hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
奇生性原虫赤痢アメーバにおけるコレステロールホメオスタシスに関する研究

コレステロールは赤痢アメーバの生育に必須な因子の一つであり、赤痢アメーバは細胞外からのコレステロールの取込み、あるいは細菌や宿主細胞を貪食することによりコレステロールを摂取している。ヒトにおいて、コレステロールが局在するオルガネラは細胞膜であるが、赤痢アメーバではリソソームに局在していることが明らかになった。そこで、コレステロールの細胞内輸送の特殊性を理解するために、リソソーム輸送の制御機構について解析を行った。他種生物ではリソソームへの輸送は低分子量GTPaseであるRab7が膜融合を担っているが、赤痢アメーバゲノムにはRab7が9種存在した。そのうちの一つEhRab7AはエンドソームからTGNへの逆行輸送に関与することが以前に報告されていたが、EhRab7Aにもっとも高い相同性を示したEhRab7Bは赤痢アメーバ内で大量発現することにより、リソソームの肥大化を誘引ことが分かった。EhRab7Bの機能をさらに詳細に解析するために、EhRab7Bの優性変異であるH69L変異を発現させたところ、EhRab7B H69Lタンパク質の細胞内局在は膜から可溶性画分へと変化し、リソソームの形成が阻害された。さらにEhRab7B H69L変異発現株ではリソソーム酵素であるシステインプロテアーゼが細胞外に大量に分泌されていた。システインプロテアーゼの細胞内での発現はEhRab7B H69L変異株では僅かに減少しており、システインプロテアーゼのmis-secretionが起こっていると考えられた。以上の様に、赤痢アメーバのリソソーム輸送は、複数のRab7が異なるステップを調節しており、Rabの機能の細分化が起きていると考えられた。赤痢アメーバにおいて生育に必須なコレステロールの取込みに関与する小胞輸送経路を明らかにするために、まず、エンドソームに局在するRab GTPaseがゲノムに幾つ存在するかを検索した。その結果、赤痢アメーバゲノムデータベースにはRab遺伝子だと考えられるsmall GTPaseが91種存在し、その数は多細胞生物のヒト(60種)やシロイヌナズナ(57種)の1.5倍に相当するものであった。そのうち、初期エンドソームに局在すると予想されるRab5は1種、後期エンドソーム/リソソーム系に存在すると予想されるRab7のアイソタイプが9種(Rab7A-Rab7I)、リサイクリングエンドソームに局在すると予想されるRab11のアイソタイプが4種(Rab11A-Rab11D)存在した。定量PCR法によって実験室株HM1:IMSS cl6での発現を検討したところ、いずれのRabも発現が確認された。よって、赤痢アメーバは他種生物に比べ、エンドソーム系の輸送経路が複雑化していると考えられた。中でも哺乳類細胞ではRab11は、リサイクリングエンドソームでコレステロールの細胞外への排出に関与すること報告されている。そこで、赤痢アメーバのRab11アイソタイプがリサイクリングエンドソームに局在するかどうかを検討した。まず、C末にHAタグを付加したRab11アイソタイプを赤痢アメーバ内で大量発現する形質転換株を作製し、その細胞ライセートを用いて細胞分画を行った。これまでの解析で、赤痢アメーバのRab7AならびにRab5はp13ならびにp100画分に回収されることが分かっている。一方で、Rab11A,11B,11Cのアイソタイプは何れもp13の重い膜画分に回収され、Rab7AならびにRab5とは異なる局在を示した。抗HAを用いた間接蛍光抗体染色では、細胞内に多数散在する凝集した膜状に観察された。リソソームマーカーのLysoTracker Red,あるいはFITC-デキストランを60分パルスしたエンドソームとは共局在しなかった。しかしながらFITC-デキストランをさらに60分チェイスすると、一部分のエンドソームとRab11ポジティブな膜との部分的な共局在が観察され、Rab11ポジティブな膜とリサイクリングエンドソームとのkiss-and-run融合が観察されていると推測した。さらにEhRab

7B H69L変異発現株ではリソソーム酵素であるシステインプロテアーゼが細胞外に大量に分泌されていた。システインプロテアーゼの細胞内での発現はEhRab7B H69L変異株では僅かに減少しており、システインプロテアーゼのmis-secretionが起こっていると考えられた。以上の様に、赤痢アメーバのリソソーム輸送は、複数のRab7が異なるステップを調節しており、Rabの機能の細分化が起きていると考えられた。
森林発生人獣共通マラリアの生態学社会学的研究

ベトナム・カンホア省カンフー地区の住民、ベトナム・クワンチ省ラオスサバナケット県間の国境地域の住民の血液からサルマラリア原虫Plasmodium knowlesiを検出した。カンフー地区で採取したハマダラカAnopheles dirusからヒトマラリア原虫3種とサルマラリア原虫4種を検出した。P. knowlesi感染実験用サルの糞便からそのDNAを検出した。野生サルにおいても同様にP. knowlesiのDNAを検出した。P. knowlesi感染住民の血液中に生殖母体を検出した。ヒトマラリア伝播が特定グループで維持される傾向があった。地形植生、土地利用、住民の生活基盤が明らかになった。東南アジアではマラリアが根絶可能だと予想されたが、サルマラリア原虫Plasmodium knowlesiのヒト感染が予想以上に多いことが明らかとなり、実態を把握するとともに人獣共通感染が生じる理由を明らかにする研究が開始された。私たちは既に、世界で初めて1匹のAnopheles dirusからヒトマラリア原虫2種とP.knowlesiを検出していたので、調査を拡大し、予想通り、調査地域(森林地帯)の感染者と原虫保有媒介蚊の約25%において、P.knowlesiを検出した。この結果は、調査した森林地域に野生サルが生息し、野生サルはサルマラリア原虫のリザーバーであり、森林内で吸血活動をする媒介蚊によって森林で活動をするヒトにもサルマラリア原虫が感染することを示唆している。マラリア伝播に係わる各要因、森林環境、サルの種と分布と行動、ヒトの生活様式と森林活動、媒介蚊の分布と行動、伝播原虫種を明らかにするために、学際的な調査活動を開始した。この研究の最終目標は、進化分散して自然宿主が主にマカク属となったP.knowlesiがなぜヒトにも感染するのか、P.knowlesiのヒトーヒト感染は自然界で起こるのかという疑問を明らかにし、有効なコントロール手法を見いだすことである。平成23年度は、目標へ至る途上で、三日熱マラリア原虫とサルマラリア原虫間では交叉反応が生じること、P.knowlesi感染住民は必ずしもマラリアを発症しないこと、P.knowlesi以外のサルマラリア原虫も伝播していること、森林劣化が焼き畑だけでなく、鉱業活動などによっても起こっていること、野生サルの行動圏が住民の行動圏と重複しているなど、興味深い事実を得た。それらのいくつかは、現象をはっきりと確認するとともに、その背後に潜んでいるメカニズムの解明へと研究が発展し始めた。森林植生、土地利用が衛星情報と地上調査によって確認された。森林内の活動は農業生産では生計が成り立ちゆかない部分を補っていると考えられる。市場で換金するために非木材性森林産物を採集しているか調査をした。ナイーブな課題なので正確には把握できないが、薬用植物、タケノコ、などがリストに挙げられた。住民の移動を裏付けるためにマラリア関連のG6PD欠損調査を開始した。酵素学的にスクリーニングをし、サンプルを持ち帰って国内で欠損のタイピングの結果から、住民のもともとの居住に関する伝承の裏付けを行った。蚊のトラップ開発のために、A.dirusの生理、生態、行動を観察するため、人工飼育を導入した。飼育蚊を用い、種々の刺激に対する反応をビデオ撮影して分析を開始した。いっぽう、野外ではBGセンチネルトラップの改良型の性能試験を継続した。引き続き野生サルの追跡を行うとともに、カメラトラップにヒトの親子、ブタオザルの一群がビデオ撮影された。ヒトの移動路とブタオザルの移動路が重複していることが示されたが、ブタオザルの採食、休息が観察されていない。飼育サルからP. cynomolgi, P. coatneyiが検出された。野生サルの糞便からP. knowlesiの遺伝子DNAが検出された。このサルは従来自然宿主と考えられていたサルとは異なった。蚊の唾液腺からP. knowlesiの他に、P. inui, P. cynomolgi, P. coatneyiが検出された。住民の血液サンプルから原虫の検出するとともに生殖母体の検出を行い、熱帯熱や三日熱では家族内で遺伝子の同じ方が検出された。P. knowlesiがヒトでも生殖母体を産生することを確認した。A. dirusの人工飼育は4代までは継続したが、その後の産卵数が激減し、飼育集団が消滅したため、再度ベトナムから卵を導入し人工飼育の確立を目指した。P. knowlesi感染者が何故マラリア症状を発しないのか、免疫学的な検索が停滞している。ラオス・サバナケット周辺の森林調査の手法をカンフー地区にも展開した。衛星情報により土地利用と植生分布を作成し、植物生産性の高い地域から低い地域に範疇わけし、その範疇にそって地上調査を行い、土地利用や植物の分布を確認した。

住民の森林利用を昨年に引き続いて行う一方、カンフー地区に居住する少数民族の生活基盤を明らかにするため、マラリアに関連する伝統的治療薬の調査を実施した。少数民族の呪医とイボツヅラフジを採取し、成分分析を行い、パルマチンなどアルカロイドを検出した。これらの成分はマラリア原虫に特異的な薬効はないがインド大陸ではベーダにも記載され種々な目的で用いられた。農作物を荒らすために野生のサルは住民から追われる対象のため、野生サルは人間に対する警戒が非常に強く目視観察が困難なことが判った。さらに、野生サルの捕獲し麻酔し採血すると、後の調査継続が難しくなる。カメラトラップを設置して移動を確認し、カメラトラップの結果を検討してbio-loggingの実施を検討することになった。一方、マラリア罹患を糞便サンプルを用いて調べることにし、実験サルにPlasmodium knowlesiを感染させ、血液、尿、糞便サンプル内の原虫のDNAの消長を追跡した。サルマラリア原虫は現行のPCRではサルマラリア原虫相互で、またP. vivaxに対して交叉反応が生じる。そのためにミトコンドリアのDNAを検出し、配列を確認して感染を決定しているが、検出の標準的な手法や方法を確立する必要が生じている。原稿の蚊採取はヒト囮法を行っている。ヒト囮法は吸血にやって来る森林居住性Anopheles dirusを採取する手法としては最も効率がよいが、吸血後の休止など吸血ー産卵ー吸血に関連する一連の行動が明らかではない上、採集者に負担を強いるため継続可能とは考えられない。トラップ開発を開始した。1ヒトマラリア原虫の中で、三日熱マラリア原虫は東南アジアのサルから検出されるマラリア原虫と系統学的に非常に近いため、鑑別手法を樹立する必要がある。2ベトナム国籍を有さない研究者がベトナム国内で野外調査を行うには、ベトナム人共同研究者を確保して共同で許可申請をしなくてほならないが、共同研究者の確保が難しい。3研究者が多忙などのために調査研究に時間を割くことが困難である。25年度が最終年度であるため、記入しない。4遅れている理由1研究者が申請書の作成、報告書作成、学生募集、運営会議などに時間を割くために、調査研究の時間を作りださなければならない。。2人マラリア原虫、サルマラリア原虫の鑑別が予想以上に困難3糞便から検出が不安定。4人材の確保が難しい。人獣共通マラリアは、伝播、進化、環境、多様性など今日的な課題を含んでいる。研究を進めるにはマラリア伝播の現状把握が最も重要である。なかでもマラリア原虫の種の鑑別は必須の項目であり、競争の激しい課題であるから引き続き鑑別法の樹立を目指す。ヒト、サル、媒介蚊の分布、行動などの調査の体勢がほぼ整った。それぞれの領域の課題を研究する。同時に、研究対象を他の領域へ拡大する。オンライン会議、GISなどの技術を充実させ学際的な研究グループの活動の質、量を向上させる仕組みを導入する。今後の課題
海洋生態系にフグ毒ループは存在するのか―フグ毒と海洋生物のミッシングリンクを解く

フグはその体内に保有する膨大な量の毒をどこから獲得しているのか。この疑問を明らかにすべくTTXループの存在を提唱し、昨年度までの研究にに引き続き実施した。その結果、以下の成果が得られた。これまでの研究で、関東南岸では、クサフグの稚魚がふ化後12ヶ月までにその体内に比較的高濃度のTTXを蓄積していることが明らかとなった。この要因を明らかにするために、当該海域で採捕したクサフグの稚魚の消化管内容物を真核生物のCOI領域を対象とする次世代シーケンサ分析に供した。その結果、オオツノヒラムシと一致する配列が検出され、これは昨年度までに得られた結果を支持するものであった。つまり、クサフグの稚魚は、高濃度のTTXを保有するオオツノヒラムシの幼生を摂餌することでTTXを獲得していることが示唆される。本研究は、わが国の最西端に位置する海域でもフグ毒保有生物を対象に実施した。石垣島および西表島で採取したツムギハゼおよびオキナワフグの稚魚の消化管内容物を真核生物のCOI領域を対象とする次世代シーケンサ分析に供した結果、オオツノヒラムシと一致する配列が多数検出された。また、オキナワフグ稚魚の消化管内容物では、オオツノヒラムシのCOI配列の割合が低い個体では、ツムギハゼのCOI配列が多数検出され、この現象は、石垣島および西表島で採取した個体群間で共通していた。この結果は、オキナワフグおよびツムギハゼの稚魚がオオツノヒラムシの幼生を摂餌することでTTXを獲得していると同時に、オキナワフグがツムギハゼを捕食することでTTXを効率的に獲得している可能性を示唆しており、ここにも高次捕食者間のTTXループが存在することが考えられる。平成30年度が最終年度であるため、記入しない。フグが保有する大量の毒はどこから獲得しているのかを明らかにするべく、TTXループの存在を提唱し、研究を実施した。その結果、研究初年度は、以下の成果が得られた。クサフグでは、ふ化後12か月間にその体内に比較的高濃度のTTXを蓄積することが予備的研究で明らかとなっていたが、その要因の一つにオオツノヒラムシの幼生を摂餌していることが示唆された。オオツノヒラムシは、クサフグの産卵期とほぼ同時期に産卵し、孵化する。これらオオツノヒラムシのTTX量をLC-MS/MS分析により定量したところ、成体、卵およびふ化直後の幼生はきわめて多量のTTXを保有していた。人工授精により得たクサフグの稚魚にオオツノヒラムシの幼生を与える捕食実験を実施したところ、クサフグの稚魚はこれを食べ尽くし、速やかに毒化した。オオツノヒラムシ以外の他の多岐腸類におけるTTXの保有状況を調べるため、まず、当該分類群を対象とする分子生物学を用いた分類体系の構築を実施した。沿岸部で採取した種々のヒラムシ類を形態学的特徴にもとづき分類後、28S rRNA遺伝子を対象とする分子系統解析に供した。その結果、一部解像度が低い部分があるものの、吸盤亜目および無吸盤亜目に分類される両個体群ともに、既報の形態学的特徴にもとづく分類体系とある程度一致した。上述の結果から、クサフグはオオツノヒラムシの幼生を摂餌することで毒化していることが示唆されたことから、自然環境下でこれを確認する手法の開発を試みた。種々のヒラムシの遺伝子データをもとにオオツノヒラムシ特異的なプライマーを用いるPCR法を開発し、種々のヒラムシとともに種特異的な検出が可能か調べた。その結果、オオツノヒラムシを特異的に検出することができた。これがフグの消化物でも可能か調べるため、トラフグの養殖種苗にオオツノヒラムシの成体を与えて調べた結果、消化物からもオオツノヒラムシ特異的なDNA配列を検出できた。フグの毒化に絡む生物としてオオツノヒラムシに着目し、少なくとも仔稚魚期の毒化に関与していることを示唆するデータが得られたことから、フグ毒ループの一部がつながったと考えることができる。また、オオツノヒラムシを特異的に検出可能な手法が確立されつつあるだけでなく、多岐腸類の分類体系を分子系統解析により可能なことが明らかになりつつあり、今後の研究に役立つことが期待される。この疑問を明らかにすべくTTXループの存在を提唱し、昨年度に引き続き研究を実施した。申請者らの予備的研究で、関東南岸では、クサフグの稚魚がふ化後12ヶ月までにその体内に比較的高濃度のTTXを蓄積していることが明らかとなっていた。この要因を明らかにするために、当該海域で採捕したクサフグの稚魚の腸内容物を真核生物のCOI領域を対象とする次世代シーケンサ分析に供した。その結果、オオツノヒラムシと一致する配列が検出され、これは昨年度得られた結果を支持するものであると考えている。

つまり、クサフグの稚魚は、高濃度のTTXを保有するオオツノヒラムシの幼生を摂餌することでTTXを獲得していることが示唆される。これまで、琉球列島の近海では高濃度のTTXを保有するヒラムシ類の報告がなかった。本研究では、沖縄本島近海で採捕されたPlanocera属と思われるヒラムシについて、TTXの保有の有無を調べるとともに、分子系統解析を行った。その結果、このヒラムシは、きわめて高濃度のTTXを保有することが明らかとなり、分子系統解析でもPlanocera属に分類されることが明らかとなった。形態学的特徴から、このヒラムシはPlanocera hedaであることが予想される。前年度までに設計したオオツノヒラムシを特異的に検出できるプライマーを用いる種特異的PCRの精度を確認するため、近縁のツノヒラムシやPlanocera sp.を対象に当該手法を試すとともに、これら近縁種の当該プライマー配列およびその近傍の配列を精査した。また、これら近縁種についても特異的に検出可能なプライマーセットの設計を行った。これまでの研究成果にもとづき、フグ類の若魚および成魚の毒化に関わるオオツノヒラムシの影響について明らかにするため、オオツノヒラムシの成体を用いて毒化実験を行う予定であったが、十分な数をこなすことができなかった。一方で、琉球列島で高次捕食者にTTXを供給する可能性のあるツノヒラムシ類について分子系統およびその毒性を明らかにすることができ、今後、TTX保有生物間におけるTTXの循環を示すのに貴重な知見が得られたので、おおむね順調に研究を進めることができていると判断している。フグはその体内に保有する膨大な量の毒をどこから獲得しているのか。この疑問を明らかにすべくTTXループの存在を提唱し、昨年度までの研究にに引き続き実施した。その結果、以下の成果が得られた。これまでの研究で、関東南岸では、クサフグの稚魚がふ化後12ヶ月までにその体内に比較的高濃度のTTXを蓄積していることが明らかとなった。この要因を明らかにするために、当該海域で採捕したクサフグの稚魚の消化管内容物を真核生物のCOI領域を対象とする次世代シーケンサ分析に供した。その結果、オオツノヒラムシと一致する配列が検出され、これは昨年度までに得られた結果を支持するものであった。本研究は、わが国の最西端に位置する海域でもフグ毒保有生物を対象に実施した。石垣島および西表島で採取したツムギハゼおよびオキナワフグの稚魚の消化管内容物を真核生物のCOI領域を対象とする次世代シーケンサ分析に供した結果、オオツノヒラムシと一致する配列が多数検出された。また、オキナワフグ稚魚の消化管内容物では、オオツノヒラムシのCOI配列の割合が低い個体では、ツムギハゼのCOI配列が多数検出され、この現象は、石垣島および西表島で採取した個体群間で共通していた。この結果は、オキナワフグおよびツムギハゼの稚魚がオオツノヒラムシの幼生を摂餌することでTTXを獲得していると同時に、オキナワフグがツムギハゼを捕食することでTTXを効率的に獲得している可能性を示唆しており、ここにも高次捕食者間のTTXループが存在することが考えられる。これまでに確立された分類手法およびオオツノヒラムシを特異的検出可能な手法を用いて、自然海域においてフグ類がこれら生物群を摂餌していることを明らかにする。また、多岐腸類の分子系統解析による分類の弱点に関しては、核ゲノムよりも進化速度が速いとされるミトコンドリアゲノムにコードされる遺伝子を対象に、より解像度の高い分子系統解析手法を開発する。この他、フグ毒保有生物間におけるフグ毒のやり取りを網羅的に明らかにし、フグ毒の生産者のみに頼らないフグ毒の蓄積機構、すなわちフグ毒ループの全貌を明らかにしていく予定である。
ハドロンコライダーでの精密測定及びエキゾチックトラックを用いた暗黒物質探査

暗黒物質の存在はさまざまな天文学的観測などによって確立している。その正体というのは未だ不明であるが、それを解き明かすことはは現在の素粒子物理学で最も重要な課題である。大型ハドロン衝突型加速器(LHC)は暗黒物質の正体を探るのに大きな役割を果たすと期待されている。しかしながら、暗黒物質の加速器での検出というのは概して困難である。なぜならば仮に暗黒物質が生成されたとしても、暗黒物質は検出器を相互作用せずただすり抜けていくだけであるためである。そのため暗黒物質生成に伴って生成される光子やグルーオンなどを観測することで、暗黒物質の持ち去った運動量を推定する。これによって暗黒物質の検出を目指すのが通常であるが、これには大量の標準模型からのバックグランドが存在するという問題がある。そこで本年度の研究では、暗黒物質の直接生成ではなく、その量子力学的効果を測ることで間接的に暗黒物質の検出を目指す方法を研究した。その結果、LHCでの標準模型過程への微小な補正を検出することで暗黒物質が間接的に発見できることを示した。具体的には電弱ゲージ相互作用をおこなう暗黒物質のループ補正によって陽子衝突によって生成されるレプトンの微分断面積が補正を受けることを示した。その補正は1%かそれ以下の小さなものであるが、レプトンシグナルはLHCにおいて最も精密に測定可能なオブジェクトであるので、微小な変化であっても検出可能である。この方法は暗黒物質の直接生成に基づく発見能力よりも同じ程度か、場合によってはより強力であることがわかった。さらにエキゾチックトラックを使った暗黒物質の検出についても研究を行なった。新しいトラック再構成の方法を提案し、暗黒物質の発見可能性が著しく向上することを示した。当初の予定通り、どのような過程を測定するのが暗黒物質の間接検出にとって有効なのかを解き明かすことができた。この方法はLHCでの新しい暗黒物質検出の方法として注目をあびている。もうひとつの課題であるエキゾチックトラックを用いた暗黒物質探査に関しては実験屋との議論は続いており、十分進展していると考えている。LHCにおいて、暗黒物質の間接検出というテクニックが非常に有用であることがわかったので、それをもっと深めるための研究を行う。まずは非摂動的効果も取り入れた暗黒物質の間接検出の研究を行う。今までは摂動的計算に基づいたものであるが、暗黒物質のタイプにとってはこの非摂動的効果が効き得る。もうひとつは実験グループと共同研究を行い、系統誤差なども考慮した暗黒物質の検出可能性を調べる予定である。旅費の概算と実費の違いにより,未使用額が生じた。翌年度の会議登録費などで使用する予定である。
安定同位体ラベルアミノ酸の多量調製法の確立と応用技法の開発

本年度の実施計画は概ね順調に進行した。昨年度から引続いて行なっているカルボキシル基の選択的【^(13)C】ラベルは全ての残基について完了した。型石は少いものでも1g以上の【^(13)C】ラベルアミノ酸を確保し、蛋白質の構造研究の重要な基盤を提供している。特に合成の執行したアスパラギン酸についても比較的吸収量でフマール酸のラベル体を合成し、ついで固定化E.aoli菌体を用いてアスパラギン酸に変換するプロセスを用いて多量合成に成功した。現在はプロリンなど手持ち量の少いアミノ酸類について更に多量合成を続行している。また、【^(15)N】-ラベルアミノ酸についても味の素(株)中研の助力を得て10g以上のスケールで微生物発酵を利用して調整しつつある。一方、均一ラベルアミノ酸の利用技術は大幅に発展し、特に均一に【^(15)N】ラベルした菌体を加水分解し、その分解物に特定の【L_1】-【^(13)C】ラベルアミノ酸を添加して得られたSSIはJcnにより分裂したサラライト・シグナルのyを与え、多くの応用に有効に用いられる。現在はサグチリシンとの複合体形成時における切断結合のJcnの変化を精密に測定し、【P_1】訂位の歪yについて検討中である。また均一に【^(13)C】-ラベルしたアミノ酸の利用についても多くの初期的成果をあげ、本試験研究は極めて実り多いものとなった。次年度は最終年度ではあるが、将来の安定同位体ラベル手法の更なる飛躍の礎石を築くつもりである。本試験研究は生体高分子、特に蛋白質の溶液内高次構造(変化)を迅速且つ鋭敏に知る新手法として、代表者が行っている安定同位体ラベル法とNMRスペクトルとの組み合わせ技法と表裏をなしている。即ち、蛋白質の各アミノ酸残基の存在状態を詳細に研究するためには、選択的に安定同位体ラベルしたアミノ酸を組み入れた蛋白質の多量調製が必須となる。NMRスペクトルの特性を活かすためには、天然存在比の低い同位体(【^(13)C】,【^(15)N】)ではラベルによりシグナルを特異的に増大するアプローチが、【^1H】のように存在比の大きいものは重水素化による不要なシグナルの減少・除去をはかるアプローチが有効である。我々の多年に渡る経験から、この種のアプローチに最も重要な因子の一つには、安価・多量に安定同位体ラベルしたアミノ酸を得ることの可否にあることは明白である。従って、NMRスペクトルによる蛋白性プロテアーゼ・インヒビターSSIの高次構造の研究を進めつつ、我々の研究手法の一般化を念頭において安定同位体ラベルアミノ酸の多量調製法について検討を開始した。カルボキシル基を選択的に【^(13)C】ラベルしたアミノ酸は〔【^(13)C】〕シアン化ソーダを出発原料にして実験室規模での最適合成法をマニュアル化した。現在までに、アスパラギン酸・アスパラギンのα-カルボキシル基ラベル体を除く全アミノ酸を、少なくとも数グラム規模で合成することに成功している。このようにして多量合成したアミノ酸を用いてSSIの構造研究を並行して行い多くの重要な知見を得ている。さらに、カルボニル炭素シグナルの帰属を側鎖原子団へと拡張するために必要となる、全ての炭素を均一・高濃度に【^(13)C】ラベルしたアミノ酸を調製する方法の確立に向けて、幾つかの異なるアプローチを試みた。次年度においては、安定同位体ラベルした培養菌体から各アミノ酸を分離精製する手法を含め均一ラベルアミノ酸の一般的な調製手法を確立させる。
無限次元確率解析の新展開とその応用

(1)ラフパス解析の視点からのラプラス近似・ループ群上での1次元L^2コホモロジーの消滅などの研究(2) (構成的)場の量子論に現れるハミルトニアンのスペクトルの準古典極限の決定、汎関数積分による解析(3)アレクサンドロフ空間上の確率測度のなす空間の幾何に関して熱流とエントロピーの勾配流が一致するなど、確率測度の空間の幾何に関する成果(4)ウィーナー空間のH-凸集合上のソボレフ空間の性質や極限定理の一種である処罰問題に関する基本的な成果、その他確率論の基礎事項に関する結果(1)ラフパス解析の視点からのラプラス近似・ループ群上での1次元L^2コホモロジーの消滅などの研究(2) (構成的)場の量子論に現れるハミルトニアンのスペクトルの準古典極限の決定、汎関数積分による解析(3)アレクサンドロフ空間上の確率測度のなす空間の幾何に関して熱流とエントロピーの勾配流が一致するなど、確率測度の空間の幾何に関する成果(4)ウィーナー空間のH-凸集合上のソボレフ空間の性質や極限定理の一種である処罰問題に関する基本的な成果、その他確率論の基礎事項に関する結果会田はラフパス解析の意味での開球上で1-微分形式に関して,ポアンカレ型の消滅定理を示した.この応用として,単連結コンパクトリー群のループ空間上の1次元L^2コホモロジーの消滅を証明した.稲浜はハーストパラメータが(1/3,1/4)にあるときの分数べきブラウン運動の汎関数積分に関するラプラス近似をラフパス解析を用いて解析した.河備はBerlin工科大学のPeter Friz氏を訪問し,ラフパス理論を用いたLaplace型汎関数積分の漸近挙動に関する稲浜氏との共同研究に基づいた講演を行い,それを元に振動型汎関数積分への応用に関する議論を行った.日野,原がその共同研究で,ラフパス理論の基本定理の証明に用いられる新古典不等式の,最良係数に関する予想を肯定的に解決したのは,特筆すべき結果である.太田は,確率測度の空間の幾何学について研究し,その結果の1つとして,曲率が負定数以上のアレクサンドロフ空間上の確率測度のなす空間での第一変分公式を得た.応用として,凸関数の勾配流の収縮性などを得た.三上は最適輸送問題の応用として、最大従属確率変数の満たす関係式を求めた.さらに,Knothe-Rosenblatt rearrangementの確率過程版をある種の確率制御問題旨の最小解として定義し,その特徴付けを与えた.矢野は一次元対称安定レヴィ過程に対する処罰問題(極限定理の一種)をYor氏・矢野裕子氏と共同で研究し,局所時間の関数及びカッツ消滅の場合において,ブラウン運動の場合の既知の結果を見通しよく拡張することに成功した.重川は,非対称Dirichlet形式に対する解析を進め,半群の超縮小性などが非対称な場合にも同様に議論できることを示した.また,会田はP(φ)_2ハミルトニアンのスペクトルの最小固有値の準古典極限を決定した.会田はリーマン多様体の連続な道の空間の中の測地線を含む小さな開部分集合上でディリクレラプラシアンを考えその一般化された意味での第二固有値の準古典極限に関して下からの評価を得た.更に投稿中の論文ではこの極限が存在し,道のエネルギー関数の測地線におけるヘッシアンのスペクトル下限と一致することを示した.また,別の投稿中の論文では空間切断の入ったP(φ)_2ハミルトニアンの第一固有値,および第一固有値と第二固有値の間のスペクトルギャップの準古典極限について研究した.重川はリーマン多体上の非対称な拡散作用素に対する一意性の問題を、L^2の場合とL^pの場合とで十分条件を、ドリフトの発散の有界性と内向き増大度が距離に関して線形という形で与えた。これを利用して、生成作用素の定義域の決定も行った。半田はKawazu-S.Watanabe(1971)の「移入を伴う連続相空間上の分枝過程」を調べ,有限個のガンマ分布の畳み込みの弱収束極限が定常分布となり得ることを示した.矢野は二つの処罰問題が共通のシグマ有限測度によって統合される条件を,対応する調和関数の漸近挙動によって与えた.また,後続マルコフ性を持つ測度のクラスにおける端点性をエルゴード性と関係づけた.稲浜はラフパス理論の観点から確率微分方程式で決まる確率過程から導出される微分過程(ヤコビアン過程)の積分可能性について論じた.太田は,熱流を、確率測度のなす距離空間の幾何の観点から研究し、特にアレクサンドロフ空間上の熱流はエントロピーの勾配流と一致することを示した.これから,然核のリプシッツ連続性などの非常に良い性質が導かれる.日野は,抽象Wiener空間におけるH-convexかつH-openの集合について,1階L^2-Sobolev空間の2種類の定義が同値であることを示した.(1)構成的場の量子論に現れるハミルトニアンのスペクトルの準古典極限下での漸近挙動の研究を行った。具体的には、空間が区間の場合のP(φ)_2ハミルトニアンについて(a)最小固有値の準古典極限の決定,(b)ポテンシャル関数が対称・二重井戸型ポテンシャルの場合,最小固有値とその上の第2固有値の差の指数減衰オーダーがポテンシャル関数のゼロ点間のAgmon距離以上であることの証明を行い、論文にまとめた。空間が実数全体の場合や正確な指数減衰オーダーの決定は今後の重要な課題である。(会田)

(2)ループ群上のL^2-1-微分形式に作用するホッジ・小平型作用素の調和形式が0のみであるという研究結果をまとめた論文を学術誌に掲載した。(会田)(3)反射境界条件つき確率微分方程式の駆動過程に関するラフパス解析の意味での連続性について予備的な考察を行った。(会田)(4)時間によらないローレンツ多様体上に定義された場の量子論のハミルトニアンを汎関数積分を用いて解析した。また紫外切断を確率論的手法によって外すことに成功した.熱半群の真空期待値を経路積分表示することにより,従来の作用素論的手法とは全く異なる仕方で紫外切断を外した.さらにくりこみ項の新しい解釈を与えることに成功した.(廣嶋)(5)今年度は引き続きラフパス理論の解析的な側面を研究した。主な手法としてはマリアヴァン解析をラフパス理論に持ち込んで、フラクショナル・ブラウン運動などのガウス過程をラフパスに持ち上げたものの性質を調べた。研究した解析的な定理は、大偏差原理やラプラス近似、密度関数の漸近展開など、通常の確率論で中心的な位置をしめる極限定理である。(稲浜)24年度が最終年度であるため、記入しない。24年度が最終年度であるため、記入しない。
性ホルモン誘導性増殖因子による癌増殖

性ホルモン依存性癌の増殖は、性ホルモン誘導性に産生される自己増殖因子を介しておこるのではないかと考えられるようになったが、分子レベルでの実証はなされていない。その最大の理由は、無血清・無蛋白培地で性ホルモン依存性の増殖を示す実験系がなかったからである。我々は、無血清培地〔Ham's Fー12:MEM(1:1,v/v)+0.1%BSA〕においてアンドロゲン依存性増殖を示すCloned Cell line(マウス乳癌シオノギ癌由来のSCー3)を樹立し、その依存性増殖の分子機構を解明した。(1).アンドロゲンはSCー3の受容体と結合し、結合物はfibroblast growthfactor(FGF)様因子を産生・分泌させ、因子はSCー3のFGF受容体と結合しSCー3の増殖を促進することが明らかになった。その際bFGF,aFGF,hstー1,intー2のmRNAは発現しないので,SCー3がアンドロゲン誘導性に産生にする因子は、新らしいFGF familyと考えられた。...松本,佐藤,島崎,吉川。(2).上述の無血清培地からBSAを除いた無蛋白培地でも,1)と同様のことが示された...松本,佐藤。(3)。アンドロゲンの作用でSCー3.から産生、分泌される因子を2度のヘパリンセファロ-ズカラムとC4の逆相高速液体クロマイグラフで純化し,SDSーPAGEで分子量28KDaの増殖活性を示す因子を得た。この因子の一部のアミノ酸配列を決定し,これより因子のcDNAのクロ-ニングに成功した。COS7細胞にcDNAを導入・発現させ,SCー3増殖促進活性のあるクロ-ンの塩基配列を決定した。アミノ酸数215でN末にシグナルペプチドを有し、成熟因子の推定分子量は22KDaである。糖鎖が附着して28KDaの因子となりFGF受容体結合部位を有する。FGF familyとの相同性は30ー40%の新しい増殖因子であった...宮本,松本。(3)。
転座型遺伝子変化の新規ユニバーサル検出法の確立

肺腺癌におけるEML4ーALK転座は、恒常的な発現のあるEML4のプロモーターによって転座したALKキナーゼが発現する。このためALK転座があれば5'末と3'末の転写物の間に乖離が生じ、この差を定量RT-PCRで検出することですクリーニンが可能となる。臨床検体で解析した結果、明瞭に区別することができた。他の転座型変異であるROS1、RETについては正常組織での発現が観察されたが、うまくcut-off値を設けることによって検出することができた。更にこれらの結果を免疫染色も応用しようとし、ROS1の免疫染色によるスクリーニング法確立し、報告した。転座型遺伝子変化の多くは、その由来細胞で転写が促進されている遺伝子とがん遺伝子が転座する。すなわち転写が促進されている遺伝子のプロモーター下にがん遺伝子が位置するようになるため、がん遺伝子の転写も促進され、それが腫瘍増殖に寄与すると考えられる。例えば、肺ではEML4転写物は通常レベルに検出されるが、ALK遺伝子変異はほとんど検出されない。しかしながら、EML4-ALK転座によって、EML4のN末蛋白とALKのC末キナーゼドメインとが転座を起こし、キメラ蛋白が生成される。その蛋白はEML4のBASICドメインを使って恒常的にダイマーを形成し、ALKのキナーゼドメインを活性化させると考えられている。このため、ALKの5'末と3'末の転写物は、転座があればその発現量に乖離が生じるはずである。これを定量的RT-PCRで計測することで、転座のよいスクリーニングになると考えられる。そこで、本年度はこのアッセイ系の確立を試みた。すでにFISH法やIHC法を用いてALK転座の存在がわかっている15症例および正常型の症例40例で両者を明瞭に区別する方法が確立できた。定量的RT-PCRでは一般に増幅産物は非常に短いことが多く、確立できたアッセイ系においても100bp程度のPCRであり、汎用されているFFPEサンプルでも応用可能かどうかについても検討を進めた。しかしながら、非特異的な増幅も観察され、現在至適化カットオフ値などを検討している。転座型遺伝子変化の多くは、その由来細胞で転写が促進されている遺伝子とがん遺伝子が転座を起こすことがほとんどである。すなわち、転座が促進されている遺伝子のプロモーター下にがん遺伝子が位置するようになるため、がん遺伝子の転写も促進され、それが腫瘍増殖に寄与すると考えられている。そこで、EML4転写物は肺組織においては検出されるものの、ALK遺伝子の発現は認められず、EML4-ALK転座によって、EML4のN末蛋白とALKのC末キナーゼドメインとが転座を起こし、キメラ蛋白が生成される。その蛋白はEML4のBASICドメインを用いて恒常的にダイマーを形成し、ALKのキナーゼドメインを活性化させると考えられている。昨年度は、ALK転座の存在がわかっている15症例および正常型の症例40例で両者を明瞭に区別する方法を確立した。また、多くの臨床の現場で用いられているFFPEサンプノレでも応用可能かどうかについても検討を進めたが、有用な方法の確立には至らなかった。現在、転座型遺伝子変異としてROS1も治療の対象となりうるドライバー変異として知られており、臨床第三相試験も試みられている。そこで、ROS1についても検討を進めた。免疫組織化学法を用いてタンパクの発現を見たところ、ALK再構成とは異なり、正常細胞での発現を認めた。しかしながら、ROS1転写物の5'末と3'末では差が認められ、うまくcut-off値を設けることでスクリーニングツールとして活用できることが明らかとなった。分子病理学少なくともmRNAを用いたアッセイ系は確立できたが、より汎用性の高いFFPEサンプルでの適応の点で若干の遅れが出ている。それは固定状態によると思われる断片化により非特異的な増幅が観察され、至適化条件を調整する必要があり、追加検討がまだ必要である。少なくともmRNAを用いたアッセイ系は確立できたため、他の転座遺伝子、ROS1、RET、ETV6、MYBに広げて行く。この検討で得られた転座症例については、mRNAアッセイ系のみならず、C末、N末エピトープ認識抗体により同様の発現乖離についても検討を広げていきたい。
強い重力場下における固体中の原子の沈降と構造制御に関する研究

1装置の改良:(1)原研の大容量型超重力場発生装置を用いた100万Gでの高温長時間の安定運転を目指した。これまでに96万G、130°Cでの長時間運転に成功していたが、装置がやや不安定であり、それ以上の条件が望めなかった。そこで、タービンのダンパーブッシングの改良とローターの改良を行った結果、安定な重力場の発生が可能になり、102万G、260°Cの条件での長時間運転に成功した。また、高周波加熱装置の導入テストを行った。テストでは、静止状態で500°C以上への試料の加熱に成功した。導入により、より広い物質系での実験が可能になると期待できる。(2)熊本大学の超重力場発生装置にデータ収集システムを導入した(キーエンスGR3500)。実験室外での温度や波形データの記録監視ができるので、遠隔監視が可能となり、装置から発生する騒音、排気ガス、オイルミスト等による人体への影響に対する不安を減らすことが出来た。2低融点合金中の原子の沈降実験:低融点合金であるBi-Sb合金およびSe-Te合金(半導体)について超重力場実験を行い、原子の沈降による原子スケールの傾斜構造を実現した.(ともに102万G、260°C、100時間)。両合金ともに大きな結晶成長が見られた。今回の実験目的は原子の沈降の実現に絞っていたが、原子の沈降と結晶成長について調べる必要がある。3化合物についての原子の沈降実験:化合物等についての実験として金属間化合物Bi_3Pb_7についての超重力場実験を行った。Bi_3Pb_7では原子の沈降による金属間化合物の分解が確認された。今後の装置の温度条件の向上に合わせて一般的な化合物についても実験を行う予定である。
導電性ナノ粒子の2次元ランダム配列を用いた低コストな確率論的単一電子素子作製法

本研究課題では,微小ナノギャップの作製やナノ粒子の精密配置を排除した,単一電子素子の新しい作製方法を提案し,その有効性の実証を目指している。島電極に導電性ナノ粒子を利用する点は従来研究のアプローチと同じであるが,本研究課題で提案する手法では,電極ナノギャップへのナノ粒子の精密配置を行わず,サブミクロン程度の比較的大きな電極ギャップにナノ粒子の2次元ランダム配列を形成し,3電極間でのパーコレーション接続・非接続を利用した確率論的な作製を行う。また,この実験方法をモデル化し,数値シミュレーションによって,歩留まりや予想される電気的特性を予測し,実験における素子設計や作製条件へのフィードバックを図る。2年目となった平成30年度においても,実験と数値計算の両方について取り組んだ。実験では,3電極を設けた酸化膜付きシリコン基板を,大小2種類の粒径を有する金ナノ粒子コロイド溶液に浸漬し, 2次元ランダム配列を形成した。具体的には,まず電子ビームリソグラフィと抵抗加熱蒸着法を用いて金電極を作製し,シラン化処理を施した後に,粒径が小さな金コロイド溶液中に浸漬した。続いて,チオール化処理を施し,粒径が大きな金コロイド溶液中に浸漬した。その後,室温での電極間の電気的接続を確認したのちに,液体ヘリウム温度でクーロン閉塞を確認した。さらに,液体ヘリウム温度から室温までの温度範囲で,電気的抵抗の温度変化を測定した。また,磁性ナノ粒子を用いた単一電子素子の作製にも着手した。数値計算については,前年度の数値シミュレーション結果を整理するとともに,パラメータ範囲を拡張した数値シミュレーションを実施した。最終的に,それらの結果を査読付き英語論文として出版した。金ナノ粒子のパーコレーション接続については,実験方法をある程度確立してある。1年目に用いた金ナノ粒子は粒径が1種類,2年目に用いた金ナノ粒子は粒径が2種類であり,いずれにおいても単一電子素子として動作することを確認している。基板表面や金ナノ粒子表面の化学的処理についても,試行錯誤的な実験を経て,作製に有効である条件を見い出している。得られた成果については,査読付き論文の出版や,学会講演会における口頭発表・ポスター発表を通して外部に発信している。なお,2種類の粒径の金ナノ粒子を混合した実験では,粒径におおよそ反比例する単一電子素子帯電効果の影響を特性上に示すことができ,研究会での口頭発表を行ってはいるが,査読付き論文に必要となる定量的な考察をするには実験条件が不ぞろいな点があったため,作製方法の最適化と合わせて今後も取り組む。数値計算に関しては,三角格子を用いたパーコレーション接続のシミュレーションを出発点として,格子点でのナノ粒子の占有確率とパーコレーション接続確率との関係,回路シミュレータを援用した電極間の電気抵抗を計算,モンテカルロシミュレーションによる単一電子トンネリングの計算とクーロン閉塞閾値電圧の導出が可能となった。これにより,電気抵抗と閾値電圧との相関関係を見い出すことができ,査読付き論文として出版済みである。数値計算の次のステップとしては,大小2種類のナノ粒子を用いた実験のシミュレーションがある。これについては,計算アルゴリズムを検討している段階であり,まだ計算プログラムとしては実現されていない。実験の再現に適した計算アルゴリズムを開発する必要がある。以上のことから,当初計画よりも遅れている部分があるものの,現在までの研究の進捗としては,おおむね順調に進展していると判断している。基本的には,当初の平成31年度の研究実施計画に基づいて研究を遂行する。実験では,ナノ粒子のサイズを変更した実験,また,複数のサイズのナノ粒子を用いた実験を行う。特に,平成30年度の実験において不ぞろいだった測定条件(バイアス条件)を整えて電気的特性の測定を行い,査読付き論文として出版することを目指す。また,金コロイド溶液の塗布後に外部から電極に電気的信号を印加し,ナノ粒子配列を人為的に制御することを行う。これは,ナノ粒子に作用する誘電泳動力を利用するものである。この方法で作製されるナノ粒子の配置は完全なランダムではなくなるが,単一電子素子の実現に向けて効果がでるのであれば,本研究課題の当初の目的に沿った成果になる。さらに,金ナノ粒子に代えて磁性ナノ粒子を用いた単一電子素子の作製を行う。平成30年度での予備的な実験により,カーボンコートされたコバルト・ナノ粒子を用いて単一電子素子が実現できることを確認している。磁性ナノ粒子を用いることで,その作製(配列方法)に磁場を用いることが可能となり,さらに,単一電子素子が磁場に応答するようになることが期待される。上述の誘電泳動力の併用も考えられる。数値計算においては,サイズの異なる粒子を扱えるようにプログラムを拡張し,シミュレーションを行う。大小の粒子を組み合わせた場合のパーコレーション接続確率,電気抵抗,さらにはクーロン閉塞閾値電圧を求め,実験結果との比較を行う。実験の再現に適した計算アルゴリズムの開発がカギになると思われる。また,扱う系がランダム事象であることから,計算結果の統計的な処理方法についても検討を行う。

島電極に導電性ナノ粒子を利用する点は従来研究のアプローチと同じであるが,本研究課題で提案する手法では,電極ナノギャップへのナノ粒子の精密配置を行わず,サブミクロン程度の比較的大きな電極ギャップにナノ粒子の2次元ランダム配列を形成し,3電極間でのパーコレーション接続・非接続を利用した確率論的な作製を行う。また,この実験方法をモデル化し,数値シミュレーションによって,歩留まりや予想される電気的特性を予測し,実験における素子設計や作製条件へのフィードバックを図る。初年度となる平成29年度においては,実験と数値計算の両方について取り組んだ。実験では,3電極を設けた酸化膜付きシリコン基板上に金ナノ粒子を分散したコロイド溶液を塗布し, 2次元ランダム配列を形成した。具体的には,まず電子ビームリソグラフィと抵抗加熱蒸着法を用いて金電極を作製し,その上に金コロイド溶液を塗布・乾燥させた。種々の金電極構造,塗布条件を試み,電極間の接続を確認するとともに,電子顕微鏡観察によって,金ナノ粒子の密度を計測した。電気的特性の測定結果においては,液体ヘリウム温度もしくは液体窒素にてクーロン閉塞を確認した。数値計算については,三角メッシュ上に電極を設定した後に,ある占有確率で格子点に粒子を配置した場合のパーコレーション接続の様子をシミュレーションした。さらに,計算プログラムを拡張し,パーコレーション接続した場合の抵抗値やクーロン閉塞閾値電圧を計算できるようにした。結果としては,例えば,1200回の数値計算から統計的な結果として,抵抗値と閾値電圧との相関関係を得た。実験に関しては,実験方法・工程をほぼ確立した。当初の予定では,金コロイド溶液の塗布・乾燥・測定のサイクル数と接続確率の関係を取得する予定であったが,サイクルを繰り返しても接続確率が増えない,あるいは減少する結果がしばしば得られた。これは,乾燥後の金ナノ粒子が必ずしも基板表面に固定されていないため,と推測された。そこで,実験方法の改善として,基板表面のシラン化処理,さらには,金コロイド溶液の塗布と乾燥の後のチオール化処理を新たに導入した。現在までに,金コロイド溶液への試料の液浸時間と金ナノ粒子密度との関係が明らかになっている。また,電気的測定においては,クーロン閉塞が確認されている。この結果については,外部発表を行っている。数値計算に関しては,三角格子を用いたパーコレーション接続のシミュレーションが可能となり,格子点でのナノ粒子の占有確率とパーコレーション接続確率との関係が得られている。種々の電極構造(寸法や形状)に対する数多くの数値計算を実施し,おおよその傾向は把握できている。一方,接続確率だけでは単一電子素子としての特性が予測できないことも明らかとなってきた。そこで,パーコレーション接続の計算プログラムに回路シミュレータを組み込み,電極間の電気抵抗を計算できるようにした。さらなる拡張として,モンテカルロシミュレーションによる単一電子トンネリングの計算を組み込み,クーロン閉塞閾値電圧も得られるようにした。これまで,電気抵抗と閾値電圧との相関関係を見い出すことができている。これについては,学術論文として投稿準備中である。以上のことから,平成29年度における研究の進捗としては,おおむね順調に進展していると判断している。
２型糖尿病の腎障害発症リスクに及ぼす食事中脂質の影響

糖尿病性腎症の発症リスクへ及ぼす食事中脂質の影響を検討するために、糖尿病マウスへ高脂肪食を負荷し、腎臓への影響、特にその症状の進行に対する影響を明らかにすることを目的として研究を計画・実施した。自然発症II型糖尿病マウス(NSYマウス)へ高脂肪食を負荷したところ、血糖値や尿糖に影響を及ぼし糖尿病の進行を早めた。高脂肪食を負荷したNSYマウスでは著しい皮下脂肪の増加が見られた。この皮下脂肪の増加は、高脂肪食を負荷し耐糖能異常を引き起こした肥満マウスとは異なり、NSYマウスに特徴的に見られたものであった。そこで、皮下脂肪組織の遺伝子発現解析を行ったところ、いくつかの生活習慣病に関わると考えられる因子の発現に、高脂肪食負荷による変動が見られた(PPAR-δ・u-PAなど)。これらの変動が、代謝異常の増悪や、腎症へどのように影響するのかさらに検討する必要がある。また、高脂肪食負荷によって腎肥大が観察され、病理切片でも腎障害に進行が観察された。そこで腎障害に関わる因子に対する高脂肪食負荷の影響についてさらに検討する予定である。病理切片の解析、特異的な変化の見られた脂肪組織での遺伝子発現解析などを実施し、概ね研究計画の予定通りに研究を実施することができた。腎組織での腎障害に関する因子の高脂肪食による影響について、現在までに得られた結果との関連性についても考慮して検討する。前年度に切片の作成を終了した病理切片の解析に時間をかけたため、次年度使用額が生じた。次年度は、腎組織のタンパク質等の分析を予定しており、抗体やELISAキットなど、研究遂行に必要な試薬・器具の購入、また共同研究施設の施設利用料など、申請通りに使用する予定である。自然発症II型糖尿病マウス(NSYマウス)へコントロール食および高脂肪食(60%脂質)を自由摂取させて25週間飼育した。糖尿病の発症・進行の指標として5週間ごとに経口糖負荷試験(OGTT)、試験紙による尿糖の定性および尿中アルブミン量を測定した。高脂肪食群の体重は食事負荷1週間で有意に増加し、その後もコントロール食群と比較して著しい体重増加を示した。また、高脂肪食群ではOGTTにおいてもコントロール食群と比較して空腹時の血糖値の上昇、耐糖能異常が観察された。さらに89週目には高脂肪食群の尿量の増加が見られ、尿糖も陽性(+3+4)であり、尿中のアルブミン量も上昇していた。一方コントロール食群では25週目でも尿糖は(±)であった。NSYマウスはICRマウスから樹立された自然発症II型糖尿病マウスであるため、ICRマウスの血糖値や耐糖能を正常マウスとして、NSYマウスコントロール食群の血糖値や耐糖能について比較検討すると、高脂肪食群よりも軽度であるが、コントロール食群の空腹時血糖は上昇しており、耐糖能異常も見られた。以上のように、高脂肪食は糖尿病を自然発症するNSYマウスにおいて、血糖値や尿糖に影響を及ぼし、糖尿病の進行を早めた。この実験モデルでは食事負荷によってその病態の進行に著しい差異が認められ、本研究の目的を達するのに有用なモデルであると考えられた。今後、採取した試料を用いてさらに検討を進める予定である。平成24年度の研究計画では、食事負荷試験の実施とその試料の処理までを予定しており、ほぼ予定通りに研究を実施できた。食事負荷試験後に腎臓の病理切片を作製した。これを用いて血管基底膜や細胞外貴基質の変化について解析し、その結果に影響すると考えられる因子について、免疫組織染色を行う。肝臓・脂肪組織についても病理切片を作製し、病態に影響を及ぼす変化が見られれば同様に解析を行う。

II型糖尿病の自然発症を早め、症状の悪化を誘導する因子や、腎障害に関与する因子について、酵素活性、蛋白量などを検討し、高脂肪食負荷の影響を明らかにする。また必要があればマイクロアレイ解析を行う。前年度に切片の作成を終了した病理切片の解析に時間をかけたため、次年度使用額が生じた。次年度は、腎組織のタンパク質等の分析を予定しており、抗体やELISAキットなど、研究遂行に必要な試薬・器具の購入、また共同研究施設の施設利用料など、申請通りに使用する予定である。平成24年度は若干の遅れがあり、研究費の次年度への繰り越しがあった。次年度は、平成24年度の繰り越し分を含めて、申請通り、研究遂行に必要な試薬・器具の購入、機器の使用料、研究成果発表に使用する計画である。