hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
光刺激で薬効制御が可能な抗体薬物複合体の開発

本研究では、非天然アミノ酸を用いずに、タンパク質の活性を損なうことなく、タンパク質のN末端特異的に機能性分子を修飾する新手法の開発を行った。そして、このN末端特異的修飾法を用いて、抗体医薬として臨床で用いられているIgG抗体に対して抗がん剤を修飾した抗体薬物複合体の新規合成法を開発した。さらに、これらの研究過程を通じて、ケージド抗体薬物複合体の合理的な設計指針に関する知見を得ることができた。本研究では、抗がん剤の薬剤活性を光分解性保護基で一時的に抑制したケージド抗がん剤を化学合成し、抗体医薬として使用されている抗体の特定部位にケージド抗がん剤を修飾することで、標的細胞に送達されるまでは複合体が安定かつ薬剤活性が抑えられ、標的細胞において光照射によって確実に薬剤を放出可能な「光活性型抗体薬物複合体(ケージド抗体薬物複合体)」の開発を目指している。まず、抗がん剤の活性を一時的に抑制したケージド抗がん剤の合成を行った。光分解性保護基として6-Bromo-7-hydroxycoumarin-4-ylmethyl基(Bhc基)を用い、Bhc基の4位に抗がん剤としてチューブリン重合阻害剤Monomethyl auristatin F (MMAF)を修飾、7位に末端アルデヒド基を有するPEGリンカーを修飾したケージド抗がん剤の合成を進め、MMAFを修飾可能なBhc-ケージド基誘導体を合成した。一方、ケージド抗がん剤を抗体の特定部位に高効率に修飾するための新たな手法の開発を行った。具体的には生細胞内における非天然アミノ酸のタンパク質への部位特異的導入技術を応用し、芳香族アミン含有非天然アミノ酸を部位特異的に導入したタンパク質を発現させ、弱酸性条件において機能性分子のアルデヒド誘導体との還元的アルキル化反応を行うことで、芳香族アミン特異的かつ高効率な機能性分子(PEGや蛍光基など)の修飾が可能であることを実証した。さらにこの技術開発過程において、タンパク質・ペプチドのN末端特異的修飾法を見いだした。また、抗体医薬品の活性を評価できる細胞実験系を構築した。ケージド抗がん剤の合成に関してはMMAFの入手およびケージド抗がん剤の合成方法を変更したため時間を要したが、これらはおおむね解決されておりケージド抗がん剤合成の目処はついている。一方、ケージド抗がん剤を部位特異的に修飾する技術として、当初の芳香族アミン特異的修飾法以外にタンパク質N末端特異的修飾法を見いだし、簡便かつ高収率なケージド抗体薬物複合体の作製が可能となった。これらの修飾法は抗体以外のタンパク質にも適用できる技術であり、今後様々な研究テーマへの展開が期待される。本研究では、抗がん剤に光分解性保護基を修飾することで薬効を一時的に抑えたケージド抗がん剤を化学合成し、抗体医薬として用いられているIgG抗体の特定部位にケージド抗がん剤を修飾することで、標的細胞に到達するまでは抗がん剤の薬効が抑えられており、標的細胞において光照射によって薬剤放出を制御可能な「ケージド抗体薬物複合体」の開発を目指している。平成28年度は、前年度に見いだしたタンパク質・ペプチドのN末端特異的修飾法を抗体医薬として用いられているIgG抗体への適用を目指した。今回、モデル抗体として乳がん細胞に過剰発現している上皮成長因子受容体2型(Her2)に対するIgG抗体のN末端特異的修飾の検討を行った。N末端のアミノ基のpKa値(7-8)はLys側鎖のpKa値(9-10)より低いため、弱酸性条件下ではN末端アミノ基の一部は脱プロトン化しており求核性を保持しているため、アルデヒド誘導体と還元剤を用いた還元的アミノ化によってN末端優先的にアルデヒド誘導体を修飾可能になると予想される。N末端特異的修飾技術を構築するために、今回は修飾分子として蛍光標識アルデヒド誘導体を用い、pH 5において抗Her2 IgG抗体の還元的アミノ化を行った。反応後の蛍光標識抗体をペプチド断片化しタンデム質量分析で解析したところ、蛍光標識アルデヒド誘導体と抗体の濃度比を調節することでN末端アミノ基特異的に蛍光標識されることが確認された。また、蛍光標識化した抗体に抗原ペプチドを添加することで、抗原依存的な蛍光強度の増大が確認されたことから、抗体のN末端を修飾しても抗原-抗体反応を阻害しないことを確認した。また、ケージド抗がん剤のアルデヒド誘導体の合成方法の改良を行った。IgG抗体のN末端特異的な機能性分子の修飾技術はほぼ確立しており、このN末端特異的修飾技術は抗がん剤を含む様々な機能性分子に適用可能であることから、簡便かつ高効率なケージド抗体薬物複合体の作製が可能になると期待される。一方でケージド抗がん剤の合成に関しては、抗がん剤であるチューブリン重合阻害剤(MMAF)のケージド化およびアルデヒド誘導体の合成方法に改良の必要性が生じ時間を要したため、ケージド抗体薬物複合体の作製および評価に遅れが生じている。これらの問題の解決および研究の遅れにより実施できていない実験を引き続き遂行し、学会発表および論文発表に向けた研究の取りまとめを行うため、研究期間を平成29年度まで延長申請した。本研究は、標的細胞に到達するまでは抗がん剤の薬効が抑えられており、標的細胞において光照射によって薬剤放出を制御可能な「ケージド抗体薬物複合体」の開発を目指して研究を進めている。平成29年度は、前年度までに検討を進めたIgG抗体のN末端特異的修飾法を用いて、抗がん剤をN末端特異的に修飾した抗体薬物複合体の合成を行った。

まず、抗がん剤であるチューブリン重合阻害剤Monomethyl auristatin F(MMAF)の末端2級アミノ基に対して、末端アルデヒドを有するPEGリンカーを連結させた抗がん剤アルデヒド誘導体を化学合成した。その後、乳がん細胞に過剰発現している上皮成長因子受容体2型(Her2)に対するIgG抗体とともに弱酸性条件下で混合し還元的アミノ化を行うことで、IgG抗体のN末端アミノ基特異的なMMAFの修飾反応を行った。反応液をSDS-PAGEで分析したところ、抗体重鎖のN末端アミノ基へのMMAFの修飾は確認できたものの、抗体へのMMAFの修飾効率が低かった。そこで、修飾反応条件の最適化を抗がん剤アルデヒドの代わりにPEGアルデヒド誘導体を用いて検討を進めたところ、水溶液中での反応効率が低下すると考えられる0度以下の低温において、抗体のN末端特異的修飾反応が高効率に進行することを偶然発見した。そこで、この低温における反応を詳細に調べることと、低温で反応を行うことによるIgG抗体の活性への影響を調べるために、前年度に実施したIgG抗体のN末端特異的蛍光標識化を低温条件下で行った後に抗原を添加したところ、抗原濃度依存的に蛍光強度が増大したことから、蛍光免疫センサー分子としての機能を保持していることが確認された。よって、新たに発見した低温条件下におけるN末端特異的修飾反応はIgG抗体の活性に影響を与えないことが示された。本研究では、非天然アミノ酸を用いずに、タンパク質の活性を損なうことなく、タンパク質のN末端特異的に機能性分子を修飾する新手法の開発を行った。そして、このN末端特異的修飾法を用いて、抗体医薬として臨床で用いられているIgG抗体に対して抗がん剤を修飾した抗体薬物複合体の新規合成法を開発した。さらに、これらの研究過程を通じて、ケージド抗体薬物複合体の合理的な設計指針に関する知見を得ることができた。ケージド抗がん剤の化学合成を引き続き行い、合成したケージド抗がん剤の光化学特性評価を進める。そしてケージド抗がん剤を部位特異的に修飾した抗体を作製し、試験管内および細胞実験による評価を行う。さらに、ケージド抗がん剤とタンパク質の部位特異的修飾技術を組み合わせた本手法を様々な種類の抗体薬物複合体に適用することで、本手法の一般性を検証する。ケージド抗がん剤のアルデヒド誘導体の合成法の改良を早急に行う。もし抗がん剤MMAFのケージド化もしくはアルデヒド誘導体の収量が十分でない場合は他の抗がん剤のケージド化を試みる。一方、簡便かつ高効率にIgG抗体のN末端特異的修飾が可能になったことから、合成したケージド抗がん剤のIgG抗体のN末端特異的修飾を行うことでケージド抗体薬物複合体を作製し、その光化学特性などのin vitro評価および細胞実験への適用を試みる。化学生物学ケージド抗がん剤の合成とケージド抗体薬物複合体の作製方法の検討および改良に時間を要したため、当初の計画に遅れが生じた。研究の遅延によって実施できていない実験の遂行と研究の取りまとめを行うために研究期間を延長し、それによって次年度使用額が生じた。研究の遅延により実施できていない実験のための試薬購入費、学会発表のための旅費、論文発表のための英文校閲・論文掲載費に充当して使用する。
市民に分かりやすい民事関連法律用語の言換えに関する研究

本研究では、市民の司法アクセス障害になっている難解な民事関連の法律用語についてわかりやすい言換えや説明を示した。実務家へのアンケート調査(問題語記述調査)及び法律書籍と一般書籍等の語彙調査(コーパス調査)を行った。アンケート調査では、実務家に困難が生じた法律用語51語を挙げてもらった。コーパス調査は、法律の入門書からリスト化した民法用語234語について、『現代日本語書き言葉均衡コーパス』からダウンロードした。アクセス障害となっている98語をリスト化し、用例の出典情報や語源をもとに、共起例、複合語例を示すことに重点を置いた語義の解説をした。また、意味領域の検討には類義関係を整理して説明した。本研究では、市民の司法アクセスの障害となっている難解な民事関連の法律用語についてわかりやすい解説を提案した。実務家へのアンケート調査(問題語記述調査)及び法律書籍と一般書籍等の語彙調査(コーパス調査)を行って、難解な法律用語を類型化して、わかりやすい言換えや説明を考案した。アンケート調査では、実務家に依頼人や当事者とのコミュニケーションで困難が生じた法律用語を3語程度挙げてもらい、その用語についての対応を尋ねた。48名(司法書士31名、弁護士16名、裁判官1名)から回答が得られ、難解と回答された語は51語で、頻度順にリスト化した。コーパス調査では、法律の入門書『日本法への招待〔第2版〕』からリスト化した民法用語234語について、国立国語研究所編『現代日本語書き言葉均衡コーパス』から用例をダウンロードした。用例の出典情報をもとに、法律分野の用例(法律語義)と非法律分野の用例(一般語義)とに分類し、法律語義について法律分野に占める率の高い順に98語をリスト化した。アンケート調査で実務家が回答した難解な法律用語51語とコーパス調査から得られた法律語義98語をすりあわせて、法律用語の「わかりにくさ」について、「難解語義」と「誤解語義」の2つのタイプに分類した。「難解語義」は、「先取特権」のように用語自体に馴染みがないために難解である。「誤解語義」は、「悪意」や「故意」などのように用語が日常語と同じため語義が異なることに“気づかず"市民の誤解を招くために難解である。本研究では、「難解語義」よりも「誤解語義」の方により問題があるとして、「誤解語義」について、具体的な用例や共起例や複合語例を示すことに重点を置いた語義の解説を行った。特に、「作為」「故意」「悪意」については、類義関係を整理する説明を試みて意味領域からも検討した。今後は、対象語をさらに拡大させていきたい。本研究では、重要な難解な法律用語(問題語)を抽出して、法曹と市民の理解を阻んでいる法律用語を法学領域から特定して、市民の目線からの解説や言い換えを提案することにある。平成24年度は、法実務家へのアンケート調査と語彙調査(コーパス調査)を行った。1、アンケート調査法実務家(弁護士・司法書士)のアンケートの調査項目を検討した。性別、年齢に加えて、業務歴(弁護士の場合は司法修習の時期)、今後の研究協力の可能性の有無も問うた。依頼人や当事者とのコミュニケーションで理解が難しい法律用語を3語程度挙げてもらい、説明の工夫等についても自由回答してもらう調査にした。地方都市と首都圏の地域間のバランスをとるために、裁判官と弁護士については、群馬民事研究会でアンケート調査(平成24年9月28日、回収枚数17件)を行い、司法書士については2回に亘る研修会等でアンケート調査(平成24年9月8日と15日、回収枚数31件)を行った。アンケート調査結果から51語を重要な難解な法律用語として抽出した。2、語彙調査コーパスに基づく分類では、『日本法への招待第2版』(松本他、2006)に提出されている民法用語234語をリスト化した。この234語について、国立国語研究所編『現代日本語書き言葉均衡コーパス』(BCCWJ)を検索ツール『中納言』で検索し、検索結果をダウンロードした。ダウンロードしたデータの出典情報をもとに、法律分野の用例と非法律分野の用例が占める比率を語別に算出した。非法律分野の用例数の比率が50%未満のものを第一のタイプ、50%以上のものを第二のタイプに分類した。第一のタイプは、用語リストとその言い換え・説明集の形で指針を示していくことが考えられるが、第二のタイプは、用語リストと言い換え・説明集を示すだけでは不十分で、用語法についてもっと踏み込んだ運用の指針が求められるので、事例研究を始めた。法実務家対象のアンケート調査から、実務家の捉えた問題語とその対応策まとめた。コーパス調査では、抽出された用語と用法について、類型化を始めた。よって、当初の研究計画に沿って進展している。

アンケート調査で、司法書士と弁護士の間には、問題語について若干の異なりが見られた。司法書士は、「遺産分割」「相続放棄」「共有持分」「登記識別情報」「管財事件」「債務名義」「同時廃止」を問題語として挙げた。弁護士は、「瑕疵」「宥恕」「特別受益」「信義則」「悪意」「故意」「債権と債務」「被相続人」「申立人」「相手方」などである。対応策としては、具体的に説明している場合が多く、使わないようにしているという回答もあった。コーパス調査では、BCCWJの検索結果によって分類したタイプの中で、第二タイプ(非法律分野の比率50%以上)の中から事例研究を始めた。具体的には、各語の辞書記述の比較(「明鏡国語辞典」と「有斐閣法律用語辞典」)、法律分野と非法律分野の語義の比較、品詞構成である。例えば、「故意」の場合、法律分野では70.2%が名詞の用例であるのに対し、非法律分野では名詞用例は33.5%で、副詞が58.0%と副詞の用例が多い。日常語と法律用語が同一語であっても、その内実が異なっていることが推測される。日常語と語義の違いが大きい法律用語を市民に説明する場合は、その違いに注意を喚起する工夫が必要である。「故意」のように、法律用語と日常語の語義の異なりが明確な用例もあるが、「錯誤」のように、法律用語(意思とその意思が表れた行為が一致しないこと)と日常語(思っていることと事実とが一致しないこと)のように、重なる部分が多く、連続性の強い用例もある。その連続性を活かす工夫もまた重要であると思われる。1、リスト化した民法用語234語から、非法律分野の比率が低い順選んだ98語に絞って、語源分析を行う。第一タイプは、「先取特権」「地役権」「留置権」「物権」「債務名義」「地上権」「遺留分」「供託」「賃借権」「法律行為」「執行文」「連帯保証」「登記」「登記所」「代位」「弁済」「賃貸権」「法廷代理人」「抵当権」「質権」「催告」「寄託」「公告」「相続人」「不作為」「登記簿」「占有」「相続分」「所有権」「請求権」「履行」「債権」「不法行為」「正当防衛」「損害賠償」の35語である。第二タイプは、「債務」「時効」「親権」「追認」「後見」「取消し」「遺贈」「過失」「精算」「引渡し」「相続」「担保」「離縁」「委任」「免責」「嫡出」「約款」「持分」「血族」「相殺」「故意」「無効」「不動産」「利息」「約定」「異議」「和解」「承諾」「意思」「契約」「保証」「悪意」「解散」「動産」「元本」「離婚」「配偶者」「善意」「養子」「戸籍」「添付」「撤回」「法人」「解除」「扶養」「給付」「委託」「有価証券」「利率」「売買」「理事」「慰謝料」「錯誤」「組合」「混同」「解約」「詐欺」「請負」「雇用」「着手」「共有」「申込み」「認知」の63語である。2、第二タイプについては、辞書記述、語義比較、品詞構成の分析を引き続いて行う。3、アンケート調査とコーパス調査の結果を結合して、問題語の法律用語の類型化を進める。特に、合成語の用例が法律分野では非法律分野の2倍もあるので、言い換えの解説の一助となるような合成語の類型化を試みる。4、98語について、具体的な行為や場面に即した説明や語源の情報も入れ、「一定の結果」「認容する」などの用語を避け、市民にわかりやすい解説をする。解説にあたっては、特に、「一定の結果」「認容する」などの用語を避けるなど表現に注意する。
卵巣がん関連遺伝子の網羅的メタボローム解析

卵巣明細胞癌は子宮内膜症という酸化ストレスの中から発生するが、抗癌剤耐性で予後不良の疾患である。明細胞癌に高発現するHNF1Bはストレス環境においても増殖を促し、抗癌剤耐性に関わることが明らかとなった。また、発癌に関わるARID1AはSWI/SNF複合体に含まれる因子である。AIRD1A因子のみでは予後とに相関を認めなかったが、SWI/SNF複合体全体の発現を検討すると予後とに相関を認めた。代謝に関わる遺伝子を検索するために、代謝異常を示す卵巣明細胞癌において、どのような遺伝子変異やコピー数異常があるかを検討するために明細胞癌39検体を用いてエクソームシークエンス解析を行った。遺伝子変異解析では426遺伝子に変異を認め、62%にARID1A遺伝子、51%にPIK3CA遺伝子、10%にKRAS遺伝子、ARID1B遺伝子変異をそれぞれ認めた。コピー数異常解析では、染色体8qの増幅を64%、20qの増幅を54%、17qの増幅を46%、19pの増幅を41%に認めた。染色体8qにはMYC遺伝子、17qにはERBB2、HNF1B、STAT3遺伝子がある。また、欠失はSMARCA4遺伝子がある19pは41%に、RB1遺伝子がある13qは28%に認めた。遺伝子変異とコピー数異常を統合すると、85%にSWI/SNF複合体に属する因子に、82%にKRAS/PI3Kシグナルに、75%にMYC/RBシグナルに異常を認めた。次にSWI/SNF複合体に着目して解析した。免疫組織染色では卵巣明細胞癌の46.3%にARID1A遺伝子がコードするBAF250a発現の消失を認めた。SWI/SNF複合体全体で見ると、7.8%は1因子のみ、23.2%は複数因子に発現消失を認めたSWI/SNF複合体発現の消失因子多いと有意に進行期が多く、複合体の発現消失は累積的に無病生存期間、全生存期間ともに予後不良であった。多変量解析では病期と、SWI/SNF複合体の発現消失が独立予後予測因子となった。コピー数異常解析では、SWI/SNF複合体の発現消失がない症例は、発現消失のある症例と比較してコピー数異常がより強かった。以上の結果は、卵巣明細胞癌には、SWI/SNF複合体の発現が消失した予後不良の群と、SWI/SNF複合体の発現がありコピー数異常が多い予後良好群との2つの亜型が存在することを示唆している。1)遺伝子改変HSOE細胞における発癌に関わる表現型の確認:遺伝子導入が進んでいない。発癌にかかわる表現型が予想された結果にならない。2)遺伝子改変HOSE細胞の発現マイクロアレイ解析(バイオインフォマティクス)により、各遺伝子シグネチャーの作成とパスウェイ解析、3)遺伝子改変HOOSE細胞を用いた網羅的メタボローム解析(メタボロミクス)により、各遺伝子の代謝への影響を解明、4)新規治療標的物質や遺伝子の治療実験、ヒトサンプルを用いた早期診断法の開発:2)から4)は始めることができないでいる。卵巣癌卵巣明細胞癌細胞株のHNF1B発現抑制株を用いた網羅的メタボローム解析では、糖代謝、アミノ酸代謝、グルタチオン代謝などが大きく変わることがわかっている。この細胞株において発癌に関わる表現型が変わるかを確認する。遺伝子変異のみが代謝に関わるわけではないため、代謝が大きく変わっている卵巣明細胞癌を用いて代謝に関わる因子を探索するためにARID1Aが属するSWI/SNF複合体や、その他の遺伝子などに遺伝子変異などのゲノム異常がないかを検討する。また、代謝に大きな影響を与えているHNF1Bが、卵巣明細胞癌の特徴(抗癌剤耐性、血栓の合併、遅い増殖能)に関わるかを検討する。本年度予定していた解析の一部が予定通り進まなかったため、次年度に行うこととした。その為、予定していた諸費用も次年度へ繰り越すこととした。成功した複数の癌関連遺伝子導入を進め、本年度予定していた代謝解析等、研究計画を進める予定である。
自閉性障害の概日リズム異常の分子機構

自閉性障害(ASD)の病態には大脳皮質発達障害、特にシナプス構造・機能障害が重要な役割りを果たす。一方、半数以上のASD患者は睡眠障害を合併することから概日リズム異常も想定される。しかし、ASDにおける概日リズム障害(時計遺伝子の機能障害)の実体や分子機構、シナプスとの関連性は殆ど判っていない。一方、申請者らは、ASD患者の網羅的遺伝子解析により、10種類の時計関連遺伝子にアミノ酸置換を伴う変異を見出している。そこで本研究では、最先端の高解像度ライブイメージ解析を行なうことで、これらの遺伝子変異が大脳皮質形成とシナプス動態に及ぼす影響を明らかにすることを目的とした。本年度は、時計遺伝子であるTimeless, NR1D1,およびPer3の発現抑制ベクターを構築し、それらの性能チェックを行なうと共に、TimelessとNR1D1の特異抗体の作成を行なった。
前癌肝細胞の癌化および分化に関する研究

Hepatomaの発生と肝再生における前癌病変の関係を明らかにすることは、Hepatomaの予防と治療の上で重要な課題である。本研究では我々が独自に開発した脾内移植肝細胞モデルを使って、hyperplastic nodule(HN)、腹水肝癌さらにDAB肝癌を脾内に移植し観察した。HNについては、宿主肝に部分肝切除を加える以外に、さらに宿主肝再生を抑制する状態で(2-acetylaminofluorene;AAFの前投与後肝切除)脾内移植肝に強い再生刺激を与えてみた。HNの作製は0.025%AAF含有飼料3040日摂取後に発生したearly phaseのHNを使用した。その性状をFlowcytometry、BrdU染色、H.E.染色、γ-GTP染色等を用いて組織学的、細胞動態的に検討した。HNはコラゲナース灌流法で細胞分離し、同系ラット脾内に移植した。移植後3カ月まで経時的に脾臓を摘出し、脾内HNを観察した結果、肝切除後早期には肝切の程度に相関したDNA合成の亢進と増殖を認め、日数経過とともにHNの増殖力は弱まり、3カ月後では正常肝細胞移植後と同程度になった。組織学的にも初め異型性をもっていたが、3カ月後では全く正常肝移植後と同じ形態となり、hepatomaの出現はみられなかった。今回使ったearly phase脾内移植HNは、かなり強い再生刺激を与えられても癌化しないと結論された。佐々木研究所より提供を受けた腹水肝癌3種類AH13、AH66F(自由細胞型)、AH66(島を混ず)の脾内移植(10^4-10^5個)では、前者は肝、脾に白血病様に増殖、後者は脾内に結節上に増殖した。またDAB投与約56カ月頃の肝癌より分離した肝癌細胞の脾内移植では術後510日で脾内に大きな腫瘍塊を形成した。HNについては、今後特にlate phaseのHNと他の方法で作製したHNの脾内移植の検討が引き続き必要とされる。今回の研究からは、肝切除により残存肝に存在する前癌細胞が癌化する可能性は少ないことが示された。肝癌由来の腫瘍細胞,および前癌肝細胞と考えられているHyperplastic nodule(HN)細胞を,同系ラットの脾内に移植した.1.移植する腫瘍細胞としてはDAB肝癌を作製し(DAB投与56カ月),この肝癌組織および肝癌細胞と,佐々木研究所(東京)より腹水肝癌3種類, AH13,AH66F(自由細胞型),AH66(島を混ず)を送ってもらい,新鮮および凍結腫瘍を用いた.2.HN細胞は10週令のWistar系雄性ラットに0.025%2ーAcetylaminofluorene(AAF)含有飼料を3040日間摂食させ,多発性のHNが肉眼的に認められるものより, Berry&Friendの方法によりコラゲナーゼ灌流し, HN部分を核出し,これを細切し細胞とした.結果1: DAB肝癌移植により約510日で脾内に大きな腫瘍塊を形成し,他部位への移植とほぼ同じであった.

腹水肝癌細胞の移植は,自由型は脾,肝に白血病様に,島を混じ型は脾にのみ結節状に増殖した.結果2: HN細胞は脾内に確実に生着した.その組織像は,胞体の明るい大型細胞が索状に増生したところと,小管腔をなす丈の低い細胞が集族するCholangioーfibrosisであった.DNA合成率はBromodexyuridine(Brd)抗体50mg/kg静注し, 1時間後に肝と脾を摘出し, ABCおよびH.E.染色を行ない,細胞1,000個あたり核内に取り込んだBrd Uの細胞を数えた結果,移植一週目肝細胞巣が2035,胆管細胞巣が4555と高率であった.本年度は,主に腫瘍細胞を脾内に移植し,移植した細胞による生着,増殖状態の観察を進めた.次年度は, HNのできた比較的早い時期と, hepatocellular carcinoma(HC)あるいはその少し前の時期の細胞を移植し,比較すること,またこの時に宿主ラットに肝切除,Cyclosporineなどを投与し,移植されたHNおよびHCがどのように変化するかを観察する.2-acethylaminoflucrene(AAF)によるラッド化学発癌の過程で生じるHyperplastic nodule(H.N.)は、前癌病変と目されている。これが肝再生刺激をpromotionとして癌化するか否かを検討するために、0.25%AAF含有飼料3040日摂取後に発生したHNをearly phaseのHNと定義し、その性状をFlowcytometryやBrdu染色、H.&E.染色、γ-GPT染色らを用いて組織学的、細胞動態的に把握し、かつ癌でないことを確認した。その上で、このHNをコラーゲナーゼ灌流法で細胞分離し、同系ラット脾内へ移植し、宿主肝に部分肝切除を加えたり、さらには宿主肝再生を化学的に抑制して脾内肝に強い再生刺激を加えた。移植後3カ月まで経時的に脾臓を摘出し脾内HNを検討した結果、肝切後早期には肝切の程度に相関したDNA合成の亢進と増殖を認め、日数経過とともにHNの増殖力は弱まり、3カ月後では正常肝細胞移植後と同程度になった。組織学的にも始め異型性をもっていたが、3カ月後では全く正常肝移植後と同じ形態となり、hepatomaの出現はみられなかった。以上により、少なくともearlyphaseのHNは部分肝切除刺激によって癌化しないと結論づけられた。
情報の流れによる非平衡熱・統計力学

前年度に得た結果が,論文の形で複数出版に至った.さらに,情報流れを用いた非平衡熱・統計力学を構築するための様々な知見を得ることに成功した.出版した論文の内容は,グラフ理論を基礎とした確率的な熱力学であるSchnakenbergネットワーク理論を用いて, Onsager相反定理の情報流れを含んだ形に拡張を行ったものと,情報の流れの一種である移動エントロピー(transfer entropy)を時間反転方向で定義した新しい量を導入し,情報熱力学と情報理論の関係を議論したもの,等がある.これらの出版内容は,非平衡熱・統計力学を情報流れを含んだ形に拡張するための指針となりうるものであり,本研究課題において重要な意味をもつと考えている.また,本研究課題に関連した成果として,複数の解説や書籍の出版も挙げられる.当該当年度では,情報の流れを含んだ熱力学やその生体系への応用に関する解説記事が生物物理誌から出版され,また物理学会誌にも同様の解説記事の投稿を行った.さらに書籍についても,博士論文の書籍化やブックチャプターなどが出版に至った.新たに開始した研究としては,前述のSchnakenbergネットワーク理論を用いて,非平衡相転移における一般的な枠組みについて研究を行い, ASEPなどの具体的な非平衡相転移模型を解析したものと,生体システムにおける情報熱力学の新たな適用例を構築したものが挙げられる.翌年度、交付申請を辞退するため、記入しない。翌年度、交付申請を辞退するため、記入しない。前年度はこれまでにやってきた複数の研究をまとめながら、さらに研究課題を完成させるために複数の新しい研究を試行錯誤しながら行った。以下の研究が今年度に行った主な研究である。《『情報理論による熱力学の拡張と、生物現象への応用』について》熱力学第二法則の情報理論への拡張である一般化第二法則を用いることで,生体の情報通信システムである「大腸菌の走化性」を解析した.その結果として『大腸菌の細胞内を流れる情報量が、外界からのノイズに対して走化性がどのくらい安定(ロバストネス)であるかを決める』という熱力学的な関係があることを明らかにした。この結果はNature Communication誌にて出版された。《『情報の流れを含んだオンサーガー相反関係』について》情報の流れを統計力学に拡張する第一歩として、情報の流れが存在するときに既存の非平衡統計力学の法則が成り立つかどうかを調べた。その結果、既存の非平衡統計力学の法則であるオンサーガー相反関係が、熱力学量と情報の間にも成り立つことを極めて一般的に示すことに成功した。この結果は近日投稿予定である。《『確率的な熱力学を基礎とした非平衡相転移理論』について》非平衡相転移理論を、情報を含んだ形に拡張するための前段階として、情報理論と熱力学の融合である確率的な熱力学を基礎とした非平衡相転移理論の構築に着手した。相転移理論で重要な役割を果たす自由エネルギーを、グラフ理論によって熱力学的に記述する方法を構築し、明示的に非平衡相転移現象における様々な熱力学的な効果の寄与を記述する手法を編み出した。この結果を用いて、ASEPやGlauber dynamicsなどの具体的な(非)平衡相転移模型を扱うことを次のステップとしている。『情報理論を用いて非平衡熱・統計力学を拡張していく』という計画のなかで、非平衡統計力学の金字塔であるオンサーガー相反定理を「情報の流れ」まで拡張ができたという今年度の成果は、計画を進行させる上で非常に重要な指針となりうるからである。特に確率模型であるMarkov jump過程に対し、グラフ理論的な確率的な熱力学形式であるSchnakenbergネットワーク理論を用いることで、極めて簡潔な証明を得ることに成功したのが本成果の重要な点であり、本研究課題の目標である『情報理論を用いた非平衡相転移理論の拡張』に素直に応用できる可能性を秘めている。特に、同様の手法を用いて相転移理論で重要な役割を果たす自由エネルギーを、グラフ理論によって熱力学的に記述する方法を構築できたのも大きい。同様の手法を出発点にすることで、将来的に現在構築中の『確率的な熱力学を基礎とした非平衡相転移理論』のなかに「情報の流れ」が含まれる形で拡張が可能なのではないかと期待している。前年度に得た結果が,論文の形で複数出版に至った.さらに,情報流れを用いた非平衡熱・統計力学を構築するための様々な知見を得ることに成功した.出版した論文の内容は,グラフ理論を基礎とした確率的な熱力学であるSchnakenbergネットワーク理論を用いて, Onsager相反定理の情報流れを含んだ形に拡張を行ったものと,情報の流れの一種である移動エントロピー(transfer entropy)を時間反転方向で定義した新しい量を導入し,情報熱力学と情報理論の関係を議論したもの,等がある.これらの出版内容は,非平衡熱・統計力学を情報流れを含んだ形に拡張するための指針となりうるものであり,本研究課題において重要な意味をもつと考えている.また,本研究課題に関連した成果として,複数の解説や書籍の出版も挙げられる.当該当年度では,情報の流れを含んだ熱力学やその生体系への応用に関する解説記事が生物物理誌から出版され,また物理学会誌にも同様の解説記事の投稿を行った.さらに書籍についても,博士論文の書籍化やブックチャプターなどが出版に至った.新たに開始した研究としては,前述のSchnakenbergネットワーク理論を用いて,非平衡相転移における一般的な枠組みについて研究を行い, ASEPなどの具体的な非平衡相転移模型を解析したものと,生体システムにおける情報熱力学の新たな適用例を構築したものが挙げられる.

今後は『情報の流れを含んだオンサーガー相反関係』の研究で得られた、新たに判明した事実を基礎にして、『情報の流れによる非平衡熱・統計力学』のさらなる構築に力をいれていく。特に情報と熱力学における新しい知見を用いて、新しい「情報の流れ」の尺度を導入したり、もしくはグラフ理論の手法を駆使することで、現行の『非平衡熱・統計力学』の様々な理論を「情報の流れ」を用いて拡張していく。特に非平衡相転移の理論を情報に拡張するために、まずは『確率的な熱力学を基礎とした非平衡相転移理論』を完成させることを一つの目標にしたい。翌年度、交付申請を辞退するため、記入しない。国際共同研究者のwebページ
リサイクル古紙を利用した環境保全型農業に関する研究

リサイクル古紙による作物の生育阻害を知るために,粉砕して6mmメッシュを通した5種類のリサイクル古紙の水抽出液について,pHと発芽・初期の生育阻害を検討し,広告紙を含まない印刷前新聞紙はpHが低く,発芽や生育に対する阻害の小さいことを認めた.そこで,砂丘畑にこの6mmメッシュを通した印刷前新聞紙(以下紙資材)を播種条20cm幅の深さ10cmの土壌に容積比25%,50%,75%,および0%(対照)で混合し,ダイズ(2003年と2004年,条間60cm・株間20cm)およびトウモロコシ(2004年,条間75cm・株間25cm)を栽培した.また大麦と小麦についてもガラスハウス内で準じた栽培(12月播種)を行った.紙資材を混合した土壌層では,土壌水分が高く,地温についても最高気温が低く,最低気温の高かった.また,紙資材を混合すると,8月においても紙資材混入土壌層のアンモニア態窒素含有量が高かった.なお,これらの効果は,25%,50%混合区では顕著であったが,75%混合区では雨水や潅漑水の下層への浸透が悪くて混合した土壌層から横方向への水の流亡が推察され,大きくなかった.ダイズ,トウモロコシ,麦類のいずれでも,土壌が乾燥している条件では土壌の水分保持に優れた25%,50%混合の出芽が無処理に比べ優れた.また,ダイズの25%,50%混合区では分枝数,着莢数が多く,収量がやや高かった.そしてこれら区では,降雨が少なくて土壌が乾燥した時期に対照区や75%区に比べ気孔抵抗値が低く,出液量が多く,地表面から10cmまでの土壌層に分布する根量が多かった.しかしトウモロコシでは,これらの関係が明確でなく,75%混合区では根の伸長が阻害され,生育・収量がかえって対照区に劣った,このことから,紙資材土壌混合による根を中心とした生育阻害も考えられ,それが降雨の多い場合や乾燥に強い作物においてより強く現れると推察された.リサイクル古紙による作物の生育阻害を知るために,粉砕して6mmメッシュを通した5種類のリサイクル古紙の水抽出液について,pHと発芽・初期の生育阻害を検討し,広告紙を含まない印刷前新聞紙はpHが低く,発芽や生育に対する阻害の小さいことを認めた.そこで,砂丘畑にこの6mmメッシュを通した印刷前新聞紙(以下紙資材)を播種条20cm幅の深さ10cmの土壌に容積比25%,50%,75%,および0%(対照)で混合し,ダイズ(2003年と2004年,条間60cm・株間20cm)およびトウモロコシ(2004年,条間75cm・株間25cm)を栽培した.また大麦と小麦についてもガラスハウス内で準じた栽培(12月播種)を行った.紙資材を混合した土壌層では,土壌水分が高く,地温についても最高気温が低く,最低気温の高かった.また,紙資材を混合すると,8月においても紙資材混入土壌層のアンモニア態窒素含有量が高かった.なお,これらの効果は,25%,50%混合区では顕著であったが,75%混合区では雨水や潅漑水の下層への浸透が悪くて混合した土壌層から横方向への水の流亡が推察され,大きくなかった.ダイズ,トウモロコシ,麦類のいずれでも,土壌が乾燥している条件では土壌の水分保持に優れた25%,50%混合の出芽が無処理に比べ優れた.また,ダイズの25%,50%混合区では分枝数,着莢数が多く,収量がやや高かった.そしてこれら区では,降雨が少なくて土壌が乾燥した時期に対照区や75%区に比べ気孔抵抗値が低く,出液量が多く,地表面から10cmまでの土壌層に分布する根量が多かった.しかしトウモロコシでは,これらの関係が明確でなく,75%混合区では根の伸長が阻害され,生育・収量がかえって対照区に劣った,このことから,紙資材土壌混合による根を中心とした生育阻害も考えられ,それが降雨の多い場合や乾燥に強い作物においてより強く現れると推察された.リサイクル古紙による作物の生育阻害を知るために,粉砕した5種類のリサイクル古紙の水抽出液について,pHと発芽・初期の生育阻害を検討した.広告紙を含まない印刷前新聞紙では,pHが低く,発芽・生育阻害を認めなかった.砂丘畑において,播種する条20cm幅の地表面下10cmの土壌層に切断粉砕した広告紙を含まない新聞紙を混和(容積比で25%,50%,75%,対照無混合)してダイズを栽培(播種時期6月20日)した.この新聞紙を混和した土壌層では,土壌水分が高く,日中の最高地温が低く,8月の土壌中アンモニア態窒素濃度も高かった.これら効果は,その効果は混和量が多いほど大きかった.しかしこれらの効果は,混合した土壌層より下の層では認められなかった.このように粉砕新聞紙を混合した土壌層においては,土壌水分が高く保持されたため,ダイズの出芽が早く出芽率もやや高くなった.しかし,栄養生育量・収量,あるいは気孔の開度には効果が認められなかった.この理由として本年は7月の降雨量(431mm)が平年のそれ(231mm)に比べ多かったことが考えられたので,降雨量が少なくなった7月31日にダイズを播種し,効果を検討した.

このような降雨の少ない条件では,粉砕新聞紙の土壌混合によって出芽,気孔の開度が優れ,葉色も濃くなった.しかし,生育・収量は50%混合>25%混合>無混合混合であった.75%混合では明らかな根の伸長抑制が見られた.粉砕新聞紙そのものによる生育阻害ははとんど考えられないので,この根伸長抑制は古紙の物理的要因によるものと考えた.砂丘畑において,粉砕して6mmメッシュを通した印刷前新聞紙(以下紙資材)を播種条20cm幅の深さ10cmの土壌に容積比25%,50%,75%,および0%(対照)で混合し,ダイズ(6月15日播種,条間60cm・株間20cm)およびトウモロコシ(6月1日播種,条間75cm・株間25cm)を栽培した.また大麦と小麦についてもガラスハウス内で準じた栽培(12月314日播種)を行った.紙資材を混合した土壌層では,土壌水分が高く,地温についても最高気温が低く,最低気温の高かった.また,紙資材を混合すると,8月においても紙資材混入土壌層のアンモニア態窒素含有量が高かった.なお,これらの効果は,25%,50%混合区では顕著であったが,75%混合区では雨水や潅漑水の下層への浸透が悪くて混合した土壌層から横方向への水の流亡が推察され,大きくなかった.ダイズ,トウモロコシ,および麦類のいずれでも,土壌が乾燥している条件では土壌の水分保持に優れた25%,50%混合の出芽が無処理に比べ優れた.また,ダイズの25%,50%混合区では分枝数,着莢数が多く,収量がやや高かった.そしてこれら区では,降雨が少なくて土壌が乾燥した時期に対照区や75%区に比べ気孔抵抗値が低く,出液量が多く,地表面から10cmまでの土壌層に分布する根量が多かった.しかしトウモロコシでは,これらの関係が明確でなく,75%混合区では根の伸長が阻害され,生育・収量がかえって対照区に劣った,このことから,紙資材土壌混合による根を中心とした生育阻害も考えられ,それが降雨の多い場合や乾燥に強い作物においてより強く現れると推察された.
高配位ビニルヨウ素錯体と反応性中間体の時空間制御

ビニルヨードニウム塩は、結晶状態では、対アニオンと超原子価相互作用をもつような構造をとっている。溶液状態では対アニオンの求核性に応じて超原子価錯体と平衡状態にあると考えられ、実際にハロゲン化物イオンとの反応においては、超原子価錯体、λ^3-ハロヨーダンの生成が反応に大きく関与している。ビニルヨードニウムテトラフルオロボラート塩の溶液にハロゲン化物イオンを添加すると、λ^3-ハロヨーダンの生成による新しい吸収が長波長側に観測される。今回、シクロヘキセニルヨードニウムテトラフルオロボラートと臭化物イオンとの反応の速度を測定し、遊離ヨードニウムイオンとλ^3-ハロヨーダンの反応性を定量的に評価した。反応は臭化物塩の添加によって大きく阻害され、反応速度は臭化物濃度とともに飽和曲線を描いて減少した。その曲線を解析することによって、ヨーダン生成の平衡定数K_1と、ヨードニウムイオンとヨーダンの単分子分解速度定数(k_1とk_2)を決定することができる。平衡定数も速度定数も反応溶媒に依存し、クロロホルム、アセトニトリル、メタノールにおけるK_1/M^<-1>:10^4k_1/s^<-1>:10^4k_2/s^<-1>は1600:8.1:1.5、690:30:0.6、5.0:6.8:0と大きく変化した。錯体生成は電荷の消失を伴うので溶媒極性の小さいほどK_1は大きい。ヨードニウムイオンの反応は、イオン基質からイオンの生成であり、k_1奥は溶媒にあまり依存しない。一方、ヨーダンの反応速度k_2は溶媒極性とともに大きく減少している。これはヨーダンの主反応が、イオン化ではなく分子内のリガンドカップリングであることを示唆している。したがって、ヨーダニル基の脱離能は非常に小さいと言える。すなわち、ヨードニオ基の脱離能はヨーダニル基にくらべると桁違いに大きい。シクロペンテニルヨードニウムテトラフルオロボラート(1)を合成し、クロロホルム溶液中、60°Cで種々の求核剤/塩基との反応を調べた。臭化物はビニル置換生成物を主として生成したのに対して、シアン化物はアリル型置換生成物を与えた。一方,酢酸イオンは両者の置換生成物を与えた。臭化物の反応は,類似のヨードニウム塩の場合と同じように超原子価中間体を経てリガンドカップリングによって進んでいると考えられた。酢酸イオンの反応はシクロヘキセニル誘導体の場合と同じように,脱離-付加機構によって進行している可能性があるため,重水素化基質を合成し、生成物の重水素分布を調べた。その結果,重水素は反応中全く失われていないことから、脱離中間体を経ていないことがわかった。また、非常に効率のよい捕捉剤であるテトラフェニルシクロペンタジエノンを用いてもシクロペンチンは捕捉されなかった。ビニル置換体は主としてリガンドカップリングで生成しているものの、部分的に重水素の移動が起こっており、付加-脱離によるカルベン中間体からの転位でも生じているものと結論された。アリル型生成物は、マイケル付加によって生成したヨードニウムイリドからヨードニオ基の脱離でカルベンを生じ、1,2(重)水素移動で生成したものと結論された。また反応速度は、求核剤濃度にほとんど依存せず,超原子価中間体(ヨーダン)を生成する前段平衡を経て反応が進んでいるものとして説明された。
神経冠進化の分子メカニズムの解明

脊椎動物の複雑な頭部顔面形成には、神経堤細胞による咽頭領域の前後軸にそったパターニングが必須であり、そのパターニングにはHoxコードが中心的な役割を果たしている。一方、脊椎動物ともっとも近縁な無脊椎動物であるホヤやナメクジウオはHox遺伝子が神経管でのみ前後軸に沿ったパターニングを行っており、脊椎動物の神経堤で新しいHoxコードが進化したと考えられる。本研究では、この新しいHoxコードの進化がどのような分子機構で生じたかを明らかにするために、ナメクジウオのHox1遺伝子の転写制御に関わると考えられるシス領域を脊椎動物に導入して、活性を調べた。その結果、レチノイン酸レセプターの結合コンセンサス配列が、脊椎動物の神経管および神経堤での発現に必要十分であることを明らかにした。この結果は、無脊椎動物では神経管での発現に関わっていたレチノイン酸による転写制御機構が神経堤でも機能できるようになったことが、脊椎動物の複雑な頭部顔面形成に必要な神経堤でのHoxコードの進化に結びついたことを示している。また、ナメクジウオのHox2の転写制御機構の解析も行った。ナメクジウオのHox2は神経管での発現を失っており、pre-oral pitでの発現を二次的に獲得した結果、偽遺伝子となることを免れたと考えられる。このpre-oral pitでの発現に、Etsの結合コンセンサス配列が二つ必要であることがわかった。また、そのpre-oral pitでの発現の特異性には、その周辺の配列も必要になっており、別の因子との共同でpre-oral pitでの特異的な発現を制御していると考えられた。神経冠細胞の起源となった細胞がホヤやナメクジウオの表皮と神経管の境界に存在した可能性が示唆されている。だとすると神経冠の進化は、全く新しい細胞タイプが生み出されたのではなく、起源細胞が移動能や前後軸に沿った位置価といった性質を新たに獲得したことであると考えられる。ここでは、前後軸に沿った位置価の獲得がどのような分子的な背景を伴って進化してきたかを明らかにすることを目指した。神経冠の前後軸に沿った位置価はHox遺伝子の発現としてコードされており、前後軸に沿った位置価の進化には、Hox遺伝子が新たな発現を神経冠で獲得したことが鍵であるといえる。そこで、この新しい発現獲得の分子機構の解析を試みた。すでにナメクジウオのHox1遺伝子の3'側には、脊椎動物に導入すると神経管と神経冠で発現を活性化するシスエレメントが含まれていることを報告している。また、この神経系での発現はロンボメア6/7境界から後方に限局されていた。そこで、この発現に関するシスエレメントを同定し、神経管と神経冠それぞれでの発現に関しての活性が分離できるのかについて検討した。その結果、ナメクジウオHox1の3'側約2.7kbのなかには7つのレチノイン酸応答エレメントのコンセンサス配列が認められたが、5'側からの欠失、3'側からの欠失によって活性を絞り込んでいくと、一つのレチノイン酸応答エレメント(二つのレチノイン酸レセプター結合配列が5塩基のギャップを挟んでいるエレメント:DR5)で神経管と神経冠での活性が担われていることがわかった。さらに、このDR5を二つつないだものだけでも、神経管と神経冠での発現を活性化するのに十分であることもわかった。
術後痛に及ぼす麻酔法の影響-硬膜外麻酔と全身麻酔の比較

【研究1】全麻併用硬麻で麻酔した胃切術後患者33名を任意の3群に分け、ブプレノルフィン(以下Bと略す)3mug/kgの単回投与に引き続き、違った量のB(1日量0.15mg,0.3mg,0.6mg)の連続硬膜外注入を行い、Bの至適投与量を検討した。その結果より0.6mg/日投与群が疼痛の程度が軽く、副作用も少ない傾向にあり、投与量としては1日量0.6mg(≒10mug/kg)が適当と思われた。【研究2】胃切術予定患者21名を任意の2群に分け、全麻併用硬膜外麻酔(硬麻群11名)またはイソフルランを用いた全麻(全麻群10名)で麻酔した。手術終了覚醒抜管後、硬麻群の患者は痛みのないことを確かめて、全麻群の患者は局麻薬の硬膜外投与を行って一旦痛みを止めた後、0.5%ブピバカイン4-7mlとBを3mug/kgを目標に硬膜外単回投与し、0.6mgのBを0.5%ブピバカインで希釈し全量を24mlとして1ml/時の速度で連続硬膜外注入した。連続注入は術後48時間行った。また麻酔導入時より術後72時間までブドウ糖を5g/時で静脈内投与した。連続注入開始24,48,72時間後の安静時および体動時のVisual Analogue Scale(VAS:mm)による疼痛の程度、併用鎮痛薬の使用状況、また内分泌反応を観察するために連続注入開始1,3,24,48,72時間後の血糖値を調べた。24-48時間後の安静時のVASは平均2-6前後、体動時のVASは30-50前後で両群間に差はなかった。72時間後の安静時のVASは硬麻群1.4、全麻群6.1(p<0.005)、体動時は硬麻群24,全麻群44(p<0.05)と硬麻群が有意に低かった(wilcoxon)。併用鎮痛薬の使用状況に差はなかった。血糖値(mg/dl)は3時間後に硬麻群130,全麻群174と有意差(p<0.05:student)を認めたが、それ以外は両群とも110-150前後で差はなかった。胃切術において硬膜外麻酔によるpreemptive Analgesiaは認められなかったが、前回胆嚢摘出術で認められたことと考え合わせて、侵襲の程度がpreemptive Analgesiaの効果を左右する因子の一つとなると思われた。
歯質接着性修復材料の象牙質接着界面の構造解明に関する研究

歯科用修復材料の歯質に対する接着機構を解明するために、接合界面の形態的な観察や組成分析が行われてきているが、従来型のSEMを使用する限り、乾燥・電子ビーム・イオンビーム・凍結によるアーチファクトを常に勘案して所見をとらなければならず、本来の接合界面を観察していることにはならない。最近開発された、環境制御型電子顕微鏡は湿潤した試料でも乾燥することなくそのまま無蒸着で観察でき、試料にたいするダメ-ジが非常に少ない観察装置として注目されている。本研究では、本科学研究費で購入した環境制御型電子顕微鏡を使用し、高真空下での観察の難しい接着性修復材料材料について接合界面を観察し、それらの所見を従来のアルゴンイオンビームエッチング法と対比させ、含浸層内超微小漏洩との関連を有機的に統合し、歯質接着構造を解析することを目的としている。光硬化型グラスポリアルケノートセメントでは、歯面処理剤を用いない場合は象牙質接合界面には明瞭な構造物は観察されなかったが、歯面処理剤を用いると、これによる象牙質表層の脱灰層が明瞭に観察された。しかしながら、この脱灰層は接着性レジンの樹脂含浸層と異なり、内部に多量に銀を吸着し、さらに観察面を酸処理することで消失してしまい、構造的には比較的脆弱なものであることが示唆された。実験動物の歯に充填された歯質接着性レジンを中心に観察を行った結果、各種接着性レジンシステムにおいて象牙質表層に樹脂含浸層が明瞭に観察された。生活歯における樹脂含浸層は、抜去歯におけるそれよりも被験歯の歯種や部位によるバラツキが少なかった。これは、生活歯象牙質が抜去歯と異なり象牙細管中に組織液を含み、組織液中のタンパクが歯面処理材に対して緩衝作用を有しているためと考えられた。本研究の結果、光硬化型グラスポリアルケノートセメントの象牙質に対する接着機構は、酸処理剤によって生じた脱灰層の表層コラーゲンに対するセメントマトリックス成分の絡み合いであり、歯質接着性レジンの様な樹脂含浸層は明瞭でないことが判明した。本研究では、本科学研究費で購入した環境制御型電子顕微鏡を使用して、歯質接着性レジンにとどまらず、歯質に対して接着性を有する修復材料材料について、それらと象牙質接合界面の構造解明を目標として、象牙質表層のスメア層・脱灰層・樹脂含浸層・樹脂含浸層内超微小漏洩層を中心に出来る限り試料にダメ-ジを与えないで生のままの接合界面を観察し、それらの所見を従来のアルゴンイオンビームエッチング法や反射電子組成像並びに透過型電子顕微鏡像と対比させ、接着強さ測定と破断部位の観察所見や含浸層内超微小漏洩と接着耐久性の関連を有機的に統合し、全世界が容認し得る歯質接着構造の統一理論を提示することを目的としている。

平成6年度は、光硬化型グラスポリアルケノートセメントと歯科用セメントを中心に観察を行った。光硬化型グラスポリアルケノートセメントでは、歯面処理剤を用いない場合は象牙質接合界面には明瞭な構造物は観察されなかったが、歯面処理剤を用いると、これによる象牙質表層の脱灰層が明瞭に観察された。しかしながら、この脱灰層は接着性レジンの樹脂含浸層と異なり、観察面を酸処理することで消失してしまい、構造的には比較的脆弱なものであることが示唆された。また、従来型の歯科用セメントについても、これらが金属酸化物と酸性溶液との練和物であることから、象牙質との接合部には、明瞭な脱灰層が生じることが判明した。歯科用修復材料の歯質に対する接着機構を解明するために、接合界面の形態的な観察や組成分析が行われてきているが、従来型のSEMを使用する限り、乾燥・電子ビーム・イオンビーム・凍結によるアーチファクトを常に勘案して所見をとらなければならず、本来の接合界面を観察していることにはならない。最近開発された、環境制御型電子顕微鏡は湿潤した試料でも乾燥することなくそのまま無蒸着で観察でき、試料にたいするダメ-ジが非常に少ない観察装置として注目されている。本研究では、本科学研究費で購入した環境制御型電子顕微鏡を使用して、歯質接着性レジンにとどまらず、歯質に対して接着性を有する修復材料材料について、それらと象牙質接合界面の構造解明を目標として、象牙質表層のスメア層・脱灰層・樹脂含浸層・樹脂含浸層内超微小漏洩層を中心に出来る限り試料にダメ-ジを与えないで生のままの接合界面を観察し、それらの所見を従来のアルゴンイオンビームエッチング法や反射電子組成像並びに透過型電子顕微鏡像と対比させ、接着強さ測定と破断部位の観察所見や含浸層内超微小漏洩と接着耐久性の関連を有機的に統合し、全世界が容認し得る歯質接着構造の統一理論を提示することを目的としている。平成7年度は、実験動物(成猿)の歯に充填された歯質接着性レジンを中心に観察を行った。その結果、象牙質の脱灰は、使用する歯面処理材によって異なり、EDTA3-2が最も少なく、次いでScotchprepとCA Agentが続き、37%リン酸ゲルのk-etchantが最も脱灰が大きかった。脱灰の深さは、同一の歯面処理材を使用しても、象牙質の深さによって異なり、窩洞の深部では浅く、浅部では深かった。特に、深部では象牙細管中のレジンタグは、アルゴンイオンエッチングで顕著に粗造となり、重合硬化が十分でないことが示唆された。また、象牙細管中の組織液と接着性レジンの混和物と想像される構造が象牙細管開口部付近に観察された。生活歯における脱灰の深さは、抜去歯におけるそれよりも被験歯の歯種や部位によるバラツキが少なかった。これは、生活歯象牙質が抜去歯と異なり象牙細管中に組織液を含み、組織液中のタンパクが緩衝作用を有しているためと考えられた。