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運動器慢性痛の発症に関与する疼痛関連物質の生後発達因子からの探索

成熟処置で慢性痛がみられ、若齢処置では慢性痛がみられない慢性期においては、ほぼ正常に近い筋組織像が成熟、若齢処置のどちらも同様にみられた。また、分子生物学的検討において、炎症性サイトカインであるTNFαの発現は、急性期において成熟処置では増加しているのに対し、若齢処置ではやや減少傾向であった。慢性期においては成熟・若齢処置ともに処置前と同等であった。また、筋の分化・成熟に関与するmyogeninの発現は、急性期においてはTNFαと同様の傾向を示し、慢性期では処置前より成熟処置では減少、若齢処置ではほぼ同等であった。今後さらに、末梢での変化のみならず、中枢での可塑的変容の関与も併せて検索していくことにより、慢性痛発症メカニズムの解明につながる。疼痛学、リハビリテーション医学本モデルでは末梢筋損傷が長期痛み行動を引き起こすトリガーとなる可能性が考えられるため、障害筋である下腿三頭筋の凍結試料を作成し、血液サンプルの採取は順調に進んでいる。現在、筋組織でのサイトカイン、神経栄養因子など筋損傷および再生に関与する物質を現在試行検討中であるが、標的に最適と考えられる物質の決定に時間がかかっている部分に関してやや計画から遅れている。本モデルでは末梢筋損傷が長期痛み行動を引き起こすトリガーとなる可能性が考えられるため、障害筋である下腿三頭筋の凍結試料を作成し、血液サンプルの採取は順調に進んでいる。現在、筋組織でのサイトカイン、神経栄養因子など筋損傷および再生に関与する物質として、ELISAおよびPCR法を用いて現在試行検討中であるが、標的に最適と考えられる物質の決定に時間がかかっている部分に関してやや計画から遅れている。ただし、脊髄組織、血液サンプルでの物質の探索も同時に進めており、全体としてはおおむね順調に進んでいる。筋組織でのサイトカイン、神経栄養因子など筋損傷および再生に関与する物質として、ELISAおよびPCR法を用いての検索を継続する。その際、さらに関連文献の検索、関連分野の研究者からの情報も含めて検索の効率を上げる。また、脊髄組織、血液サンプルでの物質の探索も同時にさらに進行させていく。現在、筋組織でのサイトカイン、神経栄養因子など筋損傷および再生に関与する物質を試行検討中であるが、標的に最適と考えられる物質の決定に時間がかかっている。関与する物質の検討により関連の高い物質を決定し、その物質において、慢性痛の各時期における発現の本測定を行っていく。また、その結果をまとめ、論文化していく。モデル作成および行動実験に必要な薬品・消耗品に加えて、分子生物学的・免疫組織学的実験では、種々の抗体および薬品が必要で、それに応じてディスポーザブル器具・溶液作成のための試薬の購入が必要である。また、関連分野の情報の収集や実験打ち合わせ等による学会や研究施設間の移動の旅費も必要である。さらに、結果をまとめるうえで必要な図書、校正費等も必要となる。
15年戦争下における集団体操の奨励と国民身体の統制

本研究では、15年戦争下に数多く創出され、国家的に奨励された集団体操に着目し、国民の体力向上や身体の規律化が、なぜ体操で、どのように行われようとしたかについて検討することを目的とした。研究を通じて、この時期に創案・実施された種々の体操を網羅的に示し、工場、農村、各種団体における体操普及の実相を、体操を普及・指導した人々の言説編成や文部省、厚生省および関係諸団体を中心とした戦時体制への動きとともに論じた。本研究の目的は、15年戦争下に奨励された集団体操について、(1)戦時へ向かう中で考案・実施された種々の体操の実態把握、(2)各種団体、工場、農村などにおける普及の実相、(3)体操を指導した人々や文化人・知識人の言説編成の分析を通じで、国民の体力向上や身体の規律化が、なぜ体操で、どのように行われようとしたかについて検討することである。本研究は、30年代以降の国民体育奨励をめぐる識者の議論をふまえて、これまでの研究では十分にその歴史的位置づけを検討されてこなかったこれらの体操がどのような経緯で生み出されたのかを明らかにするものであり、22年度は上記(1)の作業のための資料収集をほぼ完了した。上記(2)については日中戦争勃発以降、国民体育の一つのモデルとして位置付く労働者の体操が、20年代末から産業衛生施策として取り組まれ始めた経緯について明らかにすることができた。その成果は23年5月の学会で発表し、速やかに論文化する予定である。22年度は、学会および雑誌において研究成果を公表することができなかったが、イギリスのDe Montfort大学主催の日英学術交流シンポジウム(Japanese Reflections on the History of Sport)で"Changes in Body and Health Values along with Modernization of Japan"と題して、明治以来の近代化・西洋化における医療体制の転換や体操の導入が日本人の身体観にもたらした影響や、その反動としての191020年代における脱西洋化を指向した動きについて口頭発表したことを付記しておく。これは、近代日本における体操実施の状況や体操の日本化という30年代状況の萌芽的状況を説明するものでもある。公式の学会ではないものの、イギリス・スポーツ史の第一線の研究者と日本の「近代」と「身体」について議論をする貴重な場となった。研究成果の公表に際しては、23年度中に著書(単著)として刊行することを予定している。23年度は複数の学会発表および雑誌論文等とあわせて研究成果の公表に精力的に取り組む所存である。本研究の目的は、15年戦争下に奨励された集団体操について、以下の諸点を明らかにし、国民の体力向上や身体の規律化が、なぜ体操で、どのように行われようとしたかについて検討することであった。(1)戦時へ向かう中で実施された種々の体操の実態把握(2)各種団体、工場、農村などにおける普及の実相(3)体操を指導した人々や文化人・知識人の言説編成23年度には以下のように研究成果の公表をおこなった。(1)研究発表「昭和初期の工場体操について」(日本体育学会体育史専門分科会、2011年5月)(2)論文(「昭和初期の工場体操普及について:産業衛生協議会答申と内務省社会局の取り組み」『龍谷紀要』33(1)、2011年9月、121-137)(3)研究発表「『体操の時代』:十五年戦争下の国民体育と集団体操」(早稲田大学東伏見スポーツサイエンス研究会、2012年1月)(4)著書(共著)「太平洋戦争下の国民体育と体操:東京帝国大学における鍛錬部の設置と『全学鍛錬体操』の実施」楠戸一彦先生退職記念論集刊行会編『体育・スポーツ史の世界:大地と人と歴史との対話』2012年2月、205-224(1)および(2)では1930年代に国民体育として成長を遂げる工場労働者の体操に着目し、内務省社会局および関係団体の動向を中心とした工場体操普及の施策化の過程を明らかにした。(3)では1930年前後から様々な体操が考案・普及される過程を国民体育の台頭と競技スポーツの後退という状況と合わせて説明した。(4)では1942年の大日本体育会設立前後から本格化する国民修錬、さらには学徒出陣に向けた高等教育機関における鍛錬体操実施の様子を競技スポーツの位置づけの変化にも着目して描き出した。15年戦争期の国民身体の統制に着目した従来の研究では、ラジオ体操が象徴的なものとして取り上げられてきたが、実際には文部省、内務省、厚生省のほか、関係諸団体が1930年前後から様々な体操を創案・普及し、日中戦争前後からはメディアも巻き込んで「体操の時代」を作り出していたことを明らかにすることができた。上記を含めた本研究課題の成果を公表すべく23年度中に著書の刊行を目指していたが、24年度にずれ込むこととなった。
長期野外活動の身体的健康に及ぼす影響-主に血中コレステロール代謝変動について-

長期野外活動における活動プログラムを「運動(身体活動)」として捉え、その影響が身体的生理機能にどのように関与するのか明らかにし、より効果的なウエルネスキャンププログラムのスタイルを構築する上の基礎資料とすることを目的とし、55名の女子学生を対象に、4泊5日のキャンプ活動を実施し、本研究を試みた。血中コレステロールの代謝変動について、バイオインピーダンス法による体脂肪率と個々の血清総コレステロール、中性脂肪、LDLコレステロール等の値の変化を検討した結果、有意に好ましい(適正値)変化が明らかになった。しかし、HDLコレステロールについては有意な変化はみられなかった。心拍数データによる、活動プログラムの運動負荷量推測値との関連性については、最も身体負荷量の多かった登山活動による影響が、疲労測定値からも、代謝変動に最も影響を及ぼしたプログラムであったことが推測された。今回の研究方法では、野外活動プログラムの一つ一つとの関連性を検討するまでは至らなかったが、活動プログラムを1日あたりの運動量としてとらえた場合、日常生活レベルに比して高く、適正運動量を充足するに十分な活動であったといえる。今後、身体疲労度との関連性を考慮しつつ、より検討すべき点である。今回の調査においては、栄養学的側面からの分析は、血中脂質を検討する上で不十分であった。野外活動における食品摂取状況は、調理しやすく、手間のかからないものに集中する傾向がある。その結果、栄養学的には非常に偏りのある栄養摂取状況にあると考えられる。生体内の脂質の組成は食餌由来の影響を強く受ける。飽和脂肪酸値、n-3,n-6系不飽和脂肪酸値等の分析を更に実施し、血中コレステロール値の代謝変動を栄養学的側面からもより深く分析する必要性が認識された。
周期性四肢疼痛に関わる新規遺伝子の機能解析と創薬への応用

我々は先行研究において、1乳児期よりはじまり成長とともに症状が軽減する。2四肢の大関節に定期的に繰り返す。3寒冷曝露で悪化し温熱曝露で改善する。4他合併症を伴わない、といった特徴を有する慢性疼痛家系6家系を見出し、エクソーム解析よりNav1.9をコードするSCN11A遺伝子の遺伝子変異(p.R222S/H)を同定した。さらにNav1.9 p.R222Sの遺伝子改変マウスを作成し、行動解析および電気生理学的解析によって、変異マウスは疼痛閾値が低下していること、疼痛経路である後根神経節(DRG)ニューロンの発火頻度が増加していることを明らかにした。以上より、SCN11A p.R222S/H変異は疼痛伝導路を過剰に興奮させることで痛みを引き起こすことを示した(Okuda et al., 2016)。この研究により、小児における発作性の四肢疼痛に対する原因遺伝子を確定し、新たな疾患概念として「小児四肢疼痛発作症」と命名、遺伝子診断を可能にした。2016年研究成果発表後、本疾患と同じ症状を持つ患者を日本全国から集積し、その原因である遺伝子変異をSCN11Aはじめ、疼痛経路に存在するSCN9A,10Aにおいても網羅的に探索した。その結果、本疾患症状をもつ疼痛家系が日本全国に分布し、その3割がSCN11A変異を持つことを明らかにし、SCN9Aの変異を持つ家系を見出した。新たに見出したSCN11A p.F814C, F1146Sの変異を持つノックインマウスを作成し、電気生理学的機能解析を行い、これら変異によって疼痛経路の神経の過剰興奮が起こり、疼痛発作を引き起こすことを示唆した(Kabata et al., Plos one 2018)。今後、引き続き全国的な症例収集、遺伝子変異の同定、客観的診断基準の確立を行うことによって、本疾患の社会的認知と治療体制整備への寄与が可能になると考える。本年度は、四肢の大関節に痛みを来す遺伝性慢性疼痛発症家系6家系で見いだされた痛み物質として考えられるSphingosine-1-phosphate(SPH-1-P)の代謝関連タンパク、(1)ペンタマイド(Paintamide)、および同家系で見つかった(2)ナトリウムチャネルの変異について、in vivo, in vitro解析を行った。1)Paintamideに関する解析患者の疼痛時、非疼痛時におけるPaintamideの血中濃度比較を行ったが差がなかった。ノックインマウス作成段階において、ノックアウトベクターによる複数のキメラマウスからF1ヘテロマウスを獲得することが困難であり、上記のとおり疼痛による差がなかったことから、ノックインマウス作成は行わないこととした。2)ナトリウムチャネルの変異変異X1,2の安定発現株において、パッチクランプ法を用いチャネル電流解析を行った。変異と野生型(WT)チャネル間で、チャネルの活性化において差がないことを示した。また、変異X2について作成したノックインマウス(6-8週令)において、疼痛行動解析を行ったところ、機械刺激、熱、冷感刺激においてノックインマウスで有意な差がみられた。今後、このマウスの老齢での疼痛行動、電気生理学的解析を行う。安定発現株による電気生理学的解析を終了し、チャネルの活性化は各変異と野生型で差がなかったことを見出した。作成中であったNav1.9変異のノックインマウスが完成し、それら若齢マウス(6-8週)の行動解析で、ノックインマウスが疼痛行動を示すことを見出した。今後、DRG採取による電気生理学的解析を行う。本研究では、遺伝性慢性四肢疼痛発症家系6家系から見出された変異についてKnock inマウスを作製し、その変異モデルマウスでの行動実験、電気生理学的実験により、疼痛発症メカニズムを解明することを目的とした。本年度は変異X2(以下R222S変異として表記)をもつ高齢Knock inマウス(36-38週齢)での疼痛行動解析を行い、若齢(8ー10週)と同様、変異マウスでの有意な痛覚過敏を示した。また、行動実験と同週齢の若齢マウス(野生型、X2 knock in mouse)から痛みの伝達経路であるDRGニューロンを単離し、活動電位の性質について、静止膜電位、活動電位発生の閾値、振幅の大きさ、幅、早さ(maximum AP rise/fall)、後脱分極について計測した。その結果、変異型のKnock inマウスにおいて有意に振幅が大きく、後脱分極が過分極側にシフトしていた。また、発火頻度においても変異型のKnock inマウスは有意に増大した。以上のことから、NaV1.9の変異(R222S)によりDRGニューロンが過剰に興奮することで疼痛発生に関与することを示した。本研究では、遺伝性慢性四肢疼痛発症家系6家系から見出された変異(SCN11A, pR222S/H)についてKnock inマウスを作製し、その変異モデルマウスでの行動実験、電気生理学的実験により、疼痛発症メカニズムを解明することを目的とし、その成果を論文として発表した(Okuda et al., Plos one 2016)。変異p.R222Sをもつ高齢Knock inマウス(36-38週齢)での疼痛行動解析及び電気生理学的解析によりNaV1.9の変異(R222S)はDRGニューロンが過剰に興奮することで疼痛発生に関与することを示した。

また、論文発表後、疼痛家系の集積を引き続き行っており、疫学的知見を得るとともに新たに見つかった変異について、機能解析を行う予定である。論文発表後、本研究で見つかった変異についての一般人口でのスクリーニング、および本研究室に問い合わせのあった疼痛患者に対する家族歴等の問診、臨床所見を得るとともに、Nav1.9のp.R222、およびNav1.9全体について遺伝子型の判定を行っている。現在までに多くの家系の解析を行っており、疫学的知見を得るためにも、本疾患の集積、周知活動を行う。我々は先行研究において、1乳児期よりはじまり成長とともに症状が軽減する。2四肢の大関節に定期的に繰り返す。3寒冷曝露で悪化し温熱曝露で改善する。4他合併症を伴わない、といった特徴を有する慢性疼痛家系6家系を見出し、エクソーム解析よりNav1.9をコードするSCN11A遺伝子の遺伝子変異(p.R222S/H)を同定した。さらにNav1.9 p.R222Sの遺伝子改変マウスを作成し、行動解析および電気生理学的解析によって、変異マウスは疼痛閾値が低下していること、疼痛経路である後根神経節(DRG)ニューロンの発火頻度が増加していることを明らかにした。以上より、SCN11A p.R222S/H変異は疼痛伝導路を過剰に興奮させることで痛みを引き起こすことを示した(Okuda et al., 2016)。この研究により、小児における発作性の四肢疼痛に対する原因遺伝子を確定し、新たな疾患概念として「小児四肢疼痛発作症」と命名、遺伝子診断を可能にした。2016年研究成果発表後、本疾患と同じ症状を持つ患者を日本全国から集積し、その原因である遺伝子変異をSCN11Aはじめ、疼痛経路に存在するSCN9A,10Aにおいても網羅的に探索した。その結果、本疾患症状をもつ疼痛家系が日本全国に分布し、その3割がSCN11A変異を持つことを明らかにし、SCN9Aの変異を持つ家系を見出した。新たに見出したSCN11A p.F814C, F1146Sの変異を持つノックインマウスを作成し、電気生理学的機能解析を行い、これら変異によって疼痛経路の神経の過剰興奮が起こり、疼痛発作を引き起こすことを示唆した(Kabata et al., Plos one 2018)。今後、引き続き全国的な症例収集、遺伝子変異の同定、客観的診断基準の確立を行うことによって、本疾患の社会的認知と治療体制整備への寄与が可能になると考える。作成したノックインマウスについて、電気生理学的な機能解析を行う。また若齢だけでなく、老齢での疼痛症状についても行動学的、電気生理学的解析を行う。疼痛経路に発現するチャネル変異の機能解析を詳細に行うことで、本疼痛家系だけでなく、チャネル変異による痛みを呈するメカニズムの解明をめざし、チャネル機構の創薬ターゲットとしての可能性を探る。今後は本研究で見つかった変異についての一般人口でのスクリーニング、および本研究室に問い合わせのあった疼痛患者に対する家族歴等の問診、臨床所見を得るとともに、Nav1.9のp.R222について遺伝子型の判定を行う。研究計画通りに研究を完了したが、その成果を学会発表、研究対象者及び学術雑誌への報告のため、学術研究助成基金助成金の補助事業期間を一年度延長する。大学経費にて購入してあった試薬を使用することができたため。研究成果報告のための学会経費や旅費、およびk根久対象者への解析結果報告等に使用する。
野外環境における光による花成制御の分子機構

適切なタイミングでの花成は、植物の生存戦略としてだけでなく農業においても重要である。花成ホルモンフロリゲンをコードするFT遺伝子の発現は、これまでの実験室条件では、夕方に1回のみであり、そのことを前提とした基礎・応用研究が進められてきた。しかし申請者らは、野外条件においてFTは夕方だけでなく朝方にも発現しており、花成に重要な役割を果たしていることを見出した。そこで本研究では、朝にFTが誘導される分子メカニズムの解明を目的とする。本研究は、外的符合モデルの見直しにつながるだけでなく、植物工場や精密農業にも大きなインパクトをもたらす。
舌エコーで舌初期癌の治療戦略を変える

平成29年度に粘膜上皮層の描出に焦点を絞った研究に移行し、音響カップリング材の試作とその性能検証を遂行してきたが、平成30年度はその成果をもとにさらなる展開を行った。口腔粘膜へ適用しうるサイズや形態のものでは現在最高水準の高分解能を有する超高周波探触子である、GE社製L10-22-RSを超音波診断装置本体LOGIQ e Premiumとともに導入し、正常な舌粘膜の描出の極限性能について検証した。粘膜と探触子とのカップリング部には、平成29年度の成果として得られた、アーチファクトがほとんど生じない寒天ゲル音響カップリング材とPMPラップとの組み合わせを基本として採用した。また、現在日常診療で使用している高分子ゲル音響カップリング材との比較も行った。その結果、正常な舌の側縁においては、寒天ゲル音響カップリング材を用いた場合、高分子ゲル音響カップリング材では界面での表面反射による音響陰影アーチファクトによりマスクされていた粘膜上皮層の深部辺縁の微細な凹凸が表現されることが確認できた。この凹凸は粘膜上皮の上皮釘脚の形態が再現されている可能性が高いこと、またドプラモードにおいては正常な粘膜上皮であっても上皮釘脚の辺縁に沿ったループ状の血流がアーチファクトを受けず明瞭に確認でき、上皮乳頭内ループ状毛細血管の一部が描出されうる可能性が示唆された。本研究の結果は、今後の口腔癌の深達度診断に必要な粘膜上皮基底部の定義において、少なからず影響を与える可能性があるものと考えられた。本研究の成果は、第73回NPO法人日本口腔科学会学術集会(平成31年4月20日,川越市)において宿題報告の一部として発表を行った。また、同日同学会にて併催された超音波研修会ハンズオンでも寒天ゲル音響カップリング材とL10-22-RS探触子による正常舌粘膜の描出について実演を行った。2013年1月から2014年12月にかけてエラストグラフィを施行した初期舌癌患者25例を対象としてretrospective studyを行った。内訳は女性10例、男性15例で、年齢は最低38歳、最高85歳、中央値64歳であった。病理組織学的には扁平上皮癌が20例、上皮内癌が5例で、扁平上皮癌症例のT分類はT1が7例、T2が13例であった。超音波診断装置本体には日立メディコ社製Preirusを使用し、探触子にはホッケースティック型の7-13Mz術中用小型探触子を使用した。舌エコーは、探触子表面に厚み3mmあるいは5mmの高分子ゲル音響カップリング材を装着し、探触子保護のためラップでカバーして腫瘍表面にあてて施行した。まず通常のBモードを施行し、粘膜上皮層と連続性のある低エコー域として描出される腫瘍領域を確認した。次いでエラストグラフィを施行し、Bモードで描出された腫瘍領域とエラストグラフィで青く表示された硬い領域との範囲の相違を評価し、病理組織学的所見における筋層浸潤の有無と比較した。その結果、病理組織学的に筋層浸潤が認められた症例(20例)では、全例でBモードにおける低エコー域とエラストグラフィで青く表示される硬い領域との範囲が不一致であり、低エコー域よりも1mm幅以上の広い範囲にエラストグラフィで硬い領域のにじみ出し所見が得られた。一方、病理組織学的に筋層浸潤が認められなかった症例(5例)では、全例でBモードにおける低エコー域とエラストグラフィで青く表示される硬い領域との範囲がほぼ一致していた。以上より、Bモードの低エコー領域とエラストグラフィの硬い領域の範囲の相違に注目することで、初期癌の筋層浸潤の有無を推測できる可能性が示唆された。25症例のretrospective studyにより、病理組織学的な筋層浸潤を推測しうる可能性のある有用なエラストグラフィ所見を得ることができ、本研究の成果について複数回の国内学会発表と国際学会での招待講演を行い、和文誌に掲載され、国際誌への投稿準備を整えることができた。前年度に引き続き症例を加えて、舌初期癌に対する口腔内超音波エラストグラフィ(strain elastography)の鑑別診断における有用性に関する検討を行った。対象は2013年3月から2016年3月の間に術前に口腔内エラストグラフィを施行した舌早期癌の疑い17症例であり、性別は男性11例・女性6例、年齢は最低38歳・最高85歳(中央値67歳)であった。病変の最大径が30mmを超えるか厚み5mmを超える症例は対象から除外した。頸部リンパ節転移を有していた症例も除外した。画像解析については、エラストグラフィの動画記録から、ストレイングラフのピークを参考に静止画像を得て、病変部の低エコー域の青・緑・赤の占める面積で弾性スコア(elasticity score)を評価した。弾性スコアは、以下のとおりとした[1:(非常に軟らかい)緑と赤が優勢(70%以上)でわずかに青、2:(やや軟らかい)緑が青よりも大部分を占める(5070%)、3:(やや硬い)青が緑よりも大部分を占める、4:(非常に硬い)青が優勢でわずかに緑]。全例に外科的切除術が施行され、その病理組織学的診断は、扁平上皮癌12例、上皮内癌3例、ウィルス性口内炎1例、膿原性肉芽腫1例であった。扁平上皮癌と上皮内

癌をcarcinoma群、ウィルス性口内炎と膿原性肉芽腫をnon-malignant群に大別して弾性スコアについて検討した結果、弾性スコアはcarcinoma群では4または3、non-malignant群では2または1であり、群間でのオーバーラップはみられず、前者が有意に硬い傾向にあることが示唆された。以上の結果より、舌早期癌の鑑別診断において、口腔内超音波エラストグラフィが有用である可能性が示唆された。本研究の成果は、国際誌Oral Radiologyに原著論文として掲載された。昨年度に引き続き症例を集積し、舌初期癌に対する口腔内超音波エラストグラフィ(strain elastography)の有用性に関して病理組織学的診断との比較検討を行い、鑑別診断においてエラストグラフィが有用である可能性が示唆される結果を得た。本研究の成果について関連学会にてワークショップ・セミナーでの発表を行い、国際誌に投稿し原著論文として掲載されることができた。また平成29年度の国際学会での発表と国際共同研究の展開に結びつけることができた。改定されたAJCC、UICCにおいて、口腔癌のTMN分類におけるT分類にdepth of invasion (DOI)の概念が加わった。このため追加実験として超音波ファントムを用いて口腔内走査を想定した撮像を行い、本研究遂行に必要な粘膜上皮層に関する検討を行うこととした。ファントムは内部均一な高エコーを呈する本体の表面に厚み0.5 mm、1.0 mm、3.0mmに設定した内部無エコーの模擬粘膜上皮層を積層した。音響カップリング材には高分子ゲル音響カップリング材と寒天ゲル音響カップリング材、ラップにはpolyvinylidene chloride製、polyethylene製、polymethylpentene(PMP)製を用いた。術中用小型リニア探触子の走査面に音響カップリング材をのせ、全体をラップで包んで撮像した。その結果、寒天ゲル音響カップリング材とPMPの組み合わせ以外では、表面反射層が観察され、また厚み3.0 mmの模擬粘膜上皮層内部にアーチファクトと考えられる線状高エコー構造が描出された。高分子ゲル音響カップリング材ではラップの種類に関わらず模擬粘膜上皮層が無い場合でもファントム表面に線状低エコーが生じた。模擬粘膜上皮層はいずれも実際よりも薄く計測される傾向にあったが、寒天ゲル音響カップリング材とPMPとの組み合わせが最も実際の厚みを正確に評価しうることが示唆された。高分子ゲル音響カップリング材の場合、ラップの種類に関わらず音響陰影と推察される線状低エコーが生じ、表面反射層と併せた範囲はアーチファクトにより正確な描出がなされず、これまで粘膜上皮層として報告しされてきた線状低エコーは、アーチファクトを含む可能性が示された。一方、寒天ゲル音響カップリング材とPMPの組み合わせではこうしたアーチファクトがほとんど生じなかった。平成29年度は国際的な口腔癌のTNM分類が改定され、これに適合するように研究手法を再検討してファントム実験により追加検討を行った結果、舌エコーに用いる音響カップリング材について新規開発に繋がることが期待できる非常に興味深いデータが得られたため、引き続き1年間の延長でこれを再検証し舌エコーのエラストグラフィ像とドプラ像の統合解析への応用と治療戦略見直しへの反映について検討することとした。
金属ナノ粒子担持配位高分子触媒における配位高分子の担体効果の解明

本研究では金属ナノ粒子担持配位高分子触媒における配位高分子の担体効果について系統的に解明することを目的としている。そのために十分な酢酸耐性を有し、且つ酢酸吸着能の異なる配位高分子を複数種類見出す必要があった。そこで、まずはZn-MOF-74, MIL-101, HKUST-1などの熱安定性配位高分子や、中心金属や構造は同一で配位子の側鎖のみが異なるバリエーションを持つ配位高分子であるUiO-66-X (X =H, NH2, NO2, Br, (CH3)2)等を作製した。尚、作製した全ての配位高分子に対して簡易的な酢酸暴露による酢酸耐性のスクリーニング実験を行い、酢酸耐性が低いことが明らかとなった配位高分子は後の実験に使う試料からは除外した。次に、作製した各種配位高分子の酢酸吸着特性を調べるため、昇温脱離-質量分析実験による酢酸脱離温度の決定を行った。まず、構造が大きく異なるZn-MOF-74, MIL-101, HKUST-1などの配位高分子試料を用いた昇温脱離-質量分析実験の結果から、Zn-MOF-74は酢酸の脱離に由来するピークが観測されず、その細孔内に酢酸がほとんど吸着されていないことがわかった。一方で、MIL-101とHKUST-1はそれぞれ60°C、85°Cと異なる脱離温度を示し、配位高分子の種類によって酢酸の脱離温度が異なるということが明らかとなった。次に、配位子の側鎖のみが異なる4つのUiO-66-Xを用いた昇温脱離-質量分析の結果から、4つの配位高分子は中心金属の金属種(Zr)と構造が同一であるにも関わらず、それぞれ異なる酢酸の脱離挙動を示すことが明らかとなり、配位子側鎖の種類の違いによって酢酸吸着特性が異なるということが明らかとなった。以上のような結果から、酢酸耐性を有する複数種類の配位高分子を作製し、それぞれの酢酸吸着特性を評価することが出来た。本研究では酢酸耐性を有する複数種類の配位高分子を作製し、それぞれの酢酸吸着特性を評価することを初年度の目的としていた。そして実際に、様々な種類の配位高分子の合成実験や、簡易的な酢酸雰囲気下への暴露実験を通して、酢酸耐性を有する配位高分子を8種類程度(Zn-MOF-74, HKUST-1, UiO-66-NH2等)見出すことに成功した。また、それらの試料を用いた昇温脱離-質量分析実験による酢酸脱離温度の決定を通して、それぞれの配位高分子試料の酢酸吸着特性を評価することが出来た。本研究で最も危惧されたことの1つとしては、複数種類の配位高分子試料の酢酸吸着特性を評価した結果、配位高分子の種類の違いによる酢酸吸着特性の違いが観測できない、ということが挙げられた。しかし、初年度の実験結果から、作製した各配位高分子試料は65-100°C程度の範囲で酢酸の脱離温度が異なり、配位高分子の種類の違いによってそれぞれの酢酸吸着特性が異なるということが明らかとなった。また、作製した各種配位高分子担体に対してアークプラズマ蒸着法による白金ナノ粒子担持実験を行い、粒径と担持量がほぼ同一(約2nm, 0.5wt%)な白金ナノ粒子を担持した触媒の作製を行った。次年度はこれらの試料を用いた酢酸還元反応の触媒試験を行う予定であるが、実験を行うのに十分な量であるグラムスケールでの白金ナノ粒子担持配位高分子試料の作製を既に終えている。以上のような結果から、酢酸耐性を有する複数種類の配位高分子の作製、それぞれの酢酸吸着特性の評価、そして白金ナノ粒子担持配位高分子試料の作製に成功したことから、当初の実験計画に概ね則った結果を得ることが出来たと言える。昨年度の実験の結果、粒径と担持量が同一な白金ナノ粒子を担持した触媒を作製した。また、作製した各白金ナノ粒子担持配位高分子触媒の酢酸吸着特性の評価を行い、担体である配位高分子の種類の違いによって酢酸吸着特性が異なることを見出した。そこで次年度は、昨年度の研究結果から十分な酢酸耐性が確認され、且つその酢酸吸着能が明らかになったPt/UiO-66-Xを始めとする各白金ナノ粒子担持配位高分子触媒の酢酸還元能の評価を行う。そして明らかとなった各白金ナノ粒子担持配位高分子の触媒活性の違いについて検討・考察を行うことで、担体である配位高分子が有する酢酸吸着能と、担持された白金ナノ粒子が有する酢酸還元触媒能の間の関係性を探る。各白金ナノ粒子担持配位高分子触媒の酢酸還元能を評価するための実験には固定床流通式反応装置を用い、ガスクロマトグラフィーによってその生成物の定量を行う。この触媒活性評価のための固定性流通式反応装置は、酢酸蒸気と水素ガスを流通させながら1-10気圧程度の範囲で反応時に任意の圧力を掛けられる仕様のものを作製する。これらの実験から得られた各種白金ナノ粒子担持配位高分子触媒の酢酸還元能と昨年度に評価を行った酢酸吸着特性との比較を行い、この間にどのような関係があるのかということを見出す。そして、配位高分子の配位子の側鎖と酢酸吸着特性との間での関係性とも併せて比較を行い、配位高分子の配位子の側鎖の種類やその他の物性が、担持された白金ナノ粒子の触媒能にどのような影響を与えるのかということを系統的に明らかにする。

そのために十分な酢酸耐性を有し、且つ酢酸吸着能の異なる配位高分子を複数種類見出す必要があった。そこで、まずはZn-MOF-74, MIL-101, HKUST-1などの熱安定性配位高分子や、中心金属や構造は同一で配位子の側鎖のみが異なるバリエーションを持つ配位高分子であるUiO-66-X (X =H, NH2, NO2, Br, (CH3)2)等を作製した。尚、作製した全ての配位高分子に対して簡易的な酢酸暴露による酢酸耐性のスクリーニング実験を行い、酢酸耐性が低いことが明らかとなった配位高分子は後の実験に使う試料からは除外した。次に、作製した各種配位高分子の酢酸吸着特性を調べるため、昇温脱離-質量分析実験による酢酸脱離温度の決定を行った。まず、構造が大きく異なるZn-MOF-74, MIL-101, HKUST-1などの配位高分子試料を用いた昇温脱離-質量分析実験の結果から、Zn-MOF-74は酢酸の脱離に由来するピークが観測されず、その細孔内に酢酸がほとんど吸着されていないことがわかった。一方で、MIL-101とHKUST-1はそれぞれ60°C、85°Cと異なる脱離温度を示し、配位高分子の種類によって酢酸の脱離温度が異なるということが明らかとなった。次に、配位子の側鎖のみが異なる4つのUiO-66-Xを用いた昇温脱離-質量分析の結果から、4つの配位高分子は中心金属の金属種(Zr)と構造が同一であるにも関わらず、それぞれ異なる酢酸の脱離挙動を示すことが明らかとなり、配位子側鎖の種類の違いによって酢酸吸着特性が異なるということが明らかとなった。以上のような結果から、酢酸耐性を有する複数種類の配位高分子を作製し、それぞれの酢酸吸着特性を評価することが出来た。本研究では酢酸耐性を有する複数種類の配位高分子を作製し、それぞれの酢酸吸着特性を評価することを初年度の目的としていた。そして実際に、様々な種類の配位高分子の合成実験や、簡易的な酢酸雰囲気下への暴露実験を通して、酢酸耐性を有する配位高分子を8種類程度(Zn-MOF-74, HKUST-1, UiO-66-NH2等)見出すことに成功した。また、それらの試料を用いた昇温脱離-質量分析実験による酢酸脱離温度の決定を通して、それぞれの配位高分子試料の酢酸吸着特性を評価することが出来た。本研究で最も危惧されたことの1つとしては、複数種類の配位高分子試料の酢酸吸着特性を評価した結果、配位高分子の種類の違いによる酢酸吸着特性の違いが観測できない、ということが挙げられた。しかし、初年度の実験結果から、作製した各配位高分子試料は65-100°C程度の範囲で酢酸の脱離温度が異なり、配位高分子の種類の違いによってそれぞれの酢酸吸着特性が異なるということが明らかとなった。また、作製した各種配位高分子担体に対してアークプラズマ蒸着法による白金ナノ粒子担持実験を行い、粒径と担持量がほぼ同一(約2nm, 0.5wt%)な白金ナノ粒子を担持した触媒の作製を行った。次年度はこれらの試料を用いた酢酸還元反応の触媒試験を行う予定であるが、実験を行うのに十分な量であるグラムスケールでの白金ナノ粒子担持配位高分子試料の作製を既に終えている。以上のような結果から、酢酸耐性を有する複数種類の配位高分子の作製、それぞれの酢酸吸着特性の評価、そして白金ナノ粒子担持配位高分子試料の作製に成功したことから、当初の実験計画に概ね則った結果を得ることが出来たと言える。昨年度の実験の結果、粒径と担持量が同一な白金ナノ粒子を担持した触媒を作製した。
コイ普通筋をモデルとした魚類ミオシンの構造と特性に関する分子生物学的研究

魚類ミオシンは畜肉のそれに比べて著しく不安定であるが、その性状が魚肉の貯蔵・加工に際して大きな問題になっている。そこで本研究は、馴化温度依存的に発現するコイ普通筋ミオシン・アイソフォームをモデルとして、一次構造のレベルから上述の魚類ミオシンの特異性を探ることを目的として行われた。まず、市販のコイを10および30°Cの水槽で1ケ月以上飼育し、温度馴化させた。これらコイの背側普通筋からミオシン重鎖C末端側のL-メロミオシン(LMM)を調製してN末端アミノ酸配列を調べたところ、両馴化コイのLMMでは明らかに一次構造が異なることが示された。次に、10および30°C馴化コイの普通筋からcDNAライブラリーを作製した。さらに、先に得られたLMMのN末端アミノ酸配列をもとにDNAプライマーを合成し、ライブラリーを鋳型としてPCRを行って、LMMをコードするDNAプローブを得た。そこで、10および30°C馴化コイ普通筋のcDNAライブラリーをスクリーニングしたところ、3種類のクローンを単離することができた。各クローンは、10および30°C馴化コイに主成分のタイプ、およびそれら30の中間的な性質を示すタイプに分かれた。ノーザンブロット解析を行ったところ、10および30°CタイプのmRNAはそれぞれ、10および30°C馴化コイに最も多く検出された。一方、中間タイプのmRNAはいずれの馴化魚にも普遍的に存在することが明らかになった。各LMM(約560残基)タイプ間の演澤アミノ酸配列の相同性は95%以上であったが、これらの配列を熱安定性が高いとされる高等脊椎動物由来のLMMの配列と比較したところ、30°Cタイプの配列が最も高い相同性を示した。したがって、コイは高温馴化に伴って、熱安定性の高いミオシン重鎖アイソフォームを発現することが示唆された。魚類ミオシンは畜肉のそれに比べて著しく不安定であるが、その性状が魚肉の貯蔵・加工に際して大きな問題となっている。そこで、コイ普通筋から温度馴化に伴って発現する、性状の異なったミオシン・アイソフォームを単離し、その一次構造を決定して比較するために、まずcDNAクローニング用のDNAプローブを作製することを試みた。まず、市販のコイ(平均体重600g)を10,20,30°Cの水槽で1ヶ月以上飼育し、温度馴化させた。これらコイから背側普通筋を採取し、高イオン強度下、Mg^2+ATPを加えて、ミオシンを抽出し、硫安分画で精製した。次に、この精製ミオシンを0.12M NaCl存在下、1/130量のα-キモトリプシンを加えて、10°Cで30分間限定分解し、頭部サブフラグメント-1と尾部ロッドに切断した。ロッドについてはさらに、0.5M KCI存在下、再び1/130量のα-キモトリプシンを加えて、10°Cで30分間限定分解し、L-メロミオシン(LMM)とサブフラグメント-2に切断した。さらに、LMMをSDS-PAGE後にナイロン膜に転写し、プロテインシーケンサに供試して、N末端アミノ酸配列を調べた。その結果、10°C馴化コイのLMMではRAKYETDAIQRTE、一方30°C馴化コイのLMMではRTKYETDAIQRTEELEEAKと決定された。したがって、10および30°C馴化コイのLMMではN末端から2番目のアミノ酸が異なることが明らかになった。次に、常法より、10および30°C馴化コイの普通筋から、λファージをベクターとしてcDNAライブラリーを作製した。

さらに、先に得られたLMMのN末端アミノ酸配列をもとにDNAプライマーを合成し、ライブラリーを鋳型としてPCRを行ったところ、約200bpのDNAフラグメントが得られた。DNAシーケンサに供して塩基配列を決定し、アミノ酸を演繹したところ、上述の配列と一致し、DNAプローブとして有効であることが明らかとなった。魚類ミオシンは畜肉のそれに比べて著しく不安定であるが、その性状が魚肉の貯蔵・加工に際して大きな問題になっている。著者らは最近、温度馴化したコイでは異なったミオシン・アイソフォームが発現し、ATPase活性や、この活性を指標とする熱安定性を変化させることを見いだした。本研究はこのような背景の下、著者らが従来から進めてきたコイ普通筋ミオシン・アイソフォームの生化学的研究に、分子生物学的手法を取り入れて、一次構造のレベルから魚類ミオシンの特異性を探ることを目的として行われた。コイ普通筋ミオシン重鎖をコードするDNAプローブを用いて、10および30°C馴化コイの普通筋から構築したcDNAライブラリーをスクリーニングしたところ、3種類のクローンを単離することができた。各クローンの全塩基配列を解析し、その演繹アミノ酸配列をL-メロミオシン(LMM)のN末端アミノ酸配列と比較して、10および30°C馴化コイのタイプを同定した。3つ目のクローンは、塩基配列および演繹アミノ酸配列での、前述の10および30°C馴化タイプの中間的な性質を示すものであった。次に、3側の約200bpをプローブとし、10、20および30°C馴化コイから調製した全RNAを対象にノーザンブロット解析を行った。その結果、10および30°CタイプのmRNAはそれぞれ、10および30°C馴化コイに最も多く検出された。一方、中間タイプのmRNAはいずれの馴化魚にも普遍的に存在した。次に、各タイプ間のLMM全アミノ酸配列の相同性は95%以上であった。これら配列を熱安定性が高いとされる高等脊椎動物由来のそれと比較したところ、3つのコイLMMアイソフォームのうち、30°Cタイプの配列が最も高い相同性を示した。したがって、コイは高音馴化に伴って、熱安定性の高いミオシン重鎖アイソフォームを発現することが示唆された。
骨芽細胞のアポトーシスにおける核蛋白ニュークレオリンの分解と蛋白質脱リン酸化酵素

タンパク質脱リン酸化酵素1型(PP1)の各アイソフォーム(PP1α,PP1γ-1,PP1δ)はヒトおよびマウスの骨芽細胞内にそれぞれ特異的な細胞内局在を示した。特にPP1δは細胞核に5-7個のドット様構造物として,核小体に強力に発現した。この存在様式はリボゾームRNA合成の場と考えられ,悪性腫瘍細胞に高度に発現し,硝酸銀により染色されるArgyrophilic Nucleolar Organizer Regions(AgNORs)とその構成タンパクであるニュークレオリンの細胞内局在と完全に一致した。アポトーシスは核内の変化を特徴とする細胞死であり,クロマチンの凝縮,核の断片化,DNAラダーの形成を伴う。蛋白質脱リン酸化酵素阻害剤オカダ酸はヒトおよびマウスの骨芽細胞にアポトーシスを誘導した。正常細胞において核小体にドット状に染色されるニュークレオリンは,アポトーシス細胞では核全体に拡散した。正常細胞から調製したタンパク質をSDS-polyacrylamidegel electrophoresisで分離し,ウエスタンブロット法で分析すると,110kDaのニュークレオリンが検出されるが,アポトーシス細胞から調製したタンパク質では110kDaのタンパク量が減少し,新たに80kDaのタンパクが出現しその量が増加した。つまり,アポトーシスによりニュークレオリンは分解されて80kDaの断片になる。PP1δに特異的な塩基配列を有する2重鎖RNAを合成して,RNAiを行うと他のPP1の発現は抑制を受けなかったが,PP1δの発現は著しく抑制された。また,PP1δのRNAiにより,ニュークレオリンの発現も減少した。以上の結果は,ニュークレオリンのリン酸化状態とアポトーシス誘導が密接な関係にあり,その関係をPP1δが調節することを示唆している。蛋白質脱リン酸化酵素1δ型(PP1δ)は核小体に3-7個のドット様構造物として認められる37kDaの蛋白である。この細胞内分布は硝酸銀により検出されるNucleolar Organizer Regions(AgNORs)及びその構成蛋白のひとつであるニュークレオリンの細胞内局在と一致している。我々はAgNORsとニュークレオリンの細胞内変化に注目して,アポトーシスによっておこるこれらの蛋白の変化を調べた。正常細胞では,核小体にPP1δの局在と類似するニュークレオリンが検出されるが,アポトーシス細胞では,この構造物は分解されて検出されなかった。この物質を同定するために,我々はオカダ酸処理アポトーシス細胞から蛋白を調製し,SDS-PAGEを行い分離した蛋白を抗ニュークレオリン抗体を用いてウエスタンブロットを行った。アポトーシス細胞では分子量110kDaの蛋白の発現量が減少し,逆に分子量80kDaの蛋白が新たに出現し,その発現量は増加した。このことは,アポトーシスによりニュークレオリンは分解されて80kDaの蛋白に断片化されることを意味している(Kato et al. 1993)。PP1δに特異的な2本鎖RNAを合成し,HEK-293細胞に導入すると,この細胞ではPP1δのmRNAと蛋白の発現が阻害された。ところが,PP1αとPP1γ-1の発現は阻害されなかった。HEK-293細胞の細胞抽出液は2本鎖RNAを分解するが,ヒト骨芽細胞の抽出液は分解しなかった。さらに,HEK-293細胞ではRNA分解酵素Dicer,が強力に発現していたが,ヒト骨芽細胞MG63細胞における発現は弱かった。

このことはPP1δのRNAiがHEK-293細胞では起こるが,骨芽細胞では起こらないことを意味している蛋白質脱リン酸化酵素阻害剤オカダ酸はヒトおよびマウスの骨芽細胞にアポトーシスを誘導した。核小体にドット状に局在するニュークレオリンは蛋白質脱リン酸化酵素1δ型と結合する。正常細胞においてドット状に局在するニュークレオリンはアポトーシス細胞では分解されて核全体に拡散し,最終的には核から消滅した。ニュークレオリンは核と細胞質間のシャペル蛋白であり,細胞の生存や癌化に関連するリン酸化蛋白である。この蛋白のアポトーシスにおける動向を蛋白レベルで調べるために,正常細胞およびアポトーシス細胞から調製したタンパク質をSDS-PAGEで分離し,抗-ニュークレオリン抗体を用いてウエスタンブロット法で分析した。正常細胞では110kDaのニュークレオリンが検出されるが,アポトーシス細胞から調製したタンパク質では110kDaのタンパク量が減少し,新たに80kDaのタンパクが出現しその量が増加した。つまり,アポトーシスによりニュークレオリンは分解されて80kDaの断片になる。同様の結果はインビトロアポトーシス系においても認められた。蛋白質脱リン酸化酵素1δに特異的な塩基配列を有する2重鎖RNAを合成して,RNAiを行うと他のPP1(PP1α,PP1γ-1)の発現は抑制を受けなかったが,PP1δの発現は著しく抑制された。また,PP1δのRNAiにより,ニュークレオリンの発現も減少した。以上の結果は,ニュークレオリンとアポトーシスには密接な関係にあり,その関係をPP1δが調節することを示唆している。
肺結核症における抗結核薬血中濃度測定の有用性の検討

2011年8月から2013年7月に福島県立医科大学附属に入院した肺結核患者のなかで条件を満たした26名の患者を対象にイソニアジドとリファンピシンの血中濃度を測定し、NAT2遺伝子の多型を解析した。【結果】抗結核薬内服2時間後のイソニアジドの平均血中濃度は2.5±1.3(平均値±標準偏差)μg/ml,リファンピシンの平均血中濃度は6.8±4.3 μg/mlであった。統計学的に排菌期間と有意な相関を認めたのは、治療開始時の排菌量であった。治療開始時の排菌量が多いほど、排菌期間は延長した。また、血中リファンピシン濃度が高い群では排菌期間は短い傾向にあった。【背景】本邦においては、排菌を有する肺結核症の患者に対しては、イソニアジド(INH)とリファンピシン(RFP)を含んだ抗結核薬4剤もしくは3剤が標準化学療法として行われている。この標準化学療法ではINH 5 mg/kg/day、RFP 10 mg/kg/dayと、どのような患者に対しても画一的な投与量となっている。その一方で抗結核薬の治療効果の目安となる患者の喀痰抗酸菌塗抹陽性持続期間や培養が陰性化するまでの期間は、患者によって大きく異なるという事実がある。【目的】肺結核患者における抗結核薬の血中濃度を測定し、喀痰抗酸菌検査との関係を検討する。【対象】当院の結核病棟に入院して化学療法を行った患者15名を対象とした。年齢分布は25-90歳(平均66.9歳)であり、男性13名、女性は2名であった。病巣の性状はI/II/III型が各々2例/4例/9例であり、plは2例、粟粒パターンは2例であった。病巣の拡がりは1/2/3型が各々2例/10例/3例であった。病側はr/l/bが各々5例/2例/8例であった。【方法】検体の採取日は抗結核薬の内服開始日から2週間以降として、採取時間は抗結核薬内服後2時間の時点で行った。血中濃度の測定はINHとRFPの2剤について行った。投与量は2剤ともに結核診療ガイドラインの投与量に準拠した。【結果】INHの血中濃度は2.6±1.4 μg/ml(1.1-6.3 μg/ml, N=14)であり、RFPの血中濃度は8.1±4.2 μg/ml(0.9-17.5 μg/ml, N=15)であった。血中INH濃度、RFP濃度と喀痰抗酸菌検査第一塗抹陰転日までの日数、第一培養陰転日までの日数、施設退院基準日までの日数との関係を検討したが、いずれも有意な相関関係は認められなかった。平成25年度は平成24年度に引き続いて、本研究に的確である患者から研究参加への同意と取得を得ることに努めた。平成25年度は合計10名の患者から研究参加への同意を得ることができた。同意を取得したすべての患者の末梢血単核球からDNAを抽出し、血漿中のイソニアジドとリファンピシンの血中濃度を測定した。平成25年度と24年度に得られた結果をを統合して解析を行うと、解析を行った時点での結果では、抗結核薬の血中濃度(リファンピシンとイソニアジド)と活動性肺結核患者の排菌期間の間に一定の相関関係を見出すことは出来なかった。イソニアジドを代謝するNAT2遺伝子のSNPの解析に関しては、実験系の確立に予想以上に時間が掛かってしまい、結果的に十分な解析を行うことができなかった。インターフェロンγ遺伝子のSNPの多形に関しても、リアルタイムPCRによる遺伝子解析の実験系の確立には時間が不十分であり、こちらに関しても十分な解析を行うことは出来なかった。また、結核病学会総会と感染症学会総会と東日本地方会に出席し、抗菌化学療法における最新の知見を学んだ。平成23年度は、9例の患者で抗結核薬の血中濃度の測定を行った。また、これらの患者から遺伝子を採取した。NAT2とインターフェロンγの放出に関する遺伝子多形を解析するための実験系について検討した。また、日本結核病学会に参加して抗結核薬の代謝について最新かつ重要な知見を得た。最終年度においては、2011年8月から2013年7月に福島県立医科大学に入院した結核患者のなかで条件を満たした29名の患者を対象にNAT2遺伝子の多型を解析した。

対象の内訳は男性25名、女性4名で、合計29例となった。年齢分布は25-90歳で平均年齢は69.2歳、中央値は79歳であった。すべての患者から書面による同意を得た後に抗結核薬(イソニアジドとリファンピシン)の血中濃度を測定し、同時に末梢血単核球から遺伝子を抽出した。患者から抽出した遺伝子を用いてNAT2遺伝子の解析を行った【結果】抗結核薬内服2時間後のイソニアジドの血中濃度は2.5±1.3(平均値±標準偏差)μg/ml,リファンピシンの血中濃度は6.8±4.3 mg/mlであった。NAT2遺伝子を解析した29例のうちRA (NAT2*4のホモ接合体)は15例、IA (NAT2*4と変異アレルとのヘテロ接合体)は11例、SA (変異アレル同士の組み合わせ)は3例であった。イソニアジドの血中濃度は、RAの患者においては1.9±0.9 μg/ml、IAの患者においては2.8±1.0 μg/mlであり、SAの患者においては5.3±1.4 μg/mlであった。抗結核薬による治療が中断することなく継続された26例の平均の排菌期間は74.88±35.41日(平均値±標準偏差)であった。統計学的に排菌期間と有意な相関を認めたのは、治療開始時の排菌量であった。治療開始時の排菌量が多いほど、排菌期間は延長した。血中リファンピシン濃度が4.0μg/ml以上の群では排菌期間は短縮する傾向にあった。感染症内科学当院の結核病棟に入院する患者については積極的に本研究への参加のをお願いしたところ、ほぼ全ての患者から同意が得られた。しかし、肺結核症による入院患者数が当初予測していたよりも少ない状況であり、現在のところ、予定していた研究として解析できる研究サンプルが集まっているとは言い難い状況である。抗結核薬の血中濃度測定に関しては、三菱化学メディエンスに測定を依頼し、順調に結果が得られている。NAT2遺伝子とインターフェロンガンマ遺伝子の多型に関する解析も、現在のところアプライドバイオシステムのreal-time PCRを用いて解析を行うことを決めたのみで、実験系を構築している最中であり、具体的な遺伝子多型の解析結果を得るには至っていない。また、新たに患者の排菌期間に加えて、結核病学会における病型分類も解析の対象とすることとし、これに関しては対象症例を全例分類することができた。その一方で第88回結核病学会総会に出席して、抗結核薬の薬物代謝に関するシンポジウムに出席することができた。そこに登壇していた、抗結核薬の薬物代謝を研究している複数の基礎研究者と直接議論を交わすことによって、現在の研究についての計画や方法論について貴重な助言を得ることができた。2012年12月に開催された結核・非定型抗酸菌症治療研究会に本研究の成果を発表したところ、本研究について、他施設の研究者より貴重な意見を頂き、本研究の改善点を洗い出し、計画を修正する必要があるという結論に至った。平成25年度は主任研究者が当初研究を開始した施設から遠距離にある施設に異動してしまい、物理的に研究を継続することが困難な状況になった。また、主任研究者は医師であるが、平成25年度に勤務した施設は日常臨床業務が非常に多忙な施設であり、科学研究費を用いた研究を遂行することに十分な時間を確保することができなかった。現在のところ平成23年度においては1名を除いて対象患者の全員より本研究への参加の同意が得られており、症例数も今後は増えてゆくものと考えられる。しかし、遺伝子解析については現在実験系を確立している最中であり、この系を可及的速やかに確立する。現在の症例蓄積状況では、単施設研究では本研究の結果を出すのに十分なサンプル数を集めることは困難であると予想されるため、他施設においてもこの研究に参加して頂ける患者に協力を依頼する。