hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
アミラーゼインヒビター生産乳酸菌の生理機能解析と機能性食品デザインへの応用

分離したアミラーゼインヒビター生産乳酸菌をWeissella sp. KY5-4株と同定した。KY5-4株は、温度37°C、培養14時間目において最大インヒビター活性(22. 5%)を示した。また、KY5-4株はプロバイオティクスとしても有用であること、生産するアミラーゼインヒビターは耐熱性・保存性に優れていることがわかった。さらに、KY5-4株を用いて蕪漬けを試作したところ、発酵後のインヒビター活性値が上昇した。新たな糖尿病予防食の開発を目的として、世界で初めて糖尿病予防に大きく貢献する可能性を持つアミラーゼインヒビターを生産する新規乳酸菌(KY5-4株)を島根県特産の発酵食品(蕪漬け)からマイクロプレートを用いたハイスループットスクリーニング法により分離することに成功した。本研究では、世界で初めて分離したアミラーゼインヒビター生産乳酸菌について、生産する新規アミラーゼインヒビターの機能を解明するとともに、アミラーゼインヒビター生産乳酸菌を用いた発酵食品ベースの新しい糖尿病予防食を開発することを目的とした。KY5-4株を同定したところ、Weissella sp.であることが明らかとなった。次に、KY5-4株の培養液上清におけるアミラーゼ阻害活性を培養条件を変えて調べた結果、培養温度37°C、培養時間14時間目において最大阻害活性22.5%を示すことが分かった。また、アミラーゼ阻害活性は耐熱性・保存性に優れていた。次に、KY5-4株の胃酸・胆汁酸耐性を調べたことろ、他の乳酸菌と比べて比較的優れていたことから、プロバイオティクスとしても有用であることが示唆された。さらに、KY5-4株を用いて蕪漬けを試作したところ、風味豊かな漬物ができ、発酵後の漬け汁のアミラーゼ阻害活性値は発酵前と比べて上昇した。以上のことから、KY5-4株を生産菌として、もしくは、発酵液上清を食品に用いることでバラエティ豊かな糖尿病予防食を開発できると考えられる。新たな糖尿病予防食の開発を目的として、世界で初めて糖尿病予防に大きく貢献する可能性を持つアミラーゼインヒビターを生産する新規乳酸菌(Weissellla sp.KY5-4株)を島根県特産の発酵食品(蕪漬け)からマイクロプレートを用いたハイスループットスクリーニング法により分離することに成功した。KY5-4株の培養液上清からアミラーゼインヒビターの単離を行うにあたり、同株の回分培養におけるアミラーゼインヒビター発酵生産性について解析した。その結果、培養温度37°C、培養時間14時間目において最大アミラーゼインヒビター活性が確認できたことから、本培養条件にて効率的にアミラーゼインヒビターを発酵生産可能なことが明らかとなった。次に、得られた培養液上清を限外ろ過(限外分子量3,000)に供し、アミラーゼインヒビターの粗分画を行ったところ、アミラーゼインヒビターの分子量は3,000以上であることが明らかになった。また、121°C、20minでの加熱処理によりアミラーゼインヒビターの残存活性は73.5%となり、比較的耐熱性に優れることがわかった。これらのことから、アミラーゼインヒビターは熱安定性の高い糖・タンパク質様物質であることが示唆された。現在、アミラーゼインヒビターの完全精製を進めるとともに構造解析に向けた実験を行っている。
新規ビスイミダゾリン不斉触媒の創製と不斉カップリング反応の開発

カップリング反応は分子同士を自在に連結させる方法として重要かつ魅力的な手法の1つである。また、触媒的不斉反応は少量のキラル源から大量の光学活性化合物を合成する手法であり、高機能性医農薬品の効率的合成を行う際に有用な手法である。すなわち、不斉カップリング反応の開発を行うことで、多様なキラルビルディングブロックの合成が可能となる。そこで、本反応を達成するために、ニトリル基を有する新規不斉イミダゾリン触媒の設計・合成を行い、ニトリル基と金属間の相互作用を利用することで、イミダゾリン触媒においてこれまで使われてこなかった不斉反応場を高度利用した触媒の合成を行った。前年度合成に成功したイミダゾリン触媒のライブラリー構築及び不斉カップリング反応をはじめとする様々な不斉反応への展開を行った。また、イミダゾリン触媒上のニトリル基と反応剤の金属間の相互作用の逆、すなわちイミダゾリン触媒上の金属と反応剤のニトリル基との相互作用が有効に機能すると考えられる。これを利用し、ジチオアセトニトリルを求核剤とした不斉マンニッヒ型反応の検討を行ったところ、キラルビルディングブロックとして有用なα,α-ジチオ-β-アミノニトリルを高い収率、エナンチオ選択性で得ることに成功した。また、アレニルニトリルのイミン類に対する不斉求核付加反応にも成功し、α-ビニリデン-β-アミノニトリルを良好な収率、エナンチオ選択性で得ることに成功した。いずれの反応も注目の論文としてSynfacts誌に掲載された。29年度が最終年度であるため、記入しない。また、触媒的不斉反応は少量のキラル源から大量の光学活性化合物を合成する方法であり、高機能医農薬品の効率的合成を行う際に有用な手法である。しかしながら、その合成技術は多くない。そこで、本反応を達成するために、高機能を有する新規不斉触媒の設計・合成を行い、ビスイミダゾリン触媒の適切な位置にニトリル基を導入し、ニトリル基ー金属間の相互作用を利用することで、イミダゾリン触媒においてこれまで使われていなかった不斉反応場を高度利用した触媒の合成を行った。本触媒によって、かさ高い反応環境が形成され、高度な不斉反応場を構築するとともに、還元的脱離反応を促進することが期待される。現在、本触媒を用いて、不斉カップリング反応を始めとする様々な不斉反応の検討を行っている。また、上述の反応はビスイミダゾリン触媒上のニトリル基と反応剤上の金属間の相互作用を利用しており、その逆の相互作用も有効であると考えられる。すなわち、ビスイミダゾリン触媒上の金属と反応剤上のニトリル基の相互作用を利用した不斉合成反応の開発を行った。ジクロロアセトニトリルのイミン類に対する不斉マンニッヒ型反応の開発を行ったところ、キラルビルディングブロックとして有用なα,αージクロローβーアミノニトリルを高収率、高エナンチオ選択的に得ることに成功するとともに、様々な有用な化合物へ誘導することに成功した。本反応は世界初のジクロロアセトニトリルを用いた不斉反応である。当初提案した触媒の合成を試みたものの、合成が困難であったことから、より汎用性の高い新たな触媒構造の再設計を行ったところ、合成に成功した。新たに設計した触媒は、従来のビスイミダゾリン触媒にも本研究のコンセプトを導入できる設計となっているため、有用であるといえる。現在、不斉カップリング反応を始めとする様々な新規不斉反応への展開を行っている。また、ニトリル基と金属間の相互作用を利用するというコンセプトを応用して、世界初のジクロロアセトニトリルのイミン類に対する不斉求核付加反応の開発に成功した。

いずれの反応も注目の論文としてSynfacts誌に掲載された。今後は、再設計したビスイミダゾリン触媒を用いることで、不斉カップリング反応など種々の有用な不斉反応の開発を行うとともに生物活性物質の効率的合成手法の開発を目指す。また、本触媒の配位性官能基の有用性を示していきたい。また、ニトリル基と金属間の相互作用を利用するというコンセプトをさらに展開していきたい。29年度が最終年度であるため、記入しない。
個人別環境破壊度指標の作成

1、個人別環境破壊度指標の作成のための基本資料とするために、一般市民の生活様式とエネルギ-消費量についてのアンケ-トを実施した。昨年は区部の住民29世帯を対象としたが、本年度は多摩地区、我孫子地区の住民について実施した。また、比較資料として、学生についても全く同じアンケ-トを実施した。本年度実施したアンケ-トの回答のうち、エネルギ-消費量では区部と多摩地区では比較的同じ傾向がみられた。我孫子市のグル-プは、熱源の多様性などでバラツキがあった。ガス、電気、プロパン、灯油など家庭で消費する生活必要熱源をジュ-ルでまとめたところ、各地区での特異性はなく、一所帯の人数および平均年令による消費量の差が明確となった。一所帯の人数が少ない程、また平均年令が高い程、エネルギ-消費量は大きい。これらの結果は家族の家庭滞在時間の総時間と水やエネルギ-の消費量に相関があることからもある程度は推定されるものの、エネルギ-別ではそれ程顕著な傾向が見られなかったので、大変注目されるべきことである。エネルギ-のなかにガソリン使用量を加算していないが、月あたり40リットルのガソリンの使用は年間使用する生活関連の一人あたりのエネルギ-の数倍に相当することがわかった。自動車を利用している人にはこの事実を知らせる必要がある。2.個人別環境破壊度指数の作成を行った。このチェックリストを点検することにより、生活と環境との関連が直ちに理解できるように点数表はなるべく単純化した。
インフルエンザウイルスのゲノム機能により規定される細胞特異性及び宿主域の解析

これまでのインフルエンザウイルスに関する生化学的解析から、ウイルス遺伝子の転写およびウイルスゲノムの複製には、宿主因子が必須であることが明らかにされた。特に、ウイルスゲノムの複製反応は、宿主因子への依存性が高く、試験管内RNA合成系において、ウイルス粒子より調製されたウイルスRNAポリメラーゼ複合体のみでは、ウイルスゲノムの複製反応は観察されない。また、子孫ウイルス粒子の産生には、効率の良いウイルスゲノム複製が必須であり、インフルエンザウイルス感染に対して非許容な細胞では、ウイルスゲノム複製量の低下が観察される。しかし、ウイルスゲノムの複製機構に関しては、遺伝学を用いた報告があるのみであり、複製反応の分子機構および細胞特異性に関しては未だ明らかにされていない。そこで本研究では、インフルエンザウイルスゲノム複製の分子機構およびその反応を支える宿主因子によるインフルエンザウイルスの細胞特異性および宿主城の決定機構を明らかにすることを目的とした。昨年度までに、インフルエンザウイルスのゲノム複製を促進する宿主因子、Influenza virus REplication Factor-1 (IREF-1)の同定に成功した。今年度、質量分析法より、IREF-1はMinichromosome mainenance (MCM)2、3、4、5、6、7よりなるヘテロ6量体であることが明らかになった。MCM複合体は、DNA複製のライセンシング因子であり、DNA複製開始反応を制御するヘリカーゼであることが報告されている。RNAi法を用いて、MCMの発現量を低下させた培養細胞では、ウイルスゲノム複製活性が低下した。さらに、MCM複合体が新規合成鎖とウイルスRNAポリメラーゼに結合することで、RNA合成伸長反応複合体が安定化され、その結果、ウイルスRNAポリメラーゼのProcessivityが促進されることを明らかにした。また、今後は、細胞種間、組織間、および宿主間でのMCM複合体の発現量およびその活性の違いを検討し、MCM複合体によって規定される細胞特異性、組織特異性および宿主域についても解析を行っていく予定である。そこで本研究では、インフルエンザウイルスゲノム複製の分子機構およびその反応を支える宿主因子によるインフルエンザウイルスの細胞特異性および宿主域の決定機構を明らかにすることを目的とした。本年度は、インフルエンザウイルスのゲノム複製を促進する宿主因子、Influenza virus REplication Factor-1(IREF-1)の同定に成功した。IREF-1を添加することにより、試験管内ウイルスゲノム複製が再現され、IREF-1の標的となるウイルスタンパク質はウイルスRNAポリメラーゼであることを明らかにした。RNAi法を用いて、IREF-1の発現量を低下させた培養細胞では、ウイルスゲノム複製活性が低下した。さらに、IREF-1により、RNA合成伸長反応途中のウイルスRNAポリメラーゼと新規合成鎖の相互作用が安定化され、ウイルスRNAポリメラーゼのprocessivityが促進されることを明らかにした。来年度は、細胞種間、組織間、および宿主間でのIREF-1の発現量およびその活性の違いを検討し、IREF-1によって規定される細胞特異性、組織特異性および宿主域について解析を行っていく予定である。
多様体の分岐と特性サイクルについて

今年度は、まず、2つの構成可能複体が同じ暴分岐をもつという条件を暴惰性群の表現の不変部分のことばを使った昨年度より弱い条件に改良し、その条件のもとで2つの構成可能複体が同じ暴分岐を持つ場合に同じ特性サイクルを持つということを証明した。完全体上なめらかな代数多様体上の構成可能複体に対し、特性サイクルが定義される。この特性サイクルは余接束上の代数的サイクルであり、余接束の切断との交点数により、オイラー数や全次元などの他の不変量と結びつく。また、特性サイクルは古典的には分岐理論の不変量を用いて構成され、一般の場合にも分岐理論の不変量との関係性が期待されており、これはその一つの例を与える。また、この2つの構成可能複体が同じ暴分岐を持つという条件が多様体の射による押し出しにより保たれることを証明し、論文にまとめて投稿した。これにより、同じ暴分岐をもつ2つの構成可能複体はそれらの代数多様体の射による押し出しも同じ特性サイクルを持つという特性サイクルのひとつの性質が得られる。また、昨年度与えていた階数1の層の分岐の不変量である特性形式の計算についてもヴィット環の層を用いた計算に改良し、論文を投稿した。正標数の完全体上なめらかな代数多様体の上の階数1のなめらかなエタール層のうち、因子に沿った分岐がクリーンという条件を満たすものについて、その特異台も研究した。任意次元の代数多様体に対し、昨年度わかったよりも弱い分岐の条件のもとで特異台の候補となる余接束の閉部分集合を得た。28年度が最終年度であるため、記入しない。今年度は階数1の層の特性サイクルの分岐理論の不変量を用いた計算と2つの非対数的な分岐フィルトレーションの一致についての研究を行った。多様体上の層の特性サイクルは斎藤氏によって定義された余接束上のサイクルで、Beilinson氏による非輪状性で特徴づけられた特異台とよばれる余接束の部分集合を台とし、交点数で消失輪体の全次元を計算するミルナー公式によって特徴づけられる。特性サイクルは交点数によって層のオイラー数を計算する指数公式をみたすが、消失輪体の全次元の計算は一般には難しく、特性サイクルを計算することも一般的には難しい。多様体の次元が1であるという古典的な場合には特性サイクルの多様体の分岐の不変量による計算が知られていたため、次に単純な場合である多様体の次元が2で層の階数が1の場合から特性サイクルの多様体の分岐の不変量による計算について研究を進めた。そして、多様体の次元が2で層の階数が1の場合、さらには一般次元の多様体で層がstrongly cleanとよばれる対数的な分岐の条件を満たす場合に特性サイクルの多様体の分岐の不変量による計算を得た。これらの分岐理論の不変量はWittベクトルと閉点でのブローアップの計算で明示的に得られる。さらに、特性サイクルの一般的な性質として、暴分岐が等しい2つの層が同じ特性サイクルを持つこともわかった。また、剰余体が完全とは限らない正標数の完備離散付値体の分岐理論について知られていた2つの非対数的な分岐フィルトレーションが同じであることも示した。これら2つの分岐フィルトレーションは松田氏によるものとAbbes氏、斎藤氏によるもので、松田氏の理論の中で例外とされていた標数が2で全次元が2である場合に、Abbes氏、斎藤氏の特性形式をWittベクトルを用いて計算し、松田氏の理論に沿った構成を得た。当初の予定通り、多様体が曲面の場合に特性サイクルの分岐の不変量による計算を与えることができ、さらには一般次元の多様体に対しても、層が特別な条件をみたす場合の特性サイクルの計算を得ることができた。また、特性サイクルが暴分岐で定まるという一般的な性質や、ホモトピー不変性などの一般の多様体に対する手法が得られたため。一般次元の多様体に対する階数1の層の特性サイクルの計算について研究を続ける。
腎糸球体疾患における線維芽細胞増殖因子(FGF)・骨形成蛋白(BMP)関与の解析

1.FGF2と糸球体上皮細胞障害糸球体上皮細胞が障害された後、Bowman嚢上皮細胞の増殖反応が観察され癒着病変が形成される。この後分節状の糸球体硬化病変が連続して観察される。この病的反応のFGF2が関与することを明らかにした。そこで、糸球体上皮細胞にPuromycin(PAN)にて障害後、FGF2を投与すると蛋白尿の増加、糸球体上皮細胞障害の増強、Bowman嚢上皮細胞の増殖が観察され、逆に中和抗体投与により蛋白尿の減少、癒着病変形成の抑制が観察された。2.Dominant NegativeFGF受容体発現によるメサンギウム細胞増殖の抑制培養メサンギウム細胞増殖は、FGF2添加により増殖が観察されることが知られている。FGF受容体は4種類の存在が知られているが、この内、FGF受容体1、2のKinase domainを取り除いたcDNAを作成し、培養メサンギウム細胞に発現させた。その発現をRT-PCRで確認した後、FGF2添加による増殖作用への影響を観察した。FGF受容体1、2共に、dominant negative FGF受容体では増殖作用の抑制が観察された。3.糸球体上皮細胞障害とWT1蛋白の関連正常糸球体上皮細胞は、成熟早期から核内にWT1蛋白の発現が観察される。糸球体上皮細胞は正常、病的状態でも細胞回転が起こりにくい細胞とされている。糸球体上皮細胞をPuromycin(PAN)にて障害すると、多核上皮細胞が観察され、その細胞ではWT1蛋白の発現の減少が観察された。この背景には、WT1蛋白の細胞周期調節への関与を示唆している。
酸素プラズマ照射によるSi-DLC膜の超低摩擦化および油中における摩擦機構の解明

本研究ではSi-DLC膜の表面に酸素プラズマ処理を施すことで超低摩擦および高硬度を兼ね備えた膜を開発し,その摩擦摩耗機構の検討を行った.シリコン含有量の増加とともにSi-DLC膜の摩擦係数と硬さはともに減少する.酸素プラズマ処理によりSi-DLC膜の膜全体の硬度は維持したまま,摩擦係数は0.02まで低減できる.酸素プラズマ処理により,シリコン酸化物,カーボンで構成される移着膜を増やすことができ,これにより低摩擦化が実現できる.グラファイト化が進んだカーボンの移着は,Si-DLC膜の低摩擦の一つの原因である.以上の結果から酸素プラズマ処理は,Si-DLC膜の低摩擦化,シリコン添加による硬度減少の防止に有効であると考える.本研究ではSi-DLC膜の表面に酸素プラズマ処理を施すことで超低摩擦および高硬度を兼ね備えた膜を開発し,その摩擦摩耗機構の検討を行った.シリコン含有量の増加とともにSi-DLC膜の摩擦係数と硬さはともに減少する.酸素プラズマ処理によりSi-DLC膜の膜全体の硬度は維持したまま,摩擦係数は0.02まで低減できる.酸素プラズマ処理により,シリコン酸化物,カーボンで構成される移着膜を増やすことができ,これにより低摩擦化が実現できる.グラファイト化が進んだカーボンの移着は,Si-DLC膜の低摩擦の一つの原因である.以上の結果から酸素プラズマ処理は,Si-DLC膜の低摩擦化,シリコン添加による硬度減少の防止に有効であると考える.シリコンを添加ダイヤモンドライクカーホン膜(以下,Si-DLC膜)は非常に低い摩擦係数を示すことで注目されている.Si-DLC膜の摩擦係数は膜中のシリコン含有量の増加と共に減少するが,シリコン含有量の増加と同時に膜はポリマー化され膜の硬度は減少する.一般的に,摺動の際,摩耗率は硬さに反比例するので,膜が軟化することは膜の摩耗寿命の短縮を意味する.Si-DLC膜の低摩擦特性は摩擦試験中に生成されるシリコン酸化物の摩耗粉に深く関係があることが知られている.このことから,低摩擦,高硬度を併せ持つ膜を開発するにあたり,Si-DLC膜の表面に酸素プラズマを照射することで,膜の最表面に形成されるシリコン酸化物の量を制御することで,摩擦係数を制御することが可能であると考えられる.本年度は,イオン化蒸着法を用いて,Si-DIC膜を作成するし,作成したSi-DLC膜の膜構造,組成,摩擦特性を明らかにすることを目標に研究を行った.また,超低摩擦特性を有するSiDLC膜の開発およびシリコン含有量の増加による膜の硬度の低下を防ぐことを目標で,Si-DLC膜表面を酸素プラズマ処理する方法を試した.Si-DLC膜は,イオン化蒸着法によって,成膜圧力0.4Pa,フィラメント電流30A,アノード電流0.5A,リフレクター電圧10V,バイアス電圧・1.5kV,バイアス電圧の周波数1kH,デューティー比25%の条件で作成した.原料ガスにはトルエン(C7H8)とテトラメチルシラン(Si(CH3)4)の混合ガスを用い,その流量比を変えることで膜中のシリコン含有量を制御した.基板は(100)面の単結晶シリコン板を使用し,基板の前処理として,バイアス電圧一2.OkVで20分間のAr+イオンボンバードメントを施した.酸素プラズマ処理はSi-DLC膜を作成した後,同じ装置を用いて試料を大気にさらすことなく,ガス圧力0.8Pa,基板バイアス電圧-2.OkVの条件で,30秒および300秒間行った.また比較のためにシリコンを含まないDLC膜も同装置を用いて作成した.以下に得られた主な結果を示す。(2)酸素プラズマ処理により37at.%のシリコンを含有したSi-DLC膜の摩擦係数は約0.02まで減少する。(3)酸素プラズマ処理により生成される数nmの酸化層により膜表面の硬度は僅かに減少するが,摩耗トラックの硬度は酸素プラズマ女。(4)摩擦係数の低い試料ほど移着膜の量が多く,グラファイト化が進んでいる。以上の結果から酸素プラズマ処理は,Si-DLC膜の低摩擦化,シリコン添加による硬度減少の防止に有効であると考える。シリコンを添加ダイヤモンドライクカーボン膜(以下,Si-DLC膜)は非常に低い摩擦係数を示すことで注目されている.Si-DLC膜の摩擦係数は膜中のシリコン含有量の増加と共に減少するが,シリコン含有量の増加と同時に膜はポリマー化され膜の硬度は減少する.一般的に,摺動の際,摩耗率は硬さに反比例するので,膜が軟化することは膜の摩耗寿命の短縮を意味する.Si-DLC膜の低摩擦特性は摩擦試験中に生成されるシリコン酸化物の摩耗粉に深く関係があることが知られている.このことから,低摩擦,高硬度を併せ持つ膜を開発するにあたり,Si-DLC膜の表面に酸素プラズマを照射することで,膜の最表面に形成されるシリコン酸化物の量を制御することで,摩擦係数を制御することが可能であると考えられる.本年度は,プラズマ利用イオン注入成膜法を用いてSi-DLC膜を作成し,有機分子との吸着特性を調べることを試みた.また,作成したSi-DLC表面に酸素プラズマ処理を施した後,有機分子との吸着特性の変化を調べるための基礎実験を行った.Si-DLC膜は,プラズマ利用イオン注入

成膜法によって,成膜圧力約0.3Pa,正の高電圧パルス2.0kV,負の高電圧パルス-5.0kV,パルス周波数4kHzの条件で作成した.原料ガスにはトルエン(C7H8)とテトラメチルシラン(Si(CH3)4)の混合ガスを用い,その流量比を変えることで膜中のシリコン含有量を0から11at%まで制御した.基板は(100)面の単結晶シリコン板を使用し,基板の前処理として,20分間のAr+イオンボンバードメントを施した.酸素プラズマ処理はSi-DLC膜を作成した後,同じ装置を用いて試料を大気にさらすことなく行った,以下に得られた主な結果を示す.(1)Siを添加することで有機分子の吸着特性が向上した.これはシリコンが増加するとともに吸着サイトの数が増加し,吸着速度が上昇すると考えられる.シリコン含有量が増加すると膜中のsp3結合が増えるといわれており,シリコン添加によりDLC膜に構造変化が起こる(シリコンを含んだクラスタ内に新しい吸着サイトが生成される)ことで吸着速度が上昇したと考えられる.また,Si-DLC膜表面に酸素プラズマ処理を施すことで,有機分子の吸着特性は改善された.これは,Si-DLC膜表面に酸素プラズマを照射することで,有機シラン分子の吸着サイトである,シラノール基の密度が増えたためであると考える.(2)シリコン含有量の増加に伴い吸着サイトが増えてSAMの形成速度が速くなるとともに,Si-DLC膜とSAMの界面が安定化して摩擦特性が向上する.(3)浸積時間とともに島状のSAMの密度が増加し,最終的に直立した状態の単分子膜が得られた.SAM形成後の表面粗さはSi-DLC基板と同程度になる.平成22年には、自動車の高燃費化による省エネルギー、CO_2削減を目指して、Si-DLC膜を自動車のエンジン部品に応用するための研究を行った。エンジンに応用するためには、潤滑環境(エンジン油中)でのSi-DLC膜の摩擦摩耗特性を明らかにすることがキーである。そのために、まず、開発した超低摩擦Si-DLC膜と油分子との吸着特性を明らかにしなければならない.そこで,Si-DLC表面と油分子との吸着特性を明らかにするためもモデル実験としてSi-DLC膜上に有機シラン自己組織化単分子膜(Self-assembled Monolayer, SAM)を形成し,その形成過程,摩擦特性,熱安定性を調べた.得られた主な結果を以下に示す.(1)浸積時間とともに島状のSAMの密度が増加し,最終的に直立した状態の単分子膜が得られた.SAM形成後の表面粗さはSi-DLC基板と同程度になる.(2)シリコン含有量の増加に伴い吸着サイトが増えてSAMの形成速度が速くなるとともに,Si-DLC膜とSAMの界面が安定化して摩擦特性が向上する.(3)Si-DLC膜上で高密度に充填されたSAMは,大気中400°C程度まで安定して表面に存在する.
心筋サルコメアの遺伝子異常に起因する洞不全症候群の分子病態の解明

洞不全症候群などの上室性徐脈疾患は基礎心疾患により二次的に引き起こされることが多いが、一部には基礎心疾患なしに発症することがあり、遺伝子異常がその一因である。本研究ではいまだ変異の見つからない約2/3の家族性上室性徐脈疾患患者の原因遺伝子を明らかにするために、次世代シークエンサーを用いて網羅的遺伝子解析を行い、見つかった遺伝子変異についてはその疾患メカニズムを電気生理学的な手法や分子生物学的手法により決定した。本研究により、これまで原因不明であった約2/3の患者のうちの約4割(11名)の6遺伝子に遺伝子変異を同定した。中でも2つの原因遺伝子はこれまでに報告のない新規原因遺伝子であった。本年度は(1)器質的異常を伴わない家族性洞不全症候群の遺伝学的背景の解明を目的として、次世代シークエンサーによる網羅的遺伝子解析を行い、同時に(2)新規原因遺伝子MYH6変異による疾患発症メカニズム解析を行った。(1)については心疾患、心機能関連遺伝子群を選抜し、カスタムプローブを作成して網羅的にシークエンスを行った。サンガー法による確認の後に、日本人データベースHGVDなどと比較して、未報告あるいはレアバリエーション(Minor Allele Frequency<0.5%)の検出を行った。その結果、既に知られているペースメーカチャネルなどの遺伝子異常に加えて、新たな原因遺伝子として転写因子遺伝子Aやチャネル遺伝子Bを見つけることができた。それぞれの遺伝子変異については、サンガー法で家族の遺伝子もシークエンスし、家系内での遺伝型・表現型連関を確認した。一部の遺伝子変異については機能解析実験系を開始しており、新たな家族性洞不全症候群のメカニズムの解明を行っている。(2)についてはMYH6遺伝子変異が伝導遅延をもたらすことが、洞不全症候群を導く電気生理学的異常であることを明らかにした。洞不全症候群は一般に基礎心疾患に続いて二次的に発生することが多いが、一部の患者では基礎心疾患なしに発症することがあり、その一部は遺伝子異常に起因する。本年は昨年度国際誌に報告を行った心筋サルコメア遺伝子MYH6変異に続き、いまだ未知の原因を見つけるために、心臓に発現するとされる心臓遺伝子200個を選び、次世代シークエンサー(NGS)を用いたターゲットシークエンスにより原因遺伝子を探索した。その結果、これまでのサンガーシークエンスによるスクリーニングでは約3分の1の患者においてしか変異を見いだせなかったが、NGSにより新たに約3分の1の患者に病因変異の候補を見つけることができた。この中には既知の原因遺伝子だけでなく、これまでに報告のない新規原因遺伝子も2つ含まれていた。今回採用した、心臓遺伝子を対象としたNGS解析は、費用対効果の高い遺伝子変異解析技術であった。続いて各原因遺伝子変異の機能解析を行い、病態の検討を行った。まず既知の原因遺伝子として、昨年度報告したMYH6変異が3例、TBX5変異が3例、HCN4変異が1例見つかった。HCN4変異はパッチクランプ法によってチャネル機能を検討したところ、変異保有者にみられる徐脈を証明する機能喪失型変異であることが分かった。また新規原因遺伝子として、チャネル遺伝子Xを見つけた。これは3世代にわたり、青年期から発症する重症徐脈患者に見いだされた。ヒト心房筋cDNAライブラリより目的のチャネル遺伝子cDNAをクローニングし、強制発現系を用いて機能解析を行った。その結果、チャネルそのものは細胞膜に存在し、多量体の形成には成功するものの、イオンチャネルとしての機能が著しく阻害されており、洞結節や心房興奮の興奮発生・拡散を早期に遮断すると推察された。現在、この研究結果を論文にまとめているところである。本年度の目標は(1)洞不全症候群の網羅的遺伝子解析を行うことと(2)すでに見つけていた洞不全症候群変異の分子病態を明らかにすることであった。(1)についてはシークエンスを行った結果、これまで予期しなかった原因遺伝子を見つけることができ、家系内集積性も確認できた。これらについては強制発現系を中心とした機能解析系に既に着手している。(2)については、予備研究ですでに見つけていたMYH6遺伝子変異の機能解析を行い、新たな病態メカニズムを提示することができた。研究の進捗はおおむね当初の予想通りであると思われる。循環器遺伝学今回新たに見つかった遺伝子変異について、強制発現系を用いたin vitro実験を中心にして新規病態メカニズムを明らかにしていきたい。また複数家系にまたがって見つかった遺伝子については家族内の罹患者・非罹患者を引き続き集積し、罹患者に注目して遺伝子型に基づく特徴的臨床像の確立を試みたい。当初の予想に反して次世代シークエンスの結果が思わしくなく、追加シークエンスを行うために2015年1月に20万円の前倒し請求を行った。

実際に追加シークエンスには20万弱の出費となり、研究は遂行できたが、もともと2015年度の予算であるため、残額を2015年度の研究に充てるために次年度使用額が0でなくなった。次世代シークエンサーで得られた結果として、新規疾患遺伝子変異を見つけたので、その機能解析を行う予定である。実際には機能解析の中心である細胞培養系のメディウムなど消耗品に使用する予定である。
筋線維芽細胞による死細胞の貪食が組織の線維化に及ぼす影響の解析

組織が損傷すると、細胞死を契機に、組織の線維化がおこる。従来、線維化の微小環境においては「マクロファージによる炎症惹起物質の認識と死細胞の貪食」→「マクロファージからのTGF-bやPDGFなどの放出」→「筋線維芽細胞によるそれら放出物質の感知」→「筋線維芽細胞による線維化の実行」という順に、応答が起こると考えられてきた。我々は、心筋梗塞時の死細胞除去機構を研究する過程で、これまで死細胞を貪食すると思われていなかった、筋線維芽細胞が死細胞を効率よく貪食することを見出した。昨年度までに、筋線維芽細胞による死細胞の貪食現象が、急性炎症時(心筋梗塞時)の心臓のみならず、慢性炎症時(高血圧性の心肥大時)の心臓に出現する筋線維芽細胞においても認められることを見出した。そしてその貪食に関与する分子を同定し、その受容体が筋線維芽細胞に発現することを見出した。本年度は、筋線維芽細胞から別の貪食促進分子が産生されることを見出し、研究を進めた。その結果、その分子を介した貪食経路が心肥大時の病態形成において重要な役割を果たすことを見出した。すなわち、この貪食促進分子の受容体は、筋線維芽細胞には発現せず、マクロファージに発現していた。実際にこれら分子をアデノ随伴ウイルスを用いて、心肥大時の心臓に発現させると、心臓の機能が有意に改善した。一方で、マウスのみならず、心肥大を罹患した患者さんの心臓においてもこれら分子が筋線維芽細胞に発現することも見出した。平成30年度が最終年度であるため、記入しない。申請者は、心筋梗塞時の死細胞除去機構を研究する過程で、これまで死細胞を貪食すると思われていなかった、筋線維芽細胞が死細胞を効率よく貪食することを見出した。この発見は、これまでマクロファージからの指令を受けて、線維化を実行する細胞としてのみ捉えられていた筋線維芽細胞が、実はマクロファージのみが行うと考えられてきた機能をも担うことを示す。そこで本年度は、筋線維芽細胞による死細胞の貪食現象が、急性炎症時(心筋梗塞時)の心臓のみならず、慢性炎症時(高血圧性の心肥大時)の心臓に出現する筋線維芽細胞においても認められるかを検討した。その結果、高血圧性の心肥大モデルマウス心臓から単離した筋線維芽細胞が、死細胞の貪食能を持つことを見出した。そしてその貪食能は、マクロファージのそれよりは劣るものの、心筋梗塞時の筋線維芽細胞の場合と同程度であることも見出した。さらに、この心肥大モデルマウス心臓から単離した筋線維芽細胞が産生する貪食促進分子を同定した。すなわち、その分子を欠損すると心肥大時の心臓において未処理の死細胞が増加し、その結果、心臓の機能が増悪することを見出した。肥大した心臓における死細胞の貪食に関与する分子を初めて同定することができたため、おおむね順調に進展していると考えている。今後は、研究計画書に記載した通り、心臓のみならず、他臓器の筋線維芽細胞が貪食するか、さらには、死細胞の貪食が筋線維芽細胞の炎症、線維化以外の生理的応答に及ぼす影響などについて検討する予定である。
高温超電導機器用固体窒素冷却材の開発研究

我々は、固体窒素を高温超伝導機器冷却に利用するための検討を行っている。一般に、固体冷媒は冷却対象との熱接触が極めて悪いため、これまで殆ど使用されていなかった。そこで、昨年度はビスマス系高温超伝導テープ材を用いた熱接触向上法に関する検討を行い、ある程度の熱伝達特性向上を可能とした。しかしながら、上記方法で作製した固体窒素中でさえも、ある閾値となる熱擾乱パワー以上では、最終的に熱接触が失われることを示唆する結果が得られた。そこで、この固体窒素中に微少量の液体ネオンを導入することで、熱伝達特性が格段に向上することを始めて明らかにした。即ち、固体窒素を蓄冷材とし、また液体ネオンを冷却対象との熱交換材に用いることで、極めて高性能な冷却材が実現される。窒素が固体状態、ネオンが液体状態となる温度領域は25K付近であるが、同温度領域では、高温超伝導材料の電流輸送特性ならびにその磁界特性が向上し、システム全体としても最適の運転温度を考えられる。ネオンは現状では高価であるが、若干量の使用で十分であることから、経済的にも全く問題ないと考えられる。また、本年度は上記冷媒の応用として高温超伝導コイルを考え、同コイルの定量的評価法の確立を行った。その結果、任意の温度・電流負荷率で特性評価可能な電磁界-熱連成解析プログラムコードを開発することに成功した。今後、固体冷媒含浸高温超伝導コイルの最適設計を、以上の成果をもとに行っていく。最適設計法としては、遺伝アルゴリズムを採用予定であり、有限要素解析法と組み合わせることにより、コイルの高性能化を図っていく予定である。本年度は,主として高温超電導コイル冷却用固体窒素冷媒の熱伝達特性改善法ならびにその蓄冷効果に関する研究を行った。以下のような研究成果が得られた。1.昨年度までに,伝導冷却で冷却速度を非常に遅くして窒素固化を行うことにより,固体窒素と冷却対象との熱接触が格段に向上することを明らかにした。本年度は,実際にBi-2223/Ag多芯テープを用いて小形高温超電導ソレノイドコイルを製作し,同コイルにおいても同様の効果が得られることを確認した。これは,過電流通電時の温度ならびに電圧測定によって確認されたものである。また,高温超電導コイルを上記方法で固体窒素含浸後,2気圧程度に加圧することによって熱伝達特性がさらに向上することを示した。この原因としては,加圧によって固体窒素の昇華が抑えられたものと推測され,現在検討を進めている。2.液体ヘリウム熱交換方式による高温超電導コイル実験用窒素固化装置を設計・製作し,その冷却特性を調べた。これは,ある一定時間外部からの冷媒供給を要しないスタンドアロン方式高温超電導コイルシステムを志向して製作したものである。液体ヘリウム流路と固体窒素含浸コイル設置用試料室間の熱交換効率向上のため,両者の接触面積を向上する工夫を施した。実験の結果,熱交換器のシール部にリークがあることが判明し,当初予測した結果は得られなかったが,ある程度の蓄冷効果を実験的に確認することができた。現在,上記リークの問題を改善し,より詳細な実験を行うべく準備を進めているところである。また,固体窒素とネオンを混合した場合についても熱伝達特性ならびに蓄冷特性の実験を行う予定である。
分有型リーダーシップの導入がチーム・コンピテンシーの強化・育成に及ぼす効果

本研究は、分有型リーダーシップ(shared leadership)をチームに導入することが、チーム・コンピテンシーの強化・育成にいかなる効果をもたらすのか、社会心理学と組織科学の観点から明らかにすることを目的としていた。初年度は、組織現場における質問紙調査やフィールドワークおよびインタビュー調査等を行い、分有型リーダーシップをチームに導入するための現実的で有効な手順について検討を進めた。さらに、医療・看護業界および電力業界における研究協力組織と連携して、電力発電の運転チームを対象にした危機対応場面におけるチームワーク訓練の前後で、チーム状況にいかなる変化が生じるか検討するアクション・リサーチを展開した。最終年度になる2年目は、前年のアクション・リサーチの成果をふまえ、看護集団を対象に,分有型リーダーシップの導入を実践し,その効果を測定する現場実験を行った。従属変数として,チームワーク要素(チーム指向性,チーム・リーダーシップ,モニタリング,フィードバック,支援,相互調整)および共有メンタルモデル,チーム同一視,職務満足感,職務ストレス等を測定し,分有型リーダーシップの効果を導入前から6ケ月に渡って時系列的に検討した。その結果,チームワーク要素の中のチーム指向性,そして職務満足感,職務ストレスにおいてポジティブな変化が確認される一方,その他のチームワーク行動や共有メンタルモデルにおいては明確な変化は確認されなかった。分有型リーダーシップの効果は,チームワークの心理的側面ではポジティブな効果をもつものの,チームワーク行動,そしてチーム・コンピテンシーの強化に関しては十分とは言えず,他の手法も加えた多重的なチーム・マネジメントの工夫が必要であると考えられた。その方法論に関して議論し,具体的提言を行った。(761字)本研究は、分有型リーダーシップ(shared leadership)をチームに導入することが、チーム・コンピテンシーの強化・育成にいかなる効果をもたらすのか、社会心理学と組織科学の観点から明らかにすることを目的としていた。(761字)本研究は、分有型リーダーシップ(shared leadership)をチームに導入することが、チーム・コンピテンシーの強化・育成にいかなる効果をもたらすのか、社会心理学と組織科学の観点から明らかにすることを目的としている。本年度は、2年計画の初年度として、以下の研究に取り組んだ。まず、自律管理型チーム・マネジメントおよびリーダーシップ発達論に関する先行研究のレビューを丹念に行って、それを参考にしつつ、チームによる職務遂行現場のリアリティを十分に反映した概念の規定に取り組んだ。そして、分有型リーダーシップをチームに導入するために、組織現場における質問紙調査やフィールドワークおよびインタビュー調査等を行い、現実的で有効な手順について検討を進めた。職務の現場では、基本的に管理者のリーダーシップを重視し依存する傾向が強いことが確認されるとともに、メンバー間のチームワーク概念の共有(shared mental model)の程度の高さは、メンバー相互のリーダーシップ発揮に対する肯定的評価に結びついていることが明らかになった。こうした検討と並行して、医療・看護業界および電力業界における研究協力組織との連携したアクション・リサーチによる現場実験を行う準備を進めた。具体的には電力発電の運転チームを対象にして、安全管理・危機対応訓練におけるチームワーク研修によって、その前後で、チーム状況にいかなる変化が生じるかの検討を行う段階に進めている。分有型リーダーシップの行動的側面での測定は、必要とされながら困難とされてきたが、研修の機会を活用し、かつ経験豊かな指導者による評価基準を詳細に設定し、それに基づく測定を行うことで、妥当性と信頼性の高い尺度開発の道が開けてきている。2年計画の最終年度の研究は以下の通り取り組んだ。前年度のアクション・リサーチを継続して、電力発電の運転チームを対象にした危機対応場面におけるチームワーク訓練の前後で、チーム状況にいかなる変化が生じるか検討を行った。併せて、チームワーク行動の測定およびチームワークの心理的側面の測定のさらなる精緻化を進めた。チームワーク訓練の効果は、心理面では即効性があるものの、減衰も早く、訓練後の日常の業務遂行の中での効果的なチームワーク・トレーニングのあり方を検討する必要性が明確になった。

この課題をふまえ、看護集団を対象に、分有型リーダーシップの導入を実践し、その効果を測定する現場実験を行った。従属変数として、チームワーク要素(チーム指向性、チーム・リーダーシップ、モニタリング、フィードバック、支援、相互調整)および共有メンタルモデル、チーム同一視、職務満足感、職務ストレス等を測定し、分有型リーダーシップの効果を導入前から6ケ月に渡って時系列的に検討した。その結果、チームワーク要素の中のチーム指向性、そして職務満足感、職務ストレスにおいてポジティブな変化が確認される一方、その他のチームワーク行動や共有メンタルモデルにおいては明確な変化は確認されなかった。分有型リーダーシップの効果は、チームワークの心理的側面ではポジティブな効果をもつものの、チームワーク行動、そしてチーム・コンピテンシーの強化に関しては十分とは言えず、他の手法も加えた多重的なチーム・マネジメントの工夫が必要であると考えられた。その方法論に関して議論し、具体的提言を行った。
プリン代謝異常症で臨床症状が発現する生化学的機序ー特にグアニンヌクレオタイドとの関連

2.従来、消化液中のプリン代謝酵素活性については全く報告されていなかったが、膵液、胆汁等にプリン体を分解するS'ーnucleotidase,purine nucleosidephosphorylase,xanthine oxidaseが存在することを明らかにした。さらにプリン分解酵素をliposome封入し.トリに経口投与するとイノシン負荷による血清尿酸値の上昇を防止することを確認した。liposomeプリン分解酵素は高尿酸血症の治療薬になる可能性を示した。3.HGPRT活性が完全に欠損した我国のLeschーNyhan症候群6例でリンパ球を用いてcell line株を樹立し、これよりDNA,RNAを分離してSouthern blotおよびNorthern blotを行なった。さらに4例ではHGPRTのCーDNAをpolymerase chain seactionにより増幅させ、このDNAの塩素配列を決定した。1例では54番目+ATF(メチオニン)よりCTG(ロイシン)に、1例では179番目がGTT(バリン)からGGT(グリシン),また180番目がGGA(グリシン)がAGA(アルギニン)に1例では747より797までの51のnucleotidesが欠落していた。他の1例では51番のCGA(アルギニン)がTGA(stop codon)に変化していた。以上我国で始めて4例のHGPRT欠損症の突然変異による塩基配列の変化を明らかにした。4.従来,尿酸産生は核酸の分解、特に赤血球の脱核によるRNAの分解によると推定されていた。しかしメチル化反応によるSーadenosylmethionineの分解により尿酸が産生されることを明らかにした。creatineの産生はguanidinoacetic acidがメチル化をうける。すなわちcreatineと尿酸代謝は密接に関連していることを明らかにした。2.近年、我国で増加している高尿酸血症はプリン体の過剰摂取によると考えられる。従来、消化液中のプリン代謝酵素活性については全く報告されていなかった。膵液、胆汁等にプリン体を分解する5 ́-nucleotidase、adenosine deaminase、purine nucleosidephosphorylase、xanthine oxidase活性が存在することを確認した。プリン体であるイノシンをトリに経口投与すると、血清尿酸値は著しく上昇する。しかしあらかじめpurine nucleosidephosphorylase、xanthino oxidase、uricaseをliposomeに封入して経口的に投与しておくことにより、イノシンによる血清尿酸値の上昇は抑制される。従って、プリン体を分解する酵素の経口投与は消化管内でプリン体を分解して、吸収されるのを防ぐ。このためこの酵素は高尿酸血症の予防薬として有用であることを明らかにした。3.adenylosuccinase欠損症では自閉症と同様の精神症状を示すが、この機序は全く不明である。この疾患ではadenylosuccinateがsuccinyladenosineに代謝され、これが体内に増加する。succinyladenosinoはadenosineと同様に細胞膜のadenosine receptorに作用することを発見した。すなわち、succinyladenosinoが神経細胞のadenosine receptorに作用して自閉症の様な症状を発現させる可能性があり、theophyllineがこの疾患で効果がある可能性がある。Hypoxanthineguaninephosphoribosyltransferase(HGPRT)はプリン体の再利用に働く酵素である。HGPRTの活性が低下(部分欠損症)すると、プリン体は尿酸に分解され、幼少時より高尿酸血症を来たし、腎障害、痛風を発症する。HGPRTが完全に欠損すると自傷行為、choreoathefose,等の精神神経症状を伴ったLesch-Nyhan症候群となる。今回、5例のHGPRT欠損症でリンパ球を用いてcell line株を樹立した。

酵素の基質、hypoxanthine,PRPP(phosphoribosylpyrophosphate)へのKmを測定するとPRPPに対しては正常者と差がなかったが、Hypoxanthineに対してはコントロ-ルの710倍の高値を示した。5例よりDNAをGross-Bellard3の方法により分離し、制限酵素BamH_1、HindIII、EcoRl、BglII、PstI、PvIIで切断して^<32>Plabelled HGPRT C-DNA probeを用いてSouthern blot analysisを行なった。しかしコントロ-ルと全が差がなく、遺伝子のdelotion等は検出できなかった。4例よりRNAをSimpson3の方法でOligo-dTクロマトグラフィ-を用いて分離し、^<32>P-CTPをラベルしたHGPRT・C-DNAを用いてNorthern blotを行なったことろ、1例のみでmRNAが短いことが判明したが、他の例ではコントロ-ルと差がなかった。3例のHGPRT欠損症のDNAでpolymerase chain reactionによりdeoxyribonucleotide primerを用いてこれらのHGPRTのC-DNAを増幅させ、このDNAのseguenceを行なった。Lesch-Nyhorm症候群の1例では54番目がATGよりCTGに変化(メチオニンガロイシン)、1例では179番目がGTTよりGGTに変化、また180番がGGAよりAGAに変化(このためバリンガグリシン、またグリシンガアルギニンに変っていた。他の1例では747より797まで51のnucleotideが欠落していた。このためこの例では短いm-RNAが産生されており、アミノ酸は2つ欠けていた。以上HGPRT欠損症3例の遺伝子の変異を解明した。Hypoxanthine guanine phosphoribosyltransferase(HGPRT)欠損では自傷行為,choreoathetosis等の精神神経症状を伴なったLoschーNyhan症候群となる。今回,我国の1例のLeschーNyhan症候群でリンパ球をEBウイルスを用いてcell line化し.RNAをguanindinium thiocyanate cesium chloride法で分離し、これよりreverse transcriptaseを用いてcーDNAを合成した.さらにPCR法によりHGPRTのcーDNAを増幅させ、このDNAの塩基配列を決定した。51番目がCGA(アルギニン)よりTGA(Stop codon)に変異していた。このためHGPRT活性が完全に欠損したことが判明した。
メカノセンサー欠損によるエナメル質形成不全

歯科臨床では、多様なエナメル質形成不全に遭遇するが、その機構は未だ明らかとは言えない。私たちは口腔上皮に高発現している温度感受性TRPV3およびエナメル芽細胞に存在するメカノセンサーであるTRPV4(transient receptor potential vanilloid 3,4)チャネルがエナメル質の形成調節に関与するとの仮説を立て、野生型(WT)とTRPチャネル遺伝子欠損マウス(V3KO、V4KO)を用いて、エナメル質形成への影響を調べた。その結果、WTに比べてV3KO、V4KOマウスは歯のエナメル質石灰化が不十分であることを見いだした。その機序を調べるため、V3KOおよびV4KOがマウス歯エナメル芽細胞におけるエナメルタンパクの発現および歯エナメル質のカルシウム、リン、マグネシウム分布に及ぼす影響について検討した。我々は生後21日齢のWTおよびV3KO、V4KOマウスの切歯、臼歯を用いて、アメロゲニン(AMEL)、アメロブラスチン(AMBN)、エナメリン(ENAM)抗体による免疫染色を行った。また、エナメル質のミネラル分布状況についてX線マイクロアナライザー(EPMA)を用いて解析を行った。その結果、WTおよびV3KO、V4KOマウスの歯はいずれもエナメルタンパクの免疫陽性反応が確認された。WTマウスに比べてV3KO、V4KOマウスのアメロブラスチン発現が弱い傾向が示した。一方、EPMA解析では、WTと比較してV3KOマウスは、臼歯および切歯エナメル質のカルシウム、リン、マグネシウム濃度が有意に低下した。V4KOマウスにおいても同様な結果が得られた。これらのことから、TRPチャネルはエナメル質形成に影響を与える可能性が示唆された。今後はさらにMicro CTによるエナメル質形成密度の解析やEDXによるカルシウム、リン、マグネシウムの元素分析を進めていく予定である。H30年度は歯の発生におけるミネラル成分沈着へのTRPチャネル関与についてWTとKOマウスを使ってMicro CTの解析を予定したが、動物飼育室の感染により、動物は殺処分され、施設の改修に時間がかかったため、年度内の研究がやや遅れている。今年度はWTとTRPV3、TRPV4チャネルKOマウスを使って歯の発生におけるミネラル成分沈着へのTRPチャネル関与についてMicro CTを用いてエナメル質形成の密度を解析し、さらにSEMによるエナメル質形成の元素分析を行う予定する。エナメル質形成不全は、エナメル芽細胞の成熟や石灰化に依存する。エナメル質形成に関わる研究は基質タンパクにかかる知見はあるが、石灰化におけるカルシウム移動の分子実体は未だ明らかとは言えない。本課題では、高いカルシウム透過性を有するTRPV3、TRPV4 (transient receptor potential vanilloid 3,4)チャネルに着目し、歯の発生、特にエナメル質の石灰化機構に与える役割を明らかにする。私たちはin situハイブリダイゼーション法によりマウスから採取した歯胚におけるTRPチャネルの発現を明らかにした。Trpv3, Trpv4はE13.5日の歯堤、E15.5日の内エナメル上皮、外エナメル上皮、E18.5日とP1日の内エナメル上皮、中間層細胞にそれぞれ強く発現していた。さらにTRPV3, TRPV4の免疫染色を行い、エナメル質の形成および影響について野生型(WT)とTRPV3、TRPV4遺伝子欠失マウスを使って比較した。生後21日齢マウスのエナメル質にTRPV3がエナメル芽細胞、TRPV4は中間層細胞にそれぞれ強い発現が認めた。また、21日齢および6週齢マウスの歯を走査型電顕により観察した。切歯、臼歯ともに外形や大きさ、エナメル質の厚さはWTとV3KO、V4KOを比較して顕著な差は認められなかったが、WTよりV3KO、V4KOの方が磨耗は顕著であった。エナメル小柱および小柱間質の発達はWTとV3KO、V4KOで異なっていた。WTのエナメル小柱は棒状であるが、V3KO、V4KOでは細糸状を呈し、小柱の形成が不十分で間隙が広くなっていた。本研究の結果によりTRPV3、TRPV4がエナメル質に発現し、エナメル質の形成に影響を与えていることが明らかとなった。本年度の目標であった歯の発生過程におけるTRPV3、TRPV4の発現時期についてin situハイブリダイゼーション法により歯胚におけるTRPチャネルの発現を明らかにできた。また、エナメル質の形成・成熟がTRPV3、TRPV4の遺伝子欠損による影響を受けることがわかった。目標はおおむね達成された。私たちは皮膚に高発現している温度感受性TRPチャネルがエナメル質の形成調節に関与することを仮説とし、野生型(WT)とTRPチャネル遺伝子欠損マウス(V3KO、V4KO)を用いて研究を行った。H29年度はエナメル芽細胞におけるエナメルタンパクの発現、TRPチャネルとエナメル基質のカルシウム、リン、マグネシウムの分布状況について検討した。生後21日齢のWTおよびV3KO、V4KOマウスの歯を用いて、アメロゲニン(AMEL)、アメロブラスチン(AMBN)、エナメリン(ENAM)の抗体を使って免疫染色を行った。WTおよびV3KO、V4KOマウスの歯はいずれもエナメルタンパクの免疫反応陽性を示したが、WTマウスに比べて弱かった。特にWTマウスではアメロブラスチンの免疫反応が近心端および細胞核を含めてエナメル芽細胞全体が強く染色された。一方、V3KO、V4KOマウスではアメロブラスチンは近心端に弱い免疫反応が観察された。