hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
高機能自閉症における倫理的課題処理時の脳活動の機能的MRIによる研究

自閉症には脳の器質的障害があり、「心の理論」、実行機能、中枢統合機能などの機能不全が生じ社会性の障害、コミュニケーションの障害、想像力の障害の3徴候を示すと推測されている。このことから、社会のルール、特に明文化されない暗黙の了解、道徳的、倫理的事柄の把握が困難である。さらに、学校生活での問題行動や日常生活においての様々なトラブル、触法行為を起こしてしまうことも報告されている。本研究では自閉症児に見られるこのような問題行動と脳機能の関係を明らかにするために、倫理・道徳的場面を画像として課題負荷し、良い、悪いの判断を求め、その情報処理の過程の脳活動をfMRIを用いて測定した。対照は無意味図形とした。刺激は課題負荷45秒-コントロール課題45秒を2回、1シリーズ3分の構成のbox-carデザインで行い、判断できた合図は右手でスイッチを押させた。対象は高機能自閉症男児7名(1117歳)と健常男児3名(13歳)、健常成人7名、非自閉症のてんかん、Sotos症候群各1例の計19名である。検査に際しては保護者及び被験者に十分に説明し納得と同意を得た。健常者では側頭・後頭境界部側頭葉中部(左>右)、左右前頭葉背外側および前内側に活動性の亢進が見られた。高機能自閉症では前頭葉背腹(左<右)、前頭葉全部内側、頭頂葉側頭・後頭境界部側頭葉前部(左<右)に活性が見られた。その他、左中心前回、右前頭葉腹側および正中部に活性が見られた。自閉症と健常児の間では課題の正答率に差はなかった。課題の正答率に差がなかったがこれは課題内容が簡単であったことが想定されるが、実際の場面とこのような課題負荷では情動の影響が異なっていること、自閉症ではいかに行動すべきか解っているが実際に採るべき行動が採れない解離現象があることから、差が出なかったとも考えられる。fMRIの結果から自閉症では課題処理の系が健常者と異なることが想定されるが、さらに例数を増やし、課題の工夫をして検討することが必要である。自閉症は根底には脳の器質的障害があり、「心の理論」、実行機能、中枢統合機能などの機能不全が生じ社会性の障害、コミュニケーションの障害、想像力の障害の3徴候を示すと推測されている。さらに、こだわり、興味の偏り、因果関係のつかみにくさから学校生活での問題行動や日常生活においての様々なトラブル、触法行為を起こしてしまうことも報告されている。本研究では自閉症児に見られるこのような問題行動と脳機能の関係を明らかにするために、倫理・道徳的問題行動の場面を画像として課題負荷し、良い、悪いの判断を求め、その情報処理の過程の脳活動をfMRIを用いて測定した。対象は高機能自閉症男児4名(1214歳)と健常男児3名(13歳)の計7名である。

高機能自閉症児のうち2名は体動のアーチファクトのため結果から除外した。健常者では左右側頭・後頭境界部、左中心前回、前頭葉腹側(左または右)に活動性の亢進が見られた。また、1例では左側頭極にも活性が見られた。高機能自閉症の1例では左中心前回、左中心後回、左運動前野、右頭頂葉、右角回、側頭・後頭境界部(左<右)に活性が見られたが、前頭葉腹側の活性は認められなかった。他の例では左中心前回、左中心後回、左運動前野、左頭頂葉、左右後頭部外側、前頭葉腹側正中部に活性が見られた。自閉症と健常児の間では課題の正答率に差はなかった。課題の正答率に差がなかったがこれは課題内容が簡単であったことが想定されるが、実際の場面では情動負荷があることが多いことから、そのような負荷がかかっていないので差が出なかったとも考えられる。fMRIの結果から自閉症では課題処理の系が健常者と異なることが想定されるが、さらに例数を増やして検討することが必要である。自閉症は根底には脳の器質的障害があり、「心の理論」、実行機能、中枢統合機能などの機能不全が生じ社会性の障害、コミュニケーションの障害、想像力の障害の3徴候を示すと推測されている。このことから、社会のルール、特に明文化されない暗黙の了解、道徳的、倫理的事柄の把握が困難である。さらに、こだわり、興味の偏り、因果関係のつかみにくさから学校生活での問題行動や日常生活においての様々なトラブル、触法行為を起こしてしまうことも報告されている。本研究では自閉症児に見られるこのような問題行動と脳機能の関係を明らかにするために、倫理・道徳的場面を文章として課題負荷し、良い、悪いの判断を求め、その情報処理の過程の脳活動をfMRIを用いて測定した。対照は事実文とした。刺激は課題負荷45秒-コントロール課題45秒を2回、1シリーズ3分の構成のbox-carデザインで行い、判断できた合図は右手でスイッチを押させた。対象は高機能自閉症男児4名(1214歳)と健常男児3名(13歳)、健常成人1名の計8名である。検査に際しては保護者及び被験者に十分に説明し納得と同意を得た。健常者では側頭・後頭境界部側頭葉中部(左>右)、左右前頭葉背外側および前内側に活動性の亢進が見られた。高機能自閉症では前頭葉背腹(左<右)、頭頂葉側頭・後頭境界部側頭葉前部(左<右)に活性が見られた。その他、左中心前回、右前頭葉腹側および正中部に活性が見られた。課題の正答率に差がなかったがこれは課題内容が簡単であったことが想定されるが、実際の場面とこのような課題負荷では情動の影響が異なっていること、自閉症ではいかに行動すべきかは解っているが実際に採るべき行動が採れない解離現象があることから、差が出なかったとも考えられる。自閉症には脳の器質的障害があり、「心の理論」、実行機能、中枢統合機能などの機能不全が生じ社会性の障害、コミュニケーションの障害、想像力の障害の3徴候を示すと推測されている。さらに、学校生活での問題行動や日常生活においての様々なトラブル、触法行為を起こしてしまうことも報告されている。
光学活性ステロイド類のエナンチオ選択的合成法の開発と安定同位体標識体合成への応用

合成ステロイド剤のC/D環を合成素子とし,光学活性な副腎ステロイドホルモンを再構築する方法を検討した.本法をステロイドホルモンの代謝・体内動態研究に必要となるprednisolone,cortisolとcortisoneおよび6β-水酸化代謝物の安定同位体標識体の合成に適用した.合成ステロイド剤のC/D環を合成素子とし,光学活性な副腎ステロイドホルモンを再構築する方法を検討した.本法をステロイドホルモンの代謝・体内動態研究に必要となるprednisolone,cortisolとcortisoneおよび6β-水酸化代謝物の安定同位体標識体の合成に適用した.ヒトにおけるステロイドホルモン代謝・体内動態研究のために,生物学的内標準物質(トレーサー)と質量分析の内標準物質となるcortisol,cortisone及びその6β-水酸化体の安定同位体標識体の合成を行った.1.prednisoneの17位ジヒドロキシアセトン側鎖のBMD化,Birch還元,オゾン酸化を行いindanonepropionic acidを合成した.次に,[1,3-^<13>C_2,1,1,1,3,3,3-^2H_6]acetoneから導かれたisopropenylanionをindanonepropionic acidに求核付加反応させた後,分子内環化反応,オゾン酸化,アルドール縮合反応を経て[1,2,4,19-^<13>C_4,1,1,19,19,19-^2H_5]cortisoneを合成した.また,[1,2,4,19-^<13>C_4,1,1,19,19,19-^2H_5]cortisol(96.7atom%)は11位のNaBH_4還元により得た.ヒトにおけるステロイド代謝・体内動態研究に用いられるcortisol、6β-hydroxycortisol及びprednisoloneの安定同位体標識体の合成法を検討した。1.prednisoneの17位ジヒドロキシアセトン側鎖のBMD化、Birch還元、オゾン酸化を行いindanonepropionic acidを合成した。次に[1,1,1,3,3,3-^2H_6]acetoneから導かれたisopropenylanionをindanonepropionic acidに求核付加反応させた後、分子内環化反応、オゾン酸化、アルドール縮合反応を経て[1,1,19,19,19-^2H_5]cortisoneを合成した。さらに、1,2位に二重結合の導入、11位のNaBH_4還元、脱保護を経て[1,1,19,19,19-^2H_5]prednisoloneを得た。今後、[1,3-^<13>C_2]acetoneを標識原料として用い、[1,2,4,19-^<13>C_4]prednisoloneを合成する予定である。3.indan法によるdexamethasone,betamethasone,triamcinoloneの一般合成法については、検討中である。ヒトにおけるステロイドホルモンの代謝・体内動態研究に必要となる,合成ステロイド剤prednisoloneおよびcortisolとcortisoneの6β-水酸化代謝物の安定同位体標識体の合成を行った.一方,9位にフッ素F原子を有するdexamethasone, betamethasoneの場合,合成ステロイド薬の再構築に必要となるindanonepropionic acidの収率はいずれも極めて低く,再検討する必要がある.
リンパ節premetastatic niche形成を制御するプロスタノイドの役割

肺癌リンパ節転移モデルでの検討から、原発巣の増殖に伴い、所属リンパ節でごく早期からCOX-2が誘導され、COX-2由来のPGE2がEP3刺激することによりケモカインであるstromal cell derived factor (SDF)-1の発現がsubcapsular regionで増大しpremetastatic nicheを形成することを明らかとした。さらにCOX-2陽性の樹状細胞がSDF-1を産生するとともに、EP3依存性にTGF-βを産生することでregulatory Tcell (Tregs)を動員することによって免疫寛容が生じ、腫瘍転移を増強させることを証明した。がんのリンパ行性転移は血管と同様に間質ストローマさらには腫瘍にリンパ管が新生し、それへ腫瘍細胞が移行するとの見方が重要視されてきており、VEGF-C/D-VEGFR-3を基盤とするシグナル伝達経路が腫瘍に随伴するリンパ管新生においても極めて重要であることが示唆されている。我々はこれまでにプロスタグランジン(PG)がリンパ管新生の制御に役割を果たすことを報告してきている。一方、がんの血行性転移では、あらかじめがん細胞が転移しやすい環境“premetastatic niche"を構築しそこにがん細胞が転移巣を形成することが分かってきているが、リンパ節において同様のpremetastatic nicheが成立するかについては知見が乏しいことから、申請者はPGがpremetastatic niche形成に役割を持ち、実際に転移を制御しているかについて検討を行うこととした。これまでにLewis Lung Carcinoma (LLC)細胞を用いた皮下接種モデルでの検討では、腫瘍およびストローマ組織に多くリンパ管が新生してくることが確認され、さらにこの新生リンパ管はCOX-2阻害薬celecoxibの投与により有意に抑制されることを明らかとしていたが、さらにトロンボキサン受容体(TP)ノックアウトマウスに接種した腫瘍リンパ管染色像を野生型と比較した結果明らかな減少が観察され、腫瘍リンパ管新生にトロンボキサン受容体シグナリングが関与していることが明らかとなった。加えて大腸癌細胞移植による腸間膜リンパ節転移モデルでも検討を開始している。また、LLC皮下接種モデルに加えて腫瘍リンパ新生をミミックするマトリゲルモデルや創傷治癒モデル、腹膜炎モデル等を用いて炎症性肉芽組織に集族する細胞群を免疫組織化学的手法等を用いて検討したところ線維芽細胞の増加やマクロファージ、好中球、T細胞の集族が観察された。また、経時的に間質構成細胞とVEGF-C/VEGF-Dとの2重染色を行い、リンパ管新生の司令塔細胞を特定するため検討を続けている。一方、がんの血行性転移では、あらかじめがん細胞が転移しやすい環境“premetastatic niche"を構築しそこにがん細胞が転移巣を形成することが分かってきているが、リンパ節において同様のpremetastatic nicheが成立するかについては知見が乏しいことから、申請者はPGがpremetastatic niche形成に役割を持ち、実際に転移を制御しているかについて検討を行った。これまでにLewis Lung Carcinoma (LLC)細胞を用いた皮下接種モデルでの検討では、腫瘍およびストローマ組織に多くリンパ管が新生してくることが確認され、さらにこの新生リンパ管はCOX-2阻害薬celecoxibの投与により有意に抑制されることを明らかとしていたが、さらにLewis Lung Carcinoma (LLC)細胞を用いた肺癌リンパ節転移モデルでの検討では、縦隔リンパ節への転移がCOX-2阻害薬の投与により抑制され、さらにCD11c陽性樹状細胞及び樹状細胞の代謝産物であるIDOの発現やリンパ節内の樹状細胞でのSDF-1の発現が有意に抑制されたことから、COX-2由来のPGE2が樹状細胞を介しケモカインの分泌を促進する事で腫瘍細胞を縦隔リンパ節に誘導することでPremetastatic nicheを形成しリンパ節転移を促進することが推測された。薬理学一般当初の予定通り、腫瘍増殖を経時的に調べ、腫瘍及び間質ストローマにおけるリンパ管の新生をを免疫組織化学的に評価するとともに既存のリンパ管新生因子(VEGF-C, VEGF-D, FGF, EGF等)の発現についても免疫組織化学、real time PCR等で経時的に検討した。加えて炎症性肉芽組織に集族する細胞群の評価も行った。これらの評価はすでにPG受容体ノックアウトマウスを用いての検討も進めている。今後は、転移前のリンパ節に集族する細胞について詳細な検討を進めていく予定である。現在進めている皮下接種モデルによる検討により、集族する細胞の機能的役割とPG受容体シグナルの関係を詳しく検証していく。

また、すでに腸癌細胞移植による腸間膜リンパ節転移モデルでの検討を開始しているが得られるデータの精度をさらに高めていく必要があり、手技の安定をはかり詳細な検討を進めていく予定である。次年度の研究遂行に向けて予算を繰り越した。実験動物の購入および飼育費用と一般試薬、抗体の購入に使用する。
大気化学・散逸計算によるハビタブル惑星の水量進化の解明

昨今、地球のように海を湛え生命を育む惑星(ハビタブル惑星)の発見への期待が高まっている。いっとき液体の水を保持する惑星として誕生した天体でも、形成以後の進化過程によっては容易にそのハビタビリティを喪失してしまう。惑星表層の水は大気中で水素と酸素に光解離し、軽い水素は上層大気へ輸送され宇宙空間へ流出していく。本研究の目的は、地球型惑星の水量進化を解明し、ハビタブル惑星の表層環境が長期間維持される条件を解明することである。当該領域が推進する銀河進化・星惑星形成の理論研究・観測と連携することで、銀河系における場所・時間の関数としてのハビタブル惑星の存在確率の解明に貢献する。
胃癌におけるクロマチンリモデリング因子異常とそれら諸因子の機能の解明

胃癌の発癌、進行にクロマチンリモデリング因子がどのように関与しているかを明らかにするため、手術材料で発現状態を検索し、臨床病理学的因子との比較を行った。468例の胃癌、47例の胃腺腫を免疫組織化学的に検索した結果、癌の進行と共にARID1A, 1B, 2の発現が低下することが分かった。特にARID1Aが臨床病理学的因子と強く関連していた。他のクロマチンリモデリング因子もほぼ同様の傾向であった。これまで突然変異がARID1Aの低下の原因とされていたが、今回、培養細胞での研究でARIDの発現がDNAメチル化の影響を受けていることが示唆された。胃癌の進行度、脈管侵襲との関連が多くの因子で見出され、いずれの因子も腫瘍抑制的な作用が示唆された。hMLH1発現低下はMSI形質を示唆するが、MLH1発現低下と諸クロマチンリモデリング因子発現低下が関連していた。p53蛋白の発現状態との関連は無かった。EBウイルス感染との関連はARID1Aのみであった。クロマチンリモデリング因子発現低下の相互の関連もあり、共通する発現低下機構があることが推察された。培養細胞系では、胃癌細胞株MKN1, 7, 45, 74, NUGC3, AGSについて、ARID1A, 1B, 2の発現状態を検索した。MKN74のARID1A, 2発現が多いほか、その他の細胞でも様々レベルの発現を確認した。メチル化状態がARIDの発現に関連している可能性を探るために、5-Aza-dC処理後の各細胞、各ARIDの発現を検索した。5-Aza-dC処理後にARIDの発現が増加することがわかり、メチル化状態の関与が示唆された。siRNAによるARIDの発現抑制の条件を検討して、それぞれの細胞の至適濃度を決定した。600例の胃癌のティシューアレイを構築し、クロマチンリモデリング因子の構成要素のうち、ARID1A, ARID1B, ARID2の発現と胃癌の進展の関連を明らかにし、論文として発表した。良性腫瘍である胃腺腫でのARIDの発現解析結果は興味深く、胃癌と非腫瘍組織との中間的な発現状態であった。癌の中でも深達度に対応して、3つのARIDの異常が増える傾向が明らかになった。3つのARIDの異常は相互に関連があり、それらに共通するメカニズムが想定された。3つのARIDの異常はいずれもhMLH1発現低下との関連があり、MSIとの関連が示唆された。p53蛋白の発現異常との関連は見られなかった。培養系での実験で5Azaによる脱メチル化後、ARIDの発現が増え、ARIDの発現異常にメチル化も関与していることが示唆された。引き続き、胃癌でのSMARCC1, PB1, BRG1の発現の意義をまとめている。各種癌で他のSWI/SNFファミリー遺伝子変異の報告は少ないことから、現在、対象を他のクロマチン関連蛋白に広げて、検索を進めている。また、培養細胞系では、ARID1A/1B/2のsiRNAによる抑制が増殖率、浸潤能にもたらす影響を検討したが、これまでのところ、有意な違いは得られていない。5Azaによる脱メチル化がもたらす影響は、細胞傷害も加わっており、発現以外の変化を得るには至っていない。胃癌検体を用いた組織研究では、免疫組織化学的検索を順次進めており、着実に結果を得ている。一方で、培養細胞系での研究はARIDの遺伝子を抑制するところは終えているが、その結果引き起こされる影響の解析を慎重に進めている。これまでのところ、影響が明らかでないが、手技による偽陰性である可能性を含め、再検討を行っている。胃癌や他の癌でも報告があるARIDを中心に検索を進めた。850例の胃癌ティシューアレイの検索の結果。ARID1Aの低下は20%、ARID1Bは10%、ARID2は15%であり、胃腺腫でも胃癌ほどではないが、低下していた。胃癌の中でも進行に伴う発現低下がみられた。腸上皮化生や胃炎ではARIDの発現低下は見られなかった。さらに、予後との比較を行ったが、ARID1Aは予後と有意な関連が見られたが、ARID1B, 2は予後と関連は明らかではなかった。他のクロマチンリモデリング因子では、BRG1, PB1, SMARCC1, MLLを検索し、いずれも胃癌での発現低下が見られたが、癌の進行との関係は明らかではなかった。ARIDにくらべると、発現低下の割合が少なく、発癌や進行への関与は小さいと考えられた。hMLH1, p53に続いて、新たにmiR-21との発現を検索したが、関連はなかった。EBV感染との関連は終了していたが、さらにMUC2, 5AC, 6をマーカーとした粘液形質との関連を検索した。胃癌と同様に進行度を分類しやすい、膀胱癌での検索を追加したが、同様に進行にともなう低下傾向を認めた。

培養細胞ではsiRNAによる発現抑制を用いて、胃癌細胞株AGS, MKN74, NUGC3, MKN7の変化を観察した。ARIDの発現を低下させることで、96時間までの観察では、増殖率、アポトーシス、浸潤能、移動能の変化は明らかでなかった。5AzaCによる脱メチル化によって、ARIDの発現が増加し、ARIDの発現コントロールにメチル化が関係していると考えられた。脱メチル化による細胞増殖などの変化は明らかではなかった。胃癌の発癌、進行にクロマチンリモデリング因子がどのように関与しているかを明らかにするため、手術材料で発現状態を検索し、臨床病理学的因子との比較を行った。468例の胃癌、47例の胃腺腫を免疫組織化学的に検索した結果、癌の進行と共にARID1A, 1B, 2の発現が低下することが分かった。特にARID1Aが臨床病理学的因子と強く関連していた。他のクロマチンリモデリング因子もほぼ同様の傾向であった。これまで突然変異がARID1Aの低下の原因とされていたが、今回、培養細胞での研究でARIDの発現がDNAメチル化の影響を受けていることが示唆された。組織標本での検索は6つの因子について終了しており、順次、因子を追加しているところである。培養細胞系での発現状態、次年度のための条件検討も順調に進んでいる。本課題の開始時の計画に変更は無い。組織研究は引き続き、クロマチン関連蛋白を検索し、これまでに得られたクロマチンリモデリング因子の結果と比較することで、胃癌発癌・進展における役割を明らかにしていく。また、培養系での機能解析も最終年度として結果を得られるよう、注意深く進める。消化管、癌組織研究では、検索するクロマチンリモデリング因子を増やし、ヒストン修飾酵素に関しても検討する。胃癌で関連の見られた因子については、腺腫や前癌病変でも発現を調べて、その臨床病理学的意義を明らかにしていく。培養細胞系では、siRNAによる実験系を利用して、それぞれの因子の機能を明らかにしていく。また5-Aza-dC処理によって発現増加が見られたことから、プロモータ域のメチル化状態を検索する。諸因子の中でARID1Aが比較的つよい腫瘍抑制効果を有すると考えられるため、その結合部位について、培養細胞を利用して検索を進める。論文発表に向けて、これまで得られた結果の見直し、再検討を行っていたため、組織研究の進行が少し遅れた。利用する抗体の選定が少し遅れ、抗体の発注が一部、次年度になった。検索に使用する抗体は選別が進んでおり、早期に発注して、研究を進める予定である。次年度予算とともに、速やかに抗体を発注する。その他は予定通りに研究計画を遂行する。
低出生体重児のストレス反応関連遺伝子DNAメチル化の複合的変化と精神行動発達

低出生体重児では注意欠如多動症(ADHD)や自閉スペクトラム症(ASD)などの発達障害に類似した特異的な行動発達を高率に認めるといわれる。その原因はいまだ不明だが、子宮内、新生児期の高度なストレスによるエピジェネティクスの関与も疑われる。ストレス反応には、ヒトGR遺伝子(NR3C1)のほかに、コルチゾール不活化酵素である11β- hydroxysteroid dehydrogenase 2遺伝子(11βHSD2)、セロトニントランスポーター遺伝子(SLC6A4)などが関与していることが知られている。本研究では、この3つのストレス反応関連遺伝子のメチル化解析を行うことを目的とした。平成30年度も前年度に引き続き、1)先行研究「低出生体重児のストレス反応とGR遺伝子DNAメチル化解析」で使用した残余の保存試料を本研究に使用すること、2)研究者の研究グループで運用している「NICU入院児の検体保存バンク」の試料を用いること、3)妊娠経過、在胎期間、出生体重の周産期情報、NICU入院期間中にみられる合併症、治療についての臨床情報を用いることについて、対象の選択と同意取得を行った。先行研究の保存試料のうち17名から本研究での使用の新たな同意を得た。新たな対象については「NICU入院児の検体保存バンク」での試料保存している8名から同意を得た。メチル化測定にむけ11βHSD2の解析領域候補の遺伝子情報から、11βHSD2 promotor, exon 1およびexon 5領域CpGを解析部位としてプライマー設計を行った。対象となる25名の周産期・新生児情報を後方視的に診療録から取得し、データベースを作成した。研究対象の臍帯血、本人血液を用いた臨床研究は本研究の他にも実施されている。そのため、新生児である対象の負担を減らし、効率よく試料を用いるため「NICU入院児の検体バンク」を設立し、そこに保管された試料を用いて研究を行うこととした。現在「検体バンク」には対象に該当する20名の試料が収集・保管されているが、本研究での試料の使用について同意を得られたのは8名であった。NR3C1、11βHSD2のDNAメチル化率測定は目標対象数30名に達した時点で同時解析を行う必要があるため解析に至らなかった。先行研究の保存試料の使用の同意取得は終了した。新規症例の目標対象数まで同意取得を継続し、平行して試料の採取と保存を継続する。解析数が30検体以上に達した時点で、臍帯血およびNICU退院時血液のそれぞれについてNR3C1、11βHSD2の各CpGサイトのメチル化率を測定する。データベースに登録した対象の在胎期間、出生体重、NICU入院中の合併症や治療などのライフイベントと3つの遺伝子のCpG各サイトのDNAメチル化率の関係について統計学的手法を用いて検討する。低出生体重児では注意欠如多動症(ADHD)や自閉スペクトラム症(ASD)に類似した行動発達の障害を高率に認める。ヒトのストレス反応には、グルココルチコイドレセプター(GR)遺伝子(NR3C1)のほかに、コルチゾール不活化酵素である11β- hydroxysteroid dehydrogenase 2遺伝子(11βHSD2)、セロトニントランスポーター遺伝子(SLC6A4)などが関与していることが知られている。平成29年度は、1)先行研究「低出生体重児のストレス反応とGR遺伝子DNAメチル化解析」で使用した残余の保存試料を本研究に使用すること(対象数26名)、2)研究機関で運用している「NICU入院児の検体バンク」の試料を用いること(目標対象数30名)、3)妊娠経過、在胎期間、出生体重の周産期情報、NICU入院期間中にみられる合併症、治療についての臨床情報を用いることについて、研究機関の倫理委員会の審査をへて承認をうけた。先行研究の保存試料のうち2名から本研究での使用の同意を得た。新たな対象については「NICU入院児の検体バンク」での試料保存を継続している。検体バンクでは、全血からリンパ球芽球を培養し保管することでより多くのDNAを抽出・保存することができている。また、次年度以降のメチル化測定にむけ、11βHSD2、SLC6A4の測定領域候補の遺伝子情報を解析し、11βHSD2 promotor, exon 1およびexon 5領域CpG、SLC6A4 promoterexon1領域CpGを解析部位としてプライマー設計を行った。研究の対象は、研究機関で出生しNICUに入院する在胎33週未満または出生体重1500g未満の児であるが、同対象の臍帯血、本人血液を用いた、そのほかの臨床研究も計画・実施されている。そのため、新生児である対象の負担を減らし、効率よく試料を用いるため「NICU入院児の検体バンク」を先に立ち上げ、倫理審査をうけ承認を受けた。その承認後に本研究の実施について倫理審査をうけたため、本研究の開始がやや遅れる結果となった。「NICU入院児の検体バンク」には10名の対象の試料が保管されており、今後本研究での使用について同意を得て研究に用いていく予定である。

低出生体重児では注意欠如多動症(ADHD)や自閉スペクトラム症(ASD)などの発達障害に類似した特異的な行動発達を高率に認めるといわれる。その原因はいまだ不明だが、子宮内、新生児期の高度なストレスによるエピジェネティクスの関与も疑われる。ストレス反応には、ヒトGR遺伝子(NR3C1)のほかに、コルチゾール不活化酵素である11β- hydroxysteroid dehydrogenase 2遺伝子(11βHSD2)、セロトニントランスポーター遺伝子(SLC6A4)などが関与していることが知られている。本研究では、この3つのストレス反応関連遺伝子のメチル化解析を行うことを目的とした。平成30年度も前年度に引き続き、1)先行研究「低出生体重児のストレス反応とGR遺伝子DNAメチル化解析」で使用した残余の保存試料を本研究に使用すること、2)研究者の研究グループで運用している「NICU入院児の検体保存バンク」の試料を用いること、3)妊娠経過、在胎期間、出生体重の周産期情報、NICU入院期間中にみられる合併症、治療についての臨床情報を用いることについて、対象の選択と同意取得を行った。先行研究の保存試料のうち17名から本研究での使用の新たな同意を得た。新たな対象については「NICU入院児の検体保存バンク」での試料保存している8名から同意を得た。メチル化測定にむけ11βHSD2の解析領域候補の遺伝子情報から、11βHSD2 promotor, exon 1およびexon 5領域CpGを解析部位としてプライマー設計を行った。対象となる25名の周産期・新生児情報を後方視的に診療録から取得し、データベースを作成した。研究対象の臍帯血、本人血液を用いた臨床研究は本研究の他にも実施されている。そのため、新生児である対象の負担を減らし、効率よく試料を用いるため「NICU入院児の検体バンク」を設立し、そこに保管された試料を用いて研究を行うこととした。現在「検体バンク」には対象に該当する20名の試料が収集・保管されているが、本研究での試料の使用について同意を得られたのは8名であった。NR3C1、11βHSD2のDNAメチル化率測定は目標対象数30名に達した時点で同時解析を行う必要があるため解析に至らなかった。引き続き同意を得た上で、新規症例の目標対象数まで試料の採取と保存を継続する。先行研究の保存試料の使用については、外来診療時に保護者に説明し同意を得る。NR3C1、11βHSD2、SLC6A4のDNAメチル化率測定のためのプライマーを作成する。解析対象数が20例に達した時点で、1回目のメチル化測定を行う。臍帯血およびNICU退院後血液のそれぞれについてNR3C1、11βHSD2、SLC6A4の各CpGサイトのメチル化率を測定する。測定した対象の在胎期間、出生体重、NICU入院中の合併症や治療などのライフイベントと3つの遺伝子のCpG各サイトのDNAメチル化率の関係について統計学的手法を用いて検討する。先行研究の保存試料の使用の同意取得は終了した。新規症例の目標対象数まで同意取得を継続し、平行して試料の採取と保存を継続する。解析数が30検体以上に達した時点で、臍帯血およびNICU退院時血液のそれぞれについてNR3C1、11βHSD2の各CpGサイトのメチル化率を測定する。データベースに登録した対象の在胎期間、出生体重、NICU入院中の合併症や治療などのライフイベントと3つの遺伝子のCpG各サイトのDNAメチル化率の関係について統計学的手法を用いて検討する。
アーバスキュラー菌根菌による不可給態リン酸の獲得機構の解明

アーバスキュラー菌根(AM)菌の外生菌糸から浸出されるACP活性の検出と土壌中の不可給態リン酸の関係を検討した。ネギ(Allium fistulosum L.)にRhizophagus clarusを接種した区と非接種の区を設け、30μmナイロンメッシュで根と菌糸が伸長する菌根区画と外生菌糸のみが伸長する菌糸区画に分けられた2区画ポットで生育させた。土壌溶液採取管を用いて菌糸区画の土壌溶液を採取し、酸性ホスファターゼ活性を測定した。Hedly法を用いて菌糸区画の土壌を連続抽出し、各リン画分濃度を測定した。菌根形成率は菌根菌接種区で97%であった。地上部乾物重及び地上部リン吸収量は非接種区より接種区で高かった。菌糸区画の土壌中の酸性ホスファターゼ活性は接種区で非接種区より高かった。Hedley法により土壌中のリンをResin-P, NaHCO3-Pi, NaHCO3-Po, NaOH-Pi, NaOH-Po及びHCl-Pに分画できた。アーバスキュラー菌根菌の外生菌糸から酸性ホスファターゼ活性が浸出されることを明らかにした。土壌中のリンをHedley法により分画することができた。以上により、本研究課題はおおむね順調に進展していると評価される。Hedley法による土壌中の有機態リン酸の測定方法を確立し、栽培前後の不可給態リン酸濃度の変化と酸性ホスファターゼ活性との関係を明らかにする。実験に必要な試薬等が予定通り進捗したため、物品の購入が少なくなった。2019年度に開催される国際会議へ参加するための旅費として使用する。
反転対称性が欠如した有機超伝導体の創出

物質のキラリティーが導電性に与える影響を利用した電子デバイスは省電力化に寄与することができるため、材料科学の分野で注目されている。本研究では、不斉炭素を有する置換基を導入した新規電子供与体を合成し、反転対称性が欠如したキラルな有機超伝導体を創出する。この目的を達成するために不斉炭素原子を有するジメチルエチレンジチオ基を導入した電子供与体に着目した。本研究の標的分子は類似する分子系を用いた導電性材料の問題点を克服し、キラルな超伝導体を開発するための指針に沿って設計している。新規電子供与体を用いた導電性有機材料を作製して、その反転対称性の欠如に起因するキラリティーと超伝導が相関した物質を創出する。
ペアリング暗号の大規模解読実験による安全性解析

ペアリング暗号は、従来の公開鍵暗号では実現が困難であった暗号プロトコルを構成できるため、クラウドコンピューティング時代に適した暗号として研究開発が活発に行われている。本研究課題では、ペアリング暗号の安全性の根拠となる拡大体上の離散体問題の困難性の考察を行なった。特に、拡大体上の離散対数問題の高速解法となる数対篩法exTNFSに対して、固定した鍵長に関する計算量の考察を行ない、ペアリング暗号で用いられる楕円曲線のパラメータの安全性を評価した。また、ペアリングを利用した暗号プロトコルの研究も進め、鍵漏洩に耐性のある階層的IDベース暗号、鍵の失効が可能なIDベース署名付き暗号などを考察した。次世代暗号として注目されているペアリング暗号は、従来の公開鍵暗号では実現が困難であった暗号プロトコルを構成できるため、クラウドコンピューティング時代に適した暗号として研究開発が活発に行われている。今年度は以下に関する成果を得た。(1)ぺアリング暗号の安全性の根拠となっている拡大体上の離散対数問題を考察した。JouxらはCRYPTO 2006において、拡大体上の離散対数問題の漸近的に最も高速な手法として数体篩法JLSV06-NFSを提案した。また、素体上の離散対数問題に対する現在漸近的に最速の解法として数体篩法JL03-NFSが知られている。今年度は、JL03-NFSにおいて用いられる2次元格子篩を、3次元へ拡張した格子篩法の構成方法を検討した。特に、2次元の格子篩法において格子点を効率的に列挙できるFranke-Kleinjung法を、3次元の格子篩法に拡張して基底の生成方法および効率的な列挙アルゴリズムの提案を行った。(2)合成数位数のペアリング暗号の高速演算に関して、2進3進混合形式(w-HBTF)を用いたWindow法ベースのMiller's Algorithmの高速化アルゴリズムを提案した。超特異楕円曲線上のTateペアリングを用いて、Window法ベースのMiller's Algorithmの既存方式と比較したところ、提案アルゴリズムは80ビットの安全性レベルで約11%の高速化が実現できた。(3)ペアリングを利用した暗号プロトコルの考察を行い、署名付きIDベース暗号化方式に対して、標準モデルにおいて決定BDH仮定の下でIND-CCA2及び計算DH仮定でEUF-CMAと安全性が証明可能となる方式を提案した。複数の受信者を持つ効率的な匿名暗号化方式を考察し、受信者のIDのプライバシとメッセージの秘匿性を同時に達成する方式を提案した。本研究課題では、ペアリング暗号の安全性評価の研究を進めている。特に、拡大体上の離散対数問題の困難性を評価することを目的として数体篩法の計算量の見積もりを行っている。昨年度には、2次元格子篩法で用いられていた効率的な格子巡回法を、3次元以上の空間上に拡張した多次元格子篩法を提案した。本年度は、3次元領域内の全ての格子点を高速に計算できる条件を考察し、基底の向きやサイズを特定することにより3次元の格子点を単純な演算により列挙できることを証明した。本成果は、平成26年10月22日24日に札幌コンベンションセンターで開催された情報処理学会コンピュータセキュリティシンポジウムCSS2014において学生論文賞を受賞した。また、昨年度までに研究会や国際会議で発表してきた論文3編を、ジャーナル論文化した(IEICE Transactions, JSIAM Letters(2編))。一方、ペアリングを利用した暗号プロトコルも考察した。階層的なIDベース暗号において、鍵漏洩攻撃に耐性のある方式を提案した。直交部分空間を用いたデュアルシステム暗号化を拡張することにより、128ビットセキュリティにおいて40-70%の漏洩に対して耐性がある方式を提案した。また、匿名性を持つ空間暗号化方式(Spatial Encryption)を考察した。提案方式は、メッセージ秘守、適応的安全性、受信者匿名性、部分順序代理、短い暗号文などの性質を有する。また、合成数位数のペアリングを利用した方式と、それを素数位数ペアリングを利用する方式への変換方法も議論した。本研究課題では、ペアリング暗号の安全性の根拠となる拡大体上の離散体問題の困難性を考察している。大きな標数を持つ拡大体上の離散対数問題を高速に解くアルゴリズムとして数体篩法が知られているが、2015年になり数体篩法の計算量が大幅に改良されてきた。実際、Asiacrypt 2015において、BarbulescuらはTower Number Field Sieve (TNFS)を再考し、ペアリング暗号の高速実装で利用される特殊な形の標数pに対して従来より計算量が低下することを示した。その後、Kimらは標数のサイズがmediumとなる場合にも計算量が低下するExtended Tower Number Field Sieve (exTNFS)を発表した。本年度は、これらの拡大体に対する数体対篩法の計算量の改良状況をサーベイ論文としてまとめ、2016年1月に熊本で開催された2016年暗号と情報セキュリティシンポジウム(SCIS2016)で発表した。また、昨年度までに提案した3次元の高速な格子篩法に関する論文をIACR ePrintに投稿した。本年度は、ペアリングを利用した暗号プロトコルに関してジャーナル論文2編(The Computer Journal, International Journal of Network Security)を発表し、2015年に計算量の低下があった数体篩法(ex)TNFSに関するサーベイ論文をSCIS2016で発表するなど、おおむね順調に進展している。

本研究課題では、ペアリング暗号の安全性の根拠となる拡大体上の離散体問題の困難性を考察している。国際会議CRYPTO 2016において、KimらはexTNFSと言われる拡大体上の離散対数問題を漸近的に高速に解くアルゴリズムを発表した。本年度は、ペアリングフレンドリ曲線BLS-24, KSS-32, KSS-36, BLS-42, BLS-48に対して、Kimらの手法に従って256ビット安全性を実現するペアリング暗号の鍵長を評価した。ペアリング暗号が256ビット安全性を持つためには、およそ26,000ビット以上の鍵長が必要であることが判明し、従来256ビット安全性に必要とされていた14,000ビットの鍵長よりも、10,000ビット以上大きい値となった。更に、昨年度にIACR ePrintで発表した3次元版のFranke-Kleinjung格子篩法を実装し、通常の線篩法および格子篩法との速度比較を行なった。これらの結果は、2017年暗号と情報セキュリティシンポジウムSCIS 2017で3件の論文として発表した。本年度は、CRYPTO2016で発表された高速数体篩法exTNFSの対して256ビット安全性を持つペアリング暗号のパラメータの選択方法を考察した。更には、ペアリング写像を利用した暗号プロトコルに関してジャーナル論文2編(Security and Communication Networks, IEEE Transactions on Information Forensics and Security)を発表するなど、おおむね順調に進展している。次世代暗号として注目されているペアリング暗号は、従来の公開鍵暗号では実現が困難であった暗号プロトコルを構成できるため、クラウドコンピューティング時代に適した暗号として研究開発が活発に行われている。本研究課題では、ペアリング暗号の安全性評価の研究を進めている。特に、拡大体上の離散対数問題の困難性を評価することを目的として数体篩法の計算量の見積もりを行っている。昨年度までに、拡大体上の離散対数問題を漸近的に高速に解くことが可能な数対篩法exTNFS(extended Tower Number Field Sive)に対して、固定した鍵長に関する計算量の考察を行なってきた。本年度は、ペアリング暗号で用いられる楕円曲線のクラスに対して、256ビットの安全を有するパラメータの鍵長をexTNFSの計算量を用いて評価した。これらの結果は金沢で開催された国際会議ACNS2017で発表した。一方、群の代数的演算を用いた代数的群モデルにおいて、ペアリング暗号の安全性根拠となるDiffie-Hellman問題系と離散対数問題の関係を考察した。実際、代数的群モデルにおいて、Bilinear Diffie-Hellman問題と離散対数問題の等価性を証明し、2018年電子情報通信学会総合大会において発表した。更に、ペアリング暗号の安全性評価を目的として、有限体の標数が小さい場合の安全性に関して議論を行なった。
骨形成、骨吸収の特異的マーカーの確立:オステオカルシン.その関連ペプチドの検討

我々は、osteocalcin(OC)のNおよびC末端に対する2抗体を用いたsandwich ELISA法によるintact osteocalcin測定法を開発した。さらに、我々はproosteocalcinのpropeptide部分に対する抗体を作製し、sandwich ELISA法によるpropeptide測定系も開発した。正常値として5歳から15歳までの小児186名を対象に、血中OCおよびpropeptide値を測定したところ、血中OC値、propeptide値は男女ともに身長の著しい増加の認められる思春期に高値を示した。上記のごとく、I-OC、P-OCは急激な身長増加を認める思春期や、GH投与に伴い増加を示すことから、ともに骨形成の指標として有用と考えられた。また、GH投与1ヵ月目のI-OC、P-OC値が、GH投与1年間の身長増加を反映したことから、これらpropeptideがGH投与の効果を早期に反映する指標として有用なことが示唆された。一方、N-OCも思春期に高値を示したことから、思春期には骨形成の増大とともに吸収も亢進し、骨の代謝回転そのものが亢進していることが示唆された。われわれは、osteocalcin(OC)のNおよびC末端に対する2抗体を用いたsandwich ELISA法によるintact osteocalcin測定法を開発した。さらに、われわれはproosteocalcinのpropepoide部分に対する抗体を作製し、sand-wich ELISA法によるpropeptide測定系も開発した。正常値として、5歳から15歳までの小児186名を対象に、血中OCおよびpropeptide値を測定したところ、血中OC値、propeptide値は男女ともに身長に著しい増加の認められる思春期に高値を示した。興味深いことにこの年齢に伴うOCあるいは、propeptide濃度の変化は、小児期のheight velocity carveに一致した変動を示し、これらのpeptideが骨形成を反映することを示していた。下垂体性小人症23例を対象としたわれわれの検討では、intact OsteocalcinおよびそのpropeptideともにGH投与に伴い明らかな上昇を示した。興味深いことに、投与開始1か月目の明らかな上昇が認められたこれら両peptide値とGH投与に伴う1年間の身長増加の間には、明らかな正の相関が認められた。この結果、成長ホルモン投与早期(1か月)のOCおよびprpeptideを測定することにより、GH投与効果をある程度予測できることを示す。しかがって、これらpeptideはGH投与効果を早期の判定する指標として有用と思われるが、今後さらに、多数の症例による検討が必要と思われる。年齢に伴う変動はI-OC,P-OC,N-OCとも身長増加率曲線と平行した動きを示し,思春期に高値を示す傾向が認められた.GH投与に伴う変動を経時的に検討したところ,GH投与1カ月でI-OC,P-OCは明らかな上昇を示し,GH投与前1年間の身長増加とI-OC,P-OC値並びに,GH投与開始1カ月目のI-OC,P-OC値と投与開始1年間の身長増加の間にはそれぞれ正の相関が認められた.N-OCもGH投与に伴い上昇する傾向がみられたが,I-OCやP-OCの上昇に比べて軽度で遅延する傾向がみられた.上記の如く,I-OC,P-OCは急激な身長増加を認める思春期やGH投与に伴い増加を示すことから,共に骨形成の指標として有用と考えられた.また,GH投与1カ月目のI-OC,P-OC値がGH投与1年間の身長増加を反映したことからこれらpropeptideがGH投与の効果を早期に反映する指標として有用なことが示唆された.一方,N-OCも思春期に高値を示したことから,思春期には骨形成の増大と共に吸収も亢進し,骨の代謝回転そのものが亢進していることが示唆された.
高温における亜粒界強化機構の解明

本研究は、クリープ変形における亜粒界強化のメカニズムを明らかにすることを目的としている。これまで経験的な理解のみに留まっていた高温での亜粒界強化メカニズムについて、申請者が過去に行った研究結果から導き出した「亜粒界による抵抗をThermalな現象として取り扱う仮説」について、実験的検証と理論構築を加えて学理へと昇華させる。具体的には、すでにいくつかの実験結果が得られつつある既存フェライト系(マルテンサイト系)耐熱鋼について、固溶強化型合金の高温変形に関する基礎研究において確立された試験方法と理論的取扱いを応用して亜粒界による粘性抵抗の定式化ならびに理論モデルの構築を行い、対象材料を先進材料であるデルタフェライト系耐熱鋼やFCC系耐熱合金に拡張していくことで、亜粒界強化理論の一般化を目指すものである。これまでの研究で、まず、超高精度単軸クリープ試験により10^-10 s^-1オーダーの極低速クリープ変形の測定に成功した。さらに、フェライト系耐熱鋼では高応力・高ひずみ速度域と低応力・低ひずみ速度域では最小ひずみ速度の応力依存性が異なることを短時間の超高精度単軸クリープ試験から明らかにした。また、この最小ひずみ速度の応力依存性の変曲点は材料の初期転位密度に依存しており、転位密度が高い材料ほど変曲点が高応力側にシフトすることが明らかになった。このことは転位密度によって決定される非熱的降伏応力を境にしてクリープ変形時の転位運動の様式が異なっていることを意味していると考えられる。超高精度単軸クリープ試験により10^-10 s^-1オーダーの極低速クリープ変形の測定に成功した。これにより実用耐熱合金の実用環境に相当する変形領域を含めた研究が可能となった。加えて、このような極低ひずみ速度領域も含めてクリープ変形挙動を評価することによって、最小ひずみ速度の応力依存性の変化を見出した。さらにこの変曲点が転位密度に関係していることを明らかにした。転位密度によって決定される非熱的降伏応力を境にしてクリープ変形時の転位運動の様式が異なっていることを意味していると理解できるこれらの結果は本研究にとって極めて重要な事実である。すなわち、同一材料、同一時間においては転位組織以外の微細組織変形は同一のものとみなすことができ、これら両領域において応力急変試験などで転位運動の素過程を評価すれば、本研究で掲げた「亜粒界による抵抗をThermalな現象として取り扱う仮説」を実験的に検証することが可能である。「亜粒界による抵抗をThermalな現象として取り扱う仮説」を実験的に検証するために、最小ひずみ速度の応力依存性が異なる両領域において応力急変試験を実施し、有効応力の有無を明らかにする。また、長時間の焼鈍によって微細組織を変化させた試料を準備し、これまでと同様の実験を実施することにより、各領域での転位運動に対して主要な抵抗として作用している微細組織因子を特定する。過去に実施した関連研究の結果からは、変曲点よりも低応力側では分散粒子が、高応力側では亜粒界組織が主要な抵抗になっていると予想される。したがって、とくに高応力側において測定された抵抗力と亜粒界の幅および転位密度の関係を整理することで、本研究の目的のひとつである「亜粒界による抵抗力を転位速度、亜粒界間隔の関数として定式化」を目指す。

転位密度によって決定される非熱的降伏応力を境にしてクリープ変形時の転位運動の様式が異なっていることを意味していると理解できるこれらの結果は本研究にとって極めて重要な事実である。すなわち、同一材料、同一時間においては転位組織以外の微細組織変形は同一のものとみなすことができ、これら両領域において応力急変試験などで転位運動の素過程を評価すれば、本研究で掲げた「亜粒界による抵抗をThermalな現象として取り扱う仮説」を実験的に検証することが可能である。「亜粒界による抵抗をThermalな現象として取り扱う仮説」を実験的に検証するために、最小ひずみ速度の応力依存性が異なる両領域において応力急変試験を実施し、有効応力の有無を明らかにする。また、長時間の焼鈍によって微細組織を変化させた試料を準備し、これまでと同様の実験を実施することにより、各領域での転位運動に対して主要な抵抗として作用している微細組織因子を特定する。過去に実施した関連研究の結果からは、変曲点よりも低応力側では分散粒子が、高応力側では亜粒界組織が主要な抵抗になっていると予想される。したがって、とくに高応力側において測定された抵抗力と亜粒界の幅および転位密度の関係を整理することで、本研究の目的のひとつである「亜粒界による抵抗力を転位速度、亜粒界間隔の関数として定式化」を目指す。
上皮性卵巣癌におけるARID1Aの細胞競合現象を介したがん抑制メカニズムの解明

ARID1A遺伝子の機能喪失は、多くのがんで頻繁に見られる現象であり、ARID1Aは真のがん抑制遺伝子であることがわかってきた。本研究は、ARID1Aのがん抑制機能の中でも、細胞増殖制御と細胞競合との関係という新たな概念に焦点を当てた解析から、ARID1A発現が消失したARID1A変異細胞がどのように周囲の正常細胞と相互作用しながらがん化へと向かっていくのかについて解析した。ARID1A遺伝子の有無による細胞増殖の違いを検討するために、ARID1A遺伝子をノックアウトし、且つ蛍光タンパク質を発現する細胞株を20種類作製した。それぞれの細胞株を単独で培養したときの増殖曲線を確認したところ、ARID1Aをノックアウトした細胞では細胞増殖が亢進していた。次に、これらの細胞株を共培養したときの細胞増殖過程をタイムラプス顕微鏡にて観察した結果、いくつかの細胞同士の組み合わせにおいてARID1Aを欠いた細胞がARID1A発現細胞よりも優位に増殖する様子が観察できた。次に、マウス初代培養系でも確認するために、卵巣明細胞癌の発生母地であると考えられている卵巣表層上皮細胞を単離し、レンチウイルスを用いて不死化させたのち、蛍光タンパク質の安定発現細胞を作製した。さらにこの細胞のARID1Aをノックアウトさせた細胞も作製した。これらの細胞を用いて共培養させた様子を観察したところ、ARID1Aを欠損した細胞はARID1A発現細胞よりも優位に増殖することが明らかとなった。さらに、細胞増殖を制御するARID1Aの標的遺伝子についてマイクロアレイ解析を用いて探索し、ARID1Aにより遺伝子発現が促進または抑制される遺伝子群を同定した。このうち卵巣明細胞腺癌や子宮類内膜腺癌における高い体細胞変異の保有率からは、ARID1Aの発がん過程における中心的な役割が示唆されている。本研究は、ARID1Aのがん抑制機能の中でも細胞増殖制御と"細胞競合"という新たな概念に焦点を当てた解析から、ARID1Aの発現が消失した変異細胞がどのように周囲の正常細胞と相互作用しながら腫瘍化していくのかを解明し、婦人科腫瘍における新たな治療法や診断マーカーの開発につなげることを目的としている。平成27年度は研究計画に基づき、ARID1A発現の有無における細胞競合現象を共培養系で観察するためにレンチウイルスを用いた発現系とCRISPR/Cas9システムを組み合わせた実験系により、細胞の蛍光タンパク質標識およびARID1Aのノックアウトを行い様々な細胞株を作製した。樹立された細胞株は、ゲノムシークエンス、リアルタイムPCRおよびWestern blotによる解析で確実にARID1Aが欠損していることを確認した。当該年度はタイムラプス観察および今後の研究に使用するための様々な標識細胞株の樹立作業を中心に進めてきた。その過程ではCRISPR/Casシステムによるノックアウト細胞の作製およびそのスクリーニングにかなりの時間を要したもののノックアウト細胞の作製を効率良く進めるプロトコールを確立することができた。しかし、当初予定していたタイムラプス観察の段階までは進めることができなかったため、やや遅れていると判断したが、本年度に作製した細胞株は今後の有用な研究ツールとなる。平成28年度は、研究計画に基づきARID1Aの細胞競合における役割について解析を進めた。ARID1A遺伝子の機能喪失は多くのがんで頻繁に見られる現象であり、ARID1Aは真の癌抑制遺伝子であることがわかってきた。本研究はARID1Aの癌抑制機能の中でも細胞増殖制御と細胞競合という新たな概念に焦点を当てながら、ARID1Aの発現が消失した変異細胞がどのように周囲の正常細胞と相互作用しながら腫瘍化していくのかを解明することを目的としている。昨年度までに、ARID1Aを消失し且つ蛍光タンパク質で標識された細胞株を20種類作製してきた。本年度はこれらの細胞株を用い共培養時のタイムラプス観察並びに卵巣表層上皮細胞を用いた細胞の不死化と蛍光標識を行ってきた。タイムラプス観察では、いくつかの細胞同士の組み合わせにおいてARID1A遺伝子欠損が駆動すると考えられる細胞競合現象が観察できた。マウス卵巣表層上皮細胞を用いたがん細胞モデルの作製では、細胞の不死化と蛍光標識までが完了しており、ARID1A遺伝子のノックアウトを現在進めている。本年度は、昨年度までに作製してきた蛍光タンパク質標識細胞を使用して共培養時のタイムラプス観察を行ってきた。一方、研究計画に予定されていた卵巣上皮初代培養細胞を用いた不死化あるいは蛍光標識施したがん細胞モデルの作製に時間を要してしまったため、やや遅れていると判断した。ARID1Aの機能喪失は多くのがんで頻繁に見られる現象であり、ARID1Aは真のがん抑制遺伝子であることがわかってきた。本研究はARID1Aのがん抑制機能の中でも細胞増殖制御と細胞競合という新たな概念に焦点を当てながら、ARID1Aの発現が消失した変異細胞がどのように周囲の正常細胞と相互作用しながら腫瘍かしていくのかを解明することを目的としている。これまでに、ARID1Aが発現する、あるいはARID1Aをノックアウトし且つ蛍光タンパク質で標識された細胞株を20種類作製した。まずはそれぞれ単独で培養したときの増殖曲線を確認したところ、ARID1Aを欠損させた細胞は細胞増殖が亢進し、反対にARID1Aを発現している細胞では細胞増殖が抑制されていた。