hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
生体触媒におけるメタン水酸化反応制御に寄与する触媒部位への電子伝達経路の解明

本研究では、メタンからメタノールへの酸化反応に活性な銅含有メタン酸化酵素における高酸化活性種生成の制御機構に関わる、銅含有メタン酸化酵素触媒部位への電子伝達経路を特定することを目的とした。単核銅欠損型メタン酸化酵素の調製方法を確立した。この酵素のメタンからメタノールへの酸化反応への活性は、電子供与体に依存した。この結果から、銅含有メタン酸化酵素の単核銅部位が、細胞膜内の電子伝達系から電子を受容していることを明らかにした。すなわち、細胞膜内の還元型キノンから単核銅を経由して、触媒中心である二核銅へと電子が供与されることが明らかになった。本研究は、メタンからメタノールへの酸化反応に活性な銅含有メタン酸化酵素(pMMO)における高酸化活性種生成の制御機構を明らかにするため、pMMO触媒中心への電子伝達系路を特定することを本研究の目的とした。これまでに申請者は、pMMOへの電子供与体が細胞膜内の還元型キノンであることを特定しているため、本研究では細胞膜内の還元型キノンからpMMOが電子を受け取る部位をpMMO分子内に複数存在する銅イオン結合部位から特定することをめざした。平成25年度は還元型キノンから銅含有メタン酸化酵素触媒中心への電子伝達経路において銅含有メタン酸化酵素の単核銅部位が果たす役割を解明した。銅含有メタン酸化酵素を得るため、メタン酸化細菌を培養し、回収した菌体から銅含有メタン酸化酵素を精製した。さらに、エチレンジアミン四酢酸を用いて銅含有メタン酸化酵素の単核銅イオンを選択的に取り除く手法を確立した。この単核銅欠損型銅含有メタン酸化酵素によるメタンからメタノールへの酸化反応を行った。その結果、単核銅欠損型メタン酸化酵素では、水溶性の還元型キノンであるテトラメチルハイドロキノンに依存したメタン酸化活性はほとんど影響を受けなかった。一方、細胞膜に内在する還元型キノンに依存したメタン酸化活性は阻害された。この結果から、銅含有メタン酸化酵素の単核銅部位は、細胞内の電子伝達系から電子授受する役割を果たしていることがわかった。本研究はメタンからメタノールへの酸化反応に活性な銅含有メタン酸化酵素位における高酸化活性種生成の制御機構を明らかにするため、電子供与体ハイドロキノンから酵素分子内に複数存在する銅イオン結合部位から特定することで、酵素活性点である銅イオンへの電子伝達経路を明らかにすることを目的とした。平成25年度に単核銅結合部位が細胞内の電子伝達系から活性点への電子伝達を仲介することを明らかにした。平成26年度は、電子スピン共鳴測定により,銅含有メタン酸化酵素に結合する銅イオンの酸化還元挙動を明らかにした。一方、銅含有メタン酸化酵素とその類縁タンパク質でメタン酸化反応に活性を示すアンモニア酸化酵素のアミノ酸配列を比較し、活性中心のアミノ酸側鎖の違いを明らかにした。さらに、アルカン酸化反応におけるアルコール位置・立体異性体への選択性を明らかにし、活性点へのアルカン配向性を推定することで、メタン酸化酵素とアルカン酸化酵素のアルカン配向性の違いを明らかにした。これら結果から、二核銅結合部位が銅含有メタン酸化酵素の触媒部位であることを明らかにした。すなわち、細胞膜内の電子伝達系から単核銅を経由し、二核銅へと電子が供与されていることがわかった。本研究は、メタンからメタノールへの酸化反応に活性な銅含有メタン酸化酵素における抗酸化活性種生成の制御機構を明らかにするため、銅含有メタン酸化酵素触媒中心への電子伝達経路を特定することを目的とした。平成26年度までに電子伝達経路を特定し、平成27年度はメタンからメタノールへの酸化反応に活性な銅含有メタン酸化酵素の銅イオン配位構造を明らかにするため、酵素へのアミノ酸側鎖置換を行った。その結果、アミノ酸置換した銅含有メタン酸化酵素は、酵素を生合成する微生物細胞内において強い毒性を示すため、酵素が合成できないことがわかった。一方、メタン以外のアルカンを酸化できる酵素に種々のアミノ酸側鎖置換を行った場合、酵素を合成する細胞への毒性は観測されなかった。この結果は、銅含有メタン酸化酵素の銅イオン配位構造を明らかにするためには、この細胞毒性を回避する新たな酵素合成法を確立する必要があることを示している。メタン以外の基質分子を酸化する銅含有酵素において、電子スピン共鳴ースピントラップ法によって生成する活性酸素を測定した。その結果、これら酵素においてヒドロキシラジカルや一重項酸素が生成することを明らかにした。これら酵素の生合成において細胞毒性を示さなかったことから、これら活性種そのものが細胞毒性の要因ではないと考えられる。一方、活性酸素種の生成量は酵素のアミノ酸置換に依存した。すなわちアミノ酸置換の影響により、これら活性酸素種の生成量が増えることで高い細胞毒性を発現する可能性が示唆された。平成25年度平成26年度にかけて、目的としていた細胞膜内電子伝達物質から銅含有メタン酸化酵素活性点への電子伝達系を明らかにすることができたことから、現段階までおおむね順調に研究が進んでいる。

生体触媒化学タンパク質工学的手法によって銅含有メタン酸化酵素の銅結合部位を欠損させ、銅含有メタン酸化酵素の銅イオンの役割をより明確にする。そのため,遺伝子組換えによる銅含有メタン酸化酵素の調製方法を検討する。また,これまでに得られた研究結果を学術論文として発表する。平成25年度の目的とした銅含有メタン酸化酵素の単核銅部位が果たす役割を明らかにすることができたことから、現段階までは研究はおおむね順調に進展している。平成26年度に、タンパク質分子への銅イオン配位状態を明らかにすることを目的に、酵素の電子スピン共鳴測定を行った。その結果、酵素へのアミノ酸側鎖置換を行うことで、銅イオンの配位状態を明らかにできることがわかった。この実験を遂行するために研究期間の延長が必要となり、同時に未使用額が生じた。平成25年度の結果において、単核銅欠損型メタン酸化酵素における単核銅部位の果たす役割が、電子を供与する還元型キノンの種類に依存することがわかった。また研究遂行中に、銅含有メタン酸化酵素において、新たな銅結合部位が発見された。そこで、平成26年度は、前年度に調製した銅欠損型メタン酸化酵素の銅結合状態を明らかにする。そのため、調製した酵素の電子スピン共鳴測定を行い、銅イオンのタンパク質への配位状態を明らかにする。さらに還元型キノン共存下で測定を行なうことで、酵素に結合した銅イオンの酸化還元挙動を測定する。また、還元型キノンの結合部位を特定するため、修飾型ハイドロキノンが銅含有メタン水酸化酵素へ結合するアミノ酸側鎖を明らかにする。上記理由により必要となった酵素へのアミノ酸側鎖置換を平成27年度に行うこととし、この実験に必要となる試薬・器具の購入に未使用額を充てることとする。平成25年度は、酵素調製方法の確立とその酵素を用いた反応により、目的であった銅含有メタン酸化酵素の単核銅の役割を明らかにすることができた。その結果から、平成25年度に調製した酵素とは異なる酵素が必要なことがわかった。そのため研究計画を変更し、次年度に引き続き酵素調製を確立することとしたため、未使用額が生じた。上記理由により必要となった酵素調製を次年度に行なうこととし、酵素調製、酵素反応および分析に必要となる試薬および実験器具等の消耗品費として使用する。
院内製剤チアマゾール及びレボチロキシンの新規製剤の開発

甲状腺機能低下症の薬物治療において、主にレボチロキシン(以下、LT4と略)が用いられるが、現在経口製剤のみである。そこで院内製剤としてLT4含有の新規製剤開発を目的に、本年度はクリーム製剤ならびにテープ製剤を作製し、各製剤におけるLT4含量試験ならびin vitro皮膚透過性試験を行った。まずアルコール類やエステル類、エーテル類などの各種溶媒(22種)に、LT4ナトリウム水和物錠剤を粉砕して得られたLT4ナトリウム水和物粉末を溶解過剰量となるように添加し、LT4含有溶液を作製した。溶媒中LT4濃度を測定したところ、LT4溶解度はN-メチル-2-ピロリドン(以下、NMPと略)で最も高値となった(193 μg/mL)。このLT4含有NMP溶液に親水クリームを1 : 9(重量比)の割合で混合したところ、LT4を14.1 μg/g含有するクリーム製剤を作製することができた。有機溶媒(アセトン:エタノール:イソプロパノール= 9 : 5 : 1)にLT4粉末を添加し、テープ製剤の膏体であるEUDRAGIT E100、クエン酸トリエチル及びポリエチレングリコール溶液をポリ塩化ビニルシート上に展延した後、50°Cで放置して有機溶媒を留去させて行った。そしてLT4を1.62 μg/cm2含有するテープ製剤を作製できた。さらに、LT4原末を用いて15 μg/cm2テープを作製し、ラット腹部皮膚を用いた垂直型Franz-type拡散セルによりin vitro皮膚透過性を検討したところ、24時間でのLT4累積透過量は7.53 ±2.30ng/mLであった。そこで、さらなる透過性向上を目的に、pH調整剤のジイソプロパノールアミン、および透過促進剤のミリスチン酸イソプロピル、NMPおよびラウリルアルコールの添加を試みたが、LT4透過性の上昇は認められなかった。レボチロキシン含有クリーム製剤及びテープ製剤のレボチロキシン含量測定や、テープ製剤のin vitro皮膚透過性試験における高速液体クロマトグラフィー測定において、測定条件や手技による問題から結果に時間を要したため、さらに新規剤形であるフォーム製剤に現在着手しており、これまでに医薬品におけるフォーム製剤に関する評価方法の報告があまりなされておらず、その物理学的評価法について検討しているため、当初計画よりもやや遅れている状況である。これまでに製したクリーム製剤及びテープ製剤における製剤学的な評価を行う。米国薬局方や日本薬局方に準じた試験(含量均一性試験、溶出性試験など)を行い、製剤学的に適した品質が確保されているものを選定する。次に甲状腺機能亢進症モデルラットおよび甲状腺摘出モデルラットを用いた薬物動態による有効性の評価を行う。まず甲状腺機能亢進症における検討では、甲状腺機能亢進症モデルラットを作製し、メルカゾール水溶液を経口摂取、注射剤を静脈内投与する。クリーム製剤については、ラットの剪毛した背部に塗布し、塗布部の上部は非閉塞状態とする。テープ製剤については、ラットの剪毛した背部に貼付し、剥がれないように包帯などで固定する。投与前および投与後において血液を採取し、血漿中Free T4濃度を測定する。薬物動態学的パラメータはノンコンパートメント解析法により算出する。すなわち、CmaxおよびTmax、AUCは実測値より算出する。血中濃度の測定はLC/MSを用いて測定する。起泡性の製剤であるフォーム製剤は、泡状のため広範囲に塗布できることから、これまでに化粧品や医薬品などに使用されている。さらに近年では環境への配慮から液化ガスを用いたタイプからノンガスタイプのフォーム製剤に置き換わりつつある。そこでフォーム製剤を用いることで、直腸への広範囲での付着できることにから、甲状腺機能低下症の治療におけるとして新たな剤形として期待できる。本研究では、ノンガスタイプのフォーム製剤に用いる基剤の種類やその濃度の違いに着目し、それらの処方が異なるフォーム製剤のテクスチャー(固さや滑らかさ、など)について明らかにすることを目的とする。

さらに、LT4原末を用いて15 μg/cm2テープを作製し、ラット腹部皮膚を用いた垂直型Franz-type拡散セルによりin vitro皮膚透過性を検討したところ、24時間でのLT4累積透過量は7.53 ±2.30ng/mLであった。そこで、さらなる透過性向上を目的に、pH調整剤のジイソプロパノールアミン、および透過促進剤のミリスチン酸イソプロピル、NMPおよびラウリルアルコールの添加を試みたが、LT4透過性の上昇は認められなかった。レボチロキシン含有クリーム製剤及びテープ製剤のレボチロキシン含量測定や、テープ製剤のin vitro皮膚透過性試験における高速液体クロマトグラフィー測定において、測定条件や手技による問題から結果に時間を要したため、さらに新規剤形であるフォーム製剤に現在着手しており、これまでに医薬品におけるフォーム製剤に関する評価方法の報告があまりなされておらず、その物理学的評価法について検討しているため、当初計画よりもやや遅れている状況である。これまでに製したクリーム製剤及びテープ製剤における製剤学的な評価を行う。米国薬局方や日本薬局方に準じた試験(含量均一性試験、溶出性試験など)を行い、製剤学的に適した品質が確保されているものを選定する。次に甲状腺機能亢進症モデルラットおよび甲状腺摘出モデルラットを用いた薬物動態による有効性の評価を行う。まず甲状腺機能亢進症における検討では、甲状腺機能亢進症モデルラットを作製し、メルカゾール水溶液を経口摂取、注射剤を静脈内投与する。クリーム製剤については、ラットの剪毛した背部に塗布し、塗布部の上部は非閉塞状態とする。テープ製剤については、ラットの剪毛した背部に貼付し、剥がれないように包帯などで固定する。投与前および投与後において血液を採取し、血漿中Free T4濃度を測定する。薬物動態学的パラメータはノンコンパートメント解析法により算出する。すなわち、CmaxおよびTmax、AUCは実測値より算出する。血中濃度の測定はLC/MSを用いて測定する。起泡性の製剤であるフォーム製剤は、泡状のため広範囲に塗布できることから、これまでに化粧品や医薬品などに使用されている。さらに近年では環境への配慮から液化ガスを用いたタイプからノンガスタイプのフォーム製剤に置き換わりつつある。そこでフォーム製剤を用いることで、直腸への広範囲での付着できることにから、甲状腺機能低下症の治療におけるとして新たな剤形として期待できる。本研究では、ノンガスタイプのフォーム製剤に用いる基剤の種類やその濃度の違いに着目し、それらの処方が異なるフォーム製剤のテクスチャー(固さや滑らかさ、など)について明らかにすることを目的とする。次年度使用額が生じた理由として、今年度の事業計画に遅れが生じたためである。次年度使用額の使用計画として、これまでに製したクリーム製剤及びテープ製剤における製剤学的な評価を行うための備品や甲状腺機能亢進症モデルラットおよび甲状腺摘出モデルラットの費用、さらに新規剤形であるフォーム製剤に関する添加剤などの試薬調達や容器、その試験に関わる費用に充填する予定である。
恐怖条件付けにおける小脳の役割の解明

本研究は、恐怖を伴う情動における小脳神経回路の役割を明らかにすることを目的としている。ゼブラフィッシュをモデル動物として小脳神経回路の恐怖条件付けにおける役割の解明を目的とした。小脳を含む神経回路の活性をモニターあるいは制御する遺伝子改変フィッシュ(Tg)を作製した。プルキンエ細胞、小脳顆粒細胞、全脳の神経細胞に発現するエンハンサー/プロモーターを使用した。活性をモニターする系統としてGCaMP6に加え、光照射とカルシウム濃度によって発色が変化するCAMPARIを発現するTgを得た。活性をコントロールするTgとしては、これまでのChRWR、ArchTに加え、GtCCR4やアニオンチャネルGtACR1/2などを作製した。これまでの研究で、生後20日前後のゼブラフィッシュを用いて条件刺激としてLEDライトの消灯、無条件刺激として電気ショックを行い、条件反応として心拍数の変化を測定する恐怖条件付け学習の実験系を樹立した。小脳が古典的恐怖条件付けに関与していることを明らかとし、条件反応の獲得に従って反応する小脳内ニューロンを同定した。特定の脳領域に光照射を行い、光遺伝学ツールを活性化することよって神経活動を制御するシステムを導入した。また、光遺伝学ツールがゼブラフィッシュで有効に機能するかを確認するために仔魚を用いたアッセイ法を構築した。成魚を用いた回避学習のシステムを構築するために、狭い通路を通じて往来できる2つのコンパートメントに分割された水槽に電極と緑色LEDを付けた装置を作製した。電気ショックとLED点灯を組み合わせたパラダイムで回避学習を調べたところ、小脳顆粒細胞やプルキンエ細胞をボツリヌス毒素で機能阻害した成魚において学習個体の割合が低下していた。これらの魚では、運動機能に異常は見られなかった。以上のことから、回避学習に小脳が重要な働きをしていることが明らかとなった。研究計画書に記載した事柄のうち、以下のように研究の進展が見られた。本研究に使用する遺伝子改変フィッシュ(Tg)の作製した。神経活動をモニターするTgとしてCAMPARIを神経細胞に発現するTgを作製した。神経活動を制御するTgとして、これまでのChRWR、ArchTに加え、GtCCR4やアニオンチャネルGtACR1/2などを作製した。さらに、これらの光遺伝学ツールがゼブラフィッシュで機能するかを確認するために仔魚の遊泳行動を指標としたアッセイ方法を構築した。パターン照射装置を用いて、ゼブラフィッシュ仔魚の限定された脳領域(後脳)に適切な波長の光を照射することによって誘発される遊泳行動をモニターする。ゼブラフィッシュ仔魚を用いた恐怖条件付け学習における小脳の役割を解析するために、ボツリヌス毒素による神経阻害に加えてニトロレダクターゼを小脳神経細胞に発現するTgを作製した。このTgにメトロニダゾールを投与することによって細胞死を起こすことを確認した。成魚を用いた回避学習(オペラント条件付け)のシステムを構築するために、狭い通路を通じて往来できる2つのコンパートメントに分割された水槽に電極と緑色LEDを設置した装置を作製した。本年度の実験を継続して行う。すべての小脳顆粒細胞の活性を阻害したゼブラフィッシュ(cbln12プロモーター)や小脳プルキンエ細胞(aldocaプロモーター)を阻害した魚での恐怖条件付け学習の実験を行う。学習過程で活動が上昇する小脳ニューロンがどのような細胞であるかを解析する。また、新たに作製したTgにおいて、光遺伝学ツールが有効に使用できることを光刺激による遊泳行動の誘発によって確認する。回避学習における小脳の役割を解析するため、小脳神経を阻害した魚で実験を行う。さらに当研究室で作成された変異体(reelin、fat2など)を用いて回避学習実験を行い、恐怖応答における小脳の役割を明らかとする。

成魚を用いた回避学習のシステムを構築するために、狭い通路を通じて往来できる2つのコンパートメントに分割された水槽に電極と緑色LEDを付けた装置を作製した。電気ショックとLED点灯を組み合わせたパラダイムで回避学習を調べたところ、小脳顆粒細胞やプルキンエ細胞をボツリヌス毒素で機能阻害した成魚において学習個体の割合が低下していた。これらの魚では、運動機能に異常は見られなかった。以上のことから、回避学習に小脳が重要な働きをしていることが明らかとなった。研究計画書に記載した事柄のうち、以下のように研究の進展が見られた。本研究に使用する遺伝子改変フィッシュ(Tg)の作製した。神経活動をモニターするTgとしてCAMPARIを神経細胞に発現するTgを作製した。神経活動を制御するTgとして、これまでのChRWR、ArchTに加え、GtCCR4やアニオンチャネルGtACR1/2などを作製した。さらに、これらの光遺伝学ツールがゼブラフィッシュで機能するかを確認するために仔魚の遊泳行動を指標としたアッセイ方法を構築した。パターン照射装置を用いて、ゼブラフィッシュ仔魚の限定された脳領域(後脳)に適切な波長の光を照射することによって誘発される遊泳行動をモニターする。ゼブラフィッシュ仔魚を用いた恐怖条件付け学習における小脳の役割を解析するために、ボツリヌス毒素による神経阻害に加えてニトロレダクターゼを小脳神経細胞に発現するTgを作製した。このTgにメトロニダゾールを投与することによって細胞死を起こすことを確認した。成魚を用いた回避学習(オペラント条件付け)のシステムを構築するために、狭い通路を通じて往来できる2つのコンパートメントに分割された水槽に電極と緑色LEDを設置した装置を作製した。本年度の実験を継続して行う。すべての小脳顆粒細胞の活性を阻害したゼブラフィッシュ(cbln12プロモーター)や小脳プルキンエ細胞(aldocaプロモーター)を阻害した魚での恐怖条件付け学習の実験を行う。学習過程で活動が上昇する小脳ニューロンがどのような細胞であるかを解析する。また、新たに作製したTgにおいて、光遺伝学ツールが有効に使用できることを光刺激による遊泳行動の誘発によって確認する。回避学習における小脳の役割を解析するため、小脳神経を阻害した魚で実験を行う。さらに当研究室で作成された変異体(reelin、fat2など)を用いて回避学習実験を行い、恐怖応答における小脳の役割を明らかとする。当年度に購入予定であった行動解析ソフトに代替するものを導入したために当該助成金が生じた。翌年度の古典的恐怖条件付け学習の実験に必要な消耗品の購入に使用する。
MIFワクチンの開発とそのリウマチモデルマウスに対する効果の検討

1)RA患者由来滑膜繊維芽細胞を用い、MIFがIL-8のmRNA発現を誘導し、この誘導にはチロシンキナーゼ、PKC、および転写調節因子AP-1およびNF-κBが強く関与していることを明らかにした(Arthritis Rheum 2004)。2)In-vivoにおいてマウス抗II型コラーゲン抗体カクテル関節炎モデルを用いて関節炎発症におけるMIFの関与を検討した。野生型(以下WT)マウスは関節炎発症に伴い関節局所におけるMIF、MMP-13およびMIP-2 mRNAの発現が増加した。関節炎発症操作によりWTマウスでは関節炎スコア(12点満点)が平均8点であったのに対し、抗MIF抗体を投与したWTマウス群およびMIFノックアウトマウス群では、それぞれ平均3点、平均2.5点と有意に関節炎が抑制され、これに伴い後者2群とも関節局所におけるMMP-13およびMIP-2 mRNA発現、および炎症性細胞浸潤が抑制された。(Cytokine 2004)。3)MIFをターゲットとした新規関節炎治療法の開発;MIF-DNAワクチン法を試みた。MIF-DNAワクチンとしてMIF cDNAの2nd loopにヘルパーTエピトープとしてtetanus toxin、ovalbumin、およびHEL (hen egg-whitelysozyme)の各十数残基を組み込んだプラスミドベクター、コントロールとして空ベクターを準備し、これらを8週令Balb/cマウス♀(各群n=5)にエレクトロポレーション法にて筋内接種した後II型コラーゲン抗体カクテル関節炎発症を試みたところ、ピーク時の関節炎スコアはコントロールワクチン群で平均5.5点に対し、前3者の混合接種により平均2.0点と有意な発症抑制効果を示した。まだ検討途上であるが本方法は新規RA治療法として期待される(投稿中)。ワクチンは(1)MIFワクチン、および(2)MIF DNAワクチンの2種類を平行して作製し、効果を検討することとした。(1)MIFワクチンとしてリコンビナントMIFをPPD (purified protein derivative of tuberculin)とconjugateしたもの(MIF-PPD)を作製し、PPD単独をコントロールとして8週令Balb/cマウス♀に2週おきに3回接種した。ワクチン接種により抗MIF抗体価は上昇を認めた。次にこれらマウス(MIF-PPD群、PPD単独群、無投与群、各群n=5)にII型コラーゲン抗体カクテル関節炎発症を試みたところ、MIF-PPD群の関節炎スコアは無投与群に比べ低い傾向を示したが、今のところ統計的有意差は認めない。(2)MIF DNAワクチンとしてa, MIFにヘルパーTエピトープとしてtetanus toxinの21残基を組み込んだもの、b.およびc.,さらにこれのN端にTNF-α(b)およびIL-5 (c)の分泌用シグナル配列を組み込んだもの、d.,コントロールとしてMIF cDNAそのものを準備した。これらを8週令Balb/cマウス♀(各群n=5)に2週おきに6回接種したところ、抗MIF抗体価の上昇を明確に認めたのはa群で1匹、b群で2匹のみであった。各群すべてにII型コラーゲン抗体カクテル関節炎発症を試みたところ、抗MIF抗体価の上昇しなかったマウスはすべて関節炎を発症したが、抗MIF抗体価上昇マウス3匹はいずれも関節炎を全く発症しなかった。MIFワクチンは現段階ではDNAワクチン方式に期待がかかるが、抗体価の上昇が不確実な点が問題であることが判明した。さらなるデザインの改良が必要である。1)RA患者由来滑膜繊維

芽細胞を用い、MIFがIL-8のmRNA発現を誘導し、この誘導にはチロシンキナーゼ、PKC、および転写調節因子AP-1およびNF-κBが強く関与していることを明らかにした(Arthritis Rheum 2004)。2)In-vivoにおいてマウス抗II型コラーゲン抗体カクテル関節炎モデルを用いて関節炎発症におけるMIFの関与を検討した。野生型(以下WT)マウスは関節炎発症に伴い関節局所におけるMIF、MMP-13およびMIP-2 mRNAの発現が増加した。関節炎発症操作によりWTマウスでは関節炎スコア(12点満点)が平均8点であったのに対し、抗MIF抗体を投与したWTマウス群およびMIFノックアウトマウス群では、それぞれ平均3点、平均2.5点と有意に関節炎が抑制され、これに伴い後者2群とも関節局所におけるMMP-13およびMIP-2 mRNA発現、および炎症性細胞浸潤が抑制された。(Cytokine2004)。3)MIFをターゲットとした新規関節炎治療法の開発;MIF-DNAワクチン法を試みた。MIF-DNAワクチンとしてMIF cDNAにヘルパーTエピトープとしてtetanus toxin、ovalbumin、およびHEL(henegg-whitelysozyme)の各十数残基を組み込んだプラスミドベクター、コントロールとして空ベクターを準備し、これらを8週令Balb/cマウス♀(各群n=5)にエレクトロポレーション法にて筋内接種した後II型コラーゲン抗体カクテル関節炎発症を試みたところ、関節炎スコアはコントロールワクチン群で平均7.5点に対し、前3者の混合接種により平均2.4点と有意な発症抑制効果を示した。まだ検討途上であるが本方法は新規RA治療法として期待される(投稿準備中)。
心の制御に関する統合的理解：認知心理学・認知神経科学・発達科学からの多面的接近

心のはたらきは,無意識的な自動的処理と意識的に操作しようとする意識的処理が区別され,中でも自動的処理が大きな役割を果たしていることが多数示されてきた。一方,人は自分自身の心をある程度コントロールできていると認識しているとともに,場合によっては不要な考えがいつも心に浮かぶなどコントロールできない状況も多く経験する。本研究では,このような心のコントロールが可能かどうか,またその背景メカニズムにはどのようなものがあるかを,記憶抑制研究を中心として検討したものである。その結果,人は自分自身の不要な記憶を忘れることができること,またその機能には前頭前野の働きが関係していることを見いだした。記憶の抑制制御について,英国のMichael Anderson氏と共同研究の打ち合わせ実験実施の準備を行った。具体的には,Think/No Think課題を用いて,自伝的記憶の意図的抑制が可能かどうか,またその神経基盤を明らかにしようとする研究である。実験はCognition and Brain Science Unitで次年度に実施予定である。ワーキングメモリとの関わりについては,展望記憶課題において見られる検索誘導性忘却の生起要因の検討を行うとともに,ワーキングメモリ課題として知られるn-back課題の課題特性について理論的検討を行った。記憶制御に関わる脳内メカニズム,身体との関連性については,展望記憶の想起における自律神経活動および脳活動を脳波計によって記録した。その結果,身体の活動,およびそれを反映する脳の活動が,意識的な想起を促す要因として機能している可能性を示唆する結果を得た。発達的側面については,乳児の聴覚運動連関に関する知識を検討するために、聴覚情報と運動が意味的・文脈的に一致する場合と不一致の場合における乳児の視線を眼球運動計測装置で計測した。その結果,視聴覚刺激に変化が生じた場合に、7ヵ月齢児が視覚的な探索の範囲を広げたことを示唆する結果を得た。社会的情報の制御については,顔写真の人物に関する評判を学習した後,その評判を無視して信頼性を直感的に再評価するという社会的認知のコントロールの神経基盤を解明するために,fMRI実験をおこなった。その結果,評判を無視しながらの信頼性判断は,前頭極による学習した情報の意図的抑制,側頭頭頂接合部による顔写真の人物の心の推論(メンタライジング),後頭皮質による顔構造の再符号化などで実現される複合的な過程であることが推察された。記憶抑制研究については,Michael Anderson氏(英国,Medical Research Council: Cognition and Brain Science Unit, University of Cambridge)と共同研究を進めた.そこでは,自伝的記憶研究の一般的手続きによって想起した実際のネガティブな体験の記憶の抑制が可能かどうか,また認知制御を行うことによって,記憶の質,感情価が変化するかについて実験を行った.記憶の詳細さなどの質に影響を与える可能性が示されたが,参加者を増やして検討中である.実験そのものは英国で実施している.また,非言語情報についても言語刺激と同様に記憶抑制が生じる結果を検索誘導性忘却課題を用いて見いだした.ワーキングメモリとの関連については,特に展望的記憶課題において見られる検索誘導性忘却について,その生起要因の検討を行い学術誌に出版した.また、ワーキングメモリ課題として知られるn-back課題に含まれる抑制機能について実験的検討を行った.さらに認知制御に関わる脳内基盤については,昨年度から続いて,展望的記憶の想起に関する自律神経活動,脳波を用いた実験を行った.身体の活動,およびそれを反映する脳の活動が,意識的な想起を促す要因である可能性について検討を進めたが,次年度さらに展望記憶と未来思考性のメカニズム解明を進める予定である.社会的情報の抑制については,ある人物の悪い評判を学習すると,後にその恣意性が判明しても,当該人物への不信感は持続することが知られているが,そうした持続的な不信感の神経基盤を機能的磁気共鳴画像法を用いて検討した.実験の結果、眼窩・腹側前頭前皮質の外側部の活動が持続的な不信感と関連することが明らかになった.研究打ち合わせを3回行い(慶応大学1回,名古屋大学2回),研究内容について理解を深めた.記憶抑制研究については,自伝的記憶の意図的抑制に関して,M.Anderson(MRC:CBU,Cambridge)と共同研究を進め,意図的抑制時に右前頭前野と海馬および扁桃体を含む前頭頭頂ネットワークが関与していることを見いだし国際学会で発表した。展望記憶課題において見られる検索誘導性忘却を国際誌に掲載した。また、展望記憶課題おける反応抑制の役割を検討するために、Go/No-go taskで検討し,当該の手がかりが焦点的手がかりであった場合にのみ、展望記憶想起に影響を与えることが示された。前頭極の機能的解明を目的として,未来思考や展望記憶をはじめとする,前頭葉活動に関する統合的な実験的検討を行った。前頭極が関わる認知処理をいくつかの要素に分けることができ,それぞれが他の脳部位とどのような連関を担っているかについてデータ解析を行った。社会的情報のコントロールについて,人間はある人の悪い評判を耳にするとその評判が後で嘘だとわかってもその人に不信感を抱き続ける傾向があるが,こうした認知的コントロールによる抑制が困難な不信感が,腹外側前頭前皮質の活動と関係していることをfMRIを用いた実験で明らかした。発達心理学的アプローチでは,生後2-3ヶ月児における乳児の運動特性の変化に関してH26年度に計測したデータの解析をおこない学会にて報告した。家庭や保育施設等で乳児の運動を長時間モニターできるスーツの開発をおこなった。このことから閉じられた実験室時空間だけではなく、日常生活での予測行動を捉えることが期待される。乳児の運動・脳機能発達を包括的に検討し,書籍の一章として執筆した。

認知コントロールと抑うつについて,主たる目標の追求時に抑制されるはずの代替目標へのアクセスが抑うつ気分によって促進される可能性について検討を行い,その成果を日本心理学会において報告した。記憶の抑制,ワーキングメモリと制御,制御と脳内基盤・身体との関連,発達,社会的情報の制御というテーマで研究を進めている。tDCSを用いた研究に倫理審査に時間を要しているためやや遅れがあるが,おおむね順調に進んでいる。記憶抑制研究については,自伝的記憶の意図的抑制に関して,Anderson, M.(MRC:CBU,Cambridge, UK)らと共同研究を進めており,意図的抑制時の脳内ネットワーク,および精神的健康度との関係を検討している。意図的抑制の効果を高める手法についての検討も行った。また,記憶抑制が記憶成績そのものへの影響にとどまらず,対象となる記憶の他の属性に影響することを見いだした。具体的には,Think/ No-Think課題による記憶の意図的抑制によって,対象となる記憶が忘却されるのみならず,その対象の感情価(ポジ・ネガ)が低下することが示された。また,顔の記憶課題を用いて,その後の記憶課題で想起が成功した顔と忘却した顔に関する好みを測定すると,忘却された顔の好みが低下していることも見いだした。これらは,記憶の忘却という現象が,その記憶の認知的属性のみならず,他の属性である感情価の強度を弱めたり,好ましさの程度が低下する可能性が考えられた。さらに,記憶抑制能力が,日常的な注意制御能力の反映と考えられるメディアマルチタスキング頻度と関連する可能性も示された。これは,実験室内で測定された認知コントロール能力が普段の生活における活動と密接に関わっていることを示唆している。またこのような記憶抑制能力を簡便に測定する質問紙を作成した。また,記憶の未来思考に関する研究では,「未来思考」の脳内メカニズムに関する脳波および自律神経の同時測定実験を実施した。思考内容を限定せずに未来方向への思考を示唆するだけで,かなり早期の段階で特有な脳活動があることが示された。そして,その脳活動は自律神経活動を介して,心臓などから求心性の信号によって修飾されていることが示された。心のはたらきは,無意識的な自動的処理と意識的に操作しようとする意識的処理が区別され,中でも自動的処理が大きな役割を果たしていることが多数示されてきた。一方,人は自分自身の心をある程度コントロールできていると認識しているとともに,場合によっては不要な考えがいつも心に浮かぶなどコントロールできない状況も多く経験する。本研究では,このような心のコントロールが可能かどうか,またその背景メカニズムにはどのようなものがあるかを,記憶抑制研究を中心として検討したものである。
児童生徒が自ら取り組む体力向上プログラム開発

Gボール運動が児童の座位姿勢に与える影響について基礎的な知見を得ることを目的として,Gボールを用いた座位バウンド運動を行わせ,運動の前後ならびに運動中における姿勢変化について動作分析と内省調査を行った。その結果は以下の通りである。1.被験者全員におけるバウンドのテンポの平均は,109±6.2回/分であった。男女別では,男子は108±6.4回/分で,女子は111±6.3回/分で,男女間における有意差は認められなかった。2.バウンド運動前後における座位姿勢のBEDの平均値は,バウンド運動前で18.3±3.71cmで,バウンド運動後には17.1±4.04cmへと有意に減少した(P<0.01)。また,男子,女子ともにBEDは有意に減少したが,男女を比べた場合,女子(P<0.05)よりも男子(P<0.01)の方がより顕著な減少が認められた。また,円背群においてバウンド運動前後のBEDの平均値は21.8±2.53cmから20.3±3.84cm,中間群において17.3±0.96cmから16.3±1.57cmと,ともに有意に減少した(両群P<0.01)。3.15回のバウンド毎に最上位局面と最下位局面におけるBEDの平均値は,いずれもバウンドを重ねながら有意に減少していく傾向が認められた(P<0.05)。4.運動後の内省調査では全体の94.1%の者が肯定的な回答を示した。1)ドイツの学校教育プロジェクト「Bewegte Schule:運動を通して子どもの心と体を取り巻く諸問題を総合的に解決させる取り組み」に関しての学会に参加した。また現地研究者との情報交換会において情報収集も併せて行った。9月22日にはSachsen州のプロジェクトリーダーであるライプツィヒ大学のChristian Mueller氏と同研究室スタッフ及び日本の研究者による情報交換会が行われた。そこでは10年間のSachsen州での取り組みとその実践結果についての報告がなされた。このプロジェクトはヨーロッパ各地で非常に注目され、9月2224日にライプツィヒ大学で行われた第17回ドイツスポーツ科学学会においても、「Bewegte Schule」に関するセクションが組まれ、ドイツ全土のみならずヨーロッパ各国の研究者がその取り組みについての研究発表を行っており幅広い情報を得ることができた。2)児童生徒向けのGボール運動指導プログラムの立案とインターネットによる動画配信:Gボール運動に関する国内外の文献,ビデオを収集し,分析した。Gボールの技術的な系統性を検討し,小学生・中学生の発育発達段階に応じた適切な168件運動プログラムを立案した。これをインターネット上でデータベース化し、対象やねらい、効果など、様々な条件で検索することのでき、その結果のデータを動画閲覧できるシステムを構築した。URLはhttp://gtm.taiiku.tsukuba.ac.jp/nao/index.htm。また、この動画配信システムの評価と運動内容について、電子アンケート調査を実施し、現場教師からの改善点などの情報を得てフィードバックできるようにした。1.データベース用のサーバーを立ち上げ、Gボール運動検索システム(全168件)を構築した。人数・形態・ねらい・コーディネーション(定位能力/変換能力/連結能力/反応能力/識別能力/リズム能力/バランス能力)難易度・対象(小学生/中学生)から動画データを閲覧できる。また、この運動内容について、ネット上でアンケート調査を行い、運動プログラムについての改善に役立てる資料を得ることを可能とした。URL:http://gy.taiiku.tsukuba.acjp/yoka/2. Gボール運動が児童の座位姿勢に与える影響について基礎的な知見を得ることを目的として,Gボールを用いた座位バウンド運動を行わせ,運動の前後ならびに運動中における姿勢変化について動作分析と内省調査を行った。

この際、姿勢の良否を示す値としてBED(Back-Ear-Distance :垂直線検査法に基づき,耳珠点からの鉛直線と背部最突出部の鉛直線との水平距離)を算出し,頭部の前出と円背を表す指標とした。その結果、座位姿勢のバウンド運動前後におけるBEDの平均値は,バウンド運動前で18.3±3.71cmで,バウンド運動後には17.1±4.04cmへと有意に減少した(P<0.01)。また、15回のバウンド毎に最上位局面と最下位局面におけるBEDの平均値は,いずれもバウンドを重ねながら有意に減少していく傾向が認められた(P<0.05)。さらに、運動後の内省調査では全体の94.1%の者が肯定的な回答を示した。
腎癌幹細胞に癌周囲微小環境変化が与える影響の解析：新たな治療戦略の開発を目指して

・腎癌細胞培養の条件設定:本研究における細胞培養における条件設定として、基礎培地の共通化が必要不可欠である。つまり、培地のpH,グルコース濃度、酸素濃度を変化させて癌細胞のアポトーシスや各種マーカーの発現を比較検討する場合、cell lineによって基礎培地が異なることは、結果の解釈に支障を及ぼす可能性があるためである。そこで、過去の文献を検討し、まずMcCoy-5Aによる培養を各種の腎癌のcell linesで行う準備をしている。また、アポトーシス関連因子や血管新生関連因子の発現を観察するのに必要な抗体をチェックしている。・動物実験:長崎大学の規定に沿った審査が必要であり、「研究の目的」および「研究実施計画」に則った動物実験の申請中である。また、研究協力者が実験に参加するための講習を受け、実験参加の許可が長崎大学より得られた。これを受けて、まずは動物の購入・飼育を行っている。・臨床検体:本研究を行う際には、院内倫理委員会で承認を得る必要がある。まずは、腎癌患者の調査をカルテベースにて行う必要があることより、“腎癌データベース"を作成するべく、長崎大学病院臨床研究倫理委員会へ申請し、研究許可を得た。また、付随研究として、当院を中心に他施設共同研究を行うために、参加協力の意思を示された施設へ、上記内容の説明を行った後に、各施設内の倫理委員会に申請して頂いている。さらには、本データベースを用いて臨床研究を展開し、一部学会にて報告した。細胞培養に関しては、実験室内での場所の確保が予想より難しく、現在の進捗は培養条件の設定までにとどまっている。しかしながら、この間に行われた他の実験結果から、予定していた内容以外にも研究が展開できている。また、動物実験の手続きは順調にすすんでいるが、血管新生抑制薬の購入にはまだ至っていない。臨床検体を採取するために必要な手続きは、おおむね順調に進んでおり、すでに当院臨床研究倫理委員会においてデータベースを作成可能な状況になっている。さらに作成したデータベースの内容から、予定していた内容以外にも新たな研究展開が期待できる状況になっている。細胞培養に関しては、現在設定している培養条件下において、癌細胞のアポトーシス、CD44の発現、VEGFsなどの発現を確認する予定である。動物実験に関しては、まず血管新生抑制薬を購入する。さらに腎癌細胞および腎癌幹細胞にGFPを発現させ、ヌードマウスの腎皮膜下に接種し、血管新生抑制薬を投与する群およびしない群に分け、飼育する予定である。臨床検体に関しては、予定よりも多くの因子を検討する可能性がある。まずは、当院における臨床研究倫理委員会に追加申請を行い、さらなる検討が可能な状況を作る予定である。(理由)2018年度に細胞実験などに使用予定であった、血管新生抑制薬が未購入であったことが一因である。
津波塩水化プロセスの解明を起点とした水質診断ネットワークの創出

岩手県大槌町を中心に、流域全体にわたり地表水と地下水を約300地点で採取し、3種類の安定同位体を含め各種の水質項目を分析した。分析結果を水質マップとして表現することにより、降水や地質、人間活動の影響評価に加えて、降水と地表水、地下水、湧水のつながりを視覚化できた。研究成果は、市民講演会などの社会還元を通して、同町沿岸域の湧水保全計画に反映されると共に、新たなイトヨ研究が開始されている。市民と協働した水質マップ作成は、福井県大野市など他地域でも展開されており、フューチャーアースに代表される研究と教育、利害関係者との統合を目指す今後の地球環境研究において有効な手法と考えている。東日本大震災による甚大な津波被害を受けた岩手県大槌町では、その復興に向けて湧水を生かした町づくりが検討されている。この検討案に貢献するため、連携研究者の鷲見准教授が中心になって5月19日に実施した地下水位一斉測定に、申請者がこれまで地下水研究を実施してきた愛媛県西条市、山形県遊佐町の職員らも参加して、湧水研究ネットワークの強化を図った。大槌町において水質マップ作りを紹介した結果、大槌町からの研究支援を受けることになり、本研究と連動して、25年5月に大槌町の地下水を、8月に大槌湾流域全体の河川水を採水した。合計300ほどの水試料に対して50成分の濃度および水素、酸素、ストロンチウムの安定同位体分析を行った。得られた結果を水質マップとして表現した結果、(1)大槌川、小鎚川のほか、北部の城山からの地下水が流入していること、(2)これら3涵養域の識別にストロンチウム同位体比が有効であること、(3)重金属汚染や窒素汚染もうけていない良質な地下水であること、さらに(4)津波後3年経過した現在、地下水への塩水化影響は見られず流速が早いことなどが明らかとなった。これらの成果を、2月8日に大槌町で開催した湧水シンポジウムで発表し、参加した遊佐町や福井県大野市の職員、東久留米の湧水関係者、リバーフロント研究者らと、町づくりに向けた問題点などに関する情報交換がなされた。西条市では、それまでの研究成果を市長および市議会に報告し、条例制定などに向けた対策が講じられることになった。本研究を介して、平成25年度の日本水大賞に輝いた大野市からも市民を巻き込んだ水質マップ作成に向けた要請があり、本研究が目指した水質診断ネットワークの構築とそれを介した大槌町震災復興の実現可能性は着実に進展したと考えている。東日本大地震、とくに津波による壊滅的な被害を受けた岩手県大槌町は地下水が豊富であり、町の産業や生活に利用されてきた。津波3か月後の水道水の測定結果は、その取水源である浅層地下水に津波による塩水侵入が起こったこと、また沿岸の自噴水についてもその影響が弱いながら見られたことから、2012年の7月に同町の流域全体にわたって調査を行い約60点の水を採取した。これまでの多項目にわたる水質分析の解析によれば、津波影響を受けていない山地域の表流水の水質は大きな変化を受けていない。いっぽう、津波を受けた大槌川の下流では、震災3か月後でも高塩分を示し、大槌川の右岸に広く分布する地下水プールが津波により塩水化したことを示している。さらに震災1年半を経過しても、右岸側ではその影響が残っていることが明らかになりつつある。一方、沿岸の自噴水も塩水影響が見られたが、地点による検討を進めた結果、地域性の存在が明らかになってきており、大槌川以外にも涵養域が存在する可能性が強く示唆されている。共同研究者の鷲見准教授は、今年度の5月に一斉の地下水採水を予定している。また5月19日は市民参加を集い、世界初の地下水位の一斉測定を予定している。これにより、大槌町の地下水の全体像が相当程度明らかになると考えられる。このイベントには、愛媛県西条市や山形県遊佐町の職員も参加予定である。両地域においても分析結果の検討を進めており、遊佐町では2012年12月24日に講演会を開催し、町長をはじめ多くの町民が参加し、湧水を中心とした街づくりに向けた大きな議論が沸き起こっている。今回の調査や水採取の結果は、大槌町に還元する予定である。本研究では、水質診断ネットワークの構築、またそれを介した大槌町震災復興の実現可能性を目指しているが、このような現状は、萌芽研究に値する内容と考えている。

本研究は、良質な地下水に恵まれている岩手県大槌町を主な対象地域とし、多元素安定同位体を用いて、同町の震災復興に有益な地下水モデルを提供すること、さらに日本各地で行われている地下水保全に関する水質診断ネットワークの萌芽を形成することを目的としている。平成26年度は、これまでに同町および関連地域で採取した試料の分析と共に、分析データの再検討および解析を行った。その結果、大槌町の河川水質は地質、地理・地形(沿岸からの距離と標高)によって変化すること、さらに沿岸域自噴水との水質比較から、地下水の起源は、大槌川と小鎚川に加えて背後の城山にあることが明らかとなった。この3種類の地下水は、流動に伴う堆積物との反応により水質変化するものの、津波による塩水影響は見られなかったことから、地下水は2年程度で沿岸域まで達していることが明らかとなった。この成果は、大槌町で開催した市民シンポジウムで報告したが、愛媛県西条市では、地下水流動をさらに明らかにする上で鍵となる地点において、市と連携したモニタリング研究を開始している。また平成25年度の日本水大賞の対象となった福井県の大野市においては、同様な水質マップ作成を市および小学校の環境教育と連携して開始している。大槌町では、本研究によって得られた成果を基盤情報にして、町のシンボルであり、津波被害地域で新たな発生したイトヨと湧水との関係について、安定同位体を用いた研究が始まっており、水質マップを基に湧水研究のネットワーク化が生まれている。環境動態、環境評価本研究は、津波被害を受けた大槌町の河川水や地下水を中心に、(1)多くの水質項目を調べることで地下水研究を進展させると共に、研究成果を基に(2)湧水・地下水を介した街づくりネットワーク化の可能性を探ることにある。(1)については、大槌湾流域全体および大槌町地下水全体の水質マップを完成できた。これにより、地下水の涵養域と流動系を世界的にみても最も高精度に明らかにできたと考えている。とくに水同位体と共に、塩素や臭素などの陰イオンさらにストロンチウム同位体が涵養域のトレーサーとして利用できることは新発見であると同時に、同地域の地下水の流動速度が速い事を示している。(2)については、大槌町、遊佐町、西条市のネットワーク化が着実に強化されつつあると同時に、大野市では市民教育という視点で水質マップ化が検討されており、新たな研究の萌芽となっている。本研究の目的は、津波影響を受けた大槌町の表流水や地下水を調べることで、(1)地下水流動や自噴水の形成機構に新しい視点を提供すると共に、(2)湧水・地下水を介した街づくりネットワーク化の可能性を探ることにある。前者に対しては、多項目水質分析という新しい水文地球化学的な手法を用いたことで、水質情報が格段に増加し、より高精度の水環境診断ができるようになった。水循環研究で用いられてきた水同位体に代わる手法として、塩素など岩石に由来しない元素が利用できること、いっぽう岩石由来の元素については、Sr同位体を併用することで、各元素の大気および岩石からの寄与を定量的に提案できると考えている。いっぽう後者に対しては、大槌町、遊佐町、西条市のネットワーク強化が図られつつある。とくに遊佐町では、自噴水を含め広域的な多項目水質マップの結果を町民に説明し、湧水の涵養域を特定したことで、保全に向けた取り組みが本格的になされるようになった。遊佐町では、貴重な生態系が維持されている湿地の涵養域としての可能性が明らかとなり、生態系保全との関係においても新たな研究の萌芽になりつつある。大槌町で実施する一斉採水による多項目水質マップの展開を図るために、より高精度の水質マッピングを計画している。また今年度の検討により、地下水流動に関する発見を福井県越前大野市や静岡県の衛生研究所とも同様な研究を推進しており、萌芽研究の新たな展開が期待できると考えている。
パルミトイル化によるβ３アドレナリン受容体の脱感作と脂肪分解促進メカニズムの解明

β3アドレナリン受容体(β3受容体)の活性化は脂質の代謝や熱産生を引き起こすなど重要な機能を持つにも関わらず、その活性化がどのようにオフ状態になるのかは不明な点が多い。本研究により、ヒトのβ3受容体が新たに、パルミトイル化修飾(脂質修飾)を複数受けており、非パルミトイル化受容体では活性化レベルに減弱が見られること、また、β3受容体自体の半減期が変化することが判明した。つまりβ3受容体では、パルミトイル化状態の変化が、活性化状態を制御している可能性がある。パルミトイル化によるβ3アドレナリン受容体(β3受容体)の脱感作の新規メカニズムを提唱することを目的とし研究を進めている。さらにその結果を用いて、脂肪細胞における、β3受容体の脱パルミトイル化の制御が脂肪の分解・燃焼を促進させる可能性に着目し、その機構を標的とした創薬を目指している。今年度は同定したパルミトイル化修飾がβ3受容体の機能にどの様な影響を与えているのかについて、培養細胞を用いた基礎的な研究を進めた。今回我々は、定常状態におけるβ3受容体のパルミトイル化修飾を解析をした。結果、β3受容体のC末端部位のシステイン残基(C361/363)にパルミトイル化が検出された。さらに、153番目と292番目のシステイン残基もパルミトイル化修飾を受けることが判明し、β3受容体は少なくとも3箇所がパルミトイル化修飾を受けていることが分った。これらのパルミトイル化システイン残基をアラニンに置換し、非パルミトイル化受容体を作製し受容体の機能を検討したところ、C末端部位(C361/363)のパルミトイル化がcAMPの産生に重要な役割を担い、さらにはその下流のERKシグナルにも減弱がみられた。次に、定常状態での代謝回転速度をタンパク質合成阻害薬(CHX)を加えて測定したところ、受容体の半減期は1.7時間程度であり、速い速度でβ3受容体は分解を受けていることが判明した。さらに、その分解にはプロテアソーム経路ではなく、リソソームが重要な役割を担っていることが分った。同定したパルミトイル化修飾の機能を検証し、各部位について機能を明らかにしつつある。また、刺激依存的なインターナリゼーションを起こさないβ3受容体の脱感作のメカニズムについて、そもそもの代謝回転が速くリソソームに輸送され、直接分解されていることが判明した。つまり、受容体の刺激依存性がなく、ユビキチンプロテアソーム経路に非依存的であった。一方で、β3受容体の質量分析解析により、これまで報告されていないその他の翻訳後修飾が次々と同定され、β3受容体の機能調節は、当初考えていたよりも複雑であることが判明した。当初の計画にそってパルミトイル化修飾の解析は当初の計画通り進捗している。一方で、β3受容体の脱感作のメカニズムの研究については、当初予期していた結果と異なっておりパルミトイル化以外の翻訳後修飾を考慮する必要がでてきた。β3アドレナリン受容体(β3AR)は脂肪組織や膀胱平滑筋に発現しているGPCRで、受容体の活性化により脂質の代謝や熱産生、平滑筋の弛緩を引き起こす。β3ARは多くのGPCRと異なり、リガンド結合後の受容体の内在化(インターナリゼーション)を起こさず、その脱感作の機構は不明である。本研究では以下の研究成果を得た。1パルミトイル化修飾は受容体半減期を変化させる;β3ARの4つのパルミトイル化修飾部位を同定し、また、パルミトイル化阻害薬2-BP処置によりβ3ARが急速にリソソームで分解されることを見出した。非パルミトイル化変異型受容体(β3AR-C4A)を用いて、2-BPの効果を検討したところ、β3AR-C4Aも2-BPの影響を受けることから、β3ARの結合タンパク質のパルミトイル化状態がβ3ARの分解に関与することが解った。一方で、野生型β3ARの半減期は1.7時間と短いのに対して、パルミトイル化修飾の数を減らすことで半減期に延長がみられた。つまり、β3ARはパルミトイル化状態の変化により、受容体の存在量が変化することが判明した。2パルミトイル化修飾はβ3ARの下流シグナルを制御する;野生型と比較してβ3AR-C4Aでは受容体刺激後のcAMPの産生量が低下した。4つの修飾部位の内、特に受容体のC末端領域のパルミトイル化修飾がGタンパク質との結合に必要であることが考えられた。また、cAMP/PKAの下流にあるERK1/2のリン酸化にも低下が見られ、パルミトイル化状態により、受容体の活性化状態が変化する可能性を示した。これらの結果より、β3ARは多くのGPCRとは異なるメカニズムで、受容体の発現量を調節し、下流シグナルを変化させることが判明した。今後はパルミトイル化状態を薬剤で変化させ、β3ARの発現量を調節し、脂質の代謝や熱産生、平滑筋の弛緩を制御することを目指している。