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熱方程式に対する基本解の漸近展開とその応用

種々の作用素に対応する熱方程式の基本解の構成について考察し、得られた表示を応用する事により、スペクトルゼータ函数の特異点や固有値の解析についての結果を得た。その考察対象とした作用素は、Fokker-Planck作用素、球面上のsubelliptic作用素、冪零リー群上の作用素と幅広く扱った。さらにGrushin型と呼ばれている退化した楕円型方程式の基本解を、変形ベッセル函数を有効に使うことにより,具体的に記述することに成功した。この手法を複素函数論と密接な関連のある退化した楕円型作用素にも適用できることを示した。助成期間に得られた研究成果は合計6編の論文として出版した。放物型方程式の基本解の構成を研究の主目的とする。擬微分作用素の表象計算を応用し、種々の作用素の基本解の構成について考察してその表示を得るとともに、その表示を応用することによって、固有値の展開やスペクトルゼータ函数の特異点の解析を行った。これらの結果を総合して2013年日本数学会秋季総合分科会において特別講演において概要を発表した。考察はまず、退化した放物型方程式であるFokker-Planck方程式を研究対象として、この基本解を擬微分作用素として構成をして、これを使って解の漸近的挙動や、固有函数展開を得た。これらは国際研究集会で発表するとともに、単著論文として2014年に出版された。さらに、古谷教授(東京理科大学)とBauer教授(ゲッチンゲン)と共同研究の成果としては、球面上のベクトル場の球面の次元による特徴付けがある。3次元のときは既に知られていたが、それ以上の次元の場合には不明であった。この成果は2013年の3名の共著論文として出版された。最近の成果としては、Grushin型と呼ばれる退化した楕円型方程式の基本解を変形ベッセル函数を有効に使う事により、具体的に書き表すことに成功した。さらにこの手法をKohn-Laplacianと呼ばれる複素函数論と密接な関係がある退化した楕円型作用素に応用して、その基本解の具体的表示を得た。これらの研究に関しては長い歴史があり、級数展開の方法は知られていたが、ここで得られた基本解の表示はその和を求めたことに対応する。これらの研究に対しての大きな進展である。(I)交付申請書に記載された研究目的は大きく2項目に分かれている。そのうちのフォッカープランク方程式の研究に関しては、その基礎となる基本解の具体的で正確な形を得ることができた。この成果は,ポツダムで2012年に開催されたワークショップで発表し、さらにフィンランドで2012年に開催された国際研究集会で発表するとともに、論文として出版される予定である。(II)もう一つの大きな研究目的であるsub-elliptic作用素に対する熱方程式の基本解の構成は困難であることが判明したので、2次以上の退化した楕円形作用素の基本解を構成することを目指した。これに関しては,わずかな作用素についてその基本解の正確な形が得られているだけである。Grushin型と呼ばれている退化が高次の作用素に関して、具体形を得る統一的な方法を考案した。これらの結果は,2013年の台湾および、ドイツでのワーショップで発表した。現在これに関して論文を執筆中である。(III)球面上のsub-elliptic作用素に関する共同研究結果が出版された.Grushin型と呼ばれている退化した楕円型方程式の基本解を、変形ベッセル函数を有効に使う事により、具体的に記述することに成功した。2次で退化する場合については良く知られていたが、高次の退化する場合には統一的な方法は知られていなかった。さらに、助変数を含むより広い作用素にもこの手法を拡張して、その解析接続を考察する事により基本解を得た。これらをKohn-Laplacianと呼ばれる複素函数論と密接な関係がある退化した楕円型作用素にも適用できることを示した。これらの結果は2編の論文に纏めて、2015年に出版した。幾何学的、解析的不変量を具体的に決定出来る多様体の一つのクラスに巾零多様体がある。その中でHタイプ群は、もとになるクリフォード代数が正定値二次形式に対応するもののみに考察が限定されていた。これを一般の符号を持つ二次形式に対応するクリフォード代数にまで拡張しても、2ステップ巾零リー群(一般型Hタイプ群)の各格子に対応する巾零多様体上には自然なサブリーマン構造があり、本研究主題の一つである劣楕円型作用素のスペクトルゼータ函数が存在することがわかる。平成26年には、そのうちでも標準的格子に対する巾零多様体のある場合についてスペクトルゼータ函数を決定するとともに、この研究対象がスペクトルは一致するが、幾何学的構造の異なる多様体を含むことを示した。これらの結果は、論文として纏めて投稿中である。

研究期間全体を通して種々の作用素の基本解の構成について考察し、その表示を応用することにより、固有値やスペクトルゼータ函数の特異点の解析を得た。その考察対象とする作用素は、Fokker-Planck作用素、球面上のsubelliptic作用素、Nilmanifold上のsubelliptic作用素と巾広く取り扱った。それらの結果は、合計6編の論文として出版した。偏微分方程式nilmanifoldに自然に導入される退化した楕円型作用素に関する考察を、stepが「2」の一般のリー群の場合に広げて、熱方程式の基本解を擬微分作用素として表示することに成功した。この結果を使ってスペクトルゼータ函数の極が唯一であること、及びその位置、留数の値を求めることができた。これらは、同じ空間上の楕円型作用素に対してはスペクトルゼータ函数の極が無限に出現することと大きな違いがあり、退化した楕円型方程式をnilmanifold上で考察することは有意義なことだと示す事ができた。これは予想以上の成果であり、これらの結果を2編の論文として纏め、2012年,2013年度に発表した。「2」以上のより高いstepを持つリー群上に自然に定義される退化した楕円型方程式に考察を広げることは、興味深い問題ではあるが、目下の所は有効なアプローチ手段は見つかっていない。Grushin型作用素の基本解に関しては、変形ベッセル函数を有効に使う事により具体的に書き表すことに成功した。さらにこの手法をKohn-Laplacianと呼ばれる広く研究されている偏微分作用素に応用して、その基本解を表示を得た。これはKohn-Laplacianの今後の研究の進展に重要となる。フォッカープランク方程式については、具体的な基本解の形だけでなく、固有関数展開も具体的に求めることができた。これは自己共役でない作用素で固有関数展開が求められた少ない例の一つである。これらの結果は、3年間で進める計画であった研究目的の一つである。高次の退化した方程式に関しては基本解の具体的な形を求めている例は非常に少ない。それを、特殊関数である変形ベッセル関数を使って表示することを経由することで、明確な段階を重ねることにより、基本解の構成に成功した。これは当初の研究目的とは違ったものであるが、元の研究目的のひとつであるsub-elliptic作用素に対する基本解の構成に有用となると思える。1.Fokker-Planck方程式に関しては、ポテンシャルをより一般の形にして、熱方程式の基本解を擬微分作用素として構成する。2.nilmanifoldに自然に導入される退化した楕円型作用素に関する考察を行ったが、ultra-hyperbolic作用素の基本解まで研究対象を広げてその関連を古谷教授,Bauer教授と共に研究する。3.Kohn-Laplacianに対し、得られた基本解の表示を使って助変数に関する解析接続を考察する。1。Grushin型方程式の基本解が、予想より明確な形として得ることができた。これにより、さらに助変数を含んだ作用素に対する基本解も明確な形で構成出来ると予想できる。その基本解の、助変数に関する解析性を論じる。これをKohn-Laplacianに応用することも目指す.
超音速コアンダジェットの非定常現象のウェーブレット解析

今日では、コアンダ効果を利用した技術が、多くの流体制御分野に適用されている。例えば、代表的なものとして翼のフラップがある。近年では超音速コアンダジェットの偏向に及ぼす膨張波と衝撃波の効果を明らかにすることにより、ノズルで生ずるスラストベクトルを改善しようとする試みが行われている。また、先細のコニカルノズルと環状スリットからのコアンダジェットから得られるスパイラルフローにより光ファイバーを送通したり、微粉体、針状結晶の連続表面改質技術等がある。しかしながら、ノズル圧力比に対するジェットの壁面上からのはく離位置との関係やノズル出口マッハ数の影響についての詳細な研究はない。よって、コアンダジェットの特性を正確に把握することにより、より効率的な応用が可能になるものと考えられる。ところで、最近では波形解析にウェーブレット解析と呼ばれる手法が試行錯誤ながら多くの分野で適用され始めている。ウェーブレット変換は、非定常波形解析の有力な方法であると考えられる。本研究では、超音速コアンダジェットの基本的な流れ構造に及ぼすノズル圧力比やノズル出口マッハ数の影響を、光学観察と圧力計測により実験的に明らかにした。また、非定常流れ場での圧力波形に対しウェーブレット解析を適用し、その有用性を調べた。その結果、流れの構造はノズル出口マッハ数に関わらずほぼ同様となるが、ノズル圧力比が増加する場合と減少する場合に観察される流れのはく離と再付着に関連するヒステリシスループは、出口マッハ数が大きいほど小さくなることがわかった。また、ジェットのはく離が存在する場合としない場合には、それらの周波数特性には高周波領域において違いが観察された。さらに、非定常圧力波形に連続ウェーブレット変換を適用すると、現象の階層構造や波の連続的な伝播に関する情報が得られることがわかった。
ハロゲン結合および光励起を利用した革新的グリコシル化反応の開発と応用

(1)N-グリコシド化反応:チオ尿素触媒とハロゲン結合供与体の共触媒系を2位に隣接関与基を持たない2-O-Bn-グルコース誘導体に応用し、未だ選択的に合成できていないα-N-グリコシド体の合成を達成した。チオ尿素触媒については、3,5-bis(SF5)C6H3基を有するチオ尿素触媒の合成に成功し、既存のSchreiner触媒より有効であることを見出した。また、ハロゲン結合供与体についてもこれまでのベンズイミダゾリウム型よりも容易に合成できるフェナンスレン型の触媒の創製に成功した。溶媒としてエーテル系溶媒を用いることが重要であり、中でもn-BuOMeが最も高いα選択性で目的のN-グリコシドを与えた。(2)アミノグリコシル化反応:アミノ化剤の合成法について、収率・スケールアップに課題が残るため、試薬の改良を行った。これまでの反応はオルト位にメトキシメチル基を有するN-アシルイミノヨージナン試薬であったが、オルト位に電子求引性のニトロ基やスルホニル基を導入することで収率の向上に成功した。また、アミノグリコシル化反応の適用拡大として、選択性の制御が難しいグルカール誘導体に適用できることも見出した。また、添加剤としてAWMS(Acid-washed Molecular Sieves)よりもMS5Aの方が収率が向上し、おおむね良好な収率で対応するアミノグリコシル化体を得ることに成功した。さらに、生物活性物質合成への応用も行った。(1)N-グリコシル化反応:グリコシル化反応でもっとも繁用されるトリクロロアセトイミダート型の糖供与体(シュミット供与体)を用いてアミドを直截的にNーグリコシル化する反応を検討した。興味深いことに、シュライナーチオウレア触媒と2ーヨードベンズイミダゾリウム塩から成る共触媒系を用いた場合に予期せぬオルトアミド体が主生成物となった。本手法は、ジペプチドやトリペプチドのアスパラギン残基に適用可能であった。更なる検討の結果、今回新たに開発した2-ヨードベンゾイミダゾールーブレンステッド酸複合塩触媒を用いると、所望のN-グリコシド体が立体選択的に生成することを見出した。トリペプチドのアスパラギン残基の導入にも成功し、初のトリププチドN-グリコシド体の効率合成を達成した。(2)アミノグリコシル化反応:オルト位にメトキシメチル基を有するヨードベンゼンから合成したヨードベンゼンジアセタートとトリフルオロアセトアミドを塩基性条件下で攪拌すると、N-トリフルオロアセチルイミノヨージナンが得られた。また、X線結晶構造解析によりオルト位置換基の安定化の寄与を確認することができた。一般に、N-アシルイミノヨージナンは加水分解やホフマン転位が起こりやすいなどの課題があったが、初の単離・構造決定に成功した。得られたイミノヨージナンを用いて、ガラクタールのアミノグリコシル化反応に成功した。アルコールとしては、セリン誘導体やジオスゲニンなどの多官能性のアルコールが適用可能あった。(1)N-グリコシル化反応:同じトリクロロアセトイミダート型の糖供与体からオルトアミド体とN-グリコシド体を作り分ける2種類の触媒系を開発した。本反応をトリペプチドのアスパラギン残基の糖鎖導入に応用し、トリププチドN-グリコシド体の初の合成に成功した。(2)アミノグリコシル化反応:ガラクタールと新規に開発したアミノ化剤を用いて、アミノグリコシル化反応に成功した。反応には、セリンやジオスゲニンなどの多官能性アルコールを導入することができる。(1)N-グリコシド化反応:チオ尿素触媒とハロゲン結合供与体の共触媒系を2位に隣接関与基を持たない2-O-Bn-グルコース誘導体に応用し、未だ選択的に合成できていないα-N-グリコシド体の合成に挑戦する。

また、2-ヨードベンゾイミダゾールーブレンステッド酸塩の更なる応用として、アミドの直截的な付加反応による2-デオキシ-N-グリコシド体の合成を目指す。(2)アミノグリコシル化反応:アミノ化剤の合成法について、収率・スケールアップに課題が残るため、試薬の改良を行う。また、アミノグリコシル化反応の適用拡大として、選択性の制御が難しいグルカール誘導体への応用を目指す。
全身・口腔の健康増進に寄与する亜硝酸塩は、口腔細菌叢内で如何に産生されるか？

本年度は、昨年度に引き続き、口腔プラークバイオフィルム中の硝酸還元活性をもつ細菌を簡便に見分ける方法について、さらにブラッシュアップして確立した。また、確立した手法を用いて、被験者の歯面・舌面より採取した口腔バイオフィルム試料中の硝酸還元活性菌の割合を求めたほか、その硝酸還元活性菌について菌種の同定をすすめ、統計分析を試みているところである。これまでのところ、硝酸還元活性菌の割合については個人差がかなり大きいことに変わりはないが、菌種については、主に口腔に常在しやすいVeillonella属やActinomyces属などの菌が多く検出されており、どんな人の口腔内でも、硝酸還元細菌による硝酸代謝が行われていることが示唆された。また歯面と舌では検出細菌にやや違いが見られており、次年度に向けて、さらに詳細に確認を進めていきたい。また、検出菌種の一つであるVeillonella属を用いた基礎実験を通じ、培養条件や代謝環境条件の違いにより、硝酸還元活性が変動することが示唆された。個々の口腔バイオフィルムによる硝酸還元能は、含有される硝酸還元菌の割合だけではなく、その菌種構成や、それらの代謝環境の違いなどを含めて、複合的な視野でとらえていく必要があることが示唆された。一部予定していた実験に着手できていないためず、この区分とした。次年度の早い時期に取りくむ予定である。30年度までに確立した手法を用いて、引き続き被験者試料の解析を行いながら、個々のプラークの硝酸還元活性、硝酸還元活性を持つ菌の割合や菌種などの様々なデータを複合的に統計解析し、学会発表・論文発表へとすすめたいと考えている。また、すでに同定された菌種を用いた基礎研究についても、さらに深い追及を行い、同様に学会発表や論文発表を行っていきたいと考えている。昨年度、一部着手できなかった実験(他菌種の代謝への影響など)についても、早期に取り組みたい。本年度は、口腔バイオフィルム細菌叢内の硝酸還元活性を持つ細菌について、まず検索を試みた。十分な説明の上、同意をいただいたボランティア5名程度より、口腔バイオフィルムを採取し、バイオフィルム中の硝酸還元活性をもつ細菌について検討を行った。試料は歯面、舌表面から採取後、速やかに嫌気実験システムに搬入し、生理的食塩水にて懸濁後血液寒天培地にて培養した。培養後のコロニーの中から、硝酸還元活性を持つ細菌を簡便に見分ける手法について確立を試みた。現在確立途上であるため詳細は記載しないが、次年度に向けてさらに完成度を高めていく予定である。しかし、現段階までに確立している方法を用いた予備実験結果からではあるが、活性を持つ細菌の割合が、歯面、舌で異なること、個人差も大きいことが示唆されている。また、プラーク試料そのものを用いたプラーク全体としての硝酸還元活性測定も試みたが、こちらも個人差が大きいことが観察されている。この個人差と硝酸還元活性をもつ菌の割合との相関などについては、次年度以降、被験者数を増やしながら、様々な関連性について検討したいと考えている。また、活性を持つ菌については、DNA抽出を行い、PCR増幅後、16s rRNAに基づくシークエンス解析を行い、菌種の特定などを行っているところである。Veillonella属などの細菌がこれまでも硝酸還元活性を持つものとして知られているが、現在までの結果では、実際にプラーク中からもそのような菌が検出されており、これらの菌の標準株を用いた基礎研究(各種条件下での硝酸還元活性の変動)もはじめている。予定していた実験に着手できていること、試行錯誤した部分はあるが、今のところ順調に進行しているため、この区分とした。30年度に確立した手法を用いて、さらに被験者数を増やしながら、個々のプラークの硝酸還元活性やプラークに含まれる硝酸還元細菌の割合や菌種に関するデータを蓄積し、臨床指標などとの関連などを含めさらなる解析を行っていく予定である。また、菌種の同定後、当該菌種の標準株を用いた基礎実験についても進めていく。具体的には環境条件などによる還元活性への影響などを探っていく予定である。これらの結果より、口腔内における硝酸還元活性の概要を明らかにしていきたいと考えている。

30年度までに確立した手法を用いて、引き続き被験者試料の解析を行いながら、個々のプラークの硝酸還元活性、硝酸還元活性を持つ菌の割合や菌種などの様々なデータを複合的に統計解析し、学会発表・論文発表へとすすめたいと考えている。また、すでに同定された菌種を用いた基礎研究についても、さらに深い追及を行い、同様に学会発表や論文発表を行っていきたいと考えている。昨年度、一部着手できなかった実験(他菌種の代謝への影響など)についても、早期に取り組みたい。当初予定していたよりも試薬消耗品関連の支出が少なかったため次年度使用額が生じた。次年度に引き続き実験を継続するためその費用に充てる予定である。当初予定していた実験の一部を次年度に実施する予定になったことで、試薬消耗品関連の支出が少なく済んでおり、次年度使用額が生じた。次年度に引継ぎ、実験費用として使用予定である。
自発進行波による高成熟心筋を用いた新規心筋梗塞治療法の開発

ヒトiPS細胞由来の心筋を用いた再生医療による治療法の開発が期待されている。しかし、既存の方法で作製した心筋細胞シートは厚さ0.2mmが限界であり、成熟度や収縮力、そして物理的な強度などが不足している。これまでに、我々は組織工学的技術を駆使したiPS細胞由来心筋リングの作製に成功することによって、心筋細胞特異的な進行波の自発を誘発することが実現し、心筋細胞の成熟を促進することを明らかとなった。さらに、十分な強度と良好なハンドリング性を有する。本研究課題においては、この高成熟度組織化心筋リングを心筋梗塞モデル動物の心臓を嵌め込む形で、力学的に心臓の収縮をサポートする新規治療法の開発を目指す。
日本漢字音受容史における近世唐音の基礎的研究

本研究で得た成果は、(1)資料調査上の成果と、(2)受容史的観点から見た場合の資料の位置づけに対する必要性の認識の深まり、それに付随して、(3)研究の過程で得た知見による近世漢字音研究、の3点に集約される。(1)京都・東京等を中心とする資料調査、あるいは既出版の文献資料の調査等を通して、近世唐音資料は広く全国の図書館・社寺等に分在していること、実は相当数既に紹介されていることなどを発見するとともに、それらに対してはそれぞれ改めて受容史的観点から精査を加えるべきこと、そしてそれらにはその価値が十分にあることを見いだした。なお、現在までに完成させえた、そのリストアップ、学会への紹介等は本研究の所期の目的を十分満足させるものであるが、現在もなお資料整理は続行中であり、今後とも長期間にわたる課題となるものである。(2)近世唐音受容史的に上記のような近世唐音資料を観察を通してそれぞれの資料の逐一の受容史的観点からの資料的位置づけが今日なおほとんど研究されていないこと、従ってそれ自体の遂行が急務であることなどを明らかにするとともに、この事実を踏まえて、本研究ではまずはこの基礎的作業の礎を作るべく、そのための基本的なマニュアルを自ら考察し、そして、それに従って基礎的研究を一定程度進めること、すなわち、本研究の目的である受容史的観点からの近世唐音ないし近世唐音資料の位置づけ方について道筋を付けることができた。(3)本研究の過程で、自ずから近世唐音、さらには呉音・漢音あるいは唐音一般について種々の情報が入手できたが、それらを用いて近世日本漢字音史研究を前進させることができた。今後は、本研究で得た情報・知見を生かし、さらに近世唐音の全体像の把握に向かう計画である。今年度は、当初の計画に沿いつつ、主として近世唐音資料の調査を京都以西を中心として行った。ただし、近世唐音の特徴を把握するためには、唐音全般にわたる資料調査、さらには当該資料での呉音・漢音との関係の調査も必要なので、その調査も同時に適宜行った。本年度は、特に新しい資料の発見を目指すというよりは、その資料の資料性、すなわち、その資料は、〈近世唐音が日本漢字音史さらには日本語音韻史の流れの中で、どのように受容されたのか、また、逆になぜ受容されなかったのか〉について、それがどの程度語っているのか、の把握を第一の目標とした。もとより、なお調査は継続中であるが、今年度の調査を通じて、狭義の唐音資料を通してその受容の歴史を明らかにする方向と、唐音をその書の中で実際に用いている文学作品や韻学書等を用いて行う方向との2つがあるとの認識に達することが出来たのは、大きな収穫であった。両者の総合が理想であるが、本研究は「基礎的研究」であることを鑑み、さし当たってはいずれか一方を徹底的に解明し、本研究の後にこれを基盤として更なる発展のためにもう一方の解明と両者の総合的解明を試みるべきであろうと考えている。なお、本研究が日本漢字音史研究の一部をなす過程において、唐音と密接不可分の関係にある呉音・漢音史について論究することが出来たのも本年度の成果の一つである。来年度は、主として京都以東を中心にして調査をさらに進めつつ問題を絞り込み、呉音・漢音受容史と関わらせながら近世唐音受容史の問題を解明し結論を出したいと考えている。今年度は、当初の計画及び前年度成績、そして今年度計画に基づきつつ、近世唐音資料の調査を京都・東京あるいは筑波大学図書館等において行いつつ、初期の目的を達すべく研究を推し進めた。

もとより、近世唐音に関わる問題を解くためには、唐音(資料)全般にわたる調査のみならず、呉音・漢音(資料)との関係等の調査も必要なので、それをも同時に適宜行ったが、今年度は本研究の最終年度ということから、新しい資料の発見を目指しつつも、まずは、その資料の資料的価値、すなわち〈当該資料は近世唐音が日本漢字音史さらには日本語音韻史の流れの中で、どのように受容されたのか〉をどの程度物語りうるのかを基準として、その資料的価値の高いものの特定を最大の目標とした。ついで、その概要の把握と学会に対するその紹介をなすべく研究全体の総括に努力した。具体的には、本研究が「基礎的研究」を目論むものであることを鑑み、浅く広く総花的に調査・研究を行うのでなく、今後のこの方面の研究の糸口となるように、その範囲をいわゆる唐和辞書に限った。そして、その書誌的、資料的な考察を行うとともに、それに伺われる唐音の性格、位置づけを通して漢字音受容史上における唐音の位置・実体を把握し、その成果を学会に報告できるような形にまとめることに力を傾けた。そして、目的はおおむね達成することができた。なお、本研究の課程で得た知見は右に示したような、できるだけ早い機会に学会に報告すべきようなことがらだけでなく、今後における近世唐音に関わる研究に資するものも多かった。そして、すでに本研究者はそれを一部に盛り込んだ一書を今年度発行することができた。これも本研究の成果の一である。
電気測定によるバクテリオロドプシンとハロロドプシンのイオン輸送機構の解明

初年度はバクテリオロドプシン(bR),ハロロドプシン(hR)を含む膜画分をコンデンサーフィルム用薄膜に吸着させて,光照射による電流電圧の変化を高速度で検出する系を構築した.二年度は,bR及びその変異体,二種類の高度好塩菌由来のhRについてpHおよび塩素イオン濃度のイオンポンプによる光駆動性電流に及ぼす影響を検討した。その結果bRのプロトン輸送速度のpH依存性は、輸送経路の出入り口のプロトンに対する親和性を反映するらしいことがわかった。hRでも塩素イオン輸送速度の塩素濃度依存性から同様の結論が得られ、イオンの移動様式がマルチイオンチャンネルと同様に表されることが示された。さらにレーザー光を励起光として用い、single turnover中の蛋白内の電荷移動をbR及びその変異体,二種類の高度好塩菌由来のhRについて測定した。その結果bRがμsec及びmsecのオーダーの時間領域で顕著な電荷移動を起こすのに対して、hRではmsecとsub-msecのオーダーで電荷移動を示すことがわかった。この結果を分光測定による光サイクルと比較することにより、hRではN中間体の生成と崩壊の時に電荷移動が起こる可能性が高いと結論できた。また,初年度にはbRによるプロトン輸送特性を考慮したモデル研究を行った.このモデルではbRにならい3ケ所のイオン結合部位を持つマルチイオンチャネルを考え,そのイオンに対する親和性が変化すると能動輸送が行えることを示した.さらに輸送を起こすためには親和性の異なった状熊の分布が非平衡にならなければならないことを明確にして,ポンプとチャネルの共通性と差異を提起した.二年度の実験結果もこのモデルとよく一致し、イオン輸送の一般的な機構として「エネルギー化と脱エネルギー化に伴って輸送イオンに対する親和性が変化するマルチイオンチャンネルを想定する」という考え方を支持する.初年度はバクテリオロドプシン(bR),ハロロドプシン(hR)を含む膜画分をコンデンサーフィルム用薄膜に吸着させて,光照射による電流電圧の変化を高速度で検出する系を構築した.二年度は,bR及びその変異体,二種類の高度好塩菌由来のhRについてpHおよび塩素イオン濃度のイオンポンプによる光駆動性電流に及ぼす影響を検討した。また,初年度にはbRによるプロトン輸送特性を考慮したモデル研究を行った.このモデルではbRにならい3ケ所のイオン結合部位を持つマルチイオンチャネルを考え,そのイオンに対する親和性が変化すると能動輸送が行えることを示した.さらに輸送を起こすためには親和性の異なった状熊の分布が非平衡にならなければならないことを明確にして,ポンプとチャネルの共通性と差異を提起した.二年度の実験結果もこのモデルとよく一致し、イオン輸送の一般的な機構として「エネルギー化と脱エネルギー化に伴って輸送イオンに対する親和性が変化するマルチイオンチャンネルを想定する」という考え方を支持する.本年度は研究計画にもあるようにバクテリオロドプシン,ハロロドプシンを含む膜画分をコンデンサーフィルム用薄膜に吸着させて,光照射による電流電圧の変化を検出する系をほぼ作り上げた.高速度の電圧変化を記録するため新たな増幅器を作製し,最高2MHzで取り込めるAD変換器を計算機に装備してその信号を記録できるようにした.レーザー光源は東京大学理学部の茂木博士との共同研究で使わせていただき,バクテリオロドプシン及びその変異体,二種類の高度好塩菌由来のハロロドプシンについて,時間分解能の極めて高い測定が容易に行えるように装置を作り上げた.現在,今まで明らかでなかったハロロドプシンの電荷移動ステップについての情報が得られつつある.また,イオン輸送一般についての考察をするためにバクテリオロドプシンによるプロトン輸送特性を考慮したモデルによる研究を行った.このモデルではバクテリオロドプシンにならって3ヶ所のイオン結合部位を持ったマルチイオンチャネルを考え,その結合部位のイオンに対する親和性がエネルギー化と脱エネルギー化によって変化すると能動輸送が行えることを示した.さらにこの親和性変化の仕方が,平衡分布を保つような熱揺らぎで起こった場合には,能動的な輸送を起こせず,輸送を起こすためには親和性の異なった状態の分布が非平衡にならなければならないことを明確にして,イオンポンプとイオンチャネルの共通性と本質的な差異を明らかにした.本年度は研究計画の最終年度であるが、ほぼ計画通り、コンデンサー用薄膜にバクテリオロドプシンおよびハロロドプシンを含んだ膜を吸着した系でイオン濃度を広範囲に変えられる利点を生かして、pHおよび塩素イオン濃度がこれらのイオンポンプの光駆動性電流に及ぼす影響を検討した。その結果バクテリオロドプシンについてプロトン輸送速度のpH依存性は、輪送経路の入り口及び出口のプロトンに対する親和性を反映しているらしいことがわかった。さらにハロロドプシンでも塩素イオン

輸送速度の塩素濃度依存性から同様の結論が引き出されるとともに、輸送経路には複数のイオン結合部位が存在し、イオンの移動様式がいわゆるマルチイオンチャンネルと同様に表されることが示された。またパルスレーザー光を励起光として用いることにより、single turnover中の蛋白内の電荷移動を直接測定する系を立ち上げて、バタテリオロドプシンの野生型、D96N変異体、H.salinarum由来のハロロドプシン、N.pharaonis由来のハロロドプシンについて測定を行った。その結果バクテリオロドブシンがμsec及びmsecのオーダーの時間領域で顕著な電荷移動を起こすのに対して、二種のハロロドプシンではmsecとsub-msecのオーダーで電荷移動を示すことがわかった。このハロロドプシンについての結果を時間分解分光測定による光サイクルのデータと比較することにより、0中閏体の生成と崩壊の時に電荷移動が起こる可能性が高いと結論できた。以上の結果は前年度に提案したイオンポンプについてのモデルとよく一致するものであり、イオン輸送の一般的な機構として「エネルギー化と脱エネルギー化に伴って輸送イオンに対する親和性が変化するマルチイオンチャンネルを想定する」という考え方を支持するものである。
語彙獲得のニューラルネットワークモデルの構築と背景メカニズムの推定

統語知識の中でも特に,複文構造の獲得に焦点を当てシミュレーションを行った.英語において,複文には4種類の構造が存在する.これらの構造は,関係節によって修飾される名詞が,「主節内」および「関係節内」で主格または目的格のどちらの役割を果たすかという2つの要因によって生成される.複文の4つの構造に対する成人の理解度は異なっており,右分岐文の理解が中心埋め込み文に比べて容易であることが示されている.この理解の困難さの違いは,複文自身が持つ構造的な複雑さ,および言語環境における複文構造の典型性の2点から説明されている.また,最近の幼児における複文理解を調べた研究からも,複文それぞれの理解度は構造の典型性や頻度など言語刺激のもつ統計的な性質を反映していることが示唆されている.もし,この示唆が正しいものであるならば,統計的な性質を反映した統語獲得を行う能力を有するニューラルネットワークモデルに対して幼児が経験する言語刺激として尤もらしいコーパスで学習を行えば,人の示す複文理解を再現できると考えられる.尤もらしいコーパスとは,複文だけを含むのではなく,単文や等位接続文,分裂分や関係節修飾名詞句など多くの文構造を含むコーパスである.シミュレーションには,私達が提案した自己組織化マップを含む再帰的ニューラルネットワークを用いた.シミュレーションの結果,複文だけで学習したネットワークに比べ,単文や等位接続文を含む尤もらしいコーパスで学習したネットワークは,人の複文理解をよく再現し,構造による理解の困難さの違いを示した.この結果から,先行研究で示唆されているように,人の統語学習,特に複文学習は言語刺激の統計的性質を反映した形でなされること示した.本年度の研究では,まず,提案したニューラルネットワークモデルによって得られた語彙獲得曲線と実際の幼児の語彙データとの比較を行った.具体的には,幼児の語彙獲得曲線をよく回帰するロジスティック曲線によって提案モデルの語彙獲得曲線を回帰した.その結果,非常によく回帰できており,幼児の獲得と同様,モデルの語彙獲得曲線も急峻な獲得速度を示す時期を持つことが示された.新奇単語を獲得するまでに必要な提示回数の調査から,モデルが学習に伴って新奇単語を効率的に獲得していることが示された.また,文脈に対するモデルの内部表現を調べると,学習の初期では安定していなかった表現が,学習後期には安定していた.これらの結果から,提案モデルは,学習によって獲得した安定な文脈表現に基づいて新奇単語を適切なカテゴリを割り当てることで,新奇な単語を効率的に学習していることが示された.次に,提案したモデルの統語規則の学習を重点的に解析した.提案モデルは,主語や目的語を関係節で修飾した複文に対しても適切な予測を行うよう学習を行うことができた.この結果はElman(1991,1993)の研究で提案されたモデルと比較して遜色がなかった.しかしながら,単文の学習において大きな違いが見られた.Elmanの提案したモデルが,提示する言語モデル内の規則(語順や他動性,主語・述語の数の一致など)をほぼ同時期に獲得しているのに対して,本研究で提案したモデルはほぼ一定の順序で段階的に獲得していた.岩立(1994)は,文とシーンのマッチングに対して幼児が利用する手がかりから,動詞の意味や語順,格など単文理解に4つの段階的な発達があることを示唆している.今後,モデルの規則の学習時期に影響を与える要因を検討することで,幼児の統語発達のメカニズムの推定を行う.提示される単語系列内に含まれる規則の獲得順序についてニューラルネットワークを用いて検討した.具体的には,名詞や動詞などの語彙範疇の識別,自動詞・他動詞といった他動性の識別,主語と述語の数の一致(単数形主語には単数形述語)による数の識別の獲得順序を調べた.結果から,語彙範疇の識別がもっとも早く,次に他動性の識別,最後に数の識別が獲得されることが示された.この結果からネットワークは,「名詞」や「動詞」といった語彙範疇というおおまかな情報から獲得し,徐々に「単数の名詞」「単数の動詞」といった微細な情報を扱うようになることが示唆された.次に,提示される具体的な単語系列から抽象的な統語知識を獲得するための機能をより詳細に検討した.提案したネットワークを学習した結果,単語の用法の類似度が高いときのみ同一のカテゴリとして判定する条件および,低くても同一のカテゴリとして判定する条件の両方で学習に失敗した.これらの条件では,用法の規則性を抽出する能力,または用法の類似度からカテゴリを構築する能力のどちらか一方しか見られなかった.しかし,高くも低くもない中間の類似度のときに同一のカテゴリとして判断する条件では,ネットワークは規則抽出とカテゴリ構築の両方の能力を示した.また,この条件でのみ,訓練で用いた単語だけでなく,新奇な単語に対しても文脈から適切なカテゴリを推定し,推定したカテゴリから適切に次の単語を予測するよう学習することができた.新奇な単語から次の単語を予測することは,単に訓練された単語系列に対して学習するだけでなく,獲得した規則や関係性を汎化適用する能力が求められる.この結果から,適切な範囲の用法の類似度に基づいて単語をカテゴリとして組織化することが,カテゴリ構築と規則抽出という2つの能力を実現し,これら2つの能力が統語獲得に関与することが示唆された.統語知識の中でも特に,複文構造の獲得に焦点を当てシミュレーションを行った.英語において,複文には4種類の構造が存在する.

これらの構造は,関係節によって修飾される名詞が,「主節内」および「関係節内」で主格または目的格のどちらの役割を果たすかという2つの要因によって生成される.複文の4つの構造に対する成人の理解度は異なっており,右分岐文の理解が中心埋め込み文に比べて容易であることが示されている.この理解の困難さの違いは,複文自身が持つ構造的な複雑さ,および言語環境における複文構造の典型性の2点から説明されている.また,最近の幼児における複文理解を調べた研究からも,複文それぞれの理解度は構造の典型性や頻度など言語刺激のもつ統計的な性質を反映していることが示唆されている.もし,この示唆が正しいものであるならば,統計的な性質を反映した統語獲得を行う能力を有するニューラルネットワークモデルに対して幼児が経験する言語刺激として尤もらしいコーパスで学習を行えば,人の示す複文理解を再現できると考えられる.尤もらしいコーパスとは,複文だけを含むのではなく,単文や等位接続文,分裂分や関係節修飾名詞句など多くの文構造を含むコーパスである.シミュレーションには,私達が提案した自己組織化マップを含む再帰的ニューラルネットワークを用いた.シミュレーションの結果,複文だけで学習したネットワークに比べ,単文や等位接続文を含む尤もらしいコーパスで学習したネットワークは,人の複文理解をよく再現し,構造による理解の困難さの違いを示した.この結果から,先行研究で示唆されているように,人の統語学習,特に複文学習は言語刺激の統計的性質を反映した形でなされること示した.
震災特有疾患に対する一酸化炭素結合型ヘモグロビン小胞体の医薬品としての有用性評価

昨年度はクラッシュ・シンドロームモデルラットをCO付加体(一酸化炭素結合(CO)型ヘモグロビン小胞体(CO-HbV)及びCO結合型RBC (CO-RBC))で治療することで致死率が低下し、腎機能パラメータ(尿素窒素、血清クレアチニン)の上昇も抑制することを明らかにした。そこで平成30年度は、クラッシュ・シンドロームモデルラットをCO付加体で治療した後の腎傷害についてPAS染色(組織形態評価)、TUNEL染色(アポトーシス評価)及び4-HNEの免疫染色(酸化傷害の評価)により検討を行った。その結果、生理食塩水投与群で観察された組織形態の変化がCO付加体治療群では抑制されていた。また、CO付加体治療時にはアポトーシスと酸化傷害も抑制されており、COの腎保護効果が組織学的な評価からも確認された。続いて、CO付加体の筋傷害に対する影響について血清中のクレアチニンキナーゼとミオグロビン濃度を測定することで評価した。その結果、生理食塩水投与群と比較してCO付加体治療時においてクレアチニンキナーゼとミオグロビン濃度は低値を示した。加えて、トレッドミルにより歩行力(運動性)について評価したところ、生理食塩水投与群では運動性が低下していたものの、CO付加体投与群では維持していた。以上の結果より、CO付加体投与時には筋傷害の増悪も抑制する可能性が示唆された。平成31年度は、CO付加体投与時の腎保護メカニズムについて検討を行う予定である。しかしながら、クラッシュ・シンドロームモデルラットの生存時間は6時間以内と短く、メカニズムの検討に不向きと考えられる。そこで、クラッシュ・シンドロームと同様の発症機序で急性腎傷害を併発する横紋筋融解症モデルラットを用いて検討を行う予定である。現在、横紋筋融解症モデルラットを確立し、CO付加体の腎保護効果について検討を進めている。現在までにCO付加体のクラッシュ・シンドロームに伴う急性腎傷害に対する治療効果を明らかにしており、最終年度(平成31年度)には予定通りCO付加体の腎保護メカニズムの解明に着手できる。すでにグリセロール誘発性の横紋筋融解症モデルラットが急性腎傷害を併発することも確認済みであり、本モデルに対するCO付加体の腎保護効果を確認し次第、COの腎保護メカニズムの解明を行う予定である。グリセロール誘発横紋筋融解症モデルラットに対してCO付加体(CO-RBC及びCO-HbV)を投与し、CO付加体の横紋筋融解症に伴う急性腎傷害に対する治療効果について確認を行う。続いて、CO付加体の腎保護メカニズムについて検討を行う。具体的には、横紋筋融解症に伴う急性腎不全の発症機序として知られている、1ミオグロビンの尿細管蓄積による尿細管閉塞、2ミオグロビン内部ヘム鉄の酸化に起因する組織傷害、3腎チトクロームP450分解に由来する遊離ヘム介在性の酸化傷害、4好中球の遊走及び炎症性サイトカインの蓄積、について検討を行う。本研究は、一酸化炭素結合(CO)型ヘモグロビン小胞体(CO-HbV)が震災時に多発するクラッシュ・シンドローム治療薬としてのポテンシャルを有するかを評価することを目的とする。平成29年度はクラッシュ・シンドロームモデルラットの作製とCOのクラッシュ・シンドロームに対する治療効果をHbVと類似機能を有する赤血球(RBC)を用いて検討を行った。まず、クラッシュ・シンドロームモデルラットを作製し、生存率の評価を行った。その結果、生理食塩水処置群では圧迫開放6時間後より死亡例が急激に増加し、解放後9時間までに全例が死亡した。この結果より、クラッシュ・シンドロームに伴う急性腎不全の評価時間として圧迫開放後6時間が適切であると考えられた。一方、CO結合型RBC (CO-RBC)処置群では圧迫解放24時間まで全例が生存し、COがクラッシュ・シンドロームの創薬シーズとして有望であることが明らかとなった。次に、圧迫開放6時間後にCO-RBCがクラッシュ・シンドロームに伴う急性腎傷害に対する影響について検討を行った。その結果、生理食塩水処置群では尿素窒素、血清クレアチニン値が上昇し、明らかな急性腎傷害が確認された。しかしながら、CO-RBC処置群ではこれらの上昇は抑制され、腎保護効果が確認された。また、予備試験としてCO-HbVを1400 mg Hb/kgの投与量でクラッシュ・シンドロームモデルラットに投与したところ、血清クレアチニン、尿素窒素の上昇はCO-RBC投与時と同様に抑制されており、CO-HbVにおいてもクラッシュ・シンドロームの伴う急性腎不全を抑制する可能性が示唆された。平成30年度は、クラッシュ・シンドロームモデルラットに対してCO-HbVを投与量依存的に投与し、CO-HbVの至適投与量の設定と急性腎傷害に与える影響について詳細に検討する予定である。CO-HbVを用いた検討が予備試験にとどまっており、申請段階の研究計画よりやや遅れている。しかしながら、平成29年度内にクラッシュ・シンドロームモデルラットの作製と急性腎傷害の評価時間の設定は完了しているため、平成30年度にCO-HbVを用いた検討を実施予定である。

そこで平成30年度は、クラッシュ・シンドロームモデルラットをCO付加体で治療した後の腎傷害についてPAS染色(組織形態評価)、TUNEL染色(アポトーシス評価)及び4-HNEの免疫染色(酸化傷害の評価)により検討を行った。その結果、生理食塩水投与群で観察された組織形態の変化がCO付加体治療群では抑制されていた。また、CO付加体治療時にはアポトーシスと酸化傷害も抑制されており、COの腎保護効果が組織学的な評価からも確認された。続いて、CO付加体の筋傷害に対する影響について血清中のクレアチニンキナーゼとミオグロビン濃度を測定することで評価した。その結果、生理食塩水投与群と比較してCO付加体治療時においてクレアチニンキナーゼとミオグロビン濃度は低値を示した。加えて、トレッドミルにより歩行力(運動性)について評価したところ、生理食塩水投与群では運動性が低下していたものの、CO付加体投与群では維持していた。以上の結果より、CO付加体投与時には筋傷害の増悪も抑制する可能性が示唆された。平成31年度は、CO付加体投与時の腎保護メカニズムについて検討を行う予定である。しかしながら、クラッシュ・シンドロームモデルラットの生存時間は6時間以内と短く、メカニズムの検討に不向きと考えられる。そこで、クラッシュ・シンドロームと同様の発症機序で急性腎傷害を併発する横紋筋融解症モデルラットを用いて検討を行う予定である。現在、横紋筋融解症モデルラットを確立し、CO付加体の腎保護効果について検討を進めている。現在までにCO付加体のクラッシュ・シンドロームに伴う急性腎傷害に対する治療効果を明らかにしており、最終年度(平成31年度)には予定通りCO付加体の腎保護メカニズムの解明に着手できる。すでにグリセロール誘発性の横紋筋融解症モデルラットが急性腎傷害を併発することも確認済みであり、本モデルに対するCO付加体の腎保護効果を確認し次第、COの腎保護メカニズムの解明を行う予定である。クラッシュ・シンドロームモデルラットにCO-HbVを投与量依存的に投与し生存率の評価を行う。得られた結果より、CO-HbVの至適投与量の設定を行う。また、クラッシュ・シンドロームに伴う急性腎傷害についても評価を行う。具体的には、圧迫開放6時間後に血液と腎臓を回収し、生化学パラメータ(クレアチニン・尿素窒素など)と組織形態変化(PAS染色、免疫染色など)によって評価する。また、蓄尿を行い尿検査(クレアチニン、ミオグロビン、蛋白尿など)も行う。グリセロール誘発横紋筋融解症モデルラットに対してCO付加体(CO-RBC及びCO-HbV)を投与し、CO付加体の横紋筋融解症に伴う急性腎傷害に対する治療効果について確認を行う。続いて、CO付加体の腎保護メカニズムについて検討を行う。具体的には、横紋筋融解症に伴う急性腎不全の発症機序として知られている、1ミオグロビンの尿細管蓄積による尿細管閉塞、2ミオグロビン内部ヘム鉄の酸化に起因する組織傷害、3腎チトクロームP450分解に由来する遊離ヘム介在性の酸化傷害、4好中球の遊走及び炎症性サイトカインの蓄積、について検討を行う。
歯科矯正学的歯の移動における骨細胞の機能の解明と新たな固定源としての開発応用

申請者は研究計画に基づき、矯正学的歯の移動におけるsclerostinの発現解析を目的として、12週齢雄性野生型マウスを用いて歯の移動実験を行った。ニッケルチタンコイルスプリングをマウスの上顎第一臼歯に結紮し、反対側は上顎骨前歯部に固定することで、上顎第一臼歯の近心移動を行った。マウスはそれぞれ4、8、12日後に灌流固定を施し、上顎骨を採取した。採取した上顎骨は固定、脱灰後、パラフィン包埋を行い、上顎第一臼歯遠心頬側根の横断切片を作製した。組織学的解析としてH&E染色、免疫組織化学法を行い、歯の移動前後におけるsclerostinの発現分布を解析した。H&E染色において、移動開始4日目には、圧迫側・牽引側に数個の破骨細胞の出現を認めた。また圧迫側の歯根膜は狭小化し、細胞の死滅を認めた。8日目には、圧迫側の固有歯槽骨では骨細胞の死滅が、牽引側では骨新生が認められた。12日目には、圧迫側・牽引側で破骨細胞を多数認め、活発にリモデリングが行われている様子が確認できた。免疫組織化学法では、歯根周囲の歯槽骨に存在する骨細胞においてsclerostinの発現が認められ、そのシグナルは骨細胞の細胞膜だけでなく周囲の骨細管にも分布していた。移動開始4日目には、歯根周囲の歯槽骨においてsclerostinの発現量は有意に低下していた。このことより、歯根周囲の歯槽骨に存在する骨細胞はメカニカルストレスを感知し、sclerostinの発現量を低下させることが明らかとなった。8日目、12日目には、徐々に歯根周囲の歯槽骨におけるsclerostinの発現量の回復が認められ、特に牽引側におけるsclerostin発現が先行して回復する所見が得られた。H&E染色の結果を踏まえ、圧迫側の歯槽骨における骨細胞の死滅がsclerostin発現の回復の遅延に関与している可能性が示唆された。研究計画では、免疫組織化学法のデータの解析が終わり次第、ノックアウトマウスを用いた実験および抗sclerostin抗体を用いた実験に着手する予定としていたが、免疫組織化学法の結果が仮説と異なるものであったため、プロトコールを見直し、再度染色を行った。よりよい染色条件を検討することで、自家蛍光または非特異的染色に由来するバックグラウンドシグナルを減じ、適切なコントラストを得ることができたが、歯の移動後の歯槽骨におけるsclerostinの分布は仮説通りの局在を示さなかった。圧迫側と牽引側では、どちらも歯槽骨にメカニカルストレスが加わるが、そのメカニズムが両者で大きく異なる点を考慮し、仮説を再検討する必要がある。また、骨のリモデリングに関与する他の液性因子の分布も確認する必要があると考えられる。また研究に用いる予定としていたヒト抗sclerostinモノクローナル抗体製剤を、企業から供与していただくことができなかったことにより、研究計画の大幅な見直しが必要となり、sclerostinに対する完全ヒト型抗体ではなく、抗sclerostin抗体を代わりに用いる研究計画への変更が必要となった。今後、下記実験を予定している。1. sclerostinノックアウトマウスにおける歯の移動についてsclerostinの欠損が歯の移動に与える影響を検討するため, sclerostinをコードする遺伝子Sostをβ-ガラクトシダーゼをコードするlacZで置換したマウス(Sost-/-)を購入する。Sost-/-マウスにおいて、sclerostinがノックアウトされていることを確認するため、骨細胞におけるβ-ガラクトシダーゼ活性の検出を行う。さらに、定量的コンピュータ断層法(QCT)を用いて長管骨の骨密度を測定し、sclerostinの欠失が骨密度に及ぼす影響を調べる。このSost-/-マウスに対して歯の移動を行い、マイクロCTを用いて歯の移動量を計測し、野生型マウスとの比較、検討を行う。2.歯科矯正学的歯の移動における抗sclerostin抗体の作用について抗sclerostin抗体を投与した12週齢雄性野生型マウスを用いて、歯の移動実験を行う。実験開始3日前より、全身投与群は腹腔内に、局所投与群は上顎左側第一臼歯部口蓋粘膜下に抗体を投与し、以後3日ごとに投与を行う。また対照群として、抗体の代わりに生理食塩水を同様の方法にて投与する群を設定する。歯の移動後は、マイクロCTを用いた歯の移動量の算出、TRAP染色を用いた破骨細胞数の計測、免疫組織化学法を用いたsclerostin発現の変化の観察を行う。さらに、歯の移動終了時の血清を採取し、血中の抗sclerostin抗体濃度の測定を行う。最終的に、平成30年度に得られた免疫組織化学法のデータと平成31年度のノックアウトマウスを用いた実験および抗sclerostin抗体を用いた実験のデータを統合し、歯科矯正学的歯の移動における骨細胞の機能という観点から、新たな知見を得ることを目指す。申請者は、研究計画に基づき、矯正学的歯の移動におけるsclerostinの発現解析を目的として、12週齢雄性野生型マウスを用いて、歯科矯正学的歯の移動実験を行った。吉松らの報告に基づき、10gのニッケルチタンコイルスプリングをマウスの上顎第一臼歯に結紮し、反対側は上顎骨前歯部に固定することで、上顎第一臼歯の近心移動を行った。

マウスはそれぞれ4、8、12日後にパラホルムアルデヒドを用いて灌流固定を施し、上顎骨を採取した。採取した上顎骨は固定、脱灰後、パラフィン包埋およびを行い、上顎第一臼歯遠心頬側根の横断切片を作製した。組織化学的解析としてH&E染色を行った。続いて、抗sclerostin抗体を用いて免疫組織化学法を行い、歯科矯正学的歯の移動前後におけるsclerostinの発現分布を解析した。まずH&E染色像において、歯科矯正学的歯の移動に伴う歯根膜及び歯槽骨の経時変化を確認した。移動開始4日目には、牽引側・圧迫側に数個の破骨細胞の出現を認めた。また、圧迫側の歯根膜は狭小化し、細胞の死滅を認めた。移動開始8日目には、圧迫側において歯根を囲むように破骨細胞が出現し、骨破壊を行うとともに、破壊された場所には新たな歯根膜が形成された。さらに、圧迫側の固有歯槽骨では骨細胞の死が、牽引側では骨新生が認められた。移動開始12日目には、牽引側・圧迫側で破骨細胞を多数認め、活発にリモデリングが行われている様子が確認できた。また免疫組織化学法より、歯根周囲の歯槽骨に存在する骨細胞においてsclerostinの発現が認められ、そのシグナルは骨細胞の細胞膜だけでなく周囲の骨細管にも分布していた。移動開始4日目および8日目には、周囲の歯槽骨においてsclerostin発現の低下が認められたが、牽引側および圧迫側において発現量に著名な差は認められなかった。交付申請書に記載した計画通り、野生型マウスに対して矯正学的歯の移動を行い、上顎第一臼歯遠心頬側根の横断切片の作成および免疫組織化学法を行い、歯根周囲のsclerostinの局在を明らかにすることができた。しかし、現時点における免疫組織化学法のイメージングにおいては、十分なイメージング画像が得られているとは言い難い。具体的には、自家蛍光または比特異的染色に由来するバックグラウンドシグナルを認め、適切なコントラストを得ることができていない。そのため、今後は抗原の前処理や抗体の希釈濃度についてプロトコールを見直し、よりよい染色条件を検討することで、輝度の高い特異的なシグナルを、最低限のバックグラウンドシグナルの存在下において取得することを目指す。また、免疫組織化学法より歯根周囲の歯槽骨に存在する骨細胞においてsclerostinの発現が認められたが、圧迫側と牽引側でのsclerostinの発現量および矯正学的歯の移動に伴う発現分布の変化は、実験計画の仮説とは異なる結果も認められた。圧迫側と牽引側では、どちらも歯槽骨にメカニカルストレスが加わるが、そのメカニズムが両者で大きく異なる点を考慮し、仮説を再検討する必要があると考えられる。申請者は研究計画に基づき、矯正学的歯の移動におけるsclerostinの発現解析を目的として、12週齢雄性野生型マウスを用いて歯の移動実験を行った。ニッケルチタンコイルスプリングをマウスの上顎第一臼歯に結紮し、反対側は上顎骨前歯部に固定することで、上顎第一臼歯の近心移動を行った。マウスはそれぞれ4、8、12日後に灌流固定を施し、上顎骨を採取した。採取した上顎骨は固定、脱灰後、パラフィン包埋を行い、上顎第一臼歯遠心頬側根の横断切片を作製した。組織学的解析としてH&E染色、免疫組織化学法を行い、歯の移動前後におけるsclerostinの発現分布を解析した。H&E染色において、移動開始4日目には、圧迫側・牽引側に数個の破骨細胞の出現を認めた。