hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
旋回培養法を用いた巨包の再構築と移植試験

単離した細胞からin vitroおよび,in vivoで毛包組織を再構築する系について、旋回培養法,浮遊培養法,および移植試験を行い検討した。胎生1516日目のSprague-Dawley ratの頬髭を含む上口唇皮膚を実体顕微鏡下に採取し0.25%trykpsin処理にて細胞を単離した。得られた細胞を旋回培養用のmediumとして作成したDMEM+Ham'sF12(1:1)87%,FBS 10%,chick-embryoextract 3%を用い細胞浮遊液とした後、35mm dishに1.5×10^6cells/dishの細胞を播種した。さらに,約20時間,Rotary shakerを用いて、37°C,60rpmの条件で旋回培養を行った。旋回培養によって得られた細胞の集塊をcollagen-coated-Nudepore上に移し、浮遊培養用として作成したmedium,DMEM+Ham'sF12(1:1)90%,FBS10%で7日間浮遊培養を行なった。HE標本を作成し、それらを組織学的に観察した。さらに、移植試験として、56週令のrat背部全層欠損創にsilicone製のchamberを埋め込み、周囲からの皮膚および皮膚付属器などの組織の侵入を防いだ創面を移植床として作成し、chmber内の肉様膜上に、旋回および浮遊培養によって得られた細胞の集塊を移植し、組織学的に観察した。in vitroおよび、in vivoの系いずれも分化が促進され、移植後の組織像では外毛根鞘、内毛根鞘毛乳頭細胞を有する再構築された毛包構造が観察された。旋回培養によって完全に単離された細胞からの毛包再構築が可能であった。
全合成系人工酸素運搬体リピドヘムマイクロスフェアの酸素運搬能に関する基礎的研究

II価の鉄を持ち可逆的に酸素の吸脱着ができるlipidhemeの合成をした。このlipidhemeの運搬体として静脈内投与用の脂肪乳剤の脂肪油滴を用い、この油滴の周囲をLipidhemeで被覆することにより全合成系の酸素運搬体を作成した。本物質の生体内における酸素運搬体としての機能を動物における脱血交換実験で検討した。当初、循環血液量の80%までの脱血を目指してプロトコールを作成したが、当材料の作成量が250ml/2月と少なく、また予備実験の数がM=2頭と少なかったので、本年度循環血液量の40%までの実験にとどめ、その数をM=7まで増やし、LHMの酸素運搬能についての検討を行った。[方法]ビーグル犬を全身麻酔し機械呼吸下に実験を行った。循環血液量の40%に相当する30ml/Kgを急速脱血して出血性ショックを作成した。その後脱血量と同量のLHM溶液を静脈内投与した。脱血後の心拍出量、ヘモグロビン濃度(HB)の測定や動脈血や混合静脈のガス分析を行った。LHMのヘムの血中濃度をcyanomethohemoglobin法により、ヘムの酸素飽和度をvisible absorption spectrum法により測定した。HBとLHMによる酸素運搬量(TO_2ml/min)、HBとLHMからの酸素消費量(VO_2ml/min)を計算した。さらにLHMによる酸素運搬量を総酸素運搬量で割ることにより総酸素運搬量におけるLHMの貢献率(%TO_2)を、LHMからの酸素消費量を総酸素消費量で割ることにより総酸素消費量におけるLHMの貢献率(%VO_2)を計算した。以上、この実験系において静注後3時間までLHMによる酸素運搬量は総酸素運搬量の15.510.5%を、LHMからの酸素消費量は総酸素消費量の15.211.1%を占めており、LHMが酸素運搬体としての機能を持つことが示された。栄養補強剤としての脂肪油滴の安全性には問題がなく、lipidhemeの安全性が確立されれば血液型を考慮せずに使用できる人工酸素運搬体が開発される可能性がある。
Ｂｅｒｒｙ曲率の実時間拡散ダイナミクスへの影響

著者が前回の論文で明らかにしたベリー曲率の拡散運動への影響に続いて、エネルギー交差点におけるベリー曲率の磁気単極子が波束のダイナミクスに及ぼす影響を明らかにした。これは光反応後のフォノンのダイナミクスや、より一般に化学反応全般の現象に関係すると期待される。主要な結果として、第一に、ベリー曲率の効果によって、エネルギー交差点に粒子がトラップされるボトルネック効果を、有効エネルギーを求める解析的な計算によリ明らかにした。この結果は、一般にボルン・オッペンハイマー近似で記述される広範な現象において、純粋な量子効果であるベリー曲率によって反応時間が増大し得ることを明らかにしたという点において重要である。第二に、ベリー曲率による項の非線形性によって運動がカオス的になる(カオス的散乱)領域が生じることを数値計算によリ明らかにした。さらにこのカオスを引き起こすストレンジサドルのフラクタル次元、カオスの直接的指標であるコルモゴロフ・シナイエントロピーを数値計算によリ計算し、可積分な領域に向かってパラメータを変化させたときにabrupt bifurcationとよばれる、突然カオスが消滅する現象が起きることを明らかにした。通常のカオス的散乱はポテンシャルの丘が複数存在するときにそれらの間の散乱によって引き起こされるが、今回発見したカオス的散乱は磁気単極子という単一の散乱子によって引き起こされること、及び主にローレンツ力によってカオスが引き起こされるという点で、既存の模型と大きく異なり、理論的にも興味深い現象である。これらの現象はいずれも磁気単極子が小さな衝突係数について強力な後方散乱子であり、さらに後方散乱のピークが無限個存在するという特殊な性質によっており、エネルギー交差点近くを通過するような現象を扱う際にはBerry曲率の効果を考える必要があることを示唆する。近年実験的に観測されている二次元超伝導物質において極低温まで有限の伝導度が残る現象に関連して、散逸が超流動に及ぼす影響について現在計算を進めている。超伝導中の渦はボゾンとして振る舞うために極低温では超流動相になり常伝導になってしまうか、または超流体が媒介する長距離力によってアブリコソフ格子を組む。一方で実験的には有限の伝導度が観測されているので、渦が超流動を起こさず、かつ有限密度で残っているような中途半端な状態が実現しているのではないかと期待される。そこで著者らは、渦が運動する際に感じる散逸(古典的にはバーディーン・ステファン機構により、量子力学的には渦内のギャップレスな励起であるアンドレーフ束縛状態による)を考えることで、絶対零度でも超流動密度が0になるような状態が実現されるというシナリオを考案し、更に連続空間の多体ボゾンのモデルにおいてwormアルゴリズムと呼ばれる量子モンテカルロ法で数値計算を行った。数値計算の結果、有限の散逸において超流動密度が0になるような結果が得られた。この結果はファインマンによる超流動の描像において自然に理解できる:散逸のないボゾン系では粒子の組み換えにかかるエネルギーは温度を下げていくと0に近づいていき、低温で必ず組み換えによるエントロピーの利得が勝つようになり超流動相が実現される。一方散逸下では粒子の組み換えにかかるエネルギーが温度を下げていっても有限に残る。このことによって通常は必ず2次元以上の極低温で起こる超流動が極低温でも起こらず、常流体のままであるという描像が生まれる。この結果は、絶対零度において知られるボゾンの相であるモット絶縁体、超流動、ボーズグラスのいずれとも異なる、極低温でのボゾンの常流体の存在を示唆する、理論的にも非常に重要な結果である。量子モンテカルロの結果得られた超流動密度に加え、全運動量の相関関数についても計算で得られているので、この虚時間相関関数を実時間に解析接続することによって伝導度を求める。散逸がなければ全運動量は保存量なので有限のドルーデ重みが存在するが、散逸下でどうなるか調べる。さらに、量子モンテカルロ計算によって得られた、極低温で超流動密度が散逸によって0になっている常流体が、二次元超伝導体中で実現している「異常金属相」であるという期待のもと、第二量子化で記述されるモデルでのさらなる数値/解析計算によってこの低温相での物理量、特に超流動密度や電気伝導度などを計算し、他の低温領域での相、特に不純物によるボゾンの局在化に起因するボーズグラス相との相違について明らかにし、更に二次元超伝導体において得られた実験結果との比較を行う。解析計算については通常低密度で相互作用が弱い時に有効なボゴリューボフ近似を用いるが、このボゴリューボフ近似が散逸の存在下においてどのようなパラメタ領域で良い近似になるかについて調べる。ボゴリューボフ近似が有効でない場合は、ポポフ近似などによって近似を改善し実際の系に関係するパラメタ領域での物理を記述できるかについて調べる。これらの物理的性質が熱浴の低エネルギーの自由度がohmic、superohmic、subohmicなどの場合で変わるか、また超伝導の渦間に働く超流体を通じて生じる長距離相互作用による影響はあるかについても調べる。また、絶対零度で超流動になることはガリレイ不変性による性質であるが、熱浴の存在する系においてこのガリレイ不変性がどのように破れているのか、またガリレイ不変性を破って超流動にならないような系が、不純物が存在するボーズグラス、及び今回の低エネルギーに熱浴の自由度があり散逸があるような系以外に存在するかについても調べる。

主要な結果として、第一に、ベリー曲率の効果によって、エネルギー交差点に粒子がトラップされるボトルネック効果を、有効エネルギーを求める解析的な計算によリ明らかにした。この結果は、一般にボルン・オッペンハイマー近似で記述される広範な現象において、純粋な量子効果であるベリー曲率によって反応時間が増大し得ることを明らかにしたという点において重要である。第二に、ベリー曲率による項の非線形性によって運動がカオス的になる(カオス的散乱)領域が生じることを数値計算によリ明らかにした。さらにこのカオスを引き起こすストレンジサドルのフラクタル次元、カオスの直接的指標であるコルモゴロフ・シナイエントロピーを数値計算によリ計算し、可積分な領域に向かってパラメータを変化させたときにabrupt bifurcationとよばれる、突然カオスが消滅する現象が起きることを明らかにした。通常のカオス的散乱はポテンシャルの丘が複数存在するときにそれらの間の散乱によって引き起こされるが、今回発見したカオス的散乱は磁気単極子という単一の散乱子によって引き起こされること、及び主にローレンツ力によってカオスが引き起こされるという点で、既存の模型と大きく異なり、理論的にも興味深い現象である。これらの現象はいずれも磁気単極子が小さな衝突係数について強力な後方散乱子であり、さらに後方散乱のピークが無限個存在するという特殊な性質によっており、エネルギー交差点近くを通過するような現象を扱う際にはBerry曲率の効果を考える必要があることを示唆する。近年実験的に観測されている二次元超伝導物質において極低温まで有限の伝導度が残る現象に関連して、散逸が超流動に及ぼす影響について現在計算を進めている。超伝導中の渦はボゾンとして振る舞うために極低温では超流動相になり常伝導になってしまうか、または超流体が媒介する長距離力によってアブリコソフ格子を組む。一方で実験的には有限の伝導度が観測されているので、渦が超流動を起こさず、かつ有限密度で残っているような中途半端な状態が実現しているのではないかと期待される。そこで著者らは、渦が運動する際に感じる散逸(古典的にはバーディーン・ステファン機構により、量子力学的には渦内のギャップレスな励起であるアンドレーフ束縛状態による)を考えることで、絶対零度でも超流動密度が0になるような状態が実現されるというシナリオを考案し、更に連続空間の多体ボゾンのモデルにおいてwormアルゴリズムと呼ばれる量子モンテカルロ法で数値計算を行った。数値計算の結果、有限の散逸において超流動密度が0になるような結果が得られた。この結果はファインマンによる超流動の描像において自然に理解できる:散逸のないボゾン系では粒子の組み換えにかかるエネルギーは温度を下げていくと0に近づいていき、低温で必ず組み換えによるエントロピーの利得が勝つようになり超流動相が実現される。一方散逸下では粒子の組み換えにかかるエネルギーが温度を下げていっても有限に残る。このことによって通常は必ず2次元以上の極低温で起こる超流動が極低温でも起こらず、常流体のままであるという描像が生まれる。
量子伝導性有機分子の創製

金電極と接続する原子として硫黄、あるいはセレンを持つ有機分子1個の電気伝導度を超微小電極で計測したところ、硫黄を持つ有機分子1個の電気伝導度が、セレンを持つ有機分子1個の電気伝導度より大きいことを明らかにした。電極-分子-電極接合で量子伝導を得るための設計指針は確立されていないが、応用可能な単分子デバイスを開発するためには、量子伝導あるいは同程度の高いコンダクタンスを実現する必要がある。そこで、本研究では、HOMO-LUMOギャップの小さな有機ドナー分子の単分子コンダクタンス計測を行い、HOMO-LUMO,ギャップとコンダクタンスの相関を調べた。単分子伝導測定にはナノ加工機械的破断接合を用い、まずHOMO-LUMOギャップが3.8eVと1.4eVであるテトラチアフルバレン(TTF)とNi錯体([Ni(dmit)_2])を測定対象とした。TTFとNi(dmit)_2は金-硫黄結合で電極に接続されていることが光電子分光測定から示唆された。TTFとNi(dmit)_2の単分子コンダクタンスは、それぞれ、28mG_0(G_0 :量子コンダクタンス)と5.3mG_0であることが、コンダクタンスヒストグラムより明らかとなった。さらに、TTFの硫黄原子をセレン原子に置換したテトラセレナフルバレン(TSF : HOMO-LUMOギャップ3.4eV)のコンダクタンスを測定したところ、単分子コンダクタンスが3.4mG_0であった。HOMO-LUMOギャップが5.3eVのベンゼンジチオールの単分子コンダクタンスが11mG_0であることを考えると、単分子コンダクタンスとHOMO-LUMOギャップは単純な1次相関の関係にないことが示唆され、電極-分子接合の結合状態が単分子コンダクタンスに大きく寄与することが示唆された。本研究では、超高速・超高効率分子デバイスを実現する上で必要不可欠な量子伝導を発現させるための分子設計指針を提案することを目的としている。特に、単分子伝導機構を支配するHOMO-LUMOギャップと電極-分子カップリングを系統的に制御した分子の設計・開発を行い、これら2つのパラメータと単分子電気伝導の相関を明らかにし、量子伝導機構に適した分子設計指針を最適化していく。昨年度、TTFと、TTFの硫黄をセレンに置換したTSFの単分子コンダクタンスを比較したところ、TTFの方が高いコンダクタンスを持つことを明らかにしている。これは、分子と電極がface-to-faceの結合様式、つまり金のs軌道と硫黄(セレン)のp軌道がσ結合で接合されているため、すでにTTFで強結合が実現され、セレンに置換することで、より強い電極-分子カップリングが生じたためと考えられる。そこで、今年度は、TTF、TSFと同程度のHOMO-LUMOギャップを持つチオフェン3量体のジチオール体(3T-S)とジセレノール体(3T-Se)を合成し、これらの単分子コンダクタンスを比較した。その結果、3T-Seの単分子コンダクタンスは、3T-Sの1.4倍の0.17G_0(G_0:量子化コンダクタンス)であった。3T-S(3T-Se)と電極は、金のs軌道と硫黄(セレン)のp軌道がπ結合で接合されているため、3T-Sでは弱い電極-分子カップリングが形成されているが、セレンに置換することで、適度に強い電極-分子カソプリングが形成されたと考えられる。従って、単分子コンダクタンスは、電極-分子カップリングの大きさに強く依存し、電極-分子カップリングの制御には電極-分子の結合様式の制御が重要であることが明らかとなった。
複数の離島小学校と海外多民族学級をICTで結んだ新教育地域における新規的英語教育

前年度までに日本の離島の小学校同士をiPadで繋いだ英語での交流授業を2回行ったが、本年度は長崎県五島市の小学校とハワイ島の小学校(ともに5年生)をスカイプで結び、英語での交流授業を行った。交流授業の実践日は2019年2月22日であった。授業内容は、五島市の小学校が用いているHi, friends!1のLesson 7 "What's this?"を基にし、自分の地域の文化を双方に伝え合い、質疑応答をすることとした。授業では互いの学校で児童がほぼ等身大で映し出されるスクリーンを使って、あたかも同じ空間で授業をしているように感じられる工夫を行った。授業案は、1)挨拶、2)双方4つのグループに分かれ、写真を見せながら文化の紹介を行い、質問を受けて答えることとした。授業当日まで、授業案について入念な計画を立て、それをハワイと五島の小学校の両担任に伝え、各小学校で、声の明晰さ、話すスピードなどに気をつけてさらに準備をしてもらった。授業当日は、両小学校の担任教員に、児童たちがコミュニケーションに困ったら、支援してもらうことをお願いした。授業は比較的スムースに実践できた。両小学校の児童に授業後行ったアンケート調査(自由書式)でも、ほとんどの児童が再び交流授業を行いたいと回答した。英語学習に更に力を入れたいと述べる五島の児童も多く、モチベーションを上げる結果にもなった。ハワイの児童も初めての日本の小学校との交流で、文化的差異や類似性に強い興味を示した。肝心の英語については、当初、英語によるコミュニケーションが成立するのかといった懸念があったが、予想以上に理解し合っていた。こうした結果となった最も大きな要因として考えられるのは教師の役割である。授業内容を制御し児童を支援すれば、英語のネイティブスピーカーの小学生と日本の小学生との間で英語による交流授業が不可能ではないことがわかった。初年度から、交流授業を予定していた中国の小学校が相次いで実施直前になって取りやめになり、中国のかわりにハワイの小学校との交流授業を実施したため、また研究代表者が学部長、研究分担者の一人が副学長となり、業務多忙のために遅れが生じている。今回の交流授業を通して、一点課題が残った。国内の離島の小学校同士で行った交流授業では問題がなかったが、ハワイと五島を結んだ今回の交流授業ではソフトウェアが不安定なことがあった。今後、国内外の三校以上の小学校を同時に結ぶ場合は、さらなる回線の不安定さが懸念される。こうなると、サイバースペース上の教育の場の構築が難しくなる。この課題を克服する工夫として、回線が比較的安定しているZoom等のソフトウエアを用いるのが一案であろうと考えている。このことを踏まえて、本年度はZoomなどのソフトウエアを用いて、三校以上を結ぶ交流授業に対応するサイバースペース上の教育の場の確立方法を探究する。本研究の目的は、地理的な制約に起因する離島・へき地教育の課題を克服することである。具体的には、日本各地に点在する離島やへき地の小学校小規模校、ならびに海外の小学校の多民族学級をICTで結び、ICTネットワークによる新たな教育「地域」を創出し、同「地域」を用いた効果的な小学校外国語活動の授業方法・教師の役割・教授の方法を考案することである。平成28年度は、北海道厚真町、及び礼文町、新潟県佐渡市、島根県雲南市吉田町、長崎県五島市、沖縄県宮古島市の離島・へき地地区を取り上げて、これらの地域における小学校外国語活動の現状を英語力、学習進度、教授法、教育目標、教育カリキュラム、ICT接続環境等に関して調査を行った。併せて、小学校外国語活動や小学校英語の教科化等に関する教師の意識調査等も行った。それらの調査をもとに、パイロットケースとして、北海道厚真町の厚真中央小学校と長崎県五島市の崎山小学校をICTで接続し、ネットワークによる教育「地域」の創出を試みた。その結果、ICTで結んだ合同授業の方法を考案するのに必要な視点を明確にすることができた。例えば、合同授業のアーカイブを構築し、誰にでも簡単に使えるノートパソコンやタブレット端末等を用いて、好きな時に、好きな場所からアーカイブコンテンツに接続すれば、物理的な距離の隔たりを越えた学びや対話が可能となり、小学校外国語活動の研修や教材に資すること、また、学校教育の現場は多忙であるため、アーカイブのコンテンツは、教員が初めから作るのではなく、ダウンロードできる資料があれば小学校の教員に役立つことが明らかになった。こうしたICTネットワークによる新たな教育の場の創出に関する成果は、海外学術誌(2017年度発表確定1本)、国内学術誌(1本)、大学紀要(3本)、口頭発表(1件)に公表されている。1.パイロットケースとして、北海道厚真町の厚真中央小学校と長崎県五島市の崎山小学校をICTで接続し、ネットワークによる教育の場の創出を試みたところ、I CTで結んだ合同授業の方法を考案するのに必要な知見を得ることができたため。2.離島やへき地の小学校小規模校の調査により、地理的な制約を解消し、負担の少ない教員研修や教師教育が期待されていることが明らかとなり、小学校外国語活動の指導に課題を抱えている教員が少なくないこと、なかでも、外国語活動という新たな授業科目への戸惑い、自らの英語力に関する心配、発音、文字、異文化理解教育の指導に関する不安、外国語活動の研修に寄せる期待など、さまざまな声を聴取できたことで、本研究の意義と今後の研究の方向性を明確にできたため。

3.小学校外国語活動に関してICTを有効に活用することにより、本土と離島やへき地を結び、教員研修を行うことも想起され、本研究から派生する新たな視点と方向性を得ることができたため。以上の理由により、おおむね順調に進展していると判断した。昨年度は北海道と長崎の離島にある小学校をICTネットワークで繋いだ英語の授業をパイロットケースとして行った。本年度は新潟県にある島・佐渡島の小学校と長崎県の離島(五島)の小学校をICTネットワークで繋いで英語の授業を行った。北海道と長崎を結ぶ授業で得られた成果ならびに課題を踏まえて、成果の偶然性の分析ならびに課題克服のための方法を実践し、よりよい教育の場ならびに授業実践の構築を考えた。具体的に言えば、北海道と長崎の離島同士を結んだ授業では、異なる文化の交流を通して児童の地平(視野、認識)が広がり、また異なる発音や表現などの癖をもつ英語と接触することで英語力が高まり、これらを通して英語学習の動機ならびに学力をさらに高めていくことに成果があることを確認した。この成果を基盤に3校以上の小学校をICTで結んだ授業を行うことも可能であったが、しかしその前に、昨年度得られた成果が、例えば授業を実践した当該校同士の相性といったような偶然性にどれくらい起因するものなのかを分析し、偶然性の低さを確認することで、本研究で構築していく教育の方法ならびに教育の場の有効性と意義が証明できるため、異なる離島の小学校との合同授業を行って分析を行った。北海道ー長崎間も新潟ー長崎間も得られた成果は同様であった。異なる文化に属する子どもたちが、離島という条件ゆえに異なる文化や異なる英語との直接的な接触が困難であるという教育課題を克服し、英語力を動機づけや豊かな人間力と共に高めていけることが確認できた。また、ICTネットワークに大きな工夫を用いて授業を行った。昨年度の不安定な回線状況を克服したほか、大画面を用い、等身大の生徒をディスプレイに映し出すことで、あたかも遠く離れた離島の児童同士が同じ教室にいるかのように思える臨場感あふれる授業を実践することができた。成果については別項を参照されたい。予定していた中国の小学校との合同授業が、小学校教員とともに計画まで立てるものの実施直前になって先方から取りやめにされる事態が続けて発生している。期間内で海外の小学校との合同授業を行うため、中国に代えて韓国等の小学校との合同授業も模索したが、入試に直結しない授業という理由から保護者の理解が得られにくい状況がある。こうした課題を克服して海外の小学校との合同授業を実践する解決策についてはすでに考案したため、次年度において実践していく予定である。前年度までに日本の離島の小学校同士をiPadで繋いだ英語での交流授業を2回行ったが、本年度は長崎県五島市の小学校とハワイ島の小学校(ともに5年生)をスカイプで結び、英語での交流授業を行った。交流授業の実践日は2019年2月22日であった。授業内容は、五島市の小学校が用いているHi, friends!1のLesson 7 "What's this?"を基にし、自分の地域の文化を双方に伝え合い、質疑応答をすることとした。授業では互いの学校で児童がほぼ等身大で映し出されるスクリーンを使って、あたかも同じ空間で授業をしているように感じられる工夫を行った。
分子識別光ナノメカニカル素子の創出

本研究は、微小量ガスの高感度検出,ガス種識別のための“分子識別ナノメカニカル素子"を実現する技術,知見を獲得することを目的としてる。質量や電荷など様々な物量を高感度にセンシング可能な“ナノメカニカル素子"と光の制御性に優れた“フォトニックナノ構造"を組み合わせ、ガス分子の吸収スペクトルの計測を可能とする素子の実現を目指している。今年度は、光スペクトル形成に向けた光波長検出デバイスの試作,デバイス構造の最適化とこれによる光検出に関する研究を進めた。具体的には、フォトニックナノ構造として、構造の周期や高さにより吸収波長を制御可能なブルズアイアンテナ構造を、特定波長範囲の光波長に対応させるためスパイラル型に配置したスパイラル型ブルズアイアンテナ構造を用いた。この中心に円形の薄膜振動子を配置した。これにより、スパイラル型ブルズアイアンテナ構造に照射され、その中心に誘導された光作用(光強度)を薄膜振動子の共振特性から読み取ることを試みた。ブルズアイアンテナ構造上での各照射位置では、特定の波長の光のみ吸収されるため、照射光の波長と照射位置での吸収波長とが一致した場合に、薄膜振動子に光が作用し、各々の波長での光強度を測定することができる。この光ナノメカニカル素子は、Si基板上にdiamond-like carbon及びAuを用いて構成した。また、本研究では1.5 μm帯の波長可変レーザーを計測対象として用いた。結果として、作製した光ナノメカニカル素子を用いて、特定波長のレーザー光の検出を達成し、ブルズアイアンテナ構造とナノメカニカル素子を組み合わせたデバイスが特定波長の光検出に有効であることを示した。光吸収波長をフォトニック構造により任意に制御し、光吸収(熱)に伴い変化するナノメカニカル素子の共振特性の変化から特定波長の光強度を計測,これを各波長に対して連続的に繰り返し行うことで、各波長の光強度を計測し、スペクトル形成を行うというのが本研究で提案する光スペクトルの計測原理である。これにおいて、特定波長の光強度計測の達成は、光スペクトル形成実現のキーとなる達成目標の一つである。現時点では、単一波長のレーザー光の検出にとどまるが、これは、提案したスパイラル型ブルズアイ構造を有する光ナノメカニカル素子を用いて、吸収させる光波長をスパライル型ブルズアイ構造の各々の位置で制限し、選択的に吸収させ、その際の光強度を薄膜振動子の共振特性の変化から計測できることを示しており、光スペクトル形成に必須の機能である“特定波長での光強度計測"が実現できることを示した成果であるといえる。以上のことから、本研究はおおむね順調に進展している。上記のとおり、提案したスパイラル型ブルズアイアンテナ構造とナノメカニカル素子を組み合わせたデバイスにより、特定波長の光強度計測が可能であることを示した。今後は、獲得したこの知見をさらに発展させ、光スペクトル形成に向けた取り組みを進める。具体的には、高分解能なスペクトル形成のためには、フォトニックナノ構造,プラズモニックナノ構造により高い波長選択性,効果的な光吸収をいかに引き起こすかがポイントである。そのため、本研究では、数値解析的手法もフル活用しながら、3次元プラズモニックナノ構造の適用も視野に入れ、波長選択性の高い,光吸収の大きなフォトニックナノ構造に関する研究を重点的に行う。これにより光スペクトルの形成に向け、その根幹となるフォトニックナノ構造による波長選択,光吸収制御に関する基礎的研究の完成を目指す。本研究は、微量量ガスの検出,識別を実現する、“分子識別ナノメカニカル素子"の創出を目的としている。微量物理量に対して、超高感度性を有するナノメカニカル振動子上に、光制御性に優れたフォトニック構造体を設置し、光スペクトロメーターを実現することにより、ガス分子の検出,識別を目指している。フォトニック構造体により吸光波長を任意に変調し、ガス分子との作用による各々の波長での光強度をナノメカニカル振動子により計測、この光強度を連続的につなげることで光スペクトル取得し、このスペクトルより分子識別を行うというのが有効な検出,識別原理になりえると考えている。今年度は、この達成の足掛かりとなる吸光波長の変調を実現するフォトニック構造、高感度光強度計測のための極微細ナノメカニカル振動子構造について検討を行った。フォトニック構造体については、解析的アプローチにより、Auからなる半透鏡,全反射鏡からなる光共振器構造を利用することが、吸光波長任意制御のための有力な手段になりえることを見出した。具体的には、その手段の一つとして、半透鏡を静電力により電気的に制御し、半透鏡ー全反射鏡間の光路長を変調さることが、吸光波長制御に有効であることがわかった。また、極微細ナノメカニカルについては、その作製プロセスの検討、試作を行った。結果して、集束イオンビーム化学気相成長法,アニール処理,ウエットエッチング等を組み合わせやプロセスにより、膜厚サブ10 nmスケールのナノメカニカル振動子の作製が可能であることを実証した。ガス分子の検出,識別を実現する上記原理の新たなデバイスの実現には、光スペクトル形成のために、光の吸光波長を制御するための“フォトニック構造体"と、光強度を高感度に計測するための“ナノメカニカル振動子"が必須である。フォトニック構造体については、吸光波長制御のために、主に解析的手法を用いて、デバイス構造設計を固めるための機能性についての基礎的検討を行った。

結果として、優れた吸光特性,吸光波長の制御を実現する有力な手段の一つとして、Auからなる半透鏡,全反射鏡からなる光共振器構造を利用し、これを稼働させることが有効であることを見出した。これは、今後のデバイス試作を進めるための方針となるものである。また、ナノメカニカル振動子については、上記のとおり膜厚がサブ10 nmスケールの振動子を任意に作製できることを実験的に実証した。ナノメカニカル振動子の微細さ,軽量さは高感度素子達成のための重要な要素であり、本研究の成果は、高感度な光強度計測実現を期待させるものである。そのため、現在の進捗として、研究は順調に進展している。本研究は、微小量ガスの高感度検出,ガス種識別のための“分子識別ナノメカニカル素子"を実現する技術,知見を獲得することを目的としてる。質量や電荷など様々な物量を高感度にセンシング可能な“ナノメカニカル素子"と光の制御性に優れた“フォトニックナノ構造"を組み合わせ、ガス分子の吸収スペクトルの計測を可能とする素子の実現を目指している。今年度は、光スペクトル形成に向けた光波長検出デバイスの試作,デバイス構造の最適化とこれによる光検出に関する研究を進めた。具体的には、フォトニックナノ構造として、構造の周期や高さにより吸収波長を制御可能なブルズアイアンテナ構造を、特定波長範囲の光波長に対応させるためスパイラル型に配置したスパイラル型ブルズアイアンテナ構造を用いた。この中心に円形の薄膜振動子を配置した。これにより、スパイラル型ブルズアイアンテナ構造に照射され、その中心に誘導された光作用(光強度)を薄膜振動子の共振特性から読み取ることを試みた。ブルズアイアンテナ構造上での各照射位置では、特定の波長の光のみ吸収されるため、照射光の波長と照射位置での吸収波長とが一致した場合に、薄膜振動子に光が作用し、各々の波長での光強度を測定することができる。この光ナノメカニカル素子は、Si基板上にdiamond-like carbon及びAuを用いて構成した。また、本研究では1.5 μm帯の波長可変レーザーを計測対象として用いた。結果として、作製した光ナノメカニカル素子を用いて、特定波長のレーザー光の検出を達成し、ブルズアイアンテナ構造とナノメカニカル素子を組み合わせたデバイスが特定波長の光検出に有効であることを示した。光吸収波長をフォトニック構造により任意に制御し、光吸収(熱)に伴い変化するナノメカニカル素子の共振特性の変化から特定波長の光強度を計測,これを各波長に対して連続的に繰り返し行うことで、各波長の光強度を計測し、スペクトル形成を行うというのが本研究で提案する光スペクトルの計測原理である。これにおいて、特定波長の光強度計測の達成は、光スペクトル形成実現のキーとなる達成目標の一つである。現時点では、単一波長のレーザー光の検出にとどまるが、これは、提案したスパイラル型ブルズアイ構造を有する光ナノメカニカル素子を用いて、吸収させる光波長をスパライル型ブルズアイ構造の各々の位置で制限し、選択的に吸収させ、その際の光強度を薄膜振動子の共振特性の変化から計測できることを示しており、光スペクトル形成に必須の機能である“特定波長での光強度計測"が実現できることを示した成果であるといえる。以上のことから、本研究はおおむね順調に進展している。
垂直性眼球運動の脳幹神経機構

前年度の報告でカハル間質核,特にカハル間質核から前庭核への投射系が垂直眼球運動の位置形成機構に関与することを示した.今回はまずこの経路の性質を解析する目的で覚醒ネコで垂直眼球運動時のカハル間質核領域のニユーロン活動を記録し,逆行性刺激を橋内側縦束に加えて前庭核付近への投射の生むを調べた.その結果,カハル間質核領域で記録されたニューロン132コの内訳は垂直方向のバーストトーニックニューロン(52%),トーニックニューロン(13%),バーストニューロン(4%)で,残り31%はこれらのいずれにも属さないが垂直半規管刺激に応答したニューロンであった.バーストトーニック及びトーニックニューロンの発射頻度は垂直方向の眼位と直線関係にあり,これらの約半数は前庭核付近へ投射していた.これは,これらニューロンの有する垂直眼球位置信号が前庭核付近へ投射されることを示す.次にこの投射経路が垂直眼球位置形成機構に関与することを更に詳しく調べるために,垂直前庭動眼反射の利得(積分値)を人為的に上昇させる状況を旁,その時のカハル間質核ニューロン活動を解析した.人為的な利得の上昇を作るため一側眼の上下直筋腱を切断して垂直運動を制限し,その眼への視覚入力をパッチで遮断し,回転台上でパッチを健康側へ移して前庭動眼反射を解析した. 0.11Hz(±10°)のPitch回転刺激により利得は15分以内に上昇を始め一時間以内で視覚入力遮断時の平均利得はControl値の約150%に上昇した.パッチを術側眼にもどし健康眼に視覚入力を与えると利得は可逆的にControl値にもどった.このような適応性の利得変化時にカハル間質核領域のバーストトーニック及びトーニックニューロンの応答利得は前庭動眼反射の利得変化と平行して有意な変化を示した.これはカハル間質核が前庭核への投射を通じて前庭動眼反射の位置形成機構に関与することを更に強く指示する.前年度の報告でカハル間質核,特にカハル間質核から前庭核への投射系が垂直眼球運動の位置形成機構に関与することを示した.今回はまずこの経路の性質を解析する目的で覚醒ネコで垂直眼球運動時のカハル間質核領域のニユーロン活動を記録し,逆行性刺激を橋内側縦束に加えて前庭核付近への投射の生むを調べた.その結果,カハル間質核領域で記録されたニューロン132コの内訳は垂直方向のバーストトーニックニューロン(52%),トーニックニューロン(13%),バーストニューロン(4%)で,残り31%はこれらのいずれにも属さないが垂直半規管刺激に応答したニューロンであった.バーストトーニック及びトーニックニューロンの発射頻度は垂直方向の眼位と直線関係にあり,これらの約半数は前庭核付近へ投射していた.これは,これらニューロンの有する垂直眼球位置信号が前庭核付近へ投射されることを示す.次にこの投射経路が垂直眼球位置形成機構に関与することを更に詳しく調べるために,垂直前庭動眼反射の利得(積分値)を人為的に上昇させる状況を旁,その時のカハル間質核ニューロン活動を解析した.人為的な利得の上昇を作るため一側眼の上下直筋腱を切断して垂直運動を制限し,その眼への視覚入力をパッチで遮断し,回転台上でパッチを健康側へ移して前庭動眼反射を解析した. 0.11Hz(±10°)のPitch回転刺激により利得は15分以内に上昇を始め一時間以内で視覚入力遮断時の平均利得はControl値の約150%に上昇した.パッチを術側眼にもどし健康眼に視覚入力を与えると利得は可逆的にControl値にもどった.このような適応性の利得変化時にカハル間質核領域のバーストトーニック及びトーニックニューロンの応答利得は前庭動眼反射の利得変化と平行して有意な変化を示した.これはカハル間質核が前庭核への投射を通じて前庭動眼反射の位置形成機構に関与することを更に強く指示する.カハル間質核障害が垂直眼球運動と前庭核ニューロンの活動に及ぼす影響を調べるために、1.カハル間質核ニューロンがどのような信号を有するかを解析した。これは笑気麻酔ネコを用い頭部垂直回転刺激に対するニューロンの応答の位相とゲインを調べることによる行った。カハル間質核ニューロンは頭部回転加速度入力より位相が約140°遅れ、ゲインは0.15Hzで1.67±0.64spikes/s/deg/【S^2】を示した。比較のため正常ネコで同様な回転刺激に対する前庭核ニューロンの応答を調べると、位相は入力加速度より約90°遅れ、ゲインは2.07±0.78spikes/s/deg/【S^2】であり、カハル間質核ニューロンは前庭核ニューロンに比べ位相遅れ信号を有することがわかった。2.両側カハル間質核を障害したネコについて前庭核ニューロンから同様な頭部回転刺激に対する応答を調べると、位相は加速度より約60°遅れ、ゲインは1.27±0.68spikes/s/deg/【S^2】を示した。これはカハル間質核の障害が前庭核ニューロンの応答の位相の先行とゲインの低下を起こしたことを意味する。

3.両側カハル間質核を障害したネコで垂直眼球運動を調べると垂直前庭動眼反射は位相遅れの減少を起こし自発性の垂直サッケードも位置の保持ができなくなった。両眼球運動の時定数は約2秒とほゞ同様な値を示し正常値(約20秒)より明らかに短縮した。このことはカハル間質核が両眼球運動系の積分機構の一部であることを示す。4.カハル間質核障害効果は電気凝固だけでなくプロカインも用いて可逆的に行った。前庭核ニューロンの応答の変化は垂直運動の変化より先に起り前者が後者の結果ではないことが示された。5.コンピュータを用い前庭核ニューロンの応答をカハル間質核からの入力の有無でシミュレーションすると、得られた値は実際の成績とよく一致しカハル間質核から前庭核へのフィードバック信号が垂直眼球運動の積分機構の一部に関与する可能性が示唆された。
従業員エンゲージメント度数向上に寄与する人的資源管理の理論的・実証的研究

本研究の目的は、「組織に貢献しようという従業員の自発的な態度・意欲・姿勢そして行動」を意味する従業員エンゲージメント(Employee Engagement:EE)について、その向上に寄与する日本的な人的資源管理(Human Resource Management:HRM)のあり方を、アメリカ企業における先進的な取り組み事例との比較検討を通じて、理論的・実証的に考察することにある。研究初年度に位置する平成30年度は、まず第1に国内外の先行研究を渉猟し、EE研究の現地点を再確認することに努め、日本においても、米国に比して立ち後れていたEE向上の取り組みに関して、コンサルタント業界が牽引する形でモデル化が進められていることを把握できた。第2に、グローバル・タレント・マネジメントを研究テーマとした他の科研研究グループの成果をとりまとめる過程で、EEについての概念整理を進めることができた。第3に、国際展開を進めている人材派遣会社主催のセミナーに参加し、アメリカにおけるHRMや労働規制の最新動向について知見を得る一方で、所属研究機関内研究センター実施のアンケート調査への関与を通じ、国内地方中小企業が直面する雇用問題の実情の一端を明らかにすることができた。後述の通り、後者の国内中小企業へのアンケート調査については、今後規模を拡大し、かつ質問事項をより詳細にした形で再度実施し、中小企業現場におけるEEの実態把握と先進的事例の特定につなげていきたい。Great Place to Work@「働きがいのある会社」調査ランクイン企業に象徴されるような先進的企業への聞き取り調査が様々な理由で困難であったこと、またそもそも学内業務との兼ね合いから、研究代表者がアメリカ出張の機会を見いだすことができなかったことが、進捗がやや遅れ気味であることの最大の理由である。今年度以降、調査対象の再検討や企業へのアプローチ方法を見直すことで、聞き取り調査を着実に実行していきたい。国内中小企業を対象に、より規模を拡大したアンケート調査を実施し、高いEE度数を実現できている企業を特定したうえで、それら企業の定性的な調査を行う。また、こうした調査を補完する意味で、EE構築・向上のためのサービス提供を行っている代表的なコンサルタント企業との情報交換を試みる。他方で、これら成果を踏まえながら、アメリカ調査を実施し本研究の主眼であるEE度数向上に資する人HRMの日米比較に着手したい。当初予定していたアメリカへの調査出張を実施できなかったため。今年度は、校務負担の軽減が期待できるため調査出張を着実に実行したい。
ジーンターゲッティング法を用いたマウス個体内でのδEF1遺伝子の機能検索

遺伝子の発現制御は、主に転写の段階で転写制御因子により行われる。転写制御因子にはアクチベターとリプレッサーの大きく分けて2つのタイプがありこれらの協調した働きにより厳密な遺伝子発現が行われるということが明らかになりつつある。転写制御因子δEF1はニワトリのδクリスタリン遺伝子の転写抑制に関わる因子である。δEF1はδクリスタリン遺伝子のエンハンサー上でDNA認識配列がオーバーラップしたアクチベーターと競合することにより遺伝子発現を制御していると思われる。一方δEF1の発現は意外にも水晶体以外の特定の組織でも胚発生の時期において強く、δEF1はδクリスタリン遺伝子のみならず、他の遺伝子の発現の制御に対しても幅広く関わっていることが予想された。現在マウスにおいてジーンターゲッティング法(標的遺伝子組み換え法)により突然変異個体を作製して生体内における任意の遺伝子の機能を解析することが可能となった。そこで本研究ではδEF1の胚発生における機能を明らかにする目的でマウスを用いてδEF1遺伝子欠損個体の作製を計画した。まずマウスδEF1 homologue(mδEF1)のcDNA、ゲノムDNAのクローニング、及びそれらの大まかな構造解析を行った。得られたゲノムDNAを用い、δFE1のDNA結合に重要なカルボキシル基末端側のZn-フィンガードメインを欠損するような変異を導入したターゲッティングベクターを構築した。このベクターを用いて変異個体の作製を行いヘテロ変異個体までの作製に成功した。δEF1ホモ変異個体については現在作製中である。またマウスにおける胚発生過程でのmδEF1の発現をmRNAレベルでノーザンハイブリダイゼーション法により調べた。すでに我々のグループでクローニングに成功しているニワトリのδEF1のcDNAをプローブにして、マウス12日胚のmRNAより調製したcDNA Libraryをスクリーニングした。その結果、ニワトリのδEF1とクロスハイブリダイズするマウスのcDNAクローンが複数個得られた。これらに関して制限酵素地図や部分的塩基配列の決定等を用いて解析したところ、それらは同一種のクローンであり、またニワトリのδEF1との塩基配列およびアミノ酸配列との比較からこのcDNAクローンはマウスのδEF1ホモローグであることが確認された。次にこのcDNAをプローブとしてマウス(Bulb/c)のgenomic DNA libraryをスリーニングした結果、一個のPositiveクローンが得られた。このクローンを解析したところ、δEF1タンパクの中流域に存在するホメオドメインとC末端に存在するZincfinger領域をコードするエクソンを有し、おもにδEF1遺伝子3'側を含むものであることが判明した。プロモーター領域の解析等のためには、5'上流域を含むgenomicクローンを得る必要があり、引き続きgenomic libraryをスクリーニングする必要がある。次に、上で得られたgenomicクローンからgene targetingのためのベクターを作製し、ES細胞株であるE14細胞にElectroporation法により導入し、δーEF1遺伝子のみを特異的に破壊している細胞コロニーを検索した。その結果、200コロニー中少なくとも一個のコロニーにおいては遺伝子破壊を伴う相同的組み換えが起こっていることが判明した。現在、この細胞を用いてキメラマウスを作製中である。

現在マウスにおいてジーンターゲッティング法(標的遺伝子組み換え法)により突然変異個体を作製して生体内における任意の遺伝子の機能を解析することが可能となった。そこで本研究ではδEF1の胚発生における機能を明らかにする目的でマウスを用いてδEF1遺伝子欠損個体の作製を計画した。まずマウスδEF1 homologue(mδEF1)のcDNA、ゲノムDNAのクローニング、及びそれらの大まかな構造解析を行った。得られたゲノムDNAを用い、δEF1のDNA結合に重要なカルボキシル基末端側のZn-フインガードメインを欠損するような変異を導入したターゲッティングベクターを構築した。このベクターを用いて変異個体の作製を行いヘテロ変異個体までの作製に成功した。δEF1ホモ変異個体については現在作製中である。またマウスにおける胚発生過程でのmδEF1の発現をmRNAレベルでノーザンハイブリダイゼーション法により調べた。
核変換に伴なう後遺効果の研究

本研究の目的は、水分子以外の塩基配位子を持つ二価あるいは三価の化合物にコバルト57をドープし、我々の考案したガンマ・エックス線同時計数メスバウアー分光法等によるこれらの化合物に対する実験から、結晶中での核変換に伴なう後遺効果の機構を調べることである。このため我々はコバルト57をドープした比放射能の高い各種の試料、Fe【SO_4】・【H_2】O,Fe【SO_4】・4【H_2】O,Fe【SO_4】・7【H_2】O,Co【SO_4】・7【H_2】O,Mg【SO_4】・【H_2】O,Zn【SO_4】・7【H_2】Oをつくり、実験を行なった。これにより新たに得られた知見は次のようなものである。1.【^(57)Co】の崩壊により出現した【^(57)Fe】のイオン半径が結晶格子を形成している金属イオンの半径より大きい場合には【^(57)Fe】は三価となり、その逆の場合には二価となる。2.硫酸塩のように構造をもった配位子もまた水分子同様に後遺効果の発現に重要な働らきをしている。3.後遺効果により出現した異常状態のイオンの囲りの電場匂配の大きさは、そのイオンに属している配位子が隣りの金属イオンにも同時に配位しているかどうかによって大きく異なる。これらの知見が得られた結果、核変換に伴なうイオン半径の変化、中心金属イオンに対する配位子の空間分布と後遺効果との関係が明らかになった。今後三価の化合物に対しても同様の研究を行ない後遺効果のより深い理解をめざしている。そのために現在Nd【Cl_3】・6【H_2】O,Cr【F_3】・3【H_2】O等による実験を準備している。
セルロース合成酵素複合体の構造解析基盤の構築

セルロース合成酵素複合体の三次元構造解析を、電子顕微鏡画像のランダムコニカルティルトおよび単粒子解析により進めた。得られた三次元構造は、2013年に別グループから報告された、セルロース合成酵素複合体のX線結晶構造にフィットすることが判明した。以上から、本系を用いて構造解析を進めることが可能だと結論でき、構造解析基盤構築の目的を達成した。また、構造解析データの詳しい解釈のために、機能解析研究を行った。粗酵素の速度論的解析と、組換え体による、セルロース合成酵素の大腸菌内機能再構成を行った。後者の機能再構成系をCESECと名付け、変異体酵素の活性評価など、機能解析実験を開始した。大腸菌発現系で、酢酸菌のセルロース合成酵素複合体の構成サブユニットCesAとCesBを共発現させ、遠心分画と各種クロマトグラフィーを使い精製した。現在までCesBについては純度高く精製することに成功し、ゲル濾過で分子量1,000kD程度であることから、8-12量体の会合体であることが判明した。負染色法により電顕観察を行い、まずテストとして568粒子像を使い構造解析計算を行った。ランダムコニカルティルト法(以下RCT法)で初期構造をおこし、これを使ってプロジェクション・マッチングにより各粒子像の投影角度の精密化を行った。この結果、構造の上面と下面で凹凸の程度が異なっており、凹凸の激しい面には明らかな突起物が見られた。そこでモデルの信頼度を上げるために粒子数を3500まで増やし解析を行ったが、得られたモデルは先の結果ほど明快な特徴を示さなかった。しかし、構造の上面と下面で凹凸の程度が違う点は再現した。以上から、引き続き精製、電顕観察および解析計算の最適化を行う必要があるものの、制御サブユニットCesBタンパク質について、ドラフトモデルであるが初めて構造モデルを提案することができた。一方でCesA及び、CesA /CesB複合体については、その精製に成功していない。しかし、CesA/CesBが解離するかどうかは膜から可溶化するときの界面活性剤の条件が大きく影響することを示唆するデータが得られており、今後の精製実験の指針は得られている。また、酢酸菌そのものから抽出した合成活性の速度論的解析を行ったところ、1界面活性剤で可溶化する前とした後で酵素学的特徴が根本的に異なる(Hill係数が違う)、2セロビオースやセロオリゴ糖が何らかの形で反応に関与していることが判明し、今後構造解析結果を使って機能を議論する際や、構造解析のためのタンパク質精製を進める上でも重要な知見が得られた。BcsABCDの精製実験を行った。BcsDにHisタグをつけて精製を行ったところ、BcsAとBcsDに相互作用があることを示唆するデータを得た。2013年1月に別グループにより報告された、セルロース合成酵素複合体のX線結晶構造解析による三次元構造(PDB ID: 4HG6)に、平成23年度に予備的な解析の結果として得られたBcsBの構造データが当てはまることを確認した。さらに、先述のPDBモデルでは、BcsABのコンプレックスが、1量体として結晶内に充填されているが、我々のデータは、BcsBが4量体である可能性を示唆した。構造解析計算に用いた粒子数が少ないために、発表するには信頼度を高める必要があるが、上述のX線結晶構造解析からは得られない構造情報を期待できることが判明するとともに、我々の持つ実験系で構造解析を進めることが十分可能であることが示された。前年度に構築した、セルロース合成酵素の大腸菌内再構成系「CESEC」を使い、20のセルロース合成酵素点変異体のセルロース合成活性を定性評価し、配列保存性の高いアミノ酸や、先述のX線結晶構造から重要と推測されたアミノ酸に変異導入した場合には、セルロース合成活性が低下する結果を得た。また、CESECで合成されるセルロースは、大腸菌の細胞外に合成されることが、蛍光顕微鏡と電子顕微鏡観察の結果から判明した。特に電子顕微鏡観察の結果から、大腸菌の菌体除去処理前のセルロースは微細な繊維構造を取ることが判明した。繊維構造のセルロースは、前例に照らすとセルロースIであると推測されるが、菌体除去のために使った酸処理や希アルカリ処理により得られたセルロースはII型結晶である。従来の知見によれば、これらの処理でI型からII型への結晶系変換が起こるとは考えにくい。この繊維構造は、慎重な解釈が必要だが、大変興味深い実験データである。セルロース合成酵素は複数のサブユニットからなる複合体である。その構造解析のために、大腸菌発現系による組換え体セルロース合成酵素を得る実験系の構築を進めた。

酢酸菌の合成酵素複合体は、BcsA, BcsB, BcsC, BcsDの4サブユニットからなると考えられているが、そのうち、最低限必要なサブユニットはAとBの二つと考えられている。これらの構造解析を進めるために、前年度に引き続きBcsAとBcsBの大腸菌共発現系を使い、精製実験を行ったが、構造解析に足る試料を得ることができなかった。一方で、酢酸菌におけるセルロース合成活性を活性化するc-di-GMPを過剰生産させた大腸菌に、上述のBcsAとBcsBを発現させることで、セルロースを合成することのできる大腸菌形質転換体を得ることに成功した。以上から、本発現系による組換え体セルロース合成酵素が正しく発現しており、構造解析に使用可能である発現系であることが確認され、精製条件の検討が取るべき方針であることを確認した。しかし上述のセルロース合成で得られたのはセルロースIIという非天然型の構造であり、天然型構造のセルロース合成に不十分であることが示唆された。そこでBcsAとBcsBに加えて、BcsCとBcsDも発現する大腸菌発現系を構築し、同様にセルロース合成を行わせたが、同様のセルロースIIが得られた。天然活性(セルロースI合成活性)の再構成のために必要な因子がまだ存在することが示された。以上の大腸菌セルロース合成系をCESEC(Cellulose Synthesis in E. coli)と名付け、これを使い、点変異体によるセルロース合成を行わせ、保存性の高いアミノ酸を点変異させるとセルロース合成活性が消えることが確認された。構造解析計算については、一通りのプロトコルを組むことができ、意味のありそうなデータを得ることができた。従って、より多くの画像で構造解析計算を進めることで、信頼に足る三次元構造データを得ることが可能となった。そこで数千枚の画像データを得るために、CesBタンパク質の精製実験を再度行ったが、以前に成功した精製条件でも結果が再現しなかった。そこで、再度精製条件の最適化まで戻る必要が生じ、現在もまだ成功に至っていない。すなわち、タンパク質精製の過程でつまづいていることが原因で、達成度はやや遅れていると自己評価している。25年度が最終年度であるため、記入しない。本課題の初年度に、BcsBの精製タンパク質が得られ、構造解析に供したところ、適当な構造が得られたので、引き続き精製を進め、データ数を増やして構造解析を完遂させようとしたが、BcsBタンパク質の精製が再現できなくなり、構造解析を進めることができなくなった。構造解析のためのタンパク質精製実験(精製条件の最適化)を継続して進め、CesBタンパク質およびCesABタンパク質複合体の精製を進める。また研究実績の概要の項で述べたように、反応速度論的解析から、セルロース合成活性の酵素学的特徴について大変面白いデータが得られたので、構造解析と平行して、速度論的解析にも力点を置く。本課題の当初目標はセルロース合成酵素の構造解析の基盤構築であるが、構造解析データをより深く解釈するためには機能解析データが必須であり、セルロース合成酵素の構造と機能を総合的に理解するための基盤構築を行う。引き続き、構造解析の目的のためにタンパク質精製実験を行い、条件検討を行う。また、昨年度までに大腸菌セルロース合成系の構築に成功した。