hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
重症/難治性肝疾患を克服する新しい遺伝子治療戦略の開発

背景:Monocyte Chemoattractant Protein-1(MCP-1)は単球マクロファージの浸潤を特異的に誘導するケモカインであり、肝疾患を含め多くの病態において、MCP-1が重要な役割を果たしていると考えられている。肝線維(肝硬変)化においては、細胞外マトリックスの産生など肝星細胞が中心的役割を果たしているが、MCP-1が肝星細胞の活性化に関与していることがin vitroで報告されている。しかしながら、MCP-1の作用阻害が実際にin vivoで肝線維化を阻害しうるかについては不明である。方法:我々はMCP-1のC末アミノ酸を7つ除いた(コドン28)変異型MCP-1(7ND)を用いて、MCP-1作用を阻害することで肝線維化が阻害できるかを検討した。肝線維化モデルとしてはジメチルニトロサミン投与ラットを既報に準じて使用した。変異型MCP-1は発現プラスミドDNAを大腿筋肉に1マイクログラム/体重g実験開始時と開始2週後に投与した。結果:変異型MCP-1を発現させたグループはコントロール群に比べて、明らかに組織学的に肝線維化が抑制されていた。これらの事実は、肝組織中のハイドロキシプロリン含量やα平滑筋アクチンの組織学的発現および肝組織中のコラーゲン遺伝子発現の比較においてこれらが有意に抑制されることからも支持された。また、変異型MCP-1の導入によるMCP-1作用の阻害は、肝組織中のインターロイキン12(Th1サイトカイン)量を減少させ、一方、組織中インターロイキン10(Th2サイトカイン)量を増加させた。結論:変異型MCP-1によるMCP-1の阻害は、肝線維化を抑制した。本方法は、遺伝子を筋肉内に投与し発現させるもので、ウイルスベクターなどを使用する必要がなく、簡便で安全性に優れているものと考えられ、今後の臨床応用に期待がもたれた。MCP-1の強力なdominant negative inhibitorとして作用する変異型MCP-1(N末端の2番目から8番目までのアミノ酸が欠損したもの)発現ベクター(DNA)をジメチルニトロサミン(DMN)による肝線維化モデルに対して筋肉内に投与した。体重及び肝重量はDMN単独投与群(DMN群)では減少したが、DMNプラス変異型MCP-1(DMN+7ND)群、ではこの減少が有意に抑制され、DMNを投与していない(コントロール)群とほぼ同じであった。コンピューター画像処理による定量的肝線維化の評価、αsmooth muscle actinの免疫染色による伊東細胞の活性化評価、組織ハイドロチシプロリン含量ではDMN+7ND群はDMN群に比しいずれも有意に減少しておりコントロール群と同程度もしくは軽度増加であった。また、ノーザンブロットによるコラーゲン遺伝子の発現もDMN+7ND群において抑制されていた。これらの結果は変異型MCP-1が強力に肝線維化を抑制することを示していた。つぎに、この線維化抑制機構を解析するために、肝組織へのED陽性細胞(浸潤単核球)の数を検討したが、DMN+7ND群では有意にその数が減少しており、炎症の抑制が線維化の抑制に関連していることが示唆された。現在、血中及び組織中サイトカイン、TNFα、interleukin(IL)10、IL12を解析している。平常ラットにジメチルニトロサミンを連日3日間(各週)腹腔内に4週間投与し、肝硬変モデルを作成した。変異型MCP-1を1mg/kgにて筋肉内(大腿筋)にジメチルニトロサミン投与開始時と開始後2週後に投与した。

肝線維化はコンピュター画像解析、組織ハドロキシプロリン、α-smooth muscle actinによる免疫染色にて評価した。変異型MCP-1投与群では、コントロール群に比して各種検査にて有意に線維化を抑制した。また、肝でのコラーゲンmRNAも抑制されていた。抑制メカニズムの解析として、ジメチルニトロサミン投与1週間後の肝組織中の単核球(炎症細胞)の比較を行ったが、治療群では有意に浸潤単核球数が抑制されていた。さらに、4週後の組織中IL12(Th1)、IL10(Th2)を測定したが、コントロール群ではTh2優位であったのに対して、治療群ではTh1優位であった。MCP-1はCCR2レセプターに結合して、細胞内にシグナルを伝達するが、現在、CCR2ノックアウトマウスに対して、同じプロトコールにてジメチルニトロサミンを投与し、正常マウスに比べて、炎症・線維化の変化を検討中である。背景:Monocyte Chemoattractant Protein-1(MCP-1)は単球マクロファージの浸潤を特異的に誘導するケモカインであり、肝疾患を含め多くの病態において、MCP-1が重要な役割を果たしていると考えられている。肝線維(肝硬変)化においては、細胞外マトリックスの産生など肝星細胞が中心的役割を果たしているが、MCP-1が肝星細胞の活性化に関与していることがin vitroで報告されている。しかしながら、MCP-1の作用阻害が実際にin vivoで肝線維化を阻害しうるかについては不明である。方法:我々はMCP-1のC末アミノ酸を7つ除いた(コドン28)変異型MCP-1(7ND)を用いて、MCP-1作用を阻害することで肝線維化が阻害できるかを検討した。肝線維化モデルとしてはジメチルニトロサミン投与ラットを既報に準じて使用した。変異型MCP-1は発現プラスミドDNAを大腿筋肉に1マイクログラム/体重g実験開始時と開始2週後に投与した。結果:変異型MCP-1を発現させたグループはコントロール群に比べて、明らかに組織学的に肝線維化が抑制されていた。これらの事実は、肝組織中のハイドロキシプロリン含量やα平滑筋アクチンの組織学的発現および肝組織中のコラーゲン遺伝子発現の比較においてこれらが有意に抑制されることからも支持された。また、変異型MCP-1の導入によるMCP-1作用の阻害は、肝組織中のインターロイキン12(Th1サイトカイン)量を減少させ、一方、組織中インターロイキン10(Th2サイトカイン)量を増加させた。結論:変異型MCP-1によるMCP-1の阻害は、肝線維化を抑制した。本方法は、遺伝子を筋肉内に投与し発現させるもので、ウイルスベクターなどを使用する必要がなく、簡便で安全性に優れているものと考えられ、今後の臨床応用に期待がもたれた。
ダイヤモンドなど炭素系薄膜を利用した新規硬度耐久性バイオ基材の開発

本年度は、徳島大学にあるマイクロ波プラズマCVD装置およびアークイオンプレーティング装置を使いダイヤモンド薄膜の創製を行った。そして、これらに化学的修飾を施し、酵素を付着させ、耐久性の評価を行った。1)マイクロ波プラズマCVD法を用いて、純チタン基板にダイヤモンドを成長させた。2)平滑な純チタン基板にダイヤモンドを成長させた試験片を用い、化学修飾するための化学処理を行った。ダイヤモンド終端の水素(H)を酸化処理するため硫酸と硝酸の混合液の中で処理を行ってケトン化させ、続いてNaOH処理、HCl処理を行うことによりカルボキシル基(-COOH)とエステルに置換することができたと見られるFT-IR, MiniSIMSにより定性的にカルボキシル基に置換することが確認できた。3)化学処理を施したダイヤモンド薄膜に、カルボジイミドカップリングを用いることにより酵素を付着させることに成功した。4)抗ガン剤や放射線等による化学的・物理的ストレスによるアポトーシス過程において、アポトーシス誘導シグナルとしての特定遺伝子が高速検出できる可能性が示された。本研究ではマイクロ波プラズマCVD法によりTi基板上にダイヤモンド薄膜を作製し、その最表面上に存在するC-H結合の水素を塩素で置換して、ダイヤモンドと様々な有機物を結合させる手法の確立を試みた。その際、成膜条件と結晶粒径の関係を明らかにし、結晶粒径が化学修飾の状態に及ぼす影響について検討を行った。その結果、基板温度11231473K、メタン濃度0.51.0%、圧力4060Torr、時間36hourの成膜条件で、平均結晶粒径は0.52μmから1.25μmの範囲内で変化させることができた。これらの試験片をラマン分光器で分析したところ、すべてダイヤモンドが主体の薄膜であることがわかった。このような平均結晶粒径の異なる薄膜を用いて化学修飾を試みた。化学修飾はまず表面の塩素化のため、窒素置換した容器内にクロロホルム、塩化スルフリルおよびAIBNの混合溶液と試験片を入れ、327Kで1hr保持した。混合液が完全に蒸発した後、n-ブチルアミンを注入し塩素化した部分への結合を試みた。処理後、試験片表面をSIMSで分析を行ったところ、処理前のものに比べて炭素ピークがすべて低下しており、何らかの物質が精製されていることがわかった。また、このようなピークの低下量と粒径の間には明確な相関関係は認められず、粒径は化学修飾のしやすさにあまり大きな影響を与えていないものと考えられる。
ＮＢＳ１新規ドメインによるユビキチン・シグナルとＤＮＡ鎖切断修復

放射線感受性遺伝病の蛋白NBS1は、そのC末側でATMおよびMRE11と結合してそれぞれ細胞周期チェックポイントと相同組換え修復を制御する事が報告されている。本研究で、NBS1蛋白はさらにユビキチンE3リガーゼのRAD18およびRNF20と直接結合して、PCNAのユビキチン化を介した損傷乗り越えDNA合成およびヒストンH2Bのユビキチン化を介したクロマチンリモデリングを開始する事を明らかにした。放射線感受性遺伝病ナイミーヘン症候群の蛋白として同定されたNBS1には、そのC末側に高等真核生物で良く保存された5領域が存在する。このうち2領域はATMおよびMRE11と結合してそれぞれ細胞周期チェックポイントと相同組換え修復を制御する事が既に報告されている。我々の最新の研究から残りの2保存領域に結合する蛋白はユビキチンE3リガーゼのRAD18およびRNF20である事が明らかになった。本研究ではこれらのユビキチン化酵素のDNA二重鎖切断における役割および5番目の領域の意義を明らかにすることを目的とする。転写の研究から、RNF20はヒストンシャペロンFACTと結合することが知られている。そこで、免疫共沈法を用いて解析した結果、FACTの構成因子Spt16とRNF20が放射線照射依存的に結合することが判明した。放射線照射によりRNF20がフォーカスを形成することを以前に報告したが、Spt16蛋白のノックダウンによりRNF20フォーカスが消失した。このことから、Spt16がRNF20と結合して、放射線照射により発生したDNA二重鎖切断部位に動員することが明らかとなった。一方、DR-GFPレポーター遺伝子を用いてこれらのNBS1領域を欠損した細胞の相同組み換え修復能を測定した。この結果、MRE11領域のみならず、RAD18ならびにATM領域の欠損による相同組み換え能が顕著に低下することが示された。続いて、pEJレポーター遺伝子を用いて非相同末端再結合を測定した。驚いたことに、チェックポイントに関わるATM結合領域の欠損により非相同末端再結合能が低下した。現在までに、非相同末端再結合経路へのATMの役割は知られてないので、さらなる解析が必要である。最後に、5番目の領域が欠損した幾つかの詳細な欠損変異体を作成した。この領域はATM領域に隣接しており、欠損変異体はATM欠損細胞と類似していた。しかし、異なる点も見られるので次年度以降の解析が必要である。放射線感受性遺伝病の蛋白として同定されたNBS1は、そのC末側に高等真核生物で良く保存された5領域が存在する。そこで、本研究はこれらのユビキチン化酵素のDNA二重鎖切断における役割を明らかにし、さらに残された5番目の領域の結合蛋白とその機能を明らかにすることを目的とする。RAD18結合ドメインを欠損したNbs1欠損細胞は放射線にわずかに感受性となる。その程度は相同組換え修復の欠損細胞と類似しているので、DR-GFPレポーター遺伝子を用いて相同組換え能をアッセイしたが異常は見られなかった。しかし、EdUを用いて放射線照射後の修復合成を測定した結果、顕著に低下していた。放射線はDNA二重鎖切断以外にも数多くの塩基損傷を誘発するので、修復合成における損傷乗り越えにこのRAD18ドメインが必要であると思われる。一方、DNA-クロマチン構造はまるで呼吸するかのように、緩んだり、堅くなったりすることが知られている。ヒストンシャペロンFACTは緩んだクロマチンをより安定にする作用がある。DNA二重鎖切断に構造を緩めて、FACTが損傷部位に多く結合、そしてRNF20をリクルートすることが明らかとなった。このようにNBS1と結合するRAD18およびRNF20の解析から、損傷応答の新しい概念が導かれた。さらに、5番目のドメインは放射線アポトーシスに関わることが明らかとなり、NBS1の修復、チェックポイント、クロマチン・リモデリング、アポトーシス、損傷乗り越え合成から構成される損傷応答機構の全体象が鮮明となった。ナイミーヘン症候群は染色体不安定性、放射線高感受性と高発がん性を特徴とするヒト劣性遺伝病である。その蛋白NBS1はC末側に存在するATMおよびMRE11との結合領域により、放射線照射後のATM依存性チェックポイントならびにMRE11依存性相同組み換え修復を制御することが既に知られている。我々はNBS1のC末側にはさらにユビキチンリガーゼRNF20およびRAD18と結合する領域が存在することを最近明らかにした。本年度の研究では、NBS1とRNF20の結合は転写やDNA複製阻害剤の添加により影響を受けず、放射線照射にのみ依存することが示された。

また、この結合はRAD51のような相同組み換え蛋白のDNA損傷部位への集積に必須であるが、クロマチン構造を弛緩させる薬剤処理により代替できた。一方、RNF20と結合する蛋白として新たにヒストンシャペロンを同定して、そのノックダウンと結合領域の変異蛋白から、RNF20を経由したクロマチン構造の弛緩とそれに続く相同組み換え修復の制御機構の存在が明らかになった。次に、RAD18結合ドメインを欠損したNBS1の欠失変異体を用いて、その役割を解析した結果、NBS1/RAD18の結合は紫外線のみならず、アルコール摂取により発生するアセトアルデヒドやその他のアルキル化剤にも高感受性を示した。RAD18欠失変異体ではレポーター遺伝子を用いた相同組み換えの測定により、これらのDNA損傷の修復には相同組み換え修復に加えてRAD18依存性の損傷乗り越えDNA合成が重要な役割を果たしていることが判明した。一方、Flag標識NBS1に免疫共沈する蛋白をマススペクトル法により同定した結果、幾つかの関連蛋白との新規結合が明らかとなった。このうちの1つの蛋白はNBS1の新規保存領域で結合して、損傷乗り越えDNA合成の開始に重要な役割を担うことが明らかになった。放射線生物学研究代表者および2名の分担者の各項目につついて、研究実績の概要に記載したように順調に進行している。25年度が最終年度であるため、記入しない。当初の計画を上回るスピードで順調に進んでいる。例えば、RAD18とNBS1の結合そしてそのDNA損傷応答機構を明らかにして論文公表した(Molecular Cell, 43:788-97, 2011)。また、RNF20とヒストンシャペロンの結合の放射線応答における役割を明らかにして現在論文投稿中である。当初計画に沿って遂行する。RPAがRAD18依存性損傷乗り越えDNA合成に重要であることが既にUlrich HDのグループにより報告されていた(Molecular Cell, 29:625-636, 2008)。しかし、本研究の解析ではRPAがこの開始機構に直接かかわらないことが判明した(つまり、Ulrich HD等の論文では重要な点が欠落していると思われる)。代わりにマススペクトルを用いた実験によりNBS1と他の蛋白との結合が重要であることが明らかになった。そこでRPA結合の解析に代えて、この蛋白とNBS1との結合による開始機構の全容解明を進める予定である。
中高エネルギー核破砕及び核分裂の放射化学的研究

本研究は、国内既設の種々の加速器を用い,最も単純な光子から複雑な重イオンにわたる中高エネルギー粒子による核破砕(s)・核分裂(f)・フラグメンテーション(F)を化学の手法で総合的に調べることであった。実質1年半の期間であったが,各分担者において,相互に,あるいは他の協力者と共に初期の成果を挙げてきた。年度末(3月3日)に開催の総合報告書によれば,先づ,坂本,藤原,柴田は東大ESと東北大linaccからの最大エネルギーE_o=60-1000MeVの制動放射線照射により^<27>Al^<209>Biにわたる22種の標的について,s,f,F及びπ^±中間子放出反応を調べた。特に^<197>Auの光核分裂片と^<65>Cuのs生成核の反跳測定を行い,動力学的情報を得た。桝本,大槻は300MeV-linacの250cm遮蔽コンクリートに蓄積のs生成核の方向と深さ分布を,三頭は^<237>Npの光核分裂と^<197>Au(γ,xn)による制動放射スペクトルの検証を行った。関根は同linaccと東北大サイクロトロン及び立教大原子炉を用いて^<51>V,^<52,50>Crからの^<51>Crと^<197>Auからの^<196>Auと^<198>Auを例に反跳エネルギー測定や有用標識化合物の反跳合成を研究した。篠原はHIMACからの3.0-4.8GeV^<12>Cと12-28GeV^<40>Arを用いてAu,Cu及びNbのs断面積と反跳飛跡を調べ、理研での運動量移行の結果と照合した。また、浜島らと協力して高エ研PSからのπ^-ビームを用いるパイ中間子原子の化学を進行した。工藤は東北大サイクロで^<238>Uと^<232>Thの陽子誘起のfを調べ,分裂時での角運動量移行からf過程の知見を深めた。今村,小林,永井は長寿命核の^<10>Be,^<14>C,^<26>Al,^<36>ClのAMS測定を行い、坂本,柴田はこれを用いて光Fの研究を開始できた。また,今村,柴田は^<14>N,^<16>O,^<39>K,^<40>Ca,^<63>Cuの陽子及び中性子誘起反応で生成する^<10>Beの励起関数測定を調べた。さらに三頭は超ウラン核種(^<242>Cm,^<238>Pu等)のJMTR中性子反応による製造とそれらの化学研究を行った。以上の結果は既報並びに準備中の論文で詳述・公表されるが,過去の蓄積に加えて本研究より新たな発展・飛躍の方向を見出すことができた。本研究は、年度後半に補助金交付決定を受けたが、各分担者において東大電子シンクロトロンとタンデム加速器(AMS用)、東北大電子ライナックとサイクロトロン、理研サイクロトロン、高エ研陽子シンクロトロン、放医研HIMAC、立教大原子炉の利用による核破砕、核分裂、フラグメンテーション及び関連の基礎諸実験が進行し、年度末に研究会を開いて、これまでの状況報告と次年度に向けての討議を行った。先ず、坂本、藤原、柴田は、最大エネルギーE_o=400-1000MeVの制動放射線照射により^<63+65>Cu,^<197>Au,^<209>Biの光核破砕を化学的に調べ、またCuの場合の生成核反跳飛程と放出粒子数の関係を調べた。桝本は300MeVライナックの250cm遮蔽コンクリート中の光核破砕の方向と深さ分布を、三頭は^<237>Npの光核分裂と^<197>Au(γ,xn)を用いる制動放射スペクトルの検証を試みた。また、関根は同ライナックとサイクロトロン及び立教大炉を利用して^<51>V,^<52>Cr,^<50>Crからの^<51>Crと^<197>Auからの^<196>Auと^<198>Auを例に反跳エネルギースペクトルの薄膜法による測定法を開発しつつある。他方、篠原はHIMACからの3.0及び4.8GeV^<12>CイオンによるAu,Cu及びNbの核破砕断面積をはじめて測定し、Cuでは39の生成核種の反跳飛跡を調べて、理研での結果と合わせて運動量移行のエネルギー依存性を検討している。また、高エ研PSからのπ^-中間子を用いたパイ中間子原子の化学を進行した。工藤による^<238>Uと^<232>Thの陽子誘起核分裂の研究は生成核異性体比測定から分裂時での角運動量移行の知見を得て分裂機構を探ろうとするものである。小林と永井は^<10>Be,^<14>C,^<26>Al,^<36>Cl,^<129>Iなど長寿命核の超高感度測定を目指して新しいAMSの整備と予備測定に入り、今村は^<14>N,^<16>O,^<39>K,^<40>Caの陽子及び中性子反応で生成する^<10>BeなどのAMSによる励起関数測定を開始した。

以上のように、各分担者は過去の蓄積に加えて特徴ある方向へ進みつつあり、一層の協力を行って、短期ながら次年度での大きな成果と将来に向けての発展を期する。本研究は、国内既設の種々の加速器を用い,最も単純な光子から複雑な重イオンにわたる中高エネルギー粒子による核破砕(s)・核分裂(f)・フラグメンテーション(F)を化学の手法で総合的に調べることであった。実質1年半の期間であったが,各分担者において,相互に,あるいは他の協力者と共に初期の成果を挙げてきた。年度末(3月3日)に開催の総合報告書によれば,先づ,坂本,藤原,柴田は東大ESと東北大linaccからの最大エネルギーE_o=60-1000MeVの制動放射線照射により^<27>Al^<209>Biにわたる22種の標的について,s,f,F及びπ^±中間子放出反応を調べた。特に^<197>Auの光核分裂片と^<65>Cuのs生成核の反跳測定を行い,動力学的情報を得た。桝本,大槻は300MeV-linacの250cm遮蔽コンクリートに蓄積のs生成核の方向と深さ分布を,三頭は^<237>Npの光核分裂と^<197>Au(γ,xn)による制動放射スペクトルの検証を行った。関根は同linaccと東北大サイクロトロン及び立教大原子炉を用いて^<51>V,^<52,50>Crからの^<51>Crと^<197>Auからの^<196>Auと^<198>Auを例に反跳エネルギー測定や有用標識化合物の反跳合成を研究した。篠原はHIMACからの3.0-4.8GeV^<12>Cと12-28GeV^<40>Arを用いてAu,Cu及びNbのs断面積と反跳飛跡を調べ、理研での運動量移行の結果と照合した。また、浜島らと協力して高エ研PSからのπ^-ビームを用いるパイ中間子原子の化学を進行した。工藤は東北大サイクロで^<238>Uと^<232>Thの陽子誘起のfを調べ,分裂時での角運動量移行からf過程の知見を深めた。今村,小林,永井は長寿命核の^<10>Be,^<14>C,^<26>Al,^<36>ClのAMS測定を行い、坂本,柴田はこれを用いて光Fの研究を開始できた。また,今村,柴田は^<14>N,^<16>O,^<39>K,^<40>Ca,^<63>Cuの陽子及び中性子誘起反応で生成する^<10>Beの励起関数測定を調べた。さらに三頭は超ウラン核種(^<242>Cm,^<238>Pu等)のJMTR中性子反応による製造とそれらの化学研究を行った。以上の結果は既報並びに準備中の論文で詳述・公表されるが,過去の蓄積に加えて本研究より新たな発展・飛躍の方向を見出すことができた。年度末(3月3日)に開催の総合報告書によれば,先づ,坂本,藤原,柴田は東大ESと東北大linaccからの最大エネルギーE_o=60-1000MeVの制動放射線商社により^<27>Al^<209>Biにわたる22種の標的について,s,f,F及びπ^±中間子放出反応を調べた。関根は同linaccと東北大サイクロトロン及び立教大原子炉を用いて^<51>V,^<52,50>からの^<51>Crと^<197>Auからの^<196>Auと^<198>Auを例に反跳エネルギー測定や有用標識化合物の反跳合成を研究した。
PETによる脳血管障害患者の運動負荷脳血流とオピオイド受容体反応の計測

脳主幹動脈閉塞患者5名に対し安静時、運動開始3分後、開始13分後、終了後2分後にO-15標識水を用いたPETによる脳血流定量を行った。健常者に同等の計測を行い対比した。患者群も健常者も運動中は下肢運動野や小脳に血流上昇がある以外は全脳血流は安定していた。正常者では運動終了後に血流低下部位が見られたが患者群では低下が見られなかった。C-11 Carfentanilを用いたPETμオピオイド計測を正常被験者にて行った。運動時に辺縁系で結合能の低下を示し内因性オピオイド系の活性化が示唆された。変化量は気分変化と有意な相関を認めた。これら結果はいずれも世界で初のものであり今後の研究継続を計画している。健常者の運動時脳内μオピオイド受容体の結合能を安静時と比較して計測するPET研究のデーターがまとまった。適度な負荷での運動を行った場合辺縁系を中心に広い部分で運動時に結合能低下が発生することがわかった。一方で、より強い負荷を与えた場合はその結合能低下域がより狭まることがわかった。すなわちこれは適度な運動を与えたときの高揚感が脳内の内因性オピオイドの放出を促しているが、これが本人の快適な運動以上の負荷となった場合高揚感うすれ分泌が減少すると言うことが示唆された。そして、運動後のアンケートで得られたうつの使用が受容体結合能と正相関する部位が帯状回全体に見られたことがこの仮説を支持する所見と捉えられた。また、本研究の主題である脳血管障害患者の計測に関しては2014年当初に東京医科歯科大学倫理審査委員会に申請し7月に認可されたが研究開始には臨床研究保険の締結が条件とされた。保険の締結が諸般の事情で大幅に遅れ2015年4月になってしまったのが予定外であった。2015年4月運動負荷PET計測を開始する予定である。昨年度末に本研究の臨床研究保険が承認されたため本年度から運動負荷時の脳血流計測を開始することが出来た。ただし、近年のPETカメラの新機種への変更のため、既に取得した健常被験者の計測データーをコントロールとして使用できないことが判明したため、本研究の目的である脳血管障害患者の計測を行う以前に再度健常者データーベースを構築する必要が発生したためその計測を開始した。本年度中に目標は達成することができたので前年度末から患者計測を開始することが出来た。28年度において被験者数を増やすため現在被験者を募集している。本研究のもう一方の柱である脳内オピオイド受容体結合能計測の基となる健常被験者研究の論文を投稿中であるが、被験者の少なさを指摘されるにいたりこちらも健常者再計測を必要とした。改訂した上で再投稿中である。また本年度より、本研究に従事するために教室の大学院修士課程に受け入れた大学院生の研究活動も開始した。研究テーマとしては、既出版の運動負荷中の脳血流計測のみで無く運動終了後の脳血流変化に関しても解析することとし解析環境の整備を本研究費で行った。またPET脳血流を対比して同被験者で経時的な前頭葉脳血流変化を近赤外線法にて計測するという研究も開始した。この二つの方法の対比により負荷による血流変化がより高い時間解像度で計測できるようになったため患者研究に関してもより非侵襲的な手法である近赤外線を用いて行う可能性も出てきたため今後の研究のために有用なデーター取得となった。大学院生の活動補助(学会参加および発表費用、解析ソフトウェアーの購入)に本研究費を使用した。前述のように前年度の臨床研究保険締結にかかった時間、健常者計測数を増やすあるいはやり直す必要が生じたため目的としている患者計測の開始が遅れている。しかし前述のごとくこれらが完了したので患者計測を開始できた。昨年度後半より開始可能となった脳血管障害患者の運動負荷時PET計測を継続し年度内に5名の患者計測を完了することが出来た。また正常被験者10名の計測も完了し運動負荷時脳血流の正常者データーベースの作成も完了した。これらデーターを用いて統計画像解析を行い年度内に初期成果として日本脳卒中学会および日本ニューロリハビリテーション学会での口頭発表を行なった。現時点での結果を集約すると脳主幹動脈の閉塞がある患者でも自然経過あるいは血行再建術を行い安定した循環動態に回復している場合は正常被験者と変わりない血流反応が得られていることが確認されている。ただし、正常者よりも運動時に血圧が高値になりがちなことも判明しており何らかの代償機構の存在も示唆されるような興味深い所見が得られている。今後の論文作成までには更に数名の被験者計測が必要のため今後も計測を継続していく計画である。また正常被験者の運動時血流研究においては経頭蓋ドプラー法による計測との対比を行うとともに運動時のみでなく運動後の血圧と脳血流の反応に関しても計測を行なった。これらの結果は一論文を投稿中で有り、さらに国際学会で発表を行った後の一論文を作成中である。運動時の脳内オピオイド受容体結合能の変化に関してはPET研究では正常被験者での解析を終え論文出版することが出来た。運動強度を変化させ適度な運動時にはオピオイド分泌が見られるが過負荷がかかった場合は抑制されるなどの興味深い内容を世界で始めて報告することが出来た。

脳主幹動脈閉塞患者5名に対し安静時、運動開始3分後、開始13分後、終了後2分後にO-15標識水を用いたPETによる脳血流定量を行った。健常者に同等の計測を行い対比した。患者群も健常者も運動中は下肢運動野や小脳に血流上昇がある以外は全脳血流は安定していた。正常者では運動終了後に血流低下部位が見られたが患者群では低下が見られなかった。C-11 Carfentanilを用いたPETμオピオイド計測を正常被験者にて行った。運動時に辺縁系で結合能の低下を示し内因性オピオイド系の活性化が示唆された。変化量は気分変化と有意な相関を認めた。これら結果はいずれも世界で初のものであり今後の研究継続を計画している。脳血管障害患者の運動負荷PET研究の倫理審査委員会での認可は年度前半で既に得ることができたが、計測開始の条件であった臨床研究保険の締結が大幅に遅れたため(主因は本研究のような脳疾患者の臨床計測に関して本学担当の保険会社が不慣れであったことに由来する)年度内に計測が開始できなかった。運動時脳血流計測を行える脳血管障害患者を多数リクルートし計測を重ねる予定である。当面研究年度内の患者脳血流計測に集中する。一方で、患者計測においても近赤外線法との対比を行っていく予定である。オピオイド受容体計測の患者における計測はこれらが終了し次第となる予定である。脳神経外科学研究の遅れを取り戻すため2015年4月から積極的な計測を進める予定である。前述のように健常被験者のデーター収集を再度行う必要が発生し、目的としている脳血管障害患者の計測は次年度に集中的に行う事になった。そのためそれに要する費用を意図的に残存させた。臨床研究保険の締結が大幅に遅れ年度内の出費ができなかったため。本研究の最終目的である脳血管障害患者の計測を可及的に多くの被験者を募集した上で行う計画である。既に2015年4月に臨床研究保険費用としてほぼ次年度使用額を使用し終わった。
ネトリン受容体DCCの細胞表面移行を介した大脳皮質ニューロン軸索分岐の調節

ハムスター大脳皮質ニューロン初代培養系を用い、神経回路形成に働く軸索ガイダンス因子ネトリン-1のもつ軸索分岐形成作用に、ネトリン受容体DCCの細胞表面移行が関与するか否かを調べた。大脳皮質ニューロン軸索シャフトではネトリン-1刺激により糸状仮足を経て分岐が形成されるが、糸状仮足形成時にシャフト表面でDCCレベル上昇・クラスター形成がエキソサイトーシス依存的に認められ、DCCの細胞表面移行が軸索分岐の調節に関わることが示唆された。神経回路形成において軸索が伸長と分岐とを繰り返し標的へと投射する際には、種々の軸索ガイダンス因子が働くことが知られている。軸索ガイダンス因子ネトリン-1の受容体の一つであるDCC(deleted in colorectal cancer)は脊髄交連ニューロン内の調節性小胞に局在しており、ネトリン-1存在下におけるプロテインキナーゼA活性化の際には、エキソサイトーシスにより細胞表面DCCが増加して、ネトリン-1へのケモアトラクションが増強されるといわれる。そこで本研究ではハムスター大脳皮質由来の初代培養ニューロンを用いて、このニューロンで知られるネトリン-1による軸索分岐形成の促進に、小胞輸送を介したDCCの細胞表面移行が関与するという仮説について検証することを目指している。課題の初年度となる平成19年度の研究では、ハムスター新生仔大脳皮質由来の初代培養ニューロンにおいて、神経突起の分岐形成がネトリン-1によって刺激されることが確認され、その際にニューロン表面ではDCCのレベルが上昇するとともに、DCCが偏在し微細なクラスター様の構造をつくることが、抗DCC抗体を用いた蛍光免疫組織化学および白色光TIRF(全反射蛍光)検鏡により観察された。さらにこの反応が、v-SNARE(R-SNARE)タンパク質類の分解・無効化を介したエキソサイトーシス阻害剤である破傷風毒素を用いて前処理を行った際に消失したことから、このような細胞表面DCCの変化にはエキソサイトーシスが関与することが示唆された。現在、これらの現象の定量的画像解析に取り組んでおり、大脳皮質ニューロンにおけるDCCの細胞内輸送にそのリガンドであるネトリン-1が与える影響について、平成20年度も引き続き調べる計画である。軸索ガイダンス因子ネトリン-1は、発生過程における神経回路形成の際、種々のニューロンにおいて軸索の伸長/誘引/反発/分岐形成などの多様な機能を発揮する。大脳皮質ニューロン軸索の分岐形成には、成長円錐を介して分岐が生ずる様式と、シャフトに生ずる糸状仮足が分岐へと発達する様式との二通りが知られ、ネトリン-1は後者を刺激するといわれる。一方、脊髄交連ニューロンでネトリン-1受容体DCC(deleted in colorectal cancer)は細胞内の小胞に局在し、エキソサイトーシスによる細胞表面DCCの増加によって軸索伸長が増強されることが知られている。本研究ではハムスター新生仔由来の大脳皮質ニューロン初代培養系を用いて、ネトリン-1による軸索分岐形成に、小胞輸送を介したDCCの細胞表面移行が関与するか否かを検証することを目指した。30分間のネトリン-1刺激を行った際、軸索シャフトでは糸状仮足数の増加が認められ、ニューロンは軸索分岐形成の前段階にあるものと考えられた。細胞表面DCCの分布とレベルの変化について免疫染色像の定量的画像解析を行ったところ、シャフト表面ではネトリン-1刺激に応じてDCCがクラスター様の構造を形成し、これに伴ってDCCのレベルが上昇することが判明した。この変化はエキソサイトーシスの阻害剤である破傷風毒素により妨げられた。一方、成長円錐表面においては変化が認められなかった。大脳皮質ニューロンの細胞内にもDCC小胞が存在し、この小胞がネトリン-1刺激に応じエキソサイトーシスを介して細胞表面に移行することにより、細胞表面におけるDCCの分布とレベルの調節が行われるものと考えられた。またDCCの細胞表面移行は、ネトリン-1の引き起こす、シャフトから糸状仮足を経て分岐が生ずる様式の軸索分岐形成に関与することが示唆された。
パフォーマンス評価を導入した美術鑑賞教育の協働実践的方法論の開発

教師としての資質や能力を育むための美術鑑賞教育の協働実践的方法論の開発に取り組んだ。実践コミュニティや逆向き設計を活用したパフォーマンス評価を導入した鑑賞学習プロジェクトは、立場や専門性の異なる他者との開かれた協働探究の評価活動の場を生みだし、自らの実践を再構成していくための省察的探究プロセスをもたらせることを明らかにした。鑑賞学習プロジェクトにおいて、子どもたちと「学習発表会」の場をつくり出すパフォーマンス評価を導入したことで、学習評価を「探究や学習を促進するための道具」や「目標と学習そのものを問い直す道具」として活用する探究プロセスが実現されることを確認した。平成25年度は、「美術鑑賞教育における子ども及び学生の探究プロセスを省察的に再考し、それらをパブリックな場で公表していく」といったパフォーマンス評価を美術科教育法の授業に導入することで、開かれた協働実践研究の場を学生たちと共につくり出すことができるのではないか、という仮説を基に実践研究に取り組んだ。具体的には、「岡倉天心展を活用したワークショップにおける子どもと学生の探究プロセスを再構成した発表会【おしゃべり展覧会をひらこう】の開催」(平成25年11月24日:福井大学アカデミーホール)や「子ども及び学生の探究プロセスを省察的・ビジュアル的に表現し、パブリックに発信していく実践報告書【START LINENo1-No2】の作成」といったパフォーマンス評価を導入し、実践研究に着手した。これらのパフォーマンス評価に対する教育的価値を実践報告書・研究論文等を作成する中で検討してきたところ、次のような成果が認められた。〇美術鑑賞活動のプロセスの再構成を促す「おしゃべり展覧会」のような学習発表の場は、自分たちの実践をさらに価値あるものへと創造していこうとする子どもと学生の協働実践の場を生み出す。〇学生たちがつくり出す協働実践研究の場は、未熟であるが故に参加した実践者の誰もが入り込める開かれた学び合いの場をつくり出し、鑑賞教材としての価値や意味を協働的に生成していく展開が期待できる。〇学生と教員が一つのチームとなって、授業記録(写真・ビデオ)・振り返りレポート・子どもたちの学習成果物といった資料をもとに、実践のプロセスを実践報告書として編み直していくプロセスは、子どもたちの「みる」や実践の展開を多重的に捉え直す省察的思考を育む。〇実践のプロセスを省察的に捉え直した活動報告書「START LINENo1-No2」は、多様な実践者たちとの協働研究の場も豊かにデザインするための資料として活用できる。本研究では、学生・学校教員・美術館学芸員らの協働的な学びの場を創出する「パフォーマンス評価を導入した美術鑑賞教育の協働実践的方法論」を構築し、子どもの実際の学びから鑑賞学習で形成されていく力をグループ・モデレーションなどで明らかにするとともに、実践場面における多様な問題設定に対して創造的に対応できる力をもった教員を養成するための協働実践プログラムの開発を目指す。平成24年度の主な研究実績は次の通りである。1「美術作品を活用した幼稚園児のための造形遊びの出前授業」を学生たちへのパフォーマンス課題とした授業を、学生・幼稚園教員・大学教員らの実践コミュニティが支えていく協働実践研究に着手した。その結果、実践コミュニティの力を活用することで、実践と省察が繰り返される専門職的な学習のプロセスが生まれる授業構造が明らかになった。パフォーマンス課題に取り組んだ学生の実践報告書の整理と検討からは、「5歳児の見る」や「5歳児のための鑑賞方法」といった鑑賞学習に関わる発達理論が実践から導き出されてくることが判明した。同時に、学生の実践報告書には多義的重層的な実践知が蓄積されていることが検証され、今後の研究につながる示唆を得た。2「鑑賞対象を学生作品とした中学生のための対話型鑑賞の授業づくり」を学生たちへのパフォーマンス課題として設定した教員養成の授業実践を、蔵野美術大学生とのコラボレーションによる公開出前授業研究会(於坂井市丸岡中学校)や福井大学教職大学院のラウンドテーブル(於福井大学)といったパブリックな場へと連動させていく協働実践研究にも取り組んだ。これらの実践から得られた成果は、これからまとめていくところである。パフォーマンス評価の質的な向上を目指すためには,福井大学教員養成スタンダード(以下FTSと記す)の評価観(省察的探究や批判的省察を促す評価)を活かしたものへと発展させていく必要がある考え,鑑賞学習プロジェクト(以下PJと記す)において子どもたちと「学習発表会」の場をつくりだすパフォーマンス評価を設定すれば,FTSの評価観が活かされた省察的探究プロセスが生まれるのではないかという仮説を立て,実践的研究に取り組んだところ次のような成果を得た。1FTSの背後には,DeSeCoのホリステック・モデルと同様の概念や教育専門職の基軸になりつつある省察的思惟の探究の理論が据えられていることを明らかにし、省察的探究プロセスを生み出す指針として、評価を「探究や学習を促進するための道具」や「目標と学習そのものを問い直す道具」として活用していくことを見出した。

2子どもたちと「学習発表会」の場をつくりだすパフォーマンス評価を設定することで,多様な人に開かれた評価の場を設定することが可能であり,FTSの評価観も活かされることを考察した。3おしゃべり展覧会PJで設定した7つのパフォーマンス評価についてドキュメンテーションを作成し、それぞれの評価が,学生たちによって「探究や学習を促進するための道具」として,あるいは「目標と学習そのものを問い直す道具」として活用されていたことを確認した。4学生Tの実践報告書には,自らの実践と出会い直し,まとめ直し,その意味を問い直す省察的な探究のプロセスが表現されていることを考察した。美術教育学「美術鑑賞教育における子ども及び学生の探究プロセスを省察的に再考し、それらをパブリックな場で公表していく」といったパフォーマンス評価を導入したことで、次のような協働実践研究の場をつくり出すことができたことから、おおむね順調であると判断した。(1)学生たちは、小学生対象のワークショップ「日本美術で遊ぼうーおしゃべり展覧会をひらこう」を企画・運営し、その最終日には、保護者や教員(幼・小・中・大学)、学芸員たちを招待し、学生と子どもの鑑賞学習の探究プロセスを表現した「おしゃべり展覧会」を発表した。(2)「おしゃべり展開会」終了後、シンポジウム「【見る】を活用してみる」(平成25年11月24日:福井大学アカデミーホール)を開催した。立場や経験年数の異なる実践者が交じり合う小グループの話し合いの場を設け、子どもの学びの見取りや学習方法に対する捉え方の違い等を語り合い、子どもたちにとって意味ある鑑賞学習の在り方を模索した。(3)12の研究成果を基に、「日本美術で遊ぼう鑑賞教材シートNo1No4」を作成し、福井大学大学院教育研究科教育内容・教材開発研究会(平成26年2月15日:福井大学)で鑑賞教材シートを紹介するワークショップを開催した。(4)ワークショップや出前授業など2年間にわたる活動記録(映像・レポート・子どもたちの学習成果物)をもとに、実践のプロセスとその意味をチームの力を活用しながら捉え直し、そこから見出した課題や今後に向けての提案も含めた活動報告書「START LINENo1」、「START LINENo2」として発行した。また、それらは、国立図書館を始め県外の大学や美術館に送付した。学生と教員らによる実践コミュニティが機能する授業構造が明らかになったことで、今後の協働実践研究の場を開発していくうえでの足場ができた。協働研究の学習成果物として、グループ・モデレーションによるルーブリックの作成を計画していたが、学生が実践と省察のプロセスを綴っていく実践報告書の作成に変更した。実践報告書には、ルーブリックの作成目的であった鑑賞学習に関わる子どもの発達理論だけなく、教材研究の意義や方法といった学生たち自身の課題から編まれていく物語知も数多く綴られていたことから、教職の専門性も培っていくためには実践報告書の作成のほうが有効であったと考える。
軟骨内骨化過程に発現する非コラーゲン性タンパクの遺伝子・タンパクレベルでの研究

平成14年度は,ラット形成期脛骨における非コラーゲン性タンパクの発現について検討を行った。【方法】【結果】MGP遺伝子の発現:E16に初めてMGP遺伝子は骨幹中心部の軟骨細胞に発現した。E17では骨幹部の肥大軟骨細胞に遺伝子発現が認められ,E20になると骨端軟骨板の肥大層と石灰化層の軟骨細胞に遺伝子発現が認められた。生後10日齢では,二次骨化中心周囲の肥大軟骨細胞にも遺伝子発現が認められた。いずれの日齢においても骨幹部周囲と一次骨髄腔の骨芽細胞には遺伝子発現が認められなかった。BSP遺伝子の発現:E17に初めてBSP遺伝子は骨幹部周囲の骨芽細胞と骨幹部の肥大軟骨細胞に発現した。E20になると骨幹部周囲と一次骨髄腔の骨芽細胞に遺伝子発現が認められた。生後2日齢では骨端軟骨板にBSP遺伝子の発現が認められ,生後10日齢になると二次骨化中心周囲の肥大軟骨細胞にも遺伝子発現が認められた。【結論】MGP遺伝子は脛骨発生過程の比較的初期より軟骨細胞に発現していたことから,軟骨細胞の分化に関与している可能性が考えられる。また,BSP遺伝子は骨芽細胞と軟骨細胞に発現していたことから,骨芽細胞および軟骨細胞の分化に関与している可能性が考えられる。このように,非コラーゲンタンパクであるBSPとMGPは互いに異なる遺伝子発現パターンを示し,軟骨内骨化の様々な過程に関与している可能性が考えられる。平成13年度は,ラット形成期脛骨における非コラーゲン性タンパクの発現について検討を行った。【方法】【結果】形成期脛骨の形態変化:E15に軟骨原基が認められた。E17になると骨幹部周囲の軟骨膜下に骨芽細胞が分化し,E18では骨幹部周囲の骨基質が石灰化した。E19になると一次骨髄腔が形成された。OPN遺伝子の発現:E17に0PN遺伝子は骨幹部周囲の軟骨膜下に分化した骨芽細胞に初めて出現した。E19になると,一次骨髄腔の骨芽細胞に遺伝子発現が認められた。引き続き10dayまで骨幹部周囲および一次骨髄腔の骨芽細胞にOPN遺伝子発現が認められた。Dmp1遺伝子の発現:E18になって初めて,Dmp1遺伝子は骨幹部周囲の骨膜下の骨芽細胞に軽度に発現した。E19になると,主に骨幹部周囲に分化した骨細胞に遺伝子発現が認められた。誕生直後,一次骨髄腔の骨梁周囲では,ごく一部の骨芽細胞のみに遺伝子発現が認められた。2dayになり,Dmp1の遺伝子は一次骨髄腔に出現した骨細胞にも認められ,以後10dayまで,主に骨幹部周囲および一次骨髄腔の骨細胞に認められた。【結論】以上の結果より,osteopontinは骨芽細胞分化に関与している可能性が考えられる。また,Dmp1遺伝子は骨芽細胞よりも主に骨細胞に発現し,骨細胞の機能に関与している可能性が考えられる。
ラット下顎骨顎裂モデルを用いた骨芽細胞シートの顎骨再生に関する基礎的研究

ラット骨髄由来間葉系細胞より細胞シートを作製した。ラット下顎骨顎裂部への移植実験を行い、本移植方法による顎骨再生の有用性を確認した。次に、ヒト骨髄由来間葉系細胞より細胞シートを作製し、免疫不全ラットの下顎骨顎裂部への移植実験を行ったが、骨形成は明らかではなかった。免疫不全ラットの背部皮下で移植実験を行ったところ、細胞シートを人工骨と複合化させて移植を行った群で、限定的ではあったが骨形成を確認した。ヒト骨髄由来間葉系細胞による細胞シート単独移植での骨形成は困難であったが、人工骨と複合化させ移植を行うことで、ヒト骨髄由来間葉系細胞による骨再生のヒト臨床応用の可能性を見出すことができた。1ラット間葉系細胞(rMSC)由来骨形成細胞シートの作製、in vitro評価Fisher344ラット骨髄を採取し、デキサメタゾン、アスコルビン酸添加培地で培養を行うことにより骨形成細胞シートを作製した。作製した骨形成細胞シート中のDNA量、ALP活性値を測定するとともに、骨形成細胞シートそのものをホルマリン固定、パラフィン包埋して組織学的検討を行った。シート上には23層に重なった細胞がみられ、その周囲には多量の間質組織が認められた。間質組織は、免疫組織化学的検討ではtype1 collagen陽性であった。また、シート中にはオステオポンチン、オステオカルシンなどの骨タンパクも陽性であった。2同系ラットへの移植、in vivo評価作製した骨形成細胞シートを折りたたみ、塊状としてラット下顎骨に移植した(実験群)。移植部位は下顎骨正中の骨欠損部とした。コントロール群は手術操作のみ行い、移植は行わなかった。移植後8週で顎骨を摘出し、micro-CTによるX線学的評価および組織学的評価を行った。X線学的、組織学的ともに骨欠損部には十分量の骨形成が認められた。1ヒト骨髄間葉系細胞(ヒト骨髄MSC)由来骨形成細胞シートの作製、in vitro評価ヒト骨髄MSCを使用し、デキサメタゾン、アスコルビン酸添加培地で培養を行うことにより骨形成細胞シートを作製した。添加因子の濃度と培養日数を調整することで、ヒト骨形成細胞シートのDNA量、ALP活性値に加え、シートとしての強さ、しなやかさを確認し、最適と考えられる条件を設定した(デキサメタゾン濃度:100nM、アスコルビン酸濃度:20.5ug/ml、培養日数:10日)。2免疫不全ラットへの移植、in vivo評価上記条件により作製したヒト骨形成細胞シートを折りたたみ、塊状としてラットの下顎骨正中部の骨欠損部位に移植した。移植に使用したレシピエントラットはF344/NJcl-rnu/rnuを使用した。移植後8週目で顎骨を摘出し、micro-CTによるX線学的評価および組織学的評価を行ったが、いずれにおいても骨形成は認められなかった。今年度、ヒト細胞を使用して実験を行った。前年度に実験を行っていたラット細胞に比較すると、ヒト細胞は個体により分化能が著しく異なることが問題であった。そのため、複数検体を使用して、ヒト骨形成細胞シートの作製条件を設定することが必要であった。また、免疫不全ラットを使用したin vivo実験では、骨形成が全く認められなかった。骨形成がみられなかった原因を検索するため、免疫不全ラットを使用した皮下移植による実験を計画し、現在進行中である。上記理由により、本研究はやや遅れているといえる。1免疫不全ラット顎骨への移植、in vivo評価(前年度までの研究)初年度に設定した条件により作製したヒト骨髄MSC由来骨形成細胞シートを、塊状にして免疫不全ラットの下顎骨正中部の骨欠損部位に移植した。移植に使用したレシピエントラットは、F344/NJcl-rnu/rnuとした。移植後8週目で顎骨を摘出し、micro-CTによるX線学的評価、組織学的評価を行ったが、いずれの評価においても骨形成は認められなかった。2免疫不全ラット皮下への移植、in vivo評価(今年度の実験)ヒト骨髄MSC由来骨形成細胞シートで人工骨(βTCP)を包みこみ、細胞シートと人工骨を複合化し、F344/NJcl-rnu/rnuラットの背部皮下に移植した。移植後8週目で摘出し、組織学的評価を行った。複数のヒト骨髄MSCを使用して実験を行ったが、人工骨上に、わずかに骨形成が認められた標本と、全く骨形成がみられない標本がみられた。前年度に、ラットの顎骨骨欠損部への移植を行ったが、骨形成は認められなかった。本年度は、ラット細胞における骨形成研究における評価として従来より行われている皮下移植を行い、骨形成を確認した。複数の細胞検体により実験を行ったが、ヒト骨髄由来細胞によっては、わずかに骨形成がみられるもの、全くみられないものがあり、その差は明らかでなかった。骨形成能の高いと考えられる細胞を、in vitro評価結果と合わせることで選別した。前年度に、予想していた結果が得られなかったため、本年度に別の検証実験を行ったことにより、本研究はやや遅れているといえる。1免疫不全ラット顎骨への移植、in vivo評価(前年度までの研究)初年度に設定した条件より作製したヒト骨髄MSC由来骨形成細胞シートを、塊上にして免疫不全ラット(F344/NJcl-rnu/rnu)の下顎正中部の骨欠損部位に移植し、移植後8週目で顎骨を摘出したが、明らかな骨形成は認められなかった。

次にヒト骨髄MSC由来骨形成細胞シートで人工骨(βTCP)を包み込み、細胞シートと人工骨を複合化し、免疫不全ラット背部皮下に移植を行ったが、移植後8週目に摘出し組織学的評価を行ったが全く骨形成は認められなかった。2免疫不全ラット顎骨への移植、in vivo評価(前年度までの研究)ヒト骨髄MSC由来骨形成細胞シートで人工骨(βTCP)を包み込み、細胞シートと人工骨を複合化し、免疫不全ラット背部皮下に移植を繰り返したが、摘出しても明らか骨化は認められなかった。ラット骨髄由来間葉系細胞より細胞シートを作製した。ラット下顎骨顎裂部への移植実験を行い、本移植方法による顎骨再生の有用性を確認した。次に、ヒト骨髄由来間葉系細胞より細胞シートを作製し、免疫不全ラットの下顎骨顎裂部への移植実験を行ったが、骨形成は明らかではなかった。免疫不全ラットの背部皮下で移植実験を行ったところ、細胞シートを人工骨と複合化させて移植を行った群で、限定的ではあったが骨形成を確認した。ヒト骨髄由来間葉系細胞による細胞シート単独移植での骨形成は困難であったが、人工骨と複合化させ移植を行うことで、ヒト骨髄由来間葉系細胞による骨再生のヒト臨床応用の可能性を見出すことができた。ラット細胞による骨形成細胞シートの作製、評価を行い、同系ラットへの移植実験による評価を行った。器具の準備が遅れたため、力学的評価のみ行えていないが、研究の進行は概ね順調であるといえる。ラット下顎骨骨欠損への移植実験は、侵襲が大きいことに加え、ラット1匹に対して1検体の移植しか行えない。対して、ラット皮下移植実験は低侵襲であり、1匹で複数の検体を移植することが可能である。免疫不全ラットを使用した皮下移植実験を行うことにより、ヒト骨形成細胞シートの作製条件をin vivo実験で再度設定するとともに、今回使用しているF344/NJcl-rnu/rnuが骨形成実験に対して適切な免疫不全動物か、検討を行う。必要に応じて、他の免疫不全動物を使用することも検討する。今回の実験により、わずかであるがヒト骨髄MSC由来骨形成細胞シートにより骨形成が確認できた。選別した細胞を使用し、また、スキャホールドである人工骨と複合化することにより、再度顎骨移植を行い評価を行う予定である。再生医療研究の次の過程は、ヒト骨髄由来間葉系細胞による実験である。ヒト細胞を使用した実験であるため、本学倫理委員会への実験計画の承認を受けるとともに、共同研究施設である産業技術総合研究所健康工学部門組織再生工学研究グループよりヒト骨髄由来間葉系細胞の提供を受ける予定である。免疫不全ラットの顎骨骨欠損部を使用したin vivo実験において、予想していた結果が得られなかったため、使用額が減少した。前年度に設定した条件で作製したヒト骨形成細胞シートの移植で、免疫不全ラットに骨形成が認められたら、結果の再現性を得るために検体数を増やす予定であった。しかし、骨形成細胞シートの条件設定を再度行う必要があったため、再現性獲得のための免疫不全ラット購入費用が本年度は必要なくなった。ヒト骨髄MSC由来骨形成細胞シート移植によるin vivo実験において、免疫不全ラットの顎骨では骨形成は得られなかった。