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知識国家の歴史的系譜に関する比較国制史的研究

渡邊の生涯の事績を初めて系統的に明らかとすることによって、彼のなかにもまた知識の交換を通じて明治維新以後の国家形成を成し遂げていくという考えが認められることを究明し、その再構成を行った。知識国家とは、国民国家の意義と役割を知識の創発と循環に求める新たな国家概念を提唱したものである。本研究では知識国家の萌芽的な存立形態と系譜関係を歴史のなかに探求し再構成することを試みた。そのような関心から特に注目に値するのが、明治前半期の国家構想である。そこでは、近代的な国家の形成が、知識の集積と連携の推進というかたちで進められた。そのことを明確に意識していた人物として、伊藤博文と彼の意を体現するかたちで帝国大学の初代総長として知の制度化を担った渡邉洪基がいる。この両者を主たる対象として、明治期の知識国家の実態を考察した。交付申請書に記していたように、平成27年度中に日本における知識国家論の先唱者と目される帝国大学初代総長渡辺洪基について、その思想と生涯を実証的に解明する評伝研究を刊行する予定であるが、昨年度のうちに必要な資料調査を一通り成し遂げることができ、執筆に着手することができた。引き続き資料収集が必要な部分もあり、そのために若干執筆に遅れが生じているが、今年度内の完成は十分可能と考えている。ドイツ語論集"Staatsverstaendnis in Japan"のほうも、原稿の取りまとめに遅れが生じているが、当初の刊行計画を大幅に見直すまでには至っていない。おおむね順調である。知識国家論の歴史的系譜を探求する作業は、幕末維新期にまでさかのぼり、特に大久保利通や岩倉具視の関係資料を精査しながら進めていく。また、その現代的意義の抽出のために、最新の知識論や国家論の吸収に努め、理論体系の枠組みの提示に向けて研究を行う。比較法史国制史また、知識国家とは、政治に内在する暴力を秩序化し解消する国家作用として観念することが可能である。この点は、近代化に突入し、既存の伝統的秩序の解体ないし動揺が将来された政治社会において、普遍的に問題化することができる。そのような社会ではいずこにおいても、政治的なテロ活動が盛んとなった。明治の日本も例外ではい。そのような政治的暴力の過激化を矯正する試みは、権力の内外で展開された。いわゆる藩閥政府のなかでは、岩倉具視、木戸孝允、大久保利通による初期の政権運営はそのことを強く意識したものだったと考えられ、また明治中期以降では、星亨によって、自由民権運動という反政府運動が内部改革のかたちで体制内化していくが、それは星の独特な政治思想の発露であり、まさに知識国家的な構想と評価できるとの感触を抱いている。以上の二つの側面から知識国家論の歴史的かつ理論的内実を緻密化するかたちで今後の研究を推進していきたい。前年度は研究のために必要な資料の入手を心がけた。他方で、その整理のために予定していた人員を使っての作業は2016年度に持ち越されることになった。そのために、謝金額が生じず、次年度に持ち越されることになった。昨年度は主としてアメリカにおける実地調査に主眼を置いていたため、資料整理のために確保していた人件費・謝金がそれほど必要ではなかった。
異常型αシヌクレインの多様な高次構造は疾患特異的な病態を引き起こすか？

プリオン様異常タンパク質病変の脳内伝播は、アルツハイマー病、パーキンソン病などの主要な神経変性疾患の発症、進行の根底にあるメカニズムと考えられ、その病変拡大のメカニズムの解明は神経変性疾患の予防・治療法の確立につながると考えられる。本研究は、疾患の臨床症状及び病態進行の多様性が生じる要因になると考えられているαシヌクレイン(αS)の"strain"(株)に関してその構造的、生化学的性質とシード能の関係性について明らかにすることを目的としている。今年度は、αシヌクレイン(αS)病変を病理学的特徴とするレビー小体型認知症(DLB)及び多系統萎縮症(MSA)患者脳由来の異常型αSのシード活性について、合成αS線維のシード活性とともにヒト神経芽細胞腫SH-SY5Y細胞及び野生型マウスを用いて検討した。その結果、培養細胞において、MSA患者脳由来の異常型αSはDLB患者脳由来の異常型αSに比べて高いシード活性を示した。また100pg/mL以上の合成αS線維がシード依存的なαS凝集を引き起こし、MSA患者脳由来の異常型αSのシード活性は合成線維と同等、もしくはそれ以上であった。野生型マウスにおいては、0.1ug以上の合成αS線維がシード依存的なリン酸化αS病変を引き起こし、MSA患者脳由来シード接種マウスにおいても接種3ヶ月後にレビー様病理が観察された。一方、DLB患者脳由来シード接種マウスでは、接種9ヶ月後にレビー様病理が観察され、野生型マウス脳においてもDLB及びMSA患者脳シードの活性の違いがみられた。さらにこれまでに報告されている家族性パーキンソン病の原因となる変異型αSの合成線維のシード活性を培養細胞において検討すると、変異によって異なるシード活性を示すことも明らかになった。今年度は、αシヌクレイノパチー患者脳由来異常型αS及び合成αS線維のシード活性について培養細胞、野生型マウスを用いて検討した。これらの検討からプリオン様伝播実験モデルにおいてシード依存的なαS凝集を引き起こすαSシードの最小量が明らかとなり、得られた結果は異常型αSシードの不活性化方法の評価と共に、Acta Neuropathilogica Communication誌に発表した。よって本研究の基礎となるαシヌクレイノパチー患者脳由来シード及び合成線維の活性の違いについての知見が得られ、培養細胞及び野生型マウスのプリオン様伝播モデルを用いたαSシード活性の評価系を確立したことから、本研究はおおむね順調に進展していると考えられる。今年度は、αシヌクレイノパチー患者脳由来異常型αS及び野生型、変異型合成αS線維のシード活性についての知見を得た。よって今後は構造的、生化学的に異なる異常αシヌクレインがシード能及び断片化に与える影響について様々な細胞種を用いて検討する。患者脳由来の異常型αS及び野生型、変異型合成線維をシードとして初代培養神経細胞及びグリア細胞内で異常型αSを増幅し、そのシード活性を試験管及び培養細胞を用いたプリオン様伝播モデルを用いて評価する。また神経細胞とグリア細胞において増幅されるシード活性の違いを比較することで、異なる細胞環境が異なる"strain"を生み出す可能性を検討する。さらにMSA及びDLB患者脳に蓄積している異常型αSに対して、トリプシンやプロテイナーゼKなどによるプロテアーゼ処理を行い、プロテアーゼに対する抵抗性及び耐性バンドの差異についての検討を行い、プロテアーゼ処理後の異常型αSのシード活性を培養細胞を用いたプリオン様伝播モデルによって調べる。

これらの検討からプリオン様伝播実験モデルにおいてシード依存的なαS凝集を引き起こすαSシードの最小量が明らかとなり、得られた結果は異常型αSシードの不活性化方法の評価と共に、Acta Neuropathilogica Communication誌に発表した。よって本研究の基礎となるαシヌクレイノパチー患者脳由来シード及び合成線維の活性の違いについての知見が得られ、培養細胞及び野生型マウスのプリオン様伝播モデルを用いたαSシード活性の評価系を確立したことから、本研究はおおむね順調に進展していると考えられる。今年度は、αシヌクレイノパチー患者脳由来異常型αS及び野生型、変異型合成αS線維のシード活性についての知見を得た。よって今後は構造的、生化学的に異なる異常αシヌクレインがシード能及び断片化に与える影響について様々な細胞種を用いて検討する。患者脳由来の異常型αS及び野生型、変異型合成線維をシードとして初代培養神経細胞及びグリア細胞内で異常型αSを増幅し、そのシード活性を試験管及び培養細胞を用いたプリオン様伝播モデルを用いて評価する。また神経細胞とグリア細胞において増幅されるシード活性の違いを比較することで、異なる細胞環境が異なる"strain"を生み出す可能性を検討する。さらにMSA及びDLB患者脳に蓄積している異常型αSに対して、トリプシンやプロテイナーゼKなどによるプロテアーゼ処理を行い、プロテアーゼに対する抵抗性及び耐性バンドの差異についての検討を行い、プロテアーゼ処理後の異常型αSのシード活性を培養細胞を用いたプリオン様伝播モデルによって調べる。
未利用資源ユズ種子の香粧品としての機能性解明

ユズは、多くが加工利用されている。果実中に多くの種子を有しており、これらユズ種子は産業廃棄物として廃棄されてきた。我々は、未利用資源であったユズ種子をアロマテラピーや香粧品分野への有効活用を目指して、種子油や種子エキスを調製し、それらの理化学的特徴や皮膚への安全性、およびヒト皮膚の水分保持効果・メラニン生成抑制効果などの機能性を明らかにしてきた。本研究では、ユズ種子の香粧品分野におけるさらなる優位性や付加価値化を明らかにすることを目的とする。具体的には、ユズ種子油および種子エキスの抗菌作用、抗アレルギー、抗シワ作用などの機能性を、微生物や培養細胞などを用いて試験管レベルで評価する。
現実の人の動きを元にした移動履歴解析とその解析に適したプライバシー保護手法

近年のICT技術の発展に応じて,スマートフォンのアプリケーションやIoTデバイスの移動履歴を利用して個人が特定されにくい移動履歴データの生成交通統計データを生成することを検討することが必要である.従来の履歴ごとにエリアを拡大しながら匿名化を行う方法ではなく,四分木を利用してグリッドごとの人口分布のデータを生成したうえで.エリア内の人口が一定以上になるようにエリア範囲を調節することで,人口の多いエリアでは小エリアに分割,人口の少ないエリアでは大エリアに分割することとした.それらの匿名化手法を良し悪しの検討と匿名化結果に関する評価の提案を行う個人情報保護のなかでプライバシー保護は重要であると言われており,利用履歴を匿名化したとしてもその個人特有の利用履歴がある場合には本人の特定がしやすいと一般的に言われている.この本人特定リスクは利用履歴や乗降履歴の長さが長くなるにつれ,高くなるということが知られている.本研究では大規模な移動履歴である「人の流れプロジェクト」の移動履歴から乗降履歴を生成し,実際の利用傾向による履歴の分布について考察を行った上で,履歴長と本人特定性の関係についての検討を行い,移動履歴の80%以上が二点間の往復移動であること,また二点間の移動を除くほぼすべての履歴が一意であることを示す.その上で午前と午後に分けた履歴を生成し,そのような履歴のもとでは一日単位と比較して,一意である利用履歴の数が増加することを示す.また,今後の特性を評価するための,匿名性とは何かについての評価関数についての研究を行った.匿名加工に関する評価関数をつくるために,匿名加工中と加工後の評価の評価関数の考え方について説明し,匿名加工中の枝選択における評価関数設計の考え方を検討した.同時に,匿名加工後の元データとの対照による評価関数の設計についてもあわせて検討した.この中で,クロス集計を前提にした分析軸を設定すると有用性と安全性は極めて相反する課題であることがわかった.実験に必要なデータが,全てそろっているわけではないので,古い実験データで解析を行っている.今月までに取得したデータにて,再度実験予定.位置情報に関するプライバシー保護の研究を継続して行っており,本年度は国際会議へ採択されるなどの成果を出した.詳細は次のとおりである.IoT機器の位置情報の履歴から活用可能な移動履歴データを生成することを目的に,近年のICT技術の発展に応じて,スマートフォンのアプリケーションやIoTデバイスの移動履歴を利用して個人が特定されにくい個人情報保護法への対応を行った.移動履歴データの生成交通統計データを生成することを検討することが必要であることを示してきた.従来の履歴ごとにエリアを拡大しながら匿名化を行う方法ではなく,四分木を利用してグリッドごとの人口分布のデータを生成した.これは,エリア内の人口が一定以上になるようにエリア範囲を調節することで,人口の多いエリアでは小エリアに分割,人口の少ないエリアでは大エリアに分割することでよりアプリケーションで利用し易く,より解析ニーズに近いデータを生成できることを示した.この研究ではそれらの匿名化手法を適用した結果ともとのデータを比較する手法に関して検討を行った上で,匿名化の良し悪しの検討と匿名化結果に関する評価の提案を行った近年のICT技術の発展に応じて,スマートフォンのアプリケーションやIoTデバイスの移動履歴を利用して個人が特定されにくい移動履歴データの生成交通統計データを生成することを検討することが必要である.従来の履歴ごとにエリアを拡大しながら匿名化を行う方法ではなく,四分木を利用してグリッドごとの人口分布のデータを生成したうえで.エリア内の人口が一定以上になるようにエリア範囲を調節することで,人口の多いエリアでは小エリアに分割,人口の少ないエリアでは大エリアに分割することとした.それらの匿名化手法を良し悪しの検討と匿名化結果に関する評価の提案を行う実験に必要なデータとして,当研究室で行っているMITHRAプロジェクトのデータを利用して解析を行う予定.それにより,今回に匿名加工の実験に即した解析を行うことが可能となる.情報セキュリティ研究で利用する実験データの収集に時間がかかったため,研究が遅れた.次年度にその研究を繰り越す予定で,そのための繰り越しである.実験データを受け取り次第,研究を継続し,費用を使用する予定である.
寄生虫より単離した新しい糖鎖構造を持つ糖脂質が寄生現象に果たす役割を解明する研究

我々は、宿主・寄生虫特異関係を決定する因子解明への生化学的アプローチとして、寄生虫の糖脂質に着目し、その組成・構造解析行い、寄生虫の寄生現象と寄生虫糖脂質との関わりについて研究を行った。マンソン裂頭条虫より抽出した糖脂質(SEGLx)が、新しい糖鎖構造をもつ糖脂質であることはすでに報告した(J.Biochem.114,1993)が、本年度はSEGLxの生合成経路を調べる目的で,SEGLx以外の糖脂質の詳細な構造解析を行った。SEGLxの前駆体物質であるCMHの化学構造については構造解析は終了し、CMHはほとんどがGal-CerでわずかにGlc-Cerが含まれていることがわかった(Lipids,in press)。その他の前駆体CDH,CTHについても化学構造の解析は最終段階にきており、CDHはGlc1-3Gal1-Cerと微量のGal1-6Gal1-Cerからなり、CTHはGal1-4Glc1-3Gal1-CerとGlc1-(Gal1-6)3Gal-Cerからなることが推定された。さらに我々は、SEGLxの還元末端のガラクトースの6位にもう1モルのガラクトースが付加した構造をもつと推定される分子種Gal-SEGLx(投稿中)も見い出した。このようにSEGLxおよびGal-SEGLxの生合成経路についてはほぼ解明された。また最近我々は、この条虫が寄生した動物の血液中にSEGLxの抗体が存在すことを発見したことから、これら新しい系列に属する糖脂質は感染機構に密接な関係をもっていると考えられ、糖脂質本来の機能面からもさらに詳細な化学構造および局在部位を調べることは、寄生虫の宿主体内における存在状態と機能を考える上できわめて重要であると考えられた。
悪性黒色腫に対する新規樹状細胞療法の開発

悪性黒色腫に対するPoly(I.C)/カチオニックリボゾーム複合体(PIC-L)を用いた新規免疫療法に開発をマウスB16F10モデルにより検討した。PIC-Lはin vitroでは濃度依存性に増殖の抑制効果を示した。また、in vivoでは生着したB16F10を濃度依存性に増殖を抑制した。この腫瘍増殖抑制効果は既存のCpG-ODNs-やIFN-βより強力であり、抗腫瘍薬としての可能性が示された。そのため、次に病理組織学的に腫瘍の抑制効果を検討したところ、縮小した腫瘍の周辺に超密にリンパ球浸潤を認めた。これら浸潤細胞が腫瘍特異的エフェクター細胞か否かをマウスの所属リンパ節においてのテトラマーアッセイで検討したところ、所属リンパ節の細胞ではPIC-L治療群で有為にTRP-2陽性細胞が増殖していた。さらにこれらのエフェクター細胞が誘導されるメカニズムを抗原提示細胞に注目し検討したところ、PIC-L投与により真皮樹状細胞、表皮ランゲルハンス細胞の活性化が生じることが分かった。ヒトでの臨床応用を考え、ヒト樹状細胞に対するPIC-Lの効果を検討したところ、ヒト樹状細胞においても細胞表面マーカーおよびアロの抗原提示能が増加することが証明された。PIC-Lの抗腫瘍効果は単独投与では短期間のみの維持であったため、in vivoモデルに骨髄由来の樹状細胞(BMDC)を加えたところ、腫瘍は完全に治癒するに至った。この樹状細胞を加えることによる、抗腫瘍効果の増強は全身のIFN-γ産生細胞の増加に伴うものであることをマウスの脾臓細胞のサイトカイン産生能を検討することにより証明した。また、この治療に加えたBMDCの所属リンパ節へのmigrationを検討したところ、PIC-L治療はBMDCの所属リンパ節への遊走能を増加することも証明された。以上の結果よりPIC-Lは単独投与でも抗腫瘍効果を示すが、BMDCと組み合わせることにより、より強力な抗腫瘍免疫を誘導することが証明された。今後、臨床応用を考えるに当たり、BMDCに代わり、より簡便な方法で長期免疫を誘導する方法の開発が必要であると考えられる。悪性黒色種に対するpolyIC/カチオニックリポゾーム(PIC-L)を用いた樹状細胞療法の開発を行った。まず試験管内でそのマウス悪性黒色腫(B16F10)に対する抗腫瘍効果を確認したところ、濃度依存性に腫瘍増殖抑制効果を認めた。そのため、マウス生体内での抗腫瘍効果を5mm大に成立したB16F10モデルを用いて検討したところ、PIC-L群では濃度依存性にB16F10の抑制効果を認め、空のリポゾームや溶解液単独群では腫瘍の抑制効果は認めなかった。次に他剤との比較を行ったところ、既存のインターフェロンやCpGに比較してより強力な抗腫瘍効果を認めた。次に、PIC-Lの抗腫瘍効果のメカニズムより詳細に検討した。腫瘍部での病理組織では、PIC-Lの濃度依存性に腫瘍の破壊とリンパ球の浸潤を著明に認めた。また、PIC-Lの生体内での抗原提示細胞に対する影響を調べたところ、表皮ランゲルハンス細胞、真皮樹状細胞で細胞表面のCD86の発現の上昇を認めた。また、治療後のマウスの所属リンパ節においてB16F10特異的エフェクターT細胞の誘導が生じたかをTRP2テトラマーを用いて検討したところPIC-L濃度依存性にTRP2+CD8+の誘導が認められた。次にヒトでの使用目的のため、PIC-Lがヒトの樹状細胞に対する影響をヒト単球由来樹状細胞で検討したところ、PIC-LではCD80、CD83、CD86の細胞表面での発現が有意に上昇していた。さらによりPIC-Lの抗腫瘍効果を高めるため、治療モデルに骨髄由来樹状細胞を加えたところ、腫瘍は完全に拒絶された。今後、ヒトメラノーマでの治療に使用するため、ヒトにおけるより詳細な抗腫瘍免疫誘導能を検討する予定である。

この樹状細胞を加えることによる、抗腫瘍効果の増強は全身のIFN-γ産生細胞の増加に伴うものであることをマウスの脾臓細胞のサイトカイン産生能を検討することにより証明した。また、この治療に加えたBMDCの所属リンパ節へのmigrationを検討したところ、PIC-L治療はBMDCの所属リンパ節への遊走能を増加することも証明された。以上の結果よりPIC-Lは単独投与でも抗腫瘍効果を示すが、BMDCと組み合わせることにより、より強力な抗腫瘍免疫を誘導することが証明された。今後、臨床応用を考えるに当たり、BMDCに代わり、より簡便な方法で長期免疫を誘導する方法の開発が必要であると考えられる。
核構造の安定化に機能を持つリボソーム生合成調節因子に関する研究

出芽酵母のリボソーム生合成調節因子Ebp2およびRrs1について機能解析を行い、以下の成果を得た。1.膜輸送経路遮断時におけるシグナル伝達に欠陥を持つrrs1-1の低温感受性を抑圧する変異としてkcs1を見出した。kcs1の変異点を同定し、イノシトール6リン酸キナーゼ領域が欠失する変異であることを明らかにした。kcs1変異およびkcs1破壊が共にrrs1-1における60Sリボソームサブユニットアセンブリの欠陥を抑圧することを示し、イノシトールポリリン酸代謝機構とリボソーム生合成にクロストークが存在することを示唆した。2.これまでにリボソーム生合成調節因子Ebp2およびRrs1が、真核生物において広く保存されたSUNドメイン蛋白質Mps3との結合を介して核膜に局在することを明らかにしている。Mps3は核内における染色体配置に機能を持つことから、本機構におけるEbp2およびRrs1の関与を調べた。テロメアマーカータンパク質であるRap1と蛍光タンパク質CFPを融合したタンパク質を発現する株を用いた蛍光顕微鏡観察により、Ebp2およびRrs1がテロメアのクラスター形成に関与していることを明らかにした。近年、核膜が転写や修復、さらには老化など、核内における多様な機構に関与していることが報告されている。核膜を足場とした機構とリボソーム生合成との関連についてはこれまでに報告がなく、Ebp2およびRrs1がこれら機構間の連携を解き明かす鍵となることが期待される。核膜に局在する酵母のリボソーム生合成調節因子Ebp2p,Rrs1pについて機能解析を行い、以下の成果を得た。1.Ebp2pと相互作用するRrp14pが60Sリボソームサブユニットの生合成に機能を持つことを示した。また、rrp14破壊によりアクチン極性に重大な欠陥が生じることから、Rrp14pが細胞極性に重要な役割を果たすことを見出した。これらの結果はリボソーム生合成と細胞分裂の連携解明に向けた重要な発見である。2.出芽酵母には、細胞膜合成経路の遮断によりリボソーム構成成分の転写抑制が引き起こされるシグナル伝達経路が存在する。ebp2変異株を用い、ノザン解析および[3H]メチオニン・パルスチェイス実験により、Ebp2pが本シグナル伝達に必須の機能を持つことを明らかにした。また、細胞膜合成経路を遮断した時、核小体の凝縮が引き起こされることを示し、栄養状態によりリボソーム生合成を調節しているTOR経路における転写抑制機構との類似性を示した。3.in vitro pull downassayによりEbp2pおよびRrs1pが、真核生物において広く保存されたSUNドメイン蛋白質Mps3pと相互作用することを明らかにした。Mps3pは膜貫通ドメインを介して核の内膜に埋め込まれ、そのN末端側の領域を核質側に露出した配向をとる。N末端領域が欠失したMps3pを発現する変異株において、Ebp2pの核膜への局在が不安定となり、核形態の異常が検出された。この結果はEbp2pがMps3pのN末端領域との結合を介して核膜に局在し、核の形態維持において重要な役割を果たすことを示している。核膜は転写や修復、さらには老化など、核内における多様な機構に関与しているが、これらとリボソーム生合成との関連についてはこれまでに報告がなく、Ebp2pおよびRrs1pがこれら機構間の連携を解き明かす鍵となることが期待される。
家族性IgA腎症の疾患遺伝子マッピング

目的IgA腎症は、慢性腎不全・透析導入の2大原因疾患の一つで、遺伝素因が発症に関与する多因子疾患である。その病因は不明であり、解明が待たれているが本研究では遺伝学的アプローチにより疾患感受性遺伝子の同定を目指す。方法本研究は、比較的大きいメンデル遺伝IgA腎症家系に対し、パラメトリック連鎖解析とハプロタイプ解析を行い、疾患遺伝子のマッピングを試みる。ゲノム解析の手法は申請者らが家族性巣状糸球体硬化症で用いた方法(MLINK programを用いた2点連鎖解析)を採用する。結果(1)常染色体優性遺伝のIgA腎症家系4家系について家系図の構築を行った。家系図をさらに水平・垂直方向へ拡大すべく調査を進めている。(2)そのうち一家系IgAN-MHの患者6名、健常7名の計13名について候補遺伝子座6q22 (IGAN1)の連鎖解析を行った。候補領域20cMにマイクロサテライトマーカーを配置して、ゲノタイピングを行い、常染色体優性遺伝・不完全浸透率(75-85%)のモデル下での連鎖の有無を検討した。領域内の4マーカーの2点及び多点LOD scoreはいずれも-2.0以下で、かつハプロタイプ解析でも疾患アレルと臨床症状はcosegregateせず、IGAN1の関与を否定した(論文準備中)。(3)次に準備を進めている家系IgAN-TT (患者8名、不明3名、健常人7名)のタイピング前の検出力評価を行った。SLINKプログラムで1000個のランダマイズされた遺伝子型を作成し、家系から得られるLOD score値を検討した。最大予測LOD score=3.2で、LOD score>1.5レベルのスコア検出力は70%以上であった(empirical P<0.05)。考察シミュレーションが終了し、候補領域への連鎖が否定された家系より、ゲノムワイドでの疾患遺伝子探査を行う予定である。
博物学とイギリス・ロマン主義文化

18・19世紀に確立した博物学および近代生物学や生理学等から生まれた多様な言説を、広い意味での表象という視点から、18世紀前半から19世紀半ばにかけてのイギリス・ロマン主義時代の文化(文学、哲学、政治、宗教、視覚芸術等)の中に探った。このような観点から、第一次資料の詳細な分析をもとに領域横断的な考察を行うことにより、断片的で細分化されたものとしてとらえられがちな当時の文化の諸相を新たな視点で読み解くと共に、それらの諸相が、緊密な相互依存の編み目を形成している様子を明らかにした。(理由)「おおむね」としたのは、論文が活字になるまでに多少時間がかかったため。「おおむね」としたのは論文が活字になるまで多少時間を要したため。昨年度に引き続き本年度も博物学および近代生物学や生理学等から生まれた多様な言説を、18世紀前半から19世紀半ばにかけてのイギリス・ロマン主義時代の文学・文化の中に探った。「おおむね」としたのは、研究開始当初は、文献収集に多少手間取ったため、成果を出すのに少し遅れをとったためである。平成26年度・27年度の作業を引き続き精力的に行う。これと並行して、イギリス・ロマン平成26年度から平成28年度までの研究作業全体を再考し、必要な作業を繰り返し欠けているところを補い考察の足りない箇所をさらに詰める。イギリス文学・文化研究は順調に進んだがわずかの未使用額が残った。研究は順調に進んだがわずかの未使用額が残った。研究は順当に進んだが、わずかの未使用額が残った。次年度の科研費を加えてパソコン関連のソフト代購入費に充てる予定である。次年度の科研費を加えてパソコン関連のソフト購入代に充てる予定である。
硬組織時刻描記法のEDDPO法とテトラサイクリン法の比較検討実験

両時刻描記剤のRIラベル化合物^<14>C-EDDPOと^3H-Tc.をSD系雄性ラットの背部皮下に投与し、経時的に屠殺して血清半減期と、腎、脾、肝、顎下腺、心筋、骨の臓器内残存量を投与直後から24時間まで比較検討した。その結果、血清半減期はEDDPOが29分30秒、Tc.が1時間57分であり、EDDPOの方が約4倍早く血中から消失することが判明し、硬組織時刻描記剤に求められる繊細な時刻描記線の描記にEDDPOは優れていることが明らかになった。また、臓器残存量についてはEDDPOはTc.とともに、骨以外の臓器では投与直後をピークとして漸次減少する経過をたどったが、他臓器に比較して腎で若干高い残存量を示した。次に、EDDPOの血清半減期が短いことから、2本の時刻描記線として分離識別できる最短時間間隔を確認する実験を行った。EDDPOを1,2,3,6,9,12時間間隔をおいて投与し、下顎切歯象牙質の脱灰パラフィン切片で観察したところ、16mg/kgのEDDPOを背部皮下注射した場合、3時間の投与間隔で2本の時刻描記線が確認できた。識別できる時間間隔はTc.では4時間、酢酸鉛で3時間と報告されているのでこれらと比較して遜色のないものといえる。以上の結果から、EDDPOは従来から用いられてきた硬組織時刻描記剤と比較して血中半減期は十分に短く、臓器残留性も少ないことが認められたので、生体に対して為害作用の少ない優れた時刻描記剤であることが確認された。なお、本研究の一部は第36回歯科基礎医学会総会(平成5年10月)で発表した。
肺癌手術症例における hybrid E/Mの臨床病理学的探索

本研究の方法は、1まず過去の肺癌切除症例の腫瘍の病理組織を用いてhybrid E/Mと予後との関連を検討し、1で予後との相関関係が認められれば、引き続いて、2臨床的に前向き介入試験を行うこととしている。現時点では1の研究段階である。切除病理組織標本を用い、まず少数のサンプルで網羅的に病理組織の染色を行い、探索因子であるhybrid E/Mをより反映する試薬を選定した。平成30年度はhybrid E/Mを反映する試薬の同定に研究時間を要した。今後、同定した試薬を用いて、サンプルサイズを増加し、過去の肺癌切除症例の腫瘍の病理組織を用いてhybrid E/Mと予後との関連を検討検討を行なう方針である。並行して、肺癌手術症例の予後因子の検討をhybrid E/Mの他にも、多角的に行い、今後の多変量解析ためのデータ集積および解析を行い、その成果の研究発表を行った。探索する因子であるhybrid E/Mをより反映する試薬の同定に平成30年度は研究時間を要した。共同研究者の病理医との協力を得ることや共通の認識を構築することに、予定より時間を要した。しかし、臨床医と病理医という異なる視点から、再度、試薬の探査を行ったことで、より質の高い研究が今後可能となるのではないかと考えている。今後、検討の症例数を増やし、結果の解析を行い、過去の肺癌切除症例の腫瘍の病理組織を用いてhybrid E/Mと予後との関連を検討していく。さらに、最終目的である、研究の第2段階として、臨床的に前向き介入試験研究に進んでいきたいと考える。研究に必要な試薬の購入が予想より高値であった。
トライボロジーにおける動的埋もれた界面のオペランド観察および解析に関する研究

本研究では、最も複雑な界面現象であるトライボロジーにおける摩擦、摩耗、潤滑現象が係わる動的埋もれた界面を、機械物性と化学構造の同時測定手法を開発することによりそのメカニズムを明らかにすることを目的とする。平成30年度では、石英基板またはサファイヤ基板にAgナノ粒子を埋め込んで耐摩耗性を向上させた透過型プラズモンセンサを試作し、ダイヤモンドライクカーボン(DLC)膜や潤滑膜との摺動試験を行い、通常のラマン散乱分光法に比べ370万倍の超高感度で膜および摺動界面の化学構造変化を100ミリ秒の時間分解で同時測定することに成功した。また、照明光をフィルターでアンチストークス領域の単色光にし、高速・高感度のEMCCDカメラで摺動中のセンサの干渉像を観測しながら、励起光照射部の増強ラマン散乱スペクトルを同時観察することに成功した。これにより、センサスライダーの姿勢(跳躍、並進、回転など)とスペクトルの関係がよく分かるようになった。また励起光をスペクトル上で表せるノッチフィルター機構を試作し、観測点での干渉によるすき間量を同時測定できるようにし、照明光の干渉像と合わせて、精密なスペクトル解析が可能となった。上記の測定システムを用いて、Feなどの金属膜上の潤滑膜の化学構造変化と摩擦力の変化を調べ、トライボ化学反応により摩擦力が下がることを実時間で観察した。このとき、未知のトライボ反応を示唆するいくつかのスペクトルピークの出現を測定した。この新しいメカニズムは、今後詳細に解析する予定である。研究は、当初の予定通りに進んでいる。初年度の第一段階で開発した計測装置も従来にない機能と高速・高感度なトライボロジー測定が可能となっている。すでにこれらを用いて摺動時の新しい現象が次々と見つかっており、今後の解析が期待される。今後は当初の計画に沿って、独自の光学デバイスを用いた超高感度表面増強ラマン分光法とマルチビームラマン分光法、および他の分光法との複合機能を有する計測装置を開発し、それらを用いてナノからマイクロメートルにわたる動的界面の測定・解析を行う。具体的には、摩擦力や荷重の変動と分子構造や結晶構造の変化、温度および界面の幾何学形状を同時に観察する。さらに干渉光や偏光、表面弾性波との測定により界面形状、膜厚、密度、分子配向、粘弾性などの物理的変化も同時に測定する。さらにAEと併用し、ミリ秒レベルの高速測定から摩耗を含む過渡現象を捉える手法を開発する。本手法を、鋼材、ゴム、DLC(ダイヤモンド状炭素)膜、各種潤滑油・極圧添加剤など工業的に重要な材料系の摺動解析に応用する。
低ホスファターゼ症における組織非特異型アルカリホスファターゼの細胞生物学的解析

申請者は、これまでに骨格形成不全、病的骨折、乳歯や永久歯の早期脱落を特徴とする低アルカリホスファターゼ症の細胞分子生物学的メカニズム解明のため、従来報告されていた本酵素の遺伝子の突然変異に着目し、この変異が酵素活性の消失と細胞内輸送の異常をもたらすことにより、低アルカリホスファターゼ症が生じることを明らかにしてきた。次の段階として、最近新たに見い出された組織非特異型アルカリホスファターゼの別の変異について、それを引き起こすメカニズムの解明を目的とし実験を行った。今回、低アルカリホスファターゼ症で報告された組織非特異型アルカリホスファターゼの複合ヘテロ接合体(F310L,V365I)症例について解析を行った。野生型および変異型組織非特異型アルカリホスファターゼ遺伝子をCOS細胞に導入し、各々の細胞内局在について共焦点レーザー顕微鏡を用いて解析を行ったところ、いずれも細胞膜表面に発現していることが判った。さらに、P-nitrophenyl phosphateを基質としたassayによりアルカリホスファターゼ活性について検討したところ、野生型の酵素活性を100%とすると、F310Lは67%、V365Iは31%であった。アゾ色素法にて、形態的およびSDS-PAGEにて解析した結果、P-nitrophenyl phosphateを基質としたassayの結果に一致していた。以上の結果から、複合ヘテロ接合体(F310L,V365I)症例は、細胞内輸送に異常をきたさず、酵素活性が低下することにより、臨床的に重篤な低アルカリホスファターゼ症を引き起こすことが判明した。低ホスファターゼ症の患者では、ヒトでは4種類存在するアルカリホスファターゼのアイソフォームのうち、特に組織非特異型アルカリホスファターゼに点突然変異が生じていることが報告されている。申請者はこれまで重症の低ホスファターゼ症患者で報告された変異型酵素に注目し、その解析を進めてきた。細胞が野生型の酵素と変異型の異常酵素を見分ける過程ではタンパク質のフォールディングや会合に預かる分子シャペロンが関与することが報告されている。そこで、Bip/GRP78、カルネキシン、カルレテキュリンなどの分子シャペロンとの結合を野生型酵素と変異型酵素で比較検討を行った。今回、一過性の発現系を用いて、放射性のアミノ酸の存在下で細胞を培養し、標識された細胞を可溶化した後、分子シャペロンに対する特異的な抗体を用いて免疫沈降を行い、SDS-PAGE/Fluorographyで共沈してくるタンパク質の同定を行った.その結果、Bip/GRP78は野生型酵素と変異型酵素の両方に結合することが判明した。当初の予想では、分子シャペロンは野生型酵素とは一時的に結合してから解離するが、変異型酵素に対しては異常タンパク質と認識することから解離せずに結合したままでいることが推測されていた。しかし、今回の一過性の発現系では特定のタンパク質が大量に合成される結果、しばしば分子シャペロン自体の誘導が引き起こされ、野生型酵素と変異型酵素で共に同程度のBip/GRP78との結合が観察された。他の分子シャペロン(カルネキシン、カルレテキュリン)との関与は野生型酵素、変異型酵素ともに検出されなかった。現在、野生型酵素と変異型酵素をそれぞれstableに発現する系を樹立している段階である。今後さらに解析を進めて、細胞側の変異タンパク資に対する品質管理機構について詳しく解析しようと思う。
椎間板変性過程におけるマクロファージの動態と極性化の解明

ラット椎間板変性モデルにおいて、M1マクロファージは穿刺後1週から2週にかけて多く発現し、M2マクロファージは2週で最も多く、4週から減少し8週では消失した線維輪外層にわずかに存在していた。GFP陽性骨髄細胞移植キメララットにおいて、穿刺後1週目以降に観察されたマクロファージは骨髄由来で、極性変化後のM2マクロファージも骨髄由来の細胞であった。ヒト頚椎椎間板の観察において、血管新生が旺盛な肉芽組織ではM1マクロファージの割合が高く、神経成長因子とそのレセプターを有する神経線維が観察されたが、M2マクロファージの割合が高い肉芽組織では、血管、神経線維共に少ない傾向にあった。ラット椎間板変性モデルにおける、椎間板組織内への血管侵入、マクロファージの浸潤について調べ、M1/M2マクロファージの極性変化を調査し、極性変化が椎間板変性及び椎間板性疼痛に及ぼす影響を明らかにすることを目的としている。現在、ラット椎間板変性モデルの作成を行っているが、モデル作成に時間を要したが、およそ6週で椎間板内への血管侵入が起こり、その後マクロファージの浸潤が起こることを確認した。ラット椎間板変性モデルの作成に時間を要したために予定より遅くなった。現在は、キメララットの作成を開始している。ラット椎間板変性モデルにおけるマクロファージの浸潤を組織学的、免疫組織化学的に調査した。ラット尾椎椎間板に針を刺し、針刺し後1日、3日、1週、2週、4週、6週、8週の変化を観察すると、針刺し後1日から1週までは、椎間板周囲にM2マクロファージが観察されたが、2週目以降に椎間板内に血管新生を認めM1マクロファージが浸潤し、6週以降はM1マクロファージが減少しM2マクロファージが増加していた。ラット尾髄DRGにおける疼痛関連タンパクは、2週から4週がピークであり、M1マクロファージの浸潤との関連が示唆された。ヒト頚椎椎間板semi-en bloc標本における、血管新生、マクロファージの浸潤、神経伸長について観察を行った。脱出型のヘルニア椎間板組織では、非脱出型のヘルニア椎間板、頚椎症椎間板に比べ、血管新生とその周囲のマクロファージの浸潤および神経伸長が著明に観察された。マクロファージの極性は、40%の椎間板組織でM1マクロファージのみが観察されたが、60%の椎間板組織ではM1, M2マクロファージが混在していた。M1マクロファージは脱出した髄核周囲に観察されたが、M2マクロファージは肉芽組織の周囲に観察された。ラット尾椎椎間板変性モデルにおけるマクロファージの極性に関する研究で、現在DNAマイクロアレイの解析を行っている。また、GFP陽性骨髄細胞移植キメララットの作成に成功している。ラット尾椎椎間板に針を刺し、針刺し後1日、3日、1週、2週、4週、6週、8週の変化を観察すると、針刺し後1週から2週までに椎間板周囲への血管進入とM1マクロファージの浸潤がみられ、2週目以降は椎間板内に血管新生を認め、M1マクロファージは減少し、M2マクロファージが増加していた。GFP陽性骨髄細胞移植キメララットにおける同様の実験で、これらマクロファージは骨髄由来であることが確認された。ラット尾髄DRGにおける疼痛関連タンパクは、1週から2週がピークであり、M1マクロファージの浸潤との関連が示唆された。DNAマイクロアレイ法によるクラスター解析で、穿刺後2週の椎間板ではTNF-α、IL-1の遺伝子発現が上昇し、pathway解析でもそれらに関連する遺伝子発現が上昇していた。マクロファージの極性は、M1, M2マクロファージが混在して存在していた。M1マクロファージとM2マクロファージの比(M1/M2)が大きい肉芽組織において、神経線維が多く観察された。変性椎間板におけるマクロファージは、血管新生に伴い骨髄由来のマクロファージが浸潤し、変性椎間板の吸収のみならず、その極性変化により疼痛発現に関与し、M1/M2比が大きい肉芽組織での神経伸長が観察されたことから、神経伸長に影響を及ぼしている可能性があることが示唆された。

平成27年度に行う予定であった、MRI画像評価、DNAマイクロアレイ法による発現遺伝子の網羅的解析、Western blotting、免疫組織化学染色を行うと同時に、キメララットによるマクロファージフェノタイプの解析を進めていく予定である。キメララット椎間板変性モデルにおいて、マクロファージの起源と極性変化を観察し、マクロファージの極性変化に関するタンパクの検出を中心に確認を行っていく計画である。椎間板病理補助事業の誠実な執行に努めた結果、当初計画より経費の使用が節約できたことにより未使用額が生じた。補助事業の誠実な執行に努めた結果、当初計画より経費の使用が節約できたことにより未使用額が生じた。当該未使用額を次年度に持ち越して追加の試薬・抗体・消耗品等購入する。
食育に還元可能な野菜のおいしさ評価の再検討と成分含有量・テクスチャーとの関連

野菜の持つ滋味深い味を理解することは和食の維持継承に必須である。本研究では、エダマメとキャベツを用い、大学生をパネルとして官能評価方法の検討ならびに官能評価方法とテクスチャー特性の関連を検討した。エダマメからは官能評価方法としてVAS法と評点法が適していること、また、ショ糖含有量によっては甘いと感じるが、ショ糖含有量が甘味の感覚強度に影響しない場合もあることが明らかになった。キャベツからは70°C蒸しでキャベツの硬化が起こること、その硬化は大学生が感じるかたさの感覚強度に影響を及ぼさなかったことを明らかにした。100°Cで蒸したキャベツの甘味は感じられる傾向であったが有意な相違はみられなかった。本年度は寒玉キャベツに着目し、キャベツのテクスチャーと蒸し加熱による影響を検討した。キャベツを外葉・中葉・内葉に分け、さらに葉脈の有無で分類して破断強度を検討した。測定は10mm×50mmのキャベツを5枚重ね、クリープメータ(山電、RE-3305B)に金属板プランジャを用いて行った。その結果、葉脈がない場合は部位による破断強度解析曲線に大きな違いがみられなかったが、葉脈があると外葉>中葉>内葉の順に破断荷重が小さい傾向がみられた。また、70°C加熱することでキャベツの硬化(Firmness)が起こり、40分加熱しても破断荷重が維持された。キャベツの硬化と官能評価の関連を明らかにするために各部位の葉脈のある部分を用い、100°C5分加熱、70°C20分加熱、電子レンジ加熱30秒、生キャベツの4試料を調製して女子大学生10名にて官能評価を実施した。部位により好ましい調理法は異なり、外葉では100°C5分加熱が最も好まれた。外葉における100°C5分加熱は5段階評価で平均4.7の甘さであったことから、甘さが好ましさに影響しているのではないかと考察した。70°Cで20分加熱したキャベツのかたさを目的変数、破断強度解析項目を説明変数とした重回帰分析を行ったところ、かたさは破断時厚さ、破断歪率、変化率(0から-1、-1から-2)の4項目が影響していた(R2=0.889、p<0.05)。内葉の生キャベツにおけるかたさは破断応力、弾性率、破断歪率、変化率(0から-1、-2から-3)の項目が影響していた(R2 =0.776、p=0.056)ことから、人の感じるかたさは部位によって影響する物性項目が異なるものの、物性項目からの予測が可能ではないかと推察された。本年度は食品物性測定装置(クリープメータ、山電RE-3305B)を新規導入し、食品のテクスチャー測定に関するプロトコルの確立と、野菜のテクスチャー測定、モデルゲルの調製、ならびにモデル咀嚼によるフレーバーリリースについて、ゲルの調製と実験方法を検討した。1:野菜のテクスチャー測定果菜、根菜、葉菜など、野菜として食べる部位はまちまちであるから、野菜のテクスチャーも実際には野菜によって、また、同じ野菜でも調理によってテクスチャーは異なる。そこで、野菜のテクスチャーを整理する目的で加熱して摂取する野菜に着目し、代表的な加熱野菜20種(グリーンアスパラガス、かぼちゃ、にがうり、ごぼう、さつまいも、さといも、じゃがいも、ズッキーニ、だいこん、とうがん、にんじん、にんにく、らっかせい、れんこん、えだまめ、かぶ、くわい、きゅうり、なす、ながいも:表記は「食品成分表2011」に準拠)を選出した。各野菜試料の10mm立方体を調製し、試料重量の2ー5倍の純水で調理した後、試料のテクスチャーをクリープメータで測定した。得られた特性値と水分含有量を多変量解析にて解析した。その結果、今回用いた野菜のテクスチャーは3種類に分類できた。2:モデルゲルの調製と咀嚼によるフレーバーリリースの検討加工食品などの濃い味に慣れていると、野菜に含まれる微量の糖類に対する嗜好性は低い可能性も考えられた。そこで、野菜に含まれる微量の糖類に対する嗜好性を検討するため、10%コーンスターチゲルにショ糖を10%添加し、咀嚼をプランジャの上下運動に置き換えて、水中のゲルに対するプランジャの上下運動によるショ糖の溶出量を高速液体クロマトグラフィーにより定量した。コーンスターチゲルの大きさは20mmの立方体で、キューブアイス調製ラックを活用した。その結果、咀嚼回数10回で添加ショ糖量の1015%が水に溶出することがわかった。野菜の摂取量不足は慢性化している。野菜には味がないという大学生がいることは、この摂取量不足に寄与していると考えられる。

これは濃い味やはっきりした味に慣れているので野菜類が持つ滋味深い味を理解しにくくなっているのであるから、味わうことに関する教育を官能評価などから体系化できないかと考えるに至った。野菜類のおいしさを理解することは野菜の摂取量の不足に貢献するだけでなく、世界無形文化遺産である和食の継承にもつながるものである。そこで食育でも使えるような野菜類のおいしさ評価の体系化について検討した。野菜類としてエダマメとキャベツを取り上げ、ショ糖含有量と甘味の感覚強度の関連、甘味とクリープメータによるテクスチャー測定、嗜好特性について検討した。その結果、ショ糖含有量が600mg/100gのエダマメは大学生に大変甘いと評価できるものであること、エダマメのテクスチャーと嗜好特性の検討からは、大学生にとっては、エダマメのテクスチャーとしてポリポリ・歯切れが良い・コリコリした感じが好まれていることが分かった。甘いエダマメは黒大豆未熟豆を柔らかくなるまでゆでたものであることから、甘味はエダマメの嗜好に影響を及ぼさない可能性も考えられた。また、キャベツでは最も甘いと感じられた調理法のキャベツ(100°Cで5分蒸したもの)が好まれたが、キャベツの甘味は有意ではなかったことから、キャベツからも甘味だけが嗜好に影響しているのではないことを明らかにした。官能評価の評価方法はVAS法や評点法が適切であると考えられたが、大学生21名を対象とする2%・3%・5%ショ糖溶液の識別試験では5名が正確な順位をつけることができなかった。ゆえに野菜類のおいしさにかかわる官能評価の実施には、野菜試料とともに基準溶液を提供することでより野菜の甘味やおいしさを考えやすくできると考えられた。食物学キャベツは農研機構内でも研究されている野菜である。今回、キャベツを用いることで、「かたさ」というヒトの主観的な感覚を破断強度解析項目で予測可能であることが判明した点は順調に進展していると考えるが、用いる手法の再検討や再現性の確認ができていないこと、パネルが少ないこと、また成分含有量に関しては着手できなかったことが完全ではないと判断するので達成度区分を(2)にした。もう一つ、昨年度からモデルゲルによるショ糖リリース、テクスチャーと官能評価の関連についての研究は、消費者パネルの場合、甘さの尺度が個人によってかなりばらつき、パネルによっては5%ショ糖溶液でも甘くないと感じることが分かった。この状況で、同じ品質のゲルを官能評価する場合、個人差の補正は必要不可欠である。しかも、消費者パネルは分析型パネルではないため、官能評価に対する訓練もできない。それをうまくカバーしながら、個人差の補正を行うのが難しく、持越し課題となった。なお、5段階評点法よりはVAS法による評価がばらける点で評価しやすいことは突き止めた。クリープメータは新規導入であり、微量な糖含有量の定量のために合わせて高速液体クロマトグラフィー用示差屈折検出器を導入したが、これは12月中旬であった。本研究室では糖分析に関するプロトコルがなく、糖分析に関してはプロトコルを確立した。さらに、テクスチャーの測定プロトコルを確立して野菜のテクスチャーを測定し、また、モデルゲルの調製とフレーバーリリースを含めた咀嚼モデル実験プロトコルを作成したことから、少なくとも実験プロトコルを確立し、それなりにデータがとれるようになった点で、遅れている状況ではないと考える。1)キャベツのテクスチャーと官能評価の関連について本年度は昨年度のキャベツデータに関して得られた結果の再現性を確認する。
植物の細胞分裂を制御する分子機構の解析

キネシン様タンパク質、NACK1とMAPKカスケードから成るNACK-PQR経路は、植物の細胞質分裂を制御する中心の制御系である。NACK-PQR経路は、NACK1とMAPKカスケードの最初の酵素であるNPK1MAPKKKが直接結合することにより活性化される。この活性化は細胞質分裂時に特異的であるが、NACK-PQR経路を構成する全てのタンパク質は中期以前にも存在しているので、この特異的な活性化を制御するメカニズムの存在が予想されていた。本研究では、この経路の活性化にサイクリン依存性キナーゼ(CDK)が関わっていることが明らかとなった。生体内で、NPK1とNACK1はCDK活性に依存してリン酸化されており、このリン酸化は両タンパク質の結合を阻害することが分かった。細胞質分裂異常を示すAtNACK1/HINKEL(NACK1のシロイヌナズナホモログ)の変異体において、野生型AtNACK1はatnack1変異体の表現型を相補したが、CDKリン酸化サイトにリン酸化ミミック変異を持つAtNACK1はこれを相補することが出来なかった。これらの結果はCDKが、適切な時期までNACK-PQR経路の活性化を抑制する因子として機能していることを示唆している。また、CDKによるNACK-PQR経路の抑制を解除する因子を明らかにするために酵母の系を用いて解析を進め、NACK1のCDKリン酸化サイトに特異的に結合するフォスファターゼを見つけた。生化学的な解析を進め、このフォスファターゼが、CDKリン酸化NACK1に対して脱リン酸化活性を有していることが分かった。さらに、このフォスファターゼは、NPK1のCDKリン酸化サイトにも結合することが明らかとなり、この分子がNACK-PQR経路の活性化に関与している可能性が示唆された。本研究では、植物に特異的な細胞分裂制御因子であるMAPキナーゼカスケードを基軸として、植物の細胞分裂の制御に関わる新奇因子の同定を試みる。細胞分裂の最終過程である細胞質分裂の進行には、植物ではキネシン様タンパク質(NACK1)とMAPキナーゼカスケードからなるNACK-PQR経路が必要である。この経路はNACK1がNPK1 MAPKKKと直接結合することにより活性化する。最近この経路の活性化にサイクリン依存性キナーゼ(CDK)が関わっていることが分かってきたので、本年度は、その生体内での分子機構に焦点をあて研究を行った。NACK1とNPK1のin vitroでの結合は、CDKによるリン酸化により阻害される。今回、タグを融合したNACK1とNPK1を発現させたBY-2細胞を作製し、タグ抗体による免疫沈降実験を行ったところ、CDKリン酸化NPK1とNACK1は生体内で結合していないことが分かった。両タンパク質がリン酸化されている時期はNPK1が活性化していない時期と一致していた。つまり、CDKはM期の前半では、リン酸化を介してNACK1とNPK1の結合を阻害することにより、この経路の活性化を抑制し、細胞質分裂の開始時期を調節していることが分かった。また、新奇因子の同定のために、シロイヌナズナ培養細胞と質量分析解析を用いたスクリーニングを進めている。これまでの研究から、この経路は、植物の細胞質分裂装置であるフラグモプラスト微小管構造体の動態を制御していると考えている。以前、タバコ培養細胞から精製した微小管結合タンパク質を用いて本経路のMAPキナーゼの基質を探索したところ、複数の候補が得られたにも関わらずタバコのデータベースが整備されていないことから、1分子の同定しかできなかった。今回、シロイヌナズナを用いて同様の実験を行い、複数の候補を得たので、順次解析予定である。

本研究では、植物に特異的な細胞分裂制御因子であるMAPキナーゼカスケードを基軸として、植物の細胞分裂の制御に関わる新奇因子の同定を試みる。キネシン様タンパク質、NACK1とMAPKカスケードから成るNACK-PQR経路は、植物の細胞質分裂を制御する中心の制御系である。NACK-PQR経路は、NACK1とMAPKカスケードの最初の酵素であるNPK1 MAPKKKが直接結合することにより活性化される。この活性化は細胞質分裂時に特異的であるが、NACK-PQR経路を構成する全てのタンパク質は中期以前にも存在しているので、この特異的な活性化を制御するメカニズムの存在が予想されていた。我々は、この制御にサイクリン依存性キナーゼ(CDK)が関与している可能性を見いだした。生体内で、NPK1とNACK1はCDK活性に依存してリン酸化されており、このリン酸化は両タンパク質の結合を阻害した。細胞質分裂異常を示すAtNACK1/HINKEL(NACK1のシロイヌナズナホモログ)の変異体において、野生型AtNACK1はatnack1変異体の表現型を相補したが、CDKリン酸化サイトにリン酸化ミミック変異を持つAtNACK1はこれを相補することが出来なかった。これらの結果はCDKが、適切な時期までNACK-PQR経路の活性化を抑制する因子として機能していることを示唆している。また、CDKによるNACK-PQR経路の抑制を解除する因子を明らかにするために酵母の系を用いて解析を進め、NACK1のCDKリン酸化サイトに特異的に結合するフォスファターゼを見つけた。生化学的な解析を進め、このフォスファターゼが、CDKリン酸化NACK1に対して脱リン酸化活性を有していることが分かった。さらに、このフォスファターゼは、NPK1のCDKリン酸化サイトにも結合することが明らかとなり、この分子がNACK-PQR経路の活性化に関与している可能性が強く示唆された。今後、さらに分子機能を解析し、この可能性を検証していく予定である。