hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
頭蓋冠縫合部早期癒合症におけるmicroRNAの発現および機能解析

アペール症候群(As)の発生機序に関与するmicroRNAを同定することを目的とした。ASモデルマウス(Ap)及び同腹コントロールマウス(Ct)頭蓋冠より冠状縫合部を摘出し、miRNAを抽出後、miRNAアレイにてmiRNAの解析を行った。また縫合部における発現量をリアルタイムPCR法にて検索した。Apにおいて19種類のmiRNA発現が有意に亢進し、5種類のmiRNA発現が抑制されていた。リアルタイムPCRにより、Ctと比較して、Ap(n=3)においてmmu-miR-182-5p、mmu-miR-206-3pの有為に高い発現が確認され、mmu-miR-133a-3pの発現が高い傾向にあった。真核生物に広く保存されているmicroRNA(miRNA)はゲノム上に多数存在し、タンパク質をコードしない小分子RNAである。miRNAが個体発生、形態形成、細胞死、細胞増殖等様々な生命現象を制御していることが明らかとなることで、新たな遺伝子発現調節ネットワークの存在が注目され、miRNAの機能異常と疾患との関わりも報告されている。先天性骨系統疾患の一つである頭蓋冠縫合部早期癒合症は、近年その原因遺伝子が報告されているが、明らかとされている遺伝子は極一部に過ぎない。頭蓋冠縫合部の発生には様々の遺伝子発現が時間的・空間的に制御されているが、その発現調節機構の詳細は不明である。本研究は、頭蓋冠縫合部の発生、およびその関連疾患の発症機序に関与するmiRNAを同定し、その機能解析を行うことを目的とする。頭蓋冠縫合部早期癒合症(craniosynostosis)は、胎生期あるいは出生後早期に頭蓋骨間の線維性結合組織が骨性癒合する先天性骨系統疾患の一つであるこれら顎顔面領域の骨格に形態異常を呈する先天性疾患は、顎骨の形態異常に起因する重篤な不正咬合を併発するため、外科的矯正治療の対象となる場合も多く、非侵襲的かつ病態成立機構に根ざした有効的な治療法の確立が国内外で強く期待されている。miRNAという新しい遺伝子発現調節機構が内軟骨性骨化において重要な役割を果たすことが個体レベルで証明されている。研究代表者らのこれまでの研究成果をさらに発展させるため、miRNAの分子機構と膜性骨化および頭蓋骨縫合部発生・成長、疾患との関わりを明らかにすることは、顎顔面領域に形態異常を呈する先天性骨代謝疾患に対し、新たな創薬ターゲットを探索し、新規治療法の開発基盤となることが期待される。【背景と目的】アペール症候群(AS)は、頭蓋冠冠状縫合部の早期癒合と中顔面部の劣成長を伴う重篤な不正咬合、四肢の合指症を主徴とする先天性疾患である。原因遺伝子として、線維芽細胞増殖因子受容体(FGFR)2における点突然変異(S252WまたはP253R)が報告されており、FGFシグナル異常に起因した機能獲得型変異が原因であるといわれているが、詳細な病態成立機序は不明である。近年、microRNA(miRNA)という新しい遺伝子発現調節機構が骨の発生および代謝において重要な役割を果たすことが報告されている。本研究はAS頭蓋冠縫合部早期癒合症の発生機序に関与するmicroRNAを同定することを目的とした。【試料と方法】ASモデルマウス(Ap)及び同腹コントロールマウス(Ct)(胎生15.5日齢)頭蓋冠より冠状縫合部を摘出し、当該部位におけるmiRNAを抽出後、miRNAアレイ(3D-Gene mouse miRNA、東レ)にて疾患特異的変動miRNAの抽出を行った。両群間で有意な発現の差が認められたmiRNAについては、縫合部における発現量をリアルタイムPCR法にて検索した。【結果】Ctと比較してApにおいて19種類のmiRNA発現が有意に亢進し、5種類のmiRNA発現が抑制されていた。【考察】本研究により500種類以上のmiRNAが発生中の頭蓋冠縫合部に発現することが明らかとなり、何らかの役割を果たす可能性が示唆された。Ap特異的に高発現するmiRNAとしてmmu-miR-205-5p mmu-miR-182-5p、mmu-miR-206-3pを同定した。頭蓋冠縫合部早期癒合症は、胎生期あるいは出生後早期に頭蓋骨縫合部が骨性癒合する先天性骨系統疾患の一つである。アペール症候群(As)は、頭蓋冠冠状縫合部の早期癒合と中顔面部の劣成長を伴う重篤な不正咬合、四肢の合指症を主徴とする先天性疾患である。原因遺伝子として、線維芽細胞増殖因子受容体(FGFR)2における点突然変異(S252WまたはP253R)が報告されてiる。本研究はAs頭蓋冠縫合部早期癒合症の発生機序に関与するmicroRNAを同定することを目的とした。【試料および方法】当分野で飼育するASモデルマウス(Ap)及び同腹コントロールマウス(Ct)(胎生15.5日齢)頭蓋冠より冠状縫合部を摘出し、当該部位におけるmiRNAを抽出後、miRNAアレイ(3D-Gene mouse miRNA、東レ)にて疾患特異的変動miRNAの抽出を行った。

両群間で有意な発現の差が認められたmiRNAについては、縫合部における発現量をリアルタイムPCR法にて検索した。【結果および考察】1265種類のmiRNAについて発現を検索したところ、ApおよびCtの冠状縫合部において511種類のmiRNA発現が確認された。Ctと比較してApにおいて19種類のmiRNA発現が有意に亢進し、5種類のmiRNA発現が抑制されていた。リアルタイムPCRにより、Ctと比較して、Ap(n=3)においてmmu-miR-182-5p、mmu-miR-206-3pの有為に高い発現が確認され、mmu-miR-133a-3pの発現が高い傾向にあった。頭蓋冠縫合部の発生過程におけるmiRNAの発現およびその機能は全く不明であったが、本研究により500種類以上のmiRNAが発生中の頭蓋冠縫合部に発現することが明らかとなり、何らかの役割を果たす可能性が示唆された。アペール症候群(As)の発生機序に関与するmicroRNAを同定することを目的とした。ASモデルマウス(Ap)及び同腹コントロールマウス(Ct)頭蓋冠より冠状縫合部を摘出し、miRNAを抽出後、miRNAアレイにてmiRNAの解析を行った。また縫合部における発現量をリアルタイムPCR法にて検索した。Apにおいて19種類のmiRNA発現が有意に亢進し、5種類のmiRNA発現が抑制されていた。リアルタイムPCRの条件設定が困難であったため。歯科矯正学頭蓋冠縫合部の発生過程におけるmiRNAの発現およびその機能は全く不明であったが、本研究により500種類以上のmiRNAが発生中の頭蓋冠縫合部に発現することが明らかとなり、何らかの役割を果たす可能性が示唆された。Ap特異的に高発現するmiRNAとしてmmu-miR-205-5p mmu-miR-182-5p、mmu-miR-206-3pを同定した。今後、当該miRNAの標的遺伝子を検索し、新たな縫合部発生制御機構を検索することが課題と考えられる。顎顔面矯正学分野で飼育するASモデルマウス(Ap)及び同腹コントロールマウス(Ct)(胎生15.5日齢)頭蓋冠より冠状縫合部を摘出し、当該部位におけるmiRNAを抽出後、miRNAアレイ(3D-Gene mouse miRNA、東レ)にて疾患特異的変動miRNAの抽出を行った。【結果】1265種類のmiRNAについて発現を検索したところ、ApおよびCtの冠状縫合部において511種類のmiRNAの発現が確認された。【考察】頭蓋冠縫合部の発生過程におけるmiRNAの発現およびその機能は全く不明であったが、本研究により500種類以上のmiRNAが発生中の頭蓋冠縫合部に発現することが明らかとなり、何らかの役割を果たす可能性が示唆された。
翻訳制御による人工遺伝子回路の構築およびRNPの改変と探索

本研究は、翻訳制御による抑制振動子の構築、RNPモチーフの改変と得られた人工RNPモチーフによる翻訳制御システムの構築、新規RNPモチーフの探索という3つの研究テーマについて研究を行い、RNPの性質について解析を行うことを目的とした。そのうち最も研究を進めたのが2番目の研究テーマであり、その成果を論文として海外雑誌に公表することができた。その成果を述べる。kink-turn(K-turn)への結合力が弱いL7Ae変異体(L7KKとする)に対してSELEX法を行い取得したアプタマーについて、その結合力をまずEMSAで測定した。SELEX法では42クローンから38配列のアプタマーが得られており、そのうち29配列でA/G-AUGAという共通配列が見つかったが、その配列以外の部分は多種多様であったので、38配列全てについてL7KKとEMSAを行い、強く結合するアプタマー9種(D12、G2、G6、G10、H1、H2、H5、H8、H10とする)を特定した。その9種のアプタマーについてSPR法(表面プラズモン共鳴法)を行い、解析ソフトで解離定数を計算したところ、9種とも1nM前後という低い値であることが確認できた。L7KKは、K-turnの一つであるBoxC/Dと約130nMの解離定数で結合することがSPR法で確認できたことから、SELEX法によって目的通り、L7KKにより強く結合するRNAを選択できたことが示された。最終的にアプタマーの最小配列としてH5のK-turnを組み込んだ23塩基のRNA(H23)を作製し、SPR法でL7KKとの結合を測定したところ、約1nMの解離定数で結合することが確認できた。最後にL7KKとH23を使用してHeLa細胞内で機能する翻訳制御スイッチを作製し、期待通りに機能することを確認した。これらを通して遺伝子発現制御方法の種類を増やすことに貢献できた。その成果を述べる。
臨床疫学的手法を用いた診療ガイドライン遵守割合と治療アウトカムの定量的評価

本研究では、日本における診療ガイドラインの遵守割合を明らかにし、その遵守割合と治療アウトカムとの関連を明らかにする。本研究は透析医療を研究対象とし、以下の3点を明らかにする。1.診療ガイドラインの遵守割合2.診療ガイドラインの遵守割合の違いと治療アウトカムの関連3.診療ガイドラインの遵守割合に影響する医療機関の特徴これら3点の研究を統合することによって、診療ガイドラインを遵守することの効果を定量的に把握することができ、診療のバラツキを適正にコントロールするうえで有益な成果が期待される。
生体機能分子の複合化を基盤とする光増感中分子の腫瘍への集積制御

光音響腫瘍造影剤として有効であると考えられるナフタロシアニン、フタロシアニン類を合成した。中心金属元素として、軸配位子を持つアルミニウム、ガリウム、インジウム、ケイ素を選択した。ガリウムフタロシアニンは軸配位子として水酸基とクロロ基が混在し、正確な物性調査に不向きであった。インジウムフタロシアニンは軸配位子としてハロゲン元素以外を導入しにくいことがわかった。アルミニウムフタロシアニンを水中で分散させ、紫外ー可視吸収スペクトルを測定したところ、H会合体とJ会合体に相当する吸収帯が観測された。シリコンフタロシアニンではJ会合体に由来するシグナルが主に観測された。これらのサンプルに近赤外パルスレーザー光を照射し、発生する光音響信号の強度を測定したところ、アルミニウムフタロシアニンの方が強い信号を発することがわかった。このことは、H会合様式で集合体を形成するアルミニウムフタロシアニンの方が光音響造影剤として適していることを示す。なお、アルミニウムフタロシアニンの軸配位子にポリエチレングリコールを結合させたところ、水に溶解し、またH会合体形成も確認された。ポリエチレングリコールの長さや末端への腫瘍ターゲティング分子の結合など、腫瘍集積性を高める工夫を行い、造影剤としての利用を目指すことが2019年度の課題となる。上記の手法を応用し、より長波長領域で光吸収が可能なアルミニウムナフタロシアニンの合成を行った。フタロシアニンと同様に光音響信号を発することを確認している。2019年度はフタロシアニンと比較し、より有効な造影剤として機能するかどうかを確認することが課題といえる。なお、これら成果は2019年3月に開催された日本化学会春季年会において発表した。2018年度の実施計画で挙げたアルミニウムフタロシアニン、ナフタロシアニンの合成と光音響信号強度の測定、評価を行い、その有用性を明らかにした。この点は本課題が順調に進捗していることを示す。また、水溶性官能基の導入も初期の結果であるが、問題なく行えることを示せており、順調な進捗といえる。ただ、腫瘍ターゲティング分子の導入を目標としていたが、この点は行えておらず、2019年度に行うこととしており、やや遅れているといえる。しかし、シリコンフタロシアニンやガリウム、インジウムフタロシアニンとの比較において、光音響信号強度の由来に関わる重要な知見を得たことは、本課題のみならず他の研究の推進に影響を与える成果といえ、計画以上の成果といえる。これらを鑑み、本課題は順調に進行しているものと考えた。本課題は順調に進行しており、当初予定通り、研究を推進することで、目標とする光音響腫瘍造影剤の開発につながると考えている。具体的には、アルミニウムフタロシアニン、ナフタロシアニンの軸配位子に、水溶性官能基の導入(初期実験結果から問題ないことは確認済み)、続き、腫瘍ターゲティング分子(環状RGDペプチドを想定、固相合成によりすでに合成済み)を導入する。得られる光音響腫瘍造影剤の細胞表面の表面インテグリン(環状RGDペプチドと特異的に結合するサイト)認識能を評価する。担がんマウスに投与し、腫瘍集積性を明らかにする。これらとは別にアルミニウムフタロシアニンとナフタロシアニン、水溶性官能基の間に腫瘍で過剰発現する酵素により切断されるペプチド鎖を導入し、腫瘍の識別能を付与する工夫も試みる予定である。これらを通し、強い光音響信号を発し、高い腫瘍集積性を示す光音響腫瘍造影剤を開発する。

また、水溶性官能基の導入も初期の結果であるが、問題なく行えることを示せており、順調な進捗といえる。ただ、腫瘍ターゲティング分子の導入を目標としていたが、この点は行えておらず、2019年度に行うこととしており、やや遅れているといえる。しかし、シリコンフタロシアニンやガリウム、インジウムフタロシアニンとの比較において、光音響信号強度の由来に関わる重要な知見を得たことは、本課題のみならず他の研究の推進に影響を与える成果といえ、計画以上の成果といえる。これらを鑑み、本課題は順調に進行しているものと考えた。本課題は順調に進行しており、当初予定通り、研究を推進することで、目標とする光音響腫瘍造影剤の開発につながると考えている。具体的には、アルミニウムフタロシアニン、ナフタロシアニンの軸配位子に、水溶性官能基の導入(初期実験結果から問題ないことは確認済み)、続き、腫瘍ターゲティング分子(環状RGDペプチドを想定、固相合成によりすでに合成済み)を導入する。得られる光音響腫瘍造影剤の細胞表面の表面インテグリン(環状RGDペプチドと特異的に結合するサイト)認識能を評価する。担がんマウスに投与し、腫瘍集積性を明らかにする。これらとは別にアルミニウムフタロシアニンとナフタロシアニン、水溶性官能基の間に腫瘍で過剰発現する酵素により切断されるペプチド鎖を導入し、腫瘍の識別能を付与する工夫も試みる予定である。これらを通し、強い光音響信号を発し、高い腫瘍集積性を示す光音響腫瘍造影剤を開発する。
幼児の嘘-「心の理論」の指標としての発達的意味とその発現の規定要因の検討-

幼児に対して、ヒーローを救うために悪者にウソをつけるかという欺き課題と「心の理論」の獲得を見る標準的な誤信念課題を実施し、あわせて行った母親のアンケート調査の結果を含めて、子どものウソの出現時期の確認とウソを可能にする認知的・人格的要因を検討し、子どもの心的世界の形成にとっての子どものウソの持つ意味を考察した。研究は、1)幼稚園児の個別実験と2)母親に子どものウソに気づいているかを問うアンケート調査からなった。その結果、個別実験からも親の調査からも、効果を意図したウソの年齢下限は、満4歳頃であることが確認された。しかし、非第一子的性格であると見られたパーソナリティの「のびやかさ」尺度得点が実験場面でのウソの出現を早めるという仮説は検証されず、むしろ「慎重さ」尺度と逆転させて名付け、この尺度得点が正の影響力を持つとして仮説とは逆に解した方が適合する結果が示された。この尺度が認知的能力の代替変数になった可能性がある。また、前研究に比べ、ウソが可能になる年齢や「心の理論」獲得の年齢がやや遅かったことについては、対象児の保育経験(幼稚園児か保育所児か)の違いが自他の分化に影響している可能性が示唆された。この点については、今後、年長児のデータも加えて分析し、検討したい。「子どものうそは比較的見過ごされているテーマである。」と矢野は指摘した(1992)。子どもの嘘を本格的に取り上げたピアジェの研究もあくまで道徳的意識の発達の道筋についての研究であった。他人に嘘をつく行為の出現は、内的世界にとって重要なメルクマールである。近年、研究が盛んに行われている「心の理論」の獲得の指標として、子どもの嘘の出現を、実験的にだけでなく、自然場面の観察など生態学的な方法も加味して研究することで、「心の理論」獲得の下限の時期を明らかにすることができる。今年度は、次年度に実施する子どもの個別実験のための準備作業として、(1)欺き課題の作成、(2)幼稚園保護者への嘘・隠し事、空想などの出現について問う質問紙を作成、(3)嘘の検出ための生理学的指標の検討を行った。その結果、(1)の欺き課題については、幼児にとってファミリアな課題を作成し、予備的研究によって教示等を検討した。(2)については、35歳児を対象とした保護者質問を作成した。きょうだい関係や母子関係等についても設問に含め、嘘と子どもの自我形成・自立との関係が分析できるようにした。(3)については、実験場面の制約や親の同意を得ることの難しさなどから、指尖容積脈波を使用することとし、了解の得られる保護者の子どもについて、脳波等を加え、個別事例研究として生理学的指標と子どもの嘘の出現についてさらに深めることにした。生体反応測定装置が、幼稚園等の計測条件に恵まれない場所でも測定可能なことを確認した。本年度の学会発表は、科学的関心(ここでは、自然物への興味や関心)について、幼少期の親のかかわりなども含めて大学生で調査したが、子どもの自立や外界への関心と親子関係・同胞関係との関連について示唆が得られ、これをもとに、次年度の保護者質問で、嘘だけでなく自立に関わる質問を幅広く加え、「心の理論」獲得期の発達の諸相を検討できるよう、質問を拡充した。他人に嘘をつく行為の出現は、子どもの内的世界形成において重要なメルクマールである。今年度は、(1)幼稚園児の保護者に協力を依頼し、子どもの嘘の出現状況について質問紙によって尋ねた。また、(2)その保護者の子どものうち、3歳児と4歳児を対象に、瓜生(2007)で使用した、ヒーローを救うために嘘を求める課題を実施し、反応を分析した。

その結果、(1)については、「言い訳などで嘘をつく」という言語行為は、3歳児・4歳児・5歳児ともに、約4割程度の親が気づいたことがあると答えており、3年齢間で大きな違いはみられなかった。しかし、行為面で「親に見つからないように隠し事をする」では、年齢差が顕著で、その出現時期は4歳以降と見られ、従来から「心の理論」課題通過時期が4歳以降とする結果との符合がうかがえた。(2)については、瓜生(2007)において、低年齢児が課題場面での恐怖感等から嘘をつく行為を取りにくかったのではないかという解釈の余地が残されていた点を改良して実施したが、やはり、3歳児では嘘をつく行為の出現率は低く、とくに3歳後半では25%程度であった。以上より、保護者回答によった(1)からも、子どもを対象とした(2)の実験からも、嘘をつく行為の出現はおよそ満4歳以降と見られる。ただし、3歳代の対象児数が少なく、次年度に対象児を増やす追加実験を行って結果をまとめたい。なお、嘘をつく行為に伴う心理状況を把握するため、生理的指標をモニターしたが、指尖容積脈波だけでは不十分なので、次年度は心拍等の指標も加えてさらに検討を加えることにした。本年度の学会発表では、母親調査により、本研究で焦点となる3歳児についてその発達や育児状況について分析し、自他の分離・自我の形成について重要なこの時期の子どもの育ちの今日的課題について検討した。「心の理論」研究において、「アン=サリー課題」などの標準的な誤信念課題を使用した研究では、自他の心的世界の違いに気づき始めるのは4歳頃と言われてきた。瓜生(2007)は、子どもが親しみやすい新たな課題を工夫して与え(アンパンマン課題)、アンパンマンのためにバイキンマンを欺けるかどうかを検討した。その結果、4歳前後ではまだウソをつくこと自体が難しかったことから、「心の理論」獲得の時期が4歳以前に遡ることはできないと結論づけた。本研究では「心の理論」の年齢下限の論争に結論づけることを目的とした。昨年度は、養育者への質問紙調査(有効回答数149)を実施し、3歳後半と4歳前半では、子どもの嘘の出現に差が見られるという結果を得た。また、年小児・年中児の個別実験(上述のアンパンマン課題等による)の結果ともすりあわせて分析したが、年小児の参加児数が少なかったため、今年度、対象児を増やして検討した。その結果、ウソをつくことができた年小児は26.2%、年中児は50%であった。年小児と年中児との間に有意差があるとまでは言えなかった。また、前研究で示唆された出生順位の影響を想定して母親に尋ねた性格評定から、「自己主張の強さ」「のびやかさ」(これらは、予想通り、第一子より非第一子の方がその傾向が強いと評定されていた)の2つの因子が抽出されたので、この2つの性格得点や年齢等を説明変数として、アンパンマン課題の正答についてロジスティック解析を行ったところ、適合度指標等もよい結果が得られた。しかし、「のびやかさ」変数はマイナスの符合であり、むしろ「慎重さ」因子の正の影響と解釈される結果となった。「親への隠し事の経験あり」はプラスの符号であった。以上より、1)年小児、とくにおよそ4歳未満では、ウソの行使が難しいことが再確認された。2)性格要因の影響が仮説と逆になった点は、「慎重さ」が課題構造の理解という点で知的要因に近似した説明要因になったものと見られた。3)アンパンマン課題の正答率が年中児でもまだ高くなかったのは、前回は保育園児が多かったのが今回は幼稚園児のみを対象としたことの影響かもしれない。これらの解釈については、年長児のデータも加えてさらに検討したい。
前周期遷移金属錯体を用いた高選択的有機合成

前周期遷移金属有機金属化合物の高い求核性とα-軌道を介しての基質の配位能を利用した位置および立体選択的有機反応を開発してきたが、本年度は一連のジルコニウム-ジエン錯体とα,β-不飽和ケトン,不飽和エステル,置換オキシラン,二酸化炭素,イソシアネート等二官能性基質との反応を検討した。ジエン錯体の代表例としてZr【Cp_2】(isoprene)(【I!】)を用いた。1.不飽和アルデヒドや不飽和ケトン(アクロレイン,メチルビニルケトン,2-シクロヘキセノン等)は【1!】に高選択的(99%)に1,2-付加し、イソプレンのC1位のみでC-C結合生成反応が起きた。2.不飽和エステルは置換基の有無にかかわらず、【1!】に1,2-付加し(99%選択率)、【R^1】【R^2】C=C【R^3】CO基がイソプレンのC1位で結合したケトンが加水分解により収率よく得られた(C-C結合生成時の選択率,98%)。3.ビニルおよびフェニル置換したオキシランは【1!】と置換基のある側のオキシラン炭素上で選択的(98%以上)に反応し、C-C結合生成はイソプレンC1炭素との間のみで起きた。(E)-および(Z)-1-フェニル-2-メチルオキシランとの反応から立体選択性はかなり小さいと結論した。4.二酸化炭素とジルコニウム-ジエン錯体の反応は、ジエンの配位様式(S-トランス,S-シス)と補助配位子(Cpや【C_5】【Me_5】基)のかさ高さにより異なった反応が進行し、3種類の反応形式(1:1,1:2,2:1)にまとめることができる。それぞれ高選択的に反応は進行する。5.イソシアネートとジエン錯体の反応では補助配位子の大きさはあまり問題とならず、フェニルイソシアネートを用いた時はジエンの両末端にイソシアネートが付加し、t-ブチルイソシアネートを用いた時は1:1付加物のみが生成した。金属を含む中間体のコンフォメーションの安定性により立体化学が決定される。
唾液腺における分泌タンパク質の選別輸送シグナルの同定

タンパク質が細胞外へ分泌される経路には,調節性と構成性の2つの経路が存在するが,その選別機構については不明な点が多い。我々は,リポータータンパク質であるHaloTagと様々な輸送先を持つタンパク質との融合遺伝子を作成し,耳下腺腺房細胞の初代培養細胞における輸送先および輸送効率の解析を行った。その結果,唾液タンパク質の1つであるシスタチンとの融合タンパク質が効率よく分泌顆粒へ輸送され,その輸送効率は,最も多い内在性唾液タンパク質であるアミラーゼと相関することが明らかになった。したがって,分泌顆粒内のタンパク質同士が相互作用することにより,効率良く分調節性分泌経路に輸送されることが予想された。唾液腺における分泌タンパク質の輸送先の選別機構を解明するために,小胞で輸送されるタンパク質とHaloTagタンパク質との融合遺伝子を作成した。HaloTagは,人工的な蛍光リガンドを結合するように設計されたリポータータンパク質であり,膜透過性リガンドを培地に添加することによって,生きた状態で局在の変化を観察することが出来る。これまでの研究で, HaloTagに唾液タンパク質の1つであるアミラーゼのシグナルペプチド配列を付加した遺伝子(ssHalo)をアデノウイルスに組み込み,耳下腺腺房細胞の初代培養細胞に発現させると,融合タンパク質が分泌顆粒へ輸送されることを報告している。しかし,アミラーゼの全長遺伝子は大きく,アデノウイルスに組み込むことができなかったため,シグナル配列のみの効果とアミラーゼ全長タンパク質の効果を比較することが出来なかった。そこで,選別を受けるタンパク質の候補として,唾液中に分泌されるタンパク質であるParotid secretory protein (PSP)やシスタチンDに注目した。これらはアミラーゼよりも分子量が小さく,全長をウイルスベクターに組み込むことが容易であると考えた。また,カテプシンBはタンパク質合成後,一度分泌顆粒に運ばれるが,顆粒の成熟に伴って排除され,リソゾームへ輸送されることが知られている。したがって,唾液タンパク質とは異なる影響がみられると考えた。そこで,PSP,シスタチンD,プロカテプシンBの遺伝子をクローニングし,HaloTagとの融合遺伝子を作成し,アデノウイルスによる発現系を構築した。これらを耳下腺腺房細胞に発現させると,いずれも分泌顆粒マーカーであるアミラーゼの局在と重なった。しかし,共局在の効率は用いた標的タンパク質によって差がみられることから,そのアミノ酸配列中に何らかのシグナルが含まれていることが予想された。唾液腺における分泌タンパク質の選別輸送システムを解析するために,細胞内を小胞で輸送されると予想されるタンパク質と,レポータータンパク質であるHaloTagとの融合遺伝子を作成した。分泌顆粒への輸送には,分泌タンパク質自身の複合体形成能,または複合体形成能を持つ他の分泌タンパク質との相互作用が重要であると考えられている。したがって,耳下腺における分泌顆粒への輸送効率に影響を与える因子の1つとして考えられるのは,主要な唾液タンパク質であるアミラーゼとの相互作用である。我々はこれまでの研究で,アミラーゼのシグナル配列のみとHaloTagの融合タンパク質であるssHaloが,単独での複合体形成もアミラーゼとの相互作用もなく,分泌顆粒へ輸送されることを示した。しかし,一部のタンパク質が非刺激的に分泌されたことから,構成性分泌経路へも輸送されていることが予想された。そこで,耳下腺で発現している他の標的タンパク質の全長配列とHaloTagとの融合遺伝子を作成して耳下腺腺房細胞に発現させ,分泌顆粒への輸送効率を解析した。発現タンパク質は,いずれも分泌顆粒マーカーであるアミラーゼの局在と重なった。βアドレナリン刺激・非刺激時の分泌効率も測定したが,アミラーゼとの共局在率の高いタンパク質は,非刺激時の分泌がアミラーゼ同様に抑制されており,調節性分泌へssHaloより特異的に輸送されたと考えられる。分泌顆粒への輸送効率の高いタンパク質について,分泌顆粒における存在状態を調べたところ,単独では複合体形成能はみられないものの,アミラーゼと相互作用している可能性が示され,高分子複合体の形成が分泌顆粒への輸送に重要な役割を果たしていると考えられる。調節性分泌経路への輸送選別を担うシグナルを同定するという目標に対して,HaloTagとの融合により調節性分泌への輸送が促進される分泌タンパク質としてシスタチンを同定した。アミラーゼのシグナルペプチド配列のみを付加したssHaloと比較すると,HaloTag融合したシスタチンの方がアミラーゼと共局在する率が高いこと,分泌顆粒内のHaloTag融合シスタチンとアミラーゼのシグナル強度には正の相関があることが示された。これまでにアミラーゼは分泌顆粒内で複合体を形成していることを報告している。HaloTag融合シスタチンはアミラーゼと相互作用することによって,高分子複合体に参加しているために,調節性分泌経路へ効率よく輸送されている可能性があると考えた。しかし,ブルーネイティブPAGEを用いて,細胞抽出液中の非変性状態の複合体を解析したところ,アミラーゼ複合体にHaloTag融合タンパク質は含まれていなかった。また,光反応性クロスリンカーを用いて細胞内におけるタンパク質同士のクロスリンクを試みたが,アミラーゼとHaloTag融合タンパク質の架橋産物は検出されなかった。このことは,大部分の分泌顆粒内ではアミラーゼとHaloTag融合タンパク質との複合体は形成されていないことを示唆している。耳下腺の分泌顆粒は,ゴルジ装置で形成されるときには内部pHが酸性に傾いているが,成熟するにつれて中性に近づくと報告されている。

したがって,ゴルジ装置における分泌顆粒形成時にはpHの影響で複合体を形成している可能性がある。タンパク質が細胞外へ分泌される経路には,調節性と構成性の2つの経路が存在するが,その選別機構については不明な点が多い。我々は,リポータータンパク質であるHaloTagと様々な輸送先を持つタンパク質との融合遺伝子を作成し,耳下腺腺房細胞の初代培養細胞における輸送先および輸送効率の解析を行った。その結果,唾液タンパク質の1つであるシスタチンとの融合タンパク質が効率よく分泌顆粒へ輸送され,その輸送効率は,最も多い内在性唾液タンパク質であるアミラーゼと相関することが明らかになった。したがって,分泌顆粒内のタンパク質同士が相互作用することにより,効率良く分調節性分泌経路に輸送されることが予想された。調節性分泌と構成性分泌という2つの輸送経路への選別シグナルを同定するという目標に対して,これまでに調節性分泌への輸送が促進されるタンパク質を同定した。また,選別輸送を促進する因子の1つとして,アミラーゼと相互作用している可能性が見いだされた。以前の研究で,アミラーゼは複合体を形成していることを報告しており,そのアミラーゼと相互作用することによって,高分子複合体に参加していると考えられる。したがって,高分子複合体の形成が,分泌顆粒への輸送に大きな役割を果たしていることが示唆された。一方,構成性分泌への輸送シグナルを見いだすために,構成性分泌に輸送される候補タンパク質であるエリスロポエチンとHaloTagの融合遺伝子(EpoH)を作成し,耳下腺腺房細胞に発現させたが,これもアミラーゼと局在が重なっており,分泌顆粒へ輸送されていることがわかった。我々は分泌顆粒を持たない培養細胞にssHaloを発現させたときの分泌効率を計測しており,構成性分泌のみが存在する場合には非刺激時の分泌割合が高いことを見いだしている。耳下腺腺房細胞に発現させたEpoHのβアドレナリン刺激・非刺激時における分泌効率を測定したところ,ssHaloと同程度の分泌効率が確認できた。したがって,EpoHは構成性分泌経路へ積極的に輸送されてはいないと考えられる。エリスロポエチンは,マウス顎下腺に強制発現させると血液中に分泌されると報告されており,そのアミノ酸配列中に構成性分泌経路へ輸送されるシグナルが存在していると予想していたが,本実験から,構成性分泌への輸送シグナルには,さらに複雑なメカニズムが存在することが予想された。構成性分泌への輸送シグナルの解析については,細胞外基質など,上皮細胞において構成的に基底膜側に分泌されることが明らかなタンパク質を新たな標的タンパク質として,解析を続ける予定である。口腔生理学これまでの研究から,分泌顆粒へ輸送され,刺激依存的に分泌されるタンパク質であっても,アミラーゼとの共局在の仕方はタンパク質の種類によって異なることがわかってきた。
H. suis感染による胃MALTリンパ腫形成とTLR4シグナル活性化機構の解明

本研究で我々は、H. suis感染後の胃MALTリンパ腫形成は、TLR4-TRIFシグナル伝達経路の活性化によって引き起こされることを明らかにした。また、TLR4-TRIFシグナル伝達経路の活性化により誘導される1型IFNsは、感染胃粘膜B細胞を刺激する結果、B細胞からのIFN-γの産生を促進することで胃MALTリンパ腫発症に関与していることも明らかとなった。これらの研究成果によりH. suis感染から胃MALTリンパ腫発症に関わる分子メカニズムが明らかとなり、今後、これらの分子メカニズムを標的とした胃MALTリンパ腫形成における新規治療法の開発が期待される。本研究課題では、細菌感染症からインターフェロン誘導に重要な自然免疫系であるToll様受容体4(TLR4)シグナル伝達経路に着目し、H. suis感染からIFN-γを誘導させる新たな分子メカニズムを解明し、胃MALTリンパ腫発症における新規治療法を模索することを目的としている。平成27年度において、我々は、H. suis感染後の胃リンパ濾胞形成とTLR4シグナル伝達経路の活性化との関連性を明らかにするために、TLR4シグナル伝達に重要なアダプタータンパク質MyD88、TRIFを欠損したマウス、ならびに、野生型マウスを用いてH. suisの感染実験を行った。その結果、野生型、ならびに、MyD88欠損感染マウス胃粘膜では胃リンパ濾胞形成が多数認められていたが、TRIF欠損マウスの胃粘膜では、その数は有意に減少していることが明らかとなった。また、TLR4は、H. suis感染マウスの胃粘膜上皮組織において強い発現を示していたほか、細菌由来成分でるモノホスホリルリピドA(MPLA)を処理した胃上皮細胞において、TLR4シグナル伝達経路の活性化が認められ、1型インターフェロン産生が亢進していることが明らかとなった。今後、H. suis感染マウス上皮細胞で発現したTLR4シグナル伝達経路の活性化がどのようなメカニズムで胃粘膜B細胞からのIFN-γ産生を促進させ、胃リンパ濾胞形成を誘導するかの詳細を明らかにする予定である。平成27年度の計画では、H. suis感染における胃MALTリンパ腫形成とTLR4シグナル伝達機構の役割、ならびに、細菌由来モノホスホリルリピドA(MPLA)で刺激後の胃上皮細胞からの1型インターフェロン産生誘導メカニズムの解明について検証を行った。まず、H. suis感染後の胃リンパ濾胞形成とTLR4シグナル伝達経路の活性化との関連性を明らかにするために、MyD88、ならびに、TRIF欠損マウスにH. suisを感染させたところ、TRIF欠損マウス胃粘膜にて胃リンパ濾胞形成が抑制され、TLR4-TRIFシグナル伝達経路がH. suis感染後の胃リンパ濾胞形成に重要であることが示唆された。また、H. suis感染マウス胃上皮細胞においてTLR4の活性化が認められたほか、細菌成分であるMPLAを処理した胃上皮細胞において、TLR4シグナル伝達経路の活性化が認められた。これらの研究結果より、H. suisのもつMPLAが胃上皮組織におけるTLR4-TRIFシグナル伝達経路を活性化させることで、胃リンパ濾胞形成に寄与していることが示唆され、平成27年度の計画で予想していた研究成果が得られたものと考えられる。また、これらの研究成果は、次年度予定している研究計画の発展に密接に関連していることからも、本年度は、当初の目的を達成しながら、おおむね順調に進展してきているものと考えている。Helicobacter suis (H. suis)は、マウス胃粘膜に感染すると胃粘膜B細胞から産生されたIFN-γにより100%の確率で胃MALTリンパ腫を発症させことが知られている。本研究課題では、細菌感染症からインターフェロン誘導に重要な自然免疫系であるToll様受容体4(TLR4)シグナル伝達経路に着目し、H. suis感染からIFN-γを誘導させる新たな分子メカニズムを解明し、胃MALTリンパ腫発症における新規治療法を模索することを目的とする。平成28年度において我々は、H. suis感染マウス胃粘膜に浸潤したB細胞上の遺伝子発現解析を行った。その結果、H. suis感染マウス胃粘膜に浸潤したB細胞は、非感染マウスB細胞に比べて、1型IFNs受容体、ならびに、IFN-γの発現が有意に上昇していた。これらの知見により、H. suis感染後の胃粘膜上皮細胞から産生された1型IFNsは、胃粘膜に浸潤したB細胞上に高発現した1型IFNs受容体に相互作用し、B細胞からのIFN-γの産生を促進することで、胃MALTリンパ腫発症に寄与していることが示唆された。また、1型IFNs発現上昇と胃粘膜B細胞との相互作用におけるIFN-γ活性化機構について解析を行った。その結果、組換えIFN-α、βで刺激したリンパ腫由来B細胞株では、時間依存的にIFN-γの発現が上昇していた。さらに、培養上清中のIFN-γ産生についても同様に増加していた。これにより。H. suis感染後に誘導される1型IFNsは、胃粘膜B細胞を刺激する結果、IFN-γの産生を加速させ、胃MALTリンパ腫発症に密接に関連していることが明らかとなった。

また、TLR4-TRIFシグナル伝達経路の活性化により誘導される1型IFNsは、感染胃粘膜B細胞を刺激する結果、B細胞からのIFN-γの産生を促進することで胃MALTリンパ腫発症に関与していることも明らかとなった。これらの研究成果によりH. suis感染から胃MALTリンパ腫発症に関わる分子メカニズムが明らかとなり、今後、これらの分子メカニズムを標的とした胃MALTリンパ腫形成における新規治療法の開発が期待される。前年度の研究成果で、H. suis感染後の胃リンパ濾胞形成は、胃上皮組織におけるTLR4-TRIFシグナル伝達経路の活性化が重要であることを示した。本年度は、胃上皮組織におけるTLR4-TRIFシグナル伝達経路の活性化がどのようなメカニズムで胃粘膜B細胞からのIFN-γの産生に寄与し、かつ、胃リンパ濾胞形成を誘導するのかを以下の項目について詳細に検証する。具体的には、非感染野生型マウス、ならびに、H. suis野生型感染マウスから胃を摘出し、感染胃粘膜に浸潤したB細胞をセルソーターにて精製する。精製後、細胞からRNA抽出を行い、1型インターフェロン受容体、ならびに、IFN-γの発現について検証予定である。21型インターフェロン発現上昇と胃粘膜B細胞との相互作用におけるIFN-γ活性化を検証する。具体的には、リンパ腫由来B細胞株を用いて、組換え1型インターフェロンで刺激実験を行い、IFN-γ遺伝子、ならびに、その他関連遺伝子の発現を定量的PCR法で、また、培養上清中に産生されるIFN-γをELISA法にて検出予定である。今後、H. suis感染後の胃MALTリンパ腫形成メカニズムの詳細を明らかにし、学会発表、ならびに、論文発表にて成果を公表していく予定である。細菌感染症と消化器疾患平成27年度に購入予定であった試薬が国内在庫がなく輸入扱いになり、今年度中に試薬の確保が出来なかったため。H. suis感染マウス胃粘膜に浸潤したB細胞上の遺伝子発現解析、ならびに、1型インターフェロン発現上昇と胃粘膜B細胞との相互作用におけるIFN-γ活性化機構の解明に関する試薬購入に使用予定である。
液体粘性知覚の神経メカニズムの解明

近年、視覚生理学研究分野では、素材や光沢感など物体の質感の脳内表現が調べられるようになってきている。腹側経路V4野やIT野における研究で、素材やテクスチャ、光沢感などの物体の質感に選択的に反応する細胞の報告がされたが(Okazawa et al. 2014, Nishioet al. 2011, 2014)、これらの研究では静止画像が主に用いられてきた。しかし、質感知覚は、動きの情報からも質感知覚を得ることができる。例として液体粘性知覚が挙げられ、複雑な運動情報から、液体の粘性を知覚することができる。視覚生理学の運動視研究は従来、ランダムドット運動などの単純な視覚刺激を用いて調べられてきており、液体運動の様な複雑運動がどのように表現されているのかはあまり研究されてこなかった。また、運動方向/速度と空間位置の組み合わせは膨大となり、技術的に生理実験を行うことが困難であった。本研究では、近年人の心理物理研究から報告された、液体粘性の知覚判断と相関する高次運動統計量(Kawabe et al. 2014)を視覚刺激生成に用いることで、液体粘性知覚が質感関連領野と視覚運動領野の両方から入力を受けている、高次視覚領野FST野で表現されているかどうかを明らかにすることを目的とし、電気生理実験を行ってきた。FST野で実験を行う前段階の実験として、運動情報処理を行っていることが既に知られているMT野から記録を行った。過去の知見から、MT野神経細胞は液体粘性には選択性を持たず、運動方向のみに選択性を示すことが予想され、昨年度の生理実験からも予測に近い結果が得られたが、視覚運動刺激の局所的な運動ベクトルの配置による影響かどうかを区別する必要があることが分かった。その後FST野からの電気生理実験の為、実験システムのセットアップを行い、引き続きデータ記録を行っている。29年度が最終年度であるため、記入しない。本研究では、近年人の心理物理研究から報告された、液体粘性の知覚判断と相関する高次運動統計量(Kawabe et al. 2014)を視覚刺激生成に用いることで、液体粘性知覚が質感関連領野と視覚運動領野の両方から入力を受けている、高次視覚領野FST野で表現されているかどうかを明らかにする。質感研究は近年社会的にも注目されてきているフィールドであり、運動を伴う質感の生理学的基盤とメカニズムを理解することは、科学的な意義があるだけでなく、質感デバイスの開発などに寄与することができると期待される。28年度は、液体粘性選択性を調べるための複雑運動刺激をデザインし作成し、電気生理実験を行った。液体運動の特徴である局所ベクトルの連続性をコントロールするために、小さなランダムドット刺激をグリッド状に配置した視覚刺激を作成した。本研究のターゲットは主にFST野であるが、FST野で実験を行う前段階の実験として、まずMT野から記録を行った。MT野は視覚運動領野としてこれまで多くの研究がされてきた領野であり、本実験に用いる刺激に対する応答のテストとして記録を行った。

本研究では、近年人の心理物理研究から報告された、液体粘性の知覚判断と相関する高次運動統計量(Kawabe et al. 2014)を視覚刺激生成に用いることで、液体粘性知覚が質感関連領野と視覚運動領野の両方から入力を受けている、高次視覚領野FST野で表現されているかどうかを明らかにすることを目的とし、電気生理実験を行ってきた。FST野で実験を行う前段階の実験として、運動情報処理を行っていることが既に知られているMT野から記録を行った。過去の知見から、MT野神経細胞は液体粘性には選択性を持たず、運動方向のみに選択性を示すことが予想され、昨年度の生理実験からも予測に近い結果が得られたが、視覚運動刺激の局所的な運動ベクトルの配置による影響かどうかを区別する必要があることが分かった。その後FST野からの電気生理実験の為、実験システムのセットアップを行い、引き続きデータ記録を行っている。今後の生理実験には前年同様、小さなパッチ状のランダムドット刺激をグリッド状に配置した視覚刺激を呈示する。局所ベクトルの空間連続性を離散ラプラシアンで定量化し、液体粘性運動の刺激軸とすることで、運動による質感(液体粘性)選択性を調べることができる。各パッチ刺激は独立の運動ベクトルを持つため、運動ベクトルがすべてのパッチ刺激で同一であれば一様運動となり、従来使われてきた視覚運動刺激と同じ性質を持つ。刺激の平均の運動方向を8段階用いることで神経細胞の運動方向選択性を調べることができる。これまでの実験刺激のデザインでは、各パッチ刺激の運動ベクトルは刺激呈示中に変化しなかったが、刺激に時間的な変化を加える。各グリッドの運動ベクトルが時間的に変化することで、刺激全体の空間パタンのバリエーションを増やすことができ、神経細胞の液体粘性刺激に対する応答が、運動ベクトル刺激の局所的な空間パタン依存的かどうかを区別することができると考えられる。この視覚刺激には受容野特性を調べるためのパラメータが組み込まれており、研究計画段階で予定していた逆相関法を用いた受容野測定も、解析段階で合わせて行えると考えている。改良した時空間的に変化をする複雑運動刺激を用い、運動速度・液体粘性・空間パタンの3軸の刺激空間において、MT野およびFST野神経細胞の応答特性を調べ、どの刺激軸が重要かを定量的に調べることができる。この実験結果を取りまとめて、学会発表を行う。29年度が最終年度であるため、記入しない。
ルーメン微生物を用いた新規ルーメンミメティク有機酸生産システムの開発

リグノセルロース系バイオマスを有用な化学物質に変換する経済的で環境負荷が少ない方法が求められている。そこで、ルーメンミメティック・バイオプロセスを提案する。このプロセスはリグノセルロース系バイオマスの乾式粉砕とルーメン細菌の連続培養からなる。このプロセスで60日以上に及ぶルーメン菌の連続嫌気培養を行い、結晶セルロース、稲わら、杉から揮発性脂肪酸(VFA)を生産することができた。20gのセルロースから180 mmolのVFAを生産した時の炭素収率は60.6%であった。DGGE菌叢解析の結果、セルロース分解菌、その共生菌、プロピオン酸生産菌を確認した。牛の第一胃(ルーメン)から採取したルーメン微生物を長期間恒常的に連続培養することにより稲わらなどのセルロース系バイオマスから酢酸などの工業的に有用な揮発性脂肪酸(VFA)を効率的に生産するルーメンミメティック有機酸生産システムを構築することを目的として研究を行った。牛(日本短角種)からルーメン液を1L採取し、人工唾液1Lを加えて全量2Lで窒素ガスの間欠通気による嫌気培養を39°Cで行った。VFAの生成は培養液のpHの低下で検出しHPLCおよびLC-QTOFMSで定量した。栄養源として稲わら等の粉砕物を1日20g添加して培養を開始した。VFA生成活性はpH低下速度(pH/h)で評価した。VFA生成活性を維持する為に窒素源の検討を行った結果、硫酸アンモニウムを0.1%添加した人工唾液による6.50のpH制御により窒素源の供給が可能であることが分かった。プロトゾアは培養23日で消失したが一カ月以上に及ぶ連続培養でもVFA生成活性を維持することができた。ルーメン微生物の群集構造解析は16S rDNAを標的としたPCR-DGGE法で経時的に行った。採取培養液の静置上清からDNAを抽出し、GC-357Fと518Rをプライマーとした。PCR産物を変性剤濃度勾配ゲル電気泳動法(DEEG法)により分離してバンドのパターンを比較した。稲わらなどのセルロース系バイオマスで培養を継続すると特徴的なバンドの出現が見られ、特にセルロースパウダーのみで培養すると特定のバンドが増強した。これらのことからルーメン微生物の群集構造は菌が消失するのではなく菌数の増減により添加されたバイオマスの消化に最適な群集構造に移行していくことが示唆された。今後は特徴的なバンドを切り出してDNA配列解析を行い菌の同定を行うと共にそれらの菌のVFA生成における役割を考察して更に有機酸生産の最適化を図っていく。平成27年度の研究計画では、1)ルーメン微生物の有機酸生成活性を指標とした連続培養条件の検討、としている。これまでに1カ月以上に及ぶルーメン微生物の連続培養が可能な培養装置および培養条件を確立した。窒素源の供給および6.50のpH制御は0.1%硫酸アンモニウムを加えた人工唾液のフィードで行い、VFA生成に関わるルーメン微生物の連続培養を可能にした。2)LC-QTOFMSによる発酵代謝物の網羅的な分析、ではどのような培養液からもVFAの定量を可能にし、酢酸とプロピオン酸については通常の210nmの吸光度によるHPLC分析による定量も可能にした。3)PCR-DGGE法による人工ルーメン内の微生物群集構造の解析、では16S rDNAを標的としたルーメン菌の群集構造のプロファイリングを可能にした。当初、真核生物(プロトゾア)の解析も計画したが、プロトゾアは培養初期に消失したこととプロトゾアはVFAを生産しないことから行わなかった。ルーメン微生物の群集構造解析の結果、微生物種の同定はまだであるがVFAの生成に寄与すると考えられる複数のDGGEバンドを確認している。以上の成果から概ね順調に進展しているとした。本研究の目的は、リグノセルロース系バイオマスから揮発性脂肪酸(VFA)を生産する為に、反芻動物のルーメン機能をまねたバイオプロセス(rumen-mimetic bioprocess)を開発することである。牛(日本短角種)の第一胃(ルーメン)からルーメン液1Lを採取し、人工唾液1Lを加えて全量2Lで窒素ガスの間欠通気による嫌気的連続培養(人工ルーメン)を39°Cで行った。pHコントローラーによる人工唾液の添加によりpHを6.50に保ち、人工唾液の添加量と同量の培養液を排出液として引く抜き、排出液中のVFAをHPLCにより定量した。人工ルーメンに20gの結晶セルロース、稲わら微粉末、スギ微粉末を添加した時のVFA生成量は、それぞれ183 ±29.7、69.6 ±12.2、21.8 ±12.9 mmolであった。消化はいずれも24時間以内に終了した。20gの結晶セルロースを添加して180 mmolのVFAが生成した時の炭素収率は60.6%であった。PCR-DGGE法により人工ルーメンの菌叢解析を行った。典型的な9つのバンドについてDNA配列を決定し16SrDNAのBLAST解析を行った。これらの内、3つのバンドはルーメン由来の3菌株(相同性%)、1)Fibrobacter succinogenesHM2 (89%)、2)Succiniclasticum ruminis SE10 (98%)、3)Prevotella ruminicola Bryant 23 (93%)と高い相同性を示した。

1)はセルロース分解菌であり、2)はコハク酸からプロピオン酸を生産し、3)はセルロース分解菌との共生が報告されていた。また、1)と3)はピルビン酸からリンゴ酸経由でコハク酸を生成することから、1)、2)、3)は共生関係にあると考えている。リグノセルロース系バイオマスを有用な化学物質に変換する経済的で環境負荷が少ない方法が求められている。そこで、ルーメンミメティック・バイオプロセスを提案する。このプロセスはリグノセルロース系バイオマスの乾式粉砕とルーメン細菌の連続培養からなる。このプロセスで60日以上に及ぶルーメン菌の連続嫌気培養を行い、結晶セルロース、稲わら、杉から揮発性脂肪酸(VFA)を生産することができた。20gのセルロースから180 mmolのVFAを生産した時の炭素収率は60.6%であった。DGGE菌叢解析の結果、セルロース分解菌、その共生菌、プロピオン酸生産菌を確認した。平成28年度の研究計画として、セルロース系バイオマスからの酢酸等の揮発性脂肪酸(VFA)の生成量を上げる為にルーメン微生物群集構造の誘導と再構成を行う。また、様々なバイオマスの消化に対応しうるルーメン微生物群集構造の恒常性を検証する。稲わら等のセルロース系バイオマスを添加した際の特徴的なDGGEバンドからDNAを抽出して微生物を同定し、VFAの生成における役割を考察する。VFAの生成に重要な役割を果たしている菌については誘導と再構成を行い、VFA生成のボトルネックを解消することによりVFA生成速度を上げてVFAの蓄積量を理論収率に近づける。さらに、10リッターレベルの連続嫌気培養装置を作り、設定したルーメン微生物群集構造と培養条件で連続培養を行い、様々なバイオマス添加に対する各VFAの生成速度と生成比率、微生物群集構造の恒常性について検証する。得られたデータからルーメンミメティク有機酸生産システムの実用化へ向けた収率計算、コスト計算を行う。生物工学