hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
眼球運動を用いた読み習熟度評価法の検討～健常児の発達変化と読字障害児での検討～

本研究課題は視線解析装置を用いて単語や単文を読んだときの眼球運動を解析することで「逐次読み」から「まとまり読み」への習熟度変化を定量的に示す有効な指標を探索し、健常児や発達性読字障害児の読みの習熟度を客観的に評価することを目的とした研究である。研究成果として以下のことを明らかにした。(1)成人と健常児における読み特性の違いは音読時の注視回数の有意な減少で説明でき、習熟度評価指標として注視回数が有効である。(2)健常児の読みの発達的変化は注視回数の減少で説明できる。(3)発達性読字障害児と健常児の読み特性を比較したところ、各課題にて音読時間が発達性読字障害児で有意に遅く、注視回数が少なかった。本研究課題は視線計測装置を用いて、音読時の眼球運動を計測し、逐語読みからまとまり読みへの読みの習熟度変化を定量的に評価できる指標をみつけることが主な目的である。H24年度は下記の3つについて研究を遂行した。1)健常児の単語読みの習熟変化に関する解析:H24年度はH23年度に得られた健常児のデータ(88名)を解析し、そこから習熟の定量指標として眼球運動の注視回数の変化が最も有力な因子であることを明らかにした。また、それは特に語彙効果として単語読みの変化に表れる。その他読みに関わる習熟因子として、1度に把握出来る文字認知範囲(Visual Attention Span)が影響することが示唆された。2)文字認知範囲実験:読みの初期の逐語読み、習熟期のまとまり読みの両方の習熟に関与する因子と言われている文字認知範囲課題を健常成人および健常児に試験的に行った。課題の難易度、刺激提示方法を調整し、小児に実施可能な形に精錬した。また数名の健常児と発達性ディスレクシア児に実施した。3)眼球運動課題実験:視機能の評価課題として数字呼称速度と衝動性眼球運動の正確性を測定するDevelopmental Eye Movement Test(DEM)を実施し、saccadeの正確性について数名の健常児と発達性ディスレクシア児でパイロットデータを取得した。その結果、発達性ディスレクシア児では目標物を注視し続けることが難しく、読んでいる場所がわからなくなってしまうなど、健常群とはことなり課題の遂行自体が困難な印象であった。今後詳細な解析を行う。本研究課題は、視線解析装置を用いて単語や単文を読んだときの眼球運動パターンを解析することで、逐次読みからまとまり読みへの習熟度変化を定量的に示す有効な指標を探索し、健常児や発達性読字障害児の読みの習熟度を客観的に評価することを目的として掲げ、研究を遂行した。本研究課題により、以下のことが明らかとなった。(1)成人(大学生)と健常児(小学3年と小学5年)における読み特性の違いを眼球運動解析により明らかにした。音読時の注視回数と平均注視時間を用いて評価したところ、注視回数において、ひらがなの単語音読、単文音読は小学5年で成人レベルに達していることが示唆された。一方で非単語音読は成人と健常児で有意差が見られなかった。また小学3年生と小学5年生においても単語課題において注視回数の有意な減少がみられた。これらのことより習熟度評価指標として注視回数が有効であることが明らかとなった。(2)健常児における読み特性の発達的変化を明らかにした。同一被験児を小学3年時と小学5年時に同様の課題で比較したところ、単語、非単語、単文課題すべてにおいて注視回数の減少が見られた。一方で非単語課題のみ平均注視時間が小学5年時に有意に減少していた。(3)6名の発達性ディスレクシア児と12名の健常児の眼球運動特性を解析し、注視回数、平均注視時間による習熟度評価を健常児との比較検討を行った。単語、非単語、単文課題の音読時間は発達性ディスレクシア児で有意にはやく、注視回数も多かった。平均停留時間に有意差は見られなかった。また、視覚的注意課題においても発達性ディスレクシア児では正答率が有意に低かった。本研究課題は、視線解析装置を用いて文字を読んだり、視標を追視したりするときの眼球運動パターンを解析することで、音韻-言語機能と視機能の両面を評価できる眼球運動の有効な指標を探索し、健常児における読みの習熟度を定量的に評価することを目的として行っている。

また最終的には読字障害児との比較を行い、読字障害(ディスレクシア)児の眼球運動特性と比較し、各種読字指導法の選択時に活用することで教育や医療に還元することを目標としている。本年度はまず成人で予備実験を行った後、健常児での音韻-言語機能と眼球運動の特性を明らかにするために、「特異的発達障害診断治療のための実践ガイドライン」の単語、非単語、単文の音読課題を用いて、音読時の眼球運動を計測した。音韻-言語機能を評価する指標として、音読時の注視点数、平均注視時間、全注視時間について検討した。本年度は単語、非単語課題の実験の結果について報告する。実験の結果、単語、非単語課題音読時の注視点数、全注視時間は年齢とともに減少する傾向にあり、これらの指標は音読時間と有意に相関した。平均注視時間は年齢によらず一定の傾向を示していた。これらの結果は、音読時間の短縮は音読中の注視点数の減少であり、平均注視時間に年齢による差がないことを考えると、単一注視時間に把握できる文字数が年齢とともに増加していることを示唆し、読みの質的変化の1つと考えられる。平成24年度にはこれらの成果を学会にて発表予定である。また単文音読時のデータの解析を遂行中であり、こちらも成果をまとめて学会に発表し、単語、非単語の結果と合わせて論文化を進める。また実験に関しては、単一注視時の文字認知範囲や視機能の評価課題も準備が整っているので今後、実験を開始して新たなデータを蓄積し、評価および検討を行う予定である。所属機関が変更となったため、機器や書類などの整備の時間に多くを費やしたた。そのため当初予定した計画を行うことが困難となった。本年度健常児のデータを取得できた意味では当初の計画以上に進展している、といえるが、機器の性能の限界により、当初予定していた神経眼科学的評価が十分に行えていない。そのため、現機器での視標追跡時の眼球運動の測定に工夫が必要となった。そのため、達成度としてはおおむね順調に進展している、とした。次年度に神経眼科学的評価を実施予定である。H25年度は最終年度となるため、これまでの成果を論文にまとめ国内雑誌に投稿する。また実験に関しては発達性ディスレクシア児数名と同年代の健常児のデータを取得し、眼球運動特性に違いがあるかについて検討する。さらにディスレクシア症例においては、語彙指導の効果判定として音読課題時における眼球運動の注視回数を用いて定量的にその習熟変化を検討予定である。加えて語彙検査や知覚範囲検査、DEMテストのような視機能の評価を行い、各データと眼球運動因子の関係を明らかにする。所属の変更に伴い、いくつかの解析ソフトなどを改めて準備する必要がある。また健常児の被験者は引き続き鳥取大にて募集した被験者への実施を予定している。そのため、夏期休暇中に鳥取大学へデータ取得のために10日間程度滞在して集中的にデータを取得予定である。基本的な実験の計画は変更せずに行えるよう準備を進めている。引き続き、前任地の鳥取大学にて実験を行うため、多くを旅費として使用する。その他、成果発表のための経費、論文作成費などが中心的な支出となる。主要な支出の予定は夏期休暇中に行う予定の鳥取大学での実験にかかる諸費用となる。研究打ち合わせの旅費および機器運搬費をそれに充てる予定である。その他、関連書籍購入費を必要な刺激提示ソフト費などに変更予定である。
論文作成支援システムを用いた知識構築過程の研究

本研究の目的は,自己説明活動中の記憶補助,認知的支援として,電子化されたダイアグラム機能がどのような効果を持っているのかを検討することであった.自己説明活動は,学習者自身が能動的に自らの知識を反省し,学習を展開する活動を支援する新たな教授的介入であり,これまでその効果が検証されていた.本研究は,さらにそうした教授的介入をさらに促進するための新たなメディアとしてダイアダラム機能を付加して,学習者の概念的理解がより促進されるか,2つの実験をとおして検討した.まず第一実験では,新たに付加するダイアグラム機能の学習効果を検討するために,2つの実験条件(通常の自己説明群,およびダイアダラムを用いた群)の下で,学部生8名を対象に「記憶のメカニズム」についての学習を展開してもらった.事後テストの評価の結果,ダイアグラムを用いた学習者の方がより高次な概念的理解に到達しており,自己説明活動中にも知識を再構築する活動により頻繁に従事していたことがわかった.さらに第二実験では,同じ教材を繰り返し学習させることで記憶の負担を軽減させたとき,さらにダイアグラムを用いることに学習効果が見られるかどうかを検討した.16名の学部生が第一実験と同じ手続きで「記憶のメカニズム」を2日間にわたって繰り返し学習した.その結果,概念的理解を測定する事後テストの得点では群間に差が見られなかったが,学習活動においては,第一実験と同じようにダイアグラムを用いた学習者はより有効な知識構築活動に従事していたことがわかった.これらの結果から,ダイアグラム機能は自己説明活動の質を変化させる効果を持ちあわせているが,それ自身が概念的理解を必ず促進するわけではないことがわかった.今後,さらに概念的理解を常に促進できるよう,教授的介入のあり方を検討する必要がある.本研究の目的は,自己の知識を外化するダイアグラム機能を用いることで,自己説明活動をとおした概念的理解を向上させることができるか,その効果を検討することであった。参加者は,まず「記憶のシステム」について自己の理解を口頭で報告し,その内容を実験以前の各参加者の理解とした。さらに「記憶システム」の講義内容をテープで聴講し,さらに配付された資料にメモをとることによって,自己説明活動の補助として用いた。統制群(大学生4名)は,記録したメモをもとに,学習した内容が自己の知識とどうかかわり,さらに理解を深めるためにどのような情報が必要かを考える自己説明活動を展開し,別の用紙に自己の知識を整理した。実験群(大学生4名)はメモをもとに作文支援システムのダイアグラム機能を用いて自己説明活動を展開した。最後に,再度記憶システムについての理解を口頭で報告させ,さらに記憶の自由再生の実験内容を説明し,その結果を予測させ,その解答の正確さを実験後の理解度の指標として用いた。口頭報告の分析の結果,記憶のメカニズムの異なる機能間の関係に言及する推論活動が,実験群においてより頻繁にみられ,さらに事後テストにおける概念的理解のレベルも統制群より有意に高かった。新たなメディアとして,ダイアグラムが時間的,内容的に分割された情報の間の関係を考慮する際の補助として用いられるだけでなく,さらには知識を構築するという活動をビジュアルに意識させることができることで,自己説明活動を大きく促進させることがわかった。本研究の目的は,自己説明活動中の記憶補助,認知的支援として,電子化されたダイアグラム機能がどのような効果を持っているのかを検討することであった.自己説明活動は,学習者自身が能動的に自らの知識を反省し,学習を展開する活動を支援する新たな教授的介入であり,これまでその効果が検証されていた.本研究は,さらにそうした教授的介入をさらに促進するための新たなメディアとしてダイアダラム機能を付加して,学習者の概念的理解がより促進されるか,2つの実験をとおして検討した.まず第一実験では,新たに付加するダイアグラム機能の学習効果を検討するために,2つの実験条件(通常の自己説明群,およびダイアダラムを用いた群)の下で,学部生8名を対象に「記憶のメカニズム」についての学習を展開してもらった.事後テストの評価の結果,ダイアグラムを用いた学習者の方がより高次な概念的理解に到達しており,自己説明活動中にも知識を再構築する活動により頻繁に従事していたことがわかった.さらに第二実験では,同じ教材を繰り返し学習させることで記憶の負担を軽減させたとき,さらにダイアグラムを用いることに学習効果が見られるかどうかを検討した.16名の学部生が第一実験と同じ手続きで「記憶のメカニズム」を2日間にわたって繰り返し学習した.その結果,概念的理解を測定する事後テストの得点では群間に差が見られなかったが,学習活動においては,第一実験と同じようにダイアグラムを用いた学習者はより有効な知識構築活動に従事していたことがわかった.これらの結果から,ダイアグラム機能は自己説明活動の質を変化させる効果を持ちあわせているが,それ自身が概念的理解を必ず促進するわけではないことがわかった.今後,さらに概念的理解を常に促進できるよう,教授的介入のあり方を検討する必要がある.
血管性浮腫の病態解明ー包括的補体・凝固線溶系検査システムの活用ー

血管性浮腫は全身のさまざまな部位に突然の浮腫をきたす疾患である。顔面や四肢の腫れはもちろんのこと、激烈な腹痛、呼吸困難や窒息などをきたす場合があるため、プライマリーケアの領域では見逃してはならない疾患である。血管性浮腫は遺伝性、非遺伝性の大きく二つに分類されるが、それぞれの原因や病態はヘテロでありいまだ不明な点が多い。本研究では、複数の学会や厚労省研究班と連携して患者レジストリを進め、原因や重症度に関与する遺伝子の同定をおこない、個々の病態にもとづいた治療法の展開を目的とする。
カルパイン・カルパスタチン系による関節リウマチの病態解析と関節炎制御

我々は関節リウマチ(RA)特異的自己抗体の対応抗原の1つがカルシウム依存性システインプロテアーゼ(カルパイン)の特異的内在性阻害因子であるカルパスタチン(CS)であることを報告し,抗CS抗体陽性RA血清中のIgG分画がCS機能を抑制してカルパイン活性を上昇させることを確認した.カルパインは炎症に関与する様々な因子の活性化を司り,RAの関節破壊に関与する中性プロテアーゼの一種と考えられている.本研究はRAの新しい治療戦略をめざして,1)カルパイン阻害薬によるマウスモデル関節炎の制御,2)カルパイン遺伝子導入によるT細胞および線維芽細胞の活性化に及ぼす影響を検討した.1.カルパイン阻害薬によるマウスモデル関節炎の制御モノクローナル抗II型コラーゲン抗体で誘発したBALB/cマウスの関節炎は,カルパイン阻害薬E-64-dの腹腔内投与によって有意に抑制された.定量的RT-PCR実験では,E-64-d投与群で組織中のIL-6およびIL-1 mRNA量が有意に低下していた.In vivo実験と同様,培養滑膜細胞にE-64-dを添加すると,IL-6およびIL-1産生が有意かつ濃度依存性に阻害された.2.カルパスタチン遺伝子導入によるT細胞および線維芽細胞の活性化に及ぼす影響Th1およびTh2細胞におけるCSの発現を免疫ブロット法で解析すると,CSの発現はTh1細胞でTh2細胞よりも減少しており,特に活性化Th1細胞での減少が著しかった.またヒトCS cDNAを組み込んだレトロウイルスベクターをBalb/cマウス脾細胞より分離したCD4+T細胞および3T3線維芽細胞にトランスフェクトさせたところ,INF-γおよびIL-6産生の抑制が確認された.RA患者ではCSは滑膜細胞のIL-6産生を抑制するのみならず,TH1/Th2分化に影響を及ぼすことで炎症を抑制する可能性が示唆される.我々は関節リウマチ(RA)特異的自己抗体の対応抗原の1つがカルシウム依存性システインプロテアーゼ(カルパイン)の特異的内在性阻害因子であるカルパスタチン(CS)であることを報告し,抗CS抗体陽性RA血清中のIgG分画がCS機能を抑制してカルパイン活性を上昇させることを確認した.カルパインは炎症に関与する様々な因子の活性化を司り,RAの関節破壊に関与する中性プロテアーゼの一種と考えられている.本研究はRAの新しい治療戦略をめざして,1)カルパイン阻害薬によるマウスモデル関節炎の制御,2)カルパイン遺伝子導入によるT細胞および線維芽細胞の活性化に及ぼす影響を検討した.1.カルパイン阻害薬によるマウスモデル関節炎の制御モノクローナル抗II型コラーゲン抗体で誘発したBALB/cマウスの関節炎は,カルパイン阻害薬E-64-dの腹腔内投与によって有意に抑制された.定量的RT-PCR実験では,E-64-d投与群で組織中のIL-6およびIL-1 mRNA量が有意に低下していた.In vivo実験と同様,培養滑膜細胞にE-64-dを添加すると,IL-6およびIL-1産生が有意かつ濃度依存性に阻害された.2.カルパスタチン遺伝子導入によるT細胞および線維芽細胞の活性化に及ぼす影響Th1およびTh2細胞におけるCSの発現を免疫ブロット法で解析すると,CSの発現はTh1細胞でTh2細胞よりも減少しており,特に活性化Th1細胞での減少が著しかった.またヒトCS cDNAを組み込んだレトロウイルスベクターをBalb/cマウス脾細胞より分離したCD4+T細胞および3T3線維芽細胞にトランスフェクトさせたところ,INF-γおよびIL-6産生の抑制が確認された.RA患者ではCSは滑膜細胞のIL-6産生を抑制するのみならず,TH1/Th2分化に影響を及ぼすことで炎症を抑制する可能性が示唆される.【目的】我々はRA特異的自己抗体の対応抗原の1つがカルシウム依存性システインプロテアーゼ(カルパイン)の特異的内在性阻害因子であるカルパスタチン(CS)であることを報告し,抗カルパスタチン抗体陽性RA血清中のIgG分画がカルパスタチンの機能を抑制してカルパイン活性を上昇させることを確認した.カルパインは炎症に関与する様々な因子の活性化を司り,RAの関節破壊に関与する中性プロテアーゼの一種と考えられている.本研究はRAの新しい治療戦略をめざすために,1)カルパイン阻害薬によるマウスモデル関節炎の制御,2)滑膜細胞のサイトカイン産生におけるカルパインの関与,を検討した.【方法】1)モノクローナル抗II型コラーゲン抗体でBALB/cマウスに関節炎を誘導し,高用量(9mg/kg/day)および低用量(3mg/kg/day)E-64-d,rCS(9mg/kg/day),対照溶液をそれぞれ腹腔内投与し,関節炎点数と足趾腫脹度を追跡評価,病理学的検討も行った.2)カルパイン阻害物質が腫脹関節でのサイトカイン産生に及ぼす作用を解析するため,定量的RT-PCR法により組織中の各サイトカインmRNA量を測定した.3)RA患者滑膜細胞から樹立された細胞株E11およびcrudeなRA患者滑膜細胞を用いて,in vitroで各化合物が細胞増殖とサイトカイン産生に及ぼす効果を検討した.【結果】1)高用量E-64-d群では有意に関節炎点数,足部腫脹度,関節病理所見が改善していた.

2)定量的RT-PCR実験では,高用量E-64-d群で組織中のIL-6およびIL-1mRNA量が有意に低下していた.3)In vivo実験と同様,E-64-d添加E11細胞およびcrude滑膜細胞では,E-64(E-64-dの膜非透過性誘導体)添加群と異なり,IL-6およびIL-1産生が有意かつ濃度依存性に阻害された.しかし,E-64-d,E-64のいずれもE11細胞の増殖に影響を及ぼさなかった.【結論】RAモデル関節炎の病態におけるカルパインの重要な役割が示唆された.その機序として特に細胞内での炎症性サイトカイン産生抑制作用を介すると推論された.【目的】我々はRA特異的自己抗体の対応抗原の1つがカルシウム依存性システインプロテアーゼ(カルパイン)の特異的内在性阻害因子であるカルパスタチンであることを報告し,抗カルパスタチン抗体陽性RA血清中のIgG分画がカルパスタチンの機能を抑制してカルパイン活性を上昇させることを確認した.カルパインは炎症に関与する様々な因子の活性化を司り,RAの関節破壊に関与する中性プロテアーゼの一種と考えられている.昨年度までに我々はカルパイン阻害薬がマウスの関節炎を抑制し,滑膜細胞のIL-1およびIL-6産生を抑制することを見出した.本年度はRAの新しい治療戦略をめざし,カルパイン遺伝子導入によるT細胞および線維芽細胞の活性化に及ぼす影響を検討した.【方法】1)Th1およびTh2細胞におけるカルパインとカルパスタチンの発現を免疫ブロット法で解析した.2)ヒトカルパスタチンcDNAを組み込んだレトロウイルスベクターをBalb/cマウス脾細胞より分離したCD4+T細胞および3T3線維芽細胞にトランスフェクトさせた.このカルパスタチン導入T細胞をTh1およびTh2条件下で培養し,サイトカイン産生を検討した.【結果】1)カルパスタチンの発現はTh1細胞でTh2細胞よりも減少しており,特に活性化Th1細胞での減少が著しかった.2)カルパスタチン過剰発現CD4+T細胞ではインターフェロンγ産生が減少し,IL-4およびIL-6の産生が増加した.3)線維芽細胞にカルパスタチンを過剰発現させるとIL-6産生は抑制された.【結論】RA患者においてはカルパイン活性の亢進はCD4+T細胞をTh2からTh1へ分化誘導させることによっても関節炎症を増悪させる可能性がある.また,カルパスタチンは線維芽細胞ではIL-6産生を抑制することから,RA滑膜細胞によるIL-6を抑制して抗炎症作用をもたらす可能性が示唆された.
農業協同組合を中心とした新しい協同理論構築に向けての基礎的研究

本研究は、組合員が事業・活動や組織運営の主人公となり、地域社会と共存共栄していけるような農協の存立可能性を展望するために、その基礎となる「協同理論」を再構築するための第一ステップとして位置づけられるものである。本年度(平成21年度)も引き続き、(1)地域農業ならびに地域社会と農協(協同組合)との関係構築の方向性、(2)農協の内部構造変質下での協同組合らしい組織運営および事業方式、(3)多様な「非営利協同セクター」との連携可能性、という課題を設定して、研究メンバーによる既存研究のサーベイと問題提起に関する研究会を開催し、検討を進めた。その結果、(1)現代的な意味での協同組合らしい組織・運営、事業方式に開する理論深化、(2)これからのJAの将来像として「地域協同組合化」を想定できるが、その具体的なイメージ、実現条件に関する理論深化、(3)集落営農の進展や組合員組織の変貌のなかで、産地形成や営農指導事業に関する現代的な位置づけと理論深化、(4)NPO法人などの非営利協同セクターの台頭の中で、新たな事業領域も念頭に置いた非営利協同セクター間での連携理論の構築、などの必要性を明らかにした。本年度(平成20年度)は、(1)地域農業ならびに地域社会と農協(協同組合)との関係構築の方向性、(2)農協の内部構造変質下での協同組合らしい組織運営および事業方式、(3)多様な「非営利協同セクター」との連携可能性、という課題を設定して、研究メンバーによる既存研究のサーベイを中心に検討を進めた。その結果、(1)現代的な意味での「協同組合らしい」(組織力を活かした)組織・運営、事業方式に関する理論の深化を進める必要があること、(2)これからのJAの将来像として「地域協同組合化」を想定できるが、その具体的なイメージ、実現条件に関する理論深化の必要性があること、(3)集落営農の進展や組合員組織の変貌のなかで、産地形成や営農指導事業に関する現代的な位置づけと理論深化が求められていること、(4)NPO法人などの非営利協同セクターの台頭の中で、新たな事業領域も念頭に置いた非営利協同セクター間での連携理論が求められていること、などを整理・確認した。
化学反応における非平衡状態の理論研究

昨年度に引き続き、以下に示す励起酸素原子と塩酸の反応を中心に研究を行った。O(1D)+HCl(1Σ+)→OH(2II)+Cl(2P),ΔHO=-44.4kcal/mol,→ClO(2II)+H(2S),ΔHO=-6.0kcal/mol,この反応は、大気化学のモデリングにおける重要な反応である。そして、基礎的な反応ダイナミクスの視点からも次の様な点で興味深い系である。(i)電子基底状態においてHOClとHClO分子に対応する二つの深い井戸が存在することによりO(1D)+H2反応のように単純な挿入反応を想起させられるが、引き抜き反応の可能性も実験から示唆される。(ii)二つの生成経路が存在する(上の反応式)。(iii)スピン対称性を保持した場合、5つの電子状態がこの反応には関与するが、今まで電子基底状態のみ理論研究が行われてきており、電子励起状態の役割については不明な点が多い。本研究では昨年、高精度な量子化学計算を行うことにより世界で初めて決定した電子励起状態のポテンシャルエネルギー面を使い、量子反応動力学計算を行った。そして、上で述べた疑問点について正確な知見を得ることができた。我々の計算で分かったことは、電子基底状態の反応過程については引き抜き反応というよりは、接近する酸素と塩素原子の間で水素分子が激しくふらふらする付加反応的過程を経て反応が進んでいる。これは特に基底状態に二つの井戸があるためと思われる。一方、最初の電子励起状態である1^1A"状態は、反応経路の遷移状態手前に井戸があるため、共鳴効果が反応確率に現れる一方、もう一つの電子励起状態である2^1A'状態は、反応経路及び遷移状態とは全く異なる核配置にvan der Waals結合の井戸があるため、一般には、反応を促進するはず井戸が、反応を阻害するような結果となった。これは、新しい知見である。また、この系においてこれまで50年間理論と実験の一致をみなかったが、我々の理論結果が世界ではじめて実験結果と一致することができた。主に本年度は、励起酸素原子と塩酸の反応について研究を行った。この反応は長い間、実験と理論の研究における一つの興味の中であり、O(^1D)+HCl(^1Σ^+) →OH(^2II)+Cl(^2P),ΔH_0=-44.4kcal/mol,→ClO(^2II)+H(^2S),ΔH_0=-6.0kcal/mol,大気化学のモデリングにおける一つの重要な反応である。(i)電子基底状態においてHOClとHClO分子に対応する二つの深い井戸が存在することによりO(^1D)+H_2反応のように単純な挿入反応を想起させられるが、引き抜き反応の可能性も実験から示唆される。本研究では第一に、今まで基底状態の特徴のみで議論されてきた問題について新たに2つの電子励起状態を含めた3つの電子状態を考慮することにより、この反応の全体像をつかむための考察を行った。そこでまず、現在考えられる最高レベルの計算を行い、精密なポテンシャルエネルギー曲面を得た。電子構造計算の方法は、状態平均を行った多配置SCF(MCSCF)計算を行い分子軌道(MO)を求め、得られたMOを基に多配置参照配置間相互作用計算(MRCl)を行い、最後にDavidsonの補正を行った。基底関数は、Dunningらの4重基底関数aug-cc-pVQZを用いた。これらの方法を用い、約5000核配置について1^1A'、1^1A"、2^1A'状態のポテンシャルエネルギーを求めた。行った計算の規模は例えば、ある一つの核配置においてA'状態に関するCI行列の大きさは約450万次元程度であり、合計の計算時間がSGI Origin2800(64CPU)を用いて約1ヶ月半を要した。得られた計算精度は、実測のポテンシャルパラメーターに対して全域において0.1kcal/mol以内で一致していることが確認された。相互作用ポテンシャルは、O(^1D)+H_2と同様に、挿入型の基底状態ポテンシャルと引き抜き型の励起状態ポテンシャルからなり、引き抜き型のエネルギー障壁は0.09eV(約2kcal/mol)と極めて類似した結果となっている。そこで、得られたポテンシャルエネルギー曲面を用い量子波束計算を行い、反応の生成物の分岐比を衝突エネルギーの関数として評価した結果、ほぼ衝突エネルギーと無関係にOH+Clの収率がClO+Hの2倍であることが判明した。また、実験結果をほぼ再現する結果を得ている。さらにこの研究は、分子研基礎理論第二中村宏樹グループとの共同研究として実施している。

そして、基礎的な反応ダイナミクスの視点からも次の様な点で興味深い系である。(i)電子基底状態においてHOClとHClO分子に対応する二つの深い井戸が存在することによりO(1D)+H2反応のように単純な挿入反応を想起させられるが、引き抜き反応の可能性も実験から示唆される。(ii)二つの生成経路が存在する(上の反応式)。(iii)スピン対称性を保持した場合、5つの電子状態がこの反応には関与するが、今まで電子基底状態のみ理論研究が行われてきており、電子励起状態の役割については不明な点が多い。本研究では昨年、高精度な量子化学計算を行うことにより世界で初めて決定した電子励起状態のポテンシャルエネルギー面を使い、量子反応動力学計算を行った。そして、上で述べた疑問点について正確な知見を得ることができた。我々の計算で分かったことは、電子基底状態の反応過程については引き抜き反応というよりは、接近する酸素と塩素原子の間で水素分子が激しくふらふらする付加反応的過程を経て反応が進んでいる。これは特に基底状態に二つの井戸があるためと思われる。一方、最初の電子励起状態である1^1A"状態は、反応経路の遷移状態手前に井戸があるため、共鳴効果が反応確率に現れる一方、もう一つの電子励起状態である2^1A'状態は、反応経路及び遷移状態とは全く異なる核配置にvan der Waals結合の井戸があるため、一般には、反応を促進するはず井戸が、反応を阻害するような結果となった。これは、新しい知見である。また、この系においてこれまで50年間理論と実験の一致をみなかったが、我々の理論結果が世界ではじめて実験結果と一致することができた。
痴呆性高齢者の自立支援のための環境デザインに関する研究

この研究において、以下の3点についての課題と実際のデザインの提案をおこなった。1.逆デイサービス実施の効果について逆デイサービスを試行している施設において、認知症高齢者の利用者に対し、逆デイ実施の前後などの観察をおこなった。逆デイ実施中は笑顔が増加、逆デイ実施直後は自発的行動がやや増える傾向が見られるなど試行ではあるが、効果の一端が見られた。歩いていける民家を利用しているため、その移動中に季節感を感じるなど、外出としての効果もあり、制度上の課題(職員の配置、費用の担保など)をクリアし、普及させていく必要があることを示した。2.高齢者施設における個別入浴について個別入浴を実施している施設において、職員へのヒアリングを通してその課題等を明らかにした。メリットはきめ細かいケアができることで、課題は、入浴専用にケアをする職員が必要な点であった。ユニットケア型の特養が増え、個別入浴も増加してきているが、個別浴槽そのもののデザインだけではなく、ケアとしては望ましいが人員体制をどう工夫して確保するかを検討して進める必要があることを明らかにした。3.職員の休憩室について認知症高齢者に対していいケアをするためには、直接的ケアだけでなく、見守りなど高度な室が要求されるケアも必要である。そのためには一緒に生活して休憩を取るだけでなく、現場からある程度独立するが、すぐ戻れるような位置に休憩室があることが重要であると考えられる。ここでは休憩室の使い方等をアンケート調査することで明らかにし、休憩室のデザインについての課題を整理した。以上の課題を明らかにするとともに、実際の施設の計画に関わり特別養護老人ホーム1施設、老人保健施設1施設の具体的環境デザインの提案をし、完成した施設において、そのデザインの有効性について検証をおこないはじめ、今後、継続していくこととした。今年度は、以下の2点についての課題を明らかにした。1.特別養護老人ホームにおける個人浴について平成16年12月にI県に開設されている特別養護老人ホーム90施設すべてに対し、電話聞き取りの形式で、「個別入浴を実施しているかどうか」「個別入浴にたいしての質問紙アンケート調査に協力してもらえるかどうか」をたずね、協力してもらえる施設に質問紙アンケートを実施した。今回の調査では、個別入浴の導入実態について、利用者からみた個別入浴の利点・問題点、職員から見た個別入浴の利点・問題点を捉えた。個人浴については新型特養になってから急増しているが、従来の特養ではハード面の制限から導入したくても困難状況であることを明らかにした。個別入浴の利点は、「入浴そのものが楽しみ・喜びになる」「入浴にたいしての安心感が生じる」「本人のペースで入浴ができる」などで、問題点は「従来のケアの流れをかえることができない」「一人で入浴することに対する不安・恐怖感」などがあげられた。また、職員に対する利点は「介護負担の軽減」「介護に対する意識変革」などがあげられた。問題点は「入浴以外の業務への影響」「人員配置」などであった。2.具体的環境デザインの提案2つの施設に対し、個室のあり方、ユニットのあり方、浴室のあり方、共用空間のあり方について現場の意見と調整しながら痴呆性高齢者の自立支援のための環境デザインの条件・あり方を整理した。個室についてはトイレを付けるかどうか、ユニットの空間構成に変化をつける、個人浴の導入、ユニット外にラウンジ的空間を用意し生活のメリハリをつける、などが必要とされた。これらを基に具体的に施設の計画をおこない実現の提案をおこなった。来年度はこれらの提案を検証する予定である。今年度は計画に関わった認知症のケア施設において以下の2点について明らかにした。(1)個別入浴の提案およびその評価計画・設計に関わり個別入浴を提案した3施設において、その個別入浴の環境条件と実際の入浴ケアの特徴を把握した。さらに介護職員に対し個別入浴の良い点と課題点についてアンケート調査を通して明らかにした。

集団浴と比較して6割以上の職員が個浴のほうが見守りとコミュニケーションがしやすいとしていた。しかし、「心身の疲労度が軽減される」「気持ちに余裕が持てる」という回答は4割未満で、個浴特有の介助負担が職員にあることが明らかになった。職員も1人が入浴専用の担当になることが全体のケアとのバランスがうまくいかないことも問題点としてあげられていた。見守りとコミュニケーションができるという点で認知症高齢者には効果的であるが、職員側の体制がまだ十分ではないことが明らかになった。(2)逆デイの実態とその効果について個別的ケアの方法として取り組まれはじめている逆デイサービスについて、利用者へどのような影響と、今後の課題を把握した。先駆的におこなっている逆デイサービス事業について、参加している4人の利用者を逆デイサービス中、逆デイサービス後、普段の施設において10分ごとにその行動や表情、職員の働きかけなどについて観察を行った。また、施設長、施設職員に対してヒアリング調査を行った。その結果、逆デイサービス中には職員の働きかけが増えていること、利用者の笑顔が増えていること、個別的なケアが行え、利用者が落ち着いて過ごしていることが明らかになった。また、今後の課題として、職員の体制の確保、費用の確保などがあることがわかった。
胸部大動脈瘤手術における安全性の検討ー特に皮質脊髄誘発電位を用いてー

胸部大動脈瘤における弓部大動脈再建術は、手術操作が繁雑で、手術時間も長時間となることが多く、術後合併症としての脳障害が重要視されている。これらに対する脳保護を考慮した補助手段として。超低体温下循環停止法(以下HCA)、脳分離体外循環法(以下SCP)などが用いられており、その有用性が報告されている。しかし、HCAに関してはその許容時間、SCPに関しては脳潅流量・潅流圧などの点で問題を残している。また。脳保護に関して、術中に脳機能を評価することも術後合併症を予防するうえで重要であるが、これには電気生理学的評価法(電気生理学的脳機能モニタ-)として、皮質脊髄誘発電位(以下CDR)、脊髄誘発電位(以下ESCP)、体生感覚誘発電位(以下SEP)などがある。そこで、本研究ではHCAについて、大脳機能の指標として、CDRとESCPをモニタリングし、チオ・ペンタ-ル麻酔下の雑種成犬を用い、直腸温15°Cの超低体温循環停止を30分、60分、90分間の3群に分けて施行し、その電位の変化と病理組織学的変化により以下の結論を得た。1.CDR、ESCPの変化は、体外循環中、温度に対応した一定の規則性を持っており、経時的にモニタリングすることは、循環再開後の脳・脊髄障害を予測する上で有効な手段であると考えられた。2.CDRならびESCPの回復と脳・脊髄の病理組織学的変化より、直腸温15°CのHCAにおける脳循環停止時間は、60分が可能であると考えられた。また、脊髄については、その許容時間は90分、あるいはそれ以上の可能性が考えられた。さらに、現在、上記研究の引き続き、SCPについて。その至適脳潅流量・潅流圧を、フェンタニ-ル麻酔下の雑種成犬を用い、CDRとSEPを大脳機能の指標としてモニタリングし検討中である。また。対象として、雑種成犬30頭を用いた。皮質脊髄誘発電位Corticospinaldirect response (COR)は大脳皮質運動領野を硬膜外より、伝導性脊髄誘発電位(ESCP)は頚部にて脊髄を硬膜外より刺激して、それぞれ腰部より挿入した双極型カテ-テル電極にて硬膜外より導出した。体外循環下に直腸温15°Cまで冷却し、以下の3群に分けた。I群循環停止30分(10頭)、II群循環停止60分(10頭)、III群循環停止90分(10頭)である。脳機能はCDRの第1陰性電位(N_1)を、脊髄機能はESCPの第1、第2陰性電位(N_1、N_2)をモニタリングした。冷却中は、潜時は徐々に延長していった。振幅は冷却の初期に一時的に増大したが、その後は温度の低下とともにその振幅は低下していった。また、冷却中の変化は3群間で有意差は認められなかった。循環停止中、CDRはI群の2例を除き、また、ESCPは1群の5例を除き、電位が消失した。加温期、CDRはI群、II群とも全例回復を認めたが、III群では、加温しても1例は電位の回復が認められず、残り9例も直腸温19.6±2.8°Cで回復したが、うち5例は再び消失する二次抑制が認められ、最終的には4例のみが回復し、その振幅は23.0±35.6%と他の2群との間に有意差を認めた。ESCPは3群とも正常まで回復した。

病理組織学的所見では、III群の大脳皮質運動領野にのみ神経細胞の核および原形質の萎縮と染色性の変化、Nissl小体の消失、凝固濃縮(shrinkage)などの虚血性変化を認めた。脊髄では明らかな虚血性変化を認めなかった。これらのことより、復温時、CDRの回復過程を経時的にモニタリングすることは、循環再開後の脳障害を予測する上で有効な手段であると考えられた。今回のCDRとESCPを用いた検討では、直腸温15°Cにおける脳循環停止時間は60分が安全限界であり、脊髄に対する低温保護効果は90分かそれ以上維持されるものと考えられた。弓部大動脈瘤に対する手術は、弓分枝再建を必要とするため、手術操作も繁雑となり、手術時間も長時間となることが多く、術後合併症としての脳障害が重要視されている。近年、これらに対する補助手段法として、超低体温下循環停止法が用いられてきており、その有用性が報告されているが、その許容時間に関しては、いまだ一定の見解はない。また、脳保護に関して、術中に脳機能をモニタリングすることも、術後合併症を予防するうえで大切なことである。そこで本研究では、大脳機能の指標として、皮質脊髄誘発電位(CDR)と、脊髄誘発電位(ESCP)をモニタリングしチオ・ペンタ-ル麻酔下の雑種成犬を用い、直腸温15°Cの超低体温循環停止を30分、60分、90分間の3群に分けて行い、その電位の変化と病理組織学的変化より以下の結論を得た。1.CDR、ESCPの変化は、体外循環中、温度に対応した一定の規則性を持っており、経時的にモニタリングすることは、循環再開後の脳、脊髄障害を予測する上で有効な手段であると考えられた。2.CDRならびにESCPの回復と脳、脊髄の病理組織学的変化より、直腸温15°Cの超低体温下循環停止法における脳循環停止時間は60分が可能であると考えられた。また、脊髄については、その許容時間は90分、あるいはそれ以上の可能性が考えられた。現在、超低体温下循環停止法に引き続き、脳分離体外循環法について、その安全性を体性感覚誘発電位(SEP)とCDRをモニタリングし検討中である。
ストレスから細胞を防御する仕組み

1-1.ストレス蛋白質HSP90は、熱変性したホタルのルシフェラーゼをトラップし、その会合沈殿を防ぐ作用をもつことを見いだした。HSP90とシフェラーゼ複合体は、HSP70、HSP40とレティキュロサイトライセ-ト中に含まれる未知の第3成分の作用によて解離し、ルシフェラーゼは再生することを明らかにした。1-2.ストレス蛋白質HSP90は生理的条件でホモ2量体であり棒状の構造である。今回、N端およびC端に特異的な抗体の修飾と電子顕微鏡観察によって、N端が棒の両端に位置し、C端は棒の中間にあることが分かった。1-3.酵母にはHSP90関連遺伝子が2個、HSP82とHSC82がある。HSC82を高発現するとカナバニンに対し超感受性になり、欠損させると抵抗性になることを見いだした。他のストレスに対しても同様な傾向を示す。この理由に一つは、ストレス下において動員される蛋白質分解系のどこかが、HSC82高発現下に抑制されることが明らかとなった。また、カルシニューリンの機能阻害も関係あることを見いだした。2-1.NMRによて立体構造を解明した。その結果、コフィリンの立体構造は、ゲルゾリンの6回繰り返している基本セグメントの立体構造と非常によく似ていることが明らかになった。また、両者の構造から、コフィリンがCa^<2+>依存的にアクチンに結合することが説明できた。2-2.細胞性粘菌で、コフィリンを過剰発現させると、大量のアクチン束が認められた。イン・ビトロ実験により、アクチンネットワークがコフィリンの作用で切断され、アクチン束に変換されることを示唆する結果をえた。また、細胞を高浸透圧ストレスにさらすと、アクチン束が収縮することを見いだした。2-3.コフィリンはリン酸化によって、アクチンへの結合能を失うことを見いだし、そのリン酸化はN端から3番目のセリン残基に起こることを同定した。2-4.出芽酵母のコフィリン温度感受性変異株を、マルチコピーで救済する遺伝子SCF1を単離したところ、機能が未知のアクチン結合蛋白質をコードする遺伝子AIP1と同じであった。Scf1は8個のWD40リピートをもち、その中の最後の2個を欠落させるとサプレッサー活性が消失した。SCF1は生存に必須の遺伝子ではない。2-5.細胞性粘菌のAIP1cDNAと蛋白質を単離した。生化学的実験によりAIP1はアクチン繊維に結合し、コフィリンに対し感受性を高めることが明らかになった。1.ストレス蛋白質HSP90は、熱変性したホタルのルシフェラーゼをトラップし、その会合沈殿を防ぐ作用をもつことを見いだした。

HSP90とルシフェラーゼ複合体は、HSP70、HSP40とレティキュロサイトライセ-ト中に含まれる未知の第3成分の作用によって解離し、ルシフェラーゼは再生することを明らかにした。現在、未知の第3成分を精製、同定しているところである。2.細胞がストレスを受けると、アクチンと共に核内に移行し、ロッド状の構造を作るアクチン結合蛋白質コフィリンについて次の結果をえた。2-1.NMRによって立体構造を解明した。その結果、コフィリンの立体構造は、ゲルゾリンの6回繰り返している基本セグメントの立体構造と非常によく似ていることが明らかになった。また、両者の構造から、コフィリンがCa^<2+>非依存的に、ゲルゾリンがCa^<2+>依存的にアクチンに結合することが説明できた。2-2.細胞性粘菌で、コフィリンを過剰発現させると、Fアクチン量が増加し、大量のアクチン束が認められた。また、イン・ビトロの実験によって、αアクチニン二よって架橋されたアクチンネットワークが、コフィリンの作用で束に変換されることを見いだした。この結果は、コフィリンがFアクチンを切断したためと考えられる。2-3.コフィリンはリン酸化によって、アクチンへの結合能を失うことを見いだし、そのリン酸化はN端から3番目のセリン残基に起こることを同定した。1)ストレス蛋白質HSP90は生理的条件でホモ2量体であり、棒状の構造である。今回、N端およびC端に特異的な抗体の修飾と電子顕微鏡観察によって、N端が棒の両端に位置し、C端は棒の中間にあることが分かった。2)酵母にはHSP90関連遺伝子が2個、HSP82とHSC82がある。HSC82を高発現するとカナバニンに対し超感受性になり、欠損させると抵抗性になることを見いだした。他のストレスに対しても同様な傾向を示す。この理由に一つは、ストレス下において動員される蛋白質分解系のどこかが、HSC82高発現下に抑制されることが明らかとなった。また、カルシニューリンの機能阻害も関係あることを見いだした。3)出芽酵母のコフィリン温度感受性変異株を、マルチコピーで救済する遺伝子SCF1を単離したところ、既に単離されているが、機能が未知のアクチン結合蛋白質をコードする遺伝子AIP1と同じであった。Scf1は8個のWD40リピートをもち、その中の最後の2個を欠落させるとサプレッサー活性が消失した。SCF1は生存に必須の遺伝子ではない。4)細胞性粘菌にコフィリンを過剰発現させると、アクチン繊維の束が多数形成され、コフィリンの濃度に依存して細胞運動が早くなることを見いだした。また、これらのアクチン繊維の束が、高浸透圧ストレスに応答して収縮することを見いだした。5)細胞性粘菌のAIP1cDNAと蛋白質を単離した。生化学的実験により、AIP1はアクチン繊維に結合し、コフィリンに対し感受性を高めることが明らかになった。また、AIP1は細胞運動およに高浸透圧ストレスに対し細胞が収縮するとき、コフィリンとアクチンと同じ細胞内分布をすることを認めた。
血小板凝集を惹起する新しい受容体CLEC-2:抗血栓薬新規ターゲット蛋白の可能性

先に我々は、血小板凝集を惹起する蛇毒ロドサイチンの血小板上受容体が、CLEC-2という、既知の血小板凝集惹起受容体とは全く異なるCタイプレクチン様受容体の蛋白であることを発表した。今回、CLEC-2の生理的リガンドの検索とノックアウトマウスの作成を目的とした。1)CLEC-2欠損マウス:平成18年5月より新たにベクターを作成しなおして、ノックアウトマウスを作成したが、ES細胞の品質不良のため不備に終わった。その後新たなES細胞を使用して19年4月より作成しなおし、現在はF1へテロマウスが9匹得られている。2)生理的リガンド:ロドサイチンのアミノ酸配列と相同性を示す蛋白に、プロテオグリカンの一種、バーシカンがある。粗精製バーシカンとCLEC-2の結合はビアコアで確認されたが、バーシカンによる血小板活性化は認められず、純粋なバーシカンを得ることも困難なため、この検討は中断した。腫瘍細胞の表面に発現するポドプラニンは血小板凝集を惹起し、腫瘍の血行性転移促進するといわれているが、その血小板上受容体は不明であった。我々はポドプラニンとロドサイチンによる血小板凝集の類似性から、ポドプラニンの受容体がCLEC-2ではないかと考えた。ポドプラニン発現細胞に組換CLEC-2蛋白の結合フローサイトメーターで確認され、ポドプラニン惹起血小板凝集は組換CLEC-2蛋白で抑制されることから、この仮説が正しいことが証明された。これは非常に有用な発見といえ、Journal of Biological ChemistryのPapers of the Weekに選ばれ、プレスリリースされるなど、大きな反響があった。さらに我々は、抗ポドプラニン抗体がマウスの尾静脈より投与した腫瘍の肺転移を抑制することも見出し、ポドプラニンとCLEC-2の結合を抑制することで癌の血行性転移を抑制できる可能性を示した。現在JSTの支援を受けて、国際特許出願準備中である。先に我々は、平成16年度科学研究費若手Bの助成(16790533)を受け、血小板凝集を惹起する蛇毒蛋白rhodocytinの血小板上受容体が、CLEC-2であること見出し、発表した。CLEC-2は今までに知られている血小板凝集惹起受容体とは全く異なるCタイプレクチン様受容体に属し、そし生理的なリガンドと生体内での役割が注目されている。今回の基盤Cでは、そのCLEC-2の生理的なリガンドを検索することと、ノックアウトマウスの作成を目的とした。1)CLEC-2ノックアウトマウスES細胞へのターゲッティングベクターのエレクトロポレーションの段階からクラボウに委託した。出願時、キメラマウスよりF1マウスが誕生した段階であったが、その後スクリーニングの段階で不備が見つかり、このベクターでのノックアウトマウス作成を断念した。平成18年5月より新たにノックアウトベクターを作成しなおして、ノックアウトマウスを作成中である。現在PCR,サザンブロットで7個の陽性ESクローンが検出された段階である。2)CLEC-2の生理的リガンドCLEC-2のリガンドである蛇毒蛋白ロドサイチンのアミノ酸配列の相同性を検索したところ、プロテオグリカンの一種、バーシカンのコア蛋白がヒットした。ウシ大動脈より粗精製したバーシカンを用いて、ビアコアでCLEC-2リコンビナント蛋白との結合を検討したところ、結合が認められた。

しかし、粗精製バーシカンによる血小板活性化は認められず、純粋なバーシカンを得ることも困難なため、この検討は中断し、別のリガンドを検索した。腫瘍細胞の表面に好発現する蛋白Aは血小板凝集を惹起し、これが腫瘍の血行性転移促進しているのではないかといわれている。しかし、蛋白Aの血小板上のリガンドは不明であった。我々は蛋白Aによる血小板凝集とロドサイチンによる血小板凝集の性質が類似していることに着目し、蛋白Aの受容体がCLEC-2ではないかと考えた。蛋白A発現細胞にCLEC-2リコンビナント蛋白の結合とその逆の現象がフローサイトメーターで確認され、蛋白A惹起血小板凝集はCLEC-2リコンビナント蛋白で抑制されることから、この類推が正しいことが証明された。蛋白AとCLEC-2の結合を抑制することで癌の血行性転移を抑制できる可能性があり、非常に有用な発見といえる。そのためこの知見は現在国際特許仮出願中である。また、現在Joumal of Biological Chemistryに投稿中である。先に我々は、血小板凝集を惹起する蛇毒ロドサイチンの血小板上受容体が、CLEC-2という、既知の血小板凝集惹起受容体とは全く異なるCタイプレクチン様受容体の蛋白であることを発表した。今回、CLEC-2の生理的リガンドの検索とノックアウトマウスの作成を目的とした。1)CLEC-2欠損マウス:平成18年5月より新たにベクターを作成しなおして、ノックアウトマウスを作成したが、ES細胞の品質不良のため不備に終わった。その後新たなES細胞を使用して19年4月より作成しなおし、現在はF1ヘテロマウスが9匹得ちれている。2)生理的リガンド:プロテオグリカンの一種、バーシカンがCLEC-2のリガンドである可能性を検討していたが、様々な困難な点があったため中断した。その後別のリガンド検索を行った。腫瘍細胞の表面に発現するポドプラニンは血小板凝集を惹起し、腫瘍の血行性転移促進するといわれているが、その血小板上受容体は不明であった。我々はポドプラニンとロドサイチンによる血小板凝集の類似性から、ポドプラニンの受容体がCLEC-2ではないかと考えた。ポドプラニン発現細胞に組換CLEC-2蛋白の結合フローサイトメーターで確認され、ポドプラニン惹起血小板凝集は組換CLEC-2蛋白で抑制されることから、この仮説が正しいことが証明された。これは非常に有用な発見といえ、Journal of Biological ChemistryのPapers of the Weekに選ばれ、プレスリリースされるなど、大きな反響があった。さらに我々は、抗ポドプラニン抗体がマウスの尾静脈より投与した腫瘍の肺転移を抑制することも見出し、ポドプラニンとCLEC-2の結合を抑制することで癌の血行性転移を抑制できる可能性を示した。現在JSTの支援を受けて、国際特許出願準備中である。
非侵襲性出生前診断法の開発を目指した妊娠初期母体血中の胎児細胞分離技術の確立

妊娠初期の女性の末梢血から密度勾配液を用いた遠心分離を繰り返して胎児細胞を濃縮した。この胎児細胞リッチな細胞液を、胎児細胞膜特異抗体を内壁に塗布したチャンバーに入れて胎児細胞を選択的に付着させて回収を図った。既知の抗体のほかに胎児細胞膜に特異性を有するナノ抗体については、有用な情報は入手できなかった。また、胎児nRBC細胞のFACSによる分離法も検討した。これらの方法で濃縮、分離した細胞のスライド標本で、胎児nRBC細胞を同定した。その細胞を用いて、各染色体を識別するプローブを用いたFISH法で胎児細胞の染色体構成を確認した。本研究の完成は、胎児染色体の「確定診断」を可能にする。従来の出生前診断における羊水穿刺や絨毛採取法などの検査手技では感染や流産のリスクが0.30.5%ほどあるとされていて、そのことが出生前染色体検査をためらう理由の一つと考えられている。したがって、そのようなリスクを伴わない非侵襲性検査法の開発が望まれてきた。妊娠9週以降の妊婦の母体血中において、およそ血球10万個に1個程度の割合で胎児細胞が存在するとされている。そこで、本研究の目的はその胎児細胞の特性を利用した効率的な方法で胎児細胞を濃縮し、最終的に胎児細胞を分離する方法の確立を目指すことである。最近国内で開始された母体血の血清中のDNA解析による新しい方法はあくまで確率値の結果であり確定診断には至らないが、本検査法が樹立されると母体血中の胎児細胞による直接的な「出生前診断」が可能になり、その意義は極めて大きい。本研究では、胎児有核赤血球nRBCやトロフォブラストをターゲットにして、母体血球との比重差、有核でヘモグロビンを多量に含む特徴的な細胞形態(有核赤血球)、胎児有核赤血球に特異なmRNAの発現、胎児細胞膜特異抗原などを胎児細胞の特性として利用した。昨年度から引き続き妊娠初期の女性から母体血の提供を受けて実験を実施した。まず母体血から定法により赤血球を分離除去した。次に厳密な密度勾配液を用いた遠沈分離法による胎児細胞の濃縮、胎児細胞膜特異抗体を塗布した特殊な培養チャンバーによる胎児細胞の吸着、FACSを用いた分離法などで胎児細胞の分離を目指した。これらの方法で得た細胞を胎児nRBCに特異なmRNA probeなどを用いたin situ hybridization法で胎児細胞の特定を図った。分離された細胞では特定遺伝子および染色体のDNAをprobeにしたin situ hybridizationで胎児細胞の遺伝子・染色体情報を取得する診断法の確立を図った。妊娠女性の末梢血に胎児有核赤血球nRBCやトロフォブラストなどが低頻度で含まれる。本研究ではそれらの細胞特性を利用して、母体血中から胎児細胞の分離を試みた。胎児細胞の特性とは、母体血球との比重の違い、有核でヘモグロビンを多量に含む特徴的な細胞形態、胎児有核赤血球に特異的なmRNA、及び胎児細胞膜特異抗原などである。具体的には、妊娠8週齢以降の女性から末梢血の提供を受けて本実験に用いた。それらの末梢血から定法によって赤血球を分離除去した。低調液で赤血球を破壊する方法も試みたが、この方法では胎児細胞自体が影響を受け、胎児細胞の特性を引き出すのに支障をきたす可能性があったので、一旦中止した。赤血球を除いた細胞液を用い、密度勾配液を用いた遠心分離法で胎児細胞の濃縮を図った。さらに、胎児細胞膜特異抗体を塗布したチャンバーによる胎児細胞の吸着を試みた。一方、FACSによる胎児細胞の分離法も検討したがまだ不十分である。これらの方法で得た細胞をスライドガラス上に伸展し、胎児nRBCに特異的なプローブを用いたFluorescence in situ hybridization (FISH法)で胎児細胞の検出を試みた。検出した胎児細胞で特定染色体のDNAをプローブにしたFISH法で胎児細胞の染色体数を調べた。各方法の精度を高め、最終的には確定診断法の確立を目指した。我が国でも非侵襲的出生前検査(NIPT)が昨年から漸く開始された。しかし、それはあくまでもリスク値を確率で示す検査であり、確定診断ではない。本研究では、妊婦の母体血中に含まれる胎児由来の細胞に着目し、その細胞特性を利用した方法で胎児細胞を濃縮し、最終的に胎児細胞を分離する方法の確立を目指す。研究は徐々に進展しているが、母体血から胎児細胞の分離技術が確立されると、胎児細胞による「確定診断」が可能になり、その意義は極めて大きい。従来の出生前診断において羊水穿刺や絨毛採取(CVS)法などの検査手技による感染や流産のリスクがかなり高い。