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微生物岩に認められるラミナの形成‐ミクロな構造中のマクロな情報‐

ストロマトライトを特徴づける「ラミナ」の形成様式は多様であり,時代的・堆積環境的に変化に富む.形成に関与する微生物類として,酸素発生型光合成バクテリアのみならず,酸素非発生型光合成バクテリアや化学合成バクテリアなどが考えられ,それらの代謝活動によって「鉱物(炭酸カルシウムなど)の沈殿作用」が生じている.「鉱物の溶解作用」や「組織の破壊(ミクライト化)作用」もラミナの形成に複合的に関わっている.各ラミナ形成の周期性は,それぞれ異なる時間間隔を示す.特徴的なラミナの集積様式(Conophytonなどの円錐型ストロマトライト)は,先カンブリア時代当時の強光や紫外線に対する一種の防御形態と考えられる.ストロマトライトを特徴づける「ラミナ」の形成様式は多様であり,時代的・堆積環境的に変化に富む.形成に関与する微生物類として,酸素発生型光合成バクテリアのみならず,酸素非発生型光合成バクテリアや化学合成バクテリアなどが考えられ,それらの代謝活動によって「鉱物(炭酸カルシウムなど)の沈殿作用」が生じている.「鉱物の溶解作用」や「組織の破壊(ミクライト化)作用」もラミナの形成に複合的に関わっている.各ラミナ形成の周期性は,それぞれ異なる時間間隔を示す.特徴的なラミナの集積様式(Conophytonなどの円錐型ストロマトライト)は,先カンブリア時代当時の強光や紫外線に対する一種の防御形態と考えられる.1.江蘇省・安徽省に分布するエディアカラ紀(とくにガスキアーズ氷期以降)の礁を構築するストロマトライトの「成長形態」や「ラミナの形成様式」の時代的な変遷様式を調べた.とくに,江蘇省寧県九頂山層の珪質ストロマトライト中に保存されたシアノバクテリア(フィラメント状や球状)の構成・存在様式とラミナ形成との関連性を調べた.シアノバクテリアの種類や成長形態の違いがラミナの形成に密接に関係している.2. Conophyton(円錐形)で代表される,単純形態ながら特徴的なストロマトライトに注目し,1)なぜ,それは先カンブリア時代に特異的に形成されたのか,2)なぜ,そのラミナはきわめて明瞭なのかを明らかにする手掛かりを得るために,ラミナ形成様式(規則正しく細互層するミクライトとスパーセメント)の成因を考察した.3.骨格を分泌する生物が未だ不毛だった,先カンブリア時代最後期,絶滅事変によって一定期間不毛になった,カンブリア紀中・後期,石炭紀前期,トリアス紀最前期のストロマトライトの成長形態やラミナの存在様式を比較検討した.時代によって,微生物の代謝活動が誘導するミクライトやセメントの沈殿作用,微生物の穿孔作用に起因するミクライト化の程度,炭酸カルシウムの無機的な沈殿量に大きな変化が認められる.4.バクテリアによるラミナの形成過程と石灰化との関係を明らかにするために,バクテリアの飼育培養装置の立ち上げに成功した.形成されたバイオマットのメタゲノム解析によって,約250属(多くはシアノバクテリアの仲間)が識別された.好気的・嫌気的双方のバクテリアが認められることから,培養は首尾よく進行していると判断できる.1.中国江蘇省寧県に分布する九頂山層(エディアカラ系)の珪質ストロマトライト中にシアノバクテリア(フィラメント状と球状)が認められる.それらバクテリアの分布様式とラミナ形態との関連から,気泡(おそらく酸素)の痕跡と考えられる構造が識別できる.この現象を通じて,ストロマトライトを特徴づける「ラミナ」の形成要因の一端を解明した.2.先カンブリア時代に特徴的な円錐形ストロマトライト(Conophyton)に注目し,その形態学的な意義を受光量の観点から実験的に考察した.円錐形は,形成当時の強光や紫外線に対する一種の防御形態と考えられる.3.太古累代から形成されるストロマトライトの形成要因は,現世ストロマトライトの形成要因と必ずしも同じではない.各地質年代の「ストロマトライトの形成要因」の比較・検討から,ラミナ組織の形成要因は,形成年代や形成環境ごとの「化学的な条件(酸化・還元状態など)」や「電磁波の条件(紫外線や赤外線量を含む)」によって異なっている.シアノバクテリアで代表される光合成バクテリアのみならず,化学合成バクテリアなども関与し,主として炭酸塩鉱物の沈殿作用や溶解(ミクライト化)作用を通じてラミナが形成されている.4.とりわけ先カンブリア時代のストロマトライトの形成には,バクテリアによる「硫酸イオンの還元作用」や「硫化水素の酸化作用」に基づく「硫黄の物質循環」を考慮する必要がある.層位・古生物学ベンド系,カンブリア系,石炭系,トリアス系の野外調査を行ない,時代毎に特徴的なストロマトライト試料を獲得できた.とくにベンド系ストロマトライトに関しては,「ストロマトライトの成長形態」や「ラミナの形成様式」の時代的な変遷様式に関する基礎的なデータを得,それをもたらした環境要因に関する仮説を構築できた.バクテリアの飼育培養装置の立ち上げに成功し,バイオマットのメタゲノム解析を行った.

そして,ラミナの形成からマクロな情報得るための研究の方向性を見いだすことができたため.ベンド系ストロマトライトの「成長形態」や「ラミナの形成様式」の時間的な変遷様式に関する考えを深めるとともに,変遷様式を北中国地塊以外でも調べることで,変遷様式の地域性とともに時代特異性を明らかにしていく.さらに,バクテリアの飼育培養を継続し,生息環境条件を変えることによって,どのように微生物相や石灰化様式が変化するのかを探る.その際,バクテリア類のメタゲノム解析を行い,ストロマトライトのラミナ構造と形成環境との間の相互関係性を明らかにしていく予定である.今年度中に複数回のメタゲノム解析を行う予定だったが,バクテリア類の繁殖状況を鑑みて,1回の解析を行なうにとどまったため.次年度には,十分に繁殖したバクテリア類のバイオマットのサンプリングを行い,当初計画と同様のメタゲノム解析を行なうことで,次年度使用額を執行する.
視覚系視床核への皮質下行投射の解剖学的機構

今回の研究の目的は、視覚系寝床諸核での皮質からの終止部と皮質第5層および第6層での起治部との関係を明確にすることにある。ネコの視覚系視床核の各部に標識化合物を注入し、大脳皮質での逆行性標識の分布を検索した。以下に個々の注入例の所見を要約する。1)外側膝状本背側核:皮質での起始細胞はA、A1、C、C1-3層のいずれの層への注入でも第6層に限られる。2)視覚関連後部視床核A.枕核:a:網膜投射受容部:下行線維の起始は17、18、19、21a、7野、PMLSに在るが、このうち17、18、19野での起始細胞は、第5層に存在し、その他は第6層に在る。b:視蓋前野投射受容部:後部は、19、21b、PMLS、VLS、7野、帯状回の第5層から、19、20a、20b、帯状回の第6層から投射を受ける。前部は、7、19野の第5層から、7、21a、20a、帯状回の第6層からの線維を受けるが、7野と帯状回の5層の分布は第6層の分布に比して後部にあり、分離している。B.後外則核:a:外側部:第5層での分布は、17、18野に限局してみられ、第6層の分布は、19、21a、21b、VLSに存在する。このように皮質起始細胞の層別分布は完全に分離している。B:中間部:第5層での分布は、19、PMLS、VLSに、第6層の分布は、PMLS、VLS、前シルヴィウス外溝に存在する。c:内側部:第5層の分布は、PLLSに最も多く、一部PMLSに及ぶ。第6層の分布は、PLLSの他、前シルヴィウス外溝、DLSに見られ、特にDLSの第6層からの投射はこの部に特有である。C.外側中心核:外側中心核の前方部への皮質からの線維の起始部は視覚関連野の広い範囲に及ぶが、第5層での分布は主に7野の後部から21野に存在し、第6層の分布はPLLSに最も強い。また、第5層と第6層からの視床での終末に形態的違いが存在し、6層からのものは、細い軸索に細径の密集した終末ボタンを持っているのに対して、5層からは大型の終末ボタンが葡萄房状に配列している。
漢代北方境界領域における地域動態の研究

漢代の北方境界領域では、中国世界と北方世界が多様な関係を有した。その様相を、政治、経済、文化、地理環境等の様々な視点から、複合的に描き出すことが本研究の目的である。地理環境と城郭を共通基礎資料として、政治史、環境史、自然地理学、考古学という各視点で分析を進めた。北方境界領域へは、二つの視点で接近した。それは、地域圏(広域)を対象とするマクロな視点と地域社会(狭域)を対象とするミクロな視点である。マクロな視点では、漢の地域経営戦略や地域紐帯を明らかにして、地域圏の様相を検討した。そして、漢代以外の視点からその地域圏を比較して、検討した。開発や北方交通路の実態から辺境地域を比較し、城郭の分布や墓葬の構築技術に注目して、漢の北方境界領域の経営戦略を指摘した。類似した葬制からは、北方境界領域の地域紐帯・共通性を明らかにした。そして、地形分類と生業適応の関係に基づいた地理学的な地域圏や、中原を中心とした王権が成立する以前の地域圏のあり方や地域間関係を比較、対照することで、漢代の地域圏を検討した。ミクロな視点では、空間性と人・集団から、地域社会を検討した。城郭都市と周辺の生活諸遺跡を統合して地域社会の復元を試み、県城の領域を復元することによって、地域社会の空間性へと接近した。地域社会の運営主体である人・集団に対しては、「人口」「開発と徒民」「葬制と地域社会の階層集団」などの視点で接近した。本研究では、地域圏(広域)と地域社会(狭域)を対照して、漢代北方境界領域の地域動態を重層的に描き出した。なお、漢代北方境界領域の地域動態を明らかにするだけでなく、多様な分析手法や検討視点を複合した、地域動態研究の一方法論を提示することができたと考えている。本研究は、漢代において北方異民族と漢民族が交錯する北方境界領域に注目し、環境、生業、政治領域、経済圏、帰属意識(アイデンティティ)といった視点より、当地域での交流の実態を解明し、地域動態を描出することを目的としている。本年度は、各視点での問題点の整理と共有化に重点を置き、研究会を3回開催し、中国山西省での現地調査をおこなった。具体的な関係性と観念的なイメージを対比しつつ、境界領域における交流の実態把握に努めた。交流を具体的に示す交通路については、文献資料にみえる交易ルート、あるいは戦争時の漢あるいは北方異民族の侵入経路の復元に取り組み、地理環境との比較検討を進めた。また、当該地域の地域区分について、地理環境や生業などからブロックとしての小地域の抽出に取り組むとともに、両世界のマージナルラインの変遷についても検討を進めた。また、漢民族世界の地域集団の核となる城郭の立地や周辺環境を検討し、その指向性や領域認識について検討を進めた。これは盆地を単位とした雁門郡や代郡などの地域内部における、マクロなレベルでの地域間ネットワーク復元への取り組みへの序章と考えている。漢代史研究における、県レベルでの社会の動向を解明への胎動とも位置付けることができよう。また、当地域出土の性格の異なる遺物群を対象として、その生産と流通状況を比較対照することにより、境界領域地域で活動した集団の出自や帰属意識に注目し、地理・政治とは異次元での両世界の境界線のあり方について検討を進めた。本研究は、漢代において北方異民族と漢民族が交錯する境界領域に注目し、その地域動態を、政治動向、地理環境と生業適応、地域集団の帰属意識等から多角的に検討することを目的とする。

本年度は2回の研究会開催と、中国山西省・内蒙古自治区等での現地調査をおこなった。研究会では、漢代境界領域における相互交渉について、各視座からの検討を進めた。上野は、山西北部地域の墓葬資料を対象に、被葬者の階層性に注目し、地域社会の階層集団の動向について検討した。他地域社会との比較を通じて、当該地域の集団の帰属性について議論し、境界領域社会の漢的世界での位置づけを検討した。杉本は、境界領域の郡県に対する、漢の政治理念的な支配・帰属意識について検討を深めた。大川は、漢と匈奴の軍事衝突を取上げ、匈奴の侵入経路に基づいて境界領域を明示するとともに、漢の防衛政策を支えた経済システムに注目した。軍糧調達・徙民・開拓の動向を整理し、政治理念と経済実効支配とを対比しつつ、境界領域に対する漢の支配型帰属意識を検討した。阿子島は、生業と環境適応を主眼に据えて、農耕と牧畜を対置し、山西北部地域における両生業システムが交錯する地域に注目した。双方の世界からみた漢代境界領域への親縁性と、地理環境的な限界ラインについて議論を進めた。また、昨年度の現地調査の成果を踏まえつつ、盆地単位の地域社会の在り方について、城郭、領域、生業、環境など複合的な視点から、共同して検討を進めた。境界領域における漢的世界の連続性と断絶を、文化、政治・軍事、経済、環境という視点から複合的に議論を深めつつ、地域における郡県社会の動向・実態をより明確にする試みを前進させることができた。現地調査は、山西省北部から内蒙古自治区南部にかけて地域において実施した。漢的世界の「外なる周縁領域」に対する調査であり、昨年の山西省中・北部地域における「内なる周縁領域」を対象とした調査とあわせて、双方向的な交流の実態解明に向けた調査を終えることができた。本年度は、成果公開に向けて共通基礎資料の取りまとめ、政治史、環境史、地理学、考古学など各視点での分析・検討を総合して、漢代北方境界領域に対する認識を統括した。3月に国際研究集会を開催して、研究の成果を公開した。まず、議論の共通の基礎となった当該地域の地理環境と城郭を提示した。これに基づいて、各視点からの検討成果を発表した。ここでは、大きく3つのテーマで漢代の北方境界領域の地域動態を描出した。一つは地域圏、一つは地域社会、そして漢代北方境界領域の相対化である。まず、開発の実態や交通路の様相、城郭の分布や墓葬の形態を対象として、北方境界領域の地域圏の様相を明らかにした。そして、空間性と人・集団という視点から県城を中心にした社会を復元し、地域社会の様相を評価した。そして、自然地理環境と生業適応の関係や、漢代以前の地域間関係などを検討することによって、漢代の北方境界領域を相対的に評価した。地域圏と地域社会という二つの視点で漢代の北方境界領域の様相を整理し、両者を基に描き出せる地域動態を比較の視座から評価した。研究成果の一つは、地理環境と城郭という共通資料を設定し、分析の対象を共有化することによって,各視点の比較や検討を容易にし,総合的な議論が進んだことである。もう一つは、地域圏を対象とするマクロな視点と地域社会を対象とするミクロな視点を対照して、北方境界領域の地域動態を重層的に描出したことである。本研究は、漢代北方境界領域の地域動態を明らかにするだけでなく、多様な分析手法や検討視点を複合した、地域動態研究の一方法論を提示することができたと考えている。
遺伝性筋萎縮性側索硬化症の遺伝子異常と運動ニューロン死

筋萎縮性側索硬化症(ALS)は、今日までその原因が充分には明らかにされていない進行性難治性筋疾患で、主として運動ニューロンの選択的細胞死を惹起して筋萎縮をもたらし、その予後が極めて不良でありながら有効な治療法は未だ確立していない。ALS発症者の5-10%は遺伝性で(FALS)、何らかの遺伝子異常によって発症すると考えられている。近年、白人大家系の研究により一部のFALSの責任遺伝子座が第21染色体長腕に存在することが明らかにされ、また1993年には細胞質内の活性酸素消去機構であるCu/ZnSOD(superoxide dismutase)遺伝子に点突然変異が見い出されてきて、これが一部のFALSの原因遺伝子であることが強く推定されるに至った。すでに以前の研究により日本人の家系を用いた予備的な研究によって2家系のCu/ZnSOD遺伝子に、これまで検討された150以上の白人家系でも見られていない症状の進行が極めて遅いなどの際立った臨床的特徴を持った新しい遺伝子変異(点突然変異)を見い出して報告している(H46R変異)。さらに本年度の本研究により、もう5家系においても、白人家系にはまだ報告のないCu/ZnSOD遺伝子の5つの異なった異常を見い出した。異なった遺伝子変異は、それぞれに特徴的な臨床所見を示しており遺伝子変異と臨床的特徴の関連が注目され、遺伝子異常による運動ニューロン死のメカニズム解明の足掛りとなり、当初の目的は達成できたものと考えられる。
含ホウ素自律組織体を協働性担体とする金ナノクラスター触媒の開発

ジボロン酸と多価アルコール類との逐次的反応は,階層的自己集合を経て単分散性ボロネート微粒子を与える。本研究では,その表面機能化に着目して次の検討をおこなった。1)金属ナノ粒子の固定化:ポリエチレンイミンをバインダーとして析出還元法を用いたところ,その単分散微粒子にナノ金属(Au, Pdなど)を固定化することができた。それら複合化粒子は不均一触媒として機能し,ファインケミカル反応の高度化に寄与した。2)発光性ナノ粒子の調製:関連研究として,その表面に色素のグラフト化や凝集誘起発光特性を付与することで,白色発光性センサー粒子を提案した。逐次的ボロン酸エステル反応をうまく制御すれば,生成するポリマー構造をサブミクロンスケールで自律組織化できる。本研究の目的は,その自律組織体の多彩なモルフォロジー特性とホウ素の化学的性質に着目し,金ナノクラスターの担体利用へ機能展開を試みることである。平成24年度は,以下の項目を検討した。1.ボロン酸エステル高分子担体の最適化と金ナノ粒子の担持1,4-ベンゼンジボロン酸とペンタエリスリトールのTHF溶液を48時間静置したところ,2.3±0.3μmの粒径をもつ花弁状のボロネート粒子(BP)を得た。ATR-FTIRおよび固体NMR測定より,2,4,8,10-tetraoxa-3,9-diboraspiro-【5.5】undecaneを構成単位となるポリマー形成が示唆され,そのポリマー体のzigzag型パッキングからなる組織体であることがPXRDシグナルから類推された。そのBPは熱的に安定であったので,有機一無機ハイブリッド触媒の開発を意図して,金の担持を試みた。析出還元法を用いた結果,BP上に粒径が2.7±0.6nmの金ナノ粒子を担持したハイブリッド体(Au-BP)を単離できた。他のジボロン酸誘導体を使用した場合も,単分散系粒子を得た。2.ニトロスチレン類の選択的水素化反応の高効率化検討ハイブリッド体(Au-BP)を用いて,4-ニトロスチレンの水素化反応を実施した。反応条件として,Auが基質の1.1mol%になるよう触媒量を調整し,当該基質のトルエン分散中,0.5MPa,100°Cで実施された。その結果,高選択的なニトロ基還元反応が進行した。事実,22時間後,転化率96%,4-アミノスチレンを96%収率で得た。3.シンナムアルデヒドの選択的水素化反応'α,β-飽和アルデヒドに水素を付加する触媒反応は工業的に重要で,ひとつの分子の中に反応する部位が二つあるため(C=C結合とC=O結合),そのうち一方だけを選択的に反応させることが課題となっている。当該ハイブリッド触媒(Aw-BP)が当該還元反応に適用できるかどうか調査した。反応はガスクロマトグラフで追跡されるため,目的物以外の生成物としてベンゼンアルデヒド,ベンジルアルコール,3-フェニルプロパナール,3-フェニル-1-プロパナールの各検量線をひき,定量評価の準備をおこなった。予備的ながら,トルエン中,100°C,0.5MPaの水素圧下で反応を実施した結果,転化率62.5%でシンナミルアルコールを32.3%で得る一方,他の副生を7%以下に抑える選択性を示した。反応条件を精査して,触媒効率の向上をおこなっている。多価ボロン酸類と多価アルコール類との逐次的なボロネートエステル化反応は温和な条件で多彩な階層構造体の形成を導き,その界面特性を生かした機能材料の創出が期待される。当該年度で得た成果を以下に記す。1)ナノパラジウム及びナノゴールド担持ボロネートマイクロ粒子の合成と触媒機能:本研究課題で取り扱う触媒系がグリーン触媒として働くかどうかに興味がもたれた。モデル反応として,ファインケミカル反応で重要視されているシンナムアルデヒドの水素化反応に適用した。平均粒径1.5 nmのもつPdナノ粒子を担持させたボロネート粒子の共存下,水中,常温・常圧(水素圧;0.1 MPa, 25°C)の条件で当該反応は速やかに進行し,6時間後転化率100%で,C=C部分の還元により生成するヒドロシンナムアルデヒドを高選択的(94%)に与えることがわかった。使用溶媒をメタノールに変更したところ,反応選択性をほぼ維持したまま転化率の向上が観測され,再利用特性を持つことが見出された。これらの結果から,当該触媒はファインケミカル反応のグリーン化に寄与するものと思われる。一方,金ナノ粒子を担持させたボロネート触媒は,水中,水素圧0.8MPa,80°Cで選択的にC=O部分を還元し,シンナミルアルコールを好収率で与えた。2)白色発光ケモセンサー粒子の提案:ベンゼン-1,4-ジボロン酸とペンタエリスリトールの逐次的脱水縮合反応から生成するボロネートマイクロ粒子は,界面に構成ポリマー末端の水酸基もしくはボロン酸基を有する。そこで,ボロン酸基をもつ赤・緑・青の各蛍光色素をグラフトさせ界面に組織したところ,白色発光粒子の調製に成功した。さらに,それら色素の一つに金属イオン配位機能を付与させた粒子は,水中で金属イオンの検出を可能にする白色発光ケモセンサーになり得ることがわかった。含ホウ素自己組織体の性質を引き出す検討と貴金属を担持させた関連複合体の触媒機能を継続して調査した。

1)貴金属担持型ボロネートナノ粒子を触媒利用したレブリン酸の水素化反応:独自のアプローチで達成される当該触媒を環境調和型物質変換系へ適用することを考え,レブリン酸(LA)の化学変換反応に着目した。バイオリファイナリー基幹物質の一つであるLAは炭素利用効率が高い化学原料である。よってLAを利用する化学変換反応の開発は「木質バイオマス」利用の観点から意義深いと判断した。そこで,種々の貴金属担持型ボロネートナノ粒子を合成して,LAの水素化反応を検討したところ、ルテニウム担持型ボロネートナノ粒子が樹脂材料の前駆物質であるγ-バレロラクトンを効率よく生成する触媒として機能することを見出した。2)発光性含ホウ素自己組織体の調製とその温度応答性挙動:当該含ホウ素自己組織体は,分子部品であるジボロン酸類と多価アルコール類との逐次的ボロン酸エステル化反応から達成される。そこで,その分子部品に発光性を付与させた場合,それが自己組織化を通じてどのような協働的機能創出につながるか,興味深い関連課題である。われわれは,凝集誘起発光(AIE)特性をもつテトラフェニルエチレンにジヒドロキシボリル化を施し,それを分子部品にペンタエリスリトールと逐次的ボロン酸エステル化反応をおこなった。興味深いことに,青色発光性の含ホウ素自己組織粒子を得た。さらにその粒子界面にローダミンB色素を,ボロン酸エステル結合を通じてグラフトさせることに成功した。そのグラフト量のチューニングは白色を含むマルチ発光を導き,得られた白色発光型ボロネート粒子は温度応答性を示した。ボロン酸の動的共有結合性を用いた階層的自己組織化により単分散性粒子が得られ,不均一触媒の担体として機能することを見出している。今年度は,キラルなV字型トレーガー塩基(TB)を分子部品とするボロネート担体の構築を目指した。具体的には,2位,8位にボロン酸基を有する誘導体の合成を試みた。既報に基づいて, 4-ブロモアニリンをトリフルオロ酢酸中,パラホルムアルデヒドと反応させ,得られたラセミ体Br2TBをジベンゾイル-L-酒石酸で光学分割しee > 99%の光学純度をもつ(R,R)- Br2TBを得た。次に,BuLiとトリメチルホウ酸を用いてボリル化をおこなったところ,目的の構造体の形成は確認されたが,光学異性体分離用カラムを用いたHPLC測定から,ラセミ化が起こってしまった。そこで,キラルな(R,R)- Br2TBを分子部品を用いることに変更し,多孔性有機ポリマーの合成を検討している。一方,ペンタエリスリトールと1,4-ジベンゼンボロン酸との逐次的脱水縮合から組み上がるボロネート粒子の表面にPdを担持させた(Pd-BP)。そのPd-BPと不斉修飾剤としてシンコニジン(CD)を共存させ,α-フェニル桂皮酸(α-PCA)の水素化反応を実施した。その結果,(S)-2,3-ジフェニルプロピオン酸が優先的に得られたことに対して,擬鏡像異性体であるシンコニン(CN)を添加した場合,その鏡像異性体である(R)-2,3-ジフェニルプロピオン酸が主生成物して得られることがわかった。ジボロン酸と多価アルコール類との逐次的反応は,階層的自己集合を経て単分散性ボロネート微粒子を与える。本研究では,その表面機能化に着目して次の検討をおこなった。1)金属ナノ粒子の固定化:ポリエチレンイミンをバインダーとして析出還元法を用いたところ,その単分散微粒子にナノ金属(Au, Pdなど)を固定化することができた。それら複合化
特異な層状構造を利用したビスマス層状強誘電体の材料設計

次世代のコンピュータに搭載されるメモリとして、強誘電体メモリが期待されている。これは、DRAMのキャパシタの部分を強誘電体で置き換えたものであり、電圧をオフにしても電荷が蓄えられるという強誘電体の分極特性を利用した究極の不揮発性メモリとして位置づけられている。強誘電体には、大きい分極をもつこと、低い電圧で動作すること、電圧の反転により分極が劣化しないことが要求される。現在もっとも有望な強誘電体は、Bi層状構造をもつSrBi_2Ta_2O_9(SBT)である。しかし、残留分極値が小さいという欠点がある。Bi層状構造強誘電体は、酸化ビスマス層とペロブスカイト層が交互に積層した層状構造を持つ。この申請研究では、Bi層状構造強誘電体の特殊な層状構造を利用した新たな材料設計指針の確立を目的として、基礎研究を行った。本申請者は、Bi層状構造強誘電体に属するBi_4Ti_3O_<12>(BIT)において、欠陥の制御により従来の3倍もの巨大なP_r(非鉛系層状構造強誘電体で世界最高値:P_r≒21μC/cm^2)を達成した。BITにおいて得られるP_rが小さかったのは、ドメイン壁に局在するBi空孔一酸素空孔の複合欠陥が、電界によるドメイン壁の移動を妨げるピニング中心として働くためであることを突き止めた。Tiよりも価数の大きいVおよびWの微量添加により、移動度の大きい酸素空孔の低減をはかると同時に、陽イオン空孔-置換イオンダイポールの形成という秩序欠陥の制御により、強誘電特性が飛躍的に改善された。格子欠陥を、電子・原子レベルでの秩序構造を考慮して積極的に導入・利用するという欠陥エンジニアリング(本申請者が提案)により、鉛を含まない強誘電体で、PZTに匹敵する分極特性が初めて得られた。本申請者は、新規な不揮発性メモリ材料の探索・設計を目的として、リートベルト法によりBi層状構造酸化物の結晶構造解析を行い、強誘電物性との相関を明らかにしてきた。その中で、特異な層状構造をもつ交代層化合物がSBTの2倍の残留分極値をもち、かつ電界の反転に伴う分極の疲労が全くないことを発見した。交代層酸化物は、mの異なるペロブスカイト層が交互に積層した構造をもつ。この特異な構造をもつ化合物は、m=3のBi_4Ti_3O_<12>(BIT)とm=4のSrBi_4Ti_4O_<15>(SBTi)が交互に積層した自然超格子構造をもつ酸化物である。BITは、残留分極値は大きいものの、繰り返し作動による分極の劣化が著しいことから、実用材料としては考えられていなかった。本申請者は、BITとSBTiが交互に積層した交代層構造の形成により、単体よりも残留分極値が大きく、かつ分極疲労が全くない材料の開発に成功した。また、中性子および放射光を利用した精密構造解析により、単体よりも大きな残留分極を示すのは、従来常誘電層として考えられていた酸化ビスマス層のBiイオンが、分極方向に大きく変位していることに起因することを突き止めた。

Tiよりも価数の大きいVおよびWの微量添加により、移動度の大きい酸素空孔の低減をはかると同時に、陽イオン空孔-置換イオンダイポールの形成という秩序欠陥の制御により、強誘電特性が飛躍的に改善された。格子欠陥を、電子・原子レベルでの秩序構造を考慮して積極的に導入・利用するという欠陥エンジニアリング(本申請者が提案)により、鉛を含まない強誘電体で、PZTに匹敵する分極特性が初めて得られた。
現世および化石カキ礁の形成過程から解明する古環境とカキ類の古生態変遷

日本各地の白亜系現世カキ化石密集層や現生カキ礁において,産状や堆積構造の観察,カキ類の形態・生態調査から,個々の密集層や礁の形成過程を復元し,形成要因を考察した.道東の厚岸湖では現世カキ礁を含む完新世バリアーシステムの堆積史や海水準変動を復元し,パシクル沼では縄文海進初期の津波遡上による自生・他生カキ化石密集互層を認定した.また,九州八代海南部潮下帯のカキツバタ礁マウンドの地形や生態を調査した.日本各地の白亜系現世カキ化石密集層や現生カキ礁において,産状や堆積構造の観察,カキ類の形態・生態調査から,個々の密集層や礁の形成過程を復元し,形成要因を考察した.道東の厚岸湖では現世カキ礁を含む完新世バリアーシステムの堆積史や海水準変動を復元し,パシクル沼では縄文海進初期の津波遡上による自生・他生カキ化石密集互層を認定した.また,九州八代海南部潮下帯のカキツバタ礁マウンドの地形や生態を調査した.三畳紀以降(250Ma)現世に続くカキ上科の地史的変遷について,系統分類,生態,生息環境,産出岩相などの観点から文献研究を行った.日本におけるカキ類は三畳紀後期のLiostrea shiraiwensisに始まる.マガキ亜科については,古第三紀暁新世に記録がないが,ジュラ紀後期以降現世にいたるまで,各地で密集層やカキ礁をなして産することがわかった.第四紀カキ礁の代表として,北海道東南部の完新世カキ化石層の分布を把握するため,厚岸湖口周辺域の公共工事の沖積ボーリングに関する情報を各機関の保存資料から収集し,厚岸湖のカキ礁の起源解明につながる情報を探索した.特に,平成20,21年度に掘削された厚岸港の港湾調査工事で掘削されたボーリング試料と,厚岸町の上水道工事などのボーリング調査記録から,湖北および湖南地区の地下地質構造を調べ,厚岸湖の過去1方年間の形成史(海進,砂嘴・潮流口の形成時期など)の概要を推定した.特に湖北地区の厚岸湖側にカキ化石が密集する層準が確認できた.また,平成23年度以降に実施するボーリングの好適サイトを探すため町の関係者を取材した.白糠町パシクル沼のカキ化石礁については,平成23年度のトレンチ調査のための予備調査を行った.また,根室市周辺では縄文期の貝化石層からカキ化石が産出しており,文献調査からは,現在も試料を採集できるところはないことが判明した.しかし,道東では縄文期の考古遺跡からも多くのカキ類が産しているので,釧路市立博物館や根室市立歴史と自然の資料館の協力を得て情報や試料を収集し,縄文前期にはこの地域にカキ礁が幾つか成立していた可能性が高いことが確認できた.一方,第四紀更新世以前のカキ化石層の研究については,文献研究から調査野適地の情報を収集し,平成23年度以降に本格的な現地調査を行うこととした.平成22年度に行った,ジュラ紀後期現世のカキ化石密集層やカキ礁の分布の文献調査に基づいて,完新世のカキ礁が知られている,厚岸湖と白糠町パシュクル沼に焦点を当てて調査を行った.厚岸湖の現生カキ礁は1980年代に死滅しているので,厚岸港湾調査工事で掘削されたボーリング試料と,公共工事のボーリング調査記録から,カキ礁が成立した厚岸湖の過去1万年間の形成史(海進,バリアーシステムの形成時期など)を推定し,厚岸湖のカキ礁の起源につながる情報を探索した.また湖内の澪筋に沿って音波探査を行い,潮汐平底三角州の内部構造やカキ礁の地下構造を把握した.これらの成果のうちバリアーシステムの発達様式と海水準変動復元について学術誌に論文投稿した.パシュクル沼では,5本のトレンチ掘削を行い,カキ礁の形態・産状について調べた.湖岸露頭と5本の柱状における垂直・水平層序分布から完新統の堆積史を復元できる.化石密集層の貝類は,層準による組成変化はいくらかあるが大きな変化はなく,縄文海進最高期付近に道東が黒潮の影響を受けて暖流系種が卓越したことを示す.層厚2m弱のカキ化石密集層は,離弁殻や破片が水平に集積した他生的なカキ殻層層の上に,直立合弁殻の自生密集層が重なっており,少なくとも4回互層している.自生層準は上限が他生化石層で浸食的に覆われており,転倒した合弁殻の方向や配列は陸側を向くものが多い.貝殻の炭素14年代,カキ化石層より上位の泥炭層に含まれる数枚の遡上津波砂層の存在を総合すると,パシュクル沼のカキ化石層は,約8,000年前からの約千数百年間における数百年周期で襲来した数回の津波の影響を受けて形成されたことが示唆される.また,昨年来進めてきた香川県の上部白亜系和泉層群の北縁相に含まれるカキ化石密集層の産状記載については,カキ礁形成史を詳細に復元した成果が論文として出版された.北海道東部厚岸湖とパシクル沼での調査結果の取りまとめと,新規に調査を行った九州南西部八代海南部の現生カキツバタ礁の研究を中心に進めた.

厚岸湖では,公共工事のボーリング資試料から得られた岩相・粒度・貝殻・珪藻化石・火山灰・炭素14年代などの各種データから,厚岸湖の過去1.14万年間の形成史(潮汐平底三角州の内部構造や湖底下のバリアーシステムの形成時期など)が推定でき,厚岸湖のカキ礁は約5500年前頃に成立したことが想定された.パシクル沼のトレンチ調査では,露頭断面・露頭剥ぎ取りシート試料での層相,産状,軟体動物構成種などの観察から,カキ化石密集層の内部構造を把握し9層序ユニットを識別した.カキ密集層は,泥質干潟に発達したカキ礁を擾乱・洗掘し,多量のマガキの殻を運搬・再堆積させた高エネルギーの水流によるイベント堆積物である.貝殻の炭素14年代,上位の泥炭層に含まれる数枚の遡上津波砂層,北海道東部太平洋岸における諸条件を考慮すると,津波によって形成された可能性が高い.約8000年前に湾奥の干潟にカキ礁の広がっていたパシクル沼には,約千数百年間に数百年周期の巨大津波が複数回襲来して破壊されながらも,その間にはカキ礁が再構築され,層厚2mに達するカキ化石密集層が形成された.八代海南部の水深30mの海底に発達するカキツバタのカキマウンド群については,精密海底地形探査,海底地質構造調査を行い,マウンド1ヶ所で潜水調査を実施した.マウンド表面は,大半が貝殻質底をなしており,カキツバタの中大型個体の死殻を主体とし,上面に生貝が少数固着している.生貝は単独の横臥個体も少なくないが,数個体の固着塊をなすものがあり,リレー型固着個体も認められる.マウンドは多様な生物の生息場となっており,カキツバタ礁となっているが,これほど大規模な礁はこれまで少なくとも日本近海では知られていない.目標の一つとした厚岸湖底ボーリングは諸般の事情により実施を見送ることとしたが,それを補うために,既存の陸上ボーリング試料や調査情報を収集することで,厚岸湖のバリアーシステムの実態を明らかにすることができた.パシュクル沼のトレンチ調査は諸機関や分担者・協力者からの協力で充実した調査ができ,これまでにない貴重な情報から,カキ化石密集層が数百年周期で襲来した数回の津波の産物である可能性が新たに明らかとなり,大きな展開となった.24年度が最終年度であるため、記入しない。今後はパシュクル沼での研究成果の取りまとめに取り組むが,新たな展開として,厚岸湖の北側の風蓮湖でも音波探査を行い,バリアーシステムの内部構造を把握するとともに埋没したカキ礁がないかを探査する.一方,九州の八代海南部の水深30mの海底で,我々の研究グループが3年前に調査した現生カキツバタ礁について,千葉県館山市にある完新統化石密集層と比較しながら新たに調査を行う.最終年度のまとめとして,道東のカキ礁の発達史について,分担者や協力者と情報交換しながら,炭素14年代などの新規貴重データを有効に用いた成果発表を行っていく.24年度が最終年度であるため、記入しない。
戦国期の秩序流動化・再構築メカニズムの研究―発給文書と秩序認識の関係を中心に―

大分県先哲史料館、山口県文書館において主として大友分国を中心とする九州地域、毛利分国を中心とする中国・四国地域の関係史料の調査・撮影をおこなった。また、戦国期発給文書等を全国的なレベルで比較分析するための基礎作業として、全国の自治体史を網羅的に所蔵し、開架で利用可能な東京都立中央図書館において、西日本(三重県・滋賀県以西)の自治体史の史料編を中心とする網羅的調査をおこなった。史料編や本文編の記述から、すでにこれ以前の研究で収集していた史料に加えて、さらに収集すべき史料群を今回の調査から特定した。この調査成果に基づいて、関係史料の収集を進めた。これらの成果を踏まえ、中世後期の西日本の判物のデータベースの作成を進めている。データベースでは発給主体、文書様式などのほか、宛行状、安堵状、寄進状等にみえる、給与対象の表記方法なども注目して、データを整理している。以上のようにして収集した史料を活用して、「戦国期大友氏勢力圏における判物発給をめぐって」を執筆した。同稿は戦国期における大友氏の勢力圏を中心とした地域(具体的には豊後国・豊前国・筑前国・筑後国・肥後国の一部・日向国の一部・肥前国の一部)について、14世紀以降の判物を網羅的に収集し、大友氏発給判物との文書様式の比較検討と、発給主体と大友氏との関係性の分析をおこない、戦国期の秩序形成について論じたものである。同稿は近日刊行予定の『戦国期文書論』に掲載予定である。史料収集についてはほぼ予定どおり進んでいる。基礎作業としての自治体史調査については、当初の中国地方以西までを予定していたが、さらに近畿地方まで進んだ。研究成果の論文化については逐次進めていく予定であるが、2018年度は大友氏に関する研究成果を論文にまとめることができた。2019年度は東日本に関する史料収集、データベース化、分析を進める。また西日本の史料についても、追加の調査をおこない補充する。2018年度同様、東京都立中央図書館における自治体史調査をおこない、主として刊本から史料収集を進めるが、その過程で必要があれば未刊行史料の調査にも赴く。また引き続き研究成果の公表に向けて取り組む。
フォトトロピンを介した気孔開口運動の解明

気孔の青色光による開口反応について、その情報伝達成分の解明を目指して多くの方法を用いて研究した。その結果、光のフォトトロピンによる受容から細胞膜H^+-ATPaseの活性化にいたる経路に、シグナル伝達体として働く複数のタンパク質成分や活性化状態を同定した。また、フォトトロピンの自己リン酸化反応が下流への情報伝達に必須であり、気孔応答以外のフォトトロピンを介した青色光応答に共通の事象である事を証明した。気孔開口における青色光による気孔開口反応を調べた。また、これまでの研究によって気孔開口の青色光受容体がフォトトロピンであることから、同時にフォトトロピンに依存する別の反応についても調べた。以下の事が解明された。1.青色光シグナルはフォトトロピンを通して細胞膜H^+-ATPaseに伝えられる。この反応の仲介をタイプ1プロテインフォスファターゼが行う事を証明した。孔辺細胞にこの酵素が発現する事、この酵素の活性を無くした変異型酵素を孔辺細胞に過剰発現させると、青色光に依存した気孔開口が阻害された。動物細胞においてこの酵素の制御因子として作用する蛋白質性のインヒビター2を孔辺細胞に発現させると青色光依存の気孔開口が阻害された。さらに、膜透過性のある阻害剤、Tautomycinはフォトトロピンのリン酸化は阻害しなかったが、細胞膜H^+-ATPaseのリン酸化を阻害した。2.通常、タイプ1プロテインフォスファターゼにはそれを制御する制御サブユユニットが存在する。この制御サブユニットを複数個単離し、機能解析を行っている。3.この中に、タイプ1プロテインフォスファターゼを阻害する事の知られるインヒビター3が含まれていた。この蛋白質は動物や、酵母でその働きが知られていたが、その生理的意義な不明である。このインヒビター3は孔辺細胞のタイプ1プロテインフォスファターゼ活性を強く阻害した。現在、孔辺細胞の青色光情報伝達系に関与するかどうか調べている。4.インゲンマメは光に反応して葉枕の運動を行う。この反応にフォトトロピンが関与し、最終の標的として葉枕の運動細胞中の細胞膜H^+-ATPaseが存在する事を示した。興味深いことに細胞膜H^+-ATPaseは孔辺細胞と対照的に脱リン酸化され阻害された。気孔開口におけるフォトトロピンを介した情報伝達系について研究を行い、以下の成果を得た。(1)フォトトロピンから細胞膜H^+-ATPaseへの情報伝達をタイプ1プロテインフォスファターゼが仲介する事を証明した。これを制御する可能性のあるインヒビター3について調べた。植物のインヒビター3中に存在する結合モチーフの中にはリン酸化部位が含まれており、動物のものには存在しない植物固有のものであった。そこで、この部位を人工的にリン酸化するとタイプ1プロテインフォスファターゼから解離し、阻害効果が低減した。この事実は、インヒビター3が上流にキナーゼによりリン酸化され、制御因子としてのインヒビター3のフォスファターゼが活性化される事を示している。特に、上流に存在することの明らかなフォトトロピン自身の基質になっている可能性がある。インヒビター3の破壊株を作出したが致死であった。現在、別の方法でインヒビター3の機能解析を行っている。(2)フォトトロピンから下流への情報伝達に際してフォトトロピンが自己リン酸化される事が分かっているが、自己リン酸化の生理学的意味は不明である。その点を解明するため、リン酸化部位の決定を質量分析によって行った。その結果、リン酸化部位が8個決定され、その大部分は新たに見いだされたものであった。このリン酸化の機能解析を行うため、それぞれのリン酸SerをAlaに置き換えたコンストラクトを構築し、これをphot1 phot2二重変異体に導入し、機能回復を調べた。その結果、新たに見つかったキナーゼドメイン中の851番目のSerがフォトトロピンの気孔開口におけるシグナル伝達に必要であった。興味深いことにこの部位はその他のフォトトロピン依存の反応、光屈性、葉緑体運動、葉の平滑化にも必要であった。以上の結果は、フォトトロピンの自己リン酸化の特定部位が光情報伝達に必須である事を示している。本年度は、フォトトロピンの自己リン酸化に注目し、以下の成果を得た。(1) phot1の自己リン酸化部位をシロイヌナズナの芽生えを用いて同定した。この実験には質量分析が可能になる大量のphot1が必要なので多くの芽生えに青色光照射を行い、ミクロゾーム画分を調製し、それから、免疫沈降によってphot1を単離した。(2)これを材料にして質量分析によってin vivoのリン酸化部位を特定し、8つの部位を同定した。(3)これらのリン酸化部位の生理的役割を解明するためphot1のリン酸化部位に変異を入れ、その変異phot1遺伝子をphot1 phot2二重変異体に導入し、その機能相補からリン酸化部位の働きを調べた。

その結果、キナーゼドメインのアクチベーションループ内にあるSer-851のリン酸化が必須でSer-849が補助的役割を果たしている事が示された。この2つの部位がリン酸化されないと青色光を照射しても気孔はわずかしか開かず、H+の放出もわずかしか認められなかった。(4)さらに、SerをAspに置き換え疑似リン酸化すると、青色の光照射により気孔が開口し、H+が放出された。ただし、疑似リン酸化だけでは反応は進まず、青色光照射が必須であった。興味深いことに疑似リン酸化しておくと、H+放出が長い間継続した。この事実は、反応の停止に脱リン酸化が関与する事を暗示する。(5)そこで、Ser-851のリン酸化(pSer)抗体を用いて、Ser-851のリン酸化レベルを追跡すると、青色光により素早くリン酸化され、暗くすると脱リン酸化された。(6)この自己リン酸化反応の気孔開口以外のphot1依存の反応光屈性、葉緑体集合反応、葉の平滑化に置ける役割について調べた。その結果、いずれの反応にもSer-851のリン酸化の自己リン酸化が必要である事が示され、この反応は下流への情報伝達に共通の必須過程である事を示している。(7)さらに、これら変異photlのin vivoにおける自己リン酸化活性は有意に残存しており、リン酸化浩性の大きな低下は認められなかった。本年度は、フォトトロピン2の自己リン酸化に注目し、以下の成果を得た。青色光受容体フォトトロピン(phot1, phot2)は光屈性,葉緑体定位運動,葉の平坦化,気孔の開口等の生理応答を誘導する。シロイヌナズナのphot1は青色光に依存してキナーゼドメインのアクティベーションループが自己リン酸化され、これが上記の生理応答に共通して必要であることが解明されたが、phot2に関してはこの部位のリン酸化の生理学的意味は明らかでない。まず、このphot2のリン酸化部位の決定を、免疫沈降により単離したphot2に対して行った。phot2のリン酸化によるモビリティシフトはphot1より大きく、多くのリン酸化部位が予測された。実際、phot2のN-末、LOVドメインのヒンジ領域など20以上のリン酸化部位が見いだされた。残念ながら、最も機能に関連するアクチベーションループの部位には見出せなかった。おそらく、適当なリン酸化断片が得られない事が原因であると考えられる。しかし、機能に関連することの予想されるアクティベーションループに保存されたSer-761とSer-763をAlaに置換したphot2をphotlphot2二重変異株に導入し、変異phot2がフォトトロピンの生理応答を正常に誘導できるか調べた。Ser-761とSer-763がAlaに置換された形質転換植物ではphot2応答がすベて抑制されたが、Aspに置換された形質転換値物ではphot2応答がほとんど正常に誘導された。以上の結果は、phot2においても青色光に依存したキナーゼアクティベーションループの自己リン酸化が下流への情報伝達に必要で、phot1とphot2の間で共通に必要な生化学ステップであることを示唆している。
DNA/RNAミスマッチ認識蛋白質を用いた高精度逆転写による相同miRNAの識別

相同miRNA識別技術の構築を目指し, DNA/RNAミスマッチ認識タンパク質の構造機能解析と,その応用法の開発を行った。高度好熱菌由来BsbPタンパク質およびMutS2タンパク質を主要なターゲットとした。MutS2タンパク質については, C末端領域に存在するエンドヌクレアーゼドメインを除去した変異体を作製し,研究に用いた。まず, DNA/RNA結合能を調べたところ, BsbPタンパク質はDNA/DNAまたはDNA/RNAから成る5塩基以上の比較的大きなミスマッチ(ループ状/バブル状の構造)を認識することが分かった。一方, MutS2は,同じくDNA/DNAまたはDNA/RNA 2本鎖分子に結合するが, BsbPとよりもさらに大きな10塩基以上のループ状/バブル状構造を認識することが分かった。そのようなミスマッチ構造は, RNAを検出するための逆転写反応において, primerと鋳型の間で形成されると予想される構造である。そこで, MutS2やBsbPが,ミスマッチを含むprimer-DNAまたはprimer-RNA複合体からのDNA増幅を阻害するかどうかを, real-time PCR装置を用いて調べた。その結果,両タンパク質は,ミスマッチを含むprimer-鋳型複合体からの増幅を特異的に阻害した。DNA結合特異性の解析結果から示唆されたとおり, BsbPやMutS2は, primer-鋳型複合体が比較的大きなミスマッチ(3塩基以上)を含む場合に,核酸の増幅を強く阻害した。これらの特徴は, primerの設計を工夫することによって,目的の配列を持ったDNAまたはRNAを特異的に検出する方法に応用可能であると考えられる。本研究課題では、相同miRNAファミリーの簡便な識別に利用できる高精度逆転写反応の構築を目指す。これまでに耐熱性の新規ミスマッチ認識タンパク質LLBPを同定していた。今年度はLLBPを上記課題に適用するために、その生化学的性質を詳細に解析した。LLBPは3塩基以上のループ状構造を持ったDNA/RNAハイブリッドから成るミスマッチに特異的に結合し、10塩基程の大きなミスマッチを特に強く認識した。また、LLBPによるミスマッチへの特異的な結合は、DNA/DNAから成るミスマッチにおいても確認できた。real-time PCR装置を用いて、LLBPが、ミスマッチを持つプライマーからのDNAの増幅を抑制できることを確かめた。LLBPに存在するRXXXHmotifが核酸の結合に決定的な役割を果たしていることを、部位特異的変異導入により確かめた。さらなるLLBPの機能解析のために、LLBPの結晶構造解析を進めた。結晶化条件スクリーニングの結果、LLBPの結晶を得ることに成功し、放射光を用いてX線回折データを取得した。LLBP結晶の位相が決定できず、構造解析が予定より遅れた。今後、重原子を用いた位相決定により立体構造を解き、LLBPの機能解析を完了する。相同miRNAは各種癌組織で発現しており、その発現パターンの正確な解析は診断や基礎研究に極めて重要である。相同miRNAの識別のために、高度好熱菌由来BsbPタンパク質を利用する。このタンパク質はDNA/RNAハイブリッドから成るミスマッチ/ループを認識できる。逆転写反応のプライマーが鋳型と誤対合し、ミスマッチ/ループを形成した際に、BsbPが強く結合する。これは逆転写反における非特異的増幅を抑制し、相同miRNA検出/識別の精度を上昇させることに繋がる。高度好熱菌由来BsbPタンパク質の逆転写反応における非特異的抑制効果をリアルタイムPCRによって確認した。対照実験として高度好熱菌由来MutSを用いた。高度好熱菌由来MutSはDNA/DNAから成るミスマッチは認識できるが、DNA/RNAハイブリッドから成るミスマッチは認識できない。MutSでは逆転写反応時の非特異的増幅抑制効果は得られなかったが、BsbPでは、プライマーが鋳型に対合した際に6塩基以上のループを形成する場合に増幅阻害の効果を示した。より小さいループに対しても阻害効果を示すようBsbPをタンパク質工学的に改良することを目的としてBsbPのX線結晶構造解析を試みた。BsbPの高純度精製法を確立し、結晶化スクリーニングを行った結果、3種類の結晶化条件でタンパク質結晶が得られた。結晶化条件の最適化を経て、X線回折実験に適した結晶を得た。SPring-8の放射光を利用して回折像を取得した。BsbPタンパク質結晶のX線回折データを取得できたが、位相決定が困難であったため、重原子誘導体でのデータの取得を試みている。そこで, MutS2やBsbPが,ミスマッチを含むprimer-

DNAまたはprimer-RNA複合体からのDNA増幅を阻害するかどうかを, real-time PCR装置を用いて調べた。その結果,両タンパク質は,ミスマッチを含むprimer-鋳型複合体からの増幅を特異的に阻害した。DNA結合特異性の解析結果から示唆されたとおり, BsbPやMutS2は, primer-鋳型複合体が比較的大きなミスマッチ(3塩基以上)を含む場合に,核酸の増幅を強く阻害した。これらの特徴は, primerの設計を工夫することによって,目的の配列を持ったDNAまたはRNAを特異的に検出する方法に応用可能であると考えられる。今後、LLBPの回折データに位相をつけ、立体構造解析を明らかにし、LLBPにとって最適となるプライマーの形状を決定する。そのプライマーを用いて、鋳型miRNAからの非特異的なDNA増幅をLLBPが抑制できる条件を検討する。BsbPタンパク質は、プライマーが鋳型と6塩基以上の比較的大きなループを形成する場合にのみ逆転写反応の阻害効果を示した。BsbPをより広範な条件で利用可能とするためにはタンパク質工学的改良が必須である。そのためにはBsbPの立体構造情報の利用が有効である。現在、BsbP結晶のX線回折データの取得に成功しているが、位相決定に至っていない。今後、重原子誘導体結晶を利用して位相決定を行い、立体構造情報を得る。LLBPの結晶構造解析において、X線回折データの位相決定が予定より遅れた。それに伴い、その後に行うはずであった機能解析実験を行わなかったため。高度好熱菌由来BsbPタンパク質のX線結晶構造解析の位相決定に困難があったために予定よりも研究の進捗が遅れたため。今後、重原子誘導体を用いたSPring-8放射光での構造解析と、その結果に基いたBsbPタンパク質の改良に予算を使用する。具体的にはS SPring-8のビームタイム使用料とそれに伴う旅費、また、BsbPタンパク質精製用試薬類とリアルタイムPCR関連試薬に予算を使用する予定である。LLBPの結晶構造解析の位相決定の準備は整っており、次年度に計画通りに機能解析実験を行う予定である。結果、当初申請した額と同じ費用が必要になる。