hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
ツメガエル幼生尾の再生不応期に自己反応性免疫細胞の標的となる自己抗原の探索

インターロイキン11(IL-11)と器官再生との関わりは知られていないが、il-11は顕著に再生芽選択的に発現しており、再生に重要な役割を果たすことが示唆されたため、これを解明するのが最重要であると考え、研究を進めた。IL-11シグナルが再生に必要であるかを調べるため、まずはIL-11の受容体(GP130)及び下流のシグナル伝達分子(MEK, PI3K, Stat3)を薬剤により阻害したところ、4つの阻害剤全てがコントロールと比べ再生尾長を有意に短縮させる効果があった。各シグナルのマーカーの発現を調べたところ、少なくともMEKとPI3Kの阻害剤を用いた場合にはこれらのシグナルが阻害されていることが確認された。il-11の下流の分子の阻害だけではil-11自体が再生に必要であるのかわからないので、CRISPR/Cas9法を用いてil-11のノックアウト個体を作製し、il-11が再生に必要であるか調べた。ノックアウト個体を前期可能期まで飼育し、尾を切断し、再生尾長を測定したところ、ノックアウト群ではコントロール群と比べて有意に再生尾長が短くなった。il-11の異なる部位を標的としてゲノム編集を行った場合にも同様の効果が見られ、il-11は再生に重要であることが示唆された。また、il-11は不応期の再生能を賦活化し得るか調べた。Tet-on法でil-11を強制発現するコンストラクトをノックインしたオタマジャクシを不応期まで育てて尾を切断し、il-11を全身で強制発現させたところ、尾再生能の賦活化は認められなかった。現在、リコンビナントIL-11を用いてIL-11の再生芽細胞への影響を調べる実験系の確立等も試みている。当初、不応期に免疫系の標的となる自己抗原の同定と、再生の進行に重要な役割を果たす分子機構の解明という2つの目的で再生芽増殖細胞選択的遺伝子の解析を行うことを計画していた。そして、再生芽増殖細胞選択的遺伝子の中でも最も顕著に再生芽選択的な発現を示すインターロイキン11を最優先に解析を進めてきた。CRISPR/Cas9法でインターロイキン11をノックアウトしたところ、コントロールと比べて再生尾長が有意に短縮し、インターロイキン11が再生に重要な役割を果たすことが示唆された。また、ゲノム上の異なる部位を標的としてインターロイキン11遺伝子に対してゲノム編集を行った際にも再生尾長の短縮が認められ、再生尾長の短縮はオフターゲット効果ではないことが示唆された。インターロイキン11と器官再生の関わりはこれまで知られておらず、この成果は世界で初めて器官再生に重要な役割を果たす新しい経路を発見したものであり、再生の研究にとって極めて重要な発見である。再生の進行に重要な役割を果たす分子機構の解明という目的に関しては順調に進展しており、また、このまま研究を進め、インターロイキン11がどのように再生に関わっているかということや、既知の再生の分子機構とインターロイキン11がどのように関わっているかということ等を明らかにしてゆくことで、再生の分子機構をより深く理解することが可能となると期待されるため、おおむね順調に進展していると判断した。インターロイキン11が再生に果たす役割の解析は再生の研究にとって非常に重要であるため、引き続きIL-11の解析を行う。まず、ノックアウト個体で実際にIL-11の発現量が低下しているかどうかを確認する。具体的には、アフリカツメガエルのリコンビナントIL-11を抗原として抗IL-11抗体を作製する。そして、ノックアウト個体とコントロール個体の尾切断端のタンパク質を抽出し、抗IL-11抗体を用いてウエスタンブロッティングを行うことで、ノックアウト個体の尾切断端ではコントロール個体の尾切断端に比べてIL-11の発現量が低下しているか調べる。また、ノックアウト個体の再生尾長短縮効果がオフターゲットによるものではないことをより確かにするため、il-11をノックアウトした個体でIL-11を強制発現または投与することで再生尾長の短縮効果がレスキューされるか調べる。具体的には、il-11の強制発現コンストラクトをノックインすると同時にil-11をノックアウトした個体でil-11を強制発現させることで、あるいはノックアウト個体の尾切断端にリコンビナントIL-11を顕微注入することで再生尾長の短縮効果がレスキューされるか調べる。さらに、il-11が他の既知の再生に関わる遺伝子とどのように関わっているか調べる。具体的には、il-11のノックアウト個体とコントロール個体の尾切断端の遺伝子発現をRNA-seq等により網羅的に比較し、ノックアウト個体で発現上昇もしくは低下している遺伝子を調べる。これにより、再生の分子機構全体の中でil-11が果たす役割が明らかになることが期待される。

il-11の下流の分子の阻害だけではil-11自体が再生に必要であるのかわからないので、CRISPR/Cas9法を用いてil-11のノックアウト個体を作製し、il-11が再生に必要であるか調べた。ノックアウト個体を前期可能期まで飼育し、尾を切断し、再生尾長を測定したところ、ノックアウト群ではコントロール群と比べて有意に再生尾長が短くなった。il-11の異なる部位を標的としてゲノム編集を行った場合にも同様の効果が見られ、il-11は再生に重要であることが示唆された。また、il-11は不応期の再生能を賦活化し得るか調べた。Tet-on法でil-11を強制発現するコンストラクトをノックインしたオタマジャクシを不応期まで育てて尾を切断し、il-11を全身で強制発現させたところ、尾再生能の賦活化は認められなかった。現在、リコンビナントIL-11を用いてIL-11の再生芽細胞への影響を調べる実験系の確立等も試みている。当初、不応期に免疫系の標的となる自己抗原の同定と、再生の進行に重要な役割を果たす分子機構の解明という2つの目的で再生芽増殖細胞選択的遺伝子の解析を行うことを計画していた。そして、再生芽増殖細胞選択的遺伝子の中でも最も顕著に再生芽選択的な発現を示すインターロイキン11を最優先に解析を進めてきた。CRISPR/Cas9法でインターロイキン11をノックアウトしたところ、コントロールと比べて再生尾長が有意に短縮し、インターロイキン11が再生に重要な役割を果たすことが示唆された。また、ゲノム上の異なる部位を標的としてインターロイキン11遺伝子に対してゲノム編集を行った際にも再生尾長の短縮が認められ、再生尾長の短縮はオフターゲット効果ではないことが示唆された。インターロイキン11と器官再生の関わりはこれまで知られておらず、この成果は世界で初めて器官再生に重要な役割を果たす新しい経路を発見したものであり、再生の研究にとって極めて重要な発見である。再生の進行に重要な役割を果たす分子機構の解明という目的に関しては順調に進展しており、また、このまま研究を進め、インターロイキン11がどのように再生に関わっているかということや、既知の再生の分子機構とインターロイキン11がどのように関わっているかということ等を明らかにしてゆくことで、再生の分子機構をより深く理解することが可能となると期待されるため、おおむね順調に進展していると判断した。インターロイキン11が再生に果たす役割の解析は再生の研究にとって非常に重要であるため、引き続きIL-11の解析を行う。まず、ノックアウト個体で実際にIL-11の発現量が低下しているかどうかを確認する。具体的には、アフリカツメガエルのリコンビナントIL-11を抗原として抗IL-11抗体を作製する。そして、ノックアウト個体とコントロール個体の尾切断端のタンパク質を抽出し、抗IL-11抗体を用いてウエスタンブロッティングを行うことで、ノックアウト個体の尾切断端ではコントロール個体の尾切断端に比べてIL-11の発現量が低下しているか調べる。また、ノックアウト個体の再生尾長短縮効果がオフターゲットによるものではないことをより確かにするため、il-11をノックアウトした個体でIL-11を強制発現または投与することで再生尾長の短縮効果がレスキューされるか調べる。
特殊環境下における微細加工面の評価システムに関する研究

超高真空中での極微細加工における特異現象を究明するため,加工,測定,観察及び評価といった一連の作業が同一システム内で可能な超高真空微細加工評価システムを構築し,その基礎性能を評価した。第1番目の研究課題として,環境温度の変化があっても高精度の測定ができる原子間力顕微鏡(AFM)を開発することを目的にAFMユニットの熱変形対策について検討した.環境温度が変化しても2点間の距離が一定に保たれる構造を新たに提案・検証し,この原理を自作のAFMユニットに適用することで,熱環境変化の影響が少なく高精密画像が得られるAFMシステムを構築した.第2番目に,微細加工,加工力測定,加工面観察及び加工面評価などの一連のシステムを兼ね備えた原子間力顕微鏡一体型微細加工評価装置を設計,試作した.試作装置では,とくに超高真空中で駆動する各種の新しい機械要素及び機構を取り入れ,小型軽量で高性能化を実現した.第3番目に,試作した微細加工評価装置の超高真空下での挙動及び性能を調べ問題点を抽出した結果,抵抗値変化型カンチレバ-及び粗動機構に適用した磁力式インチワ-ムに不具合が生じ,精密画像を得るに至らなかった.今後,これらの問題を解決し,目的を達成することに注力していく予定である.今後の展望として,試作システムを用いて各種雰囲気ガス中と超高真空中での微細加工を行い,超高真空中での加工現象の特異性を抽出するとともに,大気中での酸化や吸着がない清浄な新生面の特徴を把握していくことを考えている.超高真空中での極微細加工における特異現象を究明するため,加工,測定,観察及び評価といった一連の作業が同一システム内で可能な超高真空微細加工評価システムを構築し,その基礎性能を評価した。第1番目の研究課題として,環境温度の変化があっても高精度の測定ができる原子間力顕微鏡(AFM)を開発することを目的にAFMユニットの熱変形対策について検討した.環境温度が変化しても2点間の距離が一定に保たれる構造を新たに提案・検証し,この原理を自作のAFMユニットに適用することで,熱環境変化の影響が少なく高精密画像が得られるAFMシステムを構築した.第2番目に,微細加工,加工力測定,加工面観察及び加工面評価などの一連のシステムを兼ね備えた原子間力顕微鏡一体型微細加工評価装置を設計,試作した.試作装置では,とくに超高真空中で駆動する各種の新しい機械要素及び機構を取り入れ,小型軽量で高性能化を実現した.第3番目に,試作した微細加工評価装置の超高真空下での挙動及び性能を調べ問題点を抽出した結果,抵抗値変化型カンチレバ-及び粗動機構に適用した磁力式インチワ-ムに不具合が生じ,精密画像を得るに至らなかった.今後,これらの問題を解決し,目的を達成することに注力していく予定である.今後の展望として,試作システムを用いて各種雰囲気ガス中と超高真空中での微細加工を行い,超高真空中での加工現象の特異性を抽出するとともに,大気中での酸化や吸着がない清浄な新生面の特徴を把握していくことを考えている.今年度は,超高真空中での極微細加工における特異現象を究明するため,加工,測定,観察及び評価といった一連の作業が同一システム内で可能な超高真空微細加工評価システムを構築し,その基礎性能を評価した.成果の概要を次に示す.(1)試料の移動,微細加工,加工反力測定,加工面観察及び加工面評価などの一連のシステムを兼ね備えた原子間力顕微鏡(AFM)一体型微細加工評価装置を設計,試作した。試作装置では,とくに超高真空中で駆動する各種の新しい機構を取り入れ,小型軽量で高性能化を実現した.(2)試作した微細加工評価装置の超高真空下での挙動及び性能を調べ問題点を抽出すると共に,その解決策を検討し改善した.(3)試作システムを用いて大気中と超高真空中で微細加工を行った後,AFMの機能を用いて加工面を観察し,超高真空中での加工現象の特異性を抽出した.当初の研究計画に沿って,目的とした成果が得られている.次年度は,試作した超高真空対応原子間力顕微鏡一体型微細加工装置を用い,超高真空雰囲気中での微細加工現象の本質を理解するための基礎実験を予定している.さらに,大気中での酸化や吸着がない清浄な新生面の特徴を把握するとともに,超高真空中で得られる極めて清浄かつ活性な新生面の応用を考慮して,新生面が安定して得られる加工手法及びその制御法を検討する.超高真空中での極微細加工における特異現象を究明するため,加工,測定,観察及び評価といった一連の作業が同一システム内で可能な超高真空微細加工評価システムを構築し,その基礎性能を評価した.成果の概要を次に示す.1.環境温度の変化があっても高精度の測定ができる原子間力顕微鏡(AFM)を開発することを目的として,AFMユニットの熱変形対策について検討した.環境温度が変化しても2点間の距離が一定に保たれる構造を新たに提案・検証し,この原理を試作したAFMユニットに適用することで,熱環境変化の影響が少なく精密画像が得られるAFMシステムを構築した.2.微細加工,加工力測定,加工面観察及び加工面評価などの一連のシステムを兼ね備えた原子間力顕微鏡一体型微細加工評価装置を設計,試作した.試作装置では,とくに超高真空中で駆動する各種の新しい機械要素及び機構を取り入れ,小型軽量で高性能化を実現した.

3.試作した微細加工評価装置の超高真空下での挙動及び性能を調べ問題点を抽出した結果,抵抗値変化型カンチレバ-及び粗動機構に適用した磁力式インチワ-ムに不具合が生じ,精密画像を得るに至らなかった.今後これらの問題を解決していく予定である.今後の展望として,試作システムを用いて各種雰囲気ガス中と超高真空中での微細加工を行い,超高真空中での加工現象の特異性を抽出するとともに,大気中での酸化や吸着がない清浄な新生面の特徴を把握していくことを考えている.
労働力減少を予期した就業支援事業全体の技術と法理マップの構築

今年度は、〈参入援助〉、〈確保労働力の活用と開発〉、〈雇用管理の合理化〉、そして〈労働力の移動分配〉という法理モデルを構想したうえで、「出口保証」すなわち就業実現と持続、企業内外の労働力の適正創出と配置を見据えた連続した就業支援事業の実効重要性をどのように構築するかについて、いくつかの取材現場におけるヒアリングと、多数の文献情報から考察した。その中途段階における考察に関して、学会報告や論稿記事掲載の成果をそれぞれ得た。2018年日本法社会学会全国大会において、若年者の能力開発投資と引き換えにする労働力囲い込みのメカニズムを検討する内容の「御礼奉公契約総論貸金特約付き労働契約の当否」を発表したほか、『修道法学』「職場の信頼と助けで成り立つ常用型テレワーク:離職回避の雇用型在宅勤務ケーススタディ」、『熊本法学』「副業兼業の推進法政策と税制:源泉徴収の行方、あるいはマイナンバー制度下の所得税制度と確定申告のわかりやすい理解について』等の論稿記事を掲載公表した。これらは上記モデルのうち、特に〈参入援助〉、〈確保労働力の活用と開発〉、そして〈労働力の移動分配〉に関する考察を今後さらに深める契機となっている。また、取材現場におけるヒアリング内容は、次年度掲載予定の論稿の基礎部分となったほか、ヒアリング対象者を改めて招聘し、公開研究会を開催する準備も進んでおり、研究の中途段階でも成果の社会的還元を意識することができた。諸外国の先端就業支援事情との相補あるいは情報摂取に関して、やや作業を遅らせている。勤務校の大学院改組に関する営業集客に想定外のエフォートを割かれたのが原因である。これら原因は新年度は取り除かれ、進捗遅れを挽回できる見通しがある。〈参入援助〉、〈確保労働力の活用と開発〉、〈雇用管理の合理化〉、そして〈労働力の移動分配〉法理モデルを、〈雇用持続の規範〉と接合させる内容の成果マップ、すなわち労働市場法制/雇用政策法制に必須となる雇用規範の具体的展開と導入の見通しについて結論を得る。そのための有識者との意見交換や、諸外国の類比可能な就業支援実態情報などの摂取を進める。この研究は労働力減少の次代を見据えて、雇用の持続維持と労働力の融通をゴールとする、連続プロセスとしての就業支援事業の技術と法理を考えるものである。とくに〈参入援助〉〈確保労働力の活用と開発〉〈雇用管理の合理化〉そして〈労働力の移動・分配〉のモデルを手がかりにして、フィールドワークと文献資料の交差を進め、これらを連携・総合した労働市場法制/雇用政策法制の立案を目指すものである。今年度は特に参入援助と労働力移動・分配に着目して調査を進め、なかでも労働力形成の投資と回収の具体化問題について、新聞奨学生や看護奨学生の問題にアプローチすべく、多数の当事者関係者に取材ヒアリングを行った。その成果は現在取りまとめ中であるが、2018年の日本法社会学会全国大会にて発表報告をしてのち、公表公刊を計画している。上記は研究成果の一部であり、この研究は労働市場法制/雇用政策法制を運用し、効果的かつ持続的な企業内外の労働力分配と配置を中核とした政策事業、それに労働者の負担増にならない適正就業と配置の社会実現を目指すものである。ひきつづき雇用法理の到達点と修正アイデア、比較法的知見を上記プロセスとモデルに組み込んで、試行スケールを意識した(=地方自治体レベルで実施可能となる)事業構想マップを含んだ提示提案型の研究を目指す予定である。上記の各モデル〈参入援助〉〈確保労働力の活用と開発〉〈雇用管理の合理化〉そして〈労働力の移動・分配〉について、上記概要の通り〈参入援助〉そして〈労働力の移動・分配〉に関する掘り下げを意識した調査研究を行うことが出来た。他項目については下記に記載の通り。上記の通り〈確保労働力の活用と開発〉〈雇用管理の合理化〉の各モデルを通じた総合については次年度に回し、そのモデル総合をもとにした事業構想マッピング作業へと研究内容を高度化してゆく。

〈参入援助〉、〈確保労働力の活用と開発〉、〈雇用管理の合理化〉、そして〈労働力の移動分配〉法理モデルを、〈雇用持続の規範〉と接合させる内容の成果マップ、すなわち労働市場法制/雇用政策法制に必須となる雇用規範の具体的展開と導入の見通しについて結論を得る。そのための有識者との意見交換や、諸外国の類比可能な就業支援実態情報などの摂取を進める。この研究における前述各モデルの深化と探求の作業には関係者等への取材ヒアリングが必要であるが、他方ヒアリング対象者の異動配置換や業務上の都合により取材ヒアリングのスケジュールが変更したり事情に支障が生じたりすることは特に研究初年度に起こりやすい。それにともない必要な物品の用意等も先送りになることがある。次年度に今年度使用予定であった旅費や物品費を活用して必要な取材ほか研究活動を行う。海外調査に充当する旅費や専門的知見の提供に関する謝金等について、研究のおくれによって使用が遅れたものである。海外調査は次年度に計画しており、計画に沿った確実な使用を想定している。
あて材細胞がまるい形になる仕組みとその役割

針葉樹の仮道管細胞の横断面を顕微鏡観察した場合、あて材の細胞はまるい形をしている。応募者は、次世代シークエンサーを用いて、あて材でペクチンメチルエステラーゼ遺伝子の発現が抑制されていることを明らかにした。この遺伝子は細胞と細胞の接着にかかわっている。細胞壁の形成途中で細胞間の接着が不十分になるので、あて材細胞はまるい形になるのではないだろうか。本研究では、ペクチンメチルエステラーゼに着目し、あて材細胞がまるい形になる仕組みを明らかにする。本年度は、前年度までの結果を検証するためサンプルサイズを増やしてデータの充実を図ったことと、前年度に作成した一次抗体を用いて免疫染色実験を実施した。(1)苗木を傾斜生育してあて材試料を調整し、定量PCR解析の比較ct法によりペクチンメチルエステラーゼ遺伝子発現量と細胞のまるい形との相関分析を行った。その結果、着目遺伝子の下方制御と細胞のまるみとにはよい相関があった。傾斜角度を変えることで、あて材の発達程度を調整した試料生育を行った。まるみはデジタルイメージを取得し、画像計測から円形度を指標に定量した。(2)前年度に作成したペクチンメチルエステラーゼ抗体を用いた免疫染色検鏡法で、ペクチンメチルエステラーゼが細胞形成のいつ、どこで働いているかを調べた。また、各種多糖類の存在部位を調べ、それと合わせてまるみ形成の仕組みを考察した。以上の成果を論文にまとめ投稿した。針葉樹の仮道管細胞の横断面を顕微鏡で観察すると、あて材の細胞はまるい形をしている。この遺伝子は細胞間の接着にかかわっている。細胞形成の途中で細胞間の接着が不十分になるから、あて材細胞はまるい形になるのだろうか。本研究で、あて材細胞がまるい形になる仕組みを明らかにする。本年度の研究結果は、1.ペクチンメチルエステラーゼ遺伝子発現量と細胞の形との関係を解明した。苗木を傾斜生育してあて材試料を調整し、定量PCR解析の比較Ct法によりペクチンメチルエステラーゼ遺伝子発現量と細胞のまるい形との相関分析を行った結果、この遺伝子の下方制御と細胞のまるみとには非常によい相関があった。苗木を傾斜し角度を変えることで、発達程度の異なるあて材試料を調整できた。定量PCRの比較Ct法を用いて、発現するペクチンメチルエステラーゼ遺伝子を定量し、調整したあて材細胞横断面のデジタルイメージを取得し、画像計測によってまるい形を円形度によって定量した。2.ペクチンメチルエステラーゼが細胞形成のいつ、どこで働いているかを明らかにするため、ペクチンメチルエステラーゼ抗体を作成した。これまでの研究で入手した遺伝子配列の情報から、タンパクの高次構造を求め、抗体に認識させる領域を設計した。その設計をもとに複数種類の抗体を作成した。その中の一つがペクチンメチルエステラーゼを特異的に標識できることを明らかにした。これにより、次年度で使用する抗体が作成できた。当初予定していた通り、ペクチンメチルエステラーゼ遺伝子発現量とあて材細胞のまるみとの相関が得られた。試料が順調に生育できあて材程度がことなる試料が準備できた。また、ペクチンメチルエステレーゼを特異的に認識する抗体の作成が行えたことらが、その理由である。作成したペクチンメチルエステラーゼの抗体を用いて、細胞形成のいつ、どこで働いているかを明らかにする。苗木を人為傾斜させることで、さまざまな程度のあて材を誘導して試料に用いる。分化中木部を採取し、瞬間凍結・凍結置換を行う。その後、樹脂切片と凍結切片を作成する。切片をペクチンメチルエステラーゼ抗体で免疫染色し、共焦点レーザー顕微鏡を用いて、標識を観察する。これによりペクチンメチルエステラーゼが細胞形成のいつ、どこで働いているかを調べる。

まるい形と姿勢調整機能の関係を明らかにするペクチンメチルエステラーゼの抗体作成に時間を要した。複数回の抗体作成を経て、使用できる抗体が作成できたため、免疫顕微鏡法の実施回数が当初予定よりも少なったことが、その理由である。次年度は免疫顕微鏡法を当初予定数通りに実施するため、実験数に応じた2年分の費用が必要となる。共通機器の利用状況によっては、いくつかについて専用機の導入も検討し研究遂行を図る。
ＴＣＲζ鎖ｍＲＮＡ　３’ＵＴＲ異常に伴う全身性エリテマトーデス発症機序

T細胞ζ鎖mRNA(TCRζ)の安定性を規定している3'UTR CS1領域がTCRζ鎖発現制御に関わるかどうかを検討するために、CS1を欠損させたarmを作製し、ターゲッティングベクターを構築した。続いてこのターゲッティングベクターをES細胞に導入し組み替えES細胞を作製した。さらにこれをインジェクション法により注入しキメラマウス作製を行った。次にこの作製したキメラマウスと野生型マウスを交配させてF1マウスが得られた。しかし、F1マウスのゲノム中に組み込まれているloxPで挟まれたpgk-neoカセットを除去するために、Creマウスとの交配を試みたが上手く行かなかった。これまでわれわれは、SLE患者末梢血T細胞では560nt欠損した短い3' UTR(AS)をもつTCRζ鎖(ζ鎖)mRNAが優位に発現し、欠損した560ntにはζ鎖mRNA 3' UTR内の2つのconservative sequence(CS1,CS2)が含まれ、この2つのCSがζ鎖mRNAの安定性を決定し鎖発現を規定することを報告した。そこで本研究では、今年度はまずこのCSに結合しζ鎖発現を規定するタンパクを同定することを試みた。まず、WT(wild-type)cDNA,AS cDNAならびにCS1あるいはCS2を欠損させたcDNA(CS1 cDNA, CS2 cDNA)をそれぞれPCRで増幅し、pCRIIベクターに組み込み、biotin RNA labeling mixを用いてin vitro transcriptionでビオチン標識したmRNAを作製した。続いてこのビオチンラベルmRNAをJurkatt細胞抽出物と混和させた後にstreptavidin-agarose beadsを加えて洗浄後、抽出液を用いてmRNA結合タンパクを抽出した。その結果、WT mRNAとCS1 mRNAからは14-kDタンパクが抽出された。その一方でAS mRNAとCS2 mRNAからは抽出されなかった。以上のことから、14-kDタンパクは、鎖mRNA 3' UTR内のCS2に結合し鎖mRNAを安定かさせることで鎖発現を規定する可能性が示唆された。さらに、CS2をノックアウトさせたマウスを作製し、SLE様のphenotypeを呈するかどうかを検討するために、BALB/cマウスζ鎖遺伝子中のCS2部位欠損させたarmを作製し、5'側の相同領域とするデザインとした。5'相同領域を3.54.5kbとし、3'相同領域を58kbでターゲッティングベクターをデザインし、作製を行った。ζ遺伝子exon8の3'UTR内にある31塩基のCS1を欠損(ΔCS1)させたarmを作製し5'側の相同領域とするデザインとした。5'相同領域を3.54.5kbとし、3'相同領域を58kbでターゲッティングベクターを設計し構築した。その後ターゲッティングベクターがデザイン通りかどうか確認するために、制限酵素処理後電気泳動を行った。ターゲティングベクターを制限酵素NotIにて線状化した後、精製を行った。次にプラスミドDNAおよびBALB/c系統のES細胞を使用し、エレクトロポレーションを行った。ターゲティングベクター導入後、48時間培養し、培地にG418及びガンサイクロビルを添加した。薬剤による選択培養を6目間行い、薬剤耐性ES細胞を作製した。得られた薬剤耐性ESクローン440個をピックアップした。そして次に、相同的遺伝子組換えのおこったES細胞株を選別し、8細胞期胚又は胚盤胞期胚の中に、その組換えES細胞を、インジェクション法により注入し、相同組み換えクローンを用いて、アグリゲーション法、及び、インジェクション法によるキメラマウス作製を行った。なお、キメラ率は、体全体の黒色以外の毛色の率を目視によって判定した。キメラ胚を作製した。次に、そのキメラ胚を偽妊娠マウスの子宮に移植し、産仔(キメラマウス)を得ることができた。さらに、作製したキメラマウスと野生型マウスを交配し、F1マウスを得て、生殖細胞が組換えES細胞由来の細胞により形成されているかどうかを確認した。平成22年度に得られたF1マウスを解析したところ、ジャームライン・トランスミッションを伴うヘテロマウスであることが確認できなかったため、平成23年度、再度相同組み換えESクローン(clone No.a1519)からアグリゲーション法、及びインジェクション法によって得られたキメラマウスより、毛色寄与率上位のマウスを用いてF1産子を作製することを試みた。アグリゲーション法により得られたキメラマウスNo.1♂60%,No.2♂40%,No.3♀40%に関しては、自然交配により27匹の産仔が得られた。

インジェクション法により得られたキメラマウスNo.5♂80%,No.6♂80%に関しては、自然交配により8匹の産仔が得られた。No.4♂80%に関しては、自然交配で産仔は得られなかった。得られたF1産子の尾部よりDNA抽出後、PCR法により遺伝子型を判定した結果、遺伝子型解析の結果、9匹(♂5、♀4)のF1マウスついて、ヘテロマウスであることが確認された。すなわち、変異遺伝子の伝達(ジャームライン・トランスミッション)が確認された。以前に作製したF1マウスのゲノム中に組み込まれているloxPで挟まれたpgk-neoカセットを除去するために、得られたF1マウス♂(loxP/+♂)をCreマウス♀(Creホモ)と交配、ならびにF1マウス♀(loxP/+♀)をCreマウス♂(Creヘミ)と交配することによりノックアウトマウスの作製を再度試みたが、ゲノム中のpgk-neoカセットは除去することができなかった。これまで申請者らは、SLE患者末梢血リンパ球(PBT)では、syndecan(Sdc)分子発現異常、とくにHS糖鎖修飾をうけたSdc4発現が低下していることを報告した。またその機序の一つとして、exostosin-like 2 (EXTL2)酵素発現低下がSLE患者PBTにおいて認められた。これまで検討したところ、EXTL2発現低下例に、EXTL2 mRNA exon5に173bpの挿入部分が観察され、SLE患者EXTL2発現異常にEXTL2遺伝子発現異常が関与することが示唆された。昨年度作製し得たF1マウスのゲノム中に組み込まれているloxPで挟まれたpgk-neoカセットを除去するために、得られたF1マウス♂(loxP/+♂)をCreマウス♀(Creホモ)と交配、ならびにF1マウス♀(loxP/+♀)をCreマウス♂(Creヘミ)と交配することによりノックアウトマウスの作製を試みたが、ゲノム中のpgk-neoカセットは除去することができなかった。これまで申請者らは、TCRζ鎖mRNA 3'UTR異常を伴うSLE患者末梢血リンパ球(PBT)では、syndecan(Sdc)分子発現異常、とくにHS糖鎖修飾をうけたSdc4発現が低下していることを報告した。またSdc4のコアタンパクに、HS糖鎖の一部であるN-アセチルグルコサミンを結合させるexostosin-like 2 (EXTL2)酵素発現をSLE患者PBTにおいて検討したところ、HS糖鎖修飾Sdc4発現が低下していたSLE患者ではEXTL2発現が低下していることを発見した。本年度は、SLE患者PBTにおけるEXTL2遺伝子発現異常の有無を検討したところ、EXTL2発現低下例に、EXTL2 mRNA exon4欠損例あるいはtruncated form exon5例が存在し、SLE患者EXTL2発現異常にEXTL2遺伝子発現異常が関与することが示唆された。当初の予定では、ジャームライン・トランスミッションを伴うヘテロマウスを得ることを平成22年度までの目標としていたが、作製したF1マウスがヘテロマウスであることを確認することができたのが平成23年度になった。25年度が最終年度であるため、記入しない。今年度、F1マウスのゲノム中pgk-neoカセットを除去してノックアウトマウスを作製することができなかったため、当初の予定が遅れている。
酵素免疫測定法の食品添加物分析への応用ー天然着色料の分析法の開発ー

2.免疫及び細胞融合:6週令のマウス(♀,A/J)にComplete Freund's Adjuvantと共にそれぞれの免疫原を腹腔内に投与した。5週間後に抗原のみで再度免疫し、3日後に免疫した脾細胞を取り出しX63ーAg8ー6.5.3.細胞とポリエチレングリコ-ル(MW=1,500)を用いて細胞融合を行なった。3.抗体のスクリ-ニング及びクロ-ニング:抗体の測定はポリスチレン製96ーwellーplatesにそれぞれの抗原をコ-トした物を用いて測定した。また限界希釈法を用いてクロ-ニングを行なった結果、PhycocyaninおよびCarmic acidに対してそれぞれ13クロ-ンのモノクロナ-ル抗体産生細胞が得られた。しかしながらBixinに対する抗体は得る事が出来なかったので、使用したマウスの抗血清を用いて抗体価を測定し、再度免疫をして細胞融合を行う予定である。4.マウス抗色素モノクロナ-ル抗体の特異性及び酵素免疫測定法の確立:培養上清中からモノクロナ-ル抗体を精製し、この抗体を使用してPhycocyaninにおいてはSandwich assayを、Carmic acidにおいてはInhibition Assayを用いた系を作成中である。さらにこれらの系を使用して、実際の食品中の天然色素量を測定する計画である。
海馬錐体細胞のグルタミン酸感受性単一イオンチャンネル電流の解析

グルタミン酸は中枢神経系シナプスの主要な興奮性伝達物質である。また近年、脳の可塑性変化がグルタミン酸受容体の活動を介して発現することが報告されている。したがってグルタミン酸の中枢ニュ-ロンへの作用機構を調べることは神経科学の重要な課題の一つである。本研究はラットの培養海馬ニュ-ロンを対象として、パッチクランプ法によりグルタミン酸受容体チャンネルの電気生理学的性質を明らかにすることを目的として行われた。主な結果は以下の通りである。1.生理的な細胞内液、外液中に存在するイオンのうちグルタミン酸受容体チャンネルを透過するのは、Na^+、K^+、Ca^<2+>である。2.グルタミン酸投与により発生する単一チャンネル電流を記録し、単一チャンネルコンダクタンスを求めると、4050pSのものと20pS以下のものとがあった。前者はN-メチル-D-アスパラギン酸(NMDA)型、後者は非NMDA(キスカル酸、カイニン酸)型受容体チャンネルの活動によることが結論された。3.膜電位が-40mVにより負側にある場合、細胞外液中のMg^<2+>はNMDA型チャンネルの活動を著しく抑制した。4.NMDA型チャンネルはCa^<2+>に対して高い透過性を示し、Ca^<2+>の透過係数はNa^+の6.2倍に達した。2価陽イオンの透過係数比はBa^<2+>(1.2)>Ca^<2+>(1.0)>Sr^<2+>(0.8)>Mn^<2+>(0.3)>>Mg^<2+>(<0.02)であった。5.トリプトファンの代謝産物であるキノリン酸は選択的なNMDA受容体のアゴニストであり、キノリン酸感受性電流はMg^<2+>により膜電位依存性に抑制を受け、単一チャンネルコンダクタンスは4055pSであった。6.従来カイニン酸受容体チャンネルはCa^<2+>透過性をもたないとされてきたが、比較的高いCa^<2+>透過性を示す新しいタイプのカイニン酸受容体の存在することが明らかになった。この新しいタイプのチャンネルの微視的性質を決定し、従来から報告されているカイニン酸受容体チャンネルとの差異を検討することは今後の研究課題である。本研究の目的は、培養海馬錐体細胞を対象として、グルタミン酸受容体の三つの亜型(NMDA型,カイニン酸型,キスカル酸型)を賦活した場合に活性化されるイオンチャンネルの動態を単一チャンネルレベルで解析し、中枢神経細胞のグルタミン酸受容体チャンネルの活動様式を明らかにすることである。実験は胎生1720日目のラット胎児から海馬錐体細胞を初代培養し、パッチクランプ法を適用して行った。主な結果は次の通りである。1.ラット海馬錐体細胞は培養後約7日目からグルタミン酸感受性を示し、以後日数の経過とともに感受性は漸増した。

グルタミン酸感受性を示す細胞は、NMDA,カイニン酸,キスカル酸に応答した。2.NMDA,カイニン酸,キスカル酸によって誘起される電流の反転電位はほぼ等しく、これらの薬物によって活性化されるイオンチャンネルは類似の陽イオン選択性をもつことが結論された。3.NMDAによる膜コンダクタンス増加はマグネシウムイオン(【Mg^(2+)】)存在下で顕著な膜電位依存性を示し、-40mVより過分極側でコンダクタンス増加量が漸減し、-90mVではNMDAによるコンダクタンス増加はほとんど観察されなかった。このような【Mg^(2+)】存在下でのコンダクタンス増加の膜電位依存性はカイニン酸,キスカル酸の場合は観察されなかったので、これはNMDAチャンネルのもつ特異な性質の一つであると結論された。4.【Mg^(2+)】欠如液中では、NMDAは顕著に電流雑音を増加させた。これらの電流雑音の解析と単一チャンネル電流の記録から、【Mg^(2+)】欠如液中でのNMDAチャンネルの単一チャンネルコンダクタンスは40pSであった。この40pSのチャンネルはグルタミン酸によっても活性化された。一方カイニン酸型,キスカル酸型チャンネルの単一チャンネルコンダクタンスは、電流雑音の分散から判定するとNMDA型のそれの1/3以下であると推定された。
酸性雨による土壌からの重金属溶出挙動解析と生物影響評価

1.酸性成分による土壌からの金属成分の溶出挙動の解析重金属に汚染された土壌試料からの酸性雨中の酸成分による溶出挙動について検討した。土壌中の主要成分については,まずアルカリ土類金属がCa→Ma→Baの順で溶出した後,土壌の緩衝作用が失われるにつれて,さらにAl,Feが溶出した。微量成分についてはNi,Co→Zn,Cd→Pb,Cuの順で溶出した。このことから,Ni,Coは降水中に溶解しやすく,汚染が広範囲に広まるのに対し,Zn,Cd汚染は局所的にとどまるが,Ca,Mg等のアルカリ土類金属の溶出が進み,土壌の緩衝力が失われた時点で溶出が始まることが明らかとなった。2.溶出金属の水生微生物における蓄積土壌からの溶出が確認された重金属イオン(Ni,Co,Zn,Cd,Pb)を培養液中に個別に加えてラン藻を培養後、細胞壁画分および細胞質画分に分画し,それぞれの重金属含有量を測定した。必須性の高いZnは細胞内部に取り込まれ易く,それ以外の金属は細胞壁画分のほうに高い濃度で分布した。Pbは大部分が細胞壁画分に存在した。ラン藻に対するPbの毒性が他の金属と比較して低いのは,細胞内部への侵入が抑えられることが一因と考えられる。3.水生微生物における重金属の変換ラン藻体内における重金属の存在形態について検討するために,上記の水溶性画分を高速液体クロマトグラフィー/誘導結合プラズマ質量法により分析した。Zn,Cd存在下で培養したラン藻については,メタロチオネイン(MT)が誘導され,アミノ酸分析を行った結果,1分子中に1011個のシステインを含有していた。Co,Ni,PbストレスではMTの誘導は確認されなかった。
化学物質過敏症の発症要因解明と芳香療法による症状緩和(無作為化割付介入研究)

いわゆる化学物質過敏症を疑って札幌市内1医院を受診した患者全員(30人)に基本調査票の記入を依頼し、男性2名を含む26名から回答を得た。平均年齢は44.5歳、発症からの経過年数は2-5年が10人、発症時と比べて症状が悪化した11名、症状頻度が増加した13名だった。ドイツのBeilerらが開発した化学物質過敏症尺度(IEI尺度)を用いた結果、主訴は「においを強く感じる、頭痛、集中力の低下、疲労感、眠気」であり、原因物質は「ある種の香水、塗料または希釈液、タバコや葉巻、ガソリンのにおい、整髪料、マニキュア」だった。化学物質曝露による「健康状態、職場や学校での能力、余暇、家庭生活、身体的能力」への影響の有訴が高かった。この結果、先行研究同様に本研究対象者にとってもいわゆる化学物質過敏症は複数の身体症状が長く続く状態であるといえた。このうち同意が得られた18名(内男性1名)に芳香療法(アロマセラピー)の介入を、無作為化クロスオーバー比較試験として実施した。IEI尺度、および不安尺度については、介入期間前後と対照期間前後の得点差には統計学的有意差は見られなかったが(p>0.05)、各回のアロマセラピー前後では気分尺度の6つ全ての下位尺度に有意な改善が認められた(p<0.05)。化学物質過敏症は臨床的な疾病概念が定義されていない。しかし患者にとって身体症状は事実であり、症状コントロールが必要であるにもかかわらず、現在までに有効性が示された療法はない。本研究は化学物質過敏症へのアロマセラピーの効果を初めて検討した。対象者数が少なく、アロマセラピー介入による症状改善効果は本研究では明らかにならなかったものの短期には気分の改善が認められ、対象者の多くは機会があればこれからもアロマセラピーを受けたいと答えたことから、本研究の課題を改善することでさらなる研究の可能性が示唆された。いわゆる化学物質過敏症を疑って札幌市W医院を受診した患者全員に基本調査票の記入を依頼した。これまでに配付した18部のうち16人から回答が得られ、平均年齢は43歳±9.6、15人が女性であった。Bailerら(2006)が開発したIEI(Idiopathic Environmental Intolerance)-scaleを実施したところ、IEI-症状13.1±3.7、IEI-誘因34.8±10.6、IEI-生活への影響30.2±13.7で、いずれもBeilerらの結果よりも本研究のほうが若干高得点となった。このうち、介入に同意した11名を性・年齢グループでマッチさせて無作為にケース(前半に芳香療法)と対照(後半に芳香療法)に割り付けた。ベースライン時のケースと対照ではPOMS(気分評価尺度)の6つの下位尺度のひとつである疲労のみ対照群の得点が低かった(P=0.017)が、そのほかのアウトカムであるIEI-scaleとSTAI(不安評価尺度)に有意差は見られなかった。芳香療法前後でPOMSを実施したところ、1回目の介入では下位尺度のうち緊張-不安、抑うつ-落ち込み、怒り-敵意の得点が、2回目の介入ではこれらに加えて疲労、混乱も有意(P<0.05)に減少した。これまで化学物質過敏症については発症要因の解明や、診断基準を確立するための研究がなされてきたが、具体的な治療方法についての研究は少ない。本研究は、化学物質過敏症患者に芳香療法を実施する世界で初めての研究で、短期的であれ対象者の気分に好影響を与えることが明らかになれば、その意義は大きい。現在研究を継続中であり、今後対象者数が増えることで、短期的な影響のみならず、ケースと対照を比較することで化学物質過敏症の症状、発症要因、あるいは生活への影響に対する芳香療法の効果について明らかにすることが可能と考える。

本研究は化学物質過敏症へのアロマセラピーの効果を初めて検討した。対象者数が少なく、アロマセラピー介入による症状改善効果は本研究では明らかにならなかったものの短期には気分の改善が認められ、対象者の多くは機会があればこれからもアロマセラピーを受けたいと答えたことから、本研究の課題を改善することでさらなる研究の可能性が示唆された。
人工衛星データを用いたシミュレーションによる作物生育モニタリングに関する研究

人工衛星データから推定した日射量やルーチン観測の気象データを入力することにより,コンピュータ上に広域にわたる作物生育の状況を作り出すことを目標として研究を行った。本研究は,(1)衛星データによる日射量の推定,(2)アメダスデータの時別値メッシュ化手法の開発,(3)気象関係値推定モデルと作物生育モデルの結合による成育シミュレーションから成り立つ。まず,衛星データによる日射量の推定については,GMS(ひまわり)可視データによる陸域用の日射量推定モデルに改良を加えた。GMSの可視バンドで得られる惑星アルベドを用いた晴天域判定アルゴリズムに土地利用状況を考慮した閾値を用いたことにより,日積算値のRMS誤差を16%に低減できた。次に,アメダスの気象値を1kmメッシュに拡張する手法開発については,気温・風速・日照時間の空間分布を計算するために,地形因子解析法に新たな考え方を盛り込んだモデルを開発した。これは,アメダスの測定値からメッシュデータを補間する際に,予測値は距離成分と地形成分を合計したものとして計算する手法である。本手法による推定値は従来法と比較して,精度が33%向上することが確認できた。上述の気象関係の推定値を既存の作物生育モデルの入力値として用いることにより作物生育の状況をシミュレーションした。20002002年のアメダスデータとGMSデータを入力して求められた収量と実際の収量とを比較した結果,RMS誤差は10a当り65.2kgとなり,気象実測値を用いた場合と同程度の推定精度が得られた。本研究の手法を用いて毎日の衛星データと気象データを利用して計算すれば,リアルタイムで標準的な生育状況を得ることができ,営農指導・気象災害解析・収量変動予測等への利用が期待される。衛星データから推定した日射量や実測によって得られる気象経過を入力することにより,コンピュータ上に広域における作物生育の状況を作り出すことを目標として,今年度は大別すると以下の3項目についての研究を行った。1.衛星データによる日射量の推定雲量の空間分布に基づくGMS(ひまわり)可視データによる陸域用の日射量推定モデルを作成・改良を行った。GMSの可視バンドデータからアルベドを求めて晴天か曇天かを判断し,気候値や実測値を基にして日射の減衰を量的に決定するアルゴリズムを用いた。推定値の算出に当っては,GMSから直接受信したS-VISSRデータを保管し,北海道の領域を切出し,さらに地上実測値の得られる地点部分を抽出してモデルの入力値として利用した。2.アメダスの気象値を1kmメッシュに拡張する手法開発アメダスの時別値データを用いてメッシュ展開を行い,気温・風速・日照時間の空間分布を計算するために,地形因子解析法に新たな考え方を盛り込んだモデルを開発した。従来,予測法として近隣の観測点からの距離に応じて重み付けした平均値を用いる方法があったが,これより精度が向上するのが確認できた。3.作物生育のシミュレーションモデル既存の水稲とダイズの作物生育シミュレーションモデルを用いて,過去の気象値を入力して求められた収量と実際の収量とを比較した結果,妥当な結果が得られ,今後,衛星データと気象データの複合利用による作物生育のモニタリングへの利用可能性が確認できた。人工衛星データから推定した日射量やルーチン観測の気象データを入力することにより,コンピュータ上に広域にわたる作物生育の状況作り出すことを目標として研究を行った。

まず,衛生データによる日射量の推定については,GMS(ひまわり)可視データによる陸域用日射量推定モデルに改良を加えた。GMSの可視バンドで得られる惑星アルベドを用いた晴天域判定アルゴリズムに土地利用状況を考慮した閾値を用いたことにより,日積算値のRMS誤差を16%に低減できた。次に,アメダスの気象値を1kmメッシュに拡張する手法開発については,気温・風速・日照時間の空間分布を計算するために,地形因子解析法に新たな考え方を盛り込んだモデルを開発した。これは,アメダスの測定値からメッシュデータを補間する際に,予測値は距離成分と地形成分を合計したものとして計算する手法である。本手法による推定値は従来法と比較して,精度が33%向上することが確認できた。上述の気象関係の推定値を既存の作物生育モデルの入力値として用いることにより作物生育の状況をシミュレーションした。20002002年のアメダスデータとGMSデータを入力して求められた収量と実際の収量とを比較した結果,RMS誤差は10a当り65.2kgとなり,気象実測値を用いた場合と同程度の推定精度が得られた。本研究の手法を用いて毎日の衛星データと気象データを利用して計算すれば,リアルタイムで標準的な生育状況を得ることができ,営農指導・気象災害解析・収量変動予測等への利用が期待される。
胃プロトンポンプの構造生理学研究

昨年度は胃プロトンポンプ初となる原子分解能の構造解析を達成し、どのようにしてH+が強酸性である胃に押し出されるのかが分子レベルで理解できた(Abe et al., 2018, Nature)。しかしながら、得られた構造は輸送反応サイクルの一状態であり、ダイナミックに変化するこのポンプの作動機構解明には、少なくとも複数個の別な反応中間体の構造解析が必要である。本年度は、対向輸送イオンであるK+の結合構造の解析に注力した。この為に最適な基質及びアナログの検討によって、AlF, MgFと、K+, Rb+の組み合わせ条件下で結晶が得られ、幾つかの構造が分解能2.5A程度で決定できた。胃プロトンポンプがどのようにK+を特異的に認識しているか、またK+の結合によってどのような構造変化が誘起されるかを理解するために、変異体による機能解析を進めている。当該年度も初年度とは異なる反応中間体の構造解析に成功しており、当初の計画以上に順調に計画が進展していると言える。輸送機構の理解の為、複数の反応中間体の構造解析を進めていく。また、アイソフォーム特異的なメカニズムの理解のために、non-gastric HKATPase alpha2の構造解析に着手していく。本年度は、胃プロトンポンプの初めての高分解能構造解析に成功した。得られた構造は胃酸抑制剤が結合し、胃内腔側へイオン輸送経路が開いたE2P状態の構造であった。この構造から、胃酸抑制剤の詳細な結合状態が理解できた。2種類の異なる化合物について構造解析し、これらの薬剤が部分的にオーバーラップするものの、明確に区別できる形で結合していることが示唆され、これは変異体を利用した機能解析によってクリアに検証された。また、得られた構造は、カチオン結合サイトが胃内腔側にH+を放出した直後の状態であったことから、胃プロトンポンプがどのようにして胃の内部の酸性溶液(pH 1)に対してH+を放出することができるかが理解できた。カチオン結合サイトの構造で、まず目を引くのは、非常に近接した2つのグルタミン酸、Glu795とGlu820である(距離2.5 A)。これら酸性アミノ酸は通常負に帯電しているので、これらの近接構造は少なくともどちらか1つがプロトネーションされているということを意味する。Glu795Gln変異体は野生型とほぼ変わらない活性プロファイルを示すことから、この場合Glu795がH+を結合した状態であると考えてよいであろう。従ってGlu820はGlu795と水素結合を形成していることになる。この他にも、Glu820はAsn792や近傍の水と水素結合を形成しており、Glu820を中心とした水素結合ネットワークが形成されている。これに加えて、Lys791のアミノ基が、Glu820と塩橋を形成できる距離(3.1 A)に存在していた。このように、周りから多くの極性相互作用を受けているGlu820のカルボキシル基が置かれる特異な環境によって、これのpKa値が大きく下がる(つまりH+が解離しやすくなる)ことが示唆された。研究スタートの時点で三次元結晶が得られており、初年度で高分解能構造解析を達成する見込みであった。しかしながら、計画当初は想定していなかった、生理的に重要な分子機構を発見することができたので、計画以上の進展とした。今回の構造はイオン輸送反応サイクルの1つのスナップショットであり、ダイナミックな構造変化をと伴う胃プロトンポンプの作動機構の理解には、少なくとも複数の別なコンフォメーションの構造を理解する必要がある。対向輸送イオンであるK+の結合が誘起する構造変化、H+を取り込むステートでの構造、ATPの加水分解が起こる仕組み、等々、様々なコンフォメーションにおける構造情報の取得を目指す。
ダイコン青変症の原因遺伝子の特定と発症制御機構の解明

ダイコンの内部が出荷後の数日間で青く変色するダイコン青変症が全国的に発生し、市場関係者の問題となっている。これまでに申請者らは、青変症になりやすい品種と、青変症になりにくい品種を迅速に区別する検定法を発明し、特許化した。さらに、同検定法を応用して、ダイコンの成分から青色色素の前駆物質を、4-hydroxyglucobrassicin(4-OHGB)と同定した。そこで、本課題では、その原因遺伝子を特定し、発症機構を解明することにより、青変症になりにくいダイコン品種の育成に有用な基礎的知見を得ることを目的として実験を行った。本年度は、青変しやすいダイコン品種`福誉'、青変しにくい`耐病総太り'および、中間的な`勇人'各3個体を用いて、それぞれの根からRNAを抽出精製し、NovaSeq 6000を用いたRNA-seq解析を行い、さらにマッピング解析を経て、各遺伝子ごとの発現量を求めた。これらの中から、トリプトファンを出発物質として4-OHGBに至るインドールグルコシノレート代謝関連遺伝子をピックアップして、品種ごとの発現量の差異を可視化した。その結果、青変しにくい`耐病総太り'と、他の青変しやすい品種との比較では、glucobrassicinから青色色素の前駆物質となる4-hydroxyglucobrassicinおよび、青色色素の前駆物質にならない1-hydroxyglucobrassicinに分岐する部分の特定のCYP81系遺伝子の発現量に有意な差が認められた。このことは、インドールグルコシノレートの代謝に関連する遺伝子の発現によって、青変しやすさが制御されているものと考えられた。青変しやすいダイコン品種`福誉'、青変しにくい`耐病総太り'および、中間的な`勇人'各3個体を用いて、それぞれの根からRNeasy Plant Mini Kitを用いてRNAを抽出精製した。RNAサンプルは,3μgずつ3反復を混合してRNA-seqの試料とした。核酸定量後、Agilent 2200TapeStationによる品質検定を行い、TruSeq Standard mRNA Sample Prep Kitを用いてmRNAライブラリを作成した。Agilent 2100Bioanalyzerを用いてシーケンスライブラリーの品質を検定後、NovaSeq 6000を用いて、150 baseペアエンドシーケンス(約1億リード/検体)によるRNA-seq解析を行った。マッピングには、ゲノム配列として、GCF_000801105.1_Rs1.0_genomic.fna.gz、遺伝子情報として、GCF_000801105.1_Rs1.0_genomic.gff.gzを用いて、インドールグルコシノレート代謝関連酵素遺伝子の発現量を比較したところ、青変しにくい`耐病総太り'と、他の青変しやすい品種との比較では、glucobrassicinから青色色素の前駆物質となる4-hydroxyglucobrassicinおよび、青色色素の前駆物質にならない1-hydroxyglucobrassicinに分岐する部分の特定のCYP81系遺伝子の発現量に有意な差が認められた。このことは、インドールグルコシノレートの代謝に関連する遺伝子の発現によって青変しやすさが制御されているものと考えられた。本年度の実験結果から、ダイコン品種による青変程度の違いは、インドールグルコシノレート代謝関連酵素遺伝子の発現量の違いに由来すると考えられたことから、インドールグルコシノレート代謝関連酵素遺伝子等のリアルタイムPCRを行い、品種や部位による発現量の差異を調べる。また、RNA-seqのマッピング解析の結果から、関連する遺伝子の塩基配列の変異についても可能性を検討する。これら、ダイコン青変症にかかわる生理的メカニズムを明らかにすることによって、品種改良に役立つ知見を得る。一方で、食品由来としては珍しい青色色素の高度利用の観点から、前駆物質生成に及ぼす栽培条件の影響など、青色色素前駆物質の高含有化についても検討する予定である。