hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
イネの開花期の高温ストレス適応に関する集団遺伝学的研究

イネの高温大勢に強くかかわる葯基部の裂開の長さの決定に関与する遺伝子座の位置および裂開の大きさが決定される仕組みを明らかにすることを目的として,日本晴/カサラースの戻し交雑自殖系統群(BILs)および日本晴/カサラース染色体断片置換系統(CSSLs)を対象に,グロスチャンバー内に設定した高温条件下での葯の裂開特性と稔実に関するQTL解析を行った.BILsを用いた解析から,葯基部の裂開にかかわる遺伝子座が第2染色体上に検出され,その寄与率は12%であった.また,その効果はCSSLsによって確認された.この遺伝子座における対立遺伝子の相加効果は, BILsで40.0μmであり, CSSLsで132.7μmであった.圃場におけるこれまでの研究報告に照らして,高温条件下における稔実を6.220.5%向上させる可能性のあることが示された.同様に, BILsを用いた解析から,葯の頂部の裂開に関与するQTLが第5および第12染色体上に検出され,そのうち,第5染色体上のQTLの効果がCSSLsによって確認された.葯基部の裂開の長さに関与するQTLは,高温条件下での稔実率を対象としたQTL解析では検出されなかった.また, BILs内では,高温条件下における葯基部の裂開長と稔実率との間に有意な相関関係が認められた.これにより,稔実率だけでなく,個別の高温耐性形質に関するQTL解析やそれに基づく育種は,高温耐性の向上に有効であることが示された.得られた結果を論文として公表するに至っていない.分担者と連絡を緊密に取り合い,速やかに論文かするための努力をする.地球温暖化の進行に伴い,温帯を含む世界の各地でイネの高温不稔の頻発が懸念されている.育種による高温耐性の向上は温暖化対策として有効である.イネの高温耐性には葯の裂開特性がかかわっており,葯の基部と頂部に形成される裂開が大きいほど高温条件下における受粉が安定し耐性が強くなることが明らかにされている.そこで,本年度は,葯基部の裂開の大きさの決定に関する遺伝子座の位置および裂開の大きさが決定される仕組みを明らかにすることを目的とし,日本晴/カサラースの戻し交雑自殖系統群を対象に,葯の裂開特性についてQTL解析を行った.解析の結果,葯長,葯頂部の裂開,基部の裂開ついて,それぞれ,5,3,3個のQTLを検出した.これらのQTLは,葯長,葯頂部の裂開,基部の裂開の変異の28-46,13-32,16-27%をそれぞれ説明した.また,それぞれの形質について,4,3,6個のエピスタティックに作用する遺伝子座のペアが検出された.戻し交雑自殖系統群で検出されたQTLの効果を日本晴/カサラースの染色体断片置換系統群(CSSLs)で検討したところ,多くのQTLでその効果を確認することができた.これらの結果は,今回の実験で検出されたQTLを利用して葯長や葯の裂開長を育種的にコントロールすることが可能であることを示している.現在,さらに詳しいマッピングを行うために,日本晴と比較して葯の裂開長が有意に異なるCSSLsを対象に,日本晴の戻し交雑を行い,F2の形質調査を進めている.イネの高温大勢に強くかかわる葯基部の裂開の長さの決定に関与する遺伝子座の位置および裂開の大きさが決定される仕組みを明らかにすることを目的として,日本晴/カサラースの戻し交雑自殖系統群(BILs)および日本晴/カサラース染色体断片置換系統(CSSLs)を対象に,グロスチャンバー内に設定した高温条件下での葯の裂開特性と稔実に関するQTL解析を行った.BILsを用いた解析から,葯基部の裂開にかかわる遺伝子座が第2染色体上に検出され,その寄与率は12%であった.また,その効果はCSSLsによって確認された.この遺伝子座における対立遺伝子の相加効果は, BILsで40.0μmであり, CSSLsで132.7μmであった.圃場におけるこれまでの研究報告に照らして,高温条件下における稔実を6.220.5%向上させる可能性のあることが示された.同様に, BILsを用いた解析から,葯の頂部の裂開に関与するQTLが第5および第12染色体上に検出され,そのうち,第5染色体上のQTLの効果がCSSLsによって確認された.葯基部の裂開の長さに関与するQTLは,高温条件下での稔実率を対象としたQTL解析では検出されなかった.また, BILs内では,高温条件下における葯基部の裂開長と稔実率との間に有意な相関関係が認められた.これにより,稔実率だけでなく,個別の高温耐性形質に関するQTL解析やそれに基づく育種は,高温耐性の向上に有効であることが示された.ほぼ予定通りQTLの解析が進んでいるため.得られた結果を論文として公表するに至っていない.日本晴/カサラースのBILsの葯の裂開に関する形質及びそのQTL解析の結果に年次変動が確認された.

そこで,人工気象器内の高温条件で,葯の裂開特性に関するQTL解析を行い,高温条件下におけるQTLの効果を確認する実験を当初予定していた,葯の形態形成・裂開特性に関するマイクロアレイ解析と並行して行う.分担者と連絡を緊密に取り合い,速やかに論文かするための努力をする.
組織工学を用いた接着性レジン上に歯周組織再生を伴う垂直破折歯根接着治療法の開発

垂直歯根破折歯の接着治療法の成功率向上のため、破折部を修復したレジン上に歯周組織再生を目指して実験を行った。レジンと象牙質粉末、及びβ-TCPを混ぜた試料の細胞増殖性の検討では細胞増殖がみられた。rhBMP-2を塗布した試料を培養細胞シートで被覆し動物の皮下に埋植し組織学的評価を行った。象牙質含有試料周囲は線維に被包された。rhBMP-2を塗布したβ-TCP含有試料上に硬組織形成が観察され、レジン上に歯周組織再生の可能性が見出された。これまでの基礎的研究により、象牙質含有レジン上にはわずかにセメント質形成が観察され、レジン上に歯周組織再生の可能性があることを見出した。この可能性は、骨誘導を強力に促進するBMP-2と多量の歯根膜細胞が存在すれば、さらに高めることができると考えられる。本研究は、象牙質を含有する4-META/MMA-TBBレジンにBMP-2と培養歯根膜細胞シートを応用し、レジン上に歯周組織再生の実現を目的として行われるものである。生体親和性が良好である接着性レジンセメントに同一個体から得られた象牙質を粉末にして混合し、作製した象牙質含有レジン上へセメント質再生を促進させる方法を採用し、骨様硬組織誘導能をもつBMP-2を塗布した象牙質含有レジンに大量の歯根膜細胞を供給することにより再生を促進させることを期待して行うものである。そこで、細胞の流失を最小限に抑制するために、細胞シートを作製し移植法を採用する。22年度は、象牙質含有レジン作製し、MC3T3-E1細胞を播種し、細胞の付着性をSEMで確認した。また、F344ラット(6週齢)の歯根膜を採取し、付着性細胞を10%FBS、1%抗生物質添加のMEMで培養を行った。その後同じ細胞1.3×10^6cellを1日、3日、5日目にベースに追加播種し、それを開始してからは、培地をascorbic acid(50μg/ml)、10mM β-glycerophosphate,100nM dexamethasonを添加したosteogenic mediumに変更した。培養7日後にスクレーパーにて細胞シートをディッシュより剥離した。これよりゲル状の細胞塊を得たが、シート状にするためには更なる検討が必要である。現在、強固な歯根膜細胞シートの作製のため、培養期間、細胞数などを検討し、実験を継続中である。23年度は、F344ラット(6週齢)の歯根膜を採取し、細胞シートを作製した。象牙質含有レジンをEDTAで脱灰後にrhBMP-2を塗布、細胞シートで被覆しラット皮下に埋入した。H-E染色で顕微鏡観察したところ、著明な炎症は見られなかったが、周囲に線維の被包が観察された。硬組織形成はほとんど観察されなかった。さらに象牙質含有レジンをEDTAで脱灰後にrhBMP-2を塗布、ヌードマウス皮下に埋入した。その結果、BMP-2のみ塗布した象牙質含有レジン周囲には硬組織形成は観察されなかった。現在、BMP-2を塗布した象牙質含有レジンを細胞シートで被覆し、ヌードマウス皮下に埋入した組織標本を作製、観察中であるこれまで象牙質含有レジン上にはわずかにセメント質形成が観察され、レジン上に歯周組織再生の可能性があることを見出した。この可能性は、骨誘導を強力に促進するBMP-2と多量の歯根膜細胞が存在すれば、さらに高めることができる。本研究は、象牙質を含有するレジンにBMP-2と培養細胞シートを応用し、レジン上に歯周組織再生の実現を目的として行われた。

生体親和性が良好である接着性レジンセメントに象牙質粉末を混合した象牙質含有レジン上へセメント質再生を促進させる方法を採用し、骨様硬組織誘導能をもつBMP-2を塗布し、大量の細胞を供給することにより再生を促進させることを期待して行った。24年度は、Jcl:Wistar系ラット(3週齢)の大腿骨骨髄を採取し10%FBS,10%抗生物質添加のMEMにて培養を行い細胞シートベースを作製した。その後1日,3日,5日目にベースに追加播種することで多層シートの作製を行った。追加播種を開始してからは、培地をascorbic acid(50μg/ml),10mM β-glycerophosphate 100nM dexamethasonを添加したosteogenic mediumに変更した。培養7日後にスクレーパーにて細胞シートをディッシュより剥離した。象牙質含有レジンを作製し、表面にBMP-2を塗布し細胞シートで被覆しヌードマウス(BALB/cAJcl-nu/nuJcl8週令オス)頭蓋骨面に移植した。5週間後に屠殺し、組織標本を作製・HE染色しレジン及び周囲組織を観察した。レジン周囲に線維の被包が観察された。さらに象牙質およびβ-TCP含有レジンを作製し表面にBMP-2を塗布し細胞シートで被覆し、ヌードマウスの皮下に移植した。4週間後に屠殺し組織標本を作製・HE染色し、レジン及び周囲組織を観察した。β-TCP含有レジン上には骨様組織が観察された。1:歯根膜細胞培養中に細胞が死滅したため、細胞シートの作成に遅延が生じた2:採取できる細胞が少ないため、細胞が増殖しない事例があった。3:組織標本で線維の被包が観察された。シートで被覆したが、BMP-2が根面に十分に付着しづらく、細胞が付着・増殖できなかった可能性がある24年度が最終年度であるため、記入しない。細胞の採取を行いやすいラット骨髄細胞を培養し、細胞シートを作製する。それを用いて、ヌードマウスの皮下に埋入し、骨様組織の形成や周囲の細胞動態を観察し、再生の可能性を探る。BMP-2を根面に十分に付着させ、細胞を大量に供給するために、コラーゲンスポンジなどのスキャフォールドの導入を検討している24年度が最終年度であるため、記入しない。
共鳴トンネルアクティブ伝送線路とそれを用いたTHz信号生成・処理技術

共鳴トンネル素子を装荷した伝送線路におけるTHz帯域増幅器の可能性について検討した。共鳴トンネルダイオードは直列ペア構成とし、その接続点を信号線に接続することにより、広い線形範囲を得た。この構造の安定性について検討し、右手/左手系複合伝送線路構造の利用を提案した。回路シミュレーションにより、この提案の可能性を調べ、非常に広い周波数範囲でゲインが得られることを示した。さらに、これらのアクティブ伝送線路を用いて高性能な高調波発振器が得られる可能性を明らかにした。THzアンプの実現を目指し、共鳴トンネル分布定数線路の理論的、及び、シミュレーションによる検討を行った。ここでは、特に、ゲイン、安定性、周波数帯域と、素子パラメータの関係に着目した。この構成は損失のある伝送線路と同じであるが、負性抵抗により、損失が負、つまりゲインを持つことになる。しかし、共鳴トンネルダイオードはdcからTHz領域まで負性抵抗を示すため系が不安定になりやすい。また、共鳴トンネルダイオードの負性抵抗領域は電圧的には限られているので線形性を維持することも難しい。我々はこれに対して相補的にバイアスした共鳴トンネルダイオードペアを用いることにより、安定した特性が得られることを示した。また、共鳴トンネルダイオードペア分布定数線路のバイアス回路について検討し、その安定動作条件を明らかにした。次に、アンプの帯域幅を決める要素について検討を進め、ユニットセルの大きさと帯域幅に明瞭な関係があることを見出した。シミュレーションによれば、1平方μm程度のエミッタ面積を持つ共鳴トンネルダイオードを用いることにより、1THzを越える帯域の信号増幅が可能であった。上記と並行して、デバイスプロセスの再検討も行った。エアブリッジ配線の採用により、従来の共鳴トンネルダイオードで問題であった、エミッタ-コレクタ間の寄生容量を低減することが可能となった。さらに、これを用いた共鳴トンネル分布定数線路の設計・試作を行った。今後、高周波特性の評価を行う予定である。本研究の目的は、共鳴トンネル素子(RTD)を分布定数化したアクティブな非線形伝送線路と、それを用いたTHz信号生成・処理技術の可能性を開拓することにある。RTDはTHzを超える高速性を持つ高周波デバイスであり、最近THz領域の信号源としての可能性が注目を集めている。本研究では入出力分離が困難と言うRTDの問題点を解決し、その高速性を活かすため、RTDを配置した非線形伝送線路に着目し、研究を進めている。本年度は、昨年に引き続き、寄生成分、特にエミッタの寄生容量、コレクタ抵抗を低減したRTDを実現するための作製プロセスの検討を行った。昨年度の検討では、エミッタ引き出し電極形成工程において、エアブリッジ配線をウエットエッチングで形成したことが歩留まりを悪化させる原因となっていた。そのため、ハードベークしたレジストを利用した2層配線構造を導入することを検討した。その結果、ウエハの端を除けば、100%に近い歩留まりが得られるようになった。ハードベークしたレジストは後にアッシングで除去することも可能であり、それにより、さらに容量を小さく出来る。上記と並行して、RTDペアを装荷した伝送線路の安定性に関して検討を進めた。特に、負性抵抗部分にバイアスが可能であるための条件と、発振を防ぐための条件を詳細に検討した。その結果、Composite Right/Left Handed(CRLH)伝送線路構成の導入により、ゲインの増大と安定動作の両立が可能となることを見出した。この構成について、現実的な素子パラメータを用いたシミュレーションを行い、その基本動作を確認した。本研究では入出力分離が困難と言うRTDの問題点を解決し、その高速性を活かすため、RTDを配置した非線形伝送線路に着目し、研究を進めた。まず、直列接続共鳴トンネル素子を用いた非線形伝送線路の基本特性の実証を目的として試作を行った。しかし、共鳴トンネルダイオードのエミッタ構造の作製工程において、異常エッチングが生じ、コレクタ層が失われるという問題が生じた。この問題は、単体の共鳴トンネルダイオード試作では生じておらず、その原因を詳しく検討した。その結果、エッチング中に配線金属を通して異常電流が流れ、これがエッチングを促進していることが明らかになった。現在、この問題を解決した新しいマスクパターンで試作を行っているところである。次に、高周波化が容易で負荷変動に強い高調波発振器として、アクティブ伝送線路の利用を検討した。アクティブ伝送線路の両端で意識的に反射を起こすことにより、線路長を半波長とする発振が生じる。この回路において、共鳴トンネル素子を装荷する位置を変えることにより、発振信号の高調波成分の割合が変化することを見出した。特に、構造によっては、かなり次数の高い高調波が得られる可能性があることが分かった。
看護必要度と看護師の労働負担評価に基づいた運動器障害予防対策に関する研究

病棟看護師の調査時点腰痛訴え率は、女58%男46%、過去1か月の腰痛は女75%男63%、頸痛は女29%男16%、肩痛は女37%男21%、腕痛は女10%男6%、背痛は女26%男19%であった。身体的につらい作業は、男女とも、移乗介助、おむつ交換、体位変換・ベッド上移動、排泄介助、入浴介助が上位だった。病棟別の看護必要度と筋骨格系症状訴え率の相関は、A項目のうち「創傷処置」「血圧測定5回以上」「点滴ライン同時3本以上あり」「シリンジポンプの使用あり」「輸血や血液製剤の使用あり」で負相関を認め、全B項目で正相関を認めた。看護必要度は筋骨格系障害予防のリスクアセスメントに活用できると考えられた。平成25年度は、2大学病院、6民間病院の看護師計2134人を対象に、労働と腰痛に関する質問紙調査を実施した。また、計56病棟の看護必要度データを収集し、病棟別の自覚症状訴え率との関連を検討した。回収数(率)は1549人(73%)、性別の有効回答数は女性1434人、男性102人、平均年齢はそれぞれ33.3歳と29.6歳であった。調査時点の腰痛有訴率は女性57.4%・男性48.0%で、うち「時々休憩が必要な」あるいは「休憩するほどではないがかなり痛い」腰痛の訴え率は男女とも30%、過去1か月の腰痛(いつも+時々)有訴率は、女性74.0%・男性62.7%であった。介護職員と同程度に高い有訴率だが、腰痛での休業経験は女性7.5%、男性9.8%であり、痛みを抱えながら仕事をしている様子が伺われた。身体部位別の痛み有訴率は、女性で頸29.4%・肩36.7%・腕10.0%、男性で頸13.7%・肩19.6%・腕4.9%と、女性の方が約2倍高かった。看護師では、腰痛のみならず頸・肩・腕部痛に対する対策も必要であると考えられた。2大学病院の全病棟と1民間病棟の一部は2交替制勤務、その他の民間病院の病棟では3交替制勤務であった。2大学病院の全病棟は看護基準が7:1であったが、民間病院では看護基準13:1や15:1の回復リハビリ病棟や、看護基準10:1の慢性期・療養型病棟が含まれていた。看護必要度のB項目の点数が高い病棟の看護師は腰痛訴え率が高い傾向にがあったが、診療科目、交替制勤務の種類、勤務日数などの要因を考慮した詳細な分析が必要である。なお、平成24年度の調査結果の一部は、釜山(韓国)で7月10に開催された第8回作業関連性運動器障害予防の国際科学会議(PREMUS)のシンポジウム(第3回作業関連性運動器障害に関する日韓共同シンポジウムを兼ねる)にて発表した。H24年度は、次年度のパイロット調査として、某大学附属病院(以下、A大学病院)および某民間病院(以下、C民間病院)の病棟に勤務する全看護師を対象に、労働と運動器障害の実態に関する質問紙調査を行い、調査実施時期の病棟別の看護必要度のデータと自覚症状等との関連を検討した。回収率は、A大学病院69%、C民間病院80%。A大学病院およびC民間病院における調査時点での腰痛有訴率はそれぞれ47%・58%、過去1ヶ月の腰痛有訴率は68%・75%、身体部位別の痛み有訴率は頸23%・29%、肩32%・37%、腕6%・9%、背21%、25%であった。腰・頸・肩の痛み有訴率は、過去に腰痛や頸肩腕障害が多発している介護職員、障害児学校教員、手話通訳者等と同等もしくはそれ以上の高さであった。看護必要度との関連を検討したところ、頸・肩・腕痛訴え率は、A項目との関連が乏しく、B項目との関連が認められる傾向があったが、腰痛訴え率に関しては一定の傾向を認めなかった。次年度の対象者数を増やした調査でさらに検討する予定である。その他、チェックリスト作成の基礎資料を得るため、A大学病院の2病棟およびB大学病院の3病棟を対象に職場巡視を実施した。また、海外の資料を収集(一部翻訳)し、さらに第2回作業関連性運動器障害日韓合同シンポジウム(ソウル、8月12日)に参加して、韓国の研究者と情報交換を行った。

本研究により、看護管理と労働衛生の観点から、看護師の運動器障害予防対策に看護必要度のデータをいかに活用できるか検討し、看護師が長く健康に働き続けられるような対策を提案することにつなげたい。【2014年度】前年度に実施した質問紙調査および看護必要度のデータについて解析し、学会にて発表。また、年度内に日程調整できた2協力病院に対し、結果報告を兼ねた腰痛予防研修会を実施し、看護必要度B項目のデータを活用した腰痛予防に関するリスクアセスメントを提案。最終報告書を冊子にまとめ、ホームページにアップした。【研究期間全体を通じて実施した研究成果】1.看護師の労働と健康の実態調査について質問紙調査の結果、病棟看護師における調査時点の腰痛訴え率は、女57.9%、男46.1%、過去1か月の腰痛訴え率(いつも+時々)は女75.0%、男62.9%であった。過去1か月の頸部痛は女29.2%、男15.7%、肩部痛は女37.3%、男21.3%、腕部痛は女10.2%、男5.6%、背部痛は女26.4%、男19.1%と、女性では男性の約1.52倍の高さであった。女性の約半数は、薬を毎日もしくは時々服用しており、薬の種類は64%が鎮痛剤であった。身体的につらい作業は、男女ともに、移乗介助、おむつ交換、体位変換・ベッド上移動、排泄介助、入浴介助の5項目が上位に挙がった。2.看護師の運動器障害予防対策における病棟別看護必要度の活用病棟別の筋骨格系症状訴え率と看護必要度との相関を検討すると、A項目は、「創傷処置」「血圧測定5回以上」「点滴ライン同時3本以上あり」「シリンジポンプの使用あり」「輸血や血液製剤の使用あり」において、いずれかの筋骨格系症状訴え率と負の相関を認めた。B項目は、全項目において、いずれかの筋骨格系症状訴え率と正相関を認め、腰痛より頸肩腕痛の方が、相関が強い傾向にあった。入院患者の医療的な重症度を示すA項目よりも、患者の状況を示すB項目の方が、看護師の筋骨格系の負担を反映している可能性があり、B項目は筋骨格系障害予防のリスクアセスメントに活用できるものと考えられた。労働衛生いくつかの民間病院で質問紙調査の回収が遅くなったため、集計開始が当初の予定よりやや遅れ、データクリーニングに時間がかかった。全体集計は終了したものの、クロス集計や看護必要度との関連については、現在詳細な分析を進めている。運動器障害予防チェックリストの第1版の原案は作成中であり、協力病院でのパイロット的な使用はまだ実施していない。ほぼ予定どおりだが、H25年度に実施する質問紙調査の調査項目がまだ確定していない。また、C大学病院で実施した職場巡視の報告が未実施である。平成26年度は、質問紙調査のデータをさらに検討し、また、現場で使用可能な運動器障害予防対策チェックリスト第1版を完成させた上で、調査対象病院に出向き、結果報告会を行う。チェックリストは実際の使用と評価を依頼し、バージョンアップを図る。可能なところは運動器障害予防研修会を兼ねて実施し、本研究が各病院の安全衛生管理の向上と、看護師が長く健康に働き続けられるような対策立案に貢献できるように努める。本研究の成果は、日本産業衛生学会および社会医学会にて発表し、論文を執筆・投稿する。また、公開可能な成果物は教室のホームページにアップする予定である。また、厚生労働省が中央労働災害防止協会に委託して行う医療機関を対象とした腰痛予防対策事業について、その教材作成に協力する予定である。当初の計画通り、大学病院と民間病院の病棟に勤務する看護師(計50病棟、約1500人)を対象に質問紙調査を行い、運動器障害と労働の実態を明らかにするとともに、調査実施時期(67月)の病棟別の看護必要度のデータを収集し、運動器障害との関連を検討する。現時点で、A大学病院、B大学病院およびC民間病院で実施できる見込みであるが、大阪府の4民間病院と兵庫県の1民間病院にも協力をお願いする予定で、準備を進めている。調査内容および収集する看護必要度の項目の決定は、6月には完了し、調査方法は前年度と同様とする。
早期の心筋障害に関する法医病理学的研究

法医病理学において急死の原因を正確に診断することは重要な課題である.急死の原因としては心筋梗塞などの虚血性心疾患が多いとされているが,これらの早期虚血性心筋障害の剖検診断は極めて困難である.そこで我々は,長崎大学医学部法医学教室で剖検された内因または外因により死亡した63例について,心筋組織を通常のHE染色,PTAH染色で観察し,さらに障害時に心筋細胞内に発現すると考えられる細胞間接着因子Fibronectinと補体成分C9,逆に逸脱すると考えられる心筋特異タンパクTroponin Iに対する抗体を用い,各々免疫組織化学染色を行い観察した.その結果,これらのマーカーの染色像は症例によりいろいろな染色パターンを示した.このことは,心筋障害時におけるこれらのマーカーの動態を鋭敏に反映しているものと考える.次に,我々は免疫組織化学的手法を用い74例の法医剖検によって得られた心臓において,左心室の組織切片から早期虚血性心筋障害を検出するために心筋細胞におけるcomplement component C9の発現様態を検討した.その結果,心筋細胞におけるC9陽性像は,早期虚血性心筋障害の剖検診断として信頼性が高く,かつ感受性の高いマーカーであると考えられた.さらに,1年以上の長期間ホルマリン固定されていた11例でも,C9の染色性にまったく影響が認められなかった.以上のことにより,我々が指標としたC9を用いた心臓の免疫染色は,法医実務において早期虚血性心筋障害を診断する際に,retrospectiveな分析を行うことができ,単純かつ有用な方法であると考える.法医病理学において急死の原因を正確に診断することは重要な課題である.急死の原因としては心筋梗塞などの虚血性心疾患が多いとされているが,これらの早期虚血性心筋障害の剖検診断は極めて困難である.そこで我々は,長崎大学医学部法医学教室で剖検された内因または外因により死亡した63例について,心筋組織を通常のHE染色,PTAH染色で観察し,さらに障害時に心筋細胞内に発現すると考えられる細胞間接着因子Fibronectinと補体成分C9,逆に逸脱すると考えられる心筋特異タンパクTroponin Iに対する抗体を用い,各々免疫組織化学染色を行い観察した.その結果,これらのマーカーの染色像は症例によりいろいろな染色パターンを示した.このことは,心筋障害時におけるこれらのマーカーの動態を鋭敏に反映しているものと考える.次に,我々は免疫組織化学的手法を用い74例の法医剖検によって得られた心臓において,左心室の組織切片から早期虚血性心筋障害を検出するために心筋細胞におけるcomplement component C9の発現様態を検討した.その結果,心筋細胞におけるC9陽性像は,早期虚血性心筋障害の剖検診断として信頼性が高く,かつ感受性の高いマーカーであると考えられた.さらに,1年以上の長期間ホルマリン固定されていた11例でも,C9の染色性にまったく影響が認められなかった.以上のことにより,我々が指標としたC9を用いた心臓の免疫染色は,法医実務において早期虚血性心筋障害を診断する際に,retrospectiveな分析を行うことができ,単純かつ有用な方法であると考える.法医病理学において急死の原因を正確に診断することは重要な課題であり,特に急性心臓死や乳幼児突然死症候群など死亡原因が十分明らかにされていない例ではその機序の解明が急がれている.法医剖検例のうち死後24時間以内に剖検された内因死または外因死症例についえFibronectin,C9,TroponinIを用いて,免疫組織化学的に心筋の障害部位,程度並びに心筋障害の時期について検討した.対象は(1)内因死症例として,剖検時明らかな梗塞巣が認めれらた5例,心筋梗塞が疑われた6例,肺炎・心筋炎等の12例,乳幼児急死症例12例(2)外因死症例として,窒息死(溺死,絞・扼頚,縊頚)13例,ショック死及び失血死5例,頭部外傷10例の合計63例である.組織標本は,心臓の左心室前壁,心室中隔および右心室壁より組織片を採取し,パラフィン包埋後連続切片を作製した.染色法は,一般染色としてH.E染色,PTAH染色を行い,また免疫組織化学的染色として抗Fibronectin抗体,抗C9抗体,抗体Troponin I抗体を用い,ABC法にて染色を行った.免疫組織化学的染色の染色動態は,全く陽性像が認めれれないもの,少数のsingle myocardial cellが散在的に陽性像を示すもの,陽性像が集積して認められるものといった3つのグループに大別され,心筋障害の程度を反映するものと考える.また,Fibronectin,C9,Troponin Iの染色像は同一症例でも異なった結果を示し,症例によっては一部の抗体にのみ陽性像が発現するものが認められた.このことは心筋障害時における発現時間の違いによるものと考える.これらの内,C9は早期の心筋障害と考えられる例でもその発現が認められた.なお,頭部外傷3例,縊頭1例及び乳幼児突然死症候群3例においてはいずれの抗体においても陽性像は認められなかった.法医病理学において急死の原因を正確に診断することは重要な課題である.急死の原因としては心筋梗塞などの虚血性心疾患が多いとされているが,これらの早期虚血性心筋障害の剖検診断は極めて困難である.本研究で我々は,免疫組織化学的手法を用い74例の法医剖検によって得られた心臓において,左心室の組織切片から早期虚血性心筋障害を検出するために心筋細胞におけるcomplement component C9の発現様態を検討した.

剖検心を肉眼所見に基づいて3つのグループに分けた.即ち,明らかな心筋梗塞が認められたか,疑われた31例では28例(90%)にC9陽性像が観察された.冠状動脈に病変がなく,肉眼的にも冠状動脈硬化が認められなかった内因性急死15例中,3例がC9陽性を示した.これらは,死戦期に虚血状態が遷延したと考えられる症例であった.しかし,心臓に起因しない内因死28例では,まったくC9陽性像は認められなかった.これらの結果より,心筋細胞におけるC9陽性像は,早期虚血性心筋障害の剖検診断として信頼性が高く,かつ感受性の高いマーカーであると考えられた.さらに,1年以上の長期間ホルマリン固定されていた11例でも,C9の染色性にまったく影響が認められなかった.以上のことより,我々が指標としたC9を用いた心臓の免疫染色は,法医実務において早期虚血性心筋障害を診断する際に,retrospectiveな分析を行うことができ,単純かつ有用な方法であると考える.
低施肥栽培を目指した土壌微生物によるプライミング効果発現機構の解明

多量の畜産廃棄物を排出する我が国では、炭素貯留と資源リサイクルを両立させる堆肥化利用が必須である。申請者は易分解性有機物の添加によって増殖した微生物が、難分解性有機物の分解を促進し(プライミング効果)、養分(窒素・リン)を放出することを示してきた。プライミング効果を応用すれば、堆肥の利用効率を高める新たな環境保全型農業技術を開発することができる。本課題では、安定同位体プローブ法および遺伝子解析技術を用いて、1プライミング効果による難分解性有機物からの養分放出を実証し、2プライミング効果を駆動する微生物群集および最適環境条件を特定した上で、3栽培試験によって低施肥技術としての有効性を検証する。
グリア細胞に存在するNMDA受容体の機能解析

哺乳類の中枢神経系において、グルタミン酸は主要な興奮性神経伝達物質であり、記憶・学習などの脳高次機能に重要な役割を果たしている。グルタミン酸は、グルタミン酸受容体を介してその作用を発揮するが、神経細胞だけでなくグリア細胞にもグルタミン酸受容体が存在することが知られている。しかし、グリア細胞に存在するグルタミン酸受容体の機能的役割は、不明な点が多い。本研究では、グルタミン酸受容体のサブタイプの中で、神経回路網の形成、シナプス伝達の可塑性、神経細胞死などに深く関与することが知られているNMDA受容体に焦点をあて、グリア細胞に存在するNMDA受容体(網膜のミューラー細胞、小脳のバーグマングリア細胞、大脳皮質アストロサイトに存在)の機能的役割を、グリア細胞特異的にNMDA受容体を欠損させたマウスを作成し、解明する。今年度は、網膜に焦点を絞り、網膜ミューラー細胞特異的にNMDA受容体NMDAR1を欠損マウスさせたマウスを作成し、網膜の発達、網膜神経細胞死に対するグリア細胞に存在するNMDA受容体の機能を解析した。現在までにグリア細胞からの領域特異的なNMDAR1の消失と、正常な網膜の発達、虚血障害に対する脆弱性を確認している。したがってグリア細胞に発現するNMDA受容体は、網膜の発達には大きな役割を果たしていないが、神経変性時には神経細胞保護的にはたく。これはNMDA受容体の活性化によりCREBがリン酸化され、神経栄養因子であるNT3の転写を促進し、ミューラー細胞から放出されたNT3が神経節細胞に対し保護的に作用することによることを明らかにした。また、網膜電位図の解析から、ミューラー細胞に存在するNMDA受容体は視細胞-双極細胞間のシナ伝達にとって重要な役割を果たすことがわかった。したがってグリア細胞に発現するNMDA受容体は、網膜の発達には大きな役割を果たしていないが、神経変性時には神経細胞保護的にはたらく可能性が考えられ、現在はこのメカニズムについて検討中である。また今後は網膜の光伝達・情報処理ににおける同受容体の生理学的役割についても検討を行う予定である。
発展途上国における持続可能な都市交通システム構築における交通需要管理政策の評価法に関する研究

発展途上国において持続可能な都市交通システムを構築するには,公共交通機関の整備や土地利用の改変などの長期的対策と料金施策などの短期的対策を同時に推し進め,交通需要を的確にコントロールしてゆく必要がある.そのためには,急激に進展するモータリゼーションの動向を的確に予測することが特に重要となる.そこで,今年度は,これまでのアプローチを踏襲し,各世帯における自動車保有台数を記述・予測するモデルを構築し分析を行った.構築したモデルは,二輪車・自動車保有台数同時決定モデルであり,これにより,途上国における二輪車と自動車保有の代替・補完関係や,モータリゼーションの進展に伴うその構造変化を捉えることが可能となる.また,別途構築した交通手段選択モデルなどから計算されるアクセシビリティ指標を説明変数として用いることにより,交通インフラの整備水準やその空間的配置が及ぼす影響を行動論的に解釈することが可能となっている.モデルの推定には,バンコク,クアラルンプール,マニラで収集された行動日誌データに加え,急激なモータリゼーションを経た名古屋において1970年代から収集された4時点の行動日誌データを用い,主にモータリゼーションの動的推移や地域格差に着目して分析を行った.その結果,1)自動車・二輪車の保有は途上国においては代替関係にあるが,名古屋ではモータリゼーションの初期段階においても両者の関連性は低く,文化的背景などが大きく影響していると思われる,2)公共交通機関へのアクセシビリティが低い場合や,全ての交通機関と公共交通機関単独によるアクセシビリティの差が大きい場合に自動車・二輪車保有が助長される,3)モータリゼーションの動的推移については,世帯レベルでは地域間での画一的が低いため,モデルの地域移転に際しては,経済状況や地域格差に応じた補正が不可欠である,等の知見が得られた.発展途上国における急激なモータリゼーションの進展は,交通渋滞の問題だけでなく,エネルギー環境問題を通して人類全体の持続可能性の脅威となっている.これを解決するためには,公共交通機関の整備や土地利用の改変などのハード面における長期的対策とともに,自動車利用に依存する交通行動に直接働きかける交通需要管理(TDM)政策などのソフト的対策を同時に推し進めてゆく必要がある.そこで本研究では,まず,当研究グループが構築した,世帯ベースでの自動車・二輪車の保有及び交通手段の同時選択モデルを用いて,バンコクを対象に各種交通政策の効果をシミュレートした.その結果,ロードプライシングで得た収入をバス運賃補助に活用するような「アメとムチ」型の交通政策や,土地利用の改変とロードプライシングを組み合わせたような「パッケージ型」のアプローチを採用することにより,交通量及び環境負荷が大幅に削減可能であることが明らかとなった.上述のモデルは,1時点のクロスセクショナルデータに基づいて構築したモデルであるため,特に自動車保有等の長期的意思決定に基づく交通需要の推移を厳密に表現し得るものではない.そこで,次に,急激なモータリゼーションを経た先進国の例として名古屋に着目し,1970年代からの3時点の行動日誌データを用いて,自動車・二輪車保有行動の基礎的な分析を行った.併せて,バンコク及びクアラルンプールのデータについても同様の分析を行い,それらの比較を通じて,自動車・二輪車保有に何らかのトレンドがあるか否かを検討した.その結果,いずれのデータにおいても自動車・二輪車保有台数は,世帯における就業者数と最も相関が高く,また,経済が成熟するにつれ,二輪車から自動車保有へとシフトする傾向がある,等の知見が得られた.発展途上国において持続可能な都市交通システムを構築するには,公共交通機関の整備や土地利用の改変などの長期的対策と料金施策などの短期的対策を同時に推し進め,交通需要を的確にコントロールしてゆく必要がある.そのためには,急激に進展するモータリゼーションの動向を的確に予測することが特に重要となる.そこで,今年度は,これまでのアプローチを踏襲し,各世帯における自動車保有台数を記述・予測するモデルを構築し分析を行った.構築したモデルは,二輪車・自動車保有台数同時決定モデルであり,これにより,途上国における二輪車と自動車保有の代替・補完関係や,モータリゼーションの進展に伴うその構造変化を捉えることが可能となる.また,別途構築した交通手段選択モデルなどから計算されるアクセシビリティ指標を説明変数として用いることにより,交通インフラの整備水準やその空間的配置が及ぼす影響を行動論的に解釈することが可能となっている.モデルの推定には,バンコク,クアラルンプール,マニラで収集された行動日誌データに加え,急激なモータリゼーションを経た名古屋において1970年代から収集された4時点の行動日誌データを用い,主にモータリゼーションの動的推移や地域格差に着目して分析を行った.その結果,1)自動車・二輪車の保有は途上国においては代替関係にあるが,名古屋ではモータリゼーションの初期段階においても両者の関連性は低く,文化的背景などが大きく影響していると思われる,2)公共交通機関へのアクセシビリティが低い場合や,全ての交通機関と公共交通機関単独によるアクセシビリティの差が大きい場合に自動車・二輪車保有が助長される,3)モータリゼーションの動的推移については,世帯レベルでは地域間での画一的が低いため,モデルの地域移転に際しては,経済状況や地域格差に応じた補正が不可欠である,等の知見が得られた.
咬合障害を与えたラットの前頭皮質ドーパミン放出は精神的ストレスに起因する

ラットに咬合障害を付与した群と対照群で摂食時の前頭皮質ドーパミン放出量の測定を脳内マイクロダイアリシス法によって行った.その結果,咬合障害群は対照群に比較して摂食後ドーパミン放出量の有意な増加が認められた.そこでドーパミン放出量の上昇が精神・心理的ストレスによることを検証するために,抗不安薬を投与した際の摂食時ドーパミン放出量に対する影響を咬合障害群と対照群で比較した.また,抗不安薬の投与の手技による影響を調べるために,生理食塩水を投与した際の摂食時ドーパミン放出量に対する影響を調べた(咬合障害群と対照群).ベンゾジアゼピン系薬物は中脳皮質ドーパミン系の賦活を抑制するとされている.また,ジアゼパムは歯科臨床でも咬合神経症のような症例に対して用いられている.以上を踏まえて,本研究では,抗不安薬としてベンゾジアゼピン系薬物のジアゼパムを選択した.咬合障害群と対照群にジアゼパムを腹腔内投与した結果,摂食を行っても前頭皮質ドーパミン放出量の有意な増加は両郡ともに認めず,統計処理をおこなっても群間に有意な差は認めなかった.このことはジアゼパムにより前頭皮質ドーパミン放出量の増加が抑制されたことを示している.また,両郡に生理食塩水を投与し測定した結果,咬合障害群は対照群に比較して摂食後に前頭皮質ドーパミン放出量の増加が確認された.さらに,生理食塩水では咬合障害群のドーパミン放出量を抑制しないこと,そして腹腔内投与という方法自体が対照群のドーパミン放出量に影響を与えないことから,ラット咬合障害は,精神・心理的ストレスを惹起することが実験的に立証された.ラットに咬合障害を付与した群と対照群で摂食時の前頭皮質ドーパミン放出量の測定を脳内マイクロダイアリシス法によって行った.その結果,咬合障害群は対照群に比較して摂食後ドーパミン放出量の有意な増加が認められた.そこでドーパミン放出量の上昇が精神・心理的ストレスによることを検証するために,抗不安薬を投与した際の摂食時ドーパミン放出量に対する影響を咬合障害群と対照群で比較した.また,抗不安薬の投与の手技による影響を調べるために,生理食塩水を投与した際の摂食時ドーパミン放出量に対する影響を調べた(咬合障害群と対照群).ベンゾジアゼピン系薬物は中脳皮質ドーパミン系の賦活を抑制するとされている.また,ジアゼパムは歯科臨床でも咬合神経症のような症例に対して用いられている.以上を踏まえて,本研究では,抗不安薬としてベンゾジアゼピン系薬物のジアゼパムを選択した.咬合障害群と対照群にジアゼパムを腹腔内投与した結果,摂食を行っても前頭皮質ドーパミン放出量の有意な増加は両郡ともに認めず,統計処理をおこなっても群間に有意な差は認めなかった.このことはジアゼパムにより前頭皮質ドーパミン放出量の増加が抑制されたことを示している.また,両郡に生理食塩水を投与し測定した結果,咬合障害群は対照群に比較して摂食後に前頭皮質ドーパミン放出量の増加が確認された.さらに,生理食塩水では咬合障害群のドーパミン放出量を抑制しないこと,そして腹腔内投与という方法自体が対照群のドーパミン放出量に影響を与えないことから,ラット咬合障害は,精神・心理的ストレスを惹起することが実験的に立証された.ラットに咬合障害を付与した群と対照群で摂食時の前頭皮質ドーパミン放出量の測定を脳内マイクロダイアリシス法によって行った.その結果,咬合障害群は対照群に比較して摂食後ドーパミン放出量の有意な増加が認められた.そこでドーパミン放出量の上昇が精神・心理的ストレスによることを検証するために,抗不安薬を投与した際の摂食時ドーパミン放出量に対する影響を咬合障害群と対照群で比較した.また,抗不安薬の投与の手技による影響を調べるために,生理食塩水を投与した際の摂食時ドーパミン放出量に対する影響を調べた(咬合障害群と対照群).ベンゾジアゼピン系薬物は中脳皮質ドーパミン系の賦活を抑制するとされている.また,ジアゼパムは歯科臨床でも咬合神経症のような症例に対して用いられている.以上を踏まえて,本研究では,抗不安薬としてベンゾジアゼピン系薬物のジアゼパムを選択した.咬合障害群と対照群にジアゼパムを腹腔内投与した結果,摂食を行っても前頭皮質ドーパミン放出量の有意な増加は両郡ともに認めず,統計処理をおこなっても群間に有意な差は認めなかった.このことはジアゼパムにより前頭皮質ドーパミン放出量の増加が抑制されたことを示している.また,両郡に生理食塩水を投与し測定した結果,咬合障害群は対照群に比較して摂食後に前頭皮質ドーパミン放出量の増加が確認された.さらに,生理食塩水では咬合障害群のドーパミン放出量を抑制しないこと,そして腹腔内投与という方法自体が対照群のドーパミン放出量に影響を与えないことから,ラット咬合障害は,精神・心理的ストレスを惹起することが実験的に立証された.ラットに咬合障害を付与した群と対照群で摂食時の前頭皮質ドーパミン放出量の測定を脳内マイクロダイアリシス法によって行った.その結果,咬合障害群は対照群に比較して摂食後ドーパミン放出量の有意な増加が認められた.そこでドーパミン放出量の上昇が精神・心理的

ストレスによることを検証するために,抗不安薬を投与した際の摂食時ドーパミン放出量に対する影響を咬合障害群と対照群で比較した.また,抗不安薬の投与の手技による影響を調べるために,生理食塩水を投与した際の摂食時ドーパミン放出量に対する影響を調べた(咬合障害群と対照群).ベンゾジアゼピン系薬物は中脳皮質ドーパミン系の賦活を抑制するとされている.また,ジアゼパムは歯科臨床でも咬合神経症のような症例に対して用いられている.以上を踏まえて,本研究では,抗不安薬としてベンゾジアゼピン系薬物のジアゼパムを選択した.咬合障害群と対照群にジアゼパムを腹腔内投与した結果,摂食を行っても前頭皮質ドーパミン放出量の有意な増加は両郡ともに認めず,統計処理をおこなっても群間に有意な差は認めなかった.このことはジアゼパムにより前頭皮質ドーパミン放出量の増加が抑制されたことを示している.また,両郡に生理食塩水を投与し測定した結果,咬合障害群は対照群に比較して摂食後に前頭皮質ドーパミン放出量の増加が確認された.さらに,生理食塩水では咬合障害群のドーパミン放出量を抑制しないこと,そして腹腔内投与という方法自体が対照群のドーパミン放出量に影響を与えないことから,ラット咬合障害は,精神・心理的ストレスを惹起することが実験的に立証された.
敗血症進展における肝細胞増殖因子による生体防御機構とその分子基盤解析

敗血症病態ではHGFは炎症の場となるマクロファージに直接作用し、NF-κB活性化制御とともに炎症性サイトカインの産生を転写レベルで抑制する事が判明した。この際、HGFは抗炎症因子であるヘムオキシゲナーゼ1の発現を介して、急性腎不全、肺傷害、肝炎の発症を顕著に抑制する事がマウス敗血症モデルを用いた解析から明らかとなった。今回の検討から、マクロファージでのHGF-ヘムオキシゲナーゼ1経路の活性化が敗血症の病態改善に有効な治療戦略になる事が期待される。様々な感染症により惹起される敗血症は近年増加しており、多臓器不全に至る症例では致死率が高い。以上の病態はIL-I,IL-6,IL-18などの炎症性サイトカインを介した全身性炎症反応症候群(SIRS)によって惹起される。一方、生体には敗血症の進展を阻害する生体防御機構が備わっており、たとえば炎症時に誘導されるヘムオキシゲナーゼ1(HO-1)はSIRS病態を制御することで多臓器不全の進行を遅延させることが知られている。そこで今回、エンドトキシン(LPS)により敗血症を惹起したマウスを用いて、炎症病態におけるHGFによるHO-1誘導促進の可能性と、その意義について解析を行った。健常マウスにLPSを投与したところ、血中IL-1,IL-6,IL-18濃度が著しく上昇した。LPS投与後腎臓、肺、肝臓を組織学的に精査したところ、各臓器ともに炎症像、血栓形成といった所見が顕著に観察され、これに一致して多臓器不全が進行した。そこで、LPS処置マウスにHGFを投与したところ,LPS投与後尿細管上皮、肺・肝のマクロファージでのHO-1発現が高まること、HGFはLPSによるHO-1発現をさらに数倍に高める事が明らかとなった。以上に一致して、LPSによる血中IL-1,IL-6,IL-18濃度の上昇はHGFにより顕著に抑制された。その結果、各臓器のinjury scoreはHGF投与群では有意に低下していた。最後にHGFによるHO-1産生促進の意義を明らかにする目的でLPS投与マウスに、HGFとともにHO-1阻害剤(SnPP)を皮下投与した。その結果、HGFによるIL-1,IL-6,IL-18産生阻害効果はHO-1阻害剤により解除される事が明らかとなった。HGFはLPSマウスに必見される腎・肺・肝の組織傷害を強く抑制するが、このような臓器保護作用はHO-1阻害剤によって減弱されていた。今回の解析から、HGFはLPSが標的とするマクロファージに作用してIL-1,IL-6,IL-18産生を抑制することが浮きぼりとなった。即ち、HGFは敗血症初期相ではHO-1と連携して、SIRSを特徴づける高サイトカイン血症そのものを阻止する事により、来るべき多臓器不全の発症を事前にブロックしていると考えられる。細菌感染などによる敗血症は近年増加の一途を辿っており、米国では年間70万人以上が敗血症経過中の多臓器不全によって死亡している。私達は肝細胞増殖因子(HGF)による多臓器不全症の発症予防効果を敗血症のマウスモデルを用いて明らかにしていた(前年度)。本年度はその分子機構を明らかにすべく、敗血症病態における生体防御機構、とりわけIL-1,IL-6,IL-18などの炎症性サイトカインの産生を制御する事が知られているヘムオキシゲナーゼ(HO-1)に注目し、その発現に対するHGFの効果を調べた。HO-1研究で汎用されているマクロファージ、Raw264細胞を用い、HO-1産生に対するHGFの機能を調べた。その結果、HGFはLPS刺激後12時間以内に、HO-1 mRNAのレベル修飾なしに蛋白レベルを数倍に上昇させることが判った。そこでLPS刺激したRaw264細胞にリボゾーム阻害剤(シクロヘキシミド)を添加したところ、HGFによるHO-1産生誘導が阻害されたのに対し、転写阻害剤(アクチノマイシンD)では変化が認められなかった。次にHGFの抗炎症作用に対するHO-1の貢献度を明らかにすべく、Raw264細胞にHO-1阻害剤(SnPP)を添加した。その結果、LPS刺激MfではHGF添加によりIL-6産生抑制とIL-10産生亢進が促されたのに対し、HGFにSnPPを併用すると、IL-6発現低下の解除、IL-10発現上昇の制御が認められた。以上の結果はLPS処置マウスにHGF単独またはHGF+SnPPを投与したin vivo系でも再現された。今回の結果から、炎症病態では(1)HGFはマクロファージを直接標的とし、翻訳後修飾を介してHO-1発現を高める、(2)HGFによるHO-1発現促進を介したIL-6産生制御、IL-

10産生促進が肝炎や肺傷害の改善に寄与する、以上の作用機序が明らかとなった。敗血症病態において腎傷害は致命的な病態イベントとなりうる。そこで本年度は敗血症病態における腎傷害に着目し、マウス疾患モデル動物を用いてHGFによる腎保護機構を下記の通り解析した。1.敗血症病態における蛋白尿発症機序について解析を行った。その結果、炎症性サイトカインであるIL-1βの産生亢進がLPS投与後12時間目にマクロファージ(Mφ)を中心に観察され、投与後24-36時間にかけて糸球体ポドサイトにおいてスリット分子であるネフリンの産生抑制が認められた。この時、ネフリンの転写促進因子であるWT1の核内発現は減弱していた。これに一致してアルブミン尿の排泄が顕著となった。以上の成果はBiomed Research 31:363-369 (2010)に公表した。2.次いで敗血症病態における蛋白尿漏出に対するHGFの効果を検討した。LPS処置マウスにHGFを投与すると、MφでのIL-1β産生が抑制され、ネフリンの産生抑制が軽減された。さらにポドサイト自身にHGFシグナル伝達を示すc-Metチロシンリン酸化が認められた。その結果、HGF投与群では炎症時に惹起される炎症性酵素、カテプシンLの誘導は抑制され、その基質であるシナプトポディン(PSD)の分解も緩和される事が判明した。以上の成果はNephrology 16:310-318 (2011)に報告した。3.その一方で、ヒトHGFを動物に反復投与すると、蛋白尿が惹起されるという知見も相次いでおり、HGFによる蛋白尿抑制効果を疑問視する報告も見受けられる。私達はヒトHGFがラットに対して抗原性を持つ事に注目し、免疫介在性糸球体腎炎によるpseudo-toxicな効果である事を実証した。実際、抗原性を持たないラットHGFをラットに長期間投与しても免疫複合体の沈着は認められず、重篤な蛋白尿も惹起されない事を実証した。以上の成果はClin Exp Pharmacol Physiol 38:192-201 (2011)に報告した。
ヒトと植物の複合糖鎖を分解するビフィズス菌の新規ファミリー酵素の構造解析

β-L-アラビノフラノシダーゼ(HypBA1)の結晶構造をGH127として初めて決定した。HypBA1はCysを活性中心に持つ世界初の「システイングリコシダーゼ」であった。B. bifidumからは新規なグリコシダーゼを4種発見した。さらに、B. longumのβ-アラビノオリゴ糖鎖分解酵素群の転写誘導機構を解明し、HypBA1ホモログの諸性質の解析を行なった。1、発現コンストラクトの作製:4種類のターゲット((1)B-Ga1ABb、(2)NagBb、(3)HypBA2、(4)HypBA1)のうち、(1)B-GalABbおよび(3)HypBA2で多数のdeletionコンストラクトを作製してその性質を調べた。(1)については、24-700残基のコンストラクト(B-Gal1Bb-de1700)が、(3)についてはC末端側を300537残基欠失したCΔ300、CΔ404、CΔ537の活性が高く、十分な安定性を備えていることが確認された。ただし、CΔ537はCa2+存在下で活性が発現することが判明した。2、欠失コンストラクトの作製が必要ない(2)NagBb、(4)HypBA1に加えて、上記の欠失コンストラクトを用いて、大腸菌での大量発現条件を検討した。その結果、全てのコンストラクトで大量発現(10mg/培養L以上)させることに成功した。結晶化条件の探索の結果、(1)B-GalABb-de1700と(4)HypBA1で構造解析可能な結晶が得られ、両方で最大2.0Åのnativeデータセットを測定することに成功した。さらに、(4)HypBA1では、SeMet置換体を作成してデータ測定を行った結果、SAD法により位相決定に成功し、GH127として世界初の立体構造の決定に成功した。(1)B-GaIABb-de1700はSeMet置換体がnative結晶と同様の条件で成長しないため、他の結晶化条件の探索および他の位相決定法を検討中である。残り2種類のターゲットに関しては、いくつかの条件で微結晶が得られているものの、構造解析に適した結晶が得られないため、引き続き条件検討を行う。1B-GalABbでは、24-700残基のコンストラクト(B-GalABb-del700)を用いて安定な結晶化条件を確立した。SeMet置換体も作成したが置換率が低く利用できなかった。重原子置換体を作成して数種のデータを測定したが、現時点では初期位相を決定できておらず、引き続き条件探索を行う。2NagBbでは、PEG6000を沈殿剤とした条件で結晶が得られ分解能2.8 Aのデータセットを取った。しかしその後、結晶化の再現性が得られておらず、引き続き条件探索を行う。3HypBA2では、前年度までに安定性が高いことが確認されたC末端側を300537残基欠失したCΔ300、CΔ404、CΔ537を用いて結晶化を行った。いつくかの条件で微結晶が得られたので、構造解析に適した結晶を得るため、引き続き条件検討を行う。4HypBA1ではさらにアラビノース複合体の結晶構造を決定した。15種類の変異体を作成し、詳細な生化学的解析を行った結果をまとめて、査読付き原著論文を発表した。GH127として世界初の立体構造の報告である。5種類のターゲット(1B-GalABb、2NagBb、3HypBA2、4HypBA1、5β-Ara2結合タンパク質)の結晶化と構造解析を行なった。1B-GalABbでは、24-700残基のコンストラクトを用いて安定な結晶化条件を確立した。位相決定までは至っていないが、分解能2.0Aの結晶が再現よく得られており、構造決定が可能になった。2NagBbでは、タンパク質のリジン残基をメチル化することにより、再現性高く、分解能約2.8Aの結晶が得られるようになった。3HypBA2では、C末端側を300残基欠失した1129残基のコンストラクトを用いて、β-Ara2の存在下で0.3 mm程度のサイズの結晶が得られており、現在分解能2.8Aのデータセットを得ている。4HypBA1ではアポ体、アラビノース複合体の結晶構造を決定し、変異体作成および詳細な生化学的解析を行なった結果をまとめて、査読付き原著論文を発表した。GH127として世界初の立体構造の報告となった。5ABCトランスポーターの溶質結合ドメインであるβ-Ara2結合タンパク質の結晶化と構造決定に成功した。ITC測定によりリガンドのKd値を決定し、MD計算によりオープン型構造の推定にも成功した。さらに、ビフィズス菌由来の植物および動物由来糖鎖に作用する加水分解酵素の性質解明を行い、新規な酵素を3種類発見した。