hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
ポスト孔形成後に残存したレジン系シーラーが支台築造接着に及ぼす影響の解析

本研究では、ポスト孔形成後のレジン系根管充填用シーラーの残存に着目し、レジン系シーラーの残存状況を2種類の蛍光色素を用いて染め分け、共焦点レーザー顕微鏡で観察する方法を確立することに成功した。次に、この方法を用い、種々のレジン系シーラーの残存状況を観察したところ、実験に使用した全てのシーラーにおいて、象牙細管内にレジン系シーラーが残存していることが明らかとなった。さらに、ポスト孔形成後に超音波チップを用いて形成窩洞の清掃を行っても、残存したレジン系シーラーを完全に除去することができないことがわかった。前年度はヒト抜去歯を用い、蛍光色素を配合したレジン系シーラーにて根管充填を行って試料を作製し、共焦点レーザー顕微鏡観察(以下CLSM)を行うのに最適な条件を検討した。本年度は、まず、前年度と同様に0.1% w/wのRhodamine Bを配合した、リアルシールSEシーラー、スーパーボンド根充シーラー、メタシールsoft、AHプラスの4種類のレジン系シーラーにて根管充填を行った。ポスト孔の形成後、0.1%w/wのFluoresceinsodium soltを配合した支台築造用レジンとファイバーポストにて支台築造を行い、抜去歯を根管上部・中部・根尖部と3分割して、観察用試料を作製した。その後、CLSM観察を行い、レジン系シーラーの残存状況について検討した。その結果、使用した全てのレジン系シーラーにおいて、シーラーのレジンタグが象牙細管内に残存していることがわかった。また、支台築造用レジンのレジンタグの形成は部分的であり、大半が管間象牙質で接着していることがわかった。次に、ポスト孔形成窩洞の清掃による残存したレジン系シーラーの除去効果について調べた。リアルシールSEシーラーを用い、同様の方法にて根管充填、ポスト孔形成後、ダイヤモンドコーティングされた超音波チップにて形成窩洞の清掃後、支台築造を行い、CLSM観察を行った。その結果、いずれの試料においても象牙細管内に形成されたレジンタグを完全に除去することができていないことが明らかとなった。本年度は、ヒト抜去歯を用いて蛍光色素を配合したレジン系シーラーと根管充填ポイントを用いた根管充填後の共焦点レーザー顕微鏡観察を行うための試料作製方法の詳細に関して検討した。まず、レジン系シーラに配合する蛍光色素の種類・濃度・配合方法について検討した。具体的には、蛍光色素としてこれまで象牙質接着システムで比較的によく使用されているRhodamine BとFluoresceinsodium saltを用い、0.1%1% w/wと濃度を変更して、配合方法については、「蒸留水に希釈してシーラーと混和」、「蛍光色素を直接シーラーに混和する」と方法を変えて検討した。その結果、0.1% w/wのRhodamine Bを直接レジン系シーラーに練和する方法が、象牙細管に侵入したレジンタグを明瞭に観察することができた。次に、試料作製方法の詳細について検討した。共焦点レーザー顕微鏡を行うにあたり、最適な試料の厚み、研磨の有無による観察像への影響に関して調べた。試料の厚みに関して、厚みが薄くなるほど、明瞭な観察像が得られる反面、切断時や研磨時に根管充填ポイントが脱離しやすくなるため、本研究では200μm以上の試料の厚みが必要であることがわかった。また、研磨性に関しては、種々の耐水ペーパーの使用、アルミナ配合研磨剤などの研磨性を変更して検討した。その結果、最終研磨の細かさに関わらず、焦点深度を考慮することで観察像に大差なく、むしろ研磨剤の使用によりシーラーの侵入具合が変化し、正確な観察像を得ることができないことがわかった。平成24年度の実施計画は、ヒト抜去歯を用いて蛍光色素を配合した試作レジン系シーラーと根管充填用ポイントを用いて根管充填を行い、共焦点レーザー顕微鏡にてレジンタグの形成状況を観察し、配合する蛍光色素の濃度、種類などを変更して評価するのに適切な条件を検討することであったが、実施計画通り進行していると思われる。次年度は、本年度に検討した試料作成法をもとに、0.1% w/wのRhodamineBを配合したシーラーにて根管充填後、別の蛍光色素を配合した接着システムにより支台築造を行って、ポスト孔形成後のレジン系根管充填シーラーの残存状況を詳細に検討する予定である。研究を進めていく上で必要に応じて研究費を執行したため当初の見込み額と執行額は異なったが、研究計画に変更はなく、前年度の研究費も含め、当初予定通りの計画を進めていく。
てんかん原生獲得機構の解明と予防薬の探索

てんかんは、人口の約1%が罹患する精神疾患であり、遺伝要因と環境要因が複雑に関係するとされている。しかし、まだその分類法は不十分で、且つその発症・進展機構も理解不足で良い診断・治療法も確立されてはいない。てんかんは、主に「イオンチャンネル」および「神経回路網」のいずれかの異常によってもたらされると考えられている。近年では、いくつかの遺伝性てんかんの原因遺伝子が同定されたが、そのほとんどは「イオンチャンネル関連分子」をコードしていた。その結果、モデル動物の開発も進み、その病態の理解と治療法の開発なども比較的順調に進んでいる。一方、神経回路網異常に起因するてんかんは、ほとんど原因遺伝子が同定されていないため、モデル動物はあまり存在せず、病態の理解や治療法の開発も遅れている。申請者らは“てんかん自然発症ラット(IER)"において、抑制性神経細胞の形態・分布・機能の異常を見出した。さらにIERの原因遺伝子としてDSCAML1を同定した。てんかん患者のゲノム解析から、DSCAML1上の複数のミスセンス変異を同定し、その変異がDSCAML1の機能低下に繋がることを明らかにした。平成29-30年度には、(1)てんかん患者型DSCAML1ノックイン(KI)マウスの作製と解析、(2)変異型DSCAML1の発現/局在に対し正常化に働く抗てんかん薬のスクリーニング、(3)てんかん患者型DSCAML1の機能解析、を遂行した。今後、変異型DSCAML1の発現/局在に対し正常化に働く薬として他の薬理学的シャペロンも検討する。最終的に、てんかん原生獲得に対する予防効果やてんかん発作抑制効果を検討する。また、DSCAML1がてんかん以外の精神・神経疾患に関与している可能性も追求することで、本研究成果が幅広い疾患に対応できる可能性を模索する。(1)てんかん患者型DSCAML1 KIマウスの作製と解析:DSCAML1A2105T変異は細胞内に蓄積してしまい、細胞膜に局在できない機能欠損であることを見出している。そこで、DSCAML1A2105T KIマウスを作製した。次に、組織学的な解析を行ったところ、抑制性神経細胞の形態・分布・機能の異常を見出した。さらに、初代培養神経細胞の解析により、IERと同様の樹状突起伸長阻害が認められた。さらに、DSCAML1 KIマウスのヘテロ/ホモの遺伝子型でも異常な脳波が検出できた。A2105T変異を持つてんかん患者はヘテロの遺伝子型であるので、DSCAML1 KIマウスはこのてんかん患者型のモデルマウスになりうると考えている。(2)変異型DSCAML1の発現/局在に対し正常化に働く抗てんかん薬のスクリーニング:培養細胞レベルでのスクリーニングを終え、薬理学的シャペロンの4PBAを個体での解析に用いた。生後1ヶ月のマウスに1ヶ月間4PBAを引水投与させた。その結果、DSCAML1 KIマウスで見られていた樹状突起の伸長阻害が部分的に回復することが確認できた。(3)てんかん患者型DSCAML1の機能解析:160名の発達障害を伴うてんかん患者のDSCAML1遺伝子を解析し、アミノ酸置換を伴う15種類のSNPを見出した。患者型変異を伴うDSCAML1を海馬初代培養神経細胞に発現させ、樹状突起伸長作用を計測した。野生型DSCAML1には樹状突起伸長作用が認められるが、6種のDSCAML1変異体では樹状突起伸長作用が認められなかった。従って、機能欠損である可能性が高い。現在、なぜ6種のDSCAML1変異体が本来の機能を有していないのか培養細胞に発現させ、局在やDSCAML1同士が接着する機能を有しているのか検討している。所属機関のてんかん患者型DSCAML1 KIマウスが想定以上に、組織学的に異常が認められた。今後、このマウスの解析を中心に進める予定ある。DSCAML1A2105TKIマウスを、抑制性神経細胞を光らせるマウス(GAD67-GFP)や大脳皮質の5層の神経細胞を光らせるマウス(Thy1-YFP)と掛け合わせ、組織学的な解析を行なう。DSCAML1A2105T KIマウスに対して、4PBA以外の薬理学的シャペロンの投与実験を開始する。さらに、扁桃体・海馬・大脳皮質の抑制性神経細胞の形態・分布異常、神経回路異常の改善を検討する。てんかん発作感受性に関しては、脳波の測定も行う。また、発生期(妊娠マウス)や生後の初期段階で、DSCAML1A2105T KIマウスに薬理学的シャペロンを投与する。発生期の投与でてんかん発作を予防/抑制できれば、てんかん原生獲得に対する予防薬の開発に繋がると考えている。近年のエキソーム解析により、様々な神経・精神疾患の患者ゲノム情報が公開されている。統合失調症・発達障害・自閉症などの患者由来のミスセンス変異を伴うDSCAML1を調べ上げている。一部のDSCAML1ミスセンス変異体は作製してあるので、DSCAML1ミスセンス変異体を培養細胞に発現させ、局在の異常について調べる。また、ミスセンス変異型DSCAML1のin vitroでの機能解析をする。これらの解析から機能欠損型であると判断できたら、KIマウスの作製を試みる。

てんかんは、主に「イオンチャンネル」および「神経回路網」のいずれかの異常によってもたらされると考えられている。近年では、いくつかの遺伝性てんかんの原因遺伝子が同定されたが、そのほとんどは「イオンチャンネル関連分子」をコードしていた。その結果、モデル動物の開発も進み、その病態の理解と治療法の開発なども比較的順調に進んでいる。一方、神経回路網異常に起因するてんかんは、ほとんど原因遺伝子が同定されていないため、モデル動物はあまり存在せず、病態の理解や治療法の開発も遅れている。申請者らは“てんかん自然発症ラット(IER)"において、抑制性神経細胞の形態・分布・機能の異常を見出した。しかし、これらの異常がどのようにして“てんかん原生の獲得"に繋がるのか不明である。本研究では、IERの神経回路網形成異常の行程を解明する。さらにIERの原因遺伝子としてDSCAML1を同定した。てんかん患者のゲノム解析から、DSCAML1上の複数のミスセンス変異を同定し、その変異がDSCAML1の機能低下に繋がることを明らかにした。現有の治療薬はてんかん発作を抑制するものの、てんかんの発症自体を防ぐものではない。そこで、DSCAML1の発現や機能を向上させる新規てんかん治療薬のスクリーニングを行う。平成29年度には、(1)てんかん患者型DSCAML1ノックイン(KI)マウスの作製と解析(2)イハラてんかんラット(IER)の神経回路網異常部位の同定、(3)DSCAML1の発現/局在に対し正常化に働く抗てんかん薬のスクリーニング、を遂行した。(1)てんかん患者型DSCAML1 KIマウスの作製と解析:てんかん患者のエクソンシークエンスにより、DSCAML1のミスセンス変異を引き起こす6種のSNPを発見した。そのうち、DSCAML1A2105T変異は細胞内に蓄積してしまい、細胞膜に局在できない機能欠損であることを見出している。そこで、CRISPR-Cas9システムを用いてDSCAML1A2105T KIマウスを作製した。次に、組織学的な解析を行ったところ、抑制性神経細胞の形態・分布・機能の異常を見出した。さらに、初代培養神経細胞の解析により、IERと同様の樹状突起伸長阻害が認められた。DSCAML1A2105T KIマウスはヘテロの遺伝子型でも野生型とホモ型の中間の表現型が認められた。てんかん患者はヘテロの遺伝子型であるので、DSCAML1A2105T KIマウスはこのてんかん患者型のモデルマウスになりうると考えている。(2)IERの神経回路網異常とてんかん発作の関連性:嗅内皮質と海馬間の投射経路の異常はヒトのてんかん発作に関与すると考えられている。そこで、生後7日目のIERをホルマリン固定後、蛍光色素を嗅内皮質2/3層に注入したところ、海馬台へ異常に過剰投射をしていることを見出した。(3)DSCAML1の発現/局在に対し正常化に働く抗てんかん薬のスクリーニング:これまでに、DSCAML1A2105
「私人・私企業対外国国家」型紛争の処理に関する国際法の研究

私人や私企業に対して外国国家が損害をもたらした場合に生ずる「私人・私企業対外国国家」型紛争を処理するためのさまざまな手続について、その共通目的や手続間の相互連関に着目し、「私人と外国との間の請求の処理に関する国際法の一般原則」を措定することにより、私人・私企業にとって他に紛争処理手続があるかどうかを考慮せずに外国国家に裁判権免除を認める裁判例・国連裁判権免除条約の問題点や、国際法上の外国国家免除の範囲が広がっていることを明らかにした。本研究は、私人や私企業に対して外国が損害をもたらした場合に生ずる「私人・私企業対外国国家」型の紛争を処理するためのさまざまな手続(例えば、私人の本国における国内裁判、私人の本国と外国との間の国際的手続(外交的保護))について、外国に対する私人・私企業の利益の救済という共通の目的や手続間の相互連関に着目することにより、「私人・私企業対外国国家」型紛争の処理に関する国際法という枠組にまとめ、その現代的構造と問題点を明らかにしようとするものである。本研究の目的は、私人や私企業に対して外国国家が損害をもたらした場合に生ずる「私人・私企業対外国国家」型の紛争を処理するためのさまざまな手続(例えば、私人・私企業の本国における国内裁判、私人・私企業の本国と外国国家との間の国際的手続(外交的保護))について、外国国家に対する私人・私企業の利益の救済という共通の目的や手続間の相互連関に着目することにより、「私人・私企業対外国国家」型紛争の処理に関する国際法という枠組にまとめ、その現代的構造と問題点を明らかにすることにある。今年度の研究実績は、主に次の3つからなる。(1)私人の本国における国内裁判で問題となる外国国家免除(主権免除)について、それまでの判例を明示的に変更した最高裁2006年7月21日判決(対パキスタン貸金請求事件)等、今世紀に入ってから日本の裁判所が判断を下す事例が増加しており、それらの意義と問題点について、日本が2007年1月11日に署名した国連裁判権免除条約にも照らしながら検討した。(2)同じく外国国家免除に関する英国貴族院2006年6月14日判決(ジョーンズ事件)について、原審の控訴裁判決とは異なり代替処理手続の存否を考慮しなかった点を主に取り上げながら、外国国家に対する私人・私企業の請求処理手続の確保という観点から批判的に分析し、とりわけ外交的保護との比較を通じて同判決および国連裁判権免除条約の問題点を明らかにした。(3)領域外での外国国家の活動によって私人の人権が侵害された場合についての国際法(特に人権条約)の対応について、英国貴族院2007年6月13日判決(アル=スケイニ事件)を素材として考察し、その問題点を指摘した。それぞれについて、関連する資料を入手し、研究会で口頭報告した際に受けた批判やコメントをも考慮に入れた上で、論文の形でまとめた((1)と(2)は英文)。本研究の目的は、私人や私企業に対しそ外国が損害をもたらした場合に生ずる「私人・私企業対外国国家」型の紛争を処理するためのさまざまな手続(例えば、私人の本国における国内裁判、私人の本国と外国との間の国際的手続(外交的保護))について、外国に対する私人・私企業の利益の救済という共通の目的や手続間の相互連関に着目することにより、「私人・私企業対外国国家」型紛争の処理に関する国際法という枠組にまとめ、その現代的構造と問題点を明らかにすることにある。2年目となる今年度の研究実績は、主に次の3つからなる。(1)前年度からの継続研究として、紛争の代替処理手続の存否を考慮せずに私人の本国における国内裁判からの免除を外国に与えた英国貴族院2006年6月14日判決について、外国に対する私人・私企業の請求処理手続の確保という観点から、とりわけ外交的保護との比較を通じて、批判的に分析した。(2)日本が国連裁判権免除条約の批准に向けて準備を進めていることを考慮し、国際法規則としての外国国家免除(主権免除)の展開を、「国際法の一般原則に基づく免除」「慣習国際法上の免除」「国連裁判権免除条約における免除」という流れとして捉えた上で、「私人と外国との間の請求の処理に関する国際法の一般原則」を措定することにより、免除の範囲が、従来の一般的な説明とは異なり、むしろ広がっていることを明らかにした。(3)本研究開始後の新たな注目すべき展開の1つと言える米国の外国主権免除法の新テロリズム免除例外規定(2008年1月)について、私人がサウジアラビアを訴えた9.11テロ損害賠償請求事件(連邦控訴裁2008年8月14日判決)と関連づけて分析し、その意義と問題点を指摘した。それぞれについて、関連する資料を入手し、学会および研究会で口頭報告した際に受けた批判やコメントをも考慮に入れた上で、論文の形でまとめた((1)は英文)

本研究の目的は、私人や私企業に対して外国が損害をもたらした場合に生ずる「私人・私企業対外国国家」型の紛争を処理するためのさまざまな手続(例えば、私人の本国における国内裁判、私人の本国と外国との間の国際的手続(外交的保護))について、外国に対する私人・私企業の利益の救済という共通の目的や手続間の相互連関に着目することにより、「私人・私企業対外国国家」型紛争の処理に関する国際法という枠組にまとめ、その現代的構造と問題点を明らかにすることにある。3年目となる平成21年度の研究実績は、主に次の3つからなる。(1)前年度からの継続研究として、本研究開始後の新たな展開の1つと言える米国の外国主権免除法の新テロリズム免除例外規定(2008年1月)について、私人がサウジアラビアを訴えた9.11テロ損害賠償請求事件(連邦控訴裁2008年8月14日判決)と関連づけて分析し、その意義と問題点を指摘した。(2)同様にテロ問題に関して、対テロ安保理決議を国連加盟国が実施する過程で私人に対して損害をもたらした場合に、それが人権侵害であるとして個々の国連加盟国が人権条約上の責任を負うかどうかという問題について、自由権規約委員会の注目すべき見解が出されたので(2008年10月22日)、本研究に関連する論点を中心に検討を行った。(3)本研究が対象とするのは主に民事紛争であるが、このようにテロ問題も関わってくると、刑事の問題も含めた広い視野からの研究が求められるため、具体的には、外務大臣の刑事管轄権免除に関する国際法の問題に取り組み、逮捕状事件(国際司法裁判所2002年2月14日判決)について批判的に分析した。それぞれについて、関連する資料を入手し、研究会で口頭報告した際に受けた批判やコメントをも考慮に入れた上で、論文および判例評釈の形にまとめ、専門雑誌等で公表した。
カルシウムイメージングとパッチクランプによる緑内障治療薬の神経保護作用の検証

1)パッチクランプ法による神経節細胞Ca電流への緑内障治療薬の効果:金魚網膜を酵素的に処理し神経節細胞を単離,顕微鏡下に同定した.穿孔パッチクランプをかけwhole cell configurationにてCa電流を測定した.網膜神経節細胞L-型Caチャネルへのニルバジピンの最小有効濃度が1μMであること,保持電位が-28+50mVでCa電流の抑制効果を認めることを認めた.これらの結果と内服投与後の眼内濃度よりニルバジピンは神経節細胞に直接作用して保護しうると推測された.これらの結果はJournal of ocular pharmacology and therapeuticsに平成17年12月に投稿した.2)Caイメージング法による神経節細胞の低酸素負荷による細胞内Ca^<2+>濃度([Ca^<2+>]_1)上昇の解析.ラットを用いて,新たに開発した網膜スライス内神経節細胞(GC)選択的Caメージング法を用いて神経節細胞内Ca濃度測定を行った.スライス標本を低O_2条件にするとGCの[Ca^<2+>]_1上昇が認められた,GC(0.14±0.04, Mean±SD)。この[Ca^<2+>]_i上昇はNMDA型glu受容体阻害薬APV(60μM)でGCにおいて樹上突起部で抑制された,神経節細胞層(0.12±0.01,), IPL(0.04±0.04, p<0.005).CNQXはGCの[Ca^<2+>]_i上昇を抑制しなかった.L型Caチャネル阻害薬ニフェジピンはGCでは抑制しなかった(0.13±0.01).結論:低酸素条件下でのGC樹上突起部での[Ca^<2+>]_I)上昇はNMDA受容体を介する.1)パッチクランプ法による神経節細胞Ca電流への緑内障治療薬の効果:金魚網膜を酵素的に処理し神経節細胞を単離,顕微鏡下に同定した.穿孔パッチクランプをかけwhole cell configurationにてCa電流を測定した.網膜神経節細胞L-型Caチャネルへのニルバジピンの最小有効濃度が1μMであること,保持電位が-28+50mVでCa電流の抑制効果を認めることを認めた.これらの結果と内服投与後の眼内濃度よりニルバジピンは神経節細胞に直接作用して保護しうると推測された.これらの結果はJournal of ocular pharmacology and therapeuticsに平成17年12月に投稿した.2)Caイメージング法による神経節細胞の低酸素負荷による細胞内Ca^<2+>濃度([Ca^<2+>]_1)上昇の解析.ラットを用いて,新たに開発した網膜スライス内神経節細胞(GC)選択的Caメージング法を用いて神経節細胞内Ca濃度測定を行った.スライス標本を低O_2条件にするとGCの[Ca^<2+>]_1上昇が認められた,GC(0.14±0.04, Mean±SD)。この[Ca^<2+>]_i上昇はNMDA型glu受容体阻害薬APV(60μM)でGCにおいて樹上突起部で抑制された,神経節細胞層(0.12±0.01,), IPL(0.04±0.04, p<0.005).CNQXはGCの[Ca^<2+>]_i上昇を抑制しなかった.L型Caチャネル阻害薬ニフェジピンはGCでは抑制しなかった(0.13±0.01).結論:低酸素条件下でのGC樹上突起部での[Ca^<2+>]_I)上昇はNMDA受容体を介する.網膜スライスにおける神経節細胞(GC)とミューラー細胞(MC)のCaイメージングを用いた低酸素応答の解析目的:低O_2条件下での網膜スライスにおける細胞種特異的な細胞内Ca^<2+>濃度[Ca^<2+>]_Iの変化とそのメカニズムを調べる.方法:ラットの硝子体に非エステル型fura-2を注入しMC選択的にfura-2を負荷した.眼杯の視神経断端に非エステル型fluo-3を接触させてGC選択的にfIuo-3を負荷し[Ca^<2+>]_i測定を行なった。結果:スライス標本を低O_2条件にすると[Ca^<2+>]_i上昇が認められた(MC:Δratio 0.11±0.02,Mean±SD),GC(0.14±0.04)。この[Ca^<2+>]_i上昇はglu受容体阻害薬APV(60μM)でMCにおいては抑制されず,GCにおいて局所的に抑制されたMC(0.09±0.01),神経節細胞層(0.12±0.01,),IPL(0.04±0.04,p<0.005).CNQXはMC,GC共[Ca^<2+>]_i上昇を抑制しなかった.ニフェジピンはMCの[Ca^<2+>]_i上昇を抑制した(0.02±0.02,p<0.005)が,GCでは抑制しなかった(0.13±0.01).考察:細胞種特異的Ca指示薬負荷法は網膜スライス内のGCとMCに選択的に負荷させ,各々独立して[Ca^<2+>]_I測定可能となった.低O_2条件下でのMCの[Ca^<2+>]_

i上昇はL型Caチャネル阻害薬により抑制され,GCの樹状突起部ではNMDA受容体阻害薬により抑制されることから,MCではL型Caチャネルが,GCの樹状突起部ではNMDA受容体が[Ca^<2+>]_i上昇に関与すると考えられる.結論:低O_2条件下でのMCの[Ca^<2+>]_i上昇はL型Caチャネルにより,GCの樹状突起部ではNMDA受容体を介する.1)パッチクランプ法による神経節細胞Ca電流への緑内障治療薬の効果:金魚網膜を酵素的に処理し神経節細胞を単離,顕微鏡下に同定した.穿孔パッチクランプをかけwhole cell configurationにてCa電流を測定した.網膜神経節細胞L-型Caチャネルへのニルバジピンの最小有効濃度が1μMであること,保持電位が-28+50mVでCa電流の抑制効果を認めることを認めた.これらの結果と内服投与後の眼内濃度よりニルバジピンは神経節細胞に直接作用して保護しうると推測された.これらの結果はJournal of ocular pharmacology and therapeuticsに平成17年12月に投稿した.2)Caイメージング法による神経節細胞の低酸素負荷による細胞内Ca^<2+>濃度([Ca^<2+>]_I)上昇の解析.ラットを用いて,新たに開発した網膜スライス内神経節細胞(GC)選択的Caメージング法を用いて神経節細胞内Ca濃度測定を行った.スライス標本を低O_2条件にするとGCの[Ca^<2+>]_I上昇が認められた,GC,(0.14±0.04 Mean±SD)。この[Ca^<2+>]_i上昇はNMDA型glu受容体阻害薬APV(60μM)でGCにおいて樹上突起部で抑制された神経節細胞層(0.12±0.01),IPL(0.04±0.04,p<0.005).CNQXはGCの[Ca^<2+>]_i上昇を抑制しなかった.L型Caチャネル阻害薬ニフェジピンはGCでは抑制しなかった(0.13±0.01).結論:低酸素条件下でのGC樹上突起部での[Ca^<2+>]_I)上昇はNMDA受容体を介する.
マルチモデル相互比較による事例別の季節予測可能性

熱帯太平洋に発生するエルニーニョ・南方振動(ENSO)現象は、数か月先の異常気象予測の鍵となる現象であるが、事例別に見ると、最先端の気候モデルを持ってしてもENSOの発達・衰退の予測を大きく外すケースが少なからず存在し、その原因は事例・モデル・手法毎に異なる。本研究では、これまで難しいとされてきた複数の異なる季節予測システムを並行して実行するマルチモデル季節予測可能性研究を実施し、事例別に予測の鍵となる物理プロセスを明らかにすることを目的としている。本年度は、3つの季節予測モデルの選定を行い、実行環境を整えた。具体的には、1第5期結合モデル相互比較計画(CMIP5)の代表モデルの一つであるMIROCをベースとした季節予測システム、2気象庁現況季節予報システムCPS2、3気象研究所の地球システムモデルをベースとした新しい予測システム、の3種類である。1のモデルについては1979年以降の事後予測実験例が揃っており、予測精度の特性なども十分に調査済みである。今年度は主に3については詳細な予測精度の調査を行ったが、改善の余地があることが明らかになったため、変更を加えた新たな予測システムを導入する準備に取り掛かった。本課題は、複数の季節予測モデルによる数値実験から科学的知見を引き出すことを目指すものであり、ここから得られる知見は、飽和しつつある季節予測技術を次の段階に進めるためのマイルストーンにつながるものと期待される。本年度は3モデルの実行環境を整備した上で、比較可能な事後季節予測実験結果を揃える計画であったが、予定していた実験の3分の2が未実行となった。その理由として、2018年7月に連続して発生した豪雨と猛暑の調査に時間を要したことが挙げられる。進捗がやや遅れる結果となったものの、2018年7月の異常気象は本研究が対象としているENSO予測とも密接に関係しており、予期しなかったこれらの事例の調査は、本研究のテーマの一つである事例別の予測結果比較に通じる重要な参考データとなり得ることから、本研究課題の成果が促進されることが期待される。2年目の早い段階で事後予測実験のセットを完成させ、比較解析を実施する。特に、モデル間の予測結果が大きく異なることが知られている2014年の事例について集中的に調査を行う。得られた知見をもとに、2年目後半から3年目前半にかけて、追加の感度実験等を実施し、3年目の後半までに成果を取りまとめて報告する。参加を予定していたInternational Detectionand Attribution Group(IDAG)の年次会合が次年度に延期されたため、予定していた外国出張1件分の出張費が未使用となった。また、優先度の高い会議が重なったため、予定していた異常気象研究集会への参加がキャンセルとなり、国内出張1件分の出張費が未使用となった。同等の会合が来年度も予定されているため、未使用分は来年度の出張に充てる計画である。
シオノギ癌115のin vitroにおけるホルモン抵抗性獲得の機序の研究

(1)細胞の維持継代:SC115及びS2の細胞株は,テキストランチャーコール処理しステロイドホルモンを除去した牛脂児血清〓%含むRPMI16〓O培地に10nMのテストステロンを添加した培地にて継代,維持,クローニングを行なった.クローニングによって得られたサブリローンは液体窒素中に保存してある.(2)細胞増殖:i)テストステロン依存性を示すSC115細胞はMEM培地とHAM培地を1:1に混合した無血清培地では次第に死滅していくが, 10nmのテストステロンを加えることにより増殖が可能であった.テストステロン非依存性のCS2細胞はテストステロンの有無にかかわらず増殖可能であった.上皮成長因子やインシュリンはSC115細胞やCS2細胞の増殖を促進させなかった. ii)SC115とCS2を混在させて培養すると,テストステロンを含まない無血清培地での培養にもかかわらずSC115が死滅することなく増殖していることが顕微鏡所見よりわかった.(3)染色体分析:i)SC115, CS2のマウスにおける染色体数はそれぞれ40, 72であったが,細胞株における染色体数はそれぞれ39, 69を示し, in vivoからin vitroへの条件の変化により染色体の変化がおきていることがわかった. ii)(2)のii)において染色体分析を行った結果, SC115細胞の増殖はCS2細胞によって促進されていることがわかった.(4)DNA定量:i)プロピディウムイオダイド染色により,フローサイトメトリーでDNAを定量したところSC115細胞はマウス正常細胞とほぼ同じDNA量を示し, CS2細胞はほぼそれの倍の量であった. ii)SC115細胞とCS2細胞を混在させたときのDNA量測定からも染色体分析で得られた結果と同様にCS2細胞によるSC115細胞の増殖が促されていることがわかった.(1)細胞の維持継代:SC115及びS2の細胞株は,テキストランチャーコール処理しステロイドホルモンを除去した牛脂児血清〓%含むRPMI16〓O培地に10nMのテストステロンを添加した培地にて継代,維持,クローニングを行なった.クローニングによって得られたサブリローンは液体窒素中に保存してある.(2)細胞増殖:i)テストステロン依存性を示すSC115細胞はMEM培地とHAM培地を1:1に混合した無血清培地では次第に死滅していくが, 10nmのテストステロンを加えることにより増殖が可能であった.テストステロン非依存性のCS2細胞はテストステロンの有無にかかわらず増殖可能であった.上皮成長因子やインシュリンはSC115細胞やCS2細胞の増殖を促進させなかった. ii)SC115とCS2を混在させて培養すると,テストステロンを含まない無血清培地での培養にもかかわらずSC115が死滅することなく増殖していることが顕微鏡所見よりわかった.(3)染色体分析:i)SC115, CS2のマウスにおける染色体数はそれぞれ40, 72であったが,細胞株における染色体数はそれぞれ39, 69を示し, in vivoからin vitroへの条件の変化により染色体の変化がおきていることがわかった. ii)(2)のii)において染色体分析を行った結果, SC115細胞の増殖はCS2細胞によって促進されていることがわかった.(4)DNA定量:i)プロピディウムイオダイド染色により,フローサイトメトリーでDNAを定量したところSC115細胞はマウス正常細胞とほぼ同じDNA量を示し, CS2細胞はほぼそれの倍の量であった. ii)SC115細胞とCS2細胞を混在させたときのDNA量測定からも染色体分析で得られた結果と同様にCS2細胞によるSC115細胞の増殖が促されていることがわかった.
甘味受容体の構造機能解析とその進化過程における変化の解明

甘味受容体の構造機能特性の解明を目的に、複数の種の甘味受容体T1r2/T1r3について膜移行機序、甘味阻害効果等の解析を行った。まず、T1r2/T1r3の様々な部位の変異体について解析した。その結果、味物質を結合させる部位の変異が、受容体全体の構造を変化させてしまう現象を見出した。次に、ヒト、齧歯類、霊長類、魚類のT1r2/T1r3を用いて、膜移行能の比較を行った。その結果、齧歯類と魚類のT1r3は単独で膜へ移行出来るが、霊長類とヒトT1r3の膜移行にはT1r2の共存が必要であることが明らかになった。よって、T1r3は単独では膜移行できないように進化したことが強く示唆された。甘味受容体の構造機能特性の解明を目的とし、ヒト甘味受容体hT1r2/hT1r3が甘味を受容して細胞内へ伝達するまでの経路と、進化によって膜移行機序がどのように変化したかについて検討を行った。まず、甘味受容体が甘味を受容してから細胞内伝達に至る構造機能についての解析を行うために、甘味受容体T1r2/T1r3の構造の内、サッカリンの受容に特異的に関与する部位、VFTと膜貫通部位の相互作用に関与する部位、Gタンパク質と結合する部位の3カ所のいずれかを変異させた変異体を作製した。それぞれの変異体の甘味に対する応答を測定するのに先立ち膜移行を検討したところ、一部は正常な膜移行が観察されなかった。また、マウス甘味受容体T1r2/T1r3について、マウスの種による甘味感受性の差の原因とされるT1r3内のアミノ酸残基を甘味非感受性マウスのタイプに変異させたところ、種々の甘味料に対する甘味応答は著しく減少したものの、受容体の膜移行には変化が無かった。また、甘味受容体には甘味物質と結合する部位は複数あるが、変異によりどの部位に結合する甘味物質についても応答が減少することが観察された。以上より、マウス甘味受容体の甘味非感受性タイプへのアミノ酸置換は、変異させた部位のみにとどまらず、受容体全体の構造を変化させることが示唆された。進化による甘味受容体の構造機能変化に関しては、魚類と霊長類のcDNAより甘味受容体の単離を行った。甘味受容体の構造機能特性の解明を目的とし、様々な種の甘味受容体T1r2/T1r3について膜移行機序の比較を行った。昨年度までに得たヒト、霊長類、齧歯類、魚類のT1r2/T1r3を用いて、膜移行能の比較を行った。その結果、齧歯類のマウスや魚類のT1r3は単独で細胞膜上に移行できることが明らかになった。一方、3種類の霊長類のT1r3の膜移行能を調べたが、ヒトT1r3と同様、単独では膜移行できないことが明らかになった。これらの解析結果から、T1r3は単独では膜移行できないように進化したことが強く示唆された。さらに、T1r3のC端を一部欠損させた変異体を構築して膜移行を調べたところ、全てについて膜移行能が著しく低下することを見出した。よってT1r3のC端には種を超えた膜移行の仕組みが存在する可能性が有ると考えられる。また、高濃度の高甘味度甘味料を甘味受容体に作用させた時におこる甘味阻害効果について、ヒトとマウスの甘味受容体を用いて比較した。その結果、マウス甘味受容体では甘味阻害効果を観察できなかった。また、膜外領域がヒトT1r3由来、膜貫通領域がマウスT1r3由来の甘味受容体についても同様の解析を行ったところ、ヒト甘味受容体と同様の阻害効果が確認できた。よって、この甘味阻害効果はヒト甘味受容体の膜外領域で起こる可能性が高いと考えられる。その他、ヒト甘味受容体の四量体形成の可能性を調べるために、FRET解析ができるように細胞膜外領域にタグを付加した甘味受容体変異体を作成した。甘味受容体の構造機能特性の解明を目的とし、様々な種の甘味受容体T1r2/T1r3について膜移行機序、甘味阻害効果、多量体形成等を行った。甘味受容体T1r2/T1r3はGタンパク質共役型受容体ファミリーのクラスCに属していることから、同じクラスCに属し、構造的に解析の進んでいる、代謝型グルタミン酸受容体mGluRを参考にした。まず、甘味受容体が甘味を受容してから細胞内伝達に至る構造機能についての解析を行うために、甘味受容体T1r2/T1r3の構造の内、甘味物質と相互作用する部位、Gタンパク質への情報伝達に関与する可能性のある部位などを点変異させて、受容体の膜への移行、甘味物質に対する応答等を解析した。その結果、多くの変異体で膜移行が出来なくなる現象が見られた。また、T1r2/T1r3には甘味物質との結合部位を複数保有しているが、1つの結合部位の変異が、受容体全体の構造を変化させてしまう現象も見られた。これらから、味物質を結合させる部位が、受容体全体の構造機能にも関与することが示された。齧歯類と魚類のT1r3は単独で膜へ移行出来るが、霊長類とヒトT1r3の膜移行にはT1r2の共存が必要であることが明らかになった。

よって、T1r3は単独では膜移行できないように進化したことが強く示唆された。さらに、T1r3のC端を一部欠損させた変異体を構築して膜移行を調べたところ、全ての種について膜移行能が著しく低下することを見出した。それぞれについて膜移行に関わる部位を特定したところ、種によって異なっていることが示唆される結果が得られた。よって、T1r3は種により異なる膜移行の仕組みを持つことが改めて示された。甘味受容体の構造機能特性の解明を目的に、複数の種の甘味受容体T1r2/T1r3について膜移行機序、甘味阻害効果等の解析を行った。まず、T1r2/T1r3の様々な部位の変異体について解析した。その結果、味物質を結合させる部位の変異が、受容体全体の構造を変化させてしまう現象を見出した。次に、ヒト、齧歯類、霊長類、魚類のT1r2/T1r3を用いて、膜移行能の比較を行った。その結果、齧歯類と魚類のT1r3は単独で膜へ移行出来るが、霊長類とヒトT1r3の膜移行にはT1r2の共存が必要であることが明らかになった。ほぼ予定通りに作成した甘味受容体について膜移行や甘味応答測定を行うことができたため。また、高濃度甘味料の甘味阻害効果および洗い流し時に発生するWater-sweet現象については、まず高濃度での甘味阻害効果について解析することができたため。食品機能学T1r3のC端で起こる膜移行能の仕組みの解明を中心に、甘味受容体の構造機能について進化を考慮しながら解析する。また、FRET解析を行うことで甘味受容体の四量体形成能についても検討する。初年度に予定していた、各種変異体の作製を終え、一部については膜移行や甘味応答といった機能解析も完了することができているため。研究費を効率的に使用したために発生した。25年度に作製した甘味受容体変異体について、順次、膜移行と甘味応答を行う予定である。また、高濃度甘味料を洗い流した時に発生するWater-sweet現象や、甘味受容体の4量体形成の可能性についても検討を開始する。本研究課題の推進のため、次年度の研究費は、交付申請時の計画通り使用する。なお、次年度使用額の183,122円については、研究費を効率的に使用したために発生した残額であり、次年度に請求する研究費と合わせて研究計画遂行のために使用する。
座位MRI画像を用いた女性の骨盤内臓器の位置と骨盤底筋力の関連性

女性の骨盤内臓器の位置と骨盤底筋力の関連性を明らかにするため、座位時の骨盤内MRI画像を用いて、骨盤内臓器下垂に影響するリスク因子を検討した。結果、骨盤内臓器は、加齢、分娩、腹圧性尿失禁により下垂することが明らかとなった。また、骨盤内臓器の位置と骨盤底筋収縮による膀胱頸部の挙上量には負の相関が認められたことから、骨盤内臓器が下垂している女性は、膀胱頸部の可動性が大きいことが示唆された。さらに、12週間補整下着着用及び骨盤底筋訓練を実施した結果、尿失禁改善が認められた。本研究は、女性の骨盤内臓器の位置と骨盤底筋力の関連性を明らかにすることを目的としている。平成25年度における具体的な課題は、1妊娠・分娩、加齢、肥満などのリスク要因と骨盤内臓器の位置との関連性(座位における骨盤内臓器の本来の位置、リスク要因により骨盤内臓器は下垂するか)、2骨盤内臓器の位置と骨盤底筋力の強度との関連性(骨盤内臓器の位置が低いと骨盤底筋力も弱いのか)の検証であった。2070歳代の一般女性160名を対象に、オープン核磁気共鳴画像装置(GEヘルスケア社製0.5テスラSIGNA SP/2,以下オープンMRとする)を用いた座位における骨盤内臓器の位置評価、経皮的骨盤底筋収縮確認装置(Furun Medical社製PFMトレーナー)を用いた骨盤底筋の収縮力測定、体組成測定、質問紙調査を実施した。結果は現在分析中であるが、その一部として30歳代、BMI25 kg/m2未満の未産婦16名(尿失禁無16名)と経産婦50名(尿失禁無24名,有26名)の膀胱頸部の位置を比較した結果について報告する予定である(第27回老年泌尿器科学会)。現時点においては、膀胱頸部の位置は未産婦よりも経産婦の方が低く、経産婦のうち尿失禁を有する者は尿失禁のない者よりも低い傾向を認めており、今後さらに詳細に分析し、他のリスク要因との関連性および骨盤底筋力との関連性についても検討を重ねる。これらの結果は、骨盤内臓器下垂を原因とする腹圧性尿失禁や骨盤臓器脱等の疾患に対する予防や改善のためのケアの提言につながると考えている。平成26年度における具体的な課題は、以下の2つであった。1.平成25年度にデータ収集を行った「妊娠・分娩、加齢、肥満などのリスク要因と骨盤内臓器の位置との関連性の検証(座位における骨盤内臓器の本来の位置、リスク要因により骨盤内臓器は下垂するか)」、「骨盤内臓器の位置と骨盤底筋力の強度との関連性の検証(骨盤内臓器の位置が低いと骨盤底筋力も弱いのか)」のデータ分析と成果発表平成25年度に、2070歳代の一般女性を対象に、オープン核磁気共鳴画像装置(GEヘルスケア社製0.5テスラSIGNA SP/2,以下オープンMRとする)を用いた座位における骨盤内臓器の位置評価、経皮的骨盤底筋収縮確認装置(Furun Medical社製PFMトレーナー)を用いた骨盤底筋群の収縮力測定、体組成測定、質問紙調査を実施した。平成26年度は、データ収集の追加に加えてこれらのデータの分析を行い、膀胱頸部の位置や骨盤底筋群の収縮力に関する成果発表を行った。現在、論文投稿に向けて準備中である。2.「骨盤底筋群の強化と骨盤内臓器の位置の関連性の検証(骨盤底筋群を強化すれば骨盤内臓器の位置は挙がるか)」のための準備上記検証を行うため、腹圧性尿失禁症状を有する女性60名程度を骨盤底筋体操群、サポート力のある下着の着用群、対照群に分けて3か月の介入実験を行う予定である。平成26年度はその準備として、対象者のリクルート準備、下着着用群のプレテスト等を行い、平成27年度の実験に向けて調整中である。平成27年度における具体的な課題は、以下の2つであった。1)「妊娠・分娩、加齢、肥満などのリスク要因と骨盤内臓器の位置との関連性の検証(座位における骨盤内臓器の本来の位置、リスク要因により骨盤内臓器は下垂するか)」、「骨盤内臓器の位置と骨盤底筋力の強度との関連性の検証(骨盤内臓器の位置が低いと骨盤底筋力も弱いのか)」に関するデータ分析と成果発表平成25-26年度に、2070歳代の一般女性を対象に、オープン核磁気共鳴画像装置(GEヘルスケア社製0.5テスラSIGNA SP/2,以下オープンMRとする)を用いた座位における骨盤内臓器の位置評価、経皮的骨盤底筋収縮確認装置(Furun Medical社製PFMトレーナー)を用いた骨盤底筋群の収縮力測定、体組成測定、質問紙調査を実施した。平成27年度は、これらのデータを分析し、腹圧性尿失禁には骨盤底筋の収縮持続時間の短縮が関連していることを明らかにし、論文投稿を行った。また、骨盤内臓器下垂には加齢・分娩・尿失禁が関連していることを明らかにし、関連学会において発表した。

2)「骨盤底筋群の強化と骨盤内臓器の位置の関連性の検証(骨盤底筋群を強化すれば骨盤内臓器の位置は挙がるか)」するための介入実験上記検証を行うため、腹圧性尿失禁症状を有する女性に対し、サポート下着の着用群、対照群に分けて3か月の介入実験を行った。現在データを取りまとめ、分析の準備を進めている。平成26年度末の時点で、所属機関の異動や実験用具の再調整などの理由により「骨盤底筋群の強化と骨盤内臓器の位置の関連性の検証」の対象者のリクルートが遅れ、平成27年度に実施した。この介入実験で用いるサポート下着は、夏季には多少暑いため、夏季以降に実験を開始した。また、この介入実験は、観察期間も含めると16週間にまたがるため、データ分析、成果発表まで進めることができなかった。一方、「妊娠・分娩、加齢、肥満などのリスク要因と骨盤内臓器の位置との関連性の検証」、「骨盤内臓器の位置と骨盤底筋力の強度との関連性の検証」については、予定通り成果発表を実施できた。本研究は、女性の骨盤内臓器の位置と骨盤底筋力の関連性を明らかにすることを目的とした。具体的な課題13についてそれぞれ検討を行った。1妊娠・分娩、加齢、肥満などのリスク要因と骨盤内臓器の位置との関連性(座位における骨盤内臓器の本来の位置、リスク要因により骨盤内臓器は下垂するか)、2骨盤内臓器の位置と骨盤底筋力の強度との関連性(骨盤内臓器の位置が低いと骨盤底筋力も弱いのか)に関して、平成25-26年度に、2070歳代の一般女性を対象に、オープン核磁気共鳴画像装置(GEヘルスケア社製0.5テスラSIGNA SP/2,以下オープンMRとする)を用いた座位における骨盤内臓器の位置評価、経皮的骨盤底筋収縮確認装置(Furun Medical社製PFMトレーナー)を用いた骨盤底筋群の収縮力測定、質問紙調査を実施した。平成27・28年度は、データ分析を行い、骨盤内臓器下垂に影響するリスク因子として加齢、分娩、尿失禁症状が抽出されたこと、腹圧性尿失禁は骨盤底筋群の収縮持続時間の短縮と関連することを報告した。3骨盤底筋群の強化と骨盤内臓器の位置の関連性(骨盤底筋群を強化すれば骨盤内臓器の位置は挙がるか)に関して、平成27年度に腹圧性尿失禁を有する30-50歳代の女性を対象に骨盤底筋体操と骨盤内臓器挙上作用のある補整下着着用による尿失禁症状改善効果と膀胱頸部挙上効果を検証した。結果、尿失禁症状の改善は骨盤底筋体操と補整下着着用ともに認められたが、膀胱頸部の挙上は骨盤底筋体操のみに認められた。女性の骨盤内臓器の位置と骨盤底筋力の関連性を明らかにするため、座位時の骨盤内MRI画像を用いて、骨盤内臓器下垂に影響するリスク因子を検討した。結果、骨盤内臓器は、加齢、分娩、腹圧性尿失禁により下垂することが明らかとなった。また、骨盤内臓器の位置と骨盤底筋収縮による膀胱頸部の挙上量には負の相関が認められたことから、骨盤内臓器が下垂している女性は、膀胱頸部の可動性が大きいことが示唆された。さらに、12週間補整下着着用及び骨盤底筋訓練を実施した結果、尿失禁改善が認められた。平成26年度末には、「骨盤底筋群の強化と骨盤内臓器の位置の関連性の検証」のリクルートを行い、実験を進める予定であったが、年度途中で所属機関を移動したこと、下着着用群に用いる下着の再調整のためのプレテストを優先したことなどから、年度内にリクルートを行うことが難しい状況であった。一方、「妊娠・分娩、加齢、肥満などのリスク要因と骨盤内臓器の位置との関連性の検証」「骨盤内臓器の位置と骨盤底筋力の強度との関連性の検証」については、成果発表等、順調に計画を進めることができた。「骨盤底筋群の強化と骨盤内臓器の位置の関連性の検証」について、データを分析し、成果発表を行う。また、「妊娠・分娩、加齢、肥満などのリスク要因と骨盤内臓器の位置との関連性の検証」「骨盤内臓器の位置と骨盤底筋力の強度との関連性の検証」に関しても論文投稿を進める。
報酬に基づく学習に関与する脳内メカニズムの解明

視床下部で合成されるオレキシンが、脳内報酬系の働きに与える効果を検討した。脳内報酬系は、薬物依存のみならず、食行動の異常などにも関与していると考えられている部位である。実験の結果、腹側被蓋野に投与したオレキシンは、コルチコトロピン放出因子(CRF)含有ニューロンの活動を増大させることで脳内自己刺激の閾値を上昇させることが示唆された。この結果は、薬物依存などの行動の形成過程にオレキシンやCRFが関与している可能性を示している。平成19年度の研究では、視床下部新規神経ペプチド・オレキシンが脳内報酬系の機能に与える効果について検討するための実験を行った。外側視床下部の内側前脳束に刺激電極を留置し、テットがオペラント箱内の小穴に鼻を差し入れると刺激電極を介して同部位が刺激されるという脳内自己刺激行動を形成させたラットの腹側被蓋野ヘオレキシンAを投与することで、脳内自己刺激の報酬閾値が上昇することが明らかになった。また、マイクロダイアリシス法を用いた実験により、腹側被蓋野へのオレキシンA投与は、投射野である前頭前野、側坐核core野、分界条床核、扁桃体中心核でのドーパミン放出を増加させることが明らかになった。特に分界条床核、扁桃体中心核はコルチコトロピン放出因子(CRF)ニューロンを含有し、CRFの脳室内投与は脳内自己刺激の報酬閾値を上昇させることから、腹側被蓋野へのオレキシンA投与がこれらの領域のCRFニューロンを活性化させることで報酬閾値の上昇を招いたと考えられた。そこでオレキシンAによる閾値上昇効果がCRFアンタゴニスト(D-phe CRF(12-41))処置によって抑制されるか否かを検討したところ、実際にオレキシンAの閾値上昇効果が減弱された。これらの結果は、腹側被蓋野でのオレキシンAはCRF系を介して報酬閾値の上昇を惹起することを示唆している。オレキシンAが摂食促進ペプチドであるという事実は、直感的には、オレキシンが報酬系に対して促進的に作用することを示唆しているようだが、実際には抑制的に作用していることを明らかにした点が本研究の意義である。平成20年度の研究では、腹側被蓋野ヘオレキシンA投与が、同部位のドーパミンニューロンの投射部位である扁桃体中心核、分界条床核のコルチコトロピン放出因子(CRF)含有ニューロンを賦活するか否かを検討した。その結果、オレキシンA投与によって扁桃体中心核ではCRF含有ニューロンが賦活されるが、分界条床核では賦活されないことが明らかになった。これまでの研究で、腹側被蓋野へのオレキシンA投与は、1)脳内自己刺激行動(外側視床下部の内側前脳束に刺激電極を留置し、ラットがオペラント箱内の小穴に鼻を差し入れると刺激電極を介して同部位が刺激される行動)の閾値を上昇させ、2)扁桃体中心核、分界条床核でのドーパミン放出を増加させること、また3)オレキシンAによる閾値上昇はコルチコトロピン放出因子(CRF)阻害薬の投与によって抑制されることが明らかになっていた。これらの結果をまとめると、腹側被蓋野で放出されたオレキシンAは扁桃体中心核でのドーパミン放出を増加させることで同部位のCRFニューロンを賦活し、それによって脳内自己刺激閾値が上昇することが示唆される。以上の結果は、薬物依存の形成/維持過程に見られる嗜癖性薬物の過剰摂取や退薬に伴う不快な情動経験の発現に、オレキシン系とCRF系とが関与している可能性を示唆している。このような知見は、薬物中毒の症状形成に至る過程の理解や新しい治療法の開発につながる大変意義深いものであり、臨床的応用を見据えたさらなる基礎データの蓄積が必要である。
ヒト脂肪由来幹細胞の細胞特性と潜在機能の解析

培養ASCの細胞表面抗原発現の変化: ASCを接着培養すると新鮮時には発現がなかったCD105(endoglin ;間葉系幹細胞のマーカーの1つ)が発現することをあきらかにした。また、培養を続けると減少するCD34の発現を長期的に維持する培養法を開発した。ASCは、皮膚線維芽細胞をはじめ、骨髄由来間葉系幹細胞(BM-MSC)、臍帯由来幹細胞など間葉系の組織前駆細胞と形態的には類似しているが、機能、表面抗原発現における相違点を明らかにした。Adの内容についてJournal of Cellular Physiology誌(2006)に報告した。脂肪再生に関する研究を行い、ヒト吸引脂肪が幹細胞欠乏組織であることを明らかとし、幹細胞を補助的に用いる新しい脂肪移植法の概念を提唱した。免疫不全動物を用いて、ヒト脂肪組織および脂肪組織由来幹細胞を用いて脂肪再生への有効性を示した。また、GFPラットを用いて、幹細胞の追跡実験を行い、血管内皮細胞への分化を確認した。また、ヒト脂肪とヒト脂肪由来幹細胞の混合移植モデル(ヌードマウス)を用いて、やはり血管内皮細胞への分化を確認した。この研究内容については、Tissue Engineering誌(2006)に報告した。遠心処理により脂肪組織から水分が失われ、一部の脂肪細胞は破壊されるが幹細胞は生存することを明らかにし、また脂肪移植における遠心処理の最適化に関する研究についてPlast Reconstr Surg誌(2008)に報告した。脂肪組織および幹細胞の非凍結保存の最適化についてPlast Reconstr Surg誌(2007)に報告するとともに、長期凍結保存した脂肪由来幹細胞の機能解析結果をやはりPlast ReconstrSurg誌(2008)に報告した。脂肪幹細胞の多分化能を維持したままで、効率的に短期間で増殖させる方法についてCytotherapy誌(2007)に報告した。脂肪由来幹細胞にbFGFが作用するとHGFを強力にHGFを分泌することを明らかにした。またこの作用はJNKシグナルを介し、脂肪組織の虚血再還流傷害後の脂肪再生、血管新生において、脂肪幹細胞由来のHGFが線維化を抑制する働きがあることを明らかにした。また、血管新生、脂肪再生において脂肪幹細胞が主役的な役割を果たして増殖、遊走することを明らかにした。これらの結果はStem Cells誌(2008)に報告した。脂肪由来幹細胞(ASC)に対する創傷関連因子の影響を調べ,なかでもbFGFによりJNKシグナルを介してASCからのHGF分泌およびHGFmRNA発現が強力に促進されること,ASCの増殖が促進されることを明らかにした。また,その作用は,bFGF刺激が1週間継続することにより加速度的に大きくなったことが明らかになるとともに,MAPKシグナルの中でもJNK阻害剤で最も特異的に阻害された。