hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
安静時/課題遂行時の脳血流・酸素代謝MRI定量法-疲労の脳内機序解明に向けて

ヒトの疲労の脳内機序の解明に向けて,安静時および課題負荷時を通じて計測可能な非侵襲的脳機能イメージング法の開発を目的とした研究を行った.MRIのスピン標識法を用いた安静時の脳血流量と酸素摂取率の定量法を新規に開発し,健常人を対象にその測定を行った.動脈スピン標識のためのパルス系列は,多スラブ3次元収集法を用いて最適化し,その計測精度の妥当性を検証した.本方法は,定量の精度を犠牲にすることなく計測時間を短縮でき,実用性が高い方法であることを示した.ヒトの疲労の脳内機序の解明に向けて,安静時および課題負荷時を通じて計測可能な非侵襲的脳機能イメージング法の開発を目的とした研究を行った.MRIのスピン標識法を用いた安静時の脳血流量と酸素摂取率の定量法を新規に開発し,健常人を対象にその測定を行った.動脈スピン標識のためのパルス系列は,多スラブ3次元収集法を用いて最適化し,その計測精度の妥当性を検証した.本方法は,定量の精度を犠牲にすることなく計測時間を短縮でき,実用性が高い方法であることを示した.本研究においては、ヒトの疲労の脳内メカニズムの解明に向けて、MRIを用いた非侵襲的脳機能定量法を確立し、安静時および疲労負荷時を通じての脳機能モニタリングを可能にする。これにより疲労に関連した脳領野を同定し、それら脳領野間の機能連関を探ることが本研究の目的である。本年度の研究実施計画の項目1.「MRIを用いた安静時の局所脳血流量、酸素代謝率の定量法の確立」に関しては、それぞれの撮像方法の新規開発を終えた。これらの方法により、従来の機能的MRIでは観測ができない安静時における脳血流量、および、酸素摂取率の定量測定が可能になった。これらの開発に関しては、一部に定量性向上のための改良の余地を残し、さらには、実用のための最適化を施す過程が残されてはいるが、本年度の実施予定目標はほぼ達成できたと考える。目下、それらの定量法としての残された課題を仕上げ、方法論的妥当性を検証し、成果発表へ向けて結果をまとめる作業に入っている。本年度の研究実施計画の項目2.「健常人ボランティアを対象に疲労負荷課題を施行して、疲労関連脳領野を同定する」計画に関しては、上記項目1の定量法が開発され、方法論的に確立されてから本格的に実験を施行する予定であり、この優先順序のため、今年度は疲労負荷課題の選定など実験課題の準備段階に留まっている。これは来年度実施予定の中心的課題であり、現在、その計画と準備を進めている。本研究においては、ヒトの疲労の脳内メカニズムの解明に向けて、MRIを用いた非侵襲的脳機能定量法を確立し、安静時および疲労負荷時を通じての脳機能モニタリングを可能にする。研究実施計画の項目1.「MRIを用いた安静時の局所脳血流量、酸素代謝率の定量法の確立」に関しては、昨年度までに開発されたそれぞれの撮像方法により、安静時における脳血流量、および、酸素摂取率の定量測定が可能になったが、定量性向上のための改良の余地を残し、また、実用のための最適化の必要性もあった。これら課題は当初の想定とは異なる方法を用いて遂行できた。現在、具体的な研究成果に結びつけるための作業を進めている。研究実施計画の項目2.「健常人ボランティアを対象に疲労負荷課題を施行して、疲労関連脳領野を同定する」計画に関しては、上記項目1の定量法が開発され、方法論的に確立されてから本年度施行する中心課題として本格的に実施する予定であった。実際にはMRI装置のハードウェアの状態不良が障害となり実施が遅れているのが現状である。研究実施計画の項目3.「安静時,疲労負荷課題遂行時の両相における、脳領野間の機能連関・結合性の評価」に関しては、来年度の実施へ向けての準備を行うことであった。現在は予備的実験段階にある。今年度中に、計測・解析両面からの方法論上の準備を整え、来年度に本実験の実施を予定している。本研究においては,ヒトの疲労の脳内メカニズムの解明に向けて,MRIを用いた非侵襲的脳機能定量法を確立した上で,安静時および疲労負荷時を通じての脳機能のモニタリングを可能とすることを目標とした.

その手法を用いて,疲労に関連した脳領野を同定し,それら脳領野間の機能連関を探ることを目的とした研究を計画した.本年度は,昨年度までに開発済みである安静時の脳血流量と酸素摂取率の定量法について,実用化のための方法論的な最適化を行った.脳血流量の測定には,動脈スピン標識(ASL)法を用いたが,得られた脳内の灰白質,白質における局所脳血流量の定量値が,従来のASL法やPETを用いた計測値との比較により妥当な値であることを確認した.また,多スラブ3D-GRASE法を用いたASLを新規に開発し,その脳血流量定量性に関して従来の単スラブ法との比較を行った結果,定量の精度を犠牲にすることなく計測時間を従来法の4割程度に短縮できた.一方,本年度の研究の中心的な実施計画となるべき,健常人ボランティアを対象に疲労負荷課題を施行して,疲労関連領野を同定する実験計画に関しては,機能的MRI実験に用いるための適切な疲労負荷課題の選定が困難であったことと,当サイトにおける装置の不具合が続いた状況から十分な実験時間が確保できなかったことにより,当初の計画通りには進まなかった.脳血流量と酸素摂取率は,従来の機能的MRI法では観測できない脳機能計測指標であり,これらを新規に開発し,基礎的脳機能計測法として導入できたことに意義があると考える.また,それら指標を従来の核医学イメージングを用いるのではなく,より非侵襲的にMRIによって計測を行うことを可能とした点で,臨床脳病態分野における応用にもつながる可能性がある.現在、当施設におけるMRI装置はハードウェア上の不具合により正常に利用できない状況にあり、そのために特に実験実施段階での遅れが生じていることが主な理由である。24年度が最終年度であるため、記入しない。今後は残された課題の実施に力点を置き研究を進めて行く。研究計画の変更予定はない。現状における研究遂行上の問題としては、当施設におけるMRI装置の故障の問題があるが、その対応策として、外部の実験環境も利用して実施していく必要があり、その準備を進めている。
がんゲノム医療に向けたクリニカルシークエンスの変異解析パイプライン開発

がん遺伝子パネル検査「東大オンコパネル(Todai OncoPanel)」のための解析パイプラインを開発した。このパネルは、464種類の遺伝子の点突然変異・挿入欠失・コピー数異常、449種類の遺伝子融合を調べることを目的とし、東京大学附属病院にて実際に使用されているものである。本研究では主にRNAデータから融合遺伝子を検出することを目的とし、既知の融合遺伝子については仮想配列を事前に作成し、それ以外については検出したトランスクリプトームから融合遺伝子ペアを予測し、ダイナミックに仮想配列を作成して検出するものである。肺がんや肉腫など180症例以上を解析し、病理診断時には原因を特定できなかった検体から疾患原因融合遺伝子が検出や、新規の融合遺伝子の検出を可能にしている。この結果はCancer Sci. 2019; 110:1464-1479に報告している。大腸がんの全エクソン解析では、MLH1のプロモーター領域がメチル化された散発性MSI-H大腸がん(MM)は、Lynch症候群(LS)やLynch-like変異を持つ大腸がん(LL)とは異なる臨床病理学的プロファイルであることを示した(Clin Cancer Res. 2019; 25:378-389)。MMではLSやLLと比べてBRAFとRNF43の点変異・挿入・欠失が多く見られ、またKRAS、BRAFに変異がなかったMM症例特異的にキナーゼ領域を保持する融合遺伝子(融合キナーゼ)が検出された。これらの特徴からMSI-H大腸がんのMMタイプの分類にMLH1のメチル化アッセイと変異・融合キナーゼの相互排他性を考慮することで簡便な診断戦略の方法を提案した。ゲノム医療に用いるパイプライン開発を進め、実装することができた。しかし、パネルのバージョンアップに伴うアップデートが少々遅れている状況である。発現解析用プログラムのアップデートを主に開発を進めていく。また、これまで挙がってきた問題点を見直して新しいアルゴリズムの設計も検討している。東京大学で開始されたがんゲノム個別化医療を目的とした「ゲノム医療研究プロジェクト」において、467種類の遺伝子の点突然変異・挿入欠失・コピー数異常、476種類の遺伝子融合を調べる東大オンコパネルを使用し、次世代シークエンサーで解読したRNAデータから遺伝子融合とエクソンスキッピングを解析するパイプラインを開発した。本パイプラインは、上記のプロジェクトに実装されている。融合点を含むリードの検出を目的としたアルゴリズムで、抗がん剤の存在する融合遺伝子に対しては仮想配列を事前に作成して確実に探索し、それ以外については、トランスクリプトームをリファレンスにして融合遺伝子ペアもしくはスキッピングしているエクソンを予測し、ダイナミックに仮想配列を作成して検出するものである。1リードからの検出感度を有するが、発がんに寄与しないものや擬陽性、更には試料汚染による検出のフィルタリング方法は今後も検討する必要がある。解析事例は、主に肺がんと肉腫症例で、臨床現場における前向き検体およびアーカイブ検体180例以上を解析した。病理診断時には原因を特定できなかった検体から疾患原因融合遺伝子が検出することができ、肉腫では新規の遺伝子融合が数多く検出され、診断のための有益な情報提供ができると共に、疾患の原因究明に向けた糸口になるような結果を得ることができた。現在はRNAパネルから発現量解析を可能にするプログラムの実装とパネルのバージョンアップに合わせたパイプラインのアップグレードを検討中である。ゲノム医療プロジェクトにおいて実際の臨床現場からの意見などを受け、パイプラインへの追加機能が求められたため、当初予定してした開発事項は遅らせている状況である。東大オンコパネルのバージョンアップが行われ、解析遺伝子数やプローブ設計が変更されている。今後は、新しいパネルに対応した解析パイプライン開発を進めていく。

また、これまで挙がってきた問題点を見直して新しいアルゴリズムの設計も検討している。適切な研究費使用を行ったが、支出項目が多岐に渡るため若干の差額を生じた。次年度の使用計画には影響を与えるものではないと考えている。
動脈硬化形成における血管内皮細胞のCD36の発現意義の解明

酸化ストレスと動脈硬化の関連については過去に多くの報告が見られるが、血管内皮細胞におけるCD36の発現と動脈硬化の関連をin vivoおよびin vitroで検討した報告は見られなかった。また、血管内皮細胞に発現したCD36が動脈硬化進行性に働いているのか、抑制性に働いているのかもわかっていない。あたらしい動脈硬化治療へのアプローチを模索する意味で本研究を開始した。マウスやヒトの動脈をen faceに免疫染色した実験で、CD36は血管分岐部の内皮細胞に発現していたことから動脈硬化病変形成の初期の段階から病巣の進展に関わっていると考えられた。しかし、高コレステロール食を負荷しても、発現増加が見られなかったことやプラーク部分の内皮細胞、特にshoulder部分の内皮細胞に強く発現していたことから、ずり応力など血流因子の影響がより考えられた。in vivoでは血管内皮細胞での、CD36の発現はあきらかであったが、培養内皮細胞では、検出可能な程度にCD36の発現させることが困難であった。培養内皮細胞で、特異的にCD36の発現を促す因子を特定するために、さらなる研究が求められる。また、ヒトの冠状動脈を用いた免疫染色では、線維性被膜の厚いプラークでは、泡沫細胞にはHO-1が強発現しており、CD36は深部の壊死物や少数の泡沫細胞に発現を認めるのみであったが、破裂をきたしたプラークで、泡沫細胞でのCD36の発現が増加しており、逆にHO-1の発現が減少していた。このことから、泡沫細胞におけるCD36の発現亢進が粥腫の不安定化に関与している可能性が示唆された。ヒトの動脈硬化病変組織や培養細胞を用いて、血管内皮細胞におけるスカベンジャー受容体の一つであるCD36と内皮機能に関連しているストレス蛋白であるHO-1の動脈硬化の発生進展に対する役割を明らかにすることを目的とする。まず、ヒトの動脈硬化性大動脈瘤や頚動脈内膜剥離術検体、剖検で採取した様々な段階の動脈硬化病変が見られる冠状動脈や大動脈のパラフィン包埋切片及び凍結切片を用いて、動脈壁内におけるCD36とHO-1の発現細胞や分布状況について検討した。CD36は粥腫のnecrotic coreの深部の泡沫細胞やコレステリンを含む壊死物に発現を認めたが、fibrous cap内の平滑筋細胞やfibrous capやshoulderにおける泡沫細胞、泡沫化していないマクロファージやリンパ球などに発現を認めなかった。粥腫に接した変性した中膜平滑筋細胞に発現が見られることもあった。血管内皮細胞におけるCD36の発現は、発現が見られる切片もあるが、発現の明らかでない切片もあり、一定の傾向を認めなかった。HO-1は、潰瘍形成による血管内皮細胞の剥離が見られない切片では、HO-1は概ね、血管内皮細胞に強発現を呈しており、CD36と発現状況が異なり、fibrous cap内の平滑筋細胞やfibrous capやshoulderにおける泡沫細胞、泡沫化していないマクロファージやリンパ球などに発現を認めた。よって、動脈硬化病変内では、CD36とHO-1の発現は血管内皮細胞を含めて、異なっていると考えられた。次に、剖検材料におけるヒト大動脈のen faceに観察しているが、内皮細胞が剥離してしまっているものも多く含まれており、動脈硬化マウス(apoEノックアウトマウスなど)の動脈も用いて観察したいと考えている。この実験の成果をふまえ、培養の実験を行おうと考えている。ヒトの動脈硬化病変組織や培養細胞を用いて、血管内皮細胞におけるスカベンジャー受容体の一つであるCD36と内皮機能に関連しているストレス蛋白であるHO-Iの動脈硬化の発生進展に対する役割を明らかにすることを目的とする。

まず、ヒトの動脈硬化性大動脈瘤や頚動脈内膜剥離術検体、剖検で採取した様々な段階の動脈硬化病変が見られる冠状動脈や大動脈のパラフィン包埋切片及び凍結切片を用いて、動脈壁内におけるCD36とHO-1の発現細胞や分布状況について検討した。CD36は粥腫のnecrotic coreの深部の泡沫細胞やコレステリンを含む壊死物に発現を認めたが、fibrous cap内の平滑筋細胞やfibrous capやshoulderにおける泡沫細胞、泡沫化していないマクロファージやリンパ球などに発現を認めなかった。粥腫に接した変性した中膜平滑筋細胞に発現が見られることもあった。血管内皮細胞におけるCD36の発現は、発現が見られる切片もあるが、発現の明らかでない切片もあり、一定の傾向を認めなかった。HO-1は、潰瘍形成による血管内皮細胞の剥離が見られない切片では、HO-1は概ね、血管内皮細胞に強発現を呈しており、CD36と発現状況が異なり、fibrous cap内の平滑筋細胞やfibrous capやshoulderにおける泡沫細胞、泡沫化していないマクロファージやリンパ球などに発現を認めた。よって、動脈硬化病変内では、CD36とHO-1の発現は血管内皮細胞を含めて、異なっていると考えられた。次に、動脈硬化マウス(apoEノックアウトマウスなど)の動脈を用いてen faceに蛍光免疫染色を行い、血管内皮細胞におけるこれらの発現を検討した。CD36はほぼ粥腫の部分に発現は限局していたが、少数の血管内皮細胞およびマクロファージと思われる細胞にのみ陽性を示した。HO-1は粥腫の見られない動脈壁の血管内皮細胞にも発現を認めたが、特に、粥腫のshoulde部分に強く発現する傾向を示した。CD36は粥腫部分の内皮細胞に発現することがわかったので、次に培養細胞を用いて、どのような状態で血管内皮細胞にCD36の発現が誘導されるか検討したい。ヒトの動脈硬化病変組織や培養細胞を用いて、血管内皮細胞におけるスカベンジャー受容体の一つであるCD36と内皮機能に関連しているストレス蛋白であるHO-1の動脈硬化の発生進展に対する役割を明らかにすることを目的とする。動脈硬化マウス(apoEノックアウトマウス)やヒトの冠状動脈や頸動脈の動脈を用いてen faceに免疫染色を行うことにより、血管内皮細胞におけるCD36やHO-1の発現や局在について検討した。CD36は粥腫の形成の見られない内皮細胞にはほぼ陰性であったが、血管分岐部では少数の内皮細胞に陽性であった。また、泡沫細胞が比較的豊富なプラークのshoulder部分の内皮細胞およびマクロファージと思われる細胞に発現する傾向を認めた。進行した線維性プラークでは頂部の少数の内皮細胞に陽性所見を認めるのみであった。HO-1は粥腫の見られない動脈壁の血管内皮細胞にも弱い発現を認めたが、特に、泡沫細胞の集簇部の近傍、粥腫のshoulde部分に強く発現する傾向を示した。また、CD36とHO-1が共発現している内皮細胞も見られた。培養内皮細胞を用いた実験では、酸化LDLの刺激により、CD36の発現が増加しなかった。CD36の発現に血流の影響が大きいと思われるため、shear stressを加えたときの内皮細胞でのCD36の発現について検討したい。
大豆シスト線虫ふ化促進物質グリシノエクレピンAの活性部位の分子機能

我々は最近、インゲン豆の根より単離された大豆シスト線虫ふ化促進物質グリシノエクレピンA(GEAと略す)の最初の人工的合成に成功した。本研究は当面の課題としてGEAの活性部位がどこにあるのかを明確にし、ふ化活性機能に必要な、可能な限り最小の単位を分子設計することを目的とする。本年度はこれらの研究目的に沿って以下に述べる2つのテーマについて検討した。先ず我々は、GEAの19位がメチレン基であることより、生合成的前駆体をシクロアルタン系トリテルペンと推定した。そして我々は生合成推定経路に沿った合成を試みた。その結果、生薬トラガントより大量に入手可能なシクロアストラガロールを出発原料とし短工程且つ好収率でGEAのA環部の構築とB環部の形成に成功し、GEA本体の完全合成にあと一歩と迫ることが出来た。そこで得られた合成中間体のふ化活性を検討し、GEAの活性発現に必要な最小の機能分子を創案し、その短工程合成を検討した。Wieland-Miescherケトンを出発原料とし、13工程を経てGEAのCD環に相当する化合物の合成に成功した。この反応の過程にあって、2回にわたる酸触媒下でのバックボーン転位は立体選択的且つ位置選択的に進行した。現在、出発原として光学活性体を用い大量合成法の確立を検討している。
カブモザイクウイルスの宿主決定タンパク質と宿主植物側の抵抗性因子の解析

本研究ではカブモザイクウイルス(TuMV)においてダイコンに感染できるがキャベツに感染できないダイコン分離株と,キャベツに感染できるがダイコンに感染できないキャベツ分離株を用い,ウイルス側の宿主範囲を決定している遺伝子(産物)と植物側のウイルス抵抗性因子を明らかにしてその相互関係を解析するために、TuMVのコードする各種タンパク質の細胞内所在を確認することを目的に実験を行い、次の結果を得た。(1)ウイルスタンパク質の細胞内所在を明らかにするために、GFPとの融合タンパク質を容易にプロトプラストで発現させるようなタバコモザイクウイルス(TMV)ベクターを構築した。このベクターは、TMVの30Kタンパク質およびCPの領域を削除し、GFP遺伝子とその上流にSacI部位を挿入した。ここへ読み枠を合わせて外来遺伝子を挿入すると、GFPとの融合タンパク質として発現する。なお、このベクターに外来遺伝子を挿入せずに接種すると、フリーGFPを発現する。(2)TuMVキャベツ分離株のP1タンパク質遺伝子をこのベクターに挿入してプロトプラストに接種したところ、核表面への蓄積が観察された。そこでさらに、TuMVのP1タンパク質を前半部(アミノ酸1138まで)と後半部(139)に分けてプロトプラストで発現させたところ、前半部のみ核表面への蓄積が観察された。(3)このP1タンパク質が核に蓄積する現象がPotyvirusで一般的かどうかを調べる目的で、インゲンマメ黄斑モザイクウイルス(BYMV)のP1タンパク質遺伝子をTMV発現ベクターに挿入して接種したところ、TuMVの場合と同様に核への局在が観察された。なお、Po-tyvirusのP1タンパク質が核に局在する知見は世界で最初と思われる。
国民国家形成過程における日本人の自己意識と他者認識

平成8年度から10年度にかけておこなってきた「国民国家形成過程における日本人の自己認識と他者認識-民俗学と民族学を中心に-」の研究は、主として日本の近代初期に出発点をもつ民族学と民俗学を中心にして、日本人としてのアイデンティティと他者としての他(異)民族意識の形成に、この二つの学問がいかなる役割を果たしてきたかを明らかにすることであった。かつて植民地であった台湾・朝鮮・満州・樺太千島や日本のなかでの周辺的な位置に存在したアイヌや沖縄など、当時とすれば地理的および文化的な周辺にあった文化の系譜や日本的と考えられてきたものとの異質性を明確にすることで日本人とそれ以外との境界線を設定することに民族学や民俗学が大きな役割を果たしてきたことがこの研究で明らかになった。同時に、それは他者としてのそれらの文化と自国の民俗的な文化の深い理解を通じて、民俗学や民族学を担ってきた研究者が、安易に植民地政策や同化政策に与してきたわけではないこともあきらかになった。そして、こうした外部の文化が刺激となって、自国を研究する民俗学が、日本の内部においても文化が系譜や起源や変遷において一律ではなく多元的であり、また時代によってあらたに生成されていくことも明らかになった。日本における民俗学や民族学(文化人類学)の生成が、近代の日本の国民国家の形成と密接に関係していて、それが現在の二つの学問のありようをある意味で規定している。このふたつの学問の将来は、このふたつの学問の生成過程の深い認識の延長線上にあることはまちがいない。「国民国家形成過程における日本人の自己認識と他者認識」の研究は、主として日本の近代初期に出発点をもつ民族学と民俗学を中心にして、日本人としてのアイデンティティと他者としての他民族意識の形成過程を明らかににすることを目的としている。かって植民地として存在した台湾・朝鮮・満州・樺太千島の住民の調査・研究に深く関わってきた人類学者や民族学者の記述した民族誌や思想にみられる民族観の揺れを詳細に検討していくと、国家と民族意識あるいは自国の民俗との微妙な関係性が浮かび上がる。平成8年度は特に沖縄・台湾など当時「南方」と称されていた地域を取り上げ、国家・植民地・民族・民俗の概念が当時の研究者にどう把握されていたのか、人類学者・金関丈夫、鳥居龍蔵などについて議論を重ねてきた。またそれと呼応するように柳田国男は自国の民俗を研究する立場を民俗学として確立していくが、柳田の民俗学における民俗・風俗・殊俗の使い分けが明確になった。沖縄研究の歴史的推移は日琉同祖論を軸に展開してきたが、沖縄が境界あるいは日本文化の周辺という地理的な位置だけにとどまらず、日本人の自己認識と他者認識の形成過程に重大な役割をはたしてきたことが明らかになった。平成8年度は研究会を3回(歴博、石垣市民会館、東大)で開催した。また研究分担者の研究分担にしたがって、それぞれ沖縄県での実施調査を試みた。平成9年度は「北方」を小テーマに植民地時代の朝鮮・満州・樺太千島と民族学・民俗学の関わりについて研究を行う予定である。平成9年度「国民国家形成過程における日本人の自己認識と他者認識」の研究は、主として日本の近代初期に出発点をもつ民族学や民俗学を中心にして、日本人としてのアイデンティティと他者としての他民族意識の形成過程を明らかにすることを目的にしている。今年度は研究会を2回、そして研究分担者のそれぞれのテーマに沿った文献資料調査を個別に行った。今年度の第1回研究会は大阪大学文学部で開催し、ゲストスピーカーとして松田京子氏と木名瀬高継氏を招き、その発表をもとに議論を行った。松田氏は戦前の台湾における伊能嘉矩人類学的調査について、植民地台湾と人類学の関係を「他者」表象の構造的ありかたから検討した。また木名瀬高継氏はアイヌをめぐる文化人類学的言説の歴史的検討を行った。第2回研究会では中生勝美氏と森雅雄氏をゲストスピーカーに招き、その発表をもとに議論を行った。

中生氏には植民地時代の台湾で行われた旧慣調査と台北帝大土俗人種教室のコロニアリズムの関係を、森氏には「唐人お吉」物語生成過程を発表してもらい、それをもとに課題のテーマについて議論を行った。平成10年度は主として北方関係の資料を中心に研究会を行う予定である。研究課題「国民国家形成過程における日本人の自己認識と他者認識」の研究は、主として日本の近代初期に出発点をもつ民俗学と民族学を中心にして、日本人としてのアイデンティティと他者としての他民族意識の形成過程を明らかにすることを目的としている。平成10年度は過去2年間の研究会の継続をはかりながら、かつ総括的な討論をおこなってきた。研究会は北海道立北方民族博物館と東京大学で開催し、過去2年間で言及できなかった千島アイヌ、ミクロネシア・トラック島移民、在日コリアンなどについての研究を検討した。第1回の研究会ではゲストスピーカーとして斉藤玲子「観光地での民族文化-アイヌ工芸の歴史的変遷を中心に-」、宇田川洋「鳥居龍蔵・千島アイヌ・考古学」、嶺吉城「暴力としての植民地の残滓」の三人に発表してもらい、研究会側から小松和彦「ミクロネシア・トラック島民移民第一号・森小弁をめぐって」の発表があり、これらをめぐって総合討諭をおこなった。第2回の研究会では、最近在日コリアン研究を活発におこなっている島村恭則に「『日本民俗学』から多文化主義民俗学へ-在日コリアンをめぐる話題を中心に-」を発表してもらい、赤坂憲雄に「柳田国男と一国民俗学」と題して、現在の民俗学のかかえる根源的な問題を提起してもらった。そして今後の民俗学あるいは民族学の方向性についての総合的な討論をおこなった。過去3年間の研究実績については、今後なんらかの出版を考えていきたい。
空気力カプセルの走行に関する基礎的研究

大量の物質を効率的に輸送できる近代的な輸送手段として、空気力カプセル輸送が近年注目されるようになり、カプセルの抗力係数やカプセル走行、さらにはカプセル走行制御に関する研究が国内外で盛んに行なわれている。本研究はカプセル走行に関する解析法を確立するための基礎資料を得ることと、その走行特性を調べることを目的としている。まず単独走行および連続走行カプセルつき、流れを非定常1次元圧縮性としてこれを特性曲線法によって計算し、実験結果と比較してその一致の程度を調べた。次にカプセル重量、タンク圧、カプセルと管壁とのすき間、さらにはカプセル発射間隔がカプセル速度や管内圧力分布に及ぼす影響を理論計算によって系統的に調べこれらカプセル輸送装置を構成する種々パラメータの差異がカプセル走行に及ぼす影響の程度を明らかにした。以上の研究成果を以下に述べる。1.計算結果は実験結果とよく一致することが明らかとなった。ただしすき間がない場合には走行状熊が複雑となり実験結果との対応は悪い。2.カプセル重量、カプセルと管壁とのすき間、タンク圧およびカプセルの発射間隔の差異がカプセル平均速度に及ぼす影響の程度を調べた結果、すき間なしで連続走行する場合を除き、カプセル重量などの各パラメータの変化割合に対するカプセル平均速度の変化割合は、他のパラメータの影響を受けず、単調な曲線で関係ずけられることが明らかとなった。今後はカプセル停止ゾーンでのカプセル挙動や数値解析法の違いがカプセル走行に及ぼす影響などについて研究を進める予定である。
古代オリエントにおける都市形成とその展開

1996年度より98年度までの3年間、「古代オリエントにおける都市形成とその展開」をテーマに据えた研究活動を行なった。研究プロジェクトの推進にあたっては、多くの外部講師を招き、オリエント各地域の古代都市研究についての研究会を行なった。研究会は、都合9回行い、扱った地域は、東地中海沿岸、エジプト、パレスティナ、アナトリア、メソポタミア、イラン、ペルシャ湾岸、インド西北部、中国におよぶ。研究会では、各地域の都市展開についての個別研究を行なった後、比較研究、総括研究を行なった。各地域の都市形成の実像を把握していく過程で、旧来考えられてきたようなメンポタミアでの都市形成をモデルとしたようなステロタイプの理解では個別地域の都市形成が語れないことなどが、明らかとなった。また、青銅器・鉄器時代といった人類の発展段階上の時代により都市の様相が異なることなども確認された。本研究の成果は、日本西アジア考古学会の第2回総会(1997)で行なわれたシンポジウムでも公開してある(要旨は『日本西アジア考古学会通信』2号に掲載:1997)。また、『古代オリエントにおける都市形成とその展開』(12論文掲載)(文部省提出冊子)においても示してある。研究分担者および外部講師を招いての研究会を都合6回行った。プロジェクト初年度であることから、研究会では、当該する各地域での古代都市形成期の様相を把握することに努めた。研究会で扱った地域は、メソポタミア、湾岸、エジプト、イラン、西北インド、シリア・パレスティナである。東地中海世界のうち、小アジア、バルカン半島については、次年度早い時期に研究会を行うことを予定している。研究会で提起された問題を以下整理する。メソポタミアでは、都市形成の前段階のウバイド期の年代をどう確定していくか、またそこで社会構造にいかなる変化がみられるかが、問題となった。湾岸地域では、都市成立と交易活動(特にメソポタミアの諸都市が行った)とが密接に関係していることが指摘された。西北インドでは、インダス文明の都市が、規模や構造において、従来いわれてきたように必ずしも画一的でないことが指摘された。イラン(ペルシャ)の都市成立と展開については、同地域をいくつかに区分して考える必要が指摘された。エジプトでは、都市が定型的都市と非定型的都市に分かれること、そしてその区分が社会構造と関わることが、仮説として提起された。シリア・パレスティナでは、鉄器時代の都市を対象に議論がすすめられ、青銅器時代の都市とは異なる都市原理(あるいは機能)を考える必要が唱えられた。以上が研究会で提起された問題である。いずれの地域でも、旧来のステロ=タイプ化した古代都市論の見直しが迫られていることが強調されていた。これを統合し、新しい都市論を展開していくのが、次年度以降の課題である。本研究は、昨年度よりの継続である。昨年度の成果を、6月に行われた日本西アジア考古学会第1回総会シンポジウム(「古代オリエントにおける都市形成」)で公開した(その概要は、『西アジア考古通信』2号に掲載してある)。さて、本年度の研究の状況を以下述べることとする。研究分担者および外部講師を招いての研究会を都合5回行った。昨年度に引き続いてオリエントとその周辺地域の古代都市形成期の様相を把握することを、研究会の第一の目的とした。さらに、地域様相から導かれる古代都市の概念規定を行うことを第二の目標とした。地域様相の把握であるが、本年度は、ペルシャ湾岸地域、東地中海世界(小アジア・アナトリアおよびバルカン半島)を扱った。加えて、オリエントと比較するために、古代中国の都市形成がどのように把握されているかについて外部講師に発表願った。「都市」の概念規定についての議論であるが、各研究会ごとに小シンポジウムを行い、発表された地域の「都市」が、どのような構成要素をもっているかを抽出し、検討を加える討議を行った。昨年度からの研究会は都合11回を数え、基本的な資料の蓄積が徐々にできてきている。次年度はこうした成果を踏まえ、旧来の「古代都市論」を再構築する議論を深化させていく所存である。本研究は、本年度が最終年度にあたる。

本年度の研究および作業であるが、昨年度までの2年間で行った個別研究の取りまとめと、総括的研究とを行った。過去、オリエント諸地域(エジプト、メソポタミア、アラビア湾岸、イラン、西北インド、アナトリア、東南ヨーロッパ)それぞれに焦点をあて、個別研究をすすめてきた。また、比較研究をすすめるべく、中国の都市発生の問題についても扱った。さらに、研究課題の概念化作業についてもおこなってきた。過去2年間の各研究は、講師の研究発表とそれについての討議とを重ねることですすめてきた。本年度は、その個々の研究の原稿化を図った。原稿は、研究発表のレジメではなく、新たに書き起こした。そうすることによって、討議が活きると考えたからである。各研究発表者が書き起こした原稿もとに、研究代表者・研究分担者が、古代オリエントの都市の地域性、時代性について討議を行った。上の討議では、「都市」を巡る議論は通時的には行なえないこと、すなわち、人類史上の発展段階によって「都市」の概念が変わることなどがあらためて指摘され、都市概念の規定について意見交換をおこなった。結果、これまでに研究集会をかさねすすめてきた個別研究のうち、12テーマの論考を掲載する冊子(A4版、118頁)の完成をみた。この冊子の作成およびそれを巡る議論が、本年度の研究実績と考えている。
超小型精密自走機構を用いた高速連続ナノ転写加工と局所化学的加工

本研究では超小型自走精密機械を用い、機械的微細転写法と微細化学反応加工を融合させた新しい微細加工法を開発し、その性能を実験的に実証した。ナノメートル移動分解能を有する圧電素子と電磁石で構成された超小型精密自走機構にナノオーダの凹凸型を精密に転写する新しい微動アクチュエータを搭載した。またピコリットルオーダーの極微小液滴の精密塗布機構を開発し、局所的に化学反応を発生させ、微細機械加工と局所化学反応を融合させたナノカプセルの生成に実験的に成功した。本研究では微細加工機能を有する1立方インチサイズの超小型自走精密機械を反応性ガスチャンバー内で稼動させ、機械的微細形状転写法(ナノイプリント)と微細化学反応加工を融合させた新しい高速微細表面加工法を提案し、実験的に検証すること。すで基本性能を確立した圧電素子と電磁石を用いた超小型精密自走機構を改良し、ナノメートル移動分解能を有するようにし、さらにナノオーダの凹凸を有する微細な型を精密に加工面に転写するための新しい微動アクチュエータを提案し検討した。ここでは微小ボイスコイルアクチュエータにより微小加工されたクリスタル製の型を母材に転写し、熱または光で硬化させる。同時にピコリットルオーダーの極微小液滴の精密塗布機構により、局所において化学反応を発生させ、金属または非金属表面をナノ処理できるかどうかについて検証を行った。本年度は超小型自走機械がまずナノインプリント用工具アクチュータの下に誘導され、精密な転写加工を行う。さらにそれらの加工サンプルはSPMなどの計測器の下まで誘導し、その精度の検証を行った。これらの広域の誘導はカメラを用いたPCで制御されるが、それぞれの局所位置での位置決めはナノメートル分解能を有するリニアスケールで行い、自在性と精密性の両方を実現した。本年度は従来のナノインプリントが平面への転写に限定されており、さらに微細立体形状の生成を試みた。ここでは微小ガラスピペットの中の液体を尖端加工したタングステンロッドを高速駆動し、ピペット内の液体を媒質液中に精密に吐出し、微小なカプセルを生成させることに成功した。さらに化学的な反応をさせて機械と化学を融合させたナノカプセルの生成について検討を進める。すで基本性能を確立した圧電素子と電磁石を用いた超小型精密自走機構を改良し、ナノメートル移動分解能を有するようにし、さらにナノオーダの凹凸を有する微細な型を精密に加工面に転写するための新しい微動アクチュエータを搭載した。本年度は従来のナノインプリントが平面への転写に限定されていたため、この手法を液中に格調し、微小ガラスピペットの中の液体を尖端加工したタングステンロッドを高速駆動し、ピペット内の液体を媒質液中に精密に吐出し、微小球体を生成させることに成功した。さらに化学的な反応を付加させて機械と化学を融合させたナノカプセルの生成を実験的に明らかにした。
不活性小分子の活性化

本研究の目標は、地球上に豊富に存在する小分子、窒素分子(N_2)とメタン(CH_4)、および化石燃料の利用から派生し地球規模での環境問題となりつつある二酸化炭素(CO_2)を化学原料として用いて、有機化合物の重要な構成元素である炭素および窒素を効率よく供給する物質変換法を確立することである。すなわち、二酸化炭素およびメタンを最小単位の炭素資源として、また窒素分子を最小単位の窒素資源として利用することにより、究極の化学プロセスの確立を目指した基礎研究である。ここで取り扱う小分子は化学的に最も不活性な化合物の代表例であり、その効率的な活性化と化学的利用は化学における最も挑戦的な課題の一つである。以下に主な研究成果を述べる。(1)モリブデンあるいはタングステンに配位結合した窒素分子が温和な条件下に有機化合物と反応し、ピロール、アミノピロールなどの複素環化合物に変換される反応が開発された。チタン系でもインドール誘導体などが合成された。これらは窒素分子から温和な条件下に様々な含窒素有機化合物を合成する新しい化学の幕開けとなろう。(2)二酸化炭素を銅電極を用いて電解還元するとメタン、エチレン、エタノールなどが生成することが明らかとなり、これらの反応が一酸化炭素を中間体として進行することが判明した。(3)酸化還元酵素の機能を電気化学的還元に利用することにより、世界にさきがけ、二酸化炭素を高選択的にメタノールに還元することに成功した。(4)p型シリコン表面上に銅の超微粒子を付着させて二酸化炭素の光電解還元を行い、銅電極より正の電位でメタンとエチレンを生成させることに成功した。(5)銅系の触媒を用いてメタンと一酸化炭素から酢酸が生成する新規な反応が開発された。これらは温和な条件下でのメタンのC-C結合形成反応の最初の例と言える。本研究は平成4年度より発足した重点領域研究「不活性小分子の活性化」の総括班の計画研究に関するもので、本領域における研究計画の円滑な推進と各研究班間の情報・意見交換、ならびに研究成果の他分野および社会への広報・還元を計ることを目的としている。平成4年度は当初の研究計画に基づき2回の公開シンポジウムを開催した。第1回公開シンポジウムは平成4年7月10、11日に東京で開催し、101名の出席者があった。講演内容は領域研究者全員(51名)の研究計画概要であり、活発な質疑が行われた。また、シンポジウムとあわせて総括班会議、各班会議、全体会議が行われ、第3班班長交替(生越久靖京都大学教授から藤元薫東京大学教授へ)などの研究計画遂行上必要な議題が検討された。第2回公開シンポジウムは12月11,12日に大阪で開催し、81名の出席者があった。講演は各研究班から2名ずつ、計10名の研究者により行われ、研究結果の詳しい説明がされるとともに活発な質疑、討論が行われた。またシンポジウムとあわせて総括班会議、各班会議、全体会議が開かれ、研究成果についての討論と研究計画に関する連絡が行われた。また研究成果のとりまとめと広報活動に関しては、2回の公開シンポジウムでの講演要旨集ならびに領域全研究者による平成4年度研究成果報告書を作成して各研究者に配布したほか、班員相互の連絡を緊密にし、また研究成果の社会への広報を促進する目的で、広報No1、No2を作成配布した。尚、本総括班では研究の効果的進展を計るため、備品として本年度に単結晶自動X線構造解析装置、270MHz超伝導核磁気共鳴装置、およびクライオストリームクーラーを購入して東京大学工学部に設置し、班員の協同利用を開始している。本研究は平成4年度より発足した重点領域研究「不活性小分子の活性化」の総括

班の平成5年度計画研究に関するもので、本領域における研究計画の円滑な推進と各研究班間の情報・意見交換、ならびに研究成果の他分野および社会への広報・還元を計ることを目的としている。平成5年度は当初の研究計画に基づき2回の公開シンポジウム(第3回ならびに第4回公開シンポジウム)を開催した。第3回公開シンポジウムは平成5年6月28、29日に東京で開催し、104名の出席者があった。講演は各研究班から2名ずつ計10名の研究者により行われ、研究結果の詳しい説明がなされ活発な質疑、討論が行われた。また、これにあわせて総括班会議、各班会議、全体会議が行われ、研究成果に関する討論、研究計画に関連する連絡があり、1995年環太平洋国際化学会議における小分子活性化に関するシンポジウム開催の計画、およびEuropean Research Network on“Small Molecules:Selective Process and Catalyses"との研究協力の提案がなされた。第4回公開シンポジウムは12月17、18日に大阪で開催し、77名の出席者があった。講演は各研究班から14名ずつ計12名の研究者により行われ、研究結果の詳しい説明と質疑、討論が行われた。またシンポジウムとあわせて総括班会議、各班会議、全体会議が開かれ、研究成果についての討論と研究計画に関する連絡が行われた。研究成果のとりまとめと広報活動に関しては、2回の公開シンポジウムでの講演要旨集ならびに領域全研究者による平成5年度研究成果報告書を作成して各研究者に配布した。尚、本総括班では研究の効果的進展を計るため、備品として本年度に元素分析装置(東京大学工学部)、リサイクル分取HPLC(大阪大学工学部)、カメラ用X線結晶構造解析装置(東京大学理学部)、フーリエ変換赤外分光光度計(東京大学理学部)を購入設置し、班員の協同利用を開始している。本研究は平成4年度より発足した重点領域研究「不活性小分子の活性化」の総括班の平成6年度計画研究に関するもので、本領域における研究計画の円滑な推進と各研究班間の情報・意見交換、ならびに研究成果の他分野および社会への広報・還元を計ることを目的としている。平成6年度は当初の研究計画に基づき2回の公開シンポジウム(第5回ならびに第6回公開シンポジウム)を開催した。第5回公開シンポジウムは平成6年7月8、9日に京都で開催し、81名の出席者があった。講演は各研究班から24名ずつ計13名の研究者により行われ、研究結果の詳しい説明がなされて活発な質疑、討論が行われた。また、これにあわせて総括班会議、各班会議、全体会議が行われ、研究成果に関する討論、研究計画に関連する連絡が行われた。第6回公開シンポジウムは12月12、13日に東京で開催し、107名の出席者があった。講演は各研究班から1/5名ずつ計13名の研究者により行われ、研究結果の詳しい説明と質疑、討論が行われるとともに、シンポジウムとあわせて総括班会議、各班会議、全体会議が開かれた。さらに11月7日に京都で合同班会議を開き、研究の進捗状況について討論を行った。さらに、班間にまたがる6件の共同研究に対して、総括班より研究費の助成を行った。
糖鎖生物学の新展開

α-1,3-フコース転移酵素cDNAの導入と強制発現により、L細胞のインテグリン依存性の接着が促進された。ヒト骨髄球系細胞に於て、ガングリオシドの合成を制御する酵素としてGM3を合成するシアル酸転移酵素とLc3Cerを合成するN-アセチルグルコサミン転移酵素を同定した。ヒト結腸癌組織においてシアリルLe^aの抗原を持つ糖鎖の構造を明かにした。ルウィス血液型陰性の個体に於て、FuT-III遺伝子の変異をヌクレオチドレベルで解明した。胃体部と胃前庭部に於て、消化管ムチンの硫酸化糖鎖の構造パターンが異なっていた。Gsl-5糖鎖を形成するβ-1、6-N-アセチルグルコサミン転移酵素を精製し、アミノ酸部分配列を明かにした。肝細胞膜の表層糖鎖末端β-ガラクトシドが肝細胞接着に関与し、この機構にC-型レクチンは関与しないと示唆された。成人型異染性脳白質変性症の原因となるアリルスルファターゼAの新しい構造異常を見出した。ウシ精巣性ヒアルロニダーゼの糖転移反応を利用して、新しいハイブリッド型プロチオグリカンを作成した。ニワトリCa^<2+>依存性α-マンノシダーゼの特異性を解明した。マクロファージレクチンのチロシン残基(Tyr5)がインターナリゼイションに必須なことを明かにした。また、C-型レクチンの1つであるコンアグルチニンのcDNAおよびゲノムシークエンスを明かにした。Sophora japonica樹皮中のレクチンが損傷の修復に関与する可能性を指摘した。アルコール依存症患者血清に糖鎖欠損トランスフェリンを見出した。コンドロイチン硫酸のペプチドとの結合部位を合成した。ヒトマクロファージのレクチンcDNAを単離し、構造決定した。マクロファ-ジのエンドサイト-シスレセプタ-としてのレクチンのcDNAをCOS細胞に導入し、N末端近傍の構造が細胞表面への発現に必要なことを明らかにした。エンジュ樹皮のレクチンを精製し、特異性を明らかにした。糖タンパク質からヒドラジン分解で遊離したオリゴ糖をピリジルアミノ化したものを基質として輸卵管のαーマンノシダ-ゼを精製し、特異性を決定した。コンドロイチン硫酸鎖を担うプロテオグリカンの新しいコアタンパク質をcDNAクロ-ニングし、その構造を決定した。いくつかの硫酸基転移酵素を精製し、そのcDNAクロ-ニングを準備した。プロテオグリカンの糖とタンパク質の結合部位に作用するエンドグリコシダ-ゼのアッセイを蛍光標識グリコサミノグリカン鎖を用いて行い、酵素の精製に役立てた。消化管ムチンのOーグリコシド型糖鎖の酵素的および化学的切り出し方法を検討し、糖鎖マッピングを行った。癌細胞の細胞表面接着因子として細胞膜ガラクト-ス転移酵素を同定した。ガラクト-ス転移酵素に対するモノクロ-ナル抗体のエピト-プを組換え体ガラクト-ス転移酵素の変異体を用いて決定した。また、その抗体を用いて細胞膜ガラクト-ス転移酵素の組織内分布、ことに細胞膜における存在を決定した。ヒト癌の転移能と糖鎖抗原の発現パタ-ンの間に強い相関があることを明らかにした。ことにヒト膀胱癌においてはシアリルニ量体ルウィスX抗原を発現する原発巣は発現しない癌に比べてリンパ節転移が多かった。このことは癌細胞上の糖鎖をリンパ節の内皮細胞上のセレクチンが誤って識別してしまうことが癌転移を促進することを示唆する。α1-3ガラクトース転移酵素cDNAを導入したトランスジェニックマウスを作成した。

このマウスは肺,精巣,目の網膜に異所にガラクトースα1→3ガラクトース結合を発現した。このトランスジェニックマウス由来の着床前の胚は2細胞期からガラクトースα1→3ガラクトース結合を発現したが、発生能に変化はなかった。しかし、このトランスジェニックマウスは生後肝と腎に異常ずる例が多く、糖鎖の異所性発現は組識の機能異常と結びつくことが示された。マウス初期胚の糖鎖原のエピトープを合成するα1-3フコース転移酵素cDNAを導入したL細胞を作成した。この形質転換細胞はシャーレとの接着性を増し、また、テラトカルシノーマ幹細胞F9と、シャーレ面で共存した。この実験結果は、初期胚性のフコース結合が細胞接着,ことに細胞と基質の接着に重要なことを示している。いっぽう、細胞のガラクトース転移酵素の活性を抑えるために、ラクトアルブミンにゴルジへの輸送シグナルをつけたcDNAを作成して、細胞に導入する方法が開発された。ラクトアルブミンはガラクトース転移酵素の特異性を変化させ、グルコース転移酵素とすることが知られている。また、胃粘膜ムチンの分別法が考察された。マウスにおけるガングリオシドの遺伝的差異の基盤となるGM2合成酵素が高度に精製された。エンドグリコシダーゼの逆反応を利用してグリコサミノグリカンの合成反応が考察された。ヒアルロン酸オリゴ糖の化学合成法も進展した。血球分化の過程において糖転移酵素の活性変化が示された。α-1,3-フコース転移酵素cDNAの導入と強制発現により、L細胞のインテグリン依存性の接着が促進された。ヒト骨髄球系細胞に於て、ガングリオシドの合成を制御する酵素としてGM3を合成するシアル酸転移酵素とLc3Cerを合成するN-アセチルグルコサミン転移酵素を同定した。ヒト結腸癌組織においてシアリルLe^aの抗原を持つ糖鎖の構造を明かにした。ルウィス血液型陰性の個体に於て、FuT-III遺伝子の変異をヌクレオチドレベルで解明した。胃体部と胃前庭部に於て、消化管ムチンの硫酸化糖鎖の構造パターンが異なっていた。Gsl-5糖鎖を形成するβ-1、6-N-アセチルグルコサミン転移酵素を精製し、アミノ酸部分配列を明かにした。肝細胞膜の表層糖鎖末端β-ガラクトシドが肝細胞接着に関与し、この機構にC-型レクチンは関与しないと示唆された。成人型異染性脳白質変性症の原因となるアリルスルファターゼAの新しい構造異常を見出した。ウシ精巣性ヒアルロニダーゼの糖転移反応を利用して、新しいハイブリッド型プロチオグリカンを作成した。ニワトリCa^<2+>依存性α-マンノシダーゼの特異性を解明した。マクロファージレクチンのチロシン残基(Tyr5)がインターナリゼイションに必須なことを明かにした。また、C-型レクチンの1つであるコンアグルチニンのcDNAおよびゲノムシークエンスを明かにした。Sophora japonica樹皮中のレクチンが損傷の修復に関与する可能性を指摘した。アルコール依存症患者血清に糖鎖欠損トランスフェリンを見出した。コンドロイチン硫酸のペプチドとの結合部位を合成した。ヒトマクロファージのレクチンcDNAを単離し、構造決定した。
プロテオインジェクションを利用した細胞内プロテオーム解析プラットホームの構築

タンパク質を細胞内に直接導入し(プロテオインジェクション)、細胞応答を評価することによりタンパク質の細胞内機能を総合的に解析するという、新規細胞内プロテオーム解析の基盤技術を確立した。まず、タンパク質を機能を保持したまま直接標的単一生ES細胞へ導入する技術開発に成功した。また、DNAプローブに転写因子特異的配列を挿入することにより、生細胞内へ導入したプローブのレポーター発現効率が上昇することを明らかにした。この原理を利用したES細胞内タンパク質機能を評価する新しい測定法の可能性を示した。本研究では、タンパク質を細胞内に直接導入し(プロテオインジェクション)、細胞応答を評価することによりタンパク質の機能を総合的に解析するという、新規細胞内プロテオーム解析のプラットホームを構築することを目的としている。初年度はまずタンパク質の細胞内機能のモデルとして、核移行を取り上げ、プロテオインジェクションを行い、その機能解析を行った。まず、核移行シグナル付き蛍光タンパク質発現用DNAプローブをES細胞へ導入し、生体内で発現されたタンパク質の局在化を観察することにより、利用した核移行シグナルがES細胞内において機能することを明らかにした。次に、核移行シグナル付き蛍光タンパク質を、大腸菌を用いて大量に作製した。このタンパク質を細胞質にプロテオインジェクションし、経時的に蛍光観察したところ、核内の蛍光が徐々に強くなっていく様子が観察された。一方、核移行シグナルを持たない蛍光タンパク質をプロテオインジェクションした場合は、細胞全体に蛍光が観察されたままであった。以上の結果から、導入した蛍光タンパク質の核移行機能が評価可能であると結論した。次に、核移行機能を持つES細胞特異的転写因子である、Oct3/4転写因子に着目した。Oct3/4転写因子結合配列を含むレポータープラスミドをES細胞内にインジェクトしたところ、遺伝子発現効率が向上した。一方、Oct3/4を発現しないことが明らかになっているMIN6細胞に同レポータープラスミドをインジェクトしたところそのような遺伝子発現効率の向上は認められなかった。この結果から、この配列を導入したレポータープラスミドの発現効率変化を利用することにより、細胞内のOct3/4転写因子の機能を評価できる可能性が示唆された。本研究では、ゲノム情報などを元にタンパク質を得て、そのタンパク質を細胞内に直接導入し(プロテオインジェクション)、細胞応答を評価することによりタンパク質の細胞内機能を総合的に解析するという、新規細胞内プロテオーム解析のプラットフォームを構築することを目的としている。本年度は、プロテオインジェクション条件の検討を行うことにより導入の高効率化を目指し、またより詳細な機能解析法開発への展開を行った。サンプル作製条件、インジェクション圧、キャピラリーの形状等を検討することにより、初年度には数%であったタンパク質導入成功率が23%まで向上した。またキャピラリー内のタンパク質濃度を変化させることにより、定量的にタンパク質を標的単一生ES細胞内へ導入する技術を確立した。タンパク質のES細胞への定量的インジェクションは本研究によって世界で初めて実現したものである。さらに、核移行シグナル付き蛍光タンパク質を細胞質にプロテオインジェクションした後、核内の蛍光が徐々に強くなっていく様子を動画として撮影することに成功した。またES細胞の未分化能維持に重要な役割を果たしていると考えられる転写因子、Oct3/4、Sox2、Nanogの構造遺伝子をクローニングし、蛍光タンパク質AcGFPとの融合タンパク質の作製を行った。発現ホスト種や誘導条件を検討し、融合タンパク質の可溶化発現に成功した。今後、これらのタンパク質を用いた詳細な生細胞内プロテオーム解析が期待される。以上の結果から、タンパク質を機能を保持したまま直接標的単一生ES細胞へ導入する技術開発に成功し、これを利用した細胞内プロテオーム解析のための基礎技術を確立したと結論した。