hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
量子化学大規模並列計算アルゴリズムの開発とその実装

大規模並列量子化学計算アルゴリズムを開発・実装し、作成したプログラムSMASHをオープンソース(Apache 2.0)ライセンスで公開した。京コンピュータ10万CPUコアでも高い並列化効率と実行性能を示し、比較的高精度での巨大分子の電子状態及び構造計算が実用的になった。頻繁に用いられる1,2電子積分などの計算ルーチンをライブラリ化し他のプログラムへの組み込みを容易にした。応用面では、ナノサイズ金クラスターの精密な構造計算、他のプログラムと組み合わせた第一原理分子動力学計算による化学反応の活性化エネルギー計算を行った。量子化学計算でよく用いられるHartree-Fock法及び密度汎関数(DFT)法のエネルギー1次微分計算のMPI/OpenMPハイブリッド並列アルゴリズム開発及びその実装を行った。最も計算コストが大きいのは4つのインデックスを持つ2電子クーロン反発項の微分計算であるが、4重ループの最外ループをOpenMPで、第3ループをMPIランクでそれぞれノード内、ノード間に計算を分散させることで、振り分けのコストを極力減らしながら並列化を行った。さらに、DFT計算での汎関数の数値積分についても、グリッド点をMPIとOpenMPで各コアに振り分け、均等な負荷分散も行った。また、Gauss関数を微分すると軌道角運動量は異なるが再びGauss関数が出てくる特徴を生かして、すでに作成されている2電子クーロン反発項ルーチンを再利用することで、プログラム開発を効率的に行った。京コンピュータ2048ノード(16384CPUコア)での180原子系のDFTエネルギー微分計算の並列化効率は95.8%であった。Hartree-Fock法及びDFT法のエネルギー計算の並列化効率向上にも取り組んだ。Newton-Raphson法を基にした行列対角化を行わないSecond-order SCF法の導入、初期軌道計算を含めた計算全体のハイブリッド並列化を行い、京コンピュータ12288ノード(98304CPUコア)で360原子系のDFT計算時間を測定したところ、並列化効率50%以上を達成し、その実行性能は13%であった。Newton-Raphson法を利用した構造最適化計算において、初期Hessianを分子力場パラメータから作成するため分子の結合、角度、二面角の情報を使うredundant座標を導入し、さらにHessianの固有値を補正し確実にエネルギーが下がる方向に原子座標を動かすRational FunctionOptimization(RFO)法も実装して、Cartesian座標を用いた場合に比べて最適化サイクル数を1/5から1/6に削減した。分子間相互作用計算にも対応するため、強い共有結合でつながっていない分子間の結合を追加するなどの工夫も行った。初年度に開発したエネルギー1次微分計算のMPI/OpenMPハイブリッド並列アルゴリズムと組み合わせることで、ナノサイズ分子系の実用的な構造最適化計算が可能になった。2014年9月に大規模並列量子化学計算プログラムSMASHをオープンソース(Apache 2.0)ライセンスで公開し、Webサイトとマニュアルを英語で作成した。分子軌道を可視化するため、計算結果をvtkファイルに変換するコードも準備し、2015年1月には2電子積分計算のチューニングで実行性能が5%程向上したバージョン1.1.0を公開した。2015年3月までの6か月間のダウンロード数219で、そのうち20%弱は海外からであった。応用計算では、金24原子とその保護基からなる原子数264、直径2.5nmの分子の計算を京コンピュータで行った。中心部分の金4原子クラスター2つの距離をMP2法で計算と解析を行い、弱い相互作用が重要であることを示した。この計算では、6TByte以上の大量のデータを各ノードに分散させて実行した。原子数560、5重項開殻系の金属酸化物担体とロジウムクラスターの計算では、電子の詰まっていない軌道のエネルギーを補正しSCF繰り返し計算途中での軌道の混ざり方を制限するLevel Shift法などを実装し、複雑な電子状態のエネルギー計算の収束を可能にした。非共有結合などいわゆる弱い相互作用や大きな置換基による立体障害を多用した新規分子構造・機能の設計のため、2次の摂動(MP2)エネルギー1次微分計算のMPI/OpenMPハイブリッド並列アルゴリズムの開発を行い、大規模並列量子化学計算プログラムSMASHに実装した。一度に取り扱う占有軌道数を総メモリ量に応じて変更し、中間データ(原子数の2乗から4乗に比例して増加)をすべてメモリ上に分散保存して、ハードディスクは使用していない。一方、占有軌道の分割数回重複して原子軌道2電子積分項及びその微分計算を行うため、総計算量は利用ノード数に依存する。データ送受信はすべてOpenMP領域外で行い、シンプルなMPI通信にしている。高い並列性能を示し、ナノサイズ分子の精密な構造計算が可能になった。これまでに開発したSMASHと第一原理経路積分法を組み合わせたPIMD-SMASHプログラムを開発し、レプリカごとのMPI並列、さらにSMASHのMPI/OpenMP並列の3段階の並列化を行った。シクロペンタジエンとブテノン、さらに水分子を配置してDiels-Alder反応の計算を行い、実験で示されている水の存在で遷移エネルギーが下がることを再現した。研究期間全体を通じた成果としては、京コンピュータでも高い並列性能と実効性能を達成したプログラムをオープンソース(Apache2.0)ライセンスで2014年9月に公開し、1年半でダウンロード数は596であった。SMASHと他のプログラムとの融合も行い、また複数のプログラムにSMASHの一部ルーチンの組み込みも始まっている。

SMASHを利用した金属微粒子などの計算を京コンピュータで実行し、これまでは困難であったナノサイズ分子の高精度電子状態及びその構造計算を行った。大規模並列量子化学計算アルゴリズムを開発・実装し、作成したプログラムSMASHをオープンソース(Apache 2.0)ライセンスで公開した。京コンピュータ10万CPUコアでも高い並列化効率と実行性能を示し、比較的高精度での巨大分子の電子状態及び構造計算が実用的になった。頻繁に用いられる1,2電子積分などの計算ルーチンをライブラリ化し他のプログラムへの組み込みを容易にした。応用面では、ナノサイズ金クラスターの精密な構造計算、他のプログラムと組み合わせた第一原理分子動力学計算による化学反応の活性化エネルギー計算を行った。初年度に開発したエネルギー微分MPI/OpenMPハイブリッド並列アルゴリズムにより構造最適化1サイクルの計算時間が短くなり、今回のredundant座標及びRFO法の導入によりサイクル数の大幅な削減を実現し、構造最適化計算全体を並列効率良く高速に実行できるようになった。京コンピュータを始めとするスーパーコンピュータで、数百原子からなるナノサイズ系の計算を開始した。計算負荷、データを均等に分散させることでこれまで困難であったサイズの計算が可能になった。得られた計算結果を可視化するコードも作成し、詳細な解析も進めている。複数の2電子積分ルーチンの統一的インターフェイスを作成し、エネルギー計算だけではなく、エネルギー微分計算のプログラム実装を容易にした。さらに、プログラムをオープンソースで公開したことで、2電子積分計算など一部のルーチンを抜き出しと他のプログラムへの組み込みが始まり、これまでボトルネックであった電子状態計算部分を高速化させるなど他の研究者との連携が始まった。計算及び開発両面で実用的なプログラムになりつつあると考えられる。作成した大規模並列量子化学計算プログラムSMASHをオープンソース(Apache 2.0)ライセンスで公開した。計算化学スーパーコンピュータを利用してこれまで困難であったサイズの触媒反応などの計算及び解析を進めていく。複雑な電子状態でも確実にエネルギーを収束させるため、様々な収束技術や初期値計算方法の導入も行う。初期値については、現在単純な拡張Huckel法で求めているが、特に金属原子の多い系の計算ではより精度の高い方法で作成することで繰り返し計算の初めから適切な軌道に電子を詰めることができると考えられる。さらに、化学反応の中間体である遷移状態の計算、分子の振動計算など、化学反応の解析及び予測で行う一連の計算を可能にするため、エネルギー2次微分計算の並列アルゴリズムを開発、実装する。SMASHプログラム公開によって始まった量子化学計算と他の計算方法との融合についても、さらに発展させていく予定である。
アクチンとチューブリンのトレッドミリングの検証

1.アクチンフィラメントをFITC(黄色発光), DACM(青色発光),ローダミンITC(赤色発光)で染め分けた.これらを蛍光顕微鏡下で観察すると,ダイクロイックミラーおよびフィルターを使い分けることにより上記三種のアクチンフィラメントを識別できることがわかった.ビデオモニターを用いてフィラメントの長さを測定し,その時間変化を定量的に解析する方法の開発および試行は現在進行中である.光学顕微鏡の分解能以下の領域でも,蛍光強度から長さを算定できる見通しがたった.2.トレッドミリング現象をコンピューターシミュレーションする最もシンプルなアルゴリズムを用いて解析を進めているが,申請書に記載した「尺取り虫運動」は再確認された.さらに第二種の運動(先端も伸縮しながら運動するケース)がある限られた條件下では見出された.また,より現実に近い長さのフィラメントの間のユニットの交換を調べるためには,大容量の大型計算機が必要であることが明らかになり,現在計画を進めている.3.溶液内実験として, PIAAをラベルしたG-アクチンがF-アクチンに取込まれる速度を解析しているが,トロポミオシンの存在下ではアクチンの両端でのユニットの取込みが約十分の一に低下すること,また,トロポミオシン・トロポニン存在下ではカルシュウム濃度に依存して取込み速度が加速されること,特に, P端への影響が大であることが明らかになった.1.アクチンフィラメントをFITC(黄色発光), DACM(青色発光),ローダミンITC(赤色発光)で染め分けた.これらを蛍光顕微鏡下で観察すると,ダイクロイックミラーおよびフィルターを使い分けることにより上記三種のアクチンフィラメントを識別できることがわかった.ビデオモニターを用いてフィラメントの長さを測定し,その時間変化を定量的に解析する方法の開発および試行は現在進行中である.光学顕微鏡の分解能以下の領域でも,蛍光強度から長さを算定できる見通しがたった.2.トレッドミリング現象をコンピューターシミュレーションする最もシンプルなアルゴリズムを用いて解析を進めているが,申請書に記載した「尺取り虫運動」は再確認された.さらに第二種の運動(先端も伸縮しながら運動するケース)がある限られた條件下では見出された.また,より現実に近い長さのフィラメントの間のユニットの交換を調べるためには,大容量の大型計算機が必要であることが明らかになり,現在計画を進めている.3.溶液内実験として, PIAAをラベルしたG-アクチンがF-アクチンに取込まれる速度を解析しているが,トロポミオシンの存在下ではアクチンの両端でのユニットの取込みが約十分の一に低下すること,また,トロポミオシン・トロポニン存在下ではカルシュウム濃度に依存して取込み速度が加速されること,特に, P端への影響が大であることが明らかになった.
Ｗｎｔモルフォゲンの動態と受容の発生・細胞生物学的解析

1.蛍光相関分光法および光変換後蛍光減衰法による定量的解析に基づき、結合成分と自由拡散成分の2状態を考慮する、モルフォゲンの細胞外挙動の数理モデルを構築した。これは従来の1状態モデルでは記述しづらい、モルフォゲン分子の局所的集積をうまく記述するものである。2. XenopusのWnt8およびWnt11に対する抗体を作成し、内在性のWnt蛋白質の分布を可視化した。内在性のWnt蛋白質はドット状の分布を示し、N-sulfo修飾を受けたヘパラン硫酸と共局在を示した。またヘパラン硫酸のN-sulfo修飾に関わる酵素であるNDST1が内在性のWnt蛋白質の適切な分布に必要であると示唆された。本研究では、モルフォゲンとして知られる分泌性シグナル蛋白質のWntが、組織中でどのように振る舞うか(拡散等)という事とともに、Wntによるシグナル伝達を一種の情報処理と捉えて、シグナルが細胞に受容される前後でどのような細胞生物学的現象が起こるのかを主にアフリカツメガエル(以下Xenopusと記す)胚を用いて解析する。1. Xenopus胚で発現させたmVenus-Wnt8およびmVenus-Frzbの細胞間隙における挙動を蛍光相関分光法にて解析した。その結果、それぞれ自由拡散的な動きをしている分子が一定割合観測されたが、これまでに得られている知見と総合すると、細胞間隙においてそれらの分泌性蛋白質の大部分はヘパラン硫酸等に結合しており、自由拡散成分の量は限られていることが示唆された。そこで発生場でのモルフォゲンの挙動の全体像を記述すべく、ヘパラン硫酸の微小構造(HSNSs)に基づき、結合成分と自由拡散成分を考慮した濃度勾配形成の数理モデルを構築した。従来モルフォゲンの拡散現象は1成分を想定してモデル化されてきたが、本研究では2成分モデルを提案することで1成分では説明しがたい現象をうまく説明することができるようになった。2.非典型経路を活性化するWntとして知られるWnt11の機能の解析を行った。原腸胚でWnt11を発現させたところ、Wnt11発現細胞において頂端収縮(apical constriction)が見られた。Wnt11は原口背唇部において発現することが知られており、原腸形成開始時の最初期の細胞の形態変化がWnt11で制御されている可能性が考えられる。また並行してWnt11に対する抗体作成を行い、少なくとも過剰発現した蛋白質を免疫染色で検出可能なウサギ抗血清を得た。本研究では、モルフォゲンとして知られるWnt蛋白質の局在に着目し、それが細胞生物学的レベルで如何に制御されているか、また形態形成運動に重要だと考えられる細胞形態にどのように作用するかを主にアフリカツメガエル胚を用いて解析した。1.これまでにヘパラン硫酸の微小構造がWntの細胞外分布を制御する可能性を見いだしていたが、ヘパラン硫酸鎖の修飾酵素NDST1に注目して過剰発現実験およびアンチセンスモルフォリノオリゴによる機能阻害実験を行った。この結果、N-sulfoの修飾を強く受けた微小構造はNDST1によって硫酸化修飾を受けている可能性が示唆された。従来ヘパラン硫酸鎖の修飾は単一糖鎖内でのドメイン構造が示唆されていたが、本研究から同一細胞表面上の微小構造単位で修飾の度合いが異なりうるという新たな可能性が示唆された。2.内在性のWnt蛋白質を可視化するために抗体作成を試みた。この結果、xWnt8、xWnt5a、およびxWnt11に対する免疫染色可能なウサギポリクローナル抗体を得た。現在これらの抗体を用いて内在性のWntの分布を解析中であるが、特に非典型Wntシグナルに関わると考えられているxWnt11については形態形成運動への関与を強く示唆する特異な分布を見いだした。計画通り、蛍光相関分光法による分泌性蛋白質の測定を行い、その結果を基に数理モデルを構築することができた。特に数理モデルに関しては、観測結果を踏まえて、新たに結合成分と自由拡散成分の2成分を考慮したモデルを構築することができた。従来の1成分のモデルでは拡散現象は説明できても、モルフォゲンの局所的集積は説明しづらかったが、本研究で得られた2成分モデルはモルフォゲンの局所的集積現象をうまく記述できる。このため、本研究で解析したWntやsFRPのみならず、多くのヘパラン硫酸結合性の分泌性蛋白質の挙動を理解する為の基本モデルとなり得ると考えている。またWnt11の機能解析において、原腸形成時の最初期のイベントたり得る、背側での頂端収縮にWnt11が関与している可能性が得られた。

この可能性は当初計画では考慮していなかったが、観察が容易であり、Wnt11の関与を念頭に形態形成運動を細胞レベルで解析する良いモデル系になると期待している。今後内在性のWnt11蛋白質の局在が焦点になると考えているが、そのために免疫染色可能な抗体の作成に取り組んだ。当初はモノクローナル抗体の作成を計画していたが、費用対効果や抗体作成の成功率を熟慮した結果、ウサギのポリクローナル抗体を作成した。これは過剰発現したWnt11蛋白質を免疫染色可能なことを確認しており、当初計画分の予定を達成した。25年度が最終年度であるため、記入しない。1. HSNSはプロテオグリカンが集合したものである可能性が高い。そこでXenopus原腸胚に発現が知られる、Glypican、Syndecan等のプロテオグリカンがWntの分布に与える影響およびそれらのコア蛋白質自身の分布を検討する。そのため蛍光蛋白質を融合したコンストラクトをXenopus胚で発現させ、蛍光観察によるライブイメージングおよび免疫染色でその分布を高解像度で解析する。またコア蛋白質に対する糖鎖付加の状態を検討するため、Xenopus胚で発現させたエピトープタグ付きのGlypicanやSyndecanに対して抗ヘパラン硫酸抗体でウェスタンブロット解析を行う。GlypicanやSyndecanには機能ドメインや糖鎖付加部位が知られているのでそれらの欠損体や変異体を作成し、同様の解析を行う。2. Wnt11による頂端収縮の可能性を引き続き検討する。これまでWnt11の発現が頂端収縮を引き起こす十分性が示唆されているので、Wnt11の発現阻害を行い、必要性についても解析する。また内在性のWnt蛋白質の局在を可視化する為、免疫染色を行う。この結果を定量的に解析する。また従来の共焦点顕微鏡での解析では表層の観察しかできなかったが、胚の透明化を行い2光子顕微鏡を用いることで、Wnt発現細胞の3次元画像を取得して、細胞形態を高解像度で解析する。
高分化能TET1ヒトiPS細胞を用いた高効率心房筋分別法の確立

汎用的ヒトiPS細胞誘導法確立の為、患者初代培養細胞を用いてiPS誘導を試みたが、購入株化細胞に比べて誘導効率は極めて悪く、特に患者心臓由来線維芽細胞にiPS細胞誘導は不可能であった。多くの患者残余検体組織から分別された線維芽細胞は、αーSMA(smooth muscle actin)を高発現する筋線維芽細胞であり、この筋線維芽細胞を用いた場合、誘導は極めて困難であった。誘導がかかりやすいように培養液を調整し、特に誘導初期にiPS細胞に必須なTGF-βをOFFにしたところ、効率は良くないが、筋線維芽細胞からもiPS細胞誘導が確認された。このiPS細胞を用いて心筋細胞群誘導は成功した。分担研究者より供給されるTET1 stabilizedヒトiPS細胞を用いた中胚葉誘導(心筋細胞群誘導)並びに患者心房組織並びに皮膚組織からの線維芽細胞分別法の確立し、そして皮膚由来線維芽細胞細胞を用いたヒトiPS細胞誘導ー中胚葉誘導(心筋細胞群誘導)は平成26年度に確立することが出来た。心筋細胞群誘導に関しては、ActivinAを高濃度加えることにより約2週間の誘導期間から10ー11日間という数日間の時短に成功した。この実験はすでに10回以上成功を収めており、プロトコールとして完成したと考えている。心筋細胞誘導において細胞塊を形成させることは極めて重要であるが、一方で誘導された心筋細胞群には心室筋細胞、心房筋細胞、ペースメーカー細胞、伝導系細胞が誘導されており、これらを分別することが極めて重要となる。細胞分別はFACSを用いて行うが、その条件として細胞の単一化が必要であるが、この段階での細胞損失が極めて高く、改善が必要であると考えている。また、SIRPA I抗体を用いて心筋細胞群から心筋細胞の分別は数回の実験であるが問題なく可能と考えているが、心房筋分別に必要な至適な表面抗原はなく、現在いくつかの抗体を作成中である。興味深いことに、患者から分別培養した心房由来線維芽細胞は、ヒトiPS細胞誘導に皮膚組織と同様のプロトコールではiPS細胞誘導が、全くかからないことが判明した。増殖性は皮膚のそれとほとんど変わらず、GFPを用いた遺伝子導入効率も十分であったが、現時点では成功出来ていない。技術的な問題なのか、同じ線維芽細胞でも細胞特性が異なるためか原因を解明する上で、RNA,レトロウイルスを含め数種類の導入法を行う予定である。昨年度の研究実績の概要にも記載したが、購入した間葉系細胞を用いてヒトiPS細胞誘導を行った場合、今までに発表されたプロトコールを用いて問題なくヒトiPS細胞を誘導することは可能である。一方患者由来初代培養間葉系細胞を用いた場合、皮膚由来であれば、その効率は購入したそれに比して極めて悪いもののiPS細胞を誘導することは可能であるが、患者心房由来線維芽細胞を用いた場合、山中法やそれに準拠した方法を用いてもiPS細胞を誘導することは不可能であった。その1つの理由として、病態を有した心臓(手術により切離破棄されるものである。)のため、筋線維芽細胞が高発現しているためであった。しかし、平成27年度後半にiPS細胞誘導の際生じる遺伝子群発現の変化に注目し、その誘導による遺伝子発現変化を生じやすくなるように細胞培養液を細かく変化させたところ、心房由来もしくは他の間葉系細胞(予備実験)からもヒトiPS細胞誘導に成功した。これら誘導されたiPS細胞からも我々の最終目的である心筋細胞群の誘導を確認した。ただし、依然その誘導効率は決して高くなく、更なる誘導効率の高い誘導法を推し進めている。これら培養液を変化させる方法を用いて皮膚由来間葉系細胞でiPS細胞誘導をかけると極めて効率が良くなることも確認している。前回同様、概ね順調と考えている。皮膚由来線維芽細胞を用いたiPS細胞誘導では、心筋細胞群誘導を成功しており、現在表面抗体を用いた心筋細胞、心房筋細胞分別実験を実行中である。最大の問題点であった心臓由来線維芽細胞からのiPS細胞誘導は、遺伝子導入後の培養液の変更で誘導が可能となった。まだまだ効率は良くないが、同一患者の異なる臓器(生理的、病的臓器を含め)からのiPS細胞誘導が可能となった。皮膚もしくは心臓由来線維芽細胞ーヒトiPS細胞誘導ー心筋細胞群誘導ー心筋細胞分別(現在進行中)の一連の誘導にほぼめどが立つ状況である。ヒトiPS細胞には分化能の劣る細胞(epiblast stem cell )が混在することが判明しており、このためヒトiPS細胞を高効率に分化誘導かけることは極めて困難である。しかし、易分解性を解除したTET1を用いて誘導をかけると、現行ヒトiPS細胞に比較して圧倒的に高効率で神経前駆体細胞になることが判明した。そこでTET1恒常的に発現させてヒトiPS細胞の高効率分化誘導を基盤とした研究を続けている。しかし、ヒトiPS細胞誘導において、患者初代培養間葉系細胞と株化された細胞(市販され、購入可能な細胞)では、その誘導効率において隔世の感があることは禁じ得ない。患者皮膚由来線維芽細胞を用いればヒトiPS細胞誘導は何とか可能であるが、患者左心耳より分別培養された心臓由来線維芽細胞からのヒトiPS細胞誘導は、少なくともエピソーマルベクターの遺伝子導入による山中法を用いた場合、全く誘導することが不可能である。

昨年度、培養液の詳細な変更により極めて低い効率であるがヒトiPS細胞の誘導に成功したが、良質なiPS細胞をコンスタントに確保するには、少なくとも数十個のコロニー取得が望ましいが、すべて患者の心臓組織からコンスタントに誘導に成功はしておらず、さらなる改変が必要である。そこで下記の項目が現状の目的となる。1)心臓組織から分別培養した線維芽細胞を用いた高効率ヒトiPS細胞法の確立。2)同一患者の皮膚組織並びに心臓組織から分別された線維芽細胞から誘導されたヒトiPS細胞エピゲノム評価。3)両ヒトiPS細胞からの高効率心臓細胞群分化誘導法の確立4)心房利尿ペプチド分泌能を高めた心房型心筋細胞の作製に焦点をあて研究を行う。前年度に、心臓組織(左心耳)より分別培養した線維芽細胞から、培養液の変更で極めて僅かではあるがヒトiPS細胞の誘導に成功し、代表的な未分化遺伝子の発現の確認にてヒトiPS細胞であることは、確認できた。しかし、同様の誘導を何人かの患者組織を用いて行ったが、コンスタントにヒトiPS細胞誘導は起こらず、たとえ出来たとしてもコロニー数は極めて少なく、コウンスタントに分化誘導が掛かる良質ヒトiPS細胞を心臓由来組織から十分に誘導がかけられないでいる。その為、さらなる培養法の変更が必要である。しかし、山中4因子導入後最初に生じる遺伝子変化として間葉系遺伝子発現の減弱を生じさせることが重要であることは判明しており、Lonza Japan社のNucleofuctor2btmを用いた何種類かの電気穿通法を用いた異なる導入効率と培養液変更のプロトコールの組み合わせにより、およその方向は掴んでおり、まずはベストと言える導入法の確立を目指す。ヒトiPS細胞には分化能の劣る細胞が混在することが判明しており、このためヒトiPS細胞を高効率に分化誘導かけることは極めて困難である。しかし、易分解性を解除したTET1を用いて誘導をかけると、現行ヒトiPS細胞に比較して圧倒的に高効率で神経前駆体細胞になることが判明した。そこでTET1恒常的に発現させてヒトiPS細胞の高効率分化誘導を基盤とした研究を継続している。しかし、TET1恒常的に発現させるシステムを用いても患者由来初代培養間葉系細胞を用いた場合、その誘導効率は極めて悪い。患者皮膚由来線維芽細胞を用いればヒトiPS細胞誘導は何とか可能であるが、患者左心耳より分別培養された心臓由来線維芽細胞からのヒトiPS細胞誘導は、少なくともエピソーマルベクターの遺伝子導入による山中法を用いた場合、全く誘導することが不可能である。加えて最近の論文でも話題となっているが、iPS細胞誘導後にはゲノムに点突然変異や遺伝子コピー変異等が多く発生し、iPS細胞としての品質が安定せず、臨床的に使い物にならない可能性が大きな問題として残されている。平成28年度より、培養液の詳細な変更により極めて低い効率であるが初代培養間葉系細胞よりヒトiPS細胞の誘導に成功した(投稿準備中)が、上記の如く確率論として遺伝子変異が挿入されてしまうため、良質なiPS細胞をコンスタントに確保するには、少なくとも数百から数千個のコロニー取得が望ましいが、すべて患者組織からコンスタントに誘導に成功はしておらず、さらなる改変が必要であり、以下の項目を中心に研究を進めていく。
変異原性環境化学物質、ニトロ多環芳香族炭化水素類の人体曝露評価法の開発

多環芳香族炭化水素(PAH)は、化石燃料の燃焼過程で生成する非意図的生成物であり、自動車やタバコなどを排出源として環境中に放出されるPAHは、燃焼時もしくは大気中で窒素酸化物と反応して極めて強い発ガン性・変異原性を有するニトロ多環芳香族炭化水素(NPAH)を生成するNPAHのヒトや動物への暴露量は高いと予測され、その大気内挙動や季節変動、都市のエネルギー・交通事情との関係等が明らかになりつつあるが、ヒトに対するリスク評価(健康影響評価)が急務となっている。そこで本研究では、NPAHのヒトに対する曝露量を評価するためのバイオマーカーの開発を行うにあたり、指標の候補となるNPAHの尿中代謝物を同定した。NPAHの中で大気粉塵やディーゼル排ガス粉塵に高濃度で存在する1-ニトロピレン(1-NP)に着目し、まず代謝物として考えられるヒドロキシ-1-ニトロピレン(OH-1-NP)を合成した。尿中代謝物として存在するOH-1-NPを定量するためには、より高感度な分析法の開発が要求された。そこでOH-1-NPを逆相カラムで分離した後、オンライン白金/ロジウムカラムにより効率よく蛍光性のアミノ体に還元してその蛍光を検出することによりOH-1-NPを高感度に測定するHPLC-蛍光検出法を開発した。次に尿試料の前処理法を検討し、抱合体として存在するOH-1-NPを酵素で加水分解した後、逆相系と順相系の固相抽出カラムを組み合わせること夾雑ピークを効率よく除去することに成功した。実際にヒトの尿試料を用いてOH-1-NPの同定を試みたところ、OH-1-NPのピークを確認することができ、さらにそのピークを分取してLC-MSで測定したところ、その分子量関連イオンピークを観察することができた。開発したヒト尿中OH-1-NPの分析法は、NPAHの曝露量の有用な指標(バイオマーカー)となる可能性が高い。
孟宗竹を活用した保水性ポーラスコンクリート舗装材料の開発

本研究では、鹿児島県の未利用資源の孟宗竹の新たな利用用途として舗装材料への適用を想定しており、孟宗竹を活用した繊維補強型保水性多孔質材料に関する研究開発に取り組むことで、生活環境の昇温緩和対策に貢献する技術開発を行う。具体的には、孟宗竹材料の使用状態が繊維補強ポーラスコンクリートおよびセメント系充填材の施工性、硬化物性および昇温緩和効果に与える影響を明らかにした上で配合設計法の確立を目指すものである。本研究で得られる成果によって、年間360万トンの未利用木質バイオマスをコンクリート材料に有効活用する技術への応用が可能となり、高吸水素材とコンクリートの融合を図る技術基盤となる。
ナノ流体内光電気効果の解明と、複数一分子操作への応用

本研究は、ナノ流体デバイス技術に、柔軟に可変な光パターニング技術を融合させ、ナノ空間内の光電気効果による空間選択的静電場を生成し、水中の生体一分子の非接触操作技術を開発しようとしている。電気二重層の厚みより小さな数百nm以下の流路高さと粒子が自由に動き回れる50200umの流路幅を持つナノ流体デバイス作製法を開発した。さらに、自在な光パターンを対象に照射できる光電気工学系を実現し、実際に微粒子が光電気的に操作できることを検証した。本研究の目的は、ナノ流体空間内の光電気効果による局所静電場発生機構を用い、自在な光パターンで複数の微小粒子や生体分子を非接触操作できる光ナノ流体回路技術を開発することです。その礎として、本年度は、光学実験系、電気実験系、各種ファブリケーション法の確立を進め、光電気効果を用いた微粒子操作の土台を作りました。具体的には、デバイスへの光パターン照射とイメージングのための光学顕微鏡やDigital Micromirror Deviceなどの各種光学素子を組み合わせた光学系を、デバイス測定のためのオシロスコープやファンクションジェネレータを組み合わせた電気系を構築し、光電気デバイス機能を測定・解析できるプラットフォームを完成させつつあります。さらにナノ流路の簡便な作成や高い光導電性を有するアモルファスシリコン膜の成膜のためのファブリケーション方法の確立を推し進めました。ナノ流路作製法はスピンコートしたフォトレジストを光硬化させた後、これを熱して極薄の接着剤として使うことにより、非常にシンプルに流路天井と床となるガラス同士の間隔をナノスケールで制御するものです。従来法はガラスをエッチングして、ガラス同士を張り合わせるものであり、コストも時間も遥かにかかるものでした。本方法は、斬新で簡便で汎用性の高い基本技術となると期待しています。高い光導電性を有するアモルファスシリコンは最適化されたPlasma Enhanced Chemical Vapor Deposition(PECVD)法を必要とするため、複数の国内大学や企業をめぐり、質の高い成膜を可能とするPECVDシステムを模索しました。信頼性の高い光学系・電気系・各種マテリアルや構造が揃ったことにより、目的であるナノ流体光電気デバイスの開発に向け、大きく前進しています。未来の究極に網羅的な1細胞解析には、非接触に一分子を並列自在操作できる技術が必要である。本研究は、ナノ流体デバイス技術に、柔軟に可変な光パターニング技術を融合させ、ナノ空間内の光電気効果による空間選択的静電場を生成し、水中の生体一分子の非接触操作技術を開発している。バルク系では起こり得ない光電気的な局所性電場の発生および維持が、ナノ流体空間内では起こる可能性を調べ、これを操作技術に応用しようとしている。当該年度中に、まず、電気二重層の厚みより小さな100nm以下の流路高さと粒子が自由に動き回れる50200nmの流路幅を持つナノ流体デバイス作製法を開発した。光リソグラフィーでパターニングしたSU-8ポリマーを熱で緩めて糊として使うことで、安価に複雑な構造のナノ流路作成を実現した。さらに、操作する微粒子をイメージングしつつ、自在な光パターンを対象に照射できる光電気工学系を実現した。具体的には、高感度カメラを用いて微粒子を観察しつつ、DMD: Digital Micromirror Deviceを用いて任意の光パターン照明の照射を実現し、流路内の光電気効果を誘引したた。その結果、このシステムを用いて、ポリスタイレンビーズの自在な操作を実現した。今後の展開としては、より小さな粒子である量子ドット・金ナノ粒子の並列自在操作に着手する。そしてこれを実現した後に、より困難な有機蛍光分子の操作に進む予定である。全体としては、光学実験系、電気実験系の確立、デバイスやマテリアルのファブリケーション方法開発と、目的に向かって確実に前進しており、概ね順調に進行しています。しかし難航したのは、アモルファスシリコン膜の成膜に必要なPlasma Enhanced Chemical Vapor Depoition装置を探す点でした。装置を所有していても公に公表していなかったり、共有装置として貸し出すことをしていなかったりして、限られた選択肢を求めて日本中を巡ることとなりました。ナノ流路作成においては、東京大学武田先端知ビルの共有装置を使わせていただき、順調に進展しています。光学実験系や電気実験系も、順調に構築を終えています。27年度が最終年度であるため、記入しない。ナノ・マイクロ工学平成27年度に進めたファブリケーション法の最適化を進める一方で、すでに確立した光学系・電気系・デバイスなどを融合させることで、目標であるナノ流路内での光電気効果を用いた微粒子操作の実現を進めます。1作製したアモルファスシリコン膜の光応答性を確認します。国内大学においてPECVD法を用いて作成したアモルファスシリコン膜の光導電性を定量的に評価します。2マイクロビーズ、蛍光ビーズのOptotlectronic Tweezersによる操作を実証します。ビーズは視認しやすく、退色の問題もなく、比較的容易にデバイスの実験的実証が行えます。

Digital Micromirror Deviceでパターンした光による光電気的な微粒子操作を実現します。3金ナノ粒子や量子ドットの操作の実証を目指します。これらの微粒子は既に従来の光ピンセット技術では補足の難しくなってくる大きさを有しており、挑戦的な課題となります。この実証を礎に、最終目標である分子操作に挑みます。27年度が最終年度であるため、記入しない。
フッ化物透明セラミックスによる新規レーザー材料の開発

近年、透明フッ化物セラミックスは、酸化物よりも優れたレーザー媒質であると認識されつつあり、注目が集まっている。これまで、酸化物の多結晶透明セラミックスに研究は多く行われているが、フッ化物の多結晶透明セラミックスに関する研究は皆無である。多結晶セラミックスでは、微細構造が透光性に与える影響が極めて大きく、高い透光性を実現するためには、微細構造制御による透光性の発現メカニズムの解明が必須となる。平成26年度は、CaF2粉末を用いて、放電プラズマ焼結(SPS)法のフッ化物セラミックス焼結プロセスへの適用性を明らかにした。SPSプロセスパラメータ(昇温速度、焼結温度、保持時間、印加圧力)が、焼結体の緻密化過程と微細構造変化に与える影響について調べた。得られた試料のX線回折図形は、CaF2に指数付けることができた。印加圧力および焼結温度が高い程、CaF2焼結体の透光性は向上した。一方、昇温速度が低い程、CaF2焼結体の透光性は向上した。焼結温度750°Cおよび800°Cの時、波長2600nmでの透過率は、いずれも85%に達した。このように、SPSを用いて透明フッ化物セラミックスの合成に成功し、SPS法のフッ化物セラミックス焼結プロセスへの適用性を実証した。さらに優れた透光性を示すセラミックスを合成するためには、微細構造と透光性の関係を明らかにする必要があり、微細構造と透光性の関係を丹念に調べながら、焼結条件の適正化することで、優れた透光性を示すフッ化物セラミックスを合成できる。本研究課題は、平成26年度が最終年度のため、記入しない。本研究では、SPS法を用いて透明フッ化物セラミックスを合成とする。本研究では、SPS法を用いて透明フッ化物セラミックスを合成する。一連の研究を通じ、SPSのプロセスパラメータ(昇温速度、焼結温度、保持時間、印加圧力)が、焼結体の緻密化過程と微細構造変化に与える影響について、系統的に明らかにする。また、本研究では、我々が開発した二段焼結法を適用したSPS法を用いて、透明フッ化物セラミックスを合成する。焼結後の熱処理プロファイルもまた、透光性や機械的特性に与える重要な因子であるため、これらの点についても、詳細に研究を行う。さらに、透明フッ化物セラミックスの微構造を丹念に調査し、単結晶体と比較することで、多結晶体におけるドープイオンの局在構造の制御や、微構造が光学特性に与える影響についての基盤的な研究となる。平成26年度は、CaF_2粉末を用いて、SPS法のフッ化物セラミックス焼結プロセスへの適用性を明らかにした。SPSプロセスパラメータ(昇温速度1-100K/min、焼結温度1023-1273K、保持時間5-20min、印加圧力10-100MPa)が、焼結体の緻密化過程と微細構造変化に与える影響について調べた。得られた焼結体は、いずれの条件でも相対密度は95-100%であり、よく緻密化した。焼結温度を1023から1223Kに上昇させると、透明性は向上した。SPSを用いて透明フッ化物セラミックスの合成に成功し、SPS法のフッ化物

セラミックス焼結プロセスへの適用性を実証した。さらに優れた透光性を示すセラミックスを合成するためには、微細構造と透光性の関係を明らかにする必要がある。微細構造と透光性の関係を丹念に調べながら、焼結条件の適正化する。
結晶界面の移動とすべり速度に及ぼす界面構造の効果

これまでの我々の研究により結晶性材料の粒界エネルギーは粒界の方位関係、すなわち粒界構造に強く依存することが明らかとなっている。そこで本研究では、粒界の移動やすべりの難易に及ぼす界面構造の効果について明らかにするために、再結晶中の粒界の移動速度の方位依存性が問題となっている方向性電磁鋼板の材料であるFe-3%Si合金について粒界移動の機構について検討を行い、集合組織の形成との関連を明らかにした。1.粒界移動機構:粒界移動速度はある臨界の駆動力を境にして不連続に変化し、駆動力の大きさによって移動機構の異なる2つの領域が存在することが明らかとなった。粒界移動の活性化エネルギーは高駆動力域ではα-Feの粒界拡散の活性化エネルギーと、低駆動力域ではα-Fe中のSiの固有拡散の活性化エネルギーとほぼ等しいことから、粒界は、低駆動力域においては、粒界と溶質原子との相互作用により形成されたSiの溶質雰囲気を引きずりながらドリフト運動していると考えられるのに対し、高駆動力域ではSiの溶質雰囲気から離脱して運動しているものと考えられる。さらにこのような移動機構の遷移は温度の変化によっても起こることが知られた。2.易動度の方位依存性:易動度の方位依存性は上述の2つの領域で異なる。粒界がSiの溶質雰囲気を引きずりながら運動している場合には、Σ9粒界の易動度がランダム粒界、Σ3粒界やΣ5粒界よりも大きいのに対し、溶質雰囲気から離脱して運動している場合には、逆にΣ9粒界よりもランダム粒界の易動度が大きくなり、易動度の粒界性格依存性も小さくなる。このような易動度の粒界性格依存性が変化する温度は、駆動力にも依存するが、実用材において2次再結晶が生じる場合の駆動力に近いときには1100°C近傍で起こる。実用的には約1100°C以上で焼鈍した場合にはGoss方位(圧延面が{110}面で圧延方向が<001>方向)への集積度が低くなることが知られていることから、Goss方位を有する集合組織の形成は、Σ9粒界の優先的移動に起因するものと考えられる。
脳血管の増殖の分化-脳血管系における血管新生・血液脳関門形成機構の解明-

個体発生過程において、脳血管は血管新生により増殖した後、血液脳関門(blood-brain barrier、以下BBB)形成血管へと分化する。個体発生過程における脳血管新生では、脳組織の成長に伴い生じる局所の低酸素状態刺激としたvascular endothelial growthfactor(VEGF)産生亢進が重要な役割を担う。我々は低酸素誘発性VEGF産生亢進の分子機構解析を通じ、脳血管新生には脳組織における転写因子hypoxia-inducible factor 1(HIF1)とAP1の産生が関与することを明らかにした。また、BBB形成血管への分化過程に関してはquail(ウズラ)-chick(ニワトリ)間異種移植系に基づくin vivo BBB誘導モデルを確立し、その免疫組織学的・超微形態学的・機能的解析により胎児脳細胞(我々の系ではquail脳細胞)がBBB誘導能を有することを示した。さらに、上記in vivoモデルおよびquail脳の解析を通じ、脳血管新生過程とともにBBB形成血管への分化過程にもVEGFが関与する可能性を示唆する所見を得た。即ち、発生初期よりquail脳においてはisoform VEGF_<122>とVEGF_<166>の発現がみられるが、BBB誘導期にさらにVEGF_<146>とVEGF_<190>の発現が加わった。VEGFは血管新生因子であると同時に血管透過性制御因子であり、BBB誘導期のVEGF発現変化は注目すべき点と考えられた。脳以外の胎児組織でのVEGFisoform発現パターンと比較検討した結果、VEGF_<146>の発現亢進が脳組織特異的であることが明らかになった。In situ hybridizationにてVEGF産生細胞が胎児脳細胞であることが示され、胎児脳細胞の有するBBB誘導能とVEGF_<146>発現亢進との関連が示唆された。さらに我々は、上記のisoform発現変化の機能的意義を解析する目的で、quail胎児脳組織より各種VEGFisoformの翻訳領域全長を含むcDNA断片をクローニングし、各種isoform発現細胞を作製した。現在、それらの細胞につき解析中である。我々は、quail(ウズラ)-chick(ニワトリ)間異種移植系を用いた実験系により、quail胎児脳が血液脳関門(以下、BBB)誘導能を有することを明らかにした。その後、quail胎児脳の解析を通じ、血管透過性制御因子であるvascular endothelial growthfactor(VEGF)のisoform(VEGF122,146,166,190)がBBB誘導時期に一致して変化することを見出した。即ち、それまでVEGF122,VEGF166であったisoformにBBB誘導時期にはVEGF146,VEGF190の発現亢進が加わった。VEGFは正常個体発生における脳血管新生過程のkey regulatorであるが、我々の解析結果は、VEGFが脳血管の分化過程、即ちBBB形成過程にも関与している可能性を示唆する知見と考えられる。さらに我々は、このVEGF isoformの変化が脳組織特異的な現象であるか否かについて検討を行う目的で、胎児肺および腎組織におけるVEGF isoformの発現を経時的に検索した。その結果、脳組織において発現するVEGF isoformに変化が見られるのに対し、肺および腎組織においては胎児期を通じてVEGF isoformの変化は観察されなかった。成体の肺組織、腎組織の血管はともにbarrier機構を有していないことから、脳組織におけるVEGF isoformの変化が、胎児血管のBBB形成血管への分化過程に関与する可能性をさらに強く示唆する知見と考えられる。

続いて我々は、上記のVEGF isoform変化の機能的意義を明らかにする目的で、4種類のquail VEGF isoformのクローニングを試みた。Quail胎児脳組織(胎齢15日)よりtotal RNAを抽出し、RT-PCRにて翻訳開始および終止コドンを含むVEGF cDNA断片を増幅し、各isoformをpBluescript KS vectorに挿入した。そして、得られたcDNA断片の配列も確認した。現在までに、4種類すべてのisoformにつき、open reading frame全長を含むcDNAをクローニングした。さらに、VEGF isoform変化の機能的意義解明のために、BBB誘導時期以降に発現の見られるisoform(VEGF146,190)特異的配列をターゲットとしたantisense oligonucleotideを投与し、quail胎児脳におけるVEGF isoform変化を阻害し得るかについても現在検討中である。個体発生過程において、脳血管は血管新生により増殖した後、血液脳関門(blood-brain barrier、以下BBB)形成血管へと分化する。我々はquail(ウズラ)-chick(ニワトリ)間異種移植系に基づくin vivo BBB誘導モデルを確立し、その解析により胎児脳細胞がBBB誘導能を有することを示した。さらに、上記in vivoモデルおよびquail胎児脳の解析を通じ、脳血管新生過程とともにBBB形成血管への分化過程にもvascular endothclial growth factor(VEGF)が関与する可能性を示唆する所見を得た。即ち、発生初期よりquail脳においてはisoform VEGF_<122>とVEGF_<166>の発現がみられるが、BBB誘導期以降にはさらにVEGF_<146>とVEGF_<190>の発現が加わった。脳以外の胎児組織(肺、腎を検索)におけるVEGF isoform発現パターンと比較検討した結果、上記の発現変化のうち特にVEGF_<146>の発現が脳組織特異的であることが明らかになった。VEGF_<146>発現亢進と胎児脳細胞の有するBBB誘導能との関連を検討するため、in situ hybridizationにてVEGF産生細胞の同定を行った。その結果、VEGFは胎児脳細胞より産生きれることが示され、BBB誘導時期にみられるVEGF_<146>の発現亢進が、胎児脳細胞のもつBBB誘導能と関連を有する可能性が示唆された。さらに我々は、上記のisoform発現変化の機能的意義を解析する目的で、各種VEGF isoform発現細胞の作製を行った。Quail胎児脳組織より各種VEGF isoroform cDNAをクローニングし、発現プラスミドを作製した。それらのプラスミドをCHO-K1細胞に導入し、各種isoformを発現するクローンを得た。
ルソーにおけるパフォーマティヴィティに関する教育思想史的研究

18世紀研究における啓蒙理解が単に革命を終着点として見る単純な見方から、より重層的で多様なものへと変化するにつれ、ルソー研究においては従来のようなルソーの「思想体系」の抽出ではなく、ルソーをいかに読み直し、啓蒙の思想系譜の中に位置づけるのかということへと研究の視点が移りつつある。このような状況を踏まえ、本研究は構造主義による言語論的転回以降のテクスト論に基づき、テクストにおけるパフォーマティヴィティという観点からテクスト分析を行ってきた。特に、本年度はルソーの執筆スタイルに着目し、しばしば矛盾する二つの要素として捉えられる「思考を促す言葉」と「装飾的な言葉」との「あいだ」を問う試みとして、テクストの言葉それ自体が持つ力に焦点を当て、言葉はそれが担っている字義的な意味だけでなく、テクストの中で非常に多義的な働きをすること、それゆえ読者の読み方やそれを通した理解に関わる側面において、多大な影響を与える力を孕んでいるということを、ド・マンの『読むことのアレゴリー』等においてなされた仕事を批判的に踏まえながら、ルソーの主要著作を中心にテクスト分析を行うことによって明らかにした0教育学の領域において、人を変える力/人が変わる力はどこから生じるのかということは一つの大きな問いである。ルソーをパフォーマテイヴィティという観点から読み直す本研究は、この問いに、言葉という角度からアプローチする一研究として位置づけられる。言葉を、現実指示的というよりはむしろ現実創出的な側面から捉え直すことによって、例えば、従来、教育場面で「問題」とされてきたような事象は、教育を語る言葉によって規定されている側面があるということを指摘することが可能となり、教育を語る言葉自体に注意をうながし、その転換を図ることにより、逆に、語る言葉によって事象を創っていくという新たな観点を提示することができる。本年度は、「アール(art)=技」を鍵概念として、フランス構主義以降のテクスト論を踏まえて、『エミール』を中心にテクスト分析を行った。従来のルソー研究では、「ルソー問題」と言われるようにルソーの思想の「矛盾」が問題とされ、「統一性」を提示するという形でその「矛盾」の解決を図ることが試みられてきたのに対し、本研究は「パフォーマティヴィテイ」(パフォーマンス性)という観点を入れ込むことにより、「矛盾」を「統一性」の方へと収斂させるのではなく、逆に「矛盾」を手掛かりとして、表面的には「矛盾」して現れるその根本にあるルソーの思想の特異性を浮かび上がらせようとするものである。本年度はこのような試みの一つとして、『エミール』に見られるとりとめのないもののように思われる多くの具体例に着目した。これは、従来のような「人間の成長段階」を体系的に取り出すような見方からは「些細なもの」として切り捨てられるものであるが、逆にそこにこそ『エミール』でルソーが提示しようとする教育における「原理」、「人間をつくるアール」を見ることができるのではないかということを明らかにした。本研究は、教育にとって古典的で、かつ現代においても変わらず重要なものである「原理」と「応用」、「普遍」と「個」の問題に関わるものである。教育は「実践」の領域にあるものであり、また「個」に関連するものであるというところにその本質があるゆえ、教育「学」と言った場合、その実践的で個別的なものをどのように「原理」として述べるのかという困難がある。本研究はこのような問いに対して、実践的であり個別的なものを「アール」という概念のもとに取り上げ、そこからいわゆる近代自然科学的な「学」の観点からはなかなか捉えきれなかった、実践的であり個別的なものである教育および教育「学」の語りの新たな可能性を模索する研究の一つとして位置付けられる。
プリオン感染に必須なプリオン蛋白質以外の分子の同定

我々は、新規の正常プリオン結合分子としてソーチリンを同定した。正常プリオンは、細胞膜表面でソーチリンと結合していた。プリオン持続感染細胞からソーチリンをノックダウンすると、異常プリオンが増加した。逆に、ソーチリンを過剰発現すると、異常プリオンは減少した。さらに我々は、ソーチリンのノックアウトしたマウス神経芽細胞を樹立し、プリオンを感染させた。その結果、コントロール細胞と比べて、ソーチリンのノックアウト細胞はプリオン感受性が著明に亢進し、異常プリオンも大量に産生した。これらの結果は、ソーチリンが正常プリオンから異常プリオンの構造変換に関与している可能性を示唆している。プリオン病はプリオンの感染によって起こる神経変性疾患である。プリオンが感染するために、正常プリオン蛋白質(以下、正常プリオン)が神経細胞に発現する事が必須である。しかし、正常プリオン以外にもプリオン感染に必須な分子が存在する事が指摘されている。本研究では、この分子の同定にチャレンジする。このために、平成25年度には、正常プリオンを過剰発現するマウス線維芽細胞とマウス神経芽細胞腫由来N2a細胞クローンを樹立し、これらの細胞がプリオンに感染しにくいことを確認後、マウス脳cDNAライブラリーのプールをこれらの細胞に導入した後にプリオンを感染させ、どのcDNAライブラリーのプールを導入された細胞がプリオンに感染するようになったのか明らかにする。我々は、まず、マウス正常プリオン発現ベクターをマウス線維芽細胞やN2a細胞に導入し薬剤選択後に、限界希釈法にて、正常プリオンを過剰発現するマウス線維芽細胞及びN2a細胞を樹立することに成功した。次に、樹立したこれらの細胞がプリオンに感染するのか否か解析した結果、樹立したN2a細胞クローンの中にプリオンに感染しにくいクローンを得ることが出来た。また、まだ予備的な実験段階であるが、樹立したマウス線維芽細胞クローンの中にもプリオンに感染しにくいクローンがあることを見出している。既に我々は、200個の異なる遺伝子からなるマウスの脳cDNAライブラリーのプールを作製していた。本研究では、これらのcDNAプールを上記で樹立した細胞に導入し、その中からプリオン感染に関与するcDNAを同定することを計画している。そこで我々は、蛍光蛋白質発現ベクターを用いて、cDNAを最も効率よく導入する条件を検討した。その結果、最も効率よく蛍光蛋白質発現ベクターを導入する条件を決定できた。プリオンが感染するためには、細胞膜表面に発現する正常プリオン蛋白質(以下、正常プリオン)が異常プリオン蛋白質(以下、異常プリオン)に構造変換することが必須である。しかし、正常プリオンから異常プリオンの変換に関与する宿主分子は同定されていない。本研究では、プリオン蛋白質の構造変換に関与する宿主分子の同定を行なう。ソーチリンは細胞内小胞輸送に関与する膜蛋白質であり、アルツハイマー病の病態にも関与する分子であることが知られている。免疫細胞化学により、正常プリオンは細胞膜表面でソーチリンと結合していることが分かった。さらにこれらの結果は、ソーチリンがプリオン感染に抑制的に機能していることを示している。今後、正常プリオンから異常プリオンの構造変換におけるソーチリンの役割をさらに解明していく予定である。ウイルス学平成25年度内に、正常プリオンを過剰発現するマウス線維芽細胞やN2a細胞クローンを樹立し、これらの細胞がプリオンに感染しにくいことを確認後、マウス脳cDNAライブラリーのプールをこれらの細胞に導入した後にプリオンを感染させ、どのcDNAライブラリーのプールを導入された細胞がプリオンに感染するようになったのか明らかにする1次スクリーニングを終了する予定であった。しかし、正常プリオンを過剰発現するマウス線維芽細胞やN2a細胞クローンの樹立の途中で、コンタミネーションの問題が発生し、はじめからやり直さなければならなくなり、予定より時間を要した。また、樹立したこれらの細胞がプリオンに感染するのかどうか最終的に確認するために、一回の実験に約1ヶ月を必要とする感染実験を数回行なわなければならなくなり、予定より時間を要した。従って、現時点の実施状況としては、申請時の研究計画より2ー3ヶ月の遅れとなっている。

研究を継続するのに必要な、プリオンに感染しにくい正常プリオンを過剰発現するマウス線維芽細胞やN2a細胞クローン、マウスの脳cDNAライブラリーのプール、及びcDNAライブラリーを最も効率よく導入する方法等に関しては、平成25年度内に解決している。申請時の研究計画より遅れているが、本研究の目的であるプリオン感染に必要な正常プリオン以外の分子の同定を行なえる状態にある。従って、今後も引き続き、申請時の計画に乗っ取り研究を行う。研究計画の遅れを取り戻すためにも、今後、研究代表者と研究分担者はさらに強力な連携をはかり研究を遂行していく。現時点の実施状況としては、申請時の研究計画より2ー3ヶ月の遅れとなっている。この遅れのために、次年度使用額が生じた。申請時の研究計画より遅れている実験を2ー3ヶ月のうちに早急に行ない、それに伴い次年度使用額を執行する。