hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
Ｘ線支援原子間力顕微鏡ＸＡＮＡＭの量子干渉効果に基づく理解

絶縁体表面にも適用可能な非接触原子間力顕微鏡と放射光X線を組み合わせたナノスケール元素分析・化学状態分析法、X線支援非接触原子間力顕微鏡(X-ray Aided Noncontact Atomic forcemicroscopy, XANAM)の開発を行った。これは探針-試料間の相互作用を試料原子の内殻電子励起が可能なX線で人為的に変化させることで、探針直下の元素種の同定や化学状態識別を可能とする手法である。本課題により相互作用測定の精密化と解析方法を確立した。また元素選別イメージング像の取得の足がかりとなるデータ取得に成功した。次世代の触媒や半導体材料の新材料開発において、「表面原子実空間観察」と「単原子操作」が可能という特徴を備える走査プローブ顕微鏡(Scanning Probe Microsocpy:SPM)は非常に有用である。しかし、観察対象の元素種や化学種を直接に知る方法論は未だ確立されていない。申請者は、非接触原子間力顕微鏡(NC-AFM)と放射光X線を組み合わせたX線支援非接触原子間力顕微鏡(X-ray aided non-contact atomicforce microscopy:XANAM)の開発を行っており、探針ー表面間の引力相互作用のX線エネルギー依存性から、NC-AFM探針で試料表面の元素種を直接分析可能な事を示し、その原理について検討を行っている。これまでの測定から、少なくとも2成分の相互作用力A、Bが関係することを明らかにし、成分Aは化学結合力由来、そして成分Bは静電気相互作用とする解釈を行った。しかし、成分Aの検出感度向上には成分Bを小さくする必要があることがわかってきた。また成分B自身もX線吸収に伴う光電子放出増加現象からは単純に理解できないエネルギー依存性を示しメカニズム解明が必要である。本年度は、これらの問題解決に取り組むため、水晶振動子型カンチレバーを導入したXANAM装置を用いて、放射光X線下で測定を行った。その結果、成分Bを有効に減らす手段によって化学結合に由来する成分Aをより明瞭に検出できる条件を確定し、また成分Bがやはり静電的相互作用に関係することも結論した。これは放射光+SPMの実験系では大きな進歩である。次年度に本系に適用することで、成分Aの量子干渉効果の有無、また成分Bが光電子放出増加現象と符合しない理由について検討できると考えている。本研究は、将来の電子デバイスやエネルギーデバイスの開発に必要とされる基板表面の構造解析と化学状態分析をナノレベルで行う装置開発に関するものである。具体的には、NC-AFMで基板表面の特定の構造を観察すると同時に、放射光X線により試料-AFM探針間相互作用に摂動を誘起することで、構造に一対一に対応したナノスケールの元素・化学情報を提供するものである。本手法を、X線支援非接触原子間力顕微鏡;X-ray Aided Noncontact Atomic force microscopy(XANAM:ザナム)と呼ぶ。本手法では元素識別に必ずしも原子像を必要とせず、複雑組成の電子デバイス、触媒粉体や半導体量子ドットといったナノ材料への幅広い適用を目指すものである。これまでの測定から、相互作用力のエネルギー依存性から試料表面の元素種を識別可能な事を示し、エネルギー依存性の詳細な測定法の検討を行ってきた。本年度は、相互作用力を静電的相互作用、van der Waals力、化学(共有)結合力に分離して、入射X線エネルギーに対する個々の成分の依存性の検討を行った。その結果、金属間に生じるX線照射誘起の局所的な鏡像電荷効果、またはカシミール相互作用効果の存在が示唆された。また測定したX線エネルギー領域で探針-試料間の接触電位差が補償される仮定の下で、静電的相互作用の変化と2次電子放出やホール生成の関連を検討した。これはX線エネルギーによる電位変化の探針-試料間のナノ空間の情報を与え、XANAMと同様の斜入斜X線光学系を用いるX線異常散乱や回折実験に対して有用な情報も与える。また化学結合力、van der Waals力については、引き続きX線エネルギー依存性の詳細の検討を行っている。異種原子同士が接触する表面/界面は新たな機能性・化学特性を創発する重要な場として活発な研究が行われている。しかし、元素を識別しながら異種原子同士の原子配列や構造性を直接、顕微的に分析するのは未だ容易ではない。本研究では、この問題を克服するために、表面/界面のナノ構造を個々に識別しながら、化学状態を特定する手法として「X線支援原子間力顕微鏡(XANAM)」を開発してきた。これは非接触原子間力顕微鏡(NC-AFM)における表面と探針間における力相互作用が、試料側元素の吸収端エネルギーを持つX線照射によって変化するという現象を基礎して、元素情報を導く。既に、NC-AFMの研究では力相互作用には、共有結合性を持つ化学結合力が含まれる事がわかっている。そこで、この化学結合力に局在する占有・非占有電子軌道にX線励起電子が相互作用することで力変化が生じるという仮説のもと、この仮説の証明のための精密測定と理論解析を行ってきた。ここでは、NC-AFMの力場スペクトル(力の探針-試料間距離依存性)形状のX線エネルギーに対する変化の様子を捉えることで、力に含まれるvan der Waals力、静電的相互作用力、化学(共有)結合力の精密測定を行い、最近のNC-AFM理論に基づく解析を行った。測定は、つくばのKEK-PFのBL-7Cにて、専用に設計・製作したNC-AFM(XANAM)装置で測定を行った。

結果、van der Waals力、静電的相互作用力、共有結合力を分離でき、X線による誘起信号のほとんどが供給結合力由来であることを証明した。これにより、量子干渉効果の有無を顕わにすることはできなかったが、本課題の目的であったXANAMの理論的裏付け、仮説の証明をすることができた。さらに、以上の結果を踏まえた元素マッピングへの展開のための方法の検討と基礎データ取得を行った。絶縁体表面にも適用可能な非接触原子間力顕微鏡と放射光X線を組み合わせたナノスケール元素分析・化学状態分析法、X線支援非接触原子間力顕微鏡(X-ray Aided Noncontact Atomic forcemicroscopy, XANAM)の開発を行った。これは探針-試料間の相互作用を試料原子の内殻電子励起が可能なX線で人為的に変化させることで、探針直下の元素種の同定や化学状態識別を可能とする手法である。本課題により相互作用測定の精密化と解析方法を確立した。また元素選別イメージング像の取得の足がかりとなるデータ取得に成功した。本年度は、前年度に整備した走査探針によるX線検出系の改良がうまくいき、データの取得が十分に行えた。また同時に、測定法の改良に重点を置いてきた流れを、解析法の拡充へ発展できた。具体的には、Sader法と呼ばれる力場解析法と、力場の分離方法について、独自にプログラムによるソフト開発を行い簡便に行えるよう整備した。この開発に少し時間を要したため、学会発表等は、前年に比べて少し少なくなったが、前年同様、国内外学会の研究者の交流を通して、有意義な議論の機会を得た。最終年度に向けた準備が出来たと言え、おおむね順調という判断をした。表面物理化学走査プローブ顕微鏡分野だけでなく、X線光学系を軸とした分野においても、同様のナノスケール元素分析を目指す研究が近年活発化している。その中で、唯一、探針-表面間の引力相互作用のX線エネルギー依存性を測定する手法として実験と検討を地道に重ねてきた。そして現状でようやく、測定の根本的な部分においては正しいと、確信に似たものを得るに至った。今後は、研究体制は現状を維持しつつも、研究結果の発信速度を今よりも上げたい。本年度は、実験進行の都合で、走査探針によるX線検出系の整備が先に行われた。結果、内容を平成26年度と半ば入れ替えたようになったが、これまでの懸案であった測定法上の問題を先に一つ解決できた。また国内外学会等で多くの成果発表の機会を得ると同時に、有意義な議論を行えた。これより、さらなる問題点の明瞭化と解決の糸口も得る事ができた。予算上は、平成25年度の内容は予算繰越によって次年度に実施できるよう計画してあり、おおむね順調という判断をした。実験進行の都合で、本年度は研究遂行上必須な、2つの機器の修理が生じたため、その修理に合計で30万円ほど経費がかかり、予算上はずれが生じたが、当初の目的は別途、財団からの寄付金により補填し実施することができたため、研究遂行上の問題はなかった。
インフレーション宇宙の研究

近年の宇宙論的観測の進歩によって,インフレーション宇宙理論の証拠が続々と見つかりつつある。特に,インフレーション理論が予言する宇宙の曲率揺らぎの生成やそのスペクトルは,マイクロ波背景放射の揺らぎの観測データを非常によく説明する。しかし現状ではまだ,インフレーションを引き起こす場,インフラトン場が何であるかを特定するまでには至っていない。この現状の下,本研究では,様々なインフレーション宇宙モデルに関して,それらのダイナミクスをはじめとして,曲率揺らぎの統計的性質や重力波揺らぎのスペクトルを系統的に調べ,それぞれのモデルがどのような理論的予言をするか,また,それらがどのように検証できるかを明らかにすることを目指して研究を進めた。そして以下の成果を得た。「2次の宇宙論的摂動からの重力波」インフレーション宇宙では、宇宙の構造形成の種となる曲率揺らぎに加えて、時空の量子揺らぎが増幅し、現在重力波として観測されると期待されている。さらに、モデルによっては、摂動の2次で生成される重力波も将来的に観測可能と考えられている。しかし、摂動の振幅が大きすぎると原始ブラックホールの過剰生成が起こる。そこで、この2次摂動からの重力波を正確に評価し、原始ブラックホールの過剰生成の制限にかからない範囲で、実際に観測可能かどうかを調べた。その結果、いくつかのモデルで、DECIGO,BBOやLISAなどの将来のスペース重力波干渉計で十分観測可能であることを明らかにした。「複数場インフレーションモデルにおけるトライ・スペクトル」最近、インフレーション宇宙からの揺らぎの非線形性、特にその統計的非ガウス性の検出可能性が盛んに議論されており、曲率揺らぎの3点関数(バイ・スペクトル)に関しては、一般的な性質がかなり分かってきた。そこで、本研究では、場が2つある場合の一般的インフレーションモデルにおける曲率揺らぎの4点関数(トライ・スペクトル)に着目し、その性質を詳しく解析し、それがどのような場合に大きな値を取るかを系統的に明らかにした。宇宙論的揺らぎの2次の項から生成される重力波を正確に導出したのは、非常によい成果である。これは、将来の重力波観測実験でインフレーションモデルが決定される可能性を与え、最低でもモデルの有益な制限が得られることを意味する。また、スカラー場が複数ある場合の3次の非ガウス性(4点関数)の導出は、今後の宇宙背景輻射の観測を使えば、複数スカラー場モデルへの強い制限を与える可能性があり、重要な成果である。こうした成果が得られたので、当初計画通り順調に進展したと評価する。本計画は、本年度で終了であるが、新たな、より精度の高い観測データが続々と出つつあることを考えると、本研究をさらに進めて行くことには、十分な意味があると考えている。H22年度は、11月からの研究開始であったので、H23年度からの本課題の本格的遂行に向けての準備期間として、まずこれまでの研究成果の整理を行った。特に、様々なインフレーション宇宙モデルの中で、曲率揺らぎがどのように生成されるかを詳しく調べ、大きな非ガウス的曲率揺らぎが生成されるモデルの共通点を解析した。この一つの結果として、いわゆる変調再加熱(modulated reheating)モデルを非線形のエネルギー移送を考慮したモデルに拡張することができた。この成果を論文として発表した。その後、以下の2つのテーマに関して、準備的研究を開始した。1.最近大きな関心を呼んでいる宇宙論的課題に摂動の2次での重力波生成とその検出問題がある。特にそうした重力波の検出、あるいは非検出によってインフレーション宇宙モデルに強い制限がつくと考えられている。そこで、2次で大きな重力波が生成される場合の原始ブラックホール生成や極小スケールでのダークマターハローの生成可能性とその観測的予言について研究を開始した。2.もうひとつは、いわゆるリッジ・ポテンシャルを持つインフレーションモデルにおける非ガウス的曲率揺らぎの評価である。リッジ・ポテンシャルモデルとは、スカラー場の軌道が、ポテンシャルの尾根上を微妙なバランスを保って進むモデルであり、インフレーションはその尾根から落下することで終わるため、一般に大きな非ガウス的曲率揺らぎを生成すると考えられる。そこで、この最後の尾根からの落下の仕方と非ガウス性の大きさとの関係を調べている。これによって非ガウス的曲率揺らぎの生成機構の理解がさらに深まると期待している。本年度は以下の3つのテーマに関して研究を進めた。(1) 2次の宇宙論的摂動からの重力波インフレーション宇宙では、宇宙の構造形成の種となる曲率揺らぎに加えて、時空の量子揺らぎが増幅し、現在重力波として観測されると期待されている。しかし、小さなスケールでより大きな曲率揺らぎの振幅を与えるモデルにおいては、摂動の2次で生成される重力波も将来的に観測可能と考えられている。しかし、摂動の振幅が大きすぎると原始ブラックホールの過剰生成が起こることが知られている。そこで、この2次摂動からの重力波を正確に評価し、原始ブラックホールの過剰生成の制限にかからない範囲で、実際に観測可能かどうかを詳しく調べた。その結果、モデルによっては、DECIGO,BBOやLISAなどの将来のスペース重力波干渉計で十分観測可能であることを明らかにした。この成果は最近arXivに発表した(arXiv:1203.4663)。査読雑誌への投稿は現在準備中である。(2)複数場インフレーションモデルにおける4点関数

最近、インフレーション宇宙からの揺らぎの非ガウス性の検出可能性が盛んに議論されており、曲率揺らぎの3点関数に関しては、一般的な性質がかなり分かってきた。そこで、場が2つある場合の一般的インフレーションモデルにおける曲率揺らぎの4点関数の性質を詳しく解析し、それがどのような場合に大きな値を取るかを系統的に調べた。この成果もarXivに発表し(arXiv:1203.684)、現在査読雑誌へ投稿中である。(3)3点関数スペクトルの簡潔な計算手法場が2つある場合のインフレーション宇宙における曲率揺らぎの3点関数の計算は、一般には極めて煩雑である。そこで、これをより高速かつ安定的に計算するコードを開発した。このコードは解析的計算が難しいモデルの3点関数の計算に役立つ。この成果は、現存論文を準備中である。近年の宇宙論的観測の進歩によって,インフレーション宇宙理論の証拠が続々と見つかりつつある。特に,インフレーション理論が予言する宇宙の曲率揺らぎの生成やそのスペクトルは,マイクロ波背景放射の揺らぎの観測データを非常によく説明する。しかし現状ではまだ,インフレーションを引き起こす場,インフラトン場が何であるかを特定するまでには至っていない。この現状の下,本研究では,様々なインフレーション宇宙モデルに関して,それらのダイナミクスをはじめとして,曲率揺らぎの統計的性質や重力波揺らぎのスペクトルを系統的に調べ,それぞれのモデルがどのような理論的予言をするか,また,それらがどのように検証できるかを明らかにすることを目指して研究を進めた。そして以下の成果を得た。「2次の宇宙論的摂動からの重力波」インフレーション宇宙では、宇宙の構造形成の種となる曲率揺らぎに加えて、時空の量子揺らぎが増幅し、現在重力波として観測されると期待されている。さらに、モデルによっては、摂動の2次で生成される重力波も将来的に観測可能と考えられている。しかし、摂動の振幅が大きすぎると原始ブラックホールの過剰生成が起こる。そこで、この2次摂動からの重力波を正確に評価し、原始ブラックホールの過剰生成の制限にかからない範囲で、実際に観測可能かどうかを調べた。その結果、いくつかのモデルで、DECIGO,BBOやLISAなどの将来のスペース重力波干渉計で十分観測可能であることを明らかにした。「複数場インフレーションモデルにおけるトライ・スペクトル」最近、インフレーション宇宙からの揺らぎの非線形性、特にその統計的非ガウス性の検出可能性が盛んに議論されており、曲率揺らぎの3点関数(バイ・スペクトル)に関しては、一般的な性質がかなり分かってきた。そこで、本研究では、場が2つある場合の一般的インフレーションモデルにおける曲率揺らぎの4点関数(トライ・スペクトル)に着目し、その性質を詳しく解析し、それがどのような場合に大きな値を取るかを系統的に明らかにした。研究は順調に進んでいる。いくつかのプロジェクトを並行して進めたため、学術雑誌の論文としての発表が少し遅れ気味であるが、arXivには既に発表しており、ここ1-2ヶ月中に一挙に2-3編の論文が査読付き雑誌に掲載決定となると予想されるので、研究が遅れているわけではない。
圧着接合されたプレストレストコンクリート骨組接合部の構造性能を評価する基礎研究

これまでにPCaPC造の接合部に関する研究はいくらか行われてきたが接合部せん断破壊型の研究はほとんど行われておらず,特に立体架構の2方向加力実験は皆無である.そこで,本実験は試験体形状を変数とした接合部破壊型スラブなしPCaPC造立体柱梁接合部試験体に水平2方向交番載荷実験を行い,接合部せん断破壊型立体架構の接合部せん断耐力,および接合部のせん断強度の2軸相関について検討することを主目的とする.また,同様に実験データのないシース管内にグラウトを注入しないアンボンド型の立体架構試験体について実験を行い一般的な接合部破壊型との比較も行う.さらにそれぞれに付随した平面試験体についても実験を行い,実験結果と比較した.立体試験体は1サイクルで主方向と直角方向(主方向に対して)にも動かす為に接合部部分,特に隅角部には著しい破壊がみられた.梁のひび割れはプレストレス導入の効果と柱コンクリートに先に大きくひび割れが入ってしまうことからそれほど多く見られなかった.4方から梁の接続する立体柱梁接合部がせん断破壊することが確認された.PCaPC接合部の性能評価を試みた結果,接合部のせん断ひび割れ幅とせん断変形角との間にはせん断変形角が0.5%から0.6%で勾配が変わる2つ折れ線の線形性を有する評価式を得るとともに,PC接合部はRC接合部に比べてプレストレス力によって損傷低減効果が期待できることが明らかになった.これまでにPCaPC造の接合部に関する研究はいくらか行われてきたが接合部せん断破壊型の研究はほとんど行われておらず,特に立体架構の2方向加力実験は皆無である.そこで,本実験は試験体形状を変数とした接合部破壊型スラブなしPCaPC造立体柱梁接合部試験体に水平2方向交番載荷実験を行い,接合部せん断破壊型立体架構の接合部せん断耐力,および接合部のせん断強度の2軸相関について検討することを主目的とする.また,同様に実験データのない梁曲げ破壊先行型の立体架構試験体について実験を行い接合部破壊型との比較も行う.さらにそれぞれに付随した平面試験体についても実験を行い,実験結果と比較した.立体試験体は1サイクルで従方向にも動かす為に接合部部分は著しい破壊がみられた.梁のひび割れはプレストレス導入の効果と柱コンクリートに先に大きくひび割れが入ってしまうことからそれほど多く見られなかった.梁曲げ先行型の試験体でも他の試験体と比較しても大きな差は見られなかった.4方あるいは3方から梁の接続する立体柱梁接合部がせん断破壊することが確認された.立体架構と平面架構の層せん断力を比較した場合,両方向に直交梁が付いた場合25%,片側に付いた場合に13%の耐力上昇が見られた.立体架構における二軸せん断力下の層せん断力は矩形相関曲線の外側に位置しており,各構面の応力に対して各々個別に設計することで,任意方向のせん断力に対して接合部の設計できることを確認した.直行梁の効果は接合部パネルの縦横方向ひずみ,また接合部補強筋のひずみからも大きいことが認められた.これまでにPCaPC造の接合部に関する研究はいくらか行われてきたが接合部せん断破壊型の研究はほとんど行われておらず,特に立体架構の2方向加力実験は皆無である.そこで,本実験は試験体形状を変数とした接合部破壊型スラブなしPCaPC造立体柱梁接合部試験体に水平2方向交番載荷実験を行い,接合部せん断破壊型立体架構の接合部せん断耐力,および接合部のせん断強度の2軸相関について検討することを主目的とする.また,同様に実験データのないシース管内にグラウトを注入しないアンボンド型の立体架構試験体について実験を行い一般的な接合部破壊型との比較も行う.さらにそれぞれに付随した平面試験体についても実験を行い,実験結果と比較した.立体試験体は1サイクルで主方向と直角方向(主方向に対して)にも動かす為に接合部部分,特に隅角部には著しい破壊がみられた.梁のひび割れはプレストレス導入の効果と柱コンクリートに先に大きくひび割れが入ってしまうことからそれほど多く見られなかった.4方から梁の接続する立体柱梁接合部がせん断破壊することが確認された.PCaPC接合部の性能評価を試みた結果,接合部のせん断ひび割れ幅とせん断変形角との間にはせん断変形角が0.5%から0.6%で勾配が変わる2つ折れ線の線形性を有する評価式を得るとともに,PC接合部はRC接合部に比べてプレストレス力によって損傷低減効果が期待できることが明らかになった.
DNAメチル化を基盤とした転写制御機構および発癌関連性の解明

DNAメチル化というエピジェネティックな遺伝情報は、特異的な結合タンパク質群によって解読されており、その結果、遺伝子抑制およびクロマチン形成が行われている。メチル化DNA結合ドメイン(MBD)をもつタンパク質(MBD1、MBD2、MBD3、MeCP2)による転写抑制はヒストン脱アセチル化酵素複合体(HDAC)と共同していると報告されているが、その詳細は不明な点が多い。とりわけMBD1による転写抑制はHDAC阻害剤で解除されにくいことから、MBD1の転写抑制ドメインを用いて酵母2ハイブリッド法を行った。その結果、新規メディエーター分子MCAF (methylated chromatin associated factor)の同定に成功し、MBD1はMCAFを介して基本転写因子群やRNAポリメラーゼII、さらに転写因子と相互作用することで遺伝子を直接的に不活化することが判明した。また、MBD1のMBD自身も中等度の転写抑制効果を保有することもすでに報告していたがその機能については不明であった。今回、私たちはタンパク・クロマチン免疫沈降法あるいは免疫染色法によりMBDがヒストンメチル化転位酵素Suv39h1と結合することを明らかにした。興味深いことにMeCP2もMBD領域にもヒストンメチル化活性が認められた。以上の結果からMBD1の転写抑制のメカニズムはヒストンの脱アセチル化よりはむしろ転写の開始を直接抑制する新規のクロマチンの形成し、さらにはヒストンのメチル化を促進することでヘテロクロマチンも形成し転写を強固に抑制していることを明らかにした。DNA中のシトシンのメチル化は哺乳類のゲノムを修飾する唯一の生理的な機構であり、不活性なヘテロクロマチンと強く相関しており遺伝子発現を負に制御している。ゲノムインプリンティングやX染色体不活性化はエピジェネティックな現象であり、DNAメチル化により調節されている。また多くの腫瘍で全体的なメチル化の低下によるゲノムの不安定性および癌抑制遺伝子のプロモーター領域の異所性メチル化が確認されており癌の悪性化、進展の助長に働いていると考えられる。MBD1はメチル化DNAを認識して転写を抑制するメチル化CpG結合タンパク質群に含まれるが、他の相同タンパク質とは異なりその転写抑制機構はヒストン脱アセチル化酵素に非依存的であった。転写抑制部位を用いた酵母ツーハイブリッドの結果、新規メデイエーター分子MCAF (MBD1-containing chromatin associated factor)の同定に成功した。MCAFは細胞内の非メチル化プロモーター上では直接転写因子Sp1、基本転写装置と結合することでより転写を活性化するコアクチベーターであることがわかった。一方、メチル化プロモーター上ではMBD1と結合することでSp1あるいは基本転写装置との結合活性が弱まり、結果的にSp1転写活性化複合体のDNA上への結合を阻害していることが判明した。転写因子Sp1はエンハンサー様の転写因子であることで知られており、標的プロモーターから約2kbの距離を置いても転写を活性化することが可能である。このことはMBD1も遠隔部位から強力な転写抑制効果を示す点で一致する。以上の結果からMBD1の転写抑制のメカニズムはヒストンの脱アセチル化よりはむしろ転写の開始を直接抑制する新規のクロマチンの形成することでメチル化非感受性転写因子Sp1の結合を阻害していることが示唆された。
口蓋形成の分子基盤

本研究では我々が同定したLIMホメオドメイン遺伝子の一種であるL3/Lhx8が胎児発生の過程で口腔周囲部の中胚葉組織に特異的に発現することを受けて、本遺伝子のノックアウトマウスを作成することにより口腔を形成する組織(口蓋、歯、舌等)の形成にL3/Lhx8遺伝子がどのような機能を及ぼすかについて検討した。ノックアウトマウスは例外なく口蓋裂を発症し、本遺伝子が口蓋の形成、特に胎児期の口蓋板の癒合に必須であることが示唆された。L3/Lhx8遺伝子と構造類似のLhx6遺伝子の発現も口蓋形成の過程においてよく似通ったパターンを呈することを認めたが、L3/Lhx8遺伝子の方がより広く、且つより強く発現していることが明らかとなった。我々はノックアウトマウスにおいて、口蓋板癒合に関わる遺伝子に異常をきたしているとの仮説を立て、細胞-細胞相互作用に関わる可能性が考えられる細胞外基質、接着因子、成長因子及びそれらの受容体遺伝子の発現を組織学的にノックアウトマウスと野生型マウスの間で比較検討を行った。その結果ノックアウトマウスの口蓋において特異的にDecorinの発現が上昇していることを見出した。DecorinはTGFβのデコイ受容体として機能していることが知られていること、及びTGFβ3のノックアウトマウスがL3/Lhx8遺伝子のノックアウトマウスと非常に良く似た口蓋裂発症頻度を呈することから、L3/Lhx8ノックアウトマウスではDecorinがTGFβの機能を阻害することにより口蓋裂発症に至っていると考えられた。さらに器官培養系でL3/Lhx8ノックアウトマウス由来の口蓋癒合不全が培地にTGFβを添加することで救済されること、及びレチノイン酸誘導性の口蓋裂組織においてもDecorinの発現が上昇していることなどから口蓋形成にL3/Lhx8-Degorin-TGFβのシグナル伝達経路が重要であることを示した。L3/Lhx8 KOマウスは、非症候群性口蓋裂を呈し、TGFβ3KOマウスと表現型が酷似している。TGFβシグナル伝達系関連因子について解析したところ、唯一変化があったものはプロテオグリカンの一種Decorinであった。野生型と比較してL3/Lhx8 KOマウスではDecorinのmRNA発現領域が拡大していることをin situ hybridizationで確認し、その結果口蓋突起におけるmRNA発現量が約2倍に上昇していることを定量的RT-PCRで確認した。(Zhang et al.論文投稿中)。また野生型マウスの口蓋組織においてDecorinと構造類似のByglicanの双方をIn situ hybridization法を用いて発現のパターンを比較したところDecorinが口蓋突起癒合部の中胚葉組織に強く発現するのに対し、Byglicanは口蓋中心部の軟骨部に主に発現することを見出した(Zhang et al. Developmental Dynamics, in press)。次に野生型とKOマウスにおいて口蓋突起培養系を確立し、TGFβの影響を見た。野生型マウス由来の口蓋突起を器官培養すると生体内と同様に癒合が起こるのに対し、KOマウス由来の口蓋突起は近接して培養しても癒合は起こらない。更にこのKOマウスの口蓋突起ではDecorin蛋白の発現が上皮直下の基底膜に強く認められ、且つTGFβ蛋白群もその部位に強く局在することが明らかとなった。これはDecorinがTGFβを結合することにより本来機能すべき上皮での発現を低下させていることを示唆している。

そこでこの培養系にTGFβ3を添加したところ、容量依存的に口蓋突起の癒合が促進された(Zhang et al.論文投稿中)。以上の結果はDecorinが口蓋突起上皮におけるTGFβの活性を調節していること、及びL3/Lhx8がDecorinの発現に影響を及ぼしていることを示している。口蓋形成のおけるL3/Lhx8遺伝子の機能を平成14年度に引き続き、ノックアウトマウスを用いて解析を行った。野生型マウスとノックアウトマウスにおけるDecorin (プロテオグリカンの一種)の発現の違い(野生型に比してノックアウトマウスではDecorinの発現が口蓋突起上皮直下の間葉系組織において上昇している)に着目した。Decorinは口蓋突起癒合に重要な役割を担っているとされるTGFβを高親和性に結合することが知られており、シグナル伝達を行うTGFβ受容体にTGFβが結合することを阻害することが近年明らかとなってきている。我々はL3/Lhx8遺伝子が何らかの機序でDecorinの発現を間葉系組織で抑制しており、ノックアウトマウスではこの抑制が解除されたためにDecorinの発現上昇とそれに引き続くTGF βの機能不全、口蓋突起癒合の阻害に至るのではないかという仮説を立てた。この仮説を裏付ける現象として、1)ノックアウトマウスの口蓋突起ではTGFβ3の分布が野生型に比して上皮直下の間葉系組織に集中していること。2)ノックアウトマウスの口蓋突起では上皮の細胞分裂が野生型に比して低下していること(TGFβは上皮の分裂を促すことが知られている)などが観察された。ノックアウトマウスの口蓋突起を摘出して器官培養を行う際に、二つの突起を物理的に近接させても突起の癒合は観察されない。しかしこの培養系にTGFβ3を添加すると用量依存的に突起の癒合が観察されるようになる(Development、in revision)。この結果はL3/Lhx8遺伝子のノックアウトによる口蓋突起癒合不全がTGFβの機能に依存していることを示している。また我々はニワトリ口蓋突起を用いてL3/Lhx8遺伝子の発現を制御している因子の検索にも取り組んだ。ニワトリ口蓋突起で上皮を酵素処理で除去しておくとL3/Lhx8遺伝子の中胚葉組織での発現が観察されなくなる。よって上皮からの因子がL3/Lhx8遺伝子の発現を誘導している可能性が考えられた。
非対称環状ペプチドの立体構造の安定性と生理活性との相関

以前より、海洋生物由来の顕著な生理活性を示す対称及び非対称な環状ペプチドの立体構造について研究を行っている。これまでの研究結果からアシジアサイクラマイド、ユリチアサイクラマイド、パテラマイドAの立体構造は、溶液中においても結晶中においても化学構造と同様にC2対称で関係づけられるコンフォメーションを取るのに対し、化学構造が2回対称から大きくずれているパテラマイドB、C、Dの立体構造はねじれた非対称のコンフォメーションを取るということを明らかにした。以上のことから一連の環状ペプチドの立体コンフォメーションの差異と殺細胞活性との間には強い相関性が考えられるとともに、分子内対称構造からのずれがこれら化合物のとる活性型コンフォメーションの形成に大きく関与している可能性を示唆した。この様な実験結果の背景のもと今年度はアシジアサイクラマイドの一方のi-ロイシンを(1)ロイシン(2)グリシン(3)フェニルアラニンに置換した誘導体をそれぞれ合成し、NMRによる溶液中でのコンフォメーション解析を行った。その結果誘導体(1)は結晶中での立体構造と同様のC2対称で関係づけられるコンフォメーションを取るのに対し誘導体(2)(3)は8の字にねじれた非対称のコンフォメーションを取るということを明らかにした。今後はそれら誘導体のX線構造解析による結晶中でのコンフォメーション解析及びL1210細胞を用いた殺細胞活性の測定等を行い、結晶場及び溶液状態での立体コンフォメーションとの相関性に関して詳細な検討を行う。更に芳香環のついていないより大きな疎水性の側鎖に置換した誘導体と芳香環をもつトリプトファン誘導体を合成し同様の研究を実施していく予定である。
Ⅲ型分泌装置阻害剤のケミカルバイオロジー解析と新たな天然物リガンドの発掘

特異的に結合するタンパク質を同定した。一つは結合タンパク質として知られているEF-Tuと結合未知の遺伝子Xであった。タンパク質Xについて、遺伝子欠損株、ベクター相補株、および遺伝子X相補株をそれぞれ作製し、溶血阻害活性およびT3SSを構成する分泌タンパク質であるEspタンパク質群の分泌を検出した。その結果、遺伝子X欠損株で溶血活性は消失した。遺伝子X相補株では溶血活性は部分的に回復した。さらに、遺伝子X欠損株でEspA, B, CおよびDの分泌量は減少した。遺伝子X相補株ではその分泌量の減少が部分的に回復した。したがって、遺伝子XがT3SSの発現に関与していることが明らかとなった。加えて、平成27年度は調製・供給された糸状菌培養物2,208サンプルおよび放線菌培養物1,760サンプルの合計3,968サンプルを用いて、EPECを検定菌として羊赤血球の溶血阻害活性を指標に3型分泌装置阻害剤の探索を実施した。結果として、Streptomyces sp. K14-0012株培養物より、guadinomine AおよびBをそれぞれ単離・構造同定した。予定通りに研究を実施できたために、平成27年度の研究成果はおおむね達成されている。現在までに、aurodox/agarose-beads化体を用いて、特異的に結合する3つのタンパク質をコードする遺伝子破壊株の作製を行っている。あわせて標的タンパク質候補の遺伝子クローニングを行い標的タンパク質の発現と精製も検討している。加えて放線菌、糸状菌培養物から2,208検体、1,760検体の合計3,968検体を用いてスクリーニングを行った。一次通過基準(溶血を示さなかったもの):12サンプル、二次通過基準(抗菌活性を示さなかったもの):1サンプルであった。Streptomyces sp.K14-0012株培養物より、guadinomine AおよびBと推定される化合物をそれぞれ単離した。平成28年度においても微生物培養物より3型分泌装置阻害剤の探索を実施可能である。特異的に結合する3種類のタンパク質を同定している。一つは既に結合タンパク質として知られているEF-Tuであり、残り二つはタンパク質XおよびYであった(論文未発表のため未記載)。EF-TuがT3SSの発現に関与しているか否かを検証するために、EF-Tu阻害剤として知られているpulvomycinのT3SSによる溶血阻害活性および抗菌活性を調べた。その結果、T3SS阻害剤であるaurodoxと比較し、pulvomycinはtetracyclineと同様な阻害活性プロファイルを示したことから、EF-Tu阻害活性がT3SSの機能に関与しないことが示唆された。次に、標的分子候補タンパク質Xについて、遺伝子欠損株、ベクター相補株、および遺伝子X相補株をそれぞれ作製し、溶血阻害活性およびT3SSを構成する分泌タンパク質であるEspタンパク質群の分泌を検出した。その結果、遺伝子欠損株で溶血活性は消失した。遺伝子X相補株ではその溶血活性は部分的に回復した。さらに、遺伝子欠損株でEspA, B, CおよびDの分泌量は減少していた。この結果から、遺伝子XがT3SSの発現に関与し、溶血活性を制御していることが初めて明らかとなった。期間内の研究によりEPECの病原性発現に関わる主要な因子として知られているT3SSの阻害剤aurodoxの標的分子の1つを同定し、その遺伝子XがT3SSを構成するEspタンパク質群の分泌を制御することを初めて明らかにした。今後は、遺伝子Xの機能をaurodoxが阻害するか否かを検証する。そして、遺伝子XとT3SS発現およびその機能との因果関係を明らかにすることで、T3SS阻害物質を含めた薬剤の研究開発に有用な知見を得ることができると考えられる。EF-Tu阻害剤として知られているpulvomycinのT3SSによる溶血阻害活性および抗菌活性を調べた結果、T3SS阻害剤であるaurodoxと比較し、pulvomycinはtetracyclineと同様な阻害活性プロファイルを示したことから、EF-Tu阻害活性がT3SSの機能に関与しないことが示唆された。次に、標的分子候補タンパク質Xについて、遺伝子欠損株、ベクター相補株、および遺伝子X相補株を用いた実験により、遺伝子欠損株で溶血活性は消失した。さらに遺伝子X相補株ではその溶血活性は部分的に回復した。以上の3点の結果から、遺伝子XがT3SSの発現に関与し、溶血活性を制御していることが初めて明らかとなった。これらのことが期間内の研究により明らかになったことで、本研究課題はおおむね順調に進展していると考えられる。MALDI-TOF/MS実験において異的に結合する3種類のタンパク質を同定している。これらの結果を別方法で検証するために、iTRAQタンパク質発現・相対定量解析を行った。本解析方法は2つのサンプルを用い、片方のサンプルを基準とした時、もう一方のサンプルで“あるタンパク質"が何倍検出されたかを解析する方法である。今回の場合aurodoxの対象としてtetracyclineを用いた。理由として、aurodoxはEF-Tuに作用することにより、タンパク質合成をすると言われている。そのため、近い作用点を持つtetracyclineを用いることで、aurodoxのT3SSに結合タンパク質が浮き彫りになると考えた。

それぞれのビーズを既存の方法にそって作製し、サンプルを作製、解析した。それぞれのビーズでおよそ3,000個のタンパク質が同定され、tetracycline-beadsに比べてaurodox-beadsで優先的に同定されているタンパク質143種類(p<0.06)について分類した。これらタンパク質は10種類に分類され、EF-Tu、標的タンパク質候補XとYが再度検出された。したがって、違う解析方法用いてもこれらタンパク質が検出されることがわかった。一つは既に結合タンパク質として知られているEF-Tuであり、残り二つはタンパク質XおよびYであった(論文未発表のため未記載)。溶血活性および分泌タンパク質による検証から標的タンパク質候補XがT3SSに関与していることが示された。続いて標的タンパク質候補Xの溶血活性に必要な機能部位の同定を行った。アミノ酸配列のC末端側をいくつかの長さで欠損させた標的タンパク質候補X欠損変異株を作製し、溶血活性が回復する部位の同定をおこなった。その結果、標的タンパク質候補X欠損変異株の解析で溶血活性に必要なドメインを同定した。特異的に結合するタンパク質を同定した。一つは結合タンパク質として知られているEF-Tuと結合未知の遺伝子Xであった。タンパク質Xについて、遺伝子欠損株、ベクター相補株、および遺伝子X相補株をそれぞれ作製し、溶血阻害活性およびT3SSを構成する分泌タンパク質であるEspタンパク質群の分泌を検出した。その結果、遺伝子X欠損株で溶血活性は消失した。遺伝子X相補株では溶血活性は部分的に回復した。さらに、遺伝子X欠損株でEspA, B, CおよびDの分泌量は減少した。遺伝子X相補株ではその分泌量の減少が部分的に回復した。したがって、遺伝子XがT3SSの発現に関与していることが明らかとなった。おおむね順調に進展しているので、平成28-29年度の研究計画に沿って研究を推進する。Aurodoxの標的タンパク質候補の分子生物学的・生化学的実験を実施し、標的タンパク質が3型分泌装置の発現や機能に影響を与えているか検証する。加えて、平成28-29年度においても調製・供給される微生物培養液サンプルを用いて、3型分泌装置阻害剤の探索をEPECを検定菌として実施する。今後は、遺伝子Xの機能をaurodoxが阻害するか否かを検証する。遺伝子Xの機能ドメイン解析およびaurodoxが結合する構造ドメインを決定する。さらに、遺伝子XとT3SS発現およびその機能との因果関係を明らかにすることで、T3SS阻害物質を含めた薬剤の研究開発に有用な知見を得ることができると考えられる。また、溶血阻害活性を指標とした微生物培養物サンプルからのさらなるT3SS阻害物質の探索も同時に実施する。以上のことを前提にして最終年度の計画にそって本研究課題を実施する。天然物化学
非一様な界面活性剤水溶液における乱流境界層の流動抵抗低減メカニズムの解明

水の平板上乱流境界層流れに、壁面から界面活性剤水溶液を注入した場合の抵抗低減(DR)メカニズムの解明を目的として、溶液注入システムを構築し、流れ場の可視化観察ならびにLDV計測を行った。本研究により、界面活性剤水溶液を注入した(非一様な)場合、壁面に平行な層状の流れが下流に向けて発達し、壁面垂直方向の拡散が著しく抑制されること、ならびに一様な場合と同様にDRにより速度分布が整理できることが判った。水における平板上乱流境界層流れに、壁面から界面活性剤水溶液を注入することにより、非一様な濃度場を生成し、注入速度、注入時間、及び注入角度を変化させることにより、紐状ミセルのネットワーク構造の乱流境界層内における存在位置を制御し、抵抗低減(DR)効果との関係を解明することを本研究の目的としている。本研究目的を達成するため、平成21年度においては,以下の手順で研究を推進した。手順1)テストプレート及び溶液注入システムを構築手順2)トラバースシステムを構築手順1)として、界面活性剤水溶液の注入用スロットを有するテストプレート(アクリル製)及び溶液注入システム(ステンレス製)を構築した。溶液の注入速度と注入時間は、ステッピングモータの回転速度をPCで制御することにより変化させることが出来るようにした。注入スロットはテストプレートから取替え可能な機構とした。手順2)として、既存のテスト流路の側面方向ならびに鉛直方向の直交する2方向からの撮影が可能となるように、高解像度デジタルビデオカメラを電動アクチュエータ機能付きのトラバース装置に設置した。それらをPC制御することによって、下流に同時に移動させることが出来る機構にした。以上により、乱流境界層に注入した界面活性剤水溶液の拡散の様子を撮影することが出来るようになった。平成22年度は、界面活性剤の濃度分布の測定を行い、抵抗低減率と速度場との関係を明らかにする予定である。水の平板上乱流境界層流れに、壁面から抵抗低減界面活性剤水溶液を注入した場合の速度場の詳細を明らかにし、抵抗低減メカニズムを解明することを本研究の目的としている。本研究目的を達成するため、平成22年度においては,以下の順序で研究を推進した。1.可視化観察による乱流構造の解明2.LDV計測によるDR効果及び乱流統計量の解明1においては、主流方向および壁面垂直方向断面、ならびに主流方向およびスパン方向断面をスリットレーザーにより光切断し、その断面を高解像度デジタルビデオカメラにより撮影した。これより、界面活性剤水溶液を注入した場合、壁面に平行な層状の流れが下流に向けて発達し、水注入の場合よりも壁面垂直方向の拡散が著しく抑制されること、ならびに壁面近傍のストリーク構造のスパン方向間隔が広くなることが明らかになった。2においては、異なる主流方向位置において、主流方向および壁面垂直方向速度成分のLDV計測を実施した。界面活性剤水溶液注入の場合、同濃度の一様な界面活性剤水溶液の境界層流れよりも抵抗低減率(DR)が大きいことが明らかになった。また、壁変数で正規化された平均速度分布は、界面活性剤水溶液注入の場合、一様な界面活性剤水溶液流れの場合に関係なく、DRにより速度分布を整理できることが判った。さらに、界面活性剤水溶液注入の場合には,壁面ごく近傍における壁面垂直方向乱れ強さが、一様な界面活性剤水溶液流れの場合よりも小さくなることが明らかになった。以上、平成22年度においては、壁面から界面活性剤水溶液を乱流境界層に注入した場合の可視化観察およびLDV計測により、乱流構造、抵抗低減率、乱流統計量の詳細を明らかにすることが出来た。
精神障がい者の家族のFamily Resilienceを促進するガイドライン作成

本研究の目的は、精神障がい者の家族のFamily Resilienceを明らかにし、精神障がい者を家族員にもつ家族への効果的な看護支援方法の開発を行うことである。精神障がい者の19家族を対象とした面接から、73の精神障がい者の家族のFamily Resilience特性が明らかになった。精神科看護師8名を対象とした面接から、精神障がい者の家族のFamily Resilienceを促進する25の看護支援方法が明らかになった。明らかになった特性は、精神障がい者の家族を支援する際のアセスメント視点として、また、看護支援方法は支援モデルとしての活用が可能である。今年度の目標は、1精神障がい者の家族のFamily Resilienceの特性と獲得方法を明らかにすること、2その結果の洗練化である。概念分析の結果抽出されたFamily Resilienceの特性である、「家族の楽観的な未来志向」「家族の逆境への意味づけと受容」「家族の自己の能力への信頼」「家族の挑戦・対処」「家族の資源の活用と資源に繋がる力」「家族のゆるぎない拠り所」「家族の調整・統制」を手掛かりに、12家族へのインタビューが終了している。現在、インタビューデータから、Family Resilienceの特性を明らかにしようとしている段階である。12家族の発病からの経過年数は、1045年であった。「家族の逆境への意味づけと受容」「家族の挑戦・対処」「家族の資源の活用と資源に繋がる力」は、比較的多くの家族から語られたが、「家族の自己の能力への信頼」は、発病から何十年も経過した家族であっても語られることは少なかった。自己の能力への信頼は、介護経験を重ねるだけで得られるものではないことが明らかになりつつある。また、発病当時に診断名を明確に伝えられなかったことによって、症状軽快とともに服薬を中断し、再発した家族、定期薬をイライラした時にだけ服薬すればよいと理解していたために、症状のコントロールがうまく出来ず苦労した家族が存在していた。Family Resilienceの促進を阻害する要因も明らかになりつつある。平成26年度の目標は、前年度に計画していた精神障がい者の家族のFamily Resilienceの特性と獲得方法に関する結果を受けて、1精神障がい者の家族のFamily Resilienceを促進する看護支援方法の抽出、2精神障がい者の家族のFamily Resilienceを促進する看護支援方法・類型化に関する結果の洗練化であった。発病からの経過の短い家族へのインタビューが滞り、看護支援方法の抽出・類型化には至っていないが、経過の短い家族へのインタビューを行うことができ、19家族へのインタビューが終了した。現段階で、「家族の結束を強める」「希望を持って前に進む」「状況に対処する」「地域社会の理解と仲間との繋がり」「社会資源の活用」「状況を楽観的に受け止める」「現実的な回復目標を持つ」「病者と共に生きる覚悟を決める」「家族としてのありようへの納得」を含む12の特性が抽出された。現在、明らかになっているこれらの特性がどのような関係性にあるかの検討を進めている。その結果、Family Resilienceが単に時間経過によって促進されるものではないこと、家族内の力は必要であるがそれだけではなく、社会から理解されることや仲間と繋がれることといったように、家族外との関係性も影響していることが明らかになった。また、精神障がいのように長きに渡り家族の世話が必要な家族には、家族の力を枯渇させないように働く特性が存在しているようである。平成27年度の目標は、過去2年間の成果(精神障がい者の家族のFamily Resilience特性の明確化、および精神科看護師が家族のFamily Resilience促進に向けておこなっている看護支援方法の抽出)から、精神障がい者の家族のFamily Resilienceを促進するガイドラインを作成することであった。発病から経過の短い家族の研究協力を得ることが難しく、インタビューが滞っていたため、精神障がい者の家族のFamily Resilience特性の明確化に2年間を要した。そのため、今年度、精神科看護師が家族のFamily Resilience促進に向けておこなっている看護支援方法の抽出・類型化を行った。精神科看護師8名を対象に、12回の半構造化面接を実施した。看護師の経験年数は、1038年、平均21.8年であった。看護師が精神障がい者の家族のFamily Resilienceを促進するために実践している看護支援方法として、「家族間のコミュニケーションを改善し、活性化する」「家族が抱え込んでいる気持ちを吐き出せるようにする」「社会資源の活用を促す」等、25の方法が抽出された。平成25年度に計画していた精神障がい者の家族へのインタビューのうち、発病からの経過が短い家族へのインタビューが滞っていた。理由は、対象者の協力が得られにくかったためである。

時間経過は、Family Resilienceにとって重要な要素であるため、経過の短い家族のデータは欠かすことが出来ないと考え、本年度もデータ収集に時間を費やした。精神看護学研究計画では、看護者へのインタビューから精神障がい者の家族への支援方法を明らかにして、精神障がい者の家族のFamily Resilienceを促進するガイドライン作成に結びつける予定であったが、研究計画を変更する。まず、現在明らかになっている特性とそれら特性の関係性をもとに、研究者がガイドライン(案)を作成し、その後看護師にインタビューを実施する。インタビューでは、まず看護師に精神障がい者の家族を上手く支援出来たと考える場面について語ってもらう。その後、ガイドライン(案)を提示してガイドライン(案)との比較や研究者との議論を通して妥当性について検討してもらうこととする。データ収集の遅延。現在、6施設に研究協力者の紹介を依頼している。協力の得られた家族は、発病からの経過が1045年と長く、発病後の経過が短い家族へのインタビューが実施できていない。今年度実施予定であったエキスパートナースへのインタビューが滞ったために、インタビューに係る交通費、及び謝礼を中心に次年度使用額となった。研究課題の達成には、発病後の経過が短い家族のデータも必要である。現在依頼中の各施設に、再度、経過の短い家族の紹介を依頼する。また、訪問看護を実施している施設や病院家族会を有している施設を中心に、依頼施設数を増やす。今後は、経過の短い家族のデータ収集と既に集まっているデータの分析を並行して行い、結果を洗練化する。また、エキスパートナースの看護支援方法を明らかにするためのインタビューを準備する。エキスパートナースへのインタビューを進める。また、最終年度となる為、ガイドライン作成に向けて、研究分担者と頻回に議論する機会を設ける。更に、成果発表に向けた費用として使用する予定である。データ収集遅延により、データ収集の為の旅費と協力者への謝金が予定通り使用できなかった。次年度からは、発病からの経過が短い家族のデータ収集、およびエキスパートナースのデータ収集に力を入れる。研究依頼施設数を増やす予定であり、県外でのデータ収集が増えると予測される。次年度使用額を、この費用として使用する予定である。
皮膚苔癬反応におけるランゲルハンス細胞によるCD8 T細胞抑制機構の解明

自己免疫性CD8 T細胞が制御する苔癬反応モデルマウスにて、免疫反応標的となっている表皮に常在するランゲルハンス細胞を、遺伝子組換え手法を用いて除去したところ、苔癬反応は増強し、皮膚組織に浸潤する自己反応性CD8 T細胞数が増加していた。抗原刺激したCD8 T細胞培養系にランゲルハンス細胞を共培養すると、CD8 T細胞のアポトーシスが増加し、増殖反応も抑えられていた。このことより、ランゲルハンス細胞は、活性化CD8 T細胞数を抑制することで、疾患制御に働いていると考えられる。ヒトKeratin14プロモーター下に卵白アルブミン(OVA)遺伝子を連結した遺伝子断片を挿入したトランスジェニック(Tg)マウスは、表皮角化細胞にOVAを発現する(K14-mOVA Tgマウス)。このをレシピエントとし、OT-IマウスをドナーとしてOVA特異的T細胞受容体(TCR)-Tg CD8 T細胞であるOT-I細胞を1 ×106個、経静脈的に移入すると、4日後より移植片対宿主病様に体重減少とびらんを伴う皮膚粘膜疾患を発症し、皮膚病理組織学的には液状変性を伴う苔癬反応を認める。ランゲルハンス細胞マーカーのLangerinにジフテリア毒素受容体を連結した遺伝子を挿入したTgマウス(Langerin-DTRマウス)とK14-mOVA Tgマウスを掛け合わせ、Langerin-DTR/K14-mOVA Tgマウスを作成し、シフテリア毒素を投与すると、ランゲルハンス細胞を欠損するが、このマウスへOT-I細胞移入を行うと、皮膚粘膜症状は悪化した。また、OT-I細胞をOVA CD8エピトープペプチド提示細胞で刺激すると顕著な増殖反応を呈するが、この疾患モデルの皮膚をトリプシン処理して回収した表皮細胞から磁気細胞分離法Epidermal Langerhans cell Microbeads kit (Milltenyi Biotec)でランゲルハンス細胞を採取して、上述のOT-I細胞増殖系に加えると、この増殖反応を抑制することが分かった。つまり、ランゲルハンス細胞は、皮膚組織局所にて自己反応性CD8 T細胞の増殖を抑えることを介し、苔癬反応において疾患抑制的働きを持つことが明らかにされた。計画通りに進んでいる。移植片対宿主病(GVHD)や全身性エリテマトーデスなどの皮膚症状は自己免疫反応によって生じる病態であり、病理組織ではT細胞の表皮内浸潤や表皮角化細胞死などの苔癬反応を呈している。この病態生理は未だ不明で、また表皮に常在する抗原提示細胞であるランゲルハンス細胞の機能も分かっていない。そこで、表皮角化細胞特異的に卵白アルブミン(OVA)が発現しているトランスジェニックマウス(Keratin14-promoter-membrane OVA transgenic; K14-mOVA Tgマウス)で、OVA特異的CD8T細胞(OT-I細胞)を移入することで、病理組織像で苔癬反応を伴ったGVHD様の皮膚症状を起こすモデルマウスを用いて解析を行った。Langerinにジフテリア毒素受容体(DTR)が導入されたマウス(Langerin-DTR Tgマウス)にDTを腹腔内投与するとランゲルハンス細胞が除去されたマウスを作製できる。このマウスを交配してLangerin-DTR/K14-mOVA double Tgマウスを作製し、DTを投与しランゲルハンス細胞を除去した後に、OT-I細胞を移入したところ、ランゲルハンス細胞除去マウスにて、GVHD様皮膚症状は増強した。そこで、OVA CD8エピトープ(SIINFEKL)提示Naive脾臓細胞を抗原提示細胞としOT-I細胞と共培養すると、OT-I細胞は増殖するが、ここへK14-mOVA Tgマウスの全身皮膚から磁気細胞分離法でランゲルハンス細胞のみを回収して加えると、コントロールとして、K14-mOVA Tgマウス脾臓樹状細胞を加えた場合と比べて、OT-I細胞はよりアポトーシスを起こしていた。以上より、ランゲルハンス細胞は、自己抗原に反応するCD8 T細胞にアポトーシスを誘導することでGVHD様皮膚疾患を抑制する機構を持つと考えられる。予定通り進捗しており、来年度で完成できると考えている。このマウスをレシピエントとし、OT-IマウスをドナーとしてOVA特異的T細胞受容体(TCR)-Tg CD8 T細胞であるOT-I細胞を1 ×106個、経静脈的に移入すると、4日後より移植片対宿主病様に体重減少とびらんを伴う皮膚粘膜疾患を発症し、皮膚病理組織学的には液状変性を伴う苔癬反応を認める。