬ非常に重要な課題であると認識した。そこで,平成19年度も前年度に引き続き,計画を若干変更し,ミトコンドリアでのAβ-ABAD相互作用に関連する細胞内Aβ輸送経路を重点的に解析した。培養神経細胞の培地にAβを添加すると,Aβがミトコンドリア内へ移行することを免疫染色により確認した。神経細胞におけるAβ取込みは,糖化最終産物受容体(RAGE)抗体の共存により抑制され,RAGE遺伝子欠損マウス由来細胞では消失していた。これらの結果より,Aβの神経細胞膜の透過にRAGEが関与することを明らかとした。
日本人ブル-ム症候群の分子的欠陥

ブル-ム症候群(Bloom's syndrome BS)患者および正常人由来のリンパ芽球様細胞(LCL)の粗抽出液中のDNAリガ-ゼI活性をHAカラムクロマトグラフィ-によりリガ-ゼII活性と分離して測定した。正常人由来7株、日本人BS由来5株、白人BS由来1株、ユダヤ人BS由来3株のリガ-ゼI活性は標準NLーHa株活性の比で示すと正常人0.74ー1.24平均0.91、BS0.33ー1.12平均0.65と幅広く分布した。BSF07(日本人)は明らかに正常人より低値を示すが、他のBS株では正常人の活性範囲を有意に外れるものはなく、また活性値の高低に民族差を認めなかった。リガ-ゼI反応の基質オリゴdTおよびATPに対するKm値でも正常人とBS間に差はなかった。ヒトDNAリガ-ゼIcDNAを用いてBS7株と正常人株のRFLP(EcoRI,BamHI,XbaI)検索を行ったが差異を認めなかった。DNAリガ-ゼIに関する数個のゲノム・クロ-ンを得たが5'上流の調節領域を含んでいなかった。6チオグアニン抵抗性(TG)変異を指標とした突然変異率測定でBS2KA 19.4x10^<-7>、GM3403 13.9x10^<-7>/細胞/世代と正常人細胞の510倍高値を示し、multiplex PCRによるHPRT各exonの構造解析から、調べた8個のTGクロ-ンすべてに欠失を認めた。この内約半数が全exonの欠失であった。BS患者株粗抽出液中のポリ(ADP・リボ-ス)シンセタ-ゼ活性は対照正常人細胞株との間に有意差はなかった。
グルコース応答性ボロン酸ポリマーの開発と分子的人工膵島への応用

本研究では、血中のグルコース濃度に敏感に応答して適量のインスリンを投与しうる人工膵島システムの確立を目指した。特に、フェニルボロン酸がグルコースのような多価水酸基化合物と可逆的に共有結合する特性を有することに着目し、ボロン酸基含有高分子をグルコース濃度のセンサー部位として有する人工膵島の構築を目指した。フェニルボロン酸基含有高分子にアミノ基を導入することで、生理的pH(7.4)でグルコース濃度に敏感に、かつ可逆的に応答し、グルコース濃度変化を電気信号に変換しうることが示された。これを受けて、ボロン酸基含有ゲルビーズを作製し、外部からのグルコース濃度変化にともなってインスリンが置換・放出されるインスリン放出デバイスの有用性を検討した。pH7.4で放出インスリン量はグルコース濃度の増大に応答して大きくなった。さらに、パルス的にグルコース濃度を変化させた場合、グルコース濃度変化に追随して、遅れ時間なしにインスリン放出量を制御でき、これは120時間以上継続できることがわかった。このシステムを用いるとヒトで24IU/日のインスリン投与が必要な場合に、理論的にはわずか1.36cm^3のゲルがあれば正常な血糖値を維持できる計算になり、in vivoへの応用に適したシステムが構築可能であることが示唆された。血中のグルコース濃度に応答して適切にインスリンを投与する人工膵島システムの開発は糖尿病患者の効果的な治療方法としてその確立が急務である。本研究はフェニルボロン酸の多価水酸基との特異的・可逆的な共有結合の形成に着目し、血中の糖濃度に敏感に応答して必要量のインスリンを放出する新しい人工膵島システムの構築を目指す。本年は、グルコースの検知と物質移動制御法を明らかにする目的で、ボロン酸含有分子とポリビニルアルコール(PVA)との高分子間コンプレックスのグルコース応答型膨潤-収縮機能を利用した白金電極を設計し、グルコース濃度変化に敏感に応答し電気信号に換えるセンサーシステムの構築を追究した。生理pH7.4で多価水酸基と可逆的に結合するボロン酸ポリマーは三級アミノ基を有するモノマーの共存下でラジカル重合により合成した。このボロン酸含有ポリマーとPVAとを有機溶媒中で混合後、トリイソシアナ-トで化学架橋することによりゲルとした。pH7.4の緩衝溶液中で、グルコース濃度の増大に伴ってこのゲルの膨潤度は増加した。これは、PVA水酸基と共有結合していたボロン酸がグルコースの水酸基と置き換わり、見かけの架橋点数が減少し、高分子間コンプレックスが一部解離するために生起した。この膨潤度変化を利用して測定試料中のイオン伝導度変化を計測するセンサーシステムを新たに設計した。白金電極表面にボロン酸ポリマー/PVA高分子間コンプレックスを固定しセンサーとした。グルコース濃度を種々変化させたときの電流の出力はグルコース濃度に比例して増加した。このとき、α-メチル-D-グルコシドの添加による電流変化はほとんど無視できたことから、このセンサーのグルコースに対する特異性が見いだされた。さら、グルコース濃度を繰り返し変化に対応した電流の振幅が観察できたことから、フェニルボロン酸を血中糖濃度のセンサーデバイスとして利用することの有用性が示された。血中のグルコース濃度に応答して適切にインスリンを投与することのできる人工膵島システムは糖尿病患者の効果的な治療方法としてその開発が緊急課題となっている。本研究はフェニルボロン酸が多価水酸基と特異的かつ可逆的な共有結合を形成することに着目し、血中の糖濃度に敏感に応答して必要量のインスリンを放出する新しい人工膵島システムの構築を目指す。本年は、生理的pH(7.4)においてグルコース濃度の検知と、インスリン放出制御を目的として、フェニルボロン酸含有ポリマーへのアミノ基の導入効果と、グルコース濃度変化に応答したインスリン放出を検討した。アミノ基とボロン酸基含量の比を変えたコポリマーゲルを調製し、伝導度滴定によりグリコースとコンプレックス形成するボロン酸含量を定量した。pH7.4でのフェニルボロン酸とグルコースとのコンプレックスはアミン含量に依存して増大した。つまり、アミノ基を導入することによってボロン酸とグルコースとのコンプレックス形成が安定化できることが示唆された。

この結果を受けて、フェニルボロン酸ゲルにグルコンアミド化インスリンを結合させ、外部からのグルコース濃度の変化にともなって置換・放出されるインスリンの放出量変化を液体クロマトグラフィーシステムを用いて、pH7.4で解析した。放出インスリン量はグルコース濃度の増大に応答して大きくなった。さらに、パルス的にグルコース濃度が変化した場合グルコース濃度変化に追随してインスリン放出を制御でき、これは120時間以上継続できることがわかった。以上のように、アミノ基の導入により生理的pH7.4でフェニルボロン酸とグルコースとの安定なコンプレックス形成とグルコンアミド化インスリンとの置換に基づくインスリン放出システムの構築が可能であることを明らかにし、グルコース濃度に応答してインスリンを放出する新しい人工膵臓システムの基礎的知見を集積することができた。血中の糖濃度に応答して適切にインスリンを投与することができる人工膵島システムは、糖尿病患者を効果的に治療できる手段としてその開発が緊急課題となっている。本研究では、フェニルボロン酸が多価水酸基化合物と特異的かつ可逆的な共有結合を形成することに着目し、血中の糖濃度に敏感に応答して必要量のインスリンを放出しうる新しい人工膵島システムの構築を目指した。フェニルボロン酸のpKaは8.6であり、生理的pH(7.4)ではグルコースと可逆的な結合をしうるボロン酸は6%程度しかない。一方、フェニルボロン酸含有ポリマーへのアミノ基を導入すると、pH7.4でのフェニルボロン酸とグルコースとのコンプレックスはアミン含量に依存して増大した。アミノ基を導入することで生理的pHでのェニルボロン酸とグルコースとのコンプレックス形成が安定化でき、かつ、感度よくグルコース濃度を検出できることが示唆された。この結果を受けて、インスリンの3つのアミノ基のうち2つをグルコンアミド化してアミノ基含有フェニルボロン酸ゲルに結合させ、外部のグルコース濃度の変化にともなってゲルから置換・放出されるインスリンの放出量変化を液体クロマトグラフティーシステムを用いてpH7.4で解析した。さらに、パルス的にグルコース濃度を変化させた場合グルコース濃度変化に追随してインスリン放出を制御でき、これは120時間以上継続できることがわかった。このシステムを用いるとヒトで24IU/日のインスリン投与が必要な場合に理論的にはわずか1.36cm^3のゲルがあれば正常な血糖値を維持できる計算になり、in vivoへの応用に適したシステムが構築可能であることが示唆された。以上の結果、グルコース濃度に応答してインスリンを放出する新しい人工膵臓システムの基礎的知見を集積することができた。
高等植物におけるミトコンドリアの雌雄性にかかわるタンパク質の解析

我々は真正粘菌でミトコンドリアの融合とミトコンドリアDNAの組換えにかかわるプラスミドmFを発見している。「融合」と「遺伝子組み換え」は「性」現象と捉えることが可能であり、ミトコンドリアにも雌雄が存在することが示唆される。mFプラスミド中に存在するアミノ酸数640のORF640は膜貫通型のコイルドコイルタンパク質をコードしており、このコイルドコイル領域を用いたタンパク質間相互作用を基本としたミトコンドリア融合機構が予想されている。本研究では、真正粘菌のミトコンドリアDNAの全塩基配列を決定し、12のタンパク質遺伝子(cox1-3,cytb,atp6,9,nadl,3,4,5,7とrps12)、2つのrRNAと5つのtRNAを同定した。真正粘菌のミトコンドリア遺伝子には、置換型だけでなく、フレームシフトを伴う挿入型RNAエディティングが存在しているため、NADH脱水素酵素複合体のサブユニット7(nad7)のcDNAを決定し、46カ所において、計51塩基の挿入型RNAエディティングが存在することを明らかにした。また、ORFの推定より、ミトコンドリアDNA上に既知遺伝子と有意な相同性を持たない100アミノ酸以上のORFが20個存在しており、ORF14-19は転写されていることがわかった。これらのタンパク質の機能、ミトコンドリア融合との関係、高等植物における相同遺伝子の単離等は今後の課題である。我々はミトコンドリアの融合とミトコンドリアDNAの組換えにかかわるプラスミドmFを発見し、その解析を行なっている。このmFプラスミドはミトコンドリア内に存在する約16kbpの線状DNAである。既に、mFの全塩基配列を決定しており、DNAおよびRNAポリメラーゼと9つのORFを発見している。ORFのうち、アミノ酸数640個のORF640のコードするタンパク質は、4つの膜貫通領域と2つないし4つのコイルドコイル領域が推定され、ミトコンドリア融合のキータンパク質と予想される。ORF640pと相互作用する因子を同定し、ミトコンドリア融合の分子機構を明らかにするために、今年度はミトコンドリア内の候補遺伝子を探索する目的で、真正粘菌のミトコンドリアDNAの全塩基配列を決定した。真正粘菌のmt遺伝子には、置換型だけでなく、フレームシフトを伴う挿入型RNAエディティングが存在しているが、12のタンパク質遺伝子(cox1-3、cytb、atp6、9、nad1、3、4、5、7とrps12)、2つのrRNAと5つのtRNAを同定した。また、ORFの推定より、既知遺伝子と有意な相同性を持たない100アミノ酸以上のORFが20個存在することがわかった.これらのORFは既知の遺伝子の領域とはまったく重ならず、内14個が同方向で一領域に並んでいた。また、11個が膜貫通領域を、1つがコイルドコイル構造を持つと予想された。コイルドコイル構造持つORFのタンパク質とORF640pとがどのように関連しているか(もしくはしていないか)、またミトコンドリア融合とどのように関係しているかは今後の課題である。
精神障害者当事者が参加する隔離・拘束を減らすためのプログラムの効果の検証

今年度は、研究参加に協力していただく病院のリクルートを行った。数ヶ所の病院に説明を実施しているが、まだ検討中である。そのため倫理審査受審についても準備中である。病院の承諾が得られ次第、倫理審査の受審を進める予定である。また研究を実施する際には、介入前後で行動制限に関する職員の意識の変化を測る尺度を使用する予定である。その尺度については、日本語で開発された尺度では適切なものはないため、海外で開発されたもので適切な尺度はないか文献検討を実施した。その結果、研究目的に合う尺度について複数候補に挙がった。研究会議を2回実施し、内容の吟味を重ね、そのうちの1つの尺度を使用することに決定した。その尺度はノルウェーで開発されたものであるため、開発者の使用承諾を得たところである。現在、その尺度の日本語版の開発を進めているところである。地域で生活する当事者が、隔離や身体的拘束を減らすためのプログラムに協力者として参加するという取り組みは少なく、病院がこれまでに経験していないことが多い。そのためプログラムの実施には、多くの不安があることはこれまで研究を進める中でも課題となっていた。病院のその不安を軽減するために、プログラムを実施するための研修を実施し策定してきた経過がある。研修を受講した病院からはプログラム実施に関する、前向きな意見が聞かれたが、実際に実施するには、参加できる当事者の人数の確保などが難しい病院もあり、協力病院のリクルートが難航している状況である。また隔離・身体的拘束の体験は、当事者にとっても心理的侵襲の高いものであることが多い。その体験を安心して話してもらうためには、当事者自身が病気とうまくつきあう力を身に付けている必要があることや、環境として当事者をサポートする体制を整えることが重要である。研究協力病院の選定にあたっては、このようなことがあり、病院や当事者の体制を整えることに時間がかかり、保留になっている病院があり、決定までに至っていない状況である。プログラムに参加できる当事者の協力を得るために、病院だけではなく、病院が設置されている地域で、病院と連携している事業所などにもリクルートの範囲を広げていくことにした。また引き続き、研究協力に関する広報を関連学会、団体を通して行っていく。さらに隔離・身体的拘束を減らすことに関心のある病院が他にないか、関係者から情報収集を行い、積極的に研究協力に関する説明を行っていくこととする。尺度の日本語版の開発に関しては、現在ノルウェーの研究者と調整をしているところであるが、プログラムの実施までに日本語の翻訳を確定させる予定である。翻訳には、ノルウェー語と日本語ができる人材が必要であるため、ノルウェーの研究者の協力も得て、人材を確保できるよう準備を進める予定である。研究協力病院が決定次第、倫理審査を受審予定である。倫理審査が終了後、9月を目途に介入を開始できるように準備を進める。

倫理審査が終了後、9月を目途に介入を開始できるように準備を進める。本研究に関連する研究で、介入前に行う教育プログラムの開発を行っている。研究協力病院のリクルートには、教育プログラムを実施した病院も含まれていたため、費用がかからなかった。また学会参加の機会等を利用して、リクルートを行ったため、想定より経費がかからなかった。尺度開発を追加で実施することになったため、開発経費に充てる予定である。
遺伝学的危険因子ＰＩＣＡＬＭとＢＩＮ１がアルツハイマー病発症に果たす役割の解明

本研究課題においては、近年アルツハイマー病(AD)の遺伝学的危険因子として同定されたPICALMおよびBIN1といったエンドサイトーシス関連分子が、病因物質アミロイドβペプチド(Aβ)の産生過程において果たす役割を解明し、これらをターゲットにしたAβ産生を制御するAD分子標的治療薬の開発を目指すものである。当該年度において生化学的および細胞生物学的解析により以下のことを明らかにした。まずPICALMに関しては(1)PICALMヘテロノックアウトマウス脳内Aβ42比率が野生型マウスに比して有意に減少している(2)γセクレターゼ複合体サブユニットの一つニカストリンと直接結合し、γセクレターゼの表面膜からの取り込みと引き続く後期エンドソームへの輸送を促進すること(3)エンドソームの成熟•酸性化がγセクレターゼのAβ42産生活性を促進することなどを複数の実験手法を用いて明らかにし、PICALM機能阻害がγセクレターゼのエンドソーム輸送の制御を介して特に毒性の高いAβ42産生を抑制すること、従ってPICALMはAβ42産生を阻害するAD治療薬の有望なターゲットであることを示唆した。これらの成果をまとめ現在Nature Communication誌に投稿中である。またBIN1に関しては(1)BIN1欠損によりAβ産生が有意に上昇する(2)βセクレターゼBACE1のC末端に結合し、そのリソソームでの分解を促進している(2)BIN1消失時に分解を免れたBACE1は初期エンドソームに蓄積することなどを明らかにし、BIN1が特にBACE1のエンドソームにおける分解/リサイクリング経路選別機構を介してBACE1の定常量を制御し、Aβ産生に関与している可能性を強く示唆した。本研究課題では、アルツハイマー病(AD)の遺伝学的危険因子として最近同定されたPICALMおよびBIN1といったエンドサイトーシス関連分子が、病因物質であるアミロイドβペプチド産生過程において果たす役割を解明するとともに、これらをターゲットにしたAβ産生を制御するAD分子標的治療薬の開発を目指すものである。当該年度においては、生化学的および細胞生物学的解析により以下のことを明らかにした。まずPICALMに関しては(1)クラスリン被覆ピットにおいてγセクレターゼと共局在すること(2)γセクレターゼ複合体サブユニットの一つニカストリンと結合すること(3)γセクレターゼの後期エンドソームへの輸送を促進すること(4)エンドソームの成熟とそれに伴う内腔の酸性化がγセクレターゼのAβ42産生活性を促進することなどを明らかにし、PICALM機能阻害がγセクレターゼのエンドソーム輸送の制御を介して特に毒性の高いAβ42産生を抑制すること、従ってPICALMはAβ42産生を阻害するAD治療薬の有望なターゲットである可能性を示した。これらの成果をまとめたものを現在Nature Communication誌に投稿中である。またBIN1に関しては(1)βセクレターゼBACE1のリソソームでの分解を促進している(2)BACE1C末端と結合することなどを明らかにし、BIN1が特にBACE1のエンドソームにおける分解/リサイクリング経路選別機構を介してBACE1の定常量を制御し、Aβ産生に関与している可能性を強く示唆した。今後は生細胞イメージングなどによりBACE1輸送制御に関する詳細な細胞生物学的検討を進める。RNAi法によるPICALM、BIN1各分子のノックダウン効率が非常に良好で一定の傾向を有する表現型が安定して得られたこと、相互作用解析などに必要なリコンビナントタンパク質が量・精製度共に良好な状態で得られたこと、細胞生物学的解析に不可欠である免疫染色に使用可能な内因性タンパク質を検出する抗体が入手できたことなどが、本研究課題がここまで順調に進展してきた理由として考えられる。

引き続き当初の研究計画に基づいてPICALMについてはγセクレターゼやAPP、BIN1に関してはBACE1の輸送を制御する分子機構に関しての解析を進める。具体的にはPICALMやBIN1と協働してこれら輸送を制御するタンパク質を相互作用分子の同定を通じて探索する。またそれぞれのノックアウトマウスを入手できたので、これらから得られた細胞、特に神経細胞におけるPICALM、BIN1の輸送制御機構を主に生化学的、あるいは生細胞イメージングなどの手法により解析してゆく予定である。生化学実験用、あるいは細胞生物学実験用試薬を中心としたの消耗品購入、およびPICALMやBIN1相互作用分子同定を目的とした質量分析受託解析などが主な使途となる