hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
分岐理論に基づくヒト固有心筋自動能の発生機序並びに合理的制御法の解明

本研究の目的は、ヒト固有心筋細胞モデルを用いた数理生理学的解析により、1)QT延長症候群における早期後脱分極(EAD)発現・伝播の機序と合理的制御方法、2)ヒト固有心筋由来バイオペースメーカー(BP)開発・機能強化のための合理的イオンチャネル発現制御方法を明らかにすることである。平成26年度は、EAD発生機序をSlow-Fast Decomposition Analysisにより明らかにするとともに、ヒト心室筋細胞におけるBP活性発現の非線形力学的機序、BP細胞機能に対する自動能修飾イオンチャネル電流導入効果を解析した。また、内向き整流Kチャネル電流IK1抑制あるいは過分極活性化陽イオンチャネル電流If導入過程において、サドル-ノードまたはホップ分岐により自動能が出現すること、自動能発現性はモデル依存性である(自発性活動電位を再現できるモデルは限られている)ことを明らかにした。さらに、BP細胞と正常心室筋細胞をギャップ結合で連結した多細胞モデルを構築し、自動能調節イオンチャネル導入によるBP機能(自動能のロバスト性および心室筋ドライブ機能)の変化を解析した結果、モデルによらずIf導入のBP機能強化作用は小さく、持続性内向き電流Istの導入(共発現)が効果的であることを明らかにした。26年度が最終年度であるため、記入しない。本研究の目的は、ヒト固有心筋細胞モデルを用いた細胞組織レベルでの数理生理学的解析により、1.早期後脱分極(EAD)発現・伝播の機序と合理的制御方法、2.ヒト固有心筋由来バイオペースメーカー開発・機能強化のための合理的イオンチャネル発現制御方法を明らかにすることである。平成25年度は、まず我々のヒト心室筋細胞モデル(Kurata et al, Biophys J 83:2074-2101, 2005)及び近年公開されたモデル(O'Hara et al, PLOS Comput Biol, 2011;Carro et al, Phil Trans R Soc A, 2011)を用い、QT延長症候群(LQTS)症例の病態と臨床・実験データ(変異チャネルの電気生理学的特性)を基に、遅延整流カリウムチャネル電流(遅い活性化成分IKs又は速い活性化成分IKr)の抑制(LQT1,2)或いはナトリウムチャネル電流(INa)非不活性化成分の増大(LQT3)を設定して、EADを再現できるヒト心室筋LQT1-3モデル細胞を作成した。さらに、ヒト心室筋細胞モデルのパラメータ依存性分岐パターンを非線形力学系の分岐理論に従って解析するための分岐構造解析システムを構築した。ヒト心室筋細胞モデルのパラメータ(IKr, IKs及びL型カルシウムチャネル電流のコンダクタンス等)に依存した分岐構造を解析することにより、ヒト固有心筋におけるEAD発現の条件、力学的機序に関する以下の結論を得た:1.EADは脱分極領域のホップ(平衡点安定化)分岐点近傍で生じる。2.LQTSではシステムのEAD発現領域への近接化(又は領域拡大)によりEAD発現が促進される。3.EADの発現パラメータ領域はIKsのコンダクタンスに依存して拡大し、EADは「遅いIKsの活性化に伴って消失する一過性の周期軌道」と考えることができる。平成25年度の主な目標は、ヒト心房・心室筋細胞モデルのパラメータ依存性分岐パターンを非線形力学系の分岐理論に従って解析することにより、ヒト固有心筋における早期後脱分極(EAD)・バイオペースメーカー活性発現の条件、力学的機序及び制御方法を細胞レベルで明らかにすることであった。研究実績の概要で述べたように、初年度には、遅延整流カリウムチャネル電流(遅い活性化成分IKs又は速い活性化成分IKr)の抑制、或いはナトリウムチャネル電流(INa)非不活性化成分の増大を設定することにより、EADを再現できるヒトQT延長症候群(LQTS)モデル心室筋細胞を作成することができた。さらに、ヒト心室筋細胞モデルのパラメータ依存性分岐パターンを非線形力学系の分岐理論に従って解析するための分岐構造解析システムを構築し、モデル細胞のパラメータ(IKr, IKs及びL型カルシウムチャネル電流のコンダクタンス等)に依存した分岐構造を解析することにより、ヒト固有心筋におけるEAD発現の条件と力学的機序を明らかにすることができた。このように、EADの解析に関しては概ね当初の計画通りに解析が進んでいる。

バイオペースメーカー活性の解析に関しては現在進行中であり、当初の計画よりやや解析が遅れているが、分岐解析システムはほぼ完成しており、多細胞レベルでの解析の準備(モデルシステムの構築)も順調に進んでいるため、総合的には「概ね順調に進展している」と考えている。平成26年度は、早期後脱分極(EAD)発生・伝播機構とその制御方法の解析を推し進めると共に、ヒト心室筋におけるバイオペースメーカー(BP)活性発現の力学的機序、BP細胞のロバスト性・心室筋ドライブ機能に対する自動能修飾イオンチャネル電流導入効果を究明していく予定である。モデルシステムの数値解析にかなりの時間を要するが、平成26年度には多細胞システムの解析を行う予定であるため、モデルシステムのスケール増大に伴って、解析に要する時間が大幅に拡大する可能性が高い。高速処理が可能なワークステーションをさらに1台補充すると共に、HPCシステムの構築・科学技術計算ソフトウェア(MATLAB)のバージョンアップなど、数値計算処理速度をさらに高速化して予定の解析を完了するための方策を講じる予定である。
コンパクトな都市構造が人々のアクティビティならびに交通行動に及ぼす影響の評価

本研究では、高齢者のアクティビティひいては生活の充実度に影響を与える要因として、都市の規模や都市構造、さらには公共交通のサービス水準が、高齢者の活動としてどのようにあらわれ、また生活にどのような影響を与えるかという観点から分析を行い、高齢者に住みよい都市の在りようや、交通サービスの在りようについて検討したものである。都市構造をコンパクトにし,移動を容易ならしめるためには,自動車などの私的交通手段に頼らなくても,自由に移動できる環境が必要である。本年度は,高齢者や障がい者の交通需要の潜在化の状況と,これを顕在化するための都市交通システムのあり方という視点から研究をすすめた。パーソントリップデータを用いてさまざまな分析を行った結果から、交通に時間を割かなくてもよい都市構造や施設配置が高齢者の生活の充実度を高めることがある程度把握することができた。また,コンパクトな都市(コンパクトシティ)における都市機能,住民の評価については,コンパクトシティにおいて空き店舗などを利用して高齢者の社会活動を支援するまちづくり「シルバーコンパクトシティ」に対し、利用者側の一般住民、受け入れ側の商店主とも約90%の賛同が得られ、コンパクトなまちづくりの可能性が示唆された。さらにコンパクトな都市を交通面から支援するタウンモビリティについては、都市中心部のモビリティ改善や中心部の活性化、交流促進にも役立つと期待されていることから、中心部での高齢者の交通手段としての可能性が示された。これらのことから,高齢化がますます進展するわが国の都市において,交通抵抗をできるだけ小さくし利便性を高めるためには,空間的にも,機能的にも,コンパクトな都市づくりが必要であり,さらに交通面からは,都市内の移動を支援する公共交通の充実や,そうした交通システムまでのアクセス支援をあわせて行う必要があることが明らかとなった。本年度は,都市施設の配置状況と人々の交通行動に関する研究実績を踏まえ,コンパクトな都市において,求められる都市の機能とこれをモビリティ面から支援するための一方策であるタウンモビリティの現状と課題について研究を行った。コンパクトな都市に求められる諸機能としては,集会場や公園,コミュニティセンター等,人々の交流が図られる施設が求められていることが明らかとなった。とくに高齢者においては,健康管理について気軽に相談できる施設が望まれていることがわかった。またコンパクトなまちづくりを支援する一方策であるタウンモビリティについては,現在各地で実施されているタウンモビリティの状況を分析した結果,単に電動三輪車を貸し出すだけでなく,利用者のケアや,歩行環境の整備,高齢者だけでなく障害者など,より多くの人々を対象としたしたシステムが必要であり,英国のショップモビリティと比べた場合,わが国のタウンモビリティは,物理的な環境整備のみならず,人的な環境整備,さらには対象とする利用層の設定において,検討すべき状況にあることが明らかとなった。電動3輪車を利用したタウンモビリティシステムについては,都市中心部内のバリアフリー化や,タウンモビリティオフィスの設置だけでは十分ではなく,外出に困難を有している人のために,中心部まてのアクセスサービスや付き添いサービスが必要であることが明らかとなった。また,移動に困難を伴う人のための交通手段として,近年介護タクシーが普及しており,通院という限られた目的ではあるが,自宅から目的地までの移動手段として高く評価されていることが明らかとなった。

さらに2001年に施行された交通バリアフリー法では,公共交通のバリアフリー化において,新規に購入するバスをノンステップまたはワンステップにすることが規定されているが,車いす利用者などの障がい者がこうしたバスを利用するためには,バスのステップの改善だけではなく,こうしたバスが運行しているバス停までのアクセスサービスが必要であることが明らかとなった。これらのことから,高齢化がますます進展するわが国め都市において,交通低抗をできるだけ小さくし利便性を高めるためには,空間的にも,機能的にも,コンパクトな都市づくりが必要であり,さらに交通面からは,都市内の移動を支援する公共交通の充実や,そうした交通システムまでのアクセス支援をあわせて行う必要があることが明らかとなった。
金属一絶縁グラニュラ合金のトンネル伝導と新奇な巨大磁気抵抗効果の機能材料的研究

金属ー絶縁グラニュラ合金薄膜は、磁性金属微粒子と粒子間の絶縁相からなっており、スピン依存トンネル効果に起因する特異な巨大磁気抵抗効果を示す。本研究では、この現象の解明により、トンネル型巨大磁気抵抗の一般的性質に関する理解、および、微小構造体の磁気伝導現象の研究の新展開に寄与することを目指した。また、この系の特徴である高電気抵抗を活用し、磁気センシング材料等への応用研究も行った。CoーAl-Oグラニュラ合金薄膜を中心に、高分解能電子顕微鏡等による微細構造解析、トンネル伝導の測定・評価、磁化過程の測定およびシミュレーションを行い、磁気抵抗の振舞いと比較検討した。その結果、巨大磁気抵抗発現のメカニズムは、基本的には強磁性トンネル接合と同様であることが明らかになった。しかし一方で、低温における磁気抵抗の異常な増大効果や電気抵抗および磁気抵抗の異常なバイアス電圧依存性を見出した。FeーA-O系の低温での磁気抵抗効果は30%を超える大きさである。系統的な測定と理論的検討より、この増大は磁性金属微粒子の帯電効果を原因とする高次のトンネル効果によるものであることを知見した。このような帯電効果に関連する異常な振舞いは、グラニュラ系に特有のものであり、微小構造体の磁気伝導現象として極めて興味深いものである。また、応用上でも、磁気抵抗効果を大きくする指針となり重要である。上記の基礎物性に係わる成果に加えて、グラニュラ系の巨大磁気抵抗の磁場感度を飛躍的に向上させることにも成功した。これは、軟磁性金属と金属ー絶縁グラニュラ合金を微細ハイブリッド化(GIG構造)することによって達成されたものであり、金属ー絶縁グラニュラ合金の高電気抵抗が活かされたものである。軟磁性金属としてパ-マイロを用いた場合には、数O_eの微小磁気で磁気抵抗変化を発現し、高性能磁気センサーや磁気記録ヘッドの応用が期待できる。金属-絶縁グラニュラ合金は、磁性金属粒と絶縁体粒界相からなり、電気伝導は特有のトンネル効果によっている。この系における巨大磁気抵抗は、近年盛んに研究されている一連の巨大磁気抵抗(GMR)の中でも全く新しいものであり、物理的新奇性と応用上の両方から極めて注目されている。そこで本研究初年度には、基礎的振舞いを捉えることに主眼をおき研究し、以下の成果を得た。(1)高周波スパッタ装置により、Co-Al-Oグラニュラ合金に加えて、新たにCo-Si-O,Co-Mg-O,Fe-Al-O,Fe-Si-O,Fe-MgO,Fe-RE-O(RE:Rare Earth),CoFe-Al-O系の試料を作製した。これらにより、酸素との化学親和力がグラニュラー構造を決定する主要因子であることが分かった。また、磁性相のスピン分極率の立場からは、Fe系の方が大きなGMRを示すことが予想されたが、Fe酸化物の生成を示唆する特異な振舞いが見出され、この影響により現在のところ明確な結論は得られていない。(2)電子顕微鏡によるナノ構造解析の結果から、磁性金属粒と絶縁体相の境界が明瞭で、かつ、磁性金属粒サイズおよび絶縁相厚が小さいものほど大きなGMRを示すことが分かった。(3)電気抵抗の温度変化の解析より、比抵抗に比較して、そのトンネル活性化エネルギーが大きい場合に大きなGMRを示すことが分かった。このことは、明瞭な相分離構造や薄い絶縁相等によって理解され、ナノ構造解析の結果と一致している。(4)磁化過程の詳細な測定・解析により、隣合う磁性粒子間の磁化はほとんど結合していないことが分かった。

すなわち、これらのグラニュラー構造薄膜はある臨界温度以上で超常磁性、以下で磁気異方性によるランダムな磁化状態となり、外部磁場により磁化が揃えられる過程でGMRを生じている。磁気応用の一つとして巨大磁気抵抗効果(GMR)が注目されている。これまでに、それを示す物質として磁性人工格子薄膜、グラニュラー磁性合金、磁性トンネル接合薄膜が見出されているが、我々は独自に金属一非金属グラニュラー薄膜において磁性トンネル型の新しいGMRを見出した。この物は、ナノメータ(nm)サイズの極微小トンネル接合がネットワーク状に繋がった絶縁性グラニュラー・システムと見なされ、磁性トンネル接合GMRの起源であるスピン依存トンネル効果の物理を究明する上で極めて興味深い。さらに、高インピーダンス型のGMRという特徴があり応用としても極めて注目される。本研究は、これらについて3カ年に亙って系統的研究を行うものである。本年はその2年次であり、以下の実験的研究を行い重要な成果を得た。1)磁性金属(Co,Fe)と酸化活性な金属(Al,Si,Mg,RE等)からなるターゲットをAr+Oガス中でスパッタし、種々の金属一非金属グラニュラー薄膜を合成する実験を行った。2)X線回折、電顕、STMにより、適切なスパッタ条件のときに約5nm径の粒状Fe,Coが約1nm幅の酸化物に取り囲まれたグラニュラー構造の薄膜が得られることが分かった。酸化物はAl_2O_3、SiO_2、MgO,RE_2O_3に近い組成になっているが、構造は化学量論化合物と同じかは未だ不明である。Al-O系はむしろアモルファスに近いことが分かった。4)電気抵抗のO濃度、温度、磁場依存性から、いずれの系でも金属粒子が酸化物で分離されるパーコレーション閾値以上でトンネル伝導を示し、同時にスピン依存トンネル効果によるGMRが現れることが分かった。閾値は酸化物の種類に依存することが分かった。5)ホール効果の測定を開始し、閾値以上でホール効果が通常と異なることを見出した。金属-絶縁グラニュラ合金薄膜は、磁性金属微粒子と粒子間の絶縁相からなっており、スピン依存トンネル効果に起因する特異な巨大磁気抵抗効果を示す。本研究では、この現象の解明により、トンネル型巨大磁気抵抗の一般的性質に関する理解、および、微小構造体の磁気伝導現象の研究の新展開に寄与することを目指した。また、この系の特徴である高電気抵抗を活用し、磁気センシング材料等への応用研究も行った。Co-Al-Oグラニュラ合金薄膜を中心に、高分解能電子顕微鏡等による微細構造解析、トンネル伝導の測定・評価、磁化過程の測定およびシュミレーションを行い、磁気抵抗の振舞いと比較検討した。その結果、巨大磁気抵抗発現のメカニズムは、基本的には強磁気性トンネル接合と同様であることが明らかになった。しかし一方で、低温における磁気抵抗の異常な増大効果や電気抵抗および磁気抵抗の異常なバイアス電圧依存症を見出した。Fe-Al-O系の低温での磁気抵抗効果は30%を超える大きさである。系統的な測定と理論的検討より、この増大は磁性金属微粒子の帯電効果を原因とする高次のトンネル効果によるものであることを知見した。
微小管構造と動態のイメージング

1.微小管重合核複合体の動態をγチューブリン複合体構成タンパク質GCP2およびGCP3を用いてライブイメージング解析することにより、植物間期細胞の表層微小管の形成過程を観察した。微小管切断タンパク質カタニンにより新規に重合した微小管がそのマイナス端で切り離される過程を、蛍光標識カタニンを使って解析した結果と合わせて、国際細胞生物学誌に発表した。重合核が既存の表層微小管側部との相互作用で安定化された際に、重合活性が増大すること、娘微小管がカタニンにより切り離されたり、プラス端からの脱重合により消失した場合には、重合核は不安定となり、親微小管側部から乖離すること、などを含む表層微小管重合核のリサイクリングモデルを提唱した。2.新規の微小管付随タンパク質および微小管重合核複合体構成因子を同定するために、アラビドプシス培養細胞から調整した細胞質に富むプロトプラストから微小管結合性タンパク質を濃縮し、その中から微小管結合性新規タンパク質候補を多数同定した。GFP融合タンパク質をmCherry微小管標識マーカーと共にアラビドプシス細胞で一過的に発現させたところ、複数のタンパク質が表層微小管に局在した。特に、ひとつの候補因子は表層微小管の重合開始点に局在することが判明した。現在、これらの微小管局在タンパク質遺伝子のT-DNA挿入変異株の表現形を解析している。1.種々の植物組織において、間期およびM期の微小管(微小管全体、プラス端、マイナス端)を蛍光標識できるGFPマーカー系統を確立した。微小管全体はチューブリン、プラス端はEB1,マイナス端はγチューブリン複合体構成因子を用い、必要であれば該当遺伝子自身のプロモーターを用いて、適度の発現レベルで標識マーカーを発現させた。2.微小管重合核複合体の動態をGFPマーカーを用いて解析することにより、動的な重合核複合体が表層微小管壁と相互作用することにより、重合能が活性化されることが判った。微小管を重合した後の重合核複合体は微小管切断タンパク質カタニンにより新規に重合した微小管がそのマイナス端で切り離されるか、新規微小管のプラス端が重合核まで脱重合することにより、重合核は不安定化し、母体の微小管壁から遊離する。これらの観察結果より、植物間期細胞の表層微小管の形成過程モデルを提唱した。3.アラビドプシスEB1cイソフォームがC末端の核移行シグナルにより分裂前の核内に蓄積し、紡錘体微小管の構築に重要な役割を果たすこと、また細胞質局在性のEB1イソフォームによりその機能は充分には代替できないこと、をin vitroの生化学的解析、変異株の表現形解析、各種EB1-GFPの細胞内局在性、各種EB1コンストラクトによる変異株の相補解析、などにより明らかにした。
脳性麻痺児の「個にとっての意味」を重視したライフ・ベースト・サポートモデルの構築

本研究は、脳性麻痺児をより自律的な生活者へと育てるためライフ・ベースト・サポートモデル(LBSM)を提唱し、その定式化を試みた。その成果として、従来の障害診断と教育的アプローチに、生活履歴(ライフ・ヒストリー)という当事者の通時的側面の情報を加えることで、介助者には対象に即したより包括的な支援の視点を、そして、脳性麻痺児には自律的な判断の機会を提供する手続きを組み込んだサポートモデルを構築できた。本研究は、肢体不自由児を自律的な生活者へと育てるためのライフ・ベースト・サポートモデルの構築であり、自己決定能力を高めることを中核とする。このため、日常生活での自己決定場面を対象として、判断実施後の省察過程とこれを支援する手続きを明確化する。省察とその支援のために対象者の自己決定時の言動と状況への対処行動を映像記録した。この記録映像をもとに対処判断と行動計画の過程を言語化させながら支援者が質問を加えた。質問の観点は、特定状況に対する「知識」、これに基づく「自己能力の評価(自己認識)」、「対処方法の選択理由」、「結果の評価(事実判断)」、「結果に対する満足度とその理由(価値判断)」とした。省察後、同状況に対して再対処させ、個人の満足度が満たされるまで繰り返した。これらの資料をもとに、個人にとっての「意味」の生成に関わる要素とこれらの関係を検討し、支援者が状況に対する意味を解釈する際の手続きを検討した。結果、状況への対処には、その理解と対処後の状況変化イメージ(達成イメージ)が影響した。すなわち、達成イメージに基づく自己能力評価の低さが効力感を低め、対処行動の動機を低下させる悪循環が明らかとなった。この悪循環を断つ上で、達成イメージの修正が有効であった。達成イメージの修正により、状況理解のための知識が修正された。このことは対処のための自己能力評価を変えて効力感を高めた。その後、行動動機の高揚が見られ、これに伴い対処行動の頻度が高まり種類も多様化した。結果、特定状況への知識量が増加した。これより、知識が自己認識を方向付け、両者の関係で効力感が決まり、対処行動の計画と満足度に影響する力動的な関係が確認できた。肢体不自由児には、運動機能障害故に行為の介助・代行され易い、行為時間が十分に確保されない等、生活における行為主体の経験の積み方が生活事象への知識を歪めると思われた。研究遂行のための時間確保に苦慮し、当初予定していた実践者に対する研究成果の公開と意見聴取、教育・医療・福祉専門職との検討の機会が十分に持てなかった。今後、この機会の確保に努める。本研究は、脳性麻痺児をより自律的な生活者へと育てるためライフ・ベースト・サポートモデル(LBSM)を提唱し、その定式化を試みるものである。28年度は、LBSM原型による支援計画の策定と実践検証(検討課題2)に取り組んだ。1)LBSM原型の作成のために、まず「個にとっての意味」の解釈過程を支援計画策定過程に組み入れたLBSM原型を作成した。その際、下記視点からの検討を行いつつ、計画および支援・評価に関する妥当性を検証した。1障害実態把握方法(診断的評価)の検討、2支援計画の目標に即した指導目標・内容の検討、3生活・教育環境設定の可能性を含めた指導内容・方法(形成的評価方法)の検討、4遡及的資料と形成的資料の分析・総合による支援計画目標の再検討、5本人・家族の自己評価を含めた総括的評価方法の検討、6基礎資料の再検討、7実践資料(基礎資料・診断的評価・形成的評価・総括的評価等)の蓄積方法についての原型書式を作成できた。2)本人と支援者の恊働性の解明に取り組んだ。本研究では、支援をインフォームド・コンセントから、さらに発展させたインフォームド・コオペレーションの過程として実施し、当事者との「協力関係」を強化する試みを行った。結果、本人の自己決定能力を増進し、実行結果から自覚的に現状問題を学ぶことに重要な意味をもち、本人の自己管理行動における自律性獲得に大きく役立つものと期待できた。一方で、インフオームドコオペレーションの効果の最大化を求める上で、生活状況の変更や本人・家族の障害受容、価値観の変化に伴う支援内容の修正が必要とされた。この他、協働関係の形成に困難さをもたらす要因として、支援者の専門性(職業)に対する当事者のイメージの影響が大きいことがわかった。このことは、当事者の「生活ニーズ」をもとに、専門的知見の活用を検討する上で課題となった。28年度までに計画した課題については概ね順調に遂行できている。その上で、H28年度に実施した検討課題2の一部である「本人の自立性を育成するための専門家との協働性の解明」において、支援する専門性に対して当事者が抱くイメージの関与の影響がわかった。この課題については、H29年度課題の遂行と合わせて、実施する。本研究は、脳性麻痺児をより自律的な生活者へと育てるためにライフ・ベースト・サポートモデル(LBSM)の定式化を試みるものである。最終年度は、1 )脳性麻痺児10例の自己決定支援から得られたLBSM原型に事例を加えて汎用性検討を行い、2)手続きと支援モデルを成果として小冊子にまとめた。また、3)脳性麻痺に加えて、筋原性疾患児、脊髄脊椎疾患児、骨系統疾患児を加え、運動機能制限による行為制約と自己決定能力形成の関係も検討した。

1)原型に事例を追加しての汎用性検討からLBSMの構築:本研究のLBSMは、当事者(本人と家族)と支援者による協働企画・実施・評価過程である。この過程は、1本人のニーズを具体化して、活動目標の設定。2活動実行過程。3活動省察過程。4省察・評価過程、5総括過程(満足度・目標知識と実行する自己への認識の更新)から成る。各過程での支援要件について、1では、到達の具体的生活像をイメージすること、そのための目標に対する既有知識量・知識内容の適正さが影響した。既有知識の適正化により到達目標が修正されて行動実行が促進された。目標決定には、到達目標についての知識提示や自己能力の認識についての確認・評価情報の提示が重要である。このため、234では実行結果と自己能力へのセルフモニタリング向上のための介入支援が有効かつ重要であった。5では、活動を通しての満足度を中心に目標に関する知識と自己認識を更新させる介入が重要であった。2)LBSMの理論と実践の小冊子をまとめた。3)運動機能制限による行為制約と自己決定の関係:発達期にある筋原性疾患児、脊髄脊椎疾患児、骨系統疾患児では生活行動に介助・代行を受けることが多く、生活事象の知識不足、介助・代行される存在としての自己認識が効力感に影響することがわかった。ニーズに即して、行動時間の十分な確保と遂行・省察介入過程が重要である、本研究は、脳性麻痺児をより自律的な生活者へと育てるためライフ・ベースト・サポートモデル(LBSM)を提唱し、その定式化を試みた。その成果として、従来の障害診断と教育的アプローチに、生活履歴(ライフ・ヒストリー)という当事者の通時的側面の情報を加えることで、介助者には対象に即したより包括的な支援の視点を、そして、脳性麻痺児には自律的な判断の機会を提供する手続きを組み込んだサポートモデルを構築できた。肢体不自由児は、普段の生活行為において、介助・代行されやすく、また、行為時間を十分に確保されにくい(支援者による見守りの不十分さ)。このような生活状況は、生活事象がもつ状況に際して個が抱く意味に影響することが明らかとなった。そして、この意味に影響する要素(知識・これに基づく自己能力の評価(自己認識)・対処方法の想起・結果の評価の事実判断・結果に対する満足度(価値判断))とその力動的関係を同定した。これより、今後、状況判断と対処にかかる各過程とそこでの要件を規定した支援の原型モデルを作成する。下記の検討課題を遂行する。検討課題1:ライフ・ベースト・サポートモデルの原型作成:原型作成のための対象者を「幼児・低学年期」「中学年期」「高学年期」「中学部期」「高等部期」「成人期」の6つのライフステージにある者とし、発達特性を考慮した類型モデル(原型)を作成する。そして、原型モデルの適用には、その手続きをリードするためのワークシートを作成する。検討課題2:対象者と支援者の協働性の解明:類型モデル検証には、インフォームド・コンセント(専門職からの一方向的説明と実施)をさらに発展させたインフォームド・コオペレーション(協働企画・実施・評価)の過程として実施する。本研究は、自律的な生活者へと育てることを重視する。これまで取り上げられることが極めて少なかった対象者の満足度を指標として、対象者の満足度と自己管理行動の動機付けの変容の関係を検討する。
児童用白杖グリップの開発と児童用白杖導入マニュアルの作成

2年目になる2018年は,白杖グリップの周径を小,中,大の3種類を学外杖製作所に製作依頼した,それぞれのグリップの使用時における上肢筋電位を採取した,グリップの周径は小;79-91mm,中;87-103mm,大;95-110mm,重量は小;219g,中;219g,大;241gであった.採取した対象筋は前腕部の手指屈筋群,手指伸筋群,腕橈骨筋,上腕筋の4筋とした,筋電計はS&ME社BioLog,電極はアクティブ電極DL-141(電極間距離12mm)を筋腹中央部の置いた.筋電位解析はDKH社のTRIAS2を用いた.採取した筋電位には10Hz450Hzのバンドパスフィルターをかけ,全波整流後に課題開始から0.5秒間の電位のRMSを算出して比較検討した.白杖操作の課題は,1安静,2床からの挙上,3タッピング,4スライディング法であり,各々の操作時の電位を記録した.対象は上肢に外傷や疾病歴がない18歳から40歳の女性11名で平均年齢は21.1歳であった.また,基本情報として,手掌の長さと中指の長さを測定した.統計はStatFlex ver.6.0を用いて,グリップ径と筋電位は群間比較,指と手掌の長さと筋電位は相関関係をみた.結果:1)グリップ径と筋電位の関係は1手指屈筋群ではグリップ「小」の電位が全ての操作において高く,「中」の電位は低かったが,有意差はなかった.2手指伸筋群はグリップ「中」が全ての操作において平均電位が高い傾向であったが,有意差はなかった.3腕橈骨筋はグリップ「中」がliftにおいて平均電位が高い傾向であったが,有意差はみられなかった.さらに,全盲の女児(7歳)に一例み対し,3種類のグリップ使用時の筋電位を測定し,電位量を比較したが有意な差はなかった.しかし,従来の白杖グリップと比較し握りやすいという意見があった.グリップを製作して,その使用状況を確かめる段階まで到達している.データの解析も順調に進んでいるが,予定していた,白杖操作および訓練に関するマニュアル制作の進行が若干遅れている.遅れている理由は初年度に採取したデータを基に英文での論文作成に費やしたためである.その結果,British Journal of Occupational Therapy 4月号に掲載された.3年目の課題は,下記の3つである.1白杖操作および訓練マニュアルの作成2視覚障害児の杖操作中の筋電図採取3日本語論文の作成(日本語論文は,晴眼児童と視覚障害児童の杖操作時の筋電位の比較)以上.初年度は,1研究対象者の選出と基本情報の取得,2白杖の操作において,杖を床に接触する力を測定する床反力計の製作依頼を行った.対象者の選出においては,白杖訓練を実施していない全盲視覚障害児としたため,対象者を見つけることに苦労した.視覚障害者の関係団体等の協力を得て,7歳の白杖未経験者を選出できた.この対象児は現在普通小学校の特別支援学級に通学している.両親も協力的で本研究に対して同意をいただいた.初年度は,対象児の基本データとして,安静時の右上肢の前腕筋である杖を握るために必要な手指屈筋群と手関節を伸展させる手関節伸筋群の筋電位,さらに物体のつまみ,箸の操作時の筋電位を記録した.しかし,小学1年生であること,こちらの意図を伝えることに苦労している.白杖の操作では,床に杖を接触させて床からの情報を取得する.そのためには,杖を移動するために力が必要である.その力を測定するために床反力を測定することで示すことが可能である.今回は,3方向(左右,前後,垂直)の力を測定可能な床反力計を特注した.この床反力計は可搬型であり,パソコンとUSBでつながり,継続的に簡単に測定が可能である.白杖の握り部(グリップ)の製作は長野県内の杖製作所打ち合わせをして.2年目に現存するグリップの形状の握り部を10%太くしたもの,10%細くしたものを製作する打ち上せが終わっている.グリップ部の材質は発泡性材料とシリコーン製を準備している.今年度は試験グリップを実際に使用するに当たり,杖を操作する上肢の筋電図だけではなく,脳活動(脳波)も同時に記録する予定である.グリップ部の設計が難しいところであるが,製作業者(社長および設計者)が協力的であり,順調に進んでいる.2年目になる2018年は,白杖グリップの周径を小,中,大の3種類を学外杖製作所に製作依頼した,それぞれのグリップの使用時における上肢筋電位を採取した,グリップの周径は小;79-91mm,中;87-103mm,大;95-110mm,重量は小;219g,中;219g,大;241gであった.採取した対象筋は前腕部の手指屈筋群,手指伸筋群,腕橈骨筋,上腕筋の4筋とした,筋電計はS&ME社BioLog,電極はアクティブ電極DL-141(電極間距離12mm)を筋腹中央部の置いた.筋電位解析はDKH社のTRIAS2を用いた.採取した筋電位には10Hz450Hzのバンドパスフィルターをかけ,全波整流後に課題開始から0.5秒間の電位のRMSを算出して比較検討した.

白杖操作の課題は,1安静,2床からの挙上,3タッピング,4スライディング法であり,各々の操作時の電位を記録した.対象は上肢に外傷や疾病歴がない18歳から40歳の女性11名で平均年齢は21.1歳であった.また,基本情報として,手掌の長さと中指の長さを測定した.統計はStatFlex ver.6.0を用いて,グリップ径と筋電位は群間比較,指と手掌の長さと筋電位は相関関係をみた.結果:1)グリップ径と筋電位の関係は1手指屈筋群ではグリップ「小」の電位が全ての操作において高く,「中」の電位は低かったが,有意差はなかった.2手指伸筋群はグリップ「中」が全ての操作において平均電位が高い傾向であったが,有意差はなかった.3腕橈骨筋はグリップ「中」がliftにおいて平均電位が高い傾向であったが,有意差はみられなかった.さらに,全盲の女児(7歳)に一例み対し,3種類のグリップ使用時の筋電位を測定し,電位量を比較したが有意な差はなかった.しかし,従来の白杖グリップと比較し握りやすいという意見があった.グリップを製作して,その使用状況を確かめる段階まで到達している.データの解析も順調に進んでいるが,予定していた,白杖操作および訓練に関するマニュアル制作の進行が若干遅れている.遅れている理由は初年度に採取したデータを基に英文での論文作成に費やしたためである.その結果,British Journal of Occupational Therapy 4月号に掲載された.研究の進捗は順調であり,8月にはグリップ部の試作品が完成するので,完成後に対象者に試用していただき生体情報を記録する.さらに,小児用白杖操作法に関した使用マニュアルも同時に進めていく.3年目の課題は,下記の3つである.1白杖操作および訓練マニュアルの作成2視覚障害児の杖操作中の筋電図採取3日本語論文の作成(日本語論文は,晴眼児童と視覚障害児童の杖操作時の筋電位の比較)以上.身体機能を測定する器具のソフトウエアの購入を予定していたが,新規開発が遅れ,2年目に購入予定としている.最終年度は,白杖操作マニュアル作成に予算が必要になるので,残してある.また,今年度は,被験者に謝金は必要なかったが,来年度はわからないために残してある.
びまん性大脳白質病変の病態の研究-剖検脳MRIと拡散強調画像を用いた検討-

1.剖検脳MRIと病理所見の対比検討を95例で行い,びまん性大脳白質病変に関しては,アルツハイマー型痴呆(DAT)2例,Binswanger病3例,Creutzfeldt-Jakob病(CJD)3例,intravascular lymphomatosis(IVL)1例,パーキンソン病3例で検討可能であった。Binswanger病では,半卵円中心を中心とした大脳白質は,髄鞘染色および軸索染色でびまん性の淡明化を示し,アストロサイトの反応は乏しく,まだら状の分布を示した。U-fiberおよび脳回内白質は病変を免れるかあっても軽度であった。一方,CJDでは変化は白質全体に及びU-fiberは保たれていなかった。DATでは,白質の変化は側頭葉に強く,前頭・頭頂葉では比較的軽度であった。IVLでは,白質の変化は虚血による変化と区別できなかった。2.拡散強調画像(DWI)を用いた拡散異方性の検討は,脳血管性痴呆(VD)8例,DAT8例,正常対照者5例,その他15例で行った。VDでは,前頭・頭頂後頭葉深部白質におけるADC値は他の2群に比べ有意に高値を示した。また,同部のFA値は他の2群に比べ有意に低値を示し,大脳白質の拡散異方性がびまん性に障害されていた。一方,DATでは深部白質のT2強調像での信号上昇は軽度で,前頭・頭頂後頭葉深部白質におけるADC値は正常対照群と比べ有意な変化が見られなかった。しかし,FA値の検討では正常対照群に比べて頭頂後頭葉白質で有意に低値を示し,DATでは前方白質に比し後方白質での異方性拡散の障害が顕著であった。以上の結果から,MRIはびまん性大脳白質病変を忠実に描出しており,DWIによる異方性拡散の評価を加えることで,MRIはびまん性大脳白質病変の鑑別診断に有用であるとの結論を得た。今後は,剖検例MRIと病理所見の更なる詳細な検討を加える予定である。MRIのT2強調画像で,側脳室周囲や深部白質に認められるびまん性高信号域はleuko-araiosisと呼称されるが,本研究の目的はこの病理学的背景を明らかにすることである。平成10年度は,これまで35例の剖検脳をホルマリン固定後に,MRIの撮像を施行した。その結果,うち6例においてはleuko-araiosisの所見を認めた。MRIを撮像後,剖検脳のカッティングを行い,病理標本を作成後に,Creutzfeldt-Jakob Disease(CJD)と若年性パーキンソン病の2例については剖検脳MRIと病理所見の詳細な対比を行った。1例のCJDについては,生前のMRIを含めて検討した。白質の変化が著しい全脳型CJDにおいては,leuko-araiosisは側脳室周囲深部白質から皮質下白質への進展を示した。剖検脳MRIでは,すでにほぼ白質全体に及んでいた。病理所見では,白質は皮質と共に著しい海綿状変化を示していたが,gemistocytic astrocyteやmacrophageの著しい浸潤を認めた。

これらの変化は,CJDにおける白質の変化をワーラー変性とする従来の報告とは矛盾し,あくまでも一次的な変化をとらえているものと考えられた。また,MRI上ではCJDと似た白質の高信号を示した若年性パーキンソン病においても,病理学的には一次的な変化と考えられた。一方,エコープラナー法を用いた拡散強調画像による検討では,leuko-araiosisを認めた3例に施行したがいずれも虚血性変化によるものであり,アルツハイマー型老年痴呆で認められる変性に伴うleuko-araiosisとの比較に関しては,今後の症例の蓄積を待たねばならない。MRIで認められるleuko-araiosisの病理学的背景を明らかにする目的で、平成11年度はホルマリン固定後に剖検脳30例のMRIを撮像した。その結果、うち3例においてleuko-araiosisの所見を認め、いずれもBinswanger病によるものであった。病理学的には、半卵円中心を中心とする大脳白質は、髄鞘染色および軸索染色でびまん性の淡明化を示し、有髄線維は減少しアストロサイトの反応は乏しく、まだら状の分布を示していた。U-fiberおよび脳回内の白質は病変を免れるか、あっても軽度であったが、MRIはこれら所見を明瞭に反映し、その診断における有用性が確認された。一方、エコープラナー法を用いた拡散強調画像による検討では、leuko-araiosisを認めた10例に施行した。その内訳は脳血管性痴呆4例、アルツハイマー型老年痴呆3例、intravascular lymphomatosis(IVL)2例、Methotrexate白質脳症1例である。IVLの2例のみが拡散強調画像で淡い高信号を示し、ADC値の有意な低下を認めた。この所見は、T2強調画像で血管障害と類似した所見を呈するIVLの診断に拡散強調画像が有用であることを示唆している。また、脳血管性痴呆とアルツハイマー型老年痴呆における白質病変の鑑別については、ADC値の差違を検討するには今年度までの症例が少なく、平成12年度の症例の蓄積を持って評価する予定である。脳血管性痴呆4例、アルツハイマー型痴呆4例、intravascular lymphomatosis(IVL)1例に対してMRI・T2強調像と拡散強調像を施行した。拡散強調像はb=1000sec/mm^2にてMPGを体軸方向、左右方向、前後方向に印加して撮像し、MPGを印加しないb=0の画像を得て、拡散強調像(trace画像)、ADC map、anisotropyを得た。脳血管性痴呆症例ではT2強調像にて大脳深部白質に高信号域が広範に広がり、拡散強調像にて信号上昇はみられず、ADCは有意に上昇し、anisotropyにて拡散異方性の低下がみられた。アルツハイマー型痴呆では深部白質のT2強調像の信号上昇は軽度で、拡散強調像での信号、ADCに顕著な変化はみられなかった。IVLではT2強調像にて大脳半球深部白質に広範にひろがる高信号域が認められ、拡散強調像ではT2強調像の高信号域に一致して信号の上昇がみられた。深部白質のADCはやや上昇し、拡散異方性は低下した。拡散強調像の信号の上昇はT2 shine throughによるものと考えられ、IVLのADCの上昇の程度は脳血管性痴呆症例に比して軽度であった。剖検脳と病理組織所見との対比により脳血管性痴呆の高信号病変は深部白質の髄鞘の淡明化と有髄線維の減少に対応した。IVLの深部白質の高信号病変は梗塞(anemic infarct)の像に対応し、悪性リンパ腫細胞は全脳の血管(動脈、毛細管、静脈)内に限局して観察され、血管外脳実質にはみられなかった。脳血管痴呆ではニューロンの減少や髄鞘の消失を反映し、ADCが上昇して異方性拡散の障害をきたすと考えられる。
昆虫の脳の組織図譜と機能地図の作製:高次神経機能の神経解剖学的、神経生理学的基礎

1)本研究では昆虫の脳の構造と学習能力を比較することで、脳の機能を解明を試みた。行動学的に対極にあるワモンゴキブリとオオスズメバチについて特に詳しい実験を行った。2)キノコ体は前大脳の最大の構造であるが、キノコ体内在性のニューロンは軸索や樹状突起をキノコ体の外に出すことはない。そのため、キノコ体は入力繊維から情報を受け取り、それを統合あるいは一旦蓄積し、出力繊維に信号を伝えると考えられる。内在性のニューロンは小さく、その応答は現在のところ記録できない。2種で脳の構造を比較すると、キノコ体の差異が顕著であった。オオスズメバチのキノコ体はワモンゴキブリに比べ、より高度にかつ複雑に構成されていた。他方、前大脳のもう1つの顕著な構造である中心体についてはこれら2種を含め、調べた数種の昆虫で顕著な差異は認められなかった。3)これら2種の昆虫の学習記憶に関して以下の結果を得た。オオスズメバチは巣と餌場の間を往復する。この採餌行動には複数の記憶が利用される。野外観察、実験室内観察でスズメバチは運動系のプログラムの記憶、途中の目印を利用した飛翔経路の調節、広い視野でのイメージ照合、ゴール(あるいは餌場)の特徴の記憶を利用することを明らかにした。他方、ワモンゴキブリは自然状態で戻るべき巣を持たず、外界の化学的、機械的刺激に対して、ステレオタイプの応答をすることで生存できる。実験的にも、ワモンゴキブリの学習能力は乏しく、若干の連合学習の可能性しか証明できなかった。4)以上の結果から、キノコ体の構造的複雑さと昆虫の学習との間の相関が示唆された。これはアリやミツバチなど主な行動が学習に基盤を持つ種では、オオスズメバチと同様に複雑なキノコ体を持つことからも支持される。中心体の機能については破壊実験や局所刺激の結果から、運動の方向性の調節が示唆された。本年度は昆虫の脳の立体構造を比較し、脳の各部の機能の解析を行った。従来、研究者が「昆虫の脳と言う用語を用いる場合、種間の違いなどは考慮されず、昆虫の脳には一律の定型的イメージがあった。昆虫の脳は、キノコ体、嗅葉、中心体およびこれらを囲む神経叢からなる。本研究では、ミツバチ、トノサマバッタ、ワモンゴキブリ等行動様式の異なる昆虫の脳を連続顕微鏡写真から立体構築し、これらの主要な構造について検討した。嗅葉、中心体は種を越えて類似の形態を示した。ただし、嗅覚を諸行動の手がかりとするワモンゴキブリ、ミツバチでは他の昆虫に比べ嗅葉が発達していた。キノコ体の構造は明確な種間差を示した。ワモンゴキブリ、トノサマバッタ、ミツバチではキノコ体のサイズそのものはほぼ同じであった。しかしながら、ワモンゴキブリではその形態は単純なキノコ状であるのに対し、ミツバチではサブ構造からなる複雑に入り組んだ形態を示した。これは、脊椎動物の脳が基本的構築は同じでありながら、進化過程でより複雑な形態に変化することに似ている。昆虫についても、ワモンゴキブリでは摂食行動、配偶行動が化学刺激、フェロモンでステレオタイプに解発され、彼等は戻るべき巣も持たない。他方、ミツバチの行動には、蜜源の花の色学習や形態学習、餌場と巣のコースの学習記憶持等高次なものが多い。ミツバチのキノコ体の構造的複雑さは、より高次の脳機能を反映している可能性がある。

これら脳構造の微細構造レベルでの研究は現在継続中であるが、ゴキブリの脳のニューロン構築はミツバチのそれに比べ単純である感触を得ている。本研究は脳の各部のニューロン構築を調べることで、昆虫の脳の機能を探ることを目的とした。昆虫の脳には視葉、嗅葉、キノコ体、中心体などの明確な構造が区別される。これらの構造を組織学的に調べると共に、各構造の微小破壊や局所電気刺激の効果から各部の機能を追究した。さらに、行動様式の異なる昆虫の脳を比較することにより各部の機能を検討した。1,系統学上古いとされるワモンゴキブリと最も進化したミツバチの脳を比較した結果、キノコ体の構造に顕著な差異が認められた。両種共、キノコ体はカサ、柄、α葉、β葉からなり、その配置は類似していた。ミツバチでは杯状のカサの部分に縁、側面底面が区別され、柄の部分でもこの3区分は明確であった。他方、ワモンゴキブリではカサ、柄とともに均一な形態を持つ、ミツバチの発達したキノコ体は、この種に特徴的な高い学習能力を反映している可能性を示唆している。2,膜翅目のアリ、スズメバチのキノコ体もミツバチと同様複雑な形態を示すことから、キノコ体の発達は社会性と関連すると考えられる。これは、非社会性の昆虫であるハエ、甲虫、トンボなどのキノコ体が相対的に小さいこと、バッタではカサの一部が欠落していることからも裏付けられた。3,キノコ体はカサの部分で入力を受け、α葉、β葉で出力ニューロンに連絡する。キノコ体の内在ニューロンはキノコ体の外に樹状突起や軸索をのばすことはない。この形態からキノコ体は異種感覚の統合を連合学習の場であることが示唆された。4,中心体は脳の中心部に位置する左右相対の構造である。種間による差異が少なく、この部分の電気刺激や破壊が個体の異常な回転運動を引き起こすことから、中心体は歩行や飛翔時の方向転換に関わると考えられる。5,嗅葉、視葉も種特異的構造を示すが、感覚入力の場であるので、詳細は割愛する。
カキ培養細胞を用いたノロウイルス濃縮法の開発

ノロウイルスを濃縮するための手段として,カキ中腸線細胞培養の培養条件を検討した.その結果,LDF培地(50% D-MEM, 35% F-12, 15% L-15)に,10% FBS,10 μg/ mlインシュリン,10 nM亜セレン酸ナトリム,5.5 μg/mlトランスフェリン, 2 mM GlutaMax, 0.1 x MEM非必須アミノ酸を添加することにより,中腸線由来の細胞は培養容器に接着し増殖することを確認した.ノロウイルスを濃縮するための手段として,カキ中腸線細胞培養の培養条件を検討した.その結果,LDF培地(50% D-MEM, 35% F-12, 15% L-15)に,10% FBS,10 μg/ mlインシュリン,10 nM亜セレン酸ナトリム,5.5 μg/mlトランスフェリン, 2 mM GlutaMax, 0.1 x MEM非必須アミノ酸を添加することにより,中腸線由来の細胞は培養容器に接着し増殖することを確認した.我が国において,ノロウイルス(NV)食中毒事件は社会的な問題になっている.NV食中毒の原因食品は,主にカキなどの二枚貝であるが,近年は,青果物によるNV食中毒事件も報告されている.現在,糞便からのNV検出にはRT-PCR法が用いられているが,食品検査に応用した場合,食品マトリックスの影響を受けることや,食品のNV汚染濃度が少ないなどの理由により,十分な検出感度が達成されていない.このため,安全な食品を提供するためには,食品の前処理や試料中からのNV濃縮法の開発を含めた検査法の開発が急務である.本研究は,NV濃縮法について,NVを体内で濃縮すると考えられているカキの中腸線由来の培養細胞株の樹立を試み,さらにその細胞を用いたNV濃縮法を開発することを目的としている.本年度はカキ中腸線の細胞培養の最適化を行った.試料として用いたマガキ(Crassostrea gigas)は,福岡県唐泊漁業組合の販売所にて購入した.購入したカキは,滅菌水で調製した人工海水(18°C)の水槽で2436時間飼育後に中腸線を取り出した.取り出した中腸線は,LDF培地(50% D-MEM,35% F-12,15% L-15)にて洗浄後,同培地中で細かく刻んだ後に,抗生物質および種々の増殖因子を添加したLDF培地で初代培養を行った.その結果,通常の補助因子の他に,上皮成長因子(EGF)あるいは繊維芽細胞上食因子(FGF)を添加することにより,培養容器に接着し増殖することを確認した.なお,中腸線については,RT-PCR法により中腸線中にノロウイルスが存在しないことを確認したものを使用した.これまで,カキについては細胞培養の報告はなく,今後この細胞がNVに対しどのような相互作用を持つかなど,細胞の特性を明らかにすることが必要となる。日本において,ノロウイルス(NV)食中毒事件は社会的な問題になっている. NV食中毒の原因食品は,主にカキなどの二枚貝であるが,近年は,青果物によるNV食中毒事件も報告されている.現在,糞便からのNV検出にはRT-PCR法が用いられているが,食品検査に応用した場合,食品マトリックスの影響を受けることや,食品のNV汚染濃度が少ないなどの理由により,十分な検出感度が達成されていない.このため,安全な食品を提供するためには,食品の前処理や試料中からのNV濃縮法の開発を含めた検査法の開発が急務である.本研究は, NV濃縮法について, NVを体内で濃縮すると考えられているカキの中腸線由来の培養細胞株の樹立を試み,さらにその細胞を用いたNV濃縮法を開発することを目的としている.本年度は,昨年に条件を決定した培養条件でのカキ中腸線由来細胞の大量培養を行なった。まず,カキ培養細胞の継代にかかる期間は26週間程度かかること,研究で用いるマガキ(Crassostrea gigas)が入手可能な期間が、103月であることを考慮し、研究室内でのマガキ飼育法を検討し,細胞の大量培養の準備を行なった。その結果、人工海水として、リーフクリスタル(インスタントオーシャン社)を18°Cにおける比重が1.025となるように調製し、エサとしては植物性プランクトンであるナノクロロプシス,テトラセルミスおよびイソクリシスを含むフィトプレックス(ケントマリン社)を50 L水槽に対して、2日間に5 mlずつ与えることにより,市販のカキは6ヶ月以上生存し、その間の個体の重量の現象も5%程度であることを確認した.また,細胞培養条件の再検討を行なった結果,コラーゲンI型でコーティングした容器を用いることにより,初代培養における細胞の付着が促進されることを見いだした.哺乳類の細胞と違い,今回の研究で使用している細胞の培養温度は18°Cである.研究代表者は以前サメの細胞培養を行った経験があり,18°C培養すると細胞の成長が増殖は遅く,十分な量の細胞が得られるまでに26週間かかることを予め予測しており,当初の計画通りに培養が進んでいる.24年度が最終年度であるため、記入しない。今後は,より多くの細胞が必要となってくるために,培養スケールを上げていく必要がある,また,マガキの季節か終了しているため,場合によってはイワガキの細胞培養も行う必要がある.24年度が最終年度であるため、記入しない。
胆管構造を有する機能的肝組織再構築に関する研究

本研究では、肝細胞を脂肪組織由来間葉系幹細胞(ADRC)とともに共培養移植し、肝細胞機能維持やADRCの肝構成細胞(特に胆管細胞)への分化を促し、小腸粘膜下異所性移植における胆管構築を伴った機能的異所性肝組織構築の可能性について検討する。1)肝組織+ADRC異所性移植:雄性8週齢SDラットに70%Hx+虚血再灌流20minを加え、再生肝組織(ホモジネート+ADRC)を計1ml(5well)27Gy針と1ml注入。異所性移植部位は小腸粘膜下、十二指腸粘膜下、胃粘膜下、腎被膜下、脾内とした。術後3,7日に擬死させたところ胃粘膜下、腎被膜下、十二指腸粘膜壁に生着肝組織を確認したが、術後14日では生着肝組織は胃壁と腎被膜下のみであった。またADRCをCSFEで蛍光標識し、再度同部位にホモジネート肝組織+ADRCもしくはADRC単体を異所性移植したところ、術後14日でホモジネート肝組織+ADRC群の標識ADRCはアルブミン産生細胞に分化していたが、胆管細胞への分化を認めなかった。2)小腸粘膜からの幹細胞分離:胆管細胞と起源を同じくする小腸粘膜陰窩から幹細胞を分離し、胆管細胞への分化の可能性を検討するため、8週齢SDラットから5mm間隔で小腸を採取し、2ml EDTA+PBSで氷上30min固定した後、Cell strainerde小腸幹細胞(Small intestinal crypt)を分離培養したところ、分離後7日目にLgr5陽性細胞の確認に成功した。3)3D培養による分離肝細胞保護、ADSCから肝細胞・胆管細胞分化:1)2)の検討で移植肝細胞壊死が問題であったため3D培養の可能性を検討した。これにより分離後14日目でもcell viabilityが80%に維持できることを確認した。またADSCから肝細胞・胆管細胞分化研究を継続中で、肝細胞に関しては分化プロトコール20日目にアルブミン産生細胞にまで分化させることができた。胆管細胞分化に関しては、研究継続中である。本研究では、肝細胞をADRCとともに3次元培養し、肝細胞機能維持やADRCの肝構成細胞(特に胆管細胞)への分化を促し、小腸粘膜下異所性移植における胆管構築を伴った機能的異所性肝組織構築の可能性について検討する。1.肝組織+ADRC異所性移植:雄性8週齢SDラットに70%Hx+虚血再灌流20minモデルを対象とし、三次元培養組織(再生肝組織:ホモジネート+ADRC)を計1ml(5well)27Gy針と1ml注入。各部位に対し、注入量は肉眼的に膨隆ができる程度とした。術後3,7日に擬死させ、移植肝組織の評価を行ったところ胃粘膜下、腎被膜下、十二指腸粘膜壁に生着肝組織を確認したが、術後14日では生着肝組織は胃壁と腎被膜下にのみであった。2.小腸粘膜からの幹細胞分離:8週齢SDラットから5mm間隔で小腸を採取し、2ml EDTA+PBSで氷上30min個した後、Medium除去後、PBSで洗浄、遠心分離により上清を除去した後、PBSで再懸濁・遠心を数回施行し、Cell strainerde小腸幹細胞(Small intestinal crypt)を分離成功した。上記実験系において至適異所性移植部位を同定するとともに、ADRCの組織内分化を確認することができた。また消化管由来幹細胞を分離することができ、今後の肝構成細胞へ分化誘導が期待されるcell sourseが確認できた。これはADRCを併用せずに、消化管由来組織幹細胞が肝構成細胞へ分化する可能性を示唆するものである。しかしながら、今年度は胆管細胞への分化誘導を確認することができず、次年度への課題が残されている。1)肝組織+ADRC異所性移植:雄性8週齢SDラットに70%Hx+虚血再灌流20minモデルを対象とし、三次元培養組織(再生肝組織:ホモジネート+ADRC)を計1ml(5well)27Gy針と1ml注入。術後3,7日に擬死させ、移植肝組織の評価を行ったところ胃粘膜下、腎被膜下、十二指腸粘膜壁に生着肝組織を確認したが、術後14日では生着肝組織は胃壁と腎被膜下にのみで、十二指腸壁内では壊死が認められた。