hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
異所性脂肪の心臓血管病発症における病態生理学的意義の解明

(1)腹部脂肪、肝臓、骨格筋、心臓周囲脂肪および筋量を非侵襲的に測定し、異所性脂肪分布様式を検証した。玄米食介入で減量および血管内皮機能改善効果を確認した。(2)飽和脂肪酸処理されたヒト臍帯静脈血管内皮細胞(HUVEC)でプロテオーム・トランスクリプトーム解析をおこない、発現変動の顕著な産物Xを同定した。分子X siRNAを過剰発現したHUVECでは、飽和脂肪酸による細胞死が、カスパーゼ3,7切断を阻害することで抑制された。(3)心臓手術症例で、心臓脂肪発現シグナルと全身および心臓脂肪分布との関係を検証した。心臓バイパス手術症例は、心臓周囲脂肪量が増加して炎症性シグナルが増加していた。(1)臨床疫学的研究:平成23年度の研究計画を継続実施。(2)実験的臨床研究:平成23年度の研究計画プロトコール1、プロトコール2の継続に加えて、プロトコール3:心臓手術症例で、心臓脂肪サンプリングを実施し、全身および心臓脂肪分布との関係を検証・実施した。冠動脈疾患を疑われる症例で、multi-slice computed tomographyを施行し、心臓周囲脂肪を計測した。男性では、年齢とともに、心臓周囲脂肪量が蓄積する傾向があり、心臓周囲脂肪量蓄積が多い症例で、冠動脈プラークを有していたが、女性では、年齢による変化に乏しく、心臓周囲脂肪量蓄積と冠動脈プラークの関係も明らかではなかった(Cardiovasc Diabetol 2012;11:106)。冠動脈バイパス手術症例で、心臓周囲脂肪量の関与する程度を計算したところ、従来の心臓血管病リスク(男性、年齢、2型糖尿病)と同程度であることがわかった。さらに、心臓周囲脂肪のマクロファージ数、アディポサイトカイン発現量(IL1β、アディポネクチン)が、冠動脈バイパス手術の説明因子として最も強いことがわかった(Arterioscler Thromb Vasc Biol 2013)。(3)遺伝子改変モデルおよび高脂肪食負荷モデル:平成23年度の研究計画を継続実施。(4)モデル動物およびヒト組織のマイクロRNAおよびプロテオミクス解析:プロテオーム・トランスクリプトーム解析により、脂肪酸処理された培養血管内皮細胞ならびにヒトサンプルにおいて発現変動の顕著な遺伝子(産物)を一部同定した。当該分子の細胞内挙動および機能を一部明らかにした。(1)臨床疫学的研究:プロトコール1:健診受診者で異所性脂肪分布様式と代謝マーカー、脂肪細胞由来生理活性物質の関係を検討した。プロトコール2:異所性脂肪を推定する指標を検討。腹部脂肪、肝臓、骨格筋、心臓周囲脂肪および筋量を非侵襲的に測定し、その妥当性を検討した(Intern Med 2013;52:1561-71, Diabetol Metab Syndr 2014;6:27.)。プロトコール3:メタボリックシンドローム男性に、玄米食による8週間の治療介入をおこない減量および血管内皮機能改善効果を確認した(Br J Nutr 2014;111:310-20)。メカニズムとしてインスリン節減効果、玄米に含まれる機能性分子の関与が示唆された(Diabetes 2012;61:3084-93.)。(2)モデル動物およびヒト組織のマイクロRNAおよびプロテオミクス解析飽和脂肪酸処理されたヒト臍帯静脈血管内皮細胞(HUVEC)でプロテオーム・トランスクリプトーム解析をおこない、発現変動の顕著な産物を同定した。分子X siRNAを過剰発現したHUVECでは、飽和脂肪酸による細胞死が、カスパーゼ3,7切断を抑制することで抑制された。飽和脂肪酸による細胞死のメカニズムに分子X誘導が重要であることが示唆された。(3)実験的臨床研究:心臓手術症例で、心臓脂肪サンプリングを実施し、全身および心臓脂肪分布との関係を検証した。冠動脈疾患群(心臓バイパス手術症例)は、非冠動脈疾患群(弁膜症手術群)に比べ、心臓周囲脂肪量が増加しており、M1マクロファージが著明に増加していた(ATVB 2013;33:1077-1084.)。ミクロアアレイによる遺伝子発現パターンは、心臓周囲脂肪と皮下脂肪で差があった。1)臨床疫学的研究:プロトコール1:某健診センター(30-80才代まで年間1万2000名受診)受診者で異所性脂肪分布様式と代謝マーカー(内臓脂肪分布、血圧、耐糖能異常、脂質代謝異常)、脂肪細胞由来生理活性物質の関係を明らかにするための解析を継続中である。プロトコール2:全身脂肪分布の測定をおこなう。異所性脂肪の測定は、腹部脂肪、肝臓、骨格筋、心臓周囲脂肪にフォーカスして実施。CTを用いて心筋細胞内、冠動脈周囲、心臓外膜、近位大動脈および大動脈弁の異所性脂肪の測定をおこなった。本年度は特に心臓周囲脂肪および腹部周囲脂肪の分布様式を解析した。

心臓周囲脂肪量は、男性でのみ冠動脈狭窄病変を予測する因子で有り、BMIよりも強い相関を有することが明らかとなった(論文投稿中)。プロトコール3:脂肪分布様式と生活習慣病・心臓血管病発症の関係を前向きコホートで調べる。(2)実験的臨床研究:研究は当大学および関連施設の倫理審査委員会の許可をうけ被験者全員から文書同意を得る。プロトコール1:異所性脂肪蓄積を有する症例および性、年齢をマッチさせた健常者で、血管機能、心臓機能、インスリン感受性(M値)を測定し、遊離脂肪酸、アディポネクチン濃度、脂肪由来生理活性物質との相関を検討する。現在、心臓血管病のない症例(103例の手術時採取検体)で、脂肪分布様式と脂肪細胞で発現する炎症性シグナルの相関を調べている。プロトコール2:佐田政隆教授との共同研究で心臓血管病症例で、各種マーカーと全身および心臓脂肪分布との関係を検証中である。1)臨床疫学的研究:プロトコール1:異所性脂肪分布様式と代謝マーカー(内臓脂肪分布、血圧、耐糖能異常、脂質代謝異常)、脂肪細胞由来生理活性物質の関係を明らかにするための解析、プロトコール2:異所性脂肪の測定については、おおむね、計画通りに進行中である。プロトコール3:脂肪分布様式と生活習慣病・心臓血管病発症の関係を前向きコホートにて調べている。2012年度9月までに追加症例の調査は完了し、データベース入力も順調に経過している。(2)実験的臨床研究:プロトコール1:異所性脂肪蓄積を有する症例および性、年齢をマッチさせた健常者での検討は解析を終了。論文作成、投稿にて論文掲載受理となった。心臓血管病のない症例(103例の手術時採取検体)て、脂肪分布様式と脂肪細胞て発現する炎症性シクナルの相関も継続して調べている。プロトコール2:各種マーカーと全身および心臓脂肪分布との関係を検証中である。いずれも順調に経過している。1)臨床疫学的研究:プロトコール1:異所性脂肪分布様式と代謝マーカー(内臓脂肪分布、血圧、耐糖能異常、脂質代謝異常)、脂肪細胞由来生理活性物質の関係を明らかにするための解析、プロトコール2:異所性脂肪の測定については、ほぼ、計画通りに進行中である。についてもデータベースの入力を中心にほぼ順調に経過している。(2)実験的臨床研究:プロトコール1:異所性脂肪蓄積を有する症例および性、年齢をマッチさせた健常者での検討。心臓血管病のない症例(103例の手術時採取検体)で、脂肪分布様式と脂肪細胞で発現する炎症性シグナルの相関を調べている。いずれもほぼ順調に経過している。プロテオーム・トランスクリプトーム解析により、脂肪酸処理された培養血管内皮細胞ならびにヒトサンプルにおいて発現変動の顕著な遺伝子(産物)を一部同定した。現在その分子挙動、細胞内機能を検索しており、当初予期した結果がえられつつある。
難治性真菌感染症の克服を目指した新規治療戦略の開発

本研究は病原真菌Candida glabrataにおける多剤耐性機序の解明を目的としている。以前、研究代表者は、わずか一つの遺伝子の一つのアミノ酸変異によって多剤耐性が誘導されることを見出した。その後、DNAマイクロアレイを用いた網羅的解析とリアルタイムPCRによる検証を行い、ある細胞内シグナル伝達経路の転写調節因子が活性化されることによって、薬剤排出ポンプ遺伝子の高発現をきたしていることが明らかとなった。その結果、実際に細胞内薬剤濃度が著明に減少していることをフローサイトメトリー解析で確認した。さらに、これらの関連遺伝子欠損株を作製し、感受性が回復することを確認できたため、薬剤排出ポンプの活性化が一つの機序として関与していると結論付けた。電子顕微鏡による細胞構造解析では有意な所見を認めなかったが、薬剤と標的分子の結合にも何らかの影響を及ぼしていると推察されたため細胞膜構成成分を解析し、感受性株と耐性株の間に重要な違いがあることを見出した。また、今回の責任遺伝子の野生型と変異型にそれぞれ3xFLAG-HAタグを付け、免疫沈降法を行った。Western blottingの結果から、有意に差があるものについて、LC-MS/MSおよびMALDI-TOF/MSを用いて関連分子を同定後、これらの遺伝子欠損株および変異株を作製して表現型の解析を行った。その結果、今回の多剤耐性機序に関与している上流の細胞内シグナル伝達経路も明らかとなった。最終年度には追加の検証実験を行い、これらの再現性を確認した。現在、英語論文としてまとめている。また、新規治療薬の開発を目指して化合物ライブラリーのスクリーニングを施行し、主要病原真菌に活性を有する複数のヒット化合物から構造展開および周辺化合物の探索を行った。最終的に最も優れた化合物について、広域性と毒性を評価し、こちらも現在英語論文としてまとめている。以前、研究代表者は、薬剤曝露によって生じた複数の遺伝子変異の中から、わずか一つのアミノ酸変異によって多剤耐性が誘導されることを見出した。今回、その変異がどのシグナル伝達経路を活性化しているのかをDNAマイクロアレイを用いた網羅的解析結果から推定し、リアルタイムPCRによる検証を行った。その結果、ある転写調節因子を介した経路によって、薬剤排出ポンプ遺伝子の発現が著明に上昇しており、フローサイトメトリーを用いた解析で細胞内薬剤濃度の減少が確認された。さらに、これらの関連遺伝子欠損株を作製し、感受性が回復することを確認できたため、薬剤排出ポンプの活性化が一つの機序であると結論付けた。電子顕微鏡による細胞構造解析では有意な所見は得られなかったが、細胞膜構成成分にはある一定の変化が起こっていることを確認した。これは、薬剤と標的分子の結合に影響を及ぼしていると推察しているが、更なる検証が必要である。Western blottingの結果から、有意に差があるものについて、LC-MS/MSおよびMALDI-TOF/MSを用いて関連分子の同定を行った。今後はこれらの遺伝子欠損株や変異株を作製して解析を進めることで、多剤耐性機序の解明を目指している。平成27年度の研究計画として、C. glabrataにおける多剤耐性機序の解明を目指した分子生物学的研究を掲げた。具体的には、責任遺伝子変異による二次的影響の解析、DNAマイクロアレイを用いた網羅的遺伝子発現解析、電子顕微鏡や細胞膜脂質成分解析による細胞構造解析などであるが、これらはいずれも上述のように実行され、期待通りの成果が得られた。一方、化合物ライブラリーのスクリーニングについては、共同研究先の事情もあり予定を変更した。電子顕微鏡による細胞構造解析では有意な所見を認めなかったが、薬剤と標的分子の結合にも何らかの影響を及ぼしていると推察されるため、現在、詳細な細胞膜構成成分の変化を解析中である。Western blottingの結果から、有意に差があるものについて、LC-MS/MSおよびMALDI-TOF/MSを用いて関連分子を同定した。その後、これらの遺伝子欠損株および変異株を作製して、今回の多剤耐性機序に関与している上流の細胞内シグナル伝達経路を複数推定することができている。これら一連の研究成果をまとめて、国際学会および国際論文への発表準備を進めていく予定である。平成28年度の研究計画として、C. glabrataにおける多剤耐性機序をより詳細に解明するための研究計画を掲げた。具体的には、責任遺伝子変異による二次的影響を解析後、関与していると推定された遺伝子の欠損株や過剰発現株を作製し細胞内シグナル伝達経路を同定するものであるが、上述のように期待通りの成果が得られた。

新規治療薬の開発を目指した化合物ライブラリーのスクリーニングについては、効率よく進めるためのアッセイ系を確立することができた。現在までに主要な病原真菌に活性を有するヒット化合物を複数同定できている。本研究は病原真菌Candida glabrataにおける多剤耐性機序の解明を目的としている。以前、研究代表者は、わずか一つの遺伝子の一つのアミノ酸変異によって多剤耐性が誘導されることを見出した。その後、DNAマイクロアレイを用いた網羅的解析とリアルタイムPCRによる検証を行い、ある細胞内シグナル伝達経路の転写調節因子が活性化されることによって、薬剤排出ポンプ遺伝子の高発現をきたしていることが明らかとなった。その結果、実際に細胞内薬剤濃度が著明に減少していることをフローサイトメトリー解析で確認した。さらに、これらの関連遺伝子欠損株を作製し、感受性が回復することを確認できたため、薬剤排出ポンプの活性化が一つの機序として関与していると結論付けた。電子顕微鏡による細胞構造解析では有意な所見を認めなかったが、薬剤と標的分子の結合にも何らかの影響を及ぼしていると推察されたため細胞膜構成成分を解析し、感受性株と耐性株の間に重要な違いがあることを見出した。また、今回の責任遺伝子の野生型と変異型にそれぞれ3xFLAG-HAタグを付け、免疫沈降法を行った。Western blottingの結果から、有意に差があるものについて、LC-MS/MSおよびMALDI-TOF/MSを用いて関連分子を同定した。その後、これらの遺伝子欠損株および変異株を作製して、今回の多剤耐性機序に関与している上流の細胞内シグナル伝達経路を同定した。現在、これら一連の研究成果をまとめて、学会および国際論文への発表準備を進めている。平成29年度の研究計画として、C. glabrataにおける多剤耐性機序をより詳細に解明するため、関連している細胞内シグナル伝達経路の細部を検証する研究計画を掲げた。具体的には、責任遺伝子変異による二次的影響を解析後、関与していると推定された遺伝子のタグ付き株を作製し、免疫沈降法とLC-MS/MS、MALDI-TOF/MSを用いて関連分子を同定した。また、薬剤排出ポンプのみならず細胞膜構成成分の変化も多剤耐性に関与していると推察している。今回、C. glabrataがどのようなメカニズムで多剤耐性を獲得しているのか、関与している細胞内シグナル伝達経路を含めて明らかにすることができた。一方、新規治療薬の開発を目指した化合物ライブラリーのスクリーニングについては、効率的なアッセイ系を確立し、現在までに主要な病原真菌に活性を有するヒット化合物を複数同定できたため、それらの広域性と毒性の評価を行った。当初予定していた研究計画は順調に進行し期待通りの成果が得られたが、本研究の目的をより精緻に達成するための追加実験を行い、これらの研究成果をまとめて次年度の学会および論文で発表するために経費の一部を平成30年度分として繰り越した。
InAsSbN/GaAsSbN新量子井戸構造を用いた赤外光素子の研究

新量子井戸構造を用いた光デバイスとして、InGaAs(N)/GaAsSbタイプII光検出器、およびInAsSbN歪量子井戸レーザを検討した。その結果、InGaAs/GaAsSbタイプII量子井戸構造を用いることにより波長2μmの2次元イメージセンサーの室温動作を実現した。またInAsSbN歪量子井戸レーザにおいて210Kで波長2.3μmの発振を実現した。今年度は新構造赤外素子として量子井戸レーザおよび赤外光検出器の試作を行った。まず、量子井戸レーザに関してはInAsSbN層の成長条件を把握するとともに、これを量子井戸活性層に用いた赤外量子井戸レーザを試作した。バリア層にはInGaAsN層を用いた歪み補償構造を採用した。また光ガイド層にはInGaAs層、クラッド層にはInAlAs層を用いることとした。その結果、210Kで波長2.3μmのパルスレーザ動作を実現することが出来た。また発振閾値の特製温度は60K程度であり、光通信用レーザと同程度の値を得ることが出来た。これはInAsSbN層を用いた初めてのレーザ動作である。次に赤外光検出器に関しては、光吸収層としてInGaAsN層とInGaAs/GaAsSbタイプII量子井戸層の2種類を検討した。InGaAsN層については格子整合条件で波長2μmのフォトルミネッセンス(PL)発光を観測することに成功した。しかしながらそれ以上の長波長化は実現出来なかった。これに対してInGaAs/GaAsSb層に関しては行使整合条件で波長2.4μmまで長波長化することが可能であった。このタイプII量子井戸構造を用いることにより、プレーナ型の光検出器を試作した。その結果、室温での暗電流として37nA/cm^2というこの波長帯では最少の値を実現した。今年度はInAsSbN量子井戸レーザの特性向上、およびInAsSbN/GaAsSbN量子井戸の基本物性を明らかにすることを目的に実験を進めた。まずInAsSbN量子井戸レーザに関しては単一井戸層の評価用結晶を作製し、窒素組成、Sb組成をパラメータとしてフォトルミネッセンス測定により光学的特性を評価した。その結果、窒素の導入により、臨界膜厚が増大し、高品質の量子井戸が形成出来ることが明らかとなった。Sb組成を2%と4%の試料を作製したがSbが4%の場合に大幅な特性の変化が生じることを見出した。InAsSbN/GaAsSbN量子井戸に関しては、その基本となるInGaAs/GaAsSbタイプII量子井戸層において歪み補償構造を作製し、その発光特性を測定した。その結果、6%の歪み補償構造において、約40meVの低エネルギーシフトを観測した。これは理論値である30meVにかなり近い値である。また発光強度の低下もほとんど見られず、光学的に高品質の結晶が得られていることが明らかとなった。今年度はInAsSbN量子井戸レーザの室温レーザ発振のための条件を見出すこと、およびInGaAsN/GaAsSb量子井戸の発光特性を明らかにすることを目的に実験を進めた。まずInAsSbN量子井戸レーザに関しては昨年と同様、単一井戸層の評価用結晶を作製し、層厚、SbI組成をパラメータとしてフォトルミネッセンス測定により光学的特性を評価した。層厚を3nmと変更し、Sb組成を2%から6%まで変化させてPL強度を測定した。その結果、Sb組成2%の場合にもっとも発光強度が強くなることを見出した。この条件によりレーザ構造を作製することにより室温発振が実現出来ると考えられる。次に、InGaAsNIGaAsSb量子井戸に関しては、その1基本となるInGaAs/GaAsSbタイプII量子井戸層の発光波長と強度を測定し、それを基準として特性の変化を調べた。N組成は1%に固定し、成長中断ありと成長中断無しの二つを比較した。その結果、成長中断ありの場合は液体窒素温度においても発光を観測することが出来なかった。これに対し、成長中断無しの場合においては、液体窒素温度において発光が観測され、N導入の効果により、波長が長波長側にシフトしていることが観測された。この結果からInGaAsN/GaAsSb量子井戸は長波長化にきわめて有効であることが明らかとなった。ただし、室温での発光は観測されていないことから、界面の欠陥を低減することが今後必要である。
トレーニングによる全身諸臓器毛細血管活性化の基礎的研究

平成19年度の本研究で、トレーニングによる全身諸臓器毛細血管活性化を調べるためにGFP(green fluorescent protein)骨髄キメラマウスモデルを用い、以下の研究結果を得た。脳、心、肺、肝、脾、腎、膵、消化管、胸腺、骨格筋等の全身諸臓器の毛細血管に、ドナー骨髄由来内皮細胞の基本的な動態が存在することを、GFPとCD34の連続切片による免疫組織化学染色およびGFPとCD34の二重免疫組織化学染色で確認した。心筋毛細血管では最も多数の骨髄由来内皮細胞が動員されており、骨格筋毛細血管よりも100倍前後の骨髄由来内皮細胞が存在した。心筋周皮細胞様骨髄由来細胞も認められた。心臓弁に多数の骨髄由来内皮細胞および間葉系細胞が存在した。心臓に続いて腎臓毛細血管に多数の骨髄由来内皮細胞が存在した。血液脳関門にも骨髄由来内皮細胞が存在したが、ミクログリア様骨髄由来細胞も出現していた。肝臓、脾臓の類洞に骨髄由来内皮細胞が存在した。大動脈では上行大動脈起始部に骨髄由来内皮細胞および間葉系細胞が存在した。上行大動脈起始部以外の大動脈骨髄由来内皮細胞はごく少数であるが、大動脈周皮細胞に相当する多数の骨随由来樹状細胞が存在した。一方、ドナー骨髄由来の上皮細胞、神経細胞、心筋細胞、骨格筋細胞、平滑筋細胞は見られなかった。最後に、8週間から16週間トレッドミルを負荷する長期トレーニングモデルにより、骨格筋毛細血管の骨髄由来内皮細胞は対照に比較し2-3倍多く動員された。以上、トレーニングによる全身諸臓器毛細血管活性化が示唆ざれた。近年、内皮幹細胞治療の大きな可能性が語られ、さまざまな臨床試験が始まっているが、その臨床応用においては骨髄由来内皮細胞(内皮幹細胞)の基本的な動態を改めて考慮する必要がある。1.トレッドミルを8週間、16週間連続負荷するという長期トレーニングマウスモデルを確立した。2.脳、心、肺、肝、脾、腎、膵、消化管、胸腺、骨格筋等の全身諸臓器の毛細血管にドナー骨髄由来細胞の基本的な動態が存在することを形態学的に確認した。3.心筋毛細血管に最も多くの骨髄由来細胞が認められた。4.心臓弁に多くの骨髄由来細胞が認められた。5.血液脳関門に多くの骨髄由来細胞が認められた。6.骨髄由来細胞のほとんどは血管内皮細胞と考えられた。7.毛細血管壁に骨髄由来周皮細胞様細胞が認められた。8.脳実質内に骨髄由来ミクログリア様細胞が認められた。9.一方、ドナー骨髄由来の上皮細胞、神経細胞、心筋細胞、骨格筋細胞、平滑筋細胞は見られなかった。以上、トレーニングによる全身諸臓器毛細血管活性化が示唆され、心筋内毛細血管や血液脳関門や心臓弁に骨髄由来細胞を多量に誘導させうる可能性が示唆された。近年、幹細胞治療の大きな可能性が語られ、臨床試験が始まっているが、その臨床応用においては骨髄由来細胞(幹細胞)の基本的な動態の意味を改めて考察する必要がある。平成19年度は、詳細な形態学的検討を中心に本研究を進めていき、国内外の学会で発表し、論文化する予定である。平成18-19年度の本研究で、二種類の骨髄キメラマウスを用いた病理形態学的検討により、以下の研究結果を得た。

1.トレッドミルを最長16週間連続負荷する長期フィジカルトレーニングマウスモデルを確立した。2.脳、心、肺、肝、脾、腎、膵、消化管、胸腺、骨格筋等の全身諸臓器毛細血管へのドナー骨髄由来細胞の基本的な動態と、骨髄由来細胞の多くは血管内皮細胞であることを確認した。3.全身諸臓器のなかで、心筋の毛細血管に最も多くの骨髄由来内皮細胞を認めた。4.心臓弁、腎臓毛細血管に多数の骨髄由来内皮細胞を認めた。5.肝臓の類洞と脾洞に骨髄由来内皮細胞を認めた。6.血液脳関門に骨髄由来内皮細胞ないしグリア細胞を認めた。7.上行大動脈起始部に骨髄由来内皮細胞を、大動脈内皮直下に多数の骨髄由来樹状細胞を認めた。8.骨格筋の骨髄由来内皮細胞は極端に少なかったが、フィジカルトレーニングにより骨格筋毛細血管へより多くの骨髄由来内皮細胞を動員しえた。9.ドナー骨髄由来の上皮細胞、神経細胞、心筋細胞、骨格筋細胞は見られなかった。以上、全身諸臓器における骨髄由来内皮細胞の分布及び動態の臓器及び部位による不均等性と、トレーニングによる臓器毛細血管の活性化が示唆された。骨髄由来内皮細胞の基本的な分布や動態には血流量や血流の変動と密接に関連している可能性がある。漠然と動脈硬化症や糖尿病等の成人病予防ないし老化予防に有効とされているトレーニングの基盤的意義の一部を、全身諸臓器毛細血管の活性化という視点から明らかにした。
麻痺性貝毒の代謝に関する研究

麻ひ性貝毒(PSP)はAlexandrium tamarenseなどの渦鞭毛藻が持つ強力な神経毒で、食物連鎖で二枚貝に蓄積する。蓄積した毒は時間とともに変化を受けないまま貝の体外に排出されると考えられてきた。筆者らは前年度までの研究で貝に取り込まれた毒の一部が貝のタンパクと結合することを明らかにした。タンパクに毒が結合した場合、タンパクの構造は変化し、このことがタンパクの生理機能に影響を与えることが考えられる。そこで本年度は、生理活性を持つタンパクとしてパパインを選び、毒の存在下でのパパインの活性を調べ毒とタンパクの生理活性の関係を検討した。パパイン活性は基質に人工基質N^α-benzoyl-DL-arginine-p-nitroanilide(BAPNA)を用いる吸光度法で調べた。毒には11-0-sulfateを持つ毒成分GTXsとCトキシン、およびこれをもたない毒成分STXおよびneoSTXを用いた。これら毒成分の存在下で測定したパパインの活性は、対象に比較して有為に低下した。活性の低下はGTXsおよびCトキシンで高く、STXおよびneoSTXでは低かった。以上の結果はPSPがパパインの活性を阻害することを示すもので、本阻害効果はPSPと結合することによりパパインが構造変化を起こし、この構造変化が活性に影響を与えたためと考えられた。11-0-sulfateを持つ毒成分はタンパクのシステイン残基のチオールと結合する。また、種々のPSP成分はその強い陽電荷によりタンパクと結合する。活性阻害は11-0-sulfateを持つGTXsやCトキシンばかりでなくこれを持たないSTXやneoSTXでも見られた。このことはPSPはチオールを介した結合ばかりでなく、陽電荷による結合でもパパインと結合していることを示唆する。すなわち、どのような形で結合しても、毒の結合はパパインに構造変化を起こし、このことがパパインの活性に影響を与えることが明らかになった。本研究の結果はPSPが神経毒ばかりでなく、タンパクに結合することでその活性を阻害する作用を持つことを示すものである。
南アジア古代絵画の伝播と変容-アジャンターからティヴァンカまで-

本年度は、アジャンター壁画をはじめ、南インド古代中世絵画、スリランカのアヌラーダプラ時代・ポロンナールワ時代を対象に、各地域・時代の遺例の調査・写真撮影と文献の資料収集、さらに歴史文献の精査を行った。各考古局および大学機関(Deccan College-Postgraduate and Research Institute,Pune/Kelanya University,Sri Lanka)の助力により調査を実施し、また三脚を用いた写真撮影を行い、考古局や先学による報告者や論文、書籍等も収集した。また、ポスト・アジャンターの遺例ピタルコーラー石窟やカンヘーリー石窟、エローラ石窟についても調査し、前者においては様式的変化と図像にみる南インド、アーンドラ美術の伝統とアジャンターの影響を受けた新しい図像の折衷の様相を明らかにした。また、スリランカの仏教寺院構造や美術様式にも影響を及ぼしたアーンドラ地方の初期仏教遺跡および博物館の調査と平行して、未見の中世絵画の遺例も調査した。特に、スリランカ美術の研究では、マヒヤンガナ壁画におけるシヴァやヴィシュヌなどヒンドゥー尊像が仏陀(舎利)を礼拝守護する図様が見られ、インド・チョーラ朝文化が浸透し、ヒンドゥー文化と伝統的スリランカ仏教とのシンクレティズムの様相が明らかとなった。このことは寺院建築においても同様で、南インド様式を呈する仏教寺院ナーランダー寺院においても顕著である。また、仏教史学の分野では、森祖道氏の研究も参考にしつつ、歴史文献にみる遺跡や壁画に関する記述を抜粋し、現在もその作業は進行中である。この他、アジャンター研究の成果も論文として発表し、「壁画主題と配置にみる仏教寺院の空間概念」と題してアジャンターに加え、ティヴァンカ壁画も比較作例として提示し、仏殿空間と説話主題の伝統と構図の普遍性について発表した。
AIHの新たな非HLA疾患感受性遺伝子の同定と遺伝子産物の免疫病態への関与の解析

§平成12年度自己免疫性肝炎(AIH)、原発性胆汁性肝硬変(PBC)の発症および疾患活動性を規定するHLA以外の遺伝学的背景因子の詳細を明らかにすることを目的に、症例のDNAを用いCTLA-4の遺伝子多型を分析した。本研究は本学ヒト遣伝子解析研究倫理審査会の承認を得て行い、患者さんに血液の一部を本研究に用いることを説明し承諾を得た後に採血した検体を用いて検討した。CTLA-4のエクソン1+49部位の1塩基多型解析により、PBCにおいてはTを有する割合が健常人に比し有意に多いことが示された。また、ATを有する症例は高年齢発症で、活動性も軽度である傾向があった。AIHでは症例数が少ないため統計学的有意差を得るには至っていないが、同様の傾向を認めた。§平成13年度昨年度はCTLA-4エクソン1+49部位の1塩基多型解析により、PBCにおいてはTを有する割合が健常人に比し有意に多いことが示し、ATを有する症例は高年齢発症で活動性も軽度である傾向があることを明らかにしたが、今年度はIL-12 p40遺伝子3'UTR TaqI siteをPCR-RFLP法にて遺伝子型解析し、INF-γ遺伝子+874 A/TおよびTGFβ遺伝子codon 10 C/TをARMS-PCR法で遺伝子型決定し、疾患感受性との関連を検討した。IFN-γ遺伝子型はPBCでは健常人に比べA/T型が有意に多かった(p<0.005)。PBC発症の相対危険度はCTLA-4:G/G型で2.34、IFN-γ:A/T型で2.95で、両方を有する場合は5.23と相乗的な増加し、これらの症例はUDCA治療に抵抗性を示した。一方、TGFβ、IL-12 p40の遺伝子型分布は患者、健常人間で有意差を認めず病態との関連も認めなかった。以上よりCTLA-4、IFN-γの遣伝子多型がPBCの発症に単独かつ相乗的に関連し、病態や治療効果とも関連することが明らかとなった。AIHでも同様の傾向が見られたが、サンプル数が少なく統計学的有意差を得るには至らなかった。§平成14年度今年度はCTLA-4の遺伝子多型と機能の関連について解析し、CTLA-4の遺伝子多型がタンパクの機能変化と関連して病態に影響を及ぼすか検討した。具体的には、CTLA-4リガンドを発現したCHO細胞と各患者のT細胞を混合培養した後のT細胞増殖の程度を、トリチウムチミジンアッセイを用いて解析し、CTLA-4タンパクの機能を評価した。その結果、PBC症例に有意に多く認められたG/G型のT細胞活性化抑制機能はA/G型に比しむしろ強力なことが明らかとなり、PBCではCTLA-4のT細胞抑制機能が低下しているため自己免疫現象が生じやすいという仮説を実証するには至らなかった。従って、CTLA-4のPBCの疾患感受性への関与は機能変化を介したものではなく、遣伝子多型はマーカーとしての意義のみを有する可能性が示された。

§平成14年度今年度はCTLA-4の遺伝子多型と機能の関連について解析し、CTLA-4の遺伝子多型がタンパクの機能変化と関連して病態に影響を及ぼすか検討した。具体的には、CTLA-4リガンドを発現したCHO細胞と各患者のT細胞を混合培養した後のT細胞増殖の程度を、トリチウムチミジンアッセイを用いて解析し、CTLA-4タンパクの機能を評価した。その結果、PBC症例に有意に多く認められたG/G型のT細胞活性化抑制機能はA/G型に比しむしろ強力なことが明らかとなり、PBCではCTLA-4のT細胞抑制機能が低下しているため自己免疫現象が生じやすいという仮説を実証するには至らなかった。従って、CTLA-4のPBCの疾患感受性への関与は機能変化を介したものではなく、遣伝子多型はマーカーとしての意義のみを有する可能性が示された。本研究は、自己免疫性肝炎(AIH)、原発性胆汁性肝硬変(PBC)の発症および疾患活動性を規定するHLA以外の遺伝学的背景因子の詳細を明らかにすることを目的に、症例のDNAを用いCTLA-4の遺伝子多型を分析するとともに、CTLA-4の発現および機能との関連を解析した。患者さんに、血液の一部を本研究に用いることを説明し承諾を得た後に採血した検体を用い検討し、以下の結果を得た。§CTLA-4の遺伝子多型解析CTLA-4のエクソン1+49部位の1塩基多型解析により、PBCにおいてはTを有する割合が健常人に比し有意に多いことが示された。また、ATを有する症例は高年齢発症で、活動性も軽度である傾向があった。機能との関連に関しては、Tを有する症例ではT細胞のマイトジェンに対する反応性が低く、またCTLA-4リガンドによる増殖抑制機能はほとんど変化ないことが示された。AIHでは症例数が少ないため統計学的有意差を得るには至っていないが、同様の傾向を認めている。本研究では、自己免疫性肝疾患(AIH、PBC)の発症および疾患活動性を規定するHLA以外の遺伝的背景因子を明らかにすることを目的に、各疾患症例のDNAを用い種々のサイトカイン、免疫応答関連分子の遺伝子多型を分析する。患者さんに血液の一部を本研究に用いることを説明し承諾を得た後に採血した検体を用い検討し以下の結果を得た。昨年度はCTLA-4エクソン1+49部位の1塩基多型解析により、PBCにおいてはTを有する割合が健常人に比し有意に多いことが示しATを有する症例は高年齢発症で活動性も軽度である傾向があることを明らかにしたが、今年度はIL-12p40遺伝子3'UTR TaqI siteをPCR-RFLP法にて遺伝子型解析し、IFN-γ遺伝子+874A/TおよびTGFβ遺伝子codon 10C/TをARMS-PCR法で遺伝子型決定し、疾患感受性との関連を検討した。IFN-γ遺伝子型はPBCでは健常人に比べA/T型が有意に多かった(p<0.005)。PBC発症の相対危険度はCTLA-4:G/G型で2.34、IFN-γ:A/T型で2.95で、両方を有する場合は5.23と相乗的な増加し、これらの症例はUDCA治療に抵抗性を示した。一方、TGFβ、IL-12p40の遺伝子型分布は患者、健常人間で有意差を認めず病態との関連も認めなかった。以上よりCTLA-4、IFN-γの遺伝子多型がPBCの発症に単独かつ相乗的に関連し、病態や治療効果とも関連することが明らかとなった。AIHでも同様の傾向が見られたが、サンプル数が少なく統計学的有意差を得るには至らなかった。本研究では、自己免疫性肝疾患(AIH、PBC)の発症および疾患活動性を規定するHLA以外の遺伝的背景因子を明らかにすることを目的に、各疾患症例のDNAを用い種々のサイトカイン、免疫応答関連分子の遺伝子多型を分析した。
未刊行資料の解読によるフレーベル保姆養成の思想・制度・カリキュラムとその評価研究

本研究はフレーベルの晩年の教育活動である「保姆養成」の思想・制度・カリキュラムを具体的に現地での調査により明らかにすることと同時に、フレーベル幼稚園の実践家である保育士や学園の関係者の実践報告書を分析して,フレーベル主義幼稚園の実態を解明した。とくに、フレーベル主義幼稚園の実践家のフレーベルに対する具体的で、かつ<生>の「評価」(声)をわが国では初めて考察した。研究計画ならびに方法により、本年度はフレーベルが設置した以下の<保姆養成施設>の諸資料をフレーベル博物館所蔵のBIM資料を調査・収集した。1.バート・ブランケンブルク近郊の施設として:1839年の<児童指導者のための養成施設>。2.1840年の<児童指導者コース>。3.1834-45年の<カイルハウ保姆養成>。4.1848年の<ルドールシュタット養成施設。5.1849年の<リーベンシュタイン養成施設。あわせて、フレーベルの保姆養成に関わるW.ミッテンドルフの資料調査を行った。1848年の<ドレスデン保姆養成施設>,1949-50年の<ハンブルク幼稚園教員養成コース>については文献を通じて概要を解読した。フレーベル博物館長のロックシュタイン女史の全面的協力をいただき、ほぼ、予定している資料の収集ができた。(翻訳書:『フレーベル賛歌ー子どもと人間の友あての女性たちの書簡ー幼稚園創設150周年記念出パ版、フレーベル館,1991年。)全体的に、フレーベルに対する尊敬の念に満ちた記述が中心であるが、フレーベルの「遊戯』に対する教育方法が優れている事。遠足等における自然観察の手法に対する高い評価をしている。1.ドイツ・バートブランケンブルクのフレーベル博物館の諸資料の収集と解読を行った。2.ベルリン「陶冶史研究図書館」(BBF)のBN遺稿の「記録」「書簡」を収集・分析を行った。3.ベルリン国立図書館」所有の通称KN資料(カイルハウ資料)の調査を行った。本「未刊行資料の解読によるフレーベル保姆養成の思想・制度・カリキュラムとその評価研究」の課題は、1)フレーベルの晩年の教育活動である「保姆養成」の思想・制度・カリキュラムを具体的に現地での調査により明らかにすることと,2)残されている書簡等によるフレーベル主義幼稚園の実践家(保姆・関係者)の実践報告書を手がかりに分析し解明しフレベル主義教育実態を実践家の観点から評価することである。1)の「保姆養成」の思想・制度・カリキュラムに関しては,現地調査から(1)バート・ブランケンブルク近郊の施設として1.<児童指導者コース>(1839),2.幼稚園の設立及び実施のための計画案に基づく<児童指導者コース>(1840)3.カイルハウ保姆養成(1844-45),4.ルドールシュタット養成施設、5.リ-ベンシュタイン養成施設(2)ドレースデン保姆コース(1848-45),(3)ハンブルク民衆幼稚園(1854)を確認した。特に,ドレースデン保姆コースは現在も存続し,フレーベルデイプロマを発行し,フレーベル主義保育者養成機関として全ドイツを牽引している。2)のフレーベル主義幼稚園の実践家による「評価』研究として,フレーベルの教え子による養成施設に対する評価をH.ケーニヒ編著『私の愛するフレーベル』(1990)に集録されている1840年から52年にかけて関係した50人の保母を抽出して調査した。本著は旧東ドイツ国営出版社から"Mein lieber Herr Froebel"の書名で刊行されたもので、わが国では『フレーベル賛歌』の書名で旧東ドイツ崩壊の直前の1991年に翻訳刊行され,論者自身も翻訳に関った。重要なことは、フレーベルの教育活動の実態を関係する実践家自身による「評価」を論究・解明したしたことである。この種の評価研究は初めての手法である。平成28年度はフレーベルの保姆養成施設ならびにその実践の「評価」を重点的におこなう。そのため、ドイツ就学前教育の指導的研究者、K.ノイマンドイツフレーベル学会長と共に諸図書館や施設を訪問し調査を実施する。なお、フレーベル幼稚園における<庭>の思想の展開として、現在、ヨーロッパで最も注目されているイタリア/レッジョ・エミリア市の幼児教育の実践を視察し、フレーベルの保姆養成の全体的な「評価」をしたく考えている。最終年度においては、今日もなお継続的にフレーベル式「保姆養成」を行っている次の3養成施設を訪問し、フレーベルの保姆養成に関わる全体の「評価」を行う。1.ルドールシュタット養成施設(コース)2.ドレスデン養成施設(コース)3.ハンブルグ養成施設(コース)研究成果の発表:2018年第4回国際フレーベル会議(広島で開催)にて公表予定。教育哲学,教育思想。フレーベル研究。第2回文化学園大学教育研究会の開催期日が年度末で、次年度で使用することとなった。
退職者のアクティヴィティ測定尺度と地域活動参加促進のためのプログラム開発

本研究は、研究代表者がこれまで取り組んできた退職研究の一環をなすものである。今回は、退職者の健康と社会活動を総合的に捉えたアクティヴィティに関する測定尺度を開発し、介入研究を行い支援技術のモデル化を目指したものである。初年度となる今年度は滋賀県を調査地として選定し、尺度開発のための「質的調査(面接)」と「アンケートによる量的調査(質問紙調査)」の両者を実施した。前者は滋賀県内の退職者シニアボランティアグループを訪れ、退職者への面接調査と同時に、関係者への各種データの収集をおこなった。退職者の「社会活動」に関するインタビューデータを現在分析中である。分析手法にはライフ・ストーリーアプローチを用い、退職の類型別に退職前後の生活構造の変化を明らかにするよう試みている。引き続き、データの解釈を深化させ、退職制度が流動化、希薄化する現代における退職者の健康と社会活動の関連について明らかにする予定である。後者は、「勤務者の健康と社会活動に関するアンケート」と「退職者の健康と社会活動に関するアンケート」の2種類の調査票を作成し、A県内の企業に配布した。対象ケース数は、約6,000となり、当初計画よりもかなり大規模なものになった。対象自治体および多くの企業の協力が得られたことが反映している。「2007年問題」として団塊の世代の退職が社会的関心事となっていることから、退職者への支援は、関係の自治体で政策的課題として捉えられ始めており、次年度は研究結果を還元しつつ、介入研究への準備に取りかかる予定である。調査内容は健康状態、社会活動の活動性、退職準備、自己意識等を尋ねる質問項目、約250問からなっている。調査票のデータは現在集計中であるため、分析は次年度にかけておこなう予定であるが、質的調査と総合して、退職者のアクティビティ測定尺度を開発できるものと考える。また、次年度の準備として退職者の社会活動参加を促進するプログラムに関して、9月に1週間にわたる英国におけるボランティア団体等を訪れ、関係者への調査、資料収集を行った。これらについても現在分析中であるが、英国のボランティア活動がすでに定着していることから日本におけるプログラムにも有効な資料となりうると推測される。3年間の研究期間の中間年にあたる19年度は、18年度に実施した「質的調査(面接)」と「アンケートによる量的調査(質問紙調査)」の両者の分析を深め、アクティヴィティ尺度開発の準備、退職者への支援方法の開発のための介入の実施に取り組んだ。とくに、「勤務者の健康と社会活動に関するアンケート」と「退職者の健康と社会活動に関するアンケート」の2種類の調査分析に関しては複数の商工会議所、大手企業の管理者らと継続的に検討し、中間報告書を作成した。現在、「2007年問題」として団塊の世代の退職が社会的関心事となっていることから、退職者への支援は、企業においても重要な課題として認識されており、次年度は研究結果を還元しつつ、対策について検討する。20年度も引き続き調査の分析に取り組み、アクティヴィティに関する測定尺度を作成する。介入方法の開発については、19年度から退職者講座を開催しており、20年度も継続して実施しながら、その効果について検証する予定である。20年度は、研究のまとめの年度にあたるため、これまでの質的・量的調査の分析、イギリスにおける退職者への社会活動の支援方法の検討の一連の調査活動を総括し、アクティヴィティ尺度開発を行う予定である。さらに、退職者の地域活動への参加促進のための支援の効果の検証および地域保健活動における退職者への介入方法のプロトコール作成に取り組み、地域保健活動における退職者支援のあり方について提案する予定である。3年間の研究期間の最終年にあたる20年度は、これまで取り組んできた質的および量的調査の分析を深め、定年退職者の類型化および定年退職者に関するアクティヴィティ尺度開発を行った。また、定年退職者への介入方法の開発については、19年度から男性定年退職者講座を開催しており、20年度はその効果について検証した。さらに、定年退職者の地域活動への参加促進のための支援の効果の検証および地域保健活動における定年退職者への介入方法のプロトコール作成に取り組み、地域保健活動における定年退職者支援のあり方について提案する予定である。これらの調査および介入研究に関連して、イギリスにおける定年退職者支援プログラムに関する調査を行った。この調査のまとめと平行して日本における定年退職者ボランティアの教育方法についての調査を行った。検討の結果、日本の定年退職者への支援方法には大きく3つのタイプがあることがわかった。引き続き、高齢者保健福祉施策担当者らとともに、定年退職者への社会活動の支援方法について検討する予定である。これら一連のまとめをもとに20年度は、これまでの質的・量的調査の一連の調査活動を総括し、老年社会学における定年退職者研究の新たな知見を見いだすことに力を注いだ。今後は、これらの成果をまとめ、公表するための準備を進めている。高齢化のさらなる進展とともに、「2007年問題」といった団塊の世代の退職が社会的関心事となったことから、地域保健活動においても退職者の健康づくりのための支援体制は喫緊の課題といえよう。
ウイルス性心筋炎に対するインターフェロンの効果に関する実験的研究

近年、遺伝子組換え技術の進歩により、インターフェロン(IFN)の大量生産が可能となり臨床応用の道が開かれた。IFNは宿主特異性があり、天然型のヒト白血球IFNαはマウスには効果を示さないが、リコンビナントIFNαA αDのハイブリッドであるαA/Dはヒトおよびマウス両方の細胞に対し効果があることが知られている。我々は、最近、encephalomyacarditis(EMC)ウイルス性心筋炎実験モデルにおいて、リコンビナントIFNが心筋炎の発症予防に有効であることを報告した。本研究では、ヒトにおけるウイルス性心筋炎の最も頻度の高い病因と考えられているコクサッキーウイルスに対するIFNの効果を実験モデルを用いて検討した。[方法]3週令C3H/HeマウスにコクサッキーB3ウイルス、【10^(5.5)】【TCD_(50)】を腹腔内に接種し心筋炎を作製した。IFNαA/D、【10^4】u/g/日を1日1回、ウイルス接種1日前またはウイルス接種同日から皮下に投与し、ウイルス接種の7日後に屠殺した。対照群には生理食塩水を同様に投与した(各群n=10)。[結果]IFN非処置群では2匹が死亡したが、IFN投与群では死亡したものはなかった。心臓のウイルス量はIFN非投与対照群で4.4±0.9【log_(10)】【TCD_(50)】/mg、前日に投与を開始した群(第【I】群)で0.7±0.1【log_(10)】【TCD_(50)】/mg、ウイルス接種と同日に投与を開始した群(第【II】群)で2.5±1.2【log_(10)】【TCD_(50)】/mgとIFN投与群でウイルス増殖は著明に抑制された(P<0.005)。病理組織学的検討(4段階分類)では、細胞浸潤はIFN非投与群3.6±0.7、第【I】群0.1±0.3、第【II】群0.9±0.6であり、心筋細胞の壊死は、対照群3.8±0.6、第【I】群0.1±0.3、第【II】群1.1±0.7で、細胞浸潤、壊死いずれもIFN投与群で著明に軽減した(P<0.005)。[結論]マウスにおけるコクサッキーウイルス性心筋炎実験モデルにおいて、IFNαA/Dはウイルス接種前または同日投与により、心筋内でのウイルス増殖を抑制し心筋病変を軽減した。
若年性排泄低下型高尿酸血症の病態解明

高尿酸血症患者の大半が尿酸排泄低下型の病態を呈する。これまでの知見では、ABCG2遺伝子のSNPが高尿酸血症発症に重要であるとされてきたが、ABCG2は主に消化管経由の尿酸排泄に働いており、腎臓での尿酸排泄低下はこの分子の機能低下では説明できない。本研究では、ABCG2と並んで血清尿酸値や痛風発症に関連が深いとされているSLC2A9遺伝子の機能または発現の亢進が高尿酸血症の原因になっているのではないかという仮説を検証する目的で、家族性高尿酸血症の家系から、同意を得た後全遺伝子解析を行った。高尿酸血症と慢性腎機能障害の20代男性患者とその父、母である。検出されたSLC2A9のアミノ酸置換を伴う変異をアフリカツメガエル卵母細胞に発現させて機能解析を行ったが、尿酸への親和性、最高輸送速度とも野生型に比べ変化がなかった。一方、プロモーター部位で、ともに血清尿酸値の高い父と患者にみられ、母にはみられない変異に着目して解析したところ、200kb中に8箇所の変異がみられた。これらの変異をもったプロモーター領域の活性をルシフェラーゼアッセイで調べたところ、2つの変異につきプロモーター活性が上昇していることが確認された。これは、腎排泄低下型高尿酸血症を呈する患者で、腎臓近位尿細管基底側で尿酸の再吸収にかかわるSLC2A9の発現が亢進している可能性を示唆するものである。今後これらの変異がプロモーター領域に存在したとき、SLC2A9の発現が亢進するかを細胞モデルで確認し、SLC2A9の発現調節のメカニズムについても研究していく予定である。排泄低下型の家族性高尿酸血症が再吸収トランスポーターの機能または発現の亢進で説明できるのではないかとの仮説の検証が目的で、候補となるトランスポーターSLC2A9のアミノ酸変異を伴う変異では機能変化を検出できなかった。一方プロモーター領域の解析によりSLC2A9の発現量を亢進させる変異の候補が2つ見つかっており、この変異についてさらに詳細に解析する。当初バックアッププランとして提案したSLC17Aファミリーについては解析を行わず、GWASにより尿酸値への影響の最も大きい遺伝子領域の一つであるSLC2A9の発現に集中することにした。SLC2A9のプロモーター領域で発見された、転写活性を亢進させる変異について解析を進める。どのようなエンハンサーが変異により影響を受けるのか、また、SLC2A9を発現している細胞株BeWoを用いて、当該変異を導入し、SLC2A9の発現量に変化があるかを調べる。近年、ゲノムワイド関連解析により、高尿酸血症や痛風に関連する遺伝子が同定された。中でもABCG2とSLC2A9の2つの尿酸トランスポーター遺伝子領域の一塩基多型(SNP)と尿酸値との関連が強いことが報告されている。ABCG2の主な機能部位は腸管であり、その機能低下は、腎排泄低下型でなく、腎負荷型の高尿酸血症となる。一方SLC2A9は尿酸再吸収トランスポーターであるが、尿酸の腎排泄低下を説明できる変異は同定されておらず、臨床上大多数を占める排泄低下型高尿酸血症の原因は未だ解明されていない。そこで、家族性尿酸排泄低下型高尿酸血症を呈する患者とその家族で遺伝子解析を行い、その病態解明を目指した。家族性高尿酸血症の家系で、同意を得た後全遺伝子解析を行った。患者の父と父方の祖父に高尿酸血症と痛風があり、患者の母の尿酸値は正常であった。血清尿酸値と関連するアミノ酸置換をともなう既知のSNPで、母にはなく父と患者にあるものを調べたら、ABCG2のQ141K変異とSLC16A9のK258T変異が同定された。いずれも腎負荷型の高尿酸血症と関連する変異であり、この患者の尿酸排泄低下は説明し難い。そこで、SLC2A9のアミノ酸置換を伴うSNPについて解析したところ、患者と母でP350Lが、患者と父(ホモ)と母(ヘテロ)でG25Rが見つかった。これらの変異mRNAをアフリカツメガエル卵母細胞に発現させて、野生型のSLC2A9と尿酸輸送機能の解析を行ったが、親和性、最高輸送速度とも変化が見られなかった。現在尿酸排泄トランスポーター遺伝子変異をさらに詳細に解析中である。当初の研究計画通り、家族性尿酸排泄低下型高尿酸血症の家系の遺伝子解析、それにより同定された、SLC2A9変異体の発現及び機能解析を行った。予想通りアミノ酸置換を伴う変異では、SLC2A9の発現や機能に影響を及ぼすことはないようである。実績に報告した1家系の他にも解析を行ったが、うまく遺伝子配列が読めず、サンプルのとりなおしを計画している。

本研究では、ABCG2と並んで血清尿酸値や痛風発症に関連が深いとされているSLC2A9遺伝子の機能または発現の亢進が高尿酸血症の原因になっているのではないかという仮説を検証する目的で、家族性高尿酸血症の家系から、同意を得た後全遺伝子解析を行った。高尿酸血症と慢性腎機能障害の20代男性患者とその父、母である。検出されたSLC2A9のアミノ酸置換を伴う変異をアフリカツメガエル卵母細胞に発現させて機能解析を行ったが、尿酸への親和性、最高輸送速度とも野生型に比べ変化がなかった。一方、プロモーター部位で、ともに血清尿酸値の高い父と患者にみられ、母にはみられない変異に着目して解析したところ、200kb中に8箇所の変異がみられた。これらの変異をもったプロモーター領域の活性をルシフェラーゼアッセイで調べたところ、2つの変異につきプロモーター活性が上昇していることが確認された。これは、腎排泄低下型高尿酸血症を呈する患者で、腎臓近位尿細管基底側で尿酸の再吸収にかかわるSLC2A9の発現が亢進している可能性を示唆するものである。今後これらの変異がプロモーター領域に存在したとき、SLC2A9の発現が亢進するかを細胞モデルで確認し、SLC2A9の発現調節のメカニズムについても研究していく予定である。排泄低下型の家族性高尿酸血症が再吸収トランスポーターの機能または発現の亢進で説明できるのではないかとの仮説の検証が目的で、候補となるトランスポーターSLC2A9のアミノ酸変異を伴う変異では機能変化を検出できなかった。一方プロモーター領域の解析によりSLC2A9の発現量を亢進させる変異の候補が2つ見つかっており、この変異についてさらに詳細に解析する。当初バックアッププランとして提案したSLC17Aファミリーについては解析を行わず、GWASにより尿酸値への影響の最も大きい遺伝子領域の一つであるSLC2A9の発現に集中することにした。家系を増やして遺伝子解析を行い、SLC2A9、ついでSLC17A1,SLC17A3に着目して解析を進める。またSLC2A9のコード領域以外の変異について、その発現や機能に与える影響を細胞株を使って検討する。これらはすべて当初の計画どおりであり、現時点で研究計画に変更はない。SLC2A9のプロモーター領域で発見された、転写活性を亢進させる変異について解析を進める。どのようなエンハンサーが変異により影響を受けるのか、また、SLC2A9を発現している細胞株BeWoを用いて、当該変異を導入し、SLC2A9の発現量に変化があるかを調べる。患者家系の遺伝子解析を外注したが、そのうち一部のサンプルで解析がうまくいかず、その解析結果により、遺伝子解析を行うサンプルを決めることにしていたので、あと数例の遺伝子解析にあてる予定の予算が残ってしまった。本年度には失敗した例を再解析し、その結果により追加するサンプルを決めて遺伝子解析を行う予定である。他の予算に関しては当初の申請どおり使用する予定である。予想したより遺伝子解析のできる検体が得られなかったため、遺伝子解析費用が少なくなった。今年度は変異をノックインした細胞を作製するなどの費用が必要となり、そちらに当てる予定である。