hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
心筋症発症におけるC型肝炎ウイルスの意義

臨床的検討として80例の肥大型心筋症(HCM)患者(男性55例、女性25例、年齢56.6±12.4歳)について年齢と性別をマッチングさせたコントロール群80例と比較し、臨床的検討を行った。HCV抗体陽性患者数はHCM群では18例(21%)でありコントロール群の5例(6.2%)に比べ有意に高率であった(p=0.007)。HCM群においてHCV抗体陽性18例中12例においてHCV geno typeの測定を行なったが、7例(58%)が1b型、5例(42%)が2a型であった。基礎的検討としてHCVコア蛋白が心筋細胞の肥大に与える影響についての検討として、HCVコア蛋白のcDNAを培養心筋細胞に導入し蛋白合成能やANP、BNPの遺伝子発現を評価したが、明らかな変化は認めなかった。培養心筋細胞では長期間の培養ができないため、HCVコア蛋白の発現による影響が生体では長期間の経過後に出現する可能性を考え、HCVトランスジェニックを用いマウスでの心筋肥大や心機能を評価を行った。12ヶ月後には左室肥大と収縮期および拡張期の機能不全を認め肥厚型心筋症に進展した。また、HCVコア蛋白陽性マウスは全体的に血圧が低いが一部で心重量の増加が認められることよりHCVコア蛋白が心筋細胞の肥大に影響する可能性があると思われる。病理学的検討において、筋繊維の破壊、欠損、Z-band異常を認めた。さらに、筋繊維細胞の核の変形、ミトコンドリア数の増加、ミトコンドリアの凝集を認めた。これらの結果はHCVコア蛋白が心筋症の進展に重要な役割を果たしていることを示唆している。このトランスジェニックマウスを用いる方法はHCV感染による心筋症発症に対する適切な動物モデルになるものと考えられる。臨床症例での検討として、大阪市立大学医学部附属病院第一内科外来を受診し、病歴、臨床症状、身体所見、安静時心電図などにより肥大型心筋症が疑われた患者205例のうち、113名に心エコー図検査にて心筋肥大(心室中隔厚13mm以上)が確認できた。それら患者のうち、HCV抗体検索が可能であった63例を対象とした。ほぼ同時期に同附属病院冠疾患集中治療室に入院した患者リストから、心筋肥大を認めず年齢、性別を対応させた患者を対照群とした。心筋症群のうちHCV抗体陽性者14名、陰性者49名[陽性率22.2%(95%CI:12.7-34.5%)]に対して、対照群はHCV抗体陽性者5名、陰性者58名[陽性率7.9%(95%CI:2.6-17.6%)]であり、有意に心筋群のHCV抗体陽性率が高値であった(χ2乗検定:P=0.004)。HCV抗体陽性心筋症群14例のうち13例は家族歴を認めず弧発性であった。また、HCV抗体陽性心筋群全例において血中HCV-RNAは陽性であり、genotypeは1bが60%、2aが40%であった。肥大型心筋症には濃厚な家族歴を有し、遺伝子異常を認める症例が約半数あるが、残りは弧発性であり病因は不明である。今回の検討でHCV陽性心筋症患者の93%が弧発性であり、血中HCV-RNAが陽性であった。このことより、肥大型心筋症の原因としてC型肝炎ウイルスが関与していることが示唆された。

臨床的検討:80例の肥大型心筋症(HCM)患者(男性55例、女性25例、年齢56.6±12.4歳)について年齢と性別をマッチングさせたコントロール群80例と比較し、臨床的検討を行った。心エコー検査にて心筋が15mm以上の症例をHCMと診断した。HCV抗体陽性患者数はHCM群では18例(21%)でありコントロール群の5例(6.2%)に比べ有意に高率であった(p=0.007)。HCM群においてHCV抗体陽性18例中12例においてHCV genotypeの測定を行なったが、7例(58%)が1b型、5例(42%)が2a型であった。基礎的検討:HCVコア蛋白が心筋細胞の肥大に与える影響についての検討として、HCVコア蛋白のcDNAを培養心筋細胞に導入し蛋白合成能やANP、BNPの遺伝子発現を評価したが、明らかな変化は認めなかった。培養心筋細胞では長期間の培養ができないため、HCVコア蛋白の発現による影響が生体では長期間の経過後に出現する可能性を考え、HCVトランスジェニックをもちいて生後1年以上のマウスで現在心筋肥大や心機能を評価しているところである。HCVコア蛋白陽性マウスは全体的に血圧が低いが一部で心重量の増加が認められることよりHCVコア蛋白が心筋細胞の肥大に影響する可能性があると思われる。現在マウスの解析数を増やして検討中である。12ヶ月後には左室肥大と収縮期および拡張期の機能不全を認め肥厚型心筋症に進展した。また、HCVコア蛋白陽性マウスは全体的に血圧が低いが一部で心重量の増加が認められることよりHCVコア蛋白が心筋細胞の肥大に影響する可能性があると思われる。また、心筋内のANPのmRNA発現はHCVトランスジェニックマウスで増強していた。さらに、AP-1(activator protein-1)蛋白の転写活性の増強を認めた。このことより活性化したAP-1がHCVトランスジェニックマウスの心筋肥大を引き起こすと考えられた。病理学的検討において、筋繊維の破壊、欠損、Z-band異常を認めた。さらに、筋繊維細胞の核の変形、ミトコンドリア数の増加、ミトコンドリアの凝集を認めた。これらの結果はHCVコア蛋白が心筋症の進展に重要な役割を果たしていることを示唆している。このトランスジェニックマウスを用いる方法はHCV感染による心筋症発症に対する適切な動物モデルになるものと考えられる。
食道胃接合部腺癌における個別化治療を目的としたバイオマーカー解析

近年アジア諸国でも増加傾向にある食道胃接合部腺癌(Adenocarcinoma of the esophagogastr ic junction; AEG)のバイオマーカー解析を目的として計画した研究であり、近年治療薬として用いられる事が増えてきた分子標的製剤のターゲットとなるHER2やBEGF-R2のみならずEGFRやc-METの計測を計画している。2017年に本邦でも胃癌に保険収載された免疫チェックポイント阻害薬(PD-1/PD-L1経路)に関連するバイオマーカーの計測も予定しており、組織型などが類似しているAEGにも外挿が可能かどうかなども検討したい。また、2014年にアメリカで進められたThe Cancer Genome Atlas(TCGA)と称する癌ゲノムプロジェクトの結果が報告され、胃癌を4つのサブタイプに分類する新たな取り組みが進んでいる。今後の新規治療開発に向けて注目されているそのサブタイプ分類のキーとなるバイオマーカー(PDL-1, MMR, EBVなど)の日本人の胃癌症例での解析がなされ報告されている。そのため、AEGにおいても同様の分類が可能なのかの検討をすすめる予定である。H30年度は、神奈川県立がんセンター(KCC)および横浜市立大学(YCU)の臨床データベース構築(術前臨床データ、病理データ、再発予後データ)を個人情報の管理に十分留意の上で、それぞれの施設で情報収集およびアップデートを進めた。同時に、YCUコホートのTissue micro array)作製について、病理部門と協議を行い作製を進めてきた。神奈川県立がんセンター(KCC)および横浜市立大学(YCU)で臨床データベース構築及びYCUコホートのTissue micro array)作製を進めており、バイオマーカーの計測に必要な試薬を購入し、実際に免疫染色を行う段階までは到達している。しかし、H30年4月より、個人情報保護法により、さらに厳密な情報管理が求められるようになるため、特に臨床データの取り扱いに注意が必要となる。複数の施設でのデータ共有にあたり、それぞれの病院での規定に基づき、研究計画書の見直し及び倫理委員会への書類の再提出などが求められており、現在再申請及び倫理審査委員会の審査通過を待っている状況にあります。個人情報保護法に基づいた臨床データベース構築はほぼ終了しており、一部再発や予後を含めたデータの更新を行う。。マイクロアレイの構築もほぼ完了しており、2019年6月より免疫染色を行う予定である。バイオマーカー計測を進めて行く。解析を予定しているバイオマーカーはHER2、EGFR、VEGFR2、cMET、PD-1、PD-L1、MMR、EBV、TP53、である。次にこれらと既知の胃癌におけるタンパク発現率との差異を明らかとし、再発や予後を含めた臨床病理学的因子との関連を統計学的に解析する。近年アジア諸国でも増加傾向にある食道胃接合部腺癌(Adenocar cinoma of the esophagogastr ic junction; AEG)のバイオマーカー解析を目的として計画した研究であり、近年治療薬として用いられる事が増えてきた分子標的製剤のターゲットとなるHER2やBEGF-R2のみならずEGFRやc-METの計測を計画している。H29年度は、神奈川県立がんセンター(KCC)および横浜市立大学(YCU)の臨床データベース構築(術前臨床データ、病理データ、再発予後データ)を個人情報の管理に十分留意の上で、それぞれの施設で情報収集およびアップデートを進めた。

また、2014年にアメリカで進められたThe Cancer Genome Atlas(TCGA)と称する癌ゲノムプロジェクトの結果が報告され、胃癌を4つのサブタイプに分類する新たな取り組みが進んでいる。今後の新規治療開発に向けて注目されているそのサブタイプ分類のキーとなるバイオマーカー(PDL-1, MMR, EBVなど)の日本人の胃癌症例での解析がなされ報告されている。そのため、AEGにおいても同様の分類が可能なのかの検討をすすめる予定である。H30年度は、神奈川県立がんセンター(KCC)および横浜市立大学(YCU)の臨床データベース構築(術前臨床データ、病理データ、再発予後データ)を個人情報の管理に十分留意の上で、それぞれの施設で情報収集およびアップデートを進めた。同時に、YCUコホートのTissue micro array)作製について、病理部門と協議を行い作製を進めてきた。神奈川県立がんセンター(KCC)および横浜市立大学(YCU)で臨床データベース構築及びYCUコホートのTissue micro array)作製を進めており、バイオマーカーの計測に必要な試薬を購入し、実際に免疫染色を行う段階までは到達している。しかし、H30年4月より、個人情報保護法により、さらに厳密な情報管理が求められるようになるため、特に臨床データの取り扱いに注意が必要となる。複数の施設でのデータ共有にあたり、それぞれの病院での規定に基づき、研究計画書の見直し及び倫理委員会への書類の再提出などが求められており、現在再申請及び倫理審査委員会の審査通過を待っている状況にあります。個人情報保護法に基づいた臨床データベース構築及び運用の実際の修正を行い、予定通りのバイオマーカー計測を進めて行く。解析を予定しているのは、EGFR、VEGFR2、cMET、PD-L1、MMR、EBV、TP53、である。次にこれらと既知の胃癌におけるタンパク発現率との差異を明らかとし、予後を含めた臨床因子との関連を統計学的に解析する。個人情報保護法に基づいた臨床データベース構築はほぼ終了しており、一部再発や予後を含めたデータの更新を行う。。マイクロアレイの構築もほぼ完了しており、2019年6月より免疫染色を行う予定である。バイオマーカー計測を進めて行く。解析を予定しているバイオマーカーはHER2、EGFR、VEGFR2、cMET、PD-1、PD-L1、MMR、EBV、TP53、である。次にこれらと既知の胃癌におけるタンパク発現率との差異を明らかとし、再発や予後を含めた臨床病理学的因子との関連を統計学的に解析する。バイオマーカーの計測などの実験作業が当初の計画より少し遅れており試薬などの購入が予定より少なかったため、次年度の消耗品購入に充てる予定である。
“交流”を主眼とする災害復興活動の記録・分析とリスクコミュニケーションモデル構築

研究代表者は、平成22年度より“交流"を中心に据えたいわき市復興活動に参加している。本活動では、現地有志らと研究者らが、互いの立場関係無く、「いわき市でのコミュニティ交流活動」について議論を行っていた。平成26年3月17日、本活動は「NPO法人ふくしま洋上風力発電・絆ネットワーク」のコミュニティ交流活動事業となり、その活動拠点として、(有)ネクストホームモデルルーム(福島県いわき市仁井田町)を使用し、他法人より無償貸与された微量放射能測定装置を設置した。平成30年度は、前年度に龍谷大学で開催された「『ナラティブ(語り)研究の社会貢献を考える』ラウンドテーブル」に関連する共著の人文科学系研究書籍(論文集)の一章分を執筆した。具体的には、平成27年度に収録した「放射線に関する専門家の講演会を聴く小学校4年生・保護者の質疑応答」の場面を、「制度的場面での社会的相互行為における語り」とみなし、ELAN(動画内の言語・非言語情報に詳細にアノテーション付与出来るソフトウェア)を用いて動画に言語・非言語情報のアノテーション付与・分析作業を行い、その分析結果に基づいて、原稿を執筆した。本書籍は、2019年度に出版される予定である。また、平成30年度は、上述講演会の様な「公的な場での語り」との比較のための「私的な場での語り」として、日常会話場面を、撮影・記録するフィールワークも継続的に実施した。収録環境は、上記拠点、並びに、もう一つの活動拠点であるいわき市内のペンションである。本年度は最終年度であるが、次年度以降においても使用できる様に、平成26年度平成30年度の間に、十分な量の会話データを取得した。本データは、2019年度に採択された科研費・基盤(C)「『日常の科学コミュニケーション』が変化する局面の多角的分析」(2019年度2023年度、研究代表者)においても活用する。研究代表者は、2012年度より“交流"を中心に据えたいわき市復興活動に参加している。本活動では、現地有志らと研究者らが、互いの立場関係無く、「いわき市でのコミュニティ交流活動」についてボトムアップスタイルで問題提起し、議論を行っていた。2014年3月17日、本活動は「NPO法人ふくしま洋上風力発電・絆ネットワーク」のコミュニティ交流活動事業となった。その活動拠点(コミュニティスペース)として、(有)ネクストホームモデルルーム(福島県いわき市仁井田町)を使用することとし、他のNPO法人より無償貸与された微量放射能測定装置を、コミュニティスペースに設置した。交流活動事業の中心メンバーは、研究代表者の他に、上記NPO法人メンバー・菅野理沙氏、東京慈恵会医科大学・箕輪はるか氏、電気通信大学・佐藤賢一氏、いわき市フリーペーパー“Hi Magazine"ライター・高木永氏、(有)ネクストホーム代表・大森猛氏、並びにその従業員の方々で構成されている。初年度は、「微量放射能測定装置を設置したコミュニティスペースの運営方針」の洗い出し作業を実施し、「活動のエスノグラフィー記録」を行った。その結果、(1)交流活動の方向性を決めるだけに留め、具体的目標は敢えて定めない、(2)現場の意見を伺い、時々刻々と変化する状況・ニーズの変化を捉え、臨機応変に対処する、(3)交流活動事業外のコミュニティと積極的かつ有機的に連携し、「交流活動のソーシャル・キャピタル向上」を目指す、と言った方針が有効との知見を得て、それに関して学会で発表した。また、いわき市立小名浜第二小学校にて、46年生・PTA向けに、箕輪はるか氏を講師とした「放射線に関する出前授業」を企画・実施した。その場において、児童らの授業聴講の様子をビデオ撮影し、自由記述のアンケート調査を行うことで、マルチモーダルデータを獲得出来た。本活動では、現地有志らと研究者らが、互いの立場関係無く、「いわき市でのコミュニティ交流活動」について、ボトムアップに議論を行っていた。2014年3月17日、本活動は「NPO法人ふくしま洋上風力発電・絆ネットワーク」のコミュニティ交流活動事業となり、その活動拠点(コミュニティスペース)として、(有)ネクストホームモデルルーム(福島県いわき市仁井田町)を使用し、他法人より無償貸与された微量放射能測定装置を、コミュニティスペースに設置した。本科研費の研究課題は、本活動およびその近隣のコミュニティで営まれている“交流"を記録・分析し、リスクコミュニケーションの新しいモデルを提案することである。平成27年度は、前年度に得た知見((1)交流活動の方向性を決めるだけに留め、具体的目標は敢えて定めない、(2)現場の意見を伺い、時々刻々と変化する状況・ニーズの変化を捉え、臨機応変に対処する、(3)交流活動事業外のコミュニティと積極的かつ有機的に連携し、「交流活動のソーシャル・キャピタル向上」を目指す)に基づき、交流活動事業の現地有志らと研究者らとが協働し、いわき市立小名浜第二小学校のみならず、宮城県大崎市・中山平温泉観光協会の協力を得て、放射線に関する科学コミュニケーション(談話会)を実施し、また、その現場をビデオ撮影(エスノグラフィ記録)するフィールドワークを行い、マルチモーダルデータを得た。また、これまでに得たマルチモーダルデータの分析結果は、交流活動事業の改善、並びに地域の課題発見・解決のためのリソースとして活用出来ることを確認した。フィールドワークによって、下記(1)・(2)を行い、貴重なデータを得た。

しかしながら、年度後半に、電子情報通信学会「第29回回路とシステムワークショップ」運営業務に多くのエフォートを割く必要があり、データ分析作業とその研究発表を行うことが出来なかった。そのため、区分として「やや遅れている」を選択した。ただし、研究発表のためのデータは、過去2年間のフィールドワークにより、十分に獲得している。(1)平成27年8月、いわき市立小名浜第二小学校において、「箕輪はるか氏を講師とした出前授業を聴く児童達の様子を撮影した動画」を用い、当時の小学校担任の先生方を交えて、ビデオによる振り返り(ビデオリフレクション)を実施した。リフレクション素材として、社会科学分野で広く用いられているELANを用いてアノテーション付与した動画と、児童一人ひとりの感想文一覧表・動画のテキスト起こし文のハンドアウトを用いた。ビデオリフレクション参加者の表情を捉えるために、前方にビデオカメラを設置し、また、再生動画のどの部分に着目しているかを確認するために、後方にもビデオカメラを設置した。それにより、ビデオリフレクションの様子を詳細に撮影・記録出来た。(2)平成27年10月、宮城県大崎市の中山平温泉観光協会主催の「放射線に関する談話会」を、箕輪はるか氏を講師として実施した。この談話会に関しても、前後からビデオカメラで撮影し、数十名の参加者の表情・動作・質疑応答の様子に関するマルチモーダルデータを得た。研究代表者は、2012年度より“交流"を中心に据えたいわき市復興活動に参加している。本活動では、現地有志らと研究者らが、互いの立場関係無く、「いわき市でのコミュニティ交流活動」について、ボトムアップに議論を行っていた。2014年3月17日、本活動は「NPO法人ふくしま洋上風力発電・絆ネットワーク」のコミュニティ交流活動事業となり、その活動拠点(コミュニティスペース)として、(有)ネクストホームモデルルーム(福島県いわき市仁井田町)を使用し、他法人より無償貸与された微量放射能測定装置を、コミュニティスペースに設置した。平成27年度までに得た「放射線に関する出前授業を聴く小学校児童達(4・5・6年生)を撮影した動画」並びに「中山平温泉観光協会主催の放射線に関する談話会の動画」の内容は、「フォーマルかつ公的な場でのナラティブ」であった。そこでそれらとの比較のために、平成28年度は「インフォーマルかつプライベートな場でのナラティブ」に焦点を当て、フィールドワークを実施した。その結果として「研究協力者に研究代表者が交じり懇談する場面」を撮影し、多くのマルチモーダルデータを得た。対外的アウトリーチ活動としては、電子情報通信学会・システム数理と応用研究会において、本研究の進捗状況について「“交流"を主眼とする科学コミュニケーション活動の記録・分析いわきにおける放射線に関する対話」と題する招待講演を行った。また、3月に龍谷大学で開催された「『ナラティブ(語り)研究の社会貢献を考える』ラウンドテーブル」において、本研究課題に関する発表並びに全体討議に参加した。(1)「インフォーマルかつプライベートな場でのナラティブ」として、「研究協力者に研究代表者が交じり懇談する場面」を、いわき市近郊の様々な場所において収録した。
φX174ファージ感染を司るスパイクHタンパク質の機能と構造

スパイクHタンパク質のリポ多糖認識と立体構造変化におけるリポ多糖脂質部分の寄与φX174の宿主である大腸菌C株のLPSをヒドラジンや熱アルカリ処理することによって脂質部分を切断した脱アシルLPS誘導体を調製した。それらの脱アシル誘導体では,Hタンパク質との親和性が大きく低下し,立体構造が変化が極めて小さくなった。スパイクタンパク質による認識におけるLPSの荷電残基の寄与LPSをフッ化水素酸や水素化ホウ素ナトリウムによって処理し,脱リン酸およびKDO還元LPS誘導体を調製した。それらの誘導体とスパイクHおよびGタンパク質の相互作用を検証したところ,Hタンパク質はリン酸残基をGタンパク質はKDO残基の負電荷を失うことで,認識と立体構造変化を大きく低下することが明らかになった。Hタンパク質のプロテアーゼ抵抗性ドメインの同定と機能解析Hタンパク質をV8プロテアーゼ処理することによって,二つのプロテアーゼ耐性断片(F2,F3)を得た。F2は,Hタンパク質の215-345残基であり,F3は,N末端側の1-102残基であることが,N末端アミノ酸配列解析や,質量分析から判明した。これらの二つのドメインと大腸菌C株のLPSに対する相互作用を表面プラズモン共鳴装置によって検証したところ,C末端側のF2ドメインが,Hタンパク質と同等の親和性を示したのに対して,N末端側のF3ドメインは,Hタンパク質の約1/10の親和性を示した。バクテリオファージφX174のスパイクHタンパク質は、宿主菌外膜に含まれるリポ多糖(LPS)を認識してファージ遺伝子を運ぶパイロットタンパク質であると考えられてきた。これまで,我々は遺伝子工学的に調製したHタンパク質と大腸菌LPSの相互作用解析を進め,Hタンパク質はLPSと相互作用することにより,大きく立体構造を変えることが判った。平成17年度は,以下の研究を行った。Hタンパク質と脱アシルLPS誘導体の相互作用解析大腸菌C株由来のLPSの脂質部分を部分的あるいは,全て切断したO-脱アシルおよび,O,N-脱アシル誘導体を調製して、Hタンパク質との相互作用を非処理のLPSのそれと比較した。その結果,蛍光スペクトル強度が増大から減少に転じ,CDスペクトルでは,αヘリッックスに対応する立体構造の変化が起こらなくなった。そのことから,Hタンパク質が立体構造変化を起こすためには,LPSの脂質部分が重要であると結論した。Hタンパク質の結晶化条件の検討市販の結晶化スクリーニングキットを利用して多くの沈殿剤から結晶化に好適な沈殿剤を探すため,備品として購入した,低温恒温機を用いて条件を検討した。クエン酸とイミダゾールを加えた緩衝液において,ポリエチレングリコール#6000を沈殿剤として加える条件で微結晶が得られた。さらに,これらの条件を検討する価値があると考えられた。Hタンパク質のドメイン構造の切り出し実験Hタンパク質を薄い濃度のV8プロテアーゼによって処理したところ,まず,主に2つの断片F1,F2に分解し,その後,F1断片はさらに分解してF3断片になることを見いだした。F2およびF3断片は,ある程度の安定で単離できる見込みがある。今後,これらの断片を大量に得ることによって,切断箇所の特定を行う必要がある。φX174ファージのスパイクHタンパク質は、宿主菌表面のリポ多糖(LPS)を認識すると共にファージ遺伝子を菌体内に運ぶ役割を持つと考えられてきた。平成17年度は,Hタンパク質がLPSと結合して立体構造が変わる際にLPSの脂質部分が重要であることを明らかにした。また,Hタンパク質をV8プロテアーゼで処理すると二つの断片に分かれることが判った。平成18年度は,以下の研究を行った。

リン酸残基やKDOのカルボキシル基の除去したLPS誘導体とスパイクタンパク質の相互作用解析LPSをフッ化水素酸で処理して,脱リン酸LPSおよび,さらに水溶性カルボジイミドと水素化ホウ素ナトリウムで処理して,脱リン酸・KDO還元LPSを調製して、HおよびGタンパク質との相互作用を調べた結果,Hタンパク質の相互作用と立体構造変化には,KDO残基とリン酸残基の両方が関与し,いっぽう,Gタンパク質では,KDO残基の関与がとても大きいことが判った。LPS含有単分子膜を利用する表面プラズモン共鳴法の検討金薄膜に疎水性の表面を調製したBIACORE社のHPA基盤に対して,PC:PE:PG=2:1:1の組成を持つリン脂質混合物を使って調製した小型リン脂質リポソーム(SUV)にLPSを混ぜ込む方法で,LPSを含有する単分子膜を基盤上に安定に固定化することができた。そこへ,スパイクタンパク質やφX174ファージを注入すると特異的な相互作用を検出することに成功した。ウイルス粒子のLPS含有単分子膜に対する親和性は,二つのスパイクタンパク質よりも桁違いに高かった。Hタンパク質の中のプロテアーゼ耐性ドメインの特定V8プロテアーゼによるHタンパク質の限定分解によって得た二つの断片(F2およびF3)をSDS-PAGEゲルから疎水膜に転写して,N末端アミノ酸配列解析を行ったところ,F2断片は,Hタンパク質の215番目のアスパラギンからC末端345番目までの131残基の断片であり,F3断片は,N末端メチオニンから102番目のグルタミン酸までの102残基の断片であることが判った。今後,これらの断片を大量に調製し,そこから単離精製を行って,LPSとの相互作用を検証する必要がある。Hタンパク質のプロテアーゼ抵抗性ドメインの単離と機能解析Hタンパク質をV8プロテアーゼによって穏和な条件で限定分解することよって得られた,二つのプロテアーゼ耐性ドメイン(F2,F3)をNi-NATアガロースとDEAE-セルロファインによるクロマトグラフィーによって単離精製した。それらとファージの宿主菌である大腸菌C株のリボ多糖に対する相互作用を表面プラズモン共嗚装置によって検証したところ,Hタンパク質のC末端側1/3にあたるF2ドメインが,Hタンパク質と同等の親和性を示したのに対して,N末端側の1/3にあたるF3ドメインは,Hタンバク質の約1/10の親和性を示した。このことから,Hタンパク質は主にC末端ドメインでリボ多糖を認識することが判った。また,二つの断片の円偏光二色性スペクトを合算したスペクトルが,Hタンパク質のスペクトルに極めて良く一致したことから,プロテアーゼによって取り除かれた部分(103-214残基)は,あまり強固な立体構造を持たない部分と推定された。Hタンパク質のプロテアーゼ抵抗性ドメインの大量発現と機能解析および結晶化の試みF2ドメインにヒスチジンタグを融合したタンパク質断片を大腸菌JM109株で大量に発現することに成功し,ヒスチジンタグを利用したNi-NTAアガロースによるクロマトグラフィーによって単一に精製することができた。この組み替えタンパク質とリポ多糖との相互作用を蛍光スペクトルや円偏光二色性によって確認したところ,先に得られたF2断片による測定結果と良く一致した。
電気化学反応の原子スケールでの固液界面制御と超精密界面を用いた触媒機構の解明

電気化学、表面科学、触媒化学などの固液界面現象が深く関わる科学技術分野において、界面現象の原子レベルでの制御技術の確立が強く望まれている。そんな中でも燃料電池の電極反応について、原子レベルで根源的理解を追求するために、より広範囲に原子レベルで平坦な表面「超平坦表面」を基板として利用した抜本的な再調査が必要である。本研究課題において初年度である当該年度は、研究実施計画に基づいて、まず超平坦表面の作成技術の確立を実施した。金属単結晶表面を用いた電気化学・表面科学研究はこれまでにも世界中で報告されているが、技術的要因から最も広いテラスでも高々100nm程度の幅をもつ結晶表面しか作成・使用することができず、理想的は平坦表面と比較してそのステップ・表面欠陥密度は高く、それによる影響も無視できない状況であった。また単結晶表面は著しく汚染され易く、電気化学測定を実施する場合にこれまでの使用環境では30分程度で表面汚染されることが確認されている。超平坦表面の耐久時間を延長することは今後の研究開発を実施する上で長時間測定を可能にするだけでなく、研究開発・分析の精度・感度、つまりは信頼性を向上するためにも必要不可欠な技術革新を見出すものである。そこで超平坦表面の電気化学的な創製法の確立と、超平坦表面を評価・活用する実験環境の厳密清浄化技術の開発・確立を行った。極限的に電位制御することで、電気化学的エッチングにより金表面のステップを選択的に溶解させる原子レベルでの反応制御条件を見出した。このことで最大2μmの幅のテラスを示す平坦表面の恒常的作成に成功した。また実験環境の厳密清浄化技術を改善することで、これまで30分程度だった単結晶表面の測定耐久時間を42時間にまで延長する技術・環境の開発に成功した。
高温期のトマト肥大不良果発生における温度反応特性の解析

トマト夏秋期生産の不安定要因のひとつとして肥大不良果の発生が考えられるが、その発生機構には未解明な部分が残されている。本研究では、温室の夏期高温下における国内品種の果実発達と気温との関係を解析し果実肥大特性を解明する。また、既に選定している高温応答性および細胞周期関連機能を持つ肥大不良果発生関連遺伝子の発現変動を、環境制御装置内の多様な高温条件下において明らかにする。さらに、これらの解析結果から果実肥大に関して温度制御すべき果実発達段階や適正な温度条件を特定し、夏期高温下の肥大不良果発生回避技術の開発に役立てる。
EUおよびドイツにおける労働者の個人情報保護の実効性確保についての法的検討

本年度は、EUおよびドイツにおける労働者の個人情報保護の実効性確保についての法的検討をさらに進める目的で以下の通り家施した。1裁判例の検討ドイツにおける労働者の個入情報保護の仕組みである、事業所内テータ保護監督員の法的地位に係る裁判例を検討したまた、職場における労働者のインターネント利用のあり方と職務専念義務との関係に関わる裁判例を検討した。2インタビュー調査2007年9月6日13日、トイツ連邦共和国において調査を行った。フランクフルトにおいて労働法を専門に扱う弁護士と面談した。また、ハンフルクにおいて、ハンブルク大学のUrlich Zachert教授と面談し、EUおよびドイツにおける労働者の個人情報保護のあり方についての知見を得た。さらに、ハンフノヒク労働裁判所の裁判官と面談し、実際の裁判の様子を見学した。3学術論文等の検討ドイツにおける労働者の個人情報保護の実効性確保に関わって重要な役割を担うのは事業所内データ保護監督員であるが、その者の事業所内における法的地位に関する学術論文を検討し、考察を深めた。また、学術論文を検討する過程において、現在のドイツにおける問題関心が、企業内における情報管理のあり方や情報技術との関わり方(たとえば、勤務時間中におけるインターネノトの私的利用に対する規制など)など、情報と労働という全般的なとらえ方かなされていることを確認した。本研究の目的は、職場における労働者の個人情報保護を実効性あるものとするにはどのような仕組みが必要であるかを、比較法的検討を通じて、明らかにすることにある。比較法の対象として取り上げるのは、EUおよびドイツである。EUは、1995年に個人情報保護に関する指令を発し、そのなかで安全管理措置のありようについても言及した。そこで採用された措置は、ドイツが同国における最初の個人情報保護である連邦データ保護法以来採用している個人情報保護のための措置である。すなわちそれは、監督官庁による監視を通じて個人情報保護をはかるのではなく、組織内にデータ保護監督員を任命してその者を通じて組織内の個人情報保護を図ろうとするものである。まずEUおよびドイツの状況を分析するにあたっては、なぜこのような仕組みが採られたのかということが注目される。次に問題となってくるのは、このデータ保護監督員がいかなる法的位置づけをもつものとして把握されるかである。すなわち、その任務を十分に全うするための職業訓練システム、身分保障、独立性の確保とくにこのことはデータ保護監督員が当該組織(会社)のなかで従業員としての業務をも負っているときに大きな問題となる。平成18年度は、ドイツにおける判例および分権の分析研究を中心におこなった。また、日本人のドイツ労働法研究者およびドイツから招聘されたドイツ人の労働法研究者との議論を通じて検討を深めてきたところである。日本においては、個人情報保護にかかわる専門スタッフを置くという意識はまだまだ弱いが、今後必要となってこざるを得ない。次年度にこれまでの研究をまとめていくことにしている。
明治期学校訓育の成立に関する地域実態史研究

本研究は、従来ともすればその理論だけを対象としがちであった。明治期の学校訓育の研究の限界性を越えて、地域の学校で行われていた実際の学校訓育の実践に着目し、とりわけ特色ある独自の実践を行っていた地域やそこの学校の実践を明らかにすることを通して、明治期学校訓育の成立に関する地域実態史の実像に迫ろうとしたものである。その際、調査対象の仮説設定および具体的な対象地域として、(1)学校訓育実践の「定型」がかなり確定している地域-広島、愛媛、(2)学校訓育実践における「定型」からの「自由」がある程度追求されている地域-長野、福井,(3)その他特色ある学校訓育実践を展開している地域-青森、奈良とした。今年度の研究成果として、(1)については、広島県の佐伯地区を中心にして、(3)については、奈良県の桜井地区を中心にして、その地域で保管されている地方史料(東京での中央および地方の史料調査を含む)の収集・分析・検討を行い、仮説にもとづくそれらの地域の学校訓育実践の特質を一定程度解明することができた。今後は、引き続き、(1)(3)の残された地域および(2)について調査を進め、それらの地域の学校訓育実践の特質を明らかにするとともに、その結果の比較分析も行っていく予定である。
熱対流方程式の研究

熱対流方程式(ブシネスク近似)について、次の結果を得た。境界条件はいずれも第三種である。1.定常問題について領域がR^3の有界領域でかつ境界が滑らかなとき、与えられた境界条件の大きさに無関係に、弱解が常に存在する。2.非定常問題について(i)2≦n≦4のとき、滑らかな境界をもつ有界領域(R^nの)の場合境界条件と初期条件の大きさに関係なく弱解が存在する(ii)解の挙動に制限を加えれば一意性も得られる。
市民・行政・企業のパートナーシップによる「持続可能なコミュニティ」の形成

本研究は、市民・行政・企業のパートナーシップの下に、市民公益活動によって地域で環境問題に配慮した「持続可能なコミュニティ」が形成されていく可能性を探ることを目的としていた。研究成果は、(1)地域で環境問題に取り組む環境NPOの活動について、(2)環境NPOを軸としたパートナーシップ形成について、(3)世界遺産の候補地でもある鎌倉市という「環境自治体」における市民と行政のパートナーシップによるコミュニティづくりについて、の3点に具体的に現われている。第1は、論文「環境NPOとNPO段階の市民運動-日本における環境運動の現在」(『講座環境社会学』第7巻、有斐閣)として今年出版される予定である。環境問題を分類し、それに取り組む環境NPOはコミュニティづくりに収斂していくことを明かにした。第2は、論文「環境NPOの現在とパートナーシップ形成の可能性」(「NPOシリーズ」第7巻『NPOと環境』、ミネルヴァ書房)として今年12月に出版される予定である。環境NPOの支援体制の中で行政や企業とのパートナーシップ形成の条件について述べている。第3は、「鎌倉NPO環境・交通調査」として報告書の形でまとめた。鎌倉市に対しては、1998年度には環境分野での市民活動、1999年度には環境問題としての交通対策とコミュニティづくりについて行政と市民のパートナーシップに焦点を合わせて調査した。これはゼミの学生たちとの共同執筆となっている。これらから明らかになったことは、現代の大きな流れはパートナーシップを通じて「市民社会」実現に向っていること、しかしまだ市民の力が弱いこと、そのエンパワーのためには制度的枠組が必要なこと、具体的にはNPO法への税制優遇措置の追加、市民による民設民営のNPOサポートセンターの充実である。なおNPOサポートセンターについては、『講座・社会変動』第10巻「計画化と公共性」(ミネルヴァ書房)の中の論文として現在執筆中である。今回の調査で明らかになったことは、市民・行政・企業の間のパートナーシップ核となる市民活動を中心にしたNPO(民間非営利組織)と、それに接する行政・企業との境界が柔らかくなり、行政・企業の中の人たちもNPOと共働で地域に「公益領域」を創り出そうとする動きが現われていることを確認できたことである。そしてその「公益領域」の場が先の3者の関係する「コミュニティ」なのである。八戸、名古屋、三重、仙台、帯広、札幌等のヒアリング調査で得られた知見をまとめると次のことが言える。パートナーシップの仕組みに関する基本認識としては=1)NPOは「公益領域」での活動主体であり、その領域の大切さを自覚した者たち(行政、企業、非営利共働セクター)が、直接援助(人・金・情報)および基盤整備を行う。2)NPO、行政、企業、非営利共働セクターは、それぞれが組織としての社会的責任を自覚し、具体的にはそれぞれが関わるコミュニティの活性化を目指して共働する。次にパートナーシップを成り立たせる条件としては=1)NPOは実績(そのためのしっかりした組織をつくること。2)NPO、行政、企業、非営利共働セクターは、共に「NPOセクター」を形成しつつあるという自覚をもつこと。3)具体的な関係では、組織を背負わない個人どうしの関係であること。(肩書きなしの関係。それが「公益領域」の特質のーつ。)4)相互の信頼関係が根本であること。そのためにはお互いによく知り合うこと。そのためには互いの垣根を低くしておく(境界をオープンに)。加えて、相手の価値観や言葉を理解する媒介者を必要としている。以上の結果、市民・行政・企業のパートナーシップによる「持続可能なコミュニティ」が形成される。だがNPOをとりまく状況は時々刻々と変化している。その現状をリアルタイムで捉えるには、さらに研究を続けていく必要がある。(785字)

本研究では、市民・行政・企業のパートナーシップの下に、市民公益活動によって地域で環境問題に配慮した「持続可能なコミュニティ」が形成されていく可能性を探ることを目的としている。そのために研究実施計画では3つの柱を立てたので、それぞれについてどのように研究を進めたかを具体的に述べていく。1.地域で市民公益活動の基盤づくり(コミュニティづくり)を行っているNPOサポートセンターの活動実態の調査。⇒環境保護団体が中心になってサポートセンターをつくった「NPOふくおか」、4階建てのビルと什器を企業より提供してもらってサポートセンターとした「NPOプラザなごや」、仙台市から公開入札でサポートセンター運営の業務委託を受けた「せんだい・みやぎNPOセンター」、青年会議所が母体になっている「大阪NPOセンター」などを調査した。2.NPOセンターの全国組織を調査し、それぞれのNPOセンターをどのようにつないでコミュニティづくりに寄与しているのかの調査。⇒「NPOサポートセンター連絡会(元推進フォーラム)」の5月の全国会議、「日本NPOセンター」の9月の全国大会に出席し、各地の実践例と資料の収集を行った。3.NPOによるコミュニティづくりの具体例として、「環境自治体」を宣言している鎌倉市の調査。⇒現在の最大の問題である広町・台峯緑地の保存問題およびパーク&ライドによる交通量削減問題をめぐって、「広町を愛する市民の会」、「鎌倉風致保存会」、「鎌倉のまちづくり市民懇談会」、交通政策課、みどり課などにヒアリングを行った。今後は「持続可能なコミュニティ」を市民の手でつくろうとしている動きとして、ナショナル・トラストやグラウンドワーク・トラストなどの全国的な展開を見せている「地域づくり」を調査していきたい。
湿式酸化によるN、P循環型バイオエタノール発酵システムの研究

近年、バイオエタノールに関する研究が活発に進められている。バイオエタノール生産を実現させるためには、製品エタノールが化石燃料に対して価格競争力を持つこと、生産システムが持続可能であること、CO_2削減効果を有することが重要である。本研究は、持続可能性の観点からバイオエタノール生産の発酵工程における資源循環を検討するものである。バイオエタノールの製造では、発酵微生物の生産は不可欠な工程であり、この微生物の生産工程では、菌体増殖に必要な窒素、リン、カリウム等の栄養素が投入されるが、一般的には、これらの栄養素はプロセス後段で回収されることなく、系外に排出されている。発酵後の菌体と発酵前の菌体の組成は基本的に同じであり、循環利用は可能である。ただし、循環させるためには、どのように栄養素を回収するかを検討する必要がある。廃酵母は水分を多く含むため燃焼して栄養素を回収することは難しい。そこで、湿式酸化法の適用を検討することとした。湿式酸化は水中燃焼法とも呼ばれ、高温高圧条件下で酸素と反応させ、有機物を分解する技術であるため、無機物の回収は可能である。廃酵母の湿式酸化処理物は、基本的に酵母菌体の成長に必要な栄養元素を満たしている。この湿式酸化処理物を利用し、酵母を生産することができれば、循環型の発酵システムを構築できる。本研究では、バイオエタノール生産の発酵工程において湿式酸化工程を導入したリン、カリウム循環型の発酵システムの検討を行った。その結果、湿式酸化工程の導入は生産されるエタノールの発熱量の2.3%相当のプロセスエネルギーで十分にリン、カリウムを回収できると試算された。また、基質消費量の削減による経済性向上は大きく、湿式酸化工程導入の経済的優位性が明らかとなった。とくに、リンは近い将来に枯渇すると言われている貴重な資源であり、使用量の削減は重要である。さらに、リンは水質汚濁防止法の項目に挙げられているものであり、廃水処理の負荷を減らすことには着目するべきである。現状としてあまり関心の払われていない廃棄物および廃水処理に関する問題はいずれ顕在化するのは明らかであり、本提案プロセスはこの意味で極めて有効なプロセスと考えられる。
液状検体を用いた唾液腺癌の診断および予後因子の検討

本研究の目的は、唾液腺腫瘍(SGT)において細胞診で組織型を確定することで治療選択、予後を改善することにある。近年、SGTは組織亜型により治療戦略を変更している。SGTは耳下腺発生が多く、一般的に術前診断には細胞診が用いられるが、組織型確定は困難である。形態的に核異型が弱く、類似する組織型の多い腺様嚢胞癌(ACC)ではMYB, MYBL1, NFIBの検討が有用であった。FISH法は一般的にパラフィン切片で実施するが、組織型に特異的な融合遺伝子の検出が細胞診で可能か検討し発表した。我々は、ACCの細胞診において生検の負担の軽減、治療戦略の点から、FISH法が極めて有用であることを見出した。本研究の目的は、唾液腺腫瘍において細胞診の診断精度をあげて治療選択および予後予測に役立てることにある。耳下腺腫瘍においては術前に穿刺吸引細胞診を実施するのが通常であるが、これまでの検討では正診率は71.2%で、小唾液腺の腺様嚢胞癌の症例に限ると更に低く30%となる。唾液腺腫瘍では、ときに良性、悪性が鑑別に挙がり、診断困難な例が少なくない。組織診断に際しては免疫染色が必須であり、最近では融合遺伝子の検索が診断確定および予後予測のうえで重要な意味を持ちはじめている。細胞診においては形態学的な検索が主流であるが、免疫染色や融合遺伝子の検索システムを導入することにより、診断精度が上がることが予測される。昨年度に引き続き唾液腺腫瘍組織(10%ホルマリン固定/パラフィン包埋組織)を用い、融合遺伝子のスクリーニングを行った。組織マイクロアレイ(Tissue Miroarray, TMA)は、合計184例とほぼ予定の症例数に達した。既知の融合遺伝子についてFISH法にてスクリーニングを実施している。昨年までの融合遺伝子と併せて唾液腺腫瘍で知られるCTNNB1-PLAG1, LIFR-PLAG1, TCEA1-PLAG1, NFIB-HMGA2, FHIT-HMGA2, WIF1-HMGA2, CRTC1-MAML2, CRTC2-MAML2, CRTC3-MAML2, EWSR1-POU5F1, NTRK3-ETV6と唾液腺腫瘍以外で知られているROS1, KIF5B, EML4-ALK, BRD4-NUT, BRD3-NUTなどを加え検討した。これまでの報告と同様に組織型に特異的な融合遺伝子の転座が確認されたが、一部は診断を変更すべき症例が存在した。様々な組織型に存在する亜型(淡明化、粘液化生、オンコサイト化など)を有する群につき解析を加えたところ、特に淡明細胞の混在する腫瘍については、腫瘍の本質を捉えるうえで融合遺伝子の解析が重要な意味を持つ可能性がでてきた。細胞診検体でのFISHの検討については、手術検体から捺印細胞を採取し、適した採取条件やプロトコールを検討し終えた。現在、各組織型の捺印検体を準備し、組織での陽性細胞の割合や分布との比較検討を行っている。また、細胞診検体で融合遺伝子の検出が診断上有用であった例の症例報告を予定している。唾液腺癌は耳下腺発生が多く、生検が困難で術前診断には穿刺吸引細胞診が実施される。また、唾液腺腫瘍は一部の成分のみでの全体像の把握は難しく、診断確定は困難である場合が多い。1)従来の治療の問題点唾液腺癌の治療は手術が第1選択で補助的に放射線化学療法を実施している。切除不能な場合には、細胞診で組織型を確定することなく放射線化学療法を施行することが少なくない。近年HER2陽性の唾液腺癌に関しては、術後化学療法としてHER2を標的とした治療の有効性が示されつつあり、組織型に基づいた化学療法の選択が可能となりつつある。そこで、組織型別の奏効率を検討し報告した。2)組織学的悪性度評価の意義既存の悪性度分類や、唾液腺導管癌の多施設共同研究においても同時に進めている核グレードなどを用いた悪性度分類を行うことにより、予後の不良な群を抽出し、治療を行うことが可能となる。これらの検討を行い報告した。3)融合遺伝子による分類の意義形態的に良悪性腫瘍で類似したものがあり、形態のみで組織型を確定することは難しいことから免疫染色や融合遺伝子の検索が必要となる。高悪性度の癌の場合にも、時に低悪性度に分類される腫瘍から高悪性転化により発生した腫瘍が含まれ、融合遺伝子の検出によりもとの組織型を確認することが可能な症例があった。既知の融合遺伝子を組織切片上で検討し、既報告と同様の結果が得られ、形態診断と融合遺伝子の発現は一致したが、ごく少数例不一致の症例があり報告した。細胞診検体においても、組織切片での陽性率や分布と同様に検出できた。特に形態的に核異型が弱く、他の類似する組織型の多く存在する腺様嚢胞癌についてはMYB, NFIBのFISH検討が有用であり、7割程度の症例を検出できることが解かった。既知の融合遺伝子については予定数の検索が終わった。

検索により、融合遺伝子の発現と組織型は概ね報告と矛盾ない結果であった。融合遺伝子の検索と形態学が合わないものについては報告を行ってきた。融合遺伝子の確認される組織型は臨床上は悪性腫瘍であっても、局所制御が可能な場合が多く経過も良好である。しかし、融合遺伝子のみつかっている腫瘍のうち腺様嚢胞癌の場合は特に経過の不良な群があり、追加治療の適応となる。しかし、これまでの化学療法では効果が得られないことから、早期に手術を行うか新たな治療標的を探すことが必要となる。良性腫瘍との鑑別が難しい形態的特徴から、診断確定が遅れることにより進行してしまう。診断確定のためには形態学的な検索以外に融合遺伝子の検索が有用なこと、融合遺伝子の検索は細胞診でも可能なことを報告してきた。しかし、既知の融合遺伝子では7割程度の腺様嚢胞癌だけが陽性となるが、残りの3割を診断を確定できる融合遺伝子をみつけることが重要である。本研究期間の終了直前に腺様嚢胞癌の融合遺伝子としてMYB以外のものとしてMYBL1が同時に3つの論文が報告された。本研究において腺様嚢胞癌の検索は重要な意味を持つことから、この因子の解析を追加で実施している段階にあり、研究期間の延長を申請した。本研究の目的は、唾液腺腫瘍において細胞診の診断精度をあげて治療選択および予後予測に役立てることにある。本年度は特に唾液腺導管癌の研究に加え、腺様嚢胞癌および硝子化明細胞癌に着目し、検討して報告した。1)唾液腺癌の治療の検討唾液腺癌の治療は手術が第1選択で補助的に放射線化学療法を実施する。特に近年バイオマーカー(HER2等)を標的とした治療の有効性が示され、組織型に基づいた化学療法の選択が可能となりつつある。単施設で組織型別の奏効率を検討し報告した(Nakano K, Sato Y, et al.)。多施設共同研究ではバイオマーカー陽性の唾液腺導管癌の組織型に絞って検討して報告した(Ohtsuka, et al., Kawakita D, et al.)。2)融合遺伝子による分類の意義形態のみで組織型を確定することが難しい場合に、融合遺伝子の検索が必要となる。特に臓器によって、細胞診検体で組織型を特定できた場合、積極的な外科手術を検討する機会が増える。特に腺様嚢胞癌においては遠隔転移があった場合でも、長期予後が望めることから、原発切除の可能性がある。細胞診検体で融合遺伝子の検索(MYB, MYBL1等)を行うことにより、細胞診検体で診断推定に至る確率が増える可能性を報告した。3)多臓器横断的な検討腺様嚢胞癌については、呼吸器、眼科、乳腺科、婦人科においても検索し、頭頸部の唾液腺発生と同様の結果を得られ、MYB, MYBL1の異常などの病因論を発表した(冨樫ら)。硝子化淡明細胞癌については、呼吸器で粘表皮癌と診断されてきた症例のうち、淡明な成分を有するもの、硝子化の強い群では、EWSR1の変異が確認され、診断を変更する報告を行った(高松学ら)。いずれも論文化をすすめている。4)細胞診検体での検討組織切片での陽性率や分布と同様に検出でき、FISHの条件を確立した。本研究の目的は、唾液腺腫瘍(SGT)において細胞診で組織型を確定することで治療選択、予後を改善することにある。近年、SGTは組織亜型により治療戦略を変更している。SGTは耳下腺発生が多く、一般的に術前診断には細胞診が用いられるが、組織型確定は困難である。
疾患動物モデルを用いた抗MuSK抗体陽性重症筋無力症の治療薬探索と病態機序の解明

抗MuSK抗体陽性重症筋無力症(MuSK-MG)は従来の治療法に対して難治性の症例が多く、急激に悪化して重症化する症例も報告されている。現在、重症筋無力症の治療としてはステロイド薬が第一選択とされているが、その多彩かつ重大な副作用を考慮して治療方針を構築するためには、ステロイド薬以外の免疫抑制薬をうまく活用する必要があると考えられる。本研究では、MuSK-MGの動物モデルを用いて、mTOR阻害薬のラパマイシンが新たな治療薬として有用である可能性が示された。現在、重症筋無力症の治療はステロイド薬を第一選択とし、それを補う形で他の免疫抑制薬が併用されている。しかし、抗MuSK抗体陽性重症筋無力症(MuSK-MG)は抗AChR抗体陽性重症筋無力症(AChR-MG)と比較して患者数が少ないこともあり、治療薬に対する根拠に乏しい状況である。また、AChR-MGとMuSK-MGの発症機序が異なることを考慮すると、区別して治療に当たる必要があると考えられる。本研究では、申請者が作成したMuSK-MGの動物モデルを用いて、現在の重症筋無力症の治療指針に対して新たな指針を提言するだけでなく、MuSK-MGの新たな病態機序の解明を介して新規治療法の確立につなげることを目的とする。平成25年度は、迅速な臨床研究への移行と疾患への適応認可を目的とするため、海外で既に使用が認可され、免疫抑制作用が報告されているmTOR阻害薬のラパマイシンの治療効果を検討した。マウスにMuSKタンパクを2回免疫注射すると、筋萎縮・筋力低下を伴う体重減少が認められ、重症筋無力症が発症する。しかし、2回目のMuSKタンパクを免疫注射した日からラパマイシンの投与を開始すると、MuSK-MGの発症に伴う体重減少が抑えられた。神経筋シナプスの形態観察では、シナプス後膜に多数のAChR凝集が明確に認められ、vehicle投与マウスとの形態の違いは明らかであった。また、血中の抗MuSK抗体価の上昇が抑えられており、ラパマイシンは抗体の産生を抑制することでMuSK-MGの発症を抑えていると考えられ、MuSK-MGの新たな治療薬として有用である可能性が示された。MuSK-MGの病態はポストシナプス側の感受性低下だけでなく、プレシナプス側の機能低下も関与している。そのため、プレシナプス側の形態変化を解析することはMuSK-MGの病態機序の解明につながり、治療効果を評価する上で有用であると考えた。平成26年度はプレシナプス側のactive zone (アセチルコリンの放出部位)に存在するbassoon分子に対する抗体を作成した。この抗体を用いた免疫蛍光染色と超解像顕微鏡での観察を組み合わせることで、従来の光学顕微鏡の分解能(200 nm)を上回る精度でシナプスの病態変化を解析することが可能になった。本研究では、現在の重症筋無力症の治療指針に対して新たな指針を提言するだけでなく、MuSK-MGの新たな病態機序の解明を介して新規治療法の確立につなげることを目的とする。平成27年度は、従来の抗体よりMuSKに対して高い親和性を有するウサギのモノクローナル抗体を作製した。数種類のモノクローナル抗体を組み合わせることで、病原性自己抗体と同様にMuSKの機能を抑制することがin vitroで示された。作製したモノクローナル抗体を用いることで、MuSK-MGの発症につながる分子機構を解明することが可能となった。新たに確立した技術の有効性を確認している。申請者が作成した動物モデルは、ほぼ100%の確率で発症させることが可能であり、発症の経過は再現性が高いため、順調にデータが取得可能であると考えている。

神経筋生理学・生化学平成25年度の研究でMuSK-MGの動物モデルに対する治療効果が認められたラパマイシンと今年度に確立した解析技術を用いてデータを取得していく予定である。検討した薬剤の有効性が確認されており、これらの成果を学会や論文で発表する見通しが立っているため、順調に進展していると考えている。近年、重症筋無力症の発症機序に関して、過剰な免疫反応を抑制する制御性T細胞の機能が注目されるようになってきている。ラパマイシンはmTORのシグナルを抑制して胸腺での制御性T細胞への分化を亢進し、免疫寛容を誘導するという研究がいくつか報告されていることから、今後は制御性T細胞に着目して作用機序の研究を進めていく予定である。今年度は助成金をほぼ計画通りに使用しており、次年度使用額は今年度の端数に相当する分である。今年度と同様に実験動物を用いた研究を遂行していく予定である。そのため、実験動物の購入や維持管理に加え、解析用の試薬や消耗品の購入に助成金を使用する予定である。