hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
多標的性miRNAのphenotypeを利用した炎症及び癌に対する治療戦略

この中でmiR-21, 146aなどは炎症のシグナル伝達分子をターゲットとし、炎症を負に制御するため、やや遅れて発現していた。最近、血清中にもmicroRNAが測定可能であるとの報告が散見されているので、診断として意義の可能性について検証していきたい。炎症性サイトカインのIL-6の癌細胞に与える影響について不大腸癌・膵臓癌細胞を用いて検証を行ってきたが、IL-6がSTAT3の活性を介して、癌の進展(増殖・浸潤)に関与していた。大腸癌細胞株にIL-6刺激によりlet7aの低下が確認されたが、MYC, RAS, cyclin D2, RB1, E2F5などの癌細胞の増殖に関与する遺伝子を制御している。一方、miR-146aはIL-6により増強されたが、NFkappaBのジグナル伝達に関与するIRAK1, TRAF6をnegative feedbackに制御している。今後、炎症と癌の接点を明らかにするため、IL-17、TGFbetaなどとの関連性も明らかにしていきたい。急性および慢性炎症の指標として、C-reactive protein (CRP)が挙げられるが、進行癌においてCRPが上昇し、予後悪化因子の一つであることが、各種癌において報告されている。炎症に関連するmicroRNAを明らかにするため、外科手術(食道癌・胆石・ヘルニア等)前の血清中のCRPとmiR-21の発現を検証した。CRPとmiR-21発現に正の相関傾向を認めた。また、miR-21はTHP-1細胞株(単球由来)において、TNFalpha, IL-1beta, LPSの存在下にて濃度依存性に発現増強しており、炎症に特異的な指標の一つになりえる可能性がある。最近、miR-21はPDCD-4を介してnegativefeed backとしてNFkappaBを抑制することが報告されており(Nature Immunology, 2009)、miR-21が炎症を惹起するのか、炎症後の反応なのか今後明らかにしていきたい。この他に炎症に特異的に発現が増強するmicroRNAが同定できた(miR-24, 25, 34a, 27a, 29a, 181d, 199a, 132, 1826など)。これら意義と臨床応用(診断・治療)の可能性について続けて検証していく予定である。膵臓癌細胞における炎症を検証するために、IL-6とその受容体の発現を解析したが、受容体は解析した全てに認めたが、IL-6はいくらかに認めた。IL-6の存在下で、膵癌細胞はSTAT-3を活性化させ、浸潤能と運動能を有意に亢進させた。この際、miR-155と146aが濃度依存的に発現が亢進していた。また、線維芽細胞と癌細胞のcross talkを検証するため、co-cultureや培養上清の交換添加の結果より、線維芽細胞の存在によりIL-6の発現はより亢進し、tumor microenvironmentにおいてはより炎症が惹起され易い環境状態になっていることが予想された。
不均質なグラフ集合に対する教師付き学習系の設計

創薬における定量的構造活性相関など、対象データがグラフ表現で与えられる場合の教師付き学習において、データの出自、計測対象の多因子性などの影響により、実データは「不均質さ」を伴う。この問題に対処するため主に4点の研究を行った。1:可能な部分グラフ特徴の有無をすべて考え、その中から予測モデルの学習と必要な特徴の学習を同時に行う手法の開発と分析を行った。2:部分グラフ特徴の空間を0/1値、相関構造、冗長性等の観点から分析した。3:全ての部分グラフ特徴を対象に決定木・回帰木を学習する手法の構築とアンサンブル学習拡張を行った。4:部分グラフ特徴にワイルドカードを許容する場合の手法構築と分析を行った。本課題では化学構造式とそれが表現する化合物の生物活性など、多数の構造のデータに基づく統計的モデリングにおいて、対象構造が何らかのグラフ表現で抽象化できる場合の教師付き学習の手法構築と実データの特徴空間の性質の理解を目指している。PubChemやChEBIなど各種アッセイとその化学構造の公的リポジトリなど実際の大規模な構造データにおいては、データの出自や計測環境の異なるデータが混合された多混合母集団となってしまう。こうした構造的「不均質さ」を伴うデータを手法側で取り扱うための手法確立への技術的貢献を目標とする。本年度は調査および技術課題として次の3点に取り組んだ。(1)各サンプルがグラフ表現で与えられる場合、可能な部分グラフ特徴の有無やカウントの特徴は現在の様々な手法の基盤となっている。この部分グラフ指示子を特徴量とする特徴空間は、0/1と離散的である点、次元が非常に高いが疎性も非常に高い点、特徴同士に高い相関がある点など、自然言語処理で扱うBag of Wordsの特徴空間と類似する点を多く持つ。そこで潜在構造を利用する機械学習手法の技術的詳細の検討、及び、標準的なトピックモデル等の実装や効率の詳細についてサーベイとグラフ拡張の実装について技術的検討を行った。(2)代表者が構築してきた一般のロス関数に対しすべての可能な部分グラフ指示子の中から特徴選択と学習パラメタの推定を同時に行う手法の改良を行った。特に、最適化の各反復での列挙木構築反復のキャッシング、実際のデータに対するパラメタ依存性の解析、ヒューリスティクスの導入による実精度を保持した近似アルゴリズムの開発および数値実験を行い、論文投稿を行った。(3)ベンチマークで用いられてきたいくつかの標準的な実データ(化学構造とその活性値のデータ)について、部分グラフ特徴の共起を調べるアルゴリズム開発を行った。化学構造式データをはじめとしてグラフ構造として保持されているデータが近年増大しており、これらのデータに対する機械学習技術の重要性や関心が高まっている。本研究では、創薬における低分子化合物の毒性や薬物動態のADME(吸収・分布・代謝・排泄)など、機序が複雑で化学的な定義付けが困難な生物活性について、機械学習によって統計的に特徴付けを与える技術を目指している。特にこうしたデータは出自や計測環境の異なるデータの混在に由来する「不均質さ」を伴うため、この問題に対処する技術の検討が課題である。本年度は次の2点に取り組んだ。(1)隠れ変数モデリングに基づき不均質性に対応する手法の技術的検討を行った。化学構造式に対しては構造特徴や物性特徴などに基づく様々な記述子が提案されており、記述子生成プログラムにより数百数千の記述子ベクトルを得ることができる。この表現に対し、いくつかの隠れ変数モデルを適用し、有効な方法論の検討を行っている。(2)本年、ECFP法のようなグラフの記述子生成の仮定をgraph convolutionと見なして固定長表現を深層学習によって得る方法が提案された。深層学習もデータの入力表現を階層的に隠れ構造に分解する手法であり課題解決に寄与すると考えられるため、記述子表現とgraph convolutionの両面を評価と検討を行っている。(3)グラフを直接入力とする厳密法の拡張として、すべての部分グラフ特徴を候補とする学習法の開発を行った。非線形構造の効率的な学習として決定木の学習アルゴリズムの構築、深い探索に落ち込むケースに対処すべくwildcardを伴う緩和表現付き部分グラフの列挙、のアルゴリズム開発を行った。実際の化合物データセットに基づき、様々な方法論を検討することができた。研究計画当初に想定したよりも、部分グラフ特徴の指示子空間での実データの分布は複雑であることが分かってきたが、決定木のブースティングやgraph convolutionに基づく深層学習などの新たな切り口も得ることができた。化学構造式データなど、グラフ構造として保持されているデータが近年増大しており、これらのデータに対する機械学習技術の重要性や関心が高まっている。本研究課題では、創薬における低分子化合物の毒性や薬物動態のADME(吸収・分布・代謝・排泄)など、機序が複雑で化学的な定義付けが困難な生物活性の予測への応用を念頭に、機械学習に基づいて統計的にグラフデータの特徴付けを与える技術開発を目指している。特にこうしたデータは出自や計測環境の異なるデータの混在に由来する「不均質さ」を伴うため、この問題に対処する技術の検討や問題の分析を行っている。本年度は、グラフデータを特徴付けする際の説明変数として部分構造特徴(部分グラフ)の有無を用いる一般的問題設定において次の研究に取り組んだ。(1)データ中に生起するすべての部分構造特徴から有効な少数の特徴だけを予測モデルを学習しながら同時に探索・学習を行う枠組みの基礎として、スパース性に対する制約付きで一般のロス関数を最小化する線形モデル学習の論文が受理・出版された。(2)実際に創薬の現場の統計的

バーチャルスクリーニングでよく用いられるECFP法(Extended Connectivity Fingerprint法)に関して、複数の不均質な実データに関して解析と精度評価を行い、グラフ学習法と比較を行った。(3)与えられた予測問題を解く際に必要な特徴間の相関についてすべての部分構造特徴を考慮した上での決定木学習およびそのアンサンブル予測の実現・および不均質な実データに対する適用・解析を行った。創薬における定量的構造活性相関など、対象データがグラフ表現で与えられる場合の教師付き学習において、データの出自、計測対象の多因子性などの影響により、実データは「不均質さ」を伴う。この問題に対処するため主に4点の研究を行った。1:可能な部分グラフ特徴の有無をすべて考え、その中から予測モデルの学習と必要な特徴の学習を同時に行う手法の開発と分析を行った。2:部分グラフ特徴の空間を0/1値、相関構造、冗長性等の観点から分析した。3:全ての部分グラフ特徴を対象に決定木・回帰木を学習する手法の構築とアンサンブル学習拡張を行った。4:部分グラフ特徴にワイルドカードを許容する場合の手法構築と分析を行った。当初計画では初年度中にグラフ指示子空間上での潜在構造学習のアルゴリズム構築まで完了している予定であったが、基本探索アルゴリズムの改良に予想以上に手間と時間を要したこと、潜在構造学習分野の進展が早く綿密なサーベイに時間を要したことにより、現時点でアルゴリズム構築中である。また、本年度途中での所属・職務変更のため当初計画の見込みに無かった準備が生じ、当初計画での想定より本課題に割ける時間が取れなかった。隠れ構造モデルの検討を引き続き行っているが、本年の研究を通して、化合物の記述子研究における知見や、本年に提案されたgraph convolutionなど、対象問題に対する知見を集めることができたため、典型的に使われている記述子空間の分析や理解、深層学習などの多階層計算グラフによる隠れ構造抽出について、さらに検討も行う計画である。機械学習主に、本年度の成果の発表が次年度になったため。購入予定の備品および書籍について発売日が次年度となったため。次年度の成果発表の旅費等として利用する計画である。発売日の後、当初購入予定の備品および書籍の購入に使用する予定である。
肝臓の血液浄化機能に着目した新たな敗血症治療法の確立～LL-37ペプチドを用いて

グラム陰性菌の膜成分であるリポ多糖(LPS)は、内毒素とも呼ばれる敗血症の主要な病原因子である。一方、ヒトの好中球や上皮細胞から放出される生体防御ペプチドのLL-37は、LPSと結合してLPSの生理活性を中和する。我々は、LPSと結合したLL-37が、血中の異物除去を担う肝臓の類洞内皮細胞に速やかに取り込まれ、リソソームに移行することを見出している。このため、LL-37は血中に混入したLPSの除去剤として敗血症の治療に役立つ可能性がある。昨年度までの研究成果として、ヒト臍帯静脈内皮細胞(HUVEC)にLL-37を作用させた際にオートファジーが活性化されることを見いだした。さらに、オートファジーが阻害された状況においてはLL-37の分解が遅延することが明らかになった。このことから、LL-37自身がオートファジーによって分解されることがわかった。したがって、LL-37がLPSと結合して類洞内皮細胞に取り込まれ、オートファジーで分解されることにより、LPSの速やかな分解を促すと考えられた。今年度は、オートファジー機能不全のHUVECにおいて、LL-37が細胞の生存にどのような影響を示すか検討した。その結果、オートファジーを阻害した細胞ではLL-37の添加によって生細胞が減少し、死細胞(アポトーシスおよびネクローシス)が増加することがわかった。このことは、LL-37を血中LPSの除去剤として用いた場合、オートファジーが機能している細胞に対してはLPS除去の促進効果が期待できる一方、オートファジー機能不全に陥った血管内皮細胞に対してLL-37は細胞死を誘導する可能性が示された。そのメカニズムを明らかにするため、LL-37による細胞死誘導の仕組みについて検討をおこなった。LL-37はHUVECの核周囲に蓄積することがわかったが、詳細なメカニズム解明には至っていない。LL-37とLPSの取り込みにオートファジーが関わることが示唆されたため、当初の研究計画を若干修正して、LL-37によるオートファジーのメカニズムやその意義の解明に注力ししてきた。その結果、LL-37自身のオートファジー誘導能により細胞内消化が促進され、LPSのクリアランスが促進されることを明らかにできた。しかしながら、メカニズムの研究に注力したため、当初計画していたLL-37の改変ペプチドを用いた機能解析やマウスモデルを用いたin vivoでの検討はやや遅れている。LL-37はヒト血管内皮細胞に作用してオートファジーを活性化し、自身の細胞内消化を促進することを明らかにした。一方、オートファジー機能不全に陥った血管内皮細胞に対して、LL-37は細胞死を誘導することがわかったが、この詳細なメカニズムについては未解明である。また、今後、敗血症モデルマウスにLL-37を投与し、LPSのクリアランスの促進効果を明らかにするとともに、その際、オートファジーの活性化が関わるかどうかを調べる必要がある。このため、研究期間を延長して以上の課題に取り組むこととした。グラム陰性菌の膜成分であるリポ多糖(LPS)は、ヒトの細胞に作用して過剰炎症や細胞傷害を引き起こすため、敗血症の主要な病原因子である。一方、ヒト好中球などが産生する生体防御ペプチドのLL-37はLPSと結合してこれを中和し、肝臓の類洞内皮細胞に速やかに取り込まれた後、リソソームに移行することを我々は明らかにしている。このため、LL-37は敗血症の治療において血中に混入したLPSの除去剤として役立つ可能性がある。本年度は一つ目として、LL-37とLPSの取り込みに関わる類洞内皮細胞表面の分子の同定を試みた。グリコサミノグリカンの添加実験や分解酵素処理の実験から、LL-37とLPSの複合体は類洞内皮細胞表面のヘパラン硫酸プロテオグリカンに結合して取り込まれることがわかった。二つ目として、血管内皮細胞におけるLL-37とLPSの細胞内消化メカニズムを特にオートファジーとの関わりについて解析した。その結果、ヒト臍帯静脈内皮細胞(HUVEC)にLL-37を作用させると、オートファゴソーム特異的タンパク質LC3-IIの増加やオートファジー関連遺伝子atgの発現上昇が確認されたことなどから、LL-37は血管内皮細胞にオートファジーを誘導すると考えられた。このことから、LL-37とLPSの細胞内消化にオートファジーが関わることが示唆された。LL-37とLPSの細胞内消化にオートファジー関わることを示唆する興味深い結果を得た。一方、当初計画していた肝臓常在マクロファージ(クッパー細胞)においてのLL-37ペプチドのLPS取り込み効果の解明は遅れている。グラム陰性菌の膜成分であるリポ多糖(LPS)は内毒素とも呼ばれ、敗血症の主要な病原因子である。一方、ヒトの好中球や上皮細胞から放出される生体防御ペプチドLL-37は、LPSと結合してこれを中和する。我々は、LPSと結合したLL-37が肝臓の類洞内皮細胞に速やかに取り込まれ、リソソームに移行することを報告している。昨年度の研究成果として、ヒト臍帯静脈内皮細胞(HUVEC)にLL-37を作用させた際にオートファジーが活性化されることを見いだした。これにより、LL-37とLPSはオートファジーによって消化される可能性が示された。

本年度は一つ目として、LL-37がオートファジーによって分解されるか調べた。まず、HUVEC培養系に添加したLL-37の挙動を調べたところ、LL-37は核周囲に局在し、さらに、一部はオートファゴソームマーカーLC3と共局在した。また、オートファジーの阻害剤やオートファジー必須遺伝子の発現抑制系を用いた結果、オートファジーを阻害した状況においてLL-37の分解が遅延した。二つ目として、オートファジー機能不全のHUVECにおいて、LL-37が細胞の生存にどのような影響を示すか検討した。その結果、オートファジーを阻害した細胞ではLL-37の添加によって生細胞が減少し、アポトーシス細胞が増加した。以上の結果、LL-37はヒト血管内皮細胞に作用してオートファジーを活性化し、自身の消化を促進することが明らかとなった。このことは、血中LPSの除去剤としてLL-37を用いた場合、LL-37はLPSと結合して類洞内皮細胞に取り込まれ、オートファジーによって分解される可能性を示す。一方、オートファジー機能不全に陥った血管内皮細胞に対して、LL-37は細胞死を誘導する可能性が示された。LL-37とLPSの取り込みにオートファジーが関わることが示唆されたため、当初の研究計画を若干修正して、LL-37によるオートファジーのメカニズムやその意義の解明に注力した。このためオートファジー必須遺伝子atg7のin vitroノックダウン系を確立して、解析した結果、LL-37の細胞内消化にオートファジーが関わることを明らかにすることができた。しかしながら、これらの研究に必須である血管内皮細胞用培養培地が世界的な品薄状態に陥り入手困難となったため、研究に遅れが生じた。このような理由により、LL-37の改変ペプチドを用いた機能解析などはやや遅れている。グラム陰性菌の膜成分であるリポ多糖(LPS)は、内毒素とも呼ばれる敗血症の主要な病原因子である。一方、ヒトの好中球や上皮細胞から放出される生体防御ペプチドのLL-37は、LPSと結合してLPSの生理活性を中和する。我々は、LPSと結合したLL-37が、血中の異物除去を担う肝臓の類洞内皮細胞に速やかに取り込まれ、リソソームに移行することを見出している。このため、LL-37は血中に混入したLPSの除去剤として敗血症の治療に役立つ可能性がある。昨年度までの研究成果として、ヒト臍帯静脈内皮細胞(HUVEC)にLL-37を作用させた際にオートファジーが活性化されることを見いだした。さらに、オートファジーが阻害された状況においてはLL-37の分解が遅延することが明らかになった。このことから、LL-37自身がオートファジーによって分解されることがわかった。したがって、LL-37がLPSと結合して類洞内皮細胞に取り込まれ、オートファジーで分解されることにより、LPSの速やかな分解を促すと考えられた。今年度は、オートファジー機能不全のHUVECにおいて、LL-37が細胞の生存にどのような影響を示すか検討した。その結果、オートファジーを阻害した細胞ではLL-37の添加によって生細胞が減少し、死細胞(アポトーシスおよびネクローシス)が増加することがわかった。
低速多価イオンビームによる原子操作

高配向性グラファイトに多価のアルゴンイオンを照射することにより、ナノサイズのダイヤモンドの創製が可能なことが、本研究の成果として得られたが、本年度はさらに作成した構造が本来持っていない新たな特性を示すことを明らかにした。高配向性グラファイトに8価のアルゴンイオンを照射した後、He-Cdレーザーを照射しイオン照射領域をsp^3を有するナノダイヤモンド様の構造に変化させ、さらにその構造を水素雰囲気中で600°C、30分間の熱処理を施すことにより、複数の特性に顕著な変化が見られた。グラファイトは可視域、紫外域には発光を示さない材料であるが、20Kで測定したカソードルミネッセンスでは、微弱ながら紫外域に発光を示すことが分かった。また、イオン照射領域に対して走査トンネル顕微鏡を用いて電界放出効果を調べたところ、化学気相成長法で作成した多結晶ダイヤモンド薄膜と同等の電界放出特性を示すことも確認された。これらの結果は、ナノスケールでの新しい材料創製を示唆する結果と考えられる。また、ラマン分光法を用いて多価イオン照射の高配向性グラファイト基板に対する効果を調べた結果、同程度のドーズ量では価数が高くなるにつれて、ディフェクティブなスペクトルが得られた。これは、価数が低い場合には、イオン照射により点欠陥が生成されるが、価数の増加に従い点欠陥の複合体が形成されることを示している。また、レーザーアブレーションによりナノ構造シリコン(Siナノ微粒子)を創製し、気相での水素表面修飾、および固相でのErとPの不純物をドーピングを試み、Siナノ微粒子の形成過程については第2レーザー照射法により時間分解PL測定を行ない、その動的過程を明らかにし、Erドーピングにより温度消光のないSiナノ結晶の作製とPドナーのSiナノ結晶へのドーピングの可能性を示した。既存の多価イオンビームライン及び真空装置を用いて、基礎データの収集を行い、多価イオン減速用超高真空チャンバーの設計を行った。減速用チャンバーの基本的仕様としては、入射多価イオンのkinetic energyを100eV以下まで減速可能であること、更に減速を行った際にビームのコリメーションは保ったままであること、また減速レンズ前段にビーム偏向系及びアパーチャを設けることにより高いエネルギーを持った中性粒子の基板への入射を防ぐこと、を念頭に置いて設計を行った。減速系が無い現在の装置状況では、詳細なデータの検討は出来ていないが、塩素等の活性雰囲気の有無に関わらずイオン照射により誘起される基板原子の脱離イールドがイオン価数により顕著に増加する事を確認した。塩素に関係なく、脱離イールドの増加は7価以上のArイオン照射で顕著であったが、特に、塩素雰囲気中において、GaAsの脱離イールドが7価以上のArイオン照射によって、塩素を供給しない場合に比べて顕著に増加する現象が見いだされた。これは照射するイオンの価数が、化学反応性に対しても影響を及ぼしていることを示唆しており、クーロン爆発等のような1価のイオンには見られない多価イオンに特徴的な現象との組み合わせにより、新しい材料プロセシングへの可能性が期待されると考えている。高配向性グラファイドに多価のアルゴンイオンを照射することにより、ナノサイズのダイヤモンドの創製に成功した。通常グラファイトにイオン照射を行ってsp^2結合をsp^3結合に変化させる場合には高いドーズ量が必要であり、結果としてsp^3結合が出来たとしても非常に全体の構造に乱れが生じてしまっていた。本実験で得られた多価イオン照射によるナノダイヤモンド生成では、多価イオンの持つ大きなクーロンポテンシャルにより、イオンが表面に衝突する前の段階で表面からの多数の電子放出がおこり、それが局所的な電子状態の変化を誘起するためにグラファイトからダイヤモンドへの変化が起こるものと考えている。従って、例えば1つのAr^<8+>イオンを照射することにより、グラファイト表面の数ナノメーターの領域が局所的にダイヤモンド化するため、周辺領域の結晶性は全く乱されず、走査トンネル顕微鏡観察でも明瞭な原子象が観察されている。形成されたダイヤモンドの構造の詳細は現在検討中であるが、走査トンネル顕微鏡を利用した電流-電圧特性からは、多価イオン照射領域において、6eV程度のギャップが観察され、さらにラマン分光からは微結晶ダイヤモンドや非晶質ダイヤモンドに対応すると思われるピークが観測されている。最終年度である次年度は、これらの構造の決定、機構の解明、並びに応用面での新たな可能性に関して検討していく計画である。

また、ラマン分光法を用いて多価イオン照射の高配向性グラファイト基板に対する効果を調べた結果、同程度のドーズ量では価数が高くなるにつれて、ディフェクティブなスペクトルが得られた。これは、価数が低い場合には、イオン照射により点欠陥が生成されるが、価数の増加に従い点欠陥の複合体が形成されることを示している。また、レーザーアブレーションによりナノ構造シリコン(Siナノ微粒子)を創製し、気相での水素表面修飾、および固相でのErとPの不純物をドーピングを試み、Siナノ微粒子の形成過程については第2レーザー照射法により時間分解PL測定を行ない、その動的過程を明らかにし、Erドーピングにより温度消光のないSiナノ結晶の作製とPドナーのSiナノ結晶へのドーピングの可能性を示した。
自己心筋線維芽細胞を利用した重症心不全治療法の開発

本研究は、組織メタロプロテアーゼ阻害物質(TIMP)を用いて心不全心に存在する線維芽細胞を収縮能を持つ筋肉細胞の一つである筋線維芽細胞に分化させ、心不全心に筋肉細胞を増加させることにより心機能を改善させる新しい治療法の開発を目的とした。TIMPは線維芽細胞の筋線維芽細胞への分化を増強させ、さらに伸展刺激による心筋細胞の肥大を有意に抑制した。TIMP徐放コラーゲンゲルを虚血性心筋症モデルラットの心臓に貼付し検討した結果、心機能の改善、筋線維芽細胞の増加、心筋リモデリング抑制作用が認められた。以上よりTIMPによる治療は、重症心不全に対する移植細胞を用いない新しい治療法となることが示された。in vitroでの検討より、TIMPファミリーのなかから、より効果的な心筋組織中の線維芽細胞の筋線維芽細胞への分化誘導効率、心筋リモデリングおよびアポトーシス抑制作用を有するTIMP-1およびTIMP-3を選び、この2つの因子をそれぞれ徐放するコラーゲンゲルを作製し虚血性心筋症モデルラットに移植した。コラーゲンゲル移植2、4、6、8週間後に心機能評価と組織学的評価を行った。心機能評価の結果、ゲル移植2週後からTIMP-1,TIMP-3徐放ゲル移植群では結紮のみを行ったコントロール群と比較し有意に心機能が改善し、その心機能改善効果はゲル移植8週後まで持続していた。梗塞境界領域の心筋組織での心筋線維化、心筋細胞の肥大や左心室腔の拡張といった心筋リモデリングにおいてもTIMP-1,TIMP-3徐放ゲル移植群でコントロール群と比較し有意な抑制効果が認められた。アポトーシスに関しても、TIMP-1、TIMP-3徐放ゲル移植群において、梗塞領域および梗塞境界領域の心筋組織でのcleaved-PARPの発現量が少なく、有意にアポトーシスによる心筋細胞死を抑制していた。以上の結果より、TIMP-1またはTIMP-3徐放ゲル移植によって有意かつ持続的な心機能改善効果が認められた。この効果は、ゲルより徐放されたTIMPによる梗塞周辺部の心筋リモデリングの抑制およびアポトーシスの抑制効果によるものと考えられた。新生仔ラットより単離した心線維芽細胞に、リコンビナント・ラットTIMP-1、TIMP-2、TIMP-3、TIMP-4をそれぞれ添加し、心線維芽細胞の筋線維芽細胞への分化効率、ウエスタン・ブロットを用いてSmooth Muscle Actin (SMA)の発現量の比較を行った。その結果、TIMP-1、TIMP-2、TIMP-3、TIMP-4は同程度に心線維芽細胞を筋線維芽細胞へ分化誘導することを示した。また、新生仔ラットの心臓より単離した心筋細胞に、伸展培養装置を用いた伸展刺激を与えることで心肥大を誘導させ、TIMPを作用させたときのシグナル伝達系の活性化(MAPK経路、FAK経路、AKT経路)をウエスタン・ブロット法で検討したところ、TIMP-1、TIMP-3、TIMP-4は心筋細胞の肥大を抑制する作用を有していることが分かった。さらに虚血状態を作り出すことでアポトーシスを誘導させた単離心筋細胞にTIMPを作用させたときのアポトーシス抑制効果を、PARP、cleaved PARP、Bcl-2、Baxのタンパク発現量の変化についてウエスタン・ブロット法を用いて検討し、TIMP-1、TIMP-2は心筋細胞においてアポトーシス抑制効果を有していることを明らかにした。以上の結果より、TIMPファミリーはMMP非依存的な作用として心筋肥大抑制効果やアポトーシス抑制効果などそれぞれ異なる心筋保護作用を有していることが分かった。TIMP-1およびTIMP-3をそれぞれ徐放するコラーゲンゲルをラット虚血性心筋症モデルに移植した。移植2, 4, 6, 8週後に心機能評価と組織学的評価を行った。TIMP-1,TIMP-3徐放ゲル移植群では徐放ゲルを移植しないコントロール群、PBS徐放ゲル移植群と比較し移植2週目から有意に心機能が改善し、その効果は移植8週目まで持続していた。TIMP-1,TIMP-3徐放ゲル移植群では移植4週目より梗塞領域において多数の平滑筋アクチン陽性の筋線維芽細胞の集積が認められ、移植6および8週目においては、移植4週目よりもさらに多くの筋線維芽細胞が観察された。これはゲルから徐放されたTIMPにより梗塞領域の線維芽細胞が筋線維芽細胞へと分化誘導されたことによると考えられる。

コントロール群、PBS徐放ゲル移植群では移植後、梗塞領域におけるエラスチン線維の割合が低下し、コラーゲン線維に置換されていくのに対して、TIMP-3群では梗塞領域のコラーゲン線維に対するエラスチン線維の量が高く維持されていた。以上の結果より、TIMP-1またはTIMP-3徐放ゲル移植によって有意かつ持続的な心機能改善効果が認められた。この効果は、ゲルより徐放されたTIMPがhost心筋の線維芽細胞を筋線芽細胞へ分化させることにより梗塞領域の筋肉細胞を増加させ、さらに弾性線維も増生させることにより、梗塞壁に弾性と収縮性が与えられたことによると考えられた。重症心不全に対するTIMP徐放ゲルシート移植治療法は、心不全心の心機能改善効果を長期間維持できることが示唆され、重症心不全に対する治療の新しいアプローチとして期待される。心臓血管病理学TIMP-1およびTIMP-3を徐放するコラーゲンゲルを作製し虚血性心筋症モデルラットに移植し検討した結果、TIMP-1およびTIMP-3は心筋リモデリング抑制作用、アポトーシス抑制作用を有していることを示した。さらに、これらの作用により心機能を改善する効果があることを示した。ラット梗塞モデルの心臓から単離した線維芽細胞を用いて4種類あるTIMP(TIMP-1、TIMP-2、TIMP-3、TIMP-4)すべてが効率よく筋線維芽細胞に分化させることを同定し、さらにTIMP-1、TIMP-3、TIMP-4は心筋細胞の肥大を抑制する作用を有することを確認した。また、TIMP-1、TIMP-2は心筋細胞においてアポトーシス抑制効果を有していることが示された。虚血性心筋症モデルラットを用いて、TIMP-1およびTIMP-3の線維芽細胞から筋線維芽細胞への分化誘導作用、マトリックス・メタロプロテアーゼの活性、サイトカイン(肝細胞増殖因子、血管内皮細胞増殖因子、インシュリン様増殖因子)分泌、エラスチン線維増殖作用について検討する。ラット心筋梗塞モデルを用いて、前年度のin vitroの検討より得られた線維芽細胞から筋線維芽細胞への分化効率が高く、心筋リモデリングおよびアポトーシス抑制作用を有するTIMP分泌筋芽細胞の細胞シート移植を行い心機能改善効果、リモデリングおよびアポトーシス抑制効果について検討する。研究を進めていく上で必要に応じて研究費を執行したため当初の見込み額と執行額は異なった。当初の見込み額と執行額は異なったが、研究計画に変更はなく、前年度の研究費も含め、当初予定通りの計画を進めていく。研究を進めていく上で必要に応じて研究費を執行したため当初の見込み額と執行額は異なったが、研究計画に変更はなく、前年度の研究費も含め、当初予定通りの計画を進めていく。
トリプトファンの肝タンパク質合成促進機能の解析と摂取の有効性・安全性の評価

トリプトファン(Trp)の医用食品分野への活用を念頭に、Trpの肝臓タンパク質合成促進機能と摂取した場合の安全性を動物実験で検証した。その結果、Trpは細胞増殖に関わるスペルミンの合成を刺激して、肝臓のタンパク質合成を促進している可能性が示唆された。また、Trpは神経伝達物質セロトニン(5HT)の前駆物質であり、Trpを一度に多量に投与すると不快情動を制御している脳部位である扁桃体の5HT神経活動を活性化して不快情動が惹起される可能性が示唆された。18時間絶食させたラットにトリプトファン(Trp)(135mg/100g体重)を経口投与する実験系で、Trpの肝タンパク質合成促進機能およびTrpの脳に対する影響を解析した。・発現量が変化するタンパク質の解析(蕪山):Trp投与3時間後に肝臓から常法に従って抽出したタンパク質を、二次元電気泳動法を用いて分離して、Trp投与によって発現量が大きく変化するスポットを調べた。その結果、Trp投与によって発現が増加したスポットが3個、発現が減少したスポットが2個確認された。・肝タンパク質合成促進シグナルの作用点の解析(吉澤):Trp投与1時間後に肝臓の4E-BP1のリン酸化状態、eIF4E・eIF4G複合体量、eIF4E・4E-BP1複合体量を、イムノブロット法で解析した結果、TrpはeIF4F複合体形成のためのeIF4Eの利用性を調整することで翻訳開始段階を刺激することが明らかになった。・Trpの脳に対する影響の解析(橘、吉澤):Trpはセロトニン(5HT)の前駆物質であることから、5HT神経系により不快情動を制御している脳部位である扁桃体に注目し、ラットが1日に食餌から摂取する1,2,4,8倍量のTrpを一度に経口投与したときの扁桃体細胞間隙5HTとその代謝産物である5-ヒドロキシインドール酢酸(5HIAA)の動態をマイクロダイアリシス法により解析した。その結果、5HT量はTrp投与によって変化しなかったが、5HIAA量はTrp投与1時間後から増加し始め、投与用量が多いほど高い状態が長時間持続したが、何れの用量でも最大値は同程度であった。18時間絶食ラットにトリプトファン(Trp)溶液及び生理食塩水(対照)を経口投与し、Trpの肝タンパク質合成促進機能および脳(扁桃体)に対する影響を解析した。1.Trpの肝タンパク質合成促進シグナルの特徴の解析(1)発現量が変化するタンパク質の解析(蕪山):Trp投与3時間後に摘出した肝臓から常法に従って抽出したタンパク質を、二次元電気泳動法を用いて分離した結果、Trp投与によって2つのスポットの増加と2つのスポットの減少が確認された。これらのスポットを質量分析法により同定した結果、発現が減少したスポットのうちの1つはBCKDHEIalphaと同定された。(2)個々のタンパク質の合成速度の測定(吉澤、蕪山):Trpによって発現量が変化するタンパク質のスポットをゲルから切り出して、そのスポットに含まれる安定同位体量の測定を試みたが、個々のタンパク質の合成速度を算出するには至らなかった。2.肝タンパク質合成促進シグナルの伝達経路の概要の解明(吉澤):インスリンはPKBの活性化を介してmTORシグナル伝達系を刺激してS6K1と4E-BP1のリン酸化を増加させることが知られているが、TrpはPKBを介さずmTORシグナル伝達系を刺激して、S6K1や4E-BP1に作用して翻訳開始段階を刺激することでタンパク質合成を促進することが明らかになった。3,Trpの脳に対する影響の解析(橘、吉澤):Trpを投与しても扁桃体の細胞間隙5HT量は変化しないが、5HTの代謝産物である5HIAAは増加する。5HTを5HIAAに代謝する酵素であるMAOの阻害剤をラットに腹腔内投与し、その直後にTrpを経口投与すると5HT量が劇的に増加したことから、5HIAA量が増加したにもかかわらず5HT量が増加しなかったのは、MAOによる5HTの代謝が迅速に行われたためであることが示された。Trpが有する肝臓のタンパク質合成促進作用の詳細を知ることを目的として、Trp投与が肝臓に与える影響をプロテオミクス的手法、メタボロミクス的手法を用いて解析した。絶食ラットにTrp (135mg /100g体重)を経口投与し、3時間後に肝臓をプロテオーム解析およびメタボローム解析に供した。プロテオーム解析の結果から、Trp投与でオルニチンアミノトランスフェラーゼ(OAT)の発現が減少することが示された。OATはオルニチン(Orn)の分解を介する酵素であり、組織中のOrn濃度を制御している。また、血中のOrn濃度がTrp投与によって増加していたことから、Trp投与によるOATの発現減少によって血中Orn濃度が上昇したと考えられる。

さらに、メタボローム解析の結果から、Trp投与で肝臓においてもOrn濃度が増加していること、Ornからオルニチンデカルボキシラーゼ(ODC)を介して始まるスペルミン(Spm)合成経路が活性化されSpm濃度が上昇していることが明らかになった。Spmは細胞増殖に関わるポリアミンであることから、Spm濃度の上昇がTrpの肝臓でのタンパク質合成の促進作用に関係していると考えられる。以上のことから、TrpがOATの発現抑制により肝臓中のOrn濃度の上昇を招き、ODCの活性上昇を介してSpm合成を促進し、肝臓でのタンパク質合成を促進している可能性が示唆された。さらに、Trp投与がラットの行動、ストレス状態、不安行動に与える影響を調べるために、Trp (720mg /100g体重)を経口投与し、投与後24時間の自発運動量、摂食量、飲水量、投与24時間後の血中コルチコステロン濃度を測定し、合わせてオープンフィールドテスト、エレベイテッドプラスメイズテストを実施した。いずれの項目にも変化は見られず、Trp投与の悪影響を観察することはできなかった。本年度計画したすべての研究に予定どおり着手したが、個々のタンパク質の合成速度の測定法が確立できていない。また、トリプトファン摂取がラットの基本的性状と行動に与える影響についての実験も、予備実験が終了した段階で、全体として研究計画に若干の遅れがある。24年度が最終年度であるため、記入しない。研究の進捗状況に若干の遅れはあるものの、当初の計画通りに研究を推進することで、本研究の目的を達成できるものと考える。来年度は当初計画した5つの研究項目のうち、未着手の「トリプトファンの肝タンパク質合成促進機能の医用利用の可能性の検索」に重点的に取り組む。
マウス初期胚発生における多能性細胞の発生・分化機構の解明

本研究は、マウス初期胚発生におけるエピブラスト(EPI)と原始内胚葉(PrE)分化メカニズムを明らかにすることを目的としている。マウス初期胚発生過程では、着床までに3つの細胞系譜が生じる。最初の分化は8細胞期から16細胞期にかけて行われ、将来胎児へ発生する細胞集団である内部細胞塊(ICM)と、着床後に胎盤組織へ分化する栄養外胚葉が生じる。ICMは後期胚盤胞期(E4.5)までに多能性細胞で着床後に胚体組織へ寄与するエピブラスト(EPI)と、胎児へ栄養を供給する卵黄嚢を形成する原始内胚葉(PrE)へ分化する(図1)。初期胚盤胞期(E3.25)のICMはEPIとPrEの両方の分化能を持つ共通の前駆細胞であり、このICMからEPIとPrEの分化には線維芽細胞増殖因子(FGF4)とそれにより活性化されるERK経路が重要である。しかし、どの様な細胞がFGF4を発現し、どの様な細胞でERK経路が活性化するのかはEPIとPrE分化メカニズムを明らかにする上で非常に重要であるが、その実態は殆ど明らかにされていない。昨年度は、転写因子Klf5が初期胚盤胞期(E3.25)においてFgf4の発現を制御する因子であることを明らかにして、報告した。本年度は、どの様な細胞でFGF-ERK経路が活性化し、PrEへの分化が開始するのかを明らかにするため、リン酸化ERKを初期胚で解析する手法の確立を試みた。フランスオーベルニュ大学との共同研究により、世界で初めて着床前胚でリン酸化ERKを染色・可視化する手法を確立した。この手法により、E3.25の一部の細胞でERKのリン酸化が開始し、徐々にPrE系列の細胞へリン酸化ERKが局在する様子が観察された。これらの成果は、現在論文投稿中である。また、FGF4を発現する細胞を可視化するためのノックインマウスの樹立も進めている。申請者らは、転写因子Klf5がマウスES細胞の未分化性維持に重要なコア転写因子であるNanog、Oct4、Sox2と同様に、初期胚発生に重要であることと、特にKlf5欠損(KO)マウス胚からES細胞が樹立できないことに着目し、EPIの発生に重要であると考えた。そこで、Klf5 KO胚の表現型を詳細に解析した結果、胚盤胞期のKlf5 KO胚ではNanog陽性のEPIが消失しており、内部細胞塊(ICM)の殆どの細胞はGata6陽性のPrEに分化していた。Klf5 KO胚を用いたマイクロアレイ解析および単一細胞qPCRを行い、Klf5の標的遺伝子の同定を試みた。その結果、Klf5 KO胚ではFGF4の発現がEPIとPrEが分化する前段階の後期桑実胚期において亢進していることがわかった。マウスES細胞において、Klf5はFgf4のプロモーターおよびエンハンサー領域に結合していたことから、Fgf4はKlf5の直接の標的遺伝子であることが示唆された。また、FGF-ERK経路の阻害剤を含む培地中でKlf5 KO胚を発生させた結果、Klf5 KO胚のICMにNanog陽性細胞が出現したことから、Klf5 KO胚におけるFgf4の発現の亢進がPrEへ分化を進めていたことが判明した。以上から、EPIとPrEの分化が開始する前段階のE3.25において、転写因子Klf5がFGF4の発現を抑制することによりEPIとPrEの分化バランスを保障していることを明らかにした(Azami et al., Development, 2017)。着床前胚のEPIで見られる最初に特異的な遺伝子発現はFGF4であるが、FGF4の初期の発現がどの様一部の細胞で開始するのかは不明のままだった。そこで、どの様な細胞でFGF4の発現が開始するのかを明らかにするため、FGF4タンパクの染色方法を確立した。その結果、E3.0の内部細胞塊の一部でFGF4の発現が観察された。さらに、FGF4を発現する細胞を発生の初期段階から経時的に観察するため、FGF4 H2B-GFPノックインマウスの作製を進めている。今後、作製したマウスを用いてライブイメージングを行うことで、FGF4陽性細胞の発生起源を明らかにする。また、FGF-ERK経路が活性化している細胞を同定するため、リン酸化ERKの染色方法を確立した。その結果、これまでの手法は着床前胚では再現性の低さが指摘されていたが、再現性高く、高感度にリン酸化ERKを染色方法を確立することに成功した。今後は、確立したFGF4とリン酸化ERKの染色を組合せて、引き続きEPIとPrEの分化において、FGF-ERK経路がどの様な制御を受けているのかに着目して研究を進めていく。

ICMは後期胚盤胞期(E4.5)までに多能性細胞で着床後に胚体組織へ寄与するエピブラスト(EPI)と、胎児へ栄養を供給する卵黄嚢を形成する原始内胚葉(PrE)へ分化する(図1)。初期胚盤胞期(E3.25)のICMはEPIとPrEの両方の分化能を持つ共通の前駆細胞であり、このICMからEPIとPrEの分化には線維芽細胞増殖因子(FGF4)とそれにより活性化されるERK経路が重要である。しかし、どの様な細胞がFGF4を発現し、どの様な細胞でERK経路が活性化するのかはEPIとPrE分化メカニズムを明らかにする上で非常に重要であるが、その実態は殆ど明らかにされていない。昨年度は、転写因子Klf5が初期胚盤胞期(E3.25)においてFgf4の発現を制御する因子であることを明らかにして、報告した。本年度は、どの様な細胞でFGF-ERK経路が活性化し、PrEへの分化が開始するのかを明らかにするため、リン酸化ERKを初期胚で解析する手法の確立を試みた。フランスオーベルニュ大学との共同研究により、世界で初めて着床前胚でリン酸化ERKを染色・可視化する手法を確立した。この手法により、E3.25の一部の細胞でERKのリン酸化が開始し、徐々にPrE系列の細胞へリン酸化ERKが局在する様子が観察された。これらの成果は、現在論文投稿中である。また、FGF4を発現する細胞を可視化するためのノックインマウスの樹立も進めている。EPIとPrEの分化において、FGF4を発現する細胞とそれを受けてFGF-ERK経路が活性化する細胞を明らかにするために、確立したFGF4タンパクおよびリン酸化ERKの染色を同一の胚で行う。また、前年度より作製を進めているFgf4 H2B-GFPノックインマウスを用いてライブイメージングを行い、どの様にFgf4を発現する細胞が発生の過程で出現するのかを明らかにする。Fgf4を最初に発現する細胞を同定できた場合、GFP蛍光を元に単離し、単一細胞qPCRおよびRNA-seqを行い、Fgf4陰性の細胞と遺伝子発現の違いがあるかどうか解析する。これらの解析を通じ、EPIの起源であるFgf4陽性細胞が出現するメカニズムを明らかにすることを目指す。一方、EPIが着床前後でどの様に分化するのかを明らかにする。既に作製したFgf5-Venusマウス(Khoa and Azami et al., 2016)を用いて、どの発生ステージから着床後EPIの指標であるFgf5の発現が開始するのかを明らかにする。さらに、着床前のFgf5-Venus胚をin vitroで着床後胚まで発生させる実験系を用いて、着床にともなう細胞形態の変化とFgf5-Venusの発現を観察し、着床後EPIの多能性状態(primed型)へ以降する様子を捉える。これらの解析を通じて、マウス初期胚発生過程における多能性細胞の発生と分化メカニズムを明らかにすることを目指す。
中国地方劇形成過程の研究

従来、中国戯曲は、宋・金代の諸宮調という比較的簡単な寸劇的物語を基点として、元代の元曲に結実し、この段階において実質的な戯曲の確立がなされた、というように理解されて来た。しかしながら、一方で、宋・金の演劇と元曲との間に連続性があるのではないか(岩城秀夫氏『中国戯曲演劇研究』p427)という意見もあった。今回、我々が実施した華北地方の戯曲文物の調査と宋・金・元・明代の戯曲文献の分析などから、戯曲は、宋・金代には、既に華北では一定の水準に達し、それが次の元代に引き継がれて発展を重ねて行ったと見る方が良いのではないかと考えを強く懐いた。元曲の初期において、重要な役割を演ずる晋南地方(山西省南部)は、もともと金の故地で、そこより多数の戯曲レリ-フを備える墓室が発見されていることは、その一端を物語ると思われる。金朝は北宋朝を滅ぼした女真族の征服王朝であるが、かなり早い時期から漢民族の文化を受容し、例えば河南省登封県の中嶽廟に建てられる碑石(北宋・金の両大碑が並立する)からもわかるように、北宋朝、つまり中国王朝を継承する国家という自負があったらしい。それゆえ、北宋代の戯曲が断絶なく全国(金・南宋)に継承されたであろうことは、十分に推測可能である。元代、その晋南の地が、戯曲文化の一大中心地となり、辺鄙な農村部にまで戯台が設けられているのも、恐らく、北宋・金の伝統を継ぐ結果であろう。当時、江南は北宋を再興した南宋朝の支配となり、やはり戯曲は盛んであった。一般には、北宋の伝統がこの南宋に引き継がれ、北の金朝の文化はそれと比較すると劣るように考えられる傾向にあるが、実は、北宋の文化、ことに本研究のテ-マとする戯曲は、ほぼ同質的に南(南宋)・北(金)に分承されたのではなかろうか、と思われる。この点、福建省などの華南地方における戯曲の成熟度の問題とも関連して、更に検討を重ねる必要があろう。明代に入ると、戯曲は各地域に土着化し、その地方の文化の影響を受けて、独特の色彩を持つ地方劇化してその発展をみせる。その背景には、南京・北京・杭州・蘇州・建陽などで書林が活発な出版活動を行ない、そのもとに文才豊かな読書人や知識欲にもえる商人・工匠人などが集まったことなどがあったからであろう。清代になると、戯曲は社会の安定とともに、各地方に定着し、今日言うところの地方劇となる。その上演場所は、大きく分類すれば、1)寺廟2)商人の会館3)祠堂4)草台(村落・城市の空地)といった広域になり、しかも、一ケ所に複数の戯台が設けられ、戯曲の競演が行なわれる場合も多かった。山西省翼城の対面戯台(明代のもの一座、清代のもの一座)、河津県の品字台などはその好例である。

その背景には、南京・北京・杭州・蘇州・建陽などで書林が活発な出版活動を行ない、そのもとに文才豊かな読書人や知識欲にもえる商人・工匠人などが集まったことなどがあったからであろう。清代になると、戯曲は社会の安定とともに、各地方に定着し、今日言うところの地方劇となる。その上演場所は、大きく分類すれば、1)寺廟2)商人の会館3)祠堂4)草台(村落・城市の空地)といった広域になり、しかも、一ケ所に複数の戯台が設けられ、戯曲の競演が行なわれる場合も多かった。山西省翼城の対面戯台(明代のもの一座、清代のもの一座)、河津県の品字台などはその好例である。
大腸癌の分子異常サブタイプ別のmicroRNA解析と次世代診断・標的治療への応用

microRNAの研究においてはmicroRNA-31がBRAF遺伝子変異のある大腸癌で発現亢進がみられること。また抗EGFR抗体投与例を対象に従来の遺伝子変異解析にmicroRNA-31を加えることで、より正確なコンパニオン診断の実現が期待されることを世界に先駆けて報告した。また大腸癌以外の消化器腫瘍においては消化管間質腫瘍や直腸カルチノイドの生物学的悪性度の新規バイオマーカーとしてmicroRNA-196aやmicroRNA-885をそれぞれ同定することに成功した。さらにはアレイ解析を用いてmicroRNA-196bが膵癌組織の癌細胞で発現亢進し、不良な予後と相関すること。また膵癌細胞株を用いた検討ではmicroRNA-196bを抑制することで抗腫瘍効果が期待できることを報告。また胆道癌においてmiR-31はIL-6の発現を調節し、予後因子にもなりうることを報告した。さらに今回、我々は大腸癌患者の血液を用いて、その超早期診断を目的としたmolecular classificationに基づいたmicroRNA発現解析を施行。その結果、miR-31は血中への分泌量は少ないためか非侵襲的分子診断方法としての利用は難しいと考えられた。また従来の分子標的薬剤にmicroRNA阻害薬を併用した新たなオーダーメイド治療の可能性についても検討したところBRAF遺伝子変異陽性の大腸癌細胞株では従来の抗EGFR抗体薬にその下流シグナルを制御するmicroRNA阻害薬を併用することで、抗腫瘍効果が得られた。以上の解析結果よりこれらのmicroRNAは将来的な分子診断、個別化治療への応用が期待される。大腸癌は前癌病変からの発生経路が単一でなく、また遺伝子異常も多様であることから、その異常のサブタイプ別に癌患者の血中や組織で特異的に発現するmicroRNAを同定する必要がある。それが実現可能になれば診断や治療の個別化が進み、大腸癌患者数の減少や治療薬の選択等により医療費削減に大きく貢献できるものと考えられる。そこで我々は研究期間内に以下の計画を行った。1バイオマーカー探索としての大腸癌の分子異常サブタイプに基づいた血中microRNA解析対象は血中と癌組織のDNAとRNA解析が可能な約200例の大腸癌患者。それらの検体を用いて、血中と癌組織におけるmiR-31の両者の発現を比較検討したが、血中でのmiR-31の発現量が少ないためか両者に相関は認められなかった。またアレイ解析でmiR-31以外のmicroRNAに関しても網羅的に解析を行ったが血清サンプルでの発現量が低く、癌組織と血中で相関は得られなかった。2従来の分子標的薬剤にmicroRNA阻害薬を併用した新たなオーダーメイド治療の可能性治療のターゲットとなりうるmicroRNAに関しては細胞株や動物実験を用いて、その阻害薬を抗EGFR抗体薬(cetuximab)に併用することで、更なる抗腫瘍効果が期待できるかどうか検討。その結果、BRAF遺伝子変異陽性の大腸癌細胞株においてのみ抗EGFR抗体薬にmiR-31阻害薬の上乗せ効果が認められた。血中と癌組織におけるmicroRNAの両者の発現を比較検討したが、血中での発現量が少ないため両者に相関は認められなかった。よって血中だけでなくエクソソーム内のmicroRNA発現についても解析が必要であるため。microRNA-31(miR-31)は大腸癌でoncogenicな役割を果たすmicroRNAであり、EGFR下流シグナルを制御することも近年、報告されている。我々は最近、大腸癌でヒストンメチル化酵素であるEZH2がヒストン修飾によりmiR-31発現を抑制的に制御することを明らかにした。よって大腸癌症例においてEZH2の発現レベルは抗EGFR抗体薬の効果予測因子となる可能性がある。そこで、我々はその投与症例を対象にEZH2発現レベルと大腸癌の生存期間との関連を検討した。対象は外科的に切除され、術後に抗EGFR抗体薬を投与されたKRAS(codon 12/13)野生型大腸癌113例。癌部のEZH2発現を免疫化学染色法で検討。またホルマリン固定標本からDNAとRNAを抽出し、EGFR下流シグナルの活性化に関与する遺伝子変異KRAS、NRAS、BRAFとmiR-31発現に関しても解析。それらの分子異常と生存期間との関連を検討した。その結果、大腸癌においてEZH2発現はnegative(11%)、weak(21%)、moderate(18%)、strong(50%)で認められた。生存期間についてはEZH2低発現群(negativeとweak)では高発現群(moderateとstrong)と比較してPFSとOSはいずれも有意に短かった(log-rank test: P<0.01)。また抗EGFR抗体薬の効果が期待されるmiR-31の低発現群、KRAS野生型、NRAS野生型、BRAF野生型のそれぞれの群に限定して解析してもEZH2低発現群では高発現群と比較してPFSがいずれも有意に短かった(P<0.05)。また多変量解析においてもEZH2低発現群は他の因子(遺伝子変異やmiR-31)とは独立して有意に生存期間が短いことも明らかとなった(P<0.05)。miR-31を制御するヒストンメチル化酵素のEZH2が大腸癌症例において抗EGFR抗体薬の効果予測因子として臨床応用できる可能性が明らかになったため。