hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
Metabolic Tumor Volume値による頭頸部癌の治療方針選択

本研究の目的は頭頸部癌患者の一次治療前に施行しているFDG-PETの画像データを用いて病巣体積を三次元的に計測したMetabolic Tumor Volume (MTV)と治療予後との相関について検討した。放射線治療を行った喉頭癌・下咽頭癌患者について後ろ向きに検討したところ、治療前のMTVが高値の症例は治療後の遺残・再発および長期予後のいずれにおいても予後不良であると示された。本研究の目的は,頭頸部癌患者の一次治療前に原発巣と頸部リンパ節転移,および遠隔転移の有無を精査する目的で施行されている18F-FDG-PETおよびFDG-PETとCTとの融合画像であるPET/CTを用いた,病巣体積の三次元計測値であるMetabolic Tumor Volume (MTV)と治療予後との相関を解析することであった.まず,研究計画について当院の研究倫理委員会による承認を得たのちに検討を開始した.はじめは当院で加療を行った頭頸部癌患者全体に対する治療前MTV値の検討を計画していたが,原発巣の部位によって値のばらつきがあることが判明したため,喉頭癌と下咽頭癌に限って検討することとした.喉頭癌については一次治療として放射線治療を行った症例での検討では,治療前のMTV値は一次治療効果,治療後再発,長期予後のすべてにおいて予測因子となりうると判明したため,英論文発表(PLoS One. 2015 Feb 18;10(2):e0117924.),国際学会発表(第39回日本頭頸部癌学会第4回アジア頭頸部癌学会(神戸), 2015.6),国内学会のシンポジウムでの発表(第28回日本喉頭科学会総会・学術総会(大阪),2016, 3,シンポジウム2「局所進行喉頭・下咽頭癌喉頭温存に向けたcutting edge-」)を行った.下咽頭癌についても同様の結果が得られたため国内学会発表(第116回日本耳鼻咽喉科学会総会(東京), 2015.5)を行い,現在英論文作成中である.上記の通り、研究目的である治療前のMTV値が治療予後予測因子となりうる可能性が複数の頭頸部癌で示されているため。本研究の目的は、頭頸部癌患者の一次治療前に原発巣と頸部リンパ節転移、および遠隔転移の有無を精査する目的で施行されている18F-FDG-PETおよびFDG-PETとCTとの融合画像であるPET/CTを用いた病巣体積の三次元的計測値であるMetabolic Tumor Volume (MTV)と治療予後との相関を解析することであった。研究計画について当院の研究倫理委員会による承認を得たのちに診療記録の後ろ向き検討を行った。はじめは当院で加療した頭頸部癌患者全体の検討を予定していたが、原発巣の部位によってMTV値のばらつきが異なるため喉頭癌と下咽頭癌に限った検討を行った。喉頭癌、下咽頭癌に対して放射線治療を行った場合、いずれの癌種においても治療前のMTV値が高値であった症例は治療後の遺残、再発、長期予後のいずれにおいても予後不良であると示された。また、喉頭癌においてはMTV値が高値である症例に対して手術と術後放射線治療を組み合わせた治療を行うことで放射線治療を行った場合と比較して予後が良好となることが示された。今後は治療前に計測したMTV値による至適治療法選択が可能となりうると考えられた。上記研究結果につき英論文で発表(PLoS One. 2015 Feb 18;10(2):e0117924、Head Neck. 2016Nov;38(11):1666-1671、Laryngoscope. 2017Apr;127(4):862-867)、国際学会での発表(第39回日本頭頸部癌学会第4回アジア頭頸部癌学会(神戸), 2015年6月)、国内学会シンポジウムでの発表(第28回日本喉頭科学会総会・学術総会(大阪),2016年3月)を行った。上記の通り、下咽頭癌に関しての研究成果を論文発表する。また、上記検討では、高MTV症例対して放射線治療を行った場合の治療予後が不良であった。この高MTV症例に対する適切な治療法の検討を行う。頭頸部癌統計解析ソフトの購入を予定していたが汎用のソフトで代用したため差額相当額が差異として生じた。研究補助の人件費および論文掲載料に充てる予定である。
中分子創薬にむけた標的結合ペプチドを制御する天然足場ペプチドの探索

分子量が小さく化学合成が可能で、標的結合性を有するペプチドが抗体の代替となる中分子薬として期待されている。しかし、多くの標的結合ペプチドは結合力が弱く、これまでに実用化された例はない。そこで本研究では、A)「構造ゆらぎ」の制御による高性能な抗体代替ペプチドの創製理論を確立し、B)足場ペプチドとして利用可能な天然ペプチドの探索法、C)足場ペプチドへの組み込みによる「構造ゆらぎ」の制御法を構築し、化学合成可能な中分子ペプチドの創製原理を確立した。本研究で確立したデザイン技術のさらなる高度化と汎用化を実現することにより、将来的には抗体医薬に代わる中分子医薬の開発に発展させたい。当該年度においては、イン・シリコ・スクリーニングによって標的結合ペプチドの「構造ゆらぎ」を制御するための天然足場ペプチドを探索した。Protein Data Bankに登録されている天然ペプチドの構造情報を用いて、1天然構造のゆらぎ、2全ループの溶媒への露出度、3モデルペプチドを組み込んだ際の構造ゆらぎ抑制効果をMDシミュレーションにより評価した。その結果、どのようなアミノ酸配列を持つペプチドであっても「構造ゆらぎ」を抑制できる天然足場ペプチドの同定に成功した。次に、乳がんマーカーHER2に結合するペプチドを同定した足場ペプチドに組み込んだところ、予想通り、「構造ゆらぎ」が抑制されることが分かった。さらにこの中分子ペプチドは精製HER2に結合することを確認した。本研究では、1組み込んだペプチドの「構造ゆらぎ」を制御できる天然足場ペプチドを探索し、2標的結合ペプチドを組み込んだ中分子ペプチドの結合力評価によりペプチド創製理論を確立し、3抗体代替分子としての有用性を示すことを目的としている。現在までに、天然足場ペプチドを同定し、標的結合性を有する中分子ペプチドの創製に成功しており、順調に進んでいる。前年度に創製した中分子ペプチドのHER2への結合力を、等温滴定型カロリメーターにより測定したところ、解離定数(KD)は30-45 μMであった。これは、抗体の結合力(KD = 0.8 nM)と比べると弱いことから、この中分子ペプチドを抗体代替分子として利用するのは難しいことが分かった。そこでこの中分子ペプチドの有用性評価はこれ以上行わず、創製理論を再考して分子を再設計した。検索条件を変更したイン・シリコ・スクリーニングによって標的結合ペプチドの「構造ゆらぎ」を制御するための天然足場分子を探索し、新たに7種類の分子を同定した。並行して、HER2抗体医薬とHER2の複合体構造を元に結合エネルギー計算を実施し、HER2との結合に重要な5種類のペプチド配列を同定した。これらのHER2結合ペプチドを足場分子に組み込んだところ、全てのHER2結合ペプチドの構造ゆらぎを抑制できた。次に、設計した分子を大腸菌発現系により調整し、結合力を指標にスクリーニングした結果、4種類のHER2結合分子が得られた。最も強い結合力を持っていた分子のKDは24 nMと抗体に匹敵し、さらに抗体同様にHER2発現細胞の検出やHER2陽性腫瘍切片の免疫染色に利用できたことから、抗体代替分子としての有用性が示された。以上より、標的結合ペプチドの「構造ゆらぎ」の制御により、抗体代替分子を創製するための理論および方法が確立できた。今後は、本創製理論に基づいて様々な抗体医薬の代替分子を創製するとともに、創製方法の高度化と汎用化を目指して改良を進めたい。創製した中分子ペプチドの詳細な結合力評価を行う。足場ペプチドに組み込むHER2結合ペプチドを最適化し、より結合力の強い中分子ペプチドを創出する。抗体代替分子としての性能を評価するため、得られた中分子ペプチドを用いてHER2発現がん細胞への結合評価、皮下腫瘍への集積性を検討する。創薬化学購入予定であった超低温フリーザーの購入が必要なくなったため、その分が次年度繰越額として生じた。次年度では多くの動物実験を予定しており、それらに必要な維持費と消耗品費として利用する。
マメ科種子貯蔵タンパク質の分子レベルにおける構造・加工特性相関に関する研究

食源性疾患の増大、高齢社会の到来、そして食糧の不足に対するために、脂質代謝改善能をもつ種子貯蔵タンパク質の高度利用法を開発することが望まれる。このためには、種子貯蔵タンパク質の構造と加工特性の相関を解明することが必要である。そこで、以下のように研究を進めた。1.各種種子タンパク質の大腸菌発現系の構築、精製、結晶化と構造解析アズキ7S、エンドウ11S、バンバラマメ11SのcDNAの大腸菌発現系を構築し、組換え型の発現タンパク質の特性を明らかにするとともに、結晶化に供した。その結果、アズキ7S2種とエンドウ11Sの結晶化に成功し、アズキ7S2種についてはx線結晶構造解析によって1.8Aと2.25Aの分解能で立体構造の解明に成功した。1.8Aの分解能は、これまでに報告されている7Sの構造の中で最も優れたものである。2.種子7Sの構造・特性相関所属研究室がこれまでに特性と立体構造を解明していたダイズ7Sα'とβ、マングビーン7Sαに加えて、今年度に解明したアズキ7S2種の特性と立体構造との関係を総合的に考察した。その結果、熱安定性は多くの要因の総合として決まるが、キャビティーの大きさの寄与が大きい可能性があること、表面疎水性は、脂肪族性、芳香族性を問わず、疎水性領域の分布割合のみでは決まらないこと、低イオン強度下中性から弱アルカリ性における溶解性は、静電ポテンシャル状態によって決まることが明らかとなった。
マンガの要素と用語の分析研究によるマンガ用語法の確立

マンガ表現を構成する諸要素と名称について、技法書等の文献を対象にコーパス分析などの調査分析を行い、マンガの諸要素を名指す語彙の水準における諸問題が、図に対する名指しと、概念への名指しの関係の曖昧な二重性に起因することを明らかにした。さらに個々の語彙と図との結びつきの実際をウェブを用いて調査し、要素によって前述の二重性に差があること等を明らかにし、将来における辞書的な整理等に資する成果を得た。本研究は、マンガ表現を構成する諸要素の分析を経て、用語法の調査と研究を行い、今後のマンガ領域における教育研究や政策策定の基盤となる用語の整理を目的とする。また、現場の要請から用いられている「技術用語」の精査により、マンガ表現をより深く理解し分析する学術的な「理論用語」への転用可能性をはかる。つまり、本研究は単に現場の技術的水準で用いられている用語の収集と整理に留まるものではなく、さらに大きな目標として、人文知としての「マンガ学」の基盤の整備を睨むものである。平成25年度は研究開始年度であり、共同研究者との話し合いを重ねながら、マンガに関連する用語と要素を抽出する範囲、分析の方法、ならびに論理的な構造について検討を行い、マンガを校正する要素の中から、マンガに使用される言葉/文字を登場人物の主に発話であることを示す「フキだし」に限り調査を進めた。マンガの評論書や技巧書、論文を対象に文献調査を行い、「フキだし」に関する記述を抽出してデータ入力を終える事ができた。収集したデータから、従来「フキだし」と考えられてきた定義を拡張する必要のある可能性のある形状の発見や、登場人物によって発話されない言葉について、階層構造が構築されているなどの発見がなされた。また、「フキだし」と思われる形状のリストを作成し、形状と機能によるグループの形成を行った。作成したリストをもとに、それぞれの形状の一般的な呼ばれ方を調査するためのアンケートを作成した。マンガに関連する技法書や評論書250冊とwebサイトの調査を行った。マンガ研究・批評とされる日本語の文献においては、terminologyを体系的に行った先行研究を見出すには至らなかった。ゆえに、本研究は技法書の調査を主とし、「慣習的な呼び名」についての調査となった。その過程で、紙面上に「描かれたもの」として形式的に定義可能なものに対象をしぼることとし、文献調査から得られた結果として、語句を抽出する作業を行った。慣習的に呼び習わされる「名称」の調査であるため、「呼び習わされる」機会の有無に左右されることが多いと思われる。つまり、「名前のない」要素が少なからず存在することは予想されていたとおりだが、「名称」が必要に応じて生じるため、本調査に際しては、調査による接触がその場かぎりの「名称」を生むといった問題が生じた。逆にいえば、本研究がコミュニティによるマンガとの接し方(読者・作り手・研究者)の違いこそを浮き彫りにした側面があった。本研究は技法書の調査を主としたため、おのずと「慣習的な呼び名」についての調査となった。紙面上に「描かれたもの」として形式的に定義可能なものに対象をしぼり、文献調査から得られた結果として、語句を抽出した。逆にいえば、本研究とは、コミュニティによるマンガとの接し方(読者・作り手・研究者)の違いこそを浮き彫りにするものとも言えるだろう。当該年度は要素をフキだしに絞り、6月に実施されたマンガ学会第15回大会においてパネル発表を行った。マンガ学会の第15回大会での発表後に本研究の代表の伊藤剛の病状が悪化し研究を中断することとなった。前年度までの、マンガ技法書、研究書からの語彙の抽出作業およびその分析を踏まえ、今年度においては、技法書と理論的な研究書についてコーパス分析を行った。<要素>を名指す名称間の文中での出現パターンからの分析から、これらの名称が指し示す概念間の関係に、その文章が書かれた目的や機会に対する依存度の存在が確認された。一方、本研究は、マンガを構成する諸要素(ここでいう「要素」とは、もっぱら線で構成され、紙面上に視認できる形で示されたものを指す)と、それらを名指す名称との対応が、人々によってどのようになされているかを知る方法論の探求という問題に行き当たった。これは、マンガを構成する諸要素と、理論的に考えられる諸概念とを形式的な紐づける根拠を一意的に示すことができないことに由来する。そこで、今年度の研究では、前述のような問題点を考慮し、Webを用いて「用語の認知度」と並行して「図示された要素との対応」を回答させるアンケート調査を実施、主に「マンガを描いたことがある初心者」という水準の揃った回答者約500名を得ることができた。

アンケート結果からは、用語としての認知度にかかわらず、認知されていれば、おおむね「要素」との対応は良くとられているという一般的な傾向が確認されたが、マンガを構成する概念のうち最も基本的なものと目される「コマ」「枠線」に関しては、要素との対応が明瞭ではなかった。ここから、自然言語と扱いうる「コマ」名称の使われ方と、「コマ」概念の論理的な定義困難性が大きく関係していることが浮かび上がった。このような相関と、書籍等のコーパス分析との結果を併せることで、今後考えられる「用語法」の確立とは、それがいかなる形であれ、目的と機会に依存することは避けられず、概念と要素の結びつきを明瞭に示す方法論および、概念体系をアド・ホックなものに留まらないものとする必要が示唆された。マンガ表現を構成する諸要素と名称について、技法書等の文献を対象にコーパス分析などの調査分析を行い、マンガの諸要素を名指す語彙の水準における諸問題が、図に対する名指しと、概念への名指しの関係の曖昧な二重性に起因することを明らかにした。さらに個々の語彙と図との結びつきの実際をウェブを用いて調査し、要素によって前述の二重性に差があること等を明らかにし、将来における辞書的な整理等に資する成果を得た。紙面上の"要素(エレメント)"としては存在するが、明確な名称のないものを多く含むため、調査対象の確定には論理的な困難が伴った。そこで、平成26年度の調査範囲を文献調査と学生を対象にしたアンケート調査の結果、調査方法のより繊細な検討が必要となり、当初予定していたweb調査やマンガ家等を対象にした、より広範な調査の開始に遅れが生じている。本研究の代表、伊藤剛の健康状態が改善の兆しが見られるので平成27年度に収集したデータの分析を再開し、用語の体系の構築を試みる。芸術一般マンガ表現の諸要素について、その論理的構成を分析し、名称が付与されるべき単位の抽出を行う。その際には、一般的な用語法(terminology)における先行研究等を検討し、今後の聞き取り調査のための調査票を設計する。調査の結果から得られた知見をもとに、マンガ表現の論理構造について再度分析し用語の体系の構築を試みる。今後は、マンガ家や編集者等への調査を行う一方、調査の結果得られた呼称を踏まえつつ、それらの論理的な関係を明らかにしていきたい。マンガを構成する要素全ての調査項目は膨大であるが、まずは要素の抽出からデータ入力等、分析の一連の作業手順を確立することができた。また、次年度の調査対象とする要素についての検討も進んでおり、初年度の計画はおおむね順調に進展していると考える。当該年度中に研究代表者の病気により研究に遅れが生じたため。紙面上に「描かれたもの」として形式的に定義可能なものに対象をしぼり、文献調査から得られた結果として語句を抽出したため、当初予定していたマンガ家や編集者などへの聞き取り調査とwebを利用した調査が実施されなかったため。分析入力に伴う人件費、謝金。webアンケート実施の費用等。今後の推進方策平成26年度は、引き続き他の要素についての調査、分析作業を進めるほか、途中報告として平成27年度の東京工芸大学紀要への論文掲載を行う予定である。次年度の研究費の使用計画平成26年度の研究費は、主に要素の抽出とデータ入力作業に関わる謝金に用いるほか、アンケートの制作と分析のための費用としての支出を予定している。平成27年度への持ち越し額はweb調査の実施費用と聞き取り調査の謝金として使用する。平成25年度の調査対象を「フキだし」に限定したことにより要素の抽出に必要な人件費、謝金が減額となった。
ミッドカインの腫瘍の診断、治療そして血液幹細胞増殖への応用

酵素抗体法による血清中のミッドカインレベルの大規模スクリーニングを行い、80%以上ののヒト癌患者ケースにおいてコントロール値より高く陽性であり、血清中のミッドカインレベルが腫瘍マーカーとして利用できる可能性が高くなった。短縮型のミッドカインmRNAの癌特異性がさらに確認された。また全例のリンパ節転移巣では短縮型が発現され短縮型ミッドカインmRNAは手術時において微細な転移等の存在をPCRによって検出する際の良いマーカーとなると考えられた。また、ミッドカインmRNAの発現は大腸癌の前癌段階のアデノーマにおいても上昇していることが明らかになった。ミッドカインはヒトの食道癌14例中8例に発現しているが、正常食道組織に発現されなかった。ミッドカイン遺伝子の5'上流域2.3kbは食道癌細胞株で下流の遺伝子の発現をうながすプロモーターとして作用した。そこでこのプロモーターを自殺遺伝子の発現に使うことが考えられた。実際このプロモーターの下流にチミジンキナーゼを置くと、遺伝子導入細胞はガンシクロビルに感受性を獲得した。ミッドカインは、骨折部に発現し、ミッドカインcDNAの導入と強制発現により、軟骨前駆細胞の分化をうながし、骨折の治療に応用する可能性が生じた。また、ミッドカイン遺伝子欠失マウスはシスプラチンによる腎障害を起しやすく、ミッドカインを制癌剤の細胞毒性を軽減する薬剤として使用することが考えられた。ミッドカインはリウマチ患者の滑膜液中に検出されるが、正常者の滑膜液中には見出されず、炎症と関連すると考えられていた。実際ミッドカインはマクロファージの遊走能を示した。ミッドカイン遺伝子欠失マウスでは血管内膜損傷時の内皮の肥厚が起らず、この時、マクロファージの遊走もなかった。マクロファージの遊走をミッドカインがうながし、その結果病像の形成が起ることが確認された。ミッドカインはヘパリン結合性の成長分化因子で神経組織の発生分化に関与すると共に多くのヒト癌で発現が増大している。ヒトの癌で、N末端側のドメインを欠失した短縮ミッドカイン(tMK)mRNAが検出されている。今回、47例のヒト消化器癌で検討したところ過半数(12/16の胃癌、8/13の大腸癌、5/9の肝臓、2/2の食道癌)のケースで、tMKmRNAが癌部で検出された。しかし、非癌部では、tMKmRNAはまったく検出されなかった。また14例のリンパ節転移部では全例に於てtMKmRNAが検出され、3例の肝転移部では1例もtMKmRNAが検出されなかった。これらの結果は、tMKmRNAがリンパ節転移の診断マーカーとなることを示している。また、ヒトのアストロサイトーマで、ミッドカインの高発現は予後の悪さと相関した。高感度EIAで血清中のミッドカイン値を測定すると、多くの癌患者に於てミッドカイン値が上昇していた。ことに肺癌患者でその傾向が顕著であった。また、大腸癌患者では、癌の浸潤度とミッドカイン値の上昇の間に関連があった。腎透析の患者では透析の開始と共にミッドカインの値が急上昇してその後ゆるやかに低下した。ミッドカイン値の上昇は透析の際にヘパリンを使用することによるが、正常人にヘパリン投与すると、ミッドカイン値は急上昇の後、急低下した。腎透析患者の血液中の高ミッドカイン状態は透析の副作用と関連する可能性がある。短縮型のミッドカインmRNAの癌

特異性がさらに確認された。また全例のリンパ節転移巣では短縮型が発現され短縮型ミッドカインmRNAは手術時において微細な転移等の存在をPCRによって検出する際の良いマーカーとなると考えられた。また、ミッドカインmRNAの発現は大腸癌の前癌段階のアデノーマにおいても上昇していることが明らかになった。ミッドカインはヒトの食道癌14例中8例に発現しているが、正常食道組織に発現されなかった。ミッドカイン遺伝子の5'上流域2.3kbは食道癌細胞株で下流の遺伝子の発現をうながすプロモーターとして作用した。そこでこのプロモーターを自殺遺伝子の発現に使うことが考えられた。実際このプロモーターの下流にチミジンキナーゼを置くと、遺伝子導入細胞はガンシクロビルに感受性を獲得した。ミッドカインは、骨折部に発現し、ミッドカインcDNAの導入と強制発現により、軟骨前駆細胞の分化をうながし、骨折の治療に応用する可能性が生じた。また、ミッドカイン遺伝子欠失マウスはシスプラチンによる腎障害を起しやすく、ミッドカインを制癌剤の細胞毒性を軽減する薬剤として使用することが考えられた。ミッドカインはリウマチ患者の滑膜液中に検出されるが、正常者の滑膜液中には見出されず、炎症と関連すると考えられていた。実際ミッドカインはマクロファージの遊走能を示した。ミッドカイン遺伝子欠失マウスでは血管内膜損傷時の内皮の肥厚が起らず、この時、マクロファージの遊走もなかった。マクロファージの遊走をミッドカインがうながし、その結果病像の形成が起ることが確認された。
より柔軟な文献検索システムの構築にむけて:テキスト解析と引用解析の融合

現在までにKandolaらのノイマンカーネルを複数のコミュニティが存在する引用関係グラフに適用する際に生ずる間題点について議論を展開した.ノイマンカーネルはパラメタ調整によって,個々の論文に対して,関連論文あるいは重要論文をランク付けして提示できる.しかし,パラメタを重要度に偏らせると引用グラフ全体における支配的なコミュニティの重要論文のみが,個々の論文が属するコミュニティにかかわらず,上位にランキングされてしまうという間題を指摘した.これに対して我々は,引用の生成過程をHofmannのpLSI(probabilistic Latent Semantic Indexing)によりモデル化し,その結果を用いて,コミュニティごとの重みつき引用グラフ(コミュニティグラフ)を計算する.これらのグラフは,引用の各コミュニティに対する帰属確率を計算し,弧の重みとするため,同一の引用が,複数のコミュニティグラフに異なった重みのもとで存在することができる(多重コミュニティ).得られたコミュニティグラフにノイマンカーネルを適用することによって,対象論文が属するコミュニティを考慮して重要論文を推薦,提示できることを示した.さらに,提案手法の性能の検証を行うために,技術文書の提案システムに適用し,他のアルゴリズムとの比較を行った.結果,提案手法が既存のアルゴリズムに対して性能が向上すること確認した.現在までにKandolaらのノイマンカーネルを複数のコミュニティが存在する引用関係グラフに適用する際に生ずる間題点について議論を展開した.ノイマンカーネルはパラメタ調整によって,個々の論文に対して,関連論文あるいは重要論文をランク付けして提示できる.しかし,パラメタを重要度に偏らせると引用グラフ全体における支配的なコミュニティの重要論文のみが,個々の論文が属するコミュニティにかかわらず,上位にランキングされてしまうという間題を指摘した.これに対して我々は,引用の生成過程をHofmannのpLSI(probabilistic Latent Semantic Indexing)によりモデル化し,その結果を用いて,コミュニティごとの重みつき引用グラフ(コミュニティグラフ)を計算する.これらのグラフは,引用の各コミュニティに対する帰属確率を計算し,弧の重みとするため,同一の引用が,複数のコミュニティグラフに異なった重みのもとで存在することができる(多重コミュニティ).得られたコミュニティグラフにノイマンカーネルを適用することによって,対象論文が属するコミュニティを考慮して重要論文を推薦,提示できることを示した.さらに,提案手法の性能の検証を行うために,技術文書の提案システムに適用し,他のアルゴリズムとの比較を行った.結果,提案手法が既存のアルゴリズムに対して性能が向上すること確認した.
デオキシ糖含有抗生物質の生合成における配糖化関連酵素遺伝子の機能解析

(成果概要)5領域に分割したGT1b及びGT1cのうち、領域II(50残基)に対してPCRを利用したDNAシャフリングを行い、改変型GTを構築した。これらをS.fradiaeのXTC mutant及びAx mutantを発現宿主に用いて発現させ、形質転換体の配糖化産物を検出することにより活性を評価した。形質転換体をそれぞれ400及び198検体について検討したところ、天然型にはみられなかったGT1bとGT1cの双方の活性を有するものの他、新規GT活性として分枝型糖鎖を有するurdamycin Pを与える改変型GTの創出に成功した。構成デオキシ糖を生成する酵素遺伝子群のうち、UrdRはデオキシ糖4位の還元酵素と推定された。UrdRのフレームシフト変異株RN-435の代謝産物を分析することにより、2種類の新規URD代謝産物が見出された。各種スペクトル分析により構造決定したところ、URD-Mの9位D-rhodの4'水酸基がL-rhod化されたURD-R及びURD-Rの9位D-rhodがL-rhodとなったURD-Sであることが判明した。この結果、UrdGT2はその基質となる各種ヌクレオチド糖供与体プールが適切に供給されれば、D-,L-双方のrhodinoseをC-配糖化する能力があることが判明した。上記の知見は、有用物質生産を指向した代謝工学的応用研究に向けた重要な知見となった。(研究目標)(今年度の研究成果)5領域(I, IIa, IIb, III, IV)に分割したGT1b及びGT1cのうち、領域IIは50残基中18箇所と最も大きな差異がみられたので、この18残基をシャフリングの対象とした。改変箇所を絞りこむため、領域IIで改めてサブキメラ体を構築し、両GT活性に影響を与えない残基を探索したところ、8箇所を改変対象から除外することができた。残り10箇所についてPCRを利用したDNAシャフリングを行い、改変型GTを構築した。これらをermEプロモーター下流に組み込んだ発現プラスミドとし、S.fradiaeのXTC mutant及びAx mutantを発現宿主に用い、各プラスミドを導入した。形質転換体を液体培養し,培地の酢酸エチル抽出物を逆相系HPLC及びLC/MSにて分析し、基質並びに配糖化産物を検出することにより活性を評価した。Ax mutant及びXTC mutantでの形質転換体をそれぞれ400及び198検体について検討したところ、天然型やこれまでのキメラにはみられなかったGT1bとGT1cの双方の活性を有するものの他、新規GT活性として分枝型糖鎖を有するurdamycin Pを与える改変型GTの創出に成功した。(研究目的)放線菌Streptomycesfradiae由来angucycline系抗生物質UrdamycinA(URD-A)の構成デオキシ糖であるD-olivose(D-oliv)とL-rhodinose(L-rhod)の4つの糖転移酵素(GT)に関する代謝工学的研究を展開している。当該年度、構成デオキシ糖の生合成に関わる遺伝子の破壊体から新規URD誘導体を単離、構造決定し、C-配糖化に関わるGTであるUrdGT2の基質認識に関する以下の新知見が得られた。(今年度の業績)構成デオキシ糖を生成する酵素遺伝子群、urdZ1,urdG, urdH, urdZ3,urdQ, urdR, urdS及びurdTはurdGT2とともにゲノム上で約8.7kbのクラスター構造を有し、UrdRはデオキシ糖4位の還元酵素と推定された。UrdRのフレームシフト変異株RN-435の代謝産物を分析することにより、URDアグリコンC-9位にD-rhodがC-配糖化されたURD-Mが同定された。野生株においてD-olivのC-配糖化酵素として機能するUrdGT2の基質特異性が比較的低く、D-rhodも認識したことがURD-M生産に繋がったと判断した。

今回RN-435変異株代謝物をさらにLC/MSを用いて分析したところ、分子量698と推定される2種類の新規URD代謝産物が見出された。各種スペクトル分析により構造決定したところ、URD-Mの9位D-rhodの4'水酸基がL-rhod化されたURD-R及びURD-Rの9位D-rhodがL-rhodとなったURD-Sであることが判明した。この結果、UrdGT2はその基質となる各種ヌクレオチド糖供与体プールが適切に供給されれば、D-,L-双方のrhodinoseをC-配糖化する能力があることが判明した。C-配糖化を含む代謝工学的応用研究に向けた重要な知見である。
特発性リンパ浮腫と特発性リンパ性胸腹水の病態解明と外科的治療確立

特発性リンパ浮腫に対して、LVAが有効であることを示した。リンパ浮腫の発症年齢が低い患者ではLVAの効果は限定的であったが、発症年齢が11歳以上の患者ではLVA後に患肢周径が有意に減少していた。また、ICG蛍光リンパ管造影の所見により、LVAの効果がある群と限定的である群が認められた。特発性乳糜胸腹水については、ICG検査を施行し、必要あればLVAを施行した。ICG検査の所見とその後の予後には関連があり、ICG蛍光リンパ管造影でリンパ管機能不全が重症であるほど、予後は悪かった。これらの結果について学会発表を行った。特発性リンパ性胸腹水、特発性リンパ浮腫を含む特発性リンパ疾患について、病理学的な検討を行った。LVA術中、吻合の際に余剰の集合リンパ管をトリミングすることがあり、これを用いて組織学的検討を行い(HE染色、podoplanin染色、LYVE-1染色、CD31染色などの免疫染色、電子顕微鏡)、特発性リンパ疾患における集合リンパ管の変化を解析した。さらに、術野周辺の皮膚を一部トリミングし、HE染色、podoplanin染色、LYVE-1染色、CD4染色、CD8染色、CD31染色など行い、その変化を解析した。また、特発性リンパ浮腫に対するリンパ管静脈吻合術やリンパ節移植の適応を検討した。その結果、特発性リンパ浮腫の患者においてはリンパ管静脈吻合術が著効するグループと効果を持たないグループがあることが解明された。これまで、特発性リンパ浮腫は発症年齢による分類しかなく、病態に基づいた新分類の必要性が示唆されてきた。今回の我々の研究から、発症年齢に基づく分類は必ずしも間違いでなく、発症年齢に基づいた分類の背景に病態が内在する可能性が示唆された。また、インドシアニングリーン蛍光リンパ管造影法の所見とリンパ管静脈吻合術の結果についても一定の関連を見いだした。今後、さらに病理学的所見とリンパ管静脈吻合術の効果、リンパ節移植の適応についても検討を行いたい。これらの結果について英語論文を作成し、国際誌に投稿を行っているところである。また、国内外の各学会において研究結果についての発表を行った。特発性リンパ浮腫の病態解明について、われわれが以前より行っているICGリンパ管造影法、リンパシンチ、MRTDの技術を、全身へ応用した。東京大学医学部附属病院のみならず、神奈川、大阪などの病院より診療についての相談を受け、出張検査なども行った。これにより、原因解明の難しかった乳糜腹水、乳糜胸水の病態を推測し、治療方針決定に寄与した。特に、新生児の特発性リンパ性胸腹水については、全身的なリンパ管低形成を併発していることがあり、治療法選択に難渋することがあるが、今回の研究から、ICGリンパ管造影法の所見とLVA効果に一定の関連があることが示唆されており、ICG検査において良好なリンパ管像を呈した症例にLVAの適応があると考えられた。特発性リンパ浮腫の治療法について、これまでわれわれはリンパ浮腫についてLVAを行ってきているが、特発性リンパ浮腫に対するLVAの有効性はほとんど報告されていなかった。今回の研究において、東京大学医学部附属病院でLVAを行った特発性下肢リンパ浮腫患者について後方視的調査を行い、LVA効果とリンパ浮腫の発症年齢に一定の関連があることを発見した。また、ICG検査所見とも関連があった。このことについて、英語論文として発表した(Hara H, et al. Plast Reconstr Surg, 2015)。以上の実績について、国内、国外での学会発表を行い、研究者達との意見交換を行った。STEP1(済)ICGリンパ管造影、リンパシンチ、組織学的検査施行環境の整備STEP2(未)特発性リンパ疾患の病態解明STEP3(未)特発性リンパ疾患に対する外科的治療の適応基準確立本研究費の申請段階で上記のように研究計画を設定していた。STEP2、STEP3ともに進行中であり、それぞれ一部には論文作成の段階に至っている。リンパ外科引き続き、特発性リンパ浮腫患者より採取した集合リンパ管、皮膚について、解析を行い、病態解明、各治療法の適応を検討する。結果について論文発表や学会発表を行う。
専用計算機による高密度恒星系の進化の研究

平成3年度牧野(東大)はHeggie(エディンバラ大)、McMillan(ドレクセル大)やAarseth(ケンブリッジ大)といっしょに専用計算機に適したソフトウエア開発に従事した。その結果、衝突系の重力多体シミュレーション用のHermite積分コードが完成した。このコードはこれまで広く使われてきたAarsethコードと比べて、単純で専用計算機に向いていること、時間ステップを2倍取れること、再出発が簡単にできることなど多くのメリットを持っている。McMillan(ドレクセル大)は東大に滞在し、専用計算機GRAPE-2Aに彼の球状星団の進化のシミュレーションコードを実装した。その際、稲垣(京大)もその作業を手伝った。Hunquist(カリフォルニア大)も東大に滞在し、彼のSPH(ならされた粒子)法コードを専用計算機GRAPE-3に実装した。どちらの計算コードも専用計算機GRAPEを使って十分に加速できることを確認した。平成4年度牧野(東大)、Hut(プリンストン高等研究所)、Hunquist(カリフォルニア大)はツリーコードを使った重力多体シミュレーションの誤差解析を組織的に行ない、そのシミュレーション結果に与える影響を調べた。この結果、ツリーコードは無衝突系の重力多体シミュレーションには十分な精度があることを確認した。また、Hut(プリンストン高等研究所)、McMillan(ドレクセル大)は球状星団に最初から含まれる連星系の星団の進化に与える影響を調べ、球状星団の重力熱力学的コアコラプスの後の進化に大きな影響があることがわかった。蜂巣(東大)は渦糸法による非圧縮性流体のシミュレーションを専用計算機GRAPEで大幅に加速できること示した。また、戎崎、牧野(東大)は大学院生の福重といっしょに専用計算機GRAPE-2Aを使って光の重力散乱実験を行ない、天体の重力散乱で3K宇宙背景放射の異方性が消えてしまう可能性があることを示した。さらに、戎崎、牧野(東大)は大学院生の船渡といっしょに専用計算機GRAPE-3を使って、銀河団の力学的進化のシミュレーションを行なった。この結果、銀河の外側のかなりの部分がはぎ取られてしまうことがわかった。平成5年度平成5年度は最終年度に当たるので8月下旬にHut(プリンストン高等研究所)、McMillan(ドレクセル大)、Teuben(メリ-ランド大)が研究成果を東京大学教養学部に持ち寄り、高密度恒星系の進化と専用計算機の開発についてワークショップを開いた。このワークショップには初年度の参加者である杉本、戎崎、牧野も参加した。このワークショップで球状星団や銀河中心領域などの高密度恒星系での恒星どうしの直接衝突の重要性が改めて確認された。ハッブル宇宙望遠鏡による球状星団の中心部の高分解能観測によって、中心部には恒星どうしの直接衝突でできたと思われる重たい星がたくさんあることがわかった。また、銀河中心にあるブラックホールは、恒星とブラックホールの衝突・合体によって成長したと考えられる。この認識を元に、自己重力流体シミュレーションの専用計算機の開発が必要であることが結論された。ワークショップの成果は成果報告書にまとめ、広く公表する予定である。蜂巣、上野(東大)と観山(国立天文台)は色々なSPH法のアルゴリズムを検討し、観山の大学院生である犬塚が開発したGudnov型SPH法が最も自己重力流体計算用の専用計算機に適していると結論した。東京大学教養学部と国立天文台理論部が共同で自己重力流体専用計算機の概念設計を行ない、専用計算機の試作を進めている。来年度はこの試作1号機で恒星の衝突のシミュレーションを行なう。また、その経験を元に専用LSIの試作を進めるつもりである。船渡(東大)は重力多体問題専用機HARP-2を使って、遠方の銀河の像が手前にある天体による重力散乱でどのように変形するか調べた。その結果、赤方偏移が1以上の銀河の明るさは平均して2倍近く暗くなるという結果を得た。これは遠くの銀河の統計的な性質を議論するとき、重力散乱の効果を考慮しなければならないことを示している。

また、戎崎、牧野(東大)は大学院生の福重といっしょに専用計算機GRAPE-2Aを使って光の重力散乱実験を行ない、天体の重力散乱で3K宇宙背景放射の異方性が消えてしまう可能性があることを示した。さらに、戎崎、牧野(東大)は大学院生の船渡といっしょに専用計算機GRAPE-3を使って、銀河団の力学的進化のシミュレーションを行なった。この結果、銀河の外側のかなりの部分がはぎ取られてしまうことがわかった。平成5年度平成5年度は最終年度に当たるので8月下旬にHut(プリンストン高等研究所)、McMillan(ドレクセル大)、Teuben(メリ-ランド大)が研究成果を東京大学教養学部に持ち寄り、高密度恒星系の進化と専用計算機の開発についてワークショップを開いた。このワークショップには初年度の参加者である杉本、戎崎、牧野も参加した。このワークショップで球状星団や銀河中心領域などの高密度恒星系での恒星どうしの直接衝突の重要性が改めて確認された。ハッブル宇宙望遠鏡による球状星団の中心部の高分解能観測によって、中心部には恒星どうしの直接衝突でできたと思われる重たい星がたくさんあることがわかった。また、銀河中心にあるブラックホールは、恒星とブラックホールの衝突・合体によって成長したと考えられる。この認識を元に、自己重力流体シミュレーションの専用計算機の開発が必要であることが結論された。ワークショップの成果は成果報告書にまとめ、広く公表する予定である。蜂巣、上野(東大)と観山(国立天文台)は色々なSPH法のアルゴリズムを検討し、観山の大学院生である犬塚が開発したGudnov型SPH法が最も自己重力流体計算用の専用計算機に適していると結論した。東京大学教養学部と国立天文台理論部が共同で自己重力流体専用計算機の概念設計を行ない、専用計算機の試作を進めている。来年度はこの試作1号機で恒星の衝突のシミュレーションを行なう。また、その経験を元に専用LSIの試作を進めるつもりである。船渡(東大)は重力多体問題専用機HARP-2を使って、遠方の銀河の像が手前にある天体による重力散乱でどのように変形するか調べた。その結果、赤方偏移が1以上の銀河の明るさは平均して2倍近く暗くなるという結果を得た。これは遠くの銀河の統計的な性質を議論するとき、重力散乱の効果を考慮しなければならないことを示している。牧野(東大)は研究分担者のD.C.Heggie(エジンバラ大)、S.McMillan(ドレクセル大)やS.Aarseth(ケンブリッジ大)といっしょにエジンバラ大において、重力多体問題専用計算機GRAPEのソフトウエア開発に従事した。その成果は牧野とAarsethの共著の論文にまとめられ、P.A.S.J.誌に受理された。S.McMillan(ドレクセル大)は東京大学教養学部に滞在し、専用計算機GRAPEー2Aに彼の球状星団の進化シミュレ-ションコ-ドを実装した。
ミツバチの高次行動を支配する遺伝子の単離と解析

ミツバチは社会性昆虫であり、ダンス言語などの他の昆虫には見られない多彩な社会行動を示す。しかしながら、ミツバチのように小さな脳を持つ昆虫が、どうしてこのような高次行動を示すことができるのかは全く不明である。ミツバチの脳では、感覚統合や記憶の中枢と考であるキノコ体が他の昆虫に比べて顕著に発達しており、キノコ体の機能の高度化が、その高度な社会行動の基盤となった可能性がある。本研究ではミツバチの高次行動を規定する遺伝子の候補として、キノコ体特異的に発現する遺伝子をDifferential display法にて検索し、以下の成果を得た。1、ミツバチのキノコ体を構成する2種の介在神経細胞(ケニヨン細胞)の内、大型ケニヨン細胞特異的に発現するM5遺伝子と、小型ケニヨン細胞特異的に発現するKs遺伝子を世界で初めて同定した。これらの遺伝子の転写産物はいずれも有意なORFを含まないことから、非翻訳性RNAとして機能する可能性が考えられた。また、これらの遺伝子の蛹の脳での発現解析から、ミツバチのキノコ体が、それぞれ固有な遺伝子を発現する2つの領野を含む、4つの繰返し構造からなることが示された。今後、これらの遺伝子産物の機能解析を通じて、ミツバチの高次行動を支えるキノコ体の内部構造と、その機能分担の分子メカニズムが解明されるものと期待される。2、さらに、ミツバチのケニヨン細胞では細胞内カルシウム情報伝達系に働く遺伝子群(IP3受容体、CaMKII、PKCの遺伝子)の発現増強が起きていることを示した。ショウジョウバエでは、これらの遺伝子はともに脳皮質に一様に発現すると報告されている。神経細胞におけるカルシウム情報伝達系は、多くの動物種で記憶や学習の成立に重要と考えられているが、ミツバチでは、カルシウム情報伝達系の機能が亢進することにより、キノコ体のシナプスの可塑性が増強している可能性が指摘できる。昆虫の脳機能と行動の系統進化といった観点から、非常に興味深い知見であると思われる。ハチやアリなどの膜翅目の昆虫の多くは社会性を持ち、昆虫の中でも最も成功した種族とされている。特にミツバチは8の字ダンスで花の位置を教え合うなど高度な行動を示すが、その分子的基盤については全く不明である。さて、ミツバチの脳では記憶や学習の高次中枢と考えられているキノコ体が格段に発達しており、その機能の高度化が、ミツバチが高次行動を獲得した大きな原因となった可能性がある。本研究では、ミツバチの高次行動を支配する脳の神経回路と、そこに働く分子機構を解明する目的で、キノコ体の領野特異的に発現する遺伝子をDifferential display法により探索し、世界で初めて以下の3種の遺伝子を単離した。(1)大型Kenyon細胞特異的なM5遺伝子;ミツバチのキノコ体を構成する介在神経細胞であるKenyon細胞は、細胞体の大きさから大型と小形の2種類に分類され、それぞれ異なる領野を形成する。M5遺伝子は大型Kenyon細胞特異的に発現し、その蛹期における発現解析からミツバチのキノコ体の成立過程を初めて明らかにした。(2)小型Kenyon細胞特異的なKs遺伝子;小型Kenyon細胞は、種々の感覚信号を連絡、統合する領野を形成し、特に8字ダンスなどの行動の成立には重要であると考えられる。この遺伝子の9.5kbpにおよぶcDNAを同定した結果、Ks遺伝子の転写産物は蛋白をコードせず、RNAとして機能する可能性が示唆された。(3)IP3受容体(IP3R)

遺伝子;ミツバチではIP3R遺伝子の発現がキノコ体で亢進していることが判明した。ショウジョウバエではIP3R遺伝子は脳全体に発現することから、ミツバチのキノコ体の機能の高度化が、情報処理能力の亢進という、質的変化を伴うことが示唆された。以上の知見は、申請者らのグループが初めて明らかにしたものであり、その学術的価値は極めて高い。現在、ミツバチの脳の分子的解剖は世界でも申請者らのグループだけが行っており、その研究成果は大きな波及効果を持つと期待される。ミツバチは社会性昆虫であり、ダンス言語などの他の昆虫には見られない多彩な社会行動を示す。しかしながら、ミツバチのように小さな脳を持つ昆虫が、どうしてこのような高次行動を示すことができるのかは全く不明である。ミツバチの脳では、感覚統合や記憶の中枢と考であるキノコ体が他の昆虫に比べて顕著に発達しており、キノコ体の機能の高度化が、その高度な社会行動の基盤となった可能性がある。本研究では、ミツバチの高次行動を規定する遺伝子の候補として、キノコ体特異的に発現する遺伝子をDifferential display法にて検索し、以下の成果を得た。1、ミツバチのキノコ体を構成する2種の介在神経細胞(ケニヨン細胞)のうち、大型ケニヨン細胞特異的に発現するM5遺伝子と、小型ケニヨン細胞特異的に発現するKs遺伝子を世界で初めて同定した。また、これらの遺伝子の蛹の脳での発現解析から、ミツバチのキノコ体の内部構造を解析した。これらの遺伝子の転写産物はともに、有意なORFを含まないことから、非翻訳性RNAとして機能する可能性がある。今後、これらの遺伝子産物の機能解析を通じミツバチの高次行動を支えるキノコ体の機能が解明されるものと期待される。2、さらに、ミツバチのケニヨン細胞ではCa^<2+>情報伝達系に関わる遺伝子群(IP3受容体、CaMKII、PKCの遺伝子)の発現増強が起きていることを示した。ショウジョウバエでは、これらの遺伝子はともに脳皮質に一様に発現すると報告されている。神経細胞におけるCa^<2+>情報伝達系は、多くの動物種で、記憶や学習の成立に重要と考えられているが、ミツバチのキノコ体ではCa^<2+>情報伝達系の機能が亢進することにより、シナプス可塑性が増強している可能性が指摘できる。昆虫の脳の機能と行動の系統進化といった観点からも非常に興味深い知見と思われる。
肺転移モデルにおけるアンジオテンシンＩＩ受容体サブタイプの転移抑制効果機序の解明

Angiotensin II(AngII)が腫瘍の増殖、転移に関与している報告があるが、詳細な機序は不明である。我々は以下の実験にてその機序について検討した。WTはAngII投与すると血小板の活性化を促進するが、AT1a-/-では認められなかった。P-selectin中和抗体投与群は、WTでは腫瘍の転移形成の抑制を認めたが、AT1a-/-では認められなかった。更に、WTでは血小板由来のSDF-1及びVEGFの中和抗体を投与すると腫瘍の転移は抑制されたがAT1a-/-では認められなかった。これらの結果より、血小板の活性化によりAT1aシグナルが腫瘍の転移を促進する事が示唆された。血小板にはVEGFやSDF-1などの血管新生促進因子が含まれ、それが腫瘍の転移形成に関与している。また腫瘍転移形成にあたりは血小板の活性化は不可欠であり、その時、血小板でのp-selectinの発現の増強及び末梢血液中のsoluble-p-selectin濃度の上昇を認めた(Blood 2000)。今回腫瘍転移巣形成時における血小板の活性化にAT1aが関与しているか否か検討を行った。A.末梢血液中のsoluble p-selectin濃度の比較検討:腫瘍肺転移モデル作成後1,3,5,7,14日に採血し、ELISAを用いてsoluble p-selectin濃度について比較検討を行った。野生型マウスと比較しAT1a-/-では有意に低下を認めた。B血小板のp-selectinの発現の比較検討:腫瘍肺転移モデル作成後1,3,5,7,14日に採血しフローサイトメトリーを用いて活性化された血小板(CD41とCD62P)の発現について比較検討を行った。腫瘍細胞静脈注射後一日目で野生型マウスと比較しAT1a-/-では有意に低下を認めたC.血中のVEGFR1+造血前駆細胞の発現の測定:AT1aシグナリングが骨髄組織のストローマ因子を活性化させることにより骨髄組織から、VEGFR1+造血前駆細胞の動員を促し転移の形成の増強を促している可能性があると考えられるためBと同様にフローサイトメトリーを用いて末梢血液中のVEGFR1陽性細胞の発現について比較検討した。腫瘍細胞静脈注射後七日目で野生型マウスと比較しAT1a-/-では有意に低下を認めた降血圧薬として使用されているアンギオテンシンII変換阻害薬が癌の発症するリスクを低下する報告があるが長年その詳細なメカニズムは不明であった。以前我々は、AngIIの受容体であるAngiotensin type 1受容体(AT1)のサブタイプであるAT1aが血管新生促進因子の1つである血管内皮増殖因子(Vascular Endothelial Growth Factor=VEGF)を誘導し、腫瘍血管新生を増強することを報告した(Carcinogenesis 2005)。今回、腫瘍肺転移の際にもAT1aが関与しているか否か検討した。AT1aは、血小板、血管平滑筋などに発現している。最近、癌の浸潤・転移に対する微小環境の役割が注目され、原発巣と同様に癌細胞と転移組織との相互作用の結果、動員された血小板、骨髄細胞が重要な役割を担っていると考えられている。野生型マウス(以下WT),及びAI1a受容体欠損マウス(以下AT1aKO)から血小板を描出し、Angiotensinを添加すると血小板の活性化のマーカーであるP-selectinの発現がAT1aKOで有意に低下を認め更に、腫瘍細胞(B16F1)静脈注射後4週で、AT1aKOでは肺表面のコロニー形成の低下を認め、また血中の血小板におけるP-selectinの発現の低下を認めた。更にP-selectin中和抗体を投与すると、WTでは肺の転移は抑制を認めたが、AT1aKOでは抑制を認めなかった。この事から肺の転移形成にあたり、血小板の活性化が必須で、それはAT1asignalingに依存しいている事が考えられた。腫瘍転移形成に関与する血液幹細胞(CXCR4+VEGFR1+)の末梢血液及び肺組織の集積を検討したところ、AT1aKOで低下を認めた。以上の結果から、AT1a signalingによる腫瘍転移制御は血小板の活性化だけでなく、CXCR4+VEGFR1+細胞の動員にも関与している事が示唆された。上記の事項はAm J Pathol. 182(2):553-64 2013,アメリカ胸部疾患学会ミニシンポジストとして発表,第10回森村豊明会奨励賞受賞(2013)に至った。

これらの結果より、血小板の活性化によりAT1aシグナルが腫瘍の転移を促進する事が示唆された。平成23年度はAT1a+/+とAT1a-/-との骨髄機能回復能力効果の相違について検討した。A. AT1a+/+とAT1a-/-との骨髄機能回復能力効果の相違の検討:5-FUを腹腔内注射し骨髄機能の回復能力について比較検討を行いAT1a-/-はAT1a+/+と比較し骨髄組織の回復力の遅延を認めた。投与後1,3,7,14,21日に末梢血液中の血小板数と血清中のSCF, pro MMP-9, SDF-1をELISA kitを用いて測定したところ、AT1a-/-はAT1a+/+と比較し有意に濃度の抑制を認めた。2.腫瘍肺転移モデルを用いた検討:A. AT1a+/+とAT1a-/-との肺表面転移巣の形成効果及び生存率の検討: AT1a+/+及びAT1a-/で3.0X105個/mlの悪性黒色腫細胞(B16F1)を尾静脈より静脈注射し、肺転移モデルを作成後2週間に、肺を摘出した後,肺表面の腫瘍コロニー数を実態顕微鏡でカウントした。また、生存率も検討した。腫瘍転移数はAT1a-/-はAT1a+/+と比較し有意に低下を認めた、また生存率はAT1a+/+は3週間でほとんど死亡するのに対し、AT1a-/-の死亡率は20%であった。B.血小板数、SCF, pro-MMP9, SDF-1値の経時的変化の比較検討:腫瘍細胞静注1,3,7,14日に継時的に血小板数と血清中のSCF, pro MMP-9, VEGF, SDF-1をELISA kitを用いて測定するとAT1a-/-はAT1a+/+と比較し有意にこれらの低下を認めた。また7日と14日目に免疫組織化学による骨髄組織中の巨核球数について比較検討も同様でとAT1a-/-はAT1a+/+と比較し有意に低下を認めた。今回の実験からAT1aシグナリングが、骨髄作用、特に血小板産生に関与し、それが腫瘍転移形成と関与がある可能性が示唆された。去年、結果をまとめ下記の雑誌に採択された当研究は申請する以前から予備実験を繰り返し行ってきたため、今現在、進行は順調である。今後、血小板の表面マーカーの探索、フローサイトメトリーを行う予定なので、抗体の特異度など難しい局面が予想される。血小板にはVEGFやSDF-1などの血管新生促進因子が含まれ、それが腫瘍の転移形成に関与している。また腫瘍転移形成にあたりは血小板の活性化は不可欠であり、その時、血小板でのp-selectinの発現の増強及び末梢血液中のsoluble-p-selectin濃度の上昇を認める。今後、腫瘍転移巣形成時における血小板の活性化にAT1aが関与しているか否かについて検討する。詳細は以下にしるす。A.末梢血液中のsoluble p-selectin濃度の比較検討B血小板のp-selectinの発現の比較検討(天野、江島が担当)C.血中のVEGFR1+造血前駆細胞の発現の測定(天野、江島が担当)またAT1aシグナリングが骨髄組織のストローマ因子を活性化させることにより骨髄組織から、VEGFR1+造血前駆細胞の動員を促し転移の形成の増強を促している可能性があると考えられるためBと同様にフローサイトメトリーを用いて末梢血液中のVEGFR1陽性細胞の発現について比較検討する。