hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
行動する動物からニューロン並列活動を計測する共焦点スキャンシステムの開発

本研究は,無傷の動物から脳回路網の活動を単一のニューロンレベルで光学計測する非侵襲計測システムを構築し,試用することを目的とする.本年度は,昨年度製作した共焦点レーザー高速スキャンシステムの画像処理システム部分を開発を加え,開発した光学計測システムを用いて,実際にゼブラフイッシュの脳ニューロンの活動を計測した.512×512画素のイメージを260ミリ秒ごとに取り込む平面スキャンと1走査線を2ミリ秒ごとに取り込むラインスキャンを主に用いて,ゼブラフィッシュ稚魚の後脳に存在するマウスナー細胞の抑制性シナプス応答を記録することに成功した.ゼブラフィッシュの稚魚は体が透明であるので,カルシウム蛍光指示薬(Calcium Green-1Dextran)でラベルしたニューロンの活動を体の外から光学計測できた.マウスナー細胞の活動電位に伴う蛍光強度の変化は,べースラインのおよそ60%であり,加算処理をせずに単一のニューロンの活動を記録できた.抑制性シナプス応答がこの活動電位に伴う蛍光応答を減弱させることを利用して,抑制応答を計測した.光学計測したシナプス応答は,パッチクランプ法を用いて電気生理学的に記録したシナプス電流により確認した.本研究成果は,無傷動物の脳から抑制性シナプス応答を計測した初めての例で,Joumal of Neuroscience誌に発表した.本研究は,無傷の動物から脳の個々のニューロン活動を光学計測する非侵襲計測システムを構築することを目的とした.本年度は,製作した共焦点レーザー高速スキャンシステムを用いて,実際にゼブラフィッシュの脳ニューロンの活動を計測するのに加えて,新たに動物の運動と脳ニューロン活動を同時計測する光学システムに発展させた.100×100画素のイメージを100ミリ秒ごとに取り込む平面スキャンと1走査線を2ミリ秒ごとに取り込むラインスキャンを主に用いて,ゼブラフィッシュの後脳に存在するマウスナー細胞やその相同ニューロンである網様体脊髄路ニューロンの活動を同時記録することに成功した.ゼブラフィッシュの稚魚は体が透明であるので,カルシウム蛍光指示薬(Calcium Green-1 Dextran)でラベルしたニューロンの活動を体の外から光学計測できた.活動電位に伴う蛍光強度の変化は大きく(約60%),加算処理をせずに単一のニューロン活動を記録できた.マウスナー細胞では抑制性シナプス応答が活動電位応答を減弱させることを利用して,抑制応答を光学計測した.この成果は,動物の脳から抑制性シナプス応答を非侵襲計測した初めての例で,Journal of Neuroscience 22: 3929-3938, 2002に発表した.また,運動中のゼブラフィッシュからニューロン活動の光学計測と運動の高速解析を同時に行うために,共焦点レーザー顕微鏡と光学顕微鏡を上下に組み合わせた計測システムを新たに製作した.2つの顕微鏡間で光の干渉が起こらないように工夫し,さらに高感度高速ビデオカメラ(2ms/frame)を光学顕微鏡に装着して,瞬時に起こるゼブラフィッシュの逃避運動を記録した.新しく開発した同時計測システムを用いれば,運動中の動物の脳から複数のニューロンの活動が計測され,脳の並列処理の実態を解析できる.
側線感覚器官の形成を担う細胞外環境の遺伝学的解析

側線系に異常を引き起こすことを指標に新規のゼブラフィッシュ変異体め原因遺伝子の同定と異常を引き起こすメカニズムについて解析を行った。mujina変異体は、もともとは神経軸索が変性する系統として同定されたが、その他にも有毛感覚器管の分化異常、血管内腔の形成異常、メラノサイトの形態異常といった多彩な表現型をもつ興味深い系統である。組換え頻度を指標に変異遺伝子座の遺伝子マッピングを行ったところ、コレステロール合成に関与する酵素をコードする遺伝子に変異のあることが判明し、さらにモルフォリーノ・アンチセンスオリゴによる遺伝子ノックダウン・当該酵素の阻害剤によって同様の表現型を確認したことから、原因遺伝子のクローニングに至ったと判断した。さらに上記の発生異常を引き起こす原因となる代謝産物を探索することを目的として、コレステロール合成系路の遺伝子群を順次ノックダウン解析した結果、Gタンパク群を修飾するゲラニルゲラニル転移酵素の欠損によって上述の表現型が引き起こされることが判明した。すなわちコレステロール代謝経路を担う原因遺伝子の異常が低分子量Gタンパクの機能異常を引き起こすことによって、神経軸索の変性や血管内腔の発達異常が誘発されたと考えることができる。今後は機能低下によって異常を引き起こす要因となったGタンパクを同定し、さらに神経軸索の維持や血管内腔の形成に必要と考えられる細胞外環境因子の存在を明らかにする。同時に、残されている変異系統の遺伝子クローニングを行い、側線器官の形成に必要な細胞外環境の解明を目指していく。器官発生において細胞の移動および分化に関与する細胞外シグナルの作用をゼブラフィッシュの側線系を用いて明らかにすることを目指し、これまでに新規の変異体を同定してきた。平成18年度においては、ゼブラフィッシュ側線変異体、Slow tempo、walk off(軸索ガイダンス・細胞移動の変異体)、shane(側線原基と神経の細胞間相互作用および軸索伸長の変異体)、mujina(細胞分化と神経軸索の維持に異常をきたす変異体)の4系統似絞ってで原因遺伝子のクローニングを試みたが、shaneおよびmujinaでクローニングに成功したものの、残る2系統ではゲノム情報の不正確な領域にはまりこんでしまい、遺伝子の同定には至らなかった。また本題からはやや逸脱するがmujina変異体においては側線神経のみならず、血管系・色素細胞系に異常を引き起こすことを発見した。特にmujina変異体の血管系の表現型は興味深く、血管発生期の内皮細胞の配列パターンは正常に形成されるが、血管内腔ができないために血流が流れることができない。そこで同定したmujina変異遺伝子をさらにヒト培養細胞系で解析し、培養細胞でも同様の働きを持つことを明らかにした。mujina変異体ではコレステロール代謝系に異常があり、側線神経の変性のメカニズム、血管内腔形成異常のメカニズムにmujina遺伝子がそれぞれどのように作用していくかを解明していくことで、細胞外環境の研究のブレークスルーとなる可能性を期待したい。
「いのち」とジェンダーの視点からみた性と生殖の近世・近代

本研究の目的は、性と生殖の現場として「家」と「遊所」を取り上げ、性と生殖の近世から近代への重層的な展開を明らかにすることにある。そのため28年度には「いのち」の視点を明確にするために、日本人口学会公開シンポジウムで「近世日本の妊娠・出産管理」と題する報告を、大阪歴史科学協議会例会で「乳からみた近世社会の女の身体・子どものいのち」と題する報告を行い、『歴史科学』に論文としてまとめた。さらに29年度は「いのち」の視点から性と生殖の問題を考えるうえで、「乳」と出産に焦点を当てることの重要性が改めて浮かび上がってくるなかで、産婦、乳幼児ともに死亡率の高かった近世社会の人々は、どのように「いのち」をつないできたのか、「乳」を切り口に、日記や妊娠・出産管理政策の中で残された史料群、図像など多様な史料を手がかりに『江戸の乳と子どもーいのちをつなぐ』をまとめた。最終年度には、近世後期の下層武士の日記を素材に、離別によって母子となった事例を取り上げ、共同体のネットワークのなかで、どのようにいのちをつないでいったのかについてまとめたほか、山形大学附属博物館所蔵文書のなかの女・子どものいのちに関する史料収集をおこなった。なお本研究の持つ意味を歴史学全体の研究状況の中に位置付けるため「いのち」とジェンダーの視点が歴史学にとって持つ意味について『現代歴史学の成果と課題』所収「いのち」とジェンダーの歴史学」としてまとめた。以上三年間の本研究の成果は『女と男の近世史(仮題)』(岩波新書)として刊行予定である。1、「「いのち」とジェンダーの視点からみた性と生殖の近世・近代」をテーマとする本研究の目的は性と生殖の現場として「家」だけでなく「遊所」の性と生殖を取り上げるとともに、性と生殖の近世から近代への重層的な展開を明らかにすることにある。2、研究の初年度にあたる今年度は、本研究のキーワードである「いのち」への視点を明確にするために日本人口学会公開シンポジウムで「近世日本の妊娠・出産、管理」と題する報告を、さらに大阪歴史科学協議会例会で「乳からみた近世社会の女の身体・子どものいのち」と題する報告を行い、そこで出された様々な意見もふまえ『歴史科学』に論文としてまとめ、また松江藩領内の遊女関係の史料収集をおこなった。3、以上のような準備段階を経る中で浮かび上がってきたのが、「いのち」をつなぐうえで、「乳」が持っていた重要な役割である。そこで、近世社会にあっては赤子の命綱であった「乳」を切り口に、産婦、乳幼児ともに死亡率の高かった近世社会の人々は、どのように「いのち」をつないできたのか、文学作品、日記、妊娠・出産管理政策の中で残された史料群、図像など多様な史料を手がかりに、また分析にあたっては当事者である男、女、子どもの声を浮かび上がらせるよう努めつつ『江戸の乳と子どもーいのちをつなぐ』と題する一書をまとめた。4、その中で、長期授乳により出生間隔をあけ出生コントロールをはかる農民と乳母を雇うことで頻産に陥る上層武士層など、階層による出生コントロールのありかたの違い、また胎内で乳綱を通して乳を吸う赤子という胎児観などが明らかとなり、「乳」は、近世社会の「いのち」のありように迫るうえで重要な切り口になることも見えてきた。1研究計画の初年度が経過したが、当初の計画以上に、研究の視点を明確にしたうえで、研究成果を出すことができた。2本研究の視点、史料読解の方法を明確にするための論文を一本、学会での発表を一回、おこなうことができた。3また、視点の明確化と、多様な史料の分析を深めるなかで単著をまとめることができ、その中で、「いのち」のありようを階層の違いにも留意して分析し、胎児観や性と生殖の近世から近代への重層的展開を明らかにするうえで「乳」が重要な切り口になることを明らかにできたことは、当初の計画以上の進展と言える。2、研究の二年目にあたる今年度は、本研究のキーワードである「いのち」への視点を明確にするために日本家政学会、乳房文化研究会で報告を行うとともに、松江藩領内の「いのち」に関わる民間療法や出産をめぐる史料や遊女関係の史料収集、岩手県永年保存文書のなかの明治初年の育子法をめぐる史料収集をおこなった。3、以上のような調査を経るなかで、「いのち」の視点から性と生殖の問題を考えるうえで、「乳」と出産に焦点を当てることの重要性が、改めて浮かびあがってきた。また、昨年、産婦、乳幼児ともに死亡率の高かった近世社会の人々は、どのように「いのち」をつないできたのか、「乳」を切り口に、日記、妊娠・出産管理政策の中で残された史料群、図像など多様な史料を手がかりに、また分析にあたっては当事者である男、女、子どもの声を浮かび上がらせることに留意して『江戸の乳と子どもーいのちをつなぐ』をまとめたが、残された課題を「『江戸の乳と子ども』その後」で整理し、国会図書館史料の中から、近世から近代の展開を明らかにするための史料収集を行った。

4、本課題に接近する上で、時間軸のみならず空間軸に留意し、「いのち」をめぐる多様な史料をクロスさせる必要性も明らかとなり、空間軸にも留意した分析結果を「町絵図と日記に見る女の姿」にまとめた。また、「いのち」とジェンダーの視点が歴史学にとって持つ意味を、近世史研究と、近現代の性、生殖、売買春を扱った研究成果に学び「「いのち」とジェンダーの歴史学」をまとめた。1研究計画の二年度が経過したが、当初の計画通りに、研究の視点を明確にするとともに、研究成果を出すことができた。2本研究の視点、史料読解の方法を明確にするための論文を二本、共著を一冊まとめ、学会、研究会での招待講演を三回おこなうことで、さらに課題の明確化がはかれた。3課題と視点が明確になる中で、当初の計画通りの史料収集以外に、近世から近代への展開を明らかにする重要な手がかりとなる史料を、岩手県永年保存文書のなかから、また国会図書館で収集することが出来た。「いのち」をめぐる史料は、断片的にしか残されていないが、松江市域については、それら断片的で多様な史料をクロスさせていくことで、「いのち」をめぐる状況が明らかにできるという見通しが持て、それらについては、松江市史に執筆中である。さらにいのちをつなぐ当事者の声や実像を探るうえで日記は有効な歴史史料であるが、日記をもとに、人々がどのようにいのちをつないできたか「乳のやりとり」に焦点を当てた論文を、国立民族学博物館の共同研究の成果として刊行予定の共著に執筆中である。以上の点から、おおむね順調に進展しているといえる。本研究の目的は、性と生殖の現場として「家」と「遊所」を取り上げ、性と生殖の近世から近代への重層的な展開を明らかにすることにある。そのため28年度には「いのち」の視点を明確にするために、日本人口学会公開シンポジウムで「近世日本の妊娠・出産管理」と題する報告を、大阪歴史科学協議会例会で「乳からみた近世社会の女の身体・子どものいのち」と題する報告を行い、『歴史科学』に論文としてまとめた。さらに29年度は「いのち」の視点から性と生殖の問題を考えるうえで、「乳」と出産に焦点を当てることの重要性が改めて浮かび上がってくるなかで、産婦、乳幼児ともに死亡率の高かった近世社会の人々は、どのように「いのち」をつないできたのか、「乳」を切り口に、日記や妊娠・出産管理政策の中で残された史料群、図像など多様な史料を手がかりに『江戸の乳と子どもーいのちをつなぐ』をまとめた。最終年度には、近世後期の下層武士の日記を素材に、離別によって母子となった事例を取り上げ、共同体のネットワークのなかで、どのようにいのちをつないでいったのかについてまとめたほか、山形大学附属博物館所蔵文書のなかの女・子どものいのちに関する史料収集をおこなった。なお本研究の持つ意味を歴史学全体の研究状況の中に位置付けるため「いのち」とジェンダーの視点が歴史学にとって持つ意味について『現代歴史学の成果と課題』所収「いのち」とジェンダーの歴史学」としてまとめた。以上三年間の本研究の成果は『女と男の近世史(仮題)』(岩波新書)として刊行予定である。1本研究をすすめるにあたり、さらに広く日本近世、近現代史の「「いのち」」とジェンダーの歴史学」のなかでの本研究の位置づけを明確にするために、歴史学研究会編『現代歴史学の成果と課題』に「「いのち」とジェンダーの歴史学」を執筆し、今年度5月に刊行予定である。2今年度の研究成果の一部は、今年度10月21日に開催される日本家政学会家族関係学セミナー『家族/家庭のリアリティーを多角的に考えるー生活者としての女・男・子どもの生きざまを問い直す』で報告し、さらに国立歴史民俗学博物館の共同研究の成果としての共著に分担執筆する。
バイオミネラリゼーションに倣ったナノカーボン融合マテリアルの形態制御と機能探索

単層カーボンナノチューブ(SWCNTs)は、高い電気・熱伝導性をはじめとする多彩な機能を持つことが知られているが、分散性・混和性が低く他材料との融合が困難な点が材料応用の妨げになっていた。本研究では、デンドリマーの界面制御機能を利用することで、SWCNTsと様々な無機材料とのハイブリッド化を可能とするとともに、得られる階層構造に由来する機能を明らかとすることを目的とした。これまでの成果に基づき、平成26年度以下の研究を行った。(1)CNT融合マテリアル合成に利用するデンドリマーとしてフラロデンドロンを利用した場合、C60部位と多層カーボンナノチューブ(MWCNT)との相互作用が弱いため、MWCNT融合マテリアル合成が困難であった。そこで、あらゆるCNT融合マテリアル合成を可能とするため、アルキル鎖をコアに持つ新規デンドリマーを開発し、CNT/デンドリマー超分子複合体形成に成功した。さらに、炭酸カルシウムとのハイブリッド化について検討した所、SWCNTにおいてもMWCNTにおいても、同様なナノハイブリッドが得られることが分かった。(2)コアのSWCNTsの直径分布の違いが光触媒機能に与える影響について蛍光寿命測定から詳細に検討し、直径の太いSWCNTsが光触媒機能向上に有用であることを明らかとした。したがって、光触媒機能向上のためには、コアのSWCNTの直径制御が必要と考えられる。26年度が最終年度であるため、記入しない。本研究では、デンドリマーの界面制御機能を利用することで、SWCNTsと様々な無機材料とのハイブリッド化を可能とするとともに、得られる階層構造に由来する機能を明らかとすることを目的としている。これまでの成果に基づき、平成25年度は、(1)SWCNTをコアに持つ同軸ケーブル構造のシェル部化学修飾による光触媒機能の向上、(2)ナノ同軸ケーブル構造を持つ融合マテリアルの光誘起電子移動におけるSWCNTコアの役割と材料設計指針の提案、(3)新たなナノカーボン融合マテリアル合成法の開発、の3点について検討を行った。具体的には、フラロデンドロンを利用したナノカーボン界面修飾法を用いCaCO3やSiO2といった無機材料とSWCNTsとのハイブリッド化を可能とするとともに、得られる融合マテリアルの持つ同軸構造を有する光機能界面が光電変換機能や光触媒機能発現に有効であることを明らかとした。さらに、コアのSWCNTsの直径分布の違いが光触媒機能に与える影響について蛍光寿命測定から詳細に検討することで、直径の太いSWCNTsが光触媒機能向上に有用であることを明らかとするとともに、シェル部への白金錯体導入による高効率光触媒の開発に成功した。また、これまで報告例のないテンプレートを用いないSnO2マクロ孔配列の作製に成功し、ナノカーボン材料とSnO2とのハイブリッド材料の形態制御を環境調和型のプロセスで行うことを可能にした。当初の計画では,ナノカーボン融合マテリアルをデンドリマー型置換基を利用して合成し,その光機能を調べることで融合マテリアルの優位性を確かめたいという目的であったが,実際に検討をした結果,目的通りのナノ同軸ケーブル構造を持つ融合マテリアルを合成できただけでなく,その構造により,世界的に見てもトップレベルの機能性発現を可能にすることが明らかとなったため。独自に見出した融合マテリアル合成法を用い,ナノカーボン材料,および,無機材料,そして,それらを結びつけるデンドリマーの分子デザインについての検討を進めることで,光機能性融合マテリアル合成のための新しい「分子技術」を確立することを目指す。
クロス・コンプライアンス適用に向けた新たな農業政策設計のための手法開発

EUでは、環境に配慮した農業生産を行うなどの一定要件を満たした農業生産者に補助金等を支払うというクロス・コンプライアンス(CC)を適用した農業政策が実施されている。本研究では、CC受給要件を、農業由来の環境負荷などの外部性効果とみなして評価し、CC受給要件の内容設計に資する手法の開発や適用を試みた。農業生産活動由来の環境負荷に及ぼす環境影響を経営段階のミクロレベルや国全体のマクロレベルで定量評価できる手法の開発と適用を行い、CCを適用した新たな農業政策の設計に資する基礎知見を得ることができた。日本においてもCCを適用した補助金等の支払いをうけるためのCC受給要件は、環境保全など、様々な取り組み例が想定される。これらCC受給要件を、農業由来の環境負荷抑制や多面的機能発揮などの外部性効果とみなして評価して、CC受給要件の内容設計に資する手法の開発や適用を試み、CCを適用した新たな農業政策の設計に資する基礎的知見を得る点が、本研究の課題である。この研究課題の解明に接近すべく、本年度は以下の研究を実施した。1.第一は、研究サーベイと実態調査である。具体的には、まず、外部性評価の研究サーベイについては、国内外の学術論文・文献を電子ジャーナルなどを利用してサーベイし、また学会参加なども通じて関連する情報を入手した。さらに、開発手法の適用対象となる韓国と日本の事例について、実態調査を実施した。2.第二は、クロス・コンプライアンスの受給要件設定に資する評価手法の開発と適用である。具体的には、農業農村整備事業における農業排水路整備を事例とし、環境影響を総合的に評価できるライフサイクルアセスメントを適用し、環境に対する影響緩和措置を講じた環境保全型工法で農業排水路を整備した場合、従来型工法と比べて自然環境や生物多様性は保全される一方で、温室効果ガスは低減するのか否かを評価できる手法の開発と適用を試みた。この手法を、現況で排水能力が低下している土水路の改修を想定したモデル事例に用した結果、植物の生育や生物の生息に適した工法によって環境への配慮はなされる一方で,施工や農地の改廃で温室効果ガス排出が増加する傾向が示唆される点などが明らかとなった。財政制約が厳しくなっている日本においても、広く国民的な合意を獲得しうる農業政策を展開して行くために、こうしたCCを適用した新たな農業政策を設計して行くことは、極めて重要な課題である。これらCC受給要件を、農業由来の環境負荷抑制や多面的機能などの外部性効果発揮とみなして経済評価して、CC受給要件の具体的内容を設計に資する手法の開発や適用を試み、CCを適用した新たな農業政策の設計に資する基礎的知見を得ることが、本研究の課題である。こうした研究課題の解明に接近すべく、本年度は以下の研究を実施した。1.環境負荷などの外部不経済抑制に関する研究サーベイと実態調査の実施である。具体的には、外部不経済抑制の研究サーベイについては、国内外の学術論文・文献を電子ジャーナルなどを利用してサーベイし、また学会参加なども通じて関連する最新の研究情報を入手した。さらに、昨年度から引き続き、開発手法の適用対象となる韓国と日本の事例に係る実態調査を実施した。2.外部不経済抑制に係るクロス・コンプライアンスの受給要件設定に資する手法の開発と適用である。具体的には、農業生産活動由来の環境負荷(温室効果ガス、窒素など)に及ぼす環境影響を計量的に評価する手法などを開発し、これらの手法を稲作事例などへ適用した。こうした研究課題の解明に接近すべく、本年度は、クロス・コンプライアンス要件が、政策に適用される場合に、考慮すべき論点に関する研究サーベイと実態調査を実施した。

具体的には、クロス・コンプライアンス要件が、政策に適用される場合に、考慮すべき論点については、国内外の学術論文・文献を、電子ジャーナルなどを利用してサーベイし、また学会参加なども通じて関連する最新の研究情報を入手した。さらに、昨年度から引き続き、開発手法の適用対象となる日本の事例に係る実態調査を実施した。クロス・コンプライアンス要件が、政策に適用される場合に、考慮すべき論点として、社会的に望ましい環境水準の設定、ならびに農家と社会の責任分界点であるレファレンスレベルにおける環境水準の設定が重要となる点が示唆された。26年度が最終年度であるため、記入しない。農業経済学26年度が最終年度であるため、記入しない。平成23年度は、当初の研究計画に沿って、おおむね順調に進展している。具体的には、外部性評価の研究サーベイについては、国内外の学術論文・文献を電子ジャーナルなどを利用してサーベイし、また学会参加なども通じて関連する情報も入手し、最新の研究動向をサーベイできた。開発手法の適用対象となる韓国と日本を対象とした実態調査について、調査のごく一部が次年度に繰り越されたが、この影響は軽微であり、全体として概ね順調な調査が実施できた。手法開発とその適用についても、環境影響を総合的に評価できるライフサイクルアセスメントを適用し、環境に対する影響緩和措置を講じた環境保全型工法で農業排水路を整備した場合、従来型工法と比べて自然環境や生物多様性は保全される一方で,温室効果ガスは低減するのか否かを評価できる手法の開発と適用を試みた成果などの複数の研究成果を、雑誌論文、学会発表、図書として公表できた。平成24年度は、当初の研究計画に沿って、おおむね順調に進展している。具体的には、外部不経済抑制の研究サーベイについては、国内外の学術論文・文献を電子ジャーナルなどを利用してサーベイでき、また学会参加なども通じて関連する最新の研究情報を入手できた。開発手法の適用対象となる韓国と日本の事例に係る実態調査も継続して実施できた。外部不経済抑制に係る手法の開発と適用についても、農業生産活動由来の環境負荷(温室効果ガス、窒素など)に及ぼす環境影響を計量的に評価する手法などを開発し、これらの手法を稲作事例へ適用するなどの複数の研究成果を、雑誌論文、学会発表、図書として公表できた。平成24年度における研究の推進方策は、次の通りである。外部性評価の研究サーベイについては、引き続き国内外の学術論文・文献を電子ジャーナルなどを利用してサーベイし、また学会参加なども通じて関連する情報をさらに入手して、平成24年度時点における最新の研究動向を整理する予定である。開発手法の適用対象となる実態調査については、前年度に調査実施した事例を対象に、補足調査などを実施する予定である。こうしてサーベイし、また実態調査を通じて入手した情報・知見を、本年度に実施する農業由来の環境負荷抑制に係る事例などを対象した環境影響評価手法の開発と適用に反映させる予定である。また、平成24年度に研究実施した成果を、学会発表し、論文としてとりまとめて行く予定である。平成25年度における研究の推進方策は、次の通りである。
嫌気性超好熱古細菌の高度耐熱性酸化還元酵素の特徴と構造

超好熱古細菌は100°C付近の高温で生育できることと、進化面で最も古い生物であるこなどのために、その酵素の特徴と構造の研究は、酵素の耐熱化機構の解明、バイオリアクターなどへの応用、分子進化の解明等において、新たな可能性を開くものとして期待が大きい。本研究では嫌気性超好熱古細菌を対象として、種々の高度耐熱性酸化還元酵素の検索とその精製、特徴と構造の解明を行うことを主な目的とした。その結果、内陸性の超好熱古細菌Pyrobaculum islandicumにグルタミン酸脱水素酵素を見いだし、精製することに成功した。本酵素は既に明らかにしている海洋性超好熱古細菌Pyrococcus furiosusやThermococcus litoralisのNADP依存性グルタミン酸脱水素酵素とは異なり、NAD依存性酵素であることが明らかになった。本酵素は100°Cでも熱失活せず、NAD依存性の脱水素酵素として耐熱性の最も高い酵素である。酵素活性の最適pHはP.furiosusやT.litoralisの酵素に比較して高かった。また、本酵素の分子量、サブユニット構造は他の生物由来のものと比較して、小さいという特徴が認められた。さらに、L-グルタミン酸のほかにL-ノルバリンなども反応性を示し、比較的低い基質特異性を有している。また、本酵素は有機溶媒のトルエンや変性剤の塩酸グアニジンなどによって強く活性化を受ける。現在、本酵素遺伝子の大腸菌でのクローニングと一次構造の解明、タンパク質工学的手法やX線結晶構造解析などの研究を進めており、それにより、高度耐熱性グルタミン酸脱水素酵素の構造と機能の相関をさらに明らかにする予定である。さらにPyrococcus furiosusのNADPH脱水素酵素を部分精製し、特徴を明らかにした。この酵素は100°Cでも熱失活せず、極めて高い耐熱性を示すことが判明した。また、両酵素はイオン強度の強弱で解離会合するなど複雑な挙動をとる。今後、さらに詳細な特徴を明らかにする予定である。超好熱菌は水の沸点である100°C付近の高温でも良好に生育する。その生体機能成分である酵素は通常の生物のものよりかなり高い耐熱性を持ち、酵素の耐熱性の分子設計を解明するのに良好な材料となりうる。また、原始的な生物である古細菌(始原菌)として、その酵素は進化の面からも注目されている。本研究では嫌気性超好熱菌を対象として種々の高度耐熱性酸化還元酵素の検索とその精製、特徴と構造の解明を行うことを主な目的とした。酸化還元酵素としては、Thermococcus celerのグルタミン酸脱水素酵素とPyrococcus furiosusのNADPH脱水素酵素を対象とした。まず、前者のT.celerのグルタミン酸脱水素酵素の精製に成功し、その分子量、サブユニット構造、基質特異性、補酵素特異性、耐熱性などの酵素化学的特徴を明らかにし、既に明らかにしているP.furiosus,P.woesei,T.litoralisの酵素のものと比較した。その結果、T.celerの酵素は触媒活性に関する多くの酵素化学的性質が三種の既知超好熱菌の酵素と類似していた。

本酵素の耐熱性は10分間の処理では95°Cまで変性せず、50%失活は97°Cで起こった。この酵素は常温菌などのものと比較して極めて高い耐熱性を示すが、P.furiosusやP.woeseiの酵素よりは少し低く、T.litoralisの酵素とほぼ同様の耐熱性を示した。次に、NADPH脱水素酵素の高い活性を超好熱菌に見いだし、P.furiosusから精製に成功した。この酵素の分子量、基質特異性、耐熱性などの酵素化学的特徴を明らかにした。その結果、本酵素は1.0M NaClの共存下では100°Cで90分でも熱失活せず、極めて高い耐熱性を示すことが判明した。これは本酵素が既知のNADPH脱水素酵素の中で最も高い耐熱性を持つことが分かり、解明のあまり進んでいない本酵素の耐熱性と構造の相関に関する今後の分子レベルでの詳細な研究に優れた材料を提供する。現在、補酵素やN-末端アミノ酸配列の決定、遺伝子のクローニングなどの研究を進めている。超好熱古細菌は100°C付近の高温で生育できることと、進化面で最も古い生物であることのために、その酵素の特徴と構造の研究は、酵素の耐熱化機構の分子レベルでの解明、バイオリアクターやバイオセンサーへの応用、さらには分子進化の解明等において、新たな可能性を開くものとして期待が大きい。本研究では嫌気性超好熱古細菌を対象として、種々の高度耐熱性酸化還元酵素の検索とその精製、特徴と構造の解明を行うことを主な目的とした。その結果、海洋性超好熱古細菌Pyrococcus furiosusとThermococcus litoralisにNADPH脱水素酵素の高い活性を見いだした。この酵素は90100°Cでも熱失活せず、極めて高い耐熱性を示すことが判明した。また、両酵素はイオン強度の強弱で解離会合するなど複雑な挙動をとることが分かった。現在、高純度の本酵素標品を得るために精製法を種々検討している。次に、内陸性の超好熱古細菌Pyroba-culum islandicumにグルタミン酸脱水素酵素を見いだし、高度に精製することに成功した。本酵素は既に明らかにしている海洋性の超好熱古細菌P.furiosusやT.litoralisのNADP依存性グルタミン酸脱水素酵素とは異なり、NAD依存性酵素であることが明らかになった。本酵素は100°Cでも熱失活せず、NAD依存性の脱水素酵素として耐熱性の最も高い酵素である。酵素活性の最適pHはP.furiososやT.litoralisの酵素に比較して高かった。また、本酵素の分子量、サブユニット構造は他の生物由来のものと比較して、小さいという特徴が認められた。さらに、L-グルタミン酸のほかにL-ノルバリンなども反応性を示し、比較的低い基質特異性を有していることが分かった。今後、本酵素遺伝子の大腸菌でのクローニングと一次構造の解明、タンパク質工学的手法やX線結晶構造解析などの研究を進め、構造と機能の相関を明らかにする予定である。
太陽白色光フレアの解析に基づく、スーパーフレア星の磁気活動機構の解明

太陽面爆発(フレア)に代表される太陽活動は、地球環境「宇宙天気」に様々な影響や被害を及ぼすことが知られており、その宇宙天気の予報「宇宙天気予報」は、人類文明の緊急の課題である。本研究では、宇宙天気現象の中でも特に巨大な太陽白色光フレアと、ケプラー衛星により最近次々と発見されている太陽型星での「スーパーフレア」、つまり最大太陽フレアの1001万倍のエネルギーを解放する超巨大フレアとの比較研究を行っている。スーパーフレア星には太陽黒点より1桁以上大きい巨大黒点が存在すると推定されることから、スーパーフレア発生の解明のためには、どのようにして巨大黒点が生成・消滅するのか?を明らかにすることが重要であり、恒星黒点の面積の時間変化の調査が鍵であると考えられる。そこで、巨大黒点を持つ太陽型星の自転によって生ずる光度変化から、恒星黒点の面積の生成・消滅率を調べたところ、太陽黒点の経験則と同じであることを発見した(Namekata et al. 2019, ApJ, 871, id.13)。また、西はりま天文台で観測されたM型星フレアの分光観測を行い、発見されたスペクトル線の謎の青色非対称に関する観測的特徴を学術論文としてまとめ、報告した(Honda et al. 2018, PASJ, 70, id.62)。加えて、M型星や太陽型星のスーパーフレアから放射される白色連続光の起源に関して放射輸送計算とフレア電磁流体モデルを用いて詳細に検討したところ、従来の考えと異なり、白色連続光はループの足元の彩層・光球からだけではなく、高密の(ポスト)フレアループから放射されている可能性もあることが判明した(Heinzel and Shibata 2018, ApJ, 859, id.143)。さらには、2018年に完成した京大岡山天文台せいめい望遠鏡において、M型フレア星の観測を行い、連続光やH-alpha線での増光を検出することに成功した。この成果は現在学術論文としてまとめている。平成30年度が最終年度であるため、記入しない。太陽面爆発(フレア)に代表される太陽活動は、地球環境「宇宙天気」に影響や被害を及ぼすことから、宇宙天気を予報する「宇宙天気予報」は、人類文明の緊急の課題である。本研究では、宇宙天気現象の中でも特に巨大な太陽白色光フレアと、最近次々と発見されている太陽型星での「スーパーフレア」、つまり最大太陽フレアの1001万倍のエネルギーを解放する超巨大フレアとの比較研究を行う。可視光により観測されるスーパーフレアは全て白色光フレアであるため、太陽白色光フレアと太陽型恒星スーパーフレアの両者を観測と理論研究に基づいて比較研究し、白色光フレアの発生機構を解明する。さらにその研究成果に基づき、スーパーフレアが太陽で発生する確率を明らかにすることを目的とする。28年度は、太陽白色光フレアを積極的に観測・解析した。京都大学飛騨天文台・太陽磁場活動望遠鏡(SMART)に実装された高速撮像装置により、2011年9月に発生した白色光フレアの超短時間変動を追跡した。加えて、新たに低分散分光器をSMART望遠鏡に設置し、太陽全面からの放射スペクトルを広い波長域にわたって取得する環境を整えた。一方、磁気リコネクションにより生成された高速電子ビームが彩層に突入することにより白色光フレアが形成されたとするモデルが、白色光フレアのモデルとして有力である。このモデルでは、白色光フレア(彩層凝縮層)、低温(一万度)下降流と高温(一千万度)上昇流を説明できる特色があるが、一部の観測で「低温上昇流」が観測されており謎であった。28年度に詳細な1次元流体数値シミュレーションを行い、「低温上昇流」が電子ビームモデルの枠組みで可能であることが判明した。また2次元電磁流体シミュレーションによりループトップの自励振動する多重衝撃波生成が発見された。この振動衝撃波は白色光フレアの原因の電子ビームの加速場所として有望である。京都大学飛騨天文台・太陽磁場活動望遠鏡に導入された高速撮像装置による、太陽白色光フレアの高時間分解能データを解析、論文にまとめるに至った。太陽白色光フレアの低分散分光観測環境の整備が順調に行われた。数値計算も順調に推進されている。また、これまでの研究成果は、複数の学術論文や多数の学会発表で公表された。本研究では、宇宙天気現象の中でも特に巨大な太陽白色光フレアと、ケプラー衛星により最近次々と発見されている太陽型星での「スーパーフレア」、つまり最大太陽フレアの1001万倍のエネルギーを解放する超巨大フレアとの比較研究を行う。〇太陽白色光フレアの低分散分光観測:H28年度に製作した、330-800nmの太陽総スペクトルモニターを飛騨天文台・SMART望遠鏡に設置し、太陽総スペクトルの観測を開始した。白色光フレアのスペクトルを取得・分析し、恒星フレアのスペクトルとの比較研究を進めることで、今後、太陽型星のスーパーフレアに関する分光観測計画を策定することが可能となる。〇太陽白色光

フレアと太陽型星スーパーフレアの比較研究:黒点による光度曲線の局所的な極小を追跡する手法、およびマルコフ連鎖モンテカルロ法を用いた光度曲線解析の2通りの手法をケプラー宇宙望遠鏡の光度曲線に適用し、太陽型星の巨大黒点の時間発展を解析した。特に多くの太陽黒点の統計データとの比較から、太陽黒点の成長・減衰との共通点、相違点を見出した。〇白色光フレアの1次元数値モデリング:国際共同研究などを推進することにより、太陽やM型星の白色光フレアの白色光の起源に関して新しいメカニズムを見出した。また、西はりま天文台で観測されたM型星フレアで発見されたスペクトル線の謎の青色非対称に関して、観測的特徴を学術論文としてまとめ、報告した。太陽総スペクトルモニターは定常的に稼働しており、太陽フレアを観測する環境が整備できた。ケプラー宇宙望遠鏡の光度曲線の解析は順調に進んでおり、学術論文としてまとめる段階にある。国際協同研究等を通して、太陽白色光フレアやM型星スーパーフレアの白色光の起源についての新しいメカニズムを提唱するに至った。また、M型星スーパーフレアで発見されたスペクトル線の謎の青色非対称に関しての観測論文を発表するに至っている太陽面爆発(フレア)に代表される太陽活動は、地球環境「宇宙天気」に様々な影響や被害を及ぼすことが知られており、その宇宙天気の予報「宇宙天気予報」は、人類文明の緊急の課題である。本研究では、宇宙天気現象の中でも特に巨大な太陽白色光フレアと、ケプラー衛星により最近次々と発見されている太陽型星での「スーパーフレア」、つまり最大太陽フレアの1001万倍のエネルギーを解放する超巨大フレアとの比較研究を行っている。スーパーフレア星には太陽黒点より1桁以上大きい巨大黒点が存在すると推定されることから、スーパーフレア発生の解明のためには、どのようにして巨大黒点が生成・消滅するのか?を明らかにすることが重要であり、恒星黒点の面積の時間変化の調査が鍵であると考えられる。そこで、巨大黒点を持つ太陽型星の自転によって生ずる光度変化から、恒星黒点の面積の生成・消滅率を調べたところ、太陽黒点の経験則と同じであることを発見した(Namekata et al. 2019, ApJ, 871, id.13)。また、西はりま天文台で観測されたM型星フレアの分光観測を行い、発見されたスペクトル線の謎の青色非対称に関する観測的特徴を学術論文としてまとめ、報告した(Honda et al. 2018, PASJ, 70, id.62)。加えて、M型星や太陽型星のスーパーフレアから放射される白色連続光の起源に関して放射輸送計算とフレア電磁流体モデルを用いて詳細に検討したところ、従来の考えと異なり、白色連続光はループの足元の彩層・光球からだけではなく、高密の(ポスト)フレアループから放射されている可能性もあることが判明した(Heinzel and Shibata 2018, ApJ, 859, id.143)。さらには、2018年に完成した京大岡山天文台せいめい望遠鏡において、M型フレア星の観測を行い、連続光やH-alpha線での増光を検出することに成功した。この成果は現在学術論文としてまとめている。太陽白色光フレア、太陽型星スーパーフレア、数値計算それぞれの研究推進は順調に行われいる。今後は、太陽フレアと太陽型星スーパーフレアとの比較研究や、数値計算結果との比較を行い、統一的な理解を目指す。研究成果は、引き続き学術論文としてまとめるほか、学会発表等を積極的に行う。定例のセミナーなどにより、研究代表者・分担者・協力者の意思疎通は十分にできている。
環境シグナルに対する植物の応答:フォトトロピンを介した青色光情報伝達機構の解明

フォトトロピン(phot)は青色光を感知し、光屈性・葉緑体定位運動・気孔開口を誘引する因子である。シロイヌナズナではphot1、phot2の2種類のフォトトロピン遺伝子が存在している。photはN末端側にフラビンを発色団として結合する発色団領域とC末端側のSer/Thrキナーゼ領域からなる色素タンパク質であり、細胞膜と結合して存在すると言われている。様々な遺伝学的解析から、フォトトロピン反応関連因子が取得・解析されてはいるものの、詳細な情報伝達経路解明には至っていない。そこで、申請者はシロイヌナズナを用いて分子レベルでのフォトトロピン情報伝達機構の解明に取り組んだ。その足がかりとして酵母Two-hybrid法にてphotと相互作用する因子を検索したところ、4種類の新規遺伝子の取得に成功した。その一つが、小胞輸送に関与する低分子量G蛋白質ARF1であった。ゲノム配列からシロイヌナズナでは19種類のARF遺伝子の存在が明らかになっているが、動物のそれほど詳細な解析は進んでおらず、その生理的役割は不明である。詳細な相互作用解析を行ったところ、photはARF1のGTP結合型に親和性が高く、ARF1(GTP型)はphot1、phot2両者のキナーゼ領域と強く相互作用することが明らかになった。また、現在継続中の研究課題(若手(B))では、フォトトロピンが青色光依存的にGolgi体に移行すること、その移行にはphotのキナーゼ領域が必要であることを発見した。シロイヌナズナARF1がGolgi体に局在することは既に報告されており、これらの結果から、フォトトロピンが光依存的にGoligi体でARF1を制御している可能性が考えられる。実際、ARF1(GDP型)及びARF1(GTP型)を過剰発現させた植物体では光屈性が見られなくなる。さらに、ARF1(GDP型)及びARF1(GTP型)を一過的に発現させると、葉緑体運動に異常が見られることからオルガネラ運動へのARF1の関与も示唆できる。フォトトロピン(phot)は450nm付近の青色光を感知し、光屈性・葉緑体定位運動・気孔開口を誘引する光受容体である。これまでに単細胞緑藻類から高等植物においてフォトトロピン(phot)の存在が報告され、様々な遺伝学的解析により同情報伝達経路に関与する因子が幾つか取得されている。しかし、相互作用因子を含めた詳細な分子機構に関しては未だ不明である。そこで、申請者はシロイヌナズナを用いてフォトトロピンを介した青色光情報伝達機構の解明に取り組んだ。その足がかりとして酵母Two-hybrid法にてフォトトロピンと相互作用する因子を検索したところ、小胞輸送に関与する低分子量G蛋白質Arf1の取得に成功した。ゲノム配列からシロイヌナズナでは22種類のArf遺伝子の存在が明らかになっているが、動物のそれほど詳細な解析は進んでおらず、生理的役割は不明である。本研究では、Arf1の役割とその分子機構の解明に焦点をあてることで青色光情報伝達系の分子機構の解明を行った。先ず、photとArfとの詳しい相互作用解析を行ったところ、photのKinase領域を介してGTP結合型Arf1が特異的に相互作用することを明らかにした。シロイヌナズナにはphot1、phot2という2種類のフォトトロピンが存在している。両者のArfとの相互作用を調べると、phot1はArf1とのみ結合できるが、phot2はArf1のみならず、Arf1と機能的に大別されるArf3とも結合できることが明らかとなった。このことは、phot1とphot2の機能的相違を説明しうる可能性を示唆している。続いて、Arf1及びArf3のドミナント変異の過剰発現植物体の作出に取り組んだ。現在、予備的結果ではあるが、これら植物体において青色光応答に異常が観察されている。この他に、Yeast two hybrid法を用いてArf1と相互作用できないphotの変異遺伝子を網羅的に検索したところ、幾つかの興味深い変異を取得することに成功した。今後、これら変異photを用いて詳しい解析を行う。

詳細な相互作用解析を行ったところ、photはARF1のGTP結合型に親和性が高く、ARF1(GTP型)はphot1、phot2両者のキナーゼ領域と強く相互作用することが明らかになった。また、現在継続中の研究課題(若手(B))では、フォトトロピンが青色光依存的にGolgi体に移行すること、その移行にはphotのキナーゼ領域が必要であることを発見した。シロイヌナズナARF1がGolgi体に局在することは既に報告されており、これらの結果から、フォトトロピンが光依存的にGoligi体でARF1を制御している可能性が考えられる。実際、ARF1(GDP型)及びARF1(GTP型)を過剰発現させた植物体では光屈性が見られなくなる。さらに、ARF1(GDP型)及びARF1(GTP型)を一過的に発現させると、葉緑体運動に異常が見られることからオルガネラ運動へのARF1の関与も示唆できる。
バイオプロセスにより合成されるポリエステルの分子量制御法の開発

本研究は、バイオプロセスにより合成されるポリエステル(ポリヒドロキシアルカン酸; PHA)の分子量制御法の開発を目指して、申請者らが発見したPHA重合酵素が示す特異なPHA分子量変化機構を解明することを目的としている。この分子量変化は他の重合酵素においては確認されておらず、この重合酵素を利用することでPHAの分子量制御を行うことが期待できる。分子量はPHAを含む高分子材料の物性に影響するため、一律な物性を有する材料の安定な供給にはこれを制御できるようになることが望ましい。これまでの結果から、この特異な分子量変化は本酵素自身により引き起こされることが示唆されている。第2年度は、PHAの分子量変化に関与するアミノ酸残基の特定を試みた。変異型酵素を用いた実験から、特定のアミノ酸残基が本反応に関与することが示唆された。当初これらのアミノ酸を改変して分子量低下を制御できる変異型酵素の作製を考えていたが、今回特定したアミノ酸残基はPHAの重合反応にも重要な役割を担っていたため、この手法での分子量制御は困難と考えられた。一方、昨年度構築した無細胞系を利用して分子量低下を誘導する代謝生産物と分子量低下の度合の関係を調査した。その結果、代謝生産物に類似した化合物を供給することでも分子量低下が誘導されることを確認した。さらに化合物ごとに分子量低下の度合いが異なることを確認した。これは、本酵素による認識が異なるためであると考えられる。この分子量低下の度合いの変化は細胞内実験系においても確認した。これらの結果から、本重合酵素を用いて合成されるPHAの分子量は、酵素活性、代謝生産物の種類や濃度によって様々に制御可能であることが明らかになった。(抄録なし)本研究ではバイオプロセスにより合成されるポリエステル(ポリヒドロキシアルカン酸;PHA)の分子量制御法の開発を目指しており、現在は申請者らが発見したPHA重合酵素のみが示す特異なPHA分子量変化に関し知見の獲得を行っている。この分子量変化は他の多くの重合酵素においては確認されておらず、得られた知見を応用しPHAの分子量制御を行うことを考えている。本年度はまず、この分子量変化について「分解能発現を誘発する因子の特定」を試みた。これまでの結果から本酵素によるこの特異なPHA分子量変化は、酵素がポリマー鎖を分解するために引き起こされていると考察している。すなわち本酵素はポリエステル重合能と分解能を有しており、通常は重合能を優先して発現しているが何らかの条件が満たされると分解能を示すようになると考えられる。本年度における研究の結果から、この分子量変化に代謝生産物が関与することが示唆された。またこの物質の濃度と重合酵素活性の大小に依存して分子量低下の度合いが変化することを確認し、分解能発現はこの二つの因子により左右されていると考察している。また本年度は、微生物細胞膜の物質選択の影響を排除し本現象について知見を獲得できる「細胞外実験系の構築」も試みた。しかしながら精製酵素を用いた実験系では、PHAの分子量低下を確認することができなかった。一方、細胞膜破砕により獲得した重合酵素とPHAを用いて構築した無細胞系では、条件を整えることにより分子量低下を誘発できることを確認した。今後この系を用いて細胞膜の影響を排除した評価を行うことを考えている。本年度は、当初の計画通り分解能発現を誘発する因子の特定に成功した。また、細胞外実験系における検証は出来なかったものの当初の目的に適う他の手法を見出していることから、当初の計画と比較して順調に進展していると評価している。今後の推進方策としては、本年度に構築した無細胞系を用いて本分子量低下について更なる知見の獲得を試みる。

本研究で見出した分子量低下反応は他の重合酵素では報告されていない特異な現象であるため、そのキャラクタリゼーションは学術的にも重要な知見となると考えている。また、本反応に関与する酵素部位の特定を試みる。特定した部位によっては分子量低下を制御できるようになる可能性があり、最終年度にこれらの知見を統括しPHAの分子量制御を試みる予定である。(抄録なし)
神経線維腫症2型遺伝子産物(Merlin)の細胞内腫瘍抑制シグナル伝達機構の解明

神経線維腫症2型(NF2)は両側聴神経鞘腫、髄膜腫などの中枢神経系良性腫瘍を多発することを特徴とする遺伝疾患で、その予後は極めて悪い。我々は以前より、その原因遺伝子NF2の関わる脳内良性腫瘍形成機構を解明することを目的として、NF2遺伝子産物Merlinの細胞内機能を詳細に解析し、以下の事を明らかにしている。1)NF2患者における変異型merlinの多くは、N末端側(細胞膜裏打ち蛋白質群ERMfamilyとの相同部位)にdeletion型やmissence, nonsence型の変異部位を有する,2)NF2高変異部位において細胞内merlinが特異的にカルパインによるプロテオリシスを受けて失活する,3)NF2高変異部位はPARP、Ku85、Ku70その他の細胞内merlin結合蛋白質との結合部位でもあり、これらの結合蛋白質は変異merlinと結合しない。4)変異merlinは細胞内局在が核に集中する傾向にあり、正常merlinの細胞内シャトル(細胞質→核→細胞質→細胞膜)が機能していない。5)変異merlin発現細胞は細胞接着能を低下させている。以上のことから、正常merlinの細胞内機能として、結合蛋白質群を介した細胞内シグナル伝達機能、細胞内局在調節、及び細胞膜・骨格系蛋白質への関与が注目された。本年は、merlinがその結合蛋白質であるPARPやDNA-Pksとの複合体を形成し、scaffoldとして細胞内の局在とこれらのDNA修復酵素活性の制御に関わっていること、更に細胞障害性のストレスによるDNAダメージがこれらの機能を誘起する可能性を示した。これらの制御機構はDNA損傷修復、細胞周期、・細胞死のシグナル制御に大きく関与していることが示唆され、merlinの核における役割が重要であると考えられたことから、更に転写制御因子としての可能性に注目した。様々なelementを用いたレポーターアッセイから、merlinと細胞膜直下で結合する細胞接着因子CD44の細胞内ドメイン(CD44ICD)との相互作用によって、特に種々のシグナル分子の転写のenhancer elementとして知られる12-O-tetradeacanoylphorbol 13-actetate-responsive element (TRE)が大きく応答することが判明した。細胞外刺激によって活性化した膜内在性メタロプロテアーゼによりCD44ICDは断片化され、優位に核移行してTREに作用するが、これにmerlinがコアクチベータとして働いている可能性がある。merlinによって誘導される分子群とこれらの作用機構、及び腫瘍抑制機能との関連性に関する詳細な解析が急務であると考える。

我々は以前より、その原因遺伝子NF2の関わる脳内良性腫瘍形成機構を解明することを目的として、そのNF2の産物Merlinと会合する細胞内蛋白質を同定することにより、Merlinが関わる細胞内シグナルを明らかにしてきた。これまでに70kd,85kd,125kd,140kd,165kdの5種類の細胞内蛋白がこれに関与することを見いだしている。そしてこの中で125kdの蛋白質は、Poly(ADPribose)polymerase(PARP)、70kd,85kdはDNA-PK subunit Ku-antigen p70,Ku-antigen p85であることを突き止めた。これらはDNA修復やアポトーシスシグナルに関与する分子である。本年は、これら細胞内結合性蛋白質群との細胞内相互作用及び機能変化に注目し、細胞障害性刺激とこれらの活性変化を解析した。その結果、(I)細胞のBleomycin処理によってDNA傷害を誘起したMEFにおいて、我々の同定したNF2蛋白質細胞内結合性蛋白質である、PARP、DNA-PK subunit Ku70,Ku80は顕著に活性化した。これと同時にmerlinはその高変異部位であるN末端側(19-339)を介してPARPと結合し、PARPのpoly(ADP)ribosepolymerase活性を上昇させ、merlinのN末端側にpoly(ADP)ribsyl化を誘導した。一方、PARP-/-MEF細胞ではmerlinのpoly(ADP)ribosyl化は認められなかった。(II)MEFにて過剰発現したmerlinは、核内へ一端移行した直後、そのN末端側上の核外輸送シグナル配列(NES)を介して核外へ輸送され、細胞質内及び細胞質辺縁・突起部に局在するが(昨年度までの我々の所見)、細胞にBleomycin処理などのDNA傷害を誘起することによってmerlinの細胞内局在が細胞質から核近傍へ移行した。核外移行阻害剤であるLeptmycinB共存化においてはこの現象は顕著であった。一方、PARP遺伝子欠損MEFにおいてはこの現象が遅延し、顕著な細胞死が観察されたが、PARP遺伝子導入によってこれらの現象が有意に相補された。(III)Ku70,Ku80は細胞質及び核内に分散して存在しているが、PARPはほとんどが核内に蓄積しており、DNA傷害によってDNA-PKs(Ku70,Ku80)とPARPは細胞内で強く相互作用している所見が得られたことから、Ku、PARP、merlinはそれぞれをお互いのscaffoldとして結合し、それぞれの細胞内局在に関与して、DNA修復、細胞死に関わっている可能性が示唆される。神経線維腫症2型(NF2)は両側聴神経鞘腫、髄膜腫などの中枢神経系良性腫瘍を多発することを特徴とする遺伝疾患で、その予後は極めて悪い。我々は以前より、その原因遺伝子NF2の関わる脳内良性腫瘍形成機構を解明することを目的として、NF2遺伝子産物Merlinの細胞内機能を詳細に解析し、以下の事を明らかにしている。1)NF