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ストレスが視床下部-下垂体内分泌系と自律神経系を介して卵巣機能に及ぼす影響

本研究はストレス刺激が末梢血中エストラジオール濃度へ及ぼす影響とその機序の解明を目的として行った.麻酔ラットを用い,後肢足蹠へ5分間の侵害刺激および交感神経が最大に興奮する強度で直接卵巣交感神経に5分間の電気刺激を加えたところ,いずれの場合も末梢静脈血中のエストラジオール濃度に変化はみられなかった.一方,同じ刺激によって,卵巣からのエストラジオール分泌速度はそれぞれ約30%および約50%減少した.以上の結果から,短期のストレス刺激による卵巣エストラジオール分泌速度の減少は,末梢血中には反映されないことが明らかとなった.本研究はストレス刺激が末梢血中エストラジオール濃度へ及ぼす影響とその機序の解明を目的として行った.麻酔ラットを用い,後肢足蹠へ5分間の侵害刺激および交感神経が最大に興奮する強度で直接卵巣交感神経に5分間の電気刺激を加えたところ,いずれの場合も末梢静脈血中のエストラジオール濃度に変化はみられなかった.一方,同じ刺激によって,卵巣からのエストラジオール分泌速度はそれぞれ約30%および約50%減少した.以上の結果から,短期のストレス刺激による卵巣エストラジオール分泌速度の減少は,末梢血中には反映されないことが明らかとなった.本研究はストレス刺激が末梢血中エストロゲン濃度へ及ぼす影響とその機序の解明を目的として行った.本年度はまず卵巣からのエストロゲン分泌に及ぼすストレス刺激の効果を検討した.実験は36ヵ月齢の雌性Wistar系成熟ラットを用い,麻酔下,人工呼吸下で体温,血圧などを生理的に安定に維持した状態で行った.ストレス刺激としては後肢足蹠に侵害刺激を行った.卵巣静脈から間欠的に採血し,血漿中のエストロゲン濃度をEIA法で測定した.その結果,5分間の後肢足蹠への侵害刺激中に卵巣静脈血漿中のエストロゲン濃度および分泌速度は減少した.卵巣に分布する交感神経を電気刺激したところ,α_2受容体を介して卵巣からのエストロゲン分泌が減少することが明らかとなった(論文投稿中).従って,侵害刺激による卵巣静脈血漿中エストロゲン濃度の減少反応には卵巣交感神経が関与することが示唆された.次に侵害刺激による卵巣エストロゲン分泌減少反応が末梢血中にどう反映されるかについて検討した.初めに末梢血漿中エストロゲン濃度を安静時において測定したところ,末梢動脈血漿と末梢静脈血漿中のエストロゲン濃度はほぼ等しく,卵巣静脈血漿中の濃度の約半分であることが分った.末梢血中のエストロゲンは,卵巣から分泌されるだけでなく,一部は副腎皮質から分泌されるデヒドロエピアンドロステロン(DHEA)に由来することが知られている。ストレス時には視床下部-下垂体-副腎皮質系が亢進することは周知の事実である.従って,今後はストレス刺激時の末梢血中エストロゲン濃度の変化を調べ,さらにその濃度変化に対する副腎皮質および視床下部-下垂体系の関与を,副腎や視床下部を除去したラットで調べる予定である.本研究はストレス刺激が末梢血中エストロゲン濃度へ及ぼす影響とその機序の解明を目的として行った.実験は36カ月齢の発情日の雌性Wistar系成熟ラットを用い,麻酔下,人工呼吸下で体温,血圧などを生理的に安定に維持した状態で行った.ストレス刺激としては後肢足蹠に侵害刺激を行った.刺激と対側の大腿静脈から間欠的に採血し,血漿中のエストロゲン濃度をEIA法で測定した.その結果,5分間の後肢足蹠への侵害刺激により末梢血中のエストロゲン濃度に変化はみられなかった.その理由として,侵害刺激が卵巣からのエストロゲン分泌に影響を及ぼさなかった可能性と,侵害刺激が軽度だった可能性とが考えられる.そこでまず,卵巣静脈から採血を行い,侵害刺激時が卵巣からのエストロゲン分泌に影響を及ぼすかどうかを調べた.その結果,5分間の後肢足蹠への侵害刺激により卵巣静脈血漿中のエストロゲン濃度およびエストロゲン分泌速度は減少した.これらの減少反応は,卵巣に分布する交感神経を切断すると消失した.さらに,卵巣交感神経を電気刺激したところ,α2受容体を介して卵巣からのエストロゲン分泌が減少した(研究成果:Kagitani et al. 2011).以上のことから,侵害刺激により卵巣交感神経およびα2受容体を介してエストロゲンの卵巣静脈血漿中濃度および卵巣からの分泌速度が減少することが明らかとなった.卵巣エストロゲン分泌は,視床下部-下垂体-卵巣系のホルモンによって制御されることがよく知られているが,今回の侵害刺激によるエストロゲン分泌減少反応には,内分泌系による制御は関与しないことが考えられた.現在,侵害刺激の強度を高めて末梢血エストロゲン濃度に及ぼす影響を調べており,この結果をふまえて論文を作成する予定である.
肝実質細胞の部位差に基づく領域区分と各種血管樹との肝葉内立体配置の観察

肝葉内組織構築を立体的に捉えることを目的とし、本年度は、肝葉に領域区分をもたらす肝細胞の部位差の発現と肝細胞索の形成過程について、二次元および三次元観察と形態計測を行った。スンクス胎生22、24、25、26、28、29日、生後0、2、4、11、16日および成獣は、ザンボニ液灌流固定後、肝臓を1ないし1.5μmのトルイジンブルー染色エポン連続切片とし以下の観察に供した。二次元形態計測では、小葉間静脈と中心静脈の間の領域に分布する肝細胞切片のうち、核を含むものを対象とし、肝細胞の面積、形状係数を測定、数値化した。三次元観察および形態計測では、1本の肝類洞が小葉間静脈から分岐し中心静脈に至るまでを連続的に追跡し、これに接するすべての肝細胞と共に立体再構築を行い、肝細胞の体積、形状係数を測定、数値化した。胎生期の肝臓ははじめ造血細胞優位であるが、造血巣の衰退に伴い肝細胞索が発達する。形態計測および三次元観察から、肝細胞の成長および肝細胞索の形成過程は、以下の4段階に分けられた。(1)観察した胎生2228日:肝細胞は不定形を呈し、造血巣間に散在する時。(2)胎生29日生後0日:肝細胞はグリコーゲンを蓄積、特に門脈域では丸みを帯び、肝細胞索がほぼ完成する時。(3)生後24日:肝細胞はグリコーゲンを消費し、特に中心静脈域で不定形を呈し、肝細胞索が再び不完全になる時。(4)生後1116日:肝細胞はほぼ均一に丸みを帯びた多角形を呈し、門脈域で大きく中心静脈域で小さいというスンクス特有の顕著な部位差を示し、肝細胞索が完成する時。以上の結果より、スンクス肝細胞の形態的部位差は出生直前に発現し、生後成長に伴いさらに顕著になること、肝細胞索は出生直前に形成されるが、出生直後のグリコーゲン消費に伴い一時不完全となったのち、生後16日までには再形成され完成することが明らかとなった。肝葉内組織構築を立体的に捉えることを目的とし、本年度は、連続切片再構築法および共焦点レーザー顕微鏡(CLSM)法を用い、スンクス、マウス、ラットの肝類洞走行を三次元的に観察した。連続切片再構築法では、1ないし1.5μmのエポン連続標本を作製、光学顕微鏡下、門脈から分岐し中心静脈に流入する肝類洞を、両静脈と共に抽出、独自の二次元画像処理を施した後、三次元観察に供した。購入したリアルタイム三次元表示システム(Real Time Visualization)は再構築した立体像を任意に回転、切断しながらの観察を可能にする。これにより再構築した肝類洞走行をあらゆる角度から観察した。CLSM法では、血管内にFITC標識ゼラチンを注入した肝臓を80120μm厚切片とし、CLSMで連続光学スライス像を作製、Real Time Visualizationシステムにより上記と同様の三次元観察を行なった。スンクス肝類洞は、門脈から分岐した後、直線的に走行し規則的な二分岐を数回繰り返した。この間隣接する類洞との吻合は見られなかった。中心静脈に近づくにつれて分岐角度は大きくなり、吻合もみられた。類洞は中心静脈の直前でこれを取り囲む1層の網状の槽を形成し、ここから限られた数の類洞が中心静脈へと流入していた。この網状槽はスンクスに特異的にみられた。エポン連続標本の光顕所見と照合することにより、類洞が直線的に走行する部位は大型肝細胞が分布する門脈域、吻合の見られる部位は小型肝細胞が分布する中心静脈域にそれぞれ一致することがわかった。マウス肝類洞は、門脈域で吻合のない規則的な二分岐をする点でスンクスと同じだが、その走行にやや蛇行がみられた。中心静脈域では並走する類洞の間にこれらをつなぐ吻合がみられ、網目構造を呈していた。ラット肝類洞は、全域において吻合が多く、複雑な網目構造を呈していた。中心静脈付近で合流により数を減じ中心静脈へと流入していた。現在ヒト肝類洞についても同様の方法で観察中である。(1)観察した胎生

2228日:肝細胞は不定形を呈し、造血巣間に散在する時。(2)胎生29日生後0日:肝細胞はグリコーゲンを蓄積、特に門脈域では丸みを帯び、肝細胞索がほぼ完成する時。(3)生後24日:肝細胞はグリコーゲンを消費し、特に中心静脈域で不定形を呈し、肝細胞索が再び不完全になる時。(4)生後1116日:肝細胞はほぼ均一に丸みを帯びた多角形を呈し、門脈域で大きく中心静脈域で小さいというスンクス特有の顕著な部位差を示し、肝細胞索が完成する時。以上の結果より、スンクス肝細胞の形態的部位差は出生直前に発現し、生後成長に伴いさらに顕著になること、肝細胞索は出生直前に形成されるが、出生直後のグリコーゲン消費に伴い一時不完全となったのち、生後16日までには再形成され完成することが明らかとなった。
注水停止後の逸水に伴う地下き裂閉口特性を応用した地殻応力計測評価に関する研究

本研究では、ボアホールと直交する横き裂が存在する場合を対象として、シャットイン後のき裂閉口挙動を解析し、シャットイン後のボアホール水圧降下曲線(シャットイン曲線)とき裂閉口挙動との関係を解明して、き裂閉口圧決定法を提案するとともに室内実験による検証を行った。この結果得られた知見をまとめると次のようになる。(1)ボアホールと直交し、かつ、ボアホール軸に対して軸対称な地殻圧縮応力を受ける横き裂を対象とし、シャットイン後のき裂閉口挙動を解析してシャットイン曲線を求め、それに及ぼす諸因子の影響について検討した。その結果、次のことがわかった。すなわち、ボアホール水圧の大きさがき裂面垂直方向の地殻圧縮応力の大きさに等しくなったとき、き裂全体が同時に閉じてしまう。また、シャットイン曲線の形状はき裂長さが変わってもほとんど変化しないが、逸水係数の影響は強く、逸水係数が大きくなるほどシャットイン曲線のこう配が大きくなる。また、逸水係数が同じでも、き裂閉口挙動の違いから、縦き裂の場合の方が横き裂の場合よりシャットイン曲線のこう配が全体的に大きくなる。(2)横き裂のシャットイン後の水圧降下には、シャットイン直後に起こるき裂進展が終了してからき裂が閉じるまでの段階およびき裂全体が閉じた以降の段階の各段階で、ボアホール水圧の時間変化率の逆数がボアホール水圧に比例するという特性がある。(3)上記の特性を利用すれば、き裂閉口圧を明確に決定できる。すなわち、シャットイン曲線をボアホール水圧の時間変化率の逆数とボアホール水圧との関係に整理し直し、それを二直線近似したときの二直線の好転を検出すれば、その交点のボアホール水圧として、き裂閉口圧が与えられる。
歯科衛生士教育におけるｉＰａｄアプリケーションの開発と教育効果に関する研究

文部科学省では学校教育分野、社会教育分野における情報化の推進のため様々な取組を実施している。学校教育では授業でのICT(Information and Communication Technology)活用が着実に進展し、情報教育の充実やアクティブ・ラーニングへのICT活用が議論されているがICT教育が進んでいない教育分野も見受けられる。歯科臨床の現場では、患者情報や検査データをデジタル化をして管理をしている。しかし、歯科衛生士教育ではデジタル化に対応しきれておらず活用が進んでいない。本研究の目的は、歯科臨床の現場に即したICTを用いた教育を行うこと、歯科衛生士教育にとって重要である実技習得及び患者指導技術向上を中心としたiPadアプリケーションの開発すること、授業やアクティブラーニングで使用した教育効果を検証することである。歯科衛生士教育に特化したiPadアプリケーションの開発と教育効果の検証は先行研究がほとんどない。筆者はこれまでにiPadアプリケーションの開発に着手しており、本研究ではそれらを更に発展させていく。さらに全国約160校の歯科衛生士養成機関と、iPadアプリケーションとそのデータの共有化を考慮し、ネットワーク環境の整備にも力を入れる予定である。初年度は歯科衛生士教育に特化したiPadアプリケーション開発を行い、歯科衛生学生に使用してもらった。学生の意見を基に操作性について改善を行った。初年度はiPadアプリケーション開発を行い、歯科衛生学生に使用してもらった。結果については日本歯科衛生教育学会にて発表を行い、歯科衛生士教育に携わる教員から意見をもらい、今後の方向性の示唆を得た。今後は、改善をしたiPadアプリケーションをiPadアプリケーションを用いて、実際に授業や学生の自主学習などのアクティブラーニングを行い、教育効果について検証していく予定である。物品費について、初年度にiPadを購入する予定であったがネットワーク環境を考慮して研究代表者の所属大学所有のiPadを使用して研究を行った。次年度はiPad数台を新たに購入予定である。
環状ビニルポリマーの新規合成法の開発

アジド基とアセチレン基を有するアルコキシアミン誘導体を合成し、続いてアジド/アルキン-クリック反応により分子内に環状構造を導入した。次に得られた環状アルコキシアミン誘導体をNMP開始剤とするスチレンの重合を行った(NMP:安定ニトロキシドによる制御ラジカル重合)。生成物および生成物を開環したサンプルの分子量測定などから、本重合反応が大環状のビニルポリマーを環拡大重合機構により生成する系であることが支持された。大環状ポリマーは、多くの場合、鎖状ポリマーの両末端を何らかの化学反応により閉環することで得られる。すなわち、最後にポリマーの閉環を伴わない方法はあまりない。特にビニルモノマーの環拡大型重合に関してはほとんど報告例がない。そこで本研究では、汎用のビニルモノマーにも適応可能な環拡大型重合を開発することを目的として研究を行った。以下に成果を記す。1)安定ニトロキシドラジカルを用いたリビングラジカル重合(NMP)の開始剤として機能するアルコキシアミン誘導体に、環状構造の導入を行った。はじめにトリメチルシリル基で保護したアルキンを有するニトロキシドラジカル誘導体を合成した。これをクロロメチルスチレンに反応させてアルコキシアミン誘導体とした。続いて4-アジド安息香酸との反応およびトリメチルシリル基の脱保護反応を行い、分子内にアジドとアルキンを有するアルコキシアミン誘導体に変換した。最後に銅触媒を用いたアジドーアルキン/クリック反応を行い、目的物である環状NMP開始剤を得た。2)環状NMP開始剤によるスチレンの重合を行った。重合は溶媒にフルオロアルコールを用い125°Cで行った。生成物の構造解析を行った結果、本重合系、すなわち環状NMP開始剤を用いた重合系は、鎖状NMP開始剤の系に比べて、非常に高分子量のポリマーを与えることが明らかとなった。この結果より本重合系では、i)環拡大重合が進行し大環状ポリマーが生成し、同時に、ii)鎖状のアルコキシアミンを用いた系では起こらない反応、すなわちラジカル環交差反応が生じ、結果として環がさらに拡大した分子量の大きなポリマーが生じたと考えた。生成物の質量分析および生成物を開環したサンプルの構造解析からi)およびii)がそれぞれ支持された。大環状ポリマー(リングポリマー・マクロサイクリックポリマー)は通常、鎖状ポリマーの両末端を何らかの化学反応により閉環することで得られる。そこで本研究は「安定ニトロキシドラジカルを用いたリビングラジカル重合(NMP)」を利用することによってビニルモノマーの環拡大型重合を達成することを目的とする。具体的には、NMPの重合開始剤となり得るアルコキシアミン誘導体の頭尾をクリック反応により結合した化合物(環状NMP開始剤)の合成を行う。それを用いてスチレンの重合を行い生成物の構造を調べる。マクロモノマーの重合についても検討を行う当該年度は環状NMP開始剤を合成した。具体的には、トリメチルシリル(TMS)基で保護したアルキンを有するブロモベンゼン誘導体(1)をグリニャール試薬に変換し、続いてこれにニトロンを反応させ、TMS基で保護したアルキンを有する安定ニトロキシドラジカル(2)を合成した。次に2をクロロメチルスチレンに反応し、TMS基で保護したアルキンおよびクロロメチル基をそれぞれ頭および尾に有するアルコキシアミン(3)を得た。クロロメチル基をアジド基に変換した後、TMS基を脱保護し、アジド基およびアセチレンを有するアルコキシアミン誘導体(4)を得た。最後に分子内アジド/アルキン-クリック反応を行い環状NMR開始剤(5)を得た。5によるスチレンおよびメチルアクリレートの重合を行った。ガスクロマトグラフィーにより重合動力学を調べ、NMR測定およびサイズ排除クロマトグラフィーにより生成物の構造解析を行い、ビニルモノマーの環拡大重合を達成する系に関する知見を実験的に得た。
実養殖環境下におけるスサビノリ共生細菌の生態と共存機構に関する研究

本研究では、ノリ養殖環境における共生細菌の生態とそれをとりまく細菌叢を解明し、ノリ養殖環境下におけるノリおよび現場細菌群集の共存機構に関する理解の深化を図ることを目的とする。本研究では、2年間にわたり、ノリ養殖環境の海水およびノリにおける細菌叢を培養法および非培養法により調べ、優占菌種の変動と普遍的に存在する細菌群を明らかにした。さらに、ノリと養殖海域から採取した海水を室内で共培養することで、スサビノリと共存する細菌群を見出すことに成功した。日本の重要対象種であるスサビノリの室内培養系中に共生細菌が存在し、これらの共生細菌は、藻体の形態形成や発育促進に重要な影響を与えることが解明されつつある。しかし、共生細菌が実際のノリ養殖環境中でどのような挙動を示すかは明らかにされていない。そこで本課題では、ノリ養殖環境中における共生細菌の生態を解明するとともに、それをとりまく環境要因および細菌叢との関連を明らかにすることを目的とする。ノリ養殖環境におけるスサビノリの共生細菌Hyphomonas sp.株の定量的調査の前段階として、本菌株に特異的な定量PCR法を開発した。本菌のハウスキーピング遺伝子塩基配列を標準株の既知配列と比較し、特異性の高い領域にプライマーおよびプローブを設計し、特異性評価を行った。次に、ノリの養殖時期に経時的に、スサビノリの養殖環境から育苗ノリを採取し、培養法と非培養のDNAおよびRNAクローンライブラリー法により、16S rRNA遺伝子塩基配列に基づいた細菌叢解析を行った。ノリ表面の細菌群は、培養法ではα-ProteobacteriaおよびFlavobacteriaが優占し、非培養法ではα-Proteobacteria、γ-Proteobacteria、およびFlavobacteriaが優占したが、両手法における優占種は異なる場合が多かった。また、既知の細菌の塩基配列と比較して、相同性の低い分離菌株およびクローンが多く含まれたことから、ノリの表面には独特な細菌叢が形成されていることを明らかにした。平成27年度は、当初の年次計画に沿って、スサビノリ共生細菌の特異検出定量法を開発し、養殖ノリの細菌叢解析を実施したことから、それぞれの課題をほぼ達成した。スサビノリの室内培養系中には共生細菌が存在し、共生細菌は藻体の形態形成や発育促進に重要な影響を与えることが解明されつつある。本研究では、ノリ養殖環境中における共生細菌の生態を解明するとともに、それをとりまく環境要因および細菌叢との関連を明らかにすることを目的とする。本年度は、スサビノリ共生細菌Hyphomonas sp.の特異検出定量PCR法を用いて、ノリ養殖環境の育苗ノリおよび海水における菌数を経時的に調べた。その結果、共生細菌は、海水および育苗ノリ試料ともに検出限界以下であったが、ノリの幼葉状体が付着したノリ網からは少量の菌数が検出された。検出された試料が少なかったため、環境要因との関連を調べるには至らなかった。本年度は、当初の研究計画通りに、養殖環境下における共生細菌の生態を解明し、前年度に引き続いて細菌叢解析を実施し、2年間の結果をまとめることが出来た。また、スサビノリ養殖環境における細菌叢の網羅的解析から、今後の研究を進める上で重要な知見を得ることができたことから、研究の進捗状況としてはおおむね順調に進展していると評価した。ノリは共存する細菌叢に選択的な影響を与え、その結果としてノリ養殖場において特徴的な細菌叢が形成されていると考えられる。そこで、スサビノリと細菌群の共存機構を理解することを目的とし、この仮説に対する実証試験を環境要因に依存しない室内閉鎖系で評価した。ノリ養殖場から育苗ノリと海水を採取するとともに、ノリ養殖環境とは異なる海域の海水を採取した。これらの海水試料に、ノリの抽出液および表面をクエン酸で殺菌したノリ葉体をそれぞれ添加した後、室内培養を行い、培養前後の細菌叢の変化を16S rRNA遺伝子アンプリコン解析により調べた。各海域から採取した海水ではFlavobacteriia、α-Proteobacteriaおよびγ-Proteobacteriaが優占し、育苗ノリの表面ではFlavobacteriiaが最も優占し、その割合は海水に比べて高かった。ノリの抽出液を両海域の海水に添加した区において、培養後の海水の優占菌群はγ-Proteobacteriaであった。次に、殺菌したノリをノリ養殖場の海水で培養したとき、海水ではγ-Proteobacteriaが優占したのに対して、ノリ表面ではFlavobacteriiaが優占する傾向にあった。一方、ノリを養殖環境とは異なる海域の海水で培養したとき、海水およびノリ表面においてγ-Proteobacteriaが優占し、Flavobacteriiaは低い割合を示した。これらの結果から、育苗ノリの表面に優占するFlavobacteriiaは、ノリ養殖場の海水からノリ葉体自体の影響を受け、選択されることが推察された。

当初の研究計画通りに、スサビノリ共生細菌の養殖環境下における生態調査を実施するとともに、平成27年度と同様に、ノリ養殖環境における網羅的な細菌叢解析を継続して行う予定である。これまでの結果から、養殖環境下のノリ表面には特徴的な細菌叢が形成されていることを明らかにした。これは、ノリが産生する代謝産物が共存する細菌叢に選択的な影響を与えていると考えられる。この仮説に対する実証試験を、環境要因に依存しない室内閉鎖系で行う。ノリ藻体自体とその代謝産物のどちらが、ノリ表面と海水中の細菌叢に選択的な影響を及ぼすかを検討し、養殖場におけるノリと細菌群の共存機構を理解する。環境微生物学当初予定していたノリ養殖環境の海水試料の細菌叢解析が十分に実行できなかった。当初予定していた旅費の支出が少なかったことと、購入を予定していた試薬・消耗品類が、安価で購入できたことがあげられる。また、平成29年度に室内培養での実証試験を、次世代シーケンス解析にて行う予定にしている。それに関連する費用が必要となり、次年度に支出するために残した。経費を次年度に持ち越し、海水試料の細菌叢解析を実施するために使用する。次年度、次世代シーケンス解析にて必要となる経費に充てる予定である。
薬剤低感受性腫瘍克服に向けての分子生物学的解析とその臨床的方策に関する研究

1.低感受性腫瘍細胞の遺伝子レベルでの解析:(1)Fisherラット線維芽細胞3Y1に各種癌遺伝子を組み込み発現させた細胞株の制癌剤に対する感受性の差を比較し、src又はras発現細胞では共通の多くの薬剤に低感受性を示す事実を明らかにした。(2)アロ組織適合抗原支配遺伝子(H-2)、又は癌遺伝子(erbB遺伝子)とH-2との融合遺伝子を腫瘍細胞内に移入したtransfectantでは移入移伝子産物に対する強いkiller活性の誘導と腫瘍に対する特異免疫の獲得を証明した。2.抗癌剤の薬理生化学的解析と耐性克服に有効な物質の探索:(1)bleomycin(BLM)不活化酵素がシスティンprotease阻害物質E-64により顕著に阻害されることを見出し、本物質とペプレオマイシン併用によりチャイニーズハムスター肺由来のV79の殺細胞作用の増強、BLM不活化酵素活性減少効果を認めた。(2)同様に耐性克服の面ではヒト結腸癌WiDrのDDP及びACNUの低感受性がglutathione生合成阻害剤BSOさらにO^6-AGTを阻害するO^6-methylguanineとの併用により増強されることを見出した。(3)一方、多剤耐性を克服する薬剤の多くが多剤耐性蛋白(gp170)と強い親和性を示すことを明らかにし、さらにgp170との親和性の強いdihydropyridine系薬剤のスクリーニングによりCa^<2+>拮抗作用のない耐性克服物質を見出した。また耐性克服物質セファランチンがライソソームに対して強い親和性を有することを見出した。3.臨床例の解析と低感受性克服の試み:(1)肺癌化学療法に重要な位置を占めるシスプラチンに対する耐性株の分子生物学的特性を分析し、感受性株に比し薬剤の代謝と関連するGSTπのmRNA及び解毒蛋白とみられるmethalthioneinlのexpressionの増加を認めた。(2)CMMC誘導体KT6149、anthracycline誘導体menegorlはinvitrolmother compoundに比し強い抗腫瘍作用を認めた。
ナノ多結晶ダイヤモンドの大型化とマントル最下部に至る圧力発生技術開発への利用

NPDの合成条件は出発試料によって大きく変動することが明らかとなっている。本研究では5-10万気圧、500-1500°C程度の実験条件においてダイヤモンドへの変換率や粒径、焼結状態などを確認しつつ合成条件を模索して行き、最終的には愛媛大学地球深部ダイナミクス研究センター(GRC)設置の世界最大級の高圧発生装置を用いて直径10 mm級の超大型NPDの合成を目指す。さらに合成しNPDの高圧発生装置への応用と試料部構成の最適化を行い、地球のマントルー核境界に相当する圧力発生技術の開発に取り組む。
高温プラズマイオン温度測定用炭酸ガスレーザ励起サブミリレーザの試作

臨界プラズマのイオン温度を協同トムソン散乱法により測定するには、散乱用光源となる高出力・狭帯域サブミリレーザの開発が不可欠である。本研究では、実験室プラズマでの散乱計測が可能となる出力100mJ,パルス幅200300ns以上の狭帯域重水サブミリレーザの試作を目的に研究を行った。前年度までに、出力30Jのシングルモード炭酸ガスレーザ励起重水サブミリレーザを試作し、当所の目標を上回る出力120mJ,パルス幅800ns,スペクトル幅100MHz以下の波長0.385mm重水レーザ光を得た。そこで本年度は、これらの結果をさらに発展させて、現在集中的に開発が行われている重水レーザ以外の高出力サブミリレーザ開発の可能性について、理論的,実験的に検討を加え、サブミリレーザの最適化を計ることを目的に研究を行った。主要な結果を以下に述べる。(1)与えられた励起用炭酸ガスレーザ出力に対し、散乱受信パワーの評価を種々のサブミリレーザ媒質について行った。その際、サブミリレーザの発振特性は、本研究代表者等により既に開発されているシミュレーションコードを用いた。その結果、【NH_3】0.151mm,0.257mmの発振線が有望であることを見い出した。同発振線を用いれば、同一の受信パワーに対しレーザ系を半分程度の規模にコンパクト化できる。(2)【NH_3】0.257mmについて励起実験を行い、発振を確認した。今後、この波長域でサブミリ波検出器が開発されれば、重水レーザに比してコンパクトな散乱計測システムを構成できると思われる。以上により、重水レーザについては、より大型化する際の設計手法が確立され、重水レーザに代る有望なサブミリレーザ媒質を指摘した。サブミリレーザによる協同トムソン散乱法は、時間・空間分解に優れた高温プラズマのイオン温度計測法として、その実現が期待されている。光源となるサブミリレーザとしては、炭酸ガスレーザ励起重水レーザが、現時点で唯一の可能性を持っている。本研究では、独自の方式としてエタロンで同調する小型シングルモードTEA炭酸ガスレーザを注入源に用いた注入ロック式励起用炭酸ガスレーザの試作と、同レーザ励起重水レーザの試作を行った。本年度は、波長0.385mmの重水レーザより100KW級の出力パワ、パルス幅μsの狭帯域サブミリ光を得、さらにレーザシステムの動作を安定化を行うことを目標に研究を行った。以下に、主要な結果を列挙する。(1)出力エネルギー30Jのシングルモード炭酸ガスレーザ励起重水レーザより、出力パワ120KW、パルス幅800ns、スペクトル幅100MHz以下のサブミリ光を得た。(2)重水レーザに、バッファガスとしてS【F_6】を添加し、1030%の効率改善が得られた。(3)重水レーザシステム動作の安定性は、励起用炭酸ガスレーザのシングルモード動作の安定性、即ち注入ロック動作の安定性で決っている。(4)注入ロック動作の不安定性は、注入光周波数と被注入レーザの共振周波数間の不整合により生じ、安定動作のためには、レーザ共振周波数を20MHz(共振器長換算1μm)以内に安定化する必要がある。(5)注入ロック動作の受動安定化について検討した結果、レーザガスの混合比の揺らぎが共振周波数の揺らぎの原因として支配的であり、予め混合されたレーザガスの使用により、格段の安定度が得られることが分った。
「満洲国」の戦犯問題

「満洲国」崩壊後、同国統治に関与した中国人高官はソ連に連行され捕虜となった後、人民共和国に送還されて戦犯となった。中ソの国際関係と、中国の国際連合加盟戦略が戦犯管理・裁判に大きく影響したこと、「満洲国」関連戦犯には張作霖・学良両政権の関係者や二世官僚が多く、「満洲国」以前の経緯も、彼らが「満洲国」に関与する契機として看過できないことなどを解明した。従来のいわゆる近現代中国「満洲」史研究には、大別して2つの偏りがあった。1つは人民共和国成立を自明のゴールとし、共産・社会主義を是として、それ以外の政治勢力やイデオロギーを軽視してきたことである。もう1つは日本側からみた中国像を重視しすぎ、中国人の同時代感覚に近づいてこなかったことである。本年度はこうした分析反省に基づき、「漢民族の裏切り者」という感情論を含む「漢奸」概念、および国際法規にてらした罪状のみを問い原則として国籍を諭じない「戦犯」概念の検討から研究を着手した。中でも3人の戦犯(王賢、袁慶清、于静遠)の事跡と罪状の解明に的を絞った。彼らの父(王永江、袁金鎧、于冲漢)はいずれも張作霖政権(191628年)の高官であり。清末新政への関与や「満洲国」参加問題を抱え、父子をトータルで捉えれば中華民国(清末を含む)史と「満洲国」史、日中関係史を濃密に連結できるからである。これに「満洲」史不可欠の要素たる中ソ・日ソ関係、人民共和国前半史、「満洲国」成立以前の地域の骨格たる張作霖・学良父子政権の研究を順次加え、単行本として成果を公表した。20年度最大の成果は、中国・遼寧省档案館で史料調査を行い、張作霖と溥儀の実家(醇親王家)とが交わした文書群を発見したことである。19年度に、「満洲国」関連中国人戦犯4人の伝記を含む著作『「漢奸」と英雄の満洲』(講談社選書メチエ,全194頁)を発表したが溥儀への言及は不充分であった。今回の発見は、旧清朝統治者・満洲族としての溥儀と、民国統治者・張作霖が、同郷人として強い結びつきを保っていたことを示す。内容的には、醇親王家が北陵周辺の所有地売却を張作霖に任せていたこと、また民国政府から清室優待歳費の支払いが滞り、あるいは不足したため、張に借金を申し入れたり資金提供を依頼していたことなどがわかるものである。従来、溥儀の「満洲国」入りについては復辟願望が大きな原因とされてきたが、民国成立以降の生活困窮と、パトロンであった張作霖の死(1928年)という経済生活上の問題を加味して検討し直す必要が出てきた。張作霖政権期(1916-28年)にまでさかのぼって戦犯問題を分析するという新たな切り口から今後は展開していきたい。
X線波長変調回折法によるBragg反射の「位相」決定

物質の結晶構造を決定する方法として知られているX線回折法において「位相問題」とよばれる難問が存在している。これはBragg反射、すなわち各原子からの散乱X線波の合成波、の振幅は反射強度の測定から知ることができるが、その位相は測定不可能であるため、フーリエ合成によって電子密度分布を得ることができず、結晶構造が決定できないという問題である。本研究において放射光の波長連続性と高輝度性に着目し、結晶に入射するX線の波長を特定の原子の吸収端近傍において時間的に変動させながらBragg反射を記録し、その強度プロフィルに現われる勾配から位相を決定するという新しい方法、「X線波長変調回折法」、を考案した。結晶に対称中心の有る場合は強度勾配からただちに位相、この場合は符号、を知ることができる。対称中心のない場合は二つの波長領域において強度勾配を測定し、連立一次方程式を解くことにより位相が求められる。これら二つの場合について具体的な実験方法を示すとともに、測定される強度勾配に入る誤差の評価を行った。そして立命館大学の放射光源を用いてテスト実験を行い、X線波長変調回折法が位相決定のための強力な方法として発展し得ることを確かめた。
脾臓を標的とした脳虚血性疾患の創薬

内頚動脈狭窄症の不安定プラークの病態はマクロファージを中心とした慢性炎症が主体である。しかし、慢性炎症は不安定プラークのみならず全身に見られることが判ってきた。そこで、本研究は全身の慢性炎症の炎症関連細胞にはresourverが存在すると考えた。脾臓を摘出した患者は脳梗塞が軽症である傾向があることから、脾摘に着目して研究をおこなった。内頚動脈狭窄症の不安定プラークの症例に対して全身FDG-PETを撮像して、炎症状態を観察し、健常者と比較検討をおこなった。その結果、不安定プラーク群では、頚動脈プラーク、大動脈、脾臓におけるSUVmaxが健常者と比較して有意に上昇していた。本研究の結果から、内頚動脈狭窄症の不安定プラークは、全身炎症の1つの表現型であり、脾臓は全身の慢性炎症のresourverとして働いていることを示した。本研究で得られた知見は、同時に多動脈において動脈硬化が進行するpolyvascular diseaseを説明するうえで重要な機序である。研究計画通り、症候性内頚動脈狭窄症に対してCEAを行った5例から同意を得たうえでFDG-PETを施行した。FDG-PETでは、骨髄、肝、脾臓、プラークのSUVmaxを測定した。また、標本を免疫染色し新生血管とその関連因子の陽性細胞数とSUVmaxとの関係を調べた。現在、統計学的有意差を調べるには対象が少ないため、今後も継続して研究を進める。1年の間に3例程度の症例の登録を予定していたが、それを上回ったため。内頚動脈狭窄症による脳梗塞の発症メカニズムは、多くの場合は不安定プラークからの遠位塞栓が原因である。当科においても内頚動脈狭窄症による脳梗塞のうち92%が遠位塞栓によることを報告してきた。このため、我々は不安定プラークに焦点をあてた研究を開始した。不安定プラークは局所におけるマクロファージを中心とした慢性炎症が主体であるが炎症関連細胞の由来については不明である。そこで我々は、脳梗塞急性期の急性炎症では脾臓が炎症関連細胞のリザーバーとなっていることから不安定プラークの慢性炎症においても同様に脾臓が関与していると仮説をたてた。Minor strokeで発症し内頚動脈内膜剥離術を実施した不安定プラーク8例とコントロール7例を対象にして18F-FDG PETを実施した。その結果、対象の脾臓でのSUVmaxはコントロールと比較して有意に上昇しており、対象のプラークのSUVmaxとよく相関していることが判明した。しかし、骨髄のSUVmaxは対象とコントロールの間で有意な差は無かった。このことから、内頚動脈狭窄症における不安定プラークの原因である炎症関連細胞は脾臓がリザーバーとなっており、全身炎症が関与していると考えられた。現在までに、対象とコントロールのFDG-PETの撮像を終了している。また、一部免疫染色をおこなうことにより炎症関連細胞について、従来の活動型マクロファージに加えて血管内皮前駆細胞についても脾臓がリザーバーになっている可能性をつきとめた。計画通りに症例の蓄積をおこない、統計学的な差が出るかどうかを調べる。内頚動脈内膜剥離術を行ったプラーク検体をさらに免疫染色をおこない関与している免疫関連細胞を同定する。調達方法の工夫などにより、経費の節約ができたため。免疫染色を行うための抗体等の購入にあてる。染色用の試薬等の購入にあてる。
自己組織化ボトムアップCADの研究

本研究課題においては、従来の設計法が基本構造設計から始まり、部品設計までトップダウンに進められていたのに対して、逆に部品集合に要求仕様を投入し、対応部品の自己組織化によってボトムアップに行う設計法の可能性を探り、そのCADの実現を試みる。研究成果は次の如くである。1.ボトムアップCADの要素となるモデロンの研究:自律要素モデロンの構成と自己組織化の理論を構築するとともに、機械要素(歯車,軸,軸受など)についてモデロンの具体例を作成した。2.モデロンシステムの開発:ボトムアップCADの実行環境のプロトタイプとして、モデロンが相互に対話し、自己組織化を行うことのできるマルチタスク実行環境を試作した。3.メッセージの標準化:上記実行環境はオープンシステムであるからモデロンが対話する際、使用する言語は標準化されねばならない。機械設計を例にとって標準語を提案した。この場合モデロンの設計式群を述語論理形式に統一し、論理推論プロセスのユニイフイケーションの中で解を得るようにした。4.ボトムアップCADシステムの実験:歯車減速機の設計を例にとり、歯車モデロン、軸モデロン、軸受モデロンが開発した自己組織化環境において対話しつつ、互いのパラメータを決定する過程を実験した。以上、本年度を最終年度とする研究はボトムアップCADを具体化する方法を提案し、その実現性を例示することを成果として終了した。本研究は部品モデルの集合に設計仕様を投入し、対応部品モデルの自己組織化によってボトムアップに行う設計法の実現可能性を探るとともにそのCADの開発を試みることを目的としている。本年度はまずこの研究を進めるためのテストベンチとしてのボトムアップ設計用マルチタスク並列処理システムの構築を行った。本研究費で購入したSUN Sparc LXを主機とするワークステーションネットワーク環境上で動作するソフトウェアを作成した。このシステムは次の二つの環境からなる。(1)部品モデルをモデロンと呼び、その集合を定義するための定義環境。設計者がこの環境でモデルを構成する部品モデロンを記述する。(2)定義されたモデロン集合を自己組織化させるための実行環境。ここで各モデロンは互いにメッセージを交換し、他と協調しながら自律的に自己を設計する。このシステムの実行は次の三種類のタスクにより行われる。a)システムドライバー:キーボード/マウスから指示を受け取り、システム全体の実行を制御する。b)モニタータスク:メッセージをモニターし、ログファイルに書き込む。要求があれば画面にも書き出す。c)モデロンタスク:モデロンのインスタンスを作成する。これは階層構造をもったモデル単位にライブラリに登録する。各モデロンは、要求とそれに対する返答をメッセージ形式で受け渡しする。メッセージは放送形式で各モデロンに送信される。受信したメッセージをアクセプトするかどうかは受信側のモデロンが自律的に判断する。通信の作業はモデロンドライバーによって行われる。このテストベンチにより簡単な具体例をテストしてみた・分かりやすい計画問題の一つとしてAGVのスケジューリング問題を取りあげ、AGV、機械、製品の各モデロンが自己組織化によってスケジュールを行うことを確認することができた。次年度の軸、軸受、歯車、フレームなど機械要素による自己組織化ボトムアップCADの要素プログラム作成についても一部スタートしている。設計は与えられた要求仕様に対応して、基本構造設計から始まり部品設計までトップダウンに進められるのが普通であるが、本研究では逆に部品集合に要求仕様を投入し、関係する部品の自己組織化によってボトムアップに設計を行う。本年度は次の各項目を研究した。(1)自己組織化モデリング要素モデロンの準備:自己組織化の要件は各要素が設計仕様に反応して自発的に行動を起こし、他の要素と協調的に対話し、自律的に自己を決定する機能である。そのような要素をモデロンと呼んでいるが、モデロンの簡単な具体例として、軸、軸受、歯車、モータ、カップリング、ワイヤ、ブレーキ、ドラムの各々について上記機能を持たせることを試みた。これらを昨年度試作したテストベンチ上に置き、ウインチの仕様を与えて、一応原理的にボトムアップCADのプロセスに沿って動作することを確かめた。

(2)モデロンの表示用ソフトウエアの開発:設計がボトムアップであっても、その状態を人間の設計器がチェックする必要があるので、モニターを過去に作成したTIPS-1と呼ぶ3次元ソリッドモデラ-を改良してモデロン用に作成した。次年度は本格的マルチタスク並列処理システムに再構成して、自己組織化によるボトムアップCADシステムを完成する。本研究課題においては、従来の設計法が基本構造設計から始まり、部品設計までトップダウンに進められていたのに対して、逆に部品集合に要求仕様を投入し、対応部品の自己組織化によってボトムアップに行う設計法の可能性を探り、そのCADの実現を試みる。研究成果は次の如くである。1.ボトムアップCADの要素となる生物型モデロンの研究:モデロンの構成と自己組織化の理論を構築するとともに、機械要素(歯車,軸,軸受)についてモデロンの具体例を作成した。2.モデロンシステムの開発:ボトムアップCADの実行環境のプロトタイプとして、モデロンが相互に対話することのできるマルチタスク実行環境を試作した。3.メッセージの標準化:上記実行環境はオープンシステムであるからモデロンが対話する際、使用する言語は標準化されねばならない。機械設計を例にとって標準語を提案した。この場合モデロンの設計式群を述語論理形式に統一し、論理推論プロセスのユニイフイケーションの中で解を得るようにした。4.作図システムの開発:結果の表現のためにTIPS-1ソリッドモデラ-を上記モデロンシステムに組み込む作業を行った。以上、本年度を最終年度とする研究はボトムアップCADを具体化する方法を提案し、その実現性を例示することを成果として終了した。
冷凍機を用いた電子顕微鏡内極低温ホルダーの開発

電子顕微鏡内その場実験は材料の構造変化、材料中の欠陥の性質などに関してユニークな情報を与えるが、これまでは主として高温での現象が観察されてきた。しかし、最近では超伝導で代表されるように極低温での現象の電子顕微鏡内その場観察にも関心が集まっている。しかし液体ヘリウムを用いた電子顕微鏡内極低温その場実験は極めて大がかりとなり、しかも液体ヘリウムの取り扱いにはかなりの熟練を要するため、その実施はごく一部の研究グループに限られてきた。一方、最近、高性能の圧縮機を用いた冷凍機によって極低温が容易に達成できるようになり、超伝導マグネットなどで実用化されている。本研究はこの冷凍機を電子顕微鏡内試料冷却ホルダーに接合して、電子顕微鏡内極低温その場観察がルーチンワークとして容易に遂行できるような装置を開発することを目的とした。本研究においては、冷凍機を用いた電子顕微鏡試料極低温冷却装置の設計を行った。一部試作品を作製したが、完成品の試作までには至らなかった。しかし、その設計に必要な設計概念と基本設計を提示することができた。関連メーカーが近い将来、本装置の完成品を市販することを期待する。本研究はこの冷凍機を電子顕微鏡内試料冷却ホルダーに接合して、電子顕微鏡内極低温その場観察がルーチンワークとして容易に遂行できるような装置を開発することを目的とする。本年度は冷凍機の性能をチェックすると同時に、電子顕微鏡内試料冷却ホルダーとその冷凍機への接合に関する基本設計を行った。すなわち、冷凍機の容量と熱伝導率を考慮して到達温度を評価するとともに、冷凍機の運転に伴う振動の回避法について検討した。本年度は平成6年度に購入した冷凍機に、同じく平成6年度に設計した電子顕微鏡内極低温ホルダーを接合させた。
メタボリックシンドロームに合併するCKDにおける肥満遺伝子Azgp1の機能解析

本研究では、2型糖尿病肥満モデルKK/Taマウスの腎臓におけるAzgp-1の発現部位を特定し、Azgp-1の腎組織における発現部位や腎でのAzgp1の機能を解析することにより、肥満症・糖尿病(メタボリックシンドローム)に合併する慢性腎臓病(CKD)におけるAzgp-1の役割を検討した。KK/Taの腎組織では、BALBcマウスと比較して尿細管上皮細胞においてAzgp-1蛋白の発現が有意に亢進していることを確認した。ストレプトゾトシンを投与したBALBcマウスでは、Azgp-1蛋白の発現増加は認めなかった。C57BL/6マウスの高脂肪食群では、腎臓でのAzgp-1のmRNAの発現は低下していた。KK/Taマウスにピオグリタゾンを投与した群の腎組織では、Azgp-1の発現が上昇していた。2型糖尿病患者群において、尿中Azgp-1蛋白濃度は有意に上昇しており、推定糸球体濾過量、尿中アルブミン/クレアチニン比、尿中NAG/クレアチニン比との相関関係を認めた。Azgp-1は、糖尿病腎症おいて近位尿細管上皮細胞に発現の上昇が認められ、腎の脂質代謝に関与し、転写因子PPARγは腎におけるAzgp-1の調節因子である可能性が示唆された。また、尿中Azgp-1濃度は2型糖尿病腎症患者における新規の尿中バイオマーカーとして有用である可能性が示唆された。目的:本研究では、2型糖尿病肥満モデルKK/Taマウスの腎臓におけるAzgp-1の発現部位を特定し、Azgp-1の腎組織における発現部位や腎でのAzgp1の機能を解析することにより、肥満症・糖尿病(メタボリックシンドローム)に合併する慢性腎臓病(CKD)におけるAzgp-1の役割を検討する。方法:1.BALB/cAマウスにストレプトゾトシンを投与し1型糖尿病を惹起する。C57BL/6マウスを低脂肪食群と高脂肪食群に分ける。また、KK/Taマウスを脂肪代謝に関係するPPARのリガンドであるピオグリタゾン投与群と非投与群に分ける。2.尿アルブミン/クレアチニン比、体重、空腹時血糖、インスリン抵抗性などを経時的に測定し、統計学的に評価する。3.各グループの腎・肝・脂肪組織におけるAzgp-1、PPARγなどのmRNA・蛋白発現の差を検討する。結果:KK/Taの腎組織では、BALBcマウスと比較して尿細管上皮細胞においてAzgp-1蛋白の発現が有意に亢進していることを確認した。C57BL/6マウスの高脂肪食群では腎臓でのAzgp-1のmRNAの発現は低下していた。以上の結果から、Azgp-1蛋白はメタボリックシンドロームモデルの腎組織において血糖とは関係なくその発現が増加し、腎障害の進展に関与している可能性が考えられた。目的:2型糖尿病腎症における肥満候補遺伝子Azgp-1の役割を検討した。方法:C57BL/6マウスを低脂肪食負荷群と高脂肪食負荷群、KK/Taマウスをピオグリタゾン投与群と非投与群に分け、腎組織におけるAzgp-1の発現を検討した。また、2型糖尿病を合併した患者群(30名)と健康成人群(5名)における尿中のAzgp-1蛋白濃度を測定した。結果:KK/Taマウスにおいて、近位尿細管上皮細胞にAzgp-1蛋白の発現上昇が認められた。高脂肪食負荷C57BL/6マウスでは腎でのAzgp-1のmRNA発現の低下傾向を認めた。

一方、ピオグリタゾンを投与したKK/Taマウスでは、腎におけるAzgp-1の発現上昇が認められた。2型糖尿病患者群において、尿中Azgp-1蛋白濃度は有意に上昇しており、推定糸球体濾過量、尿中アルブミン/クレアチニン比、尿中NAG/クレアチニン比との相関関係を認めた。結論:Azgp-1は、糖尿病性腎症おいて近位尿細管上皮細胞に発現の上昇が認められた。また、2型糖尿病腎症患者における新規の尿中バイオマーカーとして有用である可能性が示唆された。
硫酸転移酵素遺伝子(Sultlc2)欠損マウスの作製による腎嚢胞形成の解析

腎の単純嚢胞は非常に頻度の高い疾患である。遺伝的嚢胞腎とは別に、末期慢性腎不全の腎に見られる後天性嚢胞腎(Acquired cystic disease of kidney ; ACDK)は、発癌との関連においても臨床的に重要な問題である。しかし、これらの嚢胞性疾患に共通した嚢胞化の機序については不明である。我々は、Differential Display法で、マウス硫酸転移酵素Sult1c2遺伝子発現が、嚢胞を2-amino-4,5-diphenylthiazole (DPT)で誘導した場合に、抑制されることを発見した。この遺伝子は細胞外マトリックスにおける硫酸転移に関係すると考えられ、細胞生理学的な面からも腎尿細管の嚢胞化に関して重要であると考えられる。我々の目的は、マウス硫酸転移酵素Sult1c2遺伝子についてノックアウトマウスを作製することにより、細胞レベル、個体レベルで嚢胞形成が促進するかどうか組織学的に解析することである。我々は、マウスSult1C2遺伝子ゲノムをPCRにより増幅し、クローニングした。さらに、ターゲティングベクターの作製のため、マウスマウスSult1C2遺伝子の開始コドンを含むエクソンをネオマイシン耐性遺伝子を挿入した。マウスES細胞(R1)にターゲティングベクターをエレクトロポレーションで導入し、ネオマイシン耐性細胞の中から、サザンブロット解析を行った。その結果、通常のコロニー数(500クローン)からは、相同組み換え体が得られなかった。Sult遺伝子周辺のクロマチン構造などが不活性であることが示唆された。さらに選択を行った結果、2個の相同組換えクローンを得た。現在、マウス8細胞期胚と相同組換え細胞を凝集させ、偽妊娠マウスの子宮内に戻し、キメラマウスを作製しているところである。腎の単純嚢胞は、非常に頻度の高い疾患である。また、末期慢性腎不全においてみられる後天性嚢胞腎は、発ガンとの関連においても重要な問題である。しかし、嚢胞性疾患に共通の嚢胞化の機序については、不明である。我々は、マウス硫酸転移酵素Sult1C2遺伝子発現が、ラットにおいて嚢胞を誘導した場合に、抑制されることを見い出した。この遺伝子は、細胞外マトリックスにおける硫酸転移に関係すると考えられ、腎尿細管の嚢胞化に関して重要であると考えられる。このことを実証するために、我々は、この遺伝子の欠損マウスを作製し、腎の嚢胞化に関して、どのような表現型がみられるか解析するすることにした。マウスSultC2遺伝子を含む約20kbのゲノムをマウス129ゲノムDNAより、PCRにより増幅し、クローニングした。さらに、マウスSult1C2遺伝子の開始コドンを含むエクソン領域にネオマイシン耐性遺伝子を挿入したターゲッティングベクターを作製した。マウスES細胞(R1)にターゲッティングベクターをエレクトロポーレーションにより導入し、ネオマイシン耐性の細胞の中から、サザンブロットにより、相同組換え体を現在選択中である。同時に、この遺伝子が発生等に必要である場合は、致死となるので、Cre-loxPを用い、Creを発現させた場合だけ、Sult1C2遺伝子の発現に必要でloxPで挟まれた開始コドン(ATG)を含むエクソンを除去できるようなターゲッティングベクターを作製中である。

我々は、Differential Display法で、マウス硫酸転移酵素Sult1c2遺伝子発現が、嚢胞を2-amino-4,5-diphenylthiazole (DPT)で誘導した場合に、抑制されることを発見した。この遺伝子は細胞外マトリックスにおける硫酸転移に関係すると考えられ、細胞生理学的な面からも腎尿細管の嚢胞化に関して重要であると考えられる。我々の目的は、マウス硫酸転移酵素Sult1c2遺伝子についてノックアウトマウスを作製することにより、細胞レベル、個体レベルで嚢胞形成が促進するかどうか組織学的に解析することである。我々は、マウスSult1C2遺伝子ゲノムをPCRにより増幅し、クローニングした。さらに、ターゲティングベクターの作製のため、マウスマウスSult1C2遺伝子の開始コドンを含むエクソンをネオマイシン耐性遺伝子を挿入した。マウスES細胞(R1)にターゲティングベクターをエレクトロポレーションで導入し、ネオマイシン耐性細胞の中から、サザンブロット解析を行った。その結果、通常のコロニー数(500クローン)からは、相同組み換え体が得られなかった。Sult遺伝子周辺のクロマチン構造などが不活性であることが示唆された。さらに選択を行った結果、2個の相同組換えクローンを得た。現在、マウス8細胞期胚と相同組換え細胞を凝集させ、偽妊娠マウスの子宮内に戻し、キメラマウスを作製しているところである。