hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
細胞周期におけるレチノブラストーマタンパクの機能制御

1。造血系細胞における厳密な外来遺伝子の発現抑制を可能にする系を用いてヒトpRBcDNAをサイトカイン依存性リンパ球細胞株を、Ba/F3に導入し、誘導時において非誘導時の50倍程度のpRB蛋白蓄積をしめす安定変異株複数樹立した。これら細胞の細胞周期進行過程、細胞増殖曲線等を検討した結果、pRB非誘導・誘導における有意な増殖能変化は認められなかった。2。pRBはリン酸化を受けて不活化されるため、次にサイクリン-CDKの標的となりうる18個のセリン、スレオニン残基をアラニンに置換した人工改変pRB分子を作製した。この人工改変pRB分子をBa/F3細胞株に導入し細胞増殖に及ぼす効果を検討したところ、わずかな細胞増殖抑制が認められるのみで、細胞周期は停止することなく進行した。3。上記発現誘導系を用いて、pRB関連分子をBa/F3細胞株に導入し蛋白誘導を行なったところp130を導入発現することによりきわめて強力な細胞増殖抑制活性が認められた。4。その活性がp130により抑制されることが知られているE2F4をBa/F3細胞株に導入し蛋白誘導を行なった。その結果、E2F4を構成的に発現させることにより、Ba/F3細胞のサイトカイン依存性が消失し、細胞は増殖因子非依存的増殖応答能を獲得した。本研究から、これまですべての体細胞増殖におけるブレーキ分子として細胞周期制御に普遍的に関与すると考えられてきたpRBがサイトカイン依存性の造血系細胞増殖制御に際してきわめて限定的な役割しか担っていないことが明らかになった。本研究はpRB不応答性細胞の存在を示した最初の報告である。さらに、この細胞の増殖はpRB関連分子のひとつであるp130により強力に抑制された。この事実はある種の血球系細胞において、pRBではなくp130を負の制御因子として有する細胞周期制御機構の存在を示している。この結論は、p130の標的分子と考えられているE2F4の異所性発現によりBa/F3細胞が増殖因子非依存性増殖能を獲得することからも強く支持された。我々は既に酵母を用いたヒトpRBの誘導発現系を樹立するとともに、pRBのG1細胞周期特異的リン酸化(不活化)が酵母内できわめて高度に再現できることを明らかにしている。この系におけるpRBリン酸化に直接関与する酵母分子を同定するため遺伝子破壊法を用いて一連の酵母G1サイクリン欠損株を作製し、それら細胞株のpRBリン酸化能を検討した。その結果、pRBリン酸化には酵母細胞の有する3つのG1サイクリンのうちのある種のコンビネーションが必須となることが明らかとなった。このコンビネーションはCln2+Cln3あるいはCln1+Cln3である。一方これまでの研究から、これらG1サイクリン存在下に活性化されるCDKとしてCdc28が示されてきたが、Cdc28の温度感受性変異体を用いた解析からpRBリン酸化における同分子の重要性がより直接的に証明された。しかしながら酵母におけるpRBリン酸化/不活化にはCdc28活性のみでは不十分であり、第二の酵母CDKと考えられるPho85がCdc28とともに重要な役割を担うことが明らとなった。Cln2あるいはCln3を欠失させヒトpRBリン酸化能を失った酵母細胞株にヒト由来サイクリンcDNAを導入した結果、Cln2の機能はサイクリンEによりまたCln3の機能はサイクリンD1により相補された。前述したPho85欠損株はpRBリン酸化能を欠く一方、Cdc28欠損株と異なり継続的な細胞増殖が可能である。そこでPho85欠損株を用いヒト分子によるpRBリン酸化の再構成を試みるため、新たに4つの異なる選択マーカー(ADE2,TRP1,LYS2,HIS3)を利用した酵母cDNA発現ベクターを作製した。これら発現ベクターにヒト由来サイクリンD1,D2,D3,E,B1,C,ならびにCDK2,CDK4,CDK6,CDC2cDNAを組み込んだ後Pho85欠損酵母細胞に遺伝子導入し、複数個のヒトサイクリン-CDK複合体を同時発現する安定変異株を樹立した。現在、これらトランスフェクタントを用いpRBリン酸化に直接関与するヒト由来サイクリン-CDKならびにその組み合わせの検討を進めている。ヒト由来のサイクリンならびにCDK分子を異所性共発現させることにより細胞周期をヒト分子により再構成した出芽酵母を用い、サイクリンE-CDK2ならびにサイクリンD1-CDK4からなるG1サイクリン-CDK複合体が協調的に関与するpRBリン酸化/不活化機構の存在を示すことに成功した。現在、各々のサイクリン-CDK複合体活性は異なる細胞増殖関連上位シグナルにより制御されているものと推察されている。したがって、pRB不活化に際し複数のサイクリン-CDK複合体が関与するという事実は、pRB分子が多様な細胞増殖関連シグナル(情報)をリン酸化の形で細胞内外から集積・統合することにより、細胞増殖の最終的な意思決定を下す局面に直接関与している可能性を分子レベルで説明しうるものと考えられる。酵母モデル系を用いて得られたこれらの知見を哺乳動物細胞において検証するため、テトラサイクリン制御プロモーターを改変しきわめて高度な発現制御能をもつ哺乳動物細胞内遺伝子発現誘導系を確立した。この発現誘導システムにおいては、非誘導時における強い蛋白発現の抑制とテトラサイクリン除去による強力な誘導が期待され、pRBに代表される細胞増殖抑制能を持つ蛋白の機能解析に強力な手段を提供する。

この発現誘導系を用いてヒトpRBcDNAを増殖因子依存性マウスリンパ系細胞細胞株に導入し、pRBを迅速かつ強力に誘導発現する一連の安定変異細胞株を樹立した。現在、pRBの細胞内発現レベルが細胞の増殖・分化能に与える影響に関し検討を加えている。1。造血系細胞における厳密な外来遺伝子の発現抑制を可能にする系を用いてヒトpRBcDNAをサイトカイン依存性リンパ球細胞株を、Ba/F3に導入し、誘導時において非誘導時の50倍程度のpRB蛋白蓄積をしめす安定変異株複数樹立した。これら細胞の細胞周期進行過程、細胞増殖曲線等を検討した結果、pRB非誘導・誘導における有意な増殖能変化は認められなかった。2。pRBはリン酸化を受けて不活化されるため、次にサイクリン-CDKの標的となりうる18個のセリン、スレオニン残基をアラニンに置換した人工改変pRB分子を作製した。この人工改変pRB分子をBa/F3細胞株に導入し細胞増殖に及ぼす効果を検討したところ、わずかな細胞増殖抑制が認められるのみで、細胞周期は停止することなく進行した。3。上記発現誘導系を用いて、pRB関連分子をBa/F3細胞株に導入し蛋白誘導を行なったところp130を導入発現することによりきわめて強力な細胞増殖抑制活性が認められた。4。その活性がp130により抑制されることが知られているE2F4をBa/F3細胞株に導入し蛋白誘導を行なった。その結果、E2F4を構成的に発現させることにより、Ba/F3細胞のサイトカイン依存性が消失し、細胞は増殖因子非依存的増殖応答能を獲得した。本研究から、これまですべての体細胞増殖におけるブレーキ分子として細胞周期制御に普遍的に関与すると考えられてきたpRBがサイトカイン依存性の造血系細胞増殖制御に際してきわめて限定的な役割しか担っていないことが明らかになった。本研究はpRB不応答性細胞の存在を示した最初の報告である。さらに、この細胞の増殖はpRB関連分子のひとつであるp130により強力に抑制された。この事実はある種の血球系細胞において、pRBではなくp130を負の制御因子として有する細胞周期制御機構の存在を示している。この結論は、p130の標的分子と考えられているE2F4の異所性発現によりBa/F3細胞が増殖因子非依存性増殖能を獲得することからも強く支持された。
C-CおよびB-C結合形成における触媒プロセス

本研究では炭素-炭素および炭素-ホウ素結合形成の両面から、触媒的有機合成反応の開発を目的とした。1.芳香族C-H結合の触媒的直接ホウ素化反応(担当:石山、宮浦)触媒サイクルと合成化学的利用に関する調査を行った。反応の精査、B-B、B-H、Si-Si,Si-H化合物を利用した量論量の芳香族化合物の効率的なホウ素化およびケイ素化を達成した。さらには芳香族化合物以外のsp^2-CH、sp^3-CH結合のホウ素化に成功した。2.末端アルキンの内部選択的ヒドロホウ素化反応(担当:山本、宮浦)Et_3N存在下Rh(I)/^iPr_3P錯体が末端アルキンのシス選択的ヒドロホウ素化反応の反応機構に関する調査を行った。ピナコールボラン、ボラジンを用いたアルケン、アルキン類の触媒的ヒドロホウ素化反応を新たに開発した。3.有機ボロン酸のロジウム触媒グリニャール型付加反応(担当:宮浦)カチオン性ロジウム/トリエチルアミン存在下アリールボロン酸のアルデヒド、イミンへの不斉付加に成功した。配位子としてホスホロアミダイト系配位子が効果的であることがわかった。4.触媒的アリルホウ素化反応(担当:石山、山本)アリルホウ素試薬と芳香族ハロゲン化物とのγ位選択的なクロスカップリングの開発に成功した。また、不斉クロスカップリング反応へ展開し、最高90%eeを達成した。5.触媒的分子内付加反応(担当:山本)分子内アリル化による付加環化を調査し、6,7,8員環エーテルおよびシクロブタノール類の立体選択的合成に成功した。シクロブタノールの不斉付加環化に成功した。この他、カチオン性ロジウムおよびパラジウム触媒を用いる有機ボロン酸の不斉共役付加反応を開発した。ロジウム系ではキラホスを用いた不斉付加反応に成功しDFT計算により反応機構の解析を行った。さらに高活性な新規不斉2座ホスホロアミダイト配位子を設計・合成した。またパラジウム系では、不斉付加反応に成功し、X線構造解析、DFT計算により反応機構を解明することができた。さらにパラジウムおよびロジウム触媒を用いる有機ボロン酸の不斉1,4-付加それに続く分子内付加により光学活性クロメンおよびインデンの合成に成功した。6.有機ポロン酸の分子内グリニヤール型付加反応(担当:宮浦、山本)分子内ケトンカルボニル基に対するロジウム触媒分子内付加環化反応について精査した。触媒として[RhCl(cod)]_2、塩基としてK_2CO_3が適しておりTHF/H_2O溶媒中で室温、1時間で環化反応が進行した。5および6員環アリルアルコールが立体選択的に生成していることがわかった。

触媒として[RhCl(cod)]_2、塩基としてK_2CO_3が適しておりTHF/H_2O溶媒中で室温、1時間で環化反応が進行した。5および6員環アリルアルコールが立体選択的に生成していることがわかった。1.芳香族C-H結合の触媒的直接ホウ素化反応(担当:石山、宮浦)アリールボロン酸の合成はグリニヤール試薬とホウ酸エステルの反応が一般的である。原子効率を含めた反応の効率を追及すると芳香族C-H結合の直接ホウ素化が最も効率的変換法となる。Ir-bipyridine錯体が高い活性を示すことを見出し、触媒サイクルと合成化学的利用に関する調査をした。反応の精査の結果、4および4'位にt-Bu基を有するbipyridineを配位子に用い溶媒にヘキサンを使用すると量論量の芳香族化合物を室温でホウ素化できることを見いだした。さらに複素環芳香族化合物も使用でき、直接ケイ素化反応も同様の条件下進行することが明らかとなった。2.末端アルキンの内部選択的ヒドロホウ素化反応(担当:山本、宮浦)Et_3N存在下Rh(I)/Pr_3P錯体が末端アルキンのシス選択的ヒドロホウ素化反応を触媒することは先に報告したが、反応機構に関する調査を行った。いくつかのロジウム錯体が途中生成していることがわかった。3.有機ボロン酸のロジウム触媒グリニャール型付加反応(担当:宮浦)ロジウム触媒存在下アリールボロン酸がアルデヒド、イミシに付加反応を行うことは先に報告した。このようなグリニヤール型付加反応は典型金属で一般的であるが、遷移金属触媒では極めて希な反応例である。この反応を精査した結果、カチオン性ロジウム錯体/トリエチルアミン系で室温から50度で付加が進行することがわかった。4.触媒的アリルホウ素化反応(担当:石山、山本)カルボニル化合物へのアリルボランの付加反応は一般に無触媒で進行する。従って、酒石酸などを量論的キラル補助剤として不斉反応が行われてきた。我々は最近、アリルボロン酸ピナコールエステルの付加反応がルイス酸触媒で加速され高いジアステレオ選択性を発現することを報告した。ランタノイドキラル触媒に関してはすでに多くの研究があることから、触媒的不斉反応に展開したい。ビナフトールとの組み合わせで現在60%eeが達成されている。さまざまな配位の合成に成功した。1.芳香族C-H結合の触媒的直接ホウ素化反応(担当:石山、宮浦)lr-bipyridine錯体が高い活性を示すことを見出し、触媒サイクルと合成化学的利用に関する調査を開始した。反応の精査により量論反応に成功した。またC-H直接ケイ素化へ展開し複素環芳香族化合物に適応できた。配位子の置換基を変えると位置選択性が向上することがわかった。2.末端アルキンの内部選択的ヒドロホウ素化反応(担当:山本、宮浦)ピナコールボランによるアルケンの触媒的ヒドロホウ素化を開発した。イリジウム触媒/二座ホスフィン配位子の組み合わせが効果的であることがわかった。3.有機ボロン酸のロジウム触媒グリニャール型付加反応(担当:宮浦)ロジウム触媒存在下アリールボロン酸がアルデヒド、イミンに付加反応を行うことは先に報告した。この反応を精査し、反応の適用限界の拡張、触媒効率の改善を計った。様々イミンについて調査しカチオン性ロジウム/トリエチルアミン系での不斉付加に成功した。
インスリン受容体基質のモノユビキチン化を介したインスリン活性調節機構の解明

インスリンとインスリン様成長因子(IGF)は互いに類似した構造のホルモンで、インスリンは血糖値の調節に、IGFは細胞増殖や個体成長に重要な役割を果たします。私達は、これまでにインスリンやIGFの細胞内情報伝達を担うタンパク質の一つ「インスリン受容体基質」がモノユビキチン化という種類の分子修飾を受けるとインスリンやIGFの作用が強まることを見つけており、今回の研究によってその詳細な分子機構を明らかにすることが出来ました。また、肝臓では細胞が受け取る栄養量が変化すると、この新しい機構を介してインスリンへの応答性が変化することも明らかになり、糖尿病発症機構の理解にとっても重要な発見と考えられました。研究代表者は、これまでに、インスリン/IGFシグナルを仲介するIRS-2にユビキチンリガーゼNedd4が結合すると、IRS-2がモノユビキチン化され、インスリン/IGFに応答したIRS-2のチロシンリン酸化が促進、インスリン/IGF活性が増強されることを見出してきた。本研究では、この現象の分子機構と生理的意義の解明を目的としている。平成25年度は、まず、前年度に続いてNedd4とIRS-2の結合の制御機構の解析を進めた。詳細な解析の結果、「Nedd4のC2ドメインとHECTドメインの分子内相互作用が解除されることにより、Nedd4とIRS-2の相互作用が可能となる」という新しい制御機構が存在することが示された。次に、Nedd4によるIRS-2のユビキチン化部位を調べた。IRS-2に存在する39個のリジン残基を種々の組み合わせでアルギニン残基に置換した変異体を作製し解析を進めた結果、IRS-2のC末端側の複数のリジン残基がユビキチン化部位であることが明らかとなった。このユビキチン化部位が、Nedd4によるIRS-2のチロシンリン酸化の増強効果に必要であることも確認された。更に、モノユビキチン化されたIRS-2を認識するタンパク質としてEpsin1を同定した。Epsin1はユビキチン結合モチーフを有し、また、細胞膜のクラスリン被覆小胞形成部位に集積することが知られている。Epsin1を発現抑制すると、Nedd4によるIRS-2のチロシンリン酸化の増強効果が消失した。以上の解析から、「Nedd4によってユビキチン化されたIRS-2はEpsin1と相互作用することにより細胞膜にリクルートされ、そこに存在するインスリン/IGF受容体キナーゼによってチロシンリン酸化されやすくなり、インスリン/IGFシグナルが増強される」という全く新しい分子機構が存在していると結論した。インスリンシグナルを仲介するIRS-2にユビキチンリガーゼNedd4が結合すると、IRS-2がモノユビキチン化され、インスリンに応答したIRS-2のチロシンリン酸化が促進、インスリン活性が増強される。この現象の分子メカニズムを解明するため、まず、IRS-2とNedd4の結合の制御機構を調べた。その結果、肝細胞をグルコースやアミノ酸が欠乏した培地で培養すると、Nedd4とIRS-2の結合量が増加することを見出した。更に、Nedd4のC2ドメインとIRS-2のPH-PTBドメインが互いの結合領域であり、グルコース不足に応答してNedd4に何らかの分子修飾が起こりPH-PTBドメインに対する親和性が上昇することがわかった。現在、Nedd4の分子修飾についてLC-MS/MSを用いて解析を進めている。次に、IRS-2と結合したNedd4によるIRS-2のユビキチン化部位を調べるため、種々の領域を欠失したIRS-2の変異体をNedd4と共に細胞に発現し、IRS-2のユビキチン化の有無をイムノブロット法で調べた。並行して、Nedd4を過剰発現した細胞を用いIRS-2のユビキチン化部位をLC-MS/MSにより解析した。一連の解析の結果、PTBドメインの幾つかのリジン残基がユビキチン化を受けることがわかった。現在、このリジン残基を置換したIRS-2変異体を作製し、インスリンシグナルの調節におけるこれらリジン残基の役割を確認している。また、Nedd4の過剰発現によりIRS-2との結合量が増加するタンパク質群の中に、ユビキチン結合ドメインを有するタンパク質を見出した。このようにNedd4によるIRS-2を介したインスリンシグナルの増強機構の解明が進んできており、次年度に予定している、個体レベルにおけるこの機構の意義を解析する研究の基盤ができつつある。研究代表者は、これまでに、インスリン/IGFシグナルを仲介するIRS-2にユビキチンリガーゼNedd4が結合すると、IRS-2がモノユビキチン化され、インスリン/IGFに応答したIRS-2のチロシンリン酸化が促進、インスリン/IGF活性が増強することを見出してきた。平成26年度は、まず、Nedd4とIRS-2の相互作用の特異性を検討した。

その結果、Nedd4と類似構造を持つNedd4-2はIRS-2に結合しないこと、Nedd4はIRS-1をユビキチン化しないことなどがわかった。次に、Nedd4によるIRS-2のユビキチン化部位を調べた。IRS-2のリジン残基の変異体を用いた前年度の解析からIRS-2のC末端側の複数のリジン残基がユビキチン化部位であることが示されていたが、定量的質量分析によって特に1331番目のリジン残基が最もユビキチン化を受けやすいことが示された。また、前年度にモノユビキチン化されたIRS-2を認識するタンパク質としてEpsin1を同定していたが、IRS-2やEpsin1の変異体を用いた結合解析から、IRS-2にC末端付近に付加されたユビキチンにEpsin1のユビキチン結合モチーフが結合することがわかった。初年度からの解析を総合し、「Nedd4によってユビキチン化されたIRS-2はEpsin1と相互作用することにより細胞膜にリクルートされ、そこに存在するインスリン/IGF受容体キナーゼによってチロシンリン酸化されやすくなり、インスリン/IGFシグナルが増強される」という全く新しい分子機構が存在すると結論した。また、肝細胞では、細胞が低栄養状態に置かれると何らかの仕組みでNedd4とIRS-2の複合体形成が促進し、明らかとした機構を介してインスリン感受性が増強する可能性が示された。広島大学医歯薬保健学研究院医化学研究室インスリンやインスリン様成長因子の細胞内シグナル伝達機構の研究Nedd4-IRS-2複合体の形成機構に関しては、詳細な結合領域を特定でき、Nedd4のダイナミックな構造変化を介してIRS-2との複合体形成が可能となることを示すことができた。一方、Nedd4のIRS-2結合部位のみからなる変異体を過剰発現することにより、内在性のNedd4とIRS-2の結合を阻害できるか検討を進めているが、現在まで阻害効果は見られておらず、発現量を増加させるなどの工夫が必要である。IRS-2のモノユビキチン化がインスリン/IGF刺激に応じたIRS-2のチロシンリン酸化を増強する分子機構については、IRS-2のユビキチン化部位が特定でき、その部位がIRS-2のチロシンリン酸化の増強に必須であることを明らかにできた。また、Epsin1がユビキチン化IRS-2に結合しおそらくIRS-2を細胞膜へとリクルートする、このことによりインスリン/IGF受容体によるIRS-2のチロシンリン酸化が増強されることが明らかとなった。ただし、この解析の予備検討で、ユビキチン化IRS-2の質量分析により多数のユビキチン化候補部位が同定されたため、最終的にIRS-2の全てのリジン残基に変異を導入して調べる必要が生じ、変異体作製に約半年の時間を要したため、研究に遅れが生じた。最後に、上記の解析で明らかとなったメカニズムを介して生体内の肝臓のインスリン活性が増強することを証明するため、マウスの肝臓にアデノウイルス法によりNedd4のshRNAを導入しインスリンシグナルや糖代謝を解析する予定であった。現段階では、Nedd4の発現抑制が十分でなく、shRNAの配列設計等を工夫する必要がある。
ＭＥＭＳ光学系による異種画像同一光軸撮像システム

コンパクトな同軸光学系で、遠赤外光と可視光の二種の画像を得た。そのためにシリコンとガラスから成るハイブリッドレンズを新たに考案した。遠赤外光と可視光はシリコンウエハによるビームスプリッタで分割し、それぞれに対応したイメージャで撮影した。光学系としての基本的な機能の確認として、ハイブリッドレンズの位置によって焦点調節ができることを示した。また、MEMSシリコン三次元加工によるシリコンフレネルレンズを用いてハイブリッドレンズを試作した。このハイブリッドレンズで点光源の像をスクリーンに結像し、遠赤外光と可視光のそれぞれの像が同じ位置に結像されることを確認した。色、距離、温度の三種類の画像を同じ視野で1枚の画像として撮影するカメラを実現するために、可視光、近赤外光、遠赤外光という質の異なる光を同一の光軸で撮影する撮像システムの研究を行う。平成23年度は、同軸撮像素子の構成法の確立を目標として、シリコンフレネルレンズを設計し、可視光・遠赤外光同軸レンズの試作と評価を行った。同軸結像系の周辺部はシリコンをフレネルレンズに三次元加工したもので、遠赤外光を結像するために用いる。フレネルレンズの外形は一辺が12mmの正方形で、焦点距離が10mmになるように設計した。三次元加工により形状を球面に限らず設計できる利点を活かし、レンズの球面収差を抑えるために、曲率半径が中心部では25mm、周辺部では35mmとした。また、中央部は可視光用のガラスレンズを固定するための直径5mmの穴を開けた。以上のフレネルレンズと中心部の穴を三次元加工で一括製作した。触診段差計を用いた形状計測で設計どおりに作製できたことを確認した。三次元形状の高低差は最大で180μmであり、これまでの7.2倍を達成した。同軸結像系の中心部には市販のガラスレンズで直径が5mm、焦点距離がの10mmものを使用した。光学系の評価として、同軸光学系の中心軸のずれの計測を行った。可視光から遠赤外光を発する熱源を光源として用い、その像を同軸光学系で紙のスクリーンに結び、その像をCMOSカメラおよびサーモグラフィによって観察した。光源の場所を9点に変えつつ計測した結果、二種のレンズの中心軸の方向のずれが1.2°に抑えられたことを確認した。平成24年度は、色、温度同軸撮像システムの設計を行い、試作を進めた。三種類の画像を取得するにあたり、まずは可視光、近赤外光、遠赤外光のうちで透過する材料などの特徴が異なる可視光と遠赤外光を対象とした。結像レンズには、前年度に研究したガラスとシリコンからなるハイブリッドレンズを用いることにした。可視光と遠赤外光を同時に撮影するシステムを検討した結果、可視光と遠赤外光をビームスプリッタで分割し、それぞれ対応する波長の撮像素子で撮影する構成を取ることにした。システムの光学設計を行った。結像レンズの中心部分を半径3mm、曲率半径40mmのガラスレンズとし、周辺部を半径6mm、曲率半径80mmのシリコンフレネルレンズとする。その後方に厚さ0.5mmのシリコンのビームスプリッタを置く。可視光はシリコンで反射され、遠赤外光はシリコンを透過する。可視光と遠赤外光の撮像素子は、一般に手に入るものとして、それぞれ対角で1/2インチと1インチとした。対応する波長の光が焦点を結ぶ位置に撮像素子を置くことで、光軸が一致し、画角もほとんど等しい撮像システムを実現することができる。平成25年度は、色、温度同軸撮像実験をした後に、レンズの再設計、試作を行った。さらに平成26年度は、色、温度同軸撮像の再実験を行い、距離計測と組み合わせた。平成24年度までに試作したレンズでは温度画像の撮像が困難であったため、可視光、遠赤外光同軸レンズを再設計した。外側のシリコンレンズは、平凸の球面レンズの中央に穴を開けたもので、直径25.4mm(1インチ)、穴の直径6.25mm(1/4インチ)、厚さ3mmとした。シリコンレンズの球面の曲率半径を126mmとすることで、焦点距離が50mmになるようにした。シリコンの切削や研磨などの加工を外注してシリコンレンズを試作した。

シリコン中空レンズの穴に直径6mmのガラスレンズをはめ込んで同軸レンズとした。可視光と遠赤外光を分離するビームスプリッタとしてシリコン平板を用いた。撮像素子には可視光のイメージャおよび遠赤外光のイメージャを用いた。それぞれの光学素子の位置や角度を光学シミュレーションにより設計した。この光学系を組み、撮像実験をした。二種の画像はよく一致した。また、レンズの位置を動かすことで、二種の画像の焦点位置を同時に変更できることも確認した。最終的に、距離計測と組み合わせ、色、距離、温度の画像を得た。26年度が最終年度であるため、記入しない。MEMS,ロボティクス26年度が最終年度であるため、記入しない。当初の計画どおりに進んでいる。本年度は当初計画においては、色、温度同軸撮像の特性計測まで行う予定であったが、方法の検討および光学系の設計に時間がかかったために、特性計測までは至らなかった。今後は、当初計画に従って、可視光と遠赤外光を同軸で撮影することのできる同軸撮像素子の研究に進む。平成25年度は、距離計測の光学系の設計、試作を行い、同軸光学系を完成させる。近赤外光のみを透過するビームスプリッタとして、光学的バンドパスフィルタとなるMEMSのナノ構造体などの構造を検討し、試作して、特性を評価する。さらに距離計測ユニットを導入して、距離画像の取得を行う。最後に、各要素を組み合わせた撮像システムを試作し、異種画像の取得実験を通じてシステムの評価を行う。色・距離・温度の各画像の光軸と視野角度を評価し、同一の光軸を持つことを示す。距離画像については計測可能な距離範囲と距離精度を評価する。温度画像については計測可能な温度の範囲と温度の精度を評価する。
固体におけるセル構造のダイナミクス

固体中での結晶粒成長のダイナミクスを議論するための計算機シュミレーションプログラムを開発しこれを実行した。2次元セル構造の計算機シュミレーションは今日では充分行われている。併せて理論的な統計力学的取扱いもなされている。しかしながら理想的な2次元系をつくる事は実際的には困難であり、実験との比較を行うための3次元系の効率的なシュミレーションの方法の開発が望まれていた。既にポッツモデルによるモンテカルロシュミレーションは行われているがそのコストパフォーマンスは著しく悪いだけでなく、物理的な時間空間スケールが決まらないという原理的な困難を抱えていた。そこでセル構造の自由度をセルの頂点の自由度にまで縮約したモデル「バ-テックスモデル」に基づくシュミレーション方法を開発した。即ち、セル壁(界面)を三角形分割し界面の運動方程式より各三角形頂点の運動方程式を導き、これを時間方向に積分する事で各頂点、即ち、セル形状の時間発展を追跡する事が出来る。空間時間的な粗視化の目安となるカットオフ長以下でのイベントはトポロジーの変化(セル間でのスイッチング及びセルの合体)として処理した。この様にしてポッツモデルによる方法での困難をすべて克服する事が出来た。シュミレーションの結果、面数分布及びセルサイズ分布に関してはポッツモデルによる大規模シュミレーションで得られた結果をカバーしただけでなく、今回新たにAboav-Weaire則及びLewis則が3次元セル系でも成立する事を高精度で確認した。後者はセル構造による空間充填という純粋に幾何学的な要請によるものと考えられる。これらの結果は2編の論文にて出版する予定である。これと並行してフラストレートした氷のモデルを統計力学的に論じた。このモデルは界面上での新しいタイプの相転移として今後発展させる予定である。(論文投稿中)固体中での結晶粒成長のダイナミクスを議論するための計算機シュミレーションプログラムを開発しこれを実行した。(論文投稿中)
ケトン体の神経保護効果とドパミン神経幹細胞における増殖・分化シグナルへの関与

1.ドパミン神経幹細胞の増殖・分化の解析:H17年度,ラット中脳由来ドパミン神経幹細胞の培養を行い,各種サイトカインによる刺激を加えて分化・増殖させ,その種々の段階でケトン体(D-βヒドロ酪酸)を投与し,ドパミン神経幹細胞の分化・増殖に対する効果を検討したが,獲得できるドパミン神経細胞の割合が低く,不十分な結果であった.効率よくドパミン神経細胞を得るため,H18年度は前年度の結果をふまえて,より広範な条件での解析を追加し,ケトン体の中脳由来神経幹細胞の増殖と分化に対する効果および神経栄養因子など既報の刺激シグナル(BDNF, GDNF, dopamineやpramipexolなどのdopamine agonist, Retinoic acid, folskolin等)とケトン体の影響をRT-PCR法および蛍光免疫染色法により分析した.また,ケトン体の神経保護効果についてドパミン系神経細胞株SH-SY5Y細胞を用いた検討を行った.ケトン体はロテノンなどの神経毒によるアポトーシスを抑制し,ミトコンドリアを介した機序で神経保護作用を有することを証明した(Journal of Neuroscience Research 2006).さらに,初代中脳神経培養においてホモシステインがドパミン神経細胞に対して毒性を有することを証明し(NeuroReport 2006),ホモシステイン毒性モデルにおいてpramipexoleが抗酸化作用を有し,神経保護効果を呈することを示した(Soc Neurosci Abst 2006).2.ドパミン神経幹細胞の移植に関する検討:胎生ラット由来ドパミン神経幹細胞の培養を行い,ケトン体や各種サイトカインによる刺激を加えて増殖・分化させ,ラットの線条体へのドパミン神経幹細胞移植によるパーキンソン病治療モデルの確立を試みた.ラット中脳由来ドパミン神経幹細胞の培養を行い,各種サイトカインによる刺激を加えて分化・増殖させた.その種々の段階でケトン体(D-βヒドロ酪酸)を投与し,ドパミン神経幹細胞の分化・増殖に対する効果をRT-PCR,蛍光免疫染色などを用いて検討した.1.中脳由来ドパミン神経幹細胞培養:胎生ラット中脳より中脳由来神経幹細胞を培養した.培養条件は無血清培地を用い,線維芽細胞増殖因子(FGF-2)を添加して培養した.中脳由来神経幹細胞は培養3日目より増殖を始め,9日で増殖細胞塊を形成した.コーティングを施していないプラスチックフラスコにFGF-2添加無血清増殖培地で培養を続けると神経sphereが形成され,継代増殖可能であった.このsphereは無血清保存液を用いて増殖能・分化能を損なわずに凍結保存が可能であった.細胞外マトリックスを使用して培養すると分化培地に変更後効率的に神経細胞が得られた.2.ドパミン神経幹細胞の増殖・分化の解析:解析する刺激の条件(1)ケトン体(D-βヒドロ酪酸)の中脳由来神経幹細胞の増殖と分化に対する効果を検討した.解析する指標(1)中脳由来神経幹細胞のmRNAを各々の条件で回収しRT-PCR法によりシグナルを解析した.幹細胞・部位関連のマーカー・シグナルとしてNestin, Nurr-1,分化シグナルとしてDAT, THを調べた.(2)蛍光免疫染色による解析を行なった.神経細胞マーカーとしてMAP-2,神経phenotypeマーカーとしてTH,グリアマーカーとしてGFAPをそれぞれ調べた.今年度の解析をもとに,次年度,パーキンソン病モデル動物を用いた治療への応用を試みる予定である.1.ドパミン神経幹細胞の増殖・分化の解析:H17年度,ラット中脳由来ドパミン神経幹細胞の培養を行い,各種サイトカインによる刺激を加えて分化・増殖させ,その種々の段階でケトン体(D-βヒドロ酪酸)を投与し,ドパミン神経幹細胞の分化・増殖に対する効果を検討したが,獲得できるドパミン神経細胞の割合が低く,不十分な結果であった.効率よくドパミン神経細胞を得るため,H18年度は前年度の結果をふまえて,より広範な条件での解析を追加し,ケトン体の中脳由来神経幹細胞の増殖と分化に対する効果および神経栄養因子など既報の刺激シグナル(BDNF, GDNF, dopamineやpramipexolなどのdopamine agonist, Retinoic acid, folskolin等)とケトン体の影響をRT-PCR法および蛍光免疫染色法により分析した.また,ケトン体の神経保護効果についてドパミン系神経細胞株SH-SY5Y細胞を用いた検討を行った.ケトン体はロテノンなどの神経毒によるアポトーシスを抑制し,ミトコンドリアを介した機序で神経保護作用を有することを証明した(Journal of Neuroscience Research 2006).さらに,初代中脳神経培養においてホモシステインがドパミン神経細胞に対して毒性を有することを証明し(NeuroReport 2006),ホモシステイン毒性モデルにおいてpramipexoleが抗酸化作用を有し,神経保護効果を呈することを示した(Soc Neurosci Abst 2006).2.ドパミン神経幹細胞の移植に関する検討:胎生ラット由来ドパミン神経幹細胞の培養を行い,ケトン体や各種サイトカインによる刺激を加えて増殖・分化させ,ラットの線条体へのドパミン神経幹細胞移植によるパーキンソン病治療モデルの確立を試みた.
項書換え計算モデルのプログラミングへの応用

関数、論理型言語を融合する宣言型言語の計算モデルとして、遅延ナロ-イング計算系と呼ばれる計算系を定義した。この計算系は、条件付き項書換え系に基づくものである。反駁による証明を計算の機構とし、証明の過程で値が必要となった関数項のみをナロ-イングにより簡約するものである。この計算系はナロ-イングをいくつかの基本的な推論規則に分解することで、等式の反駁の高速な実行を可能にしている。この計算系関して行った研究内容を以下に示す。1.遅延ナロ-イング計算系の完全性の証明我々が答とみなすすべての項が答として確かに得られることを示した。2.関数・論理型言語の設計遅延ナロ-イング感算系に基づく言語を設計し、さらにその処理系を実装した。3.上記言語の抽象機械の設計上記言語の処理系は、抽象機械をシミュレ-トすることによって動作している。この抽象機械を、遅延ナロ-イング計算系の推論規則の振舞いを解析することによって、得た。また、プログラムから抽象機械の命令列へと翻訳するコンパイラも作成した。4.正則項書換え系の正規化手続きの実現への応用遅延ナロ-イング計算系を応用して、正則項書換え系の正規化簡約系を得る方法を示した。
物語論的アプローチからの識字教育論の構築

本研究の目的は、物語論的観点から識字教育論を構築していくことにある。継続的な参加的研究を通して申請者は、識字と「解放」とをきり結んで捉える従来の識字教育論では、正当に評価されない学習のあり方や学習者がいることを目の当たりにしてきた。理念に先立ち生身の人の思いや生き様から識字という営みを捉え直す必要があると考える。そこで、申請者は物語論に着目する。物語論とは、人びとの間で構成される物語としてのナラティヴを読み解くことで、彼らに現前している世界を理解し、その世界への関与を可能にする方法論である。そうした視点から、フィールド調査とアクションリサーチを行い、識字実践を「自己とコミュニティの新たな物語の再構築過程」として再定義した。識字学習に対して多様な向き合い方を許容できる識字教育論の構築に向けた基礎的な作業を終えることができた。継続的な参加的研究を通して申請者は、識字と「解放」とをきり結んで捉える従来の識字教育論(以下、「解放の識字論」)では、正当に評価されない学習のあり方や学習者がいることを目の当たりにしてきた。この方法論で識字学習者の語りを読み解いていくことで、新たな学習者理解が拓けてくるだろう。また、「自己とコミュニティの新たな物語の再構築過程」として識字実践を捉えることで、「解放の識字論」との理論的接合も可能になる。そして、なによりも、高齢化が進む識字の現場において、「書くことにこだわると出口が見えなくなる」という切実かつ喫緊の課題を解決する実践的切り口を提供することができるだろう。本研究は4年計画で進められる。1年目である本年度は、申請者のこれまでの研究成果を叩き台に、国内外の関連する理論研究の知見を吸収しつつ、暫定的な理論を確定していった。その成果を積極的に発信し、意見交換に努めた。とくに、フランスの成人教育学の第一人者であるピノー氏を招いてのライフストーリーに関心のある若手社会教育研究者の研究会での意見交換は理論的課題への有意義な示唆を得ることができた。なお、当日のレジュメを加筆修正したものをフランスで刊行する予定となった。以上のように、計画通り研究は遂行されている。2年目である本年度は分析ツールとしての物語論に関する理論的検討をふまえて、開発したその研究方法論で、実際のデータを分析した。成果は大きく4つである。第一に、本科研の成果を博士論文としてまとめている。とくに序章部の方法論の検討部は、今後、識字教育研究のみならず社会教育研究においても一石を投じるチャレンジングなものとなろう。教育・社会・個人の関係構造の再創造という社会教育学研究の伝統的方法意識に立ち戻り、「解放の識字」論を展開できないかを構想中である。政治学者の齋藤純一や栗原彬などの議論と現代社会教育学を牽引する佐藤一子の議論とを交差させながら、親密圏概念を分析視座として導入することを検討している。親密圏として識字教室を描いていくというアイデアは、現場のリアリティを伝えるだけでなく、つぶやきが生まれ、そのつぶやきが共鳴し、<私たち>という主語で教室内外に波及していく様を説得的に描いていくことができよう。第二に、昨年度フランスの研究者を招いて行った研究会での「解放の識字論」を物語論的に再読するという報告を加筆修正し、フランスのライフストーリーの研究雑誌に寄稿した。第三に、分析ツールとしての物語論を援用した事例分析を試みた。夜間中学校教諭・見城氏の実践分析を行った。第四に、識字教育・成人基礎教育保障にむけたアクション・リサーチを記録した。まだ論文にまでは至っていないが報告書やモノグラフとして蓄積したデータを発表した。

また、「自己とコミュニティの新たな物語の再構築過程」として識字実践を捉えることで、「解放の識字論」との理論的接合も可能になる。そして、なによりも、高齢化が進む識字の現場において、「書くことにこだわると出口が見えなくなる」という切実かつ喫緊の課題を解決する実践的切り口を提供することができるだろう。4ヶ年計画の3年目にあたる本年度は、次の四つを柱に研究を行なった。一つ目は、物語論を基礎に識字教育理論を実践的に論じていく作業である。教室内外に波及する「私たち」ということばがどのように生まれ、働くのかに関して関連領域の成果をふまえつつ検討した。また、学習支援者が実践を語り合うことの意味に関する考察も行った。二つ目は、実際に地元市民と共同して釧路自主夜間中学「くるかい」という識字教育・成人基礎教育の場を組織し、学習支援に携わるなかで、実践と理論の整合性を検証する作業を行った。そうしたアクションリサーチの成果を学会報告し、論文としてまとめている。三つ目は、生活困窮者の学び直し支援のあり様と保障システムに関して検討を行った。四つ目は、これまでの研究成果を体系立てて整理し、博士論文としてまとめる作業に取り組んでいる。本研究の目的は、物語論的観点から識字教育論を構築していくことにある。物語論とは、人びとの間で構成される物語としてのナラティヴを読み解くことで、彼らに現前している世界を理解し、その世界への関与を可能にする方法論である。この方法論で識字学習者の語りを読み解いていくことで、新たな学習者理解が拓けてくるだろう。4ヶ年計画の最終年度にあたる本年度は、主に研究成果の発信と実践への還元を視野に入れて活動を行った。次の3つを柱に研究を行なった。一つ目は、物語論を基礎に識字教育理論を実践的に論じてきたこれまでの成果を実践者と研究者が集う識字研究交流会の場で報告した点である。大阪で開催されたこの研究会は、国際識字10年の最終年度でもあった今年度において、おそらく国内唯一の識字に特化した研究討議の場であった。二つ目は、これまでの筆者の識字や夜間中学に関する研究成果をふまえて、テキストや事典の執筆に協力することである。社会教育・生涯学習に関する事典への「基礎教育」に関する項目の執筆、生涯学習・社会教育のテキストの分担執筆、本研究で深めてきた物語論的アプローチの知見を社会教育職員論に応用し、実践者向けの論稿を執筆した。三つ目は、本科研の成果をふまえつつ、次のテーマにつなげていくための若手研究者の研究交流会に出席し、日本社会教育学会プロジェクト研究「社会教育研究における方法論の検討」の発足に寄与したことである。本年度の柱であった(1)物語論を基礎に識字教育理論を実践的に論じていく作業、(2)識字教育・成人基礎教育のアクションリサーチ、(3)生活困窮者の自立を支えるリテラシーのあり様に関する調査研究、(4)博士論文としてまとめる作業、の4点について予定通り進めることができたから。24年度が最終年度であるため、記入しない。おおむね予定通り進んでいるので、最終年度も同様に進めていきたい。
自然リンパ球の機能制御におけるＴＮＦ受容体型分子群の役割

2型自然リンパ球(以下ILC2)は、呼吸器などの臓器特異的に局在し、呼吸器にアレルギーを惹起するトリガー細胞として注目されている。本研究では、ILC2に発現するGITRに焦点を当てて、ILC2の機能・活性化制御機構の解明を行った。GITR欠損マウスにおいて肺炎症が抑制されたほか、T細胞を欠損するGITR/RAG2二重欠損マウスにおいてもアレルギー性肺炎症が抑制された。したがって、ILC2に発現するGITRが直接的にILC2の活性化に関与することが示唆された。さらに、in vitro解析により、GITRシグナルによるILC2活性化の増強は、主にIL-9を介する機序であることがわかった。自然リンパ球(以下ILC)は、呼吸器、消化管、脂肪組織などの臓器・組織特異的に局在する新たなリンパ球系細胞として発見され、炎症反応を制御することで生体恒常性維持と生体防御に必須の細胞として注目されている。ILCの分化や増殖にサイトカインが重要であることが明らかにされているが、ILCの活性化制御の分子機構はほとんど解明されていない。そこで本研究では、GITR、OX40、CD27およびTRAF5に焦点を当てて、ILC2の機能・活性化制御機構の解明を行う。OX40欠損マウス、GITR欠損マウスおよびOX40リガンド/GITR二重欠損マウスにパパインを鼻腔投与することにより、ILC2依存的なアレルギー性肺炎症を惹起した。その結果、GITR欠損マウスおよび二重欠損マウスにおいて肺炎症が抑制された。したがって、GITRがパパイン誘導アレルギー性肺炎症に重要な役割を果たし、一方、そのファミリー分子であるOX40は同炎症には関与しないことが示唆された。以前より、ILC2にGITRが発現することが知られていたことから、GITRがILC2の活性化に直接に関与する可能性を考え、ILC2を試験管内でIL-33およびGITRアゴニスト抗体で刺激した。その結果、IL-33刺激により誘導されるIL-5およびIL-13の産生が、GITRアゴニストの投与によって、著しく増強された。この結果は、ILC2の活性化にGITRシグナルが関与することを示唆する。しかし、GITRはILC2のみならずT細胞にも発現しているため、生体内のGITRの機能を明らかにするためにはT細胞とILC2を分けて考える必要がある。次年度には、この課題を解決しながらGITRシグナルのILC2の活性化機構の解明を行う予定である。GITRがILC2の活性化に直接関与することを証明した。この結果はILC2の活性化制御機構を解明する上で重要な知見である。そこで本研究では、GITR、OX40、CD27およびTRAF5に焦点を当てて、ILC2の機能・活性化制御機構の解明を行うこととした。GITR欠損マウスに、パパイン鼻腔投与あるいはIL-33気管内投与を行うことにより、ILC2依存的なアレルギー性肺炎症を惹起した。その結果、GITR欠損マウスにおいて肺炎症が抑制された。以前より、GITRがT細胞とILC2に発現することが知られていたことから、GITRがILC2の活性化に直接に関与する可能性を考え、T細胞を欠損するGITR/RAG2二重欠損マウスにIL-33の気管内投与を行った。その結果、同マウスにおいてもアレルギー性肺炎症が抑制された。さらに、ILC2を試験管内でIL-33およびGITRアゴニスト抗体で刺激した。その結果、IL-33刺激により誘導されるIL-5、IL-9およびIL-13の産生が、GITRアゴニストの投与によって著しく増強された。IL-5とIL-13のGITRアゴニストによる産生増加が抗IL-9抗体添加で強く減弱すること、GITRアゴニストによるIL-9産生増強が、IL-5とIL-13のシグナルを抑制しても、有意な影響は受けないことから、GITRシグナルによるILC2活性化の増強は、主にIL-9を介する機序であることがわかった。順調に進捗しているの当初の計画どおりに研究を進行する。免疫学
肺癌における低酸素トレーサーFAZA集積領域の臨床腫瘍生物学的解析

本研究では肺癌切除例において、第二世代低酸素トレーサーFAZAの集積部位を切除標本における病理組織所見と対比することにより、その集積部位の腫瘍生物学的意義を問うことを目標とする。本年度は臨床研究として肺癌切除例23例を解析した。これらの症例では全例でFDG-PETとFAZA-PETが施行された後、切除が行われた。切除標本には手術中、切除直後の頭側にマークを付け、オリエンテーションを確保した後に固定を行った。標本切り出しの際にはそのマークを確認し、CT断面で標本を作成した。術式は肺葉切除14例、肺区域切除6例、肺全摘術3例であった。腫瘍径は1.86.0cm、平均3.7cm、組織型は扁平上皮癌9例、腺癌13例、腺扁平上皮癌1例であった。リンパ節転移は8例に見られた。FAZA投与による有害事象は1例もなかった。腫瘍以外の部分では肝臓に比較的高頻度に集積が見られた。これはFDGと同様な所見であった。その他の正常組織には明らかに集積する傾向は見られなかった。この意味でFAZAの臨床応用、臨床的評価は可能であると考えられた。FAZAの集積は様々な分布を示したが、腫瘍中心部よりは辺縁部に集積が見られる傾向が考えられた。腫瘍血流による補正を検討する必要がある可能性も考えられた。集積強度については対側肺を基準として解析中であるが、さらなる最適化が必要かもしれない。また大半の症例でFDGとは異なる範囲に集積が見られる点が特徴的であった。糖代謝を見ていると考えられるFDGとは全く異なる機序による腫瘍細胞あるいは腫瘍組織への選択的集積の可能性が考えられた。FAZAならびにFDG集積画像と組織切片を対比させながら、現在組織所見を解析中である。またリンパ節転移の有無における集積分布、集積強度も解析中である。この臨床研究に先立ち我々が行った動物実験では慢性低酸素下に培養された癌細胞がnormoxiaで培養された細胞に比べて浸潤能が増大する可能性が示唆された。本年度は、我々の確立した慢性低酸素モデルを用いた肺癌細胞株の検討を行った。肺癌細胞株はPC9、NCI-H292、NCI-H441を用いた。先ず各細胞株のNOGマウスへの移植可能性を確認した。PC9とNCI-H292は均一な発育速度を示した。NCI-H441やや遅い傾向が見られた。我々は慢性低酸素モデルの癌腫特異性は少ないと想定しており、大腸癌株HCT116と同様の結果を想定している。今後PC9、NCI-H292、NCI-H441を用いて低酸素培養条件の最適化を計る。これにより臨床標本における結果を動物実験にフィードバックすることが可能となり本動物実験モデルの腫瘍生物学的意義を確認することができる。また、臨床検体を用いて測定する免疫染色項目に関する基礎的データを動物実験より取得する。EMTのマーカーや糖代謝に関与するマーカーの有意な変化が見られた。これらのマーカーを臨床検体においても検討し、FAZAおよびFDG集積部位との相関を検討することにより、FAZAの臨床的意義ならびに固形癌における低酸素領域の腫瘍生物学的検討をbench to bedsideに行うことができる。
ヒトD_3ドーパミン受容体アイソフォームの発現調節および細胞内情報伝達機構

平成7年度の研究において、ヒト神経芽細胞腫SY-5Y細胞に発現しているD_3DA受容体mRNAに由来するRT-PCR産物の他に、約100-bp分子量の小さいRT-PCR断片を得た。この分子量の小さな断片は、既報のヒトD_3DA受容体cDNAの構造と比較すると98-ntの欠失を伴っていた。この欠失D_3DAは実際にタンパク質に翻訳されているものと推定されるが、DA受容体としてのリガンド結合能を有しておらず、その機能は明らかにすることができなかった。ヒトD_3DA受容体mRNAは約8kbであり、その構造を明らかにするには、転写開始点近傍の領域までを含むcDNAが必要であるため、D_3DA受容体を多量に発現しているヒト黒質のポリ(A)^+RNAを基質にRT-PCRを行い、部分cDNAライブラリーを作成、ヒトD_3DA受容体全翻訳領域に相当するcDNA断片をプローブにスクリーニングを試みたが、十分な長さの5'非翻訳領域を含むcDNAクローンは得られなかった。ヒト末梢血白血球より抽出したゲノミックDNAを5種の制限酵素で切断後、アンカーオリゴヌクレオチドを接続、ヒトD_3DA受容体遺伝子翻訳開始点付近の配列を基に作製した2種のプライマーとアンカーオリゴヌクレオチドに対するプライマーを用いたlong PCR法に準じた方法により、ヒトD_3DA受容体遺伝子5'非翻訳領域を増幅することを試みたが、解析に十分な長さの5'非翻訳領域断片を得ることができなかった。Long PCR反応条件の最適化を試みたが、おそらく5'非翻訳領域のGC含有量が多いためか、十分な長さの断片は得られなかった。そこで、ヒトD_3DA受容体全翻訳領域に相当するcDNA断片をプローブに用い、ヒロ胎盤ゲノムDNAライブラリーから、ヒトD_3DA受容体遺伝子5'非翻訳領域を含むファージクローンを得、現在その構造を解析中である。ラット、マウス、ヒトD_3ドーパミン(DA)受容体cDNAの構造、およびD_2DA受容体における選択的スプライシング部位を考慮し、ヒトD_3DA受容体第3細胞質内ループのアミノ端側およびカルボキシル基末端部位に特異的な順、逆プライマーを作成し、ヒト神経芽細胞腫SY-5Y細胞の全RAMを基質に、逆転写・ポリメラーゼ連鎖(RT-PCR)反応を行った。部分的にGC含有量が多い領域が存在するためか、通常PCR反応に用いられるTaq DNAポリメラーゼでは、RT-PCR産物が得難かった。そこで、より耐熱性のPfu DNAポリメラーゼを用い、DNA変性温度を98°Cに上昇させることにより、特異的なRT-PCR産物を得ることが可能となった。RT-PCR産物をアガロース電気泳動法により分離すると、予想されたヒトD_3DA受容体mRNAに由来するRT-PCR断片の他に、約100-bp分子量の小さいRT-PCR断片の、2つの断片を得た。これらの断片をゲルから、抽出し、塩基配列を決定すると、分子量の大きな断片は、既報のヒトD_3DA受容体のcDNAの構造に一致していたが、分子量の小さな断片は、既報のヒトD_3DA受容体cDNAの構造と比較すると98-ntの欠失を伴っていた。この欠失D_3DAと精神分裂病などの疾患との関連性は不明である。ヒトゲノミックDNAを5種の制限酵素で切断後、アンカーオリゴヌクレオチドを接続、ヒトD_3DA翻訳開始点付近の配列を基に作製した2種のプライマーとアンカーオリゴヌクレオチドに対するプライマーを用いたlong PCR法に準じた方法により、ヒトD_3DA受容体遺伝子5'非翻訳領域を増幅し、現在その構造解析を行っている。

そこで、ヒトD_3DA受容体全翻訳領域に相当するcDNA断片をプローブに用い、ヒロ胎盤ゲノムDNAライブラリーから、ヒトD_3DA受容体遺伝子5'非翻訳領域を含むファージクローンを得、現在その構造を解析中である。