hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
個体光合成量の制御と予測のための個葉の光合成特性の経時推移モデルの開発

本研究の目的は、光環境に応じた植物個体の各個葉の光合成特性の推移を時系列モデルとして表現することである。このモデルを用いて、近い将来までの環境条件のもとでの個体総光合成量を制御・予測することを目指す。平成30年度は、個葉の光・CO2飽和条件下での光合成速度(光合成能力)の推移に着目し、光環境制御が光合成能力およびその律速要因である光合成タンパク質複合体cytochrome b6f (cyt-bf)の分解・合成に及ぼす影響を解析した。光合成能力の順化に関する既往の研究では、成熟葉の光合成能力は受光量の低下に応じて速やかに低下し、それ以降の受光量の再上昇は光合成能力の強光順化応答を誘導しないとされていた。これらの研究成果を受け「葉の強光順化の柔軟性は成熟後徐々に失われる」という作業仮説のもと、成熟葉に対して2-8日間の弱光処理ののち再び強光処理を行う試験区を設け、葉の強光順化応答の柔軟性を調査した。エンドウを供試植物として、グロースチャンバ内で光環境制御実験を行った。栽培期間を通して強光条件下に置かれた陰性対照区の葉の光合成能力およびcyt-bf量は概ね一定の値となった。一方、弱光処理された陽性対照区の葉のそれらは弱光処理開始以降、指数関数的に減衰した。再強光処理を行った試験区の葉では、弱光処理の日数に依らず、再強光処理後に光合成能力およびcyt-bf量が上昇した。さらにcyt-bfの分解・合成に基づく統計モデリングでは、弱光処理日数が再上昇の時定数に及ぼす影響は小さいことを示唆する結果が得られた。したがって、本研究では、既往の研究から予想される結果とは異なり、少なくともエンドウでは1)葉の光合成能力は成熟以降も柔軟に強光に対して順化すること、2)一週間程度の弱光処理は光合成能力の可逆的な順化を損ねないこと、が明らかとなった。翌年度、交付申請を辞退するため、記入しない。平成29年度は、モデルの説明変数となる葉の受光量(葉面における光合成有効光量子束密度)および光合成光利用効率(受光量あたりの総光合成速度)を空間的かつ経時的に推定するための研究を行った。1)受光量透過波長帯を限定した葉面反射画像中の画素濃度値は、受光量との間に正の相関を示すことが報告されている。本研究では、青緑波長帯透過型の光学フィルタとCMOSカメラを用いた分光画像計測により、一定の光源光質のもとでは、対象葉の葉齢および乾燥状態に依らず受光量を比較的安定的に推定可能であることを示した。2)光利用効率分光パラメータPRI (Photochemical Reflectance Index;光化学反射指数)は光利用効率を反映するとされる。本研究では、透過波長帯の異なる2種の光学フィルタとCMOSカメラを組み合わせた分光画像計測により、1) PRIの空間的かつ経時的な計測が可能なこと、2) PRIの絶対値の代わりに暗条件下での値からのPRI変化量を説明変数とすることで、光利用効率をより正確に推定可能であること、を示した。また、3)光照射開始後のPRIの応答は光利用効率の応答と比較して遅いこと、4)阻害剤により光合成電子伝達に機能不全を生じさせた葉のPRIは光照射に対して応答しないこと、を明らかにした。これらの結果は、PRIに基づく推定により光利用効率が過大評価される可能性を示唆する。本年度は、次年度以降の研究を進めるための基礎となる研究を概ね予定通り進めた。CMOSカメラおよび光学フィルタを用いた分光画像計測により、葉の受光量および光合成光利用効率を推定することが可能であることを示し、推定を制限する条件を明らかにした。イメージング対象となる葉の重なり、撮像領域の不足などの技術的な問題があるため、供試植物の変更を検討している。

再強光処理を行った試験区の葉では、弱光処理の日数に依らず、再強光処理後に光合成能力およびcyt-bf量が上昇した。さらにcyt-bfの分解・合成に基づく統計モデリングでは、弱光処理日数が再上昇の時定数に及ぼす影響は小さいことを示唆する結果が得られた。したがって、本研究では、既往の研究から予想される結果とは異なり、少なくともエンドウでは1)葉の光合成能力は成熟以降も柔軟に強光に対して順化すること、2)一週間程度の弱光処理は光合成能力の可逆的な順化を損ねないこと、が明らかとなった。個体内の各個葉の受光量および光合成光利用効率を入力として、個体内各葉の光合成特性を推定する時系列モデルを作成・検証する。まずは、本モデルの推定対象である最大光合成速度をモデル化すべく、cytochromeの光環境要素に対する応答を解析する。最大光合成速度を既定する光合成系タンパク質であるcytochromeは展開期の幼葉でのみ合成され、成熟葉では光強度の低下により不可逆的に減少することが報告されている。展開期および老化期の光環境に対するcytochrome量および最大光合成速度の推移を簡単なモデルとして表現することを試みる。翌年度、交付申請を辞退するため、記入しない。
蒸気消毒処理が土壌に及ぼす影響-特に臭化メチル処理代替法としての検討-

[目的]土壌燻蒸剤の臭化メチル剤がオゾン層破壊物質として2005年にその使用が全面禁止されるのに伴い、臭化メチル代替法や消毒後の肥沃度管理技術の開発・普及が必要とされている。本研究では、臭化メチル代替法として蒸気消毒法を取り上げ,同法の問題点であるアンモニア態窒素や可溶性マンガンの蓄積への対処法として,消毒後の土壌への堆肥施用の効果について検討した.[方法]高知大学附属農場のビニルハウス内に蒸気消毒、臭化メチル剤(以下MB区)処理区及び対照区(CT区)を設け、トマトを栽培した。蒸気消毒区には,堆肥(牛糞堆肥)を消毒前に施用する区(SB区)と消毒後に施用する(SA区)を設けた。経時的に土壌を採取し,化学性および微生物性を調べた.[結果と考察]1.消毒処理が土壌の微生物バイオマス量や硝化菌数,基質資化性から評価した微生物群集の多様性に及ぼす影響は,SB≒SA>MBであった.2.消毒処理により土壌中のアンモニア態窒素量が増加した(SB>SA>MB).3.蒸気消毒処理により,可溶性Mnが増加した(SB>SA).Mnの増加は,消毒により水溶性還元糖が増加することによると考えられた.4.堆肥を消毒後に施用することにより,1)硝化菌が土壌に付加され,蓄積していたアンモニア他意窒素は速やかに硝化された,2)土壌中の微生物群集の多様性が増大した,3)マンガン酸化菌が土壌に付加され,蓄積していた可溶性Mnが減少し,植物体中のMn含量も減少した.以上から,堆肥を消毒後に施用することは,消毒前に施用することに比べ,消毒による土壌中のアンモニア態窒素や可溶性Mnの増加を低く抑え,消毒後の土壌に硝化菌やMn酸化菌を付加する効果があることが分かった.また,消毒により低下した微生物群集の多様性を,増大させる可能性が示唆された.[目的]土壌燻蒸剤の臭化メチル剤がオゾン層破壊物質として2005年にその使用が全面禁止されるのに伴い、臭化メチル代替法や消毒後の肥沃度管理技術の開発が必要とされている。本研究では、各種消毒処理が土壌微生物群集の多様性とその機能に与える影響を評価するため、基質資化性及び窒素の無機化について比較検討した。[方法]高知大学附属農場のビニルハウス内に蒸気消毒、クロルピクリン剤、臭化メチル剤(以下SS、CP、MB)処理区及び無処理区を設け、トマトを栽培した。栽培前にバーク堆肥のみを施し、化学肥料は使用しなかった。土壌試料を経時的に採取し、分析に供試した。[結果と考察]1.微生物バイオマスは消毒により全ての区で減少した(SS、CP>MB)。希釈平板法による糸状菌及び細菌数は、各処理区間で明確な傾向はみられなかった。Biolog Ecoプレートにより評価した土壌微生物群集の基質資化性は、SSでは消毒直後に大きく低下したが、以後は無処理区よりも高かった。これに対し、CPでは定植時に最も低くなったが、定植1カ月後には無処理区と同じレベルまで回復した。MBでは消毒後やや増加したが、定植時には無処理区と同じレベルになった。2.硝化菌は消毒によりSS、CPで大きく減少し、定植1カ月後でも無処理区のレベルまで回復しなかった。NH_4-Nは消毒により全ての区で増加し(SS、CP>MB)、SS、CPでは定植1カ月後でも高かった。一方、NO_3-Nは消毒により全ての区で減少した(SS、CP>MB)。一方、生育調査では、どの区もNH_4-Nの蓄積による生育障害は認められず、SSで最も生育が旺盛であった。各種消毒処理が無機態窒素の動態及び生育量へ及ぼす影響と、基質資化性へ及ぼす影響との関係を明らかにする必要があると考えられた。経時的に土壌を採取し,化学性および微生物性を調べた.[結果と考察]1.消毒処理が土壌の微生物バイオマス量や硝化菌数,基質資化性から評価した微生物群集の多様性に及ぼす影響は,SB≒SA>MBであった.2.消毒処理により土壌中のアンモニア態窒素量が増加した(SB>SA>MB).3.蒸気消毒処理により,可溶性Mnが増加した(SB>SA).Mnの増加は,消毒により水溶性還元糖が増加することによると考えられた.4.堆肥を消毒後に施用することにより,1)硝化菌が土壌に付加され,蓄積していたアンモニア他意窒素は速やかに硝化された,2)土壌中の微生物群集の多様性が増大した,

3)マンガン酸化菌が土壌に付加され,蓄積していた可溶性Mnが減少し,植物体中のMn含量も減少した.以上から,堆肥を消毒後に施用することは,消毒前に施用することに比べ,消毒による土壌中のアンモニア態窒素や可溶性Mnの増加を低く抑え,消毒後の土壌に硝化菌やMn酸化菌を付加する効果があることが分かった.また,消毒により低下した微生物群集の多様性を,増大させる可能性が示唆された.
脳におけるアクアポリン４の立体構造と機能連関

脳で主に発現している水チャネルAQP4の構造と機能相関を解明するために、二価カチオンである水銀と脱炭酸酵素阻害剤でもあるアセタゾラミド(AZA)がそれぞれ結合した状態を極低温電子顕微鏡像を用いて立体構造解析を決定した。水銀は細胞質側、AZAは細胞外側から特異的に阻害できることを明らかにできた。水銀結合型では、結合位置を原子レベルで特定できなかったが、結合サイトを含むループDのコンフォメーション変化が引き起こされないことがわかった。AZA結合型では、AZAの立体配置まで特定できなかったが、ポアを塞ぐ位置で結合し水透過を抑制していることがわかった。更なる分解能向上が創薬へ向けての鍵である。(A)脳における水チャネルaquaprin-4(AQP4)特有な水透過機構の解明:二価カチオンによりチャネルが閉じた状態のAQP4二次元結晶を作製できており、極低温電子顕微鏡像を用いて二次元結晶の実像を収集することで、直接位相情報を得て6Å分解能での立体構造解析を行い、明瞭な膜貫通へリックスを観察することができた。更に同じ分解能でのチャネルが開いた状態のAQP4と比較するために、二次元結晶の実像を収集し構造解析を進め、最終的に2つの立体構造を比較したところ、対応するヘリックスの位置や傾きに大きな変化はなかった。更に細かく見ていくと、細胞質側のCys残基付近にデンシティの差が認められる場所を特定することができた。この位置は、当初予想されていた2か所のカチオン結合部位の1つに相当するが、直接ポアを塞ぐ位置ではないため、間接的に作用して水透過を抑制していることが示唆された。(B)アストロサイトのエンドフィートでみられるAQP4のアレイ形成および調節機構の解明:電子回折図形由来のデータでは、アレイ形成に重要なN末端側のデンシティを確認できないことから、極低温電子顕微鏡像を用いてより高い分解能の二次元結晶の実像を収集できるように試みた。特に、最近脚光を浴びているdirect electron detector(DED)と呼ばれる直接電子をカウントできる記録装置(Gatan社のK2 Summit)を、効果的に使用できるようにデータ収集条件および画像処理条件を探索した。まだ最適な条件ではないものの、倍率1万倍で6Å分解能まで解像できることから、今後の条件等の改良によって倍率を上げても良い実像が記録できるようになれば更なる分解能の向上が期待できる。(A)脳における水チャネルaquaprin-4(AQP4)特有な水透過機構の解明:脱炭酸酵素の阻害剤であるアセタゾラミド(AZA)を用いてもAQP4の水透過活性を下げられることが知られているため、AZAと結合したAQP4二次元結晶を作製し、極低温電子顕微鏡像を用いて二次元結晶の実像を収集することで、5Å分解能の立体構造解析を行った。三次元再構成像からは、明瞭な膜貫通へリックスを観察することができただけでなく、細胞外側でのAZAの結合位置に関してもおおよそ特定することができた。また、リガンドドッキングシミュレーションと組み合わせることで、エネルギー的に安定な複数のリガンドドッキングポーズを提示できた。シミュレーションによるリガンドの予想結合位置および観察されたデンシティは一致し、直接ポアを塞ぐ位置にあるため、AZAがAQP4の水透過を抑制しているという実験結果と一致した。(B)アストロサイトのエンドフィートでみられるAQP4のアレイ形成および調節機構の解明:極低温電子顕微鏡像を用いた三次元再構成の場合だけ、アレイ形成に重要なN末端側のデンシティが確認されていることから、従来のフィルムより高い分解能の二次元結晶の実像を収集できるようなデータ収集システム構築を試みた。その際、最近脚光を浴びている直接電子をカウントできる記録装置(Gatan社のK2 Summit)を効率よく使用できるように、コントロールPC上でモーション補正プログラムを起動できるようGUI(グラフィックユーザーインターフェース)ベースのシステム開発を行った。最適な条件を探すことによって、3万倍の倍率で3Å分解能程度の実像をリアルタイムで記録できるようになった。コントロールPCを用いて、直接電子をカウントできるK2 Summitによって高分解能の画像を記録し、併せてモーション補正プログラムの適用も可能になったおかげで、ナイキスト周波数限界以上の分解能をリアルタイムで画像収集することが可能となった。この開発したシステムを用いることで、実像による三次元再構成の高分解能化計画が進展した。また、これまでAZAのAQP4に対する阻害作用に関して長らく議論が続いていため、阻害剤であるAZAがAQP4に結合した状態を可視化することができた意義は大きい。(A)脳における水チャネルaquaprin-4(AQP4)特有な水透過機構の解明:脱炭酸酵素の阻害剤であるアセタゾラミド(AZA)はAQP4の水透過活性を下げることでも知られており、極低温電子顕微鏡像を用いてAZAが結合したAQP4二次元結晶の実像データで5Å分解能の立体構造解析を明らかにした。原子分解能でAZAの結合位置を特定するするため、二次元結晶由来のデータの分解能向上をめざした。同一結晶条件内に含まれる複数の対称性をもつ二次元結晶が生成されるため、原子分解能レベルのデータ収集には、試料作製および電子回折データの収集にかなりの時間を要したが、3.2Å分解能での立体構造解析が可能になった。

最終的なデータ数を増やすことで分解能の向上が期待できるが、現時点でもリガンドに相当するデンシティは、直接ポアを塞ぐ位置で結合し、AQP4の水透過を抑制していることがはっきりし、5Å分解能の三次元再構成像で推定された結合位置とも一致した。(B)AQP4のアレイ形成に重要なN末端構造の解明:AZAが結合したAQP4の二次元結晶でも、同様なアレイ形成に重要なN末端側のデンシティが確認されていることから、3.2Å分解能の電子回折データと5Å分解能の実像データ(フィルムに記録)を組み合わせたハイブリッドのデータ生成し構造解析を進めることで、通常の解析では確認できなかったN末端側の主鎖構造をある程度特定でき、アレイ形成の足場を提供する部分がわかってきた、しかし、記録媒体であるフィルムの性質に依存して詳細な部分が可視化できないことが判明したため、更なる分解能向上を目指して、昨年度より導入した直接電子をカウントできるK2 Summitによる高分解能の画像の記録システムをようやく完成させることができた。将来的には、実像データのみの二次元結晶高分解能三次元再構成が有望であることもわかってきた。脳で主に発現している水チャネルAQP4の構造と機能相関を解明するために、二価カチオンである水銀と脱炭酸酵素阻害剤でもあるアセタゾラミド(AZA)がそれぞれ結合した状態を極低温電子顕微鏡像を用いて立体構造解析を決定した。水銀は細胞質側、AZAは細胞外側から特異的に阻害できることを明らかにできた。水銀結合型では、結合位置を原子レベルで特定できなかったが、結合サイトを含むループDのコンフォメーション変化が引き起こされないことがわかった。AZA結合型では、AZAの立体配置まで特定できなかったが、ポアを塞ぐ位置で結合し水透過を抑制していることがわかった。更なる分解能向上が創薬へ向けての鍵である。直接電子をカウントできる記録装置DEDが使用できるようになり、ナイキスト周波数限界以上の分解能でデータを収集することが可能となり、実像による三次元再構成構造の高分解能化への道が開けた。また、二価カチオンの添加によるグリット上での局所的な大幅な濃度変化による結晶性の悪化が予想されたが、試料調整時の湿度調整等を含めた試料作成方法の改善に努めることで安定的に実像データが収集できるようになった。水透過阻害状態としてのAZA結合型AQP4を5Å分解能で決定し、阻害剤の結合部位をおおまかに特定できた。AZA結合に伴うコンフォメーション変化は観察することができなかったが、今後の原子分解能での構造解析を遂行することで、より詳細な情報を得ることでドラッグデザインのために役立てられる可能性がある。本年度実施した結晶化の実験結果からは、AZAは二次元結晶性に大幅に影響しないことから、最終的に3.0Å分解能程度の構造解析が期待できる。今後の原子分解能モデルによってAZAによる阻害機構が原子レベルで解明されるだけでなく、同じ水チャネルの仲間であるAQP1には結合しないといった特異的な結合性についても考察を行いたい。更に、AZAのメチル誘導体であるメタゾラミド(MZA)では、AQP4を阻害できないこともわかっているので、AZAの詳細な立体結合状態が可視化できれば、メチル誘導体によって結合できなくなる理由も説明することができ、AQP4に対してより高いアフィニティを持つリード化合物設計のガイドになると考えている。
ｐＨ応答スピンクロスオーバー錯体膜の構築とプロトンの流れの可視化

スピン転移温度がpHに依存する室温スピンクロスオーバー鉄錯体[Fe(II){(NH2)2sarH}]をイオン交換膜Nafionのナノ空間反応場で合成し、この透明スピンクロスオーバー鉄錯体膜に電圧を印加することによりプロトンの濃度勾配を発現させ、低スピン状態と高スピン状態の時空間制御を行った。pH = 4.5で作製したpH応答透明スピンクロスオーバー錯体膜に電圧を20 V印加したところ、膜の色が黄緑色から深い緑色に変化し、電極の極性を入れ替えると膜の色が深い緑色から黄色に変化する現象を捉えることに成功し、低スピン状態と高スピン状態の膜の色の変化を利用してプロトンの流れを可視化することができた。本研究課題では、基底スピン状態がpHに依存するスピンクロスオーバー錯体膜の開発とこの錯体膜を用いたプロトン流の直接観測を目的としている。平成25年度は、スピンクロスオーバー鉄錯体[Fe(II){(NH2)2sarH}](sar = 1,8- diamino-3,6,10,13,16,19- hexaazabicyclo[6,6,6]icosane)をイオン交換膜Nafionのナノ空間反応場で合成し、この膜に電圧を印加することによりプロトンの濃度勾配を発現させ、低スピン状態と高スピン状態の時空間制御を行った。かご型の6座配位子、diAMsarが配位した[Fe(II)(diAMsar)]錯体は、酸性側では両端にあるアミノ基にプロトンが付加することでFe(II)ー配位子間距離が膨張し高スピン状態をとるが、塩基性側では脱プロトンによりFe(II)ー配位子間距離が縮み低スピン状態をとるものと推定される。これを実証するため、高エネルギー加速器研究機構・放射光施設において、pH = 4, 7, 10で作製した[Fe(II)(diAMsar)]@Nafionについて室温および50 KでXANESおよびEXAFSの実験を行った。pH = 4, 7, 10におけるFe-K XANESスペクトルから、酸性および中性下ではFe(II)の高スピン状態が、塩基性下ではFe(II)の低スピン状態が主に実現されていることが確認された。また、EXAFSの解析により、pH = 4.5で作製した錯体膜では[Fe(II)(diAMsar)]の両端にあるアミノ基にプロトンが付加することでFe(II)ー配位子間距離が膨張し高スピン状態をとること、pH = 10で作製した錯体膜では脱プロトン化によりFe(II)ー配位子間距離が縮み低スピン状態をとることを実証することができた。本研究課題では、pH応答スピンクロスオーバー錯体膜の開発プロトン流の直接観測を目的としている。平成24年度は、スピン転移温度がpHに依存する室温スピンクロスオーバー鉄錯体[Fe(II){(NH2)2sarH}](sar = 1,8-diamino-3,6,10,13,16,19-hexaazabicyclo[6,6,6]icosane)をイオン交換膜Nafionのナノ空間反応場で合成し、この透明スピンクロスオーバー鉄錯体膜に電圧を印加することによりプロトンの濃度勾配を発現させ、低スピン状態と高スピン状態の時空間制御を行った。pH = 4.5で作製したpH応答透明スピンクロスオーバー錯体膜に電圧を20 V印加したところ、膜の色が黄緑色から深い緑色に変化し、電極の極性を入れ替えると膜の色が深い緑色から黄色に変化する現象を捉えることに成功し、プロトンの流れを可視化することができた。[FeII(diAMsar)]は、酸性側では両端にあるアミノ基にプロトンが付加することでFe(II)ー配位子間距離が膨張し高スピン状態をとるが、塩基性側では脱プロトンによりFe(II)ー配位子間距離が縮み低スピン状態をとるものと推定される。このことを実証するため、高エネルギー加速器研究機構・放射光施設においてEXAFSの実験を行い、pH応答スピンクロスオーバー錯体膜のスピンクロスオーバー転移に伴うFe周りの局所構造変化を調べた。pH = 4.5で作成した錯体膜では[FeII(diAMsar)]の両端にあるアミノ基にプロトンが付加することでFe(II)ー配位子間距離が膨張し高スピン状態をとること、pH = 10で作製した錯体膜では脱プロトンによりFe(II)ー配位子間距離が縮み低スピン状態をとることを実証することができた。pH応答透明室温スピンクロスオーバー錯体膜に電圧を印加することにより、プロトンの濃度勾配を発現させ、スピンクロスオーバー転移の時空間制御によって発現する膜の色変化を利用してプロトンの流れを可視化することに成功した。また、高エネルギー加速器研究機構・放射光施設においてEXAFSの実験を行い、pH応答スピンクロスオーバー錯体膜のスピンクロスオーバー転移に伴うFe周りの局所構造変化を調べた。

pH = 4.5で作成した錯体膜では[FeII(diAMsar)]の両端にあるアミノ基にプロトンが付加することでFe(II)ー配位子間距離が膨張し高スピン状態をとること、pH = 10で作製した錯体膜では脱プロトンによりFe(II)ー配位子間距離が縮み低スピン状態をとることを実証することができたことは、当初の計画通りの成果である。平成24年度に開発したpH応答透明室温スピンクロスオーバー錯体膜によるプロトン流の可視化の研究を分子システムとして発展させる。具体的には、新たな機能性化合物をプロトン伝導膜に導入する研究を推進する。Rh錯体の中には、プロトンの脱離に伴って発光性能がスイッチするものがあり、pH応答発光性錯体膜を開発し、発光特性の変化を通してプロトン流の直接観測を試みる。また、ナフィオンとプロトン伝導性機能の異なるイオン交換膜中での物質開発も推進する。新たな機能性化合物をプロトン伝導膜に導入する研究を推進するため、pH応答発光性錯体など様々なpH応答性金属錯体を合成する。以上の研究を推進するため、平成25年度の主な研究費は試薬購入費の予定である。
脱水縮合剤を用いる新規糖供与体の合成と酵素触媒グリコシル化反応

糖供与体の合成は、従来、糖のヒドロキシ基の保護・脱保護など多段階工程を要する有機合成法に依存していたが、我々は、脱水縮合剤を用いて無保護糖から一段階かつ水中で糖加水分解酵素を用いるグリコシル化反応に利用できる新規な糖供与体4,6-ジメトキシ-1,3,5-トリアジン-2-イルグリコシド(DMT糖)を一段階合成することに成功してきた。これまで、DMT糖を糖供与体とする酵素的グリコシル化に用いた酵素触媒はセルラーゼのみであったので、これ以外の酵素を用いるグリコシル化反応への適用を検討した。はじめに、β-ガラクトシダーゼを触媒とするガラクトシル化を目的として、無保護のガラクトースを原料に、塩化4-(4,6-ジメトキシ-1,3,5-トリアジン-2-イル)-4-メチルモルホリニウム(DMT-MM)を用いて、4,6-ジメトキシ-1,3,5-トリアジン-2-イルβ-ガラクトシド(DMT-β-Gal)を水中で一段階合成した。続いて、β-ガラクトシダーゼを触媒とした酵素的グリコシル化を行った結果、収率46%で二糖生成物が得られた。同様に、グルコサミン(GlcN)あるいはN-アセチルグルコサミン(GlcNAc)から一段階で合成したDMT-β-GlcNおよびDMT-α-GlcNAcは各々exo-キトサナーゼ、α-N-アセチルグルコサミニダーゼによる糖転移反応の供与体として有用であることを見出した。また、DMT糖の酵素による基質認識機構解明を明らかとするため、基質-酵素複合体のX線結晶構造解析を行うにあたり、DMT糖のアグリコン部のグリコシド結合を酸素原子から硫黄原子へと変換した加水分解されない基質を有機合成により5工程で合成した。
アジアにおける媒介動物の分布特性に基づく新興再興感染症の拡散経路の解明

今回の課題は、野生動物が保有しダニが媒介する新興再興感染症がアジアから日本列島へ拡散(時に隔離進化)してきた経路を、地理病理学や分子疫学の手法で解明するのが目的で、南西日本韓国、中国中南部、台湾、タイ、ネパールの現地踏査を基に、"点"としてのデータを"線ないし帯"、として繋ぐことを目指した。以下、主な項目ごとに成果を列記する。1.ベクター関係は、保有病原体にみる大陸と日本列島の強い関連性と拡散経路を説き、ベクター分類の基礎も整理、特にI.ovatusのアジア共通性を分子疫学的に証明した。2.スピロヘータ関係では、ライム病ボレリア種はベクター分布(渡り鳥も)に伴い欧州アジア日本まで繋がることを、地域や病種ごとに現地調査そして臨床例も基に示した。3.リケッチア関係では、アジア欧州までの共通性を視野に、紅斑熱、ツツガムシ病、また新規の感染症病原体までを分離ないしDNA検索を進めて、新種や新記録種を記載しながら症例も発掘した。4.原虫関係では、バベシアのベクターかI.ovatus等であること、また特にヒト感染をみた神戸型は東シナ海トライアングルに広く見られるほか、国内では日本海側中心に散在することを示した。5.そのほか、マダニ保有の血液寄生原虫の多様性が証明され、またヒトの潜在感染が推測されるエーリキアについても大陸との関連が解明されっつある。以上の成果を縦糸横糸にして考察すれば、病原体の拡散招洛が"線ないし帯"として大筋で見えるわけで、各論文等の中では視覚的な理解を容易にするため極力図表により経路を描くことを試みた。これを基に、各地域の自然環境や社会要因まで包括した3次元イメージの画像化を進めるならば、公衆衛生対応上で疫学的有用性を高まると考える。なお、残された課題としては、南西日本を包含する環東シナ海地域での拡散経路の細部の確認証明があろう。前回の科研課題で解明できた東アジア共通のI.ovatus、北アジア共通のI.persulcatus及び東南アジア共通のI.granulatusの分布を基に病原体拡散経路を分子疫学的に追尾するため、年度前半は国内で大陸と関連強い地区、後半は中国周辺地域の調査を計画した。1.福井市(2004年4月):班員全員が日本衛生動物学会にて前年までの調査成績を発表。2.徳島県(同4月)及び長野県(5月):厚生科研班の協力で、前年からの継続として調査。3.北海道、群馬県(同6月):北日本のボレリア及びバベシア分布を調査、帰路に北関東を視察。4.屋久島(同6月):全班員及び関係者の参加で初年度班会議を開催、及び現地調査。5.鳥海山(同7月):ボレリアの調査不足であった東北地方の日本海側において実施された。6.白神山地(同7月):知見が不足していた東北北部において、関係のあらゆる分野から調査。7.台湾(同9月):アジア太平洋Zoonoses会議でアジアのバベシアにつき発表、及び関係の調査。8.トカラ中之島(同10月):生物地理上で本土要素の南限であるため、厚生科研班と共同で調査。9.西宮市(同11月):衛生動物学会西支部会で、欧州共通紅斑熱の本邦初確認を発表(仏と共同)。10.島根県(同11月):大陸との関連で隠岐諸島及び同県本土側で厚生科研班と共同で調査。

11.八重山諸島(同12月):東南アジアヘの島道として石垣・西表島を予備的調査。12.兵庫県(同12月):同県北部(和田山町)でバベシア及びツツガムシ分布の補充調査。13.台湾(同12月):昨年の継続として、同島の北部中部の中・高山帯にて調査。14.中国南部(2005年2月):大陸の南端で台湾に対峙し自然度も高い福建省と浙江省で調査。15.薩南諸島種子島(同3月):本土要素の南限地帯の1つとして予備的調査。以上、前回の課題で調査不足であった地域を中心に試料の補充ができ、特に、今回の課題から追加されたバベシア症分野に重点を置くことができた。得られた試料は各研究室にて継続して分析中である。本年度の海外分は、中国南部の主要ベクター3種にI.sinensisも絡むという新たな問題に重点を置くこととした。国内分ではバベシアに主眼を置いた。結果として、中国南部韓国地区南西諸島(南西日本)という、いわば東シナ海トライアングルにおいて、ベクターや動物相の動きに伴う新興再興感染症病原体の拡散経路が検証できた。なお、アジアへの渡航は、紛争地域の拡大や新型感染症の突発で計画遂行や人員の確保に影響が出ている。1.海外活動・中国(2005年4月;杭州市臨海市):天台山地域などで調査を試み、中国南部調査の方針がなった。(同12月;武夷山市温州市杭州市):雪のため武夷山方面は割愛したが、中国南部を広く調査した。(同12月;中国浙江省、安徽省):黄山天目山の調査は、風雪による空港閉鎖で渡航中止となった。(2006年2月;中国浙江省、安徽省):上記調査の再挑戦で、同地域の冬春の生態系を把握できた。(同3月;中国安徽省):黄山に的を絞っての再々調査で、春季に入った生態圏での成果を得た。・韓国(2005年11月;韓国済州島):中国と韓国の架け橋的存在の地区で初めて調査し、今後の方針がなった。2.国内活動・北海道・青森県(2005年6月):札幌市郊外、また下北半島最奥部を調査した。・東北地方(同6月;青森県西部域、新潟県上越地方):白神山地そして長野、上越地方に回つて調査した。・静岡県(同9月;伊豆半島南半部):関係知見の少ない伊豆地方を調査した。・島根県(同10月;島根県中西部域):昨年度の東部地区に続き、西部地区を調査した(厚生科研班と共同)。・高知県(同11月:高知県北西部および室戸地区を調査した。・学会・セミナー:名古屋市(2005年4月;日本感染症学会大会)、札幌市(同6月;日本衛生動物学会大会)、帯広市(同9月;日本ダニ学会大会)、下田市(同9月;科研班会議)、京都市(同10月;日本熱帯医学会大会)、高知県(同11月;日本衛生動物学会西日本支部会)において、前年今年度の成果発表やシンポジウム招請講演。我国東アジアまで分布が推測される紅斑熱群リケッチアの新種(R.tamuraeとR.asiatica)を記載できたほか、大陸と日本列島の接点である韓国(特に済州島)に主眼を置き、隣接の南西日本の島嶼も加えて調査した。その結果、東シナ海トライアングルと呼ぶ地域で多くの示唆に富む知見、例えば、地理病理学的な予想通りバベシア神戸型の広い分布、また済州島と中国黄山地区でみたリケッチア類(上記新種や新興病原性Montezuma)は日本ロシア極東まで共通すること、一方、重要なベクターI.ovatusの分布が済州島と九州で繋ぎ難いことが示された。更に、タイ北部でツツガムシ病多発を確認、ネパールでは中国共通紅斑熱リケッチアも検出できた。
英語母語話者と日本人英語学習者の母音F1F2パターンによる即興発話モデル提示

英語母語話者と日本人英語学習者の母音の特徴を即興発話録音データを用いてモデルにて提示を行った。フォルマントのうち、第一フォルマントと第二フォルマントを抽出し、前者は口の開きの大小、後者は舌の盛り上がった部分の前後の位置にほぼ一致するという特質から、母音発音の精緻な分析を行うことができた。母音の生成は母音の知覚と密接に関係しているが、日本人英語学習者が5母音母語を基本として英語を聞き取る傾向があることから、この影響が上級レベルの学習者にも観察されると予想できる。本研究は英語教育研究と音響音声教育の融合を試みたものである。音響音声研究の分野では、機械の音声合成、音声認識の精度を上げる目的で、また人間の発話の音声上の特徴を探るため、即興発話の分析が大規模なレベルで行われている。この目的は両研究分野に共通するものとも言えよう。音響音声研究でのデータ分析とモデル構築手法を英語教育研究に応用し、3種の対話形式による発話の音声特徴を研究し、さらに客観的データとモデルを基に、英語スピーキング・リスニング指導法を議論する。繰り返しにおける母音の性質の変化を観察するため、物語の登場人物の名前を朗読した場合の音響特徴を文脈内の新密度の違いにより比較分析を行った。母音のうち、/〓: /を取り上げ、第1フォルマントと第2フォルマント、及び長さを測定した結果、2度目につかわれた語の音は最初のものよりもわずかに曖昧な音となり、母音発音空間の中心に多少近い位置で発せられ、長さも多少短くなることがわかった。この結果は普通名詞を用いた分析結果に比べるとわずかな違いであり、名前の特異性と分析対象の発話のスタイルとの関連を再考する必要性が指摘された。声に出した読みにおける母音の性質や変化を観察する場合、固有名詞、普通名詞という分類における変化の違いが観察されると予測できる。今回の分析結果からは、普通名詞に比べ、固有名詞の場合の方が、文脈における新密度の変化が母音の性質の違いに反映される度合いが少ないといえる。この結果は朗読を分析対象としたものであり、聞き手のいる対話の場合には異なった傾向を示すことが予想される。この場合、聞き手との親密さなどの関係も要因に含まれ、より複雑な結果を示すと思われる。今後対話を分析対象とした母音変化の測定を続け、変化に違いが見られる場合の理由についても考察していく。対話の相手が同じ母語話者であるか、外国語学習者であるかによって、その発話の音響音声特徴に違いが観察されるのではないかと考えられる。英語母語話者同士、及び英語母語話者と日本人英語学習者との対話の音響特徴を分析し、対外国人発話における母音の特徴を調査した。単語のリスト読み、母語話者との対話、日本人英語学習者との対話の3つのスタイルの録音分析調査を行った。分析は、母音の第1フォルマントと第2フォルマントの値を測定した。分析の結果は、リスト読みでは、母音は母音空間の周辺に近い位置で発せられ、対話では中心に近い位置で発せられるという傾向を示していた。対母語話者と対学習者の場合を比較すると、後者の方が周辺に近い位置での発話であったが、あまり大きな違いは観察されなかった。日本人英語学習者同士の対話を文字おこししたものを用いた対話風朗読では、リスト読み程ではないが、周辺に近い位置での発話が観察された。英語母語話者と日本人英語学習者の即興スピーチの録音を前年度に引き続き行い、音響特徴としてのフォルマント1とフォルマント2により形作られる両者の母音空間の特徴を比較した。また、即興の場合とリスト読みの場合の母音空間は英語母語話者と日本人英語学習者共、それぞれ異なった特徴を示すことが予想できるが、この点についても、語彙リストを読み上げ、録音したデータを分析し、特徴の抽出を試みた。さらに、イントネーションの変動幅が母音に与える影響についても調査を行った。相手の気持ちや考えや行動を尋ねる発話に対する、強い肯定や否定の返答で、英語1語か2語で表される表現を映画の台詞から捜し、そのイントネーション曲線を分析した。さらに、同じ表現を日本人英語学習者が使った場合の発話を録音し、同時に分析した。その結果、英語母語話者と日本人英語学習者の間には、予想していた程の、イントネーションの下がり具合の度合いの違いは観察されなかった。両者の違いとして分析結果に現れた特徴は、下がったイントネーションを最後に少し上げるという方法を英語母語話者は使うが、日本人英語学習者は使わないという点、及びイントネーションの下がり具合の様々な度合いを英語母語話者が使用するのに対し、日本人英語学習者には母語話者程の多様性は観察されなかったという点である。両者の多様性についての違いは即興発話で特に顕著に現れる音響音声特徴であり、モデルの提示において重要な概念となり得る。英語母語話者と日本人英語学習者の即興スピーチの録音を前年度に引き続き行った。また、語彙リストの録音も行い、スタイルの違いによる母音の音響音声特徴の違いを抽出した。

これに加え、言語音声の変化について、音韻論的立場や音声学的立場からの研究について文献調査を行った。言語が話される状況や言語用法の要因をも考慮に入れることにより、音声変化についての説明が可能になる場合もあることが明らかとなった。母音は大母音推移が歴史的に観察されているが、現代英語では、複数の母音、例えば[〓][〓][〓][〓]が順々に変化する例が,ある特定の状況で観察されている。また,特に[〓]の母音が文脈に依存し,変化の度合いが異なることも観察されている。鼻音の前では最も変化しやすく,無声破裂音の前では変化が起こりにくいなどの例が特定の地域で観察されている。母音が変化する理由や,変化の型,もしくは一定の傾向が音韻論,音声学,音声科学を通して研究されている。これらの変化は,特定の言語が持つ音声体系に従って音声変化が起こっているものや,発声音の聞きやすさに応じるような傾向で変化が起こっているものが観察されている。音声変化は特定言語の音声体系や言語上の文脈の影響のみからでは説明できない場合もある。特定の話者やある状況に限られた例については,その変化の方向や程度を種々の観点から長期的に調べ説明する必要がある。そのひとつとして,言語の使用頻度を考慮に入れることが必要な場合もある。また,発話の状況や種類を考慮に入れることも考えられる。話のスタイルや単語の使用頻度を考慮に入れることにより、即興スピーチにおける音響特徴の変化について、説明を行うことができるようになった。英語母語話者と日本人英語学習者の英語単語リスト読みと即興発話の録音の蓄積を継続して行った。母音体系の異なる言語を母語とする人は、外国語学習の場合にも母語の音韻体系の影響で、異なった特徴を示すと思われる。英語母語話者の英語母音のF1F2と日本人英語学習者の英語母音のF1F2を母音空間を使って比較提示を行った。結果を約200ページの冊子にまとめ出版する予定である。第1章から第7章から成る章立てと、6節から成る関連項目の内容は以下の通りである。第1章ー序章、第2章ー英語母語話者の単語リスト読み、第3章ー英語母語話者の即興発話、第4章ー日本人英語学習者の単語リスト読み、第5章ー日本人英語学習者の即興発話、第6章ー英語母語話者と日本人英語学習者の母音、第7章ー結論、付録Aー母音知覚、付録Bー母音の類型、付録Cー母音特定周波数領域の測定、付録Dー母音の学習、付録Eー母音空間の視覚化、付録Fー母音特定周波数領域の広がり。平成20年度から24年度までの研究成果の集大成としてF1F2パターンによる即興発話モデルの試案を提示したが、より精密で正確なものを追求する必要がある。即興スピーチと語彙リストの録音データ分析に予想を上まる時間を要し、目標としている即興発話モデルの考察にまで至っていないため。24年度が最終年度であるため、記入しない。即興スピーチと語彙リストの録音と分析を引き続き行いながら、以下の5点について研究成果をまとめる予定である。(1)英語母語話者の即興スピーチと語彙リスト読みにおける母音空間比較(2)日本人英語学習者の即興スピーチと語彙リスト読みにおける母音空間比較(3)即興スピーチにおける英語母語話者と日本人英語学習者の母音空間比較
人の生命・健康に関わる医療情報の価値構造の研究

本研究の成果は、人と生命・健康に変わる医療情報に関して、患者と医療者との共同の意思決定を行う際の重要な概念として「Prospective Consensus Building」を導出できたことである。この概念には、医療者・患者という関係者の「意見の理由」および「理由の来歴を共有」し、選択後のリスクを提示することが含まれる。本研究では、「人の生命・健康に関わる医療情報共有に関わる価値構造」として、多様なステークホルダーが関わる複雑で不確実性を伴う医療の意思決定では、変化する医療空間に即応し続ける情報提供と共有のあり方の要請が公正および正義に関する価値と連関することを明らかにした。本研究「人の生命・健康に関わる医療情報の価値構造の研究」は、「人の生命・健康に関わる医療情報の提供・共有」に含まれる課題を分析し、その適正な方法の条件を考察することによって、情報共有に実現すべき「公正・正義」の倫理的構造を明らかにすることを目的とする。他方、パブリックな情報共有の例としては、福島県南相馬市の住民が抱える健康問題に関して分析を行った。不確実性の高い健康問題について、行政から住民に向けた情報提供が適切に行われなければ、住民の自己決定を阻害しかねないという正義に関する問題と深く関わることを示した。本結果は、Justice of Sharing Information as Commons After the Nuclear Disaster in Fukushimaとして発表した。本年度の目的は、医療情報共有のための倫理的価値構造の構築を行うために、情報の正義に関する要素を探索することであった。昨年度の成果は、生殖補助医療技術などの情報共有に関わる倫理的問題の特徴とその問題解決のための方法論として、合意形成の観点から、時間と空間の視点を用いることの重要性を示した。本年度は、特に医療の倫理的問題など、多様な価値と意見が存在する場合の問題解決の方法として用いられる倫理的合意形成の概念について考察を深めた。その結果、情報共有のあり方として、意見の理由がどのような経緯で形成されたかを把握し、選択後のリスクを提示した上で、現在の最善の方法を考えるというパースペクティブの見方が重要であることを明らかにした。このパースペクティブの概念には、レトロスぺクティブとプロスぺクティブの両方の方向性を含む。本研究「人の生命・健康に関わる医療情報の価値構造の研究」は、「人の生命・健康に関わる医療情報の提供・共有」に含まれる課題を分析し、その適正な方法の条件を考察することによって、情報共有に実現すべき「公正・正義」の倫理的構造を明らかにすることを目的とするものである。平成27年度は、平成25年度と平成26年度の研究成果から得た「倫理的合意形成」の概念および、情報共有の方法として、意見の理由がどのような経緯で形成されたかという「理由の来歴」の概念の考察をさらに進めた。その結果、患者と医療者との共同の意思決定を行う際の重要な概念として、「Prospective Consensus Building」を導出した。この概念には、現在から未来という時間軸の視点と関係者(ステークホルダー)や問題の複雑さなどの広がりを医療空間の視点を含有している。この概念を取り入れた医療者向けの倫理教育の理論と方法論についての論文を投稿し、2015年には雑誌Journal medicine and Lawに掲載された。また、同様に、本概念を用いた倫理教育の具体的な内容については、雑誌「看護管理」(医学書院、2015)にて連載された。さらに医療情報共有のあり方として、倫理的合意形成の概念を取り入れた倫理教育については、2015年、International Conference on Clinical Ethics & Consultationにて報告した。平成26年度は、医療情報共有における倫理的価値構造に関わる正義の要素を探索することであった。昨年度の成果から、時間と空間の視点をもとに、倫理的問題にかかわる合意形成の情報共有の特徴を分析することから、正義にかかわる要素の探索を進めた。応用倫理次年度は、本研究の最終年度であるため、医療情報の倫理的価値構造の理論化を行う。倫理的問題に対する問題解決の方法としての倫理的合意形成の考察をさらに深めるとともに、倫理的問題に対する医療者の行為のあり方としての正義について考察する。また、上記の考察の結果は、国際学会での発表、論文の投稿論文によって、研究成果を発信する。平成26年度は、本研究の成果である「prospective consensus building」の概念についてさらに考察を深めて、環境の視点を加えるとともに、正義、公正に関する要素の探索を進めたい。前年度からの繰り越し分で残りが発生している状況である。研究は計画通りに進んでいるが、一時的に体調を崩して国際学会での発表ができなかったことなどで旅費が予定より少なくてすんでいる。

平成26年度は、平成25年度の成果をもとに、医療情報共有に関わる正義・公正に関する要素の探究を深めて、最終年度の理論化に向けた準備をすすめていく。パーソナルな情報共有、パブリックな情報共有のそれぞれについて、情報共有の手続き、情報提供者・受け手の状況、資源の特徴の視点から整理していく。抽出した概念の内容を確かなものにするため、パブリックな情報については、宮崎県高千穂町などのまちづくりから、現地視察、関係者から情報収集し、健康にかかわる医療情報の共有のしくみ、重要な視点を考察する。また、パーソナルな情報共有については、病名の告知について取り上げて考察を進める。他方、医療の正義に関する国内外の文献、正義に関する西洋哲学思想の文献、東洋哲学における正義に相当する概念に関する文献等を参考に医療情報における正義とは何か、理論的な考察を行う。さらに、「prospective consensus building」の概念と医療の正義の関係を考察するために、国内外の学会への参加、研究者等との意見交換を行うとともに、研究成果を逐次、発表していく。次年度は、最終年度であるため、繰り越し分と平成27年度請求分とあわせて、研究成果発信のために国際学会の参加および発表、研究成果を投稿論文として作成するための翻訳代などにあてる予定である。平成25年度の予算は、予定通り使用した。予定していた金額より安価で購入できたため残額が発生した。残りは次年度の繰り越しとして、使用する。平成26年度は、消耗品20万、旅費30万、その他(論文校正、翻訳代)20万で予算を立てている。繰り越し分は、旅費および消耗品に加える。
多和田葉子の文学における複数文化的トポスの研究

本研究は、日独バイリンガル作家・多和田葉子の文学における複数文化的なトポスの諸相を明らかにすることを目的としている。研究期間の初年度にあたる2018年度は、多和田文学で舞台設定が意味することを、文化的・歴史的・社会的な場としての可能性という観点から検討するにあたり、まず、基礎的な資料として、特定の場所を舞台として設定した作品と、不特定の場所を舞台とした作品とが、どのように創作されてきたのか、その展開を整理するところから着手した。ここには、作品の舞台の他、作品が翻訳された場所、また多和田が朗読やパフォーマンスで訪れる場所をも含めている。この調査過程で得られた成果の一端は、作品発表、演劇化の動向、朗読、講演、パフォーマンス等の多和田の活動をめぐる事蹟を年次ごとにまとめた年譜や著書目録の作成に生かした。以上の作業と並行して、作品分析に進むための作業も開始した。具体的な対象作品として、まず、多和田の日本語作品の中から、現代のベルリンの通りや広場を歩く「わたし」を描いた小説『百年の散歩』を選び、舞台設定に関する調査を進めた。併せて、本作に関してすでに指摘のある、ヴァルター・ベンヤミンの〈遊歩者〉的存在として「わたし」を捉える見方の再検証にも入った。『パサージュ論』をはじめとするベンヤミンの著作やそれに関する研究文献を手掛かりとしながら、ベンヤミンの〈遊歩者〉とベルリンの街路を歩く「わたし」との比較検証を試みた。上記研究実績の概要に記載したように、文献調査の面では計画に従って進めることができたが、半面、実地調査の方は、十分な日程が確保できず実施に至らなかった。2018年度に着手した文献調査を継続するとともに、実地調査を行う方針である。『百年の散歩』の舞台として設定された実在の通りや広場に関して、それぞれの場所を遊歩する語り手が具体的にどこに行き、何を見て、どのような思索をめぐらせたのか、について調査を進める予定である。進捗状況報告欄に記載したように、2018年度は実地調査の実施に至らなかったこと、及び文献調査が図書館での調査に終始したことにより、収支状況に変更が生じた。これについては2019年度に執行を持ち越したい。
マイクロチャンバーによるABCトランスポーター基質測定系の開発

本研究の目標は、微細加工技術(MEMS)で作成したマイクロチャンバー上の人工膜にABCトランスポーターを再構成し、その輸送活性をリアルタイムで測定する系を確立することである。本研究では、ABCトランスポーターを平面膜に組み込む必要があるが、好熱菌のABCトランスポーターの大腸菌を宿主とした発現系の構築が必要である。先年度においてATPase活性を保持したヘテロオリゴマータイプのABCトランスポーターの発現および平面膜への膜タンパク質であるV-ATPaseの再構成の確認には成功している。ABCトランスポーターの平面膜への再構成効率を評価するために、蛍光色素を導入した。蛍光色素ラベルによりABCトランスポーターのATPase活性が消失することはなかった。1分子蛍光観察により平面膜への組み込みを調べた。効率は悪いものの、平面膜上にタンパク質由来のものと思われる輝点を多数確認した。蛍光を持つ輸送基質の取り込みをATP存在下で調べているが、背景に比べて明確なチャンバー内の蛍光強度の増加は確認されていない。その原因の一つとしてチャンバー自体の自然蛍光があり、現在チャンバーの素材の検討を行っている。本年度においてATPase活性を保持したヘテロオリゴマータイプのABCトランスポーターの発現に成功している。膜タンパク質を平面膜に再構成すること自体容易でなく、成功例も少ない。また、ABCトランスポーターは複数の異なるサブユニットからなるオリゴマー蛋白質であり、解離による活性の喪失等をさけつためには、オリゴマーの形成過程の理解が必要である。同じ好熱菌から調製したオリゴマー蛋白質であるV-ATPaseのサブユニットからの再構成実験によりヌクレオチドがオリゴマー形成に必須であることが判明した。実際にABCトランスポーターを平面膜に組み込むわけだが、その確認のためにこれに蛍光分子を導入し、1分子蛍光観察により平面膜への組み込みを調べた。効率は悪いものの、平面膜への組み込みは確認できた。以上のように、本申請研究の目標でもある膜マイクロチャンバーによる活性計測計の構築にはいる道筋をつけることができた。
ヌクレオソーム構造修飾によるストレス応答増強法の開発に関する研究

新規histone deacetylase inhibitor(HDACI)であるCHAP31及びFR901228が、培養細胞系においてアデノウィルスによる導入遺伝子(LacZ)発現を約10倍以上に増強させうることを明らかにした。又、LacZのようなレポーター遺伝子のみならず、熱ショック蛋白72(HSP72)のような機能を持った遺伝子を導入した場合においても同様の増強効果が確認された。上記の外来性遺伝子発現増強効果が、細胞内コアヒストンのアセチル化の程度と強く相関し、過去に報告されていたような、細胞表面に存在するアデノウィルスレセプターの発現上昇によるものでないことを確認した。従来内因性の遺伝子発現制御に深く関わっているとされているヒストンアセチル化が、外来性に導入された遺伝子の転写制御にも影響を与えていることが示唆された。HSP72を、熱ショックにより内因性に誘導した場合にはHDACIによる発現増強効果は観察されず、HDACIによる発現増強効果は導入遺伝子に特異的な現象であることが示唆された。マウス肝臓にLacZを遺伝子導入した後、CHAP31もしくはFR901228を投与することにより、遺伝子発現を約2倍に増強させることに成功した。TSAによるin vivoでの遺伝子発現増強効果はこれまでに報告がない。CHAP31やFR901228はTSAに比し安定性が高く、動物個体に静脈投与した場合でも比較的長時間の有効血中濃度を維持できることがin vivoでの効果発現に寄与している可能性が高いものと考えられた。また、アデノウィルスの導入効率自体が低いものの、同様の発現増強効果は肝臓のみならず心、肺、腎などの臓器に於いても観察された。HSP72の遺伝子導入による肝虚血再潅流障害抑制効果については現在検討中であるが、十分な発現を得るべくベクターの投与量を増やすと、ウィルス自体の持つ肝毒性が現れてくると言うジレンマがある。HDACIと併用することにより使用するウィルス量を減少せしめることが、ブレイクスルーにつながるものと期待している。Rat2 fibroblastに大腸菌由来beta galactosidaseをアデノウイルス(AdLacZ)による遺伝子導入法にて発現させ、これに種々のHDACIを併用することでbeta galactosidaseの発現が増強されるかを検討したところ、FR901228は4ng/ml、CHAP31は32ng/mlの濃度にて発現を約10倍に増強させることに成功した。TSAの場合、発現効率上昇の効果がみられる濃度よりも低濃度で細胞に対する毒性の方が強く現れ、増強効果は著明ではなかった。CHAP31に関してはアデノウイルスによる遺伝子発現を増強させうるという報告は過去になく、新しい知見である。FR901228、CHAP31による発現効率上昇効果はbeta galactosidaseのようなレポーター遺伝子のみならず、熱ショック蛋白のような機能を持った遺伝子の場合についても当てはまる事を確認した。マウスを用いたin vivoの系に於いても現在検討中であり、AdLacZを感染させた際の肝臓におけるbeta galactosidaseの発現が、CHAP31を併用する事により増強可能であることの感触を得ている。次に、内因性の遺伝子発現増強効果の有無について検討した。