hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
脳機能画像手法に基づく触の錯覚の検討と解離性離隔の臨床治療への実証的試み

本研究は,心理学,医学,工学,哲学が連携し,感覚間統合という現象から解離と呼ばれる精神病理の治療可能性までを研究対象としたトランスレーショナル研究である.精神医学領域では,統合失調症の一症状として,自己同一性を喪失する解離という精神病理が報告されており,自己意識に関わる「触知覚」の基本原理が深く関与している可能性がある.認知科学の中で蓄積されてきた感覚間統合の知見を元に,解離の精神病理学的メカニズムを脳機能画像法などの神経科学的手法を用いて解明し,最終的に臨床応用に役立てることを目的としている.本年度では,触感覚の錯覚が視覚的錯覚と連鎖的に生じるラバーハンド(RH)イリュージョン学習を3日間連続で行い,感覚間統合の錯覚学習における自己所有感と位置感覚の変容プロセスを検討した.その結果,全日において,学習後にRHへの自己所有感の増加および位置感覚のドリフトが認められ,従来のRHイリュージョンを再現する結果となったが,自己所有感のデフォルト評定値は日毎に低下し,位置感覚のデフォルト評定値は日毎に増加した.矛盾した感覚を引き起こす仮想現実的な環境では,RHを自身の手だと受容することは拒みながらも,位置感覚は視覚的RHに依存しながら変容していくことが示唆され,少なくとも,自己所有感と位置感覚の長期的学習メカニズムに異なる神経可塑性プロセスが関与していると考えられる(論文投稿中).現在は脳機能画像分析法(functional Magnetic Resonance Imaging: fMRI)を用いた実験を開始し,分析中である.また本プロジェクトの着想に至るもととなった研究を論文化した.翌年度、交付申請を辞退するため、記入しない。翌年度、交付申請を辞退するため、記入しない。本プロジェクトは、基礎心理学、医学、工学、哲学が連携し、「触知覚」という心理学的現象から「解離」と呼ばれる精神病理の治療可能性までを研究対象としたトランスレーショナル研究である.「触知覚」は痛みの認識という視点を含め、自己と他者の境界線の問題として多いに議論がなされ、自意識との関係で現代哲学の中心的命題の位置にある.一方、精神医学領域では、不安障害の心的外傷後ストレス障害(PTSD)の一症状として、防御のため自己同一性を喪失する「解離」という精神病理が報告されており、自己意識に関わる「触知覚」の基本原理が深く関与している可能性がある。本プロジェクトは、認知科学の中で蓄積されてきた触知覚の知見を元に、「解離」の精神病理学的メカニズムを脳機能画像法などの神経科学的手法を用いて解明し、最終的に臨床応用に役立てることを目的としている.初年度では、健常者における痛みの触知覚メカニズムを検討するために、視触覚間の感覚間統合における心理物理学的実験をラバーハンドイリュージョンパラダイムによって実施した.その結果、参加者に提示する視覚情報を操作することによって痛みの知覚強度が変化することを明らかにした.現在は論文執筆に時間を割いている.さらに次年度以降で行う脳機能画像手法(functional Magnetic Resonance Imaging : fMRI)用の触刺激装置を空気圧式で作製し(非鉄性素材)、実験の準備を整えた。また本プロジェクトの着想に至るもととなった研究が論文化された。本研究は,心理学,医学,工学,哲学が連携し,感覚間統合という現象から解離と呼ばれる精神病理の治療可能性までを研究対象としたトランスレーショナル研究である.精神医学領域では,統合失調症の一症状として,自己同一性を喪失する解離という精神病理が報告されており,自己意識に関わる「触知覚」の基本原理が深く関与している可能性がある.認知科学の中で蓄積されてきた感覚間統合の知見を元に,解離の精神病理学的メカニズムを脳機能画像法などの神経科学的手法を用いて解明し,最終的に臨床応用に役立てることを目的としている.本年度では,触感覚の錯覚が視覚的錯覚と連鎖的に生じるラバーハンド(RH)イリュージョン学習を3日間連続で行い,感覚間統合の錯覚学習における自己所有感と位置感覚の変容プロセスを検討した.その結果,全日において,学習後にRHへの自己所有感の増加および位置感覚のドリフトが認められ,従来のRHイリュージョンを再現する結果となったが,自己所有感のデフォルト評定値は日毎に低下し,位置感覚のデフォルト評定値は日毎に増加した.矛盾した感覚を引き起こす仮想現実的な環境では,RHを自身の手だと受容することは拒みながらも,位置感覚は視覚的RHに依存しながら変容していくことが示唆され,少なくとも,自己所有感と位置感覚の長期的学習メカニズムに異なる神経可塑性プロセスが関与していると考えられる(論文投稿中).現在は脳機能画像分析法(functional Magnetic Resonance Imaging: fMRI)を用いた実験を開始し,分析中である.また本プロジェクトの着想に至るもととなった研究を論文化した.計画書に記載した健常者の実験を終え、fMRI実験の準備も整えた.翌年度、交付申請を辞退するため、記入しない。当面は平成23年度に取得した実験データを論文化することに集中し、同時にfMRI実験のデータ取得を開始する.また平成25年度に予定している解離性患者のデータ取得のために病院との連携を高め、参加者を確保をしていく.翌年度、交付申請を辞退するため、記入しない。
歯科・口腔外科領域における周術期呼吸管理の基礎および臨床的研究

歯科・口腔外科領域の手術の顎間固定操作と呼吸機能、特に鼻呼吸-口呼吸の変換に着目し、口腔外科領域の周術期の呼吸管理上の問題点について検討を加えた。基礎的研究1.換気測定用マスク(専用マスク)の試作を行った。2.顎間固定によって口呼吸は消失し、呼吸経路は全例鼻呼吸のみとなった。また、顎間固定前の鼻および口呼吸から固定後の鼻呼吸のみへの移行がみられた。3.顎間固定後の口呼吸の消失は開口制限によるものと考えられる。臨床的研究1.手術症例における顎間固定後の呼吸経路は鼻呼吸を主とするものが29例中27例(93.1%)であった。2.顎間固定後に口呼吸が消失症例がみられた。3.顎間固定前、鼻呼吸および口呼吸の両者を呼吸経路にしていた症例では、術中の顎間固定によって全身麻酔後鼻呼吸のみとなり、TVおよびMVの減少とEtCO2の増加が認められた。4.鼻呼吸経路の閉塞によって口呼吸経路への移行が認められ、鼻呼吸経路の解放により再び鼻呼吸が再開するが、同時に口呼吸も継続して観察された。しかし、SpO2およびPaCO2の変動から術直後の鼻閉に関しては注意が必要である。5.術前に口呼吸が関与している場合、顎間固定後鼻呼吸経路の遮断によって、ある程度口呼吸が補填できるもののRCおよびAbdの呼吸運動は不規則、振幅の増大とAbdへの依存度が大きくなった。また、主呼吸経路を閉塞した場合、胸郭・腹壁運動の増大、不規則な呼吸状態を示し、気道閉塞(奇異呼吸)様の変化が認められた。6.慢性心不全を合併している患者の診療姿勢と呼吸・循環におよぼす影響について観察した。その結果、起座位では正常なカプノグラムが水平位では呼吸平坦相に複数の乱れが生じ、SpO2の低下も認められた。診療姿勢が予備能力の少ない心疾患患者では重要であり、画一的な歯科診療中の水平位に対しては注意を喚起したい。歯科口腔外科領域の手術は換言すると上気道の手術であり麻酔野と手術野とが重複し気道管理の面から種々の制約を受けることが少なくない。平成7年度は手術中に行われる顎間固定が呼吸経路に及ぼす影響について観察を行った。〈対象および測定方法〉有意識下健康成人18名(健康成人群)および全身麻酔下にて術中顎間固定を行った患者10名を対象とした。両群は顎間固定前の呼吸経路により鼻呼吸のみの群(N群)、および鼻+口呼吸群(NO群)に分類できた。顎間固定前後における口呼吸および鼻呼吸の1回換気量(V_T)、分時換気量(MV)、終末呼気炭酸ガス濃度(ETCO_2)および経皮的酸素飽和度(SpO_2)の測定を行った。〈結果および考察〉N群:健康成人群および患者群ともにV_T、MV、SpO_2およびETCO_2のいずれかのパラメーターにおいても顎間固定前後において有意な変動を認めなかった。NO群:健康成人群では顎間固定前、鼻呼吸経路でV_T438.6ml、MV5.7l、口呼吸経路でV_T216.6ml、MV2.7l、顎間固定後には鼻呼吸のみとなりV_T597.6ml、MV8.0lとなり鼻呼吸部分の換気量が増加したが、固定前と比較して総換気量、SpO_2およびETCO_2は変化を認めなかった。

患者群では顎間固定前、鼻呼吸経路でV_T265.7ml、MV4.8l、口呼吸経路でV_T205.8ml、MV3.1lに対して、固定後は鼻呼吸のみとなりV_T319.7ml、MV5.1lと鼻呼吸経路部分の換気量は増加したが総換気量は固定前と比較して減少傾向を示した。SpO_2は固定前後において変動を示さなかった。術中の顎間固定操作は全身麻酔後の呼吸経路に影響を及ぼし、特に口呼吸を抑制することからその適応については慎重を要すると考えられた。歯科・口腔外科領域の手術の顎間固定操作と呼吸機能、特に鼻呼吸-変換に着目し、口腔外科領域の周術期の呼吸管理上の問題点について検討を加えた。基礎的研究1.換気測定用マスク(専用マスク)の試作を行った。2.顎間固定によって口呼吸は消失し、呼吸経路は全例鼻呼吸のみとなった。また、顎間固定前の鼻および口呼吸から固定後の鼻呼吸のみへの移行がみられた。3.顎間固定後の口呼吸の消失は開口制限によるものと考えられる。臨床的研究1.手術症例における顎間固定後の呼吸経路は鼻呼吸を主とするものが29例中27例(93.1%)であった。2.顎間固定後に口呼吸が消失症例がみられた。3.顎間固定前、鼻呼吸および口呼吸の両者を呼吸経路にしていた症例では、術中の顎間固定によって全身麻酔後鼻呼吸のみとなり、TVおよびMVの減少とEtCO2の増加が認められた。4.鼻呼吸経路の閉塞によって口呼吸経路への移行が認められ、鼻呼吸経路の解放により再び鼻呼吸が再開するが、同時に口呼吸も継続して観察された。しかし、SpO2およびPaCO2の変動から術直後の鼻閉に関しては注意が必要である。5.術前に口呼吸が関与している場合、顎間固定後鼻呼吸経路の遮断によって、ある程度口呼吸が補填できるもののRCおよびAbdの呼吸運動は不規則、振幅の増大とAbdへの依存度が大きくなった。また、主呼吸経路を閉塞した場合、胸郭・腹壁運動の増大、不規則な呼吸状態を示し、気道閉塞(奇異呼吸)様の変化が認められた。6.慢性心不全を合併している患者の診療姿勢と呼吸・循環におよぼす影響について観察した。その結果、起座位では正常なカプノグラムが水平位では吸気平坦相に複数の乱れが生じ、SpO2の低下も認められた。診療姿勢が予備能力の少ない心疾患患者では重要であり、画一的な歯科診療中の水平位に対しては注意を喚起したい。
ビスマスの特色を活かした含ヘテロ機能性分子の設計と機能特性

カルボキシル基,あるいはアミド基を持つトリアリールビスムタンは,固体状態においてこれら官能基間の分子間水素結合により8分子が立方体状に配置した自己集合系を構築すること,さらに,その際生じる空孔はゲスト分子を包接するのに十分な大きさを持つことが期待される。本年度は,このような官能基を有するトリアリールビスムタンの合成と単離を目指して研究を行って来た。その結果,4-ヨード安息香酸エチルより誘導されるGrignard試薬を三塩化ビスマスと反応させることで,エチルエステル基を有するトリアリールビスムタンの合成することができた。これをアルカリ加水分解することで,目的とするカルボキシル基を有するトリアリールビスムタンの合成に成功した。今後,単結晶を調製し,X線構造解析による結晶構造の解明を行う予定である。また,従来合成ができなかった,あるいは合成が困難であったニトロ基,シアノ基,ホルミル基のような電子求引性基を有するトリアリールビスムタンの合成法も同時に確立することができた。これにより,capto-dative置換基を有する種々のトリアリールビスムタンが合成可能となった。現在,紫外/可視吸収スペクトルにより電子状態を検討中である。さらに,ジフェニルスルホンを骨格とするアリールオキシビスムタンでは,4-メトキシフェノールを水素結合により取り込んだ包接現象が観測された。これらの成果の一部は,既に学術論文に掲載されることが決まっている。
プロスタサイクリン制御系の解明

1.HDLで制御されている血中プロスタサイクリン半減期について、心筋梗塞、不安定狭心症、狭心症、健常人について検討した。血清APO AI、血清プロスタサイクリン半減期は虚血性心疾患群において有意に低く又この半減期はHPL表面のApo AIとよい相関を示した。2.プロスタサイクリンは平滑筋細胞においてコルステリルエステル水解酵素の活性を上昇させて細胞内のコレステリルエステルを分解する作用を持っている。最近我々はプロスタサイクリンの血中での半減期がHDLにより延長することを見出した。HDLは抗粥状動脈硬化作用を持つといわれているがそのメカニズムについては不明である。我々はHDLがプロスタサイクリンを安定化させることによりコレステリルエステルの分解を促進し抗粥状硬化作用を行なっている可能性について検討した。プロスタサイクリンとHDLを培養細胞と共にインキュベ-ションした後、酵素活性を測定するために酵素を抽出した。HDLは有意にプロブタサイクリンによる酵素活性の上昇をさらに刺激していることが判明した。このHDLの作用はプロスタサイクリンの非存在下ではみられなかった。又細胞内の上昇したcyclic Aupの濃度はHDLによりより長く持続した。細胞内cyclie Aupと水解酵素の活性は2'5'-dideoxyadenosineで阻害された。これらのことからHDLはプロスタサイクリンの安定性を増強させることによってコレステリルエステル水解酵素の活性を強めていることが結論づけられた。
新しいヘパリン親和性成長因子、プレイオトロフィンの神経栄養効果の解析

我々は生後1過性に発熱が増強する神経突起伸長作用を有する新しい成長因子、プレイオトロフィン(PTN)に対する特異的抗体の作成をまず行なった。方法としてはPTNcDNAを大腸菌融合蛋白ベクターに組みこみ発現させそれを家兎に免疫して抗体作成を行なった。またこれと併行して、PTNのN未14個のペプチドを合成これに対する抗体を作成した。ウエスタンブロットの結果、両者共に約18kaの位置にバンドが確認されたので、ひき続いて、合成ペプチドをカラムに不動化し抗体の精製を行った。結果として生後1週ラット脳の粗抽検出し得た。次にこの抗体が組織におけるPTN蛋白局在を検出しうるか否かを免疫組織化学的手法を用いて検討した所、胎生期ラット脳より染色性が認められ、かつ生後12週のラット脳で広範に強い免疫陽性反応が観察された。この反応は成熟ラット脳では低下しており、我々が以前におこなったPTNmRNAの経時変化および組織分布とよく一致した。また微細構造レベルではPTN蛋白は主に細胞膜に付随した形で認められ、本因子が細胞外基質分子として神経突起伸長などを促す可能性が考えられた。また併行しておこなった胚性癌細胞の神経分化モデルにおけるPTNの発現解析でも、本因子のmRNA、蛋白発現は神経突起伸長の程度とよく相関し、また局在が神経細胞様細胞に認められたととから本因子がオートクラインあるいはパラクライン性に神経突起伸長に働くことが示唆された。この系においてアンチセンス法によりPTN発現を抑制したところ、コントロールに比して有意に神経突起伸長が抑制され、この結果は上記の仮説を強く支持するものと考える。
微小素子を搭載した高機能SPM用プローブの開発

走査型プローブ顕微鏡(SPM)技術はプローブ先端近傍と試料表面との間に働く様々な相互作用を検出し、相互作用の変化を高い空間分解能でマッピングできる技術であり、ナノテクノロジの基盤技術の一つである。本研究では、MEMS技術と強磁性体多層膜作製技術を融合し、微小素子を搭載した高機能SPM用プローブを開発し、新しいSPM技術の研究・開発を推進することを目指した。磁気力顕微鏡などSPM技術を応用した磁気的相互作用の高分解能検出は、磁気記録媒体やヘッドの評価など磁気工学に活用されているところであるが、本研究では特に、測定値の定量性、高速応答性が得られる磁気顕微鏡を実現するために、磁気抵抗効果素子を搭載したSPM用カンチレバーの設計・作製ならびに評価を試みた。また、磁気抵抗効果素子の変わりにカーボンナノチューブを用いた電界効果トランジスタを搭載したカンチレバーの作製し、高感度電界検出用SPMプローブの開発も試みた。はじめに、異方性磁気抵抗効果素子を窒素化シリコン上に作製し、外部磁場印加機構を取り付けたSPM装置により、試料からの漏洩磁場の定量測定を可能にした。さらに、4端子型の電極構造を作りこみ、S/N比を向上とカンチレバーのたわみにより発生する電歪効果の影響の低減を試み、これに成功した。また、外部磁場印加機構を必要としないセンサを実現するためにトップスピンバルブ構造に変更し、これを実現するための成膜条件等の詳細な研究を行い、作製後の熱サイクルでも特性劣化の少ない磁場バイアスを実現することのできる交換結合薄膜の作製条件を見出し、これによりスピンバルブつきカンチレバーの作製を試みた。微小磁気センサ素子つきSPM用プローブの特性評価をガーネット薄膜表面観察および微細加工電極パターン上に発生する漏洩磁場計測より行った。この微小素子を搭載したSPM用プローブ作製技術を応用し、単層カーボンナノチューブを利用した電界効果トランジスタ素子を磁気抵抗効果素子に換えてカンチレバー上に作製することを試みた。また研究ではSPMの微小相互作用検出に関する研究も行った。フォトリソグラフィーおよび電子線リソグラフィー等の微細加工技術を用い、微小磁気抵抗効果素子を搭載したSPM用プローブの試作を行った。ウェットエッチング時に素子薄膜が侵食を受け感度が低下する等の問題があったが、ドライエッチングとの組み合わせを行い、プローブ作製プロセスを最適化することにより、これを解決した。また素子の信号対雑音比を向上し、プローブ表面にパターニングした信号引き出し配線の抵抗成分の寄与を低減するために、4端子測定が可能な信号引き出し配線配置の設計を行い、これを製作した。プローブ上に試作した磁気抵抗効果素子の検出性能についてMR曲線の測定などによる評価を行った。MR素子のサイズをさらに小さくするために、電子線リソグラフィーの実験条件に関する最適化を行い、これの試作を行った。性能評価に関しては次年度実施する予定である。MR素子として検出感度の高いスピンバルブ膜等の使用を可能にするために購入したマルチターゲットスパッタ装置の単層膜の成膜実験条件の最適化を行った。作成しの単層薄膜の膜構造についてはSTM/AFMを用い、その磁気特性についてはSQUIDによる磁化測定を行い評価した。多層膜センサの作成は次年度実施する予定である。ICテスタとしての実験準備として、電子線リソグラフィーにより作製したくし形電極パターンを用い、金配線からの誘導磁界の測定を行い、現時点で作製したSMRM用センサプローブの検出感度等の定量評価を行った。

1.昨年度試作を行った4端子タイプの磁気抵抗効果センサプローブ作製時の歩留まりを向上するために、更なる作製プロセスの改良を行った。新しい作製プロセスでは80%以上の歩留まりを達成できた。昨年度の作製プロセスにおいて電極薄膜の応力でプローブ全体が若干曲がっていた問題については、電極薄膜の薄膜材料と膜厚の最適化を行うことによってこれを解決した。2.微少電極パターンに流した電流が生じる静磁場の測定から4端子タイプのプローブの基本特性を評価した。また、磁気抵抗効果素子のアスペクト比を変えたものの特性評価を行った。さらに、ガーネット薄膜の迷路磁区を観察することで、センサプローブの面内分解能の評価を行った。これにより、薄膜のサイズと同程度の分解能が得られることを確認した。3.マルチターゲットスパッタの成膜条件出しを行った。この装置を用いて磁気抵抗効果素子薄膜を作製し、作製したセンサプローブの特性評価を行った。また、これまでに用いていたAMR素子に替え、スピンバルブ素子を磁気抵抗効果素子とするために、この成膜装置を用いて、交換バイアスを実現するための反強磁性体薄膜および強磁性体薄膜の成膜条件出しを行った。作製した素子表面のカー効果測定により交換バイアスが実現できていることを確認した。最終年度では交換バイアス膜付きに磁気抵抗効果素子を搭載したプローブを作製するとともに、その時間応答特性の詳細について評価する。MEMS技術と強磁性多層膜作製技術を融合し、4端子測定型の磁気抵抗効果素子を搭載したSPM用カンチレバーの作製方法を確立した。歩留まりの向上、薄膜作製時の応力の緩和など、微小素子を搭載したSPMプローブの作製必要とされるプロセスに関わる問題点を解決し、諸作製条件の最適化をした。初期の外部磁場印加型のAMR磁気抵抗交差素子に代え、外部磁場の印加の必要がないスピンバルブ型磁気抵抗効果素子の搭載方法について検討を行った。とくに、窒化薄膜上で交換バイアスを実現するために、トップスピンバルブ構造とし、強磁性層、非磁性層、反強磁性層の薄膜作製条件を検討を繰り返し、作成後の熱サイクルでも特性劣化の少ない交換バイアスの実現可能な交換結合薄膜の作製条件を見出した。これを用いて、ガーネット薄膜の表面軸構造の観察、微細加工を施した強磁性薄膜表面の磁区構造、微細電極パターンに流れる電流が生じさせる磁界の測定を試みた。窒化薄膜上で適正な交換バイアスを実現するための薄膜作製条件出しに当初計画より時間を労したため、時間応答測定の結果については今後公表する予定である。われわれが調査した範囲では、窒化薄膜上に適正な交換バイアスを実現したスピンバルブを作製した例は報告されておらず、本研究がそれを実現した最初の例であり、これにより多数個の感度方向の異なるスピンバルブセンサーを同一プローブ上に配置するなど高機能SPM用プローブの開発が可能となるものである。
Bacillus sp.由来ウリカーゼの反応機構に関する構造生物学的研究

Bacillus sp.由来ウリカーゼについてX線結晶構造解析を行った。大型放射光施設Spring-8のビームラインBL41XUにおいてX線回折実験を実施した結果、本結晶の空間群はP21212、格子定数はa=133.8Å, b=144.6Å, c=78.9Åであり、非対称単位中に含まれるサブユニットの数は4分子と求められた。A. flavus UOXの3次元構造モデルの座標データ(PDB code : 1UOX)を用いて分子置換法による初期位相の計算を行い、さらに溶媒領域の平滑化、及び非結晶学的対称を利用した平均化の手法を駆使して位相の改良を行い、3次元構造モデルの精密化を行った。その結果、2.2Å分解能においてR値=18%、R_<free>値=22%のモデルを得た(PDB code : 1J2G)。A.flavus UOXと主鎖構造を比較した結果、A. flavus UOXでは4量体形成に関与すると考えられてきたループ領域に大きな主鎖構造の変化が認められた。このループ領域は2回軸で関係づけられる2つのUOX分子間の接触に関与していた。また、リガンドとして添加した8-azaxanthineの結合はA. flavus UOXのそれとは異なっていることが明らかにし、従来考えられてきたArgによる反応中間体の安定化では反応機構が説明できないことが分かった。また、酸素結合部位を探ることを目的としてXeによる同型置換体結晶の作成について検討を行ったが、本酵素結晶は塩濃度の変化に非常に敏感であり、Xeガス封入によって結晶が容易に壊れてしまった。そこで、塩濃度が結晶化に与える影響を検討した結果、本酵素の熱安定性が塩の添加で上昇すること、SO^<42->イオンが先に述べたループに結合することが明らかとなった。一重項状態である尿酸を基質として三重項ラジカルである酸素を用いた酸化反応を触媒するにもかかわらずウリカーゼ(UOX)は補酵素を有しておらず、その反応機構については不明な点が多い。本研究は、原核生物Bacillus sp.由来UOXを用いて本酵素の3次元構造を明らかにし、その反応機構を解明しようとするものである。本年度は、リガンドフリーのnative酵素とinhibitor複合体の結晶を得ることを目的として実験を行った。補酵素を持たない特異な酸化酵素であるウリカーゼ(UOX)の反応機構については不明な点が多い。本研究では、原核生物Bacillus Sp.由来UOXのX線結晶構造解析を行い3次元構造を明らかにするとともに、その反応機構について考察した。Hanging Drop蒸気拡散法によりUOX結晶化を行い、0.5×0.3×0.03μmの板状結晶を得た。Spring-8のビームラインBL41XUにおいてX線回折測定を行った結果、分解能42.6-2.7Åの範囲の回折強度データが収集できた。結晶は斜方晶系に属し、結晶学的データとして空間群P2_12_12、格子定数a=133.7Å,b=144.6Å,c=78.9Å,α=β=γ=90°を得た。Aspergillusflavus由来UOXの3次元構造モデルを用いて分子置換法による位相決定を行い、初期構造モデルを得た。モデルの精密化による位相改良を行い、最終的な3次元構造モデルが得られた時点で、,R値19.8%(R_<free>値24.8%)となった。A.

flavus由来UOXとの主鎖構造の比較を行ったところ、活性中心部分やT-foldモチーフからなるβバレル部分に大きな違いはなかったが、4量体形成に関わるストランドまたはループ構造に大きな違いがあることが明らかになった。この部位はリガンド結合時のドメイン間の動きに影響を与えることが示唆され、また両者の熱安定性の違いにも寄与すると考えられた。活性中心部分の構造について詳細に調べるため結晶化方法を改善し、さらに2.2Å分解能までデータが得られた。得られた高分解能データを用いて現在3次元構造モデルの精密化を行っており、これにより反応機構に関わる反応中心近傍の精密な構造モデルが得られるものと期待される。Bacillus sp.由来ウリカーゼについてX線結晶構造解析を行った。大型放射光施設Spring-8のビームラインBL41XUにおいてX線回折実験を実施した結果、2.2_分解能をこえる回折斑点が観測された。本結晶の空間群はP2_12_12、格子定数はa=133.8Å, b=144.6Å, c=78.9Åであり、非対称単位中に含まれるサブユニットの数は4分子と求められた。次に既知のA. flavus UOXの3次元構造モデルの座標データ(PDB code:1UOX)を用いて分子置換法による初期位相の計算を行った。分子置換法の計算にはCNSを用いた。次に、溶媒領域の平滑化、及び非結晶学的対称を利用した平均化の手法を駆使して位相の改良を行い、さらに3次元構造モデルの精密化を行った。その結果、2.2_分解能においてR値=18%、R_<free>値=22%のモデルを得た(PDB code:1J2G)。A.flavus UOXと主鎖構造を比較した結果、A. flavus UOXでは4量体形成に関与すると考えられてきたループ領域に大きな主鎖構造の変化が認められた。これまでに示差走査型カロリメトリー測定及び動的光散乱測定を行った結果から、本酵素は、塩濃度が低い場合、温度上昇に伴ってまずサブユニットの部分的な変性が起こりその後に個々のサブユニットの変性に至るが、塩濃度が高い場合は8量体が形成されるためにサブユニットの部分的な変性が抑制され、部分的な変性が抑えられることにより熱安定性が増すと考えられた。このループ領域は2回軸で関係づけられる2つのUOX分子間の接触に関与していた。また、リガンドとして添加した8-azaxanthineの結合はA. flavus UOXのそれとは異なっていることが明らかになった。このことは結合モードを代えることで基質と阻害剤の認識の違いが制御されていることや、尿酸8位の酸素原子が基質の活性化に重要であることを示唆するものと考えられた。
高分子固体の分子レオロジー:複屈折測定による微視的内部ひずみの評価

巨視的な粘弾性現象を,系の微視的な(分子レベルでの)構造変化や運動と関係づけて理解することを目的とし,粘弾性測定とひずみ複屈折測定を同時に行い,高分子の固体状態での局所ひずみと応力の発生について検討した.分子構造を系統的に変化させたポリカーボネート樹脂について,粘弾性副緩和(γ緩和)と分子運動の関係について検討した.ビスフェノールAポリカーボネートの繰り返し単位の二つのフェニレン基に置換基を導入したA系列と,メチル基を置換したB系列について,複素ヤング率と複素光学係数の温度分散の測定を,-140°Cからガラス転移温度付近までの幅広い温度域で行った.ビスフェノールAポリカーボネートでは,粘弾性γ分散は周波数12Hzで-50°C付近で観測された.このγ分散は非常に顕著なもので,弾性率はγ分散の前後で約2倍変化した.A系列では,導入した置換基の大きさに応じてγ分散が高温側に移動するのが観測された.一方,B系列では,γ分散は置換基の導入によって変化しなかった.これらの結果のみでは,γ分散の分子論的起源として,フェニレン基のπフリップ運動を示唆するものと考えることもできるが,A系列,B系列のいずれの試料においても,γ分散のひずみ光学係数は負であることが判明した.したがって,γ分散には,フェニレン基といった光学的異方性の大きい原子団の配向が関与しているとは考えられない.複屈折の結果を矛盾なく説明するためには,鎖間の滑りといった光学的異方性の解放をともなわない並進的な運動が関係していると見なす方が適当であることが明らかになった.巨視的な粘弾性現象を,系の微視的な(分子レベルでの)構造変化や運動と関係づけて理解することを目的とし,粘弾性測定とひずみ複屈折測定を同時に行い,高分子の固体状態での局所ひずみと応力の発生について検討した.分子構造を系統的に変化させたポリカーボネート樹脂について,粘弾性副緩和(γ緩和)と分子運動の関係について検討した.ビスフェノールAポリカーボネートの繰り返し単位の二つのフェニレン基に置換基を導入したA系列と,メチル基を置換したB系列について,複素ヤング率と複素光学係数の温度分散の測定を,-140°Cからガラス転移温度付近までの幅広い温度域で行った.ビスフェノールAポリカーボネートでは,粘弾性γ分散は周波数12Hzで-50°C付近で観測された.このγ分散は非常に顕著なもので,弾性率はγ分散の前後で約2倍変化した.A系列では,導入した置換基の大きさに応じてγ分散が高温側に移動するのが観測された.一方,B系列では,γ分散は置換基の導入によって変化しなかった.これらの結果のみでは,γ分散の分子論的起源として,フェニレン基のπフリップ運動を示唆するものと考えることもできるが,A系列,B系列のいずれの試料においても,γ分散のひずみ光学係数は負であることが判明した.したがって,γ分散には,フェニレン基といった光学的異方性の大きい原子団の配向が関与しているとは考えられない.複屈折の結果を矛盾なく説明するためには,鎖間の滑りといった光学的異方性の解放をともなわない並進的な運動が関係していると見なす方が適当であることが明らかになった.平成12年度の研究は,粘弾性主分散に関する検討を中心にして進めた.現有の動的複屈折測定装置を利用して,ずり流動下で,速度勾配がある面と流動面に対して垂直な方向からレーザービームを入射できるようにジグ,光学系の変更を行った.高分子固体の実験では,広い温度領域での測定が不可欠となるので,本研究費により購入するチラー,エアードライヤーを用いて,低温乾燥空気の供給源を確立し,低温での測定が行えるようにした.その結果,-100度,精度0.02度での実験が行えるようになった.ポリスチレンについて,現有の粘弾性測定装置を用いた通常の粘弾性測定に加え,本研究経費により改良した装置によってガラス転移温度近傍で周波数分散の測定を行った.修正応力光学則を利用して第二法線応力差と第一法線応力差を算出し,第二法線応力差と第一法線応力差の比,βを求めた.その結果.鎖の配向に起因するゴム状成分については,β=0.2程度であることがわかった.この値は,これまでに知られている値とよく一致した.一方,ガラス成分に対するβは,本研究により初めて得られ,1程度であることが判明した.巨視的な粘弾性現象を,系の微視的な(分子レベルでの)構造変化や運動と関係づけて理解することを目的とし,粘弾性測定とひずみ複屈折測定を同時に行い,高分子の固体状態での局所ひずみと応力の発生について検討した.分子構造を系統的に変化させたポリカーボネート樹脂について,粘弾性副緩和(γ緩和)と分子運動の関係について検討した.ビスフェノールAポリカーボネートの繰り返し単位の二つのフェニレン基に置換基を導入したA系列と,メチル基を置換したB系列について,複素ヤング率と複素光学係数の温度分散の測定を,-140°Cからガラス転移温度付近までの幅広い温度域で行った.ビスフェノールAポリカーボネートでは,粘弾性γ分散は周波数12Hzで-50°C付近で観測された.このγ分散は非常に顕著なもので,弾性率はγ分散の前後で約2倍変化した.A系列では,導入した置換基の大きさに応じてγ分散が高温側に移動するのが観測された.一方,B系列では,γ分散は置換基の導入によって変化しなかった.

これらの結果のみでは,γ分散の分子論的起源として,フェニレン基のπフリップ運動を示唆するものと考えることもできるが,A系列,B系列のいずれの試料においても,γ分散のひずみ光学係数は負であることが判明した.したがって,γ分散には,フェニレン基といった光学的異方性の大きい原子団の配向が関与しているとは考えられない.複屈折の結果を矛盾なく説明するためには,鎖間の滑りといった光学的異方性の解放をともなわない並進的な運動が関係していると見なす方が適当であることが明らかになった.
硬膜外麻酔の癌再発抑制機序の解明

今回、当研究室で既に確立済みのラット硬膜外カテーテル長期留置モデルを用いて、「硬膜外麻酔が免疫担当細胞natural killer細胞、T細胞の周術期機能を保持し、癌増殖を抑える」との仮説の下に、癌再発と周術期免疫機能の変化を探求する研究を行った。今回の研究においては硬膜外麻酔が免疫担当細胞Natural killer細胞、T細胞の周術期機能に与える影響を観察することが出来なかったが、今後も更なる研究を続けていく予定である。今回、当研究室で既に確立済みのラット硬膜外カテーテル長期留置モデルを用いて、「硬膜外麻酔が免疫担当細胞natural killer細胞、T細胞の周術期機能を保持し、癌増殖を抑える」との仮説の下に、癌再発と周術期免疫機能の変化を探求する研究計画を立てた。本研究計画の初年度である25年度は、硬膜外麻酔を施した担がんラットモデルの作成を目標として研究を行った。当初は既存の論文(Radiat Environ Biophys 2011;50:199)に倣ってラット結腸癌細胞DHD/K12/TRbをBD-IXラット肝臓の左側葉、左中葉、右中葉にマイクロシリンジによって注入することで担がんラットの作成を試みた。しかし、この方法で肝臓にがんが生着したのは12例中6例と低率であったためにモデルの変更を余儀なくされた。次に行った方法はラット肝臓がん細胞McAーRH7777をSprague-Dawleyラット肝臓の左側葉、左中葉、右中葉にマイクロシリンジによって注入する方法であった。この方法によりがんが生着したのは10例中8例と良好な成績を収めた。この新たな担がんラットモデルに対しFreiseらの方法(Anesth Analg 2005;100:255)に従って、第3/第4腰椎椎間より硬膜外カテーテルを挿入し、先端を下位胸椎に留置したラットを無作為に1硬膜外生食投与群と2硬膜外リドカイン投与群に分け、癌細胞の肝臓内増殖に対する硬膜外麻酔の関与を手術侵襲の影響を含め検証してきた。現在のところ標本数が少ないため結論を得るに至ってはいないが、標本数を増やす事で研究を完遂できる可能性が高いと考えられる。硬膜外麻酔による悪性腫瘍増殖の抑制が確認され、その機序が解明されれば、硬膜外麻酔の積極的な周術期の適用に関して新しい知見をもたらし、癌手術患者にとって大きな利益をもたらすと考える。今回、当研究室で既に確立済みのラット硬膜外カテーテル長期留置モデルを用いて、「硬膜外麻酔が免疫担当細胞Natural killer細胞、T細胞の周術期機能を保持し、がん増殖を抑える」との仮説の下に、癌再発と周術期免疫機能の変化を探究する研究計画を立てた。本研究計画の初年度である25年度は硬膜外麻酔を施した坦がんラットモデルを作成する事を目的とし、当初の予定したがん細胞株とは違う細胞株を用いてこれを確立した。本研究計画の最終年度である26年度は、前年度に確立した担がんラットモデルを用いて50匹のラットを1生食投与群(25匹)と21%リドカイン投与群(25匹)に分け、がん細胞注入の14日後にセボフルラン投与による全身麻酔下にラット尾静脈より採血を行い、それぞれ動脈血液ガス、白血球数を測定したところ両群間に有意な差を認めなかった。また、血清IFN-γ、TGF-β、IL-4、IL-6、IL-10、IL-12、IL-17濃度をELISA法で測定したところ、全ての項目で両群間に有意差を認めることが出来なかった。更にがん細胞注入14日後にラットから肝臓組織を採取し、腫瘍組織とそこから離れた肝組織から組織標本を作製し観察したが、やはり両群間で有意な違いを認めるには至らなかった。また、肝臓から単核球を抽出しNK活性をMTT法にて測定(Leuk Lympoma 2003;44:1957)したがこれも両群間に有意差を認めなかった。今回の研究では硬膜外麻酔が免疫担当細胞Natural killer細胞、T細胞の周術期機能に与える影響を観察することが出来なかったが、これはがん細胞株の変更により観察期間を28日間から14日間へ短縮せざるを得なかった影響が大きいと考えられる為、今後も更なる研究を続けていく予定である。麻酔学当初の予定では平成25年度中に担がんラットモデルを完成させた上で50匹のラットを無作為に1生食投与群(25匹)と21%リドカイン投与群(25匹)の2群に分け、癌細胞の肝臓内増殖に対する硬膜外麻酔の関与を手術侵襲の影響を含め検証する予定であった。現在のところ当初予定していた方法とは異なるものの、担がんラットモデルに関してはほぼ確立させて実験を開始している。また、平成25年度の実験の残りは平成26年度の実験と同時に並行して行うことが出来るため、遅延なく研究を完遂できると考えられる。平成26年度は、前年度の実験の残りを遂行すると同時に、新たな測定を行う。

前年度と同様に50匹のラットを1生食投与群(25匹)と21%リドカイン投与群(25匹)に分ける。14日目にセボフルラン投与による全身麻酔下にラット尾静脈より採血を行い、それぞれ動脈血液ガス、白血球数を測定する。血清IFN-γ、TGF-β、IL-4、IL-6、IL-10、IL-12、IL-17濃度をELISA法により測定する。血清IL-12濃度、血清IFN-γ濃度、血清IL-4濃度の変化を経時的に測定することでTh1/Th2バランスを知ることが可能である。同時に血清IL-17濃度の変化を測定することでTh17発現の程度を知ることが可能である。また、血清TGF-β、IL-6、IL-10濃度の変化を測定し、免疫抑制分子の趨向を観察する。14日目にラットを安楽死させ、無菌下に肝臓組織を採取する。肝臓の腫瘍組織と腫瘍から離れた組織から組織標本を作製し、ヘマトキシリンーエオジン染色を施し腫瘍細胞の健常部/壊死部を観察する。また、NK活性を測定するため、肝臓は膜を通して培養液で濾過後、遠心分離機にて単核球を抽出する。NK活性はMTT法によって計測する(Leuk Lympoma 2003;44:1957)予定である。これらの研究により、硬膜外麻酔による免疫担当細胞への影響を生体内外実験系で検証する。以上、2年間にわたる研究により、硬膜外麻酔が周術期リンパ球機能の保持を通じ、抗腫瘍免疫機能を保持し、癌再発の危険性を軽減していることを明らかにしたい。また、硬膜外麻酔と免疫抑制分子についての関連を検証したい。当初の計画では28日間にわたる観察研究であったが、がん細胞株の変更のため観察期間を14日に変更して対応する。
浸漬型ナノろ過膜分離バイオリアクターによる排水の超高度処理

本研究は、栄養塩除去、内分泌撹乱化学物質を含む溶存有機物質の高度な除去を同時に達成する浸漬型ナノ濾過膜分離バイオリアクターを開発し、実験室規模の連続運転により超高度処理システムとしての安定運転性能を実証し、家庭用小型浄化槽としての実用化可能性を工学的に評価することを目的とした。具体的には、1)中空糸膜を応用した長期安定性能を有する浸漬モジュールを開発する。2)100日以上の連続実験により、処理性能を評価する。3)さらに、上記バイオファウリングによる表面特性の変化を詳細に検討し、設計にあたっての重要な工学的情報を得ることを目標とした。1)2)については、人工下水を用いた実験ではあるが、塩素阻止率の比較的低い中空糸NF膜モジュールを曝気槽に懸架し、下部から曝気し吸引ろ過で処理水を得る装置により、特別な洗浄無しで75日すなわち目標の3/4の期間の連続運転を達成した。滞留時間は1日であり、戸別浄化槽としての実用可能性は高いと判断できた。ただし、原子間力顕微鏡等を用いた項目3)の検討により、バイオファウリングが特に60日以降進行し、膜表面の劣化が進行したことが判明した。これは、膜材質が2酢酸セルロースであったことが大きいと判断され、生物分解が進行した結果であると結論できた。これを防ぐためには、ポリアミド系の膜等を使用することが考えられた。これより、実下水を用いてポリアミド膜と3酢酸セルロース膜を用いた実験を行った。処理性能としては、処理水TOCを1mg/L以下を達成できることが実証できた。しかし、タイトな膜では塩素阻止率が高く、稠密なモジュール形態では浸透圧の上昇による有効ろ過圧力の減少が吸引ろ過であるので無視できないことがわかった。従って、モジュール構造としては膜糸をフリーに懸架する構造で問題は解決される判断され、実用化は可能であると結論される。
インフルエンザウイルスを用いた多目的ベクターの開発と実用化

1)インフルエンザウイルスNA分節に、IRESを介在配列として約100-1800bpの種々の外来遺伝子を導入したウイルスの回収を試みた。短い遺伝子は安定に導入されたが、発現は極めて低かった。最も長い遺伝子として麻疹HA遺伝子を導入したウイルスを回収したが、HA遺伝子の約70%を欠失していた。既存の技術を用いたインフルエンザベクター系には発現レベルと安定性に問題のあることが判明した。2)そこで、インフルエンザゲノム中最もサイズが小さく遺伝子発現レベルの高いNSゲノムを当面の標的とし、新たな遺伝子組換え技術の開発を行った。ウイルス粒子から単離したRNPをNSのcDNA存在下RNaseHで処理し、NSのcDNAから試験管内で再構成したRNPと共に細胞に導入することにより様々な変異ウイルスを回収した。NLS2(核移行シグナル2)及びエフェクタードメインを含むC端側半分を削除すると、ウイルスは弱毒化した。N端側半分に12残基の欠失を持つウイルスは温度感受性となった。ウイルス弱毒化のプロトコールが得られた。次に、CAT遺伝子をNSゲノムへ2Aプロテアーゼ配列を介在配列として導入し、ウイルスを回収した。3)サブジェノミックRNAの非コード領域に、ゲノム特異的認識シグナルの存在が確認された。今後サブジェノミック型ベクター開発にはこの領域への変異導入が必要である。4)インフルエンザウイルスRNA転写・複製を促進する宿主因子RAFを同定した。今後、大量発現のヘルパー細胞としてRAFの過剰発現が利用可能と思われる。1)組換え体インフルエンザウイルスを作成する系を改良し、種々の変異ウイルスを効率良く回収する、新しいトランスフェクション系を開発した(榎並)。2)麻疹ウイルス中和抗原蛋白質Hの細胞外領域にインフルエンザウイルスHA蛋白シグナル配列を結合した分泌型蛋白質をデザインした。組換え体バキュロウイルスを用い昆虫細胞で発現したところ、大量に発現され培養液中に効率良く分泌されることが確認された(佐藤、榎並)。3)インフルエンザウイルスNA蛋白質をコードする第6RNA分節に、ヒト免疫グログリンH鎖結合蛋白質mRNA翻訳開始部位上流に存在するIRESを介在配列として外来遺伝子を導入した。すなわち、HIVgp120蛋白質中和抗原エピトープV3領域を含む分泌型蛋白質を発現する組換え体インフルエンザウイルスを作成した(榎並)。4)サブジェノミックRNAを優先的に複製・パッケージングするインフルエンザウイルスNS2変異株を用い、CAT遺伝子を挿入したサブジェノミックRNAの複製、蛋白発現、ウイルス粒子への取り込みを検討した。ウイルスゲノムの非コード領域に、ゲノム特異的認識シグナルの存在が確認された(小田切)。5)インフルエンザウイルスRNA複製に機能する宿主因子の解析を行った。ウイルス感染細胞から宿主因子を抽出分画し、試験管内でウイルスRNA複製活性を促進する分子量100KのRAF(RNA polymerase activating factor)、及び阻害するPRF(Polymerase regulating factor)を同定した(永田)。6)インフルエンザウイルスRNA複製装置の機能構造解析を行い、RNAポリメラーゼサブユニットPB1、PB2、PA蛋白質相互の結合部位を同定した(豊田)。2)そこで、インフルエンザゲノム中最もサイズが小さく遺伝子発現レベルの高いNSゲノムを当面の標的とし、新たな遺伝子組み替え技術の開発を行った。

N端側半分に12残基の欠失を持つウイルスは温度感受性となった。ウイルス弱毒化のプロトコールが得られた。さらに現在、種々の外来遺伝子をNSゲノムへ2Aプロテアーゼ配列を介在配列として導入し、ウイルスの回収と発現の解析を行っている。サブジェノミックRNAの非コード領域に、ゲノム特異的認識シグナルの存在が確認された。今後サブジェノミック型ベクター開発にはこの領域への特異導入が必要である。4)インフルエンザウイルスRNA転写・複製を促進する宿主因子RAFを同定した。今後、大量発現のヘルパー細胞としてRAFの過剰発現が利用可能と思われる。
上皮細胞腫瘍化因子レトロウイルスエンベロープの構造と機能の相関性の解明

本研究では、(1)JSRV/ENTVエンベロープ分子に相互作用し、腫瘍化・トランスフォーメーションに関与する宿主細胞内因子を同定すること、また(2)JSRV/ENTVエンベロープのX線結晶構造解析を行うことを目的として、これまでにJSRVエンベロープ分子のSUドメイン、TMドメイン、およびCT細胞内ドメインをそれぞれGSTとの融合タンパク質として大腸菌で発現させる系を確立してきた。GST-CT細胞内ドメイン融合タンパク質を大腸菌で発現させ、208F細胞溶解液と混合することにより、CT細胞内ドメインと相互作用するタンパク質との複合体をin vitroで形成させ、グルタチオンビーズの添加によって複合体をpull-downし、SDS-PAGEで見られた特異的バンドをMALDI-TOF型質量分析計により解析した。複数の候補因子の中から今回はビメンチンに着目した。208F細胞からビメンチンmRNAを単離しcDNAを調製後、ビメンチン発現プラスミドを構築した。ビメンチン発現プラスミドとJSRVエンベロープ-HA発現プラスミドを293T細胞にトランスフェクションし、抗HA抗体により免疫沈降を行った。また、JSRVエンベロープ-HAでトランスフォームした208F細胞の溶解液に抗HA抗体を添加することで、同様に免疫沈降を行った結果、両分子の共免疫沈降が観察された。さらに208F細胞を用いたトランスフォーメーションアッセイの際に、ビメンチンに対する阻害剤を添加した結果、JSRVエンベロープによるフォーカス形成に対して濃度依存的な阻害効果が観察された。タンパク質発現に成功したJSRVエンベロープ分子のCT細胞内ドメインを用いて同定した相互作用候補分子に、細胞トランスフォーメーションに関与する可能性を見出した。タンパク質発現に成功しているJSRVエンベロープ分子のSUドメイン、およびTMドメインを精製し、結晶化のスクリーニングを行う。またX線結晶構造解析は、物質構造科学研究所放射光科学研究施設(高エネルギー加速器研究機構:つくば市)で行う。レトロウイルスjaagsiekte sheep retrovirus (JSRV)とenzootic nasal tumorvirus (ENTV)の構造タンパク質エンベロープは、どちらもがん遺伝子として機能することで、JSRVエンベロープはヒツジの肺で、ENTVエンベロープはヒツジの鼻腔内で腫瘍を発症させる。JSRVとENTVのエンベロープはどちらも同じレセプターHyal-2を利用して細胞に感染するにもかかわらず、なぜヒツジで腫瘍発生部位を異にするのかが最大のなぞである。本研究では、(1)JSRV/ENTVエンベロープに相互作用し、腫瘍化・トランスフォーメーションに関与する宿主細胞内分子を同定すること、また(2)JSRV/ENTV/エンベロープのX線結晶構造解析を行うことを提案した。どちらの実験計画においてもGSTとの融合タンパク質を調製する必要があることから、JSRVエンベロープのSUドメイン、およびTMドメインの遺伝子をクローニングし、それぞれGSTとの融合タンパク質として大腸菌BL21(DE3)にて発現させることに成功した。発現・精製したGST-エンベロープ融合タンパク質と上皮細胞溶解液を混合することにより、相互作用しうるタンパク質とエンベロープタンパク質の複合体をin vitroで形成させた後、グルタチオンビーズの添加によって複合体をpull-downした結果、SDS-PAGEにて陰性対照には見られない特異的バンドを複数見出した。JSRVエンベロープのSUドメイン、およびTMドメインをそれぞれGSTとの融合タンパク質として大腸菌BL21(DE3)にて発現させることに成功した。また、JSRVエンベロープのSUドメイン、あるいはTMドメインと相互作用している宿主因子の候補を見出した。SDS-PAGEにて陰性対照には見られない特異的バンドを切り出しトリプシン消化後、MALDI-TOF型質量分析計により解析することが可能である。エンベロープタンパク質結晶化のスクリーニングを行い、結晶構造解析は高エネルギー加速器研究機構物質構造科学研究所放射光科学研究施設で行う。これらの実験のために必要な試薬類の購入のための消耗品費、およびX線結晶構造解析のための旅費を必要とする。

また国内学会において本研究成果を発表するために、旅費を必要とする。タンパク質発現に成功しているJSRVエンベロープ分子のSUドメイン、およびTMドメインを精製し、結晶化のスクリーニングを行う。またX線結晶構造解析は、物質構造科学研究所放射光科学研究施設(高エネルギー加速器研究機構:つくば市)で行う。MALDI-TOF型質量分析計を用いて解析するために必要な試薬類の購入に使用する。また次年度はエンベロープタンパク質のX線結晶構造解析を高エネルギー加速器研究機構物質構造科学研究所放射光科学研究施設で行うので、この実験のために必要な試薬類の購入、および旅費に使用する。物質構造科学研究所放射光科学研究施設でのX線結晶構造解析実験のために必要な試薬類の購入、および旅費に使用する。また、学会発表のための参加費や旅費、およびこれまでの成果を論文発表するための投稿費、校閲費に使用する。
てんかん患者の基本的な皮膚電気活動を明らかにする

【背景】難治性てんかんの治療法の一つに、皮膚電気活動(electrodermal activity: EDA)を用いたバイオフィードバック療法が存在する。これは、EDAを末梢交感神経機能の指標とし、バイオフィードバックによってEDAを亢進させることでてんかん発作抑制を目指す方法であり、他の治療法と同等の治療効果を持つとされる。しかしながら、その基盤となるてんかん患者のEDAに関する報告はなく、これらがどのような性質を持つのかは不明である。今回我々は、てんかん患者の安静時EDAを測定し、健常群と比較した。【対象と方法】てんかん患者22名と、健常者24名を対象に、横断的観察研究を行った。測定にはリストバンド型の皮膚電気活動測定器を用い、温度・湿度・時間などの測定条件を統一した上で、両側手首の安静時EDAを10分間計測した。またてんかん群においてEDAと、てんかんに関わる要因との相関を解析した。【結果】てんかん群と健常群の安静時EDAは、全10分間の平均において明らかな差を認めなかった。ただし測定開始後1分間において、てんかん群のEDAは健常群より低い傾向を認めた(P=0.12)。てんかん群から発作抑制者4名を除く18名で健常群と比較した場合は、有意にEDAが低かった(P=0.036)。また、てんかん群においては、発作頻度がEDAと有意に逆相関した(ρ=-0.50, P=0.016)。一方、罹病期間や薬剤数はEDAと相関しなかった。【考察および結論】てんかん群ではEDAが低く、また発作頻度が多いほどEDAが低下していた。これは、てんかん患者における交感神経機能低下を示していると考えられる。その機序としては、繰り返す発作が、交感神経機能を担う辺縁系-視床下部に機能不全を引き起している可能性がある。測定および解析を終了し、論文投稿まで至っているため。論文の受理を目指す。また今回の結果を踏まえて、皮膚電気活動をどのように本人にフィードバックすると、てんかん発作抑制効果が高まりやすいかについて検討を加えていく。論文の受理を目指す。一部の物品で購入予定であったものが、寄贈されたことにより無料で使用できるようになったため、物品購入費を使用せずに済んだ。次年度には皮膚電気活動を詳細に測定でき、かつバイオフィードバック療法にも応用可能な研究機材の購入を計画している。