hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
茶葉カテキンは糖尿病性うつ病を改善するか

茶葉カテキン類(EC、EGC、ECG、EGCG、CAT)が、脳海馬のセロトニン(5-HT)放出に及ぼす影響および市販の高濃度茶カテキン飲料(カテキン茶)投与による血清中の酸化ストレス度および抗酸化力を健常および糖尿病ラットを用いて調べた。茶葉カテキンは、健常および糖尿病ラットともに5-HTの放出を増加させた。また、カテキン茶を投与した糖尿病群における結果からカテキンは、血清中の酸化ストレス度を軽減し、抗酸化力を上昇させる可能性があることが示唆された。近年、茶に含有される成分の生理機能や茶と健康との関わりについての研究が進み、茶カテキンを中心に科学的な根拠をもって実証されつつある。カテキン類には、抗がん作用をはじめ、血圧上昇抑制、血小板上昇抑制、血糖上昇抑制、アルツハイマー病予防、肝障害予防など様々な生活習慣病を予防する効果があることが次々と明らかにされている。しかしながら、脳機能へのカテキンの効果に関しては十分には検討されていない。そこで、本研究では抗不安・抗ストレスに対して脳内に放出される神経伝達物質であるセロトニン(5-HT)に焦点を当て、カテキンが脳海馬の5-HT放出に及ぼす影響を調べた。実験動物として雄性のWistar系ラット(体重;270310g、週齢;810週)を用いた。脳海馬の細胞外5-HTは、麻酔下にてin vivoマイクロダイアリシス法により定量した。使用したカテキン類は(+)-catechin(以下CAT)、(-)-epigallocatechin gallate(以下EGCG)、(-)-epigallocatechin(以下EGC)、(-)-epicatechin gallate(以下ECG)、(-)-epicatechin(以下EC)の5種類である。茶葉に含まれるのは含有量順にEGCG、EGC、ECG、ECの4種であるが、加熱中にECはCATに変化するため今回は主にCATの作用について調べた。CATは1μM1mMの範囲で標準灌流液に混和して用い、他のカテキン類は10μMで用いた。なお、カテキン類の脳内灌流時間は100分間とした。その結果、5種類のカテキン類全てにおいて5-HT放出を増加した。中でもECは5-HTのbaselineレベルを約270倍増加し、次いでCAT(約5.5倍)、EGC(約2.9倍)、ECG(約2.6倍)、EGCG(約1.6倍)の順であった。CATは濃度依存性に5-HT放出を増加し、ED_<50>は約0.1mMであった。茶に含有される成分であるカテキン類には、抗がん作用をはじめ、血圧上昇抑制、血小板上昇抑制、血糖上昇抑制、アルツハイマー病予防、肝障害予防など様々な生活習慣病を予防する効果があることが次々と明らかにされている。一方、生活習慣病の一つである糖尿病は酸化ストレスの増大が病態悪化の一因であると推察されるが、茶カテキンにおける糖尿病状態の酸化ストレスに対する改善効果に関しては十分には検討されていない。そこで、本研究では高濃度茶カテキン飲料における糖尿病の改善効果について検討した。実験動物として雄性(体重;270310g、週齢;810週)のWistar系ラット(非糖尿病群)およびSTZを投与した糖尿病ラット(糖尿病群)を用いた。それらを市販の高濃度茶カテキン飲料(カテキン茶)を経口投与(5.8ml/kg)した群、自由摂取させた群および水摂取群の3群に分け2週間飼育した。その結果、糖尿病群におけるカテキン茶投与による血糖値の上昇抑制効果はみられなかった。このことはカテキン茶投与期間が短期間(2週間)であったことが考えられる。一方、糖尿病群は非糖尿病群に比べ、血清中の酸化ストレス度は高い傾向にあり、抗酸化力は低い傾向にあることがわかった。しかし、カテキン茶を投与することで糖尿病状態にある糖尿病群では、血清中の酸化ストレス度を軽減し、抗酸化力を上昇させる可能性があることが示唆された。さらに血清中のNO量は非糖尿病群に比べ糖尿病群の方が少ない傾向にあった。糖尿病における血清中のNO量の報告は様々であり、一定の評価は得られていないが、本研究の結果はKinoらの報告と一致するものであった。緑茶中の成分であるカテキン類には、抗がん作用をはじめ、血圧上昇抑制、血糖上昇抑制、アルツハイマー病予防など様々な生活習慣病を予防する効果があることが次々と明らかにされている。

実験動物としてWistar系雄性ラット(体重;255±6g、8週齢、以下健常群)およびSTZを投与した糖尿病ラット(体重;377±45g、10週齢、以下DM群)を用いた。それらを市販の高濃度茶カテキン飲料を摂取させた群(カテキン茶群)および水群に分け3週間飼育した。さらにカテキン茶群と水群にストレスを負荷〔コミュニケーションボックスシステムにより1分間に10秒間の電気ショック(1mA)を30分〕した群(ストレス群)の2群に分け、体重、食餌量、飲水量、血清中の酸化ストレス度、抗酸化力および一酸化窒素(NO)の変化を調べた。その結果、空腹時の血糖値は健常群では水群よりカテキン茶群が有意に減少し、DM群においても同様の傾向であった。ストレスホルモンであるコルチコステロンは、DM群では水+ストレス群で有意に増加したが、カテキン茶+ストレス群での増加は緩慢であった。一方、抗酸化力は健常群の水+ストレス群で減少したが、カテキン茶+ストレス群で増加傾向がみられた。また、血清中のNOは、カテキン茶+ストレス群では健常群で有意な減少、DM群では有意な増加がみられた。このことから茶カテキンには糖尿病における血糖の上昇抑制およびストレスを軽減する効果があることが示唆された。
酸性アミノ酸をN末端基質とする新規L-アミノ酸リガーゼの取得とその応用

効率的なペプチド合成プロセスの確立を目的として微生物由来酵素であるL-アミノ酸リガーゼに着目し、酸性アミノ酸を基質とする新規リガーゼ酵素の探索を実施した。酸性アミノ酸を構成要素とする抗生物質の生産菌から、酵素精製ならびに遺伝子工学的手法を用いて目的酵素の取得を試みた。その結果、目的酵素の取得にまでは至らなかったが、本抗生物質の生合成に関与することが推定されるリガーゼ酵素の取得に成功した。L-アミノ酸リガーゼ(Lal)は無保護のアミノ酸をATPの加水分解反応と共役して直接連結可能であり、工業利用の観点から有用な酵素である。我々は新たなLalの探索を継続的に実施してきたが、酸性アミノ酸をN末端基質とするLalの取得には至っていない。本研究では、Streptomyces plumbeusが生産するトリペプチド性抗生物質プランベマイシン(A : Ala-Asp-APPA、B : Ala-Asn-APPA)が酸性アミノ酸(Asp)を含む点に着目し、本生産菌株からAspを基質とするLalの取得を検討した。まず、無細胞抽出液を用いて、Ala,Asn,Aspを基質にペプチド結合形成活性を検証した結果、Aspでは微弱だったが、Alaにおいて有意な活性を検出した。ここで、我々は同じくAPPAを構造中に含むトリペプチド性抗生物質リゾクチシンの生合成遺伝子がクラスターを形成し、2種類のLalが合成に関与することを強く示唆する結果を得ていたことから、Alaを基質とする酵素を同定した後、Aspとの結合を作る酵素を取得することとした。そこで、4段階のカラムクロマトグラフィー操作によりAlaを基質とするペプチド合成酵素(約95kDa)を均一に精製し、このN末端アミノ酸配列情報から相同タンパク質を検索した結果、リボソームでのペプチド合成に関与するvalyl-tRNAsynthetase(ValS)と相同性を示した。そこでゲノム情報が既知のStreptomyces avermitilisから組換えValSを調製し、活性を検証した結果、AlaとAsp-ValおよびAsn-ValからAla-Asp-Val, Ala-Asn-Valを合成可能であった。今後は、今回取得した酵素のプランベマイシン合成との関連性を明らかとするとともに、酸性アミノ酸を基質とするペプチド合成酵素の取得を目指す。L-アミノ酸リガーゼ(Lal)は無保護のアミノ酸をATPの加水分解反応と共役して直接連結することが可能な微生物酵素であり、Lalを利用したペプチド合成法は、効率的で環境負荷が少ない革新的な製造法として注目されている。本研究では、酸性アミノ酸(Asp)を含むトリペプチド性抗生物質プランベマイシン(Ala-Xaa-APPA:A,Asp;B,Asn)を生産するStreptomyces plumbeusに着目し、Aspを基質とし得るLalの取得を検討した。まず、プランベマイシンはペプチド性抗生物質リゾクチシンと同様にAPPAを構造中に含むことから、リゾクチシンと同様の生合成機構によって生産されていると推察した。既に我々が取得しているリゾクチシン生合成遺伝子クラスター中の14個のORFから該当する類似酵素との保存領域を推定し、S.piumbeusのゲノムDNAを鋳型として、縮重プライマーを用いたPCR法によるプランベマイシン生合成遺伝子クラスター断片の増幅を行った。様々な遺伝子断片の取得に成功し塩基配列解析を行ったが、生合成遺伝子クラスターならびに推定Lal遺伝子を取得するには至らなかった。これと同時に、ショットガンクローニングによる遺伝子クラスターの取得、ならびにNRPS(nonribosomal peptide synthetase)のAドメイン保存領域を用いた遺伝子断片の取得も試みた。前者では、スクリーニングにて陽性を示す遺伝子断片取得には成功したが、最終的に目的とする遺伝子を取得するには至らなかった。一方、後者でも幾つかの遺伝子断片の取得に成功したが、同様に酸性アミノ酸を基質とする目的遺伝子ではなかった。しかしこれまでの経緯から、プランベマイシンもLalなどのNRPS以外のペプチド合成酵素を含む生合成システムによって生産されていると示唆された。
前例の全く無いスルホンアミドのHofmann転位反応の開発

ジフルオロブロマンを用いたベンゼンスルホンアミド類のHofmann転位反応を世界に先駆けて開発することに成功した。トリルスルホンアミドとの反応ではフッ化スルファモイルが高収率で生成した。電子供与基や電子求引基を導入した芳香族スルホンアミドのHofmann転位反応は効率良く進行した。フッ化スルファモイルの構造はX.線結晶解析により決定した。本Hofmann転位の反応機構を検討し、ナイトレンは関与していないことを明らかにした。1)ベンゼンスルホンアミドのHofmann転位反応の開発:ジフルオロ-λ3-ブロマンを用いたベンゼンスルホンアミドのHofmann転位反応を詳細に検討し、フッ化スルファモイルを生成する最適反応条件を決定することに成功した。既に、反応溶媒をアセトニトリルからベンゼンに変えると、フッ化スルファモイルの収率が大幅に向上することも見出しつつあったが、同時に副反応も出現してしまう。そこで、本副反応を抑えるために、反応溶媒として、電子求引性置換基を導入したベンゼン誘導体の使用について検討したところ、無置換ベンゼンが最適溶媒であることが明らかとなった。2)スルホンアミドのHofmann転位反応の一般性を解明:芳香族スルホンアミドのHofmann転位反応の一般性・適用範囲について明らかにした。電子供与基やハロゲンを導入した芳香族スルホンアミドのHofmann転位反応は効率良く進行した。ところが、強力な電子求引基であるニトロ基や2個のCF3基の導入は、フェニル基の1,2-転位能を大幅に減少させてしまうため、Hofmann転位反応が進行しなくなることが明らかとなった。オルト位への置換基の導入は、パラ位異性体と比べるとエントロピーの減少を伴うため、カルボン酸アミドのHofmann転位反応が加速されることが知られている。今回開発した芳香族スルホンアミドのHofmann転位反応においても、オルト置換基のエントロピーの効果が有効に作用することが明らかとなった。なお、脂肪族スルホンアミドのHofmann転位反応は現在のところ観察されていない。転位能の差が反映された結果であろう。3)反応機構:ジフルオロブロマンを用いたベンゼンスルホンアミドのHofmann転位の反応機構を解明することに成功した。フッ化スルファモイルの生成機構としては、Hofmann転位機構以外に、ナイトレンが関与する反応機構も考慮する必要がある。最初に生成する中間体スルホンアミド-λ3-ブロマンが、三価の臭素置換基の大きな超脱離能のためにα-脱離を引き起こしてナイトレンが生成した後、フェニル基が1,2-シフトして、N-スルホニルアミンを生成するナイトレン経路も可能である。そこで、Hofmann転位機構と上記ナイトレン経路とを区別するために、テトラメチルベンゼンスルホンアミドとの反応を行い、生成物を詳細に解析したところ、スルタムの生成を検出することはできなかった。上記結果から、ジフルオロブロマンを用いたベンゼンスルホンアミドのHofmann転位反応にナイトレンは関与していないことが明らかとなった。
歯周病原細菌の口腔環境からの生体鉄の獲得を阻害する薬物の開発研究

非鉄金属含有プロトポルフィリンIXのなかのガリウムポルフィリン(Ga-PPIX)とインジウムポルフィリン(In-PPIX)にPorphyromonas gingivalisの増殖を抑制する働きがあることを見い出した。とくにIn-PPIXは低濃度で強い増殖抑制効果があった。In-PPIXの抑制作用の分子レベルでの機序を明らかにする目的で種々の変異株を作製し、効果を調べた。ヘムの菌体内への取り込みにはhmuR遺伝子の関与する機構やihtB遺伝子の関与する機構が報告されている。そこでこれらの変異株を作製し、In-PPIXに対する感受性を調べた。hmuR変異株は野生株より感受性を示したが、ihtB変異株は抵抗性を示した。この結果からIn-PPIXは主としてihtB遺伝子の関与する取り込み系を介して菌体内に取り込まれることが示唆された。大腸菌のSOD欠損株やカタラーゼ欠損株はGa-PPIXに高度感受性になることから大腸菌のGa-PPIX感受性は菌体内で活性酸素が生じるためであることが報告されている。P.gingivalisのIn-PPIX感受性は嫌気的環境でおこっており、酸素から生じる活性酸素による傷害とは考えにくい。P.gingivalisSOD欠損株は野生型株と比較し、やや感受性になる程度であることもこのことを示唆している。また、興味深いことに過酸化水素に高度感受性を示すP.gingivalis dps変異株は野生株よりIn-PPIXに抵抗性になっていた。このことはIn-PPIXが菌体内に取り込まれたのち、インジウムがDpsタンパク質内に入り、毒性を発揮するという可能性を与えている。先にラクトフェリンのP.gingivalis増殖抑制作用を報告したがIn-PPIXとの併用によりさらに強い抑制作用が期待できる。1)鉄金属含有プロトポルフィリンIXの効果:Porphyromonas gingivalisは鉄源として、ヘモグロビン、ヘム、トランスフェリンを利用することができる。ヘムはプロトポルフィリンIX骨格内に鉄を含有している物質であるが、鉄の代わりにガリウムやインジウムを含むプロトポルフィリンIXには各種の細菌に対して抗菌性があることがStojilikovicらにより報告された(Mol. Microbiol.、1999、31:429-442)。その報告のなかにはP.gingivalisについては行われていなかったので、Stojilikovicらにより非鉄金属含有プロトポルフィリンIXの分与をうけ、P.gingivalisに対する抗菌活性を調べた。その結果、これらの非鉄金属含有プロトポルフィリンIXにはP.gingivalisの増殖を抑制する活性があることがわかった。この増殖抑制作用はBacteroides fragilisでもみられたが、Prevotella intermediaやActinobacillus actinomycetemcomitansではみられなかった。2)ガリウムポルフィリンとインジウムポルフィリンとを比較するとインジウムポルフィリンの方が増殖抑制が顕著であった。1μg/mlのインジウムポルフィリンでほぼ完全に増殖を抑制した。3)ラクトフェリシンとガリウムポルフィリンとの併用効果を調べたところ、それぞれ単独で処理した場合には抑制効果が顕著ではない濃度で併用して用いたところ、顕著な抑制効果がみられた。また、この作用はウシ血清アルブミン存在下で増幅された、。1)非鉄金属含有プロトポルフィリンIXの効果:ガリウムポルフィリンIXとインジウムポルフィリンIXにはP.gingivalisに対してその増殖を抑制する作用があることがわかった。とくにインジウムポルフィリンIXは低濃度でも強い増殖阻害活性があった。一方、マンガンポルフイリンIXはまったく増殖抑制作用を示さないばかりか、ヘム制限下で培養した菌に対しては増殖を促進することがわかった。

2)ヘムの菌体内への取り込みにはhmuR遺伝子が関与していることが報告されている。ガリウムポルフィリンIXやインジウムポルフィリンIXの増殖抑制作用がヘムと同様な系で菌体内に取り込まれたのち、作用を発揮するかどうかを検討するため、hmuR遺伝子領域をATCC33277染色体DNAからクローン化した。塩基配列を決定したところ、報告されているもの(W83株)と塩基配列レベルで7カ所、アミノ酸配列レベルで2カ所異なっていた。このhmuR遺伝子DNA内にエリスロマイシン耐性遺伝子カセットDNAを挿入し、P.gingivalis菌体に導入し、hmuR変異株を作製した。現在、この株のガリウムポルフィリンIXやインジウムポルフィリンIX抵抗性を検討している。非鉄金属含有プロトポルフィリンIXのなかのガリウムポルフィリンとインジウムポルフィリンにPorphyromonas gingivalisの増殖を抑制する働きがあることを見いだしている。とくにインジウムポルフィリンは低濃度で強い増殖抑制効果があるが、平成15年度はこのインジウムポルフィリンの抑制作用の分子レベルでの機序を明らかにする目的で種々の変異株を作製し、効果を調べた。まず、米国の研究者から提供されたインジウムポルフィリンが底をついたので日本の薬品製造会社に特別注文し、合成した。ヘムの菌体内への取り込みにはhmuR遺伝子やihtB遺伝子が関与していることが報告されている。そこでこれらの変異株を作製し、インジウムポルフィリンに対する感受性を調べた。hmuR変異株は野生株より感受性を示したが、ihtB変異株は抵抗性を示した。この結果はインジウムポルフィリンは主としてihtB遺伝子の関与する取り込み系を介して菌体内に取り込まれることを示唆した。また、興味深いことにdps変異株は野生株よりインジウムポルフィリンに抵抗性になっていた。このことはインジウムポルフィリンが菌体内に取り込まれたのち、インジウムがDpsタンパク質内に入り、毒性を発揮するという可能性を与えている。ガリウムポルフィリンとインジウムポルフィリンによる抗菌作用は細菌の種を越えて見られる現象であり、Dpsタンパク質の関わりを他の細菌で検討している。
ニューロラチリズムモデルラットにおける酸化ストレス運動神経細胞死の毒性機構

グラスピーは干ばつに強い作物であるが、毒性アミノ酸L-β-ODAPを含有し、単独過剰摂取により運動神経疾患ニューロラチリズムを生じる。背景として含硫アミノ酸欠乏、グルタチオン低下がある。このような酸化ストレス下、培養細胞ならびにモデルラット脊髄においてカチオンチャネルTRPM2および7の特異的発現誘導を明らかにした。さらに、モデルラット脊髄に起こる出血に伴って誘導されるヘムオキシゲナーゼ-1が病態発症に関わっていることを明らかにした。ニューロラチリズムはグラスピー豆の単独過剰摂取による運動疾患である。我々が開発したニューロラチリズムモデルラットは、豆の神経毒β-ODAPの連続末梢投与によって後肢対麻痺を発症し、アダルトでは腰髄・仙髄の運動神経(MN)が約4割まで脱落する。今回投与初期の麻痺を発症する時期に、責任部位である脊髄運動神経はすでにネクローシス様の形態変化を示すことがわかった。同時にグリオーシス、IL-6ならびにTNF-αのmRNAレベルの有意な上昇が検出された。一方、血管の生存維持に重要なVEGF receptor(R)-2についてはタンパク質とは逆にmRNAが上昇しており、血管透過性にかかわる諸因子は不変だった。従って神経毒β-ODAP投与によって生ずる脊髄での炎症性変化とVEGFR-2プロセシングの異常が明らかとなった。一方、β-ODAPのMN毒性機構についても検討した。運動神経培養株NSC34において、含硫アミノ酸およびグルタチオン欠乏にすると毒性が増加する。この時Transient receptorpotential(TRP)チャネル2および7のmRNA発現が上昇していた。TRPM2および7を薬理学的に抑えるとβ-ODAPの毒性も有意に低下した。また、モデル動物脊髄においても、麻痺発症期の脊髄下部でTRPM7のmRNAが有意に上昇していた。以上の知見から本疾患の病態のメカニズムとして、豆由来の含硫アミノ酸の低下による酸化ストレス条件下にβ-ODAPが作用すると、TRPMチャネル開口を介したCa2+-オーバーロードによりMN細胞死がひきおこされると考えられた。また観察された炎症像から、β-ODAPは同時にMNを養う脳・脊髄の血管系ならびに(もしくは)周辺グリアに対しても何らかの未解明の影響を与え、毒性増幅が起こると予想された。今後これを明らかにしたい。運動神経疾患ニューロラチリズムの発症機序としての運動神経細胞死のメカニズムについて検討した。平成23年度の実施計画【運動神経における酸化ストレスとCa上昇の接点分子としてのtransient receptor potential channe1(TRP)分子種を解明する】に関しては以下の展開があった。まず、酸化ストレス応答性のあるTRPM2およTRPM7について其々の阻害剤フルフェナム酸およびMK-886について、株化運動神経様細胞NSC34においてL-β-ODAPの引き起こすCa^<2+>に対する作用をFluo-4を用いたCa^<2+>イメージングで見たところ、両者とも有意な阻害作用を示した。これらの物質はL-β-ODAPによるこの細胞の生存性低下も部分的に軽減した。このCa^<2+>流入はTRPM2をRNAi法で低下させると抑制された(TRMP7については試薬未入手)。以上の結果から、L-β-ODAP毒性の少なくとも一部は酸化ストレスを介したこれらのチャネル経由のCa^<2+>流入であることが推定された。次に、平成22年度に一部を明らかにした【出血にかかわる因子の解明(1)脊髄前部の血管周辺の構造的特徴を明らかにする】に関して、病態組織学的に解析した。脊髄下部前角側に起こる出血について縦断標本でみると、出血部位に一致した運動神経のSMI-32抗体(非リン酸化ニューロフィラメントを認識)の染色性の低下、その付近を中心とした血管様構造におけるTUNEL染色陽性像、周辺のグリオーシス等が見られた。一方、L-β-ODAPはHUVEC細胞に対して、直接の細胞毒性を示した。これらのことは、原因物質L-β-ODAPの引き起こす脊髄前角の出血の背景として血管内皮そのものの細胞死が引き起こされ、その結果起こる透過性変化により脊髄下部に本物質の濃度上昇が起こり、それに続いて運動神経でのCa^<2+>流入、酸化ストレス、TRPM2および7の発現上昇ならびに過剰興奮(Ca^<2+>流入増大)という新規の脊髄運動神経毒性メカニズムが予想された。錐体路の上位および下位運動神経の障害で,食糧問題とも関連が深いニューロラチリズム(NL)の発症メカニズムの解明を酸化ストレスの役割を中心に行った.NLの原因神経毒β-ODAPを脳脊髄関門が未完成な時期に連続末梢投与する事で後肢にのみ対麻痺をもつラットの疾患モデルが得られ,この際脊髄下部実質内の出血を必ず伴う.血管と神経障害の関連性について組織学的に検討した.患部血管ではVEGF受容体1,2の染色性が低下し,血管内皮と周囲のアポトーシス,運動神経の突起の減少,患部組織の炎症性サイトカインの発現上昇とリンパ球の浸潤が顕著であった.

さらに責任部位のheme oxygenase-1(HO-1)mRNAとタンパク質が約10倍上昇していた.HO-1上昇を抑えるZn-プロトポルフィリンIXの前投与はβ-ODAPによる麻痺個体発現を有意に低下させ,HO-1の発現抑制と運動神経保護の間に強い相関がみられた(BBRC 428(2012)160-166).株化運動神経NSC34において,グルタチオン低下を起こす条件下β-ODAPの毒性が高まる(既報).この時に膜電位非依存性で酸化ストレス応答性カチオンチャネルtransient receptor potential channel (TRP)M2およびM7のmRNAならびにタンパク質の上昇が認められた.β-ODAPによる神経細胞死のメカニズムとして,酸化ストレスが重要な上流因子であり,活性酸素種(ROS)の発生に伴ってTRPM2,7が誘導されることも確認されたので,これがCaイオンに対する高いコンダクタンス維持につながり,しかもROSにより開口状態が維持されるという正のフィードバック機構が働く仕組みがβ-ODAPによる運動神経細胞死に関わると推定された.今後はβ-ODAPの作用点AMPA型グルタミン酸受容体とROS発生のリンク機構を解明したい.酸化ストレスとCa^<2+>上昇、TRPチャネルというつながりは予想を通りに進展し、本疾患の新たな一面が解明できた。一方、飼育条件において含硫アミノ酸を変化させて、in vivoで酸化ストレスを引き起こさせ、モデル動物の出現頻度の変動を見るという課題(H2223年度)については、動物飼育における倫理審査に耐える研究体制をとるための、協力人員の確保ができなかったことから実行できなかった。24年度が最終年度であるため、記入しない。ニューロラチリズムの病態解明に関して、脊髄運動神経の本物質による特異的な毒性は酸化ストレスが重要であり、その状況に強く影響を受けるTRPチャネルの遺伝子発現の上昇と活性化を伴うことが判明した。このことから、その変化の過程における詳細な情報伝達メカニズムをまずは明らかにすることがin vivoの検討に先立って重要であると考えられた。したがって、細胞を使ってその機序を解明することを優先し、in vivoの「実験的治療」は後半の残った時間を充てるという優先順位をつけることに方針を変更する。この成果は本疾患に限らず、他の運動神経疾患につながると推定される。
グルココルチコイドによる遺伝子発現調節機構解明と新規抗炎症薬・免疫抑制薬の創成

グルココルチコイド受容体(以下グ受容体)を介した情報伝達経路の分子生物学的理解を深め、グ受容体以降の情報伝達系を多様にかつ選択的に調節する薬理学的方法を確立することを目的とした。[1]化合物ライブラリーからの一次スクリーニング系の確立生細胞を用いてgreenfluorescent proteinで標識したグ受容体の核移行を検出するシステムを構築した。かかるシステムは他の転写因子の機能解析にも応用可能であることを証明した。[2]グ受容体とAP-1との相互作用に対するリガンドの役割の解明グ受容体を活性化するウルソデオキシコール酸がグ受容体依存性に転写因子AP-1応答性遺伝子発現を抑制することを明らかにした。[3]グ受容体のレドックス制御機構の解明と酸化還元活性を有する新規化合物の作用の解析グ受容体のリガンド結合・核移行、そして標的遺伝子の転写調節活性のレドックス制御の分子機構を明確したとともに、新規抗酸化剤EPC-K1によるグ受容体制御法を開発し、抗炎症療法の改良に貢献しつつある。本研究所はグルココルチコイド受容体(以下、グ受容体)を介した情報伝達経路の分子生物学的理解をさらに深め、新規抗炎症薬・免疫抑制薬創成の基盤となる、グ受容体以降の情報伝達系を多様にかつ選択的に調節する薬理学的方法を確立することを目的とする。平成9年度は、1)化合物ライブラリーから目的薬剤の候補を効果的経済的にスクリーニングするためのシステムを構築した。北米大陸沿岸に生息するオワンクラゲ由来のgreenfluorescent proteinを用いてグ受容体を生細胞内で連続的に可視化することに成功した。定量的解析も可能であり、今後、新規化合物のスクリーニングに多大なる貢献をすることが予想される。Dexamethasone,cortivazol,cortisolを比較検討した結果、グ受容体を核にとどめる作用が強いほど抗AP-1活性が強いことが判明した。現在、グ受容体の核局在の分子機構を追及中である。3)グ受容体のレドックス制御機構の解明とその過程を修飾する新規化合物を同定した。千寿製薬と共同で、vitamin Cとvitamin Eのリン酸ジエステル化合物が抗酸化活性を有し、グ受容体依存性の遺伝子発現を酸化条件化でも回復させることを発見した。
有用野生植物からの金属ストレス、酸化ストレスに高耐性を示す遺伝子群の単離と解析

1)Maize(トウモロコシ)を用いた多種ストレスに対する耐性機構の生理学的な解析エジプト種のトウモロコシの6品種を用いて、多種ストレスに対する耐性反応を解析した。まずAlストレスに対する感受性試験を進めた。その結果、cv321が最も強く、cv122が最も弱かった。Cu,Cdストレスでも同様の結果が得られたので、この後の研究にはこの2品種を用いることにした。これらのストレスによる生育の違いは、主に根部で見られた。なお、Cr、Zn、Diamide、過酸化水素などには、両品種間で大差は見られなかった。このような差を示す原因を解明するために根と地上部における金属含有量を測定し、2品種間で比較した。その結果、Cu、Alでは明らかに根での含有量が耐性品種の方で低く抑えられていた)。特にCuでは根から地上部への積極的な輸送が認められ(Cu金属輸送率は耐性株では約3倍高い)、cv321がCu耐性となる一因と思われた。一方Cdでは、このような差はなかった。2)Andropogonn(メリケンカルカヤ)を用いたAlストレスや多種のストレスに応答する遺伝子群の分子遺伝学的解析新たに野生植物メリケンカルカヤより、Alストレスに応答する遺伝子群の単離も試みられた。まず、Al処理を施した植物と未処理植物よりRNAを抽出し、finger print法により、Alストレス誘導性遺伝子の候補を6クローン得た。塩基配列の結果から、これらのほとんどは未知の遺伝子であったが、1つだけはトウモロコシのABC transporter遺伝子と相同性を示した。また、この遺伝子は根でも地上部でも、Alストレスで誘導されることが、リアルタイムPCR法による解析で示された。他のストレスに対する誘導性に関しても検討したところ、Diamideによって根で誘導されるものの、Cd、Zn、過酸化水素に対してはむしろ根で逆に発現抑制が見られ、各ストレスに異なる応答を示すことが示された。現在、この遺伝子のAlストレスや他のストレスにおける機能を解明するために、メリケンカルカヤからの完全長ORFが単離された。今回は特にAl、重金属などの金属ストレスや酸化ストレスに対する植物の耐性機構について分子遺伝学的手法を用いて以下の点について研究した。今期は研究開始からまだ4か月であり、成果は上がっていない。1)Al耐性を示した野生植物、メリケンカルカヤ(Andropogon virginicus L.)とススキ(Miscanthus sinensis)からのAlストレス誘導性遺伝子群の単離Finger printing法により、上記の2つの植物からAl誘導生遺伝子の候補群を単離した。これまでに各々から最終的に16個と9個の候補クローンを得た。これらの内、メリケンカルカヤの分についてAlストレス下での発現量をRT-PCR法で解析した。その結果、7クローンに関しては確かな発現誘導性を確認できた。ススキについても検討を試みたが、得られたRNAサンプルの精製度が悪く確認にまで至っていない。2)両植物を用いたAl処理によるプロリンの合成量の検討重金属ストレスや酸化ストレスでは、生育阻害の現われのためプロリンの合成量が上昇することが知られている。Alストレスにおける合成量を検討した結果、両植物では少ないことが判明した。Al耐性であることとよく一致している。今後、感受性植物シロイヌナズナでの合成量も検討する予定である。3)両植物を用いたAl処理による蛋白質合成量の検討2次元電気泳動法によるストレス誘導型蛋白質群や抑制型蛋白質群の生成状況を検討し始めた。今後、特に誘導性蛋白質群については、耐性遺伝子単離に向けて活用する計画である。1)ケリケンカルカヤの示す多種のストレス耐性機構の解明メリケンカルカヤは、Al,Znなどの金属ストレスやH_2O_2、diamideなどの酸化ストレスに対して耐性を示す。そこでこの多種耐性機構に関連すると考えられる遺伝子群の単離と解析を試みた。まずAlストレスを付与したメリケンカルカヤから全RNAを抽出し、逆転写によりcDNAを調製しcDNA libraryを構築した。さらにlibraryからAl,Cd,Zn,diamide,H_2O_2等に耐性を示すクローンの単離を行った。その結果、其々のストレスに対していくつかのクルーンが得られたので、さらにその耐性について再現性を確認した。さらに挿入されていたcDNA断片に関して塩基配列を決定し、その機能の推定を行ったところ、AL3A-4クローンについては、SAMS(S-adenosyl methionine synthetase)遺伝子であることが明らかとなった。しかし、残りのクローンついてunknown proteinであった。SAMS遺伝子の完全長cDNAを得て、これを導入した酵母形質転換体についても感受性試験を行った。その結果、この形質転換体も金属ストレス、酸化ストレスに広範囲に耐性を示した。Metwally博士にもこの研究の一部を協力してもらった。2)ススキの示す多種のストレス耐性機構の解明ススキもAl,Znなどの金属ストレスやH_2O_2、diamideなどの酸化ストレスに対して広く耐性を示す。そこでこの多種耐性機構に関連すると考えられる遺伝子群の単離と解析を試みようとしたが、total RNAの抽出がうまく行かず、断念したかわって蛋白質れべるでの解析を試みることにした。まずAlストレスを付与したススキと未処理のススキから全蛋白質を抽出し、2次元電気泳動を試みた。その結果、このストレスに対して発現量を変化させる蛋白質が多数観察された。3)多種の金属ストレスに対して耐性を示すトウモロコシの解析多種の金属ストレスに対して耐性を示す遺伝子に関しては、トウモロコシを研究材料としても解析を進めることにした。

トウモロコシのコレクションの中から、Al,Cd,Cu,Znなどの金属ストレスやNaCl塩ストレスに対して共通して耐性を示す系統を選抜するために、根伸長を指標とする感受性試験を行った。これらの結果を基に耐性株と感受性株を1株づつ選抜した。今後、これら2株を基に2次元電気泳動を行い、これらのストレスに対して発現量を変化させる蛋白質を解析していく予定である。1)Maize(トウモロコシ)を用いた多種ストレスに対する耐性機構の生理学的な解析エジプト種のトウモロコシの6品種を用いて、多種ストレスに対する耐性反応を解析した。まずAlストレスに対する感受性試験を進めた。その結果、cv321が最も強く、cv122が最も弱かった。Cu,Cdストレスでも同様の結果が得られたので、この後の研究にはこの2品種を用いることにした。これらのストレスによる生育の違いは、主に根部で見られた。なお、Cr、Zn、Diamide、過酸化水素などには、両品種間で大差は見られなかった。このような差を示す原因を解明するために根と地上部における金属含有量を測定し、2品種間で比較した。その結果、Cu、Alでは明らかに根での含有量が耐性品種の方で低く抑えられていた)。特にCuでは根から地上部への積極的な輸送が認められ(Cu金属輸送率は耐性株では約3倍高い)、cv321がCu耐性となる一因と思われた。一方Cdでは、このような差はなかった。2)Andropogonn(メリケンカルカヤ)を用いたAlストレスや多種のストレスに応答する遺伝子群の分子遺伝学的解析新たに野生植物メリケンカルカヤより、Alストレスに応答する遺伝子群の単離も試みられた。まず、Al処理を施した植物と未処理植物よりRNAを抽出し、finger print法により、Alストレス誘導性遺伝子の候補を6クローン得た。塩基配列の結果から、これらのほとんどは未知の遺伝子であったが、1つだけはトウモロコシのABC transporter遺伝子と相同性を示した。また、この遺伝子は根でも地上部でも、Alストレスで誘導されることが、リアルタイムPCR法による解析で示された。他のストレスに対する誘導性に関しても検討したところ、Diamideによって根で誘導されるものの、Cd、Zn、過酸化水素に対してはむしろ根で逆に発現抑制が見られ、各ストレスに異なる応答を示すことが示された。現在、この遺伝子のAlストレスや他のストレスにおける機能を解明するために、メリケンカルカヤからの完全長ORFが単離された。
ヘムオキシゲナーゼ1の造血系および免疫系調節機構における生理的重要性

ヘムオキシゲナーゼ1(HO-1)はヘムを一酸化炭素(CO)とビリルビンとフェリチン(Feより誘導される)に代謝する律則酵素である。われわれが世界で初めて発見した「ヒトHO-1欠損」症例(1999)は2歳頃からの全身性慢性炎症が増悪し6歳で死亡した。本症例及びその後海外で発見された症例の詳細な病態解析とin vitro実験的研究によって、HO-1欠損症の臨床病態が明らかにされるとともに、HO-1の造血系および感染免疫系調節機構における生理的重要性が強く認識された。われわれが世界で初めて発見した「ヒトHO-1欠損」症例(1999)は2歳頃からの全身性慢性炎症が増悪し,6歳で死亡した。本症例のこれまでの詳細な病態解析とin vitro実験的研究によって、HO-1の、生体へのストレス防御因子としての役割を解明し、下記の研究成果を得た。(1)患児の生検材料やリンパ球細胞株でHO-1の発現が認めらないことと、HO-1遺伝子の異常から本疾患が確立された。(2)HO-1欠損症の臨床特徴は、主として造血系単球と血管内皮細胞及び腎尿細管細胞の障害に起因する。(3)HO-1欠損症では、外因性酸化ストレスによって、全身性炎症と凝固線溶系の著しい亢進を惹起し、ストレスが長期に継続すると、免疫系や凝固線溶系が消耗、破壊される。(4)単球細胞表面抗原の異常、貪食能の低下が認められた。また、CD16high/CCR2-の細胞亜群にHO-1発現が強く、この細胞群の動態は細菌性感染症とウイルス性感染症で異なっていることから、単球のHO-1発現が各種感染症の病態表現に深くかかわっていることが示唆された。さらに、単球のHb/Hp/CD163コンプレックスがHO-1誘導と強く相関することがわかった。(5)各種腎疾患の生検材料、及びin vitro細胞株の検討から、HO-1は腎尿細管上皮がストレス防御に有効に働いていることが強く示唆された。さらに尿沈さ細胞中のHO-1濃度測定は、腎尿細管傷害を観察する非侵襲的な方法として有用であろうと思われた。(6)IL17が骨髄移植後の慢性GVHDを憎悪させる可能性を、IL17ノックアウトマウスを用いた移植実験で示した。(7)乳児白血病のCD10表面抗原陰性例では広範な遺伝子メチル化が関与していることが知れた。以上、HO-1欠損症の詳細な検討は、システミックな炎症発症、発癌における新しい病態機序の解明に役立ち、そして、新しい治療法の開発に繋がるかも知れない。(3)HO-1欠損症では、外因性酸化ストレスによって、全身性炎症と凝固線溶糸の著しい亢進を惹起し、ストレスが長期に継続すると、免疫系や凝固線溶系が消耗、破壊される。また、単球のHb/Hp/CD163コンプレックスがHO-1誘導と強く相関することがわかった。(6)マウス骨髄移植実験で、IL-17ノックアウト(KO)マウス骨髄細胞と野生型(WT)マウス骨髄細胞を比較すると、IL-17KO細胞を移植した場合慢性GVHDが軽減された。即ち、IL-17細胞は移植中期から後期におけるGVHD病態形成に深く関与しており、IL-17を中和することによる慢性GVHDの予防・治療への応用が期待される。(7)GM-CSFで大量培養した樹状細胞にPUVA処置を施すことによって"制御性"樹状細胞へ、の形質転換が容易に可能であることが示された。

この制御性樹状細胞はリンパ球混合培養反応(MLR)を有意に抑制したことから、GVHD予防の臨床応用に期待が持たれる。(8)乳児白血病のCD10表面抗原陰性列では広範な遺伝子メチル化が関与していることが知れた。ヘムオキシゲナーゼ1(HO-1)はヘムを一酸化炭素(CO)とビリルビンとフェリチン(Feより誘導される)に代謝する律則酵素である。われわれが世界で初めて発見した「ヒトHO-1欠損」症例(1999)は2歳頃からの全身性慢性炎症が増悪し,6歳で死亡した。本症例のこれまでの詳細な病態解析とin vitro実験的研究によって、HO-1の、生体へのストレス防御因子としての役割を解明し、下記の研究成果を得た。(1)患児の肝臓ほかの生検材料や不死化リンパ球細胞株でHO-1蛋白の発現が認めらないこと、ただしHO-1mRNAの発現は認められた。(2)患児および両親のHO-1遺伝子解析から、母親アリルにエクソン2の欠損、父親アリルではエクソン3に2塩基欠損があることがわかり、患児はその複合ヘテロ接合体であることが知れた。さらに母親の染色体遺伝子を詳細に解析したところ、エクソン2を含む1、730bpにおよぶ大きな欠損が証明された。そして、エクソン2はAluくり返し配列にはさまれる構造であることが知れ、本例のエクソン2欠損はAluくり返し配列の相同的組み換えによる配列欠失の可能性が示唆された。以上から本疾患が確立された。(3)HO-1欠損症の臨床特徴は、主として造血系単球と血管内皮細胞及び腎尿細管細胞の障害に起因する。(4)HO-1欠損症では、外因性酸化ストレスによって、全身性炎症と凝固線溶系の著しい亢進を惹起し、ストレスが長期に継続すると、免疫系や凝固線溶系か消耗、破壊される。(5)単球細胞表面抗原の異常、貪食能の低下が認められた。また、単球のHb/Hp/CDI63コンプレックスがHO-1誘導と強く相関することがわかった。(6)各種腎疾患の生検材料、及びin vitro細胞株の検討から、HO-1は、腎尿細管上皮におけるストレス防御に有効に働いていることが強く示唆された。(7)われわれの第1例発見から十年余を経てようやく第2例目が発見報告された。(Radhakrishnan N, etal.雑誌論文参照)この症例にはわれわれも遺伝子解析で協力した。無脾症であることなど臨床症状に類似性が高い。ただし、軽症で15歳を超えて比較的元気で生存おり、これは遺伝子変異箇所の違いによるのかもしれない。本症例の遺伝子変異は、エクソン2(R44X)のミスセンス変異がホモでみられストップコドンとなっていた。症例が複数になることでHO-1欠損症の病態がより詳細に解明された。
アリールオニウム塩のビーム誘起酸発生機構の解明

光酸発生剤としてリソグラフィーに用いられているジフェニルヨードニウム塩およびトリフェニルスルホニウム塩の光分解反応の機構については多くの研究が報告されており、励起状態からのC-I結合あるいはC-S結合の切断を経る酸発生機構が明らかにされている。一方、高エネルギービーム誘起反応については、系統的な研究がなされていない。本研究では、リソグラフィーの高解像度化を目指して、電子線やγ線によるビーム誘起反応について研究を行った。電子線やγ線照射によって誘起される反応の機構は光分解のそれとは異なり、溶媒や添加物より生成する様々な活性種との反応によりブレーンステズ酸、カルボカチオンまたはラジカルカチオンを生成する。水溶性のジフェニルヨードニウムクロライドを用いて、水溶液のパルスラジオリシスにより、水和電子やOHラジカルと塩との反応によるブレーンステズ酸発生の機構が明らかになった。また、γ線分解によるブレーンステズ酸のG値や水和電子による塩の一電子還元反応の速度定数を求めた。塩化メチレン溶液のパルスラジオリシスでは、多環芳香族化合物やジフェニルポリエンのジフェニルヨードニウム塩による一電子酸化反応について検討を行った。これらの比較的酸化電位の低い溶質が塩により速やかにラジカルカチオンに酸化される事が明らかになった。ポリ(α-メチルスチレン)のジフェニルヨードニウム塩による架橋反応については、パルスラジオリシスによりポリマーカチオンの生成過程を検討した。また、生成する酸の拡散による解像度の低下を防ぐために、ポリスチレンスルホン酸のような高分子電解質を対アニオンとする塩の合成を行った。
干渉性共鳴励起現象を利用した多価重イオンの精密原子分光

結晶中をチャネリングする高速イオンは,結晶の周期ポテンシャルを,振動電磁場として感じ得る。もし,この振動数に対応するエネルギーがイオンの内部構造の励起エネルギーに一致すれば,イオンの共鳴的な励起が期待され干渉性共鳴励起と呼ばれている。我々は,放射線医学総合研究所の重イオン加速器(HIMAC)において,数10GeVという相対論的エネルギーの重イオンビームを用いて,従来の分解能を全く一新する干渉性共鳴励起の観測に成功している。相対論的エネルギーの重イオンビームを用いたために,非常に高いコヒーレンスが達成され,共鳴幅が先鋭化する。これらに基づいて,今までの精度および統計をさらに向上させる実験装置の導入および新たなビーム開発により,我々はチャネリング下の干渉性共鳴励起という特異な現象を活かした多価重イオンの精密原子分光を目的とした実験を行った。平成15年度は,懸案であった結晶中でのイオン軌道を観測のために結晶標的として用いるSi検出器を開発することに成功した。この検出器を用いて出射荷電分布と付与エネルギーを同時測定しながら,全く同条件下で,H-like Ar^<17+>イオンの基底状態からn=2,3,4への共鳴励起を観測した。このように複数の共鳴励起ピークを観測することから,ビーム速度と遷移エネルギーを同時に高精度で決定することができるため,基底準位のラムシフトが求められる。すなわち,ラムシフトは基底状態において圧倒的に大きい値を示すため,n=2,3,4の準位では無視できるとして,理論値を採用すると,n=1,2間,n=1,3間,n=1,4間のエネルギー差測定から,n=1の準位とビーム速度が同時決定される。従来行ってきたH-like, He-likeイオンの同時観測による原子分光実験の際に精度を制限している大きな要因は,イオン軌道がイオン散乱角度だけからでは正確に押さえられないため,シュタルク効果を完全には補正できないことのみならず,2種類イオンの入射エネルギー等の条件の違いを押さえることの困難さに起因していた。しかしながら本手法ではそのような問題は存在せず,より高い精度でラムシフトが決定されたと考えられ,現在詳細な解析評価が進行中である。結晶中をチャネリングする高速イオンは、結晶の周期ポテンシャルを、振動電磁場として感じ得る。もし、この振動数に耐応するエネルギーがイオンの内部構造の励起エネルギーに一致すれば、イオンの共鳴的な励起が期待され干渉性共鳴励起と呼ばれている。我々は、放射線医学総合研究所の重イオン加速器(HIMAC)において、数1OGeVという相対論的エネルギーの重イオンビームを用いて、従来の分解能を全く一新する干渉性共鳴励起の観測に成功している。相対論的エネルギーの重イオンビームを用いたために、非常に高いコヒーレンスが達成され共鳴幅が先鋭化する。これらに基づいて、今までの精度および統計をさらに向上させる実験装置の導入および新たなビーム開発により、我々はチャネリング下の干渉性共鳴励起という特異な現象を活かした多価重イオンの精密原子分光を目的とした実験を行う。本年度は具体的には、H-like Ar^<17+>イオンによって干渉性共鳴励起の観察を行い、その2P_<3/2>のピーク位置によって,入射ビームエネルギーを決定した。

その後He-likeAr^<16+>の干渉性共鳴励起を行い2^1P,2^3P準位への励起を観測した。また同様の測定をFeイオンに対しても行った。その結果,Arの場合3139.27+/-0.15eV(2^1P),3123.30+/-0.16eV(2^3P)Feの場合6700.22+/-0.16eV(2^1P),6667.52+/-0.17eV(2^3P)という値が得られた。Feイオンの場合は得られた遷移エネルギーはほぼ理論値と一致したが,Arイオンの場合は理論値よりO.3eVほど小さい値がえられた。これは今回のようにイオンの出射角度を制限するだけでは、結晶中の振幅の大きい軌道の寄与を完全に取り除くことができなかったため結晶中の静電場によるスタルク効果が寄与していることが原因と考えられる。そこで次年度では結晶にSi検出器を使うことによってイオンの結晶に対する付与エネルギーから厳密に軌道を制限することを予定している。結晶中をチャネリングする高速イオンは、結晶の周期ポテンシャルを、振動電磁場として感じ得る。もし、この振動数に対応するエネルギーがイオンの内部構造の励起エネルギーに一致すれば、イオンの共鳴的な励起が期待され干渉性共鳴励起と呼ばれている。我々は、放射線医学総合研究所の重イオン加速器(HIMAC)において、数10GeVという相対論的エネルギーの重イオンビームを用いて、従来の分解能を全く一新する干渉性共鳴励起の観測に成功している。相対論的エネルギーの重イオンビームを用いたために、非常に高いコヒーレンスが達成され、共鳴幅が先鋭化する。これらに基づいて、今までの精度および統計をさらに向上させる実験装置の導入および新たなビーム開発により、我々はチャネリング下の干渉性共鳴励起という特異な現象を活かした多価重イオンの精密原子分光を目的とした実験を行う。昨年度は、H-like Ar^<17+>イオンによって干渉性共鳴励起の観測を行い、その2P_<3/2>のピーク位置によって,入射ビームエネルギーを決定した。Feイオンの場合は,得られた遷移エネルギーはほぼ理論値と一致したが、Arイオンの場合は理論値より0.3eVほど小さい値がえられた。これはイオンの出射角度を制限するだけでは,結晶中の振幅の大きい軌道の寄与を完全には取り除くことができなかったため結晶中の静電場によるスタルク効果が寄与していることが原因である。そこで,今年度は日本原子力研究所と協力して薄膜Si結晶検出器を新たに開発し,これを試料結晶として使うことによってFeおよびArイオンの結晶に対する付与エネルギーを同時測定した。その結果,厳密にイオン軌道を制限することに成功し,遷移エネルギーに対するスタルク効果の寄与を取り除くことに成功した。現在これ以外の原因による誤差の積み重ねを正確に計算し,遷移エネルギーの最終的実験結果を評価中である。結晶中をチャネリンクする高速イオンは,結晶の周期ポテンシャルを,振動電磁場として感じ得る。もし,この振動数に対応するエネルギーがイオンの内部構造の励起エネルギーに一致すれば,イオンの共鳴的な励起が期待され干渉性共鳴励起と呼ばれている。
ヘリコン波励起型反応性高密度金属原子混合プラズマの開発と超硬質薄膜合成への応用

ヘリコン波励起による反応性高密度プラズマ源の開発に主眼をおいて実施した初年度の成果をもとにして、本年度は物理蒸着系を構成することにより、窒化物系超硬質薄膜の合成実験を行い、合成した薄膜の組成・構造とブラズマ特性との相関について検討を行った。まず、ヘリコン波励起プラズマの生成には3ターンの方位角モードm=0アンテナを使用し、負バイアスを印加したターゲットを配置することにより、金属原子をプラズマスパッタリングにより供給することが可能な物理蒸着系を構成した。ヘリコン波が励起されている高密度モードのプラズマ中では、毎分90nm程度の成膜速度で薄膜合成が可能であることが示された。ついで、上記の物理蒸着系を用いて主として窒化炭素薄膜の合成実験を行い、化学量論組成比(N/C=4/3)の達成を第一目標に置いて研究を行った。ラザフォード後方散乱法を用いて薄膜の組成分析を行ったところ、原子状窒素の生成密度の高い条件で成膜するほど膜中の窒素組成比は向上し、最も高い値は目標値である化学量論組成に非常に近いN/C=1.3のものが得られることが明らかとなった。化学結合状態についてX線光電子分光法により調べた結果、窒素組成比の向上とともに膜中のCN結合の割合が増加することが明らかとなった。薄膜の硬度について評価を行ったところ、基板への負バイアスの印加により20GPa程度の硬度を示す試料も得られたが、目標値に比べると低い値に止まっていることがわかった。このため、薄膜の結合相手ならびに微細構造の制御とともに水素等の不純物の影響について、今後の検討課題としてさらなる研究が必要である。さらに、ヘリコン波プラズマをはじめとする誘導結合型放電において重要となる、内部アンテナを用いたプラズマ生成と金属スパッタリングについても実験を行い、高周波電力給電方式の最適化により静電結合の抑制が可能であることが示された。本年度は、ヘリコン波励起型反応性高密度金属原子混合プラズマの開発を主眼において、1)プラズマ源の製作および2)反応性高密度プラズマ生成と診断をサブテーマとして研究を実施した。まず1)のテーマに関しては、ヘリコン波プラズマ生成が可能な装置構成は概ね完了した。また、スパッタリング系については円筒型のものは完成しているが、ディスク状のスパッタリング系については細部の設計についてさらに検討中である。2)のテーマについては、本研究で目的としている窒化物系超硬質薄膜合成を行う上で特に重要となる窒素気体中でのプラズマ生成を行い、波動磁場計測を実施して、ヘリコン波の励起伝播特性について調べた。さらに、波動が励起されることにより生成する高密度窒素プラズマ中において、窒素分子の電子衝突解離により高い反応性を有する窒素原子が高い割合で発生可能であることを分光法により明らかにした。また、窒素中でのプラズマ生成においては、この分子解離過程にもパワーが消費されるため磁化プラズマ中でヘリコン波を励起するのに要する投入電力として2KW以上の高出力が必要であった。このため、実用化を考慮した非一様磁場中での磁場強度分布をアンテナ位置の最適化を行うことにより、ヘリコン波を励起するのに要する投入RF電力のしきい値を従来の50%程度まで低減することに成功した。また、スパッタリングターゲットに負極性の直流バイアスを印加することに伴う影響について調べ、特に基板へ流入するイオン電流密度がターゲットバイアスにより大きく変化することが明らかとなった。現在、次年度での本格的成膜実験に向けて、上述のディスク状ターゲットの詳細設計を含め、成膜システムとしての最適化について検討中である。