hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
スギヒラタケ中青酸産生メカニズムと急性脳症発症との因果関係について

原因不明急性脳症は平成16年の秋に日本海側の地方で発生したもので、その年の患者数は55名、死亡者は19名であった。このように高致死率の中毒であるにも関わらず、その後の発症の報告は無く、本研究の原因究明を難しくしている。従って原因究明は原因物質として最も疑われるスギヒラタケから行わなければならない。しかし、きのこは自然界に発生するもので研究材料としてのスギヒラタケの採取が天候による影響を受けてしまうことは避けられない。平成24年度は例年よりもスギヒラタケの発生が遅かったが、量的にも質的にも満足いくきのこが採取できた。平成23年度の採取で十分に量が得られなかったために採取時期を10月後半としたのが幸いであった。しかし、一般的に青酸の測定に用いられる窒素リン検出器付きガスクロマトグラフではきのこに含有される青酸に対する感度が十分とはいえず、新たな分析法の工夫が必要なことがわかったため、測定方法を変更する必要があり、その検討に時間を要した。本研究では自然界に発生するきのこを研究材料とするために、天候による影響を受けてしまうことは避けられない。さいわい、以前から研究材料としてスギヒラタケをはじめとした毒キノコを採取し冷凍保存していたために、研究を中断することは避けられた。しかし、採取時期や、採取場所について工夫することは不可能であったので、本来の研究はあまり進行していない。目的きのことは異なるきのこではあるが、イボテングタケおよびドクササコについて毒成分の新しい抽出法や、タンデム型質量分析装置による新しい分析法を確立し、高感度分析が可能となったことは、今後のスギヒラタケの毒成分分析法の開発に必ず役立つものと考える。スギヒラタケの採取は本年度も行う予定である。平成24年度と同様に10月後半を主な採取時期とする。きのこ中の青酸の測定法についてはすでにきのこ以外では測定法を確立した質量分析法の利用について検討する予定である。そして、高感度分析法が確立したら、本研究の研究開始前より採取してきているスギヒラタケを含めたきのこについて、年別のスギヒラタケ中青酸濃度を比較検討する。新たに検討を始めたスギヒラタケの培養により発生したきのこの成長に合わせて青酸濃度を測定する。研究の最終年度であるのでスギヒラタケ中青酸濃度の年別変化やきのこの成長段階過程での青酸濃度の変化などを検討し、青酸発生のメカニズムを明らかにする。スギヒラタケの採取は次年度に行う予定である。平成23年は天候の影響もあり十分採取できなかったことを考慮し、次年度は9月後半より複数回にわたって採取を試みることにする。また、採取地点を今まで重点をおいてきた秋田県のみではなく、静岡県を含む採取可能な他県にも広げる計画である。毒成分の高感度検出法を確立するためおよび青酸代謝へのスギヒラタケの影響について検討するために質量分析装置を利用することにし、ガスクロマトグラフィ質量分析器や高速液体クロマトグラフィ-タンデム型質量分析器での分析を試みる。これらの機器ではイボテングタケやドクササコでの中毒事例についての検査で得られた抽出方法や分析方法についての経験を生かし、新たな高感度分析法について開発を行う。
雌マウス体細胞からのin vitro精子細胞樹立

哺乳類の正常発生に必須なプロセスである生殖細胞形成過程におけるゲノムの印付け(インプリンティング)に着目し、in vitroで機能的な配偶子を形成するために、インプリンティングの分子的実体であるDNAメチル化を人為的に操作することによって、雌マウス体細胞型のインプリンティングパターンを精子型に変化させることを目的に実験を行った。3種類のDNAメチル化阻害剤をマウス線維芽細胞に作用させたが、一部のインプリント遺伝子のメチル化が低下したものの、全ての遺伝子のメチル化レベルを低下させることはできなかった。哺乳類の正常な発生に必須なゲノムインプリンティングおよびその分子的実体であるDNAのメチル化に着目し、メチル化を人為的に操作することによって、「機能的な精子細胞」のin vitroにおける確立を目指す。そのために、本年度は、脱メチル化剤をマウス胎子線維芽細胞に添加し、インプリントの人為的な消去を目的とする実験を行った。PWKマウスの胎生14.5日目の胎子より樹立した線維芽細胞を用いて、3種類のDNAメチル化阻害剤(Zebularine,DNA methylation inhibitor RG108および5-Aza-2'-deoxycytidine)を0.1μM-100μMの濃度で添加し、インプリント遺伝子および反復配列領域におけるDNAメチル化状態を解析した。解析した領域は、精子でメチル化されるインプリント遺伝子であるH19,IG-DMR,Rasgrf1、卵子でメチル化されるインプリント遺伝子Igf2r,Peg1,Peg3,Lit1,Snrpn、さらにゲノム全体のメチル化レベルを解析するために、反復配列であるLine1の5'および3'領域、IAP,Major satellite,Minor satelhte領域を選んだ。薬剤処理した線維芽細胞からDNAを回収し、バイサルファイト処理を行った後、上記プライマーによるPCRを行った。PCR産物が確認できたものについては、制限酵素処理によりメチル化レベルを電気泳動で確認した(COBRA法)。高濃度の阻害剤添加では早期に細胞が死滅したため、2週間培養後生き残った細胞についてDNAメチル化解析を行ったが、全ての領域について明らかに脱メチル化される薬剤・至適濃度を見つけることはできなかった。H19遺伝子のメチル化は、薬剤添加前は5586%であったが、RG108(1μM100μM添加により5292%、Zebularine(110μM)添加により5694%、5-Aza(0.110μM)添加により5292%と一部の濃度ではメチル化が上昇した。Peg3遺伝子は、薬剤添加前は4357%のメチル化レベルであったが、RG108添加により2854%、Zebularine添加により4452%、5-Aza添加により2975%とRG108添加群の多くでメチル化が低下した。Igf2r遺伝子のメチル化は、薬剤添加前は4953%であったが、RG108添加により4264%、Zebularine添加により4957%、5-Aza添加により4865%とメチル化の低下はほとんど見られなかった。今回用いた薬剤・濃度では全ての遺伝子のメチル化レベルを低下させることはできなかった。
クラックと結晶欠陥の相互作用

破壊靱性に及ぼす温度効果や異種原子添加効果の原因を究明するため,転位や侵入型不純物原子などの易動性結晶欠陥の挙動に注目し,これら欠陥とクラックの相互作用について解析・計算するとともに実験によって追究した.まず,転位の場合には,応力集中を緩和する遮蔽型転位と促進する反遮蔽型転位とがあり,クラック先端から生成する転位は前者,内部転位源から生じクラックに近づく転位は後者に対応し,互いの活動の割合が破壊靱性を左右する.NaCl結晶を想定した転位挙動の大規模計算の結果,77Kからの昇温とともにまず内部転位源からの反遮蔽転位が活動して靱性が緩やかに低下し,450K以上になるとクラック先端からの熱活性化放出した遮蔽転位の活動によって靱性値の上昇することを示し,実験結果とほぼ同様の傾向を得た.しかし,細部においては一致しないところがあり,クラック鈍化と転位組織の効果に着目して光弾性法を用いた定量的観察を行った所,クラック鈍化効果は遮蔽効果の約1/3程度の靱性上昇への寄与があること,転位組織は安定構造をとる傾向があって過剰転位のみがクラック場の応力に影響することなどを明らかにした.また,クラックと侵入型不純物原子との相互作用の場合にも遮蔽型と反遮蔽型があり,それぞれクラック先端の後方・前方にある侵入型原子が前者・後者を誘起するため,易動性侵入型不純物の挙動について大規模計算を行った結果,不純物の前方集積はクラックを介した不純物原子同士の相互作用や不純物の正方歪みによって促進されることを示し,易動性侵入型不純物によって普遍的に脆化の起こることを提起した.破壊靱性に及ぼす温度効果や異種原子添加効果の原因を究明するため,転位や侵入型不純物原子などの易動性結晶欠陥の挙動に注目し,これら欠陥とクラックの相互作用について解析・計算するとともに実験によって追究した.まず,転位の場合には,応力集中を緩和する遮蔽型転位と促進する反遮蔽型転位とがあり,クラック先端から生成する転位は前者,内部転位源から生じクラックに近づく転位は後者に対応し,互いの活動の割合が破壊靱性を左右する.NaCl結晶を想定した転位挙動の大規模計算の結果,77Kからの昇温とともにまず内部転位源からの反遮蔽転位が活動して靱性が緩やかに低下し,450K以上になるとクラック先端からの熱活性化放出した遮蔽転位の活動によって靱性値の上昇することを示し,実験結果とほぼ同様の傾向を得た.しかし,細部においては一致しないところがあり,クラック鈍化と転位組織の効果に着目して光弾性法を用いた定量的観察を行った所,クラック鈍化効果は遮蔽効果の約1/3程度の靱性上昇への寄与があること,転位組織は安定構造をとる傾向があって過剰転位のみがクラック場の応力に影響することなどを明らかにした.また,クラックと侵入型不純物原子との相互作用の場合にも遮蔽型と反遮蔽型があり,それぞれクラック先端の後方・前方にある侵入型原子が前者・後者を誘起するため,易動性侵入型不純物の挙動について大規模計算を行った結果,不純物の前方集積はクラックを介した不純物原子同士の相互作用や不純物の正方歪みによって促進されることを示し,易動性侵入型不純物によって普遍的に脆化の起こることを提起した.クラックと結晶欠陥の相互作用を解明するため,本年度は転位ならびに侵入型原子がクラックの進展抵抗に及ぼす効果について研究を行った。得られた結果は次のように要約される。1.転位の活動しやすい純粋なNaCl結晶では,クラックは断続的に進展し,その先端形状は湾曲・ピン止めを繰返しながら進展する。転位の動抵抗を高めたNaCl-NaBr混晶結晶では,クラックは停止することなく速く進展する。2.NaCl結晶において,転位活動はクラックに対して遮蔽場のみならず反遮蔽場の形成をもたらす。これは転位の運動とクラック先端からの転位生成の相対的な難易度に依存し,転位生成の容易な高温では遮蔽場を形成し靱性向上に寄与するが,低温では反遮蔽場形成によって靱性低下をもたらす。3.侵入型原子が等方的歪みを持つとして計算すると,そのクラック近傍への集積は反遮蔽場をもたらすことを示すが,その場の強さは大きくはない。しかし,侵入型原子が正方歪みを持つとして計算した結果,その原子のクラック近傍への集積は強い反遮蔽場の形成に寄与することを示した。この結果から侵入型原子が正方歪みをもつと考えられるBCC金属中の水素や窒素原子がクラック近傍に集積すると,強い脆化作用をもたらす可能性のあることを指摘した。以上の結果をそれぞれの項目毎に整理・考察し,成果を印刷公表した。クラックと結晶欠陥の相互作用を解明するため,本最終年度は相互作用の実証および計算機シミュレーションの研究を行った.得られた結果は次のように要約される.1.岩塩型イオン結晶を用いた光弾性測定によってクラック-転位相互作用の定量的評価に成功し,脆性-延性遷移温度以上では斥力相互作用が強く実測靱性値の上昇と対応すること,および,低温側では引力型相互作用が混在して靱性低下に到ることを定量的に実証した.

2.転位活動の自由度に対する温度の効果はクラック近傍における低エネルギー転位構造の質的変化をもたらし,低温側では正負転位の混在する双極子型すべり帯構造,高温側では多量すべり型転位構造になることを観察し,これらが先に示した転位活動によって生ずる具体的な転位構造であり相互作用変化の原因となることを明かにした.3.クラック-侵入型不純物原子相互作用を考慮してクラック近傍における不純物の分布変化について計算機シミュレーションを行い,不純物の正方歪み増大と共にクラック前方への板状分布の傾向が強まってクラック進展力の増大に寄与することを示し,これらと実測結果との対応から正方歪みをもつ易動性侵入型原子の再配列が靱性低下をもたらし遅れ破壊や照射脆化の要因となることを指摘した.以上の結果を系統的に検討・考察し,成果の公表を行った.
観光接触場面のツーリスト・トーク：ツーリズムのためのやさしい日本語の開発と実践

前科研課題においては、観光場面における「やさしい日本語」はどのような形式と使い方が適切であるかのについて探るために、基礎となるデータの収集と分析を行ってきた。今回の課題は、引き続きデータ集中と分析を行いつつも、これまで得られた知見を現場で実践する段階と位置づけている。その実践の場として昨年は箱根(旅館1件、料理店1件、和菓子店1件)、京都(旅館1件)、福岡(柳川市全域)、大分(旅館1件)、北海道美唄市(全域)、北海道倶知安町(一部地域)を選び、現地を訪問して講演や実践の方法などを説明した。その実施報告は2018年度には間に合わなかったが、2019年度6月23日開催予定の「インバウンドで使うやさしい日本語-外国人旅行者とのコミュニケーションを考える」で公表される。同時に6月中にはこれまでの課題研究から得られた知見と、現場の方たちの報告を集めた書籍を大修館から刊行する予定となっている。また、前後するが書籍に関しては2018年度5月には研究社から「やさしい日本語とやさしい英語でおもてなし」という書籍が出版され、この中には科研で得られた知見をもとにした外国人観光客とのコミュニケーションの方法について説明を行っている。また、講演(美唄市、倶知安町)や出版などの研究結果の開示以外には、昨年9月に北海道美唄市へ留学生4人を連れて訪問し、美唄市民のやさしい日本語使用実践の場を提供した。これらのコミュニケーションはデータとして記録され、本科研研究期間中に論文発表或いは学会発表などを実施する予定である。本研究課題は観光現場におけるやさしい日本語の使用と異文化コミュニケーションの分析及び、やさしい日本語の使用を現場の人たちに拡げるとこを目的としているが、すでにこの試みを知り、新聞社の取材、某自治体観光関連組織のプロジェクトへの協力要請、某専門学校の関連講座開設の協力依頼などが届いている。社会の反応が予想以上に早いが、本研究課題の目的でもある実践に繋がる活動であるので、各方面からの協力は惜しみなく行いながらも、データ収集と分析自体は拙速に事を運ぶことは避けるつもりであるので、概ね順調と考える。2019年度は観光接触場面における異文化コミュニケーションの状況を、これまで主に行ってきた各地の観光現場でのインタビューによるデータ収集の他に、SNSなどにより投稿された情報を関係会社から入手するなどして、より量的分析を加味したデータ収集を行う予定である。同時に、やさしい日本語を観光現場で使用する効果やその基礎となる概念などを現場に人により正しく理解してもらうために、前述したシンポジウムの開催、書籍出版、講座開設などを行っていく。本研究課題は2020年が最終年度であるが、2020年はオリンピック・パラリンピック年であり4000万人の外国人観光客の来日が期待されるている。間違いなくこの年にはこれまでの日本には見られなかった量の異文化コミュニケーションとコミュニケーション問題の発生が予測される。したがって、その前にできるだけ新たな異文化コミュニケーションの可能性を現場の人に伝えられるセッティングを作っていく方法を模索していきたい。

本研究課題は2020年が最終年度であるが、2020年はオリンピック・パラリンピック年であり4000万人の外国人観光客の来日が期待されるている。間違いなくこの年にはこれまでの日本には見られなかった量の異文化コミュニケーションとコミュニケーション問題の発生が予測される。したがって、その前にできるだけ新たな異文化コミュニケーションの可能性を現場の人に伝えられるセッティングを作っていく方法を模索していきたい。2019年6月23日に「インバウンドで使うやさしい日本語-外国人旅行者とのコミュニケーションを考える-」というシンポジウムを予定しているが、その際に福岡、大分、箱根、北海道美唄市、北海道倶知安町からパネラーの参加を予定している。そのシンポジウム開催にかかる諸費用を考えて一定額を次年度使用に残した。
建築物防災のためのマグネトレオロジー（ＭＲ）材料に基づいた革新的耐震技術

本研究では、磁場で粘性が変化するMR(マグネトレオロジー)流体を用いた高速応答多機能なダンパを開発し、それを活用した建築構造物の革新的耐震技術を研究開発する。新規なMR流体ダンパは、減衰力可変MR流体ダンパに剛性(弾性)可変機構を付与したもので、減衰力と剛性の両特性を制御可能なため、従来の減衰力可変MR流体ダンパに比して、振動エネルギーを効果的に吸収できるだけでなく、同時に剛性可変制御により非共振制御も可能なことから、構造物の振動制御性能を格段に向上できる。本ダンパーを3階の建築物モデルに各床間のブレースとして装着して、典型的な地震波に対する構造物の応答からその制御法及び性能について検討する。
高規則性ポーラスアルミナを用いた膜乳化プロセスによる単分散エマルションの作製

ナノホールアレー構造材料である高規則性陽極酸化ポーラスアルミナを用いた膜乳化プロセスにより,サイズの均一なハイドロゲル微粒子の作製が可能であった.本プロセスでは,用いるポーラスアルミナの細孔径を変化させることにより,ハイドロゲル微粒子サイズの制御が可能であり,細孔サイズと微粒子サイズは直線的な関係を示すことが確認された.本プロセスは,サイズが制御された単分散ハイドロゲル微粒子を高スループットに作製可能であるため,得られた単分散ハイドロゲル微粒子は,ドラッグデリバリーシステムの薬物キャリヤをはじめ,様々な機能性デバイスへの応用が期待できる.陽極酸化ポーラスアルミナを乳化膜とした膜乳化プロセスにより,単分散エマルションの作製とハイドロゲル微粒子の形成について検討を進めた.膜乳化プロセスとは,乳化膜を介して分散相を連続相中に押し出すことで,サイズの揃った液滴形成が可能な手法であり,乳化膜の細孔径を変化させることで,得られる液滴サイズの制御が可能なことが知られている.本研究では,微細な液滴形成を行うために,直径が100nm以下のポーラスアルミナを乳化膜とした膜乳化について検討を行った.その結果,界面活性剤を溶解した水中に油滴を形成する系において,100nm以下の単分散な液滴形成が可能なことが明らかとなった.このような知見に基づき,微細なハイドロゲル形成について検討を進めた結果,ハイドロゲルの前駆体溶液を分散相として水滴形成を行い,油相中でゲル化を行うことでサブミクロンスケールの単分散ハイドロゲル微粒子の形成が可能であることを確認した.ハイドロゲル材料としては,化学ゲルであるポリアクリルアミドゲルに加え,物理ゲルであるゼラチンやアガロースについて検討を行ったが,何れの材料を用いた場合においても単分散なハイドロゲル微粒子の形成が可能であることを確認した.また,乳化膜として用いるポーラスアルミナの細孔径を変化させることにより,得られる微粒子サイズを200nmから800nmの範囲で制御可能なこともわかった.本研究で得られた単分散ハイドロゲル微粒子は,薬物キャリヤーをはじめ様々な応用が期待できる.ナノホールアレー構造材料である高規則性陽極酸化ポーラスアルミナを用いた膜乳化プロセスにより,サイズの均一なハイドロゲル微粒子の作製が可能であった.本プロセスでは,用いるポーラスアルミナの細孔径を変化させることにより,ハイドロゲル微粒子サイズの制御が可能であり,細孔サイズと微粒子サイズは直線的な関係を示すことが確認された.本プロセスは,サイズが制御された単分散ハイドロゲル微粒子を高スループットに作製可能であるため,得られた単分散ハイドロゲル微粒子は,ドラッグデリバリーシステムの薬物キャリヤをはじめ,様々な機能性デバイスへの応用が期待できる.高規則性ポーラスアルミナを用いた膜乳化プロセスによる単分散微粒子の作製において,H24年度は,分散相にハイドロゲルの溶液を適用し,単分散なハイドロゲル微粒子の作製を目指し検討を進めた.ハイドロゲルにはアガロースやゼラチンのような,冷却することで高分子鎖が絡み合いゲル化する物理ゲルと,ポリアクリルアミドのような高分子鎖が化学的に架橋することでゲル化する化学ゲルがあるが,H24年度は物理ゲルからなる微粒子の形成を試みた.具体的には,アガロースやゼラチンを溶解した水溶液を,温度制御を行いながら膜乳化を行うことで単分散な液滴形成を行い,冷却することで固化粒子の作製を行った.膜乳化プロセスでは,用いる溶液の粘度や界面張力が液滴形成に大きな影響を与えるため,予備検討として分散相中の溶質濃度と溶液物性について詳細に検討を行い,乳化可能な溶液条件を探索した.これらの溶液は,温度によって物性が大きく変化するため,膜乳化時に温度調節を行うための治具も試作した.その結果,適切な温度条件下で膜乳化を行うことで,サイズ均一性に優れた液滴形成が可能なことを確認した.得られたエマルション溶液は,氷浴中で冷却することにより,液滴が凝固しハイドロゲル微粒子を得ることができた.また,膜乳化に用いる高規則性ポーラスアルミナの細孔径を変化させることにより,得られるハイドロゲル微粒子のサイズ制御も可能であることを確認した.H24年度の検討により,ハイドロゲル微粒子の作製が可能であることを確認し,用いるポーラスアルミナの細孔径を変化させることにより,微粒子サイズの制御も可能であることが変わったことから,おおむね順調に進展していると考えている.今後は,分散相に添加剤を付与することにより溶液物性を調節し,得られる微粒子の単分散性の向上について検討を進める予定である.さらには,分散相にあらかじめ様々な物質を添加することによる微粒子内への物質の内包についても検討を行う.膜乳化時の温度調節を行うため,当初購入設備として恒温槽装置をH24年度に購入する計画でいたが,低予算にて試作した装置により温度調節が可能であったため,購入を取りやめた.そのため,繰越金が生じているがH25年度に高精度な温調装置を試作する予定であるため,その購入予算とする予定である.その他は,計画通り試薬や実験器具などの消耗品の購入を予定している.また,研究成果を国内外での学会で発表するため,旅費の支出も予定している.
高効率DNA連結反応に関与するタンパク質複合体の構造・機能解析

ラジオデュランスは二種類のDNAリガーゼ(DR2069、DRB0100)を持っている。解析の結果、DR2069にはDNAリガーゼ活性が認められたが、DRB0100はDNAリガーゼ活性は認められなかった。一方でDNAリガーゼによる連結反応の前段階において消化酵素からDNAを保護するDdrAタンパク質の結晶解析を実施し、結晶化、回折データ収集に成功した。最大分解能2.1Åまでの良好な回折データを収集し、現在構造解析中である。ラジオデュランスは生物にとって致死的効果の高いDNA二本鎖切断を効率よく修復する機構を持つ事に起因している。ラジオデュランスのゲノム中にはNAD依存型DNAリガーゼDR2069とATP依存型DNAリガーゼDRB0100の二種類のDNAリガーゼが存在する事がゲノム解析の結果から予想されている。しかしこれら2つのDNAリガーゼのどちらが高効率DNA二本鎖切断に関与しているか明らかにされていない。そこで本研究では上記二種類のタンパク質の生化学的、物理化学的解析を行い、二本鎖切断修復に関与するタンパク質を同定し、その機能解析を行う事を目的としている。大腸菌発現系の構築を行ったところ、両タンパク質の発現量は極めて乏しく高純度精製は困難であったが、N-末端もしくはC-末端にHis-tagを付与した発現系を構築し、高純度に精製する事に成功した。N-末端にHis-tagを付与したDR2069にはDNAリガーゼ活性が認められたが、C-末端にHis-tagを付与した発現系では活性を確認できなかった。またN-末端もしくはC-末端にHis-tagを付与したDRB0100はどちらもDNAリガーゼ活性は認められなかった。今後、DNAリガーゼ活性が認められたDR2069とDNA修復促進タンパク質PprAの協調機構を明らかにするため、より詳細な生化学的解析、さらには分子機構の解明を目指し複合体の結晶化を行う。一方DNAリガーゼ活性が認められなかったDRB0100に関してはRNAを基質とする可能性もあるため、RNAを用いた生化学的解析を継続し、さらにHis-tagを付与したDRB0100を用いて菌体抽出液からのpull-downアッセイを実施し、相互作用分子の探索を行う。さらにRNAを基質とした酵素活性も確認したところ、RNAリガーゼ活性も認められなかった。一方でDNAリガーゼによる連結反応の前段階として切断点を認識し、消化酵素から保護するDdrAタンパク質が存在する事が他のグループの研究によって明らかになった。そこでDNAリガーゼとの関係に着目し、DdrAの切断点認識機構、DNAリガーゼリクルート機構を明らかにする事を目的として結晶解析を実施し、結晶化、回折データ収集に成功した。最大分解能2.1A^^0までの良好な回折データを収集し、現在構造解析中である。
エピトランスクリプトーム解析による新規がん治療標的の探索

DNAメチル化修飾は、遺伝子発現調節機構として知られるエピジェネティクス修飾の1つであるが、近年、RNAも同様にメチル化を受けることが報告された。RNAのメチル化は、mRNAの発現量調節や安定性、スプライシング、miRNAの結合能調節など様々な機能に関与することが明らかとなっており、エピジェネティクスと同様にゲノム配列に拠らない遺伝子発現制御機構として、エピトランスクリプトームと呼ばれ注目を集めている。申請者は、がん細胞を用いて、RNAメチル化というmRNAの転写後調節機構が、どのようなメカニズムで遺伝子の発現量や機能調節を行っているかを明らかにすると共に、がん細胞特異的なエピトランスクリプトーム変化から、抗がん剤の治療標的となりうる遺伝子の探索を行うことを目的としている。昨年度までに、幾つかのがん細胞種においてRNAメチル化に関連する遺伝子についてノックダウンを行った結果、肺がん細胞において腫瘍形成能に大きな影響が認められた。今年度は、幾つかのがん細胞、ヒト多能性幹細胞についてRNA-seq、及びマイクロアレイを行い、発現解析を行うと共に、スプライシングパターンの変化が見られる遺伝子の同定を行っている。また、公開されているRNA-seqデータを利用し、正常体細胞を含む様々な細胞種についてスプライシングパターンの解析を行うことで、がん細胞特異的なスプライシングパターンの同定を試みている。昨年度、ヒトRNAメチル化関連遺伝子をノックダウン可能なshRNAによりがん細胞におけるRNAメチル化変化を誘導したところ、幾つかの細胞種において腫瘍形成能に影響が見られた。現在、これらのがん細胞種について、RNA-seq及びマイクロアレイにより発現解析を行っている。また、RNAメチル化関連遺伝子を特異的にノックダウンするためのshRNA発現レンチウイルスを作成した。このレンチウイルスを用いて、複数のヒトがん細胞株においてRNAメチル化関連遺伝子のノックダウンを行い、増殖性や腫瘍形成能に影響が見られるがん細胞株の同定を行った結果、腫瘍形成能に顕著な差が認められるがん細胞株の同定に成功した。現在、これらのがん細胞種について、RNA-seq及びマイクロアレイを用いた網羅的発現解析を進めている。本年度は所属研究室の移転に伴い、所属研究室が変更となったため、がん細胞だけではなく、ヒトES細胞に対象を広げ、研究を進めている。RNAメチル化はマウスES細胞の未分化性を維持する作用があることが知られている。所属研究室では、ナイーブ型ヒトES細胞の樹立系が確立されていたことから、ナイーブ型とプライム型ES細胞を用いてRNA-seqを行い、スプライシングパターンの変化を調査している。また、がん細胞に見られるスプライシングパターンが、がん細胞特異的かどうかを検討するために、公共データベースから正常体細胞を含む様々な細胞種のRNA-seqデータを収集し、解析を行っている。昨年度に作成したドキシサイクリン存在下でshRNAを発現誘導可能なプラスミドをヒトES細胞に導入し、プライム型からナイーブ型へのリセットや分化時におけるRNAメチル化の影響を観察する。さらに、ES細胞はがん細胞に類似した代謝パターンを示すことから、代謝関連遺伝子に着目してRNA-seqデータの解析を行うことを予定してしている。RNAメチル化の標的となる遺伝子が同定されてた際には、がん細胞、ヒトES細胞を用いてRNAメチル化が誘導する発現変化、スプライシングパターン変化のメカニズムの解明に着手する。DNAメチル化修飾は、遺伝子発現調節機構として知られるエピジェネティクス修飾の1つであるが、RNAも同様にメチル化を受けることが知られている。近年、RNAメチル化がmRNAの発現量調節やスプライシングを介した機能調節に関与することが明らかとなりつつあるが、その詳細なメカニズムや、標的となるmRNAには未だ不明な点が多い。申請者は、がんにおけるRNAメチル化の役割を探索するとともに、そのメカニズムを明らかにすることを目的としている。本年度は、RNAメチル化酵素をノックダウンするためのshRNA発現レンチウイルスベクターの構築とRNAメチル化を検出する手法の検討を行った。作成したレンチウイルスベクターを用いて複数のヒトがん細胞株においてRNAメチル化酵素のノックダウンを行い、増殖性や腫瘍形成能に影響が見られるがん細胞株の同定を行った結果、いくつかのがん細胞株において腫瘍形成能に顕著な差が認められた。さらに、我々はがん細胞のリプログラミングに抗がん剤を投与することで、通常起こらないがん細胞のエピゲノム変化が誘導されることを明らかにした。また、ある種のヒトがん細胞においては、抗がん剤投与に伴う形質の変化により、抗がん剤耐性を獲得することが報告されている。これらの点から、抗がん剤投与時のRNAメチル化の標的遺伝子の同定や網羅的発現解析により抗がん剤耐性のメカニズムを明らかにすることができる可能性が示唆された。現在、抗がん剤投与時のRNA-seqデータから、スプライシングパターンの解析を進めている。ヒトRNAメチル化酵素をノックダウン可能なshRNA発現レンチウイルスを作成し、いくつかのヒトがん細胞において、in vitro, in vivoでの増殖試験を行った結果、興味深いことに、in vitroにおいてRNAメチル化酵素ノックダウン時に増殖に明らかな影響が認められなかった細胞株において、in vivoでの腫瘍形成能に顕著な差が認められることが明らかとなった。この細胞株において、コントロール群、およびノックダウン群からRNAサンプルを回収しており、RNAメチル化レベルの比較および発現解析を行っている。また、がん細胞株を追加し、in vitro, in vivoでの増殖・腫瘍形成能試験を行うと共に、レンチウイルスを用いないDox-inducibleのshRNA発現誘導系の確立を進めている。さらに、抗がん剤投与時に、がん細胞に初期化因子を強制発現させることで、リプログラミングに伴う遺伝子発現の誘導が観察された。この結果は、がん遺伝子の下流で維持されているエピゲノム、転写ネットワークががん細胞の個性維持に重要であることを示唆している。

現在、RNA-seqによる網羅的発現解析から、抗がん剤投与により、スプライシングパターンの変化が認められる遺伝子群の同定を行うための解析環境の構築を行っている。DNAメチル化修飾は、遺伝子発現調節機構として知られるエピジェネティクス修飾の1つであるが、近年、RNAも同様にメチル化を受けることが報告された。RNAのメチル化は、mRNAの発現量調節や安定性、スプライシング、miRNAの結合能調節など様々な機能に関与することが明らかとなっており、エピジェネティクスと同様にゲノム配列に拠らない遺伝子発現制御機構として、エピトランスクリプトームと呼ばれ注目を集めている。申請者は、がん細胞を用いて、RNAメチル化というmRNAの転写後調節機構が、どのようなメカニズムで遺伝子の発現量や機能調節を行っているかを明らかにすると共に、がん細胞特異的なエピトランスクリプトーム変化から、抗がん剤の治療標的となりうる遺伝子の探索を行うことを目的としている。昨年度までに、幾つかのがん細胞種においてRNAメチル化に関連する遺伝子についてノックダウンを行った結果、肺がん細胞において腫瘍形成能に大きな影響が認められた。今年度は、幾つかのがん細胞、ヒト多能性幹細胞についてRNA-seq、及びマイクロアレイを行い、発現解析を行うと共に、スプライシングパターンの変化が見られる遺伝子の同定を行っている。また、公開されているRNA-seqデータを利用し、正常体細胞を含む様々な細胞種についてスプライシングパターンの解析を行うことで、がん細胞特異的なスプライシングパターンの同定を試みている。昨年度、ヒトRNAメチル化関連遺伝子をノックダウン可能なshRNAによりがん細胞におけるRNAメチル化変化を誘導したところ、幾つかの細胞種において腫瘍形成能に影響が見られた。現在、これらのがん細胞種について、RNA-seq及びマイクロアレイにより発現解析を行っている。また、RNAメチル化関連遺伝子を特異的にノックダウンするためのshRNA発現レンチウイルスを作成した。このレンチウイルスを用いて、複数のヒトがん細胞株においてRNAメチル化関連遺伝子のノックダウンを行い、増殖性や腫瘍形成能に影響が見られるがん細胞株の同定を行った結果、腫瘍形成能に顕著な差が認められるがん細胞株の同定に成功した。現在、これらのがん細胞種について、RNA-seq及びマイクロアレイを用いた網羅的発現解析を進めている。本年度は所属研究室の移転に伴い、所属研究室が変更となったため、がん細胞だけではなく、ヒトES細胞に対象を広げ、研究を進めている。RNAメチル化はマウスES細胞の未分化性を維持する作用があることが知られている。
磁気微粒子を用いた自動遺伝子解析システムの開発

磁気微粒子を用いたDNAの分離精製機能を有する遺伝子組換え用ワークステーションはすでに市販されており,遺伝子組換えの様々な操作の自動化が可能である.しかし,電気泳動によるDNAの分離・精製を行うことができないため遺伝子解析や遺伝子組換えの全自動化は不可能であった.そこで,アガロースゲルによるDNAの分離・精製の自動化を実現するためにシステムの改造を行った.具体的には,電気泳動装置,CCDカメラを用いたゲル撮影装置,自動サンプル注入装置及びゲル回収装置の開発とそれらに伴うソフトの開発を行った.作製した装置(SX-8G plus)は,コンピューター上からのコマンドにより装置内を3次元的に自由に移動できる8連のノズルを有し,デスクトップには,マイクロタイタープレート,チップラック,試薬コンテナーの他に,自動開閉蓋式サーマルサイクラー,試薬をストックするための冷却ブロック,アガロースゲル電気泳動槽が配置されている.また,電気泳動用電源,ゲルの染色と脱色を自動で行うためのポンプ,ゲルを撮影するためのトランスイルミネーターとCCDカメラも本体に組み込まれている.SX-8G plusは,これまで困難とされていたアガロースゲル電気泳動,遺伝子断片の検出とゲルからの切り出しの自動化を可能とした.一般的に,XYZロボットはアガロースゲルのウエルの位置を合わせるのに十分な精度を有している.ロボットによるサンプルのアガロースゲルへのローディングが困難なのは,使用するチップやゲルの位置などの精度が低いためである.SX-8G plusでは,特別な二重になったコームを使用することで,チップやゲルの精度の低さによるローディングの失敗を防いでいる.ゲルの写真はCCDカメラで撮影されコンピューターに取りこまれる.目的のDNA断片をディスプレイ上でカーソルを用いて指定することにより,自動的に切り出すことが可能である.ゲルの切り出しはノズルにゲルカッターを装着しておこない,切り出したゲルはマイクロタイタープレートなの任意の位置に排出される.現在,この装置の性能評価を行っている.磁気微粒子を用いたDNAの分離精製機能を有する遺伝子組換え用ワークステーションはすでに市販されており,遺伝子組換えの様々な操作の自動化が可能である.しかし,電気泳動によるDNAの分離・精製を行うことができないため遺伝子解析や遺伝子組換えの全自動化は不可能であった.そこで,アガロースゲルによるDNAの分離・精製の自動化を実現するためにシステムの改造を行った.具体的には,電気泳動装置,CCDカメラを用いたゲル撮影装置,自動サンプル注入装置及びゲル回収装置の開発とそれらに伴うソフトの開発を行った.作製した装置(SX-8G plus)は,コンピューター上からのコマンドにより装置内を3次元的に自由に移動できる8連のノズルを有し,デスクトップには,マイクロタイタープレート,チップラック,試薬コンテナーの他に,自動開閉蓋式サーマルサイクラー,試薬をストックするための冷却ブロック,アガロースゲル電気泳動槽が配置されている.また,電気泳動用電源,ゲルの染色と脱色を自動で行うためのポンプ,ゲルを撮影するためのトランスイルミネーターとCCDカメラも本体に組み込まれている.SX-8G plusは,これまで困難とされていたアガロースゲル電気泳動,遺伝子断片の検出とゲルからの切り出しの自動化を可能とした.一般的に,XYZロボットはアガロースゲルのウエルの位置を合わせるのに十分な精度を有している.ロボットによるサンプルのアガロースゲルへのローディングが困難なのは,使用するチップやゲルの位置などの精度が低いためである.SX-8G plusでは,特別な二重になったコームを使用することで,チップやゲルの精度の低さによるローディングの失敗を防いでいる.ゲルの写真はCCDカメラで撮影されコンピューターに取りこまれる.目的のDNA断片をディスプレイ上でカーソルを用いて指定することにより,自動的に切り出すことが可能である.ゲルの切り出しはノズルにゲルカッターを装着しておこない,切り出したゲルはマイクロタイタープレートなの任意の位置に排出される.現在,この装置の性能評価を行っている.
動静脈奇形における新生血管の分子制御機構　～病的血管はいかに新生するか？～

体表の動静脈奇形(AVM)の血管増殖機序に関して検討を行った.体表AVMの手術検体からexplant法で血管内皮細胞を初代培養し,動静脈奇形由来血管内皮細胞(AVMVEC)を得た.対照として同様に手術検体から正常動脈から血管内皮細胞(NAVEC)を得た.AVMVECはNAVECに比べ,高い増殖能を示し,その増殖能はヒト臍帯血由来血管内皮細胞(HUVEC)と同程度であった.さらに,これら培養細胞からRNAを抽出し,網羅的にマイクロアレイを行ったところpiezo-type mechanosensitive ionchannel component 2(PIEZO2)ならびにselectin-P(SELP)遺伝子においてNAVECならびにヒト臍帯血由来血管内皮細胞(HUVEC)よりもAVMVECにおいて高い発現を認めた.これら遺伝子について固定標本における免疫組織学的検討を行ったところ,PIEZO2の発現は明らかではなかったが,SELPにおいて血管内皮付近で高い発現を認めた.体表AVMにおけるSELP発現の意味や意義についてはなお不明であるが,固形癌において血小板侵入によって腫瘍増殖に関与することや脳AVMで強発現することから,体表のAVMの異常血管増殖に関与している可能性が高いと考えられた.一方,機械的刺激によるAVMVECの反応について検討を行った.閉鎖系で培養液を一定速度で還流させ,培養細胞の動態を観察する潅流培養においては,培養液の流動方向には広がらずむしろ逆行する様式でAVMVECが増殖する結果となった.血管奇形は先天性の血管性病変であり、特に動静脈奇形は軟部組織の醜状変形にとどまらず、筋・骨格系の変形、病変からの大量出血など組織破壊的となることもあり、日常生活に著しい制限を生じる。病変の多くは進行性であり、難治病変では進行を止める手段さえない場合がある。動静脈奇形を含めた血管奇形の病態生理および悪化の機序には不明な点が多い。われわれは本研究を通じて、血管奇形における新生血管の形成過程について,1.幹細胞の有無,2.Angiopoitetinの関与,3.機械刺激の関与の3つに焦点を当てて分子生物学的側面より評価し、本疾患の分類・診断基準作成の補助ならびに疾患治療の確立へ結びつけることを目的とした。われわれのこれまでの研究では,動静脈奇形由来血管内皮細胞の増殖能が正常動脈に比べて明らかに高い結果が得られた。この原因の一つとして未分化な細胞が正常動脈より多く存在することが推察される。臍帯血には造血幹細胞以外に間葉系幹細胞(mesenchymal stem cell: MSC)や血管内皮前駆細胞といった幹細胞や前駆細胞が存在することが明らかとなっている。そこで,血管奇形を種々のMSCマーカーに関する検討を行う。また,Angiopoitetin(Ang)のうちAng1は血管内皮細胞と壁細胞の安定化を促す。一方、組織が低酸素状態にさらされるとAng2が内皮細胞と壁細胞の接着を抑制することで、内皮細胞が誘導され血管新生へと導く。体表の動静脈奇形におけるAngiopoitetinの関与を分子生物学的に検討する。動静脈奇形悪化の機序として、外傷や不適切な部分切除が指摘されている。何らかの機械的刺激が、血管内皮細胞の発芽を通じて血管新生を生じる可能性が十分に考えられる。灌流培養でシェアストレスを変化させて細胞形態の変化やsprouting assayによる血管内皮細胞の発芽の程度を検討する。増殖因子検討の端緒として,動静脈奇形由来血管内皮細胞(AVMVEC)を単離培養し,mRNAを抽出した。同様に,正常血管由来の血管内皮細胞を単離培養し,マイクロアレイを施行て両者を比較検討したところ,PIEZO2とSELPで両者間に著明な差を認めた。今後,免疫組織学的な検討に加えて,リアルタイムPCRならびにウェスタンブロッティングで発現を検討する予定である。血管奇形は先天性の血管性病変であり、特に動静脈奇形(AVM)は軟部組織の醜状変形にとどまらず筋骨格系の変形、病変からの大量出血など組織を破壊することもあり、日常生活に著しい制限を昌実。病変の多くは進行性であり、難治病変では進行を止める手段さえもない場合がある。AVMを含む血管奇形の病態生理および悪化の機序には不明な点が多い。われわれは本研究を通じて、血管奇形における新生血管の形成過程について、1.幹細胞の有無、2.Angiopoietin(Ang)の関与、3.機械的刺激の関与の3つに焦点を当てて分子生物学的側面より評価し、本疾患の分類・診断基準作成の補助ならびに疾患遅漏の確立へ結びつけることを目的とした。われわれはこれまでの研究で、AVM由来の血管内皮細胞の増殖能が正常動脈に比べて明らかに高いという実験結果を得た。この理由の一つに未分化な細胞が正常動脈より多く存在することが推察される。臍帯血には造血幹細胞以外に間葉系細胞ののmesencymal stem cell(MSC)や血管内皮前駆細胞といった幹細胞や前駆細胞が存在することが明らかとなっている。そこで、血管奇形に対して種々のMSCマーカーに関する検討を行う。またAngのうちAng1は血管内皮細胞と壁細胞の安定化を促す。体表のAVMにおけるAngの関与を分子生物学的に検討する。

AVM悪化の機序として、外傷や不適切な部分切除が指摘されている。何らかの機械的刺激が、血管内皮細胞の発芽を通じて血管新生を生じる可能性が十分に考えられる。還流培養でシェアストレスを変化させて細胞形態の変化やsprouting assayによる血管内皮細胞の発芽の程度を検討する。増殖因子の検討に動静脈奇形由来血管内皮細胞(AVMVEC)を単離培養し、mRNAを抽出した。正常動脈由来血管内皮細胞(NAVEC)を含めてマイクロアレイで網羅的に検討したところ、複数のサイトカインで両者に著明な差を認めた。その中でもSELPは免疫組織学的検討でもAVMで有意な差を示した。還流培養では、HUVECを用いて培養液の還流速度や細胞数など至適条件設定を行っている。体表の動静脈奇形(AVM)の血管増殖機序に関して検討を行った.体表AVMの手術検体からexplant法で血管内皮細胞を初代培養し,動静脈奇形由来血管内皮細胞(AVMVEC)を得た.対照として同様に手術検体から正常動脈から血管内皮細胞(NAVEC)を得た.AVMVECはNAVECに比べ,高い増殖能を示し,その増殖能はヒト臍帯血由来血管内皮細胞(HUVEC)と同程度であった.さらに,これら培養細胞からRNAを抽出し,網羅的にマイクロアレイを行ったところpiezo-type mechanosensitive ionchannel component 2(PIEZO2)ならびにselectin-P(SELP)遺伝子においてNAVECならびにヒト臍帯血由来血管内皮細胞(HUVEC)よりもAVMVECにおいて高い発現を認めた.これら遺伝子について固定標本における免疫組織学的検討を行ったところ,PIEZO2の発現は明らかではなかったが,SELPにおいて血管内皮付近で高い発現を認めた.体表AVMにおけるSELP発現の意味や意義についてはなお不明であるが,固形癌において血小板侵入によって腫瘍増殖に関与することや脳AVMで強発現することから,体表のAVMの異常血管増殖に関与している可能性が高いと考えられた.一方,機械的刺激によるAVMVECの反応について検討を行った.閉鎖系で培養液を一定速度で還流させ,培養細胞の動態を観察する潅流培養においては,培養液の流動方向には広がらずむしろ逆行する様式でAVMVECが増殖する結果となった.増殖因子の免疫組織学的検討に加えて,機械刺激の関与については今年度に灌流培養で評価を行う予定である。上述のマイクロアレイで網羅的検討を行った増殖因子(特にSELP)に関して、リアルタイムPCRならびにウエスタンブロッティングで発現を検討する予定である。また、還流培養においても増殖因子の発現を検討する。手術で得られた標本が予想よりやや少なかったため,細胞培養のコストが当初計画より少なくなった。また,研究者自身が主に実験する機会が多く,人件費の拠出が少なかった。(理由)手術で得られた標本が予想より少なく、細胞培養のコストが当初計画より少なくなった。また研究者自身が主に実験する機会が多く、人件費の拠出が少なかった。学術集会の開催都市が大阪のため、旅費の拠出がなかった。(使用計画)次年度では、細胞培養に加えで免疫組織学的検討に必要な試薬の購入で予算が必要である。
コンディショナルノックアウトマウスによるB細胞終未分化におけるAML1の機能解析

(1)B細胞特異的AML1欠損マウスの確立私達が既に確立したCre-LoxPシステムを用いたAML1コンディショナルノックアウトマウスの系を使用し、B細胞特異的AML1欠損マウスを確立に成功した。具体的にはAML1flox/+マウスとCD19-Creノックインマウスを交配し、AML1flox/-CD19-Creマウスを作製した。作製したマウスを更にSTOPflox-GFPトランスジェニックマウスを交配し、AML1flox/- STOPflox-GFP CD-19-Creマウスを作製した。このマウスでGFP陽性となる細胞集団が、AML1欠損する細胞集団とほぼ一致する。B細胞初期分化(プレB細胞)からB細胞終末分化にてAML1が欠損していることを確認した。(3)B細胞特異的AML1欠損マウスの解析作製したマウスを用いて、解析を進めた。病理組織学的解析では骨髄、脾臓、リンパ節とも明確な表現系を確認できなかった。フローサイトメーターによるB細胞系各分化段階の解析では、B細胞初期分化、とりわけプレB細胞から初期B細胞への分化が障害され、B細胞初期分化にAML1が重要な転写因子であることを確認した。また後期B細胞分化に関して、B細胞終末分化としての形質細胞分化が、特に抗原負荷状態で障害されることを確認した。血清抗原各サブクラス量のELISA法による測定では、SPF環境下では特に異常を認めず、現在抗原負荷状態での血清抗原各サブクラス量を測定したところ、B細胞特異的AML1欠損マウスではIgG1,IgG2a, IgG2bの産生が有意に増加傾向を示した。さらに、B細胞終末分化に抗原刺激下で観察されるSHM(体細胞超変異)に着目したところ、B細胞特異的AML1欠損マウス由来B細胞はSMHの頻度がコントロールに比し、有意に増加していた。これらのことはAML1がB細胞終末分化においてリプレッサーとして働くことを示唆している。今後の研究では、これら転写調節をする上での、AML1の標識遺伝子の検索が重要となろう。具体的にはAML1flox/+マウスとCD19-Creノックインマウスを交配し、AML1flox/+CD19-Creマウスを得て、さらにこのマウスとAML1-/+マウスを交配し、AML1flox/- CD19-Creマウスを作製した。作製したマウスを更にSTOPflox-GFPトランスジェニックマウスを交配し、AML1flox/- STOPflox-GFP CD19-Creマウスを作製した。血清抗原各サブクラス量のELISA法による測定では、SPF環境下では特に異常を認めず、現在抗原負荷状態での血清抗原各サブクラス量を測定中である。現在、B細胞終末分化に特に注目し、その免疫賦活に果たす転写因子AML1の機能を解析中である。

さらに、B細胞終末分化に抗原刺激下で観察されるSHM(体細胞超変異)に着目したところ、B細胞特異的AML1欠損マウス由来B細胞はSMHの頻度がコントロールに比し、有意に増加していた。これらのことはAML1がB細胞終末分化においてリプレッサーとして働くことを示唆している。今後の研究では、これら転写調節をする上での、AML1の標識遺伝子の検索が重要となろう。
転写因子複合体による新たな歯原性上皮幹細胞分化制御機構の解明

ヒトの体には不完全ながら修復・再生能力が備わっている。皮膚損傷や骨折などでは、自らの治癒能力を駆使して組織修復を行う。しかしながら失った組織や臓器で修復・再生されることはほとんどない。歯科領域では、ヒトの歯のエナメル質は修復・再生不可能な組織である。エナメル芽細胞分化に必須の因子である、転写因子Epiprofin(Epfn)と複合体を作るT-Box1 (Tbx1)を同定した。Epfn-Tbx1複合体は歯原性上皮細胞分化の過程でエナメル芽細胞分化に関与し、歯の上皮細胞の運命決定に関わっている可能性が考えられる。そこで本研究では、株化したSox2陽性歯原性上皮細胞(CLDE細胞)とマウスモデルを用いた実験から、EpfnとTbx1の制御因子が歯原性上皮細胞のエナメル芽細胞への誘導、分化を制御していることがわかった。Tbx1はSox2発現を誘導し歯原性上皮細胞の維持に必要であると考えられる一方で、Epfnは発現量によってエナメル芽細胞への誘導、殖、分化の異なる機能をする多機能因子であることがわかった。低発現レベルのEpfnはEpfn/Tbx1複合体を形成することによりTbx1のSox2誘導転写機能を阻害して、Epfnが歯原性上皮細胞のエナメル芽細胞への誘導を促進させる。また低発現レベルのEpfnはTbx1のプロモータに結合してTbx1の発現を誘導する。さらに低発現レベルのEpfnはCLDE細胞の増殖を促進させるが、高発現レベルのEpfnはCLDE細胞のエナメル芽細胞への分化を促進する。これらの研究結果からエナメル芽細胞の新たな分化誘導法を導くことができた。転写因子Epiprofin(Epfn)と複合体を作るT-Box1 (Tbx1)の幹細胞維持、分化に関わるメカニズムが解明された。現在,論文に必要と思われる結果は全て出揃い,論文投稿中のため.論文がacceptされた後は,さらに転写因子以外のfactorを解析し分子生物学的にさらにメカニズムについて探索していく.ヒトの体には不完全ながら修復・再生能力が備わっている。我々はエナメル芽細胞分化に必須の因子である、転写因子Epiprofin(Epfn)と複合体を作るT-Box1 (Tbx1)を同定した。そこで本研究では、われわれが株化したSox2陽性歯原性上皮細胞(CLDE細胞)とマウスモデルを用いた実験から,EpfnとTbx1の制御因子が歯原性上皮細胞のエナメル芽細胞への誘導,分化を制御していることがわかった.Tbx1はSox2発現を誘導し歯原性上皮細胞の維持に必要であると考えられる一方で,Epfnは発現量によってエナメル芽細胞への誘導,増殖,分化の異なる機能をする多機能因子であることがわかった.低発現レベルのEpfnはEpfn/Tbx1複合体を形成することによりTbx1のSox2誘導転写機能を阻害して,Epfnが歯原性上皮細胞のエナメル芽細胞への誘導を促進させる.また低発現レベルのEpfnはTbx1のプロモータに結合してTbx1の発現を誘導する.さらに低発現レベルのEpfnはCLDE細胞の増殖を促進させるが,高発現レベルのEpfnはCLDE細胞のエナメル芽細胞への分化を促進する.これらの研究結果からエナメル芽細胞の新たな分化誘導法を導くことができた.現在はおおむね順調に経過している.学会発表も行いポスター賞も受賞した.ヒトの体には不完全ながら修復・再生能力が備わっている。そこで本研究では、われわれが株化したSox2陽性歯原性上皮細胞(CLDE細胞)とマウスモデルを用いた実験から、EpfnとTbx1の制御因子が歯原性上皮細胞のエナメル芽細胞への誘導、分化を制御していることがわかった。

転写因子Epiprofin(Epfn)と複合体を作るT-Box1 (Tbx1)の幹細胞維持、分化に関わるメカニズムが解明された。現在,論文に必要と思われる結果は全て出揃い,論文作成中で今年度中に論文のacceptを目指せるため.ヒトの体には不完全ながら修復・再生能力が備わっている。皮膚損傷や骨折などでは、自らの治癒能力を駆使して組織修復を行う。しかしながら失った組織や臓器で修復・再生されることはほとんどない。歯科領域では、ヒトの歯のエナメル質は修復・再生不可能な組織である。エナメル芽細胞分化に必須の因子である、転写因子Epiprofin(Epfn)と複合体を作るT-Box1 (Tbx1)を同定した。Epfn-Tbx1複合体は歯原性上皮細胞分化の過程でエナメル芽細胞分化に関与し、歯の上皮細胞の運命決定に関わっている可能性が考えられる。そこで本研究では、株化したSox2陽性歯原性上皮細胞(CLDE細胞)とマウスモデルを用いた実験から、EpfnとTbx1の制御因子が歯原性上皮細胞のエナメル芽細胞への誘導、分化を制御していることがわかった。Tbx1はSox2発現を誘導し歯原性上皮細胞の維持に必要であると考えられる一方で、Epfnは発現量によってエナメル芽細胞への誘導、殖、分化の異なる機能をする多機能因子であることがわかった。低発現レベルのEpfnはEpfn/Tbx1複合体を形成することによりTbx1のSox2誘導転写機能を阻害して、Epfnが歯原性上皮細胞のエナメル芽細胞への誘導を促進させる。また低発現レベルのEpfnはTbx1のプロモータに結合してTbx1の発現を誘導する。さらに低発現レベルのEpfnはCLDE細胞の増殖を促進させるが、高発現レベルのEpfnはCLDE細胞のエナメル芽細胞への分化を促進する。これらの研究結果からエナメル芽細胞の新たな分化誘導法を導くことができた。現在,論文に必要と思われる結果は全て出揃い,論文投稿中のため.今後は当初の予定通り研究し論文の発表を計画する.現在,論文に必要と思われる結果は全て出揃い,論文作成中で今年度中に論文のacceptを目指す.論文がacceptされた後は,さらに転写因子以外のfactorを解析し分子生物学的にさらにメカニズムについて探索していく.初年度はin vitroの実験に重きを置いたため予算が次年度使用額が生じた.外部発注する予定のマイクロアレイが年度内に施行できず,29年度の研究費に未使用額が生じたが,次年度に施行されるため,今年度行う予定の研究計画と併せて実施する。最終年度は論文投稿や追加実験,また学会発表もする予定となっている.科研費使用期間内に論文が投稿できなかったため残額が生じた.この研究課題が社会に貢献するために,現在,論文投稿中にて投稿料が必要なため次年度使用額が生じた.2019年内に投稿予定.次年度はRNAシークエンス等で詳細を詰めいいくことからそれらに予算を当てる予定としている.