hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
神経細胞のSingle-cell patterningを制御する遺伝子の探索

生体内での神経細胞の極性の誕生や、樹状突起の伸長・分岐形成の機構をin vivoで研究するモデル系として、ショウジョウバエ胚のmultiple dendrite neuron (md neuron)に着目した。md neuronは、複雑に分岐する樹状突起を細胞体あたり複数本発達させる。我々が同定した7回膜貫通型カドヘリンFlamingo(Fmi)は、md neuronの樹状突起の伸長調節において重要な働きをする。Fmiの神経系内での発現を調べると、md neuronで強く、分岐しない短い樹状突起を1本だけ発達させる神経細胞では弱い傾向がある。そこで、md neuronに比較的限局して発現する他の遺伝子を分離すれば、その中に樹状突起のパターン形成に関わる新しい遺伝子が同定できるのではないかと予想した。遣伝子探索の方法として、エンハンサートラップ法を採用した。約4,500株のトラップ系統を探索し、現在までに20以上の候補遺伝子を同定した。それぞれの遺伝子が期待する機能を担っているかどうかを、以下の方針に基づき検証中である。1)すでに突然変異が分離されている遺伝子については、緑色蛍光タンパク質をマーカーとするtransgeneと組み合わせ、md neuronの突起パターンを調べる。2)ホモ接合体が致死となるトラップ系統については、ホモ接合体内でのmd neuronの突起パターンを調べる。この手法により、樹状突起の伸長を負に制御する遺伝子が分離できた。この遺伝子はZinc++フィンガーモチーフを持つタンパク質をコードしていた。3)ヌル変異が分離されていなかったり、全くの新規の遺伝子については、2本鎖RNA干渉(Double-stranded RNA interference,RNAi)による遺伝子ノックアウトを計画しており、その手法の導入のための実験を進めている。
日用類書による明清小説の研究

日本国内に現存する日用類書の調査を行ない、当該研究に役立ちそうな日用類書を中心に、写真版等による収集を行った。それらの収集資料によって、日用類書そのものの内容・性格の調査・分析を行った。その結果、これらの明代日用類書が、明代社会における広範な皆層の人びとの日常生活の具体的な面を、即物的に反映しているものであるが知られた。これらをふまえて、明清小説-『金瓶梅』『酲世姻縁伝』『紅桜夢』などに描かれた日常生活の場面の現解や解釈を深めることができた。その結果、これらの小説が深く広く明清の人々の日常生活に立脚して成立していることが窺われるに至った。このようにとらえると、明清小説が日常生活を反映した今日的小説のイメ-ジを与えるが、実際には、因果応報や輪廻転生の物語構造や占メの充満が見られて、かなり特異である。小説のこのような状況もまた日用類書に具体的かつ濃厚に見られるもので、その点でも両者は共通した性格を示す。このことによって、明代・清初の人々の生活内容、現実の質が推測され、今日とはかなり異質であったことが知られる。明清小説はそのような社会に密着したという意味では「日常的」「現実的」なのだが、今日的小説とはかなり異質であると把握すべきであろう-という見通しをもつに至った。
亜鉛イオンの特異的口腔内細菌生育抑制に基づく口臭抑制剤の開発

口臭を亜鉛を含んだ洗口液で抑制するために、どのような口腔内細菌が亜鉛の影響を受けて減るのか、あるいは増えるのかを調べた。同時に、その洗口液の使用を継続すると耐性菌が出てくるのか、さらに、使用を停止するとすぐに元に戻ってしまうのかを実験によって確認した。培養液中に亜鉛を添加することで口腔内細菌の生育にどのような影響を与えるかという実験結果を合わせて、亜鉛洗口によって口臭の原因菌の一部、即ちPorphyromonas、Fusobacterium属細菌が有意に減少すること、また4週間を越えた使用で一部の菌が耐性を獲得すること、使用を停止して4週間ほどでもとの細菌叢に戻ることなどが明らかになった。福岡歯科大学総合歯科学講座にて、ボランティアの同意を得て、20人から140サンプルを採取した。この内、10人には亜鉛による洗口を行い、菌叢に与える影響を調べている。このサンプルから細菌固有の16S rRNA遺伝子の保存領域を利用したPCR法で増幅することで、ヒトの遺伝情報も侵害することのない、細菌叢遺伝子情報が得られる。塩化亜鉛水溶液で洗口しながら、週に2回唾液および舌苔サンプルを採取した。唾液中の細菌を遠心分離で集め、菌体を粉砕したのちDNAを精製した。これを塩基配列決定用サンプルとし、16S rRNA遺伝子共通領域の塩基配列をプライマーとしてPCR法でDNA断片を増幅した。得られた16S rRNA遺伝子断片を、MiSeqシステムを用いて塩基配列を決定した。口臭検査結果のあるものについては、細菌叢と口臭との関係についても解析をおこなった。それぞれのサンプルあたり30000140000のコンティグが得られた。CD-HIT-OTUなどのソフトウェアを用いた解析により、各サンプルにおよそ3070のOTUが認められた。現在この350億塩基の配列について解析を進めているところである。亜鉛は、口臭の抑制剤に含まれていることが多く、特定の菌の生育を抑制するという報告もある。亜鉛と口臭が細菌叢とどのような関係があるかということについて、細菌叢から種機械学習の手法と出現頻度による重みづけを組み合わせて、メチルメルカプタンがヒトの嗅覚で関知できる濃度を上回るかどうかの予測を行ったところ、サンプル間出現頻度のエントロピーに基づく係数で重みづけした値を用いて予測した精度が最も高く82.5%という値が得られ、そのときの感度(sensitivity)が95.0%となった。この結果は、唾液サンプルから、高確率で口臭の有無が予測でき、口臭の予備的診断にふさわしい検査・予測方法であることが示唆された。平成25年度は亜鉛イオンが口腔内細菌叢にどのような影響を与えるのかを短期間(5日間)しか解析できなかったが、平成26年度は、亜鉛イオンの影響を20名のボランティアの協力を得て、8週間にわたって解析することができた。まず洗口の習慣づけを目的として、両グループともに生理食塩水で一週間洗口をした。続いて、Aグループは0.3% ZnCl2溶液5 mLで一日3回、8週間洗口を行った。Bグループは、0.3% ZnCl2溶液5 mLで一日3回、4週間洗口を行った後、後半4週間は生理食塩水で一日3回洗口を行った。洗口開始前、4週後、8週後に刺激唾液を採取した。唾液より抽出した細菌DNAから、高速シーケンス解析法によって1150万リード数(約2.8億塩基)の配列が得られた。OTU解析後、口腔内細菌16S rRNA塩基配列データベースを用いて相同性検索を行い、菌叢解析を行った。その結果から、ZnCl2溶液による洗口で、口臭の原因菌として知られる菌の減少がみられたこと、洗口を中止すると変化が消失したこと、亜鉛イオンによって影響を受けた菌のいくつかは、長時間曝露で、耐性を獲得する可能性が示唆された。この結果は、第88回日本細菌学会(岐阜市)で「塩化亜鉛洗口によるヒト口腔内細菌叢の変化と持続性」として発表した。昨年までに、塩化亜鉛水溶液による口腔内細菌叢への影響について、10日間程度の短期間の変化と4週間程度の長期間の変化を試料を取得し、その解析を進めることができた。その結果から亜鉛洗口によって口腔内細菌叢が影響を受け、生息数が減少する種を見出すことができた。本年度は、長期間亜鉛イオンにさらされることにより、一度は減少した菌種も抵抗性を有するようになる可能性を検証することと、一度亜鉛の影響を受けた口腔内細菌叢は亜鉛水溶液洗口を停止するとすぐにもとの状態に戻るのかどうかの二点を明らかにすべく、8週間に渡って亜鉛水溶液洗口を続けた群と4週間後に亜鉛水溶液洗口を停止して塩化ナトリウム水溶液で洗口を行った群について、唾液と舌苔の試料を採取して、その細菌叢を16S rRNA配列解析にて行った。その結果、4週間後に、Rothia属、Prevotella属、Actinomyces属細菌の割合が増加し、一方、Haemophilus属、Neisseria属、Gemella属、Corynebacterium属、Lautropia属、Porphyromonas属、Leptotrichia属、Alloprevotella属、Fusobacterium属細菌が減少した。8週間まで亜鉛洗口を続けることで、このうちおよそ半数の細菌の変化がもとに戻ったので、長期間の亜鉛イオン暴露により耐性を獲得することが強く示唆された。

また、亜鉛イオンからナトリウムイオンへの変更後4週間で多くの細菌叢が元の細菌叢に近い状態に戻り、その影響を長期に渡り維持するのは難しいことが示唆された。また、個々の種の比較だけでなく、菌叢全体の比較を行なうために、菌叢同士の距離を求めて類似性を比較する方法が必要であると考え、5塩基連続配列の出現頻度による菌種や菌叢を評価する方法を検討した。その結果を第38回日本分子生物学会で、「n-gram塩基出現頻度に基づく微生物系統樹解析」として発表した。口臭を亜鉛を含んだ洗口液で抑制するために、どのような口腔内細菌が亜鉛の影響を受けて減るのか、あるいは増えるのかを調べた。同時に、その洗口液の使用を継続すると耐性菌が出てくるのか、さらに、使用を停止するとすぐに元に戻ってしまうのかを実験によって確認した。培養液中に亜鉛を添加することで口腔内細菌の生育にどのような影響を与えるかという実験結果を合わせて、亜鉛洗口によって口臭の原因菌の一部、即ちPorphyromonas、Fusobacterium属細菌が有意に減少すること、また4週間を越えた使用で一部の菌が耐性を獲得すること、使用を停止して4週間ほどでもとの細菌叢に戻ることなどが明らかになった。亜鉛が口腔内細菌叢に与える影響については、8週間に及ぶ解析を行うことができた。来年の解析のための新たな菌叢構成種解析の開発も可能になったことは予定以上の進展である。口臭成分の変化の分析は予定より遅れているが、平成27年度に行う予定である。予防歯科学平成27年度は、亜鉛イオンを含む水溶液で洗口後に停止した場合、すぐに戻ってしまうのか、それともある程度維持されるのか、その影響は菌種によって異なるのかどうかを、平成26年度までと同様の方法で、しかし、さらに長期間の観察時間で解析をする予定である。それらの結果、亜鉛イオンの影響を強く受けると判明した菌種から数種を選んで、培養条件下において亜鉛イオンが生育にどのような影響を与えるのかを確認する。口腔内あるいは試験管内の解析によって、亜鉛イオン耐性を獲得するということが判った菌種においては、それがどのような変化で耐性を獲得したのかを解析する。亜鉛の存在下・非存在下でのプロテオーム解析・トランスクリプトーム解析による発現解析等を行う予定である。平成26年度までは、菌叢解析に16S rRNA遺伝子を指標に行ってきたが、より効率的な解析を行うために、新たな一次構造の相同性に基づかない菌叢構成解析計算法を開発し、本研究に適応する。モデル細菌叢および亜鉛洗口細菌叢のサンプル採取とメタゲノム配列決定まで進んでいるので、今後はそのデータ解析により解析法の確立と評価を行う予定である。ボランティアの確保とサンプル採取にやや手間取ったが、初年度の予定どおりの第一回解析サンプルから配列情報が得られた。それぞれのサンプルあたり30000140000のコンティグが得られた。CD-HIT-OTUなどのソフトウェアを用いた解析にも予定通り進んでいる。塩基配列委託の受け入れサンプル数単位の区切りによって残高が生じてしまった。それに伴い、共同研究者の解析サンプル調製も次年度へと移すことになったため。今年度はMiSeqの結果の解析を進め、亜鉛による影響の強い菌種を明らかにする。その菌を培養して、亜鉛の添加による生育阻害の有無を確認する。また、プロテオーム解析等によりどのような変化が生じているかを解析する。
新しい致死性神経病原性ヘルペスウイルスの病原性発現に関する分子病態学的研究

比較ウイルス学的解析から神経病原性に関する遺伝子の情報を得るため,約150kbの長さのEHV-9およびEHV-1ウイルスゲノムを8から12kbの部分的重複断片としてLA-PCR法により増幅し,種々の制限酵素を用い,制限酵素切断点多型性解析(RFLP)を行った.より詳細で幅広い解析を行うため,EHV-9に加え,日本分離EHV-124株,アメリカにおいてウシから分離されたEHV-18株,さらにシマウマ,オナガー(アジアノロバ)およびトムソンガゼルから分離されたEHV-1各3株を用た.我が国におけるEHV-1分離株の比較解析では,神経病原性株と非神経病原性株間で相違が見られた.変異遺伝子はImmediate Early(IE)遺伝子であった.この変異はEHV-1とウマヘルペスウイルス4型(EHV-4)との遺伝子組換えにより生じたことが示唆された.ウイルス粒子エンベロープ糖蛋白質の一種であるgI遺伝子にも変異が見られた.他のEHV-1株の解析でも,ハムスターに対し神経病原性が見られなかった株でIE遺伝子に変異が見られた.一方,ハムスターに神経病原性を示した株においてICPO遺伝子およびORF1から3の欠損が見いだされ,これらの遺伝子は神経病原性には関与しないことが示唆された.クローン化小プラーク形成EHV-9についても同様の解析を詳細に行っているが,これまでに変異は見いだされておらず,点突然変異のようなごくわずかな変異である可能性がある.エンベロープ糖蛋白質gIおよびgEのβーガラクトシダーゼ遺伝子挿入変異体を作成し,ウイルス学的性状を解析した.gI挿入変異体のハムスターにおける神経病原性は野生株に比較して減弱していた.gE挿入変異体のハムスターにおける病原性はほぼ消失していた.この結果からgEは神経病原性の決定因子のひとつであることが明らかとなった.比較ウイルス学的解析から神経病原性に関する遺伝子の情報を得るため,約150kbの長さのEHV-9およびEHV-1ウイルスゲノムを8から12kbの部分的重複断片としてLA-PCR法により増幅し,種々の制限酵素を用い,制限酵素切断点多型性解析(RFLP)を行った.より詳細で幅広い解析を行うため,EHV-9に加え,日本分離EHV-124株,アメリカにおいてウシから分離されたEHV-18株,さらにシマウマ,オナガー(アジアノロバ)およびトムソンガゼルから分離されたEHV-1各3株を用た.我が国におけるEHV-1分離株の比較解析では,神経病原性株と非神経病原性株間で相違が見られた.変異遺伝子はImmediate Early(IE)遺伝子であった.この変異はEHV-1とウマヘルペスウイルス4型(EHV-4)との遺伝子組換えにより生じたことが示唆された.ウイルス粒子エンベロープ糖蛋白質の一種であるgI遺伝子にも変異が見られた.他のEHV-1株の解析でも,ハムスターに対し神経病原性が見られなかった株でIE遺伝子に変異が見られた.一方,ハムスターに神経病原性を示した株においてICPO遺伝子およびORF1から3の欠損が見いだされ,これらの遺伝子は神経病原性には関与しないことが示唆された.クローン化小プラーク形成EHV-9についても同様の解析を詳細に行っているが,これまでに変異は見いだされておらず,点突然変異のようなごくわずかな変異である可能性がある.エンベロープ糖蛋白質gIおよびgEのβーガラクトシダーゼ遺伝子挿入変異体を作成し,ウイルス学的性状を解析した.gI挿入変異体のハムスターにおける神経病原性は野生株に比較して減弱していた.gE挿入変異体のハムスターにおける病原性はほぼ消失していた.この結果からgEは神経病原性の決定因子のひとつであることが明らかとなった.今年度はハムスターに対する病原性およびプラーク形成能を指標としたプラーク変異弱毒型EHV-9に対する強毒型EHV-9株DNA断片のマーカーレスキュー試験および,EHV-1における様々な臨床分離株の比較を行った。1.マーカーレスキュー試験報告書作成時点までにおいて残念ながら,結果は得られていない。さらに実験を継続している。2.比較ウイルス学的試験神経病原性が確認されているEHV-1株と神経病原性がないと考えられている株について制限酵素切断点地図の比較を行ったところ,ICP4遺伝子内に存在するBamHI部位に差がみられた。さらに,これまでの研究から病原性との関連が示唆されているgE,gI遺伝子について塩基配列の比較を行ったところ,病原性と関連して,アミノ酸置換が見いだされた。今後はICP4およびgI遺伝子に注目し,EHV-1およびEHV-9ともに,変異と機能との関連性を明らかにしていく予定である。比較ウイルス学的解析から神経病原性に関する遺伝子の情報を得るため,約150kbの長さのEHV-9およびEHV-1ウイルスゲノムを8から12kbの部分的重複断片としてLA-PCR法により増幅し,種々の制限酵素を用い,制限酵素切断点多型性解析(RELP)を行った.より詳細で幅広い解析を行うため,EHV-9に加え,日本分離EHV-1 24株,アメリカにおいてウシから分離されたEHV-1 8株,さらにシマウマ,オナガー(アジアノロバ)およびトムソンガゼルから分離されたEHV-1各3株を用いた.我が国におけるEHV-1分離株の比較解析では,神経病原性株と非神経病原性株間で相違が見られた.変異遺伝子はImmediate Early(IE)遺伝子であった.この変異はEHV-1とウマヘルペスウイルス

4型(EHV-4)との遺伝子組換えにより生じたことが示唆された.ウイルス粒子エンベロープ糖蛋白質の一種であるgI遺伝子にも変異が見られた.他のEHV-1株の解析でも,ハムスターに対し神経病原性が見られなかった株でIE遺伝子に変異が見られた.一方,ハムスターに神経病原性を示した株においてICPO遺伝子およびORF1から3の欠損が見いだされ,これらの遺伝子は神経病原性には関与しないことが示唆された.クローン化小プラーク形成EHV-9についても同様の解析を詳細に行っているが,これまでに変異は見いだされておらず,点突然変異のようなごくわずかな変異である可能性がある.
アフリカツメガエル初期発生におけるETS転写因子を介した細胞内情報伝達の解析

アフリカツメガエル初期発生において、FGFはMAPキナーゼを介して中胚葉形成に関わる因子として知られているが、このFGF/MAPキナーゼ経路の下流でどのような転写因子がシグナルを伝えるのかは明らかにされていなかった。Ets転写因子はFGF/MAPキナーゼ経路の下流でMAPキナーゼによりリン酸化を受けることが分かっているが、アフリカツメガエル初期発生におけるその機能は現在まで不明であった。私がこれまでに行ったアフリカツメガエル初期胚への野生型及び変異型Ets mRNAのマイクロインジェクションやアニマルキャップを用いたRT-PCRの結果から、Ets転写因子がFGF/MAPキナーゼ経路の下流で中胚葉形成に重要な役割を果たすことが明らかになった。また、アンチセンスオリゴのインジェクションからも同様の結果を得た。さらにFGF/MAPキナーゼ経路の標的遺伝子で中胚葉形成における重要な転写因子であるBrachyuryのプロモーター領域とルシフェラーゼ遺伝子とを融合したレポータープラスミドを用いてルシフェラーゼアッセイを行ったところ、Brachyuryの転写制御をEts転写因子が行っている可能性が示唆された。さらにBrachyuryのプロモーター領域を用いたゲルシフトアッセイやレポーターアッセイの結果より、Brachyuryのプロモーター領域に存在するEts転写因子の結合部位を特定し、その転写制御機構を明らかにした。中胚葉形成以外にも死刑誘導や神経冠細胞の移動などより発生後期におけるEts転写因子の果たす機能について現在解析中である。
障害者雇用政策の国際比較

本年度は、障害者の雇用問題に関する従来の議論にみられる、能力の低い障害者の排除は正当か不当かという立場の違いに焦点をあて、それぞれの立場の背後にある理論構造を明らかにするとともに、新たな理論モデルの構築を試みた。まず、障害者の能力の構成を理論的に定式化し、健常者との能力差にはインペアメントによる差・ディスアビリティによる差・努力量による差が含まれることを示したうえで、それぞれの立場の主張を分析した。「能力主義モデル」は、ディスアビリティによる機会不平等のみを問題とし、インペアメントによる能力的不利および努力量については個人の側に帰属させる。しかし、インペアメントによる不利は障害者にとって責任のないものであり、社会的に扱われるべき問題であるといえる。一方、「反能力主義モデル」は、インペアメントによる能力低下や能力の社会性を根拠として、能力にもとづく処遇を否定する。しかし、個人の努力量まで社会の側の責任とするのは理論的な無理を伴うといえる。これに対して本研究では、「責任の有無」を軸に障害者の能力を性質ごとに区分し、それにもとづいて正当な排除と不当な排除を判断することを提案した。この「責任モデル」によって、従来のモデルの理論的困難が解消するとともに、機会不平等と能力的不利を同時に把握することが可能となり、社会的対応の範囲も定まった。また、責任モデルにもとづいて新たな政策を構想したところ、これまで対立的に捉えられてきた3つの施策が、ひとつの理論のもとに位置づくことが示された。さらに、機会平等と結果平等の対立を超えて、「機会の格差および能力的不利のない状態」が新たな平等として提示された。以上の研究成果は、論文「障害者の就業問題と社会モデル:能力をめぐる試論」としてまとめられ、『社会政策研究4』(東信堂,2004年)に掲載されている。当初瀞章害者-健常者間の就業格差の国際比較を予定していたが、近年の障害研究にみられる立場の対立や矛盾に気づき、問題や政策に関する分析をさらに深める必要があると考えるに至った。そこで本年度は、障害理論やジェンダー問題、差別問題等に関する国内外の文献を参照し、障害者の就業問題と雇用政策について理論的検討を行い、次の成果を得た。1.現在の障害理論の主流である社会モデルの限界と矛盾が明らかになるとともに、障害者の労働能力をどう解釈するかによって障害者問題への対応の仕方も異なってくることが示された。社会モデルは障害者の能力の社会的・属性的側面を見過ごし、その結果、労働市場からの排除や不利益の問題は個人に帰責される。しかし、障害者の能力のそうした側面を認識すればそれらの問題に対して何らかにの社会的対応が必要といえる。そして、議論の焦点は、能力が低い者の排除を正当とするか能力に応じた就業を求めるかの対立から、労働市場への参入のための策を講じるか、所得保障等により労働市場の外で補償するかという政策的選択へと移行することになる。2.こうした議論を基盤とし障害者雇用政策を再評価した結果、従来相反する理論的根拠をもつと考えられてきた3つの施策が、一つの理論枠組のもとに包摂される可能性が示された。社会モデルにおいては差別禁止法が唯一適正な施策とみなされる一方で、割当雇用や保護雇用は障害者を優遇するものとして批判されてきた。しかし、障害者の能力不足の問題への対応の必要性を根拠とすれば、後の2つの施策も正当性をもつといえ、残る論点はそれらの実施のシステムおよびコスト負担の配分ということになるだろう。これらの研究成果をもとに、本年度は第75回日本社会学会大会において発表を行った。また現在は、社会政策研究ネットワーク機関誌『社会政策研究』第4号へ投稿する論文を執筆中である。
脊髄損傷への幹細胞治療とロボットを用いたリハビリテーションによる新規治療の開発

中枢神経疾患の代表的な疾患のひとつである脊髄損傷は神経機能の永続的な欠損を引き起こし重篤な後遺障害をもたらすことが知られている。本研究では、脊髄損傷を起因とする運動・感覚障害に対する細胞移植効果を検討するとともに、移植後のリハビリテーション介入の効果を検証することを目的とし、実験を進めている。今年度は、昨年度に引き続き、ヒトおよびラット組織由来の間葉系幹細胞を培養し、移植に最適な細胞について検討を行った。ヒトの間葉系幹細胞として、頭蓋骨由来間葉系幹細胞、脂肪組織由来間葉系幹細胞、臍帯組織由来間葉系幹細胞、腸骨骨髄由来間葉系幹細胞の培養を行った。ラットの間葉系幹細胞として、頭蓋骨由来間葉系幹細胞、脂肪組織由来間葉系幹細胞、長管骨骨髄由来間葉系幹細胞の培養を行った。それぞれの細胞の遺伝子発現を解析した。昨年度ヒト間葉系幹細胞のみで行ったNG108-15(神経細胞のin vitroモデルとして使用)への各種ストレスに対する保護効果の検討をラット間葉系幹細胞でも実施した。また、weight drop methodによって作製した脊髄損傷モデルラットに対する静脈経由での細胞投与の効果についても検討を継続した。その結果、ヒト間葉系幹細胞、ラット間葉系幹細胞ともに頭蓋骨由来間葉系幹細胞で神経堤関連遺伝子の発現が高い傾向にあった。また、神経栄養因子の発現はヒト間葉系幹細胞・ラット間葉系幹細胞ともに由来する組織によって発現が異なることが示された。ヒト間葉系幹細胞を用いたラット脊髄損傷モデルに対する移植実験では、間葉系幹細胞の移植によって対象群と比較して運動機能の改善が顕著であることが明らかとなったが、由来の差異については明らかでなく、引き続き次年度の課題となった。移植に最適な間葉系幹細胞の選定を進めており、移植後の運動介入にまでいたっていないため。また、細胞移植後の運動介入に用いる機器検討に遅れが生じているため。移植に適した間葉系幹細胞の選定を進め、移植実験を行っていく予定である。同時に、運動介入に使用する機器の検討を行い細胞移植後のリハビリテーション効果について明らかにする予定である。脊髄損傷は、重篤な運動障害および感覚障害などの後遺障害を呈する要因となる疾患であるが、未だに運動・感覚障害に対する根本的な治療法は開発されていない。本研究では、脊髄損傷を起因とする運動・感覚障害に対する細胞移植効果を検討するとともに、移植後のリハビリテーション介入の効果を検証することを目的とした。近年の報告で、間葉系幹細胞は採取する由来によって、細胞特性や疾患モデルへの移植効果が異なることが示唆されており、本年度は移植に使用する細胞の選定についても検討を行った。本研究では、間葉系幹細胞として、頭蓋骨由来間葉系幹細胞、脂肪組織由来間葉系幹細胞、臍帯組織由来間葉系幹細胞、腸骨骨髄由来間葉系幹細胞の培養を行い、過去の報告で移植効果に関連することが示されている遺伝子の発現を解析した。また、神経細胞のin vitroモデルとして使用されるNG108-15に各種ストレス曝露を行い、各間葉系幹細胞の培養上清が与える影響についても検討を開始した。さらに、実際に脊髄損傷モデルに対して、静脈経由での細胞移植を行い治療効果の差異についても一部検討を行った。その結果、採取する由来の違いによって、遺伝子発現が異なる可能性が示されたが、遺伝子発現の解析を行った検体数が十分でないため、引き続き検討を続けていく。培養皿上でストレス曝露した神経細胞に対して培養上清が与える影響、さらに、脊髄損傷モデルに対する細胞移植効果ともに、対象群と比較して間葉系幹細胞によって改善する結果は得られているが、由来の差異については十分な検体数での検討が課題である。本研究成果の一部は、再生医療関連の国内学会(第17回日本再生医療学会総会)にて発表した。移植に使用する間葉系幹細胞について、近年の報告で由来の差異によって治療効果が異なることが示されており、由来の差異についても解析対象としているため。ヒト

間葉系幹細胞を用いたラット脊髄損傷モデルに対する移植実験では、間葉系幹細胞の移植によって対象群と比較して運動機能の改善が顕著であることが明らかとなったが、由来の差異については明らかでなく、引き続き次年度の課題となった。移植に最適な間葉系幹細胞の選定を進めており、移植後の運動介入にまでいたっていないため。また、細胞移植後の運動介入に用いる機器検討に遅れが生じているため。移植に使用する間葉系幹細胞の選定を進め、移植効果の差異について確認していく予定である。さらに、移植後にリハビリテーションを加えた実験系を行っていくことで、脊髄損傷に対する細胞移植とリハビリテーションの併用効果について明らかにしたいと考える。移植に適した間葉系幹細胞の選定を進め、移植実験を行っていく予定である。同時に、運動介入に使用する機器の検討を行い細胞移植後のリハビリテーション効果について明らかにする予定である。当初予定したよりも多くの国際学会で研究成果を発表するために、前倒し請求を行った。前倒し請求を行った中で、次年度使用額が発生した。当初の予定通り、細胞移植とリハビリテーションの併用効果の解明に向けて、解析ならびに成果発表を続けていく。実験計画に遅れが生じたことにより次年度使用額が発生した。引き続き、間葉系幹細胞移植とリハビリテーションの併用効果を明らかにするとともに成果発表に努めていく。
日本・米国・ECの国内通商法規にみられるガット(GATT)規定との抵触の研究

1.昭和62年度においては,米国の通商法規のうち61年度において検討し得なかった部分と,ECの通商法規・慣行について,それぞれガット諸規定との抵触状況を分析・検討した. 2.その成果と昭和61年度における成果を合わせて得られた結論は,およそ次のようである.(1)米国は,アンチ・ダンピング法(30年関税法731条以下),相殺関税法(同701条以下),1930年関税法337条,エスケープ・クローズ(74年通商法201条),報復権限条項(74年通商法301条)等の通商規制法規を活発に運用しており,それによってかなりの保護主義的効果を各国との通商に与えてきたといえよう.これは,いわば法規定を活用した保護主義と見ることもでき,「法的保護主義」ともいうべき状況が生じている.このような結果は,上述の各種規定とその運用において,実体法・手続法の両面で,ガットの本条約と各種コードへの抵触が生じていることが原因していると考えられる.(2)わが国は,米国とは極めて対照的であり,輸入規制のための各種法規定は,米国ほどではないが,近時,整備されつつある(例えば,インチ・ダンピング措置については,関税定率法第9条とその政令及びガイドラインがある)ものの,その活用はほとんど行われていない状況である.むしろわが国においては,流通機構の複雑さとそこでの商慣行の不透明性などが実質上輸入規制効果を発生させ,保護主義的機能を果しているといえよう.このような状況は,自由貿易を阻害していることはいうまでもないが,ガットの諸原則に明確に抵触するものであるか否かの判定は極めて微妙であった. (3)ECは,上述の米国と日本の両極端な特色の両面をともに持ち合わせているといえよう.通商法規の運用においてガットとの抵触が認められると同時に,ガットで認められていない一方的セーフガード措置も3者中最も多く実施されており,また関税率も3者中最も高くなっている.1.本研究計画は、日本・米国・ECの国内通商法規にみられるガット(GATT)規定との抵触を、自由貿易体制の維持・促進という観点から分析し、あわせてこの抵触状況を解消する方策を検討しようとするものである。2.本年度(昭和61年度)の前半においては、上述の研究の前提として、GATTが指向する自由貿易体制の根念の明確化が試みられた。その結果として次のことがいえよう。現在のGATTが指向する自由貿易主義は、リカード以後の近代経済学が主張する比較生産費説を理論的根拠としたものであり、そこでは関税および非関税障壁を可能な限り低減することによって国際的財価の移動を自由にすることが、国際社会の富を最大化し世界経済の繁栄に寄与するとの考えのもとに、関税の引下げ、各種非関税障壁の撤廃が図られてきた。しかし問題となるのは、このような意味での自由貿易主義を前提としてきたGATT自らがMFA(多角的繊維取極)等の保護主義的色採の極めて強い制度を容認してきたことをどう位置づければよいかという点であった。実際にはMFAは政治的妥協の産物ではあるが、理論的にはGATTの一般原則への回帰を予定しつつ過渡的かつ例外的に無差別原則の例外を容認したものとして位置づけられよう。従ってGATT全体としては、これら保護主義的制度の容認によって上述の自由貿易主義の原則が修正されていると見る必要はない。3.昭和61年度の後半においては、各国の通商法規・慣行にみられるGATTとの抵触のうち、我が国の通商法規・慣行とGATTとの抵触および米国通商法制のうち輸入制限措置を定めた規定(アンチ・ダンピング法、相殺関税法、74年通商法201条等)とGATT規定との抵触を検討した。(この部分の成果の詳細は省略するが、この点については、公表論文(予定)を参照されたい)。4.次年度(昭和62年度)は、米国法制の残りの部分とEC通商法とGATTとの抵触を分折・検討する予定である。1.昭和62年度においては,米国の通商法規のうち61年度において検討し得なかった部分と,ECの通商法規・慣行について,それぞれガット諸規定との抵触状況を分析・検討した. 2.その成果と昭和61年度における成果を合わせて得られた結論は,およそ次のようである.(1)米国は,アンチ・ダンピング法(30年関税法731条以下),相殺関税法(同701条以下),1930年関税法337条,エスケープ・クローズ(74年通商法201条),報復権限条項(74年通商法301条)等の通商規制法規を活発に運用しており,それによってかなりの保護主義的効果を各国との通商に与えてきたといえよう.これは,いわば法規定を活用した保護主義と見ることもでき,「法的保護主義」ともいうべき状況が生じている.このような結果は,上述の各種規定とその運用において,実体法・手続法の両面で,ガットの本条約と各種コードへの抵触が生じていることが原因していると考えられる.(2)わが国は,米国とは極めて対照的であり,輸入規制のための各種法規定は,米国ほどではないが,近時,整備されつつある(例えば,インチ・ダンピング措置については,関税定率法第9条とその政令及びガイドラインがある)ものの,その活用はほとんど行われていない状況である.

むしろわが国においては,流通機構の複雑さとそこでの商慣行の不透明性などが実質上輸入規制効果を発生させ,保護主義的機能を果しているといえよう.このような状況は,自由貿易を阻害していることはいうまでもないが,ガットの諸原則に明確に抵触するものであるか否かの判定は極めて微妙であった. (3)ECは,上述の米国と日本の両極端な特色の両面をともに持ち合わせているといえよう.通商法規の運用においてガットとの抵触が認められると同時に,ガットで認められていない一方的セーフガード措置も3者中最も多く実施されており,また関税率も3者中最も高くなっている.
熱傷ショックにおける微小循環動態の検討と微小循環動態モジュレーションの有用性

1.熱傷ショック期早期における熱傷創微小循環動態を30%TBSAIII度熱傷SDラットモデルにおける熱傷創のintegrityを観察することにより検討した。また、一酸化窒素(NO)合成酵素cNOS、iNOSの阻害剤(それぞれN^G-nitro-L-arginine10mg/kg、aminoguanidine100mg/kgを17日腹腔内投与)の影響を検討した。結果:(1)熱傷早期のNO代謝物NOx(NO2+NO3)の尿中排泄の増加はiNOS優位と考えられた。(2)iNOS阻害剤は2-3日の熱傷創からの不感蒸泄量を低下させる傾向がみられた。結語:熱傷ショック期早期におけるiNOS抑制剤投与は熱傷創の微小循環維持に関係し熱傷創のintegrityの保持に有益と考えられた。2.臨床で使用可能なiNOS阻害効果を有する薬剤を模索すべく、熱傷感染症期に合併することの多いsepsisのSDラットモデルにて検討した。頚動脈カニュレーション後、エンドトキシン(Et)群では頚動脈よりEt510mg/kgを1520分間隔で5回投与、この20分後に頚動脈からの採血にて犠死せしめた。Et+EUT群では初回Et投与30分前、55分後にFUT-17512mg/kgを頚動脈より投与した。control(C)群ではEt,FUTの代わりに生食水を同量投与した。血漿検体にてNOx、肺、肝、胃のNO合成酵素(iNOS、cNOS)を測定した。結果:(1)血漿NOxはC群、Et群、Et+FUT群それぞれ、19.4±2.1μM/L、36.0±4.1(p=0.013 vs C群)、26.5±7.4であった。(2)cNOSは肝、肺でEt郡でC群に比し増加、iNOSは各臓器でEt群でC群に比し増加、Et+FUT群でEt群に比し低下した。結語:FUT-175はEtによる血中NOx濃度,組織cNOSの誘導に影響しなかったが、Etによる組織iNOSの誘導を有意に抑制した。3.以上、熱傷早期、sepsis期いずれにおけるNO産生もiNOS優位であり、微小循環傷害、肺傷害に関係すると考えられた。熱傷早期およびsepsis期でのFUTの有用性が示唆された。1.熱傷ラットにおける一酸化窒素合成酵素(NOS)阻害剤投与2.外科系重症患者におけるNO基質投与ICU入室患者12名においてNO基質のアルギメート(AM)200ml/30分負荷を行った.AM負荷前NOx(=NO2+NO3)血漿濃度68±80umol/Lで,NOx高値例ではsBPは低値で,心機能も低下していた.AM負荷によりNOxのAM負荷後/前比は生存群で低い(0.95【+-】

0.10vs1.07【+-】0.11)にも係わらず心機能改善,SVR・PVR低下が認められた.生存群ではdtrulineの後/前比が死亡群と差がない(1.3【+-】0.1vs1.3【+-】0.4)のに対し,ornitine濃度の後/前比が死亡群に比し大きい(12.4【+-】7.2vs8.7【+-】3.1)ことより,生存群でのAM投与の効果は,ArgがNO合成酵素系比しornitine回路系でより多く代謝されたためと考えられた.熱傷ショック期早期における熱傷創の微小循環動態を熱傷創のintegrityを観察することにより検討した。また、微小循環に関係する一酸化窒素(NO)合成酵素であるiNOS、cNOSの抑制剤を用い微小循環をモジュレーションした際の熱傷創微小循環に対する影響について検討した。250300gのSpraugue-Dowleyラットを用いネンブタール40mg/kg腹腔内投与麻酔下、背部を剃毛後、脱毛クリームにて脱毛、boilingwaterに15秒間背部を体表面積の30%浸すことによりIII度熱傷モデルを作成した。10ml/kgの生食によるresuscitationと同時に、cNOS抑制剤(N^G-nitro-L-arginine)10mg/kgまたは、iNOS抑制剤(aminoguanidine)100mg/kgを腹腔内投与(17日)し、17日の蓄尿検体にて、NO_2、NO_3、カテコラミン(アドレナリン、ノルアドレナリン、ドパミン)、17OHCS、Na、K、3-メチルヒスチジン、ハイドロオキシプロリンを測定した。結果:1.熱傷早期のNO代謝物(NO_2+NO_3)の尿中排泄はiNOS優位と考えられた。2.iNOS抑制剤は2-3日の熱傷創からの不感蒸泄量を低下させる傾向がみられた。3.iNOS抑制剤は2日のグルココルチコイドの分泌抑制、2-3日のアルドステロン(Na/K比より推定)、アドレナリン、ノルアドレナリンの分泌亢進に関係した。4.cNOS抑制剤は3日のアルドステロン分泌を亢進する傾向があり、一方、ドパミン分泌を抑制、3-メチルヒスチジン、ハイドロオキシプロリンの遊離を抑制した。結語:熱傷ショック期早期におけるiNOS抑制剤投与は熱傷創の微小循環維持に関係し熱傷創のintegrityの保持に有益と考えられた。また、同期におけるcNOS抑制剤投与は創傷治癒過程に不利と考えられた。平成9年度の研究にて,「熱傷ショック期早期におけるiNOS抑制剤投与は熱傷創の微小循環維持に有用と考えられる」との結果を得たが,平成10年度では、臨床で使用可能な薬剤のうちiNOS抑制効果を有する薬剤を模索すべく研究を進めた.iNOSはsepsis時に多く産生されるため,モデルとして非ショック,エンドトキセミアを作製,薬剤としてsepsisに合併するDICに対し使用される多価protease inhibitorであるFUT-175を選択した.結語:FUT-175はEtによる血中NOx濃度,組織cNOSの誘導に影響しなかったが,Bによる組織iNOSの誘導を有意に抑制した.
人工現実感における仮想物体操作に関する研究

本研究では、仮想環境における物体操作の操作性向上をめざす。従来の操作方法は、動作を記号的に判定するための約束ごとを設け、そこから物体挙動へのリンクを行なうという、GUI等のインタフェースに類似の考え方がほとんどである。これに対して本研究では、現実空間におけると同様、動作そのものがシミュレーション的意味を持つ操作方法を実現した。まず人工現実感システムを開発した。手の甲の位置、姿勢計測には磁気を用いた空間位置センサを、手指の関節角度計測にはデータグローブを使用した。このシステム上に、物体操作方法を実現した。目標を「指を3本使用(親指、人指指、中指)することとし、それらが物体にほぼ滑らずにはり付いて操作を行なう」ことに設定した。○開発した方法:物体の周りに球を設定、指先でこの球を制御し、仮想物体の挙動をこの代表球から決定する。アルゴリズムは、「指が設定した半径の球を握ることができ、3指全てが物体の内部に入れば把持する。指が球を握れない、つまり指先三角形の外接円半径が球半径より大きければ開放する。物体挙動は球挙動に、物体中心は球中心に一致させる。球の半径は一定である」というものである。この方法では、指先と物体との関係により詳細な把持判定を行うため、従来の方法より高度なアルゴリズムであるが、球の半径を大きくすると姿勢制御が難しくなり(大きな球の端をつまんでいる状態)、球を小さくすると不用意に開放してしまう傾向がみられた。○改良した方法:アルゴリズムは、「球に3指が全て含まれかつ、把持点(球中心)が物体に含まれた場合把持、把持点を中心とした球から指1本でも出れば開放とする。物体の中心を強制的に把持点に一致させる。物体姿勢は球の挙動に一致する」というものである。この方法では、指の機能は姿勢制御だけとなり、把持と開放の判定が、手の状態と、手と物体との関係が分離されていると言う点で記号的であるが、ジェスチャが計測された関節角度だけから生成されるのではなく、仮想手指のモデルを含み、ある程度物理的/幾何学的な意味を持っているところが異なる。従来の方法に比べ姿勢制御はかなりの程度容易になり、全体のパフォーマンスとしても向上していることが実験により確認されている。
MRIによる新しい関節軟骨描出方法

本研究は臨床で使用可能な1.5T装置を用いて、「関節鏡に相当する」軟骨の微細病変の描出を目標とした。本研究では2つの最新技術を導入した。ひとつはparallel imaging法であり、もうひとつはマイクロスコピーコイルである。複数の表面コイルを用いて撮像時間をコイル数の分だけ短縮するparallel imaging(本研究ではSENSE(Sensitivity Encoding)法を使用)は高分解能画像の短時間での獲得に大いに威力を発揮した。実際に膝関節ルーチンMRI検査に応用したところ、計160枚以上の高分解能スライスが20分以内のscanで得られ、ポジショニングと位置決め、reference scan入れてもトータル30分以内で完了した。診断に支障をきたす画質の悪化はなく、十字靭帯と半月板病変とともに、軟骨病変も十分された。ミクロン単位の関節軟骨の描出には従来のMRIの概念を破る超高分解能画像が必須であったが、これを解決したのがマイクロスコピーコイルである。従来の「高分解能画像」は試料専用の小口径、高磁場装置であった。今回マイクロスコピーコイルを用いることにより、通常の臨床用1.5T商用機を用いても、面内分解能は100ミクロン以下を容易に達成した。マイクロスコピーコイルによる高分解能MR画像は軟骨を含む膝内側面の超微細病変を正常および病的構造を容易に描出可能であった。これらを駆使して、本研究では短時間での高分解能画像獲得の可能性を提示し、新しい関節軟骨描出方法を示すことができた。1.環境整備1-1)四肢専用コイルの調整本研究で用いるSENSE (Sensitivity Encoding)法に対応するために対向する2エレメントによるphased arraycoilの調整を行った。膝関節用に、コイルからの距離や位置が最適となるように専用装具を作成、調整した。膝のほかに足、肩、肘、手首の各関節についても装具を作成し、コイル装着方法を検討した。1-2)パルス系列の最適化)2.健常人ボランティアによる測定2-1)パルス系列の確認健常人ボランティアを用いて作成装具とコイルの装着方法、およびパルス系列の最適化の確認を行った。膝関節においては関節軟骨のみならず十字靭帯、側副靭帯および半月板の各々の描出のために角度をつけた矢状断面と冠状断面を採用した。2-2)健常者の高分解能MR像の限界撮像範囲と画像マトリックスで決定される面内分解能の限界を調査した。画像診断として診断可能な十分なSNRを持つ良好な画質を伴うためには面内分解能200ミクロンが限界と思われた。複数の表面コイルを用いて撮像時間をコイル数の分だけ短縮するparallel imaging(本研究ではSENSE (Sensitivity Encoding)法を使用)は高分解能画像の短時間での獲得に大いに威力を発揮した。

マイクロスコピーコイルによる高分解能MR画像は軟骨を含む膝内側面の超微細病変を正常および病的構造を容易に描出可能であった。これらを駆使して、本研究では短時間での高分解能画像獲得の可能性を提示し、新しい関節軟骨描出方法を示すことができた。
がんにおける薬剤耐性の阻害を目指したZIC5標的薬の同定と検証

がん細胞が治療薬に抵抗性を持つ現象である「薬剤耐性」はがん根治を妨げる大きな問題であり、薬剤耐性を克服する治療法の開発が必要である。申請者はこれまでに、メラノーマの薬剤耐性を亢進させている因子としてZIC5を同定している。がん特異的に高発現しているZIC5がSTAT3とFAKを活性化し、メラノーマ・大腸癌・前立腺癌の薬剤耐性を亢進させていることを明らかにしている。ZIC5を阻害すると、分子標的薬や抗がん剤によるがん細胞死の誘導率が大幅に増加する。また、ZIC5の阻害により、既に薬剤耐性を獲得しているメラノーマ細胞の細胞死も誘導できる。ZIC5はヒト正常組織における発現が少ない為、がん治療における薬剤耐性を減弱させる為の優れた標的分子になると考えられる。本研究の目的は、ZIC5の機能を阻害する低分子化合物を見つけ出し、ZIC5阻害薬が薬剤耐性の減弱に有効であることを示すことである。これまでに、3396化合物の一次スクリーニングが終了し、37コのヒット化合物を得ている。これら37コのヒット化合物に対して二次スクリーニングを行い、これらの中からZIC5の局在やタンパク量を変化させる化合物を選抜した。また、正常ヒトメラノサイトに対する影響や複数のメラノーマ細胞株に対して細胞死誘導効果を検証した。また、酵母two-hybrid法により約10コのZIC5結合候補タンパク質を同定しているが、それらをクローニングし、メラノーマ細胞内でのZIC5との結合を免疫沈降法で検証した。「ZIC5の核内存在量を低下させる低分子化合物の同定」を進めた。これまでに、GFP融合ZIC5を使用したスクリーニング系を構築し、3396化合物の一次スクリーニングを行い、37コのヒット化合物を得ている。2次スクリーニングにおいては、タグなしのZIC5を過剰発現させたメラノーマ細胞株を使用し、ヒット化合物を添加後、細胞を固定し、ZIC5の免疫染色を行い、ZIC5のタンパク量や局在に変化を及ぼす化合物を同定した。さらに、これらの化合物が正常ヒトメラノサイトに細胞死を誘導するか、様々なメラノーマ細胞株に対して細胞死を誘導するかを検証した。その結果、2つの化合物は正常ヒトメラノサイトやZIC5発現量が少ないメラノーマ細胞株に対しては細胞死を誘導せず、ZIC5発現の高い細胞株において細胞死を誘導した。また、BRAF阻害薬に対して耐性を獲得したメラノーマ細胞株に対して最もよくアポトーシスを誘導した。また、「ZIC5調節分子をターゲットとする低分子化合物の同定」の為、これまでにZIC5結合タンパク質のスクリーニングを酵母two-hybrid法で行い、約10個の候補タンパク質を同定している。これらの候補タンパク質をクローニングし、タグ付きの発現プラスミドを作製した。これを用いて、メラノーマ細胞内において候補タンパク質がZIC5と結合するかを免疫沈降法により検証したところ、7つの候補タンパク質についてZIC5と結合することが示唆された。「ZIC5の核内存在量を低下させる低分子化合物の同定」においては、これまでに得られている2つの候補化合物について、候補化合物による細胞死誘導がZIC5の抑制を介しているかを検証する。ZIC5の抑制による細胞死誘導効果が確認された低分子化合物については、試験するがん細胞・正常細胞の種類を拡大する。正常細胞における毒性が低く、多くのがん細胞に有効であることが確認できた化合物に対しては、最終的にマウスを用いたin vivoの実験系における効果を検証する。また、必要があれば構造展開を検討する。これらの検証の結果、有効な化合物が得られなかった場合、さらに多くの低分子化合物ライブラリについて一次スクリーニングを行う。また、「ZIC5調節分子をターゲットとする低分子化合物の同定」において、これまでに同定した7つのZIC5結合候補タンパク質について、ZIC5の薬剤耐性促進能に重要なタンパク質を同定する。ZIC5高発現細胞であるA375細胞においてZIC5結合タンパク質をRNAi法にて発現抑制し、BRAF阻害剤による細胞死誘導率が増大するか検証する。この実験により、薬剤耐性に関与しているZIC5結合因子が同定できる。さらに、ZIC5過剰発現系において、ZIC5結合タンパク質を発現抑制し、ZIC5による薬剤耐性の亢進を抑制できるタンパク質を同定する。さらに、これらの候補化合物がZIC5によるSTAT3の活性化を増強できるかを検証する。これらの検証により、ZIC5による薬剤耐性の亢進に寄与するZIC5結合タンパク質が同定される。さらに、結合タンパク質との相互作用を阻害した際に各種がん細胞の薬剤耐性が減弱するかを検証する。申請者はこれまでに、メラノーマの薬剤耐性を促進させている遺伝子としてZIC5を同定している。がん特異的に高発現しているZIC5がSTAT3とFAKを活性化し、メラノーマ・大腸癌・前立腺癌の薬剤耐性を亢進させていることを明らかにした。ZIC5を阻害すると、分子標的薬や抗がん剤による細胞死の誘導率が大幅に増加する。ZIC5は、ヒト正常組織における発現が少ない為、薬剤耐性を減弱させる為の優れた標的分子になると考えられる。

本研究の目的は、ZIC5の機能を阻害する低分子化合物を見つけ出し、ZIC5阻害薬が薬剤耐性の減弱に有効であることを示すことである。当該年度は、「ZIC5の核内存在量を低下させる低分子化合物の同定」を進めた。まず、GFP融合ZIC5を作製し、GFP-ZIC5がメラノーマ細胞株A375細胞の核に局在することを確認した。この細胞を使用し、スクリーニングの系を決定した。In Cell Analyzer 2000 (GE healthcare)を使用し、核や細胞質におけるGFP量を定量し、正しく核/細胞質における局在を定量できることを確認した。東京大学創薬機構から低分子化合物ライブラリーを入手し、一次スクリーニングを行った。現在までに、3396化合物の一次スクリーニングが終了し、37コのヒット化合物を得ている。さらに、これらの化合物について、2次スクリーニングを行っている。また、酵母two-hybrid法により約10コのZIC5結合候補タンパク質を同定した。「ZIC5の核内存在量を低下させる低分子化合物の同定」を進めた。まず、GFP融合ZIC5を作製し、GFP-ZIC5がメラノーマ細胞株A375細胞の核内に局在することを確認した。さらに、2次スクリーニングとして、これらの化合物が、タグなしのZIC5の核局在やタンパク量を減少させるか、化合物とBRAF阻害薬との併用で相乗的にメラノーマ細胞に細胞死を引き起こすか、正常ヒトメラノサイトの生存に影響を与えないか、を検証している。また、「ZIC5調節分子をターゲットとする低分子化合物の同定」の為、ZIC5結合タンパク質のスクリーニングを行った。酵母two-hybrid法は従来の方法より特異性が高いことが示されているMachmaker Gold Yeast Two-Hybrid System (Clontech)を用いて行った。ZIC5をbaitとし、prey側は市販されているNormalized humanuniversal cDNA library (Clontech)を用いて行い、現在までに約10個の候補タンパク質が同定されている。以上の結果は、特にスクリーニングにおいて既に2次スクリーニングに進んでいる化合物が複数存在し、計画以上に進展していると考えられる。がん細胞が治療薬に抵抗性を持つ現象である「薬剤耐性」はがん根治を妨げる大きな問題であり、薬剤耐性を克服する治療法の開発が必要である。申請者はこれまでに、メラノーマの薬剤耐性を亢進させている因子としてZIC5を同定している。がん特異的に高発現しているZIC5がSTAT3とFAKを活性化し、メラノーマ・大腸癌・前立腺癌の薬剤耐性を亢進させていることを明らかにしている。