hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
SK-0403によるDPP4阻害を媒介した抗炎症作用の分子機序の解明

歯周治療系歯学26年度が最終年度であるため、記入しない。anagliptinの持つ抗炎症効果が、マクロファージのみならず脂肪細胞にも認められ、かつin vivoでのマウス肝・脂肪組織においても抗炎症効果を認めたことは、当初の実験計画で推察していた以上にanagliptinまたDPP4阻害による多面的な効果を示唆するものとして考察できる。具体的には、in vitroの実験系としてRAW細胞と3T3-L1脂肪細胞共培養系での炎症性アディポサイトカインの遺伝子発現抑制に一致して炎症性アディポサイトカイン分泌が濃度依存的に抑制されたクリアなデータを出すことができた。また、脂肪細胞に対してもTNFα添加による炎症反応を抑制することを示唆するデータが得られたことから、anagliptinの脂肪細胞への作用についても洞察を得ることができ、実験の視野が広がった。また、in vivoの実験系として野生型マウスにLPSを腹腔内投与した個体にanagliptinを同じく腹腔内投与したモデルで、肝臓でのNF-κBレポーターアッセイと肝臓・脂肪組織での炎症性遺伝子の検討した結果、各臓器での抗炎症効果が認められたことから、anagliptinの抗炎症効果が全身的にも効果を持つことが分かった。実際の標的分子の同定に関しては、LPS-TLR4-NF-κB/AP-1経路下流分子としてIRAK1について、可溶型DPP4とcaveolinとの関連性を示唆する報告が出てきていることから、DPP4-caveolin-IRAK-NF-κB経路について今後検討を行っていく予定である。以上の通り、当初の実験計画よりもさらにanagliptinの多角的な作用について示唆するデータを得られており、今後の研究進行において重要な要素となることから、現在の実験達成度としては、おおむね順調に進展しているものと考える。現在まで得られているデータから、今後の研究の推進方策としてまずin vitro、in vivoでのanagliptinの抗炎症効果についてさらに検討を進めていく。次いで、anagliptinの抗炎症効果について、標的分子の同定を行っていく。具体的には、前述の通りLPS刺激RAW細胞、TNFα添加3T3-L1脂肪細胞のライセートより、anagliptinによるTLR4-NF-κB経路に存在する下流分子群への影響をウェスタンブロット法で検討する。影響がみられた分子群のうち一番上流にあるものについて、DPP4をsiRNA法でノックダウンして同じく影響を検討し、標的分子の候補とする。そこから、アフィニティクロマトグラフィ法などでDPP4と標的分子の結合を確認する。さらに、標的たんぱく質のノックダウンも行ってウェスタンブロットでの下流分子への影響ならびに炎症性遺伝子の発現への効果についても検討する。万一、標的分子の同定が困難な場合、より広い分子群からの同定を目的としてDPP4と親和性のあるたんぱく質を、ビオチン化したDPP4を用いたアフィニティクロマトグラフィ法を行う。その後、同定された標的たんぱく質をin vitroやin vivoの系でノックダウンや過剰発現を行い、その分子の性質に応じて関連する機能解析を行う。さらに、in vivoにおいては、炎症の誘発や高脂肪食負荷などして、標的たんぱく質の挙動について検討する。
熱プラズマ噴流層による廃PET材の処理と再資源化

様々な飲料用ボトルとして、PET(ポリエチレンテレフタレート)が大量に使用されている。このPETゴミはその使用量に対応して年々増加傾向にあり、リサイクル品の対象にもなっている。この研究ではこの廃PET材を高温、高活性な熱プラズマを利用した熱プラズマ噴流層を用いて処理し、可燃性ガスやPET中に触媒として含まれているゲルマニウムを回収することを目的とした。まず熱プラズマ噴流層を作成した。そして噴流状態を、不活性な炭化珪素粒子を用いて調べた。その結果、噴流層内の温度はプラズマの当たるフレーム部付近は1500°C程度であった。また高さ方向に温度分布は減少する傾向にあった。なお、炭化珪素粒子の粒径が小さいため、粒子がガスに同伴されたり、粒子の量が多いとバブリングを起こすといった問題が生じた。このフレーム部での温度を用いてPET分解の平衡組成を計算した。その結果、固体炭素が生成しない条件での平衡組成では、一酸化炭素、アセチレン、エチレン、メタンが多く生成すると予想された。一方、固体炭素が生成する条件下では、一酸化炭素、水素、固体炭素が主生成物と考えられた。実際にPETを噴流層で分解した結果、噴流層からは煤状のものが大量に発生した。このため、生成ガスの分析は困難となった。分解後の噴流層内を観察するとPET粒子の周囲が溶け、粒子同士が固まって大きな塊状のものが形成されていた。また表面が白色から黒く変色していた。この原因として、使用した粒子が大きいため粒子があまり動かず、熱にさらされた部分のみが分解または溶融し、周囲の粒子と結合したためと考えられた。したがって今後、生成ガス、固体生成物の分析を行うとともに、粒子流動化の改善のための噴流層の設計変更、煤生成抑制の為の水素や酸素の添加等を検討する必要がある考えられた。
分子ナノアーキテクトニクスによる低次元量子スピン系の構築と新奇量子物性の開拓

そのスピンを古典的なベクトルとして扱うことができない低次元量子スピン系は、これまで化学的手法によるバルク物質とバルク測定手法がその主な研究舞台だった。これに対し、本研究では、金属表面に磁性分子を物理吸着させたヘテロシステムと分子マニピュレーションを用いて、低次元量子スピン系を構築し、スピン偏極走査トンネル顕微鏡(STM)による局所スピン観測と、局所磁化測定を通して、その興味深い量子物性を解明し、さらに新たな量子物性の開拓を目指すことが本研究の目的である。具体的には、S=1の量子スピンを持つ酸素分子をAg(111)の清浄表面に吸着させて行った。前年度までに、低温吸着により物理吸着酸素分子膜の観察に成功した。本年度は、更にその酸素分子薄膜の格子構造の詳細を調べた。酸素分子薄膜は、歪んだ三角格子の構造を持っているが、詳細な測定による実空間イメージとその2次元フーリエ変換像から、三角格子が単純な二等辺三角形ではなく、三つの辺がすべて異なる不等辺三角形であることが明らかにされた。この構造は、ファンデルワールス力とスピン間の相互作用を考慮したモンテカルロ計算によって非常に良く再現され、この構造が格子の歪みを伴う反強磁性秩序に起因していることが明らかになった。更に、酸素分子膜上でのトンネル分光測定による電子状態の観察からは、近藤効果に起因するフェルミエネルギー近傍の異常は見られなかった。そのため、Ag(111)上に物理吸着された酸素分子は、そのスピンを保ったS=1の2次元量子スピン系が実現していることを明らかにした。27年度が最終年度であるため、記入しない。これに対し本研究では、金属表面に磁性分子を物理吸着させたヘテロシステムと分子マニピュレーションを用いて低次元量子スピン系を構築し、スピン偏極走査トンネル顕微鏡(STM)による磁化測定を通してその興味深い量子物性を解明し、さらに新たな量子物性の開拓を目指すことが本研究の目的である。本年度は、先行研究で酸素分子が低次元量子スピン系を形成することが期待されているAg(111)表面で、酸素分子薄膜を低温蒸着により成長させ、その構造を低温STMを用いて明らかにし、次に、構造が明らかになった酸素分子薄膜に対し、スピン偏極STMを適用し、膜厚により変化することが予想される酸素薄膜の磁性を明らかにすることを目標としていた。現在までのところ、低温吸着によりAg(111)表面上にアイランド上の酸素分子層を確認し、その構造を分子分解能により確認した。その構造解析を行ったところ、低温LEEDによって確認されていた、固体酸素のアルファ相と同様な構造を確認することができた。さらに、先行研究から予想される物理吸着酸素分子の脱離温度とほぼ同じ温度域においてアイランド上の酸素分子層が脱離することを確認し、観察した酸素分子層が物理吸着分子であると結論づけることができた。当初の目的であった酸素のアルファ相の実空間観察に成功し、先行研究である低温LEEDと昇温脱離スペクトルの結果を再現することに成功したことは、目標の達成に向けて非常に大きな進展であると考える。一方で、極低温での物理吸着に大変時間を要してしまったため、スピン偏極STMによる磁性の観察までを達成することができなかった。次年度以降は、今回観察した酸素分子層の磁性を調べることが緊急の課題である。そこで、Ag(111)基板上でスピン偏極STMを用いて調べられている磁性薄膜を用いてスピン偏極探針の同定を行い、その後に同様に酸素分子の極低温物理吸着を行う。また、酸素分子による低次元構造を構築することも本年度中に達成すべき課題である。

今回観察されたような酸素分子層から酸素分子を取り出すか、もしくは酸素分子層に探針によって欠陥を導入し、一次元もしくは二次元の構造を構築を目指す。27年度が最終年度であるため、記入しない。
自律神経機能指標を用いた自律訓練法によるストレス緩衝効果の検討-日常生活を対象としたフィールドワーク研究-

本研究は、心拍変動性を中心とする自律神経機能指標を用いて自律訓練法の日常生活における訓練効果について検討を行った。まず、ローレンツ・プロットという新しい自律神経機能指標の有効性を検討するために基礎的な実験室実験と日常生活を対象としたデータ収集を行った。基礎的な実験では、怒りをテーマに検討を行なった。怒りの喚起・持続と怒りの抑制の観点から自律神経系活動について比較した。その結果、心臓副交感神経系機能の指標である心拍変動の解析結果に有意な差が認められ、この方法の妥当性が認められた。また、日常生活のデータからも、ローレンツ・プロットで解析できることが示された。次に、自律訓練法の習得者を対象として、実際の日常生活において実験室等の環境で得られている知見が確認できるかどうか検討を行った。その結果、日常生活においても、自律訓練を実施すると、自律系の変化が起こり、交感神経の活動が低下することが示唆された。この結果を踏まえ、自律訓練法の未経験者が、日常生活で自律訓練法を練習していく場合に、その効果がどの程度表れるかについて検討を行った。まず、予備的な検討として、4週間の自律訓練法の講習(第二公式まで)を設定した短期的な実験では、参加者の動機付けの問題もあり、体系的な自律系の変化は認められなかった。しかし、8週間の自律訓練法標準練習を設定した最終的な検討では、習得前に行われたリラックスの課題と習得後に行われた自律訓練法の課題とを、ローレンツプロットを用いて比較検討したところ、自律訓練法習得後には交感神経系の活動性が低下しており、その効果が認められた。また、これまで報告されている心拍数の低下も認められた。これらのことから日常生活においても自律訓練法を実施することによって自律神経系の変化が起こることが確かめられた。今後は、より統制した検討や疾患での検討が必要と思われる。自律神経機能指標として心拍変動性の周波数分析を用いた研究はまだ新しい分野であり、そのデータ特性を明らかにするためには基礎的なデータの幅広い収集が必要となる。それゆえ、本年度は、基本的な実験システムを作成し、平成12、13年度に実施される自律訓練法の訓練過程のデータを評価するための基礎的なデータを収集することを全体の目的とした。実験は電気的に遮蔽された防音室内で行った。実験条件は安静条件とコールドプレッサーテスト、暗算課題、安静状態の4つの実験期から構成されていた。それぞれの実験期の長さは5分間であった。各実験期間、心拍を第二誘導で導出し測定した。また各実験期の終わりに、主観的ストレス評定への回答も求めた。結果は、測定した心拍のRーR間隔から心拍変動のLF/HF、HFを算出するとともに、ローレンツプロットによる分析も行った。LF/HFは暗算課題で数値が高まり、安静状態でやや低下する傾向がうかがえた。逆にHFは暗算課題で低下し、その後の安静状態で高くなる傾向がうかがえた。この結果はそれぞれ、交感神経と副交感神経の活動性を反映しているようにも解釈できるが、個人によって反応のパターンに差が見られたため、今回のデータだけでは必ずしも評価できない点も明らかとなった。一方、ローレンツプロットを用いた分析では、交感神経の指標は暗算課題で高まりその後の安静状態で低下し、副交感神経の指標は暗算課題でやや低下しその後の安静状態でやや高くなることがうかがえた。しかし、これらのデータについても現段階で必ずしも信頼性が十分に確認されているわけではない。それゆえ、今後も条件を工夫しながら検討を加えていく予定である。

心拍変動性を中心とした自律神経機能指標から実験室にお基礎研究を実施すると共に、平成13年度に実施する予定の日常生活でのフィールドワーク研究のための基礎データを収集を目的とした。【研究1】心拍変動性を中心とする自律神経機能指標を用いた基礎研究怒り喚起・持続尺度を用いて怒りを喚起・持続しやすい者と喚起・持続しにくい者を選出し、さらに怒りの抑制が強い者と弱い者を選出して、自律神経系活動について比較した。その結果、心臓副交感神経系機能の指標である心拍変動の解析結果に有意な差が認められた。今後これらの知見をもとに、実験室における自律訓練法の効果を検討していく予定である。【研究2】自律訓練法の日常生活における訓練効果の検討-心拍変動性を中心とする自律神経機能指標を用いた予備的検討-[2-1]自律訓練法修得者の日常生活における自律訓練法の訓練効果の検討自律訓練法をマスターしている人が、実際の日常生活において自律訓練法を実施した場合に、実験室等の環境で得られている知見が確認できるかどうか検討をおこなった。その結果、日常生活においても、自律訓練を実施すると、自律系の変化が起こり、副交感神経の活動が高まることが確認された。[2-2]自律訓練法の練習初期段階における日常生活での訓練効果の検討自律訓練法の練習初期段階において、日常生活で自律訓練法を練習していく場合に、その効果がどの程度表れるかについて、心拍変動性を指標として検討を行った。実験群には4週間自律訓練法を講習(第二公式まで)し、何も行わない統制群と比較をおこなった。ローレンツプロットを用いた解析の結果、実験群では、安静状態での比較において、練習初期では課題に対する抑制効果が認められ、副交感神経系の活動が低下することが示された。また、あわせて、日常生活場面における主観的なストレス度と心拍変動性の対応関係のデータを収集した。本年度は、これまでの研究のまとめとして、心拍変動性を中心とする自律神経機能指標を用いて自律訓練法の日常生活における訓練効果について検討を行った。昨年度実施した研究において、自律訓練法を修得している人が、実際の日常生活において自律訓練法を実施した場合に、自律系の変化が起こり、交感神経系の活動性の低下や副交感神経の活動性が高まることが示唆された。したがって、本年度は、健常者が自律訓練法を修得することによってどの程度日常生活において自律神経系の活動が変化するかどうかを検討した。被験者は健常者15名(内2名は中断)で、これまで自律訓練法の講習を受けたことの無いものであった。これらの被験者を対象に、毎週1回、8週間の自律訓練法の講習会を実施した。講習会では標準練習6公式を実施した。講習会の開始前に、事前テストを行い各種質問紙調査を実施すると共に、ホルター心電計を用いて個別に日常生活の日中の心拍変動を測定した。この間行動記録を求め、さらにその間に3回前後のリラックス時間を持つよう課題を設定した。事後テストでは、事前テストと同様な手続きで行なった。なお、事後テストでは、この間に3回前後のリラックス時間を持つよう課題を設定した。
HMG-CoA還元酵素阻害剤による悪性神経膠腫に対する抗腫瘍効果の系統的研究

HMG-CoA還元酵素阻害剤による抗腫瘍作用が乳がんなど様々な分野で報告されており、今回我々は悪性神経膠腫に対し、ラットを用いて抗腫瘍効果の検討を試みた。最初に、C6ラットグリオーマ細胞を用いて}刑G-CoA還元酵素阻害剤の抗腫瘍効果について検討した。まず、MTTアッセイを用いて細胞増殖の抑制を検討したところ5μMより増殖抑制効果の発現をみとめ、濃度依存性に増殖効果の抑制を認めた。次に抗腫瘍効果の詳細な検討を行うためレーザースキャニングサイトメーターを用いた細胞周期の解析を行った。HMG-CoA還元酵素阻害剤を投与した郡では、非投与郡と比較し、S期およびG1期の細胞の相対的増加、および、M期細胞の相対的減少を認め、GIarrestを観察した。この機序が細胞増殖抑制にはたらいていることが判明した。さらに詳細な検討を行うべく、アポトーシス関連酵素であるCaspaseの検討を行った。HMG-CoA還元酵素阻害剤投与郡ではCaspase3,9の増加を認め、Caspase8では優位な増加を認めなかった。以上の結果よりアポトーシスによる腫瘍抑制効果をみとめた。現在、C6ラットグリオーマ細胞を用いたラット脳腫瘍モデルを使用したin vivo studyを行うべく、定位的に脳内に腫瘍細胞を注入する腫瘍モデルを用いるべく、安定した腫瘍モデルの作成をおこない、基礎データを取っている。またラットへの田G-CoA還元酵素阻害剤投与量を決定するべく腹腔内投与にて基礎実験を行ったが、溶媒による副作用により全例死亡したため、新たな溶媒、投与量および投与方法を決定するべく検討を行っている。悪性神経膠腫は非常に予後不良の疾患で集学的な治療を用いてもmean survival timeが約1年と不良であり、新たな治療が必要とされている。高脂血症の治療薬として臨床で使用されているHMG-CoA reductase inhibitorが抗腫瘍効果があることが報告されており、今回われわれは、これらのひとつであるロバスタチンを使用して、悪性神経膠腫に対する抗腫瘍効果について検討する目的でまずin vitroでの悪性神経膠腫細胞に対する抗腫瘍効果の検討を行った。C6 gliomacellを用いて細胞増殖の抑制についてMTT assayを用いて検討を行った。またLaser Scanning Cytometer (LSC)を用いてロバスタチンによる細胞周期に対する影響について検討を行った。MTT assayではロバスタチンの用量依存性に細胞増殖の抑制を認め、5μMより有意差が認められた。LSCではロバスタチンを投与することでG1期の細胞数の著明な増加とG2、M期の細胞数の低下を有意に認め、G1 arrestが起こっていると推測された。HMG-CoA reductase inhibitorにより細胞増殖の抑制、およびG1 arrestが観察された。これらの結果は他の臓器の腫瘍に対する報告と矛盾することなく、悪性神経膠腫に対する抗腫瘍効果の可能性が示唆された。今後、invasion assayをおこない、さらにはラット脳腫瘍モデルを用いたin vivoでの抗腫瘍効果(特に浸潤性について)の検討を予定している。その一環として、現在C6 glioma cellにGFP遺伝子を組み込んだC6-GFP cellの作成と、その基礎実験を行っている。
機械学習による学生の修学状態モデルの構築と学習支援への展開

本研究課題では、学生一人ひとりに応じた学習(修学)支援を実現するための基礎技術として、機械学習手法による大学生の修学状態のモデル化について検討している。2018年度は、2017年度に引き続き、さらなる数値的検討をふまえて、さまざまな粒度の教学データをあわせた修学状態予測についてまとめるとともに、教学IRや学習支援に用いるための汎用的な予測モデル構築の支援ツールの制作とその形成的評価などを通して、機械学習による修学状態予測とその実運用についての成果をまとめるものとしていた。この当初計画にもとづき、購入機器や専用ソフトウェアを用いて研究を遂行した。まず、前年度までに提案していたベイジアンネットワークによる修学状態推移プロセスのモデリング手法を実応用することを想定し、より粒度の細かいLMS(学習管理システム)のログデータを用いたモデル構築を提案し、数値実験によりその性能を検証した。その結果は研究発表を行ったうえで、現在原著論文として投稿中である。また、教学IRやラーニングアナリティクスなど教育における先進的なデータ利活用について、システムと計算知能の観点から論点整理を行った。さらに、これまでと異なる機関におけるデータを扱った大規模な数値実験を行い、従来のような「高リスク学生の予測」だけでなく、ハイパフォーマーの予測を含めた汎用的な予測モデル構築について数値的に検討した。全体を通して、国内学会で4件の発表、国際会議で2件の発表、査読付き論文1本の掲載を行うことができた。また、文献調査や、ラーニングアナリティクスに関する国際会議(LAK)への参加により、関連分野のサーベイを行うことができた。平成28年度には、《課題1》として、有用な修学状態予測モデル構築に向けての数値的検討を行うこと、《課題2》として、確率モデルによる修学状態推移プロセスのモデル化についての数値的検討を行うことの2つの課題を計画していた。両課題における数値的検討については、購入機器や専用ソフトウェアを活用し、当初計画に合わせて遂行することができた。具体的には、隠れマルコフモデルによる潜在的修学状態の推定や、ランダムフォレストをはじめとする機械学習手法による修学状態予測に関する知見を得ることができた。数値実験の結果から、ドロップアウトリスクのある学生の検出について一定の検出性能を見込むことができ、また大学としてのカリキュラムの検討や適応的な学習支援策に対する支援など、教学IRとしての活用可能性も示唆された。その成果については3件の国内学会における発表を行ったほか、国際会議に1本投稿中である。また、ベイジアンネットワークを用いた修学状態推移プロセスに関する研究成果をまとめ、原著論文に1本投稿中である。また、文献調査に加え、国内関連学会やシンポジウム等、およびラーニングアナリティクスに関する国際会議(LAK)への参加により、広く関連分野のサーベイを行うことができた。平成28年度における当初計画では、想定する手法にもとづく数値的検討を進めるとともに、関連分野について広く調査を行うこととしていた。数値的検討については当初計画に合わせて遂行し、その成果は3件の国内学会における発表を行った。また原著論文に1本、国際会議に1本投稿中である。年度途中に所属機関を変更することとなったが、所属機関に関連するデータの使用についても適当な手続きのもとで問題なく遂行することができた。平成29年度は、平成28年度に引き続き、《課題1》有用な修学状態予測モデル構築に向けての数値的検討、《課題2》確率モデルによる修学状態推移プロセスのモデル化についての数値的検討を進めるとともに、《課題3》実際の学習支援への適用についての検討へ取りかかることとしていた。《課題1》に関しては、個人属性や出席状況、成績といった従来的な情報のみによる修学状態予測だけでなく、より粒度の細かいLMS(学習管理システム)のログデータを用いた予測モデル構築を提案し、さまざまな機械学習手法の比較によりその性能を検証した。その結果、用いるデータがログデータのみであっても、成績の予測に関して一定の性能を持つことが確認された。《課題2》《課題3》に関しては、ベイジアンネットワークを持いた修学状態推移プロセスのモデリングについて、実際の学習支援への適用を念頭においたフレームワークを提案し、原著論文にまとめた。また、各教育機関においてそれぞれの文脈にあわせた予測モデル構築を教学IRの観点から個々に行うことが必要であるという考えから、教学IRにおける予測モデル構築の支援ツールの枠組みを提案し、制作の準備に取りかかっている。全体を通して、国内学会で4件の発表、国際会議で1件の発表、査読付き論文1本の掲載を行うことができた。当初計画においては、平成28年度に引き続き数値的検討を進めるとともに、実際の学習支援への適用についての検討へ取りかかることとしていた。数値的検討においては、とくにLMS(学習管理システム)のログデータを用いた予測モデル構築についてさまざまな機械学習手法の比較によりその性能を検証し、成績の予測に関して一定の性能を持つことを確認することができた。また、数値的検討に加え、学習支援への適用については、ベイジアンネットワークを持いた

修学状態推移プロセスのモデリングのためのフレームワークについて、数値的検証をふまえて原著論文にまとめることができた。さらに、研究活動やサーベイ・学会参加等をふまえて実際の学習支援への適用について検討するなかで、学習支援や教学IRにおいて予測モデルを用いる場合に、各教育機関においてそれぞれの文脈にあわせた予測モデル構築を個々に検討するという方向性を提起する考えに至り、教学IRにおける汎用的な予測モデル構築の支援ツールを制作するという展開にもつながっている。本研究課題では、学生一人ひとりに応じた学習(修学)支援を実現するための基礎技術として、機械学習手法による大学生の修学状態のモデル化について検討している。2018年度は、2017年度に引き続き、さらなる数値的検討をふまえて、さまざまな粒度の教学データをあわせた修学状態予測についてまとめるとともに、教学IRや学習支援に用いるための汎用的な予測モデル構築の支援ツールの制作とその形成的評価などを通して、機械学習による修学状態予測とその実運用についての成果をまとめるものとしていた。この当初計画にもとづき、購入機器や専用ソフトウェアを用いて研究を遂行した。まず、前年度までに提案していたベイジアンネットワークによる修学状態推移プロセスのモデリング手法を実応用することを想定し、より粒度の細かいLMS(学習管理システム)のログデータを用いたモデル構築を提案し、数値実験によりその性能を検証した。その結果は研究発表を行ったうえで、現在原著論文として投稿中である。また、教学IRやラーニングアナリティクスなど教育における先進的なデータ利活用について、システムと計算知能の観点から論点整理を行った。さらに、これまでと異なる機関におけるデータを扱った大規模な数値実験を行い、従来のような「高リスク学生の予測」だけでなく、ハイパフォーマーの予測を含めた汎用的な予測モデル構築について数値的に検討した。全体を通して、国内学会で4件の発表、国際会議で2件の発表、査読付き論文1本の掲載を行うことができた。また、文献調査や、ラーニングアナリティクスに関する国際会議(LAK)への参加により、関連分野のサーベイを行うことができた。平成29年度以降においては、これまでの研究成果から示唆された検討点についてさらに数値的検討を加える予定である。また、研究成果にもとづいた学習(修学)支援のための簡易的なシステム構築に着手したいと考えている。さらに、引き続き関連分野の調査を広く進めていく予定である。また、昨年度途中に所属機関を異動したため、異動後の現在の所属機関におけるデータにもとづく研究も進める予定であり、本研究テーマについてさらに多角的な検討を加えられると期待している。
ZnSe系半導体青色発光素子のオーム性電極材料開発

3年間の本研究において、P型ZnSeに対する低抵抗なオーム性電極材料を開発する目的で、研究を進めてきたが、オーム性を示す電極材料を発掘するまでには至らなかった。しかしながら、研究代表者らが、これまで進めてきたGaAs系のオーム性電極材料開発の経験を適用しつつ、基礎的に研究を遂行した結果、以下の極めて重要な開発指針を得ることができた。1.ZnSe表面上には薄い自然酸化膜が存在しており、この層が電流の流れを阻害しており、オーム性電極材料開発のためにはこの層を除去することが必要である。2.ZnSe表面の清浄化には、飽和ブロム水系の化学エッチングが最も効果的であることがわかり、その原因も解明された。3.単一金属では低抵抗なオーム性電極を得ることは不可能であるが、この中でもNiが最も良好な電気特性を持つ金属であることがわかった。4.第2元素として、(1)高濃度ドープ層を形成すると期待できる元素、および(2)低障壁中間層を形成すると期待される元素を選定した。300°Cまでの熱処理では、界面反応によって高濃度ドープ層を形成することは不可能であることが判明した。低障壁中間層を形成すると期待される元素のCdは、300°Cまでの熱処理においても界面反応によりZnCdSe固溶体を形成し、この層が電流注入を促進することが判明した。5.上記アイデア(2)に基づくCdが、オーム性を得る電極材料として最も可能性があり、現時点でオーム性が得られない原因も解明した。本研究テーマは、以上の結果および材料設計指針をもとに、本試験研究が終了しても当研究グループにおいて更に続ける予定である。オーム性電極材料開発を最終目的とするとともに、コンタクト抵抗(低抵抗性)の限界を見極める計画である。これまでに、p型ZnSeに対してオーム性を示すコンタクト材は、発見されておらず、周期律表のいずれの金属に対してもショットキー型の特性を呈することが報告されている。そこで、初年度は、現在最もオーム性に近い特性を示すAuをコンタクト材として選択し、Au/p-ZnSeの電気的特性と界面反応の様子を調べることによって、界面電気伝導機構を明らかにした。アクセプタ不純物濃度4×10^<17>2×10^<18>cm^<-3>のp型ZnSe膜に対して、Au電極間のI-V特性は、非オーム性を示し、2つのショットキーダイオードの背面接合における特徴を示した。リニアスケールI-Vカーブから決定したしきい値電圧は、アクセプタイオン濃度に反比例して18から5Vまで減少した。また、Au蒸着前に飽和ブロム水系のエッチング液によってZnSe表面を清浄化することによって、しきい値電圧は3V程度減少し、表面の清浄化プロセスが重要であることが判明した。以上の結果から、Au/ZnSe界面に非常に薄い酸化膜層が存在しており、界面を流れる電流は、この酸化層とZnSeの空乏層ポテンシャルをトンネルする熱放出トンネル電流によって支配されていることがわかった。しきい値電圧のアクセプタ不純物濃度依存性は、アクセプタ濃度の増加とともに空乏層が薄くなりトンネル電流が増加するためと説明される。また、300°Cまでの熱処理に対して、I-V特性は非オーム性のままであった。X線回折法によって300°Cまでの熱処理に伴う界面の反応過程を調べたところ、Au-ZnSe間の反応生成物は検知されず、200°C以上においてAu膜が粒成長したのみであった。

このことから、Au-ZnSe界面の相互界面反応は300°Cまでの熱処理に対して、顕著に進行せず、ZnSe表面上に存在する自然酸化膜によって、反応が阻害されているものと考えられる。このために、Au膜はZnSeに対して付着性が非常に悪くはがれやすい。従って、p型ZnSeに対するオーミック電極は、ZnSeとの付着性が良く、自然酸化膜を自動的に破壊する金属を選定する必要があることが結論される。本年度は、以下の3つの目的に従って研究を進めた。即ち、(1)ZnSe表面の化学的構造を明らかにするとともに、表面を清浄化するエッチング液を見出す。(2)表面の清浄化を行った後に種々の単一金属コンタクトをp型ZnSe上に作製し、電流-電圧(I-V)特性および界面構造を調べ、オーミック・コンタクト材として用いる場合の特徴を把握するともに指針を得る。(3)熱処理後に低障壁中間層を形成すると期待されるCd基コンタクト材のI-V特性および界面構造解析を行い、今後の指針を得る。この結果、以下の重要な指針を得た。(1)X線光電子分光により、MBE成長させたZnSe表面には、ZnOおよびSeO_Xから成る自然酸化膜層が存在していることがわかった。これらの自然酸化膜層は飽和ブロム水系のエッチング液によりほぼ除去される。NiコンタクトのI-V特性を調べた結果、自然酸化膜層を除去することにより、その立ち上がり電圧(V_T:ブレークダウン電圧)は、約1/4に減少することが判明した。以上より、オーミック・コンタクト材開発のためには、ZnSe表面の自然酸化膜を除去することが必要であると言える。(2)In,Cd,Nb,W,Cu,Ag,Ni,Au,およびPtとp型ZnSeとのコンタクト特性を調べた結果、Cu,Ag,Niにおいて約3VのV_T値を得ることができた。この中でもNiは、再現性良く3Vの値が得られ、コンタクト材として用いるのに適しているものと考えられる。(3)Cd基コンタクト材のI-V特性および界面構造を解析した結果、Cdは250°C以上の温度でZnSeと反応し、CdリッチなCd_XZn_<1-X>Se(x≧0.9)層を形成することがわかった。これに対応してV_T値は250°C以上において11Vから5Vまで減少した。以上より、Cd_XZn_<1-X>Se層は金属/ZnSe界面において低障壁を形成する中間層として働いていることがわかった。以上の業績は、J.Appl.Phys誌に3編の学術論文として発表予定(平成7年3月投稿)である。本年度(最終年度)は、前年度の研究成果を踏まえ以下の3つの目的に従って研究を進めた。即ち、(1)ZnSe表面を清浄化する化学エッチング法および物理エッチング法を探索し、最適な条件を決定する。(2)前年度までに見出したAgおよびNiをベース電極にして、p型ZnSe表面近傍に高濃度ドープ層を形成すると期待される金属(LiおよびO)を添加する。そして、電流-電圧(I-V)特性および界面構造を調べ、オーミック・コンタクト材として用いる場合の指針を得る。(3)熱処理後に低障壁中間層を形成すると期待されるCd基コンタクト材のI-V特性および界面構造解析を行い今後の指針を得る。この結果以下の重要な指針を得た。(1)化学エッチング液として飽和ブロム水系、チオ硫酸系、および水酸化ナトリウム系を選択し、物理エッチング法としてArおよびNイオンによるスパッタエッチングを行った。
極めて高い時間分解能と振幅分解能を有する撮像デバイスに関する研究

本研究は、生きた細胞のイメージング法として注目されている蛍光イメージングの新しい手法を提案し、プロトタイプ試作によりその有効性を明らかにするもので、従来の光電子増倍管を用いた大がかりなシステムではなく、成功すれば半導体チップ上で直接試料の蛍光相関分光や蛍光寿命イメージングが行え、将来は内視鏡やカテーテルに本機能を組み込んでin vivoでのイメージングが可能になる等画期的な成果となる。その実現に向け、平成26年度には試作されたマルチタップ光電荷変調素子を用いて、蛍光基質を組み込んだ細胞サンプル及び、その予備実験として蛍光アクリル板に対する蛍光寿命の計測を試みた。試作したイメージセンサの評価を行った結果、素子の応答特性による寿命(Intrinsic response)が約200psであり、短い寿命を用いた測定対象でも小さい誤差で計測することが可能になった。更には素子の応答特性をデコンボリューションし、素子応答寿命の影響を除いて寿命を計測することで、いずれも寿命の測定誤差は400ps以下にできた。またDAPI(核)や量子ドットを用いたCHO細胞に対する測定を行い、蛍光寿命のカラーイメージング化に成功した。続いて、開発したセンサのマルチタップを用いた評価を行った。寿命計測の時、マルチタップを利用することで、従来の計測方式(シングルの時間窓を用いて計測する方法)より時間窓のスキャニングが必要なくなったため、測定時間をはるかに短縮することができ、リアルタイム蛍光イメージングの実現可能性を確認した。最後に、本研究を通して、電荷変調素子構造として2点及び4点まで動作確認ができており、その原理を用いた半導体蛍光寿命イメージング素子による新機能内視鏡や、マルチタップ化に基づく蛍光相関分光の多点同時計測素子の実現の基礎が築かれたことは、学術的にも、医療・健康産業の発展においても大きな意義がある。26年度が最終年度であるため、記入しない。本研究は極めて高い時間分解能と振幅分解能を有する撮像デバイスに関するものである。この研究の応用は医療、予防医学の分野に多大なインパクトを与える画期的な成果となる可能性がある。平成24年度には研究の実現のために高時間分解能と振幅分解能を有する蛍光寿命と蛍光相関イメージングの撮像デバイスの開発を行った。撮像デバイスの最適化のためには、デバイスシミュレーションをパラメトリックに行う必要があり、高精度デバイス設計のため、SIMS解析を用いてパラメータを抽出済みである0.11μm埋め込みフォトダイオードCMOSセンサプロセスを用いて、デバイスシミュレーションを行った。それから高時間分解能を有するデバイスを設計するために、信号電荷の高速転送や完全転送が必要であり、SPECTRA(デバイスシミュレータ)を使用して事前検討を行った。また、高時間分解能(<1ns)を獲得するために、高性能周辺回路の設計も重要であり、回路シミュレータ(現有ツールであるCadence社のSpectre等)を利用して検討を行った。特に、極低雑音(1電子)の実現のため読み出し回路の性能が重要であり、その回路の検討や開発を行った。上記のようなシミュレーション結果を基にして、マルチタップ光電荷変調素子を設計試作した。平成25年度には高時間分解能と振幅分解能を有する蛍光寿命と蛍光相関イメージングを実現するために開発した撮像デバイスの評価を行った。まず、試作素子を蛍光寿命と蛍光相関イメージングに応用するためには、マルチタップのすべての蓄積部に対して、光電変換部から1電子転送を可能とする電位障壁のない高速電荷転送が可能か、また、電荷蓄積部から読み出し部への完全転送により、極低雑音(1電子)の信号読み出しが可能であるかが実現の鍵を握る。これを確認するため、1サンプリングあたり、光電子の検出確率が1/100程度の極微弱光に対して、繰り返しサンプリングと電荷蓄積の動作を行い、線形性とノイズ性能の評価を行った。基本性能の確認後、試作されたマルチタップ光電荷変調素子を用いて,蛍光基質を組み込んだ蛍光ビーズ及び、糖鎖に対する蛍光寿命や、蛍光相関分光を試みる。最終的にはナノ秒オーダの時間計測機能と分子のブラウン運動によるランダムながら有意な動きを計測することで、実験的に確認している。

寿命計測の時、マルチタップを利用することで、従来の計測方式(シングルの時間窓を用いて計測する方法)より時間窓のスキャニングが必要なくなったため、測定時間をはるかに短縮することができ、リアルタイム蛍光イメージングの実現可能性を確認した。最後に、本研究を通して、電荷変調素子構造として2点及び4点まで動作確認ができており、その原理を用いた半導体蛍光寿命イメージング素子による新機能内視鏡や、マルチタップ化に基づく蛍光相関分光の多点同時計測素子の実現の基礎が築かれたことは、学術的にも、医療・健康産業の発展においても大きな意義がある。26年度が最終年度であるため、記入しない。平成24年度の計画通りにデバイスのシミュレーションや試作が進展している。平成25年度の計画通りにデバイスの開発や評価が進展している。高時間分解能と振幅分解能を有する蛍光寿命と蛍光相関イメージングを実現するために開発した撮像デバイスの評価を行う。まず、試作素子を蛍光寿命と蛍光相関イメージングに応用するためには、マルチタップのすべての蓄積部に対して、光電変換部から1電子転送を可能とする電位障壁のない高速電荷転送が可能か、また、電荷蓄積部から読み出し部への完全転送により、極低雑音(1電子)の信号読み出しが可能であるかが実現の鍵を握る。これを確認するため、1サンプリングあたり、光電子の検出確率が11100程度の極微弱光に対して、繰り返しサンプリングと電荷蓄積の動作を行い、線形性とノイズ性能の評価を行う。糖鎖に対する蛍光寿命や、蛍光相関分光を試みる。最終的にはナノ秒オーダの時間計測機能と分子のブラウン運動によるランダムながら有意な動きを計測することで、実験的に確認をする。
GATA転写因子群による赤血球系細胞特異的な遺伝子発現調節機序の解析

本研究では,GATA転写因子群の細胞分化への関わり知る目的で,GATA転写因子群の発現をRNAレベルおよび蛋白質レベルで検討し,また,それらをコードする遺伝子の構造解析を実施した.ヒト白血病由来細胞株におけるGATA転写因子群の発現の検討から,GATA-1の存在は赤血球系の分化形質発現にとって重要であること,一方,GATA-2はGATA-1の発現している細胞よりもさらに幼若な骨髄球系細胞に発現し機能していることが示唆された.種々の遺伝子調節領域に存在するGATA配列に実際に結合しているGATA因子分子種を同定する目的で,マウス赤白血病細胞核よりGATA-1/DNA複合体を抗GATA-1抗体を用いて免疫沈降し,得られた画分を抽出して調べて見ると,その中には赤血球特異的に発現している遺伝子群は存在するものの,赤血球で発現していない遺伝子は見い出されなかった.すなわち,GATA配列の中でもGATA-1因子の結合する配列は細胞によって限定されており,このことから逆に,GATA-1因子の結合がこれら赤血球系の遺伝子発現に重要な貢献をしていることが示唆される.新たに精巣におけるGATA因子の発現を見い出した.この因子の一次構造はGATA-1とまったく同一であったが,その発現には赤血球型と明らかに異なる精巣特異的なプロモーターを利用していた.ヒトGATA-2,およびGATA-3遺伝子の構造を詳細に決定したところ,これらGATA因子群をコードする遺伝子の構成は各因子間で,また,種を超えてたいへんよく保存されていた.これらの研究を通して,GATA転写因子群が細胞・組織特異的な転写調節に機能していること,また,その発現に対して複雑かつ巧妙な調節が行われることが理解された.本研究では,GATA転写因子群の細胞分化への関わり知る目的で,GATA転写因子群の発現をRNAレベルおよび蛋白質レベルで検討し,また,それらをコードする遺伝子の構造解析を実施した.ヒト白血病由来細胞株におけるGATA転写因子群の発現の検討から,GATA-1の存在は赤血球系の分化形質発現にとって重要であること,一方,GATA-2はGATA-1の発現している細胞よりもさらに幼若な骨髄球系細胞に発現し機能していることが示唆された.種々の遺伝子調節領域に存在するGATA配列に実際に結合しているGATA因子分子種を同定する目的で,マウス赤白血病細胞核よりGATA-1/DNA複合体を抗GATA-1抗体を用いて免疫沈降し,得られた画分を抽出して調べて見ると,その中には赤血球特異的に発現している遺伝子群は存在するものの,赤血球で発現していない遺伝子は見い出されなかった.すなわち,GATA配列の中でもGATA-1因子の結合する配列は細胞によって限定されており,このことから逆に,GATA-1因子の結合がこれら赤血球系の遺伝子発現に重要な貢献をしていることが示唆される.新たに精巣におけるGATA因子の発現を見い出した.この因子の一次構造はGATA-1とまったく同一であったが,その発現には赤血球型と明らかに異なる精巣特異的なプロモーターを利用していた.ヒトGATA-2,およびGATA-3遺伝子の構造を詳細に決定したところ,これらGATA因子群をコードする遺伝子の構成は各因子間で,また,種を超えてたいへんよく保存されていた.これらの研究を通して,GATA転写因子群が細胞・組織特異的な転写調節に機能していること,また,その発現に対して複雑かつ巧妙な調節が行われることが理解された.本研究ではGATA転写因子群の細胞分化への関わり、特に赤血球細胞分化の際にGATA因子群の果たす役割を知る目的で、GATA転写因子群の発現および構造の解析を行なった。ヒト白血病由来培養細胞株は分化段階の比較的そろった細胞を大量に入手できる利点を持っており、分子生物学的解析に適しているので、本研究の初期段階としてヒト白血病由来細胞株におけるGATA因子群の発現を検討した。14種類の骨髄性白血病細胞株を検討した結果、2種類を除いたすべての細胞株でGATA-2因子mRNAの発現が観察された。GATA-2mRNAを発現していなかった細胞株はリンパ球系へと分化したNALM-1細胞とGATA-3因子を高レベルに発現していたKG-1細胞である。GATA-2mRNAを発現している細胞株中には、幹細胞抗原(CD34)を発現しているような未分化細胞株が4種類含まれていたことが注目される。これに対して、GATA-1mRNAの発現は赤血球系の分化マーカーの発現とたいへん良く相関していた。赤血球系の分化形質発現にはGATA-1因子の存在が必須であること、また、GATA-2因子はGATA-1因子よりもさらに幼若な骨髄球系細胞に発現し機能していることが示唆される。GATA-1因子に対する特異抗体とゲルシフト法を組み合わせて、これら白血病細胞におけるGATA因子群発現を蛋白質レベルで検討した結果、赤血球系細胞ではGATA-1とGATA-2両因子が同時に発現していることが見出された。さらに、細胞内に両者が共存する場合にはGATA-2因子がGATA配列に結合していること、しかし、GATA-1因子が細胞増殖や分化の各段階を通して恒常的に発現しているのに対して、GATA-2因子の方はそれらの影響を受けて発現レベルが大きく低下する場合もあることが見出され、この際にはGATA-1因子の方が配列に結合するものと予想された。これらのことから、細胞分化の際にはGATA因子群の発現に対して複雑かつ巧妙な調節が行なわれることが理解された。

本研究の目的は、赤芽球分化の際にGATA転写因子群が一群の遺伝子の発現を活性化する機序を解明することであり、さらにそれを通して、各GATA因子が赤芽球分化に果たしている役割を明らかにすることにある。目的を達成するために、本研究では1)各GATA因子をコードする遺伝子のクローン化と、その調節領域の構造と機能の解析、及び2)種々の遺伝子調節領域に存在するGATA配列に実際に結合しているGATA因子の分子種の同定を行った。前者に関して、マウスGATA-1、ヒトGATA-2およびヒトとニワトリGATA-3遺伝子の構造を詳細に決定したところ、これらGATA群をコードする遺伝子の構成は各因子間で、また、種を越えてたいへんよく保存されていた。また、ニワトリGATA-3遺伝子のプロモーター上流域にはGATA配列がCACCC配列とクラスターを作って存在し、この部位はTリンパ球では抑制的に、一方、赤芽球では促進的に機能していることを見出した。後者の課題に関して、マウス赤白血病細胞核をフォルムアルデヒドで固定後、GATA-1/DNA復合体を抗GATA-1抗体を用いて免疫沈降し、得られた画分からDNAを抽出した。この中を調べてみると、赤血球特異的に発現しているGATA-1自身の遺伝子やエリスロポエチン受容体遺伝子に存在するGATA配列は存在するものの、赤血球には発現していないT細胞受容体遺伝子のGATA配列は見出されなかった。すなわち、同じGATA配列の中でもGATA-1因子の結合する配列は細胞によって限定されており、このことから、本因子の結合がこれらの遺伝子発現に重要な貢献をしていることが示唆される。これらの研究を通して、GATA転写因子群が細胞・組織特異的な転写調節に機能していること、また、その発現が巧妙に調節されている様子がさらに明らかになった。
ダイズの登熟期間に関わる開花関連遺伝子の機能解析とその活用

2018年度には、2つのホモログ遺伝子(FTB1およびFTH)の同質遺伝子系統(NIL)をインキュベータおよびガラス温室で栽培し、形質調査およびトランスクリプトーム解析のための栽培環境の予備調査を行った。インキュベータでの栽培では、両方遺伝子の形質への影響は観察されなかった。そこでインキュベータの蛍光管の種類を変え、さらに光強度を上げたところ、差が出るようにはなったが、明確な差を再現性良く検出するのが困難であった。ガラス温室では、インキュベータに比べ親品種とNILの差が明確に見られたが、個体差が出やすくトランスクリプトーム解析のサンプリングを行うにはガラス温室も、不適切な環境であると結論づけた。前年に圃場で栽培した結果がもっとも再現性良く、かつ系統間の差が見られていることから、トランスクリプトーム解析も圃場栽培で実施すべきであると結論づけた。遺伝子中に変異をもつ変異体についてもNILと同様に栽培したが、非常に生育が悪く、親品種と比較することが困難であったため、交配によって遺伝的背景をエンレイにする必要があった。また、分離集団による検定を行うために、交配を行った。生育不良ではない変異体についても、元品種に比べ開花期が遅れる現象が見られたため、遺伝的背景による問題なのか、別のアリルによっては開花期への影響も見られるのか、今後確認していく必要がある。今までFTB1の調査に使われてきた品種・系統とは違う系統間でも同様に成熟期間の延長が見られるか調査するため、FTB1のWT型と変異型の系統で交配を行いF2集団を作成した。F2のゲノム全体およびFTB1の遺伝子型を調査し、連鎖解析を行った。発現解析のため、準同質遺伝子系統を温度と光を制御したインキュベータで栽培したところ、成熟期間の差が全く見られなかった。光強度を上げたことにより差を検出することはできたが、野外圃場栽培ほどの差見られなかった。準同質遺伝子系統を、野外のガラス温室にて栽培したところ、明確な差を出すことができたが、個体間の差が出やすく、発現解析に用いる環境には不適切であると考えられた。もっとも安定的に遺伝子型による成熟期への影響が見られたのは、圃場栽培であった。しかし、本年度は成熟期を時系列で追いかけられるようにサンプリングするための圃場設計をしていなかったため、今年度ののRNAseqによる発現解析は断念した。成熟期に時系列で発現レベルで成熟期間中の遺伝子発現パターンを追いかけるには、厳密な圃場設計が必要であるため、今年の栽培では反復を十分に取れるように準備している。成熟期間中の子実中の成分分析によってサンプリング時期を決定し、サンプリングを実施する。変異体については、ターゲット遺伝子以外の変異によると思われる不良形質がある系統があるため、分離集団を用いた形質調査を実施する。今までFTB1の調査に使われてきた品種・系統とは違う系統間でNILと同様の違いが見られるか調査する。

成熟期に時系列で発現レベルで成熟期間中の遺伝子発現パターンを追いかけるには、厳密な圃場設計が必要であるため、今年の栽培では反復を十分に取れるように準備している。成熟期間中の子実中の成分分析によってサンプリング時期を決定し、サンプリングを実施する。変異体については、ターゲット遺伝子以外の変異によると思われる不良形質がある系統があるため、分離集団を用いた形質調査を実施する。今までFTB1の調査に使われてきた品種・系統とは違う系統間でNILと同様の違いが見られるか調査する。昨年度に予定していたトランスクリプトーム解析を実施するための栽培環境を得ることができず、今年度に繰り越したため。
ゼブラフィッシュ内胚葉性器官の形成異常を示すimsetyの責任遺伝子の機能解析

本年度は、imsetyと同様に内胚葉性器官の発生に異常を示すmorendo(mor)変異体の解析を重点的に行った。<1.Morタンパク質の細胞内局在>Morタンパク質が機能する細胞内領域を調べるため、FLAGペプチドで標識したMorタンパク質をゼブラフィッシュ胚で発現させ、抗FLAG抗体を用いて抗体染色を行った。その結果、Morタンパク質は核に局在することが明らかとなった。<2.microRNAのプロセシングの観察>Morタンパク質がmicroRNAの生合成に機能していることが予想された。microRNAとは、20数baseの小分子RNAで、翻訳阻害を行うことが報告されている。mor変異体で、microRNAの生合成過程の異常を調べるために、内胚葉性器官で発現するmicroRNAを、Northern blottingや半定量的RT-PCRで検出したところ、MicroRNAの前駆体が減少していることが明らかとなった。<3.Morタンパク質の機能ドメインの探索>Morタンパク質は幾つかのドメインを有している。Morタンパク質の機能を詳細に理解するために、いくつかのドメインに変異を挿入した変異型Morタンパク質をmor変異体に発現させ、表現型の回復の有無により、Morタンパク質のmicroRNA生合成に機能するドメインを探索した。その結果、ATP結合ドメインがMorタンパク質の機能に必要であることが示唆された。これら3つの結果から、Morタンパク質は核内で、ATPの分解によるエネルギーを用いて、microRNA前駆物質の転写または維持・安定化に機能していることが予想される。本年度は、imsety(ims)変異胚において、神経発生の詳細な解析や細胞死の検出を行った。また、ims変異胚と同様に、内胚葉性器官の発生に異常を示すmorendo(mor)変異体の解析を行った。<1.神経系についての解析>神経マーカーであるneurogenic differentiation, (neuroD)とisletl (isll)の発現を調べることにより、神経の形成を観察した。受精後35時間後では、野生型胚とims変異胚との間に、発現領域、発現強度の差は見られなかった。しかし、ims変異胚では、neuroDは受精後35時間以降、isllは受精後40時間以降に、発現の減少が観察された。このことから、imsの原因遺伝子は、神経発生にも重要な働きがあることが示唆される。<2.細胞死の検出>ims変異胚の内胚葉や神経系の発生異常が、細胞死である可能性が考えられた。そこで、死細胞を検出できるアクリジンオレンジ染色を行った。この結果、ims変異胚では、受精後35時間以降から、眼杯に細胞死が観察された。また脊髄でも細胞死が観察され、受精後100時間までに、細胞死が頭部から尾部へ拡大することが観察された。しかし、内胚葉性器官における細胞死は検出できなかったため、更なる条件検討が必要である。<3.mor変異胚の解析>mor変異体は腸管の腸絨毛形成に異常がみられる変異体として同定された。in situハイブリダイゼーションにより、腸管、膵臓、肝臓の各マーカー遺伝子の発現を調べたところ、これらの減少が確認された。ims変異体とmor変異体の詳細な解析と原因遺伝子の同定により、まだ明らかにされていない、内胚葉性器官形成の遺伝的メカニズム解明の手がかりになると考えられる。<1.morの責任遺伝子の同定>mor変異体の責任遺伝子の同定を目的に、ポジショナルクローニングを行った結果、mor変異体の責任遺伝子(mor遺伝子)を明らかにすることに成功した。mor変異体のmor遺伝子では、翻訳領域に塩基置換が認められ、Morタンパク質内の種間で保存されたドメインに、アミノ酸残基の置換が起きていることが予想された。この結果から、mor遺伝子の塩基置換がmor変異体の表現型の原因であることが示唆された。<2.内胚葉性器官についての解析>mor変異胚における内胚葉性器官の異常が、どの発生過程で起きているのかを調べるため、肝臓や膵臓、腸管のマーカー遺伝子の発現を、in situハイブリダイゼーションにより調べた。その結果、細胞分化は正常だが、器官の拡大・維持に異常が見られることが示唆された。また、mor変異胚の内胚葉性器官や頭部において、細胞増殖を抑制し、細胞死を促す因子であるp53の遺伝子発現の著しい上昇が検出された。このp53遺伝子の発現上昇が、mor変異胚で見られる、内胚葉性器官の拡大・維持の異常の原因であることが予想される。mor変異体の詳細な解析と原因遺伝子の同定により、未だ明らかにされていない、内胚葉性器官形成の分子メカニズム解明の手がかりになると考えられる。

mor変異体で、microRNAの生合成過程の異常を調べるために、内胚葉性器官で発現するmicroRNAを、Northern blottingや半定量的RT-PCRで検出したところ、MicroRNAの前駆体が減少していることが明らかとなった。<3.Morタンパク質の機能ドメインの探索>Morタンパク質は幾つかのドメインを有している。Morタンパク質の機能を詳細に理解するために、いくつかのドメインに変異を挿入した変異型Morタンパク質をmor変異体に発現させ、表現型の回復の有無により、Morタンパク質のmicroRNA生合成に機能するドメインを探索した。その結果、ATP結合ドメインがMorタンパク質の機能に必要であることが示唆された。これら3つの結果から、Morタンパク質は核内で、ATPの分解によるエネルギーを用いて、microRNA前駆物質の転写または維持・安定化に機能していることが予想される。