hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
酵母Cdkファミリーによる細胞周期制御機構と創薬への応用

Pho85と結合する10種のサイクリンそれぞれとPho85との融合タンパク質をPho85の代りに発現する酵母株を作製し、その性質を調べた。その結果、PH05の発現抑制はPho85-Pho80、グリコーゲンの正常な代謝はPho85-Pc18をそれぞれ発現している株でのみ見られ、またcln1cln2二重欠失株ではPho85-Pcl1を発現している株だけが生育できることがわかった。これらの結果はPho85キナーゼの特定の機能には特定のサイクリンとの組み合わせが必要であることを示している。一方、Pho85-Pclを発現している株の中でPHO5の脱抑制が不完全なものが見られたが、PHO80を欠失させることにより完全な脱抑制が見られるようになった。また融合蛋白質のPho4に対するキナーゼ活性を調べたところ、Pho85-Pho80が最も強く、Pho85-Pcl8は最も弱かった。PHO85およびPHO85-PCLを誘導発現する系を構築し、pho85 pho80二重欠失株中で発現誘導後、一定時間後にmRNAを抽出し、ジーンチップ解析を行い、PHO85およびPHO85-PCL融合蛋白質のimmediatetargetの探索を試みた。その結果、SW15およびそれにより制御されるCHS2,EGT2,PCL9、貯蔵糖代謝にかかわるTSL1,GSY1、Pho85のサイクリンであるPCL7、メタルセンサーであるCTR3などの発現量が上昇すること、また逆にMAK11,DSR1,PRS3などの発現量が減少することを見いだした。PHO85およびPHO80-PHO85発現誘導時で発現量が変化する遺伝子は多くの場合共通であったが、PCL7の発現上昇だけはPHO85の発現誘導時にのみ観察された。このことはPCL7の発現調節に必要なサイクリンはPho80以外のサイクリンであることを示している。現在残りの融合遺伝子について調べている。別の実験より、diauxic shiftによる遺伝子発現の変化にPho85キナーゼが影響することがわかったため、PHO85およびPHO80-PHO85をテトラサイクリンリプレッサー誘導体により誘導発現する系を構築した。この系をpho85欠失株中に導入し、ドキシサイクリン添加により発現誘導後、0,1,2,4時間後にmRNAを抽出し、cDNAからcRNAに変換してジーンチップ(DNAマイクロアレイ)解析を行い、PHO85およびPHO80-PH085のimmediate targetの探索を試みた。その結果、SWI5およびそれにより制御されるCHS2,EGT2,PCL9、貯蔵糖代謝にかかわるTSL1,GSY1、Pho85のサイクリンであるPCL7メタルセンサーであるCTR3などの発現量が上昇すること、また逆にMAK11,DRS1,PRS3などの発現量が減少することを見いだした。PHO85およびPHO80-PHO85発現誘導時で発現量が変化する遺伝子は多くの場合共通であったが(理由は後述)、PCL7の発現上昇だけはPHO85の発現誘導にのみ観察された。2.PCL-Pho85融合タンパク質を用いた解析Pho80以外の9種のサイクリンそれぞれとの融合タンパク質を発現する酵母株を作製し、性質を調べた。

その結果、PHO5の発現抑制はPHO80-PHO85、グリコーゲンの正常な代謝はPCL8-PHO85、非発酵性炭素源での生育はPCL6-PHO85をそれぞれ発現している株でのみ見られることがわかった。これらの結果はPho85キナーゼの特定の機能には特定のサイクリンとの組み合わせが必要であることを示している。一方、PCL-PHO85を発現している株の中でPHO5の脱抑制が不完全なものが見られたが、PHO80を欠失させることにより完全な脱抑制が見られるようになった。このことはPho80がPcl-Pho85融合蛋白質に結合している可能性を示している。Pho85と結合する10種のサイクリンそれぞれとPho85との融合タンパク質をPho85の代りに発現する酵母株を作製し、その性質を調べた。その結果、PHO5の発現抑制はPho85-Pho80、グリコーゲンの正常な代謝はPho85-Pcl8をそれぞれ発現している株でのみ見られることがわかった。一方、Pho85-Pclを発現している株の中でPHO5の脱抑制が不完全なものが見られたが、PHO80を欠失させることにより完全な脱抑制が見られるようになった。またG1サイクリンのCLN1とCLN2が欠失しているときにPHO85は生育に必須となるが、cln1 cln2二重欠失株でPho85-Pclを発現している株からさらにPHO80を欠失させることで、Pho85-Pc11を発現している株だけが生育できることがわかった。これらのことはPho80がPcl-Pho85融合蛋白質に結合している可能性を示している。また融合蛋白質のPho4に対する活性を試験管内リン酸化により調べたところ、Pho85-Pho80が最も強く、Pho85-Pcl8は最も弱かった。PHO85およびPHO85-PCLをテトラサイクリンリプレッサー誘導体により誘導発現する系を構築した。この系をPho85 Pho80二重欠失株中に導入し、ドキシサイクリン添加により発現誘導後、0、1,2,4時間後にmRNAを抽出し、cDNAからcRNAに変換してジーンチップ解析を行い、PHO85およびPHO85-PCL融合蛋白質の標的の探索を試みた。PHO85およびPHO85-PHO80発現誘導時で発現量が変化する遺伝子を調べた結果、PHO85の発現誘導時にのみ発現量が変化する遺伝子が見いだされた。このことはこのアプローチにより特定のサイクリンとの複合体によって制御される遺伝子を見つけることができることを示している。
黄変米毒クロールペプタイドの非筋細胞に及ぼす効果

黄変米から抽出され、精製構造決定されたクロールペプタイドは筋から得られたアクチンに対してキノコ毒ファロトキシンと同様に働くことがわかった。すなわちアクチンフィラメントを分断する條件、高濃度KI下でもクロールペプタイド存在下でフィラメント形を保った。我々は平滑筋からCa存在下でアクチンに結合し、その長さを調節する因子(アクチン長さ調節因子,ALRと略す)の精製に成功したが、アクチンにALRを10対1に混じ、Ca濃度を【10^(-4)】モル下でアクチンフィラメントを切断する條件下に【10^(-5)】モルのクロールプロマイドはこの切断作用を抑制することがわかった。小腸粘膜微繊毛にはアクチン切断因子ビリンが存在し、Ca存在下で繊毛内アクチンフィラメント束が切断される為、微繊毛が縮少変形することが、ブラッシュボーダー標本で確かめられた。一方あらかじめクロールプロマジンを存在させると、切断作用が抑制されるのでCaの存在下でも微繊毛の変形が生じないことが電子顕微鏡を用いた結果明らかになった。一方、ALRの抗体をつくりIg Gに精製して小腸微繊毛への存在を調べたところ、微繊毛の突端と根部が良く染った。免疫転写法を用いてSDSPAGEで調べたところALRと同じ位置で染った。この分子量は明らかにビリンのものより低い(84Kダルトン)ので、ビリンを精製してSDSPAGEで調べたところ明らかに報告されていたビリンのものよりも低く、ALR抗体で染った。ビリンとALRの相同について、非常に問題が残るので今後詳しく検討していきたい。
Development of high-fidelity large scale simulation software on reactive flow for significant improvement of combustion efficiency

米国発の超大規模数値解析ライブラリと,これと高親和性の申請者らによる計算高効率化手法とを組合せ,世界の著名研究者と連携する.当グループ独自のマイクロ燃焼現象を標準現象として採用し,モデル更新及び高効率化を継続可能な共同開発環境を整備,以てモデルベース燃焼研究の高度化を図る.既存燃焼モデルでは対応できない排出ガス予測や超高効率燃焼技術開発に必要なマルチスケール燃焼モデルを構築する.開発ソフトウェアを用い,次世代燃焼技術として期待される非平衡プラズマアシスト燃焼の数値解析技術を確立する.開発ソフトウェア群は公開し,本研究終了後も世界の研究者と連携してソフトウェア高度化を継続可能な環境を整備する.米国発の超大規模数値解析ライブラリと,これと高親和性の申請者らによる計算高効率化手法とを組合せ,世界の著名研究者と連携する.当グループ独自のマイクロ燃焼現象を標準現象として採用し,モデル更新及び高効率化を継続可能な共同開発環境を整備,以てモデルベース燃焼研究の高度化を図る.既存燃焼モデルでは対応できない排出ガス予測や超高効率燃焼技術開発に必要なマルチスケール燃焼モデルを構築する.開発ソフトウェアを用い,次世代燃焼技術として期待される非平衡プラズマアシスト燃焼の数値解析技術を確立する.開発ソフトウェア群は公開し,本研究終了後も世界の研究者と連携してソフトウェア高度化を継続可能な環境を整備する.
インドロカルバゾール生合成機構の解明および新規類縁体のコンビナトリアル生合成

本研究は、微生物が生産する抗癌活性を有するビスインドール化合物に注目し、一つ目に、ビスインドール化合物生合成酵素のX線結晶構造に基づいたアミノ酸置換による新たな酵素機能の開発を目的とし、二つ目に、改変酵素を用いたビスインドール新規類縁体のコンビナトリアル生合成による環境負荷に配慮した生産法の確立を目的としている。これまでに、ビスインドール化合物の詳細な生合成機構を解明するために、スタウロスポリン生合成酵素StaPとビオラセイン生合成酵素VioEのX線結晶構造を明らかにし、StaPとVioEが担う詳細な反応機構を明らかにしている。一方で、明らかになったStaPとVioE反応機構から、アミノ酸置換により、それぞれの酵素反応を改変することは困難であることも示唆された。そこで本年度は、RebCのX線結晶構造に基づき、新たにスタウロスポリン生合成酵素StaCのアミノ酸置換を行い、in vitroでStaC酵素反応を改変することに成功した。StaCはStaPと協調してクロモピロリン酸からK252cを合成するモノオキシゲナーゼホモログである。本酵素の反応機構は未解明な部分が多いが、RebCのX線結晶構造中で基質ポケットを構成する二か所のアミノ酸残基をStaCに導入したところ、RebC型の活性と共に、抗癌剤として臨床開発試験中であるUCN-01の基本骨格である7-hydroxy-K252cを酵素的に生成することを見出した。UCN-01の有効な培養生産法はこれまでになかったことから、本改変StaC酵素を用いることで培養生産が改善出来る可能性が見出された。また、更にインドロカルバゾール化合物の骨格構造の多様性に貢献できると考えられる。本研究は土壌微生物である放線菌の抗生物質生合成酵素の立体構造に基づき、酵素本来の機能を合目的にアミノ酸置換により改変することで新規類縁体の生合成法を構築し、放線菌の「培養」による環境負荷に配慮した新規活性物質の生産法の確立を目的としている。材料として抗癌活性などを有するインドロカルバゾール系化合物を用いている。これまでに、インドロカルバゾール骨格生合成酵素の反応機構の解明、未同定の生合成中間体の化学構造の決定を目的とし、スタウロスポリン生合成酵素StaPとビオラセイン生合成酵素VioEのX線結晶構造を明らかにしている。本年度はインドロカルバゾール生合成の鍵酵素であるP450酵素StaPの反応機構を変異酵素活性及び類似P450酵素RebPとの活性比較により解析し、活性中心に存在するアミノ酸残基の機能同定を行った。これらの事実に合わせ、共同研究により行われたエネルギー計算やX線結晶構造解析の結果から、反応には基質分子近傍の水分子を介したプロトンリレーがあることを提唱した。また非天然型のインドロカルバゾール類縁体の「培養」生産を、変異酵素を導入したコンビナトリアル生合成により行うことを目的とし、まずはインドロカルバゾール系化合物非生産菌である放線菌Streptomyces lividans株を宿主として野生型のインドロカルバゾール骨格生合成遺伝子を再構成したベクターを構築し、宿主に導入し、培養を行い目的産物の生産を確認した。
熟達を考慮した人間システムモデリングとその支援

機械が人間の熟達化を支援するシステムの設計論として,社会/計画/認知/動作/生体からなる階層的なスキル分類モデルを提案し,各階層のスキルに関する熟達定量化・支援法を研究し,6種の被験者実験でそれらの有効性を検証した.特に,社会スキルについてはチーム熟達・語用熟達・指示動作の解明,計画スキルについては人間の操作意図推定法の確立,生体スキルについては弁別度を考慮した操作支援法の実証などの成果が得られた.機械が人間の熟達化を支援するシステムの設計論として,社会/計画/認知/動作/生体からなる階層的なスキル分類モデルを提案し,各階層のスキルに関する熟達定量化・支援法を研究し,6種の被験者実験でそれらの有効性を検証した.特に,社会スキルについてはチーム熟達・語用熟達・指示動作の解明,計画スキルについては人間の操作意図推定法の確立,生体スキルについては弁別度を考慮した操作支援法の実証などの成果が得られた.本研究は,人間の相互作用機能に重点をおいた“ヒューマトロニクス"と,“操作熟達を支援するメカトロニクス=HAM(Human Adaptive Mechatronics)"を融合させて,効率的かつ自然に人間を支援する機械システムの創出を目指し,(a)熟達を定量的に考慮した人間状態モデルの確立,(b)アシスト手法の提案,(c)操作熟達を向上のためのシステム設計法の確立,を目指している.“熟達"には“個人スキル"と“集団スキル"があり,後者に関連する発話という行為は,自己が獲得した情報を確定する作業であると同時に,他者への意思伝達手段としての2面性を持つ為,特に重要である.そこで本年度は,仮想空間内のロボットを複数の人間が会話をしながら操作して共同作業を行う「箱運搬協調作業シミュレータ」を構築し,さらに複数名の視線計測が可能な装置を開発して,延べ30名の被験者の機械操作・視線・動作・会話・脳波・心拍等の,人の認知状態および熟達の解析に必要なデータの蓄積を図った.複数被験者の操作履歴の相関解析法や,自己組織化マップを利用した操作切替全体像の可視化手法を提案し,これらで解析した結果,1)役割分業化が作業全体の効率向上に貢献し,2)状況に応じた操作モードの明確な選択性が熟達に関連し,3)静的な対象物の直接視は減少して潜在的注意を起こしている,などの有意義な知見が得られた.これらの特性は,個人および集団レベルでの熟達向上のために人間が体得してきた戦略であるといえる.これら知見を,人間状態モデル及び支援システムの構築に活用し,来年度の研究へ繋げる.本成果は,招待講演1件(IEEE ETFA08),雑誌論文4件,国際会議9件などで広く公表した.本研究は,人間の相互作用に重点をおいた"ヒューマトロニクス"と,"操作熟達を支援する人間適応型機械(HAM)"とを融合させ,効率的かつ自然に人間を支援する機械システムの創出を目指している.本年度は人の認知状態および熟達の解析に必要な人間データ(機械操作や会話,視線/脳波/心拍などの生体信号)の集録の為に前年度構築した"箱運搬協調作業シミュレータ"を用い,収集した30名分のデータ解析を実施して,支援系設計に必要な集団熟達の評価方法や操作支援機構の検証を行い,次の結果を得た.1)協調作業が進展するにつれ,他者へ指示を出す"観測行動"と,実際に作業を遂行する"作業行動"とに分業する傾向が認められた.2)複数作業者間の会話をコーパスを利用して分析し,タスク操作熟達との関係を調べたところ,作業計画に関する発話は集団が熟達化するにつれ減少したが,自分や他者の状態確認質問頻度は変化せず,これら発話内容の変化から集団熟達度を定量化できる可能性が示された.また,3)開発した視線計測装置で抽出した視線データに基づき,アイコニックモデルで操作者の注意レベルを推定する方法,並びに4)自己組織化マップを活用したベイズ推定による操作者の意図推定アルゴリズム,を提案し,機械による支援に必要な各種推定機構を提案した.その他,提案する支援機構の有効性を検証する為の協調運搬用遠隔操縦群ロボットと,そのためのマルチレーザファインダ式ロボット位置推定システムを開発し,実機検証準備を進めた.これらの研究内容は,国際会議RO-MAN09で企画した特別セッションの他,他関連研究の特別セッション(IROS09, SICE-ICASE)等で発表し,本研究成果の公開に務めた.人間の相互作用性に重点をおいた"ヒューマトロニクス"と,熟達に重点をおいた"HAM(Human Adaptive Mechatronics)"とを融合させ,人間の操作向上を支援する人間-機械系設計法の確立を目指し,本研究ではその設計に必要な人間モデルと支援法の研究に取り組んだ.本最終年度では,社会・計画・認知・動作・生体の5レベルから成る熟達階層と,この階層を元に支援系を設計するSAIO(Skill Assist Input-Ouput)モデル概念を提案し,過去3年間の各研究成果項目の関係を明確化して人間モデルの体系化を行った.この体系化に基づき,前年度までに開発した箱協調運搬タスク実験を通して,複数作業者間の会話のコーパス化と操作熟達,並びに社会性役割と集団熟達の検証(社会スキルに相当),ペトリネット・自己組織化マップ・ベイズ推定による操作者の意図推定と機械の行動決定

アルゴリズムの提案と検証(計画・認知スキル相当),機械操作時の手のリーチングアクションや鏡映描写を用いた熟達判別解析(計画・動作スキル),脳モニタリングを併用した随意運動の制御特性と熟達変化の解明(動作・生体スキル)を実施した.その結果,集団の熟達化に伴う発話内容の変化と社会的役割分担率の関係が明らかになり,人間の相互作用に関する熟達度の推定が可能となることが示せた.また操作者の意図推定法の格子を確立でき,さらに会話の語用タイミングの違いで人間の意志解釈を操作し,かつそれに適した行動を生成する支援機構の設計法が示され,人間の相互作用性と熟達を考慮した支援法の一例を示せた.これらの研究成果は,国際会議Ro-Man2010(IEEE Int.Symp.on Robot & Human Interactive Communication)で企画した特別セッションで発表し,さらにHSI2011(Int.Conf.Human System Interaction)にも特別セッションを企画・採択され,2011年5月に発表予定である.
一般高齢者における受療抑制とその予後に関する追跡研究

一般高齢者を対象に行った2003年と2006年の調査の結果、日本でも、所得が低いほど受診抑制が多くみられるなど社会経済的地位による医療アクセスの差が存在した。4年間の追跡データの分析の結果、治療を中断した高齢者は、年齢や疾患などを調整しても要介護状態になりやすかった。また、低所得高齢者で費用を理由とした受診抑制が多いこと、高齢になるほど、病院が近くにない、交通機関がないなど、地理的なアクセスが問題になることを確認した。受診を控えた理由として、費用や地理的アクセスに加え、うつや社会的支援など心理社会要因の影響が示唆された。治療が必要にも関わらず様々な理由で受診を控える者かいることが報告されている。必要な治療を控える結果より疾患が重い状態で受診することになり、予後が悪いとの指摘もある。しかしながら治療中断の予後についての研究はいまだ少ない。本研究では、自治体かち提供される死亡・要介護認定データを日本福祉大学の一般高齢者調査データ(AGFS)に結合することで、治療中断の結果、健康状態が悪化するのか否か、受診行動の関連要因は何かなどを明らかにすることを目的とする。1年目は、2003年の調査データに約4年分の死亡・要介護認定状況を結合し、自己都合で受診を控えた経験と社会経済的地位(教育年数、所得)や心身の健康状態、ソーシャルサポートの有無、その後の死亡・要介護の発生との関連などを検討した。治療継続者に比べ、自己都合で受診を控えた高齢者では、男女とも要介護状態になるハザードが高く、男性で治療中断者の要介護認定ハザードは1.70.(p<0.05)、治療継続者は1.67(p<0.01)であり、女性では継続者の1.37(p<0.05)に対し中断者で1.40(p<0.10)であった。また、男性では死亡との関連も認められた。低所得者で治療を中断する者が多いため(高所得者6.7%に対し、低所得者9.2%)、所得を調整したモデルによる検討も行ったが、同様の傾向を示した。治療中断者に多い疾患は、関節疾患、視力障害、聴力障害、高血圧、排泄障害の順であり、生活の質に関する疾患の有病率が高かった。また所得が低い高齢者ほど、うつや主観的健康感が悪く、適切な介入のためには、治療中止に到る要因について、心理社会面からの多面的な検討も必要と思われた。また、20歳以上の全国代表サンプル(JGSS-2008)を用いた解析では、所得や教育程度が低いほど、医療に対する不安を多く抱えていた。なお、2006年調査データの横断解析では、低所得高齢者で費用を理由とした受診抑制が多いことを見出し、論文として発表した。医療機関や健康診断の受診などの受診行動には社会経済的地位が関連していることが示唆されている。低所得や教育歴が短い者ほど、受診を控えやすく、健康診断など健康関連行動への関心も低い。1年目の研究で、受診抑制が要介護状態につながる可能性を報告したが、その経路としてソーシャルサポートの多寡が関連しているか否かを検討するために、AGESの4年間の追跡データを用い、Coxの比例ハザードモデルによる検討を行った。年齢やベースライン時の疾患の治療状況を考慮しても、ソーシャルサポートが少ないほど、認知症を発症したり要介護状態になりやすいことを確認した。ソーシャルサポートが少ない高齢者では、認知症発症リスクが2倍以上高く(国際老年精神医学会で発表)、要介護状態発生リスクは、1.5倍から2倍程度であった。いずれも前期高齢者において関連が強く、早期の介入の必要性が示された。社会経済的地位が低いほどソーシャルサポートが少ないことは、今回の結果(低所得者に要介護状態や認知症の発症が多い)の一部を説明していると思われる。健診の受診については、主要な生活習慣病(悪性新生物、心疾患、脳血管疾患)による死亡との関連について、やはりCoxハザードモデルによる解析を行った。所得、年齢、疾患の治療状況を考慮しても、健診を1年以内に受けていない高齢者は、死亡リスクが1.21.8倍程度高かった。死因ごとの解析では、心疾患と悪性新生物で有意な関連が見られた。健診により疾患が早期発見されることで適切な治療につながる可能性が示された。特に悪性新生物による死亡は低所得者に多い理由として、健診受診など受診行動が関連している可能性が考えられた。今後は、ソーシャルサポートなど心理社会要因との交互作用の検討をしつつ、受診抑制につながる要因を多面的に解明して行きたい。1・2年目の研究から、皆保険制度の日本でも、所得が低いほど受診抑制が多くみられるなど所得による医療アクセスの差が存在し、治療を中断した高齢者は、年齢や所得など社会経済的地位を調整した上でも要介護状態になりやすいことが確認された。

受診を控える理由として、費用だけでなくうつや社会的支援など心理社会的要因の影響が示唆された。これら結果をふまえ、知多半島の5自治体分の地域高齢者パネルデータ(N=7855)を用い、精神的・社会的・身体的健康度(睡眠障害、抑うつ、主観的健康感、社会的支援など)の変化を、受診行動や生活習慣の関連から検討した。その結果、2003年調査時に睡眠障害を訴えていた高齢者は、ベースライン時の抑うつを調整しても、3年後に抑うつ症状を訴えるリスクが高かった。4年間(2003年11月2007年10月)の追跡データ(死亡・要介護・認知症発症)の分析では、睡眠障害が認知症のリスクであり、理由として、社会活動や知的活動の乏しさが推測された。これら心理社会要因に比べ健診受診などの受診行動が認知症発症に与える影響は相対的に弱かったものの、健診を受けない高齢者には抑うつや社会的孤立が多くみられた。受診抑制は、要介護発生や死亡と関連していたが、認知症発症とは関連が不明確であった。受診を控えた理由として「医者に行くのは好きではない」と回答する高齢者が「費用がかかる」の24.4%に対し23.7%とほぼ同率であり、受診行動には医師とのコミュニケーションの質など心理的要因が関連している可能性も示された。なお、以上の結果は、日本公衆衛生学会、日本心身医学会、米国公衆衛生学会で発表すると共に、連携研究者によるホームページ(http://square.umin.ac.jp/ages/)を通して公開し、自治体やNPOなどを対象にした説明会やシンポジウム、研究会などでも発表した。医療アクセスと社会経済的地位の関連については、内外の研究の動向をまとめ、各国の取り組みや今後の課題などについて日本公衆衛生雑誌の連載の一部として発表した。
メギドにおけるVI層-AとV層-A-IV層-Bの年代決定についての研究

メギドにおけるVI層-AとV層-A-IV層-Bの年代決定について考察するため、まずこれまで行われてきた発掘調査の歴史をまとめ、VI層-Aを紀元前11世紀、V層-A-IV層-Bを紀元前10世紀のソロモン時代とする伝統的な年代説と、VI層-Aを紀元前10世紀、V層-A-IV層-Bを紀元前9世紀とするイスラエル・フィンケルシュタインの低年代説の成立過程および主張を明らかにした。また、2004年に発掘から半世紀以上もたって出版された、1925年から1939年までのシカゴ大学オリエント研究所によるメギド発掘調査のVI層に関する報告書(Timothy P.Harrison, Megiddo 3 : Final Report on the Stratum VI Excavations [2004])も分析したが、VI層の年代を決定する上で新たな根拠(未知のデータ)を提示していないことを確認した。V層-A-IV層-Bの年代に関する、フィンケルシュタインの最も強力な証拠は、メギドの宮殿とサマリアの宮殿(紀元前9世紀)との間に建築技術と切り石のしるしに見られる間違えようのない類似点の存在であった。しかし、アミハイ・マザールが指摘するように、このことは、10世紀のソロモンと9世紀のアハブという2人の王がフェニキア人の石工を使ったと仮定すれば説明可能となる。結論として、フィンケルシュタインの主張の根拠は全体として不十分であると言わざるを得ない。現時点では、伝統的な年代説を低年代説に代える必然性はないと判断される。さらに、伝統的な年代説の立場にあったマザールが、フィンケルシュタインとの論争を通して、鉄器時代区分の見直しに至ったことは、低年代説を取り巻く論争が新たな段階に移ったことを意味する。これについては今後の展開をしっかりと見守っていく必要がある。参加を予定していた6-7月のメギド発掘調査がイスラエル・パレスチナ情勢悪化のため、2002年度は中止となった。しかし、11月にカナダのトロントで開催された米国オリエント学会と米国聖書学会に参加し、それぞれの学会で行われた「メギド」に関するセッション(メギド発掘調査隊の主要メンバーによる)から最新の情報を得ることができた。メギドにおけるVI層-AとV層-A-IV層-Bの年代決定に関して最も重要な資料であるヘブライ語聖書(旧約聖書)テキストの史実性を考察し、「ヘブライ語聖書の史実性-テル・メギドでの発掘調査から-」と題する論文を『基督教研究』に発表した。この論文において、史料としてのヘブライ語聖書テキストの問題点と考古学によるデータの重要性を再確認した。また、現在進行中のメギドでの発掘調査に注目するだけではなく、これまでのメギドでの発掘調査レポートを詳細に再検討する必要性を感じた。なぜなら年代決定のポイントとなる箇所(場所)はすでに発掘(破壊)されているからである。これまでメギドで発掘調査を行ったチームの記録(メモなど公開されていないもの)を徹底的に調べてみる価値があるのではないか。2003年度は、メギドでの発掘調査を行ったシカゴ大学のオリエント研究所などにそうした資料が現在残っていないかどうか問い合わせ、調査する予定である。平成15年度はメギドでの発掘調査の実施年度ではないため、これまで行われてきた発掘調査の報告書などの文献を研究対象とした。メギドにおけるVI層-AとV層-A-IV層-Bの年代決定については、現在進行中のメギド発掘調査(テル・アビブ大学とペンシルバニア州立大学による)だけでは不十分であり、これまでの発掘調査結果を再検討することも大切な課題のひとつである。

具体的には、最も重要な発掘調査と考えられる、1925年から1939年までのシカゴ大学オリエント研究所によって行われた発掘調査の報告書を今年度の研究対象とした。今年度の研究実績として以下の2点を挙げることができる。(1)メギドにおけるVI層-AとV層-A-IV層-Bの年代決定において重要む意味を持つ、イスラエル・フィンケルシュタインの主張する低年代説(Low Chronology)と伝統的な年代説(Traditional Chrnology)の比較研究を進めることができた。結果として、どちらの説も決定的な根拠を示していないことが判明した。多くの研究者(考古学者)が伝統的な年代説を支持するのは、低年代説が伝統的な年代説を覆すほどの根拠を提示できないことによる。この研究の副産物として、フィンケルシュタインとシルバーマンのThe Bible Unearthedの日本語訳が今年中に出版される予定である。(2)本研究と密接に関係している、古代イスラエルにおける10世紀問題について、3月にイスラエルを訪れ、ベン・グリオン大学のエリエゼル・オレン教授、ヘブライ大学のアミハイ・マザール教授、エフライム・シュテルン教授、ドロン・ベン・アミ博士にインタビューをすることができた。彼らはすべてフィンケルシュタインの低年代説には否定的であった。フィンケルシュタインの主張の問題点が多く指摘された。本研究の最終年度となる今年度は、1925年から1939年までシカゴ大学オリエント研究所によって行われたメギド発掘調査の、VI層に関する報告書(Timothy P.Harrison, Megiddo 3:Final Report on the Stratum VI Excavations [2004])の分析を中心的に行った。報告書は、VI層の年代を決定する上での新たな根拠を示すことなく、すでに出されてきた根拠に基づき、VI層がダビデ(紀元前11世紀)によって破壊されたと結論づけている。つまり、VI層-AとV層-A-IV層-Bに関して伝統的な年代説を支持する主張となっている(これについては、2005年11月開催のイスラエル考古学研究会で口頭発表)。しかし、VI層の陶器や建築様式が、Harrisonによる指摘のように、メギドにおいて少なくともイスラエル人、ペリシテ人、カナン人が共存していたことを示すとすると、ヘブライ語聖書の記述内容とは違うプロセスでイスラエルの統一王国が成立したことになる。これは新たな研究テーマとして検討すべき重要性を持っている。"また、メギドにおけるVI層-AとV層-A-IV層-Bの年代決定において重要な意味を持つ、イスラエル・フィンケルシュタインの主張する低年代説(Low Chronology)と伝統的な年代説(Traditional/Conventional Chronology)の比較研究を進めてきたが、ヘブライ大学のアミハイ・マザール教授が指摘する「修正された伝統的な年代説」(Modified Conventional Chronology)のように、単なる二者択一的な問題ではないことが明らかとなった。本研究のまとめは「研究成果報告書」と同志社大学神学部発行の「基督教研究」に発表される予定である。
摩擦・摩耗低減剤としてＲＢセラミックス粒子を活用した先進トライボマテリアルの開発

本研究では,米ぬかを原料とする硬質多孔性の炭素材料RBセラミックスの粒子を,低摩擦と飛躍的な耐摩耗性向上を同時に付与することが可能な「摩擦・摩耗低減剤」としてポリエーテルエーテルケトン(PEEK)樹脂及び銅合金に配合した,新しい複合材料の開発に成功した.これらの複合材料はともに優れたトライボロジー特性を示すことを明らかにした.PEEK樹脂とRBセラミックスの複合材料は,水中で低摩擦・優れた耐摩耗性を示すため,水中軸受材料として利用可能であることが明らかとなった.また,銅合金とRBセラミックス粒子の複合材料は,鉄道集電用パンタグラフのすり板として応用可能であることを明らかにした.本研究では,米ぬかを原料とする硬質多孔性の炭素材料RBセラミックスの粒子を,低摩擦と飛躍的な耐摩耗性向上を同時に付与することが可能な「摩擦・摩耗低減剤」としてポリエーテルエーテルケトン(PEEK)樹脂及び銅合金に配合した,新しい複合材料の開発に成功した.これらの複合材料はともに優れたトライボロジー特性を示すことを明らかにした.PEEK樹脂とRBセラミックスの複合材料は,水中で低摩擦・優れた耐摩耗性を示すため,水中軸受材料として利用可能であることが明らかとなった.また,銅合金とRBセラミックス粒子の複合材料は,鉄道集電用パンタグラフのすり板として応用可能であることを明らかにした.本研究の目的は,RBセラミックス粒子を樹脂材料および金属材料に配合することにより,新しい複合材料を開発し,トライボマテリアルとして応用することである.平成24年度では,水中でのしゅう動材料としての利用が期待されているPEEK樹脂にRBセラミックス粒子を充填した複合材料を開発し,水潤滑下における摩擦・摩耗特性を明らかにした.PEEK樹脂に平均粒径3μmのRBセラミックス粒子を5,10,20,30,40mass%充填することにより,PEEK/RBセラミックス複合材料を作製した.比較材料として,PEEK樹脂,RBセラミックスを用いた-水潤滑下において,半径4mmのステンレス鋼SUS304ボールを相手としたボールオンディスク摩擦試験を行った.その結果,RBセラミックス粒子の充填率によらず,PEEK/RBセラミックス複合材料の摩擦係数,比摩耗量はPEEK樹脂,RBセラミックスに比べ低い値を示した.特にPEEK/RBセラミックス複合材料の摩擦係数については,高すべり速度条件において,0.02程度の極めて低い値を示すことが判った.試験後に発生した摩耗粉の粒度分布を測定したところ,PEEK/RBC複合材料における摩耗粉の平均粒径は0.4pmであり,PEEK樹脂における摩耗粉の約1/70であった.このことからRBセラミックス粒子を充填することでPEEK樹脂の大規模な塑性流動を抑制できることが明らかになった.このようにPEEK/RBC複合材料は,耐摩耗性に優れるために相手鋼材表面へのPEEKの摩耗粉の付着による相手面表面粗さの増加,また,摩耗に伴う自身の表面粗さの増加が見られないことから,すべり速度の増加や接触圧力の減少に伴う流体潤滑効果が他の材料に比べて顕著であり,そのため低い摩擦係数が得られたと推察される.以上のことから,PEEK/RBセラミックス複合材料は水中でのしゅう動材料としての応用可能性が示された.本研究の目的は,RBセラミックス(RBC)粒子を樹脂材料および金属材料に配合することにより,新しい複合材料を開発し,トライボマテリアルとして応用することである.平成25年度における研究で得られた成果は以下の通りである.1)前年度において水中で優れた摩擦摩耗特性を示したPEEK/RBC複合材料(RBC粒子の平均粒径:3μm,充填率:40mass%)の低摩擦発現メカニズムを,ストライベック線図による潤滑状態の推定及び混合潤滑モデルを用いた数値解析により明らかにした.ストライベック線図により,PEEK樹脂に比べPEEK/RBC複合材料は,より小さな軸受特性数において境界潤滑から混合潤滑に遷移することが分かった.混合潤滑モデルによる数値計算により,摩擦係数の境界摩擦成分と流体摩擦成分を計算したところ,表面に存在するRBC粒子からなる微小突起により,水による流体動圧効果が発現し,その結果,混合潤滑状態となることが分かった.2)摩耗粉の粒度分布測定の結果,PEEK樹脂に比べPEEK/RBC複合材料では,大規模な摩耗粉の発生頻度が少ないことが分かった.これは,摩擦面に露出したRBC粒子が荷重の大部分を支持し,母材であるPEEK樹脂の塑性流動が粒子間のみで生じるためと考えられる.また,1)におけるRBC粒子による流体動圧効果の発現により,摩擦係数が低下することも耐摩耗性の向上に寄与したと考えられる.3)鉄道集電用パンタグラフすり板への応用を目指した,Cu/C/RBC複合材料を作製し,その基本的な機械的性質・電気的特性を明らかにした.パンタグラフすり板として利用可能な機械的性質,電気的特性を示すための各材料の配合条件を明らかにした.本研究の目的は,RBセラミックス(RBC)粒子を樹脂材料及び金属材料に配合することにより,新しい複合材料を開発し,トライボマテリアルとして応用することである.平成26年度では,平成25年度に明らかにされた,パンタグラフすり板として利用可能な機械的性質,電気的特性を示す配合条件で作製されたCu/C/RBC複合材料について,架線材料との摩擦試験を通電条件で行うとともに,実車搭載条件相当の実験条件での耐摩耗性評価,離線率評価等を行った.平成26年度に行われた研究で得られた成果は以下の通りである.

1)銅粉末と,コークス・ピッチなどからなるカーボン粉末,及びRBセラミックス粉末を混合し,冷間静水圧成形により成形後,焼結することにより,Cu/C/RBC複合材料製すり板(RBセラミックスすり板)を製造した.なお,RBセラミックス粒子の粒径は10μm以下とし,銅粉末,カーボン粉末,RBセラミックス粉末の配合率をそれぞれ60mass%, 35mass%, 5mass%とした.2)架線(トロリ線)材料との通電下での摩耗試験の結果,RBセラミックスすり板は,従来のカーボンすり板に比べ耐アーク性は同程度であるものの,アーク放電が発生しない場合は自身及びトロリ線材料の電気摩耗は大幅に低減される.3)実車搭載条件相当での試験の結果,RBセラミックスすり板の離線率は現行カーボンすり板に比べ低い値を示すこと,RBセラミックスすり板の平均摩耗率は実用上問題ない値であること,RBセラミックスすり板使用時のトロリ線摩耗率は現行のカーボンすり板よりもわずかに低い値を示し,トロリ線摩耗を抑制できること,が明らかにされた.以上のことから,本研究で開発されたCu/C/RBC複合材料は,鉄道集電用パンタグラフすり板として十分実用可能な性能を有していることが確認された.26年度が最終年度であるため、記入しない。トライボロジー26年度が最終年度であるため、記入しない。当初の目的である,PEEK/RBC複合材料の作製とトライボロジー特性の評価がすべて行われただけでなく,PEEK樹脂にRBセラミックス粒子を充填することにより,水中での摩擦係数,比摩耗量の飛躍的な低減効果が得られるなど,最終目的であるしゅう動材料としての応用に向けたポジティブな結果について得ることができているため.本研究の目的は,RBセラミックス(RBC)粒子を樹脂材料および金属材料に配合することにより,新しい複合材料を開発し,トライボマテリアルとして応用することである.PEEK樹脂にRBC粒子を充填した複合材料については,水中において極めて優れた摩擦摩耗特性を示すことが明らかにされ,水中でのすべり軸受材料としての実用可能性が示されている.また,金属材料とRBC粒子の複合材料として,Cu/C/RBC複合材料が開発されており,次年度での通電環境における摩擦試験により耐摩耗性評価を行うことで,鉄道集電用パンタグラフすり板としての実用可能性を検討する予定である.以上のことより,本研究は当初の目的に対して,順調に進展している.26年度が最終年度であるため、記入しない。銅合金とRBセラミックスの複合材料を作製し,機械的性質,トライボロジー特性に及ぼすRBセラミックス粒子配合の影響を明らかにするとともに.同材料のしゅう動材料として応用可能性を明らかにする.平成26年度では,パンタグラフすり板として利用可能な機械的性質,電気的特性を示す配合条件で作製されたCu/C/RBC複合材料について,架線材料との摩擦試験を通電条件で行い,摩擦摩耗特性を明らかにする.さらに,実車搭載条件相当の実験条件での耐摩耗性評価,離線率評価を行い,同複合材料の鉄道集電用パンタグラフすり板としての実用可能性を明らかにする.26年度が最終年度であるため、記入しない。次年度使用額は,今年度の研究を効率的に推進したことに伴い発生した未使用額であり,平成25年度請求額とあわせ,平成25年度の研究遂行に使用する予定である.
環境中に放出された超微量金属ポルフィリンの生物への濃縮性と影響の探査

本研究では、環境中に流出しうる金属ポルフィリンの例として石油ポルフィリンをとりあげ、特に原油や重油中の存在量が多いバナジウムポルフィリンに注目してきた.(1)石油ポルフィリン標品の調製:原油中に微量(数十数百ppm)含まれているバナジウムポルフィリンと数数十ppm含まれているニッケルポルフィリンを単離して研究用標品として調製するための分離・精製法の高効率化に取り組んだ.主に液体クロマトグラフィー分離条件の最適化を図った結果、原油中のバナジウムポルフィリンおよびニッケルポルフィリンの各22種を分離し、そのマススペクトルからポルフィリンの化学構造を推定することに成功した.(2)高分解能な石油ポルフィリン分析法の開発:高速液体クロマトグラフィーを補足する石油ポルフィリンの高分解能分離分析法としてのキャピラリー電気泳動法(CZE)の有用性を探るため、数種の石油ポルフィリンモデル化合物(バナジウムエチオポルフィリンなど)を対象として分離挙動に及ぼす溶液組成の影響を詳細に検討した.その結果、CZEで極めて高疎水性な石油ポルフィリンの分離が可能になる特殊な泳動液組成を見出すのに成功した.(3)石油ポルフィリンの分配係数:数種の石油ポルフィリンモデル化合物を対象として、化学物質の生体への取り込みを議論する上で有用な物理化学量であるオクタノール/水間分配係数(Log Pow値)の算出を試みた.逆相液体クロマトグラフィーでのリテンションファクターをベースとする相関法を適用することにより、Log Pow値として510の範囲内の値が得られた.この結果から、石油ポルフィリンが水中から生物体内に移行し蓄積される可能性が高いとする当初予想が、物性データによって支持された.本研究では、環境中に流出しうる金属ポルフィリンの例として石油ポルフィリンをとりあげ、特に存在量の多いバナジウムポルフィリンに注目してきた。本年度は、以下のように研究が進められた。(1)石油ポルフィリン標品の調製:原油中に微量含まれている石油ポルフィリンの高効率な分離・濃縮法の確立に向けて具体的な検討を進めた。その結果、主にクロマトグラフィーを組み合わせる手法により、40種もの石油ポルフィリンの迅速分離に成功し、そのうち少なくとも20種については、比較的多量得られる見通しがえられた。(2)石油ポルフィリンの化学的安定性を評価する上で必要不可欠な化学形態分析法として、液体クロマトグラフィーと紫外一可視分光法および質量分析法を組み合わせた高感度分析法の適用を検討した。これにより、石油ポルフィリンの化学形態識別が容易になった。この化学形態分析法を適用して、種々の温度、および溶媒条件下における石油ポルフィリンの化学形態変化を定量的に求める実験が開始された。(3)環境試料中の超微量金属ポルフィリンを化学形態分析するために必要不可欠な高倍率予備濃縮法の設計を進めた。その結果、純水中のバナジウムポルフィリンを通常法の100万倍濃縮して分析することに成功した。この手法を適用して、バナジウムポルフィリンの水への溶解度を測定することに初めて成功した。また、多元素分析を図るためPIXEとの組合せについて、予備実験を開始した。本研究では、環境中に流出しうる金属ポルフィリンの例として石油ポルフィリンをとりあげ、特に原油や重油中の存在量が多いバナジウムポルフィリンに注目してきた.(1)石油ポルフィリン標品の調製:原油中に微量(数十数百ppm)含まれているバナジウムポルフィリンと数数十ppm含まれているニッケルポルフィリンを単離して研究用標品として調製するための分離・精製法の高効率化に取り組んだ.主に液体クロマトグラフィー分離条件の最適化を図った結果、原油中のバナジウムポルフィリンおよびニッケルポルフィリンの各22種を分離し、そのマススペクトルからポルフィリンの化学構造を推定することに成功した.(2)高分解能な石油ポルフィリン分析法の開発:高速液体クロマトグラフィーを補足する石油ポルフィリンの高分解能分離分析法としてのキャピラリー電気泳動法(CZE)の有用性を探るため、数種の石油ポルフィリンモデル化合物(バナジウムエチオポルフィリンなど)を対象として分離挙動に及ぼす溶液組成の影響を詳細に検討した.その結果、CZEで極めて高疎水性な石油ポルフィリンの分離が可能になる特殊な泳動液組成を見出すのに成功した.(3)石油ポルフィリンの分配係数:数種の石油ポルフィリンモデル化合物を対象として、化学物質の生体への取り込みを議論する上で有用な物理化学量であるオクタノール/水間分配係数(Log Pow値)の算出を試みた.逆相液体クロマトグラフィーでのリテンションファクターをベースとする相関法を適用することにより、Log Pow値として510の範囲内の値が得られた.この結果から、石油ポルフィリンが水中から生物体内に移行し蓄積される可能性が高いとする当初予想が、物性データによって支持された.
好熱菌における酸化還元補酵素安定化戦略の解明とインビトロ代謝工学への応用

ニコチンアミド補酵素はあらゆる生物で普遍的に用いられる酸化還元補酵素である。一方、ニコチンアミド補酵素は熱安定性に乏しく、高温で容易に分解を受ける。本研究では、好熱性細菌Thermus thermophilusを主たる対象に、高温環境下でのニコチンアミド補酵素の恒常性維持に重要な役割を果たすと考えられるサルベージ合成酵素群の特性解析を行った。この結果、ニコチンアミド補酵素のサルベージ合成能が同菌の高温での生育に極めて重要な役割を果たすことを明らかにした。またニコチンアミド補酵素サルベージ合成経路をin vitroで再構成し、これにより高温域でのニコチンアミド補酵素の見かけ上の安定化を達成した。NAD+、NADHに代表されるニコチンアミド補酵素は、あらゆる生物で普遍的に用いられる酸化還元補酵素である。70°Cを超える高温でも良好に生育できる好熱菌もその例外ではないが、これらの微生物の最適生育温度においてニコチンアミド補酵素は容易に熱分解を受ける。本研究代表者は、好熱菌は高温環境下でニコチンアミド補酵素を安定的に利用するため、同物質の熱分解産物よりニコチンアミド補酵素を速やかに再構成可能な発達した合成経路(サルベージ合成経路)を有しているとの仮説を有している。本課題では、この仮説に基づき、当該酵素群の探索と同定を行う。H26年度は、ニコチンアミド補酵素のうち、特にNAD+に焦点を当てた研究を実施した。まずNAD+の標準標品を熱処理に供した後、生じる分解産物を同定した。この結果、NAD+はニコチンアミドとADP-リボースへと分解されることが明らかとなった。次いで、好熱菌Thermus thermophilusのゲノム情報に基づき、これらの熱分解産物からのNAD+再合成に関与すると思われる酵素遺伝子を選抜した。この結果、ニコチン酸ホスホリボシルトランスフェラーゼ(NAPRT)、ニコチン酸モノヌクレオチド(NaMN)アデニリルトランスフェラーゼ(NaMNAT)、NAD+シンターゼ(NADS)、ADP-リボースピロフォスファターゼ(ADPRRP)、ホスホリボシルキナーゼ(PRK)の6つの酵素を取得し、それらが所望の活性を有することを確認した。また、ホモロジー検索の結果に基づき、ニコチンアミドの脱アミノ化反応を触媒する酵素遺伝子を新たに同定することに成功した。以上により、ニコチンアミドの脱アミノ化を初発反応とし、NAPRT、NaMNAT、NADSによる4段階の反応で、NAD+を再構成可能なサルベージ合成経路の存在を確認することができた。前年度までに酸化型ニコチンアミド補酵素であるNAD+を対象にその熱分解産物(ニコチンアミドおよびADP-リボース)を同定した。また、これらを出発物質としたNAD+のサルベージ合成を担う一連の酵素群をT. thermophilusより同定した。H27年度は、その初発反応を担うニコチンアミダーゼについて詳細な特性評価を行った。この結果、本酵素はニコチンアミドに対し、非常に低いKmを示す(すなわちニコチンアミドに対する高い親和性を有する)ことを見出した。この値は、すでに生理的機能が解明されている他生物由来のニコチンアミダーゼと比較しても同等かそれ以下のものであった。さらに同酵素が一連の合成経路の最終産物であるNADHによりフィードバック阻害を受けることを明らかにした。これらの結果は、本酵素が生理的環境下においてもニコチンアミド補酵素サルベージ合成を担う酵素のひとつであることを強く示唆するものである。また、一連のサルベージ合成酵素群を用い、当該経路をin vitroで再構築することに成功した。この結果、60°CにおけるNAD+の見かけの安定性を15時間に渡り保つことが可能となった。さらには還元型補酵素であるNADHの熱分解産物の同定にも着手し、NADHが酸化型であるNAD+を経由して分解されること、また得られるNAD+のおよそ25%は通常生体内で補酵素として用いられるそれ(β-NAD+)とは異なる立体構造をもったα-NAD+であることを見出した。前年度までにNAD+サルベージ合成酵素群の同定に成功したことを受け、当該年度も当初計画以上に研究を進捗させることができた。具体的には、本課題の大きな目標のひとつであるin vitroでのサルベージ合成経路の再構築とこれによる高温環境下でのニコチンアミド補酵素の安定化技術開発に成功し、その成果を国際科学誌、国際学会等で発表することができている。さらには還元型補酵素であるNADHのサルベージ合成に関する検討を前倒しで開始することもできており、この結果、α-NAD+に代表される分解産物の一部を同定することにも成功している。70°Cを超える高温で生育する好熱菌もその例外ではないが、これらの微生物の最適生育温度においてニコチンアミド補酵素は容易に熱分解を受ける。本研究では、好熱菌は高温環境下でニコチンアミド補酵素を安定的に利用するため、同物質の熱分解産物よりニコチンアミド補酵素を速やかに再合成可能な発達したサルベージ合成経路を有しているとの仮定に基づき、本経路を構成する耐熱性酵素群の探索と同定を行った。前年度までにNAD(H)の熱分解産物を同定するとともに、好熱性細菌Thermus thermophilusを対象に本菌のNAD(H)サルベージ合成に関わる酵素を同定した。

またこれらの酵素群を細胞外で組み合わせ、高温環境下でNAD+の見かけ上の安定化を実現するためのin vitroサルベージ合成経路を構築した。平成28年度は、還元型補酵素であるNADHの主たる熱分解産物として、酸化型補酵素であるβ-NAD+に加え、その立体異性体であるα-NAD+が生じるとの発見に基づき、上述のin vitroサルベージ合成経路がNAD+だけでなくNADHの安定化にも有効であることを実証した。またT. thermophilus由来NAD(H)サルベージ合成経路の初発反応を担うニコチンアミダーゼに焦点を当てた研究を進めた。本酵素遺伝子の酵素化学的諸性質を解明するとともに、同酵素遺伝子の破壊により最適生育温度(70°C)を超える高温域でのT. thermophilusの生育が著しく阻害されることを明らかにした。本発見は、NAD(H)サルベージ合成能が、好熱菌の高温耐性に重要な役割を果たすことを示した初めての例であり、現在、成果を国際論文として投稿中である。ニコチンアミド補酵素はあらゆる生物で普遍的に用いられる酸化還元補酵素である。一方、ニコチンアミド補酵素は熱安定性に乏しく、高温で容易に分解を受ける。本研究では、好熱性細菌Thermus thermophilusを主たる対象に、高温環境下でのニコチンアミド補酵素の恒常性維持に重要な役割を果たすと考えられるサルベージ合成酵素群の特性解析を行った。この結果、ニコチンアミド補酵素のサルベージ合成能が同菌の高温での生育に極めて重要な役割を果たすことを明らかにした。またニコチンアミド補酵素サルベージ合成経路をin vitroで再構成し、これにより高温域でのニコチンアミド補酵素の見かけ上の安定化を達成した。当該年度の研究で、NAD+の熱分解産物を同定するとともに、これらからNAD+を再構成するための一連の酵素遺伝子群を同定することができた。これにより、本研究課題のもうひとつの大きな目標であるin vitroでのNAD+サルベージ合成代謝経路再構築と、これによるニコチンアミド補酵素の安定化技術開発に向け、必要な酵素遺伝子が完備された。以上より、当該年度における研究の達成度は当初計画以上のものであると評価している。一方で、これまでの研究で、今回同定した酵素群のうち、NaMNATが、NaMNに対するアデニリル化だけでなく、NaMNがアミド化された中間体(ニコチンアミドモノヌクレオチド、NMN)に対しても同様の活性を示すことが見出されている。すなわち、T. thermophilusはこれまでに同定した酵素群に加え、NaMNのアミド化、もしくはニコチンアミドへの直接的なホスホリボシル化によりNMNを生成する酵素を有している可能性が考えられる。すなわち本菌はNAD+再合成のため、すでに同定済みのものとは異なる別のルートを有しており、これら23種類のサルベージ経路を併用することにより高温条件下におけるニコチンアミド補酵素の安定的利用を達成している可能性が示唆される。(1)これまでの成果で、T. thermophilusには当該年度までに同定したものとは異なるNAD+サルベージ合成経路が存在することを示唆する結果を得ている。このバイバス経路を担うであろう酵素、具体的にはニコチンアミドのホスホリボシル化酵素の同定に取り組む。
テトラヒメナと大腸菌からなる実験室内共生系の創出と解析

本研究は、もともと共生関係にない繊毛虫テトラヒメナと大腸菌を用い、栄養のやり取りによって必須相利共生する系を構築し、さらに人為選択によって細胞内共生系を創りだすことを目的としている。複数の相利共生系を構築するため、テトラヒメナの必須アミノ酸11種と大腸菌アミノ酸合成系遺伝子欠損株6株の要求アミノ酸3種についてそれぞれ一つずつ抜いた培地を用い、66通りの組み合わせで共培養を行った。その結果、30通りの組み合わせにおいて、単独で培養した場合よりも双方の個体群が増加し、必須相利共生関係を示すことがわかった。培地から抜くアミノ酸によって相利関係のできやすさに違いあった。これは双方の細胞からの供給のしやすさの違いが関係していると考えられる。このうちの一つの組み合わせについて、人為選択を行った。まず、浮遊している大腸菌のみが排除される培養系を構築した。この系ではテトラヒメナ細胞内に大腸菌がとどまらないと培養系から大腸菌が排除され、テトラヒメナも長く生存・分裂することができない。次にこの選択系を使って共培養を人為選択にかけ、両個体群動態を追跡し、またテトラヒメナ細胞内に大腸菌がどのように保持されるかを顕微鏡観察した。選択が進むにつれて、テトラヒメナ個体群は増加または維持され、一方、大腸菌個体群は減少していった。テトラヒメナ細胞内については、始めに未消化の大腸菌を保持する細胞が増加し、さらに選択が進むと、食胞外に大腸菌を保持する細胞が出現した。テトラヒメナは素早く動き回っていることから正常に生存しており、また大腸菌は長く伸びているものが多いことからテトラヒメナ内で生存していると考えられた。