hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
超臨界二酸化炭素に溶解したTBPの硝酸錯体を用いる固相からの選択的金属抽出

この結果,温度は高い方が溶解抽出速度の大きいこと,また,圧力については最適値が存在することがわかった.温度の溶解抽出速度への影響については,溶解反応の活性化エネルギーによるものと解釈される.庄力の影響に関しては,圧力上昇に伴い溶質の溶解度が上昇する効果とTBP硝酸錯体モル分率が減少する効果が拮抗するためと考えられ,圧力-組成図の極大値付近で溶解抽出速度が最大値をもつと解釈できることがわかった.2.金属の選択的超臨界流体抽出機構の解明TBP硝酸錯体を添加した超臨界二酸化炭素によって酸化ウランやランタニド酸化物から選択的に金属を回収する方法の抽出機構を解明するため,TBP硝酸錯体のTBP/HNO_3/H_2O組成比とウラン等の抽出溶解速度の関係を整理した.この結果,HNO_3/TBP比およびH_2O/TBP比が高い条件で大きな抽出溶解速度が得られることがわかった.また,TBP硝酸錯体のTBP/HNO_3/H_2O組成比の異なる試料について,^3H-NMRスペクトルを測定し、溶解速度との関係を整理したところ,逆ミセルに類似した特殊な溶液構造の存在を考慮すべきであることがわかった.さらに,超音波を印加することによって抽出速度を10倍以上向上できることを明らかにした.(1)分子シミュレーションによる超臨界二酸化炭素へのTBP硝酸錯体溶解度の推算分子シミュレーションの一つの方法であるモンテカルロ法を適用し,超臨界二酸化炭素中へのTBPおよびTBP硝酸錯体の溶解度を理論計算によって推算する方法を確立し,平成14年度までに得られた実験データとの比較を行った.この結果,超臨界二酸化炭素中とTBP等の相平衡データをギプスエネルギーモンテカルロ法によって推算し,これを溶解度に換算しなおすことによって,実験値をある程度再現できることがわかった.また,単純なレナードジョーンズポテンシャルを用いるのではなく,四重極モーメントも考慮した電気的相互作用をモンテカルロ計算に取り入れることによって,より実験値に近い超臨界流体の状態方程式を再現できることがわかった.(2)研究の取り纏め平成13年度よりの3年間の研究により,(1)ランタニド酸化物やウラン酸化物からのランタニドやウランを超臨界二酸化炭素中に溶解抽出する際の溶解抽出速度向上に及ぼす温度,圧力,TBP硝酸錯体組成,亜硝酸濃度の影響,(2)ランタニド酸化物やウラン酸化物からのランタニドやウランを超臨界二酸化炭素中に溶解抽出する際の溶解抽出速度向上に及ぼす超音波印加の効果,(3)超臨界二酸化炭素へのTBP,TBP硝酸錯体,TBPランタニド硝酸塩錯体の溶解度の相似性,(4)超臨界二酸化炭素とTBP, TBP硝酸錯体,TBPランタニド硝酸塩錯体の混合特性の統一的記述方法,(5)分子シミュレーションによる超臨界二酸化炭素へのTBP硝酸錯体溶解度の推算方法について予定していた成果がそれぞれ得られ,関連学会での発表および研究論文としての報告を行った.
幹細胞の未分化性を管理する遺伝情報制御タンパク質群のプロテオーム解析

平成18年度は、まず培養の容易なマウスES細胞を研究材料に、未分化状態とその分化過程で特異的に発現しているタンパク質のプロテオーム解析を行った。マウスES細胞はLIF(Leukemia inhibitory factor:白血病阻害因子)存在下で、未分化状態を維持しながら増殖培養することができるが、LIFを除くとES細胞は徐々に分化していく。LIF除去した後何日間で未分化性を喪失するかを確認するため、未分化マーカーのひとつとして汎用されるアルカリフォスファターゼの活性染色をしたところ、LIF除去後数日かけて徐々に分化してゆくことが確認された。そこで、LIF存在下あるいは非存在下で培養したES細胞の核と細胞質からタンパク質抽出液を調製し、2次元電気泳動で変動のあるタンパク質を質量分析により解析した。+LIFの核抽出液を緑の蛍光色素で、-LIFで7日間培養しほぼ未分化マーカーを喪失した細胞の核抽出液を赤の蛍光色素でラベルした後、混合し1枚のゲルで2次元電気泳動した。その結果、これまでに約100個の量的に変動するタンパク質を検出し、特に核画分における主要な未分化特異的因子として実際にいくつかのクロマチン関連タンパク質を見出した。ES細胞や卵子の細胞質には、体細胞ゲノムを幹細胞ゲノムへ再プログラム化し得る因子が存在することが示唆されている。ごく最近では、カエルの卵母細胞の系で、再プログラム化(脱分化)因子のひとつがDNA結合タンパク質やクロマチンを修飾する酵素であるとする結果も報告されている。このような幹細胞特異的な遺伝子発現を制御するシステム自体の解明は「幹細胞とは何か?」という本質的な問題に対する答えに直結すると思われる。タンパク質複合体で構成されるこのシステムは、プロテオーム解析によるアプローチで研究することが非常に重要であると考え、今回の解析で得られた変動タンパク質のES細胞における機能解析を進めている。
１分子イメージングを用いた揮発性麻酔薬による幼若脳神経細胞障害作用の分子機構解明

本研究では、揮発性麻酔薬による幼若脳神経細胞の障害作用の全容を解明するため、揮発性麻酔薬がどのような投与条件でラット幼若脳神経細胞の障害作用を呈するのか、またこれがニューロトロフィンの作用阻害によるものか否かを検討した。蛍光プローブを結合させたニューロトロフィン(Qdot-NGF, Qdot-BDNF)の1分子ライブセルイメージングの系を確立し、現在、揮発性麻酔薬がニューロトロフィンの細胞膜表面受容体への結合や二量体化などにどのような影響を与えるかを解析・検討中である。揮発性麻酔薬による幼若脳神経細胞の障害作用は、主にNMDA受容体阻害やGABA_A受容体賦活を介するものと考えられているが、そのメカニズムの全容は解明されておらず、最近ではNGF,BDNFなどのニューロトロフィンによる細胞内情報伝達系の関与を示唆する結果も報告されはじめている。本年はまず、ラット胎仔大脳皮質初代培養細胞を用いて揮発性麻酔薬がどのような投与条件でラット幼若脳神経細胞の障害作用を呈するのかを確認することを目的とした。ラット胎仔大脳皮質初代培養細胞の作成は研究分担者の澁田らが確立した初代脳神経細胞培養法に従って行った。妊娠16日目のウイスターラットより胎仔大脳皮質細胞を取り出し細胞を分離、8%のfetal calf血清・4%ウマ血清を含むDMEM培養液に浮遊させ、poly-L-lysineでコーティングされた培養皿に注入した。培養開始35日目に5-フルオロ-2'-デオキシウリジンを加えグリア細胞の増殖を抑え、純度95%程度の初代脳神経培養細胞を作成することに成功した。それと平行して、顕微鏡上で蛍光1分子ライブセルイメージングを行う系の構築に着手した。ところが、本実験に唯一使用可能な超低流量対応の揮発性麻酔薬の気化器(ペンロン社製シグマデルタ気化器、セボフルラン用・イソフルラン用各1台)の日本側の唯一の輸入代理店が倒産したことが判明し、入手不可能となった。平成23年12月までには別の代理店による入手が可能となる見込みとなったため、約12ヶ月の遅延を生じた。その間、次の実験段階で使用する蛍光プローブQdot-NGF,Qdot-BDNFの合成に着手することとし、収率の向上をめざしつつ生理活性の確認を行っている。本年度は本実験に不可欠な超低流量対応のペンロン社製シグマデルタ気化器が入手可能となるまでの間に、蛍光色素1分子を観察可能な全反射蛍光顕微鏡を完成させることと、気化器が入手でき次第、オリンパス社のステージインキュベーター(MI-IBC)を搭載した蛍光顕微鏡を用い、上記で作成したラット胎仔大脳皮質初代培養細胞のライブセルイメージング及びタイムラプス計測を行うことを目的とした。ステージインキュベーター上に5%CO_2を含む空気に揮発性麻酔ガス(セボフルラン,イソフルラン)を混合した気体を流し、麻酔ガス濃度は随時計測しながら目的濃度に随時titrationした。培養皿に蛍光色素FLIVO(ImmunoChemistry Technologies社製)を注入した。FLIVOは細胞透過性が高く、細胞内の活性型カスパーゼを蛍光標識する試薬であり、細胞や核がアポトーシスによる形態変化を呈するよりも早く細胞内のカスパーゼ活性化を検出できる。またFLIVOは活性型カスパーゼのみに結合,結合していないFLIVOは細胞外に排出されるため,アポトーシスに陥る過程の『プレ死細胞』細胞を高感度で特異的に検出可能である。現在、細胞を蛍光顕微鏡下にタイムラプス計測、培養神経細胞のアポトーシスが有意に上昇しはじめる揮発性麻酔ガス濃度及び暴露時間を解析しているところである。揮発性麻酔薬による幼若脳神経細胞の障害作用の全容は解明されておらず、最近ではニューロトロフィンによる細胞内情報伝達系の関与を示唆する結果も報告されはじめている。本年度は昨年度に引き続き、揮発性麻酔薬がどのような投与条件でラット幼若脳神経細胞の障害作用を呈するのかをさらに詳細に調べることと、これがニューロトロフィンの作用阻害によるものか否かを調べるため、蛍光プローブQdotを標識したニューロトロフィン(Qdot-NGF, Qdot-BDNF)の1分子ライブセルイメージングの系を確立し、揮発性麻酔薬がニューロトロフィンの細胞膜表面受容体への結合にどのような影響を与えるかを解明することを目的とした。Qdot-NGF, Qdot-BDNFの合成には成功したが、収率が低いため、収率の向上をめざしつつ、1分子ライブセルイメージングの実験・解析を行っている。蛍光色素1分子を観察可能な全反射蛍光顕微鏡(超低流量対応のペンロン社製シグマデルタ気化器とオリンパス社のステージインキュベーター

[MI-IBC]を搭載)を用い、ステージインキュベーター上に5%CO2を含む空気に揮発性麻酔ガス(セボフルラン,イソフルラン)を混合した気体を流し、麻酔ガス濃度は随時計測しながら目的濃度に随時titrationした。培養皿に蛍光色素FLIVOを注入し、アポトーシスに陥る過程の『プレ死細胞』細胞を高感度・特異的に検出できる系を用い、細胞を蛍光顕微鏡下にタイムラプス計測、培養神経細胞のアポトーシスが上昇しはじめる揮発性麻酔ガス濃度及び暴露時間を引き続き解析・検討中である。また、蛍光色素ニューロトロフィン1分子のライブセルイメージング及びタイムラプス計測も平行して行い、揮発性麻酔薬がニューロトロフィンの細胞膜への結合や二量体化などにどのような変化をもたらすかを解析している。揮発性麻酔薬による幼若脳神経細胞の障害作用の全容は解明されておらず、最近ではニューロトロフィンによる細胞内情報伝達系の関与を示唆する結果も報告されはじめている。本年は、揮発性麻酔薬がどのような投与条件でラット幼若脳神経細胞の障害作用を呈するのかをさらに詳細に調べることと、これがニューロトロフィンの作用阻害によるものか否かを調べるために、蛍光プローブQdotを標識したニューロトロフィン(Qdot-NGF, Qdot-BDNF)の1分子ライブセルイメージングの系を確立させることを目的とした。ラット胎仔大脳皮質初代培養細胞の作成は研究分担者の澁田らが確立した初代脳神経細胞培養法に従って行った。また、Qdot-NGF, Qdot-BDNFの合成に着手し、収率の向上をめざしつつ生理活性の確認を行っている。昨年度末にようやく本実験に不可欠な超低流量対応のペンロン社製シグマデルタ気化器が入手可能となり、オリンパス社のステージインキュベーター(MI-IBC)を搭載した蛍光色素1分子を観察可能な全反射蛍光顕微鏡を完成させることができた。ステージインキュベーター上に5%CO2を含む空気に揮発性麻酔ガス(セボフルラン,イソフルラン)を混合した気体を流し、麻酔ガス濃度は随時計測しながら目的濃度に随時titrationした。培養皿に蛍光色素FLIVOを注入し、アポトーシスに陥る過程の『プレ死細胞』細胞を高感度・特異的に検出できる系を用い、細胞を蛍光顕微鏡下にタイムラプス計測、培養神経細胞のアポトーシスが上昇しはじめる揮発性麻酔ガス濃度及び暴露時間を詳細に解析中である。平成22年12月、ラット胎仔大脳皮質初代培養細胞がアポトーシスに陥る揮発性麻酔薬の投与条件の検討に使用する超低流量対応の揮発性麻酔薬気化器2台(ペンロン社製シグマデルタ気化器)を発注したところ、直前に日本側の唯一の輸入代理店である木村医科器械株式会社が倒産したことが判明し、入手が突然不可能となった。平成23年12月までには別の代理店による入手が可能となる見込みとなったため、約12ヶ月の遅延を生じた。25年度が最終年度であるため、記入しない。本実験に不可欠な超低流量対応のペンロン社製シグマデルタ気化器が入手不可能な期間が約1年あったが、その間、1分子ライブセルイメージング以外の実験は概ね順調に進展している。
データ同化による複雑内部流れ場の非定常三次元流動診断技術の高度化

そこで本研究では,変分法に基づいて任意のEFD(計測)データをCFD計算に真に同化することにより,EFD(計測)で得られた実条件の影響を考慮した実流動現象の再現を可能にするEFD/CFD同化解析手法をまず定式化した.具体的には,CFD解析モデル(流れの基礎方程式)と計測データの差異を評価関数とし,拘束条件としてCFD解析モデルを設定した変分問題から導出される随伴方程式に基づいて,任意のEFD(計測)データとCFD計算との融合手法を定式化した.また,本手法の適用対象として遷音速圧縮機を取り上げ,その翼列流れにおける失速現象を支配する三次元はく離に着目して,先ずは大規模なCFD解析(DES解析およびLES解析)を行うことにより,適用対象の遷音速圧縮機翼列で発生する三次元はく離の流れ構造および非定常挙動を詳細に調べた.さらに,CFD解析に同化するためのEFDデータを収集するために,翼列流れの失速点近傍の作動点に対して感圧塗料による壁面圧力計測(PSP壁面圧力計測)を適用することにより,CFD解析との親和性に優れたEFDデータを取得するとともに,圧縮機の失速後に管路系も含めたシステム全体で発生する振動現象としてのサージ現象に着目して,高応答圧力センサによりサージ発生時の非定常圧力データを取得した.実験流体力学(EFD)と計算流体力学(CFD)との融合したEFD/CFD同化解析手法として,変分法に基づいて任意のEFDデータをCFD計算に真に同化するための融合手法を定式化するとともに,同化対象である圧縮機における失速およびサージ現象について,大規模なCFD解析から流れ場を支配するメカニズムを把握し,CFD計算に同化するためのEFDデータも実験により既に取得できている.以上から,おおむね順調な進捗が得られている.変分法に基づいたEFD/CFD同化解析手法の基本的な定式化が完了したことから,そのプログラミング化および並列化を今後進める.また,本手法の適用対象としている遷音速圧縮機について,EFD解析とCFD解析のいずれも容易でない問題としてサージ現象を取り上げ,本EFD/CFD同化解析手法を適用する準備に取りかかる.具体的には,高応答圧力センサおよび感圧塗料(PSP)を用いて得られた非定常圧力データ,ならびに感温塗料(TSP)を用いて得られた非定常温度データをCFD計算に同化することによって,サージ発生時の質量流量の時間変化を同定するとともに,圧力波の伝播過程を明らかにする.以上により,EFD解析とCFD解析の単独適用では把握することが極めて困難であったサージ発生時の非定常流れ挙動を解明する.そこで本研究では,変分法に基づいて任意のEFD(計測)データをCFD計算に真に同化することにより,EFD(計測)で得られた実条件の影響を考慮した実流動現象の再現を可能にするEFD/CFD同化解析手法をまず定式化した.具体的には,CFD解析モデル(流れの基礎方程式)と計測データの差異を評価関数とし,拘束条件としてCFD解析モデルを設定した変分問題から導出される随伴方程式に基づいて,任意のEFD(計測)データとCFD計算との融合手法を定式化した.また,本手法の適用対象として遷音速圧縮機を取り上げ,その翼列流れにおける失速現象を支配する三次元はく離に着目して,先ずは大規模なCFD解析(DES解析およびLES解析)を行うことにより,適用対象の遷音速圧縮機翼列で発生する三次元はく離の流れ構造および非定常挙動を詳細に調べた.さらに,CFD解析に同化するためのEFDデータを収集するために,翼列流れの失速点近傍の作動点に対して感圧塗料による壁面圧力計測(PSP壁面圧力計測)を適用することにより,CFD解析との親和性に優れたEFDデータを取得するとともに,圧縮機の失速後に管路系も含めたシステム全体で発生する振動現象としてのサージ現象に着目して,高応答圧力センサによりサージ発生時の非定常圧力データを取得した.実験流体力学(EFD)と計算流体力学(CFD)との融合したEFD/CFD同化解析手法として,変分法に基づいて任意のEFDデータをCFD計算に真に同化するための融合手法を定式化するとともに,同化対象である圧縮機における失速およびサージ現象について,大規模なCFD解析から流れ場を支配するメカニズムを把握し,CFD計算に同化するためのEFDデータも実験により既に取得できている.以上から,おおむね順調な進捗が得られている.変分法に基づいたEFD/CFD同化解析手法の基本的な定式化が完了したことから,そのプログラミング化および並列化を今後進める.また,本手法の適用対象としている遷音速圧縮機について,EFD解析とCFD解析のいずれも容易でない問題としてサージ現象を取り上げ,本EFD/CFD同化解析手法を適用する準備に取りかかる.具体的には,高応答圧力センサおよび感圧塗料(PSP)を用いて得られた非定常圧力データ,ならびに感温塗料(TSP)を用いて得られた非定常温度データをCFD計算に同化することによって,サージ発生時の質量流量の時間変化を同定するとともに,圧力波の伝播過程を明らかにする.以上により,EFD解析とCFD解析の単独適用では把握することが極めて困難であったサージ発生時の非定常流れ挙動を解明する.
ホヤ卵の筋分化決定因子の分子生物学的解析

原索動物ホヤのオタマジャクシ幼生の発生にともなって幼生の尾部に42個の単核で横紋をもった筋肉細胞が分化する。この分化は予め卵細胞質中に存在する筋分化決定因子によってもたらされると考えられている。この分化決定因子は、現代発生生物学的知見から推論すれば、筋肉細胞特異的構造遺伝子の転写制御因子かもしくはそれをコードする母性mRNAであろうと思われる。この分化決定因子の分子的実体を明らかにすることを目的とた本研究で、現在までに次のような成果が得られている。ユウレイボヤの未受精卵を軽く遠心すると、卵は4つの卵片(赤卵片、透明卵片、黒卵片、茶卵片)に分かれる。媒精すると有核の赤卵片のみが発生するが、発生した胚は永久胞胚となり、表皮細胞は分化するが筋肉細胞は分化しない。しかし、赤卵片に黒卵片を融合すると融合片から発生した胚では顕著な筋肉細胞分化が認められる。他の2つの無核卵片にはそのような活性はないので、この結果は筋分化決定因子が黒卵片に分画されたことを示唆する。次に、黒卵片に紫外線を照射すると赤卵片に対する筋分化誘導活性が失われる。これに有効な紫外線の波長などから失活する分子はmRNAであろうと考えられる。そこで、予め紫外線を照射した黒卵片にインタクトな黒卵片のmRNAを注入した後で赤卵片と融合すると筋分化誘導能が回復する。したがって、黒卵片中の母性mRNAが筋分化決定因子として何らかの役割を担っていると考えられる。そこで黒卵片と赤卵片のそれぞれのcDNAライブラリーを作り、デファレンシャルスクリーニングによって黒卵片特異的cDNAクローンの単離を試みたところ、現在までに3つのクローンが得られたので、現在その解析を続けている。ホヤのオタマジャクシ幼生の発生にともなって42個の筋肉細胞が分化するが、この分化は予め卵細胞質中に存在する筋分化決定因子によると考えられている。この分化決定因子の分子的実体を、特に母系mRNAに着目して解析した結果、次のようなことが明らかになった。1.ユウレイボヤの未受精卵を遠心すると、卵核をもつ赤卵片、卵核をもたない黒、茶、透明卵片の4つに分かれる。これらを媒精すると、赤卵片のみが発生して永久胞胚になり表皮細胞のみが分化する。この赤卵片に黒卵片を融合したのち媒精すると、発生した部分胚で筋分化が起こる(茶、透明卵片には筋分化誘導能はない)。いま黒卵片にUVを照射すると、この卵片のもつ筋分化誘導能が失われる。しかし、UV照射された黒卵片にインタクトな黒卵片から単離したポリ(A)^+RNAを注入すると筋分化誘導能が回復する。したがって、筋分化決定因子の少なくとも一部は母性のmRNAであると思われる。現在、赤卵片および黒卵片のそれぞれのcDNAライブラリーを作製し、サブトラクション法により黒卵片特異的cDNAクローンの単離を試みている。もしそうしたクローンが得られれば、それらの一つ一つを赤卵片に注入して筋分化誘導能があるか否かをアッセイし、筋分化誘導能をもつcDNAクローンを同定する。2.筋分化決定因子は卵割にともなって8細胞胚のB4.1割球(植物半球後側)に分配されるがa4.2割球(動物半球前側)には分配されない。B4.1割球およびa4.2割球のそれぞれのcDNAライブライーを作り、サブトラクション法によりB4.1割球特異的cDNAクローンを数個単離して解析した結果、そのうちの一つはADP/ATPトランスロケースをコードするcDNAであった。現在さらにスクリーニングを続けている。

原索動物ホヤのオタマジャクシ幼生の発生にともなって幼生の尾部に42個の単核で横紋をもった筋肉細胞が分化する。この分化は予め卵細胞質中に存在する筋分化決定因子によってもたらされると考えられている。この分化決定因子は、現代発生生物学的知見から推論すれば、筋肉細胞特異的構造遺伝子の転写制御因子かもしくはそれをコードする母性mRNAであろうと思われる。この分化決定因子の分子的実体を明らかにすることを目的とた本研究で、現在までに次のような成果が得られている。ユウレイボヤの未受精卵を軽く遠心すると、卵は4つの卵片(赤卵片、透明卵片、黒卵片、茶卵片)に分かれる。媒精すると有核の赤卵片のみが発生するが、発生した胚は永久胞胚となり、表皮細胞は分化するが筋肉細胞は分化しない。しかし、赤卵片に黒卵片を融合すると融合片から発生した胚では顕著な筋肉細胞分化が認められる。他の2つの無核卵片にはそのような活性はないので、この結果は筋分化決定因子が黒卵片に分画されたことを示唆する。次に、黒卵片に紫外線を照射すると赤卵片に対する筋分化誘導活性が失われる。これに有効な紫外線の波長などから失活する分子はmRNAであろうと考えられる。そこで、予め紫外線を照射した黒卵片にインタクトな黒卵片のmRNAを注入した後で赤卵片と融合すると筋分化誘導能が回復する。したがって、黒卵片中の母性mRNAが筋分化決定因子として何らかの役割を担っていると考えられる。そこで黒卵片と赤卵片のそれぞれのcDNAライブラリーを作り、デファレンシャルスクリーニングによって黒卵片特異的cDNAクローンの単離を試みたところ、現在までに3つのクローンが得られたので、現在その解析を続けている。
静脈弁形成を制御する力学要因の抽出と再構成アプローチによる静脈弁誘導の試み

手足の静脈に存在する弁は,血液の逆流を防ぎ心臓に血液を送り返す「静脈還流」において重要な役割を果たしている.日常的によく見られる「下肢静脈瘤」は,この弁の機能が損なわれることで生じる疾患で,国内だけでも女性を中心に1000万人を超える患者がいると言われているが,再生を伴う抜本的な治療法はない.本研究では,マイクロ流体デバイス内に形成された3次元血管内皮管腔ネットワークを利用して,静脈弁形成関連遺伝子の発現と力学刺激との関連性を明らかにするとともに,適切な力学場を再構成することで,静脈弁のin vitro誘導を試みる手足の静脈に存在する弁は,血液の逆流を防ぎ心臓に血液を送り返す「静脈還流」において重要な役割を果たしている.日常的によく見られる「下肢静脈瘤」は,この弁の機能が損なわれることで生じる疾患で,国内だけでも女性を中心に1000万人を超える患者がいると言われているが,再生を伴う抜本的な治療法はない.本研究では,マイクロ流体デバイス内に形成された3次元血管内皮管腔ネットワークを利用して,静脈弁形成関連遺伝子の発現と力学刺激との関連性を明らかにするとともに,適切な力学場を再構成することで,静脈弁のin vitro誘導を試みる
X線をもちいた核ゲノム構造の解析

染色体は細胞が分裂する際、複製された遺伝情報(DNA)を2つの娘細胞に正確に分配するために必須な構造体である。それでは、分裂期染色体はどのようにして1本の長いクロマチン繊維から折り畳まれているのだろうか?直径2nmのゲノムDNAはまず、塩基性蛋白質のヒストンに巻かれて、ヌクレオソームと呼ばれる直径約11nmの構造体になる。このヌクレオソームが折り畳まれて直径約30nmのクロマチン繊維になり、さらに折り畳まれて直径約0.7μmの分裂期染色体を作るとされている。その凝縮過程は全くの謎であり、長年に渡って生物学者たちの興味を集めてきた。古くから提唱されているモデルでは、「30nmのクロマチン繊維が、100nm、200-250nmと、らせん状の階層構造を形成しているのではないか」と予想している。この問いに答えるため、私たちは、ドイツEMBLグループと共同で、分裂期染色体のクライオ電子顕微鏡観察(CEMOVIS)をおこなった。CEMOVISは,「生きた」状態に近い細胞内微小構造を観察するためのほとんど唯一の手段である。すると驚いたことに、ヌクレオソームの直径に相当する11nmより大きな構造は、30nmクロマチン繊維も含めて検出されなかった。しかしながら、顕微鏡観察は試料中における観察範囲が限定され、内在する規則性構造の全体像を捉えることが非常に困難である。このため、私たちはSpring-8 BL45XUでX線小角散乱解析(SAXS)をおこなっている。SAXSは、計測したい非結晶試料にX線を照射し、その散乱パターンからその試料に内在する構造や規則性を知る手段である。SAXSをもちいても同様な結果が得られている。それでは、分裂期染色体はどのようにして1本の長いクロマチン繊維から折り畳まれているのだろうか?これまで、分裂期染色体の高次構造解明のために、主として電子顕微鏡を用いた構造解析がなされてきた。このため、私たちはSPring-8 BL45XUでX線小角散乱解析(SAXS)をおこなっている(播磨研究所の伊藤らと共同研究)。現在までに染色体中に、コアヒストンの幅、ヌクレオソームの直径に相当する6nmと11nmnの散乱のピークを検出したが、それ以上の大きな構造は検出できなかった。このことから私たちは、染色体内には古くからのモデルが提唱するような明確な階層構造は存在しないのではないかと考えている(投稿準備中)。さらに、播磨理研の西野らと共同で、SPring-8 BL29XULのコヒーレントX線による単一のヒト染色体のイメージングもおこなっている(CXDM)。私たちは最近、このCXDMを用いてヒト染色体の3次元電子密度マップの作製に成功した(投稿中)。
がん遺伝子産物の機能とシグナル伝達の異常

1.腫瘍におけるがん関連遺伝子の活性化.(1).脳腫瘍におけるEGFRの質的・量的活性化.我々は多形膠芽腫においては正常型EGFRのみならず,リガンド結合ドメイン内部の欠失変異を伴う異常なEGFRの遺伝子増幅がしばしば見られることを報告してきた。今回,ゲノム上の変異部位を明らかにし,またNIH3T3細胞に対してリガンド非依存性に中間的なトランスフォ-ミング活性を示すことを観察した。(2).赤芽球系白血病における膜糖タンパク・マウスCD43の異常発現フレンドマウス赤芽球症において,単クロ-ン性の造腫瘍性細胞(MEL)で活性化される遺伝子をdifferential hybridization法により調べ,ヒトCD43遺伝子に極めて類似したマウス遺伝子がDNAレベルで増幅し,RNAレベルでも異常発現することを見出した。他のMELにおいては,同遺伝子のDNA再構成による活性化が見られた。抗体を作成し,タンパク質レベルでも異常発現を確認した。予想されるタンパク質はキナ-ゼドメインをもたない膜糖タンパク質で,このタイプの遺伝子の活性化は我々の報告が初めてと思われる。2.細胞周期(減数分裂)に関与する新しいキナ-ゼの単離.細胞周期に密接に関与し,cdc2/cdc28に構造的類似性を有する新しいプロティンキナ-ゼ遺伝子を単離した。この遺伝子は精巣のパキテン期を中心とする減数分裂期の細胞に特異的に発現することが種々の解析により明らかとなり,<mak>___ーと名付けた。さらに,合成ペプチドに対する特異的な抗体の作成に成功し,約6066kDaの2種類のタンパク質が合成されることを見出した。今後,機能面の解析を推進したい。
多文化主義の所有論と時効法学・補償問題-日米の比較法的考察

今期は、最終年度であり、今までの個別的研究の継続と、本研究のまとめとに分けられる。すなわち第1に、札幌別院の強制連行犠牲者の遺骨関連の遺族探しとの関連では、その作業に当たっている韓国ソウルの強制動員犠牲者真相糾明委員会を訪ねて、担当の調査官にインタビューして、遺族探しの実情、日韓遺骨会議の状況、さらに、近く制定予定の韓国での補償法案の問題点について、議論した(06.8)。さらに、ソウル郊外の天安にある望郷の丘を訪ねて、強制連行遺骨の追悼状況を視察した。遺族の金敬洙さんに面会して遺族会の形成状況などをインタビューし、さらに、北海道フォーラムの企画として、新たに来日した李勝吉夫妻、徐廷鶴夫妻とも面会して強制連行当時の状況、遺骨放置の問題について話し合った(07.3)。さらに、同フォーラムでは、道北猿払村とも連携して、浅茅野飛行場強制連行犠牲者の遺骨発掘作業も実施し、そのプログラムにも参加した(06.8)。さらに、空知民衆史講座の30周年記念の行事として、松村高夫教授(慶応大学)と731部隊の人体実験の問題につき討論し(06.5)、さらに、地元の中国との三光作戦の戦争体験者大河原孝一氏の当時の状況についての講演会や類似のドキュメント映画『蟻の兵隊』の主人公奥村さんとの対話集会にも参加した(06.5;06.10)。さらに、韓国の済州島での強制連行・労働者による地下壕の数々を踏査して、それを中心として日韓合同による強制連行問題のシンポに出席した(06・7)。また第2に、関連問題として、アイヌ民族の補償問題について、関連企画に参加し(市民劇の実現にも努めた)(07.2)、また沖縄における基地問題と補償について検討を進めた(金武町・伊江島の調査を試みた)(06.11)。他方で第3に、アメリカの補償問題についての会議にも参加して(07.1)、彼地での議論状況(奴隷問題、ホローコースト問題、原住民問題など)の把握に努め、日本の強制連行問題や先住民族の所有権侵奪や共有財産問題などとも統合させて、研究書を刊行した。なお新たな問題として第4に、多文化主義との関連での知的所有権の収奪問題・その保護のあり方についても議論を開始した(07.1)。(I)今年度の研究は、当初の予定通り、「北海道の掘り起こし運動」の関係者のお世話になりながら、強制連行跡地を訪ね、郷土史家・元炭鉱夫の方などにインタービュー調査することが中心を占める。例えば、(1)「掘り起こし運動」のメッカでもある北見市(さらに網走市)に行き、置戸・イトムカ水銀鉱山跡、ポンモイ石切場、それが使われた美幌飛行場跡などを訪ね(2004.4)、(2)さらに、多くの連行労働者が使役された夕張炭鉱、美唄炭鉱跡及び末広墓地(2004.5)、同じ炭鉱関係では、芦別・赤平・歌志内における朝鮮人労働者の寮の跡などを視察した(2004.9)。(3)また、大量の中国人強制連行労働の犠牲者の骨が出てきた室蘭イタンキ浜に行き、郷土史家の方とともに、かつての事業所跡を見て回った(2004.4及び10)。この関係の研究会も弁護士とともに随時行ったし(2004.4)、学会でも取り上げられてシンポジウムという形で報告もした(2004.9)。さらに、(4)札幌別院で、101体の連行犠牲者の遺骨が近年出てきて、その返還などに関する法的考察を行い、判明した遺族を訪ねて韓国訪問もした(2004.5)。(II)もう一つ、この時期に行ったことは、こうした補償問題の原理的基礎研究であり、それについて論文を書き、また、国際人権法学会のシンポジウムで報告をしてまとめた。本年度は、強制連行犠牲者の遺骨問題調査の継続(これについては、根室市大徳寺の連行朝鮮人労働者の遺骨の調査(釧路のかささぎの会の方と共に行い、さらに、牧の内飛行場も視察した)(2005年8月)、さらに赤平市宝生寺の遺骨の韓国遺族への返還を行ったフォーラムに参加した(2006年2月))のほかは、別の様々な「補償問題」、とくに時効が問題となる、民族間の不法行為(a)や蓄積的・累積的損害(b)の救済を扱った。すなわち第1に、前者((a))に関しては、アイヌ民族の所有権問題(共有財産返還、観光アイヌ問題等)を扱い、釧路春採コタンの給与地の状況、厚岸のアイヌ共有財産の島ポンモシリ、阿寒の観光アイヌコタンの様子を調査し(2005年8月、10月)、成果を公表した。さらに、知的所有権の問題に関しては、オーストラリアの学者との交流(同年8月)が有益であった。また、韓国ソロクトのハンセン病施設を訪ね、現地でハンセン患者とも交流し、彼地の弁護士と補償問題について、その法的・政治的課題を検討した(同年7月)(その後、判決及び政治的解決がなされた)。また第2に、後者((b))に関しては、尼崎のアスベスト被害を調査して京大で報告し(同年11月)さらに夕張塵肺問題について共同研究者両人によるによるシンポを開催し、夕張現地視察・岩見沢労災病院の塵肺患者との集会を試みた(同年12月)。以上の成果についても随時公表している。

すなわち第1に、札幌別院の強制連行犠牲者の遺骨関連の遺族探しとの関連では、その作業に当たっている韓国ソウルの強制動員犠牲者真相糾明委員会を訪ねて、担当の調査官にインタビューして、遺族探しの実情、日韓遺骨会議の状況、さらに、近く制定予定の韓国での補償法案の問題点について、議論した(06.8)。さらに、ソウル郊外の天安にある望郷の丘を訪ねて、強制連行遺骨の追悼状況を視察した。遺族の金敬洙さんに面会して遺族会の形成状況などをインタビューし、さらに、北海道フォーラムの企画として、新たに来日した李勝吉夫妻、徐廷鶴夫妻とも面会して強制連行当時の状況、遺骨放置の問題について話し合った(07.3)。さらに、同フォーラムでは、道北猿払村とも連携して、浅茅野飛行場強制連行犠牲者の遺骨発掘作業も実施し、そのプログラムにも参加した(06.8)。さらに、空知民衆史講座の30周年記念の行事として、松村高夫教授(慶応大学)と731部隊の人体実験の問題につき討論し(06.5)、さらに、地元の中国との三光作戦の戦争体験者大河原孝一氏の当時の状況についての講演会や類似のドキュメント映画『蟻の兵隊』の主人公奥村さんとの対話集会にも参加した(06.5;06.10)。さらに、韓国の済州島での強制連行・労働者による地下壕の数々を踏査して、それを中心として日韓合同による強制連行問題のシンポに出席した(06・7)。また第2に、関連問題として、アイヌ民族の補償問題について、関連企画に参加し(市民劇の実現にも努めた)(07.2)、また沖縄における基地問題と補償について検討を進めた(金武町・伊江島の調査を試みた)(06.11)。他方で第3に、アメリカの補償問題についての会議にも参加して(07.1)、彼地での議論状況(奴隷問題、ホローコースト問題、原住民問題など)の把握に努め、日本の強制連行問題や先住民族の所有権侵奪や共有財産問題などとも統合させて、研究書を刊行した。なお新たな問題として第4に、多文化主義との関連での知的所有権の収奪問題・その保護のあり方についても議論を開始した(07.1)。
材料極表面高精度解析を目的としたイオンビーム複合分析手法の開発に関する研究

材料表面における正確な組成分析を目的に、低エネルギーイオンビームプローブを応用した高精度分析システムの構築を行った。前年度までに構築した低エネルギープロトンを利用するPIXE分析系を利用した分析を行った。本研究では,従来,深さ方向の分解能の点で他分析法に劣るPIXE分析法について,低エネルギーイオンビームを用いた場合に,その分解能をどの程度向上させることが可能かを,特性X線発生/放出過程を含んだモデルにより,評価した。照射イオンのエネルギーやビームと試料,検出器と試料の成す角度を変化させた,独自の分析手法をこのモデルより構築し,実験に応用した。これらの結果により,本装置は材料表面数nm程度の分解能を持つ非破壊的な組成分析が可能であることが示された。構築された分析システムの応用として,半導体素子であるSiCや,個人被曝線量計に用いられるRPLガラス線量計素子,及び,微粒子試料であるDCPD試料の表面近傍の元素分析を行った。RPLガラス線量計素子の分析では,試料表面近傍に存在する元素組成の偏在が,本手法により,明確に分析できた。本研究で構築している低エネルギーイオンビームを用いた分析システムは,低エネルギーのイオンが持つ特性から材料表面層に限定した解析を行うことが可能となっている。さらにDCPDの試料の分析試行では,適切な処理を施すことで,本手法が微粒子試料の表面組成分析に応用可能であることも示している。今後,本分析装置を各種の試料の分析に応用することが可能となれば,多様な分析対象の表面近傍組成を,非破壊的に解析することが可能となると考えられる。材料表面における正確な組成分析を目的に、低エネルギーイオンビームプローブを応用した高精度分析システムの構築を行った.200keVイオンビーム照射装置を基に,Si-PIN X線検出器を利用したPIXE分析系を構築した.通常5MeV程度の高エネルギーイオンビームを利用するPIXE分析法に対し,低エネルギーイオンビームを用いた場合の特性X線発生効率を評価した.照射イオンのエネルギー,照射量を変化させ,特性X線発生量を計測した.100keV近傍の低エネルギーの陽子を用いる本PIXE分析システムにおける特性X線発生効率のエネルギー依存性について詳細な実験結加果を取得した。特性X線発生効率の急激な変動から本装置が材料表面に高感度な分析が可能であることが示された.構築された分析システムを用いて対象とする微粒子試料であるDCPD試料の解析を試みた.環境中に存在する微粒子の分析はその挙動を解析する上で非常に重要となる.しかしながら既存分析装置では,その表面に着目した解析が困難であり,微粒子の挙動を決定する上で重要となる試料表面の状態について,十分な実験データが得られていない.本研究で構築している低エネルギーイオンビームを用いた分析システムは,低エネルギーのイオンが持つ特性から材料表面層に限定した解析を行うことが可能となる.本分析の試行においては,詳細な解析には当たらないが,異なる状態をもつDCPD関連試料から得られる信号の強度に違いを見出すことが可能となった.今後,微粒子材料を対象とした表面分析に合わせて照射システムを最適化し,材料表面の元素分布の計測を試験する.低エネルギーイオンビームプローブが持つ特性を活用して,材料界面状態を取得信号から評価する分析についてシステムの構築を行い,取得データを用いた考察を行う.材料表面における正確な組成分析を目的に、低エネルギーイオンビームプローブを応用した高精度分析システムの構築を行った。
分散型情報処理システムとしての情動の研究

本研究の主要テーマとして、マイクロ・コンピュータ(PC+980+NC68000)上に小規模の知識ネットワークの中核部分を作成した。本年度においては、情動の問題解決的側面に直接間係する知識は塔載できなかったが、必要不可欠な制御構造として、矛盾した知識項目間の葛藤解消過程を模擬するプロセスを実現した。これは心理学的調査によって得られた。以下の4種に要約された葛藤解消のモデルに基づいて、SMALLTAEK-80の持つ階層構造によって表現したものである。なお、本研究では葛藤を次のように新たに定義した。まず、共に達成する必要があると判断された2つ(以上)の目標が存在すると認められ(連言的目標群)、かつそれらの目標が連立不能(行動的、構造的)と判断されること[これを強葛藤と名付けた]。次に、複数個ある相互排他的(行動的、構造的)目標のうち、いずれかを達成しなければならないと判断され(選言的目標群)、かつ目標が実現されたときの評価が予測できないと判断されること[これを弱葛藤と名付けた]。この状況では、複数個の目標が設定され、目標間相互関係の判断(目標-手段、目標-下位目標の知識)が得られたのち、(1)無関係知識として、αが成功することは、βの成功・失敗とは無関係である場合。すなわち、αとβとは、共に成功することもあれば失敗することもある。(2)含意知識として、αが成功すれば必ずβが成功することになる場合。(3)前提知識として、αが失敗すれば、必ずβが失敗する、すなわち、βを成功させるためには、αを成功させなければならない。(4)排他知識として、αが成功すれば、必ずβが失敗する。
遺伝子工学的手法による酵素ー結合タンパク質複合体の生産と免疫計測の超高感度化

本研究は遺伝子組み替え技術によって酵素とプロテインAの融合タンパク質を大量に得ること、そしてこの両者の機能を有するタンパク質を用いて高感度免疫測定が可能になることを明らかにすることを目的として行った。この目的のために化学増幅活性の大きなメタピロカテカ-ゼと抗体結合能を有するプロテインAの融合タンパク質の作製を行い、得られたタンパク質を用いて酵素免疫測定を行った。その結果、以下のような研究実績を得る事ができた。1)メタピロカテカ-ゼの遺伝子とプロテインAの遺伝子を連結し、融合タンパク質の発現ベクタ-プラスミドを作製することができた。2)このプラスミドにより大腸菌を形質転換し、メタピロカテカ-ゼープロテンA融合タンパク質を菌体内で大量に産生させる事ができた。3)得られた融合タンパク質は、メタピロカテカ-ゼの酵素活性とプロテインAの結合能力を有する新規なハイブリッドタンパク質である事が示された。4)融合タンパク質は両タンパク質化学量論的に1:1の割合で結合しているため、抗原抗体反応の立体障害となりにくい事が示された。5)融合タンパク質は分子量が小さいために、免疫測定の際固相への非特異的吸着が少なく、測定の高感度化に有利である事が示された。6)モデル抗原として牛血清アルブミン(BSA)の酵素免疫測定を行ったところ、10^<ー3>から10^<ー7>g/mlの範囲で微量抗原を検出する事ができた。以上のように本研究で得られたメタピロカテカ-ゼープロテインA融合タンパク質は、酵素免疫測定用の試薬として有用である事が明らかになるとともに、高感度な免疫計測に適用できる可能性が示唆された。
低電力損失ダイヤモンドデバイスの基幹を成す表面界面制御に関する研究

炭化タングステンを電極とするダイヤモンドショットキーダイオード(SBD)界面の熱的安定性に関して、昨年度までは作製が容易な横型構造で評価を行ってきた。界面輸送機構を調べるために、今年度は縦型構造SBDを作製した。600Kでの真空熱処理を施すことにより、ダイヤモンドSBDのショットキー障壁高さが減少し、同時に理想因子が1.1.以下と理想性の高いSBDを形成することに成功した。このSBDは600K以下の温度では安定であった。また、ダイオード特性の温度依存性を調べたところ、安定化処理を施した場合でも、ショットキー障壁高さは1つの電極内で不均一であることを見出した。更に、電極界面の断面組成を調べたところ、600Kでの熱処理を施すことにより界面に金属酸化層が形成されていることを見出した。このことは、界面の金属酸化膜が熱的安定化のカギであることを示唆している。整流比が高いSBDと低いSBDに注目して、電極の界面構造を比較したところ、不良電極では界面酸化層が不均一な膜厚で形成されていることが分かった。26年度が最終年度であるため、記入しない。昨年度は、新規に設置したマイクロ波プラズマCVD装置を用いてダイヤモンドのホモエピタキシャル成長条件最適化を行った。該特別研究員の研究プロジェクトではホウ素ドープダイヤモンドを用いる必要があり、本新設装置はその結晶合成に用いる予定である。鏡面研磨されたダイヤモンド単結晶を用いて、ノンドープ単結晶合成から研究をスタートさせた。本装置は当グループが独自に開発している非市販の装置であるためか、別途利用している単結晶ダイヤモンド合成装置と最適な合成条件が異なることが分かった。これと並行して、既存のホウ素ドープダイヤモンドを用いて、ショットキーダイオード特性を評価した。目的は、過去評価を実施したことがない高温領域におけるダイオードの熱的耐性を調べることにあった。その結果、400度程度まではデバイスは安定動作することを見出した。また、高ホウ素ドープダイヤモンドをノンドープダイヤモンドで挟み込んだ構造を作り、ホウ素ドープ/ノンドープ界面のホウ素分布の急峻性について調べた。この構造はダイオードのオーミック電極側に用いることができ、パワーデバイスの特性を大きく左右するため、これを精度良く設計する事は重要である。その結果、10nm以下の急峻性を達成することに成功した。またこの評価を行う上で、SIMS分析データを1nm以下の深さ分解能に改善させる解析法をダイヤモンドに適用することに成功した。昨年度は、新設装置でホウ素ドープダイヤモンド結晶を合成し,デバイス作製から評価までの一貫したプロセス構築を行った。また、本課題の基幹となる界面安定化に関する研究を、安定化に優れた材料群を組み合わせることで、高いレベルで制御することに成功した。詳細を以下に述べる。市販されている装置では商品質ダイヤモンド結晶合成が難しく、一方でキャリヤの界面輸送にかかわる物理機構解明には高品質ダイヤモンド結晶の利用が不可欠である。そこでリスクは高いが、高品質ダイヤモンド結晶合成用装置の開発から、本プロジェクトを開始した。新設計装置は当初、順調に動作したが、次第に装置設計の不良に伴う故障が発生し、昨年度においては予期せぬ数度の装置改良を行う必要がでた。しかしながら、数度のトラブルは年度前半でほぼ解決することが出来、年度後半はデバイスプロセスと物性評価に移行できた。この高品質結晶に対して耐熱性と機械的強度に優れた炭化タングステンを電極金属に用いてダイヤモンドショットキーダイオードを作製し、耐熱特性を詳細に調べた。その結果、金属蒸着直後に比べて、真空中での600K熱処理によりダイオード特性が改善すること、及びショットキー障壁高さが低下することを見出した。一方で, 700K以上ではダイオード特性劣化することが分かった。更に、高温でのキャリヤ輸送機構を評価するためには寄生抵抗を下げる必要があり、縦型デバイス構造を採用することで、この問題を解決できる見通しを立てた。新設のダイヤモンド合成装置で、高品質結晶を得るための条件が得られたこと、またデバイス評価手法を特別研究員自身が習得したこと、さらにデバイス高性能化において鍵となるノンドープ/ホウ素ドープ界面を急峻にする手法および評価法を確立できたことが、その理由として挙げられる。

採用した炭化タングステン電極が高温特性に優れる事、及び安定動作温度領域を見極める事が出来た。これらは高温動作時の界面輸送特性評価に不可欠な要素である。また、界面作製プロセスを構築できた事から、ダイヤモンド表面終端種依存性等、様々な比較を今後行うための準備が整ったと評価できる。加えて、その一部を昨年度中に実施できたことが、その理由として挙げられる。次年度以降は、新設合成装置でホウ素ドープ結晶を合成し、デバイス作製から一貫したプロセス構築を行う。併せて、当初から予定している絶縁膜との界面作製および評価を開始できればと考えている。次年度が最終年度であるため、構築したデバイス作製プロセスを駆使し、高温特性や高耐圧特性等、様々な界面評価を順次実施することを計画している。
ヒルシュスプルング病の神経堤幹細胞移植治療に必要とされるニッチ因子の研究

P0-Cre/CAG-CAT-EGFPマウスを用い神経堤幹細胞を含む細胞群を濃縮するシステムを確立した。ヒルシュスプルング病のモデルRet^<[-/-]>マウス胚腸管への神経様体(NLB)共培養を行いGFP・神経核マーカーPGP9.5の二重陽性細胞浸潤する様子を確認した。GFP陽性細胞から無血清浮遊培養でNLB形成に成功。10%血清存在下で神経・グリア・平滑筋の3系統の細胞への分化誘導可能を確認した。ヒルシュスプルング病(以下本症)とは、新生児期腹部膨満を主訴とする疾患で、その本態は消化管の神経節細胞の欠如である。腸管神経細胞は神経堤幹細胞(NCSCs:Neural crest stem cells)から分化することが知られている。NCSCsは自己増殖しsphereと呼ばれる細胞塊を形成する。我々は分離直後の神経堤幹細胞及びsphereを用いることで腸管疾患への移植治療の可能性を検討している。[本研究で明らかにしたい点](1)移植するsphereがどれだけ神経堤幹細胞の供給元として有効であるかを評価する。(2)腸管神経を欠失した本症モデルマウス腸管への器官培養条件における神経堤幹細胞の移植を行い移植による神経節再生を確認する。[結果(1)]P0-Creマウス腸由来GFP陽性細胞が神経堤幹細胞であることを証明するためsphereを10%血清含有ホルモン培地下で接着培養することで分化誘導を行い、抗Tuj1(神経)、GEAP(グリア)、SMA(平滑筋)による免疫組織学的染色により多分化能を有することを示した。P0-Creマウス腸由来sphereにおいて神経堤幹細胞マーカーであるNestin, p75, Sox10, Musashi-1タンパク質が発現していることを免疫組織学的染色により確認した。[結果(2)]ニッチ由来神経栄養因子受容体であるRetを欠損することで腸管神経細胞が消失したRet^<-/->胎仔より清潔下に腸管を摘出、器官培養を行った。P0-Creマウス腸由来GFP陽性細胞(神経堤由来細胞)をモデルマウス胎仔腸壁へと移植した。Ret腸管断端にsphereを接着させ5日間の培養後、抗PGP9.5(神経核)、抗GFP抗体による免疫組織学的染色及びHoechstによる核染色を用いて組織学的検討を行ったところ、無神経節腸管における移植神経堤幹細胞の生着、増殖、神経へ分化する様子が観察された。腸管神経細胞は神経堤幹細胞(NCSCs : Neural crest stem cells)から分化することが知られている。[結果(1)]PO-Creマウス腸由来GFP陽性細胞が神経堤幹細胞であることを証明するためsphereを10%血清含有ホルモン培地下で接着培養することで分化誘導を行い、抗Tuj1(神経)、GFAP(グリア)、SMA(平滑筋)による免疫組織学的染色により多分化能を有することを示した。PO-Creマウス腸由来sphereにおいて神経堤幹細胞マーカーであるNestin,p75,Sox10,Musashi-1タンパク質が発現していることを免疫組織学的染色により確認した。本年度はPO-Creマウス腸由来GFP陽性細胞(神経堤由来細胞)をモデルマウス胎仔腸壁へと移植した。