hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
転写因子NF-kBを介した甲状腺刺激ホルモン(TSH)作用に関する研究

1.甲状腺癌におけるスーパーオキシドディスムターゼ(SOD)およびグルタチオンペルオキシダーゼ(GPX)発現に関する研究外科的に摘出された甲状腺癌(乳頭癌13例、未分化癌1例)及びその付随正常組織から抽出したRNAを用い、ノーザン法によりMn-SOD,GPXmRNAの発現を検討した。Mn-SODmRNAの正常組織における発現量に対する比腫瘍組織の発現量の比(T/N ratio)は、リンパ節転移陽性群で有意の高値を示した。Cu-Zn-SOD,GPXmRNAの発現には差が無かった。腺外浸潤とMn-SOD,GPXmRNAのT/N ratioにも有意差は認められなかった。甲状腺癌組織におけるMn-SODmRNAの発現増加は、免疫担当細胞により分泌されるTNF-αなどのサイトカインによる殺細胞効果を減弱させ、リンパ節転移を起こし易くすると考えられる。NF-kBは、TNFαなどにより活性化され、IL-6などの発現を促進している。一方、TSHは、自己免疫性甲状腺患者の病態を増悪させることが示唆されている。そこで、TNFαによるNF-kBの活性化にTSHがどの様に関与するかを検討した。TNFα非刺激では、NF-kBの活性化は認められず、TSH存在下ではTNFα刺激によりp50ホモダイマーおよびp50-p65ヘテロダイマーが誘導された。しかしながらTSH非存在下ではTNFαによりp50ホモダイマーのみが誘導された。NF-kBのp50は、DNA結合能を有するが、転写活性ドメインを欠き、p50ホモダイマーは主に転写を抑制するのに対し、p65は転写活性ドメインを有し、p50-p65ヘテロダイマーは転写に促進的に作用するとされている。従って、自己免疫性甲状腺疾患におけるTSHの抑制は、TNFαによる甲状腺濾胞細胞の活性型NF-kBの誘導を抑制することにより病態を改善することが示唆された。3.チオレドキシン(TRX)、レドックスファクター-1(Ref-1)のTSHによる発現調節NF-kBの活性化には、TRX、Ref-1などの細胞内還元酵素による還元が必要とされることが知られている。TSHによるTNFαの作用修飾が認められたため、これらの還元酵素がTSHによりどの様に変動するかを検討した。その結果、TSHがTRX、Ref-1の発現を誘導することが明らかにされた。(1)甲状腺癌におけるスーパーオキサイドジスムターゼ(SOD)発現に関する検討外科的に摘出された甲状腺癌(乳頭癌13例、未分化癌1例)およびその付随正常組織からtotal RNAを抽出し、ノーザンブロット解析によりMn-SOD mRNAの発現を検討した。mRNAのintegrityおよび発現量を比較するため、house keeping geneであるglyceraldehyde 3-phosphate dehydrogenase (GAPDH) mRNAを用いた。GAPDH mRNA発現量で補正したMn-SOD mRNA発現量は腫瘍組織の正常組織に対する比(T/N ratio)は、リンパ節転移陽性群で有意差は無いものの増加傾向が認められた。TSH抑制療法の有無では、一定の傾向は認められなかった。腫瘍免疫において活性酸素は、重要な役割を果たしている。

リンパ節転移を認める甲状腺癌組織にMn-SOD mRNAの発現が増加している傾向は、腫瘍細胞が免疫担当細胞からの攻撃を効率的に回避する機構とも考えられ、今後症例を多くして検討を進めたい。ラット甲状腺瀘胞細胞由来の細胞株FRTL-5を用い、腫瘍壊死因子(Tumor necrosis factor alpha=TNFα)によるNF-kB活性化機構を検討した。Mn-SOD、IL-6などNF-kBにより転写の促進を受ける遺伝子の発現がFRTL-5細胞へのTNFαの添加により著しく増加した。この際、ゲルシフト法によりNF-kBの活性化機構を検討すると、TNFαがNF-kBの活性化を促進することが明らかとなった。それぞれのNF-kBサブユニットに対する特異抗体を用いて検討すると、TNFαがp65とp50のヘテロダイマー形成を促進することが明らかにされた。TNFαは、主にNF-κBの活性化によりIL-6などの発現を促進している。一方、TSHは、自己免疫性甲状腺疾患の病態を増悪させることが示唆されている。そこで、TNFαによるNF-κBの活性化にTSHがどの様に関与するかを検討した。TNFα非刺激ではIL-6mRNAの発現は認められなかった。TNFαによるIL-6mRNAの発現誘導は、TSH存在下でのみ認められた。TNFα非刺激では、NF-κBの活性化は認められず、TSH存在下ではTNFα刺激によりp50ホモダイマーおよびp50-p65ヘテロダイマーが誘導された。しかしながらTSH非存在下ではp50ホモダイマーのみが誘導された。NK-κBのp50は、DNA結合能を有するが、転写活性ドメインを欠き、p50ホモダイマーは主に転写を抑制するのに対し、p65は転写活性ドメインを有し、p50-p65ヘテロダイマーは転写に促進的に作用するとされている。これらの報告は、TNFαによるIL-6mRNAの発現誘導がTSH存在下のみで観察される今回の成績と合致する。自己免疫性甲状腺疾患におけるTSHの抑制は、TNFαによる甲状腺濾胞細胞の活性型NF-κBの誘導を抑制することにより病態を改善することが示唆された。2.甲状腺癌におけるスーパーオキシドディスムターゼ(SOD)およびグルタチオンペルオキシダーゼ(GPX)発現に関する研究外科的に摘出された甲状腺癌(乳頭癌13例、未分化癌1例)およびその付随正常組織からtotal RNAを抽出し、ノーザンブロット解析によりMn-SOD,GPX mRNAの発現を検討した。Mn-SOD mRNAの正常組織における発現量に対する比腫瘍組織の発現量の比(T/N ratio)は、リンパ節転移陽性群で有意の増加が認められた。GPX mRNAの発現には差が認められなかった。腺外浸潤とMn-SOD,GPX mRNAのT/N ratio検討ではいずれも有意差を認めず、TSH抑制療法の有無でも、一定の傾向は認められなかった。リンパ節転移を認める甲状腺癌組織にMn-SOD mRNAの発現が増加していることは、腫瘍細胞が免疫担当細胞からの攻撃を効率的に回避する機構の一部と考えられた。
非肥満型脂肪肝と関連病態悪化における免疫系の関与

先行の研究で一次胆汁酸であるコール酸の摂取が脂肪肝を誘導し、未病モデルであることを見出した。この病態モデルでの脂肪肝は1st hit直後の状態で、2nd hit前の単純性脂肪肝であると考えられる。しかしながら、肝臓や血中での炎症反応は見られず、消化管透過性の亢進が確認された。そこで、コール酸負荷による脂肪肝発症メカニズムを調べるため、LPSを2nd hitしてコール酸摂取ラットに投与し、肝炎での悪化を調べた。コール酸を10週間摂取したFischer344ラットにLPSを皮下に投与、投与6時間後に解剖を行った。その結果、先行研究においてWKAH系統のラットで見られた透過性の亢進は見られなかった。肝臓及び消化管内容物における胆汁酸組成が系統間で異なることより、消化管透過性に影響を及ぼすことが考えられる。一方で肝障害マーカーがコール酸群でさらに増加したことから、コール酸負荷が肝障害の悪化させることが明らかになった。また、そのメカニズムを調べるため、肝臓での炎症関連遺伝子や繊維化マーカの発現を分析した。しかし、LPS刺激でのコール酸摂取による炎症や繊維化関連遺伝子発現には有意差が見られなかった。LPSによる炎症反応に自然免疫細胞であるマクロファージが関与していることから、マクロファージの機能に関与する遺伝子を分析した結果、群間差は見られなかった。本研究では0.05%コール酸摂取による単純性脂肪肝の病態モデルで、LPS刺激による肝障害の悪化が示唆された。高脂肪食の摂取は胆汁酸の分泌を促進させ、加齢により一次胆汁酸であるコール酸の割合が増加する。また、高脂肪食による体内でのLPS濃度の増加や加齢による免疫システムの変化が知られている。したがって、胆汁酸摂取による単純性脂肪肝の発症が「未病」状態であることを強く示唆するだけでなく、炎症や代謝疾患の発症や悪化に繋がる可能性も示している。29年度が最終年度であるため、記入しない。先行研究において、0.05%コール酸添加飼料摂取ラットにおいて発症した非肥満型脂肪肝では、肝臓での炎症性サイトカインの発現増加や血中での炎症性サイトカイン濃度増加が全く観察されなかった。しかしながら、消化管透過性の亢進が確認された。脂肪肝発症のメカニズムとして、肝脂肪蓄積が生じた後に炎症や酸化ストレス亢進などが症状を悪化させるという「two hit説」が提唱されている。我々が見いだしたコール酸誘導性脂肪肝では酸化ストレス、炎症や繊維化などの2nd hitに関わる因子は作動していないことから、このコール酸添加飼料摂取での脂肪肝は1st hit直後の状態で、2nd hitを受ける前の単純性脂肪肝の状態と考えられる。そこで本研究では、2nd hitとしてリポ多糖(LPS)を投与した場合のコール酸摂取における炎症の状態を評価した。病態変化を評価した。Fischer344ラットにAIN-93Gに準拠した飼料を対照飼料、あるいはスクロースの一部を0.05%コール酸に置き換えたコール酸添加飼料のいずれかを与えた。試験飼料摂取から9週間後にin vivoでの消化管透過性を評価するため非吸収性マーカーであるCr-EDTAを経口投与し、翌日までの尿中Cr排泄を消化管透過性の指標とした。10週間後にはLPSを皮下に投与、投与6時間後に解剖を行った。これまでに確立した代謝疾患の未病モデルであるコール酸摂取ラットでは、単純性脂肪肝を発症するものの、肝臓での炎症や繊維化などの悪化した病態は観察されていなかった。そこで、この状態からの肝疾患の悪化が生じるかを観察するため、リポ多糖を投与する実験を行なったところ、コール酸を摂取した場合にのみ、肝傷害マーカーであるAST・ALTが著しく増加することを見出した。この結果は、コール酸摂取ラットが、明確な疾患は見られないもののその後悪性化する可能性が高い、いわゆる「未病」状態であることを強く示唆している。加齢や高脂肪食摂取で生じる胆汁酸代謝の軽微な変化が代謝疾患の温床になることを示す極めて重要な知見である。この研究をさらに推し進めることで、未病から疾患に至る経路の解明、ひいてはその予防・治療に至る道筋が解明されると期待される。

LPSによる炎症反応に自然免疫細胞であるマクロファージが関与していることから、マクロファージの機能に関与する遺伝子を分析した結果、群間差は見られなかった。本研究では0.05%コール酸摂取による単純性脂肪肝の病態モデルで、LPS刺激による肝障害の悪化が示唆された。高脂肪食の摂取は胆汁酸の分泌を促進させ、加齢により一次胆汁酸であるコール酸の割合が増加する。また、高脂肪食による体内でのLPS濃度の増加や加齢による免疫システムの変化が知られている。したがって、胆汁酸摂取による単純性脂肪肝の発症が「未病」状態であることを強く示唆するだけでなく、炎症や代謝疾患の発症や悪化に繋がる可能性も示している。先行研究においてWKAH系統のラットで観察された透過性の亢進は見られなかった。Fischer344とWKAHでの肝臓及び消化管内容物における胆汁酸組成の網羅的解析により、系統間での胆汁酸代謝が大きく異なることを見出しており、このことが消化管透過性に影響を及ぼすことが示唆された。一方、LPS投与により肝障害マーカーであるASL・ALTがコール酸摂取ラットでのみ著明に増大した。この結果はコール酸の摂取が肝臓での炎症を著しく悪化させることを示唆している。しかし、炎症性サイトカインであるIL-6の血中濃度に群間差は観察されなかった。また、血中アディポネクチン濃度もコール酸摂取により減少し、さらにLPS添加により有意に減少した。現在、そのメカニズムを明らかにするため、血中パラメータを含め肝臓での炎症関連遺伝子発現や繊維化の状態を分析している。29年度が最終年度であるため、記入しない。
パルス磁場を用いた生体膜機能ダイナミクスの解明

"強い磁場は身体にどんな影響を与えるか"我々は複合機能を持つ生体細胞の素機能への磁場効果を考察し,実際の生体への影響を予測することを試みた。パルスマグネットを用いた動力学的な挙動の解明は,従来にはないまったく新しいアプローチといえ,研究の遂行にあたって,パルスマグネットシステムの開発と,視覚的,光学的,および電気的な測定を行うための測定装置を組み立てる必要があった。市販のキャパシタやダイオードなどの汎用電子部品を用い,これまでに20T以上を発生させる強磁場発生システムを作成することに成功した。本課題ではベシクルや細胞モデルのような機能分子の形状変化の詳細をダイナミクスの観点から議論する。実験にはパルス磁石(PM)を用いるが,従来のPMは,極低温での使用と大口径確保に重点が置かれ,化学実験には適さない部分が多い。そこで,平成20年度は目的に合わせ,中で光学測定や電気的測定ができる空間を確保しつつ,30T強の磁場強度が得られるよう,コイル形状やコンデンサ容量を見直し,システム全体を新規設計,開発を進めた。30Tをφ8mmの空間に発生させるには,約2kJのエネルギーが必要と予想できる。そこで,キャパシタは耐圧250V,10mFのアルミ電解コンデンサを10台並列に接続させ100mFのバンクを形成し,DC200Vの充電で放電エネルギー2kJを得た。コイルはφ8のFRP製の筒にφ1.5の銅線を片側20×15mmの範囲で巻いて作成した。このインダクタンス(L)と抵抗(R)はそれぞれ132μH, 173mΩであった。得られた充電エネルギーをこのコイルに瞬間的に放電すると,200V充電時,10Tの磁場が得られた。磁場発生時間が,理想の10倍以上であったことからも,大きすぎるキャパシタ容量が当初の目標を達成できなかった原因とみられる。平成21年度内の目的達成のため,低容量,高圧充電化を進める。平成20年度はPMのシステム構築に時間を費やしたため,膜構造のパルス磁場効果については具体的に検討していない。しかし,イオン包接能と界面活性,分子集合体形成能などの複合機能を持つクラウン界面活性剤,N,N'-didecyl-diaza-18-crown-6-ether(22DD)について,包摂能やイオン透過能を静磁場中で評価したところ,カリウムを中心として,イオン透過能に磁場効果がある可能性を見出した。平成21年度は研究実施計画通り,パルス磁場中でのダイナミクス解析を電気化学的に評価する。本研究ではパルス強磁場発生システムの構築し,それにより生体膜機能分子への磁場効果のダイナミクスを解明することを目指した。助成を受けた2年間でシステムの構築とそれを用いた実験を行った。以下に詳細を記す。(1)パルス強磁場発生システムの構築:本研究で使用する強磁場発生システムを,市販のアルミ電解キャパシタや電子部品等を用いて作成した。キャパシタバンクは10mFで,最高5000Jを蓄電できる。2100Jの充電エネルギーを瞬間的にコイル(L=84.1μH,R=96.4mΩ)に放電し,20T(数msのパルス幅)以上の磁場発生が確認した。なお,コイルは直径φ50mm,コイル長20mm,磁場発生空間φ8mmである。システム全体が可動なため,各種装置に取り付けて使用ができる。従来より,固体物理の分野で使われているシステムと比較し,大幅な小型化と汎用性,安価な制作費を実現した。(2)生体機能分子への磁場の影響:(1)で作成したシステムを用い,生体膜モデルとして知られるリポソーム(DODACベシクル)や大腸菌にパルス磁場(数msのパルス幅)を印加した。その結果,ベシクルでは融合による粒径分布のシフトを,また大腸菌では菌株の死滅によるコロニー成長の抑制が観測された。以上の磁場効果は磁場印加後に磁場外で観測したものであるが,現在,特にベシクル粒径について磁場中でダイナミクスを観測できるシステムを継続して構築している。一方,錯形成能およびイオン透過能を持つジアザクラウン界面活性剤の分子集合体(黒膜)で,イオン流速への磁場効果を観測した。
数値解析ソフトウェアの研究と開発

1「常微分方程式solverの研究と開発」についてStiffな常微分方程式の初期値問題を解くための,5段5位のA安定な単対角陰的一般法が存在することを証明した。また特異2階常微分方程式の初期値問題の数値解法を出発させるためのスタ-タ-を開発した。打切り誤差の見積りと補間ができる位数4,5,6の2段法,および非ステップ点を1つもつ位数5,6,7の2段法の存在を示した。単対角陰的一段法を微分代数方程式の数値解法に応用することが今後の課題である。2「代数方程式Solverの研究と開発」について非線形方程式系の非単純分岐点での分枝が存在するための条件を陰関数定理を用いて可成り詳しく求めてあり、攝動の下で分枝がどのように変化するかを調べた。また2重および3重変わり点の位置を求める方法を開発した。分岐点の位置を求める方法,分岐を求める方法の研究が今後の課題である。3「実験計画パッケ-ジのの研究と開発」について非2値効率釣合い型実験計画の特徴づけ、および組分け型不完備ブロック実験計画の特徴づけがえられ,ある種の実験計画の非存在性もあわせて示された。4「数字教育ソフトウェアの研究と開発」について2桁の2数の加算能力の診断をするためのプログラムを作成した。誤答の原因を,1桁の2数の加算の誤りによるものが,繰り上りのミスによるものかに分けて判断し,2数の順序を入れかえるなどして,間違え方のくせを見つける工夫をしている。減算についても同じ型のプログラムを作成した。乗除算についてもこの種のプログラムを作成する予定である。1.「常微分方程式Solverの研究と開発」についてStiffな常微分方程式の初期値問題を解くための,5段5位のA安定な単対角陰的一段法が存在することを証明した。また特異2階常微分方程式の初期値間題の数値解法を出発させるためのスタ-タ-を開発した。打切り誤差の見積りと補問ができる位数4,5,6の2段式,および非ステップ点を1つもつ位数5,6,7の2段法の存在を示した。これらの方法の性能の比較検討をすることは今後の課題である。2.「代数方程式Solverの研究と開発」について非線形方程式系の分岐点での分枝の存在を示す方法が,Bartleの陰関数定理を適用することによって統一できることを指摘し,攝動の下で分枝がどのように変化するかを調べた。分岐点の位置を求める方法,分枝を求める方法の研究が今後の課題である。3.「実験計画パッケ-ジの研究と開発」について非2値効率釣合い型実験計画の特徴づけ、および組分け型不完備ブロック実験計画の特徴づけがえられ,ある種の実験計画の非存在性もあわせて示された。4.「数学教育ソフトウェアの研究と開発」について2桁の2数の加算能力の診断をするためのプログラムを作成した.誤答の原因を,1桁の2数の加算の誤りによるものが,繰り上りのミスによるものかに分けて判断し,2数の順序を入れかえるなどして,間違え方のくせを見つける工夫をしている。1「常微分方程式Solverの研究と開発」についてStiffな常微分方程式の初期値問題を数的に解く方法では.打切り誤差の見積りによるステップ幅の調節と補問ができることが要求されている。今回は打切り誤差の見積りと補間ができる位数4,5,6の2段法.および非ステップ点を1つもつ位数5,6,7の2段法の存在を示した。これらの方法の有効性を数値実験によって確めること,

および単対角陰的一段法を微分代数方程式の数値解法に応用することが今後の課題である。2「代数方程式Solverの研究と開発」について非線形方程式系の非単純分岐点での分枝が存在するための条件を陰間数定理を用いて可成り詳しく求めてあり、攝動の下で分枝がどのように変化するかを調べた。とくに攝動パラメ-タεが0に近づいたとき連続的に解が変化する場合が把握できるようになった。分岐点の位置を求める方法.分枝を求める方法の研究が今後の課題である。3「実験計画パッケ-ジの研究と開発」について半正則および正則実験計画の特徴づけかえられ.ある種の実験計画の非存性もあわせて示された。またある種のブロック計画の能率因子についての結果がえられている。4「数学教育ソフトウエアの研究と開発」について2桁の2数の減算能力の診断をするためのプログラムを作成した。誤答の原因を,1桁の2数の加算の誤りによるものか,繰り上りのミスによるものかに分けて判断し,2数の順序を入れかえるなどして,間違え方のくせを見つける工夫をしている。乗除算についてもこの種のプログラムを作成する予定である。
フォスフォリパーゼCを抑制するGタンパク質の特性

きわめて相同性の高い一対のGタンパク質(GL1とGL2)が、同一の受容体(メタボトロピック・グルタミン酸受容体)によって活性化されながら、一方(GL2)はイノシトールリン脂質代謝反応を促進するのに対し、他方(GL2)は抑制すると言う現象をわれわれはすでに報告した。本研究では、この現象について、それがこれらのGタンパク質のどのような構造に由来してどのような仕組みで起こるのかを、キメラGタンパク質やミュータントGタンパク質の作製等の分子生物学的方法とアフリカツメガエル卵母細胞発現系を用いた電気生理学的方法を組み合わせて解明することを目的とする。本年度は、GL1とGL2のキメラGタンパク質を10種類作製し、これらのキメラ分子の整理活性を電気生理学的方法で検討した。これまでのところ、促進/抑制を決める上で重要な意味を持つ領域がある程度分かってきた。すなわち、解析結果の最も顕著な特徴は、一次構造上アミノ末端側約3分の1がGL2由来の場合はキメラ分子もGL2の特性を表わしイノシトールリン脂質代謝反応を促進するのに対し、この領域がGL1由来のキメラでは反応が抑制される、と言う点であった。このことは、これらのGタンパク質がエフェクターであるフォスフォリパーゼCと作用する上で、相互作用の様式(促進/抑制)を決定するのに重要なのはアミノ末端側約3分の1であることを強く示唆しており、従来Gタンパク質とアデニル酸シクラーゼの相互作用で重要なのはカルボキシル末端側であると言われてきたのとは必ずしも一致せず、エフェクターによって相互作用の様式が異なることを意味しているものと考えられる。
算数・数学学習時における教師と学習者双方の脳生理学的特徴の解明

本研究の目的は,学習時における学習者と教師の脳内生体情報の特徴を明らかにすることである。研究の結果,下記の4点が明らかになった。1)難度の違いが,学習者のヘモグロビン濃度変化に影響を及ぼすこと, 2)教師役のヘモグロビン濃度が,学習者役のヘモグロビン濃度の増加と類似する感情移入型と,教師役のそれが増加しない客観型が存在すること, 3)ヒント提示前後の分析より,学習者役は増加から均衡,教師役は均衡から増加の変化が見られること, 4)脳活動データは,教師が学習者への適切な関与方法を検討する上での有効なデータとなること。本研究は,学習時における学習者と教師の双方について,脳内生体情報の計測・分析をもとにその特徴を明らかにするとともに,生理学的データをもとに学習者の理解を誘発する有効な教育方法のあり方を検証することを目的としている。本年度は,実験課題の開発を主目的とし,教師役(解答把握済み)と学習者役(解答未把握)が相互に交流する過程で,安定的に解法に至る実験課題の構築を目指した。大学生9名を被験者として,3種類の規則性のある数列の実験課題(難度:低・中・高)を交互に提示する方法を用いて実験を行った。その結果,9名とも開始直後は難度の低い課題は容易に解答し,難度の中程度の課題は中程度の時間で解答し,難度の高い課題は未解答となった。その後,ヒント提示などを取り入れた実験課題を繰り返すことで,難度の高い課題についても規則を発見し解答に至るようになった。また,難度が高い課題の規則発見に伴い,難度が中程度の課題の規則の確証が不安定になり,正答率が下がるという「負の学習効果の転移」現象も確認された。今年度は,ヒントなどにより理解する過程を安定的に検出することが可能な実験課題の開発が主たる目的であったが,実験に際しては行動観察に加え脳活動(ヘモグロビン濃度)計測を行った。計測の結果,難度の低い課題では,ヘモグロビン濃度が全体を通して上昇しないこと,難度の高い課題では,最初,ヘモグロビン濃度が上昇するが,規則性の発見後は急速に下降すること,そして,難度の中程度の課題では,最初から最後まで,中程度の上昇が続くということが明らかになった。このように,理解に至る過程の学習者役側のヘモグロビン濃度変化の特徴を明らかにすることができた。次年度は,同様の実験課題を用いて,ヒント提示を教師役側が行い,その際の教師役側のヘモグロビン濃度変化の特徴を,学習者役側データとの照合のもと,明らかにすることを計画している。本年度は,学習者役(解答未把握)と教師役(解答把握済み)の双方の脳活動データを同時計測し,教授-学習過程における脳活動データの特徴の分析を行った。除法虫食い算問題を実験課題として,学習者役は問題解決に取り組み,教師役は学習者役の解答進行状況に応じて,ヒント(解答の一部,6回分)を順に学習者役の前にあるディスプレイ画面にボタン操作で表示するようにした。大学生14名の被験者(学習者役7名,教師役7名)に対して,実験課題3問を制限時間120秒間(各問題)として実施した。行動観察,事後のアンケート調査,及び脳活動(ヘモグロビン濃度)計測実験結果より,学習者役と教師役の脳活動は課題遂行の状況に応じて連動して変化することが明らかになった。学習者役が課題解決の方略未獲得の時間帯では,学習者役のヘモグロビン濃度が上昇し,それに連動する形で少し遅れて教師役のヘモグロビン濃度が上昇した。また上昇の度合いは,概ね学習者役の上昇の度合いに比例した。一方,課題解決の方略獲得後には学習者役と教師役の双方のヘモグロビン濃度の上昇が抑えられるようになった。学習者役の解答進捗状況(理解の度合い)に応じて,教師役が「どのタイミング(120秒内)」に「どれだけの分量(6回分)」の支援(ヒント提示)を行うかを判断する時間帯に,教師役の被験者の脳活動が賦活するということが明らかになった。このことは,学習者の理解の状況を適切に分析し,支援の可否を判断することが,教師の重要な資質に関わることを示唆するデータであると考えられる。本研究は,学習時における学習者と教師双方の脳内生体情報の計測・分析をもとに,その特徴を明らかにするとともに,学習者の理解・発見を誘発する有効な指導方法を検討することを目的としている。

最終年次の本年度は,昨年度までに計測した学習者役(解答未把握)と教師役(解答把握済み)の双方の脳活動データに,本年度計測分を新たに加え,検討を行った。除法虫食い算問題を実験課題として,学習者役は問題解決に取り組み,教師役は学習者役の解答進行状況に応じて,ヒント(解答の一部,6回分)を順に学習者役の前にあるディスプレイ画面にボタン操作で表示するようにした。14組の被験者(学習者役14名,教師役14名,計28名)に対して,実験課題3問を制限時間120秒間(各問題)として実施した。データ分析に際しては,これまで実施してきた課題遂行時における脳活動の全体形状の比較と並行して,ヒント提示時前後各5秒間(計10秒間)の局所形状の分析を新たに行った。その結果,次の2点が明らかになった。一つ目は,全体形状分析より,課題解決に伴う学習者役のヘモグロビン濃度増加に呼応して,教師役のヘモグロビン濃度が増加する群と,教師役のそれが増加しない群が存在し,前者は心情移入型教師,後者は客観型教師という特性が見られたことである。二つ目は,局所分析より,前述のいずれの群においても,ヒント提示前後では,学習者役は増加から均衡へ,教師役は均衡から増加へという共通の傾向が見られ,学習者役はヒント提供により心的余裕が,教師役はヒント提示後の効果観察による集中が生じたと予想されたことである。上記2点より,教師役の学習者に対する観察・ヒント提示方針の違いが,ヘモグロビン濃度の全体形状に反映するとともに,ヒント提示前後における学習者と教師の思考特性によるヘモグロビン濃度の局所的変化には,ある一定の傾向があることが明らかになった。
インテリジェントセンサを集積化したマイクロフロー有機光反応システムの開拓

本研究では、フローリアクターを利用した高効率な光反応を達成するとともに、オンタイムで反応結果を解析可能な有機光反応インライン解析システムを開発することを目的としている。これまでの検討から、マイクロリアクター内において意図的に反応に不活性な試薬(窒素や水)を加えて二相系スラグ流を形成させ有機光反応を行うと、単一相系での反応結果に比べて反応がはるかに加速されることを見出している。本年度は、この特異な現象を、使用した有機溶媒、不活性試薬、フロー流路チューブの物理的パラメータとの関連性の観点から解明することを目指した。まず、有機反応相の溶媒と、反応不活性相試薬やフロー流路チューブとの間の屈折率差が大きいほど反応効率が大きく向上することが判明した。この屈折率差により、照射した光が部分的に有機反応相内に閉じ込められる作用が影響しているものと考察した。また、反応相の有機溶媒の粘性が高いほど、反応効率の向上度が低くなり、有機反応相内での内部高速混合も反応効率の向上の要因の一つであることを明らかにした。一方、ハイスピード動画カメラ撮影による二相系スラグ流の流動の様子を観察したが、不活性相とフロー流路チューブの間に有機反応相薄膜の形成は観測されなかった。加えて、本研究では、反応成績をインラインで解析するために、CMOSインテリジェントセンサを集積化したマイクロフローリアクターシステムの構築を目指しており、本年度は、フローセルに装着した光学系の構成の改善を行った。光学系のアラインメントの調整範囲を大きくすると同時に設定後の光学系の安定度の向上を実現するための部品設計を行い、その効果について基礎評価を行い、設計指針を得た。平成29年度が最終年度であるため、記入しない。本研究では、フローリアクターを利用した高効率な光反応を達成するとともに、オンタイムでの反応結果を解析可能な有機光反応システムを開発することを目的としている。これまでの検討において、マイクロリアクター内において意図的に反応不活性な試薬(窒素あるいは水)を加えて二相系スラグ流を形成させた上で有機光反応を行うと、一相系の結果よりもさらに反応が加速することを見出している。本年度は、この特異な現象の解明を目指した。また、本研究では、反応結果をオンタイムで解析するために、CMOSインテリジェントセンサを集積化したマイクロフローリアクターシステムの構築を目指しており、本年度は、センサ制御システムの改善と新設計フローセルによる精度向上を実現した。有機光反応の検討では、前年度とは異なる反応系でも高速な反応が確認されたことから、スラグ流とすることが高速の光反応の進行に有効であることを確認した。さらに、屈折率の高い溶媒を利用すると、より高速に反応が進行したことから、有機溶媒相に光が閉じ込められる効果が有効に作用していることを示唆する結果を得た。さらに、高濃度の溶液でも反応の加速が確認できたことから、得られる生成物の量も十分に向上させることが期待でき、本手法が産業プロセスへ展開可能であることも見出した。加えて、CMOSセンサシステムを利用した不斉計測においては、前述の新型フローセルにより、セル容量を低減しながら光路長の増大を実現し、特に溶液置換時のノイズの低減に成功した。マイクロリアクターを用いた光反応においては、マイクロリアクターでのみ形成可能なスラグ流の特性を積極的に利用することで、反応のさらなる加速を達成するとともに、その理由についてかなり明らかにすることができた。また、オンライン計測デバイスについても、偏光分析イメージセンサの制御システムの改善によるフィッティング性能の向上に加え、新しいフローセルによる光路長の拡大とデッドボリュームの縮小による計測反応性の向上を得た。一方、計測系の向上に伴い、あらたなセンサ設計上の課題を明らかにすることができた。以上より、おおむね順調に進展している。その結果、有機反応相の溶媒と、反応不活性相試薬やフロー流路チューブとの間の屈折率差が大きいほど反応効率が大きく向上することが判明した。さらに、蛍光電子顕微鏡観察により、一部の反応不活性相を用いた反応では有機反応相の薄膜が形成されていることも観測し、薄膜が反応効率向上へわずかながらも影響していることが示唆された。また、本研究では、反応成績をオンタイムで解析するために、CMOSインテリジェントセンサを集積化したマイクロフローリアクターシステムの構築を目指しており、本年度は、センサ制御システムの改善と新設計フローセルによる精度向上を実現した。このセル容量を低減化した新型フローセルを用いることにより、光路長を増大させることを実現できた一方で、溶液置換時のノイズの低減化に成功した。マイクロリアクター内において意図的に反応に不活性な試薬(窒素や水)を加えて作製した二相系スラグ流環境が、有機光反応の反応効率向上に与える効果の要因の解明に注力した。

不活性試薬相の一つとして一種のイオン液体を検討した際、反応基質が有機反応相だけでなくイオン液体相にも大きく溶解することが判明し、不活性相として利用できるイオン液体の選定に時間を要した。また、新たに設計・試作したCMOSセンサが、当初の予想を上回るノイズを発し、本研究で要求される精度を得るために、センサ駆動条件や読み出しシステムの回路改善を行う必要があった。改善の結果、ノイズレベルを低減することができた。最終的に、イオン液体を含めた種々の不活性相を用いたスラグ流環境を作り出すことができ、有機反応相との屈折率が収率向上の大きな要因となっていることを明らかとした。本研究では、フローリアクターを利用した高効率な光反応を達成するとともに、オンタイムで反応結果を解析可能な有機光反応インライン解析システムを開発することを目的としている。これまでの検討から、マイクロリアクター内において意図的に反応に不活性な試薬(窒素や水)を加えて二相系スラグ流を形成させ有機光反応を行うと、単一相系での反応結果に比べて反応がはるかに加速されることを見出している。本年度は、この特異な現象を、使用した有機溶媒、不活性試薬、フロー流路チューブの物理的パラメータとの関連性の観点から解明することを目指した。まず、有機反応相の溶媒と、反応不活性相試薬やフロー流路チューブとの間の屈折率差が大きいほど反応効率が大きく向上することが判明した。この屈折率差により、照射した光が部分的に有機反応相内に閉じ込められる作用が影響しているものと考察した。また、反応相の有機溶媒の粘性が高いほど、反応効率の向上度が低くなり、有機反応相内での内部高速混合も反応効率の向上の要因の一つであることを明らかにした。一方、ハイスピード動画カメラ撮影による二相系スラグ流の流動の様子を観察したが、不活性相とフロー流路チューブの間に有機反応相薄膜の形成は観測されなかった。加えて、本研究では、反応成績をインラインで解析するために、CMOSインテリジェントセンサを集積化したマイクロフローリアクターシステムの構築を目指しており、本年度は、フローセルに装着した光学系の構成の改善を行った。光学系のアラインメントの調整範囲を大きくすると同時に設定後の光学系の安定度の向上を実現するための部品設計を行い、その効果について基礎評価を行い、設計指針を得た。これまでの検討において、光反応にマイクロフローリアクターが極めて有効であるという知見が得られたことから、今後は光反応の生産性について検討していく予定である。特にスラグ流を積極的に利用することは、反応の加速が達成できているもののスラグ流形成により、単位時間当たりの基質の溶液の流量は減少してしまう。そのため条件によっては生産量が一相系よりも減少してしまう。そこで、様々な反応条件(温度、溶媒、光源など)を検討し、マイクロフローリアクターを導入することによる生産性の優位性について詳細に検討する。さらに、現在不活性試薬には水を用いているため、検討できる反応に温度の制約がある。そこで、種々の温度でもスラグ流条件で反応が検討できるよう、不活性試薬の種類についても検討を行う。
リアルタイムRIミクロイメージングを利用した植物のリン酸輸送機構の研究

本研究は、植物体内のイオンや化合物を非破壊に顕微鏡レベルで解析するためのシステムの構築を目指し、放射性同位体トレーサ、板状シンチレータ、正立顕微鏡の組み合わせた実験系により40倍に拡大した植物組織内のトレーサ分布をイメージングできるようにしたものである。このシステムにより植物の根端500μmリン酸吸収移行の様子を画像として取得し、根組織によるリン酸吸収の違いを明らかにした。ストレス耐性付加など植物の環境適応能力を高める効果的な栽培・育種を行うためには、植物体内の複雑な生理分子機構を理解することが必要である。そこで、遺伝子の発現と機能をGFPにより非破壊で解析するように、植物体内のイオンや化合物を非破壊で解析できれば植物のストレス環境応答の理解に活かせると考えている。本申請者は、これまで非破壊での物質イメージング解析を行う実験系の確立および分子生物学的知見と結びつけた総合的な解析を進めてきた。今回、このイメージング原理を応用し、分解能を向上し細胞間レベルの物質輸送解析を進めることを目的としている。22年度内に計画していたリアルタイムRIミクロイメージングシステムの改良では、コリメータ導入の検討までしか終了できなかったため、繰越し申請により23年度6月まで引き続きシステム改良を進めることとし、申請書に記載した二つ目の改良案の「ガラス蒸着型のシンチレータの利用(改良案2)」について研究を行った。まず、正立顕微鏡を基本とし、板状のFOSと対物レンズの組み合わせにより微細な組織(100μm幅の根)内のRIシグナル(^<33>P)を検出できることを確認した。次に、FOSの表面保護材のアルミニウムを透明な保護材に変更したものを特別注文により作成したことにより、顕微鏡での明視野像を容易に取得できるようにし、植物組織の部位をRIトレーサの位置情報を正確に解析できるようにした。さらに対物レンズの倍率、RIトレーサ量の検討を行った結果、最大40倍までに拡大した組織内のRIトレーサの検出に成功した。また、数分間の画像取得を連続的に行うことにより、RIトレーサの動態を動画として取得出来るようにした。23年度は、22年度の研究により改良したリアルタイムRIミクロイメージングシステムにより、植物サンプル(シロイヌナズナ)のリン酸動態解析実験を行った。まず、シロイヌナズナ野生型株の根を用いて、栽培時のリン酸栄養環境の違いにより生じる根のリン酸吸収分布を調べた。これにより、リン酸欠乏条件下で栽培したサンプルでは、根端約200μm領域での蓄積が見られ、リン酸潤沢な条件下では見られず、リン酸条件により根端の機能の違いが生じることが示された。さらに、パルス的に吸収させた^<33>Pの挙動解析では、根端への蓄積が数十分後に生じていたことから、根端に蓄積しているリン酸は、培地からの吸収のみではなくその他の組織から根端への輸送によっても生じることを確認した。次に、フランスCNRS/CEA/Aix-MarseilleのNussaume博士より提供を受けた6つのリン酸トランスポータ機能を制御した形質転換体の根のリン酸分布、動態を解析した。GFPにより分かるリン酸トランスポータの分布とリン酸分布について4つのラインで相関が見られた。
新規細胞内ガス性シグナル伝達因子硫化水素が口腔領域の炎症応答に果たす役割の解明

マウス血管内皮細胞株UV-♀2細胞を用いて、ストレスチャンバー上に播種し伸展刺激を加えたところ、4時間後に硫化水素産生酵素(CBS)のmRNAの発現量が3倍に上昇した。また、活性酸素種産生酵素のNox2の発現は1.8倍上昇した。一方、一酸化窒素産生酵素eNOSの発現量は変化がなかった。また、同様の実験を、ヒト軟骨芽細胞様細胞株ATDC5細胞についても行ったところ、伸展刺激24時間後からCBSのmRNAの発現量が上昇した。これらのことから、細胞に伸展刺激を加えると内因性硫化水素の産生が誘導される可能性が強く示唆された。細胞が産生する一酸化窒素が細胞の機能に様々な影響を与えることが発見されて以来、細胞の生理的・病理的状態を内因性のガス性因子により説明しようとする考えは、近年多くの研究者に受け入れられるところとなり、これまでの先駆的な研究成果から、一酸化窒素、一酸化炭素、及び硫化水素ガス性シグナル伝達物質として知られるようになった。歯周疾患の病態の進行において、細菌由来の外因性硫化水素が炎症を進行させる可能性は示唆されているが、内因性硫化水素の炎症応答における役割は不明な点が多い。マウス血管内皮細胞株UV-♀2細胞を用いて、ストレスチャンバー上に播種し、自動伸展装置STB-140にて伸展率20%、6回/分の条件下で伸展刺激を加えたところ、4時間後に硫化水素産生酵素cystathionine-β-synthase (CBS)のmRNAの発現量が3倍に上昇した。また、活性酸素種産生酵素のNox2の発現は0.8倍上昇した。また、同様の実験を、Insulin-Trans-Sel-Xにて2週間培養して、軟骨芽細胞に分化させたヒト軟骨芽細胞様細胞株ATDC5細胞についても行ったところ、伸展刺激24時間後からCBSのmRNAの発現量が上昇した。近年の先駆的研究から、内在性の硫化水素(H2S)は一酸化窒素(NO)や一酸化炭素(CO)に次ぐ、第三のガス性シグナル伝達物質(gasotransmitter)として注目され始めており、炎症応答における役割について研究が進められているところである。H2Sは関節滑液中にも見いだされており、関節の炎症症状との関連も報告されている。関節の炎症病態における伸展刺激や荷重刺激の果たす役割は生理学的・病理学的意義は重要であるが、これら物理的刺激による細胞が産生するH2Sの動態については報告がない。関節の軟骨に対する伸展刺激のin vitroのモデル系として、ヒト軟骨芽細胞様細胞株ATDC5をInsulin-Trans-Sel-Xにより軟骨芽細胞に分化2週間後にストレッチチャンバー上に播種し、自動伸展装置STB-140を用いて伸展率20%、6回/分の徐油研で伸展刺激下にて培養したところ、24時間後から硫化水素産生酵素cystathionine-β-synthase(CBS)のmRNA発現量が上昇した。また、培養液中のH2S濃度をフリーラジカルアナライザーTBR4100で測定したところ、8時間後以降から確認することができた。これに加え、培地中のH2O2とNOも同時に測定したところ、H2Sと同様に濃度が上昇していた。これらのことから、軟骨芽細胞に伸展刺激を加えるとH2O2、NO、およびH2Sの産生が誘導されることが明らかとなった。今回の知見に基づき、ガス性シグナル伝達物質としてのH2Sが機械的刺激に対する細胞応答において果たす役割について今後検索していく予定である。理由)伸展刺激により、当初予想していた硫化水素酸成功その発現が上昇したことを発見したため。硫化水素産生酵素のノックアウトマウスを用いた実験を行う。
聟島・火山列島を含めた小笠原諸島全域における植物多様性の研究

大小20あまりの島々からなる小笠原諸島では数多くの固有生物が見られることから、これまで様々な視点から生物進化の研究が進められてきたが、その多くはアプローチが容易な父島・母島で行われたものであり、他の無人島では十分な研究が行われていない。また小笠原では様々な外来種による生態系への影響が深刻化しつつあり、早急な現状調査が必要とされている。このような背景から、本研究では無人島域を重点的に、小笠原諸島全域における植物多様性の現状を把握し、これらの多様性が生じてきた歴史的過程や要因を推定することを目的とした。平成14年度は聟島列島、平成15年度は火山列島の北硫黄島、平成16年度は父島・母島列島の属島を主に調査を行い、小笠原諸島の広い範囲にわたって植物相の現状を把握することができた。過去の植物相調査結果と比較したところ、いずれの島においても、在来維管束植物種が減少し、代わって新たな外来植物種の侵入や様々な侵略的外来種の拡大が確認された。本研究において収集された在来植物種(フトモモ属、シロテツ属、フヨウ属)のDNAサンプルを用いて、AFLP分析などの集団遺伝学的解析を行った。その結果、フトモモ属では生育環境(特に水分・光条件)と関連して集団の遺伝的分化が進行していること、シロテツ属では生育環境や開花期の違いが集団の遺伝的分化と関連していること、フヨウ属では種子散布能力の違いが集団の遺伝的分化を引き起こしている可能性が示唆された。また、固有植物種の性表現にも着目し、ムニンアオガンピが小笠原において雌雄異株性を獲得した可能性が高いことや、ムニンハナガサノキが雄性雌雄両全異株であること、そしてオガサワラボチョウジが異型花柱性であることなど、これまで小笠原では知られていなかった多様な性表現の存在が明らかとなった。大小約20あまりの島々からなる小笠原諸島では、これまでに生物進化の研究が盛んに進められてきた.しかし,それらの多くは父島や母島において行われたものであり、アプローチが困難な無人島域を含む小笠原諸島全域をカバーした集団レベルの進化学的分析は十分には行われていない。本研究は聟島列島や火山列島を初めとする無人島を重点的に調査し、植物相の現状を把握すると共に、小笠原諸島全域を含めた植物分化のパターンとプロセスを解明することを目的とする。平成14年度は小笠原諸島の北端に位置する聟島列島を中心に調査を行った。聟島列島はかつて野生化したノヤギが増殖したために森林植生の大部分が失われてしまったが、近年ノヤギの駆除が進み、今後の植生回復が期待されている。そこで、ノヤギ駆除直後の聟島・媒島の植物相の現状を把握するための現地調査を行い、出現した維管束植物種のさく葉標本とDNAサンプルを可能な限り収集した。その結果,聟島で105種,媒島で98種の維管束植物種(亜種,変種を含む)が確認された.約10年前の植物相調査結果と比較すると,小笠原固有種数が3040%減少し,帰化植物種数が増加していることが明らかとなった.諸島内で分化してきたと考えられる分類群については,外部形態の計測・解析と遺伝的変異の解析が進行中である。これらの調査に加えて,小笠原諸島の植物相保全のための基礎調査として,これまであまり調査が行われていなかったクマネズミ(移入種)による植物の食害状況調査も実施した.その結果,絶滅危倶種を含む数多くの在来種において,種子・果実・枝・葉などが食害されていることが確認された.

島によっては,特定樹種の果実がすべて食い尽くされていることもあり,植物集団の存続や植生回復が妨げられている可能性が示唆された.大小20あまりの島々からなる小笠原諸島では、これまで様々な視点から生物進化の研究が進められてきたが、その多くはアプローチが容易な父島・母島で行われたものであり、数々の無人島では十分な研究が行われていない。またこれらの地域では様々な外来生物が在来生物種に深刻な影響を及ぼしているため、早急な現状調査が必要とされている。以上の背景から、本研究ではこれらの無人島域を重点的に、小笠原諸島全域における植物多様性の現状を明らかにすることを目的としている。今年度は訪れることが最も困難と言われている北硫黄島において、調査およびサンプリングを行った。現地調査は付近の気象条件が最も安定する6月に行い、海岸部から山頂部までを3日間かけて踏査した。今回の調査で明らかになったことの一つとして、北硫黄島においても外来種問題が深刻化しつつあるということがあげられる。特に、ガジュマルが各所で蔓延しつつあり、しかもかつては存在しなかったガジュマルコバチの生息が確認されたことで、今後の拡大が心配される。他にもトクサバモクマオウなどの新たな外来種が確認され、クマネズミによる植物の食害も深刻な状態であった。DNAサンプルは、これまでに収集されたサンプルと併せて、主にAFLP法を用いて解析を進めている。特にフトモモ属及びシロテツ属集団のAFLPデータを元にassignment testを行ったところ、種内の遺伝的構造が明らかとなり、各個体をさらに遺伝的組成に基づく亜集団に割り当てることができた。これより各個体の移住の経路が明らかとなり、集団の形成過程を知る手がかりが得られた。併せて、植物の花形態と繁殖様式に関する調査も進めている。今年度の調査で、オガサワラボチョウジ(アカネ科)は、形態的・機能的に2型異花柱性distylyであることが明らかとなった。また、ムニンハナガサノキ(アカネ科)は、高等植物には非常に珍しい雄性雌雄両全異種androdioecyであることが確認された。大小20あまりの島々からなる小笠原諸島では、これまで様々な視点から生物進化の研究が進められてきたが、その多くはアプローチが容易な父島・母島で行われたものであり、数々の無人島では十分な研究が行われていない。また小笠原では様々な外来種が在来生物種に深刻な被害を与えているため、早急な現状調査が必要とされている。以上の背景から、本研究では無人島域を重点的に、小笠原諸島全域における植物多様性の現状を把握することを目的とした。平成14年度は聟島列島、平成15年度は北硫黄島、平成16年度は父島・母島列島の属島を主に調査を行い、硫黄島など一部の島を除く小笠原諸島全域にわたって植物相の現状を把握することができた。過去の植物相調査報告と比較したところ、いずれの島においても、在来維管束植物種が減少し、代わって新たな外来植物種の侵入やトクサバモクマオウなどの侵略的外来種の拡大が確認された。小笠原の外来種問題の具体的対策として、ハワイで用いられている外来植物リスク評価システムについて検討し、このシステムが小笠原への新たな侵略的外来植物の導入を防ぐことに有効であることを検証した。本研究において収集された在来植物種(フトモモ属、シロテツ属、フヨウ属)のDNAサンプルを用いて、AFLP分析などの集団遺伝学的解析を行った。
N-myc遺伝子を標的としたアンチセンスDNA抗癌療法の基礎的研究

I. K-ras,p53,N-myc遺伝子の異常と、CDDP,CBDCA,MMC,Epi-ADMに対する薬剤感受性との関連性を、ヒト培養肺癌細胞29株を用いMTTassayにて検討を行った。その結果、N-myc遺伝子の増幅を有する肺小細胞株(2株)は、他の細胞株に比し上記抗癌剤に対する感受性が劣っていた。しかし、K-ras遺伝子異常やp53遺伝子異常と、薬剤感受性との間には有意な相関は認められなかった。以上の事実より、N-myc遺伝子の増幅が薬剤耐性において何らかの関与をしていることが示唆された(Oncology Rep,2:277-280,1995)。II. N-myc遺伝子と薬剤耐性との関連性を更に明らかにするため、試験管内でCDDP耐性細胞株(H69/cp,SBC-4/cp)を作成し、耐性株におけるN-myc遺伝子の増幅および表現の程度が親株に比しどう変化するかを検討した。その結果、いずれの耐性株においても、親株に比しN-myc遺伝子の増幅および表現には有意な変化は認められなかった。この事実は、耐性度とN-myc遺伝子増幅の程度とは直接関連しないことを示唆している。よってN-myc遺伝子の薬剤耐性への関与に関しては、別の角度から検討する必要があると思われた(Oncology,53:417一421,1996)。III. N-myc遺伝子の開始コドンを含むアンチセンスDNAを合成し、N-myc遺伝子の増幅を有する小細胞肺癌株(H69,SBC-4)に対し、CDDPとの併用殺細胞効果を検討した。その結果、アンチセンスDNAを併用することにより、CDDPの殺細胞効果が減弱するとの結果が得られた。その理由として、アンチセンスDNA処理によりDNA合成が抑制され、その結果CDDPに対する感受性が低下したと推察された。アンチセンスDNAと抗癌剤との併用療法を考える際、このような問題の生じることが示唆された(Anticancer Res,15:37-43,1995)。1.K-ras,p53,N-myc遺伝子の異常と、CDDP,CBDCA,MMC,Epi-ADMに対する薬剤感受性との関連性を、ヒト培養肺癌細胞29株を用い、MTT assayにて検討を行った。その結果、N-myc遺伝子の増幅を有する肺小細胞癌(2株)は、他の細胞に比し上記抗癌剤に対する感受性が劣っていた。しかし、K-ras遺伝子の異常(点突然変異)やp53遺伝子の異常(点突然変異)と、薬剤感受性との間には有意な相関は認められなかった。以上の事実より、N-myc遺伝子の増幅が薬剤耐性において何らかの関与をしていることが示唆された。2.N-myc遺伝子の開始コドンを含むアンチセンスDNAを合成し、N-myc遺伝子の増幅を有する肺小細胞癌(H69,SBC-4)に対し、CDDPとの併用殺細胞効果を検討した。その結果、アンチセンスDNAを併用することにより、CDDPの殺細胞効果が減弱するとの成績が得られた。その理由として、アンチセンスDNA処理により、DNA合成が抑制され、その結果CDDPに対する感受性が低下したと推察された。アンチセンスDNAと抗癌剤との併用療法を考える際、このような問題の生じることが示唆された。

今年度は、前年度の研究で認められたN-myc遺伝子と薬剤耐性との関連性を更に明らかにするため、試験管内でCDDP耐性細胞株(H69/cp,SBC-4/cp)を作成し、耐性株におけるN-myc遺伝子の増幅および表現の程度が親株に比しどう変化するかを検討した。その結果、いずれの耐性株においても、親株に比しN-myc遺伝子の増幅および表現の程度には有意な変化は認められなかった。この事実は、耐性度とN-myc遺伝子増幅の程度とは直接関連しないことを示唆している。よってN-myc遺伝子の薬剤耐性への関与に関しては、別の角度から検討する必要があると思われた。(論文投稿中)
魚類の警報フェロモンの単離と、その作用機序・生理機能の解明

本研究は、モザンビークティラピア(Oreochromis mossambicus)をモデルとして、危険回避シグナルである警報フェロモンの単離を目指すとともに、その作用機序と生理機能の解析に取り組んだ。本年度は主に作用機序の解明にフォーカスして研究を進めた。重複制限により中途辞退を行うまでのおよそ半年の間に、以下の成果を得た。モザンビークティラピアの稚魚を対象とした行動実験システムを確立することで、実際にモザンビークティラピアが警報フェロモンに反応することを明らかにした。続いてPAS染色により、他魚種と同様にモザンビークティラピアの体表においても、警報フェロモン貯蔵細胞(club cell)と考えられる細胞が存在することを確認した。さらに、走査型電子顕微鏡を用いた外部形態観察や、組織切片による観察を通して、モザンビークティラピアの嗅上皮の基礎的な情報を得た。並行して、神経興奮マーカーであるc-fosのクローニングを行うとともに、in situ hybridization用のプローブを作製した。そしてこれを用いて、警報フェロモンに曝露したモザンビークティラピアの嗅上皮の組織切片を、コントロール群のものと比較しながら観察したところ、警報フェロモン曝露群においてのみ、強く興奮する細胞を確認することができた。この細胞が警報フェロモンの受容に関与していると考えられる。これら一連の研究により、モザンビークティラピアにおける警報フェロモンの作用系の一端を明らかにすることができた。翌年度、交付申請を辞退するため、記入しない。