hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
特異あるいは極端形状をもつ領域と楕円型方程式系

液体と固体が混在する弾性体をモデル化した線形楕円型作用素は、弾性係数が一部が(液状領域において)退化し楕円性を失うため有界領域で考えているにもかかわらず離散スペクトル以外のものが発生し本質的スペクトが生じ特別な振動モードを与える.これ実数内では有界集合をなすことを正当化することに成功した. T. Katoのスペクトル分解の理論を適用して関数空間を本質的スペクトル(有界)と離散スペクトル(非有界)に対応するものに直交分解することができる.これによって研究をそれぞれの部分空間に属する波の特徴付けに還元することができた. 3.あるタイプの非有界なグラフにおけるラプラシアンのグリーン関数および熱方程式の基本解(熱核)について遠方での長時間挙動を研究した.また,多次元の非有界領域でいくつかエンドをもつものについて同様の研究をした.これらをもちいて上記の領域に対するスカラーの反応拡散方程式(Allen-Cahn-Nagumo型)の時間大域解の構成と形状の解析を行い解の構造について研究した.やや遅れながらも必死に頑張って計画通りの課題に取り組む予定。現在の進捗状況を踏まえ初年度に作成した目標および新しく得たテーマを追求する予定.共同研究者が年度末インフルエンザになり出張できなくなったため。旅費相当部分が未使用となった。購入しようと計画していた書籍がまだ出版されていないため、次年度にまわした。次の年度に研究連絡用費用として活用する。
固有値問題における,解の存在証明及び数値解の高速な精度保証法に関する研究

本研究では,固有値問題における,解の存在証明,及び近似解の精度に関する,理論的に厳密で定量的な保証を,計算機による浮動小数点演算を用いて与える方法,すなわち,固有値問題の解の精度保証付き数値計算法を構築した.本研究は,一般化固有値問題Ax=λBx(A,Bは正方行列,λは固有値,xはλに対応する固有ベクトル)における解の存在証明,及び解の精度に関する,理論的に厳密で定量的な保証を,計算機による浮動小数点演算を用いて与える方法,すなわち,固有値問題における解の精度保証付き数値計算法に関するものである.本研究における研究計画を以下に示す.(1) Aがエルミート行列で,Bがエルミート正定値行列である場合に,すべての固有値と固有ベクトルの精度保証を行う方法を構築する.また,構築した方法を応用することで,2次固有値問題におけるすべての固有値と固有ベクトルの精度保証法を構築する.(2) Aがエルミート行列,Bがエルミート正定値行列でなくとも適用可能で,すべての固有値の精度保証を行う方法を構築する.また,構築した方法を応用することで,多項式固有値問題におけるすべての固有値の精度保証法を構築する.本研究では,固有値問題における,解の存在証明,及び近似解の精度に関する,理論的に厳密で定量的な保証を,計算機による浮動小数点演算を用いて与える方法,すなわち,固有値問題の解の精度保証付き数値計算法を構築した.本研究では,実対称正定値一般化固有値問題における,全ての固有対の存在証明,及び全ての近似固有対の精度に関する,理論的に厳密で定量的な保証を,数値計算法によって与える方法,すなわち全ての固有対の精度保証付き数値計算法を構築した。この方法は,全ての近似固有対が得られたときに,各近似固有対に対して,それぞれの誤差限界を与える。このような誤差限界を得ることにより,真の固有対の厳密な存在範囲を,定量的に把握することができる。さらに,得られた近似固有対の,定量的な品質検証を行うことができる。これは理工学において真に重要な結果であり,この結果の与える意義は大きい。具体的には,下記の成果を挙げた。1,実対称正定値一般化固有値問題における,全ての固有対の精度保証を行うための基礎となる理論を構築した。2,初期の段階で得られる行列を,その後の処理において再利用したり,浮動小数点演算の事前誤差評価を利用したりすることによる,精度保証の高速化技術を構築した。3,構築した理論・技術を基に,上記の方法を考案し,この方法を実装した。4,構築した方法に関して,国内外の学会で発表した。5,構築した方法を応用することにより,二次固有値問題における,全ての固有対の精度保証付き数値計算法を考案した。6,実対称正定値一般化固有値問題及び二次固有値問題における,全ての固有対の精度保証付き数値計算法に関して,学術誌に論文を投稿した。本研究では、一般化固有値問題における、全ての固有値の存在証明,及び全ての近似固有値の精度に関する,理論的に厳密で定量的な保証を,数値計算法によって与える方法,すなわち全ての固有値の精度保証付き数値計算法を構築した.この方法は,全ての近似固有対が得られたときに,全ての近似固有値に対して, 1つの誤差限界を与える.このような誤差限界を得ることにより,真の固有値の厳密な存在範囲を定量的に把握することができる.さらに,得られた近似固有値の定量的な品質検証を行うことができる.これは理工学において真に重要な結果であり,この結果の与える意義は大きい.具体的には,下記の成果を挙けた.1、一般化固有値問題における,全ての固有値の精度保証を行うための基礎となる理論を構築した.2、初期の段階で得られる行列を,その後の処理において再利用したり,浮動小数点演算の事前誤差評価を利用したりすることによる,精度保証の高速化技術を構築した.3、構築した理論・技術を基に,上記の方法を考案し,この方法を実装した.4、構築した方法に関して,海外の学会で発表した.5、構築した方法を応用することにより,多項式固有値問題における,全ての固有値の精度保証付き数値計算法を考案した.6、一般化固有値問題及び多項式固有値問題における,全ての固有値の精度保証付き数値計算法に関して,学術誌に論文を投稿した.本研究では,一般化固有値問題Ax=λBx(A,Bは正方行列,λは固有値,xはλに対応する固有ベクトル)における,すべての固有値の存在証明,及びすべての近似固有値の精度に関する,理論的に厳密で定量的な保証を,計算機による浮動小数点演算を用いて与える方法,すなわち,すべての固有値の精度保証付き数値計算法を構築した。この方法は,すべての近似固有値と近似固有ベクトルが得られたときに,すべての近似固有値に対して,1つの誤差限界を与える。このような誤差限界を得ることにより,真の固有値の厳密な存在範囲を定量的に把握することができる。さらに,得られた近似固有値の定量的な品質保証を行うことができる。これは理工学において真に重要な結果であり、この結果の与える意義は大きい。昨年度に,Bが正則である場合に適用可能である精度保証付き数値計算法を構築した。そこで,本年度はこの方法に関して国内の学会・セミナーで発表した。なお,セミナーにおける発表は,招待講演であった。発表時に聴講者によりいただいた質問・コメントは,固有値λが重複している場合に関するものや,行列Bが特異な場合に関するもの等であった。これらの質問・コメントは本研究の今後の発展に大きく貢献することが期待される。

特に,行列Bが特異な場合に関する質問・コメントは,このような場合でも適用可能な精度保証付き数値計算法について考える機会を与えてくれたものであり,大変有意義であった。本研究では,一般化固有値問題Ax=λBx(A,Bは正方行列,λは固有値,xはλに対応する固有ベクトル)における,すべての固有値の存在証明,及びすべての近似固有値の精度に関する,理論的に厳密で定量的な保証を,計算機による浮動小数点演算を用いて与える方法,すなわち,すべての固有値の精度保証付き数値計算法を構築した.このような保証を得ることにより,真の固有値の厳密な存在範囲を定量的に把握することができる.さらに,得られた近似固有値の定量的な品質検証を行うことができる.これは理工学において真に重要な結果であり,この結果の与える意義は大きい.昨年度,すべての近似固有値と近似固有ベクトルが得られたときに,すべての近似固有値に対して,1つの誤差限界を与える方法を発表した.これに対し,今年度はすべての近似固有値と近似固有ベクトルが得られたときに,各近似固有値に対して,それぞれ別の誤差限界を与える方法を構築した.今年度に構築した方法により,昨年度に発表した方法よりも一般に高品質な保証を与えることが可能となった.さらに,この方法について国内外の学会,セミナーで発表した.発表時に聴講者からいただいた質問・コメントは前回の方法との優劣,B^-1Aの対角化可能性に関するもの等であった.特に,B^-1Aの対角化可能件に関するコメントは,この行列が対角化不可能な場合でも適用可能な精度保証付き数値計算法について考える機会を与えてくれたものであり,大変有意義であった.
ホタルルシフェラーゼは発光反応をどのように制御しているか

ホタルの黄緑色の発光を触媒するルシフェラーゼの、赤色発光色変異体であり活性部位から遠い位置の変異であるG326Sおよび発光量が低下するY257A変異体の活性測定および立体構造決定を行った。その結果、変異により生じる変化の要因は発光体の取り囲み方が弱いためエネルギーを損失することによることが示唆された。さらにホタルの発光制御に関わる別の酵素であるルシフェリン再生酵素の立体構造を決定した。ホタルによる黄緑色の発光反応は、発光基質ルシフェリンと、ATP、分子状酸素、そして発光反応を触媒するタンパク質、ルシフェラーゼによる酵素反応であり、生成してきた励起状態のオキシルシフェリンが基底状態に落ちる際、励起エネルギーが光として放出され発光する。この反応において、発光基質であるルシフェリンが同じであるにもかかわらず、酵素であるルシフェラーゼのわずか1アミノ酸置換により、発光色が赤色に変化することが知られている。そしてこの発光色変化は触媒付近のみならず、触媒機能とは全く異なる部分の変異でも生じることが知られている。しかしながらなぜこのようなことが生じるのか、その詳細なメカニズムは不明である。そこで、様々な発光色変異体を作成し、それぞれの立体構造を決定し、構造比較することにより発光色を決定しているメカニズムを明らかにしようとするものである。そこで、ゲンジボタルルシフェラーゼの発光色変異体H247A,S286N,I288V,I288A,G326S,H433Y,P452Sの7種類を作成した。その後順次大量培養、精製を行い、結晶化条件の探索を行っている。また構造解析を行う上で重要な遷移状態アナログの合成に関し、その中間化合物であるsulfamideの合成を行った。現在得られている発現精製系ではサンプル調製に1週間程度要することから、より早くサンプルが得られるための新しい発現精製系構築のための予備実験を行い、可能性の高いベクターの選定を行った。前年度作成したゲンジボタルルシフェラーゼのベクターを用い、より効率的は新規大量培養精製の構築を行った。またどうようにヘイケボタルルシフェラーゼについても同様の系の構築を行った。これらルシフェラーゼサンプルとアナログを用い結晶化を行った。ホタルにおける発光は明滅が繰り返されており、ルシフェラーゼだけではこの現象を行うことができない。そのためには生成物であるオキシルシフェリンをルシフェリンに変換するルシフェリン再生酵素が必要である。そこで、本酵素の構造解析を目指し、大量培養発現系の構築を行った。ホタルによる黄緑色の発光反応は、発光基質ルシフェリンと、ATP、分子状酸素、そして発光反応を触媒するタンパク質であるルシフェラーゼによる酵素反応である。この発光反応はATPとルシフェリンが反応しルシフェリルAMP中間体がルシフェラーゼ中で-旦生じる。その後酸化反応が起こり生成してきた励起状態のオキシルシフェリンが基底状態に落ちる際、励起エネルギーが光として放出され発光するという2段階で生じる。そこで反応の詳細を明らかにするために、1アミノ酸置換発光色変異体について、反応の1段階目と2段階目の活性をそれぞれ測定した。すると、第1段階目の活性はほとんど変化がないにもかかわらず、発光反応が激減する変異体が見つかった。このように発光反応を考える上でどのアミノ酸がどの反応に関わっているのかに関してもより詳細な機構を明らかにしていく必要性が明らかとなった。またホタルにおける発光は明滅が繰り返されており、ルシフェラーゼだけではこの現象を行うことができない。明滅を行うためには生成物であるオキシルシフェリンをルシフェリンに変換するルシフェリン再生酵素が必要である。そこでルシフェリン再生酵素のX線結晶構造解析を行い、1.4A分解能で全体構造を決定した。決定したルシフェリン再生酵素の立体構造は6-bladed β-propeller構造であった。
脳発達遅滞とその促進に関する実験的研究

本研究はヒト剖検例のGolgi study,動物実験および組織培養の3方法を用いて行われた.ヒト剖検例のGolgi studyでは新生児仮死や慢性肺疾患を合併した児の大脳皮質のニューロン樹状突起の発達は遅れた.また,脳幹網様体のニューロンでは樹状突起棘は胎生末期まで徐々に増加し,生後には急に減少するが,乳幼児突然死症候群ではこの樹状突起棘は生後も残存し,その減少は遅れていた.しかし,脊髄の前角と後角のニューロンには遅れはなく,成熟の活発なニューロンが環境の影響をうけやすく,発達促進もこの時期に行う必要がある.また, Doun症候群(DS)の大脳皮質の樹状突起の発達は胎生期には正常と差がないが,生後の発達がわるい傾向があった.とくに樹状突起棘は通常,年齢とともに増加するが, DSでは増加せず, 20才をすぎるとむしろ減少した.従って,樹状突起の発育不良は精神遅滞などの脳機能障害と関係深いと考えられる.動物実験ではニューロン発達遅滞を作るために,動物新生仔に低酸素と虚血負荷を長時間行い,脳血流の変動を観察し,大脳皮質に病変を作りえた.これのGolgi studyをすると,樹状突起の短縮と棘の減少がみられたが,現在のところ,運動負荷のみでは改善はえられていない.一方,細胞レベルで発達促進をみる目的で,正常とDS乳児および成人の皮膚線維芽細胞を用いて,種々の濃度の牛胎児血清(FCS)を加え,細胞の増殖能を比較した.乳児DSでは低栄養で増殖能がわるく,高栄養で増殖が補正されるが,成人では補正されず,人工血清ではじめて補正された.これはDS細胞の持性を示し,精神遅滞や早期老化とも関係があるかも知れない.本研究はヒト剖検例のGolgi study,動物実験および組織培養の3方法を用いて行われた.ヒト剖検例のGolgi studyでは新生児仮死や慢性肺疾患を合併した児の大脳皮質のニューロン樹状突起の発達は遅れた.また,脳幹網様体のニューロンでは樹状突起棘は胎生末期まで徐々に増加し,生後には急に減少するが,乳幼児突然死症候群ではこの樹状突起棘は生後も残存し,その減少は遅れていた.しかし,脊髄の前角と後角のニューロンには遅れはなく,成熟の活発なニューロンが環境の影響をうけやすく,発達促進もこの時期に行う必要がある.また, Doun症候群(DS)の大脳皮質の樹状突起の発達は胎生期には正常と差がないが,生後の発達がわるい傾向があった.とくに樹状突起棘は通常,年齢とともに増加するが, DSでは増加せず, 20才をすぎるとむしろ減少した.従って,樹状突起の発育不良は精神遅滞などの脳機能障害と関係深いと考えられる.動物実験ではニューロン発達遅滞を作るために,動物新生仔に低酸素と虚血負荷を長時間行い,脳血流の変動を観察し,大脳皮質に病変を作りえた.これのGolgi studyをすると,樹状突起の短縮と棘の減少がみられたが,現在のところ,運動負荷のみでは改善はえられていない.一方,細胞レベルで発達促進をみる目的で,正常とDS乳児および成人の皮膚線維芽細胞を用いて,種々の濃度の牛胎児血清(FCS)を加え,細胞の増殖能を比較した.乳児DSでは低栄養で増殖能がわるく,高栄養で増殖が補正されるが,成人では補正されず,人工血清ではじめて補正された.これはDS細胞の持性を示し,精神遅滞や早期老化とも関係があるかも知れない.本研究はヒト剖検例のGolgi study、動物実験および組織培養の3方法を用いて行われた。ヒト剖検例のGolgistudyは新生児仮死や慢性肺疾患を合併した児の大脳皮質(既報告)にひきつづき、脳幹について行った。まず、正常発達をみると、脳幹網様体のニユーロンの樹状突起棘は胎生末期まで徐々に増加し、生後には急に減少した。乳幼児突然死症侯群ではこの樹状突起棘は残存し、その減少は遅れていた。また、Down症侯群の大脳皮質の樹状突起の発達は胎生期には正常と差がないが、生後の発達がわるい傾向があった。とくに樹状突起棘は通常、年令とともに増加するが、Down症候群では増加せず、20才をすぎると、むしろ減少した。従って、樹状突起の異常は精神遅滞などの脳機能障害と関係深いと考えられる。動物実験ではまず、ラットの大脳皮質ニユーロン樹状突起の正常発達を計測形態学的に検討した。ラットではヒトより遅れて急速に樹状突起の分枝,伸展,棘増加がみられた。また、ニユーロン発達遅滞を作るために、動物新生仔に低酸素負荷を長時間行い、脳血流の変動を観察し、大脳皮質に病変を作りえた。これによるニユーロンの発達遅滞と促進のGolgistudyは次年度の課題である。一方、細胞レベルで発達促進をみる目的で、正常とDown症候群乳児および成人の皮膚線維芽細胞を用いて、種々の濃度の牛胎児血清(FCS)を加え、細胞の増殖能を比較した。1%FCSでは乳児のDown症候群細胞の増殖は止り、20%では対照と差がなくなった。しかし、成人では増殖曲線は10および20%FCSでもやゝわるく、細胞密度はDown症候群で低い傾向がみられた。このように、乳児Down症候群では高栄養で増殖が補正されるが、成人では補正されず、人工血清ではじめて補正された。これは早発老化とも関係するかも知れない。
CD21、CD23及びCD40欠損マウスを用いたリンパ球間相互作用の解析

リンパ球表面に発現している分化抗原はCDシリーズで知られているが、これらは細胞間相互作用やシグナル伝達において重要な機能を担っている。主にB細胞上に発現しているCD40及びCD23を欠損するマウスをジーンターゲティング法により作製、解析した。CD40を介するシグナルは、二次シグナルとしてB細胞の増殖、活性化に関与することが示唆されてきたが、この欠損マウスにおいてはリンパ球の分化成熟には異常を認めなかった。しかし、T細胞依存性抗原刺激時の免疫グロブリンクラススイッチは障害されており、血中のIgM以外のクラスの免疫グロブリン低値と共に、CD40からのシグナルのクラススイッチにおける重要性が明らかとなった。また、二次リンパ濾胞での胚中心の形成不全もみられ、胚中心におけるB細胞の成熟、活性化のCD40を介したシグナルの重要性が明らかとなった。一方、T細胞非依存性抗原に対する免疫応答は正常で、クラススイッチの障害が認められなかった。現在、このマウスにおける免疫記憶、抗体の親和性増強等を解析中である。またCD23はIgEに対する低親和性受容体でもあり、IgEの制御に関与している可能性がある。CD23欠損マウスはリンパ球の分化、免疫応答、寄生虫感染実験において対照マウスと差異を認めなかった。IgE産生のネガティブフィードバック制御の可能性を示す結果も得られたが、マウスの遺伝的背景により免疫応答も影響をうけ、慎重な解析が必要である。また、IgEを介する抗原提示能の増強がこのマウスではみられず、生体におけるCD23の重要性が示唆された。しかし、アスペルギルス吸入実験におけるアレルギー発症へのCD23の関与は明確にならず、現在方法をかえて解析中である。一方、CD21ノックアウトに関しては、ターゲティングベクターのES細胞への導入を試みている。
場の理論と統計力学の方法の計算量的に困難な問題の解析への応用

共同研究者とともに,ナンバープレース(数独)と呼ばれる組み合わせパズルを統計力学的に解析した.ナンバープレースは,定義域である有限集合とその部分集合族が与えられたとき,別の有限集合を値域とするある条件をみたす写像を見いだす問題である.標準的な9×9のナンバープレイスを一般化したものを考えたとき,すでに知られている標準的なものに対する解探索アルゴリズムがどのように一般化されるかを考察した.標準的な場合には,空でない共通部分を持つ部分集合は最大3個だが,この上限を増やす一般化をした場合にも,アルゴリズムは最大3個の場合の自然な拡張が最良であることを示唆する結果を得た.ナンバープレースの解の個数を,マルチカノニカルモンテカルロシミュレーションによって数値的に評価することをめざし,予備的な解析を行った.共同研究者とともに,さめがめと呼ばれる組み合わせパズルを統計力学的に解析した.これは,格子の各点が,n色のうちのひとつの状態をとるようなモデルで,プレイヤーがひとつのクラスターを選択すると,特定のルールに基づいてアップデートがかかるようなものである.有限サイズにおいてランダムに定めた様々な初期状態から分枝限定法でゴールとされる状態に達する手順を探索し,達することができる確率を数値的に評価した.この結果は,ゲームにおける最適な戦略を推定するのに有益な情報である.また,補外によって,無限サイズ極限における性質を推定した.NP完全問題として知られる,3次元マッチング問題と,排他カバー問題を,統計力学における相転移とみなして解析した.1個の確率パラメータにしたがって,ランダムに問題を生成し,その問題が肯定的に解ける確率,および肯定的か否定的かを枚挙によって決定するための計算量を,平均場的近似,および直接の計算機実験によって評価した.平均場的近似が非常に良い場合と悪い場合があり,その差の原因を調べることが重要であることがわかった.また,臨界指数を求めるために転移点近くのデータを収集した.また,3次元マッチング問題は,特定の場合には,ランダムグラフのサイクルの存在問題に帰着することを示した.特定な構造を持つ大きな疎行列の最大固有値を効率よく求める方法である密度行列くりこみ群について調べた.統計力学の問題であるO(n)ループ模型の転送行列(固有値が実な複素行列)に対して適用したところ,対称性を保つなどの種々の配慮を行って初めて,計算結果の固有値が実で意味のある値を得た.これを,系のサイズが小さく,厳密な最大固有値がわかっている場合についても行った.密度行列くりこみ群は,次元の少さい重要な部分空間だけを保持して計算する方法であるが,最大固有値の評価値は,次元を増やしても厳密な値に近づく振る舞いを見せない.このような振る舞いは,いくつかの系について,他の研究者によって報告されており,O(n)ループ模型について詳細に調べることにより,密度行列くりこみ群の適用限界について新しい知見が得られる可能性がある.ナンバープレースと呼ばれる組み合わせパズルを統計力学的に解析した.ナンバープレースは,実験計画法の概念であるデザインに関する問題ととらえることができ,ある条件を満たすデザインを見つけるというパズルである.分枝限定法ではなく,問題の論理的構造から演繹的に解を見つけるアルゴリズムを実装し,人間が発見的に作った問題のアンサンブルに対して,その性能評価を行った.15パズルと,それに類する組み合わせパズルを解くアルゴリズムについて調べた.15パズルを解くには,分枝限定法を用いることが有効であることが指摘されている.そこで,上界,下界を与える種々の関数について,15パズルのサイズをより大きくした場合の性能評価を行った.また,サイズを変化させたときの計算量の漸近形を求めるための予備的解析を行った.さめがめと呼ばれる組み合わせパズルを統計力学的に解析した.これは,格子の各点が,n色のうちのひとつの状態をとるようなモデルで,プレイヤーがひとつのクラスターを選択すると,特定のルールに基づいてアップデートがかかるようなものである.特定の条件が成立するまでアップデートを繰り返し,利得が計算される.ルールが非常に複雑であることから,分枝限定法で最適な手順を探索するのではなく,各クラスターを選択することの賢明さを表す評価関数を,クラスターの形や他のクラスターとのつながりから定義することにした.この評価関数の値の大きい順にクラスターを選択するアルゴリズムを採用した.評価関数全体の空間の中で,もっとも利得の大きくなるものを探索した.共同研究者とともに,ナンバープレース(数独)と呼ばれる組み合わせパズルを統計力学的に解析した.ナンバープレースは,定義域である有限集合とその部分集合族が与えられたとき,別の有限集合を値域とするある条件をみたす写像を見いだす問題である.標準的な9×9のナンバープレイスを一般化したものを考えたとき,すでに知られている標準的なものに対する解探索アルゴリズムがどのように一般化されるかを考察した.標準的な場合には,空でない共通部分を持つ部分集合は最大3個だが,この上限を増やす一般化をした場合にも,アルゴリズムは最大3個の場合の自然な拡張が最良であることを示唆する結果を得た.ナンバープレースの解の個数を,マルチカノニカルモンテカルロシミュレーションによって数値的に評価することをめざし,予備的な解析を行った.共同研究者とともに,さめがめと呼ばれる組み合わせパズルを統計力学的に解析した.これは,格子の各点が,n色のうちのひとつの状態をとるようなモデルで,プレイヤーがひとつのクラスターを選択すると,特定のルールに基づいてアップデートがかかるようなものである.有限サイズにおいてランダムに定めた様々な初期状態から分枝限定法でゴールとされる状態に達する手順を探索し,達することができる確率を数値的に評価した.
情報伝達機構の解明を目指した骨形成因子(BMP)とそのレセプターの構造解析

以前我々が多核多次元NMR法を用いて決定したI型BMPレセプター細胞外ドメインの立体構造のリファインメントをおこなうとともに、構造に基づいてその部位特異的変異体およびTGF-βレセプターとのキメラタンパク質を設計した。それらはいずれもチオレドキシンとの融合タンパク質として大腸菌を用いて発現させることができ、正しいジスルフィド結合を形成させることが可能であった。CDおよびNMRによって、変異体の立体構造が天然型と同じであることを示すことができた。またBMPについても大腸菌を用いた発現系の改良をおこない、天然型と同等な試料の大量調製が可能となった。レセプターの変異体とBMPとの結合を表面プラズモンセンサー、超遠心沈降平衡法およびNMRを用いて定量的に解析することによって、BMPレセプターの、Ile52,Glu54,Thr62,Thr64およびPhe75がBMPの認識・結合に重要であることを明らかにした。これらの知見に基づき、X線結晶構造解析によって決定されたBMPレセプター-BMP複合体の構造をNMRによって決定したBMPレセプター細胞外ドメインの立体構造と比較したところ、認識・結合にあたってレセプターの部分的な構造変化が必要であることが示された。BMPについて、大腸菌を用いた大量発現系を構築し、ジスフィド結合を結成する条件を検討した結果、以前は得ることが難しかった天然型に巻き戻ったBMPが入手可能になった。続いて、構造解析に有利であると考えられる溶解度が高い条件を、動的光散乱法、沈降平衡法などを用いて検討した。また同時に、BMPレセプターとの複合体を形成する条件を同様の方法を用いて検討した。現在その最適化を行うとともに、複合体の構造解析に着手している。しかし、複合体の構造解析においては様々な困難が予想され、場合によっては、部位特異的変異体などを用いて構造解析に最適な物性をもつ複合体を調整する必要が生じると考えられる。その際にはあらかじめ相互作用部位を推定しておくことが不可欠である。そこでBMPレセプターのリガンド認識部位について、その立体構造に基づき系統的に部位特異的変異体を作成しBMPとの親和性を表面プラズモンセンサー、沈降平衡法、およびNMRによって定量的に解析した。その結果、認識・結合に重要なアミノ酸残基を特定できた。
メダカゲノムBACライブラリーの構築

1.北日本由来近交系HNI株をソースとして、20ゲノム相当(平均インサートサイズ160kb、9万6千クローン)のBACラィブラリーを作製し、384穴プレート250枚に個別に保存した。さらにコロニーハイブリダイゼーション法によって目的のクローンを同定するための高密度レプリカフィルターを多数作製した。2.BACクローンの末端シーケンシングを推進するための実験系を確立し、HNI-BAC8,160クローンの両末端を解読した。また我々が名大堀教授らと共同で構築していたメダカHd-rR株BAC、ドイツで構築されたメダカCab株BACについてそれぞれ、11,904クローン、1,152クローンの両末端シーケンスを決定した。これらによって解読した計21,216クロー3.メダカHd-rR.株30,720クローンに対してPCRスクリーニングを行うためのBAC-DNAプールを調製した。このスクリーニング系では、1次スクリーニングとして20スーパープール、2次スクリーニングとして各スーパープールに対して28プールの4次元DNAミックスをテンプレートにPCRを行うようデザインした。これらはBACウォーキングなどに活用した。4.領域内外の研究者と共同でメダカ22番染色体全体(約20Mb)のシーケンシングを目指して、BACコンティグの作成、シーケンシングを進めた。2004年2月現在で11Mb(55%)をカバーするBACのコンティグ作成および7Mb(35%)のシーケンシングが完了した。5.領域内外の研究者に多数のBACクローンやそのスクリーニング材料、末端シーケシスデータを提供した。その結果、メダカ性決定遺伝子など様々な遺伝子のポジショナルクローニングや構造解析、さらにBACコンティグマップや連鎖地図作成に貢献した。メダカゲノムBACライブラリーの構築を進めた。北日本由来の近交系HNIの尾ヒレより樹立した培養細胞HNI41を出発材料に用いることにより、BACライブラリーの作製に必須である良質の高分子DNAを調整する系を確立した。調整したDNAを制限酵素で限定分解後、150kb-200kbのサイズ領域を分画し、BACベクター(pBAC-Lac)と連結、大腸菌DH10B株に導入した。現在すでに平均160kbのインサートサイズをもつクローンを9万6千個収集し、384穴プレート250枚に個別の保存した。メダカゲノムは約800Mbと推定されるので、約20ゲノムをカバーした。また1万9000クローンをブロットした高密度レプリカ(HDR)に対していくつかマーカーでスクリーニングを行ったところ、予想される数のクローンが得られたことから、ライブラリーの質が高いことが確認できた。現在、作製したBACを個別クローンまで同定するためにPCRスクリーニングミックスの調製、コロニーハイブリダイゼーションのためのHDRフィルターの大量生産を進めている。また作製したBACクローンの末端シーケンスを大量に行い、STSとして登録するための予備的な実験を行っている。今後これらのBAC末端STS(GSS)とともに領域内で蓄積されるEST、多型マーカーの情報と共にデータベース化して、DH法によりメダカゲノム物理地図作製の進展させる予定である。平成12年度は、平成11年度までに作成したメダカBACライブラリー(HNI系統)からランダムにクローンを選び、BACの末端シーケンスを決定することを目的に、研究を進めた。多数の検体から、シーケンス反応に適したBAC-DNAサンプルを抽出するための条件検討を行った。具体的には、96サンプル単位で大腸菌をそれぞれ3mlの培地で培養し、QIAGEN REALキットの試薬を用いて精製を行った。

現在までに、約2,000クローンのDNAサンプルを抽出し、そのうちの1,000サンプルについてシーケンスのテストランを行った。その結果、一部に改善の余地があるものの、大量のBAC末端シーケンスを行える高純度かつ十分量のDNAサンプルを得て、効率よく安定にBACのダイレクトシーケンシングを行うたの実験条件を確立した。現在実際にBACの末端シーケンスの蓄積を進めている。これらのシーケンスはGSSとして登録し、デジタルハイブリダイゼーション法によるBACコンティグ作成などに活用していきたい。また、平成12年度には2つの研究室からBACライブラリーの使用を要請され、スクリーニング用の高密度レプリカメンブレンを譲渡した。平成11年度中に譲渡した研究室からもクローンの請求を受け、2つの研究室に、あわせて30あまりのBACクローンを供給した。昨年度までに北日本由来の近交系HNIメダカのBACライブラリーの構築とスクリーニング系を確立を完了したが、これらのBACクローンやスクリーニング材料を広く国内、国外の研究者に配布し、ポジショナルクローニングやゲノムシーケンシングなど様々な遺伝子解析に貢献している。現在までにメダカの鱗欠損変異rs-3系統の原因遺伝子の同定や(Kondo S et al., 2001)、DMRT4遺伝子のクローニング(Kondo S et al., in press)などの成果があげた。本年度は大量のBACクローンの末端シーケンシングを行いSTS化(GSSの創出)を試みた。そのためにQiagen社の96-well規格によるプラスミド調製キットの精製条件を改良して、テンプレートとして十分量のBAC-DNAを精製する系を確立した。さらに限外ろ過によってBAC-DNAの精製度を高めることにより、シーケンシング反応自体の成功率を格段に高めることに成功した。その結果、ABI3700キャピラリーシーケンサーを用いて高い成功率(80%以上)とクオリティーでシーケンシングすることが可能となった。すでに約9,000末端のシーケンスデータを蓄積した。メダカの全ゲノムは約800Mbなので、現時点で既に約90kbに1ヶ所の頻度でGSSを確保したことになる。またこれらの大量のシーケンスデータを効率的に処理するためのコンピュータソフトの開発を行った。領域内の遺伝子マッピングプロジェクトグループに対して得られた末端シーケンス情報の提供し多型マーカーの創出に貢献している。また配列のBLAST検索によって見つかった遺伝子を7個マップするなどメダカの遺伝子地図の充実化に貢献した。本研究では既に北日本由来近交系HNI株をソースとして、20ゲノム相当(平均インサートサイズ160kb、9万6千クローン)のBACライブラリーを作製し保存している。本年度は引き続きBACクローンをスクリーニングするための高密度レプリカ(HDR)フィルターやスクリーニングによって同定されたBACクローンを広く内外の研究者に対して配付し、生物学的に重要な遺伝子の単離、解析に貢献した。その成果の一つとして、メダカY染色体に特異的な約400kbの領域をカバーするBACクローンの単離、解析によりメダカ性決定遺伝子DMY/DMRT1Yの同定に貢献することができた。
中央アジアにおける共層意識とイスラムに関する歴史的研究

本研究課題は、中央アジアの各民族のアイデンティティに焦点を当て、前近代から現代に至るその歴史的展開を明らかにするためのデータを実地調査により収集し、イスラムとの関わりを軸にその変容のプロセスを検討することを目的とした。第一に、ウズベキスタンにおいては、前近代のウズベク人社会、とくにイスラム杜会の実態に関する文書史料の調査・研究に当たるとともに、ロシア帝国期ムスリム住民の状況に関するアーカイヴ史料の調査とデジタル化作業を進めた。さらに、現状におけるイスラムの情況についてモスク等における聞き取り調査に従事した。第二に、カザフスタンでは、1819世紀におけるカザフ人の動向、カザフ杜会の様相を探るために、文書史料の調査・収集を実施した。また、カザフスタン在住ウイグル人社会の現状について、主に教育・文化面において聞き取り調査と文献資料の収集を体系的に実施するとともに、新聞史料の利用により歴史的情況について検討を加えた。第三に、クルグズ共和国において、グルグズ人コミュニティにおけるイスラムの実態について実地調査を実施した。第四に、中国・新疆では、20世紀における教育状況と民族政策に関する資料の収集に当たるとともに、言語・文化面の政策と活動に関して、ウイグル人知識人などから聞き取り調査を実施した。以上のような調査・研究を通して、各民族の前近代から現状へと至る杜会・文化の変化、およびその過程における意識と活動の様相について、相当量の根本的なデータを収集・蓄積することができた。とくに、現在まで未利用であった文書史料の本格的な利用を実現し、ウズベク人・カザフ人の前近代ムスリム社会の具体的実相が明らかになりつつある。また、事例研究として、ウイグル人社会の歴史と現状について、マイノリティとしての教育・文化状況とアイデンティティの様態など、基本的な状況に関する体系的な知見が得られた。独立後の中央アジアでは文化・宗教面で新規のアスペクトが現出してきた。本研究は,このような現象の内実と背景に注目し,前近代から現在に至る歴史的な社会・文化の変容過程を,共属意識とイスラームの関係性を軸に検討することを目的としている。本年度は,現状の様態に関する総体的な把握を進めるとともに,歴史的状況を解明するための根本的な材料を新たに開拓し,集積するための基礎作業に従事した。具体的には以下の通り。(1)ウズベキスタン,カザフスタン,アゼルバイジャンにおいてモスク・聖者廟等の宗教施設,宗教政策担当官庁,宗教教育機関などを訪問し,ソ連邦末期から復興してきたイスラームの現状を包括的に調査した。また,イスラームを国家統合の支柱としてきたウズベキスタン政府が,最近宗教へのコントロールを強化している実情が明らかになった。(2)個別の事例調査として,カザフスタンにおけるウイグルとドゥンガンのコミュニティに関する調査を実施した。近年,再認識された民族文化の強調や民族意識の高揚,イスラームの復興といった現象が顕著な形で表面化している。これは,ソ連崩壊後の自由化の流れとともに,カザフ人の政治的優越性が増しつつある独立後のカザフスタン国家の中でエスニック・マイノリティが置かれている位置・境遇をも反映している。(3)前近代およびロシア帝国統治期の中央アジアのムスリム社会の様相を文書史料の利用を通じて解明する研究に突破口を開きつつある。ウズベキスタンのイチャンカラ博物館所蔵ヒヴァ・ハン国文書の本格的検討に当たるとともに,ウズベキスタン国立中央古文書館のコーカンド・ハン国文書にもアクセスを開始した。また,カザフスタン国立中央古文書館では,ロシア帝国統治期のウイグル社会の状況に関する文書史料を調査した。今後は,文書研究の発展,ソ連期の状況に関する聞き取り調査の実施を予定している。本年度の研究は、昨年度の調査を進展させる形でウズベキスタンとカザフスタンにおける調査を継続するとともに、クルグズスタンでも実地調査を実施した。第一に、ウズベキスタンでは、前近代ウズベク人のムスリム社会の実態に関する文書史料、およびロシア帝国期ムスリム住民の政治的活動に関わるアーカイヴ史料の調査・研究を実施した。

当初計画していたフェルガーナ盆地における実地調査に関しては、最近の事情に鑑みて見送らざるを得なかった。第二に、カザフスタンでは、ロシア帝国期カザフ人指導者の思想と活動に関するアーカイヴ史料の調査・研究に従事した。また、カザフスタンのウイグル人コミュニティに関して、1920世紀における文書史料の調査、ソ連末期から独立カザフスタンにおけるコミュニティの状況に関する実地調査を行った。第三に、クルグズスタンでは、ソ連期におけるクルグズ人コミュニティの様態および独立後の変化に関する実地調査を実施した。以上のような調査を通して、旧ソ連領中央アジアのウズベク、カザフの各民族に関して、前近代からロシア帝国期を経てソ連へと至る社会・文化の変化、およびそのプロセスにおける意識と活動の様相について、できる限り時間的な空白を残さぬ追究を実現できるようなデータを、共同作業を通して入手しつつあり、同時にそれらを検討中である。また、旧ソ連領におけるマイノリティのムスリムとして、ウイグル人社会に焦点を当て、教育・文化・宗教状況と、それに関連したアイデンティティの表象化の実態が明らかになりつつある。本年度の研究は、昨年度の研究を進展・補充する形でウズベキスタンおよびカザフスタンにおける調査を継続するとともに、中国・新疆でも実地調査と文献収集を実施した。第一に、ウズベキスタンおよびトルコでは、前近代のウズベク人社会、とくにイスラム社会の実態に関する文書史料の調査・収集、およびロシア帝国期ムスリム住民の状況に関するアーカイヴ史料の調査とデジタル化作業に従事した。第二に、カザフスタンでは、1819世紀におけるカザフ人集団の動向、カザフ社会の様相を探るために、文書史料の調査・収集を実施した。また、カザフスタン在住ウイグル人社会の歴史状況と現状について、主に教育・文化面から新聞史料の利用により検討を加えた。第三に、中国・新疆では、20世紀における教育状況と民族政策に関する資料の収集に当たるとともに、ウイグル人知識人など関係者から聞き取り調査を実施した。以上のような調査を通して、ウズベキスタン・カザフスタン・新疆在住の各民族について、前近代から現状へと至る社会・文化の変化、およびその過程における意識と活動の様相について、相当量の根本的なデータが収集・蓄積されつつある。とくに現在まで未利用であったウズベキスタンとカザフスタンにおける文書史料の本格的な利用の実現について目処がついたことは特筆される点である。現在、これらの史料の文献学的検討、歴史過程の鮮明化に向けての分析を行っている。また、カザフスタンのウイグル人社会の現状について、教育・文化状況とアイデンティティの様態など、基本的な状況がほぼ明らかになった。これらの具体的な成果については、研究成果報告書に示されている通りである。
タンパク質架橋化酵素の組織内活性の解析による生理機能解明

申請者は動植物や微生物において多彩な生命現象に関与するタンパク質架橋化酵素である「トランスグルタミナーゼ」(TGase)に焦点を当てて研究を進めた。今回は8つあるアイソザイムのうち皮膚形成に関与するTGase 1に着目し、皮膚形成異常が見られる道化師様魚鱗癬の疾患モデルマウスの、胎生期から新生児における全身凍結切片を対象とし実験を行った。この疾患は脂質の膜輸送に関与することで皮膚バリア形成の大きな役割を担うABCA12の異常を原因とする。これまでに確立されてきたTGase 1に特異的な酵素活性を検出できる染色、及び免疫組織学的染色を行い、正常マウスと比較することで皮膚疾患とTGase 1との関係を明らかにすることを目的とした。結果、皮膚の角質層において正常マウスと疾患モデルマウスで、活性を持つTGase 1の分布に大きな違いが観察され、新たな知見を得る事ができた。また、道化師様魚鱗癬について全身で網羅的に調べた報告はあまり無いため、TGase 1についてのみ言及するのに留めず、HE染色により組織構造を観察し、皮膚構成タンパク質や細胞増殖因子、層板顆粒から分泌される脂質など、関与しうる因子の発現部位についても免疫組織学的染色を行い、この結果を正常なマウスの染色結果と比較することで各種関連因子と皮膚疾患との相互関係を明らかにした。他に、皮膚に限らず肺のII型肺胞上皮細胞における、肺サーファクタントであるSP-Cの発現を調べることで、ABCA12欠損による肺胞への影響も調べた。これらの結果をもとに、さらなる分析考察を進めることで、疾患の機序解明や予防・治療法の開発、疾患の評価の指標として利用するなど、医学分野においても大きく貢献することを期待する。26年度が最終年度であるため、記入しない。本研究では、生体構造構築に関与することが知られているタンパク質架橋化酵素「トランスグルタミナーゼ」(以下TGaseと略記)に焦点を当てて研究を進めている。ヒトなどの高等動物では8種類のアイソザイムが確認されており、例えばTGase1やTGase3は皮膚や毛包などの上皮組織に存在し、表皮形成に必須である。TGase2は多様な組織に広く存在し細胞死や細胞接着に働くと考えられている。当研究室ではこれまでとTGase2に対して特異的で高反応な基質配列を同定しており、このペプチドを蛍光標識したものを活用することで組織切片上の全組織で架橋化酵素反応を一挙に可視化できるという斬新なシステムを確立している。これまでに出生後9日目の全身凍結切片を用いて活性分布を明らかにしてきたが、今回はE10.5から新生児に至るまでのマウス胎児の全身凍結切片を対象にTGaseの時空間的な発現の変化を明らかにすることを試みた。結果、TGase1・TGase2共にE16.5に急激な変化があることがわかり、胎生時期に従った各組織におけるTGaseの存在分布・活性分布の変化を網羅的に明らかにすることができた。よって、これまでの免疫組織化学的、生化学的解析では得られなかった新たな知見を得ることができた。しかし、組織の発生とTGaseとの関係はまだ未知な部分が多いため、より細密な解析が必要である。今後、さらなる考察を進めると共に次の疾患モデルマウスにおける、同システムを用いた研究を行う予定である。これにより生物学や医学、産業応用に至るまで幅広い領域に関与するTGaseの解明に貢献することを期待する。ヒトなどの高等動物では8種類のアイソザイムが確認ざれており、例えばTGase 1やTGase 3は皮膚や毛包などの上皮組織に存在し、表皮形成に必須である。当研究室ではこれまでTGase 1とTGase 2に対して特異的で高反応な基質配列を同定しており、このペプチドを蛍光標識したものを活用することで組織切片上の全組織で架橋化酵素反応を一挙に可視化できるという斬新なシステムを確立している。これまでに各日齢(E10.5、E12.5、E14.5、E16.5、E18.5)の胎児、及び新生児のマウスの全身凍結包埋ブロックから作成した全身凍結切片を用いて活性分布を明らかにし、新たな知見を得る事ができた。また、TGaseは異常な状態での架橋反応は種々の病理的現象にも関わることが知られている。蛋白質架橋化反応が関与した結果生じる、病態の発生部位、発生時期、発生メカニズムについては、これまで詳細な検討はなされていない。よって同システムを利用して研究を進めることで、疾患の原因究明にも大きな役割を果たすと考えられる。具体的には、皮膚形成異常である「魚鱗癬」の中で特に重篤な道花師様魚鱗癖のヒト疾患モデルマウスを用いて、同様にマウスの発生過程に伴って活性染1色・抗体染色を施行し、これまでの正常なマウスでの実験結果と比較することで、このタンパク質架橋化酵素が疾患にどのように関与するか明らかにしていく。さらなる考察を進めると共に、疾患の病態機序の解明や予防・治療法の開発など、医学分野においてもTGaseの解明に貢献することを期待する。

今回は8つあるアイソザイムのうち皮膚形成に関与するTGase 1に着目し、皮膚形成異常が見られる道化師様魚鱗癬の疾患モデルマウスの、胎生期から新生児における全身凍結切片を対象とし実験を行った。この疾患は脂質の膜輸送に関与することで皮膚バリア形成の大きな役割を担うABCA12の異常を原因とする。これまでに確立されてきたTGase 1に特異的な酵素活性を検出できる染色、及び免疫組織学的染色を行い、正常マウスと比較することで皮膚疾患とTGase 1との関係を明らかにすることを目的とした。結果、皮膚の角質層において正常マウスと疾患モデルマウスで、活性を持つTGase 1の分布に大きな違いが観察され、新たな知見を得る事ができた。また、道化師様魚鱗癬について全身で網羅的に調べた報告はあまり無いため、TGase 1についてのみ言及するのに留めず、HE染色により組織構造を観察し、皮膚構成タンパク質や細胞増殖因子、層板顆粒から分泌される脂質など、関与しうる因子の発現部位についても免疫組織学的染色を行い、この結果を正常なマウスの染色結果と比較することで各種関連因子と皮膚疾患との相互関係を明らかにした。他に、皮膚に限らず肺のII型肺胞上皮細胞における、肺サーファクタントであるSP-Cの発現を調べることで、ABCA12欠損による肺胞への影響も調べた。これらの結果をもとに、さらなる分析考察を進めることで、疾患の機序解明や予防・治療法の開発、疾患の評価の指標として利用するなど、医学分野においても大きく貢献することを期待する。26年度が最終年度であるため、記入しない。研究目的に記載した内容のうち、in situハイブリダイゼーションについて実験系がうまくいかなかったため、RNAレベルのデータは得られなかったが、その他の主要となる内容は順調に進行しており、これらをまとめた内容の論文も現在投稿中である。昨年4月から共同研究のため医学部皮膚科に在籍し、研究の目的に記載した次のテーマである皮膚疾患モデルマウスにおけるTGaseの生理機能解明を進めている6当初、このモデルマウスの十分な匹数を確保、また染色の条件検討に手間取り、多くの労力、時間を費やしたが、現在は概ね解決へ向かい順調に進展していると考える。これまでに行ってきた実験手法と同じ各TGaseアイソザイムに対する高反応性基質配列を活用した活性染色を、病態モデルマウスの胎生に伴った全身凍結切片においても行う予定である。研究計画では皮膚疾患と神経変性疾患について行うと記載したが、共同研究として医学部皮膚科で研究をさせて頂くことになったため、皮膚疾患についてのみに限定して行う。具体的には魚鱗癬の原因になるとされているABCA12をノックアウトさせた疾患モデルマウスを使用していく予定である。代わりに、TGaseについてのみ言及するのに留めず、他にABCA12などの皮膚疾患に関与しうるものの発現部位を、抗体染色により明らかにし、TGaseと皮膚疾患との相互関係を明らかにしていく。
G蛋白質共役型受容体を介した膵癌細胞の増殖・浸潤促進,抗アポトーシス機構の解明

G蛋白質共役型受容体は、7回膜貫通型の受容体で、細胞質内でG蛋白とcouplingして、増殖、運動、抗アポトーシスなどに関するシグナルを核へ伝達する作用を有することが知られている。今回、我々は、すでに膵癌組織内での過剰発現が確認さているアンギオテンシンII(Ang II)と腫瘍トリプシン、さらにはリゾホスファチジン酸(LPA)などの分子群にも注目し、それぞれの特異的受容体(AT1,PAR-2および(EDG)-2,-4)を介した膵癌細胞における細胞内シグナル伝達系について検討した。さらにこれらシグナルを介した刺激伝達の膵癌病理組織に及ぼす影響についても検討した。得られた結果は以下のように要約される。AT1、PAR-2およびEDG-2,-4受容体蛋白は、検索したすべての膵癌細胞株で発現しているのが確認された。そして、AngIIとトリプシンはそれぞれの受容体を介して膵癌細胞の増殖を濃度依存性に促進させた。また、ERK1/2やNF-κ8を活性化することで、膵癌細胞増殖を促進し、抗癌剤抵抗性を増強することが示された。さらに、腫瘍トリプシンの発現のないPanc-1にcationic typeのtrypsinogenを遺伝子導入しところ、遺伝子導入された細胞ではその増殖や運動・浸潤能が亢進した。すなわち、腫瘍から分泌され、その後活性化されたトリプシンがPAR-2を介して膵癌細胞の増殖と運動・浸潤能を亢進したものと考えられた。一方、膵癌細胞株では、LPA刺激に対し、その濃度が1μM濃度までは、膵癌細胞の有意な増殖効果は認められなかった,さらには、ERK1/2の明らかなリン酸化も確認できなかった。この結果は、Ang IIやトリプシンがnMレベルでシグナル伝達がおこなわれたのと対照的であった。最後に、ヒト膵癌組織(外科切除標本)におけるトリプシン、PAR-2およびAT1発現と組織内Ang II濃度(手術時に採取)の関係を検討した。その結果、膵癌細胞でのトリプシンおよびPAR-2発現の強い症例ほど膵癌組織内の間質の線維化の程度が強く、また、組織内アンギオテンシンII濃度も高いという傾向が認められた。このAng IIは、RAS非依存性にトリプシンによって直接アンギオテンシノーゲンから直接産生されることより、膵癌細胞から産生されるトリプシンおよびそのトリプシンによって産生されるAng IIは、それぞれの特異的受容体を介して、膵癌細胞の生存と抗アポトーシス能だけでなく、膵星細胞や線維牙細胞(いずれの細胞もPAR-2とAT1受容体の発現がある)にもパラクライン的に作用して膵癌間質の線維増生(fibrogenesis)に深く関与していることが推察されたG蛋白質共役型受容体は、7回膜貫通型の受容体で、細胞質内でG蛋白とcouplingして、増殖、運動、抗アポトーシスなどに関するシグナルを核へ伝達する作用を有することが知られている。

このAng IIは、RAS非依存性にトリプシンによって直接アンギオテンシノーゲンから直接産生されることより、膵癌細胞から産生されるトリプシンおよびそのトリプシンによって産生されるAng IIは、それぞれの特異的受容体を介して、膵癌細胞の生存と抗アポトーシス能だけでなく、膵星細胞や線維牙細胞(いずれの細胞もPAR-2とAT1受容体の発現がある)にもパラクライン的に作用して膵癌間質の線維増生(fibrogenesis)に深く関与していることが推察されたヒト膵癌は、他の消化器癌に比較し、高濃度のアンギオテンシンII(Ang II)を含んでおり、AngIIがその特異的受容体であるアンギオテンシンII type 1受容体(AT1受容体で7回膜貫通型のG蛋白質共役型受容体の1つ)を介して膵癌細胞の生存に影響を及ぼしている可能性がある。しかし、これまでにAng IIの膵癌細胞の生存に及ぼす影響について、分子生物学的レベルで詳細に研究した報告はない。そこで、本研究では、Ang IIのヒト膵癌細胞の増殖・浸潤能や抗癌剤抵抗性(抗アポトーシス能)に及ぼす影響を検討した。材料は、分化度の異なる3種類のヒト膵癌細胞株{HPAF-II(高分化型腺癌)、AsPC-1(中分化型腺癌)およびPanc-1(低分化型腺癌)}を用いた。検索項目と方法は、膵癌細胞におけるAT1受容体の発現はウエスタンブロット法および免疫染色で、Ang IIの膵癌細胞増殖に及ぼす影響はMTT assay法、抗癌剤抵抗性に及ぼす影響はannexin V-FITC bindingassay法で評価した。また、膵癌細胞株をAngIIで処理した際の細胞内への生存シグナル伝達経路(MAPキナーゼのリン酸化、NF-κB蛋白の活性化、Bcl-XLおよびsurvivinなどのアポトーシス関連蛋白の関与)については、ウエスタンブロット法およびelectrophoretic mobility shift assay法で評価した。得られた結果は以下のように要約される。(1)AT1受容体蛋白は、検索したすべての膵癌細胞株で強く発現していた。(2)Ang IIはAT1受容体を介して膵癌細胞の増殖を濃度依存性に促進させた。(3)Ang IIはシスプラチンによる膵癌細胞株のアポトーシス誘導を抑制した。(4)Ang IIは膵癌細胞においてERK1/2、NF-κBを活性化し、Bcl-XL、survivinの発現を増強させた。以上の結果より、AngIIは、AT1受容体を介してERK1/2やNF-κBを活性化することで、膵癌細胞増殖を促進し、抗癌剤抵抗性を増強することが示された。昨年度は、ヒト膵癌組織内では他の消化器癌に比較し、高濃度のアンギオテンシンII(Ang II)を含んでおり、Ang IIがその特異的受容体であるAT1受容体(7回膜貫通型のG蛋白質共役型受容体)を介して膵癌細の生存と抗アポトーシス能の獲得に重要な役割を演じている可能性を報告した。そこで、本年度は、AT1受容体と同じ7回膜貫通型のG蛋白質共役型受容体であるprotease-activated receptor-2(PAR-2)(これはトリプシンの受容体としてクローニングされた分子で、トリプシンにより限定分解を受けtetherd ligandとしてPAR-2自身の細胞外ループに特異的に結合する)に注目し、癌細胞自身が産生・分泌する腫瘍トリプシンによるG蛋白質共役型受容体を介しての細胞内シグナル伝達系に関して検討した。材料は、分化度の異なる3種類のヒト膵癌細胞株{Capan-1(高分化型腺癌)、AsPC-1(中分化型腺癌)およびPanc-1(低分化型腺癌)}を用いた。方法は前年度と同様、それぞれのリン酸化分子を認識できる特異的一次抗体を用いて、Western blotting法でリン酸化の程度を比較して評価した。NF-κBの活性化に関しては、膵癌細胞株の核分画の蛋白を抽出し、Gel shift assay法で評価した。(1)PAR-