hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
室町幕府体制下の地方禅宗による「正統と実力」及び「中央と地方」の統合に関する研究

中世叢林の史料について、上記のような出張調査や文献読解等で得られた情報について、室町期の同時代世俗史料、同時代禅宗教団史料、後世の寺誌・地誌類におおよそ三分類し、これらの史料群の相互関係を考察し、石見安国寺、備中宝福寺、備後中興寺の事例を中核とした論考二編を執筆、公表した。そこで得られた理解の概要であるが、従来の室町期禅宗檀越のイメージは、鎌倉時代の地頭御家人の系譜をひくような有力武士であり、たしかに関東ではそのような事例が継続しているが、中部・西国の荘園史料を丹念に読み込んでみると、武士といえるかどうか微妙な中間層というべき名主・百姓層が、叢林の檀越として、自らの利害を幕府に主張していると解釈できる事例を見出せた。さらに、禅宗とは武士の宗教だという通念と照らし合わせてみると、従来の室町時代論において、「室町武士」とはどのような存在であるのか、鎌倉期の地頭御家人は基本的に没落しているという事実をふまえた自覚的な議論はほとんど行われてこなかったのではないかと気づき、室町期の在地勢力は禅宗ないし叢林の檀越となることで、室町幕府につらなる武士となれたのではないか、との仮説的な見通しを提示できた。このような見通しに立つことで、かつて尾藤正英が試みたような兵農分離政策の思想史的な検討を再開できるのではないか、と考えられる。日本中世史・近世史公務の事情により、未刊史料の出張調査を十分に進められなかった。ただし、研究課題に即して、石見安国寺を中心にみる利生塔・安国寺から五山制度への推移、備中宝福寺とその末寺群にみる禅宗檀越の存在形態など、着眼点や研究対象を具体化することができ、研究成果を論考の形で具体的に示すめどが立ちつつある。以上により、おおむね順調に進展していると判断する。刊行済みの一次史料については、目を通すのに予想以上の時間がかかり、やや遅れ気味である。しかしながら、先行研究が提示している二次史料(寺誌地誌類)の特徴はほぼ把握することができ、今後は良質な一次史料の検討に、さらに集中的に取り組めるめどが立ちつつある。また、関連する成果として、二編の口頭報告と一編の史料翻刻を準備し、口頭報告と史料翻刻の各一点については、具体的に公表できるめどが立ちつつある。一定の成果を具体的に示すめどを立てながら、検討課題を絞ることができており、現在までの達成度はおおむね順調と判断している。1.論考の執筆を進めて、研究成果の公表をめざす。主なテーマは、石見安国寺を素材として、利生塔・安国寺政策から五山制度構築にいたる室町幕府の宗教政策の推移と、備中宝福寺を素材として、中央・荘園領主勢力と、地方・在地勢力との相互関係について、それぞれ検討する予定である。2.未刊史料の出張調査について、前年度は十分に実行できなかったが、その間もリストアップを続けてきているので、それらの史料の入手と検討を進める。刊行史料についても、主に論考執筆上必要なものを中心に入手する。3.論考の執筆とは別に、今枝愛眞が提示した「日本の五山・十刹・諸山表」の補訂版を科研費報告書等に掲載し、今後の五山制度研究の基盤とすることをめざす。研究計画に記載のとおり、1地方禅宗寺院伝来の古文書、2禅宗の活動状況に関連する荘園領主史料、などの一次史料の収集検討に取り組むほか、「中央」と「地方」、「正統」と「実力」をつなぎあわせる禅僧とはどのような存在かを考える際、禅僧の出自という問題の検討と思いいたり、そのような情報を記載している3禅刹・住持籍類の収集検討をあらたな課題として取り組みたい。ひきつづき成果を具体的に示すため、論考の執筆を意識しながら情報の収集と分析をおこなってゆくつもりである。公務の事情により、出張調査を予定通り進められなかった。出張調査に必要な史料のリストアップは進めているので、それに基づき、今年度において出張調査を補う予定である。1.未刊史料の出張調査をおこなう。2.日本中世史を中心に、禅宗とそれを取り巻く諸宗派、諸思想に関わる専門書の入手と読み込みを継続する。
腸管出血性大腸菌感染症に合併する急性脳症の発症機序の解明

1)志賀毒素1型のAサブユニットとBサブユニットを発現する大腸菌クローンを作製しそれぞれのサブユニットを大量に産生させることができた。Aサブユニットはin vitroタンパク合成系を阻害した。両上澄を混合することによりベロ細胞に障害性をしめすホロ毒素を作ることができた。この成果はFEMS Microbiology Letterに発表した。3)妊娠中のマウスにベロ毒素2型を投与し、妊娠、出産、分娩時期、分娩後の周産期行動に与える影響をみた。致死率は妊娠マウスと非妊娠マウスは全く同じであった。致死量以下の投与による影響については、妊娠5日目投与では胎児は血腫様となり稽留流産を示し、15日目の投与では通常の分娩が進行したが新生児を育てることができない母親マウスが高率に現れた。この結果はInfection and Immunityに発表した。1)ウサギにべロ毒素2型を静脈投与したときの死因について解析するために循環・呼吸機能とrenal sympathetic nerve activity (RSNA)を覚醒下にモニターした。その結果、最終的にvaroreflexが機能しなくなり血圧が低下することが死因に直結すると考えられた。MRIによる検査でも、循環中枢がありvaroreflexの経路が通る延髄に浮腫が認められた。この結果はAnnals of Neurologyに発表される予定である。2)ウサギに静脈投与したベロ毒素2型が髄液中に移行していることを明らかにした。また髄液中にべロ毒素2型を投与した場合、静脈投与の9分の1の量でウサギが死亡した。ベロ毒素に対する抗血清を髄液中に投与するとウサギの死亡が予防できた。この結果はMicrobial Pathogenesis25:139-146(1998)に発表した。3)べロ毒素には1型と2型がありヒトやマウスに対しては2型の方が毒性が強いが、ウサギに対しては逆で1型は脳幹部や脊髄に親和性が強く毒性が強く現れた。4)患者の脳や腎臓には微小血栓が認められると報告されている。べロ毒素がヒトの血小板を凝集するかどうかを調べたが直接の凝集作用は認められなかった。この結果はThrombosis and Haemostasis80:529-530,1998に発表した。5)妊娠中のO157感染が妊婦や胎児にどのような影響を与えるかよくわかっていない。妊娠マウスに致死量以下のベロ毒素2型を投与した。妊娠5日目に投与すると胎児成分は血腫様に変化した。妊娠15日目に投与すると分娩はしたものの新生児を育てることができない母親が多くあらわれた。
骨髄異形成症候群における4番染色体長腕の新規標的遺伝子の探索

骨髄異形成症候群(MDS)の高密度SNPアレイ解析により約30%の症例に観察されるコピー数の変化を伴わないLOH(aUPD)領域内には、標的候補である遺伝子変異が高頻度に存在する。そこで同領域内の標的遺伝子探索を行い、4番染色体長腕aUPD例においてTET2遺伝子変異が高頻度に生じており、同領域の標的遺伝子であることが明らかとなった。TET2変異はMDSおよび関連疾患の約30%の症例で認められ、MDSの病態に重要な役割を担っていると予想される。一方、SNPアレイの解析によっても、コピー数異常やUPDを有さない症例はMDSの20-30%存在し、ゲノム異常領域からのアプローチには限界がある。そこで近年、急速な技術革新が見られている次世代リシークエンサを活用したtarget-capture sequencingによるMDSにおける新規変異遺伝子の網羅的な探索を試み、20例のMDS症例の全エクソン解析により、約200個の腫瘍細胞特異的な変異が同定された。既知の標的遺伝子変異の他にも、多数の新規遺伝子変異が含まれた。複数の症例において共通して観察される遺伝子変異もあり、現在、それらの変異の多数例における頻度の解析を進めている。今後、本アプローチにより、治療標的となり得る分子が同定されることが期待される。骨髄異形成症候群MDSは、血球減少と急性骨髄性白血病への移行を特徴とする難治性の造血器腫瘍であるが、分子病態についても不明な点が多い。有効な治療法の開発には、標的となる分子の同定と病態理解が必須である。我々はMDSの約30%の症例に観察されるコピー数の変化を伴わないLOH(aUPD)領域内に標的候補である遺伝子変異が高頻度に存在することから、同領域内の新規標的遺伝子探索を行った。4番染色体長腕aUPD例においてaUPD内に存在するTET2遺伝子変異が高頻度(5/6例)に生じており、同領域の標的遺伝子であることが明らかとなった。本変異はMDSおよび関連疾患の約30%で認められ、MDSの病態に重要な役割を担っていると予想され、現在、機能解析の準備を進めている。aUPDを有する症例を用いて、aUPD領域内の変異遺伝子を探索することは、新規標的遺伝子の探索において有用なアプローチであった。変異遺伝子の探索の方法としては、次世代リシークエンサを活用したtarget-capture sequencingは有用であると考えられた。アジレント社のSure-selectを用いて、全エクソンなど特定のゲノム領域を濃縮することで、効率良く目的の領域のシークエンスを行うことが可能であった。また、同一症例から採取した末梢血からTリンパ球を純化し、自己対照として解析することにより、MDSクローン特異的な変異を見出すのに有効であった。骨髄異形成症候群(MDS)は、血球減少と急性骨髄性白血病への移行を特徴とする難治性の造血器腫瘍であるが、分子病態についても不明な点が多い。治療成績の改善には、多様な分子病態を理解し、治療標的候補分子の同定することが必須である。高密度SNPアレイ解析により、MDSの約30%の症例に観察されるコピー数の変化を伴わないLOH(aUPD)領域内に標的候補である遺伝子変異が高頻度に存在する。そこで同領域内の標的遺伝子探索を行い、4番染色体長腕aUPD例においてTET2遺伝子変異が高頻度(5/6例)に生じ、同領域の標的遺伝子であることが明らかとなった。
次世代衛星通信・放送の回線品質補償技術の開発

次世代の高速衛星通信・放送の回線品質安定化を目標に、マルチビーム衛星に対して以下の結果を示した。(1)降雨が回線に与える影響を気象予測データから予測し、送信電力制御等を行う対策は有用である。(2)効果的補償には、より短時間の降雨予測と対応が必要である。(3)短時間に強い雨が降る場合には、送信電力の制御だけでなく、符号化率や伝送速度の変更などの対策も必要である。また、大気が回線品質に与える影響を評価し、アンテナサイズが大きくなると大気揺らぎの影響が無視できないことを示した。次世代の高速衛星通信・放送システムの回線品質補償技術の確立を目指し、研究室で蓄積してきた大量の実験データと様々な気象データを用いて気象と電波伝搬の関係を評価するためのシステムを構築し、解析を進めると共に、新キャンパスにおいて引き続き新たな実験データを取得していくための準備を進めた。今年度は以下の成果を得た。(1)これまでに取得してきた降雨強度と受信信号レベルのデータを用いて、電波伝搬に影響を与える降雨の状況について統計的な評価を行った。その結果、一定時間内の降雨のありかたには、弱い雨が長時間降り続く状況や強い雨が短時間に降るといった様々な状況があるため、1時間降水量の値だけで回線品質を評価することは適当ではなく、前後の時間のデータをも組み合わせて、更に高次の統計量も活かした解析が必要であるという結果を得た。(2)回線補償法の検討の1つとして、気象庁が発表している降水予測値を参考にしてマルチビーム衛星放送の回線品質を単純に予測し、劣化が予測されるビームの電力を増力する方法の有効性を評価した。単純な方法ではあるが回線品質を改善できる可能性を得た。ただし、九州や沖縄を指向するビームに対しては電力増幅だけの対応では所望の品質を得ることが困難であった。(3)回線品質補償技術の評価に用いるための衛星回線シミュレータ開発の基礎として、実験で得られた受信信号レベルの時間変化量を用いてビット誤りを模擬する方法を検討した。ビット誤りが発生し始めるあたりの信号変動については実測に近い振る舞いをもつビットエラーを発生できた。(4)Ka帯の衛星通信への影響は降雨だけでなく大気媒質がランダムに変動する影響が大きいことも予想される。理論的な視点から大気がKa帯電波伝搬に及ぼす影響の解析を進め、アンテナの開口が大きくなると大気媒質の揺らぎによる回線品質への影響が無視できないことを示した。次世代の高速衛星通信・放送システムの回線品質補償技術の確立を目指し、昨年度に引き続き、研究室で蓄積してきた大量の実験データと様々な気象データを用いて気象と電波伝搬の関係を評価するための解析を進めた。また次世代衛星通信で用いられるKa帯システムに伝搬路媒質の揺らぎが及ぼす影響を理論的に評価した。(1)これまで衛星回線の品質を予測するための評価基準として1時間降水量を用いてきたが、1時間内に観測される降雨の状況にはばらつきが大きく、効率的な予測を行うためにはより短い時間で降雨を評価し、回線品質を予測することが必要であることを示した。国内に配置されている気象観測所で観測される短時間降水量の基準が10分間となっていることから、この時間を基準として降雨強度と降水量の関係及び信号減衰の関係を評価したところ、降水量と観測された降雨強度、信号減衰量間のばらつきが小さくなり、精度よい予測につながる可能性を得た。(2)Ka帯の衛星通信へ大気媒質の揺らぎが与える影響を不均質乱流媒質中の多重散乱理論を用いて解析し、評価した。地球から衛星に向けたアップリンク通信時には大気乱流によって引き起こされるビーム波の到来点が揺らぐスポットダンシングと波面の波形が歪む影響により誤り率が増加すること、衛星から地球局に向けたダウンリンク通信時には受信波の空間コヒーレンスの減少が主要因となって誤り率が増加することを数値解析により確認し、大気乱流媒質が与える影響が上り回線と下り回線で異なることを示した。(3)技術試験衛星である超高速インターネット衛星WINDSを用いた通信実験を九州内の福岡、佐賀、鹿児島間で実施し、降雨がKa帯衛星通信に及ぼす影響を観測した。実験中に短時間ではあったが集中的な降雨が観測され、既存のKu帯と比較して大幅な信号減衰が観測され、降雨対策が必要であることを確認した。次世代の高速衛星通信・放送システムの安定した利用を実現するために、マルチビーム衛星システムを対象に、ビームエリア毎に降雨が衛星通信に与える影響を予測し、事前に各ビームに対策を行うことで、回線品質を補償する技術の確立を目指した。このために、Ku帯衛星通信システムを用いて研究室で蓄積してきた大量の実験データを用いて、降水量と降雨強度、信号減衰の関係について統計的な性質の評価を進め、今年度は以下の成果を得た。

(1)10分間降水量と観測時間内に観測される降雨強度の関係を調査し、降水量が多くなるに従って、観測される降雨強度が大きくなること、観測される降雨強度が広く分布していくこと、降雨強度の分布の広がりは一様ではなく、ピーク値をもつことを明確に示した。これまで主に用いられていた1時間降水量を用いた解析では、時間内に観測される降雨強度が小さい降雨強度側に偏って分布し、平均として過小評価される傾向があったのに対して、10分間降水量を用いることで、衛星回線に対する降雨の影響をより適切に評価できることを示した。(2)回線品質補償技術の検討に必要となる衛星回線に影響を及ぼす降雨が持続する時間の評価を行った。実験データに対して、幾つかの降雨強度の閾値を定め、それを超える降雨が持続する時間を評価した。解析の結果、降雨強度が強くなるほど閾値を超える降雨が持続する時間が短くなるが、降雨強度が30mm/hを超える強い雨の場合でも10分を超えて持続する場合があることを示した。このことから衛星回線に影響を及ぼす降雨の持続時間は数分間続くこともあり、回線を維持するためには、送信電力の増力だけでは十分な対策がとれず、符号化率の変更、伝送速度の変更、タイムダイバーシチの適応などが必要であることを示した。
致死的突然変異生成による新規エイズ治療法の実用化へ向けた基礎理論研究

本研究では、変異原によりHIV-1遺伝子に変異を誘導することで遺伝子を破壊し、ウイルス産生を抑制する「致死的突然変異生成法」の考えに基づいたエイズ治療法の基礎理論を確立することを目的としている。エイズの根治を困難にさせている要因として、寿命の長いHIV-1潜伏感染細胞(半減期が約44か月)の存在が指摘されており、既存の治療法(HAART)ではこれらの細胞を体内から排除できないことが問題になっている。平成29年度は、致死的突然変異生成により潜伏感染細胞を体内から根絶するための数理的条件を明らかにしたが、この結果はHIV-1に対する免疫の効果を陽に含んでいない点が不十分であった。治療に役立つ、より精度の高い定量的予測を可能とする数理的条件を得るため、平成30年度は免疫の働きを考慮したHIV-1感染数理モデルを構築し、免疫力の強化が潜伏感染細胞の排除に与える影響について計算機シミュレーションを行い検討した。具体的にはHIV-1特異的傷害性T細胞のダイナミクスを考慮したHIV感染数理モデルを構築し、計算機シミュレーション実験により変異原投与後のHIV感染細胞数等の増減の時間変化を調べた。その結果、潜伏感染細胞を完全に排除することはできないが、ウイルスの過剰な増殖を抑制できる、いわゆる「免疫」状態が存在し、免疫の活性度を高めることで、免疫状態が安定化することを明らかにした。しかしながらその一方で、変異原の効能によっては免疫状態が不安定化することが判明し、体内で免疫状態を維持するには、免疫の活性度と変異原の効能がある一定の数理的条件を満足する必要があることを示した。平成29年度の研究成果は国際会議AROB2019で発表した。研究成果が出てきたことに伴い、国際会議・国内学会での発表件数が増えてきているが、国際論文誌への論文投稿が未達である。今年度は、致死的突然変異生成法における免疫効果について研究を進めると同時に、これまでに得られた研究成果をまとめ国際論文誌への投稿準備を進める。現在、既存の抗HIV-1薬に対して薬剤耐性株が確認されており、近い将来、現状唯一のエイズ治療法である多剤併用療法が効力を失う危険性がある。そのような中、ウイルス遺伝子に変異を誘導する変異原を薬剤として応用し、変異原によるウイルス遺伝子破壊によってウイルス感染を抑制する「致死的突然変異生成」の考えが提案され、この考えにもとづいたエイズ治療法の開発が欧米を中心に進められている。2010年には米Koronis社が変異原型のプロドラッグKP1461を開発し、第二相治験を実施しているが、結果は予測に反しネガティブであった。この治験が失敗した原因は今も未解明のままであり、このことが同治療法の研究開発の停滞を招いている。本研究では、この治験が失敗した原因メカニズムを数理的アプローチから解明し、そこで得られた定量的または操作的知見をもとに致死的突然変異治療法の潜在的能力を最大限引き出すための具体的指針を立てることを目的とする。そこで本年度は、治験の過程を再現するために生体内でのHIV-1感染過程をシミュレートする数理モデルを開発した。このモデルでは、変異原によるHIV-1遺伝子(Protease遺伝子、Tat遺伝子)の変異の結果、孫ウイルスの産生率低下と感染能力を欠損した孫ウイルス生成を考慮している。現在、生体内との比較実験のため、培養細胞下におけるHIV-1感染過程を再現するシミュレーションモデルの構築を進めている。今年度は、培養細胞下におけるHIV-1感染過程を再現するシミュレーションモデルの構築を計画していたが、まだ未達成である。その理由は研究時間の確保が難しかったことによる。エイズの根治を困難にさせている要因として寿命の長いHIV-1潜伏感染細胞(半減期が約44か月)の存在が指摘されており、既存の治療法ではこれらの細胞を体内から排除できないことが明らかになっている。そこで平成29年度は、致死的突然変異生成により潜伏感染細胞を体内から根絶する可能性について数理的に検討した。具体的には潜伏感染細胞のダイナミクスを考慮したHIV感染数理モデルを構築し、計算機シミュレーション実験により変異原投与後のHIV感染細胞数の増減の時間変化を調べた。その結果、HIV-1感染細胞数は変異原投与後、二段階の緩和(短期間の急激な減少とその後のゆっくりとした減少)をすることが明らかとなった。この二段階緩和の仕組みを調べたところ、急激な緩和は変異源による感染細胞の排除過程と一致し、ゆっくりとした緩和は潜伏感染細胞の排除過程と一致すること示した。またゆっくりした緩和の対数スケールでの傾きは、潜伏感染細胞の死亡率+再活性化率であった。この知見を元に、潜伏感染細胞存在下での治療戦略として変異原とウイルス再活性化薬の併用が有効であることを明らかにした。これらの研究成果を日本物理学会第73回年次大会で発表した。平成29年度に取り組む課題はまだ残っているが、今年度に取り組む課題を先に解決しつつあるため。エイズの根治を困難にさせている要因として、寿命の長いHIV-

1潜伏感染細胞(半減期が約44か月)の存在が指摘されており、既存の治療法(HAART)ではこれらの細胞を体内から排除できないことが問題になっている。平成29年度は、致死的突然変異生成により潜伏感染細胞を体内から根絶するための数理的条件を明らかにしたが、この結果はHIV-1に対する免疫の効果を陽に含んでいない点が不十分であった。治療に役立つ、より精度の高い定量的予測を可能とする数理的条件を得るため、平成30年度は免疫の働きを考慮したHIV-1感染数理モデルを構築し、免疫力の強化が潜伏感染細胞の排除に与える影響について計算機シミュレーションを行い検討した。具体的にはHIV-1特異的傷害性T細胞のダイナミクスを考慮したHIV感染数理モデルを構築し、計算機シミュレーション実験により変異原投与後のHIV感染細胞数等の増減の時間変化を調べた。その結果、潜伏感染細胞を完全に排除することはできないが、ウイルスの過剰な増殖を抑制できる、いわゆる「免疫」状態が存在し、免疫の活性度を高めることで、免疫状態が安定化することを明らかにした。しかしながらその一方で、変異原の効能によっては免疫状態が不安定化することが判明し、体内で免疫状態を維持するには、免疫の活性度と変異原の効能がある一定の数理的条件を満足する必要があることを示した。平成29年度の研究成果は国際会議AROB2019で発表した。研究成果が出てきたことに伴い、国際会議・国内学会での発表件数が増えてきているが、国際論文誌への論文投稿が未達である。今後は培養細胞下におけるHIV-1感染過程を再現するシミュレーションモデルの構築を進める。生体環境と培養細胞環境における変異蓄積速度の差に注目し、生体内での致死的突然変異生成法が抱える問題点を明らかにしていく。本年度は、変異原を含む多剤併用療法の併用効果について数理的検討を行う。ウイルス継代実験において、変異原と抗HIV-1薬の併用がHIV-1の感染能力の喪失を促すとの実験結果が得られている。その一方、生体内での検証はおこなわれていない。本課題では、変異原及び既存の抗HIV-1薬の作用をモデル化し、生体内における併用効果に関して計算機シミュレーション実験を実施する。そして併用時に効用の相乗効果が現れるかどうか明らかにする。今年度は、致死的突然変異生成法における免疫効果について研究を進めると同時に、これまでに得られた研究成果をまとめ国際論文誌への投稿準備を進める。研究の遅れにより、シミュレーション実験用のアプリケーションソフトの購入が未達であること、及び海外での研究発表を行わなかったため。次年度使用額が生じた理由:投稿論文が不採択となり論文掲載料の支払いが生じなかったこと、及び国際学会での論文投稿に間に合わなかったため、学会参加費と旅費の支払いが生じなかったため。使用計画:再投稿論文の論文掲載料、及び国内、国際学会での参加費と旅費に予算を充てる。次年度使用額が生じた理由は、当初見込んでいた論文投稿費用(英文校正費を含む)に相当する研究予算が未執行だったためであり、この予算は本年度において論文投稿および国際会議参加費用として使用する予定である。
シロイヌナズナにおけるセレンの新規生理機能とセレン調節因子の解析

セレン(Se)はヒトや動物にとって生きていくために必須の微量栄養素であるが、植物はSeを根から吸収するものの、それらを細胞内で積極的に利用できないと考えられていた。しかし本研究において、極微量のSeは実生段階の植物にとって、生育を促進するなどの効果を示すことが明らかになった。そのSeの効果を詳しく調べたところ、解糖系というエネルギーを生成する代謝系に関わるいくつかの酵素が、Seにより活性化されることが判明した。本年度は、高等植物におけるセレン(Se)の必須微量元素としての生化学的意義を解明することを最終目的に、研究実施計画に従って主に以下の点について明らかにした。1.シロイヌナズナの生育に及ぼすSe栄養の影響硫黄栄養が制限されていない通常のMS培地に種々の濃度のセレン酸ナトリウムを添加して、シロイヌナズナ種子を播種した後、10日目から経時的にシュートと根の新鮮および乾燥重量を測定することにより、植物体の生育に及ぼすSe栄養の影響を評価した。その結果、0.51.0μMセレン酸ナトリウムを添加したMS培地において、シロイヌナズナ実生の新鮮および乾燥重量が1.151.20倍に増加した。このことから、極微量のSeはシロイヌナズナ実生の生育にポジティブに作用することが明らかになった。2.シロイヌナズナNADH依存グリセルアルデヒド-3-リン酸デヒドロゲナーゼ(NADH-GAPDH)タンパク質へのSeの取り込み機構の解明1.でSeにより生育の増加傾向が認められた植物体におけるNADH-GAPDH活性は1.4±0.2倍に増加していた。NADH-GAPDHのSeによる活性化が、GSHを介した酵素タンパク質へのSeの取り込みに起因すると仮定し、GSH合成阻害剤のSeによるNADH-GAPDH活性化に及ぼす影響を調べた。約20%までGSH量が低下した植物では、NADH-GAPDHのSeによる活性化は認められなかった。Seにより活性化したNADH-GAPDHと、GSH阻害剤存在下でSeにより活性化しなかったNADH-GAPDHをそれぞれ精製し、質量分析により酵素タンパク質におけるSeの存在を評価した。その結果、Seにより活性化したNADH-GAPDHにはSeが結合しているものの、GSH阻害剤存在下でSeにより活性化しなかったNADH-GAPDHにはSeが存在しないことが判明した。以上、植物細胞におけるGSHを介した酵素タンパク質へのSeの取り込みが初めて明らかになった昨年度に引き続き、高等植物におけるセレン(Se)の必須微量元素としての生化学的意義を解明することを最終目的に、研究実施計画に従って主に以下の点を明らかにした。1.シロイヌナズナNAD依存グリセルアルデヒド-3-リン酸デヒドロゲナーゼ(NAD-GAPDH)へのSe取り込みと活性化機構の解明Se(1μMセレン酸ナトリウム)を含むMS培地およびSeを含まない通常のMS培地で17日間生育させたシロイヌナズナより、それぞれNAD-GAPDHを精製した。得られた精製酵素をトリプシンによりペプチド断片にまで消化し、それぞれの質量をMALDI-TOF/MSおよびQ-TOF/MSにより解析することで、Seの取り込み部位とその化学形態について検討した。その結果、基質のグリセルアルデヒド-3-リン酸が結合する触媒部位に相当する155番目のシステイン残基(155-Cys)を含むペプチド断片の質量のみが、Seにより活性化したNAD-GAPDHにおいて、126増加していることが判明した。このことより、Seの結合部位は触媒に関与する155-Cysであり、そこでセレノール基(-SeH)の形態で存在していることが強く示唆された。2.解糖系酵素およびATP生成量に及ぼすNAD-GAPDHのSeによる活性化の影響NAD-GAPDHがSeにより1.4±0.2倍活性化することに伴い、実生の新鮮重量が有意に増加することが明らかになっている。この点を明らかにするために、NAD-GAPDH活性が増加した植物体、すなわち1μMセレン酸ナトリウム存在下で生育させた植物体における他の解糖系酵素の活性およびATP生成量を測定した。その結果、ホスホグリセリン酸キナーゼおよびピルビン酸キナーゼなどの解糖系酵素の活性およびATP生成量は、Seにより有意な影響を受けていなかった。昨年度に引き続き、高等植物におけるセレン(Se)の必須微量元素としての生化学的意義を解明することを最終目的に、研究実施計画に従って主に以下の点を明らかにした。1.シロイヌナズナ解糖系酵素のSeによる調節機構昨年度、1μMセレン酸ナトリウムを含む培地で生育したシロイヌナズナの細胞質型NAD依存グリセルアルデヒド-3-リン酸デヒドロゲナーゼ(NAD-GAPDH)がセレン化により活性化されることを明らかにした。今回、硫黄トランスポーターのSULTRが高発現する低硫黄濃度条件下における、NAD-GAPDHおよびトリオースリン酸イソメラーゼ活性に及ぼすSeの影響について検討した。

その結果、低硫黄濃度条件下におけるSeによるNAD-GAPDHの活性化(1.55±0.11倍)は、通常の硫黄条件下(1.31±0.08倍)と比べて有意に高くなっていた。この結果は、低硫黄濃度条件により、細胞内に取り込まれるSe量が増加し、それに伴い、多くのNAD-GAPDHタンパク質がセレン化されたことによるものと示唆する。一方、Seによるトリオースリン酸イソメラーゼ(TPI)活性の増加は、低硫黄濃度条件下でも有意差は認められなかった。SeによるTPI活性の増加は、RT-PCRおよび特異抗体を用いたウエスタンブロッティングの結果より、翻訳時調節によることが明らかになった。2.カラミダイコン実生の解糖系に及ぼすSeの影響播種後10日目のSe処理したカラミダイコン実生に取り込まれたセレン量は、新鮮重量と正の相関を示した。Seの取り込みおよび有意な新鮮重量の増加が認められたカラミダイコン実生において、解糖系酵素(NAD-GAPDHおよびTPI)の有意な活性増加と、呼吸活性およびATP量の増加、および葉緑体型カルビン回路酵素の活性増加が認められた。
病弱教育におけるキャリア発達支援プログラムの開発

本研究は、院内学級における病弱児対象のキャリア発達支援プログラムを開発することを目的とした。協働的な参加型アクションリサーチの手法に則り,病弱教育担当教師と研究者が協働して研究を進めるスタイルを採用した。病弱児本人や保護者、教師たちへのインタビュー調査および質問紙調査から、病弱児の社会的自立に必要な力として「自分のことを他者に説明する力」が重要であることを明らかにし、その育成をねらいとする院内学級における教育プログラムを開発・提案した。特別支援教育においては,平成21年の特別支援学校学習指導要領の改訂において職業教育とキャリア教育の充実が要点として示されて以来,キャリア教育へ関心が向けられ,研究課題としても取り上げられるようになった。しかし、先行研究の多くは知的障害のある子ども対象のキャリア支援であり、病弱教育領域のキャリア発達支援を扱った研究は見当たらないのが現状である。病弱児は,協調性の低さ等の社会性の問題をはじめ,自立した適応的生活を送る上での独自の課題を有しているとされるが,キャリア発達支援を意識した教育プログラムは具体的に提案されていない。本研究は,病弱児の教育的環境として重要な意味を持つ院内学級におけるキャリア発達支援プログラム開発を目的とする。平成25年度は、次の研究活動を行った。特別支援教育におけるキャリア教育に関する文献研究により、「キャリア教育」がいわゆる職業教育という狭い枠組みでとらえられるのではなく、発達過程における移行支援、ひいては地域生活を含めた生涯にわたる適応支援としてとらえることの重要性が明らかになった。第二の研究として、病弱教育担当教員を主な対象として文部科学省から講師を招聘した講演会を開催し、「病弱教育におけるキャリア教育の現状と課題」に関する政策的な観点からの情報収集、および知識の普及に努めるとともに、病弱教育担当教師がキャリア発達支援に関してどのような力をつけたいと感じ、またどのようなことを支援上の課題と考えているのかに関する情報収集を行った。さらに、当初計画では、次年度に予定されていた当事者のキャリア発達支援ニーズに関する調査研究にも着手し、2名の小児がん経験者(成人)にインタビュー調査を行った。以上の研究成果は研修会講演を通して、病弱教育現場へフィードバックを行った。現在学会発表および論文執筆を準備中であり、次年度以降に公表していく予定である。交付申請書に記したとおり、本研究は、病弱児の教育的環境として重要な意味を持つ院内学級におけるキャリア発達支援プログラム開発を目的として行われた。平成26年度は、次の研究活動を行った。1.当事者のキャリア発達支援ニーズに関する研究として、新たに1名の母親にインタビュー調査を行い、平成25年度に行った2名の小児がん経験者(成人)へのインタビュー調査結果とともに逐語録化し、現在分析中である。特別支援学校卒業生については、学校ベースで蓄積された質問紙ベースのデータが存在することがわかり、現在データの活用可能性について確認中である。2.院内学級担当教師の捉えたキャリア発達課題に関する研究活動としては、前年度行った質問紙調査データを分析し、学会発表および論文として公表した。院内学級におけるキャリア発達支援を扱った実証研究は皆無であり、貴重な成果を公表することができたと考えている。キャリア発達支援実践についての研究に関しては、2つの病院内教育機関における小学部高等部までの支援実践に関する情報収集が継続中である。当初予定の面接調査ではないが、むしろ記憶に頼らないより詳細な指導案レベルのデータを収集できたことは大きな成果であった。3.院内学級における病弱児対象の新たなキャリア発達支援プログラム開発研究として、東京都内大学病院内学級との共同研究体制が確立し、院内学級におけるキャリア発達支援プログラムとして、退院支援プログラム作成に着手することができた。現場との協働体制確立は大きな収穫であると考えている。さらに、海外の病院における退院支援プログラムに関する情報収集も行うことができ、プログラム開発への応用が期待できる。以上の研究成果は学会発表6回、論文1本として公表し、かつ、研修会講演を通して病弱教育現場へフィードバックを行った。本研究は病弱児の教育的環境として重要な意味を有する院内学級におけるキャリア発達支援プログラム開発を目的として行われた。最終年度にあたる平成27年度は、下記の通りプログラム開発に従事した。1.院内学級における病弱児対象の新たなキャリア発達支援プログラム開発:26年度末に訪問した米国ボストン小児病院における退院支援プログラムより、チャイルド・ライフ・スペシャリスト(以下、CLS)が復学先に出向いて、教員・クラスメート対象に病状や教育上の留意点を説明することがあるとの情報を得た。しかし、我が国においては、CLSは全国でも8名しか配置されておらず、その援助を広く期待することは難しい。病児の社会的自立のひとつの節目が退院時であること、また今後も環境移行のたびに周囲の支援を引き出していくことが欠かせないことの2点から、「自分の病気理解」「援助要請」のベースとなる自己理解とコミュニケーション力を育てることを目的とするプログラムを考案し、東京都内の院内学級において実践し、内容について再検討を行った。さらに、別の病弱教育機関における校内研究と連携・協働しつつ、自立活動を中心としつつも教科教育をも含めた、キャリア教育授業づくりに従事し、「キャリア教育実践事例集」として冊子にまとめた。2.総括:本研究の成果を養護教諭を主な読者とする雑誌への論文1本、及び2本の学会発表として公表した。さらに、特別支援学校教諭対象とする研修・講演(6回)においても研究知見を紹介し、現場への幅広い浸透を目指して活動した。開発したプログラムについての紹介は、近日中に論文として発表していく予定である。

また、研究を進める中で「越境」「ゲーミング・シミュレーション」という2つの鍵概念の本研究課題への応用可能性に関する気づきを得、今後の展開への手がかかりも得ることができた。本研究は、院内学級における病弱児対象のキャリア発達支援プログラムを開発することを目的とした。協働的な参加型アクションリサーチの手法に則り,病弱教育担当教師と研究者が協働して研究を進めるスタイルを採用した。病弱児本人や保護者、教師たちへのインタビュー調査および質問紙調査から、病弱児の社会的自立に必要な力として「自分のことを他者に説明する力」が重要であることを明らかにし、その育成をねらいとする院内学級における教育プログラムを開発・提案した。平成26年度は以下の3つの研究目的を掲げ、従事してきた。第一の研究目的は、当事者のキャリア発達支援ニーズを明らかにすることであった。一般にアクセスしにくい当事者2名より25年度に収集したインタビュー・データの分析にとりかかることができた。また、患児保護者からは、キャリア発達支援を考える際に入院中や退院直後の適応という視点のみならず、長く地域で生きていく上で病経験の位置づけを考える必要があることが明らかになり、従来の医療者や病弱関係者にはない新たな視点を得ることができた。第二の研究目的は、院内学級担当教師を対象として,キャリア発達支援において「つけたい力」と支援実践内容について明らかにすることであった。前年度収集したデータをKJ法によって分析し直し、院内学級担当教師として子どもたちに「つけたい力」として11のカテゴリーの力が見出され、さらに大きくは「社会で他者とともに生きる力」「自分らしい人生を生きる力」「病とともに生きる力」の3つが相互に重複・関連しあいながら、潜在的な基盤として11の力に通底していることが明らかになった。昨年度進行が難しかった支援実践に関する情報として、40の実践についての指導案情報を収集することができた。第三の研究目的は、院内学級における病弱児対象の新たなキャリア発達支援プログラム開発である。26年度は米国の小児病院における退院支援プログラムに関する情報収集の機会を得ることができ、本プログラム開発へ応用可能な貴重な情報を得ることができた。また、長年のフィールドワークの成果として、院内学級現場との協働による研究体制を確立できたことは大きな収穫であったと考えている。以上より、次年度最終年度のまとめに向けて順調な進捗状況であると判断した。教育心理学、特別支援教育(病弱)本研究課題最終年度である27年度の研究推進方策として以下の点を挙げる。第一に、キャリア発達支援実践研究として、指導案の内容分析を行う。昨年度収集された40の実践事例に加え、本年度も現場との共同研究を継続することでさらに事例を増やす。「実践のねらい」「指導上の留意点としてどのようなことが挙げられているか」等の視点から事例の総括を行い、学会発表や論文としてのまとめ、研究成果の普及に取り組む予定である。
南米チリにおける大気汚染とバイオエアロゾルの統合解析による健康影響評価基盤の構築

南米チリの大気における病原性微生物に着目し、その地域性、経時的な種や量等の動態の把握、大気汚染物質との関連、また大気汚染物質による微生物保護作用の把握を目的とする。得られた成果は、大気汚染が重要な問題となっている南米チリの大気微生物に関する基礎データとなり、今後長期に渡り当該国でのバイオエアロゾル研究や公衆衛生に貢献することが期待できる。チリは、南米大陸の赤道付近から南極まで南北に長い地理的特性を有している。そのため、地球規模での気候変動の視点から長期モニタリングが求められるバイオエアロゾルと大気循環との関連を研究していくのに魅力があり、本研究で確立するプラットフォームがその礎となる。
心腎連関に果たす低酸素転写調節因子HIFの糖化修飾異常の役割の解明

本研究では臨床的に広く認知されている心腎連関の事象に対して、低酸素転写因子の糖化修飾異常の観点から分子生物学的検討を行った。慢性腎不全にて蓄積するメチルグリオキサールを候補物質とした検討では、培養細胞の低酸素応答において有意な影響が認められなかった一方、高血糖環境は最大約20%の低酸素応答の減弱をもたらした。本結果は、心腎連関ならびにメタボリックシンドロームの分子メカニズム解明の手がかりとなりうる重要な知見であると考えられた。本研究では、臨床的に広く認知されている心腎連関の現象に対し、(1)慢性腎障害患者にてしばしば認められるタンパクの糖化異常が、(2)低酸素応答性転写因子HIF(Hypoxia-Inducible Factor)の機能的減弱をもたらし、(3)低酸素組織障害を増悪させる、という仮説に対して分子生物学的検討を行った。Methylglyoxal(MG)は代謝の過程で産生される極めて細胞毒性の強い副産物で、慢性腎不全状態において生体内に蓄積され、リジン/アルギニン修飾を介してAGE s (Advanced Glycation End Products)の形成に関与している。そこでまず、MGがHIF応答性luciferaseレポーター遺伝子(HREluc)の低酸素発現誘導に及ぼす影響を調べた。今回、複数の細胞種(HeLa,HepG2,HK-2,A549)において検討を行ったが、同レポーターに対するMGの影響は認められなかった。また、代表的なHIFターゲット遺伝子であるエリスロポイエチンのエンハンサー領域に対する影響も調べたが、同様にMGの影響は見られなかった。さらにはWestern blot法にてHIF-1αの発現状況も調べたが(HeLa,HK-2)、その発現レベルはMGによって影響されなかった。一方で近年、HIFの機能的減弱は高血糖状況下においても観察されることが報告されている。高血糖環境はMGが産出され、生理的/機能的役割を果たす場でもあることから、次に高血糖そのものがHIFの発現・機能に果たす影響を検討した。HIF-1αタンパクの現量は高血糖による影響を認めなかった一方で、HIFの転写活性能の指標としてのHRElucレポーターアッセイでは、細胞種・実験条件依存的ながら最大20%前後の転写活性能の変動を認めた。本研究では、臨床的に広く認知されている心腎連関の現象に対し、(1)慢性腎障害患者にてしばしば認められるタンパクの糖化異常が(2)低酸素応答性転写因子HIF (Hypoxia-Inducible Factor)の機能的減弱をもたらし、(3)低酸素組織障害を増悪させる、という仮説に対して分子生物学的検討を行った。一方で近年、HIFの機能的減弱は高血糖状況下においても観察されることが報告されているが、高血糖環境はMGが産生され、機能的役割を果たす場でもあることから、次に高血糖そのものがHIFの発現・機能に果たす影響を検討した。高血糖刺激はHIF-1α鎖の発現量に影響を認めなかった一方で、HIFの転写活性能の指標としてのHRElucレポーターアッセイにおいて、最大20%前後の転写活性能の変動をもたらした。本結果は細胞に内在する低酸素転写応答のプログラミングが高血糖環境にて修飾を受けている可能性を示唆し、心腎連関ならびにメタボリックシンドロームの分子メカニズム解明の手がかりとなりうる重要な知見であるため、今後詳細な検討が必要であると考えられた。
胎盤絨毛由来のマスピン遺伝子を利用した、新たな妊娠合併症予知マーカーの検討

分娩前後の母体血中の胎児由来細胞と胎児由来DNAをそれぞれ定量し、それらの相関を調べることによって母体血中胎児DNAの由来・非侵襲的出生前診断での胎児由来DNAの有用性について検討した。次に、これまでの胎児由来DNA定量のマーカーであったSRY遺伝子の代わりに、絨毛由来のマスピン遺伝子をマーカーとした胎盤絨毛由来DNAを測定し、新たな妊娠合併症の予知マーカーとして利用できる可能性を検討した。新たに用いたmethylation-specific PCR法によって、マスピン遺伝子が胎児の性別に関係なく妊娠合併症の予知マーカーとして利用可能であることが示唆された。本研究では、妊娠母体および褥婦の末梢血において、絨毛由来のマスピン遺伝子をマーカーとした胎盤絨毛由来DNAを測定し、新たな妊娠合併症の予知マーカーとして利用できるかどうかを検討することが目的である。本年度にまず、主に検体収集と検体処理・保存を行った。広島大学病院の倫理委員会で承認された本研究への同意書に基づき同意を得た妊帰・褥婦の母体末梢血を採取し、血清分離し、血清を-80°Cに保存している。それに並行して、血清検体からのDNA抽出をQIAGEN QIAamp DNA Mini kitを用いて行い、-80°Cに保存している。これらの検体を用いて、2つのPCR法で母体末梢血中の胎児・胎盤由来DNAを定量解析している。これまでの研究では、Y染色体上のSRY遺伝子をマーカーとして母体末梢血中の胎児由来DNAを検出定量していたが、今回新たなマーカーとしてマスピン遺伝子を利用し、母体末梢血中の絨毛由来DNAの定量を行う。後者のマスピン遺伝子をマーカーとしたmethylation-specific PCR法は、本研究で新たに行うため、プローブ・プライマーを慎重に設定し購入した。研究の第一段階として、新たなmethylation-specific PCR法を用いた胎盤由来DNA測定法を評価することが必要である。よって現在、新たなmethylation-specific PCR法と、これまで行っていた定量法であるSRY遺伝子をマーカーとしたTaqMan PCR法とで母体末梢血中の胎児・胎盤由来DNAを定量し、随時データー蓄積・解析を行なって比較検討中である。本研究では、妊娠母体および褥婦の末梢血中の胎児胎盤由来DNAとして、絨毛由来のマスピン遺伝子をマーカーとした胎盤絨毛由来DNAを測定し、新たな妊娠合併症の予知マーカーでとして利用できるかどうかを検討することが目的である。本年度発表した成果に加え、本研究では新たなマーカーとしてマスピン遺伝子を利用したmethylation-specificPCR法を行い、母体血中の絨毛由来DNAの定量を進めている。このPCR法と以前より行なっているTaqMan PCR法とで分析したデータの比較検討、および、正常妊婦と妊娠合併症を有する妊婦の検体間での比較検討を行い、母体末梢血を用いた妊娠合併症の予知マーカーとして利用できるかどうかを検討中である。妊娠母体および褥婦の末梢血において、絨毛由来のマスピン遺伝子をマーカーとした胎盤絨毛由来DNAを測定し、新たな妊娠合併症の予知マーカーとして利用できるかどうかを検討することを目的とした。基礎的検討として、従来のSRY遺伝子をマーカーとした胎児DNA定量法、および今回新たなマーカーとしてマスピン遺伝子を用いたmethylation-specific PCR法の二つの異なる方法で、正常妊娠(男児妊娠20例、女児妊娠20例)での母体血中胎児DNA量を測定し比較検討した。この結果、従来の方法では男児妊娠の場合にしか母体血中胎児DNAが定量できなかったが、新たな定量法では、胎児の性別に寄らず母体血中胎盤絨毛由来DNAが定量できた。さらにこの新たな定量法で、早産症例、妊娠高血圧症例、子宮内胎児発育不全症例、絨毛羊膜炎症例の母体血中胎盤絨毛由来DNA定量を行った。それぞれの疾患症例群と正常妊娠群とで母体血中胎盤絨毛由来DNA量を比較検討した。今後本研究を基盤とし、さらに各種妊娠合併症症例を追加し、正常妊娠群と各種妊娠合併症の疾患群との比較で、母体血中胎盤絨毛由来DNA量に有意差が示されれば、臨床的に妊娠合併症の早期診断のための予知マーカーとしてマスピン遺伝子の有用性に注目できることとなる。本研究では、新たに用いたmethylation-specific PCR法によって、マスピン遺伝子が胎児の性別に関係なく妊娠合併症の予知マーカーとして利用可能であることが示唆された。今後のさらなる研究解析結果とともに成果を報告する予定である。
機能性分子F430を用いた堆積物深部メタン生成ポテンシャルの精密定量

当該研究期間において、種々の環境試料から高回収率で精密に補酵素F430を定量するための、前処理および分析法を開発し、従来法に対しておよそ10万倍の高感度定量分析法を確立した。これにより0.1フェムトモルでの定量検出が可能になり、最も検出が困難な海洋堆積物をはじめ、微生物マット、水田土壌、地下水などからの補酵素F430の検出を実現した。また、科学掘削史上最も深い海底下2000 mの石炭層において補酵素F430の検出に成功し、活きたメタン生成アーキアの存在を示した結果がサイエンス誌に掲載された。当該研究機関の研究成果は計4報の査読付論文と11件の学会発表により公表し、国内外で高い評価を得た。本研究の目的は、これまで定量的な議論が困難であった海洋堆積物深部でのメタン生成アーキアのバイオマスや活動を定量的に評価するツールを開発・実用化する事にある。具体的には、これまで応用されたことのない、メタン生成アーキアがメタン生成のために用いる機能分子、補酵素F430の堆積物中における濃度を精密に分析する手法を開発し、メタン生成アーキアの分布や活動度を定量的に明らかにする事である。それにより、メタンハイドレート形成や地球温暖化に関与するメタンが、海底下のどこで、どれくらいの速度で作られているのかを理解でき、地球における炭素循環に新しい知見を与えることができる。当該年度の計画は1.F430抽出・精製法の確立、2.F430標品の作成、3.1000倍程度の分析感度の向上を行うことであった。1.においては、試行錯誤の結果95%以上の回収率を実現できた。2.においては、メタン菌が高濃度に存在する活性汚泥試料からのF430メチルエステル(F430M)の抽出、高速液体クロマトグラフィー(HPLC)による単離によって得られたF430Mは各種分析によって高純度であることが確認でき、さらに濃度を決定することで、世界で唯一のF430Mの濃度既知溶液を作成することができた。これによりF430M標品の作成を達成できた。3.においては、標品を用いて、高速液体クロマトグラフ・質量分析計/質量分析計(LC-MS/MS)による分析法を開発した。これにより従来の分析手法に比べ10万倍の高感度化が実現できた。これらの成果はAnalytial Chemistryに掲載され、審査では高い評価を受けた。その他5回の学会発表(内国際学会2回)を行った。以上のように当該年度の研究計画を非常に高い次元で達成することができた。本研究の目的は、これまで応用されたことのない機能性分子F430の分析法を開発・実用化する事で、これまで不明であった海洋堆積物深部でのメタン生成アーキアのバイオマスや活動を定量的評価できるようにする事である。当該年度および次年度の研究計画は、1.環境試料中のF430の定量分析法を確立する、2.培養実験や、水田土壌などを用いてF430濃度とメタン生成アーキアのバイオマスや活性の関係性を明らかにする、3.深海掘削コアへの応用を行うことであった。1においては、水田、海洋堆積物、微生物マット、地下水など様々環境試料中からのF430の定量分析法を確立し、国際誌Analytical Chemistryに掲載された。2においては、様々な環境試料中のF430濃度が現場のメタン生成アーキアのバイオマスと相関することを示した。3においては、下北半島沖の掘削堆積物を用いて堆積物下0-2400 mにおけるF430の深度分布を明らかにした。特に、堆積物下70 mでF430の濃度が顕著に高くなる層準を見いだすことに成功し、メタン生成場とその規模の特定に成功した。また、海底下2000 m以深でのF430の検出にも成功した。これはこれまで報告されている海底下生命圏よりもさらに深部であることから、最深部の地下生命圏の検出という記録を樹立できる成果となった。これらの成果は3回の学会発表(内国際学会1回)にて研究報告を行った。以上のように当該年度の研究計画を高い次元で達成することができた。本研究の目的は、これまで応用されたことのない機能特異分子補酵素F430の分析法を開発・実用化することにより、これまで不明であった海洋堆積物深部でのメタン生成アーキアのバイオマスや活動を定量的に評価できるようにする事である。当該年度の研究計画は、補酵素F430濃度とメタン生成アーキアのバイオマスや活性の関係性を明らかにする、深海掘削コア等への応用を行う事であった。この目的に対し、海洋堆積物を含む様々な環境試料中の補酵素F430濃度と、微生物学的手法によるバイオマスを比較し、補酵素F430がバイオマスと相関することを示した。これらの成果は、2回の国際学会(うち1つはplenaryセッションに選出)と学術雑誌3報(うち1つはサイエンス誌)にて発表した。以上の様に、当該年度の研究計画を高い次元で達成することができた。

これにより0.1フェムトモルでの定量検出が可能になり、最も検出が困難な海洋堆積物をはじめ、微生物マット、水田土壌、地下水などからの補酵素F430の検出を実現した。また、科学掘削史上最も深い海底下2000 mの石炭層において補酵素F430の検出に成功し、活きたメタン生成アーキアの存在を示した結果がサイエンス誌に掲載された。当該研究機関の研究成果は計4報の査読付論文と11件の学会発表により公表し、国内外で高い評価を得た。平成26年度の研究計画は、1.環境試料中のF430の定量分析法を確立する、2.培養実験や、水田土壌などを用いてF430濃度とメタン生成アーキアのバイオマスや活性の関係性を明らかにする、3.深海掘削コアへの応用を行うことであった。1においては、主に環境試料特有の夾雑物の除去法を検討することであったが、シリカゲルカラムクロマトグラフィーを用いた夾雑物除去法を確立することができた。2においては様々な環境試料中のF430濃度とメタン生成アーキアの推定バイオマスの比較から、F430濃度がバイオマスと相関関係にあることを明らかにした。培養実験においては現在遂行中であり、平成27年度中には成果が出る予定である。3においては、下北半島沖で採取された堆積物コア試料を用いて、堆積物下0から2400 mのF430の深度分布を明らかにし、70 m付近に重要なメタン生成場があることを定量的に明らかにした。また、これまで報告がない深度2000 m以深でのメタン菌の存在を明らかにした。以上のとおり、平成27年度で培養実験を残すのみとなり、すでに当研究課題の難関はクリアしているため、最高評価とした。有機地球化学本研究課題のなかで、未遂行である培養実験を次年度に行う。まずはMethanothermobacter thermoautotrophicusを培養し、F430濃度とメタン菌バイオマスおよびメタン生成速度の関係性を明らかにする。その後、さらに数種のメタン菌や培養条件をコントロールした高度な培養実験へと移行する。当該年度の計画は1.F430抽出・精製法の確立、2.F430標品の作成、3.1000倍程度の分析感度の向上を行うことであった。1においては、低温度下における抽出、固相抽出カラムによる精製、誘導体化による安定化・低極性化の方法を確立したことにより95%以上の回収率を実現できた。また、2において、メタン菌が高濃度に存在する活性汚泥試料からのF430メチルエステル(F430M)の抽出、高速液体クロマトグラフィー(HPLC)による単離によって得られたF430Mは核磁気共鳴分光法や質量分析により高純度であることが確認でき、元素分析計により濃度を決定することで、世界で唯一のF430Mの濃度既知溶液を作成することができ、F430M標品の作成を達成できた。3においては標品を用いて、高速液体クロマトグラフ・質量分析計/質量分析計(LC-MS/MS)による分析法を開発した。従来、F430は吸光光度計を用いて定量分析が行われていたが、LC-MS/MSを用いたゼロコリジョンエナジーMRM法による分析法を確立し、従来の10万倍高という予定よりも遙かに高い次元で高感度定量分析法を確立した。このように、研究計画を完璧に達成できたため、最高評価とした。平成26年度の計画の内、環境試料中の夾雑物除去法の開発が比較的円滑に進み、培養実験を次年度に先送りしたため、物品費の使用が少なくなった。また、当初予定していた国際学会での研究成果発表を平成27年度に延期したため、旅費の余剰が発生した。