hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
遺伝的にコード可能な超音波イメージング造影剤の開発

一部の微生物において、ガスベシクルと呼ばれる、双円錐型や紡錘体型の特徴的な構造を持つ、蛋白質ナノ粒子が、近年さまざまな生物工学的応用の面で注目されている。特に、原核生物において発現したガスベシクルが、遺伝子コード可能な超音波エコーイメージングやHyperCEST MRIにおける造影剤として機能することが先行研究により示されていたが、ほ乳類細胞における発現手法が確立しておらず、ほ乳類個体へ応用する上で、障害になっていた。コドンをほ乳類細胞での発現のために改変した光合成細菌planktothrix rubescens/agardhii由来のガスベシクル遺伝子の一部(gvpA, gvpC16, gvpC20, gvpC28)を、Tol2トランスポゾンベクターを用いて、様々な組み合わせで、細胞で発現することにより、ガスベシクル様の蛋白質ナノ粒子をほ乳類細胞内で発現し、その大きさや形を遺伝的に操作する方法を開発した。このほ乳類細胞内で発現したナノ粒子が、超音波エコーイメージングや、Xe-129 HyperCESTMRIにおける遺伝子コード可能な高感度の造影剤として機能することを細胞レベルで示した。本研究において、ほ乳類細胞におけるガスベシクル様の蛋白質ナノ粒子を発現する方法を開発したことで、遺伝子コード可能な超音波エコーイメージング、およびHyperCEST MRI造影剤が実用化可能であることを細胞レベルで示した。将来的には個体レベルで、非侵襲的なイメージング手法であるMRIや超音波エコーイメージングによって、分子細胞レベルの現象を可視化できる可能性を示す成果であり、生物医学研究における広範な応用が期待される。ほ乳類個体において「遺伝子コード可能な超音波エコー造影剤」を実現するため、光合成細菌planktothrix rubescenes/agardhii由来のヒト化したガスベシクル(GV)遺伝子をほ乳類細胞に導入し、ほ乳類細胞でGV発現について検証した。その結果GV遺伝子gvpA, gvpC16, gvpC20, gvpC28を組み合わせて導入することで、ヒト乳がん由来細胞株KPL-4において、形や大きさの分布の異なるGVが形成されることを、透過型電子顕微鏡や動的光散乱法によって証明した。以下で、これらのGV発現細胞およびガスベシクルを、導入した遺伝子の種類によりGV_AC20、GV_AC16C20などと呼ぶ。次にこれらのGVを発現した細胞サンプルに超音波を照射した時に散乱される超音波の強度を測定することで、細胞内で発現して、機能する超音波エコー造影剤としての有用性を検証した。その結果5MHzのトランスミット周波数では、GV_AC20を除く全てのGV導入細胞で、コントロールの細胞と比較して、2倍以上の散乱強度の増加を観測できた。特に、GV_AC16C20は比較的均一な大きさの分布を持ち、100nm以下と、GVとしては小さいが、超音波の散乱強度の顕著な増加を観測できた。この結果は、世界に先駆けて、ほ乳類細胞内で機能する遺伝子コードされた超音波エコー造影剤の概念を細胞レベルで実証するものであり、画期的な成果である。GVは、既存のマイクロバブルやナノバブルといった安定化気泡による超音波エコー造影剤と比較して、生体内での安定性が高く、ナノサイズで、腫瘍血管孔を透過可能であるので、腫瘍造影のための次世代超音波エコー造影剤としても期待されているが、GV_AC16C20はその有力な候補であると考えられる。これらの研究成果について理化学研究所が国際特許(PCT)出願中である。導入するヒト化ガスベシクル遺伝子の組み合わせを変えることで、ほ乳類細胞で発現するガスベシクルの大きさや形を制御するというアイデアを実証することに成功し、さらにその超音波エコー造影剤としての有用性を細胞レベルで実証することができた。また、これらの成果について特許出願も行っている。この点で、当初の想定通りに研究はおおむね順調に伸展していると言える。しかし、マウス個体にガスベシクル発現KPL-4乳がん細胞を移植した担癌マウスを用いた、ガスベシクルの造影効果の検証実験が、当初予定していた実験施設において、遺伝子組み換え動物の実験申請が困難なことにより、頓挫してしまった。現在、このガスベシクルの超音波エコー造影効果をマウス個体において検証する実験を実施可能な施設及び共同研究者を探しているところである。

本研究において、ほ乳類細胞におけるガスベシクル様の蛋白質ナノ粒子を発現する方法を開発したことで、遺伝子コード可能な超音波エコーイメージング、およびHyperCEST MRI造影剤が実用化可能であることを細胞レベルで示した。将来的には個体レベルで、非侵襲的なイメージング手法であるMRIや超音波エコーイメージングによって、分子細胞レベルの現象を可視化できる可能性を示す成果であり、生物医学研究における広範な応用が期待される。GVを発現するKPL-4乳がん細胞株を移植した担癌マウスモデルを用いて、マウス個体でGVの造影効果をさらに検証する必要がある。また、CHO細胞などの浮遊細胞株でGV安定発現株を作成し、GVを大量に生産できる細胞を作成することを計画している。この細胞を用いて、gvpCのC末端にさまざまなペプチド配列を付加することで、特定の生体分子を標的可能なGV造影剤を生産できる系を確立することを目指す。また、GVが細胞内で発現してからどの程度の時間で細胞内で分解され消化されるかや、細胞生理への影響など、GFPと同様に、遺伝子コードされた造影剤としての基本的な性質について研究することも必要であると思われる。超音波エコー測定を外部の業者に外注して行うことを計画していたが、遺伝子組み換え動物の実験申請が、予定していた実験施設において困難であるということで、実施できなかった。今後、共同研究者などを探すことで、ガスベシクルのマウス個体における造影効果について検証する実験に使用することを計画している。
医療・介護レセプト，特定健診データベースの構築とこれを用いた臨床疫学研究

それぞれ別個に存在する医療レセプト、介護レセプト、特定健診のデータを個人が紐づく形でかつ時間を追って追跡可能な横断的かつ縦断的データベースを構築する。このデータベース構築によってこれまで困難であった「地域における医療と介護の関わりを明らかにする」ことを達成する。
トウモロコシの耐湿性に寄与するテオシント染色体逆位領域の耐湿性関連遺伝子群の同定

湛水・還元耐性に寄与するテオシント染色体領域が逆位の状態で導入されているトウモロコシ自殖系統IL#18bおよびこれが由来する自殖系統Mi29において、還元処理した個体のde novo RNA-seq解析で得た189358遺伝子について、モデル系統B73のリファレンスゲノムへのマッピングを試みた。その結果、テオシントゲノムが導入されている第4染色体全体にわたり、21605個の遺伝子がマッピングされた。また、第4染色体中のテオシントゲノムに相当する領域(bin4.07bin4.11)に絞った解析では14571個の遺伝子がマッピングされた。当初、遺伝子配列のマッピング深度は、テオシントゲノムに相当する領域で低くなることが予想されたが、大きな差が認められなかったので、テオシントゲノムとトウモロコシゲノムの境界を特定するため、自殖系統IL#18bのゲノムのショートリード配列をリファレンスゲノムにマッピングした。解析の結果、第4染色体のマッピング深度は他の染色体よりやや低かったものの、本解析でもテオシントゲノムに相当する領域でマッピング深度が低くなる傾向は認められなかった。そこでさらに、リファレンスゲノムに対して5塩基以上の変異(挿入、欠失、置換)を持つ断片の頻度を1メガ塩基毎にまとめてヒストグラムを作成したところ、変異が多く認められる領域が長腕内で検出された。当該領域は当初予想されたbin4.07付近を起点としていることから、テオシントゲノムに相当する領域であることが示唆された。de novoRNA seq解析で得たORF配列情報とリファレンスゲノムの配列を比較し、変異の有無によってフィルタリングする(変異の多い断片を除く)ことで、トウモロコシに導入されているテオシントゲノムの物理的領域を明らかにすることに成功した。当初の計画では耐湿性と関連の深い遺伝子について、塩基配列をもとにDNAマーカーを作成し、テオシント由来染色体逆位領域との遺伝的位置関係を解析する予定であったが、本成果で得られた目的領域の物理的情報は、本研究の目的「テオシントゲノムがトウモロコシ自殖系統にもたらす耐湿性のメカニズム解明」において、遺伝的情報に代わる重要なものであり、本年度の研究はおおむね順調に進展していると言える。ロングリードの情報が得られる次世代シーケンサーを用いて自殖系統IL#18bのゲノムを解析し、テオシントゲノムに相当する領域の構造解析を行うとともに、同ゲノム領域の塩基配列から湿害応答遺伝子の情報を抽出する。湿害応答遺伝子について、他のモデル植物のゲノム配列、EST配列あるいは遺伝子共発現解析に関する公開データベースを照会し、テオシントゲノムに由来する耐湿性に関連すると思われる遺伝子を推定する。湛水・還元耐性に寄与するテオシント染色体領域を逆位の状態で導入されているトウモロコシ自殖系統IL#18bおよびこれが由来する自殖系統Mi29に対し、還元処理を施した。処理後、処理区と未処理区の各系統の根からRNAを抽出し、シーケンスライブラリーを作製した。シーケンスライブラリーから次世代シーケンサー(HiSeq)により塩基配列を取得し、各系統につき530万665万個の塩基配列フラグメントを得た。フラグメント情報を用いてde novoRNA seq解析を実施した結果、約19万のコンティグが構築され、そのうち約6万8千個がORFと推定された。これらORF配列についてblast検索を行うとともに、リード数から遺伝子発現量を求め、遺伝子オントロジーによるカテゴリー分類を行った。さらに、系統間および処理区間で発現量に差があると思われる遺伝子を確認した結果、還元ストレス処理により、各系統につき400500個の遺伝子において発現量に1000倍以上の差があると推定された。次世代シーケンシングにより取得した塩基配列情報をもとにde novoRNA seq解析を実施してORF配列を取得することに成功した。また、ORFの推定発現量から還元ストレスに応答する遺伝子の情報を抽出する作業が完了したことから、本年度の研究はおおむね順調に進展している。de novo

RNA seq解析で得たORF配列情報とリファレンスゲノムの配列を比較し、変異の有無によってフィルタリングする(変異の多い断片を除く)ことで、トウモロコシに導入されているテオシントゲノムの物理的領域を明らかにすることに成功した。当初の計画では耐湿性と関連の深い遺伝子について、塩基配列をもとにDNAマーカーを作成し、テオシント由来染色体逆位領域との遺伝的位置関係を解析する予定であったが、本成果で得られた目的領域の物理的情報は、本研究の目的「テオシントゲノムがトウモロコシ自殖系統にもたらす耐湿性のメカニズム解明」において、遺伝的情報に代わる重要なものであり、本年度の研究はおおむね順調に進展していると言える。湿害応答遺伝子について、他のモデル植物のゲノム配列、EST配列あるいは遺伝子共発現解析に関する公開データベースを照会して耐湿性に関連すると思われる遺伝子をさらに絞り込む。耐湿性とより関連の深い遺伝子について、塩基配列をもとにDNAマーカーを作成し、テオシント由来染色体逆位領域との遺伝的位置関係を解析する。具体的には、テオシント由来の当該ゲノム領域を持つ自殖系統IL#18b等と交配して得たF1系統を自殖してF2集団を作製し、連鎖解析に用いる。当該領域の染色体上の位置はbin4.07-4.08とされているので(Mol Breed 29:137-146.)、その周辺にあるSSRマーカー情報をMaizeGDB(http://www.maizegdb.org/ssr.php)より入手し、それらとDNAマーカー化した耐湿性関連遺伝子との連鎖地図上の位置関係を解析し、遺伝的に連鎖する遺伝子を特定する。ロングリードの情報が得られる次世代シーケンサーを用いて自殖系統IL#18bのゲノムを解析し、テオシントゲノムに相当する領域の構造解析を行うとともに、同ゲノム領域の塩基配列から湿害応答遺伝子の情報を抽出する。湿害応答遺伝子について、他のモデル植物のゲノム配列、EST配列あるいは遺伝子共発現解析に関する公開データベースを照会し、テオシントゲノムに由来する耐湿性に関連すると思われる遺伝子を推定する。(理由)手持ちの研究資源を有効に使い、研究費を効率的に使用した結果生じたものであり、次年度に請求する研究費と合わせて研究計画遂行のために使用する。(使用計画)本研究課題推進のため、次年度の研究費は、物品費、旅費、謝金(英文校閲)、プライマー合成に使用する。(使用計画)本研究課題推進のため、次年度の研究費は、物品費、旅費、謝金(英文校閲)、受託解析サービス等に使用する。
演算の自在な組合せにより試行錯誤的探索を支援するスプレッドシート環境の開発

スプレッドシート環境を使うことによって、一般のユーザでも自分なりのアプリケーションを作成し、それらのアプリケーションへ入力された値を変えることによる結果の変化を探索することが可能である。しかし、通常のスプレッドシートが支援する探索では、セルの値を変化させることによる結果の比較は可能であるが、セル間の式を変更することによる結果の探索が難しい。このプロジェクトでは、拡張されたスプレッドシートモデルと適当なインタフェースを開発することによって、ユーザがシートの演算構造をもセルの値と同様に変えることを可能にし、このモデルに基づいた環境を実装した。また、本研究室で開発された、ウェブアプリケーションが提供する処理をスプレッドシートの式として使えるようにする技術を同じ環境に導入して組み合わせた。実装された環境の応用例を一つあげる。バイオインフォマティクス研究者がこの環境を使用した場合、あるウェブサイトで提供されるアミノ酸配列検索サービスや他サイトで提供される系統樹作成サービスを一つのシートに導入して接続することが可能である。検索サービスが提供する配列群がセルに表示され、その中のどれが次のサービスへ送られるかを研究者の自由な選択で決定することが可能である。これと同様に、系統樹を作る様々なサービスもセルでリストアップされることによりサービスも自由に選択可能である。様々な配列群で得られた結果も、様々な分析サービスで得られる結果も自在に探索して比較できる。このような探索支援機能は様々な分野で幅広く応用可能であると思われる。このプロジェクトの主な目的は、拡張されたスプレッドシートモデルと適当なインタフェースを開発することにより、一般のユーザがシートの演算構造もセルの値と同様に変えることを可能にし、異なった演算結果の検索や比較を支援することである。1.スプレッドシートのプログラミングモデルの拡張(1).セル間の式によってできた依存関係を表すオブジェクトを調理法の比喩を使ってRecipeと名づけ、Recipeの属性、関数、組み合わせ方などを決めた(2).演算がRecipeで定義されているスプレッドシート環境(RecipeSheet)のデザインとプロトタイプを開発した(3).RecipeSheetの定義と編集を支援するユーザインタフェース技術のデザインとプロトタイプを開発した2.複数のシナリオを制御するためのインタフェース技術のデザインと評価(1).以前研究開発してきたSubjunctive Interfaceの概念に基づき、上記でのスプレッドシートモデルを使って異なるシナリオを探索するための技術のデザインとプロトタイプを開発した(2).本研究科にいるバイオインフォマティクス研究者や海外でE-learningに取り組んでいる研究者の協力を得て、RecipeSheetの応用例を作成し、複数のシナリオを同時に制御できることを確認した(3).一般のユーザに対してRecipeSheetの使いやすさの評価を得るための実験を計画した[研究協力者]上述の成果を得るにあたり、コペンハーゲン大学コンピュータサイエンス学部のKasper Hornbaek助教授を一度招聘し、コペンハーゲン大学を訪問した。
植物フェリチンを基盤とした新規金属蓄積分子の創出

新規カルシウム結合蛋白質の遺伝子をクローニングし、その特性解析を行った。更に詳細なカルシウム貯蔵機構を明らかにするため、本蛋白質の立体構造解析を分解能1. 6Åで解析し、現在カルシウム貯蔵機構の検討中である。また、海産多細胞緑藻であるアオサフェリチンのX線結晶構造解析による立体構造解析に成功し、植物フェリチン特有のドメインであるエクステンションペプチド領域がフェリチン多量体の安定性と鉄貯蔵、放出機構に関わっていることを明らかにした。平成22年度は、まず植物フェリチン(ダイズ由来)の立体構造解析を行い、フェリチンにおける鉄貯蔵機構を解析した。その結果、植物フェリチンにおける鉄の取り込みチャネルから鉄酸化部位に至る鉄の移動経路を明らかにした。この経路を構成するアミノ酸残基群(Transit site)は、植物のみならず、脊椎動物のフェリチンにおいても保存されていたことから、動物フェリチンにおいてもこの鉄輸送経路が機能している可能性が考えられた。この仮説を明らかとする為、代表的な動物フェリチンであるヒトH鎖フェリチンおよび、そのTransit site変異体を大腸菌発現系により調製し、X線結晶構造解析による立体構造解析と鉄取り込みに関する反応速度解析を行った。その結果、植物で明らかにしたTransit siteを介したフェリチンにおける鉄取り込み経路は、動物フェリチン(ヒトH鎖)においても共通していることが明らかとなった。これらの成果により、現在まで不明な点が多かったフェリチンにおける金属取り込み機構のうち、鉄取り込みチャネルから鉄酸化部位への移動経路が明らかとなり、この移動経路は生物種を超えて共通している可能性が示唆された。また、鉄以外の希少金属を高度に集積する分子を創出するため、植物フェリチンのN-末端及びC-末端に対する金属特異的ペプチドの導入を行った。その結果、改変型植物フェリチンは、レアメタルの一つであるニッケルを天然型と比較して有意に多く蓄積することが確認された。現在、蓄積金属分子の定量的な解析、反応機構の解析を進めている。本年度は、新規金属蓄積蛋白質として、ザクロ由来クラスIIIキチナーゼを同定した。本蛋白質は、一分子に約10から20個のカルシウムイオンを結合する性質があり、種子中においてカルシウム貯蔵蛋白質として機能していた。報告者は、当該蛋白質の遺伝子をクローニングし、その特性解析を行い、カルシウム貯蔵様式を提案した(Yang H.et al, Plant J.2011, 68, 765-776)。更に詳細なカルシウム貯蔵機構を明らかにするため、本蛋白質の結晶化を試み、X線結晶構造解析による立体構造解析を目指した。結果として、分解能1.6Åで構造解析に成功し、現在立体構造の情報を基礎としたカルシウム貯蔵機構の解明を行っている。また、高等植物から進化的に大きく隔たった、海産多細胞緑藻であるアナアオサにおいて、フェリチンが金属の安定な貯蔵に大きく寄与していることを明らかにした(投稿準備中)。この中で、アオサに存在するフェリチンは、高等植物由来のものに類似しており、ヒト由来のフェリチンよりも鉄貯蔵活性が高いことを示した。更に、このアオサフェリチンのX線結晶構造解析による立体構造解析に成功し、植物フェリチン特有のドメインであるエクステンションペプチド領域がフェリチン多量体の安定性と鉄貯蔵、放出機構に関わっていることを明らかにした(Masuda T.et al.Protein Sci.2012, in press)。新規金属貯蔵蛋白質の設計に関し、植物由来のフェリチンのN,C-末端に金属特異的ペプチドを付加した変異体を作製した。この変異体は、天然型植物フェリチン蛋白質と比較して、ターゲットとした金属元素の蓄積量が約5倍増大し、本研究の目的である、金属特異性の改変を達成したと考えられる(投稿準備中)。
光干渉断層画像診断法による象牙質接合界面のクオリティ評価

コンポジットレジン復物の予後を支える重要なものとして,歯質接着システムの存在が挙げられる。しかし,その長期接着耐久性に関しては,必ずしも安定したものではなく,象牙質基質から放出されるMatrix Metalloproteinaseなどによって劣化する可能性が指摘されている。したがって,接着システムの予後を考えるうえで,象牙質接着界面の質を判定する手法の確立が必要と考えられる。そこで,象牙質接合界面におけるクオリティーを光干渉断層画像診断法および超音波透過法で評価し,これによって欠陥の生じにくい接合界面を形成する修復システムを確立する一助とする。コンポジットレジンの象牙質への接着は,歯面処理された歯質表面にレジン成分が浸透効果することによって獲得される。これに,機能性モノマーの有する化学的反応性が加味されることでさらに強固な接着性を得ることができる。しかし,コンポジットレジンの重合硬化に伴って生じる収縮挙動によって,象牙質接着界面に何らかのひずみを生じる可能性があるものの,その詳細については明らかにされていない。そこで,歯質接着界面におけるクオリティーを評価することを目的として,光干渉断層画像法(以後OCT)を用いて検討した。さらに,超音波透過法を用いることによって,その考察材料とした。実験には,ウシ抜去下顎前歯の唇側象牙質をブロックとして切り出し,耐水性シリコンカーバイドペーパーの#2000まで順次研磨した後,超音波洗浄したものを用いた。これらの試片を,pH4.75に調整した乳酸緩衝脱灰液2mlに10分間浸漬した後,人工唾液中に保管した。なお,この脱灰サイクルは,実験期間を通じて一日2回繰り返した。これらの試片について,超音波送受信装置を用いるとともに,SLD光源から照射された光線が,対象物の内部に入射し,反射あるいは散乱する様相を光学干渉計によって捉えるもので,測定対象の内部構造を光干渉強度と内部位置情報から,精密断層像を得るOCTによって歯質における変化を詳細に分析した。その結果,歯質に生じる脱灰を抑制するとともに,再石灰化を促進する効果が期待できることが示唆された。これは,歯質と象牙質との接合界面における接着層の改善にも寄与するものと考えられた。被着対象である象牙質に関しては,口腔内で様々な変化を受けている。とくに,飲食物由来の酸による影響に関しては近年注目されており,これによって構造的にあるいは科学的に変化した象牙質へのコンポジットレジンの接着性について検討が必要である。しかし,チェアサイドにおいてこのような基質的変化を定量的に評価し,介入の指標となり得る診断法は未だ確立されていないのが現状である。そこで,歯質における脱灰抑制および再石灰化傾向を,1310 nmおよび840 nmの波長を有するOCTを用いて検討した。実験には,ウシ抜去下顎前歯の唇側エナメル質をブロックとして切り出し,耐水性シリコンカーバイドペーパー2000番まで順次研磨したものを用いた。その後,ここに示す人工唾液中に保管した。人工初期齲蝕モデルの製作は,試表面に8%メチルセルロースとpH4.6の乳酸を注入し作成した。脱灰の状況は超音波透過法による縦波音速の系時的変化を測定することで評価した。さらに試片表層の脱灰状況の観察には走査型レーザ顕微鏡を用いた。その結果,人工初期齲蝕作成前をベースラインとした健全歯のOTDRの波形と,人工初期齲蝕病巣から得られたOTDRの波形比較すると,ベースラインではその値は約-56dBであった。一方,人工初期齲蝕病巣では約-65dBであった。このことは,脱灰によって変化した歯質の構造は,深さ方向へ進展していることを裏付けるものと考えられた。今後,接着材を用いてこの歯質との接着界面の変化を検討する予定である。実験条件の設定が終了し,OCTを用いた観察とともにこれを確認するための超音波測定装置を用いた検証を進めている。すなわち,脱灰によって歯質に生じている変化を,OCTおよび超音波透過法によってとらえることができた。今後,機能性モノマーを適用することによって,その種類が酸で影響を受けた歯質に同能な相互作用を生じるかについて検討を加えることへの準備が整った。歯質接着性レジンの象牙質接着機構において,ハイブリッド層の形成が重要であり,その形態的ならびに機能的検討は現在も国内外で積極的に続けられている。最近では,歯質接着性レジンシステムの長期耐久性を低下させる因子として,象牙質基質あるいは口腔内から放出されるMMPがハイブリッド層に及ぼす影響について検討されている(Mazzoni A et al. J Dent Res 2015;94:241-251.)。すなわち,口腔内のバクテリアや唾液中の消化酵素などがレジンと象牙質との接合界面付近のコラーゲン線維に加水分解をもたらし接着構造を崩壊させるというものである。そこで,MMP inhibitorであるクロルヘキシジンなどを用いて,生じうる劣化を未然に防ぐことが考えられている。しかし,MMP inhibitorの効果は一時的なものであり,象牙質接合界面における劣化は恒常的に防げるものではない。したがって,単にMMP inhibitorを応用することだけではなく,歯質を強化することが接着耐久性を根本的に改善するための臨床的手法となるものと考えられる。

そこで,生物学的機能性(バイオアクティブ)を有するPre-reacted Glass-ionomer Fillerに着目し,このフィラーから象牙細管への石灰化物の沈着を誘発する作用を持つとされる様々なイオンが徐放されることを報告した。そこで,次の研究の段階として,再石灰化に最も有効であるとともに修復材に応用可能なイオン種を特定し,接着界面の劣化部が再石灰化によって修復されるかを的確に判定するモダリティーを確立した。コンポジットレジン復物の予後を支える重要なものとして,歯質接着システムの存在が挙げられる。しかし,その長期接着耐久性に関しては,必ずしも安定したものではなく,象牙質基質から放出されるMatrix Metalloproteinaseなどによって劣化する可能性が指摘されている。したがって,接着システムの予後を考えるうえで,象牙質接着界面の質を判定する手法の確立が必要と考えられる。そこで,象牙質接合界面におけるクオリティーを光干渉断層画像診断法および超音波透過法で評価し,これによって欠陥の生じにくい接合界面を形成する修復システムを確立する一助とする。これまで,OCTを用いて歯質の乾燥状態について検討を行うとともに,A-scanモードを用いてその差について比較する手法を確立した。その手法を用いることにとって,象牙質表面に生じた脱灰現象をとらえることが可能であることが示された。象牙質への接着機構も,歯質の脱灰とその部へのレジン成分の浸透によるところが大きいところから,今後その状態変化について検討を進めることができると考えている。脱灰の様相を種々に異なるものとした試片に対するコンポジットレジンの接着性について,接着強さ試験とともに接合界面付近での変化をOCTを用いることで検討を加える。試片にはウシの歯を用い,これまでの脱灰条件をいくつかの段階に変更し,脱灰状態をOCTを用いて確認するとともにこれにコンポジットレジンを接着させる。その後,接合界面について再びOCTを用いて観察することによって,接着界面の質的な評価を行う。保存修復学測定機器の精度,調整ならびに測定方法がほぼ確立された。この初年度の結果を踏まえ,OCTと超音波透過法の成績との比較,検討を行うことでOCTを用いた接合界面のクオリティー評価を確立する。超音波透過法は,広く工業界あるいは医学領域でも使用されており,これによって象牙質接合界面における超音波特性を非破壊的に測定するものである。この手法を用いて歯質表面処理法の違いの影響を検討する。さらに,歯面処理の違いによるレジンモノマー浸透性の違いを含めた検討を行う予定である。実験に使用する材料を予定よりも安価で購入することができたところから出費が抑制され,そのためにわずかであるが残金が生じた。年度末に研究打ち合わせのための出張を予定していたものの,これを中止にしたために,その旅費分の経費が繰り越しとなった。実験計画に則り,ウシ抜去歯の購入とともに歯質接着材料について,歯面処理法が異なる製品をできるだけ多品目購入する。これによって,歯質接着システムごとに異なるであろう接着界面の質の評価を行うことができる。また,OCT測定ならびに超音波装置に使用する各種消耗品の購入費にこれをあてる。また,最終年度にあたるところから,国内学会における成果発表を精力的に行う予定である。金額的には多くはないものの,これらを実験材料の購入に充てる。
フェレット緑内障モデルを用いた視覚中枢神経障害の解析

i)免疫組織学的に外側膝状体での神経細胞やグリア系細胞の障害の程度を定量的に評価する。さらに、ii)外側膝状体の層構造のそれぞれの層の障害差を検討することで、X、Y、W cellの障害の時間的、空間的な障害差を検討する。iii)視皮質における高眼圧の影響を、神経細胞やグリア系細胞に狙いを絞り組織学的に定量評価を行う。iv)解明できたメカニズムをもとに、薬剤による神経保護が外側膝状体、視皮質で有効か検討するi)免疫組織学的に外側膝状体での神経細胞やグリア系細胞の障害の程度を定量的に評価する。iv)解明できたメカニズムをもとに、薬剤による神経保護が外側膝状体、視皮質で有効か検討する
顆粒膜細胞におけるプラスミノーゲン・アクチベータ-及びインヒビター産生とその役割

排卵過程において、プラスミノーゲン・アクチベータ-やカリクレインといったセリンプロテアーゼが重要な役割を果たしているが、その産生・調節機序については未だ不明である。我々は現在までにPMSG/hCGによる排卵誘発未熟ラットモデルを用いて、これらの酵素活性が排卵過程にともない著増し、インドメサシンやエポスタンといった作用機序の異なる薬剤で排卵を抑制した場合に異なる抑制パターンをとることから、異なった機序によってその産生・調節が行なわれていることを報告した。さらに最近、ラット顆粒膜細胞培養系を用いて、顆粒膜細胞が性ステロイドのみならずプロスタグランジンさらにはリポキシゲナーゼ代謝産物を産生することを見いだしている。また、ラット顆粒膜細胞培養系において、FSH/LHを添加するとプラスミノーゲン・アクチベータ-(PA)抗原量およびそのインヒビター(PAI)抗原量が増加することを見いだしている。しかし、その詳細および調節機序についてはさらに検討中である。さらに、ヒト体外受精の際に得られる卵胞液中のPAおよびPAIの測定を行い、卵・卵胞成熟の指標としての有用性に関して検討を加えている。卵胞液中のtPA抗原量は末梢血中と同レベルであるが、PAI-1抗原量は末梢血中よりかなり高く、卵胞内での産生が考えられる。現在、妊娠群と非妊娠群間で差があるかどうか検討中であるが、ヒト卵胞液を研究材料としているため、短期間にデータを集積し解析するには十分ではない。
腎炎におけるスリット膜関連分子群とユビキチン・プロテアソーム蛋白分解経路の関与

ラットPuromycin aminonucleoside(PAN)腎症モデルを用いたスリット膜構成分子の検討ヒト微小変化群の動物モデルであるPAN腎症の単離糸球体・腎組織切片を用いて免疫組織染色、ウエスタンブロット、リアルタイムRT-PCRによりスリット膜構成分子の蛋白レベルおよびmRNA発現を正常ラットと比較検討した。スリット膜構成分子の一つであるPodocin蛋白はPAN腎症発症後、徐々に減少しており蛋白尿発症以前に蛋白レベルはすでに減少していることがウエスタンブロットにより確認された。また免疫組織染色上、ZO(Zona Occludence protein)-1蛋白は正常およびPAN腎症糸球体において係蹄壁に線状に染色されたが、Podocin蛋白はPAN腎症において係蹄壁に顆粒状に染色された。それに対して定量的RT-PCRによるPodocin mRNA発現量は正常ラットに比較しPAN腎症において不変一むしろ増加していた。PAN腎症糸球体におけるPodocin蛋白の分解機構の解析上記結果をふまえて、まずはPodocinに注目しPAN腎症の単離糸球体抽出液において内因性Podocin蛋白の分解活性を正常ラット単離糸球体抽出液と比較検討した。正常ラット単離糸球体抽出液では6時間チェイスしてもPodocin蛋白レベルは不変であったのに対して、PAN腎症単離糸球体抽出液中では時間経過とともにPodocin蛋白レベルは減少傾向を認めた。さらにPAN腎症単離糸球体抽出液中にプロテアソーム阻害材であるMG132を加えてチェイスするとPodocin蛋白の減少は抑制された。この結果から、PAN腎症におけるPodocin蛋白の減少はプロテアソーム依存性の蛋白分解であることが示唆された。現在、ヒト巣状糸球体硬化症の動物モデルであるラットAdriamycin(ADR)腎症を用いて同様な現象がおきているのかを検討しているところである。1.ラットpuromycin aminonucleoside(PAN)腎症モデルを用いたスリット膜構成分子の解析ヒト微小変化群の動物モデルであるPAN腎症の単離糸球体・腎組織切片を用いて免疫組織染色、ウエスタンブロット、リアルタイムRT-PCRにより各種スリット膜構成分子の蛋白およびmRNA発現を調べており、現在のところスリット膜構成分子の一つであるpodocin蛋白が減少し、その局在が変化することが判明した。2.PAN腎症糸球体におけるスリット膜構成分子の分解機構の解析最近、PAN腎症モデルにてスリット膜構成分子の一つであるpodocinが、その蛋白レベルは減少するが、mRNA発現は不変であることが報告されている(Kawachi H, JAm Soc Nephrol13:46-56, 2003)。そこでpodocinに関して、PAN腎症の単離糸球体において、パルスチェイス実験によるpodocin分解の亢進を解析する。さらに、同モデルを用いて、抗podocin抗体免疫沈降+抗ユビキチン抗体ウエスタンブロットによりpodocinのユビキチン化を解析し、PAN腎症糸球体におけるpodocinユビキチン化活性亢進の有無を調べる。また一方で、リコンビナントpodocin蛋白を用いて、経時的に採取したPAN腎症糸球体の蛋白抽出液がユビキチン、ATP存在下でpodocin蛋白をユビキチン化する活性についてコントロールラット腎の蛋白抽出液との比較を加in vitroの系を用いて、今後検討していく予定である。
レセプトで評価した受診状況による健診データ改善効果および中長期的医療費の低減予測

職域コホートにおいて、1循環器疾患リスク因子とその後の医療費の関連、2外来受診状況と循環器疾患リスク因子改善の関連を検討した。本対象集団では、血圧水準が高いほどその後の外来医療費が高額であった。しかしながら、stage2高血圧者の外来医療費増加分も年間数万円に留まり、降圧治療は不十分である可能性が示唆された。そこで、高血圧者における外来受診頻度と9年後の目標血圧未達成の関連を検討したところ、月1回程度外来受診群に比べ、殆ど外来を受診しない群ではコントロール不良者が約3倍であることが示された。糖尿病についても、外来受診と1年後健診で評価したHbA1c低下者割合に正の関連が示された。本研究は、職域集団において健診データとレセプトデータを突合し、1循環器疾患リスクの保有や重積と医療費の関連を前向きに検討すること、2適切な外来通院や調剤内容がその後の生活習慣病コントロールや入院医療費の抑制に寄与するかを検討すること、の2点を目的としている。初年度である平成25年度は、ベースラインから9年分の健診データと医療費データの突合データベース約8500人分を整えた上で、上記1を進めた。具体的には、中性脂肪と高血圧発症、中性脂肪と糖尿病発症、血圧水準と医療費、循環器疾患リスク数と医療費、外来受診頻度と医療費、健康的な生活習慣と高血圧発症の関連等について検討を行い、関連学会で順次公表した(一部準備中)。このうち中心的課題であった外来受診頻度と医療費の関連については、ベースライン健診で高血圧(収縮時血圧140mmHg以上または拡張期血圧90 mmHg以上または降圧剤治療中)を認めて8年後の健診を受診した者において、ほとんど外来を受診しなかった群と比べ、月1回程度の頻度で外来を受診していた群では8年後に目標血圧を達成した者が約2倍であること、月2回程度の受診群では約3倍であること、即ち、外来受診頻度が多い群において血圧コントロールが良好であることが示された。そこで、来年度以降は外来受診の内容分析を加えるためにデータベースの拡充を行い、適切な外来受診や調剤内容とその後の疾病コントロール状況の関連研究(前述の2)に進む予定である。2年目であるH26年度は、1フィールド健康保険組合の協力のもとにデータを拡充すること、2レセプト情報を、「診療内容の分析評価ができる匿名化データ」として提供してもらうシステムを整えること、が中心課題であった。1については、H26年9月時点で、2004年2013年の診療区分別診療日数・医療費データを整えることができた。2については、H27年1月に、2010年以降のレセプトデータから、病名をはじめ検査内容・処方薬・処方日数等のレセプト内容を解析課題別に適宜ダウンロード可能なシステムが整えられた。なお、いずれのデータも提供前に健康保険組合内で匿名化され、健康診断データと突合される仕組みとなった。平行して、H25年までに整えたデータベースの検討を進め、健康習慣と生活習慣病・医療費の関連について解析を進めた。まず、ベースラインにおけるブレスローの7つの生活習慣数と9年後の高血圧との関連については、健康習慣の実施項目数が6-7個の者では9年後の高血圧者割合が23.4%であったのに対して、健康習慣の実施項目が少ないほど高血圧となった者が多く、実施項目が0-1個と少ない群では45.0%で、高血圧となるオッズ比が約3倍となることが示された。また、喫煙習慣については、喫煙有無別に循環器リスク集積と外来医療費(調整幾何平均)の関連を共分散分析により検討し、全体として喫煙者は非喫煙者に比べ外来医療費が低額であること(喫煙者:40,255円/年,非喫煙者44,712円/年, p=.013)、リスク個数別の分析では、循環器疾患リスク因子が3個以上ある群において有意差はないものの金額差が大きく(喫煙者93,153円/年,非喫煙者122,272円/年,p=0.124)、喫煙者の受診行動が不十分である可能性が示唆された。3年目である平成27年度は、生活習慣病についての外来受診状況と、その後の疾病コントロール良否の関連を検討することが課題であった。高血圧については、「高血圧治療を目的とする3年間の外来受診状況」をレセプトにおける降圧剤処方データから評価した。その結果、本対象集団においては、3年間の降圧剤処方間隔別が長い群では、降圧目標未達成(140/90mmHg以上)のオッズ比が約4倍であることが示された。今回の結果は、国外の病院ベースの報告や、我々の先行研究の結果とも矛盾しなかった。処方間隔が長い群では、服薬コンプライアンスが悪かったり、生活習慣是正が不十分であったりした可能性が考えられる。また、糖尿病有所見者では、1年間に1度も糖尿病の外来受診がなかった者に比べ、年に7日以上外来を受診していた群において、1年後健診でHbA1cが1%以上低下者の割合が約3倍であることが示された。HbA1cの下がりやすさはベースラインの数値により異なると考えられるが、糖尿病コントロールを改善するためには、隔月よりも頻繁な受診が必要である可能性が示唆されたと考える。なお、前年度までに学会発表を行っていた課題2本について、国際誌のアクセプトを得た。

更に、研究成果を還元する目的で、血圧管理についての小冊子を作成しフィールド対象者に配布した。レセプトデータをもとに受診状況を評価し、生活習慣病のコントロールについて2題の学会発表を行うことができた。また、前年度までに学会発表していた課題については、国際誌からアクセプトを得ることができた。本研究では、壮年期職域コホートにおいて健診データとレセプトデータの突合データベースを構築し、【研究1】高血圧や糖尿病などの循環器疾患リスク因子および保健介入と、その後の医療費の関連等を前向きに検討すること、【研究2】レセプト情報をもとに評価した「適切な外来受診」が生活習慣病コントロールの改善につながるかを検討することの2つを目的とした。基礎解析として行ったベースライン中性脂肪とその後の糖尿病発症の関連検討では、中性脂肪高値群において糖尿病発症が多いことが示された。高血圧と医療費の関連では、血圧が高いほど医療費が有意に高額であることが示された一方で、医療費の増加額は年平均数千円にとどまり、血圧コントロールのための受療の不足が示唆された。また、喫煙習慣と医療費の関連では、喫煙者では循環器疾患リスクの集積がありながら受療行動が不十分である可能性が示唆された。これらを受けて、外来受診行動とその後の循環器疾患リスク管理の検討を進めた。まず高血圧者では、受診頻度が少ないと9年後の血圧コントロールが不良であること、更に、糖尿病有所見者でも、受診頻度が少ないと1年後にHbA1cが1%低下する者が少ないことが示された。最終年度であるH28年度は、職域における保健指導対象者選定に資するために、睡眠時間が糖尿病発症に与える影響について検討を加え、睡眠時間と糖尿病発症の関連は肥満度によって異なり、肥満者では短時間睡眠が糖尿病発症のリスクとなることが示唆された。本申請課題では、受療行動を中長期的に追跡可能な職域データベースを構築することができ、一連の解析を通じて、循環器疾患発症予防のためには中性脂肪の管理や睡眠時間の確保等が重要であること、職域の保健指導では肥満有無や喫煙習慣等を考慮する必要があること、循環器疾患コントロールのためには壮年期からの適切な外来受診が重要であること等が示唆された。職域コホートにおいて、1循環器疾患リスク因子とその後の医療費の関連、2外来受診状況と循環器疾患リスク因子改善の関連を検討した。本対象集団では、血圧水準が高いほどその後の外来医療費が高額であった。しかしながら、stage2高血圧者の外来医療費増加分も年間数万円に留まり、降圧治療は不十分である可能性が示唆された。そこで、高血圧者における外来受診頻度と9年後の目標血圧未達成の関連を検討したところ、月1回程度外来受診群に比べ、殆ど外来を受診しない群ではコントロール不良者が約3倍であることが示された。糖尿病についても、外来受診と1年後健診で評価したHbA1c低下者割合に正の関連が示された。交付申請時の計画にもとづき、H26年度中に「診療内容の分析評価ができる匿名化データとしてレセプト情報の提供を受けられるシステムを整える」ことができた。また、そのシステムを利用して、まずは高血圧治療中者をレセプト情報からリストアップし、降圧剤処方間隔とその後の血圧コントロール状況の関連を検討できるデータベースを整えた。すなわち、最終年度に向けて、解析課題に即して順次データを整えられる環境がとなった。平行して、H25年度までに整えたデータを利用し、生活習慣とその後の高血圧、医療費について2題の学会報告を行なった。平成28年度に成果発表を行った内容について、より広く公表するため、追加解析を加えた上で、国際誌への論文投稿を行う予定である。
ナノスタック超伝導接合系における集団電荷励起の研究

超伝導体と絶縁体がナノスケールで交互に積み重なった構造(ナノスタック超伝導接合)を持つ高温超伝導体の固有ジョセフソン接合における複雑な位相ダイナミクスを解明するために、Bi系及びLa系高温超伝導体のナノスタック接合素子を作製する技術を開発した。この二つの物質系で大きく異なる接合間相互作用の違いがナノスタック接合素子の位相ダイナミクスに強く影響することを見出した。さらに、接合間相互作用効果の検証にスイッチング電流分布測定が有効なことを見出した。Bi系の高温超伝導体単結晶を作製し、集束化イオンビーム装置を用いた微小ナノスタック構造の作製に着手した。液体ヘリウム温度で電流-電圧特性を測定し、加工したナノスタック構造が固有ジョセフソン効果を示すことを確認した。さらに、電流-電圧特性に見られるゼロ電圧状態から有限電圧状態へのスイッチング電流確率分布の測定から巨視的量子トンネル状態を観測し、マイクロ波照射実験によって離散化した量子準位形成の観測に成功した。次に、固有ジョセフソン接合におけるジョセフソンプラズマ共鳴(JPR)の観測に向けてボロメーター法によるマイクロ波吸収装置を設計し、電磁界解析シミュレーターを用いて、金属探針によってマイクロ波電場が局所的に集中する効果を検証した。また、デジタル・ロックインアンプを購入して測定系を構築した。現在、低温下でマイクロ波吸収測定を行うための実験装置を作製中である。固有ジョセフソン接合における接合間の相互作用の強さを物質パラメーターの違いから調べることを目的に、Bi系以外のLa系高温超伝導薄膜を集束化イオンビームで微細加工する試みも行い、パルスレーザー法で作られる薄膜試料では粒径サイズに制限されるため、Bi系で観測されるような電流-電圧特性が得られないことを実験的に検証した。現在、粒径サイズに制限されない単結晶試料を用いた実験を行うため、単結晶試料の微細加工に着手した。次年度は、マイクロ波吸収実験を行うと共に、Bi系とLa系の両方でナノスタック構造を作製し、ジョセフソン接合間の相互作用の強さを評価していく予定である。ボロメトリック検出法によるマイクロ波吸収測定から、ナノスタック超伝導接合の集団的な電荷励起であるジョセフソンプラズマ共鳴(JPR)の直接観測を目指したが、現在の照射方法では微小ナノスタック部からのJPRとバルク結晶部からのJPRを区別するのは非常に困難であることが判明した。今後、金属探針部の設計からやり直し、さらなる高感度化を図っていく必要がある。一方、前年度に成功した集束化イオンビーム(FIB)法によるナノスタック接合の作製技術を駆使しながら、Bi系とLa系のナノスタック超伝導接合に対する電流電圧測定およびスイッチング電流分布測定を系統的に実施した。その結果、物質系によって異なると予想される接合間相互作用の違いに起因した位相ダイナミクスの違いを見出した。さらに、Bi系ナノスタック接合においてゼロボルト状態からの最初のスイッチング過程と2番目のスイッチング過程でスイッチング電流分布の温度依存性が異なることを見出した。マイクロ波照射効果やパルス電流幅依存性などからこの振舞いを検証し、接合間相互作用の影響を調べるのに、スイッチング電流分布測定が非常に有効であることを見出した。今後、さらに定量的解析を進めながら接合間相互作用の寄与を解明していくと共に、マイクロ波照射効果を利用した新しい巨視的量子現象の探索にも着手していく予定である。
治療抵抗性を示す難治性癌に対する抗癌標的化ハイブリッドペプチド療法の研究

難治性癌(膵臓癌、脳腫瘍など)で高発現しているトランスフェリン受容体、IL-4受容体、Neuropilin-1、Her2を標的としたペプチドおよび細胞膜崩壊型lyticペプチドを組み合わせた、各種ハイブリッドペプチドを設計した。これらハイブリッドペプチドは、効果的な殺細胞効果および抗腫瘍効果を発揮すること、また、分子標的抗癌剤(trastuzumab、lapatinib)耐性癌細胞株に対しても効果的であることが確認された。以上の結果から、本研究で新たに設計されたハイブリッドペプチドは、これら標的受容体を高発現している癌に対する新たな抗癌標的治療薬候補の一つとなることが期待される。現在、医療現場で用いられている「抗体医薬」などの癌の増殖を抑制する分子標的抗癌剤は、患者の癌に遺伝子変異があると投与している薬剤が効かず副作用がでるという問題を抱えている。これらの問題点を克服するために我々は、35個程度のアミノ酸の連なりで、癌細胞を特異的に認識して、その膜をこわしていく「ハイブリッドペプチド」を新たに設計した。本研究では、各癌の性質、特徴に合わせて設計した各種ハイブリッドペプチドが、これまでの分子標的薬が抱えている問題を克服できることや、さらに優位性を明らかにして、難治性の癌に対してこれまでの分子標的薬に代わる新たな治療法を示すことを目的としている。平成23年度は、主に下記の研究内容を行った。(1)難治性癌に対する各種ハイブリッドペプチド候補配列の検討各種難治性癌における高発現受容体を標的分子候補とした。膵臓癌ではsemaphorin 3A (sema3A)の受容体であるNeuropilin-1、脳腫瘍、肺癌ではTransferrin受容体(TfR)、胆道系癌ではHer2を標的として候補配列の設計を行った。設計された配列に関しては、これら標的との結合度合いの相性などを調べた後、癌細胞膜を特異的に破壊させるペプチド配列lyticと組み合わせた。各種設計されたハイブリッドペプチド、Sema3A-lytic、TfR-lytic、Her2-lyticのこれら標的分子が多く発現している癌細胞に対しての殺傷効果を確認したところ、いずれのペプチドも効率的に癌細胞を殺すことが判明した。(2)候補ペプチドの抗腫瘍効果試験TfR-lytic、Her2-lyticの二つのハイブリッドペプチドは、ヒトの癌細胞を用いた動物モデルにおいても、効果的に腫瘍が大きくなるのを抑える効果が示され、同時に肺、肝臓、腎臓に顕著な毒性が出ないことも確認された。(3)細胞内メカニズム解析Lyticペプチドが癌細胞膜を特異的に見分ける機構を調べた結果、単に細胞膜へ結合して外から崩壊させるだけでなく、一部は取り込まれて殺細胞効果を示す可能性が示唆された。平成25年度では、主に下記の内容に関して研究を行った。(1)Lyticペプチドの作用メカニズム解析に関して、Lyticペプチドの細胞膜への作用メカニズムを調べるために、人工リポソーム(giant unilayer vesicles (GUV))および蛍光標識したLyticペプチドを用いて解析を行ったところ、時間経過ごとにGUV内の蛍光強度の増加が観察されたが、lyticペプチド処理細胞における蛍光低分子化合物カルセインのGUV内の蛍光強度の増加が確認されなかった。また、癌細胞を用いた免疫染色実験において、lyticペプチドの一部が、エンドソームマーカーearly endosome antigen prtein 1 (EEA-1)と共局在することが観察された。さらに、エンドサイトーシス阻害剤であるサイトカラシンD等の前処理により、癌細胞に対するlyticペプチドの取り込み及び殺細胞効果が減少することが確認された。以上の結果から、Lyticペプチドは細胞膜を崩壊させるだけでなく、低濃度ではエンドサイトーシス依存および非依存的な経路により癌細胞内に取り込まれ、殺細胞効果を発揮することが示唆された。(2)ハイブリッドペプチドの免疫動態解析に関して、トランスフェリン受容体標的化ハイブリッドペプチド(TfR-lytic)を用いて、正常マウスに投与後の各種免疫動態解析を行った結果、特異的な中和抗体の産生は確認されず、また、免疫細胞の顕著な活性化も見受けられなかった。さらに、ハイブリッドペプチド処理後の溶血活性においても顕著な溶血活性は確認されなかった。以上、現在までに得られた成果をもとに、EGFRを標的としたハイブリッドペプチドに関して、国内製薬企業と臨床応用化への準備を進めている段階である。現行の分子標的薬、特にチロシンキナーゼ阻害分子標的薬(TKI)に対して治療抵抗性・獲得耐性を示す難治性癌への新規治療法を見出すべく、癌細胞膜を崩壊させて癌細胞を殺傷し、化学合成できる革新的な分子標的抗癌剤「ハイブリッドペプチド」を設計した。平成24年度では、各種癌細胞高発現受容体のEGFRだけでなく、乳癌等高発現のErbB2(Her2)、脳腫瘍等高発現のTransferrin受容体(TfR)などへの分子標的化

ハイブリッドペプチドについて、そのTKI等に対する優位性、生体内でのプロファイル解析等を実施した。(2)生体内プロファイル等解析抗腫瘍効果を示す用法用量においてTfR-lyticの免疫原性及び各種毒性を評価したところ、T細胞応答、中和抗体産生等の免疫反応はみられず、白血球減少、若干の溶血作用以外の特段の毒性所見はみられなかった。蛍光標識EGFR-lyticペプチドをマウスに静脈内投与して、経時的な血中動態を蛍光イメージング法で調べたところ比較的すみやかに血中から消失したため、血中分解抑制と徐放化の目的でゼラチンゲルとの複合体を作成してその体内動態安定性を向上させることが確認できた。(3)癌細胞膜崩壊性Lyticペプチドの細胞内メカニズム解析Lyticペプチドは癌細胞においてエンドサイトーシス依存的及び非依存的の両方の作用で細胞内へ取り込まれている可能性が示唆され、その作用に関与する分子をいくつか同定できた。平成23年度の研究計画の内容に関して、予定としていた各種ハイブリッドペプチドの設計、評価、さらには、抗腫瘍効果も確認できたこと、また、癌細胞の殺傷のメカニズムに関しても、取り込まれて殺細胞効果を示す可能性を示唆するデータもえられ、ここまでおおむね順調に進展している。25年度が最終年度であるため、記入しない。H24年度の研究計画の内容に関して、予定していたハイブリッドペプチドの生体内プロファイル解析の一部とともに免疫動態解析を実施し、Her2-lyticについては現行の分子標的薬等で耐性を示す癌に対するin vitroにおける殺細胞効果、in vivo抗腫瘍効果も確認することができた。また、爆薬部分配列の癌細胞膜崩壊性lyticペプチドの殺細胞効果のメカニズム解析においても新たな結果を得ることができており、ここまでおおむね順調に進展している。今後は、さらにハイブリッドペプチドが癌細胞を殺傷するメカニズム解明、ならびに、生体内におけるこれらペプチドの動態、安定性を確認すること、また、必要に応じていくつかのDDS(薬剤配送システム)と組み合わせて、さらに効果を高め、毒性を軽減できるかどうかを確認していく予定である。今後は、ハイブリッドペプチドのDDS(Drug Delivery System)との組み合わせによる、in vivoにおける抗腫瘍効果の増強ならびに体内動態向上の可能性をさらに検討を加えていく。また脳腫瘍に特異的に高発現しているInterleukin13受容体α2サブユニットに特異性を示すハイブリッドペプチドの作用検討、さらには、爆薬部分配列lyticぺプチドの癌細胞内取り込み及び内部動態、関与分子の特定等のメカニズム解析を進め、更なるハイブリッドペプチド療法の可能性を示す予定である。