hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
唾液腺細胞の分化転換と再生に必要な転写因子の同定

マウス顎下腺を構成する複数の細胞タイプを分離し、それらの細胞タイプで発現している転写因子遺伝子を同定することを試みた。顎下腺構成細胞は2種類の細胞表面分子CD66aとCD117の発現パターンによって4種類の細胞タイプ、すなわち、腺房細胞CD66a(+)CD117(-)、介在部導管細胞CD66a(+)CD117(+)、一部の導管細胞CD66a(-)CD117(+)、他の導管細胞および筋上皮細胞CD66a(-)CD117(-)にFACS分離できることを明らかにした。これらの細胞で発現している転写因子の同定を試みたが、確定するには至っていない。器官再生のアプローチの1つは器官形成や細胞分化を制御している転写因子を用いて特定の細胞タイプへと分化誘導することである。申請者は,特定の細胞タイプへの分化誘導に必要な転写因子は器官形成初期で発現する転写因子と成体器官で細胞タイプ特異的に発現する転写因子との組み合わせであるという仮説を立てた。マウス唾液腺をモデルケースとしてこの仮説を立証するために,平成23年度は,成体マウス唾液腺の主要な4種類の細胞を分離し,各細胞タイプで発現する転写因子を同定することを目的とした。当初はSox9-EGFPマウスおよび抗CD117抗体を用いて細胞を分離する予定であった。しかし,転写因子Sox9の代わりに細胞表面分子CD66aを指標に用いて唾液腺の各細胞タイプを分離できる可能性が出てきたため野生型マウスを用いて実験を進めてきた。マイクロアレイ解析からCD66aは唾液腺上皮組織の腺房細胞の分化開始とともに発現レベルが急上昇することが明らかになり,免疫染色の結果から成体でと同様に腺房細胞と介在部導管細胞で発現することを見いだした。CD66a抗体はフローサイトメトリーに利用可能であることから,2種類の細胞表面分子CD66aとCD117を指標にすることにより,野生型の成体マウスを用いて唾液腺上皮の各細胞タイプを分離できる可能性が示唆された。成体マウス唾液腺をコラゲナーゼ/ヒアルロニダーゼで処理によって上皮細胞画分を得た後、CD66a抗体とCD117抗体を用いたフローサイトメトリーによって各上皮細胞タイプを分離することに成功した。現在、各細胞タイプの遺伝子発現や分化能の解析を進めているところである。唾液腺は腺房部と導管部からなり、それぞれを構成する複数種類の細胞が協同して働いている。これらの細胞タイプを分離し、遺伝子発現を明らかにすることは、細胞分化機構の解明や再生方法の確立にとってきわめて重要である。形成途上のマウス唾液腺を用いたマイクロアレイ解析から、細胞表面分子CD66aは唾液腺上皮組織の腺房細胞の分化開始とともに発現レベルが上昇することが明らかになり、免疫染色の結果から成体でと同様に腺房細胞と介在部導管細胞で発現することを見いだした。一方、別の細胞表面分子CD117は介在部導管細胞など一部の導管細胞で発現している。CD66a抗体もCD117抗体もフローサイトメトリーに利用可能であることから、これらの細胞表面分子を指標にすることによって野生型マウスを用いて唾液腺上皮細胞の各細胞タイプを分離できる可能性が示唆された。成体マウス唾液腺をコラゲナーゼとヒアルロニダーゼで処理して上皮細胞画分を得た後、CD66a抗体とCD117抗体を用いたフローサイトメトリーによって腺房細胞、介在部導管細胞、他の導管細胞など複数の細胞タイプを分離できることを明らかにした。これらの成果により、各細胞タイプの遺伝子発現や分化能の解析を行うことが可能となる。唾液腺の各細胞タイプの分化に必要な転写因子を同定するという当初の目標には至っていないが、本研究成果はその達成に向けた大きな前進と言える。マイクロアレイ解析からCD

66aは唾液腺上皮組織の腺房細胞の分化開始とともに発現レベルが急上昇することが明らかになり,免疫染色の結果から成体ではSox9と同様に腺房細胞と介在部導管細胞で発現することを見いだした。CD66a抗体はフローサイトメトリーに利用可能であることから,2種類の細胞表面分子CD66aとCD117を指標にすることにより,野生型の成体マウスを用いて唾液腺上皮の各細胞タイプを分離できる可能性が示唆された。成体マウス唾液腺から純度の高い上皮細胞を調製する条件を検討した。唾液腺をコラゲナーゼ/ヒアルロニダーゼで処理後,遠心条件を適切に設定することなどによって間質細胞や血球細胞をほとんど含まない上皮細胞画分を得られることがわかった。現在,CD66a抗体とCD117抗体を用いたフローサイトメトリーによって上皮細胞タイプを分離するための条件を検討して,細胞の分離を進めているところである。本研究課題の目標は唾液腺を構成する各細胞タイプを分離して、それらに特異的な遺伝子を同定し、細胞分化に必要な転写因子を同定することであるが、現状は分離した細胞に特異的な遺伝子の解析を進めている段階であり、細胞分化に必要な転写因子の同定までには至っていない。それにはいくつかの原因がある。1つは細胞分離の指標分子を変更したことである。当初は転写因子Sox9と細胞表面分子CD117を指標にする予定であった。しかし,この方法ではSox9-EGFPトランスジェニックマウスを利用する必要があり,将来の応用を考えると野生型マウスの利用が望まれた。マイクロアレイの結果等を参考にして,Sox9の代わりとなるような細胞表面分子を探索した結果,CD66aが利用可能であることが判明したため,CD66aとCD117を指標にし,また,Sox9-EGFPトランスジェニックマウスではなく野生型マウスを用いた実験に変更した。2つめの原因はフローサイトメトリーのための唾液腺上皮細胞画分の調製方法を再検討する必要があったことである。他研究者の方法では上皮細胞画分に間質細胞や血球細胞が多く含まれていた。そのため,細胞調製方法を再検討し,上皮細胞を99%以上の収率で分画する方法を見つけた。3つ目の原因はフローサイトメーターの不具合のためしばらく装置を使用することができなかったことである。当初の予定よりも遅れているが,研究プランそのものは妥当であり,実行可能であることに変わりはない。平成23年度の当初の目標は唾液腺の各上皮細胞タイプを分離してそれぞれの細胞の遺伝子発現解析を行う予定であったが,現状は細胞分離のメドがついた段階であり遺伝子発現解析までには至っていない。
抗体の変性状態タンパク質認識特性とその分離への応用

リフォールディング工程などにおいて、可溶化後弱い変性状態にある目的タンパク質を免疫アフィニティクロマトグラフィーで精製するため、目的タンパク質の構成ペプチドに対する抗体のタンパク質認識特性を検討した。特に、抗ペプチド抗体は立体構造の自由度の高い状態のタンパク質と結合しやすいと考えられ、変性状態にあるタンパク質の精製に適していると期待される。このような抗体の認識特性とタンパク質の変性状態の関連を明らかにし、リフォールディングと分離に適切な変性剤濃度条件を検討し、以下の成果を得た。1.ミオグロビン、インスリン、イネα-アミラーゼのC末端ペプチドに対する抗体を作製し、nativeおよび変性状態におけるこれらタンパク質の吸着特性を検討した。ミオグロビンに対する抗ペプチド抗体はnativeミオグロビンはわずかしか吸着しなかったが、3M尿素中で変性状態にあるときは抗原ペプチドと同程度に吸着された。このことからこの抗体は変性した自由度の高い状態のタンパク質に強く結合することが示された。一方、インスリンやアミラーゼに対する抗体ペプチド抗体は、nativeタンパク質にも結合し、変性状態にすると吸着量は少し低下した、これらのタンパク質はC末端部が本来自由度が高く、抗ペプチド抗体と結合できるためと考えられる。この結果から3M尿素程度の変性状態において、抗ペプチド抗体を用いた免疫アフィニティ精製が行えると言える。2.リゾチームを用いてリフォールディング条件と、連続装置を用いるリフォールディングを検討した。その結果、変性状態リゾチームをいったん3M尿素程度の液中でloose foldingさせることによってリフォールディング効率が高くなることが示された。また、新しく考案した装置によってリフォールディングを連続的に効率よく行えた。本研究では、封入体形成時の分離工程において、可溶化後弱い変性状態にある目的タンパク質を免疫アフィニティクロマトグラフィーで精製するため、目的タンパク質およびその構成ペプチドに対する抗体の弱い変性状態にあるタンパク質認識特性を検討する。特に、抗ペプチド抗体は立体構造の自由度の高い状態のタンパク質と結合しやすいと考えられるので、変性状態にあるタンパク質の精製に適していると期待される。このような抗体の認識特性とタンパク質の変性状態の関連を明らかにし、リフォールディングと分離に適切な変性剤濃度条件を検討する。本年度の成果としては1.ミオグロビン、インスリン、イネα-アミラーゼなどのタンパク質およびそのC,N末端ペプチドに対する抗体をウサギに免疫することによって作製し、特異抗体を精製した。これを不溶性担体に固定化したものを調製し、8M尿素等で変性させた後、適当な変性条件(14M尿素など)にしたタンパク質の結合特性を求めた。抗ペプチド抗体は、nativeタンパク質とも結合する場合があったが、変性タンパク質とよく結合し、抗ペプチド抗体を用いれば変性状態での免疫アフィニティクロマトグラフィー精製が可能であることが明らかとなった。変性タンパク質のリフォールディング条件についてリゾチームを用いて検討し、リフォールディングにさきだって2M尿素等の弱い変性状態に置くことによって、リフォールディング効率が高められることが示された。以上の結果を得て、予定どおり次年度の研究計画を実施する。

一方、インスリンやアミラーゼに対する抗ペプチドは、nativeタンパク質にも結合し、変性状態にすると吸着量は少し低下した、これらのタンパク質はC末端部が本来自由度が高く、抗ペプチド抗体と結合できるためと考えられる。この結果から3M尿素程度の変性状態において、抗ペプチド抗体を用いた免疫アフィニティ精製が行えると言える。2.リゾチームを用いてリフォールディング条件と、連続装置を用いるリフォールディングを検討した。その結果、変性状態リゾチームをいったん3M尿素程度の液中でloose foldingさせることによってリフォールディング効率が高くなることが示された。また、新しく考案した装置によってリフォールディングを連続的に効率よく行えた。
D-アミノ酸による生体制御システムの解明と応用

本年度はまず新規D-アミノ酸生合成酵素遺伝子の検出を目的としたファンクショナルスクリーニング系の構築を行った。そのため、まずE. coliの生育に必須なD-Glu、D-Alaの合成をそれぞれ担うグルタミン酸ラセマーゼ、アラニンラセマーゼ遺伝子を欠損したD-Glu, D-Ala要求性の大腸菌、MB3000株を作製した。同株に様々なD-アミノ酸とα-ケト酸の間のアミノ基転移反応を触媒するD-アミノ酸アミノトランスフェラーゼ(DAAT)遺伝子を導入することによって、菌体内で何らかのD-アミノ酸生合成酵素が発現した場合にD-グルタミン酸、D-アラニン要求性が相補される菌株を構築した。得られたこのD-アミノ酸要求株に既知のアミノ酸ラセマーゼ遺伝子を導入、発現させたところ、D-アミノ酸非添加培地における菌体の生育が確認され、同株がD-アミノ酸生合成酵素遺伝子のスクリーニングに使用できる可能性が示された。なおこの研究の過程で、DAATが遊離のリン酸イオンの存在下でセリンのラセミ化も触媒すること、その際リン酸がセリンの2位水素の引き抜きと付加を触媒する一般酸塩基触媒として機能することを見出した。今年度はさらに、D-Ser生合成を担うセリンラセマーゼが基質であるセリンと反応し、酵素自殺基質反応様の修飾を受けることを、放射標識したセリンの酵素タンパク質への取り込みにより確認した。このほか、ヒト尿中のD-Asp濃度とクレアチニンの比が、各個人や性別、あるいは採尿の時期にかかわらずほぼ一定になることを見出すとともに、腎疾患のリスクを有する患者の尿における同比の解析を開始した。平成30年度が最終年度であるため、記入しない。真核生物型セリンラセマーゼ(SerR)はSerのラセミ化とともに、デヒドレーション反応も触媒するがD- Serに対する活性はL -体に対して顕著に低い。重水中でのセリンデヒドレーション反応やトレオニンエナンチオマー分解反応の動力学的解析によって、活性中心における基質OH基の配向の差異がこの原因であると推測した。哺乳動物におけるD-Asp生合成へのSerRの関与を検証するため、PC12細胞にSerRを大量発現させたところ、培地中のD- Asp濃度が上昇した。一方、SerR遺伝子をノックアウトした場合は、D-Ser濃度は低下したがD-Asp濃度は変化しなかった。同遺伝子をノックアウトしたマウス個体では前頭皮質と海馬でのD-Asp濃度が減少したが、大脳と睾丸では変化がなかった。この結果、Ser RはD-Asp生合成に関与するものの、別のD-Asp生合成系が存在することが示唆された。健常者の尿中D-Ser濃度とクレアチニン濃度の比がほぼ一定であることを見出した。一方、アテローム性動脈硬化など腎障害のリスクファクターを有する被験者では、尿中D-Ser濃度は尿中L-SerよりもeGFRに対する良い相関を示すことを明らかにした。これに対して、尿中のD-およびL-Ser濃度とL-FABPやNAGとの相関は認められなかった。交付申請書に記載した4項目の研究計画のうち、3項目については順調に進行し、一定の結論を得ることができた。このうち1件については論文として報告、1件はを投稿中であり、もう1件は論文作成中である。当初の研究計画にある残りの1項目、D-Aspによる培養細胞の抗酸化性の増強については、培養細胞を用いて検討を行い、D-AspによるNrf2の転写を促進を示唆するデータが得られたが、このデータの再現性が認められなかったため断念した。以上の状況を鑑みて、おおむね順調に進展していると判断した。

研究代表者らは先に、出芽酵母からD-Serをピルビン酸とアンモニアに分解するFold-type III型の新奇PLP酵素、D-セリンデヒドラターゼ(Dsd1p)を見出した。同酵素の高い基質特異性を利用して、生成ピルビン酸をNADH存在下で乳酸脱水素酵素を用いて測定するD-Serの酵素定量法を開発した。本法およびHPLC法を併用し、20名の健康なボランティアを募って尿中D-Serとクレアチニンの濃度を測定した。その結果、尿中のD-Serとクレアチニンの濃度比が、性別や採尿のタイミングにかかわらずほぼ一定であることを明らかにした。上記の研究を進める過程で、ヒト尿中にDsd1pの基質となる新規アミノ酸の存在を見出した。(1)このアミノ酸からDsd1p処理によって生じるケト酸と、アスパラギンの脱アミノ化反応によって生じるケト酸が同一であること、(2)AQC誘導体化物のMS分析から得た分子量が148であること、(3)アスパラギナーゼ処理により、L-エリスロ-β-ヒドロキシアスパラギン酸を生じることから、このアミノ酸がL-エリスロ-β-ヒドロキシアスパラギンであると結論した。さらに同アミノ酸がマウス由来セリンラセマーゼの競合阻害剤となることや、同アミノ酸がラット尿中には著量存在するのに対して、大脳、小脳、肝臓、腎臓、精巣、血漿での濃度は検出限界以下であることを明らかにした。本研究ではまた、未知のDーアミノ酸生合成酵素遺伝子をcDNAの発現ライブラリーからスクリーニングするE. coliを用いた系を構築する準備として、E. coliにおいてそれぞれD-AlaとD-Gluの生合成に関わるアラニンラセマーゼ遺伝子(alrとdadX)とグルタミン酸ラセマーゼ遺伝子(murI)を破壊し、D-Ala、D-Glu要求株であるMC3000株を作成し、その性質を調べた。本研究では、健常者ボランティアの尿中D-Serとクレアチニンの濃度濃度比が、性別や採尿のタイミングにかかわらずほぼ一定であることを明らかにした。これは当初の予想通りの結果であり、このD-Ser/クレアチニン比と腎疾患患者での同比を比べることにより、新たな腎疾患マーカーの開発が可能となる可能性が高まった。また本研究ではE. coliを用いた新奇Dーアミノ酸生合成酵素遺伝子のファンクショナルスクリーニング系構築の準備段階に成功した。これは未だ不分明の状態にあるD-Asp生合成酵素の検出に繋がるものと考えている。これらの理由により上記評価とした。真核生物型セリンラセマーゼの反応機構について今回得られた「活性中心における基質OH基の配向の差がD-SerとL-Serのデヒドレーション反応の効率に影響する」という考察を検証するため、それぞれのエナンチオマーを基質とした場合の反応中間体アナログと酵素の複合体の結晶構造解析を行う。具体的には基質との分子外シッフ塩基アナログであるピリドキシル-D-およびL-セリンと酵素の複合体の結晶構造解析を進める。今回の研究の結果、哺乳動物のD-Aspの生合成にセリンラセマーゼが関与する一方、未知のD-Asp生合成系の存在が示唆された。この未知の系を明らかにするため、D-アミノ酸生合成酵素遺伝子をファンクショナルクローニングによって得る系を考案する。まずE. coliの生育に必須なD-AlaとD-Gluの生合成酵素であるアラニンラセマーゼとグルタミン酸ラセマーゼ遺伝子を破壊したE.coli株を作成する。D-AlaおよびD-Gluの要求
歯周病原菌の外膜蛋白質に特異的なTh2型T細胞によるラット歯周病発症への防御効果

免疫応答の著しい特徴は、それが多様な機能と特異性を持った細胞集団の相互作用によって成り立っている点にある。このような免疫担当細胞の多様性は、無数ともいえる外来抗原の刺激に対して個体が正確に対応するために必須のものであるが、研究する上では、このような多様性は均一な研究材料を大量に得られない困難さとなっている。そこで、本研究は、ラットを抗原[(分子量40,000のPorphyromonas gingivalis外膜蛋白質(r40-kDa OMP)]にて免役した後、取り出した局所リンパ節からanti-CD4^+抗体カラムを用いたpunning法にて採取したCD4^+-T細胞クローンを抗原刺激を繰り返すことによって、正常リンパ球を半永久的に増殖させることに成功した。この抗原特異的T細胞を下記のように同定した。Th1型あるいはTh2型サイトカインmRNA発現の測定細胞内サイトカインの産生量の測定細胞株培養上清を用いて、Th1型(IFN-γ,Il-12)あるいはTh2型サイトカイン(IL-4,IL-5,IL-6,IL-10)の産生量を特異抗体を用いたELISA法にて測定し、分離したクローンはIL-4活性を示した。r40-kDa OMPおよびP.gingivalis菌体に対するTh2型クローンのin vitro proliferationをトリチウムチミジンの取り込みおよび細胞増殖試薬WST-1によるcell proliferation assayを用いて測定した。B細胞からのin vitro抗体産生へのTh2クローンによる介助r40-kDa OMPにて免疫したラットの脾臓からB細胞を採取し、クローンT細胞を加えた場合と、加えない場合のB細胞からの抗体産生量を測定し、Th2クローンによるB細胞からのin vitro抗体産生への介助機能を同定した。Th2型細胞はIL-4およびIL-6を産生することによって、B細胞を活性化し、抗体産生を促す。産生された抗体は局所における細菌の中和とオプソニン化を亢進し、歯周病発症を阻止する方向に働くことを期待する。慢性の限局した炎症性疾患である歯周病の感染初期の局所にはTリンパ球が優位であり、歯周病が進行するにつれてBリンパ球や形質細胞が顕著になると言われ、歯周病がより進んだ段階では局所の免疫調節のバランスは崩れていることが示唆される。細胞性免疫と体液性免疫とは完全に独立した系ではなく、2つの系はその調節機構やエフェクター機構において相互に関連している。特に、ヘルパーT細胞は体液性免疫の調節機構において重要な機構を司っており、中でもTh2型細胞はIL-4およびIL-6を産生することによってB細胞を活性化するので、活性化B細胞が産生する抗体が局所における細菌の中和とオプソニン化を亢進し、歯周病発症を阻止する方向に働くと考えられる。そこで、歯周病原菌の病原因子に特異的なTh2型細胞をin vitroでクローニングすることを試み、本年度はTh2クローンの作製方法を確立した。1.免疫抗原としてP.gingivalisの分子量40,000の外膜タンパク質起源の組み換えタンパク質r40-kDa OMPを用いた。3.注入リンパ節である鼡径部・旁大動脈リンパ節から細胞を取り出した。panning法を用いてBリンパ球ならびにCD8^+細胞を除去し、CD4^+-T細胞画分を得、in vitroに移した。

抗原に加えて、同系ラットの脾臓をfiller cellsとして、また脾臓細胞培養のConA刺激上清をT細胞増殖因子として培養に添加した。病原体に対する感染防御機構の多くは抗体産生と細胞性免疫との二重の防御機構によって成り立っているとされる。ヘルパーT細胞はTh1型とTh2型に分類され、細胞性免疫の調節ばかりでなく、体液性免疫の調節機構において重要な役目を担っている。Th1型細胞誘導が歯周組織破壊あるいは骨吸収を誘引するとされるのに反し、Th2型細胞はIL-4およびIL-6を産生することでB細胞を活性化し、抗体産生を促す。産生された抗体は、局所において細菌の中和とオプソニン化を亢進し、歯周病発症を阻止する方向に働くと示唆される。本研究はP.gingivalis細胞表層タンパク質に特異的なTh2型ヘルパーT細胞のクローニングを目的とした。ラットを抗原にて免役した後、局所リンパ節を取り出し、Kimoto & Fathmanの方法にてT細胞株樹立を試みた。しかし、得たT細胞クローンを同定した結果、これらクローンのphenotypeはCD8^+であった。そこで、phenotype CD4^+を示す細胞を効率的に得るために、次の方法をとることにした。生体内で免役された特異ヘルパーT細胞を出発材料とし、anti-CD4抗体を用いたpunning法にてCD4^+-T細胞を先ず分画し、ついで抗原の存在化に、この分画をin vitro実験系に移した。今後、抗原刺激を数回繰り返し、長期培養細胞株を得る予定でいる。この中から、anti-CD3,anti-CD4,anti-CD8,anti-CD45などの抗体を用いて、flow cytofluorometerによるphenotypic analysesにてTh2クローンを選別する。細菌表層タンパク質や各P.gingivalis菌株に対するTh2クローンのin vitro proliferativeresponsesを^3H-thymidineのuptakeによって測定し、Th2クローンによる感染防御機構を検索する。本研究はPorphyromonas gingivalis外膜タンパク質に特異的なTh2型ヘルパーT細胞のクローニングを目的とした。ラットをP.gingivalis外膜組換えタンパク質で免役した後、局所リンパ節を取り出し、anti-CD4抗体カラムを用いたpunning法にてCD4^+-T細胞を先ず分画し、ついで抗原の存在化に、この分画をin vitro実験系に移した。
心不全の個別薬物療法を目的としたβ遮断薬の体内動態変動機構と人種差の解明

近年の欧米大規模臨床試験によって、慢性心不全に対するβ遮断薬(カルベジロール、メトプロロール、ビソプロロール)の有用性が明らかとなった。一方、近年日本でも心不全に対するカルベジロールの適応が認められたが、日本での標準的投与量が欧米と大きく異なる理由や、治療効果に大きな個体差が認められる原因は不明である。肝代謝型β遮断薬の代謝にはチトクロームP450(CYP)2D6が主に関与すると推定されているが、その遺伝子多型には人種差がある。過去に申請者は、日本人でアレル頻度が高いCYP2D6*10遺伝子の保有者ではメトプロロールの経口クリアランスが顕著に低下することを見出している。本研究では心不全の個別薬物療法を目指して、カルベジロールとビソプロロールの体内動態変動機構と人種差の原因の解明を図るとともに、β遮断薬の薬効の個体差および薬効に及ぼす病態の影響について検討を追加した。健常者を対象とした臨床試験を行い、カルベジロールの体内動態に及ぼす薬物酸化・抱合酵素およびトランスポーターの遺伝子多型の影響を評価した。CYP2D6*10の保有者ではカルベジロールの経口クリアランスが有意に低下した事から、CYP2D6*10が日本人におけるカルベジロールの体内動態変動の主要因であると推定された。一方、ビソプロロールではCYP2D6*10の影響が認められず、体内動態およびβ遮断効果の個体差が小さい事が明らかとなった。また、β受容体の感受性が心不全や腎機能低下などの病態時に変化するとの報告があることから、両側尿管を結紮した腎障害モデルラットにおけるβ遮断薬の薬効評価を追加した。β遮断作用自体は腎障害の影響を受けず、血中濃度データに基づくβ遮断薬の投与調節が重要である事が明らかとなった。本研究の結果は、心不全症例に対するβ遮断薬の個別投与設計法の開発に繋がる有用な知見と考えられる。近年の欧米における大規模臨床試験により、慢性心不全に対するβ遮断薬投与の有用性が明らかとなった。しかし、β遮断薬のカルベジロールは日本人における標準投与量が欧米と大きく異なることや、治療効果に大きな個体差が認められる事が報告されており、その原因は不明である。肝代謝型β遮断薬の代謝にはチトクロームP450(CYP)2D6が主に関与すると推定されているが、その遺伝子多型には人種差があり、欧米人では約7%がpoor metabolizer(PM)であると報告されている。一方、日本人ではPMの頻度は1%以下であるが、^*10変異の発現頻度が高いために、extensive metabolizerの中にも代謝活性の低い人が数多くいる。これまでに、β遮断薬(メトプロロールおよびビソプロロール)の体内動態に及ぼすCYP2D6^*10の影響を検討したところ、肝代謝を受けるメトプロロールの経口クリアランスは^*10を持つ患者において顕著に低下した。一方、約50%が腎排泄を受けるビソプロロールの経口クリアランスには^*10の影響が認められなかった。そこで、我々は日本人健常ボランティア54人を対象に、カルベジロールの体内動態に関わる、CYP分子種、グルクロン酸抱合酵素、および消化管吸収に関わるP-糖蛋白質の遺伝的多型の影響を、非線形混合効果モデル(NONMEM)法と重回帰分析法を用いて検討した。その結果、カルベジロールの経口クリアランスはCYP分子種のうちCYP2D6^*10のホモ接合体をもつ被験者ではCYP2D6^*10を持たない被験者に比べ、R体では51%、S体では30%減少した。

また、他の影響因子の遺伝的多型による体内動態の変動性は認められなかった。これらの結果はカルベジロールの投与設計を行う上において重要な知見となると考えられた。交感神経β受容体遮断薬は、高血圧や狭心症など治療に繁用されているが、1980年代までは心不全患者に投与禁忌とされてきた。しかし、欧米の大規模臨床試験で、3種類のβ遮断薬(カルベジロール、メトプロロール、ビソプロロール)が心機能と生命予後を著明に改善したことから、β遮断薬は心不全の治療薬となりつつある。一方、近年日本でも心不全に対するカルベジロールの適応が認められたが、日本での標準的投与量が欧米と大きく異なる理由や、治療効果に大きな個体差が認められる原因は不明である。そこで本研究では、心不全の個別薬物療法を目指して、カルベジロールの体内動態変動機構と人種差の原因の解明を図るとともに、β遮断薬の薬効に及ぼす病態の影響についても検討を追加した。健常者ボランティア54名を対象とした臨床試験を行い、カルベジロールの体内動態に及ぼす薬物酸化・抱合酵素およびトランスポーターの遺伝子多型の影響を評価した。カルベジロールの経口クリアランスは、日本人でアレル頻度が高いCYP2D6*10遺伝子の保有者において有意に低下したことから、CYP2D6*10が日本人におけるカルベジロールの体内動態変動の主要因であると推定された。また、β受容体の感受性が心不全や腎機能低下などの病態時に変化するとの報告があることから、両側尿管を結紮した腎障害モデルラットにおけるβ遮断薬の薬効評価を行った。その結果、β遮断作用が腎障害の影響を受けず、血中濃度データに基づくβ遮断薬の投与調節が重要である事が明らかとなった。本研究の結果は、心不全症例に対するβ遮断薬の個別投与設計法の開発に繋がる有用な知見と考えられる。
タイプIII分泌エフェクターXopRを介したイネ白葉枯病菌の植物感染機構の解明

白葉枯病菌において、タイプIII分泌エフェクターXopRが宿主イネへの病原性に関与し、タバコ耐病性への関与が報告されているイネOsBIPP2C1と相互作用するとの予備的知見を得ていた。本研究では、植物細胞内における両タンパク質の相互作用について明らかにすることはできなかったが、XopRがイネの抵抗性抑制に関与することが示唆された。また、OsBIPP2C1がアルカリフォスファターゼ2Cとしての酵素活性を有することを明らかにした。1.xopR遺伝子を導入した形質転換イネを利用したイネ防御応答の解析XopR発現が植物体内での細菌増殖および植物の自然免疫に及ぼす影響についての検討を行ったが、本年度は、XopR発現が植物体内での細菌増殖を促進する、あるいは、植物の自然免疫反応の1つとされる細胞壁におけるカロース蓄積を抑制するといった明確なデータを得ることが出来なかった。一方、XopR発現により影響を受けるイネ遺伝子の発現動態の解析を行うためマイクロアレイ解析を行ったところ、防御応答関連遺伝子として知られるPR1遺伝子をはじめとする遺伝子の発現抑制が確認された。2.XopRとOsBIPP2C1の相互作用についての解析アグロバクテリウムを介した一過性発現実験によりXopRとOsBIPP2C1を共発現後、pull-down assayおよびBi-FC法により、両タンパク質の相互作用について検討したが、これまでのところ、両者が結合するという知見は得られていない。RNAi法によりOsBIPP2C1の発現を抑制させた形質転換イネの作出を行い、T1種子の採種を行った。過剰発現型の形質転換体も作出し、OsBIPP2C1の発現量と耐病性との関連について検討する。1.xopR遺伝子を導入した形質転換イネを利用したイネ防御応答の解析デキサメタゾン誘導プロモーター制御下でxopR遺伝子を発現する形質転換イネを用いた解析では、xopRが植物防御応答拘制に関与するという明確なデータを得ることが出来なかった。一方で、形質転換シロイヌナズナを用いた解析では、白葉枯病菌XopRの発現により、(1)植物体内での細菌増殖の促進、(2)植物の自然免疫反応の1つとされる細胞壁におけるカロース沈着の抑制、(3)自然免疫の引き金となるMRMPs誘導性遺伝子の発現誘導が確認され、本エフェクタータンパク質が植物防御応答抑制に関与することが示唆された。2.XopRとOsBIPP2C1の相互作用についての解析本年度もosBIPP2C1の局在を明らかにすることは出来なかった。また、BiFC法によりXopRとOsBIPP2C1の相互作用について検討を行ったが、ポジティブな結果を得ることは出来なかった。トウモロコシ由来のユビキチンプロモーターでOsBIPP2C1を過剰発現させた形質転換イネの作出を試みた。しかし、空ベクターを導入した対照区では形質転換候補が得られた一方、OsBIPP2C1遺伝子導入区ではそれが得られず、本遺伝子の過剰発現が致死に作用している可能性が考えられた。OsBIPP2C1は、プロテインボスファターゼ2Cフナミリーのタンパク質と相同性をもつが、実際にホスファターゼ活性をもつかについては明らかでなかった。大腸菌において発現・精製したHis-OsBIPP2C融合タンパク質は、塩基条件下でホスファターゼ活性を示し、リン酸化スレオニンを含むペプチドを基質とし、その活性にはMg^<2+>イオンが必要であることが確認され、OsBIPP2C1がPP2Cファミリータンパク質であることが明らかとなった。1.xopR遺伝子を導入した形質転換イネを利用したイネ防御応答の解析(1)XopR発現が植物体内での細菌増殖に及ぼす影響についての検討するため、DEX処理により形質転換イネにおけるxopR遺伝子の発現を誘導後、白葉枯病菌野生株を接種した。その結果、Mock処理区におけるよりも顕著な病斑の伸長がみられ、XopRのイネ自然免疫抑制への関与の可能性が示唆された。(2)XopR発現により影響を受けるイネ防御関連遺伝子の発現動態を調べるため、形質転換イネをMockあるいはDEX処理直後、および24時間後のイネ葉をサンプリングし、マイクロアレイ解析を行った。その結果、既知防御関連遺伝子のPR-1遺伝子やペルオキシダーゼ遺伝子に加え、エチレン応答への関連が予想されるAtERF5と相同性を有する遺伝子やOsERF3遺伝子の発現がMock処理区における2分の1以下にまで抑制されていることが確認された。xopR遺伝子導入形質転換シロイヌナズナにおいて、シロイヌナズナのエチレン処理時に観察されるトリプルレスポンスを確認している。エチレンは植物の防御応答シグナル物質の1つとして知られる。これらのことから、白葉枯病菌タイプIIIエフェクターXopRはエチレンを介した植物の防御応答シグナルカスケードを攪乱することで自然免疫を抑制する可能性が示唆された。

OsBIPP2C1のPP2Cアルカリフォスファターゼ活性をXopRが阻害するかについてin vitroで検討するため、XopRの組換えタンパク質の発現・精製を試みた。Hisタグ標識をした組換えタンパク質を可溶性タンパク質として得ることができなかったため、標識タグをGSTに変更したが、可溶性タンパク質を得ることができず、XopRがPP2C阻害活性を有するかを明らかにすることはできなかった。イネでOsBIPP2C1を過剰発現させると致死的に作用する可能性が示唆され、今後は誘導型プロモーター等の利用の検討が必要であることが明らかとなった。形質転換イネを用いた解析については、あまり進めることができなかった。また、タンパク質の局在およびタンパク質問相互作用については、解析を試みたものの結果を得ることができなかった。しかし、OsBIPP2C1の機能解析では、本タンパク質がPP2Cとしての酵素活性を有することが明らかにできたことから、今後、in vitro実験によりXopRがOsBIPP2C1のホスファターゼ活性に及ぼす影響についての検討可能であることが明らかとなった。24年度が最終年度であるため、記入しない。エフェクター遺伝子を導入した形質転換イネを用いた解析にいくらか重点を置き、解析を推進する。OsBIPP2C1遺伝子の過剰発現イネが得られなかったのは、イネで本遺伝子を過剰発現させると致死的に作用する可能性も考えられる。したがって、次年度は薬剤誘導型プロモーターの利用を検討している。これにより得られた形質転換体については、次年度が最終年度であることを踏まえ、カルスを用いた解析を中心とし、植物体を用いた解析はRNAi法により発現抑制させた形質転換体について行う。
子どもと大人における病気・健康の因果性の理解:素朴生物学の視点から

子ども(とくに幼児)と普通の大人が病気や健康の因果性をどのように考えているかを調査し、次のことが明らかになった。幼児は罹病・病気の回復の因果性として生気論的因果説明(食物等の摂取により取り入れた活力が病気への抵抗力として働くとする考え)を、社会的・道徳的望ましさ説明より好み、活力源としての食物は、その種類より摂取量を重視する傾向がある。大人では、科学用語(例えばウィルス)を用いるものの、その理解は浅く、依然として生気論的考えが存続している。本研究では、子どもと普通の大人が、病気と健康の因果性をどのように理解しているのかを、素朴生物学における生気論的因果の観点から検討することを目的とし、同時に生気論的因果の特徴をより明細化することをめざすものである。従来のこの分野の研究では、西洋医学の見方を前提とし、もっぱら細菌説の立場から研究がなされていたため、幼児や低学年児童では細菌の生物学的理解はまでできないとの知見が強かった。しかし健康や病気の予防は、人類の生き延びに必須であるという進化論的視点から考えると、子どもが早くから病気や健康についての理解をもっている可能性がある。そこで本研究では、細菌説とは異なる視点、すなわち素朴生物学における生気論的因果の視点から病気の因果性の理解の問題を検討しようとした。素朴生物学を特徴づけているのは生気論的因果ともいわれており、この因果の特徴をより明らかにしたいと考えたからである。具体的には、主に次の点について検討することを目的とした。(1)病気の抵抗力の理解に関して発病と病気の治癒における活力の役割を子どもや大人はどのように理解しているか。(2)健康の基礎として、また活力源として、食べ物・栄養について子ども(と大人)はどのように捉えているか。(3)子どものもつ「知識」への「インプット」として重要な位置を占めると思われる、子どもを持つ親は、日常生活場面で子どもにどのような言葉かけや説明をすることが多いか。(4)普通の大人は、病気の因果性に関してどの程度、どのような形で生気論的な考え方を持っているか。病気と健康の因果性の理解を素朴生物学における生気論的因果の観点から検討するために、本年度は、主に幼児を対象として、病気の抵抗力の理解に関して病気の発病と治癒における活力の役割を中心に実験をおこなった。これまで活力源としてもっぱら摂食がとりあげられてきたが、ここではさらに共感・はげましなどを通じての他者の「力」の取得もとりあげ、これらが病気の治癒に関与しうると幼児(幼稚園の4,5歳児)が考えているかを中心に検討した。その結果次のことが明らかになった。1.45歳児とも、摂食とともに他者の励ましも病気の回復に影響すると考えていたが、同時に日頃のよい道徳的行動も病気の治癒を早めると考えていた。2.身体的・生物学的要因(例、摂食)と他者の励ましという心理的・共感的要因との間でどちらか一方を強制的に選択させると、身体的・生物学的要因の方が心理的・共感的要因より重要だとするが、心理的・共感的要因と道徳的要因との間で選択させると、心理的・共感的要因の方が病気の治癒により好ましい影響を及ぼすと考える傾向が見られた。3.病気の治癒に関する2つの説明、すなわち生気論的説明(例、野菜を食べると力が出てばい菌を追い払える、他の人から元気パワーをもらえるなど)と道徳的説明(例、野菜を食べる子はいい子、友達から好かれるいい子)との問で選択させると、大部分の5歳児は生気論的説明をよりもっともらしいとして選択した。生気論的説明を自発的に構成する子どもは多くないが、提示した説明の中からもっともらしい説明を選ばせるとほとんどの者が生気論的説明を選ぶことが明らかになった。病気と健康の因果性の理解を素朴生物学における生気論的因果の観点から検討するために,本年度は健康の基礎としての食べ物、栄養の理解の問題を中心に実験をおこなった。1)就学前の幼児では,食べ物の種類(野菜類,穀類,肉類,菓子類)にかかわらず,多量に食べた方が,少量しか食べない場合よりも成長が速く,病気にも罹りにくいとする傾向が菓子類を除き,非常に強い。菓子類は他の食べ物ほどこの傾向が顕著ではなかったが,しかし大人のように,明瞭に,菓子類は多量に食べる方が病気にかかりやすいとは考えておらず,少量しかたべないと病気にかかりやすいと考える子どもがかなり多い。2)食べ物であれば,野菜類,穀類,肉類のいずれでも健康(成長と病気への抵抗力)に同じような働きをすると考えている子どもがいる一方で,同じような割合で,成長へ寄与するのは野菜がもっとも大きく,次が穀類(ご飯),その次が肉類という順番があり,野菜類の(活力源としての)価値を過大評価する子どもがいる。

またバランスのよい食事という概念はまだなく,同種のものであっても,おかずの品目が多ければ,少ないときより成長や病気の抵抗力に寄与するという考えが強い。3)4種類の食べ物のうちから主な栄養素をもつ食べ物を選ばせたとき,幼児は,「血や肉をつくるもとになる食べ物」として肉類を選ぶ傾向はあるが,「食べると力がでてくる食べ物」としては野菜を選ぶ傾向がある(大人では力がでてくる食べ物は炭水化物が多いものとして穀類を選ぶのが普通)。子どもと普通のおとなが、罹病、病気の回復、健康の因果性をどのように理解しているかを素朴生物学における生気論的因果の観点から検討するために、本年度は幼児が持っている病気や健康についての「知識」への「インプット」として重要な位置を占めると思われる日常生活場面での親の言葉かけや説明をとりあげ、親や将来の親の予備群としての大学生は幼児にどのような言葉かけをしているかを調べた。その結果、次のことが明らかになった。1)日常生活では、親は、健康・病気に関する幼児の行為(食事を沢山残す、好き嫌いをする、夜更かしをするなど)に対して、生活習慣上のしつけの問題として対処し、生物学的にくわレい説明をすることは少ない。2)幼児に対する親の「生物学的」説明においては、「ばい菌」という用語が使われることが多いが、親自身の「細菌」についての理解は浅く、細菌の増殖には時間がかかることの理解はほとんどの者ができていなかった。学校教育で科学的な知識を教えられたはずであるが、そうした知識は定着していない可能性が示唆される。3)親予備群としての大学生は、親に比べて、一つの場面での言葉かけの量がやや多い傾向があったが、その他は、上記の1)2)と同様の傾向がみられた。4)このような研究結果から、従来の研究で明らかにされてきた病気の理解を示す幼児の発言は、親からいわれたことをそのまま記憶したということによるのではなく、親の断片的発言をもとに幼児が自分で構成している可能性が大きいことが示唆される。本研究は、子どもと大人が病気の因果性についてどのように理解しているかを素朴生物学における生気論的因果の観点から検討することを大きな目的としている。今年度は大学生と中高年者に焦点をあて、大人がどのような生気論的な考えをもっているかを面接調査し、次のことが明らがになった。1.風邪の原因として最も重要なものをあげさせ、どうして風邪になるのかを説明させたところ、風邪が感染性の病気であるにもかかわらず、中高年者の方がウイルスに言及しない反応が多い傾向が見られた。2.大学生ではウイルスという科学用語を使用することがやや多いとはいえ、ウイルスや細菌の性質についての科学的理解があるというわけではなかった。食中毒において症状がでるのが、食べ物を口にした直後でなく数時間後である理由を問うと、細菌の繁殖時間に言及する者は、大学生でも中高年者でも殆どおらず、多くは消化に要する時間を理由としてあげた。3.疲労と風邪の発症の関係についてはどちらの大人も「関係あり」としたが、その理由は、大学生の方が中高年者よりも[疲労による免疫力・抵抗力の低下(によるウイルスの侵入を阻止できない)]の説明が多かった。4.意気消沈という心理的要因と風邪の発症の可能性については、大学生の8割、中高年者の9割の者が「ありうる」と回答し、その根拠として多くが[心身相関]や「病は気から」の観点から説明した。心理的ストレスが病気への抵抗力や免疫力を低下させると明白に述べる「生気論的な」説明も見られた。5.元気な人のそばにいくと自分も元気になる可能性については全員がみとめ、他者への共感を通して活力を得ると考える者が多いことが示された。
リンゴの完全ホモ個体の作出による育種・遺伝解析の効率化モデルの構築

葯培養によるリンゴの倍化半数体(DH)の作出では胚様体形成、胚様体からのシュート誘導、増殖・馴化の各過程が律速要因となることが判明した。効率よくDHを獲得するためには上記の過程で分化能・増殖能に優れる品種を選抜することが重要で`千秋'、`Starking Delicious'、`世界一'を好適品種として選抜した。1核前期から後期の花粉を多く含む緑蕾後期から中心花紅蕾前期の花叢を採取し、25日35日間の低温処理を行うことで胚様体形成率が高まることが明らかになった。DH個体を片親に使用した交雑実生群を用いることで遺伝解析の精度が向上した。作出したDHから開花・結実する個体が確認された。リンゴ10品種を用いて約10万個の葯培養を実施した.最も効率的に胚様体を形成する花粉ステージは1核期で,その時の花蕾ステージは中心花紅蕾前期であった.高い胚様体形成率を示した品種は`祝',`世界一',`千秋',`Starking Delicious'(SD)で,それに次いで`Gala',`GD',`金星',`つがる'の順であった.胚様体は`祝',`世界一'が7週間目,`Gala',`千秋'が8週間目,`金星'が9週間目,`つがる'が10週間目,`GD'と`SD'が11週間目から形成が確認された.大きな胚様体は早期に形成される傾向が示され,大きな胚様体ほど発根しやすくシュート誘導が容易であることから,胚様体形成が早い品種ほど倍加半数体獲得(DH)を獲得しやすいことが明らかとなり,効率的なDH獲得の方向性が明らかになった.シュートを形成が容易な品種として,`千秋'に加えて`世界一'を選抜したことからDH相互の交配によるF1種子獲得が実現可能となった.`千秋'の葯培養に由来し稔性を有するDHの`95P6'を`Prima'と交雑して育成したF1実生集団を用いてリンゴ果実形質の遺伝解析を行った.分析の結果,酸,果肉色,果汁褐変性,Brixおよび肉質などの食味および日持ち性に係る果実諸形質の相互関係が明瞭になった.このF1集団を用いて`Prima'の連鎖地図を作成し,連鎖地図を用いて果実形質のQTL解析を行ったところ,果皮色(b値),果皮色(L値),果肉色,酸度,果汁褐変度,収穫適期,果実縦径,果実径縦横比,および糖度で有意なQTLが検出された.酸度および果汁褐変のQTLが高感度で検出された要因は,`Prima'の保有する対立遺伝子の性質だけでなく,倍加半数体を花粉親とした集団をQTL解析に用いたことにより検出感度が向上した可能性が高く,DHの遺伝解析素材としての有効性が証明された.リンゴ品種千秋、世界一、祝、Starking Deliciousの葯培養を約10万個実施した。これまでの葯培養によって馴化個体が得られた千秋、世界一、Starking Deliciousを用いて、シュート形成に影響する要因を統計的に解析した、その結果、胚様体の発根がシュート形成と最も相関が高く、胚様体からの発根を促進する条件を整えることが有効であることが判明した。その他の要因では、胚様体が一定以上の大きさになるとシュート形成を有意に阻害することから、胚様体形成後速やかに低温処理、発根誘導を行うことが重要と判断された。葯置床前の低温処理期間、胚様体形成時期は品種間差が大きいことが判明した。また、馴化した倍加半数体を獲得するためには胚様体形成、シュート形成、シュート増殖・馴化の三つの段階が律速要因となっていることが判明した。これらの要因は異なる遺伝子で制御されており、これらの要因をすべて満たす品種の選抜が重要である。農業上重要な形質の解析に関して、リンゴの最主要品種であるふじと千秋由来の倍加半数体との交雑を行い、実生を獲得した。現在育苗中で、今後福島県果樹研究所、農研機構果樹研究所とともに遺伝解析、ゲノム解析を行う。倍加半数体相互の交雑によるF1実生作成のための予備的試験として、遺伝的背景がそろう無配偶生殖性を示すM.hupehensisについて、多数の無配偶種子を獲得した。獲得した種子の一部について、放射線育種場でガンマ線の照射を実施した。今後は対照の無照射個体とともに播種、育苗して、開花までの年限の変化や形態的生理的変異の検出を実施する。今年度は約10万個のリンゴの葯を置床し新たに「千秋」「世界一」に由来する植物体の獲得に成功した。小胞子培養も新たに試みた。小胞子培養はDH獲得効率が葯培養の約50倍高いとされているが、リンゴに関しては1例の成功例があるだけで、技術的に不明な点が多い。そこで「千秋」の休眠枝を用いて小胞子培養実験を行い、小胞子からのカルス増殖に成功した。小胞子培養にはカルスおよび胚様体の誘導培地における小胞子密度が重要と考えられるが、休眠枝を用いた開花誘導において充実した小胞子を得るためには、加温開始からサンプリングまでが約20日で経過するように温度制御を行うことが重要と判明した。開花・結実するDHの「95P6」を用いて葯培養を行った。

DHを用いた葯培養系を確立することで、実験の再現性が確保され、遺伝子組換えやゲノム改変効率の向上が期待できる。「95P6」は「千秋」の葯培養に由来するDHであり、通常品種より胚様体形成率が高かったが、葯培養を経ていることにより胚形成能が高い個体が選抜された可能性が示された。これまでの研究によって「千秋」、「Starking Delicious」のDHを多数獲得し、圃場に馴化することに成功した。そのうち「千秋」由来の1個体が開花・結実した。リンゴで3例目の成果である。DHを交雑して育成したF1実生集団を用いて酸、果肉色、果汁褐変、Brix等のQTL解析を行ったところ従来の方法より解析精度が向上し、DHの遺伝解析用素材としての有効性が証明された。葯培養の手順の中で胚様体形成、シュート形成、増殖・馴化の各過程で個体数が大きく減少するが、DHを効率よく獲得するには、胚様体の速やかな発根誘導が重要であることを統計解析により明らかにした。DHの獲得が遺伝子型に大きく依存する理由は、上記の過程をすべてクリアできる品種・系統が少ないためであるが「千秋」、「Starking Delicious」、「世界一」はDHを獲得しやすい品種であることが判明した。葯培養によるリンゴの倍化半数体(DH)の作出では胚様体形成、胚様体からのシュート誘導、増殖・馴化の各過程が律速要因となることが判明した。効率よくDHを獲得するためには上記の過程で分化能・増殖能に優れる品種を選抜することが重要で`千秋'、`Starking Delicious'、`世界一'を好適品種として選抜した。1核前期から後期の花粉を多く含む緑蕾後期から中心花紅蕾前期の花叢を採取し、25日35日間の低温処理を行うことで胚様体形成率が高まることが明らかになった。DH個体を片親に使用した交雑実生群を用いることで遺伝解析の精度が向上した。作出したDHから開花・結実する個体が確認された。今年度は倍加半数体を獲得しやすい4品種に限定して、合計約10万個の葯を培養した。その結果、千秋、世界一、Starking Delicious由来の個体を獲得した。葯培養において個体獲得に影響を及ぼす要因の解析を行い胚様体の発根がシュート形成に最も重要であることを明らかにし、胚様体形成後速やかに低温処理、発根誘導を行うことが個体再生のポイントとなることを明らかにした。これらの研究から、倍加半数体獲得のためには、胚様態形成、シュート形成、増殖・馴化の三つの過程が律速要因となっていることを明らかにし、これらの要因が独立の遺伝的因子で制御されていることを示した。農業上重要な諸形質と遺伝子マーカーとの対応に関しては、稔性を有する倍加半数体とPrimaの交配によって作出した実生の遺伝解析を農研機構果樹研究所、福島県果樹研究所と共同して解析を実施しており、成果を国際学会で報告する。倍加半数体相互の交雑によるF1実生作成のための予備的試験として、遺伝的背景がそろう無配偶生殖性を示すM.hupehensisについては、無受粉・袋かけ処理により多数の無配偶種子を獲得し、獲得した種子の一部について、放射線育種場でガンマ線の照射を実施した。今後は播種、育苗して変異の検出を実施する。果樹園芸学倍加半数体の新たな利用方法として、倍加半数体の葯培養系および小胞子培養系を立ち上げ、小胞子の段階で変異導入を図ることで、遺伝的背景が斉一な1細胞に由来の理想的な実験系が確立できることが判明した。稔性のある倍加半数体と主要品種の交配によって獲得した実生群の解析は農業上重要な知見となることが予想されるので、リンゴの最主要品種であるふじと倍加半数体の交配による実生を獲得する必要がある。
チベット高地における高エネルギー宇宙線の研究

1995年以来、中国と共同でチベットのヤンパーチン高原(標高4,300m)の空気シャワー観測装置を用いて(拡張されて221台のシンチレーション検出器で構成)、10TeV領域の宇宙ガンマー線点源探索及び高エネルギー一次宇宙線の研究を行っている。これは10TeV領域の宇宙線の精度良く観測出来る世界で唯一の空気シャワー観測装置であり、すでに多くの重要な結果が得られている。この実験で得られたデータを用いて4×10^<14>-2×10^<16>eV領域の一次宇宙線のエネルギースペクトルを求めた。これにより、一次宇宙線のスペクトルは2×10^<15>eV近辺を境に徐々に傾斜が急になることがはっきりした。これは、高エネルギー字宙線の加速、伝播機構に強い制限を与える。また、太陽の影の位置の一年毎との時間変動を調べた。特に1990年から1993年までの太陽活動がその最大値から徐々に静かになる時期に得られた結果は、太陽活動と太陽の影の移動に強い相関が見いだされた。今後、これらの観測を継続することにより惑星間磁場について新たな情報を得ることが出来るものと期待される。これらの結果は学術雑誌に既に掲載されている。1996年の秋にはこのアレイの中央付近に高密度のアレイ(110台の検出器)と全面積が80m^2のエマルションチェンバーとバースト検出器の設置を行ない、現在観測が継続されている。前者は2-3TeV領域の宇宙ガンマー線の探索、後者はKnee領域の一次陽子成分のスペクトルの観側が主な目的である。今年の秋頃にこれらの最初の結果が得られるはずであり、高エネルギー宇宙線の加速機構の解明に重要な手掛かりを与えることができる。1990年より、中国と共同でチベットのヤンパーチン高原(標高4,300m)に空気シャワー観測装置(65台のシンチレーション検出器からなる)を設置し、10TeV領域の宇宙ガンマー線点源探索及び高エネルギー一次宇宙線の研究を行っている。これにより、一次宇宙線のスペクトルは2×10^<15>eV近辺を境に除々に傾斜が急になることがはっきりした。これは、高エネルギー宇宙線の加速、伝播機構に強い制限を与える。期間は1990年から1993年までの太陽活動がその最大値から除々に静かになる時期に相当している。結果は、太陽活動と太陽の影は強い相関を示し、将来これらの観測により惑星間磁場について新たな情報を得ることが出来ることを示している。これらの結果は学術雑誌に掲載されることになっている。昨年の秋に221台の検出器からなる空気シャワー観測装置が完成し、現在データの取得を行っている。シャワーのトリガー頻度は約200Hzであり、これによって数TeVまでの宇宙ガンマー線の探索が可能となる。また、この空気シャワー観測装置の中央部分に小規模のエマルションチェンバーとバースト検出器(面積1.6m^2)を設置し、その性能テストを行った。予定通りの結果が得られ、今年の夏に本実験(面積80m^2)に入る予定である。この実験により、いわゆるKnee領域の一次宇宙線中の陽子のエネルギー