hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
固体高分子形燃料電池の起動停止過程その場３次元空間観察による触媒劣化機構の解明

固体高分子形燃料電池において、燃料電池の起動・停止動作によるカソード電極触媒の劣化が喫緊の課題の一つとなっている。その触媒劣化は空間全体に斑を持って広がっているが、詳細な原因と劣化機構は明らかになっていない。本研究では、新たに開発したXCT-XAFS(X線コンピュータ断層撮影X線吸収微細構造)法を用いることで、起動・停止動作による触媒劣化を3次元空間でin-situ(オペランド)解析し、劣化時の触媒状態の変化を解明した。固体高分子形燃料電池(PEFC)において、燃料電池の起動・停止動作によるカソード電極触媒の劣化が喫緊の課題の一つとなっている。その触媒劣化の主要因は炭素担体の腐食によると考えられ、空間全体に斑を持って広がっていることが分っているが、詳細な原因と劣化機構は明らかでない。そのため、次世代高耐久PEFC開発のために、触媒粒子の劣化がどのように空間的に広がっていくかをその場3次元解析することが望まれている。本研究は、新たに開発したin-situ XCT-XAFS法を用いることで、起動・停止動作による触媒劣化を3次元空間でin-situ(オペランド)解析し、詳細な劣化要因とメカニズムを解明することを目的としている。2015年度においては、まず印加電圧に応答するPt触媒粒子の空間分布を解析するため、種々の炭素担体にPt粒子を担持した触媒をカソード触媒として使用したMEAについて、炭素担体の腐食が特に進行する1.0 V - 1.5 V三角波劣化加速試験を行った前後に、印加電圧を0.4 Vおよび1.0 V印加しながらin-situ XCT-XAFS測定を行った。その結果、Pt/KB触媒を使用した試料で劣化試験後において、同一視野中にPt量分布が大きく減少した領域が生成されている結果が得られた。これは劣化加速試験による炭素担体の腐食により、担持されていたPt粒子の移動によると推察される。次に、カソード触媒層にPt/KB触媒を使用したMEAについて、実走行時の起動・停止動作に相当するアノードガス交換を300回繰り返した前後で、同様に印加電圧を0.4 Vおよび1.0 V印加しながらin-situ XCT-XAFS測定を実施した。同測定結果については現在解析中である。2015年度に実施を予定していた電圧印加環境下における測定、およびアノードガス交換による劣化前後の測定については順調に実施することができた。当初懸念されていた測定中における試料の位置ずれについても、測定結果に対して各測定エネルギー毎に位置補正を行うことで、問題なくXCT-XAFS画像解析が行えることが実証できた。ただし、燃料電池発電環境下における測定のため、供給ガス中の水蒸気および生成される水によって発生するノイズの低減が必要であることがわかった。また、一番のボトルネックとなっているのがCT画像解析にかかる時間であり、それを解消するためCT画像解析用サーバの導入を検討している。その触媒劣化の主要因は炭素担体の腐食によると考えられ、空間全体に斑を持って広がっていることがわかっているが、詳細な原因と劣化機構は明らかでない。2015年度においての測定で、in-situ XCT-XAFS測定を行いながらのアノードガス交換によって、燃料電池の性能低下が想定されるものよりも大きく減少してしまうことがわかった。これはXCT-XAFS測定のために長時間X線を照射し続けたためによるX線照射ダメージであると考えられる。そこで2016年度では、まずin-situ XCT-XAFS測定の測定時間短縮および照射X線強度をX線照射ダメージが無い状態になるまで、かつCT解析が可能な限りX線照射量を減少させる測定条件の探査を行った。その結果CT測定を行ってもMEAに対してX線照射ダメージを与えない測定条件を得ることが出来、その条件の下アノードガス交換を行いながらin-situ XCT-XAFS測定を行った。その結果、アノードガス交換を行うに従い、Pt量が増えていく領域と減少していく領域の二つがあることがわかった。Pt量が増えていく領域はもとのPt価数が低く、Pt量が増えていくに従いPt価数が減少し、Pt量が減少していく領域ではPt価数が高い状態であることがわかった。2016年度については、まず測定実施済みの実走行時の起動・停止動作に相当するアノードガス交換による劣化前後のCT画像解析を進める。また並行して、測定実施中における水の生成によるノイズの低減を図り、CT画像解析の手順の最適化を行い、画像解析の精度を上げる。

その後、使用する炭素担体を変えて同様の実験を実施し、それぞれのMEAにおける劣化の進行の差異を捕らえ、最終的に起動・停止動作に相当するアノードガス交換による劣化の詳細な原因と劣化機構を明らかにする。物理化学当初作製・購入を予定していた改良型PEFCセルが、保有するプロトタイプセルの改良によって充分に目的の性能を達成できることがわかったため、セル購入費として計上した金額分残金がでた。CT画像解析に予想よりも時間がかかることがわかったため、当初予定していなかったCT画像解析用サーバの導入を検討している。CT画像解析用サーバの導入により、すばやい解析と限りあるマシンタイムの有効活用ができると期待される。
高周波電磁場・強磁場に対するDNAの電気伝導特性の研究

(1)昨年度予備的に得られていた結果の再現性の確認を行い,確実性が得られたので現在論文を準備中である。すなわち,サケの精子のDNAの粉末を乾燥ヘリウムガス中に封入し,10GHzでの複素応答を室温から液体窒素温度(77K)までで測定した。測定した試料の複素応答データに絶縁体に対する解析方法を適用し,10GHzにおける電気伝導度と誘電率をもとめた。その結果,電気伝導度は,室温で,3x10^<-3>(ohmcm)^<-1>程度であり,温度とともに伝導度が減少する半導体的な振る舞いをすることがわかった。温度依存性から見積もった活性化エネルギーは50meV-70meVである。文献にある水分子の高周波伝導度との比較から,この値は,水分子のそれよりも一桁以上大きく,DNAに固有のものであると考えられる。同じく,文献に報告されている「100GHzでは水分子の電気伝導度しか測定されなかった」という事実も定量的に考え合わせると,DNAの電気伝導度の周波数依存性としては,ホッピングタイプの伝導が得られた。この候補としては,ヌクレオチドの一次元スタックの方向のホッピング伝導が考えられる。(2)磁場を印加して同様の測定を行ったが明瞭な変化は観測されなかった。このことから,生体にたいしてなんらかの磁場効果があるか否かに関しては(予備的ではあるが)否定的な結論が得られた。(3)粉末に対する複素伝導度測定の応用として,プロトン互変異性をしめす2-ヒドロキシフェナジンの10GHzにおける複素伝導度測定を行った結果,伝導度および誘電率に新たな相転移を見出した。現在この現象の解明を急いでいる。(4)THzの複素伝導度測定装置の製作を開始したが,本研究終了までに完成には至らなかった。生体の電磁場に対する影響に関する科学的なデータを蓄積する第一歩として,サケの精子から抽出したDNAの10GHzにおける電気伝導度を測定することに成功した。この実験にあたり,以下の点に配慮した。すなわち,DNAの電気伝導度に対するこれまでの測定で結果が収束しないことの理由として,(1)DNAと電極とのオーミックコンタクト(2)DNA分子に対するディスオーダーの影響(3)DNA分子に対する湿度の影響などが挙げられ,問題になっていた。そこで,本研究では,(a)電極に関する一切の問題をなくするために,非接触の方法を選択し,(b)湿度や水の影響を極力排除するために,試料を真空中に封入し電気伝導度測定を行った。このため,われわれのグループが開発した,マイクロ波を用いて粉末の電気伝導度を求める手法を適用した。その結果,10GHzにおいて,明らかに水分子の緩和よりも一桁以上大きな電気伝導度を示すことがわかった。この結果を過去の異なる周波数での測定結果と比べてみることにより,電気伝導度の周波数依存性が,乱れた系が示すホッピング伝導でしばしば見られるべき乗則に従うことがわかった。このことは,虚数部(誘電率)についても成り立つことが推定された。すなわち,マイクロ波領域での誘電率はオーディオ周波数領域の誘電率(やはり実測した)とほとんど変わらず,このことは,電気伝導度の虚数部が周波数にほぼ比例することを示唆している。これらのことから,我々が観測した電気伝導度は,ヌクレオチド分子の重なり方向のパイ結合間のキャリヤのホッピングを見ている可能性があることを示唆している。今後,この伝導度が磁場によってどのように変化するかなどを調べる予定である。(1)サケの精子のDNAの粉末を乾燥ヘリウムガス中に封入し,マイクロ波測定用の試料を用意した。このとき,生体試料は熱に弱いことを考慮し,室温でヘリウムガス中に封入する装置を,すべてに先立ち,開発した。(2)この試料を10GHz空洞共振器中に入れて,10GHzでの複素応答を室温から液体窒素温度(77K)までで測定した。試料からの信号のみを任意性なくとりだすために,封入管中の試料の量を変化させた数種類の試料にたいして測定を行い,試料からの信号を抽出した。(3)測定した試料の複素応答データを検討し,絶縁体にたいする解析方法を適用し,10GHzにおける電気伝導度と誘電率をもとめた。(4)その結果,電気伝導度は,室温で,3x10^<-3>(ohmcm)^<-1>程度であり,温度とともに伝導度が減少する半導体的な振る舞いをすることがわかった。(5)文献にある水分子の高周波伝導度との比較から,この値は,水分子のそれよりも一桁以上大きく,DNAに固有のものであると考えられる。(6)同じく,文献に報告されている「100GHzでは水分子の電気伝導度しか測定されなかった」という事実も定量的に考え合わせると,DNAの電気伝導度の周波数依存性としては,ホッピングタイプの伝導が得られた。

その結果,電気伝導度は,室温で,3x10^<-3>(ohmcm)^<-1>程度であり,温度とともに伝導度が減少する半導体的な振る舞いをすることがわかった。温度依存性から見積もった活性化エネルギーは50meV-70meVである。文献にある水分子の高周波伝導度との比較から,この値は,水分子のそれよりも一桁以上大きく,DNAに固有のものであると考えられる。同じく,文献に報告されている「100GHzでは水分子の電気伝導度しか測定されなかった」という事実も定量的に考え合わせると,DNAの電気伝導度の周波数依存性としては,ホッピングタイプの伝導が得られた。この候補としては,ヌクレオチドの一次元スタックの方向のホッピング伝導が考えられる。(2)磁場を印加して同様の測定を行ったが明瞭な変化は観測されなかった。このことから,生体にたいしてなんらかの磁場効果があるか否かに関しては(予備的ではあるが)否定的な結論が得られた。(3)粉末に対する複素伝導度測定の応用として,プロトン互変異性をしめす2-ヒドロキシフェナジンの10GHzにおける複素伝導度測定を行った結果,伝導度および誘電率に新たな相転移を見出した。現在この現象の解明を急いでいる。(4)THzの複素伝導度測定装置の製作を開始したが,本研究終了までに完成には至らなかった。
コムギ倍数種における低温応答機構の解析

1.Lt-Cor遺伝子の単離と構造・発現解析:パンコムギのWltr10を単離し、抗体を作成した。凍結耐性レベルの異なる2品種を用いて、凍結耐性の獲得過程(低温順化過程)と遺伝子発現を継時的に解析し、両者の相関と遺伝子発現の品種間差を認めた。2.CORタンパク質の葉緑体輸送とプロモーターの低温特異性の解析:パンコムギのCor遺伝子、Wcor14とWcor15について、35-GFP融合遺伝子を構築し、これらをラサキツユクサの表皮細胞に導入した一過性発現から、タンパク質の葉緑体輸送を明らかにした。さらに、プロモーターを導入した形質転換タバコを作出し、コムギと同様の発現パターン(低温特異性と光合成組織特異性)を確認した。3.Dhn遺伝子の単離と構造・機能解析:パンコムギのWdhn13を単離し、cDNAと抗体を用いて、発現の低温誘導性を明らかにした。プロモーター配列を単離し、Wcor14,15と同様に、これがCRT/DRE配列を持つことを明らかにした。プロモーター機能解析に向けてタバコ形質転換体を作成した。4.Aox遺伝子の単離と構造・発現解析:パンコムギから2つの非同祖的なAox遺伝子(cDNA配列とゲノム配列)を単離し、そのうちひとつ(Waox1c)の低温応答性を明らかにした。低温条件下おけるWaox遺伝子発現と、その他のミトコンドリア遺伝子発現を、品種間で比較解析した。5.Cor/Lea遺伝子群の品種間差の解析:17種のパンコムギCor/Lea遺伝子群について、発現の品種間差を解析し、これが低温耐性の品種間差をよく説明することを示した。6.転写因子の単離と構造・発現解析:WcbfとWdrebのcDNA配列を単離し、コムギ構成ゲノム間で構造を比較し、発現の品種間差を明らかにした。7.Vrn遺伝子導入系統および染色体欠失系統を用いた解析:Vrn遺伝子導入系統の低温耐性とCor/Lea遺伝子発現を比較解析し、Vrn1導入系統では遺伝子発現とともに低温耐性が低下することを明らかにした。第5群染色体の欠失系統について、同様の解析を行ったが、明瞭な結果が得られなかった。1.Wcor14,Wcor15ゲノム配列の単離と構造・発現解析:大腸菌で発現させたWcor14 cDNA配列(Genes Genet. System. 75:49-57(2000))からタンパク質を精製し抗体を作成した。cDNAと抗体を用いて発現の低温誘導性を解析し、春まきと秋まきコムギ品種間で比較した。GFPキメラ遺伝子をムラサキツユクサの表皮細胞に導入し、一過性発現からタンパク質の葉緑体輸送を明らかにした。cDNAをプローブとしてコムギゲノムライブラリーからWcor15ゲノム配列を単離し、Wcor15-GFPを用いて同様にタンパク質の葉緑体移行を明らかにした。プロモータ構造を解析しCRT配列の存在を明らかにし、Wcor15-GUSを導入したコムギ培養細胞で低温誘導性を明らかにした。3.Wltr10の単離と構造・発現解析:オオムギ低温誘導性cDNA pao86

配列に基づきWltr10 cDNAを単離し、凍結耐性レベルの異なる上記2品種を用いて凍結耐性の獲得過程と遺伝子発現を継時的に解析し両者に有為な相関を認めた。異数体を用いて座乗染色体を決定した(J. EXP. Bot. 52:2367-2374(2001)。4.Wdhn13の単離と構造・発現解析:Dhn遺伝子配列に基づきWdhn13 cDNAを単離し、大腸菌を用いて精製したタンパク質から抗体を作成した。cDNAと抗体を用いて、発現の低温誘導性を解析し、異数体を用いて座乗染色体を決定した(J. EXP. Bot.投稿中)。cDNAをプローブにコムギゲノムライブラリーからゲノム配列を単離した。5.Waox1a,1cの単離と構造・発現解析:イネミトコンドリアAOX cDNAをプローブに、コムギオーソログWaox1a, waox1cを単離した。これらをプローブにコムギゲノムライブラリーからゲノム配列を単離し、エクソン・イントロン構造を他種のAoxと比較した。cDNAを用いたノーザン解析から遺伝子発現の低温応答性を明らかにし、異数体を用いて座乗染色体を決めた(Genes Genet. Systems,投稿中)。大腸菌を用いてWAOC1aタンパク質を合成し精製した。1.パンコムギ低温誘導性遺伝子群の単離と構造解析:2.低温誘導性遺伝子群の発現解析と品種耐性試験:単離した遺伝子群の低温・ABA・乾燥・塩などのストレスに対する応答性をcDNAと抗体を用いて解析し、M808とCS間で比較した。さらに転写産物の蓄積過程と凍結耐性の獲得過程を比較解析した。3.CORタンパク質の葉緑体輸送とプロモーターの解析:Wcor14とWcor15について、GFPキメラ遺伝子を構築しムラサキツユクサの表皮細胞に導入した一過性発現からタンパク質の葉緑体輸送を明らかにした。Wcor15については、35Sプロモーターとゲノムプロモーターを持つ形質転換タバコを作出し、コムギと同様の発現パターンを確認した。Wdhn13のプロモーター配列を単離し、Wcor15と同様に、これがCRT/DRE配列を持つことを明らかにした。4.転写因子の単離と構造解析:WcbfとWdrebのcDNA配列を単離し、コムギ構成ゲノム間で構造を比較した。5.cDNA-AFLP解析:低温処理、無処理の植物体から得たmRNAを対象にcDNA-AFLP解析を行い、シロイヌナズナと比較してコムギにおける低温応答性経路の発達を示唆する結果を得た。1.Lt-Cor遺伝子の単離と構造・発現解析:パンコムギのWltr10を単離し、抗体を作成した。凍結耐性レベルの異なる2品種を用いて、凍結耐性の獲得過程(低温順化過程)と遺伝子発現を継時的に解析し、両者の相関と遺伝子発現の品種間差を認めた。2.CORタンパク質の葉緑体輸送とプロモーターの低温特異性の解析:パンコムギのCor遺伝子、Wcor14とWcor15について、35-GFP融合遺伝子を構築し、これらをラサキツユクサの表皮細胞に導入した一過性発現から、タンパク質の葉緑体輸送を明らかにした。さらに、プロモーターを導入した形質転換タバコを作出し、コムギと同様の発現パターン(低温特異性と光合成組織特異性)を確認した。3.Dhn遺伝子の単離と構造・機能解析:パンコムギのWdhn13を単離し、cDNAと抗体を用いて、発現の低温誘導性を明らかにした。プロモーター配列を単離し、Wcor14,15と同様に、これがCRT/DRE配列を持つことを明らかにした。プロモーター機能解析に向けてタバコ形質転換体を作成した。
前庭頚運動系の感覚入力から運動出力への空間座標変換中枢神経機構

本研究は、前庭頚運動系において、中枢神経系に存在する感覚入力座標系と運動出力座標系における信号の空間座標変換(sensorimotor transformation)の中枢神経機構を解析することを目的として行われた。左右6個の三半規管神経に刺激電極を植え、15の異なる頚筋の運動ニューロンから細胞内記録を行い、各筋の運動ニューロンが6個の半規管からどのような入力を受けるのか、さらに延髄で切断実験を行い、各半規管からの中枢の神経経路を明らかにした。各筋の全ての運動ニューロンは左右の半規管からの入力に関してその筋固有の入力パターンを持っていた。この入力パターンは、4種類あり、全ての頚筋へのパターンは、この4種類のいづれかに属していた。水平半規管入力については、全ての頚筋に共通であり、対側から興奮、同側から抑制を受けていた。頚筋伸筋群は両側前半規管から興奮、両側後半規管から抑制を受けており、屈筋群は、その逆で、前半規管から抑制、後半規管から興奮を受けた。外側に位置する最長筋群は、対側垂直半規管から興奮、同側垂直半規管から抑制を受け、後頭斜筋は、その逆で、対側垂直半規管から抑制、同側から興奮の入力を受けていた。以上のように、異なる頚筋群に属する頚筋が、6半規管から一定のパターンの入力を受けており、異なる頚筋群に属する頚筋は全て、6個の半規管から一定の空間パターンの入力を受けており、形態的に分類された頚筋群の分類が機能的にも重要な構成単位となっていることが明らかとなった。
一方向凍結を利用した高強度組織侵入性骨補填材の創製と多孔構造制御法の開発

ヒドロキシアパタイト(HAP)あるいはリン酸三カルシウム(TCP)を含有する有機スラリーの調製,一方向凍結,凍結乾燥,空気焼成によってモノリスを作製した。有機スラリーとしてレゾルシノールーホルムアルデヒドゲルを使用したところ,細孔径は100μm以上であったが,圧縮強度は2.3MPaに過ぎなかった。tーブタノールを溶媒,ポリビニルピロリドンをバインダーとして用いた場合,100μm以上の細孔径,10MPa以上の圧縮強度をもつHAPあるいはTCPモノリスを作製することができた。また,一方向凍結シミュレーションを活用してモノリスの多孔構造を制御する方法を提示した。骨補填材作製過程は,1有機ゲルや複素環構造を側鎖に有する高分子を含有したアルコールにリン酸カルシウム系セラミックスを分散させる工程,2一方向凍結で組織侵入性(貫通性)気孔構造を形成させる工程,3凍結させたスラリーを凍結乾燥させて成形体を得る工程,4乾燥させた成形体を焼成する工程からなる。バインダーや溶媒の選定,一方向凍結条件,リン酸カルシウム系セラミックスの焼成条件に詳細な検討を加え,100μm以上の連通気孔径,10MPa以上の圧縮強度,優れた骨伝導性をもつ骨補填材を作製し,気孔率,気孔径,壁構造を制御する方法を確立する。平成25年度は,骨補填材用に作製したモノリスの高強度化と多孔構造の制御に関して検討を加えた。一方向凍結を利用し,t-ブタノール(TBA)を溶媒,ポリビニルピロリドン(PVP)をバインダーとして,リン酸カルシウム系セラミックス粒子(ヒドロキシアパタイト(HAP)粒子あるいはリン酸三カルシウム(TCP)粒子)を成形し,焼成によって細孔径100μm以上,圧縮強度10MPa以上のモノリスを作製することができた。モノリスの空隙率と圧縮強度の関係,モノリスの特性(細孔特性,圧縮強度,結晶構造)に及ぼす焼成温度の影響,生体適合性に劣るα-TCPを生成させない焼成温度が明らかになった。成形体の多孔構造の制御因子を明らかにするために,一方向凍結シミュレーションを実施した。シミュレーションによりモノリスの多孔構造を制御する因子は,冷媒への浸漬速度,外界温度,試料サイズであり,冷媒温度は顕著な影響を及ぼさないことが分かった。モノリスのマクロ孔を大きくするには,浸漬速度を小さく,外界温度を低く,試料サイズを大きくする必要があることが明らかになった。この結果は,冷媒温度,外界温度,試料サイズを変化させて作製したモノリスの多孔構造を評価することによって裏付けられた。レゾルシノールーホルムアルデヒド(RF)ゲルをバインダーとしてヒドロキシアパタイト(HAP)粒子を成形し,焼成によって,細孔径100μm以上,圧縮強度2.3MPaの純アパタイトハニカムを作製した。原料として低結晶性ヒドロキシアパタイトを用い,遊星式攪拌・脱泡装置を使用せずに最も強度が高いアパタイトハニカムを作製できる条件を明らかにした。一方,遊星式攪拌・脱泡装置を用いてアパタイトをハニカム状に成形するためには,高速で一方向凍結を行う必要があることがわかった。以上のレゾルシノールーホルムアルデヒドゲルをバインダーとする方法では,細孔径100μm以上,圧縮強度10MPa以上のアパタイトハニカムを作製することは困難であった。次に,t-ブタノール(TBA)にバインダーとしてポリビニルピロリドン(PVP)を加え,HAP粒子を添加し,遊星式攪拌・脱泡装置で十分に分散させスラリーを作製した。スラリーを円筒状の型に入れ,一定温度に保った冷媒中に垂直に一定速度で挿入することにより,円柱状の試料内部にマクロ孔のテンプレートとなるTBAの柱状結晶を成長させた。凍結後の試料から凍結乾燥によってTBAを除去しバインダーで成形されたHAPのモノリスを作製した。次に,空気雰囲気下で焼成することによって,バインダーを燃焼によって除去するとともに微粒子を焼結させ,HAPモノリスを作製することに成功した。レゾルシノールとホルムアルデヒドからゾル-ゲル法で合成した有機ゲルやポリビニルピロリドン(PVP)を成形用のバインダーとして使用した。有機ゲルやPVPを含有したt-ブタノール(TBA)にヒドロキシアパタイト(HAP)粒子を分散させてスラリーを調製した。スラリーを円筒状の型に入れ,一定温度に保った冷媒中に垂直に一定速度で挿入することにより,円柱状の試料内部に連通気孔のテンプレートとなる柱状氷晶を成長させ,凍結乾燥によって骨補填材前駆体を作製した。

次に,空気雰囲気下で焼成することによって,バインダーを燃焼によって除去するとともに微粒子を焼結させ,HAPモノリスを作製することに成功した。また,連通気孔を有するモノリスを作製できる焼成温度,焼成時間,昇温速度を詳細に検討した。有機ゲルをバインダーとして使用して,細孔径100μm以上,圧縮強度2.3MPaの純アパタイトハニカムの作製に成功したので,平成24年度の研究目的はほぼ達成できていることが分かる。上述のように研究は順調に進展しているが,レゾルシノールーホルムアルデヒドゲルをバインダーとする方法では,細孔径100μm以上,圧縮強度10MPa以上のアパタイトハニカムを作製することは困難であることが判明した。したがって,今後は,ポリビニルピロリドン(PVP)を成形用のバインダーとして使用する方法に検討を加える必要がある。本研究では,骨伝導性が高く,生体親和性に優れた高強度骨補填材を開発することを目的とする。具体的には,ヒドロキシアパタイト(HAP)粒子あるいはリン酸三カルシウム(TCP)粒子を含有するスラリーの一方向凍結によって氷晶を成長させ,凍結乾燥によってマイクロハニカム状に成形し,空気焼成によってバインダーを分解して,100μm以上の連通気孔径,10MPa以上の圧縮強度,優れた骨伝導性をもつ純HAPモノリスあるいは純TCPモノリスを作製する手法を確立する。本年度の研究で,レゾルシノールーホルムアルデヒドゲルをバインダーとする方法では,細孔径100μm以上,圧縮強度10MPa以上のアパタイトハニカムを作製することは困難であることが判明した。そこで,平成25年度は,バインダーと溶媒の再選定,一方向凍結条件と空気焼成条件の再検討により問題点を解決する予定である。具体的には,骨補填材の作製条件,構造解析,一方向凍結時の熱流束シミュレーションにより,多孔構造の制御因子を明確化する。また,モノリスの高強度化のためには,気孔を形成する壁厚の増加,焼結の適切な進行が重要である。壁厚の増加には,セラミックス粒子濃度と凍結速度の増加が有効である。焼結を十分に進行させるには,バインダーの種類,溶媒の選定,昇温速度,焼成温度に詳細な検討を加える必要がある。したがって,本年度の研究実績に基づいて,ポリビニルピロリドンを含有したt-ブタノールにリン酸カルシウム系セラミックスを分散させて作製したスラリーを使用する計画である。(1)多孔構造制御高強度で連通気孔をもつ骨補填材を作製するには,気孔率,気孔径,壁構造を制御する必要がある。骨補填材の作製条件と構造解析結果より,多孔構造の制御因子を明確化し,100μm以上の連通気孔径をもつ骨補填材を作製する。モノリスのマクロ細孔径の制御因子としては,セラミックス粒子濃度,バインダーと溶媒の種類,凍結条件(凍結温度,凍結速度),焼成条件(焼成温度,昇温速度)が考えられるので,実験的に詳細な検討を加え,高強度の骨補填材が具備すべき多孔構造を明確にする。さらに,一方向凍結時の熱流束シミュレーションを実施し,理論的な裏付けを与える。本検討に物品費を使用する。(2)モノリスの高強度化骨補填材強度の制御因子を明確化し,圧縮強度10MPa以上の骨補填材を作製する。なお,荷重負荷による破壊試験によって作製した骨補填材の強度を測定する。
熱モードスペクトロスコピーによる革新的熱伝導率測定法の開発

微小固体の熱伝導率を正確に計測する熱モードスペクトロスピー法を確立した。熱的に孤立した固体には多くの熱モードが存在し、各モードの緩和時間は試料寸法と熱拡散率だけで決まるため、特定の熱モードだけを選択的に励起してその緩和時間を測定することにより、正確に熱拡散率、そして、熱伝導率が得られる。必要なパラメタは試料寸法だけであり、不確定なパラメタを含まず原理的に精度が高い。また、微小かつ高熱伝導率の試料ほど熱モードが明確に現れるため、従来法の不得意とする領域をむしろ得意とする手法である。微小機能性固体の熱モードという新しい概念に基づいた理論解析および有限差分法という数値解析法を考案・実施し、任意形状の試料に対して、熱モードの緩和時間と対応する温度分布を決定する手法を開発することに成功した。また、レーザーポンプ・プローブ光学系を開発し、微小試料の表面に局所加熱と局所温度変化を計測するシステムを確立した。励起には高出力のグリーンレーザー光を用い、検出には、チタンサファイアフェムト秒レーザーを用いた。熱モードの腹部にポンプ光により局所加熱を行い、熱モードの別の腹部において、プローブ光により光熱変換効果により温度計測を行う。これにより、微小ダイヤモンド、微小アルミニウム、微小ニッケル、微小銅等の様々な微小固体に対して、熱モードを励起させ、その緩和時間から熱拡散率を正確に計測することに成功した。さらに、任意形状への適用可能性を示すために、解析解の存在しない四面体に対して計測を行い、開発した計算アルゴリズムにより、その熱モードの選択的観測に成功した。温度分布を級数展開し、リッツ法を用いてモード解析を行うアルゴリズムを新しく完成させた。さらに、理論解析および数値シミュレーションを行うことにより、熱モード現象が、表面に成膜した熱抵抗膜や試料内温度分布の影響を受けにくいことを示すことができた。これらの成果は、我々が提案する熱モード現象を用いた熱伝導率計測法が、従来法では決して達成し得ない計測精度を実現することを裏付ける結果となった。当初目標としていた光学系の構築、熱モードの腹と節を利用したモード選択原理の確立、理論および数値シミュレーションによる熱モード現象の再現等の目的はすべて達成することができた。加えて、本手法の原理を任意形状にまで拡張し、実際にこれが可能であることを、実験的・解析的に証明することに成功した。さらに、理論解析および数値計算を新たに構築し、熱モード現象が従来の計測法よりも優れていることを証明することに成功した。これらの成果は当初の目標を大きく超えるものであり、当初の計画以上に進んでいると判断することができる。インパルス熱源を与えることにより、多数の熱モードを励起し、それらを選択的に検出する手法を確立した。さらに、熱源を点から直線状とすることにより、より、モード選択を向上することができる可能性を検討した。まずは、有限体積法によりその効果を確認した。このシミュレーションでは、アルミニウム直方体を用い、帯状のインパルス熱源を与えた際の温度応答を時間発展的に計算した。その結果、理論的に予測される熱モードが高い選択性により発生することが明らかとなった。実験的には、微小試料の任意の場所を加熱・検出することのできる光学系を構築した。さらに、特殊な楕円レンズをもちいることにより、加熱領域を帯状とすることに成功した。結果、熱モードの検出においてモード選択性が向上した。さらに、シミュレーションにおいて、試料の一部が熱接触を受けているときの解析を行った。これは、実際の試料は完全に熱的に孤立していることはなく、少なからず、熱接触を有するためである。加熱箇所と検出箇所を様々に変化させてシミュレーションを行った結果、もっとも緩和時間の長いモードにおいて系統的な知見を得ることができた。さらに、同じモードの腹内での加熱と検出、および、節をまたいだときの加熱と検出における温度応答のシミュレーション結果から、正確に緩和時間を決定するための実験条件を予測することができた。また、計測プログラムの確立を行った。個々の加熱パルスごとに応答を積算する形式の波形取得型と、10パルス程度の応答を一気にとりこみ、その後、自動的に分割して積算する形式の制御プログラムを確立した。これらにより、計測条件に応じてプログラムを選択することができる。これまでの手法では計測が極めて困難であったダイヤモンド等の高熱伝導率試料に対して計測を行い、同位体効果や結晶粒径効果を探求する。また、位相変調法も考案し、さらに高精度に熱モードを観測する実験系を構築する。超音波工学
中小企業向け資産証券化スキーム構築のための調査研究

本調査研究は、資産証券化を利用した中小企業・ベンチャー企業向けの新たな直接資金調達スキームのデザインを目的とし、(1)わが国において中小企業による資産証券化を阻害している制度的・経済的要因の明確化、(2)欧米諸国における中小企業の資産証券化を支える環境や仕組みの調査・分析、(3)欧米諸国の資産証券化スキームや制度のわが国企業への適用可能性に関する検討、(4)中小企業による資産証券化の具体的スキームのデザインと、それを支える中小企業施策あるいは証券化施策に関する提言、というプロセスで研究が進められた。1年目(初年度)においては、金融機関、証券会社、関連団体、地方自治体、監督官庁等からの聞き取り調査により、中小企業による資産証券化を阻害している制度的・経済的要因を明確化するとともに、現地調査や文献資料調査により、欧米においては、上記のような阻害要因を取り除くためにどのような工夫が施されているのかを明らかにした。2年目(最終年度)においては、現地調査や文献・資料調査によって把握された欧米各国における中小企業の証券化スキームやそれに関する制度が、わが国の現行の制度や金融・証券システム全体と整合性を有するかどうか、またわが国の企業文化やその他さまざまなビジネス環境の中で受容されるものであるかどうかを、細部にわたって検証するとともに、いかなる形で修正が試みられれば適用可能なものとなるかについて検討した。そして、以上の分析・検討結果を踏まえて、中小企業の資金調達に寄与する証券化スキームを構築するとともに、その効果を十分に発揮せしめるための制度的整備やその他必要となる施策をデザインした。中小企業への新たな資金供給ルートとして期待される「資産証券化」は、1998年のSPC法の施行以来、大企業や金融機関においては徐々に活発化してきてはいるものの、中小企業においてはまったく進んでいないというのが現状である。他方、欧米諸国においては、公的機関の支援や制度的な整備により、中小企業も資産証券化による資金調達を多用している。こうした現実認識の下、本調査研究は、資産証券化を利用した中小企業・ベンチャー企業向けの新たな直接資金調達スキームのデザインを目的とするが、そこで本年度末までの到達目標としたのが、(1)わが国において中小企業による資産証券化を阻害している制度的・経済的要因の明確化、(2)欧米諸国における中小企業の資産証券化を支える環境や仕組みの調査・分析である。前者に関しては、金融機関、証券会社、関連団体、地方自治体、監督官庁等からの聞き取り調査の結果、a.証券化対象資産決定にあたっての逆選択の問題、b.小口資産をプールする機関や仕組みの問題、c.企業評価スキルや企業データの蓄積不足の問題、d.流通市場未整備の問題、e.情報開示や信用各付けの問題、f.コスト・パフォーマンスの問題、g.オリジネーターのインセンティブの問題などが、本質的な阻害要因を形成することが判明した。一方、後者に関しては、現地調査や文献資料調査により、欧米においては、上記のような阻害要因を取り除くための工夫がさまざまな形で施されていることが明らかとなった。こうした現実認識の下、本調査研究は、資産証券化を利用した中小企業・ベンチャー企業向けの新たな直接資金調達スキームのデザインを目的としたが、2年目(最終年度)にあたる本年度実施したのは、(1)欧米諸国の資産証券化スキームや制度のわが国企業への適用可能性に関する検討、(2)中小企業による資産証券化の具体的スキームのデザインと、それを支える中小企業施策あるいは証券化施策に関する提言である。

前者に関しては、昨年度実施した現地調査や文献・資料調査によって把握された欧米各国における中小企業の証券化スキームやそれに関する制度が、わが国の現行の制度や金融・証券システム全体と整合性を有するかどうか、またわが国の企業文化やその他さまざまなビジネス環境の中で受容されるものであるかどうかを、細部にわたって検証するとともに、いかなる形で修正が試みられれば適用可能なものとなるかについて検討した。後者に関しては、ここまでの分析・検討を踏まえて、中小企業の資金調達に寄与する証券化スキームを構築するとともに、その効果を十分に発揮せしめるための制度的整備やその他必要となる施策をデザインした。
湾曲・分岐・合流部を有する大規模河川・水路網を遡上する津波の基本伝播特性の解明

本年度は,湾曲・分岐・合流部を有する河川・水路網を遡上する津波の基本伝播特性に関して,以下の検討を実施した.(1)波流れ共存場解析のための高精度数値解析モデルの開発河川を遡上する波浪は,河川流によりブロックされ,波高が増幅するとともに,波長が減少する(Wave-Blocking).本年度は,こうした波長変動を精度良く解析でき,高波数領域にも適用可能な新しい波浪変形モデル(理論および数値モデル)の構築を行った.また,砕波減衰や任意反射境界を取り扱うための手法を新たに開発した.現在,空間的に非一様な流速分布を有する河川に孤立波が入射した場合の波浪伝播特性を解析中である.(2)湾内に入射した孤立波の透過・反射特性の解析湾内に入射した津波は,河川・水路網を遡上する前に,湾形状の影響を受けて局所的に波高を増幅させる.ここでは,台形型の湾を対象に,平面波動水槽と湾模型を用いた室内実験を実施し,壁面近傍の局所的な波高増幅特性を検討するとともに,実験結果と解析結果を比較し,解析手法およびその結果が定性的並びに定量的検討に十分な精度を有することを示した.また,入射波高および湾形状(収縮角)を変化させて,体系的な数値解析を実施し,孤立波の透過・反射特性を解明した.(3)水路・河川網における孤立波伝播特性の解析多数の分岐合流部を有する複雑形状領域の波浪伝播特性を簡易に解析できるように従来の解析モデルを拡張し,モデル地形を対象に孤立波の伝播特性を解析した.また,本数値モデルが,複数の水理構造物を含む領域や複雑形状を有するダム貯水池等の波浪解析にも適用可能であることを示した.本年度は,湾曲・分岐・合流部を有する河川・水路網を遡上する津波の基本伝播特性解明の第一段階として、各種の水路網を対象に以下の検討を実施した.(1)水路湾曲部における孤立波のマッハ反射特性の解析まず,入射波高および水路の形状(水路幅,曲率,湾曲角)を変化させて,体系的な数値解析を実施し,同心円状の湾曲部を有する曲水路を孤立波が伝播する際の波浪の伝播特性,最大波峯高およびその空間分布特性を解明した.特に,水路幅が十分に大きい曲水路を波浪が伝播する際に発達するステム波(マッハ反射)に着目した解析を行い,直線壁に沿った孤立波のマッハ反射特性との類似・相違点を明らかにした.(2)水路分岐部における孤立波の分裂特性の解析次に,(1)で用いた解析プログラムを,分岐・合流部を有する水路網に適用できるように拡張して体系的な数値解析を実施し,y字型の分岐水路を対象に分岐通過後の透過波高と水路形状との関連を明らかにした.また,平面波動水槽と水路模型を用いた室内実験を合わせて行い,解析結果と実験結果を比較した結果,解析手法およびその結果が定性的並びに定量的検討に十分な精度を有することを検証した.(3)水路合流部における孤立波の衝突特性の解析さらに,y字型の合流部を有する水路を対象に合流部における2つの孤立波の衝突過程を詳細に解析し,入射波高および水路形状と壁面での最大波峯高との関連を明らかにした.また,(2)と同様な室内実験を実施し,解析手法およびその結果が定性的並びに定量的検討に十分な精度を有することを検証した.本年度は,湾曲・分岐・合流部を有する河川・水路網を遡上する津波の基本伝播特性に関して,以下の検討を実施した.(1)波流れ共存場解析のための高精度数値解析モデルの開発河川を遡上する波浪は,河川流によりブロックされ,波高が増幅するとともに,波長が減少する(Wave-Blocking).本年度は,こうした波長変動を精度良く解析でき,高波数領域にも適用可能な新しい波浪変形モデル(理論および数値モデル)の構築を行った.また,砕波減衰や任意反射境界を取り扱うための手法を新たに開発した.現在,空間的に非一様な流速分布を有する河川に孤立波が入射した場合の波浪伝播特性を解析中である.(2)湾内に入射した孤立波の透過・反射特性の解析湾内に入射した津波は,河川・水路網を遡上する前に,湾形状の影響を受けて局所的に波高を増幅させる.ここでは,台形型の湾を対象に,平面波動水槽と湾模型を用いた室内実験を実施し,壁面近傍の局所的な波高増幅特性を検討するとともに,実験結果と解析結果を比較し,解析手法およびその結果が定性的並びに定量的検討に十分な精度を有することを示した.また,入射波高および湾形状(収縮角)を変化させて,体系的な数値解析を実施し,孤立波の透過・反射特性を解明した.(3)水路・河川網における孤立波伝播特性の解析多数の分岐合流部を有する複雑形状領域の波浪伝播特性を簡易に解析できるように従来の解析モデルを拡張し,モデル地形を対象に孤立波の伝播特性を解析した.また,本数値モデルが,複数の水理構造物を含む領域や複雑形状を有するダム貯水池等の波浪解析にも適用可能であることを示した.
天然河川におけるニホンウナギの生理生態学的解析に基づいた資源動態モデルの構築

ニホンウナギの養殖は天然のシラスウナギに依存しているものの,漁獲量は減少の一途にある.資源の回復には,河川に加入する時期や量を把握することに加え,質の評価も重要である.ニホンウナギは,河川への加入後も汽水域や沿岸を成長の場として利用できる優れた浸透圧の調節機構を持っている.そこで本研究では,まずシラスウナギの接岸パタンの年変動を明らかにした.続いて,鰓で浸透圧調節を行う塩類細胞の形態的変化や各種イオン輸送体の発現パタンを調べることで,自然環境下における塩分適応能を検討した.さらに,環境変化に応じた適応機構においてエネルギー源として利用されるグリコーゲン量の比較も行った.2009および2010年級群で見られた初夏の来遊群は,その後もおよそ2年に1度の頻度で小さな規模で見られた.接岸は概ね12月から翌年の4月にかけてであり,年による変化はなかった.一方,2017年級群は3月のごく短期間にのみ集中して接岸する特異なパタンを示した.早期変態期,シラスウナギ期,淡水クロコ期,汽水クロコ期,および黄ウナギ期の標本について,塩類細胞の相対面積を比較したところ,環境塩分を反映して大きさが変化することがわかった.シラスウナギ期では接岸時期を通して塩類細胞の体積は一定であったものの,同時に接岸した群には様々な大きさの細胞を持つ個体が含まれていた.小型の塩類細胞を持つ個体はより早く淡水適応を開始したと考えられ,こうした個体差が広い塩分の環境を成長の場として利用するニホンウナギの回遊多型をもたらしているものと考えられた.各月の接岸群のグリコーゲン含量は,接岸時期が遅くなるほど少なくなった.2017年級群は,他の年級群に比べて来遊が著しく遅れる特異的なものであった.したがって,輸送を妨げる何らかの要因により接岸までの時間がかかり,多くのグリコーゲンが消費されていた可能性が考えられた.ニホンウナギの漁獲量は1970年代から激減し,天然種苗に専ら依存している養鰻業では深刻な問題となっている.本種の資源を回復するためには,河川に加入する時期と量,および河川での生残の実態を把握することが重要である.しかし,いつどのくらいの数のシラスウナギが接岸し,どのように河川に定着するのかはほとんど明らかとなっていない.そこで本研究は,周年の来遊量調査によりシラスウナギの接岸量と時期について科学的に信頼できるデータを取得するとともに,淡水域移行にともなう生理・生態的な変化を多面的に理解することを目的とした.相模川河口において,2016年4 - 6月にそれぞれ7- 32個体のシラスウナギが採集され,7月にはクロコ期の個体が確認された.11月から翌年の2月にかけては22 - 106個体のシラスウナギが採集され,これは同地点における過去7年間の接岸量と比べて著しく多かった.酒匂川水系の下菊川では,クロコ期から黄ウナギ期にかけて計10個体が採集された.鰓の組織観察は,シラスウナギ期およびクロコ期について行った.クロコ期の標本は,生息域の塩分により汽水群と淡水群に区分した.4種類の抗体による免疫染色では,いずれも明瞭な陽性反応を確認できた.抗NKA抗体および抗NKCC抗体は,いずれの標本でも免疫陽性細胞が確認された.一方,抗CFTR抗体はシラスウナギ期および汽水クロコ期では明瞭な陽性細胞が見られたものの,淡水クロコ期では微弱であった.抗NKCC抗体陽性細胞はすべての生活史段階で存在し,抗CFTR抗体陽性細胞は淡水に移行した時点で減少したことは,環境の塩分に応じた変化と解釈できる.抗マウスNKA抗体の陽性細胞の大きさは,シラスウナギ期では汽水クロコ期の2.3倍,淡水クロコ期の3.2倍であった.すなわち,抗NKA抗体陽性細胞は塩分を反映して細胞の大きさが変化することがわかった.標本の採集および解析について,ほぼ計画通りに進行した.相模川河口におけるシラスウナギの定量的採集については,現段階では技術的および漁獲規制による問題の解決が難しいため,これまでと同様に光を利用した採集を実施した.過去7年間の実績と比較して採集量は極めて多く,東アジア一帯における漁獲動向と一致していた.クロコ期の個体の採集については期待したほどを得ることはできなかったが,これは前年度の加入量が少なかったためと考えられた.2016年度は多くの加入があったと考えられるため,次年度は十分な数を確保できると予想している.鰓の塩類細胞の観察では,用いた全ての抗体で明瞭な陽性シグナルを検出できた.また,海水から淡水へと生息の場を移行する際の生理的な変化と対応させることができた.一方,二重染色の際に非特異的なシグナルも見られたことから,組織固定法の改善を検討している.ニホンウナギは,フィリピン海のグアム島周辺海域で生まれ,12月から翌年の3月ごろにかけて河川に接岸する.一方,来遊量は激減を続けて絶滅危惧種(IB類)に掲載されており,有効な保全策の立案が急務となっている.しかし,来遊量に関しては信頼度の乏しい漁獲統計しか存在せず,また海洋から河川に生活の場を移す際の生態的および生理的な変化は十分に理解されていない.そこで本研究は,シラスウナギの接岸量モニタリングを実施するとともに,河川生活初期における生理的な変化を明らかにすることを目的とした.成果-1:新月の前後に神奈川県相模川河口においてシラスウナギの接岸量を調べた.

2016年11月から2017年6月にかけて接岸が確認され,12月から3月にかけてがピークであった(n = 27-99).一方,2017年は12月まで接岸がなく,2018年1月と2月もわずかに認められたのみであった(それぞれn = 9, 4).しかし,3月には182個体,4月にも90個体の接岸が認められた.本研究により,接岸時期が例年よりも遅れていることが確認された.成果-2:海水から淡水へと成長の場を移す際には,塩分の異なる環境に適応する必要がある.この機構を定量的に評価するために,鰓に存在して塩イオンの取り込みと排出を担う塩類細胞の解析を実施した.塩類細胞で機能する3種類のタンパク質(NKA,NKCC,CFTR)について,特異抗体を用いた2重染色法を確立した.また,共焦点レーザー顕微鏡を利用して,塩類細胞の体積を測定した.その結果,シラスウナギ期(全長,53.2 - 58.6 mm)では2000 - 10000 um^3)であるのに対し,黄ウナギ期では2000 um^3以下となり,これを指標として塩分適応を定量的に評価できることが示唆された.2017年の5月ごろに河川においてクロコ期の標本の採集を計画していたが,ほとんど採集できなかった.過去に十分な実績がある地点であり,理由は明らかではない.そこで,2018年度も採集を実施する.ニホンウナギの養殖は天然のシラスウナギに依存しているものの,漁獲量は減少の一途にある.資源の回復には,河川に加入する時期や量を把握することに加え,質の評価も重要である.ニホンウナギは,河川への加入後も汽水域や沿岸を成長の場として利用できる優れた浸透圧の調節機構を持っている.そこで本研究では,まずシラスウナギの接岸パタンの年変動を明らかにした.続いて,鰓で浸透圧調節を行う塩類細胞の形態的変化や各種イオン輸送体の発現パタンを調べることで,自然環境下における塩分適応能を検討した.さらに,環境変化に応じた適応機構においてエネルギー源として利用されるグリコーゲン量の比較も行った.2009および2010年級群で見られた初夏の来遊群は,その後もおよそ2年に1度の頻度で小さな規模で見られた.接岸は概ね12月から翌年の4月にかけてであり,年による変化はなかった.一方,2017年級群は3月のごく短期間にのみ集中して接岸する特異なパタンを示した.早期変態期,シラスウナギ期,淡水クロコ期,汽水クロコ期,および黄ウナギ期の標本について,塩類細胞の相対面積を比較したところ,環境塩分を反映して大きさが変化することがわかった.シラスウナギ期では接岸時期を通して塩類細胞の体積は一定であったものの,同時に接岸した群には様々な大きさの細胞を持つ個体が含まれていた.小型の塩類細胞を持つ個体はより早く淡水適応を開始したと考えられ,こうした個体差が広い塩分の環境を成長の場として利用するニホンウナギの回遊多型をもたらしているものと考えられた.各月の接岸群のグリコーゲン含量は,接岸時期が遅くなるほど少なくなった.2017年級群は,他の年級群に比べて来遊が著しく遅れる特異的なものであった.
ATP合成酵素(FoF1)の構造、回転、制御

ATP合成酵素のATP合成/分解の触媒活性は, F_1-ATPase部分にある。F_1-ATPaseではα3β3がリング状に配置され、その内部に棒状のγサブユニットが存在する。3つのβサブユニットそれぞれに触媒部位が存在し、そこでATP加水分解が進行すると、γサブユニットが回転する。そこで、1つのβサブユニットだけ活性を99%失う変異を導入して回転を観察した結果、以下のことが明らかになった。γサブユニットが.度の位置で1つのβサブユニットに結合したATPは、それから200度回転した位置で加水分解され、320度回転した位置で無機リン酸を放出する。3つのβサブユニットが、あたかも輪唱のようにこの過程を120度の位相差でおこなうことでγサブユニットがスムーズに回転することが分かった。蛍光色素を1つのβサブユニットにふらふらしないように2点で結合してその構造変化を回転と同時に観察した。ATP合成酵素(F_oF_1)は、H^+の流れで駆動するF_oモーターと、ATPで駆動するF1モーターが、共通の回転シャフト(c_(10)-γε)を持つことによって、H^+の流れでATPを合成する。この基盤研究(S)では、F_oF_1およびF_oモーターの原子構造の解明、回転の分子的な理解、F_oF_1によるATPの合成と分解の制御、を追究する。平成18年度は、適当な研究員が雇用できなかったために、19年度繰越しして研究員を採用し、ATP合成酵素の結晶構造解析に主力を傾注した。結晶化には、均一な構造をもった分子集団が必要であり、回転異性によるATP合成酵素の不均一化は重大な問題である。そこで、回転子と固定子を遺伝子的に融合し回転を一箇所で止めたATP合成酵素とそのバリアントを多数作製し、大腸菌内で発現させる条件、精製法などを検討した。その結果、数種の回転しない(したがって活性はない)、しかし、構造はインタクトな酵素を得ることが出来た。現在、これらの結晶化条件を探索してきた。そのほかに、固定子のa-subunitにある必須のアルギニンは、プロトンの短絡を防ぐ役割を担っていることを生化学的に確かめた。ATP合成酵素は、膜電位と無機リン酸が存在すると、ADP阻害から回復する。そのときにεサブユニットのC-末端側のヘリックスの構造変化が重要な役割を果たしていることがわかった。また、ATPが結合したεサブユニットの立体構造を決めることが出来た。ATPがないと、C-末端側のヘリックスは固定されないでふらふらしていることもわかった。ひとつのβサブユニットだけを低活性としたF1を作製して、その回転挙動をみた。すると0度でそのひとつのβサブユニットに結合したATPは、それから200度回転したところで加水分解されることがわかった。320度のところで、もうひとつのイベントがおきる。こうして3つのβサブユニットが協調するようすが1分子で観測された。平成20年度は、前年度に作製した回転子と固定子を遺伝子的に融合し回転を一箇所で止めたATP合成酵素とその多数のバリアントを、大腸菌で発現させて精製して結晶化の条件を検索した。界面活性剤の種類と条件を徹底的に検討した。19種類の界面活性剤を用いて、膜画分からATP合成酵素、(C_<10>-a)F_0複合体およびab_2サブ複合体の可溶化および精製をおこなった。SDS-PAGE、ゲルろ過クロマトグラフィー、ATP加水分解活性測定から、各界面活性剤で得られる複合体の収率、安定性、単分散性、活性を検討した。その結果、ドデシルマルトシドやウンデシルマルトシドなどのマルトシド系の界面活性剤で、安定で単分散したATP合成酵素、(C_<10>-a)F_0およびab_2を得ることができることを見出した。(a-ε-γ)F_0F_1と(c_<10>-a)F_0をドデシルマルトシドで精製し、結晶化を行ったところ、いくつかの条件で擬結晶が得られた。これらの擬結晶は目的のタンパク質からなることを電気泳動で確認した。このことは、結晶化に用いているサンプルは安定で単分散した良好なものであることを示している。また、ab_2部分複合体を抗原にして、モノクロナル抗体を生産する抗体産生細胞株作成した。抗体のスクリーニングを工夫して、ab_2の細胞質側に結合する抗体とab_2のペリプラズム側に結合する抗体を産生する細胞株を得ることに成功した。

これらのFabフラグメントは、F_0F_1および(c_<10>-a)F_0に1:1で結合する。1分子観察によって、回転と同時に一つのβサブユニットの構造変化を追跡することに成功した。その結果、今までのF1の結晶構造は、80度のいわゆる加水分解角度のときの構造で、ATP待ちのときのF1の構造においてはこれと違った構造が現れていることがわかった。平成21年度は、好熱菌のATP合成酵素(F_0F1)の結晶化に全力を注いできた。回転位置停止位置をそろえるために、c-ring-ε-γを遺伝子的に融合したF_0F1を用いて、さまざまな界面活性剤で可溶してゲルロカで単分散になる条件、および活性を失わない条件をさぐった。ついで、標品を長時間放置してその安定性を検定した。その結果、すべての点でオクチルマルトシドが好適であることがわかったので、結晶化条件の探索を進めたところ、ある条件で結晶が得られた。しかし、結晶を集めて溶かして分析したところ、αとβサブユニットしかなかった。さらに調べると、意外なことに、沈殿剤としてもちいたポリエチレングリコール存在下ではこのF_0F1は不安定であり、おそらく混入するわずかなプロテアーゼによって分解されて残ったα_3β_3が結晶化したと思われる。F_0の回転子と固定子の間のふらつきがこの不安定性の原因と考えて、今度はc-ring-aを遺伝子的に融合したF_0F1で、結晶化を試みることとした。また、精製度をたかめてプロテアーゼをできるだけ除くようにした。精製品は単分散である。現在、ポリエチレングリコール存在下の安定性を検定している。平成22年度も、好熱菌のATP合成酵素(FoF1)の結晶化に全力を注いできた。平成21年度は、c-ring-ε-γを遺伝子的に融合したFoF1を用いて、結晶化を試みたのだが、結局とれたのは、α_3β_3の結晶であった。おそらく混入するわずかなプロテアーゼによって分解されて残ったα_3β_3が結晶化したと思われる。そこで、c-ring-ε-γをあきらめて、今度はc-ring-aを遺伝子的に融合したFoF1で、結晶化を試みてきた。単分散の精製品を得ることが出来て、今度は長期間、安定であった。しかし、凝集しやすい欠点があり、これは条件検討の末に塩濃度をあげることで単分散を保ったまま結晶化を試みることができるようになった。微細な結晶あるいは擬結晶がでるようになったが、微量過ぎてこれが完全なホロ酵素か、まだ確認が出来ていない。ひきつづき結晶化条件をつめているのだが、この研究を行っていた研究員が、平成22年9月に工業専門学校に就職したので、FoF1(c-ring-a)を精製し結晶化に専念する者がいなくなってしまった。にわかには、膜タンパク質の精製や結晶学に優れた研究員の補充はできず、したがって、これ以降、平成22年度の残りの期間は、研究補助員によって発現大腸菌の培養、膜の分離のみを行っている。研究費は繰り越しを申請せざるをえなかった。繰り越しが認可され次第、新規の研究員を雇って平成23年度の研究を発足させる。