hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
新提案：午後に衰退する光合成・転流の潜在力を引き出す為の履歴積み上げ型環境調節

代表者らは,施設内作物生産の律速要因である午後に衰退する光合成・転流に関して,それらの潜在力は午後にも低下せずに最適化の余地があることを見出した.そこで,午後の光合成・転流の潜在力を引き出すために,午前中の作物の水分生理に着目した「履歴積み上げ型環境調節」を新たに提案し,効果を調べた.その結果,午前中から高湿度環境を創出することで,午後になっても気孔開度と光合成を午前と同程度に維持することが出来た.さらに,転流の駆動力となる葉の水ポテンシャルも,午後でも低下せずに高く維持することが出来た.すなわち,履歴的な水分生理の調節によって,午後の光合成と転流を改善し得る事が示された.究初年度では,午前の高湿度環境の創出が午前と午後の作物の水関係に及ぼす影響とそのメカニズムの解明を目的とした課題群に取り組んだ.先ず,温室に導入した細霧冷房装置を午前中(912時)に稼働させることで,葉(材料植物はキュウリ)と空気中との湿度差(葉面飽差)を減少させた.その際に,代表者らが開発した根の養水分吸収速度評価システムを用いて植物の蒸散速度(=吸水速度)の日変化を調べた結果,当該時間帯の蒸散速度を約3割抑制出来たことが示された.しかしながら,高湿度環境の創出処理を終えた午後の蒸散速度には抑制効果を見出すことは出来なかった.次に,植物の水分状態の指標として,リーフコンダクタンスと葉の水ポテンシャルを計測した.有意差は見られなかったものの,リーフコンダクタンスはとくに午後において減少する傾向が観察された.また,水ポテンシャルについても,高湿度処理によって午後の値が午前よりも上昇し(ただし有意差は無し),植物の水分ストレスが緩和された可能性が示唆された.また,高湿度環境の創出に伴う根の養分吸収への影響を調べたところ,いくつかの必須栄養素(NO3-,K+,Mg2+,Ca2+)について吸水と同程度の減少が見られた(14-16%).さらに,高湿度環境の創出が光合成速度に及ぼす影響を調べるために,植物個体チャンバーを用いた実験を行った結果,高湿度によるリーフコンダクタンスの増加と,それに伴う光合成速度の増加が観察された.以上のように,温室において午前の高湿度環境を細霧冷房装置を用いて創出し,それが作物の水関係,光合成速度等に及ぼす影響を明らかにした.「研究実績の概要」で述べたように,研究初年度は,午前の高湿度環境の創出が午前と午後の作物の水関係に及ぼす影響とそのメカニズムの解明を目的とした課題群に取り組んだ.一連の取り組みの結果,温室の細霧冷房装置を用いた高湿度環境の創出とそれに伴う蒸散速度の減少,リーフコンダクタンスの増加,水ポテンシャルの増加の効果を観察することができ,当初の計画を概ね達成することが出来た.さらに,当初の計画には含まれていなかった,光合成速度への影響(促進効果)および蒸散抑制に伴う根の養分吸収速度の減少についても明らかにすることが出来た.しかしながら,当初の研究計画の1つである,「午前の作物の水分状態を午後まで維持させること」については期待するデータを得ることが出来なかった.その理由として,代表者が当該年度に所属機関を移動したことが挙げられる(高知大学から九州大学へ移動).この点については次年度以降の課題とする.以上のように,一部課題については当初の目的を達成することが出来なかったものの,当初の目的の大部分と,さらに当初の目的以上の成果(光合成,根の養分吸収)についても得られたことから,当該年度の進捗状況を「おおむね順調」と判断した.研究2年目では,超高湿度環境に基づく履歴環境調節の効果を,植物個体のガス交換特性(蒸散速度,光合成速度,リーフコンダクタンス)に着目した実験を行った.とくに,超高湿度環境をより容易に創出する方法として,ミストを用いて植物体を直に濡らす手法を採用した.先ず,葉が濡れた条件下でもガス交換特性が計測可能な作物個体チャンバシステムを構築した.当該システムは開放型であり,個体チャンバ(0.5 ×0.6 ×1.2 m),CO2分析計(LI-820, Li-cor),温湿度計(HMP60, Vaisala),茎内流量センサ(SGB16ーWS, Dynamax),熱電対,データロガー(CR1000, Campbell Scientific),およびLED光源(LLM031,スタンレー)などで構成されている.葉が濡れている時の蒸散速度は,茎基部に取り付けた茎内流量センサによって計測可能である.ポット栽培した10葉期のトマトにおいて2処理区を設けた.1つは10時から14時まで毎時1回ミストで濡らした区(濡れ区),もう1つは濡らさない区(対照区)とした.これらの処理区のトマト個体のガス交換特性を,前述の作物個体チャンバシステムで晴天日の11時と14時に計測した.その結果,対照区における14時のリーフコンダクタンスと光合成速度が11時より優位に低下したことに対して,濡れ区においては,11時と14時のリーフコンダクタンスと光合成速度は同程度であった.結果として,14時の光合成速度は,濡らすことによって11時より13%有意に増加した.以上のように,超高湿度の履歴環境が作物個体のガス交換特性に及ぼす影響を明らかにした.「研究実績の概要」で述べたように,研究2年目では,超高湿度の履歴環境が植物個体のガス交換特性に及ぼす影響とそのメカニズムの解明を目的とした課題に取り組んだ.

その結果,細霧処理による植物体極周辺の高湿度環境の創出と,それに伴う蒸散速度の減少,午後のリーフコンダクタンスの減少回避,さらには午後の光合成速度の減少回避の効果を観察することができた.すなわち,午後の光合成速度は,超高湿度環境の処理を行わなかった植物と比べて,処理を行った植物は約13%増加し,当初の目的を概ね達成することが出来た.その過程で,植物が濡れた状態においてもそのガス交換特性を計測可能なオリジナリティのある計測器(作物個体チャンバシステム)の構築もなされ,その点では当初の計画以上の成果を上げることが出来た.しかしながら,当初計画に挙げていた「CO2施用との組み合わせ」および「超高湿度の履歴環境が転流(葉から果実への糖輸送)」に及ぼす影響については調査を実施することが出来なかった.その理由として,代表者が前年度に所属機関を異動(高知大学から九州大学へ異動)したため,前年度からの進捗状況が全体的に遅れ気味にあったことが挙げられる.これらの未達成の点については次年度の課題とする.以上のように,一部課題については当初の目的を達成することが出来なかったものの,当初の目的の大部分と,さらに当初の目的以上の成果(新規計測システムの構築)についても得られたことから,当該年度の進捗状況を「おおむね順調」と判断した.研究3年目では,超高湿度環境に基づく履歴環境調節の効果について,異なる季節(春,夏,秋,冬)において植物個体のガス交換特性(蒸散速度,光合成速度,リーフコンダクタンス)に着目した実験を行った.超高湿度環境をより容易に創出する方法として,ミストを用いて植物体を直に濡らす手法を採用した.葉が濡れた植物体のガス交換特性の計測については,前年度に構築したオリジナルの作物個体チャンバシステムを利用した.ポット栽培した10葉期のトマトにおいて2処理区(1つは10時から14時まで毎時1回ミストで濡らした濡れ区,もう1つは濡らさない対照区)を設けた.これらの処理区のトマト個体のガス交換特性を,前述の作物個体チャンバシステムで晴天日の11時と14時に計測し,これを異なる季節(春,夏,秋,冬)に実施した.その結果,春,秋,冬においては,対照区における14時のリーフコンダクタンスと光合成速度が11時より有意に低下した.これは作物成長の律速になる昼寝現象が発生したことを意味する.一方,濡れ区においては,11時と14時のリーフコンダクタンスと光合成速度は同程度であり,結果として,14時の光合成速度は11時より有意に増加し,昼寝現象を回避することが出来た.夏については,計測上のトラブルがあり,十分なデータが得られなかった.その他,前年度に課題として挙げていたCO2施用との組み合わせの効果については,システム構築が完了せずに達成することはできなかった.また,転流への効果の調査については,転流の駆動力となる水ポテンシャルが,葉の濡れによって優位に増加することを示した.以上のように,超高湿度の履歴環境が作物個体のガス交換特性に及ぼす影響を明らかにした.代表者らは,施設内作物生産の律速要因である午後に衰退する光合成・転流に関して,それらの潜在力は午後にも低下せずに最適化の余地があることを見出した.そこで,午後の光合成・転流の潜在力を引き出すために,午前中の作物の水分生理に着目した「履歴積み上げ型環境調節」を新たに提案し,効果を調べた.その結果,午前中から高湿度環境を創出することで,午後になっても気孔開度と光合成を午前と同程度に維持することが出来た.
中華民国前期における知識人の思想と活動―『甲寅雑誌』を起点として

私は1914年に創刊された『甲寅雑誌』に参与した人々に着目し、1910年代から1920年代にかけての中国政治思想の特色の解明を試みている。本年度は『甲寅雑誌』の中心人物である章士釧が1921年に発表した英文著作Chinese Politics and Professionalismの読解を通じ、中華民国建国当初には熱心な議会主義者であった章士釧が、1920年代以降、職業代表制支持論者へと転向した事実の詳細を解明した。なおこの作業にあたり、章士釧と中国国外の知識人の関わりに留意し、同書がグレアム・ウォーラスらイギリスの知識人との密接な交流から成立したこと、しかし中国に在住していた橘樸からは厳しく批判されたことも明らかにした。さらにやはり『甲寅雑誌』に参与し、後に『時事新報』や『解放与改造』など多くの新聞・雑誌で精力的に政論を発表して当時の中国に大きな論争をしばしば巻き起こした張東〓についても考察を進めた。具体的には、1920年に生じ張東〓も当事者の一人であった中国社会主義論戦において、張の議論の仕方が多くの誤解を招き、その結果、ボルシェヴィズムを奉じる陳独秀らからのみならず、張同様ギルド社会主義を奉じていた高一涵らからも批判を受けていたことを解明した。また研究の遂行に必要な史料の収集を、複数のデータベースの利用などを通じて効率的に行った。さらに平成24年1月にスタンフォード大学フーバー研究所にて史料収集を行い、同研究所が所蔵する貴重な史料の収集も行った。これらの史料に基づき、特に張東〓についてその1910年代と1930年代の思想と活動に考察を加え、成果を公表するべく準備中である。私は1914年に創刊された『甲寅雑誌』に参与した人々の研究を通じて、1910年代から1920年代にかけての中国政治思想の特色の解明を試みている。この企図に沿い、本年度は『甲寅雑誌』の中心人物である章士〓と深い関係にあり、『新青年』や『毎週評論』などで陳独秀や胡適とならんで重要な役割を果たした高-涵の思想を、彼が参照した日本語や英語の文献の検討を通じ解明した。その成果は論文として公表した。また章士〓についても、すでに失われたとみなされその内容が検討されてこなかった英文の著作Chinese Politics and Professionalism(1921)の読解を通じ、中華民国建国時には熱心な議会主義者であった章士〓が、1920年代以降、職業代表制支持論者へと転向した事実の詳細を解明した。なおこの作業にあたり、章士〓と中国国外の知識人の関わりに留意し、同書がイギリスの知識人との交流から成立したこと、しかし日本の知識人からは厳しく批判されたことも明らかにした。その成果は論文として公表される予定である。さらにやはり『甲寅雑誌』に参与し、後に多くの新聞・雑誌で精力的に政論を発表して当時の中国に大きな論争をしばしば巻き起こした張東孫についても、従来利用されていない史料の収集を行いつつ考察を進め、その成果を公表すべく準備中である。なお2010年10月より2011年3月までの約半年間、台湾の中央研究院近代史研究所に滞在し研究を行った。同所では研究報告などを通じ内外の研究者の批正を受ける機会を得て、自身の研究の進展に役立て研究視野を広げることができた。また中央研究院が有する貴重な史料を閲覧・収集し、今後の研究のための有益な基礎を築くことができた。
旋回流れによる曲がり管内乱流の制御

曲がり管内乱流の流動抵抗を旋回流れの導入によって制御・操縦する方法について、基礎的な工学情報を実験によって調査・研究した。(1)平成10年度:弱い旋回流れの場合、曲がり管内乱流の流動抵抗(管摩擦係数)が旋回を導入しない場合よりも減少することを見いだした。(2)平成11年度:引き続き、流動抵抗と流動パターンの関係を検討した結果、曲がり管内乱流の抵抗減少は、弱い旋回流れによって曲がり管内流れ特有の渦構造が不安定化され、流れの発達過程に渦構造の揺動現象が見られる場合にのみ発生することが明らかにされた。(3)平成12年度:流動パターンと流動抵抗の関係をさらに検討するため、壁面勇断応力分布を直接計測する方法について検討した。壁面フィルムセンサー(WFS)とマイクロフローセンサー(MFS)の両者を用いて管内乱流における壁面剪断応力の計測手法の確立につとめた。(4)平成13年度:曲がり管内の強い旋回流れについて、流動パターンの発達過程を詳細に計測するとともに、流動抵抗、旋回強さ、渦芯の振れ回り、流動パターンなどの諸関係を検討した。以上、4年間の研究成果を報告書にまとめた。また、その概要は下記のとおりである。曲がり管内流れでは遠心力の作用によって管断面内に一対の2次流れの渦が誘起され、流動抵抗は増加するが、この2次流れの渦と同程度の強さを持つ比較的弱い旋回流れを曲がり管へ導入すると、渦構造を含めて流れに揺動現象が生じるため、主流の偏りが一様化されて壁面せん断応力が低下するとともに、抵抗減少が現れる。しかしながら、強い旋回流れを導入すると、主流は曲がり内側へ偏り続け、旋回流れの渦もあまり減衰しないため、逆に抵抗増加になる。これらの現象論的な研究成果から、旋回流れによって曲がり管内流れの流動抵抗を制御できることが示唆された。曲がり管内に遠心力の作用によって誘起される2次流れの対称渦対のうち、曲がり管内へ大規模な旋回流れ渦を導入する方法によって、本来の対称渦のどちらか一方を抑制させ、曲がり管内乱流の流動抵抗を減少させることを目的として、(1)旋回流れの旋回強さを制御する装置(設備品)を設計・製作するとともに、(2)実験結果と比較するための計算コードの開発を準備した。曲がり管内乱流の流動抵抗を旋回流れの導入によって制御・操縦する方法について、基礎的な工学情報を実験によって調査・研究している。(1)昨10年度までに、弱い旋回流れの場合、曲がり管内乱流の流動抵抗(圧力損失による管摩擦係数)が旋回を導入しない場合よりも減少することを見いだし、そのときの流動パターンを詳細に実験・調査した。本11年度は、その研究成果をまとめ、中間報告の形で論文投稿した。(2)本11年度は、曲がり管内の強い旋回流れについて、流動パターンの発達過程を詳細に計測するとともに、流動抵抗と流動パターンの関係を検討した。その結果、曲がり管内乱流の抵抗減少は、弱い旋回流れによって曲がり管内流れ特有の渦構造が不安定化され、流れの発達過程に渦構造の揺動現象が見られる場合にのみ発生し、強い旋回流れの場合には旋回渦芯の振れ回り現象によって抵抗促進が生じることが明らかにされた。(3)以上の研究成果に基づき、流動パターンと流動抵抗の関係をさらに検討するため、本11年度から、旋回強さを数種類変えて壁面剪断応力分布の計測に着手した。壁面フィルム形センサを用いた計測結果について、すでに学会講演を行った。本12年度は、MEMS形センサーを用いて壁面剪断応力分布をさらに詳細に計測するとともに、流動パターンと流動抵抗(壁面剪断応力)の関係を明確にする予定である。

(1)平成1011年:弱い旋回流れの場合、曲がり管内乱流の流動抵抗(圧力損失による管摩擦係数)が旋回を導入しない場合よりも減少することを見いだし、そのときの流動パターンを詳細に実験・調査した。(2)平成1112年:曲がり管内の強い旋回流れについて、流動パターンの発達過程を詳細に計測するとともに、流動抵抗と流動パターンの関係を検討した。その結果、曲がり管内乱流の抵抗減少は、弱い旋回流れによって曲がり管内流れ特有の渦構造が不安定化され、流れの発達過程に渦構造の揺動現象が見られる場合にのみ発生し、強い旋回流れの場合には旋回渦芯の振れ回り現象によって抵抗促進が生じることが明らかにされた。この研究成果を日本機械学会論文集(B編)に掲載した。(3)平成1213年:流動パターンと流動抵抗の関係をさらに検討するため、旋回強さを数種類変えて壁面剪断応力分布の計測に着手した。壁面フィルムセンサー(WFS)とマイクロフローセンサー(MFS)の両者を用いて管内乱流における壁面剪断応力の計測手法の確立につとめた。そして、計測の精度や安定性に優れているMFSを用いて、曲がり管内旋回乱流の壁面剪断応力分布をさらに詳細に計測するとともに、流動パターンと流動抵抗(壁面剪断応力)の関係を実験的に調査した。曲がり管内乱流の流動抵抗を旋回流れの導入によって制御・操縦する方法について、基礎的な工学情報を実験によって調査・研究した。1.平成10年度:弱い旋回流れの場合、曲がり管内乱流の流動抵抗(管摩擦係数)が旋回を導入しない場合よりも減少することを見いだした。2.平成11年度:引き続き、流動抵抗と流動パターンの関係を検討した結果、曲がり管内乱流の抵抗減少は、弱い旋回流れによって曲がり管内流れ特有の渦構造が不安定化され、流れの発達過程に渦構造の揺動現象が見られる場合にのみ発生することが明らかにされた。3.平成12年度:流動パターンと流動抵抗の関係をさらに検討するため、壁面剪断応力分布を直接計測する方法について検討した。4.平成13年度:曲がり管内の強い旋回流れについて、流動パターンの発達過程を詳細に計測するとともに、流動抵抗、旋回強さ、渦芯の振れ回り、流動パターンなどの諸関係を検討した。以上、4年間の研究成果を報告書にまとめた。また、その概要は下記のとおりである。曲がり管内流れでは遠心力の作用によって管断面内に一対の2次流れの渦が誘起され、流動抵抗は増加するが、この2次流れの渦と同程度の強さを持つ比較的弱い旋回流れを曲がり管へ導入すると、渦構造を含めて流れに揺動現象が生じるため、主流の偏りが一様化されて壁面せん断応力が低下するとともに、抵抗減少が現れる。しかしながら、強い旋回流れを導入すると、主流は曲がり内側へ偏り続け、旋回流れの渦もあまり減衰しないため、逆に抵抗増加になる。これらの現象論的な研究成果から、旋回流れによって曲がり管内流れの流動抵抗を制御できることが示唆された。
同一複合体上に存在する脱アデニル化酵素ＣＡＦ１とＣＣＲ４の作用機構解析

真核生物におけるほとんどのmRNAは3′末端にアデニンが連続する配列、ポリ(A)鎖を持つ。細胞質におけるmRNAの分解は、主としてポリ(A)鎖の分解反応である「脱アデニル化」から始まる。脱アデニル化は主にCCR4-NOT複合体がmRNA上に誘導されることで起こる。本研究で用いたショウジョウバエにおいて、CCR4-NOT複合体の構成因子の内、脱アデニル化活性を持つ因子はCAF1とCCR4の2つである。しかし、CCR4-NOT複合体がCAF1とCCR4という2つの脱アデニル化酵素を持つ生物学的意義は不明である。本研究の目的は、未だ明らかにされていないCAF1とCCR4の使い分け、あるいは協調的作用を生化学的に明らかにすることである。CAF1及びCCR4はアデニンに強い選択性を持ち、3′末端から一塩基ずつRNAを分解する性質を持つ。しかし本研究のこれまでの結果から、CAF1もしくはCCR4はアデニン以外の塩基を持つRNAを分解できる場合があることが示唆された。本研究ではアデニン以外の塩基選択性にCAF1とCCR4の違いがある可能性を考え、酵素学的な解析を行った。しかしCAF1とCCR4に違いはなく、どちらも上流にポリ(A)配列があれば、3′末端の塩基を問わずRNAを分解できることがわかった。この結果はRNA journalに投稿され、公開された。CAF1とCCR4の解析を行う過程で、精製したCAF1及びCCR4はその反応にATPを必要としないが、一方でCCR4-NOT複合体による脱アデニル化にはATPが必要であるとする先行研究があることがわかった。そこで脱アデニル化反応におけるATPの必要性について再検証したところ、実はCCR4-NOT複合体の脱アデニル化反応にATPは必要ないことがわかった。この結果もRNA journalに投稿され、公開された。28年度が最終年度であるため、記入しない。真核生物の細胞質におけるmRNAの分解は、主としてポリ(A)鎖の分解反応である「脱アデニル化」から始まる。本研究の目的は、この脱アデニル化に関与するCCR4-NOT複合体が、CAF1とCCR4という2つの脱アデニル化酵素を持つ意義を生化学的に明らかにすることである。この目的のためにまず、ショウジョウバエのCAF1とCCR4に、酵素としての働きに違いがあるのか検証することにした。CAF1とCCR4はどちらもアデニンを認識し、RNAの3 ́末端から1ヌクレオチドずつ除く活性を持つと考えられている。しかし、CCR4-NOT複合体はポリ(A)鎖の下流にあるアデニンを持たないヌクレオチド(以下、ポリ(A)下流配列)も除去できることが示唆されていた。近年の網羅的解析から、天然のポリ(A)鎖の下流には広くA以外の配列が付加されており、それらはmRNAの安定性に影響があることが明らかとなった。この点からもCCR4-NOT複合体のポリ(A)下流配列除去活性を解析することは極めて重要である。CAF1とCCR4の一方がこの活性を持つ可能性を調べるため、交付開始の時点で、野生型と活性変異体を組み合わせた4種類のリコンビナントCAF1/CCR4へテロダイマーを精製していた。交付1年目は精製した酵素を用いてCAF1とCCR4のポリ(A)下流配列除去活性を精査した。結果として、CAF1とCCR4はそれぞれ独立にこの活性を持つことがわかった。この活性は通常の脱アデニル化の時と同様3 ́末端から1ヌクレオチドずつ除く活性であったが、興味深いことに、この活性を発揮するには上流のポリ(A)配列が必要であることがわかった。これらの結果を現在論文にまとめている。真核生物におけるほとんどのmRNAは3 ́末端にアデニンが連続する配列、ポリ(A)鎖を持つ。CCR4-NOT複合体の構成因子の内、本研究で用いているショウジョウバエにおいて、脱アデニル化活性を持つ因子はCAF1とCCR4の2つである。CAF1及びCCR4による塩基の認識には強いアデニン選択性を持ち3 ́末端から1塩基ずつRNAを分解していくことが知られている。しかし先行研究からCCR4-NOT複合体はアデニン以外の塩基を持つRNAを分解できる場合があることが示唆されていた。本研究ではCAF1もしくはCCR4がアデニン以外の塩基をもつRNAを分解でき、2つの酵素は塩基嗜好性に違いがあるのではないかという仮説を立て検証を行った。本研究では昨年度中に、CAF1とCCR4はどちらもやはりアデニンに強い選択性を持つが、上流にポリ(A)配列があれば末端にアデニンがなくても分解できることを示した。今年度は昨年度の結果を科学雑誌に投稿した。その結果データに関しては高い評価を頂いたものの掲載には至らなかったため、現在別の雑誌への投稿準備を行っている。これまでの酵素学的な研究からはCAF1とCCR4の違いを見出すことはできなかった。

そこで次の段階として、CAF1とCCR4をノックアウトした細胞に野生型あるいは活性変異体のCAF1とCCR4を戻したとき、mRNAの発現変動に違いがあるかを見ることでCAF1とCCR4に使い分けが存在するかを調べることにした。方法として、S2細胞にCRISPR-Cas9systemを用いることでCAF1とCCR4をノックアウトすることを試みた。しかしCAF1もしくはCCR4のノックアウト細胞を単離することはできなかった。そこでこれまでの研究と関連があり、かつ重要な問題である「microRNA依存的な脱アデニル化反応におけるATPの必要性」を明らかにすることにした。microRNAはCCR4-NOT複合体を誘導することで脱アデニル化を引き起こすが、脱アデニル化経路にATPが必要であるとの報告がある。しかし脱アデニル化経路においてATPを必要とする段階は明らかになっていない。これまでの研究ではATPをADPに変換する酵素を細胞抽出液中に添加すると脱アデニル化反応が顕著に遅れるため、脱アデニル化反応にはATPが必要であると考えられていた。しかしこの方法では反応系からATPが減った影響とADPが増えた影響を切り分けることができない。そこでゲルろ過カラムを用いてATPやADPを含む小分子を除き、後からATPやADPを加え戻す方法を考えた。この方法を用いてATPの必要性を調べてみると、予備的な結果であるがATPは確かに必要であり、microRNAがmRNA上に誘導されてから脱アデニル化酵素が誘導されるまでの間にATPが必要であることを示す結果が得られた。新たな知見につながる結果が得られたことから研究はおおむね順調に進展していると言える。真核生物におけるほとんどのmRNAは3′末端にアデニンが連続する配列、ポリ(A)鎖を持つ。細胞質におけるmRNAの分解は、主としてポリ(A)鎖の分解反応である「脱アデニル化」から始まる。脱アデニル化は主にCCR4-NOT複合体がmRNA上に誘導されることで起こる。本研究で用いたショウジョウバエにおいて、CCR4-NOT複合体の構成因子の内、脱アデニル化活性を持つ因子はCAF1とCCR4の2つである。しかし、CCR4-NOT複合体がCAF1とCCR4という2つの脱アデニル化酵素を持つ生物学的意義は不明である。本研究の目的は、未だ明らかにされていないCAF1とCCR4の使い分け、あるいは協調的作用を生化学的に明らかにすることである。CAF1及びCCR4はアデニンに強い選択性を持ち、3′末端から一塩基ずつRNAを分解する性質を持つ。しかし本研究のこれまでの結果から、CAF1もしくはCCR4はアデニン以外の塩基を持つRNAを分解できる場合があることが示唆された。本研究ではアデニン以外の塩基選択性にCAF1とCCR4の違いがある可能性を考え、酵素学的な解析を行った。しかしCAF1とCCR4に違いはなく、どちらも上流にポリ(A)配列があれば、3′末端の塩基を問わずRNAを分解できることがわかった。この結果はRNA journalに投稿され、公開された。
複雑な消化管形態形成の自己組織化を単純な動物を使って理解する

体内には様々な器官が3次元に配置されている。また、それぞれの器官自体も3Dの構造を持っている。しかし、複雑な形態が個体差なく作られるしくみの理解は遅れている。3D形態ができあがっていくしくみの解明には、4D (3D+t)ライブイメージングが不可欠である。ライブイメージングには、サンプルが小さく全ての過程が急速に起こる系が適している。本研究では、オタマボヤ(Oikopleura dioica)をその系として、5時間の間に起こる消化管の形態形成とその構築原理を解明することを目的とする。この系は解析に値する充分な複雑さを持つが、他の動物の消化管形成に比してとても単純化された系である。全ての過程は5時間程度で完了する。内臓の形態形成は自己組織化の例であり、オタマボヤでは62個の細胞の塊から口から、咽頭、胃、腸、肛門にかけて500個ほどの細胞でできている高度に組織化された内臓ができあがる。消化管の形態を創成するしくみの素過程として、4つの現象に注目してそのしくみを探る。器官境界の形成、上皮極性の形成、管腔形成、管腔の体外への開口、である。全ての過程は5時間程度で完了するので、包括的な解析に最適な系である。精力的に4D(3D+t)ライブイメージングを行い、多面的かつ大量のデータの取得を行いつつある。データの取得は、微分干渉顕微鏡、デコンボルーション顕微鏡、共焦点顕微鏡を用いて行っている。また、体幹部の形態形成過程において核(H2B-mCherry)・細胞膜(PH-YFP)を光らせ、Z軸を含む蛍光タイムラプスビデオで撮影した。オタマボヤの幼生は幅が40ミクロン程であり完全に透明なので、核を光らせZスタックを撮る場合、幼生の上焦点面から下焦点面までの像を得ることができる。生命維持において食事を必要とする多細胞動物は、食物を摂取する器官として口を持つ。一般的に動物の口は、外胚葉と内胚葉の接続によって形成されることが知られている。本年度は、ワカレオタマボヤを用いて口の形成過程を解析した。口の形作りの過程を微分干渉顕微鏡でタイムラプス撮影すると共に、細胞膜や細胞核を蛍光標識した上で個々の細胞の動きについてライブイメージングを行った。ワカレオタマボヤでは、将来的に口になる部分に前後軸に沿って並んでいる細胞が存在していた(oral plug)。このoral plugのうち背側最前方の二細胞が、体幹部を覆う表皮細胞に割り込んで体外に露出していた。そして、後方に位置する背腹二列の細胞が互いに解離して口の内側を形成することが分かった。また、oral plugのventral側の細胞に被さるようにして存在する細胞(lip precursor cell)の娘細胞同士(dorsal lip cellとventral lip cell)が、口の開口の際に背側と腹側に分配されていた。最後にこのoral plugとlip precursor cellが外胚葉と内胚葉どちらに由来するかを調べた。そのために、可変色蛍光タンパクであるnls-Kaedeを発現させた胚について、8細胞期に植物半球と動物半球のどちらかを赤い蛍光に変色させ、その娘細胞がどの細胞になるかを調べた。その結果、oral plugは植物半球由来の細胞、すなわち内胚葉由来の細胞であることが分かった。また、lip precursor cellが動物半球由来、すなわち外胚葉由来の細胞であること、更にその娘細胞が内胚葉由来の細胞とつながる様子が観察された。このような口の形成は、脊椎動物だけでなく無脊椎動物でも例がなく、口の形態形成に関する新たな例であるということができる。31年度は、内臓の器官境界の形成に関して追求する。オタマボヤのゲノム配列からカドヘリン遺伝子のリストアップを既に行い、staged RNA-seq発現データベースのデータを参考にし、目的のステージで発現が認められるカドヘリン約20種類にターゲットを絞った。今後、これらのカドヘリンの発現をin situ hybridizationで確認し器官原基特異的に発現を開始するカドヘリンを特定する。そしてその発現をノックダウンし、器官境界の形成におけるカドヘリンの機能を解析する。また同時に、管腔(口・肛門・鰓穴)の体外への開口過程でのカドヘリンの発現にも注目し、その変遷をモニターする。また、これまでに得られた大量のタイムラプスビデオ(微分干渉顕微鏡、及び核・細胞膜を光らせZ軸を含む蛍光タイムラプスビデオ)の情報を詳細に解析し、オタマボヤにおける内臓形態形成を包括的に調べつくす。

内蔵の形態形成は自己組織化の例であり、オタマボヤでは62個の細胞の塊から口から、咽頭、胃、腸、肛門にかけて500個ほどの細胞でできている高度に組織化された内蔵ができあがる。消化管の形態を創成するしくみの素過程として、4つの現象に注目してそのしくみを探る。器官境界の形成、上皮極性の形成、管腔形成、管腔の体外への開口、である。全ての過程は5時間程度で完了するので、包括的な解析に最適な系である。この期間を通して精力的に4D(3D+t)ライブイメージングを行い、多面的かつ大量のデータの取得を行う。データの取得は、微分干渉顕微鏡、デコンボルーション顕微鏡、共焦点顕微鏡を用いて行う。また、体幹部の形態形成過程において核(H2B-mCherry)・細胞膜(PH-YFP)を光らせ、Z軸を含む蛍光タイムラプスビデオで撮影する。オタマボヤの幼生は幅が40ミクロン程であり完全に透明なので、核を光らせZスタックを撮る場合、幼生の上焦点面から下焦点面までの像を得ることができる。現在、少なめのZスタックを含む蛍光タイムラプスビデオでは、5時間の全過程を一度に記録可能である。まず、核と細胞膜染色により、成体の体幹部の3D構築を行った。これにより、消化管がどのような細胞構成になっているかを把握できた。次に、微分干渉顕微鏡を用い、4Dライブイメージングを行いかなりのデータ量を取得した。幼生を不動化するために、尾の切断とBrachyuryのノックダウンによる尾部脊索形成阻害の両方を行った。ただし、撮影中に、胚の体積が増加し、徐々に焦点面がずれるという問題が残された。また、核(H2B-mCherry)・細胞膜(PH-YFP)を光らせ、Z軸を含む蛍光タイムラプスビデオで撮影も行っている。器官境界の形成に関しては、異なるカドヘリンが器官原基特異的に発現し、器官境界での細胞接着性が弱まることによると考えている。日本産オタマボヤのゲノム配列は決定済みであり、アッセンブリーもほぼ完了した。そこで、ゲノム配列からカドヘリン遺伝子のリストアップを行った。オタマボヤには、カドヘリンの遺伝子は26個存在することがわかった。体内には様々な器官が3次元に配置されている。また、それぞれの器官自体も3Dの構造を持っている。しかし、複雑な形態が個体差なく作られるしくみの理解は遅れている。3D形態ができあがっていくしくみの解明には、4D (3D+t)ライブイメージングが不可欠である。ライブイメージングには、サンプルが小さく全ての過程が急速に起こる系が適している。本研究では、オタマボヤ(Oikopleura dioica)をその系として、5時間の間に起こる消化管の形態形成とその構築原理を解明することを目的とする。この系は解析に値する充分な複雑さを持つが、他の動物の消化管形成に比してとても単純化された系である。全ての過程は5時間程度で完了する。内臓の形態形成は自己組織化の例であり、オタマボヤでは62個の細胞の塊から口から、咽頭、胃、腸、肛門にかけて500個ほどの細胞でできている高度に組織化された内臓ができあがる。
プログラマビリティと最大性能を両立するベクトルアーキテクチャの研究

本年度は提案するアーキテクチャの各要素技術の検討と評価、ならびにそれらの統合について研究を行った、以下ではそれぞれの研究について具体的に述べる。1)非レイテンシ指向レジスタ・キャッシュ・システム非レイテンシ指向レジスタ・キャッシュ・システム(Non-latency-Oriented Register Cache System以下、NORCSと呼ぶ)は、レジスタ・ファイルの回路面積と消費電力を削減する事を目的とした手法である。シミュレーションにより、NORCSでは性能をほとんど低下させることなく、その回路面積と消費電力を3分の1以下にまで削減できることを確かめた。また、レジスタ・キャッシュを使用する既存のシステムについても実装を行い、詳細な比較を行った。本年度は研究成果をマイクロアーキテクチャ分野における世界最高峰の会議であるMICROに投稿し、採録された。2)リネームド・トレース・キャッシュリネームド・トレース・キャッシュは、依存関係をキャッシュすることにより、レジスタ・リネーミングに必要なRMTの規模を大幅に縮小する手法である。本年度は、この手法をシミュレータに実装し、0.4%程度の性能低下でRMTの面積を20分の1以下にまで縮小できることを確かめた。研究成果については、今年度博士論文の形でまとめた。3)要素技術の統合上記の非レイテンシ指向レジスタ・キャッシュ・システムやリネームド・トレース・キャッシュを含む、各要素技術の統合について研究を行った。統合時の性能や回路面積についてモデルの構築を行い、評価した。また、これらの実証として、FPGA上で動作するプロセッサ"雷上同"の試作を行った。これらの研究成果については、今年度博士論文の形でまとめた。この博士論文については、所属する東京大学大学院情報理工学系研究科において研究科長賞を受賞している。
固-液ぬれ現象における接触角のアトムスケール計測と分子動力学的検討

固-液界面における接触角はミクロ(アトミック)サイズで見た場合とマクロサイズ(SEM以上でみた場合で異なるという考え方があるが,それを具体的に明らかにした例はない.ミクロ接触角の実験的な計測が難しいためである.しかし近年,原子間力顕微鏡の登場により,表面原子配列の観察が可能になってきた.そこで本研究では,超高真空-原子間力顕微鏡(UHV-AFM,すでに保有している)を用いて,固-液接触角のアトムスケール計測を行うことにした.超高真空-原子間力顕微鏡を用いて,固-液接触角のアトムスケールにおける計測を行う.このAFMは表面の原子配置を計測できる.但し,その装置の性能をフルに発揮するためには除振システムを現状よりも強力にする必要がある事が分かった.本研究では除振システムの組み込みにも力をさいた.表面酸化などの汚染による影響を避けるため,基板の上にろう材を乗せた試料を超高真空・原子間力顕微鏡(AFM)チャンバー内で加熱・溶解させ,分析する試料を用意する.温度分布は熱電対や赤外線センサーで測定する.試料は超高真空容器内から出さず,超高真空マニュピレーターで操作し,アトムスケールの接触角を計測する.表面の汚染の影響を除くことができる.界面の化学結合状態に関しては,透過電子顕微鏡(現有)もしくはマイクロオージェ電子分光装置(現有)で情報を得る.異なるぬれ形態を示す材料の組み合わせに対しAFM計測を行い,電子状態の観点からそれを分類する予定であった.このうち,AFM計測は予想よりはるかに困難である事がわかった.AFMチップと試料の相互作用をよく理解した上で,計測結果にフィルター処理を施す必要があることがわかった.そのための準備として,弾性接触論に界面および表面同士の原子間相互作用を考慮に入れたモデルをつくり、接触状況の把握につとめた.その結果,上記の計測では少なくとも十原子以上の接触半径を保ちながら計測されることが示唆された.原子レベルの分解能を得るには,何らかのフィルタリングが必要であることがわかったが,実際にそのフィルタをつくるにはいたらなかった.今後の研究が期待される.一方,ぬれの駆動力の大きさを統計力学的に検討した.アイリングの絶対反応速度論から導かれる速度で計測結果を矛盾無く説明できた.従来の粘性がぬれ速度を律速するモデルは無意味である可能性が出てきた.固-液界面における接触角はミクロ(アトミック)サイズで見た場合とマクロサイズ(SEM以上でみた場合で異なるという考え方があるが,それを具体的に明らかにした例はない.ミクロ接触角の実験的な計測が難しいためである.しかし近年,原子間力顕微鏡の登場により,表面原子配列の観察が可能になってきた.そこで本研究では,超高真空-原子間力顕微鏡(UHV-AFM,すでに保有している)を用いて,固-液接触角のアトムスケール計測を行うことにした.超高真空-原子間力顕微鏡を用いて,固-液接触角のアトムスケールにおける計測を行う.このAFMは表面の原子配置を計測できる.但し,その装置の性能をフルに発揮するためには除振システムを現状よりも強力にする必要がある事が分かった.本研究では除振システムの組み込みにも力をさいた.表面酸化などの汚染による影響を避けるため,基板の上にろう材を乗せた試料を超高真空・原子間力顕微鏡(AFM)チャンバー内で加熱・溶解させ,分析する試料を用意する.温度分布は熱電対や赤外線センサーで測定する.試料は超高真空容器内から出さず,超高真空マニュピレーターで操作し,アトムスケールの接触角を計測する.表面の汚染の影響を除くことができる.界面の化学結合状態に関しては,透過電子顕微鏡(現有)もしくはマイクロオージェ電子分光装置(現有)で情報を得る.異なるぬれ形態を示す材料の組み合わせに対しAFM計測を行い,電子状態の観点からそれを分類する予定であった.このうち,AFM計測は予想よりはるかに困難である事がわかった.AFMチップと試料の相互作用をよく理解した上で,計測結果にフィルター処理を施す必要があることがわかった.そのための準備として,弾性接触論に界面および表面同士の原子間相互作用を考慮に入れたモデルをつくり、接触状況の把握につとめた.その結果,上記の計測では少なくとも十原子以上の接触半径を保ちながら計測されることが示唆された.原子レベルの分解能を得るには,何らかのフィルタリングが必要であることがわかったが,実際にそのフィルタをつくるにはいたらなかった.今後の研究が期待される.一方,ぬれの駆動力の大きさを統計力学的に検討した.アイリングの絶対反応速度論から導かれる速度で計測結果を矛盾無く説明できた.従来の粘性がぬれ速度を律速するモデルは無意味である可能性が出てきた.
高次元重力理論における位相欠陥の重力崩壊とその安定性に関する理論的研究

本研究では高次元重力理論特有の現象である重力崩壊によるブラックストリング形成等に関する知見を得る事を目的にしている。そしてそこで得られた知見を通して無限に広がったエネルギー分布を持つコスミックストリング、ドメインウォールのような位相欠陥の重力崩壊の理解を目指した。具体的な内容は以下の通りである。回転楕円体形状の領域に一様に質量の分布した空間的4次元超曲面上に"見かけの地平線"が存在するかどうかを数値的に調べることによって、5次元時空におけるブラックオブジェクトの形成に関する必要充分条件の予想のチェックを行った。また、ブレインワールド・モデルにおいて、type Iのコスミックストリングのネットワークが衝突合体を繰り返して線密度を増加させ、臨界線密度を超えたところで重力崩壊し、ブラックストリングの形成がおきるというシナリオは、コスミックストリングの元々の線密度が電弱相転移のエネルギースケールでも可能だということを簡単なモデルを用いて示した。また、ドメインウォールは2次元的な空間的広がりをもつので、5次元時空のブレインワールド・モデルでは、空間的な余次元が2となるため、4次元重力理論におけるコスミックストリングと同じ振る舞いをすることが期待される。空間的な余次元が2の物体が重力崩壊すると、裸の特異点になることが予想され、一般にその取り扱いは難しくなる。そこで本研究では、4次元時空の無限に広がった円筒形状の物質の重力崩壊の研究も積極的に行った。また、位相欠陥内のインフレーション、さらに、重力崩壊によって生成されたブラックホール等の観測的な研究と深く関係する宇宙論的重力レンズの研究も平行して行った。ブレーンワールド・モデルにおける重力相互作用は、長距離ではアインシュタインの一般相対性理論とほぼ同じだが、短距離においては5次元時空の重力理論に従う。この性質により、エネルギー線密度の非常に大きな宇宙ひもが重力崩壊を起こし、ブラック・ストリングを形成することが可能になる。この宇宙ひもは真空の相転移の際に形成される。我々の宇宙における真空の相転移のエネルギー・スケールは、重力相互作用の量子効果が重要になるプランクのエネルギー・スケールより小さいと考えられている。プランク・スケール以下の相転移で形成される宇宙ひもの線密度は、重力崩壊を起こすほど大きくはなれないので、我々の宇宙において、宇宙ひもがブラック・ストリングを形成することは無いと思われるが、実はこの問題はそれほど単純ではない。今年度は、タイプIの宇宙ひもの合体過程を考慮すると、たとえ形成時の線密度が小さくても、合体による線密度の増加によって重力崩壊が起こりうることを明らかにした。このブラック・ストリングは、莫大な重力波放出をする可能性があるため、重力波天文学において重要な研究対象になる可能性がある。本研究課題に直接関係する高次元時空の問題は3つ、間接的に関係のある4次元時空のにおける重力崩壊に関する2つの問題に取り組んだ。1つめはブレーンワールド・シナリオにおけるコズミック・ストリングの重力崩壊である。タイプIのコズミック・ストリングは合体し線密度の大きなストリングになりうる。そこで、ブレーンワールドの宇宙論な状況でこの合体がどの程度発生するかの評価を行い、重力崩壊してブラックストリングになるほど大きな線密度になりうるモデルパラメターの範囲を特定した。2つめは5次元一般相対論における地平線形成の必要十分条件に関するハイパーフープ予想の研究である。相対論的初期条件を設定し、4次元的回転楕円体状に分布した質量が地平線を形成するための必要充分条件を数値的に明らかにした。そして宇宙検閲仮説が成り立たなくなる可能性を示す結果を得た。3つめはブレーンワールドにおいて、特異点がブレーン上に存在するブラックストリングの静的な解を数値的に求めるための定式化である。本研究課題に間接的に関係のある研究としては、実験室でできたモノポールが重力崩壊してブラックホールになったとき、ブラックホール内部でインフレーション宇宙が形成されるのかどうかに関する研究を行い、古典的な可能性と量子論的な可能性を考察した。そして、4次元一般相対論のもとで、モノポールのモデルによってはインフレーションが起こりうることを示した。

また、円筒状に分布するダストの重力崩壊についての研究も行い、裸の特異点を数値的に構築することに成功した。この問題は5次元時空におけるドメインウォールの重力崩壊と密接に関係する。昨年度の研究で、ブレーンワールドでは4次元時空の重力理論の場合と異なり、タイプIのコズミック・ストリングが衝突合体を繰り返して線密度を増加させ、最終的に重力崩壊してブラックオブジェクトになりうることを示した。このとき、重力崩壊したコスミック・ストリングが時空特異点に突入するのか、あるいはその宇宙項的な負の圧力の効果で、インフレーションを起こし、ブラックオブジェクトの中に別の宇宙を作りうるのかどうかは、問題として残されていた。この問題に関しては、昨年度から研究を行っていた4次元時空におけるモノポールの重力崩壊が、重要なヒントを与えてくれた。この研究では、モノポールを球形の宇宙項で近似し、その表面(ドメインウォール)の運動方程式を解析的に解くという方法を採用したので、時空の大域的な構造を明らかにすることができた。これまではインフレーションが起きるためには、ビッグバンのような初期特異点の存在が必要条件であると考えられてきたのだが、この解析の結果、それは必ずしもそうではないことが明らかになった。初期特異点が無い場合でも、ブラックオブジェクトに入ったモノポールの中でインフレーションは原理的に起きうるのである。しかし、初期特異点は無くてもブラックホールの中に荷電ブラックホールの内部に存在する時空特異点と同じ構造の裸の特異点が発生することも同時に明らかになった。このような事態は、ブレーンワールドでのコスミック・ストリングの場合も起こる。その関連もあり、昨年度から継続している円筒状に分布するダストの重力崩壊についての研究において裸の特異点を取り扱う方法を考案し、適切な境界条件を裸の特異点上に要請すると、その特異点は非常にマイルドなものになり、古典重力理論の枠内で、十分取り扱い可能になることが明らかになった.
チロシン水酸化酵素遺伝子導入ブタ神経系幹細胞のラットパーキンソン脳への移植研究

本研究は、ブタ中枢神経系幹細胞の人工代用ドナーとしての有用性を追究するものであり、従って研究の焦点は1)中枢神経系幹細胞の遺伝子操作性、2)中枢神経系幹細胞の異種間移植の可能性、3)中枢神経系幹細胞の神経回路網形成能の評価にある。これらの点を解明すべく胎生17-18日ブタ胎仔中脳胞部神経板組織を摘出直後にパーキンソン病モデルラット線条体へ移植し、その挙動を組織学的、免疫組織化学的および電子顕微鏡的に、またはアンフェタミン誘発回転運動の推移により評価した。(2)組織学的検討では、6週齢のグラフト内に未分化細胞からなるロゼット形成の所見を多数認め、さらにブタ特異的ニューロフィラメント、チロシン水酸化酵素陽性細胞がみられた。(3)電子顕微鏡的にはブタ特異的ニューロフィラメントまたはチロシン水酸化酵素系陽性神経細胞が認められ、これらの細胞はシナプス形成に関与した。またミエリン鞘を有するニューロフィラメント陽性突起を多数認めた。(4)ホストのアンフェタミン誘発回転運動は、移植後4週までは回復がみられず、機能回復については今後の課題と考える。以上より、胎生17-18日ブタ胎仔中脳胞部神経板組織は異種間移植可能であることが判明した。今後パーキンソン病モデルサル脳内への移植実験を予定し、将来的にはヒト・パーキンソン病の治療へと発展することを願って止まない。本研究は,ブタ中枢神経系幹細胞の人工代用ドナーとしての有用性を追究するものであり,従って研究の焦点は1)中枢神経系幹細胞の遺伝子操作性,2)中枢神経系幹細胞の異種間移植の可能性,3)中枢神経系幹細胞の神経回路網形成能の評価にある。これらの点を解明すべく,平成8年度において以下の成果を得た。1:中枢神経系幹細胞提供ブタ胎仔年齢の決定In vitroにおいて分裂可能であり,さらに中枢神経系細胞のみに分化し得る中脳胞部神経板細胞を確保できる胎仔年齢につき検討した。妊娠14日,17日,18日,19日,33日の中型ヨ-クシャーより胎仔を帝王切開により無菌的に摘出し,その形態学的,組織学的,電子顕微鏡的検討により胎生17-18日が適正であると判明した。2:ブタ中枢神経系幹細胞の移植実験胎生17-18日ブタ胎仔中脳胞部神経板組織を摘出直後にパーキンソン病モデルラット線条体へ移植し,その挙動を組織学的,免疫組織化学的に,またはアンフェタミン誘発回転運動の推移により評価した。(2)組織学的検討では,6週齢のグラフト内に未分化細胞からなるロゼット形成の所見を多数認め,さらにニューロフィラメント,チロシン水酸化酵素陽性細胞もみられた。(3)ホストのアンフェタミン誘発回転運動は,移植後4週までは回復がみられず,機能回復については今後の課題と考える。以上より,胎生17-18日ブタ胎仔中脳胞部神経板組織は異種間移植可能であり,遺伝子操作によるドーパミン産生能の向上を検討中である。本研究は、ブタ中枢神経系幹細胞の人工代用ドナーとしての有用性を追究するのもであり、従って研究の焦点は1)中枢神経系幹細胞の遺伝子操作性、2)中枢神経系幹細胞の異種間移植の可能性、3)中枢神経系幹細胞の神経回路網形成能の評価にある。これらの点を解明すべく、平成8、9年度において以下の成果を得た。1:中枢神経系幹細胞提供ブタ胎仔年齢の決定In vitroにおいて分裂可能であり、さらに中枢神経系細胞のみに分化し得る中脳胞部神経板細胞を確保できる胎仔年齢につき検討した。妊娠14日、17日、18日、19日、33日の中型ヨ-クシャーより胎仔を帝王切開により無菌的に摘出し、その形態学的、組織学的、電子顕微鏡的検討により胎生17-18日が適正であると判明した。

2:ブタ中枢神経系幹細胞の移植実験胎生17-18日ブタ胎仔中脳胞部神経板組織を摘出直後にパーキンソン病モデルラット線条体へ移植し、その挙動を組織学的、免疫組織化学的に、またはアンフェタミン誘発回転運動の推移により評価した。(2)組織学的検討では、移植6週のグラフト内に未分化細胞からなるロゼット形成の所見を多数認め、さらにニューロフィラメント、チロシン水酸化酵素陽性細胞もみられた。(3)電子顕微鏡的検討では、形態的に未熟なニューロフィラメント陽性細胞およびチロシン水酸化酵素陽性細胞にシナプス形成がみられた。(4)ホストのアンフェタミン誘発回転運動は、移植後4週までは回復傾向は認められなかった。以上より、胎生17-18日ブタ胎仔中脳胞部神経板組織は異種間移植が可能であると考えられた。また上記の観察期間内ではグラフト内の細胞は形態学的に未熟なものが多く、今後ホスト脳内でさらに分化していく可能性があると思われた。ホストパーキンソン病モデルラットの機能回復の評価についても、グラフト内の細胞が行動回復に充分な量のdopamineを産生すると思われる1年から2年にわたる、長期的な観察が必要である。
巨核球造血におけるホメオドメイン転写因子IRX1の機能解析

正常造血において巨核球は、トロンボポイエチンをはじめとした種々の転写因子が適切な段階で協調的に働くことにより分化・増殖すると考えられている。しかしながらこれら転写因子による制御機構は未だ完全には解明されていないのが現状である。本研究の目的は、ダウン症関連急性巨核芽球性白血病で新たに遺伝子変異が認められた、転写因子IRX1の巨核球分化における機能を明らかにすることである。巨核球分化におけるIRX1の機能を調べるため、1IRX1が巨核球分化に関わる転写因子であることの証明2RNA-Seq解析によるIRX1の下流のパスウェイの探索3ChIP-Seq解析によるIRX1の標的遺伝子の同定について研究を行っている。平成30年度では1本実験に進む前段階となる細胞株の作成、ウイルスベクターの作成2RNA-Seq実施まで実験を行っている。ChIP-SeqによるIRX1の標的遺伝子の同定に関する実験について、ChIPがうまくいかず実験が停滞している。抗体を変更したりするなど、再検討が必要である。1IRX1が巨核球分化に関わる転写因子であることの証明に関する実験については、平成30年度に作成した細胞株やウイルスベクターを使用して、本実験を行う。2RNA-SeqによるIRX1下流パスウェイの探索に関する実験については、データが得られているのでその解析を行う。3ChIP-SeqによるIRX1の標的遺伝子の同定に関する実験については、抗体を変更してChIPを行うなど重点的に取り組む予定である。物品の発注が遅れて年度内に間に合わなかったものがあった。年度は変わったが必要物品であることに変わりはなく、予算額としても少額であり、次年度に円滑に使用できる見込みである。
γ-グルタミントランスペプチダーゼのProcessing Proteaseの追求

腎臓近位尿細管刷子縁膜に結合しているγグルタミルトランスペプチダーゼは細胞内では単鎖の前駆体として合成され、糖鎖が結合したのち、細胞内移行して細胞膜上でプロセシングプロテアーゼによる切断をうけて活性なヘテロニ量体の成熟型酵素になることを明らかにしてきたが、61年度は分離刷子縁膜を用いて、前駆体からヘテロニ量体を生成するプロセシングプロテアーゼの性質を明らかにすることに集中した。Sで標識した分離刷子縁膜を種々のプロテアーゼ阻害剤で処理したのちに37°C30分後に前駆体と成熟体の放射活性を測定することによりプロセシング活性をみると2mM EDTA,EGTA処理で約40%阻害がみられ、2mM phenylmethylsulfonylfluoride(PMSF)処理で約40%阻害が見られた。また2mM EDTAと2mMPMSFの存在ではプロセシング活性の90%が阻害された。一方、種々のプロテアーゼの合成ペプチド基質の効果を同じ系でみるとsuc-ala-pro-ala-MCAや、suc-gly-pro-phe-MCAはプロッセッシング活性を85%阻害し、Boc-val-pro-arg-MCA、Boc-leu-gly-arg-MCA、Ac-ala-ala-tyr-MCAでは30-45%阻害した。ところがBz-arg-MCAやBz-phe-val-arg-MCAでは5mM存在下でもプロセシングは全く阻害されなかった。これらの結果は前駆体のプロセシングに関与するプロテアーゼの基質特異性は極めて高いことをしめしている。さらにプロテアーゼの阻害剤パターンからセリンプロテアーゼまたは金属プロテアーゼが関与しているとおもわれる。また、プロセシングプロテアーゼは膜に結合していると考えられ、TritonX100などの界面活性剤により可溶化した場合は膜標品での活性に比べて30%のプロセッシング活性しか示さなかった。