hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
ニクラス・ルーマンのコミュニケーション論の教育学への応用に関する研究

例えば、教室におけるコミュニケーションの分析でも、従来の分析は、教師対生徒のコミュニケーションという見方を出ず、前のコミュニケーションがその後のコミュニケーションとどう関わり展開してゆくかという視点が弱いのに対し、ル-マンの図式を用いれば、授業過程自身をコミュニケーションの自己展開過程として分析する事が可能となる。以上の結論が研究成果である。ル-マンのコミュニケーション論の特徴は、従来のコミュニケーション理論のように、発信者、メッセージ受信者によってコミュニケーションを分節化するのではなくて、情報、伝達、理解によってコミュニケーションを分節化する点と、社会システムの要素をコミュニケーションとして捉え、社会システムを自己準拠的に捉え、心的システムは、社会システムの環境・外部として把握する点にある。従来のコミュニケーション論では、メッセージはそのまま誤解なく伝達されることが前提されていたが、実際のコミュニケーションには誤解も多い。というより解釈のズレこそがコミュニケーションの豊かさを保障しているといえる。こうした実態を把握するには、伝達内容(=情報)と伝達意図(=伝達)を区別して、さらに理解と誤解の次元を区別する必要がある。また、従来の授業分析においては、生徒と教師のコミュニケーションという視点が強く、授業自身が要素としてのコミュニケーションによって自己準拠的に進展していくという視点に欠けていた。この観点に立つと、授業システムの自己準拠と教師の自己準拠、生徒の自己準拠が区別できることになる。そうすると教師や生徒の発言は、単に教師や生徒の発言としてではなくて、授業システムにおけるコミュニケーション要素として位置づけられる。従って、情報、伝達、理解についても、生徒の側からすれば、教師の伝達意図を授業コミュニケーションシステムとの関係で把握する必要が生じる。教師の側からすれば、今までの授業システムと一人一人の生徒の自己準拠システムへの理解に基づいた因果プランにより発言を行うということになる。こうしたモデルにより新しい授業分析が可能となる。
過敏性腸症候群の病態因子としての消化管ストレスホルモンの役割の解明

本研究の目的は、「主に脳内に存在するストレス関連ホルモンであるウロコルチン1(Ucn1)が、消化管の壁内神経系における神経伝達物質としても作用し、収縮に関与する」との仮説を証明することである。Ucn1が消化管壁内神経系における収縮系神経伝達物質である条件は、1)Ucn1が消化管壁内神経系に存在すること、2)外部からUcn1を加えることにより消化管が収縮すること、3)壁内神経を電気的に刺激することにより、Ucn1が実際に分泌されること、である。今回、ラット結腸組織を用い、上記を検討した。1)に関しては、免疫組織化学的に過去の研究により既に報告されており、今回、実際のUcn1蛋白を測定し、その存在を確認した。2)に関しては、Ucn1を外部から加えることにより、ラット結腸組織が収縮し、これはCRF1受容体を介し、テトロドトキシン及びアトロピンにてこの反応が抑制されることが明らかとなった。すなわち、Ucn1が壁内神経系に作用し、コリン作動性神経を介して収縮をきたすことが示唆された。3)さらに、壁内神経系の電気刺激により、Ucn1が刺激強度依存性に分泌されることが示された。研究実績の概要に記したように、Ucn1が消化管の壁内神経系における収縮系の神経伝達物質である条件がほぼ確認された。早急に論文投稿を行う予定である。ストレスホルモンであるUcn1が、ラット結腸組織における神経伝達物質である可能性が示されたため、次にin vivoの系において、実際のストレス負荷時にUcn1が分泌され、消化管の収縮に関与するか否かを検討する。本研究の目的は、ストレスホルモンとされるCRF(corticotropin-releasing factor)のファミリーであるウロコルチン1(Ucn 1)が、神経刺激およびストレス負荷により消化管神経系から分泌され、神経伝達物質としての役割を有するかを検証することである。本年度はまず、ラット結腸組織内にUcn1が蛋白レベルとして存在するかを検討した。結腸組織を筋層と粘膜層に分け、Ucn1蛋白を各々の組織において測定した。筋層には458.0 ±55.8pg/TPmg、粘膜層には21.9 ±1.0 pg/TPmg、(N=6)と、特に壁内神経系を有する筋層において、Ucn1蛋白の存在が蛋白レベルとして初めて測定できた。次に、ラット結腸組織において、神経刺激によりUcn 1が壁内神経系から分泌されるか否かを検討した。オーガンバス内にラット結腸組織を懸垂し、経壁電気刺激により壁内神経系を刺激し、溶液中のUcn1を蛋白レベルで測定した。経壁電気刺激は、5Hz、40V、30分間で、0.5msと2msの矩形波により行った。溶液中のUcn1は、0.5msの矩形波による神経刺激ではコントロールに対して156.1 ±13.0%、2msの神経刺激では228.8 ±18.6%と、刺激強度依存性に各々有意に増加した。また神経毒であるTetrodotoxin(TTX)(10-6M)の存在下では、2msの刺激においてもUcn1の溶液中濃度はコントロールと同等であった(コントロール;n=16, 0.5msの矩形波;n=12, 2msの矩形波;n=10, TTX; n=4, ANOVAおよびDunnett's testにてp<0.01)。以上より、結腸組織内のUcn1が蛋白レベルとしても存在し、これが経壁電気刺激により溶液中に放出されることが示された。ラット結腸組織内にUcn1が蛋白レベルとして存在することが初めて確認され、さらにラット結腸壁内神経刺激によりUcn1が溶液中に増加することが示された。今年度の予定である検討内容がほぼ終了し、仮設通りの結果が得られている。現在まで、1)CRF1受容体アゴニストであるUcn1がラット結腸壁内神経系に存在すること、2)Ucn1がラット結腸組織を収縮させること、が示されていた。

今回、3)Ucn1が蛋白レベルでも結腸組織内に存在すること、4)Ucn1が電気的な壁内神経刺激により分泌されること、が確認された。今後は、5)電気的な神経刺激により誘発されるラット結腸の収縮反応が、CRF1受容体拮抗薬により抑制されること、が示されれば、神経刺激によりUcn1が機能的にも収縮に関与していることが証明される。以上により、Ucn1が神経伝達物質として作用する可能性が強く示唆されることになる。ストレスホルモンであるUcn1が、ラット結腸組織における神経伝達物質である可能性が示されたため、次にin vivoの系において、実際のストレス負荷時にUcn1が分泌され、消化管の収縮に関与するか否かを検討する。人件費が予定以上に増加した。
オプチニューリンとその緑内障関連変異体の分子機能解析および網膜血流調節の検討

家族性緑内障原因変異となるオプチニューリン(OPTN)のE50K変異タンパクを発現させたマウス網膜では、E50K変異タンパクの沈着が認められ、神経変性疾患特有な異常タンパクの凝集性・疎水性の関与が疑われた。実際にE50K変異を有する家族性緑内障患者の末梢血より疾患特異的iPS細胞を樹立し、OPTN動態について検討し、E50K変異を有するiPS細胞から神経細胞誘導時に疎水性OPTNの増加を見出した。E50KはTBK1と強結合性を獲得しており、TBK1阻害剤処理により前述のE50Kの疎水化が軽減されることを見出し、E50K緑内障発症の根底には変異タンパクの異常凝集が関与していることが示唆された。緑内障原因変異であるOptineurin(OPTN)-E50K変異タンパクを発現するE50Kトランスジェニックマウス網膜で認められる視神経節細胞の脱落と、網膜の菲薄化の原因を探るため、このマウスを用いた詳細な病態解析と、さらに分子生物学的検討と併せて、変異タンパク発現による緑内障発症病因についての検討を行った。その結果、E50Kトランスジェニックマウス網膜では、GFAP陽性となるミューラー細胞を主体とした反応性グリオーシスが増進し、変異タンパクの沈着性局在という病理学的所見が認められ、多くの神経変性疾患に特有の変異タンパクの凝集性・疎水化が関与していることが疑われた。そこで内在発現レベルでの検証のため、実際のE50K緑内障患者の末梢血より疾患特異的iPS細胞を樹立し、その細胞内でのOPTNタンパクの動態について検討を行い、疾患特異的iPS細胞由来神経細胞における、疎水性OPTNタンパクの増加と、細胞内での凝集性局在について初めて明らかにした。これらの所見をもとに、E50K変異タンパク発現時のOPTNの凝集・疎水化がどのように起こるのかについて、分子生物学的手法およびLC-MS/MSを用いたプロテオミクスによる解析を行い、E50K変異タンパクがTBK1と強い結合性を獲得していること、またTBK1阻害剤処置により前述のE50K変異タンパクの疎水化が軽減されることを見出した。以上のことから、E50K緑内障発症の根底にはこの変異タンパクが獲得したTBK1との強結合性に関連した、タンパクの異常凝集が関与していることを本研究より見出した。(Hum. Mol. Genet. 2013, Minegishi et al.)OPTN-E50K変異とその病態発症機序、内在レベルでの変異タンパク動態については長く未解明であったが、本研究によりその一端が明らかとなり、今後の治療法研究が期待される。当研究部で有していたオプリニューリンの緑内障原因変異となるE50K変異体を遺伝子導入したトランスジェニックマウス網膜の詳細な病態解析により、網膜血管の脆弱性について見出した。またE50K変異体タンパクの網膜色素への沈着しており、網膜内で細胞死が誘発されていること、また反応性グリオーシスが広範に認められていることを見出した。た。このことから変異体タンパクの凝集性の可能性について、細胞実験系に移行して検討を行ったところ、E50K変異体では、野生型オプチニューリンと比較して細胞内での凝集性、また生化学的検討からは疎水性が増していることが明らかとなった。野生型オプチニューリン、E50K変異体それぞれに特異的に結合するタンパク分子を同定し、野生型オプチニューリンは細胞内分解系に関連する多量体化分画を持つ一方、E50K変異体ではその量体化分画が減少し、一方でTBK1と呼ばれる分子と強い結合性を持つことが明らかとなった。また、E50K変異体タンパクにおける異常な生化学的疎水性は、TBK1阻害剤処理によって解消されうることについて見出した。E50K変異体と緑内障の関連が報告された2002年以降、E50K変異とその病態発症・機序については長らく不明なままであったが、本研究によりその一端を明らかにすることができたと考える。当初の研究機関内達成目標に上げていた1)4)のうち、1)細胞外放出に対する野生型OPTNおよびOPTN変異の影響、および、3)野生型OPTNおよびOPTN変異体での網膜血流調節因子細胞外放出についての相互検証に関しては、OPTN野生型と比較して、E50K変異では血流調節に関わる因子の細胞外放出量が減少することを細胞実験系で見出している。

また2)野生型OPTNおよびOPTN変異体結合分子の同定・比較検討からの機能変化予測に関しても、野生型OPTNとE50Kに特異的に結合するタンパクの同定を行い、野生型OPTNが多量体化するのに対し、E50K変異体では一部の多量体化が障害され、一方で、TBK1と呼ばれるタンパクと非常に強い結合性を持つことを見出した。またこの際、障害されている多量体化は細胞内分解と関連していること、またE50K変異体は野生型OPTNと比較して疎水性が増しており、細胞内で易凝集性であることを見出した。さらにこの易凝集性はTBK1阻害剤処理により解消されうることについても見出している。4)マウス網膜血流におけるOPTN変異体の影響に関しては、現段階ではマウス網膜血流量を正確に計測する手法が確立されていないため、実際の流量については未解明であるが、一方でE50Kトランスジェニックマウス網膜では、網膜血管の破綻、および漏出と、周囲における反応性グリオーシスを認めており、これらは網膜におけるE50K変異体タンパクの発現が、網膜血管に負の影響をもたらすことを示唆していると考えている。以上の内容に関し、現在までに論文報告し、受理されていることから、現在までの研究達成度としては当初の計画以上に病態機序の解明が進んでいると評価できると考える。これまでの検討で当初の予定よりもE50K緑内障発症に寄与すると思われる重要な所見が多く得られたため、これまで病態機序の解明に主体を置いてきた検討から、今期はさらにOptineurin-E50K緑内障原因変異体の、異常生化学的動態(疎水化)の解消方法について治療の可能性を踏まえた研究推進に専心したい。これまでの研究結果を踏まえ、当研究部では既にE50K緑内障患者よりインフォームドコンセントのもと得られた採血検体から疾患特異的iPS細胞を樹立しており、現在はこれらiPS細胞から、E50K緑内障細胞モデル系の確立について、緑内障で障害される網膜細胞種の代表である、視神経節細胞誘導系を用いた検討を行うべく、その手技を習得中である。同時に、汎用培養細胞系においてはE50K変異体の異常生化学的動態の高効率かつ、安全性が高いと思われる解消法について、上記で用いたTBK1阻害剤のほか、TBK1の部分ペプチドの導入や、凝集性を解消する効果を持つ浸透圧調節物質を初め、凝集阻害化合物についての探索も行いたい。また、これらの実験から得られる知見をもとに、実際の治療効果についてin-vivoでの検討を行うため、E50Kノックインマウスの作製を神経科学では特に時間的にも遺伝背景的にも問題視されることが多い戻し交雑の必要がないZFNを用いた作成系によって試みたい。iPS分化誘導系には非常に高額な細胞培養費用が掛かるため、多くの研究費用はこれらの細胞培養添加物代として利用されることが予測される。またノックインマウスの作製に関しても同様に、1トライアルあたり80万円という非常に高額な金額がかかるため、折々の研究の進捗状況や、成果発表費用などとのバランスと照らし合わせながら、順次検討する必要があると考えている。
国内におけるパレコウイルスA3の前方視的疫学調査

パレコウイルス-A3(PeV-A3)は、新生児・早期乳児に敗血症や髄膜脳炎を起こす、小児科領域で注目を集める新興感染症です。日本から2004年に初めて報告されて以降、国内では2-3年おきに流行がみられていますが、各地域からの報告にとどまっていて、日本全体でみた際の実態は不明です。本研究では、小児の重症患者を診療する国内11か所、12の小児科専門医療施設において、PeV-A3の流行をとらえ、その疫学を明らかにするとともに、迅速にその情報を公開し、診療の参考になる有益な疫学情報を提供するプラットフォームの確立を目指します。
ガウス過程回帰モデルに基づくノンパラメトリック音声合成の研究

隠れマルコフモデルに基づく音声合成手法の性能の限界を超えて,より多様で自然な合成音声を生成するために,ノンパラメトリックモデルを用いた音声合成手法を確立することをめざして研究を行った。提案する音声合成手法におけるモデル化はガウス過程回帰に基づいており,入力テキストに対してフレーム単位で音声合成に必要なパラメータを予測するためのカーネル関数の設計,計算量削減手法,ハイパーパラメータの自動最適化手法,ガウス過程分類を導入した韻律情報のモデル化手法などの検討を行った。ガウス過程回帰を用いたノンパラメトリックモデル化に基づくテキスト音声合成手法の開拓・確立をめざして、研究初年度は、ガウス過程回帰モデルに基づく統計的音声合成の基礎的な検討に重点をおいて研究を実施した。具体的には、ガウス過程回帰モデルに必要なフレームコンテキストのカーネル関数について段階的に2項目の検討を行い、以下の成果が得られた。まず、単純なフレームコンテキストカーネルによる基礎的検討を行い、従来の隠れマルコフモデルに基づく音声合成の研究により得られた知見を基に音素などの音韻情報を時刻情報とともにフレームコンテキストとして用い、そのフレームコンテキストの類似度をカーネルとして利用した。先行・後続の音韻情報と時刻情報のみを用いて日本語5母音と5子音を対象とする音素単位のモデル化と音声合成を行った結果、従来の隠れマルコフモデルに基づく手法に比べて提案法は合成音声のスペクトル歪が減少することを示した。次に、音素単位での提案法の有効性が確認されたことから、フレームコンテキストの拡張と連続音声データへの適用の検討を行った。文章単位の音声合成に用いるコンテキストとして、先行・後続の音素のみでは不十分であると考えられることから、音素境界を考慮したフレームコンテキストの拡張を行った。また、そのままでは膨大な計算量が必要となるため、スパースカーネルなどによる近似より計算量の削減を行った。文章単位の音声合成実験を行い、スペクトル歪による客観評価と聴取試験による主観評価共に従来の従来の隠れマルコフモデルに基づく手法を上回る結果が得られることを示した。この他にも、モデルのハイパーパラメータの選択に関しても基本的な検討を行った。ガウス過程回帰によるノンパラメトリックモデル化に基づくテキスト音声合成手法の開拓をめざして、研究初年度では、ガウス過程回帰モデルに基づいたスペクトルパラメータ系列の生成手法を提案し、従来の隠れマルコフモデルに基づくモデル化に比べて性能が改善することを示した。本年度は提案手法のさらなる性能向上に重点をおいて研究を実施した。まず、従来の統計的パラメトリック音声合成手法において,生成パラメータの過剰平滑化の抑制に有用性が知られている系列内変動を提案モデル化手法に導入した定式化を行った。これに加えて動的特徴量を考慮したパラメータ生成の定式化も行った。その結果、系列内変動と動的特徴量を導入することで、合成音声のスペクトル歪をさらに減少できることを示した。さらに、これら提案手法で用いる最適なハイパーパラメータの推定手法を提案し、ハイパーパラメータの調整が自動化できることを示した。次に、ガウス過程回帰を用いる統一的な枠組みによる音声合成システムの構築をめざし、音声のスペクトルに加えて韻律のモデル化・パラメータ生成手法の開発にも着手した。ガウス過程分類を利用した有声/無声区間推定、ガウス過程回帰に基づく基本周波数パタンのモデル化とパラメータ生成手法、韻律生成時に有用となるフレームコンテキスト等の基礎的検討を行い、提案音声合成システムを実現できる見通しが得られた。この他に,新たな音声合成手法の枠組みの開発と同時に、読上げ調音声と比べて合成音声の再現がより難しいオーディオブック向け音声と歌唱音声の収録を行い、提案手法の性能評価を行うための基盤整備を行った。本研究で得られた成果を基に、今後はガウス過程回帰を用いる統一的な枠組みによる音声合成システムを実現し、多様な話者性や話し言葉を含む多様なスタイルによる音声合成、多言語音声合成へと,研究を展開して行く予定である。音声情報処理本研究の目的は、ノンパラメトリック回帰の一つであるガウス過程回帰をテキスト音声合成に応用し、現在の統計的音声合成手法の主流である隠れマルコフモデルに基づく音声合成の限界を超える新たな音声合成手法を開拓することにあった。この観点から初年度は2項目により段階的に検討する計画を立て研究を行ったところ、当初の予定通り研究が進み、さらに従来手法の性能を上回る結果を示せたことから、概ね順調に進んでいると判断した。初年度の研究が概ね計画通り進んだことから、計画の特段の変更は不要であり、当初の計画に沿ってこのまま研究を進めていく。研究分担者が年度半ばで研究機関を異動した関係で、必要な研究基盤整備のための金額配分が当初の予定と異なってしまったため。次年度が最終年度であることから、研究成果の公開のための費用と初年度未完了の研究基盤整備の費用として使用する予定。
歯根膜細胞から硬組織形成系細胞への分化制御機構の解析

申請者らは、歯根膜細胞から硬組織形成系細胞への分化制御機構を解明する目的で、SV-40大型T抗原導入マウスより数種類の均一な歯根膜細胞株の単離を行い、以下の検討をした。1)単離した歯根膜細胞株19クローンを用いて硬組織形成系細胞への分化実験を行った結果、歯根膜組織には、硬組織形成様式と遺伝子発現の面から、少なくとも4種類の繊維芽細胞様細胞群が存在することを初めて明らかにした。これらのうち、約7割を占めるL2細胞群は遺伝子発現パターンに関して、調べた限り、従来言われてきた歯根膜細胞と同じであり、又、硬組織形成系細胞への分化能を有するものの、通常は石灰化が抑制されている事から、従来想定されてきた歯根膜細胞に相当すると考えられた。更に、L2はCbfa1/Osf2を発現しているが通常石灰化せず独自の機能を有していることから、Cbfa1/Osf2の転写活性化能をルシフェラーゼアッセイにより解析した結果、Cbfa1/Osf2の転写活性は顕著に抑制されていることが明らかとなった。申請者らは以上の結果をまとめ、論文を投稿・審査中である。2)歯根膜細胞特異的遺伝子の単離を目的として、L2と分化段階初期の骨芽細胞株MC3T3-E1の両者の遺伝子発現の差を利用したDNAアレイ法を試みた。約一万遺伝子の検索の結果、両者で発現量の異なる遺伝子が100種類程度見出された。現在、取得した候補遺伝子群の発現特異性を検討し、更にこれら遺伝子群の構造と機能を解析している。特に、Cbfa1/Osf2に結合し、その転写活性を抑制する因子が、歯根膜細胞やアキレス腱の細胞に多く発現していることを明らかにしており、現在さらに詳細な分子メカニズムの検討が進行している。又、申請者、らは、初期から高い石灰可能を有するA9細胞等、L2細胞以外の細胞株についても同様の検討を進めている。申請者らは以上の結果をまとめた論文の投稿を準備中である。申請者らは、歯根膜細胞から硬組織形成系細胞への分化制御機構を解明する目的で、SV-40 T-antigen導入マウスより数種類の均一な歯根膜細胞株の単離を行い、以下の検討をした。1)単離した歯根膜細胞株の一つであるPDL-2の性質を検討するため、骨芽細胞分化マーカー遺伝子群の発現をRT-PCR法にて検討した結果、その遺伝子発現パターンは、in vivoの歯根膜細胞の遺伝子発現と全く同じであった。又、PDL-2は石灰化促進培養液内においても石灰化ノジュールを形成しないが、BMP-2の刺激においては若干の石灰化ノジュールを形成した。in vivoにおける歯根膜細胞とPDL-2は、Cbfa1/Osf2を発現しているが通常石灰化せず独自の機能を有していることから、歯根膜細胞には骨芽細胞への分化抑制機構が存在している可能性が考えられた。現在、この分化抑制機構を中心にさらに詳細な検討を行っている。2)歯根膜細胞特異的遺伝子の単離を目的として、PDL-2と分化段階初期の骨芽細胞株(MC3T3-E1)の両者の遺伝子発現の差を利用したDNAアレイ法を試みた。約一万遺伝子の検索の結果、両者で発現量の異なる遺伝子が少なくとも100種類程度見い出された。現在、取得した候補遺伝子群の発現特異性をRT-PCR法とin situ hybridization法により検討し、更にこれら遺伝子群の構造や機能を解析している。3)歯移植後の歯周組織の正常な修復には、歯根膜の再生が必須であることは臨床的にも良く知られているが、現在でも歯移植時の各歯根膜細胞の動態は十分に明確ではない。この点を明らかにする目的で、まず恒常的にβガラクトシダーゼを発現するPDL-2を作成した。今後、このlacZ発現PDL-2をマウス歯移植時に同時に移植し、時間を追って歯周組織の解析を行い、移植歯根膜細胞株の動態を検討する。

約一万遺伝子の検索の結果、両者で発現量の異なる遺伝子が100種類程度見出された。現在、取得した候補遺伝子群の発現特異性を検討し、更にこれら遺伝子群の構造と機能を解析している。特に、Cbfa1/Osf2に結合し、その転写活性を抑制する因子が、歯根膜細胞やアキレス腱の細胞に多く発現していることを明らかにしており、現在さらに詳細な分子メカニズムの検討が進行している。又、申請者、らは、初期から高い石灰可能を有するA9細胞等、L2細胞以外の細胞株についても同様の検討を進めている。申請者らは以上の結果をまとめた論文の投稿を準備中である。
多発性骨髄腫における分子標的薬の効果を予測する血液中バイオマーカーの同定

本研究は、多発性骨髄腫の患者さんの、末梢血検体(血漿や血清など)中の物質を網羅的に解析することで、骨髄腫の進展・悪性度の獲得に関わる重要な因子と、治療薬(ボルテゾミブ・サリドマイド・レナリドマイド・ポマリドミド)の感受性に係る因子を同定することを目的としている。2018年度も昨年度と同様に、患者さんの血清中のcell free DNA解析として、特に予後不良な患者さん検体の末梢血中の遺伝子変異の経時的な変化を解析した。当施設における2013年以降に診断された初発の多発性骨髄腫患者さん約80例のうち、生存期間が3年未満であった予後不良の骨髄腫患者さんの骨髄中の骨髄腫細胞および末梢血の血清cfDNAの両検体を、初発治療前、治療後再発、難治状態(多剤耐性時)の各段階の採取し、各段階での、次世代シークエンスを用いた検体間の遺伝子変異の数・種類の比較解析を行った。その結果、初発治療前時の検体間の比較では、骨髄中の骨髄腫細胞で検出された遺伝子変異の大半は、同時期に採取された末梢血のcfDNAの解析で検出されているものの、末梢血cfDNAの解析においては、骨髄中の骨髄腫細胞では同定されなかった遺伝子変異が多く存在しており、それらは治療経過とともに増加していた。このことは、末梢血の解析よって、髄外に存在する腫瘍細胞の遺伝子変異の種類を同定しさらにそれらの有無が予後予測につながるが可能性が示唆された。これまでの研究で、骨髄腫患者さんの末梢血検体から血清中のマイクロRNAを網羅的に解析し、今回、血清中からcell free DNAを抽出し、その遺伝子変異解析を進めてはいるが、予後不良例での解析は着手できているものの、多数例での解析までには至っていない。また、マイクロRNAおよびcell freeDNAともに、治療感受性や予後との関連の解析もまた本格的に着手できていない。cell freeDNAの抽出方法の安定と、次世代シーケンス法による変異解析の系はほぼ確立できているため、臨床情報との関連の解析を除けば、計画していた研究は進捗しているため、全体としては遅れていると判断した。これまでの研究成果を継続発展させ、引き続き多発性骨髄腫の進展・悪性度の獲得に関わる重要な因子と治療薬の感受性に係る因子を患者さんの末梢血血清中物質の網羅的な探索より同定することを目標とする。cell free DNAの解析では予後不良例だけでなく多数検体で解析を行う予定で、具体的には予後不良例と予後良好例の経時的な比較(初発から治療抵抗性に至るまで)を行い、末梢血中に現れる遺伝子変異が予後や治療の感受性にどのように関わっていくか解析していく予定である。また、すでに測定データが得られている血清中のマイクロRNAの解析においては、各個別の骨髄腫治療薬(ベルケイド、レブラミド、ポマリドミドなど)の効果に関わるマイクロRNAを、各マイクロRNAの発現量と、治療による効果(最良奏効効果や無増悪生存期間・生存期間など)を照らし合わせることで、バイオマーカーの候補となりうるものを同定する。さらに、遊離核酸のみならず、血清中の脂質代謝産物の解析も行う。具体的には、血清の脂質代謝物を酸化脂肪酸群とリン脂質群に分けて、それぞれ質量分析計を用いてその発現量の測定および構造解析を行い、プロテアソーム阻害剤や免疫調節薬などの治療効果と関連性のある脂質代謝産物を同定することを目標とする。本研究は、多発性骨髄腫に対する新規薬剤(ボルテゾミブ・サリドマイド・レナリドミド・ポマリドミド)の感受性に係る因子を患者由来末梢血血清中の物質の網羅的な探索により同定することを目的とする。これまで骨髄腫患者由来の治療前血清を解析することで、以下の研究を行った。(骨髄腫患者に由来する末梢血血清の網羅的マイクロRNA解析と健常人との比較)本研究の目的である骨髄腫治療薬の感受性に関与する血清マイクロRNAを探索する前に、まず疾患特異的な血清マイクロRNAを同定することにより、その後の治療薬の感受性に関連したマイクロRNA候補との比較を行うこととした。まずは骨髄腫患者と健常人の血清マイクロRNAの発現解析の比較を行った。具体的には、健常人15名・初発骨髄腫患者10名・再発難治骨髄腫患者52名の血清のマイクロRNAを次世代シークエンサー法にて発現量の解析を行った。検出された200前後のマイクロRNAのうち、32個のマイクロRNAが健常人と比べて、骨髄腫患者由来血清にて高発現していた。さらに、そのうち5つのマイクロRNA(mir-10a, 10b, 92a, 378a, and 378d)が、骨髄腫患者においても再発・難治例において、初発症例と比べて有意に高いことが判明した。これら5つのマイクロRNAは、乳がん等の固形腫瘍においては、細胞増殖・薬剤耐性・転移能などの悪性能に関わることが報告されている。さらに、mir-92aに関しては患者骨髄から採取し純化した骨髄腫細胞を用いた解析で、化学療法の感受性に関わることが後方視的な解析で明らかとなった。当初、平成28年度は、以下の項目を中心に研究行う計画であった。1末梢血血清中のエキソソーム解析2

末梢血血清全体の遊離核酸解析1に関しては、血清からエキソソームを安定的に単離するための予備実験を、細胞株の培養上清等を用いて行い、全血清のエキソソームから数百ngのsmall RNAを抽出する系を確立した。同時に、治療前・薬剤耐性化後の骨髄腫患者さんの各段階での血清の保存を行った。保存した血清のエキソソーム解析はまだ未施行であるため、予定通りには進んでいないと判断した。2に関しては、当初の予定通り、血清中に遊離している核酸のなかでも、small RNAを高い回収率で抽出し、ライブラリー作成および次世代シークエンスを行い、骨髄腫の病態に関わるマイクロRNAを同定できたため、概ね予定通り進行していると判断した。本研究は、多発性骨髄腫患者さん由来の末梢血(血漿や血清など)中の物質を網羅的に解析することで、骨髄腫の進展・悪性度の獲得に関わる重要な因子と、治療薬(ボルテゾミブ・レナリドミド・ポマリドミド)の感受性に係る因子(バイオマーカー)を同定することを目的としている。2017年度は主に、血清中のcell free DNA (cfDNA)の解析を集中的に行った。骨髄腫患者さん由来末梢血血清からのcfDNA抽出とその遺伝子変異解析:当施設において2013年以降に診断された初発多発性骨髄腫患者さんで遺伝子解析研究に同意いただけた約80例の治療前に採取・保存された末梢血血清の解析に着手した。具体的には、血清1mlから、QIAGEN社のcirculating nuclear acid kitを用いてcfDNA相当と考えられる血清DNA抽出を行った。対照として健常者10名の血清からも同様に抽出を行った。健常者10名と骨髄腫患者さん80名を比較したところ、血清1mlあたりのDNA収量は、31.6ng/ml vs 77.0ng/mlと有意差をもって(P=0.015)、骨髄腫患者さんの血清中cfDNAが多い結果であった。また、これら血清中のDNAをバイオアナライザーで解析したところ、mono-nucleosome(150200bp)、di-nucleosome(300-400bp)、tri-nucleosome(600bp程度)に相当するピークが認められた。80例中、先ず4例の血清DNAをQIAGEN社のターゲットシークエンスパネル(Comprehensive cancer panel)を用いて数百の遺伝子のエクソンをカバーするアンプリコンを作成し解析したところ、およそ5から40か所程度の遺伝子変異が検出された。これからの変異の臨床的意義について解析を進めている。これまでの研究で、骨髄腫患者さんの末梢血検体から血清中のマイクロRNAを網羅的に解析した。2017年度は、血清中からcell free DNA(cfDNA)を抽出し遺伝子変異解析を進めた。しかし、変異解析実施例は4例にとどまり多数例での解析にはまだ時間がかかる。また、マイクロRNAおよびcfDNAともに臨床的意義に関する解析、すなわち個々の薬剤に対する治療感受性や予後との関連についての解析もまた本格的に着手できていない。cfDNAの安定な抽出方法の確立と、次世代シーケンス法による変異解析系はほぼ達成できているため、臨床情報との関連の解析を除けば、計画していた研究は進捗しているため、全体としてはやや遅れていると判断した。また血清中脂質分画のメタボローム解析については、分担研究者の異動があったものの各施設での倫理審査委員会承認を得て、検体を既に送付の上解析を進めている。今後臨床情報との関連を解析し、意義のある候補物質の同定を行う予定である。
ヒト乳歯歯髄における抗原提示細胞の動態に関する免疫組織化学的研究

抗原提示細胞群の中でもクラスII主要組織適合性複合体(major histocompatibility complex:MHC)分子をもつ免疫担当細胞、すなわちクラスIIMHC抗原陽性細胞に注目し、生理的歯根吸収期のヒト乳歯歯髄における動態について、免疫細胞化学的、酵素組織化学的子湯法を用いて検索した。正常ヒト乳歯歯髄には多数のクラスIIMHC抗原陽性細胞が歯髄全体に見られたが、特に歯髄辺縁部に樹枝状の形態を示すクラスIIMHC抗原陽性細胞が多く見られ、中にはその細胞質突起を象牙芽細胞突起と共に象牙細管に侵入させているものも認められた。また齲蝕、咬耗、修復処置が加えられた部位に相当する歯髄・象牙質境ではクラスIIMHC抗原陽性細胞の集積像が観察された。生理的歯根吸収が開始され、歯冠部にも吸収が及ぶようになると、クラスIIMHC抗原陽性細胞は象牙芽細胞変性後も歯髄・象牙質境に観察されたが、破歯細胞による内部吸収が活発化すると吸収窩には見られなくなった。吸収が終了し、破歯細胞が離れた象牙質表面に再びクラスIIMHC抗原陽性細胞が出現し、象牙質表面に多量のセメント質様硬組織の添加が見られる時期になると、クラスIIMHC抗原陽性細胞は硬組織界面から離れて位置していた。以上よりヒト乳歯歯髄にはクラスIIMHC抗原陽性細胞が密に分布し、それらの多くは歯髄辺縁部に位置すること、象牙細管を経由して到来する外来刺激により傷害を受けた部位の歯髄・象牙質界面に集積することから、免疫防御機構に何らかの役割を果たしている事が伺われた。さらに、破歯細胞およびセメント質様硬組織形成細胞が歯髄・象牙質境に出現する過程において、クラスIIMHC抗原陽性細胞が一貫して歯髄・象牙質境に存在することから、クラスIIMHC抗原陽性細胞が破歯細胞、セメント質様硬組織形成細胞の分化、移動、活性化の誘導に関与する可能性が示唆された。抗原提示細胞の中でも特にクラスIIMHC抗原陽性細胞について検索した。1.正常ヒト乳歯歯髄について晩期残存もしくは咬合誘導のため抜去されたヒト乳歯で、生理的歯根吸収の開始して間もない乳歯を試料とした。クラスIIMHC抗原陽性細胞は歯冠歯髄全体に散在しており、その形態は部位により異なっていた。歯冠中央部に散在するクラスII抗原陽性細胞は少数であり、その形態は円形、紡錘形、樹枝状であるのに対し、歯髄辺縁部では象牙芽細胞層内、象牙芽細胞下層に位置しており、樹枝状を呈していた。また象牙芽細胞層内のクラスII抗原陽性細胞の中には、その細胞質突起を象牙芽細胞の突起と共に象牙細管に侵入させているものも観察された。免疫電顕法によりクラスIIMHC抗原陽性細胞の微細構造を観察したところ、その細胞質内に様々な大きさの小胞を多数認めた。生理的歯根吸収部位では炎症性細胞の浸潤と共にクラスII抗原陽性細胞が多数観察され、その形態は円形、紡錘形、樹枝状と様々であった。2.外来侵襲に対する抗原提示細胞の動態について象牙細管を経由して外来刺激が歯髄に加わったと思われる部位では、象牙芽細胞層内にクラスII抗原陽性細胞が集積し、その細胞質突起を象牙細管に侵入させていた。試料によってはクラスII抗原陽性細胞と共に炎症性細胞の集積が観察されるものもあった。

新たに研究分担者に野田忠を加え、今後ヒト乳歯の生理的歯根吸収過程におけるクラスIIMHC抗原陽性細胞の動態について検索する予定である。抗原提示細胞群の中でもクラスII主要組織適合性複合体(major histocompatibility complex:MHC)分子をもつ免疫担当細胞、すなわちクラスII MHC抗原陽性細胞に注目し、生理的歯根吸収期のヒト乳歯歯髄における動態について、免疫細胞化学的、酵素組織化学的手法を用いて検索した。歯冠部象牙質吸収が開始される時期には、歯冠部の歯根側寄りの歯髄・象牙質境に破歯細胞が出現した。この時期、破歯細胞による吸収が及んでいない部位の歯髄・象牙質境には扁平化した象牙芽細胞、クラスII MHC抗原陽性細胞、前破歯細胞が観察されたが、象牙芽細胞層の連続性は保たれていた。吸収が進行し、破歯細胞による歯冠部内部吸収が全域に及ぶ頃には、象牙芽細胞は萎縮し、細胞間の連続性も失われていた。一方、クラスII MHC抗原陽性細胞は象牙芽細胞変性後も歯髄・象牙質境に観察され、その後、破歯細胞による内部吸収が活発化すると、吸収窩にはクラスII MHC抗原陽性細胞は見られなくなった。吸収を終えた破歯細胞が吸収面から離れ、象牙質表面が露出するようになると、再び歯髄・象牙質境に多数のクラスII MHC抗原陽性細胞が出現した。その後象牙質表面に多量のセメント質様硬組織の添加が見られる時期には、クラスII MHC抗原陽性細胞は硬組織界面より離れて位置するようになった。このように破歯細胞およびセメント質様硬組織形成細胞が歯髄・象牙質境に出現する過程において、クラスII MHC抗原陽性細胞が一貫して歯髄・象牙質境に存在することから、クラスII MHC抗原陽性細胞が破歯細胞、セメント質様硬組織形成細胞の分化、移動、活性化の誘導に関与する可能性が示唆された。
細胞工学的手法を用いた不死化遺伝子導入肝細胞移植による先天性代謝異常の治療

肝臓は生命維持に必要な物質の代謝産生と、不要な物質の解毒排泄といった重要な機能を営む臓器である。究極的な治療法は肝移植であるがドナー不足が最大の問題である。もし、何らかの方法で、体外的にあるいは体内的に、この肝臓を組織構築できれば、代替法として使用できる可能性がある。この場合、使用する生体材料である肝細胞の確保と、細胞の機能を最大限に引き出す基質の開発が重要である。本研究では、肝細胞移植と肝機能補助のリアクターの基礎的検討を行った。1.肝機能補助療法としての肝細胞移植急性肝不全モデルや、慢性あるいは先天性肝酵素欠損症モデルとしての肝硬変症、無アルブミンラット、アスコルビン酸合成酵素欠損ラット等のモデルに対し、肝細胞移植は動物の延命、救命に有用であった。2.肝機能補助のリアクターとしての応用肝機能の長期間の再現、リアクターとしての装置化などの点より、マイクロキャリアー接着肝細胞を中空糸膜型モジュールに封入するタイプが有用であった。3.肝細胞増殖活性と機能発現の基礎的検討肝再生機構に重要であるサイトカイン(EGF、HGF、HSSなど)の併用が有用である可能性が示唆された。さらに、増殖能を獲得するために、肝細胞の不死化を試みたが、成功しなかったため、岡山大学第一外科(小林直哉博士ら)からヒト不死化肝細胞の提供を受け基礎的検討を行った。スキッドマウスへの移植では、腺腫様増殖を示し、静置培養でも良好な増殖能を示したので、今後、機能の発現について検討する必要がある。1.多孔質細胞接着基質であるDegraPolに対する肝細胞接着体重約200gのWistarラットの肝臓からコラゲナーゼ消化法より分離した肝細胞浮遊液5x10^6個/mlをDegraPolに直接播種し、Williams-E培地で24時間培養。走査電子顕微鏡による観察にて、DegraPolの細孔内部に肝細胞が球形を維持して接着していることが確認された。2.DegraPol接着肝細胞の同系ラット腹腔内移植DegraPol接着肝細胞の同系ラットの腹腔内に移植し、移植2ないし4週間後にHE染色および走査電子顕微鏡にて観察。ラット腹腔内では、DegraPol表面に新生毛細血管が観察され、培養時と同様にDegraPolの細孔内部に球形を維持して接着している肝細胞が確認でき、DegraPolの有用性が確認された。アスコルビン酸生合成酵素を有する同系ラットであるODS-+/+ラット肝細胞接着DegraPolをアスコルビン酸生合成酵素欠損にて骨格の変形、出血、体重減少で死亡するODS-od/odラットの腹腔内に移植し、肝細胞増殖刺激因子であるHSSを間欠的に投与し経時的に体重減少、出血傾向を記録した。体重減少および出血傾向は非移植群に比して抑制される傾向にあったが、移植10週間後の生存率は非移植群と同様に0%と有意差を認めなかった。以上より、DegraPolは有用な肝細胞接着基質であるが、ODS-od/odラットに対する同系ラット肝細胞の脾臓内および門脈内移植で示された良好な肝機能補助能を示すには至らなかった。したがって、虚血性肝不全の危険性がある脾臓内および門脈内移植と同様な肝機能補助能を発現させるためには、より容積が少なく早期にbiodegradableな肝細胞接着基質の応用が必要であり、次年度の検討課題と考える。急性・慢性肝障害で代謝不全に至った肝不全の治療法として、肝移植による方法と人工肝臓による方法がある。いずれの場合も、要に応じて大量の肝細胞が必要であり、また肝細胞の機能を良好にかつ長期間再現させる接着基質の開発が重要であり、以下の検討を行った。1.肝細胞の増殖法の検討:移植肝細胞の増量を、増殖因子であるEGF、HSS、HGFなどの使用により検討したところ、移植肝細胞のBrdU値の上昇が確認され、ビタミンC合成酵素欠損ラットの生存率も向上した。

2.肝細胞機能発現のための接着基質や、包埋法の検討:肝細胞は本来、何らかの基質に接着したり、基質内に安定化して良好な機能を発現する。そこで、接着基質として、生分解性多孔性担体(Degra Pol)、セルロース由来多孔性担体、アルギン酸ゲル包埋法などを検討した。Degra Polへの肝細胞接着は良好であったが、単位あたりの容積が大きく、移植肝細胞数を稼ぐには限界があった。セルロース由来担体は、孔径と内部構造も至適であり、人工肝のリアクターとして有用な機能が発現された。ゲルビーズ化肝細胞は腹腔内移植により急性肝不全モデルに有用であった。3.増殖活性を有する肝細胞の検討:初代肝細胞は通常分裂増殖活性を有しない。そこでラットの肝細胞の不死化を試みたが成功しなかったため、岡山大学第一外科(小林直哉博士ら)から、ヒト不死化肝細胞の提供を受け、基礎的検討を行った。凍結保存されたこの肝細胞は、解凍後良好な増殖能を再現し、マウスへの移植では腺腫様増大を示し、confluentな培養皿の細胞を部分的に除去してその再生能をみたところ興味ある再生状態を示した。機能の発現性の検討と、in-vitro、in-vivoの基礎的研究を継続する。
偏垂直軸回転検査(OVAR)を用いた耳石-半規管連関の解明およびその臨床応用

めまい、平衡障害を主訴に、耳鼻咽喉科外来を受診する患者の多くは、詳細な問診、生理機能検査、画像診断により確定診断が行われ、適切な治療を受けている。しかし、これら緒検査にて顕著な異常所見を見いだすことができず、その結果、めまい症と一括して診断される患者群が存在する。このめまい症の病因の1つとして、耳石機能障害の関与が示唆さている。現在、耳石機能を実用的かつ正確に評価することができる検査法がなくこれらの検査法の開発は必須と思われる。我々はこれまで、偏中心性回転刺激(Eccentric Rotation:EcR)を用いての耳石機能評価を試みてきた。EcRでは、耳石系と水平半規管が同時に刺激を受けるため、純粋に耳石機能を知ることは理論的に困難である。今回は、耳石系のみを純粋に刺激することが可能な偏垂直軸回転検査装置(Off-Vertical Axis Rotation:OVAR)を開発した。またこの装置を用いて、視覚系、半規管-眼反射と耳石-眼反射との情報伝達の有無について検討を加えた。聖マリアンナ医科大学に既設の回転椅子に油圧を用いた傾斜不可装置を付加してOVAR装置とした。最大傾斜角度は30°である。健康成人12名を対象として検討を加えた。いずれの被験者についても良好な眼振の解発が認められた。半規管-眼反射の可塑性が耳石-眼反射におよぼす影響について健康成人ボランティア12人を対象として検討を加えた。この両反射系の間で情報伝達が行われている可能性が示唆された。良性発作性頭位めまい症患者4名、メニエール病患者4名を対象として耳石機能について検討を加えた。良性発作性頭位めまい症患者については耳石機能に異常が認められる群とそうでない群の2つの群が存在することを示唆する結果が得られた。メニエール病患者については利尿薬であるフロセマイド負荷前後の耳石機能について検討を加えた。フロセマイドを投与後、耳石機能が改善する傾向が認められた。本年度は主にOVAR検査装置一式の開発および健康成人ボランティアを対象とした基礎データの取得を行った。回転椅子を傾斜してOVARとするにあたり、椅子全体を被験者ごと傾斜することが可能な傾斜負荷装置が必要となる。油圧を用いて椅子全体を傾斜することができる傾斜負荷装置を開発した。既存の回転椅子をこの傾斜負荷装置に装着した。その結果、最大傾斜角度である30°まで、被験者を傾斜した状態で回転刺激を加えることが可能であった。被験者の安全性についても考慮し、椅子部分についてもバケットシートに変更し、またベルトも4点式のものに取り替えることにより万全を期した。次に眼球運動の解析についてであるが、高速なCPUを搭載したパーソナルコンピュータおよびこれを記録しておく大容量メディアにより構成される眼球運動解析装置一式を用いて解析を試みた。回転刺激を加えることにより生じる眼振データーより急速相を除き,残った緩徐相同士をつなぎ合わせることによりcumulative eye position (CEP)を求めた。これをコンピューターにより微分しcumulative eye velocity(CEV)を求めた。このCEVより、等速度刺激でOVARを行った際はbias componentおよびmodulation componentを算出した。また振子様刺激でOVARを行った際は、利得を算出した。健康成人ボランティアを対象として基礎データの取得を行った。

そしてこの結果をもとに、1)刺激が適切に加えられているかどうか、2)解析が適切に行われているのかについて検討を加えた。その結果、等速度刺激でOVARを行った際に出現するbias componentおよびmodulation componentは、これまでの報告とほぼ同様の値を示した。また振子様刺激でOVARを行った際は眼振の解発が良好に認められ、この利得とmodulation componentとの間に相関関係を示す可能性が示唆された。本年度は耳石-眼反射における速度蓄積機構の特性を評価することを目的に、視覚-半規管入力混乱パラダイムを用いて生じた半規管-眼反射の可塑性が耳石-眼反射におよぼす影響について検討を加えた。対象は健康成人ボランティア12人を用いた。以下に示す(1)から(5)の順番に実験を行った。1)振子様回転刺激(周波数0.16Hz、最大角速度60°/sec)による半規管-眼反射の利得の測定。2)偏垂直軸回転刺激(0VAR:傾斜角度30°、60°/sec定速度刺激および傾斜角度20°、120°/sec定速度刺激)による耳石-眼反射の感度の測定。3)振子様回転刺激(周波数0.16Hz、最大角速度60°/sec)と同時に視運動刺激を以下の3条件で各々4人ずつの被験者に40分間加える。(視覚-半規管入力混乱パラダイム)a)振子様回転刺激と同方向で2倍の速度(-1刺激)b)振子様回転刺激と反対方向で同一の速度(x2刺激)c)振子様回転刺激を加えず(対象群)4)振子様回転刺激による半規管-眼反射の利得の測定。5)偏垂直軸回転刺激による耳石-眼反射の感度の測定。視覚-半規管入力混乱パラダイム(-1刺激)を行った4人中3人の被験者において半規管-眼反射の利得の低下が認められた。またこれら3人については同時に、耳石-眼反射の感度の低下を示した。視覚-半規管入力混乱パラダイム(x2刺激)を行った4人中2人の被験者において半規管-眼反射の利得の増大が認められた。またこれら2人については同時に、耳石-眼反射の感度の増大を示した。対象群では有意な利得および感度の変化は認められなかった。以上より半規管-眼反射と耳石-眼反射はその利得および感度を調整する上で共通の神経経路を共有している可能性が示唆された。めまい、平衡障害を主訴に、耳鼻咽喉科外来を受診する患者の多くは、詳細な問診、生理機能検査、画像診断により確定診断が行われ、適切な治療を受けている。しかし、これら緒検査にて顕著な異常所見を見いだすことができず、その結果、めまい症と一括して診断される患者群が存在する。このめまい症の病因の1つとして、耳石機能障害の関与が示唆されている。現在、耳石機能を実用的かつ正確に評価することができる検査法がなくこれらの検査法の開発は必須と思われる。我々はこれまで、偏中心性回転刺激(Eccentric Rotation:EcR)を用いての耳石機能評価を試みてきた。EcRでは、耳石系と水平半規管が同時に刺激を受けるため、純粋に耳石機能を知ることは理論的に困難である。
電気化学的アプローチによる加工青果物の品質特性評価技術の確立

青果物のおいしさには、咀嚼時のかたさなどの品質特性が大きく影響する。特に青果物の加工過程においては、それらの品質特性が大きく変化するため、そのモニタリングが可能となれば、高品質な青果物の加工条件選定に有用である。電気インピーダンス測定は、簡便かつ低コストでのモニタリング技術として着目され、青果物の電気特性解析について多くの研究がなされてきた。また、電極界面や細胞膜の性質を鑑みると、青果物組織の電気特性解析を行う際には、幅広い測定周波数帯における周波数特性解析が必須である。しかしながら、加工、特に加熱中における青果物組織の電気特性を解析した例は少なく、未だ固定周波数による解析も散見されるのが現状である。本研究においては、青果物組織の電気インピーダンス周波数特性を解析することにより、加工中における組織破壊のモニタリングを行い、また、青果物の品質特性として有用な力学特性などとの関係性を整理することで、電気による加工青果物の品質特性評価技術の確立を目指す。平成30年度においては、主に低温スチーム加熱による青果物の細胞構造崩壊について、電気化学的に解析した。前年度に予備試験を行ったリンゴ果実に対して40、60、80°Cのスチームで加熱を行い、その細胞構造情報を電気的に取得した。その結果、リンゴ果実の細胞の破壊は40°Cではほぼ起こらず、60°C以上の加熱により緩やかに破壊が開始されることが明確に示された。加えて、次年度の計画であった、細胞崩壊と食感の関係性の検討についても先んじて行う事ができ、本課題は順調に進捗できている。また、異なる物理指標からの食感推定が可能かどうかについても併せて検討し、カット加工されたマスカットの食感推定について、重量変化からの推定式を作成した。次年度は、最終年度に向けてのとりまとめに向け、論文執筆と投稿を行うとともに、本研究の更なる可能性の深化に尽力する。平成30年度に計画していた、加工青果物組織における細胞崩壊モニタリングを終了し、加えて、次年度に予定した細胞崩壊と食感特性の関係性についても先んじて検討を開始出来たため。次年度においては、最終年度に向けてのとりまとめに向け、論文執筆と投稿を行うとともに、本課題の結果を活用した更なる研究可能性の深化に尽力する。平成29年度においては、生鮮青果物を用いた電気特性の予備的な測定および解析を行うこととした。基金により、インピーダンスアナライザおよびプローブを整備し、また青果物測定用の針型電極を作成した。リンゴ果実を試料とし、42 Hz-1 MHz間における電気インピーダンス周波数特性を解析した。各測定周波数における電気インピーダンス値を、実数部および虚数部に分割し、その関係性を整理することでCole-Cole plotを作成した。また、リンゴ果実においては、果実の赤道における子房から表皮の中間部分において、安定した電気特性値を得られることを確認した。実験機器の整備および平成29年度の目的であった予備的な測定と解析は終了したため、次年度においては、加工青果物の電気特性の解析を開始する。平成29年度に計画していた、生鮮青果物組織における予備的な電気インピーダンス測定および解析は終了し、次年度に向けての検討を開始できたため。

その結果、リンゴ果実の細胞の破壊は40°Cではほぼ起こらず、60°C以上の加熱により緩やかに破壊が開始されることが明確に示された。加えて、次年度の計画であった、細胞崩壊と食感の関係性の検討についても先んじて行う事ができ、本課題は順調に進捗できている。また、異なる物理指標からの食感推定が可能かどうかについても併せて検討し、カット加工されたマスカットの食感推定について、重量変化からの推定式を作成した。次年度は、最終年度に向けてのとりまとめに向け、論文執筆と投稿を行うとともに、本研究の更なる可能性の深化に尽力する。平成30年度に計画していた、加工青果物組織における細胞崩壊モニタリングを終了し、加えて、次年度に予定した細胞崩壊と食感特性の関係性についても先んじて検討を開始出来たため。次年度以降においては、予定通り、加工青果物組織における電気インピーダンス測定および解析を開始する。次年度においては、最終年度に向けてのとりまとめに向け、論文執筆と投稿を行うとともに、本課題の結果を活用した更なる研究可能性の深化に尽力する。消耗品類が当初の予定より安く購入できたため。次年度における試料購入費やプローブ作成費など、消耗品の購入に使用したいと考えている。次年度における試料購入費やプローブ作成費など、消耗品の購入に活用したいと考えている。
脳cdc2関連キナーゼ/cdk5の活性阻害因子の同定と精製

cdk5はcdc2関連キナーゼの一つである。他の全てのcdc2関連キナーゼが細胞増殖の進行に関わっているのに対して、cdk5は最終分化し、分裂しない神経細胞で機能していると考えられている。神経細胞内でcdk5がどのような役割をしているのか、また、どのようにして活性化されているかは、非常に重要な問題である。すでに、我々はcdk5キナーゼを精製し、その性質を調べ、神経細胞内におけるcdk5の基質はニューロフィラメントのHサブユニット(NF-H)やタウ蛋白であることなどを明らかにしてきた。今年度の当初の目的はcdk5の活性阻害因子の同定であったが、阻害因子の検出が出来ず、ここではでは、cdk5の局在についての生化学的な検討へと計画を変更して行った。ブタ脳粗抽出液中の細胞骨格を沈殿させると、殆ど全てのcdk5キナーゼ活性は細胞骨格分画に回収された。この画分から微小管を重合・脱重合させ精製するとともに、ニューロフィラメントから分離させると、cdk5活性は微小管と挙動をともにした。再構成微小管と精製cdk5との共沈実験からcdk5は微小管結合蛋白を介さず、直接微小管に結合できることが示された。一方、微小管に結合できない画分にもcdk5蛋白質は検出されたが、ゲルろ過法により、これらはcdk5単独からなる活性を持たないモノマーであることが判った。この結果より、cdk5は微小管にp35またはその分解産物であるp26を介して結合することが示された。cdk5のこのような局在は、神経軸索内で基質であるタウやニューロフィラメントHの近傍に存在して、特定の蛋白を基質として選択する一つの方法と考えられる。