hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
骨形成因子を用いた血管柄付き骨・骨膜移植片作製の試み

血管柄付き骨膜移植の臨床応用を目的として、ラット下腿において血管柄付きで骨膜を挙上した。さらにこの骨膜に骨形成因子を作用させ、移植可能なprefabricated骨・骨膜移植片が作成できるか検討した。材料と方法:ラットの下腿を解剖学的に剥離展開し、下腿内側の骨膜が大腿動静脈の枝である伏在動静脈からの血管によって栄養されていることを確認した。顕微鏡下に下腿内側の骨膜を骨から剥離した。伏在動静脈さらに中枢では大腿動静脈により栄養されるこの部の骨膜を用いて血管柄付き骨・骨膜移植片を作製した。骨膜刺激には骨形成因子を用いた。骨形成因子の量は10μgに統一し、骨形成因子の担体にはポリ乳酸ポリエチレングリコールブロック共重合体(以下PLA-PEG)を用いた。ラット20匹を各5匹づつからなる4群に分け、各群において下腿内側で骨膜を露出した。1群では骨膜の剥離・挙上のみ行い、2群では骨膜を剥離・挙上したあと担体PLA-PEGを骨膜下に移植した。また3群では骨膜を剥離・挙上したあと骨膜下に骨形成因子を含むPLA-PEGを移植した。4群では骨膜の剥離はせず、骨膜の上に骨形成因子を含むPLA-PEGを置いた。術後3週で脛骨を摘出、ソフテックス撮影および組織学的方法を用いてにも新生骨の有無、量を検討した。結果:1群、2群では少量ではあったが新生骨形成が認められた。3群ではほとんどすべてのラットにおいて従来の皮質骨と骨膜の間に明かな新生骨の形成が認められた。周囲に筋組織の無い骨膜上に骨形成因子を含む担体を移植した4群においては新生骨の形成、骨膜の肥厚は全く認められなかった。考察:骨膜を挙上するとその手術侵襲だけで骨形成が生じ、骨膜の骨新生能が確認された。しかし形成された骨量は少なく骨膜移植単独では充分な骨形成は生じにくいと思われた。これに対し、骨膜下に置いた骨形成因子で骨膜を刺激すると、移植可能なprefabricated骨・骨膜が形成された。1.ラット下腿骨膜およびその血行に関する解剖学的検討:ラット下腿から血管柄付きで骨膜を挙上することが可能であるか検討するため下腿について解剖を行い,部位による骨膜挙上の容易さ,骨膜への血行分布を観察した。[結果]下腿中枢1/2では大腿動静脈のterminal branchであるsaphenous artery and veinから生じた数本の分枝が骨および骨膜に分布していた。しかしこの部の骨膜はけい骨粗面を覆う線維性組織と連続しており,骨と強く癒合していた。従ってこの部の骨膜は挙上困難と思われた。これに対し下腿末梢1/2から1/3では骨膜と骨の結合はゆるく,下腿前方で骨膜を鋭的に縦切開するとその後はエレバトリウムを用いて鋭的にけい骨内側から骨膜を容易に剥離することができた。この部の骨膜には下腿の中央でsaphenous artery and veinから分岐する血管が分布していた。この分枝をその前方および後方から剥離すれば血管柄つきで下腿内側の骨膜を挙上することは可能と思われた。

2.骨膜の構成に関する組織学的検討:ラット下腿骨を骨膜付きで摘出,脱灰標本を作成し,骨と骨膜の関係,骨膜の構成成分(外側に存在する線維性組織,内側に存在するcanbium layer)の特徴について組織学的に観察した。[結果]canbium layerは下腿末梢1/2において骨に接して存在する,1から2層の細胞成分に富む組織として,その外側の線維性組織から区別できた。Canbium layerの細胞の核はヘマトキシリン-エオジン染色で,線維細胞の核より大きく,またより淡く染色された。血管柄付き骨膜移植の臨床応用を目的として、ラット下腿において血管柄付きで骨膜を挙上した。さらにこの骨膜に骨形成因子を作用させ、移植可能なprefabricated骨・骨膜移植片が作成できるか検討した。材料と方法:ラットの下腿を解剖学的に剥離展開し、下腿内側の骨膜が大腿動静脈の枝である伏在動静脈からの血管によって栄養されていることを確認した。顕微鏡下に下腿内側の骨膜を骨から剥離した。伏在動静脈さらに中枢では大腿動静脈により栄養されるこの部の骨膜を用いて血管柄付き骨・骨膜移植片を作製した。骨膜刺激には骨形成因子を用いた。骨形成因子の量は10μgに統一し、骨形成因子の担体にはポリ乳酸ポリエチレング★コールブロック共重合体(以下PLA-PEG)を用いた。ラット20匹を各5匹づつからなる4群に分け、各群において下腿内側で骨膜を露出した。1群では骨膜の剥離・挙上のみ行い、2群では骨膜を剥離・挙上したあと担体PLA-PEGを骨膜下に移植した。また3群では骨膜を剥離・挙上したあと骨膜下に骨形成因子を含むPLA-PEGを移植した。4群では骨膜の剥離はせず、骨膜の上に骨形成因子を含むPLA-PEGを置いた。術後3週で脛骨を摘出、ソフテックス撮影および組織学的方法を用いてにも新生骨の有無、量を検討した。結果:1群、2群では少量ではあったが新生骨形成が認められた。3群ではほとんどすべてのラットにおいて従来の皮質骨と骨膜の間に明かな新生骨の形成が認められた。周囲に筋組織の無い骨膜上に骨形成因子を含む担体を移植した4群においては新生骨の形成、骨膜の肥厚は全く認められなかった。考察:骨膜を挙上するとその手術侵襲だけで骨形成が生じ、骨膜の骨新生能が確認された。しかし形成された骨量は少なく骨膜移植単独では充分な骨形成は生じにくいと思われた。これに対し、骨膜下に置いた骨形成因子で骨膜を刺激すると、移植可能なprefabricated骨・骨膜が形成された。
ジーントラップ挿入変異ライブラリーを用いた高脂血症発症に関与する遺伝子群の同定

【背景と目的】LDLの取り込み、細胞内コレステロールの代謝輸送からLDL受容体発現調節へ至る経路の高脂血症発症への関与が示唆されてきたが、その機構は複雑で未だ十分には解明されていない。本研究では、(1)ジーントラップ法を用いて、『コレステロールの取り込み・細胞内輸送とその調節に重要な遺伝子群の単離同定と機能解析を系統的に一括して行う』系を確立し、(2)そこから得られた遺伝子情報を基に、『コレステロールの細胞内代謝輸送ならびに高脂血症の発症と進展に重要な分子群を明らかにする』ことを目指す。[結果](1)レトロウイルスジーントラップベクターROSAβ-geoを用いて、約1x10^6のクローンからなるランダムジーントラップ挿入変異CHO(Chinese Hamster Ovary)細胞ライブラリーを構築した。(2)ジーントラップ挿入変異CHO細胞ライブラリーでは、ジフテリアトキシン耐性細胞および細胞内コレステロール代謝輸送変異細胞の出現頻度が親細胞に比較し有意に増加することを明らかにした。(3)一次スクリーニングにて、細胞内コレステロール代謝輸送変異細胞88クローンを単離した。(4)コントロール実験として、ジフテリアトキシン耐性細胞36クローンを単離した。(5)RACE法を用いて、トラップされた遺伝子の単離同定法を確立した。[考察](1)ジーントラップ挿入変異CHO細胞ライブラリーを用いることで、細胞内コレステロール代謝輸送とその調節に重要な遺伝子群を一括して検索・同定することができると期待される。(2)CHO細胞からは種々の変異細胞が分離されてきた。この挿入変異細胞ライブラリーを用いることにより、他の多くの変異の原因遺伝子の同定と機能解析を系統的に押し進めることが可能になると考えられる。
鑑別不可能な量子多体系における効率的なトモグラフィーの研究

本研究によって、従来の量子トモグラフィー手法では、量子情報プロトコルに用いられる多粒子系の識別不可能性を検証するには不十分であるということが判明した。また、有限次元系のトモグラフィー手法を無限次元系に実験可能な状態を用いて拡張することもできないことが示された。これらの結果によって、将来の研究の進むべき方向性が明確になった。基盤C本研究によって、従来の量子トモグラフィー手法では、量子情報プロトコルに用いられる多粒子系の識別不可能性を検証するには不十分であるということが判明した。本研究は、量子多体系の状態トモグラフィーにおける状態推定精度の向上を目指して、未測定の自由度が状態の再構築の際に引き起こす損失効果を分析することにより、これらの損失効果がもたらす実験の限界を考察に入れた、現実的で効率的な測定方法を提案することを目的とする。ボソン系に対する鑑別不可能な自由度がある量子多体系の状態を記述ずる数学的基盤理論は本研究の開始前に完成したため、本年度は、実際の実験における量子多体系の量子状態トモグラフィーを解析するための定式化に焦点を絞り、次の二つの研究項目を同時進行で行った。第一の研究項目では、実際の実験に適した量子トモグラフィーを提案するために、修士課程の大学院生とともに、通常の量子トモグラフィーで用いられる線形法、最尤度法、ベイズ法などの技法を、状態トモグラフィー、プロセストモグラフィー、測定トモグラフィーに対して解析した。その結果、特定の条件下で他の技法よりも有効な技法が存在することを見いだすことに成功した。第二の研究項目では、実際の実験で可能な測定が、トモグラフィーの際に有効なSICPOVMと呼ばれる特別な測定を記述する演算子の集合で記述できるかを調べるために、量子光学で用いられる連続変数系のガウス型の演算子の集合がSICPOVMであるかどうかの解析を行った。射影演算子の全ガウス型分布に対しての平均をSICPOVMと比較することによって、ガウス型の演算子の集合がSICPOVMに非常に近いことを示した。この結果は、2つの国際会議で発表された。今年度は、本研究課題に関して、次の二つの成果を得た。まず、最尤法と線形法と呼ばれる2つの量子トモグラフィ再構成法の解析を行い、量子測定トモグラフィで用いられる評価関数で誤差を評価した場合には、最尤法を用いると線形法を用いたよりもよりも誤差が小さくなる事を示した。ここでいう再構成法とは、量子トモグラフィ実験で得られたデータからトモグラフィ対象を推定する数学的手法のことであり、古典統計的推定の問題に帰着される。量子トモグラフィ結果の誤差を評価する評価関数は、古典的統計的推定理論で用いられる評価関数とは異なるため、これまで古典統計的推定の結果を適用することはできなかったが、本研究によって量子トモグラフィの誤差評価が可能となった。この成果は、8月にトロント(カナダ)で開かれた研究会で発表された。次に、第1量子化表示を用いた場合と第2量子化表示を用いた場合比ついて、量子光学の干渉実験で用いられる測定の数学的記述の相違を解析し、鑑別不可能な量子多体系の場合、第1量子化表示を用いて同種多粒子系に対する量子トモグラフィを行なうためには、単純な第2量子化表示で必要とされる以上の種類の測定演算子を用意しなければならないことを示した。そして、2光子実験に対して、この付加的に必要な測定演算子の具体的な形を求めた。更に、3光子実験における測定演算子の具体的な形を求めるための研究を続けており、この研究に役立てるために、量子光学・量子情報を専門とする英国インペリアルカレッジロンドンのTerence Rudolph博士を訪問し、研究交流を行なった。なお、修士課程大学院生の杉山太香典氏を研究補助者として雇用し、研究を遂行した。本プロジェクトに関連して1年間に行った活動は以下のとおりである。申請者が杉山太香典氏、村尾美緒氏と共同で行った量子トモグラフィの統計的側面に関する研究の成果はPhysicalReviewA誌に掲載された。この研究では、量子トモグラフィによる再構成の精度を判定するのに、通常用いられる分散による方法ではなく誤り確率による方法を用いている。我々は、この見方によって異なる再構成法の違いをより明確化することが可能となり、実験のより詳しい比較が可能となることを示した。7月にはクイーンズランド大学で開かれた量子通信・測定・計算に関する国際会議(QCMC)に参加した。申請者はそこで、多粒子系の識別不可能性の実験に関する、杉山氏、Terry Rudolph氏との共同研究の成果を発表した。この結果は、量子光学の実験で用いられる通常の同時計数測定を、3個以上の量子力学的粒子が識別不可能な状態にあるかどうかを判定するために直接用いることはできないことを示している。これは、通常のHong-Ou-Mandel型の実験によって判定が可能となる2粒子の場合には成立しない。これらの結果は、アメリカ物理学協会の論文集に掲載された。また申請者は、10月に国立情報学研究所により開催された量子情報技術に関する国際会議(ICQIT)での招待講演においてもこれらの結果を発表した。この成果がきっかけとなって量子光学のトップレベルの実験研究者たちとの連携が生まれ、とくに研究協力者JeremyO'Brien博士との連携が深まった。

11月にはロスアラモス国立研究所(LANL)のRobin Blume-Kohout博士を東京大学に招き、連続量2-デザインの研究を続けた。これは、量子トモグラフィにおける、ほとんどの用途に関して最適と見なされる測定の数学的表現である。2月下旬から3月上旬にかけての申請者のLANL訪問をもってこの研究は終了した。我々の結果は、このアイデアを無限次元系、とくに量子光学のガウシアンモードの無限次元系に適用したという点で新しい結果であり、現在、論文投稿に向けて原稿を準備中である。基盤C
パソコンによる非線形大規模逆問題解析コードの開発

(1)FEM解析で節点の変位と荷重が共に未知である逆問題の場合、影響関数法を用いて直接的に解く方法を提案した。申請者が既に開発しているマイコン/パソコンなどの小容量電算機向きのFEM解析法で採用している能率的な二重タンデム形部分構造法に、この逆解析の方法を導入した。(2)上記のFEM解析法をさらに能率的に計算するために、並列計算法を開発した。(3)上記の能率的な並列計算法をハードウエア上で実現するために、現有の16ビット・パソコンに装着するトランスピュータ(トラム)と増設メモリをそれぞれ2個ずつ購入した(本研究費)。(2)の並列計算法の妥当性を検証した。(4)上記(1)(3)の事項が弾塑性解析に適用できることを確かめた。(5)FEM解析で節点の変位と荷重が共に既知の場合、最小二乗法などで解くことになる。しかし多くのメモリ容量を使うので、パソコンで扱うことはできない。そこでペナルティ法が適用できることを確かめた。その結果、最小二乗法の活用が不要になり、効率的な計算が実現できる。(6)上記(5)の事項は引き続き弾塑性解析に適用できることを確かめた。(7)上記の事項を通じて、三次元大規模構造の任意の位置が塑性変形するときの補強構造の設計を逆問題として解析できることを可能にした。(1)FEM解析で節点の変位が既知/荷重が未知である逆問題の場合、ペナルテイ関数を用いて直接的に解く方法が適用できる。申請者が既に開発しているマイコン/パソコンなどの小容量電算機向きのFEM解析法で採用している能率的な二重タンデム形部分構造法に、このペナルテイ法を導入した。(3)上記の能率的な並列計算法をハードウエア上で実現するために、現有の16ビット・パソコンに装着するトランスピュータ(トラム)を1個購入した(本研究費)。1個のトラムで並列計算の効果を確かめることはできない。しかし時分割処理を行うことによって、並列計算法の妥当性を検証した。次年度もトラムの購入を計画し、並列計算の効果を確かめる予定である。(5)FEM解析で節点の変位と荷重が共に未知/既知の逆問題の場合、最小二乗法を用いて解くことになる。そこで節点の変位と荷重が共に既知の場合、上記(1)のペナルティ法が適用できることを確かめた。(7)上記(5)に述べた節点の変位と荷重が共に未知の逆問題の場合、最小二乗法の活用が不可欠である。そこで上半分を細分割したスカイライン法による小部分マトリックスを構築する計算法を開発した。(8)上記の事項を通じて、三次元大規模構造の任意の位置が塑性変形するときの諸条件を逆問題として解析できることを可能にした。前年度購入のトラムと共に、並列計算法の妥当性を検証した。

(5)FEM解析で節点の変位と荷重が共に既知の場合、最小二乗法などで解くことになる。しかし多くのメモリ容量を使うので、パソコンで扱うことはできない。そこでペナルティ法が適用できることを確かめた。その結果、最小二乗法の活用が不要になり、効率的な計算が実現できる。(6)上記(5)の事項は引き続き弾塑性解析に適用できることを確かめた。(7)上記の事項を通じて、三次元大規模構造の任意の位置が塑性変形するときの諸条件を逆問題として解析できることを可能にした。
固体触媒による単糖の選択的脱水反応

バイオマスの中でも糖類基本単位であるグルコースを原料とし,脱水反応により有用化合物を高選択的に合成できる固体触媒を開発することを目的とした.まず,イオン交換樹脂アンバーリスト-15がグルコースから無水糖(レボグルコサン)を選択的に合成できることを見出した.また,固体塩基(ハイドロタルサイト)と固体酸(アンバーリスト-15)を同時に加えると,ワンポットにて5-ヒドロキシメチルフルフラールが高選択的に得られることがわかった.バイオマスの中でも糖類基本単位であるグルコースを原料とし,脱水反応により有用化合物を高選択的に合成できる固体触媒を開発することを目的とした.まず,イオン交換樹脂アンバーリスト-15がグルコースから無水糖(レボグルコサン)を選択的に合成できることを見出した.また,固体塩基(ハイドロタルサイト)と固体酸(アンバーリスト-15)を同時に加えると,ワンポットにて5-ヒドロキシメチルフルフラールが高選択的に得られることがわかった.本研究課題の目的は、バイオマスの中でも糖類基本単位であるグルコースを原料とし、付加価値の高い化合物を高選択的に合成できる固体触媒を開発することである。より具体的には、固体酸塩基触媒を用いてグルコースの選択的な脱水反応を行い、無水糖(レボグルコサンら)を合成するための知見を得ることを目的とした。ゼオライト、粘土鉱物、金属酸化物、イオン交換樹脂等の各種固体酸塩基触媒を用い、グルコースから無水糖の合成を検討した。ゼオライト、粘土鉱物、金属酸化物等はグルコースの転化率が低く、無水糖が全く得られなかったのに対し、スルホ基を有するイオン交換樹脂は同反応条件にて高い転化率にて無水糖が得られた。得られた無水糖は1,6-anhydro-beta-D-glucopyranose(レボグルコサン)および1, 6-anhydro-beta-D-glucofuranoseであり、それぞれの生成量はほぼ等量であった。本反応は水中では全く進行せず、DMF、DMSO等の非プロトン性極性溶媒にて効率よく反応が進行した。イオン交換樹脂(Nafion、Amberlyst)とp-TsOH、硫酸を酸触媒として用い、酸量を合わせて反応を行った場合、同程度のグルコース転化率においてAmberlystでの無水糖選択率が最も高かった。Amberlystにおいて393K、3時間にて反応を行った場合、転化率88%、無水糖選択率は71%であった。来年度においては、この知見からスルホ基の酸強度、密度を厳密に制御した固体酸触媒を設計し、本反応との相関を明らかにしていく。本研究課題の目的は、バイオマスの中でも糖類基本単位であるグルコースを原料とし、脱水反応により付加価値の高い化合物を高選択的に合成できる固体触媒を開発することである。固体酸塩基触媒を用いてグルコースの脱水反応を行い、無水糖あるいは5-ヒドロキシメチルフルフラールを高選択的に合成するための知見を得ることを目的とした。前年度において、イオン交換樹脂Amberlyst-15がグルコースから無水糖(レボグルコサン)を選択的に合成できることを見出した。また、このイオン交換樹脂を用いると、種々の化成品の中間体として重要な5-ヒドロキシメチルフルフラールをフルクトースから容易に得られた。また、固体塩基触媒としてアニオン性粘土鉱物ハイドロタルサイト(HT)を用いると、グルコースからフルクトースへの異性化反応が効率よく進行した。これらの知見より、HT(固体塩基)とAmberlyst-15(固体酸)を同時に加え、グルコースを反応させたところ、ワンポットにて5-ヒドロキシメチルフルフラールが温和な反応条件下で高選択的に得られることがわかった。また、ハイドロタルサイトの有無、反応温度を制御することで、グルコースからの選択的な脱水反応(無水糖合成、5-ヒドロキシメチルフルフラール合成)が可能であった。さらに、ワンポット反応では、グルコースのみならず、キシロース、スクロース、セロビオースからもフルフラール類を効率よく合成できた。
樹状細胞を中心とした硝子体内炎症惹起制御機能と糖尿病網膜症進展の分子病態

糖尿病網膜症および黄斑浮腫では、炎症反応の起点として樹状細胞の関与が多くの疾患で先行しており、糖尿病網膜症の分子病態の一つとして、樹状細胞など抗原提示細胞の硝子体内へのリクルート、リクルート後の硝子体内及び網膜の細胞(神経膠細胞)のとの相互制御作用の解明により炎症メカニズムが関与する糖尿病網膜症の分子細胞生物学的病態明らかにした。この病態解明により炎症をターゲットとする治療薬として、ステロイド点眼による新たな治療法の開発をおこなった。ステロイド点眼は外来でも適応可能な新規治療薬である。糖尿病黄斑浮腫は視力低下の原因となり、日本に約70万人患者がいると推計される。その病態に基づいた治療法を選択することを目指した研究をおこなった。現時点で糖尿病黄斑浮腫に対する治療として適応がみとめられているステロイド治療と抗血管内皮増殖因子(VEGF)治療を選択して行なった場合についての治療効果を検討し治療方法選択の妥当性を検討した。山形大学医学部附属病院眼科でDMEに対して局所薬物治療を施行され6ヶ月以上の経過を追えた81例90眼について後ろ向き観察研究をおこなった。山形大学医学部倫理委員会の承認を得た研究である。全例に対してステロイドレスポンダーテストを施行し6mmHg以上の眼圧上昇がないものはステロイド治療を開始、ステロイド治療で効果が十分に得られないものに関しては抗VEGF治療に切り替え治療を行なった。ステロイドレスポンダーは抗VEGF治療を行なった。治療開始後の視力・網膜厚の推移について検討した。経過観察中に点眼を含むステロイドのみで治療したものは44眼(49%)、抗VEGF治療を施行したものが46眼(51%)うち30眼がステロイドレスポンダー、16眼がステロイド治療で効果不十分なものだった。観察開始時,3,6ヶ月時点のlogMAR視力の推移は全症例で0.416,0.334,0.349と改善していた。ステロイド単独治療群で0.329,0.290,0.276、抗VEGF治療群で0.497,0.372,0.412だった。網膜厚の推移は全症例で87.4,414.0,428.3、ステロイド単独治療群で453.6, 379.3, 391.4、抗VEGF治療群で522.5, 448.0, 466.9μmと改善していた。以上の結果より、糖尿病黄斑浮腫の病態に炎症の分子メカニズムが関与する患者が半数近く(90眼中44眼(49%))いること、このような患者にはステロイド治療を選択するのが適切とかんがえられた。ほかにVEGFが主たる関与をする患者もいることが示された。糖尿病黄斑浮腫の病態に基づいた治療法を選択することを目指した研究をおこなった。選択肢としてはステロイド治療と抗血管内皮増殖因子(VEGF)治療を選択して行なった場合についての治療効果を検討し治療方法選択の妥当性を検討した。以上の解析結果より、糖尿病黄斑浮腫の病態に炎症の分子メカニズムが関与する患者が半数近く(90眼中44眼(49%))いることが臨床的に証明された。このような患者にはステロイド治療を選択するのが適切とかんがえられ、病態に基づく適切な治療法選択の戦略が示された。以上のことより、研究は順調に推移していると考える。糖尿病網膜症、糖尿病黄斑浮腫は視力低下の原因となる。糖尿病黄斑浮腫の病態は炎症の病態との類似性がある。この病態に対する治療としてステロイド薬と抗血管内皮増殖因子治療の有効性がしめされている。本研究ではステロイド薬ジフルプレドナート点眼で糖尿病黄斑浮腫治療を2009年2015年におこなった症例66例98眼(平均年齢62.9歳)の長期予後を検討した。ジフルプレドナート点眼で糖尿病黄斑浮腫に対する薬物治療を開始後1ヶ月ごとに治療の妥当性を判断し、視力、網膜厚推移と治療後の転機について検討した。糖尿病黄斑浮腫に対して点眼薬治療を開始して、点眼のみで12ヶ月以上治療できたのものが約半数あった。長期的に視力、網膜厚の改善が得られた。今回の研究により、糖尿病黄斑浮腫の症例の約半数に病態が炎症のメカニズムによることが明らかになった。視力低下のもう一つの原因病態である増殖糖尿病網膜症(PDR)の硝子体手術の術後4年での視力予後とその関連因子について検討した。2008年1月2012年9月に初回硝子体手術を施行し術後4年間以上経過観察できた70例91眼(平均年齢55.1歳)を対象とした。術後4年で小数視力0.5以上と、全身因子、術前・術中・術後眼局所因子との関連を診療録ベースに後ろ向きに検討した。

術後4年時視力0.5以上は48眼(52.7%)であり、これに関連する因子は、単回帰により増殖膜なし、術前高眼圧あり、網膜剥離あり、黄斑剥離あり、ガスタンポナーデ不使用、再手術施行なし、術後血管新生緑内障なしであった。術後4年時視力0.5以上に関連する因子を多変量解析により検討したところ、再手術施行なしで傾向差があった。PDRの硝子体術後4年で視力0.5以上となる症例は、再手術を要さない病態の鎮静化が得られたものであった。本年のテーマとして視力低下の原因となる糖尿病網膜症、糖尿病黄斑浮腫の病態について研究をおこなった。黄斑浮腫については、その病態に基づいた治療法の選択について検討した。黄斑浮腫の病態は炎症の病態との類似性がある。この病態に対する治療としてステロイド薬と抗血管内皮増殖因子治療の選択の妥当性を研究した。糖尿病黄斑浮腫に対してジフルプレドナート点眼薬治療を開始して、点眼のみで12ヶ月以上治療できたのものが約半数あった。長期的に視力、網膜厚の改善が得られた。今回の研究により、糖尿病黄斑浮腫の症例の約半数に病態が炎症のメカニズムによることが明らかになった。ステロイド点眼で効果が見られなかった症例では抗血管内皮増殖因子治療でおこない効果がみられた。糖尿病黄斑浮腫の病態の多様性が証明されたことになる。視力低下のもう一つの原因病態である増殖糖尿病網膜症(PDR)の硝子体手術の術後4年での視力予後とその関連因子について検討した。術後4年時視力0.5以上に関連する因子としては増殖膜なし、術前高眼圧あり、網膜剥離あり、黄斑剥離あり、ガスタンポナーデ使用しなかった、再手術施行なし、術後血管新生緑内障なしがあった。増殖糖尿病網膜症の硝子体術後4年の視力には糖尿病網膜症の病態に関連することが明らかになった。ステロイド薬による病態進展への影響については今後の課題である。以上のことより、研究は順調に推移していると考える。糖尿病黄斑浮腫(DME)の薬物治療の現在の国際的な第一選択は抗血管内皮増殖因子(VEGF)治療である。しかし、抗VEGF治療単独で視力改善保持を長期にわたって維持できるDMEは少ない。海外の大規模研究の結果に迎合することなく、本邦の臨床現場で現在使われているDME治療法としては、網膜光凝固、眼局所薬物治療(ステロイド薬、抗VEGF薬)、硝子体手術があるが、複数の治療の併用や組み合わせによって、より低侵襲で、患者さんの負担を減らしてかつ治療効果をあげるプロトコールの確立を目指すべきであると考えられる。我々は過去に眼局所ステロイド薬治療としてジフルプレドナート点眼によってDMEの改善を得たことを報告した。ジフルプレドナート点眼は米国で術後抗炎症薬として認可されている新しいステロイド点眼薬で、3ヶ月間点眼で使用する。当科での過去の臨床研究では、短期的にはケナコルトテノン嚢下注射とほぼ同等の効果を、長期的にも12ヶ月以上点眼の反復投与で治療可能だった症例が50 %あった。また、ジフルプレドナート点眼で眼圧上昇などにより使用できなかった場合に、抗VEGF薬にコンバートしても効果が確保できた。本発表では、ジフルプレドナート点眼をDME治療戦略のなかでどのように位置づけるかについて、これまでの我々の臨床研究から得た知見をもとにしてDME治療の包括的治療プロトコールを策定し検討した。
希土類系高温超伝導体配向材料の後熱処理による積層欠陥制御手法の確立と実証

希土類系高温超伝導体(RE123)は90K級の臨界温度を有することからヘリウムフリーでの磁場応用などに向けて研究開発が進められている。これまでの研究で、様々なRE123配向材料の作製手法を確立し高機能化を進めてきた。本課題では、このようなRE123材料に共通して積層欠陥が存在することに着目した。後熱処理によって材料形態に依らず普遍的に適用可能な積層欠陥制御手法を確立し、配向材料の高機能化を目指す。RE123材料中に常に存在するが故に重視されてこなかった積層欠陥に光を当て、材料形態に依らない後熱処理による普遍的な材料特性改善指針を示すことで、超伝導材料の実用展開の一層の促進を試みる。
ヒト前立腺がんのアンドロゲン依存性の分子生物学

ヒト前立腺がんはアンドロゲン依存性の微小がんより徐々に依存性を消失し、非依存がんとなって死亡する。依存性喪失の機序を解明するためヒト各病期の前立腺がんの組織やマウス・アンドロゲン依存がんであるシオノギがん115(SC115)を用いて研究した。1.SC115のアンドロゲン依存性。アンドロゲンはSC115に作用して増殖因子(アンドロゲン誘導性増殖因子,AIGF)を分泌し、自己調節として作用し増殖する。AIGFおよびその受容体を構造決定した。AIGFの作用はスラミンにより阻害された。2.SC115の非依存がんへの進行。SC115は無血清培地で増殖しないがアンドロゲンまたは小量の血清により維持される。血清添加のみで継代し、非依存がんを得た。これはAIGFと異なる増殖因子を分泌しており、継代により増殖能を大きくするが、増殖因子の増加とこれのレセプターの増加が関与していた。アンドロゲンを欠く環境への適応による非依存がんへの進行と考えた。3.遺伝子変化による非依存がんSC115より得られたCS2は非依存がんであるがアンドロゲンレセプターを有する。CS2では新たにhst1が発現しており、これが新しく増殖能を得たことと関連すると考えた。ヒト早期がんおよび非依存がんで死亡した組織との比較において、rasは後者のほうがやや異常の頻度が高かった。しかし全体としてras異常20%、p53 10-20%であり、他のがんに比し遺伝子異常の頻度は高くない。さらに検討を要する。4.アンドロゲンレセプターこの変異が非依存がんで1/8にみられた。非依存がん進行において、レセプター変異はあまり大きく関与していないと考えた。さらに検討を要する。
マウス慢性脳低灌流モデルに対するヒト胚性幹細胞由来血管前駆細胞移植

ヒト人工多能性幹細胞(iPS)由来血管前駆細胞(VPC)をマウス慢性脳灌流モデルに移植し、その生着条件を検討した。VPCを定位脳手術で慢性低灌流動物、偽手術動物の大脳皮質または線条体に投与したところ、慢性低灌流動物の線条体でのみVPCの生着と血管様構造の形成が確認された。虚血条件下で血管形成に必要な因子の存在が示唆される。本年度はマウスES細胞由来血管前駆細胞(Flk-1_細胞)を血管内皮細胞および血管平滑筋細胞へ分化誘導した。まずES細胞をtype IV collagen-coated dish上で培養し、FACSを用いてFlk-1+VE-cadherin+E-cadherin+細胞を選別し、上記dishで再び培養した。3日後にVEGFをdishに加えた後、再度FACSを行い、Flk-1+細胞を選別し、最後にPDGF-BBを加え、Flk-1+細胞を増加させ移植に使用した。マウス慢性脳低灌流モデルはマウス(雄性C57B1/6、24-29g)の頸部を切開して左右の総頸動脈を露出し、直径0.18mmのマイクロコイルを両側総頸動脈に外側から装着した。1.偽手術群・血管前駆細胞移植群、2.偽手術群・生理食塩水投与群3.慢性脳低灌流群・血管前駆細胞移植群4.慢性脳低灌流群・生理食塩水投与群の4群を作成した。虚血30日後に脳のビブラトーム連続切片を作成し、血管再生効果は再生血管を標識LacZの染色、SMA免疫染色で評価した。白質病変はKluver-Barrera染色で評価した。3,4群ではSMA陽性血管の密度が皮質領域で減少傾向にあったが、有意ではなかった。4群すべてでLacZ陽性血管は認められず、移植血管の生着を確認できなかった。マウス由来ESでは移植効率の低さが他の実験系でも指摘されており、ヒトES, iPS細胞由来血管前駆細胞を用いて再検討中である。慢性脳虚血に対して効果が期待できる再生医療の有力な手段として血管再生治療が挙げられる。特に、近年ES細胞より血管を構成する内皮細胞及び血管平滑筋細胞の双方に分化する血管前駆細胞(Vascular Progenitor Cells ; VPC)が同定されている。VPCをマウス慢性脳低灌流モデルに対して経動脈的に投与することにより、脳内血管が新生し慢性脳虚血の改善につながることが期待できる。本研究ではマウス慢性脳低灌流モデルに対して、ES細胞由来の血管前駆細胞を移植することにより、慢性脳虚血に対する血管前駆細胞移植の効果を検討した。C57BL/6Jマウスの両側頚動脈を内径0.18mmのマイクロコイルで狭窄させ、脳血流を前値の70-80%に低下させた(BCAS ; bilateral carotid artery stenosis)。これらのBDCAS群および偽手術群の大脳皮質および線条体に、VPCs浮遊液を定位脳手術的に移植移植した。その結果、BCAS群では移植細胞の生着を大脳皮質および線条体で認めたが、偽手術群では陰性であった。また、血管構造が形成された陽性面積を画像解析で評価したが、大脳皮質では血管構造を認めず、BCAS群の線条体でのみ有意な血管構造の増加を認めた。血管構造の構築には血管新生因子の関与が示唆されており、実際急性虚血脳ではVEGF、bFGFの増加が報告されている。このため、RT-PCRでVEGFを定量したが、大脳皮質・線条体のいずれにおいても有意なVEGF mRNAの増加を認めなかった。以上の結果から、慢性虚血脳ではVPCsの生着が認められ、慢性虚血脳におけるVEGF以外の血管新生因子がその生着に関与する可能性が示された。血管性認知症、アルツハイマー病などの認知症では、脳血流の慢性的低下があり、認知機能障害の進展に関与が示唆されている。認知症の原因に関与する慢性脳低灌流に対して、血管床を増加させる血管再建療法は有効性が期待される。本研究では、血管性認知症のモデル動物である両側頸動脈狭窄(Bilateral carotid artery stenosis;BCAS)マウスを対象として、ヒト人工多能性幹細胞由来の血管前駆細胞(VPC)を移植してその効果を検討した。両側頸動脈に偽手術を行ったマウスを対照として用い(偽手術群)、各群5匹を作成した。VPC細胞浮遊液(1.0x10^5)をBCAS群、偽手術群の大脳皮質または線条体に定位脳手術で局所投与した。7日後にマウスを灌流固定して切片を作成して、移植細胞の生着を検討した。VPCの生着はBCAS群の大脳皮質・線条体で観察されたが、偽手術動物では観察されなかった。生着細胞群の中で血管様構造の形成が線条体で認められたが、大脳皮質では観察されなかった。

このような血管様構造はCD31との蛍光2重免疫組織化学ではCD31要請であり、血管内皮の性格を持つものと考えられた。血管様構造の面積を画像解析装置で定量すると、偽手術群に比べBCAS群で有意に増加していた(p<0.05)。血管の分化に関与するVEGF mRNAをRT-PCRで定量評価したが、両群で有意差を認めなかった。以上より、慢性虚血脳の線条体では、VPCの分化・生着に必要な分子の存在が示唆されるが、VEGFの関与は否定的であった。
肺気腫感受性マウスの結合組織に関する免疫組織化学的研究

弾性線維は結合組織の線維成分として、肺あるいは大動脈などの特に弾性を必要とする器官において重要な役割を果たしている。弾性線維の形成異常は肺気腫の成因と深い関係を持っているといわれ、肺気腫自然発症の動物モデルであるTightーskin(Tsk/+)マウスを用いて、弾性線維の異常と肺気腫の関連性について検討してきた。今回はさらに、弾性線維の形成異常を惹起する架橋阻害剤であるβーアミノプロピオニトリル(BAPN)を投与しTsk/+マウスと比較した。材料は妊娠ddyマウスを、BAPNを含む飼料で分娩後飼育し、3週で離乳その後親マウスと同じ飼料で2週間飼育した幼若マウスの肺ならびに大動脈を用いた。材料はパラホルムアルデヒドで固定後、弾性線維の構成蛋白であるエラスチンに対する抗体によって免疫反応を行ない電顕的に観察を行なった。BAPN投与マウスにおいては、肺に存在する弾性線維にはTsk/+マウスで見られたような弾性線維の断裂などの異常は認められず、また、肺の気腫化の程度も軽く肺胞壁の肥厚を若干認める程度で肺胞壁の拡張は顕著ではなかった。BAPN投与マウスにおいてはTsk/+マウスと異なり弾性線維の構成成分の一つであるマイクロフィブリルには異常が認められず、弾性線維の形成異常はマイクロフィブリルの明瞭でない大動脈の中膜の弾性線維に強く認められ、弾性線維の断裂、膨化を引き起こしていた。今回の観察から、弾性線維の構成成分の一つであるマイクロフィブリルの異常が肺気腫の成因に深く関係していることが示唆された。肺においては、弾性線維は膠原線維とならんで結合組織の主要な線維成分であり、とくに、弾性線維の異常は肺気腫の成因とも深い関連があるといわれている。しかしながら、肺気腫のみならず、正常肺における弾性線維の形成と分解に関する形態的知見はとぼしい。本研究では、肺気腫自然発症の動物モデルであるTight-skin(TSK/+)マウスを用い、弾性線維ならびにその他の結合組織成分の変化について調べた。材料は5週令のTsk/+マウスを用い、器管よりテフロンカテ-テルを挿入し水柱圧25cmにて固定液を注入し、気管と肺全体を固定した後、肺と大動脈を電顕的に観察した。Tsk/+マウスの肺は肺胞癖の破壊をともない、正常肺に比べると、肺胞腔が数倍にも拡張し、肺胞壁に存在する弾性線維の成分の一つであるエラスチンは断裂したような像を呈した。大動脈においては外膜の結合組織成分、とくにコラゲンならびにルテニウム赤陽性の物質の過形成が認められた。また、肺胞壁に存在する弾性線維ならびに大動脈の外膜に存在する弾性繊維には通常認められるmicro-faibrilsがともに明瞭ではなかった。Tsk/+マウスは肺気腫の自然発症モデルとみなされ、結合組織の代謝異常が原因と考えられている。microfibrilsの異常は弾性線維の断裂と関連し、microfibrilsの質的ならびに量的な異常が弾性線維の形態変化あるいは変性、さらには肺の構造的変化をも引き起こすのではないかと考えられた。材料は妊娠ddyマウスを、BAPNを含む飼料で分娩後飼育し、3週で離乳その後親マウスと同じ飼料で2週間飼育した幼若マウスの肺ならびに大道脈を用いた。

材料はパラホルムアルデヒドで固定後、弾性線維の構成蛋白であるエラスチンに対する抗体によって免疫反応を行ない、電顕的に観察を行なった。BAPN投与マウスにおいては、肺に存在する弾性線維にはTsk/+マウスで見られたような弾性線維の断裂などの異常は認められず、また、肺の気腫化の程度も軽く、肺胞壁の肥厚を若干認める程度で、肺胞壁の拡張は顕著ではなかった。BAPN投与マウスにおいては、Tsk/+マウスと異なり、弾性線維の構成成分の一つであるマイクロフィブリルには異常が認められず、弾性線維の形成異常はマイクロフィブリルの明瞭でない大動脈の中膜の弾性線維に強く認められ、弾性線維の断裂、膨化を引き起こしていた。観察の結果、マイクロフィブリルの異常は弾性線維の断裂と関連し、マイクロフィブリルの質的ならびに量的な異常が弾性線維の形態変化あるいは変性、さらには肺の構造的変化をも引き起こすのではないかと考えられた。
染色体ドメインの形成機構と動態:反復配列を視点として

GGA反復配列が特異な構造特性を示す。すなわち、2本鎖でありながら1本鎖特異的DNA切断酵素に感受性であること、GGA反復配列を介してホモ2量体を形成すること,分子間3本鎖構造を形成すること,およびDNA-DNAペアリング複合体を形成することである。これらは、この反復配列を介して染色体間の対合を起こす可能性を示唆している。本研究は反復配列を含む染色体ドメインのクロマチン状態、その変動を解析することを目的とする。本年度は、グアニンに富むGGAリピートを含むDNAを動物細胞発現ベクターに組み込み、ヒト培養細胞に導入したin vivo実験系において、GGAリピートのとる高次構造と転写活性への影響について解析した。SV40プロモーター下でルシフェラーゼ遺伝子(luc)を発現するベクター(pGL-2)を用い、プロモーター上流部位にGGAリピート、CAGリピートおよびグアニンに富むマウスゲノムDNA断片を組み込んだ種々のプラスミドDNAを作製した。これら反復配列がプロモーター活性にどのような影響を与えるかを調べるため、それぞれの反復配列を含むプラスミドDNAと内部対照としてのbeta-gal発現ベクターとをヒトHela細胞に同時導入し、24時間後に細胞抽出液を調製し、luc活性およびb-gal活性を調べた。その結果、これら反復配列の存在によりluc活性がGGAリピート、G5およびCAGリピートで対照ベクターに対してそれぞれ2.5、7および1.5倍程度増強した。この転写活性の変化が、DNAの高次構造とどのような関連性があるかを調べるため、分離した核をDNase Iおよびマイクロコッカルヌクレアーゼ処理し、プロモター領域や反復配列近傍のDNA高次構造を解析中である。一方、GGAリピートのヘテロ/ユウ・クロマチンへの分布と、核マトリックスとの局在の関連性を調べた。分離核を制限酵素SacIで処理しのち、遠心分離し、沈殿画分から核マトリックス付着DNA、上清から非マトリックス付着DNAを調製した。PCRによる増幅から、ヘテロクロマチンに分布する9クローンが核マトリックス付着DNA領域に優位に存在する結果が得られた。一方、ヘテロクロマチンとユウクロマチンに同じ程度分布した6クローンは、核マトリックス付着および非付着DNAに同程度に分布した。以上の結果は、GGAリピートのヘテロクロマチンへの分布と核マトリックスへの局在性に関連性があることを示唆している。GGA反復配列は特異な構造特性を示す。すなわち、2本鎖でありながら1本鎖特異的DNA切断酵素に感受性であること、GGA反復配列を介してホモ2量体を形成すること、およびDNA-DNAペアリング複合体を形成することである。そこで、この現象がクロマチンレベルでも生じるかどうかを調べるため、再構成クロマチンを用い、ゲノム中の局在性やDNA-DNA複合体形成における配列特異性について解析し、反復配列の構造と機能に関する検討を行った。反復配列(GGA/TCC)nを含むDNA断片をマウスゲノム中から19個単離し、ゲノム上にマッピングした結果、種々の染色体上にマップされた。我々が開発した核クロマチンをヘテロクロマチン(He)とユウクロマチン(Ee)へ分画化する方法を利用し、分離した反復配列(GGA/TCC)nを含むDNA断片のHe/Euへの分布を定量PCR法により調べた。約半数(9/19)はHe分画に多く分布し、残りはHeとEu両分画に同程度分布し、調べたものの中にはEu分画に多く分布するものはなかった。各々のクローン化DNAを鋳型に約160塩基長の標識及び非標識DNA断片を調製し、両者を加温することによりDNA-DNA複合体が形成するか否かをゲル移動度シフトアッセイ法およびDNase I保護マッピング法により調べた。標識したDNAは同種の非標識DNAと特異的にDNA-DNA複合体が形成され、その複合体形成は配列特異性を示した。この配列依存性は、GGAリピートの反復回数に依存し、またGGAリピート近傍の配列依存性があることが、合成DNAを用いた再構成クロマチンの解析からも確認された。これらのことから、グアニンに富む反復配列を介したDNA対合が、クロマチン高次構造形成の動的基盤を形成し、これがヘテロクロマチン化や遺伝子発現等に関与する可能性が示唆される。

その結果、これら反復配列の存在によりluc活性がGGAリピート、G5およびCAGリピートで対照ベクターに対してそれぞれ2.5、7および1.5倍程度増強した。この転写活性の変化が、DNAの高次構造とどのような関連性があるかを調べるため、分離した核をDNase Iおよびマイクロコッカルヌクレアーゼ処理し、プロモター領域や反復配列近傍のDNA高次構造を解析中である。一方、GGAリピートのヘテロ/ユウ・クロマチンへの分布と、核マトリックスとの局在の関連性を調べた。分離核を制限酵素SacIで処理しのち、遠心分離し、沈殿画分から核マトリックス付着DNA、上清から非マトリックス付着DNAを調製した。PCRによる増幅から、ヘテロクロマチンに分布する9クローンが核マトリックス付着DNA領域に優位に存在する結果が得られた。一方、ヘテロクロマチンとユウクロマチンに同じ程度分布した6クローンは、核マトリックス付着および非付着DNAに同程度に分布した。以上の結果は、GGAリピートのヘテロクロマチンへの分布と核マトリックスへの局在性に関連性があることを示唆している。
有機フッ素化合物のバイオコンバージョン:フッ素脱離・導入の酵素触媒機構と応用

1.フルオロ酢酸デハロゲナーゼの構造と機能フルオロ酢酸デハロゲナーゼはフルオロ酢酸の加水分解的脱ハロゲン反応を触媒し、グリコール酸を与える。脂肪族フッ素化合物の強固な炭素-フッ素結合の切断を触媒する唯一の既知酵素である。本酵素はフルオロ酢酸を最も良好な基質とするが、クロロ酢酸にも、その4%の活性を示す。本酵素反応では、触媒中心アスパラギン酸残基の側鎖カルボキシル基が基質のα-炭素を求核攻撃し、ハライドイオンが脱離するとともに、酵素と基質が共有結合したエステル中間体が生成する。続いてヒスチジン残基が活性化した水分子によって中間体が加水分解され、グリコール酸が遊離するとともに、触媒中心アスパラギン酸残基が再生する。本研究では、Burkholderia sp.FA1が生産する本酵素の構造と機能を解析した。結晶構造解析によって活性部位に存在することが示されたアミノ酸残基を部位特異的変異法で改変し、触媒能への影響を調べた。触媒中心のAsp104、His271のほか、これらの近傍に存在するArg105、His149、Arg108、Tyr147、Phe34、Tyr212、Phe272、His103をアラニン残基に改変すると、フルオロ酢酸とクロロ酢酸のいずれに対する活性も消失した。一方、Trp150をアラニン残基に改変した酵素では、クロロ酢酸に対する活性は野生型酵素の71%残存したにもかかわらず、フルオロ酢酸に対する活性は完全に消失した。Trp150はフッ化物イオンの脱離に必須の役割を果たすことが示された。2.2-ハロアクリル酸レダクターゼの発見と機能解析2-クロロアクリル酸資化性菌Burkholderia sp.WSが、NADPHを還元剤として2-ハロアクリル酸の不斉還元を触媒する新奇酵素2-ハロアクリル酸レダクターゼを生産することを明らかにした。本酵素と補酵素再生系を組み合わせることにより、除草剤の原料として有用な(S)-2-クロロプロピオン酸を効率よく生産することに成功した。1.フルオロ酢酸デハロゲナーゼは、脂肪族化合物の強固な炭素-フッ素結合を切断する。Moraxella sp.B由来の酵素では、活性中心のAsp105の側鎖カルボキシル基が、基質のα-炭素を求核攻撃し、フッ化物イオンが脱離するとともに、Asp105と基質がエステル結合した中間体が生成する。中間体が加水分解されてグリコール酸が遊離し、Asp105が再生する。反応液にアンモニアを共存させると、酵素が失活した。失活酵素ではAsp105がAsnに変化していた。この結果は、本酵素の活性部位ではアンモニア分子がプロトン化されず、求核性を持つことを示している。本酵素の活性部位は、アンモニアがプロトン化されない、疎水性アミノ酸残基や塩基性アミノ酸残基に富んだ環境であることが示唆された。本酵素の立体構造モデルを構築した結果、この推測が裏付けられた。基質のフッ素原子が水和されない状態を保持し、活性部位アミノ酸残基のフッ素原子への結合を容易にする上で、疎水的な環境が重要と推察された。2.L-2-ハロ酸デハロゲナーゼは、L-2-ハロ酸の加水分解的脱ハロゲン反応を触媒する。Pseudomonas sp.YL由来の酵素が触媒する反応は、フルオロ酢酸デハロゲナーゼと類似した機構で進行する。Asp10が求核性残基として機能し、エステル中間体を経由して反応が進行する。Asp10近傍にはThr14、Arg41、Ser118、Lys151、Tyr157、Ser175、Asn177、Asp180が存在する。これらを改変した変異型酵素を基質とインキュベーションし、構造変化を質量分析法により観測した。その結果、Arg41とAsp180を改変した変異型酵素では、野生型酵素に比べ、エステル中間体の形成が著しく遅くなることが判明し、これらの残基が中間体形成段階で機能することが示唆された。1.フルオロ酢酸デハロゲナーゼは、脂肪族有機フッ素化合物の強固な炭素-フッ素結合の開裂を触媒する唯一の既知酵素である。Burkholderia sp.FA1由来の本酵素の立体構造の解明をめざし、結晶化条件の検討とX線結晶構造解析を行った。T7プロモーター下流に本酵素遺伝子を持つプラスミドをEscherichia coliBL21(DE3)に導入し、培養した。菌体抽出液から、硫安分画、各種クロマトグラフィーによって本酵素を精製し、結晶化条件のスクリーニシグに供した。20%(w/v)PEG-1000、100mM Imidazole pH8.0、200mM Ca(OAc)_2を母液とし、シッティングドロップ蒸気拡散法で結晶化を行った場合に、板状の単結晶(0.1×0.1mm)が得られた。この結晶にX線を照射したところ、3.5Å分解能のデータ収集が可能であった。二枚の回折像を用いて指数付けを行った結果、斜方晶系または単斜晶系であることが示された。本結晶を高輝度放射光解析に供すれば、本酵素の精密立体構造を明らかにできるものと考えられた。2.Moraxalla sp.B

由来のフルオロ酢酸デハロゲナーゼのAsp105は、基質フルオロ酢酸のα-炭素を求核攻撃し、フッ化物イオンの脱離を引き起こす。このようにAsp105は触媒残基として機能するが、この残基をAsnに改変しても、酵素活性は完全には消失しなかった。また、木変異型酵素の活性は経時的に上昇した。本酵素の構造をイオンスプレー質量分析法によって解析した結果、再活性化は、Asnの脱アミドによるAspの再生によることが明らかとなった。L-2-ハロ酸デハロゲナーゼの触媒中心Asp10をAsnに改変した変異型酵素では、Asn10が求核性の触媒残基として機能したが、フルオロ酢酸デハロゲナーゼの変異型酵素D105NのAsn105は脱ハロゲンを引き起こす求核性の触媒残基としては機能しなかった。1.フルオロ酢酸デハロゲナーゼの構造と機能フルオロ酢酸デハロゲナーゼはフルオロ酢酸の加水分解的脱ハロゲン反応を触媒し、グリコール酸を与える。脂肪族フッ素化合物の強固な炭素-フッ素結合の切断を触媒する唯一の既知酵素である。本酵素はフルオロ酢酸を最も良好な基質とするが、クロロ酢酸にも、その4%の活性を示す。本酵素反応では、触媒中心アスパラギン酸残基の側鎖カルボキシル基が基質のα-炭素を求核攻撃し、ハライドイオンが脱離するとともに、酵素と基質が共有結合したエステル中間体が生成する。続いてヒスチジン残基が活性化した水分子によって中間体が加水分解され、グリコール酸が遊離するとともに、触媒中心アスパラギン酸残基が再生する。本研究では、Burkholderia sp.FA1が生産する本酵素の構造と機能を解析した。結晶構造解析によって活性部位に存在することが示されたアミノ酸残基を部位特異的変異法で改変し、触媒能への影響を調べた。触媒中心のAsp104、His271のほか、これらの近傍に存在するArg105、His149、Arg108、Tyr147、Phe34、Tyr212、Phe272、His103をアラニン残基に改変すると、フルオロ酢酸とクロロ酢酸のいずれに対する活性も消失した。一方、Trp150をアラニン残基に改変した酵素では、クロロ酢酸に対する活性は野生型酵素の71%残存したにもかかわらず、フルオロ酢酸に対する活性は完全に消失した。Trp150はフッ化物イオンの脱離に必須の役割を果たすことが示された。2.2-ハロアクリル酸レダクターゼの発見と機能解析2-クロロアクリル酸資化性菌Burkholderia sp.WSが、NADPHを還元剤として2-ハロアクリル酸の不斉還元を触媒する新奇酵素2-ハロアクリル酸レダクターゼを生産することを明らかにした。本酵素と補酵素再生系を組み合わせることにより、除草剤の原料として有用な(S)-2-クロロプロピオン酸を効率よく生産することに成功した。
アルテミシニンの骨格多様化・複合化による生体機能性中分子の創製

漢方薬の有効成分であるアルテミシニンは,赤血球内に侵入したマラリア原虫をほぼ一掃する薬効を示し,マラリア治療に革新をもたらした。近年では,がんや他の感染症の治療にも有望な知見が報告されている。研究代表者らは,以前アルテミシニンの骨格や立体化学を改変したアナログ群を設計し,短段階(<7工程)合成した。アルテミシニンよりも優れた抗アフリカ睡眠病活性を示すリード化合物を見出し(J. Am. Chem. Soc. 2011),生理活性天然物をモチーフとした“骨格多様化合成"の概念を実証した(Chem. Rec. 2016)。しかし,アルテミシニンの構造を簡略化した第一世代アナログ群の抗マラリア活性はアルテミシニンに遠く及ばなかった。本研究では、アルテミシニンの6位不斉炭素を窒素に置換した6-アザ-アルテミシニン(第二世代アナログ群)を設計した。天然物骨格の炭素を窒素に置換する“元素置換戦略"により、(1)構築ブロックのモジュラー式集積化、(2)触媒的不斉合成、(3)骨格の三方位に導入した置換基(R1ーR3)のバリエーション創出、(4)縮環母骨格の水溶性向上を実現することができた。実際、構築ブロックの連結から僅か3ー4工程でペルオキシド架橋をもつ四環性骨格を構築し、アルテミシニンのC3,C6,C9位に非天然型置換基を導入できる触媒的不斉合成プロセスを開発した。C6位にN-アリールアルキル基を導入すると抗マラリア活性が向上することを見出した。6位にN-アリールアルキル基を導入した新しいファルマコフォアの発見を契機として、アルテミシニンよりも優れたIn Vivo治療効果を発揮するリード化合物の創製に成功した(北里大との共同研究、論文投稿中)。本年度は、アルテミシニンのC3,C6,C9位に非天然型置換基を導入できる触媒的不斉迅速合成プロセスを実現した。まず、低原子価チタンによる環化で、C9位, C8a位の立体を同時制御する手法を確立した。次に、C3位へ嵩高いtert-ブチル基を導入したアナログを創製することができた。更に、C6位の構造改変により、従前の構造活性相関研究で手付かずのまま残されていたC環部の構造多様化を実現した。C環部にN-アリールアルキル基を導入したファルマコフォアにより、抗マラりア活性(In Vitro/ In Vivo)が大幅に向上することを見出した。これを契機にアルテミシニンよりも優れたIn Vivo治療効果を発現するリード化合物を複数創製し、論文投稿した。また、上記の知見を踏まえて、末端アルキンを導入したプローブ分子を創出することができた。四環性骨格のC3,C6,C9位に非天然型置換基を導入できる本合成プロセスを基盤として、各種ハイブリッド分子やプローブ分子を設計・合成する。マラリアにとどまらず、他の感染症やがんへの適応を進める。更に、元素置換を他の部位にも適用し、医薬化学合成や合成生物学的物質生産系と相補的な合成プロセスを開発する。