hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
北極ツンドラ生態系における土壌CO2フラックスの冬期の動態解明と年間の高精度推定

2018年7ー8月、土壌中の二酸化炭素濃度を測定するため、二酸化炭素濃度センサーを設置しているノルウェー・ニーオルスン(北緯79度)に赴き、データロガーからデータを回収した。いくつかのセンサーは積雪期の降雨や急激な昇温に伴う融雪の影響により故障していたが、冬期も含め、通年の土壌ガス中の二酸化炭素濃度の経時変化を捉えることに成功した。前年と比較すると、二酸化炭素濃度の季節変化は、絶対値は異なるものの、季節変化の傾向は類似していた。積雪期の土壌中の二酸化炭素濃度は、前年同様大きく変動しており、積雪期の降雨や急激な昇温による融雪などが二酸化炭素濃度の変動に影響していることが考えられた。各土壌層位における土壌二酸化炭濃度の変化を推定するためのモデルの開発に着手した。土壌温度や土壌水分などの環境パラメータを元にモデルを構築し、土壌中の二酸化炭素濃度変化をシミュレートしたところ、無雪期間については、実測値を再現できる見通しが立った。一方、積雪期の二酸化炭素濃度の変化をモデルシミュレーションで再現することは現時点では困難だった。この原因として、土壌微生物による二酸化炭素の生成速度、土壌中のガスの拡散などが土壌の凍結時と融解時で異なることなどが影響している可能性が考えられたため、氷点下も含めた土壌培養を実施し、二酸化炭素放出速度の変化を調査している。2019年3月に調査地に再び赴き、データをダウンロードしたところ、2018年の11月-12月は例年と比較して、降雨や昇温による融雪が多く生じていた。そのため、多くのセンサーに異常値が認められた。次年度の調査に向けて交換用のセンサーを準備する必要が生じた。得られた成果の一部は極域科学シンポジウムで発表した。計画当初は低温による二酸化炭素濃度センサーの故障を危惧していたが、実際には、積雪期間中に生じる降雨や急激な融雪時の水がセンサーの故障を誘発する主要因であることが明らかとなってきた。毎年センサーの故障が生じているものの、通年のデータを取得できているセンサーも有り、北極陸域では初めて2年間連続で積雪期も含む土壌中の二酸化炭素濃度のデータを取得できた。そのため、国際誌に論文を投稿できる準備が整った。さらに、二酸化炭素濃度センサーの季節変動をシミュレートするためのモデル構築に着手できている。当初の予想では、積雪期期間中の土壌中の二酸化炭素濃度の変化は小さいと考えていたが、実際には大きく変化している。この変化をモデルで再現することは現在困難であるが、室内実験を行い、土壌凍結時の二酸化炭素濃度の変化が生じる要因について調査を進めており、得られた結果をモデルに反映させることで、モデルによる積雪期の二酸化炭素濃度変化の再現性を高めたい。二酸化炭素濃度測定センサー内部に水が浸入することにより、センサーが故障してしまうことが明らかとなったため、センサーを保護するホルダーの構造およびセンサーの設置方法を改善し、安定的に通年測定を実施できるよう準備を進めている。積雪期に得られた連続的な土壌中の二酸化炭素濃度の変化については、北極陸域では初めてのデータとなるため、シンポジウムや北極に関する国際会議等で発表するとともに論文化を進めている。ドイツの共同研究者から論文化に必要なデータを提供してもらっており、国際的な共同研究体制も順調に進んでいる。今後は特に積雪期間中の二酸化炭素濃度の変化をモデルで再現できるようにするため、室内での土壌培養実験や野外での生態系呼吸のデータ、およびドイツが測定している土壌温度や渦相関法のデータ等を取得し、モデルの高度化に繋げる。北極域の冬期に生産される二酸化炭素量を高精度に推定することを目的に、土壌中の二酸化炭素濃度測定のための機器および環境要因として温度および水分センサーを購入した。それぞれのセンサーをデータロガーに接続し、低温環境下で問題なく作働するか国内で確認した。その後、システムの設置場所であるノルウェー・ニーオルスンに測定システムと校正用のガスを輸送した。夏期、ノルウェー・スバールバル諸島・スピッツベルゲン島のニーオルスン(北緯79度)に3名で赴き、調査地として相応しい場所を選定した。地表面から深さ50cmの間に二酸化炭素濃度センサー、温度センサーおよび土壌水分センサーを設置し、データロガーに接続した。それぞれのセンサーからデータロガーにデータが送られてきていることを確認したのち、二酸化炭素濃度測定センサーの校正を0ガスおよび既知の濃度の二酸化炭素ガスを流すことで実施した。現地滞在期間中にデータが安定的に取得できていることを確認したのち、帰国した。データは安定的にとれているが、土壌に設置したこと、および校正を行ったことが影響し、設置後しばらくの間記録されているデータは本来の二酸化炭素濃度とは異なっていると思われる。このため、来年度までデータをとり続け、その結果を見ていつ頃まで攪乱の影響が残っているのかを明らかにする必要がある。9月頃システムの不調が認められたため、急遽現場へ戻り、不調の原因を突き止めた。現地で修理可能だったため、対策を講じ、データが問題なく取得できていることを確認したのち帰国した。当初の予定通り、春に土壌中の二酸化炭素濃度測定のためのシステムを構築し、無雪期間中に調査地であるノルウェー・スピッツベルゲン島のニーオルスンにシステムを設置・稼働させることができた。一時不具合があったものの、現場で不具合の要因を取り除くことができ、二酸化炭素濃度を測定を継続させることができたため。7ー8月に土壌中の二酸化炭素濃度を測定するためにセンサーを設置しているノルウェー・ニーオルスン(北緯79度)赴き、データロガーからデータを回収した。その結果、いくつかのセンサーに物理的な障害と思われる異常値が示されたが、冬期も含め、通年の土壌ガス中の二酸化炭素濃度の経時変化を捉えることに成功した。

二酸化炭素濃度は土壌深度によって変動幅が異なっていたが、その経時変化はほぼシンクロしていた。一方、同じ土壌深度においても場所により土壌二酸化炭素濃度が大きく異なる層も認められた。土壌温度が氷点下で土壌が凍結している状態にもかかわらず、二酸化炭素濃度が比較的短時間に大きく変動していることも認められたため、冬期、凍結時における土壌表面から放出される二酸化炭素フラックスは生物的要因に加えて物理的な要因も影響している可能性が示唆された。気象データと照らし合わせた際に、積雪期に降水のある"rain on snow"のイベントが確認された。その際、土壌表層付近の土壌中の二酸化炭素濃度はイベントに連動して変化していることを捉えることに成功した。このことにより、"rain on snow"イベントは冬期の土壌二酸化炭素フラックスに影響を及ぼす可能性が示唆された。夏期は土壌中の二酸化炭素濃度が比較的安定しているため、土壌二酸化炭素濃度、土壌水分、土壌温度および土壌二酸化炭素フラックスデータをもとに、夏期の土壌二酸化炭素フラックスを推定するためのモデル開発に着手した。当初計画通り、土壌中のガスに含まれる二酸化炭素濃度の通年測定に成功した。さらに冬期、土壌が凍結しているにも関わらず、土壌中の二酸化炭素濃度がダイナミックに変化することや、場所毎に土壌中の二酸化炭素濃度が大きく異なることなど、これまで知られていなかった現象についても明らかにすることができた。さらに、得られたデータから冬期の土壌中の二酸化炭素濃度の挙動を説明するためには生物的要因に加え、非生物的要因も重要である可能性が明らかとなった。冬期の土壌中の二酸化炭素濃度が予想を超えて大きく変動していたことから、冬期の土壌二酸化炭素フラックスを推定するためのモデル開発の前に、比較的濃度が安定している夏期のデータを元に土壌二酸化炭素フラックスを推定するためのモデル開発に着手する方針を決定することができた。さらに、室内実験により、凍結状態の土壌からの二酸化炭素放出のフラックスの動態を調査する必要性も明らかとなった。2018年7ー8月、土壌中の二酸化炭素濃度を測定するため、二酸化炭素濃度センサーを設置しているノルウェー・ニーオルスン(北緯79度)に赴き、データロガーからデータを回収した。いくつかのセンサーは積雪期の降雨や急激な昇温に伴う融雪の影響により故障していたが、冬期も含め、通年の土壌ガス中の二酸化炭素濃度の経時変化を捉えることに成功した。前年と比較すると、二酸化炭素濃度の季節変化は、絶対値は異なるものの、季節変化の傾向は類似していた。積雪期の土壌中の二酸化炭素濃度は、前年同様大きく変動しており、積雪期の降雨や急激な昇温による融雪などが二酸化炭素濃度の変動に影響していることが考えられた。各土壌層位における土壌二酸化炭濃度の変化を推定するためのモデルの開発に着手した。
イネにおける茎頂分裂組織の分化決定及び維持増殖の時空における解析

既に茎頂分裂組織(SAM)を欠失する変異体を解析し、SAMの分化には少なくとも4遺伝子座(SHL1SHL4)が関与していることを明らかにしたが、SAMの分化後のSHL遺伝子の機能については不明であった。SHL2座の弱い変異体shl2-6とshl2-8ではSAMは分化するが、葉を何枚か分化した後消滅した。従って、SHL2遺伝子は、SAMの分化だけでなくその維持にも関与していることが明らかになった。更に、幼苗は葉の分化パターンの大きな異常も示し、葉原基の分化パターンの制御にも関わっていることがわかった。SHL2の弱い変異体の表現型はランダムな葉序と糸状の葉を分化するsho変異体とよく似ており、これらの遺伝子は共同してSAMのオーガニゼーションの維持に関与していると思われる。イネにおける相転換機構を明らかにするため、moril変異体を同定解析した。moril変異体では、決して生殖成長に入らず、すべての形質(葉のサイズ、葉の構造、茎の組織分化、葉間期、SAMの構造、光合成活性)が第2葉(期)と同じであった。従って、moril変異体はjuvenile phaseからadult phaseへの転換ができず、juvenile phaseを繰り返していると考えられ、MORIl遺伝子はjuvenile-asdult相転換を制御する重要な遺伝子であろう。生殖成長期における分裂組織のアイデンティティー転換制御を明らかにするため、apol変異体を解析した。apol変異体では、穂軸分裂組織が野生型で退化するより早く小穂に転換し、枝梗分裂組織もすぐに小穂に転換することが明らかになり、分裂組織アイデンティティーの転換が早まっていた。apol変異体の花でも、鱗被の増加、雄蕊の減少、雌蕊の増加が見られ、APOl遺伝子は、生殖成長期における分裂組織アイデンティティーの時間的制御に関与していると考えられる。
血液脳関門におけるバルプロ酸排出輸送の分子機構と遺伝多型

血液脳関門(BBB)を介したバルプロ酸の排出輸送機構を解明する上で、バルプロ酸と同様に脳移行性の低い薬物のBBBにおける排出輸送過程を解析することは重要である。そこで本研究は、脳移行性が低く、バルプロ酸と同様にBBBのprobenecid感受性の輸送担体によって脳内から排出輸送される抗白血病治療薬のチオプリン誘導体に着目し、チオプリン誘導体のBBBを介した脳からの排出輸送に関わる輸送担体を同定することを目的とした。In vivo brain effluxindex (BEI)法を用いた解析から、チオプリン誘導体の種である[^<14>C]6-MP及び[^3H]6-TGは共に脳から排出されることが明らかになり、排出半減期はそれぞれ43.9分、23.4分と算出された。さらに、6-MPのBBBを介した排出輸送は、バルプロ酸及びrat organic anion transporter 3 (rOAT3)の特異的阻害剤であるbenzylpenicillinによって有意に阻害された。従って、チオプリン誘導体のBBBを介した排出輸送過程に、一部rOAT3が関与していることが明らかになった。rOAT3発現系を用いた6-MPの輸送特性解析から、6-MPはrOAT3の基質となり、その親和性を示すK_m値は50.5μMであることが示された。さらに、バルプロ酸1mM共存下におけるrOAT3を介した6-MPの取り込みは、78%顕著に阻害された。従って、BBBのrOAT3はチオプリン誘導体やバルプロ酸をはじめとする薬物を脳内から排出輸送し、薬物の脳移行性を決定する一要因になっている可能性が示唆された。そこで、BBBのrOAT3の生理的機能をより詳細に解明するため、rOAT3機能低下動物の作製を目的として、rOAT3機能を選択的に低下させるRNAi配列の決定を行った。HEK細胞を用いたin vitro機能解析から、rOAT3機能を選択的に80%以上有意に抑制させる2種類のRNAi配列を同定することができた。このrOAT3に対するRNAi配列の決定により、BBBにおけるバルプロ酸の排出輸送に関わるrOAT3の寄与が明らかになると考えられる。血液脳関門を介したバルプロ酸の排出輸送機構を解明する上で、バルプロ酸と同様の有機アニオン性化合物及び脳移行性の低い薬物の血液脳関門における排出輸送過程を解析することは重要である。そこで本研究では、ドパミンの代謝物で血液脳脊髄液関門においてバルプロ酸がその輸送を阻害することが報告されているホモバニリン酸(HVA)と脳移行性が低い抗白血病治療薬である6-mercaptopurine(6-MP)に着目し、これら化合物の血液脳関門を介した脳からの排出輸送機構を解明することを目的とした。In vivo brain effluxindex(BEI)法を用いた解析から、[^3H]HVA及び[^<14>C]6-MPは共に脳から排出され、排出半減期はそれぞれ43分、47分であった。さらにHVA及び6-MPの血液脳関門を介した排出輸送は、rat organic anion transporter3(rOAT3)の特異的阻害剤であるbenzylpenicillinによって共に有意に阻害された。従って、これら化合物のBBBを介した排出輸送過程には一部rOAT3が関与していることが明らかになった。そこでrOAT3発現系を用いてHVA及び6-MPの輸送特性を詳細に解析したところ、HVA及び6-MPはrOAT3の基質となり、その親和性を示すKm値はそれぞれ274μM、125μMであることが示された。さらにバルプロ酸を1mM共存させた条件では、rOAT3を介したHVAの取り込みは約60%、6-MPの取り込みは約77%阻害された。また抗rOAT3抗体を用いた免疫科学的手法により、rOAT3が血液脳関門を構成する脳毛細血管内皮細胞の脳側膜に主として局在していることを明らかにした。以上より、rOAT3は内因性有機アニオン化合物・外因性薬物を幅広く認識し、BBBにおいてバルプロ酸をはじめとする多くの薬物の脳移行性に重要な役割を果たしている可能性が示唆された。rOAT3発現系を用いた6-MPの輸送特性解析から、6-

MPはrOAT3の基質となり、その親和性を示すK_m値は50.5μMであることが示された。さらに、バルプロ酸1mM共存下におけるrOAT3を介した6-MPの取り込みは、78%顕著に阻害された。従って、BBBのrOAT3はチオプリン誘導体やバルプロ酸をはじめとする薬物を脳内から排出輸送し、薬物の脳移行性を決定する一要因になっている可能性が示唆された。そこで、BBBのrOAT3の生理的機能をより詳細に解明するため、rOAT3機能低下動物の作製を目的として、rOAT3機能を選択的に低下させるRNAi配列の決定を行った。HEK細胞を用いたin vitro機能解析から、rOAT3機能を選択的に80%以上有意に抑制させる2種類のRNAi配列を同定することができた。このrOAT3に対するRNAi配列の決定により、BBBにおけるバルプロ酸の排出輸送に関わるrOAT3の寄与が明らかになると考えられる。
視覚認知に伴う事象関連電位の頭蓋内および頭皮上局在

目的:視覚刺激(相貌、視空間、有意単語、色彩)の認知・弁別に関与する大脳の局在、または側方性(lateralization)を明らかにする目的で視野別刺激-左右手反応による事象関連電位および反応時間を測定した。さらに、側頭葉の視覚認知への関与をみるために、左または右の前側頭葉切除術を受けたてんかん患者での測定も行った。対象:11-35歳の健常者36例(全例右利きを選択)および15-41歳の前側頭葉切除者12例(左切除者7例、右切除者5例)(アミタールテストで全例左半球優位を選択).結果:1)健常者では平仮名刺激を右視野(左半球)に、相貌または視空間点刺激を左視野(右半球)に呈示した時、反対側呈示に比べP300振幅が大であった。2)ボタン押し反応時間は平仮名刺激で左半球呈示-左半球応答が最短、右半球呈示-右半球応答が最長であり、視空間“Dot"刺激では逆の関係を示した。3)前側頭葉切除者ではP300振幅の低下と言語性および非言語性刺激に対する半球優位性の消失がみられた。特に左側頭葉切除者では平仮名刺激に対して低振幅化と波形不整がみられた。4)P300潜時は左および右切除者ともに延長し、平仮名刺激では左切除者が、視空間点刺激では右切除者で著明であった。以上の成績から、健常者の言語性視覚認知・弁別は左半球が、また非言語性視覚認知・弁別は右半球が優位であり、さらに、側頭葉切除例の検討から、側頭葉の関与が示唆された。外科症例の集積、刺激の種類、方法などの開発、さらには、各種検査法(脳磁図、functional MRI、神経心理学的検査)との併用で今後の発展性が大いに期待される。言語性(平仮名有意文字)および非言語性(相貌または視空間点)視覚刺激パターンの作成に時間がかかったが、信頼できるERPおよび反応時間が記録できるようになった.側頭葉切除予定者で頭蓋内電極によるERPがとれたものはまだ3例であるので結果は次年度に報告する.現在までに明らかになった成績を以下に示す.対象:11-32歳の健常者19例(全例右利き)および15-41歳の前側頭葉切除者10例(左切除者6例、右切除者4例)アミタールテストで全例左半球優位).1)健常者では平仮名刺激を右視野(左半球)に、相貌または視空間点刺激を左視野(右半球)に呈示した時、反対側呈示に比べP300振幅が大であった。2)ボタン押し反応時間は平仮名刺激で左半球呈示-左半球応答が最短、右半球呈示-右半球応答が最長であり、視空間点刺激では逆の関係を示した。3)前側頭葉切除者ではP300振幅の低下と言語生および非言語性刺激に対する半球優位性の消失が見られた。以上の成績から、視野別刺激事象関連電位(P300)は健常者の言語性または非言語性刺激の認知機能を半球別に評価する方法として有用であり、今後、脳外科治療患者を対象に各種神経心理学的検査と併用することで発展が期待される。

外科症例の集積、刺激の種類、方法などの開発、さらには、各種検査法(脳磁図、functional MRI、神経心理学的検査)との併用で今後の発展性が大いに期待される。目的:視覚刺激(相貌、視空間、有意単語、色彩)の認知・弁別に関与する大脳の局在、または側方性(lateralization)を明らかにする目的で視野別刺激-左右手反応による事象関連電位および反応時間を測定した。さらに、側頭葉の視覚認知への関与を見るために、左または右の前側頭葉切除術を受けたてんかん患者での測定も行った。対象:11-35歳の健常者36例(全例右利きを選択)および15-41歳の前側頭葉切除者12例(左切除者7例、右切除者5例)(アミタールテストで全例左半球優位を選択).結果:1)健常者では平仮名刺激を右視野(左半球)に、相貌または視空間点刺激を左視野(右半球)に呈示した時、反対側呈示に比べP300振幅が大であった。2)ボタン押し反応時間は平仮名刺激で左半球呈示-左半球応答が最短、右半球呈示-右半球応答が最長であり、視空間“Dot"刺激では逆の関係を示した。3)前側頭葉切除者ではP300振幅の低下と言語性および非言語性刺激に対する半球優位性の消失がみられた。特に左側頭歯切除者では平仮名刺激に対して低振幅化と波形不整がみられた。4)P300潜時は左および右切除者ともに延長し、平仮名刺激では左切除者が、視空間点刺激では右切除者で著名であった。以上の成績から、健常者の言語性視覚認知・弁別は左半球が、また非言語性視覚認知・弁別は右半球が優位であり、しかも各半球の側頭葉の関与も示唆された。今年度の研究に含めていた頭蓋内電極(硬膜下電極)による検討は5例に行ったが、両側に電極を埋め込んだ症例は1例のみであり、半球または局在優位性は導き得なかった。今後も症例を重ねて、検討する予定である。
自伝的記憶における感性情報処理と加齢効果

Waldfogel(1948)は、大学生に0歳から8歳の誕生日までの自伝的記憶の想起を求め、想起数と想起事象に随伴する感情カテゴリのタイプ(快・不快・中立)とによって幼児期の想起の特徴について検討している。本研究では彼の報告した以下の2点について再検討を加えた。1)想起数は男女とも加齢(事象生起年代)の関数として増大する。そしてこの加齢による想起数の増加曲線は、言語の獲得数によって描かれた曲線と良く一致していた。2)随伴感情によって想起内容を快・不快・中立に分類すると、それらの感情比率は、ほぼ5:3:2を示し、事象生起年齢ごとに感情比率を求めた場合にも、同様の比率が得られた。本研究では、Waldfogel(1948)の実験から約50年の年月を隔てて異なる文化圏において、彼が報告した0歳から7歳代までの自伝的記憶に関すると想起傾向と同様の結果が再現されうることを確認した。ただし、本研究では大学生による0歳から10歳の誕生日までの自伝的記憶想起実験において、8歳代以降に想起数の明確な減少を確認した。この結果に対して、児童期の自伝的記憶が小学校入学等の環境変化とそれへの慣れによる影響を受けるとする作業仮説を提出した。この仮説は、大学生による6歳から15歳の誕生日までの自伝的記憶想起実験において、小学校入学年度と中学校入学年度に想起数のピークが認められたことから、つまり環境変化の生起年度以降における想起数の明確な減少が再度確認されたことから支持された。しかしながら、想起事象に対する事象生起年代別に行なった感情分類の結果から、児童期においては、想起数の増減は想起の質(想起事象に対する感情比率)には影響しておらず、中学校入学年次と卒業年次においてのみ快感情の減少が認められた。
ヒト肥満による2型糖尿病発症機構解明のための研究用ラットリソース開発

肥満性2型糖尿病ラットOLETFの糖尿病原因遺伝子座14座の中から、Nidd4,Nidd6遺伝子座を導入したコンジェニック系統を作製し、その特性解析を行った。2系統ともにコントロールラットであるF344ラットに対し、有意に体重、腹腔脂肪量が増加した。さらに、空腹時血糖値が有意に高かった。このことはNidd4,Nidd6遺伝子座の中に、明らかに糖尿病原因遺伝子、なかでも肥満に伴い空腹時血糖値に影響を与える遺伝子の存在を明らかとした。本研究の目的は2型糖尿病の分子遺伝学的理解のために、優れたモデルラットを開発することである。その研究内容は、大きく2部から構成される。一つは、OLETFラットとヒト2型糖尿病遺伝子解析(遺伝子名:IGF2BP2、及び、TOF7L2)の知見を用いて、より優れた疾患モデルラットを開発すること。もう一つは、IGF2BP2、及び、TOF7L2のラットホモログのゲノム解析を行うことである。前半部は、現在バイオリソースプロジェクトで必要系統を準備中であり、次年度には本格的にダブルコンジェニック系統作成に向けて交配が始まる見通しがついた。後半部について、両遺伝子の配列決定をおこなった。我々がこれまで遺伝解析、及び、今回の疾患モデル系統作成に用いるOLETFラットとF344ラット(野生型)について、遺伝的多型の有無を検討した。TCF7L2遺伝子については、exon領域1377bpの配列で、系統間の多型は見いだされなかった。IGFBP2遺伝子については、同じくexon領域1542bpの配列で、2箇所1塩基置換多型(exon4と8)を同定した。しかしながら、どちらの変異もアミノ酸置換を伴わないサイレント変異であったため、疾患原因変異とは考えにくい。一部、両遺伝子のintron領域の配列を比較したが、これまでのところ多型は同定されていない。現在、次年度に向けてリアルタイムPCR法を用いてこれら二つの遺伝子の発現解析を進めている。疾患モデル系統はこれらの遺伝子のOLETFアレルを含むものであり、発現解析はその基礎データとして重要で、あると考えられる。本研究課題の目的は新規2型糖尿病モデル系統を作成することであり、その主眼とするところは世界規模で蔓延する肥満が糖尿病を引き起こすメカニズムを分子レベルで明らかにすることにある。本年度は主に二つの重要な進展があった。一つは新規コンジェニックラットの作成である。そのためヒトIGF2BP遺伝子及びヒトTCF7L2遺伝子ラットホモログを含む遺伝子座であるNidd4/of及びNidd6/ofのOLETF型コンジェニック系統とレプチンレセプター(Lepr)欠損遺伝子をF344ラットに導入した肥満ラットを交配し、ダブルコンジェニックラットの開発を試みた。即ち、F344.OLETF-(D11Mgh4-D11Mgh1)Tj、F344.OLETF-(D1Rat166-D1Rat90)/Tj、F344-Z-leprfa/Tj、これら3系統はマイクロサテライトマーカーを用いて、遺伝子型を確認した。糖尿病原因遺伝子座を持っているコンジェニック系統へレプチンシグナルを欠損した変異を導入するための交配はやや遅れ気味であるが、最終年度で解析に入れるものと考えている。もう一つの成果は、本研究課題で着目している糖尿病原因候補遺伝子のショウジョウバエ変異体の解析を行ったことである。候補遺伝子の一つであるigf2bp2遺伝子のホモログであるimp遺伝子について機能解析を行った。Protein Trap法と呼ばれる手法を用いてimp遺伝子の幼虫期における発現パターンを解析した。その結果、一部の中枢神経細胞での発現が確認された。次に脂肪代謝に与える影響について検討した。空腹時及び節食時における体液中性脂肪の量に有意な差は見られなかったが、現在、体液中糖濃度の変化を慎重に検討している。ショウジョウバエを「2次モデル動物」として用いることは、検証のみならず分子機構の解明に寄与する可能性が期待される。主に二つの重要な進展があった。バイオリソース「ラット」より以下の系統を受精卵から個体を作成した。F344.OLETF-(DllMgh4-DllMgh1)Tj、F344.OLETF-(DlRat166-DlRat90)/Tj、F344-Z-leprfa/Tj、これら3系統はマイクロサテライトマーカーを用いて、遺伝子型を確認した。前者の2系統については通常食と高脂肪食給餌下における特性比較を行った。また、同実験群における体脂肪の蓄積状況についてはCTスキャンを用いて行った。

本方法により皮下脂肪・内臓脂肪の割合の算出を非侵襲的かつ経時的に行うことが可能となり、肥満と糖尿病研究にバイオイメージングの手法を取り入れることに成功した。さらに糖尿病原因遺伝子座を持っているコンジェニック系統へレプチンシグナルを欠損した変異を導入した系統を作成した。もう一つの成果は、本研究課題で着目している糖尿病原因候補遺伝子のショウジョウバエ変異体の解析を行ったことである。候補遺伝子の一つであるigf2bp2遺伝子のホモログであるimp遺伝子について機能解析を行った。まず、imp遺伝子の発現解析を行ったところ、一部の中枢神経細胞での発現が確認された。次に神経細胞特異的にimp遺伝子の機能を低下させた系統を作成し、基礎糖代謝を検討した。その結果、空腹時においては体液中糖濃度の上昇が確認された。哺乳動物の遺伝子マッピングの過程において迅速な候補遺伝子の検証は重要である。ショウジョウバエを「2次モデル動物」として用いることは、検証のみならず分子機構の解明に寄与する可能性が期待される。
慢性腎臓病における血清スルファチド異常の臨床的重要性と機序の解明

本研究は1慢性腎臓病(CKD)患者における血清スルファチド異常の臨床的意義を明らかにすること、2CKDによる血清スルファチド低下機序を明らかにすることを目的としている。2018年度は、CKD患者の血清サンプルを用いた臨床研究を進めつつ、各種モデルマウスを用いてCKDに伴うスルファチド代謝異常の出現機序について検討した。CKDモデルマウスとして5/6腎摘マウスを用い、CKDにより血清スルファチド異常が出現することを再確認した。そして、スルファチド異常はCKDに伴うインドキシル硫酸の体内蓄積によりスルファチド分解酵素群の発現が増加することにより起こることを新たに見出した。この結果は培養実験でも確認された。CKDには高血圧や高脂血症などのCKD増悪因子が関連するため、これらの影響についても検討した。高血圧モデルとして持続的アンジオテンシンII投与マウスを用いた。高血圧の出現に伴い血清スルファチド値が低下すること、降圧薬の投与によりこのスルファチド異常は軽減すること、血清スルファチド変化はスルファチド合成酵素の発現変化によること、そしてスルファチド合成酵素の発現に影響を与える因子は、血圧自体、酸化ストレス、核内転写調節因子であるPPARαであることが示唆された。高脂血症モデルマウスとしては、高コレステロール食負荷モデルを用いた。高コレステロール食の持続的摂取により、血清スルファチド値が低下すること、そしてこの変化はスルファチド合成酵素群の発現低下によること、PPARαの欠損状態ではこのスルファチド異常が顕著になることが明らかとなった。これらの研究結果はCKDに伴うスルファチド異常に対する治療法開発に大変重要である。基礎的研究については、概ね研究結果を論文として公表することができている。臨床的研究についても、血清スルファチド値の測定自体は順調に進んでいる状況である。基礎研究としては、糖尿病状態や飽和脂肪酸に変調した食事がスルファチド代謝に与える影響についても検討予定である。臨床的研究については、スルファチド値の測定後、臨床的アウトカム(心血管病、死亡など)との関連性について統計的に解析する予定である。2018年度は本科研費取得前に購入してあった試薬を用いて実験を行えたため、予定よりも少ない支出で研究成果を上げることができた。しかし、2019年度はこれらの試薬を消耗したため、多くの実験試薬や消耗品が必要となる。また、2018年度に出した研究成果を発表するため、学会発表や論文作成に関わる費用が増大する予定であり、2018年度の繰越金もそれらに充てる予定である。
バイオモジュレーターとしてのプロテアーゼ

細胞内蛋白分解の実体を明らかにするための重点領域研究「蛋白分解のニューバイオロジー」を開始するにあたり、種々の準備を行った。(1)蛋白分解の領域の現時点での問題点と今後の展望の分析本重点領域は2つの計画班と公募研究で推進するが、研究は各自がこれまで進めてきた研究をそのまま強力に推進するだけでなく、テーマを決めて班全体として解決に向うテーマを設定するつもりである。そのためには各研究分野で現在の問題点を明確にするとともに、今後の研究の動向を見定める必要がある。そのため、プロテアソーム、カルパイン系、リソソーム系の3大蛋白質分解系、ならびに蛋白質の寿命決定機構、プロテアーゼ作用と細胞機能、プロテアーゼ作用と病態、の6点にテーマを絞って専門家2人が講師となり勉強会を開いた。その結果、今後の大きな問題点として蛋白の寿命を決めるシグナルの同定、蛋白分解の高感度測定法の開発、特異的および非特異的阻害剤の開発等が今後の焦点として浮かび上がった。(2)公募研究課題として望ましい研究の分析上記の勉強会の結果をふまえ、重点領域研究を推進するためにふさわしい研究テーマを検討した。その結果、本領域全体としてのレベルの向上も極めて重要ではあるものの、公募研究についても上記のような焦点を絞った研究テーマを中心にするべきであるとの意見で一致した。これをもとに、今後は毎年ある程度テーマを変える可能性はあるものの、中心課題に合った公募研究と計画研究とで本重点領域研究を運営することでまとまった。
ロウ管形状のディジタルデータ保存とレプリカ作製技術の開発

エジソンの発明である蓄音機の記録媒体のロウ管は,従来リアルタイムの音声再生について研究されてきた.ロウ管の主素材が植物性のロウであり針による再生そのものが音溝の破壊につながること,破損のあるロウ管であっても非接触方式であれば部分的な再生が可能なことから,特に,光を用いた非接触非破壊方式による再生は重要な技術である.本研究では,リアルタイムの音声再生から離れ,ロウ管の形状を忠実に測定・記録すること,およびそのレプリカを作製することを主な特徴とする.ロウ管に記録されている音溝は記録状態による違いはあるが,深さ100μm程度である.この形状を忠実に複写するために,歯科で用いられる印象剤を利用した.シリコン系2液混合型の印象材は対象への密着性,固化における体積変化の少なさ,混合比による固化時間制御性に優れている.音溝情報のみを取り出すためにロウ管表面に薄く印象材を塗布し,固化後にこれを剥離し,平面に展開した後,レーザ変位計により音溝の変位計測を行った.レーザ変位計の深さ方向分解能は0.1μmであり,深さの測定データから音声を再現するのに十分な分解能を有している.また,印象材のもつ柔軟性から,塗布,剥離の工程においてロウ管にはダメージを与えていない.結果として,印象材により作製した雌型を平面に展開しての形状計測に成功した.今後の課題として,円筒形を平面に展開することにより切断した部分のデータの連続性を自動的に見つけ出し,音声データとして完成させることがあげられる.本研究の成果を用いて,ロウ管の表面形状測定の完全自動化と得られたデータを用いた音声再生およびレプリカ作製を目指す.ロウ管形状のレプリカ作製技術今年度は歯科用印象剤を用いてロウ管表面形状の雌型作製を行った.2剤混合型を用い,混合比率の違いによる,混合における発泡の程度,粘度,ロウ管表面への密着度,型取り後に平面展開するための伸展の程度等について検討を行った.結果として歯科で用いる場合に比べ,体積比で1/3程度まで固化剤の割合を減らすことでロウ管表面形状を平面展開できる程度に薄いシート状の雌型を作製できることが確認できた.この技術を用いて作製した雌型を形状計測し,ディジタルデータとして保存することが今後の課題である.ディジタルデータ保存本研究では,上記技術により作製した雌型の形状計測を行う.雌型はシリコンであるため,一般的な触針接触式の形状計測手法は適用できない.そのため,非接触非破壊による形状計測が可能であるレーザ変位計を採用した.測定制度は0.01μmであり,ロウ管の音溝の深さ変位(約100μm)に十分対応できる.本年度は,変位計の精度確認,操作法の修得,データ保存のためのPCとの接続およびデータ転送までを行った.エジソンの発明である蓄音機の記録媒体のロウ管は,従来リアルタイムの音声再生について研究されてきた.ロウ管の主素材が植物性のロウであり針による再生そのものが音溝の破壊につながること,破損のあるロウ管であっても非接触方式であれば部分的な再生が可能なことから,特に,光を用いた非接触非破壊方式による再生は重要な技術である.本研究では,リアルタイムの音声再生から離れ,ロウ管の形状を忠実に測定・記録すること,およびそのレプリカを作製することを主な特徴とする.ロウ管に記録されている音溝は記録状態による違いはあるが,深さ100μm程度である.この形状を忠実に複写するために,歯科で用いられる印象剤を利用した.シリコン系2液混合型の印象材は対象への密着性,固化における体積変化の少なさ,混合比による固化時間制御性に優れている.音溝情報のみを取り出すためにロウ管表面に薄く印象材を塗布し,固化後にこれを剥離し,平面に展開した後,レーザ変位計により音溝の変位計測を行った.レーザ変位計の深さ方向分解能は0.1μmであり,深さの測定データから音声を再現するのに十分な分解能を有している.また,印象材のもつ柔軟性から,塗布,剥離の工程においてロウ管にはダメージを与えていない.結果として,印象材により作製した雌型を平面に展開しての形状計測に成功した.今後の課題として,円筒形を平面に展開することにより切断した部分のデータの連続性を自動的に見つけ出し,音声データとして完成させることがあげられる.本研究の成果を用いて,ロウ管の表面形状測定の完全自動化と得られたデータを用いた音声再生およびレプリカ作製を目指す.
マグネティックセラソームの開発と新機能

本研究では、外部磁場を制御することで自在なマニピュレーションが可能な、ナノカプセルとしての人工細胞膜を開発することを目的とした。具体的には、申請者らが独自に開発した高強度の人工細胞膜「セラソーム」を用いて、その表面に磁性体をコーティングした「マグネティックセラソーム」を作製し、この特異な磁気特性に基づいて、磁場制御によるマニピュレーションが可能でかつカプセル機能を併せもった新規ナノ材料の開発を目指して研究を行った。本年度に得られた成果は以下のとおりである。1.磁性ナノ粒子をコーティングしたセラソームの作製と機能評価前年度に申請者らは、交互積層法を利用してフェライトのナノ粒子をセラソーム表面に集積できることを見出している。本年度は、この複合体のマグネティックセラソームとしての特性をさらに詳細に評価した。その結果、セラソームのカプセル機能を活かした外部磁場制御による物質輸送系の構築が可能であることを明らかにした。2.磁性薄膜をコーティングしたセラソームの作製と機能評価申請者らはごく最近、無電解めっき法を利用してセラソーム表層を金属薄膜で被覆できることを見出している。本研究では、セラソーム表層の磁性薄膜形成に無電解めっき法を適用して、マグネティックセラソームの作製について検討した。各種分光機器をはじめ、透過型電子顕微鏡、走査型電子顕微鏡、走査プローブ顕微鏡、光学顕微鏡などを用いて、マグネティックセラソームの構造ならびに機能特性を評価した結果、人工細胞膜としてのセラソームが、これまで明らかにしてきた有機-無機複合体としての機能に加えて、磁性ナノ材料としても有効であることを明らかにした。1.「マグネティックセラソーム」を作製するためのセラソーム形成脂質の開発セラソームに磁性を付与するためのアプローチとして、無機磁性体ナノ粒子をコーティングする方法、無機磁性体薄膜をコーティングする方法、有機磁性体分子を組み込む方法の3つについて検討した。そのために、表面電荷の異なるセラソーム形成脂質や、金属配位部位をもつセラソーム形成脂質などを新たに開発した。2.「マグネティックセラソーム」を作製するためのベシクル構造の制御セラソームのベシクル構造を制御するために、従来のセラソーム作製法に改良を加え、ベシクルのサイズは50nmから数μmの範囲で制御できることを明らかにした。また、混合脂質系を用いることでドメイン形成も可能であり、水中のみならず有機溶媒中でも安定なセラソーム作製法も開発した。3.無機磁性体ナノ粒子をコーティングした「マグネティックセラソーム」の作製本年度に検討したマグネティックセラソームの作製法の中で、無機磁性体ナノ粒子をコーティングする方法が有効であることを見出した。すなわち、粒径が10nm程度のフェライトナノ粒子を作製し、これを静電的多点相互作用を利用してセラソーム表面に修飾できることを明らかにした。得られたマグネティックセラソームは、溶液中で磁場によりマニピュレートできることもわかった。
骨粗鬆症のスクリーニングテスト開発のための骨塩量関連遺伝子の解析

山梨県下の一農村地域の女性120人に対して、骨塩量を測定し、末梢血から抽出したゲノムDNA多型との関連をみた。骨塩量はDEXA法で測定した。DNA多型はコラーゲン遺伝子について検討した。既に塩基配列の決定されているコラーゲンI型A2遺伝子のなかに(TTTTTG)_n繰り返し配列が存在したためこの領域を含む部分を増幅するようにPCRプライマーを設定した。PCR産物は8%ポリアクリルアミドゲルにて電気泳動された。30人の血縁関係のない個人についてその多型を検討したが、このグループでは多型は存在せず、全て(TTTTTG)_6(TTTTTG)の配列であった。そこでコラーゲンI型A2遺伝子のIntron12からExon13に存在する多型をPCR-RFLP法で検討した。その結果、対立遺伝子1の頻度は0.44、対立遺伝子2の頻度は0.56であり、白人に比べて対立遺伝子1の頻度が多かった。次にこの遺伝子多型と骨塩量との関連について検討した。対立遺伝子1のホモ接合体の個体の骨塩量の平均値は1.028±0.226、ヘテロ接合体は0.866±0.153、対立遺伝子2のホモ接合体の平均値は0.987±0.078であった。年齢で標準化したZ値はそれぞれ1.97、0.51、1.68であった。骨塩量を決定する遺伝子は複数の遺伝子によると考えられている。その中の一つとしてコラーゲン遺伝子は考えられているが、今回の結果でその結論を出すまでには至らなかった。しかしながら骨粗鬆症患者のなかにこの遺伝子の変異が見つかっていることから骨塩量決定に際してもこの遺伝子は重要な役割をもっているものと考えられる。
アンチエイジングで全身性血管炎における制御性T細胞の制御機能を回復する

アンチエイジング蛋白であるサーチュイン遺伝子(Sirt1)を賦活化して、制御機能が障害されている全身性血管炎(ANCA関連血管炎、結節性多発動脈炎)における制御性T細胞(Treg)の回復研究を継続している。2018年度は、CD4TregにおけるSirt1の発現量と機能障害に関与するエフェクターサイトカインの発現量との相関、またCD8TregにおけるSirt1の発現量と制御機能に寄与するNADPHoxidase(NOX)2の発現との相関の証明(「CD4TregとCD8TregにおけるSirt1と制御因子、炎症性サイトカインの発現に関する解析研究」)を研究計画とし、概ね順調に研究が遂行できた。CD4Tregでは、健常コントロールに比してIFN-γやIL-17などのエフェクターサイトカインが有意に発現する一方でSirt1の発現が低下しており、有意差は得られなかったが両者間に逆相関の傾向が期待された。一方、CD8TregではSirt1およびNox2の発現は明らかに低下していた。Sirt1の活性低下と各々の制御機能に関わる因子との相関関係を明らかにすることはTregの制御機能に関わる分子標的を明確にする重要な研究であり、処理検体の増加を急ぐ。更に2019年度以降からの開始を計画していた「Sirt1の活性化によってTregの制御機能が回復するか検証する研究」にも着手することができた。これはSirt1活性化物質であるレスベラトロールでTregの刺激を行い、Sirt1の活性化によりTregの機能回復に寄与するかを検証する研究である。すなわち、CD4TregではエフェクターT細胞へのシフトがTregとしての機能を障害していると考えているため、エフェクターサイトカインの産生がどれだけ抑制されるかを検証する。またCD8TregではNOX2が制御に関わっているため、その発現の増加を検証する。初年度に計画していた「CD4TregとCD8TregにおけるSirt1と制御因子、炎症性サイトカインの発現に関する解析研究」が順調に進んだことによる。処理検体数が10検体程度である事からもう少し同研究を継続する必要はあるが、初年度の研究で比較的有意な結果が証明できたため、次の研究で必要となるベースラインのデータが蓄積できた。本来は次年度予定としていた「Sirt1の活性化によってTregの制御機能が回復するか検証する研究」にも着手しており、前述のベースラインデータを用いて研究の妥当性が検証できている。初年度の「CD4TregとCD8TregにおけるSirt1と制御因子、炎症性サイトカインの発現に関する解析研究」はベースラインとして重要なデータであるため、次の研究を円滑に進めるためにも十分量の検体数処理を並行して行いたい。一方で測定は「Sirt1の活性化によってTregの制御機能が回復するか検証する研究」の手技の一部と同様であるため、並行して研究が進められる利点があり、実験効率は良好であると確信している。また、レスベラトロールで処理する標的細胞を多めに確保し、細胞内制御因子の発現量評価と並行してsuppression assayを行う事で、今年度の研究目標を早めに終了する計画とする。

本来は次年度予定としていた「Sirt1の活性化によってTregの制御機能が回復するか検証する研究」にも着手しており、前述のベースラインデータを用いて研究の妥当性が検証できている。初年度の「CD4TregとCD8TregにおけるSirt1と制御因子、炎症性サイトカインの発現に関する解析研究」はベースラインとして重要なデータであるため、次の研究を円滑に進めるためにも十分量の検体数処理を並行して行いたい。一方で測定は「Sirt1の活性化によってTregの制御機能が回復するか検証する研究」の手技の一部と同様であるため、並行して研究が進められる利点があり、実験効率は良好であると確信している。また、レスベラトロールで処理する標的細胞を多めに確保し、細胞内制御因子の発現量評価と並行してsuppression assayを行う事で、今年度の研究目標を早めに終了する計画とする。初年度はレスベラトロール処置によるTregの制御因子解析が順調に進み当初の研究計画に比して進展が得られたため、今年度に予定する研究計画の中で、次年度に予定する研究内容の一部を繰り上げで行う事が可能と判断しており、そのための資材購入分を考慮した使用計画となっている。主には、今年度および次年度施行分のsuppression assayの実験件数が大幅に増加する予定であり、細胞分離試薬およびPCR資材の大量購入が必要になるため、その購入費用として使用する予定である。
レトロポゾン転移機構の解析と遺伝子治療ベクターへの応用

レトロポゾンとはRNAを転移の中間体とする転移因子の総称である。ゲノムプロジェクトの進展により、LINE(long interspersed elements)と呼ばれるレトロポゾンがヒトゲノムの21%を占める事が分かった。L1をはじめとする多くのLINEは挿入配列の特異性は低く、ほぼランダムにゲノム中に挿入されるが、カイコのTRAS/SARTファミリーと呼ばれているLINEはテロメアリピート配列特異的に挿入され、染色体末端の保護に役立っている可能性が示唆されている。近年、バキュロウイルスを用いて昆虫細胞で発現させたTRAS/SARTのテロメア配列への転移をTRAS/SART特異的なプライマーとテロメア配列のプライマーを用いてPCRで検出する実験系が構築され、LINEの転移機構研究のよいモデルシステムになると期待されている。本研究の目的はこの転移系を応用して、これまで転移を検出できなかったSINEの転移機構を解明することと、LINEの配列特異的挿入機構を利用した、新しい遺伝子治療ベクターの構築である。今年度はSINE転移検出の為の各種コンストラクトの作成、組換え体バキュロウイルスの作成を行った。また、SART1の転移を詳細に調べるためにin vitroの転移系を構築した。バキュウロウイルス遺伝子発現系を用いてSART1を発現するSf9細胞より、His-tagを利用して、SART1タンパク質を精製し、部位特異的逆転写酵素の活性の検出を試みた。精製したSART1タンパク質RNA複合体はin vitroにおいて、転移活性を有し、カイコテロメア配列に転移が確認された。また、制限酵素で切断した箇所にも効率よく転移することがわかった。さらに、ヒトテロメア配列においても転移可能であることが確認された。
味受容膜および嗅受容膜をモデルとした人工膜センサの開発

嗅細胞においては、匂い物質が吸着すると膜電位変化が起こる。嗅細胞膜の機能を有する人工膜センサーを開発するために、リポソームに匂い物質を与え、膜電位変化を測定した。各種の脂質でリポソームを作製し、匂い物質を与えたときの膜電位変化を、膜電位感受性の蛍光色素を用いて測定した。まず脳から抽出した脂質により作製したリポソームに、匂い物質を与えたところ、細胞の場合と異なり、過分極方向の膜電位変化が観測された。一方、アゾレクチン(大豆の脂質)で作製したリポソームは嗅細胞の場合と同じように、各種の匂い物質により脱分極方向の膜電位変化を示した。卵黄レシチン(PC)のリポソームに、匂い物質を与えたときにも、各種の匂い物質により膜電位変化が見られた。各匂い物質による膜電位変化の大きさは、アゾレクチンリポソームの場合より小さいが、膜電位変化はより低濃度で起こった。卵黄PCに小量のコレステロールを添加すると、ムスコンに対する応答のみが増大した。コレステロールの割合を増やすと、いずれの応答も小さくなったこのように、脂質組成を変化させると応答特異性が変化することがわかった。アゾレクチンおよび卵黄PCリポソームに、各種の匂い物質を与えると、膜流動性が変化した。ムスコンおよびアミルアセテートは、膜流動性を増大させ、ヨノンは低下させた。各匂い物質が膜流動性を変化させる濃度領域は、膜電位変化の起こる濃度領域と同じであった。匂い物質がリポソームに吸着すると、膜構造が変化し、この結果膜流動性が変化したものとおもわれる。膜電位変化は、膜構造の変化により起こるものと推察した。以上の結果により、匂い物質に応答する人工膜センサーの作製に成功した。今後さらに感度を上げることが必要である。
抗癌剤多剤耐性解除作用を有するアルカンジアミン誘導体の構造活性相関

抗癌剤多剤耐性が癌化学療法における大きな障害であることが明らかとされている.抗癌剤多剤耐性解除作用を有する化合物の探索を目的として、直鎖の(1)ジアミン、(2)ジカルボキサミド、(3)ジスルホンアミドを合成し、多剤耐性P388マウス白血病細胞に対する構造活性相関をin vitroで検討した。一般に(3)>(1)>(2)の順に作用が強い傾向を認めた。さらに、N-メチル誘導体の作用が強いとの知見を得た。これらの知見を基に、環状化合物を合成し、in vivoにおける1,2,3,4,5,6-ヘキサヒドロ-2,5-ビス(p-トルエンスルホニル)ベンゾ[2,5]ジアゾシンの強い抗癌剤多剤耐性解除作用を見いだした。さらに、1,3,5-トリアザシクロヘプタンを中心とした一連のアルカンジアミン誘導体を合成し、多剤耐性解除作用をin vitroおよびin vivoで検討した。これらの化合物の多くは耐性細胞内へのビンブラスチンの蓄積を増加させたが、感受性細胞では影響は少なかった。それらの中で特に興味深い化合物群は、1,5-ジベンジル-1,3,5-トリアザシクロヘプタンであった。これらの化合物の耐性細胞でのビンブラスチン蓄積増加作用は2,4-ジチオキソ>2-オキソ-4-チオキソ=4-(メチルチオ)-2-オキソ>2,4-ジオキソの順であった。この作用はベンジル基をクロロベンジルに変換するとさらに増強した。最も強い作用は、1,5-ビス(4-クロロベンジル)-1,5,6,7-テトラヒドロ-4-メチルチオ-2H-1,3,5-トリアゼピン-2-オンで見られた。この化合物を細胞培養系でビンブラスチン、アドリアマイシンおよびマイトマイシンCの作用を増強した。さらに、耐性細胞を移植したマウスにビンブラスチンと併用して経口投与すると用量に依存した生存日数の延長傾向を示した。抗癌剤多剤耐性解除作用を有する薬物の開発を目指して、直鎖構造をなすジアミン(1)、ジカルボキサミド(2)、ジスルホンアミド(3)を合わせて36種合成し、マウス白血病P388細胞およびその多剤耐性株P388/ADR細胞を用いて、細胞内ビンブラスチン蓄積に及ぼす影響について検討し、一般に(3)>(1)>(2)の順に作用が強い傾向を認めた。さらにNにメチルを導入したものの作用が強いとの検見を得た。これらの結果に基づいて、(4)の環状構造をなす化合物を合成し、活性を検討したところ、疎水性Arを有する化合物に、耐性細胞に選択性の高い、強いビンブラスチン蓄積増強活性を認めた。それらは細胞培養系で強い多剤耐性解除作用を示した。(1994,Chem.Pharm.Bull.42:1459-1462に一部発表)親水性基を導入したものでは優れた活性を示すものは得られなかった。さらに、(5)の構造をなす化合物の多数合成し、活性を調べたところ、インビトロにおいて(4)に相当する多剤耐性解除作用を有する数種の化合物を見いだした。それらの化合物についてP388/ADR担癌動物で治療試験を行っているが、ビンブラスチンの延命作用に対して経口投与で増強傾向を示すものが得られてきている。抗癌剤多剤耐性が癌化学療法における大きな障害であることが明らかとされている。

多剤耐性癌細胞の多くは細胞膜にP-糖タンパク質を過剰発現しており、そらが耐性の原因となっていることが示されている。それ故、抗癌剤多剤耐性解除作用を有する化合物の探索を目的として、1,3,5-トリアザシクロヘプタンを中心とした一連のアルカンジアミン誘導体を合成し、多剤耐性P388マウス白血病細胞に対する構造活性相関を培養系および動物実験で検討した。今回検討した化合物の多くは耐性細胞内へのビンブラスチンの蓄積を増加させたが、比較対照として用いた感受性細胞での影響は少なかった。それらの中で特に興味深い化合物群は、1,5-ジベンジル-1,3,5-トリアザシクロヘプタンであった。これらの化合物の耐性細胞でのビンブラスチン蓄積増加作用は2,4-ジチオキソ>2-オキソ-4-チオキソ=4-(メチルチオ)-2-オキソ>2,4-ジオキソの順であった。この作用はベンジル基をクロロベンジルに変換するとさらに増強した。最も強い作用は、1,5-ビス(4-クロロベンジル)-1,5,6,7-テトラヒドロ-4-メチルチオ-2H-1,3,5-トリアゼピン-2-オンで見られた。この化合物2μMを細胞培養系でビンブラスチン、アドリアマイシンあるいはマイトマイシンCと併用すると、IC50値で比較して、それぞれ11、4、2倍作用を増強した。さらに、耐性細胞を移植したマウスにビンブラスチン0.2mg/kg(i. p. )と併用して経口投与すると用量に依存した生存日数の延長傾向を示した。このような作用は感受性細胞での実験では認められないか、耐性細胞での作用と比較すると極めて弱いものであった。これらのことから抗癌剤多剤耐性解除薬リ-ド化合物としての1,5-ジベンジル-1,3,5-トリアザシクロヘプタンの意義を示した。