hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
デクスメデトミジンとプロポフォールを併用した呼吸抑制と覚醒遅延のない鎮静法の確立

また、主要評価項目以外の副次評価項目を選び、研究計画を立案した。来年度には、倫理審査委員会の承認を得た後に、実際の臨床研究を開始する予定としている。昨年度にボランティアでの研究を予定していたが、臨床研究保険費用が高額になる可能性が高く、本課題の直接経費のみでの遂行が困難と考えられた。そのため、実際には患者研究のみの方針としたが、昨年度にボランティア研究への対応に時間を要した関係で全体の進行がやや遅れている。予備研究結果を踏まえ、患者研究計画を作成する。倫理審査委員会での審査に時間を要する可能性があるため、慎重な患者研究計画を立案する。また、診療時間の短縮のために、デクスメデトミジンの初期負荷時間を10分ではなく5分で行う方向性が望ましいと考え、現在予備研究を進めている。次年度の患者研究計画決定に向けて続けてデータを取得する予定である。本研究の初期計画時とは異なるが、臨床応用するには望ましい手段に近づけることが可能と考えている。倫理審査委員会の承認を得た後、すみやかに臨床研究を開始する。進捗がやや遅れているため、研究期間の延長が必要になる可能性も考慮し、研究費を使用する。ボランティアでの研究に際し、臨床研究保険費用が高額になる可能性が高く、本課題の直接経費のみでの遂行が困難と考えられた。そのため、本年度は予備研究のみで対応し、次年度以降の患者研究を中心に行うことを計画した。患者研究での臨床研究保険増額に対応するため、本年度の使用額が少なくなった。また、患者研究での臨床研究保険増額に対応するため、本年度の使用額が少なくなった。現在の進捗がやや遅れており、臨床研究における患者の参加状況によっては研究期間を延長する必要がある可能性があることを考慮して研究費を使用することとする。
光呼吸系の再評価に基づく光合成を飛躍的に高める試験研究

光呼吸系は、葉緑体内のCO2濃度が低下するとRubiscoのオキシゲナーゼ作用がおこり、その産物であるグリコール酸が代謝され、その結果細胞内でCO2を発生させる代謝機能である。特に強光を受ける柵状組織中の葉緑体内では光合成が盛んになりCO2が不足する一方で、CO2の拡散供給速度が高くないので、光呼吸が活発に起こる。このとき、光呼吸系の活性が低いとCO2を十分に供給できず、やがては光傷害を起こす。本研究は、このメヵニズムをさらに詳細に研究することによって、作物の光合成を飛躍的に高めることをめざすことを研究目標としている。今年度の研究成果は次の通りである。1)初年度に購入したWALZ社の光合成測定装置を用いて、光合成と光呼吸との関係を詳細に調べた。その結果、強光下で光呼吸が抑制される2%CO2条件下におくと、光呼吸を行うことのできる21%O2条件下と比較して、どの植物も光合成が徐々に低下することが判明した。その原因は、2%O2条件下では、光化学系の光傷害が進行するためであることも明らかとなった。2)光合成量の高い植物(イネ、ヒマワリ、ナスなど)では、葉の表裏に気孔が発達しており、さらに細胞間隙も発達していること、のために、強光下でCO2の拡散供給速度が比較的高いこと、が判明した。3)したがって、作物の光合成を飛躍的に高めるには、CO2の拡散速度を高める方向の育種が有効であること、さらに光傷害を受けないように光呼吸系の酵素活性を高める方向の育種が有効であること、が判明した。1)購入したWALZ社の光合成測定装置を用いて、強光下の光合成と光傷害との関係を調べた。一般に2%O2条件下では、Rubiscoのoxygenase活性が抑制されるために、光合成量は増加する。しかしながら、1,500umol/m2/sの強光下で長時間同化を続けると、21%O2条件下で光呼吸を行っている場合よりも、光合成は低下することが判明した。この逆転時間は植物により異なり、ツバキなど樹木では3時間以内であったが、イネ、ヒマワリでは数時間を要した。2%O2条件下で光合成が継続できる植物の葉は、一般に細胞間隙が発達しているという特徴があった。2)いろいろな植物について光合成活性と光呼吸能とを測定すると、光呼吸能の低い植物は強光下での光合成能も低くなり、逆に光呼吸能の高い植物は高い光合成活性を示すという傾向が見られた。これは重要なデータであるので、精密な測定を継続している。3)キウリなど、GS2発現量の低い植物について、GS2の形質転換を行っている。結果は次年度以降になる。本研究は、このメカニズムをさらに詳細に研究することによって、作物の光合成を飛躍的に高めることをめざすことを研究目標としている。その原因は、2%O2

条件下では、光化学系の光傷害が進行するためであることも明らかとなった。2)光合成量の高い植物(イネ、ヒマワリ、ナスなど)では、葉の表裏に気孔が発達しており、さらに細胞間隙も発達していること、のために、強光下でCO2の拡散供給速度が比較的高いこと、が判明した。3)したがって、作物の光合成を飛躍的に高めるには、CO2の拡散速度を高める方向の育種が有効であること、さらに光傷害を受けないように光呼吸系の酵素活性を高める方向の育種が有効であること、が判明した。光呼吸系は、葉緑体内のCO2濃度が低下するとRubiscoのオキシゲナーゼ作用がおこり、その産物であるグリコール酸が代謝され、その結果細胞内でCO2を発生させる代謝機能である。特に強光を受ける柵状組織中の葉緑体内では光合成が盛んになりCO2が不足する一方で、CO2の拡散供給速度が高くないので、光呼吸が活発に起こる。このとき、光呼吸系の活性が低いとCO2を十分に供給できず、やがては光傷害を起こす。本研究は、このメカニズムをさらに詳細に研究することによって、作物の光合成を飛躍的に高めることをめざすことを研究目標としている。今年度の研究成果は次の通りである。1)初年度に購入したWALZ社の光合成測定装置を用いて、光合成と光呼吸との関係を詳細に調べた。その結果、強光下で光呼吸が抑制される2%CO2条件下におくと、光呼吸を行うことのできる21%O2条件下と比較して、どの植物も光合成が徐々に低下することが判明した。その原因は、2%O2条件下では、光化学系の光傷害が進行するためであることも明らかとなった。
荷電粒子・中性粒子・塵粒子を含む電磁流体力学の定式化と原始惑星系円盤の進化の研究

本研究は、微惑星形成過程の詳細を明らかにすることである。惑星形成の標準モデルでは、微惑星形成は、原始惑星系円盤中のダストが赤道面に沈澱し高密度ダスト層となり、この層が重力不安定状態となって分裂してできたと考えられている。しかし、ダストが沈澱するに連れて、速度シアが生じ、結果としてケルビン・ヘルムホルッ不安定が起きるのではないかと指摘されている。流体不安定が引き起こされれば、乱流状態となりダスト層がかき乱されて、高密度状態になるまでの沈澱は困難である。そこで、ケルビン・ヘルムホルツ不安定について詳細に調べなくてはならない。我々は平成17年度までにケルビン・ヘルムホルツ不安定を詳細に研究した。結果、ケルビン・ヘルムホルツ不安定が起きても重力不安定が起きる可能性を示した。微惑星は重力不安定によって形成された可能性がある。しかし、これまでのところ重力不安定によって微惑星形成に関する研究は、線形解析が行われただけである。数値シミュレーションによって具体的にどのような過程によって微惑星が形成されるかは明らかになっていない。そこで、我々は、塵粒子円盤の重力不安定の数値シミュレーションを行い、重力不安定による微惑星形成過程を詳細に調べた。まず、重力不安定が起きて斜めの密度パターンが形成される。その後、線形解析の予測通りの微惑星が形成されることが分かった。しかし、その段階はすぐに終わり、急速に微惑星が成長することを示した。今年度は、まず、原始惑星系円盤の塵粒子層におけるケルビン・ヘルムホルツ不安定の線形解析を行った。惑星形成の初期の塵粒子で満ちたダスト層の場合、中心星の重力に引かれて沈殿し次第に赤道面上に塵粒子が濃縮し高密度の塵粒子層が形成されると考えられている。この塵粒子層が重力不安定によって分裂し、キロメートルサイズの微惑星ができるのである。しかし、それには、問題点が指摘されている。赤道面上の塵粒子の密度が上昇するにつれて速度シアができる。この速度シアによりケルビン・ヘルムホルツ不安定が起こり乱流になる。乱流状態ではもはや赤道面への塵粒子の沈澱ができず重力不安定が不可能になる。そこで、今年度は、ケルビン・ヘルムホルツ不安定の詳細な線形解析を行った。その結果、塵粒子の大きさが成長した場合、不安定が抑えられるという結論を得た。そして、乱流と沈澱が釣り合いを保ちながら塵粒子の成長を続け、10mサイズで重力不安定が起こるというモデルを与えた。この結果は、現在、Astrophysical Journal誌に投稿中である。また、このモデルは、乱流の中で塵粒子が成長できるかが重要な点である。そこで、乱流の中で塵粒子はどのような運動をするのかを調べた。乱流の中では、近似的にランダムウォークをする。従って、ランジュバン方程式を用いた確率的な取り扱いが可能である。その結果、乱流状態で回転するガス中の塵粒子の拡散係数、速度分散、速度分布関数の解析的表式を求めることができた。現在、これらの公式の正当性を数値シミュレーションにより検証中である。来年度は、本研究の目的である磁場の役割について詳細に研究する予定である。惑星形成の標準モデルでは、微惑星形成は、原始惑星系円盤中のダストが赤道面に沈澱し高密度ダスト層となり、この層が重力不安定状態となって分裂しできたと考えられている。しかし、ダストが沈澱するに連れて、速度シアが生じ、結果としてケルビン・ヘルムホルツ不安定が起きるのではないかと指摘されている。そこで、ケルビン・ヘルムホルツ不安定が起きるのか、乱流状態のときにダストはどのような運動をするのか、この2点を詳細に調べなくてはならない。平成17年度は、原始惑星系円盤の高密度ダスト層におけるケルビン・ヘルムホルツ不安定の圧縮性効果についての研究と、乱流状態となっている円盤中のダスト運動の統計的性質についてシミュレーションを行い詳細に調べた。前年度の研究成果である「ケルビン・ヘルムホルツ不安定の2流体解析」をより一般的な状況へ拡張するために、これまではガスを非圧縮流体としていたが、それを圧縮性流体へと一般化した。ダストの効果によって不安定が抑制される可能性があることを始めて示した。しかし、惑星形成の問題に結果を適用すると、重力不安定を起こす前にケルビン・ヘルムホルツ不安定が発生し乱流が起きることが明らかとなった。そこで、平成16年度に引き続き、乱流中のダストの運動について研究した。前年度には、乱流中のダストの運動を統計的に取り扱い、速度分散や拡散係数に関する公式を解析的に導出した。平成17年度は、乱流中のダストの運動を数値シミュレーションで調べて、これらの公式の正当性を検証した。その結果、これらの公式は、非常によく乱流中のダストの統計量を説明することが分かった。

流体不安定が引き起こされれば、乱流状態となりダスト層がかき乱されて、高密度状態になるまでの沈澱は困難である。そこで、ケルビン・ヘルムホルツ不安定について詳細に調べなくてはならない。我々は平成17年度までにケルビン・ヘルムホルツ不安定を詳細に研究した。結果、ケルビン・ヘルムホルツ不安定が起きても重力不安定が起きる可能性を示した。微惑星は重力不安定によって形成された可能性がある。しかし、これまでのところ重力不安定によって微惑星形成に関する研究は、線形解析が行われただけである。数値シミュレーションによって具体的にどのような過程によって微惑星が形成されるかは明らかになっていない。そこで、我々は、塵粒子円盤の重力不安定の数値シミュレーションを行い、重力不安定による微惑星形成過程を詳細に調べた。まず、重力不安定が起きて斜めの密度パターンが形成される。その後、線形解析の予測通りの微惑星が形成されることが分かった。しかし、その段階はすぐに終わり、急速に微惑星が成長することを示した。
人工万能幹細胞を用いた角膜内皮・上皮細胞創生の研究

iPS細胞をある特殊な培地を用いて培養し、回収して解析したところ、これらの細胞が神経堤細胞に分化していることが判明した。更にこの神経幹細胞をsphere培養したところ、角膜内皮と同様のマーカーを発現している細胞が出現していることが確認された。一方、iPS細胞を別の特殊な培地で培養し、回収して解析したところ、角膜上皮前駆細胞に分化しており、また創傷治癒能を有していることが確認された。ES細胞から神経堤細胞への分化誘導実験を行っている既報の論文(MotohashiらStem Cells2007.)に基づき、iPS細胞から神経堤細胞への分化誘導が可能か検討を行った。iPS細胞をまず専用の培地(DiM-M培地)を用いて培養し、その途中でATRAを培地中に加えて更に培養し、最終的(ES細胞では培養12日目)に回収した細胞をFACSにかけて、c-kit(神経堤細胞のマーカー)(+)かつCD45(造血系細胞のマーカー)(-)の細胞をソーティングした。この細胞からmRNAを抽出し、Oct4(眼の分化マーカー)・Pax3・Snail・Slug・Sox10(以上、神経堤細胞のマーカー)を用いてreal-time RT-PCRを行ったところ、ソーティングされた細胞が神経堤細胞と同程度にこれらのマーカーを発現しており、神経堤細胞に分化していることが判明した。一方、既報の論文(HommaらInvest Ophthalmol Vis Sci 2004.)に基づき、iPS細胞から角膜上皮前駆細胞への分化誘導が可能か検討を行った。iPS細胞を培養し、コンフルエントとなった段階でこれをIMDM培地で希釈し、Bacteral-gradeのPetri皿で浮遊培養し、これにより得られた細胞塊(胚様体)を4型コラーゲンコーティングチェンバーに播種し、上皮細胞成長因子(EGF)を含んだKCM培地で培養を行った。一定の期間後細胞を回収し、PAX6(眼の分化マーカー)・p63(上皮前駆細胞のマーカー)・cytoleratin 12(K12、角膜上皮細胞の特異的マーカー)・cytokeratin 14(K14、扁平上皮基底細胞のマーカー)の各プライマーを用いてreal-time RT-PCRを行ったところ、角膜上皮前駆細胞と同程度にこれらのマーカーを発現しており、角膜上皮前駆細胞に分化していることが判明した。前年度までの実験で、iPS細胞を神経堤細胞に分化誘導することが可能となり、更に条件検討を行って最適な培養温度・日数を確定させた。この神経堤細胞を同じ組成の培地・フィーダーで再度培養し、neuronal class III β-tubulin(ニューロンのマーカー)、glial fibrillaryasidic protein(GFAP、グリアのマーカー)、tyrosin-hydroxylase(メラノサイトのマーカー)で免疫染色を行ったところ、この細胞がこれらのマーカーを発現していた。これにより、分化誘導された神経幹細胞が多能性を有することが確認された。更にこの神経幹細胞をsphere培養したところ、角膜内皮と同様のマーカーを発現している細胞が低い頻度ながら出現していることが確認された。現在は効率よく角膜内皮細胞への分化を促すための条件(培養日数・培地組成など)について検討を行っている段階である。一方前年度までの実験で、iPS細胞を角膜上皮前駆細胞へ分化させることも可能となった。こちらも更に条件検討を行って最適な培養温度・日数を確定させることができた。また、この細胞が角膜上皮創傷治癒時に発現されるマーカーであるCD44, E-cadherinを発現していることが免疫染色とウエスタンブロッティングで確認され、創傷治癒能を有していることが確認された。現在は角膜上皮細胞への効率的な分化を促すための条件(角膜内皮と同様)について検討を行っている段階である。
国際的通用性を有する外国人介護労働者の職業教育モデルの創設に関する研究

本研究の成果は、アジア循環型(還流型)の外国人介護者職業教育モデルの構築に向けて、受け入れ側及び送り出す側の実践的な課題を明らかにすることである。例えば、外国人介護者が働きながら介護技術やキャリアを開発できるようなローテーション型の仕組み、帰国後も技術を現地で活かすことができる循環型の職業教育システムの創設などの課題を挙げており、その上でアジアに共通する社会政策とは何かを提示したものである。すなわち、外国人介護労働者のキャリア形成やキャリアアップに対して、理論的・実践的な視野を提供できるだけでなく、アジア地域に共通する介護福祉人材育成の施策及び学問的枠組の構築の一助にもなりうるものである。本研究の目的は、アジア地域における外国人介護労働者の国際的な移動のメカニズムと職業教育との関連性を解明するとともに、彼らの素質を高めるための職業教育モデル構築における理論的・実践的課題とはなにかを明確することにある。上記の課題を達成するため、平成21年度においては、下記の研究調査活動を行ってきた。1)アンケート調査の実施。調査地は台北に定め、調査対象を2009年12月時点で外国人介護労働者を雇用している高齢者入所施設の250の施設とし、調査票を配布した。調査内容は、台湾の高齢者入所施設における外国人介護労働者雇用の実態の把握と雇用施設における外国人介護労働者の職業教育の実態の把握という2点に絞られた。現在、調査データの入力及び分析作業が行われている。2)東京ワークショップの開催。2009年度社会政策学会の春季大会において、本研究プロジェクトは「外国人介護労働者受入政策の比較研究-日本・台湾・香港の比較」を題とした分科会を企画・実施した。台湾と香港の政策経験に焦点をあて、国際比較の視点から外国人介護労働者の職業教育の実態及び課題について、議論を深めていた。3)海外ワークショップの開催。(1) 2009年10月に台北で実施するアンケート調査をめぐって現地協力団体である社団法人台湾長期照顧発展協会全国聯合会と台北県政府長期照護管理センターのメンバーたちと共催の形でワークショップを開いた。(2) 3月1日-3月3日にシンガポールSIM Universityの研究協力者の協力の下で、外国人介護労働者の職業教育における日本とシンガポールのワークショップを開催した。平成21年度の研究活動を通じて、外国人介護労働者を受け入れる国としての日本、台湾、香港、シンガポールにおける外国人介護労働者の職業教育に関する政策、プログラム、研修成果の評価システムなどを把握することができた。このような基礎研究の成果は、平成22年度の本格的な研究の展開に必要な基盤を整えた。本研究の目的は、アジア地域における外国人介護労働者の国際的な移動のメカニズムと職業教育との関連性を解明するとともに、彼らの素質を高めるための職業教育モデル構築における理論的・実践的課題を明確にすることにある。上記の課題を達成するため、平成22年度においては、下記の研究活動を行ってきた。1)国際ミニシンポジウムの開催:2010年11月13日14日シンガポールSIM大学、マレーシア大学、台湾台北県長期照顧管理中心など海外研究協力者の4名、京都大学、京都女子大学の国内協力者の2名を招き、3つのセッションに分けて下記の研究課題について議論を行った。(1)国際シンポジウム『外国人介護労働者の職業教育におけるアジアの連携とは』(2)外国人介護労働者の職業教育における課題(3)国際社会に通用する外国人介護労働者の職業教育モデルの創設にむけて2)会議用論文集「国際社会に通用する外国人介護労働者の職業教育モデルの創設にむけて」を配布。3)ベトナム現地調査及び現地ワークショップの開催:2011年1月18日22日(ハノイ市)(1)研究代表者及び研究分担者2名がベトナムに出張し、ハノイ市海外人材派遣センター、ベトナム政府海外労工管理局、看護養成学校の協力を得て、外国人介護労働者の職業研修について合計3つのワークショップを行った。(2)外国人介護労働者として一旦海外に出稼ぎに行き、ベトナムに帰国した後、現在介護士養成教育に携わっている方を対象に聞き取り調査を行った。4)日本国内の調査:外国人介護士を受け入れた横浜市、調布市の介護施設への聞き取り調査の実施本研究の目的は、(1)アジア地域における外国人介護労働者の国際的な移動のメカニズムと職業教育との関連性を解明すること、(2)外国人介護労働者の職業教育モデル構築における理論的・実践的課題を明確にすることにある。平成23年度においては、下記の研究活動を行ってきた。1)国際会議における研究成果の発信:2011年5月27日28日「上海国際フォーラム」:「福祉専門職の国際移動とアジア福祉供給構造の変化」を発表。2)現場ワークショップ及びシンポジウムの開催による研究成果の発信:2012年10月29日30日(八戸市社会福祉協議会)「外国人介護士の育成における福祉施設の役割について」を開催。

2013年2月25日(日本女子大学)「東アジアにおける社会福祉専門職養成の方法と課題」を開催。3)日本国内のアンケート調査の実施日本における外国人介護労働者への研修教育の課題を明らかにするため、平成23年8月9月に「特別養護老人ホームの外国人介護労働者の研修状況」というテーマについて、262施設を対象にアンケート調査を行った。4)研究成果の出版の準備本研究の成果として『越境する外国人ケア労働者の職業教育』と題する書籍の出版を進めている。本書は、(1)アジア地域における外国人介護労働者の国際的な移動のメカニズム、(2)外国人介護労働者のキャリア形成やキャリアアップに関する理論的・実践的課題の解明、(3)良性的循環型の職業教育システムの構築のそれぞれについて、その具体策を論じるものとなる予定である。本研究の成果は、外国人介護労働者のキャリア形成やキャリアアップに理論的、実践的な視野を提供できるだけでなく、アジア地域に共通する介護福祉人材育成の社会政策及び学問的枠組の構築の一助にもなりうるものである。
果樹における染色体解析のゲノム研究への適用

ナシにおいて原品種と同じ遺伝子型を備える葉を材料とした染色体分析法を開発した。幼葉を材料とした酵素解離法による最適条件は、酵素組成が4%セルラーゼオノズカRS、1.5%マセロザイムR200および0.3%ペクトリアーゼY-23、37°C、6075分であった。ニホンナシ黒斑病のナシにおける本病因遺伝子座の染色体上の位置を検出した。この領域を含むBACクローンを用いたFISHを行ったところ、2本の染色体の端部にシグナルが観察できた。ナシと同じくバラ科ナシ亜科に属するリンゴの染色体構成をナシと比較した。両者の染色体構成は極めて類似していた。本年度はナシにおける重要形質である自家不和合遺伝子の染色体上での位置を検出することを目的として研究を実施した。プローブの作成にあたっては、遺伝子登録情報を利用して自家不和合遺伝子の近傍の塩基配列を解析した。その結果、約5,0008,000bpの6種類のプローブを得ることができた。これらのプローブについて、ナシおよびナシと近縁のリンゴの遺伝子情報に基づいて反復配列の有無について複数の方法で精査した。6種類のプローブのうち、3種類は内部にトランスポゾンを含み、1種類は100bp程度のチュウゴクナシの反復配列を、1種類は300bp程度のリンゴの反復配列を、1種類は800bp程度のリンゴの反復配列を含むことがわかった。つづいて、これら遺伝子のナシ染色体上での検出を蛍光in situハイブリダイゼーション法(FISH)によって実施した。遺伝子はニックトランスレーション法で標識し、FITCで可視化した。検出における蛍光強度を向上させることを目的として全てのプローブを混合してFISHを実施すると多数のシグナルが観察された。続いて6種類のプローブを単独で用いたFISHを実施した。内部にレトロトランスポゾンを含む3種類のプローブでは多数のシグナルが観察された。リンゴまたはナシの反復配列を含む残りの3種類のプローブでも数か所にシグナルが観察された。これらの結果は、用いたプローブが本来の自家不和合遺伝子だけでなくレトロトランスポゾンまたは反復配列の部分にハイブリダイズした結果だと考えられた。今後、本遺伝子の検出を成功させるためには、反復配列を含まないプローブを作製することが重要であることが判明した。ニホンナシ黒斑病はAlternaria kikuchianaによって発生するニホンナシにおける重要病害である。24年度は黒斑病感受性遺伝子を含むBACクローンを用いた蛍光in situハイブリダイゼーション法(BAC-FISH)によって、ニホンナシ染色体上における本遺伝子領域の検出を実施した。ブロッキングDNAを用いることなくBAC-FISHを実施すると、多数のシグナルが観察された。これはBACクローンに含まれる反復配列が多数の染色体領域にハイブリダイズした結果によるものと考えられた。不要なシグナルの出現を防止するため、標識していないナシのゲノムDNAをブロッキングDNAとしてBAC-FISHを行った。ブロッキングDNAの量はプローブの1050倍とした。その結果、ブロッキングDNA量が多くなるに従い出現するシグナルは減少し、明瞭な2個のシグナルが検出できる割合が増加した。しかし,ブロッキングDNAが10倍量であってもシグナルが2個の場合もあった。2個のシグナルは2本の染色体の端部に観察された。ニホンナシ黒斑病原因遺伝子座はナシ第11連鎖群の上部末端に座乗することが解明されており、この2個のシグナルの染色体上の位置と一致した。続いて、同じ染色体を用いてFISHにより18S-5.8S-25SrDNAを検出したところ、既報同様6個のシグナルが出現した。18S-5.8S-25SrDNAのシグナルとニホンナシ黒斑病原因遺伝子領域のシグナルは異なる染色体上に検出された。以上のように、BAC-FISHによるニホンナシ黒斑病原因遺伝子領域の可視化に成功した。これはナシにおける重要遺伝子の染色体上での位置を解明しただけでなく、連鎖群に対応する染色体を明らかにした初めての成果である。また、カンキツにおいては各連鎖群に対応するBACクローンの選抜を実施している。本年度は原品種と同じ遺伝子型を備える葉を材料とした染色体分析法の確立およびナシの重要形質である自家不和合性遺伝子の染色体上での位置の検出を目的として研究を進めた。長さが約1から2cmの幼葉を材料とした酵素解離法による染色体標本作製の最適条件は以下の通りであった。酵素組成は4%セルラーゼオノズカRS、1.5%マセロザイムR200および0.3%ペクトリアーゼY-23で、処理温度は37°C、酵素処理時間は60から75分。この条件で1スライドガラス当たり約10個の染色体標本が観察できた。上記の条件で作製した染色体標本を用いて18S-5.8S-25S rDNA遺伝子のFISHを実施すると、rDNA遺伝子は,6本の染色体の端部に確認できた。これは幼若実生の根端由来の染色体標本における結果と一致した。昨年度に用いた自家不和合性遺伝子のプローブには反復配列が含まれており、自家不和合性遺伝子とは別の部分に存在する反復

配列遺伝子とハイブリダイズしてしまい、多数のシグナルが観察されたので、今年度は反復配列を含まないプローブを用いて染色体上での自家不和合性遺伝子の検出を試みた。プローブにゲノム上の他の部位に相同性の高い配列が含まれないことはBLAST検索によって確認した。しかしながら、いずれのプローブも全長が約2000bp以下と極めて短くなってしまった結果、蛍光シグナルが極めて微弱になってしまい、再現性のある明瞭なシグナルを検出することは困難であった。平成27年度には、ナシの不和合性遺伝子の染色体上での位置の検出を目的として蛍光in situハイブリダイゼーション(FISH)分析を実施した。不和合性遺伝子型の出現を予測し、目的の遺伝子型が出現する2種類の交配組み合わせから得られた交雑実生種子を材料とした。不和合性遺伝子近傍の各種領域の遺伝子を含むBACクローンを用いてFISHを行ったところ、BACクローンによる差異はあるものの、いずれも染色体上に4個以上のシグナルが観察された。これはBACクローンに含まれる反復配列領域にハイブリダイズした結果であると考えられた。続いて、新たな手法であるLoop-mediated isothermal amplification (LAMP)法とRolling circle amplification (RCA)法によってプローブを作成した。LAMP法で作成したプローブを用いてFISHを実施した場合、3個以上のシグナルが観察され、不和合性遺伝子領域に対応する2個のみのシグナルは得られなかった。一方、RCA法によるプローブを用いたFISHではシグナルを検出することが出来なかった。また、ナシと近縁なリンゴにおいて2種類のrDNAをプローブとしたFISHを行った。リンゴの染色体上のrDNA遺伝子領域はナシと似通っていたが、異なる点も認められた。この結果から、ナシとリンゴ染色体の共通性と多様性を明らかにすることができた。ナシとリンゴの染色体の共通性と多様性を明らかにすることができた点は、これら果樹のゲノム研究の進展に貢献するものである。しかしながら、ナシ染色体上における不和合性遺伝子領域の検出には成功していない。さらに、カンキツにおいてはFISHに用いるBACクローンの作成が完了していない。昨年度に引き続き、ナシにおける重要形質である不和合性遺伝子の染色体上での位置の検出を目的として蛍光in situハイブリダイゼーション(FISH)分析を実施した。Loop-mediated isothermal amplification(LAMP)法とRolling circle amplification(RCA)法によってプローブを作成した。これらのプローブを用いたFISHの最適条件を解明するため、ハイブリダイゼーション時間、洗浄方法およびプローブ濃度等を検討した。しかしながら、LAMP法のプローブでは多くのシグナルが検出され、RCA法のプローブでは明瞭なシグナルが確認できなかった。すなわち、不和合性遺伝子2か所を確実に検出することはできなかった。次にナシとリンゴの染色体構成の類似性について検討した。18Sー5.8Sー25SrDNAはナシでは6か所、リンゴでは8か所に確認できた。いずれも染色体の端部に検出された。5SrDNAはナシおよびリンゴの両者で動原体部2か所に認められた。ナシおよびリンゴともに18S-5.8S-25SrDNAと5SrDNAは別の染色体上に位置した。
蛍光標識プライマーを用いたPCR法によるDNA多型解析

FAXとHEXの蛍光色素をMCT118プライマーの5′末端にそれぞれ標識し、PCRの増幅を行った。用いたDNA試料はすでにアリル決定されたものであり、1635アリルまでの増幅を試み、アレリックラダーマーカーを作製した。またRoxでラベルしたスタンダードを用いて、DNAシークエンスゲル泳動を行い、GENESCANソフトで解析したところ、600bp以下ではほぼ正確な塩基数が測定された。しかし600800bpのアリルは38bpの誤差が認められるが、アリル間の塩基数の差は16bpであることから、アリル決定には問題はない。次に同一試料でFAM標識とHEX標識の泳動差を検討した。その結果1bp以下の誤差であることからラダーマーカーを用いた未知検体の型判定には極めて有効であることが証明された。STRシステムのSE33の増幅にもFAMとHEXをそれぞれ5′末端に標識したプライマーを用いた。MCT118システムと同様にアレリックラダーを作製し、検体試料をHEXで標識し型判定を行った。2色の蛍光標識による型判定は極めて正確に出来ることが判明した。また銀染色によるバンドの検出よりもはるかに検出感度が高くDNAとして100bgの量まで検出可能であった。
アレルギー・寄生虫感染症克服に向けた好塩基球プロテアーゼの炎症惹起機構解明

末梢血白血球の極少集団である好塩基球は、その希少性ゆえに長らく生体内における存在意義が疑問視されてきた。一方近年、好塩基球の画期的解析ツールが次々と開発され、好塩基球がアレルギーや寄生虫感染などの炎症病態においてユニークかつ重要な役割を果たすことが明らかになった。しかしながら、好塩基球がどのようにして炎症を惹起するのか、そのメカニズムは殆どわかっていない。本研究は好塩基球が選択的に高発現するプロテアーゼに着目し、その欠損マウスをアレルギー・寄生虫感染モデルを駆使して詳細に解析することで、好塩基球の炎症惹起機構を生体・分子レベルで明らかにし、新たな抗アレルギー薬・寄生虫ワクチンの開発を目指す。
グルココルチコイド作用増強物質によるリンパ性白血病の新治療法の開発

我々は、(1)標的細胞におけるグルココルチコイド(GC)ホルモンの感受性を増強する細胞感受性増強物質群、(2)標的細胞でのGC作用の発現を増幅する作用増幅物質群、(3)標的細胞でのGC作用を抑制する物質群を見出し、これらを用いてGC感受性リンパ性白血病、リンパ肉種症への応用を試みてきた。GC作用を増幅する生体内活性物質は、プロテインキナ-ゼCの活性化作用を持つジアシ-ルグリセリド(DG)であったが、本年度の研究で、スフィンゴリピットの代謝産物、スフィンゴシンがGC作用を著明に抑制することを見出した。しかもスフィンゴシンはプロテインキナ-ゼCの特異的阻害剤である。このように生体内ではフォスファチジ-ルイノシト-ルの代謝産物のDCと、スフィンゴリピッドの代謝産物のスフィンゴシンが細胞レベルでGC作用をそれぞれ増強、抑制していることが推定された。さらにプロテインキナ-ゼCの阻害剤のH-7やスフィンゴシンが初代肝細胞培養系、肝切片組織培養系でGCレセプタ-の核内移行を抑制し、Cytosol画分に熱ショック蛋白のHSP-90と結合した状態で留まることを明らかにした。以上の結果を基に、現在GC感受性リンパ性白血病の新しい機序に基づく治療法の開発を試みている。DGは、生理血中濃度のGC作用を著明に増強してL5178Yリンパ肉種の増殖を抑制するが、中でも炭素鎖18のDGが最も強い効果を示し、炭素鎖8,14のDGと有意の差を示した。しかしこれ等DGのプロテインキナ-ゼCの活性化能はほぼ等しい。またこれらのDGはいずれも下垂体からACTHの分泌量を変化させず、間脳下垂体-副腎間の調節系を障害しない。このように調節因子の脂肪酸の組成の違いによりこれ等の因子の細胞親和性が存在することが考えられ、副作用なしに標的細胞のみでのGC作用の増強、抑制が考えられ、これ等の可能性を現在検討している。
アンドロジェンによる脂肪酸合成調節機構の解析

ゴールデンハムスターのハーダー腺で見られる脂質組成の雌雄差が血中アンドロジェンにより調節される機構を明らかにすることを目的とし、研究を行った。雄ハムスターのハーダー腺からisovaleryl-CoA dehydrogenase(IVD)のcDNAをクローニングし、これをプローブとして用いて、遺伝子発現量を分析した。その結果、IVDの遺伝子発現量は血中テストステロン濃度に伴って増加し、酵素活性も増加が認められた。また、アンドロジェン受容体(AR)は腺内において発現が認められ、これもアンドロジェン投与後に経時的に増加するのが観察された。また、この増加はIVDの遺伝子発現量の増加に先だって起こっていることが示唆された。AR cDNAをクローニングしたところ、ヒトARの自己誘導に関与することが示されている配列と類似した配列が認められ、ヒトとハムスターで同様の機構により遺伝子発現が調節されている可能性が示された。ゴールデンハムスターではハーダー腺の脂質組織に顕著な雌雄差がみられる。これは脂肪酸合成が血中アンドロジェンレベルにより調節された結果と考えられた。そこでアンドロジェン受容体を介して脂肪酸合成が調節される機構を明らかにすることを目的とし、研究を行った。正常な雄では腺にIVO及びSBCADの活性が認められたが、去勢後2週間を経過した雄では極めて低い値であった。しかしtestosterone enanthate(TE)投与により経時的かつ濃度依存的な酵素活性の増加が認められた。ラットIVOcDNA配列をもとにプローブを作製し、ノザンブロット分析を行ったところ、IVOmRNA量はTE投与により増加が認められた。ARについて、腺内における発現を免疫組織化学的に分析したところ、去勢雄では少量の発現しか認められなかったが、TE投与後、経時的に増加するのが観察された。以上の結果からハーダー腺に見られる脂質組成の雄雌差はアンドロジェンによりIVO及びSBCADの発現が遺伝子レベルで調節された結果生じると考えられ、両酵素の発現調節にARが関与することが示唆された。
IoT システムのための形式検証手法の深化

IoTシステムの安全性保証は,IoTの普及とそのsafety-criticalな場面での利用が進むにつれ,大きな社会的課題となりつつある.この課題の解決のために大規模なIoTシステムの非自明な安全性を保証するための形式検証手法を提案する.具体的には,ソフトウェア検証の分野で成功を収めている検証手法を拡張し,人間が援助することによって自動検証プロセスをガイドするための手法を目指す.IoTシステムの安全性保証は,IoTの普及とそのsafety-criticalな場面での利用が進むにつれ,大きな社会的課題となりつつある.この課題の解決のために大規模なIoTシステムの非自明な安全性を保証するための形式検証手法を提案する.具体的には,ソフトウェア検証の分野で成功を収めている検証手法を拡張し,人間が援助することによって自動検証プロセスをガイドするための手法を目指す.
新生児脳神経障害における臍帯由来間葉系細胞の機能解析と新規治療への応用

神経傷害モデルとして、マウス胎児皮質ニューロンの初代培養を用いて、oxygen-glucose depletion(OGD)による神経傷害モデルを作成し、臍帯由来間葉系細胞(UC-MSCs)と共培養する系を用いた。通常培養条件ではニューロンはクラスターを形成し軸索を伸長するが、OGD後ではクラスター形成が破壊され、軸索萎縮が認められた。一方UC-MSCsと共培養するとこれらのクラスター破壊や軸索萎縮が改善する所見が認められた。このモデルに対してBDNFとHGFの中和抗体を用いてBDNFとHGFの神経修復への寄与を確かめることとした。結果、UC-MSCsは恒常的にBDNFやHGFといった神経栄養因子を分泌しており、その分泌濃度には少なからずロット差があることがわかった。UC-MSCsはOGDにより傷害されたニューロンに対して神経修復と神経保護の両方の作用を発揮し、UC-MSCsから分泌されるBDNF、HGFが重要な役割を担っていると考えられたが、特に神経修復作用においては中和抗体での検討にて他の分泌因子の関与も示唆された(Front Neurol. 2018;9:466.)。2018年5月より特別研究員PDとしてスウェーデンのカロリンスカ研究所に渡欧し低酸素性虚血性脳症モデルであるRice-Vannucci modelを作成し、UC-MSCsを用いて治療効果・メカニズムを検討している。また、in vitroにおいてもHIモデルを作成し発症メカニズムについて研究を継続している。平成30年度が最終年度であるため、記入しない。新生児脳神経障害における臍帯由来間葉系細胞の機能解析と新規治療への応用を検討するため、採用第1年度は、臍帯由来間葉系細胞(臍帯由来MSC)の神経保護効果を証明するための実験を行った。In vivoの脳性麻痺マウスモデルとして、新生仔脳出血モデルを作成し、手術2日後に臍帯由来MSCを静脈内投与し、その後の行動機能と病理学的評価を行った。また血清・髄液・脳組織での神経栄養因子の解析と、投与後臍帯由来MSCのtrackingとしてIn vivo imagingのIVISと、脳組織のAlu-PCRと免疫染色を行った。これらの結果より、臍帯由来MSC投与による行動機能の改善の機序としては、投与後臍帯由来MSCの神経分化・生着ではなく、臍帯由来MSCからのBDNFやHGFといった神経栄養因子の分泌によるものが考えられた。これらの結果について論文に受理された(Neuroscience. 2017 May 11;355:175-187)。本研究課題である、臍帯由来MSCが神経障害に対して保護効果をもたらすかどうかの検討を行い、in vivoの脳障害モデルにおいて神経保護効果をもたらすことを示した。これらの成果は臍帯由来MSCを神経障害に対する治療薬として用いる可能性を考慮する上で非常に重要であり、本研究課題の遂行に関しては概ね順調であると考える。今後はin vitroにおいて神経障害モデルを作成し、そこに臍帯由来MSCを共培養することで臍帯由来MSCから分泌される神経栄養因子の影響を検討し、shRNAや中和抗体を用いて阻止することにおいて検討を重ねる。更に新生児脳障害の中の低酸素性虚血性脳症モデルを用いて臍帯由来間葉系細胞を用いて治療効果、メカニズムを検討する必要がある。スウェーデンのカロリンスカ研究所は低酸素性虚血性脳症モデルであるRice-Vannucci modelを世界トップレベルで作成している施設であり、そのRice-Vannucci model作成技術を獲得し、臍帯由来間葉系細胞を用いて治療効果・メカニズムを検討することで、更に新生児脳障害に対する細胞治療としての可能性が広がるため、カロリンスカ研究所へ海外渡航してその実験を発展させる。
多波長ＬＥＤ照射による歯周疾患予防効果の向上

日常生活でも使用されているLED光を用いた安全で効果的な歯周疾患の予防方法を確立するために基礎的な研究を行った。歯周病原細菌に対しては青色LED単独照射や、白色LED光と光増感剤を組合わせた照射方法で殺菌効果が得られた。一方、ヒト歯肉線維芽細胞に対して波長の異なるLED光を単独照射したところ、赤色LEDは細胞増殖率に影響がなかったが、強い照射出力の青色LEDを照射すると細胞増殖率が減少した。これらのことから、LED光は歯周病原菌の殺菌作用を有するが、照射される周囲組織に対する安全性を配慮した照射条件を検討する必要があることが示唆された。LEDの波長の違いによる歯周病原性細菌の殺菌効果、ならびにヒト歯周組織由来培養細胞に対する影響を探索し、歯周疾患予防のためにLEDを臨床応用することを目的としている。昨年度、設計・製作したLED照射装置を用いて、照射条件の検討を進めている。歯周病原細菌のひとつであるPorphyromonas gingivalis(P.g菌)に対して、白色LEDの殺菌効果を示し、増感剤の検討を行なった学会報告に関しては、論文投稿し、受理・掲載された(日本レーザー歯会誌2013;24(2):p68-71)。白色LEDは口腔内を明るく照らすことができ、小型・軽量化が進んでいることから、家庭で一般的に使用できる歯周疾患予防器具の開発を進めていくうえで意義があると考えられるため、今後も研究を発展させる。安全かつ効果的なLED照射を行うことが重要であるため、細菌に対する殺菌効果が得られる照射条件に基づいたヒト歯周組織由来培養細胞への影響についての検討も進めることとした。一方、様々な種類のレーザー光による歯周病治療が実践されている中、LED光を用いた歯周疾患治療への期待も高まり、論文数も飛躍的に増加していることから、新たな報告の中には申請時に自身が検証すべきことに関して明らかとなることも少なくない。赤色、青色のLEDを用いた歯周病原細菌に対する殺菌効果などの研究報告がされたことから、今後はその再現実験を行うとともに、新たな着眼点や発想の転換が必要である。波長の違いにより口腔内におけるLight Emitting Diode(以下、LED)照射の効果が異なることが考えられるため、平成24年度は歯周病原性細菌の増殖抑制効果に焦点を当てた。これまで、いわゆる疑似白色LED(以下、白色LED)照射のP.gingivalis菌の増殖抑制効果について研究報告をしてきたが、まず白色LEDの2つのピーク波長に近い青色と緑色について検討した。その結果、青色LED照射の殺菌能の方が緑色LED照射に比べて高いこと、さらに青色LED照射よりも白色LED照射の方が殺菌能が高いことが示された。これは、弱いながらも緑色LED波長にも殺菌効果があることから、白色LED照射には青色と緑色の相乗効果が現れたものであると示唆している。上記研究を進めている上で、LEDに関する高度な工学的知識ならびに、細胞や細菌研究においてより精密なLED照射ができる装置の開発が必要であると確信した。そのため、これらの研究協力が得られる機関との連携をはかることとし、LED照射装置の設計・作製を依頼し、装置を入手した。この装置により詳細なLED波長データや均一なLED照射が可能となり、今後のLED照射研究成果の精度を向上させることが可能となったことの意義は大きい。完成したLED照射装置を用いて、今までの白色LED照射によるP.gingivalis菌の増殖抑制効果を検証し、さらに研究実施計画には記載していなかった光増感剤と白色LED照射とを組合わせたフォトダイナミックセラピーを歯周疾患の予防に取り入れることを提案した。そのため、白色LED波長と組合わせることでより効果的な光増感剤の検索を行った。LED光照射による、Porphyromonas gingivalis菌株(以下、P.g菌)の殺菌効果について、今年度は、標準菌株ATCC33277に加え、強毒株として知られているW83への影響を調べた。赤色光では殺菌作用が弱く、青色光では殺菌作用が認められた。白色LEDには様々な方式があるが、手用歯ブラシに搭載されている青色光と黄色蛍光体を組み合わせた方式の白色LED(以下、疑似白色LED)では、青色光以上の殺菌効果が見られた。P.g菌の有するポルフィリンの励起波長では青色光付近が最大であるが、500nm以上の複数の小さな励起波長(Q波)がある。疑似白色LED光は波長の幅が広く、Q波も網羅しているためだと考えられる。これらの殺菌作用に基づき、我々はヒト由来培養歯肉線維芽細胞株(以下、Gin-1細胞)に対するLED光の影響も調べた。歯周治療領域に応用するため、近年、数多くのLED光を用いた基礎研究がなされているが、そのどれもが既存のLED照射装置を用いているため、照射条件を細かく設定することができない。

しかしながら、我々が独自で作製したLED照射装置は、異なる波長のLED光を用いるだけでなく、照射出力(W)を変化させることができるため、青色光、赤色光の2波長のLEDの出力を100、200、300 mWとして、単位面積当たりのエネルギーが10、20、30 J/cm2となるようにGin-1に照射し、細胞増殖率をMTT改良法で調べた。その結果、赤色光では細胞への影響に変化はなかったが、青色光は出力を上げることにより、Gin-1細胞増殖率が減少する傾向が見られた。これらのことから、臨床応用に向けて安全な照射条件を探索していく必要があると考えられた。歯周病学LEDに対する歯周疾患予防・治療への関心が申請時よりも高まっており、当初の研究目的・計画に関して、既に報告がなされていることが多数ある。そのため、既存の報告と同様の研究に関しては再現実験を行いながら、研究意義を高めるためには、新たな発想・着眼点を模索せざるを得ない。申請時に行う予定でいた実際に人の歯周組織にLED光を照射する研究に関しては、学会発表、論文発表での質問、意見などに基づき、安全性を十分確認してから行うことがより重要視されていることが明らかとなった。そこで、臨床的な研究については倫理的な配慮から、基礎的なデータを収集した後に行うべきであるため、現在は行っていない。また、当初使用していた正常ヒト歯肉由来線維芽細胞株(Gin-1)の販売中止となったため、患者の抜去歯から細胞を分離培養することとなった。以上のことから、交付申請書に記載した研究計画とは異なる点が多数あるため、目的の達成度としては遅れていると考えるべきであるが、新たな研究の予備実験を同時に行っていく。平成24年度は多種の細菌や細胞を用いたin vitro研究を行うことを主な研究計画とした。LED波長は3種類を目標としていた。しかしながら、研究を進めていく上でLED照射の精度を上げるための装置の必要性を確信したため、その研究協力機関との連携、装置の開発を初年度に行うべき最重要課題とした。結果、研究目的の達成度としては、当初より遅れているが、今後のin vitro研究成果が期待できるものとなった。以前はレーザー光を主体に歯周病原細菌や歯周組織由来培養細胞に関する基礎研究、臨床研究を行っていた研究グループがLED光照射による歯周疾患予防・治療へと研究テーマを移行しており、歯周病原細菌に対する青色と赤色波長の比較検討をした論文が報告された。当初の3色の単波長LEDでのみ研究を行う研究計画に記載した内容と重複している。そのため、高齢社会が進み介護現場等での口腔ケアを重視していく必要があるため、口腔内の視認性を高い白色LED照射を研究計画に加えることとした。また、細菌、細胞といったin vitroで得られた結果を、すぐにヒト口腔内での臨床研究に移行する予定でいた。しかしながら、安全性に配慮した倫理的観点を学会発表、論文発表の際に指摘されることが多く、動物を用いたin vivoでの研究を行なったうえでヒトに応用すべきである。申請時には行っていなかったが、歯周疾患モデルラットを用いた他の研究テーマでの実験が進行しているため、LED照射研究も応用できるように研究計画を変更していく。
カイコの繭を彩るカロテノイドの搬送システムの分子機構解明と応用

血液リポタンパク質から特定の脂質のみを受け取る、組織の選択的取り込みのメカニズムを明らかにした。カイコには、中部絹糸腺にルテインまたはベータカロテンのみを取り込む選択性を示す突然変異体があり、これらは繭の色に明確な表現型を示す。前者は黄色の繭、後者は肉色の繭を作る。これらの遺伝子の分子実体をトランスジェニック法等により明らかにした。その結果、カロテノイド選択的取り込みはリポホリンレセプターであるSR-BIに属するパラログによって支配され、リポホリンからルテインとβ-カロテンを識別して取り込みを行うメカニズムを明らかにした。本研究は、同一ファミリに属するタンパク質のパラログによって異なるカロテノイドを認識することを明らかにした最初の研究となった。黄繭遺伝子(C)を持つカイコは、体液がカロテノイドを豊富に含む黄血(Y)ならばカロテノイドが絹糸腺に取り込まれ、繭は黄色となる。一方、劣性の対立遺伝子+^Cをホモに持つ場合は、カロテノイドが絹糸腺に移行せず、繭は白色となる。Cの分子実体をポジショナルクローニングによって同定した。Cは、哺乳類において血漿高密度リポタンパク質から細胞への脂質移行に関与するスカベンジャー受容体クラスBタイプI(SR-BI)の相同遺伝子Cameo2(C locus associated membrane protein homologous to SR-BI 2)であった。絹糸腺におけるCameo2の発現量をC系統と+^C系統で比較したところ、+^C系統において発現が強く抑制されていた。絹糸腺膜画分についてWestern解析を行ったところ、Cameo2は+^C系統においてタンパク質の発現も抑制されていた。中腸や精巣におけるCameo2の発現を調べたところ、C系統および+^C系統の両方で同様の発現が見られ、+^C系統における発現抑制は絹糸腺特異的におこっていることが分かった。また、黄血白繭を作るカイコにcameo2遺伝子を強制発現させたカイコが作出された。このカイコは、中部絹糸腺にも黄色の着色が復帰し黄繭が作られた。以上のことから、田中義麿によって報告されたC遺伝子の分子実体は、リポホリンレセプターであり、リポホリンからルテインのみを選択的に取り込むタンパク質であることが分かった。カロテノイドが血液から組織に取り込まれる際、決まったカロテノイドを選択的に取り込むことが知られている。申請者はカイコにはカロテノイドの選択的輸送に異常のある突然変異体が存在することから、カイコを用いてカロテノイドの認識機構の研究を行った。750種類以上存在するカロテノイドのうち、ルテインのみを取り込む機構の解明のため、絹糸腺細胞にルテインを取り込むことができない突然変異体を用いて、この原因遺伝子をポジショナルクローニングすることから研究を始めた。ある程度絞り込んだゲノム領域に存在する遺伝子について、対立遺伝子間での配列あるいは発現の違いを、ノーザンブロッティング、シークエンスなどで調べ、候補遺伝子配列を得ることができた。この候補遺伝子が、真の分子実体であるかの証明をするために、候補遺伝子をトランスジェニックの手法で導入し、表現型の復帰が起こるかどうか検討した。また、カロテノイドの認識機構を解明するためにリコペン、アスタキサンチン、フコキサンチン等をカイコ人工飼料に添加し、摂食させて繭まで搬送できるかを検討した。ルテインの特異的取り込みに関わる分子実体は、哺乳類において血漿高密度リポタンパク質から細胞への脂質移行に関与するスカベンジャー受容体クラスBタイプI(SR-BI)の相同遺伝子であることが判明した。このレセプターは血液リポタンパク質の受容体であり、リポタンパク質からルテインやアスタキサンチン等のキサントフィルを認識すると考えられた。F遺伝子についてポジショナルクローニングを行い、第6番染色体の499kbの範囲まで絞り込み、その範囲には26個の遺伝子が予測された。その中にCameo2のパラログであるScavenger receptor class B member 15(SCRB15)が存在した。SCRB15は、+^F系統の遺伝子において、Fと同じmRNAは作られなくなっていた。このことから、SCRB15は、F遺伝子の有力な候補遺伝子と考えられた。そこで、F遺伝子が、SCRB15をコードしていることを機能的に実証することを目的とし、中部絹糸腺にSCRB15をトランスジェニックの手法で強制発現させ、中部絹糸腺へのカロテノイドの取り込み量の変化を観察した。Cameo2配列を持つトランスジェニック系統とSCRB15配列を持つトランスジェニック系統をそれぞれ作出し絹糸腺を観察したところ、カロテノイドを取り込まない元系統に比べて、Cameo2を強制発現させた個体、SCRB15を強制発現させた個体では、カロテノイドの取り込みにより絹糸腺が着色しているのが観察された。

このカイコの中部絹糸腺からカロテノイドを抽出し、逆相カラムを用いたHPLCで分析したところ、SCRB15を強制発現させた場合はF遺伝子を持つ場合と同様にβカロテンが中部絹糸腺に選択的に取り込まれていることが分かった。本研究によって、基礎学術上では、カロテノイドの細胞内取り込みに選択性があらわれる機構が、リポタンパク質のレセプターであるCameo2とSCRB15によって規定される機構を解明した。カロテノイドの生体内搬送システムの研究は、他にほとんどなく、本研究は、カロテノイド搬送研究の基盤を構築し研究を先導し、加齢黄斑変性症で注目されている黄斑へのカロテノイド集積する機構は本研究を参考にして行われた。医学上からも、本研究は注目を集めカロテノイドの搬送研究の先導役を務めている。蚕糸業上からも、本研究はカイコが吐く絹の色を自在に変える技術の開発にも繋がり、化学染色による環境汚染の無い環境保全型の繊維産業を生み出す可能性を持った研究となった。