hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
ナノ構造設計に基づくイオンチャネルチップの開発

これは,生体チャネルの単一チャネル電流記録に適した電気特性と機械的安定性とを兼ね備えた人工脂質二分子膜系の構築に成功したことを意味する.次の段階は,構築した安定化脂質二分子膜系へ効率良くイオンチャネルタンパク質を埋め込むことであるが,この試行錯誤には十分な量のチャネルタンパク質が必要となるため,創薬に重要な2種のイオンチャネルを対象に大量発現細胞系の構築について検討した.細胞培養系の立ち上げとタンパク質の抽出を行い,今年度は活性を保持した状態での抽出法の構築まで進めることができた.また,高効率な薬物スクリーニング法への展開を目指し,安定化脂質二分子膜を多数個並列させた脂質二分子膜アレイを構築し,モデルチャネルのチャネル電流について複数の二分子膜から同時記録をすることに成功した(投稿準備中).
胸腺上皮性腫瘍の腫瘍内浸潤リンパ球に関する機能解析の研究

本研究では、縦隔腫瘍の中で最も発生頻度の高い胸腺上皮性腫瘍における免疫療法の可能性について腫瘍内T細胞を詳細に解析することにより追究した。胸腺上皮性腫瘍は希少疾患であり、標準治療法が確立されていないのが現状である。特に、悪性度の高い組織型では発見時には進行期となり切除不能となる症例が多い。そこで、免疫治療が有効となるか否かについての検討を行った。これまでに胸腺上皮性腫瘍の切除検体60例以上を用いて腫瘍内T細胞の免疫プロファイルおよび腫瘍免疫活性について詳細な解析を行った。研究結果からは、胸腺上皮性腫瘍の病理組織型毎にT細胞表面上の免疫チェックポイント分子の発現率が異なる知見が得られた。T細胞の抑制性マーカーであるTim-3や制御性T細胞の割合が悪性度の高い組織型になる程、高くなる傾向が認められた。一方で、PD-1の発現と組織型には関連は認められなかった。また、腫瘍細胞障害活性やサイトカイン産生能(IFN-g, TNF-a, IL-2)についても組織型毎に違いが観察され、悪性度が高い腫瘍内のT細胞では高いサイトカイン産生能が認められた。胸腺上皮性腫瘍の病理組織型による免疫プロファイルと腫瘍免疫活性に関連が認められ、特に胸腺腫B3および胸腺癌では、サイトカイン産生能や細胞障害活性が高く、免疫療法が有効となる可能性を示唆する結果が得られている。今後、抗PD-1抗体を用いて胸腺上皮性腫瘍の組織型毎にT細胞賦活効果を確認していく予定である。当院当科は毎年、年間30例以上の胸腺上皮性腫瘍の手術を行っている数少ない施設である。症例集積は順調で、すでに60例以上の免疫プロファイル解析を終えている。今後も解析を行っていく予定である。今後も症例集積が見込めるためさらに症例集積を行う。T細胞分化と抗腫瘍免疫に関する詳細な解析を行う予定である。T細胞分化に関しては様々はT細胞表面抗原の測定を行う予定である。また今後注目されるであろう制御性T細胞をターゲットにした治療が胸腺上皮性腫瘍において選択肢となり得るかについても検討を行っていく予定である。
ランゲルハンス細胞組織球症―次世代シーケンサーを用いた新規バイオマーカーの解析―

近年、乳癌や扁平上皮癌、肝細胞癌、漿液性卵巣癌、膿胸関連リンパ腫などの腫瘍でIFI27発現が上方制御されることが見出されており、腫瘍細胞の増殖や浸潤に関連していることが明らかとなっている。我々は、LCHは反応性病変の性格を有する腫瘍性疾患との発症メカニズムを提唱している。今回の結果はそれを支持するものとして矛盾しないと思われ、これらの遺伝子(KLF1、GATA-1、LYL1、IFI27)発現上昇は、LCHの増悪と関連する可能性があると考えられる。尚、次世代シーケンサーを用いるmiRNAシーケンス解析(small RNA解析)は今回検索していない(今後の検討課題として計画はしている)。臨床検体を用いたRNA-seqによって、LCH-RO (-)およびLCH-RO (+)間の網羅的な遺伝子発現比較解析を行い、差異を見出す事が出来た。これまでの、進捗と同様の方向性を示すデータで我々の目指すランゲルハンス細胞組織球症の解明に向けて更なる進展が期待できる。現時点で一段落したと考えられ、論文作成を進める。さらに、今回検索対象としていないsmall RNAの解析について、次世代シーケンサーを用いるmiRNAシーケンス解析についても推進を検討する。ランゲルハンス細胞組織球症(LCH)は、腫瘍性疾患なのか反応性疾患なのか?長い間議論の対象であったが、我々はLCHは腫瘍性疾患であり反応性疾患であると考えている。我々は、IL-17エンドクラインモデル、IL-1ループモデル等の論文報告を通じて、「腫瘍原性形質を有する異常ランゲルハンス細胞が何らかのトリガーに過剰反応した疾患」というLCH発症モデルを報告してきた。なお、ストレス刺激の一つの要因として、メルケル細胞ポリオーマウイルスが関与している可能性を示し、それに基づいて提唱したIL-1ループモデルは、血液腫瘍のWHO分類に関する書籍(WHO Classification of Tumours of Haematopoietic and Lymphoid tissues Revised 4th Edition、2017年発刊)に於いて、etiologyとして引用されている。かつて、平成23-25年及び平成26-28年度の科学研究費補助金を受けた研究に於いて、LCH亜型間で有意差のある血清タンパクを質量分析にて探索、同定した。その成果として得られた血清の質量分析器による検討結果(IL-6に反応して肝細胞が産生する急性相蛋白質の一つである血清ITIH4レベルと亜型に相関あり)等も考慮し、新たなLCH発症モデル(遺伝子異常等の腫瘍性側面、ストレス刺激と言う炎症性側面及びそれらに対する反応の面から成るトリプルファクターモデル)を提唱しつつある。LCH患者末梢血をPAX gene Blood RNA System (34)サンプルから、RNA抽出しつつあり、HiSeq (イルミナ株式会社)等の解析の委託についても検討中であり、概ね順調と考えている。RNA抽出後のLCH患者末梢血をHiSeq解析をし、LCH亜型間で有意差のある物質を選び出す。かつて、平成23-25年及び平成26-28年度の科学研究費補助金を受けた研究での成果として、LCH亜型間で有意差のある血清タンパクを質量分析にて探索、同定した。今回は、患者末梢血におけるRNAに着目した研究であり、同様に探索、同定へと推進する予定である。RNA抽出を勧めつつあるが、解析委託先に関して、複数候補があり、選定を慎重に進めているため。当初の予定を翌年度に持ち越して、論文作成、機器関連試薬購入等に用いる為。
Bcl11bによる嗅神経細胞の二者択一的運命決定の制御機構

嗅覚受容体ファミリーは、系統学的に魚類から哺乳類に共通して存在するクラスI型と陸棲動物特異的なクラスII型の2つに分類される。個々の嗅神経細胞は、クラスIもしくはII型の遺伝子レパートリーより一種類の遺伝子のみを選択的に発現する。嗅覚受容体遺伝子発現には、ベータグロビン遺伝子の遺伝子座調節領域のような転写調節配列(エンハンサー)が必要であるとされている。つまり嗅神経細胞のクラスI型かII型の二者択一的運命選択は、エンハンサーの選択とそれに続く単一遺伝子発現によって成立する。これまでにいくつかのクラスII遺伝子のエンハンサーが同定されてきたが、クラスI遺伝子のそれは同定されていなかった。我々はマウス遺伝学的手法と情報学的解析を駆使することで、カモノハシからヒトに至る哺乳動物間で高度に保存されたクラスI遺伝子クラスターのエンハンサー(Jエレメントと命名)の同定に世界で初めて成功した。ゲノム編集技術を用いた解析の結果、JエレメントはクラスIクラスター全体を制御しており、これまでに例をみない規模で遺伝子発現を制御していることがわかった。また嗅神経細胞の運命決定を制御する転写因子Bcl11bがクラスIならびにクラスIIエンハンサーに及ぼす影響を解析した結果、Bcl11bが発現しない嗅神経細胞ではJエレメント(クラスI)が優先的に活性化されること、一方、Bcl11bが発現する細胞ではJエレメントが抑制され、クラスIIエンハンサーの活性化が許容されることがわかった。このことはBcl11bがエンハンサー活性の制御を通じて嗅神経細胞の二者択一的選択を制御していることを示している。また嗅神経細胞の運命選択の破綻が個体レベルの行動に及ぼす影響を解析し、嗅神経細胞のクラスに偏りが生じることで、生得的忌避物質に対する嗅覚行動が大きく影響されることを明らかにするこができた。計画1「Bcl11b機能欠失型および獲得変異型マウスを用いたBcl11bの細胞運命の制御機構の解明」では、当初の計画どおり実験を遂行した。その結果、Bcl11b機能獲得変異によってクラスI嗅神経細胞への運命選択が阻害されることがわかった。この結果は、Bcl11b機能欠損変異とは逆の結果であった。興味深いことに、神経細胞への最終分化後のクラスII嗅神経細胞特異的にBcl11bを欠損させても、細胞運命がクラスIへとスイッチすることがわかり、嗅神経細胞の運命選択の可塑性を明らかにすることができた。しかし逆にクラスI嗅神経細胞にBcl11bを強制発現した場合、クラスI遺伝子の発現は抑制されるが、クラスIIへの運命のスイッチはおきなかった。計画2「嗅神経細胞のBcl11bが制御する標的遺伝子・ゲノム領域の同定」では、昨年度計画変更に記した通り、Bcl11b下流遺伝子の網羅的解析をMicroarrayからRNA-seqに変更して実施し、計画1で報告したBcl11bの細胞運命の制御機構を解明することができた。大きな進捗としては、これまで未同定であったクラスI遺伝子の転写調節配列(Jエレメント)の同定に世界で初めて成功したことが挙げられる(Nature Communications 2017)。またJエレメントのエンハンサー活性をBcl11bが負に制御していることを明らかにした。一方、ChIP-seqによるゲノムワイドでのBcl11bの結合部位の網羅的同定につては、マウス嗅上皮からのChIPの条件検討中である。計画3「嗅神経細胞の運命選択の破綻が嗅覚行動に及ぼす影響の解明」では、嗅神経細胞クラスのアンバランスが個体レベルの嗅覚行動に及ぼす影響を解析した。計画通りに遂行し、計画1ー3のデータをまとめて一つに論文として現在投稿中である。研究計画2の「嗅神経細胞のBcl11bが制御する標的遺伝子・ゲノム領域の同定」のなかでBcl11bが直接結合するゲノム領域の網羅的解析をChIP-seqによって明らかにする予定である。培養細胞とことなり生体組織(マウス嗅上皮)からのChIP(クロマチン免疫沈降)の条件検討中である。操作が安定しない問題があるため、マウス嗅上皮からのクマチン免疫沈降に実績のある海外の研究者との共同研究も今後検討する。マウス嗅覚受容体(OR)は、系統学的に魚類のORに類似したClass I型と陸棲動物特異的なClass II型の2つに分類される。嗅神経細胞は、その分化過程においてClass I型かClass II型かの二者択一的な細胞運命決定をおこない、いずれかのクラスのOR遺伝子を一つだけ発現する。これまでの研究で転写因子Bcl11bが嗅神経細胞の運命決定を制御していることを明らかにしている(未発表データ)。本研究課題では、その分子機構の解明に取り組んでいる。まずマウス遺伝学的手法を用いた解析から、Bcl11bがClass I OR遺伝子発現を負に制御していることを明らかにした。マウスゲノム上には158個のClass I ORが第7染色体上に3Mbの単一遺伝子クラスターを形成して存在する。我々は、独自にこの巨大なClass I OR遺伝子クラスターを制御するエンハンサー領域(J-element)を同定した(投稿中)。興味深いことに、Bcll11bはJ-elementのエンハンサー活性に抑制的に作用することが明らかになった。つまりBcll1bはClass I ORのエンハンサー、J-elementを負に制御することでClass I型の運命を抑制していると考えられる。

本研究では嗅覚系と同じ化学感覚である味覚系(舌上皮)にも研究を広げることでBcll11bの化学感覚細胞分化における機能を明らかにしたいと考え、舌上皮におけるBcl11bの機能解析をおこなった。Bcl11bは舌・軟口蓋の上皮基底細胞に発現していた。Bcl11b欠損マウスでは味細胞産生に異常は無かったが、舌乳頭、特に糸状乳頭の形態形成に異常が認められた。糸状乳頭を構築するハードケラチンや角化関連遺伝子の発現が減少していたことから、Bcl11bは舌乳頭、中でも角化上皮である糸状乳頭の形成において重要な役割を持つことを明らかにした。研究計画1「Bcl11b機能欠失型および獲得型変異マウスを用いたBcl11bの細胞運命の制御機構の解明」では、当初の研究計画である1「Bcl11b機能獲得型変異マウスの作成」は本課題採択時には達成でき、さらに2「Bcl11b機能獲得型変異マウスの解析」も完了し、Bcl11bがClass I OR遺伝子発現を負に制御するという興味深いデータを得ることができた。研究計画2「嗅神経細胞のBcl11bが制御する標的遺伝子・ゲノム領域の同定」では、Bcl11b機能獲得型変異マウスを用いたマイクロアレイ解析を予定していたが、解析方法をRNA-seqに変更して実施した。その結果、個体数1のデータであるが、計画1の結果を指示するデータを得ることができた。現在、個体数を増やし、再現性の確認をおこなっている。研究計画3「嗅神経細胞の運命選択の破綻が嗅覚行動に及ぼす影響の解明」については当初H29年度以降の実施を予定していたが、計画を前倒し、嗅神経細胞特異的Bcl11b遺伝子欠損マウスの行動解析を始めている。嗅覚受容体ファミリーは、系統学的に魚類から哺乳類に共通して存在するクラスI型と陸棲動物特異的なクラスII型の2つに分類される。個々の嗅神経細胞は、クラスIもしくはII型の遺伝子レパートリーより一種類の遺伝子のみを選択的に発現する。嗅覚受容体遺伝子発現には、ベータグロビン遺伝子の遺伝子座調節領域のような転写調節配列(エンハンサー)が必要であるとされている。つまり嗅神経細胞のクラスI型かII型の二者択一的運命選択は、エンハンサーの選択とそれに続く単一遺伝子発現によって成立する。これまでにいくつかのクラスII遺伝子のエンハンサーが同定されてきたが、クラスI遺伝子のそれは同定されていなかった。我々はマウス遺伝学的手法と情報学的解析を駆使することで、カモノハシからヒトに至る哺乳動物間で高度に保存されたクラスI遺伝子クラスターのエンハンサー(Jエレメントと命名)の同定に世界で初めて成功した。ゲノム編集技術を用いた解析の結果、JエレメントはクラスIクラスター全体を制御しており、これまでに例をみない規模で遺伝子発現を制御していることがわかった。また嗅神経細胞の運命決定を制御する転写因子Bcl11bがクラスIならびにクラスIIエンハンサーに及ぼす影響を解析した結果、Bcl11bが発現しない嗅神経細胞ではJエレメント(クラスI)が優先的に活性化されること、一方、Bcl11bが発現する細胞ではJエレメントが抑制され、クラスIIエンハンサーの活性化が許容されることがわかった。このことはBcl11bがエンハンサー活性の制御を通じて嗅神経細胞の二者択一的選択を制御していることを示している。
LA-ICP-MSを用いた微小領域地質年代測定法の開発と三波川変成岩の詳細年代測定

本研究では,(1)微小領域のin situ地質年代測定法の開発と(2)三波川変成岩へのその年代測定法の応用の2部分よりなる.今年度は(1)の年代測定法開発のための基礎的な研究として,X線マイクロアナライザーを用いた微小領域年代測定法の確立を行った.(2)に関しては,三波川変成岩とその比較試料の採取,年代測定用鉱物の分離を行った.1)年代測定を行うための三波川エクロジャイトおよび関連する藍閃石片岩,ざくろ石角閃岩,泥質片岩などの高圧型変成岩地質調査と岩石試料の採取を行った.また,比較試料として舞鶴帯,飛騨外縁帯等の変成岩試料の採取を行った.2)1)で採取した変成岩岩石試料の偏光顕微鏡を用いた岩石記載,ざくろ石,単斜輝石,角閃石,雲母類などの主要変成鉱物のEPMAによる微小領域化学組成の分析と固溶体鉱物の元素カラーマップ分析を行った.とくにざくろ石中の包有物としてのジルコンとモナズ石の存在と産状をBEIとCMP方を用いて確認した.3)高圧超高圧変成岩の微小領域年代測定を行うため,キルギスのアクチュツ及びマクバル地域地質調査と変成岩試料の採取を行った.4)上記1)および3)の高圧超高圧変成岩試料よりジルコンおよびモナザイトの鉱物分離を研究補助者の協力を得て行った.5)4)の変成岩についてその原岩の推定と形成温度・圧力条件の推定を行った.6)三波川変成帯におけるこれまでの地質年代学的研究のレビューと年代データベースの作成を行った.7)これまでの研究成果をHKT Workshopおよび日本地質学会において発表するとともに関連研究者と研究討論を行った.本研究では,(1)微小領域のin situ地質年代測定法の開発と(2)三波川変成岩へのその年代測定法の応用の2部分よりなる.今年度は(1)の年代測定法開発のための基礎的な研究として,X線マイクロアナライザーを用いた微小領域年代測定法の確立を行った.(2)に関しては,三波川変成岩とその比較試料の採取,年代測定用鉱物の分離を行った.1)年代測定を行うための三波川エクロジャイトおよび関連する藍閃石片岩,ざくろ石角閃岩,泥質片岩などの高圧型変成岩地質調査と岩石試料の採取を行った.また,比較試料として舞鶴帯,飛騨外縁帯等の変成岩試料の採取を行った.2)1)で採取した変成岩岩石試料の偏光顕微鏡を用いた岩石記載,ざくろ石,単斜輝石,角閃石,雲母類などの主要変成鉱物のEPMAによる微小領域化学組成の分析と固溶体鉱物の元素カラーマップ分析を行った.とくにざくろ石中の包有物としてのジルコンとモナズ石の存在と産状をBEIとCMP方を用いて確認した.3)高圧超高圧変成岩の微小領域年代測定を行うため,キルギスのアクチュツ及びマクバル地域地質調査と変成岩試料の採取を行った.4)上記1)および3)の高圧超高圧変成岩試料よりジルコンおよびモナザイトの鉱物分離を研究補助者の協力を得て行った.5)4)の変成岩についてその原岩の推定と形成温度・圧力条件の推定を行った.6)三波川変成帯におけるこれまでの地質年代学的研究のレビューと年代データベースの作成を行った.7)これまでの研究成果をHKT Workshopおよび日本地質学会において発表するとともに関連研究者と研究討論を行った.
インフルエンザウイルスの抗原変異に伴う立体構造変化の解析

インフルエンザの流行を効率よく制御するためには、抗原変異の機序を理解し、予測することが必要である。本研究では、インフルエンザウイルスの主要抗原であるヘマグルチニン(HA)の立体構造に焦点をあて、構造バイオインフォマティクス的手法により、抗原変異に伴うHAの抗原構造の変遷を解析した。また結果に基づき、パンデミック2009(H1N1)ウイルスの抗原変異に伴う今後のアミノ酸置換を予測した。本研究では、計算科学およびバイオインフォマティクス手法を用いて、インフルエンザウイルスの抗原変異に伴う抗原構造の変遷をアミノ酸変化と立体構造の変化から明らかにすることを目的とし、以下の研究を遂行した。また、過去にヒトで流行したインフルエンザウイルスの抗原変異解析の結果に基づき、本年度パンデミックを起こした新型インフルエンザ(2009H1N1)ウイルスの抗原変異予測を試みた。1.アミノ酸変異履歴の作成(1)データベース(DB)解析によるアミノ酸変異履歴の作成過去にヒトで流行を起こしたインフルエンザウイルス(H1N1, H2N2, H3N2)のアミノ酸置換の変遷を時系列的に解析し、変異履歴を作成した。(2)変異株のHA蛋白質の構造構築ホモロジーモデリング法を用いて、ヒトで流行を起こしたインフルエンザウイルス(2009H1N1ウイルスを含む)の抗原変異株のHA蛋白質構造を構築した。2.2009H1N1ウイルスHAの抗原構造の解析上記(2)で構築したホモロジーモデルを用いて、1918年のH1N1パンデミック株、その子孫である2007年のH1N1ワクチン株、2009H1N1の原型株でHAの抗原構造を比較した。2009H1N1と1918H1N1のHA抗原領域のアミノ酸は、よく保存していることが分かった。特に、SaおよびSb領域は構造的にも、よく似ていた。したがって、ヒト集団間で2009H1N1ウイルスも、1918H1N1ウイルスと同様の抗体で選択されると仮定した場合、2009H1N1でも、これらの領域に変異が蓄積し、同様の抗原変異が起こる可能性が予想される。DB解析では、実際に、1918H1N1と同様のアミノ酸変異を起こしているvariantが、すでに分離されていることが分かった。また、糖鎖付加を伴う抗原変異についても、1918H1N1の流行開始当初と同様の部位で起こる可能性が予想された。本年度は特にHA上への糖鎖付加による抗原構造の変化に着目した。まず、昨年度、分子モデリングにより構築した立体構造を時系列に並べ、DB解析により作成したアミノ酸変異履歴との比較を行った。この解析結果から、各年代におけるHA構造の変遷について考察した。一般に、HAに新たな糖鎖が付加することによって、その周辺エピトープに対する抗体の選択圧は減少することが予想される。本研究では、上記の変遷に関するデータを基に、情報理論的アプローチを用いて、糖鎖付加後の周辺残基の多様性の変化について解析した。その結果、糖鎖付加直後に周辺残基の多様性が減少した糖鎖付加部位もみられたが、多くの糖鎖付加部位では顕著な減少は確認されなかった。このことから、糖鎖付加部位周辺のアミノ酸が、糖鎖付加後もHAの抗原変異に関係していた可能性が示唆された。すなわち、HAに糖鎖が付加した後、その糖鎖が周辺エピトープに対する抗体の選択圧を必ずしも減少させていなかったことが予想された。また実際に糖鎖がHA上に付加することによって、糖鎖が周辺残基にどのような影響を及ぼすかを調べるため、分子動力学シミュレーションによるテスト計算を遂行した。
スタチンによるVEGF遺伝子転写促進を介した骨芽細胞分化促進機構の解明

高脂血症治療薬として臨床で広く用いられているスタチンに骨代謝調節作用のあることが明らかになってきた。今回、私達はスタチン類の一つであるシンバスタチンにより誘導される骨形成促進因子の検索を行った。マウス骨芽細胞株であるMC3T3-E1細胞にシンバスタチンを添加したところ、血管内皮増殖因子[vascular endothelial growthfactor(VEGF)]の遺伝子発現は著明に促進された。シンバスタチンの効果はメバロン酸やゲラニルゲラニルピロリン酸(GGPP)の添加により完全に消失した。タンパク質のPrenylationの阻害剤であるManumycin Aの添加により再現された。また、PI3キナーゼ阻害剤であるLY294002の前処理により抑制された。VEGF受容体阻害剤を添加すると、シンバスタチンによる石灰化の促進は消失した。シンバスタチンを添加し、MC3T3-E1細胞を長期間培養すると、VEGFの遺伝子発現及びVEGF分泌量は分化した状態の細胞で著しく上昇し、石灰化の進行時期と一致していた。従って、スタチンは骨芽細胞において、タンパク質のPrenylationを抑制し、PI3キナーゼ経路を活性化させ、VEGF遺伝子の転写を促進させ、VEGFの分泌を亢進させる。VEGFはBMP-2と協力して骨芽細胞の分化を促進させ、石灰化を亢進させることが強く示唆された。骨粗鬆症の動物モデルである卵巣摘出ラットにスタチンを投与すると、単独では骨密度上昇作用をほとんど発揮しない。骨吸収抑制剤であるエストロゲン(女性ホルモン)あるいは、骨形成促進剤である副甲状腺ホルモンと併用投与すると明らかな骨密度上昇作用がみられた。スタチンの強力な骨形成促進作用はin vitroの系では顕著であるが、in vivoの系で発現しにくい(Endocrine,24,121-129,2004)。in vivoの系で、スタチンの骨形成促進作用を検討している。コレステロール合成の律速酵素であるHMG-CoA還元酵素の特異的阻害剤、スタチンは、高コレステロール血症治療薬として広く用いられている。最近、私達はスタチン類の一つであるシンバスタチンが骨芽細胞の分化を促進させることを見出した。スタチンの骨芽細胞分化促進作用は骨形成因子の一つであるBMP-2の発現促進によることが知られている。今回私たちは、シンバスタチンにより誘導されるBMP-2以外の骨形成因子を検索した。マウス骨芽細胞株であるMC3T3-E1細胞を用いて、骨分化誘導培地(25μg/mlアスコルビン酸及び10mMβ-glycerophosphateを含むα-MEM培地)で培養、シンバスタチンや各種インヒビターを加え、血管内皮増殖因子(vascular endothelial growth factor (VEGF))のmRNA量及びタンパク質量を測定した。その結果、シンバスタチン添加により、VEGF mRNA量は時間経過と共に、また用量依存的に増加した。VEGF mRNA発現量はシンバスタチン12時間の処理、また10^<-6>Mの濃度で最大となった。コレステロール合成の中間代謝産物であるメバロン酸及びGGPPの添加により、シンバスタチンの効果は消失した。また、タンパク質のPrenylationの阻害剤であるManumycin Aの単独添加により、VEGF mRNA量は増加した。WortmanninなどのPI3-キナーゼ阻害剤により、シンバスタチンの効果は消失した。シンバスタチンは、骨芽細胞において、メバロン酸およびGGPPの合成を抑制する。GGPPの低下はSmall GTPaseなどのタンパク質のPrenylationを抑制する。

その結果、PI3-キナーゼ経路が活性化され、VEGFの遺伝子の転写が亢進される。シンバスタチンの骨芽細胞分化促進の機構はBMP-2の発現促進によるだけでなく、VEGF合成の促進も関与していると考えられる。高脂血症治療薬として臨床で広く用いられているスタチンに骨代謝調節作用のあることが明らかになってきた。今回、私達はスタチン類の一つであるシンバスタチンにより誘導される骨形成促進因子の検索を行った。マウス骨芽細胞株であるMC3T3-E1細胞にシンバスタチンを添加したところ、血管内皮増殖因子[vascular endothelial growthfactor(VEGF)]の遺伝子発現は著明に促進された。シンバスタチンの効果はメバロン酸やゲラニルゲラニルピロリン酸(GGPP)の添加により完全に消失した。タンパク質のPrenylationの阻害剤であるManumycin Aの添加により再現された。また、PI3キナーゼ阻害剤であるLY294002の前処理により抑制された。VEGF受容体阻害剤を添加すると、シンバスタチンによる石灰化の促進は消失した。シンバスタチンを添加し、MC3T3-E1細胞を長期間培養すると、VEGFの遺伝子発現及びVEGF分泌量は分化した状態の細胞で著しく上昇し、石灰化の進行時期と一致していた。従って、スタチンは骨芽細胞において、タンパク質のPrenylationを抑制し、PI3キナーゼ経路を活性化させ、VEGF遺伝子の転写を促進させ、VEGFの分泌を亢進させる。VEGFはBMP-2と協力して骨芽細胞の分化を促進させ、石灰化を亢進させることが強く示唆された。骨粗鬆症の動物モデルである卵巣摘出ラットにスタチンを投与すると、単独では骨密度上昇作用をほとんど発揮しない。骨吸収抑制剤であるエストロゲン(女性ホルモン)あるいは、骨形成促進剤である副甲状腺ホルモンと併用投与すると明らかな骨密度上昇作用がみられた。スタチンの強力な骨形成促進作用はin vitroの系では顕著であるが、in vivoの系で発現しにくい(Endocrine,24,121-129,2004)。in vivoの系で、スタチンの骨形成促進作用を検討している。
メタボローム解析に基づくANAMMOXプロセスの高効率・安定化技術の創出

本年度は"Candidatus Brocadia sinica"のプロテオーム解析のデータについて詳細な解析を行い、細胞内代謝マップの作成を行った。代謝マップ解析ではKEGG、Breda等のデータベースを用いて解析を行い、文献レビューを加えることで各代謝経路の成り立ちを考察した。主要な代謝経路として、嫌気性アンモニア酸化(anammox)、無機炭酸の固定に利用される還元的acetyl CoA経路、還元力生成のための亜硝酸酸化経路を同定することに成功した。特にanammox経路に関与するヒドラジン酸化酵素とヒドラジン合成酵素の発現量が"Ca. Brocadia sinica"の細胞内で極めて高く、主たるエネルギー生産経路となっていたことが明らかとなった。さらに、NrfAの発現がプロテオームから確認されており、これは"Ca. Brocadia sinica"が異化的硝酸還元を行っていた事を示唆する結果だった。"Ca. Brocadia sinica"による異化的硝酸還元を実証するため、細胞に硝酸とギ酸を添加し、嫌気的に培養し、亜硝酸とアンモニアの生成を同位体比分析で調査した。その結果、亜硝酸とアンモニアの生成を確認することができ、"Ca. Brocadia sinica"の新たな生理学的特性を明らかにすることに成功した。一方、興味深いことに亜硝酸還元を担う酵素がゲノム上からも見いだされなかった。そこで、亜硝酸還元酵素を同定すべくRadboud大学(オランダ)に留学し、タンパク質精製の研究に取り組んだ。細胞粗抽出液から亜硝酸還元活性を示すフラクションを確認し、段階的に精製することに成功した。一連の解析を通じて、"Ca. Brocadia sinica"の新たな生理学的特性を明らかにすることに成功したと言える。こうした解析の経過について論文誌において報告を行った。(抄録なし)本年度は、1)ゲノム配列の完成度向上、2)鉄酸化呼吸能の確認、3)anammox活性の菌体密度依存性について調査を行なった。ゲノム配列の完成度向上については、ペアエンド法による高速シーケンスデータおよびfosmidライブラリーのスクリーニングデータを組み合わせることで、anammox細菌Candiatus Brocadia sinicaが持つゲノム全体の97%以上をカバーすると予測されるゲノム配列データを得る事ができた。これは過去に報告されているanammox細菌のゲノムデータを上回る品質であり、Ca.B.sinicaの生理学的特性を理解するために重要な基盤情報を得る事ができた。また、バイアル試験によって、Ca.B.sinicaの鉄酸化呼吸能について調査を行なった。第一鉄を電子供与体、硝酸を電子受容体とした場合に、硝酸還元によって亜硝酸が生成し、逐次的にanammox反応で消費されることを明らかにした。本反応を応用することによって、anammoxプロセスにおける、亜硝酸供給律速の緩和および処理水中の窒素濃度低減に寄与することが可能であると期待された。さらにanammox活性の菌体密度依存性について調査を行なった。Ca.B.sinicaを段階的に希釈し、anammox活性を^<29>N_2ガス生成速度に基づいて算出した結果、anammox反応が生ずるには少なくとも10^7cells/mlの菌体密度が必要であり、菌体密度の上昇に従ってanamox活性が増加することを確認した。また、Ca.B.sinicaの培養液上澄には、anammox活性を向上させるある種のシグナル分子が存在したことが、培養液抽出物を用いた試験によって明らかとなった。本シグナル物質を同定、添加することにより、高機能なanammoxリアクターを運転できることが期待される。本年度は、高速anammoxリアクター内で培養されたanammox細菌についてプロテオーム解析を実施した。この目的にあたり、タンパク質の抽出条件について検討を行なった。その結果、異なる種類の界面活性剤を組み合わせ、かつ段階的に菌体を溶菌処理した場合に最も多くのタンパク質を回収できることが明らかとなった。続いて、抽出タンパク質を1次元SDS-PAGEにおいて展開し、泳動レーンからゲルバンドを切り出し、質量分析を行った。昨年度までに筆者が解読したCandidatus "Brocadia sinica"のゲノム情報に対してMS/MSパターンの相同性検索を行った結果、1,175種のタンパク質を同定することに成功した。また、昨年度までに回分試験において確認したanammox細菌の鉄酸化硝酸還元能を応用すべく、連続式カラムリアクターの立ち上げおよび連続運転試験を実施した。運転開始当初では、微量の酸素コンタミにより連続式カラムリアクターへ第一鉄を連続的に供給することが困難であった。そこで、リアクターへ供給する基質へシステインを還元剤として添加しながら培養を行ったところ、第一鉄を安定的に供給することが可能となり、鉄酸化硝酸還元能をリアクター内で確認することに成功した。一方、システインを添加しながら連続培養を行った結果、従属栄養性脱窒細菌がリアクター内で優占化し、anammox活性が低下した。これらのことから、鉄酸化硝酸還元能を組込んだanammoxリアクターの運転では酸素コンタミを極力抑える操作が必要であり、適切な還元剤を補助的に用いるべきであることが明らかとなった。

特にanammox経路に関与するヒドラジン酸化酵素とヒドラジン合成酵素の発現量が"Ca. Brocadia sinica"の細胞内で極めて高く、主たるエネルギー生産経路となっていたことが明らかとなった。さらに、NrfAの発現がプロテオームから確認されており、これは"Ca. Brocadia sinica"が異化的硝酸還元を行っていた事を示唆する結果だった。"Ca. Brocadia sinica"による異化的硝酸還元を実証するため、細胞に硝酸とギ酸を添加し、嫌気的に培養し、亜硝酸とアンモニアの生成を同位体比分析で調査した。その結果、亜硝酸とアンモニアの生成を確認することができ、"Ca. Brocadia sinica"の新たな生理学的特性を明らかにすることに成功した。一方、興味深いことに亜硝酸還元を担う酵素がゲノム上からも見いだされなかった。そこで、亜硝酸還元酵素を同定すべくRadboud大学(オランダ)に留学し、タンパク質精製の研究に取り組んだ。細胞粗抽出液から亜硝酸還元活性を示すフラクションを確認し、段階的に精製することに成功した。一連の解析を通じて、"Ca. Brocadia sinica"の新たな生理学的特性を明らかにすることに成功したと言える。こうした解析の経過について論文誌において報告を行った。計画書において想定していた試験の大半を終える事ができており、2年目計画に速やかに取りかかれる状態にあるため。研究計画書において記載した2年目計画の内容を当該年で達成することができ、翌年度の研究計画にすみやかに取りかかることが出来る状況にあるため。研究計画書において予定していた2年目の作業に速やかに取りかかる。具体的には、鉄酸化リアクターの連続運転開始、菌体密度依存的に産生されるシグナル分子の同定を行なう予定である。また、最終年度におけるプロテオミクス解析のため、試料調整法等について予備検討を行なう。本年度において実施したプロテオーム解析の結果に基づき、anammox細菌の生理学的特性について考察を深める。そのために、タンパク質発現に基づく代謝パスウェイ解析を行なう予定である。(抄録なし)
正標数の微分代数の基礎的研究

ここで扱う微分は、Hasse-奥川微分である。体論における超越的元の概念を正標数pの微分代数に拡張するとき、微分体k上の元alphaがk上の微分多項式の零点でないというだけでは十分ではない。(例えば、alphaが微分多項式の零点でないとしても、そのderivativethetaalphaは常に微分多項式の零点である。)alphaがk上微分擬代数的であることの定義をここで扱う微分は、Hasse-奥川微分である。)alphaがk上微分擬代数的であることの定義を
場の分解の方法に基づくクォーク閉じ込めの理解

今年度は以下の3つの方向性に関して進展があった。1.QCD弦の相互作用を再現しうる模型として、双対ゲージ理論におけるセンター・ボルテックス解が考えられる。今年度の研究においては、センター・ボルテックス解を持つ模型として二つの随伴スカラーをもつ双対SU(2)ゲージ理論を考えた。先行研究において考えられていなかったような随伴スカラーに対するポテンシャルにおいても、あるパラメータの範囲においては、ANOボルテックスとは異なる方程式に従うようなボルテックス解が存在することを確認した。2.場の分解によってウィルソン・ループに対する磁気モノポールの寄与を取り出すことができるが、ウィルソンループが高次元表現に属する場合には、素朴にはうまくいかないことが知られていた。今回の研究においては、非可換ストークスの定理から示唆される演算子を場の分解から素朴に定義される演算子のかわりにもちいることで、この問題は回避可能であることを格子シミュレーションによって示した。格子シミュレーションはSU(2)の随伴表現の場合、及びSU(3)の随伴表現、セクステット表現の場合においてなされた。3.場の分解の方法を応用することで、ローレンスゲージ固定したヤン=ミルズ理論に単にグルーオン質量項を加えた模型をゲージ不変な模型に拡張できる。この模型は純粋なヤン=ミルズ理論の有効模型とみなせる。今年度の研究においては、この理論のグルーオン・プロパゲータおよびゴースト・プロパゲータを1ループの量子補正を含めて計算した。ゲージ群がSU(3)の場合について純粋なヤン=ミルズ理論の格子シミュレーションの結果と比較しよく一致していることをみた。また、すべてのパラメータ領域において鏡映正値性が破れていることが確認された。この結果はすべてのパラメータ領域におけるグルーオンの閉じ込めを示唆する。今年度は3つの方向性に関して進展があった。1つ目の進展については今年度の当初から計画されていたものである。研究実績の概要に書いたように、これまで考えられてこなかった形のポテンシャルを考え、新しいセンター・ボルテックス解を発見した。また、あるパラメータの範囲については、新しく発見された解がこれまで多く議論されてきたANOボルテックスと同様の方程式を満たすセンター・ボルテックス解よりも弦張力が小さくなることがわかった。そのため、QCD弦の模型として新しく発見された解のほうが適しているという可能性がある。2つ目の進展は、ウィルソン・ループが高次元表現に属する場合について、磁気モノポールの寄与を取り出すための適した演算子を発見したというものである。高次元表現に属するカラーソース間の弦張力を再現できないということは、磁気モノポールによる閉じ込め描像の問題の一つとして知られていた。今年度の研究によって、この問題に対するひとつの解決法が示されたことになる。これについては年度当初の計画にはなかったが、「場の分解に基づいて定義された磁気モノポールによって閉じ込めを説明する」という研究全体の目標にとって重要な進展と言える。3つ目の進展は、当初の計画にはなかった新たな進展と言える。これまで考えられてきた場の分解においては、ゲージ場を二つの部分に分解する際、カラー場と呼ばれるゲージ場の汎関数を、随伴表現空間に値をとるものとして定義したが、今回はカラー場を基本表現空間に値をとるものとして定義したものを用いている。これは場の分解に基づいて閉じ込めを理解しようとする試みに対してあらたな視点を与えうる。結果としては、この場の分解に基づいて定義されたゲージ不変な質量項を含む理論は、純粋なヤン=ミルズ理論の有効模型とみなしうることがわかった。総合すると、今年度において研究は順調に進展したと言える。今後の推進方策として以下の3つの方向性が考えられる。1.今年度の研究において、SU(2)ゲージ理論におけるQCD弦の模型として、二つの随伴スカラーを持つ双対SU(2)ゲージ理論のセンター・ボルテックス解を探索したが、今回発見した解は空間を二次元とした場合の解、すなわち三次元空間においては無限にながい渦糸解である。しかし、QCD弦の模型としては有限の長さのものが望ましい。よって今後の研究として有限長さのセンター・ボルテックス解を探すということが考えられる。有限の長さの渦糸解を構成するには、無限に重い磁気モノポールを外場として導入し運動方程式をとけば良いと思われる。2.今年度の研究によって、高次元表現に属するウィルソン・ループについては、場の分解によって定義される磁気モノポールの寄与によってその振る舞いを再現しうることが示された。しかし、同様に、場の分解を素朴に適用することで磁気モノポールの寄与を取り出したとしても、その振る舞いを再現できないとされている二重巻きのウィルソン・ループについては、未だ解決策は得られていない。ただ、この問題についても、高次元表現に属するウィルソン・ループと同様に、適切な演算子を場の分解から素朴に定義される演算子の代わりに用いることによって、回避可能であると考えられる。今後の研究としてこの適切な演算子を探すということが考えられる。3.今年度の研究においては、純粋なヤン=ミルズ理論にグルーオン質量項を加えた模型を、1ループまでの量子補正を含む形で調べた。今後の研究としてグルーオン質量項の効果を格子シミュレーションによって調べるという方向性が考えられる。場の分解を用いることでグルーオン質量項をゲージ不変に定義可能であるため、格子シミュレーションで調べることが可能となる。今年度は以下の3つの項目について研究した。1.二重巻きウィルソンループと呼ばれる、ある平面上のループとその最小面上にあり一点を共有するようなループの二つのループからなる経路に対して定義されるウィルソンループの振る舞いを調べた。

正しい閉じ込めのモデルはその振る舞いを再現しなければならないので、モデルの選別にもちいることができる。本研究では、二重巻きウィルソンループの振る舞いを、SU(N)ゲージ群の場合について調べた。その結果二重巻きウィルソンループは、二つのループが一致する場合には、ひとつのループに対する高次元表現のウィルソンループの線形結合によって表せることがわかった。これにより、高次元表現のウィルソンループの振る舞いを仮定することで二つのループが一致する場合の二重巻きウィルソンループの振る舞いを決定することができた。2.純粋なヤン=ミルズ理論においては、ソリトン解は4次元におけるインスタントン解しかないが、それだけでは閉じ込めを説明することが難しいという問題がある。一方場の分解の方法を用いると、ゲージ不変な質量次元2の演算子を作ることができ、それが非ゼロの期待値を持つと、有効理論において他のトポロジカル配位が解になりうる。本研究では、ゲージ群がSU(N)の場合に、この質量次元2の演算子のゲージ固定したときの対応物であるBRST不変な質量次元2の演算子に対する有効ポテンシャルを、1ループの近似で計算した。結果として、BRST不変な質量次元2の演算子が非ゼロの期待値を持ちうることが示された。3.上記の質量次元2の演算子が非ゼロの期待値を持つと、ゲージ場は有効的に質量を得ると考えられる。その質量を有効的に取り入れた理論に対して、ゲージ群がSU(2)の場合に、ソリトン解として磁気モノポール解を数値的に得た。磁気モノポールは双対超電導描像を介して閉じ込めに寄与しうる。年度当初の目標であるゲージ不変な質量次元2の凝縮のSU(N)における1ループでの計算、およびゲージ群がSU(2)の場合についてのゲージ不変な質量項を加えた理論における磁気モノポール解の構成を達成した。また、それに加え二重巻きウィルソン・ループの振る舞いについての結果を得た。正しい閉じ込めのモデルは二重巻きのウィルソン・ループの振る舞いを再現しなければならないので、この結果は閉じ込めのモデルの選別に用いることができる。今年度は以下の3つの方向性に関して進展があった。1.QCD弦の相互作用を再現しうる模型として、双対ゲージ理論におけるセンター・ボルテックス解が考えられる。今年度の研究においては、センター・ボルテックス解を持つ模型として二つの随伴スカラーをもつ双対SU(2)ゲージ理論を考えた。先行研究において考えられていなかったような随伴スカラーに対するポテンシャルにおいても、あるパラメータの範囲においては、ANOボルテックスとは異なる方程式に従うようなボルテックス解が存在することを確認した。2.場の分解によってウィルソン・ループに対する磁気モノポールの寄与を取り出すことができるが、ウィルソンループが高次元表現に属する場合には、素朴にはうまくいかないことが知られていた。
多文化社会におけるシティズンシップ理論とその制度像

本年度は、英米圏の政治哲学におけるグローバルな分配的正義をめぐる理論について主に研究を行った。同時に、具体的制度像についての研究の一環として、カナダの移民政策、移民政策をめぐる政治状況、問題点についても研究を進めた。まず、昨年度に引き続き、4月下旬まで、カナダのクィーンズ大学哲学科において、Will Kymlicka教授のご指導の下、博士論文の基礎となる研究を行ってきた。特に、帰国直前には、現在作成中の博士論文の基礎となる英文の短い草稿をKymlicka教授及び政治学科のMargaret Moore教授にお見せし、多くの助言や関連する文献情報、執筆への激励を頂くことができた。両教授から頂いた助言等は、作成中の博士論文に様々な形で反映されている。帰国後は、諸研究会に参加しつつ、主に博士論文の執筆を進めてきた。9月には、指導教授である井上達夫の主催する科学研究費プロジェクトの会合で、「グローバルな分配的正義と労働者の国際的移動」と題し、博士論文の概要について報告を行った。博士論文の一部となるJoseph Carensによる開放的国境論の検討については、来年度(2009年度)日本法哲学会分科会報告に応募し、査読審査の上、報告の機会が得られることとなった。また、グローバルな分配的正義を巡る研究の一環として、ナショナリズム論の第一人者であるDavid Millerによるグローバルな正義論、「ナショナルな責任とグローバルな正義」について書評を『国家学会雑誌』122巻3・4号に寄せた。これは来年度(2009年)4月末に刊行される予定である。最後に、何と言っても、今年度最大の成果は、博士論文の草稿を書き上げたことである。未だ議論が不十分な点や明確でない点などもあるが、今後、さらなる改稿の上で提出する予定であり、その基礎が仕上がったと言えると思う。本年度は、英米圏の政治哲学における多文化主義論およびグローバルな分配的正義をめぐる理論について主に研究を行った。同時に、具体的制度像についての研究の一環として、多文化主義を採用するカナダの政治制度の基礎およびその移民政策、現実の多文化主義政策をめぐる政治状況、問題点についても研究を進めた。まず、4月下旬にカナダの政治哲学者、Will Kymlickaの多文化主義論と公用語政策について検討した論文が公刊された。これは2005年度に東京大学大学院法学政治学研究科に提出した修士論文を修正・改稿したものであり、修士課程から博士課程一年次にかけて行ってきた研究の一応の成果である。この論文を元に、7月に東京法哲学研究会例会においてWill Kymlickaの多文化主義論について報告を行った。8月以降は、カナダのクィーンズ大学哲学科において、Will Kymlicka教授のご指導の下、博士論文の基礎となる研究を行ってきた。滞在中、法哲学・政治哲学面では、Will Kymlicka教授およびMargaret Moore教授)演習を聴講し、博士論文において中心的に扱うことになる国際的な経済格差に対する政治哲学的アプローチや多文化主義政策と分配的正義の関係について研究の手がかりを得た。さらに、両教授の個人的なご指導を通して、多くの英米圏を代表する政治哲学者の近年の移民政策をめぐる議論について講読・検討を進めることができた。このうち、Joseph Carensの議論の検討を中核として、博士論文の序章を書き始めている。さらに、カナダ研究奨励事業を行っているICCS(International Council for Canadian Studies)が外国人研究者を対象として開催したカナダ研究に関するセミナーに参加し、カナダ政治学における最新の論争についても理解を深めることができたと思う。
膜蛋白質を耐熱化させるアミノ酸置換の理論的予測法の確立

(1)G蛋白質共役型受容体(GPCR)の耐熱化に繋がるアミノ酸置換の理論的同定法の確立に向けて我々が開発した自由エネルギー関数は,現在までにクラスAの不活性型の安定化において多くの成果を挙げてきたが,活性型に対してはまだ実績が無かった。自由エネルギー関数の活性型への適用性を調べるため,A2aRの野生型と試行錯誤的に他の研究グループが得た安定化4置換体の活性型に対し,後者の方が確かに安定であることを示せた。上記自由エネルギー関数が活性型にも適用できることが分かった。(2)上記の理論的同定法をGPCR以外の一般の膜蛋白質にも適用できるように拡張した。膜内部位のみならず水中部位をも含めた新しい自由エネルギー関数を構築した。TR (thermophilic rhodopsin)は膜蛋白質としては例外的に高い熱安定性を持つ。TRとXR (xanthorhodopsin)は高いアミノ酸配列相同性と立体構造の類似性を有するにも拘わらず,TRの熱安定性はXRのそれよりも遥かに高い。新しい自由エネルギー関数を用いて,TRの方が遥かに安定であることを示すと共に,そのような違いが生じる物理要因を特定することが出来た。(3)GPCRのように本来安定性の低い膜蛋白質の安定化と異なり,TRのようにアミノ酸配列がほぼ最適化された膜蛋白質を本来の機能を保持させつつ安定化することは非常に難しいと考えられる。後者に対して有効と考えられる別の耐熱化アミノ酸置換の理論的同定法を考え,それをTRに適用することにより,機能を保持させつつより安定にする単置換を1つ発見した。今後,多重置換を用いてさらなる安定化が実現できれば,TRを新しい高機能性材料として使用できるものと期待される。耐熱化に繋がるアミノ酸置換の我々の理論的同定法が,GPCRの不活性型のみならずGPCRの活性型や広く一般の膜蛋白質にも適用できるように拡張できた。特に,それを用いてTRのさらなる耐熱化を本来の機能を保持させつつ実現できたことは注目に値する。(1)Class Aの活性型A2aR(GPCRの一種)に対し,耐熱化に繋がるアミノ酸置換をすでに理論的に予測しているが,それらによって実際に耐熱化が得られるか否かを実験で確認する。(2)あらゆる膜蛋白質に対して,糖やアルコールなどの共溶媒の添加が熱安定性に及ぼす影響を調べる。理論解析によって,水溶性蛋白質の場合と同様に,スクロース1・グルコース2・マニトール3・エリスリトール4・グリセロール5の添加は安定化向上に繋がり,その強さは1>23>4>5の順番に従い,プロパノールの添加は安定化低下をもたらすことを予言している。TRとGPCRの一種であるA2aRに対して,このことを実験で確認する。(3)RxRとHsBR(いずれもロドプシンに属する)はアミノ酸配列が似ているにも拘わらず,RxRの方が遥かに熱安定性が高い。本研究でRxRの結晶構造を初めて解いたが,驚いたことに,HsBRと視覚的にほとんど同じ立体構造であった。こうしたことは膜蛋白質でしばしば見られる。熱安定性を議論できるのは熱力学である。立体構造という幾何学的特性と熱力学をどのように結びつけるかは,生化学における未解決の重要課題である。各原子のx-y-z座標と力場パラメータのみから熱安定性を評価できる方法論を構築し,RxRとHsBRなる顕著な例に適用してその有効性を実証する。(4)(1)および(3)で用いる理論は類似している。理論解析結果と実験結果が合わない場合には理論の改良を行う。(2)で用いる理論はこれらとは別のものである。やはり,理論解析結果と実験結果が合わない場合には理論の改良を行う。

耐熱化に繋がるアミノ酸置換の我々の理論的同定法が,GPCRの不活性型のみならずGPCRの活性型や広く一般の膜蛋白質にも適用できるように拡張できた。特に,それを用いてTRのさらなる耐熱化を本来の機能を保持させつつ実現できたことは注目に値する。(1)G蛋白質共役型受容体(GPCR)の耐熱化に繋がるアミノ酸置換の理論的同定法の確立に向けて我々が開発した自由エネルギー関数は,エネルギー成分(構造形成に伴う,主としてGPCRの分子内水素結合形成に起因する静電相互作用エネルギーの低下量)とエントロピー成分(構造形成に伴う,膜を構成する炭化水素基集団の並進配置エントロピーの増加量)から成る。これと,構造形成に伴うGPCRの構造エントロピー損失との競合でGPCRの熱安定性を記述する。そのうちのエネルギー成分に改良を加えた。(2)上記の理論的同定法を野生型の立体構造が不明である場合に拡張した。アミノ酸配列の相同性が高くかつ立体構造が分かっているものを鋳型として,広く使われているホモロジーモデリングを用いて野生型のモデル立体構造候補を複数個作成する。そして,それらの中から我々が開発した自由エネルギー関数が最低になる構造をモデル立体構造として選定する。的中率は相同性の高さに大きく依存するが,A2aRの不活性型(実測された野生型の立体構造はわざと使用しない)では5/7と極めて高かった。(3)我々のこれまでの解析で,各GPCRに対し,「それを置換して得られる変異体の多くが大きく耐熱化する」という残基が存在することが分かってきた。それを鍵残基と呼び,1つのGPCR当たり複数個存在する。さらに,数多くのGPCRに保存され共通に鍵残基となる残基(ホットスポットと呼ぶ)の存在も見出した。クラスAの不活性型GPCRのホットスポットを1個(BW数3.39の残基)発見し,その有効な置換を予測して合計8種類のGPCRの耐熱化に成功した。そのうちの2種類については結晶化と立体構造決定に成功した。(4)ホットスポット以外のアミノ酸を置換する方がより大きな安定化に繋がる場合がある。そのような場合にも,我々の方法が有用になることを示した。クラスAのGPCRの不活性型に対して,allesteros-Weinstein (BW)数3.39の残基がホットスポットの1つであることを特定できた。それをアルギニンまたはリジンに置換することにより,A2aR,muscarinic acetylcholine receptor 2 (M2R)(ムスカリン性アセチルコリン受容体),prostaglandin E receptor 4 (EP4)(プロスタグランジン受容体)EP4などの数種類のGPCRの安定化に実際に成功した。そのうち,M2RとEP4に対しては,選択的アンタゴニスト結合型の立体構造を決定することができ,その成果が後に2件のNature Chemical Biology誌に掲載された。日経産業新聞(見出し:受容体の耐久性向上と日刊工業新聞(見出し:多くの医薬品の結合標的たんぱく質耐熱化法を発見)にも報道された。数多くのクラスAのGPCRの不活性型が,BW数3.39の残基のアルギニンまたはリジンへの置換によって共通に安定化できることになり,画期的な成果である。