hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
非定型抗精神病薬の副作用に関連する糖脂質代謝異常関連遺伝子の検索

本研究では、特に新規抗精神病薬において発現頻度が高いと推測される、耐糖能異常、高脂血症、肥満などの副作用に着目し、抗精神病薬の臨床効果・副作用と各種脳内受容体の遺伝子変異との関連について検討を行っている。これまでに、抗精神病薬内服中の統合失調症入院患者を対象として、約200名の耐糖能に関連するアディポカイン、体重・BMI、ウエスト径、血圧のデータを収集済みである。平成18年度は、未治療の統合失調症患者43名におけるオランザピンの臨床効果とドーパミンD2遺伝子多型との関連について検討し、ドーパミンD2受容体のTaq1多型のA1アレルをもつ群では、A1アレルをもたない群と比較してBPRS改善率が有意に高いという結果が得られた。また、ペロスピロン単剤療法中の統合失調症患者において、ペロスピワン血中濃度とその活性代謝物であるID15036血中濃度が血中プロラクチン血中濃度に及ぼす影響について検討した。その結果、PRL血中濃度とペロスピロンの用量との間には相関が認められず、ペロスピロンおよびID15036血中濃度との間に正の相関を認め、ID15036はペロスピロンよりもPRLに及ぼす影響が大きい可能性が示唆された。
ダイナミカルアセンブリーの統計数理学的記述法の探求

米国カリフォルニア大学神経科学研究所のGray教授との共同実験を通じて、麻酔下ネコの外側膝状体における振動的細胞発火現象を解析した。視覚刺激提示下での外側膝状体における細胞活性を複数の金属微少電極で測定し、生データを本年度の予算で購入したアナログ-ディジタル変換ボード、および神経シグナル解析システムを用いて解析した。同時計測された神経細胞のスパイク活性の統計性をスパイク時系列の自己相関関数、パワースペクトラムなどを用いて解析し、特に視覚情報処理経路での上位部所である視覚皮質での細胞活性の性質と比較、検討した。この結果として、外側膝状体と視覚皮質の双方において視覚刺激依存性のある振動的細胞発火が存在することが示された。しかし、この二つの部所での振動的発火には明らかな統計的な差異が認められ、単純な関係づけは出来ないことが示された。また、異なる細胞でのスパイク発火間の時間的関係を相互相関関数を用いて解析した。この結果として、近接した細胞同士は高い確率で同期発火しているが、ある程度離れた細胞同士(500micron)においても同期発火を示す場合がわずかに存在することが判明した。これらの結果は、昨年の北米神経科学学会に引き続いてIBROの国際会議においても発表された。この研究に関連する論文を現在準備中である。また、課題研究テーマであるダイナミカルアセンブリーという概念を物理、数学、情報科学などの広い分野の研究者に理解してもらう目的で、藤井、合原、塚田らとNeural Network誌にレビュー論文を投稿し、掲載予定である。
β線検出NMR-ONによる核磁気モーメントの測定

核スピンを偏極させた場合,スピンが1/2あるいは3/2の場合γ線の異方性が全くないか非常に小さくγ線検出NMR-ONの方法では磁気モーメントの測定はは出来なかった.またβ崩壊がほとんどでγ線が検出できにくい場合もγ線の検出によるNMR-ON出来なかった.この研究の目的はNMR-ONの共鳴観測をβ線の検出で行い,此れ迄測定できなかった磁気モーメントや内部磁場の決定を行うことである.この研究費で購入した厚さ0.75mm直径8mφのSi検出器を新潟大学の3He/4He希釈冷凍機の内部に取付けた.分解能は50keV程であった.東大の原子核研究所のSFサイクロトロンを用いて89ZrFe,90NbFe,82BrNiを製作した.また日本原子力研究所の原子炉JRR-3を利用して191OsFeを製作した.こらの放射性試料はβ崩壊が99%以上でγ線の観測ではNMR-ONの実験は困難である.これらの試料を3He/4He希釈冷凍機で約8mKに冷却してβ線検出によるNMR-ONの実験を行った.その結果共鳴線の観測に成功した.結果は次のとおりである.89ZrFe:共鳴周波数は外部磁場0.2Tで51.18(4)MHz,これまで知られている内部磁場-28.1(4)Tを用いて磁気モーメントを-1.08(2)μ_Nと決定した.89mYのアイソマ-の磁気モーメントの符号を正と決定した.90NbFe:この原子核はγ線によるNMR-ON実験が既に行われてあるが,符号は決定されてなかった.β線検出による共鳴線観測によりその符号は正であると決定した.191OsFe:共鳴周波数は外部磁場0.2Tで180.3(1)MHzで観測し,磁気モーメントを+0.962(28)μ_Nと決定した.82BrNi:共鳴周波数は外部磁場0.2Tで18.71(10)MHz,既知のモーメントより内部磁場を7.34(4)Tと決定した.核スピンを偏極させた場合,スピンが1/2あるいは3/2の場合γ線の異方性が全くないか非常に小さくγ線検出NMR-ONの方法では磁気モーメントの測定はは出来なかった.またβ崩壊がほとんどでγ線が検出できにくい場合もγ線の検出によるNMR-ON出来なかった.この研究の目的はNMR-ONの共鳴観測をβ線の検出で行い,此れ迄測定できなかった磁気モーメントや内部磁場の決定を行うことである.この研究費で購入した厚さ0.75mm直径8mφのSi検出器を新潟大学の3He/4He希釈冷凍機の内部に取付けた.分解能は50keV程であった.東大の原子核研究所のSFサイクロトロンを用いて89ZrFe,90NbFe,82BrNiを製作した.また日本原子力研究所の原子炉JRR-3を利用して191OsFeを製作した.こらの放射性試料はβ崩壊が99%以上でγ線の観測ではNMR-ONの実験は困難である.これらの試料を3He/4He希釈冷凍機で約8mKに冷却してβ線検出によるNMR-ONの実験を行った.その結果共鳴線の観測に成功した.結果は次のとおりである.89ZrFe:共鳴周波数は外部磁場0.2Tで51.18(4)MHz,これまで知られている内部磁場-28.1(4)Tを用いて磁気モーメントを-1.08(2)μ_Nと決定した.89mYのアイソマ-の磁気モーメントの符号を正と決定した.90NbFe:この原子核はγ線によるNMR-ON実験が既に行われてあるが,符号は決定されてなかった.β線検出による共鳴線観測によりその符号は正であると決定した.191OsFe:共鳴周波数は外部磁場0.2Tで180.3(1)MHzで観測し,磁気モーメントを+0.962(28)μ_Nと決定した.82BrNi:共鳴周波数は外部磁場0.2Tで18.71(10)MHz,既知のモーメントより内部磁場を7.34(4)Tと決定した.
共焦点レーザー顕微鏡を用いたペプチドの細胞内動態解析と脳実質細胞標的化への応用

脳毛細血管内皮細胞の吸着介在型エンドサイトーシス(AME)機構を利用したペプチドの脳内送達を目指して、蛍光標識した合成塩基性テトラペプチド(H-MeTyr-Arg-MeArg-D-Leu-CONH(CH_2)_8NH_2、NBD-C-001-C8)をモデル化合物として、培養脳毛細血管内皮細胞における細胞内動態を、共焦点レーザー顕微鏡を用いて解析した。更に放射性標識ペプチドを用いて定量的な実験も併せて行った。その結果、1.NBD-C-001-C8の細胞への内在化(取り込み)過程を、共焦点レーザー顕微鏡によって得られる光学的断層像について経時的に形態観察を行ったところ、細胞内にエンドサイトーシスを示す顕著な顆粒状染色が見られ、細胞表面吸着と細胞内移行とが分別可能であることがわかった。2.蛍光標識された顆粒は、取り込み約10分から30分にかけてluminalからanti-luminal方向へと経時的に深部へと移行した。このことは、画像解析によりその蛍光強度を定量化することによっても確認され、確かにペプチドの細胞への内在化が進行していることを実証することに成功した。3.ペプチドの内在化はプロタミン、ダンシルカダベリン等により阻害され、AMEによる内在化であることが示された。4.細胞の糖鎖選択的消化酵素処理により細胞表面の吸着サイトとしてヘパラン硫酸の関与が示唆された。5.以上の結果は放射標識ペプチド([^<125>I]001-C8)を用いた定量実験の結果と良い一致を示した。これらにより、脳毛細血管内皮細胞のAME機構を蛍光標識体を用いた形態的観察、及び放射性標識体を用いた定量実験それぞれの結果により実証することに成功した。本研究の成果は、これまで困難であったペプチド性医薬品の脳送達が、分子に適当なカチオン性修飾を施すことにより可能になることを示すものと考えられる。
高密度・高感度サンプリングカロリメーターの開発

本研究ではタングステンワイヤーとシンチレーションファイバーを1対1の割合で組み込むことで、PWOを超える高密度サンプリングカロリメーターを開発することであった。シンチレーションファイバーを使うことでシンチレーション光の収集効率を高め、カロリメーターの感度を向上することを目指すことであった。H18年度にはシンチレーションファイバーの応答特性をシンチレーション光量や減衰長を中心に調査して、十分な光量(1MeVエネルギーに対した40個の光電子)と長い減衰長(114cm)を確認した。1mmX1mm角のタングステンワイヤーの製作にも成功し、10mmX10mmX500mmのテストモジュールを製作して。宇宙線を用いたテストで47個の光電子(1MeVのエネルギーに対して)と250cmの減衰長が測定された。H19年度には製作したテストモジュールを東北大・核理研で陽電子ビームを用いて、電磁カロリメーターとしての性能評価を行った。200MeVから800MeVまで入射エネルギーを変化しながら、モジュールの応答をFADCに記録し、入射エネルギーをどのぐらい正確に求められるかを確認した。分解能のエネルギー依存性は一般的に使われている分布を見せてあり、1GeVの入射エネルギーに対して13%の分解能を得ることになった。高密度のサンプリングカロリメーターであるので、作られた電磁シャワーがシンチレーションファイバーにエネルギーを渡す比率の揺動(Sampling Fluctuation)が主な原因であり、検出器として必要な光量は十分得られた結果になる。様々な実験の要求に合わせてコンバーターの材質、割合比を調整すると、輻射長と分解能を最適かすることができる。現在、素粒子実験分野では高エネルギー、大強度の加速器を利用して標準模型の精密な検証又は新しい物理現象を探す実験が幅広く計画されている。このような精密実験を可能にするためには、様々な検出器の開発が必要である。電磁カロリメーターは光子による電磁シャワーが作るシンチレーション光の量からエネルギーを求めるものであるが、特に、最近では検出器の巨大化、高いレートに耐えるため、Low cost-Fast responseという特性が要求されるようになっている。シャワーを起こすコンバーターとシンチレーターを積層したサンプリングカロリメーターもその流れの中にある。本研究ではタングステンワイヤーとシンチレーションラァイバーを1対1の割合で組み込むことで、PWOを超える高密度サンプリングカロリメーターを開発することである。シンチレーションファイバーを使うことでシンチレーション光の収集効率を高め、カロりメーターの感度を向上することを目指している。H18年度にはまずシンチレーションファイバーの応答特性をシンチレーション光量や減衰長を中心に調査して、十分な光量(40p.e./MeV)と長い減衰長(114cm)を確認した。1mm×lmm角のタングステンワイヤーの製作にも成功し、10mm×10mm×500mmのテストモジュー一ルを製作して。一方、タングステンワイヤーの製作は放電加工であるため、長い時間が必要になるため、鉛ワイヤーの製作にも挑戦した。比較的に早くて、安い方法で鉛ワイヤーの製作が可能になり、25mm×25mm×500mmのテストモジュールの製作に成功し、宇宙線を利用してモジュールのテストを行っている。本研究はタングステンワイヤーとシンチレーションファイバーを1対1の割合で組み込むことで、PWOを超える高密度サンプリングカロリメーターを開発することである。シンチレーションファイバーを使うことでシンチレーション光の収集効率を高め、カロリメーターの感度を向上することを目指しているH19年度には前年度に製作したテストモジュールを東北大・核理研で陽電子ビームを用いて、電磁カロリメーターとしての性能評価を行った。

分解能のエネルギー依存性は一般的に使われている分布を見せてあり、1GeVの入射エネルギーに対して13%の分解能を得ることができた。高密度のサンプリングカロリメーターであるので、サンプリングのflucturationが主な原因であり、検出器として必要な光量が十分得た結果になった。様々な実験の要求に合わせてコンバーターの材質、割合比を調整すると、Radiation長と分解能を最適かすることができる。
新規cAMP作働性蛋白の心機能制御

[目的]自律神経機能を遺伝子レベルで改変したマウスを微小重力下におくことで,微小重力下における自律神経機能を解明することである。[方法]5型のアデニル酸シクラーゼ(AC5)を欠損させたマウス(AC5KO)と心臓に過大発現させたマウス(AC5TG)に体内型心電図送信器を埋め込み,心電図記録を取得しコンピュータソフトウェア上で解析を行った。微小重力を再現するため,航空機にマウスを載せパラボリックフライト(PF)を行った。平均心拍数,SDNN(RR間隔の標準偏差)および自律神経指標のためパワースペクトラム解析によりLF/HF(交感神経指標),nHF(副交感神経指標)を計測した。データの比較は二元配置分散分析およびTukeyの多重比較検定を用いた。[結果]心拍数はAC5KOおよびAC5TGにおいて野生型に比べ有意に高かった。微小重力によって交感神経機能は低下し,副交感神経機能は亢進した。これらの変化はAC5を欠損することにより消失した。[考察]心拍数はPFに入った直後から低下がみられ,その後安定化する傾向であった。この変化は野生型およびAC5TG型で認められたが,AC5KO型では認められなかった。また微小重力下においては交感神経機能が低下し副交感神経機能が亢進することが示され,この変化はAC5KOマウスにおいては完全に消失した。これはAC5が微小重力下における自律神経機能に必須のものであることを示唆する結果である。またAC5TGに関しては微小重力まではWTとほぼ同じ動向を示したが,その後の変化はさらに遷延することが示された。これは自律神経がAC5を過大発現させることにより過敏に反応することを示唆している。[目的]自律神経機能を遺伝子レベルで改変したマウスを微小重力下におくことで、微小重力下における自律神経機能を解明することである。[方法]5型のアデニル酸シクラーゼ(AC5)を欠損させたマウス(AC5KO)と心臓に過大発現させたマウス(AC5TG)に体内型心電図送信器を埋め込み、心電図記録を取得しコンピュータソフトウェア上で解析を行った。微小重力を再現するため、航空機にマウスを載せパラボリックフライト(PF)を行った。平均心拍数、SDNN(RR間隔の標準偏差)および自律神経指標のためパワースペクトラム解析によりLF/HF(交感神経指標),nHF(副交感神経指標)を計測した。微小重力によって交感神経機能は低下し、副交感神経機能は亢進した。[考察]心拍数はPFに入った直後から低下がみられ、その後安定化する傾向であった。この変化は野生型およびAC5TG型で認められたが、AC5KO型では認められなかった。また微小重力下においては交感神経機能が低下し副交感神経機能が亢進することが示され、この変化はAC5KOマウスにおいては完全に消失した。またAC5TGに関しては微小重力まではWTとほぼ同じ動向を示したが、その後の変化はさらに遷延することが示された。
オートファジーを活用した肺がん骨転移を制御可能なリポソーム製剤の開発

本研究の目的は、リポソームの表面特性に着目し、表面電荷や表面修飾を施すことで、肺がん治療および骨転移の制御を目指した経肺投与可能な各種リポソーム製剤を構築することである。本年度は、前年度までの検討において有用性が示唆された数種のリポソーム製剤を用いて、経肺投与後の肺内滞留性およびin vivoでの抗腫瘍効果を評価した。さらに、各種リポソーム製剤の吸入特性を評価した。その結果、電荷を持たないリポソームは比較的良好な肺内滞留性を示した。また、負電荷を付与したリポソームにおいても相対的に高い肺内滞留性を示したが、負電荷が強くなり過ぎると肺内から排泄されやすいことが明らかとなった。一方、正電荷を付与したリポソームでは、肺内滞留性が低く、投与後速やかに排泄されたが、リポソーム表面をPEGで修飾することで、肺内での凝集およびマクロファージによる貪食が抑制され、肺内滞留性の向上に有用であることが明らかとなった。一方、肺がんモデルマウスを用いてがん細胞選択性を有する葉酸修飾リポソームの肺内滞留性を評価した結果、未修飾リポソームは、投与72時間後まで高い肺内滞留性を示したのに対し、葉酸修飾リポソームでは、葉酸受容体に取り込まれることで経時的に肺内から消失することが明らかとなった。次に、肺がんモデルマウスを用いてラパマイシン封入葉酸修飾リポソームの経肺投与後の抗腫瘍活性を評価した結果、静脈内投与と比較して優れた抗腫瘍効果を示すことが明らかとなった。最後に、吸入特性を評価した結果、未修飾リポソームは安定的なネブライザー噴霧が可能であったが、PEG修飾リポソームはネブライザー噴霧時に内封薬物を漏出しやすく、適切なリン脂質の選択が重要であることが明らかとなった。一方、葉酸修飾リポソームは、安定的なネブライザー噴霧が可能であり、さらに肺深部まで薬物を送達可能であることが示唆された。本研究の目的は、オートファジーを活用し、肺がんによる骨転移の制御を目指した経肺投与可能な肺胞マクロファージ選択的リポソーム製剤を構築することである。肺胞マクロファージ選択的リポソームにオートファジー誘導剤を内封することで腫瘍随伴マクロファージの活性化を抑制し、破骨細胞への分化を制御することで骨転移の抑制を目指す。さらに、オートファジーという新規殺細胞メカニズムを有することから、骨転移のみならず肺がんに対しても効果的ながん治療に繋がるキャリアを開発することを目的とする。本年度は、脂質組成の異なる数種のリポソームに加え、葉酸またはPEGを用いて表面修飾を施したリポソームにオートファジー誘導剤であるニクロスアミドおよびラパマイシンを内封し、物理化学的性質および肺組織中での安定性を評価した。その結果、正電荷を有するリポソームでは、肺組織中で凝集することが示された。一方、負電荷または電荷をもたないリポソーム、または表面修飾を施したリポソームでは、肺組織中において安定に存在できる可能性が示された。次に、調製した各種リポソームが肺胞マクロファージ選択的または葉酸レセプター発現細胞選択的に取り込まれるか否かについて、評価した。その結果、リポソームの脂質組成ならびにリポソーム表面をPEGにより表面修飾を施すことで、マクロファージ選択的に取り込まれることが示された。また、葉酸修飾リポソームにおいても、葉酸レセプター発現細胞選択的に取り込まれることが示された。本研究課題では、オートファジーを活用し、肺がんによる骨転移の制御を目指した経肺投与可能な肺胞マクロファージ選択的リポソーム製剤の構築を行っているが、本年度の結果から、調製した各種リポソームは、脂質組成や表面修飾を施すことで、肺内組織で安定に存在できること、また、吸入製剤として有用な物理化学的性質を有すること、標的細胞選択性を有すること、等の成果が得られており、次年度以降計画している抗腫瘍活性評価および作用機序の解明、肺内動態を遂行する上で十分な基礎的知見を得ている。

一方、肺がんモデルマウスを用いてがん細胞選択性を有する葉酸修飾リポソームの肺内滞留性を評価した結果、未修飾リポソームは、投与72時間後まで高い肺内滞留性を示したのに対し、葉酸修飾リポソームでは、葉酸受容体に取り込まれることで経時的に肺内から消失することが明らかとなった。次に、肺がんモデルマウスを用いてラパマイシン封入葉酸修飾リポソームの経肺投与後の抗腫瘍活性を評価した結果、静脈内投与と比較して優れた抗腫瘍効果を示すことが明らかとなった。最後に、吸入特性を評価した結果、未修飾リポソームは安定的なネブライザー噴霧が可能であったが、PEG修飾リポソームはネブライザー噴霧時に内封薬物を漏出しやすく、適切なリン脂質の選択が重要であることが明らかとなった。一方、葉酸修飾リポソームは、安定的なネブライザー噴霧が可能であり、さらに肺深部まで薬物を送達可能であることが示唆された。本年度の結果を踏まえ、以下の方策で進める予定である。1)オートファジー誘導剤内封リポソームの細胞障害活性、2)オートファジー誘導剤内封リポソームの細胞死誘導機構の解明、3)オートファジー誘導剤内封リポソームの腫瘍随伴マクロファージへの分化抑制能の評価、4)オートファジー誘導剤内封リポソームの肺内挙動評価、5)担がんマウスにおけるin vivo抗腫瘍効果および肺内動態の検討上記の検討を行い、本剤の経肺投与製剤としての有用性の検証を継続して実施する予定である。本年度、調製した各種リポソームの物理化学的性質および肺組織での安定性を評価した結果、多くのリポソームが肺内で安定に存在できる可能性が示唆された。そのため、当初予定していたよりも各種リポソーム製剤の調製が早く終了したことに加え、次年度に予定している動物実験へ用いるサンプル数が増加したことから、次年度の動物実験用経費の増額が必要と判断したため。
流れを伴う装置系の凍結に関する研究

本研究は、流動状態の水の冷却および凍結現象の実験と解析を行ったものである。実験は、昭和59年度における円管の実験、昭和60年度におけるフィン付コイルの実験である。理論解析は、主に昭和61年度に行い、層流と乱流に分けて、水の冷却および凍結を予測する実用式を導びいた。円管の実験から得られた知見は、流れ方向の水の温度降下は、滞流時間が等しい静水の時間変化にほぼ一致すること、管内の水温が0°C以下になる箇所があれば、いずれ管は閉塞するということである。なお、過冷却現象は静水ほどに顕著に見られなかった。フィン付コイルの実験から得られた知見は、水温の時間変化は、ある時間まで0°C以上を一定に維持し、ある時間から急激に氷点下に降下することであり、管は閉塞する。出口の水温がプラスであっても、管内の表面付近は0°C以下であり、氷は成長するものと考えられる。この現象は強制流の場合に特に顕著に見られる。フィン付コイルを閉塞させない条件は、管内の水温、特に管内表面の温度を0°C以上に保つことである。理論解析に関しては、管内の流動を層流と乱流に分けて、水の冷却、氷の形成の時間変化を求める実用式を、対流熱伝達率の概念を用いて初めて誘導した。層流については、厳密解・実験値を比較し、実用式が適用できることを明らかにした。この実用式を用いて、上記の円管およびフィン付コイルの実験から得られた知見の妥当性を検討した。さらに、従来の解析において全く考慮されていない、凍結に伴う圧力損失の増大、流量減少について、圧力平衡式を立てて新しく理論解析を行った。それによって、より現実に近い凍結防止指針上の知見が得られた。その中で最も重要な成果は、管内に僅かでも氷が形成されると、必ず管は閉塞されるという知見であると考える。
小脳プルキンエ細胞における抑制性シナプス長期増強の分子機構の解明

以下の2項目について研究を行った。1.抑制性シナプス長期増強へのCa^<++>/calmodulin-dependent protein kinase II(CaM-KII)およびprotein kinase A(PKA)の関与について検討した。ラット小脳スライスのプルキンエ細胞からホールセル記録を行い、シナプス後電流(IPSC)およびGABA(2-5muM)による電流をモニターした。脱分極パルス(持続500ms,-60mVから0mV)によりIPSCおよびGABA電流が増強し40分以上持続した。この長期増強は、プロテインキナーゼ阻害剤のstaurosporine、カルモジュリン阻害剤のcalmidazolium(CZ)、CaM-KII阻害剤のKN-62によって阻害された。しかし、脱分極パルスを与えてから5分後にCZおよびKN-62投与を開始した細胞群では長期増強がみられた。これらは、カルモジュリンによるCaM-KIIの活性化が長期増強の誘発に必要であり、この過程は脱分極パルスによるCa^<++>上昇の5分以内に終了することを示す。また長期増強の維持にはCa^<++>およびカルモジユリンに依存しない機構が関与することを意味する。なお、以上の薬物によって電位依存性Ca^<++>電流やシナプス伝達は影響されなかった。一方、PKA阻害剤のprotein kinase inhibitor peptide(PKIP)を細胞内に与えても長期増強をブロックできなかった。2.抑制性シナプス長期増強の誘発には、シナプス後細胞の脱分極による細胞内Ca^<++>濃度上昇と抑制性介在ニューロンの活動が同時に起こることが必要であることを明らかにした。この事実は、抑制性シナプスの可塑性もHebbの法則に従うことを示すもので、興奮性シナプスの長期抑圧とともに、抑制性シナプスの長期増強が小脳の運動学習に関与することを強く示唆するものである。
神経系培養細胞を用いた抗うつ薬の作用機序に関する研究(II)ー-細胞内情報伝達系に対する作用の検討-ー

われわれは6162年度の研究において抗うつ薬がβ_1受容体数には影響することなく直接cAMPの産生を抑制する可能性を明らかにした。しかし、その際抗うつ薬は細胞の中に蓄積する可能性があり、従ってin vitroの系で実験を行う場合に用いる濃度の検討が重要であることが指摘された。そこで63平成1年度の研究計画では1)抗うつ薬のcAMP産生抑制は抗うつ薬に特異的か否かを明らかにする2)in vitroの系で実験を行う場合に至適な抗うつ薬の濃度を決定することを研究目的とした。C_6gliomacellを三環系抗うつ薬の一種であるデシプラミン(DMI)あるいは抗精神病薬の一種であるハロペリド-ル(HAL)存在下で4日間培養した後にイソプロテレノ-ル刺激によるcAMPの蓄積を測定した。その結果、DMI、HAL共に10μMの濃度ではイソプロテレノ-ル刺激によるcAMPの蓄積が低下するが、1μM,0.1μMの濃度では変化がないことが明らかとなった。次に、C_6glioma cellをDMI存在下で培養し、細胞内平均DMI濃度を高速液体クロマトグラフィ-を用いて測定した。その結果を動物実験やヒトの死後脳で報告されている脳内DMI濃度の値と比較した。その結果、細胞内平均DMI濃度は、細胞外の約5060倍に達することが明らかになった。培養細胞を用いて抗うつ薬の薬理作用を調べたこれまでの報告では、培養液中に110μMの抗うつ薬を添加したものが多いが、その場合、細胞内濃度は50μM0.5mMに達することになり、薬理学的濃度をはるかに越えるものであることが明らかとなった。また、10μMのDMI存在下で培養すると、細胞の蛋白量が低下し、ATPの量も減少することが明らかとなった。以上より、1)10μMで得られた結果は非特異的なものであること,2)in vitroの実験に用いる濃度は1μM以下が適当であることが明らかとなった。私達の研究目的はβレセプターを有する神経系培養細胞を用いて抗うつ薬の作用機序を明らかにすることにある。すでに、私達はうつ薬はβレセプターには直接影響しないが、セカンド・メッセンジャーであるcAMPの反応性を低下させることを明らかにした。昭和63年度の研究目的は1)このcAMPの反応性の低下が抗うつ薬に特異的であるか2)抗うつ薬の種類および濃度といかなる関係があるかを明らかにすることにあった。この1)2)を明らかにするための具体的研究計画はa)抗うつ作用を有しない他の向精神薬を抗うつ薬と同様の条件下で培養液に加えて培養し、イソプロテレノールに対するcAMPの反応性を検討する。b)抗うつ薬のうち、構造および作用機序が異なるとされる薬剤を用いて培養しcAMPの反応性を検討するの2点であった。a)については神経遮断薬であるハロペリドールの10^<-5>10^<-7>Mを用いて検討した。その結果、デシプラミンと同様ハロペリドールにおいても10^<-5>Mの高い濃度ではイソプロテレノール刺激によるcAMPの反応性の低下が生ずることが明らかとなった。b)については四環系抗うつ薬の一つであるミアンセリンを用いて検討した。その結果ミアンセリンにおいてもデシプラミンと同様に10^<-5>Mにおいてのみイソプロテレノール刺激に対するcAMPの反応性の低下がみられた。

またミアンセリンの光学異性体である(+)ミアンセリンと(-)ミアンセリンの比較を行った結果いずれも10^<-5>MでcAMPの反応性の低下が見られた。以上の結果から、10^<-5>Mという高濃度でcAMPの反応性が低下するが、10^<-5>Mという濃度が薬理作用を検討するのに至適な濃度であるかどうかは問題であると考えられ、この点を明らかにするための基礎実験が必要であると思われた。平成1年度の研究目的は抗うつ薬の細胞内蓄積の検討と薬理学的至適濃度の決定であった。in vitroの実験において抗うつ薬の薬理作用を研究する場合、一般的には血中濃度や脳内濃度を参考に決めることが多いが、最近抗うつ薬が神経細胞に蓄積するとの報告もあり、必ずしも脳内濃度が脳内細胞外濃度を反映するとは言えない。そこで本研究においては、in vitroの実験における抗うつ薬の至適濃度を決定するために、培養細胞を用いて抗うつ薬の細胞内蓄積を検討し、細胞外の濃度との比を求めることにした。神経系培養細胞であるC_6細胞をdesipramine(DMI)存在下で培養し、細胞内平均DMI濃度を高速液体クロマトグラフィ-を用いて測定した。その結果を動物実験やヒトの死後脳で報告されている脳内DMI濃度の値と比較した結果、以下のことが明らかになった。1.細胞内の平均DMI濃度は細胞外の約5060倍に達する。2.細胞内濃度が定常値に達するまでの時間は10^<-7>MのDMI存在下で培養上清した場合は約20分、10^<-5>Mの場合は数時間以上であった。培養細胞を用いて抗うつ薬の薬理作用を調べたこれまでの研究報告では、培養液中に10^<-5>10^<-6>Mの抗うつ薬を添加したものが多いが、その場合、細胞内濃度は5x10^<-4>5x10^<-5>Mに達することになり、薬理学的濃度をはるかに越えるものであることが判明した。また、この濃度は過量の抗うつ薬を服用したヒトの死後脳のDMI濃度に匹敵する。したがって、培養行きには2x10^<-7>M程度の抗うつ薬を添加するのが適当と思われた。
新規視床下部分泌性小タンパク質による成長調節及び脂肪蓄積メカニズムの解明

我々は、視床下部に特異的に発現する分泌性小タンパク質(NPGL及びNPGM)を発見しており、ラットやマウスを用いて新規小タンパク質の生理機能の解析を行ってきた。その結果、ラットにおいて新規小タンパク質は脂肪組織におけるde novo脂肪合成の亢進により生じることが示唆されている。本年度は、新規小タンパク質の成長遅延及び脂肪蓄積メカニズムの解明を目的に、行動薬理学的解析や形態学的解析を用いて新規小タンパク質の解析を行った。形態学的手法により、NPGL神経線維が投射するニューロンを解析した。NPGLと既知の摂食調節因子の蛍光二重免疫染色の結果、摂食中枢として知られる視床下部の弓状核においてNPGL神経線維がPOMCニューロンに投射していることが示唆された。POMCは摂食行動を抑制性に調節するニューロンであることが知られており、NPGLは摂食行動を促進させる作用を有しているため、NPGLはPOMCニューロンを抑制性に制御することが示唆された。また、行動薬理学的解析においてもNPGLの標的作用部位の検討を行った。しかしながら、POMCニューロンが発現する領域にNPGLを局所的に投与したがde novo脂肪合成等は認められなかった。これは投与量や脳の片側への投与などの実験条件に問題があったためだと考え、現在投与条件の検討を行っている。本年度は本研究課題の最終年度であったため、国際学術誌への論文投稿を積極的に行い、成果を報告した。NPGL及びNPGMの生理作用について、eLife誌に1報、Scientific Reports誌に1報、General and Comparative Endocrinology誌に2報の計4報が受理された。29年度が最終年度であるため、記入しない。最近、鳥類及び哺乳類の視床下部領域に特異的に発現する2種類の新規遺伝子を発見した。これら新規遺伝子は分泌性の小タンパク質をコードしており、げっ歯類において絶食状態や肥満モデル動物などエネルギー状態の変化により新規遺伝子のmRNA発現量が変動する。さらに、新規遺伝子の遺伝子強制発現実験や小タンパク質の投与実験により、新規遺伝子は脂肪蓄積や成長に関与することが明らかとなっている。本研究では、2種類の新規遺伝子についてその生理機能と作用機序を解明することを目的としている。本年度は、新規遺伝子のノックアウトラインの確立及び薬理学的解析による新規遺伝子の生理機能解析を行った。その結果、新規遺伝子の内、1種類に関しては遺伝子及びタンパク質レベルでノックアウトを確認できたラインを確立した。また新規小タンパク質による脂肪蓄積メカニズムに関して、両小タンパク質が脂肪組織における脂肪合成を調節する脳因子であることが明らかになった。さらに、両小タンパク質はともに白色あるいは褐色脂肪組織の脂肪合成を制御するが、その影響の強弱には両小タンパク質間で異なっていた。このことから、両小タンパク質は同様の表現型を示すが、作用経路に異なる点があることが示唆された。摂食行動や代謝を制御し、肥満や脂肪量の調節に関わる脳因子は数多く報告されているが、末梢組織の脂肪合成を調節する脳因子はほとんど報告されていない。一方で本小タンパク質の生理機能及び生理機序の解明は、脳からの脂肪組織における脂肪合成調節機構の解明につながるため、本研究の意義は極めて高いと考えている。予想外に新規遺伝子の1種類はノックアウトが出来ず、当初の計画通りとはいかなかったが、もう1種類に関してはノックアウトラインが確立でき、来年度に向けて成果が挙げられた。また、2種類の新規遺伝子が同様の生理機能を有していると考えていたが、それぞれ異なる作用経路を有していることを示唆するデータも得られた。新規遺伝子の遺伝子強制発現実験や小タンパク質の投与実験により、新規遺伝子は、脂肪蓄積や成長に関与することが明らかとなっている。また、新規遺伝子が脂肪組織において脂肪合成を亢進させることが示唆されている。本年度は昨年作成したノックアウトラットの表現型解析を行った。しかしながら、新規遺伝子をノックアウトしても、体重や摂食量、脂肪量、エネルギー代謝等に変化は認められなかった。2種類の新規小タンパク質は同一細胞で作られ、同様の生理作用を有していることがわかっている。そのため、1種類の新規遺伝子をノックアウトしても、もう一方の新規遺伝子による代償作用により表現型が認められなかったことが考えられる。また、新規遺伝子が脂肪組織における脂肪合成に関与することが示唆されたため、本年度は脂肪合成酵素のタンパク量や実際に脂肪組織における脂肪酸量を測定して、脂肪合成を亢進させることを明らかにした。また、脂肪組織のみならず骨格筋においても脂肪合成が亢進し、肝臓では脂肪合成の亢進が生じないことも示唆された。これまでに肥満に関わる脳因子や、肝臓における脂肪合成について数多くの報告があるが、脂肪組織における脂肪合成を調節する脳因子はほとんど報告されていない。そのため本小タンパク質の生理機能及び生理機序の解明は、脳からの脂肪組織における脂肪合成調節機構の解明につながるため、本研究の意義は極めて高いと考えている。また本研究を進めることで、近年問題となっている肥満に関する新たな知見が得られるのみならず、脂肪組織における糖・脂質代謝の生理的役割の解明にもつながり、学術的にも意義のある研究であると考えている。ノックアウトラットを用いた解析では表現型が得られなかったものの、新規遺伝子が脂肪組織や骨格筋における脂肪合成を制御することを明らかにできた。

また、脂肪肝の原因ともなる肝臓における脂肪合成には変化が認められなかったため、新規遺伝子による脂肪合成制御機構の解明が肥満や脂肪肝の発症、重症化等の改善につながることが期待される。また、作用機序の解明につながる予備的なデータも得られ、来年度に行う新規遺伝子の制御機構の解明の糸口となる成果が挙げられた。我々は、視床下部に特異的に発現する分泌性小タンパク質(NPGL及びNPGM)を発見しており、ラットやマウスを用いて新規小タンパク質の生理機能の解析を行ってきた。その結果、ラットにおいて新規小タンパク質は脂肪組織におけるde novo脂肪合成の亢進により生じることが示唆されている。本年度は、新規小タンパク質の成長遅延及び脂肪蓄積メカニズムの解明を目的に、行動薬理学的解析や形態学的解析を用いて新規小タンパク質の解析を行った。形態学的手法により、NPGL神経線維が投射するニューロンを解析した。NPGLと既知の摂食調節因子の蛍光二重免疫染色の結果、摂食中枢として知られる視床下部の弓状核においてNPGL神経線維がPOMCニューロンに投射していることが示唆された。POMCは摂食行動を抑制性に調節するニューロンであることが知られており、NPGLは摂食行動を促進させる作用を有しているため、NPGLはPOMCニューロンを抑制性に制御することが示唆された。また、行動薬理学的解析においてもNPGLの標的作用部位の検討を行った。しかしながら、POMCニューロンが発現する領域にNPGLを局所的に投与したがde novo脂肪合成等は認められなかった。これは投与量や脳の片側への投与などの実験条件に問題があったためだと考え、現在投与条件の検討を行っている。本年度は本研究課題の最終年度であったため、国際学術誌への論文投稿を積極的に行い、成果を報告した。NPGL及びNPGMの生理作用について、eLife誌に1報、Scientific Reports誌に1報、General and Comparative Endocrinology誌に2報の計4報が受理された。本年度に確立したノックアウトラットや薬理学的手法での解析を進めることで、新規遺伝子の生理機序の解明につながると考えている。新規遺伝子の脳内作用機序の解析により、脳-脂肪組織間の脂肪合成調節機序の解明につながると考えている。29年度が最終年度であるため、記入しない。
喫煙感受性からみた肺気腫の成因に関する統合的研究

喫煙マウスにおける終末細気管支上皮細胞における分子生物学的解析本研究は、マウスに喫煙暴露後の細気管支上皮細胞における遺伝子発現を系統的、経時的に明らかにすることを目的とした。マウスに連日喫煙させ、肺気腫を発症する6ヵ月後に屠殺し、凍結標本からLaser capture microdissection法を用いて細気管支上皮のみを選択しRNAを抽出し、そのRNAを増幅し、Affimetrix社製Genechipを用いて増幅前後での均等性を検証した。さらに6,000種類の既知、6,000種類の未知遺伝子の増減プロファイルを経過をおって検討し、さらに全肺RNAを用いた解析との比較を行い米国胸部疾患学会にて発表した(T.Betsuyaku,2002,5月)。肺内グルタチオンにおける加齢と慢性喫煙の影響若年喫煙、非喫煙者、および中高年のBAL液、肺胞マクロファージの検体について、喫煙に対する加齢の影響がどのように反映されているかを検討した。非喫煙者のみでは加齢による総グルタチオン、及びその酸化型の差はみられなかった。喫煙者では非喫煙者に比べ総グルタチオンが若年、中高年共に有意に高値であった。GSSGは中高年では喫煙者の方が有意に増加しており喫煙指数と相関が見られたのに対し、若年では非喫煙者と同レベルであった。中高年では喫煙でGSH/GSSG比が有意に低下していたが、若年では逆に増加する傾向があった。中高年における肺気腫病変の有無では差を認めなかった。Extracellularglutathione peroxidase (eGPx)量はGSSG多寡を説明しうるものではなかった。加齢および経年喫煙は肺のアンチオキシダント機構を変化させる可能性を示唆する。研究1:喫煙マウスにおける終末細気管支上皮細胞における分子生物学的解析今年度は、マウスに喫煙暴露後の細気管支上皮細胞における遺伝子発現を系統的、経時的に明らかにすることを目的とした。マウスに連日喫煙させ、1、4、28日、肺気腫を発症している6ヵ月後に屠殺し、凍結標本からLaser capture microdissection法を用いて細気管支上皮のみを選択しRNAを抽出する方法を確立し報告した(T.Betsuyaku,AJRCMB,2001)。そのRNAを増幅し、Affimetrix社製Genechipを用いて増幅前後での均等性を検証した。さらに6,000種類の既知、6,000種類の未知遺伝子の増減プロファイルを慢性時間経過を追って検討し、さらに全肺RNAを用いた解析との比較を行った。研究2:肺組織のアデノウイルス潜伏感染と肺気腫の発症肺癌のため肺葉切除術を施行された喫煙指数450以上の重喫煙者である男性12名を対象とした。切除された肺葉のうち非癌部分について、ランダムに6ブロック作成したパラフィン包埋標本からDNAを抽出し、nested PCRを施行した。喫煙者では7名中7名(42ブロック中20ブロック)、肺気腫患者では5名中5名(30ブロック中12ブロック)にアデノウイルスE1A DNAを検出し、一肺葉内でも不均等に存在していることが示唆された。研究3:肺内好中球活性化と肺胞マクロファージ機能における加齢と慢性喫煙の影響中高年喫煙者の中で、早期肺気腫患者では健常喫煙者と比べて気管支肺胞洗浄(BAL)液中に好中球活性化の所見が認められると報告してきた。今回はこの特徴が若年喫煙者でも個体差として存在する可能性を検討した。健常若年者42名(喫煙者25名)を対象にBALを施行し、同液中の好中球エラスターゼ量、interleukin-8量、マクロファージからのIL-8放出能を測定した。若年者では非喫煙、喫煙者間で差はなく、個体差も小さかった。

一方、肺胞マクロファージのIL-8放出能は若年者では中高年者より有意に高いが、中高年者と同様に喫煙者では、非喫煙者よりもむしろ低下していることを明らかにした。喫煙マウスにおける終末細気管支上皮細胞における分子生物学的解析本研究は、マウスに喫煙暴露後の細気管支上皮細胞における遺伝子発現を系統的、経時的に明らかにすることを目的とした。マウスに連日喫煙させ、肺気腫を発症する6ヵ月後に屠殺し、凍結標本からLaser capture microdissection法を用いて細気管支上皮のみを選択しRNAを抽出し、そのRNAを増幅し、Affimetrix社製Genechipを用いて増幅前後での均等性を検証した。さらに6,000種類の既知、6,000種類の未知遺伝子の増減プロファイルを経過をおって検討し、さらに全肺RNAを用いた解析との比較を行い米国胸部疾患学会にて発表した(T.Betsuyaku,2002,5月)。肺内グルタチオンにおける加齢と慢性喫煙の影響若年喫煙、非喫煙者、および中高年のBAL液、肺胞マクロファージの検体について、喫煙に対する加齢の影響がどのように反映されているかを検討した。非喫煙者のみでは加齢による総グルタチオン、及びその酸化型の差はみられなかった。喫煙者では非喫煙者に比べ総グルタチオンが若年、中高年共に有意に高値であった。GSSGは中高年では喫煙者の方が有意に増加しており喫煙指数と相関が見られたのに対し、若年では非喫煙者と同レベルであった。中高年では喫煙でGSH/GSSG比が有意に低下していたが、若年では逆に増加する傾向があった。中高年における肺気腫病変の有無では差を認めなかった。Extracellularglutathione peroxidase (eGPx)量はGSSG多寡を説明しうるものではなかった。加齢および経年喫煙は肺のアンチオキシダント機構を変化させる可能性を示唆する。
糖脂質GM3のネフリン・リン酸化制御機構を利用した巣状糸球体硬化症の治療法の確立

申請者は、巣状糸球体硬化症(FSGS)モデルマウスの糸球体では、ネフリンの発現量減少、F-actinの崩壊がGM3の発現量の減少と相関がある事を見出した。Vitro実験で、ネフリンとGM3分子間の挙動の相関性や相互作用が示された為、生体治療標的として足細胞に発現する糖脂質GM3に焦点を当てる事とした。抗ネフリン抗体によりネフリン障害を誘導しても、細胞膜上に糖脂質GM3の発現が増強されていれば、ネフリンに起因するアクチン構成シグナルが正常化されるため、結果としてF-actinは崩壊しないことがわかった。これは、抗体結合によって破綻に向かうネフリンの構造変化をネフリン足場に局在する糖脂質が阻止する働きがあり、結果として生体では正常なスリット膜機能の維持が保たれるのではないかと推察される。Vivo実験では、FSGSモデルマウスへのバルプロ酸(VPA)の投与を介してGM3を内因的に発現増強させる事で、腎障害やネフローゼ症候群などの慢性腎疾患の予防・進行阻止効果について検討した。その結果、生体においても、VPAの投与により劇的にタンパク尿、硬化病変、ポドサイト数減少を抑制できた。本研究では、VPAを介したGM3の発現増強により、ネフリン、糸球体機能や慢性腎疾患におけるネフリン・糸球体機能やタンパク尿出現を著明に予防・進行阻止する結果が示されている。特に重要な点は、i)足細胞障害初期はGM3の減少も伴うこと、ii)GM3の発現増強により、ネフリン障害を回避できるため、正常ネフリン・リン酸化が維持され、F-actinが崩壊しないこと、iii)VPAを用いたGM3の発現増強により、抗体誘導性FSGSモデルマウスのタンパク尿、硬化病変、ポドサイトの減少を劇的に抑制できること、である。しかし、抗体誘導性の真の原因を追究するため、病態誘導前後の細胞膜の微細な分子構造の変化を捉えていきたい。i)vitro実験は、計画通りに進捗し、また良好な結果も得られていること、ii)vivo実験も、計画通りに進捗し、こちらも予想以上に良好な結果が得られている。この様に、現在までは大きな困難や問題は発生せず、全体的にスケジュール通りに順調に結果が得られているため。抗体が結合した直後の病態変化を捉えることが、真の抗体誘導性慢性腎臓病の原因を突き止めることに繋がると考えている。また、この事象を捉えることは、慢性腎臓病への新たな創薬に対しても、大きな情報を提供できると考えられる。このために、病態誘導性の抗体が抗原に結合した直後の細胞膜の微細(または劇的)な変化を観る必要性が高いが、この課題を解決するためには、凍結割断レプリカ法(SDS-FRL法)が有効であると考えている。現在、この手法に精通している福井大学医学部の深澤有吾先生らとの共同研究を開始したところであり、まずは細胞の膜構造の解析を試みる。良好な結果が得られた場合には、病態動物の腎組織の解析も行いたいと考えている。

このために、病態誘導性の抗体が抗原に結合した直後の細胞膜の微細(または劇的)な変化を観る必要性が高いが、この課題を解決するためには、凍結割断レプリカ法(SDS-FRL法)が有効であると考えている。現在、この手法に精通している福井大学医学部の深澤有吾先生らとの共同研究を開始したところであり、まずは細胞の膜構造の解析を試みる。良好な結果が得られた場合には、病態動物の腎組織の解析も行いたいと考えている。去年末に所属する医学部棟で発生した火災で深刻な被害が出たため、未だに日々の実験業務に支障をきたしている。このため、予定していた実験に関わる試薬などの発注が遅れている。また、発注済みだが現在支払い手続き中の物品もあるため、次年度への使用額が発生した。
発癌性レトロウイルスとヒト後天性免疫不全症候群ウイルスの増殖機構の比較検討

HIVのウイルス学的性格を明らかにするため,感染性DNAクローンを材料として試験管内で各種の変異株を作製した.得られた変異株はHIV遺伝子の全てに対応する.これら変異DNAをリン酸カルシウム法でヒト結腸癌由来SW480細胞に導入し,ウイルス粒子形成能を逆転写酵素を測定することによって決定した.その結果,構造遺伝子(gag,pol,env)に変異のあるウイルスの多くは粒子を形成せず,調節遺伝子(sor,3′sor)に欠損のあるウイルスは正常に粒子形成が行なわれていた.残りの調節遺伝子(tat,art)に変異があるとウイルス粒子は全く産生されず, sorと3′sorとは対照的であった.また,その存在が予測されている8番目の遺伝子Rについても変異株を作製したが,粒子形成は野生株型で正常と思われた.粒子形成能のある変異ウイルスに関しては,ヒト白血病由来細胞であるMalt4に感染させ,感染が成立するかどうかを検討した.現在までのところ, 3′sor,Rを除き感染性はないか,きわめて低いようである.一方, HIVのLTRの一部を組み込んだマウス白血病ウイルスも作製した.一つはHIVのエンハンサー,もう一つはtatに反応する領域を組み込ませたものである.現在,マウス白血病ウイルスの系でこれら二種のウイルスの性格を検討中で, HIV研究の良いモデル系となることを期待している.今後,本年度で得られた変異ウイルス,基礎データをもとにして, HIVの増殖機構,各遺伝子の機能,持続感染成立のメカニズム等を詳細に研究していく予定である.HIVのウイルス学的性格を明らかにするため,感染性DNAクローンを材料として試験管内で各種の変異株を作製した.得られた変異株はHIV遺伝子の全てに対応する.これら変異DNAをリン酸カルシウム法でヒト結腸癌由来SW480細胞に導入し,ウイルス粒子形成能を逆転写酵素を測定することによって決定した.その結果,構造遺伝子(gag,pol,env)に変異のあるウイルスの多くは粒子を形成せず,調節遺伝子(sor,3′sor)に欠損のあるウイルスは正常に粒子形成が行なわれていた.残りの調節遺伝子(tat,art)に変異があるとウイルス粒子は全く産生されず, sorと3′sorとは対照的であった.また,その存在が予測されている8番目の遺伝子Rについても変異株を作製したが,粒子形成は野生株型で正常と思われた.粒子形成能のある変異ウイルスに関しては,ヒト白血病由来細胞であるMalt4に感染させ,感染が成立するかどうかを検討した.現在までのところ, 3′sor,Rを除き感染性はないか,きわめて低いようである.一方, HIVのLTRの一部を組み込んだマウス白血病ウイルスも作製した.一つはHIVのエンハンサー,もう一つはtatに反応する領域を組み込ませたものである.現在,マウス白血病ウイルスの系でこれら二種のウイルスの性格を検討中で, HIV研究の良いモデル系となることを期待している.今後,本年度で得られた変異ウイルス,基礎データをもとにして, HIVの増殖機構,各遺伝子の機能,持続感染成立のメカニズム等を詳細に研究していく予定である.
アミノ酸関連生理活性化合物の合成を触媒する酵素の精密反応機構と機能変換

本研究では,アミノ酸代謝に重要な役割を担うオリゴマ-酵素であるアスパルタ-ゼとトリプトファナ-ゼを研究材料として用い,機能発現の精密分子機構の解明と新機能の付与を目的として研究を行い以下の結果を得た。1.トリプトファナ-ゼの高次構造については全く不明であるため,X線結晶構造解析にむけての実験を行った。まず,本酵素遺伝子を含むプラスミドを本酵素欠損株Kー12MD55に導入し発現させたところ,細胞内可溶性全蛋白質のほぼ60%に相当する本酵素が得られた。この大量発現によって得られた本酵素を用いてその結晶化を試みた。蒸気拡散法によってホロ酵素,アポ酵素,アラニンとの複合体(それぞれ約0.6×0.6×0.5mm)の結晶が得られた。しかし,これらの結晶は分解能や結晶化の再現性などの点でX線結晶構造解析には不向きであった。そこで良質の結晶を再現性よく得るために補酵素とLーアラニンの複合体をリガンドに用いたアフィニティ-カラムを作成し,それにより高度に精製した本酵素を用いて蒸気拡散法等によって種々の条件を検討した。その結果,25°C,13%硫安で0.3×0.3×0.5mm程度の大きさの結晶が再現性よく得られた。この結晶はテトラゴナルで格子定数a=b=113,c=232A^^゚でP4_32_12またはP4_12_12の空間群に属し,分解能は3A^^゚程度であった。2.オリゴマ-酵素の活性発現のために,すべてのサブユニットが活性を持つ必要があるのかどうかを明らかにするためにネイティブなサブユニットと失活サブユニットのハイブリッド化による解析を行った。同種サブユニット4個からなるアスパルタ-ゼは,可溶性状態でもゲル上でもネイティブなサブユニットとNーエチルマレイミドで本酵素の活性部位に存在するSH基の化学修飾を行って得た失活サブユニットの両者を含むハイブリッド酵素が生成し,四量体分子内に含まれるネイティブなサブユニットの数に比例した活性を持つことが判明した。
メカノセンサーによるマウス口蓋形成制御

顎顔面の発生は短期間にダイナミックで神秘的な変化を見せながら進む。その過程で機械的な力が時間的・空間的に多様に作用していることは明らかであるが、詳細は不明である。口蓋形成は、口蓋突起が挙上後伸展し、癒合するダイナミックな形態変化である。口蓋形成にかかわる分子の理解は進んでいるが、いまだ口蓋裂の機構が理解されたとは言えない。本研究では、口蓋裂とヒトのメカノセンサー遺伝子変異との関連が報告されていることから、口蓋癒合前後のメカノセンサーの発現を解析することで、口蓋形成のメカニズムおよびメカノセンサーの役割を明らかにすることを目的とした。in situ hybridization法を用いて、胎生マウス口蓋組織におけるメカノセンサーのmRNAの発現および分布を解析した。その結果、数種類のメカノセンサーで発現に違いが認められた。更に、免疫組織化学染色によるメカノセンサー蛋白の発現解析を進めている。胎生マウス口蓋組織の免疫組織化学染色標本の解析を継続して行う。また、株化細胞または初代培養細胞を用いてメカノセンサーの発現が細胞コロニーの形成や細胞移動などに与える影響を明らかにする。組織標本を観察する顕微鏡の導入に時間を要したため、本年度購入予定の機器の設置およびそれに関する消耗品の購入に遅れが生じた。平成30年度は、免疫組織化学染色や細胞培養関連試薬および細胞培養関連機器を購入する予定である。