hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
物質輸送機能の修飾・制御を目的とした新材料の開発に関する研究

生体の持つ優れた物質輸送制御機能を理解し、医薬等の生理活性物質を効率よく目標部位に送達させる新材料の開発を目的として、生体の粘膜や皮膚、歯牙等の硬組織および細胞膜に着目した物質輸送機能の修飾制御について総合的に検討し、以下に示す結果が得られた。1.植物精油中の主要成分である単環モノテルペン類及びその同族体について非ステロイド系抗炎症薬インドメタシンの経皮吸収に及ぼす促進作用を調ベた。その結果、in vivo及びin vitroいずれにおいても、リモネンに代表される炭化水素系モノテルペン類に著しい活性が認められた。Draize法による皮膚一次刺激性試験を実施した結果、リモネンの皮膚刺激性は極めて弱く、既存の吸収促進剤として知られるAzone等に比較して生体への安全性に優れることが認められた。DSC、ケイ光分析及びNMRの測定により、リモネン及び関連化合物の皮膚角質層に対する影響について検討中である。2.単量体が歯質中に浸透、拡散して重合したハイブリッド層を界面に形成して重合体を結合させ、これのう蝕予防、歯科治療用材料への実用化を目指した基礎的データを集積した。その結果、フタル酸構造を持つ単量体を含むレジンのエナメル質側接着界面にはハイブリッド層が形成され、人工う蝕成法によってもう蝕の生成を見ず、優れた耐酸性を示すことがわかった。単量体を含まないMMA系レジンでは抑制効果はなかってことから、歯質への単量体の拡散により界面に形成されるハイブリッド層が重要であると結論できる。3.α_2ーマクログロブリンに結合したプロテアーゼ及びシトクロームCの外来プロテアーゼによる分解に対する耐性、熱に対する安定性を調べ分子輸送システムとしての妥当性を検証した。また、α_2ーマクログロブリンにプロテアーゼが結合する位置を免疫電顕法により決定した。
高サブク-ル下における高造流束沸騰現象と限界熱流束

沸騰熱伝達現象に影響を与える因子として、サブク-ル度が上げられることは良く知られている。本研究では細線を取り上げて、その影響について実験により研究した。最初に、飽和沸騰のおける線径の限界熱流束に対する影響を調べるために、沸騰曲線の実測及び限界熱流束の実測を行った。その結果、無次元半径が大幅に減少する傾向が確められた。次に、サブク-ル度の影響を調べるために無次元半径0.02と0.04の2種類の細線を用いてサブク-ル度の影響を調べるために、沸騰曲線の実測及び限界熱流束の実測を行った。その結果サブク-ル度が47.5度までは限界熱流束が、サブク-ル度にほぼ比例してゆく傾向が得られた。さらに、サブク-ル度が増加しても限界熱流束の値が増加することなく、ほぼ一定値になることが明らかになった。また、沸騰の様相の観察も行った結果、サブク-ル度が20度以上になると核沸騰の状態で線の全長から微細沸騰が見られた。
並列処理による機械組立図面の自動認識とアセンブリモデラの開発

本研究は,機械組立図面をイメージスキャナを用いてオフライン入力し,最終的にCADのコアモデルとして利用するためのアセンブリモデルに変換するまでの機械組立図面認識システムを開発し,併せて機械製品CAD用汎用アセンブリモデラのプロトタイプを開発することを目的として行った.前者の組立図面の認識については,予算が大幅に減額されたため,並列処理プロセサ-を実現することは不可能となったが,後者のアセンブリモデルのプロトタイプの開発については,大きな前進が見られた.アセンブリモデルに対する要求項目の調査をCADユーザー及びベンダーに対して行い,その要求される機能項目をまとめた.その項目は,主な対象及び適用範囲,部品のモデリング機能,アセンブリモデリング機能,ボトムアップ設計のサポート,トップダウン設計のサポート,コンカレントエンジニアリングのサポート、機能解析アプリケーション,加工用データの詳細,組立工程のアプリケーション用データ,他のアプリケーションなどからなる.これらの成果については,連名で,国際会議でその成果を発表した.本研究は,機械組立図面をイメージスキャナを用いてオフライン入力し,最終的にCADのコアモデルとして利用するためのアセンブリモデルに変換するまでの機械組立図面認識システムを開発し,併せて機械製品CAD用汎用アセンブリモデラのプロトタイプを開発することを目的として行った.前者の組立図面の認識については,予算が大幅に減額されたため,並列処理プロセサ-を実現することは不可能となったが,後者のアセンブリモデルのプロトタイプの開発については,大きな前進が見られた.アセンブリモデルに対する要求項目の調査をCADユーザー及びベンダーに対して行い,その要求される機能項目をまとめた.その項目は,主な対象及び適用範囲,部品のモデリング機能,アセンブリモデリング機能,ボトムアップ設計のサポート,トップダウン設計のサポート,コンカレントエンジニアリングのサポート、機能解析アプリケーション,加工用データの詳細,組立工程のアプリケーション用データ,他のアプリケーションなどからなる.これらの成果については,連名で,国際会議でその成果を発表した.本研究は,機械組立図面をイメージスキャナを用いてオフライン入力し,最終的にCADのコアモデルとして利用するためのアセンブリモデルに変換するまでの機械組立図面認識システムを開発し,併せて機械製品CAD用汎用アセンブリモデラのプロトタイプを開発することを目的とする。本年度は,これまでの研究結果に基づき,以下のような研究を行った。1.認識結果をアセンブリモデルに変換するアルゴリズムの開発を行った。組立図面中に含まれる潜在的な情報(三次元情報を含む)を最終的に三次元の明な情報形態をもつアセンブリモデルに変換するには,いくつかの中間的なモデルが必要である。この部分の研究は,ドラフティング(2次元CAD)における計算機内モデルの研究とも密接に関係するので,それらとの関連についても考慮しながら開発を行った。2.アセンブリモデルを生成・修正するためのアセンブリモデラの開発を行った。アセンブリモデルの枠組が定まれば,図面認識によって得られる出力結果を編集(修正)するため,あるいは直接アセンブリモデルを作成・修正するためのツールが必要になる。これをアセンブリモデラと名付け,使いがってのよい対話形ソフトウェアを開発した。本研究は,機械組立図面をイメージスキャナを用いてオンライン入力し,最終的にCADのコアモデルとして利用するためのアセンブリモデルに変換するまでの機械組立図面認識システムを開発し,併せて機械製品CAD用汎用アセンブリモデラのプロトタイプを開発することを目的として行った.前者の組立図面の認識については,予算が大幅に減額されたため,並列処理プロセサ-を実現することは不可能となったが,後者のアセンブリモデルのプロトタイプの開発については,大きな前進が見られた.アセンブリモデルに対する要求項目の調査をCADユーザー及びベンダーに対して行い,その要求される機能項目をまとめた.その項目は,主な対象及び適用範囲,部品のモデリング機能,アセンブリモデリング機能,ボトムアップ設計のサポート,トップダウン設計のサポート,コンカレントエンジニアリングのサポート,機構解析アプリケーション,加工用データの詳細,組立工程のアプリケーション用データ,他のアプリケーションなどからなる.これらの成果については,連名で,国際会議でその成果を発表した.
後シナプス機能制御におけるリン酸化チロシンアダプターの役割

脳海馬における記憶学習成立の基本的な分子機構として、グルタミン酸系神経の活性化応答におけるポストシナプスでのスパイン形態変化が知られている。本研究では、受容体型チロシンキナーゼのシグナル応答に関わる神経特異的ホスホチロシンアダプターN-Shc/ShcCが、NMDA受容体刺激後のアクチン骨格再編成へ寄与するメカニズムをスパイン裏打ちタンパク質であるHomerとの機能連関の有無を含めて明らかにすることを目的とした。前年度では、初代培養系海馬神経細胞へ種々のN-Shc/ShcCのリン酸化チロシン部位変異体を遺伝子導入し、その結果からN-Shc下流のRhoシグナルカスケードを遮断することによりスパイン数が顕著に減少することを見出した。本年度は、N-Shcの発現の有無によってin vivoでも海馬神経の樹状突起スパインの形態が変わるかどうかを調べる目的でN-Shcノックアウト(KO)マウスの、スパイン形態を野生株(C57/BL)と比較した。N-Shc KOマウス由来の初代培養系海馬神経細胞では、スパイン数が有意に増加していた。そこにN-Shcを強制発現させるとスパイン密度は野生型と同様な水準にまで回復した。一方、脳海馬切片スライスに遺伝子銃を用いて蛍光色素DiIを導入し、スパイン形態を調べたところ、初代培養系と同様にN-Shc KOマウスKOスパイン数が増加していた。以前、我々は、動物行動学的及び電気生理学的手法を用いて、KOマウスでの記憶・学習およびLTPの亢進を見ており、その一因がスパイン形態の変化にも起因することが推定された。さらに、N-Shcとアクチン骨格再編成とをつなげる分子としHomerに注目しているが、N-Shcとの相互作用する分子として、p250-RhoGAP/Grit/RICS分子がHomerとも相互作用することを、免疫沈降実験から確かめられた。従ってNMDA受容体-N-Shc-Grit-Homerという分子群の相互作用を通して、アクチン骨格再編成・スパイン形態変化を誘起し、神経機能を制御している分子機構の存在が想定された。脳海馬における記憶学習成立の基礎メカニズムとして、グルタミン酸系神経の活性化応答におけるポストシナプスでのスパイン形態変化が知られている。本研究では、種々の受容体型チロシンキナーゼのシグナル応答に関わる神経特異的なホスホチロシンアダプターN-Shc/ShcCが、NMDA受容体刺激後のアクチン骨格再編へ寄与するメカニズムを、スパインモルフォゲンであるHomerとの機能連関の有無を含めて明らかにすることを目的としている。本年度は(1)樹状突起スパイン形成におけるN-Shcの役割、および(2)N-Shc-Grit複合体とHomerとの相互作用を検証する実験を行った。その結果は次のとおりである。(1)N-Shc下流のRhoシグナルカスケードを遮断するN-Shc変異体を初代培養系海馬神経細胞に形質導入するとスパイン数が有意に減少したが、その変異体に更にN-Shc下流のGrb2/Ras/MAP2シグナルカスケードを遮断する変異を誘導するとスパイン数に変化は現われなかった。したがって、N-Shcを介したアクチン骨格制御系シグナルと細胞増殖・分化シグナルカスケード間のクロストークによるスパイン形成支配が存在することが示唆された。また、N-Shc KOマウスの海馬組織におけるスパイン数のカウントも遂行し、現在統計解析中である。(2)ラット成獣海馬からPSD分画を調整し、Homer抗体およびGrit抗体による免疫沈降実験を行ったところ、両者ともにPSD分画に多く存在することを確認した。しかし、Homer-Gritの結合は検出されなかった。主な業績としては、成体の脳機能と老化におけるN-Shcの働き(森、2006)、およびHomerに関する総説(Shiraishi-Yamaguchi, 2007)をとりまとめた。

以前、我々は、動物行動学的及び電気生理学的手法を用いて、KOマウスでの記憶・学習およびLTPの亢進を見ており、その一因がスパイン形態の変化にも起因することが推定された。さらに、N-Shcとアクチン骨格再編成とをつなげる分子としHomerに注目しているが、N-Shcとの相互作用する分子として、p250-RhoGAP/Grit/RICS分子がHomerとも相互作用することを、免疫沈降実験から確かめられた。従ってNMDA受容体-N-Shc-Grit-Homerという分子群の相互作用を通して、アクチン骨格再編成・スパイン形態変化を誘起し、神経機能を制御している分子機構の存在が想定された。
ロジウム(I)錯体の新規補助配位子の開発とヒドロホルミル化における選択性の研究

ヒドロホルミル化におけるRh(I)錯体触媒は一酸化炭素の強い配位子場で5配位飽和錯体が主要な触媒中間体と考えられるので、二座配位子が中心金属となすbiteangle120°のジホスフィン(1)を設計、合成した。これはbite angle90°付近の高い歪みを受けても二座配位が可能であることを確認する目的で、この1を含むRh(I)のカチオン性錯体を調製したところ、単量体と共に2量体を副生することが分った。かつ、興味深いことには、溶液中では2量体が単量体に変化することが明かとなった。従って、ジホスフィン(1)は触媒サイクル中5配位ジエカトリアル位、6配位シス位のいづれでもRh金属中心に配位し得ることが一応保証された。これら錯体を前駆体としてスチレン、酢酸ビニルのヒドロホルミル化に用いたところRhH(CO)_2(acac)+ジホスフィン系と同様分岐型アルデヒドの生成が認められた。またそのTurnover frequency(TOF)測定で1>Ph_2P(CH_2)_2PPh_2がいずれの場合にも観測された。上記錯体のX線結晶解析を試みているが、未だ成功していない。
離散世代対称性をもつ超共形ダイナミクスに基づく素粒子模型

超対称性は,電弱対称性の破れの起源を探る上で魅力的なアイデアである。本研究では,フレーバー非保存過程の抑制機構と暗黒物質の関係に着目した。フレーバー非保存を抑制機構としては,超共形相互作用によるものと連続的R対称性によるものの二つの場合を検討した。特に後者において,R対称性の破れを表すグラビティーノ質量と,ニュートリノ質量の生成機構および陽子安定性の関係を得た。非因子型の余剰次元模型は、強結合超対称理論と双対関係にあると期待されている。本年度は最初に、超共形模型における離散フレーバー対称性の選択に対してヒントを得るために、超対称化された非因子型余剰次元模型を取り上げた。この場合、5次元フェルミ場のキンク型質量項はフェルミオンゼロモードの局在化を制御するパラメータであり、これらをフレーバーごとに自由な値を仮定することにより、現実的なクォーク・レプトンの質量行列を再現することが知られていた。トップクォークの第一励起モードが極端に軽い場合を検討し、トップクォーク質量の微調整やビッグス質量への輻射補正が大きくなる可能性を考察した。しかし、フレーバー対称性については、明確な情報を引き出すことができなかった。一方、滞在型国際研究集会Summer Institute 2010の運営にたずされり、超対称理論から、宇宙論、素粒子実験にわたる多岐の分野の専門家を招待し、彼らと議論することができたのは大変有意義であった。前年度に引き続き、離散フレーバー対称性の選択に対してヒントを得るために、強結合超対称理論と双対関係にある非因子型の余剰次元模型を取り上げた。特に、超対称性がない場合に、電弱対称性の破れの精密測定からの制限を満たす模型の拡張やその場合のフレーバー構造などについて検討した。超対称模型の文脈では、超対称性を破る強結合セクタが低エネルギーにある場合の有効理論として、超対称標準模型を非線形に拡張する模型を取り上げ、特にヒッグス粒子の質量への補正がどこまで大きくできるかを検討した。一方、基礎物理学研究所研究会「標準模型を超えた素粒子理論へ向けて」に参加し、第三世代の超対称粒子が軽い模型の可能性について検討した。LHC実験の整理とそれを踏まえた超対称模型の展望について討論できたのは大変有意義であった。特に軽い第三世代超対称粒子を実現する可能性の一つとして、従来型のU(1)対称性の有効性を再認識できた。さらに、CFTセクタの束縛状態が、本計画が当初想定していた暗黒物質ではなく、第三世代のクォーク・レプトンである可能性は興味深く、詳細に検討することとした。初年度、強結合超対称理論と双対関係にあると期待されている(非因子型)余剰次元模型を取り上げたが、本年度は、超対称な余剰次元模型から予想されるN=2拡張超対称性を部分的に持つ模型として、R対称な超対称模型を取り上げた。連続的R対称性はフレーバー問題を解決する一つのアプローチである。連続的R対称性をもつ模型の特徴は、まずゲージセクタでは、ゲージ粒子の超対称パートナー(ゲージノ)に対し通常のマヨラナ型ではなくディラック型質量項を仮定すること、またヒッグスセクタでは、ヒッグス二重項を二倍に拡張し、ヒッグス場の超対称パートナー(ヒグシーノ)がディラック型質量項を持つことである。我々はさらに、一重項場がヒッグス場と結合することで、ヒッグスセクタでも超対称性が自発的に破れる模型を取り上げ、その模型において、ニュートリノ質量スケールを自然に再現できるR電荷を見出した。さらに、この結果がレプトンフレーバー構造に与える影響(ミュー粒子異常磁気能率やレプトンフレーバー非保存過程)の大きさを見積もるため、陽子安定性からの制限を検討した。また、この模型では、昨年度に取り上げた非線型超対称標準模型と同様、軽い擬ゴールドスティーノ(超対称性の破れに伴う南部ゴールトストン粒子)が現れる。この擬ゴールドスティーノは、超重力理論におけるグラビティーノとともに、(本研究で当初注目していた超共形セクタのかわりに)、暗黒物質やさらには暗黒輻射になる可能性がある。この可能性を検討するために、擬ゴールドスティーノを含む質量行列の固有値や固有ベクトルについて詳細な解析を行い、部分的な結果を発表した。以上の成果は、日本物理学会の他、SI2012*(台湾)、日独シンポ(金沢)、HPNP2013*(富山)、KEK-ph2013(つくば)などの国際研究集会において、共著者が発表した。(*はポスタ、他は口頭発表。)本研究では、「超対称なフレーバー問題」に対してCFTセクタとの強結合相互作用による解決を目指しているが,このアプローチの特徴は第一・第二世代の超対称粒子が比較的軽い(かつ縮退する)ことである。一方、LHC実験の最新結果は少なくとも第一・第二世代の超対称粒子が重いことを示唆しており、本研究のアプローチはなんらか修正を迫られている。24年度が最終年度であるため、記入しない。

上記の現状を鑑み、超対称模型におけるフレーバー問題からいったん後退し、関連する課題である閾値補正(重い場の効果)の計算手法の一般化に研究の重点をシフトさせる。この問題に手がかりを得るため、最近提唱された可能性-軽い第三世代の超対称粒子をCFTセクタとの強結合相互作用によって実現する可能性-を詳細に検討する。また、前年度に引き続いて、超対称性の破れのスケールが低い場合や超対称性の破れが複数共存する場合におけるヒッグス質量を検討する。24年度が最終年度であるため、記入しない。
Ｄｏｋファミリータンパク質の呼吸器疾患における役割

本研究では、チロシンキナーゼシグナル抑制性アダプター分子であるDokファミリータンパク質の呼吸器疾患、特に喘息における役割を検討した。Dokファミリータンパク質は、哺乳類では7種類知られている。喘息は種々の要因で発症するが、よく分かっている原因として免疫系の異常があげられる。免疫細胞には7種のファミリー分子のうち3種類が高発現しているため、本研究ではこの3分子を欠損させたマウスを用いて、喘息の表現型について野性型と比較検討した。最終年度には、研究成果のまとめを行った。平成24年度も引き続き,交付申請書に記載した研究の目的に沿って研究を実施した.具体的には,申請書に記載した方法によりマウスの喘息様表現型の精査を行なった.喘息の発症原因としては,現在,抗原依存的な免疫反応,炎症細胞から産生されるメディエーター,冷気に接触したりスポーツを行なった直後の要因と考えられる物理的因子,アスピリンなどが知られている.平成24年度は,このうち抗原依存的な反応と炎症反応に注目して研究を進めた.喘息は,その増悪因子として,ウイルス感染と職業的要因による外来物質の吸入/接触等が知られている.喘息に係る研究を進める上で,平成24年度はこれらの因子のうちウイルス感染に注目した.より具体的には,実験モデルとしてインフルエンザウイルスの感染系に注目し,この感染実験の個体レベルと細胞レベルの立ち上げを行なった.予め感染実験が適切に行なわれているかを確認するために,平成24年度は野生型のマウスおよび培養細胞を用いて予備検討までを行った.実際には,個体レベルの実験として,経気道的に感染力価の異なるインフルエンザウイルスをマウスに感染させた後,マウスの生存率と体重変化のウイルス力価依存性を検討した.また,細胞レベルの実験として,MDCK細胞を用いてこれにインフルエンザウイルスを感染させ,感染後24時間までの生化学的解析を行なった.以上の研究は,喘息とウイルス感染といった,非常に臨床的に多く見られる現象を対象としており,この実験系において機能している遺伝子の生理的意義を検討することは学術的に重要である.こうした研究意義に加えて,得られる研究成果は抗喘息薬や抗ウイルス薬の開発への展開も考えられ,応用としても重要である.本研究では、研究期間全体を通じてチロシンキナーゼシグナル抑制性アダプター分子であるDokファミリータンパク質の呼吸器疾患、特に喘息における役割を検討した。喘息は種々の要因で発症し、その一因として免疫系の異常が知られている。免疫細胞には7種のDokファミリー分子のうち3種類が高発現しているため、本研究ではこの3分子を欠損させたマウスを用いて喘息の表現型について野性型と比較検討した。合わせて最終年度には研究成果のまとめを行った。喘息の評価は次の通り行った。成獣マウスを用い、ケタミン/キシラジン麻酔下にて気管切開し、マウスを人工呼吸装置に装着した。その後、メタコリン濃度を段階的に上昇させて、それぞれにおける気道抵抗値を測定した。三重欠損マウスの呼吸機能の評価を行う際には野性型、単欠損および二重欠損マウスの気道抵抗値も同時に測定し、比較した。検討の結果、三重欠損マウスでのみメタコリン依存的な気道抵抗値の上昇が認められた。この理由を明らかにするため、肺胞洗浄液を調製し、この中に含まれるTh2サイトカインの量をELISAにて検討したところ、三重欠損マウスで有意な上昇を認めた。また、組織学的検討を行い、杯細胞増生と粘液産生など、Th2サイトカインの亢進と相関する表現型も認められた。従って、本研究で確認されたDokファミリー分子の三重欠損マウスの喘息様表現型は、免疫細胞の異常な活性化により引き起こされたものと結論された。喘息の要因は多様であるが、本研究の成果により、チロシンキナーゼシグナル制御の重要性が明らかになった。この成果を基に、新たなチロシンキナーゼシグナル制御薬の開発などへの応用的発展が期待される。閉塞性肺疾患は気流制限を伴う肺疾患であり、喫煙や感染、その他の原因による血液細胞の活性化が主な原因と考えられている。抑制性アダプター分子Dokファミリータンパク質はこれらの血液細胞に発現し、チロシンキナーゼシグナルを負に制御している。本研究では、これら分子の遺伝子欠損マウスが呼吸器疾患、特に閉塞性肺疾患様病態や炎症との密接な関係の有無について検討する。さらにその他各種肺疾患モデルでこれらの分子が欠損した影響を精査する。こうした研究成果を踏まえ、本研究では、呼吸器内科学領域におけるアダプター分子の生理機能解明と、新たな閉塞性肺疾患の予測因子もしくは種々の肺疾患の増悪因子としての臨床的意義の確立を目指している。そこで平成23年度は、呼吸器疾患におけるこれら遺伝子の機能を明らかにするため、遺伝子欠損マウスを用いてその生理的役割の検討を行った。特に、本年度は、種々の呼吸器疾患モデルにおける当該遺伝子の機能解明のための予備的知見を得ることを目的とし、まず未処置状態におけるこれらマウスの表現型の精査を行った。

次に呼吸器疾患モデルの中で検討例が多い、卵白アルブミン誘導性気管支喘息モデルにおけるこれらの分子の生理的意義を解析した。以上の検討の結果、本研究によりチロシンキナーゼシグナルの制御破綻が呼吸器疾患の一因となることが示唆された。この結果を元に、チロシンキナーゼシグナルの上流および下流での制御因子をはじめとし、その他機能的な関連が予測される遺伝子につき注目し、呼吸器疾患における遺伝子の機能解明に関する研究を推進している。概ね順調に研究が進んでいる.現在,個体/細胞レベルの感染実験と平行して,実験材料として用いるウイルスの増幅を発育鶏卵を用いて行なう等の準備作業も合わせて行なっている.この作業も大体計画通りに進行しており,研究全体として,所定の達成度で研究が進行していると思われる.気道過敏性に注目した喘息モデルの研究は当初の研究計画以上に進展したと思われるが、感染と急性肺傷害モデルの研究については若干の遅れがあるため。今年度は,野生型マウスで実験的に確立した実験条件を,各種遺伝子改変マウスに応用して実験データを蓄積して行く予定である.このことにより,喘息とインフルエンザ感染における,研究対象遺伝子の生理的意義を解明して行きたい.本年度に解析を進めた喘息を含む呼吸器内科領域疾患について、当初計画に従いDokファミリータンパク質の呼吸器疾患における遺伝子の機能解明に関する研究を推進する。また、平成23年度の研究成果より、チロシンキナーゼシグナルの破綻が呼吸器疾患の一因と考えられた。そのため、今後はチロシンキナーゼシグナル上流および下流の遺伝子および機能的な関連が予想される遺伝子も視野に入れ、研究を推進する。次年度は,引き続き動物実験と細胞培養実験を行なう.このため所定の経費が発生する.本年度と同様に計画的に使用することを予定している.なお,本年度において次年度使用額が発生した理由は,研究代表者の異動に伴う研究体制の回復期間において,消耗品その他への支出が一時的に減少した状況にあったためである.本年度は、当初検討を予定していた感染モデルと急性肺傷害モデルの動物実験の実施が未了であった。そこで、次年度の研究費を使用し、この未了分の解析を実施する。その他の研究計画に特筆すべき変更はない。
好中球を介したアナフィラキシー様症状発現機構の解明

補体C5aは肥満細胞からヒスタミンを遊離する作用をもち、アナフィラトキシンとして知られる。リポ多糖(グラム陰性菌細胞壁成分)前投与マウスにC5aを投与すると致死的なアナフィラキシー様ショックが誘導された。他方、C5a単独投与の場合、直腸温の低下(マウス全身性アナフィラキシーの指標)は誘導されたものの、致死的ではなかった。意外なことに、リポ多糖とC5a投与により誘導されるアナフィラキシー様ショックは肥満細胞に依存せず、好塩基球と好中球、ヒスタミンに依存した。これらの結果から、先行する細菌感染が好中球の活性化を介して全身性アナフィラキシー重篤化を招く可能性が示唆された。まず、マウスにリポ多糖(LPS)と抗好中球モノクローナル抗体(抗Ly-6G抗体)投与すると補体系活性化が誘導されることを示すために、LPSおよび抗Ly-6G抗体投与後のマウス血球のフローサイトメトリー解析を行った。抗C1q抗体により補体C1qの好中球への沈着の検出を試みたが、これまでのところ補体C1qの好中球への沈着は検出されていない。今後、実験条件のさらなる検討、また、C3など他の補体成分の沈着の検出を試みるなどの工夫が必要と考えられる。次に、LPSと補体C5a投与によりマウスに誘導されるアナフィラキシー様ショックに関与する分子・細胞メディエーターの解明を試みた。LPSとC5a投与により誘導されるショックはヒスタミンに依存し、血小板活性化因子(PAF)に依存しないことが明らかとなった。また、枯渇実験の結果から、好塩基球の関与が示唆され、好中球の関与は否定された。さらに、肥満細胞欠損W/Wvマウスを用いたショック誘導実験から、肥満細胞の関与も否定された。以上から、当初の予想と異なり、LPSとC5a投与によるショックはLPSと抗Ly-6G抗体投与によるショックと機序が全く異なることが明らかとなった。すなわち、LPSとC5a投与によるショックには好塩基球とヒスタミンが関与し、LPSと抗Ly-6G抗体投与によるショックには好中球とPAFと補体C5が関与する。本研究はアナフィラキシー症状発現機構に新たな知見を加えるものであり、さらに詳細を追求したいと考えている。マウスを用いて、リポ多糖(LPS)と抗Ly-6G抗体(抗好中球抗体)投与により誘導されるショックとLPSと補体C5a投与により誘導されるショックの発症機序をそれぞれ検討した。これまでの研究から、LPSと抗Ly-6G抗体投与により誘導されるショックには補体C5が関与することが分かっていたが、どのタイミングで関与するかが不明であった。そこで、マウス血清中のC5a濃度をELISA法により経時的に測定したところ、LPS投与1時間後、一過性にC5a濃度の上昇が観察された。それに対し、抗Ly-6G抗体投与後、血清中C5a濃度の上昇は観察されなかった。従って、C5aはLPS投与により産生され、LPSによるショックのプライミング効果に関与するものと思われた。次に、LPSとC5a投与により誘導されるショックの作用機序を検討した。これまでの細胞枯渇実験の結果から、このショックには好塩基球が関与し、好中球は関与しないと考えていた。しかし、これらの細胞種を両方枯渇したところショックによる致死率が完全に抑制されたため、好塩基球に加え、好中球もショック症状発現に関与することが明らかとなった。また、C5a投与直前にヒスタミンH1受容体阻害薬(ピリラミン)を投与したところショックによる致死率が減少したため、C5aが好塩基球や好中球からのヒスタミン遊離を促進する可能性が示唆された。平成24年度の研究計画はほぼこなした。ただし、LPSと抗Ly-6G抗体投与により誘導されるショック、LPSと補体C5a投与により誘導されるショックの発症機序はそれぞれ当初の予想と異なるようであり、実験計画の修正が求められる。25年度が最終年度であるため、記入しない。それぞれのショックについて別々に発症機序を解明することを目指す。LPSと抗Ly-6G抗体投与により誘導されるショックに関しては、好中球活性化機構と補体系の役割を明らかにする。LPSとC5a投与により誘導されるショックに関しては、好塩基球とヒスタミンの役割を明らかにする。
遺伝子改変マウスを用いた血球特異的ＧＴＰａｓｅ　ＲｈｏＦの機能解析

RhoFは脊椎動物以降の造血系、神経系細胞に発現する低分子量GTPaseであり、Cdc42を介さない特徴的な長いfilopodia形成を制御しているが、下流エフェクターは同定されていない。今回我々は全身性にRhoF遺伝子を欠失させた遺伝子組み換えマウスを作製し、RhoFの血液・免疫系への関与を解析した。RhoF遺伝子欠損マウスはメンデルの法則に従い出生し、胎生致死ではないことが判明した。末梢血液細胞数、血小板機能等は野生型と差がなかった。胸腺、脾臓等の解析からRhoF欠損マウスでは脾臓の辺縁領域の低形成が見られた。RhoFが脾臓におけるBリンパ球分化に重要な役割を果たしていることが示唆された。RhoFは主に血球、腸管に発現するRhoファミリーGTPaseであり、細胞内ではfilopodia (細胞先端のマイクロスパイク状の構造)内に存在することが知られている。Mycosis fungoides等のTリンパ球性リンパ腫の一部でRhoF遺伝子の欠失が報告されているが、生体内での機能は不明である。本研究ではRhoFノックアウトマウスを作成し、その表現型解析を通して生体内におけるRhoFの機能を解明することを目的とする。本研究グループはマウスRhoF cDNAクローンの単離、それをプローブに用いてマウスRhoF遺伝子クローンを単離した。これをもとにターゲティングベクターmRhoF KO/pNTを作製した。ターゲティングベクターをD3 ES細胞に導入し、G-418入りのES培地により選択培養し、相同組換え体を単離・同定した。これをC57BL/6Jマウスより採取した胚盤胞に注入し、回復を待って仮親の子宮に移植した。仮親から産まれたキメラマウスをCAG-Creマウスと交配することによりRhoFノックアウトマウスを作製した。RhoF欠損マウスはメンデルの法則に従い出生し、胎生致死でないことが判明した。胸腺、脾臓等を解析した結果、脾臓の辺縁領域の低形成が認められた。RhoFノックアウトマウスでは脾臓におけるBリンパ球の分化に異常が見られる可能性が示唆された。これは他のRho family GTPaseであるRhoA, Cdc42のB細胞特異的ノックアウト、造血細胞のみに発現するRac2のノックアウトに類似した所見であった。当研究グループは、マウスRHOF cDNAクローンの単離、ならびにそのcDNAをプローブに用いて129SVJマウスのゲノムライブラリーをスクリーニングすることにより第1エクソンを含むマウスRHOF遺伝子クローンの単離した。これをもとに既にネオマイシン耐性遺伝子とチミジンキナーゼ遺伝子によるポジティブネガティブセレクション用のターゲティングベクターmRHOF KO/pNTを作製した。ターゲティングベクターをES細胞にエレクトロポレーションにより導入し、G-418入りES培地により選択培養し、相同組換え体を単離、同定した。仮親から生まれたターゲットアレルを持つキメラマウスをCAG-FLPe Tgマウスと交配することによりコンディショナル(flox)アレルを持つマウスを得る事が出来た。floxアレルを持つマウスとCAG-Cre Tgマウスと交配することにより全組織でRHOFを欠失したマウスを得る事が出来た。RHOF欠損マウスはメンデルの法則に従い出生し、胎生致死ではないことが示唆された。現在血液系の表現型について詳細な検討を行っている。フィロポディアはアクチンに富むスパイク状の細胞突起であり、細胞の遊走、血管新生、貪食等に必要である。フィロポディアを制御する分子はRho GTPaseの一種Cdc42とRhoFのみである。Cdc42ノックアウトマウスは胎生致死を来たし血球特異的なCdc42コンディショナルノックアウトマウスは骨髄系前駆細胞の増加と赤血球造血のブロックを示し骨髄増殖性疾患を来す。このことからフィロポディアは正常造血に必須であると考えられている。RhoFは脊椎動物以降の骨髄、リンパ球等にのみ発現する低分子量GTPaseであり、Cdc42を介さない特徴的な長いフィロポディア形成を制御している。RhoFの下流エフェクターは殆ど同定されておらずノックアウトマウスも未報告であり、その造血細胞における機能は不明である。研究代表者らはRHOFコンディショナルノックアウトマウス作製により血球系におけるRhoFの機能解析を計画した。

ターゲティングベクターmRHOF KO/pNTをES細胞にエレクトロポレーションにより導入し相同組換え体を単離、同定した。これをC57BL/6Jマウスより採取した胚盤胞に注入し、回復を待って仮親の子宮に移植した。仮親から生まれたターゲットアレルを持つキメラマウスをCAG-FLPe Tgマウスと交配することによりコンディショナル(flox)アレルを持つマウスを得る事が出来た。floxアレルを持つマウスとCAG-Cre Tgマウスと交配することにより全組織でRHOFを欠損したマウスを得る事が出来た。RHOF欠損マウスはメンデルの法則に従い出生し、胎生致死ではないことが判明した。末梢血液細胞数、血小板機能等は野生型と差がなかった。胸腺、脾臓等を解析した結果、RHOF欠損マウスにおいて脾臓の辺縁領域の低形成が見られた。RHOF欠損により脾臓におけるBリンパ球の分化異常の可能性が示唆された。血液・免疫本研究グループは既に、全組織でのRhoF欠損マウスの作製に成功している。RhoF欠損マウスはメンデルの法則に従い出生し、胎生致死でないことが判明した。胸腺、脾臓等を解析した結果、RhoF欠損マウスでは脾臓の辺縁領域(marginal zone)の低形成が認められた。RhoFが脾臓におけるBリンパ球の分化関与している可能性が示唆された。現在長期飼育による悪性腫瘍発症の有無につき現在検討中である。また廃棄血小板を試料としてエフェクター探索用のアフィニティクロマトグラフィー法も確立しており、研究計画書の平成25年度の目標は概ね達成できているものと考えられる。当研究グループは既に各種ベクターの構築と導入効率の検証のみならず、RHOFノックアウトマウスの作成に成功しており、研究計画書の平成24年度の目標は概ね達成出来ているものと考えられる。アフィニティ精製法も確立しており迅速な研究推進が可能である。研究分担者の松下の所属する名古屋大学医学部附属病院輸血部では過去に多くの遺伝子改変マウスを作製、解析した経験があり迅速な研究の進行が可能である。研究分担者の天野の所属する名古屋大学大学院神経情報薬理学講座では多年にわたりRho family GTPaseの研究に従事しており、微量蛋白質を網羅的にマススペクトロメトリーにて同定可能なシステムを完成させている。以上のことから研究はおおむね順調に進展していると判断される。RhoF欠損マウスの解析:野生型とRhoF欠損マウスの免疫器官(胸腺、脾臓、リンパ節)の形態の差異を免疫染色により詳細に検討する。さらにTNP-LPSなどの抗原刺激に対する抗体産生能、種々のケモカインに対するB細胞の遊走能等を野生型と欠損マウス間で比較検討する。アフィニティクロマトグラフィーを用いたRhoFの新規エフェクター探索:マウス表現型の解析とともに、mDia1/2以外の新規RhoFエフェクターの同定を試みる。研究代表者らは既にGST-RhoF Q71L, T33N蛋白を精製し、血小板からの細胞質分画を用いたアフィニティクロマトグラフィー、LC-MS/MSにより結合蛋白を同定する系を確立しており、迅速な研究の遂行が期待できる。RHOFコンディショナルノックアウトマウスの解析:1免疫系の検討:
江戸の女流文学者荒木田麗女とその作品について

本年度は第一に、荒木田麗女の連歌活動について分析した。連歌資料『荒木田麗女連歌発句評』を用いて、麗女が地元伊勢の連衆に行っていた連歌指導について考察した。本書において、麗女は古歌や『源氏物語』、『伊勢物語』等の古典作品を下敷きにした作句を勧めながらも、典拠の影響を受け過ぎ、本歌・本説に使用される言葉ばかりを使用して一句を構成することは良くないと戒めている。また、発句と平句との詠み方の違いや、千句連歌の発句と百韻連歌の発句の詠み方の違い、切字等について自身の見解を述べている。これらから、麗女が発句の規定や、差合等、連歌式目に関する知識を豊富に有していたことが窺える。こうして得られた結果をもとに、俳文学会第65回全国大会において、「近世期における伊勢神宮神官の連歌ー荒木田麗女の連歌指導からー」との題目で発表を行った。第二に、麗女の国学の分野に関して研究を行った。麗女は自作の擬古物語『野中の清水』をめぐって、安永年間に国学者本居宣長と論争を行っている。麗女と宣長は、古典文法や言葉の雅俗の相違、また、擬古物語に漢詩を引用することの是非等について論を戦わせた。そこで宣長の『野中の清水添削』と宣長に対する麗女の反論書『本居宣長慶徳麗女難陳』を対照し、論争内容を分析した。その結果、両者の論争は文章表現上の些末な問題に始終するかに見えるが、根本的な論争原因は、両者の和文創作の方法と学問観の相違であると判明した。以上から、麗女と宣長の論争を通して、近世中後期の国学者が和文を執筆する際に、どのような文体を模索していたのか、その課程について明らかにすることができた。こうして得られた結果をもとに、論文「荒木田麗女と本居宣長ー『野中の清水』論争をめぐってー」をまとめ、『近世文芸』第99号に投稿し、掲載された。(抄録なし)2011年度は、女流文学者荒木田麗女の作品の中で、連歌の活動に重点を置いて研究した。現代において麗女は歴史物語及び擬古物語によって有名であり、先行研究でもそれらの分野に注目したものが多く、連歌については詳細な研究がなされていない。しかし、麗女は幼少期から晩年に至るまで連歌に取り組み続けており、途絶えていた伊勢の豊宮崎文庫連歌会を再興する等、連歌に熱意を注いでいた。さらに連歌社中においては指導的役割を果たしている。有名な連歌師である西山宗因の曾孫西山昌林や、里村昌琢の子孫里村昌迪に師事する等、連歌を通しての有名な文人たちとの交流も多かった。このように、連歌は麗女文芸の基盤をなすものといえる。そこで、麗女の連歌作品『麗女独吟千句』を中心として、その成立事情、典拠となった古典作品、手引きとした類題集等を明らかにし、麗女の連歌における特徴を考察した。その結果、『麗女独吟千句』の特徴は本歌・本説に強く依拠した句作態度と、それを支える詳細な自注であると結論づけられた。作中のほとんどの句には古典から典拠が求められ、歌書においては『夫木和歌抄』、『万葉集』、『新撰和歌六帖』、『拾遺和歌集』、物語においては『源氏物語』『宇津保物語』、『伊勢物語』、『狭衣物語』、『栄花物語』、『大和物語』等から着想を得ていることが判明した。数多くの擬古物語を執筆し、自らの作品中に王朝物語の世界の再現を目指した麗女は、連歌においても様々な古典作品を典拠として、独吟千句の中に古典世界の再現をもくろんだとの結論が得られた。以上の成果を、俳文学会第63回全国大会において発表した。また、擬古物語の分野においては、従来散逸したものとされていた平安王朝を舞台とする物語『をだまき』が、石水博物館に所蔵されているのを発見し、調査を行った。その結果、『をだまき』の成立事情や、その内容が『源氏物語』「須磨」巻に強い影響を受けていること等が判明した。そして得られた結果と全文の翻刻を、『人文資料研究』に掲載した。2012年度は荒木田麗女の国学に重点を置いて研究を行った。麗女は松阪に本居宣長、宇治山田に荒木田久老が住むという国学興隆する伊勢の地に暮しながら、国学に関心を持たず、宣長と論争を行ったことを除いては国学者たちと交流を持たなかったと考えられて来た。しかし、白百合女子大学図書館に所蔵される資料『真字古今集をあげつろひし詞』(龍草盧著)から、麗女が賀茂真淵の門人であった京の学者、龍草盧と師弟関係を有し、頻繁に交流を持っていたことが判明した。そして、麗女が草盧を通して真淵の孫弟子という関係に当たることも明らかになった。しかし、麗女は草盧が真淵の教えに疑問を持ち、真淵門下を離れた後の弟子であるため、真淵の学問体系は継承していない。次いで『真字古今集をあげつろひし詞』の内容を詳細に検討した所、麗女の師の草盧は、『古今集』は撰定された当初は真名で書かれており、後世になって仮名に書き換えられたと考えていたことが判明した。

このような見解に、麗女も少なからず影響を受けていたと考えられる。また、麗女と本居宣長との間に起こった論争について、調査を行った。この論争は麗女の擬古物語『野中の清水』に宣長が批評・添削を加えたことを発端として始まり、二人の間では再三にわたる論難応酬が行われた。先行研究では、本論争は国学の大家である宣長の正当な添削に、麗女が素直に従わなかったに過ぎないと解され、対等な論争であるとは見倣されていなかった。そこで、宣長に対する麗女の反論文、『本居宣長慶徳麗女難陳』によって、論争の経緯や論点等を分析した。その結果、本論争が『古事記』、『万葉集』を重視する宣長と、後世の学問を重視する麗女との学問観及び、そこから派生する擬古物語観に関わるものであることが確認できた。以上、麗女の国学に関する見解や、師弟関係等を考察することによって、麗女の学問の内実に迫ることができた。また、近世期における女流文学者の活動の一端を明らかにすることができた。本年度は第一に、荒木田麗女の連歌活動について分析した。連歌資料『荒木田麗女連歌発句評』を用いて、麗女が地元伊勢の連衆に行っていた連歌指導について考察した。本書において、麗女は古歌や『源氏物語』、『伊勢物語』等の古典作品を下敷きにした作句を勧めながらも、典拠の影響を受け過ぎ、本歌・本説に使用される言葉ばかりを使用して一句を構成することは良くないと戒めている。また、発句と平句との詠み方の違いや、千句連歌の発句と百韻連歌の発句の詠み方の違い、切字等について自身の見解を述べている。これらから、麗女が発句の規定や、差合等、連歌式目に関する知識を豊富に有していたことが窺える。こうして得られた結果をもとに、俳文学会第65回全国大会において、「近世期における伊勢神宮神官の連歌ー荒木田麗女の連歌指導からー」との題目で発表を行った。第二に、麗女の国学の分野に関して研究を行った。麗女は自作の擬古物語『野中の清水』をめぐって、安永年間に国学者本居宣長と論争を行っている。麗女と宣長は、古典文法や言葉の雅俗の相違、また、擬古物語に漢詩を引用することの是非等について論を戦わせた。そこで宣長の『野中の清水添削』と宣長に対する麗女の反論書『本居宣長慶徳麗女難陳』を対照し、論争内容を分析した。その結果、両者の論争は文章表現上の些末な問題に始終するかに見えるが、根本的な論争原因は、両者の和文創作の方法と学問観の相違であると判明した。以上から、麗女と宣長の論争を通して、近世中後期の国学者が和文を執筆する際に、どのような文体を模索していたのか、その課程について明らかにすることができた。こうして得られた結果をもとに、論文「荒木田麗女と本居宣長ー『野中の清水』論争をめぐってー」をまとめ、『近世文芸』第99号に投稿し、掲載された。荒木田麗女の著作について、擬古物語・連歌・俳譜・漢詩・国学・紀行文等のそれぞれの分野の特色を考察する計画であり、2011年度は連歌について重点的に研究した。その結果、麗女の生涯における連歌活動の概要や、連歌師たちとの交流、連歌師としての評価及び、麗女における連歌文芸の特色を明らかにすることができた。また、擬古物語の分野においても、散逸したと考えられていた作品『をだまき』を発見することができ、『源氏物語』からの影響を確認することができた。2012年度は麗女の国学に関する活動を中心に研究を行った。その結果、白百合女子大学図書館に所蔵される資料、『真字古今集をあげっろひし詞』から、賀茂真淵、龍草盧、麗女と続く国学の学統が明らかになった。麗女の学統が確認できたことから、麗女の国学に関する研究方法や見解が明らかになった。また本居宣長との論争の詳細についても判明した。その成果について学会発表を3回行い、学術論文5編を発表した。論文5編中3編は査読誌への掲載であり、結果的に本年度の取り組みの成果が学界において評価されたと考えられる。
孤立性左室心筋緻密化障害の予後予測因子の解明

孤立性左室心筋緻密化障害(Isolated Ventricular NonCompaction : IVNC)は左室の拡大した症例や心ポンプ機能が低下している症例が多いとされ、一般的に予後不良であると推測されている。IVNCの予後予測因子の解明する目的にて当院にて心エコー図検査を行った連続3145例のうち心尖部まで評価可能であった2766例についてIVNC診断基準に基づき症例を分類し発生率を調査した。また、診断基準を満たす症例のうち、典型的なIVNC症例と心臓に特有の構造を有する以外は正常心機能を呈する症例について心エコー図データ、心電図、致死的不整脈、サイトカイン(BNP)測定を行い比較検討した。IVNCの診断基準を満たす肉柱構造を有する症例は31例(1.12%)であった。そのうち典型的なIVNCと考えられる症例は16例(0.58%)、心臓に特有の構造を有する以外は正常心機能を呈する症例は4例(0.14%)であった。この典型的な症例においては心機能が低下し、左室拡張末期径(LVDd)は拡大傾向を示した。また心電図、致死的不整脈においては典型症例に左脚ブロック、心室頻拍を多く有していた。BNP値は典型症例のほうが高値を示していた。IVNC診断基準を満たす症例は、過去の報告に比べやや高頻度であった。またこれらの症例の中には、心拡大や心電図異常、致死的不整脈を有する典型的なIVNCとは異なり、一見正常とも考えられる様相を示す症例が存在していた。これら症例の予後については現時点では断定できず、長期の経過観察が必要と考える。
培養組織構成細胞を層状に再構成した人工気管の開発

ダクロン素材全長に穿孔加工を施し、内腔保持のためスパイラル状金属ステントを内挿したporous typeの人工気管を開発し、大型犬の胸腔内気管移植実験を重ねてきた。このモデルでは、移植時に大網を人工気管全体に被覆することで、穿孔加工部からの空気漏れを防止すると同時に、大網から人工気管内腔への肉芽侵入と、その肉芽上に吻合部生体気管からの気道上皮誘導を企てた。その結果、移植後約1ヶ月で肉芽がステントを含め人工気管内腔全体を被覆、術後23カ月でその肉芽上に気道上皮誘導を確認することができた。それによりこれまで人工気管の問題点とされてきた吻合部狭窄や人工気管内腔の感染も無く、約2年に亘る生着が再現性をもって観察できるに至った。そしていくつか試作した多孔化人工気管のうち、穿孔径500μm、穿孔密度64ヶ/cm^2が有効であることがわかった。しかし組織学的検討では、人工気管素材周囲には異物反応のため、常に炎症性細胞浸潤があり、そのため人工気管内腔が上皮化しても、素材と接した部分では組織の繊維化が進行し、しいては人工気管内腔の狭窄へつながる事が判明した。一方で、移植した人工気管周囲には気管壁を構成すべく結合組織が大網によりしっかりと形成されていることも判明した。次に、組織工学手法を導入し、培養線維芽細胞をフィブリングルーに入れ、人工気管に付着させたハイブリットタイプの人工気管を作成し、これを移植した。組織侵入速度に有意な差は無いが、この系においても1年を越える長期生着が再現性をもって観察できるに至った。ハイブリット化の意義は人工気管内腔が全長にわたり上皮化するまでの間、感染や異物反応を極力抑制することにあると考えられる。現在ハイブリット化のための、細胞培養に関して線維芽細胞以外に気道上皮、血管内皮を培安定して継代培養出来る様になった。1人工気管matrixをporous typeとし、大網巻絡に依る周辺組織の気管腔内侵入を企図する系:従来の研究の延長として実施。ダクロン管内面にスパイラルのシリコンステントを焼き付け、700・300μの穿孔加工モデルをそれぞれ犬3頭、2頭に埋植した。700μでは術後3ヶ月の開存率は100%で内腔に組織侵入を得て円柱上皮の誘導を見たが経時的に過剰肉芽が内腔を狭窄、300μ群では組織の進入を得なかった。孔径を調節すれば長期の開存が期待できると判断して予定を変更、予定の5頭に加え、500μモデルを作成、3頭に埋植、現在術後25ヶ月、組織侵入を得て開存率も80%程度と良好である。2線維芽細胞・気道上皮細胞の培養:線維芽細胞の培養は既に達成しているので、気道上皮細胞の培養系確立を企図。培養素材の採取法により(1)気管支鏡下ブラッシングによる上皮細胞採取;抗生剤添加PBS培地で除菌、上皮細胞を選別、DME培地で培養、コロニーは生じたが細胞剥離のため継代に至らず。(2)切除気管からの上皮採取;3日で35mmシャーレにconfluentに増殖、6倍面積まで継代可能。(3)気管支鏡下生検鉗子に依る採取;現在上記の(2)に準じ検討中。

3培養細胞の層状構成に向けて:上記1で、ダクロン管にても組織親和性を得る見通しを得たので、フィブリン糊で線維芽細胞・気道上皮細胞を多孔化ダクロン管に接着せしめる方針とした。そこで現在、上記2(2)で得た気道上皮細胞がフィブリン糊の中でどの程度の期間生存し得るかをin itroで検討中である。1、人工気管の移値;昨年までの実験において、多孔化人工気管内腔に外部から組織誘導を得るためには、その穿孔径は500μが有効であることがわかった。しかし、人工気管内腔保持のため、人工気管外面に径1ミリメートルのシリコンをスパイラル状に熱着しており、このシリコンが穿孔部をふさぎ、有効な組織誘導がされない場合もあった。そこで、内腔保持のために径0.4mmの螺旋状ステントを挿入する改良を加え、更に、穿孔加工密度を100ヶ/cm^2、64ヶ/cm^2の二種類を作製し移殖実験を行った。100ヶ/cm^2密度では、術後わずか1ヶ月で人工気管内腔全体に組織被覆をみた。そして内1頭は線毛上皮被覆をみた。しかし3ヶ月で、人工気管中央部に過剰の組織侵入のため狭窄を生じた。過剰組織侵入は穿孔加工密度が少なければ抑制できると判断し、100ヶ/cm^2密度は2頭にとどめ、64ヶ/cm^2密度の人工気管を6頭に移植した。いずれも、23ヶ月で人工気管内腔が組織被覆され、内1頭で術後1.5ヶ月の生検で扁平上皮化生を見た。術後、現在6ヶ月から12ヶ月、人工気管感染無く全頭生存中。また全例吻合部狭窄は無い。次に線維芽細胞を培養し、その培養線維芽細胞をフィブリングルーに入れ、入工気管に付着させた、ハイブリットタイプの人工気管を作成し、これを5頭に移植した。組織侵入速度に有意な差は無く、ハイブリット化の意義はいまだ不明である。2、気道上皮培養;気管支鏡下、生検鉗子による気道上皮採取片からの培養が可能になった。現在、継代培養にまで至っている。3、今後、この気道上皮を人工気管のマトリックス上で培養が可能かという点と、フィブリングルーでマトリックスに付着が可能かどうかの検討中である。ダクロン素材全長に穿孔加工を施し、内腔保持のためスパイラル状金属ステントを内挿したporous typeの人工気管を開発し、大型犬の胸腔内気管移植実験を重ねてきた。このモデルでは、移植時に大網を人工気管全体に被覆することで、穿孔加工部からの空気漏れを防止すると同時に、大網から人工気管内腔への肉芽侵入と、その肉芽上に吻合部生体気管からの気道上皮誘導を企てた。その結果、移植後約1ヶ月で肉芽がステントを含め人工気管内腔全体を被覆、術後23ヵ月でその肉芽上に気道上皮誘導を確認することができた。それによりこれまで人工気管の問題点とされてきた吻合部狭窄や人工気管内腔の感染も無く、約2年に亘る生着が再現性をもって観察できるに至った。そしていくつか試作した多孔化人工気管のうち、穿孔径500μm、穿孔密度64ヶ/cm^2が有効であることがわかった。しかし組織学的検討では、人工気管素材周囲には異物反応のため、常に炎症性細胞浸潤があり、そのため人工気管内腔が上皮化しても、素材と接した部分では組織の繊維化が進行し、しいては人工気管内腔の狭窄へつながる事が判明した。一方で、移植した人工気管周囲には気管壁を構成すべく結合組織が大網によりしっかりと形成されていることも判明した。次に、組織工学手法を導入し、培養線維芽細胞をフィブリングルーに入れ、人工気管に付着させたハイブリットタイプの人工気管を作成し、これを移植した。組織侵入速度に有意な差は無いが、この系においても1年を越える長期生着が再現性をもって観察できるに至った。ハイブリット化の意義は人工気管内腔が全長にわたり上皮化するまでの間、感染や異物反応を極力抑制することにあると考えられる。
キャピラリー電気泳動-質量分析法直接結合法を用いる高性能光学分割法の開発研究

キャピラリー電気泳動(CE)は幅広い分野において注目されている高性能分離分析法である。CEの検出法は紫外吸収または蛍光検出が一般的であるが、一つのピークについて単一の情報しか得られないという欠点がある。質量分析法(MS)をCEに直接結合させるCE-MSではピークに関する多数の情報を得ることができるため,高感度・高選択性検出法としてその実用化が期待されている。本研究では、これまでに得られているCEによる光学異性体の分離とCE-MSに関する検討結果とに基づいて、CE-MSの光学異性体分離検出への応用を図ることを目的とした基礎的検討を行った。1. CEによる光学分割では、(1)キャピラリーゾーン電気泳動(CZE)の泳動液に種々のシクロデキストリン(CD)を添加したものを用いるCD-CZE、および(2)キラルなミセルを用いるミセル動電クロマトグラフィー(MEKC)が有効であることが分かっている。本実験では,まず光学異性体の分離系の条件設定を行った。3.キラルなミセルを用いるMEKCでは,新たに合成された酒石酸誘導体ミセルを用いて,いくつかの鏡像体試料の光学分割条件を検討した。その結果,DLーダンシルアミノ酸を中心に従来のキラルMEKCに比べ良好な分離が達成できることが明らかとなった。4. MEKC-MS系の構築のため,主に体気圧化学イオン化(APCI)法を用い,ミセル部分充填法と組み合わせた分離条件の設定および種々のパラメータの最適条件について検討し,光学異性体分離系との結合が可能であることが明らかとなった。