hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
グリア細胞を支点とした加齢性長期記憶障害の分子・神経機構の解明

ショウジョウバエでは羽化後20日以降で長期記憶に顕著な障害が現れる。これまでの研究から、加齢脳ではグリア細胞と神経細胞間の接着因子として働くKlgの発現が低下し、その結果グリア細胞特異的転写因子Repoの長期記憶学習後の発現上昇が抑制されることが分かった。そこでグリア細胞でRepoの発現を上昇させたところ、加齢性長期記憶障害が顕著に改善すること、長期記憶学習によりRepo依存性に興奮性アミノ酸トランスポーター(deaat1)の発現が上昇する一方で、Repoの発現が低下している加齢体では長期記憶学習によるdeaat1の発現上昇が起こらないことを見出した。これらの結果から、長期記憶学習で上昇した神経細胞の興奮性を、deaat1の発現上昇によりクールダウンさせることが、その後の記憶情報の安定化に必要なことが示唆された。そこでNMDA受容体の阻害剤を長期記憶学習後に摂取させたところ、Repoの過剰発現同様、長期記憶が顕著に改善することが分かった。以上の結果を背景に、今年度は細胞死シグナルの上昇が、特に想起に関わることが示唆されているMB060Bドーパミン作動性神経細胞群での細胞死シグナル上昇が主たる原因であり、このMB060Bドーパミン神経細胞群で細胞死シグナルを抑制すると、加齢性長期記憶障害が顕著に改善することが分かった。即ち、長期記憶学習後に細胞死シグナルの主要因子カスパーゼの阻害タンパクP35をMB060Bに強制発現させたところ、加齢性長期記憶障害の顕著な改善が見られた。一方で他のドーパミン作動性神経やグルタミン作動性神経、記憶中枢のキノコ体神経細胞などでP35を発現させても加齢性長期記憶障害の改善は見られなかった。計画通りに加齢性長期記憶障害の原因となるグリア細胞でのklg/Repo/deaat1経路を行動遺伝学的手法により明らかにし、長期記憶学習後の神経活動の沈静化が加齢体では十分でないことを解剖学的解析から明らかにし、神経保護薬を使った行動薬理学的解析からも確認出来た。またドーパミン作動性神経細胞の機能分類を進め、感覚情報の連合・強化に関与するドーパミン作動性神経と想起に関与するドーパミン作動性神経が異なる細胞群を形成することが分かった。加齢性長期記憶障害では、長期記憶学習後の安定化の過程でklg/Repo/deaat1経路活性不全により、細胞死シグナルが特に想起に関与するMB060Bドーパミン作動性神経細胞で誘導されることが加齢性長期記憶障害を引き起こすこと、さらに長期記憶学習後にリハーサル想起を伴う記憶情報の再統合が起こることなど、新たな記憶機構の概念とその神経基盤を示唆する成果も得られた。以上のことから概ね順調に進展していると判断した。これまでの研究から、短期記憶の「想起」にのみ必要なMB060Bドーパミン作動性神経が、長期記憶では想起過程のみならず長期記憶学習後の安定化の過程にも必要なことが分かった。このことから「安定化の過程では獲得した記憶情報の想起を繰り返すリハーサルにより長期記憶情報が安定化する」との仮説を立てた。そこでin vivoイメージングにより長期記憶学習後MB060Bドーパミン作動性神経の神経活動とシナプス小胞開口放出を顕微鏡下に固定した老齢体および若齢体で観察し、安定化過程でのリハーサルを検証する。さらに加齢性長期記憶障害を抑制する薬理学・遺伝学的操作が安定化過程でのMB060Bドーパミン作動性神経の神経活動とシナプス小胞開口放出にどのような影響を与えるか調べる。加齢性長期記憶障害(LTM-AMI)とグリア細胞でのklg/Repo/deaat1との因果関係を調べるため、Geneswitch systemにより加齢体のグリア細胞でRepoまたはdeaat1を過剰発現させたところ、いずれもLTM-AMIが顕著に改善された。さらに加齢体でRepoを強制発現させると低下していたdeaat1の発現が回復した。そこでdeaat1がグルタミン酸トランスポーターであることをふまえ、加齢体では長期記憶学習により上昇した神経活動が、学習終了後も低下しないことがLTM-AMIに関与することが示唆された。そこで神経活動の指標となるS6リボゾーマルタンパクのリン酸化状態を長期記憶学習後の加齢体で調べたところ、若齢体に比して顕著に上昇していることが分かった。さらに長期記憶学習後の個体に神経活動を抑制する神経保護薬を摂取させたところLTM-AMIの顕著な改善が観られた。以上の結果から若齢体では長期記憶学習後に上昇した神経活動(放出された過剰な細胞外グルタミン酸)がklg/Repo/deaat1経路により速やかにグリア細胞に回収されるのに対して、加齢体では十分な回収が行われないため記憶の保持、または読み出しが障害されることが示唆された。研究計画どおりに加齢性長期記憶障害(LTM-AMI)とグリア細胞でのklg/Repo/deaat1との因果関係を行動遺伝学的手法により明らかにし、長期記憶学習後の神経活動の沈静化が加齢体では十分でないことを解剖学的解析から明らかにし、神経保護薬を使った行動薬理学的解析からも確認出来た。以上の進捗を鑑みて概ね順調に進展しているとした。

そこでグリア細胞でRepoの発現を上昇させたところ、加齢性長期記憶障害が顕著に改善すること、長期記憶学習によりRepo依存性に興奮性アミノ酸トランスポーター(deaat1)の発現が上昇する一方で、Repoの発現が低下している加齢体では長期記憶学習によるdeaat1の発現上昇が起こらないことを見出した。これらの結果から、長期記憶学習で上昇した神経細胞の興奮性を、deaat1の発現上昇によりクールダウンさせることが、その後の記憶情報の安定化に必要なことが示唆された。そこでNMDA受容体の阻害剤を長期記憶学習後に摂取させたところ、Repoの過剰発現同様、長期記憶が顕著に改善することが分かった。以上の結果を背景に、今年度は細胞死シグナルの上昇が、特に想起に関わることが示唆されているMB060Bドーパミン作動性神経細胞群での細胞死シグナル上昇が主たる原因であり、このMB060Bドーパミン神経細胞群で細胞死シグナルを抑制すると、加齢性長期記憶障害が顕著に改善することが分かった。即ち、長期記憶学習後に細胞死シグナルの主要因子カスパーゼの阻害タンパクP35をMB060Bに強制発現させたところ、加齢性長期記憶障害の顕著な改善が見られた。一方で他のドーパミン作動性神経やグルタミン作動性神経、記憶中枢のキノコ体神経細胞などでP35を発現させても加齢性長期記憶障害の改善は見られなかった。計画通りに加齢性長期記憶障害の原因となるグリア細胞でのklg/Repo/deaat1経路を行動遺伝学的手法により明らかにし、長期記憶学習後の神経活動の沈静化が加齢体では十分でないことを解剖学的解析から明らかにし、神経保護薬を使った行動薬理学的解析からも確認出来た。またドーパミン作動性神経細胞の機能分類を進め、感覚情報の連合・強化に関与するドーパミン作動性神経と想起に関与するドーパミン作動性神経が異なる細胞群を形成することが分かった。加齢性長期記憶障害では、長期記憶学習後の安定化の過程でklg/Repo/deaat1経路活性不全により、細胞死シグナルが特に想起に関与するMB060Bドーパミン作動性神経細胞で誘導されることが加齢性長期記憶障害を引き起こすこと、さらに長期記憶学習後にリハーサル想起を伴う記憶情報の再統合が起こることなど、新たな記憶機構の概念とその神経基盤を示唆する成果も得られた。以上のことから概ね順調に進展していると判断した。これまでの研究から、長期記憶学習によるklg/Repo/deaat1経路の活性上昇が加齢体では障害されたため、期記憶学習後の細胞外グルタミン酸の取り込みが不十分となり長神経活動の沈静化が起こらず、結果としてLTM-AMIが起こることが分かった。では神経活動が恒常的に上昇することで予想される神経細胞死がどのタイプの神経細胞で起こるのか?細胞死シグナルを抑制すればLTM-AMIは改善するのか?を明らかにする。具体的には細胞死シグナルの鍵となるカスパーゼの活性上昇が起こり、遺伝学的カスパーゼ活性阻害によりLTM-AMIが改善する神経細胞の同定を進める。もし細胞死シグナルが容易に見つからない場合は以下の様にして責任細胞を同定する。klg/Repo/deaat1経路の活性上昇には細胞接着因子Klgを介した神経-グリア相互作用が必須である。
掘削ビットを音源とする坑井内センサアレイ3軸VSP法の開発

本研究は坑井の掘削時に発生する弾性波を別の計測用の坑井内にアレイ配置した3成分弾性波検出器により検出し、ビット以深の地下構造を推定する技術(坑井内センサアレイ3軸VSP法)の基本概念を構築することを目的として行なった。本研究の主な成果は以下の通りである。1.坑井内に配置した複数の3成分弾性検出器を用いて、連続音に重畳した反射波を検出する方法について検討を行なった。その結果、各検出器で記録した多成分信号間より求めた相関行列を主成分分析することにより、反射波の到来方向を検出可能であることを示した。2.複数の3成分弾性波検出器で検出した信号の粒子運動軌跡に対し、時空間相関係数を導入することにより、コヒーレントな雑音に埋もれた反射波を検出可能であることを見いだした。本手法は坑井内センサアレイ3軸VSP法の基本概念となるものであり、現在、反射波の遅延時間・伝搬方向を推定するための最適な評価関数について検討を行なっている。3.坑井内センサアレイ3軸VSP法を実現可能なセンサ配置に関する検討を行なった結果、約30m離れた2台の3軸センサにより、反射波の検出を実施できることがわかった。このことは、坑井内センサアレイ3軸VSP法を現存の坑井内3成分弾性波検出器で実現可能であることを示している。本研究により、坑井内センサアレイ3軸VSP法が掘削音を使用した高性能な反射法計測技術となりうることが示された。今後は本研究の成果を踏まえ、坑井内センサアレイ3軸VSP法を実現させるための具体的方法について検討を行なう。
ベル・エポックにおけるフランス・リゾートの文化史研究

◇衛生から病気療養まで、広義の「身体意識」の変容◇行楽・観光旅行から転地療養まで、広義の「アウトドアライフ」の様相◇海浜リゾートと温泉都市の発展(とくにヴィシ-を中心に)◇都市パリの水事情と水の産業化(衛生学とのかかわりを中心に)◇リゾートにかかわる身体的実践としてのスポーツ◇十九世紀の交通の歴史(とくに鉄道開発)◇リゾートとオリエンタリズム◇リゾート・ウエアの誕生と衣服のカジュアル化・ノルマンディー地方のリゾート都市(トゥル-ヴィル、ド-ヴィル等)を中心に、コート・ダジュールにもふれつつ、ほぼ上記の論点にしたがってベルエポックにおけるフランスの海浜リゾートの研究をすすめることができた。平成7年度の研究計画には以下の課題をかかげた。(1)リゾートという現象が成立する与件としてのパリ都市論研究。(2)鉄道をはじめとする交通史、観光の歴史研究。(3)第二帝政に開発されたリゾート地ノルマンディー地方の研究。(4)身体保養の実践として「温泉」開発とその利用の文化史研究。5回にわたる論文執筆により、(1)(3)(4)についてはほぼ予定通りの研究成果をおさめたが、リゾートという文化現象には「衛生学」が深く関与していることが明らかになり、またこれに関連して電気エネルギーの文化史的意味についても認識を深めた。(2)の観光旅行については、「オリエンタリズム」の問題が関与していることが明らかになり、さらには広義の「帝国主義」の問題とも関連することが明らかになってきた。この二点の研究をすすめることにより、フランス・リゾートの研究を大きくヨーロッパの歴史研究のなかに位置づけることができると思う。8年度の研究課題の留意点としたい。平成8年度の研究計画には以下の課題をかかげた。(1)リゾートにかかわる身体的実践としてのスポーツ。(2)旅行着およびリゾート・ウエアの誕生と衣服のカジュアル化。(3)十九世紀の交通の歴史上画期的な鉄道開発と汽車旅行を中心とした、自転車、自動車、飛行機にいたる交通の歴史とツ-リスムの文化史。(4)リゾートとオリエンタリズムの文化史的関連。(1)(2)(3)については、予定通りの研究成果をおさめたが、(4)の課題に関しては、研究を進めるなかで、フランス帝国主義および植民地の問題が深く関連していることがわかり、この項目に予定以上の研究を割くことになった。また、その研究のなかで、1889年、1900年のパリ万国博とリゾートの文化史の関連も明らかになった。さらに、研究計画にかかげなかったが、リゾートという現象には「土地のモード化」と「高価格化」がかかわっていることが新たな研究課題として明らかになった。このため、8年度に予定していた4回の雑誌連載による研究成果発表の予定を延長して5回の連載とし、5回目の研究成果発表をこの課題にあてた。
サル白血病ウイルスの遺伝子と病態

本研究では、各種サルに感染しているSTLV-Iの遺伝子解析を行い、HTLV-I関連疾患との相互関係を解析し、病態との関連でSTLV-Iの遺伝子構造と機能を明らかにすることを目的とする。1)アフリカ産のアフリカミドリザル、サイクスモンキーおよびアジア産のニホンザル、ブタオザル、ボンネットモンキー等マカク属由来のものについて遺伝子解析を行い、これまで報告されているHTLV/STLVとの系統関係を明らかにした。その結果、アジア産のサル由来のSTLV-Iは非常に多様であり、アフリカ産のサル由来のSTLV-IのほうがヒトのHTLV-Iに、より近縁であることが明らかとなった。2)インドネシアの類人猿であるオラウータンよりSTLVを分離する事に成功した。現在PCR法によりその遺伝子の一部を増幅し、遺伝子系統解析を行っている。これまでの解析では、アジア産のマカク族のサル由来のSTLV-Iに比較的近縁であることが示唆された。3)当研究室で飼育経過観察していたSTLV-I陽性のアフリカミドリザル5例において、プロウイルスゲイムについて解析したところ、モノクローナリティーがかなり進んでいる例が認められた。しかし、眼低検査、血液検査、脊髄反射等の詳細な臨床検査を行ったところ、ヒトでHTLV-Iに関連して認められる白血病、神経疾患、関節炎、ブドウ膜炎、肺炎等の疾患の兆候となるような異常は今のところ認められていない。
ネオ・セルフとしてのミスフォールド蛋白質解析

T細胞の活性化は、T細胞受容体(TCR)マイクロクラスターと称するT細胞活性化ユニットが時間的空間的に形成されることで制御される。これまでTCRマイクロクラスターの研究は末梢エフェクターT細胞を中心に行われ、胸腺での詳細は不明であった。胸腺細胞が分化する際、セルフ、ノン・セルフをどのように見分けるか、分子イメージングと抗原提示ガラス平面人工脂質膜を用いてマイクロクラスターの形成を解析した。セルフを示すポジティブセレクション誘導型ペプチドでは、TCRマイクロクラスターは形成と消褪とのバランスが均等である一方、ノン・セルフを示すネガティブセレクション誘導型ペプチドでは、TCRマイクロクラスターの過形成によるTCRの蓄積が著明であり、TCRマイクロクラスター形成のバランスが崩れTCRシグナルが増強延長する。このことから、T細胞が胸腺において正の選択を受けるためには、ポジティブセレクション抗原によって適度な強さのTCR刺激が継続的に行われる必要のあることが予想される。さらにTCRマイクロクラスターの形成と消褪との均衡を詳細に解析するため、TCRのユビキチン化、インターナリゼーション、分解をそれぞれ実験的に制御しながら可視化するため活性化後のTCR発現を制御するE3ユビキチンリガーゼCblファミリー分子の遺伝子欠損細胞を用いて、TCRシグナルの終焉を詳細に解析したところ、TCRマイクロクラスターの形成と消褪とがどのくらい胸腺選択やネオ・セルフの認識と関連しているか、TCR刺激と対応したTCRインターナリゼーションの強度、T細胞活性化、TCRマイクロクラスター形成のマルチファクターの相関性が分かってきた。特にCblファミリー分子においてはCbl-bとc-Cblの二つのアイソフォームで末梢T細胞と胸腺細胞とでは異なる機能と挙動を示すことが理解できた。TCRシグナルの強度によって胸腺選択がセルフ、ノン・セルフ、ネオ・セルフを認識するそのTCRが用いられるか決定するという仮説を、E3ユビキチンリガーゼファミリー分子Cblを用いてデジタルな解析を基に解析した。特にc-Cblは末梢T細胞とは異なりT細胞活性化に必須な免疫シナプス面に持続的に集積することが分かり、その結果遷延したTCR活性化シグナルソームが形成され胸腺選択に左右する可能性を示唆している。胸腺T細胞のイメージング解析から、T細胞受容体(TCR)シグナルソームの形成が末梢T細胞のものとは異なり、免疫シナプスの中心部で継続的に形成され、それが胸腺でのT細胞の選択性に係るシグナルである可能性を示した。Ovablumin(OVA)抗原の変異リガンドと特異的TCR OT-Iトランスジェニック(Tg)の系において、胸腺での正の選択を誘導するポジティブセレクター抗原と負の選択を誘導するネガティブセレクター抗原、ネオ・セルフ抗原によるTCRシグナルソーム形成に違いを示した。ヒト(h)CD19抗原に対するキメラ抗原受容体(Chimeric antigen receptor : CAR)のイメージング解析から、腫瘍抗原を認識する際のCARマイクロクラスターの可視化に成功した。また、CARの腫瘍抗原認識と同時にCAR-T細胞に発現している内在性TCRが腫瘍細胞上のMHCと共にマイクロクラスター形成することを示し、TCRと自己抗原+MHCとの結合、つまり自己抗原がネオ・セルフ抗原となっていることを明らかにした。花粉抗原Cryj1と共に四量体形成を示すHLA-DPα1*02:02 β1*05:01の1分子イメージング実験系を樹立した。プレリミナリーな解析では、Cryj1抗原ペプチド存在下にHLA-DPα1*02:02 β1*05:01の自発的凝集が観察された。胸腺選択におけるセルフ、ノン・セルフで起こっている現象をTCRシグナル活性の強度と継続時間に視点を置き、ユビキチンリガーゼCblファミリー分子欠損マウスの胸腺選択前T細胞を用いて、TCRシグナルソームのイメージング解析を行い、セルフとノン・セルフの境界で起こり得るネオ・セルフ胸腺選択をPalmerラインの推移によって検証する。ヒトCD5抗原CARを可視化する1分子イメージング実験系を樹立し、現在臨床的にその謎の解明が求められているhCD5 CAR-T細胞がhCD19ほど腫瘍縮小効果が期待できない理由を、hCD5 CAR-T細胞上の内在性TCRとネオ・セルフ抗原+MHCとのシグナルソーム形成から明らかにすることで解明する。T細胞補助刺激分子はTCRシグナルの強弱を調節する働きを持つが、これまではリガンド結合における支持・拮抗やシグナル伝達経路でのクロストークが主な作用メカニズムと考えられていた。一方、本研究班のT細胞1分子イメージングによって、補助刺激分子がTCRを物理的にネオ・セルフ抗原+MHCと会合させシグナルソームを形成する可能性が示唆された。CD28、ICOS、DNAM-1などの活性化および、PD-1、CTLA-4、TIGIT、LAG3、CD96などの抑制性補助刺激受容体の新たなメカニズムをネオ・セルフ抗原のイメージング解析から明らかにする。獲得免疫系を制御するT細胞の活性化は、T細胞活性化ユニットであるT細胞受容体(TCR)マイクロクラスターが、T細胞と抗原提示細胞との接着面に時空間的に形成、消褪されることで制御されている。これまでのTCRマイクロクラスター研究は末梢エフェクターT細胞を中心に行われ、胸腺細胞は不明であった。胸腺細胞が分化する際、セルフとノン・セルフをどのように識別するのか、分子イメージングと抗原提示ガラス平面脂質膜を用いたマイクロクラスターの解析によって、それを解明することを目的とする。

また一方、TCRのリガンドであるMHC+抗原ペプチドもTCRマイクロクラスターと同時にクラスターを形成し、これもT細胞活性化の指標となる。これまで、ネオ・セルフとしてミスフォールドした蛋白質分子が、MHCクラスII分子によって提示されること、さらにMHCクラスII分子に提示されたミスフォールド蛋白質が、自己免疫疾患における自己抗体の標的になることを明らかにしてきた。今回は、新たに原因不明な皮膚潰瘍を呈する患者の中にβ2GPI (β2-glycoprotein I)/MHCクラスII分子複合体に対する抗体を発見した。そこで、TCRマイクロクラスター同様にMHCがクラスターを形成するものか、疾患の発症原因となりうるTCR-MHCクラスターの有無が重要である。β2GPIは、抗リン脂質抗体症候群の患者血清中の自己抗体が認識する抗原であるが、今回の原因不明な皮膚潰瘍の症例は、いずれも抗β2GPI抗体検査陰性であった。このことから、β2GPI (β2-glycoprotein I)/MHCクラスIIネオ・セルフ複合体に対する抗体がこれまで検出されていた抗β2GPI抗体と異なるか、ネオ・セルフを用いた自己抗体検出法が従来の臨床検査よりも鋭敏である可能性を考え、分子イメージングの手法を駆使した実験を計画した。胸腺細胞におけるTCRマイクロクラスターの解析では、セルフを示すポジティブセレクション誘導型ペプチドでは、TCRマイクロクラスターは形成と消褪とのバランスが均等であり、持続的活性化を示す転写因子NFATの核移行も継続的であった。一方ノン・セルフを示すネガティブセレクション誘導型ペプチドでは、TCRマイクロクラスターの過形成によるTCRの蓄積が著明であり、TCRマイクロクラスター形成のバランスが崩れ、NFATの核移行も一過性であった。このことから、T細胞が胸腺において正の選択を受けるためには、ポジティブセレクション抗原によって適度な強さのTCR刺激が継続的に行われるために必要であることが分かる。また、β2GPI/MHCクラスII分子複合体クラスターの分子イメージング解析では、疾患への関与が考えられている自己抗体の産生に、単なる抗原分子ではなくミスフォールド蛋白質分子/MHCクラスIIネオ・セルフ複合体がどのように関与するか明らかにすることが自己免疫疾患における自己抗体産生のメカニズムを知る上で重要であることが判明した。HLAクラスIIアリルの遺伝子多型は、多くの自己免疫疾患の感受性に最も強く影響する疾患原因遺伝子であるが、アリルの違いによる疾患発症のメカニズムは不明である。本研究班は、従来分解されるべきミスフォールド蛋白質が、疾患感受性HLA(MHC)のシャペロン機能によって細胞表面へ運ばれ、「ネオ・セルフ」として異常免疫を誘導し疾患発症に至る機序を解明してきた。また、これまでに蓄積されている生化学・生理学的データを基に、これらと融合した先端的イメージングシステムを確立し、ミスフォールド蛋白質/HLAクラスII分子複合体の構造解析や分子間相互作用の解明に挑んでいる。
新規ポリコームグループ遺伝子SCML1の解析-脳の発生分化とその異常に果たす役割の解明-

ポリコーム遺伝子群(PcG)は、ホメオティック(Hox)遺伝子群の発現を制御すると共に、細胞の正常な分化状態を維持する「細胞のメモリー機構」に関わる重要な遺伝子群である。我々は、PcGに属する新規遺伝子を単離し、解析した。遺伝子解析の結果では、マウスSfmbt遺伝子の蛋白コード領域は20のエクソンに分割され、染色体14番に局在していた。一方、ヒトSfmbt遺伝子は染色体3p21.1にマップされた。アデノヴィルスベクターを用いた強制発現実験の結果、Sfmbt遺伝子がHOXA1遺伝子の発現調節に関与することが示された。また、ヒトグリオーマ細胞株では、Sfmbt遺伝子の強制発現に伴って細胞増殖能が変化した。これらの結果は、Sfmbt遺伝子がその構造から推定された機能を実際に待っていることを示すものである。個体レベルでの機能解析を行うために、現在ホモのSfmbtノックアウトマウスを作製しつつある。ポリコーム遺伝子群(PcG)は、体の前後軸の決定に重要な働きをするHox遺伝子群の発現を制御するなど、動物の発生過程で非常に重要な働きをすることが知られている。我々は、PcGに属すると考えられる新規の哺乳動物遺伝子を単離し、解析を行った。この遺伝子産物は、DrosophilaのScm(Sex comb on midleg)遺伝子産物と構造上の類似性があったため、SCML1(Scm-like 1)という仮の名を付けていたが、論文投稿時点でその名称が他の遺伝子に使われていたために、我々は遺伝子名をSfmbt(Scm-related gene containing four mbt domains)に変更することにした。これまでに、ラット、マウス及びヒトの脳からSfmbt cDNAを単離して構造解析を行い、SfmbtがDrosophilaで脳腫瘍を引き起こすl(3)mbt(lethal(3)malignant brain tumor)遺伝子で報告されたmbt repeatsを4回繰り返して持つという、他の遺伝子にはない特徴を持っていることを明らかにした。また、マウス遺伝子DNAをクローン化して構造解析を行うと共に、マウスとヒトのSfmbt遺伝子の染色体局在を明らかにした。mRNA発現解析については、ラット、マウス、ヒトの各種臓器、及び各種のヒト培養細胞について解析を行った。(これらの内のラットとマウスの研究成果については、論文印刷中である。)さらに、Sfmbt遺伝子の機能を明らかにするためにノックアウトマウスを作製するべく、tergeting vectorを作製しES細胞に導入してスクリーニングを行った結果、Sfmbt遺伝子の相同組換えES細胞を得ることができた。現在は、ヒト培養細胞の系を用いた機能解析実験にも取り組んでいる。我々はこれまでに、新規遺伝子Srmbt(SCML1を改名)のcDNAをマウス、ラット、ヒトの脳から単離して解析すると共に、マウスSfmbt遺伝子DNAの構造解析、染色体局在の解析、及びmRNA発現についての解析を行った。そして、Sfmbt遺伝子は遺伝子構造の上から、Hox遺伝子群の発現を制御するポリコーム遺伝子群に属し、かつDrosophilaで脳腫瘍を引き起こす1(3)mbt(lethal(3)malignant brain tumor)遺伝子と関連していることを明らかにした。平成12年度には、Sfmbt遺伝子の機能を解析するための実験を重点的に行った。まず、ヒトSfmbtcDNAとアデノヴィルスベクターを用いた強制発現実験を行い、Sfmbt遺伝子がHOXA1遺伝子の発現調節に関わっていることを明らかにした。また、ヒトグリオーマ細胞株においてSfmbt遺伝子が細胞増殖能に影響を与えることを示した。さらに個体レベルでの機能解析を行うために、targeting vectorを作製してES細胞に導入し、得られた相同組換えES細胞から、ヘテロ(F1)のSfmbtノックアウトマウスを作製した。しかし、ヘテロのノックアウトマウスでは目立った異常は認められなかったために、今後の新たな研究に向けて、ホモのSfmbtノックアウトマウスの作製し解析を行っていく予定である。
二光子吸収色素の開発

本年度は二光子吸収を用いた三次元光記録材料の開発を行った。二光子吸収部位としてエチニルポルフィリン、光スイッチング部位としてフォトクロミック分子であるペリナフトチオインジゴを連結させた。700nmの波長の光照射によってトランスからシスへの光異性化が生じ、500nmの波長の光照射によってシスからトランスへの光異性化が生じた。両異性体とも室温で安定であった。二光子吸収断面積は120 fsパスルレーザーによるZ-scan法により決定し、トランス体が2000 GM、シス体が700 GMであった。フォトクロミック分子としては非常に大きな値であった。890 nmの波長のフェムト秒レーザーによる二光子照射実験を行い、トランスからシスへの二光子光異性化を実証した。また二光子光線力学療法の検討を行った。二光子吸収断面積が大きいアセチレン連結ビスポルフィリンの末端に水溶性部位を連結し薬剤とした。水中での二光子吸収断面積はナノ秒パルスによるZ-scan法で測定し890 nmにおいて33000 GMであった。光照射による一重項酸素の発生を確認し、さらに二光子照射による一重項酸素の発生を一重項酸素スカベンジャーを用いて観測した。ヒーラ細胞を用いた殺細胞実験をフェムト秒パルスによる780 nmでの二光子照射で行った。その結果、二光子照射を行った細胞でのみ破壊が観測され二光子光線力学療法の有効性を証明した。以上、当初の設計通り高い二光子吸収効率を有する新規な三次元光記録材料の開発に成功し、二光子光線力学療法の実証にも成功した。本年度は従来の化合物を改良し、分子末端に電子吸引性のp一ニトロフェニル基の導入を行った。園頭カップリング反応により、エチニル亜鉛ポルフィリンとジブロモフリーベースポルフィリンを連結した。次にこの化合物とp-ニトロフェニルアセチレンを園頭カップリング反応によって連結し目的化合物を得た。Qバンドは724nmから776nmへと約50nmシフトし共役系の拡張が示された。Open-apertureZ scan法(5ns)を用いてテトラクロロエタン中7の二光子吸収断面積を測定したところ900nm前後の波長領域で強い二光子吸収を示し、890nmにおいて120000GMを与えた。ニトロフェニル基を導入していない参照化合物(28000GM,890nm,5ns,トルエン中)に比べて約4倍の値を示した。またイミダゾリル亜鉛ポルフィリン二量体ユニット(190GM,780nm,5ns,クロロホルム中)より三桁も大きな値であることがわかった。p-ニトロフェニル基をアセチレンを介して導入することによって二光子吸収特性の増強に成功した。また、二光子吸収色素の基本骨格として知られているフルオレンとポルフィリンとのカップリングを試みた。フルオレンの導入によって二つのポルフィリン間の電子的な相互作用を制御することに成功し、従来は一光子吸収の存在のため測定することができなかった740nmから800nmの波長領域に強い二光子吸収帯が存在することを発見した。以上、当初の設計通り優れた二光子吸収特性を有する化合物の開発に成功した。
降雨時の斜面表層崩壊の機構と植生の崩壊防止効果に関する研究

科学研究費の援助により、第一の目的とした降雨時の斜面表層崩壊の機構は、「(1)降雨の鉛直浸透、(2)斜面下部ほど水深の大きな地下水流の発生、(3)表層厚に対し地下水の水深がある値を超えた地点での斜面崩壊の発生」という3過程モデルとしてとして、明らかにできた。関係各位のご協力と、「浸透解析や斜面安定解析に、数値解析法を用いず、パラメータの影響が明確に表せるように理論式を用いて式示する」という手法を採用したことが、一応の成功の背景にある。第二の目的とした植生の崩壊防止効果については、植生による被覆が浸透特性を変化させ降雨の鉛直浸透量を減少させること、根系の存在が土に引張り強度を与えるとともにせん断強度の増加にも役立つことを力学的に指摘できた。しかし、これらの効果を定量的に評価するまでには至らなかった。無機的な土だけでなく生物も扱うためには、長期間の現地観測と室内実験など、時間をかけた研究が必要であると痛感した。ところで、斜面表層崩壊は山地・丘陵地で生じるため、テルツァーギ以来の近代的土質力学が主対象としてきた沖積地盤と比較して、土質パラメータの一様性が低い。本研究では、このようなパラメータの測定・決定法に関して、提案法を含む各種の方法をいくつかの現地調査で実用し、理論的検討結果や室内実験結果を参考に、検討を加えた。そして、表層土の浸透特性については、鉛直浸透特性は浸透能が予想最大降雨強度を越えていることの確認さえできればあまり重要でないが、基岩平行方向の浸透特性の精度が重要であることを示した。しかし、簡便で精度のよい基岩平行方向の浸透特性測定法は、現時点では開発されておらず、今後の研究課題である。研究の目的は、降雨時の斜面表層崩壊の機構を明確化するとともに、植生の果たす斜面安定化機能の力学的評価を行うことである。本年度は、現地表層土の浸透特性の把握と、根系により補強された土のせん断強度特性の把握に重点を置いた。まず、自然斜面で使用可能な現地直接せん断試験機を試作し、現地での土(根系を含むものを含む)のせん断試験を行い、現地の低拘束圧下での根系を含む土の強度特性を収集し室内せん断試験結果と比較し、礫を含まない場合には両者がかなりよく一致することを確認した。また、原位置透水試験方法を数通り考案し、透水試験機を試作して、植生・腐植土を含む現斜面での鉛直浸透特性と斜面平行方向の浸透特性を求め室内透水試験結果と比較した。しかし、現場試験のスケールと室内試験のスケールの差、試験に必要な時間などの点で、満足のできる方法は無く、今後の課題となった。なお、これらの試験機は、土砂流出について研究中の国立公園大山と鳥取大学演習林のある蒜山で試用した。植生の存在により生じるA_0層の力学特性に関しては、根系の存在により土に引張り強度が発生すること、せん断強度(特に粘着力成分)が増加することを確認したが、浸透特性に関しては確実な効果は確認できなかった。さらに、降雨浸透による表層土内の浸透流を飽和近似して理論解析と数値解析を行い、飽和近似でも現地観測結果をかなり説明できることを確認した。今年度は主に、鳥取大学の演習林で太陽電池などを用いた長期観測方法の検討と基岩平行方向の透水係数測定を中心とした長期間の現地観測を行う予定であった。鳥取大学の3つの演習林で斜面表層崩壊が発生すると考えられる表層と基岩からなる地盤を調べた。しかし、演習林内には現地観測を実施するのに適切な場所がなく今年度の長期観測はできなかった。平成11年6月29日豪雨により広島地方で土砂災害が発生した。

地盤工学会緊急調査団として7月初旬に各地の災害地域を調査した。その後、崩壊原因を検討するために、10月中旬に広島市安佐北区亀山と広島市安佐町ふじビレッジの2ヶ所で現場せん断試験や現場透水試験などの詳細な現地調査を実施し、そこで得られたデータを用いて安定解析を行った。その結果、これまでの理論モデルをそのまま用いた場合は斜面が崩壊しないという結果となったため、集水地形を考慮した理論モデルの改良を検討した。表層被覆の浸透特性を検討するために、現場の施工で実際に使われているやしがら繊維マットの浸透特性を中心に降雨土槽による表層浸透実験を行った。根系による引張り強度の安定解析法への導入方法の検討として、一次元モデルで引張り強度の導入を検討した。その結果、このモデルでは実現象を表せないことがわかり、側面力を考慮した三次元モデルの検討が必要であることがわかった。また、現場引張り試験機の試作および大学構内での実験、および室内での模型試験を行い、現場で用いる引張り試験機の検討を行った。第一の目的とした降雨時の斜面表層崩壊の機構については、以下の3過程モデルで表されることが明らかになった。(1)降雨の斜面表面からの鉛直浸透とウェッティング・フロントの降下(2)ウェッティング・フロントが基岩に到達した後に生じる、下流ほど水深の深い、基岩平行方向の浸透流の発生(3)浸透流の水深がある値を超えた場所での間隙水圧による斜面崩壊そして、この機構を積極的に応用して、人工斜面の設計法を提案し、実際に適用した。第二の目的とした植生の崩壊防止効果については、以下の力学的効果を確認した。(1)植生による被覆が浸透特性を変化させ降雨の鉛直浸透量を減少させること(2)根系の存在が土に引張り強度を与える(3)根系の存在が土のせん断強度の増加にも役立つ(4)ことを力学的に指摘できた。しかし、これらの効果を定量的に評価するまでには至らなかった。現在の二次元的な斜面安定解析では、根系により生じる土の引張り強度を解析に導入することはできないことが判明した。また、無機的な土だけでなく生物も扱うためには、時間をかけた研究が必要であると痛感した。なお、自然斜面の崩壊予知に対しては、ここで明らかにした機構は、原理的には適用できるけれど、基岩表面形状の把握の困難性、表層上の浸透特性を現地のスケールで精度良く測定することの困難性(現状では透水係数はオーダーのみを問題にする精度の測定しかできない)、降雨波形の予知の困難性などにより、適用しても意味が少ないことも明らかにした。
現代民主政治と政党組織の変容に関する研究

本研究では、現代の民主主義における政党組織の共通性と各国固有の特徴とその規定要員を明らかにするために、日本の民主党、自由民主党の政党本部、各地の地方組織(都道府県連合会)に対する聞き取り調査と、都道府県議会議員に対するアンケート調査を行い、これらの情報・データをもとに国内比較、国際比較の観点を加えつつ、研究会を積み重ねながら様々な分析を行った。本研究は、日本の自由民主党および民主党の政党組織を調査し、他国の主要政党の組織と比較することを通じて、現代の民主主義における政党組織の共通性と各国固有の特徴を明らかにし、またそうした特徴を規定する諸要因を明らかにすることを目的とするが、これに照らして、21年度には、第一に、研究グループ内の一部メンバーによる数回の勉強会を行い、自民党と民主党の組織に関する内部規定の変遷を調べるとともに、これらに言及する先行研究の内容を確認した。第二に、いくつかの政党都道府県支部連合会組織に対し、聞き取り調査を行うべく、質問項目を準備し、またこれに従って、実際に複数の都道府県連組織に聞き取り調査を行った。第三に、都道府県政治における、政党組織、会派の意味を明らかにする目的で、全国の都道府県議会議員にアンケート調査を実施した。具体的には、いくつかの県連聞き取り調査の結果を踏まえて21年秋ごろから質問項目を準備し始め、(株)日本リサーチセンターへの業務委託のもと、22年春に郵送調査を実施し、多くの議員の協力を得て、順調に回収作業を行った。第四に、韓国において、政党地方組織と中央組織の関係に関する聞き取り調査を実施した。そして第五に、メンバー全体による研究会を3回開き、日本以外の国における政党中央組織、地方組織の関係について確認するとともに、それぞれの調査内容の検討、進行状況の確認を行った。以上のような形で、21年度は研究の順調な立ち上げが進められているものと思われる。本研究は、日本の自由民主党および民主党の政党組織を調査し、他国の主要政党の組織と比較することを通じて、現代の民主主義における政党組織の共通性と各国固有の特徴を明らかにし、またそうした特徴を規定する諸要因を明らかにすることを目的とするが、22年度には、第一に、21年度に引き続いて、静岡県、群馬県、大阪府、北海道、茨城県等の政党都道府県支部連合会組織に対し、聞き取り調査を行った。第二に、21年度末に郵送、回収した全国の都道府県議会議員に対するアンケート調査について、データ集計を行い、メンバーで分担して初期的な分析を行う一方で、報告書を作成し、調査対象たる各都道府県議会議員に対して都道府県議会事務局を通じて配布した。良好な調査環境を今後も維持するための必要なフィードバックであったと考えている。第三に、イタリアにおいて、イタリア民主党の政党地方組織と中央組織の関係に関する聞き取り調査を実施し、日本の政党との比較を行った。そして第四に、都道府県ごとの政党組織に関して、事例研究を行う研究グループとアンケート調査のデータ分析を行う研究グループに分かれてそれぞれ数回の研究会を行い、またメンバー全体による研究会を2回開き、それぞれの研究、調査内容の検討、進行状況について確認を行った。経費を繰り越した23年度には、追加的な調査として愛知県、山口県、愛媛県の聞き取り調査を行い、調査内容を確認する研究会を行う一方で、事例研究を補足する都道府県連事務局アンケート調査を行い、データを取りまとめた。本研究は、日本の自由民主党および民主党の政党組織を調査し、他国の主要政党の組織と比較することを通じて、現代の民主主義における政党組織の共通性と各国固有の特徴を明らかにし、またそうした特徴を規定する諸要因を明らかにすることを目的とするが、23年度には、21年度、22年度に行った自由民主党、民主党の都道府県連に対する聞き取り調査と、それを補完するべく行った、都道府県連事務局アンケート調査、都道府県議会議員に対するアンケート調査の集計データをもとに、国内事例研究班、サーベイ調査(都道府県議会議員)分析班のそれぞれ分かれて、研究成果のとりまとめを行った。具体的には、国内事例班においては、各自が対象とする都道府県連組織を定めて事例研究を行い、またサーベイ班においては、それぞれの分析対象を差別化しつつ、分析を行った。またそうした分析結果について、研究会を開いて中間的な報告を行い、相互に意見交換を行った。特に日本選挙学会における研究会では、分担者、研究協力者からなるセッションを持ち、中間的な研究報告を行うとともに、コメンテーターからのフィードバックを受けた。また外国(ドイツ、イタリア、韓国)との比較を行う比較事例班については、日本との違いを意識しつつ、実証的な裏付けを伴う比較分析を試み、分析のとりまとめを行った。最後に、国内事例班、比較事例班、サーベイ班が、各自の分析をより一般的な枠組みに捉えなおすことを目指して研究会を行い、より理論的な研究成果へと改善をはかった。
河川・沿岸海域における健康関連微生物の挙動解析

本年度は,底泥からの健康関連微生物検出手法の確立,及び現地調査による水中・底泥中の健康関連微生物の検出を研究目的とした。底泥からの微生物検出手法としては, (1)底泥から直接核酸を抽出する手法,(2)底泥を緩衝液などに懸濁させ,低速での遠心分離後に液層を回収・濃縮する手法,の2種類が存在する。底泥からのウイルス検出手法は,対象の河川・沿岸海域で採取した底泥にポリオウイルスを添加し, (1)と(2)の回収率を比較することで評価した。(2)については,緩衝液の種類, pH,濃縮方法(陰電荷膜法またはPEG沈殿法)を検討した。その結果, (1)は土壌からのRNA抽出キット(RNA PowerSoil, Mo Bio)を用いた場合(回収率27%, N=3), (2)はグリシン緩衝液(pH=9)と陰電荷膜法を組み合わせた場合(回収率3.3%, N=11)が最も回収率が高かった。土壌から微生物を回収する際に同時に溶出してくるフミン物質はPCRを阻害することが報告されており,対象とするウイルスの直径や等電点はそれと同等であることから,フミン物質が含まれる底泥からウイルスを検出するには,核酸の状態で分離・精製を行う(1)が適していることが明らかとなった。現地調査は対象地域において毎月実施し,計6地点で採取した水・底泥試料から糞便汚染の起源解析に用いられるバクテロイデス属細菌を検出した。水試料(海水20L,河川水1L)はフィルターで濃縮した後にDNAを抽出し,底泥試料(湿潤重量0.5g)は(1)の手法で処理し,バクテロイデス遺伝子をPCRで検出した。その結果,試料の陽性率は,水が6%であるのに対し底泥は61%と大きな差が見られた。底泥におけるヒトに特異的なバクテロイデスの陽性率は47%で(水からは非検出),対象地域の底泥がヒトの糞便によって汚染されていることが確認された。
クロミタイトから探るマントルダイナミクス

ポディフォーム・クロミタイトはクロムの資源鉱石として知られているマントル構成岩であり、マントル深部での化学的プロセス・ダイナミクスを示唆する岩石として重要な岩石である。本研究では、マントルダイナミクスとクロミタイト形成を結び付けた新しいクロミタイト成因論を構築することで、物質的証拠に乏しいマントルダイナミクスを検出することを目指した。オマーン・オフィオライトにおける野外調査・実験室内での解析の結果、オマーンのクロミタイトは海洋的マントルで形成されたものと島弧的マントルで形成されたものの2種類があることが判明した。島弧的マントルで形成されたクロミタイトは鉱物の微量元素化学組成から、初期島弧マグマによって形成されたことが明らかとなった。またその裏付けとして実際の島弧下マントル起源である西南日本唐津高島の玄武岩中に産するクロミタイト捕獲岩との組織・鉱物化学組成・白金族元素含有量における類似性を明らかにした。この成果は国際誌に公表された(Miura and Arai 2014)。本研究の結果は、オマーンのクロミタイトは最上部マントルといった低圧条件で形成されたことを強く示唆する。続いて超高圧クロミタイトの成因について探るために、チベット・北極圏ウラルの超高圧クロミタイトの系統的な観察・解析を行った。両産地のクロミタイトは地質学的・岩石学的特徴において類似しており、同様のプロセスで形成されたと考えられる。これら超高圧クロミタイトとオマーンの低圧型クロミタイトの特徴は全く異なるものである。ある種の高圧起源である四国東赤石かんらん岩体中のクロミタイトは様々な特徴において超高圧クロミタイトに類似しており、超高圧クロミタイト形成に超高圧変成作用が関わっている可能性がある。様々な特徴を有するクロミタイト形成にはマントルダイナミクスが深く関わっていることが示唆される。26年度が最終年度であるため、記入しない。オフィオライトのマントル部に時折産するポディフォーム・クロミタイトはクロミウムの資源鉱石として知られ、これまで最上部マントルでマグマ混合が起きることで形成されると解釈されてきた。しかし、近年ダイヤモンドなどの超高圧を示唆する鉱物がチベット・北極圏ウラルのクロミタイトから発見され、従来提唱されてきたクロミタイト成因論を再構築する必要が出てきた。特に超高圧鉱物を含むクロミタイトと最上部マントル起源と考えられるクロミタイトの系統的な比較研究を行う必要がある。本研究ではマントルダイナミクスを取り入れた新たなクロミタイト成因論を構築することを目的とする。当該年度では、超高圧クロミタイトの比較対象である低圧起源クロミタイトの素性(テクトニックセッティング等)を明らかにすること、超高圧クロミタイトの野外での産状を明らかにすることを目標とした。オマーン・オフィオライトのマントル部に出現する非調和性クロミタイトは島弧下マントルの様な低圧条件下で形成されたと考えられている。ヒルティ地域において、非調和性クロミタイト周囲のハルツバーガイト・ダナイトの系統的な鉱物化学組成、鉱物微量元素組成を検討した結果、クロミタイトと島弧的マグマは密接な成因的関係にあることが判明した。この成果は国際誌に出版された(Miura et al., 2014)。またこれら非調和性クロミタイトと西南日本唐津高島のアルカリ玄武岩中に産する島協弧下マントル起源クロミタイトが白金族元素化学組成といった様々な面において非常に類似していることを明らかにした。特に島弧下マントル起源クロミタイトの白金族元素化学組成の特徴はクロミタイト・オフィオライトの起源を特定する上で非常に重要な指標となる。この成果は昨年度のEGUで発表され、現在投稿中である。また超高圧クロミタイトの野外での産状を明らかにするために昨年2013年7月25日から8月19日にかけて北極圏ウラルのライイズ・オフィオライトにおいて野外調査を行った。露頭において超高圧クロミタイトが周囲のマントルかんらん岩に調和的に産していることを確認し、今現在試料の解析を急いでいる段階である。

両産地のクロミタイトは地質学的・岩石学的特徴において類似しており、同様のプロセスで形成されたと考えられる。これら超高圧クロミタイトとオマーンの低圧型クロミタイトの特徴は全く異なるものである。ある種の高圧起源である四国東赤石かんらん岩体中のクロミタイトは様々な特徴において超高圧クロミタイトに類似しており、超高圧クロミタイト形成に超高圧変成作用が関わっている可能性がある。様々な特徴を有するクロミタイト形成にはマントルダイナミクスが深く関わっていることが示唆される。26年度が最終年度であるため、記入しない。本研究を進めるにあたり、超高圧クロミタイトとの比較対象である低圧クロミタイトの有するであろう特徴・素性を特定することは必要不可欠である。オマーンの非調和性クロミタイトを精査することで、テクトニックセッティングおよび島弧マグマとの関連性を明確にすることができたため、順調に進展しているといえる。今後チベット・北極圏ウラルに産する超高圧クロミタイトと明らかな低圧クロミクイト(オマーン非調和性クロミタイト)の系統的な比較研究を行う。特にクロミタイト周囲のマントルかんらん岩を含めた、記載岩石学的特徴、ラマン分光法による鉱物中の包有物の解析、鉱物中の元素拡散等を詳細に検討する、クロミタイトの系統的な分類を行い、それらとマントルダイナミクスにどの様な関係性がみられるのか、博士論文としてまとめる予定である。
寿命関連遺伝子clk-1のアポトーシス制御

寿命関連遺伝子clk-1の哺乳動物における生物学的機能についてアポトーシスおよびウルトラディアンリズムの制御に焦点を当て解析した。clk-1欠損マウスは胎生致死であり、致死直前の胎児に中枢神経系を含め全身の細胞にアポトーシスが誘導されている事から、clk-1遺伝子産物は胎生期のアポトーシス回避に必須であると考えられた。そのメカニズムを詳しく検討する為に細胞・器官培養を試みた結果、血清添加により培養可能である事が分かった。clk-1欠損マウスの胎児から分離した細胞では、ミトコンドリア膜電位の低下、ATP産生の減少、チトクロームCの細胞質への放出など、明らかなミトコンドリア機能の低下がみられた。CoQ10の培地への添加によりミトコンドリア膜電位が回復することから、clk-1欠損によるアポトーシスの誘導はCoQ産生の欠如に基づくミトコンドリアの機能低下が原因と考えられた。一方、clk-1欠損マウスの細胞培養や心臓の器官培養によりclk-1欠損細胞での細胞分裂および心臓の拍動リズムの有意な遅延が観察された。しかしこれらリズムの遅延は培地へのCoQ添加により完全にレスキューされた。以上の結果からclk-1遺伝子は、ミトコンドリア機能を介して細胞のアポトーシスと生体リズムの制御に深く関与していることが示唆された。1.clk-1欠損マウス胎児におけるミトコンドリアの呼吸機能およびアポトーシスによる細胞死clk-1欠損マウスの胎生致死の原因がアポトーシスであるか検討した。clk-1遺伝子産物はミトコンドリア呼吸鎖の電子伝達体であるCoQの合成酵素であり、clk-1欠損マウスにはCoQが存在しない。そこでミトコンドリア膜電位を測定するため胎生10.5日目の胎児由来細胞をJC-1で蛍光染色した。ホモマウス由来細胞(ホモ細胞)は、ミトコンドリアの膜電位を維持してはいるものの野生型に比べ有意に低いことがわかった。次にホモ細胞でミトコンドリア由来のアポトーシスが起きている可能性を検討する為、抗チトクロームC抗体で免疫細胞染色した結果ホモ細胞ではチトクロームCの細胞質内局在が認められた。さらに胎児細胞をヘキスト染色した結果アポトーシスに特徴的な核の断片化が確認され、胎児の組織切片においても、TUNEL陽性細胞が多数観察された。これらの結果から、clk-1欠損マウスはミトコンドリアの機能低下に由来するアポトーシスが全身の細胞に誘導され、胎生致死となることが強く示唆された。2.Tet-offシステムを用いたclk-1遺伝子発現改変マウスの作成CLK-1タンパクの発現を人為的に制御することによりCoQ合成を調節可能にしたトランスジェニックマウスの作成のためにTgPrP tTA、TgCoq7TRELacZの2つのベクターを作製した。前者はプリオンプロモーターにテトラサイクリン制御性転写活性化因子をクローニングし、後者はテトラサイクリン応答性因子下にclk-1遺伝子、lac Z遺伝子をクローニングしたもので、これらをそれぞれ直鎖状DNAにして精製したものをDNA微量注入法にて導入した。発生した16個体のうち4個体にトランスジーンが確認され、現在飼育中である。1.clk-1欠損マウスにおけるアポトーシスとウルトラディアンリズムに対するCoQの関与胎生致死直前(E10.5)のclk-1欠損(ホモ)マウス由来細胞は10%FBS添加培地で培養可能で野生型に比べ細胞増殖が遅かった。増殖の遅れは細胞分裂の遅延とアポトーシスの多発に起因していた。Clk-1の遺伝子産物はCoQの合成酵素である為、培養系にCoQを添加し影響を検討した結果、CoQ10添加によりホモ細胞の細胞分裂の遅れは完全にレスキューされアポトーシスの発生も減少した。またホモマウスは心臓の拍動リズムの遅延も観察された為、器官培養したホモマウス胎児の心臓にCoQを投与した結果、拍動リズムの遅れが完全にレスキューされた。これらの結果から、CoQは細胞のアポトーシスだけでなく分裂や心拍リズムなどウルトラディアンリズムの調節にも関与することが示唆された。

さらにCoQ10添加によりホモ細胞のミトコンドリア膜電位の上昇が認められ、CoQの作用がミトコンドリアを介していることが示唆された。2.Tet-offシステムを用いたclk-1遺伝子発現改変マウスの解析昨年度作成したトラシスジェニックマウスは交配を行い継代的にトランスジーン(tg)が保持されていることを確認した。またマウス尻尾のLacZ染色によりドキシサイクリン(Dox)投与でclk-1遺伝子発現が調節可能であることを確認した。そこでtgを持ったclk-1ヘテロマウス同士あるいはclk-1ヘテロマウスとを交配させて、ホモマウスの作製を試みた。Dox非投与下において約9ヶ月交配を繰り返したが、胎生致死をレスキューすることが出来ずホモマウスは出生しなかった。その理由としてTetシステムの介在による遺伝子発現の変化、Dox非存在下での最大発現量の不足、導入された遺伝子の数の不足などが考えられたが原因の特定には至らなかった。現在交配の継続は中断している。